(57)【要約】本発明は、顕微鏡対象物の監視および／または培養を実行するための機器、システム、および方法に関する。顕微鏡対象物は、具体的には、組織試料および胚等の培養対象物等の、細菌および培養対象物等の顕微鏡有機体であり、自動デジタル撮像および微速度撮影の顕微鏡検査のための胚の操作を容易にすることによって、胚成長中の孵化のための、および体外受精（ＩＶＦ）に使用する最適な胚の選択を容易にするための最適かつ安全な培養条件を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）および対象物培地（５ａ、５ｂ）の監視および／または培養のための機器であって、
−自身の上面（２Ａ）に少なくとも２つの凹部（３ａ、３ｂ）を備えるスライド（２）を備え、
−各凹部（３ａ、３ｂ）は、各それぞれの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）および対象物培地（５ａ、５ｂ）を保持するために該凹部よりも小さい断面を有する窪み（４ａ、４ｂ）を備え、
−該スライド（３ａ、３ｂ）は、該培地（５ａ、５ｂ）が相互に流体連通しないように、該凹部（３ａ、３ｂ）間に共通の重層（７）を提供するためのリザーバ（６ａ、６ｂ）が提供され、および／または、
−各凹部（３ａ、３ｂ）は、各それぞれの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）および対象物培地（５ａ、５ｂ）を保持するために該凹部よりも小さい断面を有する窪み（４ａ、４ｂ）を備え、
−少なくとも該凹部（３ａ、３ｂ）および／または該窪み（４ａ、４ｂ）は、該スライド（２）上に自身の輪郭に対応する底面プロファイル（２０）を呈し、そのプロファイル（２０）の微細構造は、スライドホルダの対応する微細構造に一致するように適合され、および／または、
−各凹部（３ａ、３ｂ）は、各それぞれの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）および対象物培地（５ａ、５ｂ）を保持するために該凹部よりも小さい断面を有する窪み（４ａ、４ｂ）を備え、
−該機器の少なくとも一部分には、操作突出部（７０）が設けられ、および／または、
−該スライドは、各凹部を一意的に識別するための手段を備える、
機器。
【請求項２】
前記スライド（２）は、前記培地（５ａ、５ｂ）が相互に流体連通しないように、前記凹部（３ａ、３ｂ）間に共通の重層（７）を提供するためのリザーバ（６）がさらに提供される、請求項１に記載の機器。
【請求項３】
少なくとも前記凹部（３ａ、３ｂ）および／または前記窪み（４ａ、４ｂ）は、前記スライド（２）上に自身の輪郭に対応する底面プロファイル（２０）を呈し、そのプロファイル（２０）の微細構造は、スライドホルダの対応する微細構造に一致するように適合される、請求項１または２に記載の機器。
【請求項４】
前記底面プロファイル（２０）の少なくとも一部分には、熱伝導層（２３ａ、２３ｂ）が設けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の機器。
【請求項５】
前記機器の少なくとも一部分には、操作突出部（７０）が提供される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の機器。
【請求項６】
前記リザーバ（６）は、前記上面（２Ａ）内の共通の陥凹部（６Ｂ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の機器。
【請求項７】
前記リザーバ（６）は、前記少なくとも２つの凹部（３ａ、３ｂ）間で流体連通（６Ｂ）する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の機器。
【請求項８】
前記底面プロファイル（２０）は、対応するスライドホルダに一致するように適合される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の機器。
【請求項９】
前記凹部は、前記スライド（２）上に自身の輪郭に対応する底面プロファイル（２０）を呈し、そのプロファイル（２０）は、熱伝導層（２３）が提供される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１０】
前記熱伝導層（２３）は、アルミニウム、スチール、またはその同等物等の金属である、請求項１、４〜９のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１１】
前記熱伝導層（２３）は、熱源への接続に適合される、請求項１、４〜１０のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１２】
前記熱伝導層（２３）は、前記スライド（２）の前記上面（２Ａ）の少なくとも一部分、好ましくは、前記窪み（４ａ、４ｂ）および／または前記凹部（３ａ、３ｂ）の内面の少なくとも一部分を提供する、請求項１、４〜１１のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１３】
前記上面（２Ａ）および／または前記底部分（２Ｂ）の少なくとも一部分には、前記操作突出部（７０）が提供される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１４】
前記操作突出部（７０）の少なくとも一部分は、前記スライドから上方および／または下方に垂直方向に延出している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１５】
前記操作突出部（７０）は、フィンを備える、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１６】
前記操作突出部（７０）は、熱伝導材料および／またはポリマー材料で提供される、請求項１〜１５のいずれかに記載の機器。
【請求項１７】
前記操作突出部（７０）は、自身の上に表示するスライド識別を提供するように配置される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１８】
前記窪み（４ａ、４ｂ）および／または前記凹部（３ａ、３ｂ）の内面の少なくとも一部分は、ポリマーから作製される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１９】
概してスライド（２）全体は、ポリマーから作製される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２０】
前記ポリマーは、ＰＥＮ、ＰＥＴｇ、および／またはＰＥＴ等のポリエステルである、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２１】
前記顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）は、成長中の細胞培養、具体的には、成長中の胚等の顕微鏡有機体である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２２】
一連の凹部（３ａ、３ｂ）が設けられる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２３】
前記凹部（３ａ、３ｂ）は、少なくとも１つの方向に相互に等距離に配置される、請求項２２に記載の機器。
【請求項２４】
各凹部（３ａ、３ｂ）および／または窪み（４ａ、４ｂ）の寸法は、選択される用途に適合される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２５】
凹部および／または窪みの垂直切断面は、円柱状、テーパ状、円錐状、スリット状、ピラミッド状、台形状、円形の一部、または実質的に円形、あるいは任意のそれらの組み合わせを含む群のうちのいずれかの形状を保持する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２６】
凹部および／または窪みの水平切断面は、円形、楕円形、長方形、ひし型、または６角形、あるいは任意のそれらの組み合わせを含む群のうちのいずれかの形状を保持する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２７】
前記凹部は、前記顕微鏡対象物を前記窪みに誘導するための漏斗部形式の、実質的に平滑な底部分をさらに備え、前記漏斗部の形式は、水平断面から成る群から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２８】
窪みおよび／または凹部の寸法は、実質的に等しい直径および深さを有する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２９】
前記窪み（４；４ａ、４ｂ）の寸法は、前記凹部（３；３ａ、３ｂ）の直径に比べて比較的小さくなるように選択され、監視／培養する前記対象物の大きさに対して、該対象物の直径の約１．１ｘから１０ｘであり、好ましくは、前記監視／培養する対象物の直径の１．５ｘから３ｘである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３０】
前記少なくとも２つの凹部の直径は、用途に応じて、１ｍｍと２５ｍｍとの間であり、好ましくは、２ｍｍから５ｍｍまでであり、最も好ましくは、約４．０ｍｍである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３１】
前記窪みの各々は、それらのそれぞれの凹部内の実質的に中心に設けられる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３２】
各窪みの前記底部分は、実質的に平面である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３３】
各窪みの少なくとも前記底部分は、透明である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３４】
前記スライドの寸法は、２５ｍｍｘ７６ｍｍ等の、標準的および／または特別に適応させられた顕微鏡システムおよび／または培養システム内に嵌合するような寸法である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの凹部の前記底部分には、水平に対して、約５度から６０度まで、好ましくは、１０度と４５度との間、より好ましくは、１５度から３５度まで、最も好ましくは２５度から３０度までの角度を有する実質的に平滑表面の漏斗部が設けられる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３６】
各凹部を一意的に識別するための前記手段は、前記スライドにおいて少なくとも１つの配置マーカを備える、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの配置マーカは、スライドホルダ上の対応する部分を係合可能である陥没または突出部分である、請求項３６に記載の機器。
【請求項３８】
各凹部を一意的に識別するための前記手段は、前記スライドにおける凹部の行を識別するための少なくとも１つのマーカと、凹部の列を識別するための少なくとも１つのマーカとを備える、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の機器。
【請求項３９】
各凹部を一意的に識別するための前記手段は、前記窪みの前記実質的に平面の底面の中および／またはその上、ならびに／あるいは前記底面プロファイルの中および／またはその上、ならびに／あるいは該窪みの前記透明底部分内における個々の窪み識別（４１）を提供する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の機器。
【請求項４０】
各凹部を一意的に識別するための前記手段は、解剖顕微鏡（図１２）における胚の操作中に確認可能であるように、前記窪み（４ａ、４ｂ）の近くに配置される顕微鏡数表示（高さ約１ｍｍ）から成り、これらの数表示は、通常、裸眼では不可視的である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の機器。
【請求項４１】
少なくとも２つの顕微鏡対象物の監視および／または培養を実行するように配置されるシステムであって、少なくとも２つの顕微鏡対象物および対象物培地を取り扱うための機器を備え、該機器は、自身の上面に少なくとも２つの凹部を備えるスライドを備え、各凹部は、各それぞれの顕微鏡対象物および対象物培地を保持するための該凹部よりも小さい断面を有する窪みを備え、少なくとも該窪みは、該スライド上のその輪郭に対応する底面プロファイルを呈し、該システムには、少なくとも該少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する該底面プロファイルを一致させるように適合されるスライドホルダを備える配置手段がさらに設けられる、システム。
【請求項４２】
少なくとも２つの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）の監視および／または培養を実行するように配置されるシステムであって、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の機器と、該機器を保持するための配置手段とを備える、システム。
【請求項４３】
顕微鏡をさらに備え、前記配置手段は、それに対して該顕微鏡の下に前記機器を配置するように配設される、請求項４１または４２に記載の機器。
【請求項４４】
前記少なくとも２つの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）を培養するための温度の提供に適切である熱源をさらに備え、前記配置手段は、該熱源への熱接触を確実にするように使用される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４５】
前記配置手段は、少なくとも前記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する前記底面プロファイルに一致させるように適合される、スライドホルダを備える、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４６】
所定の安定温度を少なくとも前記窪みに提供するように適合される熱伝導層がさらに設けられ、その温度は、培養、具体的には、前記少なくとも２つの顕微鏡対象物の孵化に適切である、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４７】
前記熱源は、少なくとも前記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する前記底面プロファイルに一致するように適合されるスライドホルダとして設けられる、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４８】
前記スライドホルダは、熱伝導アームとして設けられ、好ましくは、アルミニウム、鋼、またはその同等物等の金属から作製される、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４９】
前記機器の前記底面プロファイル（２３）には、前記熱源への接続に適合される熱伝導層が設けられる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の機器を引用する請求項４１〜４８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５０】
前記顕微鏡は、カメラまたは映像機器等の撮像手段をさらに備える、請求項４１〜４９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５１】
前記配置手段は、
−前記スライドホルダを貫通する少なくとも１つの垂直孔と、
−垂直光を提供するレーザ等の発光体と、
−該スライドホルダが監視および／または培養のための正確な位置にある場合に、発光される光を検知するための、該発光体に対して該スライド（２）の反対側にある光センサと、
をさらに備える、請求項４１〜５０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５２】
前記配置手段は、前記顕微鏡および／または前記熱源に対して前記機器を自動的に配置するための制御ユニットをさらに備える、請求項４１〜５１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５３】
前記制御ユニットは、安定孵卵器環境のために前記熱源の温度を制御するように適合され、および／または前記撮像手段を使用して前記顕微鏡対象物の画像を監視および／または収集し、および／または該対象物の品質査定のために該画像を分析し、および／または交換スライドを記録するように適合される、請求項５１または５２に記載のシステム。
【請求項５４】
代謝活動の非侵襲性測定を実行するための手段であって、例えば、ｐＨ、酸素含有量、およびその同等物を測定するためのマイクロセンサを備える、請求項４１〜５３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５５】
複数の機器を備える、請求項４１〜５４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５６】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載の機器を操作するための方法であって、前記システムのスライドホルダを備える対応する配置手段に、少なくとも前記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する該機器の前記底面プロファイル（２０）を一致させるステップによって、請求項４１〜５５に記載のシステム内に該機器を配置することを含む、方法。
【請求項５７】
前記顕微鏡および／または２つの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）を培養するための温度の提供に適切である前記熱源の下に、それらに対して前記機器を配置するステップを含む、請求項４１〜５５のいずれか一項に記載のシステムにおける機器の監視および／または培養のための方法。
【請求項５８】
前記システムのスライドホルダを備える対応する配置手段に、少なくとも前記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する前記機器の前記底面プロファイル（２０）を一致させるステップをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
一致させる前記ステップは、前記スライドの前記上面を実質的に水平方向に保持し、該スライドを前記スライドホルダの上の位置に移動し、該スライドホルダ上に、該スライドを垂直方向に降下させることによって実行される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記少なくとも２つの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）の顕微鏡検査を実行する前記ステップは、手動的または自動的、また、その後連続してまたは実質的に同時に実行される、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記熱伝導層を前記熱源に接続することによって、少なくとも前記窪みに所定の安定温度を提供するステップをさらに含み、その温度は、培養、具体的には、前記少なくとも２つの顕微鏡対象物の孵化に適切である、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
培養に適切な所定の温度をある期間、前記熱伝導層に提供するステップをさらに含む、請求項３４〜５５のいずれか一項に記載のシステムにおける請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記熱源は、前記スライド、前記スライドホルダ、および／または前記突出部に接続される、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
−前記培地（５ａ、５ｂ）が相互に流体連通しないように、少なくとも前記窪み（４ａ、４ｂ）の各々に対象物培地（５ａ、５ｂ）を提供するステップと、
−該少なくとも２つの窪み（４ａ、４ｂ）の各々に顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）を提供するステップと、
−該培地（５ａ、５ｂ）が相互に流体連通しないように、前記少なくとも１つのリザーバ（６）内に共通の重層（７）を提供するステップと、
−該少なくとも２つの顕微鏡対象物の顕微鏡検査および／または培養を実行するステップと
をさらに含む、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）は、成長中の細胞培養、具体的には、成長中の胚等の顕微鏡有機体である、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記顕微鏡有機体は、単一細胞培養等の体外細胞培養、卵母細胞等の胚、胚、原形質体、細胞質体等、および／または細菌、生体試料、ならびに任意のそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記共通の重層は、流体、半固体、および／または固体であり、好ましくは、培養温度中に流体である、請求項５６〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象物培地は、流体、半固体、および／または固体であり、好ましくは、培養温度中に流体である、請求項５６〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記機器を配置する前記ステップは、Ｘ、Ｙ、および／またはＺ方向において前記操作突出部（７０）および／または前記スライドホルダを操作することによって、手動および／または自動配置によって実行される、請求項５６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記配置するステップは、前記制御ユニットを使用して、前記顕微鏡および／または前記熱源に対して前記機器を自動的に配置するステップをさらに含む、請求項５６〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記配置することは、
−少なくとも１つの垂直光ビームを提供するためのレーザ光等の光を発光するステップと、
−該少なくとも１つの光ビームが、前記スライドホルダを貫通する前記少なくとも１つの垂直孔を通過し、かつ、前記スライドの反対側における前記センサによって検知されるまで、前記顕微鏡および／または前記熱源に対して該スライドを配置するステップと
をさらに含む、請求項５６〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記カメラおよび／または映像機器を使用して、前記スライドの画像を監視および／または提供するステップをさらに含む、請求項５６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
安定孵卵器環境のために前記熱源の温度を制御するステップ、および／または前記撮像手段を使用して前記顕微鏡対象物の画像を監視および／または収集するステップ、および／または該対象物の品質査定のために該画像を分析するステップ、および／または交換スライドを記録するステップをさらに含む、請求項５６〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、顕微鏡対象物の監視および／または培養を実行するための機器、システムおよび方法に関する。顕微鏡対象物は、特に、バクテリアおよび細胞培養のような微小な組織、例えば、組織試料および胚のような培養対象物であり、自動デジタル画像装置および低速度撮影顕微鏡に対する胚操作を容易にすることによって、胚発達の間の保温および体外受精（ＩＶＦ）において用いられるべき最適な胚の選択の容易化のために、光学的および安全上の培養条件を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
顕微鏡検査のために微小対象物を手動で配置することは時間を要する。対象物を見つけ出し、対象物を視野の中心に配置し、そして対象特徴に焦点を合わすことは、臨床顕微鏡検査に関連する作業の大部分を占める。具体的な対象例として、標準的なＩＶＦ治療の一部である卵母細胞および胚の顕微鏡検査が挙げられ、本検査では、規定の温度、大気、およびｐＨを有する安全な孵卵器環境の外部における胚の操作が相当なストレス要因となり、このストレス要因を最小限に抑えなければならない。対象物を配置すべき所定のＸ−Ｙ−Ｚ座標を探索することによって、対象物を効率的に再配置することが可能である自動化システムが既知である。しかしながら、所定の対象物の正確な座標を入手するという最初のタスクは、多大な時間を必要とする。対象物の動きおよび画像収集が自動である場合、これは、通常、検索アルゴリズムまたは人間の操作者による対象物の探索を可能にするために、グリッドパターンで連続的な画像を収集し、これらの画像をコラージュでステッチするという意味を含む。代替として、これは、対象物を手動で配置し、座標を記録するために操作者の支援を伴う。
【０００３】
概して、対象物を固定する所定のスポットに、大きめの対象物を配置することは可能であるが、これが、液体培地中の顕微鏡的大きさの対象物になると困難さを増す。具体的な対象物の例として、直径が約１／８ｍｍ（約１２０μｍ）だけしかなく、密度がその成長培地よりも若干高い初期のヒト胚が挙げられる。培地の液滴に胚を正確に配置することは困難であり、簡単に扱うとその配置が妨害される。
【０００４】
顕微鏡対象物の正確な配置は、多くの用途において一般的な関心事である。しかしながら、体外受精（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ＩＶＦ）および関連技法等の胚移植（Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＥＴ）技法を使用する場合、これは、選択された胚を再着床する前の期間中に、成長中の胚の体外培養を伴う。理想的な成長条件であっても、再着床のために最も生存能力のある胚を選択するツールとしての選択基準が必要となる。胚の生存能力は、移植に対する胚の適合性を判断するための重要なパラメータである。実用レベルにおいて、顕微鏡検査のための正確な配置は、操作後の胚の生存能力を査定するための前提条件である。実際には、胚評価は、事実上、形態学的基準に基づく主観的格付けに限定される。胚の呼吸速度は、客観的な生存能力指標に有効な候補であることが分かっている。ゆえに、形態学的評価および／または恐らく胚の生存能力の測定値として個々の胚の呼吸速度の測定を可能にするための、高速で簡易的な非妨害的な方法、システム、および機器の必要性が存在する。
【０００５】
特許文献１は、顕微鏡用スライドにおいて個々の細胞培養を提供するための、ウェル内部のウェル（ｗｅｌｌ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｗｅｌｌ；ＷＯＷ）手法について説明し、その利点は、記載のように、個々の胚毎により良好な培養環境を可能にするために、大きめの体積のウェル内に小さい体積のウェルを提供することにある。
【０００６】
しかしながら、上記ＷＯＷを備える顕微鏡用スライドの手動および／または自動の操作は、小さい方の体積のウェルに胚または他の細胞培養を挿入することが困難であること実践により分かっているため、時間を要し、かつ困難であることが分かっている。さらに、スライド上に複数のＷＯＷを設ける場合、一方のＷＯＷから別のＷＯＷへの汚染の危険性が存在し、細胞の成長に有害になる可能性がある。具体的には、１つの問題として、一方の細胞培養が溶解するか、または他の成長問題が発生すると、一方のウェルから別のウェルへの細胞溶解物の汚染または転移がこのような問題を拡張することが挙げられる。
【０００７】
例えば、培養目的のために少なくとも１つのＷＯＷを備える既知の顕微鏡用スライドに関する別の問題は、上記生細胞培養の成長のための安定環境をいかに維持するか、すなわち、比較的安定した既定の温度、安定気体組成、十分な量の培養培地、所要の湿度を維持し、周囲および他の環境の影響からの汚染リスクを低減させることにある。
【０００８】
さらに、ｘ、ｙ、およびｚ方向の全てにおいて設定される比較的確定した座標が、上記スライド内において達成され得るという事実から、ＷＯＷ機器を使用して個々の対象物をより正確に配置できるとしても、上述の操作問題の観点から、ＷＯＷ機器の使用によって操作時間は短縮し得るが、相互汚染および外部汚染から有意に保護されない。
【０００９】
胚の生存能力の査定に適用する場合、システムに従う顕微鏡検査方法、機器、およびシステムは、Ｏｖｅｒｓｔｒｏｅｍ１９９６（非特許文献１：１を参照）により概説される以下の重要な要素を提供するはずである。１）複数の個々の胚に関して同時に客観的測定を行なう能力、２）個々の胚／卵母細胞を測定する感度および解像度、３）迅速な査定、すなわち、３０分以下、４）生存能力検査が非摂動的であり、理想的には非侵襲性でなければならない、５）技術的に簡略的であり、ユーザが利用し易い、６）入手および操作時のコスト低減。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０１／０２５３９号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｔｈｅｒｉｏ−ｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４５：３−１６，１９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記背景に基づき、本発明の一目的は、既知の方法、機器、およびシステムに関する上述の不利点を低減する最初に述べた種類の方法、機器、およびシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、顕微鏡有機体を培養し、孵化中に適切で安定した生存条件を提供し、さらに、操作、観察、および保守を容易にすることにある。本発明は、概して、自動的に定期点検、操作、および／または撮影可能な規定のスポットに顕微鏡対象物を配置することを容易にする。
【００１４】
上述の目的は、本明細書に説明する本発明の種々の側面に従う方法、機器、および／またはシステムにより実現される。
【００１５】
第１の側面では、本発明は、少なくとも２つの顕微鏡対象物および対象物培地の監視および／または培養のための機器であって、
−その上面において少なくとも２つの凹部を備えるスライドを備え、
−各凹部（３ａ、３ｂ）は、各それぞれの顕微鏡対象物および対象物培地を保持するための凹部よりも小さい断面を有する窪みを備え、
−上記スライドには、上記培地が相互に流体連通しないように、上記凹部間に共通の重層（７）を提供するためのリザーバが設けられ、および／または、
−各凹部は、各それぞれの顕微鏡対象物および対象物培地を保持するための凹部よりも小さい断面を有する窪みを備え、
−少なくとも上記凹部および／または上記窪みは、上記スライド上のその輪郭に対応する底面プロファイルを呈し、そのプロファイルの微細構造は、スライドホルダの対応する微細構造に一致するように適合され、および／または、
−各凹部は、各それぞれの顕微鏡対象物および対象物培地を保持するための凹部よりも小さい断面を有する窪みを備え、
−上記機器の少なくとも一部分には、操作突出部が設けられ、および／または、
−上記スライドは、各凹部を一意的に識別するための手段を備える、
機器に関する。
【００１６】
凹部内に窪みを提供することによって、例えば、顕微鏡に適する平坦な底部を有する小さな窪みに収めるように、傾斜対して下方に摺動させることによって、規定のスポットに顕微鏡対象物を自動的に配置する。窪みによって、後続の操作により顕微鏡用スライド内の対象物の配置が摂動されなくなる。したがって、生有機体等の顕微鏡対象物の自動的な密度主導の配置が、凹部内の中央の窪みに提供される。中央の窪みは、例えば、自動化画像分析アルゴリズムによって容易に検出可能であるリザーバを構成し、リザーバ内における対象物の放置型自動化顕微鏡検査を実行可能にする。好ましくは、リザーバに通じるウェルの側面は、さらにより大きい大きさの凹部内における小さい大きさの窪み内部の対象物を発見する可能性を改善するために、傾斜している。
【００１７】
１つのスライド上に複数の窪みを提供することによって、スライドを除去し、かつ観察する新しい対象物毎に新しいスライドを挿入することを必要とせずに、観察または撮像が可能であるため、操作時間が短縮される。
【００１８】
第２の側面では、本発明は、少なくとも２つの顕微鏡対象物の監視および／または培養を実行するように配置されるシステムであって、少なくとも２つの顕微鏡対象物および対象物培地を取り扱うための機器を備え、上記機器は、その上面において少なくとも２つの凹部を備えるスライドを備え、各凹部は、各それぞれの顕微鏡対象物および対象物培地を保持するための凹部よりも小さい断面を有する窪みを備え、少なくとも上記窪みは、上記スライド上のその輪郭に対応する底面プロファイルを呈し、上記システムには、少なくとも上記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する上記底面プロファイルを一致させるように適合されるスライドホルダを備える配置手段がさらに設けられる、システムに関する。
【００１９】
第３の側面では、本発明は、上記に定義される機器を取り扱うための方法であって、上記システムのスライドホルダを備える対応する配置手段に、少なくとも上記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する上記機器の上記底面プロファイルを一致させることによって、上記に定義されるシステム内に上記機器を配置するステップを含む、方法に関する。
【００２０】
上述の窪み、機器、システム、および方法は、具体的には、任意の種類の利用可能なガラス毛管機器、システム、および方法を使用して、胚の酸素呼吸数の調査の実行に適切である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
以下において、正確な縮尺ではない概略の図面において図示するいくつかの実施形態を参照して、本発明についてより詳細に説明し、図面における同一の数表示は、同一の特徴を標示する。
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、胚を培養および／または監視するための、本発明の実施形態に従う機器の窪みを含む凹部の側面図と、図１の機器において上記胚を含む窪みの詳細図とである。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、胚を培養および／または監視するための、本発明の実施形態に従う機器の窪みを含む凹部の側面図と、図１の機器において上記胚を含む窪みの詳細図とである。
【図２】図２は、胚の孵化および検査に適切である本発明の第１の実施形態に従う機器の詳細の側面切断図である。
【図３】図３は、胚の孵化および検査に適切である第２の実施形態に従う機器の詳細の側面切断図である。
【図４】図４は、本発明の第３の実施形態に従う機器の詳細の側面切断図である。
【図５】図５は、操作突出部をさらに備える図４の機器の製図である。
【図６】図６は、図５に示す断面図Ａ〜Ａに沿った斜視切断図である。
【図７】図７は、透明ポリマー材料で作製される図４、図５、および図６の機器の斜視画像である。
【図８】図８は、底面プロファイルの部分、すなわち、その中に設けられる凹部、窪み、およびリザーバの逆輪郭に設けられるアルミニウムによる熱伝導層をさらに備える図４、図５、および図６の機器の斜視画像である。
【図９】図９は、本発明の第１の実施形態に従うシステムとの恊働に適切である熱源の画像である。
【図１０】図１０は、本発明の第１の実施形態に従うシステムの画像である。
【図１１Ａ】図１１Ａ、１１Ｂは、１つの凹部および６つの凹部のそれぞれについて、凹部および／または窪みにおいて個々の窪み識別ＩＤをさらに備える、本発明に従う機器の上面画像である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ、１１Ｂは、１つの凹部および６つの凹部のそれぞれについて、凹部および／または窪みにおいて個々の窪み識別ＩＤをさらに備える、本発明に従う機器の上面画像である。
【図１２】図１２は、解剖顕微鏡における操作中に容易に観察可能である顕微鏡的数表示を有するウェルＩＤ番号。番号「５」は、高さが約１ｍｍであり、幅が０．４ｍｍである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
図１Ａにおいて、本発明のある実施形態に従う機器について、窪みを含む凹部におけるスライドまたは機器の側面断面図を示し、図１Ｂにおいて、顕微鏡対象物、例えば、胚を保持する図１Ａの窪みの詳細図を示す。凹部および機器は、具体的には、胚培養および／または顕微鏡用スライドにおける監視および／または培養のために、胚の密度ベースの配置に適している。
【００２３】
上記顕微鏡対象物は、成長中の細胞培養等の顕微鏡有機体であってもよく、また、上記機器は、具体的には、成長中の胚の顕微鏡検査および／または培養に適切である。上記顕微鏡対象物は、より大きいかまたは小さい大きさの対象物の一部であってもよく、例えば、窪みの直径よりも小さいかまたは大きくてもよい。用語の「顕微鏡対象物」は、最大寸法が２ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満、好ましくは５００μｍ未満、最も好ましくは２００μｍ未満である対象物として定義される。
【００２４】
胚１は、略球形であり、ゼラチン状の殻、つまり透明帯として既知である無細胞間質で囲まれる１つ以上の細胞（割球）から構成される。透明帯は、胚が孵化するまで多種多様な機能を実行し、胚評価に有効な指標である。透明帯は、球形かつ半透明であり、細胞残屑とは明確に区別可能であるはずである。
【００２５】
胚は、精子細胞または精子の融合または注入によって卵母細胞が受精する際に形成される。その用語は、従来から、透明帯の破裂および後続の着床を含む孵化の後でも使用される。ヒトでは、受精した卵母細胞は、従来より、最初の８週間は胚と呼ばれている。その後、すなわち、８週間後および全ての主要器官が形成されると、胚は胎児と呼ばれる。しかしながら、胚と胎児の区別は、概して、十分定義されていない。
【００２６】
スライドまたは機器の表面は、上記機器の上面に少なくとも１つの培地充填の凹部３が設けられ、上記凹部は、好ましくは、直径が約４．０ｍｍである凹部等の円柱状であり、直径は、用途に応じて１ｍｍから２５ｍｍまで変動し得る。凹部の直径が対象物よりもかなり大きいため、胚は、標準的なＩＶＦピペットを使用して凹部に容易に配置され得る。高さならびに垂直方向および水平方向断面形状等の凹部の他の寸法は、顕微鏡対象物を凹部に容易に挿入できるように選択される。周囲の成長培地密度が胚の密度よりも若干低くなり、かつ上記凹部３の比較的平滑な壁を提供することを確実にして、凹部の底部に胚をゆっくりと下降させる。
【００２７】
凹部の実質的に円錐状の平滑底部分または漏斗部３１が設けられ、代替として、上記漏斗部は、ピラミッド状、スリット状、楔状、台形、または任意の他の適切な形状の垂直方向断面を有し、また、図１Ａに示すように、垂直線に対して約５度から６０度、一般的には、３０度の角度を有して設けられ得る。したがって、胚は、凹部の底部、すなわち、上記漏斗部３１の上または内部に到達すると、重力および／または付与された遠心分離回転により、凹部３および／または漏斗３１の中央にある窪み４に転がり込む。培地の粘度が比較的高い場合、放置型装填工程には数分かかる。窪みが小さいと、操作移動にかかわらず、胚のその位置における保持が確実になる。
【００２８】
漏斗部は、凹部から窪みへ対象物を移動および誘導し得る。漏斗部は、通常、周囲培地よりも密度の高い対象物を把持および配置するために、凹部の底部に位置する。好ましくは、実質的に平滑な表面を有する漏斗部は、約５度から６０度までの角度を有してもよく、好ましくは、水平線に対して、１０度から４５度までの間、より好ましくは、１５度から３５度まで、最も好ましくは２５度から３０度までの角度を有してもよい。
【００２９】
窪み４の寸法は、凹部の直径に比べて、比較的小さくなるようにしばしば選択され、対象物の大きさに対して、対象物の直径の約１．１ｘから１０ｘまでであり、好ましくは、対象物の直径の１．５ｘから３ｘであり、対象物の配置がスライド自体に対して十分規定されるようにする。したがって、上記顕微鏡に対するスライドの位置が既知である場合、窪み全体の体積の高解像度画像および監視を容易に入手することが可能である。窪みには、好ましくは、顕微鏡またはその同等物による上記胚の監視および／または培養を容易にするために、実質的に平面の底面４０が設けられる。
【００３０】
窪み４の最適高さは、操作移動にかかわらず胚１の配置を維持する必要性によって判断される。壁の高い深めの窪みは、重層の成長培地のバルク移動から胚を保護する。しかしながら、胚は、観察期間終了後にレシピエント患者への移植のために除去され得る。したがって、窪みが浅いほうが、胚を除去し易くなる。合理的な実際の妥協案は、その幅に実質的に類似する深さを有する窪み、すなわち、胚の直径の０．５ｘから１０ｘであると考えられる。図１Ｂに示すように、０．３ｍｍの深さおよび０．２ｍｍの直径が選択され得る。胚用窪みの壁は、大部分は垂直であるが、窪みの開口を広くし、かつ胚の除去を容易にするために、例えば、図１Ｂに示すように５度から２０度若干傾斜してもよい。
【００３１】
代替として、窪みは、円柱状、箱状、円錐状、切頂状もしくは錐体状、またはその同等物、顕微鏡対象物の保持、操作および環境影響による偶発的な変位の防止、および培地のバルク流動を誘起する任意の適切な形状であるように形成され得る。窪みの寸法が小さくなると、顕微鏡対象物の位置がより十分に規定される。しかしながら、窪みが極めて小さくなると、観察期間の終了時に、窪みからの顕微鏡対象物の除去が非常に困難になり得る。
【００３２】
一実施形態において、窪みの寸法は、実質的に同等の直径および深さを有する。さらに、上記窪みは、好ましくは、そのそれぞれの凹部内の実質的に中心に設けられる。
【００３３】
スライドの寸法は、好ましくは、２５ｍｍｘ７６ｍｍ等の、標準的および／または特別に適応された顕微鏡システムおよび／または培養システム内に適合するような寸法である。
【００３４】
凹部および／または窪みの垂直切断面は、円柱状、テーパ状、円錐状、スリット状、ピラミッド状、台形状、円形の一部、または実質的に円形を含む群のいずれかの形状を保持し得る。凹部および／または窪みの水平切断面は、円形、楕円形、長方形、ひし型、または６角形を含む群のいずれかの形状を保持し得る。
【００３５】
図２において、本発明の第１の実施形態に従う機器を示す。上記機器は、一連の、すなわち、少なくとも２つの上記凹部３ａ、３ｂを、スライド材料の上面２Ａに備える顕微鏡用スライド２を備える。各凹部３ａ、３ｂは、各それぞれの顕微鏡対象物１ａ、１ｂおよび対象物培地５ａ、５ｂを収容および保持するための、凹部よりも小さい断面を有する窪み４ａ、４ｂを備え、各窪みおよび／または凹部は、例えば、上述に従う寸法および／または形状を有する。２つの顕微鏡対象物、すなわち、胚１ａ、１ｂは、顕微鏡用スライド２に挿入されており、すなわち、１つが窪み４ａおよび４ｂのそれぞれに挿入されている。上記対象物培地５ａ、５ｂは、このような胚の細胞成長培地等の、上記顕微鏡対象物を囲繞、保持、および保護するための任意の適切な培地であり得る。上記培地５ａは、機器の用途に応じて、上記他の培地５ｂと異なるか、または同一であってもよい。
【００３６】
図２および図３に示すように、上記スライド３ａ、３ｂには、上記凹部３ａ、３ｂとの間に共通の重層７を提供するために、リザーバ６Ａ、６Ｂが設けられ、対象物培地５ａ、５ｂが上記凹部および／または窪み内部に提供されると、培地５ａが培地５ｂと相互に流体連通しないようにする。したがって、上記機器の操作中に、異なる凹部および／または窪み間の対象物培地５ａ、５ｂ上における漏出の危険性が低減し、これによって、前述のように、例えば、対象物が胚であり、機器が培養皿であり、上記胚のうちの１つが溶解する場合に、上記顕微鏡対象物１ａ、１ｂ間の悪影響の発生が低減される。さらに、機器の移動は、重層におけるバルク微移動を誘起し得るが、上記対象物培地内における移動は大幅に低減されるため、経時的な胚の移動が低減され、これは、具体的には、上記対象物の顕微鏡および／または培養中の利点である。さらに、上記対象物培地上に重層を提供することによって、上記対象物培地は、温度、湿度、および／または圧力変動等の有害な環境影響からより十分に保護され、対象物および対象物培地の汚染の危険性がさらに低減される。
【００３７】
図２に示すように、上記上面２Ａ内に共通陥凹部６Ｂとして上記リザーバが設けられ、これによって、例えば、液浸油の重層または上層の共通リザーバの形成が可能になる。代替的または付加的に、図３に示すように、上記機器の第２の実施形態は、上記リザーバが、流体連通部６Ｂ、例えば、上記少なくとも２つの凹部３ａ、３ｂ間におけるそれぞれが、外部表面に対して開放型または閉鎖型であるチャネルまたは管であることを示す。したがって、凹部および窪みの収容を可能にするスライドの全高が低減され得る。
【００３８】
上記スライド２には、上記培地５ａ、５ｂが相互に流体連通しないように、上記凹部３ａ、３ｂ間に共通の重層７を提供するためのリザーバ６が設けられる。
【００３９】
さらに、共通浸漬液リザーバ、すなわち、共通リザーバは、成長培地の湿度の付加的な制御を必要とせずに、容易な操作および孵化を提供する。また、比較的大きい大きさまたは深さを有する浸漬液リザーバは、個々の窪みおよび／または凹部における培地を分離し、周囲空気における粒子、気体等からの汚染の危険性を低減する。
【００４０】
各顕微鏡用スライドは、単一の顕微鏡対象物を各々が保持する一連の窪みを含み、例えば、各窪みは、同一患者または異なる患者からの胚を含む。各凹部における培地を相互連通せずに維持するように、培地を分離するための手段を提供することによって、これは、一方の凹部および／または窪みから別の凹部および／または窪みへの培地漏出の危険性を低減する。さらに、具体的には、各対象物、例えば、胚の個々の媒体区画を提供することによって、これは、例えば、近傍の窪みにおける胚または細胞培養のうちの１つが溶解する場合に、汚染または悪影響を防止し得る。各有機体が、例えば、液浸油の重層により分離される培地を含む異なる窪みに配置されるため、有害な化合物が疎水性油を通って近傍の窪みに拡散する可能性は極めて低い。
【００４１】
対象物培地は、好ましくは、上記培地５ａ、５ｂの上面におけるレベルが、上記凹部から上記リザーバ６への移行レベルの上に提供されないように、凹部／窪みの各々に充填される（図２および図３参照）。上記培地は、胚成長培地、他の細胞培養培地、およびその同等物、液体、可塑性、半剛性、または剛性の培地等の任意の適切な材料であってもよい。細胞集団を培養するための異なる培地は、当技術分野において既知である。胚を培養する例は、ＰＣＴ国際出願第２００４／０５６２６５号に記載されている。
【００４２】
さらに、液体、可塑性、半剛性、または剛性等の可変粘度を有する適切な油等の浸漬培地の重層は、培養および／または顕微鏡検査する顕微鏡対象物を保持する各窪みまたは凹部の上部直径を少なくとも被覆するように提供され得る。
【００４３】
上記対象物培地および／または重層は、粘度および／または透明度および／または密度が温度により変化する材料により提供され得る。例えば、培養温度まで加熱した際に、上記培地および／または層が透明になり、および／または少なくとも上記層の粘度が上記培地よりも高くなり、および／または上記培地の密度が上記層よりも高くなる。
【００４４】
図４に示すように、上記窪み４ａ、４ｂおよび／または上記凹部１ａ、１ｂの提供および比較的均一なスライド材料厚さ全体を提供すること（図４および図６参照）によって、結果的に、スライドの底面２Ｂが、上記スライド２上の少なくとも上記窪みおよび／または凹部の輪郭に対応する底面プロファイル２０を呈するという事実がもたらされる。例えば、図１０に関連して以下に後述する培養および／または顕微鏡システムに設けられ得るように、上記底面プロファイル２０に対応する上面輪郭を有するスライドホルダに機器を挿入する場合に、これは、利点になる。本発明に従う１つ以上の機器には、複数の機器を備え、および／または上記機器のうちの１つ以上を交換するために適合される、大型のシステムと恊働するための同一の特有の底部微細構造が設けられ得る。
【００４５】
したがって、一実施形態では、培養スライドの非平面の底面プロファイルは、スライドを保持する任意により加熱されるアルミニウム製ホルダの輪郭に一致し、窪みがアルミニウム製ホルダの凹部に挿入されるようにする。
【００４６】
図４に示すように、機器のある実施形態では、上記プロファイル２０の少なくとも部分に、熱伝導層２３ａ、２３ｂが設けられ、好ましくは、上記窪みの底面の部分を少なくとも形成する。したがって、熱源への接続のために上記機器を配置する場合、胚のために制御された温度調整環境が、長期期間において提供および維持されてもよく、これによって、上記胚の高速分析を実行するための必要性が低減し、その操作が容易になる。上記熱伝導層は、アルミニウムまたはスチール等の金属であり得る。
【００４７】
好ましくは、上記熱伝導層２３は、例えば、培養および／または顕微鏡器具に設けられるように、熱源の接続のために適合される。
【００４８】
図４において、上記熱伝導層２３ａおよび２３ｂは、窪みの実質的に平面の底面に沿って底面プロファイル上に設けられ、熱提供環境によって胚を確実に囲む。代替的または付加的に、上記層２３は、上記窪みの壁の底面プロファイルを囲むように提供される。機器は、適切な培地において有機体を含む凹部を有する使い捨て培養スライドを備える。
【００４９】
代替的または付加的に、上記熱伝導層２３は、スライド２の上面２Ａの少なくとも部分、好ましくは、窪み４ａ、４ｂおよび／または凹部３ａ、３ｂの内面の少なくとも部分を提供する。
【００５０】
窪みおよび／または上記熱伝導層の底部分は、例えば、標準的もしくは逆顕微鏡および／または画像収集および／または分析を使用して、下または上からの胚の無障害監視を確実にするように、適切に配置される穴を通過する貫通孔が設けられる上記熱伝導層２３ａ、２３ｂを提供することによって、好ましくは平面かつ透明である。
【００５１】
図５に示すように、上記機器の部分には、操作突出部（７０）が設けられ、上記部分は、上記上面２Ａ内の適切な位置および範囲にあり、代替的または付加的に、上記部分は、上記底部分２Ｂである。上記スライドの側面部分に上記操作突出部を設けることが可能である。上記操作突出部７０の少なくとも部分分は、上記スライドから上方および／または下方に垂直方向に延出している。上記操作突出部７０は、好ましくは、例えば、スライドの側面以外のさらなる１つまたは複数の延長部を備えるフィンを備え、上記操作突出部７０は、熱伝導材料および／またはポリマー材料で提供される。
【００５２】
好ましくは、上記操作突出部７０は、その上に表示する識別を提供するように配置される（図示せず）。
【００５３】
操作突出部を配置することによって、本発明は、いかなる汚染のリスクも伴わずにスライドを容易に操作および挿入するための手段を提供する。操作突出部は、スライドをスライドホルダに配置する際に特に重要である。一実施形態では、スライドホルダとスライド底部の輪郭一致により、スライドをスライドホルダに垂直方向に挿入しなければならない。これは、スライドを上手く把持しないと難しい。好適な実施形態では、操作突出部は、蓋を妨害せず、また、概して側面に触れることによってスライドを取り扱うため、操作突出部に触れることは汚染の危険とはならない。
【００５４】
図６に示すように、一連の凹部３ａ、３ｂが設けられる機器が存在し、上記凹部（３ａ、３ｂ）は、少なくとも１つの方向において相互に等距離に配置され、監視／培養中にそれに関して実行する位置測定および操作を容易にする。
【００５５】
図７に示すように、上記窪み４ａ、４ｂおよび／または上記凹部（３ａ、３ｂ）の内面の少なくとも部分は、ポリマーから作製され、好ましくは、実質的に顕微鏡用スライド２全体は、ポリマーから作製され、上記ポリマーは、ＰＥＮ、ＰＥＴｇ、および／またはＰＥＴ等のポリエステルであって、ポリマー内の細胞毒性化合物の高度の内部固定化に起因し得る胚毒性が低いポリエステルであり得る。
【００５６】
図７に示すように、窪みの上記実質的に平面の底面の中および／またはその上、ならびに／あるいは上記底面プロファイルの中および／またはその上、ならびに／あるいは上記窪みの上記透明底部分内に、個々の窪み識別４１がさらに提供され、好ましくは、顕微鏡検査、具体的には逆顕微鏡検査中等に高解像度で可視的である。
【００５７】
図８は、アルミニウム等の大幅な伝導性材料が提供されるスライドまたは機器である。
【００５８】
図９は、４つの別々のスライドまたは機器を保持するように適合されるアルミニウムのスライドホルダアームの検査室検査の装置である。
【００５９】
機器のスライドは、好ましくは、有機体に安定環境（温度、気体組成、湿度等）を提供し、かつ写真、代謝の測定等によって有機体の放置監視を可能にするシステムにおいて配置されるように適合される。
【００６０】
１）本システムは、好ましくは以下を提供する。
ａ．器具におけるアルミニウムホルダと、挿入するスライドとの輪郭一致による温度制御。したがって、各ウェルに存在する有機体は、熱伝導金属によって囲繞されるため、制御環境に囲繞される。
ｂ．スライドとスライドホルダとの一致する輪郭間の緊密な嵌合により、ホルダに収まる際に、μｍ精度によるスライドの配置が確実に容易になる。ゆえに、スライドの除去および再挿入の後であっても、放置型顕微鏡検査が可能である。
ｃ．経時的画像の自動収集のために、胚およびスライドの自動配置が必須条件である。
【００６１】
図１０に示すように、本発明は、さらに、少なくとも２つの顕微鏡対象物１ａ、１ｂの顕微鏡検査および／または培養を実行するように配置されるシステムに関し、上述のような本発明に従う機器と、上記機器を保持するための配置手段とを備える。好ましくは、顕微鏡および上記配置手段は、顕微鏡の下またはそれに対して機器を配置するように配置される。上記システムは、さらに、上記少なくとも２つの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）を培養するための温度の提供に適切である熱源をさらに備えてもよく、上記配置手段は、上記熱源に対して機器を配置するように配置される。上記配置手段は、スライドホルダを備え、スライドホルダは、好ましくは、少なくとも上記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する上記底面プロファイルを一致させるように適合され、手動および／または自動の監視および分析のためのシステムを培養および／または監視する際にスライドホルダとして提供され得る。
【００６２】
本システムには、所定の安定温度を少なくとも上記窪みに提供するように適合される熱伝導層がさらに設けられてもよく、その温度は、培養、具体的には、上記少なくとも２つの顕微鏡対象物の孵化に適切である。
【００６３】
上記熱源は、少なくとも上記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する上記底面プロファイルを一致させるように適合されるスライドホルダとして提供され得る。好ましくは、上記スライドホルダは、好ましくは、アルミニウム、スチール、またはその同等物等の金属から作製される熱伝導アームとして提供される。
【００６４】
別のシステムでは、上記機器の底面プロファイル（２３）に、上記熱源への接続に適合される熱伝導層が設けられる。
【００６５】
上記顕微鏡は、カメラまたは映像機器等の撮像手段をさらに備えてもよい。配置手段は、以下をさらに備えてもよい。
−スライドホルダを貫通する少なくとも１つの垂直孔、
−垂直光を提供するレーザ等の発光体
−スライドホルダが顕微鏡の正確な位置にある場合に、発光する光を検知するための、発光体に対して顕微鏡用スライド（２）の反対側における光センサ、
配置手段は、上記顕微鏡および／または上記熱源に対して上記機器を自動的に配置するための制御ユニットをさらに備えてもよい。
【００６６】
制御ユニットは、さらに、安定孵卵器環境のために上記熱源の温度を制御するようにさらに適合されてもよく、および／または上記撮像手段を使用して上記顕微鏡対象物の画像を監視および／または収集し、および／または上記対象物の品質査定のために上記画像を分析し、および／または交換スライドを記録するように適合されてもよい。
【００６７】
別の実施形態では、本システムは、代謝活動の非侵襲性測定を実行するための手段をさらに備え、本手段は、例えば、ｐＨ、酸素含有量、およびその同等物を測定するためのマイクロセンサを備える。
【００６８】
本システムは、好ましくは、４つまたは６つの機器等のいくつかの機器を保持可能であるスライドホルダ等の、上述の複数の機器を保持するための手段を備える。
【００６９】
本システムは、好ましくは、放置型画像収集のための、３気体孵卵器等の気体孵卵器と、デジタル顕微鏡との組み合わせである。本システムは、顕微鏡内蔵の孵卵器または孵化器内蔵の顕微鏡としてみなされ得る。
【００７０】
好適な実施形態では、本システムは、以下を備える。
１）熱伝導アルミニウムにより胚が確実に囲繞されるように、ポリマースライドの特有の底部微細構造に適合するように設計される温度調整型アルミニウム製アーム。
２）マイクロセンサを使用して代謝活動の非侵襲性を実行する能力を有する手段。一例として、ｐＨマイクロセンサを含むＣＯ２濃度の酸素微小電極を使用して酸素呼吸を測定することが挙げられる。センサの正確な配置は、スライドホルダにおける微小穴と、センサ先端部を照射する垂直レーザによって確実になる。穴を通過するレーザ光によってセンサ先端部が照射されるまで、スライドホルダを水平方向に移動し、次いで、スライドホルダのＸ−Ｙ座標を測定する、次いで、微小穴がカメラシステムの視野の中心に来るまでスライドホルダを移動し、新しいＸ−Ｙ座標を測定する。２つの観察点間の座標の差異は、カメラとセンサ先端部との間のオフセットの測定値である。次いで、オフセットを使用して、カメラ視野の中心にある可視的な対象物をセンサ先端部に移動することが可能である。すなわち、オフセットを使用することによって、画像収集位置からマイクロセンサプロファイリング位置に対象物を放置移動することが可能になる。
３）複数の機器（すなわち、その時点における複数の患者からの有機体／細胞／胚）を操作可能である手段。本発明は、総数４８個から６０個の有機体を含む４つまたは５つの異なるスライドを容易に取り扱う。
４）有機体を放置監視し、画像を収集および分析し、かつ有機体の品質査定を提供する制御ソフトウェア。ソフトウェアは、進行中の測定に影響を及ぼさずに、新しい皿の追加および他の皿の終了を受け付ける。
【００７１】
使用するソフトウェアは、例えば、国際公開第２００７／０４２０４４号および国際公開第２００７／１４４００１号に記載の方法を含み得る。
【００７２】
機器の凹部に配置される対象物を監視するための自動化システムでは、顕微鏡を配置し、各対象物を見失わずに対象物の画像を数回収集可能であることが重要であり、すなわち、対象物における任意の変化に関する情報を提供するために、各対象物が、監視および画像の収集の各期間中に一意的に識別され得ることが重要である。ゆえに、またさらなる実施形態では、本発明は、少なくとも２つの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）および対象物培地（５ａ、５ｂ）を監視および／または培養するための機器であって、その上面（２Ａ）において少なくとも２つの凹部（３ａ、３ｂ）を備えるスライド（２）であって、各凹部を一意的に識別するための手段を備えるスライドを備えるシステムに関する。一意的識別が機械可読であることが好ましく、さらに、一意的識別が自動的に登録され得ることが好ましい。
【００７３】
顕微鏡を対象物の撮像に使用するため、一意的識別が、対象物の撮像に使用する倍率で可読あることが好ましい。したがって、各凹部の一意的識別が、１ｍｍ以下等の１．５ｍｍ未満であることが好ましい。関連する顕微鏡対象物と同一の画像視野において撮像され得るように一意的識別を配置することがさらに好ましい。
【００７４】
各凹部を一意的に識別するための手段は、以下のいくつかの方式で達成され得る。
−例えば、顕微鏡およびカメラに関連する１つだけの一意的位置、例えば、スライドホルダの対応する部分を係合可能である陥没または突出部分に配置されるように、または、配置手段が、スライド上にマーカを備えることによって、上記マーカに対する各凹部の位置が判断されるように、配置手段を有する機器を提供することによる方式。
−上記スライドにおける凹部の行を識別するための少なくとも１つのマーカおよび凹部の列を識別するための少なくとも１つのマーカ等の、スライド上にＸ−Ｙ位置情報を提供することによる方式。
−窪みの上記実質的に平面の底面の中および／またはその上、ならびに／あるいは上記底面プロファイルの中および／またはその上、ならびに／あるいは上記窪みの上記透明底部分内における個々の窪み識別（４１）等の、各凹部に関連する個々の識別マーカを提供することによる方式。
【００７５】
本発明に従うスライドまたは機器の部分の上側画像を示す図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、窪みの上記実質的に平面の底面の中および／またはその上、ならびに／あるいは上記底面プロファイルの中および／またはその上、ならびに／あるいは上記窪みおよび／または上記凹部の上記透明底部分内において、印刷、成形、または切り抜かれた文字、記号、または数字の形式の個々の窪み識別４１がさらに提供され得る。
【００７６】
胚の選択または識別。本発明は、移植のために胚を選択するための用途をさらに可能にする。本方法は、細胞分裂がいつ発生したか、および任意により細胞死が発生したか否か、ならびに細胞分裂の質および胚の全体の質を判断するために、上述のように、胚の変化を判断するための方法により、胚を監視しているという意味を含む。異なる画像において急激な極値をもたらす実質的に同時に起こる細胞分裂を有する胚を選択することが好ましく、細胞死を含まない胚を選択することがより好ましい。
【００７７】
胚の質を評価するために、上述のように、選択または識別方法を他の測定と組み合わせてもよい。胚の形態学的評価における重要な基準は、（１）割球の数および分裂度合いを含む胚の形状、（２）透明帯の存在および質、（３）大きさ、（４）色およびテクスチャ、（５）その成長段階に関連する胎齢に関する知識、（６）割球膜の完全性である。
【００７８】
各凹部（３ａ、３ｂ）および／または窪み（４ａ、４ｂ）の寸法は、選択する用途に適合され得る。
【００７９】
一実施形態では、少なくとも２つの顕微鏡対象物の顕微鏡検査および／または培養を実行するように配置されるシステムは、少なくとも２つの顕微鏡対象物および対象物培地を取り扱うための機器を備え、上記機器は、その上面において少なくとも２つの凹部を備える顕微鏡用スライドを備え、各凹部は、各それぞれの顕微鏡対象物および対象物培地を保持するための凹部よりも小さい断面を有する窪みを備え、少なくとも上記窪みは、上記スライド上のその輪郭に対応する底面プロファイルを呈し、上記システムには、少なくとも上記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する上記底面プロファイルを一致させるように適合されるスライドホルダを備える配置手段がさらに設けられる。
【００８０】
スライドおよびスライドホルダの一致輪郭間の緊密な適合により、ホルダに収まる際に、μｍ精度によるスライドの配置が確実に容易になる。ゆえに、スライドの除去および再挿入の後であっても、放置型顕微鏡検査が可能であるため、自動的に定期点検、操作、および／または撮影可能なこのようなスライドの規定のスポットに顕微鏡対象物が配置される。
【００８１】
さらなる側面では、本発明は、上述のような機器を取り扱うための方法であって、上記システムのスライドホルダを備える対応する配置手段に、少なくとも上記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する上記機器の上記底面プロファイル（２０）を一致させることによって、システム内に上記機器を配置するステップを含む方法に関する。
【００８２】
さらに、本発明は、システムにおける上述のような機器おける対象物の顕微鏡検査および／または培養のための方法であって、顕微鏡および／または上記少なくとも２つの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）を培養するための温度の提供に適切である熱源の下に、それらに対して機器を配置するステップを含む。
【００８３】
一実施形態では、本方法は、上記システムのスライドホルダを備える対応する配置手段に、少なくとも上記少なくとも２つの窪みの輪郭に少なくとも対応する上記機器の上記底面プロファイル（２０）を一致させるステップをさらに含む。一致させるステップは、顕微鏡用スライドの上面を実質的に水平方向に保持し、スライドをスライドホルダの上の位置に移動し、上記スライドホルダ上に、スライドを垂直方向に降下させることによって実行され得る。
【００８４】
上記少なくとも２つの顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）の顕微鏡検査を実行するステップは、手動的または自動的、また、後続してまたは実質的に同時に実行され得る。
【００８５】
培養するための温度を提供するステップは、好ましくは、上記熱伝導層を上記熱源に接続することによって、上記窪みに所定の安定温度を提供し、その温度は、培養、具体的には、上記少なくとも２つの顕微鏡対象物の孵化に適切である。上記熱源は、上記スライド、上記スライドホルダ、および／または上記突出部に接続されてもよい。
【００８６】
本方法は、培養に適切な既定の温度を一定期間熱伝導層に提供するステップをさらに含み得る。
【００８７】
本方法は、上記培地（５ａ、５ｂ）が相互に流体連通しないように、上記窪み（４ａ、４ｂ）の少なくとも各々に対象物培地（５ａ、５ｂ）を提供するステップと、
−上記少なくとも２つの窪み（４ａ、４ｂ）の各々に顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）を提供するステップと、
−上記培地（５ａ、５ｂ）が相互に流体連通しないように、上記少なくとも１つのリザーバ（６）内に共通の重層（７）を提供するステップと、
−上記少なくとも２つの顕微鏡対象物の顕微鏡検査および／または培養を実行するステップと
をさらに含み得る。
【００８８】
共通の重層は、流体、半固体、および／または固体であってもよく、好ましくは、培養温度中に流体である。さらに、対象物培地は、流体、半固体、および／または固体であってもよく、好ましくは、培養温度中に流体である。
【００８９】
顕微鏡対象物（１ａ、１ｂ）は、例えば、成長中の細胞培養、具体的には、成長中の胚等の顕微鏡有機体である。好適な実施形態では、顕微鏡有機体は、単一細胞培養等の体外細胞培養、卵母細胞等の胚、胚、原形質体、細胞質体等、および／または細菌、生体試料、ならびに任意のそれらの組み合わせを含む群から選択される。
【００９０】
上記機器を配置するステップは、好ましくは、Ｘ、Ｙ、および／またはＺ方向において上記操作突出部（７０）および／または上記スライドホルダを操作することによって、手動および／または自動配置によって実行される。したがって、一実施形態では、配置するステップは、上記制御ユニットを使用して、上記顕微鏡および／または上記熱源に対して上記機器を自動的に配置するステップをさらに含み、配置するステップは、
少なくとも１つの垂直光ビームを提供するためのレーザ光等の光を発光するステップと、
上記少なくとも１つの光ビームが、スライドホルダを貫通する上記少なくとも１つの垂直孔を通過し、かつ顕微鏡用スライドの反対側における上記センサによって検知されるまで、上記顕微鏡および／または上記熱源に対して上記スライドを配置するステップと
をさらに含む。
【００９１】
本発明に従う方法は、上述のように、また国際公開第２００７／０４２０４４号および国際公開第２００７／１４４００１号に記載のように、上記カメラおよび／または映像機器を使用して、上記スライドの画像を監視および／または提供するステップをさらに含み得る。
【００９２】
さらに、本発明に従う方法は、カメラとセンサ先端部との間のオフセットを測定するステップを含み得る。
【００９３】
別の実施形態では、本発明に従う方法は、安定孵卵器環境のために上記熱源の温度を制御するステップ、および／または上記撮像手段を使用して上記顕微鏡対象物の画像を監視および／または収集するステップ、および／または上記対象物の品質査定のために上記画像を分析するステップ、および／または交換スライドを記録するステップをさらに含み得る。
【００９４】
（参考文献）
（記事）
Ｈｏｌｍ  Ｐ，Ｓｈｕｋｒｉ  ＮＮ，Ｖａｊｔａ  Ｇ，Ｂｏｏｔｈ  Ｐ，Ｂｅｎｄｉｘｅｎ  Ｃ  ａｎｄ  Ｃａｌｌｅｓｅｎ  Ｈ  ，（１９９８），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅｓ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｘ．，
Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５０：１２８５−１２９９
Ｌｕｎｄｉｎ  Ｋ，Ｂｅｒｇｈ  Ｃ  ａｎｄ  Ｈａｒｄｅｒｓｏｎ  Ｔ，（２００１），Ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｓ  ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＩＶＦ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １６，２６５２−２６５７
【図１Ａ−１Ｂ】
2010531644.tif 000002
【図２】
2010531644.tif 000003
【図３】
2010531644.tif 000004
【図４】
2010531644.tif 000005
【図５】
2010531644.tif 000006
【図６】
2010531644.tif 000007
【図７】
2010531644.tif 000008
【図８】
2010531644.tif 000009
【図９】
2010531644.tif 000010
【図１０】
2010531644.tif 000011
【図１１Ａ】
2010531644.tif 000012
【図１１Ｂ】
2010531644.tif 000013
【図１２】
2010531644.tif 000014
【国際調査報告】
2010531644.tif 000015
2010531644.tif 000016
2010531644.tif 000017