(57)【要約】  本発明は、細胞への核酸導入の道具として有用な多機能性の化合物である。また本発明は、該多機能性の化合物を使用するための方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉを含む化合物であって、
【化１】
2010504997.tif 000007
式中、ＡＡ１及びＡＡ２は１つ以上のアミノ酸を含み、（ＡＡ１）ｍ及び（ＡＡ２）ｎは同一又は互いに異なる配列であり；
ｍ及びｎは１〜５０の整数であり；そして、
Ｌは、中性アミノ基及びカチオン性アンモニウム基、並びにこれらの薬学的に許容できる塩、エステル及びアミドのうちの少なくとも１つを含む官能基を含むことを特徴とする化合物。
【請求項２】
（ＡＡ１）ｍ及び（ＡＡ２）ｎの少なくとも１つのアミノ酸が、システイン残基、ホモシステイン残基又はアミノ酸誘導体を含むチオール残基であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（ＡＡ１）ｍ及び（ＡＡ２）ｎの少なくとも１つのアミノ酸又は構造Ｌに疎水基が共有結合していることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
（ＡＡ１）ｍ及び（ＡＡ２）ｎの少なくとも１つのアミノ酸又は構造Ｌに標的基が結合していることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
式ＩＩを含む前記化合物であって、
【化２】
2010504997.tif 000008
式中、Ｒ１〜Ｒ８は、互いに独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アシル基、芳香族基又は疎水基を表し；
ＡＡ１及びＡＡ２は１個以上のアミノ酸であって、（ＡＡ１）ｙ及び（ＡＡ２）ｚは、同一又は互いに異なる配列であり；
ｙ及びｚは１〜５０の整数であり；そして、
Ｌは、中性アミノ基及びカチオン性アンモニウム基、並びにそれらの薬学的に許容できる塩、エステル及びアミドのうちの少なくとも１つを含む官能基を含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記構造Ｌが式ＩＩＩを含み、
【化３】
2010504997.tif 000009
式中、Ｒ９〜Ｒ１２は、互いに独立して、水素、アルキル基、アルケニル基又は芳香族基を表し；
Ｒ１３は、アルキルアミノ基又は少なくとも１つの芳香族アミノ基を含む官能基であり；そして、
ｏ、ｐ、ｑ、及びｒは、互いに独立して、１〜１０の整数であることを特徴とする請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記アルキルアミノ基が、式ＩＶ、Ｖ、又はＶＩを含み、
【化４】
2010504997.tif 000010
式中、Ｒ１４〜Ｒ２２は、互いに独立して、水素、アルキル基、疎水基又は窒素含有置換基を表し；
ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、及びｘは、１〜１０の整数であり；そして、
Ａは１〜５０の整数であることを特徴とする請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記芳香族アミノ基が、直接的又は間接的に芳香族基又は環構造に結合した１つ以上のアミノ基を含むことを特徴とする請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１〜Ｒ１２は水素であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ２であり、ｙ及びｚは０又は１であり、Ｒ１３は、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２又はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２であることを特徴とする請求項６に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１及びＲ３は疎水基であり、Ｒ２及びＲ４〜Ｒ１２は水素であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ２であり、ｙ及びｚは０又は１であり、Ｒ１３はＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２又はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２であることを特徴とする請求項６に記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物がＥＨＣＯ，ＳＨＣＯ又はＴＨＣＯであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
式ＶＩＩを含む化合物であって、
【化５】
2010504997.tif 000011
式中、Ｒ１〜Ｒ６は、互いに独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、芳香族基、又は疎水基を表し；
ＡＡ１及びＡＡ２は１個以上のアミノ酸であって、（ＡＡ１）ｙ及び（ＡＡ２）ｚは、同一又は互いに異なる配列であり；
ｙ及びｚは０〜５０の整数であり；
Ｒ２３及びＲ２４は、互いに独立して、水素又は標的基を表し；
Ｂは２〜１０，０００の整数であり；
Ｌは、中性アミノ基及びカチオン性アンモニウム基、並びにそれらの薬学的に許容できる塩、エステル及びアミドのうちの少なくとも１つを含む官能基を含むことを特徴とする化合物。
【請求項１３】
Ｌが１〜５０のプロトン化可能なアミノ又はアミン基を含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１つの項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｌが１〜５０のプロトン化可能なアミノ又はアミン基を含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１つの項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物にポリエチレングリコールが共有結合していることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１つの項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物に標的基がリンカーを介して共有結合していることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１つの項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記リンカーがポリアミノ酸基、ポリアルキレン基又はポリエチレングリコール基を含むことを特徴とする請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記標的基がペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片又はそれらの誘導体を含むことを特徴とする請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
前記標的基がＲＧＤペプチド又はボンベシンペプチドを含むことを特徴とする請求項１６に記載の化合物。
【請求項２０】
前記アミノ酸の少なくとも１つがヒスチジンを含むことを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１つの項に記載の化合物。
【請求項２１】
同一又は互いに異なる請求項１〜２０のいずれかの項に記載の化合物を、酸化剤の存在下で反応させることを含む工程で作製されたジスルフィドオリゴマー又は重合体。
【請求項２２】
核酸及び請求項１〜２１のいずれかの項に記載の１以上の化合物のキャリアを含むナノサイズ複合体。
【請求項２３】
さらに標的物質を含むことを特徴とする請求項２２に記載の複合体。
【請求項２４】
前記標的物質が、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片又はそれらの誘導体を含むことを特徴とする請求項２３に記載の複合体。
【請求項２５】
前記標的物質が、ＲＧＤペプチド又はボンベシンペプチドを含むことを特徴とする請求項２３に記載の複合体。
【請求項２６】
前記標的物質が、リンカーを介して前記ナノサイズ複合体に共有結合していることを特徴とする請求項２３に記載の複合体。
【請求項２７】
前記リンカーが、ポリアミノ酸基、ポリアルキレン基又はポリエチレングリコール基を含むことを特徴とする請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】
前記核酸が、自然の若しくは合成のオリゴヌクレオチド、自然の若しくは修飾／ブロックされたヌクレオチド／ヌクレオシド、ＤＮＡ若しくはその断片、又はＲＮＡ若しくはその断片を含むことを特徴とする請求項２２に記載の複合体。
【請求項２９】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする請求項２２に記載の複合体。
【請求項３０】
前記核酸が、プラスミドＤＮＡを含むことを特徴とする請求項２２に記載の複合体。
【請求項３１】
核酸と、請求項１〜２１のいずれかの項に記載の１以上の化合物のキャリアとを混合することを含む工程で作製された複合体。
【請求項３２】
ｐＨ５〜６で細胞膜が破壊されることを特徴とする請求項２２〜３１のいずれか１つの項に記載の複合体。
【請求項３３】
ｐＨ５〜５．５で細胞膜が破壊されることを特徴とする請求項２２〜３１のいずれか１つの項に記載の複合体。
【請求項３４】
細胞と請求項２２〜３３のいずれかの項に記載の複合体とが接触することを含み、該細胞に前記核酸が取り込まれることを特徴とする核酸を細胞に導入する方法。
【請求項３５】
前記接触が、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で起こることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記接触が、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で起こることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年９月２９日に出願された米国仮出願第６０／８２７，４４０号の優先権を主張する。この出願の全教示は、参照することにより全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
承認
本発明は、米国政府の補助金（国立衛生研究所の国立生物医学画像・生物工学研究所からの補助金ＥＢ０００４８９）を用いてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子治療は、治療目的の遺伝子を発現または制御するために、遺伝物質をヒト細胞内に導入することによって疾病を治療する新しいアプローチとして登場した。安全かつ効率的な遺伝子ベクター又はキャリアの開発は、核酸を用いた治療法が成功するための中心的な課題である。
【０００４】
核酸の導入システムは、ウイルス性の導入システムと非ウイルス性の導入システムに分類できる。ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルス等の弱毒ウイルスに基づいている。ウイルスベクターは、遺伝子をヒト細胞に導入し、発現させる点で高い効率性を有しており、研究開発において一般的なベクターである。しかしながら、ウイルスベクターの毒性、特に最近のＸ−ＳＣＩＤ患者での白血病の発症やウイルスベクターを用いた臨床試験での患者の死亡などの出来事によってウイルスベクターの臨床応用について著しい暗雲が投げかけられている。ウイルスベクターの毒性は、ウイルスベクターの不純物とウイルスベクターに対する宿主の免疫応答に関連している。そのうえ、ウイルスベクターは、１〜２回投与した後に宿主の免疫システムによってベクターに対する抗体ができるので、複数回の投与には適していない。
【０００５】
非ウイルス性の核酸導入システムにはウイルス性以外のすべてのシステムが含まれる。直接注入、流体力学的な導入、化学修飾、ペプチド、リポソーム、およびカチオン高分子を含む様々な非ウイルス性のアプローチが、例えばｓｉＲＮＡｓ等の核酸の導入に使用されてきた。ウイルス性の導入システムに比べて、これらの非ウイルス性のシステムは使用しやすく、大規模なスケールで容易に作製できる。最も重要なのは、それらには免疫原性がなく、宿主の免疫応答をほとんど刺激しないことである。現在利用可能な非ウイルス性導入システムの主な欠点は、標的細胞への核酸の導入効率が低いことである。その低い導入効率にもかかわらず、非ウイルス性導入システムは、安全性、非免疫原性、生産の容易さ、および低コストの面から一層好まれるようになっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
即ち、必要とされるものは、無毒であり、非免疫原性であり、導入プロセスの間の酵素分解から核酸を防御する導入キャリアである。また、その導入システムが体内から直ちに除去されることを防ぎ、標的組織や標的細胞に特異的に取り込まれ、作用部位の細胞内で核酸が迅速に放出されることが望まれる。本発明は、細胞へ核酸導入するためのキャリアとして有用な多機能性化合物である。本発明の多機能性導入システムは、現在の導入システムの短所の多くに対処している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、細胞へ核酸を導入するために有用な多機能性キャリア（ＭＦＣ）である。また本発明は、導入システムを使用するための方法である。本発明の効果の一部は、以下の説明に記載されており、一部はその記載から明らかであり、又は以下に記載される各実施形態によって知ることができる。後述する効果は、特に添付の特許請求の範囲で示される構成要素及び組み合わせによって理解され、達成される。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は単なる例示的なものであり、典型的なものであり、この説明により限定されるものではないと理解される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付図面は、以下に記載のいくつかの実施態様を例示する。
【図１】単量体の多機能性キャリアＴＨＣＯの合成スキームを示す図である。
【図２】本発明で作製されるいくつかのＭＦＣの構造を示す図である。
【図３】１以上のＮ／Ｐ比において、ＴＨＣＯがゲル内のＤＮＡの移動を遅延させたことを示す図である。
【図４】エルマン試薬、ＴＨＣＯ及びＴＨＣＯ／ＤＮＡ複合体によるＴＨＣＯの時間依存性酸化特性を示す図である。
【図５】ＴＨＣＯ及びＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体（Ｎ／Ｐ＝１０）の自動酸化特性を示す図である。
【図６】自動酸化とマレイミド反応の間のＴＨＣＯのチオール消費の競合を示す図である。
【図７】ＴＨＣＯ及びＰＥＩ濃度に対する相対的な細胞生存率（％）を示す図である。
【図８】ＤＯＴＡＰ及びＰＥＩと比較したＴＨＣＯのＵ８７細胞における細胞毒性を示す図である。
【図９】ペグ化された又はペグ化されてない蛍光タグを付加したＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体のＵ８７細胞内への取り込みを示す図である。ナノ粒子のペグ化は、非特異的な細胞取り込みを減少させる。
【図１０】他の市販のトランスフェクション試薬と比較したときのＴＨＣＯのトランスフェクション効率を示す図である。
【図１１】以下のトランスフェクション試薬：Ａ）ＴＨＣＯ；Ｂ）Ｔｒａｎｓｆａｓｔ（商標）；Ｃ）ＤＯＴＡＰを使用したときのＧＦＰ導入ＭＢＡ−２３１細胞の蛍光画像を示す図である。
【図１２】Ｕ８７−Ｌｕｃ細胞におけるＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｐ＝８）複合体が介在するルシフェラーゼ遺伝子抑制を示す図である（ｓｉＲＮＡ濃度は全て２０ｎＭに固定されている；Ｔｒａｎｓｆａｓｔ及びＤＯＴＡＰは対照として使用した）。抗Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ又は非特異的ｓｉＲＮＡを、Ａ：未修飾ＴＨＣＯ；Ｂ：０．５％ペグ化ＴＨＣＯ；Ｃ：２．５％ペグ化ＴＨＣＯ；Ｄ：Ｔｒａｎｓｆａｓｔ；又はＥ：ＤＯＴＡＰと複合し、得られたｓｉＲＮＡ複合体をＵ８７−Ｌｕｃ細胞と共にインキュベートし、次いで培養液を交換した。トランスフェクションの４４時間後にルシフェラーゼ活性を評価した。トランスフェクション試験は無血清培地（ａ）又は１０％ＦＢＳ培地（ｂ）において３連で実施した
【図１３】ＴＨＣＯ（Ａ）又はＴｒａｎｓｆａｓｔ（Ｂ）及び培地（Ｃ）の存在下で、ＨｅＬａ細胞を抗ラミンＡ／Ｃ  ｓｉＲＮＡと共にインキュベートしたことを示す図である。
【図１４】トランスフェクション試薬として、ＴＨＣＯ、ＰＥＩ、Ｔｒａｎｓｆａｓｔ及びＤＯＴＡＰを使用したルシフェラーゼ遺伝子抑制を示す図である。
【図１５】ＭＦＣの一般構造を示す図である。
【図１６】ＥＨＣＯを作製するための合成のプロトコールを示す図である。
【図１７】ｐＨ７．４、ｐＨ６．５及びｐＨ５．４において、ＭＦＣ（８．３μＭ）及びＤＯＴＡＰ（８．３μＭ）のそれぞれの溶血活性を示す図である。
【図１８】ＭＦＣとｓｉＲＮＡの複合体の粒子サイズを示す図である。（ａ）異なるＮ／Ｐ比におけるＥＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体のサイズ。（ｂ）８及び１０のＮ／Ｐ比におけるＭＦＣとｓｉＲＮＡ複合体のサイズ。
【図１９】エルマンアッセイにより測定されたチオール濃度に基づくｓｉＲＮＡの非存在又は存在下でのＥＨＣＯの自動酸化特性を示す図である。
【図２０】異なるＮ／Ｐ比におけるＵ８７−ｌｕｃ細胞でのＥＨＣＯが介する遺伝子抑制効果を示す図である。
【図２１】ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡ複合体と共にインキュベートした細胞のＵ８７−ｌｕｃ細胞おけるＭＦＣを介するルシフェラーゼ細胞抑制効果（棒グラフ）及び細胞生存率（折れ線グラフ）を示す図である。トランスフェクション実験は、１００ｎＭ（ａ）又は２０ｎＭ（ｂ）のｓｉＲＮＡ濃度で行った。
【図２２】Ｕ８７−ｌｕｃ異種移植片マウスにおけるＥＨＣＯ（ＭＦＣ）／抗Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ複合体のルシフェラーゼ発現のｉｎ  ｖｉｖｏでのノックダウン効果を示す図である。
【図２３】未投与対照マウス及び抗ＨＩＦ／ＥＨＣＯナノ粒子を投与されたマウス（各投与においてｓｉＲＮＡとして２ｍｇ／ｋｇの投与量）の腫瘍成長曲線を示す図である。
【図２４】第一、第二及び第三の荷電官能基を有するジチオール含有単量体の樹脂担持合成の合成を示す図である。
【図２５】酸化重合によるポリジスルフィドオリゴマー１１（ＰＤＳ）の合成を示す図である。
【図２６】示されたＮ／Ｐ比でのゲル電気泳動シフトアッセイを示す図である。
【図２７】示されたＮ／Ｐ比でのＰＤＳ／ＤＮＡ及びＰＤＳ／ｓｉＲＮＡ複合体の大きさを示す図である。
【図２８】（ａ）は、ＰＥＩとネイキッドＤＮＡとを比較した、異なったＮ／Ｐ比での１００μＭのクロロキン存在下又は非存在下におけるＣｏｓ７細胞中のＰＤＳ／ＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率を示す図である。（ｂ）は、異なった条件下におけるＵ３７３−Ｌｕｃ細胞中でのＰＤＳ／ｓｉＲＮＡ又はＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体による内因性のルシフェラーゼ遺伝子の抑制効果を示す図である。
【図２９】（ａ）はＰＤＳ及びＰＥＩ濃度に対する相対的な細胞生存率を示し、（ｂ）はＤＮＡ複合体のＰＤＳ及びＰＥＩのＮ／Ｐ比に対する相対的な細胞生存率を示す図である。カチオン性のＰＤＳはＰＥＩに比べてはるかに低い細胞毒性を示す。
【図３０】ＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌの合成を示す図である。
【図３１】ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌの合成を示す図である。
【図３２】マレイミドを含む機能的分子を用いたＭＦＣ／ｓｉＲＮＡ又はＭＦＣ／ＤＮＡナノ粒子の表面修飾を図式的に示す図である。
【図３３】標的基を有する（ＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ，２．５％程度修飾，Ａ〜Ｃ）又は標的基を有さない（ｍＰＥＧ−Ｍａｌ，２．５％程度修飾，Ｄ〜Ｆ）官能基を持つＥＨＣＯ／ＤＮＡナノ粒子の代表的な蛍光画像を示す図である。
【図３４】受容体関与エンドサイトーシスを介する標的ナノ粒子による細胞内取り込み効率（２．５％ＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾）が、非特異的なエンドサイトーシスを介する非修飾性のナノ粒子による細胞内取り込みと同等であり、ペグ化されたナノ粒子による細胞内取り込みよりも高いことを示す図である。ナノ粒子のペグ化は非特異的な細胞内取り込みを低下させる。
【図３５】標的ナノ粒子（２．５％ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾）による細胞内取り込みが、非標的性のナノ粒子（２．５％ｍＰＥＧ−Ｍａｌ修飾）による細胞内取り込みに比べて有意に高いことを示す図である。
【図３６】２．５％のＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾標的ナノ粒子を介した細胞内取り込み効率が、遊離のＲＧＤの存在下で減少することを示す図である。
【図３７】２．５％ペプチド修飾ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子（ＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ又はＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ）をマウスに静脈内投与した時間の経過に基づいたマウスの腫瘍の体積を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の化合物、組成及び方法を開示し説明するが、以下で説明する実施形態は、特定の化合物、合成方法又は用途に限定されるものではなく、当然に、様々であることが理解される。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態について説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解される。
【００１０】
この明細書と添付の特許請求の範囲において、下記の意味を有することが定義される多くの用語について示す。
この明細書と、添付の特許請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文中に特に明示のない限り、対象の複数形も含まれることに注意すべきである。したがって、例えば「医薬キャリア」という場合、そのようなキャリアの２種以上の混合物等が含まれる。
【００１１】
「任意の」又は「任意に」は、その後に記載する事又は状況が生じても、生じなくてもよいことを意味し、その記載は、その事又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。例えば「任意に低級アルキルを置換する」という句は、低級アルキルを置換しても置換しなくてもよいことを意味し、その記載は、置換されていない低級アルキルと置換された低級アルキルの両方を含む。
【００１２】
本明細書では「アルケニル基」という用語は、１つ以上のＣ＝Ｃ二重結合を有するＣ２−Ｃ２０アルキル基を定義する。
【００１３】
本明細書で使用される「アルキル基」という用語は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、デシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、エイコシル基、テトラコシル基等の炭素原子が１〜２５の分岐又は非分岐の飽和炭化水素基である。「低級アルキル」基は、１〜６の炭素原子を含むアルキル基である。
【００１４】
本明細書で使用される「アシル」基という用語は、式Ｃ（Ｏ）Ｒで表される。式中、Ｒは、例えば、本明細書に定義されるアルキル基又は芳香族基等の有機基である。
【００１５】
本明細書で使用される「アルキレン基」という用語は、相互に結合する２つ以上のＣＨ２基を有する官能基である。アルキレン基は、式−（ＣＨ２）ａ−で表すことができる。式中、ａは２〜２５の整数である。
【００１６】
本明細書で使用される「芳香族基」という用語は、これには限定されないが、ベンゼン基、ナフタリン基等を含む芳香族基を有する官能基である。また「芳香族」という用語は、その芳香族基の環に導入された少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基と定義される「ヘテロアリール基」を含む。ヘテロ原子の例としては、窒素、酸素、硫黄及びりんを含むが、これに限定されない。アリール基は、置換されていても置換されていなくてもよい。アリール基は、これには限定されないが、アルキル基、アルキニル基、アルケニル基、アリール基、ハロゲン基、ニトロ基、アミノ基、エステル基、ケトン基、アルデヒド基、水酸基、カルボン酸基又はアルコキシル基を含む１以上の官能基で置換することができる。
【００１７】
本明細書では「窒素含有置換基」という用語は、アミノ基と定義される。本明細書では「アミノ基」という用語は、第一級、第二級又は第三級アミノ基と定義される。あるいは、窒素含有置換基は、第四級アンモニウム基であってもよい。窒素含有置換基は、窒素原子が環の一部であるか、又は環に直接的に、若しくは１以上の原子を経て間接的に（すなわち、ペンダント型）結合している芳香族基又脂環基であってもよい。窒素含有置換基は、式−Ｒ−ＮＨ２を有するアルキルアミノ基であってもよい。式中、Ｒは、分岐又は直鎖のアルキル基であり、アミノ基は置換されていても置換されていなくてもよい。
【００１８】
本明細書を通して使用されるＡＡ１，ＡＡ２，Ａ，Ｂ，Ｌ，Ｒ，Ｒ１−Ｒ２４，ａ，ｂ，ｄ，ｍ，ｎ，ｏ，ｐ，ｑ，ｒ，ｓ，ｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，ｙ及びｚ等の変数は、そうでない旨が示されない限り、それ以前に定義された変数と同じである。
【００１９】
Ｉ．多機能性キャリア及びその作製方法
本発明は、細胞へ核酸を導入するために有用な多機能性キャリア化合物である。本発明の化合物は、核酸を効率的に細胞に導入できるキャリアをまとめて生産する様々な官能基を有する。それぞれの官能基について以下に議論する。
【００２０】
本発明の一実施形態は、式Ｉを含む化合物である。
【００２１】
【化１】
2010504997.tif 000002
【００２２】
式中、ＡＡ１及びＡＡ２は１つ以上のアミノ酸を含み、（ＡＡ１）ｍ及び（ＡＡ２）ｎは同一又は異なる配列である。
ｍ及びｎは１〜５０の整数である。そして、
Ｌは、少なくとも１つの中性アミノ基若しくはカチオン性アンモニウム基、又はそれらの薬学的に許容できる塩、エステル若しくはアミドを含む官能基を含む。
【００２３】
アミノ酸ＡＡ１及びＡＡ２は、１個のアミノ酸であっても、配列を形成する複数のアミノ酸であってもよい。一般に、個々のアミノ酸が、アミド結合（−ＮＣ（Ｏ）−）を介して互いに結合する。式Ｉに示すように、リンカーＬに結合するカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）は、ＡＡ１とＡＡ２の末端アミノ酸のカルボン酸に由来する。これは以下のアミノ酸配列で表される：ＡＡａＡＡｂＡＡｃＡＡｄＡＡｅ−ＣＯＯＨ，ここではカルボン酸基がアミノ酸ＡＡｅ上に存在する。アミノ酸ＡＡ１とＡＡ２は同一又は異なるアミノ酸配列で構成される。複数のアミノ酸がＡＡ１とＡＡ２に用いられる場合、そのアミノ酸の数は細胞に核酸を導入するメカニズムによって異なる。１つの実施形態では、式Ｉのｍ及びｎが１〜５０の整数である。理論に拘束されることなく、そのアミノ酸配列は、ｐＨ緩衝物質、核酸複合体形成物質、両親媒性物質、重合性の単量体、受容体結合物質として作用し、細胞内への取り込みを促進させ、一旦、細胞内での生物活性物質の放出を容易にすることができる。
【００２４】
１つの実施形態では、式Ｉを有する化合物には、少なくとも１つのチオール基（ＳＨ基）が含まれる。例えば、（ＡＡ１）ｍと（ＡＡ２）ｎのアミノ酸のひとつは、システイン残基、ホモシステイン残基、又はアミノ酸誘導体を含むチオール残基である。また（ＡＡ１）ｍと（ＡＡ２）ｎの１以上のアミノ酸では、チオール基をその配列中に導入するという誘導体化ができることも考えられる。当該技術分野で公知の技術を用いて、チオール基を含む化合物でアミノ酸内に存在する官能基を反応させることは可能である。以下で議論されるように、ナノ粒子を生産するために、核酸が式Ｉを有する化合物と一旦複合体をつくった後、チオール基が酸化によってジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合をつくり、オリゴマーやポリマーを形成するか、又は架橋結合することによって、ナノ粒子がさらに安定できる。ジスルフィド結合は細胞質内で還元し、導入システムからの核酸の放出が促進される。
【００２５】
構造Ｌは、少なくとも１つのアミノ基を含む。「アミノ基」という用語には、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、及び／又は、芳香族アミノ基、及び／又は、第４級アンモニウム基が含まれる。アミノ基は中性又はカチオン性であってもよい。例えば、第４級アンモニウム基（カチオン性）をつくるために、アミノ基はプロトン化されるかアルキル化剤で処理される。置換されたアミノ基の場合、適切な官能基には本明細書に定義されたアルキル基と芳香族基が含まれる。１つの実施形態では、構造Ｌには複数のアミノ基が存在している。１つの実施形態では、アミノ基はアルキレン鎖の一部であり、そこでは１つ以上の炭素原子が窒素で置換されている。１つの実施形態では、アミノ基がアルキレン鎖につりさげられている。当該技術分野で公知の技術を使用して、アミノ基を用いて様々な構造を合成することが可能である。Ｌの構造は、細胞に導入する核酸の特性に基づいて変えることができる。Ｌの適切な官能基の例について以下に説明する。理論に拘束されることなく、構造Ｌは、核酸を細胞へ導入することを目的としたナノ粒子を形成するために核酸との複合体を形成する。
【００２６】
ある実施形態では、（ＡＡ１）ｍと（ＡＡ２）ｎの少なくとも１つのアミノ酸に疎水基が共有結合している。あるいは、その疎水基は構造Ｌと結合してもよい。その疎水基は、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ２５脂肪酸（ＲＣＯＯＨ，式中Ｒは、Ｃ１−Ｃ２５アルキル基又はアルキレン基）又はＣ１−Ｃ２５アルキル基又はアルキレン基に由来していてもよい。あるいは、その疎水基はステロイド化合物又は芳香族化合物に由来していてもよい。１つの実施形態では、（ＡＡ１）ｍと（ＡＡ２）ｎに存在する１つ以上のアミノ基は、それに結合している疎水基を有する。理論に拘束されることなく、その疎水基は、核酸とナノ粒子のコンパクトで安定な形成を助け、両親媒性を導入し、エンドソーム小器官又はリソソーム小器官からのナノ粒子のｐＨ感受性の回避を容易にする。化合物がｉｎ  ｖｉｖｏでの導入装置として用いられる場合、これは特に有用である。
【００２７】
別の実施形態では、標的基が（ＡＡ１）ｍと（ＡＡ２）ｎの少なくとも１つのアミノ酸、カチオン性の構造Ｌ又はチオール基に結合している。標的物質は、細胞への核酸導入に有用であってもよい。標的物質は、ペプチド、抗体、抗体断片又はそれらの誘導体のひとつであってもよい。例えば、標的特異的ペプチドは、ナノ粒子の形成前か形成中に化合物と直接的に結合するか、第二のリンカー（例えば、ポリエチレングリコール）を介して間接的に結合することができる。標的化合物を選ぶことにより、標的基はアミノ酸に存在するアミノ基、若しくはチオール基、又は構造Ｌに存在するアミノ基のいずれかに共有結合できる。
【００２８】
１つの実施形態では、標的基はリンカーによって間接的に化合物に結合する。リンカーの例には、ポリアミン基、ポリアルキレン基、ポリアミノ酸基又はポリエチレングリコール基が含まれるが、これに限定されない。リンカーの分子量やリンカーの選択は所望の特性によって変えることができる。１つの実施形態では、リンカーは、分子量が５００〜１０，０００、５００〜９，０００、５００〜８，０００、５００〜７，０００又は２，０００〜５，０００のポリエチレングリコールである。ある実施形態では、標的基がリンカーに共有結合するなどの方法によって、最初に標的基がリンカーと反応する。例えば、そのリンカーには、ペプチド内に存在するアミノ基と反応できる１つ以上の官能基があってもよい。また、そのリンカーには、本明細書に記載された化合物と反応し、共有結合を形成する付加基がある。例えば、化合物に１つ以上のチオール基が存在している場合、リンカーはそのチオール基と容易に反応できるマレイミド基を有していてもよい。化合物に存在する官能基によって、リンカーに存在する官能基の選択を変えることができる。１つの実施形態では、標的化合物は、例えばポリエチレングリコールと共有結合しているＲＧＤペプチド又はボンベシンペプチドなどのペプチドである。
【００２９】
また、他の実施形態では、本明細書に記載された化合物によって作製されたナノ粒子に標的化合物を結合することも望ましい。例えば、本明細書に記載された化合物と技術を用いて核酸からできたナノ粒子を作製した後に、リンカーを介して標的化合物をナノ粒子に結合することができる。このアプローチの１つの実施形態を図３２に示す。
【００３０】
１つの実施形態では、式Ｉによって表わされる化合物は、式ＩＩを含む。
【００３１】
【化２】
2010504997.tif 000003
【００３２】
式中、Ｒ１−Ｒ８は、互いに独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、アシル基、芳香族基、又は疎水基を表す。
ＡＡ１とＡＡ２は１個以上のアミノ酸であり、（ＡＡ１）ｙと（ＡＡ２）ｚは、同一又は異なる配列である。
ｙ及びｚは１〜５０の整数である。そして、
Ｌは、少なくとも１つの中性アミノ基若しくはカチオン性アンモニウム基、又はそれらの薬学的に許容できる塩、エステル若しくはアミドを含む官能基を含む。
【００３３】
式ＩＩに示すように、化合物のそれぞれの末端はシステイン残基でキャッピングされている。特にＡＡ１とＡＡ２が他のシステイン残基を含んでいる場合、他のチオール基が式ＩＩに存在し得ることが想定される。
【００３４】
１つの実施形態では、構造Ｌは式ＩＩＩを含む。
【００３５】
【化３】
2010504997.tif 000004
【００３６】
式中、Ｒ９−Ｒ１２は、互いに独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、芳香族基を表す。
Ｒ１３は、アルキルアミノ基又は少なくとも１つの芳香族アミノ基を含む官能基であり、
ｏ、ｐ、ｑ、及びｒは、互いに独立して、１〜１０の整数である。
アルキルアミノ基の例を、式ＩＶ〜ＶＩに示す。
【００３７】
【化４】
2010504997.tif 000005
【００３８】
式中、Ｒ１４−Ｒ２２は、互いに独立して、水素、アルキル基、窒素含有置換基、又は疎水基を表す。
ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、及びｘは、１〜１０の整数であり、
Ａは１〜５０の整数である。
【００３９】
式ＩＶ〜ＶＩに示されるように、アミノ基の数は異なっていてもよい。１つの実施形態では、式ＩＩＩのＲ１３は、ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，又は、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｄＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（式中、ｄは０〜５）である。
【００４０】
１つの実施形態では、Ｒ１３は芳香族アミノ基を含む。上述のように、芳香族アミノ基には、直接的又は間接的に芳香族基に結合した１つ以上のアミノ基が含まれていてもよい。あるいは、アミノ基を芳香族環に導入することもできる。例えば、芳香族アミノ基は、ピロール、イソピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、又はインドールである。別の実施形態では、芳香族アミノ基には、ヒスチジンに存在するイミダゾール基が含まれる。
【００４１】
１つの実施形態では、化合物には式ＩＩが含まれ、Ｌには式ＩＩＩで表される構造が含まれる。式中、Ｒ１−Ｒ１２は水素であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ２であり、ｙとｚは０であり、Ｒ１３はＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。別の実施形態では、化合物には式ＩＩが含まれ、Ｌには式ＩＩＩで表される構造が含まれる。式中、Ｒ１とＲ３は疎水基であり、Ｒ２とＲ４−Ｒ１２は水素であり、ｏ、ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ２であり、ｙとｚは０又は１であり、Ｒ１３はＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２又はＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。
【００４２】
一般式Ｉが含まれる化合物は、当該分野で公知の固相技術を用いて合成できる。図１にジチオール化合物を生成するための合成方法の例を示す。図１のアプローチには、一般的に、ジチオール化合物を生成するための系統的な保護／伸張／脱保護の操作が含まれる。疎水基は、システイン残基に存在するアミノ基とオレイン酸を反応させることによって作られる。図１は式Ｉの化合物を作製するための１つのアプローチを示すが、他の合成技術も使用できる。
【００４３】
式Ｉを含む化合物は、酸化条件下でジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成できる２つ以上のチオール基を持っている。１つの実施形態では、そのジスルフィド化合物には式ＶＩＩが含まれる。
【００４４】
【化５】
2010504997.tif 000006
【００４５】
式中、Ｒ１−Ｒ６は、互いに独立して、水素、アルキル基、アルケニル基、芳香族基、又は疎水基を表す。
ＡＡ１とＡＡ２は１個以上のアミノ酸であり、（ＡＡ１）ｙと（ＡＡ２）ｚは、同一又は異なる配列である。
ｙ及びｚは０〜５０の整数である。
Ｒ２３とＲ２４は、互いに独立して、水素又は標的基を表す。
Ｂは２〜１０，０００の整数である。
Ｌは、少なくとも１つの中性アミノ基若しくはカチオン性アンモニウム基、又はそれらの薬学的に許容できる塩、エステル若しくはアミドを含む官能基を含む。
【００４６】
一旦、細胞内に入ると、ジスルフィド結合は導入システムを安定化させ、核酸の遊離を助ける。例えば、核酸がｓｉＲＮＡである場合には、還元性の細胞質内でのｓｉＲＮＡ遊離システムのジスルフィド結合の解離によって、ｓｉＲＮＡの細胞質特異的遊離が促進され得る。そのジスルフィド化合物は、非常に低い遊離チオール濃度（例えば、１５μＭ）では細胞質内で安定である。ジスルフィド化合物が標的細胞に導入されたときに、核酸の解離と遊離を促進するためにジスルフィド結合が、細胞（例えば、細胞質）内に存在する高濃度のチオールによって還元される。
【００４７】
式ＶＩＩを含むジスルフィド化合物は、核酸との複合体形成前又は酸化剤の存在下での複合体形成中に、式Ｉを有する同一又は異なる化合物と反応することによって容易に作製され得る。酸化剤は、空気、酸素又は他の化学酸化剤であってもよい。選択されたジチオール化合物及び酸化条件によって、核酸と結合していない遊離のポリマー又は核酸との複合体内のジスルフィド形成の程度を変えることができる。即ち、式Ｉを含む化合物は単量体であり、その単量体は反応条件によって二量体化、オリゴマー化又は重合化することができる。
【００４８】
本明細書に記載された化合物はすべて存在し、その塩に変換することもできる。ある実施形態では、その塩は薬学的に許容できる塩である。化学的又は薬学的に許容できる適量の塩基に遊離酸を処理することによって、その塩を作製することができる。代表的な化学的又は薬学的に許容できる塩基とは、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、消石灰、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、亜鉛水酸化物、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジン等である。１つの実施形態では、その反応は、室温などの約０℃〜約１００℃の温度で、単独の又は水溶性の不活性有機溶媒と組み合わせた水中で行われる。使用される塩基に対する化合物のモル比は、いずれの特定の塩のためにも、目的の比率を提供するように選択される。例えば、出発物質である遊離酸のアンモニウム塩を作製するために、ほぼ同量の塩基で出発物質を処理して塩を作製することができる。
【００４９】
別の実施形態では、本明細書に記載された化合物はすべて存在し、ルイス塩基を有する塩にも変換できる。化合物は適量のルイス塩基で処理できる。代表的なルイス塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、消石灰、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、亜鉛水酸化物、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジン、ＴＨＦ、エーテル、チオール試薬、アルコール類、チオールエーテル類、カルボン酸エステル類、フェノラート類、アルコキシド類及び水などである。１つの実施形態では、その反応は、室温などの約０℃〜約１００℃の温度で、単独の又は水溶性の不活性有機溶媒と組み合わせた水中で行われる。使用される塩基に対する化合物のモル比は、いずれの特定の複合体のためにも、目的の比率を提供するように選択される。例えば、出発物質である遊離酸のアンモニウム塩は、複合体を作製するためにほぼ同量の化学的又は薬学的に許容できるルイス塩基で処理することができる。
【００５０】
その化合物がカルボン酸基を有する場合、当該技術分野で公知の技術を用いて、これらの官能基を薬学的に許容できるエステル類又はアミド類に変換できる。もしくは、デンドリマーにエステルが存在する場合、エステル交換反応技術を用いてそのエステルは薬学的に許容できるエステルに変換できる。
【００５１】
ＩＩ．使用方法
本明細書に記載された化合物は、対象物への核酸導入に関して多くの応用性を有する。他の実施形態では、本明細書に記載された化合物は、細胞と組織に遺伝性物質を導入する遺伝子治療に使用できる。
【００５２】
核酸は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。本発明の方法で導入される核酸は、自然界で発生する細胞から得た核酸、組換えによって作製された核酸、化学的に合成された核酸など、いずれの供給源からの核酸でもよい。その核酸は、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は自然界に存在するＤＮＡの核酸配列に対応する配列を有する合成ＤＮＡであってもよい。また、その核酸は、変異又は変換された核酸（例えば、１個以上の核酸残基の変換、欠失、置換、付加によって自然界で発生するＤＮＡと異なるＤＮＡ）又は自然では発生しない核酸であってもよい。
【００５３】
１つの実施形態では、その核酸は機能的な核酸であってもよい。機能的な核酸とは、標的分子と結合する、又は特異的な反応を促進する等の特異的な機能を有する核酸分子である。機能的な核酸分子は、以下のカテゴリに分けることができるが、これは限定を意図するものではない。例えば、機能的な核酸には、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三本鎖形成分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及び外部誘導配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が含まれる。その機能的な核酸分子は、標的分子が有する特異的活性の作動因子、阻害因子、制御因子、及び刺激因子として作用できるか、又はその機能的な核酸分子は他の分子に関係なくｄｅ  ｎｏｖｏ活性を有することができる。
【００５４】
機能的な核酸は、優位に作用する合成遺伝因子（ＳＧＥｓ）をコードする小遺伝子断片であってもよい。例えば、それが仲介する遺伝子の機能を阻害する分子（アンタゴニスト）であるか、又はそれらの遺伝子が優位に構成的に作用する断片（アゴニスト）である。ＳＧＥｓはポリペプチド、抑制性アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、核酸デコイ、及び小ペプチドを含むが、これに限定されない。本発明では、参照することにより組み込まれた米国特許公報第２００３／０２２８６０１号で開示された小遺伝子断片とＳＧＥライブラリを使用できる。
【００５５】
本発明の方法における機能的な核酸は、例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ又はデコイ機能によって核酸レベルで内因性の遺伝子機能を阻害するように作用することができる。もしくは、ある機能的な核酸は、内因性遺伝子に対応する生物活性の一部分以上を持つポリペプチドをコードすることによって内因性遺伝子の作用を促進する（模倣も含む）ように働くことができ、特別な場合には構成的に活性化されることがある。
【００５６】
Tso,P.らがAnnals New York Acad. Sci. 570:220-241 (1987) に記載するように、他の治療上重要な核酸は、遺伝子産物の除去又は抑制のために有用なアンチセンスポリヌクレオチド配列を含んでいる。また、リボザイムの導入も想定される。これらのアンチセンスヌクレオチドやリボザイムは導入細胞で発現（複製）することができる。また、本発明で治療のために有用なポリヌクレオチドは、免疫付与ポリペプチドをコードしていてもよい。そのポリペプチドは体液性又は細胞性、又はその両方の反応を引き起こす内因性の免疫原として作用することができる。また、本発明で使用するポリヌクレオチドは抗体もコード化できる。この点で、「抗体」という用語は、２つ又は複数の抗原又はエピトープに特異的なあらゆるクラスの免疫グロブリン、キメラ抗体及びハイブリッド抗体、及びＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ２、Ｆａｂなどのハイブリッド断片を含む断片を網羅する。また、そのような断片の複合体や、例えば、その内容が参照することにより本明細書に組み込まれた米国特許公報第４，７０４，６９２号に記載のようないわゆる抗原結合タンパク質（単鎖抗体）も「抗体」の意味に含まれる。
【００５７】
１つの実施形態では、核酸はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは約２０〜２５個のヌクレオチドを有する二本鎖のＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡｓ）であり、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素Ｄｉｃｅｒによって長鎖ＲＮＡが細胞内で切断されることによって生産される。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を特異的に組み込んでおり、相補配列を含む標的のｍＲＮＡを破壊するためにそのＲＮＡｉ機能が発揮される。ＲＮＡｉの機能はヌクレオチド塩基対の相互作用に基づくため、すべての重要な遺伝子を標的に作製できるため、ｓｉＲＮＡは遺伝子抑制による疾病治療のための理想的なツールとなる。ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子抑制は、新しい治療法としてヒトの疾病の治療に大きな可能性を有する。様々な治療を目的として多くのｓｉＲＮＡが設計され、報告されており、いくつかのｓｉＲＮＡがヒトの疾病に関連する特異的で効果的な遺伝子を抑制することが証明されている。ｓｉＲＮＡの治療への応用には、抗ウイルス療法、眼疾患の抗血管新生療法、自己免疫疾患や神経障害の治療、及び抗癌療法におけるウイルス遺伝子の発現及び複製の阻害が含まれるが、これに限定されない。遺伝子抑制による治療は哺乳動物で証明されており、ｓｉＲＮＡの臨床応用にとって好ましいことである。ｓｉＲＮＡはヒトゲノムのあらゆる遺伝子を標的にすることができるため、ＲＮＡｉにはヒトの疾病を治療するための無限の可能性があると信じられている。
【００５８】
核酸に化合物又はそれに対応するジスルフィドオリゴマー若しくは重合体を混合することによって、その核酸は本明細書に記載されたキャリア化合物として複合体化することができる。本明細書に記載された化合物に存在するアミノ基をカチオン基に変換するために反応のｐＨが変更できる。例えば、アミノ基をプロトン化するためにｐＨを調整できる。化合物のカチオン基の存在により、核酸はその化合物に静電的に結合できる（すなわち、複合体化できる）。１つの実施形態では、ｐＨは１〜７．４である。別の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は０．５〜１００である。なお、Ｎは正帯電を形成する化合物に存在する窒素原子の数であり、Ｐは核酸に存在するリン酸基の数である。したがって、構造Ｌの適当な数のアミノ基で化合物を修飾することによって、核酸と化合物の結合を調節（例えば、結合のタイプや強さ）することが可能である。１つの実施形態では、核酸／キャリア複合体はナノ粒子である。１つの実施形態では、ナノ粒子の直径は、約１０００ナノメートル以下である。
【００５９】
他の実施形態では、本明細書に記載された化合物は、作製された核酸ナノ粒子が、エンドソーム小器官及び／又はリソゾーム小器官のエンドソーム−リソゾーム内のｐＨを回避するようにデザインできる。例えば、核酸とナノ粒子を形成する化合物では、その構造及び両親媒性がエンドゾーム−リソゾームｐＨ（５．０〜６．０）で変化し、エンドゾーム−リソゾーム膜を破壊して、細胞質にナノ粒子が入ることができるようにデザインできる。１つの実施形態では、プロトン化可能なアミンと親油基（疎水基）の構造と数を変えることによりｐＨ感受性のあるそれらの両親媒性を変更することによって、本明細書に記載された化合物の特定のエンドゾーム−リソゾーム膜破壊の能力を調節できる。例えば、プロトン化可能なアミノ基の数を減少させることによって、中性ｐＨの化合物で作製されたナノ粒子の両親媒性を減少させることができる。１つの実施形態では、本明細書の化合物は、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、又は２つのプロトン化可能なアミノ基、置換アミノ基又は芳香族アミノ基を有する。例えば、アミノ基及び／又は置換アミノ基及び／又はイミダゾリルアミノ基は、式Ｉ、ＩＩ又はＶＩＩのリンカーＬに存在してもよい。１つの実施形態では、本明細書に記載された化合物は、少なくとも１つのヒスチジン残基を含んでいる。他の実施形態では、その化合物は、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のヒスチジン残基を含んでいる。したがって、ナノ粒子全体のｐＫａを微調整するために、化合物とその化合物によって作られたナノ粒子のｐＨ感受性のある両親媒性を使用することができる。生理的なｐＨにおけるナノ粒子の低い両親媒性は、核酸／ＭＦＣシステムの非特異的な細胞膜破壊と非特異的な組織取り込みを最小にすることができる。ある実施形態では、そのキャリアは、生理的なｐＨでの低い両親媒性とエンドゾーム−リソゾームｐＨでの高い両親媒性を持っており、それだけがナノ粒子で選択的なエンドゾーム−リソゾーム膜破壊を引き起こすことが好ましい。
【００６０】
例えば、生体内での非特異的な組織内への取り込みを減少させるためにナノ粒子の重合されていない遊離チオールの反応によりポリエチレングリコールを共有結合で導入することによって、ナノ粒子複合体の表面を修飾することができる。例えば、ＰＥＧ−マレイミドは遊離チオール基と迅速に反応する。キャリアに付与するために求められる親水性量によってＰＥＧの分子量は変更することができる。また、キャリアのＰＥＧ修飾によって、細胞への取込みによる酵素分解（例えば、エンドヌクレアーゼ）から核酸で作られたナノ粒子を保護できる。また、遺伝物質の標的細胞への導入特異性と効率性を高めるために、複合体の作製時に、ペプチド、タンパク質、抗体又は抗体断片を含む標的物質をナノ粒子複合体に導入することができる。ナノ粒子複合体に標的物質を結合するスペーサーとしてポリエチレングリコールを使用できる。
【００６１】
細胞に核酸を導入するために本明細書に記載された化合物を使用できる。その方法には一般的に複合体を細胞に接触することを含む。そこでは、核酸は細胞の中に取り込まれる。１つの実施形態では、本明細書に記載された化合物は、遺伝病を治療するのに不十分あるいは不足している遺伝子産物を供給すること又は遺伝子発現を抑制することによって、遺伝病の治療としてＤＮＡ又はＲＮＡの導入を促進することができる。当該分野で公知の技術は、本明細書に記載された核酸を細胞に導入するための化合物の効果を評価するために使用できる。
【００６２】
本明細書で使用される「細胞」という用語は、十分に特徴付けられ、均質で、生物的に純粋な細胞集団についていうことを意図する。これらの細胞は、初代細胞、腫瘍細胞若しくは当該分野で公知の方法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで不死化された真核生物細胞又は原核細胞であってもよい。細胞株や宿主細胞は、哺乳動物起源のものが好ましいが、植物、昆虫、酵母、カビ又は細菌を含む非哺乳動物起源の細胞株や宿主細胞も使用することができる。
【００６３】
１つの実施形態では、細胞は幹細胞、分化増殖能を獲得した幹細胞、分化細胞、初代細胞、及び腫瘍細胞を含む。幹細胞の例は、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、及び臍帯幹細胞を含むが、これに限定されない。様々な実施例で用いられる細胞の他の例は、骨芽細胞、筋芽細胞、神経芽細胞、繊維芽細胞、グリア芽細胞、生殖細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、角化細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、結合組織細胞、グリア細胞、上皮細胞、内皮細胞、ホルモン分泌細胞、免疫システムの細胞、及びニューロンを含むが、これに限定されない。
【００６４】
また本発明では、腫瘍細胞などの異型細胞又は異常細胞を使用できる。本明細書に記載された物質で培養された腫瘍細胞は、薬物治療を評価するための体内の自然な腫瘍環境をより正確に再現できる。本明細書に記載された物質での腫瘍細胞の増殖は、腫瘍特異的な薬物の開発を可能にする生体内様の環境での遺伝子発現、受容体発現、及びポリペプチド産生を含む生化学的経路の特徴付け及び腫瘍の活性化を促進することができる。
【００６５】
当該技術分野で公知の技術を使用することにより、上述の複合体（すなわち、ナノ粒子）を対象物に投与することができる。例えば、医薬組成物は複合体を用いて調製できる。特定のケースにおける実際に好ましい複合体の量は、利用される特定の化合物、調製される特定の組成物、その応用方法及び治療される特定の部位や対象物に従って変わることが理解される。投与される受給者のための用量は、従来の考えを用いて決定できる。例えば、対象化合物と既知の薬物の活性の違いの通常の比較や、例えば、従来の適切な薬理学的プロトコールの手段によるものである。医薬化合物の投与量を決定する当業者である医師及び医薬調製者が、標準的な推奨に従って投与量を決定することに全く問題はない。(Physicians Desk Reference, Barnhart Publishing (1999))
【００６６】
本明細書に記載された医薬組成物は、生物学的システムや生物学的存在が許容できるすべての賦形剤中に製剤化できる。そのような賦形剤の例は水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、及び他の生理的なバランスの塩の水溶液を含むが、これに限定されない。また、不揮発性油、オリーブ油若しくは胡麻油等の植物油、トリグリセリド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エチルオレイン酸等の注射可能な有機エステルなどの非水性の溶媒も使用できる。他の有用な製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランなどの粘度を上げる物質を含む懸濁液を含む。また、賦形剤は等張性や化学的安定性を高める物質などの少量の添加物も含むことができる。緩衝液の例は、リン酸緩衝液、重炭酸塩緩衝液及びトリス緩衝液を含み、防腐剤の例はチメロサール、クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールを含む。
【００６７】
医薬品のキャリアは、当業者に公知のものである。これらの最も典型的なものは、ヒトへ投与するための標準的キャリアであり、これらには滅菌水、生理食塩水、生理的ｐＨ緩衝液などの溶液が含まれる。
【００６８】
医薬品を導入するために意図する分子は、医薬品組成で製剤化できる。医薬品組成には選択された分子に加えてキャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤及び界面活性剤などを含むことができる。また、医薬品組成には、抗菌薬、抗炎症薬及び麻酔薬など、１種以上の活性成分を含むことができる。
【００６９】
医薬品組成物は、局所投与と全身投与のどちらが目的であるか治療する場所はどこかによって、多くの方法で投与できる。投与は、眼、腟内、直腸内、鼻腔内などに局所的に行ってもよい。また投与は、静脈内、腹腔内にもできる。本明細書に記載の核酸とＭＦＣのナノ粒子複合体が細胞に接触する場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでその細胞と接触することが可能である。
【００７０】
投与用の製剤には、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液及び乳剤が含まれる。非水性キャリアの例には、水、アルコール／水溶液、乳剤又は懸濁液が含まれ、それには生理食塩水や緩衝液が含まれる。開示された組成と方法の付随的な使用に必要な場合、非経口用の溶媒には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、ラクトリンゲル液又は不揮発性油が含まれる。開示された組成と方法の付随的な使用に必要な場合、静脈内投与用の溶媒には、液体、栄養物補充液及び電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。また、防腐剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなども存在する。
【００７１】
局所投与用の製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、座薬、スプレー、液体、及び粉末を含むことができる。従来の医薬品のキャリア、水、粉末又はオイルベース及び増粘剤などが必要な場合又は好ましい場合がある。
【００７２】
投与回数は、治療が行われる状態の過酷さと反応性に依存しているが、通常、１日あたり１回以上であり、数日から数カ月又は当業者が投与を中止すべきであると決定するまでその投与コースを継続する。当業者は、容易に最適用量、投与方法及び繰返し回数を決定できる。開示された組成と方法の特定の実施形態のどれもが、実施例で議論された非多糖ベースの試薬を含む特定の実施例及び本発明の実施例と容易に比較できることが理解される。そのような比較を行うことで、それぞれの特定の実施例の相対的な有効性は容易に決定できる。特に好ましい組成と方法は、本明細書の実施例で開示されており、必ずしも制限するものではないが、それらの組成と方法は、本明細書に開示されるいずれの組成と方法でも実行できることが理解される。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例は、本明細書で説明され、クレームされた化合物、組成物及び方法について、当業者に完全に開示及び説明するために、提示され、作製され、評価される。これらは、純粋な例であることを意図するものであり、発明者が認識する本発明の範囲を限定することを意図するものではない。数値（例えば、量や温度など）に関して精度を確実にする試みがされているが、いくつかの誤りや逸脱は考慮されるべきである。特に断りのない限り、「部」は「重量部」、温度は「℃」又は常温、圧力は大気圧又は大気圧近辺である。多くの反応条件の種類や組み合わせ、例えば、組成の濃度、好ましい溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、他の反応範囲があり、また記載された過程で得られた製品の純度と収量を最適化するために用いることのできる条件がある。そのような過程の条件を最適化するためには、繰り返される適切な実験のみが必要である。
【００７４】
Ｉ．多機能性ジチオール化合物とその特徴
Ａ．概要
塩化２−クロロトリチル樹脂（１．１ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン（Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）、Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）、２−アセチルジメドン（Ｄｄｅ−ＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロほう酸塩（ＴＢＴＵ）をＥＭＤバイオサイエンス社（EMD Biosciences）（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。エチレンジアミン、ペンタエチレンヘキサミン、スペルミン、トリエチレンテトラミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）、アクリル酸メチル、１，２−エチレンジアミン、ヒドラジン、オレイン酸、トリイソブチルシラン（ＴＩＢＳ）、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）、４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をランカスター社（Lancaster）（ニューハンプシャー州ウインダム）から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジメタンクロライド（ＤＣＭ）は超乾燥溶剤であり、アクロス社（Acros）（ペンシルベニア州ピッツバーグ）から購入した。固相合成については、他の記載を除くと、フリットとキャップを備えたＩＳＯＬＵＴＥカラム容器（ヴァージニア州シャーロッツビル）の中で反応は行われた。合成に用いる前に、アミンを減圧蒸留によって精製した。他の全ての材料と溶剤は、追加の精製を行うことなく使用した。５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）をピアス社（PierceInc）（イリノイ州ロックフォード）から購入した。
【００７５】
分岐ＰＥＩ（Ｍｗ＝２５ＫＤａ）、Ｎ−（２，３−ジオレオイロキシ−１−プロピル）トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２，５−ジフェニール−３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）テトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）、ＦＩＴＣを付加した抗マウスＩｇＧヤギ抗体をシグマ−オルドリッチ社（Sigma-Aldrich）（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＭＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００をネクター社（Nektar）（アラバマ州ハンツビル）を購入した。５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）をピアス社（PierceInc）（イリノイ州ロックフォード）から購入した。ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商品名）をプロメガ社（Promega）から購入した。これは、Ｎ，Ｎ−［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−［２，３−ジ（テトラデカノイロキシ）プロピル］ヨウ化アンモニウムと、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から成る。マウス抗ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体をアブカム社（AbcamInc）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。ルシフェラーゼをコードするｇＷｉｚ（商品名）レポータープラスミド及び緑色蛍光蛋白質をアルデブロン社（Aldevron）（ノースダコタ州ファーゴ）から購入した。ラミンＡ／Ｃを標的としたｓｉＲＮＡをアンビオン社（Ambion,Inc.）（テキサス州オースチン）から購入した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列は、５’−ＵＧＵＵＣＵＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＡＧｄＴｄＴ−３’であり、センス配列は、３’−ｄＴｄＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＵＵＣＡＧＧＵＣ−５’である。ホタルルシフェラーゼを標的としたｓｉＲＮＡをダルマコン社（Dharmacon）（イリノイ州シカゴ）から購入した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列は、５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’であり、センス配列は、３’−ｄＴｄＴＡＧＣＵＵＣＡＵＧＡＧＵＣＧＣＡＵＵＣ−５’である。Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（商品名）陰性対照ｓｉＲＮＡ（アンビオン）を非特異的ｓｉＲＮＡ対照として使用した。
【００７６】
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズの精製システムを使用して行った。最終生成物は、勾配移動相（Ａ：０．０５％ＴＦＡ水溶液，Ｂ：０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）を使用し、流量５ｍｌ／分、ＺＯＲＢＡＸ  ＰｒｅｐＨＴ  Ｃ−１８カラムを備えた分取用ＨＰＬＣで精製した。Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ４００（カリフォルニア州パロアルト）を用いて、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを得た。化合物の分子量は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析で測定した。
【００７７】
Ｂ．単量体の多機能性キャリア化合物ＴＨＣＯの合成と精製（図１）
１−［２−クロロトリチル−アミノ］−１，４，７，１０−テトラアザデカン樹脂（樹脂２）
塩化２−クロロトリチル樹脂（３００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ／ｇ）を、乾燥ＤＣＭを用いてよく洗浄した。トリエチレンテトラアミン（１ｍｌ）とＤＩＰＥＡ（６４ｍｇ）のＤＣＭ溶液を樹脂に加え、その懸濁液を２時間、振盪した。溶媒を排出し、次に、ＤＣＭとＭｅＯＨを用いて洗浄した。樹脂を１０ｍｌのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７／２／１、ｖ／ｖ／ｖ）と共に、さらに２０分間振盪した。得られた樹脂２をＤＭＦ、ＤＣＭを用いてよく洗浄し、減圧で乾燥した。
【００７８】
２−アセチルジメドン（Ｄｄｅ−ＯＨ）及びｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を用いたポリアミンの選択的保護と脱保護
２−アセチルジメドン（Ｄｄｅ−ＯＨ，２ｇ）を１０ｍｌのＤＭＦに溶解した溶液を樹脂２に加えた。その懸濁液を、室温で１２時間、振盪した。ＤＭＦとＤＣＭを用いて樹脂をよく洗浄し、溶媒を排出し、樹脂３を得た。樹脂３は、Ｂｏｃ２Ｏ（１０ｇ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶解した溶液で懸濁した。その混合物を、室温で４時間、振盪した。得られた樹脂をＤＭＦとＤＣＭを用いてよく洗浄し、その後、減圧で乾燥して、樹脂４を得た。次に、２％ヒドラジンのＤＭＦ溶液で１５分間、樹脂４を懸濁した。このステップは、Ｄｄｅ基の完全な脱保護を確実にするために３回繰り返した。ＤＭＦとＤＣＭを用いて得られた樹脂をよく洗浄し、樹脂５を得た。次のステップのために、それを減圧で乾燥した。
【００７９】
アクリル酸メチル、１，２−エチレンジアミン、Ｎ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン及びＮ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システインを用いた連続伸長
乾燥樹脂５を１００ｍｌのナス型フラスコに移し、アクリル酸メチル（５０ｍｌ）とＤＭＦ（１０ｍｌ）を加えた。ロータリーエバポレーターにて、５０℃で連続振盪し、反応を行った。第一アミンが完全に消費されるまで、カイザーニンヒドリン試験で反応をモニターした。ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＤＣＭを用いて得られた樹脂６をよく洗浄し、減圧で乾燥した。次のステップのために、１，２−エチレンジアミン（５０ｍｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した溶液を樹脂６に加えた。ロータリーエバポレーターにて、５０℃で５日間連続振盪し、反応を行った。ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＤＣＭを用いてこの樹脂をよく洗浄し、減圧で乾燥して樹脂７を得た。次の固相反応のために、フリットとキャップを備えたＩＳＯＬＵＴＥカラム容器の中にこの樹脂を移した。活性化Ｎ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン（２ｇ）と、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡをＤＭＦに溶解した溶液を樹脂７に加え、カップリング反応を２時間続けた。カップリングの質は、カイザー試験で追跡した。この樹脂を数回洗浄し、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液に樹脂を懸濁（２０分×３）することでフルオレニルメトキシカルボニル保護基を除去して、樹脂８を得た。次に、次のステップのために、ＤＭＦ及びＤＣＭを用いてこの樹脂をよく洗浄し、減圧で乾燥した。続いて、活性化Ｎ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（２ｇ）と、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡをＤＭＦに溶解した溶液を樹脂８に加え、カップリング反応を２時間続けた。カップリングの質は、カイザー試験で追跡した。この樹脂をよく洗浄し、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を用いてフルオレニルメトキシカルボニル保護基を除去した。次に、次のステップのために、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＤＣＭを用いて得られた樹脂９をよく洗浄した。
【００８０】
オレイン酸を用いた伸張
活性化オレイン酸（２ｇ）とＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液を樹脂９に加え、カップリング反応を２時間続けた。カップリングの質は、カイザー試験で追跡した。この樹脂をよく洗浄し、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を用いてフルオレニルメトキシカルボニル保護基を除去した。次のステップのために、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＤＣＭを用いて得られた樹脂１０をよく洗浄した。
【００８１】
単量体の多機能性キャリアの樹脂からの開裂と脱保護
樹脂１０をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＩＢＳ（９４／２．５／２．５／１）溶液中で懸濁した。室温で３時間振盪した後に、溶液を回収し、減圧下で凝縮した。単量体の多機能性化合物１１（ＴＨＣＯ；図１）を冷ジエチルエーテルで洗浄し（４０ｍｌ×５）、乾燥した。その化合物を分取用ＨＰＬＣでさらに精製し、適切な画分を集めて凍結乾燥（dried by lyopholization）した。ＭＳ  ｍ／ｚ  計算値Ｃ３４Ｈ６２Ｎ１６Ｏ６Ｓ２（Ｍ＋Ｈ）＋＝１３８３．９４は、１３８３．７５に検出された。同様の手順は、図２に示される他のＭＦＣの生産に用いられた。
【００８２】
Ｃ．ＴＨＣＯとＴＨＣＯ／核酸複合体の生理化学的特性と生物学的特性
ゲル電気泳動シフトアッセイ
多機能性化合物ＴＨＣＯがＤＮＡに結合する能力をゲル電気泳動によって調べた。０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含むアガロースゲル（０．８％，ｗ／ｖ）をＴＡＥ緩衝液（トリス酢酸塩−ＥＤＴＡ）中に準備した。ＤＮＡ（１０μｌ，０．１μｇ／μｌ）に、規定のＮ／Ｐ比（Ｎ＝プロトン化できる窒素、Ｐ＝ＤＮＡ上のリン酸基）である等量の脂質溶液を混合し、使用する前に３０分間インキュベートした。それぞれの１０μｌサンプルに２μｌの６×ローディングダイ（loading dye）を混合し、その混合物をアガロースゲルにロードした。１００Ｖで６０分間、ゲルの電気泳動を行った。ＤＮＡのバンドの位置をＵＶ照射装置上で可視化した。図３は１以上のＮ／Ｐ比においてＴＨＣＯがゲル内のＤＮＡの移動を遅延させたことを示している。ＴＨＣＯは強いＤＮＡ結合性を示し、１以上のＮ／Ｐ比でアガロースゲル内のＤＮＡの移動を遅延させることができる。
【００８３】
溶血アッセイ
ＴＨＣＯ（１６．７μＭ）、ＤＯＴＡＰ（１６．７μＭ）及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ，登録商標）Ｘ−１００（１％，ｗ／ｖ）をｐＨ７．４、ｐＨ６．５又はｐＨ５．４のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、保存溶液とした。ラットを殺処分し、心穿刺により血液を得た。１５００ｇ、４℃で１０分間、遠心することによって赤血球（ＲＢＣ）を分離した。細胞ペレットを２％（ｗ／ｖ）ＲＢＣ溶液になるよう冷ＰＢＳで再懸濁し、９６穴のプレートに１００μｌずつ分注した。１００μｌのテストサンプルをＲＢＣ溶液に添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて各サンプルの上清の吸光度を５５０ｎｍで測定した。
【００８４】
粒子サイズ分析
５．０μｇのプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡと適量の材料を無塵水中で混合したサンプル用意し、出力波長６３３ｎｍの５ｍＷヘリウムネオンレーザを装備したＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ社製の動的光散乱光度計ＢＩ−２００ＳＭシステムを用いて分析した。その装置に備わった機能を用いて拡散係数から有効径と集団分布を算出した。測定は９０度の角度、２５℃で行い、各サンプルは３連で分析した。ｓｉＲＮＡとＴＨＣＯのナノ粒子の形成は、対照として非重合性の界面活性剤ＤＯＴＡＰを用いて、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって調べた。Ｎ／Ｐ比８でのＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体の粒子サイズは、無塵水中で直径約１３０ｎｍであり、一方、ＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡ複合体は、直径約２１０ｎｍのサイズであった。両複合体は効率的な細胞内取り込みのためのカットオフ値として報告されている２５０ｎｍ未満であった。このような低Ｎ／Ｐ比ではｓｉＲＮＡ／ＴＨＣＯの粒子サイズは、１，４，７−トリアザノニルイミノ−ビス［Ｎ−（システイニルヒスチニル）−１−アミノエチル）プロピオンアミドのポリジスルフィドとｓｉＲＮＡの複合体の粒子サイズに比べてはるかに小さかった（図２７）。理論に拘束されることなく、ＴＨＣＯ内の疎水性残基はｓｉＲＮＡとの小さくてコンパクトなナノ粒子形成を容易にする。また、ＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体のナノ粒子は、ＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡ複合体のナノ粒子よりも１０％ＦＢＳの培養液中でより安定していた。ＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体のサイズは、培養液中での３０分間のインキュベートによる１３４ｎｍから、２時間のインキュベートによって２３８ｎｍまで変化した。一方、同様の条件下で、ＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡのサイズは、３０分間のインキュベートによる２１１ｎｍから、２時間のインキュベートによって、おそらく粒子凝集のために７２７ｎｍに増加した。
【００８５】
時間依存性酸化特性
ＴＨＣＯは、保存液（２ｍｇ／ｍｌ）を４ｍｌのトリス緩衝液（１０ｍＭ  ｐＨ８．０）で、初期の理論上のチオール濃度１８０μＭになるよう希釈した。既定の時間ごとに０．２ｍｌずつ分取して、０．２ｍｌのエルマン保存液（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃに溶解した２ｍＭ  ＤＴＮＢ溶液）と混合した。紫外可視分光光度計（Ｃａｒｙ−３００  Ｂｉｏ）を用いて残存する遊離チオール濃度を測定した。複合体実験のために、界面活性剤（Ｎ／Ｐ＝６）を添加する前に、ｇＷｉｚプラスミドＤＮＡを終濃度９０μＭのリン酸塩に加えた。図４はエルマン試薬によるＴＨＣＯの時間依存性酸化特性を示している。
【００８６】
別の実験では、ＴＨＣＯは、保存液をトリス緩衝液（１０ｍＭ  ｐＨ８．０）で、初期のチオール濃度１００μＭになるよう希釈した。ＴＨＣＯ溶液を１０μｇのｓｉＲＮＡと混合し（Ｎ／Ｐ＝１０、Ｎはプロトン化できるＴＨＣＯの窒素、ＰはｓｉＲＮＡ中のリン酸基）、また混合しなかった。規定の時間ごとに分取し、等量のエルマン保存液（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ溶液中、２ｍＭ  ＤＴＮＢ）と混合し、紫外可視分光光度計によってチオール濃度を測定した。キャリアの重合は、エルマン試薬を用いて測定した時間経過中のＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体中の遊離チオール濃度の減少によって確認した。図５に示されるように、ｓｉＲＮＡの非存在下に比べて、ｓｉＲＮＡの存在下で遊離チオール濃度は迅速に減少する。ｓｉＲＮＡとの複合体形成は、酸素による酸化重合を促進するようである。
【００８７】
細胞培養
ＨｅＬａ細胞とＵ８７細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，米国メリーランド州ロックビル）から入手し、加湿５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で培養した。培養液には、ウシ胎児血清（１０％）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）を加えた。構成的にホタルルシフェラーゼを発現するＵ−８７細胞（Ｕ８７−Ｌｕｃ）はユタ大学のハンツマン癌研究所より入手した。Ｕ８７−Ｌｕｃ細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む組み換えレトロウイルスを感染させることによって作製された。細胞は１０％ＦＢＳ、Ｇ４１８（３００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びペニシリン（１００単位／ｍｌ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ培地）（ＡＴＣＣ）で培養した。
【００８８】
チオール消費の競合（自動酸化対マレイミド）
ＴＨＣＯ又はそのＤＮＡナノ粒子複合体（Ｎ／Ｐ＝６、複合体Ａは３０分間インキュベート、複合体Ｂは６０分間インキュベート）を上述のとおり準備した。既定の時間ごとに、１６μＬのＭＰＥＧ−Ｍａｌ−５０００保存液（１０μｇ／μｌ  ＤＭＳＯ溶液）を０．２ｍｌ溶液に添加し、その混合物を室温で３０分間インキュベートした後、残存する遊離チオール濃度を定量した。図６は自動酸化とマレイミド反応との間でのＴＨＣＯのチオール消費の競合を示している。
【００８９】
細胞毒性アッセイ
ＰＥＩとＴＨＣＯの細胞毒性の比較は、ＭＴＴアッセイを用いて評価した。アッセイの２４時間前に、ＭＢ−２３１細胞を９６穴プレートに１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。その細胞を異なった濃度のＴＨＣＯを含む２００μｌのＬ−１５完全培地でインキュベートした。４時間後にそれぞれの培地を１００μｌの新しい完全培地に交換した。次いで、ＰＢＳで溶解した２５μｌのＭＴＴ溶液を添加し、さらに２時間インキュベートした。培養液を除去したのち、２００μｌのＤＭＳＯをウェルに加えて、３７℃で５分間インキュベートした。吸光度はマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ５５０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．カリフォルニア州ヘラクレス）を用いて５７０ｎｍで測定した。相対的な細胞生存率を「（［Ａｂｓ］ｓａｍｐｌｅ−［Ａｂｓ］ｂｌａｎｋ）／（［Ａｂｓ］ｃｏｎｔｒｏｌ−［Ａｂｓ］ｂｌａｎｋ）×１００％」を用いて算出した。図７は、ＴＨＣＯ及びＰＥＩ濃度に対する相対的な細胞生存率（％）を示す。図７は、ＰＥＩに比べてＴＨＣＯがＭＢ−２３１細胞に対して低い細胞毒性であったことを示す。
【００９０】
別の試験では、アッセイの２４時間前に、Ｕ８７細胞を９６穴プレートに１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。その細胞を異なった濃度のＴＨＣＯを含む２００μｌの培地でインキュベートした。次にＰＢＳに溶解した２５μｌのＭＴＴ溶液を添加し、さらに２時間、細胞をインキュベートした。培養液を除去した後、２００μｌのＤＭＳＯをウェルに加えて、３７℃で５分間、細胞をインキュベートした。吸光度はマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ５５０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．カリフォルニア州ヘラクレス）を用いて５７０ｎｍで測定した。相対的な細胞生存率を上記と同様に算出した。ＴＨＣＯは主要なトランスフェクション試薬であるＰＥＩよりもはるかに細胞毒性が低かった。ＭＴＴアッセイにおけるＴＨＣＯとインキュベートされたＵ８７細胞の生存率は２５０μｇ／ｍｌの濃度で７９±８％であり、ＤＯＴＡＰ（７２±４％）よりもわずかに高かった（図８）。それに対して、ＰＥＩとインキュベートされた細胞では、６２．５μｇ／ｍｌ以上の濃度では生存率はわずか１０±１％であり、ＴＨＣＯがＰＥＩよりも安全なキャリアであることが示された。
【００９１】
ＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体の蛍光標識とＰＥＧ修飾
結合実験のすべてを１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）中で実施した。２０μｇのｓｉＲＮＡを８０ｎｍｏｌのＴＨＣＯと混合したのち、０．８ｎｍｏｌのフルオレセイン−５−マレイミドを加えた。蛍光標識ペグ化ナノ粒子のために、０．５％又は２．５％のｍＰＥＧ５０００−Ｍａｌ（ＭＦＣに基づくモル比）をＴＨＣＯ、ｓｉＲＮＡ及びフルオレセイン−５−マレイミドを混合した５分後に添加した。暗所で２時間インキュベートした後、遊離のマレイミド誘導体を遠心（Ｎａｎｏｓｅｐ（商標），ＭＷＣＯ＝１００Ｋ，５０００ｇ，５分）によって除去し、次の実験のためにナノ粒子を再生した。
【００９２】
細胞内取り込み
試験の２４時間前に、６穴プレートに１ウェルあたり約５０万個のＵ８７細胞を播種した。上述の蛍光タグを付加したナノ粒子を細胞（１ウェルあたりｓｉＲＮＡ５μｇ）と共に３７℃でインキュベートした。２時間後、培養液をアスピレーターによって除去し、細胞を冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、トリプシンで処理した。細胞を集め、ＰＢＳに溶解した２％のポリホルムアルデヒドを用いて、４℃で２０分間固定した。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、結果は、ＷｉｎＭＤＩソフトウエア（ｖｅｒ．２．９）を用いて解析した。フローサイトメトリーの結果は、ペグ化されていないＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体がペグ化されたナノ粒子に比べてＵ８７細胞内に多く取り込まれることを示している。ナノ粒子のペグ化は、非特異的な細胞相互作用を低下させ、細胞内取り込み量を減少させると考えられる（図９）。
【００９３】
Ｄ．ＴＨＣＯによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの核酸導入
ホタルルシフェラーゼ又はＧＦＰをコード化するプラスミドＤＮＡのＭＦＣを介する導入
トランスフェクションの２４時間前に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２４穴のプレートに播種した。トランスフェクション時に、各ウェルの培養液を無血清培地に交換した。異なったＮ／Ｐ比でＴＨＣＯ／ＤＮＡ複合体を加え、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。次に、培養液を１ｍｌの新しい完全培地に交換し、さらに細胞を４４時間インキュベートした。トランスフェクション試験はすべて３連で実施した。ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡの場合、インキュベート後に、細胞を２００μｌの細胞溶解緩衝液（プロメガ社，ウィスコンシン州マディソン）で処理した。細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ社，ウィスコンシン州マディソン）を用いてルミノメータ（Ｌｕｍａｔ  ９６０５，ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ）で１０秒間測定した。相対的な光強度値（ＲＬＵ）は、細胞抽出液中のタンパク質濃度で標準化し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアス社，イリノイ州ロックフォード）によって測定した。ルシフェラーゼ活性は相対的な光強度値（細胞抽出液中のタンパク質量１ｍｇあたりのＲＬＵ）として表した。図１０ＢにはＴＨＣＯの高効率トランスフェクションを示した。図１０ＡはＮ／Ｐ比が４及び６のときが最適な発現であることを示す。緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの場合、蛍光顕微鏡によってＧＦＰ発現を見ることができる（図１１）。
【００９４】
ルシフェラーゼレポータ遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡのＴＨＣＯを介する導入
トランスフェクションの２４時間前に、Ｕ８７−Ｌｕｃ細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレートに播種した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション時に、各ウェルの培養液を新しい無血清培地に交換した。２０ｎＭの抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ又は非特異的なｓｉＲＮＡをＴＨＣＯ、Ｔｒａｎｓｆａｓｔ（商標）又はＤＯＴＡＰと結合させ、使用する前に３０分間インキュベートした。ＴｒａｎｓｆａｓｔやＤＯＴＡＰによるトランスフェクションは、説明書に従って実施した。複合体は細胞と３７℃で４時間インキュベートした。次に、培養液を１００μｌの新しい完全培地に交換し、さらに細胞を４４時間インキュベートした。トランスフェクション試験はすべて３連で実施した。インキュベート後に、あらかじめ暖めたＰＢＳで細胞を洗浄し、２００μｌの細胞溶解液で処理したのち、数回凍結融解を行った。細胞残屑は１４，０００ｇ、５分間の遠心で取り除いた。細胞溶解液（２０μｌ）中のルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイキット（１００μｌのルシフェラーゼアッセイ緩衝液）を用いてルミノメータ（Ｌｕｍａｔ  ９６０５，ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ）により１０秒間測定した。遺伝子の抑制効率は未処理細胞のルシフェラーゼ発現量で標準化した。また、ｓｉＲＮＡの導入効率は１０％ＦＢＳ培養液で同様に評価した。
【００９５】
ＴＨＣＯは、４〜１６までの広い範囲のＮ／Ｐ比において、Ｔｒａｎｓｆａｓｔ（６２％）と同等で、ＤＯＴＡＰ（４７％）よりも高い６０〜７０％の遺伝子抑制率を示した。図１２は、Ｎ／Ｐ比８での、無血清培地又は１０％ＦＢＳ培地中の、ＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体及びペグ化されたＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子抑制率、並びにＴｒａｎｓｆａｓｔ及びＤＯＴＡＰとの対照複合体の遺伝子抑制率を示す。高い遺伝子抑制効率が、補助脂質であるＤＯＰＥなしでＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体及びペグ化されたＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体で認められ、それは、市販されているリポソーム又は脂質ベースのトランスフェクション試薬と比べてもすぐに使えるキャリアとしてＴＨＣＯの有利な特徴である。主な脂質ベースのキャリアでは、高いトランスフェクション効率を達成するためにＤＯＰＥ又はコレステロールの取り込みの事前形成がしばしば必要であるが、ＴＨＣＯにはそれは必要ない。
【００９６】
ペグ化ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡ複合体の細胞取り込み量が少なかったとしても、０．５％と２．５％のｍＰＥＧ５０００−Ｍａｌで修飾されたＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体は、非修飾のＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体やＴｒａｎｓｆａｓｔ複合体に比べて、無血清培地でわずかに高い遺伝子抑制効率を、１０％ＦＢＳ培地で有意に高い遺伝子抑制効率を示した。ペグ化ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡ複合体は、１０％ＦＢＳ培地中で約５６％の遺伝子抑制効率を示し、無血清培地中での６５％から低下した。無血清培地と比較して１０％ＦＢＳ存在下での遺伝子抑制効率の有意な減少はＴＨＣＯ（６１．１±２．２％〜４６．３±４．８％）、Ｔｒａｎｓｆａｓｔ（６２．３±１．６％〜４１．８±８．２％）及びＤＯＴＡＰ（４７．１±３．８％〜２１．９±７．７％）で認められた（図１２）。ペグ化されたＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は血清に順応したトランスフェクション効率を示した。理論によって拘束されることなく、表面のペグ化はナノ粒子を安定させ、リソゾーム小器官での酵素分解からｓｉＲＮＡを防御した。
【００９７】
内因性のハウスキーピング遺伝子（ラミンＡ／Ｃ）を標的としたｓｉＲＮＡのＭＦＣを介する導入
細胞を８穴の顕微鏡用チャンバースライドに播種し、多機能性のキャリア／ｓｉＲＮＡ複合体と３７℃、５％ＣＯ２の環境で４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を洗浄し、新しい培養液を加え、ＲＮＡｉの効果のためにさらに４４時間インキュベートした。蛍光顕微鏡による解析のために、１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで細胞を洗浄し、チャンバースライド上でメタノールを用いて固定した。細胞固定後、細胞をラミンに対する一次抗体（Ａｂｃａｍ）とインキュベートし、次に、蛍光標識された二次抗体（Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートした。遺伝子抑制効率は蛍光顕微鏡によって可視化された（図１３）。ＴＨＣＯ／ｓｉＲＮＡとＴｒａｎｓｆａｓｔ／ｓｉＲＮＡ複合体で処理した細胞は、ＲＮＡｉによってラミンＡ／Ｃタンパク質の発現が抑制されたため、未処理の細胞に比べて蛍光がはるかに弱かった。
【００９８】
ホタルルシフェラーゼを標的としたｓｉＲＮＡのＭＦＣを介する導入の定量的評価
構成的にホタルルシフェラーゼを発現しているヒトの星状細胞腫細胞株Ｕ３７３ＭＧ（Ｕ３７３−Ｌｕｃ）は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む組換レトロウイルスをＵ３７３ＭＧ細胞に感染させることによって作製した。Ｕ３７３−Ｌｕｃ細胞は、１０％のウシ胎児血清、Ｇ４１８（３００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びペニシリン（１００単位／ｍｌ）を含むＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）で培養した。
【００９９】
トランスフェクションの２４時間前に、Ｕ３７３ＭＧ−Ｌｕｃ細胞を２０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレートに播種した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション時に、各ウェルの培養液を新しい無血清培地に交換した。キャリア／抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ複合体は、細胞と３７℃で４時間インキュベートした。次いで、培養液を１ｍｌの新しい完全培地に交換し、さらに細胞を４４時間インキュベートした。トランスフェクション試験はすべて３連で実施した。細胞をペレットにして１００μｌの細胞溶解緩衝液（プロメガ社）に再懸濁し、凍結融解を２回行った。１４，０００ｇで１分間遠心し細胞残屑を沈殿させ、２０μｌの上清を、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）を用いて評価した。図１４はトランスフェクション試薬としてＴＨＣＯ、ＰＥＩ、Ｔｒａｎｓｆａｓｔ及びＤＯＴＡＰを用いたルシフェラーゼ遺伝子抑制を示す。ＴＨＣＯは、核酸（ｐＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ）、細胞株（ＨｅＬａ又はＭＤＡ  ＭＢ２３１）、プラスミド（ホタルルシフェラーゼ又はＧＦＰのどちらかをコードするレポーター遺伝子）及びｓｉＲＮＡ（ラミンＡ／Ｃをコードする内因性のハウスキーピング遺伝子又はホタルルシフェラーゼをコードする組み換え遺伝子のどちらかを標的とする）が異なるのにも関わらず万能で高い導入効率を示した。
【０１００】
Ｅ．追加の単量体の多機能性キャリア化合物の合成と精製
ＭＦＣを固相化学法によって合成した。（１−アミノエチル）イミノ−ビス［Ｎ−（オレイシル−システイニル−ヒスチニル−１−アミノエチル）プロピオン−アミド］（ＥＨＣＯ）の合成手順は、化合物のライブラリの合成のための代表的な手順として記述した。合成のプロトコールを図１６に示す。ＭＦＣの一般構造は図１５に示し、特定の化合物は図２に示す。
【０１０１】
塩化２−クロロトリチル樹脂（３００ｍｇ）を無水ＤＣＭでよく洗浄した。ＤＣＭ中のエチレンジアミン（１．０ｍｌ、過剰量）とＤＩＰＥＡ（６４ｍｇ）の混合物を樹脂に加え、その懸濁液を２時間振盪した。溶媒を排出し、樹脂をＤＣＭとＭｅＯＨで洗浄した。さらに、樹脂は１０ｍｌのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７／２／１，ｖ／ｖ／ｖ）で２０分間振盪した。次に、樹脂をマイケル付加でメチルカルボン酸を導入するために１０ｍｌのＤＭＦ中でアクリル酸メチル（５０ｍｌ、過剰量）と混合した。ロータリーエバポレーターを用いて５０℃で連続回転にて反応を行った。ＤＭＦ１０ｍｌ中の１，２−エチレンジアミド溶液（５０ｍｌ、過剰）をメチルカルボン酸エステルの樹脂と混合した。ロータリーエバポレーターを用いてその混合物を５日間、５０℃で回転した。第一アミンを含む樹脂をＩＳＯＬＵＴＥカラムに移し、ＤＭＦに溶解した活性化Ｎ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン（２．０ｇ，過剰量）とＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ（過剰量）の溶液と混合し、２時間振盪した。樹脂を数回洗浄し、フルオレニルメトキシカルボニル保護基を２０％ピペリジン（ＤＭＦ溶液）によって除去し（２０分間、３回）、ヒスチジン残基を含む樹脂を与えた。同様にしてＤＭＦ中の活性化Ｎ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（２．０ｇ，過剰量）及びＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ（過剰量）と樹脂との反応によりシステイン残基を導入し、フルオレニルメトキシカルボニル保護基を除去した。最終的に、ＤＭＦ中のＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ存在下でオレイン酸（２ｇ）と樹脂を２時間反応させることによってオレイシル基（oleicyl group）を導入した。第一アミノ基を含むそれぞれのカップリング反応の質はカイザー試験で調べた。各反応サイクルの樹脂は、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＤＣＭでよく洗浄し、次の反応プロセスの前に減圧下で乾燥した。最終の樹脂はＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＩＢＳ（９４／２．５／２．５／１）溶液で懸濁し、室温で３時間振盪した。その溶液を集めて、減圧下で濃縮した。残留物を冷ジエチルエーテルで洗浄（４０ｍｌ×５）し、乾燥した。最終生成物のＥＨＣＯは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００リーズ精製システムを用いて、ＺＯＲＢＡＸ  ＰｒｅｐＨＴ  Ｃ−１８カラムを備えた分取用ＨＰＬＣによって精製した。精製した画分を集めて、凍結乾燥した。最終生成物の純度は分析用ＨＰＬＣで確かめた。化合物の構造は、Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ４００（カリフォルニア州パロアルト）を用いた１Ｈ  ＮＭＲ分光法及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析よって解析した。
【０１０２】
Ｆ．ＭＦＣとＭＦＣ／核酸複合体の生理学的、生物学的特性
溶血アッセイ
アッセイは、上述の技術を用いて実施した。ＭＦＣのｐＨ感受性の両親媒性細胞膜破壊作用は、ラットの赤血球を用いた異なったｐＨでの溶血アッセイで評価した。図１７は、ｐＨ７．４、ｐＨ６．５及びｐＨ５．４のＰＢＳ緩衝液中での化合物の溶血活性を示している。陽性対照であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１％，ｗ／ｖ）は、完全に溶血させた。これらの緩衝液とＤＯＴＡＰはいずれの場合もほとんど溶血しなかった。ＭＦＣは様々なｐＨ依存性の溶血活性を示した。一般的に、すべてのＭＦＣはｐＨ７．４において、ｐＨ６．５及びｐＨ５．４よりも低い溶血活性を有していた。ｐＨ７．４では、ＥＨＣＬ及びＥＨＣＯはほとんど溶血活性がなかったが、他のＭＦＣは１０〜３５％の中程度の溶血活性を示した。ｐＨ６．５では、ＥＨＣＯを除いて、ＭＦＣの溶血活性が上昇したが、ＥＨＣＯはほとんど溶血活性を示さなかった。ｐＨ５．４では、すべてのＭＦＣが高い溶血活性を示し、ＥＨＣＬを除き、５０〜８０％の溶血が認められた。
【０１０３】
ＭＦＣの溶血活性のｐＨ感受性はそれらの構造特性によって決まる。ヒスチジン残基及び同様の疎水性残基を含むＭＦＣにおいて、ｐＨ７．４及びｐＨ６．５で頭部官能基中のプロトン化可能なアミノ基の数が増加するに伴って溶血活性が上昇する。中性付近のｐＨでは、プロトン化可能なアミノ基が多ければ多いほど、頭部官能基の電荷が増えてＭＦＣの両親媒性が高くなる。ＥＨＣ及びＴＨＣ系において、ｐＨ７．４のＥＨＴＬを除き、ｐＨ７．４及びｐＨ６．５での不飽和のオレイシル基は、同じ系の飽和疎水性テールに比べて低い溶血活性を示した。ＴＨＣＯとＴＧＣＯの比較から、ＭＦＣのエンドゾーム−リソゾームｐＨでの両親媒性のｐＨ感受性にヒスチジン残基が重要であることが示唆される。全般的に、溶血活性（赤血球膜の破壊）のｐＨ感受性は、プロトン化可能なアミノ基頭部官能基と疎水性テールの結合から由来するＭＦＣの両親媒性のｐＨ感受性によって引き起こされる。多くのアミノ基がプロトン化された場合、ＭＦＣはより両親媒性となり、より溶血活性が高くなる。プロトン化と両親媒性のｐＨ感受性は、ＭＦＣの頭部官能基の全体的なｐＫａによって決まるのかもしれない。
【０１０４】
ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の形成と径の測定
ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子複合体は、上述の技術を用いて作製し、特徴付けた。重合性のＭＦＣとｓｉＲＮＡとの複合体形成と複合体のナノ粒子の形成は、動的光散乱法で調べた。ＥＨＣＯは、まずｓｉＲＮＡとの複合体形成及び複合体形成とナノ粒子の形成におけるＮ／Ｐ比の影響を検討するために使用された。ナノ粒子の形成はＥＨＣＯ又はｓｉＲＮＡ溶液のいずれでも検出されなかった。ＥＨＣＯにｓｉＲＮＡを混合し、３０分間インキュベートした場合に、ナノ粒子複合体の形成は０．５という低いＮ／Ｐ比で認められた。粒子のサイズは複合体のＮ／Ｐ比で変化した（図１８Ａ）。Ｎ／Ｐ比０．５での初期サイズは直径約２００ｎｍであり、Ｎ／Ｐ比を４まで増加させるとサイズは増加した。比較的中性の複合体粒子の凝集が可能であったため、粒子のサイズはＮ／Ｐ比４で約３μｍと大きかった。Ｎ／Ｐ比６、８及び１０での粒子サイズは、それぞれ約２４０、２００及び１５１ｎｍと減少した。他の重合可能な界面活性剤を用いたｓｉＲＮＡ複合体の粒子のサイズは、ＥＨＣＯの検討に基づきＮ／Ｐ比８及び１０で測定した。図１８Ｂで示されるように、複合体の平均粒子サイズは、Ｎ／Ｐ比８で１６０〜２６０ｎｍの範囲であり、Ｎ／Ｐ比１０で１６０〜２１０ｎｍの範囲であった。ほとんどの複合体のサイズは効率的な細胞内取り込みのカットオフ値と報告されている２５０ｎｍ未満であった。
【０１０５】
ＭＦＣの自動酸化
ＭＦＣは、保存液（Ｎ２保護，２ｍｇ／ｍｌ）をトリス緩衝液（１０ｍＭ  ｐＨ８．０）で希釈し、初期のチオール濃度を１５０μＭとした。１０μｇのｓｉＲＮＡの存在下又は非存在下で、試験溶液（４００μｌ）を用いて界面活性剤中のジチオールの自動酸化を実施した（Ｎ／Ｐ＝１０）。既定の時間ごとに分取し、等量のエルマン保存液（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃに溶解した２ｍＭ  ＤＴＮＢ溶液）と混合し、紫外可視分光光度計（Ｃａｒｙ−３００  Ｂｉｏ）を用いたエルマンアッセイで、遊離チオール濃度を測定した。
【０１０６】
他で報告されたｓｉＲＮＡ導入システムに比べて、ＭＦＣは比較的コンパクトで小さいナノ粒子を形成した。理論に拘束されることなく、キャリアとｓｉＲＮＡとの間の電荷の相互作用によって複合体が形成されたと考えられる。疎水性テールの疎水性相互作用とジチオールの重合は、安定でコンパクトなナノ粒子の形成を促進した。ｓｉＲＮＡを混合した後の酸化を介したＭＦＣの重合は、エルマンアッセイによる測定でのチオールの消失によって確認された（図１９）。チオールの自動酸化速度はｓｉＲＮＡの非存在下に比べてｓｉＲＮＡの存在下で速く、ｓｉＲＮＡとの複合体形成が自動酸化を促進したと考えられる。これらのジスルフィド結合は、ナノ粒子複合体をさらに安定させるであろう。細胞外スペースと細胞内のチオール／ジスルフィドのレドックスポテンシャルが大きく異なるため、導入の過程では、ジスルフィド結合は細胞外のスペースでは安定しており、その後サイトゾルではその安定性は減少し、ナノ粒子の解離及びｓｉＲＮＡの遊離が促進される。
【０１０７】
ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性
Ｕ８７−ｌｕｃ細胞は上述のプロトコールに従って、異なったキャリアのＭＦＣ／ｓｉＲＮＡ複合体とインキュベートした。インキュベートの後に、それぞれのウェルにＰＢＳで溶解したＭＴＴの溶液（５ｍｇ／ｍｌ，２５μｌ）を添加し、細胞をさらに２時間インキュベートした。培養液を除去したのち、それぞれのウェルに２００μｌのＤＭＳＯを加えて、細胞を３７℃で５分間インキュベートした。吸光度はマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ５５０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．カリフォルニア州ヘラクレス）を用いて５７０ｎｍで測定した。相対的な細胞生存率は「（［Ａｂｓ］ｓａｍｐｌｅ−［Ａｂｓ］ｂｌａｎｋ）／（［Ａｂｓ］ｃｏｎｔｒｏｌ−［Ａｂｓ］ｂｌａｎｋ）  ×１００％」として算出した。
【０１０８】
Ｇ．ＭＦＣによる核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入
ｓｉＲＮＡを用いたＭＦＣを介するｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子抑制
ホタルルシフェラーゼを構成的に発現するＵ８７−ｌｕｃ細胞は１０％ＦＢＳ，Ｇ４１８（３００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）を含むＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、Ｕ８７−ｌｕｃ細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレートに播種した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション時に、各ウェルの培養液を新しい無血清培地に交換した。抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡをＭＦＣ、ＴｒａｎｓＦａｓｔ又はＤＯＴＡＰと複合体形成させ、使用前に３０分間インキュベートした。複合体は細胞と３７℃で４時間インキュベートした。次に、培養液を１００μｌの新しい完全培地に交換し、さらに細胞を４４時間インキュベートした。細胞をあらかじめ暖めたＰＢＳで洗浄し、２００μｌの細胞溶解液で処理したのち、凍結融解を数回行った。細胞残屑は１４，０００ｇ、５分間の遠心で取り除いた。細胞溶解液（２０μｌ）中のルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイキット（１００μｌのルシフェラーゼアッセイ緩衝液）を用いてルミノメータ（Ｌｕｍａｔ  ９６０５，ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ）により１０秒間測定した。遺伝子の抑制効率は未処理細胞のルシフェラーゼ発現量で標準化した。
【０１０９】
細胞のｓｉＲＮＡ導入のためのＭＦＣｓの有効性は、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現しているＵ８７−ｌｕｃ細胞株にて抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを用いて評価した。市販のトランスフェクション試薬であるＴｒａｎｓＦａｓｔとＤＯＴＡＰは対照として用いた。界面活性剤を介するルシフェラーゼ発現の抑制効果は、まず効率的なｓｉＲＮＡ導入に最もよいＮ／Ｐ比を得るために、異なるＮ／Ｐ比でＥＨＣＯを用いて評価した。ＥＨＣＯでは、ルシフェラーゼ発現の高いノックダウン効果は８〜２０のＮ／Ｐ比の範囲で認められた。（図２０）。最も高い抑制効果はＭＦＣにおいてＮ／Ｐ比１０で認められた。ＭＦＣを介するルシフェラーゼ発現の抑制効果はＮ／Ｐ比１０で固定して評価した。同時に、ＭＦＣの細胞毒性を評価するために、ｓｉＲＮＡ複合体とインキュベートした細胞の生存率をＭＴＴアッセイで調べた。図２１ａに示されるように、ＴｒａｎｓＦａｓｔは、ｓｉＲＮＡが１００ｎＭのとき、未処理の細胞に比べて８９．６±５．６％のルシフェラーゼ発現のノックダウンを示したが、有意な細胞毒性では５７．６±２．２％の生存率しか認められなかった。ｓｉＲＮＡが１００ｎＭのＴｒａｎｓＦａｓｔでは比較的高い遺伝子抑制がみられるが、細胞の生存率が低くなり得る。同じｓｉＲＮＡ濃度のＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡ複合体では高い生存率（８５．８±１．６％）であったが、ルシフェラーゼ発現のノックダウン効果は低かった（５６．７±３．１％）。ＭＦＣのｓｉＲＮＡ複合体とインキュベートされた細胞は相対的に生存率が高く、７８．６±５．７％〜８８．２±１．３％の範囲であった。そのルシフェラーゼ発現のノックダウン効果は４７．８±４．２％〜８８．４±３．１％であった。ＭＦＣの中ではＥＨＣＯが高い生存率（８６．７±８．３％）で最も高い遺伝子抑制効果（８８．４±３．１％）を示した。すべてのｓｉＲＮＡ複合体は、ｓｉＲＮＡ濃度が低いとき（２０ｎＭ）に細胞毒性が低かった（図２１ｂ）。Ｔｒａｎｓｆａｓｔを含む場合はすべて細胞生存率が高かった（８７．６±４．６％）。この条件下では、ＥＨＣＬを除くＭＦＣはＤＯＴＡＰに比べて高いルシフェラーゼ発現抑制効果を示した。ＴＨＣＬ，ＴＨＣＯ，ＴＧＣＯ，ＰＨＣＯ及びＳＨＣＯはＴｒａｎｓＦａｓｔに匹敵するトランスフェクション効率（６２．６±６．４％）を示した。ＥＨＣＯはＴｒａｎｓＦａｓｔに比べて有意に高いトランスフェクション効率を示した（７４．５±１．０％）。細胞のｓｉＲＮＡ導入効率とＭＦＣの溶血活性のｐＨ感受性及び両親媒性とは良く相関した。ＥＨＣＯは両ｓｉＲＮＡ濃度で最も高い遺伝子抑制効果を示した。ｐＨ７．４とｐＨ６．５で比較的溶血活性が低かったＴＨＣＯとＳＨＣＯは、ＭＦＣの中でも比較的高い遺伝子抑制効果を示した。
【０１１０】
Ｈ．ＥＨＣＯを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子抑制
動物腫瘍モデル
ルシフェラーゼを安定的に発現しているＵ８７細胞を集めて、培養液／マトリジェル混合液（ｖ／ｖ＝１／１）で再懸濁した。２００万個の細胞を含む細胞浮遊液１００μｌをマウスの右脇腹の皮下に注射した。
【０１１１】
キャリア
ＥＨＣＯを試験のために選択した。ＤＯＴＡＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡ導入のために用いられている市販のトランスフェクション試薬であり、対照キャリアとして用いた。
【０１１２】
ｓｉＲＮＡｓ
遺伝子抑制効果を生物発光法で非侵襲的に検出するために、抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを用いて、マウスのルシフェラーゼ発現をノックダウンした。低酸素で誘導できるファクタ−１ａ（Ｈｉｆ）は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を制御しており、抗Ｈｉｆ−ｓｉＲＮＡ複合体の腫瘍内注入によりｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖が抑制された。ホタルルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（イリノイ州シカゴ）から購入した。アンチセンスの配列は５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’であり、センスの配列は３’−ｄＴｄＴＡＧＣＵＵＣＡＵＧＡＧＵＣＧＣＡＵＵＣ−５’である。ＨＩＦを標的とするｓｉＲＮＡはユタ大学のハンツマン癌研究所から提供された。アンチセンスの配列は５’−ＵＣＡＣＣＡＡＡＧＵＵＧＡＡＵＣＡＧＡｄＴｄＴ−３’であり、センスの配列は３’−ｄＴｄＴＡＧＵＧＧＵＵＵＣＡＡＣＵＵＡＧＵＣＵ−５’である。
【０１１３】
抗Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の投与及びルシフェラーゼマウスのイメージング
マウスの生物発光イメージングは、抗ルシフェラーゼ複合体を投与する１日前に行った。ＰＢＳに溶解したホタルのＤ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州アラメダ）５０ｍｇ／ｋｇ、ケタミン１００ｍｇ／ｋｇ及び塩酸キシラジン１０ｍｇ／ｋｇ（いずれもＳｉｇｍａ）をマウスの腹腔内に投与した。１秒の照射時間でＩＶＩＳ  １００イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて、投与１０分後にマウスを中間のビニングで撮影した。イメージは、リビングイメージソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて定量化した。翌日、３００μｌに溶解した５０μｇ抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡをＥＨＣＯ又はＤＯＴＡＰに混合し、得られた複合体をマウスの腹腔内に全身投与した。ｓｉＲＮＡ複合体投与の２日後にマウスの生物発光イメージングを実施した。抗Ｌｕｃ複合体を投与される１日前の発光シグナル強度を１００％として、ｓｉＲＮＡ投与後のマウスのルシフェラーゼ発現レベルを０日に対するパーセントで標準化した。
【０１１４】
図２２は、ＥＨＣＯの２回投与後に、腫瘍でのルシフェラーゼ発現が５０％を超えて減少したことを示す。一方、ＤＯＴＡＰのみでは最初の投与後に初期効果がみられたが、２回目の投与後では有意な効果はなかった。
【０１１５】
抗Ｈｉｆ−ｓｉＲＮＡ複合体の投与及び腫瘍径の測定
抗Ｈｉｆ−ｓｉＲＮＡ複合体は腫瘍細胞移植の２１日後に投与した。１群のマウス（ｎ＝６）にｓｉＲＮＡ複合体を最初の３週間は週２回、４週目は週１回腹腔内に投与した。ｓｉＲＮＡ複合体の投与は合計７回繰り返した。他の群（ｎ＝８）は対照として用いた。２〜４日ごとにデジタルノギスで腫瘍体積を測定することによって腫瘍の成長をモニターした。腫瘍の成長はデジタルノギスを用いて測定した。腫瘍体積は、式（０．５２×長径×短径２）によって計算した。マウスに抗Ｈｉｆ−ｓｉＲＮＡ複合体を投与した日を０日とし、その腫瘍体積を１００％とした。すべての腫瘍体積を０日の腫瘍体積に対する割合として表した。
【０１１６】
予備試験では、Ｕ８７−ｌｕｃ神経膠腫異種移植片を用いたマウス皮下腫瘍移植モデルにおいて、ＥＨＣＯは、抗ＨＩＦ−ｓｉＲＮＡの全身腹腔内投与の高い抗腫瘍効果を仲介した。ｓｉＲＮＡとして２ｍｇ／ｋｇの低用量でＥＨＣＯ／抗ＨＩＦ−ｓｉＲＮＡナノ粒子を投与した６匹のマウスのうち５匹は、投与２７日後に明らかな反応を示した。図２３は、投与期間中、投与に反応したマウスの相対的な腫瘍体積変化及び未投与マウスの相対的な腫瘍体積変化を示す。投与群中の無反応マウスの腫瘍成長曲線も図２３に示す。
【０１１７】
ＩＩ．ジスルフィド多機能性化合物及びその特徴
Ａ．概要
塩化２−クロロトリチル樹脂（１．１ｍｍｏｌ／ｇ）、Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン（Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）、Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）、２−アセチルジメドン（Ｄｄｅ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロほう酸塩（ＴＢＴＵ）及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をＥＭＤバイオサイエンス社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。トリエチレンテトラミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）、アクリル酸メチル、１，２−エチレンジアミン、ヒドラジン、４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール（ＤＴＴ）、トリイソブチルシラン（ＴＩＢＳ）、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をランカスター社（ニューハンプシャー州ウインダム）から購入した。超分岐ＰＥＩ（Ｍｗ＝２５ＫＤａ）、ヘパリン硫酸塩、リン酸クロロキン（ＣＱ）及び２，５−ジフェニール−３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）テトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）をシグマ−オルドリッチ社（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジメタンクロライド（ＤＣＭ）は超乾燥溶剤であり、アクロス社（ペンシルベニア州ピッツバーグ）から購入した。固相合成については、他の記載を除くと、フリットとキャップを備えたＩＳＯＬＵＴＥカラム容器（ヴァージニア州シャーロッツビル）の中で反応は行われた。ルシフェラーゼをコードするｇＷｉｚレポータープラスミドをアルデブロン社（ノースダコタ州ファーゴ）から購入した。ホタルルシフェラーゼを標的としたｓｉＲＮＡをダルマコン社（イリノイ州シカゴ）から購入した。ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列は、５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ−３’であり、センス配列は、３’−ｄＴｄＴＡＧＣＵＵＣＡＵＧＡＧＵＣＧＣＡＵＵＣ−５’である。合成に用いる前に、アミンを減圧蒸留によって精製した。他の全ての材料と溶剤は、追加の精製を行うことなく使用した。トリエチレンテトラミンは減圧蒸留で浄化された。すべてのその他の材料と溶媒は追加精製なしで使用された。
【０１１８】
Ｂ．合成手順
図２４は、第一、第二及び第三の荷電官能基を有するジチオール含有単量体の樹脂担持合成を示す。図２５は、酸化重合によるポリジスルフィドオリゴマーの合成を示す。以下の記号は、図２８と２９における記号と同じである。
【０１１９】
１−［２−クロロトリチル−アミノ］−１，４，７，１０−テトラアザデカン樹脂（樹脂２）
塩化２−クロロトリチル樹脂（３００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ／ｇ）を反応槽に入れ、乾燥ＤＣＭを用いてよく洗浄した。トリエチレンテトラアミン（１ｍｌ）とＤＩＰＥＡ（６４ｍｇ）のＤＣＭ溶液を樹脂に加え、その懸濁液を２時間、振盪した。溶媒を排出し、次に、ＤＣＭとＭｅＯＨを用いて洗浄した。樹脂を１０ｍｌのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７／２／１、ｖ／ｖ／ｖ）と共に、さらに２０分間振盪した。得られた樹脂２をＤＭＦ、ＤＣＭを用いてよく洗浄し、減圧で乾燥した。
【０１２０】
２−アセチルジメドン（Ｄｄｅ−ＯＨ）及びｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を用いたポリアミンの選択的保護と脱保護
２−アセチルジメドン（Ｄｄｅ−ＯＨ，２ｇ）を１０ｍｌのＤＭＦに溶解した溶液を樹脂２に加えた。その懸濁液を、室温で１２時間、振盪した。ＤＭＦとＤＣＭを用いて樹脂をよく洗浄し、溶媒を排出し、樹脂３を得た。樹脂３は、Ｂｏｃ２Ｏ（１０ｇ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶解した溶液で懸濁した。その混合物を、室温で４時間、振盪した。得られた樹脂をＤＭＦとＤＣＭを用いてよく洗浄し、その後、減圧で乾燥して、樹脂４を得た。次に、２％ヒドラジンのＤＭＦ溶液で１５分間、樹脂４を懸濁した。このステップは、Ｄｄｅ基の完全な脱保護を確実にするために３回繰り返した。ＤＭＦとＤＣＭを用いて得られた樹脂をよく洗浄し、樹脂５を得た。次のステップのために、それを減圧で乾燥した。
【０１２１】
アクリル酸メチル、１，２−エチレンジアミン、Ｎ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン及びＮ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システインを用いた連続伸長
乾燥樹脂５を１００ｍｌのナス型フラスコに移し、アクリル酸メチル（５０ｍｌ）とＤＭＦ（１０ｍｌ）を加えた。ロータリーエバポレーターにて、５０℃で連続振盪し、反応を行った。第一アミンが完全に消費されるまで、カイザーニンヒドリン試験で反応をモニターした。ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＤＣＭを用いて樹脂６をよく洗浄し、減圧で乾燥した。
【０１２２】
次のステップのために、１，２−エチレンジアミン（５０ｍｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した溶液を樹脂６に加えた。ロータリーエバポレーターにて、５０℃で５日間連続振盪し、反応を行った。ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＤＣＭを用いてこの樹脂をよく洗浄し、減圧で乾燥して樹脂７を得た。
【０１２３】
次の固相反応のために、フリットとキャップを備えたＩＳＯＬＵＴＥカラム容器の中に樹脂を移した。活性化Ｎ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン（２ｇ）と、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡをＤＭＦに溶解した溶液を樹脂７に加え、カップリング反応を２時間続けた。カップリングの質は、カイザー試験で追跡した。この樹脂を数回洗浄し、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液に樹脂を懸濁（２０分×３）することでフルオレニルメトキシカルボニル保護基を除去して、樹脂８を得た。次に、次のステップのために、ＤＭＦ及びＤＣＭを用いてこの樹脂をよく洗浄し、減圧で乾燥した。
【０１２４】
続いて、活性化Ｎ−α−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（２ｇ）と、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡをＤＭＦに溶解した溶液を樹脂８に加え、カップリング反応を２時間続けた。カップリングの質は、カイザー試験で追跡した。この樹脂をよく洗浄し、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液を用いてフルオレニルメトキシカルボニル保護基を除去した。次に、次のステップのために、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ及びＤＣＭを用いて樹脂９をよく洗浄した。
【０１２５】
樹脂からの単量体の開裂と脱保護
樹脂９をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＩＢＳ（９４／２．５／２．５／１）溶液中で懸濁した。室温で３時間振盪した後に、溶液を回収し、減圧下で凝縮した。残留物を冷ジエチルエーテルで洗浄し（４０ｍｌ×５）、乾燥した。単量体１０を分取用ＨＰＬＣでさらに精製し、６０ｍｇの生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δδ８．４５（ｍ，２Ｈ），７．２（ｍ，２Ｈ），４．５（ｍ，２Ｈ），４．０５（ｍ，２Ｈ），３．２−２．８（ｍ，２４Ｈ），２．７−２．５（ｍ，８Ｈ），２．４−２．３（ｍ，４Ｈ）ＭＳ  ｍ／ｚ  計算値Ｃ３４Ｈ６２Ｎ１６Ｏ６Ｓ２（Ｍ＋Ｈ）＋＝８５５．４５は、８５５．５０に検出された。
【０１２６】
ＤＭＳＯ中の酸化重合
酸化重合は３６ｍｇの単量体１０を用いて、１００ｍｌのＤＭＳＯ中、３７℃で行った。酸化重合の間の一定の時間ポイントで、反応混合物を分取し、ＦＰＬＣで分子量を測定した。重合は５日間行った。アセトン（１０ｍｌ）を用いた析出でポリマー残渣を得、さらに超純水（ＭＷＣＯ＝２０００）に対するオーバーナイトの透析によって精製した。最終生成物を凍結乾燥で乾燥した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ８．３４（ｍ，２Ｈ），７．１２（ｍ，２Ｈ），４．５（ｍ，２Ｈ），４．１（ｍ，２Ｈ），３．２−２．８（ｍ，２４Ｈ），２．７−２．５（ｍ，８Ｈ），２．４−２．３（ｍ，４Ｈ）Ｍｗ＝６．２Ｋ（ＳＥＣで測定した）。
【０１２７】
Ｃ．ポリジスルフィド及びポリジスルフィド／ＤＮＡ複合体の特徴
ゲル電気泳動シフトアッセイ
ポリジスルフィド１１（ＰＤＳ）がＤＮＡに結合する能力をゲル電気泳動によって調べた。０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含むアガロースゲル（０．８％，ｗ／ｖ）をＴＡＥ緩衝液（トリス酢酸塩−ＥＤＴＡ）中に準備した。ＤＮＡ（１０μｌ，０．１μｇ／μｌ）に、規定のＮ／Ｐ比（Ｎ＝プロトン化できる窒素、Ｐ＝ＤＮＡ上のリン酸基）である等量の重合溶液を混合し、使用する前に３０分間インキュベートした。それぞれの１０μｌサンプルに２μｌの６×ローディングダイを混合し、その混合物をアガロースゲルにロードした。１００Ｖで６０分間、ゲルの電気泳動を行った。ＤＮＡのバンドの位置をＵＶ照射装置上で可視化した。
【０１２８】
０．１５Ｍ  ＮａＣｌ又は１ｍｇ／ｍｌヘパリンの存在下又は非存在下で、０．１Ｍ  ＤＴＴとポリプレックス（polyplexes）（Ｎ／Ｐ＝３）を３７℃で４時間インキュベートすることによって、ＰＤＳ／ＤＮＡポリプレックスを不安定にする還元条件の能力を調べた。サンプルは上述のようにゲル電気泳動によって分析した。
【０１２９】
図２６は、示されたＮ／Ｐ比でのゲル電気泳動シフトアッセイの結果を示す。レーン１：ＤＮＡのみ；レーン２〜４：単量体／ＤＮＡ複合体；レーン５〜９：重合体／ＤＮＡ複合体。（ｂ）ＮａＣｌ又はヘパリン存在下での還元はポリプレックスを不安定にする。Ｎ／Ｐ比３でのポリプレックスを試験に用いた。レーン１〜４はＤＴＴ非存在下で実施し、レーン５〜８は０．１Ｍ  ＤＴＴの存在下で実施した。ポリプレックスは３７℃で４時間インキュベートした。レーン１：ＤＮＡのみ；レーン２：ポリプレックスのみ；レーン３：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ存在下でのポリプレックス；レーン４：０．１ｍｇ／ｍｌヘパリン存在下でのポリプレックス；レーン５：ＤＮＡのみ；レーン６：ポリプレックスのみ；レーン７：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ存在下でのポリプレックス；レーン８：０．１ｍｇ／ｍｌのヘパリン存在下でのポリプレックス。（ＮＤ＝ネイキッドＤＮＡ，Ｏ．Ｃ．＝オープンサーキュラー，Ｓ．Ｃ．＝プラスミドＤＮＡの超らせん構造）
【０１３０】
図２６（ａ）に示されるように、単量体はＮ／Ｐ比９以下ではウェル内のＤＮＡ移動を遅延させることができない。それに対して、ポリジスルフィドによれば、Ｎ／Ｐ比１１で移動を部分的に遅延させ、１．５以上のＮ／Ｐ比では完全に遅延した。塩（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）又は陰電荷のヘパリン（１ｍｇ／ｍｌ）存在下のＮ／Ｐ比３では、ポリプレックスは高い安定性を示した。図２６（ｂ）に示されるように、生理的なイオン強度及び競合生体高分子よって、検出可能なポリプレックスの解離は全く生じなかった。また、ポリプレックスからのＤＮＡの遊離を異なった条件下の還元環境で調べた。ジスルフィド還元剤であるＤＴＴが存在するとフリーのＤＮＡが遊離した。高イオン強度又はヘパリンの存在下では、さらに還元環境でのＤＮＡの遊離が促進された。この結果は、カチオン性のポリジスルフィドを用いたＤＮＡポリプレックスが、細胞外では安定であり、細胞内ではＤＮＡを遊離できるので、導入効率を高めることを示唆した。
【０１３１】
粒子サイズ分析
５．０μｇのプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡと適量の材料を無塵水中で混合したサンプル用意し、出力波長６３３ｎｍの５ｍＷヘリウムネオンレーザを装備したＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ社製の動的光散乱光度計ＢＩ−２００ＳＭシステムを用いて分析した。その装置に備わった機能を用いて拡散係数から有効径と集団分布を算出した。測定は９０度の角度、２５℃で行った。各サンプルは３連で分析し、データは平均値で表した。図２７は示されたＮ／Ｐ比でのＰＤＳ／ＤＮＡ及びＰＤＳ／ｓｉＲＮＡ複合体のサイズを示す。
【０１３２】
酸塩基滴定アッセイ
酸塩基滴定は６ｍｌのＰＤＳ又はＰＥＩ溶液（正電荷に基づいて５ｍＭ）を用いて実施した。最初のｐＨは１０に調整した。２μｌの１Ｍ  ＨＣｌで連続して滴定し、各添加後のｐＨを測定した。ＮａＣｌの５ｍＭ溶液を対照として同様に滴定した。ｐＨ滴定曲線によれば、エンドゾーム−リソゾームのｐＨ範囲（ｐＨ４．５〜７．２）では、ＰＤＳはＰＥＩと同様の緩衝能力を示した。これは重合体中の第一級アミノ基、第二級アミノ基、第三級アミノ基及び芳香族アミノ基の組み合わせ効果のためである。
【０１３３】
Ｄ．細胞培養実験
プラスミドＤＮＡ導入のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏプロトコール
ＣＯＳ−７細胞（ＳＶ４０ウイルスで形質転換したサル腎臓繊維芽細胞）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト白人の悪性乳腺腫上皮細胞）をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，米国メリーランド州ロックビル）から入手した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）でＣＯＳ７細胞を、ＡＴＣＣリーボビッツＬ−１５培地でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を３７℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気で培養した。培地には１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＨｙＣｌｏｎｅ社、ユタ州ローガン）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）を添加した。トランスフェクションの２４時間前に、２４穴プレートに細胞を播種した。トランスフェクション時に、１００μＭのクロロキンを添加又は無添加の無血清培地１ｍｌと各ウェルの培地を交換した。異なるＮ／Ｐ比で、重合体／ＤＮＡ複合体又はＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を細胞と共に３７℃で４時間インキュベートした。次に、培地を１ｍｌの新しい完全培地に交換し、さらに４４時間細胞をインキュベートした。すべてのトランスフェクション試験はすべて３連で実施した。インキュベーション後、２００μｌの細胞溶解緩衝液（プロメガ社，ウィスコンシン州マディソン）で処理した。ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ社，ウィスコンシン州マディソン）を用いてルミノメータ（Ｌｕｍａｔ  ９６０５，ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ）で、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を１０秒間測定した。相対的な光強度値（ＲＬＵ）は、細胞抽出液中のタンパク質濃度で標準化し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアス社、イリノイ州ロックフォード）によって測定した。ルシフェラーゼ活性は相対的な光強度値（細胞溶解液中のタンパク質量１ｍｇあたりのＲＬＵ）として表した。
【０１３４】
図２８ａは、１００μＭのクロロキン存在下又は非存在下で、異なったＮ／Ｐ比でのＰＥＩとネイキッドＤＮＡとを比較したＣＯＳ７細胞中のＰＤＳ／ＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率を示す。平均±標準偏差（ｎ＝３）。図２８ａに示されるように、複合体が介したときのルシフェラーゼ発現レベルはＮ／Ｐ比に依存していた。ポリジスルフィドはＮ／Ｐ比１００で最も高い効率で遺伝子導入を仲介し、同様の遺伝子導入能力はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でも認められた（データ未記載）。最適のトランスフェクションのためには相対的に高い電荷比がカチオン性ポリジスルフィドに必要であり、それは、他の報告されている生物分解性の遺伝子キャリアと同様であった。それにもかかわらず、ＰＤＳポリプレックス（Ｎ／Ｐ＝１００）の毒性はＰＥＩ（Ｎ／Ｐ＝１０）に比べて低かった。Ｎ／Ｐ比の増加に従ってそのサイズが減少した（Ｎ／Ｐ＝４０で直径３２０ｎｍからＮ／Ｐ＝８０で直径１３５ｎｍ；支援情報参照）ことから、トランスフェクション効率はポリプレックスのサイズと相関しているかもしれない。最適Ｎ／Ｐ比では、ポリジスルフィドはＣＯＳ７細胞中でＰＥＩに比べて遺伝子発現が約３倍低かった。エンドゾーム膜を破壊することが知られている試薬であるリン酸クロロキン（ＣＱ，１００μＭ）の存在は、ポリジスルフィドを介した遺伝子発現をほとんど改善しなかった。そのことは、カチオン性ポリジスルフィドにはポリプレックスがエンドソーム小器官から逃れることを助けることに貢献するであろう高い緩衝能力があることを示している。
【０１３５】
ｓｉＲＮＡ導入のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏプロトコール
構成的にホタルルシフェラーゼを発現しているヒト星状細胞腫細胞株Ｕ３７３ＭＧ（Ｕ３７３−Ｌｕｃ）は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む組み換えレトロウイルスをＵ３７３ＭＧ細胞に感染させることによって作製した（最初の保存株はユタ大学、ハンツマン癌研究所のＤｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅからの好意で供与された）。Ｕ３７３−Ｌｕｃ細胞は、１０％のウシ胎児血清、Ｇ４１８（３００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びペニシリン（１００単位／ｍｌ）を含むＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）で培養した。
【０１３６】
トランスフェクションの２４時間前に、Ｕ３７３ＭＧ−Ｌｕｃ細胞を２０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレートに播種した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション時に、各ウェルを無血清又は血清含有の新しい培地に交換した。異なったＮ／Ｐ比で、キャリア／抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの複合体を細胞と共に３７℃で４時間インキュベートした。次に、培地を１ｍｌの新しい完全培地と交換し、さらに細胞を４４時間インキュベートした。トランスフェクション試験はすべて３連で実施した。細胞をペレットにし、１００μｌの細胞溶解緩衝液（プロメガ社）で再懸濁し、凍結融解を２回実施した。細胞残屑を１４，０００ｇで１分間遠心し、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）を用いて、２０μｌの上清をアッセイした。
【０１３７】
図２８ｂは、異なった条件下におけるＵ３７３−Ｌｕｃ細胞中でのＰＤＳ／ｓｉＲＮＡ又はＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体による内因性のルシフェラーゼ遺伝子の抑制効果を示す。ＡとＢは、無血清条件下で、それぞれ１００ｎＭと１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で実施した。ＣとＤは、１０％のＦＢＳ存在下で、それぞれ１００ｎＭと１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で実施した。平均±標準偏差（ｎ＝３）。ＰＤＳ／ｓｉＲＮＡを介したルシフェラーゼ抑制効果は低いｓｉＲＮＡ濃度（１０ｎＭ）であっても、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡと同様の効果であった。ルシフェラーゼ発現は、無血清培地中でポリジスルフィド／ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｐ＝３０）複合体及びＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｐ＝１０）複合体ともに３０％まで抑制された（図２８ｂ）。興味深いことに、１０％ＦＢＳの存在下では、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子抑制効果はなく、これはポリプレックスと血清蛋白質の好ましくない相互作用のためと考えられる。同様の条件下で、ポリジスルフィド／ｓｉＲＮＡ複合体は依然として４０％以下の遺伝子抑制効果を有する血清親和性を示した。
【０１３８】
細胞毒性アッセイ
ＰＥＩとの比較における、ポリジスルフィドの細胞毒性は、ＭＴＴアッセイを用いて評価した。アッセイの２４時間前に９６穴プレートに１００００細胞／ウェルの密度でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を播種した。異なった濃度の重合体又は異なったＮ／Ｐ比のポリプレックスを含む２００μｌのＬ−１５完全培地で細胞を培養した。４時間後、各ウェルの培地を１００μｌの新しい完全培地に交換した。ＰＢＳで溶解した２５μｌのＭＴＴ溶液を添加し、さらに細胞を２時間培養した。培養液を除去し、２００μｌのＤＭＳＯをウェルに加え、３７℃で５分間インキュベートした。吸光度はマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ５５０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．カリフォルニア州ヘラクレス）を用いて５７０ｎｍで測定した。相対的な細胞生存率は「（［Ａｂｓ］ｓａｍｐｌｅ−［Ａｂｓ］ｂｌａｎｋ）／（［Ａｂｓ］ｃｏｎｔｒｏｌ−［Ａｂｓ］ｂｌａｎｋ）×１００％」として算出した。図２９Ａは、ＰＤＳ及びＰＥＩ濃度に対する相対的な細胞生存率を示し、図２９Ｂは、ＰＤＳ及びＰＥＩのＮ／Ｐ比に対する相対的な細胞生存率を示す。カチオン性のＰＤＳはＰＥＩに比べてはるかに低い細胞毒性であった。
【０１３９】
ＩＩＩ．ＭＦＣを介する核酸のターゲッティング導入のための方法
ボンベシン−ＰＥＧ−Ｍａｌ複合体の合成
２つの連続する６アミノ酸単位を有するボンベシン（７−１４）を固相担持樹脂上で合成した。ボンベシンペプチドを分取用ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥し、ＮＨＳ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌと反応させてＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ複合体を得た。図３０に合成の手順を示す。ＢＮ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌの分子量はＭＯＬＤＩ−ＴＯＦで確認した。
【０１４０】
ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ複合体の合成
環状ペプチドｃ（ＲＧＤｆＫ）はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。それをＮＨＳ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌと反応させてＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌを得た。図３１に合成の手順を示す。ＢＮ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌの分子量はＭＯＬＤＩ−ＴＯＦで確認した。
【０１４１】
ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡ又はＭＦＣ／ＤＮＡナノ粒子の表面修飾の基本手順
ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡ又はＭＦＣ／ＤＮＡナノ粒子の表面修飾は、チオールマレイミド反応を利用することによって実施した。図３２にＭＦＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を機能させるための一般的手順を示す。例えば、１μｇのｓｉＲＮＡを９ｎｍｏｌのＭＦＣ−ＥＨＣＯと結合させ、適量のマレイミドを含む機能分子を添加した（０．２２５ｎｍｏｌのＢＮ−ＰＥＧ−ＭａｌではＢＮ／ＥＨＣＯモル比に基づくと２．５％程度のＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌを修飾した）。ナノ粒子は異なったマレイミド含有分子、例えば、ｍＰＥＧ−Ｍａｌ、ＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ又はＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌとの反応によって修飾される。同様にして、フルオレセイン−５−マレイミドを用いて蛍光標識したナノ粒子を得た。暗所で２時間インキュベートした後、遊離マレイミド誘導体を遠心（Ｎａｎｏｓｅｐ，ＭＷＣＯ＝１００Ｋ，５０００ｇ，５分）にて除去し、ナノ粒子複合体を次の実験のために回収した。
【０１４２】
蛍光顕微鏡
１２穴の細胞プレートに、１ウェル当たり約１０万個のＵ８７細胞を播種した。蛍光標識されたＭＦＣ／ＤＮＡナノ粒子を上述のように準備した。リガンドを有する複合体の場合、適量のＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ、ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ又はｍＰＥＧ−Ｍａｌを複合体混合物に添加した。暗所で２時間インキュベーションした後、遊離のマレイミド誘導体を遠心（Ｎａｎｏｓｅｐ，ＭＷＣＯ＝１００Ｋ，５０００ｇ，５分）にて除去した。回収したサンプルを細胞に施し、３７℃で２時間インキュベートした。培地を吸引によって除去し、細胞を冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、ウェル当たり１ｍｌのＰＢＳで溶解した４％ＰＦＡを用いて４℃で２０分間固定した。固定試薬を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。そのサンプルを蛍光顕微鏡で観察した。腫瘍特異的なペプチドを修飾したナノ粒子は、非標的ナノ粒子に比べて癌細胞中に有意な取り込みを示した（図３３）。
【０１４３】
ＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾ナノ粒子の細胞内取り込み
試験の２４時間前に、６穴プレートに、１ウェルあたり約５０万個のＵ８７細胞を播種した。蛍光標識されたＥＨＣＯ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、上述のように準備した。ＥＨＣＯ／ｓｉＲＮＡナノ粒子形成後、適量のＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ又はｍＰＥＧ−Ｍａｌを混合物に添加した。暗所で２時間インキュベートしたのち、遊離のマレイミド誘導体を遠心（Ｎａｎｏｓｅｐ，ＭＷＣＯ＝１００Ｋ，５０００ｇ，５分）にて除去した。回収したサンプルを細胞に添加し、３７℃でインキュベートした。２時間後、培地を吸引によって除去し、細胞を冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、トリプシン処理した。細胞を集め、ＰＢＳで溶解した２％ＰＦＡを用いて４℃で２０分間固定した。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。その結果は、ＷｉｎＭＤＩソフトウエア（ｖｅｒ．２．９）（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｔｒｏｔｔｅｒ）を用いて解析した。
【０１４４】
図３４は、受容体関与エンドサイトーシスを介する標的ナノ粒子による細胞内取り込み効率（２．５％ＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾）が、非特異的なエンドサイトーシスを介する非修飾性のナノ粒子による細胞内取り込み（Ｂｌａｃｋ）と同等であり、２．５％ｍＰＥＧ−Ｍａｌで修飾したＭＦＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子による細胞内取り込みに比べて有意に高いことを示している。この結果は、ナノ粒子のペグ化が非特異的な細胞内取り込みを低下させ、標的基の導入により受容体関与エンドサイトーシスを強化することを示唆する。未処置の細胞は陰性対照として用いた。
【０１４５】
ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾ナノ粒子の細胞内取り込み
試験の２４時間前に、６穴プレートに、１ウェル当たり約５０万個のＵ８７細胞を播種した。蛍光標識したＭＦＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を、上述のように準備した。ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子形成後に、適量のＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ又はｍＰＥＧ−Ｍａｌを混合物に添加した。暗所で２時間インキュベートしたのち、遊離のマレイミド誘導体を遠心にて除去（Ｎａｎｏｓｅｐ，ＭＷＣＯ＝１００Ｋ，５０００ｇ，５分）した。回収したサンプルを細胞に添加し、３７℃でインキュベートした。２時間後、培地を吸引にて除去し、細胞を冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、トリプシンで処理した。細胞を集め、ＰＢＳで溶解した２％ＰＦＡを用いて４℃で２０分間固定した。サンプルはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１４６】
図３５は、標的ナノ粒子による細胞内取り込み（青、２．５％ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾）が、非標的性のナノ粒子による細胞内取り込み（紫、２．５％ｍＰＥＧ−Ｍａｌ修飾）に比べて有意に高いことを示しており、それは、ナノ粒子中のＲＧＤペプチドの導入が受容体関与エンドサイトーシスを強化することを示唆する。未処置の細胞は陰性対照として用いた。
【０１４７】
シクロ（ＲＧＤｆＫ）のプレインキュベーションによってＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾されたナノ粒子の細胞内取り込み競合
試験の２４時間前に、６穴プレートに、１ウェル当たり約５０万個のＵ８７細胞を播種した。蛍光標識したＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾ナノ粒子を上述のように準備した。競合実験では、細胞を１００倍モルの過剰量のシクロ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドと共に４℃で３０分間プレインキュベートした。次に、ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾ナノ粒子を細胞に添加し、３７℃でインキュベートした。２時間後、培地を吸引によって除去し、冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、トリプシン処理した。細胞を集め、ＰＢＳに溶解した２％ＰＦＡを用いて４℃で２０分間固定した。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１４８】
図３６は２．５％のＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ修飾標的ナノ粒子を介した細胞内取り込み効率を示す。１００倍モルの過剰量のシクロ（ＲＧＤｆＫ）ペプチドとプレインキュベートした細胞は、ＲＧＤペプチドが無い培地の細胞に比べて取り込み効率が低かった。
【０１４９】
標的ＭＦＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の静脈内投与
（動物腫瘍モデル）
Ｕ８７細胞を集め、培地／マトリゲル混合物（ｖ／ｖ＝１／１）で再懸濁した。２００万個の細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液をマウスの右脇腹の皮下に注入した。ＭＦＣ−ＥＨＣＯを試験で用いた。ＨｉｆはＶＥＧＦの発現を制御する低酸素誘導性の因子１ａであり、抗Ｈｉｆ−ｓｉＲＮＡによるＨｉｆの発現抑制によって腫瘍の成長が抑制された。腫瘍の成長を抑制について抗Ｈｉｆ−ｓｉＲＮＡを試験した。
【０１５０】
（ｓｉＲＮＡ複合体の投与と腫瘍サイズの測定）
抗Ｈｉｆ−ｓｉＲＮＡ複合体を腫瘍細胞移植２１日後に投与した。ｓｉＲＮＡを４０μｇ含む複合体２００μｌを静脈内投与にてマウスに全身投与した。各群のマウス（ｎ＝５）に静脈内投与にてｓｉＲＮＡ複合体を投与した。各群においてマウスにナノ粒子又は溶液を投与した。具体的には、群１：ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体、群２：ネイキッドｓｉＲＮＡ、群３：ｍＰＥＧ修飾ＥＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体（修飾度：２．５％）、群４：ＢＮ−ＰＥＧ修飾ＥＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体（修飾度：２．５％）、群５：ＲＧＤ−ＰＥＧ修飾ＥＨＣＯ／ｓｉＲＮＡ複合体（修飾度：２．５％）。しかしながら、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を投与したマウスのすべてが投与直後に死亡した。これは、おそらくＰＥＩの高い毒性のためであると考えられる。
【０１５１】
残りのマウスの腫瘍の成長を２〜４日ごとにデジタルノギスで腫瘍体積を測定することによってモニターした。腫瘍体積は、式（１／６）πＤ１２Ｄ２（Ｄ１は測定された短径）を用いて計算した。マウスにｓｉＲＮＡを投与した日を０日とし、その腫瘍体積を１００％として標準化した。投与後のすべての腫瘍体積を０日の腫瘍体積に対する割合として表した。ペプチドで標的としたｓｉＲＮＡナノ粒子は、投与後２週間、腫瘍の成長を抑制したが、非標的性の導入システム及びｓｉＲＮＡのみを投与されたマウスでは有意な腫瘍の成長が認められた。図３７は２．５％ペプチド修飾ＥＨＣＯ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の静脈内投与を示し（ＢＮ−ＰＥＧ−Ｍａｌ，青；ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｍａｌ，オレンジ）、それらのナノ粒子は、非標的性のＭＦＣ／ｓｉＲＮＡナノ粒子（２．５％ｍＰＥＧ−Ｍａｌ修飾ナノ粒子）や、ネイキッドｓｉＲＮＡ溶液に比べて有意にマウスの腫瘍の成長率を抑制した。
【０１５２】
本明細書全体にわたって、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本明細書に記載される本発明の化合物、組成物及び方法をより完全に記載するために、参照することによりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０１５３】
様々な変形及び変更が、本明細書に記載される本発明の化合物、組成物及び方法になされる可能性がある。本明細書に記載される本発明の化合物、組成及び方法の他の実施態様は、本明細書に開示される本発明の化合物、組成及び方法の仕様及び実施の考察から明らかである。特定例及び実施例は例示であるとみなされることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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