(57)【要約】  本発明は、融合タンパク質およびアルツハイマー病患者の酵素的処置におけるその使用に関する。該融合タンパク質はアミロイドベータペプチドを、そのアミノ酸配列の１個所以上の開裂部位で分解できる、式Ｍ−Ａ(ここでＭは、融合タンパク質の半減期を延長するタンパク質成分であり、そしてＡはアミロイドベータペプチドを開裂するタンパク質成分である)を有する。
2010522559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドベータペプチドを、該アミロイドベータペプチドアミノ酸配列の１個所以上の開裂部位で分解できる、式Ｍ−Ａ(ここで、Ｍは、融合タンパク質の半減期を延長するタンパク質成分であり、そして、Ａはアミロイドベータペプチドを分解するタンパク質成分であり、該Ｍタンパク質成分は、Ａタンパク質成分のＮ末端部分に共有結合している)を有する融合タンパク質。
【請求項２】
Ａがプロテアーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
Ａがヒトネプリライシンである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
該ネプリライシンが細胞外ネプリライシンである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
配列番号１、２、３または４のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の細胞外ネプリライシン。
【請求項６】
Ａがインスリン分解酵素である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ａがエンドセリン−変換酵素１である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ａが足場タンパク質である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
Ｍが抗体のＦｃ部分である、請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
該抗体がＩｇＧ抗体である、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
該抗体がＩｇＧ２抗体である、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ＭがＩｇＧ２抗体由来のＦｃ部分であり、そしてＡが細胞外ネプリライシンである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ＭがＩｇＧ２抗体由来のＦｃ部分であり、そしてＡがインスリン分解酵素である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
ＭがＩｇＧ２抗体由来のＦｃ部分であり、そしてＡがエンドセリン−変換酵素１である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
Ｍがペグ化およびグリコシル化から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
ＭがＨＳＡである、請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
ＭがＨＳＡ結合ドメインである、請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
Ｍが抗体結合ドメインである、請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ＭおよびＡが一体となってリンカーＬに結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
Ｌがペプチドおよび化学リンカーから選択される、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
アミロイドβペプチド濃度を減少させる方法であって、請求項１から２３のいずれかに記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
アミロイドβペプチドの減少が血漿中で達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アミロイドβペプチドがＣＳＦ中で達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
アミロイドβペプチドの減少がＣＮＳ中で達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
薬学的に許容される量の請求項１から２３のいずれかに記載の融合タンパク質を薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む、アミロイドβペプチドを分解できる医薬組成物。
【請求項２９】
アミロイドβペプチドの分解が有利である状態の予防および／または処置方法であって、かかる予防および／または処置を必要とするヒトを含む哺乳動物に、治療的有効量の請求項１から２３のいずれかに記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項３０】
アルツハイマー病、全身性アミロイドーシスまたは脳アミロイド血管症の予防および／または処置方法であって、かかる予防および／または処置を必要とするヒトを含む哺乳動物に、治療的有効量の請求項１から２３のいずれかに記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項３１】
医学的治療に使用するための、請求項１から２３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
アミロイドβペプチドの分解が有益である状態の予防および／または処置用医薬の製造における、請求項１から２３のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３３】
アルツハイマー病、全身性アミロイドーシスまたは脳アミロイド血管症の予防および／または処置用医薬の製造における、請求項１から２３のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３４】
該医薬がアミロイドβペプチド濃度を減少させる、請求項３２または３３に記載の使用。
【請求項３５】
アミロイドβペプチドの該減少が血漿中で達成される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
アミロイドβペプチドの該減少がＣＳＦ中で達成される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
アミロイドβペプチドの該減少がＣＮＳ中で達成される、請求項３４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質およびアルツハイマー病患者の酵素的処置におけるその使用に関する。該融合タンパク質は、アミロイドベータ(Ａβ)ペプチドを開裂する成分、血漿半減期を調節する他の成分；および所望により、最初の２成分を結合させる第３の成分を含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、アミロイドペプチドとアミロイドペプチドを特異的に認識する酵素を反応させ、アミロイドペプチドをその分解および修飾を介して不活性化する、アミロイドプラーク形成および／または成長の予防方法に関する。本発明は、さらに、改善された触媒活性および／または選択性を有し、さらに長時間の血漿中活性を有する最適化アミロイドペプチド分解酵素を投与することによる、アルツハイマー病の処置方法に関する。本発明はまた、医学治療の分野、特に神経変性疾患の分野に関し、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を有する患者における脳アミロイドのクリアランス機構を誘導する方法を提供する。さらに、本発明は、かかる機構の誘導に有用なタンパク質およびペプチドの使用に関する。
【０００３】
本発明は、Ａβペプチド分解分子が、安定性および血漿半減期を調節する分子を結合することにより、どのようにして治療に適切な薬剤となることができるかを記載する。本明細書に記載のＡβペプチド分解分子は、全体として、有効な治療剤として有用であるには血漿半減期が短か過ぎる。しかしながら、これらの分解分子と、本明細書に記載され、かつ例示されたモジュレーター分子を組み合わせ、これらの最適化アミロイドペプチド分解酵素融合タンパク質を投与することによりアルツハイマー病を有効に処置するのに使用できる機能的薬剤が製造される。
【０００４】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病(ＡＤ)は、患者の生活に強い消耗性の影響を与える。さらに、これらの疾患は、保健的、社会的および経済的に多大の負担となる。ＡＤは、６５歳以上の人口の約１０％、そして８５歳を超える人口の最大４５％に影響する最も一般的な年齢関連性神経変性状態である(Vickers et al., Progress in Neurobiology 2000, 60:139-165)。現在、これは米国、欧州および日本で、推定で総計１２００万症例に達する。この状況は、先進国の高齢者数の人口統計上の増加と共に不可避的に悪化する。ＡＤに罹患した患者の脳で起こる神経病理学的特徴は、老人斑、および異常な線維状構造の出現および神経原線維のもつれの形成を伴って起こる顕著な細胞骨格変化である。家族性および散発性症例両方が、神経機能の障害および神経細胞の逸失を伴うと信じられている、脳における細胞外繊維状β−アミロイドの沈着を共通の病理学的特徴として共有する(Younkin S. G., Ann. Neurol. 37, 287-288, 1995; Selkoe, D. J., Nature 399, A23-A31, 1999; Borchelt D. R. et al., Neuron 17, 1005-1013, 1996)。Βアミロイド沈着物は、数種のアミロイドβペプチド(Ａβ)から成り、特にＡβ４２はアミロイド斑で進行的に沈着する。ＡＤは、記憶形成障害に始まり、最終的に高度認知機能の完全な喪失に至る、進行性の疾患である。ＡＤの病因の特徴的性質は、特定の脳領域および神経細胞亜集団の、変性過程への選択的脆弱性である。特に、側頭葉領域および海馬が初期に影響を受け、疾患の進行に伴いより強く影響を受ける。他方、前頭皮質、後頭皮質および小脳内のニューロンはほとんど無傷のままであり、神経変性から保護されている(Terry et al., Annals of Neurology 1981, 10:184-192)。
【０００５】
遺伝的証拠は、Ａβ４２の量的増加が、全てはないにしても、多くの家族性ＡＤをもたらす遺伝的環境において生じることを示唆し(Borchelt D. R. et al., Neuron 17, 1005- 1013, 1996;Duff K. et al., Nature 383, 710-713, 1996;Scheuner D. et al. , Nat. Med. 2, 864-870, 1996;Citron M. et al., Neurobiol. Dis. 5, 107-116, 1998)、アミロイド形成が、Ａβ４２の産生増加もしくは分解減少またはその両方により生じる可能性を指摘する(Glabe, C., Nat. Med. 6, 133-134, 2000)。ＡＰＰの遺伝子、プレセニリン−１およびプレセニリン−２における遺伝的欠陥に起因する早期発症型ＡＤの稀な症例が存在するが、優勢な形態である遅発型散発性ＡＤは、今日まで病因が未知である。しかしながら、個体がＡＤに罹りやすくなるいくつかの危険因子が同定されており、その中で最も著名であるのは、アポリポタンパク質Ｅ(ＡｐｏＥ)のイプシロン４対立遺伝子およびシスタチンＣのＢ対立遺伝子である。神経変性障害の遅発性および複雑な病因は、治療剤の開発に困難なチャレンジを提起する。
【０００６】
現在、ＡＤに対する治療法はなく、高い確実性で生前にＡＤを診断する方法すらない。しかしながら、βアミロイドの形成を減少させ (Vassar, R. et al., Science 286, 735-41, 1999)またはその脳からのクリアランスを加速する機構を活性化するためにデザインされた薬剤の開発のために、βアミロイドが主要な標的となっている。
【０００７】
しかしながら、Schenk et al. (Nature, vol. 400, 173-177, 1999;Arch. Neurol., vol. 57, 934-936, 2000)による最初の実験結果は、ＡＤに対する新規処置戦略の可能性を示唆している。変異体ヒトＡＰＰ(７１７位のアミノ酸が、正常のバリンではなくフェニルアラニンである)を過剰発現するＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスは、ＡＤの神経病理学的特徴の多くを、年齢および脳領域依存的態様で発現する。トランスジェニック動物を、ＡＤ型神経病理学的発現前(６週齢)またはアミロイドβ沈着およびその後いくつかの神経病理学的変化が確立された高齢期(１１ヶ月齢)のいずれかの時点で、Ａβ４２により免疫した。若年動物の免疫化は、実質的にβアミロイド斑形成、神経突起ジストロフィーおよびアストログリオーシス(astrogliosis)の進展を防止した。高齢動物の処置もまた、これらのＡＤ様神経病理学的変化の程度および進行を顕著に低下させた。Ａβ４２免疫化は抗Ａβ抗体の産生をもたらし、Ａβ免疫反応性単核／ミクログリア細胞が、残存している斑の領域で観察されることが示された。しかしながら、能動的免疫化法は、ヒトで重篤な副作用および未だ知られていない合併症を必然的に伴う可能性がある。
【０００８】
Bard et al. (Nature Medicine, Vol. 6, Number 8, 916-919, 2000)は、アミロイドβペプチドに対する抗体の末梢投与がアミロイド堆積を軽減するのに十分であることを報告している。受動的に投与された抗体は、相対的に高くない血清濃度でありながら、血液脳関門を通過し、中枢神経系に入り、斑を変化させ、既存するアミロイドのクリアランスを誘導できた。しかしながら、βペプチドに対する受動的免疫化でさえも、ヒト患者に望ましくない副作用を起こし得る。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、アルツハイマー患者を処置するための組換えタンパク質に関する。Ａβペプチドの代謝における同化および異化経路の間のバランスは微妙である。相当な努力がＡβペプチドの産生に焦点を絞ってなされているが、現在まで、これらのペプチドのクリアランスに対してはほとんど努力がなされていない。細胞外Ａβペプチドの除去は、細胞性内部移行および細胞外分解の２種の一般的機構を介して進行するように思われる。本発明は、アミロイドβペプチドの自然異化工程を補う新規アプローチを記載する。
【００１０】
DeMattos(PNAS 98: 8850-8855. 2001)は、Ａβペプチドが、血漿中の該ペプチドの濃度を減少させることにより、間接的にＣＮＳから除去できると述べた“sink”仮説を立てている。彼らは、血漿中でＡβペプチドと結合し、それにより、ＡβをＣＮＳから隔離する抗体を使用した。このことは、抗体がＡβの血漿からＣＮＳへ移行することを妨げ、また血漿中の遊離Ａβ濃度の低下により血漿とＣＮＳの間の平衡が変化することにより達成される。抗体ではないアミロイド結合剤もまた、血漿中での結合を介してＣＮＳからアミロイドβペプチドを除去するのに有効であることが示されている。Matsuoka et al. (J. Neuroscience, Vol. 23: 29-33, 2003)は、血漿Ａβを隔離し、それにより脳アミロイド症を軽減または予防する、２種のアミロイドβペプチド結合剤、ゲルゾリンおよびＧＭ１を使用したデータを提示している。
【００１１】
Ａβペプチドを除去または排除するための他のアプローチは、アミロイドβペプチドを、よりクリアランスを受けやすい、無毒または低毒性の小さなフラグメントに分解する分解酵素の使用である。Ａβペプチドのこの酵素的消化もまた、血漿中のアミロイドβペプチドの遊離濃度の減少による、“sink”仮説の機構を介して働く。しかしながら、ＣＮＳおよび／またはＣＳＦにおけるアミロイドβペプチドの直接クリアランスの可能性もある。このアプローチは、Ａβの遊離濃度を減少させるだけでなく、当該環境から完全長ペプチドを直接排除もする。このアプローチは、抗体のようなアミロイドβペプチド結合剤を使用した場合に見られるように、血漿中のＡβの全(遊離および結合)濃度を増加させないため、有利である。Ａβ−ペプチドを複数部位で分解する酵素、例えばＮＥＰ(Leissring et al., JBC. 278: 37314-37320, 2003)が文献に存在する。複数部位でのＡβペプチドの分解は、血流から容易に浄化される小フラグメントを産生する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】アミロイドβ１−４０ペプチド(最終濃度３００nM)の市販ネプリライシン(２.４μg／ml)またはＦｃ−ネプリライシン融合タンパク質(２.４μg／ml)による緩衝液中での分解。
【図２】モルモット血漿中のＨｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐ(SPL061128)およびネプリライシン(R&D systems)によるＡβ４０分解。Ｈｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐの２種の濃度を使用し、Ａβ４０レベルを４時間後に測定する。市販ネプリライシンをポジティブコントロールとして使用し、ホスホラミドンをネプリライシン特異的阻害剤として使用する。
【図３】モルモット血漿中のＨｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐ(SPL061128)およびネプリライシン(R&D systems)によるＡβ４２分解。Ｈｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐの２種の濃度を使用し、Ａβ４２レベルを４時間後に測定する。市販ネプリライシンをポジティブコントロールとして使用し、ホスホラミドンをネプリライシン特異的阻害剤として使用する。
【図４】ヒト血漿中のＨｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐ(SPL061128)およびネプリライシン(R&D systems)によるＡβ４０分解。Ｈｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐの２種の濃度を使用し、Ａβ４０レベルを４時間後に測定する。市販ネプリライシンをポジティブコントロールとして使用し、ホスホラミドンをネプリライシン特異的阻害剤として使用する。
【図５】市販ネプリライシンと比較したＦｃ−Ｎｅｐ融合タンパク質のＰＫプロファイル(経時的血漿濃度)である。マウスに１mg／kgの市販ネプリライシンまたは１あるいは５mg／kgの社内で製造したＦｃ−Ｎｅｐを投与した。
【図６】ネプリライシン−Ｆｃ(ＦｃのＣ末端融合)と比較した、Ｆｃ−ネプリライシン(ＦｃのＮ末端融合)の発現からの細胞媒体における酵素活性。脚注：ＰＣＥＰ４ＧＷ−Ｎｅｐ−Ｆｃ：ｐＣＥＰ４プラスミドから発現されたネプリライシン−Ｆｃ；ＰＥＡＫ１０ＧＷ−Ｎｅｐ−Ｆｃ：ｐＥＡＫ１０プラスミドから発現されたネプリライシン−Ｆｃ；ｃｏｍ.Ｎｅｐ：ポジティブコントロール、市販ネプリライシン；ＰＣＥＰ４ＧＷ−Ｆｃ−Ｎｅｐ：ｐＣＥＰ４プラスミドから発現されたＦｃ−ネプリライシン；ＰＥＡＫ１０ＧＷ−Ｆｃ−Ｎｅｐ：ｐＥＡＫ１０プラスミドから発現されたＦｃ−ネプリライシン。
【図７】Ｆｃ−Ｎｅｐでの急性処置ならびにポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤M550426での処置後の雌ＡＰＰＳＷＥ−ｔｇマウスの血漿中の可溶性Ａβ４０レベル。
【図８】Ｆｃ−Ｎｅｐでの急性処置ならびにポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤M550426での処置後の雌ＡＰＰＳＷＥ−ｔｇマウスの血漿中の可溶性Ａβ４２レベル。
【図９】ネプリライシン−Ｆｃ(ＦｃのＣ末端融合)と比較した精製タンパク質Ｆｃ−ネプリライシン(ＦｃのＮ末端融合)の酵素活性。脚注：Ｎｅｐ−Ｆｃ：ネプリライシンのＣ末端部分におけるＦｃに融合したネプリライシン；Ｆｃ−Ｎｅｐ：ネプリライシンのＮ末端部分におけるＦｃに融合したネプリライシン。
【図１０】ｈＦｃ−Ｎｅｐでの急性処置ならびにポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤M550426での処置後の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のマウスＡβ４０レベル。
【図１１】雌Ｃ５７ＢＬ６マウスへのｈＦｃ−Ｎｅｐの１回注射後種々の時点での血漿中のＡβ４０レベル。パーセンテージは、媒体と比較した減少を示す。ＨＦｃ−Ｎｅｐの暴露は、図中の各処置群の棒上に示す。ポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤M550426での処置効果を赤色で示す。ＬＯＱ線は、本アッセイの定量限界を示す。
【図１２】雌ＡＰＰＳＷＥ−トランスジェニックマウスへのｍＦｃ−Ｎｅｐ１回注射後種々の時点(１.５〜３３６時間まで)での血漿中の平均Ａβ４０(Ａ)およびＡβ４２レベル(Ｂ)。パーセンテージは、媒体と比較した減少を示す。表(Ｃ)は、各群についての血漿暴露を示す。ポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤M550426での処置効果を赤色で示す。ＬＯＱ棒は本アッセイでの定量限界を示す。データは、ＡＮＯＶＡモデルの両側ｔ検定を使用して、固定因子として時間および投与量を用いて解析した(＊  ｐ＜０.０５；＊＊  ｐ＜０.０１および＊＊＊  ｐ＜０.００１およびｎ.ｓ. 非有意)。
【図１３】全時点(１.５〜３３６時間)での媒体のパーセンテージとしてのＡβ４０およびＡβ４２各々の血漿有効性効果、ならびに、対応するｍＦｃ−Ｎｅｐの血漿暴露を示す薬物動態学的および薬力学的模式図。各図の線は予測される暴露および効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ｍＦｃ−Ｎｅｐは、５および２５mg／kgの両方で、全時点(１.５時間、１６８時間および３３６時間)で血漿中のマウスＡβ４０を有意に減少させる(図１４)。１６８時間および３３６時間の両方で、５および２５mg／kgの両方を分析し、Ａβ４０効果は用量依存性であることが示される。２週間後、２５mg／kg  ｍＦｃ−Ｎｅｐの１回注射(３３６時間)は、媒体と比較して、血漿マウスＡβ４０レベルを、７３％まで有意に減少させた。この時点での血漿暴露は４８μg／mlであり、それ故にｍＦｃ−Ｎｅｐは長い血漿半減期を有することを示す。
【図１４】雌Ｃ５７ＢＬ６マウスへのｍＦｃ−Ｎｅｐの１回静脈内注射後種々の時点(１.５、１６８および３３６時間)での血漿中の平均Ａβ４０レベル。パーセンテージは、媒体と比較した減少を示す。右側の表は、各群についての血漿暴露を示す。ポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤M550426での処置効果を赤色で示す。ＬＯＱ棒は本アッセイでの定量限界を示す。データは、ＡＮＯＶＡモデルの両側ｔ検定を使用して、固定因子として時間および投与量を用いて解析した(＊  ｐ＜０.０５；＊＊  ｐ＜０.０１、  ＊＊＊  ｐ＜０.００１およびｎ.ｓ. 非有意)。
【図１５】社内で製造したネプリライシンと比較したＦｃ−Ｎｅｐ融合タンパク質のＰＫプロファイル(経時的血漿濃度)。マウスに、１回静脈内注射で、１０または５０nmol酵素／kg体重ネプリライシン(Ｎｅｐ)またはＦｃ−Ｎｅｐ(１および５mg／kg)をマウスに投与した。
【図１６】ヒト血漿またはＡＰＰｓｗｅ−ｔｇマウス血漿における、ヒトまたはマウスＦｃ−ネプリライシンによるアミロイドβペプチド１−４０または１−４２の分解を記載する表。ヒトまたはマウスＦｃ−ネプリライシンの分解のＥＣ５０(μM)および最高(１００μg／mL)濃度での分解％。結果は、２〜３回の独立した実験に基づく。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の開示
本発明の目的は、Ａβペプチドを分解できる融合タンパク質を提供することである。従って、本発明は、アミロイドベータペプチドを、該アミロイドベータペプチドアミノ酸配列の１個所以上の開裂部位で分解できる、式Ｍ−Ａ(ここで、Ｍは、融合タンパク質の半減期を延長するタンパク質成分であり、そして、Ａはアミロイドベータペプチドを分解するタンパク質成分であり、該Ｍタンパク質成分は、Ａタンパク質成分のＮ末端部分に共有結合している)を有する融合タンパク質を提供する。
【００１４】
本発明の一つの局面において、Ａがプロテアーゼである、融合タンパク質が提供される。
【００１５】
本発明の他の局面において、Ａがヒトネプリライシンである、融合タンパク質が提供される。
【００１６】
本発明の他の局面において、Ａがヒトネプリライシンであり、該ネプリライシンが細胞外ネプリライシンである、融合タンパク質が提供される。
【００１７】
本発明の他の局面において、Ａが配列番号１、２、３または４のいずれか一つに従うアミノ酸配列を含む細胞外ネプリライシンである、融合タンパク質が提供される。
【００１８】
本発明の他の局面において、Ａがインスリン分解酵素である、融合タンパク質が提供される。
【００１９】
本発明の他の局面において、Ａがエンドセリン−変換酵素１である、融合タンパク質が提供される。
【００２０】
本発明の他の局面において、Ａが足場タンパク質である、融合タンパク質が提供される。
【００２１】
本発明の他の局面において、Ｍが抗体のＦｃ部分である、融合タンパク質が提供される。この局面の一つの態様において、該抗体はＩｇＧ抗体である。この局面の他の態様において、該抗体はＩｇＧ２抗体である。
【００２２】
本発明の他の局面において、ＭがＩｇＧ２抗体由来のＦｃ部分であり、そしてＡが細胞外ネプリライシンである、融合タンパク質が提供される。
【００２３】
本発明の他の局面において、配列番号１１に従うアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供される。
【００２４】
本発明の他の局面において、ＭがＩｇＧ２抗体由来のＦｃ部分であり、そしてＡがインスリン分解酵素である、融合タンパク質が提供される。
【００２５】
本発明の他の局面において、配列番号１２に従うアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供される。
【００２６】
本発明の他の局面において、ＭがＩｇＧ２抗体由来のＦｃ部分であり、そしてＡがエンドセリン−変換酵素１である、融合タンパク質が提供される。
【００２７】
本発明の他の局面において、配列番号１３に従うアミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供される。
【００２８】
本発明の他の局面において、Ｍがペグ化およびグリコシル化から選択される、融合タンパク質が提供される。
【００２９】
本発明の他の局面において、ＭがＨＳＡである、融合タンパク質が提供される。
【００３０】
本発明の他の局面において、ＭがＨＳＡ結合ドメインである、融合タンパク質が提供される。
【００３１】
本発明の他の局面において、Ｍが抗体結合ドメインである、融合タンパク質が提供される。
【００３２】
本発明の他の局面において、ＭおよびＡが一体となってリンカーＬに結合する融合タンパク質が提供される。
【００３３】
本発明の他の局面において、Ｌがペプチドおよび化学リンカーから選択される、融合タンパク質が提供される。
【００３４】
本発明の他の局面において、アミロイドβペプチド濃度を減少させる方法が提供され、該方法は、本発明の融合タンパク質を投与することを含む。この局面の一つの態様において、アミロイドβペプチドの該減少は血漿中で達成される。この局面の他の態様において、アミロイドβペプチドの該減少はＣＳＦ中で達成される。この局面のさらに他の態様において、アミロイドβペプチドの該減少はＣＮＳ中で達成される。
【００３５】
本発明の他の局面において、薬学的に許容される量の本発明の融合タンパク質を薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む、アミロイドβペプチドを分解できる医薬組成物が提供される。
【００３６】
本発明の他の局面において、アミロイドβペプチドの分解が有利である状態の予防および／または処置方法であって、かかる予防および／または処置を必要とするヒトを含む哺乳動物に、治療的有効量の本発明の融合タンパク質を投与することを含む、方法が提供される。
【００３７】
本発明の他の局面において、アルツハイマー病、全身性アミロイドーシスまたは脳アミロイド血管症の予防および／または処置方法であって、かかる予防および／または処置を必要とするヒトを含む哺乳動物に、治療的有効量の本発明の融合タンパク質を投与することを含む、方法が提供される。
【００３８】
本発明の他の局面において、医学的治療において使用するための本発明の融合タンパク質が提供される。
【００３９】
本発明の他の局面において、アミロイドβペプチドの分解が有益である状態の予防および／または処置用医薬の製造における、本発明の融合タンパク質の使用が提供される。
【００４０】
本発明の他の局面において、アルツハイマー病、全身性アミロイドーシスまたは脳アミロイド血管症の予防および／または処置用医薬の製造における本発明の融合タンパク質の使用が提供される。この局面の一つの態様において、該医薬はアミロイドβペプチド濃度を減少させる。アミロイドβペプチドの該減少は血漿、ＣＳＦおよび／またはＣＮＳ中で達成される。
【００４１】
本明細書を通して使用される用語は、特定の例で異なる限定がなされていない限り、次の通り定義する。
【００４２】
用語“モジュレーター”は、治療的タンパク質の分解を防止するおよび／または血漿半減期を伸ばす、特性を低下させる、免疫原性を低下させる、または生物学的活性を増加する分子を意味する。例示的モジュレーターは、Ｆｃドメインならびに直鎖状ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリリシン、デキストランなど)；分枝鎖ポリマー(例えば、米国特許４,２８９,８７２、米国特許５,２２９,４９０；ＷＯ９３／２１２５９参照)；脂質；コレステロールのグループ(例えばステロイド)；炭水化物またはオリゴサッカライド；またはサルベージ受容体に結合する任意の天然または合成タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。グリコシル化はまた、融合タンパク質のサイズを増加することにより、主に、クリアランス機構の変化により、血漿半減期を延長できるモジュレーターの例である。モジュレーターはまた、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)結合成分も含んでよく、これは、その結果融合タンパク質の血漿半減期を延長する。
【００４３】
用語“タンパク質”または“タンパク質成分”は、アミノ酸配列中の任意の可能な部位でのタンパク質切断によりアミロイドβペプチドを分解する触媒活性を有する分子を意味する。タンパク質の例は、ネプリライシン酵素ならびにアミロイドβペプチドを分解する他の触媒的活性酵素を含む。触媒的抗体もまたタンパク質部分として使用できる。タンパク質は、任意の種(例えばヒト、サル、マウス)由来の天然に存在する変異体でも、合理的設計または分子進化技術を使用して設計した変異体でもよい。タンパク質分子は、異なる多型またはスプライス変異体でもよい。タンパク質分子はまた、任意の種からの天然に存在する変異体の改良した変異体でもよい。特にタンパク質は、活性増加、アミロイドベータペプチドに対する選択性改善および増加した安定性および／または低下した阻害による血漿中の長期の活性のような改善された特性を達成するために、アミノ酸置換により構造を修飾されているネプリライシンの改良された変異体であり得る。
【００４４】
用語“融合体”は、モジュレーター分子およびタンパク質分子から成る分子を意味する。モジュレーターは、タンパク質部分に共有結合し、融合タンパク質を作り得る。タンパク質をモジュレーター部分に結合するために非共有アプローチも使用してよい。
【００４５】
用語“分解し”、“分解する”または“分解”は、１個の出発分子が２個以上の分子に分かれる工程を意味する。より具体的に、アミロイドβペプチド(アミノ酸１−４３またはそれより小さい任意のサイズ)を、開裂して、出発分子と比較して小さいフラグメントを作る。開裂は、ペプチド結合の加水分解または、分子を小さい部分に分ける他のタイプの反応を介して達成できる。
【００４６】
用語“天然Ｆｃ”は、単量体形であれ多量体形であれ、全抗体の消化に由来する非抗原結合フラグメントの配列を含む分子または配列を意味する。天然Ｆｃの最初の免疫グロブリン源は、ヒト起源でよく、そして任意の免疫グロブリンでよいが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃは、共有(すなわち、ジスルフィド結合)および非共有結合により二量体または多量体に結合し得る単量体ポリペプチドから成る。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合数は、クラス(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ)またはサブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２)によって１〜４個の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化によりもたらされるジスルフィド結合した二量体である(Ellison et al. (1982), Nucleic酸s Res. 10:4071-9参照)。本明細書で使用する用語“天然Ｆｃ”は、単量体、二量体、および多量体形態の総称である。
【００４７】
用語“Ｆｃ変異体”は、天然Ｆｃから修飾されているが、サルベージ受容体、ＦｃＲｎへの結合部位をまだ含む分子または配列を意味する。公報ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８は、例示的Ｆｃ変異体、ならびにサルベージ受容体との相互作用を記載し、引用により本明細書に包含させる。それ故、用語“Ｆｃ変異体”は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を含む。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要ではない構造特性または生物学的活性を提供するために、除去し得る部位を含む。それ故、用語“Ｆｃ変異体”は、(１)ジスルフィド結合形成、(２)選択した宿主細胞との不適合性、(３)選択した宿主細胞において発現した際のＮ末端不均一性、(４)グリコシル化、(５)補体との相互作用、(６)サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または(７)抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)が影響を受けたまたは改善された、天然Ｆｃ部位または残基の１個以上を欠く分子または配列を含む。Ｆｃ変異体は、後記にさらに詳述する。
【００４８】
用語“Ｆｃドメイン”は、天然Ｆｃおよび上記で定義の通りのＦｃ変異体分子および配列を含む。Ｆｃ変異体および天然Ｆｃと同様、用語“Ｆｃドメイン”は、全抗体から消化されたものであれ、他の手段で製造したものであれ、単量体または多量体形の分子を含む。
【００４９】
用語“薬理学的に活性”は、そのように記載されている物質が、医学的パラメーター(例えば、血圧、血球数、コレステロールレベル)または疾患状態(例えば、癌、自己免疫性障害、認知症)に影響する活性を有することが決定されていることを意味する。
【００５０】
用語“アミロイドベータペプチド”、“Ａβペプチド”または“アミロイドβペプチド”は、配列中のアミノ酸６７２〜７１４(アミノ酸１−４３)に対応するヒトＡβＡ４タンパク質[前駆体]中のアミノ酸配列(一文字表記) DAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIATと相関するペプチドの任意の形態を意味する。このペプチドの任意の短形態、例えば１−３８、１−４０および１−４２を含むが、これらの形態に限定されない。さらに、アミロイドβペプチドには、数種の天然に存在する形態がある。アミロイドβペプチドのヒト形態はＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３と呼ばれる。これらのペプチドの配列およびＡＰＰ前駆体との関係は、Hardy et al., TINS 20, 155-158(1997)の図１に説明されている。例えば、Ａβ４２は次の配列を有する：
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala-OH。Ａβ４１、Ａβ４０およびＡβ３９は、各々Ｃ末端からのＡｌａ、Ａｌａ−Ｉｌｅ、およびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌの脱落によりＡβ４２と異なる。Ａβ４３は、Ｃ末端のスレオニン残基の存在によりＡβ４２と異なる。全体として、アミロイドベータペプチドは、アルツハイマー病を引き起こすプラーク形成に含まれるペプチド形態を意味する。
【００５１】
用語“半減期”は、融合タンパク質の最初の濃度の半分が血漿から除かれるのにかかる時間により規定される。本発明は、血漿半減期を調節する方法を記載する。かかる修飾は、改善された薬物動態学的特性(例えば、増加したインビボ血清半減期)を有する融合タンパク質を生じ得る。半減期の延長は、融合タンパク質の最初の濃度の半分が血漿から除かれるかクリアランスを受けるのにより長い時間かかることを意味する。医薬または化学化合物の半減期は十分に定義され、当分野で既知である。
【００５２】
用語“結合”は、２個以上の部分の間の共有または可逆性結合を意味する。共有結合は、例えばペプチド結合、ジスルフィド結合、炭素−炭素カップリングまたは複数原子間の共有結合が基礎である任意のタイプの結合であってよい。可逆性結合は、例えばビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原または、当分野で既知の可逆性結合として分類される結合であり得る。例えば、共有結合は、融合タンパク質のタンパク質部分とモジュレーター部分が、同じプラスミド由来の組み換え形態であり、それ故結合がＤＮＡレベルで設計されるとき、直接得られる。
【００５３】
用語“共有的に結合した”は、２原子間の結合であって、それらの間の電子が共有されている化学結合を意味する。共有的に結合した結合の例はペプチド結合、ジスルフィド結合、炭素−炭素カップリングである。融合タンパク質は、結合が、融合タンパク質が産生されるときリボソーム上の翻訳工程中に達成され得るとき、ポリペプチド結合により一体となって結合し得る。共有的に結合した成分の他のタイプは、タンパク質上のアミノ残基(例えばリシン)に共有結合するペグ化試薬での修飾であり得る。化学カップリング反応は、例えば、アシル化または、２成分を融合タンパク質に結合する他の適当なカップリング反応であり得る。共有的に結合はまた、モジュレーターがタンパク質部分と共に結合する、２個の部位でのリンカーの結合も意味し得る。
【００５４】
用語“開裂部位”は、タンパク質または酵素により開裂できるペプチド配列中の特異的位置／部位を意味する。開裂は、通常、２個のアミノ酸を結合するペプチド結合の加水分解により生じる。開裂はまた、タンパク質または酵素を１個または組み合わせて使用して、同じペプチドに複数個所起こり得る。開裂部位は、また、ペプチド結合以外の部位であってもよい。本発明は、アミロイドβペプチドの開裂を詳述する。
【００５５】
用語“結合ドメイン”は、治療的に適切な親和性を有するアミロイドβペプチドを結合する分子を意味する。これらの分子は、アミロイドβペプチドに、約１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１以上の結合親和性で結合する。典型的結合ドメインは、抗体(例えば全てＣＤＲ領域を含む一ドメインであるＦａｂ、ｓｃＦｖ)、本明細書または文献に記載の足場タンパク質またはアミロイドβペプチドに親和性を有する合成により製造した分子であり、これに限定されない。
【００５６】
用語“プロテアーゼ”は、ペプチド結合の加水分解に作用する全てのタンパク質分子を意味する。それは、天然に存在するタンパク分解性酵素、ならびに部位特異的または無作為変異誘発または任意の他のタンパク質工学法により得られたその変異体、タンパク分解性酵素の任意のフラグメント、または前記タンパク質の１個を含む任意の分子複合体または融合タンパク質を含む。プロテアーゼはセリン、システイン、アスパラギンまたはメタロプロテアーゼであり得る。
【００５７】
用語“基質”または“ペプチド基質”は、プロテアーゼにより触媒的に加水分解され得るペプチド結合を含む、任意のアミノ酸組成、配列または長さの任意のペプチド、オリゴペプチド、またはタンパク質分子を意味する。加水分解されるペプチド結合は、“開裂部位”と呼ぶ。基質中の位置の番号付けは、Schlechter & Berger(Biochem. Biophys. Res. Commun. 27(1967) 157-162)により導入された系に従い行う。開裂部位に隣接したＮ末端側のアミノ酸残基をＰ１、Ｐ２、Ｐ３などと番号付けし、開裂部位に隣接したＣ末端側の残基をＰ１'、Ｐ２'、Ｐ３'などと番号付けする。本発明の基質またはペプチド基質はアミロイドβペプチドである。
【００５８】
用語“特異性”は、タンパク質またはプロテアーゼが、あるペプチド基質を、他のものは未開列のまま選択的に認識し、加水分解する能力を意味する。特異性は、定質的および定量的に表現できる。“定質的特異性”は、ペプチド基質の特定位置でのプロテアーゼにより許容されるアミノ酸残基の種類を意味する。全ての可能性のあるペプチド基質の小さい部分のみしか許容しないプロテアーゼは、“高い特異性”を有する。ほとんど全てのペプチド基質を許容するプロテアーゼは、“低い特異性”を有する。非常に低い特異性のプロテアーゼは、“非特異的プロテアーゼ”と呼ぶ。
【００５９】
用語“発生させたプロテアーゼ”は、無作為ＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリングまたはＤＮＡ／ＲＮＡレベルで多様性を生じる他のタイプの方法を使用して得られた全てのプロテアーゼをいう。これらのアプローチを記載する文献は、例えば；D.A. Drummond, B.L. Iverson, G. Georgiou and F.H. Arnold, Journal of Molecular Biology 350:806-816(2005) and S. McQ and D.S. Tawfik, Biochemistry 44:5444-5452(2005)。生じた多様性からスクリーニングおよび選択を行うための種々のアプローチもまた文献に記載されている(例えばDirected Enzyme Evolution: Screening and Selection Methods (Methods in Molecular Biology) Editors: Frances H Arnold and George Georgiou. Volume 230, 2003およびその中の引用文献)。種々の戦略を使用して、既知のおよび未知の阻害剤からの増加した安定性、増加した活性、改善された選択性および低下した阻害のような特性を選択できる。
【００６０】
用語“改善されたプロテアーゼ”は、必要であるならば、高い触媒活性を有する全てのプロテアーゼ変異体を意味する。しかしながら、いくつかの例では、低い触媒活性が好ましいことがある。改善されたプロテアーゼはまた、最初のプロテアーゼよりも、ある基質を、他の基質と比べてより効率的に開裂する変異体を意味する。改善されたは、より最適化された医薬化合物を得るために触媒活性および／または選択性のようなより好ましい特性を意味する。改善されたプロテアーゼはまた、例えば血漿(インビトロおよびインビボの両方またはいずれかで)で増加した安定性を有する変異体も意味する。改善されたプロテアーゼはまた、例えば血漿(インビトロまたはインビボの両方またはいずれか)での不活性化が低い変異体も意味する。低い不活性化は、開裂に感受性が低い、変化したアミノ酸配列により、プロテアーゼのタンパク質分解性分解を低下させることにより達成できる。低下したタンパク分解性分解はまた、タンパク質表面を、タンパク質を開裂から保護するために、例えばペグ化および／またはグリコシル化で修飾することにより達成できる。低下した不活性化は、また既知または未知阻害剤によるプロテアーゼの阻害を低下させることによっても達成される。未知血漿阻害剤の低下した阻害は、直接血漿中のプロテアーゼ活性の低下した阻害にいついて変異体をスクリーニングすることにより達成できる。
【００６１】
用語“ヒトネプリライシン”は、ヒトネプリライシンのすべての天然形態を意味する。これはまたヒト集団で自然に起こる全てのスプライスおよび多型変異体を含む。ヒトネプリライシンの多くの形態が本明細書に記載されている(配列番号１〜４)。本用語はまた、ヒトネプリライシンのフラグメントまたは伸長された変異体、ならびに“改善されたプロテアーゼ”の下に記載されているような、ヒトネプリライシンの改善された変異体も含む。
【００６２】
用語“足場タンパク質”は、アミロイドβペプチドを結合する全てのタンパク質を意味する。足場タンパク質の例は、テンダミスタット、アフィボディ、アンチカリンおよびアンキリンである。これらの足場タンパク質は、典型的に厳密なコア構造および結合因子の同定のために無作為化できる部分、ループ、表面または空洞に基づき設計され、そして基づいている。これらの足場タンパク質は、文献に十分に記載されている。
【００６３】
本発明は、最適化組み換えＡβ分解酵素の投与が、Ａβの脳レベルを減少させることによりアミロイドプラーク形成を阻害する可能性を示唆する。その結果、アミロイド斑関連アストログリオーシスも減少する。
【００６４】
本発明の一つの局面において、本治療化合物は完全にヒト起源である。融合タンパク質は、免疫原性活性の可能性が最も低いリンカーを使用して、一緒に結合した複数の完全なヒトタンパク質から成る。
【００６５】
抗体のような結合分子と比較して分解性酵素を使用する利点は次の通りである：
・  アミロイドβペプチドと複合体化した結合分子が十分に速く浄化されず、アミロイドβペプチドの濃度が上昇する可能性がある場合の結合アプローチと比較して、アミロイドβペプチドの酵素での分解は、毒性効果を直接除く。これは、特にアミロイドβペプチド濃度が末梢性に上昇したとき危険である。
【００６６】
・  アミロイドβペプチドの触媒的分解は、結合よりも効率的にそのペプチドを除去する。アミロイドβペプチドを十分に除去するのに触媒量の分解酵素しか必要ではないが、抗体のような結合分子は、治療効果のために化学量論量が必要である。これは、治療的処置に必要な量に大きく影響する。
【００６７】
・結合分子が抗体であり、ＢＢＢを通過して斑中のアミロイドβペプチドとの結合を可能にするならば、危険な免疫学的応答が起こる可能性がある。他方、触媒的融合タンパク質は斑に結合せず、Ｆｃ反応性を使用することなく、遊離アミロイドβペプチドの濃度を減少させるだけである。それ故、触媒的酵素は遊離アミロイドβペプチドのプールのみを分解する。抗体のような結合剤は恐らくＣＮＳに入り、Ｆｃ活性を介して斑を分解する。これは、大量のアミロイドβペプチドが斑の近接部位に遊離され、それらが細胞に毒性であるならば、望ましくない。
【００６８】
Ａβ異化の一つの重要な酵素は、中性エンドペプチダーゼ−２４.１１またはＮＥＰとしても既知のネプリライシンである。Iwata et al. (Nature Medicine, 6:143-149, 2000)は、Ａβ１−４２ペプチドが、生化学分析的にネプリライシンと類似または同一のＮＥＰにより行われる限られたタンパク質分解を介して、完全に分解されることを示した。このことと一致して、ＮＥＰ阻害剤の点滴は、脳における内因性Ａβ４２の生化学的および病理学的沈着をもたらした。それゆえに、このＮＥＰが触媒するタンパク質分解がＡβ４２の異化率を限定することが判明した。
【００６９】
ＮＥＰは、エンケファリン類、タキキニン類、ブラジキニン、エンドセリン類および心房性ナトリウム利尿ペプチドを含む数種の生物学的活性ペプチドの不活性化に影響を与える９４kD、２型膜結合Ｚｎメタロペプチダーゼである。ＮＥＰは、ＣＮＳにおけるペプチド作動性ニューロンに存在し、脳でのその発現は細胞特異的方法で制御されている(Roques B. P. et al., Pharmacol. Rev. 45, 87-146, 1993;Lu B. et al., J. Exp. Med. 181, 2271-2275, 1995;Lu B. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 780, 156-163, 1996)。２型ＮＥＰ転写物はＣＮＳから無くなるが、１型および３型転写物は各々脳梁のニューロンおよびオリゴデンドロサイトに局在化する(Li C. et al., J. Biol. Chem. 270, 5723-5728, 1995)。プロテアーゼおよびエンドペプチダーゼのネプリライシンファミリーは、最近開示されたＮＥＰ  II遺伝子およびそのアイソフォーム(Ouimet T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 271:565-570, 2000)のようなＮＥＰの構造的または機能的に相同性のメンバーを含み、これらは、ＮＥＰを補完するパターンでＣＮＳに発現する。このファミリーのさらなるメンバーは、ＮＥＰ阻害剤ホスホラミドンにより有効に阻害される可溶性タンパク質であるＮＬ−１(ネプリライシン様１)である(Ghaddar G. et al., Biochem. J. 347:419-429, 2000)。
【００７０】
Ａβを異化することが知られている他の酵素も記載されている。亜鉛メタロペプチダーゼインスリン分解酵素(IDE, EC. 3.4.22.11)は、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２を、無害の生成物と考えられるものに分解する。ＩＤＥは真のペプチダーゼであって、タンパク質を加水分解しない。本酵素は、インスリンおよびインスリン関連ペプチド、β−エンドルフィン、およびＡβペプチドを含む、限られた数のペプチドをインビトロで開裂する。ＩＤＥは、生理学的Ａβ代謝酵素の一つであることが示唆されている(W. Q. Qui et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 32730-32738)。KurichkinおよびGoto(I. V. Kurochkin and S. Gato(1994) FEBS Lett. 345, 33-37)は、インスリン分解酵素がＡβ１−４０を加水分解できることを最初に報告した。この発見は２つの別々の研究で確認された(W. Q. Qui et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 32730-32738;およびJ. R. McDermottおよびA. M. Gibson(1997) Neurochem. Res. 22, 49-56)。さらに、最近Ａβ分解酵素として同定された(Yamin R. et al., J. Biol. Chem. 274, 18777-18784, 1999)メタロプロテアーゼ24.15も、またＡβ注入に応答して変化しなかった。関連性のない神経型Ｚｎメタロエンドペプチダーゼであるアンギオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)もＡβペプチド分解酵素の可能性があるとして記載されているが(Barnes N. M. et al., Eur. J. Pharmacol. 200, 289-292, 1991;Alvarez R. et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 67, 733-736, 1999;Amouyel P. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 903, 437-441, 2000)、Ａβに対する親和性は未知である(McDermott J. R. およびGibson A. M., Neurochem. Res. 22, 49-56, 1997)。カテプシンＢ(ＣａｔＢ)もまたＡβペプチドを分解することが示されている(Neuron. 2006 Sep 21;51(6):703-14)。
【００７１】
ネプリライシンとして使用された配列は、本タンパク質の細胞外部分であり得る。細胞外部分は、膜領域の外側として定義されるネプリライシンの一部として定義される。本発明はまた、アミロイドβペプチド分解成分としてのネプリライシンの全配列の使用も含む。本発明はまた、アミロイドβペプチドに対して触媒活性が保存されている限り、ネプリライシンのより小さなフラグメントも含む。本発明はまた、ネプリライシンの全ての多型変異体およびスプライス変異体も含む。本発明はまた、ネプリライシンの全ての改善された変異体も含む。
【００７２】
本発明は、Ａβペプチドを、それらがアミロイド斑を形成する前に、または少なくとも既に存在する斑のさらなる発達を防止するために加水分解するための、新規かつ別の戦略を記載する。存在する斑を、遊離Ａβペプチドとの平衡により、斑由来Ａβペプチドを加水分解することにより除くことも可能である。
【００７３】
本発明の他の態様は、高親和性でアミロイドβペプチドと結合する１個の部分を含む分子を記載する。この親和性は、結合親和性がマイクロモル濃度より低い。アミロイドβペプチドに対する結合親和性は、好ましくは結合親和性がナノモル濃度である。アミロイドβペプチドとの相互作用に関連する他の部分は、アミロイドβペプチドの構造の１個所以上の部分でアミロイドβペプチドを開裂する活性成分である。両方ともアミロイドβペプチドを認識する触媒的活性部分と一体となって結合する結合部分を組み合わせる理由は、結合部分がアミロイドβペプチドと結合し、それにより局所濃度を高め(結合部分および触媒的部分)がアミロイドβペプチドの解離形態と結合するためである。幾分かは、凝集形態に結合せずに解離形態に特異的に結合する。幾分かは、凝集および解離形態両方に結合する。かかる抗体の幾分かは、天然に存在するアミロイドβペプチドのＡβの短形態(すなわち共有結合的にまたは他の態様で一体となって)と結合し、二機能性分子に加工された結合のために、接近している活性部分により開裂される。アミロイドβペプチド結合成分とアミロイドβペプチド分解成分の間の結合は、好ましくはリンカー成分を伴い、または伴わずに血漿半減期モジュレーター成分が仲介する。
【００７４】
本発明のある態様において、本治療剤は、アミロイドβペプチドまたはアミロイド斑の他の成分と特異的に結合する融合タンパク質を含む。かかる化合物は、モノクローナルまたはポリクローナルまたは何らかのアミロイドβペプチド結合因子の一部であってよい。これらの化合物は、アミロイドβペプチドに約１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１以上の親和性で結合する。これらの結合成分は、好ましくはアミロイドβペプチド分解成分で結合されている。
【００７５】
本発明の一つの局面は、抗体の“Ｆｃ”ドメインと融合タンパク質中のアミロイドβペプチド分解成分の組み合わせに関する。抗体は、２個の機能的に独立した部分である、抗原と結合する“Ｆａｂ”として既知の可変性ドメイン、ならびに補体活性化および食細胞による攻撃のようなエフェクター機能と関連する“Ｆｃ”として既知の定常ドメインを含む。Ｆｃは長い血清半減期を有し、一方Ｆａｂは短命である(Capon et al. (1989), Nature 337:525-31)。治療的タンパク質と一緒に構築されたとき、Ｆｃドメインは長い半減期を提供するか、またはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体固定およびおそらく胎盤性輸送のような機能を組み込み得る。
【００７６】
本発明に従う好ましい分子は、ＮＥＰ関連タンパク質のようなＦｃに結合したアミロイドβペプチド分解タンパク質である。
【００７７】
タンパク質治療剤の、抗体のＦｃドメインとの融合による有用な修飾は、“治療剤としての修飾ペプチド(WO99/25044)”と題する刊行物に詳述されている。この刊行物は、ＰＥＧ、デキストラン、またはＦｃ領域のような“媒体”への結合を記載する。ＦｃドメインのＣ末端部分への結合は、可能性のあるアプローチとして文献に記載されている(Protein Eng. 1998 11:495-500)。これは、融合タンパク質のタンパク質部分上のＮ末端結合を可能にする。本発明はこのアプローチおよびインビボ効力について最適化された特性を有する融合タンパク質を得るためにこの戦略を使用する利点を記載する。
【００７８】
ＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体に特異的なＦｃ受容体(ＦｃＲ)の３クラス、すなわちＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIと相互作用する。好ましい態様において、融合タンパク質の免疫グロブリン(Ｉｇ)成分は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIまたはＦｃγＲIIIの少なくとも１個に低結合親和性を有するＩｇＧの定常領域の少なくとも一部分を有する。本発明の一つの局面において、Ｆｃ受容体に対する融合タンパク質の結合親和性は、細胞上のＦｃ受容体に対する結合親和性を減少させた融合パートナーとして重鎖アイソタイプを使用することにより減少させる。例えば、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両方とも、ＦｃＲγＩに高親和性で結合するが、一方ＩｇＧ４は１０倍低くしか結合せず、そしてＩｇＧ２はもはや結合しないことが報告されている。ＩｇＧのＦｃ受容体への結合に重要な配列はＣＨ２ドメインに局在化することが報告されている。それ故、好ましい態様において、延長されたインビボ循環半減期を有する抗体ベースの融合タンパク質は、少なくともＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインを、第二の非免疫グロブリンタンパク質に結合させることにより得る。例えば、４種の既知ＩｇＧアイソタイプの中で、ＩｇＧ１(Ｃγ１)およびＩｇＧ３(Ｃγ３)がＦｃＲγＩと高親和性で結合するが、ＩｇＧ４(Ｃγ４)は１０倍低い結合親和性を有し、そしてＩｇＧ２(Ｃγ２)はＦｃＲγＩいに結合しないことが知られている。
【００７９】
一つの態様において、融合タンパク質のＡβペプチド分解成分は酵素である。用語“酵素”は、本明細書においては、プロテアーゼまたはペプチダーゼとして活性であるタンパク質、そのアナログ、およびそのフラグメントを述べるために使用する。好ましくは、酵素はセリンプロテアーゼ、アスパラギンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼを含む。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、酵素的生物学的活性を示す。
【００８０】
他の態様において、免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖から成る群から選択される。
【００８１】
他の態様において、融合タンパク質中の抗体の定常領域は、ヒト起源であり、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４クラス、好ましくはＩｇＧ２またはＩｇＧ４クラスに由来する免疫グロブリンファミリーに属する。あるいは、他の他の哺乳動物、特に齧歯類または霊長類からのＩｇＧクラスに属する免疫グロブリンの定常領域を使用することも可能である；しかしながら、本発明によって、免疫グロブリンクラスＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＥの定常領域を使用することも可能である。典型的に、本発明の構築物に存在する抗体フラグメントは、ＦｃドメインＣＨ３、またはその一部、およびＦｃドメインＣＨ２の少なくとも一部分セグメントを含む。あるいは、成分(Ａ)として、二量体化のためにＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含む、本発明の融合構築物を企図することも可能である。
【００８２】
しかしながら、天然状態で見られる免疫グロブリン配列の誘導体、特に少なくとも１個の置換、欠失および／または挿入(ここでは用語“変異体”の下に合わせる)を含む変異体の使用も可能である。典型的に、かかる変異体は、天然配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。この状況で特に好ましい変異体は、各天然配列と比較して典型的に１０個未満、好ましくは５個未満、特に好ましくは３個未満の置換を含む置換変異体である。次の可能な置換を好ましいとして注意すべきである：ＴｒｐをＭｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＨｉｓまたはＴｙｒ、またはその逆；ＡｌａをＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕ、またはその逆；ＧｌｕをＧｌｎ、ＡｓｐまたはＡｓｎ、またはその逆；ＡｓｐをＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｎ、またはその逆；ＡｒｇをＬｙｓ、またはその逆；ＳｅｒをＴｈｒ、Ａｌａ、ＶａｌまたはＣｙｓ、またはその逆；ＴｙｒをＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、またはその逆；ＧｌｙまたはＰｒｏを残り１９種を天然アミノ酸を１個、またはその逆。
【００８３】
可溶性受容体−ＩｇＧ融合タンパク質は、一般的免疫学的薬剤であり、その構築方法は当分野で既知である(例えば、米国特許５,２２５,５３８参照)。機能的アミロイドβペプチド分解ドメインを、免疫グロブリンクラスまたはサブクラス由来の免疫グロブリンＦｃドメインと融合し得る。異なるＩｇクラスまたはサブクラスに属する抗体のＦｃドメインは、別種の二次的エフェクター機能を活性化できる。活性化は、Ｆｃドメインが同族Ｆｃ受容体により結合されたとき起こる。二次的エフェクター機能は、補体系を活性化する能力、胎盤を通過する能力、および種々の微生物タンパク質に結合する能力を含む。免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの特性は、Roitt et al., Immunology, p. 4.8(Mosby - Year Book Europe Ltd., 3d ed. 1993)により記載されている。抗原に結合したＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＭ抗体のＦｃドメインは、補体酵素カスケードを活性化できる。補体の活性化にＩｇＧ２のＦｃドメインは有効性が低く、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのＦｃドメインは有効でないように見える。それ故、Ｆｃドメインを、その関連する二次的エフェクター機能が、アミロイドβペプチド分解−Ｆｃ融合タンパク質で処置される特定の免疫応答または疾患に望ましいか否かに基づいて選択できる。標的細胞を傷害するまたは殺すことが有利であるならば、特に活性のＦｃドメイン(ＩｇＧ１)を選択し、アミロイドβペプチド分解−Ｆｃ−融合タンパク質を製造し得る。あるいは、補体系を誘発しないアミロイドβペプチド分解−Ｆｃ−融合体を製造することが望ましいならば、不活性ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを選択し得る。本発明は、結合成分に直接ではなくＦｃ部分に結合した触媒的成分を含む融合タンパク質を記載する。これは、Ｆｃ由来の効果および活性が、多くのＦｃが結合を介して仲介されるために限定されることを意味する。例えば補体活性化は結合およびネットワークの形成に依存する。
【００８４】
免疫グロブリンフラグメントのＣ末端に、本発明の融合構築物は、典型的に、しかし必ずではなく、触媒的とモジュレーター部分の間にトランジション領域を含み、このトランジション領域はまたリンカー配列を含んでよく、このリンカー配列は好ましくはペプチド配列である。このペプチド配列は、１〜７０までのアミノ酸長、適当であればさらに長いアミノ酸長を、好ましくは１０〜５０アミノ酸、特に好ましくは１２〜３０アミノ酸長を有し得る。トランジション配列のリンカー領域の側面に、さらに、例えば、ＤＮＡ制限開裂部位に対応する短ペプチド配列があってよい。分子生物学の当業者によく知られた任意の制限開裂部位を、この結合に使用できる。適当なリンカー配列は、好ましくは、多数のプロリン残基(例えばリンカー領域の２位毎に)を含み、それに加えて、好ましくは全体として親水性特性を有する人工配列である。少なくとも３０％のプロリン残基を含むリンカー配列が好ましい。親水性特性は、好ましくは、少なくとも１個の正電荷を有するアミノ酸、例えばリシンまたはアルギニン、または負電荷を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸の手段により達成できる。全体として、リンカー領域は、それ故に、リンカー領域に必須の柔軟性および／または硬性を付与するために、好ましくは多数のグリシンおよび／またはプロリン残基も含む。
【００８５】
しかしながら、天然配列、例えば細胞外に廃棄されるが、直ぐに、すなわち、細胞膜の直前で作用するＮＥＰファミリーに属するリガンドのフラグメントもまた、適当であれば同様に天然セグメントの置換、欠失または挿入の後にリンカーとして使用するのに適当である。これらのフラグメントは、好ましくは５０ＡＡであり、それは膜貫通領域またはその最初の５０ＡＡのサブフラグメントの後に細胞外領域として続く。しかしながら、本発明の融合タンパク質におけるこれらのリンカー領域の免疫原性を限定し、内因性ホルモン性防御反応を何等誘発させないために、対応する天然ヒト配列と少なくとも８５％配列同一性を有するセグメントが好ましく、少なくとも９５％配列同一性が特に好ましく、そして、少なくとも９９％配列同一性が非常に好ましい。本発明の範囲内で、リンカー領域は好ましくは免疫原性を全く有しないべきである。
【００８６】
しかしながら、アミド様結合によりアミロイドβペプチド分解成分および血漿半減期モジュレーター成分に結合したペプチド配列の代わりとして、非ペプチドまたはシュードペプチド性質のまたは非共有結合に基づく化合物の使用も可能である。これに関連して記載し得る例は、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類およびヘテロ二機能性リンカー類、例えばＮ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジ−チオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)または類似のクロスリンカー類である。
【００８７】
血漿半減期を制御する他の方法は、ペグ化または、グリコシル化のような分子量を増加させる他のタイプの修飾の使用である。
【００８８】
上記の通り、ポリマーモジュレーターも使用してよい。モジュレーターとして有用な化学部分を結合するための種々の手段が現在利用可能であり、例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる“Ｎ末端化学修飾タンパク質組成物および方法”と題する特許出願ＷＯ９６／１１９５３を参照のこと。このＰＣＴ公報は、とりわけ、タンパク質のＮ末端への水可溶性ポリマーの選択的結合を記載する。
【００８９】
好ましいポリマーモジュレーターはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)である。ＰＥＧ基は任意の分子量でよく、直鎖でも分枝鎖でもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン(“kD”)〜約１００kDａ、より好ましくは約５kDａ〜約５０kDａ、最も好ましくは約５kDａ〜約１０kDａの範囲である。ＰＥＧ基は、一般に本発明の化合物に、ＰＥＧ部分に存在する反応基(例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基)の、本発明の化合物の反応基(例えばアルデヒド、アミノ、またはエステル基)へのアシル化または還元的アルキル化を介して結合する。
【００９０】
タンパク質をペグ化するための有用な戦略は、溶液中での、共役結合の形成を介した、各々、相互に対して反応性である特異的官能基を担持する、タンパク質およびＰＥＧ部分の組み合わせを含む。本タンパク質は、慣用の組み換え発現技術で製造できる。本タンパク質は、特定の部位を適当な官能基で“前活性化”されている。本前駆体を、ＰＥＧ部分と反応させる前に精製し、十分に特徴付けする。タンパク質とＰＥＧの結合は、通常水相で行い、逆相分析的ＨＰＬＣにより容易にモニターできる。ＰＥＧ化タンパク質は、分取ＨＰＬＣにより容易に精製でき、分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析により特徴付けできる。
【００９１】
ポリサッカライドポリマーは、タンパク質修飾に使用し得る他のタイプの水可溶性ポリマーである。デキストランは、主にα１−６結合により結合したグルコースの独立したサブユニットから成るポリサッカライドポリマーである。デキストラン自体、広い分子量範囲で入手可能であり、約１kD〜約７０kDの範囲の分子量で容易に入手可能である。デキストランは、それ自体で、または他のモジュレーター(例えば、Ｆｃ)との組み合わせで、モジュレーターとして本発明において使用するために適切な水可溶性ポリマーであり、例えばＷＯ９６／１１９５３およびＷＯ９６／０５３０９を参照のこと。治療的または診断的免疫グロブリンに接合したデキストランの使用は報告されている；例えば、引用により本明細書に包含させる欧州特許公報ＥＰ０３１５４５６を参照のこと。約１kD〜約２０kDのデキストランは、デキストランを本発明に従う媒体として使用するとき、好ましい。
【００９２】
炭水化物(オリゴサッカライド)基は、好都合にはタンパク質のグリコシル化部位であることが既知の部位に結合してよい。一般に、これらの基が配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る)の一部であるとき、Ｏ結合オリゴサッカライドはセリン(Ｓｅｒ)またはスレオニン(Ｔｈｒ)残基に結合し、一方Ｎ結合オリゴサッカライドはアスパラギン(Ａｓｎ)残基に結合する。Ｘは好ましくはプロリン以外の１９種の天然に存在するアミノ酸の１種である。Ｎ結合およびＯ結合オリゴサッカライドの構造および各タイプに見られる糖残基は異なる。両方に共通して見られる糖の一つのタイプはＮ−アセチルノイラミン酸である(シアル酸と呼ばれる)。シアル酸は、通常Ｎ結合およびＯ結合したオリゴサッカライド両方の末端残基であり、その負電荷のために、グリコシル化化合物に酸性特性を与える。かかる部位は、本発明の化合物のリンカーに統合されてよく、好ましくはポリペプチド化合物の組み換え製造中に細胞によりグリコシル化される(例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳのような哺乳動物細胞において)。しかしながら、かかる部位は、さらに、当分野で既知の合成または半合成工程によりグリコシル化し得る。グリコシル化に適切なアミノ酸を、モジュレーターおよびタンパク質部分の両方の特異的部位に包含できる。これらの特異的アミノ酸の工作に使用するための好ましい技術は、部位特異的変異誘発または同等な方法である。
【００９３】
他の可能な修飾は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化を含む。Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983)。それ故、アミロイドβペプチド分解成分におけるグリコシル化部位を工作できる。例えば、好ましくはネプリライシン構造表面上の残基を、グリコシル化が可能なように修飾する。ネプリライシンの３Ｄ構造は既知であり、グリコシル化およびペグ化部位両方の導入のための適当なアミノ酸置換の選択に使用できる。グリコシル化部位は、例えばＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列を使用して導入する。ペグ化のために、適当な表面に暴露されているアミノ酸を、例えばペグ化成分との特異的かつ効率的カップリングのためにシステイン残基に置き換える。
【００９４】
本発明の化合物は、同様にＤＮＡレベルで変えて良い。本化合物の任意の部分のＤＮＡ配列を、選択した細胞により適合性のコドンに変えてよい。好ましい宿主細胞である大腸菌に関して、最適化コドンは当分野で既知である。コドンを、制限部位を除くために、または、選択した宿主細胞におけるＤＮＡの処理を助け得るサイレント制限部位を導入するために置換してよい。媒体、リンカーおよびペプチドＤＮＡ配列を、前記配列変化のいずれかを含むように修飾し得る。
【００９５】
リンカー：全ての“リンカー”基は任意である。存在するとき、その化学構造は、それが主にスペーサーとして働くため、重要ではない。リンカーは、好ましくはペプチド結合により一体となって結合したアミノ酸から成る。それ故、好ましい態様において、リンカーは、ペプチド結合により結合した１〜２０個のアミノ酸から成り、ここで、本アミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のいくつかは、当分野で十分に理解されている通り、グリコシル化されていてよい。より好ましい態様において、１〜２０個のアミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。さらに好ましくは、リンカーは、大部分がグリシンおよびアラニンのような立体的に制約されていないアミノ酸から成る。それ故、好ましいリンカーはポリグリシン(特に(Ｇｌｙ)４、(Ｇｌｙ)５)、ポリ(Ｇｌｙ−Ａｌａ)、およびポリアラニンである。
【００９６】
プロテアーゼの定量的特異性は広範囲に変わる。フェニルアラニン、バリンまたはロイシン残基を含む全ポリペプチドを開裂するパパイン、またはアルギニンまたはリシン残基を含む全ポリペプチドを開裂するトリプシンのような非常に非特異的なプロテアーゼが既知である。他方、１個の特異的配列でのみプラスミノーゲンを開裂する組織型プラスミノーゲンアクティベーター(ｔ−ＰＡ)のような非常に特異的なプロテアーゼも既知である。非常に基質特異性のプロテアーゼは、生存生物のタンパク質機能の制御において重要な役割を有する。ポリペプチド基質の特異的開裂、例えば、前駆体タンパク質の活性化または活性タンパク質または酵素の不活性化は、それによりそれらの機能を調節する。高い基質特異性の数種のプロテアーゼが医学的適用において使用されている。特異的ポリペプチド基質の開裂による活性化または脱活性化の医薬の例は、急性心筋梗塞(cardiac infarction)における、プラスミノーゲンを活性化してフィブリン凝固を溶かすｔ−ＰＡ、または卒中における、フィブリノーゲンを不活性化し、それにより血液粘性を提供し、その輸送能を高めるAncrodの適用である。ｔ−ＰＡはヒト血液制御に必要な活性を有するヒトプロテアーゼであるのに対し、Ancrodは非ヒトプロテアーゼである。それは、クサリヘビであるAgkistrodon rhodostomaから単離され、その蛇毒の主成分を構成する。それ故、治療的適用を有する非ヒトプロテアーゼが数種存在する。しかしながら、それらの同定は、通常、非常に偶発的である。
【００９７】
薬剤の投与による疾患の治療は、典型的に、内因性タンパク質または感染微生物もしくはウイルスのタンパク質のものである患者体内の特異的タンパク質機能を活性化または不活性化することにより開始される分子機構に基づく。これらの標的に対する化学薬剤の作用はなお理解するのがまたは予測するのが困難であるが、タンパク質薬剤は、あまたの他のタンパク質からこれらの標的タンパク質を特異的に認識することができる。他のタンパク質を認識することが本質的に可能であるタンパク質の顕著な例は、抗体、受容体、およびプロテアーゼである。大量の潜在的標的タンパク質が存在するが、今日これらの標的タンパク質に接近するために、非常にわずかなプロテアーゼしか利用可能ではない。タンパク分解性活性のために、プロテアーゼは、タンパク質またはペプチド標的の不活性化に特に適する。ヒトタンパク質のみを考えるとき、潜在的標的タンパク質の数はなおまだ莫大である。ヒトゲノムは３０,０００〜１００,０００遺伝子を含むと概算され、その各々が異なるタンパク質をコードする。これらのタンパク質またはペプチドの多くがヒト疾患に関与し、それ故に、潜在的な医薬標的である。天然単離物のスクリーニングにより特定の定質的特異性を有するかかるプロテアーゼを発見することは恐らく不可能である。それ故に、既知プロテアーゼまたは他の触媒的抗体を含む足場タンパク質の触媒的選択性を最適化する必要がある。
【００９８】
既知特異性のプロテアーゼのための選択系は当分野で、例えば、Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 88(1991)から既知である。例として、この系は、選択可能マーカーとして酵母転写因子ＧＡＬ４、ＴＥＶプロテアーゼと共にＧＡＬ４に挿入された規定され、かつ開裂可能な標的配列を含む。開裂により、ＤＮＡ結合ドメインが転写活性化ドメインから離され、それと共に転写因子不活性を付与する。得られた細胞のガラクトースを代謝することの表現型的無能さを、熱量測定アッセイによりまたは自殺基質２−デオキシガラクトースでの選択により検出できる。
【００９９】
さらに、選択は、Harris et al. (US 2002/022243)により以前に記載された、ＡＣＣとしての基に基づく、例えば、蛍光性部分として修飾されたペプチド基質の使用により行ってよい。
【０１００】
同一のまたは類似のアプローチを、本明細書に記載の通りの有効なアミロイドβペプチド分解成分を同定するまたは製造するために使用してよい。このアミロイドβペプチド分解成分を工作するための出発点は、アミロイドβペプチドに対して幾分かの活性を有するまたは全く活性を有しない酵素であり得る。他の成分は、特異的領域がアミロイドβペプチドに対する活性を有するように無作為化されている、足場タンパク質である。足場構造の１個の部分が、結合または活性部位を産生するように相対的に関連する固定化位置に無作為化された部分を保持するコア構造である種々の足場タンパク質が文献に記載されている。アミロイドβペプチドに対して幾分かの活性を有する酵素は、アミロイドβペプチドを分解することが記載されている天然プロテアーゼであり得る。例えば、ネプリライシンは、アミロイドβペプチド分解成分としてより有効にするために、合理的設計によりまたはより無作為なアプローチにより工作し得る。
【０１０１】
改変された配列特異性を有するタンパク分解性酵素を製造するための研究室法は原則として既知である。それらは、その発現および選択系により分類できる。プロテアーゼまたは任意の他のタンパク質を生物内で産生するための遺伝的選択であって、そのプロテアーゼまたは任意の他のタンパク質は前駆体タンパク質を開裂でき、それが次に産生された生物の増殖行動の改変をもたらす。種々のプロテアーゼを有する生物の集団から、改変された増殖行動を有するものを選択できる。この原則はDavis et al. により報告された(米国特許５２５８２８９)。ファージ系の産生は、タンパク分解性酵素、またはファージタンパク質を開裂できる抗体の存在下で活性化するファージタンパク質の開裂とは無関係である。選択したタンパク分解性酵素、足場または抗体は、ファージ産生の活性化のためのアミノ酸配列を開裂する能力を有する。
【０１０２】
膜−結合プロテアーゼへの改変された配列特異性を有するタンパク分解性酵素を産生するための系が報告されている。Iverson et al. (WO98/49286)は、細胞表面上に提示された膜−結合プロテアーゼの発現系を記載する。実験的設計の必須要素は、触媒的反応が細胞表面で行われなければならない、すなわち、基質と産物が、表面上に酵素を発現する細菌と結合したままでなければならないことである。選択系の他の例は、活性タンパク質を細胞表面上に発現し、改善された特性を有する変異体を含む細胞を選別する、FACSソーティング(Varadarajan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 102, 6855(2005))の使用である。それらは、プロテアーゼ開裂部位に対する特異性に３００万倍の変化を示す。
【０１０３】
自己分泌性プロテアーゼを伴う改変された配列特異性を有するタンパク分解性酵素も既知である。Duff et al. (WO98/11237)は、自己分泌性プロテアーゼの発現系を記載する。実験的設計の必須要素は、触媒的反応が、成熟プロテアーゼを細胞膜から細胞外環境に遊離するための膜−結合前駆体分子の自己タンパク分解処理により、プロテアーゼ自体に作用することである。
【０１０４】
Broad et al. (WO99/11801)は、プロテアーゼの特異性を改変するために適切な異種細胞系を開示する。その系は、転写因子前駆体を含み、ここで、該転写因子はプロテアーゼ開裂部位を介して膜固定ドメインに結合している。プロテアーゼによるプロテアーゼ開裂部位での開裂が転写因子を放出し、次いでそれが各プロモーターの制御下にある標的遺伝子の発現を開始する。特異性を改変するための実験的設計は、プロテアーゼ開裂部位への修飾配列の挿入およびプロテアーゼを変異誘発に付すことから成る。
【０１０５】
本発明によって、任意のタンパク質またはペプチドを適当なアミロイドβペプチド分解成分を製造するために直接またはその出発点として使用できる。例えば、本発明によって、任意のプロテアーゼを第一プロテアーゼとして使用できる。好ましくは、ヒト起源の任意のタンパク質またはペプチドを使用する。ヒト体内に通常存在する天然タンパク質またはペプチドを使用するならば、最小限の可能性のある変化が好ましい。
【０１０６】
いくつかの方法において、異なる結合特異性および／または分解活性の２種以上の融合タンパク質を同時に投与し、この場合、投与される各融合タンパク質の投与量は示す範囲内に入る。融合タンパク質は通常複数回投与する。各投与の間隔は、例えば、１週、１ヶ月、３ヶ月または１年であり得る。間隔は、患者の血漿中の融合タンパク質の血中レベルを測定することにより指示される、不定期であってもよい。いくつかの方法において、投与量を、１−１０００ug／mlの血漿融合タンパク質濃度を達成するように、およびいくつかの方法において２５−３００ug／mlを達成するように調整する。またいくつかの方法において、投与量を、１−１０００ng／mlの血漿融合タンパク質濃度を達成するように、よびいくつかの方法において２５−３００ng／mlを達成するように調整する。あるいは、融合タンパク質を持続性放出製剤として投与でき、この場合必要な投与頻度が少ない。投与量および頻度は、患者における融合タンパク質の半減期により異なる。一般に、Ｆｃ部分を含む融合タンパク質は長い半減期を有する。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかによって異なり得る。予防適用では、相対的に低用量が長期間にわたり相対的に少ない頻度の間隔で投与される。ある患者は、生涯処置を受け続ける。治療的適用では、相対的に高用量で相対的に短い間隔が、疾患の進行が衰えるまでまたは終わるまで、そして好ましくは、患者が疾患の症状の部分的なまたは完全な改善を示すまで必要であることがある。その後、その患者に予防レジメで投与してよい。触媒的活性アミロイドβペプチド分解融合タンパク質を、例えば抗体のような結合剤と比較して低用量で投与できることは予測される。
【０１０７】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に有毒ではなく、特定の患者、組成、および投与方式において所望の治療応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために、変わり得る。選択した投与量レベルは、用いる本発明の特定の組成物、そのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時期、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬剤、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態および薬歴および医学分野で既知の同様な因子を含む種々の薬物動態学的因子による。
【０１０８】
ここに引用する全ての公報または特許は、それらが出願時時点での最先端技術を示すためおよび／または本発明の説明および実施可能要件を提供するために、引用により本明細書に包含させる。刊行物は全ての科学または特許公報、または全ての記録形式、電気形式または印刷形式を含む任意の媒体形式で利用可能な何らかの他の情報を意味する。次の文献を、引用によりその全体を補運命最初に包含させる：Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)。
【０１０９】
本発明の一つの局面は、天然野生型タンパク質を、アミロイドβペプチドの分解にはるかに選択的とするために修飾する可能性である。部位特異的変異誘発を、野生型配列にアミノ酸を挿入する／置換するために使用できる。一つのアプローチは、分解酵素の活性部位の調査による合理的設計である。選択性プロファイル(他のペプチド／タンパク質と比較したアミロイドβペプチドの分解)を改変する可能性のあるアミノ酸を、他のアミノ酸で置換してよく、新規変異体を当分野で既知の開裂アッセイで試験できる。好ましくは、アミロイドβペプチドに対して、他の関連ペプチドより高い触媒的分解活性を有する変異体が有用である。他の関連ペプチドは、エンケファリン、ニューロペプチドＹ、サブスタンスＰ、ソマスタチン(somatatin)およびコレシストキニンを含み、これに限定されない。
【０１１０】
ネプリライシンの三次元構造は既知である(Oefner et al(2000) J. Mol. Biol. 296:341-9;Sahli et al. (2005) Helv.Chim.Acta. 88:731)。この構造は、構造に変化を導入する、およびまたスクリーニングまたは選択用ライブラリーを製造するためにどの部分の変化が最も効率的であるかの方向を導くことができる。ネプリライシンの活性部位は構造内に非常に深く埋もれており、約５０００Da未満の分子量のペプチドフラグメントのような小基質への酵素選択性を説明する。活性部位残基はＮ５４２、Ｈ５８３、Ｈ５８７、Ｅ６４６およびＲ７１７を含む。活性部位に近いアミノ酸残基はまたＶ５８０、Ｆ５６３、Ｆ５６４、Ｍ５７９、Ｆ７１６、Ｉ７１８、Ｆ１０６、Ｉ５５８、Ｆ５６３、Ｆ５７９、Ｖ５８０、Ｈ５８３、Ｖ６９２、Ｗ６９３およびＡ５４３を含む(Voisin et al(2004) JBC 279:46172-81)。これらおよび他の残基を、三次元構造を調査する合理的デザインにより変えてよく、またはネプリライシンの改善された変異体を得るための種々のライブラリーにおいて無作為に変えてよい。
【０１１１】
神経変性疾患の処置の開発に適するおよびかかる疾患への治療的介入に有用な化合物を同定するのに適する方法および材料を提供することが本発明の目的である。β−アミロイドを最適化酵素仲介機構を介して浄化できるとの発見に基づき、本発明は、特許請求の範囲および本明細書に後記されるかかる方法および材料を提供するために述べる。
【０１１２】
本発明は、神経変性障害の予防および処置方法であって、哺乳動物の末梢系に有効量の最適化酵素活性化合物を投与することを含む方法を提供する。特に、酵素活性化合物は、一方が酵素活性であり、他方が血漿半減期を制御する融合タンパク質である。本方法は、アルツハイマー病のような脳アミロイド症の予防および処置に適する。本発明はまた、最適化酵素的化合物を試験するための、好ましくは多数の化合物をスクリーニングための、活性および血漿半減期を調節するための、種々のアッセイ原理  −  生化学および特に細胞アッセイも提供する。
【０１１３】
さらなる態様において、アッセイは、該酵素活性の測定前にネプリライシンファミリーのメンバーの既知阻害剤を添加することを含む。適当な阻害剤は、例えばホスホラミドン、チオルファン、スピノルフィン(spinorphin)、またはこれらの物質の機能的誘導体である。
【０１１４】
一般的な意味で、本発明のアッセイは、インビトロおよびインビボの両方で酵素活性および血漿半減期を測定する。
【０１１５】
他の局面において、本発明は、(ｉ)Ａβ−ペプチドを分解する、好ましくは非常に特異的であり、高いＡβ−ペプチド分解活性を有する化合物を同定し、(ii)このＡβ−ペプチド分解化合物と、血漿中の半減期を規定するモジュレーター化合物を結合する工程を含む、医薬の製造方法を提供する。
【０１１６】
本発明の化合物は、組み換えＤＮＡ技術を使用して形質転換宿主細胞中で製造してよい。そうするために、融合タンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を製造する。かかるＤＮＡ分子の製造方法は当分野で既知である。例えば、モジュレーターおよびタンパク質をコードする配列を、適当な制限酵素を使用してＤＮＡから切断できる。あるいは、ＤＮＡ分子をホスホロアミデイト法のような化学合成技術を使用して合成し得る。また、これらの技術の組合せも使用し得る。
【０１１７】
本発明はまた、適当な宿主でモジュレーター、タンパク質または融合体を発現できるベクターも含む。ベクターは、適当な発現制御配列に操作可能に結合したモジュレーター、タンパク質および／または融合体をコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前または後にこの操作的結合を行う方法は、既知である。制御配列なる表現は、プロモーター、アクティベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルを含む。
【０１１８】
ＤＮＡ分子を中に含む得られたベクターを使用して、適当な宿主を形質転換する。この形質転換は、当分野で既知の方法を使用して行い得る。
【０１１９】
多数の利用可能で既知の宿主細胞のいずれかを本発明の実施に使用してよい。特定の宿主の選択は、当分野で既知の多数の因子による。これらは、例えば、選択した発現ベクターとのコンパチビリティー、ＤＮＡ分子によりコードされる融合体の毒性、形質転換の割合、融合体回収の容易さ、発現特性、生体安全性および費用を含む。これらの因子のバランスが、全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効ではない場合があるとの理解に照らされなければならない。これらの一般的ガイドラインの範囲内で、有用な微生物宿主は、培養している細菌(例えば大腸菌属)、酵母(例えばサッカロマイセス属)および他の真菌、昆虫、植物、哺乳動物(ヒトを含む)細胞、または当分野で既知の他の宿主を含む。
【０１２０】
次に、形質転換宿主を培養し、精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように慣用の醗酵条件下に培養し得る。かかる醗酵条件は当分野で既知である。最終に、融合体を、当分野で既知の方法により培養物から精製する。一つの好ましいアプローチは、Ｆｃ部分をモジュレーターとして使用したときプロテインＡまたは融合タンパク質を精製するための類似の技術である。
【０１２１】
モジュレーター、タンパク質および融合体もまた合成法により製造できる。例えば、固体相合成技術を使用し得る。適当な技術は当分野で既知であり、Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; 米国特許３,９４１,７６３; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253;およびErickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527に記載のものを含む。固体相合成は、それが小ペプチドまたはタンパク質の最も費用効率が高い方法であるため、個々のペプチドまたはタンパク質の製造の好ましい技術である。
【０１２２】
一般に、本発明の化合物は、インビボでアミロイドβペプチドを分解する能力に由来する薬理学的活性を有する。これらの化合物の活性を、当分野で既知のアッセイで測定できる。Ｆｃ−ＮＥＰ化合物について、インビボアッセイを本明細書の実施例部分でさらに述べる。
【０１２３】
一般に、本発明はまた、本発明の化合物の医薬組成物を使用する可能性を提供する。かかる医薬組成物は注射、または経口、肺、経鼻、経皮または他の投与形態で投与するためのものであり得る。一般に、本発明は、有効量の本発明の化合物を薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と共に含む医薬組成物を包含する。かかる組成物は、種々の緩衝性内容物(例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸)、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤(例えば、Tween 80、Polysorbate 80)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、防腐剤(例えば、Thimersol、ベンジルアルコール)および増量剤(例えば、ラクトース、マンニトール)のような添加剤を含み；本物質のポリ乳酸、ポリグリコール酸などのような重合化合物の粒子状調製物またはリポソームへの包含を含む。ヒアルロン酸も使用してよく、これは循環中の持続期間を増強する効果を有し得る。かかる組成は、物理的状態、安定性、インビボでの遊離速度、および存在するタンパク質および誘導体のインビボでのクリアランス速度に影響し得る。例えば、引用により本明細書に包含させるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) pages 1435-1712を参照のこと。本組成物は、液体形態で製造してよく、または凍結乾燥形態のような乾燥粉末であってよい。インプラント可能な持続放出製剤も、経皮製剤であるため、企図される。これらの代替的投与方法は当分野で既知である。
【０１２４】
上記状態の処置のための方法に関与する投与量レジメンは、薬剤の作用を修飾する種々の因子、例えば患者の年齢、状態、体重、性別および食習慣、何らかの感染の重症度、投与の時期および他の臨床的因子を考慮して、担当医により決定される。一般に、毎日のレジメンは、本発明の化合物０.１−１０００マイクログラム／体重キログラム、好ましくは０.１−１５０マイクログラム／キログラムの範囲でなければならない。
【０１２５】
本発明は、アミロイドβ分解タンパク質を、顕著な分解活性を維持し、インビボ使用に適切とする特異的方法で修飾できることを明らかに記載する。本発明を支持する実験的証拠を開示する。
【０１２６】
ある態様において、本発明は、ダウン症候群およびβ−アミロイド血管症、例えば、限定しないが、脳アミロイド血管症、全身性アミロイドーシス、遺伝性脳出血、認知の障害と関連する障害、例えば、限定しないが、ＭＣＩ(“軽度認知機能障害”)、アルツハイマー病、記憶喪失、アルツハイマー病と関連する注意欠損症状、アルツハイマー病または混合型の血管および変性起源の認知症を含む認知症、初老期認知症、老人性認知症およびパーキンソン病と関連する認知症のような疾患と関連する神経変性、進行性核上性麻痺または皮質基底核変性症のようなＡβ関連病因の処置方法であって、哺乳動物(ヒトを含む)に治療的有効量の本発明の融合タンパク質を投与することを含む、方法を提供する。
【実施例】
【０１２７】
本発明を、次の非限定的実施例により記載する：
【０１２８】
実施例１
タンパク質ドメインの説明
ネプリライシンの細胞外ドメインはアミノ酸５１−７４９により定義される(最初のメチオニンを除く)(配列番号１−４)。このドメイン中で同定されているアミノ酸差異を導く２種の多型が存在し、異なる変異体のアミノ酸配列を配列番号１−４に記載する。
ＩＤＥ(インスリン分解酵素)は１０１８アミノ酸長タンパク質(配列番号５)である。ＩＤＥで記載されるスプライス変異体および多型変異体が存在する。一つのスプライス変異体において、一つのエキソンが、同サイズの“ｗｔ”エキソンと類似のペプチド配列をコードするエキソンで置換される(配列番号６に記載)。この変異体は、インスリンおよびＡβ両方の分解に有効性が低いことが記載されている。またＩＤＥ遺伝子に数種の多型が存在することが記載されており、これは、このドメインで同定されているアミノ酸差異を導く：Ｄ９４７Ｎ、Ｅ６１２Ｋ、Ｌ２９８ＦおよびＥ４０８Ｇ(配列番号５に従い番号付け)。これらの多型の全ての組合せも可能である。
ＥＣＥ１(エンドセリン−変換酵素１)(配列番号７)の細胞外ドメインは、完全長、膜−結合ＥＣＥ１タンパク質のアミノ酸９０−７７０として定義される、６８１アミノ酸長タンパク質である。ＥＣＥ１遺伝子は、アミノ酸差異を導く数種の可能な多型を含む：Ｒ６６５Ｃ、Ｗ５４１Ｒ、Ｌ４９４ＱおよびＴ２５２Ｉ。これらの多型の全ての組合せも可能である。
ネプリライシン、ＩＤＥおよびＥＣＥ１の細胞外ドメインをヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメイン(ヒンジ領域を含む)と融合させる。シグナル配列(配列番号８)を導入し、発現中の培養培地へのタンパク質の分泌を可能にする。ヒンジ領域の配列を配列番号９に示し、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインを配列番号１０に示す。配列番号１に対応するヒトネプリライシン変異体、配列番号５に対応するＩＤＥおよび配列番号７に対応するＥＣＥ１を含む完全融合タンパク質(シグナル配列を除く)を配列番号１１−１３に記載する。最終融合タンパク質(シグナル配列を除く)は、２１１kDａ(二量体としてＦｃ−Ｎｅｐ)、２９４kDａ(二量体としてＦｃ−ＩＤＥ)および２０６kDａ(二量体としてＦｃ−ＥＣＥ１)の予測分子量を有する。
【０１２９】
実施例２
融合タンパク質Ｆｃ−ネプリライシンをコードする遺伝子の構築の説明
ＩｇＧ２のＦｃドメインをコードする遺伝子との融合体としてのネプリライシンの細胞外ドメインをコードする遺伝子を合成により製造した(GeneArt)。シグナル配列を含む完全遺伝子(Ｆｃ−ネプリライシンをコードする)を、GeneArtベクター(pCR-Script、pGA4またはpUC-Kana)からGatewayドナーベクターに移入した。Gatewayドナーベクターを、完全遺伝子を数種の発現ベクターに挿入するために使用する。Gateway系を使用して、ドナーベクターから発現ベクターへの移入は、制限酵素の代わりに組み替えを使用して行い得る。試験した哺乳動物発現ベクターは主にｐＣＥＰ４、ｐＥＡＫ１０、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴおよびｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ(Gateway適合)であった。これらは全てＣＭＶプロモーター(ｐＣＥＰ４、ｐＥＡＫ１０およびｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ)またはＥＦ−１αプロモーター(ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ)に基づく標準哺乳動物発現ベクターである。遺伝子を、ＤＮＡ配列を確認するため全クローニング工程後に配列決定した。
【０１３０】
実施例３
融合タンパク質Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃ−ＥＣＥ１をコードする遺伝子の構築の説明
酵素ＩＤＥおよびＥＣＥ１を、ＩｇＧ２のＦｃドメインをコードする遺伝子との融合体としてコードする遺伝子を合成により製造する。完全遺伝子(シグナル配列を含み、Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃ−ＥＣＥ１融合タンパク質をコード)を、最初のクローニングベクター(ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＡ４またはｐＵＣ−Ｋａｎａ)からGatewayドナーベクターに移入する。Gatewayドナーベクターを使用して、数種の発現ベクターに完全遺伝子を挿入する。試験した哺乳動物発現ベクターは、主にｐＣＥＰ４、ｐＥＡＫ１０、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴおよびｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ(Gateway適合)である。Ａこれらは全てＣＭＶプロモーター(ｐＣＥＰ４、ｐＥＡＫ１０およびｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ)またはＥＦ−１αプロモーター(ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ)に基づく標準哺乳動物発現ベクターである。遺伝子を、ＤＮＡ配列を確認するため全クローニング工程後に配列決定した。
【０１３１】
実施例４
ＨＥＫ２９３細胞におけるネプリライシンの細胞外ドメインおよび融合タンパク質Ｆｃ−ネプリライシンの発現
タンパク質ネプリライシン(細胞外ドメインのみ)およびＦｃ−ネプリライシン(Ｆｃ−Ｎｅｐ)を、懸濁液順応哺乳動物細胞に一過性に発現させた。生成実験において使用した細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３Ｓ−ＴおよびＨＥＫ２９３Ｓ−ＥＢＮＡ細胞を含む、ＨＥＫ２９３由来の細胞株であった。目的タンパク質をコードするプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＥＡＫ１０からの発現を試験した。形質移入を、約０.５−１ｘ１０６の細胞密度で、および０.３−０.８μg／ml細胞懸濁液(最終濃度)の範囲の濃度のプラスミドＤＮＡで行った。試験した形質移入試薬は２μg／ml細胞懸濁液(最終濃度)でのポリエチレンイミン(Polyscience)である。発現を、３０ml〜１０００mlの細胞培養体積(シェーカーフラスコ)で、５Ｌ〜１０ＬのWave Bioreactorで行った。発現の後に様々な日に培養上清からサンプルを採り、細胞密度、細胞生存能、タンパク質発現および酵素活性を分析した。細胞培養物を、４〜１４日後に遠心分離により回収した。細胞培養培地をタンパク質精製実験に使用した。全てのプラスミド濃度およびベクターは、典型的に１−３mg／Ｌの範囲の種々のレベルの生成物をもたらし、十分であった。
【０１３２】
実施例５
ＨＥＫ２９３細胞における融合タンパク質Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃＥＣＥ１の発現
タンパク質Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃ−ＥＣＥ１を、懸濁液順応哺乳動物細胞に一過性に発現させる。生成実験において使用した細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３Ｓ−ＴおよびＨＥＫ２９３Ｓ−ＥＢＮＡ細胞を含む、ＨＥＫ２９３由来の細胞株である。目的タンパク質をコードするプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＥＡＫ１０からの発現を試験する。形質移入を、約０.５−１ｘ１０６のプラスミドＤＮＡの細胞密度で、および０.３−０.８μg／ml細胞懸濁液(最終濃度)の範囲の濃度のプラスミドＤＮＡで行う。試験した形質移入は、２μg／ml細胞懸濁液(最終濃度)のポリエチレンイミン(Polyscience)である。発現を、３０ml〜１０００mlの細胞培養体積(シェーカーフラスコ)で、５Ｌ〜１０ＬのWave Bioreactorで行う。発現の後に様々な日に培養上清からサンプルを採り、細胞密度、細胞生存能、タンパク質発現および酵素活性を分析する。細胞培養物を、４〜１４日後に遠心分離により回収する。細胞培養培地をタンパク質精製実験に使用する。
【０１３３】
実施例６
ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるネプリライシンの細胞外ドメインおよび融合タンパク質Ｆｃ−ネプリライシンの発現
タンパク質ネプリライシン(細胞外ドメインのみ)およびＦｃ−Ｎｅｐを、懸濁液順応哺乳動物細胞に安定に発現させた。生成実験に使用した宿主細胞は、懸濁液増殖に適合させてあるＦｌｐＩｎ  ＣＨＯ−細胞(Invitrogen)であった。目的タンパク質をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−ＤＥＳＴ３０およびｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴからの発現を試験した。発現は、ＣＭＶプロモーターまたはＥＦ１アルファプロモーターのいずれかにより駆動された。形質移入を、Ｆ１２培地中約１ｘ１０６細胞／mlの細胞密度で、約０.１μg／ml(最終濃度)の濃度のプラスミドＤＮＡを使用して行った。リコンビナーゼをコードするヘルパープラスミドｐＯＧ４４を、０.８μg／mlの最終濃度で同時形質移入した。２μg／ml細胞懸濁液(最終濃度)のポリエチレンイミン(Polyscience)を形質移入試薬として使用した。発現を、シェーカーフラスコ中３０ml〜１０００mlの細胞培養体積で行った。培養上清からのサンプルを様々な日に採り、細胞密度、細胞生存能、タンパク質発現および酵素活性を分析した。細胞培養物を、遠心分離により４〜１１日後に回収した。最終的に、細胞培養培地をタンパク質精製実験に使用した。使用した両方の発現ベクターは、所望のタンパク質の産生に十分であった。産生レベルは、典型的に１０−５０mg／Ｌの範囲であった。
【０１３４】
実施例７
ＣＨＯ−Ｓ細胞における融合タンパク質Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃ−ＥＣＥ１の発現
タンパク質Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃ−ＥＣＥ１を、懸濁液順応哺乳動物細胞に安定に発現させる。生成実験に使用した宿主細胞は、懸濁液増殖に適合させてあるＦｌｐＩｎ  ＣＨＯ−細胞(Invitrogen)である。目的タンパク質をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ−ＤＥＳＴ３０およびｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴからの発現を試験する。発現をＣＭＶプロモーターまたはＥＦ１アルファプロモーターのいずれかにより駆動させる。形質移入形質移入を、Ｆ１２培地中約１ｘ１０６細胞／mlの細胞密度で、約０.１μg／ml(最終濃度)の濃度のプラスミドＤＮＡを使用して行なう。リコンビナーゼをコードするヘルパープラスミドｐＯＧ４４を、０.８μg／mlの最終濃度で同時形質移入する。２μg／ml細胞懸濁液(最終濃度)のポリエチレンイミン(Polyscience)を形質移入試薬として使用する。発現をシェーカーフラスコ中３０ml〜１０００mlの細胞培養体積で行う。培養上清からのサンプルを様々な日に採り、細胞密度、細胞生存能、タンパク質発現および酵素活性を分析する。細胞培養物を、遠心分離により４〜１１日後に回収する。
【０１３５】
実施例８
親和性クロマトグラフィーによる発現Ｆｃ−ネプリライシンタンパク質の精製
融合タンパク質の精製を、哺乳動物細胞における発現からの細胞培地を使用して行った。精製を、親和性クロマトグラフィー(プロテインＡ)、続いて低ｐＨ溶出により行い、AKTAクロマトグラフィー系で行った(Explorer or Purifier, GE Healthcare)。ＸＫ２６カラム(GE Healthcare)中のｒプロテインＡセファロースＦＦ(GE Healthcare)を１０カラム体積(ＣＶ)のＰＢＳ(２.７mM  ＫＣｌ、１３８mM  ＮａＣｌ、１.５mM  ＫＨ２ＰＯ４、８mM  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、ｐＨ６.７−７.０、Invitrogen)で平衡化した。発現融合タンパク質(Ｆｃ−ネプリライシン)を含む細胞培養培地をカラムにかけた。カラムを２０ＣＶ  ＰＢＳで洗浄し、その後結合タンパク質を溶出緩衝液(０.１Ｍ  グリシン、ｐＨ３.０)で溶出した。精製フラクションを１mlの溶出タンパク質に対し５０μlの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅの添加により直ぐに中和した。精製フラクションを貯め、緩衝液をＰＤ１０カラム(GE Healthcare)を使用して５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌに変えた。精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、約９０％純粋であることが判明した。
【０１３６】
実施例９
親和性クロマトグラフィーによる発現Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃ−ＥＣＥ１の精製
融合タンパク質の精製を、哺乳動物細胞における発現からの細胞培地を使用して行なう。ＸＫ２６カラム(GE Healthcare)中のｒプロテインＡセファロースＦＦ(GE Healthcare)を１０カラム体積(ＣＶ)のＰＢＳ(２.７mM  ＫＣｌ、１３８mM  ＮａＣｌ、１.５mM  ＫＨ２ＰＯ４、８mM  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、ｐＨ６.７−７.０、Invitrogen)で平衡化する。発現融合タンパク質(Ｆｃ−ＩＤＥまたはＦｃ−ＥＣＥ１)を含む細胞培養培地をカラムにかける。カラムを２０ＣＶ  ＰＢＳで洗浄し、その後結合タンパク質を溶出緩衝液(０.１Ｍ  グリシン、ｐＨ３.０)で溶出する。精製フラクションを、１mlの溶出タンパク質に対し５０μlの１Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅの添加により直ぐに中和する。精製フラクションを貯め、緩衝液をＰＤ１０カラム(GE Healthcare)を使用して５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌに変える。
【０１３７】
実施例１０
Ｆｃ−ネプリライシン発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
哺乳動物細胞における発現からの細胞培養培地をウェスタンブロットを使用して分析した。２０μlの細胞培養培地を、サンプル還元剤(Invitrogen)を含む４ｘ  ＬＤＳ  サンプル緩衝液(Invitrogen)で希釈した。サンプルを９５℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル(４−１２％勾配ゲル、１０ウェル(１mm)、Invitrogen)に載せた。ＭＥＳ緩衝液をランニング緩衝液として使用した。ゲルを２００Ｖで３５分間流した。エレクトロブロッティングを３０Ｖで１時間行い、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。膜を５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ(ＴＢＳ(２０mM  Ｔｒｉｓ、５００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７.５(BioRad)＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０)中で一夜ブロックし、その後それらを３０μlの一次抗体(ビオチニル化ヤギ抗ヒトネプリライシン抗体、５０μg／ml(R&D systems))と１５ml  ＴＢＳＴ中でインキュベートした。膜を室温で２時間インキュベートし、３回ＴＢＳＴで洗浄し、１時間ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(GE Healthcare、１：１００００希釈(１５ml  ＴＢＳＴ中１.５μl))とインキュベートした。膜を３回ＴＢＳＴおよび３回水で洗浄し、その後ＥＣＬと試薬(GE Healthcare)およびＥＣＬフィルム(GE Healthcare)でバンドを可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、精製タンパク質が正しいサイズであり、約９０％純粋であることを示した。ウェスタンブロットはネプリライシンドメインの同一性を確認した。
【０１３８】
実施例１１
ネプリライシン酵素活性ＦＲＥＴ−アッセイ
ネプリライシン酵素活性を蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)アッセイで測定した。組み換えヒトネプリライシン(R&D systems)、ネプリライシンまたはＦｃ−ネプリライシン産生細胞(AZ Soedertaelje)からの培養培地または精製ネプリライシンまたはＦｃ−ネプリライシンを、１０μMの蛍光性ペプチド基質Ｖ−Ｍｃａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ(Ｄｎｐ)−ＯＨ(R&D systems)を含む９６ウェルプレートに添加した。コントロール組み換えヒトネプリライシンの最終濃度は０.１または０.２５μg／mlであった。１０μMのネプリライシン阻害剤ホスホラミドン(BIOMOL)を、アッセイ中のシグナルの特異性を制御し、特異的ネプリライシン活性を確認するために同じウェルに添加した。ウェルへの全成分の添加に続き、プレートを直ぐに蛍光プレートリーダー(Ascent)に入れ、シグナルを、２０分間、毎分励起３４０nmおよび放出４０５nmで記録した。酵素の活性を、反応の速度を計算することにより評価した  −  傾斜係数＝ΣΔＲＦＵ／Δｔ。市販組み換えネプリライシンおよびＦｃ−ネプリライシン融合タンパク質の特異的活性を比較するために、我々は式：特異的活性＝傾斜係数／アッセイ中のネプリライシンまたＦｃ−ネプリライシンモノマー(pmol)に従い計算する特異的活性係数を導入した。
【０１３９】
実施例１２
ＩＤＥおよびＥＣＥ１酵素活性ＦＲＥＴ−アッセイ
酵素活性を蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)アッセイで測定する。Ｆｃドメインなしの組み換え酵素(市販または社内製造)、培養培地(Ｆｃ−ＩＤＥまたはＦｃ−ＥＣＥ１−産生細胞から)または精製タンパク質(Ｆｃ−ＩＤＥまたはＦｃ−ＥＣＥ１)を、１０μMの蛍光性ペプチド基質Ｖ−Ｍｃａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ(Ｄｎｐ)−ＯＨ(R&D systems)を含む９６ウェルプレートに添加する。ウェルへの全成分の添加に続き、プレートを直ぐに蛍光プレートリーダー(Ascent)に入れ、シグナルシグナルを、２０分間、毎分励起３４０nmおよび放出４０５nmで記録する。酵素の活性を反応の速度を計算することにより評価する  −  傾斜係数＝ΣΔＲＦＵ／Δｔ。コントロール(市販組み換え酵素)の特異的活性を比較するために、特異的活性係数を式：特異的活性＝傾斜係数／アッセイ中の酵素ドメイン(pmol)に従い計算する。
【０１４０】
実施例１３
細胞培養上清中のネプリライシンおよびＦｃ−ネプリライシン濃度の測定
細胞培養上清中のネプリライシン濃度を、GyrosTM BioaffyTM CDマイクロラボラトリー法およびGyrolab Workstation LIF装置(Gyros AB, Sweden)を使用して測定した。異なる細胞培養物からのサンプルを標準希釈剤(Gyros AB)で希釈し、Thermo-Fast(意匠)９６ウェルＰＣＲプレート(Abgene, UK)に入れた。モノクローナルマウスビオチニル化抗ヒトネプリライシン抗体(Serotec)を捕捉試薬(最終濃度０.０５mg／ml)として使用し、Alexa Fluor 647色素(Molecular Probes)で標識されたポリクローナルヤギ抗ヒトネプリライシン抗体(R&D systems)(最終濃度１００nM)はネプリライシン濃度測定のための検出抗体として働いた。市販組み換えネプリライシン(R&D systems)を、標準として、標準を構築するために１０ng／ml〜１００００ng／mlの濃度範囲で使用した。ポリクローナルビオチニル化抗ヒトネプリライシン抗体(R&D systems)を捕捉抗体として使用し、一方Alexa Fluor 647色素(Molecular Probes)で標識されたポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Molecular Probes)を、Ｆｃ−ネプリライシン構築物構築物検出の検出抗体として使用した。社内製造および精製Ｆｃ−ネプリライシン融合タンパク質は、１０ng／ml〜１００００ng／mlの濃度範囲で標準として働いた。標準、捕捉および検出抗体をThermo-Fast(意匠)９６ウェルＰＣＲプレート(Abgene)に入れた。プレートおよびGyrolab Bioaffy TM CDの両方をGyrolab Workstation LIF装置に入れ、濃度測定を、Gyrolab BioaffyTM Software Package Version 1.8(Gyros AB)を使用して製造者のプロトコールに従い行った。
【０１４１】
実施例１４
細胞培養上清中のＩＤＥ、ＥＣＥ１、Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃ−ＥＣＥ１濃度の測定
細胞培養上清中のタンパク質濃度を、GyrosTM BioaffyTM CDマイクロラボラトリー法およびGyrolab Workstation LIF装置(Gyros AB, Sweden)を使用して測定する。異なる細胞培養条件からのサンプルを標準希釈剤(Gyros AB)で希釈し、Thermo-Fast(意匠)９６ウェルＰＣＲプレート(Abgene, UK)に入れる。ビオチニル化ＩＤＥまたはＥＣＥ１−特異的抗体を捕捉試薬として使用し、Alexa Fluor 647色素(Molecular Probes)標識ＩＤＥまたはＥＣＥ１−特異的抗体を検出抗体として使用する。市販または社内製造組み換えＩＤＥおよびＥＣＥ１を標準曲線を構築するために使用する。Ｆｃ−ＩＤＥまたはＦｃ−ＥＣＥ１濃度を測定するとき、差異は、Alexa Fluor 647色素(Molecular Probes)で標識されたポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Molecular Probes)が検出抗体として使用されることである。標準、捕捉および検出抗体をThermo-Fast(意匠)９６ウェルＰＣＲプレート(Abgene)に入れる。プレートおよびGyrolab Bioaffy TM CDの両方をGyrolab Workstation LIF装置に入れ、濃度測定をGyrolab BioaffyTM Software Package Version 1.8(Gyros AB)を使用して製造者のプロトコールに従い行なう。
【０１４２】
実施例１５
緩衝液中のＦｃ−ネプリライシンおよびネプリライシンによるアミロイドβペプチドの分解
この実験の目的は、Ｆｃ−ネプリライシンがアミロイドβ１−４０ペプチドを分解できることを証明することであった。本アッセイは、ネプリライシン(R&D systems)またはＦｃ−ネプリライシン存在下、ネプリライシン阻害剤有りまたは無しでインキュベーションした後の残留アミロイドβ１−４０ペプチド(Bachem)濃度を測定する。アミロイドβ１−４０ペプチド(最終濃度、３００、３０または３nM)および／またはネプリライシン(２.４μg／ml)、および／またはＦｃ−ネプリライシン構築物(２.４μg／ml)、および／またはホスホラミドン(１０μM)を含む１００μlの反応混合物を、丸底９６ウェルポリプロピレンプレートで３７℃で２.５時間インキュベートした。インキュベーション後、１０μlの反応混合物を１０μlの標準希釈剤(Gyros AB)を含むThermo-Fast(意匠)９６ウェルＰＣＲプレート(Abgene, UK)に移した。アミロイドβ１−４０濃度をGyrolab Workstation LIF系を使用して測定した。ビオチニル化抗アミロイドβ抗体(６Ｅ１０；最終濃度５０μg／ml；Signet)を捕捉抗体として使用し、Alexa Fluor 647色素(Molecular Probes)で標識したポリクローナル抗ヒトアミロイドβ抗体(４４−３４８；Biosource)を検出抗体として使用した。アミロイドβ１−４０ペプチド濃度測定を、Gyrolab BioaffyTM Software Package Version 1.8(Gyros AB)を使用して製造者の支持に従い行った。ネプリライシンによるアミロイドβ１−４０ペプチド分解を、ネプリライシン非存在下のアミロイドβ１−４０ペプチド濃度と比較した、ネプリライシン存在下のインキュベーション後に残ったアミロイドβ１−４０ペプチドの濃度として計算した。３７℃での２.５時間インキュベーション後、２.４μg／ml濃度の組み換えヒトネプリライシンは、６４％のアミロイドβ１−４０ペプチド(３００nM)を分解した。ほぼ同じ濃度(２.４μg／ml)の社内製造Ｆｃ−ネプリライシン構築物は、アミロイドβ１−４０ペプチド(３００nM)の５０％(バッチ１)および４２％(バッチ２)を分解した。特異的ネプリライシン活性は１０μM  ホスホラミドン存在下でほとんど完全に無くなった(図１)。この実験は、Ｆｃ−ネプリライシンがアミロイドβ１−４０ペプチドを有効に分解することを示す。
【０１４３】
実施例１６
ＩＤＥ、ＥＣＥ１、Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃ−ＥＣＥ１による緩衝液中のアミロイドβペプチドの分解
この実験の目的は、Ｆｃ−ＩＤＥおよびＦｃ−ＥＣＥ１がアミロイドβ１−４０ペプチドを分解できることを証明することである。アッセイは、酵素(Ｆｃ−ＩＤＥまたはＦｃ−ＥＣＥ１)存在下でのインキュベーション後の残留アミロイドβ１−４０ペプチド(Bachem)濃度を測定する。アミロイドβ１−４０ペプチド(最終濃度、３００、３０または３nM)、Ｆｃ−ＩＤＥまたはＦｃ−ＥＣＥ１を含む１００μlの反応混合物を３７℃で２.５時間インキュベートする。インキュベーション後、１０μlの反応混合物を１０μlの標準希釈剤(Gyros AB)を含むThermo-Fast(意匠)９６ウェルＰＣＲプレート(Abgene, UK)に移す。アミロイドβ１−４０濃度を、Gyrolab Workstation LIF系使用して測定する。ビオチニル化抗アミロイドβ抗体(６Ｅ１０；最終濃度５０μg／ml；Signet)を捕捉抗体として使用し、Alexa Fluor 647色素(Molecular Probes)で標識したポリクローナル抗ヒトアミロイドβ抗体(４４−３４８；Biosource)を検出抗体として使用する。ネプリライシンによるアミロイドβ１−４０ペプチド分解を、酵素非存在下のアミロイドβ１−４０ペプチド濃度と比較した、酵素存在下のインキュベーション後に残ったアミロイドβ１−４０ペプチドのパーセンテージとして計算する。
【０１４４】
実施例１７
Ｆｃ−ネプリライシンによるモルモット血漿中のアミロイドβペプチド１−４０およびアミロイドβペプチド１−４２の分解
ネプリライシンによるアミロイドβペプチド１−４０(Ａβ４０)およびアミロイドβペプチド１−４２(Ａβ４２)の分解を、体重２５０−３００ｇの雄Dunkin Hartleyモルモット(HBLidkoeping ka)からのヘパリン処理血漿を使用して試験した。血液を、心臓穿刺により麻酔したモルモットから採血した。血液を、予め冷却したヘパリン−血漿チューブに採取し、１０分間、４℃で３０００ｘｇで、サンプリング２０分以内に遠心分離した。血漿サンプルを予め冷却したポリプロピレンチューブに移し、直ぐにドライアイスで冷却し、使用するまで−７０℃で貯蔵した。実験を、７匹のモルモットからの貯蔵血漿で行った。Ｈｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐ(６μg／mlまたは２０８μg／ml)または５μg／ml組み換えヒトネプリライシン(R&D systems)と対応する媒体(５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ７.５または２５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８.０)を、貯蔵血漿と１０μM  ホスホラミドン(BIOMOL)存在下、または非存在下、３７℃で０および４時間インキュベートした。４.７mMの最終濃度のＥＤＴＡをチューブに添加し、その後Ａβ４０およびＡβ４２の量を、Biosource(Ａβ１−４０)またはInnogenetics(Ａβ１−４２)から得た市販ＥＬＩＳＡキットを使用して分析した。
４時間、３７℃でのモルモット血漿と６μg／mlまたは２０８μg／ml  Ｈｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐエキソビボインキュベーションは、媒体と比較して各々Ａβ４０の２６％および５１％の減少をもたらした。市販ヒト組み換えネプリライシン(５μg／ml)は、媒体と比較してＡβ４０を４９％分解した。Ａβ４０レベルは１０μM  ホスホラミドン添加後影響を受けなかった(図２)。
モルモット血漿中のＡβ４２レベルは、２０８μg／ml  Ｈｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐまたは５μg／ml  ネプリライシン(R&D systems)のいずれかとインキュベートしたとき、媒体と比較して５７％以上減少した。Ａβ４２の減少は、２０８μg／mlのｔｈｅ  Ｈｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐと比較したとき、ホスホラミドンで阻害されなかった。低濃度のＨｉｓ−Ｆｃ−ＮｅｐでＡβ４２分解はなかった(図３)。
【０１４５】
実施例１８
Ｆｃ−ネプリライシンによるヒト血漿中のアミロイドβペプチド１−４０の分解
８名(５名女性および３名男性)からの血液を予め冷却したヘパリン−血漿チューブに、２回の異なる時点でヘルスケアセンター(AstraZeneca)で採取した。血漿を、サンプリング３０分以内の２０分間、４℃で２５００ｘｇの遠心分離により製造した。血漿サンプルを、予め冷却したポリプロピレンチューブに移し、直ぐにドライアイスで冷却し、使用するまで−７０℃で貯蔵した。１０μM  ホスホラミドンの存在下または非存在下、Ｈｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐ(６μg／ml)または５μg／ml  組み換えヒトネプリライシン(R&D systems)と対応する媒体ｓ(５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ７.５または２５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８.０)を、貯蔵血漿と３７℃で０および４時間インキュベートした。４.７mMの最終濃度のＥＤＴＡをチューブに添加しその後Ａβ４０の量を、Biosourceから得た市販ＥＬＩＳＡキットで分析した。Ｈｉｓ−Ｆｃ−Ｎｅｐ(６μg／ml)および市販ヒト組み換えネプリライシン(５μg／ml)は、３７℃で４時間インキュベーション後、媒体と比較してＡβ４０を各々３３％および７０％分解した。Ａβ４０レベルは１０μM  ホスホラミドン添加後影響を受けなかった(図４)。
【０１４６】
実施例１９
社内で製造したＦｃ−Ｎｅｐによるモルモット血漿中のアミロイドβペプチド１−４０およびアミロイドβペプチド１−４２の分解(インビボ試験)
モルモットでのインビボ試験を、社内で製造したＦｃ−Ｎｅｐのインビボ効力を試験するために行う。読み取りは血漿Ａβレベルおよび血漿薬剤濃度である。γ−セクレターゼ阻害剤、ＡＺ１０４２０１３０(M550426)を参照(血漿Ａβレベル減少のポジティブコントロール)として使用する。
モルモット(雄Dunkin Hartleyモルモット、２５０−３００ｇ)を秤量し、１回静脈内投与する。この目的は、この投与量が最終的に０、５、および２０μg／mlの血漿暴露をもたらすはずであることである。動物の健康状態の観察を全実験を通して行う。８匹の動物が各辞典で含まれ、各辞典にはその時々の媒体群がある。動物をイソフルランで麻酔し、心臓穿刺により採血する。血液サンプル取り扱いおよびＡβ１−４０またはＡβ１−４２分析についての情報は(実施例２３参照)。全ての血漿サンプルを、薬剤暴露を測定するためのＰＫ試験に送った(方法の記載については、実施例２０参照)。
【０１４７】
実施例２０
Ｆｃ−Ｎｅｐおよびネプリライシンのみの薬物動態学的
Ｆｃ−Ｎｅｐ融合タンパク質を、クリアランスを減らし、半減期を改善する具体的な目的を持って、ネプリライシンの薬物動態学的本質を改善するために開発した。これを試験するために、我々は、１mg／kg市販ネプリライシンまたは１あるいは５mg／kgの社内で製造したＦｃ−Ｎｅｐをマウスに１回静脈内投与した。投与後一定時間に、血液サンプルを尾静脈から、または最後には心臓穿刺により得た。ＥＤＴＡ含有チューブにサンプリング後、アリコートを氷上に置いた。血漿をサンプリング１５分以内の遠心分離により製造し(典型的に１５００ｇ、４℃で１０分間)、直ぐに凍結させた。Ｆｃ−Ｎｅｐおよびネプリライシンの血漿濃度を、捕捉抗体として市販ネプリライシンに対して抗ＮｅｐまたはＦｃ−Ｎｅｐに対して抗ヒトＩｇＧのいずれかを使用した免疫アッセイを介して測定し、一方両方の物質は抗Ｎｅｐ抗体を介して検出した。薬物動態学的パラメーターは、ソフトウエアパッケージ(WinNonlin, Pharsight Corporation, USA)を使用して計算し、この実施例の実験で計算された半減期は、Ｎｅｐの約５分間からＦｃ−Ｎｅｐの約２０時間に増加した。結果を図５に示す。
【０１４８】
実施例２１
酵素活性ＦＲＥＴ−アッセイを使用した、細胞培地中のネプリライシン−ＦｃおよびＦｃ−ネプリライシンの酵素活性の比較
ＦｃのネプリライシンへのＣ末端融合およびＦｃのネプリライシンへのＮ末端融合を比較するために、両方のタンパク質(Ｆｃ−ネプリライシンおよびネプリライシン−Ｆｃ)を実施例４に従い製造し、実施例８に記載の通り精製した。細胞培地中のタンパク質の酵素活性を、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)アッセイで測定した。組み換えヒトネプリライシン(R&D systems)、Ｆｃ−ネプリライシン産生細胞からのおよびネプリライシン−Ｆｃ産生細胞からの培養培地を、１０μMの蛍光性ペプチド基質Ｖ−Ｍｃａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ(Ｄｎｐ)−ＯＨ(R&D systems)を含む９６ウェルプレートに添加した。コントロール組み換えヒトネプリライシンの最終濃度は０.１または０.２５μg／mlであった。ウェルへの全成分の添加に続き、プレートを直ぐに蛍光プレートリーダー(Ascent)に入れ、シグナルを、２０分間、毎分励起３４０nmおよび放出４０５nmで記録した。酵素の活性を、反応の速度を計算することにより評価した  −  傾斜係数＝ΣΔＲＦＵ／Δｔ。市販組み換えネプリライシン、ネプリライシン−Ｆｃ融合タンパク質およびＦｃ−ネプリライシン融合タンパク質の特異的活性を比較するために、我々は式：特異的活性＝傾斜係数／アッセイ中のネプリライシンまたは融合タンパク質モノマー(pmol)に従い計算する特異的活性係数を導入した。結果(図６に示す)は、Ｎｅｐ−Ｆｃの発現が、非常に低い特異的活性をもたらすが(ｐＣＥＰ４ベクターでの発現について０.１およびｐＥＡＫ１０ベクターでの発現について０.５５)、Ｆｃ−Ｎｅｐの発現ははるかに高い特異的活性をもたらすことを示す(ｐＣＥＰ４ベクターでの発現について１３.４およびｐＥＡＫ１０ベクターでの発現について１５.２)。
【０１４９】
実施例２２
酵素活性ＦＲＥＴ−アッセイを使用した精製ネプリライシン−ＦｃおよびＦｃ−ネプリライシンの酵素活性の比較
ＦｃのネプリライシンへのＣ末端融合およびＦｃのネプリライシンへのＮ末端融合を比較するために、両方のタンパク質(Ｆｃ−ネプリライシンおよびネプリライシン−Ｆｃ)を実施例４に従い製造し、実施例８に記載の通り精製した。ネプリライシン酵素活性を蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)アッセイで測定した。組み換えヒトネプリライシン(R&D systems)、精製ネプリライシン−Ｆｃタンパク質および精製Ｆｃ−ネプリライシンを、１０μMの蛍光性ペプチド基質Ｖ−Ｍｃａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ(Ｄｎｐ)−ＯＨ(R&D systems)を含む９６ウェルプレートに添加した。ウェルへの全成分の添加に続き、プレートを直ぐに蛍光プレートリーダー(Ascent)に入れ、シグナルを、２０分間、毎分励起３４０nmおよび放出４０５nmで記録した。酵素の活性を、反応の速度を計算することにより評価した  −  傾斜係数＝ΣΔＲＦＵ／Δｔ。市販組み換えネプリライシン、ネプリライシン−Ｆｃ融合タンパク質およびＦｃ−ネプリライシン融合タンパク質の特異的活性を比較するために、我々は、式：特異的活性＝傾斜係数／アッセイ中のネプリライシンまたはネプリライシン−Ｆｃモノマー(pmol)に従い計算した特異的活性係数を導入した。結果(図９に示す)は、精製融合タンパク質Ｎｅｐ−Ｆｃの特異的活性は非常に低いが(０.００１)、精製融合タンパク質Ｆｃ−Ｎｅｐの特異的活性ははるかに高い(１４.１)ことを示す。
【０１５０】
実施例２３
ＡＰＰＳＷＥ−トランスジェニックマウスにおける血漿中の可溶性Ａβレベルに対するＦｃ−ネプリライシンでの処置
この試験の目的は、急性急性静脈内処置後の雌ＡＰＰＳＷＥ−ｔｇマウスの血漿中のＦｃ−Ｎｅｐの時間および用量応答効果を評価することであった。具体的目標は、血漿Ａβ４０およびＡβ４２に対する効果の発見である。γ−セクレターゼ阻害剤Ｍ−５５０４２６を参照化合物として包含させる。
２５−３１週齢雌ＡＰＰＳＷＥ−トランスジェニックマウス(１０マウス／群)に、媒体または１もしくは５mg／kgのＦｃ−Ｎｅｐを１回静脈内注射として与えた。参照化合物として、３００μmol／kgのγ−セクレターゼ阻害剤Ｍ−５５０４２６を使用し、これらの動物を３時間処置した(４匹のマウス)。ブランク群(４匹の未処置マウス)も本試験に包含させた。血液を媒体および化合物処置動物から、投与１.５時間および３時間後に採血した。血液を、麻酔マウスからＥＤＴＡを含む予め冷却したチューブへの心臓穿刺により採取した。血液サンプルを遠心分離前に直ぐに氷上に置いた。血漿を、サンプリング２０分以内の１０分間、約３０００ｘｇで＋４℃の遠心分離により製造した。血液サンプリング後、マウス実験を終了した(terminated)。血漿中のＡβ４０およびＡβ４２レベルを、各々BiosourceおよびInnogeneticsから得た市販ＥＬＩＳＡキットにより分析した。
血漿および製剤中のＦｃ−Ｎｅｐの濃度を、実施例２０に記載の方法に従いアッセイした。血漿中の暴露を、未処置動物(ブランク）からのサンプルおよびM550426で処置した動物からのサンプルで分析した。
【０１５１】
結果
Ｆｃ−Ｎｅｐは、１または５mg／kg静脈内注射１.５時間後に媒体と比較して可溶性Ａβ４０のレベルを約２０％と有意に減少させたが(Ｐ＜０.０５)、ＡＰＰｓｗｅトランスジェニックマウスに投与３時間後は減少させなかった。１.５時間の１および５mg／kgでのＦｃ−Ｎｅｐの平均血漿暴露は各々９.８および３３.６μg／mであった。Ａβ４０の有意な変化は３時間後に見られなかったが、１および５mg／kgでのＦｃ−Ｎｅｐ血漿暴露は各々７.６および２７.３μg／mlであった。期待通り、Ａβ４０のレベルの減少が、ポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤M550426での処置後血漿で見られた。投与３時間後のM550426の平均血漿暴露は、３００μmol／kgを投与したマウスで３３.５μMであった(図７)。
５mg／kg  Ｆｃ−Ｎｅｐでの１.５時間処置後のＡβ４２の血漿レベルは、媒体と比較して約２０％減少した(Ｐ＜０.０５)。１mg／kg投与１,５時間後に有意な差は見られなかった。Ａβ４２の有意な差は、いずれの投与量でも３時間後には見られなかったが、１および５mg／kgのＦｃ−Ｎｅｐ血漿暴露は各々７.６および２７.３μg／mlであった。減少したＡβ４２のレベルが、ポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤M550426での処置後に血漿で観察された。投与３時間後のM550426の平均血漿暴露は、３００μmol／kgを投与したマウスで３３.５μMであった(図８)。
【０１５２】
実施例２４
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｈＦｃ−Ｎｅｐでの処置および血漿中の可溶性Ａβレベルに対する効果(時間および用量応答試験：１.５および３時間)
この試験の目的は、急性処置後の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血漿中ｈＦｃ−Ｎｅｐに対する時間および用量応答効果を評価することであった。具体的目標は、血漿Ａβ４０に対する効果を発見すること、および血漿中のｈＦｃ−Ｎｅｐの暴露レベルと相関させることであった。
γ−セクレターゼ阻害剤Ｍ−５５０４２６をポジティブコントロールとして包含させた。１３週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１０マウス／群)に媒体またはｈＦｃ−Ｎｅｐを１または５mg／kgで１回静脈内注射として与えた。Ｍ−５５０４２６を、終了３時間前に３００μmol／kg、経口投与した。ブランク群も本試験に包含させた。血液を、媒体−および化合物処置動物から投与１,５および３時間後に採血した。血液を、麻酔マウスからＥＤＴＡを含む予め冷却したチューブへの心臓穿刺により採取した。血液サンプルを遠心分離前に直ぐに氷上に置いた。血漿を、サンプリング２０分以内の１０分間、約３０００ｘｇで＋４℃の遠心分離により製造した。血液サンプリング後、マウス実験を終了した。動物の健康状態の観察を全実験を通して行い、有害作用のないことを確認した。血漿中のマウスＡβ４０レベルを、Biosourceから得た市販ＥＬＩＳＡキットにより分析した。血漿および製剤中のＦｃ−Ｎｅｐ濃度を、実施例２７に記載の方法に従いアッセイした。
【０１５３】
結果
結果は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、マウスＡβ４０が１.５および３時間後の両方でｈＦｃ−Ｎｅｐの処置により用量依存的方法で有意に減少することを示した。１.５時間後、媒体と比較して、１７％のＡβ４０減少が１mg／kg投与量で見られ(ｐ＝０.１６３８)、７６％の減少が５mg／kg投与量で見られた(ｐ＜０.０００１)。１.５時間での１および５mg／kgのｈＦｃ−Ｎｅｐの平均血漿暴露は各々１４および８９μg／mlであった。３時間後、Ａβ４０は、媒体と比較して、１mg／kg投与量で３６％(ｐ＜０.００５)および５mg／kg投与量で７２％(ｐ＜０.０００１)と有意に減少した。３時間目の１および５mg／kgでのｈＦｃ−Ｎｅｐの平均血漿暴露は各々１７および７８μg／mlであった。期待通り、Ａβ４０のレベルの減少は、ポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤Ｍ−５５０４２６で処置後の血漿でも見られた。投与後３時間のＭ−５５０４２６の平均血漿暴露は、３００μmol／kgを投与されたマウスで４２μMであった(図１０)。
【０１５４】
実施例２５
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射を介して１回投与したｈＦｃ−Ｎｅｐを使用した時間−応答相関関係
本試験の目的は、１回投与後の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のｈＦｃ−Ｎｅｐの時間−応答相関関係を評価することであった。具体的目標は、どの程度長くｈＦｃ−Ｎｅｐが血漿に止まるかを見ること、および血漿中の試験化合物の暴露レベルと効果レベルを相関させることである。γ−セクレターゼ阻害剤Ｍ−５５０４２６をポジティブ化合物として包含させる。
２０−２１週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(８マウス／群)に媒体またはｈＦｃ−Ｎｅｐを、５mg／kgで１回静脈内注射により与え、Ａβ４０を注射後種々の時点で分析した(１.５−１６８時間の間、すなわち、１週間まで)。γ−セクレターゼ阻害剤Ｍ−５５０４２６を経口で与え、動物を３時間処置した。ブランク群もまた本試験に包含させた。動物の健康状態の観察を全実験を通して行い、有害作用のないことを確認した。採血、血漿処理および血漿中のマウスＡβ４０レベル測定は、基本的に実施例２７に記載した通りであった。
【０１５５】
結果
結果(図１１)は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１回静脈内注射として与えたとき、血漿Ａβ４０が、ｈＦｃ−Ｎｅｐの１.５−１６８時間処置後に有意に減少することを示した。Ａβ４０減少は、全時点で(１.５、６、１２、２４、３６、７２および１６８時間)永続性であった(媒体と比較して６７−８０％)。１.５時間目のｈＦｃ−Ｎｅｐの５mg／kgでの平均血漿暴露は８７μg／mlであり、１週間(１６８時間)後３８μg／mlまでゆっくり減少した。これらのデータは、マウスにおけるＦｃ−Ｎｅｐ半減期が相当に長いことを示す。期待通り、Ａβ４０のレベルの減少は、ポジティブコントロール、γ−セクレターゼ阻害剤M550426での処置後の血漿でも見られた。投与後３時間のＭ−５５０４２６の平均血漿暴露は、３００μmol／kgを投与されたマウスで３４μMであった(図１１)。
【０１５６】
実施例２６
ＡＰＰＳＷＥ−ｔｇマウスおよびＣ５７ＢＬ／６に静脈内注射を介して１回投与したマウスＦｃ−Ｎｅｐを使用した時間−応答相関関係
本試験の目的は、１回投与後の雌ＡＰＰＳＷＥ−ｔｇマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のマウス版Ｆｃ−Ｎｅｐ(ｍＦｃ−Ｎｅｐ、配列番号１４)の時間−応答相関関係を評価することであった。具体的目標は、どの程度長くｍＦｃ−ＮｅｐのＡβに対する減少効果が血漿中に止まるかを見ること、および血漿中の試験化合物の暴露レベルと効果レベルを相関させることである。γ−セクレターゼ阻害剤Ｍ−５５０４２６をポジティブ化合物として包含させる。
２１−２３週齢雌ＡＰＰＳＷＥ−ｔｇマウスおよび２４週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(６マウス／群)に、媒体またはｍＦｃ−Ｎｅｐを、５または２５mg／kgで１回静脈内注射により与え、Ａβ４０を注射後種々の時点で分析した(１.５−３３６時間の間、すなわち、２週間まで)。Ｍ−５５０４２６を、終了３時間前に３００μmol／kg、経口投与した。両方のマウスモデルに関して、ＡＰＰＳＷＥ−ｔｇおよびＣ５７ＢＬ／６、ポジティブコントロールおよびブランク群を包含させた。ＡＰＰＳＷＥ−ｔｇマウスについては次の群が含まれた：２５mg／kg：１.５、７２、１６８および３３６時間；５mg／kg)：３３６時間(２週間)。Ｃ５７ＢＬ／６マウスについては次の通りであった：２５mg／kg：１６８および３３６時間；５mg／kg)：１.５、１６８および３３６時間。動物の健康状態の観察を全実験を通して行い、有害作用のないことを確認した採血および血漿処理は、基本的に実施例２５に記載した通りであった。Ｃ５７ＢＬ６マウスの血漿中のマウスＡβ４０レベルの分析は、実施例２５に記載の通りであった。ＡＰＰＳＷＥ−ｔｇマウスの血漿中のヒトＡβ４０およびＡβ４２レベルは、実施例２５に記載した通りであった(最後のＡＰＰ−ｔｇ試験において記載した通り)。
【０１５７】
結果
ＡＰＰＳＷＥ−トランスジェニックマウスにおいて、ｍＦｃ−Ｎｅｐは、２５mg／kgの１回投与後に全時点で血漿中のヒトＡβ４０およびＡβ４２を顕著に減少させた(図１２、ａおよびｂ)。１.５時間後、Ａβレベルは、媒体と比較したとき、Ａβ４０およびＡβ４２で各々９１％および８７％であり、Ａβレベルは暴露が減るに連れて徐々に増加する。２週間(３３６時間)後、Ａβレベルは、媒体と比較して、Ａβ４０およびＡβ４２で各々５８％および４４％である。２週間後、２５mg／ml  ｍＦｃ−Ｎｅｐの１回静脈内注射後の暴露は２９９μg／ml(１.５時間)から６０μg／ml(３３６時間)に減少している(図１２、ｃ)。１６８時間および３３６時間について、５mg／kgを与える別の動物群を追加した。図１２、ａおよびｂに示す通り、Ａβは、Ａβ４０およびＡβ４２の両方で、これらの時点で用量依存的方法で分解される。Ａβ４０およびＡβ４２両方の血漿有効性効果は、ｍＦｃ−Ｎｅｐの血漿暴露と逆相関する(図１３)。これらの結果は、ｍＦｃ−ＮｅｐのＡβ分解効果が、Ａβ４２に対するよりもＡβ４０に対して大きいことを示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ｍＦｃ−Ｎｅｐは、５および２５mg／kgの両方で、全時点(１.５時間、１６８時間および３３６時間)で血漿中のマウスＡβ４０を有意に減少させる(図１４)。１６８時間および３３６時間で、５および２５mg／kgの両方を分析し、Ａβ４０効果は用量依存性であることが示される。２週間後、２５mg／kg  ｍＦｃ−Ｎｅｐの１回注射(３３６時間)は、媒体と比較して、血漿中のマウスＡβ４０レベルを７３％減少させる。この時点での血漿暴露は４８μg／mlであり、それによりｍＦｃ−Ｎｅｐは長い血漿半減期を有することが示される。
【０１５８】
実施例２７
Ｆｃ−Ｎｅｐおよび社内製造ネプリライシンの薬物動態学的
薬物動態学的試験を、Ｆｃ−ＮｅｐａおよびＮｅｐの異なるバッチを使用して繰り返し、異なるＰＫプロファイルが得られた。最も重要なことは、ＩｇＧのＦｃ部分を含む化合物の血漿半減期の顕著な延長である。
Ｆｃ−Ｎｅｐ融合タンパク質を、クリアランスを低下させ、半減期を改善する具体的目標を持って、ネプリライシンの薬物動態学的本質を改善するために開発した。これを試験するために、我々は、マウスに１０または５０nmol酵素／kg体重のネプリライシン(Ｎｅｐ)またはＦｃ−Ｎｅｐ(１および５mg／kg)を１回静脈投与している。投与後一定時間に、血液サンプルを尾静脈から、または最後には心臓穿刺により得た。ＥＤＴＡ含有チューブにサンプリング後、アリコートを氷上に置いた。血漿をサンプリング１５分以内の遠心分離により製造し(典型的に１５００ｇ、４℃で１０分間)、直ぐに凍結させた。ＮｅｐおよびＦｃ−Ｎｅｐの血漿濃度を、捕捉抗体としてＮｅｐに対して抗ＮｅｐまたはＦｃ−Ｎｅｐに対して抗ヒトＩｇＧのいずれかを使用した免疫アッセイを介して測定し、一方両方の物質は抗Ｎｅｐ抗体を介して検出した。薬物動態学的パラメーターは、ソフトウエアパッケージ(WinNonlin, Pharsight Corporation, USA)を使用して計算し、この実施例の実験で計算された半減期は、Ｎｅｐの約１日からＦｃ−Ｎｅｐの約２.５週間に増加した。結果を図１５に示す。
【０１５９】
実施例２８
ヒトまたはマウスＦｃ−ネプリライシンによるヒトおよびＡＰＰｓｗｅ−ｔｇマウス血漿中のアミロイドβペプチド１−４０、１−４２の分解
１２名(６名女性および６名男性)からの血液を予め冷却したヘパリン−血漿チューブに、３回の異なる時点でヘルスケアセンター(AstraZeneca)で採取した。血漿を、２５００ｘｇで２０分間、４℃の遠心分離により製造した。血漿サンプルを回収し、予め冷却したポリプロピレンチューブに移し、直ぐに凍結させ、使用するまで−７０℃で貯蔵した。使用直前に血漿を融解し、１２名からのプールであった。血漿プール中のＡβ１−４０および１−４２は、対応する媒体(５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ７.５)を伴うヒトＦｃ−ＮｅｐまたはマウスＦｃ−Ｎｅｐで分解された。Ｆｃ−Ｎｅｐ構築物の次の最終濃度、１００、３２、１０、３.２、１、０.３、０.１および０pg／mlを使用し、分解を室温で１時間、オービタル・シェーカーで振盪させながら行った。酵素反応をホスホラミドン(１０μM最終濃度)添加により停止させた。ヒト血漿プール中のアミロイドβ１−４０の濃度を、製造者の指示に従いＥＬＩＳＡキット(Biosource;KHB3481)を使用して測定した。
４.７mMの最終濃度のＥＤＴＡをチューブに添加し、その後Ａβ４２の濃度を、製造者の指示に従いＥＬＩＳＡキットInnotest(登録商標) β-Amyloid1-42(Innogenetics, lot# 177462, ref# 80177)を使用して分析した。
最高濃度(１００μg／ml)のヒトＦｃ−ＮｅｐおよびマウスＦｃ−Ｎｅｐは、Ｆｃ−Ｎｅｐ処置なしの血漿と比較して、ヒト血漿アミロイドβ１−４０を、各々６６％および７１％分解し、Ａβ１−４２を各々２８％および１９％分解した。ヒトＦｃ−ＮｅｐおよびマウスＦｃ−Ｎｅｐによる分解のＥＣ５０値はヒトＡβ１−４０について各々０.５８μMおよび０.４０μMおよびＡβ１−４２について各々０.２５μMおよび０.１８μMであった。結果を図１６に要約する。
【０１６０】
９匹の動物から集めたマウス血漿を−７０℃で貯蔵した。実験直前に血漿を融解し、プールした。血漿プール中のＡβ１−４０および１−４２は、対応する媒体(５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ７.５)を伴うヒトＦｃ−ＮｅｐまたはマウスＦｃ−Ｎｅｐで分解された。Ｆｃ−Ｎｅｐ構築物の次の最終濃度、１００、３２、１０、３.２、１、０.３、０.１および０pg／mlを使用し、分解を室温で１時間、オービタル・シェーカーで振盪させながら行った。酵素反応をホスホラミドン(１０μM最終濃度)添加により停止させた。
分解後、製造者の指示に従い、血漿サンプルを標準希釈剤緩衝液で２０倍に希釈し、その後、ｔｇ−マウス血漿プールのアミロイドβ１−４０濃度をＥＬＩＳＡキット(Biosource;KHB3481)を使用して測定した。
分解後、４.７mMの最終濃度のＥＤＴＡをｔｇ−マウス血漿チューブに添加し、血漿サンプルをサンプル希釈剤で３倍に希釈し、その後Ａβ４２の濃度を、製造者の指示に従い、ELISAキットInnotest(登録商標) β-Amyloid1-42(Innogenetics, lot# 177462, ref# 80177)を使用して測定した。
最高濃度(１００μg／ml)のヒトＦｃ−ＮｅｐおよびマウスＦｃ−Ｎｅｐは、Ｆｃ−Ｎｅｐ処置なしの血漿と比較して、ヒト血漿アミロイドβ１−４０を各々７１％および７７％およびＡβ１−４２を各々３４％および５３％分解した。ヒトＦｃ−ＮｅｐおよびマウスＦｃ−Ｎｅｐによる分解のＥＣ５０値は、ヒトＡβ１−４０について各々０.４７μMおよび０.３４μMおよびＡβ１−４２について各々１.３μMおよび０.８２μMであった。結果を図１６に要約する。
【０１６１】
配列表
配列番号１
ネプリライシンの細胞外ドメインのアミノ酸配列、バージョン１
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
【０１６２】
配列番号２
ネプリライシンの細胞外ドメインのアミノ酸配列、バージョン２
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCRDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
【０１６３】
配列番号３
ネプリライシンの細胞外ドメインのアミノ酸配列、バージョン３
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMRLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
【０１６４】
配列番号４
ネプリライシンの細胞外ドメインのアミノ酸配列、バージョン４
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCRDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMRLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
【０１６５】
配列番号５
ＩＤＥ(インスリン分解酵素)のアミノ酸配列
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQLYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLRAEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGILHYYPLEEVLTAEYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQEAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTVMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLVKPHINFMAAKL
【０１６６】
配列番号６
ＩＤＥ(インスリン分解酵素)のアミノ酸配列(スプライス変異体)
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLISDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQLYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLRAEGPQGWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGILHYYPLEEVLTAEYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQEAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTAMSKLWFKQDDKFFLPKACLNFEFFSRYIYADPLHCNMTYLFIRLLKDDLKEYTYAARLSGLSYGIASGMNAILLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQGLRFIIQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLVKPHINFMAAKL
【０１６７】
配列番号７
ＥＣＥ１(エンドセリン−変換酵素１)のアミノ酸配列
QYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPTVDPCHDFFSYACGGWIKANPVPDGHSRWGTFSNLWEHNQAIIKHLLENSTASVSEAERKAQVYYRACMNETRIEELRAKPLMELIERLGGWNITGPWAKDNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSVYVSADSKNSNSNVIQVDQSGLGLPSRDYYLNKTENEKVLTGYLNYMVQLGKLLGGGDEEAIRPQMQQILDFETALANITIPQEKRRDEELIYHKVTAAELQTLAPAINWLPFLNTIFYPVEINESEPIVVYDKEYLEQISTLINTTDRCLLNNYMIWNLVRKTSSFLDQRFQDADEKFMEVMYGTKKTCLPRWKFCVSDTENNLGFALGPMFVKATFAEDSKSIATEIILEIKKAFEESLSTLKWMDEETRKSAKEKADAIYNMIGYPNFIMDPKELDKVFNDYTAVPDLYFENAMRFFNFSWRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAYYSPTKNEIVFPAGILQAPFYTRSSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGREYDKDGNLRPWWKNSSVEAFKRQTECMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLGENIADNGGLKAAYRAYQNWVKKNGAEHSLPTLGLTNNQLFFLGFAQVWCSVRTPESSHEGLITDPHSPSRFRVIGSLSNSKEFSEHFRCPPGSPMNPPHKCEVW
【０１６８】
配列番号８
発現構築物に使用したシグナルペプチドのアミノ酸配列
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD
【０１６９】
配列番号９
ヒンジ領域(ＩｇＧ２から)のアミノ酸配列
ERKCCVECPPCP
【０１７０】
配列番号１０
Ｆｃドメイン(ＩｇＧ２から)のアミノ酸配列
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０１７１】
配列番号１１
完全融合タンパク質Ｆｃ−ネプリライシンのアミノ酸配列
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKYDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
【０１７２】
配列番号１２
完全融合タンパク質Ｆｃ−ＩＤＥのアミノ酸配列
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKMRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPFQEEHLKQLYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFIINVDLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLRAEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKIAGILHYYPLEEVLTAEYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQEAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTVMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDAPRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLVKPHINFMAAKL
【０１７３】
配列番号１３
完全融合タンパク質Ｆｃ−ＥＣＥ１のアミノ酸配列
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPTVDPCHDFFSYACGGWIKANPVPDGHSRWGTFSNLWEHNQAIIKHLLENSTASVSEAERKAQVYYRACMNETRIEELRAKPLMELIERLGGWNITGPWAKDNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSVYVSADSKNSNSNVIQVDQSGLGLPSRDYYLNKTENEKVLTGYLNYMVQLGKLLGGGDEEAIRPQMQQILDFETALANITIPQEKRRDEELIYHKVTAAELQTLAPAINWLPFLNTIFYPVEINESEPIVVYDKEYLEQISTLINTTDRCLLNNYMIWNLVRKTSSFLDQRFQDADEKFMEVMYGTKKTCLPRWKFCVSDTENNLGFALGPMFVKATFAEDSKSIATEIILEIKKAFEESLSTLKWMDEETRKSAKEKADAIYNMIGYPNFIMDPKELDKVFNDYTAVPDLYFENAMRFFNFSWRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAYYSPTKNEIVFPAGILQAPFYTRSSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGREYDKDGNLRPWWKNSSVEAFKRQTECMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLGENIADNGGLKAAYRAYQNWVKKNGAEHSLPTLGLTNNQLFFLGFAQVWCSVRTPESSHEGLITDPHSPSRFRVIGSLSNSKEFSEHFRCPPGSPMNPPHKCEVW
【０１７４】
配列番号１４
完全マウス融合タンパク質Ｆｃ−ネプリライシンのアミノ酸配列
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVPRDCGCKPCICTVPPVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFASTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKYDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDASVEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYSNFDILRDELEVILKDVLQEPKTEDIVAVQKAKTLYRSCINESAIDSRGGQPLLKLLPDIYGWPVASDNWDQTYGTSWTAEKSIAQLNSKYGKKVLINFFVGTDDKNSTQHIIHFDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEQSLPIDENQLSLEMNKVMELEKEIANATTKPEDRNDPMLLYNKMTLAKLQNNFSLEVNGKSFSWSNFTNEIMSTVNINIQNEEEVVVYAPEYLTKLKPILTKYS
PRDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRNYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKKAEEKALAIKERIGYPDDIISNENKLNNEYLELNYREDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSANNFKDQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGIGQAYRAYQNYVKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFADAFHCRKNSYMNPERKCRVW
【０１７５】
配列番号１５
ヒトアミロイドβペプチド１−３８のアミノ酸配列
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
【０１７６】
配列番号１６
ヒトアミロイドβペプチド１−３９のアミノ酸配列
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV
【０１７７】
配列番号１７
ヒトアミロイドβペプチド１−４０のアミノ酸配列
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
【０１７８】
配列番号１８
ヒトアミロイドβペプチド１−４１のアミノ酸配列
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVI
【０１７９】
配列番号１９
ヒトアミロイドβペプチド１−４２のアミノ酸配列
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
【０１８０】
配列番号２０
ヒトアミロイドβペプチド１−４３のアミノ酸配列
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT
【図１】
2010522559.tif 000003
【図２】
2010522559.tif 000004
【図３】
2010522559.tif 000005
【図４】
2010522559.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月27日(2009.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年12月2日(2009.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドベータペプチドを、該アミロイドベータペプチドアミノ酸配列の１個所以上の開裂部位で分解できる、式Ｍ−Ａ(ここで、Ｍは、融合タンパク質の半減期を延長するタンパク質成分であり、そして、Ａはアミロイドベータペプチドを分解するタンパク質成分であり、該Ｍタンパク質成分は、Ａタンパク質成分のＮ末端部分に共有結合している)を有する融合タンパク質。
【請求項２】
Ａがヒトネプリライシン、インスリン分解酵素およびエンドセリン−変換酵素１から選択されるプロテアーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
該ネプリライシンが細胞外ネプリライシンである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
配列番号１、２、３または４のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の細胞外ネプリライシン。
【請求項５】
Ｍが抗体のＦｃ部分、抗体結合ドメイン、ペグ化およびグリコシル化から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＭがＩｇＧ抗体のＦｃ部分である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
該抗体がＩｇＧ２抗体である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＭおよびＡが一体となってリンカーＬに結合する、請求項１から８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｌがペプチドおよび化学リンカーから選択される、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
アミロイドβペプチド濃度を減少させる方法であって、請求項１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項１２】
アミロイドβペプチドの減少が血漿中、ＣＳＦ中またはＣＮＳ中で達成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
薬学的に許容される量の請求項１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質を薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む、アミロイドβペプチドを分解できる医薬組成物。
【請求項１４】
医学的治療に使用するための、請求項１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
アルツハイマー病、全身性アミロイドーシスまたは脳アミロイド血管症の予防および／または処置用医薬の製造における、請求項１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【国際調査報告】
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