(57)【要約】可溶性FcγRIAポリペプチド組成物、ならびにIgG媒介性および免疫複合体媒介性の炎症を治療するためにそのようなポリペプチドを用いる関連した方法が開示される。可溶性FcγRIAポリペプチドを生産するための関連した組成物および方法も開示される。2010516769.tif 000028
2010516769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IgG媒介性炎症を有する対象に可溶性FcγRIAポリペプチドの有効量を投与する段階を含む、対象におけるIgG媒介性炎症を軽減する方法であって、
該可溶性FcγRIAポリペプチドが、
（i）SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
（ii）IgGのFc領域と特異的に結合することができる、
方法。
【請求項２】
IgG媒介性炎症が免疫複合体媒介性である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
可溶性FcγRIAポリペプチドが、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
可溶性FcγRIAポリペプチドがSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
可溶性FcγRIAポリペプチドがSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜292を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
可溶性FcγRIAポリペプチドがSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜Xからなり、式中、Xが包括的に282〜292の整数である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
IgG媒介性炎症性疾患を有する対象に可溶性FcγRIAポリペプチドの有効量を投与する段階を含む、IgG媒介性炎症性疾患を治療する方法であって、
該可溶性FcγRIAポリペプチドが、
（i）SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
（ii）IgGのFc領域と特異的に結合することができる、
方法。
【請求項８】
可溶性FcγRIAポリペプチドが、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
可溶性FcγRIAポリペプチドがSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
可溶性FcγRIAポリペプチドがSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜292を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
可溶性FcγRIAポリペプチドがSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜Xからなり、式中、Xが包括的に282〜292の整数である、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
IgG媒介性炎症性疾患が、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性クリオグロブリン血症；混合性結合組織病；外因性抗原に関連する疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ITP）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギラン-バレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
IgG媒介性炎症性疾患が免疫複合体媒介性疾患である、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
免疫複合体媒介性疾患が、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性クリオグロブリン血症；混合性結合組織病；および外因性抗原に関連する疾患からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
外因性抗原に関連する疾患が、B型肝炎随伴結節性多発動脈炎である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
IgG媒介性炎症性疾患が自己免疫疾患である、請求項7記載の方法。
【請求項１７】
自己免疫疾患が、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性結合組織病；特発性血小板減少性紫斑病（ITP）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギラン-バレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
IgG媒介性炎症を有する対象に可溶性FcγRIAポリペプチドの有効量を投与する段階を含む、対象におけるIgG媒介性炎症を軽減する方法であって、
該可溶性FcγRIAポリペプチドが、
（a）以下の機能的に連結されたエレメント
（i）転写プロモーター、
（ii）SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチドをコードするDNAセグメントであって、コードされたポリペプチドがIgGのFc領域と特異的に結合しうるようなDNAセグメント、および
（iii）転写ターミネーター
を含む発現ベクターが導入された細胞を培養する段階であって、該細胞が、前記DNAセグメントによってコードされたポリペプチドを発現する、段階；ならびに
（b）発現されたポリペプチドを回収する段階
を含む方法によって生産されるポリペプチドである、
方法。
【請求項１９】
IgG媒介性炎症が免疫複合体媒介性である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
コードされたポリペプチドが、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
コードされたポリペプチドが、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
コードされたポリペプチドが、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜292を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
コードされたポリペプチドがSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜Xからなり、式中、Xが包括的に282〜292の整数である、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
IgG媒介性炎症性疾患を有する対象に可溶性FcγRIAポリペプチドの有効量を投与する段階を含む、IgG媒介性炎症性疾患を治療する方法であって、
該可溶性FcγRIAポリペプチドが、
（a）以下の機能的に連結されたエレメント
（i）転写プロモーター、
（ii）SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチドをコードするDNAセグメントであって、コードされたポリペプチドがIgGのFc領域と特異的に結合しうるようなDNAセグメント、および
（iii）転写ターミネーター
を含む発現ベクターが導入された細胞を培養する段階であって、該細胞が、前記DNAセグメントによってコードされたポリペプチドを発現する、段階；ならびに
（b）発現されたポリペプチドを回収する段階
を含む方法によって生産されるポリペプチドである、
方法。
【請求項２５】
コードされたポリペプチドが、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
コードされたポリペプチドが、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
コードされたポリペプチドが、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜292を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
コードされたポリペプチドがSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜Xからなり、式中、Xが包括的に282〜292の整数である、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
IgG媒介性炎症性疾患が、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性クリオグロブリン血症；混合性結合組織病；外因性抗原に関連する疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ITP）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギラン-バレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
IgG媒介性炎症性疾患が免疫複合体媒介性疾患である、請求項24記載の方法。
【請求項３１】
免疫複合体媒介性疾患が、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性クリオグロブリン血症；混合性結合組織病；および外因性抗原に関連する疾患からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
外因性抗原に関連する疾患が、B型肝炎随伴結節性多発動脈炎である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
IgG媒介性炎症性疾患が自己免疫疾患である、請求項24記載の方法。
【請求項３４】
自己免疫疾患が、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性結合組織病；特発性血小板減少性紫斑病（ITP）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギラン-バレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
IgG媒介性炎症性疾患を有する対象に可溶性FcγRIAポリペプチドの有効量を投与する段階を含む、IgG媒介性炎症性疾患を治療する方法であって、
該可溶性FcγRIAポリペプチドが、
（i）SEQ ID NO：47のアミノ酸残基1〜267と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
（ii）IgGのFc領域と特異的に結合することができる、
方法。
【請求項３６】
可溶性FcγRIAポリペプチドが、SEQ ID NO：47のアミノ酸残基1〜267と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
可溶性FcγRIAポリペプチドがSEQ ID NO：47のアミノ酸残基1〜267を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
可溶性FcγRIAポリペプチドがSEQ ID NO：47のアミノ酸残基1〜277を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
可溶性FcγRIAポリペプチドがSEQ ID NO：47のアミノ酸残基1〜Xからなり、式中、Xが包括的に267〜277の整数である、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
IgG媒介性炎症性疾患が、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性クリオグロブリン血症；混合性結合組織病；外因性抗原に関連する疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ITP）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギラン-バレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
IgG媒介性炎症性疾患が免疫複合体媒介性疾患である、請求項35記載の方法。
【請求項４２】
免疫複合体媒介性疾患が、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性クリオグロブリン血症；混合性結合組織病；および外因性抗原に関連する疾患からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
外因性抗原に関連する疾患が、B型肝炎随伴結節性多発動脈炎である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
IgG媒介性炎症性疾患が自己免疫疾患である、請求項35記載の方法。
【請求項４５】
自己免疫疾患が、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性結合組織病；特発性血小板減少性紫斑病（ITP）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギラン-バレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
免疫系疾患は、流行病のような比率で増加しつつある重大な医療上の問題である。このため、それらは新たな治療薬の開発に向けた新規で積極的なアプローチを必要とする。自己免疫疾患に対する標準的な治療法は、高用量で長期にわたる全身コルチコステロイドおよび免疫抑制薬であった。用いられる薬剤は3つの主なカテゴリーに分類される：（1）プレドニゾンおよびプレドニゾロンなどのグルココルチコイド；（2）シクロスポリンおよびタクロリムスなどのカルシニューリン阻害薬；ならびに（3）アザチオプリン、シロリムスおよびミコフェノール酸モフェチルなどの増殖抑制薬／代謝拮抗薬。これらの薬剤は数多くの自己免疫性病状の治療において大きな臨床的成果を挙げているが、そのような治療法は生涯にわたる使用を必要とし、免疫系全体を抑制するように非特異的に作用する。患者はこのため、感染症および癌に対する著しく高いリスクにさらされる。カルシニューリン阻害薬およびステロイドには腎毒性および糖尿病誘発性もあり、そのことはそれらの臨床的有用性を制約してきた（Haynes and Fauci in Harrison's Principles of Internal Medicine, 16th edition, Kasper et al., eds (2005), pp 1907-2066（非特許文献1））。
【０００２】
自己免疫疾患に対する従来の治療法のほかに、サイトカインおよびそれらの受容体を標的とするモノクローナル抗体および可溶性受容体も、関節リウマチ、臓器移植およびクローン病といった種々の自己免疫疾患および炎症性疾患における有効性が示されている。そのような薬剤のいくつかには、腫瘍壊死因子（TNF）を標的とするインフリキシマブ（REMICADE（登録商標））およびエタネルセプト（ENBREL（登録商標））、T細胞抗原CD3を標的とするムロモナブ-CD3（ORTHOCLONE OKT3）、ならびに活性化T細胞上のCD25と結合してこの経路を介したシグナル伝達を阻害するダクリズマブ（ZENAPAX（登録商標））が含まれる。ある種の炎症性病状の治療には有効であるものの、これらの薬剤の使用は、「サイトカイン放出症候群」および感染症リスクの増大を含む副作用のために制約されている（Krensky et al., in Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th edition, Hardman and Limbird, eds, (2001), pp 1463-1484（非特許文献2））。
【０００３】
静脈内免疫グロブリン（IVIG）による受動免疫処置は、原発性抗体欠損症の患者における補充療法を目的として、米国で1981年に認可されている。その後の調査により、IVIGは川崎病および免疫性血小板減少性紫斑病における自己免疫症状の緩和にも有効なことが示されている（Lemieux et al., Mol. Immunol., 42:839-848, 2005（非特許文献3）；Ibanez and Montoro-Ronsano Curr. Pharm. Biotech., 4:239-247, 2003（非特許文献4）；Clynes, J. Clin. Invest., 115:25-27, 2005（非特許文献5））。IVIGはまた、成人型皮膚筋炎、ギラン-バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、多発性硬化症、血管炎、ブドウ膜炎、重症筋無力症、およびランバート-イートン症候群における炎症を軽減することも示されている（Lemieux et al., 前記（非特許文献3）；Ibanez and Montoro-Ronsano、前記（非特許文献4））。
【０００４】
IVIGは、多数（10,000〜20,000人）の健常ドナーの血漿から、低温エタノール分画法によって得られる。よく用いられるIVIG調製物には、Sandoglobulin、Flebogamma、Gammagard、OctagamおよびVigam Sが含まれる。一般に、有効性は大量のIVIGを患者に注入した場合にのみ認められ、自己免疫疾患には平均用量2g／kg／月が用いられる。IVIG治療における高頻度の（患者の1〜10％）副作用には、紅潮、発熱、筋肉痛、背部痛、頭痛、悪心、嘔吐、関節痛およびめまいが含まれる。頻度の低い（患者の0.1〜1％）副作用には、アナフィラキシー、無菌性髄膜炎、急性腎不全、溶血性貧血および湿疹が含まれる。IVIGは一般に安全とみなされているが、原料であるプールされたヒト血漿は、感染病原体の移行の危険因子とみなされている。このため、IVIGの使用は、その利用可能性、高いコスト（$100／gm、注入コストを含む）および重大な有害反応の恐れのために制約されている（Lemieux et al., 前記（非特許文献3）；lbanez and Montoro-Ronsano、前記（非特許文献4）；Clynes, J. Clin. Invest., 115:25-27, 2005（非特許文献5））。
【０００５】
Fcγ受容体発現の調節、新生児Fc受容体FcRnの飽和に起因する病原性抗体のクリアランスの増加、補体媒介性障害の減弱化、ならびにT細胞およびB細胞または細網内皮系のモジュレーションを含む、数多くの機序が、IVIGの作用様式を説明するために提唱されている（Clynes、前記（非特許文献5））。IVIGから精製されたFcドメインは炎症のさまざまなインビトロおよびインビボモデルでインタクトIgGと同程度の活性があることが示されているため、IVIGの抗炎症特性はIgGのFcドメイン（Debre et al., Lancet, 342:945-949, 1993（非特許文献6））またはシアル酸化細画分（Kaneko et al., Science, 313:670-673, 2006（非特許文献7））に存在することが十分に認められている。
【０００６】
IgGのFc受容体（FcγR）は、先天性免疫系と後天性免疫系との間の架け橋として作用することにより、哺乳動物の生態において独自の役割を果たす（Dijstelbloem et al., Trends Immunol. 22:510-516, 2001（非特許文献8）；Takai, Nature 2: 580-592, 2002（非特許文献9）；Nimmerjahn and Ravetch, Immunity 24: 19-28, 2006（非特許文献10））。IgGのFc領域とのそれらの結合により（Woof and Burton, Nature Rev. Immunol.,4:1-11, 2004（非特許文献11））、FcγRはADCC、補体媒介性細胞溶解、III型過敏性反応、寛容性、食作用、抗原の提示およびプロセシング、ならびに免疫複合体の排除における種々のエフェクター機能を調節する（Dijstelbloem et al., 前記（非特許文献8）；Takai、前記（非特許文献9）；Nimmerjahn and Ravetch、前記（非特許文献10））。
【０００７】
FcγRは、ヒトにおいて、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）およびFcγRIII（CD16）を含む3つの主要な遺伝子ファミリーを構成する（Dijstelbloem et al., 前記（非特許文献8）；Takai、前記（非特許文献9））。FcγRIは単量体IgGに対する高親和性受容体であり（108〜109M-1）、一方、FcγRIIおよびFcγRIIIは単量体IgGとは低い親和性を示すが（107M-1）、IgG免疫複合体とははるかに高いアビディティーで結合する。FcγRIIサブファミリーは2つの主要なクラスの遺伝子であるFcγRIIaおよびFcγRIIbで構成され、これらはIgGと結合した後に細胞内部に対抗シグナル（opposing signal）を伝達する。FcγRIIaはその短い細胞質尾部の内部に免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含み、一方、FcγRIIbはその細胞質ドメイン内部の免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ITIM）を通じて抑制性シグナルを伝達する。FcγRIIIサブファミリーにはまた、2種類の異なる受容体遺伝子であるFcγRIIIaおよびFcγRIIIbも含まれる。FcγRIIIaは、IgG免疫複合体と結合した後に、それに付随するITAM含有性の共通γ鎖を通じて活性化シグナルを伝達するヘテロ二量体性シグナル伝達受容体である。FcγRIIIbはGPIリンカーを通じて細胞膜と結合しており、固有のシグナル伝達能力は有していない。FcγRIも固有のシグナル伝達能力は有していないが、FcγRIIIaと同様に共通γ鎖と会合し、Fc結合に応じて活性化シグナルを伝達する。FcγRを通じてのシグナル伝達は、ITAM／ITIM配列内部でのキナーゼ媒介性リン酸化／脱リン酸化イベントを伴う（Daeron, Intern. Rev. Immunol., 16: 1-27, 1997（非特許文献12））。
【０００８】
免疫生物学において報告されている役割と一致して、ヒトFcγRは単量体IgGの諸サブクラスに対して異なる親和性を示す：FcγRIはIgG1≧IgG3＞IgG4>>IgG2の順に結合する；FcγRIIaはIgG3≧IgG1, IgG2>>IgG4の順に結合する；FcγRIIbはIgG3≧IgG1＞IgG4＞IgG2の順に結合する；FcγRIIIaおよびFcγRIIIbはIgG1, IgG3>>IgG2, IgG4の順に結合する（Dijstelbloem et al., 前記（非特許文献8）；Takai、前記（非特許文献9））。
【０００９】
構造およびシグナル伝達能力の違いに加えて、FcγRは細胞発現パターンの違いも示す。ヒトでは、FcγRIは主としてマクロファージ、単球および好中球上で発現されるが、好酸球および樹状細胞上にも認められる。FcγRIIaはヒトで最も広範囲に発現されるFcγRであり、血小板、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞上で発現される。FcγRIIbはB細胞上で発現される唯一のFcγRであるが、マスト細胞、好塩基球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞によっても発現される。FcγRIIIaはヒトNK細胞上で発現される唯一のFcγRである上、広範囲に発現され、マクロファージ、単球、マスト細胞、好酸球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞上で認められる。一方、FcγRIIIbの発現はほとんど好中球および好酸球に限定される（Dijstelbloem et al., 前記（非特許文献8）；Takai、前記（非特許文献9））。
【００１０】
マウスは、ヒトの高親和性FcγRIおよび抑制性受容体FcγRIIbのオルソログといった、ヒトにおける受容体と類似して機能するFcγRを発現する（Nimmerjahn and Ravetch, Immunity, 24:19-28, 2006（非特許文献10））。ヒトFcγRIIaおよびIIIaのマウスでのオルソログはそれぞれFcγRIIIおよびFcγRIVと考えられている。マウスはFcγRIIIbを発現しないように思われる（Nimmerjahn and Ravetch、前記（非特許文献10））。細胞発現パターンにいくつかの違いは認められるものの、ヒトにおけるFcγR遺伝子発現とマウスにおけるそれらのオルソログのそれとは一般に類似している。
【００１１】
マウスにおける遺伝子ターゲティングにより、哺乳動物免疫系におけるFcγRの重要性が示唆されている（概論についてはDijstelbloem et al., 前記（非特許文献8）；Takai、前記（非特許文献9）；Nimmerjahn and Ravetch、前記（非特許文献10）を参照）。共通γ鎖、ならびにFcγRI、FcγRIIIおよびFcγRIVのシグナル伝達サブユニットの欠失は、すべての活性化FcγRを通じてのシグナル伝達を消失させ、マウスを種々の自己免疫性および炎症性病状に対して抵抗性にする。γ鎖が欠損したマウスは、免疫複合体肺胞隔炎、血管炎、糸球体腎炎、アルツス反応および自己免疫溶血性貧血の減弱化を呈する。同様のデータが、FcγRIIIおよびFcγRIのα鎖の欠失に関して記載されている。FcγRIII-/-マウスは、免疫複合体誘発性肺胞隔炎の軽減、自己免疫溶血性貧血に対する感受性の低下、およびアルツス反応の減弱化を呈する。FcγRI-/-マウスは、マクロファージの食作用機能の障害、サイトカイン放出の減少、ADCCおよび抗原提示の減弱化、関節炎の軽減、抗体応答の増強、ならびに障害された過敏性を示す。これとは対照的に、抑制性受容体であるFcγRIIbの欠失は、炎症および自己免疫応答の増強をもたらす。FcγRIIb-/-マウスは、コラーゲン誘発性関節炎の増強、C57BL／6バックグラウンドでの糸球体腎炎の自然発症、アルツス反応の増強、肺胞隔炎の増強、IgG誘発性全身アナフィラキシーの増強、および抗GBM誘発性糸球体腎炎の増強を示す。このように、FcγRは免疫系ホメオスタシスにおいて主要な役割を果たしている。
【００１２】
種々の自己免疫疾患を治療する上で有用な、FcγRIアンタゴニストを含むFc受容体アンタゴニストに対しては需要がある。具体的には、そのようなアンタゴニストは、免疫系および造血系を調節するように働くと考えられ、それはそのような調節の撹乱が炎症、ホメオスタシス、関節炎、免疫不全ならびに他の免疫系および造血系の異常に関係のある障害に関与すると思われるためである。このため、そのような障害を予防、緩和または是正するために用いうる、そのようなアンタゴニストの同定および特性決定に対しては需要が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Haynes and Fauci in Harrison's Principles of Internal Medicinekon, 16th edition, Kasper et al, eds (2005), pp 1907-2066
【非特許文献２】Krensky et at, in Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th edition, Hardman and Limbird, eds, (2001), pp 1463-1484
【非特許文献３】Lemieux et at, Mol. Immunol,, 42:839-848, 2005
【非特許文献４】Ibanez and Montoro-Ronsano Curr. Pharm. Biotech., 4:239-247, 2003
【非特許文献５】Clynes, J. Clin. Invest., 115:25-27, 2005
【非特許文献６】Debre et al., Lancet, 342:945-949, 1993
【非特許文献７】Kaneko et al., Science, 313:670-673, 2006
【非特許文献８】Dijstelbloem et al., Trends Immunol. 22:510-516, 2001
【非特許文献９】Takai, Nature 2: 580-592, 2002
【非特許文献１０】Nimmerjahn and Ravetch, Immunity 24: 19-28, 2006
【非特許文献１１】Woof and Burton, Nature Rev. Immunol.,4:1-11, 2004
【非特許文献１２】Daeron, Intern. Rev. Immunol., 16: 1-27, 1997
【発明の概要】
【００１４】
1つの局面において、本発明は、対象におけるIgG媒介性炎症を軽減する方法を提供する。そのような方法は一般に、IgG媒介性炎症を有する対象に対して、可溶性FcγRIAポリペプチドの有効量を投与する段階を含む。本方法のいくつかの態様において、IgG媒介性炎症は免疫複合体媒介性である。
【００１５】
典型的には、可溶性FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、IgGのFc領域と特異的に結合することができる。例えば、いくつかの態様において、可溶性FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292を含む。他の変形例において、可溶性FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜Xからなり、式中、Xは282から292までの整数である。
【００１６】
ある態様において、可溶性FcγRIAポリペプチドは、宿主細胞において組換え生産方法によって生産されたポリペプチドである。典型的には、そのような生産方法は、以下の機能的に連結されたエレメントを有する発現ベクターが導入された細胞を培養する段階を含む：（i）転写プロモーター；（ii）SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチドをコードするDNAセグメントであって、コードされたポリペプチドがIgGのFc領域と特異的に結合しうるようなDNAセグメント；および（iii）転写ターミネーター。この細胞を、この細胞がDNAセグメントによってコードされたポリペプチドを発現するような条件下で培養する；そして、発現されたポリペプチドをその後に回収する。いくつかの変形例において、コードされたポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292を含む。特に適したポリペプチドには、例えば、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜Xからなるポリペプチドが含まれ、式中、Xは282から292までの整数である。
【００１７】
他の態様において、可溶性FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：47のアミノ酸残基1〜267と少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そのポリペプチドはIgGのFc領域と特異的に結合することができる。例えば、いくつかの態様において、可溶性FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：47のアミノ酸残基1〜267または1〜277を含む。他の変形例において、可溶性FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：47のアミノ酸残基1〜Xからなり、式中、Xは267から277までの整数である。
【００１８】
ある局面においては、IgG媒介性炎症性疾患を治療する方法が提供される。そのような方法は一般に、IgG媒介性炎症性疾患を有する対象に対して、以上に概説した可溶性FcγRIAポリペプチドの有効量を投与する段階を含む。IgG媒介性炎症性疾患は例えば、自己免疫性または免疫複合体媒介性の疾患でありうる。特定の変形例において、IgG媒介性炎症性疾患は、関節リウマチ（RA）；全身性エリテマトーデス（SLE）；混合性クリオグロブリン血症；混合性結合組織病；外因性抗原に関連する疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ITP）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギラン-バレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群より選択される。
【００１９】
本発明の他の局面および変形例について、下記でさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】FcγRIA-CH6によるインビトロでの免疫複合体沈降の阻止を描写している。抗OVA／OVA免疫複合体沈降アッセイを、下記の実施例15に記載した通りに行った。各ポイントは、2回ずつ行った3つの独立した実験の平均値を表している。丸印：抗OVA＋OVA；三角印：抗OVA＋OVA＋500nM FcγRIA-CH6；四角印：抗OVA＋OVA＋1500nM FcγRIA-CH6。
【図２】FcγRIA-CH6による、マスト細胞における炎症性サイトカインの免疫複合体媒介性産生の阻害を描写している。下記の実施例15に記載した通りに、マウスMC／9マスト細胞を、種々の量のFcγRIA-CH6（「pFCGR1A CH6」）の存在下で、抗OVA／OVA免疫複合体とともにインキュベートし、炎症性サイトカインの分泌を定量した。各ポイントは2回ずつの定量の平均値を表しており、2つの別個の実験の代表である。
【図３】FcγRIA-CH6による、マウスのアルツス反応における免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤の阻害を描写している。皮膚逆受身アルツス反応は、マウスにおいて、ウサギ抗オブアルブミンの皮内送達およびオブアルブミンの尾静脈注射を用いて成立させた（下記の実施例15を参照）。抗OVAのみを、または抗OVAを指定量のFcγRIA-CH6（「pFCGR1A CH6」）とともに投与された動物、ならびに免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤に対するFcγRIA-CH6の影響を評価した（同上参照）。各バーは、各群当たりn＝8匹の動物に関する平均±SDを表している。0.1×、1.0×および7.0× pFCGR1A-CH6は、添加したFcγRIA-CH6のモル過剰量を、注射した抗OVAの量を基準として相対的に表しており、それぞれFcγRIA-CH6の1.3μg、13.0μgおよび91.0μgに等しい。
【図４】FcγRIA-CH6の全身送達による、マウスでのアルツス反応における炎症の阻害を描写している。マウスに対して、アルツス反応を惹起させる1時間前に、指定量の媒体のみ、または指定量のFcγRIA-CH6（「pFCGR1A CH6」）を含む媒体を注射した（下記の実施例15参照）。実施例15に記載した通りに、FcγRIA-CH6の全身投与は静脈内注射によって行い、皮膚逆受身アルツス反応はウサギ抗オブアルブミンの皮内送達を用いて行った。浮腫は、抗OVAにより誘導されるエバンスブルー色素の血管外漏出によって測定した。各バーは、n＝8匹のマウス（FcγRIA-CH6の静脈内注射）またはn＝4匹のマウス（FcγRIA-CH6の皮内注射）に関する平均±SDを表している。用いた略号は以下の通りである：iv＝静脈内；id＝皮内。
【図５】FcγRIA-CH6の全身送達による、マウスにおける浮腫アルツス反応の阻害を描写している。マウスに対して、アルツス反応を惹起させる1時間前に、指定量の媒体のみ、または指定量のFcγRIA-CH6（「pFCGR1A CH6」）を含む媒体を注射した（下記の実施例15参照）。実施例15に記載した通りに、FcγRIA-CH6の全身投与は静脈内注射によって行い、皮膚逆受身アルツス反応はウサギ抗オブアルブミンの皮内送達を用いて行った。浮腫は、抗OVAにより誘導される病変部位の組織重量の増加によって測定した。各バーは、n＝8匹のマウス（FcγRIA-CH6の静脈内注射）またはn＝4匹のマウス（FcγRIA-CH6の皮内注射）に関する平均±SDを表している。データは、非免疫IgGの注射を基準として相対的に表現されている。用いた略号は以下の通りである：iv＝静脈内；id＝皮内。
【図６】FcγRI配列を描写している。図6Aは、FcγRIA（FcγRIアイソフォームa）をコードするポリヌクレオチド配列（SEQ ID NO：1）を示している。図6Bは、FcγRIAのポリペプチド配列（SEQ ID NO：2）を示している。図6Cは、FcγRIAの細胞外ドメインのポリペプチド配列（SEQ ID NO：3）を示している。図6Dは、FcγRIAポリペプチド配列と、FcγRIアイソフォームb1（SEQ ID NO：4）およびc（SEQ ID NO：5）ポリペプチド配列との比較を示している。図6D中の縦線は、対応する遺伝子中でイントロンが位置する箇所を指し示している；三角印は、可溶性FcγRIAの特定の態様のC末端アミノ酸、または代替的には、可溶性FcγRIAのある特定のタグ付加変形物（例えば、His6タグ付加FcγRIA）に関するC末端融合部位を指し示している。図6D中のアミノ酸位置16のグルタミン（Q）の上の「16」は、成熟FcγRIAタンパク質に関するアミノ末端開始部位を指し示している。
【図７】FcγRIA-CH6による、コラーゲン抗体誘発関節炎マウスモデルにおける足掌スコア（paw score）の低下を描写している。コラーゲン抗体誘発関節炎は、マウスにおいて、下記の実施例17に記載した通りに、Arthrogen-CIA（登録商標）抗体カクテルによる処置によって成立させた。マウスにはまた、媒体のみ（PBS）、または指定濃度のFcγRIA-CH6（「pFCGR1A CH6」）を含む媒体のいずれかの皮下注射も隔日に合計5回行った。各ポイントは、各群当たりn＝8匹のマウスに関する平均±SEMを表している。群間差は反復測定ANOVAによって有意であった。
【図８】FcγRIA-CH6による、コラーゲン抗体誘発関節炎マウスモデルにおける足掌厚み（paw thickness）の減少を描写している。コラーゲン抗体誘発関節炎は、マウスにおいて、下記の実施例17に記載した通りに、Arthrogen-CIA（登録商標）抗体カクテルによる処置によって成立させた。マウスにはまた、媒体のみ（PBS）、または指定濃度のFcγRIA-CH6（「pFCGR1A CH6」）を含む媒体のいずれかの皮下注射も隔日に合計5回行った。各ポイントは、各群当たりn＝8匹のマウスに関する平均±SEMを表している。群間差は反復測定ANOVAによって有意であった。
【図９】FcγRIA-CH6によって炎症アルツス反応の低下がみられるが、FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6のいずれによっても低下がみられないことを描写している。実験は下記の実施例15および16に記載した通りに行った。データは、各ポイントからの非免疫IgGに関する値を差し引いた後に、抗OVAのみの存在下で観察されたものに対して相対的に表現されている。各ポイント、FcγRIA（●）、FcγRIIA（▲）、FcγRIIIA（■）は、6つの別個の実験からの、n＝8〜16個の病変部位（図9Aおよび9B）ならびにn＝5〜13個の病変部位（図9C）に関する平均±SEMを表している。差はANOVAによって有意であり、すべての用量群間で*p＜0.0001であった。
【図１０】FcγRIAによる処置による、関節炎疾患スコアの低下を描写している。コラーゲン誘発性関節炎（CIA）は、マウスにおいて、下記の実施例19に記載した通りに成立させた。成立した疾患が存在するようになったところで、マウスに媒体のみ（PBS）（O）または0.22mgもしくは2.0mgのFcγRIA（「FCGRIA」）を含む媒体による処置を行った（下記の実施例19を参照）。各ポイントは、各群当たり7〜13匹の動物に関する平均±SEを表している。差は反復測定ANOVAによって有意であり、*p＝0.001であった。
【図１１】延長されたFcγRIA投与レジメンによる関節炎スコアの低下を描写している。コラーゲン誘発性関節炎（CIA）は、マウスにおいて、下記の実施例19に記載した通りに成立させた。マウスに対して、媒体のみ（○）または2.0mgのFcγRIAを含む媒体の投与による処置を、隔日（■）または4日毎（▲）に行った（下記の実施例19を参照）。各ポイントは、各群当たり7〜13匹の動物に関する平均±SEを表している。差は反復測定ANOVAによって有意であり、*p＝0.0125、**p＝0.001であった。4日毎の投与を合計11日間行った。
【図１２】FcγRIA処置による関節炎性足掌の数の減少を描写している。コラーゲン誘発性関節炎（CIA）は、マウスにおいて、下記の実施例19に記載した通りに成立させた。マウスに対して、媒体のみ（○）または0.22mgのFcγRIA（▲）もしくは2.0mg（■）のFcγRIAを含む媒体による処置を隔日に行った（下記の実施例19を参照）。各ポイントは各群当たり7〜13匹のマウスの平均を表している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の説明
I．本発明の概観
本発明は、可溶性FcγRIAなどのFc受容体アンタゴニストを提供することにより、IgG媒介性および免疫複合体媒介性の疾患を治療するための新規治療薬に対する需要に応える。可溶性FcγRIAは免疫複合体沈降を完全に阻止するが、可溶性FcγRIIAまたはFcγRIIIAはそうでないことが発見された（下記の実施例に詳細に記載されている）。さらに、可溶性FcγRIAが、細胞FcγRを通じての免疫複合体の結合およびシグナル伝達を阻止することも発見された（下記の実施例に詳細に記載されている）。可溶性FcγRIAが、マウスにおいて皮膚アルツス反応、関節炎のコラーゲン抗体誘発モデルおよびコラーゲン誘発関節炎における炎症を阻止したという所見は、FcγRIAがIgG Fcに対する高親和性受容体として流血中で単量体IgGとの飽和状態にあり、それ故に免疫複合体に対する結合に対する利用能は一般に低いと予想されたため、驚くべきものであった。これらの所見は、可溶性FcγRIAが、自己免疫疾患および炎症を治療するために用いることのできる効力の強い治療薬であることを示している。
【００２２】
さらに、本明細書に記載した可溶性FcγRIAポリペプチドは、例えば、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症（MS）、全身性エリテマトーデス（SLE）、重症筋無力症、ヴェゲナー肉芽腫症、チャーグ-ストラウス症候群、B型肝炎随伴結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、関節リウマチ（RA）、ランバート-イートン症候群、炎症性腸疾患（IBD）、本態性混合性クリオグロブリン血症、C型肝炎随伴性クリオグロブリン血症、混合性結合組織病、自己免疫性血小板減少症（ITPおよびTTP）、成人型皮膚筋炎、ギラン-バレー症候群、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、抗リン脂質抗体症候群、血管炎、ブドウ膜炎、血清病、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、ならびに外因性抗原に関連する疾患、例えばウイルス感染症および細菌感染症などといった、IgG媒介性および免疫複合体媒介性の疾患の治療のために、免疫細胞（例えば、リンパ球、単球、白血球、マクロファージおよびNK細胞）におけるIgGおよび免疫複合体のシグナル伝達に拮抗するかそれを阻止する。喘息、アレルギーおよび他のアトピー性疾患を、免疫応答を阻害するため、または原因細胞を枯渇させるための本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドによって治療することもできる。本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドを用いることによる、Fcγ受容体を介したIgGおよび免疫複合体のシグナル伝達の阻止または阻害は、膵細胞、腎細胞、下垂体細胞および神経細胞の疾患にも有益な可能性がある。本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、IgGおよび免疫複合体のアンタゴニストとしても有用である。そのような拮抗効果は、FcドメインIgGおよび免疫複合体の直接的な中和または結合によって達成することができる。
【００２３】
ヒトFcγRIA（FcγRIのアイソフォームa）をコードする例示的なヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：1によって示される；コードされたポリペプチドはSEQ ID NO：2に示されている。FcγRIAは、IgGのFcドメインに対する受容体である。FcγRIA（SEQ ID NO：1）をコードするヒトcDNAクローンの分析により、およそ277個のアミノ酸残基の細胞外リガンド結合ドメイン（SEQ ID NO：2の残基16〜292；SEQ ID NO：3）を含む、374個のアミノ酸（SEQ ID NO：2）をコードするオープンリーディングフレームが明らかとなった。したがって、ある態様において、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜292を含むIgG結合ドメインを含む。他の変形例において、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282を含むIgG結合ドメインを含む。
【００２４】
FcγRIにはアイソフォームb1およびcも含まれ、これらはいずれも図6D中にFcγRIA（SEQ ID NO：2）と比較して描写されている。アイソフォームb1およびcは、3つのIgドメインを含むアイソフォームaとは異なり、2つのIgドメインしか含まない。このため、本発明の可溶性FcγRIポリペプチドは、図6Dに描写されたアイソフォームa、b1またはcのうち任意のものの細胞外ドメインを含みうる。さらに、可溶性FcγRIポリペプチドがアイソフォームb1またはcに基づく場合に、可溶性FcγRIポリペプチドがアイソフォームaの第3のIgドメインを含んでもよい。
【００２５】
したがって、1つの局面において、本発明は、免疫細胞におけるIgG媒介性または免疫複合体媒介性のシグナル伝達を中和することのできる、単離された可溶性FcγRIAポリペプチドを提供する。一般に、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含み、ここで、単離されたポリペプチドはIgG（例えば、ヒトIgG、例えばヒトIgG1など）のFcドメインと特異的に結合することができる。本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、それが単量体ヒトIgG（例えば、ヒトIgG1）と少なくとも106M-1、好ましくは少なくとも107M-1、より好ましくは少なくとも108M-1、最も好ましくは少なくとも109M-1の結合親和性（Ka）で結合するならば、特異的に結合する。ある態様において、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、単量体ヒトIgGと108M-1〜109M-1の結合親和性（Ka）で結合する。可溶性FcγRIAポリペプチドの結合親和性は、当業者により、例えば、スキャッチャード分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949）によって決定されうる。親和定数（Ka）を決定することに加えて、親和性を測定する代替的な手段には平衡定数（Kd）があり、この場合は親和性の向上に伴う低下が観察される。ある態様において、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、ヒトIgG1と10-8M未満、好ましくは10-9M未満、より好ましくは10-10M未満の平衡解離定数（Kd）で結合する。1つの具体的な変形例において、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、ヒトIgG1と約1.7×10-10Mの平衡解離定数（Kd）で結合する。いくつかの態様において、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292を含む。具体的な変形例において、可溶性FcγRIAポリペプチドはSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜Xからなり、式中、Xは282から292までの整数である。したがって、ある態様において、可溶性FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282、16〜283、16〜284、16〜285、16〜286、16〜287、16〜288、16〜289、16〜290、16〜291または16〜292からなる。
【００２６】
本発明はまた、SEQ ID NO：3のアミノ酸配列（SEQ ID NO：2の残基16〜292）の少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含む、単離されたポリペプチドおよびエピトープも提供する。例示的なポリペプチドには、SEQ ID NO：2の残基16〜282もしくは16〜292を含むかそれらからなるポリペプチド、またはその機能的IgG結合性断片が含まれる。さらに、本発明はまた、単量体形態でまたは多量体免疫複合体として存在するIgGと結合する、その活性を阻止する、阻害する、低下させる、拮抗する、または中和する、以上に開示したような単離されたポリペプチドも提供する。
【００２７】
本発明はまた、変異体可溶性FcγRIA受容体ポリペプチドも含み、ここで変異体可溶性FcγRIA受容体ポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％またはそれ以上の同一性を有し、かつ変異体ポリペプチドのアミノ酸配列とSEQ ID NO：2の対応するアミノ酸配列との間の差異は1つまたは複数の保存的アミノ酸置換に起因する。そのような保存的アミノ酸置換は、本明細書に記載されている。本発明によって提供されるようなそのような変異体可溶性FcγRIA受容体ポリペプチドはまた、単量体形態でまたは多量体免疫複合体として存在するIgGと結合する、その活性を阻止する、阻害する、低下させる、拮抗する、または中和する。
【００２８】
もう1つの局面において、本発明は、本明細書に記載した可溶性FcγRIAポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一般に、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含む可溶性FcγRIAポリペプチドをコードし、ここで、コードされたポリペプチドは、IgG（例えば、ヒトIgG、例えばヒトIgG1など）のFcドメインと特異的に結合することができる。本明細書に記載したように、コードされた可溶性FcγRIAポリペプチドは、免疫細胞におけるIgG媒介性または免疫複合体媒介性のシグナル伝達を中和することができる。具体的な変形例において、コードされたポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292を含む。
【００２９】
もう1つの局面において、本発明は、以下の機能的に連結されたエレメントを含む発現ベクターを提供する：（a）転写プロモーター；SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含む可溶性FcγRIAポリペプチドをコードする第1のDNAセグメントであって、コードされたポリペプチドがIgG（例えば、ヒトIgG、例えばヒトIgG1など）のFcドメインと特異的に結合することができる第1のDNAセグメント；および転写ターミネーター。1つの態様において、以上に開示した発現ベクターは、第1のDNAセグメント（例えば、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基1〜15をコードするDNA配列）と機能的に連結された分泌シグナル配列をさらに含む。具体的な変形例において、コードされたポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基1〜282、16〜282、1〜292または16〜292を含む。
【００３０】
もう1つの局面において、本発明は、以上に開示したような発現ベクターを含む培養細胞を提供し、ここでこの細胞は、そのDNAセグメントによってコードされた可溶性FcγRIAポリペプチドを発現する。もう1つの態様において、培養細胞は、可溶性FcγRIAポリペプチドを分泌する、以上に開示したような細胞である。もう1つの態様において、培養細胞は、IgGと結合するかまたはIgG活性に拮抗する可溶性FcγRIAポリペプチドを分泌する、以上に開示したような細胞であり、ここでIgGは単量体形態で、または多量体免疫複合体として存在する。特定の変形例において、培養細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞などの哺乳動物細胞である。
【００３１】
もう1つの局面において、本発明は、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292と少なくとも90％または少なくとも95％同一なアミノ酸残基の配列を含む、単離された可溶性FcγRIAポリペプチドを提供し、ここで可溶性ポリペプチドはIgGと結合するかまたはIgG活性に拮抗し、IgGは単量体形態で、または多量体免疫複合体として存在する。
【００３２】
もう1つの局面において、本発明は、可溶性FcγRIAポリペプチドを産生させる方法であって、以上に開示したような細胞を培養する段階；およびこの細胞によって産生された可溶性FcγRIAポリペプチドを単離する段階を含む方法を提供する。
【００３３】
もう1つの局面において、本発明は、薬学的に許容される担体および本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。
【００３４】
もう1つの局面において、本発明はまた、FcγRIAポリペプチドおよび異種ポリペプチドセグメントを含む融合タンパク質も提供する。特に適した異種ポリペプチドセグメントには、免疫グロブリン部分が含まれる。ある変形例において、免疫グロブリン部分は、ヒトFc断片などの免疫グロブリン重鎖定常領域である。本発明はさらに、そのような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子も含む。
【００３５】
もう1つの局面において、本発明は、造血細胞および造血始原細胞の、IgG誘発性または免疫複合体誘発性の増殖を阻害するための方法であって、骨髄細胞または末梢血細胞を、可溶性受容体の非存在下で培養した骨髄細胞または末梢血細胞と比較して骨髄細胞または末梢血細胞における造血細胞の増殖を低下させるのに十分な量の可溶性FcγRIAを含む組成物とともに培養する段階を含む方法を提供する。1つの態様において、本方法は、造血細胞および造血始原細胞がリンパ系細胞であって、以上に開示した通りである。1つの態様において、本方法は、リンパ系細胞がマクロファージ、B細胞またはT細胞であって、以上に開示した通りである。もう1つの局面において、本発明は、骨髄系由来細胞による抗原提示を低下させるのに十分な量の可溶性FcγRIAを含む組成物により、マクロファージまたは単球といった骨髄系列の細胞による抗原提示を阻害するための方法を提供する。もう1つの態様において、本方法は、細胞がB細胞であって、開示した通りである。
【００３６】
もう1つの局面において、本発明は、IgG媒介性または免疫複合体媒介性の炎症を軽減する方法であって、炎症を有する哺乳動物に対して、炎症を軽減するのに十分な量の可溶性FcγRIAの組成物を投与する段階を含む方法を提供する。
【００３７】
もう1つの局面において、本発明は、哺乳動物における免疫応答を抑制する方法であって、許容される薬学的媒体中に可溶性FcγRIAポリペプチドを含む組成物を投与する段階を含む方法を提供する。
【００３８】
さらに、細胞表面FcγRと免疫複合体のIgG Fcドメインとの間の相互作用の阻止は、免疫複合体に対する細胞応答を減弱させ、それ故に炎症を軽減すると考えられる。このため、本明細書に示したような本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、IgG媒介性および免疫複合体媒介性の免疫応答の阻止に有効であり、炎症性疾患、例えば、関節炎（例えば、関節リウマチまたは乾癬性関節炎）、成人呼吸器疾患（ARD）、エンドトキシン血症、敗血症性ショック、多臓器不全、炎症性肺傷害（例えば、喘息または気管支炎）、細菌性肺炎、乾癬、湿疹、アトピー性および接触性の皮膚炎、炎症性腸疾患（IBD）（例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病）、および細菌性またはウイルス性感染症に対する異常免疫応答に対する治療的処置に有用である。
【００３９】
本発明の上記および他の局面は、下記の詳細な説明を参照することによって明白になると考えられる。加えて、本明細書中に特定されているさまざまな参考文献は、それらの全体が参照により組み入れられる。
【００４０】
II．定義
別に定義する場合を除き、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、記載された方法および組成物に関係する当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書で用いる場合、以下の用語および語句は、別に特定される場合を除き、それらに与えられている意味を有する。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生じた断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生じた断片のことを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（DNAおよびRNAなど）または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα-鏡像異性形態）またはその両者の組み合わせである単量体から構成されうる。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有しうる。糖修飾には、例えば、1つまたは複数のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による置換が含まれ、または糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することもできる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体といった立体的および電子的に類似した構造によって置換することもできる。塩基部分における修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換物が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似物によって連結することができる。ホスホジエステル結合の類似物には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデートなどが含まれる。「核酸分子」という用語にはまた、天然に存在するまたは修飾された核酸塩基がポリアミド骨格と結合した、いわゆる「ペプチド核酸」も含まれる。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。
【００４２】
「核酸分子の相補物」という用語は、参照ヌクレオチド配列と比較して、相補的なヌクレオチド配列および逆の向きを有する核酸分子のことを指す。
【００４３】
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較して、1つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列のことを表す。縮重コドンは異なるヌクレオチドトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUおよびGACトリプレットはそれぞれAspをコードする）。
【００４４】
「構造遺伝子」という用語は、メッセンジャーRNA（mRNA）に転写されて、続いてそのmRNAが特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳される核酸分子のことを指す。
【００４５】
「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムDNA中に組み込まれていない核酸分子のことである。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された増殖因子をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノム中に組み込まれていない化学合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種の染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
【００４６】
「核酸分子構築物」とは、天然には存在しない配置で組み合わされかつ並置された核酸の部分を含むように人間の介入により修飾された、一本鎖または二本鎖の核酸分子のことである。
【００４７】
「線状DNA」は、遊離5'および3'末端を有する非環状DNA分子のことを表す。線状DNAは、酵素消化または物理的破壊により、プラスミドなどの閉環状DNA分子から調製することができる。
【００４８】
「相補的DNA（cDNA）」とは、逆転写酵素によってmRNAテンプレートから形成される一本鎖DNA分子のことである。典型的には、mRNAの一部分に対して相補的なプライマーが、逆転写の開始のために用いられる。当業者はまた、そのような一本鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖からなる二本鎖DNA分子を指すためにも「cDNA」という用語を用いる。「cDNA」という用語はまた、RNAテンプレートから合成されたcDNA分子のクローンのことも指す。
【００４９】
「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列のことである。典型的には、プロモーターは遺伝子の5'非コード領域に位置し、構造遺伝子の転写開始部位の近位にある。プロモーターの内部にあって転写の開始に働く配列エレメントは、多くの場合、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられる。これらのプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント（DSE；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)）、サイクリックAMP応答エレメント（CRE）、血清応答エレメント（SRE；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)）、グルココルチコイド応答エレメント（GRE）、ならびにCRE／ATF（O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)）、AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)）、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB；Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)）およびオクタマー因子（概論については、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)、およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)を参照）などの他の転写因子の結合部位が含まれる。プロモーターが誘導性プロモーターであるならば、転写の速度は誘導物質に応じて増大する。これとは対照的に、プロモーターが構成性プロモーターであるならば、転写の速度は誘導物質によって調節されない。抑制性プロモーターも知られている。
【００５０】
「コアプロモーター」は、TATAボックスおよび転写開始点を含む、プロモーター機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を高めること、または組織特異性活性を付与することのできる特定の配列の非存在下で検出可能な活性を有してもよく、または有しなくてもよい。
【００５１】
「調節エレメント」とは、コアプロモーターの活性をモジュレートするヌクレオチド配列のことである。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織またはオルガネラにおける転写を排他的または選好的に可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含みうる。これらの種類の調節エレメントは通常、「細胞特異的」、「組織特異的」または「オルガネラ特異的」な様式で発現される遺伝子に付随している。
【００５２】
「エンハンサー」とは、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または向きとは関係なく、転写の効率を高めることができる、調節エレメントの一種のことである。
【００５３】
「異種DNA」とは、所定の宿主細胞内に天然には存在しない、1つのDNA分子またはDNA分子の集団のことを指す。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA（すなわち、外因性DNA）と組み合わされている限り、宿主細胞種に由来するDNA（すなわち、内因性DNA）を含んでもよい。例えば、転写プロモーターを含む宿主DNAセグメントと機能的に連結された非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であるとみなされる。その反対に、異種DNA分子が、外因性プロモーターと機能的に連結された内因性遺伝子を含むこともできる。もう1つの実例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠く突然変異細胞に導入されているならば、異種DNAであるとみなされる。
【００５４】
「ポリペプチド」は、天然性または合成性のいずれによって生成されたかにかかわらず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の重合体のことである。アミノ酸残基が約10個未満のポリペプチドは一般に「ペプチド」と呼ばれる。
【００５５】
ポリペプチドの文脈において、「断片」という用語は、典型的には、ポリペプチドの少なくとも20個の連続したアミノ酸、または少なくとも50個の連続したアミノ酸を有する、ポリペプチドの一部分のことを指す。「変異体」には、第2のポリペプチドと比べてアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有するポリペプチドもしくはその断片；または、例えば、異種ポリペプチドの結合により、またはグリコシル化、アセチル化、リン酸化などにより、第2の分子の共有結合によって修飾されたポリペプチドもしくはその断片が含まれる。「ポリペプチド」の定義にさらに含まれるものには、例えば、アミノ酸の1つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸など）、非置換結合を有するポリペプチド、ならびに、天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方の、当技術分野で公知の修飾を含むポリペプチドが含まれる。
【００５６】
「タンパク質」とは、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子のことである。タンパク質が、糖質基などの非ペプチド性構成要素を含んでもよい。糖質および他の非ペプチド性置換基が、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加されてもよく、それらの基はその細胞の種類によってさまざまであると考えられる。タンパク質は、本明細書において、それらのアミノ酸骨格構造に関して定義される；糖質基などの置換基は一般に特定されないが、それにもかかわらず存在してよい。
【００５７】
非宿主DNA分子によってコードされたペプチドまたはポリペプチドは、「異種の」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００５８】
「クローニングベクター」とは、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有する、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージなどの核酸分子のことである。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの必須な生物的機能の喪失を伴わない決定可能な様式での核酸分子の挿入を可能にする1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにそのクローニングベクターによって形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子には、典型的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子が含まれる。
【００５９】
「発現ベクター」とは、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子のことである。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような遺伝子はそのプロモーターと「機能的に連結している」と言われる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合には、機能的に連結している。
【００６０】
「組換え宿主」とは、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞のことである。本文脈において、組換え宿主の一例は、発現ベクターからFcγRIAを産生する細胞である。これとは対照的に、FcγRIAの「天然の供給源」であり、かつ発現ベクターを欠く細胞によって、FcγRIAを産生させることもできる。
【００６１】
「組み込み形質転換体」とは、異種DNAが細胞のゲノムDNA中に組み込まれた組換え宿主細胞のことである。
【００６２】
「融合タンパク質」とは、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質のことである。例えば、融合タンパク質は、親和性マトリックスに結合するポリペプチドと融合されたFcγRIAポリペプチドの少なくとも一部分を含みうる。そのような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて大量のFcγRIAを単離するための手段を提供する。
【００６３】
「受容体」という用語は、「リガンド」と呼ばれる生物活性分子と結合する細胞結合タンパク質のことを表す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの作用を媒介する。受容体は、膜結合型であっても、サイトゾル性であっても、または核性であってもよく；単量体（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、β-アドレナリン受容体)であっても、多量体（例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体およびIL-6受容体）であってもよい。膜結合型受容体は、細胞外リガンド結合ドメインおよび典型的にはシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを含む、マルチドメイン構造を特徴とする。ある種の膜結合型受容体では、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインが、完全な機能的受容体を構成する別個のポリペプチド中に位置する。
【００６４】
一般に、受容体とリガンドとの結合は受容体のコンフォメーション変化を結果的にもたらし、それは細胞内でのエフェクタードメインと他の分子との相互作用を引き起こし、それは続いて細胞の代謝の変化を招く。受容体-リガンド相互作用と結びつけられることの多い代謝イベントには、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP産生の増加、細胞カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が含まれる。
【００６５】
「可溶性受容体」とは、細胞膜に結合していない受容体ポリペプチドのことである。可溶性受容体は、最も一般的には、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメイン、ならびにグリコホスホイノシトール（gpi）を介した結合のような細胞膜への他の結合を欠くリガンド結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチドの精製をもたらすかポリペプチドと基質との結合のための部位をもたらすアフィニティータグ、または免疫グロブリン定常領域配列などの付加的なアミノ酸残基を含みうる。多くの細胞表面受容体は、タンパク分解によって産生されるか選択的スプライシングを受けたmRNAから翻訳される、天然に存在する可溶性対応物を有する。可溶性受容体は、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体であってよく、多量体受容体は一般に、9個を超えるサブユニットを含まず、好ましくは6個を超えるサブユニットを含まず、最も好ましくは3個を超えるサブユニットを含まない。受容体ポリペプチドは、それぞれ膜係留またはシグナル伝達を提供するのに十分な膜貫通ポリペプチドセグメントおよび細胞内ポリペプチドセグメントの部分をそれらが欠いている場合、これらを実質的に含まないと言われる。さらに、当業者は遺伝コードを用いて、そのような可溶性受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを容易に決定することができる。
【００６６】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの構成要素として、そのより大きなポリペプチドをそれが合成される細胞の分泌経路を通じて方向づけるペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするDNA配列のことを表す。より大きなポリペプチドは一般に分泌経路を移行する間に切断されて、分泌ペプチドが除去される。
【００６７】
「単離されたポリペプチド」とは、天然にポリペプチドに付随する糖質、脂質または他のタンパク質性不純物などの混入性細胞成分を本質的に含まないポリペプチドのことである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、ポリペプチドを高精製された形態で、すなわち、少なくとも約80％の純度で、少なくとも約90％の純度で、少なくとも約95％の純度で、95％を上回る純度、例えば96％、97％、もしくは98％、もしくはそれ以上の純度で、または99％を上回る純度で含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後の単一バンドの出現による。しかし、「単離された」という用語は、二量体、または代替的にはグリコシル化もしくは誘導体化された形態といった代替的な物理的形態にある同じポリペプチドの存在を除外するものではない。
【００６８】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、本明細書において、ポリペプチド内の位置を表すために用いられる。文脈が許す限りにおいて、これらの用語は、近接性または相対的位置を表すために、特定の配列、またはポリペプチドの部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置するある特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしもポリペプチド全体のカルボキシル末端にあるとは限らない。
【００６９】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成のことを指す。例えば、構造遺伝子の場合には、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写、および1つまたは複数のポリペプチドへのmRNAの翻訳を伴う。
【００７０】
「スプライス変異体」という用語は、本明細書において、遺伝子から転写されるRNAの代替的形態を表すために用いられる。スプライス変異体は、転写された1つのRNA分子内部での、またはより頻度は低いが、別個に転写された複数のRNA分子間での、選択的スプライシング部位の使用によって天然に生じ、同一の遺伝子から転写されたいくつかのmRNAを生じる場合もある。スプライス変異体はアミノ酸配列の変化したポリペプチドをコードしうる。スプライス変異体という用語はまた、本明細書において、遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変異体によりコードされたポリペプチドを表すためにも用いられる。
【００７１】
本明細書で用いる場合、「免疫調節物質」という用語には、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、補助刺激分子、造血因子など、およびこれらの分子の合成類似体が含まれる。
【００７２】
「相補物／抗相補物対」という用語は、適切な条件下で非共有結合性に会合した安定な対を形成する非同一な部分のことを表す。例えば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補物／抗相補物対の典型的なメンバーである。その他の例示的な相補物／抗相補物対には、受容体／リガンド対、抗体／抗原（またはハプテンもしくはエピトープ）対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対などが含まれる。相補物／抗相補物対のその後の解離が望ましい場合には、相補物／抗相補物対は109M-1未満の結合親和性を有することが好ましい。
【００７３】
「抗体断片」とは、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fabなどの、抗体の一部分のことである。構造にかかわらず、抗体断片はインタクト抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗FcγRIAモノクローナル抗体断片は、FcγRIAのエピトープと結合する。
【００７４】
「抗体断片」という用語にはまた、軽鎖可変領域からなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「scFvタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位などの、特定の抗原と結合する合成ポリペプチドまたは遺伝的に操作されたポリペプチドも含まれる。
【００７５】
「キメラ抗体」とは、齧歯動物抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含み、抗体分子の残りの部分がヒト抗体に由来する組換えタンパク質のことである。
【００７６】
「ヒト化抗体」とは、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域からヒト可変ドメイン内に移行された組換えタンパク質である。ヒトタンパク質と結合するか、またはそれを中和するものといった、ヒトにおける治療用途のためのマウス抗体に由来するヒト化抗体の構築は、当業者の技能の範囲内にある。
【００７７】
本明細書で用いる場合、「治療薬」とは、抗体部分と結合されて治療のために有用なコンジュゲートを生じる分子または原子のことである。治療薬の例には、薬物、毒素、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活性化物質または色素、および放射性同位体が含まれる。
【００７８】
「検出可能な標識」とは、抗体部分と結合されて診断のために有用な分子を生じる分子または原子のことである。検出可能な標識の例には、キレート剤、光活性化物質、放射性同位体、蛍光物質、常磁性イオン、またはその他のマーカー部分が含まれる。
【００７９】
「アフィニティータグ」という用語は、本明細書において、第2のポリペプチドの精製もしくは検出を提供するため、または第2のポリペプチドの基質に対する付着のための部位を提供するために、第2のポリペプチドに結び付けられるポリペプチドセグメントを表すために用いられる。原理的には、抗体または他の特異的な結合剤を利用可能な任意のペプチドまたはタンパク質をアフィニティータグとして用いることができる。アフィニティータグには、ポリヒスチジントラクト（poly-histidine tract）、プロテインA（Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985)；Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3(1991)）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)）、Glu-Gluアフィニティータグ（Grussenmeyer et al., Proc..Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)）、サブスタンスP、FLAGペプチド（Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)）、ストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。概論については、Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991)を参照のこと。アフィニティータグをコードするDNA分子は、販売供給元（例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）から入手可能である。
【００８０】
「裸の（naked）抗体」とは、治療薬と結合していない、抗体断片とは異なる、完全な抗体のことである。裸の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびにキメラ抗体およびヒト化抗体などのある種の組換え抗体が含まれる。
【００８１】
本明細書で用いる場合、「抗体成分」という用語は、抗体全体および抗体断片の両方を含む。
【００８２】
「免疫結合物（immunoconjugate）」とは、抗体成分と治療薬または検出可能な標識とのコンジュゲートのことである。
【００８３】
本明細書で用いる場合、「抗体融合タンパク質」という用語は、抗体成分およびFcγRIAポリペプチド成分を含む組換え分子のことを指す。抗体融合タンパク質の例には、FcγRIA細胞外ドメイン、およびFcドメインまたは抗原結合領域のいずれかを含むタンパク質が含まれる。
【００８４】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」とは、少なくとも1つのエピトープを含み、かつ、腫瘍細胞または感染性病原体抗原を保有する細胞といった標的細胞上に発現されるアミノ酸配列のことである。T細胞は、標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに対する主要組織適合複合体分子によって提示されるペプチドエピトープを認識し、典型的には標的細胞を溶解するか、または標的細胞の部位に他の免疫細胞を動員させ、それによって標的細胞を死滅させる。
【００８５】
「抗原ペプチド」とは、主要組織適合複合体分子と結合して、T細胞によって認識されるMHC-ペプチド複合体を形成し、それによってT細胞への提示時に細胞傷害性リンパ球応答を誘導するペプチドのことである。このため、抗原ペプチドは、適切な主要組織適合複合体分子と結合して、例えば細胞溶解、または抗原と結合するかそれを発現する標的細胞に対する特定のサイトカインの放出といった細胞傷害性T細胞応答を誘導することができる。抗原ペプチドは、抗原提示細胞上または標的細胞上で、クラスIまたはクラスII主要組織適合複合体分子との関連下で結合されうる。
【００８６】
真核生物では、RNAポリメラーゼIIが、構造遺伝子の転写を触媒してmRNAを産生させる。RNA転写産物が特定のmRNAの配列に対して相補的な配列を有するRNAポリメラーゼIIテンプレートを含むように、核酸分子を設計することができる。このRNA転写産物は「アンチセンスRNA」と称され、アンチセンスRNAをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」と称される。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子と結合して、mRNAの翻訳の阻害を結果的にもたらすことができる。
【００８７】
「FcγRIAに対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「FcγRIAアンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、（a）FcγRIA遺伝子の一部分と安定した三重鎖を形成しうる、または（b）FcγRIA遺伝子のmRNA転写産物の一部分と安定した二重鎖を形成しうる、配列を有するオリゴヌクレオチドのことである。
【００８８】
「リボザイム」とは、触媒中心を含む核酸分子のことである。この用語には、RNA酵素、自己スプライシング性RNA、自己切断性RNA、およびこれらの触媒機能を遂行する核酸分子が含まれる。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と称される。
【００８９】
「外部ガイド配列」とは、内因性リボザイムであるRNアーゼPを特定の細胞内mRNA種に向かわせて、RNアーゼPによるmRNAの切断を結果的にもたらす核酸分子のことである。外部ガイド配列をコードする核酸分子は「外部ガイド配列遺伝子」と呼ばれる。
【００９０】
「変異体FcγRIA受容体遺伝子」または「変異体FcγRIAポリヌクレオチド」という用語は、SEQ ID NO：2の修飾物であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子のことを指す。そのような変異体には、FcγRIA受容体遺伝子の天然に存在する多型のほか、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換物を含む合成遺伝子が含まれる。FcγRIA遺伝子のそのほかの変異体形態には、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の挿入物または欠失物を含む核酸分子がある。変異体FcγRIA遺伝子は、例えば、その遺伝子が、SEQ ID NO：1のヌクレオチド配列またはその相補物を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを判定することによって同定することができる。
【００９１】
または、変異体FcγRIA遺伝子を配列比較によって同定することもできる。最大の一致が得られるように整列化した場合に、2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が同一である場合、2つのアミノ酸配列は「100％のアミノ酸配列同一性」を有する。同様に、最大の一致が得られるように整列化した場合に、2つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が同一である場合、2つのヌクレオチド配列は「100％のヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、DNASTAR（Madison, Wisconsin）製のLASERGENEバイオインフォマティクス-コンピューティング-スイートに含まれるプログラムのような、標準的なソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。最適なアラインメントを決定することによって2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するためのその他の方法は、当業者に周知である（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins", Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997）、およびBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)を参照のこと）。配列同一性を決定するための特定の方法については下記に述べる。
【００９２】
ある変形例において、変異体FcγRIAポリペプチドは、別のFcγ受容体の第1および第2のIgドメイン、例えばFcγRIアイソフォームb1またはFcγRIアイソフォームcの第1および第2のIgドメインなどと融合されたFcγRIAの第3のIgドメインを含む。
【００９３】
変異体FcγRIA受容体遺伝子または変異体FcγRIAポリペプチドを同定するために用いられる個々の方法にかかわらず、変異体遺伝子、または変異体遺伝子によってコードされたポリペプチドは、本明細書に記載された生物アッセイまたは生化学的アッセイを用いて、IgGと結合する能力によって機能的に特徴づけることができる。
【００９４】
「対立遺伝子変異体」という用語は、本明細書において、同じ染色体座位を占める、ある遺伝子の2つまたはそれ以上の代替的な形態のいずれかを表すために用いられる。対立遺伝子変異は、突然変異によって天然に起こり、その結果、集団内の表現型多型をもたらしうる。遺伝子突然変異はサイレント（コードされたポリペプチドが変化しない）であってもよく、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。対立遺伝子変異体という用語はまた、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたタンパク質を表すためにも用いられる。
【００９５】
「オルソログ」という用語は、異なる種に由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である、1つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質のことを表す。オルソログ間の配列の違いは種分化の結果である。
【００９６】
「パラログ」とは、生物によって生成される、異なるが構造的に関連したタンパク質である。パラログは遺伝子重複によって生じると考えられている。例えば、α-グロビン、β-グロビンおよびミオグロビンは互いにパラログである。
【００９７】
本発明は、FcγRIA受容体遺伝子の機能的断片も含む。本発明の文脈において、FcγRIA受容体遺伝子の「機能的断片」とは、本明細書に記載されたドメインであるか、または少なくともIgGと特異的に結合する、FcγRIAポリペプチドの一部分をコードする核酸分子のことを指す。
【００９８】
「対応する」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に言及して用いられる場合、2つの配列が最適に整列化された時に参照位置と整列化する第2の配列中の位置のことを指し示す。
【００９９】
本明細書に記載したFcγRポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：2の残基16〜282または16〜292の可溶性FcγRIAポリペプチド）に関連して、SEQ ID NOによって特定されるものに対応するアミノ酸残基に対する言及は、そのような残基の翻訳後修飾物も含む。例えば、SEQ ID NO：2の16位に対応する位置にあるグルタミンに対する言及は、このグルタミンのピログルタミン酸への翻訳後修飾物も範囲に含む。
【０１００】
「免疫複合体」とは、本明細書で用いる場合、IgG抗体がそのコグネイト抗原と結合して形成される複合体のことを指す。「免疫複合体」という用語は、本明細書で用いる場合、抗原：抗体複合体のすべての化学量論的組成を範囲に含む。例えば、免疫複合体は、抗原と結合した単一のIgG抗体（単量体IgG）で構成されてもよく、または抗原と結合した多数のIgG抗体（多量体免疫複合体）で構成されてもよい。
【０１０１】
「IgG媒介性炎症」とは、本明細書で用いる場合、免疫複合体の内部に含まれるIgG抗体のFc領域を介した免疫複合体とFcγ受容体との結合によって少なくとも一部には媒介される、炎症応答のことを指す。「IgG媒介性炎症」はまた、IgG免疫複合体による補体経路の活性化も範囲に含む。
【０１０２】
「免疫複合体媒介性炎症」とは、本明細書で用いる場合、1つまたは複数の組織の内部での免疫複合体の沈着によって少なくとも一部には特徴づけられる、IgG媒介性炎症のことを指す。
【０１０３】
「IgG媒介性疾患」または「IgG媒介性の炎症性疾患」とは、本明細書で用いる場合、免疫複合体の内部に含まれるIgG抗体のFc領域を介した免疫複合体とFcγ受容体との結合によって少なくとも一部には媒介される、炎症性疾患のことを指す。「IgG媒介性疾患」または「IgG媒介性の炎症性疾患」はまた、IgG免疫複合体による補体経路の活性化によって少なくとも一部には特徴づけられる疾患も範囲に含む。
【０１０４】
「自己免疫疾患」とは、本明細書で用いる場合、IgG自己抗体、すなわち、1つまたは複数の自己抗原に対して特異的なIgG抗体の存在によって少なくとも一部には特徴づけられる、IgG媒介性の炎症性疾患のことを指す。自己免疫疾患には例えば、自己抗体産生ならびに1つまたは複数の組織における免疫複合体の沈着と関連性のある疾患が含まれる；そのような疾患には、例えば、全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）および混合性結合組織病が含まれる。自己免疫疾患にはまた、例えば、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギラン-バレー症候群；およびグッドパスチャー症候群のように、自己抗体産生との関連性はあるが、免疫複合体の沈着とは明らかな関連性のない疾患も含まれる。他の自己免疫疾患には、例えば、炎症性腸疾患（IBD）、乾癬、アトピー性皮膚炎、重症筋無力症、I型糖尿病および多発性硬化症が含まれる。
【０１０５】
「免疫複合体媒介性疾患」とは、本明細書で用いる場合、1つまたは複数の組織の内部での免疫複合体の沈着によって少なくとも一部には特徴づけられる、IgG媒介性の炎症性疾患のことを指す。免疫複合体媒介性疾患には、例えば、混合性クリオグロブリン血症；全身性エリテマトーデス（SLE）；関節リウマチ（RA）；混合性結合組織病；および外因性抗原に関連する疾患、例えば、HBV随伴結節性多発動脈炎などが含まれる。
【０１０６】
標準的な分析方法の非精密さのため、重合体の分子量および長さは概略値であると解釈される。そのような値が「約」Xまたは「およそ」Xであると表現される場合には、Xの述べられた値は±10％の精度であると解釈されると考えられる。
【０１０７】
III．FcγRIAポリヌクレオチドまたは遺伝子の作製
ヒトFcγRIA受容体遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1に基づくポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。これらの技術は標準的であって十分に確立されており、販売供給元より入手可能なクローニングキットを用いて達成することができる。例えば、Ausubel et al., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons 1995；Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997；Aviv and Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972)；Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11", DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glovar (ed.), page 49（IRL Press, 1985）；Wu（1997）, pages 47-52を参照されたい。
【０１０８】
また、ヒトFcγRIA受容体遺伝子をコードする核酸分子を、FcγRIA受容体遺伝子またはcDNAのヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて得ることもできる。PCRを用いてライブラリーをスクリーニングするための一般的な方法は、例えば、Yu et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries", Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993によって提供されている。さらに、PCRを用いて関連遺伝子を単離する手法は、例えば、Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members", Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc. 1993によって記載されている。代替法として、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチドおよび本明細書に記載したヌクレオチド配列を用いて核酸分子を合成することにより、FcγRIA遺伝子を得ることもできる（例えば、Ausubel (1995)を参照）。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された手法により、少なくとも2kb長のDNA分子を合成する能力が与えられる（Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993)、Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 263-268,（Humana Press. Inc. 1993）、およびHolowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)）。ポリヌクレオチド合成の総説に関しては、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984)、およびClimie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990)を参照のこと。
【０１０９】
IV．FcγRIA遺伝子変異体の作製
本発明は、本明細書に開示されたFcγRIAポリペプチドをコードする、DNAおよびRNA分子を含む種々の核酸分子を提供する。当業者は、遺伝暗号の縮重性の観点から、これらのポリヌクレオチド分子間にはかなりの配列変化が可能であることを容易に認識すると考えられる。さらに、本発明はまた、SEQ ID NO：2の残基16〜282または16〜292のポリペプチドと実質的に相同である少なくとも1つのFcγRIAポリペプチドサブユニットを含む、単離された可溶性の単量体性およびホモ二量体性ポリペプチドも提供する。したがって、本発明は、SEQ ID NO：1の縮重ヌクレオチドを含むFcγRIAポリペプチドをコードする核酸分子、およびそれらのRNA同等物を想定している。
【０１１０】
表1は、縮重性のヌクレオチド位置を表す1文字コードを示している。「解」は、コード文字により表されるヌクレオチドである。「相補物」は、相補的ヌクレオチドのコードを指し示している。例えば、コードYはCまたはTを表し、その相補物RはAまたはGを表し、AはTに対して相補的であり、GはCに対して相補的である。
【０１１１】
【表１】
2010516769.tif 000003
【０１１２】
所与のアミノ酸について可能なすべてのコドンを範囲に含む縮重コドンを表2に記載する。
【０１１３】
【表２】
2010516769.tif 000004
【０１１４】
当業者は、アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代表する縮重コドンの決定において、多少のあいまいさが導入されることを理解すると考えられる。例えば、セリンの縮重コドン（WSN）は、場合によってはアルギニン（AGR）をコードすることができ、アルギニンの縮重コドン（MGN）は、場合によってはセリン（AGY）をコードすることができる。フェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドン間にも同様の関係が存在する。このように、縮重配列による範囲に含まれるいくつかのポリヌクレオチドは変異体アミノ酸配列をコードする可能性があるが、当業者は、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を参照することにより、そのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載する通りに機能性に関して容易に試験することができる。
【０１１５】
さまざまな種が「優先的コドン使用法」を示しうる。概論については、Grantham et al., Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980), Haas et al., Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981), Grosjean and Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986)、Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995)、およびMakrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996)を参照されたい。本明細書で用いる場合、「優先的コドン使用法」または「優先的コドン」という用語は、ある特定の種の細胞で最も高い頻度で使用され、そのため各アミノ酸をコードする可能なコドン（表2を参照）の中でも1個または少数の代表物を優先させるタンパク質翻訳コドンを指す専門用語である。例えば、アミノ酸トレオニン（Thr）はACA、ACC、ACGまたはACTによってコードされうるが、哺乳動物細胞では、ACCが最も高い頻度で用いられるコドンである；その他の種、例えば昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌では、異なるThrコドンが優先的でありうる。当技術分野で公知のさまざまな方法により、特定の種における優先的なコドンを、本発明のポリヌクレオチドに導入することができる。例えば、組換えDNAへの優先的コドン配列の導入は、特定の細胞型または種におけるタンパク質の翻訳をより効率的にすることにより、タンパク質の産生を増大させることができる。このため、本明細書に開示された縮重コドン配列は、当技術分野で一般的に用いられ、本明細書に開示されるさまざまな細胞型および種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するためのテンプレートとして役立つ。優先的コドンを含む配列を、さまざまな種において発現に関して試験し、最適化することができ、本明細書に開示した通りに機能性に関して試験することができる。
【０１１６】
FcγRIAをコードするcDNAは、完全もしくは不完全なヒトcDNAを用いた、または開示する配列に基づく1つもしくは複数の縮重プローブセットを用いたプロービングなどのさまざまな方法によって単離することができる。また、cDNAを、本明細書に開示された代表的なヒトFcγRIA配列から設計されたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法によってクローニングすることもできる。さらに、cDNAライブラリーを、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために用いることができ、関心対象のcDNAの発現を、FcγRIAポリペプチドに対する抗体を用いて検出することもできる。
【０１１７】
当業者は、SEQ ID NO：1に開示された配列がヒトFcγRIAの単一の対立遺伝子を表すこと、ならびに対立遺伝子の変異および選択的スプライシングが起こると予想されることを認識していると考えられる。この配列の対立遺伝子変異体は、異なる個体に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを標準的な手順に従ってプロービングすることにより、クローニングすることができる。サイレント突然変異を含む変異体、および突然変異がアミノ酸配列の変化をもたらすものを含む、本明細書に開示されたヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体は本発明の範囲内にあり、本明細書に開示されたアミノ酸配列の対立遺伝子変異体であるタンパク質についても同様である。FcγRIAポリペプチドの特徴を保っている、選択的スプライシングを受けたmRNAから生成されるcDNA分子も本発明の範囲に含まれ、そのようなcDNAおよびmRNAによってコードされたポリペプチドについても同様である。これらの配列の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体は、当技術分野で公知の標準的な手順に従って、異なる個体または組織に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをプロービングすることにより、クローニングすることができる。
【０１１８】
以上に考察した方法を用いて、当業者は、SEQ ID NO：2の残基16〜282または16〜292と実質的に相同な可溶性FcγRIAポリペプチドを含み、かつ野生型FcγRIAのリガンド結合特性を保っているさまざまなポリペプチドを、それらの対立遺伝子変異体、ならびにそのような変異体をコードするポリヌクレオチドを含め、調製することができる。そのようなポリペプチドはまた、本明細書に一般的に開示されるような追加的なポリペプチド部分を含んでもよい。
【０１１９】
本発明のある態様において、単離された核酸分子は、本明細書に開示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。例えば、そのような核酸分子は、SEQ ID NO：1のヌクレオチド配列と、またはSEQ ID NO：1に対して相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子、もしくはそれらの相補物と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【０１２０】
一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの、特定の配列の熱融解点（Tm）よりも約5℃低いように選択される。Tmとは、標的配列の50％が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする（規定のイオン強度およびpH下での）温度である。典型的なストリンジェントな条件は、塩濃度がpH7で少なくとも約0.02Mであって温度が少なくとも約60℃であるものである。前述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチドにはDNAおよびRNAが含まれる。DNAおよびRNAを単離するための方法は当技術分野において周知である。RNAを膵臓または前立腺組織から単離することが一般に好ましいが、cDNAを他の組織からのRNAを用いて調製すること、またはゲノムDNAとして単離することもできる。全RNAは、グアニジンHCl抽出の後にCsCl勾配下での遠心による単離を用いて調製することができる（Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, (1979)）。ポリ(A)+ RNAは、Aviv and Leder Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, (1972)の方法を用いて、全RNAから調製される。相補的DNA（cDNA）は、公知の方法を用いてポリ(A)+ RNAから調製される。続いて、FcγRIAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、例えば、ハイブリダイゼーションまたはPCRによって同定および単離する。
【０１２１】
当業者は、SEQ ID NO：2に開示された配列およびSEQ ID NO：1の対応するヌクレオチドが、ヒトFcγRIA受容体の単一の対立遺伝子を表すことを認識していると考えられる。これらの配列の対立遺伝子変異体は、さまざまな個体からのcDNAまたはゲノムライブラリーを、標準的な手順に従ってプロービングすることによってクローニングすることができる。
【０１２２】
本発明はさらに、他の種に由来する対応物受容体およびポリヌクレオチドも提供する（「種オルソログ」）。特に関心の対象となるのは、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマおよび非ヒト霊長類を含む、他の哺乳動物種に由来するFcγRIAポリペプチドである。ヒトFcγRIA受容体の種オルソログは、本発明によって提供された情報および組成物を従来のクローニング手法と組み合わせて用いて、クローニングすることができる。例えば、cDNAは、受容体を発現する組織または細胞種から入手したmRNAを用いてクローニングすることができる。mRNAの適切な供給源は、本明細書に開示された配列から設計されたプローブによってノーザンブロットをプロービングすることによって同定することができる。続いて、陽性の組織または細胞系のmRNAからライブラリーを調製する。続いて、cDNAをコードする受容体を、ヒトおよび他の霊長類の完全もしくは不完全なcDNAを用いた、または開示された配列に基づく1つもしくは複数の縮重プローブセットを用いたプロービングなどのさまざまな方法によって単離することができる。また、cDNAを、本明細書に開示された配列から設計されたプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法すなわちPCRによってクローニングすることもできる（Mullis, 米国特許第4,683,202号）。ある追加的な方法では、cDNAライブラリーを用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトさせて、関心対象のcDNAの発現を、受容体に対する抗体を用いて検出することもできる。同様の手法を、ゲノムクローンの単離に適用することもできる。
【０１２３】
本発明はまた、SEQ ID NO：2の残基16〜282または16〜292のポリペプチドと実質的に相同な少なくとも1つのFcγRIA受容体サブユニットを含む、単離された可溶性の単量体の、ホモ二量体の、ヘテロ二量体のおよび多量体のFcγRIAポリペプチドも提供する。「単離された」とは、 例えば、血その生来の環境以外の条件で、液および動物組織から隔てられて、見いだされる、タンパク質またはポリペプチドのことを意味する。1つの好ましい形態において、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起原の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形態で、すなわち95％を超える純度、より好ましくは99％を超える純度でポリペプチドを提供することが好ましい。「実質的に相同な」という用語は、本明細書において、SEQ ID NO：2に示された配列と50％、好ましくは60％、より好ましくは少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドを表すために用いられる。そのようなポリペプチドは、SEQ ID NO：3とより好ましくは少なくとも90％同一であり、最も好ましくは95％またはそれ以上同一である。配列一致度（percent sequence identity）は、従来の方法によって決定される（例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603-616,(1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992を参照）。手短に述べると、2つのアミノ酸配列を、ギャップオープンペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ1、および表3（アミノ酸は標準的な一文字コードで表示されている）に示されたHenikoff and Henikoff（同上）の「blossom 62」スコア行列を用いて、アラインメントスコアが最適となるように整列化する。続いて、配列一致度を以下のように算出する。
2010516769.tif 000005
【０１２４】
【表３】
2010516769.tif 000006
【０１２５】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されたような比を用いて、類似の方法によって決定される。
【０１２６】
当業者は、2つのアミノ酸配列を整列化するために、多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列および推定的な変異体ztryp1のアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを調べるための適したタンパク質整列化法である。FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)によって記載されている。
【０１２７】
手短に述べると、FASTAはまず、保存的アミノ酸置換、挿入、および欠失を考慮せずに、クエリー配列（例えば、SEQ ID NO：2の残基16〜282または16〜292）と最高密度の同一性（ktup変数が1である場合）または同一性の対（ktup＝2である場合）のいずれかを有する被験配列によって共有される領域を同定することによって配列類似性を特徴づける。続いて、最高密度の同一性を有する10個の領域を、アミノ酸置換行列を用いてすべてのアミノ酸対の類似性を比較することによって再スコア化し、領域の末端を、最高のスコアに寄与する残基のみを含むように「トリミング」する。「カットオフ」値（配列長およびktup値に基づいて所定の式により計算）よりも高いスコアを有する領域がいくつかある場合には、トリミングした初期領域を調べて、それらの領域を連結させてギャップを伴うおおよそのアラインメントを形成させることができるか否かを判定する。最後に、2つのアミノ酸配列の最もスコアの高い領域を、アミノ酸の挿入および欠失を行わせる、Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム（Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444, 1970；Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787, 1974）の改変法を用いて整列化する。FASTA分析の好ましいパラメーターは：ktup＝1、ギャップオープニングペナルティー＝10、ギャップ伸長ペナルティー＝1、および置換行列＝BLOSUM62である。これらのパラメーターは、スコア行列ファイル（「SMATRIX」）を、Appendix 2 of Pearson, Meth. Enzymol., 前記に説明されているように改変することによって、FASTAプログラム中に導入することができる。
【０１２８】
また、FASTAを用いて、以上に開示した比を用いて核酸分子の配列同一性を決定することもできる。ヌクレオチド配列の比較のためには、ktup値を1〜6、好ましくは3〜6の範囲、最も好ましくは3として、他のFASTAプログラムのパラメータをデフォルトの通りに設定することができる。
【０１２９】
BLOSUM62表（表3）は、500を超える関連タンパク質群の高度に保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局所的多重アラインメントに由来するアミノ酸置換行列である（Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)）。このため、BLOSUM62置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入されうる保存的アミノ酸置換を明確にすることができる。化学的特性のみに基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが（下記に考察するように）、「保存的アミノ酸置換」という用語は、好ましくは、-1よりも大きいBLOSUM62値によって表される置換のことを指す。例えば、アミノ酸置換は、置換が0、1、2、または3というBLOSUM62値によって特徴づけられる場合には保存的である。この体系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1（例えば、1、2、または3）というBLOSUM62値によって特徴づけられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2（例えば、2または3）というBLOSUM62値によって特徴づけられる。
【０１３０】
実質的に相同なタンパク質およびポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を有するものとして特徴づけられる。これらの変化は、軽度のもの、すなわち保存的なアミノ酸置換（表4を参照）、およびタンパク質またはポリペプチドのフォールディングおよび活性に著しい影響を及ぼさないその他の置換；小規模な欠失、典型的には1〜約30アミノ酸の欠失；ならびに、アミノ末端メチオニン残基、約20〜25残基までの短いリンカーペプチド、または精製を容易にする短い伸長部（アフィニティータグ）、例えばポリヒスチジントラクト、プロテインA（Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985；Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988）または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインといった、アミノ末端またはカルボキシル末端の短い伸長部であることが好ましい（概論についてはFord et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991を参照）。アフィニティータグをコードするDNAは、販売供給元（例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）から入手可能である。
【０１３１】
【表４】
2010516769.tif 000007
【０１３２】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発といった、当技術分野で公知の手順に従って同定することができる（Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085, 1989；Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-4502, 1991）。後者の手法においては、分子内のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入し、その結果得られた突然変異体分子を生物活性（例えば、リガンド結合およびシグナル伝達）に関して試験して、分子の活性にとって決定的に重要なアミノ酸残基を同定する。また、リガンド-受容体相互作用の部位を、核磁気共鳴、結晶解析または光親和性標識のような手法によって決定される結晶構造の分析によって決定することもできる（例えば、de Vos et al., Science 255:306-312, 1992；Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992を参照）。必須アミノ酸の実体を、関連した受容体との相同性の分析から推測することもできる。
【０１３３】
Reidhaar-Olson and Sauer Science 241:53-57, 1988またはBowie and Sauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989によって開示されているような、突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を用いて、複数のアミノ酸置換を作製して試験することができる。手短に述べると、これらの著者らは、ポリペプチド中の2つまたはそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択した上で、突然変異が誘発されたポリペプチドの配列を決定して、各位置において許容される置換の範囲を決定するための方法を開示している。用いることができるその他の方法には、ファージディスプレイ、例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837, 1991；Ladner et al., 米国特許第5,223,409号；Huse, WIPO公報第WO 92/06204号）、および領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986；Ner et al., DNA 7:127, 1988）が含まれる。
【０１３４】
本明細書に開示されたような突然変異誘発法を、ハイスループットスクリーニング法と組み合わせて、宿主細胞におけるクローニングされ、突然変異が誘発されたポリペプチドの活性を検出することができる。この点に関して好ましいアッセイには、細胞増殖アッセイおよびバイオセンサーを利用したリガンド結合アッセイが含まれ、これらは下記に記載されている。活性受容体またはその部分（例えば、リガンド結合断片）をコードする、変異誘発されたDNA分子は、最新の装置を用いて、宿主細胞から回収して迅速にシークエンシングすることができる。これらの方法は、関心対象のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の迅速決定を可能にし、構造が未知であるポリペプチドに適用することができる。
【０１３５】
以上に考察した方法を用いて、当業者は、SEQ ID NO：2の残基16〜282もしくは16〜292またはそれらの対立遺伝子変異体と実質的に相同な可溶性FcγRIAポリペプチドを含み、かつ野生型受容体のリガンド結合特性（すなわち、IgG結合特性）を保っているさまざまなポリペプチドを調製することができる。そのようなポリペプチドはまた、FcγRIA受容体の細胞外リガンド結合ドメイン由来の追加的なポリペプチド部分、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの一部または全体を含んでもよい。そのようなポリペプチドはまた、本明細書に一般的に開示されるような追加的なポリペプチドセグメントを含んでもよい。
【０１３６】
V．FcγRIAポリペプチドの作製
本発明のポリペプチドは、従来の手法に従って、遺伝的に操作された宿主細胞において産生させることができる。適した宿主細胞は、外因性DNAによって形質転換またはトランスフェクトさせて培養下で増殖させることのできるような細胞種であり、これには細菌、真菌細胞および培養された高等真核細胞が含まれる。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローニングされたDNA分子を操作するため、および外因性DNAを種々の宿主細胞に導入するための手法は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)、およびAusubel et al., 同書によって開示されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３７】
一般に、可溶性FcγRIAポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクターの内部で、一般に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その発現のために必要な他の遺伝子エレメントと機能的に連結される。このベクターはまた、1つまたは複数の選択マーカーおよび1つまたは複数の複製起点も通常は含むと考えられるが、当業者は、ある種の系においては選択マーカーを別々のベクター上に供与してもよく、外因性DNAの複製を宿主細胞ゲノム中への組み込みによって提供することもできることを認識していると考えられる。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよび他のエレメントの選択は、当技術分野における通常の技能のレベルの範囲内にある、慣行的な設計上の事項である。多くのそのようなエレメントは文献に記載されており、販売供給元を通じて入手することができる。可溶性受容体複合体の複数の構成要素を個々の発現ベクターにて同時トランスフェクトさせることもでき、または単一の発現ベクター中に含めることもできる。タンパク質複合体の複数の構成要素を発現させるそのような手法は、当技術分野において周知である。
【０１３８】
可溶性FcγRIAポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中に向かわせるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）が発現ベクター中に供与される。分泌シグナル配列は受容体のものであってもよく、または別の分泌タンパク質（例えば、t-PA）に由来してもよく、または新規に合成してもよい。分泌シグナル配列は、正しいリーディングフレーム内で、可溶性FcγRIAのDNA配列と連結される。分泌シグナル配列は通常、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列の5'側に配置されるが、ある種のシグナル配列は関心対象のDNA配列中の別の箇所に配置することもできる（例えば、Welch et al., 米国特許第5,037,743号；Holland et al., 米国特許第5,143,830号を参照）。
【０１３９】
培養哺乳動物細胞は、本発明における好ましい宿主である。外因性DNAを哺乳動物宿主細胞内に導入するための方法には、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション（Wigler et al., Cell 14:725, 1978；Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981；Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973）、エレクトロポレーション（Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982）、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション（Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel et al. eds., John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987)）、およびリポソームを介したトランスフェクション（Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993；Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993）が含まれ、これらは参照により参照により本明細書に組み入れられる。培養哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、米国特許第4,713,339号；Hagen et al., 米国特許第4,784,950号；Palmiter et al., 米国特許第4,579,821号；およびRingold、米国特許第4,656,134号によって開示されている。適した培養哺乳動物細胞には、COS-1（ATCC No. CRL 1650）、COS7（ATCC No. CRL 1651）、BHK（ATCC No. CRL 1632）、BHK 570（ATCC No. CRL 10314）、293（ATCC No. CRL 1573；Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、CHO-K1；ATCC No. CCL 61）細胞系が含まれる。そのほかの適した細胞系も当技術分野で公知であり、American Type Culture Collection, Rockville, Marylandなどの公的寄託機関から入手可能である。一般的に、SV-40またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターなどの強力な転写プロモーターが好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号を参照されたい。他の適したプロモーターには、メタロチオネイン遺伝子由来のもの（米国特許第4,579,821号および第4,601,978号）ならびにアデノウイルス主要後期プロモーターが含まれる。
【０１４０】
外来性DNAが挿入された培養哺乳動物細胞を選択するためには、薬剤選択が一般に用いられる。そのような細胞は通常、「形質転換体」と呼ばれる。選択剤の存在下で培養された細胞であって、関心対象の遺伝子をその子孫に受け渡すことができる細胞は「安定的な形質転換体」と呼ばれる。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、G-418などのようなネオマイシン系薬剤の存在下で行われる。選択系を利用して関心対象の遺伝子の発現レベルを高めることもでき、このプロセスは「増幅」と呼ばれる。増幅は、低レベルの選択剤の存在下で形質転換体を培養し、続いて、導入された遺伝子の産物を高レベルで産生する細胞を選択するために選択剤の量を増やすことによって行われる。好ましい増幅可能な選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。その他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を用いることもできる。
【０１４１】
植物細胞、昆虫細胞および鳥類細胞を含む、その他の高等真核細胞を宿主として用いることもできる。昆虫細胞の形質転換およびそこにおける外来性ポリペプチドの産生は、Guarino et al., 米国特許第5,162,222；Bang et al., 米国特許第4,775,624；およびWIPO公報第WO 94／06463号によって開示されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。植物細胞内で遺伝子を発現させるためのベクターとしてのアグロバクテリウム-リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987によって総説がなされている。
【０１４２】
酵母細胞、特にサッカロミセス属（Saccharomyces）の細胞を含む真菌細胞を、例えば、受容体断片またはポリペプチド融合物を産生させるために、本発明において用いることもできる。酵母細胞を外因性DNAによって形質転換し、それから組換えポリペプチドを産生させるための方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kawasaki et al., 米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welch et al., 米国特許第5,037,743号；およびMurray et al., 米国特許第4,845,075号によって開示されている。形質転換細胞は、選択マーカーによって決定される表現型、一般的には薬剤耐性または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下で増殖する能力によって選択される。酵母における使用のために好ましいベクター系は、Kawasaki et al.（米国特許第4,931,373号）によって開示されているPOT1ベクター系であり、これはグルコース含有培地中での増殖によって形質転換細胞を選択することを可能にする。酵母における使用のために適したさらなるプロモーターおよびターミネーターには、解糖系酵素遺伝子（例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kingsman et al.、米国特許第4,615,974号、およびBitter、米国特許第4,977,092号を参照）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のものが含まれる（米国特許第4,990,446号、第5,063,154号、第5,139,936号および第4,661,454号も参照のこと）。ハンゼヌラ-ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス-ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス-ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス-フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、トウモロコシ黒穂病菌（Ustilago maydis）、ピキア-パストリス（Pichia pastoris）、ピキア-メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア-ギリエルモンジイ（Pichia guillermondii）およびカンジダ-マルトーサ（Candida maltosa）を含む他の酵母の形質転換系も、当技術分野において公知である（例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986；Cregg, 米国特許第4,882,279号を参照）。アスペルギルス属（Aspergillus）の細胞を、McKnight et al.、米国特許第4,935,349号の方法に従って利用することができる。アクレモニウム-クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換させるための方法は、Sumino et al.、米国特許第5,162,228号によって開示されている。ニューロスポラ属（Neurospora）を形質転換させるための方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号によって開示されている。
【０１４３】
形質転換またはトランスフェクションを受けた宿主細胞は、選ばれた宿主細胞の増殖のために必要な栄養素および他の成分を含む培養培地中で、従来の方法に従って培養される。規定培地および複合培地を含む、さまざまな適した培地が当技術分野で公知であり、これらは一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地は、必要に応じて増殖因子または血清などの成分を含んでもよい。増殖培地は一般に、外因的に添加されたDNAを含む細胞を、例えば、発現ベクター上に保有されるか宿主細胞内に同時トランスフェクトされた選択マーカーによって補完される薬剤選択または必須栄養素の欠乏によって、選別すると考えられる。
【０１４４】
本発明の1つの局面において、本発明のFcγRIAポリペプチドは培養細胞によって産生され、その細胞はIgGのアンタゴニストをスクリーニングするために用いられる。このアプローチを要約すると、FcγRIA受容体をコードするcDNAまたは遺伝子を、その発現のために必要な他の遺伝子エレメント（例えば、転写プロモーター）と組み合わせ、その結果得られた発現ベクターを宿主細胞に挿入する。そのDNAを発現して機能的受容体を産生する細胞を選択し、さまざまなスクリーニング系で用いる。
【０１４５】
本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドを含む、FcγRIA受容体を発現させるのに用いるために適した哺乳動物細胞には、このタイプの好ましい細胞系が含まれ、これにはGM-CSF依存性ヒト白血病細胞系であるヒトTF-1細胞系（ATCC number CRL-2003）およびAML-193細胞系（ATCC number CRL9589）、ならびにIL-3依存性マウスプレB細胞系であるBaF3（Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1985)）がある。他の細胞系には、BHK、COS-1およびCHO細胞が含まれる。
【０１４６】
必要な受容体サブユニット、または所望の細胞応答のために必要な他の細胞構成要素を産生させるために、適した宿主細胞を操作することができる。このアプローチは、任意の種に由来する受容体サブユニットを発現するように細胞系を操作することができ、それにより、種特異性に起因する潜在的な限界を克服することができるために有利である。ヒト受容体cDNAの種オルソログをクローニングして、同じ種に由来する細胞系において、例えば、マウスcDNAをBaF3細胞系において、用いることができる。GM-CSFまたはIL-3などの1つの造血系増殖因子に依存する細胞系。
【０１４７】
機能的受容体を発現する細胞はスクリーニングアッセイに用いられる。さまざまな適したアッセイが当技術分野で公知である。これらのアッセイは、標的細胞における生物学的応答の検出に基づく。そのようなアッセイの1つは細胞増殖アッセイである。細胞を被験化合物の存在下または非存在下で培養し、細胞増殖を、例えば、トリチウム標識チミジンの取り込みを測定するか、または3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）の代謝分解に基づく比色定量アッセイによって検出する（Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983）。代替的なアッセイ形式では、レポーター遺伝子を発現させるようにさらに操作した細胞を用いる。このレポーター遺伝子は、受容体と結び付いた経路に応答するプロモーターエレメントと連結されており、このアッセイはレポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。これに関して好ましいプロモーターエレメントは、血清応答エレメント、すなわちSREである（例えば、Shaw et al., Cell 56:563-572, 1989を参照）。好ましいそのようなレポーター遺伝子の1つは、ルシフェラーゼ遺伝子である（Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725, 1987を参照）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当技術分野で公知の方法を用いて、発光により検出される（例えば、Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:29094-29101, 1994；Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993を参照）。ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えば、Promega Corp., Madison, WIから販売されている。このタイプの標的細胞系は、化学物質ライブラリー、細胞馴化培地、真菌培養液、土壌試料および水試料などをスクリーニングするために用いることができる。例えば、リガンドを産生する細胞を同定するために、細胞馴化培地試料のバンクを標的細胞に関して試験することができる。続いて、陽性細胞を用いて哺乳動物発現ベクター中にcDNAライブラリーを作製し、これをプールに分けて、宿主細胞にトランスフェクトし、発現させる。続いて、トランスフェクト細胞から得られた培地試料を試験し、その後にプールに分けて、再びトランスフェクトし、継代培養を行い、陽性細胞を再び試験して、そのリガンドをコードするクローニングされたcDNAを単離する。
【０１４８】
本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、細胞外ドメイン、例えば、SEQ ID NO：2の残基16〜282もしくは16〜292または非ヒト受容体の対応領域をコードする末端切断型DNAを発現させることによって調製することができる。細胞外ドメインポリペプチドは、膜貫通ポリペプチドセグメントおよび細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に含まない形態で調製されるのが好ましい。宿主細胞からの受容体ドメインの搬出を導くために、受容体DNAは、FcγRIAの本来のシグナル配列などの分泌ペプチドをコードする第2のDNAセグメントと連結される（下記の実施例に記載）。用いうると考えられる他のシグナル配列には、otPAプレプロ分泌、CD33シグナル配列またはヒト成長ホルモンシグナル配列が含まれる。分泌された受容体ドメインの精製を容易にするために、ポリ-ヒスチジンタグ、サブスタンスP、Flag（商標）ペプチド（Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210, 1988；Eastman Kodak Co., New Haven, CTから入手可能）、またはそれに対する抗体もしくは他の特異的結合剤が利用可能である別のポリペプチドもしくはタンパク質といったC末端伸長部を、受容体ポリペプチドに融合させることができる。
【０１４９】
VI．FcγRIA融合タンパク質およびコンジュゲートの作製
1つの代替的なアプローチでは、可溶性FcγRIAポリペプチド（すなわち、FcγRIA受容体の細胞外ドメイン）を、免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的には、2つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域は含むが可変領域は含まないFc断片との融合物として発現させることができる（Sledziewski, AZ et al., 米国特許第6,018,026号および第5,750,375号を参照）。本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドには、そのような融合物が含まれる。そのような融合物は、典型的には、Fc部分が互いにジスルフィド結合していて、かつ2つのポリペプチドが互いに近接して配列されている多量体分子として分泌される。この種の融合物は、インビトロのアッセイツールとして、リガンドを特異的に飽和除去する（titrate out）ことによってインビトロでのシグナルを阻止するため、およびそれらを非経口で投与することで流血中リガンドと結合させてそれらを循環から除去することによるインビボでのアンタゴニストとして、溶液からコグネイトリガンドをアフィニティー精製するために用いることができる。流血中分子はリガンドと結合し、通常の生理的過程によって循環から除去される。アッセイに用いる場合、キメラ体はFc領域を介して支持体に結合され、ELISA形式で用いられる。
【０１５０】
本発明はさらに、1つまたは複数のポリペプチド融合物を含む、さまざまな他のポリペプチド融合物および関連タンパク質も提供する。例えば、可溶性FcγRIAポリペプチドを、米国特許第5,155,027号および第5,567,584号に開示されているように二量体形成タンパク質との融合物として調製することができる。これに関連して、好ましい二量体形成タンパク質には、免疫グロブリン定常領域ドメイン、例えば、IgGγ1、およびヒトκ軽鎖が含まれる。免疫グロブリン-可溶性FcγRIA融合物を遺伝的に操作された細胞で発現させ、種々のそのような受容体類似体を産生させることができる。可溶性FcγRIA受容体には、それらを特定の細胞、組織または高分子（例えば、コラーゲン、または他のFc受容体を発現する細胞）を標的とするために、補助的ドメインを融合させることができる。すなわち、本発明の可溶性FcγRIA受容体ポリペプチドは、精製のためのアフィニティータグおよびターゲティングドメインといった2つまたはそれ以上の部分と融合させることができる。また、ポリペプチド融合物は、特にドメイン間に、1つまたは複数の切断部位を含むこともできる。Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996を参照。
【０１５１】
本発明はまた、FcγRIAポリペプチドがポリマーと連結された、化学修飾されたFcγRIA組成物も想定している。例示的なFcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292からなるポリペプチドのように、機能的膜貫通ドメインを欠く可溶性ポリペプチドである。典型的には、このポリマーは水溶性であるため、FcγRIAコンジュゲートは生理的環境などの水性環境内で沈殿しない。適したポリマーの一例は、アシル化のための活性エステル、またはアルキル化のためのアルデヒドのような単一の反応性基を有するように修飾されたものである。このようにして、重合度を制御することができる。反応性アルデヒドの一例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノ-(C1-C10)アルコキシ、もしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、Harris, et al., 米国特許第5,252,714号を参照）。ポリマーは分枝状であっても非分枝状であってもよい。さらに、ポリマーの混合物を用いてFcγRIAコンジュゲートを作製することもできる。
【０１５２】
治療法のために用いられるFcγRIAコンジュゲートは、薬学的に許容される水溶性ポリマー部分を含みうる。適した水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール（PEG）、モノメトキシ-PEG、モノ-(C1-C10)アルコキシ-PEG、アリールオキシ-PEG、ポリ-(N-ビニルピロリドン)PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、または他の含水炭素系ポリマーが含まれる。適したPEGは、約600〜約60,000の分子量を有し、これには例えば5,000、12,000、20,000および25,000が含まれる。FcγRIAコンジュゲートはまた、そのような水溶性ポリマーの混合物を含んでもよい。
【０１５３】
FcγRIAコンジュゲートの一例は、FcγRIA部分、およびFcγRIA部分のN末端に結び付けられたポリアルキルオキシドを含む。PEGは、1つの適したポリアルキルオキシドである。1つの例示として、FcγRIAをPEGで修飾することができ、これは「ペグ化」として知られる過程である。FcγRIAのペグ化は、当技術分野で公知のペグ化反応の任意のものによって行うことができる（例えば、EP 0 154 316号、Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994)、およびFrancis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)を参照）。例えば、ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。1つの代替的なアプローチでは、FcγRIAコンジュゲートは、PEGの末端ヒドロキシ基またはアミノ基が活性化リンカーに置換されている活性化PEGを縮合させることによって形成される（例えば、Karasiewicz et al., 米国特許第5,382,657号を参照）。
【０１５４】
アシル化によるペグ化は典型的には、PEGの活性エステル誘導体をFcγRIAポリペプチドと反応させることを必要とする。活性化PEGエステルの一例には、N-ヒドロキシスクシンイミドへとエステル化されたPEGが含まれる。本明細書で用いる場合、「アシル化」という用語は、FcγRIAと水溶性ポリマーの間の以下のタイプの結合を含む：アミド、カルバメート、ウレタンなど。アシル化によってペグ化FcγRIAを調製するための方法は、典型的には、（a）FcγRIAポリペプチドをPEG（PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステルなど）と、1つまたは複数のPEG基がFcγRIAに結び付けられる条件下で反応させる段階、および（b）反応産物を得る段階、を含む。一般に、アシル化反応のために最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定されると考えられる。例えば、PEG：FcγRIAの比率が大きくなるほど、ポリペグ化FcγRIA産物のパーセンテージが大きくなる。
【０１５５】
アシル化によるペグ化の産物は、典型的には、リジンε-アミノ基がアシル連結基を介してペグ化されているポリペグ化FcγRIA産物である。連結結合の一例はアミドである。典型的には、結果的に得られるFcγRIAは、少なくとも95％がモノ-、ジ-、またはトリ-ペグ化されるが、反応条件によってはより高度のペグ化を有するいくつかの種が形成されることもある。ペグ化された種は、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの標準的な精製法を用いて、コンジュゲートになっていないFcγRIAポリペプチドから分離することができる。
【０１５６】
アルキル化によるペグ化は一般に、還元剤の存在下で、PEGの末端アルデヒド誘導体とFcγRIAを反応させることを含む。PEG基は-CH2-NH基を介してポリペプチドと結び付けることができる。
【０１５７】
モノペグ化産物を生成させるための還元的アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に利用可能な異なる種類の第一級アミノ基の反応性の違いを利用する。典型的には、この反応は、リジン残基のε-アミノ基とタンパク質のN末端残基のα-アミノ基との間のpKaの違いを利用することができるpHで行われる。そのような選択的誘導体化により、アルデヒドなどの反応性基を含む水溶性ポリマーの、タンパク質との結合が制御される。ポリマーとの結合は、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性基を有意に改変せずに、タンパク質のN末端で優先的に起こる。本発明は、FcγRIAモノポリマーコンジュゲートの実質的に均質な調製物を提供する。
【０１５８】
モノポリマーFcγRIAコンジュゲート分子の実質的に均質な集団を生成するための還元的アルキル化は、（a）FcγRIAポリペプチドを反応性PEGと、FcγRIAのアミノ末端でのα-アミノ基の選択的修飾を行わせるのに適したpHの還元的アルキル化条件下で反応させる段階、および（b）反応産物を得る段階、を含みうる。還元的アルキル化に用いられる還元剤は、水溶液中で安定であり、かつ還元的アルキル化の初期段階で形成されるシッフ塩基のみを還元できなければならない。例示的な還元剤には、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボランおよびピリジンボランが含まれる。
【０１５９】
モノポリマーFcγRIAコンジュゲートの実質的に均質な集団に関して、還元的アルキル化反応条件は、水溶性ポリマー部分とFcγRIAのN末端との選択的結合を可能にするものである。そのような反応条件は一般に、リジンアミノ基とN末端α-アミノ基の間にpKaの違いをもたらす。このpHはまた、用いるべきポリマーとタンパク質との比にも影響を及ぼす。一般に、pHが低ければ、タンパク質に対して大過剰のポリマーが望まれるが、これは、N末端α基の反応性が小さいほど最適条件を達成するためにより多くのポリマーが必要とされるからである。pHが高ければ、より多くの反応性基が利用できるので、ポリマー：FcγRIAはそれほど大きい必要はない。典型的には、pHは3〜9、または3〜6の範囲にある。この方法は、FcγRIAを含むホモ二量体性、ヘテロ二量体性または多量体性の可溶性受容体コンジュゲートを作製するために用いることができる。
【０１６０】
考慮すべきもう1つの要因は水溶性ポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、タンパク質に結び付けられるポリマー分子の数は少なくなる。ペグ化反応の場合、典型的な分子量は約2kDa〜約100kDa、約5kDa〜約50kDa、または約12kDa〜約25kDaである。水溶性ポリマーとFcγRIAとのモル比は一般に、1：1〜100：1の範囲であると考えられる。典型的には、水溶性ポリマーとFcγRIAとのモル比は、ポリペグ化については1：1〜20：1であり、モノペグ化については1：1〜5：1であると考えられる。
【０１６１】
ポリペプチドおよび水溶性ポリマー部分を含むコンジュゲートを作製するための一般的な方法は当技術分野で公知である。例えば、Karasiewicz et al., 米国特許第5,382,657号, Greenwald et al., 米国特許第5,738,846号, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)を参照）。この方法を、FcγRIAを含むホモ二量体性、ヘテロ二量体性または多量体性の可溶性受容体コンジュゲートを作製するために用いることができる。
【０１６２】
本発明は、本明細書に記載された可溶性受容体または抗体のようなペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を想定している。そのような組成物は担体をさらに含んでよい。担体は従来の有機担体または無機担体であってよい。担体の例には、水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが含まれる。
【０１６３】
VII．FcγRIAポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、混入性の高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して、少なくとも約80％の純度まで、少なくとも約90％の純度まで、少なくとも約95％の純度まで、または95％を上回る、例えば96％、97％、98％もしくは99％を超える純度まで、かつ、感染性物質および発熱性物質を含まないように、精製することができる。本発明のポリペプチドはまた、純度が99.9％を上回る、薬学的に純粋な状態まで精製することもできる。ある種の調製物において、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０１６４】
分画法および／または従来の精製方法を用いて、天然供給源（例えば、ヒト組織供給源）から精製されたFcγRIA、合成FcγRIAポリペプチド、ならびに組換え宿主細胞から精製された組換えFcγRIAポリペプチドおよび融合FcγRIAポリペプチドの調製物を得ることができる。一般に、硫酸アンモニウム沈降法および酸抽出またはカオトロープ抽出を、試料の分画のために用いることができる。例示的な精製段階には、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、FPLCクロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーが含まれうる。適したクロマトグラフィー媒体には、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミドおよび特殊シリカなどが含まれる。PEI誘導体、DEAE誘導体、QAE誘導体およびQ誘導体が適する。例示的なクロマトグラフィー媒体には、フェニル基、ブチル基、またはオクチル基で誘導体化された媒体、例えば、Phenyl- Sepharose FF（Pharmacia）、Toyopearl butyl 650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）およびOctyl-Sepharose（Pharmacia）など；またはAmberchrom CG 71（Toso Haas）などのようなポリアクリル樹脂が含まれる。適した固体支持体には、ガラスビーズ、シリカベースの樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂、および用いられる条件下で不溶性である同様のものが含まれる。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および／または糖質部分によってタンパク質との結合を可能にする反応性基で修飾することができる。
【０１６５】
カップリング化学反応の例には、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびに、カルボジイミドカップリング化学反応のためのカルボキシル誘導体およびアミノ誘導体が含まれる。これらの媒体および他の固体媒体は当技術分野において周知であって広く用いられており、かつ販売供給元から入手可能である。ポリペプチドの単離および精製のための特定の方法の選択は、慣行的な設計上の事項であり、選ばれた支持体の特性によってある程度決定される。例えば、Affinity Chromatography. Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988)、およびDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)を参照。
【０１６６】
FcγRIAの単離および精製におけるさらなる変形例を、当業者は考案することができる。例えば、抗FcγRIA抗体を用いて、イムノアフィニティー精製によって大量のタンパク質を単離することができる。
【０１６７】
また、本発明のポリペプチドを、特定の特性の活用によって単離することもできる。例えば、固定化金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーを用いて、ポリヒスチジンタグを含むものを含めた、ヒスチジンリッチなタンパク質を精製することができる。手短に述べると、ゲルにまず二価金属イオンを投入してキレートを形成させる（Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)）。ヒスチジンリッチなタンパク質は、用いられる金属イオンに応じて種々の親和性でこのマトリックスに吸着されると考えられ、競合的溶出、pHを低下させること、または強力なキレート剤の使用によって溶出されると考えられる。他の精製方法には、レクチンアフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製が含まれる（M. Deutscher (ed.), Meth. Enzymol. 182:529, 1990）。本発明のさらなる態様においては、精製を容易にするために、関心対象のポリペプチドおよびアフィニティータグ（例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合物を構築することができる。
【０１６８】
FcγRIAポリペプチドまたはそれらの断片を、上記のように、化学合成を通じて調製することもできる。FcγRIAポリペプチドは、単量体でも多量体でもよく；グリコシル化性でも非グリコシル化性でもよく；PEG化性でも非PEG化性でもよく；最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも含まなくてもよい。
【０１６９】
本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドのようなリガンド結合性受容体断片を用いる1つの好ましいアッセイ系は、市販のバイオセンサー装置（BIAcore（商標）、Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）を用い、ここで受容体断片は受容体チップの表面に固定化される。この装置の使用は、Karlsson（J. Immunol. Methods 145:229-240, 1991）およびCunningham and Wells（J. Mol. Biol. 234:554-563, 1993）によって開示されている。受容体断片は、アミンまたはスルフヒドリル化学反応を用いて、フローセル内の金薄膜と結び付けられたデキストラン繊維と共有結合される。被験試料をこのセルに通す。試料中にリガンド（すなわち、IgG）が存在するならば、それは固定化された受容体ポリペプチドと結合して、媒体の屈折率の変化を引き起こし、それが金薄膜の表面プラズモン共鳴の変化として検出される。この系は、結合親和性を算出する元になるオン速度およびオフ速度の決定、ならびに結合の化学量論的評価を可能にする。
【０１７０】
また、可溶性FcγRIAポリペプチドを、当技術分野で公知の他のアッセイ系において用いることもできる。そのような系には、結合親和性の決定のためのスキャッチャード分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949を参照）、および熱量定量アッセイ（Cunningham et al., Science 253:545-548, 1991；Cunningham et al., Science 254:821-825, 1991）が含まれる。また、可溶性FcγRIAポリペプチドを抗原-抗体免疫複合体の沈降を阻止するために用いることもでき、細胞培養物中のマスト細胞からのサイトカイン分泌を阻止するために用いることもできる。
【０１７１】
さらに、可溶性FcγRIAポリペプチドを、リガンドまたはリガンドシグナル伝達の存在が望まれない治療的または他の用途において、インビボまたはインビトロでリガンド（すなわち、IgGまたは免疫複合体）と結合させるための「リガンドシンク」、すなわちアンタゴニストとして用いることもできる。例えば、自己免疫疾患において、可溶性FcγRIAポリペプチドはインビボでのIgGの直接的アンタゴニストとして用いることができ、疾患（および炎症）の進行およびそれに伴う症状を軽減する助けになる可能性があり、進行および症状の軽減ならびに再発の予防という点で治療法の効果を強化するために他の治療法（例えば、他の抗炎症薬）とともに用いることができる。
【０１７２】
FcγRIAポリペプチド（特に本発明の可溶性FcγRIAポリペプチド）に対する抗体は、FcγRIA受容体を発現する細胞に対するタグ付加のため；アフィニティー精製によって可溶性FcγRIAポリペプチドを単離するため；可溶性FcγRIAポリペプチドの流血中レベルを決定するための診断アッセイのため；基礎をなす病状または疾患のマーカーとしてFcγRIA受容体を検出または定量するため；FACSを用いる分析法において；発現ライブラリーをスクリーニングするため；抗イディオタイプ抗体を作製するため；ならびにインビトロおよびインビボでのFc受容体に対するIgG結合を阻止するための中和抗体またはアンタゴニストとして、用いることができる。
【０１７３】
また、抗原内部に含まれるエピトープ、ペプチド、またはポリペプチドと結合する抗体を調製するために、可溶性FcγRIAポリペプチドを用いることもできる。FcγRIAポリペプチドまたはその断片は、動物に接種して免疫応答を誘発させるための抗原（免疫原）として役立つ。当業者は、抗原または免疫原性エピトープが、ポリペプチドに応じて約10アミノ酸から最長でポリペプチドのほぼ全長またはそれよりも長い、より長いポリペプチド内のアミノ酸の連鎖からなることができることを認識していると考えられる。適した抗原には、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282もしくは16〜292を含む可溶性FcγRIAポリペプチドまたはその断片が含まれる。抗原として用いるのに好ましいペプチドは、疎水性プロットから当業者によって予測されるもののような親水性ペプチドであり、これは例えば、6残基スライディングウィンドウに基づくHopp／Woods親水性プロフィールから、埋もれたG残基、S残基およびT残基ならびに露出されたH残基、Y残基およびW残基は無視した上で、またはDNA*STARプログラムを用いたSEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282もしくは16〜292のJameson-Wolfプロットから決定される。加えて、zcytor11可溶性受容体の保存モチーフ、およびその保存モチーフ間の改変領域も、適切な抗原である。さらに、マウスFcγRIA受容体の対応領域を用いて、マウス受容体に対する抗体を作製することもできる。加えて、この免疫応答によって生じた抗体を、本明細書に記載された通りに単離および精製することもできる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製および単離するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989；およびHurrell, Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982を参照のこと。
【０１７４】
当業者には明らかであろうが、ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスおよびラットなどの種々の温血動物に、可溶性FcγRIAポリペプチドまたはその断片を接種することによって作製することができる。FcγRIAポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）またはフロイント完全もしくは不完全アジュバントなどのアジュバントの使用を通じて強めることができる。免疫処置のために有用なポリペプチドには、FcγRIAポリペプチドまたはその一部分とマルトース結合性タンパク質との融合物のような融合ポリペプチドも含まれる。ポリペプチド免疫原は完全長分子であってもその一部分であってもよい。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合には、そのような部分を、免疫処置のために高分子担体（キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）または破傷風毒素など）と結合または連結させるのが有利なことがある。
【０１７５】
本明細書で用いる場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびに抗原結合性断片、例えばF(ab')2およびFabタンパク質分解断片などを含む。遺伝的に操作されたインタクト抗体または断片、例えばキメラ抗体、Fv断片、一本鎖抗体など、ならびに合成性の抗原結合ペプチドおよびポリペプチドも同じく含まれる。非ヒト抗体は、非ヒトCDRをヒトのフレームワーク領域および定常領域と合体させることによって、または非ヒト可変ドメイン全体を組み入れること（任意で、露出残基の置換によってそれらをヒト様の表面で「覆い隠すこと（cloaking）」、その結果は「ベニヤ（veneered）」抗体である）によってヒト化することができる。場合によっては、適正な結合特性を強化するために、ヒト化抗体がヒト可変領域フレームワークドメイン内に非ヒト残基を保っていてもよい。抗体のヒト化を通じて、生物学的半減期を延長させることができ、ヒトへの投与時の有害な免疫応答の可能性が減る。
【０１７６】
抗体は、（1）それらが閾値レベルの結合活性を示し、かつ（2）それらが関連ポリペプチド分子と有意には交差反応しないならば、特異的に結合するとみなされる。結合の閾値レベルは、本明細書に記載した抗FcγRIA抗体が、FcγRIAポリペプチドと、対照ポリペプチドに対する結合親和性よりも少なくとも10倍大きい親和性で結合する場合に決定される。抗体は、106M-1またはそれ以上、好ましくは107M-1またはそれ以上、より好ましくは108M-1またはそれ以上、最も好ましくは109M-1またはそれ以上の結合親和性（Ka）を示すことが好ましい。抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949）により、当業者によって容易に決定可能である。
【０１７７】
当業者に公知の種々のアッセイを利用して、FcγRIAポリペプチドに特異的と結合する抗体を検出することができる。例示的なアッセイは、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表例には以下が含まれる：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降、固相酵素免疫アッセイ（ELISA）、ドットブロットまたはウエスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。加えて、抗体を、野生型および変異体FcγRIAポリペプチド（本明細書に記載したものなど）に対する結合に関して対比してスクリーニングすることもできる。
【０１７８】
VIII．Fc受容体に対するIgGの結合に拮抗させるための可溶性FcγRIA抗体の用途
本発明のFcγRIAポリペプチドには数多くの用途がある。これらのFcγRIAポリペプチドは、細胞に対するタグ付加のため；アフィニティー精製によって相同体ポリペプチドを単離するために用いることができる；それらは薬剤、毒素、放射性核種などと直接的または間接的に結合させることができる。また、これらのFcγRIAポリペプチドを、発現ライブラリーをスクリーニングして活性を中和するため、例えば、IgGと結合させる、IgGとFc受容体との間の相互作用を阻止する、阻害する、低下させる、それに拮抗する、またはそれを中和するためなどの分析方法に用いることもできる。また、これらのFcγRIAポリペプチドを診断アッセイに用いることもできる。可能性FcγRIAなどの本発明のFcγRIAポリペプチドはまた、インビトロおよびインビボにおいて、IgGの結合（例えば、リガンドに対する）およびシグナル伝達を阻止または阻害する「アンタゴニスト」としても作用しうる。FcγRIAポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292を含む可溶性ポリペプチド）はIgGに対して特異的に作用し、IgGのFcγ受容体との結合を阻害することができ、それ故にIgGおよびFcγ受容体活性を阻害するのに有用である。さらに、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドの拮抗活性および結合活性は、それぞれIgGの存在下での増殖アッセイ、ルシフェラーゼアッセイまたは結合アッセイ、および本明細書に記載した他の生物学的アッセイまたは生化学アッセイにおいて試験することができる。
【０１７９】
本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、IgGと結合して、それ故にIgGと内因性受容体（すなわち、Fcγ受容体）との結合を阻害することによって、免疫応答をモジュレートするために有用である。したがって、本発明は、炎症を有するかまたは免疫性疾患もしくは障害を有する対象を治療するための可溶性FcγRIAポリペプチドを含むFcγRIAポリペプチドの使用法を含む。適した対象には、ヒトなどの哺乳動物が含まれる。本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、このため、インビボでのIgGおよび／または免疫複合体の炎症作用を阻害するために、SLE、クリオグロブリン血症、自己免疫性血小板減少症（ITPおよびTTP）、成人型皮膚筋炎、C型肝炎随伴性クリオグロブリン血症、B型肝炎随伴結節性多発動脈炎、ギラン-バレー症候群、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、抗リン脂質抗体症候群、血管炎、ブドウ膜炎、血清病、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、外因性抗原に関連する疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚病状、エンドトキシン血症、関節炎、喘息、IBD、大腸炎、乾癬性関節炎、関節リウマチまたは他のIgG媒介性もしくは免疫複合体媒介性の炎症性病状に対する治療用途のために；ならびに、インビトロおよびインビボで、IgGと結合する、IgGもしくはFc受容体の機能を阻止する、阻害する、低下させる、もしくは拮抗する、またはIgGおよび／もしくは免疫複合体と結合する、その活性を阻止する、阻害する、低下させる、拮抗する、もしくは中和するためのアンタゴニストとして、用いることができる。
【０１８０】
また、本明細書におけるFcγRIAポリペプチドを、薬剤、毒素、放射性核種などと直接的または間接的に結合させて、これらのコンジュゲートをインビボでの診断または治療の用途のために用いることもできる。例えば、本発明のFcγRIAポリペプチドは、それを必要とする組織または臓器を同定または治療するために用いることができる。より具体的には、可溶性FcγRIAポリペプチドを検出可能な分子または細胞傷害性分子とカップリングさせて、炎症または免疫疾患を来たしている哺乳動物に送達することができる。
【０１８１】
適した検出可能分子は、本明細書におけるFcγRIAポリペプチドに直接的または間接的に結び付けることができる。適した検出可能分子には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害薬、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などが含まれる。適した細胞傷害性分子は、ポリペプチドと直接的または間接的に結び付けることができ、これには細菌または植物の毒素（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリンなど）、ならびに治療用放射性核種、例えばヨウ素-131、レニウム-188またはイットリウム-90などが含まれる（ポリペプチドと直接結び付けるか、間接的に、例えばキレート部分を介して結び付ける）。FcγRIAポリペプチドを、アドリアマイシンなどの細胞傷害薬剤と結合させることもできる。検出可能分子または細胞傷害性分子の間接的結合のためには、検出可能分子または細胞傷害性分子を相補物／抗相補物対のメンバーと結合させることができ、この場合、もう一方のメンバーはFcγRIAポリペプチドと結合される。これらの目的において、ビオチン／ストレプトアビジンは例示的な相補物／抗相補物対である。
【０１８２】
さらに、本明細書に示されているように、可溶性FcγRIAポリペプチドは免疫複合体沈降を完全に阻止した（下記の実施例に詳細に記載されている）。同じく本明細書に示されているように、可溶性FcγRIAポリペプチドは、免疫複合体の結合およびシグナル伝達を阻止した（下記の実施例に詳細に記載されている）。これらの所見は、可溶性FcγRIAが自己免疫疾患および炎症を治療するために用いうる効力の強い治療薬であることを示唆している。すなわち、好ましい態様において、可溶性FcγRIAポリペプチドは、インビボでIgGと結合する、それを阻止する、阻害する、低下させる、それに拮抗する、またはそれを中和する、単量体またはホモ二量体である。もう1つの好ましい態様において、可溶性FcγRIAポリペプチドは、免疫複合体の結合およびシグナル伝達を阻止する単量体またはホモ二量体である。特定の変形例において、FcγRIAポリペプチドは、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292を含む。
【０１８３】
以上に述べた通り、本明細書に記載したFcγRIAポリペプチドは、IgGまたは免疫複合体のアンタゴニストとして、そしてそれ故にIgG媒介性または免疫複合体媒介性のヒト疾患に対する治療薬として、有益な用途を有しうる。したがって、本発明は、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292を含む可溶性ポリペプチドなどの可溶性FcγRIAポリペプチドを含む、そのような新規アンタゴニストおよびそれらの使用法を提供する。
【０１８４】
上記のように、FcγRIAなどのFc受容体は、免疫複合体の捕捉および排除、ならびに抗体依存性細胞細胞傷害（ADCC）およびサイトカイン／炎症メディエーター放出において明らかな機能的役割を有する。このため、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、例えば、癌、感染症および自己免疫疾患において治療用途を有する。例えば、IgG誘発性または免疫複合体誘発性の炎症を治療する、モジュレートする、軽減する、または抑制する方法は、炎症を有する哺乳動物に対して、IgG媒介性または免疫複合体媒介性の炎症を軽減するのに十分な量の可溶性FcγRIAの組成物を投与する段階を含む。本明細書に記載された実験的証拠は、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドが抗炎症作用を有することを示している。
【０１８５】
以上の考察および下記の実施例に示されているように、IgGおよびFc受容体（例えば、FcγRIA）は炎症の病態に関与している。ある局面において、本発明は、IgGまたは免疫複合体と結合する、それを阻止する、阻害する、低下させる、それに拮抗する、またはそれを中和する作用物質を投与することによって、炎症を治療するための方法である。このため、本発明の特定の態様は、例えば、全身性エリテマトーデス（SLE）；ループス（腎炎、非腎性、円板状、脱毛症を含む）；クリオグロブリン血症；混合性結合組織病；自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病（ITP）；血栓性血小板減少性紫斑病（TTP））；シェーグレン症候群；成人型皮膚筋炎；C型肝炎随伴性クリオグロブリン血症；B型肝炎随伴結節性多発動脈炎；ギラン-バレー症候群；グッドパスチャー症候群；慢性炎症性脱髄性多発性神経障害；抗リン脂質抗体症候群；血管炎；ブドウ膜炎；血清病；外因性抗原に関連する疾患；関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎）；乾癬；アトピー性皮膚炎；炎症性皮膚病状；炎症性腸疾患（IBD）（クローン病、潰瘍性大腸炎）に関連する反応；憩室症；喘息；膵炎；I型（若年性発症型）糖尿病（IDDM）；膵癌；膵炎；グレーブス病；慢性自己免疫性蕁麻疹；多発性筋炎／皮膚筋炎；中毒性表皮壊死症；全身性強皮症および硬化症；呼吸窮迫症候群；成人呼吸窮迫症候群（ARDS）；髄膜炎；アレルギー性鼻炎；脳炎；大腸炎；糸球体腎炎；IgG媒介性アレルギー性病状；アテローム硬化症、自己免疫性心筋炎；多発性硬化症；アレルギー性脳脊髄炎；サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症；顆粒球減少症；再生不良性貧血；クームズ陽性貧血；ダイアモンド-ブラックファン貧血；自己免疫溶血性貧血（AIHA）を含む免疫性溶血性貧血；悪性貧血；赤芽球癆（PRCA）；第VIII因子欠損症；血友病A；自己免疫性好中球減少症；汎血球減少症；白血球減少症；白血球漏出を伴う疾患；CNS炎症性障害；多臓器傷害症候群；重症筋無力症；抗糸球体基底膜疾患；ベーチェット病；キャッスルマン症候群；ランバート-イートン筋無力症候群；レイノー症候群；スティーブンス-ジョンソン症候群；骨髄移植拒絶反応；実質臓器移植拒絶反応（高値の反応性抗体価に対する前処置を含む）；移植片対宿主病（GVHD）；類天疱瘡；天疱瘡（尋常性、落葉状をすべて含む）；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター病；全身硬直症候群；免疫複合体腎炎；自己免疫性睾丸炎および卵巣炎を含む、精巣および卵巣の自己免疫疾患；原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群）を含む自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎；リンパ系間質性肺臓炎（HIV）；NSIPと対比した閉塞性細気管支炎（非移植性）、大型血管炎（リウマチ性多発筋痛症および巨細胞（高安）動脈炎を含む）；中型血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎を含む）；強直性脊椎炎；急速進行性糸球体腎炎；原発性胆汁性肝硬変；セリアックスプルー（グルテン腸症）；ALS；冠動脈疾患；またはIgGもしくは免疫複合体の阻害が望まれる他の場合といった、IgG媒介性の炎症および免疫性疾患もしくは病状における、アンタゴニストとしての可溶性FcγRIAポリペプチドの使用法を対象とする。
【０１８６】
喘息、アレルギーおよび他のアトピー性疾患は、免疫応答を阻害するために、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチド（例えば、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基16〜282または16〜292を含む可溶性ポリペプチド）を用いて治療することができる。また、本発明のポリペプチドを、膵臓、腎臓、下垂体および神経細胞の疾患を治療するために用いることもできる。IDDM、NIDDM、膵炎および膵癌には有益な可能性がある。また、本発明のFcγRIAポリペプチドを、可溶性FcγRIAポリペプチドが癌の増殖を阻害し、免疫媒介性死滅を標的とするような癌の治療のために用いることもできる。本発明のFcγRIAポリペプチドはまた、糸球体硬化症、膜性腎症、アミロイドーシス（これは他の組織に加えて腎臓も冒す）、腎動脈硬化症、種々の起原の糸球体腎炎、腎臓の線維増殖性疾患、ならびにSLE、IDDM、II型糖尿病（NIDDM）、腎腫瘍および他の疾患に伴う腎機能障害といった腎症を治療するために用いることもできる。
【０１８７】
本発明のFcγRIAポリペプチドはまた、脳の脈絡叢への免疫複合体の沈着に伴う精神的障害を治療するために用いることもできる。そのような沈着は、例えば、全身性エリテマトーデスなどの疾患の中枢神経系性および末梢神経系性の症状発現の基礎をなす可能性がある。一部の患者では、これらの症状発現は病的状態および死亡の主な原因であり、これには認知機能障害、特に記憶および推論の障害、精神病、頭痛ならびに発作が含まれる。もう1つの例として、脈絡叢内部での免疫複合体の沈着は、本態性混合性クリオグロブリン血症で認められる末梢性ニューロパチーの原因ともなりうる（Harrison's Principles of Internal Medicine (Kasper et al. eds., McGraw-Hill, New York 2005)を参照）。
【０１８８】
本明細書に記載したように、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、Fc受容体に対するIgGまたはIgGを含む免疫複合体の結合のアンタゴニストとして有用である。そのような拮抗効果はIgGの直接的な中和または結合によって達成することができる。拮抗的用途に加えて、本発明の可溶性受容体はIgGまたはIgGを含む免疫複合体と結合して、リガンドを体内の種々の組織、臓器および細胞に輸送するための担体タンパク質として作用することもできる。このため、本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、可溶性受容体-リガンド複合体を組織、特定の免疫細胞または腫瘍といった特定の部位に向かわせる分子、ポリペプチドまたは化学部分と融合またはカップリングさせることができる。例えば、急性感染またはある種の癌では、炎症および局所急性期応答タンパク質の誘導の結果として利益が得られる可能性がある。
【０１８９】
したがって、本発明のFcγRIAポリペプチドは、多岐にわたるIgG媒介性炎症疾患に対して治療的な潜在能力を有する。炎症‐侵入性因子を避けるための生物による防御応答‐は、多くの細胞性および体液性メディエーターを伴うカスケード性イベントである。一方で、炎症応答の抑制は宿主を免疫不全状態のままにする恐れがある；しかし、検査されないままであれば、慢性は、例えば炎症性疾患（例えば、乾癬、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患など）、敗血性ショックおよび多臓器不全を含む、重大な合併症を招く恐れがある。重要なこととして、これらの多様な疾病状態には共通の炎症メディエーターがある。炎症によって特徴づけられる疾患の総体は、ヒトの病的状態および死亡に大きな影響を及ぼす。本明細書に記載した諸試験は、とりわけ、可溶性FcγRIAが免疫複合体の結合およびシグナル伝達を阻止する能力、ならびに可溶性FcγRIAが免疫複合体媒介性疾患を治療する能力を示している。したがって、本発明のFcγRIAポリペプチドは、例えば、本明細書で考察したIgG媒介性および免疫複合体媒介性の疾患のような、非常に多くのヒト疾患および動物疾患に対して治療的な潜在能力を有する。可溶性FcγRIAを用いた治療の適用対象となる例示的な疾患については、下記のセクションVIII（A）およびVIII（B）でさらに説明する。
【０１９０】
A．免疫複合体媒介性疾患
抗原とそのコグネイト抗体との結合は免疫複合体を生じさせ、組織内部でのこれらの免疫複合体の沈着は、種々の自己免疫疾患の基礎をなす発症機序である（Jancar and Crespo, Trends Immunol. 26:48-55, 2005を参照）。これらの疾患には、全身性エリテマトーデス（SLE）、皮膚筋炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群および混合性結合組織病といった結合組織自己免疫疾患；クリオグロブリン血症、結節性多発動脈炎および抗リン脂質症候群といった多様な病因の疾患；ならびに、細菌、ウイルスおよび寄生虫の感染症、有機塵に関連する疾患、ならびに感染症、毒蛇咬傷に対する受動免疫療法および薬物過敏症を含む血清病型疾患を含む、外因性抗原に関連する疾患が含まれる。これらの病状はそれぞれ特異的な抗原-抗体対によって引き起こされ、それらを呈するものの、組織損傷の機序は類似している：流血中免疫複合体が形成され、その後に組織内部でそれらの沈着が起こる（Jancar and Crespo、前記を参照）。抗原-抗体複合体は炎症を誘発することによって組織を損傷させるが、この過程は一部には、細胞表面Fcγ受容体に対する免疫複合体の結合およびそれらが補体を固定する能力によって媒介される。
【０１９１】
正常な状況では、免疫複合体は細網内皮系の食細胞によって排除される。しかし、場合によっては、免疫複合体が組織中に蓄積して沈着し、III型過敏性反応を引き起こすこともある（Jancar and Crespo、前記を参照）。免疫複合体が血液中に形成された場合、抗原侵入部位から離れた部位で沈着が起こる可能性がある。複合体の沈着は通例、血漿の漏出が起こる部位である、血管壁、関節の滑膜内、腎臓の糸球体基底膜、および脳の脈絡叢などで観察される（Jancar and Crespo、前記を参照）。これが、クリオグロブリン血症などの免疫複合体媒介性疾患で観察される関節炎、血管炎および糸球体腎炎の発生率が高い理由である。
【０１９２】
免疫複合体は、組織内部でのそれらの沈着の後に、IgGのFcドメインを介して細胞表面FcγRと結合する。前述したように、FcγRは免疫系の体液性部門と細胞性部門との間の接点として非常に重要な役割を果たす（Cohen-Solal et al., Immunol. Lett. 92:199-205, 2004；Hogarth et al., Curr. Opin. Immunol. 14:798-802, 2002；Nakamura et al., Expert Opin. Ther. Targets 9:169-190, 2005；Nimmerjahn, Springer Semin. Immunopathol. 28:305-319, 2006）。IgGのFc部分によるこれらの細胞表面受容体の連結は、抗原提示、抗体依存性細胞細胞傷害（ADCC）、食作用および炎症メディエーターの放出といった種々の免疫エフェクター機能を誘発することができる。Fcγ受容体の3つの主要クラス‐FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIII‐は、ヒト免疫系細胞の特定の一部重複するサブセット内で発現され、その発現パターンは免疫ホメオスタシスにおけるそれらの多様な役割の説明となる（Nakamura et al., 前記を参照）。単量体IgGに対する高親和性を示すFcγRIを例外として、FcγRの他のサブクラスは低親和性IgG受容体である（Cohen-Solal et al., 前記；Hogarth et al., 前記を参照）。しかし、これらの細胞受容体は、複数のFc：FcγR相互作用を通じて抗原-抗体免疫複合体（IC）と高いアビディティーで結合する。この特性は、FcγRIIおよび／またはFcγRIIIを発現する細胞が、それらの細胞外環境の標本を採取し、飽和量の単量体IgGに抗してICに適切に応答することを可能にすると考えられている（Hogarth et al., 前記を参照）。
【０１９３】
この能力を示す可溶性受容体を同定するためのスクリーニングの取り組みの一部として、各々のヒトFcγRの可溶性細胞外ドメインをCHO細胞に発現させ、それらの馴化培地から均一に精製した。rh-FcγRのそれぞれは、いくつかのインビトロ系で免疫複合体媒介性の炎症イベントを軽減したが、高親和性受容体FcγRIAのみは、マウスでの皮膚逆受身アルツス反応において炎症の一貫した軽減を生じさせた。この結果は、FcγRIAが単量体IgGに対する高親和性受容体として、インビボでは流血中単量体IgGによって飽和状態にあり、それ故にICとの結合には利用されないと予想されたため、予想外のものであった。FcγRIAの全身送達がマウスの関節炎コラーゲン抗体誘発モデルにおける炎症も消失させたという観察所見は、FcγRIAが免疫複合体媒介性疾患を治療するための新規治療法になりうるという可能性を示唆している。
【０１９４】
このように、本発明のFcγRIAポリペプチドは、細胞表面Fcγ受容体に対する免疫複合体の結合を阻止することにより、炎症性サイトカイン分泌を減少させ、好中球などの炎症性細胞種の浸潤を軽減することができる。本明細書に記載した諸試験によって実証されているように、FcγRIAポリペプチドは、抗原抗体免疫複合体の沈降を阻止し、マスト細胞による免疫複合体媒介性サイトカイン分泌を阻害した（下記の実施例15および16を参照）。さらに、マウスにおける諸試験で、FcγRIAポリペプチドは、皮膚逆受身アルツス反応における浮腫および好中球浸潤を軽減し、コラーゲン抗体誘発関節炎モデル、さらにはマウスのコラーゲン誘発性関節炎における足掌炎症も軽減した（下記の実施例15〜17および19を参照）。したがって、FcγRIAポリペプチドは、ヒトまたは他の非ヒト種におけるさまざまな免疫複合体媒介性疾患の治療に用いることができる。
【０１９５】
1．クリオグロブリン血症
クリオグロブリン血症は、37℃未満の温度で可逆的に沈降する1つ（単クローン性クリオグロブリン血症）または複数（混合性クリオグロブリン血症）の免疫グロブリンが血清中に存在することを指す（Meltzer and Franklin, Am. J. Med. 40:828-836, 1996；Dammacco et al., Eur. J. Clin. Invest. 31:628-638, 2001；Sansonno et al., Rheumatology (Oxford) 46:572-578, 2007を参照）。寒冷沈降反応の機序ははっきりしないが、Ig構造の変化、Ig Fcドメインの自己会合、および／またはIgMリウマトイド因子活性がかかわっている可能性がある（Sansonno and Dammacco, Lancet Infect. Dis. 5:227-236, 2005を参照）。クリオグロブリン血症は3つのサブグループに分類される（Dammacco et al., 前記を参照）：I型は単一のモノクローナルIgで構成される；II型はモノクローナルIgMとポリクローナルIgGの混合物で構成される；III型はポリクローナルIgM／IgGの混合物である。クリオグロブリン血症のI型、II型およびIII型はそれぞれ、血清寒冷沈降物を有するすべての人々のおよそ10〜15％、50〜60％および30〜40％を占める（Dammacco et al., 前記；Sansonno et al., 前記を参照）。
【０１９６】
クリオグロブリン血症の患者は、紫斑、筋力低下および関節痛という臨床的三徴候、ならびに糸球体腎炎、血管炎、末梢性ニューロパチー、関節炎、および／または喀血および呼吸困難という肺症状を呈することが最も多い（Dammacco et al., 前記；Sansonno et al., 前記；Ferri et al., Cleve. Clin. J. Med. 69 Suppl 2:SII20-23, 2002 ("Ferri et al. I")；Ferri et al., J. Clin. Pathol. 55:4-13, 2002 ("Ferri et al. II")を参照）。クリオグロブリン血症は、多発性骨髄腫、リンパ増殖性障害、結合組織病、感染症および肝疾患を含む種々の障害と関連して観察されることがある（Ferri et al. I、前記；Ferri et al. II、前記）。C型肝炎ウイルス（HCV）の発見の前、および抗HCV抗体を検出するための方法の開発以前には、特定可能な基礎疾患を有しない患者は、特発性または「本態性」の混合性クリオグロブリン血症を有するとみなされた。現在では、「本態性」混合性クリオグロブリン血症はHCV感染と強い関連があり、II型およびIII型クリオグロブリン血症の患者の大半を範囲に含むことが知られている（Sansonno et al., 前記を参照）。最近の証拠は、C型肝炎感染に対する異常な免疫応答がC型肝炎抗原、ポリクローナルC型肝炎特異的IgGおよびモノクローナルIgMリウマトイド因子からなる免疫複合体の形成を招いた場合に、本態性混合性クリオグロブリン血症が起こることを示唆している。感受性のある組織部位の内部でのこれらの免疫複合体の沈着は、本態性混合性クリオグロブリン血症の臨床的症候群を結果的にもたらす炎症カスケードを誘発する（Dammacco et al., 前記；Sansonno et al., 前記）。
【０１９７】
クリオグロブリン血症はまた、HCV以外の種々の他の感染症とも関連しており（Ferri et al. II、前記を参照）、これにはサイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン-バーウイルス（EBV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）およびB型肝炎ウイルス（HBV）のようなウイルス起原のもの、マイコプラズマ-ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）（梅毒）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、Q熱リケッチア（Coxiella Burnetti Q fever）、ブルセラ菌（Brucella）を含む細菌起原のもの、ならびにトキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）および内臓リーシュマニア（Visceral leishmaniasis）などの寄生虫による感染症が含まれる。
【０１９８】
本態性混合性クリオグロブリン血症は、原発性血管炎障害とみなされる。血管炎のChapel Hill Consensus Conference（CHCC）分類は冒される血管のサイズを基にしており、疾患を大血管、中血管および小血管を冒すものにグループ化する（Jennette et al., Cleve. Clin. J. Med. 69 Suppl 2:SII33-38, 2002；Fiorentino, J. Am. Acad Dermatol. 48:311-340, 2003を参照）。重要なこととして、2つの血管炎症候群が免疫複合体の沈着と関連がある：ヘノッホ-シェーンライン紫斑病はIgAを含む免疫複合体の沈着と関連がある；本態性クリオグロブリン血症血管炎はIgG／IgM免疫複合体の沈着と関連がある（Fiorentino、前記を参照）。
【０１９９】
本態性混合性クリオグロブリン血症におけるHCV感染の発生率は、地域によるが報告症例中の40〜100％の範囲である。世界中でおよそ200億人がHCVに慢性的に感染しており、新たな感染者が毎年350万人報告されている（Sy and Jamal, Int. J. Med. Sci. 3:41-46, 2006を参照)。米国での発生率および罹患率は、毎年の新たな感染者が30,000人であり、390万人が慢性感染である（Sy and Jamal、前記を参照）。慢性HCV感染を有する患者のおよそ50〜60％がその血清中にクリオグロブリンを有し、症例の約5％で顕性クリオグロブリン血症症候群が発症する（Sansonno et al., 前記；Sansonno and Dammacco、前記を参照）。B型肝炎ウイルスは、混合性クリオグロブリン血症の患者の5％における病原体と記載されている（Ferri et al. I、前記を参照）。
【０２００】
クリオグロブリン血症に対する現行の治療法には、中等度疾患に対する低用量ステロイドが含まれ、より重度の型の疾患に対してはステロイド、シクロホスファミドまたはプラズマフェレーシスの組み合わせが用いられる。活動性のHCV媒介性肝炎を有する患者はしばしば、インターフェロン-αおよびリバビリンの併用によって治療される。
【０２０１】
本発明のFcγRIAポリペプチドの有効性は、疾患の動物モデルにおいてインビボで試験することができる。クリオグロブリン血症を含む免疫複合体媒介性疾患に対する可溶性FcγRIAの有効性評価するために特に適した動物モデルは、B細胞促進特性を有するインターロイキン-7（IL-7）様サイトカインである胸腺間質性リンホポエチン（TSLP）を過剰発現するマウスである。TSLPマウスは、IgG-IgM混合組成の流血中クリオグロブリンを大量に産生する（Taneda et al., Am. J. Pathol. 159:2355-2369, 2001を参照）。これらの動物における混合性クリオグロブリン血症の発症には、腎臓、肝臓、肺、脾臓および皮膚が障害される全身性炎症性疾患が随伴し（Taneda et al., 前記を参照）、これはこれらの組織中での免疫複合体沈着に起因する。これらの動物における腎疾患は、HCV感染を有する患者で認められるヒトのクリオグロブリン血症糸球体腎炎と非常に類似している。この疾患過程におけるFcγ受容体の役割は、抑制性受容体Fcγ受容体IIbの欠失後の、病的状態および死亡の増進を伴う腎損傷の増悪によって示されている（Muhlfeld et al., Am. J. Pathol. 163:1127-1136, 2003を参照）。本発明による組換え可溶性FcγRIAによるTSLP-トランスジェニックマウスの処置については、下記の実施例16でさらに述べる。
【０２０２】
2．全身性エリテマトーデス
全身性エリテマトーデス（SLE）は、結果的に広範な組織損傷をもたらす病原性自己抗体の産生およびその後の免疫複合体の沈着を特徴とする、複合的な多臓器（全身性）自己免疫障害である。SLEの病因は不明であるが、複数の遺伝要因、環境要因およびホルモン要因が疾患に役割を果たすと考えられている（Hahn, "SystemicループスErythematosus" in Harrison's Principles of Internal Medicine (Kasper et al. eds., McGraw-Hill, New York 2005）を参照）。SLEは、漸増-漸減的な経過、ならびに皮膚、腎臓および中枢神経系を含む多臓器の障害によって臨床的に特徴づけられる（Lupus: Molecular and Cellular Pathogenesis (Kammer and Tsokos eds., Human Press, N.J., 1st ed. 1999)；Systemic Lupus Erythromatosus (Lahita ed., Academic Press, Amsterdam, 3rd ed. 1999)）。このため、この疾患は、全身性、皮膚性、腎臓性、筋骨格性および血液学的なものを含む、幅広い種々の症状および臨床的特徴を呈する。
【０２０３】
SLEの全体的な罹患率は2000人のうち約1人であり、700人の白人女性のうち約1人が生涯の中でSLEを発症する（Lahita, Curr. Opin. Rheumatol. 11:352-6, 1999）。米国だけでも、50万人を上回る人々がSLEを有しており、その大部分は妊娠可能な年齢の女性である（Hardin, J. Exp. Med. 185:1101-1111, 2003）。
【０２０４】
SLEを診断するための単一の基準は存在しない。American College of RheumatologyはSLEを診断するための11の基準を策定しており、それは皮膚、全身および臨床検査の諸局面におけるSLEの臨床的スペクトルにわたる。これらの基準には、蝶形紅班、円板上紅斑、日光感受性、口腔潰瘍、関節炎、漿膜炎、腎臓および中枢神経系の炎症、血液上の変化、ならびに抗核抗体の存在が含まれる。患者がSLE患者と分類されるためには、これらの基準のうち4つを満たさなければならない（Tan et al., Arthritis Rheumatol. 25:1271-1277, 1982）。SLEは通常、抗核抗体を検出するための血液検査；腎機能を評価するための血液検査および尿検査；SLEにしばしば伴ってみられる低レベルの補体の存在を検出するための補体検査；沈降速度（ESR）、または炎症レベルを測定するためのC反応性タンパク質（CRP）；肺損傷を評価するためのX線検査、および心損傷を評価するためのEKGを非限定的に含む検査によって確定される。
【０２０５】
SLEに対する標準的な治療法は、一般的な免疫応答阻害薬であるステロイド剤グルココルチコイドの投与である。これは症状を緩和するために用いることができる；しかし、SLEに対する治癒方法は現在得られていない。0.5mg／kg／日未満のレベルの低用量経口プレドニゾンが通常は投与される。残念ながら、この治療法は患者を寛解に保たせるには不十分であり、疾患の再燃がしばしば起こる。再燃は、連続3日間にわたる30mgメチルプレドニゾロン／kg／日での静脈内パルスを介した高用量グルココルチコイドによってコントロール可能である。しかし、高用量でのステロイド治療は患者に重大な副作用をもたらす恐れがある。
【０２０６】
これらの標準的治療は一般に非特異的であり、重篤な副作用をしばしば伴い、疾患の進行にも命を脅かす腎性合併症（ループス腎炎またはLN）への移行にも大きな影響を及ぼさない。その結果として、当技術分野ではSLEを治療するための新たな方法を開発することに長年の切実な需要がある。
【０２０７】
3．関節リウマチ
関節リウマチ（RA）は慢性的な関節炎症を特徴とし、これは典型的には組織損傷および関節変形を招く。正確な病因は明確でないが、これは免疫複合体、種々のリンパ系細胞種（T-細胞、B-細胞、好中球、マクロファージ、さまざまな炎症誘発性サイトカイン、例えばTNF-αおよびIL-1βなど）が役割を果たす自己免疫疾患であると一般に考えられている（Harrison's Principles of Internal Medicine (Kasper et al. eds., McGraw-Hill, New York 2005)；Olsen and Stein, N. Engl. J. Med. 350:2167-2179, 2004を参照）。
【０２０８】
関節リウマチは全身を冒す全身疾患であり、関節炎の中で最も頻度の高い型の1つである。RAは免疫媒介性であり、炎症、ならびに重大な能力障害および死亡率の増大を招くその後の組織損傷によって特に特徴づけられる。特にこれは関節の膜内層の炎症を特徴とし、それは疼痛、こわばり、温もり、発赤および腫脹を引き起こす。炎症細胞は骨および軟骨を消化する酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症を来した関節内層、すなわち滑膜が骨および軟骨を侵害および障害させ、関節変質および激しい疼痛をはじめとする生理的影響を招く。冒された関節はその形状および整列性を失い、結果的に疼痛および可動性喪失がもたらされる。
【０２０９】
リウマチ関節では種々のサイトカインが局所的に産生される。数多くの研究が、2つの原型的な炎症誘発性サイトカインであるIL-1およびTNF-αが、滑膜炎症および進行性関節破壊に関与する機序において重要な役割を果たすことを実証している。実際、RAの患者におけるTNF-α阻害薬およびIL-1阻害薬の投与は、炎症の臨床的および生物学的な徴候ならびに骨びらんおよび軟骨破壊の放射線学的徴候の劇的な改善を導いている。しかし、これらの有望な結果にもかかわらず、患者のかなりのパーセンテージはこれらの薬剤に反応せず、このことは、関節炎の病態生理には他のメディエーターも関与することを示唆している（Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2:135-149, 2002）。RAは、関節軟骨の主要な細胞外マトリックス成分であるII型コラーゲンを対象とする抗体の存在を特徴とするため、これらの抗体は、滑膜細胞または関節腔内の他の炎症細胞種とのそれらの相互作用を通じて、上記のような炎症性サイトカインの放出を媒介すると考えられる。
【０２１０】
RAの発生病理において重要な可能性のある免疫学的異常には、関節液細胞および血管炎で認められる免疫複合体も含まれる。これらの複合体の原因になるのは、滑膜組織に浸潤し、炎症誘発性サイトカインを産生することのできる、形質細胞およびTヘルパー細胞によって産生される抗体（RFなど）である。マクロファージおよびそれらのサイトカイン（例えば、TNF、GMCS-F）は、罹患滑膜にも多く存在する。接着分子のレベル増大は、炎症細胞の遊出および滑膜組織中への滞留に寄与する。ある種のリンパ球とともに、マクロファージ由来内層細胞の増加も顕著である。
【０２１１】
RAの確立された治療には、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、メトトレキサート、レフノミド、リツキシマブ、インフリキシマブ、アザチオプリン、D-ペニシラミン、金（経口または筋肉内）、ミノサイクリンおよびシクロスポリン、プレドニゾンなどのコルチコステロイド、ならびに非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDS）といった疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）が含まれる。これらの治療は一般に非特異的であり、重篤な副作用をしばしば伴い、関節破壊の進行に大きな影響を及ぼさない。その結果として、当技術分野ではRAを治療するための新たな方法を開発することに長い間切実に求められている。
【０２１２】
本発明の可溶性FcγRIAポリペプチドは、滑膜内での免疫複合体と炎症性細胞種との相互作用を阻止して、炎症を防止することができると考えられる。このため、本発明のFcγRIAポリペプチドは、関節リウマチおよび他の関節炎疾患における炎症を軽減するための有益な治療薬として役立つ可能性がある。
【０２１３】
当技術分野で公知の関節リウマチの動物モデルはいくつかある。例えば、コラーゲン誘発性関節炎（CIA）モデルでは、マウスがヒト関節リウマチと非常に類似した慢性炎症性関節炎を発症する。CIAはRAと共通した同様の免疫学的および病理学的な特徴を有することから、これは可能性のあるヒト抗炎症性化合物のスクリーニングのための理想モデルとなる。CIAモデルは、発症するために免疫応答および炎症応答の両方に依存する、マウスにおける周知のモデルである。その免疫応答は、抗原として提供されたコラーゲンに対する応答におけるB細胞とCD4+ T細胞の相互作用を含み、抗コラーゲン抗体の産生を招く。炎症相は、これらの抗体のいくつかがマウスのネイティブ性コラーゲンと交差反応して細胞Fc受容体および／または補体カスケードを活性化した帰結としての、炎症メディエーターによる組織応答の結果である。CIAモデルを用いることの利点は、発生病理の基本的機序がわかっていることである。II型コラーゲン上の関係のあるT細胞およびB細胞エピトープが同定されており、免疫媒介性関節炎に関係するさまざまな免疫学的（例えば、遅延型過敏性および抗コラーゲン抗体）および炎症性（例えば、サイトカイン、ケモカインおよびマトリックス分解酵素）パラメーターが明らかにされており、それ故にCIAモデルにおける被験化合物の有効性を評価するために用いることができる（Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999；Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992；Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, 1997；およびWang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995）。
【０２１４】
これらのCIAモデルマウスに対する本発明のFcγRIAポリペプチドの投与を利用して、症状を改善させ、疾患の経過を変化させるための可溶性FcγRIAの使用について評価することができる。一例として、非限定的ではあるが、マウス1匹当たり0.1mg〜2.0mgの、可溶性FcγRIA（例えば、SEQ ID NO：2の残基16〜282または16〜292を含む可溶性ポリペプチド）を含む本発明のFcγRIAポリペプチドの注射（週に1〜7回、非限定的であるが最長で4週間にわたり、皮下、腹腔内または筋肉内の投与経路を介して）は、疾患スコア（足掌スコア、炎症または疾患の発生）を有意に低下させることができる。投与の開始時（例えば、コラーゲン免疫処置の前もしくは処置時、または、疾患がすでに進行している時点を含む、第2のコラーゲン免疫処置後の任意の時点）に応じて、本発明のアンタゴニストは、関節リウマチを予防するのに、ならびにその進行を予防するのに有効となる可能性がある。例えば、本明細書に記載した諸試験によって示されているように、可溶性FcγRIAポリペプチド（SEQ ID NO：2の残基16〜282）の投与は、マウスCIAモデルにおける症状を改善し、疾患の経過を変化させた（下記の実施例19を参照）。
【０２１５】
免疫複合体媒介性リウマチ疾患のもう1つのモデルは、マウスにおける関節炎のコラーゲン抗体誘発モデルである（Terato et al., J, Immunol. 48: 2103-2108, 1992を参照）。このモデルでは、関節疾患は、II型コラーゲンを対象とするChemiconのArthrogen-CIA（登録商標）を含む4種のモノクローナル抗体のカクテルの静脈内注射によって誘発される。マウスにおける関節炎の誘発のために用いられるArthrogen-CIA（登録商標）は、II型コラーゲンのCB11ドメイン内の83アミノ酸ペプチドの内部の個々のエピトープを認識する、4種のクローンの混合物である（Chemicon Internationalの技術パンフレット）。これらのエピトープは、ヒト、マウス、ウシ、ニワトリ、サルおよびラット由来のII型コラーゲンにおいて類似している。これらの抗体はマウスの関節に局在し、そこでそれらは軟骨特異的II型コラーゲンと免疫複合体を形成する。この抗原-抗体免疫複合体は、関節内の炎症性細胞種の表面に局在するFcγ受容体との相互作用を通じて疾患を誘発させると考えられる。典型的には、第0日に、2〜4mgのArthrogen-CIAカクテルを静脈内投薬によってマウスに注射する。それに続き、3日後に50〜100μgのLPSを腹腔内注射する（Terato et al., Autoimmunity 22: 137-147, 1995を参照)。赤く腫脹した足掌として明らかになる関節炎が1〜2日で発症する。1つの典型的な実験では、マウスに対して第0日または第3日に、適した媒体中に溶解させた可溶性FcγRIA（100〜2000μgタンパク質）の注射による処置を行う。可溶性FcγRIAの投薬は、例えば、第0日または第3日から始めて隔日に行うことができる。各動物に関する関節炎スコアは関節腫脹および関節厚みに関して毎日評価しうる。1つの典型的な実験では、可溶性FcγRIAは関節炎スコアを低下させる。
【０２１６】
4．混合性結合組織病
混合性結合組織病は、SLE、全身性硬化症、多発性筋炎または皮膚筋炎とRAの臨床的特徴、およびリボ核タンパク質（RNP）抗原に対する非常に高力価の流血中抗核抗体によって特徴づけられる稀な障害である（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記；Kim and Grossman, Rheum. Dis. Clin. North Am. 31:549-565, 2005；Venables, Lupus 15:132-137, 2006を参照）。現在では抗U1 RNPと呼ばれている高力価のこの抗体は、MCTDを明確な臨床的実体とみなすことを正当化する根拠とされてきた。MCTDを明確な障害とみることに対しては、それをSLEまたは強皮症のサブセットとみなす者によって異議が申し立てられた。また別の者は、MCTDを区分されない結合組織病と分類するのがよいと考えている。手の腫脹、レイノー現象、多発関節痛、炎症性ミオパチー、食道運動性低下および肺機能障害がよくみられる。診断は、臨床的特徴、RNPに対する抗体、および他の自己免疫疾患に特異的な抗体の欠如の組み合わせによる。一部の患者では、この障害は古典的な全身性硬化症またはSLEへと進展する。
【０２１７】
レイノー現象は他の症状発現より何年も先行することがある。往々にして、最初の症状発現は初期のSLE、強皮症、多発性筋炎または皮膚筋炎またはRAに類似している。初発症状が何であれ、限局性疾患は進行して広範化する傾向があり、臨床パターンは時間経過とともに変化する。最も頻度の高い所見は手の腫脹であり、最終的には手指がソーセージ様外観になる。皮膚所見にはループスまたは皮膚筋炎様皮疹が含まれる。びまん性強皮症様の皮膚変化および指先の虚血性壊死または潰瘍形成は、MCTDでははるかに頻度が低い。ほぼすべての患者が多発関節痛を有し、75％が明らかな関節炎を有する。しばしば関節炎は非変形性であるが、RAにおけるものに類似したびらん性変化および変形が存在することもある。圧痛の有無を問わず、近位筋の筋力低下がよくみられる。腎疾患は約10％に起こり、多くの場合は軽症であるが、時には病的状態または死亡の原因となる。三叉神経感覚性ニューロパチーは、他の結合組織病におけるよりもMCTDでより高い頻度で発症する。リウマトイド因子は往々にして陽性であり、力価はしばしば高い。ESRは往々にして高値である。
【０２１８】
MCTDは典型的には、SLE、強皮症、多発性筋炎またはRAを有するように思われる患者に、そのほかの重複する特徴が存在する場合に疑われる。患者はまず、抗核抗体（ANA）ならびに抽出可能な核抗原（ENA）およびRNP抗原に対する抗体に関して検査される。これらの検査の結果がMCTDと矛盾しないならば（例えば、RNP抗体が極めて高値）、その他の診断の可能性を除外するために、γ-グロブリンレベル、血清補体レベル、リウマトイド因子、抗Jo-l（抗ヒスチジルt-RNAシンテターゼ）、ならびにENAのリボヌクレアーゼ抵抗性スミス（Sm）成分および二本鎖DNAに対する抗体を検査すべきである。さらなる精密検査は症状と徴候に応じて：すなわち、筋炎、腎障害または肺障害の症状発現に際しては、それらの臓器の検査（例、CPK、MRI、筋電図、筋炎診断のための筋生検）を行う。
【０２１９】
10年生存率は全体的には80％であるが、予後は顕著な症状発現に大きく依存する。死因には、肺高血圧症、腎不全、心筋梗塞、結腸穿孔、播種感染および脳出血が含まれる。患者によっては治療なしで長年にわたって寛解状態を維持する。
【０２２０】
混合結合組織病（MCTD）は世界中のすべての人種に発生し、発生率が最も高いのは10代および20代であるが、MCTDは小児および高齢者でもみられる。女性が主として罹患する。発生率および罹患率ははっきりとは確立されていない。大部分の研究では、MCTDの臨床的および血清学的な特徴を有する患者の数はSLEよりも4分の1の少なさであり、このことは全体的な罹患率が約10／100,000であることを示唆する（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記；Venables、前記を参照）。
【０２２１】
MCTDに対する現行の治療は、SLEの場合と類似しており、疾患が中等度または重度であればコルチコステロイドが用いられる。中等度または重度の疾患をもつ患者のほとんどは、特に早期に治療すればコルチコステロイドに反応する。軽度の疾患は、サリチル酸塩、その他のNSAID、抗マラリア薬、または時には低用量のコルチコステロイドによってしばしばコントロールされる。主要臓器の重度の障害は、通常、高用量のコルチコステロイドを必要とする。
【０２２２】
5．HBV随伴結節性多発動脈炎
古典的結節性多発動脈炎（PAN）は、1866年にKussmaul and Maierによって最初に記載された、広範囲にわたる症状を特徴とする多系統障害である（Fiorentino, J. Am. Acad. Dermatol. 48:311-340, 2003；Harrison's Principles of Internal Medicine、前記を参照）。PANは小径および中径の筋動脈の壊死性血管炎であり、腎動脈および内臓動脈の特徴的な障害を伴う。病変は分節状であり、動脈の分岐および分枝が障害される傾向がある。疾患の急性段階では、好中球が血管壁の全層および血管周囲領域に浸潤し、結果として内膜増殖および血管壁の変性を引き起こす。病変が進行するにつれて、単核細胞がその領域に浸潤し、結果として、内腔の不全、血栓形成、血管による供給を受ける組織の梗塞、および出血を伴う、血管のフィブリノイド壊死を引き起こす（Fiorentino、前記を参照）。
【０２２３】
全身性血管炎、特にPAN型の患者の10〜30％にB型肝炎抗原血症が存在することを、B型肝炎ウイルス抗原で構成される流血中免疫複合体が単離されることと併せて考えると、この疾患の発生病理における免疫学的役割が示唆される。この考え方は、この疾患をもつ患者の血管壁におけるB型肝炎抗原、IgMおよび補体の沈着の所見によって裏づけられる（Fiorentino、前記を参照）。
【０２２４】
患者は通常、発熱、体重減少、関節痛および疲労感を呈する。筋疲労、腹痛、多発性単神経炎、高血圧、睾丸炎およびうっ血性心不全が、各々の臓器系の血管障害を示す主要な症状である。B型肝炎感染に続発した場合も、臨床所見は同じである。未治療のPANの予後は不良であり、報告されている5年生存率は10〜20％である（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記を参照）。死亡は通常、胃腸合併症、特に腸梗塞および穿孔、ならびに心血管原因に起因する。
【０２２５】
PANの正確な発生率を確定するのは困難である。以前の報告では、PANの発生率を顕微鏡的多発血管炎および関連する血管炎障害と合算していた。しかし、PANの発生率は100万人当たり5〜9例と推定されており（Fiorentino、前記を参照）、症例のほぼ6％がHBV感染に起因すると推定されているが、頻度については10〜54％という範囲の報告がある（26,27）。
【０２２６】
PAN患者は現在、ステロイド単独またはシクロホスファミドとの併用によって治療されている（Fiorentino、前記を参照）。HBVを有する患者に対しては、インターフェロン-α単独またはビダラビンおよびラミブジンとの併用による抗ウイルス治療が、血漿交換と組み合わせた場合に有効である（Fiorentino、前記；Harrison's Principles of Internal Medicine、前記を参照）。
【０２２７】
6．尋常性天疱瘡
尋常性天疱瘡（PV）は、高齢患者で最も多く観察される水疱性皮膚疾患である。この疾患は、皮膚の表皮細胞間の密着の低下およびその結果起こる表皮内水疱を特徴とする。病変部または無傷部の患者の皮膚の直接免疫蛍光分析により、ケラチノサイトの表面上にIgGの沈着が示される。そのような沈着は、Ca2+依存性カドヘリンファミリーの膜貫通性糖タンパク質であるデスモグレインに対する流血中IgG自己抗体に由来する。PVは命を脅かす恐れがある。現在の治療の主力は、プレドニゾンなどの全身性ステロイドである。アザチオプリンまたはミコフェノール酸モフェチルなどの他の免疫抑制薬も用いられる（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記を参照）。
【０２２８】
7．外因性抗原に関連する疾患
外因性抗原は、ウイルス、細菌または寄生虫の感染によって引き起こされるもの、ならびに外来性タンパク質または薬剤に対する曝露によって引き起こされる血清病を含む、多岐にわたる免疫複合体疾患を生じさせる（Jancar and Crespo、前記；Harrison's Principles of Internal Medicine、前記；Knowles and Shear, Dermatol. Clin. 25:245-253, 2007；Wolf et al., Clin. Dermatol. 23:171-181, 2005を参照）。組織免疫複合体沈着に関連する細菌感染症には、以下が含まれる：連鎖球菌症、ブドウ球菌症および髄膜炎菌症；バルトネラ症、ボレリア症、ハンセン病、梅毒およびレプトスピラ症。ウイルス感染症には以下が含まれる：B型肝炎（結節性多発動脈炎）、C型肝炎（クリオグロブリン血症）、HIV関連免疫複合体腎症、ヒトパルボウイルスB19感染症、CMV感染症、感染性単核細胞症およびデング出血熱。寄生虫疾患には以下が含まれる：トリパノソーマ、プラスモジウム、トキソプラズマおよび住血吸虫症。
【０２２９】
現在、最も頻度の高い血清病様反応は非タンパク質薬剤に対する曝露である。血清病様反応と関係づけられている薬剤には、以下が含まれる：アロプリナール（allopurinal）、砒素剤および水銀誘導体、バルビツール系薬剤、ブプロピオン、セファロスポリン、フラゾリドン、金の塩、グリスコフルビン（griseofulvin）、ヒドララジン、インフリキシマブ、ヨウ化物、メチルドーパ、ペニシリン系薬剤、フェニトイン、ピペラジン、プロカインアミド、ストレプトキナーゼおよびスルホンアミド。血清病様反応の他の原因には、異種血清、アレルゲン抽出物、血液製剤、ホルモン、ハチ毒およびワクチンに対する曝露が含まれる。
【０２３０】
B．抗体産生に関連する他の疾患
1．特発性血小板減少性紫斑病（ITP）
特発性血小板減少性紫斑病（ITP）は、血小板破壊（血小板減少症を招く）を結果的にもたらす、特定の血小板膜糖タンパク質を対象とする自己抗体（IgG＞IgM）の存在、および粘膜からの広範な出血斑および出血、貧血ならびに極度の筋力低下を特徴とする、全身性自己免疫疾患である（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記；Cines and McMillan, Annu. Rev. Med. 56:425-442, 2005；Stasi and Provan, Mayo Clin. Proc. 79:504-522, 2004を参照)。
【０２３１】
血小板数は極めて少なくなり、歯肉、胃腸管および鼻からの自発的出血が認められることがある。紫斑とは、血小板減少の結果として出血が起こった皮膚および粘膜（口腔内層など）の紫がかった領域のことを指す。身体診察によって脾臓の肥大が示されることがある。典型的な皮疹は、皮膚における小血管の微小出血が原因で起こる。血小板数が10,000未満だと脳内での自発的出血を招き、死亡を引き起こす恐れがある。免疫性血小板減少性紫斑病、出血性紫斑病、血小板減少性紫斑、ウェルホーフ病とも呼ばれる。ほとんどの症例は無症候性であるが、血小板数が極めて少ないことは出血素因および紫斑を招く恐れがある。ITPには、小児が罹患する急性ITP（男女の発生率は同程度）および成人が罹患する慢性ITP（女性の方が多く、2.6対1である；10歳以上のITP患者の72％は女性である）という2つの種類がある。ほとんどの小児は治療を受けなくても回復する。小児で罹患率が最も高いのは2〜4歳であり、成人では20〜50歳である；全ITP患者のおよそ40％は10歳未満である。
【０２３２】
ITPの発生率：小児100,000人当たり毎年4〜8人、成人100万人当たり66例、小児100万人当たり50例。慢性治療抵抗性ITPの新規症例は100万人当たり毎年ほぼ10例である。米国ではITPをもつ個体はおよそ200,000人と推定されている。100万人当たりで毎年合計約100例のITPの新規症例がある。新規症例のおよそ半数は小児である。
【０２３３】
軽度のITPは治療を必要としない。血小板数が1μl当たり10,000個に低下した場合、または出血（例えば、消化管内または重度の鼻血）が起こった時で50,000未満である場合には、治療を一般にステロイドで開始する（Cines and McMillan、前記を参照）。命にかかわる症例に対しては静脈内免疫グロブリン（IVIg）が用いられる。その後に、いわゆるステロイド減量剤（代替的にはDMARDとも呼ばれる）を用いることができる。これらの戦略が奏功しない場合には、破壊の標的となる血小板はしばしば脾臓内でその運命に遭遇するため、脾臓摘出術がしばしば行われる。比較的新しい戦略は、Rh+嬰児によってRh抗原に感作した母親に通常用いられる薬剤である、anti-Dによる治療である。ビンクリスチン、アザチオプリン（イムラン）、ダナゾール、シクロホスファミドおよびシクロスポリンといった他の化学療法薬は、他の治療が有益でないことが示されている重度の症例のみにおいて患者に処方されるが、これはこれらの薬剤に有害な副作用の恐れがあるためである。IVIgは有効であるものの高価であり、改善は一時的である（一般に1カ月未満しか持続しない）。しかし、血小板数が危機的に少なく、他の治療に対する反応が不良な脾臓摘出術の前のITP患者の場合には、IVIg治療が血小板数を増加させ、脾臓摘出手術の危険性を軽減することができる。
【０２３４】
2．シェーグレン症候群
シェーグレン症候群（SS）は、ドライアイおよび口渇をもたらす唾液腺および涙腺のリンパ球性浸潤を特徴とする慢性自己免疫障害である。これは原発性（基礎をなす結合組織障害を伴わない自己免疫性シッカ（乾燥）症候群）または続発性（RA、SLEまたはSScのような進行中の結合組織障害を有する患者における自己免疫媒介性乾燥症候群）に分類される（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記を参照）。SSの女性と男性との比は9：1であり、診断時の平均年齢は60歳である。発生病理のモデルは、該当する遺伝性／ホルモン性バックグラウンドにおけるウイルス性または環境性の傷害が唾液腺および涙腺における上皮炎を招くことを仮定している。その結果生じる単核細胞の浸潤物（ほぼ70％がCD4+ T細胞、25％がCD8+ T細胞、20〜30％がB細胞）がサイトカイン（IFNγ）を放出し、それが続いて、炎症誘発性サイトカイン：TNFα、IL-1βおよびIL-6を放出するマクロファージを活性化する。続いて、これらのサイトカインは腺房細胞からのMMPの放出を引き起こし、それが基底膜コラーゲンを分解する。そのうちに、腺組織は瘢痕組織および脂肪によって置き換えられる（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記を参照）。
【０２３５】
口渇／眼症状のほかの、他の症状には以下が含まれうる：食道運動性低下、末梢性ニューロパチー関節痛および線維筋痛症。患者の60％は自己抗体（リウマトイド因子、ANA、Ro／SS-A、La／SS-B）を呈し、極度の疲労感を患う。SS患者はリンパ腫を発症するリスクが44倍も高いことが報告されている。
【０２３６】
NSAID、ステロイド、ヒドロキシクロロキンおよびメトトレキサートを含む種々の治療が、SSに対して用いられている。いくつかの抗サイトカイン治療法も用いられているが、第一選択の治療法としては推奨されない。これらには以下が含まれる：REMICADE、ENBREL、IFN-α、抗IFN-γ、RITUXAN、シクロスポリン、タクロリムス、およびさまざまな眼科用局所製剤。
【０２３７】
3．抗リン脂質抗体症候群
抗リン脂質抗体症候群は、持続的に陽性な抗カルジオリピン抗体および／またはループス抗凝固因子に関連する、動脈血栓および／または静脈血栓ならびに妊娠時病的状態を特徴とする、頻度の高い自己免疫性の血栓形成促進性病状である（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記；Blume and Miller, Cutis 78:409-415, 2006；Fischer et al., Semin. Nephrol. 27:35-46, 2007を参照）。最近の証拠によれば、これらの抗体のいくつか（IgGおよびIgM）は、リン脂質結合タンパク質（B2-糖タンパク質1、プロトロンビン、プロテインC、プロテインS、TPAおよびアネキシンV。負に荷電したリン脂質それ自体ではなく）を直接の対象とする。APSは他の自己免疫疾患、最も一般的にはSLEに随伴して起こることもあれば（続発性APS）、孤発性障害（原発性APS）として起こることもある。
【０２３８】
APSはあらゆるサイズの血管および体内のあらゆる臓器を冒す。臨床的特徴には、末梢静脈血栓症および動脈血栓症（深部静脈血栓症）、胎児死亡、皮膚疾患、心臓および肺の症状発現、腎障害および神経学的障害（脳卒中）が含まれる。血栓性合併症はSLE患者における主な死因である。
【０２３９】
APSは後天性血栓形成傾向の一般的な原因であり、米国では毎年、APS随伴性静脈血栓の新規症例が35,000例、動脈血栓症の新規症例が5000例と推定されている。APS抗体を有する患者は、これらの抗体を伴わない患者よりも再発性血栓症を起こす可能性が3〜10倍高い。米国では、一般集団の約2％が、ループス抗凝固因子、抗カルジオリピン抗体またはその両方を含む抗リン脂質抗体（AA）の検査に関して陽性である。AAは、50歳未満の脳卒中または一過性虚血発作の患者の46％、および心筋梗塞の若年生存者（45歳未満）の21％で検出されている。SLEを有する患者におけるAAの罹患率は非常に高い（30〜50％）。透析患者におけるAA高値の罹患率は、発表された文献では0.7％〜69％の間でさまざまである。APSを有する患者では、女性と男性との比は原発型については約2対1であり、SLEを伴う症例については9対1である。
【０２４０】
APSを有するが血栓イベントも皮膚変化も経験していない患者に対する現行の治療法は、低用量アスピリンによる生涯にわたる治療である。AA力価が中程度ないし高度であるか、または血栓症を有する患者は、ヘパリンなどの抗凝固因子による即時的な治療を必要とする。長期療法はワルファリンによる抗凝固である。命にかかわるAPSの患者にシクロホスファミドを用いること、およびAPS随伴性流産をコントロールするためにステロイドを用いることについてはある種の臨床試験活動が行われている。AAのレベルをコントロールするために抗B細胞療法を用いることについてはあまり前例がない。
【０２４１】
4．皮膚筋炎
皮膚筋炎は、筋酵素レベルの上昇を伴う対称性の近位筋筋力低下、および典型的には顔面の赤紫色の皮疹、ならびに眼瞼および眼周囲組織の浮腫を特徴とする進行性病状である（Dalakas, Curr. Opin. Pharmacol. 1:300-306, 2001；Dalakas, Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2:219-227, 2006を参照）。罹患した筋組織は慢性炎症反応を伴う線維の変性を示し、小児および成人で起こるが、後者では内臓癌を伴うことがある。PM／DMの原因は不明である。これが複数の家族成員で起こることは稀であるが、それは特定のHLA型（例えば、DR3、DR5またはDR7）との関連性がみられる場合がある。ウイルスおよびトキソプラズマおよびボレリア属（Borrelia）菌種を含む感染性因子が、本疾患の誘因であることが示唆されている。薬剤誘発性疾患のいくつかの症例が報告されている（例えば、ヒドロキシ尿素、ペニシラミン、スタチン系薬剤、キニジンおよびフェニルブタゾン）。免疫学的異常および体液性異常が多くみられる（例えば、筋肉内のTNF-α増加、流血中の筋炎特異的自己Ab；異常なT細胞活性およびB細胞活性、他の自己免疫疾患の家族歴）。B細胞は血管周辺部位に最も多く存在する炎症性細胞である。
【０２４２】
皮膚筋炎には皮膚障害が伴ってみられ（典型的には、顔面の赤紫色の皮疹、ならびに眼瞼および眼周囲組織の浮腫）、動脈性、心臓性、肺性および胃腸性の症状発現が患者の最大50％で起こることから、この疾患は重度の病的状態を伴う恐れがある。これはしばしばSLE、強皮症およびRAといった他の結合組織自己免疫疾患を伴う。RAとは異なり、DM／PMに特に随伴する関節炎はびらん性でも変形性でもない。SLEなどの他の自己免疫結合組織病に随伴する皮膚変化と一致して、皮膚には血管周囲炎症浸潤がみられる。PM／DMは通常は命にかかわらないが、患者はしばしば残存性の筋力低下、能力障害および生活の質の低下を生じる。PM／DMは重度の筋力低下および／または心肺障害のために死亡を引き起こすことがある。悪性腫瘍のリスクは、DMの患者では非常に高い（発生率の比＝26）が、PMのではそうではない；悪性腫瘍は60歳以上の成人でより高い頻度で起こる。皮膚または筋肉の石灰沈着（硬い黄色または肌色の結節によって明らかになる）は成人では通常みられないが、DMを有する小児または青少年では最大40％に起こる；これは極めて廃疾性である。それらは皮膚の表面から突出することがあり、この場合には続発性感染が起こる可能性がある。
【０２４３】
炎症性ミオパチーの発生率（多発性筋炎単独および多発性筋炎と皮膚筋炎の合計）は100,000人当たりそれぞれ0.1人および1人と推定されており（人種バイアスはない）、明らかに増加しつつある。罹患率はPM単独およびPM／DMの合計で100,000人当たりそれぞれ1人および6人である。女性の方が男性よりも多く罹患する（ほぼ2：1）。PM／DMはあらゆる年齢の人々に起こりうる。発症には2つのピーク年齢が存在する。成人では発症のピーク年齢はおよそ50歳であり、小児ではピーク年齢はおよそ5〜10歳である。
【０２４４】
治療の主力はステロイドである（Dalakas, Jama 291:2367-2375, 2004；Dalakas, Pharmacol. Ther. 102:177-193, 2004を参照）。メトトレキサート、アザチオプリンおよびミコフェノール酸モフェチルによる免疫抑制療法も用いられている。治療抵抗性患者では、IVIgが短期的治療法として用いられている。この障害に対して新たに登場した治療法にはリツキサンが含まれる。TNFアンタゴニストがDMに随伴するリスクのいくつか（感染、悪性腫瘍、他の自己免疫疾患の誘発）を高める若干の懸念もあるものの、レミケードおよびエンブレルがこの障害に対する進行中の治験で試験されている。
【０２４５】
5．ギラン-バレー症候群
ギラン-バレー症候群は重度の感染後神経障害である。GBS患者で観察される神経障害は、おそらく交差反応性の抗ガングリオシド抗体によって引き起こされる。GBSにおける交差反応性抗体の産生の細胞免疫学的バックグラウンドはほとんど不明である。ある者は、GBSにおいて最も頻度の高い先行感染菌であるカンピロバクター-ジェジュニ（Campylobacter jejuni）に対する樹状細胞の応答の差異が、B細胞増殖の増強および自己反応性形質細胞をもたらすという仮説を立てている。宿主関連因子ならびに病原性因子がこのことに関係している可能性がある（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記；Lewis, Neurol. Clin. 25:71-87, 2007；Said, Neurol. Clin. 25:115-137, 2007；Yuki, Muscle Nerve 35:691-711, 2007を参照）。
【０２４６】
GBSは廃疾性障害であり、死亡率は5〜15％である。IVIgがこれらの患者に対する第一選択の治療である（Harrison's Principles of Internal Medicine、前記を参照）。それでもなお、患者の約50％は6カ月後には自立歩行ができなくなる。GBSは急性末梢性ニューロパチーの少なくとも4つのサブタイプからなる。急性炎症性脱髄性多発神経根筋障害（AIDP）サブタイプの組織学的外観は、ミエリンタンパク質P0、P2およびPMP22由来のペプチドを対象とするT細胞によって引き起こされる実験的自己免疫性神経炎に類似している。AIDPにおけるT細胞媒介性免疫の役割は依然として不明であるが、抗体および補体の関与については証拠がある。現在では、GBSの軸索型サブタイプである急性運動性軸索型ニューロパチー（AMAN）および急性運動感覚性軸索型ニューロパチー（AMSAN）が、マクロファージをランビエ絞輪の箇所で軸索を侵入するように向かわせる、軸索鞘上のガングリオシドに対する抗体によって引き起こされるという強力な証拠が存在する。GBSの患者の約4分の1は最近カンピロバクター-ジェジュニに感染しており、この疾患の軸索型はこれらの人々で特に頻度が高い。C.ジェジュニの細菌壁由来のリポオリゴ糖はガングリオシド様構造を含んでおり、ウサギへのその注射は急性運動性軸索型ニューロパチーに類似したニューロパチーを引き起こす。GM1、GM1b、GD1aおよびGalNac-GD1aに対する抗体は、特に急性運動性軸索型ニューロパチーと関係づけられており、GalNacGD1aを除き、急性運動感覚性軸索型ニューロパチーとも関係づけられている。フィッシャー症候群サブタイプはGQ1bに対する抗体と特に関連しており、C.ジェジュニの壁内のガングリオシド構造との同様の交差反応性が発見されている。抗GQ1b抗体はインビトロで補体媒介性機序によって運動神経終末を障害させることが示されている。
【０２４７】
GBSは稀な障害であり、米国では男性と女性の罹患率は等しい（NIH, The National Women's Health Centre, 2004）。GBSは米国では100,000人の集団当たり1人が罹患する（NIH, The National Women's Health Centre, 2004）。GBSを含むすべての慢性炎症性脱髄性多発神経障害（CIDP）の米国での罹患率は100,000人当たり約1〜7.7人である（米国での症例は2,000〜15,000例）。しかし、これはおそらく過小評価であり、CIDPがニューロパチー全体（症例が1000万例）の5％を占めると仮定すると、現実には症例は合計でほぼ300,000例（活動性）〜500,000例と予測しうる。
【０２４８】
現在はIVIgおよびプラズマフェレーシスがGBSに対する治療法として用いられている。GBSは自己免疫性ニューロパチーであるため、T細胞、B細胞および／または補体を対象とする治療法はこれらの疾患に有用であることが期待される。
【０２４９】
6．グッドパスチャー症候群
「グッドパスチャー症候群」（GPS）という用語は、インフルエンザ感染および急性半月体性糸球体腎炎の組織学的所見を伴う肺出血の臨床的症候群を記載したErnest Goodpastureによる1919年の報告にちなんだ冠名である。年月を重ねるうちに、この用語はさまざまな者によって異なる様式で用いられるようになり、ある者は腎機能障害を伴う肺出血のすべての原因をGPSとして含めた。また別の者は、GPSという用語を、抗GBM抗体を伴うが肺出血は伴わない糸球体腎炎とは異なり、抗糸球体基底膜（抗GBM）抗体を伴う肺出血の患者に限定した。さらに別の者は、GPSではなく抗IV型コラーゲン疾患の概念を採用した。我々がこの疾患の発生病理のより良い理解を得るのに伴って、その臨床スペクトルがなぜこのように多様であるかを明確にできるようになり、ならびにGPSに対するより合理的および特異的な形態の治療法を開発できるようになる可能性が高いように思われる。
【０２５０】
GPSの診断のための必須条件は、腎臓の糸球体における結合型抗GBM抗体を実証することである。流血中抗GBM抗体は、抗GBM疾患を有する患者の90％超に存在する。未治療のGPSの、さらには治療されてたGPSであっても、その臨床経過は厳しい；この疾患でみられる予後は極めて不良である。
【０２５１】
GPSは稀な疾患であり、発生率は100万人当たり約0.1例である。この疾患はアフリカ系アメリカ人よりも白人の方が頻度が高く、ニュージーランドのマオリ族のような特定の他の人種集団ではさらに頻度が高いことがある。GPSは一年中生じうるが、その発生率は春および初夏に高くなるように思われる。
【０２５２】
GPSに対する現行の治療法には、ステロイド、免疫抑制薬および血漿交換が含まれる。腎病態は腎糸球体内の抗GBM抗体の蓄積に起因するように思われるため、B細胞を対象とする治療法がこの疾患では有用な可能性がある。
【０２５３】
7．炎症性腸疾患（IBD）
米国ではおよそ500,000人が炎症性腸疾患（IBD）に罹患しており、これは結腸および直腸（潰瘍性大腸炎）またはその両方、小腸および大腸（クローン病）を冒しうる。クローン病および潰瘍性大腸炎ではいずれも、組織損傷が、腸管微生物叢の抗原に対する不適切または過大な免疫応答に起因する。この総説は、炎症性腸疾患の発生病理における免疫炎症性メディエーターの役割に関する最近の知見をまとめている。管腔抗原に対する過剰反応という共通の基盤を有するにもかかわらず、クローン病および潰瘍性大腸炎は免疫学的に明確に異なる実体である。クローン病には、インターフェロン-γおよび腫瘍壊死因子-αの産生増強を特徴とするTh1 T細胞媒介性応答が伴う。インターロイキン（IL）-12およびおそらくは他のサイトカインがTh1細胞分化を司るが、分極化したTh1細胞の最適な誘導および安定化にはIL-15、IL-18およびIL-21などの別のサイトカインが必要と考えられる。潰瘍性大腸炎では、局所免疫応答はあまり分極化していないが、それはCD1応答性ナチュラルキラーT細胞のIL-13産生を特徴とする。これらの違いを超えて、クローン病および潰瘍性大腸炎には腸傷害に関する共通の重要な末期エフェクター経路があり、これらは免疫性および非免疫性の粘膜細胞の間の能動的な相互干渉によって媒介される。
【０２５４】
さらに、IgGの中和はIBDの動物モデルにおける疾患の症状および病態を軽減することができる（Nielson et al., Scand. J. Gastroenterol. 38:180, 2003；Schmidt et al., Inflamm. Bowel Dis. 11:16, 2005；Fuss et al, Inflamm. Bowel Dis. 12:9, 2006；Yen et al., J. Clin. Invest. 116:1310, 2006；Zhang et al., Inflamm Bowel Dis. 12:382, 2006）。したがって、本発明のFcγRIAポリペプチドは、IBDおよび関連疾患における炎症および病的影響を軽減させるための有益な治療薬として役立つ可能性があると考えられる。
【０２５５】
潰瘍性大腸炎（UC）は、俗に結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患であり、結腸の粘膜または最内層の炎症および潰瘍形成を特徴とする。この炎症は結腸を頻繁に空にさせる原因となり、それは結果的に下痢をもたらす。症状には、便の弛み、ならびに随伴する腹部痙攣、発熱および体重減少が含まれる。
【０２５６】
UCの正確な原因は不明であるが、最近の研究により、身体の自然防御が、身体が外来性とみなした体内のタンパク質に対して動作していること（「自己免疫反応」）が示唆されている。おそらくはそれらが消化管内の細菌タンパク質に類似しているために、これらのタンパク質は、結腸の内層を破壊し始める炎症過程を惹起または刺激するものと考えられる。結腸の内層が破壊されるにつれて、粘液、膿汁および血液を放出する潰瘍が生じる。この疾患は通常、直腸部で始まり、最終的には大腸全体に波及しうる。繰り返される炎症の発生は腸および直腸の壁の肥厚化を招き、これは瘢痕組織を伴う。重度の疾患では結腸組織の壊死または敗血症が起こることがある。潰瘍性大腸炎の症状は重症度の点でさまざまであり、それらの発現は段階的なことも突発的なこともある。発作は、呼吸器感染またはストレスを含む多くの要因によって誘発されうる。
【０２５７】
UCに対する治癒方法は現在得られていないが、治療は結腸内層における異常な炎症過程を抑制することに向けられている。コルチコステロイド、免疫抑制薬（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリンおよびメトトレキサート）およびアミノサリチル酸を含む治療薬を、疾患を治療するために利用可能である。しかし、コルチコステロイドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制薬の長期使用は、骨の菲薄化、白内障、感染症ならびに肝臓および骨髄への影響を含む重篤な副作用をもたらす恐れがある。現行の治療法が奏功しない患者では、外科手術が選択肢となる。外科手術は、結腸全体および直腸の除去を伴う。
【０２５８】
慢性潰瘍性大腸炎をある程度模倣しうる動物モデルがいくつかある。最も広く用いられているモデルの1つは、結腸における慢性炎症および潰瘍形成を誘発させる、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸／エタノール（TNBS）誘発性の大腸炎モデルである。TNBSを感受性マウスの結腸に直腸内滴注によって導入すると、それは結腸粘膜におけるT細胞媒介性免疫応答を誘導し、この場合には、大腸の壁全体にわたるT細胞およびマクロファージの高密度浸潤を特徴とする高度の粘膜炎症を招く。さらに、この組織病理学的病像は、進行性体重減少（羸痩）、血性下痢、直腸脱および大腸壁肥厚化という臨床像を伴う（Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000）。
【０２５９】
もう1つの大腸炎モデルは、血性下痢、体重減少、結腸の短縮化、および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍形成によって明らかになる急性大腸炎を誘発させるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を用いる。DSS誘発性大腸炎は、リンパ組織過形成、限局性腺窩傷害および上皮潰瘍形成を伴う、粘膜固有層への炎症性細胞の浸潤によって組織学的に特徴づけられる。これらの変化は、上皮に対するDSSの毒性作用、ならびに粘膜固有層細胞の食作用、ならびにTNF-αおよびIFN-γの産生が原因となって生じると考えられている。よく用いられるにもかかわらず、ヒト疾患との関連性という点でDSSの機序に関してはいくつかの問題が未解決のままである。DSSは、SCIDマウスなどのT細胞欠損動物で観察されることから、T細胞非依存的モデルとみなされている。
【０２６０】
これらのTNBSモデルまたはDSSモデルに対する本発明のFcγRIAポリペプチドの投与を用いることで、胃腸疾患の症状を改善するため、およびその経過を変化させるためのそのようなポリペプチドの使用について評価することができる。さらに、IgGまたは免疫複合体の沈降の阻害を示す結果は、可溶性FcγRIAを大腸炎／IBDモデルにおける症状を改善するため、および疾患の経過を変化させるためにも用いうるという概念実証ともなる。
【０２６１】
8．乾癬
乾癬は、数百万人を上回る米国人が罹患する慢性皮膚疾患である。乾癬は、新たな皮膚細胞が異常に増殖し、その結果として、古い皮膚が十分に速く脱落していない箇所に炎症性の腫脹した鱗状皮膚斑が生じた場合に起こる。最も多い型である尋常性乾癬は、銀白色の鱗屑で覆われた皮膚の炎症斑（「病変」）を特徴とする。乾癬は少数のプラークに限定されることもあれば、または中程度ないし広範な皮膚領域が冒されることもあり、これは頭皮、膝、肘および体幹に出現することが最も多い。非常に目立つものの、乾癬は伝染性疾患ではない。この疾患の発生病理は、罹患組織の慢性炎症を伴う。このため、本発明のFcγRIAポリペプチドは、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚および粘膜のアレルギーならびに関連疾患における炎症および病的な影響を軽減するための有益な治療薬として役立つ可能性があると考えられる。
【０２６２】
乾癬は、皮膚のT細胞媒介性炎症障害であり、かなりの不快感を引き起こしうる。これは、治癒方法がなく、あらゆる年齢の人々が罹患する疾患である。乾癬には欧州および北米の人口のおよそ2％が罹患する。軽度の乾癬を有する個体はしばしばその疾患を局所薬剤でコントロールすることができるが、世界中で100万人を上回る人々が紫外線または全身免疫抑制療法を必要とする。残念ながら、紫外線照射の不便さおよびリスク、ならびに多くの治療法の毒性がそれらの長期使用の制約となっている。さらに、患者は通常、乾癬の再発を来たし、場合によっては免疫抑制療法を中止してすぐ後にリバウンドが起こることもある。
【０２６３】
本明細書に記載した他の疾患モデルに加えて、ヒト乾癬病変に由来する炎症組織に対する本発明のアンタゴニストの活性を、重症複合免疫不全症（SCID）マウスモデルを用いてインビボで測定することもできる。ヒト細胞が免疫不全症マウスに移植されたマウスモデルがいくつか開発されている（異種移植モデルと総称される）（例えば、Cattan and Douglas, Leuk. Res. 18:513-22, 1994；Flavell, Hematological Oncology 14:67-82, 1996を参照）。乾癬のインビボ異種移植モデルとしては、ヒトの乾癬性皮膚組織をSCIDマウスモデルに移植して、適当なアンタゴニストを試す。さらに、AGR129マウスモデルに移植されたヒト乾癬性皮膚移植片のような当技術分野における他の乾癬動物モデルを現在のアンタゴニストを評価するために用いて、適当なアンタゴニストを試すこともできる（例えば、Boyman et al., J. Exp. Med. Online publication #20031482,2004を参照）。
【０２６４】
当技術分野で周知の方法を用いて、治療の有効性を、治療を受けた集団における経時的な抗炎症効果の増加として測定して統計学的に評価する。いくつかの例示的な方法には、例えば、乾癬モデルにおいて、表皮厚、真皮上部における炎症性細胞の数、および角化不全のグレードを測定することが非限定的に含まれる。そのような方法は当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている（例えば、Zeigler et al., Lab Invest 81.1253, 2001；Zollner et al., J. Clin. Invest. 109.671, 2002；Yamanaka et al., Microbiol. Immunol. 45.507, 2001；Raychaudhuri et al., Br. J. Dermatol. 144.931, 2001；Boehncke, et al., Arch. Dermatol. Res. 291.104, 1999；Boehncke et al., J. Invest. Dermatol. 116.596, 2001；Nickoloff et al., Am. J. Pathol. 146:580, 1995；Boehncke et al., J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997；Sugai et al., J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998；Villadsen et al., J. Clin. Invest. 112:1571, 2003を参照）。また、フローサイトメトリー（またはPCR）などの周知の方法を用いて炎症を経時的にモニターして、試料中に存在する炎症性細胞または病変細胞の数、IBDに関するスコア（体重減少、下痢、直腸出血、結腸の長さ）を定量することもできる。例えば、そのようなモデルにおける試験のために適した治療戦略には、本発明のFcγRIAポリペプチドを用いた直接治療が含まれる。
【０２６５】
9．アトピー性皮膚炎（AD）
ADは、ヘルパーT細胞サブセット2（Th2）のサイトカインの活動亢進を特徴とする、頻度の高い慢性炎症性疾患である。ADの正確な病因は不明であるが、活動亢進性Th2免疫応答、自己免疫、感染、アレルゲンおよび遺伝素因を含む多数の要因が関係づけられている。この疾患の重要な特徴には、乾皮症（皮膚の乾燥）、掻痒症（皮膚の痒み）、結膜炎、炎症性皮膚病変、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）感染、血中好酸球増多、血清IgEおよびIgG1高値、ならびにT細胞、マスト細胞、マクロファージおよび好酸球の浸潤を伴う慢性皮膚炎が含まれる。黄色ブドウ球菌の定着または感染は、ADを増悪させ、この皮膚疾患を慢性化させることが認識されている。
【０２６６】
ADはしばしば喘息およびアレルギー性鼻炎の患者で見いだされ、往々にしてアレルギー性疾患の初発的な症状発現である。西洋諸国の人口の約20％はこれらのアレルギー性疾患に罹患しており、先進国におけるADの発生率は増加しているがその理由は不明である。ADは典型的には小児期に始まり、青年期を経て成人期まで持続することも多い。ADに対する現行の治療には、局所コルチコステロイド、経口シクロスポリンA、タクロリムス（軟膏形態のFK506）などの非コルチコステロイド性免疫抑制薬、およびインターフェロン-γが含まれる。ADに対する種々の治療法にもかかわらず、多くの患者の症状は改善せず、または彼らが医薬品に対する有害反応を来たすため、より有効な他の治療薬の探索が必要とされている。本発明のFcγRIAポリペプチドは、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚病状、および本明細書に開示した他の炎症性病状のような特定のヒト疾患の治療のために用いることができる。
【０２６７】
10．多発性硬化症
多発性硬化症は、中枢神経系（CNS）の脱髄および慢性炎症を特徴とする、比較的高い頻度で起こる自己免疫疾患である。疾患の惹起の基礎をなす機序ははっきりとは解明されていないが、多発性硬化症の臨床的進行に寄与する疾患過程は炎症、脱髄および軸索損失または神経変性である。マクロファージおよびミクログリアはCNSの主な免疫細胞である。これらの細胞、ならびにT細胞、好中球、アストロサイトおよびミクログリアは、例えば多発性硬化症の免疫関連病態に寄与しうる。さらに、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、プロテオリピドタンパク質（PLP）、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（MOG）およびおそらくは他のミエリンタンパク質も含む、いくつかのミエリンタンパク質に対するT細胞反応／自己免疫が、多発性硬化症の疾病状態および病態の誘導および持続化と関係づけられている。自己反応性T細胞とミエリンタンパク質とのこの相互作用は、TNF-α、IFN-γおよびIL-17をはじめとする炎症誘発性サイトカインの放出を結果的にもたらしうる。そのほかの帰結には、T細胞の増殖、B細胞およびマクロファージの活性化、ケモカインおよび接着分子のアップレギュレーション、ならびに血液脳関門の破壊が含まれる。その後に続いて起こる病態は、オリゴデンドロサイトおよび軸索の損失、ならびに脱髄化「プラーク」の形成である。プラークは、ミエリン鞘が存在しなくなって、脱髄化した軸索がグリア瘢痕組織中に埋没した病変からなる。脱髄は、自己抗体によるミエリン抗原の特異的認識およびオプソニン化と、それに続く補体媒介性および／または活性化マクロファージ媒介性破壊の結果としても起こりうる。この軸索損失および神経変性が、進行性多発性硬化症で観察される非可逆的な神経学的障害の主な原因と考えられている。
【０２６８】
ヒト多発性硬化症の経過には、臨床的および病理学的に多くの不均一性がみられる。症状が始まるのは18歳〜50歳の間が最も多いものの、あらゆる年齢で始まりうる。多発性硬化症の臨床症状は、軽度の視覚障害および頭痛から、失明、重度の運動失調および麻痺に至るまでさまざまである。患者の大半（70〜75％）は、疾患症状が数時間ないし数日以内に再発し、その後にはるかに緩徐な回復がみられる再燃緩解型の多発性硬化症を有する；緩解期には症状が存在しないことが少なくない。再燃および緩解の発生率および頻度は非常にさまざまであるが、時間が経つにつれて、回復期は完了に至らず、起こるのが緩徐になることがある。これらの症例における疾患の悪化は二次性進行型多発性硬化症と分類されており、多発性硬化症患者のおよそ10〜15％で起こる。患者の別の10〜15％は、疾患症状および身体障害が疾患過程の全体を通じて定常的に進行する、原発性進行型多発性硬化症と診断されている。
【０２６９】
本発明のFcγRIAポリペプチドは、多発性硬化症の治療に用いうる可能性がある。そのようなポリペプチドの添加が、炎症メディエーター（すなわち、CNS侵入性の免疫細胞；炎症性サイトカイン／ケモカインCNS発現など）の産生および発現、ならびに多発性硬化症の症状（例えば、麻痺；運動失調；体重減少など）を顕著に軽減するならば、それはヒトの治療に有効であることが期待される。
【０２７０】
IX．薬学的組成物
FcγRIAポリペプチドを含む薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、それにより、ポリペプチドは混合物として薬学的に許容される担体と配合される。組成物は、その投与がレシピエント患者によって忍容されうるならば「薬学的に許容される担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体も当業者に周知である。例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)を参照のこと。
【０２７１】
治療を目的とする場合、本発明のFcγRIAポリペプチドおよび薬学的に許容される担体は、治療的有効量で患者に投与される。本発明の治療用分子と薬学的に許容される担体の組み合わせは、投与された量が生理学的に有意であるならば「治療的有効量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理状態に検出可能な変化をもたらすならば、生理学的に有意である。例えば、炎症を治療するために用いられる薬剤は、その存在が炎症応答を緩和するならば、生理学的に有意である。
【０２７２】
薬学的用途の場合には、本発明のFcγRIAポリペプチドは、従来の方法に従った非経口送達、特に静脈内送達または皮下送達用に製剤化される。静脈内投与は、ボーラス注射、例えばミニポンプもしくは他の適切な技術を用いた制御放出、または典型的には1〜数時間にわたる注入によると考えられる。一般に、薬学的製剤は、造血系タンパク質を、食塩水、緩衝食塩水、5％デキストロース水溶液などの薬学的に許容される媒体との組み合わせで含む。製剤はさらに、1つまたは複数の添加剤、保存料、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面のタンパク質の損失を防ぐためのアルブミンなどを含んでもよい。そのような併用療法を利用する場合、ポリペプチドは単一の製剤中に配合してもよく、または別々の製剤として投与してもよい。製剤化の方法は当技術分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990に開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。治療用量は一般に0.1〜100mg／kg患者体重／日、好ましくは0.5〜20mg／kg／日の範囲であり、正確な用量は、治療される病状の性質および重症度、患者の素因などを考慮した上で、受け入れられている標準法に従って医師によって決定される。用量の決定は当技術分野における通常の技能水準の範囲内にある。タンパク質は一般的には、化学療法または骨髄移植後の最長28日の期間にわたって、または血小板総数が＞20,000／mm3、好ましくは＞50,000／mm3に達するまで投与される。より一般的には、タンパク質は、1週間またはそれ以下、多くの場合には1〜3日の期間にわたって投与される。一般に、本発明の抗体の治療的有効量は、成熟細胞（例えば、血小板または好中球）の流血中レベルの増加として現れると考えられる、リンパ系細胞または骨髄前駆細胞の増殖および／または分化の臨床的に有意な増加を生じさせるのに十分な量である。このため、血小板障害の治療は、血小板数が少なくとも20,000／mm3、好ましくは50,000／mm3に達するまで続けられる。また、本発明のFcγRIAポリペプチドを他の抗炎症薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法のレジメンの範囲内で、他の抗炎症薬の一日量は当業者に一般に公知であり、または必要以上の実験を行わずに決定することができる。
【０２７３】
一般に、投与されるFcγRIAポリペプチドの投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的健康状態および過去の病歴などの要因によって異なると考えられる。典型的には、約1pg／kg〜10mg／kg（薬剤量／患者の体重）の範囲にある投与量の抗体をレシピエントに提供することが望ましいが、状況によってはより低い、またはより高い用量を投与してもよい。
【０２７４】
対象に対する本発明のFcγRIAポリペプチドの投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸腔内、くも膜下腔内、留置カテーテルを介した灌流、または直接的病変内注射によるものであってよい。治療用タンパク質を注射によって投与する場合には、投与は持続的注入または単回もしくは多回ボーラスによるものであってもよい。
【０２７５】
そのほかの投与経路には、経口、粘膜、肺および経皮経路が含まれる。経口送達はポリエステルミクロスフェア、ゼインミクロスフェア、タンパク質性ミクロスフェア、ポリシアノアクリレートミクロスフェア、および脂質ベースの系に適している（例えば、DiBase and Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)を参照）。鼻腔内送達の実施可能性は、そのような様式のインスリン投与によって例示されている（例えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199, 1999を参照）。本発明の抗体を含む乾燥または液体粒子は、乾燥粉末ディスペンサー、液体エアロゾル発生装置、またはネブライザーの助けを借りて調製および吸入することができる（例えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343, 1998；Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235, 1999を参照）。このアプローチは、エアロゾル化されたインスリンを肺へ送達する携帯型電動式吸入器であるAERX糖尿病管理システムによって例示されている。諸研究により、48,000kDaという大きなタンパク質が低周波超音波の助けを借りて皮膚から治療的濃度で送達されたことが示されており、これは経皮投与の実施可能性を例示している（Mitragotri et al., Science 269:850, 1995）。エレクトロポレーションを用いた経皮送達は、本発明のFcγRIAポリペプチドを投与するためのもう1つの手段を提供する（Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213, 1997）。
【０２７６】
本発明のFcγRIAポリペプチドを含む薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、それにより、ポリペプチドは混合物として薬学的に許容される担体と配合される。組成物は、その投与がレシピエント患者によって忍容されうるならば「薬学的に許容される担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体も当業者に周知である。例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)を参照のこと。
【０２７７】
治療を目的とする場合、本発明のFcγRIAポリペプチドおよび薬学的に許容される担体は、治療的有効量で患者に投与される。本発明のFcγRIAポリペプチドと薬学的に許容される担体の組み合わせは、投与された量が生理学的に有意であるならば「治療的有効量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理状態に検出可能な変化をもたらすならば、生理学的に有意である。例えば、炎症を治療するために用いられる薬剤は、その存在が炎症応答を緩和するならば、生理学的に有意である。有効な治療は、さまざまなやり方で評価することができる。1つの態様において、有効な治療は炎症の軽減によって判定される。他の態様において、有効な治療は炎症の阻害によって採点化される。さらに他の態様において、有効な治療法は、体重増加、体力の再獲得、疼痛減少、元気の良さといった徴候、および健康状態がより良好であるという患者による主観的指標を含む、患者の健全性の向上によって測定される。
【０２７８】
本発明の抗体を含む薬学的組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で提供することができる。液体形態は、注射溶液および経口懸濁液により例示される。例示的な固体形態には、カプセル剤、錠剤および制御放出形態が含まれる。後者の形態は、ミニ浸透圧ポンプおよびインプラントにより例示される（Bremer et al.. Pharm. Biotechnol. 10:239, 1997；Ranade, "Implants in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al, "Protein Delivery with Infusion Pumps," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997)を参照）。
【０２７９】
リポソームは、本発明のFcγRIAポリペプチドを対象に対して静脈内、腹腔内、くも膜下腔内、筋肉内、皮下的に送達するため、または経口投与、吸入もしくは鼻内投与を介して送達するための1つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を取り囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる微細な小胞である（概論については、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61, 1993；Kim, Drugs 46:618, 1993；Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照）。リポソームは細胞膜に組成が類似しており、その結果として安全に投与することができ、なおかつ生分解性である。調製の方法に応じて、リポソームは単層とすることも多層とすることもでき、またリポソームはサイズの点で0.02μmから10μm超までの範囲の直径でさまざまでありうる。種々の薬剤をリポソーム内に封入することができる：疎水性薬剤は二重層内に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間に分配される（例えば、Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987)、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576, 1989を参照）。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることによって、封入された薬剤の治療的利用能を制御することが可能である。
【０２８０】
リポソームは事実上あらゆる種類の細胞に吸着し、続いて封入された薬剤を緩徐に放出することができる。または、吸収されたリポソームは、食細胞性の細胞によるエンドサイトーシスを受けることもできる。エンドサイトーシスに引き続いて、リポソームの脂質はリソソーム内で分解され、封入された薬剤が放出される（Scherphof et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 446:368, 1985）。静脈内投与の後に、小さいリポソーム（0.1〜1.0μm）は、典型的には、肝臓および脾臓に主として位置する網内皮系の細胞によって取り込まれるが、3.0μmよりも大きなリポソームは肺に沈着する。細網内皮系の細胞による、より小さいリポソームのこの選好的な取り込みは、化学療法薬をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられてきた。
【０２８１】
細網内皮系は、大用量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化を含むいくつかの方法によって回避することができる（Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428, 1984）。さらに、リポソーム膜への糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質の組み込みは、細網内皮系による取り込みを有意に減少させることが示されている（Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133, 1991；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993）。
【０２８２】
また、リポソームを、リン脂質組成を変化させること、またはリポソームの中に受容体もしくはリガンドを挿入することによって、特定の細胞または臓器を標的とするように調製することもできる。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームを用いて、肝臓を標的とさせることができる（Hayakawa et al., 日本国特許第04-244,018号；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960, 1993）。これらの製剤は、ダイズのホスファチジルコリン、α-トコフェロールおよびエトキシル化硬化ヒマシ油（HCO-60）をメタノール中で混合し、この混合物を減圧下で濃縮し、続いてこの混合物を水で再構成することによって調製された。また、ダイズ由来ステリルグルコシド混合物（SG）およびコレステロール（Ch）を含むジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）のリポソーム製剤は、肝臓を標的とすることも示されている（Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881, 1997）。
【０２８３】
または、抗体、抗体断片、糖質、ビタミンおよび輸送タンパク質などの種々のターゲティング性リガンドを、リポソームの表面と結合させることもできる。例えば、肝細胞表面のみで発現されるアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体を標的とさせるために、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾することができる（Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287, 1997；Murahashi el al., Biol. Pharm. Bull. 20:259, 1997）。同様に、Wu et al. (Hepatology 27:772, 1998)は、アシアロフェツインによるリポソームの標識が、リポソームの血漿中半減期の短縮を招き、肝細胞によるアシアロフェツイン標識リポソームの取り込みを著しく増強することを示した。一方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓蓄積は、アシアロフェツインの事前注射によって阻害することができる（Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259, 1997）。ポリアコニチル化されたヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞にターゲティングさせるためのもう1つのアプローチを提供する（Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681, 1997）。さらに、Geho, et al. 米国特許第4,603,044号は、肝臓の特化した代謝細胞に随伴する肝胆管受容体に対する特異性を有する肝細胞特異的リポソーム小胞送達系を記載している。
【０２８４】
組織ターゲティングのためのさらに一般的なアプローチでは、標的細胞によって発現されるリガンドに対して特異的なビオチン化抗体で標的細胞をあらかじめ標識する（Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998）。遊離抗体の血漿除去の後に、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。もう1つのアプローチでは、ターゲティング抗体をリポソームに直接結び付ける（Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99, 1998）。
【０２８５】
本発明のFcγRIAポリペプチドは、タンパク質のマイクロカプセル化の標準的な技術を用いて、リポソーム内に封入することができる（例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099, 1981；Anderson et al., Cancer Res. 50:1853, 1990；Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95, 1991；Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)；Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124, 1987を参照）。上述したように、治療的に有用なリポソームは、種々の成分を含有することができる。例えば、リポソームは、ポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含んでもよい（Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9, 1993）。
【０２８６】
治療用タンパク質の高い全身レベルを維持するために、分解性ポリマーのミクロスフェアが設計されている。ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLG）、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生分解性エチルビニルアセテートポリマーなどの分解性ポリマーからミクロスフェアが調製されており、この場合はポリマー中にタンパク質が捕捉される（Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332, 1995；Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus el al., Science 281:1161, 1998；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153, 1998；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548, 1998）。また、ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされたナノスフェアも、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体となりうる（例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167, 1997を参照）。
【０２８７】
本発明はまた、以上に考察したように、ポリペプチドがポリマーと連結されている、化学修飾されたFcγRIAポリペプチドも想定している。
【０２８８】
例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されているように、当業者が他の剤形を考案することもできる。
【０２８９】
一例として、薬学的組成物は、本発明のFcγRIAポリペプチドを含有する容器を含むキットとして供給してもよい。本発明のFcγRIAポリペプチドは、単回もしくは複数回投与用の注射溶液の形態で、または注射前に構成する無菌粉末として提供することができる。または、そのようなキットが、治療用ポリペプチドの投与のための乾燥粉末ディスペンサー、液体エアロゾル発生装置、またはネブライザーを含むこともできる。そのようなキットはさらに、薬学的組成物の適応症および使用に関する説明書を含んでもよい。さらにまた、このような説明書には、FcγRIAポリペプチドを含む組成物が、FcγRIAに対して過敏反応を示すことが判明している患者には禁忌であるという記載を含んでもよい。
【０２９０】
本発明のFcγRIAポリペプチドを含む薬学的組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で提供することができる。液体形態は、注射溶液、エアロゾル、液滴、トポロジー溶液（topological solution）、および経口懸濁液により例示される。例示的な固体形態には、カプセル剤、錠剤および制御放出形態が含まれる。後者の形態はミニ浸透圧ポンプおよびインプラントにより例示される（Bremer et al.. Pharm. Biotechnol. 10:239, 1997；Ranade, "Implants in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al, "Protein Delivery with Infusion Pumps," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997)を参照）。他の固体形態には、クリーム剤、軟膏、他の局所外用剤などが含まれる。
【０２９１】
例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されているように、当業者が他の剤形を考案することもできる。
【０２９２】
本発明は、FcγRIAポリペプチド、ならびに本明細書に記載したようなポリペプチドを含む方法および治療的使用を想定している。そのような組成物はさらに担体を含んでもよい。担体は、通常の有機担体または無機担体であってよい。担体の例には、水、緩衝溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが含まれる。
【０２９３】
上記のことから、本発明の具体的な態様は例示の目的で本明細書に記載されているものの、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな改変を加えうることが理解されるであろう。したがって、本発明は以下の非限定的な例によってさらに例示されるが、添付の特許請求の範囲によるものを除き、限定はされない。
【０２９４】
実施例1
哺乳動物FcγRIA-Fc5発現構築物の構築
A．哺乳動物FcγRIA-Fc5発現構築物
FcγRIA-Fc5をコードする発現プラスミドを、哺乳動物発現ベクターpZMP40中に挿入されたFcγRIAの細胞外断片（SEQ ID NO：2のアミノ酸1〜282）および（Gly4Ser）3リンカー-Fc5をコードする2つのDNA断片による、酵母における相同組換えを介して構築する。Fc5はエフェクターマイナス型のヒトγ1 Fcであり、リンカーは融合パートナー間のスペーサーとして存在する。pZMP40は、マルチクローニング部位を改変することによって作製されたプラスミドpZMP21の誘導体である。pZMP21は米国特許出願第US 2003／0232414A1号に記載されており、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託されてNo.PTA-5266と命名されている。
【０２９５】
FcγRIA cDNAの指定の断片（ネイティブ性cDNA配列の残基1〜1122）を、PCRを用いて単離する。PCRのための上流プライマーは、5'末端から3'末端の順に以下を含む：ベクター由来の40bpの隣接配列、およびFcγRIAのオープンリーディングフレーム由来のアミノ末端に対応する21bp。
2010516769.tif 000008
融合タンパク質のFcγRIA部分に対する下流プライマーは、ボトム鎖（bottom strand）配列の5'から3'の順に、無関連な（Gly4Ser）3 Fc5融合タンパク質配列の（Gly4Ser）3リンカーの40bp、およびFcγRIA細胞外ドメインの最後の21bpである1102から1122までからなる。
2010516769.tif 000009
（Gly4Ser）3 リンカーを伴うFc5部分は、5'から3'の順に以下のものを含む上流プライマーを用いて作製した：FcγRIa細胞外ドメイン由来の40bpの隣接配列、および（Gly4Ser）3 Fc5パートナーのアミノ末端に対応する21bp。
2010516769.tif 000010
融合タンパク質のFc5部分に対する下流プライマーは、ボトム鎖配列の5'から3'の順に、ベクターpZMP40由来の40bpの隣接配列、およびFc5の最後の21bpからなる。
2010516769.tif 000011
【０２９６】
PCR増幅反応の条件は以下の通りである：94℃、5分間を1サイクル；94℃、1分間、続いて65℃、1分間、さらに続いて72℃、1分間を25サイクル；72℃、5分間を1サイクル。各100μlのPCR反応物の10μlを、分析のために1×TBEバッファーを含む0.8％ LMPアガロースゲル（Seaplaque GTG）上で泳動させる。BglIIで切断したプラスミドpZMP40を、PCR断片による相同組換えのために用いる。各PCR反応物の残りの90μlおよび切断したpZMP40の200ngは、20μlの3M酢酸ナトリウムおよび500μlの無水エタノールの添加によって沈降させ、すすぎ洗いし、乾燥させた上で、10μLの水中に再懸濁させる。
【０２９７】
100μlのコンピテント酵母細胞（S.セレビシエ）を上記のDNA混合物の10μlと配合し、0.2cmエレクトロポレーション用キュベットに移す。酵母／DNA混合物に0.75kV（5kV／cm）、∞オーム、25μFの電気パルスを与える。各キュベットに600μlの1.2Mソルビトールを添加し、酵母を2つの300μlアリコートにして2枚のURA-Dプレートにプレーティングして30℃でインキュベートする。約48時間後に、単一プレートのUra+酵母形質転換体から採取したおよそ50μLの濃縮酵母細胞を、100μLの溶解バッファー（2％ Triton X-100、1％ SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA）、Qiagen miniprepキット（Invitrogen, Carlsbad, CA）からの100μLのQiagen P1バッファー、および20Uのザイモリアーゼ（Zymo Research, Orange, CA、カタログ番号1001）中に再懸濁させる。この混合物を37℃で30分間インキュベートし、続いてQiagen miniprepプロトコールの残りを行う。プラスミドDNAを100μLの水で2回溶出させ、20μLの3M酢酸ナトリウムおよび500μLの無水エタノールで沈降させる。ペレットを70％エタノールですすぎ洗いし、風乾させ、形質転換のために10μLの水中に再懸濁させる。
【０２９８】
50μLのエレクトロコンピテント大腸菌細胞（DH10B, Invitrogen, Carlsbad, CA）を、2μLの酵母DNAにより形質転換させる。細胞に1.7kV、25μFおよび400オームの電気パルスを与える。エレクトロポレーションの後に、1mlのSOC（2％ Bacto Tryptone（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース）を、3枚のLB AMPプレート（LB培地（Lennox）、1.8％ Bacto Agar（Difco）、100mg／Lアンピシリン）上に、250μl、100μlおよび10μlのアリコートとしてプレーティングする。
【０２９９】
FcγRIA-Fc5の正しい発現構築物を保有する個々のクローンを、インサートの存在、およびさまざまなDNA配列が互いに正しく連結されたことをを検証するための制限消化によって同定する。陽性クローンのインサートを配列解析にかける。より大規模なプラスミドDNAは、Qiagen Maxiキット（Qiagen）を製造元の指示に従って用いて単離する。
【０３００】
FcγRIA-Fc5ヌクレオチドのコード配列は、SEQ ID NO：10に示されている。コードされたFcγRIA-Fc5ポリペプチドの対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：11に示されている。
【０３０１】
B．CHO細胞におけるFcγRIA-Fc5構築物のトランスフェクションおよび選択
200μgのFcγRIA-Fc5構築物の3つのセットを、200単位のPvuIにより37℃で3時間かけて別々に消化し、エタノールで沈降させて、1.5mL微量遠心管内で遠心する。上清をデカントしてペレットを残し、ペレットを300μLの70％エタノールで洗浄して、室温で5分間インキュベートさせる。チューブを微量遠心機にて14,000RPMで10分間遠心し、上清をデカントしてペレットを残す。続いてペレットを750μlのCHO細胞組織培養液に無菌環境下で再懸濁させ、60℃で30分間インキュベートした上で、室温まで冷却させる。およそ5×106個のCHO細胞を3本のチューブのそれぞれの中でペレット化し、DNA-培地溶液を用いて再懸濁させる。DNA／細胞混合物を0.4cmギャップのキュベットに入れ、以下のパラメーターを用いてエレクトロポレーションを行う；950μF、高キャパシタンス、300V。続いてキュベットの内容物を取り出してプールし、CHO細胞組織培養液で25mLに希釈した上で、125mL振盪フラスコに入れる。フラスコを37℃、6％ CO2の振盪機に載せたインキュベーターに入れて、120rpmで振盪する。
【０３０２】
このCHO細胞を栄養素選択にかけ、その後に、200nMメトトレキサート（MTX）に対して、続いて1μM MTXに対しての段階的増幅を行う。タグ付加タンパク質の発現をウエスタンブロットによって確認し、タンパク質精製用の収集のためにCHO細胞のプールの規模を拡大させる。
【０３０３】
実施例2
FcγRIA-CEE、FcγRIA-CHISおよびFcγRIA-CFLAGタグ付加タンパク質を発現する哺乳動物可溶性FcγRIA発現構築物の構築
ヒトFcγRIAの細胞外ドメインをGlu-Glu（CEE）、6×His（CHIS）またはFLAG（CFLAG）のいずれかのC末端タグとともに含む発現構築物を、PCR、ならびにFcγRIAをコードするDNA断片（SEQ ID NO：12）および発現ベクターpZMP20を用いた相同組換えを介して構築する。
【０３０４】
FcγRIA-CEEをコードするPCR断片は、5'非翻訳領域におけるpZMP20ベクター配列との5'重複部、SEQ ID NO：12のFcγRIA細胞外ドメインコード領域部分（ヌクレオチド1〜846）、Glu-Gluタグ（Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu；SEQ ID NO：13）コード配列、およびポリオウイルス配列内リボソーム進入部位領域におけるpZMP20ベクターとの3'重複部を含む。PCR増幅反応は、5'オリゴヌクレオチド「100」
2010516769.tif 000012
、3'オリゴヌクレオチド「200」
2010516769.tif 000013
、およびテンプレートとして以前に作製したFcγRIAのDNAクローン（SEQ ID NO：12）を用いる。
【０３０５】
PCR増幅反応の条件は以下の通りである：94℃、5分間を1サイクル；94℃、1分間、続いて55℃、2分間、さらに続いて72℃、3分間を35サイクル；72℃、10分間を1サイクル。PCR反応混合物を1％アガロースゲル上で泳動させ、予想されるサイズに対応するDNA断片を、QIAquick（商標）Gel Extraction Kit（Qiagen, カタログ番号28704）を用いて抽出する。
【０３０６】
プラスミドpZMP20は、キメラ性CMVエンハンサー／MPSVプロモーター、酵母組換えの前の線状化のためのBglII部位、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入エレメント、膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインを有する発現カセット；大腸菌複製起点；SV40プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、DHFR遺伝子およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現ユニット；ならびにS.セレビシエにおける選択および複製のために必要なURA3配列およびCEN-ARS配列を含む、哺乳動物発現ベクターである。
【０３０７】
プラスミドpZMP20をBglIIで消化し、その後に、ゲル抽出したFcγRIA-CEE PCR断片により、酵母における組換えを行う。100μlのコンピテント酵母（S.セレビシエ）細胞を、10μlのFcγRIA-CEEインサートDNAおよびBglII消化した100ngのpZMP20ベクターと配合し、混合物を0.2cmエレクトロポレーション用キュベットに移す。酵母／DNA混合物に、0.75kV（5kV／cm）、∞オームおよび25μFの電源（BioRad Laboratories, Hercules, CA）設定を用いて電気パルスを与える。600μlの1.2Mソルビトールをキュベットに添加して、酵母を100μlおよび300μlのアリコートにして2枚のURA-Dプレートにプレーティングし、30℃でインキュベートする。約72時間後に、単一プレート由来のUra+酵母形質転換体を1ml H2O中に再懸濁させ、短時間遠心して酵母細胞をペレット化する。細胞ペレットを0.5mlの溶解バッファー（2％ Triton X-100、1％ SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA）中に再懸濁させる。500μlの溶解混合物を、酸洗浄した250μlのガラスビーズおよび300μlのフェノール-クロロホルムを含むEppendorfチューブに添加し、3分間ボルテックス処理して、Eppendorf遠心分離機にて最大速度で5分間遠心する。水相の300μlを新たなチューブに移し、DNAを600μlのエタノールで沈降させ、その後に最大速度で30分間の遠心を行う。チューブをデカント処理し、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄する。チューブをデカント処理し、DNAペレットを30μlの10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA中に再懸濁させる。
【０３０８】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（DH12S）の形質転換は、5μlの酵母DNA調製物および50μlの大腸菌細胞を用いて行う。細胞に2.0kV、25μFおよび400オームの電気パルスを与える。エレクトロポレーションの後に、1mlのSOC（2％ Bacto（商標）Tryptone（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース）を添加し、続いて細胞を50μlおよび200μlのアリコートにして2枚のLB AMPプレート（LB培地（Lennox）、1.8％ Bacto（商標）Agar（Difco）、100mg／Lアンピシリン）にプレーティングする。
【０３０９】
構築物用の3種のDNAクローンのインサートを配列解析にかけて、正しい配列を含む1つのクローンを選択する。大規模なプラスミドDNAを、市販のキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を製造元の指示に従って用いて単離する。
【０３１０】
同じ工程を用いて、Gly Ser Gly Gly His His His His His His（SEQ ID NO：16）で構成されるC末端hisタグを伴うFcγRIA（FcγRIA-CHIS）、またはGly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys（SEQ ID NO：17）で構成されるC末端FLAGタグを伴うFcγRIA（FcγRIA-CFLAG）を調製する。これらの構築物を調製するためには、3'オリゴヌクレオチド「200」の代わりに、FcγRIA-CHISの作製のためには3'オリゴヌクレオチド「300」
2010516769.tif 000014
を用い、またはFcγRIA-CFLAGの作製のためには3'オリゴヌクレオチド「400」
2010516769.tif 000015
を用いる。
【０３１１】
実施例3
FcγRIA-CEE、FcγRIA-CHISおよびFcγRIA-CFLAG C末端タグ付加タンパク質を発現する可溶性FcγRIA受容体発現構築物のトランスフェクションおよび発現
200μgの各々の可溶性FcγRIAタグ付加発現構築物の3つのセットを、200単位のPvuIにより37℃で3時間かけて別々に消化し、イソプロピルアルコールで沈降させて、1.5mL微量遠心管内で遠心する。上清をデカントで除いてペレットを残し、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄して、室温で5分間インキュベートさせる。チューブを微量遠心機にて14,000RPMで10分間遠心し、上清をデカントしてペレットを残す。続いてペレットを750μlのCHO細胞組織培養液に無菌環境下で再懸濁させ、60℃で30分間インキュベートした上で、室温まで冷却させる。およそ5×106個のCHO細胞を3本のチューブのそれぞれの中でペレット化し、DNA-培地溶液を用いて再懸濁させる。DNA／細胞混合物を0.4cmギャップのキュベットに入れ、以下のパラメーターを用いてエレクトロポレーションを行う；950μF、高キャパシタンス、300V。続いてキュベットの内容物を取り出してプールし、CHO細胞組織培養液で25mLに希釈した上で、125mL振盪フラスコに入れる。フラスコを37℃、6％ CO2の振盪機に載せたインキュベーターに入れて、120RPMで振盪する。
【０３１２】
このCHO細胞を栄養素選択にかけ、その後に、200nMメトトレキサート（MTX）に対して、続いて1μM MTXに対しての段階的増幅を行う。タグ付加タンパク質の発現をウエスタンブロットによって確認し、タンパク質精製用の収集のためにCHO細胞のプールの規模を拡大させる。
【０３１３】
実施例4
FcγRIb1-CEE、FcγRIb1-CHISおよびFcγRIb1-CFLAGタグ付加タンパク質を発現する哺乳動物可溶性FcγRIb1発現構築物の構築
ヒトFcγRIb1の細胞外ドメインをGlu-Glu（CEE）、6×His（CHIS）またはFLAG（CFLAG）のいずれかのC末端タグとともに含む発現構築物を、PCR、ならびにFcγRIb1をコードするDNA断片（SEQ ID NO：20）および発現ベクターpZMP20を用いた相同組換えを介して構築する。
【０３１４】
FcγRIb1-CEEをコードするPCR断片は、5'非翻訳領域におけるpZMP20ベクター配列との5'重複部、SEQ ID NO：20のFcγRIb1細胞外ドメインコード領域部分（ヌクレオチド1〜570）、Glu-Gluタグ（Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu；SEQ ID NO：13）コード配列、およびポリオウイルス配列内リボソーム進入部位領域におけるpZMP20ベクターとの3'重複部を含む。PCR増幅反応は、5'オリゴヌクレオチド「100」
2010516769.tif 000016
、3'オリゴヌクレオチド「211」
2010516769.tif 000017
、およびテンプレートとして以前に作製したFcγRIb1のDNAクローン（SEQ ID NO：20）を用いる。
【０３１５】
PCR増幅反応の条件は以下の通りである：94℃、5分間を1サイクル；94℃、1分間、続いて55℃、2分間、さらに続いて72℃、3分間を35サイクル；72℃、10分間を1サイクル。PCR反応混合物を1％アガロースゲル上で泳動させ、予想されるサイズに対応するDNA断片を、QIAquick（商標）Gel Extraction Kit（Qiagen, カタログ番号28704）を用いて抽出する。
【０３１６】
プラスミドpZMP20は、キメラ性CMVエンハンサー／MPSVプロモーター、酵母組換えの前の線状化のためのBglII部位、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入エレメント、膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインを有する発現カセット；大腸菌複製起点；SV40プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、DHFR遺伝子およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現ユニット；ならびにS.セレビシエにおける選択および複製のために必要なURA3配列およびCEN-ARS配列を含む、哺乳動物発現ベクターである。
【０３１７】
プラスミドpZMP20をBglIIで消化し、その後に、ゲル抽出したFcγRIb1-CEE PCR断片により、酵母における組換えを行う。100μlのコンピテント酵母（S.セレビシエ）細胞を、10μlのFcγRIb1-CEEインサートDNAおよびBglII消化した100ngのpZMP20ベクターと配合し、混合物を0.2cmエレクトロポレーション用キュベットに移す。酵母／DNA混合物に、0.75kV（5kV／cm）、∞オームおよび25μFの電源（BioRad Laboratories, Hercules, CA）設定を用いて電気パルスを与える。600μlの1.2Mソルビトールをキュベットに添加して、酵母を100μlおよび300μlのアリコートにして2枚のURA-Dプレートにプレーティングし、30℃でインキュベートする。約72時間後に、単一プレート由来のUra+酵母形質転換体を1ml H2O中に再懸濁させ、短時間遠心して酵母細胞をペレット化する。細胞ペレットを0.5mlの溶解バッファー（2％ Triton X-100、1％ SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA）中に再懸濁させる。500μlの溶解混合物を、酸洗浄した250μlのガラスビーズおよび300μlのフェノール-クロロホルムを含むEppendorfチューブに添加し、3分間ボルテックス処理して、Eppendorf遠心分離機にて最大速度で5分間遠心する。水相の300μlを新たなチューブに移し、DNAを600μlのエタノールで沈降させ、その後に最大速度で30分間の遠心を行う。チューブをデカント処理し、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄する。チューブをデカント処理し、DNAペレットを30μlの10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA中に再懸濁させる。
【０３１８】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（DH12S）の形質転換は、5μlの酵母DNA調製物および50μlの大腸菌細胞を用いて行う。細胞に2.0kV、25μFおよび400オームの電気パルスを与える。エレクトロポレーションの後に、1mlのSOC（2％ Bacto（商標）Tryptone（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース）を添加し、続いて細胞を50μlおよび200μlのアリコートにして2枚のLB AMPプレート（LB培地（Lennox）、1.8％ Bacto（商標）Agar（Difco）、100mg／Lアンピシリン）にプレーティングする。
【０３１９】
構築物用の3種のDNAクローンのインサートを配列解析にかけて、正しい配列を含む1つのクローンを選択する。大規模なプラスミドDNAを、市販のキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を製造元の指示に従って用いて単離する。
【０３２０】
同じ工程を用いて、Gly Ser Gly Gly His His His His His Hisで構成されるC末端hisタグを伴うFcγRIb1（FcγRIb1-CHIS）、またはGly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysで構成されるC末端FLAGタグを伴うFcγRIb1（FcγRIb1-CFLAG）を調製する。これらの構築物を調製するためには、3'オリゴヌクレオチド「211」の代わりに、FcγRIb1-CHISの作製のためには3'オリゴヌクレオチド「311」
2010516769.tif 000018
を用い、またはFcγRIb1-CFLAGの作製のためには3'オリゴヌクレオチド「411」
2010516769.tif 000019
を用いる。
【０３２１】
実施例5
FcγRIb1-CEE、FcγRIb1-CHISおよびFcγRIb1-CFLAG C末端タグ付加タンパク質を発現する可溶性FcγRIb1受容体発現構築物のトランスフェクションおよび発現
200μgの各々の可溶性FcγRIb1タグ付加発現構築物の3つのセットを、200単位のPvuIにより37℃で3時間かけて別々に消化し、イソプロピルアルコールで沈降させて、1.5mL微量遠心管内で遠心する。上清をデカントしてペレットを残し、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄して、室温で5分間インキュベートさせる。チューブを微量遠心機にて14,000RPMで10分間遠心し、上清をデカントしてペレットを残す。続いてペレットを750μlのCHO細胞組織培養液に無菌環境下で再懸濁させ、60℃で30分間インキュベートした上で、室温まで冷却させる。およそ5×106個のCHO細胞を3本のチューブのそれぞれの中でペレット化し、DNA-培地溶液を用いて再懸濁させる。このDNA／細胞混合物を0.4cmギャップのキュベットに入れ、以下のパラメーターを用いてエレクトロポレーションを行う；950μF、高キャパシタンス、300V。続いてキュベットの内容物を取り出してプールし、CHO細胞組織培養液で25mLに希釈した上で、125mL振盪フラスコに入れる。フラスコを37℃、6％ CO2の振盪機に載せたインキュベーターに入れて、120RPMで振盪する。
【０３２２】
このCHO細胞を栄養素選択にかけ、その後に、200nMメトトレキサート（MTX）に対して、続いて1μM MTXに対しての段階的増幅を行う。タグ付加タンパク質の発現をウエスタンブロットによって確認し、タンパク質精製用の収集のためにCHO細胞のプールの規模を拡大させる。
【０３２３】
実施例6
FcγRIc-CEE、FcγRIc-CHISおよびFcγRIc-CFLAGタグ付加タンパク質を発現する哺乳動物可溶性FcγRIc発現構築物の構築
ヒトFcγRIcの細胞外ドメインをGlu-Glu（CEE）、6×His（CHIS）またはFLAG（CFLAG）のいずれかのC末端タグとともに含む発現構築物を、PCR、ならびにFcγRIcをコードするDNA断片（SEQ ID NO：25）および発現ベクターpZMP20を用いた相同組換えを介して構築する。
【０３２４】
FcγRIc-CEEをコードするPCR断片は、5'非翻訳領域におけるpZMP20ベクター配列との5'重複部、SEQ ID NO：25のFcγRIc細胞外ドメインコード領域部分（ヌクレオチド1〜570）、Glu-Gluタグ（Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu；SEQ ID NO：13）コード配列、およびポリオウイルス配列内リボソーム進入部位領域におけるpZMP20ベクターとの3'重複部を含む。PCR増幅反応は、5'オリゴヌクレオチド「100」
2010516769.tif 000020
、3'オリゴヌクレオチド「211」
2010516769.tif 000021
、およびテンプレートとして以前に作製したFcγRIcのDNAクローン（SEQ ID NO：25）を用いる。
【０３２５】
PCR増幅反応の条件は以下の通りである：94℃、5分間を1サイクル；94℃、1分間、続いて55℃、2分間、さらに続いて72℃、3分間を35サイクル；72℃、10分間を1サイクル。PCR反応混合物を1％アガロースゲル上で泳動させ、予想されるサイズに対応するDNA断片を、QIAquick（商標）Gel Extraction Kit（Qiagen, カタログ番号28704）を用いて抽出する。
【０３２６】
プラスミドpZMP20は、キメラ性CMVエンハンサー／MPSVプロモーター、酵母組換えの前の線状化のためのBglII部位、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入エレメント、膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインを有する発現カセット；大腸菌複製起点；SV40プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、DHFR遺伝子およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現ユニット；ならびにS.セレビシエにおける選択および複製のために必要なURA3配列およびCEN-ARS配列を含む、哺乳動物発現ベクターである。
【０３２７】
プラスミドpZMP20をBglIIで消化し、その後に、ゲル抽出したFcγRIc-CEE PCR断片により、酵母における組換えを行う。100μlのコンピテント酵母（S.セレビシエ）細胞を、10μlのFcγRIc-CEEインサートDNAおよびBglII消化した100ngのpZMP20ベクターと配合し、混合物を0.2cmエレクトロポレーション用キュベットに移す。酵母／DNA混合物に、0.75kV（5kV／cm）、∞オームおよび25μFの電源（BioRad Laboratories, Hercules, CA）設定を用いて電気パルスを与える。600μlの1.2Mソルビトールをキュベットに添加して、酵母を100μlおよび300μlのアリコートにして2枚のURA-Dプレートにプレーティングし、30℃でインキュベートする。約72時間後に、単一プレート由来のUra+酵母形質転換体を1ml H2O中に再懸濁させ、短時間遠心して酵母細胞をペレット化する。細胞ペレットを0.5mlの溶解バッファー（2％ Triton X-100、1％ SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA）中に再懸濁させる。500μlの溶解混合物を、酸洗浄した250μlのガラスビーズおよび300μlのフェノール-クロロホルムを含むEppendorfチューブに添加し、3分間ボルテックス処理して、Eppendorf遠心分離機にて最大速度で5分間遠心する。水相の300μlを新たなチューブに移し、DNAを600μlのエタノールで沈降させ、その後に最大速度で30分間の遠心を行う。チューブをデカント処理し、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄する。チューブをデカント処理し、DNAペレットを30μlの10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA中に再懸濁させる。
【０３２８】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（DH12S）の形質転換は、5μlの酵母DNA調製物および50μlの大腸菌細胞を用いて行う。細胞に2.0kV、25μFおよび400オームの電気パルスを与える。エレクトロポレーションの後に、1mlのSOC（2％ Bacto（商標）Tryptone（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース）を添加し、続いて細胞を50μlおよび200μlのアリコートにして2枚のLB AMPプレート（LB培地（Lennox）、1.8％ Bacto（商標）Agar（Difco）、100mg／Lアンピシリン）にプレーティングする。
【０３２９】
構築物用の3種のDNAクローンのインサートを配列解析にかけて、正しい配列を含む1つのクローンを選択する。大規模なプラスミドDNAを、市販のキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を製造元の指示に従って用いて単離する。
【０３３０】
同じ工程を用いて、Gly Ser Gly Gly His His His His His Hisで構成されるC末端hisタグを伴うFcγRIc（FcγRIc-CHIS）、またはGly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysで構成されるC末端FLAGタグを伴うFcγRIc（FcγRIc-CFLAG）を調製する。これらの構築物を調製するためには、3'オリゴヌクレオチド「211」の代わりに、FcγRIcCHISの作製のためには3'オリゴヌクレオチド「311」
2010516769.tif 000022
を用い、またはFcγRIc-CFLAGの作製のためには3'オリゴヌクレオチド「411」
2010516769.tif 000023
を用いる。
【０３３１】
実施例7
FcγRIc-CEE、FcγRIc-CHISおよびFcγRIc-CFLAG C末端タグ付加タンパク質を発現する可溶性FcγRIc受容体発現構築物のトランスフェクションおよび発現
200μgの各々の可溶性FcγRIcタグ付加発現構築物の3つのセットを、200単位のPvuIにより37℃で3時間かけて別々に消化し、イソプロピルアルコールで沈降させて、1.5mL微量遠心管内で遠心する。上清をデカントしてペレットを残し、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄して、室温で5分間インキュベートさせる。チューブを微量遠心機にて14,000RPMで10分間遠心し、上清をデカントしてペレットを残す。続いてペレットを750μlのCHO細胞組織培養液に無菌環境下で再懸濁させ、60℃で30分間インキュベートした上で、室温まで冷却させる。およそ5×106個のCHO細胞を3本のチューブのそれぞれの中でペレット化し、DNA-培地溶液を用いて再懸濁させる。このDNA／細胞混合物を0.4cmギャップのキュベットに入れ、以下のパラメーターを用いてエレクトロポレーションを行う；950μF、高キャパシタンス、300V。続いてキュベットの内容物を取り出してプールし、CHO細胞組織培養液で25mLに希釈した上で、125mL振盪フラスコに入れる。フラスコを37℃、6％ CO2の振盪機に載せたインキュベーターに入れて、120RPMで振盪する。
【０３３２】
このCHO細胞を栄養素選択にかけ、その後に、200nMメトトレキサート（MTX）に対して、続いて1μM MTXに対しての段階的増幅を行う。タグ付加タンパク質の発現をウエスタンブロットによって確認し、タンパク質精製用の収集のためにCHO細胞のプールの規模を拡大させる。
【０３３３】
実施例8
FcγRIA-CH6の精製
ヒトFcγRIAの細胞外ドメインをC末端6×His（CHIS）タグとともに含む発現構築物を、実施例1、前記に記載した通りに構築した。この構築物を、実施例2、前記に記載した通りにCHO細胞にトランスフェクトして発現させた。上記の実施例で「FcγRIA-CHIS」と称している、コードされたHisタグ付加FcγRIAを、本明細書では「FcγRIA-CH6」または「pFCGR1A CH6」とも称する。FcγRIA-CH6のヌクレオチドコード配列はSEQ ID NO：30に示されており、対応するFcγRIA-CH6アミノ酸配列はSEQ ID NO：31に示されている。発現されたFcγRIA-CH6を以下の通りに精製した。
【０３３４】
FcγRIA-CH6を、Ni IMACキャプチャー、Q Sepharose上でのクロマトグラフィー、およびSuperdex 200上でのサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによってCHO馴化培地から精製した。Ni IMACキャプチャー：CHO馴化培地は滅菌濾過し（0.22μm）、10kD MWCO 0.1m2膜を装着したペリスタポンプシステムを用いて10倍に濃縮した。濃縮した培地のバッファー交換を少なくとも5CVの50mM NaPO4、500mM NaCl pH 7.5を用いて行い、イミダゾールの最終濃度を25mMに調整した。pHは濃縮NaOHまたはHClを必要に応じて用いて7.5に調整した。His-タグ付加FcγRIAタンパク質を、Ni-NTA His Bind Superflow樹脂に対するIMACの結合を用いてキャプチャーした。培地の適用の前に、樹脂を50mM NaPO4、500mM NaCl、25mMイミダゾール pH 7.5により平衡化した。結合は、適切なサイズの回転瓶を用いるバッチ方式、またはクロマトグラフィーステーションを用いるカラム方式のいずれかを用いて4℃で一晩行わせた。ローディングの後に、樹脂を少なくとも10CVの50mM NaPO4、500mM NaClおよび25mMイミダゾール pH 7.5で洗浄した。結合したタンパク質の溶出は、50mM NaPO4、500mM NaCl pH 7.5中のイミダゾール濃度を上昇させる勾配または段階を用いて行い、500mMイミダゾールを溶出の終点とした。画分を収集してウエスタンブロット法、SDS-PAGEおよびRP-HPLCにより分析し、FcγRIA-CH6を含む画分をまとめた。
【０３３５】
Q Sepharoseパッシブクロマトグラフィー：FcγRIA-CH6を含むIMACプールを、3×10kD MWCO 0.1cm2膜を装着したLabscale TFFシステムの使用を通じて、15CVを用いて50mM NaPO4、150mM NaCl pH 7.5にバッファー交換した。7.5μgのFcγRIA-CH6当たり1.0mLのQ Sepharose樹脂の試料を、少なくとも10CVの50mM NaPO4、2M NaCl pH 7.5を用いて充填し、続いて10CVの50mM NaPO4、150mM NaCl pH 7.5を用いて平衡化した。樹脂および調整したIMACプールをまとめて、ゆっくりと撹拌しながら4℃で一晩インキュベートした。スラリーを自然流下カラムに移し、素通り成分（flow-through）を収集して、カラムを少なくとも5CVの平衡化バッファーで洗浄した。素通り画分および洗浄画分をまとめて、FcGγRIA-CH6の存在に関してRP-HPLCおよびSDS-PAGEにより評価した。
【０３３６】
サイズ排除クロマトグラフィー：Q Sepharoseの素通り画分＋洗浄画分を、10kD MWCO 0.1cm2膜を装着したTFF labscaleシステム、適切な直径のYM30膜、または30kD MWCO Ultracel遠心分離膜を装着した撹拌セルシステムのいずれかを分画容積に応じて用いて、少なくとも10〜20倍に濃縮した。濃縮FcγRIA-CH6画分を、注入される容積および質量の量に応じた適切なサイズのSuperdex 200カラムに上から注入した。カラムを、50mM NaPO4、109mM NaCl、pH 7.3または35mM NaPO4、120mM NaCl pH 7.2を含む調合用バッファーで平衡化した。カラムを45cm／hrを超えない流速で均一濃度で溶出させ、画分を収集して、FcγRIA-CH6の存在に関してSDS-PAGEおよびRP-HPLCにより分析した。FcγRIA-CH6を含む画分をまとめ、YM30膜（30kD MWCO）を装着した撹拌セル装置を用いて所望の濃度に濃縮した。最終的なFcγRIA-CH6濃縮液を0.22μm滅菌フィルターに通して濾過し、使用時まで-80℃で保存した。
【０３３７】
実施例9
可溶性FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6の構築、発現および精製
実施例2、3および8、前記に上述したような、C末端His6タグを伴う可溶性単量体形態のFcγRIAの構築、発現および精製に加えて、可溶性単量体形態のFcγRIIAおよびFcγRIIIAも、同様の方法を用いて作製した。
【０３３８】
手短に述べると、可溶性単量体形態のFcγRIIAおよびFcγRIIIAをコードする発現構築物を、それらのネイティブ性シグナル配列、それらの細胞外ドメインおよびC末端His6タグ
2010516769.tif 000024
をコードするDNA配列を用いて作製した。DNA配列は、FcγRIIAについてはアミノ酸1〜212（SEQ ID NO：33のアミノ酸1〜212）を、FcγRIIIAについては1〜195（SEQ ID NO：35のアミノ酸1〜195）をコードした。受容体を、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）DXB-11細胞（Larry Chasin, Columbia University, New York, NY）由来の上清から精製した。CHO馴化培地を滅菌濾過し、濃縮して、50mM NaPO4、500mM NaCl、25mMイミダゾール、pH 7.5（バッファーA）にバッファー交換した。His-タグ付加FcγRタンパク質（FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6）を、バッファーAで平衡化したNi-NTA His Bind Superflow樹脂（Novagen, Madison, WI）を用いてキャプチャーした。結合したタンパク質の溶出は、50mM NaPO4、500mM NaCl、pH 7.5中でのイミダゾールの勾配（0〜500mM）を用いて行った。画分を可溶性FcγRに関してSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法によって分析した（抗6×ヒスチジンHRPマウスIgG1、R & D Systems, Minneapolis, MN）。
【０３３９】
可溶性FcγRを含むNi-NTA画分を50mM NaPO4、150mM NaCl、pH 7.5（バッファーB）にバッファー交換して、バッファーBであらかじめ平衡化しておいたQ Sepharose 4FF樹脂（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）とともに4℃で一晩インキュベートした。上記のように、スラリーを自然流下カラムに移し、素通り画分および洗浄画分をまとめて、可溶性FcγRの存在に関して評価した。まとめた画分を濃縮し、50mM NaPO4、109mM NaCl、pH 7.3（バッファーC）で平衡化したSuperdex 200 Hiload（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）カラムの上に注入した。カラムをバッファーCで溶出させ、可溶性FcγRを含む画分をまとめ、濃縮し、滅菌濾過した上で-80℃で保存した。FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6を、SDS-PAGE、ウエスタンブロット法、N末端シークエンシングおよびサイズ排除マルチアングル光散乱によって分析した。エンドトキシンレベルは、ほぼ20mg／mLで調合した各受容体調製物とも1.0エンドトキシン単位／mL未満であった。
【０３４０】
FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6に関するヌクレオチドコード配列はそれぞれSEQ ID NO：32およびSEQ ID NO：34に示されている。FcγRIIA-CH6およびFcγRIIA-CH6に関するコードされたポリペプチド配列はそれぞれSEQ ID NO：33およびSEQ ID NO：34に示されている。N末端配列解析により、Gln-34が成熟FcγRIIA-CH6の場合の開始部位として、ならびにMet-18およびGlu-21が成熟FcγRIIIA-CH6の場合の開始部位として示された。このため、シグナル配列を伴わない成熟型のFcγRIIA-CH6ポリペプチドはSEQ ID NO：33のアミノ酸残基34〜222に対応し、一方、成熟型のFcγRIIIA-CH6はSEQ ID NO：35のアミノ酸残基18〜205および21〜205に対応する。
【０３４１】
実施例10
固定化されたヒトIgG1に対する可溶性His-タグ付加FcγR（FcγRIA-CH6、FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6）の結合
測定はBiacore 3000装置（Piscataway, NJ）を用いて行った。センサーチップ表面の活性化およびIgG1抗体（ヒト骨髄腫由来のLambda、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）の共有結合性固定化は、0.2M N-エチル-N'-(3-ジエチルアミノ-プロピル)カルボジイミドおよび0.05M N-ヒドロキシスクシンアミドおよびBiacore Control Softwareを用いて行った。10mM酢酸ナトリウム、pH 5.0中に11μg／mLに希釈したヒトIgG1抗体を固定化して特異的結合フローセルを調製し、第2のフローセルは活性化させたがIgG1には曝露させずに参照フローセルを調製した。特異的結合フローセルおよび参照フローセルの両方の反応しなかったエステル部位は、1M塩酸エタノールアミンでブロックした。
【０３４２】
可溶性FcγRIA結合の速度論的分析のために、IgG1抗体を458共鳴単位（RU）のレベルで固定化した。FcγRIA-CH6を、一連の活性フローセルおよび参照フローセルの両方の上から注入した。FcγRIA-CH6結合の速度論的分析のためには、濃度範囲0.16〜10.3×10-9MのFcγRIA-CH6を、HBS-EP（Biacore）アッセイ用バッファー（10mM Hepes、pH 7.4、0.15M NaCl、3.5mM EDTA、0.005％ポリソルベート20）中で用いた。FcγRIA-CH6を、40μL／分の流速で3分間注入した。その後に、FcγRIA-CH6溶液をHBS-EPバッファーに切り替え、解離を3分間にわたり測定した。FcγRIA-CH6の各濃度をランダムな順序で2回ずつ試験した。各測定の後に、10mMグリシン-HCl、pH 1.8の50μL／分での単回の30秒間注入を行って、IgG1表面を再生させた。
【０３４３】
可溶性FcγRIIAおよびFcγRIIIA結合の平衡分析のためには、IgG1抗体を1013RUのレベルで固定化した。濃度範囲0.03〜24×10-6Mの可溶性FcγRを用いた。各可溶性FcγR（FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6）を、10μL／分の流速で1分間にわたり注入した。各FcγRについての解離時間は5分間であった。FcγRIIA-CH6およびFcγPIIIA-CH6の各濃度をランダムな順序で2回ずつ試験した。各測定の後に、HBS-EPの30μL／分での単回の30秒間注入を行って、IgG1表面を再生させた。
【０３４４】
3種すべての可溶性FcγRに関する結合曲線を、特異的結合表面曲線からの参照表面曲線の減算、ならびにバッファー注入曲線の減算によって処理した。処理した結合曲線を1：1結合モデルにグローバルフィッティングさせ、その結果得られた速度定数および平衡定数をBiacoreソフトウエアを用いて評価した。
【０３４５】
可溶性FcγRは、固定化されたヒトIgG1と、1：1結合相互作用がベストフィットする様式で結合した。IgG1は共有結合性固定化によって結合活性のある程度の損失を示し、表面の活性は理論上の最大の26〜81％であった。IgG1に対するFcγRIA-CH6結合の会合相および解離相は200秒を上回る期間にわたって測定可能であり、これにより結合曲線の速度論的分析が可能になった。FcγRIA-CH6はIgG1に対して、それぞれ2.8×106M-1s-1および4.6×10-4s-1の会合（ka）および解離（kd）速度定数で結合し、平衡解離定数（KD）は1.7×10-10Mであった。FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6に関する会合／解離速度はあまりに速いために正確に測定することができず、そのため平衡解離定数は定常状態で判定した。IgG1に対するFcγRIIIA-CH6およびFcγRIIA-CH6の結合は飽和性かつ低親和性であり、推定KDはそれぞれ0.63×10-6Mおよび1.9×10-6Mであった。各可溶性FcγRは、固定化されたウサギ抗OVA IgGに対して、ヒトIgG1について観察されたものと同程度の速度および親和性で結合した。
【０３４６】
実施例11
FcγRIA-Ig融合タンパク質の精製
プロテインAアフィニティー精製：投入される0.22μm濾過培地を、RP-HPLCおよびIgタグの重鎖に対するプロービングを行う定量的ウエスタンブロットを用いて、融合タンパク質の発現に関して評価する。結合能が充填層1mL当たり15mgの融合タンパク質を上回らないと仮定して、適切なサイズのプロテインAカラムを構築する。用いる樹脂は、Poros A50（AB Biosystems）または組換えプロテインA Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）のいずれかであってよい。カラムをZGI 1×PBSで平衡化し、樹脂の最大流速および圧力定格を超えないように確認しながら、培地を4Cのカラムの上からローディングする。プロテインA樹脂のローディングは複数日にわたって行うことができ、10〜20Lの投入培地については一晩のローディングが典型的である。ローディングが完了したところで、カラムを少なくとも10CVのZGI 1×PBSで洗浄し、A280nmの吸光度をモニターして、溶出前の少なくとも1CVにわたってベースラインで安定であることを確認する。結合したタンパク質の溶出は、0.1Mグリシン、pH 3.0を用いたpHシフトを介して行う。画分は、即時中和のために十分な2M Tris pH 8.0の存在下で収集する。収集した画分をRP-HPLCおよびSDS-PAGEを介して分析し、Ig融合タンパク質の存在に基づいてプールする。
【０３４７】
Igタグがヒト以外の種に基づく場合には、用いるのに適切な樹脂（プロテインA、GまたはL）は、その種のIgサブクラスの樹脂に対する親和性に基づいて決定されなければならない（文献）。ヒト以外の種のIg融合物に関するプロテインG（またはL）Sepharose（GE Healthcare）の能力は、経験的に決定されなければならないと考えられる。
【０３４８】
下流処理：通常、アフィニティー溶出プールは、あらゆる他の従来のクロマトグラフィー手法を割愛できる程度に純粋であるが、もしそうでない場合には、数多くの手法の任意の1つまたは組み合わせを用いることによってさらなる精製を行うことができる。これらの手法には、以下のものが非限定的に含まれる：陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、セラミックハイドロキシアパタイトおよび熱凝集IgG Sepharoseアフィニティー樹脂の使用。
【０３４９】
サイズ排除クロマトグラフィー：プロテインA溶出プールを、適切な濾過機構を用いて少なくとも10〜20倍に濃縮する。この機構には、1×50kD MWCO 0.1cm2膜（Millipore）が装着されたTFF labscaleシステム、適切な直径のYM30膜（Millipore）、または30kD MWCO Ultracel遠心分離膜（Millipore）が装着された撹拌セルシステムが非限定的に含まれうる。溶液の容積によって用いる機構が決定され、上記のリストはそれぞれ大容積から小容積となっている。濃縮液を、注入される容積および質量の量に応じた適切なサイズのSuperdex 200カラム（GE Healthcare）に上から注入する。典型的には、注入される容積はカラム容積の7％を超えず、分解能を高めるために慣例的には複数回の注入が行われる。カラムを、ほぼ等張性のリン酸緩衝食塩溶液である調合用バッファーで平衡化する。用いられた溶液は以下であった：50mM NaPO4、109mM NaCl、pH 7.3および35mM NaPO4、120mM NaCl pH 7.2。カラムを45cm／hrを超えない流速で均一濃度で溶出させ、画分を収集する。溶出画分をSDS-PAGEおよびRP-HPLCによって分析し、可能な最も高い純度のIg融合タンパク質を得るためにプールする。この段階は、融合タンパク質を、凝集物およびあらゆる残留性のより低分子量の宿主細胞混入物から分離させる。
【０３５０】
最終処理：サイズ排除プールを適切な濃度に濃縮するが、それは20mg／mLを上回りうる。濃縮は、YM30膜（30kD MWCO）を装着した撹拌セル装置を用いて行う。最終的な濃縮液をシリンジフィルター（Millipore）を用いて0.22μm濾過し、アリコートにして所望のチューブ（Starstedt）に入れて、-80℃で保存する。
【０３５１】
実施例12
可溶性単量体非タグ付加FcγRIAタンパク質を発現する哺乳動物可溶性FcγRIA発現構築物の構築
ヒトFcγRIAの細胞外ドメインを含む2種の発現構築物を、PCR、ならびに短い型のFcγRIA（SEQ ID NO：2のアミノ酸1〜282）および長い型のFcγRIA（C末端に10アミノ酸が追加）（SEQ ID NO：2アミノ酸1〜292）の細胞外ドメインをコードするDNA断片、および発現ベクターpZMP31を用いる相同組換えによって構築した。
【０３５２】
短い型および長い型のFcγRIAをコードするPCR断片を、5'非翻訳領域におけるpZMP31ベクター配列との5'重複部、SEQ ID NO：2のアミノ酸残基のそれぞれ1〜282または1〜292に対応するFcγRIA細胞外ドメインコード領域、およびポリオウイルス配列内リボソーム進入部位領域におけるpZMP31ベクターとの3'重複部を含むように構築した。短い型および長い型の両方のためのPCR増幅反応に、5'オリゴヌクレオチド「zc57709」
2010516769.tif 000025
を用いた。短い型のためには3'オリゴヌクレオチド「zc57710」
2010516769.tif 000026
を用い、長い型のためには3'オリゴヌクレオチド「zc57712」
2010516769.tif 000027
を用いた。FcγRIAテンプレートは、FcγRIAの以前に作製したcDNAからのものとした。
【０３５３】
PCR増幅反応条件は以下の通りとした：95℃、2分間を1サイクル；95℃、15秒間、続いて55℃、30秒間、さらに続いて68℃、1分間を30サイクル。PCR反応混合物を1％アガロースゲル上で泳動させ、予想されるサイズに対応するDNA断片を、GE Healthcare illustra GFX（商標）PCR DNA and Gel Band Purificationキットを用いてゲルから抽出した。
【０３５４】
プラスミドpZMP31は、キメラ性CMVエンハンサー／MPSVプロモーター、酵母組換えの前の線状化のためのEcoRI部位、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入エレメントを有する発現カセット；大腸菌複製起点およびアンピシリン選択マーカー；SV40プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、DHFR遺伝子およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現ユニット；ならびにS.セレビシエにおける選択および複製のために必要なURA3配列およびCEN-ARS配列を含む、哺乳動物発現ベクターである。
【０３５５】
プラスミドpZMP31をEcoRIで消化し、その後に、ゲル抽出した短い型および長い型のFcγRIA PCR断片のそれぞれにより、酵母における組換えを行う。100μlのコンピテント酵母（S.セレビシエ）細胞を、20μlのFcγRIAの短いインサートDNAまたは長いインサートDNA、およびEcoRI消化したほぼ100ngのpZMP31ベクターと配合した。この混合物を0.2cmエレクトロポレーション用キュベットに移した。酵母／DNA混合物に、0.75kV（5kV／cm）、∞オームおよび25μFの電源（BioRad Laboratories, Hercules, CA）設定を用いて電気パルスを与えた。600μlの1.2Mソルビトールをキュベットに添加して、酵母を2つの300μlアリコートにして2枚のURA-Dプレートにプレーティングし、30℃でインキュベートした。約72時間後に、単一プレート由来のUra+酵母形質転換体を800μl H2O中に再懸濁させ、短時間遠心して酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを0.5mlの溶解バッファー（2％ Triton X-100、1％ SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH 8.0、1mM EDTA）中に再懸濁させた。500μlの溶解混合物を、酸洗浄した250μlのガラスビーズおよび300μlのフェノール-クロロホルムを含むEppendorfチューブに添加し、3分間ボルテックス処理して、Eppendorf遠心分離機にて最大速度で5分間遠心した。水相の300μlを新たなチューブに移し、DNAを600μlのエタノールで沈降させ、その後に最大速度で10分間の遠心を行った。チューブをデカント処理し、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄して、その後に最大速度で10分間の遠心を行った。チューブをデカント処理し、DNAペレットを10μlのH2O中に再懸濁させた。
【０３５６】
エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞（DH10B）の形質転換は、1μlの酵母DNA調製物および20μlの大腸菌細胞を用いて行った。細胞に2.0kV、25μFおよび400オームの電気パルスを与えた。エレクトロポレーションの後に、600μlのSOC（2％ Bacto（商標）Tryptone（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mMグルコース）を添加し、続いて細胞を50μlおよび550μlのアリコートにして2枚のLB AMPプレート（LB培地（Lennox）、1.8％ Bacto（商標）Agar（Difco）、100mg／Lアンピシリン）にプレーティングした。
【０３５７】
コロニーをコロニーPCRを介してスクリーニングし、各構築物からの5つのDNAクローンのインサートを配列解析にかけた。正しい配列を含む1つのクローンを選択した。DNAシークエンシングは、ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて行った。シークエンシング反応物はEdgeBioSystems Preforma Centriflex Gel Filtration Cartridges（Gaithersburg, MD）を用いて精製し、Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer（Applied Biosystems, Foster City, CA）に通した。その結果得られた配列データを、Sequencher v4.6ソフトウエア（GeneCodes Corporation, Ann Arbor, MI）を用いてアセンブルして編集した。正しい配列を含む1つのクローンを選択し、大規模なプラスミドDNAを、市販のキット（QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA）を製造元の指示に従って用いて単離した。
【０３５８】
短い型および長い型のインサートDNAの配列はそれぞれSEQ ID NO：39およびSEQ ID NO：41に示されている。対応する、短い型および長い型の非タグ付加FcγRIAのコードされたアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID NO：40およびSEQ ID NO：42に示されている。FcγRIAのシグナル配列はSEQ ID NO：2のアミノ酸1〜15（SEQ ID NO：40および42の残基1〜15）に対応し、それ故、SEQ ID NO：40および42の16位に、成熟非タグ付加FcγRIAタンパク質の開始部位が生じている。
【０３５９】
実施例13
非タグ付加FcγRIAタンパク質を発現する可溶性FcγRIA受容体発現構築物のトランスフェクションおよび発現
200μgずつの短い型および長い型の可溶性FcγRIAの発現構築物を200単位のBstB1により37℃で18時間（一晩）消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで洗浄して、エタノールで沈降させて、1.5mL微量遠心管内で遠心した。上清をデカントしてペレットを残し、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄して、室温で5分間インキュベートさせた。チューブを微量遠心機にて14,000RPMで10分間遠心し、上清をデカントしてペレットを残した。続いてペレットを200μlのCHO細胞組織培養液に無菌環境下で再懸濁させ、37℃で30分間インキュベートした。およそ1×107個のCHO細胞をペレット化し、DNA-培地溶液を用いて再懸濁させた。このDNA／細胞混合物を0.4cmギャップのキュベットに入れ、以下のパラメーターを用いてエレクトロポレーションを行った；950μF、高キャパシタンス、300V。続いてキュベットの内容物を取り出してプールし、CHO細胞組織培養液で25mLに希釈した上で、125mL振盪フラスコに入れた。フラスコを37℃、5％ CO2の振盪機に載せたインキュベーターに入れて、120RPMで振盪した。
【０３６０】
このCHO細胞を栄養素選択および200nMメトトレキサート（MTX）に対しての増幅にかけた。タグ付加タンパク質の発現をウエスタンブロットによって確認し、タンパク質精製用の収集のためにCHO細胞のプールの規模を拡大させた。
【０３６１】
実施例14
非タグ付加FcγRIAの精製
以下の方法が、CHO DXB11細胞馴化培地からの非タグ付加FcγR1aの精製のために適用される。
【０３６２】
A．IgGアフィニティークロマトグラフィー
非希釈（1×）培地を収集し、IgG Sepharose 6 Fast Flow樹脂（GE Healthcare）を含むカラムの上から15cm／hの流速でローディングした。10Lの馴化培地に対しては、150mLの充填樹脂を含む直径5cmのカラムを用いた。培地のローディングの後に、少なくとも2カラム容積（CV）にわたって215nmでの吸光度およびA280nmがベースラインに復帰するまで、カラムを1.6mMクエン酸、23mM二塩基NaPO4、150mM NaCl pH 7.0により100cm／hで洗浄した。結合したタンパク質の溶出は、流速61cm／hでの、20mMクエン酸、5mM二塩基NaPO4、0.05％ Tween 20、pH 3.0による10CVの下行性pH勾配を用いて行った。FcγRIAを含む画分をSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法によって同定し、最終濃度0.2Mとなるまで2M Tris pH 7.0の添加によって中和して、4M NaClの添加によって100mM NaClに至らせた。
【０３６３】
B．陽イオン交換クロマトグラフィー
FcγRIAプールからTween-20をHS50クロマトグラフィーによって除去した。FcγRIA溶出プールを固体MESおよびHClを用いて10mM MES pH 6.0に調整し、10mM MES pH 6.0を用いて5mS／cm未満となるまで希釈した。FcγRIA含有プールをHS50カラムにローディングして流速141cm／hで定量的キャプチャーを行った上で、A215およびA280nmのUVシグナルが少なくとも5CVにわたってベースラインに復帰するまで、10mM MES pH 6.0により樹脂を382cm／hで洗浄した。結合したFcγRIAを、最大で10mM MES、2M NaCl pH 6.0からなる60％溶出バッファーまで、5CVを用いてNaCl濃度を上昇させる勾配により、382cm／hrで溶出させた。画分を収集し、FcγRIAをSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法によって同定した。
【０３６４】
C．サイズ排除クロマトグラフィー
タンパク質の量を280nmの吸光度によって評価し、バッファー交換したHS50溶出プールのFcγRIA含有画分を、存在するFcγRIAの量に応じて、30kD分子量カットオフ（MWCO）Ultracel遠心濃縮器またはYM30 63.5mm撹拌セル膜を用いて濃縮した。最終的な濃縮液の容積は、用いたゲル濾過カラムの容積の3％を超えなかった。濃縮したFcγRIAプールをSuperdex 75カラム上に注入し（FcγRIAが1mg未満の場合は、カラムサイズを10／300mmとした；1〜10mgの場合は、カラムサイズを16／60mmとした；10mg超の場合には、カラムサイズを26／60mmとした）、タンパク質を流速34〜76cm／hで均一濃度で溶出させた。用いた移動相は35mM NaPO4、120mM NaCl pH 7.2であった。画分を収集し、FcγRIAをSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法によって同定した。FcγRIA含有画分を上記のように最終濃度20mg／mLまで濃縮し、0.22μm滅菌フィルターに通過させて、-80℃で保存した。FcγRIAの実体はN末端シークエンシングおよびアミノ酸分析によって確認された。N末端配列解析により、成熟タンパク質が、アミノ酸位置16のグルタミン残基から翻訳後変換されたピログルタミン酸で始まることが示された。
【０３６５】
実施例15
可溶性FcγRIAの抗炎症活性
A．免疫複合体沈降
鶏卵オブアルブミン（OVA）をリン酸緩衝食塩水（PBS）中に最終濃度15.0μg／mLとして溶解し、指定濃度の可溶性FcγRIAの存在下または非存在下で、300μg／mLのウサギポリクローナル抗OVA抗体と配合して最終容積を200μLとした。その直後から、分光光度計を利用して、反応混合物の350nmでの濁度を37℃で30秒毎に5〜10分間にわたってモニターした。線形回帰を利用して濁度曲線の直線部分の傾きを計算し、免疫複合体沈降のFcγR媒介性阻害を、OVAおよびOVAのみを含むインキュベーションに対して相対的に表現した。
【０３６６】
B．マスト細胞からのサイトカイン分泌
免疫複合体は、300uLのウサギポリクローナル抗OVAを、75.0μLの1mg OVA／mL、PBS中と混合して、PBSの最終容積を5.0mlとすることによって調製した。37℃での30〜60分間のインキュベーションの後に、混合物を4℃に18〜20時間おいた。免疫複合体を12,000rpm、5.0分間の遠心によって収集し、上清画分を取り出して廃棄し、沈降した免疫複合体を1.0mLの氷冷PBS中に再懸濁させた。もう1回の洗浄の後に、免疫複合体を最終容積1.0mLの氷冷PBS中に再懸濁させた。タンパク質濃度はBCAアッセイを用いて決定した。
【０３６７】
MC／9細胞を、0.5〜3×106個／mLの密度となるまで、培地A（10％ウシ胎仔血清、50.0μM B-メルカプトエタノール、0.1mM非必須アミノ酸、1.0mMピルビン酸ナトリウム、36.0μg／mLのL-アスパラギン、1.0ng／mLのrmIL-3、5.0ng／mLのnmIL-4、25.0ng／mLのrmSCFを含むDMEM）中で継代培養した。細胞を1500rpm、5.0分間の遠心によって収集し、細胞ペレットを培地A（サイトカインを含まない）で洗浄して、培地A中に2.0×106個／mLで再懸濁させた。細胞のアリコート（2.0×105個）を、10.0μg／ウェルのOVA／抗OVA免疫複合体（IC）とともに、96ウェルマイクロタイター中にて、最終容積200μLのバッファーA中でインキュベートした。37℃で4.0時間後に培地を取り出して、1500rpmで5.0分間遠心した。無細胞上清画分を収集し、アリコートをIL-6、IL-13、TNFαおよびMCP-1サイトカイン放出に関してLuminexサイトカインアッセイキットを用いて分析した。
【０３６８】
C．SRBCの補体媒介性溶解
抗体感作SRBC（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を調製し、種々の濃度の可溶性FcγRIAとともにインキュベートした。4℃で15分間おいた後に、ラット血清（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）の1：50希釈物の25μLの試料を添加し、混合物の540nmでの吸光度を製造元による記載の通りにモニターすることによって溶血を測定した。
【０３６９】
D．ヒトIgG1に対するFcγRIA-CH6親和性の測定
IgG1抗体を単一のフローセルに対して固定化し、第2の非誘導体化細胞をブランク参照として利用した。IgG1抗体の固定化は、アミンカップリングキット（Biacore）、およびBiacore Control Softwareによって動作する表面調製のための標準的なWizard Templateを用いて行った。pH探索試験（pH scouting study）に関するWizardの結果に基づいて、IgG1抗体溶液を酢酸ナトリウム中に11μg／mL、pH 5.0に希釈した。アミンカップリングのためのWizard Templateを用いて、抗体を単一のフローセルに対して固定化した。続いて、センサー表面上のカルボキシル基を、0.2M N-エチル-N'-(3-ジエチルアミノ-プロピル)カルボジイミド（EDC）および0.05M N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を含む溶液の注入によって活性化した。続いて抗体溶液を、活性化された表面上に、150〜200RUのレベルを目標として注入した。固定化手順は、カルボキシメチルデキストラン表面上の残りのエステル部位を1M塩酸エタノールアミンでブロックすることによって完了させた。
【０３７０】
分析物溶液（FcγRIA-CH6）の注入のための方法は、速度論的分析のためのBiacore Wizard Templateを用いて記載されている。本方法は25℃で実施され、試料は周囲温度にてオートサンプラー内に貯蔵される。Wizard Templateを用いる際には、速度論に関して最適な特定のパラメーター、例えば注入方式などを、Wizardプログラムによってあらかじめ定義しておく。
【０３７１】
FcγRIAの分析のための方法を、速度論的定数kaおよびkdの決定のために最適化した。受容体を一連のフローセル（すなわち、それぞれ1および2、ブランクおよび抗体で誘導体化したもの）に上から注入して、ヒトIgG1抗体に対するFcγRIAの結合と非改変対照表面に対するFcγRIAの結合との比較分析を行った（ウサギ抗OVA IgGに対する結合については試験しなかった）。分析物は流速40μL／分で3分間にわたって注入した（会合時間）。各分析物の注入に関する解離時間は3分とした。分析物の用量反応曲線の範囲は0.16〜10.3nMとした。用量反応曲線の各ポイントに関して、N＝2の繰り返し注入を実施した。一連のものの中には、装置のノイズおよびドリフトの減算のためのバッファーの注入も含まれる。用量反応曲線用の試料はランダム方式で注入した。FcγRIAの速度論的分析のためには、各々の用量反応曲線サイクルに続いて、グリシン、pH 1.75の単回の30秒間注入を50μL／分で行って、IgG抗体表面を再生させた。
【０３７２】
データ解析は、Biacore Control、Evaluation and Simulationソフトウエアを用いて行った。再生の段階が一連の注入の全体を通じて一貫した結合表面をもたらしたことを確かめるために、ベースラインの安定性をまず評価した。対照表面に対するFcγRIA分析物の非特異的結合のレベルを調べたところ、わずかであることが確認された。バッファー注入曲線を用いた、特異的結合表面曲線（すなわち、フローセル2）からの対照表面曲線（すなわち、フローセル1）の減算、ならびに装置のノイズおよびドリフトの減算により、結合曲線を処理した。データを分析物注入の再現性について調べ、その結果得られた補正結合曲線を結合モデルにグローバルフィッティングさせ、その結果得られた適合定数および平衡定数を評価した。
【０３７３】
E．マウスにおける皮膚逆受身アルツス反応
10週齢の雌性C57BL／6マウス（各群当たりn＝8匹のマウス）にイソフルランで麻酔を施し、それらの背部皮膚を剃毛して、各マウスの背中を70％アルコールで拭いた。各マウスは、背部皮膚の異なる部位に各0.02mLの2回の皮内注射を受けた。注射溶液は、リン酸緩衝食塩水（PBS）と、40.0μgのウサギ抗オブアルブミン（抗OVA、56℃での30〜40分間のインキュベーションにより熱失活させた）のみ、または40.0μgの抗OVAおよび指定量のFcγRIA-CH6を含んでいた。対照群のマウスは、40.0μgの非免疫ウサギIgG（上記の通りに熱失活させた）の2回の皮内注射を受けた。注射の前に、微粒子を除くために抗体調製物を14,000rpmで10分間遠心した。皮内注射の直後に、各マウスの尾静脈に、10.0mg／mLのOVAおよび10.0mg／mLのエバンスブルーを含む100.0μLの溶液を注射した。いくつかの場合には、尾静脈注射溶液に1.0mg／kgの用量のデキサメタゾンも含めた。注射から4時間後に、マウスをCO2ガスによって安楽死させた。皮膚浮腫に関しては、エバンスブルー色素の血管漏出面積（mm2）を測定すること、および病変部位から採取したパンチ生検試料の組織重量（mg）を測定することによって評価した。続いて組織試料を液体N2中で急速凍結させ、-80℃で保存した。
【０３７４】
好中球浸潤は、パンチ生検試料におけるミエロペルオキシダーゼ活性を、Cytostore（Calgary, Alberta Canada）のミエロペルオキシダーゼアッセイキットを用いて、記載の通りに測定することによって評価した（Bradley et al., J. Invest. Dermatol. 78:206-209, 1982）。
【０３７５】
マウスにおけるFcγRIA-CH6の全身投与は、媒体のみ、または指定濃度のFcγRIA-CH6を含む媒体のうちいずれかの静脈内注射によって行った。各マウスは、アルツス反応を惹起させる1.0時間前に、最終容積0.1mLの調合用バッファー（35mMリン酸ナトリウム、120mM NaCl、pH 7.2）中にある指定用量のFcγRIA-CH6を投与された。マウスにおける皮膚アルツス反応は、上記と全く同じ通りに実施した。
【０３７６】
F．結果および考察
FcγRIA-CH6が免疫複合体沈降を阻止しうるか否かを評価するために、抗OVA／OVA免疫複合体沈降アッセイを、MOller（Immunology 38:631-640, 1979）およびGavin et al. (Clin. Exp. Immunol. 102:620-625, 1995）の方法に基づいて確立した。抗OVAおよびOVAの37℃でのインキュベーションは、不溶性抗OVA／OVA免疫複合体の形成に一致する観察所見として、溶液混合物の光学密度の時間依存的な増加を生じさせた（図1、丸印）。アッセイ開始時のFcγRIA-CH6の添加は、免疫複合体沈降の用量依存的な減少を生じさせた（図1、三角印および四角印）。1500nMのFcγRIA-CH6によって免疫複合体沈降は完全に消失した。非タグ付加性の組換え可溶性FcγRIAを用いた場合にも同一のデータが得られた。抗原：抗体免疫複合体の沈降は、抗体Fc重鎖間の非共有結合性相互作用に依存するように思われ（MOller, Immunology 38:631-640）、しかもFcγ受容体は抗体のFc部分と結合するため（Dijstelbloem HM et al., Trends Immunol. 22:510-516, 2001）、これらのデータは、可溶性FcγRIAが抗OVA抗体のFc部分との結合によって免疫複合体沈降を妨げることを示唆している。
【０３７７】
FcγRIA-CH6と抗体Fcとの相互作用を直接的に評価するために、固定化されたヒトIgG1に対するFcγRIA-CH6の結合を表面プラズモン共鳴分析によって評価した。モノクローナルヒトIgG1抗体を単一のフローセル内のセンサー表面に対して、1つのFcγRIA分子と1つのIgG1分子との結合の化学量論性を仮定した場合にFcγRIA-CH6の速度論的分析のための至適レベルの範囲内にある密度レベルである、RU（共鳴単位）レベル485で固定化した（Woof and Burton, Nature Rev. Immunol. 4:1-11, 2004）。FcγRIAは固定化されたIgG1と急速に結合し、会合および解離の速度はそれぞれ2.8×106M-1s-1および4.6×10-4s-1であり、これらの値から算出された平衡解離定数として1.7×10-10Mが得られた。これらのデータは以前に報告されたものと類似しており（Paetz A et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338:1811-1817, 2005）、FcγRIA-CH6がヒトIgG1と高い親和性で結合することを実証している。
【０３７８】
マスト細胞は、III型過敏性反応などの種々の免疫障害において免疫複合体媒介性炎症を媒介すると考えられている（Ravetch, J. Clin. Invest. 110:1759-1761, 2002；Sylvestre and Ravetch, Immunity 5:387-390, 1996；Jancar and Crespo, Trends Immunology 26:48-55, 2005）。マスト細胞Fcγ受容体に対する免疫複合体の結合は、IL-6およびTNFαなどの炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導し（Ravetch、前記；Jancar and Crespo、前記）、それは後に好中球浸潤および組織損傷を招くと考えられている。マスト細胞からのサイトカイン分泌を免疫複合体によって刺激しうるか否かを評価するために、マウスのマスト細胞系MC／9を、あらかじめ形成させたウサギ抗OVA／OVA免疫複合体の存在下および非存在下でインキュベートした。抗OVA／OVA免疫複合体とのインキュベーションは、MC／9細胞馴化培地の内部での炎症性サイトカインIL-6、IL-13、TNFαおよびMCP-1の蓄積の時間依存的かつ濃度依存的な増加を生じさせた。これとは対照的に、MC／9細胞を等濃度のウサギ抗OVA IgGのみとインキュベートした場合には、サイトカイン産生は変化しなかった。これらのデータは、MC／9細胞が、免疫複合体に対して炎症性サイトカインの産生によって応答することを実証している。
【０３７９】
種々の量のFcγRIA-CH6の存在下におけるMC／9細胞と抗OVA／OVA免疫複合体とのインキュベーションは、IL-6（図2A）、IL-13（図2B）、TNFα（図2C）およびMCP-1（図2D）の蓄積の用量依存的な減少を生じさせた。非タグ付加性の組換え可溶性FcγRIAを用いた場合にも同一の結果が得られた。これらのデータは、可溶性FcγRIAがマウスのマスト細胞における免疫複合体の結合およびシグナル伝達を阻止しうることを実証している。
【０３８０】
可溶性FcγRIAを、抗体感作SRBCの補体媒介性溶解に対するその影響についても評価した。37℃での抗体感作SRBCとラット血清とのインキュベーションは、補体活性化およびSRBCの溶解をもたらした。インキュベーション混合物に対するFcγRIA-CH6の添加は、SRBC溶解を用量依存的な様式で阻止した。これとは対照的に、無関連の対照タンパク質TACI-Igを用いた場合には、溶血の阻害はほとんどまたは全く観察されなかった。
【０３８１】
上記の所見は、FcγRIA-CH6がインビトロでの免疫複合体の形成を阻止しうること、マスト細胞における免疫複合体媒介性シグナル伝達を阻害しうること、およびIgG媒介性補体活性を阻止しうることを実証している。これらのデータは、FcγRIA-CH6がインビボ状況下でのIgG媒介性または免疫複合体媒介性の炎症を阻止するのに有効な可能性があることを示唆している。このことを検証するために、皮膚逆受身アルツス反応をマウスにおいて成立させ、免疫複合体媒介性の浮腫および好中球浸潤に対するFcγRIA-CH6の影響を評価した。
【０３８２】
等濃度の非免疫性IgGの皮内注射と対比して、抗OVA抗体の注射は、処置マウスの皮膚内部における浮腫の時間上および濃度上の増加を生じさせた。浮腫は、エバンスブルー色素の血管外漏出面積（図3A）および組織重量（図3B）の双方の増加として明らかになった。OVAの尾静脈注射を行わないと浮腫は観察されなかったため、これらの影響は免疫複合体に特異的であった。ミエロペルオキシダーゼの抽出可能活性として測定される病変部位内部での好中球の蓄積も増加した（図3C）。
【０３８３】
抗OVA抗体と種々の量のFcγRIA-CH6との皮内送達は、エバンスブルー面積の減少（図3A）または病変部位の組織重量の減少（図3B）のいずれかによって測定される浮腫の濃度依存的な軽減を生じさせた。病変生検試料におけるミエロペルオキシダーゼ活性も、FcγRIA-CH6によって有意に低下した（図3C）。これらのデータは、FcγRIA-CH6がマウスにおける免疫複合体誘発性炎症アルツス反応の有効な阻害薬であったことを実証している。
【０３８４】
これらのデータは、FcγRIA-CH6の局所送達が、マウスにおける免疫複合体媒介性皮膚炎症アルツス反応を阻止しうることを実証している。
【０３８５】
FcγRIA-CH6の全身送達が皮膚炎症を軽減しうるか否かを評価するために、アルツス反応を惹起させる1.0時間前に、マウスにFcγRIA-CH6を尾静脈を介して注射した。媒体のみの注射と比較して、FcγRIA-CH6の注射は、抗OVAにより誘発されるエバンスブルー色素の血管外漏出（図4）または抗OVAにより誘発される病変部位の組織重量の増加（図5）として測定される浮腫の用量依存的な軽減を生じさせた。最も高用量のFcγRIA-CH6を用いたところ、浮腫は事実上消失した（図4および5）。上記のデータと同様に、13.0μgのFcγRIA-CH6の皮内送達も、このモデルにおける浮腫を軽減した（図4および5）。静脈内経路によって投与された最も高用量のFcγRIA-CH6で認められた浮腫の軽減は、13.0μgのFcγRIA-CH6の皮内送達により観察されたものと同程度であった（図4および5）。抽出可能なミエロペルオキシダーゼ活性として測定される病変部位内部での好中球の蓄積も、FcγRIA-CH6により処置されたマウスでは消失した。
【０３８６】
実施例16
組換えヒトFcγRIA、FcγRIIAおよびFcγRIIIAの抗炎症活性の比較
単量体FcγRIA-CH6の抗炎症活性に関する評価に加えて（実施例15、前記）、単量体FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6（上記の実施例9に記載した通りに調製）も、実施例15に記載したのと同じインビトロアッセイおよびインビボアッセイで試験した。可溶性FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6を、免疫複合体沈降、マスト細胞からのサイトカイン分泌、およびIgG媒介性補体活性に対するそれらの影響に関して、FcγRIA-CH6と並行して試験した。FcγRIA-CH6と同様に、FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6はいずれも免疫複合体沈降を低下させ、抗体感作赤血球の補体媒介性溶解を阻止し、かつマスト細胞馴化培地におけるIL-6、IL-13、MCP-1およびTNF-αの免疫複合体媒介性蓄積を阻害した。免疫複合体沈降の低下という点での効力の相対的順序はFcγRIIIA＞FcγRIA ＞FcγRIIAの順であり、最大の阻害は各々の可溶性FcγRを1〜1.5μMで用いた場合に認められ、FcγR：抗OVAのモル比はおよそ1：1であった。補体媒介性溶解の阻止およびマスト細胞サイトカイン分泌の阻害のいずれの点でも、効力の相対的順序はFcγRIA＞FcγRIIIA＞FcγRIIAであった。サイトカイン分泌の阻害という点では、各々の可溶性FcγRについて、IC50は検討した各サイトカインに関して同程度であった。
【０３８７】
FcγRIIA-CH6およびFcγRIIIA-CH6を、マウスの皮膚アルツス反応における浮腫および好中球浸潤に対するインビボでのそれらの影響についても、FcγRIA-CH6と並行して試験した。可溶性FcγRIA-CH6で観察された炎症の軽減とは対照的に、同程度の濃度範囲で用いたFcγRIIIA-CH6もFcγRIIA-CH6も、抗OVAにより誘発されるエバンスブルー色素の血管外漏出、組織重量および組織MPO活性をいずれも減少させなかった（図6、A〜Cを参照）。
【０３８８】
FcγRIIAまたはFcγRIIIAの細胞外ドメインの2つの分子がエフェクター陰性型の1つのヒトFc（Fc5）と融合したものをそれぞれが含む、二量体Fc5融合タンパク質型のFcγRIIAおよびFcγRIIIAも調製し、上記のアッセイで試験した。FcγRIIA-Fc5に関するヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID NO：43およびSEQ ID NO：44に示されており、一方、FcγRIIIA-Fc5に関するヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列はそれぞれSEQ ID NO：45およびSEQ ID NO：46に示されている。N末端配列解析により、Gln-34が成熟FcγRIIA-Fc5の場合の開始部位として、ならびにMet-18およびGlu-21が成熟FcγRIIIA-Fc5の場合の開始部位として示された。二量体Fc5融合タンパク質のそれぞれは、上記のすべてのインビトロアッセイにおいて、単量体型の各タンパク質と同程度の活性を有していた。それらの単量体対応物と同様に、この場合もFcγRIA-CH6とは対照的に、FcγRIIA-Fc5もFcγRIIIA-Fc5も、マウスの逆受身アルツス反応における炎症および好中球浸潤を軽減しなかった。
【０３８９】
実施例17
関節炎のコラーゲン抗体誘発モデル
雄性DBA／1Jマウス（8週齢、各群当たりn＝8匹のマウス）に対して、0日目に、2mg（200uL中）の抗II型コラーゲン抗体カクテル（Chemicon Intl. Arthrogen-CIA（登録商標））を、尾静脈内注射を介して投与した。注射したmAbカクテルの量は、文献値、および用量2.0mgのArthrogen-CIA（登録商標）が雄性DBA／1マウスにおいて明白かつ一貫した関節炎の症状をもたらしたという予備試験のデータを基にした。3日後に、マウスに対して、媒体のみ（PBS）または指定濃度（0、0.67または2.0mg）のFcγRIA-CH6を含む媒体のいずれかの皮下注射を行った。3.5時間後に、すべてのマウスに対して、Arthrogenキットに用意されているような、最終容積50uLのPBS中に溶解させた50ugのLPSの腹腔内注射を行った。マウスには媒体または指定濃度のFcγRIA-CH6による処置を隔日に行い、合計5回の投薬を行った。
【０３９０】
マウスを、Arthrogen-CIA（登録商標）抗体カクテルの注射前の第0日から始めて、関節炎に関して毎日スコア化した（目視スコアおよびキャリパーによる足掌測定）。マウスは第11日に殺処理した。血清を収集して、-80Cで凍結させた。足掌を10％ NBF中に収集して、組織学検査用に処理した。
【０３９１】
Arthrogen-CIA（登録商標）抗体カクテルによるマウスの処置は、目視足掌スコア（図7、PBS処置）または足掌厚み（図8、PBS処置）のいずれかによって測定される足掌炎症の時間依存的な亢進を生じさせた。媒体のみ（PBS）で処置したマウスでは、関節炎スコアの上昇が用意に観察される。FcγRIA-CH6によるマウスの処置は、足掌炎症の濃度依存的な軽減を生じさせた。目視足掌スコア（図7）または足掌厚み（図8）として明らかになる抗体誘発性炎症は、最も高用量のFcγRIA-CH6の投与によって完全に消失した。用量0.67mgのFcγRIA-CH6を投与した場合には、これらのパラメーターの幾分弱い低下が認められた。これらのデータは、FcγRIA-CH6が関節炎の状況において効力の強い抗炎症特性を有することを実証している。
【０３９２】
実施例18
TSLPトランスジェニックマウスにおける、FcγRIAによるクリオグロブリン血症の治療
B細胞促進特性を有するインターロイキン-7（IL-7）様サイトカインである胸腺間質性リンホポエチン（TSLP）を過剰発現するマウスは、IgG-IgM混合組成の流血中クリオグロブリンを大量に産生する（Taneda et al., Am. J. Pathol. 159:2355-2369, 2001を参照）。これらの動物における混合性クリオグロブリン血症の発症には、腎臓、肝臓、肺、脾臓および皮膚が影響される全身性炎症性疾患が随伴し（同上参照）、これはこれらの組織中での免疫複合体沈着に起因する。これらの動物における腎疾患は、HCV感染を有する患者で認められるヒトのクリオグロブリン血症糸球体腎炎と非常に類似している。この疾患過程におけるFcγ受容体の役割は、抑制性受容体Fcγ受容体IIbの欠失後の、病的状態および死亡の増進を伴う腎損傷の増悪によって示されている（Muhlfeld et al., Am. J. Pathol. 163:1127-1136, 2003を参照）。これらのデータを考慮すると、免疫複合体媒介性炎症に対する可溶性FcγRIAの有効性を実証している本明細書に記載した諸試験は、TSLP-トランスジェニックマウスが、クリオグロブリン血症の治療に関する可溶性FcγRIAの有効性を評価するために適したモデルであることを示唆している。
【０３９３】
10匹ずつのTSLP-トランスジェニックマウスからなる群（3〜6週齡）に対して、媒体のみ、または0.1、0.3、0.9もしくは2.0mgの可溶性組換えヒトFcγRIAを含む媒体による処置を皮下注射によって行う。媒体またはFcγRIAを伴う媒体による動物への投薬は、種々の投薬スケジュールで行われる（例えば、隔日で21日間にわたり、または4日毎に21日間にわたり）。
【０３９４】
投薬から21日後の時点で、アルブミン尿の測定のために尿試料を収集する。動物にハロタンにより麻酔を施し、心臓穿刺によって血液を採取する。脾臓、腎臓、肝臓、耳および肺を摘出し、組織学検査のために定型的に処理する。すべての臓器について、ホルマリン固定してパラフィン包埋した組織からの4μm切片を、慣例的なプロトコールに従ってヘマトキシリンおよびエオジン（H&E）で染色する。腎臓からは、2μm切片をH&E、過ヨウ素酸シッフ試薬（PAS）および過ヨウ素酸メセナミン銀染色によって染色する。
【０３９５】
血中尿素窒素は標準的な臨床検査用分析装置を用いて測定し、4℃で保存した血清を目視検査によってクリオグロブリンの存在に関して評価する。尿アルブミンとクレアチニンとの比を計算し、標準的な手順によってアルブミン尿について評価する。
【０３９６】
H&E染色および銀染色を行ったスライドに対して形態計測を行い、H&E染色スライド上の糸球体核の数および糸球体係蹄面積、銀染色スライド上の糸球体マトリックスの面積および糸球体係蹄面積、ならびにマクロファージに関する糸球体MAC-2陽性染色の面積および糸球体係蹄面積を測定することにより、腎損傷に関して評価する。結果は、糸球体当たりの細胞数、糸球体係蹄面積当たりの細胞数、各糸球体のマトリックス面積、マトリックスのパーセンテージ、糸球体当たりのクロファージの面積、および糸球体面積当たりのマクロファージの面積として表現される。
【０３９７】
FcγRIAの有効性は、野生型対照と比較した、糸球体係蹄面積、マクロファージによって占められる平均糸球体面積および糸球体当たりの平均細胞数の減少によって、ならびにマトリックス面積の減少によって測定される。
【０３９８】
実施例19
FcγRIAはマウスのコラーゲン誘発性関節炎（CIA）モデルにおける疾患発生率および進行を低下させる
A．マウスのコラーゲン誘発性関節炎（CIA）モデル
関節炎のCIAモデルは、ヒト関節炎の治療に関する薬剤の治療能力を評価するための、適切であってかつ高い評価を受けているモデルである。関節炎は、関節に伴う炎症および／または不適切な免疫複合体形成を特徴とする疾患である。免疫複合体は多くの場合、重要なヒアリン軟骨マトリックスタンパク質であるII型コラーゲンを対象とする抗体で構成される。関節内部での免疫複合体の形成は、関節腔への免疫細胞の動員および炎症性サイトカインの生成を招き、これは罹患関節内部での軟骨および骨の破壊を招く。このため、マウスにおけるコラーゲン誘発性関節炎は、ヒトにおける関節リウマチと共通する多くの生化学的な、細胞上のおよび構造的な類似点を有する。
【０３９９】
8〜10週齡の雄性DBA／1Jマウス（25〜30g）をこれらの試験のために用いた。第21日に、マウスに対して、フロイント完全アジュバント中に調合された0.1mLの1mg／mlニワトリII型コラーゲン（Chondrex Inc., Redmond, WAにより調製）の尾部皮内注射を行った。3週後の第0日に、フロイント不完全アジュバント中に調製した点を除いて同じ注射をマウスに投与した。マウスは2回目のコラーゲン注射後に関節炎の症状を示し始め、ほとんどの動物個体では1〜2週以内に炎症が発症した。各足掌における疾患の程度は、キャリパーを用いて足掌厚みを測定することによって、および臨床スコア（0〜3）を各足掌に割り当てることによって（疾患のスコア化については下記の記載を参照）。
【０４００】
B．疾患のモニタリング
このモデルにおける疾患の発生率は95〜100％であり、非応答個体（non-responder）はごくわずか（0〜2）であった（6週間の観察後に判定）。動物個体は、顕著で持続的な足掌腫脹が発症した後にはじめて、成立した疾患を有するとみなされる。すべての動物個体を、それらの足掌における疾患の状態を評価するために毎日観察したが、これは足掌のそれぞれに定性的臨床スコアを割り当てることによって行った。各動物個体は毎日、その4つの足掌に対して、その臨床疾患の状態に従ったスコア化を受けた。臨床スコアの決定のためには、足掌が3つの区域、すなわち足指（toe）、足掌それ自体（足首より先の部分（manus）または足（pes））および前脚手根部（wrist）または足首（ankle）の関節、を有するものと考える。以下のものを含む、これらの区域に関連した炎症の程度および重症度を記録した：腫脹に関する各足指の観察；裂けた爪または足指の発赤；足掌のいずれかにおける浮腫または発赤の何らかの所見の記載；腱または骨の微細な解剖学的境界の何らかの喪失の記載；浮腫または発赤に関する前脚手根関節または足首の評価；および、炎症が足の近位方向に波及している場合の記載。1、2または3という足掌スコアは、第1に重症度の全体的印象に基づき、第2にどれだけの数の区域が冒されているかに基づく。臨床的スコア化のために用いられる尺度は以下に示されている。
臨床スコア
0＝正常
0.5＝1つまたは複数の足指が冒されているが、足指のみに炎症がある
1＝足掌（1つの区域）が冒される軽度の炎症があり、1つまたは複数の足指が含まれることもある
2＝足掌における中等度の炎症があり、足指および／または前脚手根関節／足首のいくつか（2つの区域）が含まれることもある
3＝足掌、前脚手根関節／足首、および足指のいくつかまたはすべてにおける重度の炎症（3つの区域）
【０４０１】
C．処置
成立した疾患とは、1またはそれ以上に等級化される足掌炎症の定性的スコアとして定義される。成立した疾患が存在するようになった時点で、その日付を記録して、その動物個体に「成立した疾患」がみられた最初の日として指定し、処置を開始した。マウスに対して、PBSによる処置を行うか、または以下の用量：2mg；0.667mg；0.22mgのうち1つのヒトFcγRIA（hFcγRIA；PBS中に所望の濃度に希釈）の皮下投与による処置を隔日に行って合計6回投薬するか；または以下の用量：2mg；0.667mgのうち1つのhFcγRIA（PBS中に所望の濃度に希釈）の皮下投与による処置を4日毎に行って合計3回投薬した。
【０４０２】
実験期間の終了時に、抗コラーゲン抗体の血清レベル、ならびに血清中の免疫グロブリンおよびサイトカインのレベルをモニターするために血液を収集した。それらの最終処置から48時間後にマウスを安楽死させた。血液を血清用に収集し、すべての足掌および選択した組織を組織学検査のために10％ NBF中に収集した。血清を収集して、免疫グロブリンアッセイおよびサイトカインアッセイのために-800Cで凍結させた。
【０４０３】
II型コラーゲンを注射され、かつ媒体による処置を受けたマウスは、ランダム化後に数日でより高い疾患スコア（足掌スコア）として明らかになった足掌腫脹を発症した（図10、白抜き丸印を参照）。FcγRIAによる隔日での12日間にわたる処置は、臨床スコアの統計学的に有意かつ用量依存的な低下を生じさせた（図10、塗りつぶされた記号を参照）。用量0.22mgによる処置は疾患進行の50％の低下を生じさせ、一方、用量2.0mgは疾患重症度を90％低下させた。足掌スコアの低下は、FcγRIAを投薬間隔を延ばして投与した場合にも認められた（図11参照）。媒体のみ（PBS）による処置と比較して、2.0mgのFcγRIAによる4日毎の9日間にわたる処置は、臨床スコアの50％の低下を生じさせ、これに対して、FcγRIAを隔日投与した場合には90％の低下であった（図11参照）。hFcγRIAによる処置を受けたマウスでも、罹患足掌数の用量依存的な減少がみられた（図12参照）。
【０４０４】
以上を総合すると、これらの結果は、マウスのコラーゲン誘発性関節炎において、組換えヒトFcγRIAの投与が疾患の発生率および進行を低下させうることを指し示している。これらのデータは、ヒトにおける関節炎ならびに他のIgG媒介性および免疫複合体媒介性の疾患の治療のための新規で有効な治療法としてのFcγRIAの使用を裏づけるものである。
【０４０５】
実施例20
FcγRIAはマウスのコラーゲン誘発性関節炎（CIA）モデルにおけるIL-6および抗II型コラーゲン抗体のレベルを低下させる
足掌炎症の程度および重症度を評価することによってマウスCIAモデルにおける疾患発症をモニターすることに加えて、上記のCIA試験に用いたマウス（実施例19参照）を、下記にまとめたように、IL-6および抗II型コラーゲン抗体のレベルについても評価した。
【０４０６】
A．方法
Luminexアッセイによる血清サイトカインの定量
マウス血清中のサイトカインのレベルを、Upstate Biotechnology社のLuminexサイトカインアッセイキットを用いて定量した。各プレートを0.2mLのアッセイバッファーにより10分間かけてブロックし、バッファーを取り出してプレートのブロッティングを行った。0.025mLの標準試料、対照試料、ブランク試料および被験試料のそれぞれを適切なウェルに添加し、その後にSerum Matrixの0.025mL試料を添加した。容積0.025mLのアッセイ用バッファーを各試料ウェルに添加し、その後に、超音波処理によって懸濁させた0.025mLのキャプチャー用ビーズを添加した。各プレートを密封し、ホイルで覆って、振盪機にて4℃でインキュベートした。18〜24時間後に、ウェルの内容物を吸引によって除去し、プレートのブロッティングを行った。続いて各プレートを0.2mLの洗浄用バッファーで2〜3回洗浄し、0.025mLの検出抗体カクテルを各ウェルに添加して、プレートを密封し、ホイルで覆って、振盪機にて室温で60分間インキュベートした。ストレプトアビジン-フィコエリトリンの0.025mLの試料を各ウェルに添加し、各プレートを密封し、ホイルで覆って、振盪機にて室温で30分間インキュベートした。各ウェルの内容物を吸引によって取り出して、各プレートのブロッティングを行って、0.2ml／ウェルの洗浄用バッファーで2〜3回洗浄した。Sheathバッファーの0.1mlの試料を各ウェルに添加し、各試料の吸光度をLuminex装置で読み取った。
【０４０７】
抗II型コラーゲン抗体の定量
マウス血清中の抗II型コラーゲン抗体のレベルを、Chondrex社のマウスIgG抗II型コラーゲン抗体キットを用いて定量した。各プレートを0.1mLのブロック用バッファーにより室温で60分間かけてブロックした。プレートを洗浄用バッファーで3回洗浄し、標準物質、試料またはブランクを適切なウェルに最終容積0.1mLとして添加した。プレートを覆い、4℃で一晩インキュベートした。その翌日に、各プレートを洗浄用バッファーで6回洗浄し、容積0.1mLの二次抗体を各ウェルに添加した。続いてプレートを室温でインキュベートした。2.0時間後に、各プレートを洗浄して、0.1mLのOPD溶液を各ウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。0.05mLの2N硫酸を各ウェルに添加することによって反応を終了させ、各ウェルの490nmでの吸光度を測定した。
【０４０８】
B．結果
II型コラーゲンの注射を受けていない非関節炎マウスと比較して、II型コラーゲンを注射されたマウスでは、第15日の殺処理時点でのIL-6の血清レベルが上昇していた。IL-6のレベルは正常マウスでは検出水準を下回っており、コラーゲン誘発性関節炎を発症し、かつ媒体のみによる処置を受けたマウスでは320pg／mLに上昇していた。可溶性ヒトFcγRIAによる処置（2.0mgを隔日に2週にわたり投与）は、第15日時点のIL-6の血清レベルを95pg／mLへと70％低下させた。
【０４０９】
IL-6のレベルを低下させることに加えて、可溶性ヒトFcγRIAによる処置は、関節炎マウスの血清中の抗II型コラーゲン抗体のレベルも低下させた。2.0mgのFcγRIAの隔日での投与は、媒体のみによる処置を受けた関節炎マウスで観察されたレベルに比して、殺処理時である第15日時点での抗II型コラーゲン抗体の量の40〜50％の低下を生じさせた。
【０４１０】
前記の発明を、理解しやすいようにする目的で詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある種の変更を施してもよいことは理解されると考えられる。本明細書中に引用されたすべての刊行物および特許文書は、それぞれが参照により組み入れられるように個別的に示されている場合と同程度に、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月7日(2009.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の説明
I．本発明の概観
本発明は、可溶性FcγRIAなどのFc受容体アンタゴニストを提供することにより、IgG媒介性および免疫複合体媒介性の疾患を治療するための新規治療薬に対する需要に応える。可溶性FcγRIAは皮膚アルツス反応における炎症を阻止するが、可溶性FcγRIIAまたはFcγRIIIAはそうでないことが発見された（実施例15および16を参照）。さらに、可溶性FcγRIAが、細胞FcγRを通じての免疫複合体の結合およびシグナル伝達を阻止することも発見された（下記の実施例に詳細に記載されている）。可溶性FcγRIAが、マウスにおいて皮膚アルツス反応、関節炎のコラーゲン抗体誘発モデルおよびコラーゲン誘発関節炎における炎症を阻止したという所見は、FcγRIAがIgG Fcに対する高親和性受容体として流血中で単量体IgGとの飽和状態にあり、それ故に免疫複合体に対する結合に対する利用能は一般に低いと予想されたため、驚くべきものであった。これらの所見は、可溶性FcγRIAが、自己免疫疾患および炎症を治療するために用いることのできる効力の強い治療薬であることを示している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
本発明のFcγRIAポリペプチドの有効性は、疾患の動物モデルにおいてインビボで試験することができる。クリオグロブリン血症を含む免疫複合体媒介性疾患に対する可溶性FcγRIAの有効性評価するために特に適した動物モデルは、B細胞促進特性を有するインターロイキン-7（IL-7）様サイトカインである胸腺間質性リンホポエチン（TSLP）を過剰発現するマウスである。TSLPマウスは、IgG-IgM混合組成の流血中クリオグロブリンを大量に産生する（Taneda et al., Am. J. Pathol. 159:2355-2369, 2001を参照）。これらの動物における混合性クリオグロブリン血症の発症には、腎臓、肝臓、肺、脾臓および皮膚が障害される全身性炎症性疾患が随伴し（Taneda et al., 前記を参照）、これはこれらの組織中での免疫複合体沈着に起因する。これらの動物における腎疾患は、HCV感染を有する患者で認められるヒトのクリオグロブリン血症糸球体腎炎と非常に類似している。この疾患過程におけるFcγ受容体の役割は、抑制性受容体Fcγ受容体IIbの欠失後の、病的状態および死亡の増進を伴う腎損傷の増悪によって示されている（Muhlfeld et al., Am. J. Pathol. 163:1127-1136, 2003を参照）。本発明による組換え可溶性FcγRIAによるTSLP-トランスジェニックマウスの処置については、下記の実施例18でさらに述べる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２５】
PANの正確な発生率を確定するのは困難である。以前の報告では、PANの発生率を顕微鏡的多発血管炎および関連する血管炎障害と合算していた。しかし、PANの発生率は100万人当たり5〜9例と推定されており（Fiorentino、前記を参照）、症例のほぼ6％がHBV感染に起因すると推定されているが、頻度については10〜54％という範囲の報告がある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３３】
実施例8
FcγRIA-CH6の精製
ヒトFcγRIAの細胞外ドメインをC末端6×His（CHIS）タグとともに含む発現構築物を、実施例2、前記に記載した通りに構築した。この構築物を、実施例3、前記に記載した通りにCHO細胞にトランスフェクトして発現させた。上記の実施例で「FcγRIA-CHIS」と称している、コードされたHisタグ付加FcγRIAを、本明細書では「FcγRIA-CH6」または「pFCGR1A CH6」とも称する。FcγRIA-CH6のヌクレオチドコード配列はSEQ ID NO：30に示されており、対応するFcγRIA-CH6アミノ酸配列はSEQ ID NO：31に示されている。発現されたFcγRIA-CH6を以下の通りに精製した。
【国際調査報告】
2010516769.tif 000051
2010516769.tif 000052
2010516769.tif 000053