(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血または末梢血細胞におけるＴＲＰＣ６のレベルの検出によってアルツハイマー病（ＡＤ）を予測または診断する試薬またはキットの製造のための、標準一過性受容体電位チャネル６（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ６、ＴＲＰＣ６）遺伝子またはそのタンパク質の使用。
【請求項２】
前述の検出は、末梢血細胞におけるＴＲＰＣ６のｍＲＮＡレベルを測定することであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記のＴＲＰＣ６は、哺乳動物由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記のＴＲＰＣ６は、ヒト、マウス、ラット由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記の試薬は、プライマー、プローブ、核酸チップ、タンパク質チップ、ＴＲＰＣ６特異的抗体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記のプライマーは、配列番号：１（センス鎖）および配列番号：２（アンチセンス鎖）で示されるプライマー対であることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
末梢血細胞におけるＴＲＰＣ６のｍＲＮＡを測定することによってアルツハイマー病を予測または診断するキットであって、ＴＲＰＣ６を検出する核酸チップあるいはＴＲＰＣ６のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー、および末梢血細胞におけるＴＲＰＣ６のｍＲＮＡを測定することによってアルツハイマー病を予測または診断する説明を含むマニュアルを含むことを特徴とする、キット。
【請求項８】
末梢血細胞におけるＴＲＰＣ６のｍＲＮＡの発現レベルを測定することによってアルツハイマー病を早期予測または診断するキットの製造のための、ＴＲＰＣ６のｍＲＮＡの検出試薬の使用。
【請求項９】
（ａ）ＡＤを予防および／または治療する薬物の製造、（ｂ）β−アミロイドレベルを低下させる薬物の製造、および／または（ｃ）γ−セクレターゼの活性調節剤の製造のための、ＴＲＰＣ６タンパク質またはその誘導タンパク質もしくは作動薬の使用であって、ここで該ＴＲＰＣ６タンパク質またはその誘導タンパク質もしくは作動薬が、以下：
（ａ）配列番号：４で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチド；
（ｂ）ポリペプチド（ａ）と細胞透過性ペプチドエレメントからなる融合タンパク質；または
（ｄ）配列番号：４で示されるアミノ酸を有するポリペプチドおよび細胞透過性ペプチドエレメントによって形成される融合タンパク質であり、前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質（ｄ）が、Ａβレベルを下方調節するがγ−セクレターゼによるＮｏｔｃｈの切断に影響を与えない機能を有する、
からなる群から選択される、前記使用。
【請求項１０】
分離されたポリペプチドであって、
（ａ）配列番号：４で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチド、
（ｂ）ポリペプチド（ａ）と細胞透過性ペプチドエレメントからなる融合タンパク質；または
（ｄ）ＴＲＰＣ６タンパク質のＴＭ２領域（４８７〜５０７ａａ）で示されるポリペプチド、またはＴＭ２領域と細胞透過性ペプチドエレメント からなる融合タンパク質であり、前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質（ｄ）が、Ａβレベルを下方調節するがγ−セクレターゼによるＮｏｔｃｈの切断に影響を与えない機能を有する、
からなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含むか、或いはゲノムに外来の請求項１１に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１０に記載のポリペプチドを生成する方法であって、
（ｉ）請求項１３に記載の宿主細胞を培養し、請求項１０に記載のポリペプチドを発現すること、および
（ｉｉ）培養系から請求項１０に記載のポリペプチドを分離すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
薬学的に許容されるベクターと請求項１０に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項１６】
（ａ）ＡＤを予防および／または治療する薬物の製造、（ｂ）β−アミロイドレベルを低下させる薬物の製造、および／または（ｃ）γ−セクレターゼの活性調節剤の製造のための、請求項１０に記載のポリペプチド、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２に記載のベクターまたは請求項１５に記載の薬物組成物の使用。
【請求項１７】
ＡＤを予防または治療する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）テスト群で、細胞の培養系にテスト化合物を添加し、かつ前記テスト群の細胞におけるＴＲＰＣ６の発現量および／または活性を観察し、対照群で、同様の細胞の培養系にテスト化合物を添加せず、かつ対照群の前記細胞におけるＴＲＰＣの発現量および／または活性を観察する工程を含み、
ここで、テスト群におけるＴＲＰＣ６の発現量および／または活性が対照群よりも高い場合、当該テスト化合物がＴＲＰＣ６の発現および／または活性に強化作用を有する、ＡＤを予防または治療する候補化合物であることが示される、
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術の分野に関し、具体的に、アルツハイマー病を予測または診断する試薬またはキットの製造に使用される、標準一過性受容体電位チャネル6（transient receptor potential canonical 6、TRPC6と略する）遺伝子またはそのタンパク質の使用に関する。さらに、本発明は、AD治療薬の製造に使用されるポリペプチドおよびその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病(Alzheimer disease、AD)、すなわち、老年性認知症は、年配者において最も見られる認知症を引き起こす神経変性疾患である。米国ジョンズ・ホプキンス大学の研究では、2050年に、世界中で85人に1人老年性認知症を患うようになることが報告されました。ADの臨床所見は、記憶と認知の機能が持続的に悪化し、日常生活能力が進行的に衰退し、且つ様々な神経・精神的症状と行為障害が伴う。AD患者の死後の脳組織の切片では、特徴的な細胞外の老人斑および細胞内の神経線維の絡みが示される。なかでは、老人斑は、主に、神経毒性のあるβ-アミロイド(β-amyloid、Aβ)からなり、現在主流のAβ仮説では、これに基づき、過剰のAβがADになる要因の一つと言われている。
【０００３】
また、Aβは、その前駆体タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（Amyloid Precursor Protein、APP）が順にβ-及びγ-セクレターゼによって切断されてなり、一方、α-セクレターゼがAPPを切断すると、Aβの形成が阻害されると同時に、神経栄養作用のあるsAPPαが生成する(Mudher, A.およびLovestone, S. Trends Neurosci 25, 22-26 (2002)； Selkoe, D.J. Ann Intern Med 140, 627-638 (2004)； Selkoe, D.J. Nat Med 17, 1060-1065)。
【０００４】
ADの診断について、現在、ADと診断する決定的な基準は、患者が亡くなった後、脳組織の切片を採取して病理検査を行い、細胞外の老人斑および細胞内の神経線維の絡みの存在を確認することである。臨床の診断は、主に、患者の認知レベルの検査、例えばミニメンタルステート検査（MMSE）などで行われる。しかし、主観的なスケールを診断の根拠とするテストとして、MMSE指標の特異性と感度が低い。
しかしながら、ADのリスクを早期予測して早めに処置することができれば、当然、AD患者に認知障害が生じてから、ひいては亡くなってから診断するよりも臨床上もっと意義がある。
【０００５】
そのため、本分野では、認知障害が生じる前に、客観的に、正確に発病の可能性があるハイリスクグループを選別し、早期の段階でADの可能性を指摘し、かつADの予防、治療に十分な時間を与えることができるように、特異的で、確実なADの早期予測・診断に適するバイオマーカーの開発が切望されている。
【０００６】
ADの治療について、現在、各セクレターゼ（例えばγ-セクレターゼ）のAPPに対する切断を調節することによってAβの形成を減少させることはADの治療に有用であると言われている。しかしながら、γ-セクレターゼの阻害剤でADを治療する臨床試験は成功していなかった。現在、臨床試験の失敗は、主に、γ-セクレターゼの基質は、APPのほか、例えばNotch, E-cadherin, ErbB-4など、多くのほかの基質があるためであると言われている(Haapasalo, A.およびKovacs, D.M. J Alzheimers Dis 25, 3-28；Xia, W.およびWolfe, M.S. J Cell Sci 116, 2839-2844 (2003))。これらの基質は、γ-セクレターゼによる切断で、それぞれの重要な生理機能を果たす。そのため、γ-セクレターゼを抑制する薬物は、多くの基質が正常の生理機能を果たすのを阻止するかもしれない。
【０００７】
最近、リリー社はγ-セクレターゼ阻害剤（Semagacestat、LY450139）の第III相臨床試験を中止した。その臨床結果から、Semagacestatを服用した後、AD患者の認知レベルが下がり、皮膚癌の傾向が増加し、かつ胃腸障害が伴ったことが示され、後者の二つは当該テスト薬物が不利にγ-セクレターゼによるNotchの切断を抑制することに関連すると言われた(Siemers, E.,ら Safety, Clin Neuropharmacol 28, 126-132 (2005)；Siemers, E.R.,ら Neurology 66, 602-604 (2006).；Hofmann, T., Schaefer, M., Schultz, G.およびGudermann, T. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 7461-7466 (2002).)。これは、理想のAD治療薬は、特異的にγ-セクレターゼによるAPPの切断を抑制するが、ほかの基質を切断する機能に影響を与えない必要があることを示す。
そのため、本分野では、さらに、ADを治療または予防し、かつ副作用が低い薬物の開発が切望されている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一つの目的は、特異的で、確実なADの早期予測・診断に適するバイオマーカー、およびアルツハイマー病の予測または診断におけるその使用を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、ADの治療または予防に使用でき、かつ副作用が低い治療剤およびその使用を提供することである。
【０００９】
本発明の第一は、検出によってアルツハイマー病（AD）を予測または診断する試薬またはキットの製造に使用される、標準一過性受容体電位チャネル6（transient receptor potential canonical 6、TRPC6）遺伝子またはそのタンパク質の使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のTRPC6遺伝子は、TRPC6のDNA配列またはmRNA配列を含む。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記の検出は、末梢血細胞におけるTRPC6のmRNAレベルを測定することである。
もう一つの好適な例において、前記のTRPC6は、哺乳動物、好ましくはヒト、マウス、ラット由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記の試薬は、プライマー、プローブ、核酸チップ、タンパク質チップ、TRPC6特異的抗体を含む。
もう一つの好適な例において、前記のプライマーは、配列番号：1（センス鎖）および配列番号：2（アンチセンス鎖）で示されるプライマー対である。
【００１１】
本発明の第二は、末梢血細胞におけるTRPC6のmRNAを測定することによってアルツハイマー病を予測または診断するキットであって、TRPC6を検出する核酸チップあるいはTRPC6のmRNAまたはcDNAを特異的に増幅するプライマー、および末梢血細胞におけるTRPC6のmRNAを測定することによってアルツハイマー病を予測または診断する説明を含むマニュアルを含むキットを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のキットは、さらに、
（i）末梢血における全RNAを抽出する試薬、
（ii）逆転写用プライマー、
（iii）逆転写反応用逆転写酵素、
（iv）PCR反応用ポリメラーゼ
からなる群から選ばれる1種または複数種の試薬を含む。
【００１２】
本発明の第三は、末梢血細胞におけるTRPC6のmRNAの発現レベルを測定することによってアルツハイマー病を早期予測または診断するキットの製造に使用される、TRPC6のmRNAの検出試薬の使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の早期とは早期AD（例えばMCI患者）を予測または診断することで、ここで、前記の早期AD患者とはMMSE＞15の患者である。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記MCI患者とは軽度の認知障害が現れたが、ADの診断基準に達していない患者である。
もう一つの好適な例において、前記の検出は、末梢血細胞におけるTRPC6のmRNAの発現レベルを検出し、かつ正常対照（または正常者）と比較することである。
もう一つの好適な例において、前記の試薬は、プライマー、プローブ、核酸チップ、タンパク質チップを含む。
【００１４】
本発明の第四は、
（a）検出対象由来の末梢血または末梢血細胞のmRNAを抽出する工程と、
（b）前記mRNAにおけるTRPC6のmRNAの発現レベルを検出し、かつ正常者と比較し、正常者よりも顕著に低い場合、当該対象がADを患う確率または感受性が正常者がADを患う確率または感受性よりも高いことを示す工程と、
を含む検出方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前述の検出は、リアルタイム蛍光定量PCR検出である。
【００１５】
本発明の第五は、（a）ADを予防および/または治療する薬物の製造、（b）β-アミロイドレベルを低下させる薬物の製造、および/または（c）γ-セクレターゼの活性調節剤（特に、選択的阻害剤）の製造に使用される、TRPC6タンパク質またはその誘導タンパク質もしくは作動薬の使用を提供する。
もう一つの好適な例において、ニューロンにおけるγ-セクレターゼの生成レベルを低下させる薬物の製造に使用される。
もう一つの好適な例において、前記のTRPC6タンパク質は、マウスのもので、好ましくはアミノ酸配列が配列番号：5で示されるようなものである。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記の誘導タンパク質は、
（a）TRPC6タンパク質の487〜507番目を含むアミノ酸配列で構成されるポリペプチド、
（b）ポリペプチド（a）と膜透過性ペプチドエレメントからなる融合タンパク質、
（c）ポリペプチド（a）または（b）から1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって誘導され、かつAβレベルを下方調節するがγ-セクレターゼによるNotchの切断に影響を与えない機能を有する誘導ポリペプチド、
（d）Aβレベルを下方調節するがγ-セクレターゼによるNotchの切断に影響を与えない機能を有する、アミノ酸配列がTRPC6タンパク質のTM2領域（487〜507aa）に相応するポリペプチド、またはTM2領域と膜透過性ペプチドエレメントからなる融合タンパク質、
からなる群から選ばれる。
【００１７】
本発明の第六は、分離されたポリペプチドであって、
（a）TRPC6タンパク質の487〜507番目を含むアミノ酸配列で構成されるポリペプチド、
（b）ポリペプチド（a）と膜透過性ペプチドエレメントからなる融合タンパク質、
（c）ポリペプチド（a）または（b）から1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって誘導され、かつAβレベルを下方調節するがγ-セクレターゼによるNotchの切断に影響を与えない機能を有する誘導ポリペプチド、
（d）Aβレベルを下方調節するがγ-セクレターゼによるNotchの切断に影響を与えない機能を有する、アミノ酸配列がTRPC6タンパク質のTM2領域（487〜507aa）に相応するポリペプチド、またはTM2領域と膜透過性ペプチドエレメントからなる融合タンパク質、
から選ばれるポリペプチドを提供する。
もう一つの好適な例において、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号：4で示されるようなものである。
【００１８】
本発明の第七は、本発明の第六に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
もう一つの好適な例において、前記ポリヌクレオチドは、配列が配列番号：3における1459〜1521番目で示されるようなものである。
【００１９】
本発明の第八は、本発明の第七に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明の第九は、本発明の第八に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに外来の本発明の第七に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
本発明の第十は、本発明の第六に記載のポリペプチドを生成する方法であって、
（i）本発明の第九に記載の宿主細胞を培養し、本発明の第六に記載のポリペプチドを発現すること、および
（ii）培養系から本発明の第六に記載のポリペプチドを分離すること、
【００２０】
本発明の第十一は、薬学的に許容されるベクターと本発明の第六に記載のポリペプチドを含む薬物組成物を提供する。
を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明の第十二は、（a）ADを予防および/または治療する薬物の製造、（b）β-アミロイドレベルを低下させる薬物の製造、および/または（c）γ-セクレターゼの活性調節剤（特に、選択的阻害剤）の製造に使用される、本発明の第六に記載のポリペプチド、本発明の第七に記載のポリヌクレオチド、本発明の第八に記載のベクターまたは本発明の第一に記載の薬物組成物の使用を提供する。
【００２２】
本発明の第十三は、ADを予防または治療する化合物をスクリーニングする方法であって、
（a）テスト群で、細胞の培養系にテスト化合物を添加し、かつ前記テスト群の細胞におけるTRPC6の発現量および/または活性を観察し、対照群で、同様の細胞の培養系にテスト化合物を添加せず、かつ対照群の前記細胞におけるTRPCの発現量および/または活性を観察する工程を含み、
ここで、テスト群におけるTRPC6の発現量および/または活性が対照群よりも高い場合、当該テスト化合物がTRPC6の発現および/または活性に強化作用を有するADを予防または治療する候補化合物であることが示される、
方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前述方法は、さらに、
（b）工程（a）で得られた候補化合物に対し、さらにそのAβに対する抑制作用をテストする工程を含む。
【００２３】
本発明の第十四は、ADおよび/またはMCIを予防または治療する方法であって、必要な対象に安全有効量の請求項9に記載のポリペプチドまたは請求項14に記載の薬物組成物を投与する方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のADは、早期AD（MMSE＞15）を含む。
【００２４】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上述の各技術特徴および下述（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好ましい技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図1は、異なる人において末梢血細胞におけるTRPC5およびTRPC6のmRNAレベルを示す。中では、図1aで、相応する年齢の非AD対照群と比較すると、AD患者の末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが顕著に低かったが、TRPC6のmRNAレベルは相応する年齢の非AD対照群と若い非AD対照群の間で差がなかった。図1bで、末梢血細胞のTRPC5のmRNAレベルは、AD群、相応する年齢の非AD対照群および若い非AD対照群の間で有意差がなかった。図1cで、末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルは、PD患者と相応する年齢の非PD対照群の間で有意差がなかった。図1d、f、gで、サンプル量を増幅させた後、得られた結果はそれぞれ図1a、b、cと同様であった。図1eは、ROC曲線分析でAUC=0.8324、感度=78.74％、特異度=71.82％であったことを示し、TRPC6のmRNAレベルは、ADと相応する年齢の非AD対照で、特異度と感度が共に非常に高かったことがわかる。図1hは、TRPC6のmRNAおよびMMSEに対して線形回帰分析を行ったところ、R2=0.1179、P=0.0002であったことを示し、ADの痴呆程度が厳重なほど、その末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが低かったことがわかる。図1iは、早期AD患者は、末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが相応する年齢の非AD対照群よりも顕著に低かった（P＜0.0001）ことを示す。図1jは、ROC曲線分析でAUC=0.8235、感度=78.43％、特異度=70.91％であったことを示し、TRPC6のmRNAレベルでは、早期AD患者に対して有効な診断を行うことができることがわかる。図1kは、MCI患者は、末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが相応する年齢の非MCI対照群よりも顕著に低かった（***P＜0.0001）ことを示す。図1lは、ROC曲線分析でAUC=0.8370、感度=76.79％、特異度=84.62％であったことを示し、TRPC6のmRNAレベルでは、早期MCI患者に対して有効な診断を行うことができることがわかる。
【００２６】
【図２】図2は、異なるマウスにおいて末梢血細胞および脳組織におけるTRPC5およびTRPC6のレベルを示す。図2aおよび2bで、HEK293細胞においてAPPの発現によるAβの累積の向上がTRPC6およびTRPC5のmRNAおよびタンパク質のレベルに影響を与えなかった。図2cおよび2dで、野生型（WT）マウスと比較すると、APP/PS1マウスの末梢血細胞および脳組織のTRPC6およびTRPC5のmRNAレベルに有意差がなかった。図2eで、WTマウスと比較すると、APP/PS1マウスの脳組織のTRPC6タンパク質レベルに有意差がなかった。
【００２７】
【図３】図3は、TRPC6の発現レベルがAβレベルに影響を与えることを示す。図3aで、ELISAの結果から、HEK293 APP細胞において過剰発現のTRPC6がAβレベルを減少させたが、過剰発現のTRPC5は類似の作用がなかったことがわかる。図3bで、ELISAの結果から、初代培養の皮層ニューロンにおいてRNAiでTRPC6をノックアウトすることによってAβレベルを向上させたことがわかる。図3cで、ELISAの結果から、初代培養の皮層ニューロンにおいてRNAiでTRPC6をノックアウトすることによってAβレベルを向上させたが、TRPC5のノックアウトは同じような作用がなかったことがわかる。
【００２８】
【図４】図4は、異なるマウスの脳切片の老年斑の染色の結果および分析を示す。図4aは、APP/PS1およびAPP/PS1/TRPC6のマウスの脳切片のAβ抗体による老年斑の染色の典型的な図である。標尺=500μm。図4bで、老年斑沈積の定量分析では、APP/PS1/TRPC6のマウスの脳切片の老年斑の面積の百分率がAPP/PS1マウスよりも顕著に低かったことが示された。図4c〜eで、ELISA結果は、APP/PS1/TRPC6マウスの全Aβ、TBSTに可溶および不溶のAβレベルがいずれもAPP/PS1マウスよりも顕著に低かったことを示す。
【００２９】
【図５】図5は、TRPC6が特異的にγ-セクレターゼによるAPPの切断を抑制することができることを示す。図5aで、ELISA結果は、COS7C99安定細胞株において過剰発現のTRPC6がAβレベルを低下させたことを示す。図5bで、HEK293APP細胞において過剰発現のTRPC6がγ-セクレターゼの切断によるC99-GVP/UAS-ルシフェラーゼ活性を減少させた。図5cで、免疫ブロットの結果は、過剰発現のTRPC6がγ-セクレターゼによるNotch△E-mycの切断で生成したNICDの量に影響を与えなかったことを示す。
【００３０】
【図６】図6は、TRPC6の構造および487〜507aaを含むTRPC6突然変異体（断片）がAβレベルを下方調節することができることを示す。図6aは、TRPC6の位相構造図で、6つの膜貫通領域および細胞内に位置するN末端とC末端を有することを示す。図6bで、ELISA結果は、過剰発現のTRPC6-1/405またはTRPC6-725/930がAβレベルに影響を与えなかったことを示す。図6cは、TRPC6短縮突然変異体の概略図である。図6dで、ELISA結果は、437〜508aaを含むTRPC6突然変異体の過剰発現がAβを下方調節することができたが、437〜508aaを含まないTRPC6突然変異体の発現がAβを下方調節することができなかったことを示し、437〜508aaがTRPC6によるAβレベルの下方調節に重要であることを示唆する。図6eで、ELISA結果は、HEK293APP細胞において、TAT-TM2融合タンパク質が投与量依存的にAβレベルを下方調節することができたことを示す。図6fで、免疫ブロットは、TAT-TM2がγ-セクレターゼによるNotch△E-mycの切断で生成したNICDの量を変えることができなかったことを示す。図6gは、TRPC6のTM2ドメイン（487〜507aa）を含む突然変異体の概略構成図を示す。図6hは、TRPC6のTM2ドメイン（487〜507aa）を含む突然変異体のプラスミドがいずれもAβレベルを低下させることができなかったことを示す。
【００３１】
【図７】図7は、本発明のポリペプチドのヒト、マウス、ラット、チンパンジー、ウシ、イヌおよびネコのTRPC6タンパク質における相応の位置の比較結果を示す。
【図８】図8aで、APOE3遺伝子型の個体のTRPC6のmRNAレベルが比較的に高く、APOE4遺伝子型の個体のTRPC6のmRNAレベルが比較的に低かった（***P＜0.001）。ここで、AD-4*4、AD-3*3、AD-3*4は、それぞれAD患者におけるAPOE4ホモ接合体の個体、APOE3ホモ接合体の個体、APOE3および4のヘテロ接合体の個体を示す。Control-2*3、Control-3*3、Control-3*4は、それぞれ対照におけるAPOE2および3のヘテロ接合体の個体、APOE3ホモ接合体の個体、APOE3および4のヘテロ接合体の個体を示す。Combined-2*3、Combined-3*3、Combined-3*4は、それぞれ全部の個体におけるAPOE2および3のヘテロ接合体の個体、APOE3ホモ接合体の個体、APOE3および4のヘテロ接合体の個体を示す。図8bで、APOE3を含有する培養液上清がJurkat細胞におけるTRPC6のmRNAレベルを増加させることができたが、APOE4を含有する培養液上清がJurkat細胞におけるTRPC6のmRNAレベルに影響を与えなかった。図8cで、APOE3を含有する培養液上清がラットのニューロンにおけるTRPC6のmRNAレベルを増加させることができたが、APOE4を含有する培養液上清がラットのニューロンにおけるTRPC6のmRNAレベルに影響を与えなかった。
【００３２】
【図９】図9aは、融合ペプチドTAT-TM2および突然変異体ペプチドTAT-TM2-mutのHEK293APP安定トランスフェクト細胞系のAβレベルに対する影響である。ここで、TAT-TM2はAβのレベルを顕著に低下させることができたが、TAT-TM2-mutはAβのレベルに顕著な影響を与えることができなかった。図9bで、ELISA結果は、HEK293APP細胞において、TAT-TM2融合タンパク質が投与量依存的にAβレベルを下方調節することができたことを示す。図9cで、初代培養の皮層ニューロンにおいて、融合ペプチドTAT-TM2がAβレベルを顕著に低下させることができた。図9d〜eは、TAT-TM2-CがHEK293APP細胞においてAβレベルを下方調節することができたが、その突然変異体であるTAT-TM2-C-m2とTAT-TM2-C-m3およびTAT-TM2-NがAβレベルに影響を与えることができなかったことを示す。図9fで、マウス体内実験において、融合ペプチドTAT-TM2が同様にAβレベルを顕著に低下させることができた。
【００３３】
【図１０】図10a〜bで、TAT-TM2はC99がγ-セクレターゼによって切断されて生成するAβを減少させ、C99がγ-セクレターゼによって切断されて活性化するルシフェラーゼ活性を減少させた。図10cで、TAT-TM2はNICDレベルを変えず、すなわち、TAT-TM2はγ-セクレターゼによるNotchの切断に影響を与えない。
【００３４】
具体的な実施形態
本発明者は、長期間に深く研究したところ、初めて、AD患者において、末梢血細胞のTRPC6のmRNA発現レベルが低く、かつ年齢の増加によって減少するわけではないことを意外に見出した。そのてめ、末梢血細胞におけるTRPC6のmRNAレベルはADの発症（または感受性）と強く相関し、ADの早期予測、診断のバイオマーカーとして有用である。
【００３５】
また、本発明者は、初めて、ヒトTRPC6タンパク質の488〜508番目またはマウスTRPC6タンパク質の487〜507番目由来のアミノ酸配列あるいは上記アミノ酸配列を含むTRPC6断片または突然変異タンパク質ペプチドは、特異的にAβのレベルを低下させることによって、ADの症状を改善することができ、かつ副作用が少ないことを実証した。
上記知見に基づき、本発明者が本発明を完成した。
【００３６】
TRPC6
TRPC6(transient receptor potential canonical 6、標準一過性受容体電位チャネル6)は、TRP(transient receptor potential、TRP)遺伝子スーパーファミリーのCサブファミリー(canonical)の一つで、カルシウム透過可能な非選択性カチオンチャネルである。脳部組織にTRPC6のmRNAが検出される。研究によれば、TRPC6は、神経発育、学習記憶、疼痛調節などである程度の作用を果たす。
【００３７】
活性化TRPC6イオンチャネルは、ホモテトラマーまたはヘテロテトラマーで、Na+、K+、Ca2+に対して透過性を有する。N-末端に三つのアンキリンドメインが含まれ、チャネルの膜への位置付けに関係する可能性がある。C-末端にTRPCファミリーの保存配列のEWKFARボックスおよび二つのイノシトール三リン酸(inositol triphosphate、IP3)受容体ドメインを有し、そのうちの二つ目のドメインが一つのカルモジュリン(calmodulin、CaM)結合部位と重なる。
【００３８】
本発明のTRPC6は、多くの種で高度の相同性を有し、本発明に用いられるTRPC6が任意の哺乳動物由来のものでもよく、ヒト、齧歯動物（例えばマウス、ラット）、チンパンジー、ウシ、イヌ、ネコなどを含むが、これらに限定されない。また、TRPC6は野生型TRPC6と突然変異型TRPC6およびその活性断片（例えば487〜507aaを含むTRPC6突然変異体または活性断片）を含む。1種類の野生型TRPC6のヌクレオチド配列は配列番号：3で示され、コードするTRPC6タンパク質は配列番号：5で示される。
【００３９】
予測または診断の応用
本発明は、AD疾患またはその感受性の予測または診断（特に早期の補助性予測または診断）の方法および相応のキットを提供する。
本発明の方法は、検出対象の末梢血細胞におけるTRPC（特にTRPC6）の発現レベルとADの発病確率の間の相関性を利用する。
【００４０】
本発明の研究で、末梢血細胞における一部のTRPC（例えばTRPC5）の発現レベルとADの発病確率の間に相関性がないが、意外なことに、脳以外の組織として、末梢血細胞におけるTRPC6の発現レベルとADの発病確率の間に顕著な相関性があるため、特にADの早期の補助性予測または診断のバイオマーカーに適切である。
本発明の検出方法は、TRPC6のmRNA発現レベル、またはTRPC6のタンパク質発現レベルに基づいたものでもよい。
本発明において、TRPC6遺伝子は、TRPC6の各種のヌクレオチド配列、例えばDNA配列またはmRNA配列を含む。
【００４１】
一つの好適な検出方法は、末梢血細胞におけるTRPC6のmRNAの発現レベルを検出するものである。一つの代表的な方法は、
1）測定される対象の末梢血細胞の全RNAを抽出する工程と、
2）逆転写してcDNAを得る工程と、
3）cDNAに対してリアルタイム蛍光定量PCRを行い、TRPC6のmRNAの定量検出結果を得、かつ正常者のTRPC6のmRNAの発現レベルと比較し、正常者よりも顕著に低い場合、当該対象がADを患う確率または感受性が正常者がADを患う確率または感受性よりも高いことを示す工程と、
を含む。
【００４２】
487〜507aaを含むTRPC6突然変異体または活性断片
ここで用いられるように、用語「本発明のポリペプチド」とは、1種類の特に有用なポリペプチドで、マウスTRPC6の487〜507番目のアミノ酸（487〜507aa）活性断片（「コア領域」と略する）に相応し、配列番号：4で示されるようなもの、あるいは前記コア領域を含むTRPC6突然変異体、あるいは前記コア領域を含む融合タンパク質、誘導体および類似物である。
【００４３】
ここで用いられるように、用語の「断片」、「誘導体」および「類似物」とは、実質的に炎症を抑制する機能または活性を維持するポリペプチドである。本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似物は、（i）1個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、または（ii）1個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、、または（iii）本発明のポリペプチドと他の化合物（例えば、ポリエチレングリコールようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）と融合したポリペプチドでもよく、または（iv）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（リーダー配列、分泌配列または6Hisなどのタグ配列と融合して形成した融合蛋白質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似物は当業者に公知の範囲に入っている。
【００４４】
図7に示されるように、本発明のポリペプチドのヒト、マウス、ラット、チンパンジー、ウシ、イヌおよびネコのTRPC6タンパク質における相応の位置を示す。本発明のポリペプチドは、多くの哺乳動物におけるTRPC6タンパク質と高度の相同性を有することがわかる。
【００４５】
好適な本発明のポリペプチドは、マウス由来のTRPC6タンパク質の487〜507番目のアミノ酸配列（487〜507aa）を含む活性断片またはヒト由来の相応するTRPC6タンパク質の488〜508番目の配列を含む活性断片もしくはタンパク質である（図7に示すように）。もちろん、この上記コア領域を含む活性断片の長さは、21個のアミノ酸に限らず、さらにほかのTRPC6タンパク質（例えばヒトまたはヒト以外の哺乳動物のTRPC6タンパク質）の側鎖のアミノ酸配列を含んでもよく、通常、この活性断片の長さは20〜100個、好ましくは21〜70個、より好ましくは21〜40個のアミノ酸である。本発明において、活性断片は、全長のTRPC6タンパク質を除く。
【００４６】
本発明の研究では、本発明のポリペプチドは、特異的にγ-セクレターゼのAPPに対する切断を抑制することで、Aβのレベルを有効に低下させ、ADの症状を改善することができる。また、既存のγ-セクレターゼ阻害剤と比較すると、本発明のポリペプチドの顕著な利点は、γ-セクレターゼのほかの基質（例えばNotch）に対する切断機能を買えないため、副作用が少ないことにある。
【００４７】
APOE遺伝子
APOE遺伝子は、ヒトにはAPOE2、APOE3、APOE4の3種類の遺伝子型がある。ヒトの中では、約80％の個体がAPOE3を、約20％の個体がAPOE4を持つが、約40〜50％の散発性AD患者はAPOE4遺伝子型を持つ。そのため、APOE遺伝子は、散発性ADにおいて最も重要なリスク遺伝子と思われる。体内のAPOEは、主に、肝臓で生成した後、血液に放出され、さらに血液とともに全身の各箇所に循環する。中枢神経系において、膠細胞もAPOEを分泌することができる。APOE遺伝子のADにおける作用は、APOE3がAβの除去と分解を仲介する、ニューロン突起の生長を促進するなど、多くの正常の生理作用を発揮するが、APOEがAPOE4に突然変異すると、これらの正常の生理機能が影響されることで、ADの発病リスクを向上させるところに表れる。
【００４８】
薬物組成物および治療用途
本発明のポリペプチドまたはTRPC6作動薬（またはアゴニスト）は、そのまま疾患の治療と予防、例えばADの治療に使用してもよい。本発明のポリペプチドまたはTRPC6作動薬を使用する場合、さらにほかの治療薬と併用してもよい。
本発明のポリペプチドまたはTRPC6作動薬などは、治療で投与する場合、（a）ADの予防および/または治療、（b）β-アミロイドレベルの低下、および/または（c）γ-セクレターゼの選択的抑制のうちの1つまたは複数の効果を提供することができる。本発明のポリペプチドまたはTRPC6作動薬は、好適な治療効果を得るだけでなく、その副作用も少ない（例えば、γ-セクレターゼのほかの基質に対する切断機能にほぼ影響を与えない）。
【００４９】
通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、pH値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、pH値は通常5〜8程度、好ましくは6〜8程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、或いは局部給与が含まれるが、これらに限られない。TRPC6作動薬がタンパク質系物質ではない場合、経口投与でもよい。
【００５０】
また、本発明は、安全有効量の本発明のポリペプチドまたはその作動薬と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む薬物組成物を提供する。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は給与様態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、例えば生理食塩水或いはグルコースおよび他の助剤を含む水溶液を使用し通常の方法で製造することができる。錠剤やカプセルのような薬物組成物は、通常の方法で調製することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液、錠剤やカプセルの場合、無菌条件で製造するほうがよい。活性成分の給与量は治療有効量、例えば毎日約1μg／kg体重〜約5mg／kg体重である。また、本発明のポリペプチドは他の治療剤と併用することが出来る。
【００５１】
薬物組成物の使用時、安全有効量の本発明のポリペプチドまたはその作動薬を哺乳動物に使用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約10μg/kg体重で、多くの場合に、約8mg/kg体重未満で、好ましくはこの投与量が約10μg/kg体重-約1mg/kg体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも治療または予防のために、例えば遺伝子治療手段によって使用することができる。
【００５２】
薬物スクリーニング方法
また、本発明は、TRPC6に基づいて薬物をスクリーニングする方法を提供する。一つの方法は、まずTRPC6の発現または活性を影響（強化）する化合物をスクリーニングし、さらに選ばれた化合物に対してAβに対する抑制作用をテストする。
本発明によって提供されるADを予防または治療する候補化合物をスクリーニングする方法は、当該化合物のTRPC6の発現量および/または活性に対する影響に基づいたもので、典型的なスクリーニング方法は、以下の工程を含む。
【００５３】
（a）テスト群で、細胞の培養系にテスト化合物を添加し、かつ前記テスト群の細胞におけるTRPC6の発現量および/または活性を観察し、対照群で、同様の細胞の培養系にテスト化合物を添加せず、かつ対照群の前記細胞におけるTRPC6の発現量および/または活性を観察し、
ここで、テスト群におけるTRPC6の発現量および/または活性が対照群よりも高い場合、当該テスト化合物がTRPC6の発現および/または活性に促進作用を有するADを予防または治療する候補化合物であることが示される工程、および/または
（b）工程（a）で得られた候補化合物に対し、さらにそのAβに対する抑制作用をテストする工程、例えば、テスト群において、APPをトランスフェクトした細胞培養系にテスト化合物を添加し、かつそのAβに対する抑制状況をテストする。対照群において、テスト化合物を添加せず、Aβに対する抑制状況をテストする。ここで、テスト群におけるAβ量が対照群よりも低いと、当該テスト化合物がAβに対して抑制作用を有するADを予防または治療する候補化合物であることを意味する。
【００５４】
TRPC6の発現レベルとAβの低下が密接に関連するため、好ましくはTRPC6の発現量（発現レベル）を検出する。
TRPC6の発現レベルは、mRNAレベルまたはタンパク質レベルで実行することができるが、例えば通常の方法または市販の装置および試薬（例えば抗体、プライマーなど）で行われる。
【００５５】
本発明の主な利点は以下の通りである。
1．初めて、末梢血細胞に存在し、ADの早期予測または早期診断が容易で客観的なバイオマーカーを提供する。本発明では、初めて、末梢血細胞のTRPC6のmRNAとADの発病の顕著な相関性が実証されることで、末梢血細胞におけるTRPC6のmRNAレベルをADを診断する分子生物学の根拠にすることができると同時に、MMSE指標の臨床応用における主観性および不確実性も避けられることが確認された。
【００５６】
2．ADを診断する時間窓を早める。本発明は、直接末梢血細胞からTRPC6のmRNAを検出することによってADを予測または早期診断するため、既存技術で脳組織でしかTRPC6のmRNAレベルが測定できないことを改善し、ADの予防治療のための早期介入に貴重な時間を与える。
3．AD治療に主要な作用を果たすポリペプチドをスクリーニングする。本発明は、細胞レベルおよび動物実験でいずれも大量のスクリーニングおよび検証を行い、487〜507aaで構成されるコア領域がAD治療に主要な作用を果たすペプチド領域であることを実証し、AD治療薬の開発を促進する。
【００５７】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下述実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
【００５８】
共通の方法
1．末梢血細胞の全RNAの抽出
血液RNAの抽出は、QIAampR RNA Blood Mini Kits(QIAGEN Cat：52304)キットを使用し、実験操作は主にその説明書を参照して行うが、工程は以下のとおりである。
1）1体積倍の血液を5体積倍のBuffer ELに入れ、10分間氷浴に置く。
2）4℃、400×gで10分間遠心する。2体積倍のBuffer ELを入れて細胞を再懸濁し、さらに遠心する。
3）Buffer RLTを入れ、振とうして細胞を分裂させる。
4）細胞分裂液を至QIAshredder spin columnに移し、16000×gで2分間遠心する。
5）70体積％のエタノールを入れ、振とうする。
6）サンプルをQIAamp spin columnに移し、8000×gで15秒遠心する。
7）700 μlのBuffer RW1を入れてカラムを洗浄し、8000×gで15秒遠心する。
8）500 μlのBuffer RPEを入れ、8000×gで15秒遠心する。
9）500 μlのBuffer RPEを入れ、20000×gで3分間遠心する。16000×gで1分間遠心する。
10）50 μlのRNase-free水を入れ、8000×gで1分間遠心し、RNAを1.5 mlの遠心管に溶離させる。
【００５９】
2．逆転写
1）反応系に全RNA 10μlおよびランダムのプライマー1μlを入れ、70℃で5分間アニールし、プライマーを鋳型に結合させる。
2）その後、反応系に逆転写酵素Buffer 4μl、Ribolock RNase inhibitor 0.5μl、RNase-free水1.5μl、dNTPs 2μl、M-MLV Reverse Transcriptase 1μlを入れ、振とうして均一に混合した後、短時間で遠心し、20μlの反応系を得、反応温度25℃で10分間、42℃で1時間、70℃で10分間とし、cDNAを得る。
【００６０】
3．リアルタイム蛍光定量PCR
反応系の調製：2×qPCR Master Mix 10μl、水4μl、希釈したcDNA 5μl、プライマー1μl。振とうして均一に混合した後、短時間で遠心し、PCR反応管に入れる。qPCR装置に置き、運転プログラムは95℃、2min、1サイクル→95℃、10s + 63℃、30s、40サイクル→95℃から60℃に降温、1サイクルとする。操作の誤差を減少するため、各サンプルは3つの重複ウェルを作り、かつ調製しておいた混合液をさらに3つ重複管にそれぞれ入れる。
TRPC6のプライマー配列は、配列番号：1（センス鎖）、配列番号：2（アンチセンス鎖）で示される。
TRPC5のプライマー配列は、配列番号：6（センス鎖）、配列番号：7（アンチセンス鎖）で示される。
actinのプライマー配列は、配列番号：8（センス鎖）、配列番号：9（アンチセンス鎖）で示される。
【００６１】
4．細胞および脳組織の全RNAの抽出
細胞および脳組織の全RNAの抽出は、TRIzolR Reagent (Invitrogen Cat：15596)を使用し、実験操作は主にその説明書を参照して行うが、工程は以下のとおりである。
1）1ml Trizolで細胞または半脳を均質化させ、均一に混合した後、RNAse freeのEP管に室温で5min静置する。
2）各EPに0.2mlのクロロホルムを入れ、30s激しく振とうし、室温で3min静置する。4℃、13200gで15min遠心する。
3）遠心後、液体が3層に分かれ、注意して上層の透明液相を新しいRNAse freeの1.5ml EP管に入れる。
【００６２】
4）各EPに0.5mlのイソプロパノールを入れ、30s激しく振とうし、室温で10min静置する。4℃、13200gで10min遠心する。
5）上清を捨て、EP管に1mlの75％エタノールを入れ、沈殿をかき混ぜる。4℃、13200gで10min遠心する。
6）上清を捨て、EP管に1mlの無水エタノールを入れ、沈殿をかき混ぜる。4℃、13200gで10min遠心する。
7）上清を捨て、沈殿を乾燥させる。20μlのRNase free水でRNAを溶解させる。
【００６３】
5．細胞および脳組織のタンパク質の抽出およびWB検出
細胞は、直接SDSでかき取った後、95℃で10分間変性させてタンパク質を抽出する。脳組織は、RIPAで均質化した後、4℃で30分間回転混合し、4℃、回転数13200で遠心して上清を取り、SDSを入れて95℃で10分間変性させてタンパク質を抽出する。タンパク質をSDS-PAGEで分離し、かつTRPC6(SAB、1：300)およびTRPC5(Alomone、1：200)抗体で検出する。
【００６４】
6．APP/PS1のADマウスモデルの構築
a）APP/PS1マウス（B6C3背景）は米国Jackson laboratory(#004462)から購入される。
b）TRPC6遺伝子組換えマウスの構築
CaMKIIαコード領域の上流8.5 KbのプロモーターおよびマウスのTRPC6コード領域を含有する線形プラスミドでC57BL6マウスとFBNマウスが交尾して生まれた受精卵に注射し、得られた子一代のマウスをさらにC57BL6マウスと交尾させ、純C57BL6背景のTRPC6遺伝子組換えマウスを得る。CaMKIIαプロモーターによってTRPC6が前脳の興奮性ニューロンで発現される。TRPC6遺伝子組換えマウスの遺伝子型の同定は、配列番号：10および配列番号：11で示されるプライマーで行われる。
c）C57背景の野生型マウスを6.1に記載のAPP/PS1マウスと交尾させ、C57背景の子代を得、さらにTRPC6遺伝子組換えマウスをC57背景のAPP/PS1マウスと交尾させ、得られた子代がAPP/PS1およびAPP/PS1/TRPC6のマウスモデルとなる。
【００６５】
7．免疫組織化学
老年斑の免疫組織化学はVectaStain Universal ABC kit (VECTOR)の説明書を参照する。脳切片はまずH2O2で処理し、さらにギ酸で抗原の修復を行う。ブロッキング後、Aβ抗体6E10（COVANCE社から購入）で一晩インキュベートした後、二次抗体およびABC複合体でインキュベートし、最後にDAB（VECTOR社から購入）で呈色させる。脳切片は、脱水および透明化の後、密封し、Neurolucidarで撮影する。
【００６６】
8．Aβの定量
細胞の培地を収集した後、Aβ40およびAβ42のレベルをそれぞれsandwich ELISA kit（Invitorgen社から購入）で定量する。マウスの前脳を解剖して分離した後、GuHCLで均質化し、さらにELISAで全Aβを検出する。TBST（Tris-Buffered Salineおよび1％ TritonX100、1％SDS、1％DOC）に可溶および不溶のAβを検出するため、まずマウス前脳をTBSTで均質化し、遠心後、上清をELISAでTBSTに可溶のAβを検出し、沈殿をGuHCLでさらに均質化した後、ELISAでTBSTに不溶のAβを検出する。
【００６７】
9．細胞培養およびトランスフェクション
HEK293APP安定細胞株は10％FBSのDMEM培養液(200ng/ml G418を含む)で培養する。COS7C99細胞は5％FBS、1％ NEAAおよび200mM GlutamaxのMEM/F12培養液(0.4μg/ml hygromycin B)で培養する。トランスフェクションは全部Lipofectamin 2000（Invitrogen）で行われる。
【００６８】
10．ルシフェラーゼ活性の検出
HEK293APPをC99-GVP/UAS-LuciferaseおよびCTRLまたはTRPC6プラスミドでトランスフェクトする。24時間後、細胞を分裂させ、フルオレセイン検出システム（Promega社から購入）でルシフェラーゼ活性を検出する。コトランスフェクトするβ-galはトランスフェクト効率を調整するためのものである。
【００６９】
11.HEK293APP安定細胞株の調製
HEK293細胞を60 mmシャーレに接種する。密度が80％近くになったとき、Lipofectamine 2000によってAPPプラスミド4 μgでトランスフェクトし、4時間後液を置換し、400 ng/mlのG418を入れ、2日後細胞の継代を行い、かつ培養液における400 ng/mlのG418を維持する。2、3週間後、APPでトランスフェクトされなかった細胞がだんだん死亡し、生存するのはAPPを発現するHEK293細胞である。その後、G418を200 ng/mlとし、かつそのままに維持する。
【００７０】
実施例1  AD患者における末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルの特異的測定
以下の群を設け、かつ数軒の病院からの患者および対照の末梢血液サンプルを収集し、血細胞のRNAを抽出し、逆転写してcDNAを得、かつリアルタイム蛍光定量PCRによって定量テストを行った。
【００７１】
1.1  各群における末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルの比較：
a．散発性AD(n=40、平均年齢=80.55±5.25歳)、
b．相応する年齢の非AD対照（n=45、平均年齢=78.69±5.63歳）、
c．若い非AD対照（n=45、平均年齢=60.6±6.56歳）。
結果から、AD患者の末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが相応する年齢の非AD対照群よりも顕著に低く（***P＜0.001、n=40〜45）、相応する年齢の非AD対照と若い非AD対照の2群の間で、TRPC6のmRNAレベルは有意差がなかった（n=45）ことが示され、図1aに示す。
a、b、cをそれぞれ以下のようなサンプル量に増幅させた後も、同様の結果が得られた（図1dに示す）。
a．散発性AD(n=127、平均年齢=80.5±5.7歳)、
b．相応する年齢の非AD対照（n=110、平均年齢=77.1±8.3歳）、
c．若い非AD対照（n=73、平均年齢=57.5±5.4歳）。
ROC曲線分析では、AUC=0.8324、感度=78.74％、特異度=71.82％であったことが示され、図1eに示す。
【００７２】
1.2  各群における末梢血細胞のTRPC5のmRNAレベルの比較：
a．散発性AD(n=28、平均年齢=80.5±5.85歳)、
b．相応する年齢の非AD対照（n=14、平均年齢=70.07±8.25歳）、
c．若い非AD対照（n=20、平均年齢=57.45±5.36歳）。
結果から、TRPC5のmRNAレベルはこの3群の間で有意差がなかった（n=14〜28）ことが示され、図1bに示す。
a、b、cをそれぞれ以下のようなサンプル量に増幅させた後も、同様の結果が得られた（図1fに示す）。
a．散発性AD(n=50、平均年齢=78.5±3.7歳)、
b．相応する年齢の非AD対照（n=28、平均年齢=75.4±5.3歳）、
c．若い非AD対照（n=34、平均年齢=56.5±4.1歳）。
【００７３】
1.3  各群における末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルの比較：
a．PD（パーキンソン病、Parkinson's Disease）患者対照(n=18、平均年齢=60±10.85歳)、
b．相応する年齢の非PD対照（n=62、平均年齢=64.08±8.01歳）。
結果から、PD患者と非PD対照群で末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルは有意差がなかった（n=18〜62）ことが示され、図1cに示す。
a、bをそれぞれ以下のようなサンプル量に増幅させた後も、同様の結果が得られた（図1gに示す）。
a．PD（パーキンソン病、Parkinson's Disease）患者(n=30、平均年齢=65.2±2.5歳)、
b．相応する年齢の非PD対照（n=130、平均年齢=62.1±4.2歳）。
【００７４】
1.4  AD患者の末梢血細胞のTRPC6のmRNAとそのMMSEの相関性：
AD患者の末梢血細胞のTRPC6のmRNAとその痴呆程度の相関性を分析するために、TRPC6のmRNAとMMSEに対して線形回帰分析を行い、結果からR2=0.1179、P=0.0002であったことが示され、図1hに示す。これは痴呆程度が深刻なAD患者ほど、その末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが低いことを示唆する。
【００７５】
1.5  各群における末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルの比較：
a．早期AD患者（n=51、MMSE＞15、平均年齢=74.3±3.2歳）、
b．相応する年齢の非AD対照（n=110、平均年齢=77.1±8.3歳）。
結果から、早期AD患者は、末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが相応する年齢の非AD対照群よりも顕著に低かった（P＜0.0001）ことが示され、図1iに示す。ROC曲線分析では、AUC=0.8235、感度=78.43％、特異度=70.91％であったことが示され、図1jに示す。
【００７６】
1.6  各群における末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルの比較：
a．MCI（軽度認知障害、Mild cognitive impairment）患者（n=46、平均年齢=73.1±2.1歳）、
b．相応する年齢の非MCI対照（n=52、平均年齢=71.1±4.2歳）。
結果から、MCI患者は、末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが相応する年齢の非MCI対照群よりも顕著に低かった（***P＜0.0001）ことが示され、図1kに示す。ROC曲線分析では、AUC=0.8370、感度=76.79％、特異度=84.62％であったことが示され、図1lに示す。
【００７７】
上記のように以下の結論が得られる。
AD患者の末梢血細胞において、TRPCファミリーの一員であるTRPC6のmRNAレベルが正常者よりも顕著に低く、かつ年齢の増加につれてどんどん低下することなく、痴呆指標MMSEとある程度相関性がある。同時に、ほかのTRPCファミリーの分子（例えばTRPC5）のmRNAレベルが相応する年齢の非AD対照群とAD患者の間で有意差がない。また、PD患者は、末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが対照群と変わらない。
そのため、末梢血細胞のTRPC6のmRNAは、AD（早期ADを含む）およびMCIの患者において発現レベルが正常者よりも顕著に低く、末梢血細胞のADの早期予測および補助診断の特異的分子バイオマーカーとして有用である。
【００７８】
実施例2  細胞および動物レベルのTRPC6のmRNAレベルとAβの相関性の測定
2.1  細胞トランスフェクション実験
HEK293(ATCC CRL-1573)に対してAβの前駆体タンパク質であるAPPでトランスフェクトし、通常の方法でHEK293細胞を12ウェルプレートに接種し、密度が80％に近かった。各ウェルにおいてLipofectamine2000によって1μgのプラスミドでトランスフェクトし、48時間後免疫ボロット法でタンパク質の発現状況を検出し、かつAPPが過剰なときのTRPC6またはTRPC5のmRNAおよびタンパク質のレベルを測定した。
結果は図2a、bに示されるように、細胞モデルにおいてAβが過剰に生成し、TRPC6またはTRPC5のmRNAおよびタンパク質のレベル（平均値±標準偏差、n=3）に影響を与えなかった。ここで、チューブリンは内部標準タンパク質で、nsは有意差がないことを表す。
【００７９】
2.2  動物実験
WTマウスとAPP/PS1のADマウスモデルにおいてAβが過剰に生成したとき、TRPC6またはTRPC5のmRNAレベルが変化するか、比較した。ここで、通常の方法4でAPP/PS1マウスとWTマウスの末梢血細胞および脳組織の全RNAを抽出し、逆転写してTRPC6またはTRPC5のmRNAを検出し、かつ通常の方法5でTRPC6抗体を検出した。
結果は図2c、dに示されるように、WTマウスと比較すると、APP/PS1マウスの末梢血細胞および脳組織におけるTRPC6またはTRPC5のmRNAレベルはいずれも有意差がなく（平均値±標準偏差、n=4〜10匹のマウス）、脳組織におけるTRPC6タンパク質レベルも顕著な変化がなく、図2eに示す。
【００８０】
本実施例の結果から、細胞およびマウスモデルにおいて、TRPC6のmRNAおよびタンパク質のレベルがAβの増加につれて低下しなかったことが示され、AD患者の末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルが低いのは、Aβの累積によってだんだん低下するためではなく、発病前は既に低いレベルにあるのであることがわかる。そのため、TRPC6はADの早期診断のマーカーとして適切である。
【００８１】
実施例3  細胞レベルおよび体内のTRPC発現のAβレベルに対する影響の測定
3.1  HEK293APP安定トランスフェクト細胞系においてTRPC発現がAβレベルを低下させるか検出する
EK293APP安定トランスフェクト細胞系においてそれぞれTRPC6およびTRPC5を過剰発現させた（細胞を12ウェルプレートに接種し、密度が80％近くで、各ウェルにおいてLipofectamine2000によって1μgのプラスミドでトランスフェクトし、48時間後ELISAで培養液におけるAβレベルを検出した）。
結果を表1および図3aに示す。
【表１】
0006285962.tif 000002
【００８２】
3.2 初代培養のラット皮層ニューロンにおいてTRPC6およびTRPC5をノックアウトするとAβレベルが増加するか
SDラットが妊娠後17日目に胎児を取り出し、大脳皮層ニューロンを分離し、AMAXA核酸エレクトロポレーション装置によって配列番号：12(センス鎖)および配列番号：13(アンチセンス鎖)で示されるようなTRPC6 siRNA1、配列番号：18(GCUUGACUUUGGAAUGUUATT、センス鎖)および配列番号：19(UAACAUUCCAAAGUCAAGCTT、アンチセンス鎖)で示されるようなTRPC6 siRNA2、配列番号：14(センス鎖)および配列番号：15(アンチセンス鎖)で示されるような対照siRNA、配列番号：20(AACGCCUUCUCCACGCUCUUU、センス鎖)および配列番号：21(AAAGAGCGUGGAGAAGGCGUU、アンチセンス鎖)で示されるようなTRPC5 siRNAでトランスフェクトした。エレクトロポレーション後7日目にELISAでニューロン培養液におけるAβレベルを検出した。
結果を表6および図3cに示す。
【００８３】
【表２】
0006285962.tif 000003
TRPC6をノックアウトした後、培養液におけるAβが顕著に増加したが、TRPC5をノックアウトした後、Aβレベルに影響を与えなかったことがわかるが、図3b〜cに示す。
【００８４】
3.3  APP/PS1マウスのニューロンにおけるTRPC6過剰発現の老年斑沈積およびAβレベルに対する影響
前脳興奮性ニューロンにおいてTRPC6を過剰発現する遺伝子組換えマウスとADのモデルマウスのAPP/PS1マウスを交尾させ、子代のAPP/PS1およびAPP/PS1/TRPC6マウスにおいて老年斑およびAβレベルを検出した。
老年斑の免疫組織化学：通常の方法7（n=11）
Aβレベル：通常の方法8（n=13〜14）
TBSTに可溶のAβおよび不溶のAβのレベル：通常の方法8（n=13〜14）
結果は表2及び図4に示す。
【００８５】
【表３】
0006285962.tif 000004
【００８６】
このように、TRPC6は細胞レベルで細胞培養液におけるAβレベルを顕著に減少させ、初代培養のラット皮層ニューロンにおいてTRPC6をノックアウトすると、培養液におけるAβレベルが顕著に増加したことがわかる。また、ニューロンにおけるTRPC6の過剰発現はAPP/PS1マウスにおいて老年斑沈積およびAβレベルを低下させることができたことがわかる。そのため、細胞実験でも動物実験でも、TRPC6がAβレベルを低下させることが示された。
【００８７】
実施例4  TRPC6のγ-セクレターゼによるその基質の切断に対する影響の測定
4.1  TRPC6のγ-セクレターゼによるC99の切断に対する影響で、ここで、C99がAPPのC末端の99個のアミノ酸で、γ-セクレターゼの直接の基質である。
通常の方法9によって細胞をトランスフェクトし、n=5で、TRPC6過剰発現のCOS7C99細胞を得、細胞を12ウェルプレートに接種し、密度が80％近くであった。各ウェルにおいてLipofectamine2000によって1μgのプラスミドでトランスフェクトし、48時間後ELISAで培養液におけるAβレベルを検出した。
結果は表3及び図5に示す。
【００８８】
【表４】
0006285962.tif 000005
表3から、TRPC6の過剰発現はC99がγ-セクレターゼによって切断されて生成するAβを減少させ、C99がγ-セクレターゼによって切断されて活性化するルシフェラーゼ活性も減少させたことがわかる。
【００８９】
4.2  TRPC6のγ-セクレターゼによるNotchの切断に対する影響
細胞を12ウェルプレートに接種し、密度が80％近くであった。各ウェルにおいてLipofectamine2000によって1μgのTRPC6プラスミドおよび1μgのNotchプラスミドでトランスフェクトし、48時間後免疫ボロット法でNotchタンパク質の発現状況を検出した。ここで、NICD(notch intracellular domain)はNotch△E-mycがγ-セクレターゼによって切断されて生成する細胞内断片で、γ-セクレターゼによるNotchの切断の量を反映する。
【００９０】
結果から、TRPC6の過剰発現はNICDレベルを変えず、すなわち、TRPC6はγ-セクレターゼによるNotchの切断に影響を与えないことが示された。
以上の結果から、TRPC6タンパク質（野生型の全長タンパク質を含む）は、γ-セクレターゼによるNotchの切断に影響することなく、特異的にγ-セクレターゼによるAPP（C99）の切断を抑制することによってAβの生成を減少させることができることがわかる。
【００９１】
実施例5  活性作用を果たすTRPC6タンパク質の膜貫通ポリペプチドに対する選別および位置付け
5.1  活性膜貫通ペプチド領域の初期選別
TRPC6タンパク質をいくつかのペプチド領域に分け、かつこのいくつかのペプチド領域のAβレベルの影響によって選別し、それぞれTRPC6を1〜405aa、725〜930aa、 389〜930aa、389〜510aa、437〜633aa、508〜633aaといった異なる断片で発現するプラスミドを構築した。
その後、HEK293APP安定トランスフェクト細胞を12ウェルプレートに接種し、密度が80％近くであった。各ウェルにおいてLipofectamine2000によって1μgのプラスミドでトランスフェクトし、48時間後ELISAで培養液におけるAβレベルを検出したところ、標的ペプチド領域はまず437〜507番目のアミノ酸に絞った。
いくつかの顕著なペプチド領域のAβレベルに対する影響のテスト結果を表4および図6に示す。
【００９２】
【表５】
0006285962.tif 000006
このように、437〜507aaを含有する突然変異体はいずれもAβを低下させることができたが、この領域を含有しない突然変異体はAβを下方調節することができなかったことが示され、これは437〜507aaがTRPC6によるAβレベルの下方調節に非常に重要であることを示す。
【００９３】
5.2  活性膜貫通ペプチド領域の位置付け
TRPC6の437〜508aaは、第一膜貫通領域（TM1）、第一細胞外領域（Loop1）、第二膜貫通領域（TM2）を含む。活性領域を位置付けるために、それぞれC6-mut1：TM2の代わりにTM1を用いたもの、C6-mut2：TM2配列を逆にしたもの、C6-mut3：TM2配列に点突然変異を含ませたものといった、3つのTRPC6突然変異体プラスミドを構築した。その後、HEK293APP安定トランスフェクト細胞を12ウェルプレートに接種し、密度が80％近くであった。各ウェルにおいてLipofectamine2000によって1μgのプラスミドでトランスフェクトし、48時間後ELISAで培養液におけるAβレベルを検出したところ、標的ペプチド領域は487〜507番目のアミノ酸に位置付けた。
結果は表7及び図6gと図6hに示す。
【００９４】
【表６】
0006285962.tif 000007
このように、TM2ドメイン（487〜507aa）の突然変異体プラスミドはいずれもAβレベルを低下させることができなかったことが示され、487〜507aaはTRPC6によるAβレベルの下方調節に非常に重要で、γ-セクレターゼによるAPPの切断を抑制するコア領域であることが示された。
【００９５】
実施例6  487〜507aaを含む融合ペプチドの構築およびテスト
6.1  細胞レベルにおいて融合ペプチドがAβレベルを低下させるか検出する
6.1.1  HEK293APP安定トランスフェクト細胞系および初代培養の皮層ニューロンにおいて融合ペプチドがAβレベルを低下させるか検出する
本実施例において、第二膜貫通領域（487〜507aa、TM2）と膜透過性ペプチドTATを選んで融合させて合成し、融合ペプチドTAT-TM2および突然変異体ペプチドTAT-TM2-mutを得、そのHEK293APP安定トランスフェクト細胞系のAβレベルに対する影響を検出した。ここで、ペプチド断片はChinaPeptides社によって合成させ、配列は表12に示す。
結果は表8及び図9aに示す。
【表７】
0006285962.tif 000008
【００９６】
【表８】
0006285962.tif 000009
【００９７】
6.1.2  HEK293APP安定トランスフェクト細胞系において異なる投与量の融合ペプチドTAT-TM2のAβレベルに対する影響を検出した。
結果は表5及び図6eと図9bに示す。
【表９】
0006285962.tif 000010
このように、TAT-TM2がHEK293APP細胞において投与量に依存してAβレベルを下方調節することができたことがわかる。
【００９８】
6.1.3  初代培養の皮層ニューロンにおいて融合ペプチドTAT-TM2のAβレベルに対する影響を検出し、結果は図9cに示す。
Aβ40： 対照群の83％、n=6、p=0.0072。
Aβ42： 対照群の68％、n=3、p=0.0035。
【００９９】
このように、TAT-TM2がHEK293APP細胞において投与量に依存してAβレベルを下方調節することができたが、TAT-TM2-mutがAβレベルに影響を与えなかったことがわかる。TAT-TM2は初代培養の皮層ニューロンにおいてもAβレベルを下方調節することができた。
【０１００】
6.1.4  突然変異体のHEK293APP細胞のAβレベルに対する影響の検出
もっと短いAβレベルに影響できるペプチド断片を見つけるために、TM2をN末端とC末端に分け、それぞれTATと融合し、TAT-TM2-N，TAT-TM2-CおよびTAT-TM2-C突然変異体のHEK293APP細胞におけるAβレベルに対する影響を検出した。ペプチド断片はChinaPeptides社によって合成させ、配列は表12に示す。結果は表9及び図9d〜eに示す。
【表１０】
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TAT-TM2-CがHEK293APP細胞においてAβレベルを下方調節することができたが、その突然変異体であるTAT-TM2-C-m2とTAT-TM2-C-m3およびTAT-TM2-NがAβレベルに影響を与えることができなかったことがわかる。TM2-CはTM2によるAβレベルの下方調節に非常に重要である。
【０１０１】
6.2  APP/PS1マウスにおいてTAT-TM2がAβレベルを低下させるか検出する
APP/PS1マウスにTATとTAT-TM2を腹腔注射し、3時間後マウスの大脳を取ってサンプルを調製し、Aβレベルを検出した：通常の方法8（n=8）
結果は表10及び図9fに示す。
【表１１】
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TAT-TM2がAPP/PS1マウスにおいてもAβレベルを下方調節することができたことがわかる。
【０１０２】
実施例7  化合物のスクリーニング
本実施例において、mRNAレベルで薬物のスクリーニングを行ったが、方法は以下の通りである。
テスト群で、HEK293細胞の培養系にテスト化合物を添加し、かつ前記テスト群の細胞におけるTRPC6の発現量を観察し（細胞の全RNAを抽出し、cDNAに逆転写し、さらに蛍光定量PCRで発現量を測定する）、対照群で、同様の細胞の培養系にテスト化合物を添加せず、かつ対照群の前記細胞におけるTRPC6の発現量を観察した。
ここで、テスト群におけるTRPC6の発現量が対照群よりも高い場合、当該テスト化合物がTRPC6の発現に促進作用を有し、ADを予防または治療する候補化合物であることが示される。
結果：
二重盲検法で5種類の候補化合物をテストした。結果から、1種類の化合物CがTRPC6の発現量を向上させることができたことがわかる。さらに分析したところ、当該化合物CはCoCl2であることがわかった。
【０１０３】
実施例8  APOE遺伝子型とTRPC6のmRNAレベルとAβの相関性の測定
8.1  末梢血細胞のTRPC6のmRNAレベルとAPOE遺伝子型の相関性分析
散発性AD、相応する年齢の非AD対照および若い非AD対照をAPOEの遺伝子型によって群分けし、あるいはすべての個体をAPOEの遺伝子型によって群分けし、さらに群間の差を分析した。
結果から、APOE3遺伝子型の個体のTRPC6のmRNAレベルが比較的に高く、APOE4遺伝子型の個体のTRPC6のmRNAレベルが比較的に低かった（***P＜0.001）ことが示され、図8aに示す。ここで、AD-4*4、AD-3*3、AD-3*4は、それぞれAD患者におけるAPOE4ホモ接合体の個体、APOE3ホモ接合体の個体、APOE3および4のヘテロ接合体の個体を示す。
【０１０４】
Control-2*3、Control-3*3、Control-3*4は、それぞれ対照におけるAPOE2および3のヘテロ接合体の個体、APOE3ホモ接合体の個体、APOE3および4のヘテロ接合体の個体を示す。Combined-2*3、Combined-3*3、Combined-3*4は、それぞれ全部の個体におけるAPOE2および3のヘテロ接合体の個体、APOE3ホモ接合体の個体、APOE3および4のヘテロ接合体の個体を示す。
結論：ADでも対照群でも、APOE3*3の個体が見られ、そのTRPC6のmRNAの平均値のレベルがAPOE3*4の個体よりも高かった。すべての個体をAPOEの遺伝子型によって群分けすると、APOE3*3の個体のTRPC6のmRNAのレベルがAPOE3*4の個体よりも顕著に高かった（P＜0.001）。
【０１０５】
8.2  細胞実験
APOEの異なるアイソフォームを含有する培養液上清をJurkat（ヒトの末梢血T細胞株）に入れ、5時間後TRPC6またはTRPC5のmRNAレベルを検出した（平均値±標準偏差、n=5）。
結果から、APOE3を含有する培養液上清がJurkat細胞におけるTRPC6のmRNAレベルを増加させることができたが、APOE4を含有する培養液上清がJurkat細胞におけるTRPC6のmRNAレベルに影響を与えなかったことが示された。APOE3またはAPOE4を含有する培養液上清がJurkat細胞におけるTRPC5のmRNAレベルに影響を与えなかったことが示され、図8bに示す。
【０１０６】
APOEの異なるアイソフォームを含有する培養液上清を体外で培養した8日目のラットのニューロン細胞に入れ、2時間後TRPC6またはTRPC5のmRNAレベルを検出した（平均値±標準偏差、n=8）。
結果から、APOE3を含有する培養液上清がラットのニューロンにおけるTRPC6のmRNAレベルを増加させることができたが、APOE4を含有する培養液上清がラットのニューロンにおけるTRPC6のmRNAレベルに影響を与えなかったことが示された。APOE3またはAPOE4を含有する培養液上清がラットのニューロン細胞におけるTRPC5のmRNAレベルに影響を与えなかったことが示され、図8cに示す。
【０１０７】
実施例9  TAT-TM2のγ-セクレターゼによるその基質の切断に対する影響の測定
9.1  TAT-TM2のγ-セクレターゼによるC99の切断に対する影響
C99は、APPのC末端の99個のアミノ酸で、γ-セクレターゼの直接の基質である。COS7C99細胞を12ウェルプレートに接種し、密度が100％近くであった。各ウェルを5μmのペプチド断片で12時間処理した後、ELISAで培養液におけるAβレベルを検出した。
結果は表11及び図10に示す。
【表１２】
0006285962.tif 000013
表11から、TAT-TM2はC99がγ-セクレターゼによって切断されて生成するAβを減少させ、C99がγ-セクレターゼによって切断されて活性化するルシフェラーゼ活性を減少させたことがわかる。
【０１０８】
9.2  TAT-TM2のγ-セクレターゼによるNotchの切断に対する影響
細胞を12ウェルプレートに接種し、密度が80％近くであった。各ウェルにおいてLipofectamine2000によって1μgのNotchプラスミドでトランスフェクトし、24時間後さらに5μmのペプチド断片で12時間処理した後、免疫ボロット法でNotchタンパク質の発現状況を検出した。ここで、NICD(notch intracellular domain)はNotch△E-mycがγ-セクレターゼによって切断されて生成する細胞内断片で、γ-セクレターゼによるNotchの切断の量を反映する。
図6fまたは図10cに示されるように、TAT-TM2はNICDレベルを変えず、すなわち、TAT-TM2はγ-セクレターゼによるNotchの切断に影響を与えなかった。
以上の結果から、TAT-TM2はγ-セクレターゼによるNotchの切断に影響することなく、特異的にγ-セクレターゼによるAPP（C99）の切断を抑制することによってAβの生成を減少させることができることがわかる。
【０１０９】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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