(57)【要約】  うま味調節物質のスクリーニングに機能的な新規キメラタンパク質、対応する核酸配列、発現ベクター、トランスフェクトした宿主細胞、ならびに前記のものを採用したうま味応答の調節物質および増強物質のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
うま味物質、うま味物質増強物質およびうま味物質阻害物質を含むうま味調節物質から選択される少なくとも１つの化合物と結合可能なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、
配列番号２と、少なくとも９０％以上の配列同一性を有する、実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ポリペプチド、および
配列番号４と、少なくとも９０％以上の配列同一性を有する、実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ポリペプチド、
から選択される１または２以上のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを含み、
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ホモマー性キメラタンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質およびＴ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質からなる群から選択される、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項２】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質およびＴ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質からなる群から選択されるヘテロダイマー性タンパク質の形態の２つのポリペプチドサブユニットを含み、
ヘテロダイマーの該Ｔ１Ｒ１サブユニットが、配列番号８と、少なくとも９０％以上の配列同一性を有する、本質的に相同なポリペプチドを含み、
ヘテロダイマーの該Ｔ１Ｒ３サブユニットが、配列番号１０と、少なくとも９０％以上の配列同一性を有する、本質的に相同なポリペプチドを含む、
請求項１に記載のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項３】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ホモマー性キメラタンパク質である、請求項１に記載のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項４】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質である、二つのポリペプチドサブユニットを含む請求項２に記載のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項５】
うま味物質、うま味物質増強物質およびうま味物質阻害物質を含むうま味調節物質から選択される少なくとも１つの化合物と結合可能なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラタンパク質をコードする核酸であって、１または２以上の、
配列同一性によって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１）と実質的に相同な核酸、
ハイブリダイゼーションによって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１）と実質的に相同な核酸、
請求項１において定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラタンパク質をコードする核酸配列と実質的に相同な核酸、
を含み、
配列同一性によって決定された実質的に相同な核酸は、少なくとも９０％の配列同一性を有し、
ハイブリダイゼーションによって決定された実質的に相同な核酸は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳからなる溶液中の４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳからなる溶液中での６５℃での洗浄というストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、
該核酸が、任意に配列番号６（ＨＳＶタグ）を末端またはその近傍に含んで、対応するタンパク質のＣ末端を形成する、前記核酸。
【請求項６】
請求項５において定義される核酸を含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６において定義される発現ベクターをトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項８】
請求項１において定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質およびＧタンパク質を安定的に発現し、Ｇタンパク質は任意にＧａｑ−ガストデューシンと実質的に相同である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項１において定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質およびＧタンパク質を一時的に発現し、Ｇタンパク質は任意にＧａｑ−ガストデューシンと実質的に相同である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１、２、３または４のいずれかにおいて定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を産生する方法であって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を、発現に十分な条件下で培養し、それによってＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を形成し、任意に細胞からそれを回収するステップを含む、前記方法。
【請求項１１】
味覚細胞中のうま味シグナリングを調節する剤を同定する方法であって、該方法が、
（ｉ）うま味刺激およびカルシウム刺激から選択される刺激に応答する、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する細胞と剤とを接触し、それによって、任意に他の剤の存在下で、機能応答を提供すること、および
（ｉｉ）少なくとも１つの剤が、前記細胞中の前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の機能応答に影響するかどうかを、前記細胞中の少なくとも１つの機能応答によって決定すること、
のステップを含み、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が請求項１、２、３または４において定義される、前記方法。
【請求項１２】
細胞が、Ｇタンパク質もまた発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｇタンパク質が、Ｇａｑ−ガストデューシンと実質的に相同なキメラＧタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｇタンパク質が、キメラＧタンパク質Ｇアルファ１６−ガストデューシン４４である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｉｉ）が、細胞内メッセンジャーの変化または細胞内メッセンジャーに起因する変化を計測することによって行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
機能応答が、ＩＰ３およびカルシウム２＋から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することによって決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、ぜん虫細胞およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、哺乳類細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ−２９３細胞からなる群から選択される哺乳類細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｉ）が、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質と剤とをカルシウムの存在下で接触させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
カルシウムが、塩化カルシウムの形態で提供される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試験剤をＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節物質として同定するために組み合わせて利用される、
（ｉ）請求項１、２、３および４のいずれか１つにおいて定義されるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞、および
（ｉｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のアゴニスト、
を含むキット。
【請求項２３】
請求項２２に記載のキットを使用する方法であって、
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞を成長させること、
（ｉｉ）アゴニストの存在下、適切な濃度で試験剤を添加すること、および
（ｉｉｉ）試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することにより、細胞の機能応答の変化を決定し、その結果、試験剤が請求項１、２、３および４のいずれか１つにおいて定義されるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節物質であることが同定されること
を含む、前記方法。
【請求項２４】
請求項１、２、３および４のいずれかにおいて定義されるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を調節する剤を同定する方法であって、該方法が、
（ｉ）リガンドのＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質への結合に応答して変化するパラメータを計測すること、および
（ｉｉ）任意にリガンドの存在下で、試験剤に応答したパラメータの、ネガティブコントロールと比較した変化を決定し、それによりリガンドを含む調節物質を同定すること
のステップを含む、前記方法。
【請求項２５】
リガンドが、カルシウム、カルシウムイオン、および塩化カルシウムからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｉ）が、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で行われ、該方法が、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択される適切な環境においてＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の特性を計測する、請求項２４および２５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
新規核酸およびタンパク質、構築物およびそれらを含む細胞ならびにそれらの核酸、タンパク質、構築物および細胞を採用した方法が提供される
【背景技術】
【０００２】
うま味はグルタミン酸塩、特にグルタミン酸モノナトリウム塩（ＭＳＧ）、および他のアミノ酸またはその塩によって誘発され、おいしい食品（savory food）のフレーバー特質に重要である。うま味は食事中のアミノ酸の存在を検出するのに重要であり、ヒトの栄養上の健康にとって重大である。しかしながら、一般的な人間集団の一部は、加工食品中の添加ＭＳＧによって悪影響を受け得、したがって本来、ＭＳＧでないまたはアミノ酸でないうま味物質を好む。現在、グルタミン酸塩のうま味は、自然発生のプリンヌクレオチド、ＩＭＰおよびＧＭＰの添加によって増強することができるが、それらは精製が難しくまたは産生が高価であり、したがってその広範囲の使用は制限される。グルタミン酸、ＩＭＰまたはＧＭＰの代わりとして使用可能な、より安価なうま味調節物質および特にうま味物質またはその増強物質は、商用食品製品において有用である。特に興味深いのは、コスト低下およびあらゆる健康への潜在的悪影響を最小化するために、非常に低い濃度で使用可能なうま味物質またはその増強物質である。
【０００３】
うま味物質（うま味受容体のアゴニスト）、うま味増強物質およびうま味阻害物質を含むうま味調節物質のための知られたスクリーニングにおいて、野生型Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ヘテロマーうま味受容体が採用される。Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３うま味受容体ヘテロマーダイマーに基づく機能アッセイが、例えばＵＳ２００４０１７５７９３に記載されている。
【０００４】
しかしながら、知られたスクリーニングの不利点は、野生型Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体がいくつかの結合ドメイン、特にグルタミン酸塩、ＭＳＧ、アミノ酸および潜在的に他のうま味物質と結合するビーナスフライトラップドメイン（ＶＦＴ）を含む細胞外アミノ末端ドメインを含むことである。したがって、特異的リガンドの特異的調節物質、および特にＴ１Ｒ１および／またはＴ１Ｒ３膜貫通ドメイン（「ＴＭＤ（ｓ）」）のリガンド、のスクリーニングおよびこれに限定されるものではないがＭＳＧを含むＶＦＴリガンドの排除は、知られたスクリーニング方法では不可能である。知られたＴ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーの使用は、ＶＦＴにもまた結合してグルタミン酸と結合について競合する剤の同定を可能にし、したがって後に食品製品中でうま味増強物質として無効であると証明され得る剤を同定可能である。
【０００５】
したがって、依然として上記の問題、特に受容体との結合においてグルタミン酸塩と競合し得る剤の同定を回避し、ＶＦＴドメインと物理的に異なる領域、および特にＴＭＤ、に結合するうま味受容体調節物質（アゴニスト、増強物質、阻害物質を含む）を同定することができる代替的スクリーニング方法の必要性がある。
提供されるスクリーニング方法および結合アッセイは、上記問題を回避し、新規ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を使用することにより改善された結果が得られる。
【０００６】
さらに、本明細書に記載されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、グルタミン酸／ＭＳＧなどのうま味物質の代わりに、カルシウムを受容体活性化のリガンド／アゴニストとして使用可能であり、ＭＳＧ結合領域の外に結合する調節物質（アゴニスト、増強物質、阻害物質を含む）の同定が可能である。
【発明の概要】
【０００７】
第１の側面において、うま味物質、うま味物質増強物質およびうま味物質阻害物質を含むうま味調節物質から選択される少なくとも１つの化合物と結合可能なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、  配列番号２と、少なくとも９０％以上の配列同一性を有する、実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ポリペプチド、および
配列番号４と、少なくとも９０％以上の配列同一性を有する、実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ポリペプチド、
から選択される１または２以上のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを含む、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が提供される。
かかるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、うま味物質、うま味物質増強物質、およびうま味物質阻害物質を含むうま味調節物質から選択される少なくとも１つの化合物と結合可能であり、うま味物質阻害物質は、特にＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ホモマー性キメラタンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質およびＴ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質である。
【０００８】
他の側面において、上記で定義されるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質、
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質、
Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質、
からなる群から選択されるヘテロダイマー性タンパク質の形態の二つのポリペプチドサブユニットを含み、ここでヘテロダイマーのＴ１Ｒ１サブユニットが配列番号８と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する、本質的に相同なポリペプチドを含み、およびヘテロダイマーのＴ１Ｒ３サブユニットが配列番号１０と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する、本質的に相同なポリペプチドを含む、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が提供される。
【０００９】
他の側面において、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ホモマー性キメラタンパク質である、上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が提供される。
他の側面において、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー性キメラタンパク質である、上記で定義された二つのポリペプチドサブユニットを含むＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が提供される。
【００１０】
他の側面において、うま味物質、うま味物質増強物質およびうま味物質阻害物質を含むうま味調節物質から選択される少なくとも一つの化合物と結合可能なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする核酸であって、１または２以上の
配列同一性によって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１）および配列番号３（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３）からなる群から選択される核酸配列と実質的に相同な核酸、
ハイブリダイゼーションによって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１）および配列番号３（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３）からなる群から選択される核酸配列と実質的に相同な核酸、
上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする核酸配列と実質的に相同な核酸、
を含み、
ここで配列同一性によって決定された実質的に相同な核酸は、少なくとも９０％の配列同一性を有し；
ハイブリダイゼーションによって決定された実質的に相同な核酸は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳからなる溶液中の４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳからなる溶液中での６５℃での洗浄というストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし；
該核酸が、任意に配列番号６（ＨＳＶタグ）を末端またはその近傍に含んで、対応するタンパク質のＣ末端を形成する、前記核酸が提供される。
【００１１】
他の側面において、うま味物質、うま味物質増強物質およびうま味物質阻害物質を含むうま味調節物質から選択される少なくとも１つの化合物と結合可能なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラタンパク質をコードする核酸であって、１または２以上の、
配列同一性によって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１）と実質的に相同な核酸、
ハイブリダイゼーションによって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１）と実質的に相同な核酸、
請求項１において定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラタンパク質をコードする核酸配列と実質的に相同な核酸、
を含み、
ここで配列同一性によって決定された実質的に相同な核酸は、少なくとも９０％の配列同一性を有し；
ハイブリダイゼーションによって決定された実質的に相同な核酸は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳからなる溶液中の４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳからなる溶液中での６５℃での洗浄というストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし；
該核酸が、任意に配列番号６（ＨＳＶタグ）を末端またはその近傍に含んで、対応するタンパク質のＣ末端を形成する、前記核酸が提供される。
【００１２】
他の側面において、上記で定義された核酸を含む、発現ベクターが提供される。
他の側面において、上記で定義された発現ベクターをトランスフェクトされた、宿主細胞が提供される。
他の側面において、上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質およびＧタンパク質を安定的に発現し、Ｇタンパク質は任意にＧａｑ−ガストデューシンと実質的に相同である、上記で定義された宿主細胞が提供される。
【００１３】
他の側面において、上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質およびＧタンパク質を一時的に発現し、Ｇタンパク質は任意にＧａｑ−ガストデューシンと実質的に相同である、上記で定義された宿主細胞が提供される。
他の側面において、上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を産生する方法であって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を、発現に十分な条件下で培養し、それによってＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を形成し、任意に細胞からそれを回収するステップを含む、前記方法が提供される。
【００１４】
他の側面において、味覚細胞中のうま味シグナリングを調節する剤を同定する方法であって、該方法が、
（ｉ）うま味刺激およびカルシウム刺激から選択される刺激に応答する、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する細胞と剤とを接触し、それによって、任意に他の剤の存在下で、機能応答を提供すること、および
（ｉｉ）少なくとも１つの剤が、前記細胞中の前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の機能応答に影響するかどうかを、前記細胞中の少なくとも１つの機能応答によって決定すること、
のステップを含み、ここで前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が上記に定義されたものである、前記方法が提供される。
【００１５】
他の側面において、細胞がＧタンパク質もまた発現する、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、Ｇタンパク質が、Ｇａｑ−ガストデューシンと実質的に相同なキメラＧタンパク質である、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、Ｇタンパク質が、キメラＧタンパク質Ｇアルファ１６−ガストデューシン４４である、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、ステップ（ｉｉ）が、細胞内メッセンジャーの変化または細胞内メッセンジャーに起因する変化を計測することによって行われる、上記で定義された方法が提供される。
【００１６】
他の側面において、機能応答が、ＩＰ３およびカルシウム２＋から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することによって決定される、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、前記細胞が、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、ぜん虫細胞およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、細胞が、哺乳類細胞である、上記で定義された方法が提供される。
【００１７】
他の側面において、細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３細胞およびそれらの組み合わせからなる群から選択される哺乳類細胞である、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、ステップ（ｉ）が、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質と剤とをカルシウムの存在下で接触させることをさらに含む、上記で定義された方法が提供される。
他の側面において、カルシウムが、塩化カルシウムの形態で提供される、上記で定義された方法が提供される。
【００１８】
他の側面において、試験剤をＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節物質として同定するために組み合わせて利用される、
（ｉ）上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞、および
（ｉｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のアゴニスト、
を含むキットが提供される。
【００１９】
他の側面において、上記で定義されたキットを使用する方法であって、
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞を成長させること、
（ｉｉ）アゴニストの存在下、適切な濃度で試験剤を添加すること、および
（ｉｉｉ）試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することにより、細胞の機能応答の変化を決定し、その結果、試験剤が上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節物質であることが同定されること
を含む、前記方法が提供される。
試験剤は適切な濃度、例えば約１ｎＭから１００ｍＭまたはそれ以上、で添加されてよい。
【００２０】
他の側面において、上記で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を調節する剤を同定する方法であって、該方法が、
（ｉ）リガンドのＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質への結合に応答して変化するパラメータを計測すること、および
（ｉｉ）任意にリガンドの存在下で、試験剤に応答したパラメータの、ネガティブコントロールと比較した変化を決定し、それによりリガンドを含む調節物質を同定すること
のステップを含む、前記方法が提供される。
他の側面において、リガンドが、カルシウム、カルシウムイオン、塩化カルシウムおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、上記で定義された方法が提供される。
【００２１】
他の側面において、ステップ（ｉ）が、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で行われ、該方法が、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択される適切な環境においてＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の特性を計測する、上記で定義された方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書で使用される、ＣＳＲ：：Ｔ１ＲまたはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質という語は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ホモマー（すなわちＴ１Ｒ３を有しない）、またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１とＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３とのもしくは野生型Ｔ１Ｒ３とのヘテロダイマー性複合体（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３）、またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３とＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１とのもしくは野生型Ｔ１Ｒ１とのヘテロダイマー性複合体（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３またはＴ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３）を表す。
【００２３】
より一般的に、in vivoおよび多くのin vitro手法において、受容体はＧタンパク質と結合しているので、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒはまた、「ＧＰＣＲ」とも称される。
「ホモマー」／「ホモマー性」は、他のサブユニットを有さない関連するサブユニット、すなわちＴ１Ｒ３を有さないＴ１Ｒ１、またはＴ１Ｒ１を有さないＴ１Ｒ３のどちらか、を意味する。各サブユニットはおそらくホモマー／ホモオリゴマーを形成するだろうと考えられているが、必ずしもそうとは限らず、例えばモノマーとして作動し得る。
【００２４】
同様に、「ヘテロダイマー」は、２つの関連するサブユニットの組み合わせ、すなわちあらゆる形態におけるＴ１Ｒ３を有するＴ１Ｒ１を意味する。実際のヘテロダイマーが形成され得るが、必ずしもそうとは限らず、例えば受容体は、２つのサブユニットが１コピー以上存在する複合体を含むヘテロオリゴマーの形態で作用し得る。
【００２５】
キメラタンパク質は、２つまたは３つ以上のオリジナルタンパク質の断片の接合体であり、時として望まれる特性を組み合わせたり、望まれない特性を取り除いたりできる。３次元空間におけるタンパク質のフォールディングは重大であり、アミノ酸位置はフォールディングに影響するため、あらゆる２つの断片が接合できるわけではない。例え重大なドメインおよびアミノ酸が知られていても、発現の成功、正しいフォールディングおよび望まれる特性の損傷のない機能性は、非常に予測不可能である。例えば、本出願人は、様々なＧＡＢＡ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質変異体が働かないことを見出している。
【００２６】
新規なキメラホモマーＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１およびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３は、機能的であり、機能応答を提供する機能性ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーを形成できることが見出された。
「機能応答」は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒが、直接的または間接的（例えば付属タンパク質を経由して）に調節物質（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、増強物質または阻害物質）と結合することができ、うま味受容体への自然な細胞応答または各in vitroもしくはin vivoにおける前記応答の代わりの、前記調節物質による調節（例えば前記リガンドによる活性化）を示すことができる。これは当然ながら使用する方法に依存する。例において、これはカルシウムシグナルの変化であり、他の方法においては、活性化マップキナーゼシグナルまたはアレスチン転送もしくは受容体の内面化であろう。
【００２７】
機能応答の決定は、生理的、物理的および化学的パラメーターを含むパラメータにおけるあらゆる変化の決定を含む。計測され得るかかるパラメータは、選択される方法に依存し、例えば放射線、蛍光、酵素活性、イオンフラックスにおける変化、膜電位、電流、転写、濃度、特に二次メッセンジャーの濃度（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３または細胞内カルシウム）、神経伝達物質またはホルモン放出における変化を含む。機能応答は、例えば分光特性（例えば蛍光、吸光度、屈折率など）、流体力学的（例えば形状）、クロマトグラフィーもしくは溶解度特性、パッチクランプ法、膜電位感受性色素、ホールセル電流、放射性同位体流出、誘導可能マーカー、卵母細胞遺伝子発現、組織培養細胞遺伝子発現、遺伝子の転写活性、リガンド結合アッセイ、電圧、膜電位およびコンダクタンス変化、イオンフラックスアッセイ、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）などの細胞内二次メッセンジャーにおける変化、細胞内カルシウムレベルにおける変化、神経伝達物質放出、立体配座アッセイなど、当業者に知られたあらゆる適した方法によって測定することができる。
【００２８】
機能応答およびそれらをどのように計測するかのさらなる例は、以下に記載されている方法に含まれる。
本出願人による実験は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ホモマー性サブユニットもまた、ヘテロダイマーを形成することなく、それ自身が機能性うま味受容体として機能することを示唆している。
予備実験は、ホモマー性ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３サブユニットが、あるＧタンパク質との関与および／またはその活性化において困難性を有し得るものの、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３は、Ｇタンパク質を活性化する能力を必要としない結合アッセイにおいて、依然として有用であることを示唆する。キメラタンパク質と野生型タンパク質との共発現（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３）を含むヘテロダイマーもまた機能するだろう。
【００２９】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーにおいて、ヘテロダイマー複合体のそれぞれのＣＳＲ：：Ｔ１Ｒサブユニットは、２つの給源タンパク質に起因する配列を含んでいる。２つの給源タンパク質は、ヒトカルシウム感受性受容体（ｈＣａＳＲ）およびＴ１Ｒタンパク質（Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ３）である。両サブユニットに共通するｈＣａＳＲ由来断片（ＣＳＲ）は、ｈＣａＳＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。Ｔ１Ｒ由来断片はＴ１Ｒ配列の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含み、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ３のどちらに由来するかによって変わる。
【００３０】
本明細書に記載されるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ３のどちらか、あるいはＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３両方のＶＦＴドメインを有しておらず、したがってＴ１Ｒ１および／またはＴ１Ｒ３のＴＭＤドメインおよび／またはシステインリッチドメインに結合する化合物（うま味物質、うま味物質増強物質およびうま味物質阻害物質を含むうま味調節物質）を特異的に同定することができる。
これらのうま味調節物質は、それらがうま味受容体のＶＦＴ部位に結合すると考えられるＭＳＧなどのアミノ酸またはその塩と競合する化合物を含まない点で、特に興味深く、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを採用するスクリーニングは、したがって、潜在的に相乗的なより興味深い化合物を同定する傾向がある。
【００３１】
提供される新規キメラＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ構築物（ＤＮＡ、ベクター、形質転換細胞、タンパク質）は、これに限定するものではないが、うま味応答の調節物質（うま味アゴニスト、うま味増強物質、およびうま味阻害物質を含む）をスクリーニングする場合に有用である。伝統的なスクリーニング方法および結合アッセイは、新規なキメラＣＳＲ：：Ｔ１Ｒタンパク質を用いた、調節物質および増強物質についてのスクリーニングに使用され得る。かかるスクリーニング方法論は当該技術分野においてよく知られており、以下に概説する。うま味物質を同定するため、本明細書に記載されているＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体タンパク質の結合および／または活性化と連結するシグナルを、候補うま味物質の存在下および非存在下において監視する。
【００３２】
うま味増強物質または阻害物質を同定または特定するため、通常は、潜在的増強物質／阻害物質を有するおよび有さないサンプル（両サンプルはさらに１または２以上のカルシウム、グルタミン酸、ＭＳＧまたは他のうま味物質、例えば（受容体と結合しおよび活性化する）他のアミノ酸など、を含む）の結果を比較する。
【００３３】
例えばＭＳＧのようなリガンドの代わりにカルシウム（例えば、これに限定するものではないが、塩化カルシウムの形態で）を利用することは、あらゆるネガティブな効果／アーティファクト（例えば高い塩分による）または実際のリガンド／アゴニスト（ＭＳＧ）と試験化合物との間の競合を回避するというさらなる有利点を有する。
【００３４】
アッセイに利用される細胞
トランスフェクトされたまたは内在性のＴ１Ｒ３およびＴ１Ｒ１は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３のアゴニスト応答を決定する方法それぞれ、または他の調節物質に依存する前記応答の変化に、否定的に影響し得る。Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ１の欠失は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３活性化の決定のためのヌルバックグラウンドを提供し、観察されたシグナルがＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３活性化に直接結びつく。これにより、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３を特異的に調節する剤の同定が可能となり、野生型Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３を活性化する剤を除外し、ここで、Ｔ１Ｒ３の場合、Ｔ１Ｒ３は、甘味およびうま味のヘテロダイマー両方の一部であるから、甘味物質もまた含む。
【００３５】
内在性の野生型Ｔ１Ｒ１および／またはＴ１Ｒ３の存在はいくつかのバックグラウンドシグナルの原因となり、それは望ましくない。内在性Ｔ１Ｒ１および／またはＴ１Ｒ３を有する細胞は、十分に低いバックグラウンドの結果を獲得するのに依然として有用ではあるが、よりよい選択は内在性Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３を含まない細胞である。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質を利用するときは、バックグラウンドに不都合な効果なしで野生型Ｔ１Ｒ３を含むことができ、またはＴ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質を利用するときは、バックグラウンドに不都合な効果なしで野生型Ｔ１Ｒ１を含むことができるという例外が発生する。
【００３６】
下に列挙した細胞は、内在性／野生型Ｔ１Ｒ３または内在性野生型Ｔ１Ｒ１を含まない点で特に有用である。
しかし、代替的な細胞もまた本明細書に記載されている方法において有用である。
【００３７】
適切な真核細胞は、例えば、限定することなく、哺乳類細胞、酵母細胞、または昆虫細胞（Ｓｆ９を含む）、両生類細胞（メラニン保有細胞を含む）、またはシノラブディス（Caenorhabditis）（Caenorhabditis elegansを含む）細胞を含むぜん虫細胞などの真核細胞を含む。
適切な哺乳類細胞は、例えば、限定することなく、ＣＯＳ細胞（Ｃｏｓ−１およびＣｏｓ−７を含む）、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＲｅｘＴＭ細胞、または他のトランスフェクト可能な真核細胞セルラインを含む。
適切な細菌細胞は限定することなくE. coliを含む。
【００３８】
細胞は、当該技術分野において周知のように、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質（受容体をホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に連結する）を一過性にまたは安定的にトランスフェクトされてもよい。味覚ＧＰＣＲとの増強されたカップリングを提供するキメラＧタンパク質であるＧアルファ１６−ガストデューシン４４（Ｇ．ｓｕｂ．．ａｌｐｈａ．１６  ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇ．ｓｕｂ．ａｌｐｈａ．１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇα１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇａ１６ｇｕｓｔ（ｄｕｃｉｎ）４４、Ｇα１６−ガストデューシン  ４４、または以下で使用されているように「Ｇα１６ｇｕｓｔ４４」としても知られている）を採用する優れた異種発現系は、ＷＯ２００４／０５５０４８に詳細に記載されている。代替的に、ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているＧａｑ−ガストデューシンに基づいた他のキメラＧタンパク質、または、例えばＧ１６またはＧ１５などの、他のＧタンパク質もまた利用してよい。
【００３９】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒは、受容体を、例えばホスホリパーゼＣシグナル伝達経路などの、シグナル伝達経路、または例えば後述のものを含むシグナル伝達経路に連結するＧタンパク質とともに、細胞内で発現させることが可能である：アデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、ＩＰ３、ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合、アラキドン酸、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ、ＤＡＧ、プロテインキナーゼｃ（ＰＫＣ）、ＭＡＰキナーゼ、チロシンキナーゼ、またはＥＲＫキナーゼ。
【００４０】
代替的に、以下に詳述するように、いかなる適切なリポーター遺伝子もＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性化応答プロモーターに連結し、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性の決定に利用することができる。
【００４１】
上述の細胞に利用されるベクター構築物
かかる細胞中でＧＰＣＲおよび／またはＧタンパク質を発現するベクター構築物は、ポリメラーゼ連鎖反応を利用する、それ自体が周知なやり方によって産生され得る。配列の確認後、ｃＤＮＡ断片は、例えばｐｃＤＮＡ３．１哺乳類細胞用哺乳類発現ベクターなど、適切なベクター内へサブクローニングされてよく、正しい遺伝子の発現を可能にするために対応する宿主細胞に一過性にトランスフェクトされてよい。
【００４２】
例えば４８時間の、トランスフェクト後期間の後、タンパク質の正しい発現を確認するために細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロットによって解析してもよい。一度正しいタンパク質の発現が確認されれば、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ  Ｔ−ＲｅｘＴＭを含む哺乳類細胞などの適切な細胞は、当該技術分野において周知の技術に従って、安定してタンパク質を発現する細胞を生成するためにトランスフェクトされてよい。
【００４３】
代替的に、様々な非哺乳類発現ベクター／宿主システムが、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒをコードする配列の含有および発現に利用可能である。これらは、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌を含む微生物、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）、または細菌発現ベクター（例えばｐＢＲ３２２プラスミド）で感染させた昆虫細胞システムなどを含む。
【００４４】
以上に記載された系とともに利用することができる特定のベクターの例は、「G-protein coupled receptors (Signal Transduction Series)」、編者：Tatsuya Haga and Gabriel Berstein、第１版、CRC Press - Boca Raton FL; September 1999に記載されている。
【００４５】
細菌系において、多くのクローニングおよび発現ベクターが、ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド配列について意図する利用に応じて選択し得る。例えば、ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド配列のルーチンのクローニング、サブクローニング、および増殖が、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Stratagene, La Jolla Calif.）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Life Technologies）などの多機能性大腸菌ベクターを利用して行える。ＧＰＣＲをコードする配列の、ベクターのマルチクローニングサイトへのライゲーションはｌａｃＺ遺伝子を妨害し、組換え分子を含む形質転換細菌の同定のための比色スクリーニング手法を利用可能にする。加えて、これらベクターはインビトロ転写、ジデオキシシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖レスキュー（single strand rescue）、およびクローニングされた配列内のネストされた欠失の作出にも有用であり得る。例えば抗体の産生など、多量のＧＰＣＲが必要なとき、ＧＰＣＲの高発現を導くベクターが利用し得る。例えば強い、誘導可能なＳＰ６またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターなどが利用し得る。
【００４６】
酵母発現系はＧＰＣＲの産生に利用されてよい。アルファファクター、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨプロモーターなどの構成的または誘導プロモーターを含む多数のベクターが酵母Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastorisに利用し得る。加えて、かかるベクターは、発現タンパク質の分泌または細胞内の保持を導き、安定的増殖のための外来性配列の宿主遺伝子への統合を可能にする。
【００４７】
異種タンパク質を昆虫細胞セルラインで発現するために、例えば、鱗翅目昆虫のバキュロウィルスであるAutographia californicaマルチカプシドヌクレオウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）の誘導体が利用可能である。このシステムにおいて、外来性遺伝子発現は、ポリヘドリンまたはｐ１０プロモーターのいずれかの、非常に強い後期ウィルスプロモーターに導かれ、多様なベクターが、組換えタンパク質の発現および回収の最適化に利用可能である。これらのベクターは膜結合型および分泌型タンパク質の両方を高度に発現することが可能であり、また哺乳類システム中で起こることが知られる、Ｎ−およびＯ−連結糖鎖付加、リン酸化、アシル化、タンパク質分解および分泌ワクチン成分を含む多くの翻訳後修飾も可能である。例えばInvitrogenのInsectSelectＴＭなどの多くのベクターが商業的に入手可能である。
【００４８】
発現系
求めるタンパク質（ＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）およびＧタンパク質）をコードするｃＤＮＡを発現するために、典型的には、適切なｃＤＮＡを、転写を導く強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーターおよび翻訳開始のためのリボソーム結合領域を含む発現ベクターにサブクローニングする。例えばE.coli、Bacillus sp.、およびSalmonellaなど、適切な細菌プロモーターは当該技術分野においてよく知られており、かかる発現系のためのキットが商業的に入手可能である。同様に、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核細胞発現系も商業的に入手可能である。真核細胞発現ベクターは、例えばアデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウィルスベクターなどであってよい。
【００４９】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的に、宿主細胞においてタンパク質をコードする核酸を発現するのに必要な付加的要素の全てを含む、転写ユニットまたは発現カセットを含む。典型的な発現カセットはしたがって、タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターおよび、転写の効率的なポリアデニレーションに必要なシグナル、リボソーム結合領域、および翻訳ターミネーションを含む。タンパク質をコードする核酸配列は典型的に、組換えタンパク質の効率的な細胞表面発現を推進するために、ラットソマトスタチン−３受容体配列のＮ末端４５アミノ酸などの、細胞表面受容体に有用な膜標的化シグナルに連結していてよい。付加的なベクター要素は、例えばエンハンサーなどを含んでもよい。
【００５０】
発現カセットはまた、構造遺伝子の下流に、効果的なターミネーションを提供するための転写終止領域も含むべきである。終止領域はプロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよく、また異なる遺伝子から得てもよい。
タンパク質の発現のために、真核細胞または原核細胞における発現のために当該技術分野においてよく知られた、慣用のベクターを利用してよい。ベクターの例は、例えばｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、およびｐＥＴ２３Ｄを含むプラスミドなどの細菌発現ベクター、および例えばＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現系を含む。
【００５１】
真核ウィルス由来の制御要素を含む発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、サイトメガロウィルスベクター、パピローマウィルスベクター、およびエプスタイン・バーウィルス由来のベクターなどは、典型的に真核発現ベクターとして利用される。他の真核ベクターの例には、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウィルスｐＤＳＶＥ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＩＲＥＳ、およびＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウィルスプロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞内での発現に効果を示す他のプロモーターの指揮下でタンパク質を発現させられる他のいかなるベクターも含む。
【００５２】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸リダクターゼなどの遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。
【００５３】
典型的に発現ベクターに含まれる要素には、E. coli中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを取り込んだ細菌の選別を可能にする薬剤耐性をコードする遺伝子、および真核配列の挿入を可能にするプラスミドの本質的でない領域のユニークな制限部位なども含んでよい。選択される特定の薬剤耐性遺伝子は重大ではなく、当該技術分野で知られたあらゆる多くの薬剤耐性遺伝子が適している。必要ならば、原核配列は、真核細胞内でのＤＮＡの複製を妨害しないように任意に選択される。
【００５４】
細菌系において、ＧＰＣＲのｃＤＮＡ断片は、単独で、または、対象となるＧＰＣＲが、E. coliペリプラズムマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）であって、そのシグナルペプチドを含むＭＢＰがＧＰＣＲのアミノ末端に連結しているものに融合した融合タンパク質として発現されてよい。野生型ＧＰＣＲのｃＤＮＡまたはＭＢＰ：ＧＰＣＲ融合ｃＤＮＡは、例えばE. coli中でＧＰＣＲの発現がｌａｃ野生型プロモーターによって駆動されるｐＢＲ３２２など、適切なプラスミドへサブクローニングされる。E. coliにおけるＧＰＣＲの発現方法は、例えば「G-protein coupled receptors（Signal Transduction Series）」, 編者：Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 第１版, pp. 265〜280, CRC Press - Boca Raton FL; September 1999などに記載されている。
【００５５】
内在性ＧＰＣＲを欠損した遺伝子操作酵母システムおよび昆虫細胞システムは、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性化スクリーニングに対してヌルバックグラウンドであるという利点を提供する。
遺伝子操作酵母システムはヒトＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を、対応する内在性酵母フェロモン受容体経路の成分と代替するものである。下流シグナル経路はまた、通常の酵母シグナル応答が選択培地上でのプラス成長またはレポーター遺伝子発現に転換するように、改変される（Broach, J. R. and J. Thorner, 1996, Nature, 384 (supp.):14〜16に記載）。
【００５６】
遺伝子操作昆虫システムは、受容体をホスホリパーゼＣシグナル経路に連結できるヒトＧＰＣＲおよびＧαタンパク質を組み込んでいる（例えばKnight and Grigliatti, (2004) J. Receptors and Signal Transduction, 24: 241〜256参照）。
両生類細胞システム、特にメラニン含有細胞は、例えばＧＰＣＲ発現系について記載したＷＯ９２／０１８１０などに記載されている。
【００５７】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒの過剰発現
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒは、例えばＣＭＶ早期プロモーターなどの強力な構成的プロモーターの制御下に置くことにより過剰発現することができる。代替的に、保存的なＧＰＣＲアミノ酸またはアミノ酸ドメインのある変異を導入し、利用するＧＰＣＲを構成的に活性化させることが可能である。代替的に、過剰発現は、以下に記載されているＴ−Ｒｅｘシステムなどの誘導可能なプロポーターの制御下において行ってもよい。
【００５８】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ発現ベクター構築物の細胞内へのトランスフェクション
タンパク質を大量に発現する細菌、哺乳類、酵母または昆虫の細胞系を作出するために、標準的なトランスフェクション法が利用可能である。
【００５９】
核酸配列を宿主細胞に導入するために知られたいかなる方法も利用してよい。用いる特定の遺伝子操作手順は、対象となるタンパク質を発現できる宿主細胞中に関係する遺伝子を首尾良く導入できさえすればそれでよい。これらの方法は、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来性の遺伝物質を宿主細胞中に導入することを伴ってもよく、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウィルスベクターなどを含む。
【００６０】
例えば、限定することなく、Ｔ−ＲｅｘＴＭ発現系（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を用いることができる。Ｔ−ＲｅｘＴＭシステムは、E. coli Ｔｎ１０にコードされたテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性オペロン由来の調節エレメントを利用したテトラサイクリン制御哺乳類発現系である。Ｔ−ＲｅｘＴＭシステム中のテトラサイクリン調節は、テトラサイクリンのＴｅｔリプレッサーへの結合および対象となる遺伝子の発現を制御するプロモーターの抑制解除に基づいている。
【００６１】
細胞培養
トランスフェクト後、トランスフェクトされた細胞は、当該技術分野において周知の標準的な培養条件で培養することができる。異なる細胞は、適切な温度および細胞培養培地を含む、異なる培養状態を要求することは、当業者に明らかである。
【００６２】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体タンパク質回収
所望の場合、タンパク質を標準的な技術を利用して細胞培養から回収することができる。例えば、沈殿およびクロマトグラフィ工程に供する前に細胞を機械的にまたは浸透圧ショックによって破裂させてよく、その種類と順序は回収される特定の組換え物質次第である。あるいは、組換えタンパク質を、組換え細胞が培養された培養培地から回収することもできる。
【００６３】
本明細書のアッセイによって同定され得る味覚調節物質
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体活性の調節物質（リガンド、アゴニスト、部分的アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、阻害物質、増強物質を含む様々なタイプ）は、下述のように同定可能である。
調節物質のタイプは同時に１以上のタイプを含んでもよく、濃度に依存し得る。例えば、剤がある濃度範囲においてアゴニストとして作用するが、別の濃度範囲においては他のアゴニスト（例えばうま味物質）の調節物質または増強物質として作用することもある。したがって、剤はその調節活性の決定のために異なる濃度で試験されるべきである。
これから本明細書に記載された方法において同定可能な剤の定義について述べる。
【００６４】
調節物質は、１または２以上の後述のものの増大または減少を引き起こす剤である：受容体の細胞表面発現、リガンドの受容体への結合、または受容体の活性化形態によって開始される細胞内応答（アゴニストの存在下または非存在下における）。調節物質はそれ自身が受容体に結合し、それを活性化し、それによって細胞内応答の増大を調節するアゴニストであり得る。
【００６５】
調節物質は、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体またはその断片を含む様々なタイプの化合物を含む。それらは、合成または天然物質、天然材料の抽出物を含む様々な給源、例えば動物、哺乳類、昆虫、植物、細菌または真菌細胞材料または培養細胞、あるいはかかる細胞の馴化培地などに由来し得る。
リガンドは受容体と結合する剤であり、アゴニスト、部分的アゴニスト、増強物質、アンタゴニスト、または逆アゴニストであってもよい。
【００６６】
アゴニストは、受容体に結合したときに、アゴニストの非存在下での細胞内応答と比較して、受容体を活性化し、細胞内応答を増大させるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質受容体のリガンドである。付加的にまたは代替的に、アゴニストは、アゴニストの非存在下で細胞表面に存在する細胞表面受容体の数と比較して、受容体の細胞表面発現を増大させるように、細胞表面受容体の内在化を減少させ得る。
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒのアゴニストは、例えばカルシウムおよびＮ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）オキサルアミドなどを含む。
【００６７】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のリガンドは、キメラタンパク質のＣＳＲ部分に結合するＣＳＲドメインリガンド（カルシウム）、またはキメラタンパク質のＴ１Ｒ部分に結合するＴＳＲドメインリガンド（うま味応答の調節物質）の２つのタイプに分類することができる。
部分的アゴニストは、受容体を最大限活性化する他のアゴニストと比べて、部分的にしか作用しないアゴニストである。
【００６８】
アンタゴニストは、アゴニストと同じ（競合的アンタゴニスト）または異なる（アロステリックアンタゴニスト）受容体の部位に結合するが、受容体の活性化形態によって起こる細胞内応答を活性化せず、それゆえアゴニストの存在下およびアンタゴニストの非存在下と比較して、アゴニストによって誘導される細胞内応答を阻害するリガンドである。
受容体と結合する逆アゴニストは、受容体によって媒介される構成的細胞内応答を、逆アゴニストの非存在下における細胞内応答と比較して減少させる。
【００６９】
阻害物質は、阻害物質の非存在下におけるアゴニストの結合と比較して、アゴニストと受容体との結合を減少させ、および／またはアゴニストによって誘導される細胞内応答を減少させる。
増強物質は、アゴニストの受容体への結合を、増強物質の非存在下におけるアゴニストの結合と比較して増大させ、および／またはアゴニストによって誘導される細胞内応答を増大させる。
【００７０】
リガンドを結合し、例えばＧタンパク質（すなわち調節物質との種々の相互作用に起因して）などによりシグナルを伝達する受容体の活性または活性の変化は、以下に記載されるアッセイによって決定可能である。
【００７１】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体の調節物質同定のためのアッセイ
調節物質は、機能的効果／パラメータを決定および比較するための、多種多様なインビトロおよびインビボアッセイを利用して、または代替的に結合アッセイによって、同定可能である。受容体の機能上の試験剤の効果は適切な機能的パラメータを分析することで計測可能である。受容体活性に影響するあらゆる生理学的変化は、調節物質の同定のために利用可能である。
【００７２】
かかる機能的アッセイは、例えば動物から単離された無傷の細胞または組織を利用した、濃度、活性またはそれらの二次メッセンジャーの変化（例えば細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、イノシトールリン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール／ＤＡＧ、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼまたはチロシンキナーゼなどを含む）、イオンフラックス、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベルの計測に基づいたアッセイ、およびＧＴＰ結合性、ＧＴＰ分解酵素、アデニル酸シクラーゼ、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、ＰＫＣ、キナーゼおよび転写レポーターに基づいたアッセイなど、当該技術分野において周知である。いくつかの適切なアッセイが、例えばＷＯ  ０１／１８０５０に記載されている。
【００７３】
受容体活性化は、典型的には例えば、例えば細胞内に貯蔵されたカルシウムイオンを放出するＩＰ３などの二次メッセンジャーの増大など、後続する細胞内イベントの起点となる。いくつかのＧタンパク質共役受容体活性化は、ホスホリパーゼＣ媒介ホスファチジルイノシトール加水分解を通したイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する。ＩＰ３は次に細胞内に貯蔵されたカルシウムイオンの放出を刺激する。したがって、細胞内カルシウムイオンレベルの変化、またはＩＰ３などの二次メッセンジャーレベルの変化は、Ｇタンパク質共役受容体活性の決定に利用可能である。
【００７４】
全ての機能的アッセイは、例えば受容体をその表面または単離細胞膜画分上に発現する細胞を含有するサンプルで行うことができる。有用な細胞は上述されている。また、分離細胞または細胞膜を有するサンプルの代わりに、遺伝子組換え動物からの組織を利用してもよい。
本明細書に記載されたスクリーニング方法は、うま味応答の調節物質、例えばうま味増強物質、を同定するのに特に有用である。
【００７５】
それ自身がアゴニストではない調節物質（例えば、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、阻害物質、または増強物質）を同定するため、いずれもアゴニストを含有する、試験剤を含むサンプルおよび含まないサンプルを比較する。アゴニストとして、例えばカルシウムを用いることができる。カルシウムの使用は、両方のＴＭＤがアクセス可能となる利点を有する。他の知られたまたは同定されたアゴニスト、例えば、Ｎ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミドなどもまた利用可能であるが、同定される調節物質の調節物質結合部位と一致し得るリガンド／アゴニスト結合部位を部分的にふさぎ、低シグナルの原因となり得る。
【００７６】
例えば、コントロール（アゴニストを含むが調節物質は含まない）の相対的受容体活性値を１００とする。コントロールに対する活性の減少により阻害物質、アンタゴニストまたは逆アゴニストが同定され、一方、増大により増強物質が同定される。通常、試験剤を含まないサンプルと比べて、または試験剤を含むが、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクション細胞）に基づいたサンプルと比べて、試験剤を含むサンプルにおいて計測された活性における、１０％またはそれ以上の増大または減少は、有意であると考えられる。
【００７７】
うま味増強物質を同定するため、試験剤を含むサンプルおよび含まないサンプルを比較する。例えば、コントロール（例えば塩化カルシウムなどのアゴニストを含むが、調節物質は含まない）の相対的受容体活性値を１００とする。増大により増強物質が同定される。通常、試験剤を含まないサンプルと比べて、または試験剤を含むが、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクション細胞）に基づいたサンプルと比べて、試験剤を含むサンプルにおいて計測された活性における、１０％またはそれ以上の増大または減少は、有意であると考えられる。
【００７８】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を採用するスクリーニングのために、カルシウムがアゴニストとして利用可能である。代替的に、ＣＳＲ：：Ｔ１ＲのＴ１Ｒ１および／またはＴ１Ｒ３断片の関連部分に結合するアゴニストを利用してもよい。これらのアゴニストは、例えばｈＴ１Ｒ１／ｈＴ１Ｒ３野生型うま味受容体の知られた合成アゴニストであるＮ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミド、Ｃａｓ番号７４５０４７−９７−６を含む。該化合物およびその調製は、ＷＯ２００５０４１６８４およびその関連出願ＵＳ２００６０４５９５３（例１３２）に記載されている。
【００７９】
アゴニストまたは部分的アゴニストの同定
ＶＦＴドメインに結合しないアゴニストまたは部分的アゴニストを同定するために、試験剤を有するサンプルを、アゴニスト（例えば塩化カルシウム、Ｎ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミド、または他の同定されたリガンド／アゴニスト）を有するポジティブコントロールと比較する。代替的に／付加的に、試験剤を有するおよび有さないサンプルが、そのＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の活性について比較される。
【００８０】
例えば、アゴニストまたは部分的アゴニストは、アゴニストまたは部分的アゴニストが１００ｍＭまたはそれ以下で存在しているとき、ポジティブコントロールうま味アゴニストの最大生物学的活性の少なくとも１０％に相当する生物学的活性を有しており、例えばアゴニストの最大生物学的活性に匹敵するまたはそれ以上の最大生物学的活性を有し得る。最大生物学的活性は、与えられた受容体アッセイフォーマット内で達成可能なアゴニスト、例えば塩化カルシウム、Ｎ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミドなどアッセイに対する最大達成可能な受容体応答であって、その応答が、同じアゴニストの濃度を増大させて適用してもさらに増大できないものと定義される。
【００８１】
上述のアゴニストは、異なる濃度において、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のアゴニストの増強物質としても働き得る。これは、アゴニスト−試験剤をうま味増強効果を示すシグナルについて試験するために、カルシウムまたは他のアゴニストを利用したスクリーニング法で試験することができる。
代替的に、試験剤を有するサンプルにおける、例えば１０％またはそれ以上の計測活性の増大が、試験剤を有さないサンプルまたは試験剤を有するがＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクション細胞）に基づくサンプルと比較される。
【００８２】
アンタゴニストを同定するために、知られたアゴニストの存在下における、試験剤の存在下および非存在下での受容体活性が比較される。アンタゴニストは、例えば少なくとも１０％の、アゴニスト刺激性受容体活性の減少を示す。
逆アゴニストを同定するために、試験剤の存在下および非存在下での受容体活性が、上述のように、受容体を過剰発現する動物／細胞／膜を含有するサンプルで比較される。逆アゴニストは、例えば少なくとも１０％の、受容体の構成的活性の減少を示す。
【００８３】
上述のアッセイにおけるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体活性を計測する適切な検出法の様々な例を以下に記載する。
多くのスクリーニングはカルシウム活性に頼っており、これらについては、細胞、受容体、酵素またはリポーター遺伝子を非特異的に刺激することを回避するために、カルシウムの少ない緩衝系を利用すべきである。
【００８４】
細胞質イオン濃度または膜電位の変化の決定：
「G-protein coupled receptors (Signal Transduction Series)」, CRC Press 1999; 第１版, Haga and Berstein編に詳述されているように、受容体活性を報告するために、細胞にイオン感受性色素を負荷することができる。細胞質または膜電位におけるイオン濃度の変化は、それぞれイオン感受性または膜電位蛍光指標を利用して計測される。
【００８５】
カルシウムフラックス
ＧＰＣＲの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出は、カルシウムに結合する細胞持続性（cell-permanent）色素を利用して決定される。カルシウム結合性色素は、細胞内のカルシウム上昇に比例する蛍光シグナルを発生する。この方法は、受容体活性の迅速かつ定量的な計測を可能にする。
【００８６】
用いる細胞は、上述のようにホスホリパーゼＣ経路に連結できるようにするために、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ  ＧＰＣＲとＧタンパク質とを共発現するトランスフェクト細胞である。ネガティブコントロールは、候補化合物の可能な非特異的効果を排除するために、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞またはその膜（モックトランスフェクションしたもの）を含む。
カルシウムフラックス検出手順は、「G-protein coupled receptors (Signal Transduction Series)」; 編者：Tatsuya Haga and Gabriel Berstein, 第１版, 424pp.CRC Press - Boca Raton FL; September 1999に詳述されており、適合させたバージョンの概略を以下に記載する。
【００８７】
０日目：９６ウェルプレートに、１ウェルあたり８．５K個の細胞を播種し、栄養成長培地中、一晩３７℃で維持する。
１日目：１ウェルあたり合計１５０ｎｇのＧＰＣＲ  ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用して、細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞は栄養成長培地中、一晩３７℃で維持する。
【００８８】
２日目：成長培地を捨て、細胞を、１．５μＭのFluo-4 AM（Molecular Probes）および２．５μＭのプロベニシドを、３７℃で１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２および１０ｍＭのグルコースを含有する、低カルシウムＣ１緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かしたものからなる５０μｌのカルシウムアッセイ溶液で１時間（室温にて暗所で）インキュベートする。１２５μｌの低カルシウムＣ１緩衝溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートをさらに３０分室温にて暗所でインキュベートする。
緩衝溶液を捨て、プレートを１００μｌの低カルシウムＣ１緩衝溶液を洗浄緩衝液として５回洗浄し、細胞を２００μｌの低カルシウムＣ１緩衝液中で再構成する。
【００８９】
プレートを、例えばFlexstation（Molecular Devices）またはFLIPR（Molecular Devices）などの蛍光マイクロプレートリーダーに設置し、２０μｌの１０倍濃縮リガンドストック溶液を加えて受容体活性化を開始する。蛍光は、リガンドを加える１５秒前からリガンドを加えた後４５〜１１０秒後まで継続的に監視する。受容体活性化レベルは以下の３つの方程式で定義される：活性化の％＝（最大蛍光−基準蛍光／基準蛍光）×１００、または蛍光増加＝最大蛍光−基準蛍光、式中基準蛍光はリガンド添加前の平均蛍光レベルを表す、または基準蛍光（Ｆ０）によって標準化されたピーク蛍光（Ｆ）の増大の決定による。データは以下の方程式を用いて標準化される：ΔＦ／Ｆ＝（Ｆ−Ｆ０）／Ｆ０、式中Ｆはピーク蛍光シグナルおよびＦ０は基準蛍光シグナルであり、基準蛍光はリガンド添加前の最初の１０から１５秒の間について計算される平均蛍光を表す。
【００９０】
有用な細胞は、これに限定するものではないが、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ−ＲｅｘＴＭ細胞などの上述した哺乳類細胞である。細胞は、当該技術分野で周知のとおりに、ＧＰＣＲとＧタンパク質で一過性にまたは安定的にトランスフェクトすることができる。優れた異種発現系は、ＷＯ２００４／０５５０４８に詳述されている。
カルシウムフラックスアッセイは、例えば後述の例１に記載されているように行うことができる。
【００９１】
調節物質の同定は、上述の方法を以下のように変更して行われる。シグナルは、アゴニストの存在下だが試験剤の非存在下でＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現する遺伝子組換え細胞から得られた、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性の基準レベルと比較される。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性の増大または減少、例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、またはそれ以上など、により調節物質を同定する。
【００９２】
代替的に、同定は、調節物質が存在しないサンプルと比較したとき、または調節物質は存在するがＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現しない細胞（モックトランスフェクションした細胞）のサンプルと比較したとき、例えば１０％またはそれ以上の、蛍光強度の増大または減少を伴う。
【００９３】
アデニル酸シクラーゼ活性
アデニル酸シクラーゼ活性のためのアッセイは、例えばKenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585〜591に詳述されているように行われる。反応混合物は通常３７℃で１０分より短くインキュベートされる。インキュベーション後、反応混合物は０．９ｍｌの冷６％トリクロロ酢酸を添加して除タンパクする。チューブを遠心し、それぞれの上清をＤｏｗｅｘ  ＡＧ５０ｗ−Ｘ４カラムに加える。カラムからのｃＡＭＰ画分を、アゴニストによる受容体活性化を受けて発生したｃＡＭＰレベルを計測するために、４ｍｌの０．１ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で計数バイアル中に溶出する。コントロール反応もまた、Ｔ１Ｒ１−ＴＭＤまたはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現しない細胞のタンパク質ホモジネートを利用して行うべきである。
【００９４】
ＩＰ３／Ｃａ２＋シグナル
Ｇタンパク質を発現している細胞中で、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）／Ｃａ２＋およびその結果としての受容体活性に相当するシグナルを、蛍光を利用して決定可能である。ＧＰＣＲを発現している細胞は、細胞内貯蔵およびイオンチャネルの活性化経由の寄与の結果、細胞質カルシウムレベルの増大を見せ得、必須ではないが、カルシウムフリー緩衝液中でかかるアッセイを実施し、内在ストアからのカルシウム放出の結果による蛍光応答と区別するために、随意にＥＤＴＡなどのキレート剤を補完することが望ましいだろう。
【００９５】
ホスホリパーゼＣ／細胞内Ｃａ２＋シグナル
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒは、受容体とホスホリパーゼＣシグナル伝達経路を連結するＧタンパク質を有する細胞で発現される。細胞内Ｃａ２＋濃度の変化は、例えば蛍光Ｃａ２＋指示色素および／または蛍光イメージングなどを利用して、計測する。
【００９６】
ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを含むＧＰＣＲにとって、受容体活性の指標はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを含む細胞膜によるＧＴＰの結合である。本方法は、標識ＧＴＰの結合を決定することで膜と連結するＧタンパク質を計測する。
受容体を発現する細胞から単離された膜は、３５Ｓ−ＧＴＰγＳおよび未標識ＧＤＰを含有する緩衝液中でインキュベートされる。活性を有するＧＴＰａｓｅは無機リン酸塩として標識を放出し、これは２０ｍＭのＨ３ＰＯ４中の活性炭５％懸濁液中で遊離無機リン酸塩を分離した後にシンチレーションカウンティングによって決定される。混合物をインキュベートし、未結合標識ＧＴＰをＧＦ／Ｂフィルターでろ過して取り除く。結合した標識ＧＴＰを液体シンチレーションカウンティングで計測する。コントロールは、試験剤の非特異的効果の可能性を排除するために、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒを発現しない細胞（モックトランスフェクションしたもの）から単離した膜を利用するアッセイを含む。方法はTraynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol., 47: 848〜854に詳述されている。
【００９７】
調節物質を同定するために、上述の、ＧＴＰ結合またはＧＴＰａｓｅ活性などの、１０％またはそれ以上の変化（増大または減少）は通常十分である。しかしながら、アゴニストを同定するためには、上述のアッセイは以下のように変更して実施する。剤は、化合物が１００ｍＭまたはそれ以下、例えば１０μＭから５００μＭの範囲など、例えば約１００μＭで存在したときに、活性が、知られたアゴニスト（例えばＮ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミド）のそれの少なくとも５０％であった場合、または知られたアゴニストによって誘導されるレベルと同じまたはそれ以上のレベルを誘導する場合、通常アゴニストとして同定される。
【００９８】
マイクロフィジオメーターまたはバイオセンサー
かかるアッセイはHafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15: 149〜158に詳述されているように行うことができる。
アラキドン酸
アラキドン酸の細胞内レベルは受容体活性の指標として採用される。かかる方法はGijon et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:20146-20156に詳述されている。
【００９９】
ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ
細胞内または細胞外ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または、例えばHorton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91〜105に記載されているような、ｃＡＭＰ結合タンパク質を利用して計測可能である。代替的に、例えばLJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsの高効率蛍光偏光ベースホモジニアスアッセイなど、複数のｃＡＭＰ計測のためのキットもまた商業的に入手可能である。代替的に、ｃＧＭＰの細胞内または細胞外レベルもまた、イムノアッセイを利用して計測可能である。例えば、Felly-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol., 11:159-164(1994)に記載の方法などが、ｃＧＭＰレベルを決定するのに利用され得る。代替的に、米国特許第４，１１５，５３８号に記載されているｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰを計測するアッセイキットもまた利用可能である。
試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１００】
ＤＡＧ／ＩＰ３
例えばPhospholipid Signaling Protocols, Ian M. Bird, Totowa, N.J.編, Humana Press, 1998に記載のように、受容体活性に起因するリン脂質分解によって放出される、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）をＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）活性の指標として検出しおよび利用することが可能である。例えばPerkin Elmer and CisBio Internationalから商業的に入手可能な、イノシトール三リン酸の計測のためのキットもまた利用可能である。
試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１０１】
ＰＫＣ活性
成長因子受容体チロシンキナーゼは、リン脂質およびカルシウム活性化タンパク質キナーゼファミリーの、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化を伴う経路を通してシグナリング可能である。
ＰＫＣに誘導される遺伝子産物の増大は、ＰＫＣの活性化およびその結果としての受容体の活性化を示す。これらの遺伝子産物は、例えばガン原遺伝子転写因子コード遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｊｕｎを含む）、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害物質（コラーゲナーゼタイプＩおよびプラズミノーゲン活性化因子阻害物質を含む）、および接着分子（細胞内接着因子Ｉ（ＩＣＡＭ  Ｉ）を含む）などを含む。
【０１０２】
ＰＫＣ活性はKikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem., 257: 13341に記載されているように、その後ホスホセルロースペーパーに結合することによって分離されるＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を計測することで、直接計測し得る。これは精製キナーゼまたは粗細胞抽出物中の活性の計測に利用可能である。タンパク質キナーゼＣサンプルは２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ  ＤＴＴでアッセイ直前に希釈可能である。
代替的なアッセイは、PanVeraから商業的に入手可能なタンパク質キナーゼＣアッセイキットを利用して行うことも可能である。
【０１０３】
上述のＰＫＣアッセイは、ＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）を発現する細胞からの抽出物に対して行う。
活性はまた、ＰＫＣ活性化によって活性化される遺伝子の制御配列によって駆動するリポーター遺伝子構築物の利用を通して計測可能である。
試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１０４】
ＭＡＰキナーゼ活性
ＭＡＰキナーゼ活性は、例えばNew England Biolabsのｐ３８ＭＡＰキナーゼアッセイキット、またはPerkin-Elmer Life ScienceのFlashPlateＴＭ ＭＡＰキナーゼアッセイなど、商業的に入手可能なキットを利用して計測可能である。ｐ４２／４４ＭＡＰキナーゼまたはＥＲＫ１／２は、ＧｑおよびＧｉ結合ＧＰＣＲを発現する細胞を利用しているとき、ＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）活性を示すために計測可能であり、ＧＰＣＲ活性化に続く内在性ＥＲＫ１／２キナーゼのリン酸化を計測するＥＲＫ１／２アッセイキットはTGR Biosciencesから商業的に入手可能である。
【０１０５】
代替的に、知られた合成または天然チロシンキナーゼ基質および標識リン酸塩を通したチロシンキナーゼ活性の直接計測は周知であり、他のタイプのキナーゼ（例えばセリン／スレオニンキナーゼ）の活性も同様に計測可能である。
【０１０６】
全てのキナーゼアッセイは、精製キナーゼまたは１または２以上のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現する細胞から調製した粗抽出物で行うことができる。利用するキナーゼの基質は、全長タンパク質または基質の代わりとなる合成ペプチドであり得る。Pinna & Ruzzene（1996, Biochem. Biophys. Acta 1314: 191-225）は、キナーゼ活性の検出に有用な複数のリン酸化基質部位を列挙している。複数のキナーゼ基質ペプチドが商業的に入手可能である。特に有用なものは、多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である、「Ｓｒｃ−関連ペプチド」ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（Sigmaから商業的に入手可能）である。いくつかの方法は、ペプチド基質のフィルターへの結合を必要とし、そこでペプチド基質は、結合を促進するために、正味で正に荷電しているべきである。一般的に、ペプチド基質は少なくとも２つの塩基性残基および遊離アミノ末端を有しているべきである。反応は一般的に、０．７〜１．５ｍＭのペプチド濃度を利用する。
試験剤の非特異的効果の可能性を排除するためのモックトランスフェクションされた細胞またはその抽出物を有するネガティブコントロールが利用され得る。
【０１０７】
転写レポーター／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ応答性プロモーター／レポーター遺伝子
レポーター遺伝子アッセイで調節物質を同定するためには、シグナルにおける、少なくとも２倍の増大または１０％の減少が有意である。アゴニストは、試験剤の存在下および非存在下における活性を比較したとき、例えば少なくとも２倍、５倍、１０倍またはそれ以上刺激する。
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒへのアゴニストの結合によって開始される細胞内シグナルは、細胞内事象のカスケードを作動させ、最終結果として１または２以上の遺伝子の転写または翻訳における迅速かつ検出可能な変化をもたらす。
受容体の活性はしたがって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性化に応答するプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現の計測によって決定される。
【０１０８】
本明細書で使用される「プロモーター」は、遺伝子発現の受容体媒介制御に必要な１または２以上の転写制御エレメントまたは配列であり、これは受容体調節発現に必要な１または２以上の基本プロモーター、エンハンサーおよび転写因子結合部位を含む。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒへのアゴニストの結合の結果もたらされる細胞内シグナルに応答するプロモーターは、選択され、発現または遺伝子産物活性が容易に検出および計測可能な、対応するプロモーター制御レポーター遺伝子に作動可能に連結される。
【０１０９】
レポーター遺伝子は、例えばルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびいわゆる「前初期」遺伝子、ｃ−ｆｏｓガン原遺伝子、転写因子ＣＲＥＢ、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子、ソマトスタチン遺伝子、プロエンケファリン遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子、ＮＦ−κＢに応答する遺伝子、およびＡＰ−１応答遺伝子（ＦｏｓおよびＪｕｎ、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびアネキシンＩおよびＩＩの遺伝子を含む）から選択されてよい。
【０１１０】
プロモーターは、当業者には明らかなように、選択されたレポーター遺伝子に応じて選択される。
ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびその産物の検出のためのアッセイは当該技術分野で周知である。さらなるレポーター遺伝子の例は以下に記載されている。
【０１１１】
「前初期」遺伝子は好適であり、速やかに誘導される（例えば受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの接触から数分以内）。レポーター遺伝子の好ましい特性には、次の１または２以上のものが含まれる：リガンド結合に対する速やかな応答性、休眠細胞における低発現または検出できない発現、新たなタンパク質合成の一過性かつ独立した誘導、後続する転写の遮断に新たなタンパク質合成が必要であること、およびこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡが数分から数時間の短い半減期を有すること。同様に、プロモーターも好ましくは、これらの特性を１つ、数個、または全て有している。
【０１１２】
ｃ−ｆｏｓガン原遺伝子は、複数の異なる刺激に応答し、速やかな誘導を有する遺伝子の例である。ｃ−ｆｏｓ調節エレメントは、転写開始に必要なＴＡＴＡボックス、基本転写のための２つの上流エレメント、および、二回対称性を有するエレメントを含み、ＴＰＡ、血清、ＥＧＦ，およびＰＭＡによる誘導に必要なエンハンサーを含む。ｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡキャップ部位の上流−３１７〜−２９８ｂｐの間に位置する２０ｂｐのｃ−ｆｏｓ転写エンハンサーエレメントは、血清枯渇ＮＩＨ３Ｔ３細胞の血清誘導に不可欠である。２つの上流エレメントのうちの１つは−６３〜−５７に位置し、ｃＡＭＰ調節のためのコンセンサス配列に類似する。
【０１１３】
転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）は細胞内ｃＡＭＰのレベルに応答する。したがって、ｃＡＭＰレベルの調節を通してシグナルする受容体の活性化は、転写因子の結合か、またはＣＲＥＢ結合エレメント（ＣＲＥ、またはｃＡＭＰ応答エレメントと称する）に連結されたレポーター遺伝子の発現を検出することで決定可能である。ＣＲＥのＤＮＡ配列はＴＧＡＣＧＴＣＡである。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポーター構築物は米国特許第５，９１９，６４９号に記載されている。
【０１１４】
他の好適なレポーター遺伝子およびそのプロモーターは、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーター、ソマトスタチン遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーター、プロエンケファリンおよびｃＡＭＰ、ニコチンアゴニスト、およびホルボールエステルに応答性のそのプロモーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子およびｃＡＭＰ応答性のそのプロモーターを含む。
【０１１５】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答するレポーター遺伝子およびそのプロモーターのさらなる例は、ＡＰ−１転写因子およびＮＦ−κＢを含む。ＡＰ−１プロモーターは、回文配列ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡであるコンセンサスＡＰ−１結合部位により特徴付けられる。ＡＰ−１はまた、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−β−アセテート（ＴＰＡ）を含む腫瘍プロモーターによる誘導の媒介に関与しており、したがって、ＴＰＡ応答性エレメントとして、ＴＲＥと呼ばれることもある。ＡＰ−１は、増殖刺激に対する細胞の早期の応答に関与する複数の遺伝子を活性化する。ＡＰ−１応答性遺伝子の例は、ＦｏｓおよびＪｕｎ（タンパク質それ自体がＡＰ−１活性を組成する）、Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびアネキシンＩおよびＩＩの遺伝子を含む。
【０１１６】
ＮＦ−κＢプロモーター／結合エレメントはコンセンサス配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣを有する。多くの遺伝子がＮＦ−κＢ応答性であると同定されていて、その制御エレメントをリポーター遺伝子と連結し、ＧＰＣＲ活性を監視することが可能である。ＮＦ−κＢに応答する遺伝子は、例えばＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＣＣＲ５、Ｐ−セレクチン、Ｆａｓリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩκＢαをコードするものを含む。ＮＦ−κＢ応答性レポーターをコードするベクターは当該技術分野で知られているか、または当該技術分野の通常の技術、例えば合成ＮＦ−κＢエレメントおよび最小プロモーターを用いて、またはＮＦ−κＢ制御に従うことが知られる遺伝子のＮＦ−κＢ応答性配列を用いて容易に形成可能である。さらに、ＮＦ−κＢ応答性レポーター構築物は、例えばCLONTECHから商業的に入手可能である。
【０１１７】
与えられたプロモーター構築物は、構築物をトランスフェクトしたＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）発現細胞を、アゴニスト（例えばＮ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミド）に曝露することで簡単に試験することができる。アゴニストに応答するレポーター遺伝子の発現における、少なくとも２倍の増大は、レポーターがＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）活性を計測するのに適していることを示す。
転写アッセイのためのコントロールは、ＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）を発現しないがレポーター構築物を保持している細胞、およびプロモーターのないレポーター構築物を有する細胞の両方を含む。
【０１１８】
レポーター遺伝子の活性化によって示されるＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）活性を調節する剤は、他のプロモーターおよび／または他の受容体を用いて、シグナルのＧＰＣＲ（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ）特異性を立証し、およびその活性範囲を決定することによって立証可能であり、これにより、あらゆる非特異的シグナル、例えばレポーター遺伝子経路経由の非特異的シグナルなどを排除する。
【０１１９】
イノシトールリン酸（ＩＰ）計測
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解は、少なくとも４８時間またはそれ以上の３Ｈ−ミオイノシトールによる細胞標識を伴う、米国特許第５，４３６，１２８号に記載されているように決定されてよい。標識細胞は試験剤に１時間接触させ、次いでそれらの細胞を溶解し、クロロホルム−メタノール−水に抽出する。その後、イノシトールリン酸をイオン交換クロマトグラフィで分離し、シンチレーションカウンティングで定量する。アゴニストに関して、刺激比（fold stimulation）は、試験剤の存在下における計数毎分（ｃｐｍ）の、緩衝液コントロールの存在下でのｃｐｍに対する比を計算して決定される。同じように、阻害物質、アンタゴニストおよび逆アゴニストに関して、阻害比は、試験剤の存在下における計数毎分（ｃｐｍ）の、緩衝液コントロール（アゴニストを含有してもしなくてもよい）の存在下でのｃｐｍに対する比を計算して決定される。
【０１２０】
結合アッセイ
リガンド結合に対する機能的応答に起因するパラメータ変化を計測する上述の機能的アッセイに代えて、リガンド結合を、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体へのリガンドの結合を計測する結合アッセイで決定してもよい。
結合アッセイは当該技術分野で周知であり、溶液中、任意に固相に付着した二重膜中、脂質単層中、または小胞中で試験可能である。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドへの調節物質の結合は、例えば分光特性（例えば蛍光、吸収、または屈折率）の変化の計測、水力学的手法（例えば外見の採用）、およびクロマトグラフィ、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドの可溶特性の計測等によって決定可能である。１つの態様において、結合アッセイは生物化学的であり、組換えＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドを発現する細胞／組織からの膜抽出物を利用する。結合アッセイは、例えば、Ｔ１ＲについてAdler et al.によってＵＳ２００５００３２１５８の段落［０１６９］から［０１９８］に記載されているように実施することができる。
【０１２１】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体ポリペプチドおよび核酸、ならびに実質的に相同なポリペプチドおよび核酸
本明細書に記載されている方法に有用なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号２および配列番号４のキメラヘテロダイマー、配列番号２と野生型Ｔ１Ｒ３とのヘテロダイマー、および配列番号４と野生型Ｔ１Ｒ１とのヘテロダイマーから選択されるポリペプチドからなる群から選択されてよい。
【０１２２】
あるいは、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質（またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒをコードする核酸配列）は、上記ポリペプチドと実質的に相同であって、依然として機能的である（すなわちリガンドと結合するおよび／またはリガンドによって活性化される、またはかかる受容体をコードしている）レセプター（またはかかるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ受容体をコードする核酸配列）であってよい。
【０１２３】
実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質は、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ３部分が、対立遺伝子変異体またはマウス、ラット、ハムスター、サル、およびイヌ由来のＴ１Ｒ１および／またはＴ１Ｒ３を含む、異なる種の関連する部分に置き変えられているかかるタンパク質を含む。
さらに、実質的に相同なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ核酸またはポリペプチド配列は、保存的変異および／または点変異により形成されてもよく、下記のあらゆる保存的に改変された変異体を含む。
【０１２４】
核酸配列について、保存的に改変された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列（保存的に置換されたアミノ酸、すなわちアルギニンに差し替えられたリシンおよび下記に説明されているさらなる例など）をコードする核酸を意味する。
【０１２５】
遺伝コードの縮重によって、配列は異なるが機能的に同一な複数の核酸が任意の与えられたポリペプチド／タンパク質をコードする。かかる核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の１種である。ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列はまた、全ての可能な核酸のサイレント変異を記載している。したがって、それぞれの核酸中のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）は、同一のポリペプチドを産生する機能的に同一の核酸配列を得るために改変し得る。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれの与えられた核酸配列に内在する。
【０１２６】
アミノ酸配列について、アミノ酸置換は、かかる変化をＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ配列に導入するのに利用することができる、ＰＣＲ、遺伝子クローニング、ｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発法、宿主細胞のトランスフェクション、およびインビトロ転写を含む、遺伝子組換え技術の知られた手順を利用して導入することができる。次いで、変異体を、味覚細胞特異的ＧＰＣＲ機能活性についてスクリーニングすることができる。機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野で周知である。例えば、保存的置換を選択する１つの典型的な指針は（オリジナルの残基の後に典型的な置換が続く）：ａｌａ／ｇｌｙまたはｓｅｒ、ａｒｇ／ｌｙｓ、ａｓｎ／ｇｌｎまたはｈｉｓ、ａｓｐ／ｇｌｕ、ｃｙｓ／ｓｅｒ、ｇｌｎ／ａｓｎ、ｇｌｙ／ａｓｐ、ｇｌｙ／ａｌａまたはｐｒｏ、ｈｉｓ／ａｓｎまたはｇｌｎ、ｉｌｅ／ｌｅｕまたはｖａｌ、ｌｅｕ／ｉｌｅまたはｖａｌ、ｌｙｓ／ａｒｇまたはｇｌｎまたはｇｌｕ、ｍｅｔ／ｌｅｕまたはｔｙｒまたはｉｌｅ、ｐｈｅ／ｍｅｔまたはｌｅｕまたはｔｙｒ、ｓｅｒ／ｔｈｒ、ｔｈｒ／ｓｅｒ、ｔｒｐ／ｔｙｒ、ｔｙｒ／ｔｒｐまたはｐｈｅ、ｖａｌ／ｉｌｅまたはｌｅｕを含む。
【０１２７】
代替的な典型的な指針は、お互いが保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する後続の６群：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を利用する。
他の代替的な指針は、全ての荷電アミノ酸を、正であるか負であるかで、相互の保存的置換を認めるものである。加えて、コードされた配列における単一のアミノ酸または小さい割合（例えば２６％まで、２０％まで、１０％まで、または５％まで）のアミノ酸を変化させ、追加し、または削除する個別の置換、欠失または付加もまた保存的に改変された変異とみなされる。
【０１２８】
実質的に相同なヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、以下に示す配列同一性の度合いを有するか、または以下に示すある一定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
【０１２９】
％配列同一性
実質的に相同なヌクレオチド配列は、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の％配列同一性を有する。
実質的に相同なポリペプチド配列は、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の％配列同一性を有する。
【０１３０】
配列同一性の計算は、後述のように決定される。
ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Serch Tool）は、http://www.ncbi.nlm.nih.govで利用可能なプログラムｂｌａｓｔｎに使用されているヒューリスティックな検索アルゴリズムである。他のヌクレオチド配列に対するヌクレオチドクエリー配列の％同一性を決定するために、１０のＥＸＰＥＣＴ（データベース配列に対する一致を報告するための統計学的に有意な閾値）、およびＤＵＳＴフィルタリングを含む、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１．３のデフォルトパラメーターを用いて、Ｂｌａｓｔｎが利用される。他のポリペプチド配列に対するポリペプチドクエリー配列の％同一性を決定するために、１０のＥＸＰＥＣＴ、およびＤＵＳＴフィルタリングを含む、ＢＬＡＳＴバージョン２．２．１．３のデフォルトパラメーターを用いて、Ｂｌａｓｔｐが利用される。
【０１３１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
ヌクレオチド配列は、本明細書で提示するヌクレオチド配列、またはその相補体と、以下に詳述するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズできた場合、実質的に相同であると考えられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳからなる溶液中の４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）からなる溶液中での６５℃での洗浄である。
【０１３２】
バックグラウンドハイブリダイゼーションは、他のヌクレオチド配列が、例えばスクリーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ中に存在するために起こり得る。
標的ＤＮＡで観察された特異的相互作用の２倍以下の強度または任意に１０倍以下の強度のシグナルは、バックグラウンドであると考えられる。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐによって放射性標識して計測することができる。
【０１３３】
調節物質を同定するためのキット
キットは、例えば、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ、もしくはそれと実質的に相同な配列を発現する組換え細胞を含み、かつ、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒのアゴニスト、例えば、限定することなく、塩化カルシウム、Ｎ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミドＣＡＳ番号７４５０４７−９７−６などを含む、スクリーニングキットまたはハイスループットスクリーニングキットである。
カルシウムを含むキットの利用は、野生型受容体またはキメラタンパク質のＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３部分ではなく、キメラタンパク質のみに結合し、それを活性化するという利点を有する。
【０１３４】
任意に、細胞はさらに例えばカルシウムシグナリングのためのＧタンパク質を含む。好適なＧタンパク質は既知であり、上述されており、当業者は必要な場合にそれをどのように細胞に導入すればよいかを承知している。非常に有用なキメラＧタンパク質は、ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているＧアルファ１６−ガストデューシン４４である。
アゴニストは、例えば１ｎＭ〜１０ｍＭ、または０．１マイクロＭ〜１ミリＭ、例えば０．１マイクロＭ〜１００マイクロＭなどの好適な濃度で提供される。
好適な濃度は、例えば、塩化カルシウムについては０．２〜２０ｍＭ、Ｎ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミドについては５〜５００μＭである。
【０１３５】
キットの任意構成要素は、提供される組換え細胞を培養するための好適な培地、および、細胞をその上で成長させるための固体支持体、例えば細胞培養皿またはマイクロタイタープレートなどを含んでよく、これらの任意構成要素は当業者が容易に入手できる。
キットは以下のように利用されてよい：
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞を固体支持体上で成長させる。
（ｉｉ）約１ｎＭから１００ｍＭまたはそれ以上までの濃度の試験剤を、所定のプレートまたはウェルの培養培地に好適な濃度のアゴニストの存在下で加える。
（ｉｉｉ）細胞の機能的応答の変化が、試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することで決定され、その結果試験剤が調節物質であり得るかどうかが決定される。
【０１３６】
例えば、（ｉｉｉ）は上述のアッセイのいずれかに従い、上述の受容体活性を報告する検出方法のいずれかと組合せて行うことができる。これは、同じく上述された、特別に選択したまたは適応させた組換え細胞を必要とすることがある。好適なアッセイは、例えば、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒの活性化および試験剤に応答したその変化を決定するためのカルシウムフラックスアッセイである。
【０１３７】
キットは増強物質を同定するために以下のように利用することができる：
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する組換え細胞を固体支持体上で成長させる。
（ｉｉ）約１ｎＭから１００ｍＭまたはそれ以上の濃度の試験剤を、所定のプレートまたはウェルの培養培地に好適な濃度のカルシウムアゴニスト（例えば、限定することなく、塩化カルシウムの形態のもの）の存在下で加える。
（ｉｉｉ）カルシウムに対する細胞の機能的応答の変化が、試験剤の存在下および非存在下での応答を比較することで決定され、その結果試験剤が増強物質であると決定される。
好適な塩化カルシウムの濃度は、例えば、約０．２〜２０ｍＭ、または０．５〜１０ｍＭ、または約１ｍＭである。
【０１３８】
同定された増強物質の確認
上述の方法によって同定された増強物質は、フレーバリストのパネルまたは試験者に同定された調節物質をテイスティングさせる単純な官能試験によって簡単に確認し得る。化合物は、例えば、うま味を確認するために水中で、またはうま味を増強する調節物質であることを確認するためにうま味物質と一緒に、調節物質のないネガティブコントロールと比較してテイスティングする。
【０１３９】
大規模スクリーニングアッセイ
上述の転写レポーターアッセイおよびほとんどの細胞ベースのアッセイは、ライブラリーをＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ活性を調節する剤についてスクリーニングするのに適している。
アッセイは、アッセイ工程の自動化および、典型的には平行して実行される（例えばロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式など）、任意の好都合な給源からの化合物のアッセイへの供給によって、巨大な化学的ライブラリをスクリーニングするように設計され得る。
【０１４０】
アッセイは、多くの潜在的調節物質を含むコンビナトリアルケミカルまたはペプチドライブラリーの提供を伴う、ハイスループットスクリーニング法で実行されてもよい。かかるライブラリーは、次いで、上述の活性を呈するライブラリー剤（特に化学種またはサブクラス）を同定するために、上述の１またはそれ以上のアッセイでスクリーニングされる。こうして同定された調節物質は直接利用でき、または、誘導体を製造および試験することでさらなる調節物質を同定するためのリードとして利用することができる。
合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trecillet, Cornwall, UK）、Comgenex（Princeton, N.J.）、Brandon Associates（Merrimack, N.H.）、およびMicrosource（New Milford, Conn.）を含む多くの企業から商業的に入手可能である。
【０１４１】
試験剤のライブラリ
コンビナトリアルケミカルライブラリは、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」の組合せることにより、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成された様々な化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリなどのリニアコンビナトリアルケミカルライブラリは、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）について、化学的ビルディングブロック（アミノ酸）のセットをあらゆる可能な方法で組合せることによって形成される。何百万もの化学的化合物が、かかる化学的ビルディングブロックの組合せ混合を通して合成可能である。
レアケミカルライブラリはAldrich（Milwaukee, Wis.）から入手可能である。
【０１４２】
細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは、例えばPan Laboratories（Bothell, Wash.）またはMycoSearch（NC）から商業的に入手可能であり、あるいは、当該技術分野で周知の方法で容易に生成可能である。さらに、天然および合成的に産生されたライブラリおよび化合物は、慣用の化学的、物理的および生化学的手法で容易に改変される。
他のライブラリとしては、タンパク質／発現ライブラリ、例えば食物、植物、動物、細菌を含む天然給源からのｃＤＮＡライブラリ、１または２以上のポリペプチドをランダムにまたは体系的に変異させた変異体を発現するライブラリ、および１つの細胞または組織のｍＲＮＡ内容を発現させるのに利用されるウィルスベクターでのゲノムライブラリを含む。
【０１４３】
ハイスループットアッセイでは、数千の異なる調節物質またはリガンドを１日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された潜在的調節物質に対する別個のアッセイの実施に利用でき、または、濃度またはインキュベーション時間の効果を観察すべき場合、各５〜１０ウェルで１つの調節物質を試験可能である。したがって、1つの標準的なマイクロタイタープレートは約１００の調節物質をアッセイ可能である。１５３６ウェルプレートを利用した場合、１つのプレートは、約１００から約１５００の異なる化合物を、簡単にアッセイ可能である。１日にいくつかの異なるプレートをアッセイ可能なので、約６，０００〜２０，０００の異なる化合物のためのアッセイスクリーニングが可能である。
【０１４４】
本アッセイ方法でＣＳＲ：：Ｔ１Ｒの調節効果を試験し得る試験剤のタイプ
試験剤は、小化学化合物、化学ポリマー、生物ポリマー、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、核酸および脂質を含む任意の剤であってもよい。剤は、合成化合物、化合物の混合物、天然産物または天然サンプル、例えば植物抽出物、培養上清、または組織サンプルなどであり得る。
【０１４５】
うま味を調節し得る、例えばうま味を引き起こしまたは増強し得る化合物の例としては、グルタミン酸塩またはグルタミン酸モノナトリウム（ＭＳＧ）を含むその塩の１つ、イノシンモノリン酸（ＩＭＰ）、およびグアノシンモノリン酸（ＧＭＰ）を含む。
同定されたうま味物質の調節物質は、例えばＮ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）―Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミドを含む。うま味物質の調節物質はうま味感覚を引き起こし（アゴニスト）、増強しまたは阻害することができる。合成うま味アゴニストおよび／またはうま味調節物質の他の例はまた、ＷＯ２００５０４１６８４または関連出願ＵＳ２００６０４５９５３に見出すことができる。
【０１４６】
消費材は食料製品、飲料、口腔ケア製品、およびかかる製品に混合するための組成物、特にフレーバー組成物を含む。フレーバー組成物は、加工食品または飲料にその加工の最中に添加することができ、またはそれら自身が、例えばソースなどの調味料などの消費材となり得る。おいしい消費材は通常塩または塩の代替物を含み、かかるおいしい消費材の例は、これに限定するものではないが、ポテト製品、チップス、クリスプ、シリアル製品、コメ製品、タピオカ製品、サゴ製品、パン屋製品、ペストリー製品、パン製品、酵母製品、塩および香辛料製品、マスタード製品、酢製品、ソース（調味料）、加工食品、調理果物および野菜製品、肉および肉製品、卵製品、ミルクおよび乳製品、ヨーグルト、チーズ製品、バターおよび代替バター製品、代替乳製品、大豆製品、食用油および油脂製品、飲料、アルコール飲料、ビール、ソフトドリンク、錠剤、トローチ、ドロップ、乳剤、エリキシル剤、シロップおよび飲料を製造するための他の調製物、食品抽出物、植物抽出物、肉抽出物、調味料およびそれらの組み合わせを含む。
【０１４７】
核酸およびタンパク質の配列
本明細書に記載の構築物および方法に用いた配列は、後述の配列表に見出すことができる。
配列番号１はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラタンパク質をコードするヌクレオチド／核酸配列に対応し、配列番号２はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラタンパク質のポリペプチド／アミノ酸配列に対応している。
配列番号３はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質をコードするヌクレオチド／核酸配列に対応し、配列番号４はＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質のポリペプチド／アミノ酸配列に対応している。
【０１４８】
２つのサブユニットを含む複合体として一緒になって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラタンパク質およびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラタンパク質は機能的キメラうま味受容体を形成する。
トランスフェクトされた構築物において、新規なキメラタンパク質をコードする核酸（配列番号１または３）のＣ末端に、ＨＳＶタグを後続させる（配列番号５）。
得られるタンパク質はしたがって次のアミノ酸を含有する：配列番号５が後続する配列番号１、配列番号５が後続する配列番号３のアミノ酸。
【０１４９】
Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３受容体複合体の、既知のＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３サブユニットの既知の全長核酸及びタンパク質配列は、Ｔ１Ｒ１については配列番号７＋８に、Ｔ１Ｒ３については配列番号９＋１０に与えられている。
既知の全長ｈＣａＳＲ受容体核酸およびタンパク質配列は配列番号１１＋１２に与えられている。
【０１５０】
配列番号１＋２：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１核酸＋タンパク質
配列番号３＋４：ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３核酸＋タンパク質
配列番号５＋６：Ｃ末端のＨＳＶタグ核酸＋タンパク質
配列番号７＋８：Ｔ１Ｒ１（全長コード配列）核酸＋タンパク質
配列番号９＋１０：Ｔ１Ｒ３（全長コード配列）核酸＋タンパク質
配列番号１１＋１２：ｈＣａＳＲ核酸＋タンパク質
配列番号１３〜１８：プライマー配列、例２および例３を比較
【０１５１】
これより以下に、上述の方法を例証する一連の例が続く。以下の例は単なる例示であって、いかようにも本ポリペプチド、核酸、発現ベクター、宿主細胞、方法またはキットを限定すると解すべきではない。
【０１５２】
実施例
全ての例は、ヒトＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３およびｈＣａＳＲに由来するＤＮＡ配列を用いる。
例１
Ｆｌｕｏ−４カルシウムアッセイ
Ｆｌｕｏ−４は、細胞内カルシウムの蛍光指示薬であり、細胞内カルシウム濃度の変化、特にリガンド添加後に起こる受容体活性化に応答した増加の決定を可能にする。
Ｇα１６−ガストデューシン４４を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を宿主細胞として利用し、例４に記載のとおりに様々な構築物でトランスフェクトした。
【０１５３】
黒く、底が透明な９６ウェルプレートを全てのアッセイで利用した。アッセイの前日、プレートに、ウェル毎に８５００個のトランスフェクト細胞を播種し、用いた細胞に適した成長培地中、３７℃で一晩維持した。ＨＥＫ２９３細胞については、高グルコース、Ｌ−グルタミン、塩酸ピロキシジンを含有し、１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地をＨＥＫ２９３細胞の成長および維持に利用した。
【０１５４】
アッセイの際に成長培地を廃棄し、細胞を１時間（３７℃にて暗所で）、低カルシウムＣ１緩衝溶液に溶解した１．５μＭのＦｌｕｏ−４ＡＭ（Molecular ProbesTM, Invitrogen, US）および２．５μＭのプロベニシド（Sigma-Aldrich）からなる５０μｌのカルシウムアッセイ溶液でインキュベートした。低カルシウムＣ１緩衝溶液は１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２（２ｍＭから減じてある）および１０ｍＭのグルコース（ｐＨ７．４）を含有する。
【０１５５】
最初の１時間の負荷期間の後、プレートをウェルあたり１００μｌの低カルシウムＣ１緩衝液で５回、自動プレート洗浄機（BioTek）を利用して洗浄し、洗浄の後、Ｆｌｕｏ−４−ＡＭの完全な脱エステル化をもたらすために、プレートを室温にて３０分間暗所でさらにインキュベートした。緩衝溶液を廃棄し、プレートを１００μｌの低カルシウムＣ１洗浄緩衝液で５回洗浄し、最終的に細胞を１８０μｌの低カルシウムＣ１洗浄緩衝液中に入れた。
アッセイの読み取りのため、プレートをＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR-Tetra, Molecular Devices））中に置き、受容体活性化を、低カルシウムＣ１緩衝液中で調製した２０μｌの１０×濃縮リガンドストック溶液の添加後に開始させた。
蛍光は、リガンド添加前１５秒間およびリガンド添加後１０５秒間で継続的に監視した（４５〜１０５秒で十分であろう）。
【０１５６】
受容体活性化は基準蛍光（Ｆ０）で標準化されたピーク蛍光（Ｆ）の増大によって決定される。データは次の方程式を用いて標準化される：
ΔＦ／Ｆ＝（Ｆ−Ｆ０）／Ｆ０
式中、Ｆはピーク蛍光シグナルであり、Ｆ０は基準蛍光シグナルであり、ここで基準蛍光はリガンド添加前の最初の１０〜１５秒について計算した平均蛍光を表す。この値はトランスフェクトされた受容体の直接的または間接的な相互作用に応答した細胞のカルシウム増加（「シグナル」）に対応して得られた。
【０１５７】
ネガティブコントロールとして、モックトランスフェクションした細胞を同濃度のリガンドに曝露し、シグナルに対応しない微量のカルシウム濃度を決定した。
活性化された受容体を有する細胞は、ネガティブコントロールを有意に上回るシグナル（ΔＦ／Ｆ）によって同定した。
【０１５８】
例２
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ベクター構築物の調製
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラｃＤＮＡベクター構築物は、ＰＣＲによって生成された２つのＤＮＡ断片を、両方のＰＣＲ産物、すなわちｈＣａＳＲの細胞外アミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）およびシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）（１−Ｌｙｓ６０１）を含むＰＣＲ産物と膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＴｈｒ６１０から始まるＣ末端を含むＴ１Ｒ１断片を表すＰＣＲ産物、にある共通の制限酵素部位を介して連結することによって作出した。
【０１５９】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラＤＮＡの作製を容易にするために、ＢｓｉＷＩ部位を、上述の２つの断片を形成するために利用したプライマーに導入した。これらの導入部位および適した制限酵素を当該技術分野で周知のバッファーおよび条件下で利用し、断片を酵素ライゲーションによって連結した。
【０１６０】
形成されたＰＣＲ産物／断片中のこれらのＢｓｉＷＩ部位は、ｈＣａＳＲのＡＴＤ断片のＣ末端およびＴ１Ｒ１断片のＮ末端にそれぞれ位置し、キメラＤＮＡの２つのＰＣＲ産物／断片のライゲーションを可能にする。このＢｓｉＷＩ部位の組み込みは、本来のｈＴ１Ｒ１配列を、本来のｈＴ１Ｒ１配列のＴｈｒ６０９／Ｖａｒ６１０が得られた配列においてＡｒｇ６０９／Ｔｈｒ６１０に変換された配列に変換する。ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラｃＤＮＡ断片を含む断片を、以下に与えられる配列番号１３〜１６の特異的プライマーを用いて、Platinum Taq High Fidelity Polymeraseを用いたＰＣＲを利用して増幅した。Ｆはフォワードプライマーを示し、Ｒはリバースプライマーを示す。
下線文字は、後続するＰＣＲ産物のサブクローニングのための、プライマー内に存在する制限部位を示す。
【０１６１】
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＦ（配列番号１３）
ＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＧＣ
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤプライマーＲ（配列番号１４）
ＡＴＡＴＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴ
ＴＡＳ１Ｒ１−断片プライマーＦ（配列番号１５）
ＡＴＡＴＣＧＴＡＣＧＧＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＣＧＴ
ＴＡＳ１Ｒ１−断片プライマーＲ（配列番号１６）
ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴ
【０１６２】
ＰＣＲ増幅のための鋳型は、ヒトＣａＳＲをコードする全長ｃＤＮＡ（Origene Inc., USAから商業的に入手可能）、またはヒト茸状乳頭味覚組織から作出したｃＤＮＡライブラリーから単離したヒトＴ１Ｒ１をコードする全長ｃＤＮＡであった。ＰＣＲ反応パラメータは、９４℃で５分の後、９４℃で４５秒、５４℃で１５秒および７２℃で２分を３５サイクル、その後最終伸張サイクルとして７２℃で１０分であった。
【０１６３】
得られた核酸断片はゲル電気泳動によって分離し、精製し、およびｐＣＲ−Ｔｏｐｏ−ＩＩベクター（Invitrogen）にサブクローニングし、ＰＣＲ増幅によって起こった変異が無いことを保証するために、得られたクローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。
シークエンシングの後、挿入物をｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Invitrogen, USAから購入）に基づく発現カセットベクター構築物に３ピースライゲーションによりサブクローニングし、ベクター構築物においてＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラｃＤＮＡ断片のアッセンブリを可能にした。
【０１６４】
得られた形成ベクター構築物のＣ末端は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープをコードしており、このエピトープに結合する特異抗体を利用した免疫細胞化学研究に利用可能である。ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ１  ｃＤＮＡを有する得られたＣＳＲ：Ｔ１Ｒ１ベクター構築物は、（アミノ末端からＣ末端方向に）配列番号６（ＨＳＶエピトープ）が後続する配列番号２（ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ１）の連結アミノ酸配列であるＣＳＲ：Ｔ１Ｒ１：ＨＳＶタンパク質の発現を可能にする。
【０１６５】
例３
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ベクター構築物の調製
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラｃＤＮＡベクター構築物は、ＰＣＲによって生成された２つのＤＮＡ断片を、両方のＰＣＲ産物にある共通の制限酵素部位を介して連結、すなわちｈＣａＳＲの細胞外アミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）およびシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）（１〜Ｌｙｓ６０１）を含むＰＣＲ産物とその膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＡｒｇ６０９から始まるそのＣ末端を含むＴ１Ｒ３の断片のＰＣＲ産物とを連結することによって作出した。
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラＤＮＡの作製を容易にするために、ＢｓｉＷＩ部位を、上述の２つの断片を形成するために利用したプライマーに導入した。
【０１６６】
形成されたＰＣＲ産物／断片中のこれらのＢｓｉＷＩ部位は、ｈＣａＳＲのＡＴＤ断片のＣ末端およびＴ１Ｒ３断片のＮ末端にそれぞれ位置し、２つの断片のライゲーションを可能にする。ＢｓｉＷＩ部位の組み込みは、前のｈＴ１Ｒ３のＡｒｇ６０９／Ｓｅｒ６１０をＡｒｇ６０９／Ｔｈｒ６１０に変換された配列を含むベクター構築物をもたらす。導入されたライゲーション部位および適した制限酵素を当該技術分野で周知のバッファーおよび条件下で利用し、断片を酵素ライゲーションによって連結した。
【０１６７】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラｃＤＮＡ断片を含む断片を、以下に列挙した配列番号１７および配列番号１８の特異的プライマーを用いて、Platinum Taq High Fidelity Polymeraseを用いたＰＣＲを利用して増幅した。その後、Ｔ１Ｒ３の増幅ＰＣＲ産物およびｈＣａＳＲの増幅ＰＣＲ産物（後者は上記例２に記載されているように形成）を、以下に列挙されているプライマー内に導入された制限酵素部位を介してライゲーションした。Ｆはフォワードプライマーを示し、Ｒはリバースプライマーを示す。下線文字は、後続するＰＣＲ産物のサブクローニングのための、プライマー内に存在する制限部位を示す。
【０１６８】
ｈＣａＳＲ−ＡＴＤ  ＦおよびｈＣａＳＲ−ＡＴＤ  Ｒ
上記例２に示されている配列番号１３および配列番号１４
ＴＡＳ１Ｒ３−断片プライマーＦ（配列番号１７）
ＡＴＡＴＣＧＴＡＣＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＧＧＣ
ＴＡＳ１Ｒ３−断片プライマーＲ（配列番号１８）
ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴ
【０１６９】
ＰＣＲ増幅のための鋳型は、ｈＣａＳＲをコードする全長ｃＤＮＡ（Origene Inc., USAから購入）、またはヒト茸状乳頭味覚組織から作出したｃＤＮＡライブラリーから単離したｈＴ１Ｒ３をコードする全長ｃＤＮＡであった。ＰＣＲ反応パラメータは、９４℃で５分の後、９４℃で４５秒、５４℃で１５秒および７２℃で２分を３５サイクル、その後最終伸張サイクルとして７２℃で１０分であった。
【０１７０】
得られたＰＣＲ産物（ライゲーションはＰＣＲ産物が確認された後に行われる）はゲル電気泳動によって分離し、精製し、およびｐＣＲ−Ｔｏｐｏ−ＩＩベクター（Invitrogen,USA）にサブクローニングした。ＰＣＲ増幅によって起こった変異が無いことを保証するために、得られたクローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１７１】
シークエンシングの後、挿入物をｐｃＤＮＡ４／ＴＯベクター（Invitrogen, USAから購入）に基づく発現カセットベクター構築物に３ピースライゲーションによりサブクローニングし、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ベクター構築物を形成した。形成されたベクター構築物のＣ末端は単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープをコードしており、このエピトープに結合する特異抗体を利用した免疫細胞化学研究に利用可能である。得られたベクター構築物は、（アミノ末端からＣ末端方向に）配列番号６（ＨＳＶエピトープ）が後続する配列番号４（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３）の連結アミノ酸配列であるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３：：ＨＳＶタンパク質の発現を可能にする。
【０１７２】
例４
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３のトランスフェクション
トランスフェクトされたベクター構築物は、上記のとおりに形成した例２および３に記載されているものを利用した。ｈＣａＳＲについては、全長ｃＤＮＡに基づく、商業的に入手可能なｐＣＭＶベースのベクター構築物を利用した（TRUECLONE collection, Origene Inc., USA）。
【０１７３】
安定的にＧα１６−ガストデューシン４４を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＷＯ２００４／０５５０４８に記載されているように形成した）に、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ベクター構築物、またはｈＣａＳＲを次のようにトランスフェクトした：
０日目に、ＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６−ガストデューシン４４細胞を９６ウェルの黒い、透明底のプレートに、ウェルあたり８５００細胞の密度で播種し、選択的成長培地で一晩成長させた。１日目に、培地を抗生物質不含かつ血清不含の成長培地に変更し、細胞をそれぞれ７５ｎｇのＣＳＲ：Ｔ１Ｒ１およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３（合計１５０ｎｇ）、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３（合計１５０ｎｇ）、または７５ｎｇのｈＣａＳＲベクター構築物ＤＮＡおよび０．３μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を利用してトランスフェクトした。
【０１７４】
ｈＣａＳＲベクターは、カルシウムに感受性であり、カルシウム結合部位が、キメラのＶＦＴが由来するこの受容体のＶＦＴ（ビーナスフライトラップドメイン）に存在するため、カルシウムに感受性のＧＰＣＲのポジティブコントロールとして利用した。
ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーのいずれかのトランスフェクションのため、それぞれ７５ｎｇのベクター構築物を、ペア毎に合計１５０ｎｇになるように組み合わせ、０．３μｌのリポフェクタミン２０００と一緒に利用した。７５ｎｇのｈＣａＳＲベクターＤＮＡを、このカルシウム感受モノマーＧＰＣＲに利用した。
【０１７５】
上述のリポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を細胞上で３〜４時間インキュベートし、その後抗生物質不含の血清含有成長培地に交換した。細胞は一晩成長させ、Ｆｌｕｏ−４カルシウムアッセイを例１に記載したように行った。
上記ベクター構築物のうちの１つを一過性にトランスフェクトした細胞を、例１に記載したように蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR-Tetra, Molecular Devices）を利用して同定した。
【０１７６】
例５
合成うま味アゴニストによるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ホモマーおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーの活性化
様々なリガンドによる刺激後の細胞内カルシウム応答は、Ｇα１６−ガストデューシン４４を安定して発現し、かつＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１および／またはＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラ構築物をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において決定した。結果を、モックトランスフェクション細胞または（モノマーｈＣａＳＲを形成するために）例５に記載のｈＣａＳＲベクター構築物をトランスフェクトされた細胞から得られた結果と比較した。
【０１７７】
トランスフェクションは例４に記載されているように実施した。結果は例１に記載されているように計算した（データは刺激後の蛍光における基準値以上の標準化された増大（ΔＦ／Ｆ）を示し、６回の反復実験の平均（ＡＶＧ）および±標準偏差（ＳＴＤ）が与えられている）。トランスフェクトされた細胞を刺激するために次のリガンドを、括弧内に示された濃度で用いた：塩化カルシウム（２ｍＭ）、Ｎ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミド（「７４５０４７−９７−６」）（２５μＭ）、およびグルタミン酸モノナトリウム（２．５ｍＭ）とイノシンモノリン酸（０．２ｍＭ）との組合せ（下表では「ＭＳＧ＋ＩＭＰ」と記載）。
【０１７８】
得られたカルシウム可動化シグナルは、基準蛍光（Ｆ０）によって標準化されたピーク蛍光（Ｆ）における増大である。データは次の方程式を用いて標準化される：ΔＦ／Ｆ＝（Ｆ−Ｆ０）／Ｆ０、式中Ｆはピーク蛍光シグナルであり、Ｆ０はリガンド添加の前に計測される平均蛍光シグナルによって決定される基準蛍光シグナルである。得られたΔＦ／Ｆ値は、トランスフェクトされた受容体との直接的または間接的な相互作用に応答した細胞のカルシウム増加（「シグナル」）に対応する。
【０１７９】
うま味受容体を発現しない、構築物なしでトランスフェクトされた、モックトランスフェクションＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６−ガストデューシン４４細胞は、単にバックグラウンドに対応するシグナルを決定するためにネガティブコントロールとして利用した。
トランスフェクト細胞は、示されたうま味アゴニストおよびカルシウム感知ドメインを含むタンパク質のポジティブコントロール（カルシウム）、およびネガティブコントロール（Ｃ１緩衝液）に曝露した。
【０１８０】
結果は下表に示されている。
ＡＶＧ欄は平均ΔＦ／Ｆを与え、ＳＴＤ欄は標準偏差を与える。下表は、試験した様々なベクター構築物の各々における、６回の反復実験におけるΔＦ／Ｆ＋／−ＳＴＤの平均変化を示す。
【０１８１】
【表１】
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【０１８２】
ネガティブコントロール／モックトランスフェクションはバックグラウンドシグナルに対応するシグナルレベルを示す。
ポジティブコントロール（カルシウム）が示すように、カルシウム感知ドメインを有する全てのトランスフェクト細胞はカルシウムに反応した（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１ホモマー、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーおよびｈＣａＳＲ）。
【０１８３】
ＭＳＧ＋ＩＭＰの混合物による刺激に対するＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラホモマーの反応は観察されなかった。ＭＳＧ＋ＩＭＰについて、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラの応答の欠如は、Ｔ１Ｒ１由来のＶＦＴドメイン、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラに欠損しているドメインであり、理論に束縛されるものではないが、ＭＳＧおよびＩＭＰの結合領域を含むと考えられているドメイン、の欠損によるものと考えられる。
ｈＣａＳＲタンパク質は塩化カルシウムにのみ応答し、試験されたいずれのうま味物質によっても活性化されることができなかった。
【０１８４】
塩化カルシウムおよびＮ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミド（７４５０４７−９７−６）について、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラホモマーおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラヘテロダイマーを発現する細胞内において顕著なシグナルの増大が観察された。モックトランスフェクションネガティブコントロールまたはＣ１緩衝液ネガティブコントロールのいずれにおいても応答は観察できなかった。
【０１８５】
キメラＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーをトランスフェクトした細胞中で検出された塩化カルシウムおよびＮ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミド（７４５０４７−９７−６）シグナルは、ネガティブコントロール（モックトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／Ｇα１６−ガストデューシン４４細胞）中で得られた基準シグナルよりも顕著に高く、ｈＣａＳＲ受容体をトランスフェクトした細胞中で得られたシグナルの約５０％のシグナル強度であった。
【０１８６】
この結果は、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１キメラホモマーおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ１／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３キメラヘテロダイマーがカルシウムおよびＮ−（２−メトキシ−４−メチル−ベンジル）−Ｎ’−（２−ピリジン−２−イル−エチル）−オキサルアミド（７４５０４７−９７−６）によって活性化されることを明示している。
【０１８７】
受容体、核酸、ポリペプチド、発現ベクター、宿主細胞、方法およびキットは、上記においてある例示的な態様に関して記載されているが、同様の機能を実施するために、他の同様の態様が利用されてよく、または記載の態様に改変および付加が加えられてもよいと理解されるべきである。さらに、全ての開示された態様は必ずしも互いに排他的ではなく、様々な態様は必要な特性を提供するために組み合わせてもよい。当業者は、本開示の精神と範囲から離れることなく変更を加えることができる。したがって、本受容体、核酸、ポリペプチド、発現ベクター、宿主細胞、方法およびキットは、いかなる単一の態様に限定されるべきではなく、むしろ請求項の記載にしたがった幅および範囲をもって解釈されるべきである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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