(57)【要約】  本発明は、プロテインＡを発現する、遺伝子組換えされた油体を使用する、ＴＡＣＩ−Ｆｃ等のＦｃ−融合タンパク質を精製するためのプロセスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を精製する方法であって：
ａ)プロテインＡの油体を含む溶液と、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含むサンプルを、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質の(ｍｇ)／乾燥重量の油体(ｍｇ)の最終的な比率を１〜５．５の範囲内とするように混合し；そして
ｂ)ｐＨが２．７〜５の範囲内に含まれる水溶液を添加することにより、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質から前記プロテインＡの油体を分離する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
工程(ｂ)の最後に収得されたＴＡＣＩ−Ｆｃを含む溶液が、９３％、９４％、９５％、又は９６％より高濃度のＴＡＣＩ−Ｆｃ二量体を含む、、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質が、配列番号２に対し、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質が、配列番号２の配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程(ａ)を実施する前に、前記プロテインＡの油体を洗浄するプロセスを更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程(ａ)と工程(ｂ)との間に、前記プロテインＡの油体を洗浄する工程を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテインＡの油体が、ｐＨ７のリン酸緩衝液で洗浄される、請求項５又は６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記プロテインＡの油体を洗浄する前記プロセスが、２回又は３回繰り返される、請求項５、６、又は７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程(ａ)におけるＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質(ｍｇ)／乾燥重量の油体(ｍｇ)の前記最終的な比率が、３．５〜５の範囲内である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程(ｂ)が、ｐＨ３．５の水溶液を添加することにより実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶液が、２００ｍＭの酢酸塩を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程(ｂ)が、２回又は３回繰り返される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程(ｂ)の最後に収得される前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含む溶液を濾過する工程(ｃ)を更に含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程(ｃ)の最後に収得される溶液を中和する工程(ｄ)を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
１つ以上の研磨プロセスを更に含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質が、医薬組成物に更に製剤化される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を精製するための、プロテインＡの油体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野におけるものである。より具体的には、これは、プロテインＡを発現するように遺伝子組換えされた油体(oil body)を使用する、ＴＡＣＩ−Ｆｃの精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．Ｆｃ−融合タンパク質
Ｆｃ−融合タンパク質は、例えば、受容体の結合領域等のタンパク質のエフェクター領域からなり、しばしばイムノグロブリンＧ(ＩｇＧ)であるイムノグロブリンのＦｃ領域にと融合したキメラタンパク質である。Ｆｃ−融合タンパク質は：
−ＩｇＧアイソタイプに従い変化する親和性に基づく、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用した精製が可能であること。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４は、プロテインＡと強力に結合し、及び、ＩｇＧ３を含む全てのヒトＩｇＧは、プロテインＧと強力に結合し、並びに
−前記Ｆｃ領域が、リソソーム分解から保護するサルベージ受容体ＦｃＲｎと結合することにより、循環系中の半減期が延長する、
等のＦｃ領域により授けられた利点を提供するとき、治療剤として広く使用される。
【０００３】
血清半減期及びエフェクター機能は、そのＦｃ−融合タンパク質を対象とした治療目的の使用に依存して、そのＦｃＲｎ、ＦｃｖＲｓ、及びＣ１ｑとのそれぞれの結合を上昇又は低下するようにＦｃ領域を操作することにより調節され得る。
【０００４】
ＡＤＣＣにおいて、ある抗体の前記Ｆｃ領域は、ナチュラルキラー及びマクロファージ等の免疫エフェクターの表面上のＦｃ受容体(ＦｃｖＲ)と結合し、標的細胞のファゴサイトーシス又は溶解を引き起こす。
【０００５】
ＣＤＣにおいて、抗体は、細胞表面において補体カスケードを引き起こすことにより、標的細胞を死滅させる。ＩｇＧアイソフォームは、ＩｇＧ４＜ＩｇＧ２＜ＩｇＧ１≦ＩｇＧ３の順に増大する、異なるレベルのエフェクター機能を発揮する。ヒトＩｇＧ１は、高いＡＤＣＣ及びＣＤＣを呈し、そして、病原体及び癌細胞に対する治療的な使用に最も適している。
【０００６】
エフェクター機能の変更は、それらのＦｃγＲ若しくは補体因子への結合を増加させ、又は減少させるために、Ｆｃ領域を操作することにより達成され得る。
【０００７】
活性化(ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂ)及び阻害性(ＦｃγＲＩＩｂ)ＦｃγＲ、又は補体(Ｃ１ｑ)の第１成分へのＩｇＧの結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン中に位置する残基に依存する。前記ＣＨ２ドメインの２つの領域は、ＦｃγＲ及び補体Ｃ１ｑの結合に重要であり、そして、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４において、特異な配列を有する。例えば、２３３−２３６部位でＩｇＧ２残基をヒトＩｇＧ１に置き換えると、ＡＤＣＣ及びＣＤＣが著しく減少する(Armour et al., 1999; Shields et al., 2001)。
【０００８】
多数のアイソフォームがＩｇＧのＣＨ２ドメインにおいてなされており、そして、それらのＡＤＣＣ及びＣＤＣに対する効果は、インビトロで試験された(Shields et al., 2001 ; Steurer et al., 1995)。特に、Ｅ２３３のアラニンへの変異は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を上昇させることが報告された(Idusogie et al., 2000; ldusogie et al., 2001 )。
【０００９】
治療用Ｆｃ−融合タンパク質の血清半減期を上昇させることは、その有効性を改善するもう一つの方法であり、循環レベルをより高くし、頻繁な投薬をより少なくし、投薬量を減少させることを可能とする。これは、新生児のＦｃＲ(ＦｃＲｎ)へのＦｃ領域の結合を高めることにより達成され得る。内皮細胞の表面上に発現されるＦｃＲｎは、ｐＨ−依存性の様式でＩｇＧに結合し、そして、それを分解から保護する。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の結合部分に位置する幾つかの変異は、ＩｇＧ１の半減期を上昇させることが示されている(Hinton et al., 2004; Vaccaro et al., 2005)。
【００１０】
以下の表１において、幾つかの既知のＩｇＧ Ｆｃ領域の変異を概説する(Invivogenのウェブサイトからの転載)。
【００１１】
【表１】
2010516744.tif 000002
【００１２】
２．Ｆｃ−融合タンパク質の精製
Ｆｃ−融合タンパク質は、一般に「生物製剤」と称される薬物として、商業的に重要なものとなっている。最も大きな課題の一つは、費用効率が高く、そして高効率な、商業的規模におけるタンパク質の精製のためのプロセスの開発である。現在、多くの方法がタンパク質の大規模生産に利用可能であるが、細胞培養上清等の粗製品は、所望の生産物のみならず不純物をも含み、その所望の生産物から分離するのは困難である。組換えタンパク質生産物を発現する細胞の細胞培養上清は、細胞が無血清培地中で培養されるときは含まれる不純物は少ないが、宿主細胞タンパク質(ＨＣＰ)は、精製プロセスの間に排除しきることが出来ない。加えて、保健機関は、ヒトへの投与を目的としたタンパク質の純度において、高い標準を要求する。
【００１３】
多くの精製方法は、得られるタンパク質の生物活性を損ない得る、低い又は高いｐＨ、高い塩濃度、又は他の極端な条件の適用を要求する工程を含む。従って、いかなるタンパク質においても、純度が十分でありながら、生産されたタンパク質の数量当たりの価格の観点から、そのプロセスの生産性を維持することを可能とする精製プロセスを構築することが課題となる。
【００１４】
Ｆｃ−融合タンパク質の精製は、通常、クロマトグラフィーレジンに固定されたもう一つのタンパク質へのそのＦｃ−融合タンパク質の親和性を基礎としている。そのような固定リガンドの例には、細菌細胞壁タンパク質であるプロテインＡ及びプロテインＧが挙げられ、あるイムノグロブリンのＦｃ部分への特異性を有する。プロテインＡ及びプロテインＧのいずれもＩｇＧ抗体への強力な親和性を有するが、それらは他のイムノグロブリンクラス及びアイソタイプに対しても、様々な親和性を有する。
【００１５】
プロテインＡは、スタフィロコックス・アウレウス(Staphylococcus aureus)細菌により生産される４３，０００ダルトンのタンパク質であり、そして、ＩｇＧのＦｃ領域に対する４つの結合部位を含む。プロテインＧは、Ｇ・ストレプトコッキ(G Streptococci)群から生産され、ＩｇＧのＦｃ領域に対する２つの結合部位を有する。いずれのタンパク質も、様々な型のイムノグロブリンに対するそれらの親和性が広く特徴付けられている。プロテインＬは、ペプトストレプトコックス(Peptostreptococcus)を起源とする更なる細菌タンパク質であり、Ｉｇ軽鎖を含むイムノグロブリン及びそれらの断片と結合する(Akerstrom and Bjorck, 1989)。
【００１６】
プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬによるアフィニティークロマトグラフィーは、イムノグロブリンの単離及び精製に広く使用される。プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬに対する結合部位は、イムノグロブリンのＦｃ領域中に存在するため、プロテインＡ及びプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィーは、いわゆるＦｃ−融合タンパク質の精製をも可能である。しかしながら、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬによるアフィニティークロマトグラフィーを含む精製は、費用がかかり、かつ時間のかかるプロセスである。
【００１７】
従って、高効率で、容易で費用効率の高い、Ｆｃ−融合タンパク質を精製する方法の、満たされていない需要が存在する。
【００１８】
３．油体技術
米国特許第6,924,363号(Moloney et al., 2005)及び国際公開第WO 98/27115号は、「油体技術」と称される技術を開示する。この技術は、油体及びそれらに関連するタンパク質を、標的分子を分離、及び精製するためのアフィニティーマトリックスとして使用することを基礎とする。米国特許第6,924,363号及び国際公開第WO 98/27115号の一例として、標識されたウサギ抗−マウス抗体が、プロテインＡを発現するように遺伝子組換えされた油体に付着し得て、また、溶出もされ得ることを示す概念実証が挙げられる。しかしながら、米国特許第6,924,363号及び国際公開第WO 98/27115号は、抗体について言及しており、それらは、油体技術をＦｃ−融合タンパク質の分離及び／又は精製に使用することを示唆しない。それらは、抗体又はＦｃ−融合タンパク質のいずれにおいても、精製の最適な条件を教示しない。
【００１９】
４．ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質
ＴＡＣＩと称される、膜貫通アクチベーター、並びにカルシウムモデュレーター及びシクロフィリンリガンドのインタラクター(interactor)は、ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリーのメンバーである。ＴＡＣＩは、２つのシステインリッチ偽反復(pseudo- repeat)を含む細胞外ドメインを有する、膜貫通アクチベーター及びＣＡＭＬ−インタラクターである(von Bulow and Bram, 1997; Gross et al., 2000)。ＴＡＣＩは、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)リガンドファミリーの２つのメンバーと結合する。１つのリガンドはＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ、ニュートロカイン−α、ＴＡＬＬ−１、ｚＴＮＦ４、又はＴＨＡＮＫと規定される(Moore et al., 1999)。その他のリガンドは、ＡＰＲＩＬ、ＴＮＲＦデスリガンド−１、又はＺＴＮＦ２として規定されている(Hahne et al., 1998)。
【００２０】
ＩｇＧ Ｆｃ領域と融合したＴＡＣＩ受容体の可溶性形態を含む融合タンパク質も知られており、ＴＡＣＩ−Ｆｃと規定される(第WO 00/40716号、第WO 02/094852号)。ＴＡＣＩ−Ｆｃは、Ｂ細胞へのＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬの結合を阻害する(Xia et al., 2000)。それは、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、関節リウマチ(ＲＡ)、及び血液悪性腫瘍を含む自己免疫疾患の治療、又は多発性硬化症(ＭＳ)の治療のために開発されている。これに加え、ＴＡＣＩ−Ｆｃは、多発性骨髄腫(ＭＭ) (Novak et al., 2004)、非ホジキンリンパ腫(ＭＨＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、及びワルデンストロームマクログロブリン血症において開発されている。この分子はアタシセプト(atacicept)と称され、現在は臨床試験中であり、例えば、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質である。
【００２１】
ＴＡＣＩ−Ｆｃは、２つのＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含むダイマーとして活性である。ＴＡＣＩ−Ｆｃを生産するとき、２つ以上のダイマーを含む凝集体も収得される。従って、ＴＡＣＩ−Ｆｃの精製プロセスは、ＴＡＣＩ−Ｆｃの凝集体のパーセンテージを低下させることを念頭に置くべきである。
【００２２】
当該技術分野において利用可能な、ＴＡＣＩ−Ｆｃを精製する方法は、プロテインＡクロマトグラフィーを含む。例えば、Wu et al. (2000)は、プロテインＡクロマトグラフィーによる、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質の精製を開示する。クロマトグラフィーカラムには、HyperD（登録商標） Solvent-Detergent Removal Chromatography Resinが充填される。
【００２３】
ＴＡＣＩ−Ｆｃの治療的有用性を鑑みて、簡易かつ費用効率の高いプロセスを使用した、大量の精製ＴＡＣＩ−Ｆｃダイマーを収得する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の概要
本発明は、油体技術を基礎とする、ＴＡＣＩ−Ｆｃの精製プロセスの開発を基礎とする。
【００２５】
従って、本発明の第一の側面は：
ａ)プロテインＡの油体を含む溶液と、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含むサンプルを、乾燥重量の油体(ｍｇ)に対するＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質(ｍｇ)の最終的な比率を、約１〜約５．５の範囲内とするように混合し；そして
ｂ)ｐＨが約２．７〜約５の範囲内に含まれる水溶液を添加することにより、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質から前記プロテインＡの油体を分離する
工程を含む、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を精製する方法に指向する。
【００２６】
本発明の第二の側面は：
ａ)本発明に係る方法により、前記ＴＡＣ−Ｆｃを精製し；そして
ｂ)その精製されたＴＡＣＩ−Ｆｃを、医薬組成物に製剤化する
プロセスを含む、ＴＡＣＩ−Ｆｃを含む医薬組成物を製造する方法に指向する。
【００２７】
本発明の第三の側面は、ＴＡＣＩ−Ｆｃを精製するための、プロテインＡの油体の使用に指向する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】SemBioSys Genetics Inc.のウェブサイトから転載された、油体の模式図である。
【００２９】
【図１Ｂ】オレオシン−プロテインＡ融合タンパク質を発現する、プロテインＡの油体を示す略図である。この図は、SemBioSys Genetics Inc.の米国特許第6,924,363号の図１５に該当する。
【００３０】
【図２】実施例１に記載された実験を実施したときに収得された、ＴＡＣＩ−Ｆｃ５収穫物(harvest)(レーン１〜８)、及びヒトＩｇＧ１カッパーサンプル（レーン９〜１２)の、マイクロ流体電気泳動による捕捉の結果を示す。レーンＬは、分子量マーカーに該当する。レーン１は、精製前の、ＴＡＣＩ−Ｆｃ含有サンプルに該当する。レーン２及び１０は、「フロースルー」、即ち、油体と結合しなかった、ＴＡＣＩ−Ｆｃ５及びヒトＩｇＧ１カッパーサンプルのフラクションに該当する。レーン３及び５は、実施例１．３に記載された、連続洗浄後に収得された収穫物に該当する。レーン６〜８は、実施例１．４に記載された、３回の連続溶出後に収得された収穫物に該当する。レーン９は、洗浄前の、ＩｇＧ１含有サンプルに該当する。レーン１１は、洗浄工程後に収得されたフラクションに該当する。レーン１２は、第１の溶出工程後に収得されたフラクションに該当する。
【００３１】
【図３】StratoCapture(商標)油体によるＴＡＣＩ−Ｆｃ収穫物の積載能力(loading capacity)解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＴＡＣＩ受容体(例えば、国際公開第WO 98/39361号に記載される)の全長配列である。
【００３３】
配列番号２は、ＴＡＣＩの細胞外部分及びＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質に由来する配列を含む、本発明に係る、好ましいＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質である(例えば、国際公開第WO 02/094852号に記載される)。
【００３４】
配列番号３は、配列番号２のＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドである。
【００３５】
配列番号４は、本発明に係る好ましいオレオシン−プロテインＡ融合タンパク質である(米国特許第6,924,363号に記載される)。
【００３６】
本発明の詳細な説明
本発明は、ＴＡＣＩ−Ｆｃのための、精製方法の開発を基礎とする。ＴＡＣＩ−Ｆｃは、本発明の枠内で開発された実験条件を使用して、油体と結合し、溶出する(実施例１を参照されたい)。最良の結果は：
乾燥重量の油体１グラムあたり、５グラムのＴＡＣＩ−Ｆｃが充填され(実施例２を参照されたい)；
その油体が、約３．５のｐＨで溶出される(実施例３を参照されたい)
ときに得られた。
【００３７】
加えて、驚くべきことに、そして有利なことに、油体は、プロテインＡクロマトグラフィーよりも、より高いＴＡＣＩ−Ｆｃダイマーの選択性(捕捉後フラクション中９６％)を示した(実施例３を参照されたい)。
【００３８】
前記油体技術は、資本集約的な、高価なバッチの、例えばＴＡＣＩ−Ｆｃ等のＦｃ−融合タンパク質のクロマトグラフィー精製プロセスを、使い捨ての試薬として、プロテインＡの油体を基礎とする、簡便で廉価なプロセスに転換させる可能性を提示する。
【００３９】
従って、本発明の第一の側面は、以下の：
ａ)プロテインＡの油体を含む溶液と、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含むサンプルを、乾燥重量の油体(ｍｇ)に対するＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質(ｍｇ)の最終的な比率を、約１〜約６の範囲内とするように混合し；そして
ｂ)ｐＨが約２．７〜約５の範囲内に含まれる水溶液を添加することにより、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質から前記プロテインＡの油体を分離する
工程を含む、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を精製する方法に関する。
【００４０】
油体は、植物の種子中に天然に形成されるタンパク質で被覆された脂肪球(liposphere)であり、トリグリセリド(油脂)の貯蔵に機能する(図１Ａを参照されたい)。油体は、貯蔵されたトリアシルグリセリドを封入した、微小な、球状の、細胞内小器官であり、多くの植物に使用されるエネルギー貯蔵である。それらは殆どの縮物において、そして様々な組織において見出されるが、特に、脂肪種子の種子中に豊富であり、大きさは、直径が１ミクロンより小さなものから数ミクロンに及ぶものまで、様々である。油体は、リン脂質の半単位(half-unit)膜により囲まれ、そして、油体タンパク質として知られる特異な型のタンパク質に埋め込まれた、トリアシルグリセリドを含む。本明細書中で使用されるとき、「油体(単数又は複数)」という用語は、完全な構造中に存在する、任意的な、又は全てのトリアシルグリセリド、リン脂質、又はタンパク質成分を含む。本明細書中で使用されるとき、「油体タンパク質」という用語は、油体中に天然に生じるタンパク質を意味する。植物において、顕著な油体タンパク質は、「オレオシン」と称される。オレオシンは、トウモロコシ、菜種、ニンジン、及び綿花等を含む、多くの植物資源においてクローニングされ、そして塩基配列が解読されている。前記オレオシンタンパク質は、３つのドメインを含むように見える。Ｎ−末端及びＣ−末端の、タンパク質の２つの末端は大いに親水性であり、そして、サイトゾルに晒される前記油体の表面に存在する。一方、疎水性が高いオレオシンの中央コアは、膜内及びトリアシルグリセリドにしっかりと固定されている。異なる種に由来するオレオシンは、特にそのタンパク質の中央領域における、重要なアミノ酸配列の保存を示す、タンパク質の小さなファミリーを形成する。個別の種の中で、少数の異なるアイソタイプが存在し得る。油体、油体関連タンパク質、及び／又はオレオシンは、一般に、その油体の表面上に組換えタンパク質が表現されるように操作され得る。
【００４１】
本明細書中で使用されるとき、「プロテインＡの油体」という用語は、プロテインＡ又はＩｇＧと結合するプロテインＡのドメインが、遺伝子操作された油体の表面上に表現されるように遺伝子組換えされた油体を指す。そのようなプロテインＡの油体は、例えば、米国特許第6,924,363号に記載され(Moloney et al., 2005)、そして、例えば、SemBioSys Genetics Inc.により、StratoCapture(商標)の名称の下で提供される。
【００４２】
本発明の好ましい態様において、プロテインＡ又はＩｇＧと結合するプロテインＡのドメインは、オレオシンと融合する（図１Ｂを参照されたい)。そのような融合タンパク質は、本明細書の全体において、「オレオシン−プロテインＡ融合タンパク質」と称する。本好ましい態様におけるプロテインＡの油体は、「オレオシン−プロテインＡの油体」と称される。配列番号４のタンパク質は、本発明に従って、好ましいオレオシン−プロテインＡ融合タンパク質であり、１８ｋＤａのアラビドプシスオレオシンと融合したプロテインＡのドメインからなる(van Rooijen et al., 1992)。このオレオシン−プロテインＡ融合タンパク質は、例えば、米国特許第6,924,363号の実施例９に記載されるように、構築され得る。ＩｇＧとの結合が可能なタンパク質をコードする合成プロテインＡ配列は、報告された配列情報を基礎として合成された(pRIT2T、プロテインＡ遺伝子融合ベクター; Pharmacia)。得られたプロテインＡ断片は、転写終止コドンが除去されたコード領域(その関連するイントロンと共に)及びその８６７ｂｐ上流のプロモーター領域を含むアラビドプシスオレオシン遺伝子を担持するｐＵＣ１９プラスミド中にライゲーションされた。前記構築物は、ノパリン合成酵素転写ターミネーターを含む。トロンビンエンドプロテアーゼの認識配列をコードするスペーサー配列は、オレオシンコード配列の直下に組み込まれた。プロテインＡの遺伝子配列は、このスペーサー配列と前記ターミネーター配列との間に導入された。最後の発現構築物において、前記オレオシン及びプロテインＡをコードする領域は、同じ読み枠で融合され、これが、配列番号４のタンパク質をコードする配列となった。そして、構築物の全体は、前記ｐＵＣ１９プラスミドから切除され、そして、３５ＳＣａＭＶプロモーターの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼを担持するｐＣＧＮ１５５９(McBride and Summerfelt, 1990)植物形質転換ベクターにサブクローニングされた。得られたプラスミドは、アグロバクテリウム(EHA101株)に導入された。
【００４３】
本発明に係るプロテインＡの油体は、好ましくは、種子植物から収得され、より好ましくは：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、菜種種(Brassica spp.)、大豆種(Glycine max)、ヒマワリ (Helianthus annuus)、アブラヤシ(Elaeis guineeis)、綿の実(Gossypium spp.)、落花生(Arachis hypogaea)、ココヤシ(Cocus nucifera)、トウゴマ(Ricinus communis)、ベニバナ(Carthamus linctorius)、カラシナ種(Brassica spp. and Sinapis alba)、コリアンダー (Coriandrum sativum)、亜麻仁／亜麻 (Linum usitatissimum)、及びトウモロコシ(Zea mays)を含む植物種の群から収得される。植物は、当業者に周知の農耕的実践を使用して、生長し、そして結実が可能となる。種子を収穫し、そして石(stone)又は種子の外皮等の異物を例えばふるいにより除去した後、種子は好ましくは乾燥され、そして続いて、機械的圧搾(pressing)、破砕(grinding)、又は粉砕(crushing)により処理される。そのプロテインＡの油体のフラクションは、遠心分離のように、プロテインＡの油体フラクションと水性フラクションとの密度の違いを利用する、若しくは膜濾過のように、サイズ排除を基礎とする分離技術を使用する、又はこれら両方の組合せの、分離技術の資本化により、粉砕された種子フラクションから収得され得る。典型的には、種子は、５容の低温の水性緩衝液中で激しく破砕される。様々な種類の緩衝液組成物が、それらが高濃度のアセトン又はジエチルエーテル等の強力な有機溶媒を含まない限り、採用され得る。なぜなら、これらの溶媒は、プロテインＡの油体を破壊する場合があるからである。破砕緩衝液の溶液濃度は、下記のような洗浄を促進するために、０．４〜０．６Ｍのスクロースを添加して上昇させられ得る。また、前記破砕緩衝液は、典型的には、プロテインＡの油体表面に一体的に結合しない可溶性タンパク質の除去を補助するため、０．５ＭのＮａＣｌを含む。破砕後、ホモジネートは遠心分離され、微粒子のペレットと可溶性物質が形成され、水相にはその種子の可溶性成分が含まれ、そして表層には、関連タンパク質と共にプロテインＡの油体が含まれる。前記プロテインＡの油体は表層から抜き取られ、そして、１容の新鮮な破砕緩衝液に再懸濁される。プロテインＡの油体の集合は、後に続く洗浄工程における効率的な混入物質の除去を確保するために、可能な限り徹底的に解離されることが重要である。再懸濁されたプロテインＡの油体の調製品は、低密度の浮遊溶液(例えば水、水性緩衝液)の下で層を成し、そして再び円心分離され、プロテインＡの油体と水性相とに分離される。典型的には、この洗浄手順は少なくとも３回繰り返され、その後プロテインＡの油体は、ゲル電気泳動で判定したときに、充分に混入可溶性タンパク質が排除されているものとみなされる。全ての水相を除去する必要は無く、そして、最終調製品に対し、水又はｐＨ７．５(所望の場合は、そのｐＨは２に下げられ、又はｐＨ１０まで上げられる)の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌが添加され得る。脂肪種子から油体を単離する手順は、当該技術分野において利用可能である(Moloney et al., 2005)。植物由来ではないプロテインＡの油体も、本発明において使用され得る。植物遺伝子組換え油体及びオレオシンと機能的に同等の系は、細菌(Pieper-Furst et al., 1994)、藻類、及び菌類(Ting et al., 1997)において記載されている。これらの生物に由来する、又は当業者により他の生細胞から見出され得るプロテインＡの油体も、本発明に採用され得る。
【００４４】
本明細書中で使用されるとき、「ＴＡＣＩ−Ｆｃ」及び「ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質」の用語は、Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬの少なくとも一つに結合する、ＴＡＣＩの細胞外ドメイン、又はその断片を含み、イムノグロブリンのＦｃ領域と融合した、融合タンパク質を指す。また、イムノグロブリンのＦｃ領域は、ＴＡＣＩ−Ｆｃの「Ｆｃ−部分」とも称される。Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬへの結合能力を試験するアッセイは、例えば、(Hymowitz et al., 2005)において記載されている。ＴＡＣＩは、好ましくはヒトＴＡＣＩである。配列番号１は、ヒト完全長ＴＡＣＩ受容体(又はSwissProt Accession No. 014836)のアミノ酸配列に該当する。好ましくは、ＴＡＣＩに由来する断片は、少なくとも配列番号２の３３〜６７アミノ酸及び／又は配列番号１の７０〜１０４アミノ酸を含む。一の好ましい態様において、ＴＡＣＩに由来する断片は、配列番号１の１〜１６６アミノ酸、若しくは配列番号１の３０〜１６６アミノ酸、若しくは配列番号１の３０〜１１９アミノ酸、若しくは配列番号１の３０〜１１０アミノ酸を含み、又はそれらからなる。ＴＡＣＩに由来する断片の全ては、本発明に係る方法により精製されるべきＴＡＣＩタンパク質の生産にとって好ましく、それらはＦｃ−部分と組み合わせられる。本発明に係る方法により精製されるべき大いに好ましいＴＡＣＩタンパク質は、配列番号２を含み、又はそれからなる。
【００４５】
従って、ＴＡＣＩ−Ｆｃは：
ａ)配列番号１の３４〜６６アミノ酸；
ｂ)配列番号１の７１〜１０４アミノ酸；
ｃ)配列番号１の３４〜１０４アミノ酸；
ｄ)配列番号１の３０〜１１０アミノ酸；
ｅ)配列番号２；
ｆ)大いにストリンジェントな条件で、配列番号３の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；
ｇ)(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)、又は(ｆ)のポリペプチドと、少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９９％の配列同一性を有する、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)、又は(ｆ)のいずれかの変異タンパク質；及び
ｈ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)、(ｅ)、(ｆ)、又は(ｇ)のいずれかの機能的誘導体(functional derivative)；
から選択されるポリペプチドを含むことが、大いに好ましい。ここで、そのポリペプチドは、Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬの少なくとも１つと結合する。
【００４６】
「変異タンパク質」という用語は、本明細書中で使用されるとき、元のＴＡＣＩ−Ｆｃと比較したときに、得られた生産物の活性が大幅に変化すること無く、ＴＡＣＩ−Ｆｃの１つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換され、若しくは欠失し、又は１つ以上のアミノ酸残基が元のＴＡＣＩ−Ｆｃの配列に付加した、ＴＡＣＩ−Ｆｃのアナログを指す。これらの変異タンパク質は、既知の合成により、及び／又は部位指向的突然変異生成技術、若しくはそのために適した任意的な他の既知の技術により、生産される。
【００４７】
本発明に基づく変異タンパク質には、ストリンジェントな条件下で、配列番号２に係るＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズする、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸によりコードされるタンパク質が含まれる。ＴＡＣＩ−ＦｃをコードするＤＮＡ配列の例は、配列番号３である。
【００４８】
「ストリンジェントな条件」という用語は、当業者が通常、「ストリンジェント」と称する、ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄条件を指す。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N. Y., §§6.3 and 6.4 (1987, 1992)を参照されたい。非制限的に、ストリンジェントな条件の例には、研究中のハイブリッドの計算されたＴｍより１２〜２０℃低い温度で、例えば２ｘＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで５分間、２ｘＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで１５分間；３７℃で、０．１ｘＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで３０〜６０分間、そして、６８℃で、０．１ｘＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで３０〜６０分間の洗浄プロセスが含まれる。当業者は、ストリンジェントな条件が、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基)又は混合されたオリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存することを理解する。混合されたプローブが使用されるときは、ＳＳＣよりも、テトラメチル塩化アンモニウムを使用することが好ましい。上記Ausubelの文献を参照されたい。
【００４９】
同一性は、２つ以上のポリペプチド配列の間の、又は２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関連性を反映し、それらの配列を比較することにより判定される。一般的に、同一性とは、比較される配列のそれぞれの全長における、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列の、ヌクレオチドとヌクレオチド、又はアミノ酸とアミノ酸の一致を要求する。厳密に一致しない配列において、「同一性％」が採用され得る。一般的に、比較されるべき配列は、それらの配列の間で最高の一致が得られるように整列させられる。このことは、整列の程度を高めるために、一方又は両方の配列に[ギャップ」を挿入することを含み得る。同一性％は、比較される各配列の全長において判定され得て(グローバルアラインメントと称される)、それは、長さが同一又は非常に近似している配列に特に適しており、一方、より短い、限定的な(defined)長さにおいてされるもの（局所アラインメントと称される)は、長さが同等でない配列により適している。２つ以上の配列の同一性又は相同性(homology)を比較するための方法は、当該技術分野において周知である。従って、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux et al., 1984)において利用可能なプログラム、例えばBESTFIT and GAPプログラムが、２つのポリヌクレオチドの間の同一性％を、並びに２つのポリペプチドの間の同一性％及び相同性％を判定するために使用され得る。BESTFITは、(Smith and Waterman, 1981 )の「局所相同性」アルゴリズムを使用し、そして、２つの配列の間の類似性の最高の１つの領域を見出す。また、例えばBLAST系プログラム(Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997)、ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.govのNCBIのホームページを通じてアクセス可能)及びFASTA (Pearson, 1990)等の、配列間の同一性／相同性を判定するための他のプログラムも、当該技術分野において知られている。２つの配列間の同一性％は、例えば、GenePAST等のバイオインフォマティック系のツールを使用することにより、KERRアルゴリズムDufresne et al., 2002)を使用して判定され得ることが、大いに好ましい。
【００５０】
配列番号２のタンパク質と実質的に類似のリガンド結合活性を有するような変異タンパク質は、好ましくは、ＴＳＣＩ−Ｆｃと充分に重複したアミノ酸配列を有する。例えば、ＴＡＣＩの活性の一つは、Ｂｌｙｓ又はＡＰＲＩＬへのその結合能力である(Hymowitz et al., 2005)。その変異タンパク質がＡＰＲＩＬ又はＢｌｙｓへの実質的な結合活性を有している限り、それは、ＴＡＣＩ−Ｆｃと実質的に類似した活性を有していると見なされ得る。従って、得られた任意の変異タンパク質が、配列番号２のタンパク質と実質的に同一の活性を有しているか否かは、ルーチン実験を用いて、当業者により容易に判定され得る。
【００５１】
一の好ましい態様において、そのような変異タンパク質は、それに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性又は相同性を有する。
【００５２】
本発明に基づく好ましい変異タンパク質の変化は、「保存的な(conservative)」置換として知られるものである。ＴＡＣＩ−Ｆｃの保存的なアミノ酸置換には、群のメンバー間の置換がその分子の生物学的機能を保存し得る、充分に近似した物理化学的性質を有する群中の、同義的なアミノ酸(Grantham, 1974)が含まれ得る。また、アミノ酸の挿入及び欠失が、特にその挿入又は欠失が、例えば３０残基以下、２０残基以下、又は好ましくは１０残基以下の少数のアミノ酸のみになされ、そして、システイン残基等の機能的立体構造に重要なアミノ酸を除去又は置換しないときに、それらの機能を変化させることなく、上に定義された配列中にもなされることは明白である。そのような欠失及び／又は挿入により生産されたタンパク質及び変異タンパク質は、本発明の範囲内にある。
【００５３】
好ましくは、前記保存的アミノ酸群は、表２に示されたものである。より好ましくは、同義的アミノ酸群は、表３の示されたものであり；そして最も好ましくは、同義的アミノ酸群は、表４に示されたものである。
【００５４】
【表２】
2010516744.tif 000003
【００５５】
【表３】
2010516744.tif 000004
【００５６】
【表４】
2010516744.tif 000005
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、「機能的誘導体」は、本発明に従い精製されるべきＴＡＣＩ−Ｆｃの誘導体に及び、当該技術分野で既知の手段により、残基の側鎖又はＮ−又はＣ−末端基として発生する官能基から生産され得て、それらが医薬として許容される限り、即ち、それらが上に定義されたような未改変ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質の活性に実質的に類似のＴＡＣＩ−Ｆｃの活性を損なわず、そしてそれを含む組成物に有毒性を与えない限り、本発明に含まれる。
【００５８】
ＴＡＣＩ−Ｆｃの機能的誘導体は、例えば、安定性、半減期、生体利用効率、人体における耐性、又は免疫原性を改善するために、ポリマーと結合等され得る。この目的を達成するため、ＴＡＣＩ−Ｆは、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)と連結され得る。ＰＥＧ化は、例えば、国際公開第WO 92/13095号に記載される既知の方法により実行され得る。
【００５９】
また、例えば、機能的誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第一若しくは第二アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分(例えば、アルカノイル又は炭素環式アロイル基)により形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、或いはアシル部分により形成される遊離ヒドロキシル基の(例えば、セリル又はスレオニル基の)Ｏ−アシル誘導体も含まれ得る。
【００６０】
ＴＡＣＩ−ＦｃのＦｃ−部分は、好ましくはＩｇＧである、ヒト又は動物のイムノグロブリンに由来し得る。前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であり得る。前記Ｆｃ−部分は、イムノグロブリン、好ましくはＩｇＧの重鎖に由来する。より好ましくは、前記Ｆｃ−部分は、例えば、イムノグロブリン定常領域のドメイン等の部分を含む。そのようなＩｇ定常領域は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン、又はそれらのいずれかの組合せから選択される、少なくとも１つのＩｇ定常ドメインを含む。前記Ｆｃ−部分は、少なくとも１つのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むことが好ましい。前記Ｆｃ−部分は、ＩｇＧヒンジ領域、前記ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むことが更に好ましい。好ましくは、ＴＡＣＩ−Ｆｃは、イムノグロブリンの重鎖定常領域を、より好ましくはヒトの定常領域を含む。最も好ましくは、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。また、前記定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むことも好ましい。
【００６１】
一の好ましい態様は、本発明に係るＴＡＣＩ−Ｆｃを精製する方法を指向し、ここで、工程(ｂ)の最後に収得されるＴＡＣＩ−Ｆｃを含む溶液は、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のＴＡＣＩ−Ｆｃのダイマーを含む。明らかに、実施例３の表６に示されているように、本発明に係る方法は、プロテインＡのクロマトグラフィーよりも、ＴＡＣＩ−Ｆｃに対する高い選択性を明示する。
【００６２】
本精製プロセスの一の好ましい態様において、１つ以上の洗浄工程が遂行される。本明細書中で使用されるとき、「洗浄」という用語は：
(ｉ)水溶液中にプロテインＡの油体を懸濁し；
(ｉｉ)前記懸濁液を遠心分離し；そして
(ｉｉｉ)下層の水相を除去し、プロテインＡの油体を含む上相を回収する
工程を含む方法を指す。そのような洗浄工程は、例えば、本発明に基づく方法の工程(ａ)と(ｂ)との間に、及び／又は工程(ａ)の遂行の前に遂行され得る。
【００６３】
遠心分離は、例えば、５０００ｘｇ、６０００ｘｇ、７０００ｘｇ、８０００ｘｇ、９０００ｘｇ、１００００ｘｇ、１１０００ｘｇ、１２０００ｘｇ、１３０００ｘｇ、１４０００ｘｇ、１５０００ｘｇ、１６０００ｘｇ、１７０００ｘｇ、１８０００ｘｇ、１９０００ｘｇ、又は２００００ｘｇで、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０分間実行され得る。好ましくは、遠心分離は、１００００ｘｇで１０分間実行され得る。
【００６４】
好ましくは、前記プロテインＡの油体は、ｐＨが約５〜約９、約５．５〜約８．５、約６〜約８、約６．５〜約７．５の範囲内の緩衝液で洗浄される。最も好ましくは、前記プロテインＡの油体は、ｐＨが約７の緩衝液で洗浄される。
【００６５】
また、好ましくは、前記プロテインＡの油体の洗浄に使用される緩衝液は、リン酸緩衝液である。
【００６６】
また、好ましくは、前記洗浄工程は、少なくとも２、３、４、又は５回、最も好ましくは３回繰り返される。
【００６７】
本精製プロセスの更に好ましい態様において、工程(ａ)における乾燥重量のプロテインＡの油体のｍｇに対するＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質のｍｇの最終的な比率が、約１〜約６、約１．５〜約５．５、約２〜約５、約２．５〜約４．８、約３〜約４．６、約３．５〜約４．５、又は約４〜約５．５の範囲内である。好ましくは、工程(ａ)における乾燥重量のプロテインＡの油体のｍｇに対するＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質のｍｇの最終的な比率は、約４、約４．２５、約４．５、約４．７５、約５、約５．２５、約５．５、約５．７５、又は約６である。ＴＡＣＩ−Ｆｃを精製するとき、工程(ａ)における乾燥重量のプロテインＡの油体のｍｇに対するＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質のｍｇの最終的な比率は、約４、約５又は約５．５であることが大いに好ましい。
【００６８】
工程(ｂ)は、「溶出工程」と称され得て、そして、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質からのプロテインＡの油体の分離は、例えば、以下の：
(ｉ)水溶液中にプロテインＡの油体を懸濁し；
(ｉｉ)前記懸濁液を遠心分離し；そして
(ｉｉｉ)例えばシリンジを使用して、精製されたＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含む下層の水相を回収する
ように、遂行され得る。
【００６９】
本精製プロセスの一の好ましい態様において、工程(ｂ)は、ｐＨが約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．４、３．３、３．５、３．６、３．７、３．８、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、又は４．５である、最も好ましくは約３．５である水溶液を添加することにより遂行される。
【００７０】
好ましくは、工程(ｂ)において使用される水溶液には、例えば約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、又は３００ｍＭの酢酸塩である酢酸塩が含まれる。
【００７１】
また、好ましくは、工程(ｂ)の工程は、少なくとも２、３、４、又は５回、最も好ましくは３回繰り返される。
【００７２】
本発明に基づく精製プロセスは、工程(ｂ)の最後に収得される前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含む溶液を濾過する、工程(ｃ)を更に含み得る。好ましくは、そのフィルターの孔径は、０，０５、０．１、０．２、０．３、０．４、又は０．５μｍである。
【００７３】
本発明に基づく精製プロセスは、工程(ｃ)の(工程(ｃ)が遂行されないときは、工程(ｂ)の)最後に収得される溶液を中和する、工程(ｄ)を更に含み得る。その溶液は、例えばＮａＯＨを使用して中和され得る。好ましくは、１ＭのＮａＯＨが使用される。
【００７４】
任意的に、本発明に基づく精製プロセスは、例えば、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及び／又はハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の、当該技術分野で周知の任意の技術を使用する、１つ以上の補足的な精製を含み得る。これらの補足的な精製工程は、通常、当業者には、「精練(polishing)工程」と称される。特に、Ｆｃ−融合タンパク質を精製するための当該技術分野で既知の方法には、プロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬアフィニティークロマトグラフィーによる第一の精製工程、及びヒトへの投与に適する程度の純度を達成することを目的とした、更なる精練工程を含む。本発明に基づき、プロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬアフィニティークロマトグラフィーによる精製工程は、プロテインＡの油体を使用する精製工程に置き換えられ、そして、前記精練工程は、当該技術分野で既に知られているように遂行される。例えば、前記精練プロセスは、欧州特許出願番号第06 119 611.9号に開示されるような、カチオン交換クロマトグラフィーによる遊離Ｆｃ−部分の排除の工程を含み得る。例えば、前記精練プロセスは、欧州特許出願番号第06 119 610.1号に開示されるように遂行され得る。これは、例えば、以下：
(ｉ)ＴＡＣＩ−Ｆｃを含む流体を、本発明の範囲内に記載されたようなプロテインＡの油体を使用して精製し；
(ｉｉ)工程(ａ)の溶出物をカチオン交換クロマトグラフィーにかけ；
(ｉｉｉ) 工程(ｂ)の溶出物をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ；そして
(ｉｖ)工程(ｃ)のフロースルーをハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけ、溶出物を回収し、精製されたＴＡＣＩ−Ｆｃを収得する
工程を含む、ＴＡＣＩ−Ｆｃ精製プロセスを導き得る。
【００７５】
任意的に、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質は、本発明に基づく精製プロセスの後に、医薬組成物に製剤化され得る。即ち、医薬として許容される担体及び／又は賦形剤等が、本発明に基づく精製プロセスの最後に収得されたＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含む溶液に添加される。
【００７６】
「医薬として許容される」という定義は、活性成分の生物活性の有効性に干渉せず、それが投与された宿主(host)に毒性を生じない、任意の担体を包含するものと解される。例えば、非経口投薬において、活性タンパク質(単数又は複数)は、生理食塩水、ブドウ糖溶液、血清アルブミン及びリンゲル液等のビヒクル中で、注射用の剤形単位(unit dosage form)として製剤化され得る。
【００７７】
本発明に係る医薬組成物の活性成分は、様々な方法で個体に投与され得る。投与の経路には、皮内、経皮(例えば、徐放製剤)、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所、直腸、及び経鼻経路が含まれる。例えば上皮若しくは内皮組織を通じての吸収、又は遺伝子治療(活性成分をコードするDNA分子(例えば、ベクターにより)を患者に投与し、インビボでその活性成分を発現させ、分泌させる)による投薬等の、任意的な他の治療的に有効な投薬経路が使用され得る。加えて、本発明に係るタンパク質(単数又は複数)は、医薬として許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤、及びビヒクル等の、他の生物活性剤の含有物と共に投与され得る。
【００７８】
非経口(例えば静脈内、皮下、筋肉内)投与において、活性タンパク質は、溶液、懸濁液、乳濁液、又は凍結乾燥粉末として、医薬として許容される非経口ビヒクル(例えば水、生理食塩水、ブドウ糖溶液)、及び等張性(マンニトール)又は化学的安定性(例えば、保存料及び、緩衝剤)を維持する添加物と併せて製剤化され得る。前記製剤は、通常使用される技術により滅菌される。
【００７９】
治療的に有効な活性タンパク質(単数又は複数)の量は、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質のそのリガンドに対する親和性、並びに投与の経路及び患者の臨床状態を含む、多くの変数に依存する関数であり得る。「治療的に有効な量」は、投与されたとき、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質が、関連するリガンドの阻害を引き起こす量である。ＴＡＣＩ−Ｆｃの場合、リガンドは、例えば、Ｂｌｙｓ及び／又はＡＰＲＩＬであり得る。一回又は複数回投与として患者に投与される投薬量は、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質の薬学的性質、投与の経路、患者の体調及び特徴(性別、年齢、体重、健康状態、サイズ)、症状の進行度、併用療法、治療の頻度、及び求められる効果を含む、様々な要素に依存して異なり得る。確立された投薬量の範囲の調整及び操作、及び個体内で治療部分のそのリガンドの阻害を判定するための、インビトロ及びインビボの方法は、正しく当業者の能力の範囲内である。
【００８０】
精製されたＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、又は約０．１〜５ｍｇ／体重ｋｇ、又は約１〜３ｍｇ／体重ｋｇ、又は約２ｍｇ／体重ｋｇの量で使用され得る。
【００８１】
更に好ましい態様において、前記精製されたＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質は、毎日、又は１日おきに、又は１週間に３回、又は１週間に１回投与される。前記毎日の投与は、通常、所望の結果を得るために有効な、分割された投与量で、又は徐放形態でなされる。第二の、又は続いての投薬は、同一の、又は最初に若しくは前にその個体に投与された量より少ない、又は多くの投薬量で遂行され得る。第二の、又は続いての投薬は、疾患の発症中、又は発症前にされ得る。
【００８２】
一の好ましい態様において、ＴＡＣＩ−Ｆｃは、アタシセプトである。精製されたアタシセプトは、好ましくは、多くの疾患又は障害の治療及び／又は予防用の薬剤の生産に使用され得る。そのような疾患又は障害は、好ましくは、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、関節リウマチ(ＲＡ)等の自己免疫疾患、又は多発性硬化症(ＭＳ)の治療から選択され得る。また、精製されたＴＡＣＩ−Ｆｃは、多発性骨髄腫(ＭＭ)及び／又は非ホジキンリンパ腫(ＭＨＬ)等の血液悪性腫瘍、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、並びにワルデンストロームマクログロブリン血症等の、癌の治療にも使用され得る。
【００８３】
本発明に基づいて、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質は、酵母、昆虫、又は哺乳類細胞等の、真核細胞発現系において生産され得て、グリコシル化ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を生じる。前記ＴＡＣＩ−Ｆｃの発現は、動物細胞等の哺乳類細胞、又はヒト細胞株中で発現させることが、最も好ましい。チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)、又はマウスミエローマ細胞株ＮＳＯは、精製されるべきＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質の発現に特に適した細胞株の例である。また、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質は、例えば、ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０、ヒト網膜芽細胞腫細胞株ＰＥＲＣ６、若しくはヒト胚性腎臓細胞株２９３等のヒト細胞株、又は、例えば欧州特許第1 230 354号に記載されるような、不変羊膜細胞 (permanent amniocyte) 細胞株中においても、良好に生産され得る。精製されるべきＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質がそれを分泌する細胞により発現されたとき、本発明に係る精製プロセスの開始時点の材料は、培養上清(採取物(harvest)又は粗製採取物(crude harvest)とも称される)である。前記細胞が、動物血清を含む培地中で培養されたとき、その細胞培養上清も、不純物として血清蛋白質を含む。
【００８４】
好ましくは、ＴＡＣＩ−Ｆｃを発現し、そして分泌する細胞は、無血清条件下で培養される。前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質は、また、化学的に定義された培地中でも生産され得る。この場合、本発明に係る精製プロセスの開始時点の材料は、主として宿主細胞のタンパク質を不純物として含む、無血清細胞培養上清である。前記培養培地に、例えばインスリン等の成長因子が添加されるとき、これらのタンパク質も同様に、精製プロセスの間に除去され得る。
【００８５】
本発明の第二の側面は、：
ａ)本発明に基づく精製プロセスにより、前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を精製し；そして
ｂ)前記ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を、医薬粗製物に製剤化する
工程を含む、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質を含む医薬組成物を製造する方法に指向する。
【００８６】
本発明の第三の側面は、ＴＡＣＩ−Ｆｃを精製するための、プロテインＡの油体の使用に指向する。
【００８７】
本発明を充分に記載してはいるが、当業者は、幅広いパラメーター、濃度及び状態の中で、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、そして必要以上の実験を要さず、本発明が遂行され得ることを認識し得る。
【００８８】
本発明は、それらの特定の態様に関連して記載されているが、更なる改変が可能であることが理解され得る。本発明は、一般に、本発明の本質に追随する、並びに、本発明に関連する技術分野内の知見又は慣行内にある程度の、及び上記の基本的な特徴を、添付された特許請求の範囲の範囲内に追随するように説明するために応用され得る程度の、本発明からの逸脱を含む発明の、任意的な変更、使用又は応用に及ぶことを意図する。
【００８９】
雑誌論文、又は要約、発行された、又は未発行の米国若しくはそれ以外の国の特許出願、米国又はそれ以外の国で設定登録された特許、又は他の任意的な参考文献を含む、本明細書中で引用された全ての参考文献は、その引用された参考文献中で提示された全てのデータ、表、図、及び文章を含む全てが、参照されることにより援用される。また、付加的に、本明細書中で引用された参考文献中で引用された参考文献の全ての内容も、参照されることにより援用される。
【００９０】
既知の方法の工程、慣用された方法の工程、既知の方法、又は慣用された方法への言及は、いかなる場合も、本発明の任意的な側面、記載、又は態様が、従来技術として開示され、議論され、又は主張されていると認めるものではない。
【００９１】
特定の態様について上に述べた記載は、他の者が、当該技術分野の中の知識(本明細書中で引用された参考文献の内容を含む)を適用することにより、必要以上の実験を要さず、本発明の一般的概念から逸脱せず、そのような特定の態様を様々な応用に容易に改変し、及び／又は適合させる程度に、本発明の一般的本質を完全に開示し得る。従って、そのような適合及び改変は、本明細書中に提示された教示及び誘導に基づき、開示された態様の等価物の範囲内にあることが意図される。本明細書中の言語表現及び専門用語は、本明細書中で提示された技術及び誘導を踏まえて、当業者の知識を組み合わせて、本明細書中の技術用語又は言語表現が、当業者により解釈することが出来る程度の記載を目的としており、限定を目的とするものではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００９２】
実施例１：油体を使用するＴＡＣＩ−Ｆｃの精製の手順
１．１．  使用前の油体の洗浄
油体StratoCapture(商標)は、SemBioSys Genetics Incから調達された。その油体は、最初に、チューブを穏やかに回転させることにより、それを含む溶液中に均一に再懸濁された。その油体溶液は、１００００ｘｇで１０分間遠心分離され、そしてプロテインＡの油体層から、その下層の水相が除去された。
【００９３】
前記油体は、ｐＨ７．０の２５ｍＭリン酸緩衝液を含む平衡化緩衝液中に、穏やかなピペッティング又は混和を使用して再懸濁された。添加された平衡化緩衝液の量は、先に除去された水相の量と同一であった。そして、その油体溶液は、１００００ｘｇで１０分間遠心分離され、そして油体層から、その下層の水相が除去された。この平衡化工程は、３回遂行された。
【００９４】
１．２．  油体へのＴＡＣＩ−Ｆｃの充填
油体を含む前記溶液は、乾燥重量の油体１ｍｇあたり約４ｍｇのＴＡＣＩ−Ｆｃの最終的な比率を得るように、未精製のＴＡＣＩ−Ｆｃを含むサンプルに添加された。精製されたヒトＩｇＧカッパーを含むサンプルは、ポジティブコントロールとして使用された。前記溶液は、転倒により、よく、しかし穏やかに混和された。そのチューブは、１００００ｘｇで１０分間遠心分離された。脂肪層(fat pad layer)を突き破るための針付きシリンジを使用して、下層浮遊物(undernatant)は、油体から除去され、そして捨てられた。
【００９５】
１．３．  洗浄工程
脂肪油体(fat pad oilbody)は、その脂肪油体の体積の等倍又は２倍に相当する量の洗浄緩衝液に、穏やかに再懸濁された。前記洗浄緩衝液は、ｐＨが７．０で、２５ｍＭのリン酸緩衝液を含んでいた。そのチューブは、１００００ｘｇで１０分間遠心分離された。脂肪層を突き破るための針付きシリンジを使用して、下層の水相は、油体から除去され、そして捨てられた。その水相は、０．２μｍで濾過され、そして等分された。この洗浄工程は、３回遂行された。
【００９６】
１．４  溶出工程
脂肪油体は、その脂肪油体の体積の等倍又は２倍に相当する量の、適切な量の溶出緩衝液に、再懸濁された。その溶出緩衝液は、ｐＨ３．５の２００ｍＭ酢酸塩緩衝液を含んでいた。そのチューブは、１００００ｘｇで１０分間遠心分離され、そして下層が、シリンジを使用して回収された。精製されたＴａｃｉ−Ｆｃを含む前記下層は、０．２μｍで濾過され、そして１ＭのＮａＯＨを使用して、ｐＨ７．０で中和された。この溶出工程は、３回遂行された。
【００９７】
１．５．  結果
結果は、マイクロ流体電気泳動(Caliper system)により解析され、そして、図２に示される。これらのマイクロ流体電気泳動の結果は、ＴＡＣＩ−Ｆｃが、上に記載した手順を使用して、効率的に精製されることを明示する。
【００９８】
実施例２：ＴＡＣＩ−Ｆｃの最適充填容量の判定
油体の充填容量は、最適化のために重要なパラメーターである。乾燥重量(ＤＷ)の油体(ＯＢ)のｍｇあたりのＴＡＣＩ−Ｆｃの充填量が多すぎるとき、ＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質は、油体に結合し得ず、そして「フロースルー」、即ち、ＴＡＣＩ−Ｆｃを含むサンプルの未結合フラクション中に逸失してしまう。フロースルー中に逸失した未結合ＴＡＣＩ−Ｆｃの％は、「ブレークスルー％」と称される。対照的に、ＤＷ ＯＢのｍｇあたりのＴＡＣＩ−Ｆｃの充填量が少なすぎるとき、高いパーセンテージの油体が、ＴＡＣＩタンパク質を全く付着させず、これにより、費用効率の悪いプロセスとなってしまう。従って、油体の最適な充填容積は、ＴＡＣＩ−Ｆｃのために判定された。
【００９９】
前記油体の充填容積は、油体上のＴＡＣＩ−Ｆｃの増加量を充填することにより判定された。プロセスの条件は、１．２．の項の乾燥重量の油体のｍｇに対するＴＡＣＩ−Ｆｃのｍｇの最終的な比率の値を除いて、実施例１に記載されている。充填容積は、未結合フラクション中のＴＡＣＩ−Ｆｃのレベルを測定することにより、判定された。その容積は、ＤＷ ＯＢのｍｇあたりのＴＡＣＩ−Ｆｃのｍｇで表現された。
【０１００】
その結果は、図３に示されている。このじっけんにより：
−  ０ブレークスルー％で実施されたとき、ＤＷ ＯＢのｍｇあたりＴＡＣＩ−Ｆｃを約４ｍｇまで充填され得て、
−  ５ブレークスルー％で実施されたとき、ＤＷ ＯＢのｍｇあたりＴＡＣＩ−Ｆｃを約５ｍｇまで(up till)充填され得て、
−  １０ブレークスルー％で実施されたとき、ＤＷ ＯＢのｍｇあたりＴＡＣＩ−Ｆｃを約５．５ｍｇまで充填され得ることを結論付けることが可能となる。
【０１０１】
実施例３：溶出工程の最適化
溶出工程の効率は、溶出緩衝液のｐＨを３．９〜２．５の範囲で変化させることにより、検証された。平衡化、充填および洗浄の条件は、実施例１に記載されたものと同一であった。その結果は、表５に提示されている。
【０１０２】
【表５】
2010516744.tif 000006
【０１０３】
表５において明示されているように、ｐＨの低下は、溶出時の収量には影響を与えないが、ＨＣＰのＨＣＰの除去率(clearance)を低下させる。
【０１０４】
表６は、油体とプロテインＡクロマトグラフィーとの、能力の比較を明示する。
【０１０５】
【表６】
2010516744.tif 000007
【０１０６】
結論としては、StratoCapture材料は、溶出に関して、プロテインＡクロマトグラフィーと比較して特異な挙動を示す。除去因子及び収量は、プロテインＡクロマトグラフィープロセスを使用したときよりも低い。しかし他方、油体は、プロテインＡクロマトグラフィーよりもＴＡＣＩ−Ｆｃダイマーに関する高い選択性(捕捉後フラクション中９６％)を示した。
【０１０７】
実施例４：解析方法
純化された回収物中のＴＡＣＩ−Ｆｃの濃度は、Biacore装置を使用して測定された。
【０１０８】
純化された回収物の凝集レベルは、プロテインＡサイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定された。
【０１０９】
溶出後フラクション中のＴＡＣＩ−Ｆｃ濃度及び凝集のレベルは、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー(SE-HPLC)により測定された。
【０１１０】
宿主細胞タンパク質(ＨＰＣ)のレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定された。
【０１１１】
マイクロ流体電気泳動は、Caliper LabChip（登録商標）９０システムを使用して遂行された。
【０１１２】
前記油体の乾燥重量は、以下のように測定された。最初に、定量皿が測定された。約０．３〜０．５ｍｌの油体サンプルが、定量皿に置かれた。皿と湿ったサンプルとの合計の質量が測定され、記録された。前記サンプルを載せた定量皿は、８０±５℃に設定された乾燥オーブン中に置かれた。４時間〜４日後、そのサンプルはオーブンにあったサンプルから取り出され、そして、定量皿と乾燥したサンプルとの合計の質量が測定された。そのサンプル皿はオーブンに戻され、もう３０分乾燥させられ、再び定量された。そのサンプルの重量が変化していなければ、その測定値は、油体の乾燥重量に対応する。重量が変化したときは、そのサンプルはもう３０分間オーブン中に置かれ、そして再定量された。これは、サンプルの重量が変化しなくなるまで繰り返された。
【０１１３】
全体の結果及び本発明に係る精製プロセスの利点
ＴＡＣＩ−Ｆｃは、本発明の枠内で展開される実験条件を使用して、油体に結合し、そして溶出される（実施例１を参照されたい)。最良の結果は：
−  乾燥重量の油体のグラムあたり５ｇのＴＡＣＩ−Ｆｃが充填され(実施例２を参照されたい)；そして
−  その油体が、ｐＨ約３．５で溶出される（実施例３を参照されたい)
ときに得られた。
【０１１４】
加えて、驚くべきことに、そして有利なことに、油体は、プロテインＡクロマトグラフィーよりも、よりＴＡＣＩ−Ｆｃダイマーの選択性が高い(捕捉後フラクション中９６％)ことが明示された。
【０１１５】
ＴＡＣＩ−ＦＣを精製するための油体技術の使用は、幾つかの理由において、伝統的なプロテインＡクロマトグラフィーよりも有利である。
【０１１６】
第一に、上述のように、プロテインＡの油体は、伝統的なプロテインＡクロマトグラフィーよりも、ＴＡＣＩ−Ｆｃダイマーに関して高い選択性を有することが明示された。(ｉ)ＴＡＣＩ−Ｆｃダイマーのみが医薬的に活性であり；そして(ｉｉ)ＴＡＣＩ−Ｆｃ凝集塊が免疫特性を示すことから、ＴＡＣＩ−Ｆｃがヒトへの投与を意図されているときは、この特性は甚だ有利である。
【０１１７】
第二に、所定の量のＴＡＣＩ−Ｆｃタンパク質の精製のためには、本油体技術は、プロテインＡクロマトグラフィー技術よりも顕著に安価である。実際に、コストモデルを使用したところ、プロテインＡの油体を含む精製プロセスの使用が有利であることが推定された。コストモデルによると、プロテインＡクロマトグラフィーのコストは、ＴＡＣＩ−Ｆｃのグラムあたり１３米ドルと推定された。これに対して、プロテインＡの油体を使用する精製のコストは、ＴＡＣＩ−Ｆｃのグラムあたり６．７５米ドルと推定された。
【０１１８】
第三に、本油体技術は、大量のＴＡＣＩ−Ｆｃの精製を準備しようとする場合に、伝統的なクロマトグラフィーよりも実際的である。実際に、油体は水に溶解せず、従ってStratoCaptureを使用する抗体タンパク質の捕捉は、単純な液体／液体抽出であるため、プロセスが簡便となる。
【０１１９】
要約すると、本油体技術は、資本集約的な、高価なバッチの、抗体のクロマトグラフィー精製プロセスを、使い捨ての試薬として、プロテインＡの油体を基礎とする、簡便で廉価なプロセスに転換させる可能性を提示する。
【０１２０】
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【図１Ａ】
2010516744.tif 000008
【図１Ｂ】
2010516744.tif 000009
【図２】
2010516744.tif 000010
【図３】
2010516744.tif 000011
【配列表】
2010516744000001.app
【国際調査報告】
2010516744.tif 000012
2010516744.tif 000013
2010516744.tif 000014