(57)【要約】  患者における、臓器に特異的な自己免疫性疾患（例えばセリアック病および自己免疫性甲状腺炎）および／または輸血反応および／またはＩｇＡ欠乏症を包含する、免疫介在性疾患の過程における、診断、予測、および治療有効性のスクリーニングのための、血清サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）のアッセイの使用は、以下のステップを包含する。すなわち、患者から血液サンプルを採取する最初のステップと、この血液サンプルを分析して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定するステップと、先のステップにおいて決定されたＢＬｙＳのレベルと、サイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値とを比較するステップと、先のステップにおいて示唆された、サイトカインＢＬｙＳの決定された濃度とサイトカインＢＬｙＳの濃度の参照値との間の、有意な偏差を特定するステップと、先のステップに基づいて、上述の免疫介在性疾患に対して、診断を行うおよび／または予測を行う、および／または治療有効性を判断するステップとを包含する。
2010540948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において免疫介在性疾患を確定するための診断用マーカーとしてのサイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）のアッセイの使用であって、
該免疫介在性疾患は、
セリアック病、および自己免疫性甲状腺炎などの、臓器に特異的な自己免疫性疾患と、
輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、および輸血反応などの、輸血に関連した免疫介在性疾患と、
を含む群に包含され、
該患者は、該免疫介在性疾患を示唆する症状または徴候を有する、および／または該免疫介在性疾患が疑われる状況にある、および／または該免疫介在性疾患の素因を有する患者であり、
該患者から血液サンプルを採取する第１のステップと、
該血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度を、健康なコントロール群について前もって得られたサイトカインＢｌｙＳの濃度の１つ以上の参照値と比較する第３のステップと、
第３のステップにおける比較から導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢｌｙＳの濃度と該健康なコントロール群について前もって得られたサイトカインＢｌｙＳの濃度の参照値との間の、有意な偏差を特定して、該免疫介在性疾患の一つに罹患したとして患者を選択する第４のステップと、
該免疫介在性疾患の一つに罹患したとして選択された患者の、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢｌｙＳの濃度の１つ以上の参照値であって、該免疫介在性疾患に罹患した、および／または活動性疾患またはその特定の過程の診断が確立された、一連の患者について前もって得られたＢＬｙＳの参照値の範囲内である参照値とを比較する第５のステップと、
第５のステップにおいてなされた比較に基づいて、該免疫介在性疾患の１つ以上の確定的な疾患の診断を行う第６のステップと、
を包含する方法における、使用。
【請求項２】
前記方法の前記第２のステップが、ＥＬＩＳＡの技術に基づく自動装置を用いて実施されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
免疫介在性疾患の過程におけるクローン性のＢ細胞またはＴ細胞の出現において、患者を経時的にモニタリングするための方法におけるマーカーとしてのサイトカインＢＬｙＳのアッセイの使用であって、
該免疫介在性疾患は、
セリアック病、および自己免疫性甲状腺炎などの、臓器に特異的な自己免疫性疾患と、
輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、および輸血反応などの、輸血に関連した免疫介在性疾患と、
ＩｇＡ欠乏症、および分類不能型免疫不全症などの、免疫不全症と、
の群に包含され、
該方法は、
該免疫介在性疾患に罹患した患者から血液サンプルを採取する第１のステップと、
該血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値および／または患者から前もって検出されたサイトカインＢＬｙＳの１つ以上の値とを比較する第３のステップと、
第３のステップにおける比較から導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と第３のステップにおいて示されたサイトカインＢＬｙＳの濃度の参照値との間の、有意な偏差を特定する第４のステップと、
第４のステップにおいて特定された偏差に従って、該免疫介在性疾患の過程においてＢ細胞のクローン性／Ｔ細胞のクローン性へと進行するリスクが発生するとみなす第５のステップと、
第５のステップの結果に基づいて、第１のステップから第５のステップを所定の時間間隔で経時的に繰り返すことを決定する第６のステップと、
を包含する、使用。
【請求項４】
免疫介在性疾患の予測をするための方法における予測用マーカーとしてのサイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）の使用であって、
該免疫介在性疾患は、
セリアック病、および自己免疫性甲状腺炎などの、臓器に特異的な自己免疫性疾患と、
輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、および輸血反応などの、輸血に起因する免疫介在性疾患と、
を含む群に包含され、
該方法は、
ｉ）慢性の細菌感染症（肝炎ウイルス、疱疹ウイルス、クラミジアなど）の存在、
ｉｉ）疾患の発病のプロセスまたは一般に使用される治療法の対象における、特定のＨＬＡの遺伝子型または重要因子をコードする遺伝子の存在、
ｉｉｉ）甲状腺腫を伴う、または伴わない無症候性甲状腺機能低下症、
ｉｖ）産後の鬱病および／または産後の甲状腺機能低下症、
ｖ）１つ以上の活動性の免疫介在性疾患の存在、
ｖｉ）輸血の必要性、および
ｖｉｉ）新しい治療法の開始
の状況の１つ以上によって特徴付けられる患者を選択する予備的なステップと、
選択された患者から血液サンプルを採取する第１のステップと、
該血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値とを比較する第３のステップと、
第３のステップにおける比較から導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と第３のステップにおいて考慮される参照値との間の、有意な偏差を特定する第４のステップと、
該免疫介在性疾患について第４のステップにおいて特定された偏差に基づいて、予測を行う第５のステップと、
を包含する、使用。
【請求項５】
免疫介在性疾患に罹患した患者の治療をモニタリングする方法におけるマーカーとしてのサイトカインＢＬｙＳのアッセイの使用であって、
該免疫介在性疾患は、
セリアック病、および自己免疫性甲状腺炎などの、臓器に特異的な自己免疫性疾患と、
輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、および輸血反応などの、輸血に起因する免疫介在性疾患と、
を含む群に包含され、
該方法は、
該免疫介在性疾患を治療する治療ステップと、
治療法を行う前に、該患者から血液サンプルを採取する第１のステップと、
該血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
治療法の開始後に、所定の時間間隔で該患者から１つ以上の血液サンプルを採取する第３のステップと、
第３のステップの該１つ以上の血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第４のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、第４のステップにおいて患者から検出されたサイトカインＢＬｙＳの濃度の値とを比較する第５のステップと、
第５のステップにおける比較から導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と第４のステップにおいて検出されたＢＬｙＳの値との間の、有意な偏差を特定する第６のステップと、
第６のステップにおいて特定された偏差に基づいて、治療的処置に有効性があるとみなす第７のステップと、
を包含する、使用。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用であって、前記サイトカインＢＬｙＳのアッセイが、
患者を対象とする、前記免疫介在性疾患の主な徴候および症状を特定可能な理学的検査、
患者を対象とする、１回以上のＸ線検査、
上記患者から採取された生検用標本の組織学検査、および
上記患者から採取された生検用標本、末梢血液、または骨髄の、分子的な分析
からなる群より選択される、１回または複数回の検査のステップと組み合わせられ得る、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、素因、確定診断、臨床経過、および治療有効性のマーカーとしてのサイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）の血清学的なアッセイの使用に基づく、免疫に関連した疾患（例えば臓器に特異的な疾患および輸血反応）の診断的および予測的な管理に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）は、“ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）”としても知られ、１９９９年に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のスーパーファミリーのメンバーとの相同性に基づいて発見され、その特性が知られるようになった（Schneider P.ら, J Exp Med. 1999;189(11): 1747〜1756、およびNardelli B.ら, Blood. 2001; 97(1):198〜204）。
【０００３】
ＢＬｙＳは、Ｂ細胞の発生および分化を調節する際に鍵となる因子の一つであると現在考えられているので、免疫応答において非常に重要な役割を果たす（Mackay F., Browning JL. Nat Rev Immunol 2002;2:465〜475、およびBatten Mら, J Exp Med 2000; 192(10): 1453〜1466）。
【０００４】
ＢＬｙＳは、例えば、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞などの骨髄細胞株によって合成され、膜タンパク質として発現し、主として可溶性の形態で放出される（Huard B.ら, Int Immunol 2004;16:467〜475、およびNardelli B.ら, Blood. 2001;97(1):198〜204）。
【０００５】
近年、このようなサイトカインを分泌することができる一連の細胞種はさらに増加し、非骨髄性細胞（例えば、髄様ストローマの細胞（Gorelik Lら, J Exp Med 2003;198:937〜945）、滑膜細胞（Ohata J.ら, J Immunol 2005;174(2):864〜870）、アストロサイト（Markus Krumbholzら, J Exp Med. 2005;201(2):195〜200）、唾液腺上皮（IttahIttah M, Miceli-Richard C., Eric Gottenburg Jら, Arthritis Res Ther. 2006;8(2):R51）、および腸上皮（Xu W., He B., Chiu A.ら, Nature Immunol 2007;8(3):294〜303）など）も包含するようになった。
【０００６】
ＢＬｙＳは、３つの受容体との相互作用を介してその機能を発揮する。これらの３つの受容体の中でもっとも重要なものはＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦＲ）であり、Ｂリンパ球によって独特の様式にて発現する（Ng LGら, J Immunol. 2004;173(2):807〜817）。ＢＬｙＳとＢＡＦＦＲと結合によって、いくつかの抗アポトーシス因子（Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１）の発現の増加が誘導される。これにより、成熟Ｂ細胞の生存および増殖が促進される（Craxton A,ら, J Exp Med. 2005; 202(10): 1363〜1374）。
【０００７】
ＢＬｙＳは、ＡＰＲＩＬ（増殖を誘導するリガンド）と呼ばれるＴＮＦスーパーファミリーの別のメンバーに対して高い相同性を有する（Hahne Mら, J Exp Med 1998;188:1185〜1190）。このＡＰＲＩＬは、３つの受容体のうち２つの受容体、つまり、ＴＡＣＩ（膜貫通型活性化因子およびカルシウム調整シクロフィリンリガンド（transmembrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand））およびＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）を、ＢＬｙＳと共有している（Thompson JS, Schneider P, Kalled SLら, J Exp Med. 2002;192(1):129〜135、およびSeshasayee D, Valdez P, Yan Mら, Immunity 2003;18(2):279〜288）。
【０００８】
Ｂ細胞のホメオスタシスにおけるＢＬｙＳの重要性は、マウスのモデルに関する研究によって明らかになった。
【０００９】
ＢＬｙＳの発現が抑止されたＢＬｙＳノックアウトマウスでは、成熟Ｂリンパ球のプールの重大な変化が観察される（Gross JAら, Immunity 2001;15:289〜302）。これに対して、ＢＬｙＳを過剰発現するマウス（ＢＬｙＳ遺伝子を導入されたマウス）は、自己免疫性疾患に典型的に見られる特徴を多数発生させる。
【００１０】
この特徴としては、脾肥大およびリンパアデノ肥大、高血清レベルの自己免疫性抗体（リウマチ因子、抗ＤＮＡ）、シェーグレン症候群（Sjogren’s syndrome；ＳＳ）の過程において見られるような、腺構造の破壊および分泌機能の損失をともなう耳下腺のＢ細胞の浸潤、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に典型的な糸球体腎炎を大いに想起させる腎臓の変化、およびＢ細胞の異常増殖が挙げられる（Mackay Fら, J Exp Med. 1999;190(11):1697〜1710、およびThien Mら, Immunity 204;20(6):785〜798）。
【００１１】
このように、実験によって得られた証拠は、ＢＬｙＳが生理的なレベルにおいてＢ細胞の生存および分化を促進するが（Mackay F, Browning JL. Nat Rev Immunol 2002;2:465〜475）、超生理的な濃度において通常は免疫系によって抑制される自己反応性Ｂリンパ球を生存および増殖させようにすることを示している（Thien Mら, Immunity. 2004;20(6):785〜798）。
【００１２】
この実験的証拠にしたがって、ＢＬｙＳの高血清レベルおよび高組織レベルが、最近、いくつかの自己免疫性疾患において記録された。
【００１３】
これらの自己免疫性疾患としては、シェーグレン症候群（ＳＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）、多発性硬化症（ＭＳ）、混合型クリオグロブリン血症（ＭＣ）、およびウェゲナー肉芽腫症などが挙げられる（Stohl W. B Curr Rheumatol Rep 2002;4(4):345〜350、Seyler TMら, J Clin Invest. 2005;115(11):3083〜3092、Mariette Xら, Ann Rheum Dis. 2003;62(2):168〜171、Matsushita Tら, Arthritis Rheum. 2006;54(1):192〜201、M. Thangarajら, J Neuroimmunol 2004;152:183〜190、Fabris Mら, J Rheumatol 2007;46:37〜43、およびM. Krumbholzら, J Autoimmun 2005;25:298〜302）。
【００１４】
一般に、これらの自己免疫性疾患において、ＢＬｙＳの血清レベルおよび組織レベルは、患部組織（骨膜、唾液腺）における疾患に特異的な自己抗体のレベル、ならびにリンパ球浸潤の存在およびレベルと相関関係にある。特に、異所性の胚中心の形成は、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬの存在と相関関係にあるようである（Jonsson MVら,  J Clin Immunol 2005;25:189〜201、およびSzodoray Pら, Clin Immunol 2005;17:168〜176）。
【００１５】
自己免疫性疾患は、大きく２つのサブグループ、つまり全身的な障害と臓器に特異的な障害とに分類することができる。前者は、ヒト生命体全体に対して影響をおよぼす。また、後者は、体の１部分だけに対して特定の様式で影響を及ぼす。ＢＬｙＳは、一部の全身的な自己免疫性疾患について徹底的に調べられてきたが、本発明のように臓器に特異的な自己免疫性疾患について調べられていない。
【００１６】
また、例えば免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）欠乏症などの、一般的に自己免疫性障害を発症する素因になる免疫不全もある。
【００１７】
自己免疫と適切に関連しないが、臓器の損傷が由来し発生する主要メカニズムを自己免疫と共有する免疫に関連した疾患の中に、免疫に関連した輸血反応がある。免疫に関連した輸血反応としては、血漿または赤血球の不適合に起因し、輸血に伴って起こる可能性のある全ての合併症（例えばスリルハイパーセルミックシンドローム（thrill-hyperthermic syndrome）、アレルギー性反応など）が挙げられるが、特に、輸血後の溶血性反応が挙げられる。近年、自己免疫性疾患に罹患した患者は、一般的な集団と比較して、輸血後に不規則同種抗体の生成量を増加させることが観察された。不規則同種抗体とは、輸血、妊娠、または活動性免疫の獲得の後に、非自己赤血球抗原に対して生成されるか、あるいは、免疫グロブリンもしくは血漿の注入、または臓器もしくは骨髄の移植の後に受動的に獲得される抗体である。同種抗体の存在頻度は、一般的な集団において０．３％〜３８％の間でばらつきがあり、血液中の同種抗体の検出に使用される新しい方法の感度が増すことによって連続的に増加している。これらの同種抗体は、臨床上の相関性を有する溶血性輸血反応の大半にとっての原因である。
【００１８】
ＢＬｙＳのレベルの上昇は、臓器拒絶反応の過程においても見られる。この場合、Ｔ−リンパ球に対するＢＬｙＳとＢＡＦＦＲとの相互作用が、移植した臓器に対抗するＴ細胞の活性化および増殖を促進する（Ye Qら, Eur J Immunol 2004 ;34 :2750〜2759）。ＭＨＣの不適合に起因する心臓移植の拒絶反応マウスのモデルにおいて、ＢＬｙＳ−ＢＡＦＦＲを遮断すると、移植した臓器の生存が大幅に延長される。
【００１９】
臓器に特異的な自己免疫性疾患（例えば自己免疫性甲状腺炎（ＡＩＴＤ）およびセリアック病（ＣＤ）など）において、免疫に関連した輸血反応（ＩＲＴＲ）と同様に、Ｂリンパ球の役割はまだ明らかにされてない一方で、Ｔリンパ球の役割の方は比較的よく解明されている。実際に、ＡＩＴＤおよびＣＤは、関連する組織中に浸潤して蔓延したＴリンパ球によって特徴付けられており、自己抗原に対する特異性を有するＴ細胞クローンの活性化は、病理学的なプロセスの基礎において常に考慮されてきた。一方、Ｂリンパ球（浸潤においてめったに説明されない細胞である）による自己抗体の分泌は、診断レベルにおいて非常に重要であるが、病理学的なプロセスの主要なトリガーに対して二次的なものであると考えられている。実際に、ＣＤおよびＡＩＴＤも、疾患に特異的な循環している自己抗体がない場合に診断可能である。ただし、多数の他の全身的な自己免疫性疾患、例えばＲＡ、ＳＳ、ＳＬＥ、ＳＳｃなどにおいても、同様の診断上の選択肢を見つけることもできる。しかし、この後者の場合には、Ｂリンパ球の役割はさらに詳しく解明されている。実際、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験または動物モデルによって得られた発見に加えて、最近のｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｂ細胞を除去する治療法のヒトへの導入によって、慢性の病理過程の維持における、病原性の自己抗体の産生細胞としての根本的な役割のみならず、さらにＴ細胞の集団を活性化する抗原提示細胞としてのＢリンパ球の根本的な役割が明らかにされた。自己抗体を産生するＢ細胞の増殖が、ＢＬｙＳのレベルの増加によって明確に維持されることが、広く実証されている。
【００２０】
自己免疫性甲状腺疾患（ＡＩＴＤ）は、本質的には２つの異なる病理主体、すなわち、橋本甲状腺炎（ＨＴ）およびグレーブス−バセドウ病（ＧＢＤ）を含んでいる。慢性リンパ球性甲状腺炎とも呼ばれるＨＴは、ヒトにおいてもっともよく見られる自己免疫性疾患の一つであり、男性よりも女性の方が多く罹患し（女性：男性＝１８：１）、臨床病理学上、いくつかの種類がある。具体的には、甲状腺腫の型（これがもっともよくある種類である）、萎縮性の型（特発性粘液水腫としても知られる）、産後甲状腺炎、および甲状腺機能亢進性“ハシトキシコーシス”である。ＨＴは、ＣＤ４＋のＴリンパ球が甲状腺に顕著に浸潤していることを常に特徴としている。リンパ球は組織化して真性のリンパ濾胞を形成し、甲状腺細胞（つまりその破壊機能の対象）に対して近接する。甲状腺腫のバリアント、産後甲状腺炎、およびハシトキシコーシスにおいて、甲状腺は肥大し、萎縮性のバリアントにおいて甲状腺は顕著に萎縮する。最もよく見られる臨床上の症状は、甲状腺機能障害によって甲状腺機能低下症（チアノーゼ；乾燥粘膜；徐脈、筋痙攣；筋無力症；各種浮腫；体重増加；呼吸困難；希発月経；貧血など）と関連している。これは、甲状腺の根本的な成分、例えばサイログロブリン（Ｔｇ）および甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）に対する自己抗体が存在することが理由である。一部の患者は、時間の経過とともにＴＳＨ受容体（ＴＲＢａｂ）を遮断する抗体を形成する。
【００２１】
診断は、臨床上の徴候および症状とアッセイとの両方に基づいて行う。アッセイは甲状腺ホルモン（ＦＴ４およびＦＴ３）とＴＳＨとについて行うが、前者は疾患の第１の段階において正常であり得る。また、後者はＦＴ４が正常なレベルであっても高い値を示し、この状態は無症候性甲状腺機能低下症であると規定される。抗ＴＰＯ抗体は、通常患者の９０％〜９５％に見られる。一方、血清の抗サイログロブリン（抗Ｔｇ）抗体は、患者の６０％〜８０％において陽性であるが、良好な臨床用マーカーとは考えられておらず、グレーブス・バセドウ病、甲状腺癌、および健康なヒトにも見られる。治療法はステージによって変わる。末期の甲状腺機能低下症に達していれば、治療法は合成Ｔ４（レボチオキシン（levo-Thyoxine）、ＬＴ４）の連日投与に基づく。甲状腺の機能が正常な甲状腺腫を、Ｌ−Ｔ４を用いて治療することが議論されている。この治療法によって、甲状腺腫の成長を防止し、疾患が進行し甲状腺機能低下症を発症する可能性から患者を護ることができるかもしれないが、この課題については広い意見の一致があるわけではない。萎縮性甲状腺炎は、末期の甲状腺機能低下症および粘液水腫に至ることが最も多い型であり、ＴＳＨのレベルが非常に高い。さらに、萎縮性甲状腺炎は、多くの場合（症例の２０％〜５０％）、ＴＲＢａｂ抗体を有し、そしてＴｈ２疾患を伴うＴ細胞の増殖によって維持される疾患であると常に考えられてきた。現在、この型の甲状腺炎について明確な診断上の基準はない。ＬＴ４の置換療法を無症状のＡＴに罹患した患者に対して用いて、甲状腺の変性の進行を遅らせることが示唆されている。
【００２２】
グレーブス・バセドウ病（ＧＢＤ）は、刺激活性を有する、ＴＳＨ受容体に対する抗体（ＴＲＡａｂ）を循環させることによって引き起こされる甲状腺機能亢進症を臨床的な特徴とする、自己免疫性甲状腺疾患である。その病因は未知であるが、そのトリガーとなる環境因子（ヨウ素摂取の少ない食事、ウイルスの感染、または細菌の感染）と、遺伝的な感受性との間の相互作用に起因すると考えられている。診断は、甲状腺機能亢進症（高レベルのＦＴ３およびＦＴ４、ＴＳＨの低減、甲状腺機能亢進症に関連する臨床的症状（頻脈、振戦、体重の減少、発汗など））および特徴的な抗体（ＴＲＡａｂ；患者の９５％において陽性である）の存在に基づいて行われる。甲状腺腫が存在していることが多く、症例の約５０％において典型的な眼疾患が見られ、症例の１％〜２％において特徴的な下肢の皮膚症が見られる。現在の治療は症状の重症度に基づいており、例えば、抗甲状腺活性化薬（各種チオナアミド）を用いた医学療法、Ｉ１３１を用いた放射線療法、および最後に甲状腺の外科的除去を行う。多くの患者は、医学療法から比較的利益を得る。そして、多くの場合、放射線療法によって生涯にわたる置換療法が必要な甲状腺機能低下症に至る。現在の治療法は全て、症状を治療するが、疾患を治療しない。最近ではリツキシマブが首尾よく使用されている。リツキシマブは、末梢のＢ細胞を欠乏させることができる、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【００２３】
ＨＴ、ＡＴ、およびＧＢＤは基本的には類似した炎症性自己免疫性プロセスの異なる発現ではないか、また、臨床上の出現は特定の患者における免疫応答の範囲を反映しているのではないか、ということが最近示唆されている。
【００２４】
セリアック病において、ａ−ｔＴＧ抗体は、病因および診断の両観点において（特に後者の観点において）根本的な特徴である（Dieterich Wら, Nat Med 1997;3:797〜801、およびTonutti Eら, J Clin Pathol 2003;56:389〜393）。
【００２５】
古典的には、活動性セリアック病は、腸内および／または腸外の症状、およびａ−ｔＴＧ抗体の強い陽性を特徴とする。
【００２６】
組織学的には、典型的な形態変化（つまり、円蓋の過形成および絨毛の萎縮）に関連した、十二指腸および空腸の粘膜の顕著なＴリンパ球の浸潤がある。
【００２７】
十二指腸および空腸の生検は、診断のための絶好の標準であると考えられるが、実施の際には、分析的な面でも事前分析的な面でもいくつかの問題がある。
【００２８】
セリアック病は、多くの場合、他の自己免疫性疾患、特にＩ型糖尿病および橋本甲状腺炎に関連している。
【００２９】
リンパの異常増殖は、セリアック病の最もひどい合併症の一つである。
【００３０】
これらの合併症のうち、腸管Ｔ細胞リンパ腫が間違いなく最もよく見られ、そして恐ろしいことに、Ｂ細胞リンパ腫も述べられている（Celier Cら, Lancet 2000;356:203〜208）。
【００３１】
リンパ腫は、反応性リンパ球が上皮内に浸潤することから始まり、低悪性度の無痛性増殖を経て、高悪性度のリンパ腫へと転換するように段階的に発展する。高悪性度のリンパ腫は、グルテンを含まない食事および免疫抑制治療を導入した後であっても、吸収が悪い状態を持続的に引き起こす（Cerf-Bensussan Nら, Gut 2002;51:304〜305）。
【００３２】
セリアック病と混合型クリオグロブリン血症症候群とは（Rodrigo L. World J Gastroenterol 2006;12(41):6585〜6593、およびFerri Cら, J Clin World Pathos 2002;55:4〜13）、自己免疫の形成につながるメカニズムの研究にとって非常に重要な２つのモデルである。これは、（１）セリアック病において、グルテンに対する応答の変化が、精密な遺伝的設定（ＨＬＡ  ＤＱ２および８）に関連することが、広く証明されている一方、（２）混合型クリオグロブリン血症症候群において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染症が、クリオグロブリンおよび血管炎の形成の原因となる、リウマチ因子陽性の抗体応答を引き起こす上で非常に頻繁に役割を果たすことが周知である、という理由による。
【００３３】
ただし、最新の証拠は、まさにロトウイルス（Ｒｏｔｏｖｉｒｕｓ）（Troncone R, Aurecchio S. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2007;44(5):527〜528）が原因で起こるウイルス感染症も、セリアック病の病因として重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。
【００３４】
さらに、一部の最も頻発するリンパ増殖性疾患（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症）の過程における腫瘍性Ｂリンパ球によるＢＬｙＳの自己生成が、最近証明された（Chiu Aら, Blood 2007;109(2):729〜739、J. Novakら, Blood 2004;104:2247〜2253、Kern Cら, Blood 2004;103(2):679〜688、Mackay, Tangye SG. Curr Opin Pharmacol. 2004;4(4):347〜354、およびMoreaux Jら, Blood 2004;103(8):3148〜3157）。
【００３５】
一般的な集団と比較すると、自己免疫性疾患は一般に、Ｂ細胞のクローン性を発現するリスクが高く、Ｔ細胞のクローン性を発現するリスクは低い。この自己免疫性疾患は、進行すると通常のリンパ管の癌になる可能性がある。
【００３６】
こういったリスクが増加する根本には、遺伝的因子および後天性因子（治療）の両方の因子がいくつか存在する（Quartuccio Lら, Haematologica 2006, 91 (5) :691〜694）。現在、各種自己免疫性疾患の患者において、それが全身的な疾患であれ、あるいは臓器に特異的な疾患であれ、リンパ球のクローン性の発現を予測することができる明確な生物学的マーカーも遺伝的マーカーも存在しない。ＩｇＡ欠乏症も、特に進行して、拡大した免疫グロブリン欠乏症（extended immunoglobulin deficit）になる場合、この高いリスクを抱えている。
【００３７】
現在、自己免疫性疾患では、一般的な集団のように、リンパ管の腫瘍形成の主な徴候および症状（リンパアデノ肥大、脾腫、発熱、痒み、体重の減少、無力症、シェーグレン症候群の場合であれば持続性耳下腺の腫脹など）を特定するために、腫瘍形成が進行するリスクを、患者の理学的検査によって臨床的にモニタリングする。この臨床的なモニタリングの方法は、理学的検査の他に、放射線検査（超音波、ＣＴ）によっても行われ、さらに放射線検査に対しては、補助的に生検ならびに組織学的検査および分子的な検査（免疫グロブリン遺伝子またはＴ細胞受容体の高頻度可変領域の増幅）が実施されることもある。
【００３８】
セリアック病の過程では、関連するリンパ腫の症状がなくても抗トランスグルタミナーゼ抗体のレベルが持続的に高い場合、たとえグルテンを含まない食事療法が取られていても、リンパ腫の進行の疑いが生じる。これらの場合では、ＢＬｙＳのレベルが持続的に高いことが、リンパ腫が発生する前の状態であることを示唆している可能性があり、そして完全な腫瘍の症状にまで進行することを防止可能な、診断過程および治療過程を示しているかもしれない。我々が現在知る限り、確定診断（diagnostic confirmation）は、信頼できる生検の結果を得ることが難しいために、時期が遅いことが多い。したがって、これらの患者においてリンパ腫の進行を防止して治療することができる可能性は、非常に限定されている。これは、診断が遅れることと、リンパ腫が非常に攻撃的な型であり、現在利用可能な治療法にあまり反応しないこととの両方が原因である。
【００３９】
現在の技術レベルでは、グルテンの役割が広く認識されているセリアック病を除けば、本発明に記載される疾患の病理過程の開始の原因となるトリガー（一般にウイルス性、細菌性、環境性のもの）は、依然ほとんど未知のままである。また、その病理過程の永続化を促進し、認識された疾患が慢性的疾患になるに至る因子を見つける研究が広く行われている。
【００４０】
さらに、臓器に特異的な自己免疫性疾患および免疫不全症において、リンパ管の癌に先立って起こるＢ／Ｔ細胞のクローン性の発現をモニタリングする有用なマーカーが欠如している。
【００４１】
抗ＴＮＦ抗体を用いて治療中のヒトまたはその治療の対象となる可能性のあるヒトにおいて、癌を発症する素因を決定するためにＢＬｙＳのアッセイを使用することは、国際公開第２００４／０７４５１１号パンフレットによって公知である。これらの薬物は、全身的な自己免疫性疾患において共通して使用されているが、本発明のように臓器に特異的な自己免疫性疾患、輸血反応、または各種免疫性欠乏症における使用に関する理論的な根拠はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４２】
【特許文献１】国際公開第２００４／０７４５１１号パンフレット
【非特許文献】
【００４３】
【非特許文献１】Schneider P.ら, J Exp Med. 1999;189(11): 1747〜1756
【非特許文献２】Nardelli B.ら, Blood. 2001;97(1):198〜204
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【非特許文献４】Batten Mら, J Exp Med 2000; 192(10): 1453〜1466
【非特許文献５】Huard B.ら, Int Immunol 2004;16:467〜475
【非特許文献６】Gorelik Lら, J Exp Med 2003;198:937〜945
【非特許文献７】Ohata J.ら, J Immunol 2005;174(2):864〜870
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【非特許文献４０】Moreaux Jら, Blood 2004;103(8):3148〜3157
【非特許文献４１】Quartuccio Lら, Haematologica 2006, 91 (5) :691〜694
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４４】
このような背景において、本発明の目的の１つは、免疫介在性疾患の診断を確定するためにサイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）の血清学的なアッセイを使用して、免疫介在性疾患を示唆する状況にある場合および／または免疫介在性疾患が疑われる場合および／または免疫介在性疾患の素因（細菌の感染、免疫不全症、ＨＬＡ遺伝子に基づく遺伝的素因）がある場合に現在使用されている手法の限界を解消することである。なお、この免疫介在性疾患としては、臓器に特異的な自己免疫性疾患（セリアック病、自己免疫性甲状腺炎）、および免疫介在性の輸血反応（輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応）が挙げられる。
【００４５】
本発明の別の目的は、サイトカインＢＬｙＳのアッセイを、鑑別診断において産後の鬱病と区別される産後の甲状腺炎が発生するリスクのマーカーとして使用することである。
【００４６】
本発明のさらに別の目的は、サイトカインＢＬｙＳのアッセイを、急性甲状腺炎および萎縮性甲状腺炎の過程において予測用マーカーとして使用することである。
【００４７】
本発明のさらに別の目的は、サイトカインＢＬｙＳのアッセイを、輸血を行う可能性のある患者、特に活動性の免疫介在性疾患の患者において輸血反応のリスクのマーカーとして使用することである。
【００４８】
本発明のさらに別の目的は、個別化された治療法を選択するための方法として、治療（例えば、セリアック病の患者におけるグルテンを含まない食事）を守っているかどうかをモニタリングするための方法として、疾患における症状の面だけではなく疾患の生物学的なレベル（高レベルのＢＬｙＳが、治療後に正常な範囲に戻る）においても有効な治療法をスクリーニングするための方法として、サイトカインＢＬｙＳのアッセイを使用して、現在使用されている手法の限界を解消することである。ここで、この疾患としては、臓器に特異的な自己免疫性疾患（セリアック病、自己免疫性甲状腺炎）、ＩｇＡ欠乏症、および輸血反応などが挙げられる。
【００４９】
本発明のさらに別の目的は、ＢＬｙＳの血清学的なアッセイを、臓器に特異的な自己免疫性疾患（セリアック病、自己免疫性甲状腺炎）および免疫グロブリン欠乏症を包含する免疫介在性疾患における、Ｂ細胞のクローン性およびＴ細胞のクローン性の診断および予測のために使用して、現在使用されている手法の限界を解消することである。
【００５０】
本発明のさらに別の目的は、臓器に特異的な自己免疫性疾患および免疫グロブリン欠乏症の過程において、Ｂ細胞のクローン性およびＴ細胞のクローン性を防止および治療する革新的な治療方法を実現するために、ＢＬｙＳをマーカーとして使用することである。
【００５１】
現在の技術の短所を解消し、上記目的およびその他の目的を達成して長所を実現するために、出願人は、本発明について研究し、試験を行い、そして本発明を具現化した。
【課題を解決するための手段】
【００５２】
本発明を独立項において規定し、その特徴を記述する。一方で、従属項には、本発明の他の特徴、または主な発明的発想の変形例を記載する。
【００５３】
Ｂ細胞の集団に関する証拠およびＢＬｙＳの存在に関する証拠は、本明細書に記載される臓器に特異的な自己免疫性疾患および免疫に関連した輸血反応において、全く欠如していた。したがって、ＢＬｙＳがこれらの障害においても重要な病原的な役割を有するということは、有望な説明ではないようであった。この仮説は、全身的な自己免疫性疾患の知見および経験から得られる顕著な科学的背景を、関連することが多い臓器に特異的な自己免疫性疾患、免疫不全症、および輸血反応の独特の特徴の調査と総合することによって形成されている。このプロセスは、共同発明者らの異なる専門知識を体系的に統合することから得られた。
【００５４】
臓器に特異的な自己免疫性疾患（セリアック病および自己免疫性甲状腺炎）、ＩｇＡ欠乏症、および輸血反応に関する予備的な研究から発明者らによって得られた結果は、共同発明者らが、これらの免疫に関連した疾患の診断的および予測的な管理に用いる、新しい有用なマーカーとしてＢＬｙＳを見出すことにつながった。特に、ＢＬｙＳは、疾患のリスクおよび／または素因を示すマーカーとして、疾患の重症度および疾患がＢ／Ｔ細胞のクローン性であることの指標として、治療法を遵守しているかどうか検証する方法として、そして症状についてだけではなく、疾患の生物学的特徴についても有効な新しい治療方針のスクリーニングを検証する方法として、現れた。
【００５５】
上述の目的に従って、本発明の１つの特徴は、免疫介在性疾患を示唆する臨床的症状を有する、および／または免疫介在性疾患の物理的もしくは生化学的な検査を受けている、または免疫介在性疾患が疑われる状況にある、患者において、あるいは免疫介在性疾患の重大な素因（慢性の細菌感染症、ＩｇＡ欠乏症、遺伝的素因、家族特性）を有する患者において、サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）の血清学的なアッセイを、臓器に特異的な自己免疫性疾患（例えばセリアック病、自己免疫性甲状腺疾患など）と輸血に関連した免疫介在性疾患（例えば輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応など）とを包含する免疫介在性疾患の診断を確定するマーカーとしての、以下の方法における使用に関する。この方法は、
遠心分離によって血清が得られ得る血液サンプルを、この患者から採取する第１のステップと、
市販のキットを典型的に使用することによって、この血清サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
第２の段階において決定されたサイトカインＢｌｙＳの濃度と、健康な集団について前もって得られたサイトカインＢｌｙＳの濃度の参照値とを比較する第３のステップと、
第３のステップにおける比較から導き出される、第２の段階において決定されたサイトカインＢｌｙＳの濃度と健康なコントロールの集団について前もって得られたサイトカインＢｌｙＳの濃度の参照値との間の、有意な偏差を特定して、上述の免疫介在性疾患の一つに罹患した患者を選択する第４のステップと、
免疫介在性疾患の一つに罹患したとして選択された患者の、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢｌｙＳの濃度の１つ以上の参照値（なお、これらの参照値は、特定の免疫介在性疾患に罹患した、および／または活動性疾患またはその特定の過程の診断が確立された、一連の患者について前もって得られたＢＬｙＳのベンチマークの範囲内である。）とを比較する第５のステップと、
第５のステップにおいてなされた比較に基づいて、上述の免疫介在性疾患の１つ以上の確定的な疾患の診断を行う第６のステップと、
を包含する。
【００５６】
本発明の別の革新的な特徴は、疾患における、サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）の診断用マーカーとしての使用、特にＢｌｙＳのアッセイの上述の方法における使用である。ここで、この疾患は、Ｂ細胞ではなくＴ細胞が、病的浸潤における主要な成分であり、かつこれまでに特定された発病のメカニズムにおける主要な成分であるため、発病におけるこのサイトカインの役割が容易に考えられない疾患である。
【００５７】
関連する病棟の設備またはこの病棟を構成する構造物に大幅な修正を加える必要がなく、通常大規模な病院の分析ラボに存在する型の免疫学的な酵素アッセイ（酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））を実施可能な自動装置を、患者の血清中におけるＢＬｙＳの濃度を分析するために第２のステップにおいて使用することは、本発明の利点である。
【００５８】
本発明はさらに、臓器に特異的な自己免疫性疾患（自己免疫性甲状腺炎、セリアック病）および免疫不全症（例えばＩｇＡ欠乏症、分類不能型免疫グロブリン欠乏症）を包含する、患者の免疫介在性疾患の過程において、Ｂ／Ｔ細胞のクローン性の発現の開始を経時的にモニタリングする方法におけるＢＬｙＳの使用に関する。この方法は、
この患者から血液サンプルを採取して血清を得る第１のステップと、
この血清サンプルを検査して、サイトカインＢｌｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢｌｙＳの濃度と、患者から前もって検出された１つ以上のＢｌｙＳの値とを比較する第３のステップと、
第３のステップにおける比較から導き出される有意な偏差（すなわち、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢｌｙＳの濃度と患者から前もって検出された１つ以上のＢｌｙＳ値との間の、有意な増加）を特定する第４のステップと、
ＢＬｙＳの存在または第４のステップにおいて検出された有意な偏差に従って、上述の免疫介在性疾患の過程において、Ｂ細胞のクローン性またはＴ細胞のクローン性が発現する潜在的なリスクまたはＢ細胞のクローン性またはＴ細胞のクローン性に向かって疾患が進行する潜在的なリスクが発生するとみなす（attributing）第５のステップと、
第５のステージにて実施したアサイメント（assignment）の結果に基づいて、第１のステップから第５のステップを所定の時間間隔で繰り返すことを決定する第６のステップと、
を包含する。
【００５９】
この場合、セリアック病の患者の食事療法の有効性、免疫系の活性化マーカー、臓器機能性のマーカー（ＦＴ４、ＦＴ３、ＴＳＨ、自己免疫性甲状腺炎における特定の自己抗体）、患者の末梢血液または骨髄におけるＢリンパ球またはＴリンパ球のクローン増殖、理学的検査、患者に対するＸ線検査または生検などを経時的に評価することができる。なお、患者の末梢血液または骨髄におけるＢリンパ球またはＴリンパ球のクローン増殖は、分子生物学的な手法を使用することによって経時的に評価することができる。
【００６０】
本発明の別の特徴によれば、免疫介在性疾患を予測する方法（つまり、免疫介在性疾患の、発病のリスク、過程、重症度、治療法に対する良好な応答などを予測する方法）における、サイトカインＢＬｙＳアッセイの予測用マーカーとしての使用が提供される。この免疫介在性疾患としては、臓器に特異的な自己免疫性疾患（例えばセリアック病、自己免疫性甲状腺炎など）、および輸血に関連した免疫介在性疾患（例えば、輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応）が挙げられる。この方法は、
ｉ）慢性の細菌感染症（肝炎ウイルス、疱疹ウイルス、クラミジアなど）の存在
ｉｉ）疾患の発病のプロセスまたは一般に使用される治療法の対象における、特定のＨＬＡの遺伝子型／または重要な因子をコードする遺伝子の存在、
ｉｉｉ）甲状腺腫を伴う、または伴わない無症候性甲状腺機能低下症、
ｉｖ）産後の鬱病および／または産後の甲状腺機能低下症、
ｖ）１つ以上の活動性の免疫介在性疾患の存在、
ｖｉ）輸血の必要性、および、
ｖｉｉ）新しい治療法の開始
のうちの１つ以上の状況によって特徴付けられる患者、を選択する予備的なステップと、
選択された患者から血液サンプルを採取する第１のステップと、
この血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値とを比較する第３のステップと、
第３のステップから導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と第３のステップにおいて考慮される参照値との間の、有意な偏差を特定する第４のステップと、
上述の免疫介在性疾患について第４のステージにおいて特定された偏差に従って、予測を行う第５の段階と、
を包含する。
【００６１】
本発明の別の特徴によれば、免疫介在性疾患（例えば臓器に特異的な自己免疫性疾患（例えばセリアック病、自己免疫性甲状腺炎）、輸血に関連した免疫介在性疾患（例えば輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応）、および免疫不全症（例えばＩｇＡ欠乏症、分類不能型免疫グロブリン欠乏症））に有効な新しい治療法をスクリーニングするための方法としての、サイトカインＢＬｙＳのアッセイを使用することが提供される。
【００６２】
この目的を達成するために、治療の間に、ＢＬｙＳの血清学的な濃度のモニタリングを好適に使用して、ＢＬｙＳの血清レベルが正常範囲に包含されるレベルにまで実際に減少することによって示された、疾患の生物学的現象についての有効性を検証することができる。あるいは、免疫介在性疾患に罹患した患者の治療的処置の有効性を制御する方法におけるマーカーとして、ＢＬｙＳのアッセイを使用することができる。この方法は、
新しい治療法を行う前に、この患者から血液サンプルを採取して血清を得る第１のステップと、
この血清のサンプルを検査して、サイトカインＢｌｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
新しい治療法の開始後の所定の時間（例えば、１、３、６、１２ヶ月後）に患者から血液サンプルを採取する第３のステップと、
第３のステップにおいて採取された１つ以上の血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する４のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢｌｙＳの濃度と、第４のステップにおいて決定されたサイトカインＢｌｙＳの濃度とを比較する第５のステップと、
第５のステップにおける比較から導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢｌｙＳの濃度と第４のステップにおいて得られるサイトカインＢｌｙＳの濃度の値との間の、有意な偏差を特定する第６のステップと、
第６のステップにおいて特定された偏差に基づいて、新しい治療法に有効性があるとみなす第７のステップと、
を包含する。
【００６３】
本発明は、免疫介在性疾患（臓器に特異的な自己免疫性疾患および輸血反応の両方が挙げられる）に罹患した患者の、診断手法および予測手法の改善、ならびに治療を目的としたモニタリングの改善を可能にする。
【００６４】
本発明は、免疫介在性疾患（自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、および免疫不全症（例えばＩｇＡ欠乏症）が挙げられる）の過程における、Ｂ細胞のクローン性およびＴ細胞のクローン性の診断および予測に使用するために、特に有効である。
【００６５】
本発明の変形例によれば、本発明に係るＢＬｙＳのアッセイの使用は、
患者を対象とする、特定の疾患の主な徴候および症状が特定可能な理学的検査、
患者を対象とする、１回以上のＸ線検査、
患者から採取された生検用標本の組織学検査、および
患者の生検用サンプル、末梢血液、または骨髄の分子生物学的検査、
の１つ以上の分析方法と組み合わせられ得る。
【００６６】
上記およびその他の本発明の特徴は、実施形態の好適な態様についての以下の記載から明らかになる。ただし、これらの実施形態は、添付の図面を参照する非制限的な例として与えられている。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、健康な血液提供者（ＨＢＤ）に対して、セリアック病の患者（ＣＤ）における血清Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）のレベルを比較するグラフである（正常域：＜１．１４５ｎｇ／ｍｌ、平均＋２ＳＤ）。
【図２】図２は、セリアック病の患者における、サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）の濃度と抗体ａ−ｔＴＧの濃度との間の、有意な相関を示すグラフである。
【図３】図３は、セリアック病の患者においてグルテンを含まない食事療法（gluten-free diet；ＧＦＤ）を実施した後の、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）の濃度の有意な減少を示すグラフである（１．６１９±０．４１０ｎｇ／ｍｌから１．２８３±０．３１０ｎｇ／ｍｌへ減少；＊ｐ＝０．０１２２、ウィルコクソン符号順位検定）。
【図４】図４は、健康な血液提供者（ＨＢＤ）に対して、ＩｇＡＤの患者において、全体（ＩｇＡＤ  ｔｏｔ）の場合および２つのサブグループに分けた場合の、血清Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）のレベルを比較するグラフである。２つのサブグループとは、セリアック病に罹患したＩｇＡＤの患者（ＩｇＡＤ＋ＣＤ）と、ＣＤに罹患していないＩｇＡＤの患者（ＩｇＡＤ）とである（正常域：＜１．１４５ｎｇ／ｍｌ、平均＋２ＳＤ）。
【図５】図５は、健康な血液提供者（ＨＢＤ）に対して、自己免疫性甲状腺炎（ＡＩＴＤ）の患者において、全体の場合および橋本甲状腺炎（ＨＴ）とグレーブス病／バセドウ病（ＧＢＤ）とを区別した場合の、血清中のＢＬｙＳのレベルを比較するグラフである（正常域：＜１．１４５ｎｇ／ｍｌ、平均＋２ＳＤ）。
【図６】図６は、ＦＴ４の正常なレベルまたはＦＴ４の低いレベルを有するＨＴ患者において、血清中のＢＬｙＳのレベルを比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は、サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）について当該技術分野において公知であることを基礎とし、臓器に特異的な自己免疫性疾患（セリアック病、自己免疫性甲状腺炎）、免疫不全、および免疫介在性輸血反応を包含する、免疫に関連した疾患を診断および予測するのための、このようなサイトカインの血清学的なアッセイの革新的な使用を完成させる。
【００６９】
特に、出願人が得た実験結果は、複数の免疫に関連する病状（セリアック病、ＩｇＡ欠乏症、自己免疫性甲状腺炎、免疫介在性輸血反応など）におけるＢＬｙＳの発現および役割に関するものである。これらの病状は、特定の臓器の症状の原因となる免疫介在性応答によって、自己抗体の分泌によって、これら疾患同士の高い相関性および他の自己免疫性疾患との高い相関性によって、およびＢ細胞のクローン性またはＴ細胞のクローン性が発現するリスクの増加によって特徴付けられている。また出願人が得た実験結果は、これらの病状における新しい診断用、予測用、および治療用のマーカーとしてＢＬｙＳを特定し提案することへと導いた。
【００７０】
さらに、これらの病状において得られた結果に基づいて、本発明は、将来ＢＬｙＳが特定される可能性のある、他の全ての免疫介在性障害にも拡張され得る。
【００７１】
混合型クリオグロブリン血症症候群における上述のＢＬｙＳの研究結果によって、出願人は、このようなサイトカインが発見されて以降初めて、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症によるＢＬｙＳの発現の上方制御における有望で重要な役割を特定すること、および同様のメカニズムを有する他のウイルスは同じ効果を生じさせると仮定することができるようになった。本発明の対象となる臓器に特異的な自己免疫性疾患において、依然未知であるが、細菌の感染（おそらくウイルスの感染）が病理過程を引き起こすという重要な役割を果たす。出願人は、ＨＣＶ感染症そのものが、ＢＬｙＳの発現の増加を誘発し、クリオグロブリン血症症候群が現れるまで、素因を有する被験者のサブセットにおいて自己反応性Ｂ細胞の増殖を維持することに寄与できることを示した。ただし、クリオグロブリン血症症候群に罹患した患者の血清におけるＢＬｙＳの値が慢性のＨＣＶ感染症だけに罹患した被験者よりも非常に高いという条件下において、この症候群の発生は、ＢＬｙＳの発現がさらに増加することとタイミングが一致した（Fabris Mら, J Rheumatol 2007; 46:37〜43）。
【００７２】
これらの前提において、出願人は、セリアック病および自己免疫性甲状腺炎においても、ＢＬｙＳのレベルが増加すると仮定した。
【００７３】
この効果は、主に内因性の（endogen）抗ウイルス応答によって、つまりインターフェロンによって媒介される。なお、インターフェロンは、種々の研究によってインビトロにおいてＢＬｙＳの発現を強力に誘発することが示されている。
【００７４】
セリアック病の病因における、Ｂリンパ球の役割は、ＨＬＡおよびＴリンパ球の活性化が果たす根本的な役割と比較すると、これまでは非常に小さいと考えられてきた（LM Sollid, Thorsby E. Gastroenterology 1993; 105: 910〜922、Spurkland Aら, Tissue antigens 1997 ; 49:29〜34、およびMolberg Φら, Gastroenterology 2003; 125:337〜344）。しかし、出願人は、セリアック病に罹患した患者において高い割合（＞８０％）で、ＢＬｙＳが高血清レベルにて見出される事を示した（図１）。
【００７５】
特に、図１は、セリアック病の患者におけるＢＬｙＳの血清レベルを、健康なコントロール（ＨＢＤとも表記され、年齢および性別において調査対象の患者に匹敵する健康な被験者、つまり血液提供者からなるコントロール）と比較して示している。ＢＬｙＳの血清レベルは、健康なコントロールと比べて、セリアック病の患者において非常に高い（マンホイットニーのｔ検定、＊ｐ＜０．０００１）（正常域：＜１．１４５ｎｇ／ｍｌ、平均＋２ＳＤ）。
【００７６】
ここで初めて明らかにされるこの結果は、この広く見られる（集団の約１．１％）腸疾患の病因の解釈における新しい鍵を暗示している。特に重要であることは、ＢＬｙＳがこれまで研究されてきた自己免疫性障害の全てと比べても、ＢＬｙＳの上方制御は、セリアック病において最も広く記録されている（５人中４人の患者）ことである。さらに、出願人が測定および分析したＢＬｙＳの血清レベルは、この疾患に特異的な抗体である抗トランスグルタミナーゼ（ａ−ｔＴＧ）の血清レベルと有意な相関があることを示している（図２参照。同図はＢＬｙＳの血清レベルとａ−ｔＴＧ  ＩｇＡレベルとの相関関係を示している。スピアマンの順位試験：ｒ＝０．３９９、９５％ＣＩ：０．１７２４〜０．５８５６、ｐ＝０．０００７）。また、ＢＬｙＳとａ−ｔＴＧとの両方が、グルテンを含まない食事療法の導入および疾患の臨床上の寛解と同時に減少している（図３を参照。同図は、グルテンを含まない食事療法の開始後の、ＢＬｙＳの血清レベルの制御を示している。）。１２人中８人（７５％）の患者において、食事療法後のＢｌｙＳのレベルが依然正常域より高いもののを用いたアッセイ）、食事療法後のＢＬｙＳのレベルには、一般に有意な減少が見られる（１．６１９±０．４１０ｎｇ／ｍｌから１．２８３±０．３１０ｎｇ／ｍｌへ減少；＊ｐ＝０．０１２２、ウィルコクソン符号順位検定）（＞１．１４５ｎｇ／ｍｌ、エサイザのキット（R&D Systems社のクアントカインＥＬＩＳＡキット（Quantkine ELISA kit）, Minneapolis, 55413 USA）。
【００７７】
ただし、ａ−ｔＴＧが陰性になり臨床上寛解に到達する症例であっても、ＢＬｙＳのレベルは大幅に減少したものの、正常域には達していない。このことは、疾患が無症候状態のまま継続すること、または疾患の素因になり、広く共有され、ＨＬＡの遺伝子型に相当するＢＬｙＳの基礎レベルが比較的高いことを示唆している。
【００７８】
感染力を有する共同参加物（co-participation）（ロタウイルス）がセリアック病の病因において関与している可能性を示す最近の根拠からは、クリオグロブリン血症症候群において観察されたことと同じように、ＢＬｙＳの血清レベルの上昇について別の仮説が立てられる。
【００７９】
したがって、ＢＬｙＳのアッセイは、非典型的な症状のある場合、陰性のａ−ｔＴＧの血清レベルをともなった場合、あるいは腸生検が実施不可能、または倫理的に薦められない場合などの疑わしい場合や、前記のような上記疾患に罹患するリスクが比較的高い個体の集団におけるスクリーニングとしても、さらなる診断上のツールとなる。
【００８０】
さらに、高いＢＬｙＳの血清レベルが全身的に継続すると、遺伝的に素因を有する個体において、他の自己免疫性疾患に対する罹患を促進する可能性がある。これは、ＢＬｙＳが、初期のトリガーおよびクローンの集団の形成から逃れるまで、その強力な抗アポトーシス効果によって、膨張したＢ細胞において遺伝子の変異をさらに促進することと同様である。
【００８１】
出願人が前もって分析した混合型クリオグロブリン血症症候群の６６人の患者において、高いレベルのＢＬｙＳと有意な相関性を示した臨床上の特徴は、クローナルＢ細胞の増殖の存在だけであった。Ｂ細胞のクローン性の患者は、Ｂ細胞のクローン性を有しない患者と比較すると、非常に高いＢＬｙＳのレベルを示した被験者の割合が有意に高かった（９．８％に対して３３．３％；  ＯＲ＝４．６、ＣＩ＝１．１２〜１８．９６、ｐ＝０．０４）。
【００８２】
これらの症例では、各種Ｂ細胞腫瘍（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病）、およびさらに最近では一次的ＳＳ（primary SS）の患者の唾液腺に浸潤するＢリンパ球（C Daridonら, Arthritis Rheum 2007; 56:1134〜1144）において見られるように、Ｂ細胞のクローンも自己分泌刺激メカニズムによって、ＢＬｙＳを分泌し、疾患に寄与するのかもしれないと考えることもできる。
【００８３】
ＢＬｙＳは、クリオグロブリン血症およびＳＳの過程、ならびに複数の腫瘍性障害において先に示したように、多段階プロセスにおいて重要な役割を果たし得る。このプロセスは、セリアック病においてもリンパ腫の形成を引き起こす。実際に、このプロセスはＢ細胞およびＴ細胞の両方を刺激する（Mackay F, Leung H. Semin Immunol. 2006;18(5):284-289）。びまん性大細胞型Ｂ細胞腸リンパ腫を伴うセリアック病の患者において、出願人が非常に高いレベル（８．５ｎｇ／ｍｌ）のＢＬｙＳを発見したことは、この仮説と矛盾しない。
【００８４】
したがって、この結果は、ＢＬｙＳのアッセイを、Ｂ／Ｔ細胞のクローン性が疑われる（グルテンを含まない食事療法を厳格に遵守しているにもかかわらず、高いａ−ｔＴＧレベルが継続している）セリアック病の患者の症例の補助的診断法として使用することが可能であることを示唆している。
【００８５】
選択的な原発性ＩｇＡ欠乏症（ＩｇＡＤ）は、免疫不全症のもっともよく見られる型であり、白人における推定発生率は１：６００である。ＩｇＡ単独欠損症の個体は、正常なＩｇＡ遺伝子を有するが、リンパ球の最終分化に欠陥を有しており、このことが血清およびムコサールＩｇＡの生成不足を引き起こす（Cunningham-Rundles C. J Clin Immunol 2001;21(5):303〜309）。ＩｇＡＤに関連して多数の疾患、例えば、アレルギー、胃腸管および再発上気道の疾患、特に、自己免疫性疾患が報告されている（Liblau RSら, Int Arch Allergy Immunol 1992;99(1):16〜27）。最もよく見られる相関はセリアック病（ＣＤ）との相関であり、ＣＤは通常、ＩｇＡＤ患者において明らかに欠如している、特定のＩｇＡ抗体を検出することによって診断されるので、特に重要である。図４に示すように、出願人は、コントロール（０．６６±０．２４ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０００１）よりもＩｇＡＤ患者（１．５７±０．５１ｎｇ／ｍｌ）においてＢＬｙＳの血清レベルが有意に高いことを見出した。特に、ＩｇＡＤ患者の７７．８％（３５人／４５人）が、正常域を超えたＢＬｙＳのレベル（＞１．１４ｎｇ／ｍｌ）を有している。分析対象のＩｇＡＤ患者のうち、２６人がセリアック病ＣＤに罹患していたが、ＩｇＡＤおよびセリアック病ＣＤの患者１９人と比べて大きな違いがなかった（１．６７±０．５７ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝ｎｓに対して１．４９±０．４６ｎｇ／ｍｌ）。ＩｇＡＤ患者と、ＣＤに罹患しているが、ＩｇＡが正常である上述した一連の患者との間では、ＢＬｙＳのレベルの差は見られなかった（１．５４±０．４６ｎｇ／ｍｌ）。したがって、ＢＬｙＳは、ＩｇＡＤの患者において上方制御され、ＩｇＡＤと自己免疫性疾患とを強く関連付ける因子の一つである可能性があるが、Ｂ細胞のクローン性を形成するリスクを増加させる因子の一つである可能性もある。本発明では、ＢＬｙＳのアッセイを、ＩｇＡＤに罹患した被験者におけるＢ細胞のクローン性の形成の予測用マーカーとして革新的に使用する。
【００８６】
自己免疫性の甲状腺疾患（ＡＩＴＤ）は、よく見られる自己免疫性疾患であり、一般人口の罹患率は５％に上る。また、女性のほうが男性よりも罹患率が高い。甲状腺に指向する自己免疫（thyroid-directed autoimmunity）は、橋本甲状腺炎（ＨＴ）およびグレーブス・バセドウ病（ＧＢＤ）の、２つの古典的自己免疫性症状において現れる。前者は、甲状腺機能低下症（抗ＴＰＯおよび抗サイログロブリン）の原因となり、後者は甲状腺機能亢進症（ＴＳＨ受容体のアゴニストの自己抗体）の原因となる。ＡＩＴＤは、他の自己免疫性疾患（セリアック病、１型糖尿病、全身的コネクティバイティス（systemic connectivitis））と関連することが多い。ＡＩＴＤは、おそらく共通の自己免疫を誘発する表現型を共有しているのであろう。他の自己免疫性疾患のように、ＡＩＴＤは、Ｂ細胞クローナル疾患（特にＨＴ患者）の発生リスクを増加させる。
【００８７】
図５に示すように、出願人は、７７人の白人のＡＩＴＤ患者（内訳、男性１０人および女性６７人、平均年齢４８．２±１６．１歳、ＨＴ患者５２人およびＧＢＤ患者２５人）を研究し、ＢＬｙＳの血清レベルを、７７人の年齢および性別が一致する健康なコントロールと比較して分析した。ＡＩＴＤ患者は、ＢＬｙＳのレベルにおいて有意な増加を示した（ｐ＜０．０００１）。ＧＢＤ患者は、ＨＴ患者よりも高いＢＬｙＳを示す傾向があった（ｐ＝０．０６）。ＨＴおよびＧＤのどちらにおいても、ＢＬｙＳのレベルと自己抗体との間の有意な相関性は見られなかった。一方で、ＢＬｙＳとＦＴ４との間では、正の相関性が見られた（ｒ＝０．３１；ｐ＝０．０１２）。さらにその一方で、ＴＳＨ（ｒ＝−０．４５；ｐ＝０．０００２）の場合は、逆の相関性が見られた。
【００８８】
実際、ＨＴ患者において、ＦＴ４のレベルが正常である患者は、甲状腺機能低下症患者に比べてＢＬｙＳが非常に高い（＊ｐ＝０．０３９６）（図６）。
【００８９】
出願人は、ＢＬｙＳのレベルがＡＩＴＤの患者において高いことを本発明において初めて仮定し、かつ見出した。このことは、これらの自己免疫性障害においても、ＢＬｙＳが病因としての重要な役割をしていることを示唆している。全身的自己免疫性疾患（ＲＡ、ＳＳ、ＬＥＳ）において先行する実証より革新的な様式において、ＢＬｙＳのレベルは、甲状腺の機能性とは相関性を有するが、自己抗体の分泌とは相関性を有していない。したがって、ＢＬｙＳは、ＨＴの甲状腺機能が正常な第１の段階において比較的高く、甲状腺活性化のマーカーとして（自己抗体を分泌するプラズマ細胞のマーカーとしてとしてではない）ＧＢＤにおける甲状腺機能亢進症のレベルと相関性を有する。甲状腺がその機能を喪失すると（臨床上は甲状腺機能低下症によって顕在化する）、ＢＬｙＳは減少する。また、ＢＬｙＳの過剰発現は、他の自己免疫性疾患またはリンパ増殖性疾患を発症するＡＩＴＤの患者の割合の増加を説明する可能性のある、メカニズムの一つを表わしているのかもしれない。
【００９０】
以上のように、本発明は、ＡＩＴＤの患者における治療の有効性の診断、予測、およびスクリーニングのためのＢＬｙＳの血清学的なアッセイの使用を提案する。
【００９１】
自己免疫性疾患の患者は、一般的な集団に比べて、輸血後に不規則同種抗体を生成する傾向が高いことが、最近観察されている。輸血反応の発生を予測できる公知のマーカーは、今のところ存在しない。自己免疫性疾患と免疫介在性のメカニズムとの関連に基づいて、出願人は、サイトカインＢＬｙＳも輸血反応において役割を有する可能性があることを考えるに至った。この目的のために、ウディネ大学病院、血液製剤配布実験室の５人の患者に対して予備研究を行った。これらの５人の患者の内訳は、輸血を繰り返し行ったにもかかわらず同種抗体／自己抗体の形成を示さない患者（ｐｔｓ  Ａ型）が２人と、高濃度の赤血球を複数単位にて輸血した後に同種抗体／自己抗体を形成した患者が３人（ｐｔｓ  Ｂ型）である。同種抗体／自己抗体反応のある患者（Ｂ型）では、反応のない患者（Ａ型）に比べて、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦのレベルが高い傾向があった（平均値で、１．２９ｎｇ／ｍｌに対して２．４８ｎｇ／ｍｌ）。また、全てのＢ型の患者が、正常な閾値より高いＢＬｙＳのレベルを示した（＞１．１４ｎｇ／ｍｌ）。
【００９２】
したがって、本発明は、以下の状況において、血清ＢＬｙＳのアッセイを革新的な様式にて提供する。
ｉ）以下に列挙する疾患を包含する免疫介在性疾患の過程における、診断用／予測用マーカー（確定、重症度、過程、Ｂ細胞／Ｔ細胞のクローン性）および治療効果のスクリーニング。すなわち、
例えば、セリアック病、橋本甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎、産後甲状腺炎、グレーブス・バセドウ病などの、臓器に特異的な自己免疫性疾患、
例えば、輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応などの、輸血に関連した免疫介在性疾患、および、
例えば、ＩｇＡ欠乏症、分類不能型免疫不全症などの、免疫不全症。
【００９３】
したがって、患者の免疫介在性疾患における診断および／または予測および／または効果的な治療法のスクリーニングに対して適用される本発明は、以下のステップを包含する。すなわち、
患者の血清を得るための血液サンプルを採取するステップと、
この血清サンプルを検査して、濃度を決定するステップ、すなわちエサイザの技術を用いたサイトカインＢＬｙＳのアッセイのステップと、
先のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値とを比較するステップと（なお、この参照値は、健康な集団（健康な血液提供者：ＨＢＤ）について、または免疫介在性疾患に罹患した、および／または特定の臨床的症状（例えばＢ細胞のクローン性またはＴ細胞のクローン性）が見られるとの診断を受けた患者の集団について、あるいは治療法の開始前に分析した同じ患者からの血清サンプルについて決定された参照値である。）、
先のステップから得られる、サイトカインＢＬｙＳの決定された濃度と、先のステップにおいて示されたサイトカインＢＬｙＳ濃度の参照値との間の、有意な偏差を特定するステップと、
上記ステップに従って、特定の臨床的症状（例えばＢ細胞のクローン性またはＴ細胞のクローン性）について、または上述の免疫介在性疾患の過程における治療有効性のレベルについて診断および／または予測を行うための、決定的なおよび／または推定的な型のステップとである。
【００９４】
診断方法の特定の場合において、上述の比較のステップは、患者について決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、健康な集団について決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値とを比較するために実施される。これにより、有意な偏差を特定するステップによって、上述の疾患の一つに罹患したとして患者を選択する。また、有意な偏差を特定するステップと、決定的なおよび／または推定的な型の最後のステップとの間で、患者について決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、別の患者の集団のサイトカインＢＬｙＳの濃度の値とを比較する、さらに別の比較ステップを設ける。この“別の患者”とは、免疫介在性疾患に罹患した、および／または特定の臨床的症状が見られるとの診断を受けた患者である。そして、この別の比較ステップを設けることによって、最後のステップにおいて、前述の全ての免疫介在性疾患の中から、決定された免疫介在性疾患であると診断する。
【００９５】
好ましくは、アッセイは、異なる生物学的なマトリックス（血液、尿、脳脊髄液、空洞性浸出液（cavitary effusions）、組織切片、細胞培養物）におけるＢｌｙＳを特定および定量化することができる方法から選択される。
【００９６】
また、このアッセイは、ＥＬＩＳＡの技術を用いた、主要病院に通常備え付けられている自動装置を使用して実現されるので、このアッセイを採用しても、この新しいマーカーを使うにあたって利用する病棟の設備またはこの病棟を構成する構造物に対して実質的な修正を加えるわけではない。
【００９７】
したがって、本発明は、ＢＬｙＳのアッセイの使用を、以下の状況においても革新的な様式にて提供する：
ｉｉ）臓器に特異的な自己免疫性疾患および輸血反応（例えば免疫不全症（ＩｇＡ欠乏症））が発生しやすい状態、他の全身的な自己免疫性疾患または臓器に特異的な自己免疫性疾患、ＨＬＡの遺伝子型、慢性のウイルス感染症が存在しやすい状態における診断用および／または予測用マーカー、
ｉｉｉ）第ｉ）項で述べた、臓器に特異的な自己免疫性疾患（セリアック病の患者における食事療法の遵守、免疫系の活性化マーカー、治療法の一般的な有効性、疾患の再活動化、罹患した組織の残存機能、萎縮の進行など）のモニタリング（なお、この場合、本発明に基づいて、上記モニタリング方法は上記診断方法と同じステップを包含し、治療を伴う、または治療を伴わない臨床上の経過観察の間に、自己免疫性疾患の患者に対して適用される。さらにこの場合、上記第３の段階において、上述の比較は、患者において前もって検出されたサイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の値に対しても行われ、また、患者における免疫介在性疾患の進行を経時的に評価するために、第５の診断ステップに基づいて、その後の第６のステップにおいて、先行する５つのステップを所定の時間間隔で繰り返すことが決定されてもよい。）、
ｖ）（例えばセリアック病の患者または自己免疫性甲状腺炎において）より侵襲的アプローチの前に行う、診断のプロセスにおけるさらなる”決定を行う物（decisional maker）”。
【００９８】
上述したような免疫介在性疾患の過程における診断方法および予測方法における、サイトカインＢリンパ球刺激因子の血清学的なアッセイの使用に対して、本発明の分野および範囲から逸脱することなく、各部および／またはステップの修正および／または付加を行ってもよいことは明らかである。また、本発明は特定の例を参照して記載されているが、当該技術分野の当業者が、診断方法および予測方法における、サイトカインＢリンパ球刺激因子の血清学的なアッセイの使用の他の等価の形態を実現することができることも明らかであるが、これらの形態は全て請求項において説明する特性を有している限り、請求項において規定する保護の対象となるものである。
【図１】
2010540948.tif 000003
【図２】
2010540948.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月1日(2010.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、輸血後の免疫処置および輸血後の反応の、臨床管理のための予測試験およびモニタリング試験としてのサイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）の血清学的なアッセイの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）は、“ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）”としても知られ、１９９９年に腫瘍壊死因子（TNF）のスーパーファミリーのメンバーとの相同性に基づいて発見され、その特性が知られるようになった（Schneider P.ら, J Exp Med. 1999;189(11): 1747〜1756、およびNardelli B.ら, Blood. 2001; 97(1):198〜204）。
【０００３】
ＢＬｙＳは、Ｂ細胞の発生および分化を調節する際に鍵となる因子の一つであると現在考えられているので、免疫応答において非常に重要な役割を果たす（Mackay F., Browning JL. Nat Rev Immunol 2002;2:465〜475、およびBatten Mら, J Exp Med 2000; 192(10): 1453〜1466）。
【０００４】
ＢＬｙＳは、例えば、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞などの骨髄細胞株によって合成され、膜タンパク質として発現し、主として可溶性の形態で放出される（Huard B.ら, Int Immunol 2004;16:467〜475、およびNardelli B.ら, Blood. 2001;97(1):198〜204）。
【０００５】
近年、このようなサイトカインを分泌することができる一連の細胞種はさらに増加し、非骨髄性細胞（例えば、髄様ストローマの細胞（Gorelik Lら, J Exp Med 2003;198:937〜945）、滑膜細胞（Ohata J.ら, J Immunol 2005;174(2):864〜870）、アストロサイト（Markus Krumbholzら, J Exp Med. 2005;201(2):195〜200）、唾液腺上皮（IttahIttah M, Miceli-Richard C., Eric Gottenburg Jら, Arthritis Res Ther. 2006;8(2):R51）、および腸上皮（Xu W., He B., Chiu A.ら, Nature Immunol 2007;8(3):294〜303）など）も包含するようになった。
【０００６】
ＢＬｙＳは、３つの受容体との相互作用を介してその機能を発揮する。これらの３つの受容体の中でもっとも重要なものはＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦＲ）であり、Ｂリンパ球によって独特の様式にて発現する（Ng LGら, J Immunol. 2004;173(2):807〜817）。ＢＬｙＳとＢＡＦＦＲと結合によって、いくつかの抗アポトーシス因子（Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１）の発現の増加が誘導される。これにより、成熟Ｂ細胞の生存および増殖が促進される（Craxton A,ら, J Exp Med. 2005; 202(10): 1363〜1374）。
【０００７】
ＢＬｙＳは、ＡＰＲＩＬ（増殖を誘導するリガンド）と呼ばれるＴＮＦスーパーファミリーの別のメンバーに対して高い相同性を有する（Hahne Mら, J Exp Med 1998;188:1185〜1190）。このＡＰＲＩＬは、３つの受容体のうち２つの受容体、つまり、ＴＡＣＩ（膜貫通型活性化因子およびカルシウム調整シクロフィリンリガンド（transmembrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand））およびＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）を、ＢＬｙＳと共有している（Thompson JS, Schneider P, Kalled SLら, J Exp Med. 2002;192(1):129〜135、およびSeshasayee D, Valdez P, Yan Mら, Immunity 2003;18(2):279〜288）。
【０００８】
Ｂ細胞のホメオスタシスにおけるＢＬｙＳの重要性は、マウスのモデルに関する研究によって明らかになった。
【０００９】
ＢＬｙＳの発現が抑止されたＢＬｙＳノックアウトマウスでは、成熟Ｂリンパ球のプールの重大な変化が観察される（Gross JAら, Immunity 2001;15:289〜302）。これに対して、ＢＬｙＳを過剰発現するマウス（ＢＬｙＳ遺伝子を導入されたマウス）は、自己免疫性疾患に典型的に見られる特徴を多数発生させる。
【００１０】
この特徴としては、脾肥大およびリンパアデノ肥大、高血清レベルの自己免疫性抗体（リウマチ因子、抗ＤＮＡ）、シェーグレン症候群（Sjogren’s syndrome；ＳＳ）の過程において見られるような、腺構造の破壊および分泌機能の損失をともなう耳下腺のＢ細胞の浸潤、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に典型的な糸球体腎炎を大いに想起させる腎臓の変化、およびＢ細胞の異常増殖が挙げられる（Mackay Fら, J Exp Med. 1999;190(11):1697〜1710、およびThien Mら, Immunity 204;20(6):785〜798）。
【００１１】
このように、実験によって得られた証拠は、ＢＬｙＳが生理的なレベルにおいてＢ細胞の生存および分化を促進するが（Mackay F, Browning JL. Nat Rev Immunol 2002;2:465〜475）、超生理的な濃度において通常は免疫系によって抑制される自己反応性Ｂリンパ球を生存および増殖させようにすることを示している（Thien Mら, Immunity. 2004;20(6):785〜798）。
【００１２】
この実験的証拠にしたがって、ＢＬｙＳの高血清レベルおよび高組織レベルが、最近、いくつかの自己免疫性疾患およびＩｇＡ欠乏症において記録された。これらの自己免疫性疾患およびＩｇＡ欠乏症の全ては、アレルギー性反応および輸血反応の発生率が一般に増加することによって特徴付けられる（Ramsey Gら Transfusion 1995;35:582-6; Rogers RLら, Am J Hematol. 1998 Apr;57(4):326〜330）。
【００１３】
ＢＬｙＳのレベルが増加する自己免疫性疾患としては、シェーグレン症候群（ＳＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症（ＳＳｃ）、多発性硬化症（ＭＳ）、混合型クリオグロブリン血症（ＭＣ）、セリアック病（ＣＤ）、自己免疫性甲状腺炎（ＡＩＴ）、およびウェゲナー肉芽腫症などが挙げられる（Stohl W. B Curr Rheumatol Rep 2002;4(4):345〜350、Seyler TMら, J Clin Invest. 2005;115(11):3083〜3092、Mariette Xら, Ann Rheum Dis. 2003;62(2):168〜171、Matsushita Tら, Arthritis Rheum. 2006;54(1):192〜201、M. Thangarajら, J Neuroimmunol 2004;152:183〜190、Fabris Mら, J Rheumatol 2007;46:37〜43、Fabris Mら Scan J Gastroentherol 2007;42(12):1434〜1439、Fabris Mら, Autoimmun Rev. 2010 Jan;9(3):165〜169およびM. Krumbholzら, J Autoimmun 2005;25:298〜302）。
【００１４】
一般に、これらの自己免疫性疾患において、ＢＬｙＳの血清レベルおよび組織レベルは、患部組織（骨膜、唾液腺）における疾患に特異的な自己抗体のレベル、ならびにリンパ球浸潤の存在およびレベルと相関関係にある。特に、異所性の胚中心の形成は、ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬの存在と相関関係にあるようである（Jonsson MVら,  J Clin Immunol 2005;25:189〜201、およびSzodoray Pら, Clin Immunol 2005;17:168〜176）。
【００１５】
ＢＬｙＳのレベルの上昇は、臓器拒絶反応の過程においても見られる。この場合、Ｔ−リンパ球に対するＢＬｙＳとＢＡＦＦＲとの相互作用が、移植した臓器に対抗するＴ細胞の活性化および増殖を促進する（Ye Qら, Eur J Immunol 2004 ;34 :2750〜2759）。ＭＨＣの不適合に起因する心臓移植の拒絶反応マウスのモデルにおいて、ＢＬｙＳ−ＢＡＦＦＲを遮断すると、移植した臓器の生存が大幅に延長される。
【００１６】
さらに、ＩｇＡ欠乏症（ＩｇＡＤ）は、自己免疫性疾患および（輸血反応を包含する）アレルギー性反応と一般に関連付けられる。また、我々は、関連付けられた自己免疫性障害から独立して、ＩｇＡＤに罹患した患者においてＢＬｙＳのレベルが増加することも示した。この結果によって、このような異議（contest）において、関連付けられた自己免疫性障害だけに限らず、ＢＬｙＳの増加が、免疫処置および免疫介在性の輸血反応の素因となる因子を表わしているのではないか、という仮定にたどり着いた。
【００１７】
免疫に関連した輸血反応としては、血漿または赤血球の不適合に起因し、輸血に伴って起こる可能性のある全ての合併症（例えばスリルハイパーセルミックシンドローム（thrill-hyperthermic syndrome）、アレルギー性反応など）が挙げられるが、特に、輸血後の溶血性反応が挙げられる。近年、自己免疫性疾患に罹患した患者は、一般的な集団と比較して、輸血後に不規則同種抗体の生成量を増加させることが観察された（Ramsey Gら Transfusion 1995;35:582〜586）。不規則同種抗体とは、輸血、妊娠、または活動性免疫の獲得の後に、非自己赤血球抗原に対して生成されるか、あるいは、免疫グロブリンもしくは血漿の注入、または臓器もしくは骨髄の移植の後に受動的に獲得される抗体である。同種抗体の存在頻度は、一般的な集団において０．３％〜３８％の間でばらつきがあり、血液中の同種抗体の検出に使用される新しい方法の感度が増すことによって連続的に増加している。これらの同種抗体は、臨床上の相関性を有する溶血性輸血反応の大半にとっての原因である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Schneider P.ら, J Exp Med. 1999;189(11): 1747〜1756
【非特許文献２】Nardelli B.ら, Blood. 2001;97(1):198〜204
【非特許文献３】Mackay F., Browning JL. Nat Rev Immunol 2002;2:465〜475
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
このような背景から、本発明の目的の１つは、免疫処置および免疫関連輸血反応（輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応）の防止および臨床管理のための予測試験として、リスク評価のためのスクリーニング試験として、サイトカインＢリンパ球刺激因子ＢＬｙＳの血清学的アッセイを使用することである。本発明は、輸血または再輸血の対象となる全ての患者、特に素因となる疾患を有する患者（例えば、自己免疫性疾患およびＩｇＡＤに罹患した患者、ならびに、アレルギー性反応の病歴を有する患者）に対して適用してもよい。
【００２０】
本発明は、免疫処置および輸血後の輸血反応の防止および管理において現在使用されている手法の限界を解消する。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、ＢＬｙＳレベルを（例えば、コルチコステロイド、または調査中の抗ＢＬｙＳ剤（ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）およびアタシセプト（ａｔａｃｉｃｅｐｔ）など）を使用して）低減させる、または正常化する個別化された治療法が提案され得る患者を特定する方法として、サイトカインＢＬｙＳのアッセイを使用して、現在使用されている手法の限界を解消することである。
【００２２】
現在の技術の短所を解消し、上記目的およびその他の目的を達成して長所を実現するために、出願人は、本発明について研究し、試験を行い、そして本発明を具現化した。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明を独立項において規定し、その特徴を記述する。一方で、従属項には、本発明の他の特徴、または主な発明的発想の変形例を記載する。
【００２４】
Ｂ細胞の集団に関する証拠およびＢＬｙＳの存在に関する証拠は、本明細書に記載される免疫に関連した輸血反応において、全く欠如していた。したがって、これまで、ＢＬｙＳが免疫に関連した輸液反応においても重要な病因としての役割を有するのかもしれないという仮説が立てられたことはない。
【００２５】
この仮説は、ＩｇＡ欠乏症および輸血反応における全身的なおよび臓器に特異的な自己免疫性疾患における知見および経験から得られる関連する科学的背景を、これらの障害におけるＢＬｙＳに関する研究と総合することによって形成されている。このプロセスは、共同発明者らの異なる専門知識を体系的に統合することから得られた。
【００２６】
輸血反応を示す、または輸液反応を示さない患者に関する予備的な研究から発明者らによって得られた結果は、共同発明者らが、ｉ）輸血後の免疫処置（すなわち、抗血液細胞抗体の生成）および(それ故)輸血反応の、リスクの評価および予測的管理のための新しい有用なマーカーとして、ベースラインおよび輸血後の経過観察におけるＢＬｙＳを見出すことにつながった。特に、ベースラインおよび輸血後の経過観察におけるＢＬｙＳの血清レベルは、免疫処置および（それ故）輸血反応のリスクおよび／または素因を示すマーカーとして、現れた。このため、免疫処置および輸血反応のリスクが高い患者を、血清ＢｌｙＳによって特定できる可能性があり、これらの患者において、輸血をさらに評価すべきである。そして、このような高いリスクが存在するのであれば、輸血は可能な限り避けるべきである。また、上述した予備的な研究から発明者らによって得られた結果は、共同発明者らが、ｉｉ）ＢＬｙＳのレベルを（例えばコルチコステロイドまたは調査中の抗ＢＬｙＳ剤（ベリムマブおよびアタシセプトを使用して））低減させる、または正常化する個別化された治療が推薦され得る患者を、検出する方法として、ベースラインおよび輸血後の経過観察における、ＢＬｙＳのアッセイを特定することにつながった。これによれば、ＢＬｙＳの血清レベルのアッセイは、輸血に対する警告（第ｉ項）に加えて、輸血を回避することができない場合、異なる治療手法の対象となる患者を特定する方法ともなり得る。
【００２７】
上述の目的に従って、本発明の１つの特徴は、輸血反応を示唆する症状または徴候を有する、またはこれらの症状または徴候を有しない、輸血の対象となるまたは輸血を受けた全ての患者、特に輸血反応（つまり自己免疫性疾患、免疫不全症）のリスクが高い患者において、サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）の血清学的なアッセイを、免疫処置のリスクが高く、したがって輸血に関連した免疫介在性疾患（例えば輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応など）を発症するリスクが高い患者を特定する方法としての、以下の方法における使用に関する。この方法は、
遠心分離によって血清が得られ得る血液サンプルを、この患者から、ベースライン（つまり、輸血前、ならびに輸血からおよそ１ヶ月後および４ヶ月後）において採取する第１のステップと、
市販のキットを典型的に使用することによって、この血清サンプルを（輸血前に、ならびに輸血からおよそ１ヶ月後および４ヶ月後に）検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
第２の段階において決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、健康な集団について前もって得られたサイトカインＢＬｙＳの濃度の参照値とを比較する第３のステップと、
第３のステップにおける比較から導き出される、第２の段階において決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と健康なコントロールの集団について前もって得られたサイトカインＢＬｙＳの濃度の参照値との間の、有意な偏差を特定して、上述の疾患（輸液反応）を発症するリスクのある患者を選択する第４のステップと、
選択された患者の、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値（なお、これらの参照値は、輸血に関連した免疫介在性疾患に罹患した一連の患者について前もって得られたＢＬｙＳのベンチマークの範囲内である。）とを比較する第５のステップと、
第５のステップにおいてなされた比較に基づいて、上述の免疫介在性疾患の１つ以上の確定的な疾患を発症するリスクが高いとみなす第６のステップと、
を包含する。
【００２８】
関連する病棟の設備またはこの病棟を構成する構造物に大幅な修正を加える必要がなく、通常大規模な病院の分析ラボに存在する型の免疫学的な酵素アッセイ（酵素結合免疫吸着測定法（エライザ））を実施可能な自動装置を、患者の血清中におけるＢＬｙＳの濃度を分析するために第２のステップにおいて使用することは、本発明の利点である。
【００２９】
本発明の別の革新的な特徴は、ＢＬｙＳのレベルを（例えば、コルチコステロイドまたは調査中の抗ＢＬｙＳ剤（ベリムマブおよびアタシセプトなど）を使用して）低減させる、または正常化する個別化された治療が提案され得る患者を特定するマーカーとしての、サイトカインのＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）の使用である。
【００３０】
この目的を実現するために、（i）ＢＬｙＳの血清レベルが正常域に包含される血清レベルを解消する場合、輸血反応の素因のマーカーとして、輸血後のＢＬｙＳの血清学的濃度のモニタリングを有利に使用することができるか、あるいは、(ii)輸血／再輸血に対して警告するか、または輸血を受けている患者の治療的処置の有効性を制御する、以下のステップを包含する方法において、ＢＬｙＳのアッセイをマーカーとして有利に使用することができる。すなわち、この方法は、
新しい治療法を行う前に、この患者から血液サンプルを採取して血清を得る第１のステップと、
この血清のサンプルを検査して、サイトカインＢｌｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
抗ＢＬｙＳ治療法の開始後または輸血後の所定の時間（例えば、輸血から１ヶ月および４ヶ月後）に患者から血液サンプルを採取する第３のステップと、
第３のステップにおいて採取された１つ以上の血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する４のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、第４のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度とを比較する第５のステップと、
第５のステップにおける比較から導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と第４のステップにおいて得られるサイトカインＢＬｙＳの濃度の値との間の、有意な偏差を特定する第６のステップと、
免疫処置および輸血反応の防止のために、第６のステップにおいて特定された偏差に基づいて、免疫処置のリスクがあるとみなし、したがって、輸血反応を発症するリスクがあるとみなすか、または抗ＢＬｙＳ治療法の有効性を試験する第７のステップと、
を包含する。
【００３１】
本発明は、輸血を受けている患者の、診断手法および予測手法の改善、ならびに治療を目的としたモニタリングの改善を可能にする。
【００３２】
本発明の変形例によれば、本発明に係るＢＬｙＳのアッセイの使用は、
患者を対象とする、輸血／再輸血の後の輸血反応としての免疫処置のための、可能性のあるさらなるリスクファクター、ならびに輸液反応の主な徴候および症状を、現在の最高の知見に基づいて特定するための、理学的および生化学的な検査、あるいは
患者から採取された末梢血液より抽出されたＤＮＡに関する（ＢＬｙＳの発現に関連する遺伝的素因、またはＢＬｙＳの発現に関連しない遺伝的素因の）分子的な分析
の分析方法と組み合わせられ得る。
【００３３】
上記およびその他の本発明の特徴は、実施形態の好適な態様についての以下の記載から明らかになる。ただし、これらの実施形態は、添付の図面を参照する非制限的な例として与えられている。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、健康な血液提供者（ＨＢＤ）に対して、セリアック病の患者（ＣＤ）における血清Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）のレベルを比較するグラフである（正常域：＜１．１４５ｎｇ／ｍｌ、平均＋２ＳＤ）。
【図２】図２は、セリアック病の患者における、サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）の濃度と抗体ａ−ｔＴＧの濃度との間の、有意な相関を示すグラフである。
【図３】図３は、セリアック病の患者においてグルテンを含まない食事療法（gluten-free diet；ＧＦＤ）を実施した後の、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）の濃度の有意な減少を示すグラフである（１．６１９±０．４１０ｎｇ／ｍｌから１．２８３±０．３１０ｎｇ／ｍｌへ減少；＊ｐ＝０．０１２２、ウィルコクソン符号順位検定）。
【図４】図４は、健康な血液提供者（ＨＢＤ）に対して、ＩｇＡＤの患者において、全体（ＩｇＡＤ  ｔｏｔ）の場合および２つのサブグループに分けた場合の、血清Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）のレベルを比較するグラフである。２つのサブグループとは、セリアック病に罹患したＩｇＡＤの患者（ＩｇＡＤ＋ＣＤ）と、ＣＤに罹患していないＩｇＡＤの患者（ＩｇＡＤ）とである（正常域：＜１．１４５ｎｇ／ｍｌ、平均＋２ＳＤ）。
【図５】図５は、健康な血液提供者（ＨＢＤ）に対して、自己免疫性甲状腺炎（ＡＩＴＤ）の患者において、全体の場合および橋本甲状腺炎（ＨＴ）とグレーブス病／バセドウ病（ＧＢＤ）とを区別した場合の、血清中のＢＬｙＳのレベルを比較するグラフである（正常域：＜１．１４５ｎｇ／ｍｌ、平均＋２ＳＤ）。
【図６】図６は、ＦＴ４の正常なレベルまたはＦＴ４の低いレベルを有するＨＴ患者において、血清中のＢＬｙＳのレベルを比較するグラフである。
【図７】  図７は、輸血（ＢＴ）の対象となる無作為に選んだ３４人の患者、輸血後に免疫介在性の輸血反応を発症しなかった２２人の患者（Ｎｏ  ＢＴＲ）、および輸血後に免疫処置または輸血反応を発症した２１人の患者（Ｙｅｓ  ＩＭＴＲ）における、ＢＬｙＳの血清レベルを、７７人の年齢および性別が一致する健康な血液提供者におけるＢＬｙＳの血清レベルと比較して示す図である。ＢＬｙＳのレベルが非常に高い症例も見られたものの、全般的には、ＢＴの対象となる患者におけるＢＬｙＳの血清レベルは、ＨＢＤにおけるＢＬｙＳの血清レベルに重ねることができた（０．７８±１．０１ｎｇ／ｍｌ対０．６６±０．２４ｎｇ／ｍｌ；ｐ＝ｎｓ）。ＢＴを受けたが、ＩＭＴＲを発症しなかった患者は、ＨＢＤよりも有意に高いＢＬｙＳのレベルを示した（１．４１±０．９４ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０００１）。一方、ＢＴを受けてＩＭＴＲを発症した患者は、さらに高いＢＬｙＳのレベルを示した（２．３３±２．２３ｎｇ／ｍｌ；ＨＢＤに対してｐ＜０．０００１、Ｎｏ  ＩＭＴＲに対してｐ＝ｎｓ）。マンホイットニーのノンパラメトリックｔ検定を用いて統計的分析を行った。
【図８】  図８は、輸血（ＢＴ）前および１５．６±８．５日後にアッセイを受けた患者のサブグループにおける、ベースラインおよび輸血後のＢＬｙＳの血清レベルを示す図である。全般的に、ベースラインのサンプルおよび輸血後のサンプルからは、ＢＬｙＳの血清レベルに有意な増加が見られた（０．６４±０．４０ｎｇ／ｍｌ対１．３２±０．６９ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００９８（ウィルコクソン符号順位検定による））。ＢＴ後の時間が抗血液細胞抗体の発生を評価するほど十分ではなく、患者の誰もがＴＲを発症しなかったので、これらの患者の免疫処置について利用可能なデータはなかった。いずれにしても、一般的にＢＴ自体がＢＬｙＳの血清レベルの初期の有意な増加を決定するようである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、サイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）について当該技術分野において公知であることを基礎とし、免疫介在性輸血反応および輸血後の免疫処置を防止および管理するのための、このようなサイトカインの血清学的なアッセイの革新的な使用を完成させる。
【００３６】
特に、出願人が得た実験結果は、セリアック病、ＩｇＡ欠乏症、自己免疫性甲状腺炎、免疫介在性の輸液後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応などの状態におけるＢＬｙＳの発現および役割に関するものである。これらの状態は、特定の臓器の症状の原因となる免疫介在性応答（輸血反応の任意の特定の臨床的な徴候および症状を伴うあるいは伴わない、同種抗体の生成（つまり、免疫処置））によって、自己抗体の分泌によって、これら疾患同士の高い相関性および他の自己免疫性疾患との高い相関性によって、およびＢ細胞のクローン性またはＴ細胞のクローン性が発現するリスクの増加によって特徴付けられている。また出願人が得た実験結果は、これらの病状における新しい診断用、予測用、および治療用のマーカーとしてＢＬｙＳを特定し提案することへと導いた。
【００３７】
さらに、輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応において得られた結果に基づいて、本発明は、将来ＢＬｙＳが特定される可能性のある、他の全ての免疫介在性の輸血反応にも拡張され得る。
【００３８】
関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、混合型クリオグロブリン血症症候群（ＭＣ）、自己免疫性甲状腺炎、セリアック病、およびＩｇＡ欠乏症における上述のＢＬｙＳに関して出願人が発表した研究結果によって、出願人は、サイトカインＢＬｙｓが発見されて以降初めて、輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応におけるＢＬｙＳの発現の有望で重要な役割を調査することができるようになった。このように、免疫処置および輸血反応のリスクが増加することを特徴とする、自己免疫性疾患および免疫不全症におけるＢＬｙＳの過剰発現に関連して先に発表された研究や発見は、本発見の前提であった。
【００３９】
ＲＡにおいて、出願人は、ＲＡ患者の約２０％においてＢＬｙＳの血清レベルが高いことが、先の研究において実証されていることを確認した。また、これらのＢＬｙＳのレベルが、ＣＤ２０＋のＢ細胞の除去を実現するモノクローナル抗体（リツキシマブ）を有するＲＡ患者の治療後に大幅に増加したことも確認した（Quartuccio Lら Reumatismo 2004;56(3):143〜6;M. Fabrisら, Ann Rheum Dis 2009;68(Suppl3):75）。
【００４０】
出願人は、ＭＣ症候群およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によるウイルス感染症において、ＨＣＶ感染症そのものが、ＢＬｙＳの発現の増加を誘発し、素因を有する被験者のサブセットにおいて自己反応性Ｂ細胞の増殖を維持することに寄与し、クリオグロブリン血症症候群を発症しやすくできることを示した。クリオグロブリン血症症候群に罹患した患者の血清におけるＢＬｙＳの値が慢性のＨＣＶ感染症だけに罹患した被験者よりも非常に高いので、この症候群の発生は、ＢＬｙＳの発現がさらに増加することとタイミングが一致した（Fabris Mら, J Rheumatol 2007; 46:37〜43）。全般的には、抗ＢＬｙＳ治療法は、これらの新規データに基づいて、ＭＣ症候群における選択肢として初めて現れた。
【００４１】
これらの前提において、出願人は、セリアック病および自己免疫性甲状腺炎においても、ＢＬｙＳのレベルが増加すると仮定した。
【００４２】
この効果は、主に内因性の（endogen）抗ウイルス応答によって、つまりインターフェロンによって媒介される。なお、インターフェロンは、種々の研究によってインビトロにおいてＢＬｙＳの発現を強力に誘発することが示されている。
【００４３】
セリアック病の病因における、Ｂリンパ球の役割は、ＨＬＡおよびＴリンパ球の活性化が果たす根本的な役割と比較すると、これまでは非常に小さいと考えられてきた（LM Sollid, Thorsby E. Gastroenterology 1993; 105: 910〜922、Spurkland Aら, Tissue antigens 1997 ; 49:29〜34、およびMolberg Φら, Gastroenterology 2003; 125:337〜344）。しかし、出願人は、セリアック病に罹患した患者において高い割合（＞８０％）で、ＢＬｙＳが高血清レベルにて見出される事を示した（図１）。
【００４４】
特に、図１は、セリアック病の患者におけるＢＬｙＳの血清レベルを、健康なコントロール（ＨＢＤとも表記され、年齢および性別において調査対象の患者に匹敵する健康な被験者、つまり血液提供者からなるコントロール）と比較して示している。ＢＬｙＳの血清レベルは、健康なコントロールと比べて、セリアック病の患者において非常に高い（マンホイットニーのｔ検定、＊ｐ＜０．０００１）（正常域：＜１．１４５ｎｇ／ｍｌ、平均＋２ＳＤ）。
【００４５】
ここで初めて明らかにされるこの結果は、この広く見られる（集団の約１．１％）腸疾患の病因の解釈における新しい鍵を暗示している。特に重要であることは、ＢＬｙＳがこれまで研究されてきた自己免疫性障害の全てと比べても、ＢＬｙＳの上方制御は、セリアック病において最も広く記録されている（５人中４人の患者）ことである。さらに、出願人が測定および分析したＢＬｙＳの血清レベルは、この疾患に特異的な抗体である抗トランスグルタミナーゼ（ａ−ｔＴＧ）の血清レベルと有意な相関があることを示している（図２参照。同図はＢＬｙＳの血清レベルとａ−ｔＴＧ  ＩｇＡレベルとの相関関係を示している。スピアマンの順位試験：ｒ＝０．３９９、９５％ＣＩ：０．１７２４〜０．５８５６、ｐ＝０．０００７）。また、ＢＬｙＳとａ−ｔＴＧとの両方が、グルテンを含まない食事療法の導入および疾患の臨床上の寛解と同時に減少している（図３を参照。同図は、グルテンを含まない食事療法の開始後の、ＢＬｙＳの血清レベルの制御を示している。）。１２人中８人（７５％）の患者において、食事療法後のＢｌｙＳのレベルが依然正常域より高いもののを用いたアッセイ）、食事療法後のＢＬｙＳのレベルには、一般に有意な減少が見られる（１．６１９±０．４１０ｎｇ／ｍｌから１．２８３±０．３１０ｎｇ／ｍｌへ減少；＊ｐ＝０．０１２２、ウィルコクソン符号順位検定）（＞１．１４５ｎｇ／ｍｌ、エサイザのキット（R&D Systems社のクアントカインＥＬＩＳＡキット（Quantkine ELISA kit）, Minneapolis, 55413 USA）。
【００４６】
ただし、ａ−ｔＴＧが陰性になり臨床上寛解に到達する症例であっても、ＢＬｙＳのレベルは大幅に減少したものの、正常域には達していない。このことは、疾患が無症候状態のまま継続すること、または疾患の素因になり、広く共有され、ＨＬＡの遺伝子型に相当するＢＬｙＳの基礎レベルが比較的高いことを示唆している。
【００４７】
感染力を有する共同参加物（co-participation）（ロタウイルス）がセリアック病の病因において関与している可能性を示す最近の根拠からは、クリオグロブリン血症症候群において観察されたことと同じように、ＢＬｙＳの血清レベルの上昇について別の仮説が立てられる。
【００４８】
したがって、ＢＬｙＳのアッセイは、非典型的な症状のある場合、陰性のａ−ｔＴＧの血清レベルをともなった場合、あるいは腸生検が実施不可能、または倫理的に薦められない場合などの疑わしい場合や、前記のような上記疾患に罹患するリスクが比較的高い個体の集団におけるスクリーニングとしても、さらなる診断上のツールとなる。
【００４９】
さらに、高いＢＬｙＳの血清レベルが全身的に継続すると、遺伝的に素因を有する個体において、他の自己免疫性疾患に対する罹患を促進する可能性がある。これは、ＢＬｙＳが、初期のトリガーおよびクローンの集団の形成から逃れるまで、その強力な抗アポトーシス効果によって、膨張したＢ細胞において遺伝子の変異をさらに促進することと同様である。
【００５０】
出願人が前もって分析した混合型クリオグロブリン血症症候群の６６人の患者において、高いレベルのＢＬｙＳと有意な相関性を示した臨床上の特徴は、クローナルＢ細胞の増殖の存在だけであった。Ｂ細胞のクローン性の患者は、Ｂ細胞のクローン性を有しない患者と比較すると、非常に高いＢＬｙＳのレベルを示した被験者の割合が有意に高かった（９．８％に対して３３．３％；  ＯＲ＝４．６、ＣＩ＝１．１２〜１８．９６、ｐ＝０．０４）。
【００５１】
これらの症例では、各種Ｂ細胞腫瘍（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病）、およびさらに最近では一次的ＳＳ（primary SS）の患者の唾液腺に浸潤するＢリンパ球（C Daridonら, Arthritis Rheum 2007; 56:1134〜1144）において見られるように、Ｂ細胞のクローンも自己分泌刺激メカニズムによって、ＢＬｙＳを分泌し、疾患に寄与するのかもしれないと考えることもできる。
【００５２】
ＢＬｙＳは、クリオグロブリン血症およびＳＳの過程、ならびに複数の腫瘍性障害において先に示したように、多段階プロセスにおいて重要な役割を果たし得る。このプロセスは、セリアック病においてもリンパ腫の形成を引き起こす。実際に、このプロセスはＢ細胞およびＴ細胞の両方を刺激する（Mackay F, Leung H. Semin Immunol. 2006;18(5):284-289）。びまん性大細胞型Ｂ細胞腸リンパ腫を伴うセリアック病の患者において、出願人が非常に高いレベル（８．５ｎｇ／ｍｌ）のＢＬｙＳを発見したことは、この仮説と矛盾しない。
【００５３】
したがって、この結果は、ＢＬｙＳのアッセイを、Ｂ／Ｔ細胞のクローン性が疑われる（グルテンを含まない食事療法を厳格に遵守しているにもかかわらず、高いａ−ｔＴＧレベルが継続している）セリアック病の患者の症例の補助的診断法として使用することが可能であることを示唆している。
【００５４】
選択的な原発性ＩｇＡ欠乏症（ＩｇＡＤ）は、免疫不全症のもっともよく見られる型であり、白人における推定発生率は１：６００である。ＩｇＡ単独欠損症の個体は、正常なＩｇＡ遺伝子を有するが、リンパ球の最終分化に欠陥を有しており、このことが血清およびムコサールＩｇＡの生成不足を引き起こす（Cunningham-Rundles C. J Clin Immunol 2001;21(5):303〜309）。ＩｇＡＤに関連して多数の疾患、例えば、アレルギー、胃腸管および再発上気道の疾患、特に、自己免疫性疾患が報告されている（Liblau RSら, Int Arch Allergy Immunol 1992;99(1):16〜27）。最もよく見られる相関はセリアック病（ＣＤ）との相関であり、ＣＤは通常、ＩｇＡＤ患者において明らかに欠如している、特定のＩｇＡ抗体を検出することによって診断されるので、特に重要である。図４に示すように、出願人は、コントロール（０．６６±０．２４ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０００１）よりもＩｇＡＤ患者（１．５７±０．５１ｎｇ／ｍｌ）においてＢＬｙＳの血清レベルが有意に高いことを見出した。特に、ＩｇＡＤ患者の７７．８％（３５人／４５人）が、正常域を超えたＢＬｙＳのレベル（＞１．１４ｎｇ／ｍｌ）を有している。分析対象のＩｇＡＤ患者のうち、２６人がセリアック病ＣＤに罹患していたが、ＩｇＡＤおよびセリアック病ＣＤの患者１９人と比べて大きな違いがなかった（１．６７±０．５７ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝ｎｓに対して１．４９±０．４６ｎｇ／ｍｌ）。ＩｇＡＤ患者と、ＣＤに罹患しているが、ＩｇＡが正常である上述した一連の患者との間では、ＢＬｙＳのレベルの差は見られなかった（１．５４±０．４６ｎｇ／ｍｌ）。したがって、ＢＬｙＳは、ＩｇＡＤの患者において上方制御され、ＩｇＡＤと自己免疫性疾患とを強く関連付ける因子の一つである可能性があるが、Ｂ細胞のクローン性を形成するリスクを増加させる因子の一つである可能性もある。本発明では、ＢＬｙＳのアッセイを、ＩｇＡＤに罹患した被験者におけるＢ細胞のクローン性の形成の予測用マーカーとして革新的に使用する。
【００５５】
自己免疫性の甲状腺疾患（ＡＩＴＤ）は、よく見られる自己免疫性疾患であり、一般人口の罹患率は５％に上る。また、女性のほうが男性よりも罹患率が高い。甲状腺に指向する自己免疫（thyroid-directed autoimmunity）は、橋本甲状腺炎（ＨＴ）およびグレーブス・バセドウ病（ＧＢＤ）の、２つの古典的自己免疫性症状において現れる。前者は、甲状腺機能低下症（抗ＴＰＯおよび抗サイログロブリン）の原因となり、後者は甲状腺機能亢進症（ＴＳＨ受容体のアゴニストの自己抗体）の原因となる。ＡＩＴＤは、他の自己免疫性疾患（セリアック病、１型糖尿病、全身的コネクティバイティス（systemic connectivitis））と関連することが多い。ＡＩＴＤは、おそらく共通の自己免疫を誘発する表現型を共有しているのであろう。他の自己免疫性疾患のように、ＡＩＴＤは、Ｂ細胞クローナル疾患（特にＨＴ患者）の発生リスクを増加させる。
【００５６】
図５に示すように、出願人は、７７人の白人のＡＩＴＤ患者（内訳、男性１０人および女性６７人、平均年齢４８．２±１６．１歳、ＨＴ患者５２人およびＧＢＤ患者２５人）を研究し、ＢＬｙＳの血清レベルを、７７人の年齢および性別が一致する健康なコントロールと比較して分析した。ＡＩＴＤ患者は、ＢＬｙＳのレベルにおいて有意な増加を示した（ｐ＜０．０００１）。ＧＢＤ患者は、ＨＴ患者よりも高いＢＬｙＳを示す傾向があった（ｐ＝０．０６）。ＨＴおよびＧＤのどちらにおいても、ＢＬｙＳのレベルと自己抗体との間の有意な相関性は見られなかった。一方で、ＢＬｙＳとＦＴ４との間では、正の相関性が見られた（ｒ＝０．３１；ｐ＝０．０１２）。さらにその一方で、ＴＳＨ（ｒ＝−０．４５；ｐ＝０．０００２）の場合は、逆の相関性が見られた。
【００５７】
実際、ＨＴ患者において、ＦＴ４のレベルが正常である患者は、甲状腺機能低下症患者に比べてＢＬｙＳが非常に高い（＊ｐ＝０．０３９６）（図６）。
【００５８】
出願人は、ＢＬｙＳのレベルがＡＩＴＤの患者において高いことを本発明において初めて仮定し、かつ見出した。このことは、これらの自己免疫性障害においても、ＢＬｙＳが病因としての重要な役割をしていることを示唆している。全身的自己免疫性疾患（ＲＡ、ＳＳ、ＬＥＳ）において先行する実証より革新的な様式において、ＢＬｙＳのレベルは、甲状腺の機能性とは相関性を有するが、自己抗体の分泌とは相関性を有していない。したがって、ＢＬｙＳは、ＨＴの甲状腺機能が正常な第１の段階において比較的高く、甲状腺活性化のマーカーとして（自己抗体を分泌するプラズマ細胞のマーカーとしてとしてではない）ＧＢＤにおける甲状腺機能亢進症のレベルと相関性を有する。甲状腺がその機能を喪失すると（臨床上は甲状腺機能低下症によって顕在化する）、ＢＬｙＳは減少する。また、ＢＬｙＳの過剰発現は、他の自己免疫性疾患またはリンパ増殖性疾患を発症するＡＩＴＤの患者の割合の増加を説明する可能性のある、メカニズムの一つを表わしているのかもしれない。
【００５９】
以上のように、本発明は、ＡＩＴＤの患者における治療の有効性の診断、予測、およびスクリーニングのためのＢＬｙＳの血清学的なアッセイの使用を提案する。
【００６０】
自己免疫性疾患の患者は、一般的な集団に比べて、輸血後に不規則同種抗体を生成する傾向が高いことが、最近観察されている。輸血反応の発生を予測できる公知のマーカーは、今のところ存在しない。自己免疫性疾患と免疫介在性のメカニズムとの関連に基づいて、出願人は、サイトカインＢＬｙＳも輸血反応において役割を有する可能性があることを考えるに至った。この目的のために、ウディネ大学病院、血液製剤配布実験室の５人の患者に対して予備研究を行った。これらの５人の患者の内訳は、輸血を繰り返し行ったにもかかわらず同種抗体／自己抗体の形成を示さない患者（ｐｔｓ  Ａ型）が２人と、高濃度の赤血球を複数単位にて輸血した後に同種抗体／自己抗体を形成した患者が３人（ｐｔｓ  Ｂ型）である。同種抗体／自己抗体反応のある患者（Ｂ型）では、反応のない患者（Ａ型）に比べて、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦのレベルが高い傾向があった（平均値で、１．２９ｎｇ／ｍｌに対して２．４８ｎｇ／ｍｌ）。また、全てのＢ型の患者が、正常な閾値より高いＢＬｙＳのレベルを示した（＞１．１４ｎｇ／ｍｌ）。
【００６１】
出願人は、シェーグレン症候群において（そのうち５〜１０％の症例ではＭＣ症候群を同時に示す）、耳下腺上皮細胞によっても生成され、Ｂ細胞の増殖、およびリツキシマブを用いた抗Ｂ細胞療法に対する耐性の原因となり得る、血清および組織のＢＬｙＳの高いレベルを実証した（Quartuccio Lら Open Rheumatol J 2008;2:38〜43）。
【００６２】
出願人はさらに、セリアック病および自己免疫性甲状腺炎において、ＢＬｙＳのレベルが大幅に増加することを、医学文献において初めて示した（Fabris Mら Scan J Gastroentherol 2007;42(12):1434〜1439; Fabris Mら, Autoimmun Rev. 2010 Jan;9(3):165〜169）。セリアック病および自己免疫性甲状腺炎も、免疫処置および輸血反応のリスクの増加を特徴とするさらなる自己免疫性疾患である。最後に、出願人は、ＩｇＡＤにおいて血清ＢＬｙＳレベルが大幅に増加をすることも発見した（Fabris Mら Ann N Y Acad Sci. 2009 Sep;1173:268〜273）。この血清ＢＬｙＳレベルの大幅な増加は、自己免疫および輸血反応と強く結びついている（Rogers RLら Am J Hematol. 1998 Apr;57(4):326〜330）。自己免疫性疾患の患者は、一般的な集団に比べて、輸血後に不規則な同種抗体を生成する傾向が高いことが最近観察されている（Ramsey Gら Transfusion 1995;35:582〜586）。
【００６３】
輸血反応の発症を予測できる公知のマーカーは、今のところ存在しない。自己免疫性疾患における輸血反応の頻度の増加、および大半の輸血反応の免疫介在性メカニズムに基づいて、出願人は、サイトカインＢＬｙＳが輸血反応においても役割を有する可能性があることを考えるにいたった。
【００６４】
この目的のために、ウディネ大学病院、血液製剤配布実験室の５人の患者に対して予備研究を行った。これらの５人の患者の内訳は、輸血を繰り返し行ったにもかかわらず同種抗体／自己抗体の形成を示さない患者（ｐｔｓ  Ａ型）が２人と、高濃度の赤血球を複数単位にて輸血した後に同種抗体／自己抗体を形成した患者が３人（ｐｔｓ  Ｂ型）である。同種抗体／自己抗体反応のある患者（Ｂ型）では、反応のない患者（Ａ型）に比べて、ＢＬｙＳ／ＢＡＦＦのレベルが高い傾向があった（平均値で、１．２９ｎｇ／ｍｌに対して２．４８ｎｇ／ｍｌ）。また、全てのＢ型の患者が、正常な閾値より高いＢＬｙＳのレベルを示した（＞１．１４ｎｇ／ｍｌ）。
【００６５】
これらの予備的な結果に基づいて、出願人はさらに、研究を拡大し（図７）、ＢＬｙＳの血清レベルを、輸血（ＢＴ）の対象であるが、輸血されない３４人の無作為に選択された患者、輸血の後に免疫処置も輸血反応も発症しない２２人の患者（Ｎｏ  ＢＴＲ）、および輸血の後に同種抗体のために輸血反応（２人）または免疫処置（１９人）を発症する２１人の患者において分析した（Ｙｅｓ  ＩＭＴＲ）。データを、７７人の年齢および性別が一致する健康な血液提供者について予め公表された一連のデータと常に比較した。全般的には、ＢＴの対象となる患者におけるＢＬｙＳの血清レベルは、ＨＢＤにおけるＢＬｙＳの血清レベルに重ねることができた（０．７８±１．０１ｎｇ／ｍｌ対０．６６±０．２４ｎｇ／ｍｌ；ｐ＝ｎｓ）。ＢＴを受けたが、ＩＭＴＲを発症しなかった患者は、ＨＢＤよりも有意に高いＢＬｙＳのレベルを示した（１．４１±０．９４ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０００１）。一方、ＢＴを受けてＩＭＴＲを発症した患者は、さらに高いＢＬｙＳのレベルを示した（２．３３±２．２３ｎｇ／ｍｌ；ＨＢＤに対してｐ＜０．０００１、ｎｏ  ＩＭＴＲに対してｐ＝ｎｓ）。注目すべきは、ＢＬｙＳのレベルが最も高い患者は、２つの異なる血液バッグに対して２つの激しい輸血反応を起こしたことである。ＩＭＴＲの患者の間において、ＢＬｙＳの血清レベルが正常域の範囲を上回った（＞１．１４ｎｇ／ｍｌ）患者は、２１人中１５人（７１．４％）であった。これに対して、ＩＭＢＴではない患者の間において、ＢＬｙＳの血清レベルが正常域の範囲を上回った患者は、２２人中１２人（５４．５％）であった（ＯＲ＝２、ｐ＝ｎｓ）。
【００６６】
平均値の比較のためにマンホイットニーのノンパラメトリックｔ検定を用い、分割表のためにフィッシャーの正確確立検定を用いて統計的分析を行った。
【００６７】
次いで、我々は、輸血前および輸血後の１５．６±８．５日において、対応する患者から繰り返し採取されたサンプルにおける血清中のＢＬｙＳの定量化を行った。そして、ＢＴ自体が、ＢＬｙＳの血清レベルの有意な増加（０．６４±０．４０ｎｇ／ｍｌ対１．３２±０．６９ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００９８（ウィルコクソン符号順位検定による））を頻繁に（７７％）決定し、輸血後の１ヶ月以内に試験が繰り返された場合、ＢＬｙＳの血清レベルの有意な増加を常に決定する（２人の患者のみがＢＬｙＳのレベルが変化したかったことを示したが、これらの２人の患者は血液サンプルが輸血後の１ヶ月よりも後に回収された唯一の患者である。）ことを確認した。
【００６８】
このように、結果は、ＢＴが、ＢＬｙＳの血清レベルの増加と関連していることを示している。そして、このような増加は、輸血後に免疫処置（明らかな輸血反応に進行するより高いリスクのある状態）、または免疫介在性輸血反応（血液細胞に対する抗体、ならびに輸血反応の臨床的徴候および臨床的症状）を発症する患者においてより高いように考えられた。
【００６９】
したがって、本発明は、以下の状況において、血清ＢＬｙＳのアッセイを革新的な様式にて提供する。ｉ）免疫処置および輸血後の輸血反応（輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、輸血反応）のリスクのある状況、ならびに輸血が、その兆候のために再評価されるべきである場合か、あるいは輸血の前および／または後の専用の治療が望ましいものである場合、免疫処置および輸血反応のリスクがより高い患者を選択する状況。
【００７０】
自己免疫性疾患、または免疫不全症（ＩｇＡ欠乏症および分類不能型免疫不全症など）に罹患した患者は、これらの状況において増加したＢＬｙＳの発現についての発表されたデータ（出願人によって発表された最近のデータが挙げられる）に基づいて、リスクがさらに高いサブセットとして特定される。
【００７１】
したがって、患者の免疫介在性の輸血反応における予測および／または効果的な治療法のスクリーニングに対して適用される本発明は、以下のステップを包含する。すなわち、
患者の血清を得るための血液サンプルを採取するステップと、
この血清サンプルを検査して、濃度を決定するステップ、すなわちエサイザの技術を用いたサイトカインＢＬｙＳのアッセイのステップと、
先のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値とを比較するステップと（なお、この参照値は、健康な集団（健康な血液提供者：ＨＢＤ）について、または免疫介在性の輸血反応に罹患したとの診断を受けた患者の集団について、あるいは抗ＢＬｙＳ治療法の開始前または輸血前に分析した同じ患者からの血清サンプルについて決定された参照値である。）、
先のステップから得られる、サイトカインＢＬｙＳの決定された濃度と、先のステップにおいて示されたサイトカインＢＬｙＳ濃度の参照値との間の、有意な偏差を特定するステップと、
上記ステップに従って、特定の臨床的症状（同種抗体の生成、輸血反応）について、または上述の免疫介在性疾患の過程における治療有効性のレベルについて診断および／または予測を行うための、決定的なおよび／または推定的な型のステップとである。
【００７２】
診断方法の特定の場合において、上述の比較のステップは、患者について決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、健康な集団について決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値とを比較するために実施される。これにより、有意な偏差を特定するステップによって、上述の病理学的な状態の一つに罹患したとして患者を選択する。また、有意な偏差を特定するステップと、決定的なおよび／または推定的な型の最後のステップとの間で、患者について決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、別の患者の集団のサイトカインＢＬｙＳの濃度の値とを比較する、さらに別の比較ステップを設ける。この“別の患者”とは、免疫介在性疾患に罹患した、および／または特定の臨床的症状が見られるとの診断を受けた患者である。そして、この別の比較ステップを設けることによって、最後のステップにおいて、前述の全ての免疫介在性疾患の中から、決定された免疫介在性疾患のリスクがあるとみなす。
【００７３】
また、このアッセイは、ＥＬＩＳＡの技術を用いた、主要病院に通常備え付けられている自動装置を使用して実現されるので、このアッセイを採用しても、この新しいマーカーを使うにあたって利用する病棟の設備またはこの病棟を構成する構造物に対して実質的な修正を加えるわけではない。
【００７４】
したがって、本発明は、ＢＬｙＳのアッセイの使用を、以下の状況においても革新的な様式にて提供する：
ｉｉ）一般的な集団における輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、および輸血反応のための予測用マーカー、
ｉｉｉ）免疫処置および輸血反応の素因のある状態（自己免疫性疾患および免疫不全症（ＩｇＡ欠乏症および分類不能型免疫不全症）など）における輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、および輸血反応のための予測用マーカー、
ｉｖ）輸血を受けている患者（免疫系の活性化マーカー、輸血反応の防止、治療法の有効性など）のモニタリング（なお、これらの場合、本発明に基づいて、上記モニタリング方法は上記診断方法と同じステップを包含し、治療を伴う、または治療を伴わない臨床上の経過観察の間に、自己免疫性疾患の患者に対して適用される。さらにこの場合、上記第３の段階において、上述の比較は、患者において前もって検出されたサイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の値に対しても行われ、また、患者における免疫介在性疾患の進行を経時的に評価するために、第５の診断ステップに基づいて、その後の第６のステップにおいて、先行する５つのステップを所定の時間間隔で繰り返すことが決定されてもよい。）、
ｖ）上記ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）に包含される患者の管理におけるさらなる”決定を行う物（decisional maker）”。
【００７５】
上述したような免疫介在性疾患の過程における診断方法および予測方法における、サイトカインＢリンパ球刺激因子の血清学的なアッセイの使用に対して、本発明の分野および範囲から逸脱することなく、各部および／またはステップの修正および／または付加を行ってもよいことは明らかである。また、本発明は特定の例を参照して記載されているが、当該技術分野の当業者が、診断方法および予測方法における、サイトカインＢリンパ球刺激因子の血清学的なアッセイの使用の他の等価の形態を実現することができることも明らかであるが、これらの形態は全て請求項において説明する特性を有している限り、請求項において規定する保護の対象となるものである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における免疫介在性疾患のリスクについての診断用マーカーとしてのサイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）のアッセイの使用であって、
該免疫介在性疾患は、輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、および輸血反応などの、輸血に関連した免疫介在性疾患を含む群に包含され、
該患者は、輸血反応を示唆する症状または徴候を有する、またはこれらの症状または徴候を有しない、輸血の対象となるまたは輸血を受けた全ての患者、特に輸血反応（つまり自己免疫性疾患、免疫不全症）のリスクが高い患者であり、
該患者から血液サンプルを採取する第１のステップと、
該血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度を、健康なコントロール群について前もって得られたサイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値と比較する第３のステップと、
第３のステップにおける比較から導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と該健康なコントロール群について前もって得られたサイトカインＢＬｙＳの濃度の参照値との間の、有意な偏差を特定して、該免疫介在性疾患の一つに罹患したとして患者を選択する第４のステップと、
該免疫介在性疾患の一つに罹患したとして選択された患者の、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値であって、該免疫介在性疾患に罹患した、および／または活動性疾患またはその特定の過程の診断が確立された、一連の患者について前もって得られたＢＬｙＳの参照値の範囲内である参照値とを比較する第５のステップと、
第５のステップにおいてなされた比較に基づいて、該免疫介在性疾患の１つ以上の確定的な疾患を発症するリスクが高いとみなす第６のステップと、
を包含する方法における、使用。
【請求項２】
前記方法の前記第２のステップが、ＥＬＩＳＡの技術に基づく自動装置を用いて実施されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
免疫介在性疾患の予測をするための方法における予測用マーカーとしてのサイトカインＢリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）の使用であって、
該免疫介在性疾患は、輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、および輸血反応などの、輸血に起因する免疫介在性疾患を包む群に包含され、
該方法は、輸血の必要性のある患者を選択する予備的なステップと、
選択された患者から血液サンプルを採取する第１のステップと、
該血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、サイトカインＢＬｙＳの濃度の１つ以上の参照値とを比較する第３のステップと、
第３のステップにおける比較から導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と第３のステップにおいて考慮される参照値との間の、有意な偏差を特定する第４のステップと、
該免疫介在性疾患について第４のステップにおいて特定された偏差に基づいて、予測を行う第５のステップと
を包含する、使用。
【請求項４】
免疫介在性疾患に罹患した患者の治療をモニタリングする方法におけるマーカーとしてのサイトカインＢＬｙＳのアッセイの使用であって、
該免疫介在性疾患は、輸血後の免疫処置、母体と胎児との間の不適合、および輸血反応などの、輸血に起因する免疫介在性疾患を含む群に包含され、
該方法は、
該免疫介在性疾患を治療する治療ステップと、
輸血の前に、該患者から血液サンプルを採取する第１のステップと、
該血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第２のステップと、
輸血の後および／または専用の抗ＢＬｙＳ治療法の開始後に、所定の時間間隔で該患者から１つ以上の血液サンプルを採取する第３のステップと、
第３のステップの該１つ以上の血液サンプルを検査して、サイトカインＢＬｙＳの濃度を決定する第４のステップと、
第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と、第４のステップにおいて患者から検出されたサイトカインＢＬｙＳの濃度の値とを比較する第５のステップと、
第５のステップにおける比較から導き出される、第２のステップにおいて決定されたサイトカインＢＬｙＳの濃度と第４のステップにおいて検出されたＢＬｙＳの値との間の、有意な偏差を特定する第６のステップと、
第６のステップにおいて特定された偏差に基づいて、輸血反応のリスクがあるとみなす、および／または治療的処置に有効性があるとみなす第７のステップと、
を包含する、使用。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用であって、前記サイトカインＢＬｙＳのアッセイが、
患者を対象とする、輸血反応の主な徴候および症状（同種抗体、臨床的症状）を特定可能な理学的および生物化学的な検査、および
前記患者から採取された末梢血液より抽出されたＤＮＡに関する（ＢＬｙＳの発現に関連する遺伝的素因、またはＢＬｙＳの発現に関連しない遺伝的素因の）分子的な分析
からなる群より選択される、１回または複数回の検査のステップと組み合わせられ得る、使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図７】
2010540948.tif 000009
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図８】
2010540948.tif 000010
【国際調査報告】
2010540948.tif 000011
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