(57)【要約】本発明はＣＬＩＰ分子及びガンマデルタＴ細胞の標的化を介して免疫機能を調節する方法に関する。結果は多数の病気及び状態、例えば自己免疫疾患、移植物及び細胞移植片の拒絶、癌、細菌感染症、ＨＩＶ感染症、及びＡＩＤＳを治療する、その発症を阻害する、又は別様に対処する広範な種類の新しい治療計画、並びに診断する及び治療計画を対象に導入する新規な方法である。一局面において、本発明は、γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能に関連する障害を治療するための方法を提供し、この方法は、ＣＬＩＰ分子発現細胞を有効量のγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤に接触させて該ＣＬＩＰ分子発現細胞によるγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能を妨害することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能に関連する障害を治療するための方法であって：
ＣＬＩＰ分子発現細胞を有効量のγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤に接触させて該ＣＬＩＰ分子発現細胞によるγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能を妨害すること；
を含む方法。
【請求項２】
前記ＣＬＩＰ分子がＣＬＩＰである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＬＩＰ分子がＣＤ７４である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記γδＴ細胞の増殖及び／又は活性化に関連する障害が自己免疫疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記γδＴ細胞の増殖及び／又は活性化に関連する障害がＨＩＶ感染である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＬＩＰ分子発現細胞がＢ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＬＩＰ化合物発現細胞がニューロン、稀突起神経膠細胞、小神経膠細胞、又は星状細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＬＩＰ化合物発現細胞が心細胞、膵臓ベータ細胞、腸上皮細胞、肺細胞、子宮内壁上皮細胞、皮膚細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記Ｂ細胞を殺傷するのに有効な量の抗ＨＬＡクラスＩ又はＩＩ抗体と該Ｂ細胞とを接触させることを更に含む、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤がＣＬＩＰ発現阻害剤である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＬＩＰ発現阻害剤がＣＬＩＰ分子又はＨＬＡ−ＤＯのｓｉＲＮＡである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤がＣＬＩＰ活性阻害剤である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＬＩＰ活性阻害剤がＣＬＩＰを排除する薬剤である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＬＩＰを排除する薬剤がクロロキン、リソソーム向性剤、ペプチド／リポペプチド抗原、小分子化合物ｐＣＰ、クロロベンゼン（ＣＢ）、パラクロロアニソール（ｐＣＡ）、ペプチドＨＡ３０６−３１８（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）（配列番号３）又はペプチドＣＯ２６０-２７２（ＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥ）（配列番号４）である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＬＩＰを排除する薬剤がＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＬＩＰを排除する薬剤がＨＬＡ結合ペプチドである、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＬＩＰを排除する薬剤が解糖阻害剤及びハロゲン化アルキルエステルの組み合わせであるファルマコンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＬＩＰ活性阻害剤が抗ＣＬＩＰ抗体又は組み換えＨＬＡ−ＤＭである、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＬＩＰ活性阻害剤がシスタチンＡ、Ｂ又はＣ等のＣＤ７４プロセシングを阻害する薬剤である、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ負荷ペプチドに前記ＣＬＩＰ分子発現細胞を曝露することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記γδＴ細胞がｖγ９ｖδ２Ｔ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
自己免疫疾患を有する対象を治療する方法であって：
該対象のＣＬＩＰ分子発現細胞におけるＣＬＩＰ機能を低減するのに有効な量のＣＬＩＰ阻害剤を該対象に投与すること；
を含む、方法。
【請求項２３】
前記ＣＬＩＰ阻害剤がＣＬＩＰ発現阻害剤である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＬＩＰ発現阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＬＩＰ阻害剤がＣＬＩＰ活性阻害剤である、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＬＩＰ活性阻害剤がＣＬＩＰを排除する薬剤である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＬＩＰを排除する薬剤がＨＬＡ結合ペプチドである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＬＩＰ活性阻害剤が抗ＣＬＩＰ抗体である、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＣＬＩＰ抗体がＭＨＣクラスＩＩの文脈でＣＬＩＰに特異的である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ＣＬＩＰ抗体がＭＨＣクラスＩの文脈でＣＬＩＰに特異的である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症、全身エリテマトーデス、１型糖尿病、ウィルス性心内膜炎、ウィルス性心筋炎、ウィルス性脳炎、慢性関節リューマチ、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性筋炎、円板状エリテマトーデス、クローン病、シェーグレン症候群、ライター症候群、慢性関節リューマチ、ライム病、重症筋無力症、カワサキ病、セリアック病、グッドパスチャー症候群、又は再生不良性貧血である、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
ＨＩＶに感染した対象を治療する方法であって：
該対象のＣＬＩＰ分子発現細胞におけるＣＬＩＰ機能を低減するのに有効な量のＣＬＩＰ阻害剤を該対象に投与すること；
を含む方法。
【請求項３３】
前記ＣＬＩＰ阻害剤がＣＬＩＰ発現阻害剤である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＬＩＰ発現阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＬＩＰ阻害剤がＣＬＩＰ活性阻害剤である、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記ＣＬＩＰ活性阻害剤がＣＬＩＰを排除する薬剤である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記ＣＬＩＰを排除する薬剤がＨＬＡ結合ペプチドである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＬＩＰ活性阻害剤が抗ＣＬＩＰ抗体である、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
前記抗ＣＬＩＰ抗体がＭＨＣクラスＩＩの文脈でＣＬＩＰに特異的である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記抗ＣＬＩＰ抗体がＭＨＣクラスＩの文脈でＣＬＩＰに特異的である、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
前記対象から抗原非特異的活性化Ｂ細胞及び／又はγδＴ細胞を除去することを更に含む請求項３２記載の方法。
【請求項４２】
細胞又は組織移植片を有する対象を治療する方法であって：
該対象における細胞又は組織移植片の拒絶を阻害するために、該細胞又は組織移植片、又は該組織移植片中の造血細胞の中のＣＬＩＰ機能を低減するのに有効な量のＣＬＩＰ阻害剤を該対象に投与すること；
を含む方法。
【請求項４３】
前記移植片組織又は細胞が心臓、肺、腎臓、皮膚、角膜、肝臓、神経組織又は細胞、例えば造血又は胚性幹細胞である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能に関連する障害を有する対象を治療する方法であって：
該対象から抗原非特異的活性化Ｂ細胞及び／又はγδＴ細胞を除去して該障害を治療すること；
を含む方法。
【請求項４５】
Ｂ細胞死を誘導する方法であって：
抗原非特異的活性化Ｂ細胞上でＣＬＩＰ分子発現を誘導すること、及び、該抗原非特異的活性化Ｂ細胞を該抗原非特異的活性化Ｂ細胞を殺傷するのに有効な量の抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体に接触させること；
を含む方法。
【請求項４６】
前記Ｂ細胞がインビトロである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｂ細胞が対象内にある、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記対象にＣＬＩＰ誘導剤を投与する、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記対象が自己免疫疾患を有する、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記対象がＨＩＶに感染している、請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＬＩＰ誘導剤がＣＬＩＰ発現ベクターである、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
前記ＣＬＩＰ誘導剤がＣＬＩＰ活性化剤である、請求項４８記載の方法。
【請求項５３】
細胞の表面からＣＬＩＰを排除する方法であって：
ハロゲン化アルキルエステル、又はファルマコンとしての、解糖阻害剤及びハロゲン化アルキルエステルの組み合わせを対象に投与することにより該細胞の表面からＣＬＩＰを排除すること；
を含む方法。
【請求項５４】
前記ファルマコンがプロドラッグとして作用する単一の二官能性化合物である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記解糖阻害剤が２−デオキシグルコースである、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記２−デオキシグルコースが２−デオキシ−Ｄ−グルコースである、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記ハロゲン化アルキルエステルがジクロロアセテート又はその塩である、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
解糖阻害剤及びハロゲン化アルキルエステルの二官能性化合物を含む組成物。
【請求項５９】
前記二官能性化合物が下記構造：
【化１２】
2010516772.tif 000014
（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルジクロロアセテート
を有する、請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
前記二官能性化合物が下記構造：
【化１３】
2010516772.tif 000015
（３Ｓ，４Ｒ，６Ｒ）−３，６−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルジクロロアセテート
を有する、請求項５８記載の組成物。
【請求項６１】
前記二官能性化合物が下記構造：
【化１４】
2010516772.tif 000016
（３Ｓ，４Ｒ，６Ｒ）−４，６−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イルジクロロアセテート
を有する、請求項５８記載の組成物。
【請求項６２】
前記二官能性化合物が下記構造：
【化１５】
2010516772.tif 000017
［（３Ｓ，４Ｒ，６Ｒ）−３，４，６−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル］メチルジクロロアセテート
を有する、請求項５８記載の組成物。
【請求項６３】
癌を有する対象を治療する方法であって：
Ｂ細胞又は癌細胞を有効量のＣＬＩＰ誘導剤に接触させて該Ｂ細胞又は癌細胞の表面上のＣＬＩＰの発現を促進すること；
を含む方法。
【請求項６４】
前記ＣＬＩＰ誘導剤がＣＬＩＰ発現ベクターである、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記ＣＬＩＰ誘導剤がＣＬＩＰ活性化剤である、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣＬＩＰ活性化剤がｎｅｆ又はｎｅｆの発現を増大させる薬剤である、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記ＣＬＩＰ活性化剤が異所性ＣＬＩＰである、請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
前記ＣＬＩＰ活性化剤がパルミトイル化タンパク質又はＰＡＭである、請求項６５記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣＬＩＰ活性化剤が抗ＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌ分子をＩＬ−４に組み合わせたものである、請求項６５記載の方法。
【請求項７０】
前記癌細胞が乳癌細胞、肺癌細胞、頭部頚部癌細胞、脳の癌細胞、食道癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞、胃癌細胞、卵巣癌細胞、子宮癌細胞、子宮頸部癌細胞、精巣癌細胞、皮膚癌細胞、結腸癌細胞、白血病細胞、又はリンパ腫細胞である、請求項６３記載の方法。
【請求項７１】
前記癌細胞が神経膠芽腫細胞、横紋筋肉腫細胞、黒色腫細胞、又はカポジ肉腫細胞である、請求項６３記載の方法。
【請求項７２】
標準的な抗癌療法により前記対象を治療することを更に含む請求項６３記載の方法。
【請求項７３】
前記標準的な抗癌療法が化学療法、放射線療法又はホルモン療法である、請求項６３記載の方法。
【請求項７４】
前記癌が原発、転移、再発又は多剤耐性である、請求項６３記載の方法。
【請求項７５】
対象における癌細胞を殺傷する方法であって、（ａ）Ｂ細胞上のＣＬＩＰの細胞表面発現を誘導する工程；（ｂ）γδＴ細胞又はＮＫ細胞に工程（ａ）のＢ細胞を接触させる工程、及び（ｃ）該癌細胞を該γδＴ細胞又はＮＫ細胞に接触させる工程を含む方法。
【請求項７６】
前記工程（ａ）をエキソビボで実施する、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記工程（ｂ）をインビボで実施する、請求項７５記載の方法。
【請求項７８】
前記癌細胞が乳癌細胞、肺癌細胞、頭部頚部癌細胞、脳の癌細胞、食道癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞、胃癌細胞、卵巣癌細胞、子宮癌細胞、子宮頸部癌細胞、精巣癌細胞、皮膚癌細胞、結腸癌細胞、白血病細胞、又はリンパ腫細胞である、請求項７５記載の方法。
【請求項７９】
前記癌細胞が神経膠芽腫細胞、横紋筋肉腫細胞、又は黒色腫細胞である、請求項７５記載の方法。
【請求項８０】
前記γδＴ細胞がｖγ９ｖδ２Ｔ細胞である、請求項７５記載の方法。
【請求項８１】
工程（ａ）のＢ細胞が前記対象に対して同種異系である、請求項７５記載の方法。
【請求項８２】
工程（ｃ）のγδＴ細胞が前記対象に対して同種異系である、請求項７５記載の方法。
【請求項８３】
前記ＮＫ細胞が前記対象に対して同種異系である、請求項７５記載の方法。
【請求項８４】
前記ＮＫ細胞がγδ＋ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である、請求項７５記載の方法。
【請求項８５】
非ＨＩＶ感染を有する対象を治療する方法であって：
Ｂ細胞又は非ＨＩＶ感染性因子に感染した該対象の細胞を有効量のＣＬＩＰ誘導剤に接触させて該Ｂ細胞又は非ＨＩＶ感染性因子に感染した細胞の表面におけるＣＬＩＰの発現を促進すること；
を含む方法。
【請求項８６】
前記ＣＬＩＰ誘導剤がＣＬＩＰ発現ベクターである、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
前記ＣＬＩＰ誘導剤がＣＬＩＰ活性化剤である、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
前記ＣＬＩＰ活性化剤がｎｅｆ又はｎｅｆの発現を増大させる薬剤である、請求項８５記載の方法。
【請求項８９】
前記ＣＬＩＰ活性化剤が異所性ＣＬＩＰである、請求項８５記載の方法。
【請求項９０】
前記ＣＬＩＰ活性化剤がパルミトイル化タンパク質又はＰＡＭである、請求項８５記載の方法。
【請求項９１】
前記ＣＬＩＰ活性化剤が抗ＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌ分子をＩＬ−４に組み合わせたものである、請求項８５記載の方法。
【請求項９２】
抗原非特異的な様式においてＢ細胞、マクロファージ又は樹状細胞を活性化させる方法であって、該細胞内のＣＬＩＰの細胞表面発現を誘導することを含む方法。
【請求項９３】
対象に前記細胞を投与することを更に含む請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
前記活性化された細胞が前記対象に対して同種異系である、請求項９２記載の方法。
【請求項９５】
前記活性化された細胞が前記対象に対して自系である、請求項９２記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞がＢ細胞である、請求項９２記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞がマクロファージ又は樹状細胞である、請求項９２記載の方法。
【請求項９８】
対象におけるγδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞から選択される細胞の活性化を阻害する方法であって、該対象から抗原非特異的活性化Ｂ細胞を枯渇させることを含む方法。
【請求項９９】
枯渇が白血球除去法を含む請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
枯渇が抗体剥離を含む請求項９８記載の方法。
【請求項１０１】
前記対象が自己免疫疾患に罹患している、請求項９８記載の方法。
【請求項１０２】
前記対象が移植レシピエントである、請求項９８記載の方法。
【請求項１０３】
前記γδＴ細胞がｖγ９ｖδ２Ｔ細胞である、請求項９８記載の方法。
【請求項１０４】
対象に活性化されたγδＴ細胞を提供する方法であって：
（ａ）γδＴ細胞を得ること；
（ｂ）該γδＴ細胞に抗原非特異的活性化Ｂ細胞を接触させること；及び、
（ｃ）該対象に一度活性化された該γδＴ細胞を移すこと；
を含む方法。
【請求項１０５】
前記γδＴ細胞が前記対象に対して同種異系である、請求項１０４記載の方法。
【請求項１０６】
前記γδＴ細胞が前記対象に対して自系である、請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
前記γδＴ細胞がｖγ９ｖδ２Ｔ細胞である、請求項１０４記載の方法。
【請求項１０８】
自己免疫疾患の１つ以上の追加的症状を呈している対象において少なくとも１つのデフェンシンのレベルを計測することを含む自己免疫疾患の診断方法。
【請求項１０９】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症、全身エリテマトーデス、１型糖尿病、ウィルス性心内膜炎、ウィルス性脳炎、慢性関節リューマチ、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性筋炎、円板状エリテマトーデスである、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
前記デフェンシンがＬＬ３７である、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＣＬＩＰ活性化剤がより高値のＨＬＡ−ＤＯ：ＨＬＡ−ＤＭ比をもたらすＨＬＡ−ＤＯ分子である、請求項６５記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＣＬＩＰ活性化剤がＨＬＡ−ＤＭに対するアンチセンス又はｓｉＲＮＡである、請求項６５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）コード分子はＴ細胞性免疫の重要な成分である。組織適合性分子としてのこれらの分子の意義は１９３０年代後半に最初に観察された。Ｐｅｔｅｒ  Ｇｏｒｅｒ及びＧｅｏｒｇｅ  Ｓｎｅｌｌは腫瘍を同じ種の遺伝子的に同一ではないメンバーから移植した場合、腫瘍は常に拒絶されるが、腫瘍を同じ種の遺伝子的に同一なメンバー間で移植した場合、腫瘍は「生着」し、同系の動物中で生育することを観察している。拒絶を担っている遺伝子複合体はその後、主要組織適合性分子として知られるタンパク質産物をコードする遺伝子のシリーズであることが判明した。これらの遺伝子は免疫応答、即ちＩＲ遺伝子としても知られており、そのタンパク質産物は全ての移植片拒絶を担っている。ＭＨＣ分子には２つの型、即ちＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩが存在する。全ての有核細胞は細胞表面ＭＨＣクラスＩを発現する。特殊化された細胞のサブセットはクラスＩＩＭＨＣを発現する。特殊化されたプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）にとりわけ包含されるものとして、Ｂ細胞、マクロファージ、小神経膠細胞、樹状細胞、及びランゲルハンス細胞が挙げられる。
【０００２】
上記した通り、Ｂ細胞はＭＨＣクラスＩＩを発現する。抗原がＢ細胞上の抗原受容体によって結合されると、抗原及びその受容体はエンドソーム区画内に取り込まれる。この区画はリソソームとして知られる別の区画と融合する。Ｂ細胞は抗原をより小さい部分に分解すること、及びそれらの部分をリソソームのＭＨＣクラスＩＩ内にロードすることにおいて、非常に効率的である。次にＭＨＣは細胞表面に送り出され、そこでＢ細胞は効果的に抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞に「見せる」ことができる。活性化されたＣＤ４細胞は、ヘルパー細胞とも称され、２つの主要なカテゴリーであるＴｈ１及びＴｈ２が存在する。
【０００３】
ＭＨＣ分子はエンドソーム／リソソーム区画内でしっかり保護され、これにより、本発明者等が応答を必要としている抗原のみがＴ細胞に提示されることを保証している。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、抗原負荷前は、ＣＤ７４としても知られている不変鎖と称される分子に会合している。不変鎖はＭＨＣ分子の抗原結合溝内への抗原負荷の前はＭＨＣクラスＩＩと会合している（そして特定のＭＨＣクラスＩ分子と会合することが最近示されている）。抗原がプロセシングされるに従って、不変鎖は区画内のプロテアーゼにより分解される。第１に末端片が、そして次にＣＬＩＰ（クラスＩＩ不変鎖会合ペプチド）として知られる別のものが除去される。ＣＬＩＰは抗原が適切にプロセシングされるまでは、抗原を最終的には保持することになる溝を満たす。ＣＬＩＰを包含する不変鎖に関する詳細な検討は、参照により全体が本明細書に組み込まれる非特許文献１を参照できる。不変鎖及びＣＬＩＰに関するこの「シャペロン」の役割が確認されているという事実にも関わらず、免疫シグナリング及び活性化に対するこれらの分子の全影響は未だ分かっていない。
【０００４】
プロドラッグ投与の歴史はヒトにおける消化管全体にわたって使用可能なエステラーゼの使用を包含する。エステラーゼはエステル加水分解においてヒドロラーゼとして作用し、アルコールからカルボキシレートエステルを切断する。この研究の目的は一般的に吸収、代謝、及び全体の生体利用性の向上を包含していた。適用法は種々の薬剤、例えば限定しないがエナラプリル、バラシクロビル、ヘロイン、及びクロラムフェニコールにおいて使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｔｚａら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）２４（５）：２６４〜２６８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤がＨＩＶ感染、自己免疫疾患及び組織移植片拒絶等の障害の治療において有用であるという発見に少なくとも一部分は基づいている。本発明は又、同様の障害が細胞表面上のＭＨＣにおけるＣＬＩＰの提示を阻害することにより治療できるという発見にも基づいている。
【０００７】
本発明は、一部の態様においては、ＣＬＩＰ分子発現細胞を有効量のγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤に接触させてＣＬＩＰ分子発現細胞によるγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能を妨害することにより、γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能に関連する障害を治療する方法である。一部の実施形態においては、γδＴ細胞はｖγ９ｖδ２Ｔ細胞である。γδＴ細胞の増殖及び／又は活性化に関連する障害は例えば自己免疫疾患、ＨＩＶ感染、並びに細胞、組織及び移植片の拒絶を包含する。
【０００８】
ＣＬＩＰ分子発現細胞は一部の実施形態においてはＢ細胞である。他の実施形態においては、ＣＬＩＰ化合物発現細胞はニューロン、稀突起神経膠細胞、小神経膠細胞、又は星状細胞である。更に他の実施形態においては、ＣＬＩＰ化合物発現細胞は心細胞、膵臓ベータ細胞、腸上皮細胞、肺細胞、子宮内壁上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｗａｌｌ）、皮膚細胞である。細胞がＢ細胞である場合、方法は更に、Ｂ細胞を殺傷するのに有効な量の抗ＨＬＡクラスＩ又はＩＩ抗体とＢ細胞とを接触させることを含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、対象のＣＬＩＰ分子発現細胞におけるＣＬＩＰ機能を低減するのに有効な量のＣＬＩＰ阻害剤を対象に投与することにより、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法である。一部の実施形態において、自己免疫疾患は多発性硬化症、全身エリテマトーデス、１型糖尿病、ウィルス性心内膜炎、ウィルス性心筋炎、ウィルス性脳炎、慢性関節リューマチ、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性筋炎、円板状エリテマトーデス、クローン病、シェーグレン症候群、ライター症候群、慢性関節リューマチ、ライム病、重症筋無力症、カワサキ病、セリアック病、グッドパスチャー症候群、又は再生不良性貧血である。
【００１０】
対象のＣＬＩＰ分子発現細胞におけるＣＬＩＰ機能を低減するのに有効な量のＣＬＩＰ阻害剤を対象に投与することにより、ＨＩＶに感染した対象を治療する方法が本発明の別の態様に従って提供される。場合により、方法は更に対象から抗原非特異的活性化Ｂ細胞及び／又はγδＴ細胞を除去することを含む。
【００１１】
更に別の態様において、本発明は、有効量のＣＬＩＰ阻害剤を対象に投与して細胞又は組織移植片、又は組織移植片中の造血細胞におけるＣＬＩＰ機能を低減することにより、対象における細胞又は組織移植片の拒絶を阻害することにより、細胞又は組織移植片を有する対象を治療する方法である。一部の実施形態において、移植片組織又は細胞は、心臓、肺、腎臓、皮膚、角膜、肝臓、神経組織又は細胞、幹細胞、例えば造血又は胚性幹細胞である。
【００１２】
一部の実施形態において、ＣＬＩＰ分子はＣＬＩＰである。他の実施形態において、ＣＬＩＰ分子はＣＤ７４である。
【００１３】
γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤はＣＬＩＰ発現阻害剤であってよい。ＣＬＩＰ発現阻害剤は例えばＣＬＩＰ分子又はＨＬＡ−ＤＯのｓｉＲＮＡ並びにアンチセンス分子を包含する。
【００１４】
他の実施形態において、γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤はＣＬＩＰ活性阻害剤である。ＣＬＩＰ活性阻害剤はＣＬＩＰを排除する薬剤であってよい。ＣＬＩＰを排除する薬剤は限定しないがクロロキン、リソソーム向性剤、ペプチド／リポペプチド抗原、小分子化合物ｐＣＰ、クロロベンゼン（ＣＢ）、パラクロロアニソール（ｐＣＡ）、ペプチドＨＡ３０６−３１８（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）（配列番号３）又はペプチドＣＯ２６０-２７２（ＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥ）（配列番号４）を包含する。一部の実施形態において、ＣＬＩＰを排除する薬剤はＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）である。他の実施形態において、ＣＬＩＰを排除する薬剤はＨＬＡ結合ペプチドである。更に他の実施形態において、ＣＬＩＰを排除する薬剤は解糖阻害剤及びハロゲン化アルキルエステルの組み合わせであるファルマコン（ｐｈａｒｍａｃｏｎ）である。或いは、ＣＬＩＰ活性阻害剤は抗ＣＬＩＰ抗体又は組み換えＨＬＡ−ＤＭである。一部の実施形態において、抗ＣＬＩＰ抗体はＭＨＣクラスＩＩの文脈でＣＬＩＰに特異的である。他の実施形態において、抗ＣＬＩＰ抗体はＭＨＣクラスＩの文脈でＣＬＩＰに特異的である。他の実施形態において、ＣＬＩＰ活性阻害剤はシスタチンＡ、Ｂ又はＣ等のＣＤ７４プロセシングを阻害する薬剤である。
【００１５】
一部の実施形態において、方法は更に、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ負荷ペプチドにＣＬＩＰ分子発現細胞を曝露することを含む。
【００１６】
他の態様において、本発明は、対象から抗原非特異的活性化Ｂ細胞及び／又はγδＴ細胞を除去して障害を治療することにより、γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能に関連する障害を有する対象を治療する方法である。
【００１７】
更に別の態様において、本発明は、抗原非特異的活性化Ｂ細胞上でＣＬＩＰ分子発現を誘導すること、及び、ために抗原非特異的活性化Ｂ細胞を抗原非特異的活性化Ｂ細胞を殺傷するのに有効な量の抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体に接触させることにより、Ｂ細胞死を誘導する方法である。
【００１８】
一部の実施形態において、Ｂ細胞はインビトロである。他の実施形態において、Ｂ細胞は対象内にある。対象にＣＬＩＰ誘導剤を投与してよい。ＣＬＩＰ誘導剤は限定しないがＣＬＩＰ発現ベクター及びＣＬＩＰ活性化剤を包含する。対象は自己免疫疾患を有するか、又はＨＩＶに感染していてよい。
【００１９】
細胞表面からＣＬＩＰを排除する方法が本発明の他の態様により提供される。方法は、ハロゲン化アルキルエステル、又はファルマコンとしての、解糖阻害剤及びハロゲン化アルキルエステルの組み合わせを対象に投与することにより細胞の表面からＣＬＩＰを排除することにより実施してよい。一部の実施形態において、ファルマコンはプロドラッグとして作用する単一の二官能性化合物である。
【００２０】
他の実施形態において、解糖阻害剤は２−デオキシグルコースである。場合により、２−デオキシグルコースは２−デオキシ−Ｄ−グルコースである。ハロゲン化アルキルエステルは例えばクロロアセテート又はその塩であってよい。
【００２１】
解糖阻害剤及びハロゲン化アルキルエステルの二官能性化合物の組成物が本発明の別の態様により提供される。一部の実施形態において、二官能性化合物は下記構造：
【００２２】
【化１】
2010516772.tif 000002
（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルジクロロアセテート
を有する。
【００２３】
他の実施形態において、二官能性化合物は下記構造：
【００２４】
【化２】
2010516772.tif 000003
（３Ｓ，４Ｒ，６Ｒ）−３，６−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルジクロロアセテート
を有する。
【００２５】
更に他の実施形態において、二官能性化合物は下記構造：
【００２６】
【化３】
2010516772.tif 000004
（３Ｓ，４Ｒ，６Ｒ）−４，６−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イルジクロロアセテート
を有する。
【００２７】
二官能性化合物は下記構造：
【００２８】
【化４】
2010516772.tif 000005
［（３Ｓ，４Ｒ，６Ｒ）−３，４，６−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］メチルジクロロアセテート
を有してよい。
【００２９】
本発明は、癌及びＨＩＶ以外の物質による感染等の障害は、γδＴ細胞が癌性又は感染した細胞の殺傷を引き起こすことができるように表面上のＣＬＩＰを促進することにより治療できるという発見に基づいている。本発明の他の態様においては、Ｂ細胞又は癌細胞を有効量のＣＬＩＰ誘導剤に接触させてＢ細胞又は癌細胞の表面上のＣＬＩＰの発現を促進することにより癌を有する対象を治療する方法が提供される。
【００３０】
一部の実施形態において、ＣＬＩＰ誘導剤はＣＬＩＰ発現ベクターである。他の実施形態において、ＣＬＩＰ誘導剤はＣＬＩＰ活性化剤である。ＣＬＩＰ活性化剤は、例えば、ｎｅｆ又はｎｅｆの発現を増大させる薬剤、異所性ＣＬＩＰ、パルミトイル化タンパク質又はＰＡＭ、抗ＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌ分子をＩＬ−４に組み合わせたものであってよい。一部の実施形態において、ＣＬＩＰ活性化剤はより高値のＨＬＡ−ＤＯ：ＨＬＡ−ＤＭ比をもたらすＨＬＡ−ＤＯ分子である。更に他の実施形態において、ＣＬＩＰ活性化剤はＨＬＡ−ＤＭに対するアンチセンス又はｓｉＲＮＡである。
【００３１】
一部の実施形態において、癌細胞は乳癌細胞、肺癌細胞、頭部頚部癌細胞、脳の癌細胞、食道癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞、胃癌細胞、卵巣癌細胞、子宮癌細胞、子宮頸部癌細胞、精巣癌細胞、皮膚癌細胞、結腸癌細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、神経膠芽腫細胞、横紋筋肉腫細胞、黒色腫細胞、又はカポジ肉腫細胞である。一部の実施形態において、癌は原発、転移、再発又は多剤耐性である。
【００３２】
方法は標準的な抗癌療法により対象を治療することを含んでよい。標準的な抗癌療法は例えば化学療法、放射線療法又はホルモン療法を包含する。
【００３３】
（ａ）Ｂ細胞上のＣＬＩＰの細胞表面発現を誘導する工程；（ｂ）γδＴ細胞又はＮＫ細胞に工程（ａ）のＢ細胞を接触させる工程、及び（ｃ）γδＴ細胞又はＮＫ細胞を該癌細胞に接触させる工程により対象における癌細胞を殺傷する方法が本発明の別の態様により提供される。一部の実施形態において、工程（ａ）をエキソビボで実施し、他の実施形態において、工程（ｂ）をインビボで実施する。
【００３４】
一部の実施形態において、工程（ａ）のＢ細胞は対象に対して同種異系である。他の実施形態において、工程（ｃ）のγδＴ細胞は対象に対して同種異系である。更に他の実施形態において、ＮＫ細胞は対象に対して同種異系である。一部の実施形態においては、ＮＫ細胞はγδ＋ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。
【００３５】
Ｂ細胞又は非ＨＩＶ感染性因子に感染した対象の細胞を有効量のＣＬＩＰ誘導剤に接触させて、Ｂ細胞又は非ＨＩＶ感染性因子に感染した細胞の表面におけるＣＬＩＰの発現を促進することにより、非ＨＩＶ感染を有する対象を治療する方法が本発明の別の態様により提供される。
【００３６】
別の態様において、本発明は、Ｂ細胞、マクロファージ又は樹状細胞内のＣＬＩＰの細胞表面発現を誘導することにより抗原非特異的な様式でこれらの細胞を活性化させる方法である。一部の実施形態においては、細胞を対象に投与する。
【００３７】
一部の実施形態において、活性化された細胞は該対象に対して同種異系である。他の実施形態において、活性化された細胞は該対象に対して自系である。更に他の実施形態において、細胞はＢ細胞、マクロファージ又は樹状細胞である。
【００３８】
対象から抗原非特異的活性化Ｂ細胞を枯渇させることにより該対象におけるγδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞から選択される細胞の活性化を阻害する方法が本発明の他の態様により提供される。他の実施形態において、枯渇は白血球除去法を含む。他の実施形態において、枯渇は抗体剥離を含む。対象は自己免疫疾患、ＨＩＶ感染に罹患しているか、移植レシピエントであってよい。一部の実施形態において、γδＴ細胞はｖγ９ｖδ２Ｔ細胞である。
【００３９】
（ａ）γδＴ細胞を得る工程；（ｂ）抗原非特異的活性化Ｂ細胞を該γδＴ細胞に接触させる工程；及び（ｃ）該対象に該活性化されたγδＴ細胞を移す工程により、対象に活性化されたγδＴ細胞を提供する方法である。一部の実施形態において、γδＴ細胞は該対象に対して同種異系である。他の実施形態において、γδＴ細胞は該対象に対して自系である。更に他の実施形態において、γδＴ細胞はｖγ９ｖδ２Ｔ細胞である。
【００４０】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患の１つ以上の追加的症状を呈している対象において少なくとも１つのデフェンシンのレベルを計測することを含む自己免疫疾患の診断方法である。一部の実施形態において、自己免疫疾患は多発性硬化症、全身エリテマトーデス、１型糖尿病、ウィルス性心内膜炎、ウィルス性脳炎、慢性関節リューマチ、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性筋炎、円板状エリテマトーデスである。一部の実施形態において、デフェンシンはＬＬ３７である。
【００４１】
本発明はその適用において以下の説明において示される、又は図面において示される成分の構築及び配置の詳細に限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、そして種々の方法で実現されること、又は実施されることが可能である。また、本明細書において使用される表現及び用語は説明を目的としており、限定とみなしてはならない。本明細書における「包含する」、「含む」又は「有する」、「含有する」、「関与する」及びそれらの変化形の使用は、後に列挙される項目及びそれらの等価物並びに追加的な項目を包含する意味を有する。
【００４２】
添付図面は縮尺に合わせて描画することを意図していない。図面において、種々の図形で示されている各々の同一又はほぼ同一の成分は、同じ数字で表示される。明確化のために、各図面において全ての成分に標識していない場合がある。表は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】感染後１〜５日の耐性Ｃ５７Ｂｌ６ｖｓ感受性コクサッキーウィルス感染マウスにおける％Ｂ細胞死を示す。
【図２Ａ】ＣＤ４０リガンド活性化Ｂ細胞を自系ＰＭＢＣと共に５日間同時培養した５日間培養のフローサイトメトリー分析を示す点をプロットしたものである。
【図２Ｂ】ＣＤ４０リガンド活性化Ｂ細胞を自系ＰＭＢＣと共に５日間同時培養した５日間培養のフローサイトメトリー分析を示す点をプロットしたものである。
【図３−１】胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に応答したモデルＢ細胞系統（Ｄａｕｄｉ  ａｎｄ  Ｒａｊｉ）の表面からのＣＬＩＰの排除を示す。図３Ａは３時間反応である。図３Ｂは２４時間反応である。図３Ｃは４８時間反応である。
【図３−２】胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に応答したモデルＢ細胞系統（Ｄａｕｄｉ  ａｎｄ  Ｒａｊｉ）の表面からのＣＬＩＰの排除を示す。図３Ａは３時間反応である。図３Ｂは２４時間反応である。図３Ｃは４８時間反応である。
【図３−３】胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に応答したモデルＢ細胞系統（Ｄａｕｄｉ  ａｎｄ  Ｒａｊｉ）の表面からのＣＬＩＰの排除を示す。図３Ａは３時間反応である。図３Ｂは２４時間反応である。図３Ｃは４８時間反応である。
【図３−４】胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に応答したモデルＢ細胞系統（Ｄａｕｄｉ  ａｎｄ  Ｒａｊｉ）の表面からのＣＬＩＰの排除を示す。図３Ａは３時間反応である。図３Ｂは２４時間反応である。図３Ｃは４８時間反応である。
【図３−５】胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に応答したモデルＢ細胞系統（Ｄａｕｄｉ  ａｎｄ  Ｒａｊｉ）の表面からのＣＬＩＰの排除を示す。図３Ａは３時間反応である。図３Ｂは２４時間反応である。図３Ｃは４８時間反応である。
【図４】２−デオキシグルコース及びジクロロアセテートがＢ細胞表面ＣＬＩＰに影響することを示している。
【図５】合成ペプチドＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）に応答したモデルＢ細胞系統（Ｄａｕｄｉ  ａｎｄ  Ｒａｊｉ）の表面からのＣＬＩＰの排除を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は不変鎖（ＣＤ７４）及びＣＬＩＰの役割に関する新しい知見を提供し、そして不変鎖／ＣＤ７４及びＣＬＩＰの標的化を介して免疫機能を調節することへの新しいアプローチを示す。結果は多数の病気及び状態、例えば自己免疫疾患、移植物及び細胞移植片の拒絶、癌、細菌感染症、ＨＩＶ感染症の治療、又は発症又は進行の阻害のための広範な新しい治療計画、並びに、診断する及び治療計画を対象に導入する新規な方法である。
【００４５】
本発明において、Ｂ細胞が抗体の産生に加えて幾分抗原非特異性の傍観者的な様式においても活性化され得ることが発見された。例えば、ウィルス又は細菌感染の間、炎症又は蔓延中の患部に接近している抗原特異的Ｂ細胞の領域における非抗原特異的Ｂ細胞はバイスタンダー様式において活性化されるように工夫できる。このような場合、ＣＬＩＰは溝内に残存し、Ｂ細胞の細胞表面まで輸送される。細胞表面上のその存在が危険である理由は、ＣＬＩＰが自己抗原により溝から引き抜かれるとＢ細胞は自己反応性Ｔ細胞に自己抗原を提示する位置にあるためであり、これは自己反応性及び自己免疫疾患をもたらす場合があるプロセスである。一部のＢ細胞に関しては、これは近傍のキラー細胞、恐らくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるＢ細胞死をもたらす場合がある。しかしながら、これが潜在的に自己反応性Ｂ細胞を除去せず、そしてその抗原（最も可能性が高いのは胸腺に存在しないもの）を認識できるＣＤ４＋Ｔ細胞に遭遇すると、ＣＬＩＰは除去され、その場合、Ｂ細胞は、この時点で溝（ＭＨＣ分子における抗原結合場所）を占有し始めている抗原に特異的なＴ細胞から追加的な支援を受けることになる。或いは、損傷を受けた自己細胞を検出することが仕事である近傍の細胞が自己抗原提示Ｂ細胞により活性化される場合がある。そのような損傷検出細胞は、例えば、γδＴ細胞（γδはその受容体の鎖を指す）とも称されるガンマデルタ細胞であり、これが次に炎症の別の部位を見つけることができる（例えばＭＳにおける脳、自己免疫性心筋炎の場合は心臓、Ｉ型糖尿病の場合は膵臓）。或いは、γδＴ細胞は自己抗原に応答する場合があるＣＤ４Ｔ細胞を殺傷しようとする場合がある。何れの事象においても、γδＴ細胞の活性化は良好でない。
【００４６】
抗原受容体が現実の真正な抗原により結合されていない場合に選択的Ｂ細胞死が必要となる例はコクサッキーウィルスの場合である。コクサッキーウィルスに感染している者の大半は風邪のような疾患を有し、その後回復するが、遺伝子的には、一部の者（特に若年層）はコクサッキーウィルスに感染し、そしてその後自己免疫性心筋炎を発症することになる。一部の遺伝子的に近親交配されたマウス系統においては、マウスは心筋炎の後感染症に対して耐性であり；他の系統のマウスではマウスは病死する。１つの相違点は感受性のあるマウスはＭＨＣクラスＩＩの特定のアイソフォームを有していた点であった。人工的および遺伝子的の両方においてクラスＩＩの他のアイソフォームが挿入された耐性バックグラウンドにあるマウスは単にアイソフォームに基づいた感受性を示し、そして、感受性はγδＴ細胞の存在に依存していることが示されている（Ｈｕｂｅｒ等、１９９９）。
【００４７】
更に、自己免疫疾患を発症しなかったマウスにおいては、感染過程の間、それらのＢ細胞の全てが死滅したことが観察された。そのようなＢ細胞の死滅があった場合であっても新しいＢ細胞が継続的に産生されるため動物は生存する。しかしながら、自己免疫疾患に感受性の動物はＢ細胞死を有さなかった。この知見を更に裏付けるものはγδノックアウトマウス（遺伝子的にγδＴ細胞を有さない）が多発性硬化症のマウス型であるＥＡＥを発症しないこと、そしてＩ型糖尿病も発症しないことである。ＮＫ細胞ノックアウト動物は両方の場合においてより増悪した疾患を有する。更に、不変鎖ノックアウト動物は自己免疫疾患の動物モデルに対しても耐性である。機序に制約されないが、本発明によれば、γδＴ細胞の除去はＭＳの施療的治療であり、そしてＮＫ細胞は正常なヒト及び動物における抗原非特異的Ｂ細胞を殺傷することにより疾患を防止すると考えられる。これらの２つの調節細胞型の間には機能の相互性があると考えられる。
【００４８】
自己免疫及び移植の疾患をブロックする多くの治療薬には、Ｂ細胞の排出又は阻害が関与している。これらのＢ細胞枯渇治療が病気の改善をもたらす機序は不明である。本発明者等はγδＴ細胞の活性化は脂質修飾されているタンパク質に関連することを観察している。不変鎖は脂肪酸アシル化（例えばパルミトイル化）されることがわかった。後述する実施例において説明する通り、抗原非特異的活性化ヒトＢ細胞を抗ＣＬＩＰ抗体で処理し、そしてフローサイトメトリーに付した。意外にもこれらの抗原非特異的活性化Ｂ細胞は細胞表面ＣＬＩＰを発現することがわかった。即ち、本発明者等はＣＬＩＰのＢ細胞表面発現はいかにしてγδＴ細胞が活性化されるかに似ていると認識している。例えば、所定部位に炎症がある場合、長寿のγδＴ細胞は傷害部位において疾患を改善する場合があるＣＤ４ヘルパーＴ細胞の型（Ｔｈ２ＣＤ４＋Ｔ細胞；これらは、それらの表面上でＣＬＩＰを発現する可能性もあり、これによりそれらはγδＴ細胞の標的となる）を殺傷する。それらは炎症組織を攻撃し、かつＴｈ２細胞を殺傷し、ここでＴｈ１細胞に自己抗原（ＣＬＩＰ結合部位をロードする）を提示できるようになったＢ細胞が残ることになる。Ｔｈ１細胞は追加的なＣＤ８キラー細胞を活性化し続け、そして組織の攻撃も継続される。γδＴ細胞が活性化されると、それは損傷組織を探索する。重要な点として、ＣＬＩＰがＭＨＣクラスＩＩの特定のアイソフォーム（マウスではＩ−Ｅ、ヒトではＨＬＡ−ＤＲ）と、そして特定のＭＨＣクラスＩ（例えば限定しないがＣＤ１）とに優先的に会合することができる。興味深いことに、多くの自己免疫疾患は同じＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子にマッピングされ、他のアイソフォームにはマッピングされない。
【００４９】
即ち本発明には自己免疫疾患、移植、及び感染性疾患に対する治療を含む。特定の例において、ＨＩＶ感染の間、ＡＩＤＳウィルスはｎｅｆ遺伝子産物であるＨＩＶ病原性因子をコードし、そしてその発現を誘導する。この因子はＨＩＶ感染においてウィルス複製を増大させることが知られている。更に、ｎｅｆ遺伝子産物はＭＨＣ分子の表面発現をダウンレギュレートし、かつＣＤ７４の細胞表面発現をアップレギュレートする。ｎｅｆ遺伝子産物はＣＬＩＰ及びＣＤ７４の表面発現を選択的に増大させると考えられる。Ｉｉ鎖又はその産物の異所性／細胞表面発現がγδＴ細胞の活性化において中心的に重要であるとすると、ｎｅｆ遺伝子は伝統的なＨＩＶ罹患ＣＤ４Ｔ細胞の活性化及びウィルス複製又はシンシチウム形成を促進する場合があるＮＫ細胞の活性化を促進すると考えられる。従って、ＡＩＤＳにおけるＣＤ４Ｔ細胞のキラーはγδＴ細胞であるという可能性が明確になる。ＡＩＤＳはポリクローナルＢ細胞活性化及び自己免疫疾患の症状の早期の発生とその後のＴ細胞の緩徐な損失が波状的に生じることを特徴としている、これらの特定のγδＴ細胞は、特にＬＬ−３７として知られるＭＳにおいてγδＴ細胞により産生されるものである、デフェンシンと呼ばれる抗生物質様タンパク質を分泌する。これは活性化γδＴ細胞を有する者の血清中で検出することができ、このことは多発性硬化症、他の自己免疫疾患、並びにＨＩＶ疾患を包含する種々の疾患のための診断手段として重要である。
【００５０】
ｎｅｆはＨＩＶ−１感染症の病原性因子である。遺伝子の発現はウィルス複製を増大させることが知られている。ＣＤ４Ｔ細胞はＨＩＶ感染症の重要な標的である。ｎｅｆ遺伝子の発現はＴ細胞上のＣＤ４及びＭＨＣクラスＩのレベルをダウンレギュレートし、かつＭＨＣクラスＩＩＣＤ７４の発現のレベルを増大させることが知られている。一部の実験において、研究者らは成熟主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）分子の細胞表面発現の低下を示しており、同時に未成熟ＭＨＣ−ＩＩに関連する不変鎖（Ｉｉ）の表面発現のアップレギュレーションを実証している（Ｓｔｕｍｐｔｎｅｒ−Ｃｕｖｅｌｅｔｔｅ等、２００１）。更に、研究者等は増大したＩｉ発現にとって重要であるＮｅｆの可撓性Ｃ近位ループの基部に位置する酸性の残基を同定している。これらの試験の著者等は、Ｎｅｆ機能が進行性の疾患を有するＨＩＶ−１感染患者において見出される損傷したＣＤ４（＋）−Ｔ−ヘルパー細胞応答に直接寄与している場合があると結論している。ＭＨＣ−ＩＩ抗原提示を妨害するＮｅｆの能力はＡＩＤＳの発症において役割を果たしていると考えられる。重要な点として、本発明により提供される展望を介して解釈すれば、ＣＤ７４発現を増大させるｎｅｆの能力はガンマデルタＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞の活性化に重要な関わりを有する。換言すれば、ｎｅｆはＣＤ４Ｔ細胞の細胞表面上の変則的なＣＤ７４／Ｉｉ／ＣＬＩＰ発現の結果としての感染ＣＤ４細胞のガンマデルタＴ細胞媒介細胞死を促進する場合がある、
病原性感染から生じるトル（ｔｏｌｌ）様受容体活性化は強力な免疫応答を誘導することができる。感受性の遺伝子的背景において、ＴＬＲが微生物産物を優先的に認識する場合、病原体によるこれらの受容体の活性化は自己免疫に関与する細胞の活性化を誘導することができる。特定の自己免疫疾患の発症における微生物産物、自己抗原、及び他のＴＬＲリガンドの関与は依然不明である。本発明においては、本発明者等は適切な遺伝子的背景におけるＴＬＲリガンドの結合がＣＬＩＰ分子、例えば限定しないがＣＬＩＰ及び未損傷ＣＤ７４の異所性発現をもたらすことになることを示唆している。自己免疫性の後続症を媒介するγδＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞の活性化をもたらすものはこれらの分子の異所性発現である。相互に、ＴＬＲリガンドを使用して、同じエフェクタ細胞（γδＴ細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＮＫＴ細胞）による腫瘍細胞の認識及び殺傷を促進することができる。
【００５１】
細胞型
Ａ．Ｂ細胞
Ｂリンパ球は抗体産生細胞の前駆体である。これらの細胞は抗原に対するそれらの受容体である抗体の細胞表面形態を発現する（膜免疫グロブリンとしても知られている）。抗原がその受容体により結合されると、Ｂ細胞は刺激され、受容体により結合されている抗原は受容体に沿って包囲され、ここで、複合体がＢ細胞のエンドソーム系に内在化される。細胞内に入ると、抗原含有エンドソームはリソソームと融合し、ここで抗原は分解され、そして細胞表面への輸送のための特殊な分子に負荷される。Ｂ細胞表面において、新しくプロセシングされた抗原はＴリンパ球により認識され得るＭＨＣ分子の分子複合体と会合する。複合体としての抗原及びＭＨＣの認識はＴ細胞活性化及び正常な免疫応答に必要である。
【００５２】
Ｂ細胞の成熟。Ｂリンパ球前駆体は全てのリンパ様前駆体と同様、骨髄において生じ、そこではそれらは造血「幹細胞」として知られているより早期の前駆体から誘導される。前駆体Ｂ細胞が発生及び成熟に「進め」のサインを与えられると、「最初に製造されるべき」抗体、免疫グロブリンＭ、略してＩｇＭに関する重鎖の転写及び翻訳が生じる。実際、ＩｇＭに関するメッセンジャーＲＮＡの発生はその前駆体細胞がＢリンパ球となるべく運命づけられる地点を指定する。新しく形成された重鎖は最終的には真の軽鎖用の前駆体と対形成し、そして次にカッパ又はラムダ軽鎖として知られる２つの型の成熟した軽鎖の一方と会合するように切り替わる。マウス及びヒトの両方において、本発明者等の軽鎖の９５％がカッパ鎖である。重鎖がジスルフィド結合により軽鎖に共有結合すれば、分子はＢ細胞表面に輸送され、そしてＢ細胞はこの時点で前Ｂ細胞と言うことができ、しかしなお骨髄内に居留するが完全成熟型ではない。この段階において、Ｂ細胞は欠失に対して特に無防備である。骨髄内の前Ｂ細胞がそれらに特異的である抗原（最も可能性があるのは「自己」抗原）に遭遇すれば、Ｂ細胞は死滅する。「クローン流産」のこの過程は前自己反応性となることから、そして自己反応性抗体を産生することからＢ細胞を保護するために起こると考えられる。恐らくは骨髄においては、抗原の大部分は自己性である。Ｂ細胞の自殺的死滅は自己反応性Ｂ細胞の成熟を防止し、そして恐らくは自己反応性Ｂ細胞が身体の残余に侵入できないようにするその発生上の圧力を反映している。
【００５３】
骨髄内に依然存在するときにＢ細胞内で産生される重鎖の第２のアイソタイプはＩｇＤ分子に対する重鎖である。この特定のアイソタイプはＩｇＭの膜型と同様、その転写及び翻訳が起こると、そしてそれが軽鎖に連結されると、細胞表面に輸送される。Ｂ細胞が欠失により除去されていなかったとすれば、細胞表面ＩｇＭ及び細胞表面ＩｇＤの発生の発現は新しく成熟したＢ細胞が骨髄から出て末梢リンパ様組織、例えば循環系、脾臓及びリンパ節の胚芽中心に至るようにシグナル伝達する。末梢免疫系に成熟Ｂ細胞が多数存在するようになれば、Ｂ細胞は、それらに特異的である抗原に遭遇しなければ、極めて限定された寿命となる。それが起こり、そしてＢ細胞が必要な成長因子又は免疫グロブリン分泌プラズマ細胞へのその発達のために必要な他の因子を受け取れば、Ｂ細胞は細胞死から保護される。抗原に遭遇しなかったものの多数は「無視」により死滅する。残存するもの、例えばＢ細胞の活性化され増殖した抗原特異的クローンの娘細胞は、メモリーＢ細胞と考えられる。メモリー細胞は細胞表面分子ＣＤ２７を発現するとも考えられ、そしてナイーブの非プライミングＢ細胞とは異なり長時間生存すると考えられる。末梢において抗原を認識することはこの場合におけるＢ細胞の第１の生命保存工程である。
【００５４】
Ｂ細胞が抗原に遭遇すれば、抗原が特殊な種類の細菌（重合体）抗原でない限り、Ｂ細胞はサイトカインの形態の追加的な「助け」、そして更にはＣＤ４＋Ｔ細胞との直接の接触を必要とすることになる。Ｂ細胞が自身の末梢成熟化プロセスを修了することをＣＤ４＋Ｔ細胞が「助ける」機序は完全には理解されていない。大部分の試験は、実際の「同族隊」相互作用がＢ細胞とＴ細胞との間に起こることを示唆しているが、サイトカインのＴ細胞の産生が十分であることを示唆するものもある。それとは関係なく、Ｂ細胞がＩｇＭ及び膜ＩｇＤを除いて抗体の全ての形態及びアイソタイプを分泌するためには、Ｂ細胞は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥの全ての形態を産生するためのＴ細胞の「助け」を必要とする。唯一のＴ非依存性抗原は高度に重合性の型のものである。それらがＢ細胞の活性化および抗体分泌細胞への分化をシグナル伝達するのに十分であるとき、Ｂ細胞はＩｇＭを作製するのみとなる。反復して、抗体の全ての他のアイソタイプを産生するためには、抗原に対する大部分のＢ細胞の応答がＴ依存性であると言われているため、Ｂ細胞はＴ細胞の助けを必要とすることになる。
【００５５】
土地の所定の地理的な量の価格は「場所、場所、場所」に依存しているといわれることが多いが、同様のことはＣＤ４＋Ｔ細胞が最終的にＢ細胞による産生を助ける抗体のアイソタイプに対しても当てはまる。例えば、分泌中に居留することになる抗体をＢ細胞が分泌する場合、抗体のアイソタイプはＩｇＡとなる。最終的には、分泌領域の近傍、例えば唾液腺の近傍、生殖泌尿器領域、又は授乳中の乳房内において成熟するＢ細胞はＩｇＡの成熟形態を産生することになる。これらの分子は典型的な抗体の２量体（２Ｈ、２Ｌ鎖）として存在し、これにより成熟ＩｇＡ分子が分泌成分として知られる小型タンパク質により結合された２つの典型的な抗体単位及びＪ鎖と称される他の小型の分子を有することになる。分泌ＩｇＡを研究している専門家の殆どは２分子構造が新しく合成された抗体を分泌管の過酷で分解性の環境から保護することを示唆している。この型の抗体は母乳から防御の最前線を獲得する新生児にとっては非常に重要である。乳児は母親の分泌したＩｇＡを経口摂取し、そして母親のＢ細胞が既に遭遇した特異的抗原からの保護を代償的に受け取る。
【００５６】
抗原提示細胞としてのＢ細胞。Ｂ細胞に特有の特徴には、捕縄に特異的に抗原を認識して結合し、そして細胞に活性化を送達するのみならず、細胞膜に輸送されるＭＨＣクラスＩＩ分子内に負荷されたフラグメントにまで「受容体契合」抗原を分解し、そこでＭＨＣに会合している抗原がＴリンパ球に認識されるために使用可能であるリソソーム区画と融合する特有のエンドソーム区画内に抗原を包囲する膜免疫グロブリン（そのＢ細胞の受容体）の能力が関与している。Ｔリンパ球に抗原を提示するプロフェッショナル抗原提示細胞の能力はエンドソーム／リソソーム区画内で抗原をプロセシングすることに依存している。Ｂリンパ球は特殊なＡＰＣであり、その理由はこの特定のＡＰＣによる、そして他の貪食細胞とは異なる抗原の包囲が抗原特異的なことである。
【００５７】
Ｂ．「プロフェッショナル」抗原提示細胞
プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）は特殊化された細胞のサブセットであり、クラスＩＩＭＨＣを発現し、そしてＢ細胞、マクロファージ、小神経膠細胞、樹状細胞、及びランゲルハンス細胞をとりわけ包含する。常套的には、骨髄様系統、樹状細胞及びマクロファージのプロフェッショナル抗原提示細胞はＴ細胞の活性化を支援するために単に機能する副次的な細胞として主にとらえられている。しかしながら近年、骨髄様系統ＡＰＣはＴ細胞に対して重要な影響を及ぼし、応答の性質（体液性ｖｓ細胞性免疫）、及び一部の場合においては、応答が起こるかどうか自体（活性化ｖｓアネルギー）の両方を調整している。
【００５８】
Ｃ．Ｔ細胞
リンパ球はＢリンパ球と同様、骨髄における造血幹細胞から生じる。しかしながら、Ｂ細胞とは異なり、前Ｔ細胞は別の末梢リンパ様組織である胸腺まで移動し、そこでＴリンパ球成熟過程が起こる。興味深いことに、胸腺はＴ細胞発生臓器として、２〜３歳近傍のかなり早期の小児期においてその最大の大きさ及び容量に到達し、そして思春期において胸腺は退縮を開始し、以前の状態である小型の原基痕跡にまで収縮する。前Ｔ細胞がどのように胸腺に回帰するかは解明されていないが、研究によれば、細胞が到達すれば、２週間もの長期にわたって滞留し、その後、成熟した適切な細胞が胸腺を離れて末梢全体にわたって循環する場合がある。
【００５９】
胸腺は、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩのいずれかにより提示される抗原の多大なレパートリーを認識する能力を前Ｔ細胞が発生させる場所である。前Ｔ細胞は抗原及びＭＨＣに対する受容体を伴うことなく、ＣＤ４を伴うことなく、そしてＣＤ８を伴うことなく、胸腺に進入する。胸腺において、Ｔ細胞は抗原に対するＴ細胞受容体、及びＣＤ４又はＣＤ８の何れかを獲得する。プロセスの間、抗原及びＭＨＣクラスＩを認識するＴ細胞はＣＤ８＋細胞となり、そしてＭＨＣクラスＩＩ及び抗原を認識するものはＣＤ４＋Ｔ細胞となる。ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の両方が、抗原に対する細胞表面Ｔ細胞受容体を有する。Ｔ細胞、即ちＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の何れかが「自己」抗原及び自己ＭＨＣクラスＩ又は自己ＭＨＣクラスＩＩを胸腺において認識すると、そのＴ細胞は欠失される。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の大部分に関して、Ｔ細胞はアルファ鎖及びベータ鎖よりなるＴ細胞受容体を有する。ガンマ／デルタＴ細胞受容体と称される受容体を発現する他のより最近報告されたＴ細胞が存在する。興味深いことに、抗原に対するＢ細胞と同様、Ｔ細胞受容体鎖の各々は可変及び定常領域を有する。Ｔ細胞は、Ｂ細胞と同様、大多数の異なる抗原に結合することができる抗原受容体を有している（ただしＴ細胞の場合はプロセシングされた抗原がＭＨＣ分子と会合している場合に限る）。Ｔ細胞受容体の多様性はＴ細胞受容体が有することができる多数の可能な可変領域により与えられる。Ｂ細胞受容体の可変領域と同様、Ｔ細胞受容体可変領域の発生はＤＮＡのセグメントの組み換えに起因している。しかしながら、抗原に対するＢ細胞受容体とは異なり、Ｔ細胞受容体組み換えは骨髄ではなく胸腺において生じる。
【００６０】
胸腺におけるＴ細胞の発生的成熟は高比率の胸腺細胞死をもたらす。大量のコルチゾンは認識及び生存の必要条件を満たさない前Ｔ細胞の多くを殺傷する。コルチゾン依存性胸腺細胞死の他に、胸腺における抗原の認識は一部の潜在的に自己反応性のＴ細胞をレパートリーから欠失させる。胸腺における抗原特異的Ｔ細胞死のプロセスは一般的には「負の」選択と称される。注意すべきは本発明者等におけるＣＤ４＋Ｔ細胞はそれらが自己ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ＋自己抗原（ＣＬＩＰ様）を認識すると欠失されるのみであることである。（ＣＬＩＰ及び他者のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩを認識するものは欠失されないことになり、これに関しては不変鎖（Ｉｉ）及びＣＬＩＰに関する後述する考察を参照できる）。クラスＩ又はクラスＩＩの分子の何れかと会合しているＳＥＬＦ抗原を認識するＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞は胸腺において欠失されることになる。例えば抗原及びＣＤ８＋Ｔの発生のためのＭＨＣクラスＩ又はＣＤ４＋Ｔ細胞の発生のためのＭＨＣクラスＩＩの何れかの適切な認識等の生存基準の全てに合致する細胞である。
【００６１】
Ｄ．ＮＫ細胞
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）はウィルス及び腫瘍細胞に対する防御のかなり早期の系統を呈するリンパ球の集団である。ＮＫ細胞はＣＤ５６及びＣＤ１６マーカーの存在及びＣＤ３マーカーの不在を特徴とする。ＮＫ細胞は免疫コンピテント又は免疫抑制された宿主における原発又は転移の腫瘍の樹立を防止するための抗原の非特異的抗腫瘍免疫に関与している。ＮＫ細胞は腫瘍細胞又は陰性クラスＩＭＨＣ細胞変異体に対して重要な役割を果たしていると考えられる。抗原に対するそれらの非特異的細胞毒性の特性及びそれらの薬効のために、ＮＫ細胞は癌又は感染性疾患の治療のための免疫適合的アプローチの開発におけるエフェクタ細胞の特に重要な集団を構成している。ＮＫ細胞は種々の異なる種類の腫瘍の実験的治療のためにも使用されている。
【００６２】
即ち、一部の態様において、本発明は、ＣＬＩＰ化合物発現細胞を有効量のγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤に接触させてＣＬＩＰ化合物発現細胞によるγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能を妨害することにより、γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能に関連する障害を治療する方法に関する。或いは、本発明は、有効量のＣＬＩＰ阻害剤を対象に投与して対象のＣＬＩＰ化合物発現細胞におけるＣＬＩＰ機能を低減することにより、対象におけるそのような障害を治療することに関する。
【００６３】
γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能に関連する障害は、γδＴ細胞の増殖、活性化又は機能が疾患における病原性の役割をする障害である。例えばＭＨＣ分子の範囲において表面上にＣＬＩＰを発現する細胞によるγδＴ細胞の増殖及び活性化は、そのような細胞を正常量より多く蓄積させ、これによりそれらが他のＴ細胞に対して作用することができ、又は宿主組織を直接攻撃することができるようにする。γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能に関連する障害の例は自己免疫疾患である。本発明の態様によれば、ＭＨＣの範囲において表面上にＣＬＩＰを有する細胞はこれらの細胞の増殖及び／又は活性化を誘発する場合がある。γδＴ細胞が活性化されると、それらはニューロン、膵臓Ｂ細胞及び心臓組織等の宿主組織上のＭＨＣの範囲におけるＣＬＩＰを認識する場合がある。その認識の結果は宿主細胞の殺傷である場合がある。γδＴ細胞は宿主の抗原をピックアップし、そして更に宿主特異的免疫応答をもたらすことができる抗原非特異的Ｂ細胞の産生を更に引き起こす場合もある。γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能に関連する他の障害はＨＩＶ感染及び移植された細胞、組織又は移植片の拒絶である。活性化されたγδＴ細胞は、移植された細胞及び組織並びに宿主のＴ細胞の殺傷を媒介する場合があり、これはＨＩＶ感染の進行において重要である。
【００６４】
ＣＬＩＰ分子発現細胞は表面上にＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩを有する細胞であり、そしてそのＭＨＣ内にＣＬＩＰ分子を包含する。そのような細胞はＢ細胞、ニューロン、稀突起神経膠細胞、小神経膠細胞、又は星状細胞、心細胞、膵細胞、ベータ細胞、腸上皮細胞、肺細胞、子宮内壁上皮細胞、及び皮膚細胞を包含する。
【００６５】
ＣＬＩＰ分子は、本明細書において使用するとき、未損傷のＣＤ７４（不変鎖とも称する）並びにその天然に存在するタンパク質分解性フラグメントと称する。ＣＬＩＰはその天然に存在するタンパク質分解性フラグメントの１つである。本発明におけるＣＬＩＰ分子の機能は主にＭＨＣクラスＩＩシャペロンとしてである。ＭＨＣクラスＩＩ分子はＣＤ４＋Ｔ細胞に対して抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面上に外来性抗原性ペプチドを提示するヘテロ２量体複合体である。ＭＨＣクラスＩＩの合成及び組立はＣＤ７４の３量体とのＭＨＣα及びβ鎖の非共有結合会合と共に小胞体（ＥＲ）中で始まる。ＣＤ７４は非多形ＩＩ型内在性膜タンパク質であり；ネズミＣＤ７４は短い（３０アミノ酸）Ｎ末端細胞質テール部と、その後の単一の２４アミノ酸膜貫通領域及び約１５０アミノ酸長の管腔性ドメインを有する。３つのＭＨＣクラスＩＩαβ２量体は順次ＣＤ７４の３量体に結合して９量体の複合体（αβＩｉ）３を形成し、これが次にＥＲを退出する。トランスゴルジに輸送された後、αβＩｉ複合体は分泌経路から外れ、細胞内系に至り、最終的にはＭＨＣクラスＩＩ区画（ＭＩＩＣ又はＣＩＩＶ）と称される酸性エンドソーム又はリソソーム様構造内に至る。
【００６６】
ＣＤ７４のＮ末端細胞質テール部は２つの十分特性決定されたジロイシン系エンドソーム標的化モチーフを含有する。これらのモチーフは原形質膜からの、そしてトランスゴルジネットワークからの内在化を媒介する。細胞内区画において、ＣＤ７４鎖は徐々にタンパク質分解的にプロセシングされ、僅かに小型のフラグメントが残り、クラスＩＩ関連ＣＤ７４鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）は放出されたαβ２量体に結合した状態となる。ＭＨＣクラスＩＩ発現のための最終工程はヒト系ではＨＬＡ−ＤＭと称されている別のクラスＩＩ関連αβ２量体とのαβ−ＣＬＩＰ複合体の相互作用を必要とする。これは残存するＣＬＩＰを駆逐し、最終的には、主に内在化抗原から誘導され、そして細胞内経路に送達される抗原ペプチドに対してαβ２量体を結合可能にする。次にペプチド負荷クラスＩＩ分子は未知の経路によりこの区画を離れ、細胞表面上で発現され、そしてＣＤ４＋Ｔ細胞により探索される。
【００６７】
本発明のこの態様の方法はγδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤を用いて達成してよい。γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の阻害剤は直接又は間接的の何れかによりＭＨＣ上のＣＬＩＰ分子の存在を低減する何れかの分子である。γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の例は、ＣＬＩＰ発現阻害剤である。ＣＬＩＰ発現阻害剤はＣＬＩＰ分子ＲＮＡの発現を阻害する化合物である。例えばＣＬＩＰ発現阻害剤はアンチセンス及びｓｉＲＮＡを包含する。例えば、ＣＬＩＰ分子に指向されたアンチセンス又はｓｉＲＮＡ又はＨＬＡ−ＤＯは、ＣＬＩＰ発現阻害剤として有用である。アンチセンス及びｓｉＲＮＡ並びに他の発現阻害剤を以下により詳細に説明する。
【００６８】
γδＴ細胞の増殖、活性化及び／又はエフェクタ機能の別の型はＣＬＩＰ活性阻害剤である。ＣＬＩＰ活性阻害剤はＣＬＩＰを排除する薬剤、抗ＣＬＩＰ分子抗体、組み換えＨＬＡ−ＤＭ及びＣＤ７４のプロセシングを阻害する薬剤を包含する。多くの分子がＣＬＩＰ分子を排除するために有用である。例えばクロロキン、リソソーム向性剤、又はペプチド／リポタンパク質等の化合物がそのような機能を有するものとして知られている。他のＣＬＩＰ排除剤は小分子化合物ｐＣＰ、クロロベンゼン（ＣＢ）、パラクロロアニソール（ｐＣＡ）、ペプチドＨＡ３０６−３１８（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）（配列番号３）、ペプチドＣＯ２６０-２７２（ＩＡＧＦＫＧＥＱＧＰＫＧＥ）（配列番号４）、ＨＬＡ結合ペプチド、及びＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）を包含する。
【００６９】
ＣＬＩＰを排除する他の剤はハロゲン化アルキルエステルである。ハロゲン化アルキルエステルは解糖阻害剤と組み合わせた場合に特に有用である。剤の組み合わせは別個に、又はともに投与してよい。一部の場合において、剤の組み合わせはプロドラッグ二官能性分子の形態である。そのような物質は後述においてより詳細に説明する。
【００７０】
ＣＬＩＰ分子に結合する抗体を包含する抗ＣＬＩＰ抗体は、ＣＬＩＰを排除する薬剤としても有用である。そのような抗体は後述においてより詳細に説明する。
【００７１】
ＣＬＩＰ活性の他の阻害剤はＣＤ７４プロセシングを阻害する薬剤である。ＣＤ７４プロセシングを阻害する薬剤は当該分野で知られており、そしてシスタチン、Ａ、Ｂ、又はＣを包含する。
【００７２】
本発明のこの態様の方法において、ＣＬＩＰ発現細胞は、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ負荷ペプチド又は抗ＭＨＣ抗体に曝露されてもよい。ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ負荷ペプチド又は抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体に細胞を曝露することの目的は、ＣＬＩＰが除去された後に、ＭＨＣの範囲内に提示される自己抗原を細胞がピックアップすることを防止することである。ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ負荷ペプチドはＭＨＣ溝内に適合するものであり、そして一部の実施形態においては、他の免疫細胞との相互作用を誘発しない。例えばＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）等のペプチドがＭＨＣクラスＩ又はＩＩ負荷ペプチドとして極めて良好に機能する。ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）の１つの利点はそれがＣＬＩＰ分子排除剤及びＭＨＣクラスＩ又はＩＩ負荷ペプチドの両方として機能し、そのため一回投与を要するのみである点である。
【００７３】
抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体を投与し、Ｂ細胞に契合してそれを殺傷してよい。ＣＬＩＰが除去されると、抗体はＭＨＣと相互作用してＢ細胞死を引き起こすことができるようになる。これは空ＭＨＣを有するＢ細胞が自己抗原をピックアップして提示すること、又は更にγδＴ細胞の増殖及び活性化をもたらす可能性がある表面の別のＣＬＩＰ分子を獲得することを防止する。ＭＨＣは主要組織適合性複合体である。ＭＨＣにコードされたクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ又はＣ、ＨＬＡ−Ｅ、Ｆ又はＧ、ＣＤ１ａ、ｂ、ｃ又はｄ）又はクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ又はＤＱ；ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ）が本発明では一般的に有用である。
【００７４】
方法は、対象からの抗原非特異的活性化Ｂ細胞及び／又はγδＴ細胞を除去して障害を治療することを包含する。方法は上記した通り単独で、又はそのような細胞を枯渇させるための知られた方法と組み合わせて実施できる。
【００７５】
対象はヒト又は脊椎動物の哺乳動物、例えば限定しないがイヌ、ネコ、ウマ、ヤギ及び霊長類、例えばサルを意味する。即ち、本発明を使用して非ヒト対象における疾患又は状態を治療することができる。好ましくは、対象はヒトである。
【００７６】
本明細書において使用するとき、治療、治療された、又は治療しているという用語は、障害に関して使用している場合、疾患の発症に対する対象の抵抗性を増大させる、換言すれば対象が疾患を発症する可能性を低下させる予防的治療、並びに、疾患に対抗する、疾患が悪化することを防止する、又は無治療時と比較して疾患の進行を緩徐化するための対象が疾患を発症した後の治療を指す。
【００７７】
Ａ．ＡＩＤＳ又はＨＩＶ−１感染
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載する方法はＡＩＤＳ、即ちＨＩＶ−１感染の発症の阻害及び／又は治療において有用である。特定の実施形態において、治療はＨＩＶに感染した対象のＣＤ４Ｔ細胞におけるＣＬＩＰ分子の発現又は活性を阻害又は低減すること、又はそれによるＣＬＩＰの提示をブロッキングすることによる。特にＣＬＩＰ分子はＭＨＣからＣＬＩＰ分子を除去する剤による治療により、ＣＬＩＰ分子のプロセシングを防止する剤による治療により、又はＣＬＩＰ担持ＣＤ４Ｔ細胞を抗ＣＬＩＰ抗体又は結合ペプチドに接触させることにより、ブロックすることができる。
【００７８】
ＣＤ７４又はＣＬＩＰを除去する剤の例はクロロキン、リソソーム向性剤、又はペプチド／リポペプチド抗原である、ＣＤ７４及び／又はそのタンパク質分解性産物の発現を低減する剤の例はＣＬＩＰ分子／ＣＤ７４又はＣＬＩＰに対するアンチセンス又はｓｉＲＮＡ又はＨＬＡ−ＤＯである。
【００７９】
別の実施形態において、治療はＨＩＶに感染した対象における抗原非特異性活性化Ｂ細胞及び／又はγδＴ細胞、一部の場合においてはｖγ９ｖδ２Ｔ細胞を殺傷する、又はその機能を阻害することによる。機能を阻害することは、（ａ）対象から抗原非特異性活性化Ｂ細胞及び／又はγδＴ細胞（又はＮＫ又はＮＫＴ細胞）を除去すること、（ｂ）ＴＬＲリガンド活性化Ｂ細胞を除去すること、（ｃ）細胞表面上でＩｉ／ＣＤ７４又はＣＬＩＰを発現できるものはすべて除去できるように不変鎖／ＣＤ７４又はＣＬＩＰの細胞表面発現をもたらす他の抗原提示細胞を除去すること、（ｄ）細胞上に何れかの形態の不変鎖を有する細胞を選択的に除去すること、（ｅ）対象におけるＢ細胞の抗原非特異的活性化を阻害すること、又は（ｆ）Ｂ細胞及び／又はγδＴ細胞の抗体枯渇によることを包含することができる。抗ＣＬＩＰ抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ又は他の抗体販売元から入手できる。抗体の例は後述する通りである。抗γδＴ細胞抗体もＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手できる。
【００８０】
別の実施形態によれば、本発明の方法はＡＩＤＳ又はＨＩＶ−１感染症の慣用的治療と組み合わせて、又はそれに補充して適用できる。歴史的には、ＨＩＶ−１感染の認知された治療法はヌクレオシド類縁体、ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）の阻害剤である。これらの抗レトロウィルス剤による介入は報告されるエイズ症例数を減少させており、そして、進行エイズに関連する罹患率及び死亡率を低下させることが分かっている。これらの逆転写酵素阻害剤を用いた長期治療は最終的にはそれらの抗ウィルス作用に対して耐性であるウィルス株の出現をもたらす。近年、ＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤が新しいクラスのＨＩＶ−１化学療法として出現した。ＨＩＶ−１プロテアーゼはウィルス感染性及び複製に必須の酵素である。プロテアーゼ阻害剤はＨＩＶ−１ＲＴを標的化するヌクレオシド類縁体よりもインビトロでＨＩＶ−１に対してより高い力価を示している。ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤は慢性に感染した細胞からの成熟した感染性のウィルス粒子の発生を途絶させる。この酵素は治療介入の有力な標的及び併用療法の候補となっている。
【００８１】
ＨＩＶ−１プロテアーゼの構造の知見は、新しい阻害剤、例えばサキノビル、リトナビル、インジニビル及びネルフィナビルの開発ももたらしている。ＮＮＲＴＩ（非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤）は最近ＨＩＶ感染の治療においてますます重要な役割を果たしている。数種のＮＮＲＴＩが臨床開発中である（即ちチビラピン、ロビリド、ＭＫＣ−４２２、ＨＢＹ−０９７、ＤＭＰ２６６）。ネビラピン及びデラビリジンは臨床使用に関してすでに認可されている。ＨＩＶ−１複製の生命周期におけるあらゆる工程が薬剤開発の潜在的標的である。
【００８２】
化学療法において現在使用されている抗レトロウィルス剤の多くは天然産物から直接誘導されるか、又は天然産物モデルに基づいて合成される。天然系抗ウィルス剤としてのデオキシヌクレオシドの分類の根拠は１９５０年もの過去における一連の出版物に発しており、そこではバハマの風乾海綿（クリプトテチア・クリプタ）からのチミンペントフラノシドの発見及び単離が報告されている。変性糖類、又は非環状及び環状の誘導体、例えばＡＺＴ及びアシクロビルを除く多数のヌクレオシドが定期的に作製された。天然海綿誘導産物は第１世代、そしてその後の第２〜第３世代のヌクレオシド（ＡＺＴ、ＤＤＩ、ＤＤＣ、Ｄ４Ｔ、３ＴＣ）、ＨＩＶ−１ＲＴの抗ウィルス特異的阻害剤をもたらした。
【００８３】
アロステリックにＲＴを阻害する天然産物から発見されている多くの非ヌクレオシド剤（ＮＮＲＴＩ）が存在する。ＮＮＲＴＩはかなりの構造的な多様性を有するが、その阻害プロファイルにおいては特定の共通の特性を共有している。天然産物から単離されたＮＮＲＴＩにはカロフィラム・ランギラム由来のカラノイドＡ；マポロニア・アフリカンａ由来のトリテルピン類が包含される。海洋性のホヤのアルカロイドであるラメラリンに由来する天然のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤に関する文献がある。
【００８４】
機能的に感染性の粒子の生産におけるＨＩＶプロテアーゼの役割はレトロウィルス並びにＨＩＶ複製のために重要な過程として報告されている。天然産物であるペプスタチンＡはストレプトマイシシン・テスタセウスの代謝産物であり、そして及びストレプトマイセス・アルゲントルス変異体トヨナケンシスがＨＩＶ−１プロテアーゼ酵素を阻害することが分かっている。現在のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤の開発において使用されている重要な戦略は四面体の幾何学的特徴を有する非加水分解性アイソスターにより切断されやすいＰ１−Ｐ１アミド結合を置換することであり；その設計は試験により、そして基質特異性に基づいて方向付けられている。これは最終的にはペプチドミメティックのリード構造の最適化、及び、インジンビル、サキノビル、ネルフィナビル及びレチノビルを包含するプロテアーゼ阻害剤の新しいクラスの開発をもたらしている。
【００８５】
Ｂ．移植物／移植片の拒絶
臓器及び組織の外科的移植の成功は大部分が移植レシピエントの免疫応答を調節する医師の能力に依存している。特記すれば、移植された外来性組織に対して指向された免疫学的応答は組織が生存して機能するべきである場合は制御しなければならない。現在、皮膚、腎臓、肝臓、膵臓、肺及び心臓は、同種異系移植が実施されている主要な臓器又は組織である。移植レシピエントの正常に機能する免疫系は移植された臓器を「非自己」組織とみなし、その後は移植された臓器の存在に対する免疫応答を開始することはよく知られている。未確認で放置すれば、免疫応答は、移植された臓器の生物学的機能の喪失又は死滅を最後にもたらすことになる複数の細胞及びタンパク質を産生することになる。
【００８６】
この組織／臓器の拒絶は３つの型、即ち超急性、急性及び慢性に分類できる。超急性拒絶は本質的には移植された臓器（移植物）の組織に対して指向された血液中の循環抗体により引き起こされる。超急性拒絶は極めて短時間内、頻繁には数分内で生じる場合があり、そして移植物の壊死をもたらす。急性移植片拒絶反応もまた免疫学的に媒介され、そして超急性拒絶と比較して幾分遅延している。移植後数年で起こる場合がある慢性型の移植片拒絶は移植片動脈疾患（ＧＡＤ）と一般的に称されている疾患状態の結果である。ＧＡＤは大部分が平滑筋細胞の新内膜増殖並びに大型及び小型血管内の単核浸潤を特徴とする血管疾患である。この新内膜成長は血管線維症及び閉塞をもたらし、移植片組織への血流を減少させ、そして臓器不全をもたらす。現在の免疫抑制療法は慢性の拒絶を十分防止していない。過去十年における生存性の向上の大部分は急性拒絶を防止する免疫阻害剤の進歩によるものである。しかしながら慢性拒絶は従来通りであり、それを防止する薬品は重大な医療上の必要性を満足していない。
【００８７】
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載した方法は細胞移植片又は組織移植片の拒絶を阻害する場合に有用である。即ち、方法は心臓、肺、腎臓、皮膚、角膜、肝臓、ニューロン組織又は細胞、又は幹細胞、例えば造血又は胚性幹細胞等の移植された組織に対して有用である。従って、治療は移植された臓器又は細胞の細胞内のＣＬＩＰ分子の細胞表面発現を阻害又は低減することにより、又は移植された組織又は細胞の細胞によるＣＬＩＰ分子提示をブロッキングすることにより行うことができる。
【００８８】
ＣＬＩＰ分子の細胞表面発現を阻害又は低減することはＭＨＣからＣＬＩＰ分子を除去又はブロックする、又はＣＬＩＰへのＣＤ７４のプロセシングを防止する剤を用いた治療を包含する。ＭＨＣからＣＬＩＰ分子を除去する剤の例はクロロキン、リソソーム向性剤、又はペプチド／リポペプチド抗原である。ＣＬＩＰ分子の発現を低減する剤の例はアンチセンス又はｓｉＲＮＡである。ＣＬＩＰ分子の提示をブロックするためには移植された組織を抗ＣＬＩＰ分子抗体に接触させればよい。これらの方法の各々は上記においてより詳細に記載している。
【００８９】
別の実施形態によれば、本発明の方法は移植物／移植片の拒絶の慣用的な治療と組み合わせて、又はそれに補充して適用できる。組織移植片及び臓器移植レシピエントは、慣用的には、移植された臓器又は組織に対する移植レシピエントの免疫応答を抑制する試みにおいて１つ以上の細胞毒性剤で治療される。現在の免疫阻害剤は、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、メトトレキセート、マイコフェノール酸（マイコフェノレートモフェチル）、エベロリムス、アザチプリン、ステロイド及びＮＯＸ−１００を包含する。これらの薬品の全てがその長期使用を複雑化させる副作用（後に詳述）を有している。例えばシクロスポリン（シクロスポリンＡ）は１１アミノ酸残基よりなる環状ポリペプチドであり、そしてカビ種であるトリポクラジウム・インフラタム・ガムにより生産されるが、現在、同種異系の腎臓、肝臓、膵臓及び心臓（即ちドナーおよびレシピエントが同種の哺乳動物の同種である）の移植レシピエントへの投与のための選択肢となっている薬品である。しかしながら、シクロスポリンの投与は、薬品が腎臓及び肝臓毒性並びに高血圧を引き起こす場合があるため、難点を回避できない。更に、シクロスポリンの使用は悪性疾患（例えばリンパ腫）並びに薬品の長期投与を受けている患者においてそれが誘導する免疫抑制の「全般的な」性質に起因する日和見感染をもたらす場合があり、即ち、病原性微生物への宿主の正常な保護的免疫応答がダウンレギュレートされ、これによりこれらの物質により引き起こされる感染の危険が増大する。ＦＫ５０６（タクロリムス）もまた、単剤療法として、又は併用において、免疫阻害剤として使用されていた。その免疫抑制活性はシクロスポリンよりも１０〜１００倍高値であるが、なお毒性の問題を有している。知られている副作用は、腎臓損傷、発作、振戦、高血圧、糖尿病、高血中カリウム、頭痛、不眠症、混乱、発作、神経障害、及び痛風を包含する。流産にも関連している。メトトレキセートは一般的に細胞毒性剤の治療に追加されている。メトトレキセートは移植後数回小用量において投与される。シクロスポリンとメトトレキセートとの併用療法は移植片拒絶の重症度を低下させる場合には有効であることが分かっているが、口内炎や肝臓損傷等の副作用を有する。重度の移植片拒絶はステロイドで治療できる。しかしながら、ステロイドの副作用は極端である可能性があり、例えば体重増加、体液鬱滞、血糖値上昇、気分変動、及び／又は思考混乱が挙げられる。
【００９０】
ラパマイシンは抗拒絶医薬として使用されている親油性のマクロリドであり、他の抗拒絶医薬（例えばシクロスポリン）と組み合わせて摂取して主要な細胞毒性剤の毒性の量を低減することができるが、これも同様に特定の副作用、例えば高コレステロール、高トリグリセリド、高血圧、発疹及びざ瘡を引き起こす。更に、貧血、関節痛、糖尿病、低カリウム及び血小板減少に関連している。
【００９１】
本発明の治療薬と組み合わせて使用するとき、既知治療薬の用量は一部の例においては副作用を回避するために低減してよい。
【００９２】
Ｃ．自己免疫疾患
「自己免疫疾患」は内因性及び／又は外因性起源の１つ以上の免疫原性物質への対象自身の体性及び／又は細胞媒介免疫応答の帰結として一般的に生じる非アナフィラキシー性過敏反応（ＩＩ型、ＩＩＩ型、及び／又はＩＶ型過敏反応）に一般的に関連する疾患を指す。そのような自己免疫疾患はアナフィラキシー性（Ｉ型又はＩｇＥ媒介）過敏反応に関連する疾患と区別される。
【００９３】
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載する方法は抗原提示細胞によるＣＬＩＰ分子の細胞表面発現を対象において阻害すること、又はｖγ９ｖδ２Ｔ細胞等のγδＴ細胞へのＣＬＩＰ分子提示をブロッキングすることを含む、自己免疫疾患の発症を阻害する場合に有用である。即ち、方法は多発性硬化症、全身エリテマトーデス、１型糖尿病、ウィルス性心内膜炎、ウィルス性脳炎、慢性関節リューマチ、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性筋炎、及び円板状エリテマトーデス等の自己免疫疾患に対して有用である。
【００９４】
これによれば、治療は細胞中のＣＬＩＰ分子の細胞表面発現を阻害又は低減することにより、又はＣＬＩＰ分子提示をブロッキングすることにより行うことができる。ＣＬＩＰ分子の細胞表面発現を阻害又は低減することは、ＭＨＣからＣＬＩＰ分子を除去又はブロックする、又はＣＬＩＰへのＣＤ７４のプロセシングを防止する剤を用いた治療を包含する。ＭＨＣからＣＬＩＰ分子を除去する剤の例はクロロキン、リソソーム向性剤、又はペプチド／リポペプチド抗原である。ＣＬＩＰ分子の発現を低減する剤の例はアンチセンス又はｓｉＲＮＡである。ＣＬＩＰ分子の提示をブロックするためには移植された組織を抗ＣＬＩＰ分子抗体に接触させればよい。これらの方法の各は上記においてより詳細に記載している。
【００９５】
Ｄ．自己免疫疾患、ＨＩＶ及び組織移植片拒絶の診断
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載する方法は自己免疫疾患、ＨＩＶ感染及び組織移植片拒絶、例えば多発性硬化症、全身エリテマトーデス、１型糖尿病、ウィルス性心内膜炎、ウィルス性脳炎、慢性関節リューマチ、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性筋炎、及び円板状エリテマトーデスを診断する場合に有用である。方法はこれらの疾患の１つ以上の追加的症状を呈している対象における少なくとも１つのデフェンシンレベルを計測することを包含する。特定の実施形態においては、デフェンシンはＬＬ３７である。
【００９６】
デフェンシンは好中球及びマクロファージにより体内で形成される強力な抗体のファミリーであり、侵襲微生物に対抗する重要な役割を果たす。それらは細菌、カビ及びウィルスに対抗して、それらの膜に結合し、そして膜透過性増大させることにより作用する。化学レベルにおいては、デフェンシンは通常はアミノ酸システイン（Ｃｙｓ）リッチな小型ペプチドである。ヒトデフェンシンはそれらの配列相同性及びそれらのＣｙｓ残基に基づいてα−デフェンシン及びβ−デフェンシンに分類される。本発明によれば、デフェンシンはこれらの疾患に関わるマーカーとして機能できる。例えばγδＴ細胞媒介自己免疫は破壊性であるγδＴ細胞により産生されるデフェンシンの血中レベルを測定することにより診断してよい。検出可能なレベル以上のデフェンシンレベルは活性化されたγδＴ細胞が存在し、そしてそれらが恐らくは何れかの形態の自己免疫疾患の病原性成分であることを意味している。
【００９７】
Ｅ．癌
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載する方法は癌、腫瘍及び典型的には制御できない急速に分裂する細胞集団が関与する他の状態を治療する場合に有用である。「急速に分裂する細胞」とは、本明細書においては、有糸分裂成長を起こしている細胞である。そのような細胞は当該分野で良く知られており、そして例えば限定しないが腫瘍細胞、癌細胞、リンパ球（Ｔ細胞及びＢ細胞）、細菌、及び膵臓ベータ（β）細胞を包含する。本発明のこれらの態様において、急速に分裂する細胞を殺傷できるγδＴ細胞を活性化させることが望ましい。方法はＣＬＩＰ誘導剤を用いて達成してよい。
【００９８】
ＣＬＩＰ誘導剤とは、本明細書においては、ＭＨＣの範囲において細胞表面上の増大したＣＬＩＰ分子提示をもたらす化合物を指す。ＣＬＩＰ誘導剤は例えばＣＬＩＰ発現ベクター及びＣＬＩＰ活性化剤を包含する。ＣＬＩＰ発現ベクターは細胞に投与されるときＣＬＩＰ分子タンパク質の産生を引き起こすベクターである。ＣＬＩＰ分子タンパク質は例えばＣＤ７４であることができる。ＣＤ７４が産生される場合は、ＣＤ７４はそれが細胞内でプロセシングされてＭＨＣと会合したＣＬＩＰを産生するように細胞内で生産されることが望ましい。或いは、それは、ＣＤ７４タンパク質が表面上のＭＨＣと相互作用できるようにそれを分泌することができる他の細胞内でプロセシングされてもよい。発現ベクターは、ＣＬＩＰペプチドを細胞内又は細胞外のいずれで産生してもよい。
【００９９】
ＣＬＩＰ活性化剤は例えば可溶性ｎｅｆ、又はｎｅｆ発現を増大させる薬剤、例えばｎｅｆ発現ベクターを包含する。ＣＬＩＰ活性化剤はまた異所性ＣＬＩＰ、パルミトイル化されたタンパク質、又はＰＡＭ、及び抗ＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌ分子をＩＬ−４と組み合わせたものを包含する。より高いＨＬＡ−ＤＯ：ＨＬＡ−ＤＭ比をもたらすＨＬＡ−ＤＯ分子もまたＣＬＩＰ活性化剤である。より高いＨＬＡ−ＤＯ：ＨＬＡ−ＤＭ比は細胞表面上により多くのＣＬＩＰを細胞が産生するようにする。高いＨＬＡ−ＤＯ：ＨＬＡ−ＤＭ比を達成することができる別の分子はＨＬＡ−ＤＭに対するアンチセンス又はｓｉＲＮＡである。これらの化合物は本明細書においてより詳細に説明する。
【０１００】
本発明の特定の実施形態において、対象における癌細胞は、（１）可溶性ＣＬＩＰ（組み換え不変鎖のタンパク質分解性切断、単に組み換えＣＬＩＰ又は合成ＣＬＩＰを作成することにより作製できる）で直接患者を治療することによりＴｈ１応答を活性化させること；（２）（ａ）好ましくはエキソビボでＢ細胞上のＣＬＩＰの細胞表面発現を誘導すること；（ｂ）好ましくはインビボにおいて工程（ａ）のＢ細胞をγδＴ細胞又はＮＫ細胞に接触させること、及び（ｃ）γδＴ細胞又はＮＫ細胞を癌細胞に接触させることにより殺傷される。特定の実施形態において、γδＴ細胞はｖγ９ｖδ２Ｔ細胞である。更に他の特定の実施形態において、工程（ａ）のＢ細胞及び／又は工程（ｃ）のγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は対象にとって同種異系である。
【０１０１】
本発明の実施形態によれば、癌細胞は癌細胞におけるＣＬＩＰの細胞表面発現を誘導することにより殺傷される。癌細胞におけるＣＬＩＰの細胞表面発現を誘導する１つの方法は癌細胞をｎｅｆ又はｎｅｆ発現を増大させる薬剤で処理することである。即ち哺乳動物ベクター中で発現される組み換えｎｅｆの可溶性産物に癌細胞を曝露することにより癌細胞におけるｎｅｆ遺伝子の発現を標的化する遺伝子を使用できる。別の方法はｎｅｆ遺伝子のタンパク質産物、ｎｅｆタンパク質で癌細胞を処理することである。別の方法はＣＬＩＰ及び腫瘍に対する遺伝子標的ｎｅｆで直接癌細胞を処理することにより、腫瘍が不変鎖／ＣＤ７４又はタンパク質分解生産物、例えばＣＬＩＰを発現するのみとすることである。
【０１０２】
別の方法は異所性ＣＬＩＰを誘導する抗原で癌細胞を処理することである。この操作法について、トル様受容体（ＴＬＲ）を問題の癌が発現できるかどうかを調べ、そして次に癌細胞上に発現されるＴＬＲに対するリガンドで癌患者を治療することができる。本発明はＴＬＲの契合が癌細胞の表面上のＣＬＩＰの異所性発現をもたらすと予測する。腫瘍を治療するために使用できる炎症メディエータの例は、パルミトイル化タンパク質、例えばＰＡＭ、合成ＴＬＲ２リガンド、Ｐａｍ（３）Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）（４）（Ｐａｍ（３）ＣＳＫ（４）及び細菌産物由来の他のパルミトイル化タンパク質を包含する。これらのリガンドは細胞表面の不変鎖／ＣＤ７４ＣＬＩＰの増大を促進し、そしてこれにより腫瘍細胞をγδＴ細胞殺傷のための標的とする。
【０１０３】
更に別の方法は、炎症メディエータ、例えばパルミトイル化タンパク質、例えばＰＡＭ、合成ＴＬＲ２リガンド、Ｐａｍ（３）Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）（４）（Ｐａｍ（３）ＣＳＫ（４）及び細菌産物由来の他のパルミトイル化タンパク質で癌細胞を処理することである。
【０１０４】
更なる実施形態において、方法は更に、標準的な抗癌療法、例えば化学療法、放射線療法、又はホルモン療法を用いて対象を治療することを含む。
【０１０５】
上記した治療法の何れにおいても、剤は何れかの従来の手段により患者内に導入することができる。
【０１０６】
特定の実施形態において、癌細胞は乳癌細胞、肺癌細胞、頭部頚部癌細胞、脳の癌細胞、食道癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞、胃癌細胞、卵巣癌細胞、子宮癌細胞、子宮頸部癌細胞、精巣癌細胞、皮膚癌細胞、結腸癌細胞、白血病細胞、又はリンパ腫細胞である。他の実施形態において、癌細胞は神経膠芽腫細胞、横紋筋肉腫細胞、黒色腫細胞、又はカポジ肉腫細胞である。更に他の実施形態において、癌は原発、転移、再発又は多剤耐性である。
【０１０７】
即ち、本発明の方法は、一部の実施形態において、多くの型の哺乳動物細胞、特に腫瘍細胞における細胞死を誘導するために有用である。「細胞死」という用語は本明細書においては、アポトーシスのプロセス又は細胞溶解の何れかを指す。アポトーシス及び細胞溶解の両方において、細胞は死滅するが、プロセスは異なる機序及び／又は異なる細胞代謝状態を介して起こる。アポトーシスは、細胞が収縮及びフラグメント化を起こし、その後細胞フラグメントの貪食作用が起こる細胞死のプロセスである。アポトーシスは当該分野で良く知られており、何れかの当該分野で知られた方法により評価できる。例えばアポトーシスは生細胞と死細胞との間で区別可能であるフローサイトメトリーを用いて容易に測定できる。
【０１０８】
１組の実施形態において、本発明は癌に罹患し易いか、その症状を呈している対象を治療する方法を包含する。一部の場合において、癌は薬剤耐性又は多剤耐性である。本明細書において使用するとき、「薬剤耐性癌」とは従来の一般に知られた癌治療法に対して耐性である癌である。従来の癌治療法の例は、メトトレキセート、トリメトレキセート、アドリアマイシン、タキソテール、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パミドロネート２ナトリウム、アナストロゾール、エキセメスタン、クロロホスファミド、エピルビシン、トレミフェン、レトロゾール、トラツズマブ、メゲステロール、タモキシフェン、パクリタキセル、ドセタキセル、カペシタビン、ゴセレリンアセテート等の剤を用いた癌の治療を包含する。「多剤耐性癌」とは、１つの型又はクラスの癌治療薬より多くに対して耐性である癌であり、即ち、癌は第１の作用機序を有する第１の薬品、及び第２の作用機序を有する第２の薬品に対して耐性であることができる。
【０１０９】
１つの実施形態において、本発明の方法は１つ以上の別の形態の癌治療と組み合わせて、例えば、抗癌剤、化学療法、放射線療法等と組み合わせて（例えば同時に、又は治療手順全体の一部分として）使用できる。他の限定しない例として、細胞は原形質膜中のＵＣＰ又はＦａｓの量を増大するように操作してよく、そして、別の形態の癌治療法に曝露してよい。「癌治療法」という用語は本明細書において使用するとき、限定しないが、化学療法、放射線療法、アジュバント療法、ワクチン接種、又はこれらの方法の何れかの組み合わせを包含してよい。変動してよい癌治療法のパラメータは限定しないが、用量、投与の時期又は期間又は療法を包含してよく；そして癌治療法は用量、時期又は期間において変動できる。癌に対する別の治療法は、外科処置であり、これは単独で、又は前述した治療法の何れかと組み合わせて利用できる。対象に対する適切な治療は当業者が決定できる。
【０１１０】
「腫瘍細胞」とは、本明細書において使用するとき、望ましくない有糸分裂増殖を起こしている細胞である。腫瘍細胞は、本発明のインビトロの実施形態において使用する場合、対象内の腫瘍から単離できる、又は樹立された細胞系統の部分であってよい。対象内の腫瘍細胞は何れかの型の癌の部分であってよい。癌は、限定しないが胆管癌；膀胱癌；脳の癌、例えば神経膠芽腫及び髄芽腫；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；血液学的新生物、例えば急性リンパ球性及び骨髄性白血病；多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病及び成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；上皮内新生物、例えばボーエン病及びパジェット病；肝癌；肺癌；リンパ腫、例えばホジキン病及びリンパ球性リンパ腫；神経芽腫；口腔癌、例えば扁平上皮細胞癌；卵巣癌、例えば上皮細胞、間質細胞、胚細胞及び間葉細胞から生じたもの；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫、例えば平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、腺維肉腫、及び骨肉腫；皮膚癌、例えば黒色腫、カポシ肉腫、基底細胞癌、及び扁平上皮細胞癌；精巣癌、例えば胚腫瘍、例えば精上皮腫、非精上皮腫、奇形腫、絨毛癌；間質腫瘍及び胚細胞腫瘍；甲状腺癌、例えば甲状腺の腺癌及び髄質癌；及び腎臓癌、例えば腺癌及びウイルムス腫瘍を包含する。一般的に遭遇する癌は乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、及び脳の癌を包含する。一般的に、癌を治療するための有効量の組成物はインサイチュで哺乳動物癌細胞の増殖を阻害するために必要な量となる。当業者であれば抗癌剤の有効量を評価する方法を熟知している。
【０１１１】
一部の場合において、癌治療は抗癌剤又は薬品、例えば従来の公知の抗癌剤又は薬品を用いた治療を包含する。適当な抗癌剤及び薬品の例は、例えば限定しないが、メトトレキセート、トリメトレキセート、アドリアマイシン、タキソテール、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パミドロネート２ナトリウム、アナストロゾール、エキセメスタン、クロロホスファミド、エピルビシン、トレミフェン、レトロゾール、トラツズマブ、メゲステロール、タモキシフェン、パクリタキセル、ドセタキセル、カペシタビン、及びゴセレリンアセテートを包含する。適当な抗癌剤及び薬品の追加的な例は、例えば限定しないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、４−イポメアノール、５−エチニルウラシル、９−ジヒドロタキソール、アビラテロン、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ａｌｌ−ｔｋ拮抗剤、アルトレタミン、アンバムスチン、アムボマイシン、アメタントロンアセテート、アミドックス、アミホスチン、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アンドログラホリド、血管新生阻害剤、拮抗剤Ｄ、拮抗剤Ｇ、アンタレリックス、アントラマイシン、抗背方化形態形成タンパク質−１、抗エストロゲン剤、抗新生物剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、グリシン酸アフィディコリン、アポトーシス遺伝子モジュレータ、アポトーシスレギュレータ、アプリン酸、ＡＲＡ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザシチジン、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、アゼテパ、アゾトマイシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ベンゾクロリン、ベンゾデパ、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラクタム誘導体、ベータ−アレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ＢＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、塩酸ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビスナフィドジメシレート、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、ＢＲＣ／ＡＢＬ拮抗剤、ブレフレート、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブドチタン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カクチノマイシン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カルステロン、カンプトテシン誘導体、カナリポックスＩＬ−２、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ｃａｒｅｓｔ  Ｍ３、カルムスチン、ｃａｒｎ  ７００、軟骨由来阻害剤、塩酸カルブシン、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セデフィンゴール、セトロレリックス、クロラムブシル、クロリン類、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シロレマイシン、シスプラチン、シス−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類縁体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタ��ンＡ４、コンブレタスタチン類縁体、コナゲニン、クラムベシジン８１６、クリスナトール、クリスナトールメシレート、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタアントラキノン類、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダカルバジン、ダクリキシマブ、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デスロレリン、デキシホスファミド、デクソルマプラチン、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジクオン、ジクロロアセテート、ジデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ドロナビノール、ヅアゾマイシン、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エダレキセート、エデルフォシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、塩酸エフロルニチン、エレメン、エルサミトルシン、エミテフール、エンロプラチン、エンプロメート、エピブロピジン、塩酸エピルビシン、エプリステリド、エルブロゾール、赤血球遺伝子療法ベクター系、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチン類縁体、リン酸エストラムスチンナトリウム、エストロゲン作動剤、エストロゲン拮抗剤、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、ファドロゾール、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フロクスウリジン、フルアステロン、フルダラビン、リン酸フルダラビン、塩酸フルオロダウノルビシン、フルオロシタラビン、フォルフェニメックス、フォルメスタン、フォスキドン、フォストリエシン、フォストリエシンナトリウム、フォテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒドロキシ尿素、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、塩酸イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イフォスファミド、イルモフォシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫刺激ペプチド、インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤、インターフェロン作動剤、インターフェロンアルファ−２Ａ、インターフェロンアルファ−２Ｂ、インターフェロンアルファ−Ｎ１、インターフェロンアルファ−Ｎ３、インターフェロンベータ−ＩＡ、インターフェロンガンマ−ＩＢ、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イプロプラチン、イリノテカン、塩酸イリノテカン、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、三酢酸ラメラリン−Ｎ、ランレオチド、酢酸ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レ��チナン、レプトルスタチン、白血病阻害因子、白血球アルファインターフェロン、酢酸ロイプロリド、ロイプロリド／エストロゲン／プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミゾール、リアロゾール、塩酸リアロゾール、線状ポリアミン類縁体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミド７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロニダミン、ロソキサントロン、塩酸ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、細胞溶解性ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲステロール、酢酸メレンゲステロール、メルファラン、メノガリル、メルバロン、メルカプトプリン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトトレキセートナトリウム、メトクロプラミド、メトプリン、メツレデパ、ミクロアルガルタンパク質キナーゼＣ阻害剤、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテフォシン、ミリモスチム、ミスマッチ２本鎖ＲＮＡ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトグリン、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトマイシン類縁体、ミトナフィド、ミトスペル、ミトタン、ミトトキシン繊維芽細胞増殖因子−サポリン、ミトキサントロン、塩酸ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリルリピドａ／ミオバクテリウム細胞壁ＳＫ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多重腫瘍抑制剤１系治療薬、マスタード抗癌剤、ミカペルオキシドＢ、ミコバクテリア細胞壁抽出物、マイコフェノール酸、ミリアポロン、Ｎ−アセチルジナリン、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン／ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素モジュレータ、ニトロキシド抗酸化剤、ニトルリン、ノコダゾール、ノガラマイシン、ｎ−置換ベンズアミド、Ｏ６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導剤、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、オキシスラン、パクリタキセル類縁体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ポリ硫酸ペントサンナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、硫酸ペプロマイシン、ペルフルブロン、ペルフォスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニルアセテート、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピポブロマン、ピポスルファン、ピラルビシン、ピリトレキシム、塩酸ピロキサントロン、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノーゲン活性化剤阻害剤、白金錯体、白金化合物、白金−トリ��ミン複合体、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、プロピルビス−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、前立腺癌抗アンドロゲン、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡ系免疫モジュレータ、プロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、プルプリン類、ピラゾフリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ＲＡＦ拮抗剤、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ＲＡＳファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＲＡＳ阻害剤、ＲＡＳ−ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、エチドロン酸レニウムＲｅ１８６、リゾキシン、リボプリン、リボザイム、ＲＩＩレチナミド、ＲＮＡｉ、ログレチミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメックス、ルビギノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、サイントピン、ｓａｒｃｎｕ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、ＳＤＩ１模擬体、セムスチン、老化由来阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル形質導入阻害剤、シグナル形質導入モジュレータ、シムトラゼン、単鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォシン酸ナトリウム、スパルフォシン酸、スパソマイシン、スピカマイシンＤ、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、スロフェヌール、過活性血管作用性腸ペプチド拮抗剤、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリソマイシン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラスチン、サリドマイド、チアミプリン、チオコラリン、チオグアニン、チオテパ、トロンボ
ポエチン、トロンボポエチンミメティック、チマルファシン、チモポエチン受容体作動剤、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、チアゾフリン、スズエチルエチオプルプリン、チラパザミン、二塩化チタノセン、塩酸トポテカン、トプセンチン、クエン酸トレミフェン、トチポテント幹細胞因子、翻訳阻害剤、酢酸トレストロン、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、リン酸トリシリビン、トリメトレキセート、グルクロン酸トリメトレキセート、トリプトレリン、トロピセトロン、塩酸ツブロゾール、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン類、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、ウラシルマスタード、ウレデパ、尿生殖洞由来増殖阻害因子、ウロキナーゼ受容体拮抗剤、バプレオチド、バリオリンＢ、ベラレソール、ベラミン、ベルジン類、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンレウロシン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、ビンキサルチン、硫酸ビンゾリジン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、ジノスタチン、ジノスタチンスチマラマー、及び塩酸ゾルビシン、並びにこれらの塩、相同体、類縁体、誘導体、エナンチオマー及び／又は機能的に等価な組成物を包含する。
【０１１２】
別の実施形態において、細胞は腫瘍又は他の急速に分裂している細胞塊（例えば対象由来の腫瘍、インビトロで成長中の腫瘍等）から取り出し、そして本明細書に記載する方法、例えば不変鎖／ＣＤ７４、及び／又はＣＬＩＰの細胞表面発現を増大させるためのＴＬＲリガンド又は炎症剤を用いた処理に、何らかの様式で曝露してよい。適当な曝露の後、曝露した細胞を対象内に導入してよい。細胞の曝露は例えば、対象の免疫系が腫瘍細胞を認識できるようになる等、何らかの様式で腫瘍細胞の免疫学的プロファイルを改変する場合がある。対象の免疫系は、曝露された細胞との相互作用の後、対象内に存在する腫瘍を認識できるようになる場合があり、これにより癌（又は他の急速に分裂する細胞塊）を減少させる。対象が腫瘍を有する場合、細胞は腫瘍内、腫瘍の近傍に注射してよく、又は全身に、又は腫瘍から離れた身体の領域内に局所的に送達してよい。一部の場合においては腫瘍を対象から除去し、次に曝露細胞を例えば腫瘍の除去により形成された空洞内に、又は身体内部の他の部位に挿入してよい。場合により、他の癌治療法、例えば放射線照射又は従来の抗癌剤への曝露もまたこれらの方法と組み合わせて使用してよい。一部の場合において、対象は癌又は腫瘍を有さない場合があるが、細胞を注射して免疫系を刺激することにより、将来の癌及び／又は制御不能な細胞の成長に対抗して抗体を産生してよく、即ち癌及び／又は制御不能な細胞の成長から対象を「免疫化」してよい。一部の場合において、癌細胞は抗原性であり、そして免疫系から標的化されることができる。即ち、本発明の方法及び癌医薬品、特に癌免疫療法に分類されているものの複合投与は、癌抗原への特異的免疫応答を刺激するために非常に有用である。
【０１１３】
「癌抗原」とは本明細書において使用するとき、腫瘍又は癌細胞の表面に会合し、そしてＭＨＣ分子の範囲において抗原提示細胞の表面上に発現された場合に免疫応答を誘発することができるペプチド等の化合物である。癌抗原、例えば癌ワクチン中に存在するもの、又は癌免疫療法剤の製造に使用されるものは、粗製の癌細胞抽出物から、例えばＣｏｈｅｎ等（１９９４）に記載の通り、又は組み換え技術を用いて抗原を部分的に精製するか、又は既知抗原の新規合成により製造できる。癌抗原は特定の抗原の免疫原性部分の形態において使用することができ、又は一部の例においては全ての細胞又は腫瘍塊を抗原として使用できる。そのような抗原は、組み換えにより、又は当該分野で知られた何れかの他の手段により単離又は製造できる。
【０１１４】
本発明の方法は他の実施形態に従って免疫療法剤と組み合わせて使用できる。免疫療法の最終目標は樹立された腫瘍に対する対象の免疫応答を強化することである。免疫療法の他の方法はアジュバントの使用を包含する。バチルス・カルメット−グエリン等の微生物から誘導したアジュバント物質は免疫応答を高め、そして動物の腫瘍に対する耐性を増強する。免疫療法剤はしばしば、癌抗原に特異的に結合するか、又は別様に認識する抗体又は抗体フラグメントから誘導される医薬品である。そのような剤の結合は免疫応答、例えば抗原特異的免疫応答を促進することができる。抗体系免疫療法は内因性の免疫系を刺激して癌細胞を攻撃することができる癌細胞の細胞表面への結合により機能する場合がある。
【０１１５】
本明細書において使用するとき、「癌抗原」とは癌細胞により発現される抗原として広範に定義される。抗原は癌細胞の細胞表面において発現される場合がある。多くの場合において、抗原は正常な細胞によっては発現されないか、又は少なくとも癌細胞の場合と同じレベル又は濃度では発現されないものである。例として、一部の癌抗原は正常細胞においては通常はサイレント（即ち発現されない）であり、一部は分化の特定の段階においてのみ発現され、そして他は一時的にのみ発現される（例えば胚性及び胎児性の抗原）。他の癌抗原は突然変異体の細胞遺伝子、例えばオンコジーン（例えば活性化ｒａｓオンコジーン）、サプレッサ遺伝子（例えば突然変異体ｐ５３）、内部欠失又は染色体翻訳により生じる融合タンパク質等によりコードされる。更に別の癌抗原はウィルス遺伝子、例えばＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウィルス上に担持されているものによりコードされることができる。正常及び癌細胞における癌抗原の示差的発現は一部の場合においては癌細胞を標的化するために利用することができる。本明細書において使用するとき、「癌抗原」及び「腫瘍抗原」という用語は互換的に使用される。
【０１１６】
免疫サーベイランスの理論は免疫系の主な機能が腫瘍形成前に新生物性細胞を検出および排除することである。この理論の基本的原則は、癌細胞が正常細胞とは抗原的に異なり、そしてこのため免疫学的に不適合な自家移植片の拒絶を引き起こすものと同様の免疫反応を誘発できることである。腫瘍細胞はその抗原発現において定性的又は定量的に異なることが研究により確認されている。例えば、「腫瘍特異的抗原」は腫瘍細胞には特異的に会合するが、正常細胞には会合しない。腫瘍特異的抗原の例はＤＮＡ又はＲＮＡウィルスにより誘導される腫瘍におけるウィルス抗原である。「腫瘍会合」抗原は腫瘍細胞及び正常細胞の両方に存在するが、腫瘍細胞内では異なる量又は異なる形態で存在する。そのような抗原の例は腫瘍胎児性抗原（例えば癌胎児抗原）、分化抗原（例えばＴ及びＴｎ抗原）及びオンコジーン産物（例えばＨＥＲ／ｎｅｕ）である。
【０１１７】
インビトロ及びインビボで腫瘍標的を殺傷できる種々の異なる型の細胞が発見されており、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、及び活性化マクロファージが挙げられる。ＮＫ細胞は特定の抗原に対してあらかじめ感作させることなく腫瘍細胞を殺傷でき、そして活性には、標的細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされるクラスＩ抗原の存在を必要としない。ＮＫ細胞は発生期の腫瘍の制御に、そして転移性成長の制御に関与していると考えられている。ＮＫ細胞とは対照的に、ＣＴＬはそれらが腫瘍抗原に対して感作された後であって標的抗原がＭＨＣクラスＩをやはり発現する腫瘍細胞上に発現された場合にのみ、腫瘍細胞を殺傷できる。ＣＴＬは移植された腫瘍及びＤＮＡウィルスにより引き起こされた腫瘍の拒絶におけるエフェクタ細胞であると考えられている。ＬＡＫ細胞はＮＫ及びＣＴＬの集団と区別可能なヌルリンパ球のサブセットである。活性化されたマクロファージは、活性化されると、抗原依存性ではなく、そしてＭＨＣ制限性でもない様式において腫瘍細胞を殺傷することができる。活性化されたマクロファージはそれらが浸潤している腫瘍の成長速度を低下させると考えられている。インビトロの試験では、他の免疫機序、例えば抗体依存性細胞媒介細胞毒性反応、及び抗体＋補体による溶解が発見されている。しかしながら、これらの免疫エフェクタ機序はインビボのＮＫ、ＣＴＬ、ＬＡＫ、及びマクロファージの機能よりもインビボにおいて重要性が低いと考えられる（考察についてはＰｉｅｓｓｅｎｓ（１９９６）参照）。
【０１１８】
一部の場合において、免疫療法剤は癌細胞への毒性物質の特異的標的化のための送達系として機能する場合がある。例えば剤は、毒素、例えばリシン（例えばトウゴマ由来）、カリケアマイシン、マイタンシノイド、放射性同位体、例えばヨウ素−１３１、及びイットリウム−９０、化学療法剤に、及び／又は生物学的応答修飾因子にコンジュゲートしてよい。このようにすることにより、毒性物質は癌の領域において濃縮され、そして正常細胞への非特異的毒性を最小限にできる。
【０１１９】
特定の場合において、免疫療法剤は内皮細胞に結合するもの等の脈管構造の結合に指向されてよい。その理由は、固形腫瘍は一般的には新規に形成された血管に依存して生存しており、そしてこのため大部分の腫瘍は新しい血管を補充し、その成長を刺激することができる。その結果、多くの癌医薬の１つの方策は、腫瘍に供給している血管及び／又はそのような血管を支持している結合組織（又は間質）を攻撃することである。
【０１２０】
別の組の実施形態において、本発明の方法及びアポトーシス化学療法剤の併用投与を用いてよい。「アポトーシス化学療法剤」とは本明細書において使用するとき、急速に分裂する細胞においてアポトーシスを誘導する種々の機序により機能する分子を包含する。アポトーシス化学療法剤は当該分野で良く知られているクラスの化学療法剤である。化学療法剤は参照により本明細書に組み込まれるＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓの５２章及びその序論（１９９０）に開示されている剤を包含する。適当な化学療法剤は種々の作用機序を有してよい。適当な化学療法剤のクラスは限定しないが、（ａ）アルキル化剤、例えば窒素マスタード（例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン、クロランブシル），エチレンイミン及びメチルメラミン（例えばヘキサメチルメラミン、チオテパ）、アルキルスルホネート（例えばブスルファン）、ニトロソ尿素（例えばカルムスチン、別名ＢＣＮＵ、ロムスチン別名ＣＣＮＵ、セムスチン、別名メチル−ＣＣＮＵ、クロロゾチシン、ストレプトゾシン）、及びトリアジン（例えばジカルバジン、別名ＤＴＩＣ）；（ｂ）代謝拮抗剤、例えば葉酸類縁体（例えばメトトレキセート）、ピリミジン類縁体（例えば５−フルオロウラシルフロクスリジン、シタラビン、及びアザウリジン及びそのからのプロドラッグ型アザリビン）、及びプリン類縁体及び関連の物質（例えば６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ペントスタチン）；（ｃ）天然産物、例えばビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン）、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシド）、抗生物質（例えばダクチノマイシン、別名アクチノマイシン−Ｄ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エピルビシン、即ち４−エピドキソルビシン、イダルビシン即ち４−ジメトキシダウノルビシン、及びミトキサントロン）、酵素（例えばＬ−アスパラギナーゼ）、及び生物学的応答修飾因子（例えばインターフェロンα）；（ｄ）その他の剤、例えば白金配位複合体（例えばシスプラチン、カルボプラチン）、ジクロロアセテート及びその誘導体、置換された尿素（例えばヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えばプロカルバジン）、副腎皮質阻害剤（例えばミトタン、アミノグルテチミド）タキソール；（ｅ）ホルモン及び拮抗剤、例えば副腎皮質ステロイド（例えばプレドニソン等）、プロゲスチン（例えばヒドロキシプロゲステロンカプロエート、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲステロール）、エストロゲン（例えばジエチルエスチルベストロール、エチニルエストラジオール等）、抗エストロゲン（例えばタモキシフェン）、アンドロゲン（例えばテストステロンプロピオネート、フルオキシメステロン等）、抗アンドロゲン（例えばフルタミド）、及びゴナドトロピン放出ホルモン類縁体（例えばロイプロリド）、及び（ｆ）ＤＮＡ損傷化合物、例えばアドリアマイシンを包含する。腫瘍細胞の成長を阻害するために有効な本発明の方法とアポトーシス化学療法剤との併用投与は一部の場合においては腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するために有効な量である。
【０１２１】
更に別の組の実施形態において、本発明の方法は癌ワクチン等のワクチンと組み合わせて使用してよい。癌ワクチンは癌細胞に対する内因性免疫応答を刺激することを意図した医薬である。現在生産されているワクチンは主に体制免疫系（即ち抗体依存性免疫応答）を活性化させる。現在開発中の他のワクチンは腫瘍細胞を殺傷することができる細胞毒性Ｔリンパ球を包含する細胞媒介免疫系の活性化に着目している。癌ワクチンは一般的に両方の抗原提示細胞（例えばマクロファージ及び樹状細胞）及び／又は他の免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞に対する癌抗原の提示を増強する。
【０１２２】
癌ワクチンは数種の形態の１つをとってよいが、それらの目的は癌抗原及び／又は癌関連抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達することによりＡＰＣによるそのような抗原の内因性プロセシング及びＭＨＣクラスＩ分子の範囲内における細胞表面上の抗原提示の最終的提示を促進することである。１つの形態の癌ワクチンは、対象から取り出され、エキソビボで治療され、そして次に対象に全細胞として再導入される癌細胞の調製物である全細胞癌ワクチンである。腫瘍細胞の溶解物もまた特定の場合において癌ワクチンとして使用して免疫応答を誘発することができる。別の形態の癌ワクチンはＴ細胞を活性化させるために癌特異的な、又は癌関連の小型タンパク質を使用するペプチドワクチンである。癌関連タンパク質は癌細胞からのみ発現されるのではないタンパク質である（即ち他の正常細胞も依然としてこれらの抗原を発現する場合がある）。しかしながら、癌関連抗原の発現は一般的に特定の型の癌により一貫してアップレギュレートされる。更に別の形態の癌ワクチンはインビトロで癌抗原又は癌関連抗原に曝露されている全樹状細胞を包含する樹状細胞ワクチンである。樹状細胞の溶解物又は膜画分もまた一部の場合においては癌ワクチンとして使用してよい。樹状細胞ワクチンは抗原提示細胞を直接活性化することができる。癌ワクチンの他の非限定的な例はガングリオシドワクチン、熱ショックタンパク質ワクチン、ウィルス及び細菌性のワクチン、及び核酸ワクチンを包含する。
【０１２３】
他の癌ワクチンはインビトロで癌抗原に曝露されており、抗原をプロセシングしており、そして他の免疫系の細胞に対する効果的な抗原提示のためにＭＨＣ分子の範囲内で自身の細胞表面に癌抗原を発現することができる樹状細胞の形態をとることができる。
【０１２４】
一部の実施形態において、癌ワクチンはアジュバントと並行して使用してよい。アジュバントは対象の免疫系を活性化させる物質であり、本発明の系又は方法の何れかにおける副次的療法として使用できる。アジュバントは例えばミョウバン、ＱＳ−Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ）、Ｏｐｔｉｖａｘ（Ｖａｘｃｅｌｓ）及びＬｅＩＦ（Ｃｏｒｉｘａ）を包含する。
【０１２５】
Ｆ．感染症
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載する方法は、抗原提示細胞におけるＣＬＩＰの細胞表面発現を誘導すること、又は可溶性の合成ＣＬＩＰで直接処理すること、又はγδＴ細胞を活性化させることにより、対象内の細胞内細菌感染症を治療する場合に有用である。細胞におけるＣＬＩＰの細胞表面発現を誘導する特定の方法は癌の治療方法に関する説明において上記した通りである。例としてはｎｅｆ又はｎｅｆの発現を増大させる薬剤で、異所性ＣＬＩＰで、又は炎症メディエータ、例えばＰａｍ（３）Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）（４）（Ｐａｍ（３）ＣＳＫ（４）で、細胞を処理することである。
【０１２６】
従って本発明はＴ細胞応答が有効に対抗できる疾患の防止及び治療において用途を有する。例示のために言及する以下の病原性ウィルスクラス、即ち：インフルエンザＡ、Ｂ及びＣ、パラインフルエンザ、パラミキソウィルス、ニューカッスル病ウィルス、呼吸器シンシチウム症ウィルス、麻疹、おたふくかぜ、パルボウィルス、エプスタインー・バーウィルス、リノウィルス、コクサッキーウィルス、エコーウィルス、レオウィルス、ラブドウィルス、リンパ球脈絡髄膜炎、コロナウィルス、ポリオウィルス、単純疱疹、ヒト免疫不全ウィルス、サイトメガロウィルス、乳頭腫ウィルス、Ｂウィルス、水痘−帯状疱疹ウィルス、ポックスウィルス、風疹、狂犬病、ピコルナウィルス、ロタウィルス及びカポジ関連ヘルペスウィルスがＴ細胞選択ペプチド投与の標的として特に意図される。
【０１２７】
上記したウィルス疾患のほかに、本発明は、細菌感染症の防止、阻害又は治療においても有用であり、その例は限定しないが、８３以上の区別可能な血清型の肺炎球菌、連鎖球菌、例えばＳ・ピオゲネス、Ｓ・アガラクチアエ、Ｓ・エクイ、Ｓ・カニス、Ｓ・ボビス、Ｓ・エクイヌス、Ｓ・アンギノサス、Ｓ・サングイス、Ｓ・サリバリウス、Ｓ・ミティス、Ｓ・ミュータンス、他のビリダンス連鎖球菌、ペプトストレプトコッカス、連鎖球菌の他の関連の種、腸球菌、例えばエンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ファエシウム、スタフィロコッカス、例えばスタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・アウレウス、ヘモフィルス・インフルエンザ、シュードモナス種、例えばシュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・シュードマレイ、シュードモナス・マレイ、ブルセラ類、例えばブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、ブルセラ・アボルタス、ボルデテラ・パーツッシス、ボレリア種、例えばボレリア・ブルゲドルフェリ、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノレエ、モラキセラ・カタルハリス、コリネバクテリウム・ジフテリア、コリネバクテリウム・ウルセランス、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス、コリネバクテリウム・シュードジフテリチカム、コリネバクテリウム・ウレアリチカム、コリネバクテリウム・ヘモリチカム、コリネバクテリウム・エクイ等、リステリア・モノサイトゲネス、ノコルジア・アステロイデス、バクテロイド種、アクチノマイセス種、トレポネーマ・パリダム、レプトスピロサ種、ヘモフィルス種、ヘリコバクター種、例えばヘリコバクター・ピロリ、トレポネーマ種、及び関連の生物が挙げられる。本発明は、グラム陰性細菌、例えばクレブシエラ・ニューモニア、エシェリシア・コリ、プロテウス、セラチア種、アシネトバクター、イエルシニア・ペスティス、フランシセラ・ツラレンシス、エンテロバクター種、バクテリオデス及びレジオネラ種、シゲラ種、マイコバクテリウム種（例えばマイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・ボビス又は他のマイコバクテリア感染症）、マイコバクテリウム・アヴィウム複合体（ＭＡＣ）、マイコバクテリウム・マリナム、マイコバクテリウム・フォルツイタム、マイコバクテリウム・カンサイ、エルシニア感染症（例えばエルシニア・ペスティス、エルシニア・エンテロコルチカ又はエルシニア・シュードツベルクロシス）等に対しても有用である場合がある。更に、本発明は原虫、蠕虫、又は生物による他の巨視的感染症、例えばクリプトスポリジウム、エンタモエバ、プラモジウム、ギアルジア、リーシュマニア、トリパナソマ、トリコモナス、ナエグレリア、イソスポラ・ベリ、トポプラズマ・ゴンジ、トリコモナス・バギナリス、ウンシェレリア、アスカリス、シストソマ種、シクロスポラ種等、そしてクラミジア・トラコマチス及び他のクラミジア感染症、例えばクラミジア・シタチ、又はクラミジア・ニューモニア等の制御における使用も意図している。当然ながら、本発明は効果的な抗体を作製できる相手である如何なる病原体に対しても使用してよい。
【０１２８】
カビ及び他の真菌性病原体（その一部はＨｕｍａｎ  Ｍｙｃｏｓｅｓ（１９７９）；Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ  Ｍｙｃｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｍａｎ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｎｉｍａｌｓ（１９８９）；及びＳｃｒｉｐ’ｓ  Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  （１９９２）において報告されている）もまたＴ細胞選択ペプチドの投与の標的として意図される。本発明の範囲内で意図されるカビは限定しないが、アスペルギルス症、黒色砂毛症、カンジダ症、クロモマイコーシス症、クリプトコッカス症、オニコマイコーシス症、又は外耳炎（耳真菌症）、フェオフィオ真菌症、フィコマイコーシス症、癜風、白癬、須毛白癬、頭部白癬、体部白癬、股部白癬、黄癬、渦状癬、手白癬、黒色癬（掌）、足白癬、爪白癬、トルロプシス症、腋窩菌毛症、白色砂毛症、及びその同義語から重度の全身性又は日和見感染症、例えば限定しないがアクチノマイコーシス症、アスペルギルス症、カンジダ症、クロモマイコーシス症、コクシジオイデス真菌症、クリプトコッカス症、エントモフトラ症、ゲオトリクム症、ヒストプラズマ症、ムコール菌症、足菌腫、ノカルジア症、北アメリカブラストミセス症、パラコキシジオイドミコーシス症、フェオフィオ真菌症、フィコマイコーシス症、肺炎球菌性肺炎、ピチオーシス症、スポロトリクス症、及びトルロプシス症、及びこれらの同義語を包含し、その一部は致命的である。公知のカビ及び真菌症の病原体は、限定しないが、アブシジア種、アクチノマヅラ・マヅラエ、アクチノマイセス種、アレシェリア・ボイジー、アルタナリア種、アントプシス・デルトイデア、アポフィソマイセス・エレガンス、アルニウム・レオポリナム、アスペルギルス種、オーレオバシジウム・プルランス、バシジオボラス・ラナルム、ビポラリス種、ブラストマイセス・ダーマチチヂス、カンジダ種、セファロスポリウム種、カエトコニジウム種、カエトミウム種、クラドスポリウム種、コクシジオイデス・イミティス、コニジオボルス種、コリネバクテリウム・テヌイス、クリプトコッカス種、カニンガメラ・ベルトレチアエ、クルブラリア種、ダクチラリア種、エピデルモフィトン種、エピデルモフィトン・フロッコサム、エキセロフィラム種、エキソフィアラ種、フォンセカエア種、フサリウム種、ジオトリカム種、ヘルミントスポリウム種、ヒストプラズマ種、レシトホラ種、マズレラ種、マラセジア・フルフル、ミクロスポラム種、ムコール種、マイコセントロスポラ・アセリナ、ノカルジア種、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス、ペニシリウム種、フェオスクレラ・デマチオイデス、フェアネロマイセス種、フィアレモニウム・オボバツム、フィアロホラ種、フォマ種、ピエロライア・ホルタイ、ニューモシスチス・カリニ、ピチウム・インシジオサム、リノクラジエラ・アクアスペルサ、リゾムコール・プシルス、リゾパス種、サクセナエア・バシホルミス、サルシノマイセス・フェムリホルミス、スポロスリックス・シェンキ、シンセファラストラム・ラセモサム、タエニオエラ・ボピ、トルロプソシス種、トリコフィトン種、トリコスポロン種、ウロクラジウム・シャルタラム、ワンギエラ・デルマチチジス、キシロヒハ種、ジゴミエテス種及びその同義語を包含する。病原性の能力���有する他のカビは限定しないがテルモムコール・インジカエ−セウダチカエ、ラジオマイセス種及び知られた病原性の属の他の種を包含する。
【０１２９】
一部の態様において、本発明は抗ＣＬＩＰ分子および抗ＨＬＡ結合分子、例えばペプチド、抗体、抗体フラグメントおよび小分子を包含する方法及びキットを提供する。ＣＬＩＰおよびＨＬＡ結合分子は細胞の表面上でそれぞれＣＬＩＰ分子及びＨＬＡに結合する。結合分子は本明細書においてはＣＬＩＰ分子及びＨＬＡに選択的に結合する単離された分子と称する。本明細書においては、ＣＬＩＰ及びＨＬＡに選択的に結合する分子は、ＣＬＩＰ及びＨＬＡと相互作用する分子、例えば小分子、ペプチド、抗体、フラグメントと称する。一部の実施形態において、分子はペプチドである。
【０１３０】
ペプチドは最小限ＣＬＩＰ及びＨＬＡに結合する領域を含む。ＣＬＩＰ及びＨＬＡの結合領域は、一部の実施形態においては、公知又は市販の抗体のＣＬＩＰ及びＨＬＡ結合領域から誘導され、或いは、それらはそのような領域の機能的に等価な変異体である。「抗体」という用語は本明細書においては、最も広範な意味において使用され、具体的には、未損傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの未損傷の抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、所望の生物学的活性を示す限りにおいて抗体フラグメント、及びｓｃＦｖ等の抗体様分子を包含する。ネイティブの抗体は通常は２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖を有するヘテロ４量体の糖タンパク質を指す。各重鎖及び軽鎖は規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端において可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）及びその他方の末端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列しており、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成していると考えられている。
【０１３１】
多くのＣＬＩＰ及びＨＬＡ抗体が研究目的のために市販されている。可変ドメインの特定の部分が抗体間で配列において広範に異なっており、そして各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されている。しかしながら、変動性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布していない。それは軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における「相補性決定領域」（ＣＤＲ）又は「超可変領域」と称される３又は４セグメント内に濃縮されている。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。ネイティブの重鎖及び軽鎖可変ドメインは各々、４又は５つのＦＲ領域を含み、概ねβシート配置をとっており、これはＣＤＲにより接続され、それがループ接続を形成し、そして一部の場合においてはβシート構造の部分を形成する。各鎖におけるＣＤＲはＦＲ領域により近接して共に保持されており、そして別の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ等、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐａｇｅｓ  ６４７−６６９（１９９１）参照）。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接関与している必要はないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の参加等の種々のエフェクタ機能を呈する。
【０１３２】
超可変領域又はＣＤＲは、本明細書において使用されるとき、抗原結合部位を形成し、そして抗原特異性の主要決定因子である、抗体の究極的な配列変動制の可変領域内のサブ領域を定義する。１つの定義によれば、それらは軽鎖可変領域の残基（Ｋａｂａｔの命名法）２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）、及び重鎖可変領域の残基（Ｋａｂａｔの命名法）３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、９５〜１０２（Ｈ３）であることができる（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．［１９９１］）。
【０１３３】
「未損傷の」抗体は抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインはネイティブの配列の定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、未損傷の抗体は１つ以上のエフェクタ機能を有する。抗体フラグメントの産生のために種々の手法が開発されている。伝統的には未損傷の抗体のタンパク質分解性消化を介して３つのフラグメントが誘導されている（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながら、これらのフラグメントは現在では組み換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体フラグメントは抗体ファージライブラリーから単離できる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは直接大腸菌から回収し、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の方法によれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組み換え宿主細胞培養物から直接単離できる。
【０１３４】
「抗体フラグメント」は未損傷の抗体の一部分、好ましくは未損傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成した多重特異性抗体を包含する。抗体のパパイン消化は２つの同一の抗原結合フラグメント、即ち各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメント及び残余の「Ｆｃ」フラグメントを生じさせ、この名前は容易に結晶化するその能力を反映している。抗体のペプシン処理は２つの抗原組み合わせ部位を有し、そしてなお抗原に交差結合できるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせる。
【０１３５】
「Ｆｖ」は完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。この領域は堅固な非共有結合の会合における１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変領域ドメインの２量体よりなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を定義するのはこの配置においてである。合計で６つのＣＤＲが抗原結合特異性を抗体に付与している。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的なＣＤＲを僅か３つしか含まないＦｖの半分）であっても、全結合部位より低親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【０１３６】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’フラグメントは抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを包含する重鎖ＣＨ１のカルボキシ末端における数個の残基の付加により、Ｆａｂフラグメントとは異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ’に関する本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、本来は間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
【０１３７】
「Ｆｃ領域」という用語は未損傷抗体のパパイン消化により生成して良い免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域はネイティブ配列Ｆｃ領域又は変異体Ｆｃ領域であってよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界線は変動してよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常は概ねＣｙｓ２２６位置のアミノ酸残基から、又は概ねＰｒｏ２３０位置から、Ｆｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般的に２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、そして場合によりＣＨ４ドメインを含む。「Ｆｃ領域鎖」とは本明細書においては、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の１つを意味する。
【０１３８】
「ヒンジ領域」及びその変形は本明細書においては、当該分野で知られた意味を包含し、それは例えばＪａｎｅｗａｙ等、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ  ｅｄ．，１９９９）に記載されている。
【０１３９】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは種々の異なるクラスに割りつけられ得る。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、即ち：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのうち数種はさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に分割してよい。種々の異なるクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと称される。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造及び三次元配置は当該分野で良く知られている。
【０１４０】
何れかの脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」はその定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（Κ）及びラムダ（λ）と称される２つの明確に区別される方の一方に割りつけることができる。
【０１４１】
本発明において有用なペプチドは単離されたペプチドである。本明細書において使用するとき、「単離されたペプチド」とはペプチドが実質的に純粋であり、そしてそれらの意図される使用のために現実的で適切な程度まで、自然界又はインビボ系において共存している他の物質を本質的に含まないことを意味する。特に、ペプチドは、例えば薬学的調製品の製造又は配列決定において有用であるように、十分に純粋であり、そしてその宿主細胞の他の生物学的構成成分を十分に含まない。本発明の単離されたペプチドは薬学的調製品中で製薬上許容しうる担体と添加混合して良いため、ペプチドは調製品の低い重量パーセントのみ有して良い。しかしなおペプチドはそれが生体系において会合している物質から実質的に分離されているという意味において実質的に純粋である。
【０１４２】
ＣＬＩＰ及びＨＬＡ結合分子は、好ましくは選択的様式においてＣＬＩＰ及びＨＬＡに結合する。本明細書において使用するとき、「選択的結合」及び「特異的結合」という用語は、非ＣＬＩＰ及びＨＬＡ誘導化合物に対するよりもＣＬＩＰ及びＨＬＡ及びそのフラグメントに対してより高い親和性で結合するペプチドの能力を指すために互換的に使用される。即ち、ＣＬＩＰ及びＨＬＡに選択的に結合するペプチドは、ＣＬＩＰ及びＨＬＡと同じ様式においてＣＬＩＰ及びＨＬＡ結合ペプチドに結合する抗イディオタイプ抗体の炭水化物又は可変領域のペプチドミメティック等のＣＬＩＰ及びＨＬＡを模倣するために作成された交差反応性の抗原又は分子の場合を除き、それらがＣＬＩＰ及びＨＬＡ及びそのフラグメントに結合する場合と同じ程度にまでは、そして同じ親和性においては、非ＣＬＩＰ及びＨＬＡ誘導化合物には結合しない。一部の実施形態において、ＣＬＩＰ及びＨＬＡ結合分子はＣＬＩＰ及びＨＬＡ及びそれらのフラグメントにのみ結合する。
【０１４３】
「単離された抗体」とは本明細書において使用するとき、他の細胞性物質（例えば抗体を産生する細胞から分離されたもの）から、又は本発明の診断又は治療方法の何れかにおけるその使用を妨害する他の物質から実質的に物理的に分離された抗体を指す。好ましくは、単離された抗体は抗体の均質な集団（例えばモノクローナル抗体の集団）中に存在する。しかしながら単離された抗体の組成物を他の成分、例えば限定しないが製薬上許容しうる担体、アジュバント等と組み合わせることができる。
【０１４４】
１つの実施形態において、本発明において有用なＣＬＩＰ及びＨＬＡペプチドはＣＬＩＰ及びＨＬＡに特異的な単離された未損傷の可溶性のモノクローナル抗体である。本明細書において使用するとき、「モノクローナル抗体」という用語は同一のエピトープ（即ち抗原決定基）に特異的に結合する免疫グロブリンの均質な集団を指す。
【０１４５】
他の実施形態において、ペプチドは抗体フラグメントである。当該分野で良く知られている通り、抗体分子の小部分、即ちパラトープのみが抗体のそのエピトープへの結合に関与している（一般的に、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；及びＰｉｅｒ  ＧＢ，Ｌｙｃｚａｋ  ＪＢ，Ｗｅｔｚｌｅｒ  ＬＭ，（ｅｄｓ）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）  １ｓｔ  Ｅｄ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．参照）。抗体のｐＦｃ’及びＦｃ領域は例えば補体カスケードのエフェクタであり、そして、貪食細胞上のＦｃ受容体への結合を媒介できるが、抗原結合には関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されているか、又はｐＦｃ’領域を有さないように産生されている抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと称され、未損傷抗体の抗原結合部位の両方を保持している。単離されたＦ（ａｂ’）２フラグメントはその２つの抗原結合部位のために２価のモノクローナルフラグメントと称される。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されているか、又はＦｃ領域を有さないように産生されている抗体は、Ｆａｂフラグメントと称され、未損傷抗体の抗原結合部位の１つを保持している。更に進めれば、Ｆａｂフラグメントは共有結合した抗体軽鎖及びＦｄと表記される抗体重鎖の一部分（重鎖可変領域）よりなる。Ｆｄフラグメントは抗体特異性の主要な決定因子であり（単一のＦｄフラグメントは抗体特異性を改編することなく１０までの異なる軽鎖に会合する場合がある）、そしてＦｄフラグメントは単離においてエピトープ結合能力を保持している。
【０１４６】
Ｆａｂ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖという用語は何れかの標準的な免疫学的意味により使用される［Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８２）；Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  Ｅｄ．，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；及びＰｉｅｒ  ＧＢ，Ｌｙｃｚａｋ  ＪＢ，Ｗｅｔｚｌｅｒ  ＬＭ，（ｅｄｓ）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）  １ｓｔ  Ｅｄ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．］。
【０１４７】
本発明の抗ＣＬＩＰ及びＨＬＡ抗体は更にヒト化抗体又はヒト抗体を含んで良い。非ヒト（例えばネズミ）抗体のヒト化形態は非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小限の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖、又はフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を包含する。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が相当する非ヒト残基より置き換えられている。ヒト化抗体は、レシピエントの抗体にも移入されたＣＤＲにも、そしてフレームワーク配列にも見出されない残基を含む場合もある。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、その場合、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含むことになる［Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｔ，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０１４８】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野で良く知られている。一般的にヒト化抗体は非ヒトである供給源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と称される場合が多く、それらは典型的には「移入」可変ドメインから採取される。ヒト化は本質的には、ヒト抗体の相当する配列に代えてげっ歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列を置換することによりＷｉｎｔｅｒ等の方法に従って実施できる［Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］。従って、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許４，８１６，５６７）、その場合、未損傷のヒト可変ドメインに実質的に満たないものが非ヒト種由来の相当する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的には、一部のＣＤＲ残基及び恐らくは一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似の部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
【０１４９】
種々の形態のヒト化抗体又は親和性成熟抗体が意図される。例えばヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、イムノコンジュゲートを形成するために１つ以上の細胞毒性剤に場合によりコンジュゲートされたＦａｂ等の抗体フラグメントであってよい。或いはヒト化抗体又は親和性成熟抗体は未損傷の抗体、例えば未損傷のＩｇＧ１抗体であってよい。
【０１５０】
ヒト化の代替として、ヒト抗体を生成できる。「ヒト抗体」とはヒトにより産生された、及び／又はヒト抗体を作製するための何れかの手法を用いて作製されている、抗体のそれに相当するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。例えば、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを作製することが免疫化時に可能であるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが現在可能である。例えばキメラ及び生殖細胞系の突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）のホモ接合の欠失は内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが報告されている。そのような生殖細胞系突然変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は抗原攻撃時のヒト抗体の産生をもたらす。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ等、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；及び米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号及び第５，５４５，８０７号を参照できる。
【０１５１】
ヒトモノクローナル抗体はまた当該分野で知られた方法、例えばＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ等に発行の米国特許第５，５６７，６１０号、Ｏｓｔｂｅｒｇに発行の米国特許第５６５，３５４号、Ｂａｋｅｒ等に発行の米国特許第５，５７１，８９３号、Ｋｏｚｂｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４），Ｂｒｏｄｅｕｒ，等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７），及びＢｏｅｒｎｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６−９５（１９９１）に開示されているものの何れかにより作製してもよい。
【０１５２】
本発明は単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）の使用も包含する。単鎖可変領域フラグメントは短鎖連結ペプチドを用いながら軽鎖及び／又は重鎖可変領域を連結することにより作製する。十分な可撓性及び長さを有する何れかのペプチドをｓｃＦｖにおけるリンカーとして使用できる。通常、リンカーは免疫原性が殆ど、又は全くないものを選択する。連結ペプチドの例は多重ＧＧＧＧＳ残基であり、これは１つの可変領域のカルボキシ末端と別の可変領域のアミノ末端とを架橋する。他のリンカー配列を使用してもよい。
【０１５３】
重鎖及び軽鎖の如何なる部分も何れかの組み合わせにおいて使用できる。典型的には、全可変領域はｓｃＦｖに包含される。例えば軽鎖可変領域を重鎖可変領域に連結できる。或いは、軽鎖可変領域の一部分を重鎖可変領域、又はその部分に連結できる。同様に意図されるものは重鎖可変領域が目的の抗体由来であり、そして軽鎖可変領域が別の免疫グロブリン由来であるｓｃＦｖである。
【０１５４】
ｓｃＦｖは何れかの順番、例えばＶＨ−リンカー−ＶＬ又はＶＬ−リンカー−ＶＨで組み立てることができる。特定の発現系においてこれらの２つの配置の発現のレベルには差がある場合があり、その場合、これらの形態の１つが好ましい場合がある。（Ｘ）−リンカー−（Ｘ）−リンカー−（Ｘ）等のタンデムｓｃＦｖを例えば作製することもでき、この場合、Ｘは目的の抗体のポリペプチド型であるか、これらのポリペプチドと他のポリペプチドとの組み合わせである。別の実施形態において、単鎖抗体ポリペプチドはリンカーポリペプチドを有さないか、又は単に短い非可撓性リンカーを有するのみである。可能な配置はＶＬ−ＶＨ又はＶＨ−ＶＬである。連結部は鎖内のＶＬ及びＶＨの間の相互作用を可能にするには短すぎ、そして鎖は各末端においてＶＬ／ＶＨ抗原結合部位を有するホモ２量体を形成する。そのような分子は当該分野では「ダイアボディ」と称される。
【０１５５】
単鎖可変領域は組み換えにより、又は合成により製造してよい。ｓｃＦｖの合成による製造のためには自動合成装置を使用できる。ｓｃＦｖの組み換えによる製造のためには、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適当なプラスミドを、酵母、植物、昆虫又は哺乳動物の細胞等の真核生物、又は、大腸菌等の原核生物の何れかの適当な宿主細胞内に導入することができ、そして、発現されたタンパク質を標準的なタンパク質精製手法を用いて単離してよい。
【０１５６】
「ダイアボディ」という用語は２つの抗原結合部位を有する小型の抗体フラグメントを指し、その場合のフラグメントは同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメインの間で対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは強制的に別の鎖の相補ドメインと対形成させられ、２つの抗原結合部位が生じる。ダイアボディは例えばＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に説明されている。
【０１５７】
本明細書に記載するモノクローナル抗体は特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種から誘導された、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一又は相同であるが、鎖の残余は別の種から誘導された、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びに、所望の生物学的活性を呈する限りにおいてそのような抗体のフラグメントを包含する。
【０１５８】
抗体を包含するペプチドは当該分野で知られた標準的な結合アッセイを用いてＣＬＩＰ及びＨＬＡに結合するそれらの能力に関して試験することができる。適当なアッセイの例として、ＣＬＩＰ及びＨＬＡを表面上（例えばマルチウェルプレートのウェル中）に固定化し、次に標識されたペプチドと接触させることができる。次にＣＬＩＰ及びＨＬＡに結合する（そしてこれにより自身が表面上に固定化される）ペプチドの量を定量することにより、特定のペプチドがＣＬＩＰ及びＨＬＡに結合するかどうかを調べてよい。或いは、表面に結合していないペプチドの量を計測してもよい。このアッセイの変形例においては、ペプチドはＣＬＩＰ及びＨＬＡ発現細胞に直接結合するその能力に関して試験することができる。
【０１５９】
本発明は、ＣＬＩＰ及びＨＬＡに結合する小分子も包含する。そのような結合分子はファージディスプレイ操作法等の従来のスクリーニング方法により識別してよい（例えばＨａｒｔ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４６８（１９９４）に記載されている方法）。Ｈａｒｔ等は新規なペプチドリガンドを同定するためのフィラメントファージディスプレイライブラリーを報告している。一般的に、例えばＭ１３又はｆｄファージを使用したファージディスプレイライブラリーは、上記した参考文献に記載されているもの等の従来の操作法を用いて製造される。ライブラリーは一般的に４〜８０アミノ酸残基を含有するインサートをディスプレイする。インサートは場合によりペプチドの完全に縮重した、又は偏移したアレイを示す。適切な結合特性を有するリガンドは標的分子に結合するリガンドを自身の表面上に発現するファージを選択することにより得られる。次にこれらのファージを数サイクルの再選択に付すことにより、最も有用な結合特性を有するファージを発現しているペプチドリガンドを発見する。典型的には、最良の結合特性（例えば最高の親和性）を示すファージを更に核酸分析により特性決定することにより、最適な結合を達成する発現ペプチドの最適な長さにおいてファージ表面上で発現されるペプチドの特定のアミノ酸配列を同定する。ファージディスプレイペプチド又は抗体ライブラリーは、Ｂｒｉｓｓｅｔｔｅ  Ｒ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．２００６Ｍａｙ；９（３）３６３−９にも記載されている。
【０１６０】
或いは、結合分子はコンビナトリアルライブラリーから発見することができる。多くの型のコンビナトリアルライブラリーが報告されている。例えば米国特許第５，７１２，１７１号（化学分子のスカホールド骨格を有する複数の分子コンストラクトを形成すること、及び、論理的に順序づけられたアレイにおける分子上の少なくとも１つの位置を修飾することにより、合成分子コンストラクトのアレイを構築するための方法を記載している）；第５，９６２，４１２号（特定の物理化学的特性を有する重合体を作製するための方法を記載している）；及び第５，９６２，７３６号（特定のアレイ化された化合物を記載している）が挙げられる。
【０１６１】
他の結合分子は本明細書に記載するガイダンスに従って当業者により同定されてよい。ライブラリー技術を使用することによりＣＬＩＰ及びＨＬＡに結合してその機能を遮断する小ペプチドを包含する小分子を同定できる。拮抗剤同定のためのライブラリーを用いることの１つの利点は小反応容量において（即ち合成及びスクリーニングの反応において）小さいサイズの種々の数百万の推定候補の容易な操作である。ライブラリーの他の利点は、特に非ペプチド部分の場合においては天然に存在する原料を用いて別様に得ることができない拮抗剤を合成する能力である。
【０１６２】
小分子コンビナトリアルライブラリーもまた形成してよい。小型有機化合物のコンビナトリアルライブラリーは、多様性の１つ以上の点において相互に異なる緊密に関連した類縁体の収集物であり、そして多段階プロセスを用いながら有機的手法により合成される。コンビナトリアルライブラリーは多数の小型有機化合物を包含する。コンビナトリアルライブラリーの１つの型は、化合物アレイを作製するためのパラレル合成法を用いて製造される。「化合物アレイ」とは本明細書において使用するとき、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ座標における自身の空間的アドレスにより識別可能であり、そして各化合物が共通の分子コア及び１つ以上の可変の構造多様性エレメントを有するように配置された化合物の収集物である。そのような化合物アレイにおける化合物は別個の反応容器中でパラレルに製造され、そして各化合物をその空間的アドレスにより識別及び追跡される。パラレル合成混合物及びパラレル合成法の例は１９９５年７月１３日公開のＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９５／１８９７２、及び１９９８年１月２７日付与の米国特許第５，７１２，１７１号及びその相当するＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９６／２２５２９に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
本明細書に記載したＣＬＩＰ及びＨＬＡ結合分子は単独で、又は検出物質又は細胞毒性剤等の他の分子とのコンジュゲートとして、本明細書により詳述する本発明の検出及び治療において使用できる。
【０１６４】
典型的には、成分の１つは通常は検出可能な標識を含むか、又はそれにカップリング又はコンジュゲートされる。検出可能な標識はその存在が直接又は間接的に確認できる部分である。一般的に、標識の検出では標識によるエネルギーの放出を行う。標識は光子又は他の特定波長の原子粒子（例えば放射線、発光、光学的又は電子の密度等）を放出及び／又は吸収するその能力により検出できる。標識は特定の波長の光を放出又は吸収する別の部分（例えばエピトープタグ、例えばＦＬＡＧエピトープ、酵素タグ、例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ等）に結合するか、それを補充するか、そして一部の場合においてはそれを分解する自身の能力により間接的に検出できる。間接的検出の例は基質を分解して可視生成物にする第１の酵素標識の使用である。標識は化学物質、ペプチド又は核酸分子の性質のものであってよいが、それらに限定されない。他の検出可能な標識は放射性同位体、例えばＰ３２又はＨ３、発光マーカー、例えば蛍光染料、光学的又は電子密度のマーカー等、又はエピトープタグ、例えばＦＬＡＧエピトープ又はＨＡエピトープ、ビオチン、アビジン、及び酵素タグ、例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ、β−ガラクトシラーゼ等を包含する。標識はその合成の間、又は後にペプチドに結合してよい。多数の異なる標識及び標識方法が当該分野で知られている。本発明において使用できる標識の型の例は酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド状金属、化学発光化合物、及び生物発光化合物を包含する。本明細書に記載するペプチドのための他の適当な標識は当業者の知る通りであり、或いは定型的な実験を用いながらそのようなものを確認することができる。更に、これらの標識の本発明のペプチドへのカップリング又はコンジュゲーションは、当業者に一般的な標準的な手法を用いながら実施できる。
【０１６５】
より高い感度をもたらす場合がある別の標識手法は本明細書に記載する分子を低分子量ハプテンにカップリングさせることよりなる。次にこれらのハプテンを第２の反応により特異的に改変できる。例えば、ハプテン、例えばアビジンと反応するビオチン、又は特異的な抗ハプテン抗体と反応できるジニトロフェノール、ピリドキサール、又はフルオレセインを使用することが一般的である。
【０１６６】
検出可能な標識へのペプチド、例えば抗体又はそのフラグメントのコンジュゲーションは、特に、診断アッセイにおけるそのような剤の使用を容易にする。検出可能な標識の他の範疇は診断用及び画像化用標識（一般的にインビボ検出可能標識と称する）、例えば磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）：Ｇｄ（ＤＯＰＡ）；核医薬用：２０１Ｔｌ、ガンマ線放出放射性核種９９ｍＴｃ；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）用：陽電子放出同位体、（１８）Ｆ−フルオロデオキシグルコース（（１８）ＦＤＧ）、（１８）Ｆ−フルオライド、銅−６４、ガドジアミド、及びＰｂ（ＩＩ）の放射性同位体、例えば２０３Ｐｂ；１１１Ｉｎを包含する。
【０１６７】
本明細書に記載するコンジュゲーション又は修飾は定型的な化学を使用しており、その化学は本発明の部分を形成せず、そしてその化学は化学の当該分野でよく知られている。保護基及び公知のリンカー、例えばモノ及びヘテロ二官能性リンカーの使用は文献に十分記載されており、本明細書で反復しない。
【０１６８】
本明細書において使用するとき、「コンジュゲートした」とは何れかの物理化学的手段により相互に安定して結合している２つの実体を意味する。結合の性質はそれが相互の実体の有効性を実質的に損なわないようなものであることが重要である。これらのパラメータを念頭に置きながら、当該分野で知られた何れかの共有結合又は非共有結合の連結部を使用してよい。一部の実施形態において、共有結合の連結部が好ましい。非共有結合のコンジュゲーションは疎水性相互作用、イオン性相互作用、高親和性相互作用、例えばビオチン−アビジン及びビオチン−ストレプトアビジンの複合体形成、及び他の親和性相互作用を包含する。結合のこのような手段及び方法は当該分野でよく知られている。
【０１６９】
標識及び他のアッセイ成分の性質に応じて種々の方法を使用しながら標識を検出してよい。例えば、標識は固体基質に結合した状態で、又は固体基質から分離した後に検出してよい。標識は光学又は電子密度、放射性放射、非放射性エネルギー転移等を介して直接、又は、抗体コンジュゲート、ストレプトアビジン−ビオチンコンジュゲート等を用いて間接的に検出してよい。標識を検出するための方法は当該分野でよく知られている。
【０１７０】
コンジュゲートは、細胞毒性剤、例えば化学療法剤、毒素（例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント、又は小分子毒素）、又は放射性同位体（例えば放射性コンジュゲート）にコンジュゲートした抗体を包含する。本発明の抗体にコンジュゲートできる他の抗腫瘍剤は、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載の総称ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られる剤のファミリー、並びにエスペラマイシン（米国特許第５，８７７，２９６号）を包含する。コンジュゲートにおいて使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルジタンパク質、ジアンシンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカ・カランチア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。
【０１７１】
細胞の選択的破壊のためには、抗体は高放射性原子を含んでよい。種々の放射性同位体が放射性コンジュゲート抗体の製造のために使用できる。例としてはＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が包含される。コンジュゲートを検出に使用する生物学的活性、それはシンチグラフィ試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化、ｍｒｉとしても知られている）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０１７２】
放射性又は他の標識は知られた方法でコンジュゲートに取り込ませてよい。例えばペプチドは、生物合成するか、又は例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む適当なアミノ酸前駆体を用いながら化学的アミノ酸合成により合成してよい。ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１をペプチド中のシステイン残基を介して結合できる。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合できる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ等、（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を用いてヨウ素−１２３を取り込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）はその他の方法を詳述している。
【０１７３】
抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば塩酸ジメチルアジピミデート）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製してよい。例えばリシン免疫毒はＶｉｔｅｔｔａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載の通り製造できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照できる。リンカーは細胞における細胞毒性剤の放出を促進する「切断性リンカー」であってよい。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してよい。
【０１７４】
更に、本発明の方法は解糖阻害剤及び／又はハロゲン化アルキルエステルの投与を包含してよい。解糖阻害剤及び／又はハロゲン化アルキルエステルは細胞表面上のＭＨＣからＣＬＩＰを排除するＣＬＩＰ活性阻害剤として機能する。好ましい解糖阻害剤は２−デオキシグルコース化合物、即ち本明細書において，２−デオキシ−Ｄ−グルコースと定義するもの、及び２−デオキシ−Ｄ−グルコースの相同体、類縁体、及び／又は誘導体である。レボ型は優勢ではなくそして２−デオキシ−Ｄ−グルコースが好ましいが、「２−デオキシグルコース」という用語は特に２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び２−デオキシ−Ｌ−グルコース、又はこれらの混合物の何れも包含することを意図している。
【０１７５】
本発明において有用な２−デオキシグルコースの例は、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｌ−グルコース；２−ブロモ−Ｄ−グルコース、２−フルオロ−Ｄ−グルコース、２−ヨード−Ｄ−グルコース、６−フルオロ−Ｄ−グルコース、６−チオ−Ｄ−グルコース、７−グルコシルフルオライド、３−フルオロ−Ｄ−グルコース、４−フルオロ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの１−Ｏ−プロピルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの１−Ｏ−トリデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの１−Ｏ−ペンタデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの３−Ｏ−プロピルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの３−Ｏ−トリデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの３−Ｏ−ペンタデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの４−Ｏ−プロピルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの４−Ｏ−トリデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの４−Ｏ−ペンタデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの６−Ｏ−プロピルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの６−Ｏ−トリデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの６−Ｏ−ペンタデシルエステル、及び５−チオ−Ｄ−グルコース、及びこれらの混合物である。
【０１７６】
本発明において特に有用な解糖阻害剤は式：
【０１７７】
【化５】
2010516772.tif 000006
（式中、ＸはＯ又はＳ原子であり；Ｒ１は水素原子又はハロゲン原子であり；Ｒ２はヒドロキシル基、ハロゲン原子、チオール基、又はＣＯ−Ｒ６であり；そしてＲ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、ヒドロキシル基、ハロゲン原子，又はＣＯ−Ｒ６であり、ここでＲ６は１〜２０炭素原子のアルキル基であり、そしてＲ３、Ｒ４、及びＲ５の少なくとも２つはヒドロキシル基である）を有すことができる。ハロゲン原子は好ましくはＦであり、そしてＲ６は好ましくはＣ３−Ｃ１５アルキル基である。好ましい解糖阻害剤は２−デオキシ−Ｄ−グルコースである。このような解糖阻害剤はＭ．Ｋ．Ｎｅｗｅｌｌ等により２００４年６月１１日に出願された出願番号１０／８６６，５４１に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
本発明の一部の実施形態において、ファルマコンとして解糖阻害剤とハロゲン化アルキルエステルとの組み合わせを投与することによりＣＬＩＰを除去できる。組み合わせは好ましくは１つ以上の生理学的に利用可能なエーテラーゼにより加水分解されるプロドラッグとして作用する単一の二官能性化合物として組み合わせる。生理学的条件における種々のエステラーゼの全体の利用性のために、解糖阻害剤とハロゲン化アルキルエステルとを組み合わせることによりエステルを形成できる。プロドラッグは生理学的に利用できるエステラーゼにより加水分解されてその二官能性形態となる。
【０１７９】
他の特定の実施形態において、ハロゲン化アルキルエステルは式：Ｒ７ｍＣＨ１−ｍＸ２Ｒ８ｎＣＯＯＹ（式中Ｒ７はメチル、エチル、プロピル又はブチルであり、そしてｍ及びｎは各々、０又は１であり、Ｒ８はＣＨ又はＣＨＣＨであり、Ｘはハロゲンである）を有する。個別の化合物として使用する場合、Ｙはアルカリ金属又はアルカリ土類金属のイオン、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム、アンモニウム、及び置換されたアンモニウム（置換基は１〜４個の炭素原子のモノ又はジ低級アルキルラジカルである）、及びエチレンジアンモニウムである。プロドラッグとしての解糖阻害剤と組み合わせて使用する場合は、Ｙは後述する方法及び材料のセクションで記載する通り解糖阻害剤でエステル化される。
【０１８０】
好ましいプロドラッグはジクロロ酢酸のエステル化により製造されるものであり、以下の構造により例示される。
【０１８１】
【化６】
2010516772.tif 000007
（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルジクロロアセテート
【０１８２】
【化７】
2010516772.tif 000008
（３Ｓ，４Ｒ，６Ｒ）−３，６−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルジクロロアセテート
【０１８３】
【化８】
2010516772.tif 000009
（３Ｓ，４Ｒ，６Ｒ）−４，６−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イルジクロロアセテート
【０１８４】
【化９】
2010516772.tif 000010
［（３Ｓ，４Ｒ，６Ｒ）−３，４，６−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］メチルジクロロアセテート
特定の実施形態において、対象を治療するための方法は、有効量の核酸分子を対象に投与して障害を治療することを包含する。特定のこれらの実施形態においては、治療のための方法は、アンチセンス、ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド等の、小分子干渉核酸分子を有効量で対象に投与してＣＬＩＰ分子、ＨＬＡ−ＤＯ又はＨＬＡ−ＤＭの発現のレベルを低減することを包含する。ＣＬＩＰ分子、ＨＬＡ−ＤＯ及びＨＬＡ−ＤＭのヌクレオチド配列は当該分野で良く知られており、そして後述するガイダンスと組み合わせて当該分野で知られた手法を用いながら当業者により使用されることにより適切なｓｉＲＮＡ分子を製造できる。そのような方法は後に詳述する。
【０１８５】
本発明は小分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）と称される小型の核酸分子を特徴としており、それには例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子が包含される。本発明のｓｉＮＡは未修飾であるか、又は化学修飾することができる。本発明のｓｉＮＡは本明細書において考察する通り、化学合成、ベクターから発現、又は酵素的に合成することができる。本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により細胞における遺伝子の発現又は活性を調節することができる種々の化学修飾された合成の小分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。化学修飾されたｓｉＮＡの使用は、例えばインビボにおけるヌクレアーゼ分解への増強された耐性を介して、及び／又は、向上した細胞取り込みを介して、ネイティブｓｉＮＡ分子の種々の特性を向上させる。更に、多数の化学修飾を有するｓｉＮＡはそのＲＮＡｉ活性を保持している場合がある。本発明のｓｉＮＡ分子は種々の治療用途のための有用な試薬及び方法を提供する。
【０１８６】
血清中のリボヌクレアーゼによる自身の分解を防止する修飾（塩基、糖、及び／又はホスフェート）を有する化学的に合成された核酸分子はその力価を増大できる（例えばＥｃｋｓｔｅｉｎ等、国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ等、１９９０Ｎａｔｕｒｅ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ等、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４；  Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ等、国際公開ＷＯ９３／１５１８７；及びＲｏｓｓｉ等、国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号；及びＢｕｒｇｉｎ等、上出参照；これらの全ては本明細書における核酸分子の塩基、ホスフェート及び／又は糖部分に対して行うことができる種々の化学修飾を記載している。細胞におけるその薬効を増強するための修飾、及びオリゴヌクレオチド合成時間を短縮し、化学物質の必要性を低減するために核酸分子からの塩基の除去が望ましい。（これら全ての公開物は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８７】
自身のヌクレアーゼの安定性及び薬効の多大な増強を伴いながら核酸分子に導入できる糖、塩基及びホスフェートの修飾を記載する当該分野におけるいくつかの例が存在する。例えば、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性基、例えば２’アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾を用いた修飾により安定性の増強及び／又は生物学的活性の増強のために修飾される（検討についてはＵｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ．１７，３４；Ｕｓｍａｎ等、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ等、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０参照）。核酸分子の糖修飾は当該分野で広範に報告されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ  Ｎｏ．ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５  ５６８；Ｐｉｅｋｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４３１７；Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４  ３３９；Ｕｓｍａｎ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ  Ｎｏ．ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号及びＢｅｉｇｅｌｍａｎ等、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎ等、参照）。分子は１つ以上の化学修飾を含む。
【０１８８】
１つの実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は標的ＲＮＡ又はその一部分のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして２本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部分と同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、２本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は標的ＲＮＡ又はその一部分のヌクレオチド配列に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、そして２本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は標的ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部分に実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１９〜約２３ヌクレオチドを含み、そして各鎖は他の鎖のヌクレオチドと相補的である少なくとも約１９のヌクレオチドを含む。
【０１８９】
一部の実施形態において、ｓｉＮＡはゲノム的に組み込まれたトランスジーン又はプラスミド系発現ベクターによりコードされ、それから発現されるｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ−ｍｉａ、又はマイクロＲＮＡ分子である。即ち、一部の実施形態においては、ｍＲＮＡ発現又はマイクロＲＮＡ活性を抑制できる分子は小分子干渉核酸をコードするトランスジーン又はプラスミド系発現ベクターである。そのようなトランスジーン及び発現ベクターはこれらのｓｈＲＮＡの発現を駆動するためにポリメラーゼＩＩ又はポリメラーゼＩＩＩの何れかを使用することができ、そして細胞内に機能的ｓｉＲＮＡをもたらすことができる。前者のポリメラーゼは古典的なタンパク質発現方法、例えば誘導性及び組織特異的発現系の使用を可能にする。一部の実施形態において、トランスジーン及び発現ベクターは組織特異的プロモータにより制御される。他の実施形態において、トランスジーン及び発現ベクターは誘導プロモータ、例えばテトラサイクリン誘導性発現系により制御される。
【０１９０】
一部の実施形態において、本発明の小分子干渉核酸は哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。組み換え哺乳動物発現ベクターは特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向できるものであってよい（例えば、細胞特異的調整エレメントを用いて核酸を発現する）。組織特異的調整エレメントは当業者の知る通りである。適当な組織特異的プロモータの非限定例はミオシン重鎖プロモータ、アルブミンプロモータ、リンパ様特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、膵臓特異的プロモータ、及び乳腺特異的プロモータを包含する。発生的に調節されるプロモータも包含され、例えばネズミｈｏｘプロモータ及びａ−フェトプロテインプロモータが挙げられる。
【０１９１】
本明細書においては、「ベクター」とは、異なる遺伝子環境間の輸送のため、又は、宿主細胞内の発現のために、制限及びライゲーションにより所望の配列を挿入してよい核酸分子の多くのうちの何れかであってよい。ベクターは典型的にはＤＮＡよりなるが、ＲＮＡベクターも使用可能である。ベクターは限定しないがプラスミド、ファージミド、及びウィルスゲノムを包含する。発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が調節配列に作動可能に連結され、そしてＲＮＡ転写物として発現されてよいように、それが制限及びライゲーションにより挿入されてよいものである。一部の実施形態において、核酸分子を送達するためのウィルスベクターは、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ポックスウィルス、例えばワクシニアウィルス及び弱毒化されたポックスウィルス、セムリキフォレストウィルス、ベネズエラウマ脳炎ウィルス、レトロウィルス、シンドビスウィルス、及びＴｙウィルス様粒子よりなる群から選択される。外因性核酸を送達するために使用されているウィルス及びウィルス様粒子の例は、複製欠損アデノウィルス（例えばＸｉａｎｇ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１９：２２０−２２７，１９９６；Ｅｌｏｉｔ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７：５３７５−５３８１，１９９７；Ｃｈｅｎｇａｌｖａｌａ等、Ｖａｃｃｉｎｅ１５：３３５−３３９，１９９７）、修飾されたレトロウィルス（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３３６５−３３７４，１９９７）、非複製レトロウィルス（Ｉｒｗｉｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５０３６−５０４４，１９９４）、複製欠損セムリキフォレストウィルス（Ｚｈａｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：３００９−３０１３，１９９５）、カナリア痘ウィルス及び高度に弱毒化されたワクシニアウイ誘導体（Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３４９−１１３５３，１９９６）、非複製ワクシニアウィルス（Ｍｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３４１−１１３４８，１９９６）、複製ワクシニアウィルス（Ｍｏｓｓ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．８２：５５−６３，１９９４）、ベネズエラウマ脳炎ウィルス（Ｄａｖｉｓ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３７８１−３７８７，１９９６）、シンドビスウィルス（Ｐｕｇａｃｈｅｖ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１２：５８７−５９４，１９９５）及びＴｙウィルス様粒子（Ａｌｌｓｏｐｐ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２６：１９５１−１９５９，１９９６）を包含する。好ましい実施形態において、ウィルスベクターはアデノウィルスである。
【０１９２】
特定の用途のための別の好ましいウィルスはアデノ関連ウィルス、２本鎖ＤＮＡウィルスである。アデノ関連ウィルスは広範な細胞型及び種を感染することができ、そして複製欠損となるように操作できる。それは更に利点を有しており、熱及び油脂溶媒安定性、造血系細胞を包含する多様な系統の細胞における高度な形質導入頻度、及び重複感染阻害がないことによる多連の形質導入が挙げられる。アデノ関連ウィルスは部位特異性様式においてヒト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができ、これにより挿入突然変異誘発及び挿入された遺伝子の発現の変動の可能性を最小限にできる。更に、野生型のアデノ関連ウィルス感染が選択圧力の不在下で１００継代を超えて組織培養中でフォローされており、アデノ関連ウィルスのゲノム組み込みが比較的安定な事象であることを示唆している。アデノ関連ウィルスは染色体外様式において機能できる。
【０１９３】
一般的に、他の好ましいウィルスベクターは非細胞変性真核生物ウィルスに基づいており、その場合、非必須遺伝子は目的の遺伝子で置き換えられている。非細胞変性ウィルスはレトロウィルスを包含し、その生命周期はゲノムウィルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写、及びその後の、宿主細胞ＤＮＡ内への前ウィルス組み込みを包含する。アデノウィルス及びレトロウィルスはヒト遺伝子療法治験に関して認可されている。一般的に、レトロウィルスは複製欠損である（即ち、所望のタンパク質の合成を指向できるが、感染粒子を製造することはできない）。そのように遺伝子的に改変されたレトロウィルス発現ベクターはインビボの遺伝子の高効率形質導入のための一般的用途を有する。複製欠損レトロウィルスを製造するための標準的なプロトコル（プラスミド内への外因性遺伝子物質の取り込み、プラスミドによるパッケージング細胞系統のトランスフェクション、パッケージング細胞系統による組み換えレトロウィルスの生産、組織培養培地からのウィルス粒子の収集、及びウィルス粒子による標的細胞の感染）はＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．Ｅｄ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，」ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）において提供される。
【０１９４】
核酸分子をインビトロ又はインビボの何れにより宿主に導入するかに応じて、種々の手法を細胞内に本発明の核酸分子を導入するために使用してよい。そのような手法は核酸分子のトランスフェクション−リン酸カルシウム沈降法、ＤＥＡＥに会合した核酸分子のトランスフェクション、又は目的の核酸分子を包含する上記したウィルスを用いたトランスフェクション又は感染、リポソーム媒介トランスフェクションを包含する。特定の用途のためには、特定の細胞に核酸分子（例えば小分子干渉核酸分子）を標的化することが好ましい。そのような場合において、細胞に本発明の核酸分子を送達するために使用されるビヒクル（例えばレトロウィルス、又は他のウィルス；リポソーム）は自身に結合した標的化分子を有することができる。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体、又は標的細胞上の受容体に対するリガンド等の分子を核酸分子送達ビヒクルに結合するか、その中に取り込むことができる。特に好ましいものはモノクローナル抗体である。リポソームを使用して本発明の核酸分子を送達する場合、標的化のため、及び／又は取り込みを容易にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤内に配合してよい。そのようなタンパク質は特定の細胞型に対して向性なカプシドタンパク質又はそのフラグメント、サイクリングにおいて内在化を起こすタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的化し、そして細胞内半減期を増大させるタンパク質等を包含する。重合体送達系も当該分野で知られる通り、細胞内に核酸分子を送達するために良好に使用されている。そのような系は核酸分子の経口送達をも可能にする。
【０１９５】
ベクターの使用を介した送達の他に、本発明の核酸はベクターを使用することなく、例えば「ネイキッド」核酸送達として、当該分野で知られた方法を用いて送達してよい。
【０１９６】
使用できる他の阻害剤分子は、遺伝子、ＲＮＡ転写物、又はタンパク質の配列に指向された、リボザイム、ペプチド、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、三重らせん形性オリゴヌクレオチド、抗体、及びアプタマー及びこれらの修飾型を包含する。アンチセンス及びリボザイムの抑制方策は、遺伝子産物の発現を低減することにより、又は、突然変異の部位において突然変異体転写物を分解することにより、腫瘍の表現型の逆行をもたらしている（Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｍｏｉｎｅ  Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．６７（５）：８６９−７６，１９９３；Ｌａｎｇｅ等、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．６（１１）：１７８６−９４，１９９３；Ｖａｌｅｒａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４６）：２８５４３−６，１９９４；Ｄｏｓａｋａ−Ａｋｉｔａ等、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１０２（５）：６６０−４，１９９４；Ｆｅｎｇ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（１０）：２０２４−８，１９９５；Ｑｕａｔｔｒｏｎｅ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（１）：９０−５，１９９５；Ｌｅｗｉｎ等、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．４（８）：９６７−７１，１９９８）。例えば新生物性逆行は膀胱癌細胞におけるＨ−Ｒａｓ突然変異に標的化されたリボザイムを使用しながら得た（Ｆｅｎｇ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（１０）：２０２４−８，１９９５）。リボザイムは、突然変異体遺伝子の遺伝子発現の阻害、及び標的化されたトランススプライシングによる突然変異体の補正の手段として提案されている（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ  Ｎａｔｕｒｅ  ３７１（６４９８）：６１９−２２，１９９４；Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２（６）：６４３−８，１９９６）。リボザイム活性は例えば非特異的核酸結合タンパク質又は促進剤オリゴヌクレオチドの使用により増強してよい（Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ等、Ｅｍｂｏ  Ｊ．１３（１２）：２９１３−２４，１９９４；Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗｅｎｚｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（３）：４２３−９，１９９６）。多重標的化リボザイム（連結又はショットガン）は遺伝子抑制のためのリボザイムの効率を向上させる手段として示唆されている（Ｏｈｋａｗａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．（２９）：１２１−２，１９９３）。
【０１９７】
三重らせん法は配列特異的遺伝子抑制のために研究されている。三重らせん形成オリゴヌクレオチドは配列特異的な様式において結合することが一部の場合において見出されている（Ｐｏｓｔｅｌ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８（１８）：８２２７−３１，１９９１；Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（２）：５０４−８，１９９２；Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３（７）：２８１１−６，１９９６；Ｐｏｒｕｍｂ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６（３）：５１５−２２，１９９６）。同様に、ペプチド核酸が遺伝子発現を阻害することが分かっている（Ｈａｎｖｅｙ等、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１（４）：３０７−１７，１９９１；Ｋｎｕｄｓｅｎ  ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｏｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（３）：４９４−５００，１９９６；Ｔａｙｌｏｒ等、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１３２（１１）：１１７７−８３，１９９７）。浅溝結合ポリアミドは配列特異的な様式においてＤＮＡ標的に結合することができ、これによりＤＮＡレベルにおいて将来の抑制のための有用な小分子となる場合がある（Ｔｒａｕｇｅｒ等、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３（５）：３６９−７７，１９９６）。更に、優性阻害突然変異体ペプチド及び抗体を用いたタンパク質レベルにおける干渉により抑制が得られている（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２９（６１３６）：２１９−２２，１９８７；Ｒｉｍｓｋｙ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１（６２４１）：４５３−６，１９８９；Ｗｒｉｇｈｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６（９）：３１９９−２０３，１９８９）。一部の場合において、抑制方策はタンパク質の同時低減を伴うことなくＲＮＡレベルにおける低減をもたらしており、他の場合において、ＲＮＡの低減はタンパク質の低減により反映されている。
【０１９８】
使用できる多様なアレイの抑制方策は、例えばＣＬＩＰ又はＨＬＡ−ＤＯを標的化するために選択できるＤＮＡ及び／又はＲＮＡアプタマーの使用を包含する。修飾された置き換え遺伝子及びアプタマー系の抑制に対して難治性又は部分的難治性であるコードされたタンパク質と組み合わせた抑制のためのアプタマーを用いた抑制及び置き換えを本発明において使用できる。
【０１９９】
本発明の活性化剤を有効量で対象に投与して、自己免疫疾患、癌、ＨＩＶ感染、他の感染症、及び移植片拒絶のような障害を治療する。「有効量」とは例えば所望の生物学的作用を実現するために必要又は十分な量である。「癌を治療するため有効量」とは、例えば、（ｉ）癌細胞を殺傷する；（ｉｉ）癌細胞のさらなる成長を阻害する、即ちその発達を停止又は緩徐化する；及び／又は（ｉｉｉ）抗癌剤又は治療薬に対して癌細胞を感受性化するために必要な量となる、本発明の化合物の有効量である。本発明の一部の態様によれば、有効量は、組み合わせられるか、同時投与されるか、単独投与された場合に、疾患の防止又は治療のいずれかにおいて、疾患への治療応答をもたらす、単独又は他の医薬との組み合わせにおける、本発明の化合物の量である。生物学的作用は疾患から生じている症状の緩解又は完全な消失であってよい。別の実施形態においては、生物学的作用は例えば疾患又は腫瘍の症状の不在により、又は癌細胞を含まない生検試料又は血液塗沫により顕在化される、疾患の完全な停止である。
【０２００】
本明細書に記載した疾患の治療における本発明の化合物の有効量は、使用する特定の化合物、化合物の送達の様式、及び単独で使用するか組み合わせるかにより変動してよい。何れかの特定の用途における有効量は治療すべき疾患、投与する特定の化合物、対象の体格、又は疾患又は状態の重症度等の要因に応じて変動する場合もある。当業者であれば予定外の実験を行う必要なく本発明の特定の分子の有効量を経験的に決定できる。本明細書に記載した教示と組み合わせて、種々の活性化合物及び考量すべき要因、例えば力価、相対的生体利用性、患者体重、有害副作用の重症度及び好ましい投与様式を選択することにより、実質的な毒性をもたらさず、そしてなお特定の対象を治療するために完全に有効であるような、有効な予防的又は施療的な治療投薬法を計画できる。
【０２０１】
本発明の医薬組成物は製薬上許容しうる担体中に溶解又は分散させた薬剤の１つの有効量を含む。「製薬上、又は薬理学上許容しうる」という表現は、動物、例えば適宜ヒトに投与した場合に有害、アレルギー性、又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。更に、動物（例えばヒト）への投与の場合は、調製品はＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより必要とされる滅菌性、発熱性、全体の安全性及び純度基準を満足する必要があることが理解されよう。
【０２０２】
本明細書において使用するとき、「製薬上許容しうる担体」は、当該分野で知られる通り、如何なる全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性化剤、抗酸化物、保存料（例えば抗細菌剤、抗かび剤）、等張性付与剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、錠剤崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、フレーバー剤、染料、そのような材料及びその組み合わせを包含する（例えば参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）参照）。何れかの従来の担体が活性成分と不適合でない限り、治療約又は医薬組成物におけるその使用が意図される。
【０２０３】
剤は、投与されるものが固体、液体、又はエアロゾル形態であるかどうか、そして注射等の投与経路のために滅菌されていることが必要かどうかに応じて、異なる型の担体を含んでよい。本発明は静脈内、皮内、動脈内、患部内、腫瘍内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小包内、粘膜内、心膜内、臍内、眼内、経口、局部、局所、吸入（例えばエアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、局所灌流、標的細胞直接水浴、カテーテル使用、洗浄、クリーム中、液体組成物中（例えばリポソーム）、又は他の方法又は上記したもののいずれかの組み合わせにより、当該分野で知られる通り投与できる（例えば参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）参照）。特定の実施形態において、腹腔内注射が行われる。
【０２０４】
特定の実施形態において、医薬組成物は例えば少なくとも約０．１％の活性化合物を含む。他の実施形態において、活性化合物は単位重量の約２％〜約７５％、又は例えば約２５％〜約６０％、そしてこれに誘導可能な任意の範囲を含んでよい。他の非限定例において、用量は、投与あたり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上まで、そしてこれに誘導可能な任意の範囲を含んでよい。本明細書において列挙した数値から誘導可能な範囲の非限定例において、５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重等の範囲を上記した数値に基づいて投与できる。
【０２０５】
何れの場合においても、組成物は１つ以上成分の酸化を遅延させるため種々の抗酸化剤を含んでよい。更に、微生物の活動を防止することは、保存料、例えば種々の抗細菌剤及び抗カビ剤、例えば限定しないが、パラベン（例えばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、又はこれらの組み合わせにより行うことができる。
【０２０６】
剤は遊離塩基、中性又は塩の形態において組成物中に製剤してよい。製薬上許容しうる塩は酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸で形成されるものを包含する。遊離カルボキシル基で形成された塩も無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化鉄；又は有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインから誘導され得る。
【０２０７】
組成物が液体形態である実施形態においては、担体は溶媒又は分散媒体、例えば限定しないが、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、脂質（例えばトリグリセリド、植物油、リポソーム）及びこれらの組み合わせであることができる。例えばレシチン等のコーティングを使用することにより；例えば液体ポリオール又は脂質等の担体中の分散により必要な粒径を維持することにより；例えばヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性化剤を使用することにより；又はこれらの方法の組み合わせにより、適切な流動性を維持することができる。多くの場合において、等張性付与剤、例えば糖類、塩化ナトリウム、又はこれらの組み合わせを含むことが好ましい。
【０２０８】
本明細書に記載した化合物の対象用量は典型的には約０．１μｇ〜１０，０００ｍｇ、より典型的には約１μｇ／日〜８０００ｍｇ、そして最も典型的には約１０μｇ〜１００μｇの範囲である。対象の体重の観点から記載すれば、典型的な用量は約０．１μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も典型的には約１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。絶対量は種々の要因、例えば併用療法、投与回数、及び個々の患者のパラメータ、例えば年齢、身体状態、体格及び体重に応じて変動する。これらは当該分野で良く知られている要因であり、定型的実験を超えることなく認知できる。一般的には調和の取れた医学的判断に従って、最も高値の安全用量である最高用量を使用することが好ましい。
【０２０９】
本発明の分子の多用量も意図される。一部の場合において、本発明の分子を癌医薬とともに投与する場合は、分子又は癌医薬の何れかの治療用量未満量、又は両方の治療用量未満量を、癌を有するか発症の危険性のある対象の治療において使用する。２つのクラスの薬品を共に使用する場合、癌医薬は所望の治療結果をもたらすためには治療用量未満量で投与してよい。「治療用量未満量」とは本明細書において使用するとき、他剤の不在下で投与した場合に対象において治療結果をもたらす用量に満たない用量をさす。即ち、癌医薬の治療用量未満量とは本発明の分子の投与の不在下では対象において所望の治療結果をもたらさない量である。癌医薬の治療用量は癌治療の医学の分野でよく知られている。これらの用量はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，１９９０等の参考文献；そして癌の治療のための指針として医療専門家に信頼されている多くの他の医学文献に十分説明されている。抗体の治療用量も当該分野で知られている。
【０２１０】
種々の投与経路が使用可能である。選択される特定の様式は、当然ながら、選択される特定の活性化剤、治療するべき特定の状態、及び治療効果のために必要な用量に応じたものとなる。本発明の方法は、一般的に、医学的に許容される何れかの投与様式を用いて実施してよく、臨床上許容できない有害作用を起こすことなく保護の効果的なレベルをもたらす何れかの様式を意味する。好ましい投与様式は非経腸経路である。「非経腸」という用語は皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内注射、又は注入の手法を包含する。他の投与経路は限定しないが、経口、経鼻、皮膚、舌下、又は局所を包含する。
【０２１１】
本発明の製剤は製薬上許容しうる溶液として投与され、これは定型的には製薬上許容しうる濃度の塩、緩衝剤、保存料、適合性のある担体、アジュバント、及び場合により他の治療成分を含有する。
【０２１２】
本発明の化合物は医薬を投与するための何れかの通常の経路により投与できる。治療すべき癌の型に応じて、本発明の化合物は、吸入、摂取、又は全身経路で投与してよい。全身経路は経口及び非経腸を包含する。吸入医薬は、一部の実施形態においては、特に肺癌の場合には、肺に直接送達されるため好ましい。数種の型の計量用量吸入器が吸入による投与のために通常使用されている。これらの型の装置は計量用量吸入器（ＭＤＩ）、呼吸駆動型ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、スペーサ／ホールディングチャンバをＭＤＩと組み合わせたもの、及びネブライザを包含する。好ましい投与経路は限定しないが、経口、非経腸、筋肉内、鼻内、気管内、髄腔内、静脈内、吸入、眼内、膣内、及び直腸内投与である。治療に用いるためには、有効量の本発明の化合物を罹患した臓器又は組織に核酸を送達する何れかの様式により対象に投与できる。本発明の医薬組成物を「投与すること」は当該分野で知られた何れかの手段により達成してよい。
【０２１３】
本発明の方法によれば、化合物は医薬組成物において投与してよい。一般的に、医薬組成物は本発明の化合物及び製薬上許容しうる担体を含む。ペプチド、モノクローナル抗体、及び抗体フラグメントのための製薬上許容しうる担体は当該分野で良く知られている。本明細書においては、製薬上許容しうる担体は活性成分の生物学的活性、例えばＣＬＩＰ及びＨＬＡに結合するペプチドの能力の有効性を妨害しない非毒性物質を意味する。
【０２１４】
製薬上許容しうる担体は希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤及び他の当該分野で良く知られている物質を包含する。特にペプチド用の例示される製薬上許容しうる担体は、米国特許第５，２１１，６５７号に記載されている。そのような調製品は定型的には塩、緩衝液、保存料、適合性のある担体、及び場合により他の治療薬を含有してよい。医薬において使用する場合、塩は製薬上許容しうるものである必要があるが、製薬上許容されない塩を好都合に使用してその製薬上許容しうる塩を調製してよく、そして本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的及び製薬上許容しうる塩は、例えば限定しないが、以下の酸、即ち：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されたものを包含する。更に、製薬上許容しうる塩はアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩、例えばナトリウム、カリウム又はカルシウム塩として調製できる。
【０２１５】
本発明の化合物は固体、半固体、液体、又は気体形態、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、吸入剤及び注射、及び経口、非経腸又は外科的な投与のための通常の様式において調製品中に製剤してよい。本発明はインプラント等の局所投与のために製剤された医薬組成物も包含する。
【０２１６】
経口投与に適する組成物は、個別の単位として、例えばカプセル、錠剤、ロゼンジとして提示してよく、それらの各々が所定量の活性化剤を含有する。他の組成物は水性液体又は非水性の液体中の懸濁液、例えばシロップ、エリキシル又は乳液を包含する。
【０２１７】
本明細書に記載した化合物（ペプチド及び非ペプチド種を包含）を治療上使用する場合、特定の実施形態において、所望の投与経路は肺エアロゾルによる場合がある。化合物を含有するエアロゾル送達系を調製するための手法は当該分野で良く知られている。一般的にそのような系はペプチドの生物学的特性を大きく損なわない成分を利用する必要がある（例えば参照により本明細書に組み込まれるＳｃｉａｒｒａ  ａｎｄ  Ｃｕｔｉｅ，「Ａｅｒｏｓｏｌｓ，」Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版、１９９０，ｐｐ１６９４−１７１２参照）。当業者であれば、予定外の実験を行うことなくエアロゾルを製造するための種々のパラメータ及び条件を容易に決定できる。
【０２１８】
本発明の化合物は組織に直接投与してよい。好ましくは、組織はＣＬＩＰ発現細胞が検出されるものである。直接の組織投与は直接の注射により達成してよい。化合物は一回投与するか、或いは、複数の投薬により投与してよい。多数回投与する場合、化合物は異なる経路で投与してよい。例えば初回（又は最初の数回）の投与は罹患組織内部に直接行ってよく、そしてその後の投与は全身に行ってよい。
【０２１９】
経口投与のためには、化合物は当該分野で良く知られている製薬上許容しうる担体と活性化合物とを組み合わせることにより製剤できる。そのような担体は本発明の化合物を、治療すべき対象による経口摂取のための、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤可能とする。経口使用のための薬学的調製品は固体賦形剤として、場合により得られた混合物を粉砕し、そして、所望により適当な補助剤の添加後、顆粒の混合物を処理することにより錠剤又は糖衣錠コアとすることにより得ることができる。適当な賦形剤は特に、充填剤、例えば糖類、例えば乳糖、スクロース、マンニトール、又はソルビトール；セルロース調製品、例えばトウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、バレイショ澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望により、錠剤崩壊剤、例えば交差結合ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加してよい。場合により、経口用製剤は、内部の酸条件を中和するための食塩水又は緩衝液中に製剤してもよく、或いは、如何なる担体を伴うこともなく投与してよい。
【０２２０】
糖衣錠コアは適当なコーティングを用いて提供される。この目的のためには、濃縮された糖溶液を使用してよく、これは場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適当な有機溶媒又は溶媒混合物を含有してよい。識別のため、又は活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣錠コーティングに添加してよい。
【０２２１】
経口使用できる薬学的調製品はゼラチンから作成されるプッシュフィットカプセル、並びにゼラチン及び可塑剤、例えばグリセロール又はソルビトールから作成されるソフトシールカプセルを包含する。プッシュフィットカプセルは乳糖等の充填剤、澱粉等の結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、及び場合により安定剤との混合物中に活性成分を含有できる。ソフトカプセルにおいては、活性化合物は適当な液体、例えば油脂、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールに溶解又は懸濁してよい。更に、安定剤を添加してもよい。経口投与用に製剤されたミクロスフェアを使用してもよい。そのようなミクロスフェアは当該分野で良く知られている。経口投与用の全ての製剤はそのような投与に適する用量とする。
【０２２２】
口内投与のためには、組成物は従来の様式において製剤された錠剤又はロゼンジの形態をとってよい。
【０２２３】
吸入による投与のためには、本発明による使用のための化合物は、適当なプロペラント、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適当な気体を使用しながら、加圧パック又はネブライザからエアロゾルスプレー状の形態において好都合に送達してよい。加圧エアロゾルの場合は、投与単位は計量された量を送達する弁を設けることにより測定してよい。吸入器又は吸引器における使用のための例えばゼラチンのカプセル又はカートリッジは、化合物及び適当な粉末基剤、例えば乳糖又は澱粉の粉末混合物を含有するように製剤してよい。エアロゾル送達系を調製するための手法は当該分野で良く知られている。一般的に、そのような系は活性化剤の生物学的特性を大きく損なわない成分を利用する必要がある（例えば参照により本明細書に組み込まれるＳｃｉａｒｒａ  ａｎｄ  Ｃｕｔｉｅ，「Ａｅｒｏｓｏｌｓ，」、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版、１９９０，ｐｐ１６９４−１７１２参照）。当業者であれば予定外の実験を必要とすることなくエアロゾルを製造するための種々のパラメータ及び条件を容易に決定できる。
【０２２４】
組成物は、それを全身に送達することが望ましい場合は、注射による、例えば瞬時注射又は連続注入による非経腸投与のために製剤してよい。注射のための製剤は、単位剤型において、例えばアンプル又は多用量容器において、添加された保存料と共に提示してよい。組成物は油性又は水性のビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳液等の形態をとってよく、そして懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤等の製剤補助剤を含有してよい。
【０２２５】
非経腸投与のための調製品は滅菌された水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳液を包含する。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性の溶液、乳液又は懸濁液、例えば食塩水及び緩衝媒体を包含する。非経腸ビヒクルは塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、ラクテート添加リンゲル液、又は固定油を包含する。静脈内ビヒクルは水分栄養補給剤、電解質補給剤（例えばリンゲルデキストロース系のもの）等を包含する。保存料及び他の添加剤も存在してよく、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート形成剤、及び不活性ガス等が挙げられる。より低用量は別の形態の投与、例えば静脈内投与から生じることになる。適用した初回用量では対象における応答が不十分である場合、より高用量（又は異なるより局所的な送達経路による効果的に高値の用量）を患者の耐容性が許す限りにおいて使用してよい。化合物の適切な全身レベルを達成するためには一日当たり多数回の投薬が意図される。
【０２２６】
更に他の実施形態において、好ましいビヒクルは哺乳動物レシピエントへの移植に適する生体適合性の微粒子又はインプラントである。この方法により有用である例示的な生体腐食性インプラントはＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７（１９９４年３月１５日出願の米国特許出願２１３，６６８への優先権を主張しているタイトル「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ」の公開ＷＯ９５／２４９２９）に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ／０３０７は生物学的巨大分子を含有するための生体適合性の、好ましくは生体腐食性の重合体マトリックスを記載している。重合体マトリックスは対象における剤の持続放出を達成するために使用してよい。本発明の１つの態様によれば、本明細書に記載した剤はＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７に開示される生体適合性の、好ましくは生体腐食性の重合体マトリックス内にカプセル化又は分散してよい。重合体マトリックスは好ましくは微粒子、例えばミクロスフェア（ここで、剤は固体の重合体マトリックス中に分散される）又はマイクロカプセル（ここで、剤は重合体シェルのコア中に保存される）の形態である。他の形態の、剤を含有するための重合体マトリックスは、フィルム、コーティング、ゲル、インプラント、及びステントを包含する。重合体マトリックス装置の大きさ及び組成はマトリックス装置が移植される組織において良好な放出動態をもたらすように選択する。重合体マトリックス装置の大きさは更に、使用される送達方法、典型的には組織への注射又は鼻及び／又は肺領域へのエアロゾルによる懸濁液の投与に従って選択する。重合体マトリックスの組成は良好な分解速度が得られると同時に、血管、肺又は他の表面に装置が投与された場合に移行の有効性を更に増大させる生体接着性の物質から形成するように選択できる。マトリックス組成物は、分解するのではなく、むしろ長時間にわたる拡散により放出されるように選択することもできる。
【０２２７】
対象に本発明の剤を送達するためには非生体分解性及び生体分解性の重合体マトリックスを使用できる。生体分解性マトリックスが好ましい。そのような重合体は天然又は合成の重合体であってよい。合成重合体が好ましい。重合体は一般的には数時間から一年以上のオーダーにおける放出が望まれる期間に基づいて選択される。典型的には、数時間から３〜１２か月の範囲の期間にわたる放出が最も望ましい。重合体は場合により水中で自身の重量の約９０％までを吸収することができるヒドロゲルの形態であり、そして更に場合により多価イオン又は他の重合体と交差結合する。
【０２２８】
一般的に本発明の剤は拡散により、又はより好ましくは、重合体マトリックスの分解により、生体腐食性インプラントを用いて送達してよい。生体分解性送達系を形態するために使用できる例示的な合成重合体は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びその共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル及びメタクリルエステルの重合体、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロースサルフェートナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルアセテート、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン及びポリビニルピロリドンを包含する。
【０２２９】
非生体分解性重合体の例はエチレンビニルアセテート、ポリ（メタ）アクリル酸ポリアミド、これらの共重合体及び混合物を包含する。
【０２３０】
生体分解性重合体の例は合成重合体、例えば乳酸及びグリコール酸の重合体、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、及びポリ（ラクチド−コカプロラクトン）、及び天然の重合体、例えばアルギネート及び他の多糖類、例えばデキストラン及びセルロース、コラーゲン、その化学的誘導体（化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化及び当該分野で定型的に行われている他の修飾）、アルブミン及び他の親水性タンパク質、ゼイン及び他のプロラミン及び疎水性タンパク質、それらの共重合体及び混合物を包含する。一般的にこれらの物質はインビボにおいて酵素的加水分解又は水への曝露の何れかにより、表面又は塊状の腐食により分解する。
【０２３１】
特に興味深い生体接着性重合体は、参照により本明細書に組み込まれるＨ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ、Ｃ．Ｐ．Ｐａｔｈａｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９３、２６、５８１−５８７に記載の生体腐食性ヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、及びポリ（オクタデシルアクリレート）を包含する。
【０２３２】
他の送達系は徐放、遅延放出又は持続放出の送達系を包含できる。このような系は化合物の反復投与を回避することができ、対象及び医師に対する簡便性が向上する。多くの型の放出送達系が使用可能であり、当該分野で知られている。それらはポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステラミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリ無水物等の重合体基剤系を包含する。薬剤を含有する上記重合体のマイクロカプセルは例えば米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系は非重合体系を包含し、それらは脂質、例えばステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸又は中性脂肪、例えばモノ、ジ及びトリグリセリド；ヒドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチド系；ワックスコーティング；従来の結合剤及び賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分融合インプラント等を包含する。特定の例は、限定しないが例えば、（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５，１８９号及び第５，７３６，１５２号に記載のものの等のマトリックス内の形態として血小板減少剤が含有されている腐食系；及び（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号、第５，１３３，９７４号及び第５，４０７，６８６号等に記載の重合体から制御された速度において活性化合物が透過する拡散系を包含する。更に、ポンプ系ハードウエア送達系を使用することができ、その一部は移植に採用されている。
【０２３３】
長期持続放出インプラントの使用は慢性疾患又は再発癌の治療に特に適している。長期放出とは、本明細書において使用するとき、少なくとも３０日間、そして好ましくは６０日間有効成分の治療レベルを送達するようにインプラントが構築及び配置されていることを意味する。長期持続放出インプラントは当該分野で良く知られており、そして上記した放出系の一部を包含する。
【０２３４】
ペプチド又は抗体の治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、任意の製薬上許容しうる担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））に所望の程度の純度を有するペプチド又は抗体を混合することにより保存用に調製してよい。許容される担体、賦形剤又は安定剤は使用する用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして緩衝物質、例えばホスフェート、シトレート及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム。塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；クロロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖類、２糖類及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン；キレート形成剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；及び／又はノニオン系界面活性化剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。
【０２３５】
以下の実施例は本発明の実施の特定の例を説明しており、本発明の範囲を限定する意図はない。当該分野で知られる通り、本発明は種々の組成物及び方法が適用される。
【実施例】
【０２３６】
（実施例１）コクサッキーウィルス感染後のＢ細胞アポトーシス
コクサッキーウィルス感染の過程の間、後続する自己免疫続発症を有することなくウィルスから回復した動物はインビボ感染の間に脾臓Ｂ細胞アポトーシスの高いパーセンテージを有する（図１）。コクサッキーウィルス媒介自己免疫疾患に対して感受性であるものは少なくとも急性感染の間以外、又は自己免疫症状よりも前の期間を除き、アポトーシスを起こさない非特異的活性化Ｂ細胞を有しており、自己免疫疾患の発症における共通の特徴が、非特異的活性化Ｂ細胞が死滅できないことにあることを示している。
【０２３７】
（実施例２）ＨＩＶ疾患における活性化Ｂ細胞はＮＫ細胞活性化を媒介する
本発明者等はＣＤ４０契合（ＣＤ４０リガンド担持線維芽細胞）及び組み換えＩＬ−４中での培養を用いて抗原非依存性様式で末梢血ヒトＢ細胞のポリクローナル活性化を実験的に誘導した。本発明者等は活性化されたＢ細胞を単離し、そしてそれらを自系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との同時培養物に戻した。同時培養の５日後、本発明者等はＰＢＭＣ培養物中の活性化ＮＫ細胞のパーセンテージの明確な増大（生存ＰＢＭＣの２５〜５０％までに相当するＮＫ細胞、図２ａ）及びＢ細胞の劇的なアポトーシス損失（図２ｂ）を観察した。これらのデータはＨＩＶ疾患における抗原非依存性活性化Ｂ細胞が初期にはＮＫ細胞を活性化させることを示している。
【０２３８】
（実施例３）抗原非依存性Ｂ細胞活性化がＮＫ細胞活性をもたらす。
【０２３９】
ＮＫ細胞活性化及びポリクローナルＢ細胞活性化をもたらすＢ細胞への抗原非依存性活性化シグナルを提供するＨＩＶ感染の要素を検討した。
【０２４０】
Ｂ細胞：ヒトＢ細胞：ＰＢＭＣの抗原非依存性活性化は標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法を用いて５人の健常者及び５人のＨＩＶ感染成人ドナーから調製した。放射線照射（７５Ｇｙ）したヒトＣＤ４０Ｌトランスフェクトネズミ線維芽細胞（ＬＴＫ−ＣＤ４０Ｌ）をＲＰＭＩ完全培地中０．１×１０６細胞／ウェルの濃度において６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に入れ、そして３７℃、５％ＣＯ２において一夜培養した。ＰＢＳで２回洗浄後、２×１０６細胞／ｍＬＰＢＭＣを１０％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｗｉｉｄｋａｎｄ，ＣＡ）を添加した完全ダルベッコ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、組み換えヒトインターロイキン−４（ｒｈＩＬ−４；４ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）の存在下、又は精製されたＨＩＶ誘導ｇｐ１２０タンパク質と共に、ＬＲＫ−ＣＤ４０Ｌ細胞とともに同時培養した。培養された細胞は、３〜５日毎に新しく調製し照射したＬＲＫ−ＣＤ４０Ｌ細胞の入った新しいプレートに移す。使用前に、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離とその後のＰＢＳ２回洗浄によりＣＤ４０−Ｂ細胞から死細胞を除去した。この画分の生存性は＞９９％と期待され、そしてこのプロトコルを用いた場合、＞９５％の細胞が培養２週間後には９５％超の純粋ＣＤ１９＋及びＣＤ２０＋であるＢ細胞であることが分かっている。このプロトコルは＞９９％の生存性をもたらし、＞９５％の細胞が培養２週間後には９５％超の純粋ＣＤ１９＋及びＣＤ２０＋であるＢ細胞であることが分かっている。
【０２４１】
活性化されたＢ細胞を１：１０の比で自系ＰＢＭＣと共に同時培養し、５日間培養した。採取した細胞をＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４、及びＣＤ８に対する蛍光色素コンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。細胞をフローサイトメトリーで分析することにより、無感染を感染試料と比較しながら同時培養物から得られたＮＫ細胞のパーセント（パーセントＣＤ５６＋、ＣＤ３−）を測定した。ＮＫ細胞はＮＫ殺傷リガンドＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａＬ、又はＰＤ１で逆染色した。同様に、パーセント生存大及び小Ｃ１９＋細胞をフローサイトメトリーで定量した。
【０２４２】
ＨＩＶにおけるＢ細胞の活性化：活性化されたＮＫ細胞又はＣＤ３Ｔ細胞がポリクローナルＢ細胞の活性化を促進するかどうか調べるために、本発明者等は縦列同時培養実験を実施し、そこで本発明者等は意図的にＮＫ又はＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化し、そして自系ドナー由来のＰＢＭＣ中１：１０で同時培養している。ＰＢＭＣは標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法を用いながらＨＩＶ感染又は未感染の成人ドナーから調製した。ＮＫ及びＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化させるために、ＰＢＭＣを１：４０，０００のＯＫＴ３、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、又は無刺激（休止期）において、３日間２．０〜４．０×１０６／ｍＬにおいて、１０％ＦＣＳ、１ｍＭペニシリン、１ｍＭグルタマックス及び１％ｗ／ｖのグルコースを添加したＲＰＭＩ中で培養した。３日間の刺激の後、非接着ＰＢＭＣを穏やかに採取し、免疫細胞のサブセットをＭＡＣＳ技術により製造元（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）のプロトコルに従って精製した。慨すれば、ＮＫ細胞を先ずＣＤ５６＋マルチソートキットを用いて選択し、その後ビーズを放し、そして抗ＣＤ３ビーズにより枯渇させる。Ｔ細胞は各々個別のサブセットの単離のために抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８ビーズを用いて又は用いることなく、ＣＤ５６ビーズで非接着ＰＢＭＣを枯渇させることにより得た。細胞画分の純度は各々の実験につき、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ１４抗体を用いながらフローサイトメトリーにより確認した。５日間培養の後、本発明者等はフローサイトメトリーを用いながら活性化のマーカーとしてのＣＤ１９＋ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＣＤ３、及びＣＤ６９における相対的変化を測定した。
【０２４３】
本発明者等はＫＩＲ３ＤＳ１及びキラー細胞の機能を示すＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＤ１、及びＦａｓＬを包含する他のキラー細胞リガンドに関する同時培養実験からＮＫ細胞を検討した。
【０２４４】
マウスＢ細胞の抗原非依存性活性化。Ｃ５７Ｂ１６マウスからマウス脾臓を摘出し、緩衝塩化アンモニウムを用いながら赤血球を除去し、Ｔ細胞を抗Ｔ細胞抗体カクテル（ＨＯ１３、ＧＫ１．５及び３０Ｈ１２）及び補体で枯渇させた。Ｔ枯渇脾細胞を洗浄し、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を用いて分画した。本発明者等は１．０７９／１．０８５ｇ／ｍｌの密度界面においてＢ細胞を単離し（休止期Ｂ細胞）、そして洗浄して残存するＰｅｒｃｏｌｌを除去した。細胞はＬＰＳ又はＢ細胞上のＴＬＲ２のアゴニストであるトリパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイニルＮ−末端（Ｐａｍ（３）Ｃｙｓ）の存在下で培養した。活性化されたＢ細胞を全脾臓細胞と共に１：１０のＢ細胞：全脾臓細胞の比において同時培養した。培養５日間の後、残存する細胞を、マウスＣＤ５６、ＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ４及びＣＤ８を発現している者を包含する細胞のサブセットの増殖に関して分析した。これらの細胞表面分子はフローサイトメトリーで分析した。ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞をＮＫＧ２Ｄ及び他の死滅誘導受容体で逆染色した。
【０２４５】
（実施例４）ＮＫ細胞は活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を殺傷する。
【０２４６】
ＮＫ細胞活性化及びＣＤ４Ｔ細胞標的の変化の結果として、標的としての活性化されたＣＤ４Ｔ細胞をＮＫ細胞が溶解する能力を調べた。
【０２４７】
ヒトＮＫ及びＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化：ＰＢＭＣは標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法を用いながらＨＩＶ感染又は未感染の成人ドナーから調製した。ＮＫ及びＣＤ３＋Ｔ細胞は本明細書に開示する通り活性化、そして単離した。Ｔ細胞及びＮＫ細胞は定型的には８０〜９５％純度であり、そして単球混在は１％未満であった。ＯＫＴ３−刺激ＰＢＭＣにおけるＴ細胞の活性化は３Ｈ−チミジン取り込みを用いた試験により確認した。ＮＫ細胞の活性化はフローサイトメトリーによる大きさ及び顆粒性の増大により、フローサイトメトリーによるＣＤ５６＋及びＣＤ３−染色により、そして十分樹立されたＮＫ標的のクロム放出により計測される溶解活性により、確認した。本発明者等は十分樹立されたＮＫ細胞又は非特異的に活性化されたＢ細胞に本明細書に開示する通り５１−クロムを負荷した。本発明者等は標的細胞死の尺度としてクロム放出を用いた。
【０２４８】
マウスＮＫ及びＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化：本発明者等は本明細書に開示する通り脾細胞を単離した。赤血球枯渇脾細胞を３日間組み換えマウスＩＬ−２中又は１４５．２Ｃ１１（抗マウスＣＤ３、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に培養した。刺激後、細胞を採取し、ＮＫ、ＣＤ４、又はＣＤ８＋Ｔ細胞の何れかに関してＣｅｌｌ−ｅｃｔアイソレーションキットを用いて精製した。次に細胞を５１−クロム標識の十分樹立されたＮＫ細胞標的と共に、又は、５１−クロム標識の非特異的活性化Ｂ細胞と共に、本明細書に開示したとおり、同時培養した。
【０２４９】
（実施例５）慢性的に活性化されたＨＩＶ感染（又はＨＩＶ特異的ＣＤ４Ｔ細胞）は活性化されたキラー細胞の細胞間標的である。
【０２５０】
慢性的に活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞はＨＩＶ感染に起因する慢性免疫刺激の結果としてキラー細胞に対して特に感受性となる。
【０２５１】
本発明者等は本明細書に開示する通りＣＤ５６＋マルチソートキットを用いて未感染又はＨＩＶ感染個体からＮＫ細胞を単離した。本発明者等は本明細書に開示する通りＩＬ−２中で細胞を活性化した。本発明者等は自系ドナーから１：１０の比でＰＢＭＣに添加し戻したこれらの細胞を用いて同時培養実験を行った。同時培養の前に、本発明者等はＨＩＶ感染及び未感染のＮＫ細胞を、細胞死誘導受容体、即ち：キラー細胞機能の指標であるリガンド対キラー、例えばＫＩＲ３ＤＳ１、ＦａｓＬ及びＮＫＧ２Ｄリガンドに関して調べた。平行して、本発明者等はＨＩＶ感染又は未感染ドナーの自系ドナー由来の培養前及び培養後のＰＢＭＣを染色した。
【０２５２】
（実施例６）ＴＮＰ混合物はモデルＢ細胞系統からＣＬＩＰを排除する。
【０２５３】
胸腺核タンパク質混合物に応答したモデルＢ細胞系統（Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ）の表面からのＣＬＩＰの排除の動態を測定した。
【０２５４】
結果をヒストグラム分析において表示した（図３）。Ｙ軸は５０００生細胞の細胞数を表すのに対し、Ｘ軸は相対的Ｆｉｔｃ蛍光を反映している。アイソタイプ対照染色から得られたヒストグラムと特定の系統を反映したヒストグラムとの間の距離は示すように生Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ細胞の集団に対する細胞表面ＣＬＩＰのレベルの尺度である。
【０２５５】
３時間で、両方の細胞系統に対し、本発明者等は漸減比のアイソタイプ対ＣＬＩＰ染色により、２００マイクログラム／ｍｌのＴＮＰ混合物が検出可能な細胞表面ＣＬＩＰの低減をもたらした証拠を観察した。
【０２５６】
２４時間で、効果は低く、そして検出可能なＣＬＩＰの増大がもたらされていると考えられた。２４時間で顕著となったこととして、ＴＮＰ混合物は２００ミリグラム／ｍＬでＢ細胞系統の死滅をもたらし、そして４８時間までには２００マイクログラムで処理した細胞は全て死滅し、そして５０マイクログラムの濃度も、多大な毒性をもたらしていた。
【０２５７】
２００マイクログラムＴＮＰ／ｍｌ投与３時間で、トリパンブルー排出により測定した細胞死の数は２．５倍であった。フローサイトメトリー実験における細胞死は、前方ｖｓ側方の散乱変化により測定した（低下した前方散乱、増大した側方散乱）。
【０２５８】
材料及び方法
細胞培養条件：Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ細胞系統はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入し、解凍し、そして１０％ウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、１−グルタミン及び２−ＭＥを包含する標準補給物を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で生育させた。
【０２５９】
プロトコル：細胞はＤａｕｄｉ細胞の場合は約０．５×１０６／ウェル、そしてＲａｊｉ細胞に対しては１．０×１０６／ウェルを含有する総容量３ｍｌにおいて１２ウェルプレートにプレーティングした。投与群の内訳は、対照としての無投与；５０マイクログラム／ｍｌＴＮＰ混合物；２００マイクログラム／ｍｌＴＮＰ混合物；対照ウシアルブミン５０マイクログラム；又はタンパク質対照としての２００マイクログラム／ｍｌウシアルブミンとした。
【０２６０】
細胞は３７℃において５％ＣＯ２含有雰囲気及び約９２％湿度においてインキュベートした。細胞は３、２４及び４８時間インキュベートした。各時点においてその実験時間の細胞を採取し、市販（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の抗ヒトＣＬＩＰＦｉｔｃカタログ番号５５５９８１を用いてＣＬＩＰ（ＭＨＣクラスＩＩ不変ペプチド、ヒト）の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析用に染色した。
【０２６１】
採取した細胞はＦｉｔｃ抗ヒトＣＬＩＰ又はアイソタイプ対照の１：１００希釈物を使用する標準的な染色操作法を用いて染色した。２５分間氷上で染色した後、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、１００マイクロリットルに再懸濁し、そしてＰＢＳ４００マイクロリットルを含有する染色管に添加した。試料を取得し、コールターエクセルフローサイトメトリーで分析した。
【０２６２】
（実施例７）ＭＫＮ１（ｂｉｏＣＬＩＰ）は細胞表面のＣＬＩＰ及びＣＤ７４のレベルを改変する。
【０２６３】
ＭＫＮ１（ｂｉｏＣＬＩＰ）が細胞表面のＣＬＩＰ及びＣＤ７４のレベルを改変する能力をＲａｊｉ又はＤａｕｄｉ細胞を用いて測定した。
【０２６４】
データはヒストグラムにより分析し、Ｙ軸は５０００生細胞の細胞数を表すのに対し、Ｘ軸はＣＬＩＰ又はＣＤ７４に対する抗体の何れかによる相対的ＦＩＴＣ蛍光を反映している。アイソタイプ対照染色から得られたヒストグラムと特定の系統を反映したヒストグラムとの間の距離は生Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ細胞の集団を染色した場合の細胞表面ＣＬＩＰ又はＣＤ７４のレベルの尺度である。
【０２６５】
本発明者等の結果はＭＫＮ１（ｂｉｏＣＬＩＰ）の投与が細胞表面のＣＬＩＰ及びＣＤ７４のレベルを改変することを示している。
【０２６６】
材料及び方法
細胞培養条件：Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ細胞系統はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入し、解凍し、そして１０％ウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、１−グルタミン及び２−ＭＥを包含する標準補給物を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で生育させた。
【０２６７】
プロトコル：細胞はＤａｕｄｉ細胞の場合は約０．５×１０６／ウェル、そしてＲａｊｉ細胞に対しては１．０×１０６／ウェルを含有する総容量３ｍｌにおいて１２ウェルプレートにプレーティングした。投与群の内訳は、対照としての無投与；合成された化合物の報告されたモル濃度に基づいて５０マイクロモル終濃度のＭＫＮ３及びＭＫＮ５とした。
【０２６８】
ペプチド１：Ｎ末端のＭＫＮ．１（１９量体）ビオチン＝ビオチニル化ＣＬＩＰ
ＳＧＧＧＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡＬＹ（配列番号５）
５〜１０ｍｇ＞９５％純度で入手（ＥＬＩＭＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）
細胞は３７℃で５％ＣＯ２含有雰囲気及び約９２％湿度においてインキュベートした。細胞は２４及び４８時間インキュベートした。各時点においてその実験時間の細胞を採取し、市販（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のヒトＣＬＩＰＦｉｔｃカタログ番号５５５９８１ｖｓストレプトアビジンを用いながら、そしてＣＤ７４使用に関して、ＣＬＩＰ（ＭＨＣクラスＩＩ不変ペプチド、ヒト）の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析用に染色した。
【０２６９】
採取した細胞はＦｉｔｃ抗ヒトＣＬＩＰ又はＣＤ７４抗体（Ｆｉｔｃ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カタログ番号５５４６４７）又はアイソタイプ対照の１：１００希釈物を使用する標準的な染色操作法を用いて染色した。２５分間氷上で染色した後、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、１００マイクロリットルに再懸濁し、そしてＰＢＳ４００マイクロリットルを含有する染色管に添加した。試料を取得し、コールターエクセルフローサイトメトリーで分析した。
【０２７０】
（実施例８）２−デオキシグルコース及びジクロロアセテートはＢ細胞表面ＣＬＩＰの除去をもたらす。
【０２７１】
２−デオキシグルコース及びジクロロアセテートがＢ細胞表面ＣＬＩＰに影響する能力を測定した。
【０２７２】
結果はヒストグラム分析により示す（図４）。Ｙ軸は５０００生細胞の細胞数を表すのに対し、Ｘ軸はＣＬＩＰに対する何れかの抗体による相対的ＦＩＴＣ蛍光を反映している。アイソタイプ対照染色から得られたヒストグラムと特定の系統を反映したヒストグラムとの間の距離は示すように生Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ細胞の集団を染色した場合の細胞表面ＣＬＩＰのレベルの尺度である。
【０２７３】
本発明者等の結果は等モル量の２−デオキシグルコース及びジクロロアセテートによる処理が最適には４８時間においてＢ細胞系統両方から細胞表面ＣＬＩＰを低下（除去）させたことを示している。
【０２７４】
材料及び方法
細胞培養条件：Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ細胞系統はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入し、解凍し、そして１０％ウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、１−グルタミン及び２−ＭＥを包含する標準補給物を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で生育させた。
【０２７５】
プロトコル：細胞はＤａｕｄｉ細胞の場合は約０．５×１０６／ウェル、そしてＲａｊｉ細胞に対しては１．０×１０６／ウェルを含有する総容量３ｍｌにおいて１２ウェルプレートにプレーティングした。投与群の内訳は、対照としての無投与；合成された化合物の報告されたモル濃度に基づいて５０マイクロモル終濃度におけるＭＫＮ３及びＭＫＮ５とした。
【０２７６】
細胞は３７℃で５％ＣＯ２含有雰囲気及び約９２％湿度においてインキュベートした。細胞は４、２４及び４８時間、２−デオキシグルコース及びジクロロアセテートの各化合物１ｍｇ／ｍｌの存在下又は不在下においてインキュベートした。各時点においてその実験時間の細胞を採取し、市販（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のヒトＣＬＩＰＦｉｔｃカタログ番号５５５９８１を用いてＣＬＩＰ（ＭＨＣクラスＩＩ不変ペプチド、ヒト）の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析用に染色した。
【０２７７】
採取した細胞はＦｉｔｃ抗ヒトＣＬＩＰ（Ｆｉｔｃ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カタログ番号５５５９８１）又はアイソタイプ対照の１：１００希釈物を使用する標準的な染色操作法を用いて染色した。２５分間氷上で染色した後、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、１００マイクロリットルに再懸濁し、そしてＰＢＳ４００マイクロリットルを含有する染色管に添加した。試料を取得し、コールターエクセルフローサイトメトリーで分析した。
【０２７８】
（実施例９）競合ペプチドはＣＤ１ｄの細胞表面発現を誘導する。
【０２７９】
ＣＬＩＰペプチドの結合に競合し、そしてＣＤ１ｄの細胞表面発現をもたらす合成ペプチドの能力を測定した。
【０２８０】
結果：図５に示す結果をヒストグラム分析において表す。Ｙ軸は５０００生細胞の細胞数を表すのに対し、Ｘ軸は細胞結合ビオチニル化ペプチドに高親和性で結合するストレプトアビジン−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１２−４３１７）に対する相対的ＦＩＴＣ蛍光を反映している。アイソタイプ対照染色から得られたヒストグラムと特定の系統を反映したヒストグラムとの間の距離は細胞表面ＣＤ１ｄのレベルの尺度となる。
【０２８１】
４時間で、両細胞系統に関し、４時間においてヒトＢ細胞系統Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉに対して高親和性でビオチニル化合成ペプチドが結合したことの顕著な証拠が観察された。低値の結合が２４時間に観察された。細胞をＦＩＴＣ−抗−ＣＤ１ｄで逆染色したところ、ビオチニル化ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）の投与及び結合が両細胞系統に対し、４時間では辛うじて、そして２４時間では僅かに高値となったＣＤ１ｄの細胞表面発現をもたらした。
【０２８２】
方法：
細胞培養条件：Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ細胞系統はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入し、解凍し、そして１０％ウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、１−グルタミン及び２−ＭＥを包含する標準補給物を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で生育させた。
【０２８３】
プロトコル：細胞はＤａｕｄｉ細胞の場合は約１．５×１０６／ウェル、そしてＲａｊｉ細胞に対しては３．０×１０６／ウェルを含有する総容量３ｍｌにおいて１２ウェルプレートにプレーティングした。投与群の内訳は、対照としての無投与；合成された化合物の報告されたモル濃度に基づいて５０マイクロモル終濃度におけるビオチニル化ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）（ＭＫＮ５とも称する）とした。
【０２８４】
細胞は３７℃で５％ＣＯ２含有雰囲気及び約９２％湿度においてインキュベートした。細胞は４及び２４時間インキュベートした。各時点においてその実験時間の細胞を採取し、そしてＰＥ抗ヒトＣＤ１ｄ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローン５１．５、カタログ番号１２−０００１６−７１）を用いた染色によりＣＤ１ｄの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析用に染色した。
【０２８５】
採取した細胞はＰＥ抗ＣＤ１ｄの１：１００希釈物を使用する標準的な染色操作法を用いて染色した。２５分間氷上で染色した後、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、１００マイクロリットルに再懸濁し、そしてＰＢＳ４００マイクロリットルを含有する染色管に添加した。試料を取得し、コールターエクセルフローサイトメトリーで分析した。
【０２８６】
（実施例１０）本発明のプロドラッグエステルの製造は以下の実施例により説明することができる。
【０２８７】
［３，４，６−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル］メチルジクロロアセテートは２−デオキシ−Ｄ−グルコース、ジクロロアセテート、及び硫酸を混合し、そして溶液を還流することにより製造した。溶液を冷却した後、混合のために水及びジエチルエーテルを添加し、そして水層と有機層とを分離させることにより水層を除去した。次に中性のｐＨが得られるまで、生成物を重炭酸ナトリウムで抽出し、次に無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ジエチルエーテルを温かいサンドバス上で蒸発させ、生成物を室温に冷却した。
【０２８８】
［３，４，６−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル］メチルジクロロアセテートは２−デオキシ−Ｄ−グルコース、無水ジクロロアセテート及び無水酢酸を混合し、そして次に溶液を攪拌し還流することにより製造した。還流後、内容物を氷及び冷水と混合し、次に吸引濾過し、そしてエタノール中で再結晶させた。
【０２８９】
酸触媒エステル化の機序
ジクロロ酢酸の酸触媒エステル化の機序は以下のとおりであり、Ｒ＝ハロゲン、Ｒ’＝２−デオキシ−Ｄ−グルコースの残余、又はその類縁体又は相同体である。
【０２９０】
【化１０】
2010516772.tif 000011
【０２９１】
【化１１】
2010516772.tif 000012
（参考文献）
以下の参考文献は本明細書の記載に補足的な例示的な操作法又は他の詳細を提示する範囲において、特に参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９２】
【数１】
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本発明の少なくとも１つの実施形態の数種の態様を記載したため、種々の改変、変更、及び改良は当業者が容易に知り得ることとなる。そのような改変、変更、及び改良は本開示の部分であることを意図しており、そして、本発明の精神及び範囲に包含されることを意図している。従って、上記した説明及び図面は例示にすぎない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４】
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【図５】
2010516772.tif 000027
【配列表】
2010516772000001.app
【国際調査報告】
2010516772.tif 000028
2010516772.tif 000029
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