(57)【要約】形質移入剤を用いることなく細胞、組織または臓器に吸収され、標的遺伝子をサイレンシングすることができる二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を提供する。前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、細胞、組織または臓器への前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の輸送および吸収を促進するコンジュゲート部を有する。【選択図】図１８C【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖オリゴヌクレオチド複合体であって、前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、
１８個から３０個のヌクレオチドよりなるセンス鎖と、
１８個から３０個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖と、
コンジュゲート部と、
長さが３個から９個の原子数からなるリンカ分子とから構成され、
前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とは二本鎖を形成し、
前記センス鎖のヌクレオチドの４０％から９０％、および前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの４０％から９０％は、化学的に修飾されたヌクレオチドあり、
前記コンジュゲート部は細胞内への輸送を促進し、
前記リンカ分子は前記コンジュゲート部を前記センス鎖と結合させることを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項２】
前記アンチセンス鎖の１０、１１、１２、１３または１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドとの間にミスマッチを有する、請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖の１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドとの間に前記ミスマッチを有する、請求項２に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項４】
前記化学的に修飾された各ヌクレオチドが、２’F修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドからなる群から選ばれる、請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項５】
前記センス鎖の１番目および２番目のヌクレオチド、全Ｃヌクレオチド、および全Ｕヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の全Ｃヌクレオチドおよび全Ｕヌクレオチドは２’Ｆ修飾ヌクレオチドである、請求項４に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項６】
前記コンジュゲート部は、コレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸、およびエルゴステロールよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項７】
前記リンカ分子は５個から８個の原子よりなる長さを持つ、請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項８】
前記センス鎖の５’末端に結合した色素分子を少なくとも一つ有する、請求項７に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項９】
前記リンカ分子によってコンジュゲート部が前記センス鎖の３’末端に結合されている、請求項１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１０】
前記コンジュゲート部はコレステロールであり、前記リンカ分子は８個の原子よりなる長さを持ち、前記センス鎖が（式１）に示す構造を有する、請求項９に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【化１】
2010504355.tif 000024
【請求項１１】
前記コンジュゲート部はコレステロールであり、前記リンカ分子は５個の原子よりなる長さを持ち、前記センス鎖が（式２）に示す構造を有する、請求項９に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【化２】
2010504355.tif 000025
【請求項１２】
前記センス鎖の１番目および２番目のヌクレオチド、全Ｃヌクレオチド、および全Ｕヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾され、前記アンチセンス鎖の全Ｃヌクレオチドおよび全Ｕヌクレオチドは、２’Ｆ修飾される、請求項１１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１３】
ホスフェート基がアンチセンス鎖の５’末端にある、請求項１２に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１４】
前記センス鎖は１９個から２３個のヌクレオチドよりなる長さを有し、前記アンチセンス鎖は１９個から２３個のヌクレオチドよりなる長さを有する、請求項１３に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１５】
前記アンチセンス鎖の１０、１１、１２、１３または１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドとの間にミスマッチを有する、請求項１４に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１６】
前記アンチセンス鎖の１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドとの間に前記ミスマッチを有する、請求項１５に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１７】
前記アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有し、前記オーバーハングはホスホロチオエート連結部を有する、請求項１６に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項１８】
二本鎖オリゴヌクレオチド複合体であって、前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、
１８個から３０個のヌクレオチドよりなるセンス鎖と、
１８個から３０個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖と、
前記センス鎖３’末端にＣ５リンカ分子を介して結合したコレステロール分子と、
前記アンチセンス鎖の５’末端に位置するホスフェート基とから構成され、
前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
前記センス鎖に結合したコレステロール−リンカ分子は（式３）に示す構造を有し、
前記センス鎖のヌクレオチドの４０％から９０％、および前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの４０％から９０％は、化学的に修飾されたヌクレオチドであることを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【化３】
2010504355.tif 000026
【請求項１９】
前記センス鎖の１番目および２番目のヌクレオチド、全Ｃヌクレオチド、および全Ｕヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の全Ｃヌクレオチドおよび全Ｕヌクレオチドは２’Ｆ修飾ヌクレオチドである、請求項１８に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項２０】
前記アンチセンス鎖の１０、１１、１２、１３または１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドとの間にミスマッチを有する、請求項１９に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項２１】
前記アンチセンス鎖の１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドとの間に前記ミスマッチを有する、請求項２０に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項２２】
前記アンチセンス鎖の３’末端に、ホスフォロチオエート連結部を含む２ヌクレオチドオーバーハングをさらに有する、請求項２１に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体。
【請求項２３】
細胞の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記方法は請求項１から請求項２２までの任意の請求項に記載される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を、前記細胞に輸送する方法。
【請求項２４】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を、逆形質移入により前記細胞中に輸送することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を、生体中前記細胞内に輸送することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から請求項２２までのいずれかの請求項に記載される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体と、医薬品として許容される担体または希釈液の少なくとも一つとを含有する医薬品組成物。
【請求項２７】
請求項１から請求項２２までのいずれかの請求項に記載される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体および希釈血清組織培養培地を含有する医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法第１１９条第ｅ項の下、米国特許仮出願番号第６０/８２６，７０２（出願日：２００６年９月２２日）、米国特許仮出願番号第６０/８６７，７０６号（出願日：２００６年１１月２９日）に基づいて優先権を主張するものであり、前記出願のすべての記載をここに引用するものである。  
【０００２】
本発明は修飾ポリヌクレオチドを用いた遺伝子サイレンシング分野に関する。より具体的には、細胞、組織、または臓器にオリゴヌクレオチドを効率的に輸送するコンジュゲート部を有する二本鎖オリゴヌクレオチド複合体、ならびにその複合体を標的遺伝子のサイレンシングに用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉（以下ＲＮＡｉという）は、マイクロＲＮＡ（以下ｍｉＲＮＡという）によって媒介される、ほぼどこにでもある転写後遺伝子制御である。これら小さな、非コーディングＲＮＡによる遺伝子ノックダウンには、形質移入を分裂させおよび／または翻訳能を弱めるためにｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲを標的化する目的で、ｍｉＲＮＡガイド鎖２位から７位のシード領域を使ったＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（以下ＲＩＳＣという）が利用される。小さな、合成ｄｓＲＮＡ（以下、小さな干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡという）がこのために利用できることが発見されてから、ＲＮＡ干渉は機能的ゲノミックスのツールとして用いられてきた。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、以下のように構成される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を提供するものである。
ａ．約１８個から３０個のヌクレオチドよりなるセンス鎖；
ｂ．約１８個から３０個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖；
ｃ．細胞輸送を促進するコンジュゲート部；
ｄ．長さが約３個から約９個の原子数からなり、前記コンジュゲート部を前記センス鎖と結合させるリンカ分子より構成され、
前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成する。
【０００５】
前記センス鎖のヌクレオチドの約４０％から約９０％、および前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの約４０％から約９０％は、化学的に修飾されたヌクレオチドである。
【０００６】
本発明の実施形態では、前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、前記アンチセンス鎖の１０、１１、１２、１３、または１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドの間にミスマッチを構成する。好ましくは、前記アンチセンス鎖の１４番目のヌクレオチドと前記センス鎖の相対するヌクレオチドの間にミスマッチを有する。
【０００７】
本発明の別の実施形態では、前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の化学修飾された各ヌクレオチドは、２’Ｆ修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドよりなる群から選択される。好ましくは、前記アンチセンス鎖の１番目および２番目のヌクレオチド、全Ｃヌクレオチド、および全Ｕヌクレオチドは、２’Ｆ修飾ヌクレオチドである。
【０００８】
また、本発明の別の実施形態では、前記コンジュゲート部はコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸、またはエルゴステロールよりなる群から選ばれる。
【０００９】
また、本発明の別の実施形態では、前記リンカ分子は５個から８個の原子よりなる長さを持つ。
【００１０】
また、本発明の別の実施形態では、前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、前記センス鎖の５’末端に結合した色素分子を少なくとも一つ有する。
【００１１】
また、本発明の別の実施形態では、前記リンカ分子によってコンジュゲート部が前記センス鎖の３’末端に結合される。
【００１２】
また、本発明の別の実施形態では、前記二本鎖オリグヌクレオチド複合体は（式１）に示す構造を有する。即ち、前記コンジュゲート部はコレステロールであり、前記リンカ分子は８原子数の長さを持ち、前記リンカ分子により前記コレステロールが前記センス鎖の３’末端に結合される。
【００１３】
【化１】
2010504355.tif 000002
【００１４】
また、本発明の別の実施形態では、前記二本鎖オリグヌクレオチド複合体は（式２）に示す構造を有する。即ち、前記コンジュゲート部はコレステロールであり、前記リンカ分子は５原子数の長さを持ち、前記リンカ分子により前記コレステロールが前記センス鎖の３’末端に結合される。
【００１５】
【化２】
2010504355.tif 000003
【００１６】
好適には、上記実施形態において、前記センス鎖の１番目および２番目のヌクレオチド、全Ｃヌクレオチド、および全Ｕヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を施され、前記アンチセンス鎖の全Ｃヌクレオチドおよび全Ｕヌクレオチドは、２’Ｆ修飾を施される。また、上記実施形態の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、前記アンチセンス鎖の５’末端にホスフェート基を有してもよい。上記実施形態のセンス鎖は、好ましくは、ヌクレオチドから約１９個から約２３個分の長さを持ち、アンチセンス鎖はヌクレオチド約１９個から約２３個分の長さを有する。さらに、上記実施形態の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、好ましくは、前記アンチセンス鎖の１０、１１、１２、１３、または１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドの間にミスマッチを有し、より好ましくは、前記アンチセンス鎖の１４番目のヌクレオチドと前記センス鎖の相対するヌクレオチドの間にミスマッチを有する。また、上記実施形態の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、アンチセンス鎖３’末端にオーバーハングを有してもよく、前記オーバーハングはホスフォロチオエート結合部を有する。
【００１７】
また、本発明は別の一面において、以下のように構成される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を提供するものである。
ａ．約１８個から３０個のヌクレオチドよりなるセンス鎖；
ｂ．約１８個から３０個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖；
ｃ．Ｃ５リンカ分子を介して前記センス鎖３’末端に結合したコレステロール分子；
ｄ．前記アンチセンス鎖の５’末端にホスフェート基を有し、
前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
前記コレステロール−リンカ分子−センス鎖は（式３）に示す構造を有する。
【００１８】
【化３】
2010504355.tif 000004
【００１９】
前記センス鎖のヌクレオチドの約４０％から約９０％、および前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの約４０％から約９０％は、化学的に修飾されたヌクレオチドである。好ましくは、前記センス鎖のヌクレオチド１およびヌクレオチド２、全てのＣヌクレオチド、および全てのＵヌクレオチドには、２’−Ｏ−メチル修飾が施され、前記アンチセンス鎖の全てのＣヌクレオチドおよびＵヌクレオチドには、２’Ｆ修飾が施される。好ましくは、前記アンチセンス鎖の１０、１１、１２、１３、または１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドとの間にミスマッチが存在し、より好ましくは、前記アンチセンス鎖の１４番目のヌクレオチドと、前記センス鎖の相対するヌクレオチドとの間にミスマッチが存在する。また、前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、好ましくはホスフォロチオエート結合部を有する前記アンチセンス鎖の３’末端に、２つのヌクレオチドのオーバーハングを有する。
【００２０】
また、本発明は別の一面において、細胞内標的遺伝子の発現を抑制する方法を提供するものである。この方法は、先の実施形態で述べた二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を細胞内に輸送する方法である。実施形態では、逆形質移入によって前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体が細胞内に輸送される。また、別の実施形態では、生体内において前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体が細胞内に輸送される。
【００２１】
また、本発明は別の一面において、先に述べた実施例の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体から構成される医薬品組成物を提供するものであり、更に、医薬品として許容される担体または希釈液を少なくとも一つ含む医薬品組成物を提供する。
【００２２】
また、本発明は別の一面において、コンテナより構成されるキットを提供する。前記コンテナは、先に述べた実施例の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を含み、更には、希釈血清組織培養培地を含む。
本発明の更なる側面および実施形態を、以下の記載によって明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
以下の図は、本発明の理解をさらに深めるためにこの明細書の一部に組み込まれ含まれるものであり、本発明の原理を説明する詳細な記述とともに本発明の好ましい実施形態を例示するものであるが、これによって、本発明は何ら限定されるものではない。
【図１】ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子合成についての一般的合成スキームを表す。
【図２Ａ】１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オール（「Ｃ５」リンカ分子）合成に関する合成スキームを表す。
【図２Ｂ】本発明の好ましい実施形態である、コレステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシフェニルカルバメート（以下「ＣＨＯＬ−５Ｃ」という）合成に関する合成スキームを表す。合わせて、ＣＨＯＬ−Ｃ５のオリゴヌクレオチド合成に用いる、固相用担体およびホスホラミダイト（コレステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）ペンチルカルバメート）合成に関する合成スキームを表す。
【図３】（ａ）は、コンジュゲート部−ω−アミノアルコールリンカ分子合成に関する一般的合性スキームを表す。（ｂ）は、コンジュゲート部−ω−アミノアルコールリンカ分子ホスホラミダイト合成に関する一般的合性スキームを表す。
【図４】ヒドロキシメチルピロリジノールリンカ分子合成に関する一般的合性スキームを表す。
【図５Ａ】５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）ピロリジン−３−オール合成に関する合成スキームを表す。
【図５Ｂ】コレステリル  ６−（２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル）−６−オキソヘキシルカルバメート(以下「ＣＨＯＬ−Ｃ６−ＨＰ」という)合成に関する合成スキームを表す。
【図５Ｃ】ＣＨＯＬ−Ｃ６−ＨＰを用いたオリゴヌクレオチド合成用固相用担体合成に関する合成スキームを表す。
【図６Ａ】コレステリル  ３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−ヒドロキシプロピルカルバメート(以下「ＣＨＯＬ−Ｃ３」という)合成に関する合成スキームを表す。
【図６Ｂ】ＣＨＯＬ−Ｃ３を用いたオリゴヌクレオチド合成に関する固相用担体の合成を表す。
【図７】オリゴヌクレオチド合成用固相用担体に結合したコンジュゲート部−１，３−ジオールリンカ分子合成の一般的合性スキームを表す
【図８Ａ】５’および３’センス鎖コンジュゲート結合を有する二本鎖の、５００ナノモル、１マイクロモル、および５マイクロモルにおける相対的機能を棒グラフで表す。低濃度において、３’センス鎖コンジュゲートがより強い機能を示すことを表す。
【図８Ｂ】３’センス鎖または３’アンチセンス鎖にコレステロールコンジュゲート結合を有する二本鎖を、１マイクロモルと０．５マイクロモル濃度で比較した結果を表す。３’センス鎖コンジュゲートが３’アンチセンス鎖よりも強い遺伝子ノックアウト能を有することを示している。ここで、Ｙ軸は発現の割合を表し、「ｘｘ」はヌクレオチド間ホスフォロチオエート修飾の位置を表す。ｍＧＡＰＤＨ  ＳＯＳはコレステロールコンジュゲート非保持のＧＡＰＤＨ標的分子を表す。なお、ＳＯＳ修飾型には、センス鎖の全Ｃ、全Ｕでの２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全Ｃ、全Ｕでの２’Ｆ修飾、アンチセンス鎖５’末端位の５’ホスフェート基、および（５’末端より数えて）センス鎖の１位、２位における２’−Ｏ−メチル修飾が含まれる。また、「ＮＴＣ＃１０Ｃ８-Ｃｈｏｌ」は、Ｃ８リンカ分子を介しコレステロールで修飾した非標的コントロール複合体を表す。表１‐１から表１‐４、表２‐１から表２‐２に異なるリンカ分子の構造式を示した。
【図９】リンカ分子の長さを変えたときの比較を表す。各分子はエレクトロポレーションを用いて細胞内に導入した。矢印で示したオリゴヌクレオチドとコンジュゲートとの間に、５（以下「Ｃ５」という）、６（以下「ＰＩＰ」という）、７（以下「ＡＢＡ」という）原子数を有するリンカ分子は、より強い機能を示した。ここで、発現の割合をパーセントとしてＹ軸で示した。
【図１０Ａ】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるコレステロールコンジュゲート分子の機能を表す。ＰＰＩＢ＿３  ｓｉＲＮＡは、ヒトＰＰＩＢ遺伝子を標的とする。ＮＳＣ＃１を、非特異的コントロールにおいた。Ｃ８は、リンカ分子長を表す（表１‐１から表１‐４、表２‐１から表２‐２参照）。Ｃｈｏｌは、コレステロールを表す。発現は分岐ＤＮＡアッセイ（ＢＤＮＡ、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を用いて測定し、生育能はＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  アッセイを用いて測定した。
【図１０Ｂ】ＳＨＳＹ５Ｙ細胞におけるコレステロールコンジュゲート分子の機能を表す。なお、図中の記号は図１０Ａと同様の意味を表す。
【図１０Ｃ】ＨＵＶＥＣ細胞におけるコレステロールコンジュゲート分子の機能を表す。なお、図中の記号は図１０Ａと同様の意味を表す。
【図１０Ｄ】ＥＳ−Ｄ３幹細胞におけるコレステロールコンジュゲート分子の機能を表す。なお、ｍＧＡＰＤＨはマウスＧＡＰＤＨ標的ｓｉＲＮＡを表し、その他の図中の記号は図１０Ａと同様の意味を表す。
【図１０Ｅ】３Ｔ３  ＮＩＨ幹細胞におけるコレステロールコンジュゲート分子の機能を表す。なお、図中の記号は図１０Ｄと同様の意味を表す。
【図１１】アンチセンス鎖３’オーバーハングにおける、ヌクレオチド間結合部の修飾対非修飾での機能の違いを表す。ここで、両分子はＳＯＳ修飾型を有し、センス鎖の全Ｃ、全Ｕでの２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全Ｃ、全Ｕでの２’Ｆ修飾、アンチセンス鎖５’末端位の５’ホスフェート基、および（５’末端より数えて）センス鎖の１位、２位における２’−Ｏ−メチル修飾が含まれる。この結果は、ヌクレオチド間安定化リンカ分子の導入は、明らかに全体の機能を向上させることを示した。ここで、ＮＣＳは、非特異的配列を表し、「Ｎａｋｅｄ」は、非修飾型の二本鎖を表す。
【図１２】アセチル基キャップのＣ８またはＣ１４リンカ分子を有する二本鎖の機能と、コレステロールに結合するＣ８リンカ分子を有する二本鎖の機能との比較を表す。「ＮＴＣ」は非標的コントロール（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌｅ）配列を表し、「Ａｃ」はリンカ分子のアセチル基キャップを表し、「ＳＯＳ」は修飾型を表し、この中にはセンス鎖の全Ｃ、全Ｕでの２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全Ｃ、全Ｕでの２’Ｆ修飾、アンチセンス鎖５’末端位の５’ホスフェート基、および（５’末端より数えて）センス鎖の１位、２位における２’−Ｏ−メチル修飾が含まれる。また、“Ｃｈｏｌ”はコレステロールを表す。この結果から、輸送ならびに遺伝子サイレンシングには、コレステロールをコンジュゲートさせることが非常に有効であるが、一方、単純なアセチル基キャプでは無効であることが証明された。
【図１３Ａ】Ｃ８リンカ分子保有二本鎖にコンジュゲートするコレステロールに適用可能な化学修飾を表す。
【図１３Ｂ】ヒト（ＨｅＬａ）、マウス（３Ｔ３ＮＩＨ）細胞における、図１３Ａで示す化学修飾保有のＰＰＩＢならびにＧＡＰＤＨ標的二本鎖の機能を表す。
【図１４Ａ】受動輸送における遺伝子ノックダウンの動力学を表す。グラフから、ＴＰ５３標的Ｇ４ｓｉＲＮＡを０．１マイクロモルおよび１．０マイクロモル濃度でＨｅＬａ細胞に形質移入した結果、７２時間でノックダウンがピークに達したことが示される。ここで、Ｙ軸は発現された標的遺伝子の割合を表し、Ｘ軸は受動輸送開始後の時間を表す。
【図１４Ｂ】Ｇ４ｓｉＲＮＡ誘発遺伝子ノックダウンの寿命を表す。ＰＰＩＢ標的Ｇ４ｓｉＲＮＡは受動輸送によってＨｅＬａ細胞に導入した。１マイクロモル濃度において、７５％を超えるサイレンシングが少なくとも４日間持続することが証明された。ここで、Ｙ軸は発現された標的遺伝子の割合を表し、Ｘ軸は受動輸送開始後の時間を表す。
【図１５Ａ】１００ｎＭ、１０００ｎＭ（ｓｉＲＮＡ−コレステロール）でのＧ４ｓｉＲＮＡ受動輸送、１０００ｎＭでのリポフェクタミン２０００媒介輸送、および脂質処理単独の各条件下において誘発された遺伝子数を表す。Ｙ軸はアップレギュレーションされた遺伝子数を表し、白棒はアップレギュレーションされた遺伝子の総数を、黒棒は前炎症性遺伝子の数を表す。
【図１５Ｂ】ｓｉＲＮＡが、Ｇ４受動輸送中におよび脂質媒介輸送中に誘発されたＩＬ６、ＩＬ８の誘発レベルを表す。「ＨｙＱＲＳ」は希釈血清培地を表し、「Ｇ４＃１−４」は４つの異なるＧ４ｓｉＲＮＡを表し、「２９ｍｅｒ」は強いＩＬ６、ＩＬ８反応を誘発した２９塩基対の二本鎖を表し、更に、「２１ｍｅｒ」は脂質形質移入によって輸送された２１塩基対の二本鎖を表す。この結果から、脂質輸送型ｓｉＲＮＡが強いＩＬ６、ＩＬ８サイトカイン反応を誘発する一方で、受動輸送型Ｇ４ｓｉＲＮＡはほとんど内在的免疫反応を誘発しなかった。
【図１５Ｃ】脂質輸送媒介型ｓｉＲＮＡおよび受動輸送型Ｇ４ｓｉＲＮＡを用いたときの、標的ノックダウンならびにオフターゲットノックダウンを表す。ＰＰＩＢを標的とするｓｉＲＮＡの脂質媒介輸送後に、およびＰＰＩＢを標的とするＧ４ｓｉＲＮＡ受動輸送後に、標的遺伝子（ＰＰＩＢ）ならびに６個のオフターゲット遺伝子の発現レベルを観察した。Ｙ軸は正常と比較した場合の各遺伝子の発現の割合を％で表す。受動輸送型Ｇ４ｓｉＲＮＡは、オフターゲット作用をほとんどまたは全く誘発しなかった。
【図１６】希釈血清培地におけるＧ４ｓｉＲＮＡ安定性を示したグラフを表す。希釈血清培地でＰＰＩＢ標的Ｇ４ｓｉＲＮＡ保存溶液を調製し、＋４℃で保存した。合成した分子の活性は、ＰＰＩＢ遺伝子ノックダウンを測定することにより（分岐ＤＮＡアッセイ）３１日間にわたり異なる時点で試験した。比較用に、ユニバーサルバッファー中−２０℃保存したＧ４ＰＰＩＢｓｉＲＮＡを解凍し、希釈血清培地に添加、４℃試料と並べて比較した。ここでＹ軸はＰＰＩＢ発現の割合を表す。これらの結果から、希釈血清培地にてＧ４ｓｉＲＮＡは活性を失うことなく長期間保存可能なことが示された。なお、「ＮＴＣ」は非標的コントロ−ル（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を表す。
【図１７Ａ】Ｇ４ｓｉＲＮＡを用いて連続遺伝子ノックダウンを起こすためのプロトコールを図で表したものである。
【図１７Ｂ】連投実験中におけるＰＰＩＢおよびＧＡＰＤＨ遺伝子ノックダウン結果を表す。これらの結果から、先に述べたプロトコールにより、少なくとも３０日間は強い遺伝子ノックダウンが起きることが明らかに示された。
【図１８Ａ】コレスタノール、コレステロール、スチグマステロール、プレグネノロン、アンドロステロン、エルゴステロール、およびコラン酸の構造を表す。丸で囲まれた部分は、コレステロールと化学構造上特に異なる部分を表す。
【図１８Ｂ】コレスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、またはコラン酸とコンジュゲートしたＧ４ｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞にて遺伝子ノックダウン能を比較した結果を表す。
【図１８Ｃ】コレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、またはコラン酸とコンジュゲートしたＧ４ｓｉＲＮＡを、３Ｔ３ＮＩＨ細胞にて遺伝子ノックダウン能を比較した結果を表す。
【図１８Ｄ】コレステロール（例えばｍＧＡＰＤＨ−Ｃ５−ＡＮＤＲ）、プレグネノロン（例えばｍＧＡＰＤＨ−Ｃ５−ＰＲＥＧ）、アンドロステロン（例えばｍＧＡＰＤＨ−Ｃ５−ＡＮＤＲ）修飾ｓｉＲＮＡを有するｈＰＰＩＢならびにｍＧＡＰＤＨ  Ｇ４ｓｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン能を、マウス３Ｔ３ＮＩＨ細胞およびヒトＨｅＬａ細胞にて比較した結果を表す。
【図１９Ａ】ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)がＧ４ｓｉＲＮＡ受動輸送に与える影響を表したものである。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１μＭのＧ４ＧＡＰＤＨ標的ｓｉＲＮＡに対して血清濃度を変化させて（０−１０%ＦＣＳ、ｖ／ｖ）暴露し、ｔ＝７２時間にて遺伝子サイレンシング能を定量した。ここで、Ｙ軸は標準化したＧＡＰＤＨ発現レベルを示す。この結果から、血清濃度の増加は受動輸送に悪影響を与えることが示された。
【図１９Ｂ】ＨｅＬａ細胞にて血清濃度がＧ４ｓｉＲＮＡ受動輸送に与える影響を表したものである。血清濃度は０−３％の範囲で変化させ、ＰＰＩＢ標的Ｇ４ｓｉＲＮＡの濃度は０．１から１．０μＭの間で変化させた。この結果から、ＰＰＩＢ発現をＧ４ｓｉＲＮＡがサイレンシングする能力に対し、血清濃度が重要な役割を果たしていることが示された。
【図１９Ｃ】ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞にて血清濃度がＧ４ｓｉＲＮＡ受動輸送に与える影響を表す。血清濃度は０−３％の範囲で変化させ、ＰＰＩＢ６９ならびにＰＰＩＢ３９)Ｇ４ｓｉＲＮＡの濃度は０．１から１．０μＭの間で変化させた。この結果から、ＰＰＩＢ発現をＧ４ｓｉＲＮＡがサイレンシングする能力に対し、血清濃度が重要な役割を果たしていることが示された。
【図１９Ｄ】３種の異なるコレステロール結合タンパク質／タンパク質複合体（アルブミン、ＬＤＬ、およびＨＤＬ）が、遺伝子発現に与える影響を表す。３Ｔ３ＮＩＨ細胞を、共存するそれぞれの前記タンパク質濃度を０−１０μＭの範囲で変化させながら、０．５μＭのＧ４  ＧＡＰＤＨ標的ｓｉＲＮＡに暴露した。ここで、Ｙ軸はＧＡＰＤＨ発現の割合を示した。この結果から、各コレステロール結合タンパク質の濃度の増加は、Ｇ４ｓｉＲＮＡの受動輸送に悪影響を及ぼすことが示された。
【図２０Ａ】Ｃ５ならびにＨＰ６リンカ分子の化学構造式を表す。
【図２０Ｂ】ＰＰＡＲ−ガンマならびにアポＢ標的Ｇ４ｓｉＲＮＡが、腎臓、脾臓、肝臓、心臓、および肺の遺伝子に対しての標的能力を表す。この結果から、Ｇ４ｓｉＲＮＡは多様な組織において遺伝子をサイレンシングさせることが可能であることが示された。
【図２１Ａ】Ｇ４ｓｉＲＮＡのセンス６位−１０位（センス鎖５’位から数えて）でのセンス鎖とアンチセンス鎖間のシングルミスアマッチが及ぼす影響を表す。配列変換はセンス鎖において起きるので、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡ間の相補性は完全に保存される。この結果から、センス鎖６位または７位でのミスマッチ導入は、著しく遺伝子ノックダウンを増強することが示された。
【図２１Ｂ】広範囲の実験で６位ミスマッチがＧ４ｓｉＲＮＡ機能に与える影響を表す。Ｇ４（−ｍｍ）またはＧ４（＋ｍｍ）二本鎖として合成された８７個のｓｉＲＮＡが、１μＭ濃度で細胞内に形質移入された。これらの実験のために、６位に導入されたミスマッチは、センス鎖固有のヌクレオチドをアンチセンス鎖の対応位置に見られるヌクレオチドに常に置換して構成された（例えばＡ−Ａ、Ｇ−Ｇ、Ｃ−Ｃ、Ｕ−Ｕミスマッチなど）。また、遺伝子ノックダウンの評価には分岐ＤＮＡアッセイを用いた。この結果から、センス鎖６位（１９ヌクレオチドセンス鎖に対し、５’末端より数えてアンチセンス鎖１４位）でのミスマッチ導入が、著しい割合でＧ４ｓｉＲＮＡ機能を増強することが示された。
【図２２】Ｇ４ｓｉＲＮＡによって起きる、一連のヒトおよびマウス遺伝子のノックダウン能を表す。個々のまたはプーリングされた二本鎖によるＧ４ｓｉＲＮＡノックダウンに伴う各遺伝子（マウスまたはヒト）の発現レベルを相対的に表す。ここで、Ｙ軸は標的遺伝子が発現する割合を示す。Ｘ軸は個々のＧ４しＲＮＡによって標的にされる参照遺伝子を示す。「Ｆ７５」とは、７５％ノックダウンを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の様々な実施形態の上記詳細な説明は、例示および説明を目的としてなされたものであり、網羅的な説明を意図したものでも、開示された実施形態そのものに本発明を制限することを意図したものでもない。種種の変形や変更が可能なことは当業者には明らかである。前記実施形態は、本発明の原理およびその実用的な応用を最もよく説明するために選ばれて記載されたものであり、その説明によって、企図された具体的な利用目的に応じた種種の実施形態および種種の変更が本発明により可能であることを、当業者は理解することができる。本発明の範囲は、上記の請求項およびその均等物によって定義されるものである。
【００２５】
本発明は、ＲＮＡ干渉を行うための組成物ならびに方法に関する入門書を開示するものではない。本発明はＲＮＡ干渉を行うための組成物ならびに方法に関するものであり、ｓｉＲＮならびにｍｉＲＮＡ誘発遺伝子サイレンシング、ｍｉＲＮＡ阻害等を含む。本願の修飾ポリヌクレオチドおよびその誘導体を使用することによって、ＲＮＡ干渉への適応効率を向上することができる。
【００２６】
一般にここで用いられる用語ならびに成句は、技術的に認められた意味を有し、当業者に知られた標準的な本、雑誌文献を参照することで見出すことができる。以下の用語の定義は、本発明の記載における用例を明らかにするために記載するものである。
【００２７】
（アルキル）
用語「アルキル」とは、飽和または不飽和、さらに置換または未置換型であるヒドロカルビル部分のことをいう。それは、直鎖状、分岐状、環状、および／または複素環状であり、かつエーテル、ケトン、アルデヒド、カルボン酸塩等の官能基を含む部分から構成されるものであってもよい。  
【００２８】
典型的なアルキル基として、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、およびより大きい炭素数のアルキル基、同様に２−メチルプロピル、２−メチルー４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロイル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、および２−エチルヘキシルが挙げられる。上記用語アルキルはまた、アルケニル基、例えばビニル、アリル、アラルキル、およびアルキニル基も包含する。特に限定しない限り、アルキル基は置換型ではない。
【００２９】
アルキル基内での置換としては、アルキル部分で許容される任意の原子または基を含むことができ、限定されるものではないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、ならびに酸素が挙げられる。一例として、アルキル基は、アゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ、ニトロソまたはニトリル基等の修飾と、イミダゾールなどの複素環、ヒドラジノまたはヒドロキシルアミノ基、イソシアネートまたはシアネート基、スルホキシド、スルホン、スルフィド、ジスルフィド等の硫黄含有基を、含んでいてもよい。特に限定しない限り、アルキル基は、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン、アミド、エーテル、エステル、アルコール、酸素、または上記修飾を含まない。
【００３０】
さらに、アルキル基はまた、ヘテロ置換を含むものであってもよく、このような置換では、炭素原子が、例えば窒素、酸素、もしくは硫黄によって置換されるもので、複素環置換は、１つ以上のヘテロ原子を持つアルキル環のことをいう。ヘテロ環部分の例として、限定されるものではないが、モルホリノ、イミダゾール、およびピロリジノが挙げられる。特に限定しない限り、アルキル基は、ヘテロ置換基または１つ以上のヘテロ原子を含むアルキル環（例えば複素環置換基）を含まない。
【００３１】
２’位修飾の好ましいアルキル基としては、リボシル部の２’位炭素にＯ−結合をもつメチル基、例えば、２’−Ｏ−メチル基を有する２’−Ｏ−アルキルなどが挙げられる。
【００３２】
（２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド）
「２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド」という成句は、糖部分を有するヌクレオチド単位のことをいい、例えば、該ヌクレオチド単位は糖部分、該糖の２’位に位置した炭素原子とアルキル基との両方に酸素原子が結合するようにして２’位で修飾されるデオキシリボシル部分が挙げられる。種々の実施形態において、前記アルキル部分は炭素および水素から構成されるが、特に好ましい実施形態としては、メチル基が挙げられる。
【００３３】
（アンチセンス鎖）
本明細書で用いられる成句であり、「ＡＳ」と表わされることもある「アンチセンス鎖」は、目的とするところの標的核酸に対して、実質的に（例えば８０％以上）または１００％相補的であるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一領域のことをいう。アンチセンス鎖は、ポリヌクレオチド領域、すなわちＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラＲＮＡ／ＤＮＡから構成可能である。例えば、アンチセンス鎖は、一分子の伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡではないＲＮＡ配列（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｈｎＲＮＡ）、あるいはコードまたは非コードのＤＮＡ配列に対して全体的または部分的に相補的であってもよい。前記「アンチセンス鎖」としては、２本の異なる鎖から形成されるポリヌクレオチドのアンチセンス領域と、ヘアピン構造を形成することができる単分子のｓｉＲＮＡとが挙げられる。「アンチセンス鎖」および「アンチセンス領域」という成句は、等価であることを意図しており、同義的に使われる。前記アンチセンス鎖は、低分子および／またはコンジュゲートの多様な群によって修飾することができる。
【００３４】
（２’炭素修飾）
「２’炭素修飾」とは、糖サブユニット２’位が修飾された糖部分を有するヌクレオチド単位のことをいう。この位置で、糖の２’位に位置した炭素原子と、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−イソプロピル、２’−Ｏ−ブチル、２’−Ｏ−イソブチル、２’−Ｏ−エチル−Ｏ−メチル（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、および２’−Ｏ−エチル−ＯＨ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）等のアルキル基との両方に、酸素原子が結合するようにして、「２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド」は修飾される。「２’炭素センス修飾」とは、センス鎖上またはポリヌクレオチドのセンス領域内にあるヌクレオチドの２’炭素位における修飾のことをいう。「２’炭素アンチセンス修飾」とはアンチセンス鎖上またはポリヌクレオチドのアンチセンス領域内にあるヌクレオチドの２’炭素位における修飾のことをいう。
【００３５】
（相補性）
用語「相補性」とは、互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力のことをいう。塩基対は、逆平行ポリヌクレオチド鎖または領域内のヌクレオチド単位間の水素結合によって、一般的に形成される。相補性ポリヌクレオチド鎖または相補性ポリヌクレオチド領域は、ワトソン・クリック方式（Ａ対Ｔ、Ａ対Ｕ、Ｃ対Ｇなど）で塩基対を形成することができ、あるいは安定な二本鎖を形成することが可能な他の任意の方法で塩基対を形成することができる。
【００３６】
完全相補性または１００％相補性とは、一方のポリヌクレオチド鎖または領域の各々のヌクレオチド単位が他方のポリヌクレオチド鎖または領域の各のヌクレオチドと水素結合を形成することができる状況のことをいう。完全相補性に満たないとは、２本の鎖または２つの領域の、すべてではないがいくつかのヌクレオチド単位が互いに水素結合することができることをいう。例えば、２つの２０量体に関して、もし各鎖上の２つの塩基対のみが互いに水素結合することができる場合、それらのポリヌクレオチド鎖またはポリヌクレオチド領域の相補性が１０％であることを示している。同じ例で、各鎖または各領域上の１８塩基対が互いに水素結合することができる場合、ポリヌクレオチド鎖は９０％相補性を示す。実質的な相補性とは、８０％以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖またはポリヌクレオチド領域のことをいう。
【００３７】
（二本鎖）
用語「二本鎖」とは、鎖と鎖とが塩基対をなす結果、２本の非平行なポリヌクレオチドによって形成された二本鎖構造を有する領域のことをいう。二本鎖は、２本の異なるポリヌクレオチドで形成されてもよいし、単一のポリヌクレオチド配列をもつ鎖、例えばヘパリンの「ループ」部分によって２本の鎖が互いに非平行な構造をとることができるヘパリン構造など、で形成されてもよい。更に、二本鎖構造をミスマッチやループとして解釈してもよい。例えば、非平行な２本の鎖が同じ長ではあるが配列では１００％の相補性ではないところでは、二本鎖領域はミスマッチがあるために塩基対をしない領域として解釈される。
【００３８】
（デオキシヌクレオチド）
用語「デオキシヌクレオチド」とは、２’および／または３’炭素に結合した水素を持つ代わりに、適当な結合および／または２’、３’末端ジデオキシを持つ糖部分の２’または３’位で、ＯＨ基を欠いているヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
【００３９】
（デオキシリボヌクレオチド）
用語「デオキシリボヌクレオチド」および「ＤＮＡ」は、リボシル部分の２’位にＨを持つ少なくとも１つのリボシル部分を含むヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
【００４０】
（遺伝子）
用語「遺伝子」とは、転写および非転写両要素を有するものとして定義される。例えば、遺伝子には、特定のｍＲＮＡ形質移入、または非コーディングＲＮＡ発現のレベル、タイミング、組織特異性を決定する役割を持つ任意の非転写エンハンサーおよび／またはプロモーター（例えばゲノミックＤＮＡ）を含めることができる。更に、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの非コーディングＲＮＡ、および５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、３’ＵＴＲ、イントロン等が遺伝子の要素として含まれる。
【００４１】
（脂質非依存型輸送剤）
用語「脂質非依存型輸送剤」とは、技術的に認められた核酸輸送剤（リポフェクタミン、リポフェクタミン２０００、ダーマＦＥＣＴなど）を用いることなく輸送能を高めるために用いる、核酸にコンジュゲート可能な任意の数の分子のことをいう。このようなコンジュゲートは、天然の脂質であるか、あるいはタンパク質、炭水化物などで構成される。
【００４２】
（ミスマッチ）
用語「ミスマッチ」とは、センス鎖ヌクレオチドとアンチセンス鎖ヌクレオチドの間でワトソン−クリック型塩基対が形成されないことをいう。ミスマッチの例としては、Ａ対Ｇ、Ｃ対Ａ、Ｕ対Ｃ、Ａ対Ａ、Ｇ対Ｇ、Ｃ対Ｃなどが挙げられるが、同じく、非塩基残基対ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、非環状残基対ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、ギャップ、または非対ループも含まれる。広い意味において、ここで用いられるミスマッチには、特定の位置における二本鎖の熱力学的安定性がその位置におけるワトソン−クリック型塩基対の熱力学的安定性よりも低くなるように、前記の位置またはその近傍での熱力学的安定性を減少させる、その位置での任意の変換も含まれる。
【００４３】
（ヌクレオチド）
用語「ヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはそれらの修飾された形態、さらにはそれらの類似体のことをいう。ヌクレオチドとして、プリン、例えばアダニン、ヒポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられ、さらにピリミジンとして、例えばシトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体および類似体が挙げられる。「ヌクレオチド」は、好ましくは、シトシン、ウラシル、チミン、アデニン、またはグアニン部分を有する。
【００４４】
ヌクレオチド類似体としては、塩基、糖、および／またはリン酸塩の化学構造に修飾を持つヌクレオチドが挙げられる。該ヌクレオチドとしては、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン環外アミン、および５−ブロモウラシル置換のヌクレトチド、ならびに２’位糖修飾として、糖修飾リボヌクレオチドが挙げられる。ここで、該リボヌクレオチドの２’−ＯＨは、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、もしくはＣＮ等によって置換され、Ｒは本明細書に定義したようにアルキル部であるが、これらに限定されるものではない。また、ヌクレオチド類似体は、イノシン、キューオシン、キサンチンなどの塩基、２’−メチルリボースなどの糖、メチルホスホネート、ホスホロチオエートなどの非天然型ホスホジエステルヌクレオチド間連結部、ならびにペプチドが含まれていてもよい。
【００４５】
ここにおいて、修飾塩基とはヌクレオチド塩基のことを表し、該塩基として、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ならびに、１つ以上の原子もしくは基の置換または付加によって修飾されたウラシル、キサンチン、イノシン、およびキューオシンが挙げられる。塩基部分が修飾されたヌクレオチドの塩基修飾の例としては、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミン化、アミド化、またはアセチル化された種々の組み合わせの塩基が挙げられるが、これによって限定されるものではない。より特異的な修飾塩基としては、例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジンおよび５位に修飾を持つ他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルオキシウリジン、２−メチルアミノエチルウリジン、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジンが挙げられる。さらに、他のチオ塩基、例えば２−チオウリジンおよび４−チオウリジン、および２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のＯ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えばＮ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えばアミノフェノールもしくは２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇ−クランプ・ヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、８−置換アデニン、およびグアニン、５−置換ウラシルおよびチアミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシルアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアクリル化ヌクレオチドが挙げられる。修飾ヌクレオチドもまた、糖部分に関して修飾されたヌクレオチドと、さらにリボシルではない糖または類似体を持つヌクレオチドとが挙げられる。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、ならびに他の糖、ヘテロ環、または炭素環が挙げられる。ヌクレオチドという用語もまた、広範な塩基として当業者に知られているものを含むことが意図されている。例えば、広範な塩基として、３−ニトロピリジン、５−ニトロインドール、またはネブラリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
さらに、用語「ヌクレオチド」には、ヌクレオチドに結合する放射活性、蛍光活性部分を検出可能な標識として有するヌクレオチド、または質量ラベルをもつヌクレオチドも含まれる。
【００４７】
（オフ・ターゲット）
用語「オフ・ターゲット」および成句「オフ・ターゲット効果」とは、所定の標的に向けられたｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが、別のｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、または細胞タンパク質もしくは他の部分と直接あるいは間接的に相互作用することによって、意図されない効果を生ずるという任意の事例のことをいう。例えば、「オフ・ターゲット効果」は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのセンスおよび／またはアンチセンス鎖と他の転写産物との間の部分的相同性または相補性によって、他の転写産物が同時に分解する時に、生ずる可能性があるものである。
【００４８】
（オーバーハング）
用語「オーバーハング」とは、第１の鎖または領域が二本鎖を形成する相補性鎖の末端を越えて延びる１本の鎖または領域から生ずる、末端塩基対非形成型ヌクレオチドのことをいう。水素結合によって二本鎖を形成することが可能な１つ以上のポリヌクレオチドがオーバーハングを持つことができる。二本鎖の３’位および／または５’位末端を越えて伸張する単一鎖領域もオーバーハングである。
【００４９】
（リボヌクレオチドおよびリボ核酸）
用語「リボヌクレオチド」およびフレーズ「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、少なくとも１つのリボヌクレオチド単位を含む修飾または未修飾のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。リボヌクレオチド単位は、Ｎ−グリコシド連結部においてリボシル部分１’位で結合した窒素塩基を持つリボシル部分の２’位に結合する酸素を有する。さらに、別のヌクレオチドに対する連結を可能にするか、もしくは連結を不可能にするリボシル部分の２’位に結合する酸素を含む。
【００５０】
（ＲＮＡ干渉およびＲＮＡｉ）
成句「ＲＮＡ干渉」および用語「ＲＮＡｉ」は同義であり、Ｄｒｏｓｈａ、ＲＩＳＣ、Ｄｉｃｅｒ等を含むが、これらに限定されるわけではなく、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡなどの、単一の、２つ、または３つの分子が、ＲＮＡｉ経路における１つ以上の過程で相互作用して生物学的プロセスに影響を与えるプロセスを表す。このプロセスは、限定されるものではないが、ｍＲＮＡを分解し、翻訳能を弱める作用、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡとの相互作用、付加的なタンパク質によりＤＮＡメチル化が阻害されることによって引き起こされる遺伝子サイレンシングプロセスを含む。更に、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤などのＲＮＡｉ調整分子が、ＲＮＡｉ経路を増強させる分子として挙げられる（Ｔｏｍａｒｉ，Ｙ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００５，１９（５）、５１７−５２９）。
【００５１】
（センス鎖）
成句「センス鎖」とは、伝令ＲＮＡまたはＤＮＡ配列等の標的核酸として、部分的または全体的に、同一のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドまたは領域のことをいう。ある配列が与えられた場合、慣例によって特に明記しない限り、その配列はセンス鎖（または領域）を表すが、それと相補的なアンチセンス鎖（または領域）が存在していることも意味している。
【００５２】
（サイレンシング）
成句「サイレンシング」とは、ＰＣＲ法、ノーザンブロット分析、分岐ＤＮＡ，ウエスタンブロット分析、およびその他技術的に認められた技術を含む任意の数の方法によって測定される、ＲＮＡｉ媒介による遺伝子発現の減少として定義される。
【００５３】
（ｓｉＲＮＡ、すなわち短い干渉ＲＮＡ）
用語「ｓｉＲＮＡ」および句「短干渉ＲＮＡ）」とは、単分子の核酸のことをいい、またはＲＮＡｉを行うことが可能であり、かつ塩基対の長さが約１８から３０である二本鎖を持つ、２本の異なる鎖から構成される核酸のことをいう。また、用語「ｓｉＲＮＡ」および句「短干渉ＲＮＡ」としては、リボヌクレオチド部分以外の部分も含む核酸が挙げられ、該部分としては、限定されるものでないが、修飾ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド間連結部、非ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、および上記ヌクレオチドの類縁体が挙げられる。
【００５４】
（医薬的に許容される担体）
成句「医薬的に許容される担体」とは、動物またはヒトに本発明の組成物を輸送するための医薬的に許容される塩、溶媒、分散剤、またはビークルをいう。前記担体は、液体、半固体または固体であってよく、しばしば希釈液、賦形剤、または塩と同義に用いられる。成句「医薬的に許容される」とは、成分、賦形剤、担体、希釈液が、合理的な利益／危険率（比）をもち、毒性、刺激、アレルギー反応などの副作用を起こすことなくヒトおよび／または動物に用いることができることを表す。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐａｈｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ  編集（１９８０）参照。
【００５５】
以下の実施形態は、本発明の理解を助けるために示されるものであって、本願の発明をいかなる意味においても限定するものではない。本願を読んで当業者にとって明らかである全ての変更、および等価体は本願の発明の範囲に含まれる。
【００５６】
本発明はその第一の特徴として、以下のように構成される二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を提供するものである。
１．約１８個から３０個のヌクレオチドよりなるセンス鎖；
２．約１８個から３０個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖；
３．細胞輸送を促進するコンジュゲート部；
４．長さが約３個から約９個の原子数からなるリンカ分子より構成され、
前記アンチセンス鎖は標的遺伝子と同じく前記センス鎖に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、前記リンカ分子は前記コンジュゲート部を前記センス鎖と結合させる。
【００５７】
「標的遺伝子と同じく前記センス鎖に対して高い相補性を有し」とは、前記アンチセンス鎖が二本鎖を形成するに十分なセンス鎖との相補性を有する、および二本鎖オリゴヌクレオチド複合体のＤｉｃｅｒ処理に続いてＲＮＡ干渉が生じるに十分な標的遺伝子との相補性も有するということである。前記アンチセンス鎖は、好ましくはセンス鎖および標的遺伝子に対し少なくとも８０％の相補性、つまり実質的な相補性を示す。以下に、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の個々の特徴を述べる。
【００５８】
＜コンジュゲート部＞
本発明のコンジュゲート部（単に「コンジュゲート」とも呼ぶ）は、色々な構造を持つことが可能で、様々な手段による細胞内への導入を対象にできる。例えば、コンジュゲート部を天然の脂質とすることが可能であり、ｓｉＲＮＡまたは他の核酸といった被輸送物を、エンドサイトシスを含む作用機序によって膜に挿入して細胞に吸収させることで、細胞内に輸送することが可能である。例えば、脂質型コンジュゲート部は、カチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、ならびにステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノレイン酸、リノレアイジン酸、リノレン酸、およびミリスチン酸を含む脂肪酸を含むことが可能である。他方、コンジュゲート部を、ＴＡＴ、ペネトレイン、ＭＡＰなどの膜貫通型タンパク質、またはポリ（Ｌｙｓ）、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｈｉｓ）、ポリ（Ｌｙｓ／Ａｒｇ／Ｈｉｓ）、プロタミンなどのカチオン性タンパク質を含む天然のタンパク質とすることも可能である。
【００５９】
または、前記コンジュゲート部は、例えば特定の受容体または標的にするか膜の中に自身を挿入することができ、エンドサイトシス経路で吸収され得る小分子であってもよい。従って、アダマンタン、ナフタレン、フェナントレン、ピレンなどのポリ芳香族炭化水素、マクロシル、ステロイド、または別の化学的骨格に由来する小分子は、全て本発明のコンジュゲートであってもよい。
【００６０】
または、コンジュゲート部はカチオン性ポリマに基づくものであってよい。数多くの研究から、カチオン性アルブミンのようなカチオン性ポリマが、特定の細胞形および／または組織（例えば脳輸送、Ｊ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７、４２８−４４８、２００５、Ｌｕ、Ｗら、参照）。カチオン性ポリマ分子がもつ利点を考慮すると、前記コンジュゲート部はポリエチレンイミン、デンドルイミン、ポリ（アルキルピリジニウム）塩、またはカチオン性アルブミンなどのカチオン性ポリマであってよい。
【００６１】
いくつかの例において、前記コンジュゲート部は受容体のリガンドであってよいし、受容体に結合する分子に結合するものであってよい。この場合には、胆汁酸、小分子薬物リガンド、ビタミン、アプタマー、炭水化物、ペプチド（ホルモン、タンパク質、タンパク質の断片、抗生物質、抗生物質の断片を含むがこれに限定されるものではない）、カプサイドのようなウイルス性タンパク質、バクテリア毒素のような毒素、その他が前記コンジュゲート部に含まれる。更に、コレステロール、コレスタノール、コラン酸、スチグマステロール、プレグノロン、プロゲステロン、コルチコステロン、アルドステロン、テストステロン、エストラジオール、エルゴステロールなどの天然のスレロイド類がコンジュゲートに含まれる。本発明の好ましいコンジュゲート部には、コレステロール（ＣＨＯＬ）、コレスタノール（ＣＨＬＮ）、コラン酸（ＣＨＬＡ）、スチグマステロール（ＳＴＩＧ）、およびエルゴステロール（ＥＲＧＯ）が含まれる。好ましい実施形態では、前記コンジュゲート部はコレステロールである。
【００６２】
コンジュゲート部がコレステロールの場合、分子は一つ以上のタンパク質または血液中のタンパク質複合体（アルブミン、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン断片、カイロミクロンなど）に結合して、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）などの複合体に対する適当な受容体によって細胞内に輸送される。コレステロール−ＬＤＬによる輸送例は、数多くのｓｉＲＮＡが単一のＬＤＬ粒子中で輸送されるために、特に注目される。この理由から、本発明の発明者らは、生体内においてＬＤＬなどの一つ以上の天然の担体に、コレステロールでコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ、またはコレステロール誘導体にコンジュゲートしたｓｉＲＮＡを内包し、これを生体内輸送システムとして利用することを考案した。
【００６３】
また、別の実施形態では、コンジュゲートしたｓｉＲＮＡの活性低下を防ぐ目的で特定の受容体を標的とする分子を飾修した。例えば、コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡを通常の血清の共存下で加えると、その大部分は血清中のアルブミンおよび／または他のタンパク質に連結するため、ｓｉＲＮＡがＬＤＬとの相互作用が不可能になる。この理由から、本発明のコンジュゲート部は、ＬＤＬなどの目的とする標的には結合または連結し続けるが、一方、血清アルブミンなど目的ではない結合相手とは親和力を低くするように修飾することが可能である。
【００６４】
＜リンカ分子＞
定義や規定よって限定されるものではないが、本発明におけるリンカ分子の長さは、コンジュゲート部をリンカ分子に結合する原子と、リンカ分子がオリゴヌクレオチドに結合するのに用いられ、オリゴヌクレオチドに結合する末端ホスフェート部の酸素原子との間が、最短距離として表される原子の数として記述される。例えば、コンジュゲート部がカルバメート連結部を介してリンカ分子に結合している実施形態では、リンカ分子の長さは、カルバメート連結部の窒素原子とホスフェート連結部の酸素原子との間が、最短距離として表わされる原子の数として記述される。環状構造がある場合には、最短距離となる環周りの原子の数で表すことが好ましい。
【００６５】
本発明の組成物で用いられるコンジュゲート−リンカ分子の構造と製造方法について、表１‐１から表１‐４に示した。ここで、表１‐１から表１‐４に例示されるリンカ分子は、他の合成法を用いて製造してもよく、同様な長さで製造することが可能である。例えば、ω−アミノ−１，３−ジオール、ω−アミノ−１，２−ジオール、ヒドロキシプロリノール、ω−アミノ−アルカノール、ジエタノールアミン、ω−ヒドロキシ−１，３−ジオール、ω−ヒドロキシ−１，２−ジオール、ω−チオ−アルカノール、ω−カルボキシ−アルカノール、官能基置換オリゴエチレングリコール、アリルアミン、アクリル酸、アリルアルコール、プロパギルアミン、プロパギルアルコールによるリンカ分子／リンカ分子合成法を、適当な長さを持つリンカ分子の合成に応用することが可能である。
【００６６】
ある実施形態においては、リンカ分子は、コンジュゲート部に結合するための単なるサイトになるだけではなく、固相担体に結合し、オリゴヌクレチド合成を開始するための機能的なサイトにもなる。好ましくは、これらのサイトは水酸基、より好ましくは、一級水酸基ならびに二級水酸基であって、コンジュゲート修飾固相担体の合成中にこれら水酸基は化学的に区別される。ここで、水酸基のあるものは、好ましくは一級水酸基であるが、当業者にとってよく知られた方法により、オリゴヌクレオチド合成の第一段階において除去可能な保護基によって保護される。好ましくは、この保護基はクロモフォアであり、固相担体に結合するコンジュゲート部の量を見積もることができる。さらに好ましくは、これら保護基は、トリフェニルメチル（Ｔｒ）、モノメトキシトリフェニルメチル（ＭＭＴｒ）、ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴｒ）、およびトリメトキシトリフェニルメチル（ＴＭＴｒ）より選ばれる。また、他の水酸基は、好ましくは二級水酸基であるが、当業者にとってよく知られた方法により、固相合成用担体の官能基と反応して共有結合可能な官能基を持つ鎖状分子と反応して結合される。前記鎖状分子の好ましい例としては、コハク酸、グルタル酸、シュウ酸、ジグリコール酸、ならびにＯ，Ｏ’−ジ酢酸ヒドロキノンなどのジカルボン酸が挙げられる。ここにおいて、前記鎖状分子のカルボン酸官能基の一方が前記水酸基と反応して、水酸化物、炭酸化合物、またはアミンなどの塩基によって開列可能なエステル結合となる。また、もう一方のカルボン酸官能基は、固相担体上のアミン官能基とアミド結合を形成して、固相合成用担体と結合する。
【００６７】
さらに、リンカ分子によって、水溶性の向上、コンジュゲート部とオリゴヌクレオド間の距離の最適化、柔軟性（または剛性）、特異的配向性、分岐などの好ましい性質がオリゴヌクレオチドコンジュゲートに付与される。
【００６８】
リンカ分子とコンジュゲート部間の化学結合としては、好ましくはカルバメート連結部が挙げられるが、本発明の範囲に含まれる他の化学構造部であってもよい。コンジュゲート部と化学結合するリンカ分子上の官能基の例としては、水酸基、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハライド、カルボン酸活性エステル、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スルホニル、アリル、およびプロパギル基が挙げられるが、これに限定されるものではない。リンカ分子とコンジュゲート部との間に形成される化学結合の例としては、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、ホスフォジエステル、ホスフォロチオエート、ホスフォロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、スルホン、スルホキシド、ウレア、ヒドラジド、オキシム、光反応性連結部、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加体または閉環反応メタスタシス体などのＣ−Ｃ結合形成基、ならびにＭｉｃｈａｅｌ付加体によるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般に、コンジュゲート部は、天然由来、あるいは化学合成による適当な官能基を有するものであり、このような、コンジュゲート部の官能基と効率的かつ確実に反応するように選ばれた官能基を有するリンカ分子が合成される。
【００６９】
同じ長さを持ち二つ以上のコンジュゲートと連結可能なリンカ分子も、特に注目されるリンカ分子である。
【００７０】
また、別の実施形態では、リンカ分子はヌクレオシド誘導体であってもよい。前記ヌクレオシド誘導体としては、例えば、リボヌクレオシド、２’−デオキシリボヌクレオシド、または、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロなどの２’修飾−２’−デオキシリボヌクレオシドが挙げられる。更に、アラビノヌクレオシド、または２’−修飾アラビノヌクレオシドなどが挙げられる。また、当業者に周知な方法により、コンジュゲート部に結合するためのリンカ分子や官能基を提供するために、プリンおよびピリミジンヌクレオシドの塩基の特定の部位が修飾されていてもよい。例えば、ウリジン、シチジンなどのピリミジンヌクレオシドは、酢酸水銀、パラジウム触媒、または、アリルアミン、アリルアルコール、アクリル酸などのアリル系試剤を用い、ウラシル塩基またはチトシン塩基の５’位を修飾してもよい。更に、５−ヨードピリミジン類は、パラジウム触媒、プラバギルアミン、プロパギルアルコール、プロパギル酸などのプロパギル系試剤を用いて５’位を修飾してもよい。さらに、ウリジンは、トリアゾール、スルホニルクロリドによる活性化と、それに続くジアミン、アミノアルコール、アミノ酸との反応によって４位を修飾してもよい。シチジンは、同様に亜硫酸水素塩処理およびそれに続くジアミン、アミノアルコールあるいはアミノ酸との反応によって４位を修飾してもよく、プリンも、上記と同様な一連の反応により７位、８位、９位を修飾してもよい。
【００７１】
好ましい実施形態としては、リンカ分子は約３から約９個の原子数を長さとして持つものが好ましく、具体的には、４、５、６、７、８、または９個の原子数をその長さとして有し、より好ましくは、５または８個の原子数をその長さとして持つ。最も好ましい例は、リンカ分子にコンジュゲート部を連結させる原子と、リンカ分子をオリゴヌクレオチドに連結するのに用いられるオリゴヌクレオチド連結用の末端リン酸部の酸素原子との間に、５つの炭素原子を持つ直鎖のＣ５リンカ分子である。従って、カルバメート連結部を介してＣ５リンカ分子にコンジュゲート部が連結される場合には、前記カルバメート連結部の窒素原子と、前記リン酸連結部の酸素原子との間には、５個の炭素原子が存在する。
【００７２】
好ましい実施形態としては、コンジュゲート部はコレステロール、リンカ分子はカルバメート基を介してコレステロールに結合した、５個の原子を持つＣ５リンカ分子であり、コレステロール−Ｃ５コンジュゲート−リンカ分子（表１‐１から表１‐４参照）が形成される。二本鎖であるセンスおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’位および／または３’位末端にホスフォジエステル連結部を介して結合する場合、コンジュゲート−リンカ分子−オリゴヌクレオチドの構造は（式４）のようになる。
【００７３】
【化４】
2010504355.tif 000005
【００７４】
さらに別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部はコレステロール、リンカ分子はカルバメート基を介してコレステロールに結合した、Ｃ３リンカ分子であり、コレステロール−Ｃ３コンジュゲート−リンカ分子（表１‐１から表１‐４参照）が形成される。センスおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’位および／または３’位末端にホスフォジエステル連結部介して結合する場合、コンジュゲート−リンカ分子−オリゴヌクレオチドの構造は（式５）のようになる。
【００７５】
【化５】
2010504355.tif 000006
【００７６】
さらに別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部はコレステロール、リンカ分子はカルバメート基を介してコレステロールに結合した、Ｃ８リンカ分子（８原子リンカ分子）であり、コレステロール−Ｃ８コンジュゲート−リンカ分子（表１‐１から表１‐４参照）が形成される。センスおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’位および／または３’位末端にホスフォジエステル連結部介して結合する場合、コンジュゲート−リンカ分子−オリゴヌクレオチドの構造は（式６）のようになる。
【００７７】
【化６】
2010504355.tif 000007
【００７８】
さらに別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部はコレステロール、リンカ分子はカルバメート基を介してコレステロールに結合した、ＰＲＯリンカ分子（４原子リンカ分子）であり、コレステロール−ＰＲＯコンジュゲート−リンカ分子（表１‐１から表１‐４参照）が形成される。センスおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’位および／または３’位末端にホスフォジエステル連結部を介して結合する場合、コンジュゲート−リンカ分子−オリゴヌクレオチドの構造は（式７）のようになる。
【００７９】
【化７】
2010504355.tif 000008
【００８０】
さらに別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部はコレステロール、リンカ分子はカルバメート基を介してコレステロールに結合した、ＰＩＰリンカ分子（６原子リンカ分子）であり、コレステロール−ＰＩＰコンジュゲート−リンカ分子（表１‐１から表１‐４参照）が形成される。センスおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’位および／または３’位末端にホスフォジエステル連結部を介して結合する場合、コンジュゲート−リンカ分子−オリゴヌクレオチドの構造は（式８）のようになる。
【００８１】
【化８】
2010504355.tif 000009
【００８２】
さらに別の好ましい実施形態では、コンジュゲート部はコレステロール、リンカ分子はカルバメート基を介してコレステロールに結合した、Ｃ６−ＨＰ(以後「ＨＰ６」という)リンカ分子（９原子リンカ分子）であり、コレステロール−Ｃ６−ＨＰコンジュゲート−リンカ分子（表１‐１から表１‐４参照）が形成される。センスおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’位および／または３’位末端にホスフォジエステル連結部を介して結合する場合、コンジュゲート−リンカ分子−オリゴヌクレオチドの構造は（式９）のようになる。
【００８３】
【化９】
2010504355.tif 000010
【００８４】
表１に示したコレステロールに結合するその他のリンカ分子と合わせ、本実施形態に記載されるＣ５、Ｃ３，Ｃ８、ＰＲＯ、Ｃ６−ＨＰならびにＰＩＰリンカ分子は、コレステロール以外のコンジュゲート部とともに用いることができることが明らかに予期される。例えば、このようなコンジュゲート部には、コレスタノール（以下ＣＨＬＮという）、コラン酸（以下ＣＨＬＡという）、スチグマステロール（以下ＳＴＩＧという）、ならびにエルゴステロール（以下ＥＲＧＯという）が含まれる。また、表１‐１から表１‐４に示したその他のリンカ分子と合わせ、先に例示したＣ５、Ｃ３，Ｃ８、ＰＲＯ、Ｃ６−ＨＰならびにＰＩＰリンカ分子は、コンジュゲート部をリンカ分子と結合させるカルバメート基とともに示されているが、後述する別の化学構造を持つ結合部を用いてもよい。さらに、前記した実施形態に記載されるＣ５、Ｃ３，Ｃ８、ＰＲＯ、Ｃ６−ＨＰならびにＰＩＰリンカ分子は、ホスフォジエステル連結部を介してオリゴヌクレオチドに結合するように示されているが、後で述べるように、オリゴヌクレオチドへの結合用に、別の部位を用いてもよいし別の化学構造を持つものを用いてもよい。
【００８５】
また、ある実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、色素分子または放射性ラベルなどの検知可能な標識を有する。好ましい色素分子としては、蛍光色素分子や燐光色素分子などが挙げられる。好ましい蛍光色素分子としては、ＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ３またはＣｙ５  Ｄａｂｓｙｌなどのシアニン誘導体、フルオロセイン、または当技術分野で知られた適当なフルオロフォアが挙げられる。検知可能な標識は、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の任意の位置において結合してもよいが、一つ以上ある鎖の５’末端または３’末端で結合するのが好ましい。より好ましくは、前記検出可能な標識は、センス鎖５’末端に結合した蛍光色素分子である。前記検出可能な標識は、当技術分野で知られた方法を用いて結合してよく、先に述べた任意のリンカ分子を用いて結合してもよい。このように色素分子を用いることで、当業者は前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の形質移入効率を観察できるようになる。
【００８６】
＜二本鎖オリゴヌクレオチド複合体におけるコンジュゲート−リンカ分子の位置＞
二本鎖オリゴヌクレオチド複合体におけるコンジュゲート−リンカ分子の位置は、コンジュゲートされた一本または複数鎖（センス鎖、アンチセンス鎖、あるいはセンス鎖アンチセンス鎖の両方）や、修飾されるセンス鎖上の一つまたは複数の位置（例えば、一本または複数鎖上でのヌクレオチドの位置）、または糖、塩基などのヌクレオチドの修飾位置、などによって変わりえる。コンジュゲート−リンカ分子は、本発明の一本または複数鎖上の５’末端および／または３’末端に置くことが可能である。例えば、コンジュゲート−リンカ分子は、センス鎖５’末端、および／またはセンス鎖３’末端、および／またはアンチセンス鎖５’末端、および／またはアンチセンス鎖３’末端に位置してよい。また、コンジュゲート−リンカ分子は、ホスフォジエステル結合を介して鎖の５’および／または３’末端に結合できる。好ましくは、本実施形態のコンジュゲート−リンカ分子は、ホスフォジエステル結合を介してセンス鎖の一方の端または両端に結合でき、より好ましくは、センス鎖３’末端に結合される。
【００８７】
また、コンジュゲート−リンカ分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の内部にも結合可能である。更に、ウリジン５位、シチジン５位、シチジン４位、グアノシン７位、アデノシン７位、グアノシン８位、アデノシン８位、アデノシン６位、リボース２’位、リボース５’位、リボース３’位、を含むヌクレオチドの複数の位置がコンジュゲート部を核酸に結合するために用いることができる。
【００８８】
＜センス鎖およびアンチセンス鎖によって形成された二本鎖＞
センス鎖およびアンチセンス鎖の大きさは、約１８個から約３０個つながったヌクレオチドの大きさに相当し、具体的には、ヌクレオチドが、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個つながった長さになる。好ましいセンス鎖およびアンチセンス鎖の長さは、ヌクレオチド１９個から２３個の長さになるが、更に好ましくは、以下に示したようにヌクレオチド１９個の長さになる。二本鎖オリゴヌクレオチド複合体のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列は、前記配列がオフ・ターゲット作用または有害な作用を全くまたは最小限しか示さずに標的遺伝子を効率的にサイレンシングさせる場合には、当業者に知られる様々な方法、即ち、遺伝子配列に基づくランダムセレクションや、合理的設計法（多くの技術的に認められたアルゴリズムおよび／または神経ネットワークのうちの任意の方法を用いる）といった様々な方法によって、選定することが可能である。効率的な遺伝子サイレンシングに用いられるアンチセンス鎖の合理的設計法の基準の詳細に関しては、下記の文献、ＷＯ２００４／０４５５４３、ＷＯ２００６／００６９４８、ＷＯ２００５／０７８０９５、ＷＯ２００５／０９７９９２、ならびにＷＯ２００５／０９０６０６に記載される。
【００８９】
安定性、ＤｉｃｅｒまたはＲＩＳＣ処理、機能、および／または特異性を向上させるために、センス鎖ならびにアンチセンス鎖の広い範囲において化学修飾することが可能である。さらに、２３ｂｐよりも長いｄｓＲＮＡに対して細胞が一般に有する内在的免疫反応を最小限に抑えるために、化学修飾を用いることができる（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ａ等、（２００６）ＲＮＡ．１２（６）：９８８−９３０参照）。全体の安定性や酵素処理能を高めることができる内部クレオチド結合部の化学修飾としては、ホスフォロチオエート、ホスフォロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスフォノアセテート、ホスフォノアセトアミド、ホスフォノ酢酸エステル、ホスフォノアミデート、ホスフォノアルコール、ホスフォノアルコールエステル、ホスフォノホルメート、ホウ素化ホスホネート、ペプチド、核酸などが挙げられる。同様に、オリゴヌクレオチドの安定性、機能、酵素処理、特異性を高めるために、糖構造が修飾された化学修飾ヌクレオチドを用いることが可能である。ここで、糖環状構造に対する化学修飾としては、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−ハロ−２’−デオキシリボース、２’−デオキシリボース、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、２’−チオ−２’−デオキシリボース、アラビノース、Ｌ−リボース、２’−ハロ−２’−デオキシアラビノース、２’−Ｏ−アルキルアラビノース、２’−アミノ−２’−デオキシアラビノース、２’−チオ−２’−デオキシアラビノース、２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレンビシクロリボース、４’−アミノアルキルリボース、５’−アミノアルキルリボース、４−チオリボースなどが挙げられる。
【００９０】
さらに、センス鎖の約４０％から約９０％のヌクレオチド、アンチセンス鎖の約４０％から約９０％のヌクレオチドが、化学修飾されたヌクレオチドであることが好ましい。好ましい化学修飾としては、１）５’末端から数えてセンス鎖の１番目および／または２番目のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−アルキル修飾、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾、および／または２）センス鎖のＣおよびＵの一部または全部における２’−Ｏ−アルキル修飾、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾、および／または３）アンチセンス鎖のＣおよびＵの一部または全部における２’ハロゲン修飾、好ましくは２’Ｆ修飾が挙げられる。好ましい実施形態の一例としては、センス鎖の第１および第２番目のヌクレオチド、またＣおよびＵヌクレオチドの全てが２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖のＣおよびＵヌクレオチドの全てが２’Ｆ修飾ヌクレオチドである例が挙げられる。
【００９１】
内部ヌクレオチドや糖の修飾に加えて、多数の塩基類縁体をセンス鎖および／またはアンシテンス鎖の中に組み込むことが可能である。そのような類縁体は、特異性や機能を増強し、ＲＮＡ干渉過程または標的遺伝子の一つ以上のタンパク質との相互作用を促進または最小限に抑えるために、更に、内在的免疫反応の活性化を最小限に抑えるために、所望の位置で塩基対の形成能を促進または最小限とするように、組み込むことが可能である。塩基類縁体としては、イソシチジン／イソグアノシン、２−アミノプリン、シュードウリジン、５−メチルウリジン、３−メチルウリジン、ニトロインドール、イミダゾール、ピリジン、５−アザピリミジン、６−アザピリミジン、７−デアザプリン、５−ハロピリミジン、８−ハロプリン、８−オキソプリン、２−チオピリミジン、６−チオグアノシン、４−チオウリジン、２，６−ジアミノプリンなどが挙げられる。上記の３種類の修飾のほかに、モリホリノヌクレオシド、１’，５‘−アンハイドロヘキシトールヌクレオシド、２，３−ジデオキシヘキソピラノシルヌクレオシド、カルボン酸ヌクレオシド、Ｃ−ヌクレオトシド、およびアシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル、デシクロビルなどの非環式ヌクレオシド、および塩基対を形成可能な任意の数の化学修飾を含むヌクレオシド修飾が、本発明に含まれる。
【００９２】
さらに、センス鎖およびアンチセンス鎖によって形成される二本鎖は少なくとも一つのオバーハングを持ち、各オーバーハングは少なくとも一つのヌクレオチドを含む。前記オーバーハングの位置としては、センス鎖５’末端、センス鎖３’末端、センス鎖５’および３’末端、アンチセンス鎖５’末端、アンチセンス鎖３’末端、アンチセンス鎖５’および３’末端、センス鎖５’末端ならびにアンチセンス鎖５’末端、または、センス鎖３’末端およびアンチセンス鎖３’末端、が可能である。
【００９３】
好ましい実施形態としては、オーバーハングはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。より好ましくは、アンチセンス鎖３’末端上にあるオーバーハングは、２ヌクレオチドオーバーハングである。オーバーハングにあるヌクレオチドの塩基は任意に選ぶことができる。オーバーハングのヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと塩基対を形成しても形成しなくともよい。便宜上ここにおいて、２ヌクレオチドオーバーハングを、ＵＵオーバーハングとする（ＡＡ、ＧＧ、ＣＣ、ＡＣ、ＣＡ、ＡＧ、ＧＡ、ＧＣ、およびＣＧ２ヌクレオチドオーバーハング、その他も考慮のこと。Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ等、（２００５）ＲＮＡ１１（５）：６７４−６７８参照）。オーバーハングにあるヌクレオチドおよび／または内部ヌクレオチドの連結部は、先に述べたヌクレオチドまたは内部ヌクレオチドの連結部の任意の化学修飾を用いて修飾してもよい。好ましい実施形態の一例としては、アンチセンス鎖において、２ヌクレオチドＵＵオーバーハングがアンチセンス鎖３’末端に位置し、３’末端Ｕを二番目のＵヌクレトチドにつなぐホスフォロチオエート連結部をもち、前記二番目のＵヌクレオチドを５’方向のその次のヌクレオチドにつなぐホスフォロチオエート連結部をもつようなアンチセンス鎖のオーバーハングが可能である。
【００９４】
ある実施形態では、センス鎖５’末端、および／またはセンス鎖３’末端、および／またはアンチセンス鎖５’末端、および／またはアンチセンス鎖３’末端は、末端ホスフェートを有する。好ましくは、一つの末端ホスフェートは、アンチセンス鎖５’末端に位置する。
【００９５】
ある実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドとセンス鎖のヌクレオチドとの間に少なくとも一つのミスマッチを有するが、好ましくは、アンチセンス鎖の１０、１１、１２、１３、または１４番目のヌクレオチドと、センス鎖の相対するヌクレオチドとの間にミスマッチが存在する。ここで、この位置番号は５’末端からの番号であり５’末端に位置するいかなるオーバーハングも数に入れない。また、ある好ましい実施形態では、二本鎖はアンチセンス鎖の５’末端から数えて１４番目のヌクレオチドとセンス鎖の相対するヌクレオチドとの間にミスマッチを有する。ここで、センス鎖とアンチセンス鎖がオーバーハングは数えないでヌクレオチド１９個分の長さを持つ場合、アンチセンス鎖の１４位はセンス鎖の６位と相対する。ここで、位置番号は、各鎖の５’末端からの数え、オーバーハングは数えない。また、センス鎖およびアンチセンス鎖が、オーバーハングは数えないでヌクレオチド１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個分の長さを持つ場合、アンチセンス鎖の１４位は、センス鎖の５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７位にそれぞれ相対する。ここで、位置番号は各鎖の５’末端から数えた番号であり、オーバーハングは数えない。
【００９６】
ミスマッチを持たない同じ二本鎖に比べて、ミスマッチを持つ二本鎖は、センス鎖上に単一のヌクレオチド置換を有し、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの間で相補性を完全に保つ。そのようなミスマッチを持つ二本鎖では、センス鎖中のミスマッチヌクレオチドは、アンチセンス鎖中１４番目のヌクレオチドと同じ塩基を有し、この結果、もし１４番目のヌクレオチドがＡの場合にはＡ／Ａ、もし１４番目のヌクレオチドがＵの場合にはＵ／Ｕ、もし１４番目のヌクレオチドがＧの場合にはＧ／Ｇ、更にもし１４番目のヌクレオチドがＣの場合にはＣ／Ｃミスマッチを形成する。          
【００９７】
＜組み合わせについて＞
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を提供するために、センス鎖およびアンチセンス鎖によって形成される二本鎖の設計、リンカ分子の属性、コンジュゲート部の属性、コンジュゲート−リンカ分子の位置、化学的修飾を受けたヌクレオチドの位置など、先に述べたような本発明の特徴の組み合わせ方には数多くの組み合わせ方があるということは、当業者にとっては容易に認識されることである。あらゆる可能な組み合わせ方は明確に想定される。以下に挙げた二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、新規特徴が組み合わされた実施例として示されるものであり、これによって限定されるものではない。
【００９８】
二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の例を以下に示す。
１．約１８個から約３０個のヌクレオチドよりなるセンス鎖であって、５’末端より数えて１番目と２番目のヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、全てのＣヌクレオチドおよびＵヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、
２．約１８個から約３０個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖であって、全てのＣヌクレオチドおよびＵヌクレオチドは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
３．前記アンチセンス鎖３’末端に位置する２ヌクレオチドオーバーハングはホスフォロチオエート連結部を有し、
４．  Ｃ５リンカ分子を介して前記センス鎖３’末端に結合するコレスタノール分子を有し、コレスタノール−リンカ分子−センス鎖は（式１０）の構造を持ち、
【００９９】
【化１０】
2010504355.tif 000011
【０１００】
５．前記アンチセンス鎖の５’末端にホスフェート基を有し、
６．さらに前記アンチセンス鎖中の５’末端より数えて１４番目のヌクレオチドと前記センス鎖中相対するヌクレオチドとの間のミスマッチを有していてもよい。
【０１０１】
さらに、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の別の例を以下に示す。
１．  約１８個から約３０個のヌクレオチドよりなるセンス鎖であって、５’末端より数えて１番目と２番目のヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、全てのＣヌクレオチドおよびＵヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、
２．  約１８個から約３０個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖であって、全てのＣヌクレオチドおよびＵヌクレオチドは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
３．  前記アンチセンス鎖３’末端に位置する２ヌクレオチドオーバーハングはホスフォロチオエート結合部を有し、
４．  Ｃ５リンカ分子を介して前記センス鎖３’末端に結合するスチグマステロール分子を有し、スチグマステロール−リンカ分子−センス鎖は（式１１）の構造を持ち、
【０１０２】
【化１１】
2010504355.tif 000012
【０１０３】
５．前記アンチセンス鎖の５’末端にホスフェート基を有し、
６．前記アンチセンス鎖中の５’末端より数えて１４番目のヌクレオチドと前記センス鎖中相対するヌクレオチドとの間に、ミスマッチを随意に有する。
【０１０４】
さらに、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の別の例を以下に示す。
１．  約１８個から約３０個のヌクレオチドよりなるセンス鎖であって、５’末端より数えて１番目と２番目のヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、全てのＣヌクレオチドおよびＵヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、
２．約１８個から約３０個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖であって、全てのＣヌクレオチドおよびＵヌクレオチドは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
３．前記アンチセンス鎖３’末端に位置する２ヌクレオチドオーバーハングはホスフォロチオエート連結部を有し、
Ｃ５リンカ分子を介して前記センス鎖３’末端に結合するエルゴステロール分子を有し、エルゴステロール−リンカ分子−センス鎖は（式１２）の構造を持ち、
【０１０５】
【化１２】
2010504355.tif 000013
【０１０６】
４．前記アンチセンス鎖の５’末端にホスフェート基を有し、
５．前記アンチセンス鎖中の５’末端より数えて１４番目のヌクレオチドと前記センス鎖中相対するヌクレオチドとの間に、ミスマッチを随意に有する。
【０１０７】
さらに、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の別の例を以下に示す。
１．  約１８個から約３０個のヌクレオチドよりなるセンス鎖であって、５’末端より数えて１番目と２番目のヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、全てのＣヌクレオチドおよびＵヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、
２．約１８個から約３０個のヌクレオチドよりなるアンチセンス鎖であって、全てのＣヌクレオチドおよびＵヌクレオチドは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖は前記センス鎖および標的遺伝子双方に対して高い相補性を有し、前記センス鎖ならびに前記アンチセンス鎖は二本鎖を形成し、
３．前記アンチセンス鎖３’末端に位置する２ヌクレオチドオーバーハングはホスフォロチオエート連結部を有し、
Ｃ５リンカ分子を介して前記センス鎖３’末端に結合するコレステロール分子を有し、コレステロール−リンカ分子−センス鎖は（式１３）の構造を持ち、
【０１０８】
【化１３】
2010504355.tif 000014
【０１０９】
４．前記アンチセンス鎖の５’末端にホスフェート基を有し、
５．前記アンチセンス鎖中の５’末端より数えて１４番目のヌクレオチドと前記センス鎖中相対するヌクレオチドとの間に、ミスマッチを随意に有する。
【０１１０】
このようなＣｈｏｌ−Ｃ５複合体は、包括して「Ｇ４複合体」、「Ｇ４ｓｉＲＮＡ」、または単に「Ｇ４」と呼ぶことにする。具体的なＧ４ｓｉＲＮＡを述べるときに、接尾語「（＋ｍｍ）はＧ４ｓｉＲＮＡが５’末端より数えてアンチセンス鎖中１４番目のヌクレオチドとセンス鎖中の相対するヌクレオチドとの間にミスマッチを有することを表し、前記接尾語「（−ｍｍ）」はＧ４ｓｉＲＮＡ中にはミスマッチが無いということを表す。
【０１１１】
＜間接的コンジュゲートおよび処方＞
数多くの間接的コンジュゲートを、本発明の任意の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体と連結するために用いることが可能である。従って、前記したＧ４などの任意の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を、抗体などのタンパク質の融合物や、ポリカチオン、カチオン性ペプチド、ジンクフィンガー、アプタマー、ヒストン、ｄｓＲＮＡ結合タンパク質、単鎖核酸結合タンパク質、ヘパリン結合ドメイン、ＫＨドメイン、ＰＡＺドメイン、ウイルス性カプシドタンパク質、形質移入因子またはドメインとともに用いることができる。また、ペプチド、リポまたはポリプレックス、デンドリマー、ヘパリン、コレステロール、アルブミン、ＬＤＬ阻害分子、受容体阻害分子、エンドゾーマル破壊化合物または混合物、天然脂質、ポリヒスチジン、プロタミン、アミノ酸、タキソール、徐方処方、ナノ粒子に基づいた処方は、本願の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体に全て適用可能である。
【０１１２】
＜輸送方法＞
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、先に述べたように、ＲＮＡ干渉方法に用いられる。ＲＮＡ干渉方法としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｐｉＲＮＡによる一つあるいは複数の遺伝子標的化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、阻害剤によるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｐｉＲＮＡの標的化も、ＲＮＡ干渉方法に含まれる。
【０１１３】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、ＲＮＡ干渉経路による遺伝子サイレンシング能において極めて強力である。コンジュゲートとして、コレステロール（ＣＨＯＬ）、コレスタノール（ＣＨＬＮ）、コラン酸（ＣＨＬＡ）、スチグマステロール（ＳＴＩＧ）、およびエルゴステロール（ＥＲＧＯ）を有する本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、特にＧ４複合体などのＣ５リンカ分子を介してセンス鎖３’末端に連結している場合、非常に有用である。遺伝子をサイレンシングまたはノックダウンするために、これらのコンジュゲートが結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを、培養または他の環境にある細胞中に形質移入試剤を用いない受動輸送するのに利用できるからである。これらＧ４などの分子は、培養プレート、培養皿、多穴プレートなどで培養される細胞に受動輸送されるが、これら容器に限定されるものではない。また、これらＧ４などの分子は、０％血清条件（無血清）を含む希釈血清条件下、細胞内に輸送される。この条件には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＨｙＣｌｏｎｅを含む多くの会社から市販品として入手可能な、標準的希釈血清培地で培養された細胞が含まれる。上記方法の一例を挙げると次のようになる。まず細胞を血清培地中プレーティングし、次にこの血清培地を本発明のＧ４などの二本鎖オリゴヌクレオチドを含む希釈血清培地と２４時間置換し、その後前記希釈血清培地を血清培地へと置換する。
【０１１４】
受動輸送されるＧ４ｓｉＲＮＡが効率よく遺伝子サイレンシングに用いられる細胞株には、以下が挙げられる。ヒト接着細胞：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ：神経芽細胞腫、ＩＭＲ３２：神経芽細胞腫、ＬＡＮ５：神経芽細胞腫、ＨｅＬａ：Ｃｅｒｖｉｘ、腺がん，ＨｅＬａＳ３：Ｃｅｒｖｉｘ、腺がん，ＬＮＣａｐ：前立腺細胞、転移腫，ＭＣＦ１０Ａ：上皮細胞、内分泌細胞，２９３Ｔ：上皮細胞、腎，ＭＣＦ−７：肺がん、ＳＫ−ＢＲ３：肺がん、Ｈｕｈ７：肝細胞腫、ＤＵ１４５：前立腺、ｍｅｔｓ：脳腫瘍、ＧＴＭ−３：緑内障網状組織、ＨＴ１０８０：結合組織、繊維肉腫、Ｕ２ＯＳ：骨、骨肉腫、上皮細胞、ＤＬＤ−１：上皮細胞、大腸、結腸直腸腺がん、Ａ−３７５：上皮、皮膚、悪性黒色腫、ＨｅｐＧ２：肝臓、肝細胞がん、ＴＨＰ−１：単球、急性単核白血病、Ｊｕｒｋａｔ：Ｔ−白血球、急性Ｔ細胞白血病、ヒト分化幹細胞、骨芽細胞：ｈＭＳＣ由来、脂肪細胞：ｈＭＳＣ由来、初代細胞、臍帯静脈、内皮細胞、ＨＵＡＳＭＳ（６０％ＫＤ）：平滑筋初代細胞、肝細胞：マウス、肝臓、ｈＭＳＣ：非分化間葉、ＰＢＭＳ：末梢血単核細胞、ＮＨＡ：ヒト星状細胞、その他の種：３Ｔ３ＮＩＨ：マウス、胚、繊維芽細胞、ＥＳ−Ｄ３：マウス、多能性胚芽幹細胞、Ｃ２Ｃ１２：マウス、筋芽細胞、およびＨ９ｃ２：ラット、心臓、心筋。
【０１１５】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、無血清培地を含む希釈血清培地に予め混合した状態で提供できる。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、遺伝子サイレンシング活性を著しく損なうことなしに、上記培地に４℃にて長期保存が可能である。従って、本発明はその一面として、一つ以上のコンテナを持ち、各コンテナには希釈血清培地およびＧ４複合体などの本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体が含まれるようなキットを提供するものである。前記キットには、本発明に基づいて、当業者が細胞内に前記二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を受動輸送できるようにその方法を記した取り扱い説明書が入っていてもよい。このようにして、消費者は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を安定かつすぐに使用可能な処方で購入することができる。遺伝子サイレンシングは、追加の形質移入処置を施さないで決められた処方で単に細胞を培養するだけで実施することが可能である。さらに、前記処方が複数の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を含み、各二本鎖オリゴヌクレオチド複合体が特定の遺伝子に対して特異的である場合には、複数遺伝子を同時にサイレンシングするのに単一の処方を用いてもよい。さらに、もし単一の遺伝子をサイレンシングする場合には、前記処方は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を一つだけ含んでいてもよいが、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体のプールとして構成されていてもよい。それぞれの二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、それぞれの標的ｍＲＮＡ上の異なる領域を標的化する。
【０１１６】
さらに、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、「逆形質移入」フォーマット中で培養細胞中遺伝子をサイレンシングする目的で用いることができる。このフォーマットでは、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を、先ずガラススライドなどの固体担体上にディスペンスし、次にその固体担体上で細胞を培養する。こうして、固体担体上で培養した細胞は受動輸送で二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を取り込む。好ましい実施形態としては、複数の異なる二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を固体担体上決められた位置にプリンティング、ピペッティングにより付着させ、二本鎖オリゴヌクレオチド複合体マイクロアレイを調製する。この結果、固体担体上培養した細胞は、異なる二本鎖オリゴヌクレオチド複合体に位置決めされて接着する。前記担体は、前記二本鎖の保持あるいは輸送を促進する目的で、または固体担体への細胞接着を促進する目的で、一種類以上のポリマーによって修飾することが可能であるが、修飾しないままでもよい。
【０１１７】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、コレステロール（ＣＨＯＬ），コレスタノール（ＣＨＬＮ）、コラン酸（ＣＨＬＡ）、スチグマステロール（ＳＴＩＧ）、またはエルゴステロール（ＥＲＧＯ）をコンジュゲートとして有するが、特にＧ４複合体などのＣ５リンカ分子を介してセンス鎖３’末端に連結している場合、細胞への連投用として特に有用である。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の連投は、標的遺伝子の長期ノックダウンを行うのに有効である。また、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を連投された細胞は、常法の脂質媒介型形質移入が可能である。従って、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体を特定の遺伝子をノックダウンさせるために用いることが可能である。また、別の遺伝子を同時にノックダウウンする目的でｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を媒体する試薬を脂質媒介輸送させるのにも使用可能である。このようにして、目的のフェノタイプ用に、特定遺伝子の連続ノックダウウンの「バックグランド」にて、異なるｓｉＲＮＡをパネルスクリーニングすることが可能となる。
【０１１８】
ある実施形態では、本発明の構成物は、基礎研究用、薬物輸送用、ＡＤＭＥ−毒性用、治療／予防用として適用される。
【０１１９】
また、別の実施形態では、リンカ分子、コンジュゲート、輸送物を様々に組み合わせて機能スクリーンをする方法を述べる。
【０１２０】
また、別の実施形態では、核酸輸送、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡミミック、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ阻害剤の輸送を促進させるコンジュゲート構造をスクリーンするためのコンビケム手法も述べる。
【０１２１】
また、別の実施形態では、小分子スクリーニンクを実施する目的で本発明の一または複数の構成物が用いられる。
【０１２２】
また、別の実施形態では、血清タンパク質など本発明分子の相互作用能を阻害する分子を同定する目的で、本発明の一または複数の構成物および／または方法が用いられる。
【０１２３】
また、別の実施形態では、リガンド結合のバックグランドを最適化する目的で、本発明の一または複数の構成物および／または方法が用いられる。
【０１２４】
また、別の実施形態では、形質移入工程の開発用キットに用いる目的で、本発明の一または複数の構成物が用いられる。このような工程としては、１）ウエルに細胞をプレーティングし、受動輸送用にウエルに本発明の一または複数の構成物を添加する工程、２）ウエルにまたはスライドに本発明の一または複数の構成物を配置し、本発明の分子の受動輸送を開始するように細胞を加える工程がある。どちらの場合でも、上記の方法は細胞中に分子を均一に導入する、または細胞中にｓｉＲＮＡゲノムコレクションなどの多構成物を導入する目的で用いることができる。
【０１２５】
また、別の実施形態では、ハイスループットスクリーニング手法に、本発明の構成物が用いられる。
【０１２６】
また別の実施形態では、Ｊｕｒｋａｔ細胞、幹細胞、神経由来細胞、脊髄由来細胞などの難形質移入細胞にｓｉＲＮＡなどの核酸を導入する目的で、本発明の構成物が用いられる。
【０１２７】
また別の実施形態では、初代細胞にｓｉＲＮＡなどの核酸を導入する目的で、本発明の構成物が用いられる。
【０１２８】
また別の実施形態では、非接着懸濁細胞にｓｉＲＮＡなどの核酸を導入する目的で、本発明の構成物が用いられる。
【０１２９】
また別の実施形態では、幅広い種類の核酸を導入する目的で、本発明の構成物が用いられるが、これら核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡミミックおよび阻害剤、ｐｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ阻害剤、プラスミド、アンチセンス分子、修飾・非修飾型核酸、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドなどのハイブリッド核酸その他が挙げられる。本発明は、病原性ウイルスなどの病原体ゲノム、糖尿病、アルツハイマー、がんなどの疾患と関るヒトゲノムの、あるいは、病原体の侵入、複製、包合、放出、あるいは病原体の複製過程において重要な過程において重要な役割を果たす転写後遺伝子の、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡを輸送する目的に用いることができる。
【０１３０】
また別の実施形態では、単一遺伝子の複数の部位を標的するｓｉＲＮＡプール、複数遺伝子を標的するｓｉＲＮＡプール、ｍｉＲＮＡまたはｐｉＲＮＡミミックのプール、ｍｉＲＮＡまたはｐｉＲＮＡ阻害剤のプール、その他などの核酸集合体を輸送する目的で、本発明の構成物が用いられる。さらに、特定の疾患に関連したｍｉＲＮＡミミックまたはｍｉＲＮＡ阻害剤のプールは、本発明の構成物を用いて一度に輸送することが可能である。
【０１３１】
また別の実施形態では、ｓｉＲＮＡなどの無作為に選ばれた核酸を輸送する目的で、本発明の構成物が用いられる。
【０１３２】
また別の実施形態では、合理的設計法によって選ばれた一つあるいは複数の核酸を輸送する目的で、本発明の構成物が用いられる。
【０１３３】
また別の実施形態では、本発明の構成物はコントロール化合物として用いられる。これら化合物は、ＲＩＳＣ導入ができないもの、毒性を引き起こすもの、標識化して形質移入効率を評価する目的で用いられる。
【０１３４】
また別の実施形態では、特定の遺伝子またはＲＮＡ干渉用遺伝子群を標的する分子を輸送する目的で、本発明の構成物が用いられる。例えば、前記遺伝子群としては、キノメなどを標的するｓｉＲＮＡ群、ＧＰＣＲ、膜再構成に関わる遺伝子、ゲノムセット、完全ゲノムその他が挙げられる。
【０１３５】
また別の実施形態では、Ｇ４などの本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体およびそれを用いる方法は、診断、予防、治療、農業、獣医、研究ツール、化粧、その他に用いることができる。治療、予防に用いる例では、Ｇ４あんどの本発明の構成物は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトの疾患治療剤の製造に用いることができる。本発明により製造された薬剤の投与量は、検体に対してマイクログラム／キロから数百ミリグラム／キロの範囲で用いてよい。また、技術的に知られるように、投与量は、投与される哺乳動物の体重、性状、疾患の重さ、検体の血清中での薬剤安定性、またはその他当業者によく知られた要因に基づいて変わってくる。特定の標的核酸の取り扱いによって変わる、疾患を有すると疑われる組織は、本発明の構成物を投与することで治療される。その治療の結果として、特定の疾患が改善、一時緩和、予防、および／または診断される。
【０１３６】
また、治療や予防の例では、Ｇ４などの本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、様々な治療薬、輸送薬、服用方法と組み合わせて用いることができる。医薬的に許容される担体、賦形剤、希釈液は当業者に知られたものが用いられる。細胞や組織への投与方法は、当業者に知られたものが用いられる。投与方法は、治療される疾患に対する反応の重さや程度によるが、日から月にまたがる治療期間、疾患に対する治療効果が現れるまでの期間などに拠る。ある疾患に対して所望する効果を継続させるために、本発明分子の長期投与が必要なこともある。好ましい投与方法は、本発明の一または複数の分子を、医薬的に許容される担体や希釈液を用い、医薬的に許容される輸送経路によって投与量を調整しながら投与することにより決めることが可能であり、さらに体内に蓄積される薬物量を投与後何点かの時間で測定することが可能である。同様に、所望の効果を本発明分子の投与後何点かの時間で測定することができるが、このデータは、体内あるいは臓器への蓄積といった別の薬動力学的データと関連着けることもできる。当業者は、最適な投与量、投与方法、などをこうして決めることが可能であり、試験管内ならびに生体内動物モデルで得られたＥＣ５０データを、臨床試験を行うためのデータとして用いてもよい。
【０１３７】
また、別の実施形態として、本発明の構成物や方法は、併合療法、特に、がん、アルツハイマー、その他てんかんなどの神経系疾患を含むヒトの疾患を軽減、最小化する目的の併合療法に用いられる。
【０１３８】
また、別の実施形態として、本発明の構成物や方法は、別の標的用骨格を設計・試験するために構造／機能研究用として用いられる。
【０１３９】
本発明の分子は、導入される細胞型や細胞種に関係なく作用するので、別の実施形態では本発明を、植物、動物、原生動物、バクテリア、ウイルス、真菌などの幅広い生物に核酸を輸送するために用いられるが、これらに限定されるものではない。本発明は特に、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌなどの哺乳類、ハムスター、マウス、ラットなどのげっ歯類、ゴリラ、ガラゴ、チンパンジー、ヒトなどの霊長類に使用できる利点を持つ。
【０１４０】
また、別の実施形態として、本発明の構成物や方法は、特定の組織、特に心臓組織、神経組織、胃腸管、筋肉組織、肺組織、がん性組織、病原体感染組織、などの疾患組織に対して用いることができる。本発明は、初代細胞、胚芽細胞株、体細胞株などの多様な細胞型に用いてもよい。前記細胞型としては、胎芽細胞、精子、脂肪細胞、繊維芽細胞、心臓細胞、内皮細胞、神経細胞、血球細胞、リンパ球、マクロファージ、マストセル、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、骨肉腫、肝細胞、外分泌・内分泌細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４１】
また、別の実施形態としては、静脈注射、インハレーション、筋肉注射、皮下注射、経皮投与、経鼻投与、経口投与、直腸、点眼や、あるいは所望の標的核酸がある臓器、組織、細胞の近傍に本発明分子を放出する装置を用いた組織注入により、または検体に核酸を導入する技術的に認められた方法によって、本発明の構成物を輸送する。本発明分子は、クリーム、軟膏によって、また、カプセル、錠剤、懸濁液、溶液のような経口投与によって服用できる。      
【０１４２】
＜二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の合成方法＞
また、本発明はＧ４などの二本鎖オリゴヌクレオチド複合体の合成方法を提供するものである。ある実施形態では、コンジュゲート部誘導体を、固相合成用担体に結合したままでオリゴヌクレオチド鎖の所望の位置に導入することが可能である。好ましくは、ホスフォラミデート、Ｈ−ホスホネートなどといったオリゴヌクレオチド合成に用いたのと同じ合成法、またはオリゴヌクレオチド合成の開始部位として所望のコンジュゲート部を有する固相合成法を用いて実施される。別法として、オリゴヌクレオチド合成中に保護基を持つ官能基をオリゴヌクレオチドに導入し、オリゴヌクレオチド保護基と固体担体連結部と併用可能な反応条件で合成中適当な段階で脱保護し、コンジュゲート部の活性化体と共有結合させてもよい。
【０１４３】
別の実施形態では、担体からの分離、脱保護の後、完成したオリゴヌクレオチドを所望のコンジュゲート部誘導体と反応させる。この反応は非特異的であってよく、コンジュゲート部オリゴヌクレオチド上部位への無作為な共有結合的反応であるか、オリゴヌクレオチドにイオン的相互作用、水素結合、疎水的相互作用など、非共有結合的に相互作用する。または、適当なコンジュゲート部反応性誘導体との反応でオリゴヌクレオチドに特定の官能基が導入されている場合には、完成したオリゴヌクレオチドを所望のコンジュゲート部誘導体との反応は、特異的に行われる。
【０１４４】
上記のように、コンジュゲート部はオリゴヌクレオチド合成を開始する部位として固相オリゴヌクレオチド合成担体に結合できる。ある実施形態では、リンカ分子がコンジュゲート部に付き、担体への結合用、オリゴヌクレーチド合成の開使用としての機能を持たせている。好ましくは、これらの部位としては、水酸基が挙げられ、より好ましくは、コンジュゲート修飾固相担体合成中に化学的に識別されるように一級水酸基、二級水酸基が挙げられる。
【０１４５】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖で行う合成法と同じ合成法をコンジュゲート部誘導体に適用し、３’末端以外の部位でオリゴヌクレオチドにコンジュゲート部が導入される。つまり、４つの標準ヌクレオチドモノマーでは使わない、自動合成機の試薬挿入部にコンジュゲート部を入れ、適当な位置で所望の配列に導入されるように合成プログラムするコンジュゲートの付加は、最も効率的な導入に必要な溶液濃度、結合時間などの条件を除いて、モノマー合成と同様に行われる。今日行われる最も一般的なオリゴヌクレオチド合成法は、好ましくはコンジュゲート部がホスホラミダイトであるホスホラミダイト法である。
【０１４６】
先の章で述べられたリンカ分子は、合成用の骨格として用いられ、その上にコンジュゲート部の所望するホスホラミダイト誘導体を構築する。リンカ分子の水酸基の一つは、好ましくは一級水酸基であるが、当業者によく知られた方法によって、オリゴヌクレオチド合成に用いられるジメチルトリチル、シリル基などの保護基で保護される。また、別の水酸基は、好ましくは二級水酸基であるが、当業者によく知られた方法で三級塩基共存下、保護基を持つクロロホスフィンと反応し、またはテトラゾール、トリアゾール、イミダゾール誘導体の共存下、保護基を持つホスホロジアミダイトと反応し、所望のホスホラミダイトを合成する。このようなリンカ分子コンジュゲート部ホスホラミダイト誘導体は、得られるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの活性を害さないオリゴヌクレオチド配列中ほぼ任意の位置にコンジュゲート部を設置するのに用いることができる。
【０１４７】
また別の実施形態では、先に述べたように前記リンカ分子はヌクレオシド誘導体であってよい。
【０１４８】
また別の実施形態では、コンジュゲートの位置は、オリゴヌクレオチド５’末端であり、リンカ分子はコンジュゲート部と共有結合を形成できる官能基およびホスホラミダイト誘導体変換用の水酸基一つを有してさえいればよい。これは、５’末端でのコンジュゲートがオリゴヌクレオチド合成の最終工程であり、この後はモノマーの付加はもう行われないからである。先に述べたリンカ分子に加えて、ω−アミノアルカノール、ω−ヒドリキシアルカノール、ω−ヒドロキシアルカンチオール、およびω−ヒドロキシアルキルカルボン酸などのリンカ分子が用いられる。
【０１４９】
本明細書中で、温度、時間、％配列、配列相補性、長さ、構成、濃度などの範囲が示された場合、その範囲にある個々の値のみならず全ての部分的範囲も、本発明に含まれる。
【０１５０】
本願に引用される引用文件は全て、首尾一貫した完全な形でこの中に記載されている。
【実施例】
【０１５１】
以下の実施例によって本発明を説明するが、先に述べたように本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０１５２】
＜ω−アミノ−１，３−ジオール  リンカ分子の一般的合成＞
実施例１から実施例５１において、全ての原料および溶媒は市販品または当業者にとって公知な方法によって調製されたものである。実施例１から実施例５１の全ての反応によって得られた生成物は分析され、１ＨＮＭＲ分析法およびＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析法によって構造を確認した。
【０１５３】
図１に、ω−アミノ−１，３−ジオールを用いた種々のリンカ分子の一般的な合成経路を示した。なお、同じ生成化合物を得るために、ここに具体的に記載された合成方法や原料が適宜変更可能であることは、当業者にとって周知である。ベンジルオキシカルボニル保護（Ｃｂｚ）アミノ酸を、２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（メルドラム酸）、ジエチル  シアノホスホナート、およびトリエチルアミンと混合し、塩化メチレン溶液中室温にて１２−１８時間撹拌し、さらにメタノール中で４時間加熱還流した。こうして得られたＣｂｚ保護ω−アミノ−b−ケトエステルは、過剰の水素化ホウ素リチウムと、テトラヒドロフラン溶液中室温にて１２−１８時間反応させた。次に、こうして得られたＣｂｚ保護ω−アミノ−１，３−ジオールを、４，４‘−ジメトキシトリチルクロリドと、ピリジン中室温にて１２−１８時間反応させた。次に、こうして得られたＣｂｚ保護１−Ｏ−ＤＭＴｒ−ω−アミノ−１，３−ジオールを、パラジウムカーボン触媒にてメタノール溶液中、室温下４−１６時間、水素添加し、１−Ｏ−ＤＭＴｒ−ω−アミノ−１，３−ジオールを得た。
【０１５４】
以下の実施例２−実施例５および図２Ａに、上記一般合成経路による１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）−（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オールの詳細な合成法を示した。
【実施例２】
【０１５５】
＜メチル  ５−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−オキシペンタノエート（Ｉ）の合成＞
３−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロパン酸 [Ｎ−Ｃｂｚ−b−アラニン]  （５．０ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００ｍL）に懸濁させ、２，２‘−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（３．３ｇ、２２．９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（８．５ｍＬ、６１．０ｍｍｏｌ）、およびジエチルシアノホスフォナート（３．７ｍＭ，２２．８ｍｍｏｌ）を加えた。全ての固体は速やかに溶解し、反応液は黄色になった。この反応溶液を室温にて１６時間撹拌した後、塩化メチレン（１００ｍＬ）で希釈し、塩酸水溶液（３Ｍ，各５０ｍＬ）で３回、水（各５０ｍＬ）で３回、および飽和食塩水（５０ｍＬ）にて洗浄した。反応混合物溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、溶媒を留去して橙色のシロップを得た。この油状物を無水エタノール（２００ｍＬ）に溶かし、１６時間加熱還流した。メタノールを留去して得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：１５０ｍＬ）を用い、溶出液に塩化メチレン（５００ｍＬ）、塩化メチレン／メタノール（５００ｍＬ、９９．５：０．５ｖ／ｖ）、塩化メチレン／メタノール（１０００ｍＬ、９９：１ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色油状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は４．５ｇ（収率６８％）である。
【０１５６】
同様にして、以下の化合物を合成した。
【０１５７】
ｉ）メチル  ８−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−オキソオクタノエートを、６−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−ヘキサン酸より合成した。
【０１５８】
ｉｉ）メチル  １０−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−オキソオクタノエートを、８−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−オクタン酸より合成した。
【０１５９】
ｉｉｉ）メチル  １４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−オキソオクタノエートを、１０−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−デカン酸より合成した。
【０１６０】
ｉｖ）メチル  ３−（４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）フェニル）−３−オキソプロパノエートを、４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−安息香酸より合成した。
【０１６１】
ｖ）ベンジル  ４−（３−メトキシ−３−オキソプロパノイル）ピペリジン−１−カルボキシレートを、１−（ベンジルオキシカルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸より合成した。
【０１６２】
ｖｉ）ベンジル  ２−（３−メトキシ−３−オキソプロパノイル）ピロリジン−１−カルボキシレートを、１−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−２−カルボン酸より合成した。
【実施例３】
【０１６３】
＜ベンジル  ３，５−ジヒドロキシペンチルカルバメート（ＩＩ）の合成＞
メチル  ５−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−オキソペンタノエート（４．５ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（２５ｍL）に溶解し、氷冷下、水素化ホウ素リチウム無水テトラヒドロフラン溶液（２M、２５ｍL、５０ｍｍｏｌ）に徐々に滴下した。滴下終了後、氷浴を除去し、反応液を室温にて更に１６時間撹拌した。無色透明な反応溶液を再び氷浴にて冷却し、塩酸水溶液（１M、５０ｍＬ）を徐々に滴下して過剰の還元剤を分解した（この時ガスが発生する）。均一な溶液になった反応混合物を濃縮し、テトラヒドロフランを除去した。混合物に酢酸エチル（１００ｍＭ）を加えて十分に振蕩し、分液ロートに移し、下層の水層と分離した。水層を２回以上酢酸エチル（各１００ｍＬ）と振蕩し、得られた酢酸エチル溶液を合して飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル溶液を、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、溶媒留去して淡褐色のシロップを得た。この粗精物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、２００ｍＬ）を用い、溶出液に酢酸エチル（５００ｍＬ）、酢酸エチル／メタノール（５００ｍＬ、９９：１ｖ／ｖ）、更に、酢酸エチル／メタノール（１０００ｍＬ、９５：５ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色油状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は３．６ｇ（収率９２％）である。
【０１６４】
同様にして、以下の化合物を合成した。
【０１６５】
ｉ）ベンジル  ６，８−ジヒドロキシオクチルカルバメートを、メチル  ８−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−オキソ−オクタノエートより合成した。
【０１６６】
ｉｉ）ベンジル  ８，１０−ジヒドロキシドデシルカルバメートを、メチル  １０−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−オキソ−オクタノエートより合成した。
【０１６７】
ｉｉｉ）ベンジル  １２，１４−ジヒドロキシテトラデシルカルバメートを、メチル  １４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−３−オキソ−オクタノエートより合成した。
【０１６８】
ｉｖ）ベンジル  ４−（１，３−ジヒドロキシプロピル）フェニルカルバメートを、メチル  ３−（４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）フェニル）−３−オキソ−プロパノエートより合成した。
【０１６９】
ｖ）ベンジル  ４−（１，３−ジヒドロキシプロピル）ピペリジン−１−カルボキシレートを、ベンジル  ４−（３−メトキシ−３−オキソプロパノイル）ピペリジン−１−カルボキシレートより合成した。
【０１７０】
ｖｉ）ベンジル  ２−（１，３−ジヒドロキシプロピル）ピロリジン−１−カルボキシレートを、ベンジル  ２−（３−メトキシ−３−オキソプロパノイル）ピロリジン−１−カルボキシレートより合成した。
【実施例４】
【０１７１】
＜ベンジル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメート（ＩＩＩ）の合成＞
ベンジル  ３，５−ジヒドロキシカルバメート（７．３ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（各１００ｍＬ）と２回共沸留去し、無水ピリジン（３００ｍＬ）に溶解した。氷浴冷却下、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（９．８ｇ、２８，９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１６時間撹拌した。得られた黄色反応溶液から溶媒を留去し、残渣を無水トルエン（２５０ｍＬ）に溶解した。このトルエン溶液を４℃にて１時間冷却した後、ろ過した。得られた固体をトルエン（５０ｍＬ）で洗い、洗液をろ液と合わせて溶媒を留去し、暗黄色のシロップを得た。このシロップを室温にて少なくとも２４時間真空中乾燥した。粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、５００ｍＬ）を用い、溶出液にヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（３００ｍＬ、９０：５：５ｖ／ｖ／ｖ）、ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、８５：１０：５ｖ／ｖ／ｖ）、更にヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、８０：１５：５ｖ／ｖ／ｖ）、更にヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、７５：２０：５ｖ／ｖ／ｖ）、更にヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（２０００ｍＬ、７０：２５：５ｖ／ｖ／ｖ）、更にヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（２０００ｍＬ、５０：４５：５ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色油状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は１５．４ｇ（収率９６％）である。
【０１７２】
同様にして、以下の化合物を合成した。
【０１７３】
ｉ）ベンジル  ８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチルカルバメートを、ベンジル  ６，８−ジヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０１７４】
ｉｉ）ベンジル  １０−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−８−ヒドロキシドデシルカルバメートを、ベンジル  ８，１０−ジヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０１７５】
ｉｉｉ）ベンジル  １４−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１２−ヒドロキシテトラデシルカルバメートを、ベンジル  １２，１４−ジヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０１７６】
ｉｖ）ベンジル  ４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキシプロピル）フェニルカルバメートを、ベンジル  ４−（１，３−ジヒドロキシプロピル）フェニルカルバメートより合成した。
【０１７７】
ｖ）ベンジル  ４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキシプロピル）ピペリジン−１−カルボキシレートを、ベンジル  ４−（１，３−ジヒドロキシプロピル）ピペリジン−１−カルボキシレートより合成した。
【０１７８】
ｖｉ）ベンジル  ２−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキシプロピル）ピロリジン−１−カルボキシレートを、ベンジル  ２−（１，３−ジヒドロキシプロピル）ピロリジン−１−カルボキシレートより合成した。
【実施例５】
【０１７９】
＜ベンジル  １−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オール（ＩＶ）の合成＞
ベンジル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメート（１５．４ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）をメタノール（２５０ｍＬ）に溶解し、水素添加用フラスコに入れた。１０％パラジウムカーボン（１．５ｇ、５０％水／重量）を加え、フラスコを密閉した。ダイアフラムポンプを用いて空気を除いた後、乾燥アルゴンガスで置換し１０ｐｓｉとした。この置換操作を４回以上行った。反応フラスコを再度減圧し、水素を充填して３０ｐｓｉとした。反応懸濁を室温にて１６時間激しく振蕩して撹拌した。反応開始後４時間は、必要に応じて水素を再置換して３０ｐｓｉとした。反応終了後、減圧下水素を除去し、アルゴンガスで再置換して大気圧に戻した。触媒を０．４５mmナイロン膜でろ別し、更にメタノール（１００ｍＬ）で洗浄した。このメタノール洗液を母液と合し、溶媒を乾固するまで留去し、無色のガラス状泡状物を得た。このものを更に真空中で乾燥させた。収量は１１．４ｇ（収率９８％）である。
【０１８０】
同様にして、以下の化合物を合成した。
【０１８１】
ｉ）８−アミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−オールを、ベンジル  ８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチルカルバメートより合成した。
【０１８２】
ｉｉ）１０−アミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ドデカン−３−オールを、ベンジル  １０−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−８−ヒドロキシドデシルカルバメートより合成した。
【０１８３】
ｉｉｉ）１４−アミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）テトラデカン−３−オールを、ベンジル  １４−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１２−ヒドロキシテトラデシルカルバメートより合成した。
【０１８４】
ｉｖ）１−（４−アミノフェニル）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロパン−１−オールを、ベンジル  ４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキプロピル）フェニルカルバメートより合成した。
【０１８５】
ｖ）３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−（ピペリジン−４−イル）プロパン−１−オールを、ベンジル  ４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキプロピル）ピペリジン−１−カボキシレートより合成した。
【０１８６】
ｖｉ）３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−（ピロリジン−２−イル）プロパン−１−オールを、ベンジル  ２−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキプロピル）ピロリジン−１−カボキシレートより合成した。
【実施例６】
【０１８７】
＜コンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオール  リンカ分子の一般的な合成法＞
ω−アミノ−１，３−ジオール  リンカ分子にコンジュゲート部を共有結合でつなげるためには、リンカ分子上のアミノ基と反応しうるコンジュゲート部誘導体が必要である。好ましい反応活性を持つ誘導体としては、カルボン酸無水物、カルボン酸クロリド、Ｎ−ヒドロキシスクシイミドイル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルなどのカルボン酸活性エステル、または、ペンタフルオロフェニル、クロロホルメート、４−ニトロフェニルカルボナート、スルホニルクロリドなどが例としてあげられる。このような、反応活性誘導体は、精製物として合成・単離することもできるが、使用前に速やかにin situで合成して用いることもできる。一般的方法としては、当量の反応活性コンジュゲート誘導体とアミノ化リンカ分子とをともに好適な溶媒に溶かし、室温にて１ないし２４時間反応させる。なお、好適な溶媒は、反応試剤の溶解性および反応のタイプによって異なる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドは、カルボン酸活性エステルとω−アミノ−１，３−ジオール  リンカ分子との縮合反応においてよく使われる溶媒である。一方、ピリジンは、カルボン酸無水物、カルボン酸クロリド、またはクロトホルメートなど、酸副生成物が生成する場合に、より適している溶媒である。
【０１８８】
一般的合成経路について先に述べたが、以下の実施例７では、コレステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシフェニルカルバメートの詳細な合成方法を説明する。図２Ｂにその反応式を示した。この例では、コンジュゲート部にはコレステロールが、反応誘導体としてはコレステリルクロリドが相当する。実施例７−実施例１６にコレステロール以外のステロイドコンジュゲート部の詳細な合成法を示した。
【実施例７】
【０１８９】
＜コレステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメート（Ｖ）の合成＞
１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オール（４．３ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（各５０ｍＬ）と２回共沸させた後、無水ピリジン（７０ｍＬ）に溶解した。この溶液を氷浴にて冷却し、無水トルエン（１５ｍＬ）に溶かしたコレステリル  クロロホルメート（４．８ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。更に、反応液を室温にて１時間撹拌した。メタノール（２５ｍＬ）を加えた後、反応混合物から溶媒を留去し乾固させた。得られた残渣は、無水トルエン（各５０ｍＬ）と２回共沸させて粗製物を得た。この粗製物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２５０ｍＬ）、溶出液にヘキサン／アセトン／トリエチルアミン（５００ｍＬ、９３：５：２ｖ／ｖ／ｖ）、同（１０００ｍＬ、８８：１０：２ｖ／ｖ／ｖ）、更に同（１０００ｍＬ、７８：２０：２ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色樹脂状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は６．６ｇ（収率７６％）である。
【０１９０】
同様にして以下の化合物を合成した。
【０１９１】
ｉ）コレステリル  ８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチルカルバメートを、ピリジン中、８−アミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−オールおよびコレステリル  クロロホルメートより合成した。
【０１９２】
ｉｉ）コレステリル  １０−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−８−ヒドロキシドデシルカルバメートを、ピリジン中、１０−アミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ドデカン−３−オールおよびコレステリル  クロロホルメートより合成した。
【０１９３】
ｉｉｉ）コレステリル  １４−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１２−ヒドロキシテトラデシルカルバメートを、ピリジン中、１４−アミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−オールおよびコレステリル  クロロホルメートより合成した。
【０１９４】
ｉｖ）コレステリル  ４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキシプロピル）フェニルカルバメートを、ピリジン中、１−（４−アミノフェニル）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロパン−１−オールおよびコレステリル  クロロホルメートより合成した。
【０１９５】
ｖ）コレステリル  ４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキシプロピル）ピペリジン−1−カルボキシレートを、ピリジン中、３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）-1-(ピペリジン−４−イル)プロパン−１−オールおよびコレステリル  クロロホルメートより合成した。
【０１９６】
ｖｉ）コレステリル  ２−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキシプロピル）ピロリジン−１−カルボキシレートを、ピリジン中、３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−（ピロリジン−２−イル）プロパン−１−オールおよびコレステリル  クロロホルメートより合成した。
【０１９７】
ｖｉｉ）Ｎ−（８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチル）アセトアミドを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、８−アミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−オールおよび４−ニトロフェニル  アセテートより合成した。
【０１９８】
ｖｉｉｉ）コレステリル  ６−（８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチルアミノ）−６−オキソ−ヘキシルカルバメートを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、８−アミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−オールおよび１Ｈ−ベンゾ[ｄ][１，２，３]トリアゾール−１−イル  ６−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサナートより合成した。１Ｈ−ベンゾ[ｄ][１，２，３]トリアゾール−１−イル  ６−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)ヘキサナートは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中ｉｎ  ｓｉｔｕにて、６−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物およびＮ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミドより合成した。６−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸は、ピリジン中、６−アミノヘキサン酸およびコレステリル  クロロホルメートより合成した。
【０１９９】
ｉｘ）コレステリル  １２−（８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチルアミノ）−１２−オキソ−ドデシルカルバメートを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、８−アミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−オールおよび１Ｈ−ベンゾ[ｄ][１，２，３]トリアゾール−１−イル  １２−(コレステリルオキシカルボニルアミノ)ドデカナートより合成した。１Ｈ−ベンゾ[ｄ][１，２，３]トリアゾール−１−イル  １２−(コレステリルオキシカルボニルアミノ)ドデカナートは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中ｉｎ  ｓｉｔｕにて、１２−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ドデカン酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物およびＮ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミドより合成した。１２−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ドデカン酸は、ピリジン中、１２−アミノドデカン酸およびコレステリル  クロロホルメートより合成した。
【実施例８】
【０２００】
＜５a−コレスタン−３b−オール  ４−ニトロフェニル  カルボナートの合成＞
５a−コレスタン−３b−オール（３．９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を無水トルエン（５０ｍＬ）と共沸させた後、無水トルエン（１００ｍＬ）に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン（１．４ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）を加え、続いて、４−ニトロフェニル  クロロホルメート（２．０ｇ、９．９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。撹拌中、トリエチルアミン塩酸塩の無色沈殿物が生成した。反応混合物を、乾固するまで溶媒留去し粗製物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２００ｍＬ）、溶出液にヘキサン／酢酸エチル（２０００ｍＬ、９５：５ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去してアモルファス状の無色固体を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は３．５ｇ（収率６３％）である。
【０２０１】
同様にして以下の化合物を合成した。
【０２０２】
ｉ）スチグマステロール  ４−ニトロフェニルカルボナートを、トルエン中、スチグマステロール、４−ニトロフェニル  クロロホルメート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２０３】
ｉｉ）エルゴステロール  ４−ニトロフェニルカルボナートを、トルエン中、エルゴステロール、４−ニトロフェニル  クロロホルメート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２０４】
ｉｉｉ）トランス−アンドロステロン  ４−ニトロフェニルカルボナートを、酢酸エチル中、トランス−アンドロステロン、４−ニトロフェニル  クロロホルメート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２０５】
ｉｖ）プレグネノロン  ４−ニトロフェニルカルボナートを、テトラヒドロフラン中触媒量（１０ｍｏｌ％）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを添加し、プレグネノロン、４−ニトロフェニル  クロロホルメート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２０６】
ｖ）５α−アンドロスタン−３β−オール  ４−ニトロフェニルカルボナートを、トルエン中、５α−アンドロスタン−３β−オール、４−ニトロフェニル  クロロホルメート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２０７】
ｖｉ）５α−アンドロスタン−１７β−オール  ４−ニトロフェニルカルボナートを、トルエン中、５α−アンドロスタン−１７β−オール、４−ニトロフェニル  クロロホルメート、およびトリエチルアミンより合成した。
【実施例９】
【０２０８】
＜５α−コレスタン−３β−イル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートの合成＞
１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル（フェニル）メトキシペンタン−３−オール（１．２ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を無水トルエン（２０ｍＬ）に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン（０．４ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）を加え、続いて、５α−コレスタン−３β−オール  ４−ニトロフェニル  カルボナート（１．６ｇ、２．８ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物を、乾固するまで溶媒留去し黄色ガラス状の泡状粗製物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、１５０ｍＬ）、溶出液にヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（７００ｍＬ、８０：２０：２ｖ／ｖ／ｖ）、続いて同（１０００ｍＬ、７０：３０：２ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去してアモルファス状の無色ガラス状泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は２．０ｇ（収率８７％）である。
【０２０９】
同様にして以下の化合物を合成した。
【０２１０】
ｉ）スチグマステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートを、トルエン中、１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オール、スチグマステロール  ４−ニトロフェニル  カルボナート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２１１】
ｉｉ）エルゴステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートを、トルエン中、１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オール、エルゴステロール  ４−ニトロフェニル  カルボナート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２１２】
ｉｉｉ）トランス−アンドロステロニル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートを、トルエン中、１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オール、トランス−アンドロステロン  ４−ニトロフェニル  カルボナート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２１３】
ｉｖ）プレグネノロニル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートを、トルエン中、１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オール、プレグネノロン  ４−ニトロフェニル  カルボナート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２１４】
ｖ）５α−アンドロスタン−３β−イル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートを、トルエン中、１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オール、５α−アンドロスタン−３β−オール  ４−ニトロフェニル  カルボナート、およびトリエチルアミンより合成した。
【０２１５】
ｖｉ）５α−アンドロスタン−１７β−イル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートを、トルエン中、１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−オール、５α−アンドロスタン−１７β−オール  ４−ニトロフェニル  カルボナート、およびトリエチルアミンより合成した。
【実施例１０】
【０２１６】
＜コラン酸  ４−ニトロフェニルエステルの合成＞
コラン酸（３．６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２００ｍＬ）に懸濁し、室温にて激しく撹拌した。４−ニトロフェノール（１．４ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．１ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物をろ過し、固体を少量の塩化メチレンにて洗浄し、ろ液を乾固するまで減圧留去して、黄色固体を得た。粗製物を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶かし、ろ過した。ろ液を減圧留去して白色がかった固体を得、ヘキサンより再結晶した。収量は３．９ｇ（収率８０％）である。
【実施例１１】
【０２１７】
＜コラニル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルアミドの合成＞
１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル（フェニル）メトキシペンタン−３−オール（１．２ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を無水トルエン（２０ｍＬ）に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン（０．４ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）を加え、続いて、コラン酸  ４−ニトロフェニル  エステル（１．４ｇ、２．９ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物を、乾固するまで溶媒留去し黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２００ｍＬ）、溶出液にヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（１５００ｍＬ、６０：４０：２ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色ガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量１．７ｇは（収率８０％）である。
【実施例１２】
【０２１８】
＜３−Ｏ−アセチルリトコール酸の合成＞
【０２１９】
リトコール酸（５．５ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）を無水酢酸（５５ｍＬ）に懸濁し、９０〜９５℃にて終夜撹拌した。反応の間に、固体は全て溶解した。反応混合物を室温まで冷却し、減圧留去して、無色の固体を得た。この粗製物をメタノールより再結晶した。収量４．３ｇ。この固体の約３５％は、メタノールでの再結晶中に粗製物に混在した３’−Ｏ−アセチルリトコール酸混合無水物より生成したと思われる、３‘−Ｏ−アセチルリトコール酸メチルエステルであった。この混合物を精製せずにこのまま次の工程に使用した。
【実施例１３】
【０２２０】
＜３’−Ｏ−アセチルリトコール酸  ４−ニトロフェニルエステルの合成＞
実施例１２で得られた混合物（４．３ｇ）を塩化メチレン（１００ｍＬ）に溶かし、室温にて撹拌した。４−ニトロフェノール（１．４ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．１ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。反応混合物をろ過し、固体を少量の塩化メチレンで洗い、ろ液を減圧留去して黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２００ｍＬ）、溶出液にヘキサン／酢酸エチル（１５００ｍＬ、９０：１０：ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色の固体を得た。この粗製物をアセトニトリルより再結晶した収量３．９ｇ。この生成物は、目的物の４−ニトロフェニルエステルとメチルエステルの７０：３０（モル比）であった。この混合物を精製せずにこのまま次の工程に使用した。
【実施例１４】
【０２２１】
＜３−Ｏ−アセチルリトコリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルアミドの合成＞
１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル（フェニル）メトキシペンタン−３−オール（１．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を無水トルエン（２０ｍＬ）に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン（０．４ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）を加え、続いて、３-Ｏ-アセチルリトコール酸  ４−ニトロフェニル  エステル（実施例１３の生成物、１．８ｇ、２．４ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（２５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物を、乾固するまで溶媒留去し黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２００ｍＬ）、溶出液にヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（６００ｍＬ、６０：４０：２ｖ／ｖ／ｖ）、続いて、ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（１５００ｍＬ、５０：５０：２ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色ガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は１．４ｇ（収率７１％）である。
【実施例１５】
【０２２２】
＜リトコール酸  メチルアミドの合成＞
実施例１３で得られた３‘−Ｏ−アセチルリトコール酸  ４−ニトロフェニルエステル（２．０ｇ）を冷却した３３％（ｗ／ｖ）メチルアミン／エタノールに懸濁し、塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えた。反応フラスコを密栓にて固く密封し、室温にて３日間撹拌した。黄色になった反応溶液を乾固するまで減圧留去し、残渣を塩化メチレン(３００ｍＬ)および１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）で分液した。液層を分離し、塩化メチレン溶液をさらに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ），飽和食塩水（２００ｍＬ）にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して淡黄色泡状物を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）測定にて、アセチル基の除去が不十分であると認められたため、粗製物をクロロホルム（３０ｍＬ）およびメタノール（１０ｍＬ）混合溶液に溶かし、１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加えた。混合溶液を室温にて４時間撹拌し、その後、氷酢酸（１ｍＬ）、続いて酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えた。反応溶液を水（各５０ｍＬ）にて３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して無色の固体を得た。収量１．９ｇ。上記メチルアミンエタノール溶液との反応では、４−ニトロフェニルエステルのみならず、メチルエステルもメチルアミドに変換された。
【実施例１６】
【０２２３】
＜リトコール酸メチルアミド  ４−ニトロフェニルカルボナートの合成＞
リトコール酸メチルアミド（１．４ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を無水トルエン（５０ｍＬ）と共沸した後、無水トルエン（５０ｍＬ）およびクロロホルム（５０ｍＬ）の混合溶液に溶かした。反応溶液を室温にて撹拌下、トリエチルアミン（０．６ｍＬ、４．３ｍｍｏｌ）、続いて、４−ニトロフェニル  クロロホルメート（０．７ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を室温にて終夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーにて（塩化メチレン：酢酸エチル、１：１、ｖ／ｖ）反応が完結していないことが認められたため、更にトリエチルアミン（０．６ｍＬ、４．３ｍｍｏｌ）および４−ニトロフェニル  カルボナート（０．７ｇ）を加え、更に反応を２日間続けた。反応溶液を、ほぼ乾固するまで減圧留去し、得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２００ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン（５００ｍＬ）、続いて、塩化メチレン／酢酸エチル（１０００ｍＬ、３：１ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色の固体を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は１．７ｇ（収率８５％）である。
【実施例１７】
【０２２４】
＜リトコール酸メチルアミド  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートの合成＞
１−アミノ−５−（ビス（４−メトキシフェニル（フェニル）メトキシペンタン−３−オール（１．２ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を無水トルエン（２０ｍＬ）に溶解した。トルエン溶液を室温にて撹拌させながら、トリエチルアミン（０．４ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）を加え、続いて、リトコール酸メチルアミド  ４−ニトロフェニル  カルボナート（１．４ｇ、２．９ｍｍｏｌ）およびトルエン（２５ｍＬ）を加えた。その後、反応混合物を３日間撹拌した。反応混合物を、ほぼ乾固するまで溶媒留去し黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２００ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン／トリエチルアミン（５００ｍＬ、１００：２ｖ／ｖ）、続いて、塩化メチレン／酢酸エチル／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、８０：２０：２ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色ガラス状の泡状物を得た。更に真空中十分に乾燥した。収量２．５ｇ。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）によれば、この生成物には約２５％(モル比)の出発原料であるリトコール酸メチルアミド  ４−ニトロフェニル  カルボナートが含まれていた。この混合物をこのまま精製せずに次の工程に使用した。
【０２２５】
以上実施例を説明してきたが、下記に続く実施例を分かりやすくかつ明確に説明するために、表１‐１から表１‐４に実施例の化合物の構造式を記載し、その名称を省略形で記載した。
【実施例１８】
【０２２６】
＜オリグヌクレオチド合成用固相担持形コンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子の一般的合成法＞
コンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子は、固相合成用の担体に分子鎖を用いて結合することができる。先に述べたように、分子鎖としてはジカルボン酸が汎用される。先ず、環状酸無水物を形成しやすいジカルボン酸を用いる場合は、ほぼ当量のコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子および環状酸無水物を、トリエチルアミン、１−メチルイミダゾールを含む塩化メチレンに溶解し、この反応溶液を室温にて１２時間ないし数日間撹拌した。また、環状酸無水物を生成しにくいジカルボン酸を用いる場合には、カルボジイミド試剤により先ずカルボン酸を活性化させ、小過剰のコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子と、触媒量のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの存在下、室温にて１２時間ないし数日間反応させた。どちらの場合においても、ジカルボン酸分子鎖を含むコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子を、クロマトグラフィーの後にトリエチルアミン塩として単離した。
【０２２７】
次に、ジカルボン酸分子鎖を含むコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子を、固相合成用の担体に結合させた。オリゴヌクレオチド合成用の典型的な担体としては、アミノ官能基制御多孔ガラスまたは架橋アミノメチルポリスチレンのいずれかを用いた。先ず、コンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子の遊離カルボン酸部分を、以下に述べるカルボン酸活性化剤で活性化した、すなわち、ヘキサフルオロホスフェート[ＨＢＴＵ]、またはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート[ＢＯＰ]を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液中、三級アミンおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの共存下、反応させた。活性化カルボン酸溶液の一部を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、固相合成用の担体の懸濁液に加え、混合物を室温にて１−２時間振騰した。固相合成用の担体に結合した（充填した）ジカルボン酸分子鎖を含むコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子の量は、当業者によく知られた測定方法を用いて定量した。すなわち、少量の担体試料を適当な溶媒で洗い、ＤＭＴｒ-保護基を除去するために、試料を、３％ｖ／ｖジクロロ酢酸の塩化メチレン溶液などの無水の酸溶液で処理し、得られた酸溶液の４９８ｎｍにおける吸収を測定し、ベールの法則および７０，０００Ｍ-１ｃｍ-１のモル定数を用いてＤＭＴｒカチオン量を計算して測定した。こうして好ましい充填結果が得られるまで、必要に応じて、固相合成用担体に前記の活性化カルボン酸溶液を一部ずつ加えた。充填量は、固相用担体１ｇに対し、約５〜約３５iｍｏｌのコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子であった。
【０２２８】
上記一般的合成法による、固相用ポリスチレン担体結合の４−（１−（コレステリルオキシカルボキシアミノ）−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸合成法の詳細を、以下の実施例１９、実施例２０、および図２Ｂに示した。ジカルボン酸鎖としてはコハク酸を用いた。
【実施例１９】
【０２２９】
＜４−（１−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩（ＶＩ）の合成＞
コレステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメート（６．６ｇ、７．９ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．８ｇ、８．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（３．３ｍＬ、２３．７ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（０．３ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン溶液（６０ｍＬ）に溶解した。反応溶液を室温にて３日間撹拌した。この間、反応溶液は暗色になった。次に、反応溶液を塩化メチレン（１００ｍＬ）にて稀釈し、氷冷したクエン酸水溶液（１０％ｗ／ｖ、各５０ｍＬ）にて２回洗浄、飽和食塩水（５０ｍＬ）にて１回洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して暗色の樹脂を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、１７５ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９５：５ｖ／ｖ）、続いて、塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９０：５：５ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色の樹脂を得た。更に真空中十分に乾燥して白色がかったガラス状の泡状物を得た。収量は６．３ｇ（収率８５％）である。
【０２３０】
同様にして、以下の化合物を合成した。
【０２３１】
ｉ）４−（８−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  ８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチルカルバメートより合成した。
【０２３２】
ｉｉ）４−（１０−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  １０−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−８−ヒドロキシドデシルカルバメートより合成した。
【０２３３】
ｉｉｉ）４−（１４−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  １４−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１２−ヒドロキシテトラデシルカルバメートより合成した。
【０２３４】
ｉｖ）４−（１−（４−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）フェニル）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  ４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキシプロピル）フェニルカルバメートより合成した。
【０２３５】
ｖ）４−（１−（１−（コレステリルオキシカルボニル）ピペリジン−４−イル）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  ４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキシプロピル）ピペリジン−１−カルボキシレートより合成した。
【０２３６】
ｖｉ）４−（１−（１−（コレステリルオキシカルボニル）ピロリジン−２−イル）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  ２−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−１−ヒドロキシプロピル）ピロリジン−１−カルボキシレートより合成した。
【０２３７】
ｖｉｉ）４−（８−アセトアミド−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  Ｎ−（８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチル）アセトアミドより合成した。
【０２３８】
ｖｉｉｉ）４−（８−（（６−コレステリルオキシカルボニル）アミノヘキサンアミド−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  ６−（８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチルアミノ）−６−オキソヘキシルカルバメートより合成した。
【０２３９】
ｉｘ）４−（８−（（１２−コレステリルオキシカルボニル）アミノドデカンアミノ−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）オクタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  １２−（８−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−６−ヒドロキシオクチルアミノ）-１２-オキソドデシルカルバメートより合成した。
【実施例２０】
【０２４０】
＜架橋アミノメチルポリスチレンに結合した４−（１−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸（ＶＩＩ）の合成＞
ＡＭ−ポリスチレン（５．０ｇ、約３３μｍｏｌアミノ基／ｇ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ（２５０ｍＬ）中、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３７．５ｍＬ）に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ（５０ｍＬ）に、４−（１−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）−５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩酸塩（１０５ｍｇ、１１３μｍｏｌ）、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５．０ｍＬ）、トリエチルアミン（３１μＬ、２２５．０μｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１８ｍｇ、１１７．５μｍｏｌ）およびＢＰＯ（５５ｍｇ、１２４μｍｏｌ）を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて５分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液（４．５ｍＬ、２０．３μｍｏｌ）の一部を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を１．５時間振騰し、固相用担体の一部４０ｍｇを取り出した。先に述べた測定方法により充填を測定した結果、１１．０μｍｏｌ／ｇであった。更に活性化したカルボン酸溶液（４．５ｍＬ、２０．３μｍｏｌ）を固相懸濁液に加え、１時間振騰した。充填は１４．５μｍｏｌ／ｇであった。固相懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）、アセトン（２００ｍＬ）、アセトニトリル（２００ｍＬ）で十分に洗浄し、更に真空中乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸アセトニトリル溶液（１０％ｖ／ｖ、２５ｍＬ）および１−メチルイミダゾールアセトニトリル溶液（１０％ｖ／ｖ、２５ｍＬ）混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて２．５時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相担体を、アセトニトリル（５００ｍＬ）にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
【０２４１】
同様にして、実施例１９  ｉ）〜ｉｘ）に記載した化合物を約１５．０  ＋  １．０μｍｏｌ／ｇ  担持した固相用担体を合成した。
【０２４２】
上記一般合成法による固相用ポリスチレン担体に結合した４−（１−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  の詳細な合成方法を、以下の実施例２１および実施例２２に示した。この場合は、ジカルボン酸にジグリコール酸を用いた。
【実施例２１】
【０２４３】
＜４−（１−（コレスタニルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩の合成＞
コレスタニル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメート（２．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、ジグリコール酸無水物（０．４ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．０ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（０．２ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン溶液（２５ｍＬ）に溶解した。反応溶液を室温にて３日間撹拌した。この間、反応溶液は暗色になった。次に、反応溶液を塩化メチレン（２００ｍＬ）にて稀釈し、５％（ｗ／ｖ）リン酸二カリウム水溶液（５０ｍＬ）にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して褐色の油状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、１００ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン／トリエチルアミン（４００ｍＬ、９５：５ｖ／ｖ）、続いて、塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９３：２：５ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄褐色のガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は２．０ｇ（収率７９％）である。
【０２４４】
同様にして、以下の化合物を合成した。
【０２４５】
ｉ）４−（１−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、コレステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０２４６】
ｉｉ）４−（１−（スチグマステリルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、スチグマステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０２４７】
ｉｉｉ）４−（１−（エルゴステリルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、エルゴステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０２４８】
ｉｖ）４−（１−（トランス−アンドロステロニルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、トランス−アンドロステロニル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０２４９】
ｖ）４−（１−（プレグネノロニルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、プレグネノロニル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０２５０】
ｖｉ）４−（１−（５a−アンドロスタン−３b−イルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、５a−アンドロスタン−３b−イル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０２５１】
ｖｉｉ）４−（１−（５a−アンドロスタン−１７b−イルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、５a−アンドロスタン−１７b−イル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０２５２】
ｖｉｉｉ）４−（１−（コラニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、コラニル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルアミドより合成した。
【０２５３】
ｉｘ）４−（１−（３−Ｏ−アセチルリトコリルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、３-Ｏ-アセチルリトコリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルアミドより合成した。
【０２５４】
ｘ）４−（１−Ｎ−メチルアミドリトコリルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩を、リトコール酸メチルアミド  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【実施例２２】
【０２５５】
＜架橋アミノメチルポリスチレン結合４−（１−（コレスタニルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ）−２−オキソエトキシ）酢酸の合成＞
ＡＭ−ポリスチレン（５．０ｇ、約３３μｍｏｌアミノ基／ｇ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ（２５０ｍＬ）中、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３７．５ｍＬ）に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ（５０ｍＬ）に、４−（１−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）−５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ペンタン−３−イルオキシ−２−オキソエトキシ）酢酸  トリエチルアミン塩（５０ｍｇ、５０μｍｏｌ）、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１２．５ｍＬ）、トリエチルアミン（１０μＬ、９０μｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１０ｍｇ、５０μｍｏｌ）およびＢＰＯ（２０ｍｇ、５０μｍｏｌ）を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて５分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液の一部（９．０ｍＬ、３６μｍｏｌ）を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を１．５時間振騰し、固相用担体の一部４０ｍｇを取り出した。先に述べた測定方法により充填量を測定した結果、５．２μｍｏｌ／ｇであった。更に活性化したカルボン酸溶液（１．３ｍＬ、５．２μｍｏｌ）を固相懸濁液に加え、１時間振騰した。充填量は６．０μｍｏｌ／ｇであった。固相懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）、アセトン（２００ｍＬ）、アセトニトリル（２００ｍＬ）で十分に洗浄し、更に真空中乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸アセトニトリル溶液（１０％ｖ／ｖ、２５ｍＬ）および１−メチルイミダゾールアセトニトリル溶液（１０％ｖ／ｖ、２５ｍＬ）混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて２．５時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相用担体を、アセトニトリル（５００ｍＬ）にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
【０２５６】
同様にして、実施例２１  ｉ）〜ｘ）に記載した化合物を約６．０  ＋  ０．５μｍｏｌ／ｇ  担持した固相用担体を合成した。
【実施例２３】
【０２５７】
＜コンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオール  リンカ分子ホスホラミダイトの一般的合成法＞
ω−アミノ−１，３−ジオール  リンカ分子にコンジュゲート部は、当業者によく知られた方法を用いてホスホラミダイト誘導体に変換することができる。
【０２５８】
先に述べた一般的合成法によるコレステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）ペンチルカルバメートの詳細な合成方法を、以下の実施例２４および図２Ｂに示した。
【実施例２４】
【０２５９】
＜コレステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）ペンチルカルバメート（ＶＩＩＩ）の合成＞
コレステリル  ５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−ヒドロキシペンチルカルバメート（１．３ｇ、１．６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（２２４μＬ、１．６ｍｍｏｌ）を含む無水塩化メチレン（３．２ｍＬ）に溶解した。別のフラスコに、メチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトライソプロピルホスフォロジアミジト（０．６ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を、塩化メチレン（３．２ｍＬ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（２２４μＬ、１．６ｍｍｏｌ）テトラゾール  アセトニトリル溶液（０．５Ｍ、１．６ｍＬ、０．８ｍｍｏｌ）の混合溶液に溶かした。この溶液を室温にて５分撹拌し、先に調製した溶液に一回で加えた。この反応混合物を６時間撹拌した。反応混合物にメタノール（５ｍＬ）を加え、溶媒留去して濃厚な油状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、７５ｍＬ）、溶出液にヘキサン／アセトン／トリエチルアミン（５００ｍＬ、９５：５：２ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して透明無色の油状物を得た。更に、トルエンと２回共騰して無色のガラス状泡状物を得、これを真空中で十分に乾燥した。収量は１．４ｇ（収率８８％）である。
【実施例２５】
【０２６０】
＜コンジュゲート部−ω−アミノアルコール  リンカ分子の一般的合成法＞
コンジュゲート部をω−アミノアルコールリンカ分子に共有結合でつなげるためには、リンカ分子のアミノ基と反応性に富むコンジュゲ−ト部誘導体が必要である。好適な反応性誘導体としては、実施例で示したように、カルボン酸無水物、カルボン酸クロリド、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、またはペンタフルオロフェニル基などで活性化したカルボン酸エステル、クロロホルメート、４−ニトロフェニルカルボナート、および塩化スルホニルなどがあげられる。これらの反応性誘導体は、純粋な化合物として合成、単離できるが、または反応直前にｉｎ  ｓｉｔｕで合成してもよい。一般的な合成方法としては、当量の活性コンジュゲート誘導体とw−アミノアルコールリンカ分子とを、好適な溶媒に溶解し、室温にて１ないし２４時間反応させる。好適な溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが活性カルボン酸エステルとω−アミノアルコールリンカ分子との縮合に用いられるが、反応時に酸副生成物が生じるような、カルボン酸無水物、カルボン酸クロリド、クロロホルメートなどの場合には、ピリジンがより好ましい溶媒である。
【実施例２６】
【０２６１】
＜コレステリル  ２−ヒドロキシエチルカルバメートの合成＞
２−アミノエタノール（０．４ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１５０ｍＬ）に溶かし、コレステリル  クロロホルメート（３．０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて終夜撹拌した。反応混合物から溶媒を留去し、得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、５００ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン／メタノール（２０００ｍＬ、１００：４ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色ガラス状の泡状物を得た。これを更に真空中で十分に乾燥した。収量は２．８ｇ（収率８７％）である。
同様にして以下の化合物を合成した。
【０２６２】
ｉ）コレステリル  ３−ヒドロキシプロピルカルバメートをコレステリル  クロロホルメートおよび３−アミノプロパン−１−オールより合成した。
【０２６３】
ｉｉ）コレステリル  ４−ヒドロキシブチルカルバメートをコレステリル  クロロホルメートおよび４−アミノプロパン−１−オールより合成した。
【０２６４】
ｉｉｉ）コレステリル  ５−ヒドロキシペンチルカルバメートをコレステリル  クロロホルメートおよび５−アミノプロパン−１−オールより合成した。
【０２６５】
ｉｖ）コレステリル  ６−ヒドロキシヘキシルカルバメートをコレステリル  クロロホルメートおよび６−アミノプロパン−１−オールより合成した。
【０２６６】
ｖ）コレステリル  ８−ヒドロキシプロピルカルバメートをコレステリル  クロロホルメートおよび８−アミノプロパン−１−オールより合成した。８−アミノプロパン−１−オールは、８−ブロモオクタン−１−オールをアジ化ナトリウムと９５％エタノール中加熱還流させた後に、接触水素添加（１０％Ｐｄ／Ｃ触媒、３０ｐｓｉ  Ｈ２）して合成した。
【０２６７】
ｖｉ）コレステリル  １２−ヒドロキシドデシルカルバメートをコレステリル  クロロホルメートおよび１２−アミノドデカン−１−オールより合成した。１２−アミノドデカン−１−オールは、１２−ブロモドデカン−１−オールをアジ化ナトリウムと９５％エタノール中加熱還流させた後に、接触水素添加（１０％Ｐｄ／Ｃ触媒、３０ｐｓｉ  Ｈ２）して合成した。
【０２６８】
ｖｉｉ）コレステリル  ４−（ヒドロキシメチル）ペンチルカルバメートをコレステリル  クロロホルメートおよび４−アミノベンジルアルコールより合成した。
【０２６９】
ｖｉｉｉ）コレステリル  ４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシレートを、コレステリル  クロロホルメートおよび４−ヒドロキシピペリジンより合成した。
【０２７０】
以下に続く実施例を分かりやすく明確にするために、表２‐１から表２‐２に上記化合物およびその簡略名を示した。
【実施例２７】
【０２７１】
＜コンジュゲート部−ω−アミノアルコール  リンカ分子ホスホラミダイトの一般的合成法＞
コンジュゲート部−ω−アミノアルコールリンカ分子は、当業者によく知られた方法を用いてホスホラミダイト誘導体に変換することができる。
【０２７２】
図３（ｂ）にコンジュゲート部−ω−アミノアルコールリンカ分子ホスホラミダイトの一般的合成スキームを示した。続く実施例２８に、先に述べた一般的合成スキームによるコレステリル  ２−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）エチルカルバメートの詳細な合成方法を示した。
【実施例２８】
【０２７３】
＜コレステリル  ２−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）−エチルカルバメートの合成＞
コレステリル  ２−ヒドロキシエチルカルバメート（２．８ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（８１０μＬ、５．８ｍｍｏｌ）を含む無水塩化メチレン（１１．６ｍＬ）に溶かし、室温にて撹拌した。別のフラスコに、メチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトライソプロピルホスフォロジアミジト（２．３ｇ、８．７ｍｍｏｌ）を、塩化メチレン（１１．６ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（８１０μＬ、５．８ｍｍｏｌ）、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール  アセトニトリル溶液（０．５Ｍ、５．８ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）の混合溶液に溶かした。この溶液を室温にて５分間撹拌し、先に調製した溶液に一度に加えた。この反応混合物を室温にて終夜撹拌し、溶媒留去して濃厚な液体を得た。得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、４００ｍＬ）、溶出液にヘキサン／アセトン／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９４：３：３  ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して透明な無色の液体を得た。これを更に真空中で十分に乾燥した。収量は３．１ｇ（収率８５％）である。
【０２７４】
同様にして以下の化合物を合成した。
【０２７５】
ｉ）コレステリル  ３−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）プロピルカルバメートを、コレステリル  ３−ヒドロキシプロピルカルバメートより合成した。
【０２７６】
ｉｉ）コレステリル  ４−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）ブチルカルバメートを、コレステリル  ４−ヒドロキシブチルカルバメートより合成した。
【０２７７】
ｉｉｉ）コレステリル  ５−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）ペンチルカルバメートを、コレステリル  ５−ヒドロキシペンチルカルバメートより合成した。
【０２７８】
ｉｖ）コレステリル  ６−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）ヘキシルカルバメートを、コレステリル  ６−ヒドロキシヘキシルカルバメートより合成した。
【０２７９】
ｖ）コレステリル  ８−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）オクチルカルバメートを、コレステリル  ８−ヒドロキシオクチルカルバメートより合成した。
【０２８０】
ｖｉ）コレステリル  １２−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）ドデシルカルバメートを、コレステリル  １２−ヒドロキシドデシルカルバメートより合成した。
【０２８１】
ｖｉｉ）コレステリル  ４−（（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）メチル）フェニルカルバメートを、コレステリル  ４−（ヒドロキシメチル）フェニルカルバメートより合成した。
【０２８２】
ｖｉｉｉ）コレステリル  ４−（（ジイソプロピルアミノ）（メトキシ）ホスフィノオキシ）ピペリジン１-カルボキシレートを、コレステリル  ４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシレートより合成した。
【０２８３】
ｉｘ）コレステリル  メチル  ジイソプロピルホスホラミダイトを、コレステロールより合成した。
【実施例２９】
【０２８４】
＜ヒドロキシメチルピロリジノールリンカ分子の一般的合成法＞
図４に、ヒドロキシメチルプロパンジオールを用いたリンカ分子類合成の一般的合成スキームを示した。なお、当業者においては、ここで説明される具体的な方法、試薬を変更しても、同じ化合物を得ることができることは明らかである。先ず、ヒドロキシプロリン化合物に適当なＮ−保護基（例えば、Ｆｍｏｃ、ＢｏｃおよびＣｂｚなど）を作用させてＮ−保護ヒドロキシプロリンとした。この化合物を、ボラン−メチルスルフィド錯体と無水テトラヒドロフラン中１時間加熱還流することにより還元し、Ｎ−保護ヒドロキシメチルピロリジノールとした。次に、４，４‘−ジメトキシトリチルクロリドと、ピリジン中室温にて１２ないし１８時間反応させて、Ｎ−保護  Ｏ−ＤＭＴ−保護ヒドロキシメチルピロリジノールへと誘導した。前記Ｎ−保護基を、適当な脱保護反応を用い、所望のヒドロキシメチルピロリジノリンカ分子を得た。
【０２８５】
以下の実施例３０ないし実施例３３および図５Ａに、上記一般合成スキームによる５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ピロリジン−３−オールの詳細な合成法を示した。
【実施例３０】
【０２８６】
＜１−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−４−ヒドロキシピロリジン−２−カルボン酸（ＩＸ）の合成＞
トランス−４−ヒドロキシプロリン（５．０ｇ、３８．１ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（７５ｍＬ）および水（７５ｍＬ）の混合溶媒に懸濁させ、室温にて激しく撹拌した。炭酸水素ナトリウム（８．０ｇ、９５．２ｍｍｏｌ）を加え、固体が溶解するまで撹拌した。次に、９−フルオレニルメチル  クロロホルメート（１１．４ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）のトルエン（２５ｍＬ）溶液を、徐々に滴下して加え、１６時間撹拌した。この反応混合物に、水（５０ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えた。分液ロートに移した後、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）にて洗浄した。有機層と分離後、水層を濃塩酸にてｐＨ試験紙を指標に約ｐＨ２に調整した。この溶液に酢酸エチル（１５０ｍＬ９を加え、よく振騰した後に、分液ローとで分液した。水層を再度酢酸エチル（１５０ｍＬ）にて抽出し、酢酸エチル層を合して無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、溶媒留去して無色のガラス状泡状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、４００ｍＬ）、溶出液に酢酸エチル／酢酸（１８００ｍＬ、１００：２  ｖ／ｖ）、続いて、酢酸エチル／メタノール／酢酸（1000ｍＬ、９５：５：２  ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して透明な無色の液体を得た。この液体をトルエン（各１５０ｍＬ）と3回共沸させて、残留酢酸を留去した。得られた無色の固体を真空中で十分に乾燥した。収量は１２．０ｇ（収率８９％）である。
【実施例３１】
【０２８７】
＜（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ４−ヒドロキシー2-(ヒドロキシメチル)ピロリジン−１−カルボキシレート（Ｘ）の合成＞
１−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−４−ヒドロキシピロリジン−２−カルボン酸（１３．３ｇ、３７．６ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（２５０ｍＬ）に溶かした。この溶液を室温にて撹拌し、ボラン−メチルスルフィド錯体テトラヒドロフラン溶液（２Ｍ、４０ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）を、ゆっくりと先の溶液にシリンジにて加えた。気体の発生が収まった後、反応フラスコに冷却器およびドライライト乾燥管を付け、１時間加熱還流した。この間に無色の沈殿物が生じた。次に、メタノール（１５ｍＬ）をまだ熱い反応混合物に注意深く加え、更に１５分加熱還流させた。この間に、先の固体は溶解した。反応混合物を放冷後、溶媒留去して透明な液状物を得た。ホウ酸塩を除くために、この液状物をメタノール（各１００ｍＬ）と３回共沸させた。得られた無色の固体を真空中で乾燥した。収量は１２．７ｇ（収率９９％）である。
【実施例３２】
【０２８８】
＜（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ２-((ビス(４−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（ＸＩ）の合成＞
（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ４−ヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)ピロリジン−１−カルボキシレート（１０．６ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（各５０ｍＬ）と２回共沸させた後、無水ピリジン（２００ｍＬ）に溶かした。反応溶液を氷浴にて冷却し、４，４‘−ジメトキシトリチルクロリド（１１．０ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）を、各３回に分けて３０分間隔で加えた。添加終了後、フラスコを密栓し、４℃にて１６時間保存した。次に、反応混合物を溶媒留去し、濃厚な黄色の液状物を得た。これをトルエン（１００ｍＬ）に溶かし、ろ過した後に溶媒留去した。残渣を塩化メチレン（３５０ｍＬ）に溶かし、冷却したクエン酸水溶液（１０％  ｖ／ｖ、１５０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ），飽和食塩水（１５０ｍＬ）にて洗浄した。塩化メチレン溶液を、無水硫酸にて乾燥し、ろ過、溶媒留去して黄色の泡状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、５００ｍＬ）、溶出液に酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン（１３００ｍＬ、５０：５０：１  ｖ／  ｖ／ｖ）、続いて、同（1８00ｍＬ、６７：３３：１  ｖ／ｖ／ｖ）、更に、酢酸エチル／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９９：１  ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して白みがかったアモルファス状の固体を得た。更に、真空中で十分に乾燥した。収量は１７．７（収率８８％）である。
【実施例３３】
【０２８９】
＜５-（（ビス(４−メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)ピロリジン−３−オール(ＸＩＩ）の合成＞
（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  2−（（ビス(４−メトキシフェニル)（フェニル）メトキシ）メチル−４−ヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（３．４ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジホルムアミド（１５ｍＬ）に溶かした。反応溶液を室温にて撹拌し、ピペリジン（１．１ｍＬ、１１ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、多量の無色沈殿物が生成した。水（１００ｍＬ）および酢酸エチル（７５ｍＬ）を加え、先の固体がすべて溶解するまで撹拌した。２層を分離後、水層を酢酸エチル（７５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を合して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過した。ろ液の溶媒を留去して、アモルファス状の無色固体を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、１５０ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（７００ｍＬ、９４：１：５  ｖ／  ｖ／ｖ）、続いて、塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（７00ｍＬ、９０：５：５  ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して無色ガラス状の泡状物を得た。更に、真空中で十分に乾燥した。収量は２．２（収率９９％）である。
【実施例３４】
【０２９０】
＜コンジュゲート部−ヒドロキシメチルピロリジノール  リンカ分子の一般的合成法＞
以下に述べる化合物の合成方法は、先に述べたコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子の場合と同様である。
【０２９１】
以下の実施例３５、実施例３６、および図５Ｂに、先に述べた一般的合成スキームによる、コレステリル  ６−（２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル）−６−オキソヘキシルカルバメートの詳細な合成法を示した。この場合、コンジュゲート部はコレステロール、反応誘導体は６−コレステリルオキシカルボニルアミノヘキサン酸である。
【実施例３５】
【０２９２】
＜６−コレステリルオキシカルボニルアミノヘキサン酸（ＸＩＩＩ）の合成＞
６−アミノヘキサン酸（３．９ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（６０ｍＬ）に懸濁させ、氷浴にて冷却しながら撹拌した。塩化トリメチルシラン（１５ｍＬ、１１８．６ｍｍｏｌ）をシリンジにて加え、反応混合物を１時間撹拌した。この間に固体は全て溶解した。次に、コレステリル  クロロホルメート（７．０ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）を先の冷却溶液に加え、１時間後に更にコレステリル  クロロホルメート（６．５ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を取り除き、反応混合物を室温にて３時間撹拌した。再び反応混合物を氷浴にて冷却、冷却した塩酸水溶液（０．７Ｍ、１５０ｍＬ）をゆっくりと加えた。１５分後、反応混合物を分液ロートに注ぎ、塩化メチレン（２００ｍＬ）を加えた。フラスコの内容物を十分振騰し、水層、有機層を分離した。水層は、更に塩化メチレン（２００ｍＬ）にて抽出した。塩化メチレン層を合し、塩酸水溶液（０．７Ｍ、２００ｍＬ）、飽和食塩水（２００ｍＬ）にて洗い、無水硫酸にて乾燥、ろ過した。ろ液をから溶媒を留去して、アモルファス状の無色固体を得た。この固体をアセトン（１５０ｍＬ）に溶かし、塩酸水溶液（１Ｍ、２００ｍＬ）を加えて生成物を沈殿させた。この固体をろ過、水で洗浄、真空中で乾燥した。収量は１５．８ｇ（収率９７％）である。
【実施例３６】
【０２９３】
＜コレステリル  ６−(２−((ビス(４−メトキシフェニル）（フェニル)メトキシ)メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル)−６−オキソヘキシルカルバメート（ＸＩＶ）の合成＞
６−コレステリルオキシカルボニルアミノヘキサン酸（２．９ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５０ｍＬ）に溶かし、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．９ｇ、５．６ｍｍｏｌ）、続いてＮ，Ｎ‘−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温にて１時間撹拌した。この間、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルウレアの無色沈殿が生成した。次に、５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）ピロリジン−３−オール（２．２ｇ、５．２ｍｍｏｌ）加え、反応混合物を４時間撹拌した。反応混合物をろ過し、少量（約２５ｍＬ）まで濃縮した。酢酸エチル（２００ｍＬ）を加え、溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（各１００ｍＬ）にて３回洗浄し、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。この酢酸エチル溶液を、無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、溶媒留去して淡黄色のガラス状泡状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２５０ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン／ヘキサン／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、７５：２０：５  ｖ／ｖ／ｖ）、続いて、塩化メチレン／トリエチルアミン（５00ｍＬ、９５：５  ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して白みがかったガラス状の泡状物を得た。更に、真空中で十分に乾燥した。収量は４．４（収率８８％）である。
【実施例３７】
【０２９４】
＜オリゴヌクレオチド固相合成用担体に結合したコンジュゲート部−ヒドロキシメチルピロリジノール  リンカ分子の一般的合成法＞
以下に述べる化合物の合成方法は、先に述べたコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子の場合と同様である。
【０２９５】
以下の実施例３８、実施例３９、および図５Ｃに、先に述べた一般的合成スキームによる、固相合成用ポリスチレン担体に結合した４−（５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル)−１−(６-((コレステリルオキシ)カルボニルアミノ)ヘキサノイル）ピロリジン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸の詳細な合成法を示した。この場合、ジカルボン酸結合鎖にはコハク酸を用いた。
【実施例３８】
【０２９６】
＜４−（５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−１−（６−（（コレステリルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサノイル）ピロリジン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩(ＸＶ)の合成＞
コレステリル  ６−（２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル）−６−オキソヘキシルカルバメート（４．３ｇ、４．６ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．５ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．９ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（０．２ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン溶液（５０ｍＬ）に溶解した。反応溶液を室温にて２４時間撹拌した。次に、反応溶液を塩化メチレン（１００ｍＬ）にて稀釈し、氷冷した１０％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液（５０ｍＬ）にて２回、更に飽和食塩水（５０ｍＬ）にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して黄色の樹脂を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、１５０ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン／トリエチルアミン（５００ｍＬ、９５：５  ｖ／ｖ）、続いて、塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９０：５：５  ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して白みがかったガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は４．３ｇ（収率８２％）である。
【実施例３９】
【０２９７】
＜架橋アミノメチルポリスチレンに結合した４−（５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−１−（６−（（コレステリルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサノイル）ピロリジン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸 (ＸＶＩ)の合成＞
ＡＭ−ポリスチレン（５．０ｇ、約３３μｍｏｌアミノ基／ｇ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ（２５０ｍＬ）中、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３７．５ｍＬ）に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ（５０ｍＬ）に、４−（５−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）−１−（６−（（コレステリルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサノイル）ピロリジン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩（２４１ｍｇ、２１０μｍｏｌ）、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５．０ｍＬ）、トリエチルアミン（５８μＬ、４２０μｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（３４ｍｇ、２５２μｍｏｌ）およびＢＰＯ（１０２ｍｇ、２３１μｍｏｌ）を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて５分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液の一部（９．０ｍＬ、７５．６μｍｏｌ）を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を２．５時間振騰し、固相用担体の一部４０ｍｇを取り出した。先に述べた測定方法により充填量を測定した結果、１２．２μｍｏｌ／ｇであった。更に活性化したカルボン酸溶液（２．５ｍＬ、２１．０μｍｏｌ）を固相懸濁液に加え、２時間振騰した。充填量は１５．０μｍｏｌ／ｇであった。固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）、アセトン（２００ｍＬ）、アセトニトリル（２００ｍＬ）で十分に洗浄し、更に真空中終夜乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸  アセトニトリル溶液（１０％ｖ／ｖ、２５ｍＬ）および１−メチルイミダゾール  アセトニトリル溶液（１０％  ｖ／ｖ、２５ｍＬ）混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて２．５時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相用担体を、アセトニトリル（５００ｍＬ）にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
【実施例４０】
【０２９８】
＜コンジュゲート部−ω−アミノ−１，２−ジオールリンカ分子の一般的合成法＞
以下の化合物は、先に説明したコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオールリンカ分子と同様にして合成した。
【０２９９】
以下の実施例４１、実施例４２および図６Ａに、上記一般的スキームに基づくコレステリル  ３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−ヒドロキシプロピルカルバメートの詳細な合成方法を示した。
【実施例４１】
【０３００】
＜コレステリル  ２，３−ジヒドロキシプロピルカルバメート（ＸＶＩＩ）の合成＞
３−アミノ−１，２−プロパンジオール（２．０ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（各５０ｍＬ）と２回共沸し、その後無水ピリジン（１４７ｍＬ）に溶かした。反応溶液を氷浴にて撹拌しながら、コレステリル  クロロホルメート（１０．４ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）のトルエン（５０ｍＬ）溶液を、３０分かけて滴下した。滴下終了後、反応溶液から氷浴を取り除き、室温にて１６時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をトルエン（各５０ｍＬ）と２回共沸させた。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、３００ｍＬ）、溶出液にヘキサン／アセトン（１０００ｍＬ、９０：１０  ｖ／ｖ）、続いて、ヘキサン／アセトン（１０００ｍＬ、８５：１５  ｖ／ｖ）、ヘキサン／アセトン（１０００ｍＬ、７０：３０  ｖ／ｖ）、ヘキサン／アセトン（１０００ｍＬ、６５：３５  ｖ／ｖ）、を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して液状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は５．７ｇ（収率５１％）である。
【実施例４２】
【０３０１】
＜コレステリル  ３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−ヒドロキシプロピルカルバメート（ＸＶＩＩＩ）の合成＞
コレステリル  ２，３−ジヒドロキシプロピルカルバメート（５．７ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５０ｍＬ）に溶かし、氷浴にて撹拌した。４，４‘−ジメトキシトリチルクロリド（４．１ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）のピリジン（２６ｍＬ）溶液をゆっくりと滴下した。滴下終了後、反応溶液から氷浴を取り除き、室温にて１６時間撹拌した。溶媒を留去し、濃厚な黄色液状物を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２５０ｍＬ）、溶出液にヘキサン／アセトン／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９５：５：２  ｖ／ｖ／ｖ）、続いて、ヘキサン／アセトン／トリエチルアミン（２０００ｍＬ、９０：１０：２  ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して樹脂を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は８．１ｇ（収率８８％）である。
【実施例４３】
【０３０２】
＜オリゴヌクレオチド固相合成用担体に結合したコンジュゲート部−ω−アミノ−１，２−ジオール  リンカ分子の一般的合成法＞
以下に述べる化合物の合成方法は、先に述べたコンジュゲート部−ω−アミノ−１，３−ジオール  リンカ分子の場合と同様である。
【０３０３】
以下の実施例４４、実施例４５、および図６Ｃに、先に述べた一般的合成スキームによる、固相合成用ポリスチレン担体に結合した４−（１−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−((コレステリルオキシ)カルボニルアミノ)プロパン−２−イルオキシ）−４−オキソブタン酸の詳細な合成法を示した。この場合、ジカルボン酸結合鎖にはコハク酸を用いた。
【実施例４４】
【０３０４】
＜コレステリル  ３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−（（コレステリルオキシ）カルボニルアミノ）プロパン−２−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩(ＸＩＸ)の合成＞
コレステリル  ３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−ヒドロキシプロピルカルバメート（８．１ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（１．０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４．２ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（０．４ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（８１ｍＬ）に溶解した。反応溶液を室温にて２４時間撹拌した。次に、反応溶液を塩化メチレン（１００ｍＬ）にて稀釈し、氷冷した１０％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液（５０ｍＬ）にて２回、更に飽和食塩水（５０ｍＬ）にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して黄色の樹脂を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２００ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９５：５  ｖ／ｖ）、続いて、塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９３：２：５  ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去してガラス状の泡状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は８．６ｇ（収率９４％）である。
【実施例４５】
【０３０５】
＜架橋アミノメチルポリスチレンに結合した４−（１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−（（コレステリルオキシ）カルボニルアミノ）プロパン−２−イルオキシ）−４−オキソブタン酸 (ＸＸ)の合成＞
ＡＭ−ポリスチレン（５．０ｇ、約３３μｍｏｌアミノ基／ｇ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ（２５０ｍＬ）中、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３７．５ｍＬ）に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ（５０ｍＬ）に、４−（１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３−（（コレステリルオキシ）カルボニルアミノ）プロパン−２−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩（１１３ｍｇ、１１３μｍｏｌ）、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５．０ｍＬ）、トリエチルアミン（３１μＬ、２２５μｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１８ｍｇ、１３５μｍｏｌ）およびＢＰＯ（５５ｍｇ、１２４μｍｏｌ）を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて５分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液の一部（１６．７ｍＬ、７５．４μｍｏｌ）を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を１．５時間振騰し、固相用担体の一部４０ｍｇを取り出した。先に述べた測定方法により充填量を測定した結果、１２．５μｍｏｌ／ｇであった。更に活性化したカルボン酸溶液（２．７ｍＬ、１２．２μｍｏｌ）を固相懸濁液に加え、２時間振騰した。充填量は１４．７μｍｏｌ／ｇであった。固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）、アセトン（２００ｍＬ）、アセトニトリル（２００ｍＬ）で十分に洗浄し、更に真空中終夜乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸  アセトニトリル溶液（１０％  ｖ／ｖ、２５ｍＬ）および１−メチルイミダゾール  アセトニトリル溶液（１０％  ｖ／ｖ、２５ｍＬ）混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて２．５時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相用担体を、アセトニトリル（５００ｍＬ）にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
【実施例４６】
【０３０６】
＜オリゴヌクレオチド固相合成用担体に結合したコンジュゲート部−１，３−ジオール  リンカ分子の一般的合成法＞
本発明の好適なコンジュゲート部は、直接リンカ分子として機能しうるように変換される官能基を構造中に有する。例えば、コンジュゲート部の機能を妨げないようなカルボキシル基をもつコンジュゲート部は、先にω−アミノ１，３−ジオール  リンカ分子の合成で述べたのと同様な化学変換によって、コンジュゲート部−リンカ分子へと直接変換される。同様に、コンジュゲート部の機能を妨げないような水酸基をもつコンジュゲート部は、先に述べたのと同様な化学変換によって、ホスホラミダイト誘導体へと直接変換される。
【０３０７】
以下の実施例４７ないし実施例５１、および図７に、先に述べた一般的合成スキームによる、固相合成用ポリスチレン担体に結合した４−（１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサン−３−イルオキシ)−４−オキソブタン酸の詳細な合成法を示した。この場合、ジカルボン酸結合鎖にはコハク酸を用いた。
【実施例４７】
【０３０８】
＜メチル  ３−オキソエイコサノエート（ＸＸＩ）の合成＞
ステアリン酸（５．０ｇ、１７．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（８８ｍＬ）に懸濁し、２，２−ジメチル１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（２．７ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（６．７ｍＬ、４８．０ｍｍｏｌ）、およびジエチルシアノホスホナート（２．７ｍＬ、１７．６ｍｍｏｌ）を加えた。固体はすべて速やかに溶けた。反応溶液を室温にて１６時間撹拌した。次に、塩化メチレン（１００ｍＬ）にて稀釈し、注意深く、塩酸水溶液（３Ｍ、各５０ｍＬ）で３回洗浄した。更に、水（各５０ｍＬ）と３回、飽和食塩水（５０ｍＬ）で１回洗浄した。この反応混合物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、溶媒を留去した。得られた液体を無水メタノール（１００ｍＬ）に溶かし、１６時間加熱還流した。メタノールを留去し、得られた粗製物をヘキサを温めて溶かし、シリカゲルに充填した（シリカゲル、１５０ｍＬ）。溶出液にヘキサン(５００ｍＬ)、続いて、ヘキサン／アセトン（１０００ｍＬ、９８：２  ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して油状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は５．２ｇ（収率８７％）である。
【０３０９】
同様にして以下の化合物を合成した。
【０３１０】
ｉ）メチル  ３−オキソデカノエートを、カプリン酸から合成した。
【０３１１】
ｉｉ）（Ｅ）−メチル  ３−オキソエイコサ−１１−エノエートを、エライジン酸から合成した。
【０３１２】
ｉｉｉ）（Ｚ）−メチル  ３−オキソエイコサ−１１−エノエートを、オレイン酸から合成した。
【０３１３】
ｉｖ）（１１Ｚ，１４Ｚ）−メチル  ３−オキソエイコサ−１１，１４−ジエノエートを、リノレイン酸から合成した。
【実施例４８】
【０３１４】
＜エイコサン−１，３−ジオール（ＸＸＩＩ）の合成＞
メチル  ３−オキソエイコサノエート（５．２ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（３１ｍＬ）に溶かし、この溶液を氷冷した水素化ホウ素リチウムの無水テトラヒドロフラン溶液（２Ｍ、３１ｍＬ、６１．２ｍｍｏｌ）にゆっくりと滴下した。滴下終了後、氷浴を取り除き、反応溶液を室温にて１６時間撹拌した。この透明無色の溶液を再び氷浴にて冷却し、過剰の還元剤を分解するために、塩酸水溶液（１Ｍ、６２ｍＬ）をゆっくりと滴下した（ガスが発生した）。均一な溶液になった後に、この反応混合物を濃縮してテトラヒドロフランを留去した。次に、塩化メチレン（１００ｍＬ）を加え、よく振騰後、分液ロートに入れた。層が分離した後に、水層を取り出した。この水層を塩化メチレン（１００ｍＬ）で抽出し、先の塩化メチレン層と合し、飽和食塩水（５０ｍＬ）にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、メタノール（各５０ｍＬ）と５回共沸、得られた油状物を真空中で十分に乾燥した。収量は３．７ｇ（収率７７％）である。
【０３１５】
同様にして以下の化合物を合成した。
【０３１６】
ｉ）デカン−１，３−ジオールを、メチル  ３−オキソデカノエートから合成した。
【０３１７】
ｉｉ）（Ｅ）−エイコサ−１１−エン−１，３-ジオールを、（Ｅ）−メチル  ３−オキソエイコサ−１１-エノエートから合成した。
【０３１８】
ｉｉｉ）（Ｚ）−エイコサ−１１−エン−１，３−ジオールを、(Ｚ)−メチル  ３−オキソエイコサ−１１-エノエートから合成した。
【０３１９】
ｉｖ）（１１Ｚ，１４Ｚ）−エイコサ−１１，１４−ジエン−１，３−ジオールを、  （１１Ｚ，１４Ｚ）メチル  ３−オキソエイコサ−１１，１４−ジエノエートから合成した。
【実施例４９】
【０３２０】
＜１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサン−３−オール（ＸＸＩＩＩ）の合成＞
エイコサン−１，３−ジオール（３．７ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（各５０ｍＬ）と２回共沸し、無水ピリジン（６０ｍＬ）に溶解した。この溶液を氷浴にて冷却し、４，４‘−ジメトキシトリチルクロリド（４．２ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を室温にもどし、１６時間撹拌した。残留する４，４’ジメトキシトリチルクロリドをメタノール（１０ｍＬ）で処理し、得られた黄色溶液をほぼ乾固するまで溶媒留去した。残渣を無水トルエン（５０ｍＬ）と２回共沸し、得られた粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い、溶出液にヘキサン／アセトン／トリエチルアミン(５００ｍＬ  ９５．５：５：０．５  ｖ／ｖ／ｖ)を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して淡黄色液状物を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は６．８ｇ（収率９３％）である。
【０３２１】
同様にして以下の化合物を合成した。
【０３２２】
ｉ）１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）デカン−３−オールを、デカン−１，３−ジオールから合成した。
【０３２３】
ｉｉ）（Ｅ）−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサ−１１−エン−３−オールを、（Ｅ）−エイコサ−１１−エン−１，３−ジオールから合成した。
【０３２４】
ｉｉｉ）（Ｚ）１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサ−１１−エン−３−オールを、（Ｚ）−エイコサ−１１−エン−１，３−ジオールから合成した。
【０３２５】
ｉｖ）（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサ−１１，１４−ジエン−３−オールを、（１１Ｚ，１４Ｚ）エイコサ−１１，１４−ジエン−１，３−ジオールから合成した。
【実施例５０】
【０３２６】
＜４−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサン−３−イルオキシ)−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩(ＸＸＩＶ)の合成＞
１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサン−３−オール（６．８ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（１．１ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４．６ｍＬ、３３．０ｍｍｏｌ）および１−メチルイミダゾール（０．４４ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（６８ｍＬ）に溶解した。反応溶液を室温にて５日間撹拌した。この間、反応溶液は暗色になった。次に、反応溶液を塩化メチレン（１００ｍＬ）にて稀釈し、氷冷した１０％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液（５０ｍＬ）にて２回、更に飽和食塩水（５０ｍＬ）にて洗浄した。塩化メチレン溶液を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ過、減圧留去して暗色の樹脂を得た。この粗製物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い（シリカゲル、２００ｍＬ）、溶出液に塩化メチレン／トリエチルアミン（５００ｍＬ、９５：５  ｖ／ｖ）、続いて、塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（１０００ｍＬ、９３：２：５  ｖ／ｖ／ｖ）を用いて精製した。薄層クロマトグラフィーで目的物を含むフラクションを集め、溶媒留去して樹脂を得た。更に真空中で十分に乾燥した。収量は２．４ｇ（収率３０％）である。
【０３２７】
同様にして以下の化合物を合成した。
【０３２８】
ｉ）１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）デカン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）デカン−３−オールから合成した。
【０３２９】
ｉｉ）（Ｅ）−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサ−１１−エン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、（Ｅ）−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサ−１１−エン−３−オールから合成した。
【０３３０】
ｉｉｉ）（Ｚ）１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサ−１１−エン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、（Ｚ）１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサ−１１−エン−３−オールから合成した。
【０３３１】
ｉｖ）（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサ−１１，１４−ジエン−３−イルオキシ）−４-オキソブタン酸  トリエチルアミン塩を、（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサ−１１，１４−ジエン−３−オールから合成した。
【実施例５１】
【０３３２】
＜架橋アミノメチルポリスチレンに結合した４−（１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸 (ＸＶ)の合成＞
ＡＭ−ポリスチレン（５．０ｇ、約３３μｍｏｌアミノ基／ｇ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を、ラバーセプタムで栓をした一口丸底フラスコ（２５０ｍＬ）中、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３７．５ｍＬ）に懸濁させた。反応フラスコを振騰器に取り付け、室温にて固体が十分撹拌する程度に振騰した。また、別のフラスコ（５０ｍＬ）に、４−（１−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）エイコサン−３−イルオキシ）−４−オキソブタン酸  トリエチルアミン塩（４９ｍｇ、６０μｍｏｌ）、遊離アミンを含まない無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５．０ｍＬ）、トリエチルアミン（１７μＬ、１２０．０μｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１０ｍｇ、７２μｍｏｌ）およびＢＰＯ（２９ｍｇ、６６μｍｏｌ）を加えた。この混合物を固体が溶けるまでよく振騰し、カルボン酸を活性化させるために室温にて５分間放置した。こうして活性化したカルボン酸溶液の一部（１６．７ｍＬ、４０．０μｍｏｌ）を、振騰中の固相用担体にシリンジにて加えた。反応混合物を１．５時間振騰し、固相用担体の一部４０ｍｇを取り出した。先に述べた測定方法により充填量を測定した結果、１１．９μｍｏｌ／ｇであった。更に活性化したカルボン酸溶液（１．０ｍＬ、２．４μｍｏｌ）を固相懸濁液に加え、１時間振騰した。充填量は１６μｍｏｌ／ｇであった。固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空下除去した。固体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）、アセトン（２００ｍＬ）、アセトニトリル（２００ｍＬ）で十分に洗浄し、更に真空中終夜乾燥させた。担体に残留したアミノ基は、無水酢酸  アセトニトリル溶液（１０％  ｖ／ｖ、２５ｍＬ）および１−メチルイミダゾール  アセトニトリル溶液（１０％  ｖ／ｖ、２５ｍＬ）混合溶液中に固相用担体を懸濁させ、室温にて２．５時間振騰させてキャップした。次に、固相用担体の懸濁液をガラスろ過ロートに空け、液体を真空にて除去した。固相用担体を、アセトニトリル（５００ｍＬ）にて十分に洗い、真空中で終夜乾燥させた。
【０３３３】
同様にして、実施例５０  ｉ）〜ｉｖ）に記載した化合物を約１５．０  ＋  １．０μｍｏｌ／ｇ  担持した固相用担体を合成した。
【０３３４】
【表１−１】
2010504355.tif 000015
【表１−２】
2010504355.tif 000016
【表１−３】
2010504355.tif 000017
【表１−４】
2010504355.tif 000018
【０３３５】
【表２−１】
2010504355.tif 000019
【表２−２】
2010504355.tif 000020
【０３３６】
以下の表３に、リンカ分子構造部分の別の簡略名、およびオリゴヌクレオチドリン酸基部とコンジュゲートのカルバメート結合部をつなぐ原子数をまとめた。
【０３３７】
【表３】
2010504355.tif 000021
【０３３８】
註：ここで「Ａｃ」は、コレステリル基と置き換わったアセチル基を示す。
【実施例５２】
【０３３９】
＜一般的な試験方法＞
【０３４０】
コンジュゲートされたｓｉＲＮＡの遺伝子発現ノックダウン能を試験するために、２．５−５Ｋの細胞（９６穴フォーマット）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と懸濁させた培地（ＤＭＥＭ）にて、終夜（３７℃、５％ＣＯ２）培養した。翌日細胞を被った培地を、０．１−２μＭ濃度のＧ４オリゴヌクレオチド二本鎖複合体を含む無血清培地（例えば、希釈血清培地、ＭＥＭ、ＨｙＣｌｏｎｅなど）と置換した。受動輸送のまま４時間から終夜放置し、続いて、培地を交換（培地＋ＦＣＳ）して更にインキュベーションした（一般的に４８時間−７２時間）。
【０３４１】
脂質輸送は、以下の条件で行った：１０，０００細胞、ＤＭＥＭ、０．２μ／ウエル  ダーマＦＥＣＴ１、２４時間インキュベーション、１−１００ｎｎｍｏｌｓｉＲＮＡ。エレクトロポレーションの輸送条件は、２０，０００細胞、ＤＭＥＭ、矩形波プロトコール、２４時間インキュベーション、１３３ナノモルｓｉＲＮＡで行った。
【０３４２】
この試験でアッセイされた標的遺伝子の多くは、ヒト細胞株でＰＰＩＢ（ＮＭ＿０１１１４９）、マウス細胞株でＧＡＰＤＨ（ＮＭ＿００１０００１３０３）である。配列は、二本鎖で、ｈＰＰＩＢ＃３（センス：５‘ＡＣＡＧＣＡＡＡＵＵＣＣＡＵＣＧＵＧＵ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、およびｍＧＡＰＤＨ（センス：５’ＣＡＣＵＣＡＡＧＡＵＵＧＵＣＡＧＣＡＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。
【０３４３】
全ての実験において、総体的な培養生育力を非処理または偽処理細胞とＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を用いて比較し、標的ノックダウンを分岐状ＤＮＡ（ＢＤＮＡ，Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社）を用いて評価した。ヒト細胞株には、非付着細胞株ではＴＨＰ−１、Ｊｕｒｋａｔ、付着細胞株ではＳＨＳＹ５Ｙ、ＨｅＬａ、ＨｅＬａ−Ｓ３、ＭＣＦ１０Ａ、２９３Ｔ、ＭＣＦ７、およびＨｕＶＥＣを使用した。マウス細胞株の実験には、３Ｔ３ＮＩＨおよびＥＳ−Ｄ３細胞(両者ともに付着細胞)を使用した。
【０３４４】
＜総体的遺伝子プロファイル分析方法＞
ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞の遺伝子プロファイルを評価するのに、以下のプロトコールを用いた。
【０３４５】
１．試料採集方法
マイクロアレイ分析用のウェルプレートを減圧して培地を除去した。７０μＬのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．＃７９２１６）を用い、業者の手引書に従ってベータ−メルカプトエタノールの１：１００希釈液で細胞を添加した。その日のうちに全ＲＮＡ精製を行わない場合は、同じウェルプレートをプールして試料を−８０℃で保存した。
【０３４６】
形質移入効率評価用のウェルプレートは、１）ｂＤＮＡ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ：Ｐａｎｏｍｉｃｓ社、フレモント、カリフォルニア）を用いたポジティブおよびネガティブコントロール標的遺伝子のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン、および、２）ａｌａｍａｒＢｌｕｅＴＭアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｉｎｔｌ、カマリロ、カリフォルニア）を用いた培地生存能によって評価した。これら二つのアッセイは、ともに互換的であり、一つのプレート上でアッセイができる。生存能（９０−９５％生育能）およびノックダウン閾値（ポジティブコントロールｓｉＲＮＡにおける９０％基準ノックダウン）の基準を満たした形質移入を、マイクロアレイアッセイ許容とした。
【０３４７】
２．定量性の評価方法ならびに発現プロファイリング用ＲＮＡの定量方法
Ｑｉａｇｅｎ社のＤＮａｓｅを有するＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラムを用い、業者のプロトコール（http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/RNAStabilization AndPurification/FromAnimalAndPlantTissuesBacteriaYeastAndFungi/RNY_Mini/1035969_HB_BenchProtocol.pdf）に従って、全ＲＮＡをライセートから単離した。全ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮａｎｏＤｒｏｐ社、ウイルミントン、デラウエア）によりアッセイし、試料を１００ｎｇ／μＬ（一般的な収量＞１００ｎｇ／μＬ）に希釈した。必要に応じて、試料は−８０℃で保存可能である。全ＲＮＡの品質は、２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、サンタクララ、カリフォルニア）を用い、６０００ＮａｎｏＬａｂＣｈｉｐにて評価した。試料として許容されるものは、少なくとも９のＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を有し、−８０℃で保存可能である。
【０３４８】
３．ＲＮＡ増殖方法およびラベル化方法
全ＲＮＡを増殖し、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  ＲＮＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、サンタクララ、カリフォルニア）を用い、業者のプロトコール（http://www.chem.agilent.com/）に従ってラベルした。Ｃｙ５ＣＴＰおよびＣｙ３ＣＴＰは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社（ウエルズリー、マサチューセッツ）より入手した。一般に、一回の処理には６５０ｎｇの全ＲＮＡを使用した。実験試料はＣｙ５でラベル化し、偽試料（脂質処理の）はＣｙ５とＣｙ３で別々にラベル化した。非トランスフェクト試料はＣｙ３でラベル化した。過剰の色素をラベル化した試料からＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラムで、Ａｇｉｌｅｎｔのプロトコールに記載されるように、２回１分「ドライ」スピンをかけて除いた。
【０３４９】
ラベル化試料の収量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ機器（ＮａｎｏＤｒｏｐ社）により定量した。一般に、全ＲＮＡ６５０ｎｇから３００−５００ｎｇ／μＬのラベル化試料が得られ、フルオロフォア（Ｃｙ３はピンク、Ｃｙ５は青）によって統一して色分けした。色素導入の評価は、ＮａｎｏＤｒｏｐ機器に関する「マイクロアレイ」プロトコールに従い、各々の色素の波長（Ｃｙ３：５５０ｎｍ、Ｃｙ５：６５０ｎｍ）を測定して行った。
【０３５０】
４．ハイブリダイゼーション方法およびスキャニング方法
ヒト１Ａ（Ｖ２）マイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ）へのハイブリダイゼーションは、一アレイごとのＣｙ５およびＣｙ３ラベル化試料各７５０ｎｇを用い、業者の手引書に従って行った。試料は以下の通りである：
ｉ）ｓｉＲＮＡで形質移入した試料(Ｃｙ５)は、それぞれ偽トランスフェクト試料（Ｃｙ３）をレファレンスにおいてハイブリダイズした。
ｉｉ）形質移入による遺伝子発現効果を調べるためのコントロ−ルアレイを、偽形質移入（Ｃｙ５）および非形質移入（Ｃｙ３）試料を用いて組み入れた。
ｉｉｉ）色素偏向標的を検知するのみならず、非ｓｉＲＮＡ処理のシグナル／発現レベルを評価するためのコントロ−ルアレイを、偽形質移入（Ｃｙ５）および偽形質移入（Ｃｙ３）試料（自アレイ−自アレイ）を用いて組み入れた。
【０３５１】
６０℃、１７−２０時間ハイブリダイゼーションを行った後に、０．００２５%  Ｎ−ラウロイルザルコシンを用い、アレイを６Ｘおよび０．０６ＸのＳＳＰＥで洗浄した。続いて、アレイをアセトニトリルに浸し、非水系の乾燥および安定化バッファー（Ａｇｉｌｅｎｔ）にて洗浄した。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ社製モデルＧ２５０５Ｂスキャナーを用いて分析し、得られた．ｔｉｆｆイメージをＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｖ９．１のデフォルトプロトコールに従って処理した。
【０３５２】
５．データ分析
データ分析は、先ずマイクロソフト社製のエクセルを用いて行った。ファイルは、特徴識別をする列（識別番号、並、列、コントロ−ルタイプ、遺伝子名、系統名、および利用可能ならば記述子）、および試料ごとに選ばれたデータ列（Ｌｏｇ比、Ｐ値、ＬｏｇＲａｔｉｏ、ｇＰｒｏｃｅｓｓｅｄＳｉｇｎａｌ、ｒＰｒｏｃｅｓｓｅｄＳｉｇｎａｌ、ｇＩｓＷｅｌｌＡｂｏｖｅＢＧ、ｒＩｓＷｅｌｌＡｂｏｖｅＢＧ）で構成した。偽アレイ−偽アレイからとった飽和シグナルの処理データは、偽アレイ−偽アレイから計算した赤色および緑色シグナルの合計の対数値（ｇＰｒｏｃｅｓｓｅｄＳｉｇｎａｌ＋ｒＰｒｏｃｅｓｓｅｄＳｉｇｎａｌ）を示した列とともに、別の列に、飽和した緑色のシグナルを（ｇＩｓＳａｔｕｒａｔｅｄ）として、また、飽和した赤色のシグナルを（ｒＩｓＳａｔｕｒａｔｅｄ）のように記録した。
【０３５３】
更に、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ８．２による分析を行った。データは、先ず、コントロ−ルプローブおよび低シグナル／低発現プローブで、シグナル（Ｌｏｇ比  −０．３）の２倍減衰を正確に検知することが困難な配列を除くためにフィルタにかけた。この処理は、偽アレイ−偽アレイからのＬｏｇ値（合算シグナル）が２．８以下、または約６３０ピクセル以下であるプローブをフィルタにかけることで達成した。処理したシグナルの絶対範囲は、１バッチのアレイ全ての中からそれぞれのハイブリデーションができたことを確認して評価した。偽アレイ−偽アレイにおける各チャンネルで飽和を示したプローブについても除外した。一般に、上で述べた手法を採ることによって、分析用のプローブセットは、２１，０７３件から約１３，０００−１５，０００件にまで減少した。
【０３５４】
どの試料においても、２倍以上変化しないプローブ（即ち、−０．３＜ＬｏｇＲａｔｉｏ＜０．３）は除外した。残りのプローブは、非管理階層クラスタリング（非重み付け平均、ユークリッド距離、平均値）後にヒートマップ上にプロットした。また、ｓｉＲＮＡ処理試料列と偽−偽および偽−非形質移入  ハイブリダイゼーションとを更に比較することよって、これらコントロールアレイまたは本質的にノイズであるもの（例えば、試験中、３またはそれ以上のアレイにおいて対モック値がＬｏｇＲａｔｉｏ＜−０．２）のいずれかにおいて、特異的な発現を示すものは除外された。
【０３５５】
以下の全実施例において、Ｇ４ｓｉＲＮＡに関するオバーハングはＵＵオバーハングを有する。
【実施例５３】
【０３５６】
＜５’位対３’位末端修飾に関する選択性の同定＞
先ず、コレステロール基結合が、ｓｉＲＮＡセンス鎖の５’位または３’位末端に対してどのように影響を与えるのかを試験した。マウス３Ｔ３ＮＩＨ細胞を先に述べた方法によって培養し、３種類の濃度（５００んＭ、１μＭ、および５μＭ）でコレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ（二本鎖、ｍＧＡＰＤＨ２０：５’−ＣＡＣＵＣＡＡＧＡＵＵＧＵＣＡＧＣＡＡ−3’）(ＳＥＱＵＩＤ  Ｎｏ：３)と試験を行った。これら試験に使用されたリンカ分子は、オリゴヌクレオチドおよびコレステロールコンジュゲート部の間に１６原子入ったＰＥＧリンカ分子である。
【０３５７】
図８Ａにこの実験結果を示したが、低濃度側（５００んＭ、１μＭ）でセンス鎖３’末端にコレステロール結合した場合は、５’末端（囲み領域を参照）に結合した場合よりもｓｉＲＮＡ機能をよく保存した。どちらの場合も有意な毒性は示さなかった（データ示さず）。
【０３５８】
更に、センス鎖３’末端とアンチセンス鎖３’末端のコンジュゲートを有する二本鎖の効果を比較する試験を行った。この試験では、リンカ分子にはＣ８を用いた。図８Ｂに示すように、明らかに３’末端の方が有効であった。このため、以下の試験ではセンス３’末端に位置するリンカ分子−コンジュゲートを使用した。
【実施例５４】
【０３５９】
＜好適なコレステロール媒介型核酸輸送用リンカ分子長の同定＞
好適なコレステロール媒介型核酸輸送用リンカ分子長を同定するために、種種のリンカ分子長を有する３’センス鎖コレステロールコンジュゲートを持つマウスＧＡＰＤＨ標的ｓｉＲＮＡ二本鎖を合成した。そのリンカ分子配列を表１‐１から表１‐４に示した（上記参照）。配列どうしの比較は、受動、脂質媒介、およびエレクトロポレーションプロトコールに従って細胞に形質移入させて行った。更に、リンカ分子単独に比較して受動形質移入に対するコレステロールの寄与を測定するために、Ｃ１４−アセチル基リンカ分子をこの試験に含めた。
【０３６０】
図９のデータが示すように、３種の輸送システム全てにおいて好適なリンカ分子長の範囲は狭く、特に、Ｃ５リンカ分子、ＰＩＰ（Ｃ６）リンカ分子、およびＡＢＡ（Ｃ７）リンカ分子が優れた抑制効果を示した。Ｃ３およびＣ８リンカ分子も、ある条件下ではよい抑制効果を示した。これらの試験から、４−８個の原子長を有するリンカ分子、特に５−７個の長さを有するリンカ分子が、核酸−コレステロール適用型として好適であることが同定された。
【０３６１】
このデザインを種種の細胞型における受動輸送に応用するために、マウスおよびヒト遺伝子標的かつ３’コレステロールコンジュゲート(Ｃ8リンカ分子)を有するｓｉＲＮＡを、０．０１−１マイクロモルの濃度にて、ヒト（非接着および接着）およびマウス（接着）細胞で試験した。
【０３６２】
これらの試験結果を図１０Ａ−１０Ｅに示したが、短めの（Ｃ８）リンカ分子長において広い範囲で接着および非接着、ヒトおよび非ヒト細胞株に対して適用できることが示された。細胞濃度が２，５００または１０，０００細胞／ウエルでもこの結果は同じであった。
【実施例５５】
【０３６３】
＜ヌクレオチド間結合部の修飾＞
受動輸送におけるオーバーハング安定化効果を試験するために、マウスＧＡＰＤＡ標的およびコレステロールにコンジュゲートするセンス鎖３’末端にＣ８リンカ分子を有するｓｉＲＮＡを、オーバーハングのホスフォロチオエートヌクレオチド間連結部を有するもの、有さないもので合成した。次に、マウス３Ｔ３NIH細胞（２，５００細胞／ウエル）を、０．５および１マイクロモル濃度で希釈血清培地にて上記合成分子に暴露した。
【０３６４】
上記の試験結果を、図１１に示したが、Ｃ８リンカ分子を有するコレステロールコンジュゲート部３’オバーハングに安定化修飾を施したものほど高い機能を発現することが示された。
【実施例５６】
【０３６５】
＜機能の向上がコンジュゲートの結果でありリンカ分子ではないことに関する証明＞
先に観測したリンカ分子とコレステロール含有二本鎖の脂質非依存型輸送が、リンカ分子単独の結果であるか否かを決定するために、GADPH標的かつＣ８−コレステロール（センス鎖３’末端における）保有のｓｉＲＮＡの機能を、アセチル基（つまり、コレステロール無しの）を末端とするＣ８またはＣ１４リンカ分子保有の同じｓｉＲＮＡと比較した。形質移入の条件は、先に述べた方法と同様（２．５ｋ３Ｔ３ＮＩＨ、７２時間、Ｈｙ−ＭＥＭ−ＲＳ）であり、遺伝子ノックダウンの測定は、標準化にＡＣＴＢを用いた分岐ＤＮＡによって行った。
【０３６６】
これらの試験結果を図１２に示した。コレステロール結合ＧＡＰＤＨｓｉＲＮＡは、０．５マイクロモルにて強いノックダウン（〜８０％）を起こす一方、リンカ分子単独（つまり、Ｃ８−Ａｃ、Ｃ１４−Ａｃ）の二本鎖は０．５、１．０マイクロモルいずれの濃度においてもノックダウンを起こなかった。これらの結果から、先に観測した非脂質媒介型輸送が、リンカ分子とコンジュゲート（コレステロール）との組み合わせの結果であることが明らかに示された。
【実施例５７】
【０３６７】
＜二本鎖設計用化学修飾パターン検証による機能増強組合せ方法の同定＞
ｓｉＲＮＡ機能を増強することのできる化学修飾の特有の組み合わせ方法を同定するために、ＰＰＩＢおよびＧＡＰＤＨ標的かつセンス鎖３’末端Ｃ８−コレステロール保有の二本鎖を、図１３Ａに示したセンスおよび／又はアンチセンス修飾パターンのリストに基づいて合成した。次に、これら合成分子を適当なタイプの細胞（例えば、ＨｅＬａ又はＮＩＨ３Ｔ３細胞）に、０．５マイクロモル濃度、脂質非存在下で導入し、７２時間後に遺伝子ノックダウン評価を行った。
【０３６８】
これらの試験結果を図１３Ｂに示したが、この結果から、最も化学修飾された（つまり安定化された）ｓｉＲＮＡが、この形の輸送に対して最も効果があることが証明された。特に、センス鎖の全Ｃおよび全Ｕに２’−Ｏ−メチル含有、センス鎖最初の２ヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル修飾、アンチセンス鎖の全Ｃおよび全Ｕの２’Ｆ修飾、アンチセンス鎖３’オーバーハングのヌクレオチド間結合部のホスフォロチオエート修飾、を有する分子が、最も高い機能（７５−９５％ノックダウン）を発現した。先に実施例５５に示したが、ＡＳの３’オーバーハングにおけるホスフォロチオエートヌクレオチド間修飾を加えた分子が、著しくその活性を増強させた。ゆえに、オーバーハング安定化が活性に好ましいと思われる。また、どの実験においても問題となる毒性は見られなかった。
【実施例５８】
【０３６９】
＜Ｇ４媒介ノックダウンの動力学＞
受動輸送媒介Ｇ４ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウンの動力学を明らかにするために、以下の実験を行った。第一の実験では、ＨｅＬａ細胞（２．５ｋ細胞／ウエル／９６穴プレート）を、無血清培地（センス鎖５’ＧＣＵＵＣＧＡＧＡＵＧＵＵＣＣＧＡＧＡ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）中、Ｐ５３（０．１、１．０μＭ）を標的とするＧ４ｓｉＲＮＡ(具体的には、Ｇ４（−ｍｍ）ｓｉＲＮＡ)に、暴露した（回数は後記）。続いて、Ｐ５３遺伝子ノックダウンのレベルを、２４、４８および７２時間後に測定し、遺伝子ノックダウンが最適に見られる時間を同定した。
【０３７０】
これらの実験結果を図１４Ａに示したが、遺伝子ノックダウンの動力学は、どちらの濃度条件においても同じであることが示された。２４時間後には約６０％の遺伝子サイレンシングが観測され、７２時間後にノックダウンレベルはピーク（〜７０−８０％ＫＤ）に達した。これらの結果から、細胞へのＧ４ｓｉＲＮＡ単回投与において遺伝子発現が速やかにノックダウンされることが示された。
【０３７１】
先の実験と平行して、Ｇ４ｓｉＲＮＡによるノックダウンの寿命を試験する実験を行った。ＰＰＩＢ）標的Ｇ４ｓｉＲＮＡ（具体的に、Ｇ４（−ｍｍ）ｓｉＲＮＡ  ）を、０．１および１．０μＭ濃度にて希釈血清培地（センス鎖５’−ＡＣＡＧＣＡＡＡＵＵＣＣＡＵＣＧＵＧＵ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）中、細胞に導入した。  ２４時間後に、培地を１０％ＦＣＳに交換し、ＰＰＩＢノックダウンレベルを、１、３、４、５、７、および９日後に評価した。この試験結果より、１．０μＭ濃度におけるＧ４ｓｉＲＮＡ単回投与は、８０％以上のノックダウンを最短でも４日間与えた（図１４Ｂ）。よって、このようにして輸送されたＧ４ｓｉＲＮＡは、長い期間においても強いサイレンシングを起こすことが示された。
【実施例５９】
【０３７２】
＜Ｇ４誘発による内在的免疫応答およびオフ・ターゲットの影響の検証＞
脂質媒介形質移入による細胞へのｓｉＲＮＡ導入は、非特異的（内在的免疫性）および特異的（オフ・ターゲット媒介）応答の両方を誘発することが示された。実験データの解釈に際しこの効果が悪影響を与える可能性があるために、包括的遺伝子プロファイリングおよびサーチライトサイトカインアレイを用い、脂質媒介輸送ｓｉＲＮＡを受動輸送Ｇ４ｓｉＲＮＡと比較検討した。
【０３７３】
＜内在的免疫応答＞
ＰＰＩＢ（具体的にＧ４（−ｍｍ））標的Ｇ４ｓｉＲＮＡを、０．１および１．０μＭ濃度にて受動的に細胞に導入した。７２時間後、細胞を採取しｍＲＮＡを包括的遺伝子プロファイリング用に（上記プロトコール参照）精製した。平行して、同一の配列をコレステロール−Ｃ５無しで合成し、リポフェクタミン２０００（脂質）を用いて細胞（０．１μＭ）に形質移入した。形質移入２４時間後に、ｍＲＮＡ試料を同様にして調整しゲノムプロファイリングにより評価した。
【０３７４】
図１５Ａに示すように、脂質単独処理および脂質＋ｓｉＲＮＡ処理は、約５０ないし７０個の遺伝子において２倍以上のアップレギュレーションを誘発した。これら遺伝子の多くは、前炎症性反応（例えば、ＣＦＨＲ５、ＩＦＩ２７、ＩＬ６、ＤＤＸ５８、ＩＬ８、ＩＬ１Ｆ９、ＥＮＳＴ、ＣＸＣＬ１、Ｇ１Ｐ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ１、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ１、ＳＥＲＰ１、ＣＸＣＬ３、ＨＭＯＸ１）に関連する遺伝子であったことから、この結果は、細胞を脂質および脂質＋ｓｉＲＮＡ混合物に暴露すると細胞ストレスが誘発されることを示唆した。
【０３７５】
また、Ｇ４ｓｉＲＮＡを用いたｓｉＲＮＡの受動輸送では、どの濃度においても脂質媒介輸送で見られた反応を、部分的に誘発したに過ぎなかった。Ｇ４ｓｉＲＮＡ処理培養においてアップレギュレーションされた遺伝子総数は、図１５Ａに示すように脂質媒介輸送において見られた遺伝子数の三分の一未満であった。更に、この試験において３ないし４個の前炎症性遺伝子しか認められなかったことは、受動輸送による細胞障害の程度が脂質媒介輸送に比べて非常に低いことを示唆した。
【０３７６】
また、脂質媒介輸送ｓｉＲＮＡおよび受動輸送Ｇ４ｓｉＲＮＡによる内在的免疫反応を定量するために、ＩＬ６およびＩＬ８反応の分析をサーチライトＴＭアレイ技術（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。具体的には、２．５ｋ  ＨｅＬａ細胞を、希釈血清培地（配列については下記表３参照）において、１）４種のＧ４ｓｉＲＮＡ（−ｍｍ）のうちの１種、２）２１ｂｐ  ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ、脂質輸送）、または３）脂質単独、と処理した。更に、サイトカイン反応を誘発することが知られている２９ｂｐ  ｓｉＲＮＡを、ポジティブコントロールとして試験に加えた。７２時間後、ＩＬ６およびＩＬ８のレベルを製造元の手引き（http://www.endogen.com/）に従い、培地にて評価した。
【０３７７】
【表４】
2010504355.tif 000022
【０３７８】
図１５Ｂにこれらの実験結果を示した。脂質および脂質＋ｓｉＲＮＡが強いＩＬ６およびＩＬ８反応（６００−２，５００ピコグラム／ｍＬ））を起こす一方で、４種のＧ４ｓｉＲＮＡ全てに対する反応は、培地コントロール（＜５０ピコグラム／ｍＬ）と同じであった。先の実験結果と合わせ、上記試験結果から、受動輸送Ｇ４ｓｉＲＮＡは、内在的免疫反応をほとんどまたは全く起こさない効率的な遺伝子ノックアウトであることが示された。
【０３７９】
＜オフ・ターゲット  プロファイル＞
受動輸送Ｇ４ｓｉＲＮＡおよび脂質媒介輸送ｓｉＲＮＡによるオフ・ターゲットの影響を比較する目的で、ＰＰＩＢ標的二本鎖を、１）Ｇ４ｓｉＲＮＡ受動輸送（Ｇ４（−ｍｍ）複合体を使用）、または、２）リポフェクタミン２０００媒介輸送（Ｇ４ｓｉＲＮＡの場合と同じ二本鎖オリゴヌクレオチドを使用、但し、コレステロール−Ｃ５無し）によってＨｅＬａ細胞に導入した。続いて、細胞を採取し、上で述べたように包括的遺伝子プロファイリング用に処理した。各実験には、対照試料として、１）Ｇ４−ｓｉＲＮＡ用として希釈血清培地（無ｓｉＲＮＡ）にて同様に処理した細胞、２）脂質処理試料用として、脂質処理した試料（無ｓｉＲＮＡ）を、加えた。
【０３８０】
図１５Ｃにオフ・ターゲット分析の結果を示した。どちらの輸送方法においても、標的ＰＰＩＢに対して８０％を超える遺伝子ノックダウンを与えたが、オフ・ターゲットの影響に差が見られた。即ち、脂質媒介輸送において、ＴＨＣ１９７８５３５、ＦＥＲＤ３Ｌ、Ｃ１０ｏｒｆ７０、ＹＴＨＤＦ１、ＣＫＬＦＳＦ８、およびＳＰＣ１８を含む６つの異なる遺伝子が、約２倍以上のダウンレギュレーション示すものとして同定された。これとは対照的に、先の６つのオフ・ターゲット遺伝子の何れの発現に対しても、Ｇ４ｓｉＲＮＡは最小の影響を与えたのみであった。つまり、Ｇ４ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉−媒介遺伝子ノックダウンを行う時に、オフ・ターゲットの影響を限定する目的で使用できることが示された。
【実施例６０】
【０３８１】
＜無血清培地におけるＧ４ｓｉＲＮＡの安定性＞
希釈血清培地でのＧ４ｓｉＲＮＡの安定性を試験する目的で、ＰＰＩＢ・標的Ｇ４ｓｉＲＮＡ（５’−ＡＣＡＧＣＡＡＡＵＵＣＣＡＵＣＧＵＧＵ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）センス鎖保有Ｇ４（−ｍｍ）または非標的コントロール（５’−ＵＡＡＧＧＣＵＡＵＧＡＡＧＡＧＡＵＡＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３センス鎖）ｓｉＲＮＡの保存溶液を、希釈血清培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）にて調製し、＋４℃にて保存した（Ｇ４ｓｉＲＮＡ濃度：１．０、０．５および０．１μＭ）。この＋４℃Ｇ４保存溶液調製から、１、６、１３、２０、および２７日後に、ＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地にプレーティングした。次の日に、培地を除去して＋４℃保存溶液に交換した。コントロールには、２０℃にてバファー保存されたＧ４ｓｉＲＮＡを用いた。次に細胞を３日間培養し、遺伝子ノックダウンを評価した。
【０３８２】
図１６にこれらの結果を示したが、希釈血清培地にＧ４ｓｉＲＮＡを３０日間保存しても、遺伝子発現ノックダウン能力に何ら影響がなかった。１μＭ濃度におけるＰＰＩＢ遺伝子ノックダウンは、この実験を通して＞９０％維持された。０．１μＭ濃度にては、遺伝子ノックダウンレベルは若干（〜８０％ＫＤ）低下したが、この効力は実験期間中維持された。０．５μＭ濃度における非標的コントロ−ルは、全体の遺伝子発現には影響を与えなかった。以上の結果から、＋４℃希釈血清培地中Ｇ４ｓｉＲＮＡは、遺伝子サイレンシング活性を著しく失活することなく保存できることが示された。
【実施例６１】
【０３８３】
＜Ｇ４ｓｉＲＮＡ細胞連続投与誘発による長期の遺伝子発現ノックダウン＞
Ｇ４ｓｉＲＮＡが標的遺伝子に対し長期間ノックダウンを起こすために使用できるか否かを評価するために連続投与の実験を行った。この試験を行うために、以下のプロトコールを用いた（図１７Ａ参照）。
１日目：ＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＣＳにプレーティングする。
２日目：培地を、ＰＰＩＢ標的、ＧＡＰＤＨ標的、または、非標的コントロールＧ４ｓｉＲＮＡ（具体的に、Ｇ４（−ｍｍ）ｓｉＲＮＡ）含有、０．１−１．０μＭ濃度、希釈血清培地に置換する。
３日目：培地をＤＭＥＭ＋血清に戻す。
５日目：細胞を分け再びプレーティングする。
６日目：細胞を無血清培地にて再度Ｇ４ｓｉＲＮＡ処理する。
【０３８４】
細胞を繰り返してＧ４ｓｉＲＮＡに暴露するこのサイクルプロトコールを、３０日間を通して繰り返した。２、６、１４、１８、２２、および３０日目において、処理された細胞試料は採取して分岐ＤＮＡアッセイを用い標的遺伝子ノックアウトごとに評価した。
【０３８５】
図１７Ｂにこの実験結果を示したが、上記のプロトコールを用いることで、Ｇ４ｓｉＲＮＡにより、連続して遺伝子ノックダウンを達成できることが示された。０．５および１．０μＭ濃度において、８０％を超える遺伝子ノックダウンがこの実験期間中全てにわたって維持された。また、０．１μＭ濃度では、遺伝子ノックダウンレベルは若干低下したが（〜７５％ＫＤ），この実験期間中再びこのレベルは維持された。一方、非標的コントロールによる実験結果は、非処理細胞の結果を反映した。ＧＡＰＤＨ標的Ｇ４ｓｉＲＮＡコントロ−ル（０．５μＭ）は、例外データ（２６日目）を除き、強いノックダウン（〜８０％）を起こし、〜５０％サイレンシングを示した。総体的に言って、この実験結果から、プラスミドまたはウイルス媒介ＲＮＡ干渉のように、Ｇ４ｓｉＲＮＡ連続投与によって長期に渡る遺伝子ノックダウンが可能であることが示された。
【実施例６２】
【０３８６】
＜Ｃ５リンカ分子と互換性のある別のコンジュゲートの同定＞
３’センス鎖Ｃ５リンカ分子を持つｓｉＲＮＡと、別のコンジュゲート部を持つｓｉＲＮＡとの互換性を試験する目的で、ＰＰＩＢまたはＧＡＰＤＨを標的にする機能二本鎖を、コレスタノール、スチグマステロール、プレグネノロン、アンドステロン、エルゴステロール、またはコラン酸をコンジュゲート部として（図１８Ａ参照）合成した。各分子は、先に述べた方法で合成した。こうして得られた複合体は、Ｇ４のコレステロールがコレスタノール、スチグマステロール、プレグネノロン、アンドステロン、エルゴステロール、またはコラン酸に置き換えられていることを除いて、Ｇ４複合体（具体的に、Ｇ４（−ｍｍ）複合体）と同じ修飾パターンを示した。
【０３８７】
合成に続いて、受動輸送による目指す遺伝子標的への各分子のノックダウン能を、以下のようにして試験した。（１）ＨｅＬａ細胞（２．５ｋ細胞／ウエル、９６穴プレート）を完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）中、培養した。（２）０．１−２．０μＭ濃度にて試験分子を含む希釈血清培地に、培地を交換する。２４時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに培地を交換する。試験分子を処理して７２時間後、データ標準化ごとに、非標的二本鎖処理細胞または非処理細胞を用いて遺伝子ノックダウンを評価した。
【０３８８】
図１８Ｂから図１８Ｄにこの実験結果を示した。以下にその結果をまとめる。
【０３８９】
コレスタノールおよびスチグマステロール：コレスタノール（ＣＨＬＮ）およびスチグマステロール（ＳＴＩＧ）にコンジュゲートしたＰＰＩＢ  ｓｉＲＮＡは、コレステロールにコンジュゲートした分子と同様に機能し、０．１μＭと低濃度にても８０％を超えるノックダウンを起こした。同じコンジュゲートパターンを有するＧＡＰＤＨ標的分子は、非ヒト細胞（マウス３Ｔ３ＮＩＨ）においても効果を示すことが分かった。この結果から、コレスタノールおよびスチグマステロール  コンジュゲートリンカ分子コンジュゲーションを有するｓｉＲＮＡ受動輸送が、広い範囲で適用可能であることが示唆された。
【０３９０】
エルゴステロール：Ｃ５リンカ分子を介したエルゴステロール（ＥＲＧＯ）にコンジュゲートしたＰＰＩＢ  ｓｉＲＮＡは、１μＭ、２μＭの濃度において、それぞれ約６０％、約８０％の遺伝子ノックダウンを起こした。また、低い濃度では受動輸送が急勾配で低下した。マウス３Ｔ３ＮＩＨ細胞を用いた実験においても、同じ結果が得られた。
【０３９１】
プレグネノロンおよびアンドステロン：Ｃ５リンカ分子を用いたセンス鎖３’末端へのプレグネノロンまたはアンドステロンの結合は、試験したどの濃度においても標的遺伝子発現のサイレンシングを起こさなかった。この結果は、用いた細胞株（ＨｅＬａまたは３Ｔ３ＮＩＨ細胞など）によらず観測された。
【０３９２】
以上の結果から、数多くの部分構造が、ｓｉＲＮＡセンス鎖３’末端に効果的にコンジュゲート（Ｃ５リンカ分子使用）して受動輸送および強い遺伝子ノックダウンを起こすことができることが同定された。また、必ずしも全てのステロール化合物が、この形の受動輸送において互換性があるとは限らないことが証明された。
【実施例６３】
【０３９３】
＜Ｇ４  ｓｉＲＮＡ受動輸送に血清およびコレステロール結合タンパク質が与える影響＞
コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡの受動輸送に様々な組織培養の条件が及ぼす影響を明らかにする目的で、２種類の実験を行った。第１の実験では、受動輸送中、血清濃度を変化させたときの遺伝子ノックダウンレベルを測定した。このために、２．５ｋ  ３Ｔ３ＮＩＨ、ＨｅＬａ、およびＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、１０％ＦＣＳで懸濁させたＤＭＥＭ培地にて先ず終夜培養した。翌日、培地を除去し、（１）ＧＡＰＤＨまたはＰＰＩＢ（センス鎖ＰＰＩＢ６９  ５’ＵＣＡＣＧＡＣＡＧＵＣＡＡＧＡＣＡＧＣ３’(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４)およびＰＰＩＢ３９センス鎖５’ＣＡＧＣＡＡＡＵＵＣＣＡＵＣＧＵＧＵＡ３’(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５)）標的のＧ４  ｓｉＲＮＡを０．１−１μＭ濃度で含む、または（２）ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)を０−１０％（ｖ／ｖ）の濃度範囲で含む、希釈血清培地と交換した。更に４８時間細胞を上記条件下で保ち、分岐ＤＮＡを用いて遺伝子ノックダウンを評価した。Ｇ４  ｓｉＲＮＡには全てＧ４（−ｍｍ）を用いた。
【０３９４】
図１９Ａから図１９Ｃに示したように、この実験結果から、Ｇ４ｓｉＲＮＡの受動輸送は、その受動輸送中、培地での血清濃度に強く依存することが示された。２．５％ＦＣＳのような低濃度側では、遺伝子ノックダウンレベルに全体として若干影響した。一方、高濃度側では、Ｇ４ｓｉＲＮＡの受動輸送に作用し、遺伝子ノックダウンに著しい影響を与えた。
【０３９５】
ウシ胎仔血清には、コレステロールに関連した多種のタンパク質及びタンパク質複合体が含まれる。次に、３種のコレステロール結合タンパク質（ＬＤＬ、ＨＤＬ、およびアルブミン）が、ＦＣＳによるＧ４ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子ノックダウンの抑制に関与するか否かを試験する目的で、ＦＣＳに代わりＬＤＬ，ＨＤＬ、またはＢＳＡの何れかで置き換えて上で述べた試験を繰り返した。この試験結果より、上記３種のコレステロール結合タンパク質のいずれを培地に加えても、Ｇ４ｓｉＲＮＡの受動輸送が強く抑制されることが示された。図１９Ｄ参照。
【実施例６４】
【０３９６】
＜生体内におけるＧ４の効果＞
遺伝子サイレンシングを起こすＧ４ｓｉＲＮＡの生体内での効果を試験する目的で、以下のように設計されたｓｉＲＮＡを合成した。
１．非標的コントロールＧ４（−ｍｍ）、（５’ＵＡＡＧＧＣＵＡＵＧＡＡＧＡＧＡＵＡＣ、センス鎖）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
２．ＰＰＡＲ−γ・標的Ｇ４（−ｍｍ）、（５’ＧＡＣＡＵＧＡＡＵＵＣＣＵＵＡＡＵＧＡ、センス鎖）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
３．アポＢ標的Ｇ４（−ｍｍ）（５’ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡ、センス鎖）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
４．ＨＰ６リンカ分子を介するコレステロールコンジュゲート含有アポＢ標的ｓｉＲＮＡ（Ｃ５リンカ分子の代わりにＨＰ６リンカ分子である点を除いて上記３に同じ）
【０３９７】
図２０ＡにＣ５およびＨＰ６リンカ分子の構造式を示した。それぞれの分子は、体重２０−３０グラムの雄ＩＣＲマウス（１群５匹）に導入し、生理食塩水をコントロールとして与えられたマウスと遺伝子ノックダウン能を比較した。投与は、５０ｍｇ／ｋｇ、尾静脈低圧靜注、一日一回投与にて、３日連続して行った。最後の靜注から７２時間後、マウスを処理し、肝臓、脾臓、肺、心臓、および腎臓から組織を取り出した。取り出した組織は４つの部位に解剖され、液体窒素にて瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌＲＰｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号−１２１８３−５５５）を用いて精製し、ｍＲＮＡノックダウンを分岐ＤＮＡ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）にて分析した。
【０３９８】
図２０Ｂで示すように、先の２つの遺伝子実験（アポＢまたはＰＰＡＲ−γ）のうち少なくとも１つの実験において、生体内で輸送されたＧ４ｓｉＲＮＡは、脾臓、肝臓、心臓、および肺にておよそ５０％の遺伝子ノックダウンを起こした。即ち、この分析結果より、最適化していない輸送方法でも、Ｇ４ｓｉＲＮＡは強い遺伝子ノックダウンを多種の組織で誘発することが証明された。また、リンカ分子を修飾することで組織特異的な差異も生じることを、図２０Ｂに並んで示した。アポＢのＧ４およびＨＰ６媒介ノックダウン能は、腎臓、心臓、および肺で同様に見られた。他方、Ｇ４のＣ５リンカ分子は、脾臓および肝臓でノックダウン能を向上させた。従って、脾臓および肝臓組織において遺伝子ノックダウンが必要なときに、Ｇ４ｓｉＲＮＡは特に有用といえる。
【実施例６５】
【０３９９】
＜Ｇ４ｓｉＲＮＡ機能を増強させる二次的構造の同定＞
二次的構造の導入によって、全体の機能を増強させ得るか否かを明らかにする目的で、異なる位置でミスマッチを有するＧ４ｓｉＲＮＡを合成した。このために、センス鎖６位から１０位でミスマッチとなる全ての可能なセンス−アンチセンス鎖を有する、低機能ＧＡＰＤＨ標的ｓｉＲＮＡを合成した。続いて、これら分子の各々が、受動輸送を介してＧＡＰＤＨノックダウンを誘発する能力を、分岐ＤＮＡを用いて評価した（受動輸送の条件：２．５ｋ  ＨｅＬａ細胞をプレーティング、ｓｉＲＮＡ濃度＝０．１μＭ、または１μＭ、希釈血清培地、７２時間後ノックダウンを評価）。
【０４００】
図２１ａにこの実験結果を示した。この結果から、センス鎖６位および／または７位にミスマッチを導入した場合、Ｇ４ｓｉＲＮＡ機能を非常に増強させることが証明された。この増強はミスマッチのタイプ（Ｃ−Ａ＝Ｃ−Ｃなど）に関連しないと思われ、この特徴は配列には依存しないことが示唆された。１９ヌクレオチドＧ４センス鎖および１９ヌクレオチドＧ４アンチセンス鎖に対して、センス鎖の６位および７位（５’末端より番号を振って）は、アンチセンス鎖の１４位および１３位（５’末端より番号を振って）とそれぞれ相対した。
【０４０１】
６位ミスマッチの効果を更に試験する目的で、センス鎖６位ミスマッチ（アンチセンス鎖では１４位）を有する（Ｇ４（−ｍｍ）など）、または保有しない（Ｇ４（−ｍｍ）など）８７個の異なるｈＰＰＩＢ標的Ｇ４ｓｉＲＮＡを合成した。図２１ｂに示したように、ミスマッチ導入により全体として遺伝子サイレンシング能の増強がこの数において認められ、遺伝子発現を７５％サイレンシングする二本鎖数は、３０％から４３％へと増加した。
【実施例６６】
【０４０２】
＜遺伝子発現をサイレンシングするＧ４ｓｉＲＮＡの効果＞
広範な標的ｍＲＮＡをノックダウンするミスマッチ含有Ｇ４ｓｉＲＮＡの効果を試験する目的で、ラットおよびマウス遺伝子（ＰＰＩＢおよびＧＡＰＤＨ）とともに、ヒト遺伝子（ＬＭＮＡ、ＣＤＣ２、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＲＢ１、ＨＲＩ、ＭＥＴ、およびＰＬＫ）を標的にするＧ４（＋ｍｍ）ｓｉＲＮＡを合成し（配列およびアクセス番号のリストは以下の表５を参照）、先に述べたプロトコールに従い、個々のｓｉＲＮＡまたは集団のｓｉＲＮＡとして、ＨｅＬａ細胞に受動的に１μＭで導入した。
【０４０３】
図２２に示したように、試験した３６個の個々の二本鎖は７５％以上の遺伝子サイレンシング能を示した。また、これらの配列をプールして用いたときは、１２プール中１１プールにおいて、遺伝子発現を７５％以上サイレンシングした。同様な結果が、抗生物質（アンピシリンなど）の存在に関わり無く得られた。これらの知見から、Ｇ４ｓｉＲＡＮは異なる種の広い範囲の遺伝子に対して適用可能であり、プーリング戦略とも併用可能なことが証明された。
【０４０４】
【表５】
2010504355.tif 000023
実施例６６で用いた、異なる３種のｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖配列
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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