(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーフルオロクラウンエーテルおよびガドリニウム錯体を含む乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子を含むイメージング用組成物であって、
界面活性剤を実質的に含まないか、または界面活性剤を含まず、
音響イメージング、光音響イメージング、超音波イメージング、または光学コヒーレンスイメージングにおいて使用するためのイメージング用組成物。
【請求項２】
パーフルオロクラウンエーテルは、パーフルオロ−１５−クラウン−５−エーテル、パーフルオロ−１２−クラウン−４−エーテル、およびパーフルオロ−１８−クラウン−６−エーテルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ガドリニウム錯体は、ガドテリドールであることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
薬剤、受容体リガンドまたは抗体などの、治療因子または標的化因子を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
蛍光色素のような色素または放射性核種などの検出因子を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記粒子の平均粒子径は、１００〜３００ナノメートル、好ましくは１５０〜２５０ナノメートルの間の値であり、たとえば、２００ナノメートルであることを特徴とする請求項１〜５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のイメージング用組成物を提供された対象をイメージングする方法であって、
前記組成物中の前記ＰＬＧＡ粒子をイメージングすることを含み、
イメージングは、音響イメージング、光音響イメージング、超音波イメージング、および光学コヒーレンスイメージングからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医用画像を向上させる造影剤に関する。特に、提供される造影剤は、細胞イメージング、細胞治療、インビボ標的化、および薬剤送達用途に有用である。
【背景技術】
【０００２】
細胞治療は、糖尿病、心臓病、および癌などの疾患を潜在的に治療する非常に将来有望な分野である。細胞治療の何らかの形態に関する進行中の臨床試験は１５，０００を超える（www.clinicaltrials.gov）。細胞治療の発展および好適化における主要なハードルは、非侵襲的な方法で、患者の体内における細胞を一度に観察するための手段が不足していることである。
【０００３】
イメージングは、患者の体内において治療細胞を、それらの生存能力、局在、数および機能性の観点から、一度に観察するための臨床的に利用可能な解決法を提供するかもしれない（Srinivas M, Aarntzen EH, Bulte JW, Oyen WJ, Heerschap A, de Vries IJ, Figdor CG. Imaging of cellular therapies. Adv Drug Deliv Rev. 2010 Aug 30;62(11):1080-93 を参照）。
【０００４】
１Ｈ  ＭＲＩ、１９Ｆ  ＭＲＩ、蛍光イメージング、ならびに超音波および光音響イメージングのような音響イメージング技術などの多くのイメージング技術を用いて細胞を可視化することができるように、細胞を標識化するために好適な薬剤を開発することが試みられている。
【０００５】
医用イメージング法における超音波の使用は、当分野でよく知られている。それは最も頻繁に使用される臨床画像診断技術である。超音波は、確立された安全記録を有する経済的で非侵襲的なリアルタイム技術として知られている。それは長期的研究に使用することができ、反復使用は身体にとって有害ではない。超音波装置はイオン化放射線を全く発生せず、それらの操作は放射性同位体の使用を伴わない。超音波イメージングを実施するための装置は、携帯することでき、既に広く使用されている。超音波イメージングは潜在的に定量的であり、それは全身イメージング技術ではなく、したがって、標的の器官に限定される。超音波イメージングは、画像深度に関して限定される。
【０００６】
典型的には、気体が充満した微小気泡が、超音波イメージングにおける造影剤として採用される。それらは通常、比較的大きな寸法（１０００〜１００００ｎｍの直径）を有し、一般的には細胞標識化に不向きである。さらに、それらは、たとえば腫瘍イメージングなどにおける小さな血管をイメージングすることにも不向きである。そのような気体が充満した微小気泡は短い存続期間を有し、典型的には数秒から数分である。それらは、気泡が破裂するときに細胞に損傷が生じるというさらなるデメリットも有する。さらに、気体が充満した微小気泡は不安定であるので、それらは非常に長い時間保存することができず、それらは典型的には水和後直ちに使用しなければならない。最後に、そのような大きな薬剤は、血液循環に残しておくことができないので、インビボ標的化または薬剤送達用途のための非常に限定された機会を提供する。それらの大きな寸法は、腎臓による迅速なクリアランスを促進し、インビボにおけるそれらの有用な存続期間をさらに制限する。
【０００７】
超音波造影剤、およびそれらの使用は、超音波造影剤：基本原理において概説されている（Eur J Radiol. 1998 May;27 Suppl 2:S157-60 and Kiessling et al., Theranostics 2011, volume 1, 127-134）。
【０００８】
米国特許出願第２０１００１５８８１５号明細書は、細胞の超音波可視化を向上するために細胞に内在化される造影剤の使用を記載している。このことは、しかしながら、造影剤が気体であり、数時間を超える細胞追跡について不安定であるという本来的なデメリットを有する。
【０００９】
米国特許出願第２０１１００２０２３９号明細書は、イメージング用途のためにエクスビボで細胞を標識化するための方法を提供しているが、特定の造影剤を何も詳細に記載していない。
【００１０】
今日まで記載された多くの造影剤にもかかわらず、細胞イメージング、好ましくは、超音波および光音響イメージング技術に適切な、安定で、手頃な価格の、効果的な造影剤が非常に必要とされている。細胞を、検出のための、好適なトレーサーまたは造影剤で標識化することができれば、これらの両者は、治療細胞を観察する申し分のない方法である。その技術は、好ましくは定量的であるべきである。さらに、安定な超音波造影剤は、超音波血管造影法、腫瘍イメージングなどにも応用することもできる。
【発明の概要】
【００１１】
発明者らは、粒子の超音波および光音響可視化は、粒子が金属と組み合わせたフッ素化有機化合物を含む場合に非常に向上することを見出した。
【００１２】
そのような粒子は、光音響および超音波イメージング、Ｔ１およびＴ２強調画像を含む、１９Ｆイメージング、１ＨイメージングなどのＭＲＩイメージング、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、シンチグラフィ、ならびに蛍光イメージングなどの、定性的または定量的イメージングにおいて有利に採用されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、本明細書において、超音波および他の検出法に使用するための改良された造影剤を提供する。本発明者らは、本明細書において、金属と組み合わせたフッ素化有機化合物を含む粒子を記載している。本発明者らは、液体パーフフルオロカーボンと金属とを含む乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子の例を示す。そのような粒子は、超音波イメージングに限らず、ＭＲＩイメージング（１Ｈおよび１９Ｆ）において向上された性能を有することが示された。粒子は、蛍光色素、またはルシフェラーゼ（もしくはルシフェラーゼをコードする核酸）のいずれかが粒子内に組み込まれた場合、蛍光イメージング、または生物発光を用いて検出されてもよい（Pharm Res 2004; 21:354-364）。
【００１４】
用語「乳酸−グリコール酸共重合体」またはＰＬＧＡは、当該技術分野において認められている用語であり、可変の長さおよび組成の、乳酸およびグリコール酸モノマーの生分解可能なポリマーを意味する。ＰＬＧＡ粒子は、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ、Curr Drug Deliv. 2004 Oct;1(4):321-33）などの追加のポリマーを含んでもよい。ＰＬＧＡ粒子は、当分野において知られており、イメージングにおける使用が記載されている（たとえば、Biomaterials. 2010 Sep;31(27):7070-7）。ＰＬＧＡの構造は、化学式１で示される（ｘおよびｙは、それぞれ乳酸およびグリコール酸の単位の数を示す）。
【化１】
0006293149.tif 000002
【００１５】
気体が充満したＰＬＧＡ粒子は、超音波における使用も提案されている。中国特許出願第１０１５７４５３０号公報は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡマルチポリマー微小気泡超音波造影剤の使用であって、微小気泡がパーフルオロプロパン、デカフルオロブタン、または六フッ化硫黄などの気体を含む使用を記載している。
【００１６】
本発明者らは、液体フッ素化有機化合物を含む、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子は、超音波および光音響イメージングに特に適しており、そのような粒子の性能は、金属が粒子中に存在する場合に顕著に向上し得ることを見出した。
【００１７】
本明細書において使用されるような、用語「ａ」または「ａｎ」は、少なくとも１つを表す。したがって、フッ素化有機化合物は、１つ以上のフッ素化化合物として解釈されるべきである。
【００１８】
用語「粒子」は、当分野における通常の意味で本明細書において使用される。この用語は、具体的には、マトリックスポリマーの物理的特性によって、室温において乾燥した固体形態であるポリマー粒子を表す。
【００１９】
Invest Radiol. 2006 Mar;41(3):305-12, Radiology. 2013 Aug;268(2):470-80などの刊行物、さらにいくつかの刊行物は、本明細書に記載されたような「粒子」ではない「パーフルオロカーボンエマルジョン滴」を記載するために用語「パーフルオロカーボンナノ粒子」を使用している。唯一つの刊行物ＷＯ２９１２／１１３７３３は、特定のパーフルオロカーボンおよびガドリニウム造影剤を含む実際の粒子を列挙している。しかしながら、パーフルオロカーボンは、不活性担体として作用し、活性剤ではなく、粒子は肝細胞癌における１Ｈ  ＭＲＩに限定される。
【００２０】
したがって、リポソーム、ミセル、およびエマルジョン滴は、本明細書にて使用される用語である粒子には含まれない。なぜなら、これらは、液体でもある分散相の上の液体表面被覆（典型的には液体）からなるからである。本発明に係る粒子は界面活性剤を含まず、反復される凍結融解および凍結乾燥サイクルにも適している。エマルジョン滴は、凍結乾燥によって無傷に回復させることができず、エマルジョンは、軟凝集、クリーム化、癒着、およびオストワルド成長にさらされる。これらの効果は、本明細書において液体連続層に分散した固体として定義される「ゾル」としても知られる液体培地における粒子には当てはまらない。
【００２１】
さらに、本発明に係るもののような実際の粒子は、沈殿によって無傷に回復させることができない微小液滴の分散を含むエマルジョンとは異なり、沈殿させることができる。エマルジョン液滴は、生物学論文において、頻繁に不適切に「粒子」または「ナノ粒子」と称されるが、この用語は化学的に不正確であることに留意すべきである。
【００２２】
また、本明細書において使用されるような用語である粒子は、体積または質量などの、いくつかの物理的または化学的特性が原因で局在した小さな物体を示す。本発明の粒子は、たとえば５０〜５００ナノメートルなどの、１〜１０００ナノメートル、好ましくは１０〜１０００ナノメートルの寸法を有するマイクロ粒子またはナノ粒子である。寸法分布は、約１００〜３００などの、好ましくは約５０〜５００ナノメートル、たとえば２００ナノメートルの間のピークである。
【００２３】
好ましい実施形態において、粒子は生分解可能および／または生体適合性である。
【００２４】
溶液に共存するいくつかの粒子は、本発明の範囲内である、粒子状物質、またはコロイド状懸濁液、またはゾルを形成してもよい。粒子状物質との用語は、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子などの粒子から本質的に構成される組成物を示すために本明細書において使用される。
【００２５】
本明細書において使用されるような用語「液体」は、標準大気圧（約１０００ヘクトパスカル）で体温（３７℃）において単離形態にある場合、化合物の液体物理状態を表す。
【００２６】
用語「フッ素化有機化合物」は、１以上の共有結合した炭素およびフッ素原子を含む有機化合物として解釈されるべきである。特に有用なフッ素化有機化合物は、たとえば、フッ素化有機ポリマーである。好ましい実施形態において、フッ素化有機化合物は、パーフルオロカーボンである。
【００２７】
用語「パーフルオロカーボン」は、実質的に全ての、または全ての炭素−水素結合が炭素−フッ素結合によって置き換えられた、炭素化合物またはポリマーを表す。パーフルオロカーボンは、酸素などの他の元素を含むことができる。特に好ましいパーフルオロカーボンは、パーフルオロポリエーテル、パーフルオロクラウンエーテル、パーフルオロオクタン、およびパーフルオロオクチルブロミドを含む。
【００２８】
本明細書において例示されるような特定の用途において、本発明者らはパーフルオロクラウンエーテルを有利に使用した。用語「パーフルオロクラウンエーテル」（ＰＦＣＥ）は、安定な環構造において共有結合した、炭素、酸素およびフッ素を含む環状パーフルオロカーボンとして解釈されるべきである。典型的には、ＰＦＣＥはポリマーであってもよい。
【００２９】
特に有用なパーフルオロクラウンエーテルは、パーフルオロ−１５−クラウン−５−エーテルであり、その構造は化学式２で示される。
【００３０】
本発明に係る粒子は好ましくは実質的に界面活性剤を含まず、このことは、それらが、０．１％未満、好ましくは０．０１％未満、より好ましくは、たとえば０．０００１％または０．００００１％未満のような０．００１％未満の界面活性剤を含むことを意味することに留意すべきである。また、このことは、本明細書において、実質的に界面活性剤を含まないことを示す。好ましくは、粒子は全く界面活性剤を含まない。このことは、本明細書において、界面活性剤を含まないことを示す。
【化２】
0006293149.tif 000003
【００３１】
超音波および光音響イメージングにおいて、液体フッ素化ポリカーボンを含む粒子の性質は、当該粒子中に金属が含まれる場合、顕著に向上させることが可能であることが見出された。
【００３２】
用語「金属」は、遷移金属、アルカリ金属および希土類金属を含む、元素周期律表における金属として定義される元素を表す。特に、それは、金属錯体のような生体適合性のある形態にある金属を表す。特定の好ましい金属は、ガドリニウム（Ｇｄ）である。ガドリニウム錯体は、たとえば、ガドテリドールを含む「Ｐｒｏｈａｎｃｅ（登録商標）」と称される化合物などが市販されている。ガドテリドールの構造は、化学式３に示される。
【００３３】
したがって、本発明は、実質的に界面活性剤を含まない、好ましくは界面活性剤を含まない粒子であって、パーフルオロクラウンエーテル、およびガドリニウム錯体を含む粒子に関する。特に好ましい粒子は、ポリマーからなる粒子であり、より具体的にはＰＬＧＡ粒子である。
【化３】
0006293149.tif 000004
【００３４】
ＰＬＧＡ粒子は、幅広い寸法の範囲で合成されてもよい。有利には、前記粒子は細胞標識が実現可能であるような寸法を有し、特に有利な寸法分布は１５０〜２５０ｎｍなどの１００〜３００ナノメートル、たとえば約２００ナノメートルを含む。本明細書において、用語「約」または「およそ」は、プラスマイナス１０％を意味する。この寸法範囲は、インビボ標的化用途のための小さな血管からの溢出に特に有利である。
【００３５】
本発明に係る粒子は、インサイチュ（in situ）またはインビボ細胞標的化のために、およびそれらがターゲティング試薬を有利に含む目的のために適していることが見出された。
【００３６】
用語「ターゲティング試薬」は、本明細書において、インビボまたはインビトロにおいて、特定の細胞もしくは細胞腫に、または関連部位に粒子を向ける試薬を表す。特に有用なターゲティング試薬は、抗体および受容体リガンドを含む。
【００３７】
粒子は、超音波の他の方法によって検出されてもよい。粒子は、蛍光色素または他の試薬の添加なしに、光音響イメージングを用いて検出することができる。驚くべきことに、本発明者らは、ＰＦＣＥを有するＰＬＧＡ粒子が、ガドリニウムなどの金属の添加によって向上される信号によって光音響イメージングを用いて検出することができることを見出した。吸収ピークは約７０６ｎｍで生じる。色素、またはＩＣ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標）などの光音響造影剤の添加が可能である。これらは、ＰＬＧＡ粒子中のＰＦＣとして、同一または異なるピーク波長で吸収するために選択することが可能である。また、本発明者らは、たとえば、マウスにおける筋肉注射の後などにインビボで粒子を検出することができることを見出した。粒子で標識された細胞は、光音響イメージングを用いて、インビボおよびインビトロファントムの両者で検出することも可能である。ＰＦＣＥを含むＰＬＧＡ粒子は、インビトロおよびインビボの両者で光音響イメージングを用いて検出するに足り、この効果は、金属の添加によって向上される。好適な粒子の例は、ＰＦＣＥおよびガドテリドールを含む、約２００ｎｍの直径のＰＬＧＡ粒子である。
【００３８】
本発明者らは、前記粒子がＭＲＩイメージングにも適していることを見出した。本明細書において「ＭＲＩイメージング」は、磁気共鳴映像法を意味し、１Ｈおよび１９Ｆイメージングなどの多核イメージングを含む。さらに、イメージングは、Ｔ１、Ｔ２、またはプロトン密度強調であってもよい。
【００３９】
本発明に係る粒子は、蛍光色素、もしくは蛍光タンパク質、または蛍光試薬をコードする核酸などの色素も含み得る。このことは、インビボだけではなく、組織学的分析または他の顕微鏡分析も含む、粒子の蛍光イメージングを可能にする。
【００４０】
粒子を検出する他の方法は、粒子に放射性核種を組み込むことである。このことは、オートラジオグラフィー、シンチグラフィ−、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、または放射性化合物を検出することができる他の検出方法を可能にする。また、ルシフェラーゼ酵素、またはルシフェラーゼ（または類似の酵素）をコードする核酸ベクターを組み込むことによって、生物発光をインビボ検出に使用することができる。
【００４１】
粒子は、光コヒーレンストモグラフィーを含む光コヒーレンス技術を用いて検出することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＰＦＣＥ、ガドリニウム、およびＩＣ−Ｇｅｅｎ（登録商標）を有するＰＬＧＡ粒子の粒径分布を示すグラフである。平均径は、１８１ｎｍであった。プロットは、６つの独立測定の粒径分布を示す。密接な重なりは、高い再現性を示す。
【図２】ＭＩ値を高めたゲルにおける粒子の画像である。超音波画像は、脱気水（ネガティブコントロールとして、気体を除去した水）、ＰＦＣＥ（パーフルオロ−１５−クラウン−５−エーテル）を含むＰＬＧＡ粒子、またはＰＦＣＥおよびガドリニウム（ＰＦＣＥ−Ｇｄ）、ならびに通常の水道水（溶解空気を有し、明るく見える）を示す。画像の解釈は、下部の表として提供され、＋は脱気水コントロールと比較した陽性シグナルを示し、−は陰性シグナルを示す。
【図３】、高（ＭＩ＝２．０  黒）および低エネルギー（ＭＩ＝０．１  灰）超音波に３０秒間さらされた後の、直径、計数率、またはＰＤＩ（多分散性係数、直径の分布の広がり因子）の変化を示す図である。高および低ガドリニウム含有量（実施例１）を有するＰＦＣＥを含むＰＬＧＡ粒子が使用され、ガドリニウムなしのＰＬＧＡ粒子に比較された。グラフは、低および高超音波エネルギーにさらされた後の初期の粒径の割合として描かれている。初期の粒径は、１８０ｎｍであった。超音波にさらされた後のわずかな変化は、細胞標識化および他の用途に容認可能な範囲内である。
【図４】コントラストに基づいて粒子の濃度の効果を示す図である。粒子は、アガロースゲルのウェルにおいて低エネルギー（ＭＩ＝０．２）超音波にさらされた。ＰＦＣＥおよびガドリニウムを含むＰＬＧＡ粒子は１ｍｌあたり２０ｍｇで容易に可視化されたが、１ｍｌあたり２および０．２ｍｇの濃度はあまり見えなかった。ＰＦＣＥは、金属を添加することなく、ＰＦＣＥを含むＰＬＧＡを含む粒子を有するウェルを示す。画像は、ウェルの底における粒子の沈降または凝固を防ぐために粒子の添加直後に撮影された。データは、定量化に利用することができる粒子濃度と画像コントラストとの間の関係を示す。
【図５】本発明に係る粒子と、従来技術のコントロールとによって実施されたエクスビボ実験の画像である。本発明に係る粒子は、肝組織に注入され、超音波によって可視化された（ＭＩ＝０．２）。画像は、注入の直後に撮影された。５分後に撮影された画像は、全く変化を示さなかった。合成の間（高、中、および低、実施例１）に添加されたＧｄの様々な量を有するＰＦＣＥ粒子が、ＢＲ１４粒子と共に採用された。ＢＲ１４は、市販の微小気泡造影剤である。注入領域は、囲みによって示される。
【図６】本発明に係る粒子を採用するエクスビボ実験の画像である。ＰＦＣＥおよび高いＧｄ含有量を有するＰＬＧＡ粒子は、実施例１に記載されたように実質的に作製された。肝組織は、２００マイクロリットルの脱気水（矢印）、または５ｍｇの粒子を含む２００マイクロリットルの水を注入された。画像は、注入の直後（左パネル）、および２時間後に室温（右パネル）で取得された。粒子に由来するコントラストは、明確に見ることができ、経時変化を示さなかった。
【図７】実施例１０に記載されたようなＢＲ１４微小気泡のＡモード超音波キャラクタリゼーションを示すグラフである。囲みは、試料上の関連領域を示す。これらの囲み内のシグナル（すなわちピーク）は、試料が超音波活性であることを示す。
【図８】実施例１０に記載されたようなＳｏｎｏｖｕｅ（登録商標）微小気泡のＡモードキャラクタリゼーションを示すグラフである。Ｓｏｎｏｖｕｅ（登録商標）は、臨床用途に販売される市販の超音波微小気泡造影剤である。囲みは、試料上の関連領域を示す。これらの囲み内のシグナル（すなわちピーク）は、試料が超音波活性であることを示す。
【図９】実施例１０に記載されたような本発明に係る粒子のＡモードキャラクタリゼーションを示すグラフである。囲みは、試料上の関連領域を示す。これらの囲み内のシグナル（すなわちピーク）は、試料が超音波活性であることを示す。
【図１０】本発明に係る粒子を有する細胞の標識化を示す画像である。樹状細胞は、実施例１１に記載されたような、本発明に係るＰＬＧＡ粒子で標識された。細胞は、標識されない（左パネル）か、またはＰＦＣＥおよびガドリニウムを含むＰＬＧＡ粒子によって標識された（右パネル）。ＰＦＣＥ−Ｇｄ標識された細胞は、明確に見ることができる。非標識化細胞は、背景上に見えなかった。円は、細胞のある領域を示す。
【図１１】本発明に係る粒子が多型細胞イメージングに適していることを示す画像である。ＰＦＣＥ、高ガドリニウムおよびＩｃＧを含むＰＬＧＡ粒子で標識された２００万個の初代ヒト樹状細胞は、超音波（左パネル）、蛍光イメージング（第２パネル）、および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ、第３、第４、および第５パネル）を用いて可視化することができた。蛍光画像は、グレースケール画像における蛍光領域を示すために編集された。３つのＭＲＩパネルは、（左）Ｔ１強調１Ｈ  ＭＲＩ画像（細胞のある高信号領域は、矢印によって示される）、（中央）標識された細胞のみが見える１９Ｆ  ＭＲ画像、および（右）１Ｈスキャン上に１９Ｆスキャンを重ねたものを示す。
【図１２】大腿四頭筋内に本発明に係る粒子の５ｍｇの注入前後におけるマウスの足の超音波画像である。パネルは、注入の直前直後だけではなく、注入の２．５時間後に撮影された画像も示す。矢印は、注入直後と、２．５時間後との両方で検出可能である、粒子に起因するコントラストの増加を示す。
【図１３】図１３（Ａ）は、ＰＬＧＡポリマー内における、ＰＦＣとしてパーフルオロ−１５−クラウン−５−エーテル（ＰＦＣＥ）、蛍光色素としてＩＣ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標）およびガドテリドール（Ｐｒｏｈａｎｃｅ（登録商標）、Bracco社）を含む、約２００ｎｍの直径の粒子について粒子のイメージ図である。図１３（Ｂ）、１０ｍｇの様々なＰＦＣが、０．２〜１の範囲の様々なＭＩ値における音響コントラストについて試験された。脱気水が陰性コントロールとして使用され、続いて空のＰＬＧＡ（ＰＦＣなし）粒子、様々なＰＦＣ、つまりＰＦヘキサン、ＰＦデカリン、ＰＦＯおよびＰＦＣＥを有する粒子が使用された。ＰＦＣＥ粒子へのＧｄの添加は、さらにシグナルを向上する。粒子は、ゲルファントムにおけるウェルにおいて撮影された。図１３（Ｃ）、Ｇｄの低下した濃度を有する、ＰＦＯまたはＰＦＣＥを含むＰＬＧＡ粒子の１０ｍｇがブタ肝臓に注入され、撮影された。２００μｌのＢＲ１４がコントロールとして注入された。ＢＲ１４下で生じる減衰領域は、］で示され、これは、全ての粒子に欠けている。図１３（Ｄ）、ＰＦＣＥ、ＰＦＣＥ−Ｇｄ、ＰＦＯ−ＧｄおよびＰＦＯのみを含む粒子の、０．２、２、および２０ｍｇが、ゲルファントムにおいて撮影された。脱気水は、コントロールとして同様に撮影された。粒子から得られる、ウェルにおけるシグナル強度がプロットされ、粒子濃度と音響コントラストとの間の直線関係を示し、ＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子は非常に高いコントラストをもたらす。図１３（Ｅ）は、肝組織に１００ｕｌで注入された、２．５、５、および２０ｍｇのＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子の超音波画像である。図１３（Ｆ）は、対応する電子顕微鏡（ＥＭ）画像に重ねられた、ＩＣ−Ｇｒｅｅｎ、ＰＦＣＥおよびＧｄ（それぞれ左から右に）の局在を示すＥＤＸ（Ｘ線回折を用いる電子顕微鏡）画像である。ＰＦＣＥおよび色素は、粒子の外端に局在するが、Ｇｄ錯体は内部である。スケールバーは、２００ｎｍを示す。
【図１４】図１４（Ａ）、粒子の１９Ｆ含有量は、超音波照射後にも測定された。粒子は、１．３のＭＩにおいて、超音波照射に６０秒間さらされた（７．５ＭＨｚ、０．５ｃｍ焦点）。図１４（Ｂ）、ＤＬＳデータは、上述のように、粒子が超音波にさらされた前後に取得された。平均粒子径（ｎｍ）、平均計数率（ｋｃｐｓ）、およびＰＤＩが示される（上から下）。図１４（Ｃ）は、超音波エネルギーにさらされた前後の粒子の液滴径分布である。図１４（Ｄ）は、プローブ音波処理前（左）後における粒子で取得されたＳＥＭ画像である。粒子に変化は見られなかった。スケールバーは、５００ｎｍを示す。
【図１５】図１５（Ａ）は、エネルギーが増大する超音波を照射された様々な粒子の挙動を示す。結果は水道水の反応に標準化され、Ｓｏｎｖｕｅ（Bracco社）微小液滴について、反応は圧力増加として迅速に衰える。これに対して、粒子は、高い超音波圧力において、増加する反応、それらの安定性を示す。高いＧｄ含有量（ＰＦＣＥ−Ｇｄｈｉ）を有する粒子が最高の性能を示す。液体ＰＦＣＥは、コントロールとして使用された。図１５（Ｂ）は、側面および上部から設定した模式図である。粒子の分散は、長方形のガラスキャピラリ中に流されて安定化され、圧電材料が、波節または波腹に粒子を集める微小流路において低常波を生じるために使用される。下部パネルは、時間内に右から左までの粒子における集束効果を描写する。実際の実験において、粒子は流路で動かず、流路全体において同時に集束する。図１５（Ｃ）は、ＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子（左）とＰＦＯＢ粒子（右）との試料についての処理後の画像の例である。図１５（Ｄ）、様々な粒子の散乱断面積は、粒子の寸法の関数として、被覆された気泡の散乱断面積に比較して、剛体球理論を用いて計算された。四角記号は、放射圧の正記号を示し、キャピラリの中央に向けた動きに変わり、一方円は、放射圧の負記号を示す。
【図１６】図１６（Ａ）は、ＰＦＣＥ、ＩＣ−Ｇｒｅｅｎ、およびＧｄを含む粒子で標識された２００万個のＤＣの、蛍光、１Ｈおよび１９Ｆ（疑似色）ＭＲＩ、ならびに超音波イメージングである。細胞は、イメージング前にエクスビボにおいて肝組織試料に注入された。図１６（Ｂ）、１０００万個のＤＣが粒子で標識され、ウェルにおいて超音波を用いて示され、撮影された。図１６（Ｃ）、０．２〜３００万個の細胞がＰＦＣＥ，Ｇｄを含む粒子で標識され、ゲルファントムにおいて超音波を用いて撮影された。標識および非標識細胞について得られるシグナル強度がプロットされる。
【図１７】図１７（Ａ）は、ＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子（矢印）の５ｍｇの注入の前、直後（０時間）、および注入の２．５時間後の大腿四頭筋の超音波画像である。マウスは、注入後に拘束されず、自由に動けるようにされた。図１７（Ｂ）は、０．１ｍｇのＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子の注入の前（左）および後（右）のマウスの鼠径リンパ節の高周波超音波画像である。節の平均コントラストは、注入後、任意単位あたり２３０から２６６２まで変化した。図１７（Ｃ）、マウスは、２０ｍｇのＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子を皮下注射にて注入され、２週間観察された。画像（上から下）は、１匹のコントロールと２匹の注入マウスとの、腎臓、脾臓、肝臓、および流入領域同側または反対側鼠径リンパ節である。さらに、マウスは、体重または行動において全く変化しなかった（図示せず）。
【実施例】
【００４３】
実施例１：パーフルオロ−１５−クラウン−５−エーテルを含む粒子の作製
ＰＬＧＡ（０．０９グラム）をガラス管内で３ｍｌジクロロメタンに溶解した。液体のパーフルオロ−１５−クラウン−５−エーテル（８９０マイクロリットル）を、水で希釈されたＰｒｏｈａｎｃｅ（登録商標）（ガドテリドールの３ｍｇ／ｍｌ溶液）の５０ｍｌ溶液に続いて添加した。任意に、蛍光色素などの追加の試薬をこの段階でフルオロカーボンに添加してもよい。蛍光粒子が求められる場合、１ｍｇのＩｃＧまたはＩＣ−Ｇｒｅｅｎ（インドシアニングリーン、Akorn Pharmaceuticals社）が溶液に添加された。
【００４４】
以下に詳細に記載されるように、本発明者らは、ガドリニウムの、高、中、低含有量の粒子を作製した。この目的のために、上述のＰｒｏｈａｎｃｅ（登録商標）水溶液は、それぞれ１１．５、５．７５、および２．８５ｍｌのＰｒｏｈａｎｃｅ（登録商標）に水を加えて５０ｍｌ溶液にした。続いて全混合物を、一定の超音波処理（Branson Digital Sonifier 250; ６０秒間のオンおよび１０秒間のオフで３分間サイクル、２０℃の最大温度で、３０％振幅；カップホーンが使用された）の下において２５ｍｌのポリビニルアルコール水溶液（２０グラム／リットル）に滴下して加えた。得られるエマルジョンは、続いて４℃で置かれ、２４ｍｌの溶液が残るまで約１２時間一定に撹拌して蒸発させられた。等しい体積の水が続いて添加され、エマルジョンは４℃において３０分間２１０００ｇで遠心された。ペレットは水で２回洗浄され、残った懸濁液は−６０℃で少なくとも２４時間凍結乾燥された。粒子は続いて、密封された試験管に入れられ−８０℃で保存された。特に明記しない限り、本明細書に記載された実験において使用される粒子は、高いガドリニウム含有量を有する。
【００４５】
実施例２：粒子のキャラクタリゼーション
本発明者らは、上述のように作製された粒子が、乾燥形態で−２０℃において保たれる場合、少なくとも１年間安定であることを見出した。また、粒子は、マイナス４℃において少なくとも３ヶ月間にわたって作業濃度で溶液内において安定であった。
【００４６】
実施例１に従って作製される粒子の直径は、以前に記載されたように（Biomaterials. 2010 Sep;31(27):7070-7）動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて測定された。図１は、１８１ｎｍにおいて鋭いピークを有する、８０〜５００ｎｍの範囲の寸法の粒子を示す。図１は、個別の独立した６つの合成の結果を示す。結果は同一であり、全ての曲線は実質的に重なり、高い再現性を示す。粒径分布は、数カ月間安定であった。粒子は、凍結乾燥され、保存のために凍結された。しかしながら、水（凍結）中のアリコートとして保存された粒子も安定であった。
【００４７】
実施例１に従って作製され、高および中程度のガドリニウム含有量を有する粒子は、１ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に溶解され、超音波イメージングの条件下において非常に安定であると考えられる。本発明者らは、低および高超音波ＭＩ（ＭＩ＝０．１および２．０）に３０秒間さらされる前後の粒径および計数率（粒子の数の指標）を測定した。計数率は、粒子が超音波によって破壊されたか否かにかかわらず試料あたりの粒子の数を概略で示す。計数率は、Ｇｄ含有量の増加が超音波にさらされた粒子の安定性を向上させることを示す。本発明者らは、３０秒間の高エネルギー超音波にさらされた後、直径、計数率、またはＰＤＩ（直径の分布の広がり因子）が変化しないことを見出した（図３）。
【００４８】
図３に示されたデータから、本発明に係る粒子は最も厳しい超音波条件下でさえ安定であり、Ｇｄ含有量の増加は超音波照射に対する粒子の安定性を向上すると結論付けられる。
【００４９】
実施例３：インビトロ超音波イメージング
７．５ＭＨｚの中心周波数を有する線形配列トランスデューサ（Ｌ１１−３）が全ての超音波スキャンに使用された（SONOS 7500, Philips Medical Systems, Best, The Netherlands）。ＭＩは、示されるように０．１〜２．０まで変動した。ゲインは通常、９０％に設定された。
【００５０】
ゲルファントムは、８％ゼラチン（Dr. Oetker, Ede, The Netherlands）、および２％寒天（Agar Powder CMN, Boom社, Meppel, The Netherlands）溶液で構成された（これらのゲルは超音波画像において明るく示された）。
【００５１】
超音波照射は、０．２〜１までの範囲のメカニカルインデックス（ＭＩ）で実施された。ＭＩは、どれだけのエネルギーが撮影の間に、対象または試料に移動されたのかを示す安全測定基準である。臨床上の限界は、診断撮影について１．９、産科スキャンについて１．０である。
【００５２】
実施例４：エクスビボ超音波イメージング
中心周波数７．５ＭＨｚを有する線形配列トランスデューサ（Ｌ１１−３）は、全ての超音波スキャンに使用された（SONOS 7500, Philips Medical Systems社, Best, The Netherlands）。ＭＩは、示されるように、０．１〜２．０まで変動した。ゲインは通常、９０％に設定された。
【００５３】
実施例５：インビボ超音波イメージング
中心周波数７．５ＭＨｚを有する線形配列トランスデューサ（Ｌ１１−３）は、全ての超音波スキャンに使用された（SONOS 7500, Philips Medical Systems社, Best, The Netherlands）。ＭＩは、示されるように、０．１〜２．０まで変動した。ゲインは通常、９０％に設定された。
【００５４】
実施例６：ガドリニウムは、粒子の超音波可視性を向上する。
ＰＬＧＡ／ＰＦＣＥ粒子は、高いＧｄ含有量で実施例１に従って作製され、実施例３の手順に従って超音波可視性について試験された。結果は、図２に示される。ガドリニウムの添加が超音波シグナルを向上することが示される。ガドリニウムの添加は、フッ化有機化合物を含む粒子の超音波可視性の向上を提供すると結論付けられる。
【００５５】
実施例７：定量
高いＧｄ含有量で実施例１に従って作製されたＰＬＧＡ／ＰＦＣＥ粒子は、実施例３の手順に従って超音波可視性について試験された。様々な濃度の粒子、２０、２および０．２ｍｇ／ｍｌが水で希釈されて使用された。その結果は、図４に示される。そこには、超音波シグナルが、使用された粒子の濃度に比例することが示されている。本発明に係る粒子は、定量的超音波イメージングにおいて有用であると結論付けられる。独立した実験において、本発明に係る粒子で標識された場合、わずか２００．０００個の細胞を可視化することができることが確認された。
【００５６】
実施例８：従来技術との比較
液体ＰＦＣＥと、高、中、および低量のガドリニウムとを含むＰＬＧＡ粒子は、実質的に実施例４の手順に従って、ブタ肝臓に注入され、超音波によって可視化された（ＭＩ＝０．２）。比較のために、ブタ肝臓は、市販されている、パーフルオロブタンガスコアを含むＢＲ１４（Bracco Diagnostics社）３０００ｎｍ粒子も注入された。
【００５７】
本発明者らは、超音波照射によって破壊されない粒子を含むＧｄの定量的反応を観察した。この点について定量的とは、シグナルが粒子のガドリニウム含有量の増加によって増加することを意味する。さらに、本発明に係る粒子は、ガスコア粒子によって通常得られるような、いわゆる影を生じない。この影効果は、特にＢＲ１４注入領域の下部に存在した（図５）。本発明者らは、本発明に係る粒子が、超音波照射によって破壊されないとの定量的反応のレベルと、影の欠如との両者において、従来技術に比較して有利な特性を提供すると結論付ける。後者は、調査中の領域のはるかに詳細な分析を可能にする。
【００５８】
実施例９  本発明に係る粒子は、長時間見え続ける。
実施例１に従って作製される粒子（２００マイクロリットルの水において高いガドリニウム含有量を有する粒子５ｍｇ）は、実施例４の手順に従って肝組織に注入された。水は、コントロールとして注入された。図６における結果は、粒子が肝組織において室温にて２時間後でさえも明確に見えることを示している。気体状コアを含む従来の造影剤は通常、超音波エネルギー照射下において非常に短い存続期間を有する（Phys Med Biol. 2009 Mar 21;54(6):R27-57）。本発明者らは、図６のデータから、本発明に係る粒子は、超音波イメージングにおいて長く残るシグナルを提供すると結論付けた。影効果の欠如も、この実験において確認された。
【００５９】
実施例１０；従来技術の粒子との直接比較
従来技術の造影剤を含む試料は、本発明に係る造影剤と比較された。述べられたような薬剤（図７におけるＢＲ１４、図８におけるＳｏｎｏｖｕｅ、図９におけるＰＦＣＥおよび高ガドリニウムを含むＰＬＧＡ粒子）は、超音波にさらされ、得られたエコーは記録されプロットされた。Ａモードまたは振幅モードは、標準的な超音波キャラクタリゼーション技術である。ｙ軸は、受信シグナルの振幅を表し、ｘ軸は時間である。エコーは、容器の壁、および他の接触面からも生じる。（試料を含む）関連領域は、画像において囲みによって示される。データは、４種類の異なる電圧で示される（異なるＭＩ値と等価である）。このプロットは、ＢＲ１４、ならびにＳｏｎｏＶｕｅ微小気泡（両方とも市販されている）、ならびに実施例１に記載されたように作製された、ＰＬＧＡ／ＰＦＣＥおよびＧｄ粒子について示される。
【００６０】
全ての試料は、２００ｕｌ中に５ｍｇであった。試料は、５ＭＨｚ集束トランスデューサ（Panametrics NDT A308S, 1.5 inches focal distance）を備える水槽の保持体に置かれた。トランスデューサは、パルス受信機（Squarewave 5066PR）に接続され、単一パルスで作動する遅延発生器（BNC delay generator model 575）によって駆動される。受信機の出力は、単一モードに設定されたオシロスコープ（Tektronix 4034）に転送された。焦点は、保持体の中央（すなわち、試料）に設定され、後方散乱シグナルが記録された。周波数は５〜６ＭＨｚ（トランスデューサの中心周波数）に設定され、電圧は１００〜４００Ｖまで変動された。得られたデータは、ヒルベルト変換を用いて処理された。
【００６１】
データは、本発明に係るガドリニウム含有粒子が、市販試薬に比較した優れた性能ではない場合、同等の性能を有することを示す。さらに、市販試薬は、実験によって破壊されたが、本発明に係る粒子は破壊されなかった。
【００６２】
実施例１１  細胞標識
本発明者らは、Biomaterials. 2010 Sep;31(27):7070-7 and NMR Biomedに実質的に記載されたような粒子を有する初代ヒト樹状細胞（ＤＣ）を標識した。そこで、細胞の標識は、コアに金属なしにフッ素化ポリカーボンを含むＰＬＧＡによって説明される。本発明者らは、本発明に係る粒子に使用されるような追加の金属が、細胞の、生存性、表現型、機能性、および移動能に影響をもたらさないことを見出した。また、粒子を取り込んだ細胞は、粒子の金属含有量によって影響を受けない。このことは、驚くべきことである。なぜなら、ＰＬＧＡのみが露出されるからである。さらに、粒子の実際の金属含有量は微量であり、細胞に影響を与えるとは予測されない。１００万個の細胞あたりに送達される全ガドリニウム量は、インビボにおける使用についてガドリニウムの承認された臨床容量より１００倍近く低い。
【００６３】
１０００万個の標識された樹状細胞（ＤＣ）は、アガロースゲル中のウェルにそれらを設置することによって撮影された。ここで、本発明者らは、細胞が非常に迅速に底に沈降するときにウェルの底を撮影した。結果は、図１０に示される。本発明者らは、細胞が、超音波イメージングにおいて、本発明に係る粒子を用いて良好に可視化されてもよいと結論付ける。
【００６４】
実施例１２  多様な細胞イメージング
本発明に係る粒子で標識された細胞は、超音波イメージング、蛍光イメージング、およびＭＲＩを用いてエクスビボで可視化された。
【００６５】
蛍光色素を含む粒子は実施例１に従って作製され、多様なイメージングにおいて使用された。結果は、図１１に示される。本発明に係る粒子は、蛍光イメージングにおいて追加の色素を含む場合、超音波およびＭＲＩ（１Ｈおよび１９Ｆの両方）で可視化される。超音波画像：細胞は、明るい白いスポットである。蛍光：アスタリスク（＊）は細胞を示す。蛍光色素、ＩｃＧの存在は、蛍光イメージングを可能にする。ＭＲＩ：Ｔ１コントラスト（矢印）は、Ｇｄによって生じ、１９Ｆシグナルは、ＰＦＣＥから生じる（疑似色）。
【００６６】
実施例１３  顕微鏡および組織学分析
蛍光色素を含む粒子は、実施例１に従って作製され、Biomaterials. 2010 Sep;31(27):7070-7 and NMR Biomed. 2012 Sep;25(9):1095-103に実質的に記載されたように組織学的分析において使用された。その中で、細胞の標識は、コアにおける金属なしに、フッ素化ポリカーボンを含むＰＬＧＡ粒子によって表わされる。本発明者らは、本発明に係る粒子の、細胞内およびインビボ挙動に相違がないことを見出し、本発明の粒子への蛍光色素の添加は、粒子の細胞内研究だけではなく、インビボ移送後の組織学的分析を可能にする。
【００６７】
実施例１４  インビボイメージング
粒子は、高いガドリニウム含有量で、実施例１に従って作製された。粒子の５ｍｇは、大腿四頭筋に注入され、実施例５の手順に従って超音波画像を得た。図１２は、注入前、注入直後、注入の２．５時間後の結果を示す。粒子はインビボで容易に見ることができ、２．５時間後でさえも粒子に起因するコントラストは持続すると図１２から結論付けてもよい。
【００６８】
実施例１５  さらなる実験
粒子は、約２００ｎｍの直径を有するＰＦＣ封入ＰＬＧＡからなる。蛍光色素または可溶性金属錯体などの追加の部分を添加することができる。本発明者らは、ＰＦＣとしてパーフルオロ−１５−クラウン−５−エーテル（ＰＦＣＥ）、およびガドテリドール（可溶性Ｇｄ錯体；Bracco Diagnostics社）を含む粒子（図１３Ａ）に注目した。なぜなら、この組み合わせは超音波および１９Ｆ  ＭＲＩについて最も良いコントラストをもたらしたからである。蛍光色素ＩＣ−Ｇｒｅｅｎ（Akorn社）も含まれるが、音響コントラストに必須ではない。様々なＰＦＣを有する同様のＰＬＧＡ粒子は、様々な値のメカニカルインデックス（ＭＩ）のゲルファントムにおいてインビトロで試験された（図１３Ｂ）。本発明者らは、Ｇｄ錯体を有するＰＦＣＥ粒子（ＰＦＣＥ−Ｇｄ）が全てのＭＩで最も高いコントラストを示すことを見出した。本発明者らは、Ｇｄ含有量が超音波コントラストに影響を与え（図１３Ｃ）、１ｍｇのＰＦＣＥ粒子あたり４０、２０、１０、および０μｇの濃度のＧｄが試験された。最も高いＧｄ含有量は、最も良いコントラストをもたらす。粒子の１９Ｆ含有量は、８×１０１８ １９Ｆ’ｓ／ｍｇで一定のままであった。ここで、ＢＲ１４微小気泡（Bracco社）は、基準として使用された（約３０００ｎｍの平均径を有するパーフルオロブタン気体微小気泡）。ＰＦＯ粒子は、陰性コントロールとして使用された。さらに、粒子は、顕著に高い散乱減衰率（ＳＴＡＲ）を示し、粒子に基づく減衰のより小さな領域によって示される（画像におけるＢＲ１４下で強調される）。全てのさらなる実験は、最も高いＧｄ含有量を有するＰＦＣＥ粒子を用いて実施された（ＰＦＣＥ−Ｇｄｈｉ、特に示されない限り）。図１ｄおよびｅにおいて、粒子は、ゲルファントムにおいて、またはインビトロ組織試料における注入後のいずれかで撮影された。図１３Ｄは、陰性コントロールとして脱気水を用いて、粒子濃度とコントラストとの間の関係を分析したものである。試料上に目的の領域についてのシグナル強度（ＲＯＩ）が比較のためにプロットされた。同様の実験が組織に注入されたＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子のみを用いて実施され（図１３Ｅ）、濃度とシグナルとの間の明確な関係も存在した。最後に、本発明者らは、対応する電子顕微鏡（ＥＭ）画像に重ねられたＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子のエネルギー分散型Ｘ線分光学データ（ＥＤＸ）を検討した。ＩＣ−Ｇｒｅｅｎ、ＰＦＣＥ、およびＧｄの分布が示される。Ｇｄ、およびより少ない程度でＩＣ−Ｇｒｅｅｎは粒子全体に分布していると考えられるのに対して、ＰＦＣＥは周辺に沿って一層濃縮されるがＰＬＧＡマトリックス内に留まるようである。Ｇｄの分布は、より小さな粒子とは異なり、わずかに異なるＧｄ錯体、ガドベネートジメグルミン（MulitiHance；Bracco社）を用いて作製され、ＧｄはＰＦＣＥと共に粒子の周辺に沿って限定された（データは示されていない）。興味深いことに、これらの粒子は、超音波画像における向上したコントラストを示さなかった。
【００６９】
粒子の安定性
本発明者らは、粒子が、極めて高いエネルギープローブ超音波処理を含む超音波照射に対して安定であることを示す。ＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子は、インビトロにおいて組織試料に注入され、コントロールとして水道水を用いた（矢印、図６）。試料は、２時間後に迅速に撮影され、室温で置かれた。粒子に由来するコントラストにおける変化は、観察されなかった。（溶解した気泡からの）水道水に起因する全てのコントラストは、組織に広がる液体として、注入直後に消散された。本発明者らは、ＰＦＣＥ、ＧｄおよびＩＣ−Ｇｒｅｅｎを含む粒子、またはＰＦＣＥおよびＩＣ−Ｇｒｅｅｎのみを有する粒子のフッ素含有量を、１９Ｆ  ＮＭＲを用いて、超音波エネルギーに６０秒間さらされる前後で測定した（図１４Ａ）。ＰＦＣＥ含有量における変化はいずれの粒子についても見られず、液体ＰＦＣＥが蒸発する場合に予期されるように、ＰＦＣＥは音響コントラストの発生の間に失われないことが示される。さらに、粒径、平均計数率（単位体積あたりの粒子の数の指標）、およびＰＤＩ（直径分布の広がりの測定；図１４Ｂ）において変化は観察されなかった。これらのデータは、超音波エネルギーによって粒子が影響されないことを示す。図１４Ｃは、超音波照射の前後でＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子についての代表的液滴径分布を示す。液滴径分布における変化は、超音波照射によって生じなかった。本発明者らは、ＥＭを用いて粒子を観察した場合、同様に観察されるが、これらの場合、本発明者らは、超音波イメージングよりも非常に高いエネルギー付与が得られるプローブ音波処理に粒子をさらした。最後に、粒子は、ＤＬＳ特性において、凍結乾燥粉末として、少なくとも６月間変化することなく容易に保存することができる。
【００７０】
音響特性キャラクタリゼーション
増加エネルギーの超音波が照射された場合、Ｓｏｎｏｖｕｅ微小気泡（Bracco社；２５００ｎｍの平均径を有する六フッ化硫黄気泡）と共に粒子の挙動が測定された（図１５Ａ）。微小気泡に対する応答は、気泡の消失によって圧力増加として容易に衰えるが、粒子は反応増大を示す。純水液体ＰＦＣＥはコントロールとして使用された。試験された他の粒子は、ＰＦＣＥ、ならびに高および低Ｇｄ含有量を有するＰＦＣＥ（ＰＦＣＥ−ＧｄｈｉおよびＰＦＣＥ−ＧＤｌｏ）である。
【００７１】
音響特性活性および粒子のエコー輝度は、音響放射力に基づく方法を用いて定量化された１６。超音波造影剤によって後方散乱されるシグナル、およびそれに作用する放射圧は同じ起源を有するので、散乱係数の測定は、定義された音響場における変位を測定することによって達成することができる（図１５Ｂ）。圧電素子は、均一に分散した粒子によって、四角形のガラスキャピラリにおいて定常波を生じるために使用された。超音波の定常波の発生は、数秒内に、それぞれ流路の中央および端部に位置する波節または波腹に向けた移動を誘導する。粒子の動きは、高速カメラによって記録され、分析された（図１５Ｃ）。
【００７２】
音響場におけるランダム粒子に作用する力は牽引力１７、粒子の動きに続く周囲の液体の加速を説明する追加の質量力１８、および粒子の動きを駆動する放射圧を含む。与えられた寸法の粒子の軌跡を決定するために、運動量保存式をこれらの３つの力から書くことができる。第１近似において、粒子は、剛球とランダム音響場との相互作用を記載する広く受け入れられた理論に従うと想定される１６。放射圧は、球面調和関数におけるフィールド分解に由来する２つの関与に分解することができ、ｆ１は相対密度にのみ依存し、ｆ２は相対圧縮率のみに依存する。定常波における粒子の放射圧（Ｆｒ）は、
【数１】
0006293149.tif 000005
であり、ここでρ０は液体の質量密度であり、Ｐａは音響波の圧力であり、Ｖｐは粒子の体積であり、ｃ０は液体における音の速度であり、ｋは波動ベクトルである。
【００７３】
ポリマーナノ粒子について、係数ｆ２の虚数部を無視することができることを示すことができる。後方散乱圧力は、その結果、以下の式によるトランスデューサの検出における放射圧に関連する。
【数２】
0006293149.tif 000006
【００７４】
この式から、強度における散乱断面積は、入力強度を超える全散乱電力として定義することができる。
【数３】
0006293149.tif 000007
【００７５】
超音波コントラストは、非平面接触面によって反射された、または組織に存在するか、もしくは人工的に注入された小さな散乱体から散乱された圧力波から生じる。粒子からの散乱は、大部分の粒子にあてはまり、式で示される理論に対応する幾何学的散乱、または高振幅半径方向振動による音響波を散乱するなどのコントラスト気泡のための共鳴振動挙動によって生じてもよい。散乱横断面は、したがって、有効断面を表し、音響強度は粒子によって吸収されて球体法則で再放射され、コントラスト発生に二次的に関連する。試料の効率のよい横断面は、図１５Ｄに示される。青い波線は、レイリープレセット理論１９に従って、超音波コントラスト発生に典型的に使用される被覆された気泡の散乱挙動を描く。これらのコントラスト気泡についての幾何学的散乱は、検討される範囲内における振動散乱よりも低いので、無視される。ＰＬＧＡまたはＰＦＣＥのみではなく、ＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子は、同一寸法の気泡から予期されるよりも８桁大きい散乱係数を示す（図１５Ｄ）。興味深いことに、最大粒子の散乱係数は、同等寸法の被覆気泡について予期されるものと同様であった。しかしながら、そのような小さな気泡は、非常に不安定であり、実際には使用することができない。さらに、ＰＦＣＥを有する粒子の製造は、劇的に、それらの挙動を修飾し、それらの効率を、特にＧｄの添加下において向上する。他の試料に反して、ＰＦＣＥに基づくナノ粒子は小さい気泡のように波腹に向かって動き（図１５Ｃ）、同一寸法の気泡に比較して２桁大きい散乱係数を示す（図１５Ｄ）。粒子の超高速画像２０は、超音波照射を受けた粒子に変化を示さなかった（データは示さず）。
【００７６】
細胞標識化およびイメージング
臨床試験２において使用されたような初代ヒトＤＣは、標識され撮影された。細胞生存における効果は、非標識化コントロールに関して観察されなかった。Ｇｄ錯体なしを除いて、同様の粒子に関する以前の研究は、変異マーカの発現、Ｔ細胞活性化能力、および移動能に関して細胞における標識化の効果を示さなかった２１、２２。標識された細胞は、エクスビボにおける組織試料における注入後、蛍光、ＭＲ、および超音波イメージングを用いて容易に検出された（図１６Ａ）。２００万個の標識細胞が注入された。超音波イメージングが第１に実施され、続いて蛍光およびＭＲイメージングが実施された。蛍光の持続、および特に１９Ｆ  ＭＲＩシグナルは、超音波にさらされることによって粒子が損傷されていないことを示す。図１６Ｂは、ゲルファントムにおける１０００万個のＤＣを示し、細胞は、非標識、ＰＦＯ粒子で標識、またはＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子で標識のいずれかであった。また、ＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子で標識された細胞は、最も高いコントラストを示すことが明らかである。最後に、これらの細胞の希釈系列がなされ、超音波を用いて撮影された（図１６Ｃ）。３〜０．２百万個の、標識された、または非標識細胞が撮影された。ウェルを取り巻くＲＯＩについての比較強度がプロットされ、コントラストの明確な増強を示す。
【００７７】
インビボイメージングおよび毒性
ＰＦＣＥ−Ｇｄ粒子は、マウスにおいて筋肉注射された（図１７Ａ）。画像は、注入前、直後、および２時間後で示される。マウスは注入の間に麻酔されるが、次の撮影セッション前に回復された。したがって、粒子は、マウスの動きによって筋肉内にある程度分散された。さらに、以前の画像と共にいくらかの結像面を正確に得ることはできない。これらの問題にも関わらず、注入された粒子は、依然として明確に検出可能である。これらの画像は、臨床的な超音波スキャナで得られた。
【００７８】
粒子は、マウスにおける節間注入後に撮影された（図１７Ｂ）。これらの注入は臨床的症状を最小化し、細胞はＤＣワクチン接種治療において患者のリンパ節に直接に注入することができる２３。しかしながら、マウスリンパ節に注入することができる小体積（１０μｌ未満）が原因で、わずかな粒子（０．１ｍｇ）が細胞の代わりに注入された。これらの実験において、０．１ｍｇは１００，０００細胞に対応し、一定の細胞の取り込みをもたらすが、典型的には３００〜１５００万個の細胞が臨床試験において注入される。高分解超音波は２１ＭＨｚで実施され、典型的にはそれらの長軸において２ｍｍ以下のリンパ節に位置する。節の平均コントラストは、粒子の注入後１０倍を超えて変化した。注入の１８時間後においてコントラストは検出されなかった（示されていない）。リンパ節を切除しても、蛍光シグナルは検出されず、粒子が注入された節から除去されたことを示唆する。
【００７９】
最後に、本発明者らは、非常に大量の投与である２０ｍｇの粒子を皮下に注射されたマウスにおいて粒子の毒性を調べた（図１７Ｃ）。これらのマウスは、注射されなかったコントロールに比較して２週間観察された。この期間中、体重、行動、または外見に変化は観察されなかった。終点において、マウスは犠牲にされ、それらの臓器は計量され調べられた。コントロール動物に比較して顕著な相違は観察されなかった。特に、腎臓、脾臓、肝臓、および流入領域リンパ節が、詳細に調べられた。細胞標識後の効果の欠如、およびクリアランスの証拠をまとめると、これらのデータは、粒子が生体適合性を有することを示す。
【００８０】
実施例１６  さらなる手順および方法
粒子合成
粒子は、ＰｒｏＨａｎｃｅ（Bracco Imaging Europe社, Amsterdam）から得たガドテリドールを添加して、以前に記載２２されたように作製された。簡潔には、５０ｍｌの水のみ、または水およびＰｒｏｈａｎｃｅ、Ｇｄｈｉに１７８０μｌおよびＧｄｌｏに１４００、に溶解された１ｇのポリビニルアルコールが、８９０μｌのＰＦＣＥ（Exfluor社, Texas USA）、または２３２μｌのＰＦＯ（Perfluoron, Alcon社）を有するジクロロメタンに溶解された１８０ｍｇのＰＬＧＡ（Resomer RG 502 H, ラクチド：グリコリド  モル比  ４８：５２〜５２：４８； Boehringer Ingelheim社, Germany）に、氷上で、１０秒パルスにおいて２分間４０％出力で駆動している、カップホーンを備えるＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０（Branson, Danbury, USA）を用いて超音波処理とともに、滴下して加えられた。Malvern Zetasizer Nanoにおいて、動的光散乱が行われた。Ｇｄ含有量は、質量分析器を用いて測定された。ＰＦＣＥ−Ｇｄｌｏ粒子は、２０μｇ／ｍｇ含まれ、ＰＦＣＥ−Ｇｄｈｉは４０μｇ／ｍｇであった。
【００８１】
インビトロイメージング
インビトロ超音波イメージングは、ゲルファントムにおける試料について実施されたか、または７．５ＭＨｚの中心周波数で直線配列トランスデューサ（１１−３Ｌ）を備えるPhilips SONOS 7500スキャナを用いてウシ肝臓組織に注入された。ＭＩ値は、０．２に限定された。中心周波数７．５ＭＨｚを有する直線配列トランスデューサ（Ｌ１１−３）が全ての超音波スキャンに使用された（SONOS 7500, Philips Medical Systems社, Best, The Netherlands）。ＭＩは、本明細書において述べられたように、０．１〜２．０まで変化した。ゲインは、典型的には９０％に設定された。
【００８２】
８重量％ゼラチン（Dr. Oetker, Ede, The Netherlands）および２重量％寒天（Agar Powder CMN, Boom社, Meppel, The Netherlands）溶液（これらのゲルは超音波画像において明るく示された）、またはポリビニルアルコール冷却ゲル（１５重量％ＰＶＡ（Boom社, Meppel, The Netherlands）、冷却液体（Koelvloeistof Basic Safe, Halfords, The Netherlands）、ならびに６５重量％の水からなるゲルファントムは、均一な液体が形成されるまで、密封されたシリンダにおいて９０℃に加熱された。型に注がれた後、１回の凍結融解サイクル（−２５℃で１２時間、続いて２０℃で１２時間）。コントラストの分析（図１３Ｄ）は、ウェル上に目的の領域を描き、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA）を用いて平均ピクセル強度を測定することによって実施された。
【００８３】
ＭＲイメージングおよび分光法は、二重１Ｈ／１９Ｆ体積コイルを用いる、水平磁石ボアを備えた１１．７Ｔ  ＭＲシステム（Bruker Biospin社, Ettlingen, Germany）において行われた。画像設定は、８００／１０．５ｍｓのＴＲ／ＴＥ、２ｘ２ｘ２ｍｍボクセル、２５６ｘ１２８マトリックス、およびスピンエコー系列を用いて１Ｈについて２アベレージ；９６０／４６ｍｓ、４ｘ４ｘ４ｍｍボクセル、６４ｘ３２マトリックス、ＲＡＲＥ因子８を有するＲＡＲＥ系列を用いて５１２アベレージであった。
【００８４】
蛍光イメージングについて、マウスまたは試料チューブがＦｌｕｏｒＶｉｖｏ３００（INDEC BioSystems社, Santa Clara, CA USA）に置かれた。露光時間は、０．０５〜０．１５秒間であった。
【００８５】
細胞単離および標識化
初代ヒトＤＣは、記載されたように２１、被験者血液から単離され、３〜８日間のインビトロ培養期間において１００万個の細胞あたり５ｍｇの粒子で標識された。細胞は、使用前によく洗浄された（３回）。生存能力のある細胞は、トリパンブルー色素排除法で細胞数計測器を用いて計数された。
【００８６】
インビボイメージング
マウスは、中央動物研究所（Nijmegen, the Netherlands）において、特定の無菌条件下で飼育された。全ての実験は、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ動物実験委員会の動物取り扱いガイドラインに従って行われた。インビボ超音波イメージングは、ＭＳ５５０Ｓトランスデューサを備えるＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ２１００システムを用いて行われた。マウスは、イソフルレンを用いて麻酔された。
【００８７】
口腔内注入は、ＮａｎｏＦｉｌ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒシリンジ（World Precision Instruments社, Germany）を用いて、顕微鏡ガイダンス下で行われた。
【００８８】
ＥＭおよびＥＤＸ測定
試料は、懸濁液の蒸発によってガラスプレート上に固定された。金の層は、続いて、２０ｋＶおよび６０．０００ｘまでの倍率での環境制御型走査電子顕微鏡ＦＥＩ  ＥＳＥＭ  ＸＬ３０による観察前に試料に沈着された。
【００８９】
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）およびＴＥＭ−ＥＤＳ、エネルギー分散Ｘ線分析（ＥＤＳ）と一体となったＴＥＭは、０．２４ｎｍの点分解能を備える最先端の２００ＫＶ  ＪＥＯＬ  ＴＥＭ  ２１００システムで実施された。この顕微鏡は、２つのＧａｔａｎカメラ、２００ｋＶの加速電圧で最も高い点分解能および感度のＧａｔａｎ８３３ＯｒｉｕｓおよびＧａｔａｎ８９０ｕｌｔｒａｓｃａｎと、２つの検出システムＳＴＥＭおよびＥＤＳ（元素分析のためのエネルギー分散Ｘ線分析）とを備えている。ＴＥＭ測定のための標準的な標本保持体、およびＥＤＳ測定のためのベリリウム標本保持体が使用された。試料標本は、溶液の液滴（６〜１０μｌ）を炭素被覆されたＣｕグリッド（２００メッシュ、EM science社）に置き、風乾によって作製された。ＴＥＭ画像はナノ粒子とそれらの寸法分布を可視化することができるが、第２の電子イメージングは、ナノ粒子の化学組成、元素マッピング、および元素イメージング分布の試験を可能にする。
【００９０】
音響キャラクタリゼーション
図１５Ａにおいて示される結果は、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ  ５ＭＨｚ  Ａ３０８Ｓトランスデューサに接続されたＰａｎａｍｅｔｒｉｃｓ  ５０７７ＰＲパルス受信機を用いて得られた。４４ｍｍの厚みのキュベットを含む試料保持体は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製であり、トランスデューサの焦点に置かれる。水のリファレンスは、各シリーズで取得された。実験設定は、圧電性結晶に付着した約３８０マイクロメートル寸法の四角のキャピラリに基づき、図１５Ｂにおいて示されるような１．９４ＭＨｚの周波数でキャピラリにおいて音響定常波が生じる。粒子の動きは、オリンパス顕微鏡に接続された光子ＡＰＸ高速カメラの使用によって、１秒間あたり１２５フレームで記録された。１０ｘ対物レンズが可視化のために使用される。シグナルは、ＴａｂｏｒＡＷＧ波形発生器で生み出され、ＥＮＩ３５０Ｌパワー増幅器を用いて増幅された。ストリーミングの迅速な蓄積が原因で、実験は、液体中のストリーミングの衝撃を制限するために低圧で実現された。分析は、Ｍａｔｌａｂ（登録商標）を用いて達成された。特に、ＰＩＶ曲線は、自由に利用可能なソフトウェアＯｐｅｎＰＩＶを用いて得られた。２つの方法が、さらなる正確さのために光学記録を分析するために同時に使用された。第１は、画像の補助マトリックスの相互相関に基づくＰＩＶ分析である。相対移動は、ＰＩＶ分析から得ることができ、既知の幾何学に縮尺を変更することができる。第２の方法は、水平方向における平均に基づく。得られるピクセル線は、図１５Ｃにおいて示されるような単一フレームにおける以前のものに追加される。
【００９１】
インビボ毒性試験
粒子の２０ｍｇがマウスに皮下注射され、それらのマウスを未処理のコントロールに比較して２週間観察した。臓器は、観察のために除去され、２週間後に計量された。
【００９２】
実施例１７  さらなる検討
ＰＦＣは、独特の音響特性を有し、特に音の非常に遅い速度２４に関して、それらのコントラスト特性に影響を与え得る。ＰＦＣ液滴は超音波に以前に使用されたが、これらはＰＦＣの蒸発を必要とし、サブミクロン寸法になる傾向がある７、１５、２５〜２８。また、ＰＦＣは、典型的にはＭＲＩのための造影剤として使用するための金属に混合された。しかしながら、酸化鉄結晶のような、固体金属ナノ粒子を有する傾向がある２９、３０。溶解可能なＧｄ錯体、具体的には他の同様の錯体とは逆のガドテリドールの役割は、我々のデータ（たとえば、図１３Ｃ）において明らかであるが、未確定のままである。溶解金属錯体を用いる音響シグナルの増強に関する文献は存在しないが、固体金属粒子は超音波ＣＡｓとして頻繁に使用される２９、３１〜３３。したがって、超音波について、液体形態のままである液体ＰＦＣを向上させる固体金属錯体に関する文献は現在のところ存在しない。ＰＦＣＥが本発明者らの粒子において液体で残る証拠は、その高い沸点（１４５℃）、ＤＬＳおよびＥＭデータにおける変化の欠如、およびフッ素含有量（図１４）、超音波照射後でさえ１９Ｆ  ＭＲＩを実施する能力（図１６Ａ）を含む。
【００９３】
粒子後方散乱超音波による正確なメカニズムが曖昧なままであったが、粒子の音響活性は、示された実験において、間違いなく、観察および測定された。超高速記録２０は、任意のキャビテーション事象から除かれる。また、音響特性に使用される低圧（１５ｋＰａ）は、非線形効果またはキャビテーションについてわずかな可能性を残す。したがって、新規メカニズムが研究されるべきである。この仕事は、典型的な９０°設定で実現することができない。なぜなら、理論は、散乱波の指向性を予期し、粒子の少ない影によって示されると考えられるからである（図１３Ｃ）。一層複雑な理論３４、３５は、音響挙動におけるシェルの潜在的効果を説明するために必要であろう。物理メカニズムを完全に解明するための包括的な音響研究は、現在の仕事の範囲を超えるものである。現在、本発明者らは、受け取られた信号の強度を説明するために、粒子の共鳴の重要な形態であると考える。なぜなら、この種類のシステムについて全ての機械的共鳴は、非常に高い周波数でもたらされるからである。
【００９４】
ＰＦＣを含むＰＬＧＡ粒子は、最小の毒性で最高の細胞取り込みを以前に示した。事実、これらの粒子で実現された、細胞の１９Ｆローディング、１９Ｆ  ＭＲＩ研究のための主要パラメータは、以前に最も高く報告された。Ｇｄ錯体の添加は、その極めて低い濃度が原因で、取り込み、または粒子の他の特性に顕著な影響を与えるとは予測されない。さらに、Ｇｄ含有量は、現在推奨される臨床容量よりも数桁低い（表１）。ＰＬＧＡ、ＰＦＣおよびＩＣ−Ｇｒｅｅｎについても同様である（表１）。これらの成分のクリアランスも十分に研究された。これは、金またはシリカナノ粒子９、１０、１１のような通常固体である、他の安定な超音波造影剤を超える重要な利点であり、長いインビボ保持時間１２と低い臨床応用性１３を有する傾向がある。
【００９５】
本明細書において記載された、ＰＦＣＥおよびＧｄ錯体（ガドテリドール、Bracco社）を有する２００ｎｍのＰＬＧＡ粒子は、超音波エネルギーによって影響を受けることなく、高い音響コントラストを生じる。特に、粒子は、血液循環、現在の微小気泡剤の主な限定から除去されるために十分に小さく、それらのより大きな寸法およびより短い残存期間が原因で血液循環に限定される。さらに、粒子は、高いエネルギープローブ超音波処理にも安定である（図１４Ｄ）。そのような安定性は、内皮外の領域へのインビボ標的化、および細胞標識などの長期用途に必要である。本発明者らは、粒子が高い周波数におけるコントラスト生成に使用することができることも示し（図１７Ｂ）、このことは高い解像度を可能にするので、超音波に基づく画像研究について小さな動物モデルの開発を可能にする。粒子は、ＧＭＰ条件下において臨床使用のために容易に作製することができる。このことは、細胞とインビボとの両方で観察された毒性の欠如とともに、それらのヒトにおける使用の好適性を示す。ＰＬＧＡ粒子も、標的化試薬、およびワクチン送達などの様々な用途に関する文献において広く適用され、放射性リガンド３７の添加を含み、「ステルス」粒子３５を作製するためにＰＥＧで被覆されるなど様々な修飾にさらされる。粒子分解の割合、および後続の薬剤放出率、循環時間、ならびに多型モデル機能性は、制御することができる３９、２２、４０。これらの改良の全ては、本発明者らの粒子で可能になり、必要なさらなるカスタマイズが可能である。
【００９６】
超音波イメージングは、個人の治療研究に理想的に適しているが、その潜在可能性は、好適な安定性、生体適合性の造影剤の欠如によって実現されていない。本明細書に記載された粒子は、細胞追跡、および標的化薬剤送達を含む、臨床的、および臨床前の用途における多型モデルイメージングに容易にカスタマイズすることが可能である。
【表１】
0006293149.tif 000008
参考文献
1.  Srinivas, M. et al. Imaging of cellular therapies. Adv Drug Deliv Rev 62, 1080-1093 (2010).
2.  Aarntzen, E.H. et al. Early identification of antigen-specific immune responses in vivo by [18F]-labeled 3'-fluoro-3'-deoxy-thymidine ([18F]FLT) PET imaging. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 18396-18399 (2011).
3.  Aarntzen, E.H. et al. Targeting of 111In-labeled dendritic cell human vaccines improved by reducing number of cells. Clin Cancer Res 19, 1525-1533 (2013).
4.  Qin, S., Caskey, C.F. & Ferrara, K.W. Ultrasound contrast microbubbles in imaging and therapy: physical principles and engineering. Phys Med Biol 54, R27-57 (2009).
5.  Sirsi, S. & Borden, M. Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications. Bubble Sci Eng Technol 1, 3-17 (2009).
6.  Kiessling, F., Huppert, J. & Palmowski, M. Functional and molecular ultrasound imaging: concepts and contrast agents. Curr Med Chem 16, 627-642 (2009).
7.  Reznik, N. et al. The efficiency and stability of bubble formation by acoustic vaporization of submicron perfluorocarbon droplets. Ultrasonics 53, 1368-1376 (2013).
8.  Aggeli, C., Giannopoulos, G., Lampropoulos, K., Pitsavos, C. & Stefanadis, C. Adverse bioeffects of ultrasound contrast agents used in echocardiography: true safety issue or "much ado about nothing"? Curr Vasc Pharmacol 7, 338-346 (2009).
9.  Delogu, L.G. et al. Functionalized multiwalled carbon nanotubes as ultrasound contrast agents. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 16612-16617 (2012).
10.  Jokerst, J.V., Khademi, C. & Gambhir, S.S. Intracellular aggregation of multimodal silica nanoparticles for ultrasound-guided stem cell implantation. Sci Transl Med 5, 177ra135 (2013).
11.  Chung, E., Nam, S.Y., Ricles, L.M., Emelianov, S.Y. & Suggs, L.J. Evaluation of gold nanotracers to track adipose-derived stem cells in a PEGylated fibrin gel for dermal tissue engineering applications. Int J Nanomedicine 8, 325-336 (2013).
12.  Longmire, M., Choyke, P.L. & Kobayashi, H. Clearance properties of nano-sized particles and molecules as imaging agents: considerations and caveats. Nanomedicine (Lond) 3, 703-717 (2008).
13.  Lin, C., Fugetsu, B., Su, Y. & Watari, F. Studies on toxicity of multi-walled carbon nanotubes on Arabidopsis T87 suspension cells. J Hazard Mater 170, 578-583 (2009).
14.  Kang, S.T. & Yeh, C.K. Intracellular acoustic droplet vaporization in a single peritoneal macrophage for drug delivery applications. Langmuir 27, 13183-13188 (2011).
15.  Strohm, E.M., Min Rui, Michael C Kolios, Ivan Gorelikov, Naomi Matsuura in IEEE International Ultrasonics Symposium Proceedings 495-4982010).
16.  Settnes, M. & Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys 85, 016327 (2012).
17.  Mettin, R. & Doinikov, A.A. Translational instability of a spherical bubble in a standing ultrasound wave. Applied Acoustics 70, 1330-1339 (2009).
18.  Magnaudet, J. & Eames, I. The Motion of High-Reynolds-Number Bubbles in Inhomogeneous Flows. Annual Review of Fluid Mechanics 32, 659-708 (2000).
19.  Leighton, T.G. The Acoustic Bubble. (Academic Press, 1996).
20.  Gelderblom, E.C. et al. Brandaris 128 ultra-high-speed imaging facility: 10 years of operation, updates, and enhanced features. Rev Sci Instrum 83, 103706 (2012).
21.  Bonetto, F. et al. A large-scale (19)F MRI-based cell migration assay to optimize cell therapy. NMR Biomed 25, 1095-1103 (2012).
22.  Srinivas, M. et al. Customizable, multi-functional fluorocarbon nanoparticles for quantitative in vivo imaging using 19F MRI and optical imaging. Biomaterials 31, 7070-7077 (2010).
23.  Aarntzen, E.H. et al. In vivo imaging of therapy-induced anti-cancer immune responses in humans. Cell Mol Life Sci 70, 2237-2257 (2013).
24.  Strohm, E.M., Michael C. Kolios in IEEE International Ultrasonics Symposium 2368-23712011).
25 .  Matsunaga, T.O. et al. Phase-change nanoparticles using highly volatile perfluorocarbons: toward a platform for extravascular ultrasound imaging. Theranostics 2, 1185-1198 (2012).
26.  Reznik, N. et al. Optical studies of vaporization and stability of fluorescently labelled perfluorocarbon droplets. Phys Med Biol 57, 7205-7217 (2012).
27.  Sheeran, P.S., Luois, S.H., Mullin, L.B., Matsunaga, T.O. & Dayton, P.A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials 33, 3262-3269 (2012).
28.  Szijjarto, C., Rossi, S., Waton, G. & Krafft, M.P. Effects of perfluorocarbon gases on the size and stability characteristics of phospholipid-coated microbubbles: osmotic effect versus interfacial film stabilization. Langmuir 28, 1182-1189 (2012).
29.  Li, A. et al. Superparamagnetic perfluorooctylbromide nanoparticles as a multimodal contrast agent for US, MR, and CT imaging. Acta Radiol 54, 278-283 (2013).
30.  Barnett, B.P. et al. Use of perfluorocarbon nanoparticles for non-invasive multimodal cell tracking of human pancreatic islets. Contrast Media Mol Imaging 6, 251-259 (2011).
31.  Li, F. et al. Preparation of gold nanoparticles/functionalized multiwalled carbon nanotube nanocomposites and its glucose biosensing application. Biosens Bioelectron 24, 1765-1770 (2009).
32.  Niu, C. et al. Doxorubicin loaded superparamagnetic PLGA-iron oxide multifunctional microbubbles for dual-mode US/MR imaging and therapy of metastasis in lymph nodes. Biomaterials 34, 2307-2317 (2013).
33.  Niu, D. et al. Facile synthesis of magnetite/perfluorocarbon co-loaded organic/inorganic hybrid vesicles for dual-modality ultrasound/magnetic resonance imaging and imaging-guided high-intensity focused ultrasound ablation. Adv Mater 25, 2686-2692 (2013).
34.  Strifors, H.C. & Gaunard, G.C. Differences in the acoustic echoes from submerged elastic shells containing different fluids. Ultrasonics 30, 107-112 (1992).
35.  Kovalev, V.A. Matching of asymptotic approximations in the problem of the scattering of acoustic waves by an elastic spherical shell. Journal of Applied Mathematics and Mechanics 66, 581-590 (2002).
36.  Srinivas, M., Boehm-Sturm, P., Figdor, C.G., de Vries, I.J. & Hoehn, M. Labeling cells for in vivo tracking using (19)F MRI. Biomaterials 33, 8830-8840 (2012).
37.  D'Souza, M. & DeSouza, P. Preparation and testing of cyclosporine microsphere and solution formulations in the treatment of polyarthritis in rats. Drug Dev Ind Pharm 24, 841-852 (1998).
38.  Avgoustakis, K. Pegylated poly(lactide) and poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles: preparation, properties and possible applications in drug delivery. Curr Drug Deliv 1, 321-333 (2004).
39.  Mahapatro, A. & Singh, D.K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in-vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology 9, 55 (2011).
40.  Jain, A.K., Das, M., Swarnakar, N.K. & Jain, S. Engineered PLGA nanoparticles: an emerging delivery tool in cancer therapeutics. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 28, 1-45 (2011).
41.  Lu, J.M. et al. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert Rev Mol Diagn 9, 325-341 (2009).
42.  Hahn, T. et al. Visualization and quantification of intestinal transit and motor function by real-time tracking of 19F labeled capsules in humans. Magn Reson Med 66, 812-820 (2011).
【図１】
0006293149.tif 000009
【図２】
0006293149.tif 000010
【図３】
0006293149.tif 000011
【図４】
0006293149.tif 000012
【図５】
0006293149.tif 000013
【図６】
0006293149.tif 000014
【図７ａ】
0006293149.tif 000015
【図７ｂ】
0006293149.tif 000016
【図７ｃ】
0006293149.tif 000017
【図７ｄ】
0006293149.tif 000018
【図８ａ】
0006293149.tif 000019
【図８ｂ】
0006293149.tif 000020
【図８ｃ】
0006293149.tif 000021
【図８ｄ】
0006293149.tif 000022
【図９ａ】
0006293149.tif 000023
【図９ｂ】
0006293149.tif 000024
【図９ｃ】
0006293149.tif 000025
【図９ｄ】
0006293149.tif 000026
【図１０】
0006293149.tif 000027
【図１１】
0006293149.tif 000028
【図１２】
0006293149.tif 000029
【図１３Ａ】
0006293149.tif 000030
【図１３Ｂ】
0006293149.tif 000031
【図１３Ｃ】
0006293149.tif 000032
【図１３Ｄ】
0006293149.tif 000033
【図１３Ｅ】
0006293149.tif 000034
【図１３Ｆ】
0006293149.tif 000035
【図１４Ａ】
0006293149.tif 000036
【図１４Ｂ−１】
0006293149.tif 000037
【図１４Ｂ−２】
0006293149.tif 000038
【図１４Ｂ−３】
0006293149.tif 000039
【図１４Ｃ】
0006293149.tif 000040
【図１４Ｄ】
0006293149.tif 000041
【図１５Ａ】
0006293149.tif 000042
【図１５Ｂ】
0006293149.tif 000043
【図１５Ｃ】
0006293149.tif 000044
【図１５Ｄ】
0006293149.tif 000045
【図１６Ａ】
0006293149.tif 000046
【図１６Ｂ】
0006293149.tif 000047
【図１６Ｃ】
0006293149.tif 000048
【図１７Ａ】
0006293149.tif 000049
【図１７Ｂ】
0006293149.tif 000050
【図１７Ｃ】
0006293149.tif 000051