(57)【要約】   本発明の目的は、全血の検体に基づく赤血球の血液型の特定および／または検出のための装置である。  本発明はまた、この装置を活用する方式、ならびに血液型の特定と検出のためのセットの利用も狙いとしている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血の検体に基づく血液型の識別と特定のための装置であり、同装置が少なくとも１の反応区域（４）を保有する堅固な支持台（１）を含んでいることを特徴としており、同反応区域が少なくとも下記からなっている。すなわち、
−  直径1ないし20μmの細孔を有する、錯形成用試薬で含浸される、１の多重合多孔質膜（３）、および
−  分析する検体の過剰な血液を回収するための１の吸収用膜（２）。
【請求項２】
多孔質膜（３）が高密度ポリエチレン製膜であることを特徴とする、請求項１による装置。
【請求項３】
少なくとも１の反応区域（４）が、同じく１のフィルター５を含んでいることを特徴とする、請求項１または請求項２による装置。
【請求項４】
フィルター（５）が、直径１ないし７μmのガラスファイバーからなることを特徴とする、請求項３による装置。
【請求項５】
多孔質膜（３）が、モノクローナル抗体試薬を含浸されていることを特徴とする、請求項１から請求項４までのいずれか１の請求項による装置。
【請求項６】
フィルター（５）が、赤血球を凝集させることのできる試薬を含浸されていることを特徴とする、請求項３または請求項４による装置。
【請求項７】
多孔質膜（３）が、流動する血漿の抗体の固定を可能にする抗グロブリン試薬で含浸されていることを特徴とする、請求項１から請求項６までのいずれか１の請求項による装置。
【請求項８】
洗滌液および／または表出用液を内臓しているタンク６を含むことを特徴とする、前記諸請求項のいずれか１の請求項による装置。
【請求項９】
全血の検体に基づいて、ABO, Rhesusおよび／またはRAI血型血液型を識別し、特定するための請求項１から請求項８までのいずれか１の請求項による装置の利用。
【請求項１０】
下記諸段階を含むことを特徴とする、赤血球の血液型の表現型化方式、すなわち、
−  請求項１から請求項８までのいずれか１の請求項による装置の反応区域（４）上に全血の検体を乗せ、
−  少なくとも30秒間、反応させておき、
−  多孔質膜（３）に結合していない要素を溶出させるために洗滌液を付ける、赤血球の血液型の表現型化方式。
【請求項１１】
下記諸段階を含むことを特徴とする、ABO, Rhesusおよび／またはRAI血型群の表現型化方式、すなわち、
−  請求項１から請求項５までのいずれか１の請求項による装置の反応区域（４）上に全血の検体を乗せる。同装置の多孔質膜（３）には赤血球の特定の抗体抗原試薬を含浸させてあり、
−  少なくとも30秒間、反応させておき、
−  多孔質膜（３）に結合していない要素を溶出させるために洗滌液を付ける、ABO, Rhesusおよび／またはRAI血型群の表現型化方式。
【請求項１２】
下記諸段階を含むことを特徴とする、ABO, Rhesusおよび／またはRAI血型群の表現型化方式、すなわち、
−  請求項６による装置の反応区域（４）上に、全血の検体を乗せる。同装置の多孔質膜（３）には流動する血漿の抗体を固定させることのできる抗グロブリン試薬を含浸させてあり、
−  同反応区域（４）上に、既知の抗原のテスト用赤血球を乗せ、
−  少なくとも30秒間、反応させておき、そして
−  多孔質膜（３）に結合していない要素を溶出させるために洗滌液を付ける、ABO, Rhesusおよび／またはRAI血型群の表現型化方式。
【請求項１３】
少なくとも下記を含むことを特徴とする、全血の検体に基づくABO, Rhesusおよび／またはRAI血型の血液型の特定および／または検出のためのセット、すなわち、
−  請求項１から請求項８までのいずれか１の請求項による装置、
−  血液型の赤血球の抗原の特定と識別を可能にする抗体の試薬
および
−  流動する血漿の抗体の特定と識別を可能にするテスト用赤血球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全血の検体に基づく血液型の赤血球の抗原および対応する血漿の抗体の特定と識別のための装置に関する。
【０００２】
本発明はまた、この装置を活用する方式および血液型の特定用セットによるこの装置の利用も狙いとしている。
【背景技術】
【０００３】
血液は、ヒトおよび大抵の高等動物に存在する液状の結合組織である。
細胞の組成が類似しているとは言え、血液型と呼ばれている抗原系統の相違で決定される諸血液要素は、多様性に富んでいる。
【０００４】
実用面では、赤血球の表面に存在する抗原系統である、例えばABO、Rhesus，Kell, Duffy, MNS, Lewis 血型等の系統で、赤血球の血液型が特に関心の的になっている。
【０００５】
従来から、血液型の特定は、抗原・抗体の識別で行われている。抗原の特定の抗体が抗原を識別すると、抗体は、抗原で固定する。通常、血液型の識別に利用されている抗体は、赤血球を粘着させるIgM免疫グロブリンである。
【０００６】
通常、利用されている技術は、赤血球の表面で、血液型の抗原の有無を探し、識別すること、または血漿内に、血液型の抗原抗体の有無を探し、識別することにある。
【０００７】
とりわけABO血型系統では、Beth-vincentのテストは、赤血球が担持している抗原の特定を可能にしており、Simonin-Michonの補完的テストすなわち血清の対照テストは、血清中を流動する抗体の特定を可能にしている。
【０００８】
Beth-vincentのテストでは、あるいは遠心分離により、あるいは上澄み採取によって、細胞と血漿の位相の分離後で得られたヒトの赤血球は、既知の特性を有する抗体の試薬と出会わされる。
【０００９】
このテストでは、抗体が、対応する赤血球の抗原を識別すると、赤血球に起こる凝集反応を観察することによって、通常、視覚的に識別できる。
【００１０】
Simoninのテストでは、ヒトの血漿は、それぞれがABO血型系統の正確な抗原群に所属するテスト用赤血球と出会わされる。これは、テスト用赤血球によるヒトの血漿の凝集反応のテストである。
【００１１】
RAIすなわち不規則といわれている抗体の検査は、ヒトの血液中に、ヒトの赤血球の諸抗原に対する免疫グロブリンの有無を特定することにある。そのために、直接的または間接的にCoombsの技術を使って、この免疫グロブリンが、抗原が知られているテスト用赤血球で固定するかどうかを求めると、結果の比較によって、免疫グロブリンの有無が判明する。
【００１２】
免疫学・血液学の分野で、表現型化に使用されている方式と装置は多数存在しており、その技術は、手で、乳白色プレートで、試験管で、またはマイクロプレートの窪みで、あるいは検体と試薬の分配器ロボットー、攪拌器、インキュベーターおよび自動リーダーで完全に自動化であり得る。とりわけ２種類の照合用技術が知られている。それは、マイクロプレート技術およびゲルテストによるろ過技術である。
【００１３】
しかしながら、血液型の表現型化の既存の諸技術は、多数の欠点を呈している。
【００１４】
例えば、マイクロプレートによる技術は、攪拌段階を必要とするが、支持台上に同時に存在する多数の反応の面で、懸濁化の反応速度が同一ではないからである。攪拌段階は、視覚による検査の下で実施しなければならないので、ある種の試薬では、粘着現象に特に注意を払わなければならない。
【００１５】
同様に、ゲルテストによるろ過技術を実施するとき、とりわけABO血型群の血漿テストでは、一部の粘着の無検出の危険も存在する。もうひとつの欠点は、とりわけたん白質分解酵素で処理された場合の赤血球テストの準備に関連する自己抗体が頻繁に検出されることである。
【００１６】
さらに、この諸技術の大きな欠点は、血液の構成要素を分離するために、全血をあらかじめ遠心分離しなければならないが、この面倒な作業は、時間と分析費用を著しく多くし、かさばって、取り扱いの難しい遠心分離機を必要としている。
【００１７】
遠心分離の負担の大きいこの段階を無くするために、磁気を帯びた粒子の利用に基づく変形方式が開発された。
【００１８】
その例として、磁気を帯びたラテックス球に付けた抗体または抗原のような磁気を帯びたマーカーの使用による免疫測定を記したEP-0.351.857号特許出願を挙げることができる。マイクロプレートの窪みの底にあらかじめ定着させた、テスト対象血清に感作する赤血球に磁場を作用させ、洗滌し、抗免疫グロブリンで被覆した、磁気を帯びたラテックス球と混合した、免疫付着によるRAI技術が特に記載されている。
【００１９】
磁場が存在しているポリカチオン化合物を利用して、検体に含有されている物質と結合できる微粒子との凝集法を記したEP-0.230.768号特許出願も知られている。
【００２０】
しかしながら、この諸種の技術はまた、いずれも多数の欠点を有する。同諸技術は、実施するのが困難かつ長時間がかかり、たいして経済的ではなく、複雑かつ移動させにくい装置の使用を必要としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】EP-0.351.857号
【特許文献２】EP-0.230.768号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
したがって、本発明は、照合用方式で得られる綿密さと正確さと少なくとも比肩できる綿密さと正確さを有する、赤血球の血液型の表現型化および関連する血漿の抗体の識別を特定するために、単純かつ効果的な方式を提案することによって、従来の技術の欠点を排除することを狙いとしている。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
とりわけ、本発明の目的は、遠心分離の装置および／または何らかの測定装置を利用することなく、全血の検体に基づいて、直接赤血球の固定化によって赤血球の血液型を迅速に特定、検出することのできる、自動的かつ移動できる、使用しやすい、経済的な方式を提案することにある。
【００２４】
この目的に応えるべく、本発明は、少なくとも１の反応区域を有する堅固な支持台を含んでおり、全血の検体に基づいて、血液型を識別、特定するための装置を提案しており、同反応区域は、少なくとも１の錯形成用試薬を含浸させるための直径１ないし20μmの細孔を有する重合体製多孔質膜および分析する検体の余分な血液を回収するための吸収用膜を含んでいる。同装置は、血液型の赤血球の抗原および／または対応する血漿の抗体を識別し、特定することを可能にしている。    
【００２５】
本発明はまた、この装置の利用、ならびにこの装置を活用して、赤血球の固定反応による赤血球の血液型の表現型化方式も狙いとする。
【発明の効果】
【００２６】
有利なことに、本発明は、遠心分離機または測定装置を利用することなく、実証による読み取りの結果で、全血に基づいて直接かつ迅速に、赤血球の血液型を検出および／または特定することを可能にしている。本発明は、血液型の抗原およびそれに対応する血漿の抗体の同時検出を可能にしている。
【００２７】
なお、本発明は、血液型の赤血球の抗原およびそれに対応する血漿の抗体の識別および特定のためのセットにも関している。
【００２８】
それ以外の特性と利点は、本発明の添付図に照らして、単に例として示したこれから先の記述で明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の装置の斜視概略図である。
【図２ａ】本発明による装置の反応区域の第１の実施態様の概略断面図である。
【図２ｂ】本発明による装置の反応区域の第２の実施態様の概略断面図である。および
【図３】本発明による装置の実施態様の斜視図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
【実施例１】
【００３１】
本発明による装置は、全血の検体に基づく赤血球の血液型の特定および／または検出のためのものである。
【００３２】
諸図に示したように、本装置は、少なくとも１の反応区域４を保有する堅固な支持台１を含んでおり、同反応区域は、少なくとも下記の諸膜からなる。すなわち、
−  少なくとも１の錯形成の試薬を含浸させる予定の直径１ないし20μｍの細孔を有する重合体製多孔質膜３、および
−  分析する検体の余分な血液を回収する予定の吸収用膜２。
【００３３】
重合体製多孔質膜３は、直径１ないし20μmで、１ないし14μmが好ましい細孔を有する。
【００３４】
好ましい１の実施態様では、多孔質膜３は、透明である。
【００３５】
抗体の活性と固定のためにとりわけ本発明に特に適応している特性を呈する高密度ポリエチレン製膜であることができる。さらに好ましいのは、多孔質膜３が良好な耐久性、１滴の全血を10秒間以内に吸収する迅速な移動速度および平均７μmの多孔度を呈することにある。
【００３６】
膜３は、錯形成の試薬を含浸させるためのものである。例として、本装置がBeth-Vincentテストのために利用される場合、膜３は、抗体抗―A１、抗―A２、抗―B、抗―ABまたは、抗―Dのようなモノクローナル抗体試薬を含浸させる。本装置がSimoninテストのために利用される場合、膜３は、抗グロブリン試薬またはレクチンを含浸させる。錯形成の試薬は、特有な方法で活性区域に結合する。
【００３７】
錯形成の試薬は、適切ななんらかの方法で膜３に固定される。同試薬は、とりわけ選択的な受動的吸収で結合できる。この選択性は、テストの的確さと正確さを向上させる。
【００３８】
図2bに示した変形態様では、本装置の反応区域４は、フィルター５も含んでいる。このフィルターは、例えば、直径１ないし７μmの範囲のガラスファイバーからなることができる。
【００３９】
本装置がヒトの血漿中の抗体の識別と特定のために利用されるとき、このフィルター５は、全血を置いたとき、赤血球を抑留し、血漿だけを透過させるように、赤血球を凝集させることのできる試薬を含浸させることが好ましい。例として、この試薬は、大豆の凝集素、レクチンまたは赤血球を凝集させることのできる生化学的または生化学的でないその他の物質であり得る。
【００４０】
この凝集用試薬は、適切ななんらかの方法でフィルター５に固定させる。とりわけ吸収で固定させることができる。
【００４１】
図３に示した本発明に特有な方法では、本装置は、洗滌液および／または表出用液を内蔵するタンク６も包含している。このタンクは、本装置に合体するように固定されることができる。
【００４２】
本発明による装置は、全血の検体に基づいて、血液型、とりわけABO
, RhesusおよびRAIの血液型を特定および／または検出するために利用することができる。
【００４３】
本発明による装置は、全血の検体に基づいて血液型、とりわけABO, RhesusおよびRAI血型の血液型を特定および／または検出するために利用できる。
【００４４】
本発明による装置は、下記段階を含む、赤血球の固定反応による赤血球の血液型の表現型化の方式の活用のために特に利用できる。
―  全血の検体を反応区域４に置いて、
―  少なくとも3０秒間反応させ、そして
―  多孔質膜３に結合していない要素を溶出するための洗滌液を付ける。
【００４５】
血液を反応区域４に乗せると、多孔質膜の錯形成試薬と特に結合することのできる血液要素は、同膜上に捕捉される。例えばPBS−ツイン洗滌液のような洗滌液を付けると、膜３に結合していない血液要素は、吸収用膜２の方へ排除される。
【００４６】
結果の読み取りは、顕微鏡的方法で実証によってこれを実施する。赤血球が多孔質膜３上に固定されると、結果は、反応区域４の着色で現れる。
【００４７】
とりわけABO, RhesusおよびRAI血型血液型の表現型化に特に適応している本発明の実施態様によれば、膜３は、例えば抗体抗―A１、抗―A２、抗―B、抗―ABまたは抗―Dのような赤血球に特有な抗体の抗原試薬が含浸される。そのとき、膜３は、赤血球の捕捉具の役割を果たし、赤血球は、活性区域にあらかじめ固定されている免疫グロブリンに固定されることができる。反応区域に特有な方法で結合されている抗体の試薬は、赤血球の捕捉を可能にし、同試薬は、赤血球の固定をもたらす。なお、この現象は、洗滌液に溶出されていない若干の抗体の残滓による事実上の凝集で増幅される。
【００４８】
反応区域に置かれた血液の検体の赤血球が、反応区域に存在している抗体に対応する抗原を保有しているとき、赤血球の捕捉と固定の反応が起こり、同反応は、活性区域の赤色着色で視覚的に現れる。
【００４９】
赤血球が、対応する抗体に認知されないとき、同赤血球は、吸収用膜２の方に溶出されて、反応区域には着色が現れない。
【００５０】
有利なことに、この方式は、結果の表出と読み取りのための着色技術も、凝集を観察するための特別な装置も利用していない。
【００５１】
なお、本発明による方式は、従来の技術のゲルテストの実施でとりわけ誤謬の原因になる擬似凝集を避けることを可能にしている。
【００５２】
ABO, RhesusおよびRAI血型の血液型の表現型化に特に適応している本発明の別の実施態様では、膜３は、ヒトの血漿のすべての抗体の固定を可能にする抗グロブリン試薬が含浸されている。
【００５３】
全血は、凝集用試薬が含浸されているフィルター５を備えた反応区域４上に置く。赤血球は、このフィルターのレベルに凝集し、血漿だけが多孔質膜３に届く。
【００５４】
そのとき、膜３は、流動する血漿の抗体の捕捉具の役割を果たし、同抗体は、活性区域にあらかじめ固定されている免疫グロブリン試薬と結合する。
【００５５】
その次に、抗原のテスト用血漿を置き、少なくとも30秒間作用させ、そして多孔質膜３と結合しなかった要素を溶出させるために、洗滌液を付ける。
【００５６】
抗グロブリンに固定することによって膜３と結合した、血液の検体の赤血球の抗体が、対応するテストの赤血球を認知したとき、同赤血球は、多孔質膜３のレベルで固定され、停止する。結果は、適用されたテストの赤血球の固定に繋がる着色として視覚的に現れる。
【００５７】
支持台の中に固定された血漿の抗体が、テスト用赤血球を認知しないとき、同赤血球は、洗滌液によって吸収用膜の方へ排除される。
【００５８】
特に好ましいことに、テストの感度を高めるために、赤血球入り溶液を濃縮できる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
有利なことに、本発明による装置と方式は、信頼でき、容易に利用でき,事前に準備することなく、全血の検体に基づいて、直接、血液型の表現型化が可能である。本装置は、容易に運搬でき、利用者は、どのような場所でも、測定装置も、遠心分離装置も無しに、本装置を活用できる。
[実例]
【００６０】
これから述べる実例は、本発明による本装置の可能な実施態様および血液型の特定の補足的な２のテスト、すなわち、血球のテストおよび血清のテストのための本装置の利用を示しておく。
【００６１】
実例１：本発明による本装置の実施態様
【００６２】
多孔質膜
多孔質膜３は,細孔の総量40％ないし45％、細孔の平均直径７μmを有し、多孔度が１ないし14μmに配分されている高密度ポリエチレン製膜である。
【００６３】
多孔質膜３は,直径６mmおよび厚さ１mmの円盤状に画定されている。
【００６４】
円盤状膜は、低分子量の全不純物を除去するために純エタノールで洗滌し、60℃の乾燥器で乾燥させる。
【００６５】
フィルター  
フィルター膜５は、直径１ないし７μmの特にガラスファイバーからなる。
【００６６】
フィルターは、直径６mmの円盤状を呈している。
【００６７】
吸収用膜  
吸収用膜２は、ワットマン社で入手できる吸収能力198mg/cm2の膜である。
【００６８】
吸収用膜は、全血50μmに相当する吸収総量で、直径６mmの円盤状を呈している。
【００６９】
堅固な支持台
各種膜を受け入れることのできる堅固な支持台１は、長さ12cm、巾８cmのプラスチック製支持台である。
【００７０】
支持台は、８列に配置してある72の反応区域を保有するためにあり、各区域は、１のフィルター５、１の膜３および１の膜２を含む。諸列は、識別と特定のためにある。すなわち、
−  第１列は抗原A1用、
−  第２列は抗原B用、
−  第３列は抗原AB用、
−  第５列は抗原D用、
−  第６列は血漿の抗体の抗A用、
−  第７列は血漿の抗体の抗B用である。
【００７１】
第４列と第８列は、陽性検査用である。
【００７２】
抗体試薬
抗体試薬抗―A1,抗―B,抗―ABおよび抗―Dは、純化モノクローナル抗体試薬である。
【００７３】
抗体試薬は、緩衝液PBSに含有されている。
【００７４】
抗体試薬は、次に、膜３の円盤上で、抗―A1用に第１列に、抗―B用に第２列に、抗―AB用に第３列に、および抗―D用に第５列のレベルに配置されておかれ、それから乾燥される。
【００７５】
PBSツインを含有する洗滌液は、膜３に結合していない抗体を排除するために、各反応区域に付けておかれる。
【００７６】
抗グロブリン試薬
抗グロブリン試薬は、純度を高めた抗―fc抗体試薬である。
【００７７】
抗グロブリン試薬は、次に、第６列および第７列のレベルに配置することになっている膜３の円盤に置いて、その後で、乾燥される。
【００７８】
PBSツインを含有している洗滌液は、膜３に特に結合していない抗グロブリンを排除するために、各反応区域に付けておかれる。
【００７９】
赤血球を凝集させる試薬
大豆の凝集素は、ｐH７のTRIS緩衝液中に、90mg/Lの割合で調合する。
【００８０】
この緩衝液は、第６列および第７列のレベルだけに、フィルター５に含浸のために置かれ、その後で乾燥される。
【００８１】
実例２：第１列から第５列までのための方式の活用
【００８２】
全血を１滴、各活性区域上に置く。
【００８３】
30秒間ないし１分間待ってから、特に結合されていない血液要素を溶出するために、洗滌液を付ける。
【００８４】
検体を第１列から第５列までの反応区域上に置くとき、血液の全要素は、フィルター５を透過して、多孔質膜３のレベルに到達する。膜５には赤血球の凝集試薬が欠如しているからである。多孔質膜３のレベルで、血液検体の赤血球が、反応区域内に存在している抗体に対応する抗原を保有していれば、捕捉反応と赤血球の固定が起こり、活性区域の赤色着色となって現れる。赤血球が認知されないとき、同赤血球は、吸収用膜２の方に溶出され、視覚的には、活性区域が着色しないことになる。
【００８５】
実例３：第６列から第８列までのための方式の活用
全血１滴を第６列から第８列までの各活性区域上に置く。
【００８６】
赤血球は、フィルター５のレベルで凝集し、血漿の若干量はフィルターを透過して、抗グロブリンを含浸させた多孔質膜３のレベルに到達する。
【００８７】
次に、既知の抗原テスト用赤血球を各反応区域に置く。
【００８８】
30秒間ないし１分間待ってから、特に結合されていない血液要素を溶出するために、洗滌液を付ける。
【００８９】
血液の検体の血漿抗体が、対応するテスト用赤血球を認知すると、同テスト用赤血球は、反応区域のレベルに凝集する。結果は、反応区域の着色になって現れる。
【００９０】
固定された血漿の抗体がテスト用赤血球を認知しないとき、同テスト用赤血球は、洗滌液によって、吸収用膜２の方に排除される。
【００９１】
別の実施態様では、テスト用赤血球は、多孔質膜３に付着され、脱水防止の保護装置で湿潤に保たれる。全血を反応区域のレベルに付けるとき、フィルター５を透過した流動する血漿の抗体は、膜３のレベルで、対応する膜の抗原に固定されて、または洗滌液によって溶出される。
【００９２】
有利なことに、本発明は、特殊な機器無しによる血液の検体の事前変更無く、同じ装置でBeth-VincentのテストおよびSimoninのテストを実施できる。
【００９３】
なお、本発明は、血液型の赤血球の抗原およびそれに対応する血漿の抗体の識別と特定のためのセットにも関する。
【００９４】
このセットは、既に記述したように、血液型の赤血球の抗原を識別し、特定できる抗体の試薬および流動する抗体を識別し、特定できるテスト用赤血球を含んでいる。
【符号の説明】
【００９５】
１．堅固な支持台
２．吸収用膜
３．多孔質膜
４．反応区域
５．フィルター
６．タンク
【図１】
2010531989.tif 000002
【図２Ａ】
2010531989.tif 000003
【図２Ｂ】
2010531989.tif 000004
【図３】
2010531989.tif 000005
【国際調査報告】
2010531989.tif 000006
2010531989.tif 000007
2010531989.tif 000008
2010531989.tif 000009
2010531989.tif 000010
2010531989.tif 000011