(57)【要約】  本発明は、抗ウイルス剤とＴＬＲのリガンドとの組合せを使用する、ウイルス感染を治療するための方法および製品に関する。本発明はまた、スクリーニングアッセイ、関連の製品、キットおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法にも関する。【図１】2010504982.tif 000008
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とを含む組成物であって、抗ウイルス剤が、Ｃ−８置換グアノシンでもイミダゾキノリンでもなく、かつ抗ウイルス剤が、免疫賦活性オリゴヌクレオチドに連結されている組成物。
【請求項２】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、抗ウイルス剤に直接的に連結されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、抗ウイルス剤に間接的に連結されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とが、同一分子の部分である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
抗ウイルス剤が、１つまたは複数のヌクレオチド類似体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ヌクレアーゼ感受性部位を、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤との間にさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの３’−３’の連結を含有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの５’−５’の連結を含有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
薬学的に許容できる担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
無菌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
抗ウイルス剤がロキソリビンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
抗ウイルス剤がイサトリビンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドがキメラ骨格を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
抗ウイルス剤がリバビリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
抗ウイルス剤がバロピシタビンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
抗ウイルス剤がＢＩＬＮ２０６１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
抗ウイルス剤がＶＸ−９５０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、Ａ−クラス、Ｂ−クラス、Ｃ−クラス、Ｐ−クラス、Ｔ−クラスまたはＥ−クラスのオリゴヌクレオチドである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結を包含し、かつオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間連結を包含する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも３つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも３つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドが、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結を包含し、かつオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間連結を包含する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２５】
抗ウイルス剤が内部のヌクレオチドに連結している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
抗ウイルス剤が末端のヌクレオチドに連結している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
末端のヌクレオチドが３’末端のヌクレオチドである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項２８】
末端のヌクレオチドが５’末端のヌクレオチドである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項２９】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドと共に製剤化される第２の抗ウイルス剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
第２の抗ウイルス剤が、免疫賦活性オリゴヌクレオチドに連結されている、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とを収納する微小粒子を包含する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とを収納するリポソームを包含する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、脱塩基を含有するオリゴヌクレオチドではない、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドがアダプターオリゴヌクレオチドではない、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３５】
免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤と
を含み、抗ウイルス剤が免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドに随伴している組成物。
【請求項３６】
免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、抗ウイルス剤に連結している、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、抗ウイルス剤に直接的に連結している、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、抗ウイルス剤に間接的に連結している、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とが、同一の分子の部分である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４０】
免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、抗ウイルス剤に連結していない、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とを収納する微小粒子を包含する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とを収納するリポソームを包含する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
抗ウイルス剤が、１つまたは複数のヌクレオチド類似体である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４４】
ヌクレアーゼ感受性部位を、免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤との間にさらに含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４５】
薬学的に許容できる担体をさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４６】
無菌である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４７】
抗ウイルス剤がＣ−８置換グアノシンである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４８】
Ｃ−８置換グアノシンが、ＲＮＡオリゴヌクレオチド中に組み込まれている、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
Ｃ−８置換グアノシンが、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
Ｃ−８置換グアノシンが、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端の１、２または３ヌクレオチド３’側に位置する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
ウイルス性疾患を治療するための方法であって、
そのような治療を必要とする対象に、請求項１から３４または請求項３５から５０のいずれか一項に記載の組成物を、ウイルス性疾患を治療するのに有効な量で投与するステップ
を含む方法。
【請求項５２】
ウイルス性疾患がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ウイルス性疾患がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
ウイルス性疾患がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
組成物が非経口投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
対象が、非ＣｐＧ療法に対して非応答性である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
対象が、抗ウイルス剤を用いた療法に対して非応答性である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
阻害性ウイルスタンパク質およびＴＬＲを発現することができる細胞と担体と
を含む組成物。
【請求項５９】
細胞にＴＬＲレポーター構築物がトランスフェクトされている、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
ＴＬＲが、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
細胞に阻害性ウイルスタンパク質発現構築物がトランスフェクトされている、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６２】
阻害性ウイルスタンパク質がＮＳ３／４プロテアーゼである、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
細胞が、ウイルス感染患者からの免疫細胞である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６４】
阻害性ウイルスタンパク質が、細胞によって内因性に発現する、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６５】
担体が緩衝液である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６６】
免疫賦活抗ウイルス性組成物を同定するための方法であって、
請求項５９に記載の細胞を試験化合物と接触させるステップと、サイトカインの産生および抗ウイルスレポーターの読取りを測定するステップと
を含み、サイトカインの産生の増加および抗ウイルスレポーターの読取りの増加が、試験化合物が免疫賦活抗ウイルス性組成物であることを示す方法。
【請求項６７】
免疫賦活抗ウイルス性組成物を同定するための方法であって、
請求項６３に記載の細胞を試験化合物と接触させるステップと、Ｔｈ１応答、Ｔｈ−１様応答または炎症促進性サイトカインの産生を測定するステップと
を含み、Ｔｈ１応答、Ｔｈ−１様応答または炎症促進性サイトカインの産生の増加が、試験化合物が免疫賦活抗ウイルス性組成物であることを示す方法。
【請求項６８】
免疫賦活抗ウイルス性組成物を同定するための方法であって、
ウイルス感染患者から免疫細胞を単離するステップと、
免疫細胞を試験化合物と接触させるステップと、
サイトカインの産生およびウイルス価を測定するステップと
を含み、Ｔｈ１サイトカインの産生の増加およびウイルス価の減少が、試験化合物が免疫賦活抗ウイルス性組成物であることを示す方法。
【請求項６９】
抗ウイルス活性を有する、抗ウイルス剤と免疫賦活性オリゴヌクレオチドとを含有する分子についてスクリーニングするための方法であって、
ウイルス感染患者から免疫細胞を単離するステップと、
免疫細胞を前記分子と接触させるステップと、
ウイルス価を測定するステップと
を含み、ウイルス価の低下は、前記分子が抗ウイルス活性を有することを示す方法。
【請求項７０】
末梢血液の単核細胞が樹状細胞を含む、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
樹状細胞が形質細胞様樹状細胞を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
接触ステップをｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７３】
末梢血液の単核細胞が培養される、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７４】
抗ウイルス剤に連結しているＴＬＲ７／８／９のリガンド
を含む組成物。
【請求項７５】
ＴＬＲ７／８／９のリガンドが免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
ＴＬＲ７／８／９のリガンドが、抗ウイルス剤に直接的に連結している、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７７】
ＴＬＲ７／８／９のリガンドが、抗ウイルス剤に間接的に連結している、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７８】
ＴＬＲ７／８／９のリガンドと抗ウイルス剤とが、同一分子の部分である、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７９】
抗ウイルス剤が、１つまたは複数のヌクレオチド類似体である、請求項７４に記載の組成物。
【請求項８０】
ヌクレアーゼ感受性部位を、ＴＬＲ７／８／９のリガンドと抗ウイルス剤との間にさらに含む、請求項７６に記載の組成物。
【請求項８１】
癌を治療するための方法であって、
癌を有する対象に免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤との組成物を、癌を治療するのに有効な量で投与するステップ
を含む方法。
【請求項８２】
抗ウイルス剤が、免疫賦活性オリゴヌクレオチドに連結している、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
抗ウイルス剤がリバビリンである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、Ａ−クラス、Ｂ−クラス、Ｃ−クラス、Ｐ−クラス、Ｔ−クラスまたはＥ−クラスのオリゴヌクレオチドである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
オリゴヌクレオチドがＣ−８置換グアノシンをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
細菌感染を治療するための方法であって、
細菌感染を有する対象に免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤との組成物を、細菌感染を治療するのに有効な量で投与するステップ
を含む方法。
【請求項９０】
抗ウイルス剤が、免疫賦活性オリゴヌクレオチドに連結している、請求項８９１に記載の方法。
【請求項９１】
抗ウイルス剤がリバビリンである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、Ａ−クラス、Ｂ−クラス、Ｃ−クラス、Ｐ−クラス、Ｔ−クラスまたはＥ−クラスのオリゴヌクレオチドである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
オリゴヌクレオチドがＣ−８置換グアノシンをさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９７】
薬学的に許容できる担体をさらに含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９８】
癌またはウイルスもしくは細菌による感染を治療するための、請求項１から５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９９】
対象にワクチン接種するための医薬品の製造のための、抗原と組み合わせた、請求項１から５０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１００】
対象の癌を治療するための医薬品の製造のための、請求項１から５０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０１】
対象のウイルス感染を治療するための医薬品の製造のための、請求項１から５０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０２】
対象の細菌感染を治療するための医薬品の製造のための、請求項１から５０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ＴＬＲのリガンドと抗ウイルス剤とで構成された組成物、ならびにウイルス感染の治療およびスクリーニングアッセイ等の方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、哺乳動物において、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、自然免疫において重大な意味をもつ役割を担う、高度に保存されたパターン認識受容体（ＰＲＲ）ポリペプチドのファミリーである。現在、少なくとも１０個のファミリーメンバーが、同定されており、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と命名されている。種々のＴＬＲの細胞質側のドメインが、トール−インターロイキン１受容体（ＴＩＲ）ドメインによって特徴付けられている。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２：２５３−８。ＴＬＲによる、微生物の侵入の認識が、ショウジョウバエおよび哺乳動物において進化的に保存されているシグナル伝達カスケードの活性化を引き起こす。ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質ＭｙＤ８８が、ＴＬＲに結合すること、ならびにインターロイキン１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）をＴＬＲに向けて動員することが報告されている。ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路は、免疫活性化および炎症性サイトカインの産生における重大な意味をもつステップである、ＮＦ−κＢ転写因子およびｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ（Ｊｎｋ）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を導くと考えられている。総説に関しては、Ａｄｅｒｅｍ  Ａら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７８２−８７、およびＡｋｉｒａ  Ｓら（２００４）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：４９９−５１１を参照されたい。
【０００３】
最近になって、特定の低分子量合成化合物であるイミダゾキノリン類のイミキモド（Ｒ−８３７）およびレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８）が、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドであることが報告された。Ｈｅｍｍｉ  Ｈら（２００２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：１９６−２００；Ｊｕｒｋ  Ｍら（２００２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：４９９。
【０００４】
メチル化されていない細菌のＤＮＡおよびその合成類似体（ＣｐＧ  ＤＮＡ）が、ＴＬＲ９のリガンドであるという最近の発見（Ｈｅｍｍｉ  Ｈら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−５；Ｂａｕｅｒ  Ｓら（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８、９２３７−４２）を発端に、特定のＴＬＲのリガンドが、特定の核酸分子を包含することが報告されている。最近になって、特定の型のＲＮＡが、配列に依存しない様式または配列に依存する様式で免疫賦活性であることが報告されている。さらに、これらの種々の免疫賦活性ＲＮＡが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８を賦活することも報告されている。さらに、特定の低分子量合成化合物であるイミダゾキノリン類のイミキモド（Ｒ−８３７）およびレシキモド（Ｒ−８４８）が、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドであることも報告された。Ｈｅｍｍｉ  Ｈら（２００２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：１９６−２００；Ｊｕｒｋ  Ｍら（２００２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：４９９。最近になって、ウイルスに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、およびｄｓＲＮＡの合成類似体である、ポリＩ：Ｃが、ＴＬＲ３のリガンドであることが報告された。Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  Ｌら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：７３２−８。さらにより最近になって、Ｌｉｐｆｏｒｄおよび共同研究者らは、特定のＧ、Ｕを含有するＲＮＡ配列が免疫賦活性であり、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方の賦活を介して作用することを開示した。Ｈｅｉｌ  Ｆら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１５２６−９、および米国特許出願公開第２００３／０２３２０７４Ａ１号。
【０００５】
Ｈｅｉｌらは、ＨＩＶ−１に由来し、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰと複合体を形成した、グアノシンおよびウリジンに富むホスホロチオエートｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチドが、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージを賦活して、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）およびインターロイキン６（ＩＬ−６）を分泌させることを報告した。Ｈｅｉｌ  Ｆら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１５２６−９。マウスＴＬＲ７が、ＧＵに富むｓｓＲＮＡに応答性を与えることが報告され、ヒトＴＬＲ８が、ＧＵに富むｓｓＲＮＡおよびＵに富むｓｓＲＮＡに応答性を与えることが報告された。特異的な配列が試験されたが、モチーフは同定されなかった。前記。
【０００６】
Ｄｉｅｂｏｌｄらは、最近になって、ウイルスまたは合成を起源とする一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）が、ＴＬＲ７を活性化することを報告した。Ｄｉｅｂｏｌｄ  ＳＳら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１５２９−３１。彼らは、インフルエンザウイルスからのウイルスゲノムｓｓＲＮＡおよびポリＵが、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）によるＩＦＮ−αの産生を引き起こすことを報告した。ポリＵ以外は、配列特異的なモチーフは同定されなかった。マウス脾臓およびいくつかの（短い干渉ｄｓＲＮＡを作製するために使用される型の）短いｓｓＲＮＡオリゴも、ＩＦＮ−αを誘発した。前記。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明により、ウイルス感染の予防および／または治療のための方法および製品を提供する。一態様では、本発明は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤との組成物であり、抗ウイルス剤は、Ｃ−８置換グアノシンではなく、免疫賦活性オリゴヌクレオチドに連結している。
【０００９】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）またはＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）であってよい。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、Ａ−クラス、Ｂ−クラス、Ｃ−クラス、Ｐ−クラス、Ｔ−クラスまたはＥクラスのオリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを場合により包含してよい。その他の実施形態では、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する。当該の少なくとも１つ、２つまたは３つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結を包含することができ、当該のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間連結を包含する。その他の実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、キメラ骨格を含む。
【００１０】
本発明のその他の態様により、免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤との組成物であって、抗ウイルス剤が、免疫賦活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドと随伴している組成物を提供する。
【００１１】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドを、抗ウイルス剤に間接的または直接的に連結することができる。一実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とは、同一分子の部分である。抗ウイルス剤を、内部のヌクレオチドに、または末端のヌクレオチド、場合により、３’末端のヌクレオチドもしくは５’末端のヌクレオチドに連結することができる。
【００１２】
組成物は、ヌクレアーゼ感受性部位を、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤との間に包含することができる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの３’−３’の連結および／または５’−５’の連結を含有する。
【００１４】
組成物は、薬学的に許容できる担体を包含することができる。いくつの実施形態では、組成物は、無菌である。
【００１５】
抗ウイルス剤は、例えば、１つまたは複数のヌクレオチド類似体、ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）、イサトリビン（ｉｓａｔｏｒｉｂｉｎｅ）、リバビリン、バロピシタビン（ｖａｌｏｐｉｃｉｔａｂｉｎｅ）、ＢＩＬＮ２０６１、ＶＸ−９５０であってよい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、組成物は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと共に製剤化される第２の抗ウイルス剤を包含する。第２の抗ウイルス剤を、免疫賦活性オリゴヌクレオチドに連結することができる。その他の実施形態では、組成物は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とを収納する微小粒子またはリポソームを包含する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤は、Ｃ−８置換グアノシンである。Ｃ−８置換グアノシンは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド中に組み込まれていてもよく、またはＲＮＡに連結してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ−８置換グアノシンは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する。その他の実施形態では、Ｃ−８置換グアノシンは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端の１、２または３ヌクレオチド３’側に位置する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、脱塩基を含有するオリゴヌクレオチドでも、アダプターオリゴヌクレオチドでもない。
【００１９】
別の態様では、本発明は、抗ウイルス剤に連結しているＴＬＲ７／８／９のリガンドの組成物である。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ７／８／９のリガンドは、免疫賦活性オリゴヌクレオチドである。ＴＬＲ７／８／９のリガンドは、抗ウイルス剤に直接的または間接的に連結している。いくつかの実施形態では、組成物は、ヌクレアーゼ感受性部位を、ＴＬＲ７／８／９のリガンドと抗ウイルス剤との間に包含する。
【００２０】
本発明のその他の態様により、ウイルス性疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする対象に、本明細書に記載の本発明の組成物を、ウイルス性疾患を治療するのに有効な量で投与するステップが関与する。いくつかの実施形態では、ウイルス性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。担体は、緩衝液であってよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、対象は、非ＣｐＧ療法に対して非応答性である。その他の実施形態では、対象は、抗ウイルス剤を用いた療法に対して非応答性である。
【００２２】
本発明のその他の態様により、阻害性ウイルスタンパク質およびＴＬＲを発現することができる細胞と担体との組成物を提供する。
【００２３】
一実施形態では、細胞にＴＬＲレポーター構築物がトランスフェクトされている。ＴＬＲは、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９であってよい。
【００２４】
別の実施形態では、細胞に阻害性ウイルスタンパク質発現構築物がトランスフェクトされている。阻害性ウイルスタンパク質は、例えば、ＮＳ３／４プロテアーゼであってよい。
【００２５】
いくつかの実施形態では、細胞は、ウイルス感染患者からの免疫細胞である。
【００２６】
その他の実施形態では、阻害性ウイルスタンパク質は、細胞によって内因性に発現する。
【００２７】
本発明のその他の態様により、免疫賦活抗ウイルス性組成物を同定するための方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の細胞を試験化合物と接触させるステップと、サイトカインの産生および抗ウイルスレポーターの読取りを測定するステップとが関与し、サイトカインの産生の増加および抗ウイルスレポーターの読取りの増加は、試験化合物が免疫賦活抗ウイルス性組成物であることを示す。
【００２８】
さらにその他の態様では、本発明は、免疫賦活抗ウイルス性組成物を同定するための方法であり、この方法は、本明細書に記載の細胞を試験化合物と接触させるステップと、Ｔｈ１応答、Ｔｈ−１様応答または炎症促進性サイトカインの産生を測定するステップとを含み、Ｔｈ１応答、Ｔｈ−１様応答または炎症促進性サイトカインの産生の増加は、試験化合物が免疫賦活抗ウイルス性組成物であることを示す。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、ウイルス感染患者から免疫細胞を単離し、免疫細胞を試験化合物と接触させ、サイトカインの産生およびウイルス価を測定することにより、免疫賦活抗ウイルス性組成物を同定するための方法であり、Ｔｈ１サイトカインの産生の増加およびウイルス価の減少は、試験化合物が免疫賦活抗ウイルス性組成物であることを示す。
【００３０】
その他の態様では、本発明は、ウイルス感染患者から免疫細胞を単離し、免疫細胞を抗ウイルス活性を有する、抗ウイルス剤と免疫賦活性オリゴヌクレオチドとを含有する分子と接触させ、ウイルス価を測定することにより、この分子についてスクリーニングするための方法であり、ウイルス価の低下は、この分子が抗ウイルス活性を有することを示す。
【００３１】
いくつかの実施形態では、末梢血液の単核細胞は、樹状細胞を含む。樹状細胞は、形質細胞様樹状細胞である場合がある。
【００３２】
接触させるステップはｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こすことができ、末梢血液の単核細胞を培養することができる。
【００３３】
本発明の態様として、本発明の組成物の、免疫応答を賦活するための使用も提供する。
【００３４】
免疫応答を賦活するための本発明の組成物の医薬品を製造するための方法も提供する。
【００３５】
本発明の態様により、癌を治療するための方法も提供する。この方法は、癌を有する対象に免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤との組成物を、癌を治療するのに有効な量で投与するステップが関与する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、細菌感染を有する対象に免疫賦活性オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤との組成物を、細菌感染を治療するのに有効な量で投与することにより、細菌感染を治療するための方法を包含する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドに連結している。抗ウイルス剤は、リバビリンであってよい。組成物はまた、Ｃ−８置換グアノシンを包含することもできる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、Ａ−クラス、Ｂ−クラス、Ｃ−クラス、Ｐ−クラス、Ｔ−クラスまたはＥ−クラスのオリゴヌクレオチド等のＤＮＡオリゴヌクレオチドである。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する。
【００３９】
また、癌またはウイルスもしくは細菌による感染を治療するための、本明細書に記載の組成物を提供する。
【００４０】
また、対象にワクチン接種するための医薬品の製造のための、抗原と組み合わせた本明細書に提供する組成物の使用を提供する。
【００４１】
本発明はまた、対象の癌、ウイルス感染または細菌感染を治療するための医薬品の製造のための、本明細書に提供する組成物の使用も包含する。
【００４２】
本発明の制限のそれぞれが、本発明の種々の実施形態を含有することができる。したがって、いずれか１つの要素または要素の組合せが関与する本発明の制限のそれぞれを、本発明の各態様に包含し得ることが期待される。本発明は、その適用において、以下の説明に記載するまたは図面において説明する構成成分の構造および配置の詳細に制限されない。本発明は、その他の実施形態が可能であり、種々の方法で実行または実施することが可能である。また、本明細書で使用する表現および専門用語は、説明のためのものであって、制限するものであるとみなされてはならない。本明細書では、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関与する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」およびそれらの変形形態の使用は、それに続いて列挙する事項およびそれらの均等物ならびに追加の事項を含有することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】８−Ｏｘｏ−ｒＧのＯＲＮ媒介免疫賦活に対する正の影響力を実証する３つのグラフである。８−Ｏｘｏ−ｒＧ修飾ＯＲＮ（配列番号１および配列番号８）によるサイトカインの賦活を、対照のＯＲＮ（配列番号１１）のそれと比較した。サイトカインＩＦＮ−アルファ（図１ａ）、ＩＬ−１２ｐ４０（図１ｂ）およびＴＮＦ−アルファ（図１ｃ）を測定した。ｘ−軸は、μＭにおけるＯＲＮ濃度であり、ｙ−軸は、ｐｇ／ｍｌにおけるサイトカイン濃度である。
【図２】８−修飾Ｇの正の影響力は、ＲＮＡ配列中の位置によって決まることを実証するグラフである。単一の８−Ｏｘｏ−ｒＧをＯＲＮの異なる位置に有するＯＲＮ（配列番号１〜４）および未修飾ＯＲＮ（配列番号８）によるＩＦＮ−アルファの賦活。ｘ−軸は、μＭにおけるＯＲＮ濃度であり、ｙ−軸は、ｐｇ／ｍｌにおけるＩＦＮ−アルファ濃度である。
【図３】ＯＲＮの５’末端における異なる８−修飾デオキシ−およびリボヌクレオチドが、免疫を賦活する活性を増加させることを実証するグラフである。ＯＲＮの５’末端において単一の８−Ｏｘｏ−ｒＧ／Ｄｇ（配列番号１、５）、８−ブロモ−ｄＧ（配列番号７）またはイムノシン（イサトリビン）（配列番号６）（５’−５’連結を有する）を有するＯＲＮによる、ＩＦＮ−アルファの賦活を、８−ブロモ−ｄＡ修飾ＯＲＮ（配列番号１０）、対照のＯＲＮ、配列番号１１および未修飾ＯＲＮ（配列番号ＮＯ：８）と比較した（図３）。ｘ−軸は、μＭにおけるＯＲＮ濃度であり、ｙ−軸は、ｐｇ／ｍｌにおけるＩＦＮ−アルファ濃度である。
【図４】ＲＢＶとＣｐＧ  ＯＤＮ（配列番号１４）との組合せの、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生に対する効果（図４Ｂ）、およびＣｐＧ  ＯＤＮが非存在下におけるＲＢＶのＩＦＮ−γ産生に対する効果（図４Ａ）を描写するグラフのセットである。
【図５】先のＯＤＮ／ＲＢＶ処置とは独立した、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、ＲＢＶの、ＣＤ３が媒介するＩＦＮ−γ産生に対する効果を描写するグラフのセットである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける低い濃度のＲＢＶが、以前のｉｎ  ｖｉｖｏの処置とは独立に、ＩＦＮ−γのレベルを増加させた（図５Ａ）。ＣｐＧ  ＯＤＮ（配列番号１４）との組合せの効果を、図５Ｂに示す。
【図６】ＲＢＶが、配列番号１４が誘発するＩＬ−１０を減少させたことを実証するグラフである。
【図７】骨髄（ＢＭ）由来樹状細胞（ＤＣ）を使用して実施した実験を描写するグラフのセットである。ＧＭ−ＣＳＦ中に維持したＢＭ−由来ＤＣを、配列番号１４、ＲＢＶ（１μＭ、５μＭ、１０μＭ、１００μＭもしくは１２０μＭ）、または配列番号１４とＲＢＶを用いて処理し、ＩＬ−１２ｐ４０（図７Ａ）、ＩＬ−１２ｐ７０（図７Ｂ）について試験した。
【図８】マウス癌モデル中でのＣｐＧ  ＯＤＮ（配列番号１４）とＲＢＶとの組合せの効果に関するｉｎ  ｖｉｖｏにおける研究の結果を描写するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、抗ウイルス剤と、免疫賦活性オリゴヌクレオチド等のＴＬＲのリガンドとの組合せを使用する、ウイルス感染、細菌感染または癌を治療するための方法および製品に関する。本発明はまた、薬剤のこうした組合せを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアッセイも包含する。
【００４５】
組成物の同時投与を、構成成分を１つの分子として組み合わせるまたは構成成分を標的細胞に同時に送達する送達ビヒクル中で組み合わせるのいずれかによって達成することができる。本発明の組み合わせたＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤は、急性ウイルス感染または慢性ウイルス感染等のウイルス性障害の治療に有用である。急性ウイルス感染は、自己回復する場合がある、短期間、一般に６カ月未満の感染を指す。慢性感染は、再発するまたは持続期間が６カ月以上続き、回復には介入を必要とする感染である。
【００４６】
ウイルスは、一般に、核酸の芯およびタンパク質の外被を含有するが、独立して生存する生物体ではない小型の感染病原体である。ウイルスはまた、タンパク質を欠く、感染性の核酸の形態をとることもできる。ウイルスは、その内部でウイルスが複製することができる生細胞の非存在下では生存することができない。ウイルスは、特異的な生細胞に、エンドサイトーシスまたはＤＮＡの直接的な注入（ファージ）のいずれかによって侵入し、繁殖して、疾患を引き起こす。次いで、繁殖したウイルスは、遊離して、追加の細胞に感染することができる。いくつかのウイルスは、ＤＮＡ含有ウイルスであり、他のウイルスは、ＲＮＡ含有ウイルスである。ＤＮＡウイルスは、ポックス、ヘルペス、アデノ、パポバ、パロボおよびヘパドナを包含する。ＲＮＡウイルスは、ピコルナ、カリシ、アストロ、トガ、フラビ、コロナ、パラミクソ、オルトミクソ、ブニア、アレナ、ラブド、フィロ、ボルナ、レオおよびレトロを包含する。いくつかの態様では、本発明はまた、プリオンが疾患の進行に関係しているとみなされる疾患、例えば、動物におけるウシ海綿状脳症（すなわち、狂牛病、ＢＳＥ）もしくはスクレイピー感染またはヒトにおけるクロイツフェルトヤコブ病等を治療することも意図する。
【００４７】
ウイルスは、これらに限定されないが、（これらに限定されないが、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス等のピコルナウイルス科のウイルスをはじめとする）エンテロウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、ならびにＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎およびＥ型肝炎等の肝炎ウイルスを包含する。ヒトにおいて見出されているウイルスの特異的な例は、これらに限定されないが、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）等のヒト免疫不全ウイルス；およびＨＩＶ−ＬＰ等のその他の分離株）；ピコナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；イリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；ならびにその他のウイルスである急性咽頭気管気管支炎ウイルス、アルファウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパーウイルス、ノーウォークウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、トリインフルエンザ、ＳＡＲｓウイルス、ウエストナイルウイルスを包含する。
【００４８】
本発明の方法は、いくつかの実施形態において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および肝炎ウイルスの治療のために特に有用である。ＨＩＶは、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ  ＩＩＩ）としても知られるレトロウイルスの種であり、ＡＩＤＳとして知られる障害に至る増悪を引き起こす原因である。ＨＩＶは、Ｔ細胞に感染して、それを破壊し、免疫系の全体的なバランスを混乱させ、その結果、患者は、その他の感染と戦う能力を失い、致命傷になることが多い日和見感染に罹患しやくすくなる。
【００４９】
ウイルス性肝炎は、腫脹、圧痛および時には肝臓に対する永久的損傷を生じる場合がある肝臓の炎症である。肝臓の炎症が、少なくとも６カ月以上続くと、これは、慢性肝炎と呼ばれる。ウイルス性肝炎を引き起こすことが知られる少なくとも５つの異なるウイルスがあり、これらには、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型が包含される。Ａ型肝炎は、一般に、ヒトの糞便で汚染された食物または飲料水を介して伝染する。Ｂ型肝炎は、一般に、血液等の体液を介して伝播する。例えば、Ｂ型肝炎は、出産時に母親から子供へ、性的接触を介して、汚染された血液による輸血および針を介して伝播する場合がある。Ｃ型肝炎は、非常によく起こり、Ｂ型肝炎と同様、しばしば、輸血および汚染された針を介して伝播する。Ｄ型肝炎は、それが同時に結合するＢ型肝炎ウイルスを保菌するＩＶ薬物使用者中に最も頻繁に見出される。Ｅ型肝炎は、ウイルス性Ａ型肝炎に類似し、一般に、不十分な衛生設備に関連する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒトの脊椎動物を指す。非ヒトの脊椎動物は、家畜動物、愛玩動物および実験動物を包含する。非ヒトの対象はまた、具体的には、非ヒト霊長類およびげっ歯類も包含する。非ヒトの対象はまた、具体的には、これらに限定されないが、ニワトリ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ミンクおよびウサギも包含する。いくつかの実施形態では、対象は患者である。本明細書で使用する場合、「患者」は、医師もしくはその他の医療従事者に相談しているもの、医師もしくはその他の医療従事者から助言を得ているもの、または医師もしくはその他の医療従事者から処方箋もしくはその他の忠告を得ているものをはじめとする、医師またはその他の医療従事者の保護下にある対象を指す。患者は、典型的には、ウイルス感染を有するまたはウイルス感染を有するリスクがある対象である。
【００５１】
「ウイルス感染を有する対象」は、感染性ウイルスが対象に表面的、局所的または全身的に侵入することによって発生した障害を有するまたはそれを有するリスクがある対象である。ウイルス感染を有するリスクがある対象は、ウイルスが見出されることが知られる場所に旅行したもの、ウイルスが見出されることが知られる場所に住むものおよびウイルスに感染していることが知られるものに密接に接近しているもの等、特定のウイルスに暴露したことが知られるものであり得る。本発明によって、ウイルス感染を有するまたはウイルス感染を発症するリスクがある対象のウイルス感染を治療するための方法は、そのような治療を必要とする対象に、本発明の組成物を、ウイルス感染を治療するのに有効な量で投与するステップが関与する。
【００５２】
ＴＬＲのリガンド−抗ウイルス剤の組成物は、いくつかの態様では、自然免疫応答および抗原特異的免疫応答を同時に誘発して、免疫系によるウイルスに対する多面的な攻撃を導くことによって機能する。抗ウイルス剤は、特異的にウイルスを攻撃し、一方、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、長期にわたる効果をもたらす。この組合せは、投与計画を減少させ、服薬遵守および維持療法を改善し、緊急事態を減少させ；かつ生活の質を改善するように設計される。
【００５３】
ＴＬＲのリガンドは、免疫系を賦活して、ウイルス感染を治療する。オリゴヌクレオチドの免疫賦活能力の結果として得られる、強力であるが、バランスのとれた、細胞性免疫応答および液性免疫応答は、対象の侵入するウイルスに対する自然の防御系を反映する。本明細書で使用する場合、疾患または状態に関して使用する場合の「治療する」という用語は、疾患もしくは状態の発症を阻止するもしくは遅らせる、疾患もしくは状態の進行を阻止する、阻害するもしくは遅らせる、疾患もしくは状態の進行を停止させる、または疾患もしくは状態を解消するように、そのような疾患または状態に介入することを意味するものとする。本明細書で使用する場合、「阻害する」という用語は、正常と比較して、結果または効果を減少させることを意味するものとする。
【００５４】
本発明の組成物は、１つまたは複数の抗ウイルス剤に連結しているＴＬＲのリガンドを包含する。トール様受容体（ＴＬＲ）は、哺乳動物における自然免疫において重大な意味をもつ役割を担う、高度に保存されたポリペプチドのファミリーである。現在、１０個のファミリーメンバーが、同定されており、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と命名されている。種々のＴＬＲの細胞質側のドメインが、トール−インターロイキン１（ＩＬ−１）受容体（ＴＩＲ）ドメインによって特徴付けられている。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２：２５３−８。ＴＬＲによる、微生物の侵入の認識が、ショウジョウバエおよび哺乳動物において進化的に保存されているシグナル伝達カスケードの活性化を引き起こす。ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質ＭｙＤ８８が、ＴＬＲに結合すること、ならびにＩＬ−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）をＴＬＲに向けて動員することが報告されている。ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路は、免疫活性化および炎症性サイトカインの産生における重大な意味をもつステップである、ＮＦ−κＢ転写因子およびｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ（Ｊｎｋ）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を導くと考えられている。総説に関しては、Ａｄｅｒｅｍ  Ａら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７８２−８７を参照されたい。
【００５５】
ＴＬＲは、種々の組織中および種々の型の免疫細胞上で示差的に発現すると考えられている。例えば、ヒトＴＬＲ７は、胎盤、肺、脾臓、リンパ節、扁桃腺において、および形質細胞様前駆体樹状細胞（ｐＤＣ）上で発現することが報告されている。Ｃｈｕａｎｇ  Ｔ−Ｈら（２０００）Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ  １１：３７２−８；Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｎら（２００１）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：８６３−９。ヒトＴＬＲ８は、肺、末梢血液白血球（ＰＢＬ）、胎盤、脾臓、リンパ節において、および単核球上で発現することが報告されている。Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｎら（２００１）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：８６３−９；Ｃｈｕａｎｇ  Ｔ−Ｈら（２０００）Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ  １１：３７２−８。ヒトＴＬＲ９は、脾臓、リンパ節、骨髄、ＰＢＬにおいて、ならびにｐＤＣおよびＢ細胞上で発現すると報告されている。Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｎら（２００１）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：８６３−９；Ｂａｕｅｒ  Ｓら（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９２３７−４２；Ｃｈｕａｎｇ  Ｔ−Ｈら（２０００）Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ  １１：３７２−８。
【００５６】
ヒトおよびマウスのＴＬＲ７のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は既知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２４０４６７、ＡＦ２４５７０２、ＮＭ＿０１６５６２、ＡＦ３３４９４２、ＮＭ＿１３３２１１；ならびにＡＡＦ６０１８８、ＡＡＦ７８０３５、ＮＰ＿０５７６４６、ＡＡＬ７３１９１およびＡＡＬ７３１９２を参照されたい。これらの全内容が、参照によって本明細書に組み込まれている。ヒトＴＬＲ７は、１０４９アミノ酸長であると報告されている。マウスＴＬＲ７は、１０５０アミノ酸長であると報告されている。ＴＬＲ７ポリペプチドは、ロイシンに富む反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびＴＩＲドメインを包含する細胞内ドメインを包含する。
【００５７】
ヒトおよびマウスのＴＬＲ８のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は既知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２４６９７１、ＡＦ２４５７０３、ＮＭ＿０１６６１０、ＸＭ＿０４５７０６、ＡＹ０３５８９０、ＮＭ＿１３３２１２；ならびにＡＡＦ６４０６１、ＡＡＦ７８０３６、ＮＰ＿０５７６９４、ＸＰ＿０４５７０６、ＡＡＫ６２６７７およびＮＰ＿５７３４７５を参照されたい。これらの全内容が、参照によって本明細書に組み込まれている。ヒトＴＬＲ８は、少なくとも２つのアイソフォームとして存在し、一方は１０４１アミノ酸長であり、他方は１０５９アミノ酸長であると報告されている。マウスＴＬＲ８は、１０３２アミノ酸長である。ＴＬＲ８ポリペプチドは、ロイシンに富む反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびＴＩＲドメインを包含する細胞内ドメインを包含する。
【００５８】
ヒトおよびマウスのＴＬＲ９のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は既知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７４４２、ＡＦ２５９２６２、ＡＢ０４５１８０、ＡＦ２４５７０４、ＡＢ０４５１８１、ＡＦ３４８１４０、ＡＦ３１４２２４、ＮＭ＿０３１１７８；ならびにＮＰ＿０５９１３８、ＡＡＦ７２１８９、ＢＡＢ１９２５９、ＡＡＦ７８０３７、ＢＡＢ１９２６０、ＡＡＫ２９６２５、ＡＡＫ２８４８８およびＮＰ＿１１２４５５を参照されたい。これらの全内容が、参照によって本明細書に組み込まれている。ヒトＴＬＲ９は、少なくとも２つのアイソフォームとして存在し、一方は１０３２アミノ酸長であり、他方は１０５５アミノ酸であると報告されている。マウスＴＬＲ９は、１０３２アミノ酸長である。ＴＬＲ９ポリペプチドは、ロイシンに富む反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびＴＩＲドメインを包含する細胞内ドメインを包含する。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「ＴＬＲシグナル伝達」という用語は、ＴＬＲを介するシグナル伝達に関連する細胞内シグナル伝達のうちのいずれかの態様を指す。本明細書で使用する場合、「ＴＬＲ媒介免疫応答」という用語は、ＴＬＲシグナル伝達に関連する免疫応答を指す。
【００６０】
ＴＬＲ７媒介免疫応答は、ＴＬＲ７シグナル伝達に関連する応答である。ＴＬＲ７媒介免疫応答は、一般に、ＩＦＮ−αならびにＩＰ−１０およびＩ−ＴＡＣ等のＩＦＮ誘発性サイトカインの誘発によって特徴付けられる。ＴＬＲ７媒介免疫応答において誘発されたサイトカインＩＬ−１α／β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α／βおよびＭＩＰ−３α／βのレベルは、ＴＬＲ８媒介免疫応答において誘発されたサイトカインのレベルより低い。
【００６１】
ＴＬＲ８媒介免疫応答は、ＴＬＲ８シグナル伝達に関連する応答である。この応答は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０／７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α／β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α／βおよびＭＩＰ−３α／β等の炎症促進性サイトカインの誘発によってさらに特徴付けられる。
【００６２】
ＴＬＲ９媒介免疫応答は、ＴＬＲ９シグナル伝達に関連する応答である。この応答は、少なくとも、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の産生／分泌によって、ＴＬＲ８媒介免疫応答を介して達成されるレベルより低いレベルにもかかわらず、さらに特徴付けられる。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「ＴＬＲ７／８のリガンド」または「ＴＬＲ７／８のアゴニスト」は、まとめてＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８のシグナル伝達を増加させることができるいずれかの薬剤（すなわち、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８のアゴニスト）を指す。ＴＬＲ７／８のリガンドの中には、ＴＬＲ７シグナル伝達のみを誘発する（例えば、ＴＬＲ７特異的リガンド）ものもあれば、ＴＬＲ８シグナル伝達のみを誘発する（例えば、ＴＬＲ８特異的リガンド）ものもあり、また、ＴＬＲ７シグナル伝達およびＴＬＲ８シグナル伝達の両方を誘発するものもある。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「ＴＬＲ７のリガンド」または「ＴＬＲ７のアゴニスト」という用語は、ＴＬＲ７シグナル伝達を増加させることができるいずれかの薬剤（すなわち、ＴＬＲ７のアゴニスト）を指す。この場合、ＴＬＲ７シグナル伝達のレベルが、シグナル伝達の既存のレベルを超えて増強される場合もあれば、またはシグナル伝達のバックグラウンドのレベルを超えて誘発される場合もある。ＴＬＲ７のリガンドは、これらに限定されないが、Ｃ８−置換グアノシン等のグアノシン類似体、本質的にＧおよびＵからなるリボヌクレオシドの混合物、グアノシンリボヌクレオチド、ならびにＲＮＡまたはＲＮＡ様分子（ＰＣＴ／ＵＳ０３／１０４０６）、ならびにアデノシンに基づいた化合物（例えば、６−アミノ−９−ベンジル−２−（３−ヒドロキシ−プロポキシ）−９Ｈ−プリン−８−オールおよびＳｕｍｉｔｏｍｏによって作製された類似化合物（例えば、ＣＬ−０２９））を包含する。ＴＬＲ７のリガンドはまた、Ｇｏｒｄｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５、１７４：１２５９−１２６８に開示されている（例えば、３Ｍ−００１、Ｎ−［４−（４−アミノ−２−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル−］メタンスルホンアミド；Ｃ１７Ｈ２３Ｎ５Ｏ２Ｓ；分子量３６１）。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「グアノシン類似体」という用語は、グアニン塩基、グアノシンヌクレオシド糖またはグアニン塩基およびグアノシンヌクレオシド糖の両方が関与する化学的修飾を有する（グアノシンを除く）グアノシン様ヌクレオチドを指す。グアノシン類似体は、具体的には、これに限定されないが、７−デアザ−グアノシンを包含する。
【００６６】
グアノシン類似体は、７−チア−８−オキソグアノシン（イムノシン）、８−メルカプトグアノシン、８−ブロモグアノシン、８−メチルグアノシン、８−オキソ−７，８−ジヒドログアノシン、Ｃ８−アリールアミノ−２’−デオキシグアノシン、Ｃ８−プロピニル−グアノシン等のＣ８−置換グアノシン、７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン）および７−メチル−８−オキソグアノシン、８−アミノグアノシン、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン、−８−ヒドロキシグアノシン等のＣ８−およびＮ７−置換グアニンリボヌクレオシド、ならびに７−デアザ８−置換グアノシンもさらに包含する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「ＴＬＲ８のリガンド」または「ＴＬＲ８のアゴニスト」という用語は、ＴＬＲ８シグナル伝達を増加させることができるいずれかの薬剤（すなわち、ＴＬＲ８のアゴニスト）を指す。この場合、ＴＬＲ８シグナル伝達のレベルが、シグナル伝達の既存のレベルを超えて増強される場合もあれば、またはシグナル伝達のバックグラウンドのレベルを超えて誘発される場合もある。ＴＬＲ８のリガンドは、本質的にＧおよびＵからなるリボヌクレオシドの混合物、グアノシンリボヌクレオチド、ならびにＲＮＡまたはＲＮＡ様分子（ＰＣＴ／ＵＳ０３／１０４０６）を包含する。追加のＴＬＲ８のリガンドがまた、Ｇｏｒｄｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５、１７４：１２５９−１２６８に開示されている。
【００６８】
いくつかのＴＬＲ７／８のリガンドは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方のリガンドである。これらは、イミダゾキノリン類、本質的にＧおよびＵからなるリボヌクレオシドの混合物、グアノシンリボヌクレオチド、ならびにＲＮＡまたはＲＮＡ様分子（ＰＣＴ／ＵＳ０３／１０４０６）を包含する。追加のＴＬＲ７／８のリガンドがまた、Ｇｏｒｄｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５、１７４：１２５９−１２６８に開示されている（例えば、３Ｍ  ００３、４−アミノ−２−（エトキシメチル）−α，α−ジメチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール水和物、Ｃ１７Ｈ２６Ｎ４Ｏ２；分子量３１８）。
【００６９】
イミダゾキノリン類は、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）、ＴＮＦ−αおよびいくつかのインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−１２）をはじめとする、いくつかのサイトカインの発現を誘発すると考えられている免疫応答改変物質である。イミダゾキノリン類は、ＩｇＧ２ａレベルの増加を誘発するそれらの能力によって一部明らかなように、Ｔｈ１免疫応答を賦活することができる。イミダゾキノリン剤はまた、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインの産生を阻害することができるとも報告されている。イミダゾキノリン類によって誘発されるサイトカインのうちのいくつかは、マクロファージおよび樹状細胞によって産生される。イミダゾキノリン類のうちのいくつかの種は、ＮＫ細胞の溶菌活性を増加させること、ならびにＢ細胞の増殖および分化を賦活し、それによって、抗体の産生および分泌を誘発することが報告されている。
【００７０】
本明細書で使用する場合、イミダゾキノリン剤は、イミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、６，７−融合シクロアルキルイミダゾピリジンアミンおよび１，２架橋イミダゾキノリンアミンを包含する。これらの化合物は、米国特許第４６８９３３８号、第４９２９６２４号、第５２３８９４４号、第５２６６５７５号、第５２６８３７６号、第５３４６９０５号、第５３５２７８４号、第５３８９６４０号、第５３９５９３７号、第５４９４９１６号、第５４８２９３６号、第５５２５６１２号、第６０３９９６９号および第６１１０９２９号に記載されている。イミダゾキノリン剤の具体的な種は、Ｒ−８４８（Ｓ−２８４６３）；４−アミノ−２エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリンズ−１−エタノール；１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（Ｒ−８３７またはイミキモド）、およびＳ−２７６０９を包含する。イミキモドは、現在、性器および肛門のいぼ等のいぼの局所治療において使用され、また、基底細胞癌の局所治療においても試験されている。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ＴＬＲ９のリガンド」または「ＴＬＲ９のアゴニスト」という用語は、ＴＬＲ９シグナル伝達を増加させることができるいずれかの薬剤（すなわち、ＴＬＲ９のアゴニスト）を指す。ＴＬＲ９のリガンドは、具体的には、これらに限定されないが、免疫賦活性核酸、具体的には、免疫賦活性ＣｐＧ核酸を包含する。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「免疫賦活性ＣｐＧ核酸」または「免疫賦活性ＣｐＧオリゴヌクレオチド」という用語は、免疫細胞を活性化することができるいずれかのＣｐＧ含有核酸を指す。ＣｐＧジヌクレオチドのうちの少なくともＣが、必ずしもそうではないが、典型的には、メチル化されていない。免疫賦活性ＣｐＧ核酸は、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号をはじめとする、いくつかの発行された特許および公開された特許出願に記載されている。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＴＬＲのリガンドは、免疫賦活性オリゴヌクレオチドである。「免疫賦活性オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、免疫応答を誘発することができる免疫賦活性のモチーフまたは骨格を含有するいずれかの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。免疫応答の誘発は、免疫細胞の数もしくは活性の何らかの増加、またはサイトカイン等の免疫因子の発現レベルもしくは絶対レベルの増加を指す。免疫細胞は、これらに限定されないが、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージおよびその他の抗原提示細胞を包含する。サイトカインは、これらに限定されないが、インターロイキン、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、βおよびγ、Ｆｌｔ−リガンド、ならびに副刺激分子を包含する。免疫賦活性モチーフは、これらに限定されないが、ＣｐＧモチーフおよびＴに富むモチーフを包含する。免疫賦活性骨格は、これらに限定されないが、ホスホロチオエート骨格等のリン酸の修飾された骨格を包含する。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、先行技術に広範に記載されており、これらの核酸の短い概要を以下に示す。
【００７４】
「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互換的に使用して、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基および交換可能な有機塩基に連結している糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子であり、この交換可能な有機塩基は、置換されているピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））または置換されているプリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））のいずれかである）を意味する。したがって、この用語は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドの両方を包括する。この用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、リン酸を欠くポリヌクレオチド）、およびいずれかのその他の有機塩基含有高分子も包含するものとする。オリゴヌクレオチドは、現存の核酸源（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、合成したもの（例えば、核酸合成によって産生したもの）が好ましい。
【００７５】
オリゴヌクレオチドは、二本鎖であっても、または一本鎖であってもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖であるが、（例えば、それ自体が折り畳まれることによって、またはその全体を通してもしくはその長さに沿って選択されたセグメントにおいてのいずれかでそれ自体とハイブリダイズすることによって）、二次および三次の構造を形成することができる。したがって、そのようなオリゴヌクレオチドの一次構造は、一本鎖であってよいが、その高次構造は、二本鎖または三本鎖であり得る。
【００７６】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフ等の免疫賦活性モチーフ、およびＴに富むモチーフ等の非ＣｐＧモチーフを所有することができる。本発明の実施形態によっては、いくつかの免疫賦活性モチーフが、その他のモチーフより好ましい。本発明のいくつかの実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ポリ−Ｇモチーフを含有しない。いくつかの実施形態では、いずれかの核酸を、それが同定可能なモチーフを所有するか否かにかかわらず、抗ウイルス剤と組み合わせることができる。免疫賦活性オリゴヌクレオチドはまた、ホスホロチオエートで修飾された骨格等の修飾された骨格を有する核酸も包含する。特定の実施形態では、ホスホロチオエートで修飾された骨格を有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドも、同定可能なモチーフを有さないが、それでも免疫賦活性である。
【００７７】
ＣｐＧ配列は、ヒトＤＮＡ中では比較的まれであるが、細菌等の感染性の生物体のＤＮＡ中では通常に見出される。ヒトの免疫系は、ＣｐＧ配列を感染の初期の危険信号として認識して、侵入する病原体に対して即座でかつ強力な免疫応答を開始するが、その他の免疫を賦活する薬剤では頻繁に見られる有害反応を引き起こすことがないように進化していることは明らかである。したがってＣｐＧ含有核酸は、この自然免疫の防御機構に依存して、比類ないかつ自然な経路を免疫療法のために活用することができる。ＣｐＧ核酸の免疫調節に対する効果が、米国特許第６，１９４，３８８号ならびにＰＣＴ  ＵＳ９５／０１５７０、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３６７８；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０４０８；ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４７０３；ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７３３５；およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０９８６３等の公開された特許出願に広範に記載されている。
【００７８】
「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、３つ以上の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを包含する。少なくとも１つの「非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド」を含有する核酸は、シトシン−グアニンのジヌクレオチド配列（すなわち、「ＣｐＧ  ＤＮＡ」、または３’グアノシンが続き、リン酸結合によって連結している５’シトシンを含有するＤＮＡ）中に非メチル化シトシンを含有する核酸分子であり、免疫系を活性化する。
【００７９】
細胞中への取込みを促進するためには、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、長さが６から１００塩基の範囲であることが好ましい。しかし、６ヌクレオチド超のいずれの大きさの核酸であっても（数ｋｂの長さでさえも）、十分な免疫賦活性モチーフが存在すれば、本発明による免疫応答を誘発することができる。好ましくは、免疫賦活性核酸の大きさは、８ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの間、いくつかの実施形態では、８ヌクレオチドから５０ヌクレオチドの間または８ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間の範囲である。
【００８０】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、回文構造または逆方向反復（すなわち、ＡとＡ’とが通常のワトソン−クリック塩基対を形成することができる塩基であるＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’等の配列）を含有してよい。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては、そのような配列は、二本鎖構造を形成することができる。一実施形態では、ＣｐＧ核酸は、回文構造配列を含有する。この状況において使用される回文構造配列は、ＣｐＧが、回文構造の一部、好ましくは、回文構造の中心である回文構造を指す。別の実施形態では、ＣｐＧ核酸は、六量体の回文構造をもたない。六量体の回文構造をもたない免疫賦活性核酸は、ＣｐＧジヌクレオチドが、少なくとも６ヌクレオチドの長さである回文構造の一部ではない核酸である。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧが回文構造の内部にはない回文構造は包含してよい。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態では、非ＣｐＧ免疫賦活性核酸を使用する。非ＣｐＧ免疫賦活性核酸は、ジヌクレオチドのＣ残基がメチル化されているまたはメチル化されていないのいずれにかかわらず、ＣｐＧモチーフをその配列中に有しない核酸である。非ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、それらの配列、それらの送達形態およびそれらが投与される用量に依存して、Ｔｈ１免疫応答またはＴｈ２免疫応答を誘発することができる。
【００８２】
本発明の選択された態様では、非ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、Ｔに富む核酸であってよい。Ｔに富む核酸は、Ｔに富むモチーフを有する核酸である。Ｔに富むモチーフおよびそのようなモチーフを所有する核酸が、Ｋｒｉｅｇらによる２０００年９月２５日出願の米国特許出願第０９／６６９，１８７号に記載されており、その全内容が、参照によって本明細書に組み込まれている。本発明において有用なその他の非ＣｐＧ核酸が、２００１年１月２２日出願の米国特許出願第０９／７６８，０１２号に記載されており、その全内容が、参照によって本明細書に組み込まれている。
【００８３】
いくつかの実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格等の修飾された骨格を有する。Ｈｕｔｃｈｅｒｓｏｎらに発行された米国特許第５，７２３，３３５号および第５，６６３，１５３号、ならびに関連のＰＣＴ公開第ＷＯ９５／２６２０４号は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体を使用する免疫賦活を記載している。これらの特許は、免疫応答を非配列特異的な様式で賦活するホスホロチオエート骨格の能力を記載している。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、メチル化ＣｐＧおよび非メチル化ＣｐＧを欠くホスホロチオエート骨格オリゴヌクレオチドとＴに富むモチーフとの使用に依存する。
【００８４】
本発明の方法は、Ａクラス、Ｂクラス、Ｃクラス、Ｅクラス、ＴクラスおよびＰクラス等のＯＤＮクラスをはじめとする、以前に記載されたクラスの免疫賦活性オリゴヌクレオチドの使用を包括することができる。本発明のいくつかの実施形態では、免疫調節性オリゴヌクレオチドは、「ＣｐＧジヌクレオチド」である免疫賦活性モチーフを包含する。ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていても、またはメチル化されていなくてもよい。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫賦活性核酸は、メチル化されていない、シトシン−グアニンのジヌクレオチド配列（すなわち、３’グアノシンが続き、リン酸結合によって連結している非メチル化５’シチジン）を含有し、免疫系を活性化する核酸分子であり；そのような免疫賦活性核酸は、ＣｐＧ核酸である。ＣｐＧ核酸は、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号をはじめとする、いくつかの発行された特許、公開された特許出願およびその他の刊行物に記載されている。少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫賦活性核酸は、メチル化されている、シトシン−グアニンのジヌクレオチド配列（すなわち、３’グアノシンが続き、リン酸結合によって連結しているメチル化５’シチジン）を含有し、免疫系を活性化する核酸である。その他の実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドをもたない。ＣｐＧジヌクレオチドをもたない、これらのオリゴヌクレオチドを、非ＣｐＧオリゴヌクレオチドと呼び、これらは、非ＣｐＧ免疫賦活性モチーフを有する。好ましくは、これらは、少なくとも８０％のＴを有するＯＤＮ等、Ｔに富むＯＤＮである。
【００８５】
「Ｂクラス」のＯＤＮは、Ｂ細胞を活性化する点では効力があるが、ＩＦＮ−αの誘発およびＮＫ細胞の活性化においては比較的弱い。ＢクラスのＣｐＧ核酸は、典型的には、完全に安定化されており、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを特定の好ましい塩基構成の内部に包含する。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号を参照されたい。別のクラスが、ＩＦＮ−αの誘発およびＮＫ細胞の活性化については効力があるが、Ｂ細胞を刺激する点では比較的弱く；このクラスは、「Ａクラス」と命名されている。ＡクラスのＣｐＧ核酸は、典型的には、５’末端および３’末端に安定化されたポリ−Ｇ配列、および少なくとも６ヌクレオチドの、回文構造のリン酸ジエステルＣｐＧジヌクレオチド含有配列を有する。例えば、公開された特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６５２７（ＷＯ０１／２２９９０）を参照されたい。さらに別のクラスのＣｐＧ核酸が、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、ＩＦＮ−αを誘発し；このクラスは、Ｃ−クラスと命名されている。
【００８６】
「Ｃクラス」の免疫賦活性核酸は、少なくとも２つの特徴的なモチーフを含有し、免疫系の細胞に対する比類のないかつ望ましい賦活効果を有する。これらのＯＤＮのうちのいくつかは、伝統的な「賦活性」のＣｐＧ配列および「ＧＣに富む」または「Ｂ細胞を中和する」モチーフの両方を有する。これらの組合せモチーフの核酸は、Ｂ細胞活性化および樹状細胞（ＤＣ）活性化の強力な誘発物質である伝統的な「クラスＢ」のＣｐＧ  ＯＤＮに関連する効果と、ＩＦＮ−αおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化の強力な誘発物質であるが、Ｂ細胞およびＤＣの活性化の比較的不十分な誘発物質である、免疫を賦活する核酸のより最近になって記載されたクラス（「クラスＡ」のＣｐＧ  ＯＤＮ）に関連する効果とのほぼ中間に属する、免疫を賦活する効果を有する。Ｋｒｉｅｇ  ＡＭら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−９；Ｂａｌｌａｓ  ＺＫら（１９９６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：１８４０−５；Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：４０７２−６。好ましいクラスＢのＣｐＧ  ＯＤＮは、しばしば、ホスホロチオエート骨格を有し、好ましいクラスＡのＣｐＧ  ＯＤＮは、混合性またはキメラの骨格を有し、一方、Ｃクラスの、組合せモチーフの免疫を賦活する核酸は、安定化された、例えば、ホスホロチオエート、キメラまたはリン酸ジエステルの骨格うちのいずれかを有してよく、いくつかの好ましい実施形態では、それらは、セミソフトな骨格を有する。このクラスが、２００２年８月１９日出願の米国特許出願第１０／２２４，５２３号に記載されており、その全内容が、参照によって本明細書に組み込まれている。
【００８７】
「Ｐクラス」の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメイン、２つの二重鎖形成領域ならびに任意選択のスペーサーおよび３’テールをはじめとする、いくつかのドメインを有する。このクラスのオリゴヌクレオチドは、場合によっては、Ｃ−クラスよりもはるかに高いレベルのＩＦＮ−αの分泌を誘発する能力を有する。Ｐ−クラスのオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでコンカテマーに自発的に自己組織化する能力を有する。これらの分子の作用の方法に関しては、いずれの特定の理論にも拘束されないが、１つの有望な仮説は、この特性が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの以前に記載されたクラスと比較して、Ｐ−クラスのオリゴヌクレオチドに、特定の免疫細胞の内部でＴＬＲ９をより高度に架橋して、特徴的なパターンの免疫活性化を誘発する能力を付与するというものである。ＴＬＲ９受容体の架橋結合は、形質細胞様樹状細胞中のＩ型ＩＦＮＲフィードバックループを介してより強力なＩＦＮ−αの分泌の活性化を誘発することができる。Ｐクラスのオリゴヌクレオチドが、少なくとも、米国特許出願第１１／７０６，５６１号に記載されている。
【００８８】
「Ｔクラス」のオリゴヌクレオチドは、ＢクラスまたはＣクラスよりも、本発明のＯＤＮ中の場合のように修飾されていない場合にはより低いレベルのＩＦＮ−アルファの分泌、ならびにより低いレベルのＩＦＮ関連のサイトカインおよびケモカインの分泌を誘発し、一方、Ｂクラスのオリゴヌクレオチドと同様のＩＬ−１０のレベルを誘発する能力を保持する。Ｔクラスのオリゴヌクレオチドが、少なくとも、米国特許出願公開第１１／０９９，６８３号に記載されており、その全内容が、参照によって本明細書に組み込まれている。
【００８９】
「Ｅクラス」のオリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ−アルファの分泌を誘発する増強された能力を有する。これらのＯＤＮは、ＹＧＺモチーフの親油性の置換ヌクレオチド類似体５’および／または３’を有する。Ｅクラスの式の化合物は、例えば、以下の親油性の置換ヌクレオチド類似体のうちのいずれであってもよい：置換されているピリミジン、置換されているウラシル、疎水性のＴ類似体、置換されているトルエン、置換されているイミダゾールもしくはピラゾール、置換されているトリアゾール、５−クロロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ヨード−ウラシル、５−エチル−ウラシル、５−プロピル−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−ウラシルまたは２，４−ジフルオロ−トルエン。Ｅクラスのオリゴヌクレオチドが、少なくとも、米国仮特許出願第６０／８４７，８１１号に記載されている。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）である。免疫賦活性ＯＲＮは、例えば、ＴＬＲ７／８のモチーフを賦活するＯＲＮを包含する。ＴＬＲ７／８を賦活するＯＲＮは、例えば、５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’、５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’、５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’、５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’または５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’等のリボヌクレオチド配列を包含してよい。Ｃ／Ｕは、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）であり、Ｇ／Ｕは、グアニン（Ｇ）またはＵであり、Ｒはプリンであり、Ｙはピリミジンであり、Ｂは、Ｕ、ＧまたはＣであり、Ｇ／Ｃは、ＧまたはＣであり、Ａ／Ｃは、アデニン（Ａ）またはＣである。５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’は、ＣＵＧＵ、ＣＵＵＵ、ＵＵＧＵまたはＵＵＵＵであってよい。種々の実施形態では、５’−Ｒ−Ｕ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−３’は、ＧＵＡＧＵ、ＧＵＡＧＣ、ＧＵＧＧＵ、ＧＵＧＧＣ、ＡＵＡＧＵ、ＡＵＡＧＣ、ＡＵＧＧＵまたはＡＵＧＧＣである。一実施形態では、塩基配列は、ＧＵＡＧＵＧＵである。種々の実施形態では、５’−Ｇ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｂ−３’は、ＧＵＵＧＵ、ＧＵＵＧＧまたはＧＵＵＧＣである。種々の実施形態では、５’−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’は、ＧＵＧＵＧまたはＧＵＧＵＵである。一実施形態では、塩基配列は、ＧＵＧＵＵＵＡＣである。種々のその他の実施形態では、５’−Ｇ／Ｃ−Ｕ−Ａ／Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−３’は、ＧＵＡＧＧＣＡＣ、ＧＵＣＧＧＣＡＣ、ＣＵＡＧＧＣＡＣまたはＣＵＣＧＧＣＡＣである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドでも、脱塩基オリゴヌクレオチドでもない。
【００９２】
アダプターオリゴヌクレオチドは、式５’Ｘａ−ＴＴＴＴＴ−Ｘｂ３’を含み、式中、ＸａおよびＸｂは独立に、いずれかのヌクレオチドであってよく、ＸａおよびＸｂは、存在しても存在しなくてもよい。ＸａおよびＸｂは、１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、１〜１００ヌクレオチド）を表す。オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド以上の長さであってよい。オリゴヌクレオチドは、６または７個以上の近接するＴを含んでよい。好ましくは、アダプターオリゴヌクレオチドは、ｄＴホモポリマー（すなわち、本明細書に列挙する長さのオリゴｄＴ）である。さらにより好ましくは、アダプターオリゴヌクレオチドは、１７ヌクレオチドの長さのチミジン（ｄＴ）ホモポリマーである。最も好ましくは、アダプターオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート化したヌクレオチド間連結を含む（一部および完全にホスホロチオエート化した骨格を包含する）。
【００９３】
アダプターオリゴヌクレオチドは、実施形態に応じて、１００％Ｔ、９９％Ｔ、９８％Ｔ、９７％Ｔ、９６％Ｔ、９５％Ｔ、９４％Ｔ、９３％Ｔ、９２％Ｔ、９１％Ｔ、９０％Ｔ、８５％Ｔ、８０％Ｔ、７５％Ｔ、７０％Ｔ、６５％Ｔ、６０％Ｔ、５５％Ｔ、５０％Ｔまたは４５％Ｔ以下であってよい。
【００９４】
別のクラスのアダプターオリゴヌクレオチドは、式５’Ｘａ−ＵＵＵＵＵ−Ｘｂ３’を含み、式中、ＸａおよびＸｂは独立に、いずれかのヌクレオチドであってよく、ＸａおよびＸｂは、存在しても存在しなくてもよい。ＸａおよびＸｂは、１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、１〜１００ヌクレオチド）を表す。オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド以上の長さであってよい。オリゴヌクレオチドは、６または７個以上の近接するＵを含んでよい。重要な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１７ヌクレオチドの長さであり、少なくとも１つのホスホロチオエート化したヌクレオチド間連結を有する（一部および完全にホスホロチオエート化した骨格を包含する）ｄＵホモポリマーである。
【００９５】
アダプターオリゴヌクレオチドは、実施形態に応じて、１００％Ｕ、９９％Ｕ、９８％Ｕ、９７％Ｕ、９６％Ｕ、９５％Ｕ、９４％Ｕ、９３％Ｕ、９２％Ｕ、９１％Ｕ、９０％Ｕ、８５％Ｕ、８０％Ｕ、７５％Ｕ、７０％Ｕ、６５％Ｕ、６０％Ｕ、５５％Ｕ、５０％Ｕまたは４５％Ｕ以下であってよい。
【００９６】
さらに別のクラスのアダプターオリゴヌクレオチドは、式５’Ｘａ−ＡＡＡＡＡ−Ｘｂ３’を含み、式中、ＸａおよびＸｂは独立に、いずれかのヌクレオチドであってよく、ＸａおよびＸｂは、存在しても存在しなくてもよい。ＸａおよびＸｂは、１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、１〜１００ヌクレオチド）を表す。オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド以上の長さであってよい。オリゴヌクレオチドは、６または７個以上の近接するＡを含んでよい。重要な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１７ヌクレオチドの長さであり、少なくとも１つのホスホロチオエート化したヌクレオチド間連結を有する（一部および完全にホスホロチオエート化した骨格を包含する）ｄＡホモポリマーである。
【００９７】
アダプターオリゴヌクレオチドは、実施形態に応じて、１００％Ａ、９９％Ａ、９８％Ａ、９７％Ａ、９６％Ａ、９５％Ａ、９４％Ａ、９３％Ａ、９２％Ａ、９１％Ａ、９０％Ａ、８５％Ａ、８０％Ａ、７５％Ａ、７０％Ａ、６５％Ａ、６０％Ａ、５５％Ａ、５０％Ａまたは４５％Ａ以下であってよい。
【００９８】
別のクラスのアダプターオリゴヌクレオチドは、式５’Ｃｎ−Ｔｍ−Ｃｐ３’を含み、式中、ｎは、０〜１００の範囲の整数（例えば、３〜７）であり、ｐは、０〜１００の範囲の整数（例えば、４〜８）であり、ｍは、０〜１００の範囲の整数（例えば、２〜１０）である。好ましくは、ｎとｐとの和が、ｍの値以下であり、したがって、Ｃの含有量が、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満以下である。いくつかの実施形態では、上記で言及したパーセントが満たされるならば、ｎは、３〜７の範囲であり、ｍは、２〜１０の範囲であり、ｐは、４〜８の範囲である。
【００９９】
脱塩基オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の骨格に類似し、核酸塩基（例えば、アデニン、シトシン、チミン、ウラシルおよびグアニン）、ならびに場合により、糖残基が存在しない。したがって、脱塩基オリゴヌクレオチドは、リン酸含有連結によって接続されている単位の高分子である。高分子性の脱塩基オリゴヌクレオチドの各単位が、少なくとも３つの炭素原子を含有する有機残基に共有結合により連結されているリン酸基またはそのチオエート化された誘導体を包含する。有機残基は、直鎖状または環状のいずれかの、飽和または不飽和のアルキル基を含み、これは、Ｏ、ＮおよびＳのヘテロ原子を含有してよく、さらに、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ハロゲンの原子およびいずれかのそれらの組合せを含有する置換基を包含してよい。
【０１００】
有機残基は、好ましくは、プロパン−１，３−ジオール、またはβ−Ｄ−デオキシリボフラノースもしくはβ−Ｄ−リボフラノース等の糖残基から誘導する。その他の残基は、ブタン−１，４−ジオール、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位（（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ、式中、ｐは、３または６である）、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１２のアミノリンカー等のヒドロキシル−アルキル−アミノリンカー、およびＣ３またはＣ６のチオールリンカー等のアルキルチオールリンカーを包含する。糖の誘導体はまた、ピラノース等の環の拡張も含有してよい。
【０１０１】
脱塩基オリゴヌクレオチドはまた、特に３’３’−連結を含むＤｏｕｂｌｅｒまたはＴｒｅｂｌｅｒの単位（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、バージニア州）も含有してよい。二倍化、三倍化またはその他の複数倍化の複数の単位によるオリゴヌクレオチドの分枝から、本発明のさらなる実施形態であるデンドリマーも得られる。
【０１０２】
単位は、
【０１０３】
【化１】
2010504982.tif 000003
として表される脱塩基デオキシリボヌクレオチドであってよく、
式中、Ｒは、酸素、硫黄、メチルまたはＯ−アルキルを表す。
【０１０４】
単位は、
【０１０５】
【化２】
2010504982.tif 000004
として表される脱塩基リボヌクレオチドであってよく、
式中、Ｒは、酸素、硫黄、メチルまたはＯ−アルキルを表す。
【０１０６】
単位は、
【０１０７】
【化３】
2010504982.tif 000005
として表されるＣ３のスペーサー／リン酸であってよく、
式中、Ｒは、酸素、硫黄、メチルまたはＯ−アルキルを表す。
【０１０８】
脱塩基オリゴヌクレオチドは、脱塩基デオキシリボヌクレオチドのホモポリマー（ポリ−Ｄ）である場合がある。この実施形態の各単位は、脱塩基２’−デオキシリボースの糖残基および５’リン酸基を包含する。別の実施形態では、脱塩基オリゴヌクレオチドは、脱塩基リボヌクレオチドのホモポリマーである。この実施形態の各単位は、脱塩基２’−ヒドロキシリボースの糖残基および５’リン酸基を包含する。別の実施形態では、脱塩基オリゴヌクレオチドは、脱塩基リボヌクレオチドおよび脱塩基デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーである。
【０１０９】
本発明による有用な免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、修飾された骨格を有することができる。例えば、それらは、リン酸ジエステルの連結ではない、少なくとも１つのヌクレオチド間連結を含んでよい。そのような連結は、ホスホロチオエートの連結であってよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、キメラ骨格（すなわち、少なくとも２つの異なる型のヌクレオチド間連結からなる骨格）を有してよい。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、「ホスホロチオエート骨格」という用語は、非架橋性のリン酸の酸素が少なくとも１つのヌクレオチド間連結において硫黄によって置換されている、オリゴヌクレオチドの安定化された糖リン酸骨格を指す。一実施形態では、非架橋性のリン酸の酸素が、ありとあらゆるヌクレオチド間連結において硫黄によって置換されている。
【０１１１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然のＲＮＡおよびＤＮＡと比較して、リン酸ジエステルのヌクレオシド間の架橋、β−Ｄ−リボース単位および／または天然のヌクレオシド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）が関与する、種々の化学的な修飾および置換を含有することができる。化学的修飾の例は、当業者には既知であり、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ＆  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ  １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴら（１９９６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３６：１０７−２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊら（１９９５）Ｍｏｄ  Ｓｙｎｔｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：３３１−４１７に記載されている。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を有することができ、各修飾は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡからなる同一配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のリン酸ジエステルのヌクレオシド間の架橋に、および／または特定のβ−Ｄ−リボース単位に、および／または特定の天然のヌクレオシド塩基の位置に位置する。
【０１１２】
例えば、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を包含することができ、各修飾は独立に、
ａ）修飾されたヌクレオシド間の架橋による、ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルのヌクレオシド間の架橋の置換、
ｂ）デホスホ架橋による、ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するリン酸ジエステル架橋の置換、
ｃ）別の単位による、糖リン酸骨格からの糖リン酸単位の置換、
ｄ）修飾された糖単位による、β−Ｄ−リボース単位の置換、ならびに
ｅ）修飾されたヌクレオシド塩基による、天然のヌクレオシド塩基の置換
から選択される。
【０１１３】
オリゴヌクレオチドの化学的修飾に関するより詳細な例が、以下に続く。
【０１１４】
オリゴヌクレオチドは、上記のａまたはｂに記載したもの等の修飾されたヌクレオチド間連結を包含することができる。これらの修飾された連結は、分解に対して部分的に抵抗性であり得る（例えば、安定化されている）。「安定化されたオリゴヌクレオチド分子」は、そのような修飾の結果として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）分解に対して比較的抵抗性であるオリゴヌクレオチドを意味するものとする。ホスホロチオエートの連結を有するオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、最大の活性を提供し、細胞内のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護することができる。
【０１１５】
ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルのヌクレオシド間の架橋は、修飾されたヌクレオシド間の架橋で置換することができ、修飾されたヌクレオシド間の架橋は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ１Ｒ２−ホスホロアミド酸、ボラノホスフェート、α−ヒドロキシベンジルホスホネート、ホスフェート−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート−［（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール−（Ｃ１〜Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルホスホネートおよび／または（Ｃ６〜Ｃ１２）アリールホスホネートの架橋、（Ｃ７〜Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチル−アリール（例えば、ＷＯ９５／０１３６３に開示）から選択され、（Ｃ６〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２０）アリールおよび（Ｃ６〜Ｃ１４）アリールは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノで置換されていてもよく、Ｒ１およびＲ２は、相互に独立に、水素、（Ｃ１〜Ｃ１８）−アルキル、（Ｃ６〜Ｃ２０）−アリール、（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルおよび／またはメトキシエチルであるか、Ｒ１とＲ２とが一緒になって、それらを担う窒素原子と共に、Ｏ、ＳおよびＮの基からのさらなるヘテロ原子をさらに含有することができる５〜６員の複素環を形成する。
【０１１６】
リン酸ジエステル架橋の、デホスホ架橋による置換が、ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置し（デホスホ架橋は、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  ＥおよびＰｅｙｍａｎ  Ａ  ｉｎ「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌ．２０、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ  １９９３、Ｃｈａｐｔｅｒ  １６、ｐｐ．３５５  ｆｆに記載されている）、デホスホ架橋は、例えば、ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチル−ヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよび／またはシリル基のデホスホ架橋から選択される。
【０１１７】
糖リン酸骨格からの糖リン酸単位（すなわち、β−Ｄ−リボースとリン酸ジエステルのヌクレオシド間の架橋とが一緒になって形成する糖リン酸単位）（すなわち、糖リン酸骨格は、糖リン酸単位からなる）は、別の単位で置換することができ、その他の単位は、例えば、「モルホリノ−誘導体」オリゴマー（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ  ＥＰら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：６１２９−４１に記載されているもの）を作り上げる場合、すなわち、例えば、モルホリノ−誘導体単位による置換に；またはポリアミド核酸（「ＰＮＡ」；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ５：３−７に記載されているもの）を作り上げる場合、すなわち、例えば、ＰＮＡ骨格単位、例えば、２−アミノエチルグリシンによる置換に適切である。オリゴヌクレオチドは、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーをもつ骨格区域を有するオリゴヌクレオチド等のその他の炭水化物骨格による修飾および置換を有することもできる。アルキルリンカーは、分枝していても分枝していなくてもよく、置換されていても置換されていなくてもよく、かつキラルに純粋であってもラセミ混合物であってもよい。
【０１１８】
β−リボース単位またはβ−Ｄ−２’−デオキシリボース単位は、修飾された糖単位で置換することができ、修飾された糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボース、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−ピラノース、ならびに炭素環（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ（１９９２）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１４：８３２０に記載されている）および／または開鎖の糖類似体（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：７２２３に記載されている）および／または二環糖類似体（例えば、Ｔａｒｋｏｖ  Ｍら（１９９３）Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ７６：４８１に記載されている）から選択される。いくつかの実施形態では、修飾された糖は、２’修飾リボースである。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、糖は、２’−Ｏ−メチルリボース、具体的には、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオシド間の連結によって連結されている１つまたは両方のヌクレオチドに関するものである。
【０１２０】
核酸はまた、Ｃ−５プロピンピリミジンおよび７−デアザ−７−置換プリン修飾塩基等の置換されているプリンおよびピリミジンも包含する。Ｗａｇｎｅｒ  ＲＷら（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４０−４。プリンおよびピリミジンは、これらに限定されないが、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン、ならびに他の天然に存在するおよび天然には存在しない核酸塩基、置換および未置換の芳香族部分を包含する。
【０１２１】
修飾された塩基は、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＡおよびＵ等のＤＮＡおよびＲＮＡ中に典型的に見出される天然に存在する塩基とは化学的に区別されるが、これら天然に存在する塩基と基本的な化学構造を共有するいずれかの塩基である。修飾されたヌクレオシド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノ−プリン、８−アザプリン、置換されている７−デアザプリン、好ましくは、７−デアザ−７−置換および／もしくは７−デアザ−８−置換プリン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、例えば、Ｎ４−エチルシトシン、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン、例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン、６−チオデオキシグアノシン、ならびにニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド、Ｃ５−プロピニルピリミジン、ならびにジアミノプリン、例えば、２，６−ジアミノプリン、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、または天然のヌクレオシド塩基のその他の修飾から選択することができる。このリストは、例示的な意味をもち、限定するものであるとは解釈しない。
【０１２２】
本明細書に記載する特定の式中に、修飾された塩基を組み込むことができる。例えば、シトシンは、修飾されたシトシンで置換することができる。本明細書で使用する修飾されたシトシンは、オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を損なうことなくこの塩基を置換することができる、シトシンの天然に存在するまたは天然には存在しないピリミジン塩基の類似体である。修飾されたシトシンは、これらに限定されないが、５−置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシンおよび未置換または置換の５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン（ｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、シュードイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏ−ｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、縮合環系を有するシトシン類似体（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）、ならびにウラシルおよびその誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）を包含する。好ましいシトシンのうちのいくつかは、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシンおよびＮ４−エチル−シトシンを包含する。本発明の別の実施形態では、シトシン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基）、芳香環系（例えば、フルオロベンゼンもしくはジフルオロベンゼン）または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）によって置換されている。
【０１２３】
グアニンは、修飾されたグアニン塩基で置換することができる。本明細書で使用する修飾されたグアニンは、オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性を損なうことなくこの塩基を置換することができる、グアニンの天然に存在するまたは天然には存在しないプリン塩基の類似体である。修飾されたグアニンは、これらに限定されないが、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン等）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換されているアデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）、８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）、ならびに６−チオグアニンを包含する。本発明の別の実施形態では、グアニン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドールおよびＫ−塩基）、芳香環系（例えば、ベンズイミダゾールもしくはジクロロ−ベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）によって置換されている。
【０１２４】
本発明における使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知のいくつかの手順のうちのいずれか、例えば、β−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９）；またはヌクレオシドＨホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５１−４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ＢＣら（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４：５３９９−４０７；Ｇａｒｅｇｇら（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５５−８；Ｇａｆｆｎｅｙら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９：２６１９−２２）を使用して新規に合成することができる。これらの化学反応は、市場で入手可能な多様な自動化核酸合成機によって実施することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。単離したオリゴヌクレオチドは、一般に、天然においては通常であれば結合している構成成分から分離したオリゴヌクレオチドと呼ばれる。例として、単離したオリゴヌクレオチドは、細胞、核、ミトコンドリアまたはクロマチンから分離したオリゴヌクレオチドであってよい。
【０１２５】
ホスホロチオエート等の修飾された骨格は、ホスホラミダイトまたはＨホスホネートのいずれかの化学反応を利用する自動化された技術を使用して合成することができる。アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートは、例えば米国特許第４，４６９，８６３号の記載に従って作製でき；（米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されているように、荷電した酸素部分がアルキル化されている）アルキルホスホトリエステルは、自動化固相合成によって市販の試薬を使用して調製することができる。ＤＮＡ骨格のその他の修飾および置換を作製するための方法も記載されている（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １：１６５）。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ソフトまたはセミソフトなオリゴヌクレオチドであってよい。ソフトなオリゴヌクレオチドは、部分的に安定化された骨格を有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドであり、この場合、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結が、少なくとも１つの内部ピリミジン−プリンジヌクレオチド（ＹＺ）の内部およびその直近においてのみ生じる。好ましくは、ＹＺはＹＧ、すなわち、ピリミジン−グアノシン（ＹＧ）ジヌクレオチドである。当該の少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチド自体が、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結を有する。当該の少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドの直近において生じるリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結は、当該の少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドに対して、５’であっても、３’であっても、または５’および３’の両方であってもよい。
【０１２７】
具体的には、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結には、「内部ジヌクレオチド」が関与する。内部ジヌクレオチドは、一般に、ヌクレオチド間連結によって接続されている隣接したヌクレオチドのいずれかの対を意味するものとし、この場合、ヌクレオチド対中のいずれのヌクレオチドも末端のヌクレオチドではない、すなわち、ヌクレオチド対中のいずれのヌクレオチドもオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端を画定するヌクレオチドではない。したがって、ｎヌクレオチドの長さである直鎖状のオリゴヌクレオチドは、合計ｎ−１ジヌクレオチドおよびわずかｎ−３内部ジヌクレオチドを有する。内部ジヌクレオチド中のそれぞれのヌクレオチド間連結は、内部ヌクレオチド間連結である。したがって、ｎヌクレオチドの長さである直鎖状のオリゴヌクレオチドは、合計ｎ−１ヌクレオチド間連結およびわずかｎ−３内部ヌクレオチド間連結を有する。したがって、戦略的に置いたリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結は、核酸配列中のヌクレオチドのいずれかの対間に位置付けられたリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結を指す。いくつかの実施形態では、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結は、５’末端または３’末端に最も近いヌクレオチドのいずれの対間にも位置付けられていない。
【０１２８】
好ましくは、少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドの直近において生じるリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結は、それ自体が内部ヌクレオチド間連結である。したがって、式中、Ｎ１およびＮ２がそれぞれ相互に独立にいずれかの単一のヌクレオチドである、配列Ｎ１ＹＺＮ２の場合、ＹＺジヌクレオチドは、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結を有し、さらに、（ａ）Ｎ１が内部のヌクレオチドである場合、Ｎ１とＹとは、リン酸ジエステルもしくはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結される、（ｂ）Ｎ２が内部のヌクレオチドである場合、ＺとＮ２とは、リン酸ジエステルもしくはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結される、または（ｃ）Ｎ１が内部のヌクレオチドである場合、Ｎ１とＹとは、リン酸ジエステルもしくはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結され、かつＮ２が内部のヌクレオチドである場合、ＺとＮ２とは、リン酸ジエステルもしくはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結によって連結される。
【０１２９】
本発明によるソフトなオリゴヌクレオチドは、完全に安定化されたオリゴヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼの切断に比較的感受性であると考えられている。特定の理論にも機構にも拘束されることを意味しないが、本発明のソフトなオリゴヌクレオチドは、完全長のソフトなオリゴヌクレオチドと比較して免疫賦活活性が低下したまたはそれを有しない断片に切断可能であると考えられている。少なくとも１つのヌクレアーゼ感受性のヌクレオチド間連結の、特に、オリゴヌクレオチドの中央付近への組込みは、オリゴヌクレオチドの薬物動態を変化させ、その結果、オリゴヌクレオチドの最大の免疫賦活活性の持続期間を短縮させる「切のスイッチ」を提供すると考えられている。このことは、慢性的な局所の炎症または免疫賦活に関係がある損傷を回避することが望まれる、組織および臨床適用、例えば、腎臓においてとりわけ価値がある場合がある。
【０１３０】
セミソフトなオリゴヌクレオチドは、部分的に安定化された骨格を有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドであり、この場合、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結が、少なくとも１つの内部ピリミジン−プリン（ＹＺ）ジヌクレオチドの内部においてのみ生じる。セミソフトなオリゴヌクレオチドは、一般に、対応する完全に安定化された免疫賦活性オリゴヌクレオチドと比較して向上した免疫賦活効力を所有する。セミソフトなオリゴヌクレオチドのより大きな効力によって、セミソフトなオリゴヌクレオチドは、場合によっては、所望の生物学的効果を達成するために、従来からの完全に安定化された免疫賦活性オリゴヌクレオチドよりも、低い有効濃度で使用することおよび低い有効投与量を有することができる。
【０１３１】
一般に、内部ＹＺジヌクレオチドが関与するリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結の「用量」の増加と共に、セミソフトなオリゴヌクレオチドの前述の特性が増加すると考えられている。したがって、例えば、一般に、５つの内部ＹＺジヌクレオチドを有する所与のオリゴヌクレオチド配列の場合、５つの内部のリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のＹＺヌクレオチドの間の連結を有するオリゴヌクレオチドは、４つの内部のリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のＹＧヌクレオチドの間の連結を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫賦活性に優り、これは、次いで、３つの内部のリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のＹＺヌクレオチドの間の連結を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫賦活性に優り、これは、次いで、２つの内部のリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のＹＺヌクレオチドの間の連結を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫賦活性に優り、これは、次いで、１つの内部のリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のＹＺヌクレオチドの間の連結を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫賦活性に優ると考えられている。重要なことには、１つの内部のリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のＹＺヌクレオチドの間の連結の包含でさえ、内部のリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のＹＺヌクレオチドの間の連結がない場合より有利であると考えられている。リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結の数に加えて、核酸の長さに沿った位置も、効力に影響を及ぼすことができる。
【０１３２】
ソフトなオリゴヌクレオチドおよびセミソフトなオリゴヌクレオチドは、一般に、好ましい内部の位置におけるリン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結に加えて、分解に対して抵抗性である５’末端および３’末端を包含する。そのような分解に対して抵抗性の末端には、対応する未修飾の末端と比べエキソヌクレアーゼ消化に対する向上した抵抗性をもたらすいずれかの適切な修飾が関与することができる。例えば、５’末端および３’末端は、そこに、少なくとも１つのリン酸による骨格の修飾を包含することによって安定化させることができる。好ましい実施形態では、各末端における当該の少なくとも１つのリン酸による骨格の修飾は独立に、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートまたはメチルホスホロチオエートのヌクレオチド間連結である。別の実施形態では、分解抵抗性の末端は、３’末端においてペプチドまたはアミドの連結によって接続されている１つまたは複数のヌクレオチド単位を包含する。
【０１３３】
リン酸ジエステルのヌクレオチド間連結は、天然に見出される核酸に特徴的な型の連結である。図２０に示すように、リン酸ジエステルのヌクレオチド間連結は、２つの架橋酸素原子が隣接し、一方は荷電し、かつ他方は荷電していない、２つの追加の酸素原子も結合するリン原子を包含する。リン酸ジエステルのヌクレオチド間連結は、オリゴヌクレオチドの組織半減期を短縮させるのが重要である場合に、特に好ましい。
【０１３４】
リン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結は、化学的におよび／またはジアステレオ異性の面でリン酸ジエステルに類似するリン含有架橋基である。リン酸ジエステルに対する類似性の尺度は、ヌクレアーゼ消化に対する感受性およびリボヌクレアーゼＨを活性化する能力を包含する。したがって、例えば、ホスホロチオエートではなくリン酸ジエステルのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対して感受性であり、一方、リン酸ジエステルのオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートのオリゴヌクレオチドの両方が、リボヌクレアーゼＨを活性化する。好ましい実施形態では、リン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結は、ボラノホスフェート（またはボラノホスホネートに等しい）の連結である。米国特許第５，１７７，１９８号；第５，８５９，２３１号；第６，１６０，１０９号；第６，２０７，８１９号；Ｓｅｒｇｕｅｅｖら（１９９８）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２０：９４１７−２７。別の好ましい実施形態では、リン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結は、ジアステレオ異性の面で純粋なＲｐホスホロチオエートである。ジアステレオ異性の面で純粋なＲｐホスホロチオエートは、混合性のまたはジアステレオ異性の面で純粋なＳｐホスホロチオエートよりも、ヌクレアーゼ消化に対して感受性であり、リボヌクレアーゼＨを活性化するのに優ると考えられている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体は、同時係争中の１９９９年７月２７日出願の米国特許出願第０９／３６１，５７５号および公開されたＰＴＣ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７１００（ＷＯ００／０６５８８）の対象である。本発明の目的では、「リン酸ジエステル様のヌクレオチド間連結」という用語は、ホスホロジチオエートおよびメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を具体的に除外することに注目されたい。
【０１３５】
上記したように、本発明のソフトなオリゴヌクレオチドおよびセミソフトなオリゴヌクレオチドは、ＣとＧとの間にリン酸ジエステル様の連結を有することができる。リン酸ジエステル様の連結の一例が、Ｒｐ立体配座のホスホロチオエートの連結である。オリゴヌクレオチドのｐ−キラリティーは、活性を測定する時点に依存して、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫活性に対して明らかに反対の効果を有することができる。マウス脾臓細胞においては、４０分の早期の時点では、ホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチドのＳｐではなくＲｐの立体異性体が、ＪＮＫのリン酸化を誘発する。それに対して、４４時間の後期の時点でアッセイすると、ＲｐではなくＳｐの立体異性体が、脾臓細胞の増殖を賦活する点で活性である。Ｒｐ立体異性体およびＳｐ立体異性体の動態および生物活性におけるこの差は、細胞の取込みの何らかの差の結果ではなく、むしろ、ｐ−キラリティーの２つの対立する生物学的役割による可能性が大きい。最初、早期の時点におけるＳｐ立体異性体と比較してＲｐ立体異性体の免疫細胞を賦活する増強された活性は、Ｒｐが、ＣｐＧ受容体であるＴＬＲ９と相互作用する点または下流のシグナル伝達経路を誘発する点でより有効である可能性があることを示す。他方、Ｓｐと比較してＲｐのＰＳ−オリゴヌクレオチドのより迅速な分解は、シグナル伝達のはるかにより短い持続期間をもたらし、その結果、より後期の時点において試験すると、ＳｐのＰＳ−オリゴヌクレオチドが、より生物学的に活性であるように見える。
【０１３６】
驚くべき強力な効果が、ＣｐＧジヌクレオチド自体のｐ−キラリティーによって達成される。ステレオ−ランダムなＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較して、単一のＣｐＧジヌクレオチドがＲｐ中に連結されている類似物は、若干より活性であり、一方、Ｓｐの連結を含有する類似物は、脾臓細胞の増殖の誘発についてほとんど不活性であった。
【０１３７】
本発明の前述の態様のそれぞれにおいて、組成物はまた、薬学的に許容できる担体をさらに包含することができ、それによって、本発明はまた、本発明のＴＬＲのリガンドと抗ウイルス剤とを含有する医薬組成物も提供することができる。
【０１３８】
本発明の組成物はまた、対象のウイルス性状態の治療における使用のための医薬品の調製のために使用することもできる。本発明のこの態様による使用は、有効量の本発明の組成物を薬学的に許容できる担体中に置くステップが関与する。
【０１３９】
特定の実施形態では、ＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤は単離されている。単離された分子は、分子の意図する使用に実用的かつ適切な程度に、実質的に純粋であり、天然またはｉｎ  ｖｉｖｏ系において通例見出されるその他の物質が存在しない分子である。具体的には、薬剤は、十分に純粋であり、細胞のその他の生物学的構成物が十分に存在せず、したがって、例えば、医薬調製物を生成するのに有用である。本発明の単離された薬剤は、医薬調製物中で薬学的に許容できる担体と混合し得るので、薬剤（複数の薬剤）は、調製物中のごくわずかな重量パーセントに限って含むことができる。にもかかわらず、薬剤は、生物系においては結合することができる物質から実質的に分離するように単離される。
【０１４０】
本明細書で使用する場合、「抗ウイルス剤」は、ウイルスの細胞への感染またはウイルスの細胞内部における複製を阻止する化合物である。多くの抗ウイルス性の薬物があるが、その数は、抗細菌性の薬物よりは少ない。これは、ウイルスの複製過程が、宿主細胞内部のＤＮＡの複製と非常に密接に関係しており、非特異的な抗ウイルス剤が、しばしば、宿主に対して毒性を示すことがあることによる。抗ウイルス剤が遮断または阻害することができる、ウイルス感染の過程内にいくつかの段階がある。これらの段階は、ウイルスの宿主細胞への付着（免疫グロブリンまたは結合性ペプチド）、ウイルスの脱外被（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えば、インターフェロン）、ウイルスのＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオシド類似体）、新しいウイルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼ阻害剤）、ならびにウイルスの出芽および放出を包含する。
【０１４１】
ヌクレオシド類似体は、ヌクレオチドに類似するが、不完全または異常なデオキシリボース基またはリボース基を有する合成化合物である。ヌクレオチド類似体が細胞に入ると、リン酸化されて、正常なヌクレオチドとウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡへの組込みにおいて競合する三リン酸の形態が産生される。ヌクレオチド類似体の三リン酸の形態が、成長しつつある核酸の鎖内に組み込まれると、ウイルスのポリメラーゼと不可逆的な結合を引き起こし、それによって、鎖の終わりが生じる。ヌクレオチド類似体は、これらに限定されないが、アシクロビル（単純疱疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスの治療のために使用される）、ガンシクロビル（サイトメガロウイルスの治療に有用である）、イドクスウリジン、リバビリン（呼吸器多核体ウイルスの治療に有用である）、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジンならびにジドブジン（アジドチミジン）を包含する。
【０１４２】
インターフェロンは、ウイルス感染細胞および免疫細胞が分泌するサイトカインである。インターフェロンは、感染細胞に隣接した細胞上の特異的な受容体に結合して、細胞をウイルスによる感染から保護する変化を細胞中に引き起こすことによって機能する。αおよびβ−インターフェロンはまた、感染細胞の表面上のクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子の発現も誘発し、その結果、宿主免疫細胞認識のための抗原提示が増加する。αおよびβ−インターフェロンは、組換えの形態として利用可能であり、慢性のＢ型肝炎およびＣ型肝炎の感染の治療のために使用されている。抗ウイルス療法に有効である投与量では、インターフェロンは、発熱、倦怠および体重減少等の重度の副作用を有する。
【０１４３】
いくつかの米国特許が、抗ウイルス化合物を記載している。例えば米国特許第７，０９４，７６８号は、ＨＣＶを治療するための−ヒドロキシアミノ−または６−アルコキシアミノ−７−デアザプリン−リボフラノース誘導体を記載しており；米国特許第７０４１６９８号は、ＨＣＶを治療するためのトリペプチドの化合物、組成物および方法を記載しており；米国特許第６，９９５，１７４号は、ＨＣＶ阻害剤を記載しており；米国特許第７，０２２，７３６号は、ジケト酸（Ｄｉｋｅｔｏａｃｉｄ）をウイルス阻害剤として記載しており；米国特許第６，９０９，０００号は、架橋二環ＨＣＶ  ＮＳ３−ＮＳ４Ａセリンプロテアーゼ阻害剤を記載しており；米国特許第６，８６７，１８５号は、大環状のＨＣＶ阻害剤を記載しており；米国特許第６，８６９，９６４号は、複素環スルホンアミドＨＣＶ阻害剤を記載しており；米国特許第６，８４６，８１０号は、抗ウイルス性ヌクレオシド誘導体を記載しており；かつ公開ＰＣＴ第ＷＯ０２４８１５７号は、イミダゾリジノン類およびそれらの関連誘導体をＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤として記載している。
【０１４４】
ウイルスの宿主細胞への侵入を遮断するいくつかの薬物が、開発されているか開発途上にある。これらは、インフルエンザに対して使用されるアマンタジンおよびリマンタジン；ライノウイルス、エンテロウイルス、髄膜炎、結膜炎および脳炎の治療のためのプレコナリルを包含する。
【０１４５】
上記で言及したように、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの類似体は、ウイルスが細胞に侵入した後のウイルス構成成分を合成する過程を標的にするクラスの薬物である。アシクロビルは、ヘルペスウイルス感染に対して有効であるヌクレオシド類似体である。ＨＩＶを治療するためのジドブジン（ＡＺＴ）も、ヌクレオシド類似体である。ラミブジンは、Ｂ型肝炎を治療するために使用され、Ｂ型肝炎は、逆転写酵素をその複製過程の一部として使用する。
【０１４６】
開発途上のその他の抗ウイルス剤は、リボヌクレアーゼＨおよびインテグラーゼの標的、リボザイムに基づいた化合物、プロテアーゼ阻害剤、ならびにインフルエンザの治療のためのザナミビルおよびオセルタミビル等、宿主細胞からのウイルスの放出を妨害する薬物を包含する。
【０１４７】
現在使用されている抗ウイルス剤の例を、以下に包含する。
【０１４８】
ＨＩＶおよび慢性Ｂ型肝炎の治療のために使用されるラミブジン（２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン、３ＴＣ）は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅからＥｐｉｖｉｒ（登録商標）およびＥｐｉｖｉｒ−ＨＢＶ（登録商標）の商標名で市販されている逆転写酵素阻害剤である。これはまた、３ＴＣとも呼ばれる。これは、シチジンの類似体である。
【０１４９】
アバカビル（ＡＢＣ）は、ＨＩＶおよびＡＩＤＳの治療のために使用されるヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＡＲＴＩ）である。これは、Ｚｉａｇｅｎ（商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、さらに複合薬、Ｔｒｉｚｉｖｉｒ（商標）（アバカビル、ジドブジンおよびラミブジン）ならびにＫｉｖｅｘａ（登録商標）／Ｅｐｚｉｃｏｍ（商標）（アバカビルおよびラミブジン）の商号で入手可能である。ＡＢＣは、グアノシン（プリン）の類似体である。その標的は、ウイルスの逆転写酵素である。
【０１５０】
アシクロビル（ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）（ＩＮＮ）またはアシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（ＵＳＡＮ）は、化学名はアシクログアノシンであり、例えば、単純疱疹ウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）、単純疱疹ウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の治療のために使用されるグアニン類似体抗ウイルス薬である。これは、最も一般的に使用される抗ウイルス薬の１つであり、Ｚｏｖｉｒａｘ（ＧＳＫ）の商号で最も一般的に市販されている。アシクロビルは、部分的なヌクレオシド構造のみを含有する、すなわち、糖の環が開鎖構造によって置換されている点で、以前のヌクレオシド類似体とは異なる。アシクロ−ＧＴＰは、ウイルスのＤＮＡポリメラーゼの非常に効力のある阻害剤である。
【０１５１】
アマンタジン（１−アミノアダマンタン、Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ（登録商標）として販売されている）は、インフルエンザウイルスＡの治療のための抗ウイルス薬である。
【０１５２】
ジダノシン（２’−３’−ジデオキシイノシン、ｄｄＩ）は、Ｖｉｄｅｘ（登録商標）およびＶｉｄｅｘ  ＥＣ（登録商標）の商号で販売されている。これは、ＨＩＶに対して有効な逆転写酵素阻害剤であり、高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）の一部として、その他の抗レトロウイルス剤療法と組み合わせて使用される。ジダノシン（ｄｄＩ）は、糖の環に結合したヒポキサンチンを有するアデノシンのヌクレオシド類似体である。
【０１５３】
商号Ｅｍｔｒｉｖａ（登録商標）（かつては、Ｃｏｖｉｒａｃｉｌ）を有するエムトリシタビン（ＦＴＣ）は、成人のＨＩＶ感染の治療のためのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）である。エムトリシタビンは、シチジンの類似体である。
【０１５４】
エンフビルチド（ＩＮＮ）は、Ｆｕｚｅｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）の商号で市販されている、ＨＩＶ融合阻害剤である。
【０１５５】
エンテカビルは、Ｂａｒａｃｌｕｄｅ（ＢＭＳ）の商号で市販されている、Ｂ型肝炎感染の治療において使用される経口抗ウイルス薬である。エンテカビルは、ウイルス複製過程のすべての３つのステップを阻害するグアニン類似体である。
【０１５６】
ガンシクロビルは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を治療または予防するために使用される抗ウイルス性の薬物である。ガンシクロビルは、２’−デオキシ−グアノシンの合成類似体である。
【０１５７】
ネビラピンは、またＶｉｒａｍｕｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）の商号で市販されてもおり、ＨＩＶ−１感染およびＡＩＤＳを治療するために使用される非ヌクレオシドの逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）であるが、プロテアーゼ阻害剤である。
【０１５８】
オセルタミビルは、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢの両方の治療および予防において使用される抗ウイルス薬である。これは、インフルエンザノイラミニダーゼの移行期の類似体阻害剤として作用するノイラミニダーゼ阻害剤であり、新しいウイルスが感染細胞から出現するのを阻止する。オセルタミビルは、インフルエンザＡおよびＢのウイルスによる感染ならびにイヌパルボウイルス、ネコ汎白血球減少、「ケネルコフ（ｋｅｎｎｅｌ  ｃｏｕｇｈ）」として知られるイヌ呼吸器症候群（ｃａｎｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、および「イヌインフルエンザ（ｃａｎｉｎｅ  ｆｌｕ）」と呼ばれる新興疾患の治療に適応される。
【０１５９】
リバビリン（Ｃｏｐｅｇｕｓ（登録商標）；Ｒｅｂｅｔｏｌ（登録商標）；Ｒｉｂａｓｐｈｅｒｅ（登録商標）；Ｖｉｌｏｎａ（登録商標）、Ｖｉｒａｚｏｌｅ（登録商標）、さらに、Ｓａｎｄｏｚ、Ｔｅｖａ、Ｗａｒｒｉｃｋからの後発品）は、多くのＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスに対して活性を示す抗ウイルス薬である。これは、ウイルスの遺伝子材料の複製を妨害するヌクレオシド抗代謝薬のメンバーである。リバビリンは、インフルエンザ、フラビウイルスおよび多くのウイルス性の出血熱の病原体、Ｃ型肝炎、呼吸器多核体ウイルス関連の疾患およびインフルエンザに対する重要な活性をはじめとする、広い範囲の活性を有する。一実施形態では、リバビリンを、ＣｐＧ  ＯＤＮまたはＣｐＧ  ＯＲＮ等のＴＬＲ７、８、９のリガンドと共に投与すると、ＴＬＲのリガンドの結果として産生されたＩＦＮ−アルファと比較してＩＬ−１０の量が低下する。
【０１６０】
ＡＩＣＡ−リボシドは、リバビリンに類似する抗ウイルス薬である。一実施形態では、ＡＩＣＡ−リボシドを、ＣｐＧ  ＯＤＮまたはＣｐＧ  ＯＲＮ等のＴＬＲ７、８、９のリガンドと共に投与すると、ＴＬＲのリガンドの結果として産生されたＩＦＮ−アルファと比較してＩＬ−１０の量が低下する。
【０１６１】
リマンタジンは、商号はＦｌｕｍａｄｉｎｅ（登録商標）であり、インフルエンザＡ感染を、治療およびまれに予防するために使用される経口投与の薬物である。
【０１６２】
スタブジン（２’−３’−ジデヒドロ−２’−３’−ジデオキシチミジン、ｄ４Ｔ、商標名Ｚｅｒｉｔ（登録商標））は、ＨＩＶに対して活性を示す、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＡＲＴＩ）である。スタブジンは、チミジンの類似体である。
【０１６３】
バラシクロビル（ｖａｌａｃｉｃｌｏｖｉｒ）（ＩＮＮ）またはバラシクロビル（ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（ＵＳＡＮ）は、単純疱疹および帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ（ｓｈｉｎｇｌｅｓ））の管理において使用される抗ウイルス薬である。
【０１６４】
ビダラビンは、単純疱疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスに対して活性を示す抗ウイルス薬である。ビダラビン（９−β−Ｄ−リボフラノシルアデニン）は、Ｄ−アラビノースで置換したＤ−リボース糖を有するアデノシンの類似体である。
【０１６５】
ザルシタビン（２’−３’−ジデオキシシチジン、ｄｄＣ）は、ジデオキシシチジンとも呼ばれ、Ｈｉｖｉｄ（登録商標）の商号で販売されている、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＡＲＴＩ）である。ザルシタビンは、ピリミジンの類似体である。
【０１６６】
本発明のいくつかの態様では、ヌクレオシド類似体等の抗ウイルス剤を、免疫賦活性オリゴヌクレオチド中に、オリゴヌクレオチド合成の間に、３’末端または５’末端等の分子上の１つまたは種々の位置において組み込むことができる。これはまた、ヌクレオシド類似体（複数のヌクレオシド類似体）の側におけるヌクレアーゼ感受性部位の組込みも包含することができ、投与後の抗ウイルス化合物の切断を可能にして、免疫賦活性オリゴヌクレオチドに依存しないその抗ウイルス活性を可能にする。抗ウイルス剤はまた、その他の連結（例えば、３’−３’）またはリンカー（例えば、非ヌクレオチドのリンカー）によって、免疫を賦活するＯＮに連結することもできる。
【０１６７】
その上、１つの分子内への異なるＴＬＲに対するリガンドのコンジュゲーションによって、増強された免疫賦活またはいずれかの単一のそのようなリガンドから得られる免疫賦活プロフィールとは異なる免疫賦活プロフィールをもたらす受容体の多量体化を導くことができる。
【０１６８】
本発明は、抗ウイルス剤に連結しているＴＬＲのリガンドを包含する組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「連結している」という用語は、何らかの物理化学的な相互作用によって、直接的または間接的に、一緒になって連結している２つ以上の構成成分部分のいずれかの組合せを指す。一実施形態では、連結は、共有結合によって、直接的または間接的に、一緒になって連結している２つ以上の構成成分部分の組合せである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＴＬＲのリガンドは、抗ウイルス剤と一緒にではあるが、それらとは物理的に分離して投与することができる。しかし、その他の実施形態では、リガンド−抗ウイルス剤コンジュゲートを企図する。
【０１６９】
リンカーは、これらに限定されないが、骨格のリン酸基または糖のヒドロキシル基をはじめとする、オリゴヌクレオチド上のいずれかの反応性部分に結合させることができる。例えば、リンカーは、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよび／またはアミドの連結を介して組み込むことができる。異なる分子を、確立された方法によって合成し、固相合成の間にオンラインで一緒に連結することができる。別法として、個々の部分の配列の合成後に、それらを一緒に連結してもよい。
【０１７０】
リンカーは、その性質が非ヌクレオチドであってよい。非ヌクレオチドのリンカーは、例えば、脱塩基残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール（スペーサー９）もしくはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）等のオリゴエチレングリコール、またはブタンジオール等のアルカン−ジオールである。スペーサー単位は、好ましくは、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエートの結合によって連結する。リンカー単位は、分子中に１回のみ出現してもよいし、または例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートもしくはアミドの連結を介して何回か組み込んでもよい。さらに好ましいリンカーは、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１２のアミノリンカー等のアルキルアミノリンカー、およびまた、Ｃ３またはＣ６のチオールリンカー等のアルキルチオールリンカーである。オリゴヌクレオチドはまた、アルキル基または置換アルキル基でさらに置換することができる芳香族残基で連結してもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ＤｏｕｂｌｅｒまたはＴｒｅｂｌｅｒの単位を含有してもよく、これらによって、１つのまたは異なる型の複数のリガンドのオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションが可能になる。オリゴヌクレオチドはまた、ペプチド修飾試薬またはオリゴヌクレオチド修飾試薬（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓ．ｃｏｍ）から得られたリンカー単位を含有してもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（アミド）連結によって接続されている、１つまたは複数の天然のまたは天然ではないアミノ酸残基を含有してもよい。異なる型のリンカーを、新しいリンカーに組み合わせることもできる。異なるオリゴヌクレオチドを、確立された方法によって合成し、固相合成の間にオン−ラインで一緒に連結することができる。別法として、個々の部分の配列の合成後に、それらを一緒に連結してもよい。
【０１７１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＴＬＲのリガンドと抗ウイルス剤とが、同一分子の部分であるように連結している。ＴＬＲのリガンドは、抗ウイルス剤に、直接的にまたは非ヌクレオチドのリンカーを介して連結することができる。ＴＬＲのリガンドが、オリゴヌクレオチドに介在する構造がない状態で共有結合している場合には、ＴＬＲのリガンドは、「直接的に連結している」。ＴＬＲのリガンドが、オリゴヌクレオチドにリンカーを介して接続されている場合には、オリゴヌクレオチドは、「間接的に連結している」といわれる。
【０１７２】
オリゴヌクレオチドと抗ウイルス剤とを接続するリンカーは、ヌクレアーゼ感受性部位を含有することができる。本明細書で使用する「ヌクレアーゼ感受性部位」は、ヌクレアーゼとして知られる酵素のクラスのメンバーによって認識されて切断されるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ感受性部位は、標的細胞中に天然に存在するヌクレアーゼによって認識されて切断される。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤またはリンカーを、免疫賦活性オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドにコンジュゲートさせる。本明細書で使用する「内部ヌクレオチド」は、核酸高分子の３’または５’の最末端にはないヌクレオチドを指す。したがって、「末端のヌクレオチド」は、核酸高分子の３’末端または５’末端のいずれかのヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤またはリンカーを、末端のヌクレオチドにコンジュゲートさせる。本明細書で使用する場合、「３’末端のヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド高分子の３’の最末端のヌクレオチド残基を指す。同様に、「５’末端のヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド高分子の５’の最末端のヌクレオチド残基を指す。いくつかの実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、内部の３’−３’連結または５’−５’連結を含むことができる。そのような場合、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、それぞれ、２つの５’または３’の連結を有する。抗ウイルス剤が、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである場合、抗ウイルス剤も、３’−５’、３’−３’または５’−５’の連結を介して免疫賦活性オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせることができる。
【０１７４】
本発明のいくつかの態様では、ＴＬＲのリガンドと抗ウイルス剤とは連結されていないが、それらを微小粒子の構成で一緒に投与する。本明細書で使用する「微小粒子」は、哺乳動物レシピエントに対する埋込みまたは投与に適した生体適合性の微小粒子またはインプラントである。この方法に従う場合に有用である例示的な生体内分解性インプラントが、参照によって本明細書に組み込まれているＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７号（公開第ＷＯ９５／２４９２９号、標題「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ」）に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ／０３０７は、適切なプロモーターの制御下にある外因性の遺伝子を収容するための生体適合性、好ましくは、生体内分解性の高分子性マトリックスを記載している。この特許では、高分子性マトリックスを使用して、外因性の遺伝子の持続放出を達成することができる。
【０１７５】
高分子性マトリックスは、好ましくは、マイクロスフェア等の微小粒子（免疫賦活性オリゴヌクレオチドと１つもしくは複数の抗ウイルス剤とが、固体の高分子性マトリックス全体に分散している）またはマイクロカプセル（免疫賦活性オリゴヌクレオチドと１つもしくは複数の抗ウイルス剤とが、高分子性の殻の芯中に貯蔵されている）の形態である。免疫賦活性オリゴヌクレオチドと１つもしくは複数の抗ウイルス剤とを収容するための高分子性マトリックスのその他の形態は、薄膜、被覆、ゲル、インプラントおよびステントを包含する。高分子性マトリックスの装置の大きさおよび組成は、マトリックスを導入する組織において満足な放出の動態が得られるように選択される。高分子性マトリックスの大きさは、使用する送達方法、典型的には、組織内への注入または懸濁剤のエアロゾルによる鼻および／もしくは肺の領域内への投与に従ってさらに選択される。好ましくは、エアロゾルの経路を使用する場合、高分子性マトリックス、ならびに核酸、抗ウイルス剤および／またはアレルゲンは、界面活性剤のビヒクル中に包含される。高分子性マトリックスの組成は、マトリックスを、損傷を負っている鼻および／または肺の表面に投与する場合には、満足な分解速度を有するようにおよびまた生体接着性である材料で形成するようにの両面で選択して、移動の有効性をさらに向上させることができる。マトリックスの組成はまた、分解せず、むしろ拡散によって長期にわたり放出するように選択してもよい。
【０１７６】
非生体内分解性および生体内分解性の高分子性マトリックスを使用して、ＴＬＲのリガンドおよび／または抗ウイルス剤を対象に送達することができる。生体内分解性のマトリックスが好ましい。そのような高分子は、天然高分子であっても、または合成高分子であってもよい。高分子は、数時間から１年以上の程度が一般的である、放出が望まれる期間に基づいて選択される。典型的には、数時間と３から１２カ月との間に及ぶ期間にわたる放出が最も望ましい。高分子は、その重量の約９０％までの水を吸収することができるヒドロゲルの形態を場合によりとり、さらに、多価のイオンまたはその他の高分子を用いて場合により架橋される。
【０１７７】
特に興味深い生体接着性高分子は、その教示が本明細書に組み込まれている、Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ、Ｃ．Ｐ．ＰａｔｈａｋおよびＪ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌによって、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、（１９９３）２６：５８１−５８７に記載されている生体内分解性ヒドロゲル、すなわち、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルテン、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）およびポリ（オクタデシルアクリレート）を包含する。
【０１７８】
本明細書で使用する場合、疾患または状態を有する対象に関して使用する「治療する」という用語は、対象の疾患または状態の少なくとも１つの徴候または症状を予防、緩和または解消することを意味するものとする。
【０１７９】
本明細書に記載の組成物は、癌の治療において使用することができる。
【０１８０】
癌を有する対象は、検出可能な癌性の細胞を有する対象である。癌は、悪性の癌であっても、または悪性でない癌であってもよい。本明細書で使用する「癌」は、身体の器官および系の正常な機能を妨害する細胞の未制御の増殖を指す。元々の場所から転移し、生命維持に必要な器官に播種する癌は、最終的には、影響を受ける器官の機能の悪化によって対象を死に導く。白血病等の造血系の癌は、対象の正常な造血系の区分を打ち負かすことができ、それによって、究極的には死を引き起こす（貧血、血小板減少および好中球減少の形態の）造血不全をもたらす。
【０１８１】
転移は、原発腫瘍の場所とははっきりと区別できる癌細胞の領域であり、癌細胞の原発腫瘍から身体のその他の部分への散在により生じる。原発腫瘍塊の診断時に、転移の存在について対象をモニターすることができる。転移は、特異的な症状のモニターに加えて、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）スキャン、血球数および血小板数、肝機能検査、胸部Ｘ線検査ならびに骨スキャンの単独のまたはそれらを組み合わせた使用によって検出されることが最も多い。
【０１８２】
癌は、これらに限定されないが、基底細胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系（ＣＮＳ）の癌；乳癌；子宮頚癌；絨毛癌；結腸および直腸の癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頚部の癌；上皮内新生物；腎臓癌；咽頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫をはじめとする、リンパ腫；メラノーマ；神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；肉腫；皮膚癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌；尿路器系の癌、ならびにその他の細胞腫、腺癌および肉腫を包含する。
【０１８３】
本発明の免疫賦活性組成物はまた、抗癌療法と併せて投与することができる。抗癌療法は、抗癌剤、放射線照射および外科手技を包含する。本明細書で使用する場合、「抗癌剤」は、癌を治療する目的で対象に投与する薬剤を指す。本明細書で使用する場合、「癌の治療」は、癌の発症の予防、癌の症状の低減、および／または確立されている癌の増殖の阻害を包含する。その他の態様では、癌を発症する危険のある対象に、癌を発症する危険を低減する目的で、抗癌剤を投与する。癌の治療のための種々の型の医薬品を、本明細書に記載する。本明細書の目的では、抗癌剤を、化学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン、ホルモン療法および生物学的応答改変物質に分類する。
【０１８４】
化学療法剤は、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖を含有しないクロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン（ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、メグラミン（Ｍｅｇｌａｍｉｎｅ）ＧＬＡ、バルルビシン、カルムスタインおよびポリフェポサン（ｐｏｌｉｆｅｒｐｏｓａｎ）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファメシル（ｆａｍｅｓｙｌ）トランスフェラーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメテキソール（Ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）、グラモレク（Ｇｌａｍｏｌｅｃ）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール（Ｖａｌｓｐｏｄａｒ）／ＰＳＣ８３３、ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）／ミトロキサントロン、メタレット（Ｍｅｔａｒｅｔ）／スラミン、バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル（Ｉｎｃｅｌ）／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マルミスタット（Ｍａｒｍｉｓｔａｔ）、ＢＢ２５１６／マルミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナール（Ｌｅｍｏｎａｌ）ＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニール／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、メタストロン（Ｍｅｔａｓｔｒｏｎ）／ストロンチウム誘導体、テモダール（Ｔｅｍｏｄａｌ）／テモゾロミド、エバセト（Ｅｖａｃｅｔ）／リポソームドキソルビシン、ユータキサン（Ｙｅｗｔａｘａｎ）／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、ゼロード／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパクス（Ｃｙｃｌｏｐａｘ）／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ発癌遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミソール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）／レバミソール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵ賦活薬、カンプト／レバミソール、カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）／イリノテカン、ツモデックス（Ｔｕｍｏｄｅｘ）／ラリトレキセド（Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、ロイスタチン／クラドリビン、パキセクス（Ｐａｘｅｘ）／パクリタキセル、ドキシル／リポソームドキソルビシン、カエリクス（Ｃａｅｌｙｘ）／リポソームドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファルマルビシン（Ｐｈａｒｍａｒｕｂｉｃｉｎ）／エピルビシン、デポサイト（ＤｅｐｏＣｙｔ）、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタルイミド、ＬＵ１０３７９３／ドラスタイン、カエチクス（Ｃａｅｔｙｘ）／リポソームドキソルビシン、ジェムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／アノルメド（Ａｎｏｒｍｅｄ）、ＹＭ１１６、ヨウ素シード、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２の阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシフォサミド（Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、イフェス（Ｉｆｅｓ）／メスネクス（Ｍｅｓｎｅｘ）／イホサミド、ブモン（Ｖｕｍｏｎ）／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プランチノール（Ｐｌａｎｔｉｎｏｌ）／シスプラチン、ベプシド／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア、メルフェランおよびシクロホスファミド等のアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロムブシル、シタラビンＨＣＩ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸リュープロリド（ＬＨＲＨ−放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エルスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）および硫酸ビンデシンからなる群から選択することができるが、これらに限定されない。
【０１８５】
免疫療法剤は、３６２２Ｗ９４、４Ｂ５、ＡＮＡ  Ａｂ、抗ＦＬＫ−２、抗ＶＥＧＦ、アトラゲン（ＡＴＲＡＧＥＮ）、アバスチン（ベバシズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＢＡＢＳ、ＢＥＣ２、ＢＥＸＸＡＲ（トシツモマブ；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、Ｃ２２５、キャンパス（アレムツズマブ；Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）、セアサイド（ＣＥＡＣＩＤＥ）、ＣＭＡ６７６、ＥＭＤ−７２０００、エルビタックス（セツキシマブ；ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、グリオマブ−Ｈ（Ｇｌｉｏｍａｂ−Ｈ）、ＧＮＩ−２５０、ハーセプチン（トラスツズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡ、ｉｏｒ  ｃ５、ｉｏｒ  ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ  ｔ６、ＬＤＰ−０３、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−２６０、ＭＤＸ−４４７、メリムューン−１（ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１）、メリムューン−２（ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２）、モノファーム−Ｃ（Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ−Ｃ）、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）、ＯＶ１０３、オバレクス（Ｏｖａｒｅｘ）、パノレクス（Ｐａｎｏｒｅｘ）、プレターゲット（Ｐｒｅｔａｒｇｅｔ）、クアドラメット、リブタキシン（Ｒｉｂｕｔａｘｉｎ）、リツキサン（リツキシマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、スマート（ＳＭＡＲＴ）１Ｄ１０Ａｂ、スマートＡＢＬ３６４Ａｂ、スマートＭ１９５、ＴＮＴおよびゼナパックス（ダクリズマブ；Ｒｏｃｈｅ）からなる群から選択することができるが、これらに限定されない。
【０１８６】
本発明はまた、細菌感染を治療する方法にも関与する。「感染を有する対象」は、感染性微生物が対象に表面的、局所的または全身的に侵入することによって発生した障害を有する対象である。感染性微生物は、ウイルスまたは細菌であり得る。
【０１８７】
細菌は、二分裂によって無性生殖的に繁殖する単細胞生物である。細菌は、それらの形態、染色反応、栄養性および代謝性の要求、抗原構造、化学組成、ならびに遺伝的相同性に基づいて分類および命名される。細菌は、それらの形態学上の形態に基づいた３つの群、すなわち、球状（球菌）、真直ぐな棒（桿菌）ならびに湾曲したまたはらせん状の棒（ビブリオ、カンピロバクター、スピリルムおよびスピロヘータ）に分類することができる。細菌はまた、より一般的には、それらの染色反応に基づいて、２つのクラスの生物体、すなわち、グラム陽性およびグラム陰性にも特徴付けられる。グラムは、微生物学実験室において通常実施される染色方法を指す。グラム陽性の生物体は、染色手順後に染色剤を保持し、濃い紫色に見える。グラム陰性の生物体は、染色剤を保持しないが、対比染色剤を吸収し、その結果、桃色に見える。
【０１８８】
感染性細菌は、これらに限定されないが、グラム陰性およびグラム陽性の細菌を包含する。グラム陽性細菌は、これらに限定されないが、パスツレラ属の種、ブドウ球菌属の種および連鎖球菌属の種を包含する。グラム陰性細菌は、これらに限定されないが、エシェリキア・コリ、シュードモナス属の種およびサルモネラ属の種を包含する。感染性細菌の具体的な例は、これらに限定されないが、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリアの種（例えば、結核菌、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシ、マイコバクテリウム・ゴルドナエ）、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、リステリア・モノサイトゲネス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（緑色連鎖球菌群）、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ボビス、連鎖球菌（嫌気性の種）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、病原性カンピロバクター属の種、エンテロコッカス属の種、ヘモフィルス・インフルエンザエ、バチルス・アントラシス、コリネバクテリウム・ジフテリエ、コリネバクテリウム属の種、ブタ丹毒菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・テタニ、エンテロバクター・エアロゲネス、クレブシエラ・ニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ、バクテロイデス属の種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテヌエ、レプトスピラ属、リケッチア属およびアクチノミセス・イスラエリを包含する。
【０１８９】
その他の医学的に関連のある微生物が、文献に広範に記載されており、例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３を参照されたい。その全内容が、参照によって本明細書に組み込まれている。前記のリストのうちのそれぞれは、説明のためのものであり、限定する意図はない。
【０１９０】
本発明の方法は、抗細菌剤の投与をさらに包含することができる。抗細菌剤は、細菌を死滅させまたは阻害し、抗生物質および類似の機能を有するその他の合成または天然の化合物を包含する。多くの抗生物質は、微生物等の細胞が二次代謝産物として産生する低分子量の分子である。一般に、抗生物質は、微生物に特異的であり、宿主細胞中には存在しない１つまたは複数の機能または構造を妨害する。
【０１９１】
広い範囲の細菌を死滅させるまたは阻害するのに有効である抗細菌性の抗生物質は、広域スペクトル抗生物質と呼ばれる。その他の型の抗細菌性の抗生物質は、グラム陽性またはグラム陰性の細菌に対して圧倒的に有効である。これらの型の抗生物質は、狭域スペクトル抗生物質と呼ばれる。単一の生物体または疾患に対して有効であるが、その他の型の細菌に対しては有効でないその他の抗生物質は、限定スペクトル抗生物質と呼ばれる。
【０１９２】
抗細菌剤は、時には、一次作用機序に基づいて分類される。一般に、抗細菌剤は、細胞壁合成阻害剤、細胞膜阻害剤、タンパク質合成阻害剤、核酸の合成または機能の阻害剤、および競合的阻害剤である。細胞壁合成阻害剤は、細胞壁合成の過程、一般的には、細菌のペプチドグリカンの合成におけるステップを阻害する。細胞壁合成阻害剤は、β−ラクタム抗生物質、天然のペニシリン、半合成ペニシリン、アンピシリン、クラブラン酸、セファロールスポリンおよびバシトラシンを包含する。
【０１９３】
本発明の化合物を、単独で（例えば、食塩水もしくは緩衝液中で）、または当技術分野で既知のいずれかの送達ベクターを使用して投与することができる。ＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤は、アジュバント等のその他の治療剤を組み合わせて、免疫応答をその上さらに増強してよい。ＴＬＲのリガンドおよび／もしくは抗ウイルス剤ならびに／またはその他の治療剤は、同時にまたは経時的に投与することができる。その他の治療剤を同時に投与する場合には、それらは、同一または別の製剤中で投与してよいが、同時に投与する。その他の治療剤の投与と、ＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤の投与とが、時間的に分離する場合には、その他の治療剤を、相互にも、かつＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤とも経時的に投与する。これらの化合物の投与の時間間隔は、数分の程度であってもよく、またはそれより長くてもよい。その他の治療剤は、これらに限定されないが、核酸ではないアジュバント、サイトカイン、抗体、抗原等を包含する。
【０１９４】
核酸ではないアジュバントは、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を賦活することができる、本明細書に記載の免疫賦活性核酸以外のいずれかの分子または化合物である。核酸ではないアジュバントは、例えば、デポ効果を生み出すアジュバント、免疫を賦活するアジュバント、デポ効果を生み出し、かつ免疫系を賦活するアジュバント、および粘膜アジュバントを包含する。
【０１９５】
本明細書で使用する、デポ効果を生み出すアジュバントは、体内において抗原を緩慢に放出させ、これによって免疫細胞の抗原に対する暴露を延長させるアジュバントである。免疫を賦活するアジュバントは、免疫系の細胞の活性化を引き起こすアジュバントである。「デポ効果を生み出し、かつ免疫系を賦活するアジュバント」は、上記で定義した機能の両方を有する化合物である。本明細書で使用する「核酸ではない粘膜アジュバント」は、抗原と併せて粘膜表面に投与した場合、対象の粘膜の免疫応答を誘発することができる、免疫賦活性核酸以外のアジュバントである。そのような分子が例えば、それぞれが参照によって組み込まれている、ＵＳ２００４／０２６６７１９として公開された米国特許出願第１０／８８８，８８６号および米国特許第６，４０６，７０５号に記載されている。
【０１９６】
免疫応答はまた、免疫賦活性核酸および抗ウイルス剤との、サイトカイン（Ｂｕｅｌｅｒ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９６；Ｃｈｏｗら、１９９７；Ｇｅｉｓｓｌｅｒら、１９９７；Ｉｗａｓａｋｉら、１９９７；Ｋｉｍら、１９９７）またはＢ−７副刺激分子（Ｉｗａｓａｋｉら、１９９７；Ｔｓｕｊｉら、１９９７）の同時投与またはコリニアな発現（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって誘発するまたは増進させることもできる。サイトカインは、免疫賦活性核酸と共に直接投与してもよく、またはサイトカインをｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができるように、サイトカインをコードする核酸ベクターの形態で投与してもよい。一実施形態では、サイトカインは、プラスミド発現ベクターの形態で投与する。この実施形態では、免疫賦活性核酸は、同一のプラスミド中には収容されない。「サイトカイン」という用語は、ナノモルからピコモルの濃度で液性調節物質として作用し、正常状態下または病的状態下のいずれにおいても、個々の細胞および組織の機能的な活性を調節する可溶性のタンパク質およびペプチドの多様性のある群についての総称として使用する。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接媒介し、細胞外環境において生じる過程を調整する。サイトカインの例は、これらに限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、インターフェロン−γ（γ−ＩＦＮ）、ＩＦＮ−ａ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＧＦ−β、ＦＬＴ−３のリガンドおよびＣＤ４０のリガンドを包含する。サイトカインは、Ｔ細胞応答を導く役割を担う。ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞は、その他のＴ細胞をはじめとする、その他の免疫系細胞に作用する可溶性因子の産生によって哺乳動物の免疫応答を組織化する。大部分の成熟ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞は、２つのサイトカインプロフィール：Ｔｈ１またはＴｈ２のうちの１つを発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインが、Ｔｈ１サイトカインであることが好ましい。
【０１９７】
ＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤の「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するために必要または十分な量を指す。例えば、感染症を治療または予防するための免疫賦活性核酸および抗ウイルス剤の有効量は、対象がまだ感染していない場合には、微生物による感染を阻止するのに必要な量であり、または対象中に存在する感染細胞もしくは微生物の増加を阻止するのに必要な量であり、または免疫賦活性核酸も抗ウイルス剤も存在しない場合もしくはいずれかを単独で使用する場合には本来生じるであろう感染の量を減少させるのに必要な量である。本明細書に提供する教示と組み合わせて、種々の活性化合物のうちから選び、かつ効力、相対的な生物学的利用率、患者の体重、有害な副作用の重症度および好ましい投与形態等の要因を比較検討することによって、実質的に毒性をもたらすことがなく、それでも特定の対象を治療するのにもっぱら効果を示す、有効な予防または治療の処置の投与計画を立てることができる。いずれかの特定の適用のための有効量は、治療する疾患もしくは状態、投与する特定の免疫賦活性核酸もしくは抗ウイルス剤（例えば、核酸の型、すなわち、ＣｐＧ核酸、免疫賦活性モチーフの数もしくは核酸中のそれらの場所、オリゴヌクレオチドの骨格の修飾の程度、医薬品の型）、対象の大きさ、または疾患もしくは状態の重症度等の要因に応じて変動させてよい。当業者であれば、過度の実験を必要とすることなく、特定の免疫賦活性核酸および／もしくは抗ウイルス剤ならびに／またはその他の治療剤の有効量を経験的に決定することができる。
【０１９８】
本発明のいくつかの実施形態では、ＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤を、感染症を治療または予防するのに有効な相乗的な量で投与する。相乗的な量は、免疫賦活性核酸または抗ウイルス剤のいずれか単独の個々の効果の和を上回る生理学的応答をもたらす量である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、生理学的効果は、ウイルスに感染した細胞の数の低下である。相乗的な量は、免疫賦活性核酸または抗ウイルス剤のいずれか単独により低下した感染細胞の和を上回る、感染細胞の低下をもたらす量である。その他の実施形態では、生理学的な結果は、体内の微生物の数の低下である。この場合の相乗的な量は、免疫賦活性核酸または抗ウイルス剤のいずれか単独によりもたらされた低下の和を上回る低下をもたらす量である。その他の実施形態では、生理学的な結果は、感染に関連する生理学的パラメータ、例えば、真菌による病変またはその他の症状の減少である。例えば、尿路感染の診断は、尿中の細菌の存在および定量化に基づき、清潔に排泄された中間尿の検体中に、１ミリリットルあたり１０５超のコロニーの微生物が検出される。１ミリリットルあたり１０３、好ましくは、１０２未満の細菌コロニーまでこの数字が低下することによって、感染が根絶したことが示される。
【０１９９】
本明細書に記載の化合物の対象の投与量は、典型的には、約０．１μｇから１０，０００ｍｇまで、より典型的には、約１μｇ／日から８０００ｍｇまで、最も典型的には、約１０μｇから１００μｇまでの範囲である。対象の体重に関して述べると、典型的な投与量は、約０．１μｇから２０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には、約１から１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も典型的には、約１から５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２００】
場合によっては、ＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤を治療量に満たない投与量で使用する。２つのクラスの薬物を一緒に使用する場合、それらを、治療量に満たない投与量で投与して、それでも、所望の治療結果を得る場合がある。本明細書で使用する「治療量に満たない投与量」は、治療結果を対象にもたらす投与量より少ない投与量を指す。したがって、抗ウイルス剤の治療量に満たない投与量は、免疫賦活性核酸の非存在下では、対象に所望の治療結果をもたらさない投与量である。抗ウイルス剤の治療量は、感染症治療の医学分野では周知である。これらの投与量が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  ｅｄ．、１９９０等の参照文献、および医療専門家によって感染症治療のガイダンスとして信頼される多くのその他の医学参照文献に広範に記載されている。免疫賦活性オリゴヌクレオチドの治療量も、当技術分野において記載されており、対象の治療量を同定するための方法は、より詳細に上記に記載する。
【０２０１】
本発明のその他の実施形態では、定期的なスケジュールで、ＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤を投与する。本明細書で使用する「定期的なスケジュール」は、あらかじめ決定し、指定した期間を指す。定期的なスケジュールは、スケジュールがあらかじめ決定されている限り、同一である期間または長さが異なる期間を含有することができる。例えば、定期的なスケジュールは、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、毎月、またはいずれかの一定数の日もしくは週をおいて、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、１２カ月毎等の組成物の投与が関与してよい。別法として、あらかじめ決定した定期的なスケジュールは、第１週は毎日、続いて、数カ月間は毎月、次いで、それ以降は、３カ月毎の組成物の投与が関与してよい。適切なスケジュールが特定の日の投与に関与することがあらかじめ決定されている限り、いずれの特定の組合せであっても定期的なスケジュールに属する。
【０２０２】
本明細書に記載のいずれの化合物についても、治療有効量は、最初は、動物モデルから決定してよい。治療有効量はまた、ヒトにおいて試験されている（ヒトの臨床試験が開始されている）ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ならびにその他のアジュバント、例えば、ＬＴ、およびワクチン接種の目的でのその他の抗原等、同様の薬理学的活性を示すことが知られている化合物に関するヒトのデータから決定することもできる。非経口投与には、より多くの投与量が必要になる場合がある。適用する投与量は、投与した化合物の相対的な生物学的利用率および効力に基づいて加減してよい。上記の方法および当技術分野で周知のその他の方法に基づいて最大の効き目を達成するために投与量を加減することは、当業者の能力の範囲に十分収まる。
【０２０３】
本発明の製剤を、薬学的に許容できる溶液中で投与し、この溶液は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、アジュバントおよび場合によりその他の治療成分を日常的に含有してよい。
【０２０４】
療法に使用するために、有効量のＴＬＲのリガンドと抗ウイルス剤との組成物は、組成物を所望の、例えば、粘膜、全身の表面に送達するいずれかの形態によって対象に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は、当業者に既知のいずれかの手段によって達成してよい。好ましい投与経路は、これらに限定されないが、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣および直腸を包含する。
【０２０５】
経口投与のためには、化合物は、活性化合物（複数の活性化合物）を当技術分野で周知の薬学的に許容できる担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体により、本発明の化合物を、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤およびその他として、治療する対象が経口摂取するために製剤化することができる。経口使用のための医薬調製物は、固体の賦形剤として得、得られた混合物を場合により粉砕し、所望により適切な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠剤の芯を得ることができる。適切な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールをはじめとする糖等の充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等のセルロース調製物である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウム等のその塩等の崩壊剤を添加してよい。経口製剤はまた、場合により、食塩水もしくは緩衝液、すなわち、内部の酸性状態を中和するためのＥＤＴＡ中に製剤化してもよく、またはいずれの担体もなしで投与してもよい。
【０２０６】
また、具体的に企図するのは、上記の１つまたは複数の構成成分の経口投与剤型である。１つまたは複数の構成成分は、化学的に修飾して、それによって、当該の誘導体の経口送達に効き目があるようになすことができる。一般に、企図する化学的修飾は、少なくとも１つの部分の、構成成分分子自体への結合であり、前記部分により、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸からの血流への取込みが可能になる。１つまたは複数の構成成分の全体的な安定性の向上および体内における循環時間の延長も望まれる。そのような部分の例は、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンを包含する。ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよびＤａｖｉｓ、１９８１、「Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ」Ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ、ＨｏｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ｐｐ．３６７−３８３；Ｎｅｗｍａｒｋら、１９８２、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９。使用することができるその他の高分子は、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。医薬への使用に好ましいのは、上記で示したように、ポリエチレングリコール部分である。
【０２０７】
構成成分（または誘導体）の場合、放出の場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸もしくは回腸）、または大腸であり得る。胃では溶解しないが、十二指腸または腸の他の場所で材料を放出する製剤が、当業者には利用可能である。放出が、オリゴヌクレオチド（もしくは誘導体）の保護または生物学的に活性な材料の、腸内等、胃の環境を越えたところでの放出のいずれかによって、胃の環境の悪い効果を回避するのが好ましい。
【０２０８】
胃に対する完全な抵抗性を確実に得るためには、少なくともｐＨ５．０に不浸透性の被覆が必須である。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性な成分の例が、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＳおよびＳｈｅｌｌａｃである。これらの被覆は、混合性の薄膜として使用することができる。
【０２０９】
被覆または被覆の混合物はまた、錠剤上にも使用することができ、これらの被覆は、胃に対する保護を意図するものではない。これは、糖の被覆または錠剤の嚥下を容易にする被覆を包含し得る。カプセル剤は、乾燥した治療剤、すなわち、粉末の送達のために、（ゼラチン等の）硬い殻からなる場合もあれば；液体の形態の場合には、柔らかいゼラチン製の殻を使用する場合もある。カシェ剤の殻の材料は、厚いデンプンまたはその他の食用に適する紙であってよい。丸剤、トローチ剤、成型錠剤または粉薬錠剤の場合、湿式塊化法を使用することができる。
【０２１０】
治療剤は、製剤中に、約１ｍｍの粒子の大きさの顆粒またはペレットの形態で、微細な複数の粒子として包含することができる。カプセル剤の投与のための材料はまた、粉末、軽く圧縮したプラグに、または錠剤にも製剤化することができる。治療剤は、圧縮によって調製することができる。
【０２１１】
着色剤および芳香剤は、すべて包含することができる。例えば、オリゴヌクレオチド（または誘導体）を（リポソームまたはマイクロスフェアの被包等により）製剤化し、次いで、着色剤および芳香剤を含有する冷蔵飲料等の食用に適する製品の中にさらに含有させることができる。
【０２１２】
治療剤は、不活性の材料を用いて、希釈してもよく、またはその体積を増加させてもよい。これらの希釈剤は、炭水化物、具体的には、マンニトール、ａ−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを包含することができる。カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムをはじめとする、特定の無機塩も、充填剤として使用することができる。いくつかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
【０２１３】
崩壊剤を、治療剤の固形投与剤型への製剤化の際に包含させることができる。崩壊剤として使用する材料は、これらに限定されないが、デンプンに基づいた市販の崩壊剤であるＥｘｐｌｏｔａｂをはじめとする、デンプンを包含する。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラ−アミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジの皮、酸カルボキシメチルセルロース、海綿およびベントナイトは、すべて使用することができる。崩壊剤の別の形態が、不溶性のカチオン性交換樹脂である。粉末ゴムを、崩壊剤としてかつ結合剤として使用することができ、これらは、寒天、カラヤまたはトラガント等の粉末ゴムを包含することができる。
【０２１４】
結合剤を使用して、治療剤を一緒に保持し、硬い錠剤を形成することができ、結合剤は、アカシア、トラガント、デンプンおよびゼラチン等の天然の産物からの材料を包含する。その他の結合剤は、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を包含する。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）の両方は、アルコール溶液中で使用して、治療剤を顆粒化することができる。
【０２１５】
抗摩擦剤を、治療剤の製剤中に包含させて、製剤化の過程の間の粘着を阻止することができる。滑沢剤を、治療剤とダイ壁との間の層として使用することができ、これらは、これらに限定されないが、そのマグネシウムおよびカルシウムの塩をはじめとする、ステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびロウを包含することができる。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００および６０００等の可溶性の滑沢剤も使用することができる。
【０２１６】
製剤化の間の薬物の流動特性を改善することができ、圧縮の間の再配置を援助するための流動促進剤を添加することができる。流動促進剤は、デンプン、タルク、焼成シリカおよびシリコアルミネート水和物（ｈｙｄｒａｔｅｄ  ｓｉｌｉｃｏａｌｕｍｉｎａｔｅ）を包含することができる。
【０２１７】
治療剤の水性環境への溶解を援助するために、界面活性剤を湿潤剤として添加することができる。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホサクシネート（ｄｉｏｃｔｙｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）およびジオクチルナトリウムスルホネート（ｄｉｏｃｔｙｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）等のアニオン性洗剤を包含することができる。カチオン性洗剤を使用することができ、これらは、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを包含することができる。製剤中に界面活性剤として包含することができる有望な非イオン性洗剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、オリゴヌクレオチドまたは誘導体の製剤中に、単独でまたは異なる比の混合物としてのいずれかで存在することができる。
【０２１８】
経口的に使用することができる医薬調製物は、ゼラチンで作製したプッシュ−フィットカプセル（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ  ｃａｐｓｕｌｅ）、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトール等の可塑剤とで作製した密封型の軟カプセル（ｓｏｆｔ，ｓｅａｌｅｄ  ｃａｐｓｕｌｅ）を包含する。プッシュ−フィットカプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤ならびに場合により安定化剤を有する混合物中に、活性成分を含有することができる。軟カプセル中には、活性化合物を、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコール等の適切な液体中に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与のために製剤化したマイクロスフェアも使用することができる。そのようなマイクロスフェアは、当技術分野で十分に定義されている。経口投与のためのすべての製剤は、そのような投与に適した用量になされなければならない。
【０２１９】
舌下投与のためには、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとることができる。
【０２２０】
吸入による投与のためには、本発明による使用のための化合物を、加圧パックまたは噴霧器から、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切なガスを使用するエアロゾルスプレーとして提示する形態で好都合に送達することができる。加圧式エアロゾルの場合には、バルブを提供して、計量した量を送達することによって、単位用量を決定することができる。吸入器または散布器中で使用するための、例えば、ゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、化合物の粉末のミックスおよびラクトースまたはデンプン等の適切な粉末基剤を含有させて製剤化することができる。
【０２２１】
また、本明細書では、オリゴヌクレオチド（またはその誘導体）の肺への送達を企図する。オリゴヌクレオチド（または誘導体）は、吸入の間に哺乳動物の肺に送達され、肺の上皮層を越えて血流に至る。吸入された分子のその他の報告は、Ａｄｊｅｉら、１９９０、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７：５６５−５６９；Ａｄｊｅｉら、１９９０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、６３：１３５−１４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら、１９８９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１３（ｓｕｐｐｌ．５）：１４３−１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら、１９８９、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．ＩＩＩ、ｐｐ．２０６−２１２（ａ１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈら、１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−１１４６（ａ−１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら、１９９０、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、Ｍａｒｃｈ、（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら、１９８８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−３４８８（インターフェロン−ｇおよび腫瘍壊死因子アルファ）ならびにＰｌａｔｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）を包含する。全身性の効果のための薬物の肺への送達ための方法および組成物が、１９９５年９月１９日にＷｏｎｇらに発行された米国特許第５，４５１，５６９号に記載されている。
【０２２２】
本発明の実行における使用のために企図するのは、これらに限定されないが、噴霧器、用量計量型吸入器および粉末用吸入器をはじめとする、治療用製品の肺への送達のために設計された広い範囲の機械装置であり、これらはすべて、当業者であれば精通している。
【０２２３】
本発明の実行に適した市販の装置のいくつかの具体的な例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州により製造されたＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器；Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、コロラド州により製造されたＡｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器；Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ノースカロライナ州により製造されたＶｅｎｔｏｌｉｎ用量計量型吸入器；およびＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州により製造されたＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末用吸入器である。
【０２２４】
すべてのそのような装置は、オリゴヌクレオチド（または誘導体）を分配するのに適切な製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤が、利用する装置の型に特異的であり、療法に有用な通常の希釈剤、アジュバントおよび／または担体に加えて、適切な推進剤材料の使用が関与し得る。また、リポソーム、マイクロカプセルもしくはマイクロスフェア、包接複合体またはその他の型の担体の使用も企図する。化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、化学的修飾の型または利用する装置の型に応じて、異なる製剤中に調製することができる。
【０２２５】
噴出型または超音波型のいずれかの噴霧器を用いる使用に適した製剤は、典型的には、１ｍＬの溶液あたり約０．１から２５ｍｇの生物学的に活性なオリゴヌクレオチドの濃度で水に溶解させたオリゴヌクレオチド（または誘導体）を含む。製剤はまた、緩衝液および単純な糖を（例えば、オリゴヌクレオチドの安定化および浸透圧の調整のために）包含することができる。噴霧器用の製剤はまた、エアロゾルを形成する際に溶液の微粒化が引き起こすオリゴヌクレオチドの表面誘発凝集を低減または阻止するために界面活性剤を含有してもよい。
【０２２６】
用量計量型吸入器の装置を用いる使用のための製剤は、一般に、オリゴヌクレオチド（または誘導体）を含有する、微細に分割し、界面活性剤の助けを借りて推進剤中に浮遊させた粉末を含む。推進剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたはそれらの組合せをはじめとする、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンまたは炭化水素等、この目的に利用されるいずれの従来の材料であってもよい。適切な界面活性剤は、ソルビタントリオレエートおよびダイズレシチンを包含する。オレイン酸も、界面活性剤として有用である場合がある。
【０２２７】
粉末用吸入器の装置から分配するための製剤は、オリゴヌクレオチド（または誘導体）を含有する微細に分割した乾燥粉末を含み、ラクトース、ソルビトール、スクロースまたはマンニトール等の増量剤も、装置からの粉末の分散を促進する量、例えば、製剤の５０から９０重量％で包含することができる。オリゴヌクレオチド（または誘導体）は、遠位の肺への最も有効な送達ために、１０ｍｍ未満（またはミクロン）、最も好ましくは、０．５から５ｍｍの粒子の平均の大きさを有する微粒子の形態として最も有利に調製する必要がある。
【０２２８】
本発明の医薬組成物の鼻への送達も企図する。鼻への送達によって、製品の肺における堆積を必要とせずに、治療用製品を鼻へ投与した直後に、本発明の医薬組成物の血流への通過が可能になる。鼻への送達のための製剤は、デキストランまたはシクロデキストランを有する製剤を包含する。
【０２２９】
鼻への投与の場合、有用な装置は、用量計量型スプレーを取り付ける小型の硬いボトルである。一実施形態では、本発明の医薬組成物の溶液を規定された容積のチャンバー内に引き出すことによって、計量された用量が送達され、このチャンバーは、チャンバー中の液体が圧縮された場合にスプレーを形成することによって、エアロゾル製剤をエアロゾル化するような寸法にした開口部を有する。チャンバーを圧縮して、本発明の医薬組成物を投与する。特異的な実施形態では、チャンバーには、ピストンが配置されている。そのような装置が市販されている。
【０２３０】
別法として、圧迫した場合にスプレーを形成することによって、エアロゾル製剤をエアロゾル化するような寸法にした開口部または空きを有するプラスチック製のスクイーズボトルを使用する。空きは、通常、ボトルの上部に見出され、上部は、一般に、エアロゾル製剤の効率的な投与のために、鼻道中に部分的に納まるように先細になっている。好ましくは、鼻用の吸入器は、薬物の計量された用量を投与するために、エアロゾル製剤の計量された量を提供する。
【０２３１】
化合物を全身的に送達することが望まれる場合には、化合物は、注入、例えば、ボーラス注入または連続的な点滴による非経口投与のために製剤化してよい。注入のための製剤は、単位剤型として、例えば、アンプル中で、または保存剤を添加して多回用量の容器中に提示することができる。組成物は、油性または水性のビヒクル中で懸濁剤、液剤または乳剤の形態をとってもよいし、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤等の製剤化剤を含有してもよい。
【０２３２】
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性の形態の活性化合物の水溶液を包含する。さらに、活性化合物の懸濁剤も、適切な油性の注入用懸濁剤として調製することができる。適切な親油性の溶媒またはビヒクルは、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。水性の注入用懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン等、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含有することができる。懸濁剤はまた、適切な安定化剤、または化合物の溶解性を向上させて、高度に濃縮された溶液の調製物を可能にする薬剤を場合により含有してもよい。
【０２３３】
別法として、活性化合物は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質が存在しない水を用いて作り上げるための粉末の形態であってもよい。
【０２３４】
化合物はまた、直腸または膣用の組成物、例えば、カカオ脂またはその他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸等に製剤化することもできる。
【０２３５】
これまでに記載した製剤に加えて、化合物はまた、デポ調製物として製剤化することもできる。そのような長期に作用する製剤は、適切な高分子性もしくは疎水性の材料（例えば、許容できる油中の乳剤）またはイオン交換樹脂を用いてか、難溶性の誘導体、例えば、難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２３６】
医薬組成物はまた、適切な固体またはゲルの相の担体または賦形剤を含むこともできる。そのような担体または賦形剤の例は、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコール等の高分子を包含する。
【０２３７】
適切な液体または固体の医薬調製物の形態は、例えば、吸入のための水溶液もしくは食塩水の溶液、マイクロカプセル化した形態、渦巻き状にした（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）形態、極微の金粒子上へ被覆した形態、リポソーム中に収容した形態、霧状にした形態、エアロゾル、皮膚内への埋込みのためのペレット、または皮膚内に擦り込むために鋭利な物体上に乾燥させた形態である。医薬組成物はまた、顆粒剤、散剤、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、ドロップ剤または活性化合物の放出を長引かせる調製物も包含し、それらの調製物中では、崩壊剤、結合剤、被覆剤、増量剤、滑沢剤、芳香剤、甘味剤または安定化剤等の賦形剤および添加剤ならびに／または補助剤を、上記に従って習慣的に使用する。医薬組成物は、多様な薬物送達システムにおける使用に適する。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、参照によって本明細書に組み込まれている、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３、１９９０を参照されたい。
【０２３８】
組成物は、それ自体（未処理（ｎｅａｔ））でまたは薬学的に許容できる塩の形態で投与することができる。塩は、薬物中で使用する場合、薬学的に許容できる必要があるが、薬学的に許容できない塩を好都合に使用して、その薬学的に許容できる塩を調製してよい。そのような塩は、これらに限定されないが、以下に示す酸から調製する塩を包含する：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸。また、そのような塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウムの塩等、アルカリ金属またはアルカリ土類の塩として調製することもできる。
【０２３９】
適切な緩衝剤は、酢酸と塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸と塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸と塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；およびリン酸と塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）を包含する。適切な保存剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）を包含する。
【０２４０】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体中に場合により包含される有効量の組成物を含有する。薬学的に許容できる担体という用語は、ヒトまたはその他の脊椎動物への投与に適した１つもしくは複数の適合性の固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、または被包化物質を意味する。担体という用語は、天然または合成の有機または無機の成分を意味し、それと活性成分を組み合わせて適用を促進する。医薬組成物の構成成分はまた、本発明の化合物とも、構成成分どうしでも、所望の薬学的な効率を実質的に損なう相互作用がないように混じり合うこともできる。
【０２４１】
その他の態様では、本発明は、感染症の治療において有用であるキットに関する。本発明の１つのキットは、免疫賦活性核酸を収納する容器および抗ウイルス剤を収納する容器ならびに免疫賦活性核酸および抗ウイルス剤の投与の時期を定めるための指示を包含する。好ましくは、免疫賦活性核酸は全身投与のために提供され、それに応じた指示がこれを提供する。重要な実施形態では、免疫賦活性核酸を収納する容器は、免疫賦活性核酸を緩慢に放出するいずれかの装置を意味する先行技術に従って本明細書において使用する持続放出ビヒクルである。
【０２４２】
ヒトの感染を予防するためのＴＬＲのリガンドおよび抗ウイルス剤の使用に加えて、組成物はまた、非ヒト脊椎動物の治療にも適している。動物園、農場および研究用動物の場合のように、狭苦しい場所に存在し、混ざることが許される非ヒト脊椎動物も、本発明の方法の対象として包括する。例えば、ライオン、トラ、ヒョウ、チータおよびクーガー；ゾウ、キリン、クマ、シカ、オオカミ、ヤク、非ヒト霊長類、アザラシ、イルカおよびクジラをはじめとする、野外種等の動物園の動物；ならびにマウス、ラット、ハムスターおよびスナネズミ等の研究用動物はすべて、本発明の方法の潜在的な対象である。
【０２４３】
メンドリ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、カモ、ウズラおよびキジ等のトリは、多くの型の感染の主要な標的である。ヒナは、誕生後間もなく病原性微生物に暴露される。これらのトリは、最初は、母体に由来する抗体によって病原体に対して保護されているが、この保護は、一時的なものにすぎず、トリ自体の未熟な免疫系が、トリを病原体から保護し始める必要がある。しばしば、若いトリが最も感染しやすい時期に、それらを感染から予防することが望ましい。特に、より年齢が上のトリを、疾患の迅速な伝播に至る狭苦しい場所で飼育する場合には、それらを感染から予防することも望ましい。したがって、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよび抗ウイルス剤をトリに投与して、感染症を予防することが望ましい。
【０２４４】
ニワトリの一般的な感染の例が、ニワトリ伝染性貧血ウイルス（ＣＩＡＶ）である。ＣＩＡＶは、最初に、１９７９年に日本でマレック病ワクチン接種の研究の間に単離された（Ｙｕａｓａら、１９７９、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．２３：３６６−３８５）。その時以来、ＣＩＡＶは、すべての主な家禽生産国の業務用家禽において検出され続けている（ｖａｎ  Ｂｕｌｏｗら、１９９１、ｐｐ．６９０−６９９、ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０２４５】
ＣＩＡＶ感染は、若い感染しやすいニワトリにおいて、貧血、出血および免疫抑制によって特徴付けられる臨床疾患に至る。胸腺および骨髄の萎縮、ならびにＣＩＡＶ感染ニワトリに一貫性のある病変も、ＣＩＡＶ感染の特徴である。胸腺、および時折のファブリキウス嚢におけるリンパ球の枯渇は、その後の疾患の経過を複雑にする免疫抑制およびウイルス、細菌または真菌への二次感染に対する感受性の増加をもたらす。免疫抑制は、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、細網内皮症ウイルス、アデノウイルスまたはレオウイルスのうちの１つまたは複数による感染後に疾患を増悪させる。ＭＤＶの病原性が、ＣＩＡＶによって増強されることが報告されている（ＤｅＢｏｅｒら、１９８９、ｐ．２８  Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３８ｔｈ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｔｅｍｐｅ、Ａｒｉｚ．）。さらに、ＣＩＡＶは、伝染性ファブリキウス嚢病の徴候を増悪することも報告されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９８９、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３３：７０７−７１３）。ニワトリは、ＣＡＡによって実験的に誘発した疾患に対して年齢的な抵抗性を得る。これは、２週齢までに本質的に完成するが、より年齢が上のトリは、依然として感染に感受性である（Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、１９７９、上記；Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、Ａｒｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２４、２０２−２０９、１９８０）。しかし、ニワトリが、ＣＡＡと免疫抑制性の病原体（ＩＢＤＶ、ＭＤＶ等）とに二重感染した場合には、疾患に対する年齢的な抵抗性が遅延する（Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、１９７９および１９８０、上記；Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ  Ｖ．ら、Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３、９３−１１６、１９８６）。疾患の伝染を強化することができるＣＩＡＶの特徴は、環境的な不活性化およびいくつかの一般的な消毒剤に対する高い抵抗性を包含する。ＣＩＡＶ感染の家禽産業に対する経済的な影響力は、疾患の大流行においては感染したトリの１０％から３０％が死滅するという事実から明らかである。
【０２４６】
畜牛および家畜も、感染に感受性である。これらの動物に影響を及ぼす疾患は、特に、畜牛において、深刻な経済的損失をもたらす場合がある。本発明の方法を使用して、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよびヤギ等の家畜を感染から保護することができる。
【０２４７】
ウシは、ウシウイルスに感染する場合がある。ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）は、小型の外被を有するプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、ブタコレラウイルス（ＨＯＣＶ）およびヒツジボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）と共に、ぺスチウイルス属に分類される。ぺスチウイルスは、以前は、トガウイルス科に分類されていたが、いくつかの研究が、フラビウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の群と共に、フラビウイルス科内へのそれらの再分類を示唆している（Ｆｒａｎｃｋｉら、１９９１）。
【０２４８】
畜牛の重要な病原体であるＢＶＤＶは、細胞培養解析に基づいて、細胞変性（ＣＰ）および非細胞変性（ＮＣＰ）の生物型に識別することができる。両方の生物型を畜牛中に見出すことができるが、ＮＣＰ生物型は、より広く行きわたっている。妊娠中のウシが、ＮＣＰ株に感染すると、持続的に感染を有しかつ特異的に免疫寛容である子ウシを産む場合があり、この子ウシは、生涯にわたりウイルスを伝播する。持続的に感染を有するウシは、粘膜疾患に屈する場合があり、次いで、この動物からは両方の生物型を単離することができる。臨床的所見は、流産、奇形発生、ならびに呼吸器の問題、粘膜疾患および軽度の下痢を包含することができる。さらに、動物の死に至る場合がある、群れの流行病に伴う重度の血小板減少が記載されており、この疾患に関連する株は、古典的なＢＶＤＶよりも病原性が高いようである。
【０２４９】
ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、無症候性の疾患から致命的な疾患にまで及ぶ多様な感染をウマに引き起こす、一群の抗原的に特徴的な生物学的病原体を含む。これらは、ウマに偏在する病原体であるウマヘルペスウイルス−１（ＥＨＶ−１）を包含する。ＥＨＶ−１は、流産、気道の疾患および中枢神経系障害の伝染病に関連する。若いウマの上気道の一次感染は、８から１０日間続く熱性の病気に至る。免疫学的に経験のある雌ウマは、疾患が明らかになることなく、気道を介して再感染することができ、したがって、流産が通常警告なしで発生する。神経学的症候群が、呼吸器疾患または流産に伴い、性別、年齢にかかわらず動物に影響を及ぼし、協調運動障害、脱力および後躯麻痺に至る場合がある（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ．Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８９、３０４−３１６、１９９２）。その他のＥＨＶは、ＥＨＶ−２またはウマサイトメガロウイルス、ＥＨＶ−３、馬媾疹ウイルス、および以前はＥＨＶ−１、サブタイプ２として分類されていたＥＨＶ−４を包含する。
【０２５０】
ヒツジおよびヤギは、ビスナ−マエディをはじめとする、多様な危険な微生物に感染する場合がある。
【０２５１】
サル、類人猿およびマカク等の霊長類は、サル免疫不全ウイルスに感染する場合がある。細胞−ウイルス不活化ワクチンおよび無細胞サル免疫不全全ワクチンがマカクにおいて保護を付与することが報告されている（Ｓｔｏｔｔら（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ  ３６：１５３８−１５４１；Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９８９）８６：６３５３−６３５７；Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２９３−１２９７；およびＣａｒｌｓｏｎら（１９９０）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：１２３９−１２４６）。組換えＨＩＶ  ｇｐ１２０ワクチンがチンパンジーにおいて保護を付与することが報告されている（Ｂｅｒｍａｎら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：６２２−６２５）。
【０２５２】
飼猫および野生猫の両方が、多様な微生物による感染に感受性である。例えば、ネコ伝染性腹膜炎は、飼猫およびライオン、ヒョウ、チータおよびジャガー等の野生猫の両方において生じる疾患である。この病原性生物体およびその他の型によるネコの感染を予防することが望ましい場合、本発明の方法を使用して、ネコの感染を予防または治療することができる。
【０２５３】
飼猫は、これらに限定されないが、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ）、内在性Ｃ型オンコルナウイルス（ＲＤ−１１４）、およびネコ合胞体形成ウイルス（ＦｅＳＦＶ）をはじめとする、いくつかのレトロウイルスに感染する場合がある。これらのうち、ＦｅＬＶは、最も顕著な病原体であり、リンパ細網および骨髄の新生物、貧血、免疫媒介障害、ならびにヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に類似する免疫不全症候群をはじめとする、多様性のある症状を引き起こす。最近になって、ＦｅＬＶ−ＡＩＤＳと命名された、特定のＦｅＬＶの複製欠損変異体が、免疫抑制性とより具体的に関連付けられた。
【０２５４】
ネコＴリンパ好性レンチウイルス（ネコ免疫不全とも呼ばれる）の発見が、最初に、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：７９０−７９３に報告された。ＦＩＶの特徴は、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２：２０４Ｓ−２１５Ｓ；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４９：１２４６−１２５８；およびＡｃｋｌｅｙら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５６５２−５６５５に報告されている。ＦＩＶのクローニングおよび配列解析が、Ｏｌｍｓｔｅｄら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２４４８−２４５２および８６：４３５５−４３６０に報告されている。
【０２５５】
ネコ伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、家畜および野生のネコ科において予測不能に生じる散発性の疾患である。ＦＩＰは、主として、飼猫の疾患であるが、ライオン、マウンテンライオン、ヒョウ、チータおよびジャガーにおいて診断されている。ＦＩＰに罹患したことがあるより小型の野生猫は、オオヤマネコおよびカラカル、スナネコおよびマヌルネコを包含する。飼猫の場合、この疾患は、圧倒的に若いネコにおいて生じるが、すべての年齢のネコが感受性である。発生のピークは、６月齢と１２月齢との間に生じる。発生の低下が、５歳齢からから１３歳齢までに認められ、その後、１４歳齢から１５歳齢のネコにおいて発生が増加する。
【０２５６】
本発明は、免疫を賦活する活性について、および同時に、抗ウイルス活性についても、抗ウイルス剤と免疫賦活性オリゴヌクレオチドとを含有する分子についてスクリーニングする方法もさらに含有する。これは、ウイルス感染患者から単離した免疫細胞を使用すること、例えば、サイトカインの産生およびウイルス力価を測定すること、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗ウイルス試験システム、例えば、ＨＣＶレプリコンとｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫賦活試験システム、例えば、ＴＬＲ９／ＩＦＮ−アルファシグナル伝達経路を担う細胞系との組合せによって、またはウイルス感染を模倣する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるウイルス試験システム（例えば、ＨＣＶのためのウシウイルス性下痢症ウイルス感染ＰＢＭＣ）によってのいずれかで達成することができる。さらに、多くのウイルスが、それらのタンパク質を用いて、ＴＬＲ媒介シグナル伝達等の抗ウイルス効果を標的にすることから、対象とするＴＬＲシグナル伝達経路を天然に含有するまたはトランスフェクトした細胞システムと抗ウイルス剤とを使用して、抗ウイルス剤と免疫賦活性オリゴヌクレオチドとを組み合わせた効果をスクリーニングすることもできる。
【０２５７】
本発明のスクリーニング方法は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドの有効な抗ウイルス組成物および抗ウイルス療法の同定のために有用である。１つのスクリーニングの方法は、ウイルス感染患者からの免疫細胞の単離およびその後の本発明の組成物を用いた細胞の処理を利用する。組成物の有効性は、サイトカインの産生およびウイルス力価を測定することによって評価することができる。そのような測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗ウイルス試験システム、例えば、ＨＣＶレプリコン（参照が必要である）およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫賦活試験システム、例えば、ＴＬＲ９／ＩＦＮ−アルファシグナル伝達経路を担う細胞系を使用することによって実施してよい。別のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用してよいウイルス試験システムは、ＨＣＶのためのモデルとしてのウシウイルス性下痢症ウイルスにより感染させたＰＢＭＣ等、ウイルス感染を模倣するものである。さらに、多くのウイルスが、ＴＬＲ媒介シグナル伝達等の体内の抗ウイルス過程を標的にすることから、対象とするＴＬＲシグナル伝達経路を天然に含有するまたはトランスフェクトした細胞システムと抗ウイルス組成物とを使用して、抗ウイルス剤と免疫賦活性オリゴヌクレオチドとを組み合わせた効果をスクリーニングすることもできる。例えば、１つのそのような組合せの場合、抗ウイルス剤は、ＮＳ３／４プロテアーゼであり、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。
【実施例】
【０２５８】
方法
オリゴヌクレオチドおよび試薬。すべてのＯＤＮおよびＯＲＮは、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、ドイツ）から購入したか、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＧｍｂＨ（Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ、ドイツ）からの提供を受け、同一性および純度については、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＧｍｂＨが制御し、Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー）により測定した場合、検出不可能な内毒素のレベル（＜０．１ＥＵ／ｍｌ）を有した。ＯＤＮを、無菌の内毒素が存在しないＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）中に懸濁させ、ＯＲＮは、無菌の、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼが存在しないｄＨ２Ｏ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）中に懸濁させ、無菌的な条件下で保管および取扱いを行って、微生物および内毒素の両方による汚染を予防した。すべての希釈は、内毒素が存在しないＴｒｉｓ−ＥＤＴＡまたはデオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼが存在しないｄＨ２Ｏを使用して実施した。８−Ｏｘｏ−ｒＧおよびクロロキンをはじめとする、ヌクレオシドは、ＳｉｇｍａまたはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、マサチューセッツ州、米国）から得、ＤＭＳＯ、ＮａＯＨまたはＨ２Ｏ中に溶解させた。
【０２５９】
細胞の精製。健常なヒトドナーからの末梢血液バフィーコート調製物を、ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ（ドイツ）から得、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）上での遠心分離によって精製した。細胞を、５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）または１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてＳｉｇｍａ製）を補ったＲＰＭＩ１６４０培地中で、加湿したインキュベータ中、３７℃で培養した。
【０２６０】
サイトカインの検出。ＰＢＭＣを、５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、９６ウェルの丸底プレートに添加した（２５０μｌ／ウェル）。ＰＢＭＣを、種々のＯＤＮ、ＯＲＮまたはヌクレオシドの濃度と共にインキュベートし、指定した時点後に、培養物の上清（ＳＮ）を収集した。直ちに使用しない場合は、ＳＮを、必要になるまで−２０℃で保管した。阻害実験のために、細胞を、指定したＴＬＲのリガンドの濃度を用いて賦活し、ヌクレオシドまたはＯＲＮを添加した。いくつかの実験では、第２の修飾されたＯＲＮを、細胞培養の開始１時間後に添加した。
【０２６１】
ＳＮ中のサイトカインの量を、市販のＩＬ−１２ｐ４０用ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ製）、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α用ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、フランス製）、または市販の抗体（ＰＢＬ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ニュージャージー州、米国）を使用して開発したＩＦＮ−α用社内ＥＬＩＳＡを使用して評価した。広いセットのサイトカインおよびケモカインの解析のために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）製のｌｕｍｉｎｅｘ  ｓｙｓｔｅｍおよびＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＭｕｌｔｉｐｌｅｘキットを用いたマルチプレックス解析を実施した。
【０２６２】
（実施例１）
８−修飾グアノシンの免疫賦活性核酸への連結の相乗効果を観察した
ヒトＰＢＭＣ（ｎ＝３）を、８−Ｏｘｏ−ｒＧ（Ｃ−８置換グアノシン）修飾ＯＲＮ（配列番号１〜４）および未修飾ＯＲＮ（配列番号８）を用いて賦活した。上清を収集し、サイトカインであるＩＦＮ−アルファ（図１ａ）、ＩＬ−１２ｐ４０（図１ｂ）およびＴＮＦ−アルファ（図１ｃ）を測定した。データは、配列中の８−Ｏｘｏ−ｒＧの付加が、未修飾のＯＲＮ、配列番号１０と比較して、ＩＦＮ−アルファおよびＩＬ−１２を誘発する活性を増強することを実証している。
【０２６３】
（実施例２）
ＲＮＡ配列中の８−修飾Ｇの位置が、活性を増強することができる
ヒトＰＢＭＣ（ｎ＝３）を、単一の８−Ｏｘｏ−ｒＧをＯＲＮの異なる位置に有する指定したＯＲＮ（配列番号１〜４）および８−ブロモ−ｄＡにより修飾された負の対照（配列番号８）を用いて賦活した。上清を収集し、ＩＦＮ−アルファを測定した。データは、８−Ｏｘｏ−ｒＧの５’位における包含（配列番号１および３）の結果、サイトカインの誘導の向上を得るが、別途３’位において包含した場合（配列番号２および４）には、向上を得ないことを示している（図２）。
【０２６４】
（実施例３）
ＯＲＮ５’末端における異なる８−修飾デオキシ−およびリボヌクレオチドが、免疫を賦活する活性を向上させる
ヒトＰＢＭＣ（ｎ＝３）を、ＯＲＮの５’末端において単一の８−Ｏｘｏ−ｒＧ／Ｄｇ（配列番号１、５）、８−ブロモ−ｄＧ（配列番号７）またはイムノシン（イサトリビン）（配列番号６）（５’−５’連結を有する）を有する指定したＯＲＮを用いて賦活し、ＩＦＮ−アルファを測定した。データは、（デオキシ−またはリボヌクレオチドのいずれであっても）８−修飾Ｇの５’位における付加の結果、未修飾のＯＲＮ（配列番号８および１１）と比較して、サイトカインの誘発の向上を得たことを示している（図３）。同様のデータを、８−ブロモ−ｒＧについても得た（データ示さず）。さらに、８−修飾ｄＡまたはｒＡの連結（データ示さず）の結果からも、わずかにすぎないが、サイトカインの誘発の向上を得る。
【０２６５】
（実施例４）
リバビリンと免疫を賦活するＣｐＧ  ＯＤＮとの組合せから、ＩＦＮ−アルファを誘発する活性と比較した場合、ＩＬ−１０を誘発する活性の低下を得る
ヒトＰＢＭＣをＣｐＧ  ＯＤＮ（配列番号１５）を用いて賦活し、リバビリンの増加する用量と共に同時培養すると、リバビリンの、ＣｐＧ誘発性ＩＬ１０の誘発に対する抑制効果を観察することができる。重要なことには、リバビリンの抑制効果は、ＩＦＮ−アルファに関しては観察されなかった。この観察は、とりわけ、リバビリンの低い用量において認められた。
【０２６６】
【表１】
2010504982.tif 000006
【０２６７】
この観察は、治療適応におけるリバビリンの使用に関する重要な意味を有する。ＩＬ−１０は、しばしば治療介入を相殺する調節性のサイトカインである（例えば、ＴＬＲのリガンドまたはＩＦＮ−アルファによる療法の場合）。薬物併用におけるＩＬ１０を抑制する能力は有用である。これは、この能力によって、ＩＦＮおよびその他のサイトカインが増強された応答をもたらすことを可能にし、それによって、治療剤の組合せの効き目が向上するからである。したがって、リバビリンのこの効果から、上記の組合せおよびリバビリンを用いて治療した患者においては、サイトカイン環境の変化を得、サイトカインまたはＴＬＲのリガンドのより強力な、阻害されていない効果もたらすことができる。
【０２６８】
【表２】
2010504982.tif 000007
【０２６９】
（実施例５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、リバビリンの、免疫を賦活するＣｐＧ  ＯＤＮが媒介するＴ細胞サイトカイン産生に対する効果
１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（ＩＰ）リバビリン（ＲＢＶ）を用いた最初の実験は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては、ＲＢＶの効果を示さず、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、ＣＤ−３が誘発するＩＦＮ−γ産生の若干の低下の可能性すら示した。しかし、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、ＲＢＶの存在下での抗ＣＤ３による賦活は、ＩＦＮ−γ産生の増加を示したが、ＲＢＶのかなり低い濃度（１〜５μＭ）においてのみであった。実験を、ＲＢＶのより低い用量（０．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏにおいて繰り返した。
【０２７０】
マウスに、配列番号１４（１００マイクログラムＳＣ）、ＲＢＶ（０．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）、または配列番号１４とＲＢＶを注射した。ＲＢＶは、第０日または第５日のいずれかにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投与し、ＣｐＧは、第０日に投与した。第６日に、鼠頚部リンパ節から試料を単離し、抗ＣＤ３被覆プレート上の培地中で１〜１６μＭ  ＲＢＶの存在下で維持した。第８日に、ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、ＩＦＮ−ガンマを検出した。
【０２７１】
予想したように、ｉｎ  ｖｉｖｏのＣｐＧ  ＯＤＮが、ｅｘ−ｖｉｖｏにおいて、Ｔ細胞のＩＦＮ−γの産生を増加させた（図４Ｂ）。ＣｐＧ  ＯＤＮの非存在下においては、ＲＢＶのＩＦＮ−γ産生に対する小さな効果を観察した（図４Ａ）。しかし、ＲＢＶのＩＦＮ−γ産生に対する効果は、ＣｐＧ  ＯＤＮも注射した場合には、大幅に増強された。
【０２７２】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＲＢＶの、ＣＤ３が媒介するＩＦＮ−γ産生に対する効果を、先のＯＤＮ／ＲＢＶ処置とは独立に調べた。結果を、図５に示す。上記のデータと同様、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける低い濃度のＲＢＶが、先のｉｎ  ｖｉｖｏの処置とは独立に、ＩＦＮ−γのレベルを増加させた（図５Ａ）。ＣｐＧ  ＯＤＮとの組合せの効果を、図５Ｂに示す。
【０２７３】
同様の実験を、骨髄（ＢＭ）由来樹状細胞（ＤＣ）を使用して実施した。ＧＭ−ＣＳＦ中に維持したＢＭ−由来ＤＣを、配列番号１４、ＲＢＶ（１μＭ、５μＭ、１０μＭ、１００μＭもしくは１２０μＭ）、または配列番号１４とＲＢＶを用いて処理した。第４、２４および７２時間で、試料を、サイトカインであるＩＬ−１０（図６）、ＩＬ−１２ｐ４０（図７Ａ）、ＩＬ−１２ｐ７０（図７Ｂ）およびＴＮＦ（データ示さず）について試験した。１２０μＭでは、ＲＢＶ単独の効果は観察されなかった。配列番号１４は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０およびＴＮＦを誘発した。ＲＢＶは、ＩＬ−１０およびＴＮＦを減少させたが、ＩＬ−１２を増加させた（第７２時間においてのみ）。図６に示すように、ＲＢＶは、配列番号１４が誘発するＩＬ−１０を減少させた。ＲＢＶは、配列番号１４が誘発するＩＬ−１２ｐ４０を減少させ、ＩＬ−１２ｐ７０を（若干）増加させた。
【０２７４】
（実施例６）
マウス癌モデル中でのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるリバビリンおよびＣｐＧ  ＯＤＮの効果
Ｃ２６ＳＣマウスモデルを、配列番号１４およびＲＢＶ（１００マイクログラムＯＤＮ、腫瘍内／周囲、第７、１４、２１日、および０．５ｍｇ／ｋｇ  ＲＢＶ  ＩＰ、同日）を用いて処置した。このデータを、図８に示す。第３０〜４０日現在、ＣｐＧ  ＯＤＮ単独療法および組合せ療法の両方が、マウスの生存の延長をもたらした。ＣｐＧ  ＯＤＮプラスＲＢＶは、ＣｐＧ  ＯＤＮ単独療法とは、対数順位解析によっては、統計的な有意差を達成しなかったが、図８に示すように、生存の改善の明確な傾向があった。
【０２７５】
均等物
前記の明細書は、当業者が本発明を実行することができるように十分に記載されているとみなす。実施例は、本発明の一態様の単一の説明を意図し、その他の機能的に均等な実施形態も、本発明の範囲に属するので、本発明の範囲は、提供した実施例によって制限されることはない。本明細書に示しかつ記載したものに加え、本発明の種々の改変形態が、前記の説明から当業者には明らかであり、それらは、付随の特許請求の範囲に属する。本発明の各実施形態が、本発明の利点および目的を必ずしも含有するとは限らない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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