(57)【要約】  本発明では、培養細胞を処理する方法が提供され、この方法は、a）平坦な2次元対象物（薄片）を提供するステップであって、前記対象物は、外部刺激の適用の際に、平坦状態から巻き回し状態に変化する材料を有するステップと、b）前記薄片上に、細胞を提供するステップと、c）前記外部刺激の適用により、前記平坦状態から巻き回し状態に、前記薄片が変化するステップとを有する。
2010516273.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞を処理する方法であって、
a）平坦な2次元対象物（薄片）を提供するステップであって、前記対象物は、外部刺激の適用の際に、平坦状態から巻き回し状態に変化する材料を有するステップと、
b）前記薄片上に、細胞を提供するステップと、
c）前記外部刺激の適用により、前記平坦状態から巻き回し状態に、前記薄片が変化するステップと、
を有する方法。
【請求項２】
前記ステップb）は、
b1）前記薄片に、細胞を種付けするステップと、
b2）前記細胞を成長させるステップと、
のサブステップを有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記刺激は、pHの変化の発生、温度の変化の発生、電磁波に対する暴露の発生、特定の塩もしくは有機化合物に対する暴露の発生、または所与の濃度に対する暴露の発生、電場の印加、磁場の印加、音波の印加、振動の付与からなる群から選定されることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記薄片は、ヒドロゲルで構成された材料を有することを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記薄片は、2層構造、3層構造、多層構造、および／または傾斜構造を有することを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの後、前記巻き回し薄片は、所定の空間パターンで分布され、3次元組織が形成されることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの後、異なる細胞種を有する巻き回し薄片が、所定の空間パターンで分布され、3次元不均質組織が形成されることを特徴とする請求項1乃至6のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの後、前記巻き回し薄片は、開放端で相互に位置が揃えられることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの前に、異なる成長細胞支持薄片が重ね合わされることを特徴とする請求項1乃至8のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの後、前記巻き回し薄片は、損傷組織領域に供給されることを特徴とする請求項1乃至9のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
請求項1乃至10のいずれか一つに記載の2次元対象物（薄片）を製造する方法であって、
a）前記薄片の形状を定める壁を形成するグリッドを有するモールドを提供するステップと、
b）前記モールド内で前駆体材料を成形するステップと、
c）成形材料を硬化して、薄片を得るステップと、
を有する方法。
【請求項１２】
請求項1乃至10のいずれか一つに記載の方法を用いて、または請求項11による方法で製作される2次元対象物（薄片）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞を処理する方法に関し、特に、ヒト組織工学および細胞療法用途における細胞ハンドリングまたは細胞供給のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、医療科学の分野における来るべき新たな研究分野である。再生医療に使用される多くの方法および用途がある。これらは、大きく4つの領域に分離される：
生体外（in  vitro）ヒト組織工学では、組織は、土台および細胞を用いて、体外で成長される。次に、工学組織は、患者に移植され、障害のあるまたは消失した組織と置換される；
生体内（in  vivo）ヒト組織工学では、土台は、周囲の健康な組織からの細胞の成長を助長させるため、損傷した組織領域に設置され、損傷組織が再生される；
細胞療法は、損傷した組織領域に、細胞、特に幹細胞を供給することに基づいており、これにより組織機能が回復する；
例えば、サイトカンおよびケモカインのような、成長因子（growth  factor）を利用した療法があり、この場合、損傷組織領域に内生細胞が使用される。成長因子は、例えば注射等により、関心領域に、直接供給されても良い。
【０００３】
細胞は、生体外組織工学および細胞療法の両方において、重要な役割を果たし、この場合、適切な細胞源、すなわち患者（自己細胞源）から、あるいはドナー（同種細胞源）から、まず細胞が収集され、その後、いくつかの異なるステップに晒され、最終的に患者に導入され、損傷組織が置換または回復される。ここ数年にわたる細胞療法およびヒト組織工学の著しい進展にもかかわらず、基本的根本的ステップ、例えば細胞ハンドリング、細胞成長または細胞内成長のそれぞれは、土台、細胞分化、細胞供給および細胞保留に、未だ問題を抱えており、このため、再生医療が臨床的に認められるには、更なる改善が必要となっている。
【０００４】
生体外ヒト組織工学において、細胞は、生物活性分子が存在する構造的なマトリクスで種付け、成長され、細胞の成長および分化誘導が促進され、生物反応器内で新たな組織が成長する。新たに成長した組織は、後に生体内移植される。現在のヒト組織工学では、ヒト組織工学的生成物において、異なる細胞種の3次元分布を正確に制御することは難しい。3次元コントラストで細胞の成長（in-growth）を制御することは、難しい。固体多孔質土台に種付けされた細胞は、通常、均一均質な細胞分布を示さない。この問題は、細胞が土台内を移動し、栄養物および代謝体が十分に拡散されるようにするには、十分なポアサイズが必要であるが、その一方で、大きなオープンポアを有する、極めて多孔質な構造では、少しの細胞しか保有できない上、多数の細胞を得る土台数を容易に得るには、高い表面積対体積比が必須であることにある。さらに難しい問題は、3次元構造マトリクスの異なる位置の異なる細胞種類内において、幹細胞または前駆細胞の分化を制御することである。しかしながら、異なる細胞種の3次元分布にわたる制御は、完全器官のような複雑な組織を構成する上では必須である。また、異なる細胞種の3次元分布にわたる制御は、大きな組織工学生成物の脈管化を提供する上でも必要である。
【０００５】
予め製造された多孔質土台を利用する代わりに、ヒドロゲル、光重合化ヒドロゲルおよび熱重合化ヒドロゲルで、細胞を取り囲む技術が知られている。通常これにより、均一で均質な細胞分布が得られ、大きく膨脹したゲル状態により、栄養物および代謝体の十分な拡散が可能となる。しかしながら、ヒドロゲルは、骨格組織（例えば骨および軟骨）の工学設計に必要な機械的安定性に乏しい。従ってこの場合も、一つのゲル内で、異なる細胞種を3次元分布にわたって制御することは、難しい。
【０００６】
（幹）細胞療法の基本原理は、損傷または障害のある領域に、（幹）細胞を導入することである。新たな（幹）細胞の導入により、成長、分裂および分化が可能となり、損傷サイトを、最初の組織と同じまたは同様の構造と機能を有する新たに形成された組織で再生させることができる。開発下にある細胞療法における主な問題は、多くの療法において、過剰な細胞が必要となることである。しばしば、関心領域に供給され、および／または保持された損傷細胞のうちの1％しか、1週間の間、生存することはできない。細胞は、高価で、大量に得ることは難しい（時間浪費の点で）。
【０００７】
従って、これらの細胞を多量に提供することは、好ましくない。さらに重要なことは、過剰な細胞を注入した後、何が起こるか不明なことである。これらの細胞は、有害であり、例えば癌のリスクが生じる可能性がある。
【０００８】
前述の問題は、個々の細胞または複数の細胞を、小さな細胞キャリアもしくは容器で取り囲むことにより、有意に克服される。細胞培養において、小型キャリア（microcarrier）を使用することは、良く知られている。小型キャリアは、バルク状であっても良く（表面に対してのみ細胞が付着する）、あるいはキャリアは、多孔質であっても良い（内部に細胞が捕獲される）。通常の小型キャリアは、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、PGLA、およびバイオセラミクスのような生体適合性材料をベースとしている。
【０００９】
一般に、小型キャリアの使用は、細胞培養に限定されている。ヒト組織工学に小型キャリアを使用することについては、少しの報告しかない。ある最近の文献（Declercq  Hら、Biomacromolecules、2005年（6）、1608頁）には、骨芽細胞が種付けされたマクロポーラスなゼラチン系小型キャリアを、注入可能な土台用の光重合性材料と組み合わせて使用することが記載されている。
【００１０】
第2に、国際公開WO96／12510号には、熱傷創および遅延回復創傷の処置用の移植組織を得るため、固体小型キャリアの表面での上皮細胞の成長、さらには、メチルセルロース、アルギン酸塩、およびアガロースのようなヒドロゲルへのキャリアの包含が示されている。
【００１１】
現在の小型キャリアの欠点として、細胞が表面に付着し、または大きなオープンポアに滞在することが挙げられる。結果的に、小型キャリアによって細胞が環境から保護されなくなってしまう（細胞と環境の間の接触の結果、細胞は、小型キャリア上で成長することが必要となる）。
【００１２】
また、現在の小型キャリアは、反応性に劣り、このため、環境に対する暴露と環境からの保護の間を切り替えることは難しい。
【００１３】
近年、シリコン技術に基づいた、インシュリンを生成することが可能な専用生細胞が付加された小型機械容器が提案されている（D’A  quino，R、2004年、Godd  Drug  Therapy：It’s  Not  Just  the  Molecule−It’s  the  Delivery,  Chemical  Engineering  Progress、100(2)、15s）。この装置には、生体外で細胞が充填され、その後移植される。装置は、多孔質膜を有し、この膜により、栄養物は、その内腔に入り、細胞に供給されるが、Tセルおよびマクロファージは、外部に維持され、これにより、免疫反応が抑制される。しかしながら、この装置の製作は、極めて労働集約的であり、従って、ヒト組織工学ならびに細胞療法用途における細胞ハンドリングおよび細胞供給には適さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第WO96／12510号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、前述の意味において、小型キャリアを提供することであり、細胞は、この小型キャリアに提供され、少なくとも適用の一部の時間の間、例えば細胞ハンドリングまたは細胞供給の間、細胞が環境から保護される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この目的は、以下の独立請求項に記載の方法および2次元対象物によって提供される。従属請求項は、好適実施例を示している。本願において、以下に示す全ての範囲は、これらの範囲を定める値を含むことが理解される。
【００１７】
本発明では、培養細胞を処理する方法が提供され、この方法は、
a）平坦な2次元対象物（薄片）を提供するステップであって、前記対象物は、外部刺激の適用の際に、平坦状態から巻き回し状態に変化する材料を有するステップと、
b）前記薄片上に、細胞を提供するステップと、
c）前記外部刺激の適用により、前記平坦状態から巻き回し状態に、前記薄片が変化するステップと、
を有する。これにより、細胞の少なくとも一部が被覆される。
【００１８】
これにより、本発明の範囲内で、幅広い適用範囲において、以下の少なくとも一つの利点が得られる：
−「細胞被覆」技術により、例えば保管の間、細胞を保護することが可能になる
−「薄片」により、以下に示すような、複雑な構造を構成することが可能になる
−外部刺激により、薄片上に細胞を提供するステップと、「被覆ステップ」とを分離することが可能になり、位相学的に好ましくない環境において、細胞の成長および／または提供を行うことが回避される。
【００１９】
好適実施例では、ステップb）は、
b1）前記平坦薄片上に細胞を種付けするステップと、
b2）前記細胞を成長させるステップと、
のサブステップを有する。
【００２０】
前記変態の後、最初平坦な薄片は、例えば、開放されたまたは実質的に閉じた端部を有する円筒状になる。そのような形状の一例は、図2および4参照のこと。薄片の通常の寸法は、細胞の寸法のオーダーであり、あるいはそれより幾分大きな寸法である。これは、本発明の好適実施例では、平坦ヒドロゲル薄片のサイズまたは全長が、10μm以上100mm以下であり、より好ましくは、10μm以上10mm以下であり、さらに好ましくは、20μm以上1mm以下であり、さらに好ましくは、50μm以上500μm以下であることを意味する。
【００２１】
成長細胞は、巻き回された薄片の内側に被覆される。従って、前記方法は、培養細胞用の小型キャリアを提供する。従って、以降、本発明による方法で製作された巻き回された薄片は、小型キャリアと称される。
【００２２】
本発明の別の好適実施例では、平坦薄片の厚さは、100nm以上1mm以下であり、500nm以上500μm以下であることが好ましく、1μm以上100μm以下であることがより好ましい。
【００２３】
本発明のさらに別の実施例では、巻き回された状態（圧縮細胞）での薄片の内径は、1μm以上5mm以下であり、5μm以上500μm以下であることが好ましく、10μm以上100μm以下であることがより好ましい。
【００２４】
単なる細胞成長に加えて、細胞は、薄片が巻き回し状態に変化する前に、分化のため平坦薄片上に残されても良い。これは、ステップb）とc）の間に、分化ステップを導入し得ることを意味する。同様に、ステップb）とc）の間で、細胞分裂、細胞成長、および細胞調整（profilation）が促進されても良い。当業者は、知識または適当な文献から、前述の細胞分化のために適用される条件を、容易に選定することができる。
【００２５】
薄片の巻き回し状態への変態前またはその間に、薄片は、該薄片が付着した基板から開放されることが好ましい。好適実施例では、薄片の開放および巻き回しは、いずれも反応性ヒドロゲル層の膨脹によって開始される。この実施例では、開放および巻き回し状態への変態は、同時に生じる。非膨脹状態では、薄片には、ほとんど応力が付加されず、基板に対する薄片の密着性が最適化されていなくても、薄片は、基板に接着する。膨脹状態では、発生応力およびヒドロゲル層の親水性の変化により、薄片が開放される。培養細胞は、ヒトおよびヒト以外の起源の幹細胞および分化細胞を含み、例えば成人間葉幹細胞、成人造血幹細胞、脂肪誘導体成人幹細胞、胚幹細胞（ES細胞）、クロンドロサイト（chrondrocyte）、骨芽細胞、骨細胞、筋芽細胞、心臓ミオサイト、線維芽細胞、Bセル、Tセル、デンドライト細胞、赤血球、リンパ前駆細胞、脊髄前駆細胞等がある。しかしながら、研究目的で、または後に生物学的物体の生成に使用される細胞の製造のため、不死化細胞、すなわちハイブリドーマ細胞等を使用することもできる。
【００２６】
同様に、これは、全脳幹細胞が使用される場合、ステップc）が、細胞が分化し始める前に行われることを意味する。多能性細胞が使用される場合、前述のように、分化（少なくとも一部）は、ステップc）の前に行われる。
【００２７】
ほとんどの場合、標準的な細胞培養条件が使用される。例えばヒトの細胞を含む、哺乳類の細胞は、pHを生理的な範囲に維持するため、5％のCO2雰囲気下、37℃で培養することが好ましい。FCS（ウシ胎仔血清）のような、標準的な成長媒体が使用されても良く、必要に応じて、成長因子、抗生物質等が添加されても良い。しかしながら、本発明の範囲に含まれる昆虫細胞、植物細胞、および原核生物細胞は、従来知られた異なる条件で処理されても良い。
【００２８】
薄片の形状は、四角形、矩形または平行四辺形に近い形状であっても良いことがさらに理解される。しかしながら、より複雑な形状を用いて、より複雑な被覆細胞を得ても良い。例えば、螺旋状の被覆状態を得るため、薄片は、引き延ばされた平行四辺形のような形状を有しても良い。同様に、薄片は、円形、楕円形、六角形、多角形のような不等辺四辺形、または三角形等であっても良く、何れの場合も、異なる被覆状態が得られる。位相的、機械的、または組成的に構造化された表面、および薄片内のより複雑な層状化表面により、より複雑な被覆細胞を提供しても良い。
【００２９】
本願において、巻き回し状態は、2つの場合を含むことを示すことには意味がある。すなわち、図2に示すように、少なくとも一部が多層化円筒状になる場合、または実質的にぴったり閉端した円筒体になる場合である。後者は、基本的に2つの接触端部の重なりが存在しないことを意味し、この場合、薄片の閉止側の間にも、より鋭角が生じる。
【００３０】
通常、細胞は、薄片上にのみ存在し、薄片同士の間の基板上には存在しないことが望ましい。薄片の間の間質に、細胞が定着されることを回避するため、基板の表面の下側は、細胞が付着しないように改質されても良く、あるいは細胞が、基板ではなく、薄片に明確な親和性を示し、ここで成長するように改質されても良い。しかしながら、ある場合には、細胞が基板上で成長することが問題にはならないこともある。薄片が開放され、巻き回されると、直ぐに、残留細胞を有する基板は、廃棄される。
【００３１】
ある特定の場合、細胞が薄片の間の間質にあることが有意なことがある。例えば、ある難しい細胞種には、成長のため共同供給細胞、すなわち適切な成長因子の形成が必要である。これらの供給細胞は、薄片の間に種付けされ、関心細胞は、薄片上で成長する。
【００３２】
本発明の方法の好適実施例では、前記刺激は、pHの変化の発生、温度の変化の発生、電磁波に対する暴露の発生、イオンに対する暴露の発生、特定の塩もしくは有機化合物に対する暴露の発生、または所与の濃度に対する暴露の発生、電場の印加、磁場の印加、音波の印加、振動の付与、酵素および他の生物分子への暴露、酵素および他の生物分子の抑制、ならびに／または溶質組成への暴露からなる群から選定される。
【００３３】
熱刺激に関して、例えば、加熱の際（例えば36℃以上）、薄片は、平坦状態にあり、冷却時（例えば35℃以下）に、巻回状態に変化することが好ましい。これは、薄片（およびそれに含まれる細胞）の冷却により、細胞の成長が停止され、代謝速度が抑制される点で、特に有意である。従って、細胞は、損傷または劣化の影響なく、輸送のため保管され、または各用途のため調製される。また、適用される刺激は、細胞の生理機能を劣化させないように選定されることが好ましい。
【００３４】
また、好適実施例では、薄片は、刺激応答材料を有するように提供され、この材料は、可逆的膨脹特性等を示し、すなわち前記刺激は、何回も印加される。
【００３５】
「電磁波」という用語は、可視光、紫外光、赤外光、X線、マイクロ波、電波等を含むことが理解される。さらに、「音」という用語は、超音波、超低周波、および可聴音を含むことが理解される。
【００３６】
好適実施例では、薄片は、ラベルまたはマーカを有する。そのようなラベル処理は、例えば、色素、磁気ビーズ、X線マーカ、MRIマーカ、または抗原、レクチン、反応基等のようなターゲット部分の使用により行われる。
【００３７】
薄片をラベル化することは、細胞自身をラベル化するよりも好適な方法である。そのような細胞自身のラベル化処理は、核および核酸を含む細胞小器官、ならびに細胞酵素、細胞代謝等に、悪影響を及ぼし得るからである。
【００３８】
そのようなラベル化処理により、各薄片は、例えば、土台において、例えばそのラベルにより、認識され、選定され、配置されるため、より多くの細胞種で構成された組織の設計が可能になる。またそのような位置決めは、例えば専用ロボットにより、自動でなされても良く、この場合、各ラベルまたはマーカ（例えば発光マーカ）は、ロボットにより自動で検出される。
【００３９】
さらに、ラベル化処理により、成長因子の特定の用途の細胞種が得られるようになり、これは、異なる細胞種を含む組織の工学的設計に極めて有益である。また、ピペットロボットを、この目的に用いても良い。
【００４０】
細胞療法に使用される場合、細胞と接触していない層は、組織特定抗原でラベル化されても良い。これにより、薄片の供給および対象サイトにおけるそれらの内容物が支持される。
【００４１】
本願において、Ｘ線マーカおよびMRIマーカは、巻き回された薄片の対象化を容易にする。このため、X線断層撮影法またはMRI断層撮影法が使用されても良い。また、各ラベルを使用して、対象有機体の内側で、薄片の被覆および暴露が制御され、あるいは統合または分解のそれぞれが制御される。
【００４２】
この方法により、細胞療法に必要な細胞数の抑制が助長され、培養細胞は、高価で、製造に時間がかかり、労働集約的であるため、例えばコストおよび資源が抑制される。より重要なことは、療法において、領域に残留する細胞数が減少することである。これは、対象生体に自由に浮遊する細胞の好ましくない副作用の影響、さらには癌または他の疾病の発生の抑制につながる。
【００４３】
組織工学において、前述の複数の小型容器が使用されると、前述の反応基を使用して、小型キャリアを相互に取り付けることができ、機械的に安定な細胞設置土台が形成される。
【００４４】
そのような反応基は、異なる小型キャリアの間に、例えば、共有結合またはイオン結合を形成する。しかしながら、他の構成成分も、本願において「反応基」と称される定義に属する。そのような構成成分は、例えば、抗原およびその対応する抗体の組であり、両者は、小型キャリア、レクチン、ストレプタビジン（streptavidin）／ビオチン等に結合される。
【００４５】
また、薄片は、生体適合性を助長する助剤を有することが好ましい。例えば、細胞と接触しない層は、抗凝血剤、例えばヘパリン部分を有し、血液凝固を回避する。当業者には、特定の要求により、生体適合性を助長させる他の助剤が選定され得る。例えば、細胞と接触する層を、特定の固定化分子、成長因子等で、改質することが可能である。
【００４６】
さらに別の好適実施例では、薄片は、ヒドロゲルで構成された材料を有する。
【００４７】
本願に使用される「ヒドロゲル」という用語は、各材料の少なくとも一部が、水中で水膨脹ネットワークおよび／または水溶性高分子鎖のネットワークを形成する高分子を有することを意味する。ヒドロゲル透過層は、膨脹状態において、50％以上の水分および／または溶媒を含むことが好ましく、これは、70％以上であることがより好ましく、80％以上であることがさらに好ましい。好適溶媒には、有機溶媒、好ましくは、有機極性溶媒が含まれ、より好ましくは、エタノール、メタノール、および／または（イソ）プロパノールのようなアルカノールが含まれる。
【００４８】
反応性ヒドロゲルは、特に好ましい。本願において、「反応性」という用語は、特に、ヒドロゲルが特定のパラメータの変化の際に、あるいは特定の刺激の印加により、形状および全容積が変化するような反応性を示すことを含む。その性質は、前に示されている（例えば、pHの変化、温度の変化、電磁波に対する暴露、特定の塩または有機化合物に対する暴露、あるいは所与の濃度、電場の印加、磁場の印加、音波の印加、振動の付加）。他の刺激は、酵素もしくは他の生物分子のような、専用検体の存在または濃度を含む（前述）。
【００４９】
ヒドロゲルは、pH、イオン濃度、温度、溶媒組成、および電位に感度を示すことが知られている。これらのパラメータにより、位相、形状、構造、屈折率、認識もしくは浸透速度の変化が生じ、その後、材料は元の状態に戻るように反転される。また、刺激感応ヒドロゲルは、酵素、タンパク質擬態、および抗体と一体化され、制御可能なアクチュエータが設計される。これらのヒドロゲルは、対象分子の添加により、膨脹することが示されている。これらのヒドロゲルの膨脹量は、高分子ネットワーク内の非共有結合性の相互作用の変化に寄与する。また、ヒドロゲルは、対象分子の存在下で、膨脹するように設計されても良い。これらは、膨脹の度合いが、存在する配位子の濃度に比例するように構成されても良い。
【００５０】
本発明の実施例では、ヒドロゲル材料は、ポリ（メタ）アクリル材料、置換ビニール材料またはその混合物、エポキシド、オキセタン、およびチオレンを含む群から選定された材料を有する。
【００５１】
本発明の別の実施例では、ヒドロゲル材料は、少なくとも一つの（メタ）アクリルモノマーおよび少なくとも一つの多官能性（メタ）アクリルモノマーの重合により構成されたポリ（メタ）アクリル材料を有する。
【００５２】
本発明のさらに別の実施例では、（メタ）アクリルモノマーは、（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエトキシエチル（メタ）アクリレート、またはこれらの混合物を含む群から選定される。
【００５３】
本発明のさらに別の実施例では、多官能性（メタ）アクリルモノマーは、ビス（メタ）アクリルおよび／またはトリ（メタ）アクリルおよび／またはテトラ（メタ）アクリルおよび／またはペンタ（メタ）アクリルモノマーである。
【００５４】
本発明の実施例では、多官能性（メタ）アクリルモノマーは、ビス（メタ）アクリルアミド、ジエチレングリコリジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコリジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコリジ（メタ）アクリレートトリプロピレングリコール  ジ（メタ）アクリレート、ペンタエリトリトール  トリ（メタ）アクリレート  ポリエチレングリコリジ（メタ）アクリレート、エトキシ化ビスフェノール-A-ジ（メタ）アクリレート、ヘキサンエジオリジ（hexanedioldi）（メタ）アクリレート、またはこれらの混合物を含む群から選定される。
【００５５】
前述の目的に適し、本願発明者により実施された試験において明らかになった他の材料は、エチルヘキシルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、PNIPAA-co-イソブチルメタクリレート（80：20）、PMMA、PMMA-co-トリメチロールプロパン  トリアクリレート、TMPTA、DEGDA、DEGDMA、ポリスチレン、PMMA-co-DEGDA（2：1）、PMMA-co-DEGDMA（2：1）、PS-co-TMPTA（2：1）、PS-co-DEGDA（2：1）、PS-co-DEGDMA（2：1）、およびトリ2-ヒドロキシエチル  イソシアヌール酸  トリアクリレートを含む。
【００５６】
本発明の実施例では、ヒドロゲル材料は、アニオンのポリ（メタ）アクリル材料を含み、これは、好ましくは、（メタ）アクリル酸、アリールスルホン酸、特にスチレンスルホン酸、イタコン酸、クロトン酸、スルホンアミド、またはこれらの混合物を含む群から選定され、
ならびに／またはカチオンのポリ（メタ）アクリル材料を有し、これは、好ましくは、ビニルピリジン、ビニルイミダゾール、アミノエチル（メタ）アクリレート、またはこれらの混合物を含む群から選定され、好ましくは酢酸ビニル、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート（メタ）アクリルアミド、エトキシエトキシエチル（メタ）アクリレート、またはこれらの混合物の群から選定された、中性モノマーの群から選定された、少なくとも一つのモノマーで共重合化された材料を有する。
【００５７】
これらのコポリマーの広い範囲は、pHの関数として、形状が変化し、印加電場および／または電流に応答することが知られている。従って、これらの材料は、本発明内の広い適用範囲で使用することができる。
【００５８】
本発明の実施例では、ヒドロゲル材料は、置換ビニル材料を有し、好ましくは、ビニルカプロラクタムおよび／または置換ビニルカプロラクタムを有する。
【００５９】
本発明の実施例では、ヒドロゲル材料は、N-イソプロピルアミド、ジエチルアクリルアミド、カルボキシイソプロピルアクリルアミド、ヒドロキシメチルプロピルメタクリルアミド、アクリロイルアルキルピペラジン、およびこれらのコポリマーを含む群から選定された、熱応答性モノマーをベースとし、さらに、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸、アクリルアミド、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、もしくはこれらの混合物を含む親水性モノマーの群から選定されたモノマーを有し、ならびに／または（イソ）ブチル（メタ）アクリレート、メチルメタクリレート、イソブチル（メタ）アクリレートもしくはこれらの混合物を含む、撥水性モノマーの群から選定されたモノマーと共重合化される。これらのコポリマーは、熱感応性であることが知られており、従って、本発明内の用途に広く使用することができる。
【００６０】
これらの応答性ヒドロゲルの好適例は、ポリ-n-イソプロピルアクリルアミド（PNIPAA）である。
【００６１】
前述のヒドロゲルは、低分子化合物に対して、すなわち、塩、ショ糖、脂質、成長因子、酸素等に対して、透過性である。このため、これらのゲルを有する薄片は、被覆状態であっても、細胞用の適当な成長条件を提供する。
【００６２】
別の実施例では、細胞と接する層は、ヒドロゲル材料ではない。この場合、接触層は、構造化され、ホールまたはミクロポアを含むように構成されることが好ましく、これにより栄養物および代謝体の輸送が可能になる。しかしながら、輸送は、被覆の「開放側」を介して行われても良い。
【００６３】
また、薄片は、バイレイヤ（2層）構造を有することが好ましい。異なる層の適切な材料を選定することにより、所与の刺激に対して、例えば異なる熱膨張係数、吸水量等により、2つの層で異なる膨脹が得られる。この差異により、移動に必要な駆動力が得られ、すなわち薄片の巻き上がりが生じ、この結果、薄片は、巻き回し状態になる。前者の好適実施例では、薄片は、非反応層と反応性ヒドロゲルで構成された層とで構成される。
【００６４】
また、薄片は、3層もしくは多層化構造、または傾斜構造、すなわち膨脹成分もしくはゲル化成分の垂直濃度勾配を有しても良く、この場合も同様の挙動が得られる。前述の勾配は、当業者には良く知られた方法で、形成することができる。このため、例えば、電気泳動法の傾斜ゲルを形成するために広く使用されるような、勾配混合器を使用しても良い。組成傾斜を構成する別の方法は、重合比に垂直勾配を形成することである（例えばUV吸収剤を用いた強度勾配）。
【００６５】
本願において、前述の少なくとも一つの層が、構造化表面を有しても良いことに言及しておくことには意味がある。
【００６６】
3層構造の実施例は、例えば、極めて薄い上部層を有し、これは、巻き回しの動きにつながる応力機構に影響しないが、細胞成長と適合性のある、あるいはこれを促進する組成を有する。
【００６７】
なお、高い密集度の密着細胞シートが薄片上で成長すると、単一層の、すなわち傾斜または層状配置のない薄片を使用することが可能となる。これらの場合、細胞シート自身が、第2の層として機能し、単一層の薄片と、密着細胞シートの間の膨脹挙動の差異により、薄片の巻き回しが生じ、被覆状態が得られる。この特徴は、細胞の付着が細胞がどのような細胞サイクルにあるかの判定に使用されるような、本発明の別の好適実施例において、特に有益である。ある状態では、細胞は、その接着点において、他の状態よりも大きな引張応力を受けるからである。
【００６８】
さらに別の好適実施例では、薄片は、構造化細胞含有表面を有するように提供される。これは、細胞付着を刺激し、特に細胞の特定の成長および配向への誘導を助長する。これらの場合、構造化細胞接触層または構造化非接触層には、薄片の好ましい巻き回し方向が生じる。
【００６９】
また、細胞培養の間、細胞成長または細胞分化のため、外部刺激が印加されることが好ましい。
【００７０】
そのような刺激は、例えば、成長因子の付加、機械適応力の付加、または電場もしくは磁場の印加からなる群から選定される。特に、これらの刺激は、細胞種および各用途に応じて、細胞分化を加速しまたは抑制し、細胞成長の方向および形状が制御される。
【００７１】
また成長因子は、細胞と接触する層に追加され、一度細胞が被覆された後も、細胞成長がなお刺激されても良い。
【００７２】
また、薄片は、細胞が種付けされる前に、支持構造上に配置または形成されることが好ましい。
【００７３】
好適実施例では、薄片は、生体分解性のおよび／または生物学的に安全な材料を有する。これは、ヒト組織工学および細胞療法における薄片の使用の双方にとって、重要な特徴である。例えば、生体分解性材料の使用により、ある環境下で、薄片が直接対象に投与されるようになる。同様に、生体外組織工学のため薄片が使用された際に、前記材料は、分解を遅らせるために選定することができる。分解速度は、細胞成長の速度、および成長細胞による過剰細胞マトリクスの形成速度に対応する。この実施例では、細胞外液ゲルマトリクスは、生体細胞物質により、段階的に置換される。
【００７４】
適当な生体分解性材料は、例えば、Gunatillake  P、Adhikari  R、Europian  Cells  and  Materials、（5）、2003、1-16に記載されており、この全内容は、本願の参照として取り入れられている。この中には、ポリ（グリコール酸）（PGA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ならびにこれらのコポリマーおよび誘導体があり、例えばポリ（d,l-乳酸-co-グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）（PLC）のようなポリラクトンおよびその誘導体、ポリ（プロピレンフマル酸）（PPF）およびその誘導体、ポリ[1,6-ビス（カルボキシフェノキシ）ヘキサン]のようなポリアンヒドライド、チロシン-誘導ポリカーボネートおよびその誘導体、ポリオルトエステル（POE）およびその誘導体、リジンジイソシアネート（LDI、2,6-ジイソシアナトヘキサン酸）のような非有毒劣化生成物を含むポリウレタン（PU）、ヘキサメチレンジイソシアネート（HDI）および1,4-ブタン二酸イソシアネート、例えばポリ（グリコリド-co-γ-カプロラクトン）のような、他の脂肪族ジイソシアネート、エチルグリシアネートポリホスファゼンのようなポリホスファゼンおよびその誘導体等である。
【００７５】
他の生体分解性高分子は、ポリ（マレイン酸）、ポリ（p-ジオキサノン）、ポリ（トリメチレン-カーボネート）、ポリ（3-ヒドロキシブタレート）、ポリ（3-ヒドロキシバロレート）およびこれらのコポリマーを有する。適当な反応性生体分解性高分子の分類は、ポリ（N-(2-ヒドロキシプロピル）メタクリアミド  モノ／ジラクテート)であり、これはSoga  Oら、Biomacromolecules  2004  (5)  818-821に示されている。この文献は、本願の参照として取り入れられている。
【００７６】
他の適当な生体分解性材料は、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、シルクまたはこれらの組み合わせを含む。
【００７７】
これらの生体分解性材料は、自身で使用されても、架橋剤とのネットワークにおいて使用されても良い。形成されたネットワークは、その後しばらくして分解され、架橋剤は、小さな分子量となり、後者は、洗い流される。別の実施例では、生体分解性材料は、非生体分解性物質で構成されたネットワーク内で固定化される。
【００７８】
別の好適実施例では、薄片は、外部刺激の適用の際に分解する材料を有するように提供される。この特徴は、例えば、細胞療法において有益であり、これにより、細胞を対象サイトに開放することが助長される。例えば、これは、超音波または赤外光を適用することにより、行われても良い。これらは、何れもヒトまたは動物の体に対して良好な浸透性を示すからである。
【００７９】
このため、巻き回し薄片は、巻き回し薄片の外側の対象部分を介して注入され、対象化される。後者は、外部刺激の付加の際、巻き戻され、関心領域に細胞が露出される。あるいは、薄片は、対象化されずに、体内にわたって均一に分布しても良く、この場合、外部刺激は、関心領域にのみ集中する。ここでのみ、巻き回し薄片は、非巻き回し状態となり、細胞内容物が放出される。
【００８０】
本発明による方法に使用される細胞は、付着性細胞であることが好ましい。しかしながら、浮遊細胞を使用しても良い。これらの場合、浮遊細胞を含む液体は、毛細管力により、巻き回し薄片に残留する。
【００８１】
前述の方法で製造される薄片の好適用途では、薄片が平坦状態から巻き回し状態に変化した後、巻き回し薄片は、所定の空間パターンで分配され、3次元組織が形成される。この方法は、生体外および生体内のヒト組織工学に使用されるものと同様である。このため、組織または臓器の形状が予め定められた土台が使用され、ここに、本発明による小型キャリアが配置される。
【００８２】
この方法により、異なる細胞培養法において培養され、特別に処理された異なる細胞種の不均質な分布を得ることが可能となる（その後、異なる薄片に被覆される）。この方法では、新たな成長組織のどの位置に、どの細胞種を配置するかを正確に制御することが可能となる。あるいは、一つの単一全能のまたは多能性の細胞種（幹細胞または前駆細胞）が、異なる細胞種に対して分化を刺激する異なる因子を含む、異なる薄片上で培養される。その後、所定の方法で、被覆が行われ、細胞は、ヒト組織工学設計の間、異なる組織種内で成長する。従って、例えば、骨カートリッジ界面構成が得られる。
【００８３】
同様に、前述のような3次元的方法で、反応基により、複数の小型キャリアを組み立てることも可能であり、専用の土台を使用せずに、組織または臓器が形成される。また、これは、ロボットにより行われることが好ましい。
【００８４】
別の好適実施例では、薄片は、該薄片が平坦状態から巻き回し状態に変化した後、巻き回し薄片が開放端で相互に位置合わせされる。この方法では、導管または連続ニューロンが形成される。そのような巻き回し薄片の位置合わせは、形状の拘束、外部磁場または電場、流れと剪断等のような外部因子により活性化される。
【００８５】
しかしながら、同様の種類の導管組織は、前述のように、螺旋状に変態する薄片を使用しても得ることができる。
【００８６】
さらに別の薄片の好適適用例では、成長細胞を支持する異なる薄片は、薄片が平坦状態から巻き回し状態に変化する前に、重ね合わされる。重ね合わせ薄片の巻き回し状態への変化により、細胞の同軸配置が得られる。これらは、異なる臓器を有しても良い。これにより、血管のような管状組織の形成が可能となり、内皮、結合組織、血管平滑筋細胞、および外膜（神経を含む）のような、異なる細胞の層状配置が可能となる。
【００８７】
しかしながら、同様の結果は、パターン化平坦細胞支持薄片を有する基板上で、巻き回し薄片を設置し整列させることによっても得ることができる。前述の刺激の適用により、これらの薄片は、平坦状態から巻き回し薄片状態に変化し、従って設置された巻き回し薄片の周囲を被覆する。ここでも、前述のような螺旋状に変化する薄片を使用して、同様の種類の導管状組織を得ることができる。
【００８８】
薄片の別の好適用途では、巻き回し薄片は、冷凍される。これにより、これらを将来の使用のため保管することができる。これについては、本願のいずれかの箇所に示す。
【００８９】
薄片の別の好適適用例では、巻き回し薄片は、損傷した組織領域に供給される。この実施例では、損傷組織の組織機能を回復することを助長する、幹細胞を使用することが好ましい。そのような方法は、アルツハイマーまたはパーキンソン病のような神経変性の疾病の処置、さらには例えば心臓発作によって生じる壊死組織の修復に、極めて有効である。
【００９０】
ここで、本発明による小型キャリアは、細胞を直接、損傷サイトに対象化する手段を提供する。この結果、コストおよび資源が抑制され、さらに処置の領域に残存し、結果的に癌のような疾病を発生させ得る細胞数が減少する。
【００９１】
また、別の好適実施例では、細胞を有する薄片は、対象に口から投与され、すなわち飲み込まれるように提供される。薄片の組成は、唾液、胃液、および酵素、ならびに／または小腸、膵臓もしくは胆嚢の酵素に対して、耐性があるように選定される。これにより、薄片は、未反応のまま維持され、細胞が所定の関心位置に到達するまで、細胞が保護される。ここでは、薄片は、それぞれ、局部的なpHまたは例えば酵素のような特定の助剤の存在により、非巻き回し状態、または分解状態となり、細胞が機能を発揮するようになる。
【００９２】
さらに別の好適実施例は、巻き回し薄片は、注入によりまたは外科的に、対象に移植され、内分泌機能が引き継がれる。この場合、薄片は、内分泌細胞すなわち膵臓細胞を有し、あるいは、インスリンのような細胞形成内分泌剤を有する。薄片の対象化は、前述のようにして可能になる。
【００９３】
薄片の浸透性により、栄養物は、内腔に入り、細胞に供給される。同様に、内分泌剤は、分泌されても良い。これと同時に、Tセルおよびマクロファージは、外方に維持され、従って免疫反応が抑制される。
【００９４】
本発明の別の態様では、前述のいずれかの請求項による、2次元対象（薄片）の製造方法が提供される。この方法は、
a）前記薄片の形状を定める壁を形成するグリッドを有するモールドを提供するステップと、
b）前記モールド内で前駆体材料を成形するステップと、
c）成形材料を硬化して、薄片を得るステップと、
を有する。
【００９５】
硬化の後、薄片は、モールドから取り外され、前述の方法に使用されることが好ましい。しかしながら、薄片は、モールドに残留させておいても良い。この実施例では、モールドは、例えば、以降の細胞培養の支持構造として機能する。
【００９６】
この方法は、2層、3層、または多層薄片の提供に使用することができる。この場合、成形および硬化ステップは、繰り返されても良い。異なる層に、異なる前駆体材料を使用することにより、前述のように、外部刺激の適用により、薄片が平坦状態から巻き回し状態に変化する特徴を得ることができる。適当な材料は、先に詳しく説明した。例えば、硬化ステップは、UV光、電子線、熱もしくは専用硬化剤の適用により、行われても良い。しかしながら、自己硬化材料を使用することも可能である。
【００９７】
この方法の好適実施例では、いくつかの層は、モールド内で成形され、多層化薄片が得られる。同様に、成形処理を通じて、薄片に傾斜構造が得られ、例えば、膨脹成分またはゲル化成分の垂直濃度勾配が得られる。
【００９８】
この方法の好適実施例では、いくつかの層は、モールド内で成形され、多層化薄片が得られる。これは、まず第1の層が成形硬化され、その後、第2の層が成形硬化され、これが繰り返されることを意味する。同様に、成形を通じて、薄片内に傾斜構造が得られ、例えば膨脹成分またはゲル化成分の垂直濃度勾配が得られる。勾配は、硬化処理の間、層全体に、例えば、光強度の傾斜を適用することにより、形成されても良い。
【００９９】
また、以下の添加剤が前駆体材料に添加されても良い：
a）生体適合性を助長する助剤、
b）生体分解性のおよび／または生物学的に安全な材料、
c）ラベルまたはマーカ、ならびに／または
d）成長因子、
e）抗原。
【０１００】
さらに別の好適実施例では、硬化処理の前または後に、薄片に構造化表面が提供される。これは、例えば、構造化テンプレートを用い、これを薄片の表面に押し付けることにより、なされても良い。また、例えば、吸収剤を含む前記ヒドロゲル層を、光重合化させることにより、厚さ方向に勾配を形成することも可能である。本願において、例えば、ダブル（または複数の）UV露光を用いても良い。表面パターンを得るため、あるステップは、マスクを使用するステップを有することが好ましい。
【０１０１】
別の選択肢は、偏向光を使用して、構造化表面を形成することである。この場合、選択的硬化処理により、あるいは偏向面における光分解により、線形構造が得られる。この方法を、異なる偏向平面で繰り返すことにより、表面に、グリッドパターン等が形成される。
【０１０２】
本発明の別の態様では、前述の方法で示したような構造化および／または材料特性を有する2次元対象（薄片）が提供され、あるいはこれが前述の製造方法で製作される。
【０１０３】
前述の構成部材は、請求項に記載の構成部材、および本発明の前述の実施例において使用される構成部材と同様、寸法、形状、材料選定および技術的概念に関して、いかなる特定の例外もなく、適正な分野において知られた選定基準が限定なく適用される。
【０１０４】
本発明の別の実施例では、前述の請求項に記載の2次元対象物（薄片）の製造方法は、以下のステップを有する：
a）平坦基板を提供するステップ、
b）前記基板を前駆体材料でコーティングするステップ、
c）パターン化光源を援用して、コーティング材料を硬化させるステップ、
d）未硬化前駆体材料を洗浄するステップ。
【０１０５】
これは、代替ステップであり、薄片の形状は、光リソグラフィーにより得られる。これは、薄片の形状が、前述のように光源のパターンによって定められることを意味し、これは、好適実施例では、UV源である。パターンは、例えば、パターンマスクによって、あるいは走査レーザによって、得ることができる。
【０１０６】
また、この方法を用いることにより、2層、3層、または多層薄片が提供される。この場合、コーティングステップおよび硬化ステップは、繰り返される。異なる層に異なる前駆体材料を使用することにより、前述のように、外部刺激の適用により、薄片は、平坦状態から巻き回し状態に変化するようになる。
【０１０７】
前述の方法の定義に属する例は、一例として示される。
【０１０８】
本発明の対象の追加の細部、特徴、特性および利点は、一例として、本発明による方法およびフレークの好適実施例を示す従属請求項、図面、および以下の各図面および例に関する記載に示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明による方法の第1のステップを示した図である。
【図２】本発明による方法の一連のステップを示した図である。
【図３】製作された小型キャリアの異なる使用を示した図である。
【図４】本発明による2つの小型キャリアであって、反応性ヒドロゲル材料を含むバイレイヤ構造を有する2つの小型キャリアの写真である。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
図1には、本発明による第1のステップを示す。図において、支持サポート構造10の上には、薄片（flake）11が設置または形成される。次に、薄片上に細胞が種付けされ、基板は、細胞成長が可能な状態に保持される。薄片がさらに処理される前に、これらの薄片は、支持構造から解放される。薄片の通常の寸法は、細胞の寸法のオーダーであり、あるいはこれよりも幾分大きく、例えば100×100μmの寸法である。
【０１１１】
図1から明らかなように、細胞は、薄片上にのみ存在し、薄片同士の間の基板上には存在しない。細胞が薄片の間の間質に定着することを避けるため、基板表面の下側は、細胞が付着しないように、あるいは細胞が基板上ではなく薄片上において、明確な親和性を示すように、改質される。しかしながら、ある場合には、これは、重要ではなく、細胞は、基板上に成長しても良い。薄片が取り外され、巻き回されると、取り残し細胞を有する基板は、廃棄される。
【０１１２】
ここには示さないが、ある特定の場合には、細胞が薄片の間に存在することが有意である。例えば、ある難しい細胞種には、成長のため、すなわち適正な成長因子の形成のため、共同供給細胞が必要である。これらの供給細胞は、薄片の間に種付けされるが、関心細胞は、薄片上で成長する。
【０１１３】
図2には、本発明による方法の一連のステップを示す。細胞21を有する薄片20は、波状矢印で示された外部刺激に晒される。
【０１１４】
前記刺激は、例えば、熱、pH変化、または電磁波（以降の記載参照）による暴露で構成されても良い。前記刺激に対する暴露によって、薄片に応答が生じ、すなわち前者は、各矢印で示されているように、平坦な状態から巻き回された状態に変化する。この方法では、前述のようにして、小型キャリアが製作される。
【０１１５】
図3には、製作された小型キャリアの異なる使用を示す。例えば、小型キャリアは、細胞療法に使用することができる。この場合、小型キャリアは、注射器31で示されているように、注射によって患者に投与される。また、小型キャリアは、生体外ヒト組織工学に使用される土台32に設置されても良い。しかしながら、小型キャリアは、例えば冷凍処理して、保管細胞に使用されても良く、その後、この細胞は、ペトリ皿33で示されているように、通常の細胞培養用に使用される。さらに、小型キャリアは、それ自身が3次元ヒト組織工学設計用に使用されても良い。
【０１１６】
この場合、いくつかの小型キャリアは、例えば、イオン結合または共有結合を構成する反応基の支援により、あるいは抗原／抗体部分、ストラプチビジン（straptividin）／ビオチン等を用いて、相互に結合され、3次元ネットワーク34が構成される。
【０１１７】
図4には、本発明による2つの小型キャリアの写真を示すが、この小型キャリアは、反応性ヒドロゲル材料を含むバイレイヤ構造を有する。小型キャリアは、700×1400μmの寸法であり、これらは、巻き回された状態では、約500μmの直径を有する。薄片を平坦状態から巻き回し状態に変化させる際に使用される刺激は、熱刺激であった。巻き回しの動きを誘発させるため、薄片は、室温の水槽中に配置された。室温の水中では、反応性ヒドロゲルは、顕著な膨脹を示し、その結果、基板から、パターン化薄片が取り外され、巻き回される。加熱時には、水槽は、33℃を超え、ヒドロゲルは崩壊し（PNIPAAは、33℃で低い臨界溶液温度（LCST）を示す）、ヒドロゲル層は、収縮する。その結果、バイレイヤは、33℃を超える水中での加熱中に、巻き広げられる。
【０１１８】
（例）
以下、例を用いて、本発明について説明する。これらの例は、本発明の範囲を限定するものと理解してはならないことに留意する必要がある。
【０１１９】
1．反応性バイレイヤ薄片の製作
1.1  エベクリル（Ebecryl）を含む非反応性上部層
細胞を被覆するためのバイレイヤ薄片の製作を実証するため、Ebecryl  1810（非反応性上部層として使用される）に、0.1wt％の開始剤（Irgacure651）、および開始剤：インヒビター（4-メトキシフェノール）が1：10となるように追加し、これを3000RPMで30秒間、ガラス基板（10分間UVオゾンで処理した）上にスピンコーティングした。その後、基板を2つのマスクの下側に配置した。一つは、薄片を定めるため、矩形状（寸法：700μm×1400μm）であり、一つは、各薄片内にEbecrylのパターンを定めるため、ストリップ状である。その後、UV-2フィルタを有するUV装置で、1秒間照射を行った。その後、生成物をイソプロピルアルコールで洗浄した。
【０１２０】
その後、2つの基板の一つとして、パターン化されたEbecryl層を有するガラス板を使用し、2つの平坦平行基板によって、セルを形成した。パターン化Ebecryl層は、セルの内側に配置した。セルの間隔は、スペーサとして50μmの厚さのテープを使用することにより、50μmに設定され、セルには、毛細管力により、50／50wt％水／メタノール中に、50wt％のn-イソプロピルアクリルアミド（NIPAA）（1mol%ジ-エチレングリコールジアクリレート（DEGDA））からなる反応性混合物が充填される。セルは、シャドーマスク（四角形状）の下側に配置され、4分間、UV光が照射された。照射後に、セルは、上部基板を除去することにより開放され、水で洗浄された。次に、室温の水槽内に、薄片を形成するため、重合化複合材を含む底部基板が配置される。室温の水中では、PNIPAAヒドロゲルは、大きな膨脹を示し、その結果、基板からパターン化薄片が開放され、Ebecryl  1810ストリップに対して垂直な方向に、巻き回される。加熱時には、水槽は、33℃を超え、PNIPAAヒドロゲルが崩壊し（PNIPAAは、33℃で低い臨界溶液温度（LCST）を呈する）、ヒドロゲル層は、収縮する。その結果、バイレイヤは、加熱の際に水槽の温度が33℃を超えると、巻き戻される。
【０１２１】
1.2  非反応性上部層として、MMA重合化により構成されたポリ（メチルメタクリレート）
細胞被覆用のバイレイヤ薄片の製作を実証するため、メチルメタクリレートに、3wt％の架橋剤（DEGDMA）、2wt％の開始剤（Ingacure  651）、および開始剤：インヒビター（4-メトキシフェノール）が3：1となるように追加し、これを1000RPMで30秒間、ガラス基板（10分間、UVオゾンで処理した）上にスピンコーティングした。その後、基板は、UV装置において、2つのマスク組を介して、100秒間照射された（例1に示したものと同じパターンを得るため、窒素雰囲気下で、UV透明ガラス蓋を有するステンレス鋼容器内に配置した）。その後、生成物は、イソプロピルアルコールで洗浄された。以降のステップは、非反応性層として、Ebecryl  1810を用いて、バイレイヤを形成する手順と同様である。
【０１２２】
1.3  非反応性上部層としてPMMA混線により構成されたポリ（メチルメタクリレート）
細胞被覆用のバイレイヤ薄片の製作を実証するため、一つの接着側（A174シラン）と、一つのフルオロシランコーティング側とで構成され、スペーサとして50μmの厚さのテープを有するセルに、毛細管力で、50／50wt％の水／メタノール中に、50wt％のn-イソプロピルアクリルアミド（NIPAA）（1mol％ジ-エチレングリコールジアクリレート（DEGDA））からなる反応性混合物が充填される。セルは、シャドーマスク（四角形状）の下側に配置され、UV光で3分間照射される。照射後、上部基板を除去することにより、セルが開放され、セルが水で洗浄される。次に、ホットプレート上に、90℃で2分間配置され、UV装置内で、フォトマスクの下側に配置され、120秒間照射される。最後に、基板は、アニソール中で（3分間）洗浄され、10％HF中に5分間基板を保持した状態で、基板から開放することにより、個々の薄片が得られる。
【０１２３】
1.4  単一UV露光
細胞被覆用のバイレイヤ薄片の製作を実証するため、50wt％のPMMA（70：30トリメチロールプロパン  トリアクリレート）に、アニソール（またはトルエン）中の1wt％のフォト開始剤（Ingacure  651）を加え、これを、3000RPMで30秒間、ガラス基板上にスピンコーティングした。コーティング基板は、80℃で1分間保持される。次に、スペーサとしてのスコッチテープによって、50μmの間隔で分離された状態のまま、この基板を第2の基板と結合することにより、セルが形成される。その後、セルには、毛細管力により、50／50wt％の水／メタノール中の60wt％のn-イソプロピルアクリルアミド（NIPAA）（1mol％ジ-エチレングリコールジアクリレート（DEGDA））と、＋1％Irgacure  651とからなる反応混合物が充填される。セルは、シャドーマスク（四角形状）の下側に配置され、90秒間、UV光で照射される。最後に、セルが開放され、薄片を有する基板が、アニソールで（3分間）洗浄される。個々の薄片は、水中で膨脹させることにより、これらを基板から取り外すことにより得られる。
【０１２４】
2．バイレイヤ薄片を構成する際のセル被覆
真核細胞の被覆処理を実証するため、方法3により調製したようなバイレイヤのパターンを有する基板を準備した。通常、パターン化薄片の寸法は、細胞の寸法のオーダーであり、あるいは幾分大きく、700×1400μmの寸法である。
【０１２５】
基板に設置された下側層は、PNIPAA層である。PNIPAA層の上部には、PMMAが設置され、良好な細胞密着性が得られる。薄片は、37℃に維持される。この温度では、PNIPAAは、崩壊状態にあり、上部層と底部層の間に、応力はない（あるいはほとんどない）。また、ガラス基板とPNIPAAとの間の密着は、比較的低いが、パターン化薄片の平坦形状は、維持され、ガラス基板との密着は，確保される。ガラスとバイレイヤ薄片の複合材を、注意深く37℃に維持し、これらは、Nunclon  Asurface  Easyflask内に配置される。A-431ヒト癌腫類表皮細胞は、基板上に種付けされ、37℃の5％CO2湿潤雰囲気で、適切な媒体D-MEM（Dulbecco  Modified  Eagle  Medium）と、10％FCS（Fetal  Calf  Serum）と、1％のPenStrep（ペニシリン／ストレプトマイシン）と、1％GlutaMAX媒体とが補給される。細胞は、37℃の5％CO2湿潤雰囲気の培養器中で成長する。
【０１２６】
十分な細胞密集度が得られ、細胞がPMMA上部層に密着した後、温度が室温にされる。この操作により、PNIPAAヒドロゲル層が膨脹して、薄片が巻き回り、ガラス基板に対する密着性が低下する。細胞は、自動的に小さな小型キャリアに被覆される。
【０１２７】
前述の詳細な実施例における素子および特徴の特定の組み合わせは、一例にすぎず、これらの教示と、本願および参照として取り入れられた特許／出願における他の教示との相互変換および置換も、明確に考慮される。当業者には明らかなように、本願に記載の変更、修正、および他の実施は、特許請求の範囲の本発明の思想および範囲から逸脱しないで、当業者には容易に想像可能である。従って、前述の記載は、一例であって、限定的なものではない。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲およびその均等物によって定められる。また、記載および請求項中に使用される参照符号は、記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【図１】
2010516273.tif 000003
【図２】
2010516273.tif 000004
【図３】
2010516273.tif 000005
【図４】
2010516273.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月27日(2009.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞を処理する方法であって、
a）平坦な2次元対象物（薄片）を提供するステップであって、前記対象物は、外部刺激の適用の際に、平坦状態から巻き回し状態に変化する材料を有するステップと、
b）前記薄片上に、細胞を提供するステップと、
c）前記外部刺激の適用により、前記平坦状態から巻き回し状態に、前記薄片が変化するステップと、
を有する方法。
【請求項２】
前記ステップb）は、
b1）前記薄片に、細胞を種付けするステップと、
b2）前記細胞を成長させるステップと、
のサブステップを有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記刺激は、pHの変化の発生、温度の変化の発生、電磁波に対する暴露の発生、特定の塩もしくは有機化合物に対する暴露の発生、または所与の濃度に対する暴露の発生、電場の印加、磁場の印加、音波の印加、振動の付与からなる群から選定されることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記薄片は、ヒドロゲルで構成された材料を有することを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記薄片は、2層構造、3層構造、多層構造、および／または傾斜構造を有することを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの後、前記巻き回し薄片は、所定の空間パターンで分布され、3次元組織が形成されることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの後、異なる細胞種を有する巻き回し薄片が、所定の空間パターンで分布され、3次元不均質組織が形成されることを特徴とする請求項1乃至6のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの後、前記巻き回し薄片は、開放端で相互に位置が揃えられることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの前に、異なる成長細胞支持薄片が重ね合わされることを特徴とする請求項1乃至8のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
前記薄片が前記平坦状態から巻き回し状態に変化するステップの後、前記巻き回し薄片は、損傷組織領域に供給されることを特徴とする請求項1乃至9のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
請求項4乃至10のいずれか一つに記載の細胞用の小型キャリアとしての2次元対象物（薄片）を製造する方法であって、
a）前記薄片の形状を定める壁を形成するグリッドを有するモールドを提供するステップと、
b）前記モールド内で前駆体材料を成形するステップと、
c）成形材料を硬化して、薄片を得るステップと、
を有する方法。
【請求項１２】
請求項4乃至10のいずれか一つに記載の方法を用いて、または請求項11による方法で製作される、細胞用の小型キャリアとしての2次元対象物（薄片）。
【国際調査報告】
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