(57)【要約】TRIM24（TIF1-ALPHAとしても知られている）の発現及び／又は生物活性のモジュレータのスクリーニング方法が記載されている。特に、TRIM24 E3リガーゼ活性、具体的には、標的のポリペプチドがp53であるE3リガーゼ活性のモジュレータのスクリーニング方法の提供についても記載されている。TRIM24の発現及び活性のモジュレータが提供され、かかるモジュレータは、癌、特には、乳癌、レチナール癌、前立腺癌、大腸癌及び急性リンパ芽球白血病の治療に使用される。TRIM24発現の適当なモジュレータは、siRNA及びshRNAを含み、癌の治療及び癌の幹細胞を標的に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TRIM24活性のモジュレータを同定する方法であって、該方法は、
（ｉ）該TRIM24ポリペプチドを複数の候補化合物に曝露するステップと、
（ｉｉ）該TRIM24と一種以上の該候補化合物とが、TRIM24の活性を調節するように相互作用するか否かを特定するステップと、
（ｉｉｉ）TRIM24のモジュレータとして、TRIM24の活性を調節するよう、TRIM24と相互作用する化合物を同定するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記TRIM24の活性は、E3リガーゼ活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記E3リガーゼ活性は、ユビキチン化／SUMO化活性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記TRIM24の活性は、E3リガーゼ活性であり、該方法は、
TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性の基本水準を特定するアッセイにより、TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性を評価するステップと、
該TRIM24ポリペプチド又はその断片を１種以上の候補化合物を接触させるステップと、
一種以上の候補化合物の存在下にて、TRIM24ポリペプチド又はその断片の試験E3リガーゼ活性を特定するためのE3リガーゼアッセイにより、TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性を評価するステップと、
TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性の基本水準と、試験E3リガーゼ活性とが異なるかを特定するステップと、
試験E3リガーゼ活性と、TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性の基本水準とが異なる場合に、該化合物をTRIM24活性のモジュレータとして同定するステップと、を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ユビキチン又はユビキチン様タンパク質が所定の基質に結合する活性に関するE3リガーゼ活性を同定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ユビキチン様タンパク質は、Small Ubiquitin-like modifier（SUMO）タンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記基質は、p53ポリペプチド又はp53由来の断片を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
TRIM24依存型p53活性のモジュレータを同定する方法であって、該方法は、
（a）p53応答核酸レポーターコンストラクトの存在下において、p53及びTRIM24          ポリペプチドを発現させるステップと、
（ｂ）p53及びTRIM24の存在下における、レポーターコンストラクトの発現レベ          ルを検出するステップと、
（ｃ）候補モジュレータ分子を導入するステップと、
（ｄ）p53及びTRIM24存在下において、該分子がp53応答レポーターの発現レベ           ルを変化させるか否かを特定するステップと、を含み、
それらステップから、TRIM24依存型p53活性を有するモジュレータとして、p53及びTRIM24存在下において、p53応答レポーターの発現レベルを変化させる候補分子を同定することを特徴とする方法。
【請求項９】
前記方法は、in vitro又は細胞内にて実施する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法を細胞内にて実施し、該細胞は真核細胞であり、好適には哺乳類の細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーターコンストラクトは、ルシフェラーゼ、GFP又はGFP由来タンパク質、或いは、CATをコードする遺伝子を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記分子は、p53及びTRIM24の存在下における発現レベルと比較して、レポーターの発現量を減少させる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分子は、p53及びTRIM24の存在下における発現レベルと比較して、レポーターの発現量を増大させる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、p53及びTRIM24の存在下におけるレポーターコンストラクトの第一の発現レベルを検出するステップと、
p53、TRIM24及び候補分子の存在下におけるレポーターコンストラクトの第二の発現レベルを検出するステップと、
第一の発現レベルと第二の発現レベルとが異なる場合に、該候補分子をTRIM24依存型p53活性のモジュレータとして同定するステップと、を更に含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記候補分子は、核酸、ポリペプチド、小分子、ポリアミン、抗体又はその断片、或いは、アプタマから選択される分子である、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸は、shRNA又はsiRNAから選択される、RNA分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法により同定されたTRIM24依存型p53活性を有するモジュレータであって、該モジュレータは、真核細胞内におけるTRIM24の発現量を下方制御するshRNA又はsiRNA分子であることを特徴とするモジュレータ。
【請求項１８】
配列ID番号１の少なくとも１９個のコンティグ塩基を標的とするshRNA又はsiRNA分子であって、医薬品として使用することを特徴とするshRNA又はsiRNA分子。
【請求項１９】
配列ID番号1の１９〜２１個のコンティグ塩基を標的とする、請求項１８に記載のshRNA又はsiRNA分子。
【請求項２０】
前記shRNA又はsiRNA分子は、癌治療のために、TRIM24分子の発現量を下方制御するよう使用するものである、請求項１８又は１９に記載のshRNA又はsiRNA分子。
【請求項２１】
配列ID番号7〜16のいずれかの少なくなくとも１９個の連続塩基を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のshRNA又はsiRNA分子。
【請求項２２】
配列ID番号17〜21のいずれかの配列を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のshRNA又はsiRNA分子。
【請求項２３】
配列ID番号59〜64のいずれか配列の少なくとも１９個のコンティグ塩基を標的とするshRNA又はsiRNA分子であって、医薬品として使用することを特徴とするshRNA又はsiRNA分子。
【請求項２４】
前記siRNA分子は、配列ID番号17〜44のいずれかから選択してなる配列を含む、請求項２３に記載のsiRNA分子。
【請求項２５】
TRIM24発現及び／又は癌治療に使用されるTRIM24 E3リガーゼ活性のインヒビターであることを特徴とするインヒビター。
【請求項２６】
前記癌は、p53発現に陽性である癌細胞を含む、請求項２５に記載のインヒビター。
【請求項２７】
前記インヒビターは、TRIM24ポリヌクレオチド配列と実質的に相補するポリヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも12個のコンティグ塩基と実質的に相補する オリゴヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも19個のコンティグ塩基と実質的に相補的するオリゴヌクレオチドRNAi分子、抗体、人工転写因子、ポリアミン、糖タンパク質及び多糖から選択してなる部分を含む、請求項２５又は２６に記載のインヒビター。
【請求項２８】
前記インヒビターは、TRIM24とp53との間の結合相互作用を拮抗させる、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のインヒビター。
【請求項２９】
前記インヒビターは、TRIM24の酵素ドメインを標的としている、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のインヒビター。
【請求項３０】
前記インヒビターは、TRIM24のRINGドメインを標的としている、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のインヒビター。
【請求項３１】
前記TRIM24のインヒビターは、配列ID番号1の配列の少なくとも１９個のコンティグ塩基を標的とするshRNA又はsiRNA分子である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のインヒビター。
【請求項３２】
配列ID番号7〜16のいずれかの少なくなくとも１９個の連続塩基を含む、請求項３１に記載のインヒビター。
【請求項３３】
配列ID番号17〜21のいずれかの配列を含む、請求項３１に記載のインヒビター。
【請求項３４】
前記TRIM24発現のインヒビターは、配列ID番号59〜64のいずれか配列の少なくとも１９個のコンティグ塩基を標的とするshRNA又はsiRNA分子である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のインヒビター。
【請求項３５】
前記siRNA分子は、配列ID番号17〜44のいずれかから選択してなる配列を含む、請求項３４に記載のインヒビター。
【請求項３６】
癌の予防及び／又は治療を必要としている患者のための医薬品組成物であって、TRIM24発現及び／又は生物活性のインヒビター、並びに、薬学的に許容可能なキャリアを含むことを特徴とする医薬品組成物。
【請求項３７】
前記医薬品組成物は、TRIM24ポリヌクレオチド配列と実質的に相補するポリヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも12個のコンティグ塩基と実質的に相補する オリゴヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも19個のコンティグ塩基と実質的に相補的するオリゴヌクレオチドRNAi分子、抗体、人工転写因子、ポリアミン、糖タンパク質及び多糖から選択してなる部分を含む、請求項３６に記載の医薬品組成物。
【請求項３８】
前記TRIM24のインヒビターは、TRIM24とp53との間の結合相互作用、及び／又は、TRIM24のE3リガーゼ活性を拮抗させる生物活性を有する、請求項３７に記載の医薬品組成物。
【請求項３９】
前記TRIM24のインヒビターは、配列ID番号1の配列の少なくとも１９個のコンティグ塩基を標的とするshRNA又はsiRNA分子を含む、請求項３７に記載の医薬品組成物。
【請求項４０】
前記TRIM24発現のインヒビターは、配列ID番号17〜21のいずれかの配列を有するshRNA分子を含む、請求項３６に記載の医薬品組成物。
【請求項４１】
前記TRIM24発現のインヒビターは、配列ID番号17〜21のいずれか又は配列ID番号27〜44の配列を有するsiRNA分子を含む、請求項３６に記載の医薬品組成物。
【請求項４２】
TRIM24発現及び／又は生物活性のインヒビターを含み、p53シグナル経路のモジュレータとして使用することを特徴とする組成物。
【請求項４３】
前記組成物は、TRIM24ポリヌクレオチド配列と実質的に相補するポリヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも12個のコンティグ塩基と実質的に相補する オリゴヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも19個のコンティグ塩基と実質的に相補的するオリゴヌクレオチドRNAi分子、抗体、人工転写因子、ポリアミン、糖タンパク質及び多糖から選択してなる部分を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記TRIM24生体活性のインヒビターは、TRIM24とp53との間の結合相互作用を拮抗させる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
治療を必要としている患者の癌を治療する方法であって、該方法は、必要に応じてTRIM24のインヒビターを有効量投与するものであり、該インヒビターは、TRIM24ポリヌクレオチド配列と実質的に相補するポリヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも12個のコンティグ塩基と実質的に相補する オリゴヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも19個のコンティグ塩基と実質的に相補的するオリゴヌクレオチドRNAi分子、抗体、人工転写因子、ポリアミン、糖タンパク質及び多糖から選択してなる部分を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項４６】
前記TRIM24のインヒビターは、配列ID番号1及び／又は59〜64の配列の少なくとも１９個のコンティグ塩基を標的とするshRNA又はsiRNA分子を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌は、乳癌、レチナール癌、前立腺癌、大腸癌及び急性リンパ芽球白血病から選択される、請求項４５又は４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、癌の検出及び治療に関するものである。特には、この発明は、特定の癌のタイプに対して改変した発現パターンを示すp53の新規の結合パートナーの同定に関するものであり、p53と新規の結合パートナーと相互作用のモジュレータを同定する方法及び癌の治療ためにかかるモジュレータを使用することに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アメリカ合衆国において、癌は死因の第２位である。また、アメリカ合衆国において、1010万人が癌の事前診断を新たに受けている（Centres for Disease Control and Prevention, 2004 and 2005, and National Cancer Institute, 2005よりの情報）。Cancer Research UK, in 2005によると、英国では150000人を超える人が癌によって死んでいる。英国では、毎年、約44100件の乳癌の症例（すなわち、新規の癌の全症例の16％）が報告されており、英国の12400人を超える乳癌患者が当該疾患により死亡している（癌により死亡した人数の約8％）。大腸癌は、最も一般的な癌の1つであり、2003年において英国では、21600人が新たに診断されている。大腸癌は、癌により死亡する場合の最も一般的な要因の１つであり、2005年においては、癌に関連した死亡の約10％までのぼっている。
【０００３】
そのことから、米国、英国及び全世界において、癌を診断及び治療について改善した方法を開発することが希求されている。
【０００４】
癌は、遺伝子の変異又は遺伝子発現（の変化）に起因して、制御不能な細胞分裂を招くことにより発症する。変異をさせると癌へとつながる２種類の遺伝子があり、それらは、（i）細胞増殖及び有糸分裂、すなわち細胞分裂を促進するプロトオンコジーン（例えば、mdm2またはそのヒトホモログであるhdm2）、及び、（ii）細胞成長を抑制又は細胞分裂を停止させる腫瘍サプレッサー遺伝子である（例えば、p53及びp21）。
【０００５】
プロトオンコジーンは、しばしば、細胞分裂を促進する分裂促進因子を生産し、それは例えば、その他の遺伝子の発現を増大又は変化させる、転写因子、転写コリプレッサ、転写コアクチベータである。特に、プロトオンコジーンは、腫瘍サプレッサータンパク質の発現又は活性を調節するタンパク質をコードするものである。ウィルスは人の(プロト)オンコジーンのその他の原因であり、人の癌の約15％がウィルス感染を起源とするものであると考えられている。人の癌と関連する主たるウィルスは、ヒト乳頭腫ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、エプステインバー・ウィルス、ヒトTリンパ親和性のウィルス及びカポシ肉腫ヘルペスウィルスである。
【０００６】
一般に、腫瘍サプレッサー遺伝子は、有糸分裂及び細胞生長を抑制する抗細胞増殖分子をコードしている。しばしば、腫瘍サプレッサータンパク質は、転写因子であることもあるが、その発現は、細胞ストレス又はDNAの損傷により活性化する傾向にある。腫瘍サプレッサーは、一般に、細胞周期の進行を停止させることにより、内因性の細胞過程の時間を与え、（細胞ストレスに起因した）如何なる損傷したDNAをも修復して、DNAの突然変異の増殖を抑制する。或いは、例えば、任意の損傷したDNAの修復の機会が少ない状態にて細胞が過度のストレスに曝されると、腫瘍サプレッサーは、影響を与える細胞に対しアポトーシスを引き起こすこともある。従って、腫瘍サプレッサー遺伝子の発現が抑制されると、DNAの突然変異は未確認にて蓄積し、略不可避的に癌が引き起こされる。癌に関係する最も一般的な腫瘍サプレッサー遺伝子はp53であり、p53は、全ての癌の半分について発現プロファイル及び／又は突然変異を変化させることができる。
【０００７】
疾患の早期段階にて癌を検出することは、効果的に治療して、個人の寿命を延ばす鍵となる因子である。癌のスクリーニングは、集団における（未診断の）癌を検出し、早期に治療的な介入を行う試みである。癌を検出及び／又は予測するスクリーニングは、多数の対象に対して試験を行う上で、手頃であり、安価であり、非侵襲的であり、正確（すなわち、無病誤診が低確率）であることから好ましい。
【０００８】
多数の異なるスクリーニング試験が開発されてきたが、例えば、胸部癌又は精巣癌のために、その多くは視覚的/触覚的な検査を伴う。しかし、多くの癌はそのような粗い検査では検出されずに、この場合には、物理的及び／又は生化学的な検査が必要となる。例えば、例えば、乳房Ｘ線写真によるスクリーニングでは、自己診断よりも早期にて、胸部腫瘍を検出することが可能であり、また、結直腸癌は、例えば、糞便の潜在性血液検査及び結腸鏡検査法で検出されることが可能であり、及び、頸部細胞試験（拭き取り試験）では、前癌性病変を同定することが可能である。一方、前立腺癌のためのスクリーニングにおいては、血液検査とともにデジタル直腸試験を実施し、前立腺特異性抗原（PSA）を検出する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、現在のスクリーニング方法では、疾患症状が発症する（効果的な介入が可能な期間が過ぎてしまう）前に、迅速に検出ができず、又は検出の信頼性が低い、多数の異なる種類の人の癌が依然として残されている。そのことから、さらなる癌検出／スクリーニング方法、特には、疾患症状が発症する前に癌の検出が可能である生化学的な方法が求められている。また、従来技術の癌スクリーニングの診断の補助及び／又は確認を行う、付加的なスクリーニング方法も求められている。
【００１０】
p53腫瘍サプレッサーは、細胞ストレス及び／又はDNA損傷に応答したゲノム完全性を維持するための細胞過程の鍵となる成分であり(Levine, 1997, Cell, 88(3): 323-331)、前述したように、p53における乱れは人の癌の半分以上と関係しているものである。通常状態では、p53及びその細胞活性は、早期分解及び抑制との組み合わせにより、低いレベルにて維持され、それらの活性調節過程は、mdm2（又は人のhdm2）プロトオンコジーンにより、大部分が制御されている。hdm2タンパク質は、p53の転写活性化ドメインに結合し、転写活性化活性を抑制することが報告されている（Momand et al., 1992, Cell, 69(7): 1237- 1245）。また、hdm2がE3ユビキチンリガーゼとして機能し（Honda et al., 1997, FEBS Lett, 420）、p53に作用して、ユビキチン依存型経路を介してプロテアソームを分解することが報告されている（Haupt et al., 1997, Nature (London), 387: 296-299; Kubbutat et al., 1997, Nature (London), 387: 299-303）。また、hdm2遺伝子の発現そのものがp53により制御されていることら、p53の細胞内濃度及び活性はhdm2の関与した自動制御型のフィードバックループにより制御されている。
【００１１】
細胞ストレス、例えば、UV放射又は突然変異原により誘導されたDNAの損傷の結果、（そのN末端ドメインのリン酸化により）p53が一過的に安定化し、hdm2の結合を防止し、活性型の高次構造を安定化させる。p53が一旦活性化されると、p21、bax及び（前述の）hdm2を含む、複数の遺伝子の発現を誘導する。p21及びbaxタンパク質は、p53の抗増殖機能を介して、細胞周期の進行の阻害及び／又は細胞アポトーシスを誘導する(El-Deiry et al., 1995, Cancer Res., 55: 2910-2919; Miyashita & Reed, Cell, 80(2): 293-299)。（その活性から、サイクリン依存型キナーゼインヒビター1A又はCDKA1A としても知られている）腫瘍サプレッサータンパク質p21は、細胞内のDNAが損傷したときに、G1期、G2期又はS期にて細胞周期の停止することを媒介する重要な役割を果たす。また、p21及びp53の双方が、人の細胞のDNAの損傷後に、G2チェックポイントを安定化させることに必須であることが報告されている（Bunz et al., 1998, Science, 282: 1497-1501）。
【００１２】
また、p53は、多くの癌の発症及び／又は進行に関係していることから、癌治療の調節又は変更の主たる標的となっている。更に、p53により活性化又は抑制された遺伝子及び／又はタンパク質は、逆に言うと、p53の活性化又は抑制の制御に重要な役割を果すものであることから、抗癌剤及び治療に役立つものとなる可能性がある。
【００１３】
（前述したように、）一方のp53相互作用タンパク質はhdm2であり、他方は、TIF1ドメイン構造を有するタンパク質ファミリーのメンバーであるTRIM28（KAP1、Kripi、RNF96、TF1 B、TIF1 B、TIFIbeta、TIF1β、UniProtKB/Swiss-Prot entry Q13263としても公知であるtripartite motif-containing 28）である。かかるTIF1ドメインは、RBCC（RING finger-B boxes-coiled coil）モチーフをN末端領域、充分に保存されていない中央領域、及び、PHDフィンガー及びブロモドメインすなわちBROMOを有するC末端領域を含むものである（例えば、Le Douarin et al., 1996, EMBO J., 15: 6701-6715を参照）。TRIM28は、転写調節複合体の非酵素的な要素として専ら同定されたものである（Friedman et al., 1996, Genes Dev., 10: 2067-2078; Moosmann et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24: 4859-4867）。DNAそのものと結合するものではないと考えられているが、TRIM28は、KRABリプレッサー（Kim et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 15299-15304）、ヒストン結合タンパク質のHP1、SETBD1（ESET）及びhdm2（Wang et al., 2005, EMBO J., 24: 3279-3290）を含む多様な核酸要素と結合することが知られている。事実、TRIM28は、遺伝子発現の抑制及びヘテロクロマチンの安定化として一般に機能するいくつかの大きなマルチファクター複合体の一部であると思われている（Sripathy et al., 2006, Mol. Cell. Biol., 26: 8623-8638）。
【００１４】
TRIMファミリーの他のメンバーには、RINGドメインが坑ウィルス活性を媒介するE3リガーゼ活性を有する（EFP、RNF147、Z147及びZNF147として知られている）TRIM25（Gack, et al., 2007, Nature, 446: 916-920）、及び、そのRINGドメインを媒介したE3ユビキチン地ガーゼ活性を有する（PTC7、RFG7、TF1G、TIF1G、FLJ32925、TIFγ、TIF1γ及びTIF1γとして知られている)TRIM33（Dupont et al., 2005, Cell, 121 : 87-99）を含む。
【００１５】
TIF1タンパク質のサブファミリーのメンバーでもある、TRIMファミリーのその他のメンバーは、特定の核酸レセプターと相互作用し、キナーゼ活性を有することが知られている（PTC6、TF1A、TIF1、RNF82、TIF1A、hTIF1、TIF1α及びTIF1αとしても知られている）TRIM24である（Fraser et al., 1998, J. Biol. Chem., 273: 16199-16204）。より詳しくは、TRIM24は、エストロゲン、レチノイン酸及びビタミンDレセプターを含む選抜された核酸レセプター（NR）のAF2（Activation Function 2）活性化ドメインと相互作用することにより、転写調節の媒介している（Thenot et al, 1997, J. Biol. Chem., 272(18): 12062-12068）。本研究は、転写機構ではなく、クロマチンリモデリングの機構により、TRIM24が転写を調節していることを示唆している。また、TRIM24は、ヘテロクロマチン関連タンパク質と相互作用することが報告されている（Le Douarin et al., 1996, EMBO J., 15: 6701-6715）。その他の近年の文献では、受精卵（1-細胞）期での第１の転写波の期間において、TRIM24が遺伝子発現の変化に関連していることが報告されており（Torres-Padilla & Zernicka-Goetz, 2007, J. Cell Biol., 174: 329-338）、そのことは、TRIM24の後成的発現役割の可能性を示唆している。
【００１６】
これまで、TRIM24とp53との相互作用に関する報告、或いは、TRIM24のp53に関係した癌との直接的な関連を示す報告は無い。同様に、TRIM24がE3リガーゼ活性を有する旨の確証及び報告は無い（TRIM25及びTR1M33を参照）。
【００１７】
この発明は、上述した従来技術の問題を解決を解決或いは少なくとも軽減することを目的としたものであり、例えば、まず、第一に、癌、特にはp53の変化に起因した癌などの疾患状態に関係する因子を同定し、癌を治療するためのp53活性に対するモジュレータを同定するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
この発明は、p53結合タンパク質としてのTRIM24（tripartite motif-containing 24、PTC6、TF1A、TIF1、RNF82、TIF1A、hTIF1、TIF1α及びTIF1α）の同定、及びTRIM24の発現が（一般に、通常レベル以上に）異なる旨の観察に基づくものである。また、この発明は、特には、TRIM24発現及び／又は活性の調節を介して、p53の活性を調節する分子の同定に基づくものであり、また、癌治療のためのかかる分子の使用に基づくものである。
【００１９】
この発明の第一の実施形態は、TRIM24活性のモジュレータを同定する方法であって、該方法は、（ｉ）該TRIM24ポリペプチドを複数の候補化合物に曝露するステップと、
（ｉｉ）該TRIM24と一種以上の該候補化合物とが、TRIM24の活性を調節するように相互作用するか否かを特定するステップと、（ｉｉｉ）TRIM24のモジュレータとして、TRIM24の活性を調節するよう、TRIM24と相互作用する化合物を同定するステップと、を含むことを特徴とする方法である。なお、かかる活性は、p53と結合／相互作用するTRIM24の機能的な活性或いは触媒活性である。また、TRIM24の触媒活性は、E3リガーゼ活性及び／又はキナーゼ活性であることが好ましい。更に、活性は、ユビキチン化／SUMO化活性であることが好ましい。
【００２０】
かかるTRIM24の活性がE3リガーゼ活性である場合には、この発明の方法は、TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性の基本水準を特定するアッセイにより、TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性を評価するステップと、該TRIM24ポリペプチド又はその断片を１種以上の候補化合物を接触させるステップと、一種以上の候補化合物の存在下にて、TRIM24ポリペプチド又はその断片の試験E3リガーゼ活性を特定するためのE3リガーゼアッセイにより、TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性を評価するステップと、TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性の基本水準と、試験E3リガーゼ活性とが異なるかを特定するステップと、試験E3リガーゼ活性と、TRIM24ポリペプチド又はその断片のE3リガーゼ活性の基本水準とが異なる場合に、該化合物をTRIM24活性のモジュレータとして同定するステップと、を含む。
【００２１】
また、この発明の第二の実施形態は、TRIM24依存型p53活性のモジュレータを同定する方法であって、該方法は、（a）p53応答核酸レポーターコンストラクトの存在下において、p53及びTRIM24ポリペプチドを発現させるステップと、（ｂ）p53及びTRIM24の存在下における、レポーターコンストラクトの発現レベルを検出するステップと、（ｃ）候補モジュレータ分子を導入するステップと、（ｄ）p53及びTRIM24存在下において、該分子がp53応答レポーターの発現レベルを変化させるか否かを特定するステップと、を含み、それらステップから、TRIM24依存型p53活性を有するモジュレータとして、p53及びTRIM24存在下において、p53応答レポーターの発現レベルを変化させる候補分子を同定する方法を提供するものである。また、この方法は、TRIM24 及びP53 タンパク質は生きた細胞内で発現させずに、細胞抽出物又は溶出物を使用してin vitroにて実施する、又は、細胞内にて実施するものである。更に、細胞は真核細胞であることが好ましい。更にまた、好適にはルシフェラーゼ、GFP又はCATをコードする遺伝子を含む、レポーターコンストラクト／遺伝子を使用することが好ましい。特にルシフェラーゼは有用なレポーター遺伝子である。また、かかる分子は、レポーター遺伝子の発現量を増大又は減少させる。更に、かかる分子は、p53及びTRIM24の存在下における発現レベルと比較して、レポーターの発現量を減少させることが好ましい。
【００２２】
その他の実施形態では、該方法は、p53及びTRIM24の存在下におけるレポーターコンストラクトの第一の発現レベルを検出するステップと、p53、TRIM24及び候補分子の存在下におけるレポーターコンストラクトの第二の発現レベルを検出するステップと、第一の発現レベルと第二の発現レベルとが異なる場合に、該候補分子をTRIM24依存型p53活性のモジュレータとして同定するステップと、を更に含む。
【００２３】
また、候補分子は、核酸（単鎖又は二重鎖DNA又はRNA）、ポリペプチド、小分子、例えば、化学合成した薬剤などの化学物質とすることができる。好適には、候補分子は、小分子薬剤スクリーニングライブラリから得られる「小分子」である。また、候補分子がshRNA又はsiRNAから選択されるRNA分子であることが好ましい。
【００２４】
この発明の第二の実施形態は、この発明に従う方法により同定されたp53活性のモジュレータである。かかるモジュレータは、p53に対して調節を行う効果を有する分子（化合物又は化学物質）である。かかるp53活性のモジュレータは、TRIM24発現を下方制御するsiRNA分子であることが好ましい。p53活性のモジュレータは、例えば、TRIM24のp53への結合を阻害する、抗体又はその抗原結合部位などのペプチドである。ある実施形態では、p53活性のモジュレータは、TRIM24の酵素活性を阻害する化学物質である。好適には、阻害される酵素活性は、E3ユビキチンリガーゼ活性である。この発明は、薬品として使用する分子を包含するものであり、好適は、TRIM24を標的とすることでp53活性を調整するために使用するものである。
【００２５】
また、この発明は、この発明の方法によって同定されるp53活性のモジュレータを含む医薬品組成物と、個人の癌を治療するために、薬品製品であるかかるp53活性のモジュレータを使用することを包含するものである。癌は、TRIM24の発現量を増大させること及び／又は癌細胞の活性に関係することが好ましい。また、この発明の範囲には、この発明に従う方法により同定されたp53活性のモジュレータを投与して、個人の癌を治療する方法、及び、同様に、この発明に従う方法により同定されたTRIM24活性のモジュレータを投与して、個人の癌を治療する方法が包含される。
【００２６】
この発明のその他の実施形態は、TRIM24ポリペプチドと特異的に結合する抗体又はその抗原結合部位を提供する。また、かかる抗体は、TRIM24の抗原性領域に特異的に結合することが好ましい。
【００２７】
この発明の任意の実施形態において、抗体またはその抗原結合部位は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体由来のヒト型モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される。抗体の抗原結合部位は、例えば、Fab断片、F(aｂ'）2断片、Fv断片を含むものである。
【００２８】
この発明の第５の実施形態は、TRIM24のmRNAを標的とするsiRNA又はshRNA分子を提供するものである。その他の実施形態では、この発明のsiRNA又はshRNA分子は、薬剤として使用される。これらの実施形態では、siRNA又はshRNA分子は、TRIM24のmRNAの配列の少なくとも19個のコンティグ塩基を標的とすることが好ましい。標的の配列は、配列ID番号1（図１Ａ）又はそれに相当するRNAから選択することが好ましい。この発明のsiRNA又はshRNA分子は、配列ID番号1の19〜21個のコンティグ配列を標的とすることが好ましく、より好ましくは、配列ID番号1の19〜21個の塩基配列を標的とする。この発明のsiRNA又はshRNA分子は、癌、特にはp53に関連した癌の治療のためにTRIM24の発現量を下方制御することに使用されることが好ましい。ある好適な実施形態では、この発明のsiRNAまたはshRNA分子は、CGCATGAAACTTATGCAACAAC (配列ID番号 7)、GCCATGAAATGAGCCTGGCTTT (配列ID番号8)、CCTGTTGTTATAGTGAAGCAA (配列ID番号9)、GGCAGCAGTACAGCATTACTTT (配列ID番号10)、CGAGACTTATCTAAACCAGAA (配列ID番号11)又はそれら配列の相補的な配列の少なくとも19個の連続塩基を標的としている。
【００２９】
ある実施形態において、siRNA分子は、一対のオリゴヌクレオチド、
（a）5'- CGCATGAAACTTATGCAACAAC-3' (センス鎖、配列ID番号7) 及び5'- GTTGTTGCATAAGTTTCATGCG-3' (アンチセンス鎖、配列ID番号12);
（b）5'- GCCATGAAATGAGCCTGGCTTT -3' (センス鎖、配列ID番号8)及び5'- AAAGCCAGGCTCATTTCATGGC-S'(アンチセンス鎖、配列ID番号13);
（c）5'- CCTGTTGTTATAGTGAAGCAA -3' (センス鎖、配列ID番号9)及び5'- TTGCTTCACTATAACAACAGG-S'(アンチセンス鎖、配列ID番号14);
（d）5'- GGCAGCAGTACAGCATTACTTT -3' (センス鎖、配列ID番号10)及び5'- AAAGTAATGCTGTACTGCTGCC-3' (アンチセンス鎖、配列ID番号15);
（e）5'- CGAGACTTATCTAAACCAGAA -3' (センス鎖、配列ID番号11)及び5'- TTCTGGTTTAGATAAGTCTCG-S'(アンチセンス鎖、配列ID番号16)から選択される。
【００３０】
ある実施形態において、shRNA分子は、5'CCGGCGCATGAAACTTATGCAACAACTCGAGTTGTTGCATAAGTTTCATGCGTTTTT-3'(配列ID番号17)、5'CCGGCCATGAAATGAGCCTGGCTTTCTCGAGAAAGCCAGGCTCATTTCATGGTTTTT-3'(配列ID番号18)、5'CCGGCCTGTTGTTATAGTGAAGCAACTCGAGTTGCTTCACTATAACAACAGGTTTTT-3'(配列ID番号19)、5'CCGGGCAGCAGTACAGCATTACTTTCTCGAGAAAGTAATGCTGTACTGCTGCTTTTT-3'(配列ID番号20)、及び、5'CCGGCGAGACTTATCTAAACCAGAACTCGAGTTCTGGTTTAGATAAGTCT CGTTTTT -3'(配列ID番号21 )から選択されることが好ましい。
【００３１】
任意選択的に、この発明に従うsiRNA分子及びshRNA分子は、ここに記載の、dTdT又はUU3'-overhang、及び／又は、ヌクレオチド、及び／又は、ポリヌクレオチドを基本（backbone）とした修飾を更に有することが好ましい。
【００３２】
また、この発明のその他の実施形態は、TRIM24発現及び／又は生物活性のインヒビターを含み、p53シグナル経路のモジュレータとして使用する組成物である。かかる組成物は、TRIM24ポリヌクレオチド配列と実質的に相補するポリヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも12個のコンティグ塩基と実質的に相補する オリゴヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも19個のコンティグ塩基と実質的に相補的するオリゴヌクレオチドRNAi分子、抗体、人工転写因子、ポリアミン、糖タンパク質及び多糖から選択してなる部分を含むことが好ましい。ある実施形態において、TRIM2４のインヒビターの生物活性は、TRIM24とp53との間の結合相互作用を拮抗させることにあり、好適には、TRIM2４のインヒビターの生物活性は、（例えば、ユビキチン化／SUMO化活性などの）E3リガーゼ活性などの、TRIM24の酵素活性を拮抗させることにある。また、TRIM24発現のインヒビターは、ヒトのTRIM24又はそのアイソフォーム（配列ID番号1、59〜64参照）の少なくとも19個のコンティグ塩基を標的とするsiRNA又はshRNA分子であることが好ましい。更に、TRIM24発現のインヒビターは、ここに記載されているsiRNA又はshRNA分子であることがより好ましい。
【００３３】
更に、その他の実施形態は、癌の予防及び／又は治療を必要としている患者のための医薬品組成物であって、TRIM24発現及び／又は生物活性のインヒビター、並びに、薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬品組成物を提供するものである。また、その他の実施形態は、TRIM24発現及び／又は生物活性のインヒビターを含み、p53シグナル経路のモジュレータとして使用する組成物を提供するものである。このような実施形態において、TRIM24のインヒビターは、TRIM24ポリヌクレオチド配列と実質的に相補するポリヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも12個のコンティグ塩基と実質的に相補する オリゴヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも19個のコンティグ塩基と実質的に相補的するオリゴヌクレオチドRNAi分子、抗体、人工転写因子、ポリアミン、糖タンパク質及び多糖から選択してなる部分を含むことが好ましい。好適には、ポリヌクレオチドのレベルでは、TRIM24のインヒビターは、アンチセンスRNA、siRNA又はshRNAであり、ポリペプチドのレベルでは、TRIM24のインヒビターは、抗体又はその抗原結合部位であり、或いは、小分子インヒビターである。また、その他の実施形態において、TRIM24のインヒビターの生物活性は、（例えば、ユビキチン化／SUMO化活性などの）E3リガーゼ活性などの、TRIM24の酵素活性を拮抗させることにある。siRNA及び／又はshRNA分子を含む組成物において、siRNA及び／又はshRNA分子は、（例えば、この発明の第5の実施形態に従う）ここに記載の分子であることが好ましい。
【００３４】
また、その他の実施形態は、治療を必要としている患者の癌を治療する方法であって、該方法は、必要に応じてTRIM24のインヒビターを有効量投与するものであり、該インヒビターは、TRIM24ポリヌクレオチド配列と実質的に相補するポリヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも12個のコンティグ塩基と実質的に相補する オリゴヌクレオチド、TRIM24ポリヌクレオチド配列の少なくとも19個のコンティグ塩基と実質的に相補的するオリゴヌクレオチドRNAi分子、抗体、人工転写因子、ポリアミン、糖タンパク質及び多糖から選択してなる部分を含む方法を提供するものである。また、TRIM24のインヒビターは、ヒトのTRIM24又はそのアイソフォーム（配列ID番号1、59〜64参照）の少なくとも19個のコンティグ塩基を標的とするsiRNA又はshRNA分子であることが好ましい。更に、この発明の実施形態は、ここに記載されているsiRNA又はshRNA分子であることがより好ましい。
【００３５】
また、この発明のその他の実施形態は、治療を必要としている患者の癌を治療する方法であって、該方法は、必要に応じて医薬品組成物を有効量投与する方法を提供するものである。また、ここに記載のTRIM24発現及び／又は生物活性のインヒビターを、癌の治療に使用する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ヒトのTRIM24の完全長cDNA配列を示した図である。開始（ATG）及び終止（TAA）コドンのコード配列は枠に囲まれている。この発明に従うRNAi分子により認識されるDNA配列領域は、太字にて記載している。長鎖TRIM24のアイソフォームに挿入される34アミノ酸をコードしている102塩基の領域には下線を付してある。
【図２】TRIM24の長鎖のアイソフォームの完全長のタンパク質配列を示した図である。TRIM24の長鎖アイソフォーム特有の34のアミノ酸ペプチド配列に下線を付した。
【図３】銀染色したSDS-PAGEにより分析されたp53タンパク質複合体のTAP精製物の結果である。タバコエッチ病ウィルス（TEV）プロテアーゼ切断部位から単離されたタンパク質A及びカルモジュリン結合タンパク質モチーフを有する短鎖ペプチドのTAPタグを付したTAP-p53、又は、野生型(wt)のp53を発現するマウスのES（mES）細胞を、抽出作業及びTAP精製の前に、TAPタグのタンパク質Aの抗体をコートしたマイクロビーズを使用してドキソルビシンに曝す。結合タンパク質を有するビーズは、TEVプロテアーゼ処理に付され、TAP-p53タンパク質を介して結合したタンパク質のみを解離させる。タンパク質はSDSPAGEにより分離され、銀染色された。TEV処理後にビーズから溶出されたポリペプチドであって、レーン１はwtのp53発現mES細胞を示し、レーン２は、TAP-p53発現mES細胞を示す。レーン3は、wtのp53発現mES細胞の、ビーズに結合しているが、TEV処理によって溶出しなかったタンパク質（すなわち、TAP-p53に直接結合しなかったタンパク質）を示し、レーン4は、そのTAP-p53発現mES細胞を示す。矢印は、マススペクトロメトリーによるタンパク質のバンド、すなわち、同定されたTAP-p53（a）、p53（b）、IgG重鎖（c）及び軽鎖（e）、及びTEVプロテアーゼ（d）を示す。
【図４】マウスのES（mES）細胞の選択された遺伝子のRTPCRによる発現レベルの棒グラフを示した図である。mES細胞を、ドキソルビシン処理を施した（+）又は施していない（-）、コントロールsiRNA分子（黒いバー）又はTRIM24ターゲッティングsiRNA分子（縞模様のバー）により処理し、TRIM24（1）、p53（2）、p21（3）、mdm2（4）、perp（5）及びnanog(6)のmRNAレベルが示されている。夫々の実験において、試料は、ドキソルビシン処理によりp53を誘導して、5時間（a）及び12時間（b）経過したに分析に供された。発現レベルは、18SrRNAの発現レベルの相対値として標準化されたものを示している。結果は、個々の試料について3〜5回RTPCRを行った、3〜4回の独立した実験の平均値にて求められている。
【図５】マウスのES（mES）細胞の選択された遺伝子のRTPCRによる発現レベルの棒グラフを示した図である。mES細胞を、ドキソルビシン処理を施した（+）又は施していない（-）、コントロールsiRNA分子（A）又はTRIM24ターゲッティングsiRNA分子（B）により処理し、TRIM24（1）、p53（2）、p21（3）、mdm2（4）、perp（5）及びnanog(6)のmRNAレベルが示されている。結果は、2回の独立した実験の平均値にて求められている。
【図６】マウスのES（mES）細胞の選択された遺伝子のRTPCRによる発現レベルの棒グラフを示した図である。p53 を発現している(p53+/+)及び発現していない (p53-/- )、MEF細胞を、ドキソルビシン処理を施した（+）又は施していない（-）、コントロールsiRNA分子（A）又はTRIM24ターゲッティングsiRNA分子（B）により処理し、TRIM24（1）、p53（2）、p21（3）、mdm2（4）及びperp（5）のmRNAレベルが示されている。発現レベルは、18SrRNAの発現レベルの相対値として標準化されたものを示している。結果は、個々の試料について3〜5回RTPCRを行った、3回の独立した実験の平均値にて求められている。
【図７】FLAGタグ付きTRIM24発現コンストラクトを形質転換し、（DNA損傷応答経路を介してp53タンパク質を誘導する）ドキソルビシンの有無+/-の下で培養したMCF（p53陽性乳癌）細胞をウェスタンブロットにより分析されたp53及びTRIM24タンパク質のレベルのグラフ図を示す。
【図８】MCF7細胞を空のベクター又はhMdm2又はFLAG-TRIM24を発現しているプラスミドにより形質転換したウェスタンブロットの写真である。コントロールベクターにより形質転換した細胞では、MG132がp53タンパク質を実質的に増大させた。
【図９】公共のドメインにて利用可能であり、左方に対応するアクセッション番号（配列ID番号59〜64）を付した、ヒトのTRIM24タンパク質のコードする転写産物の複数の配列のアラインメントを示した図である。TRIM24の全てのアイソフォーム／バリアントに共通するこの発明にて使用されるsiRNA配列の位置に図面内にてマークを付してある。下線を付した配列はsiRNA標的を示したものである。「※」は、全ての転写産物に共通する部分である。「−」は、CLUSTALにおけるアライメント工程にて挿入されるギャップを示す。配列の最後に記載の番号は塩基対の数を示す。
【図１０】図９に示すsiRNA標的配列を示す。センス配列は、配列ID番号28〜36にて夫々示され、アンチセンス配列は、配列ID番号37〜45にて夫々示される。
【図１１】図１０に示すsiRNA配列のみにより形質転換し、TRIM24ノックダウンした、HCT116、PC3、A549、MCF7及びT47D癌細胞を示した図である。
【図１２】図１０に示すsiRNA配列のみにより形質転換し、TRIM24ノックダウンした、HCT116、PC3、A549、MCF7及びT47D癌細胞であって、ネガティブコントロールすなわち非特異的siRNAにより標準化し、NegF値の％にて示した図である。この図は、夫々の細胞系統の細胞増殖に関する情報を示すものである。大きな十字は、100％の水準を示すものである。
【図１３】図１０に示すsiRNA配列のみにより形質転換し、TRIM24ノックダウンした、HCT116、PC3、A549、MCF7及びT47D癌細胞であって、評価した夫々の細胞系統に対する細胞密集度の程度を示した図である。また、この図は、ネガティブコントロールすなわち非特異的siRNAにより標準化し、NegF値の％にて示す。大きな十字は、100％の水準を示すものである。
【図１４】（a）は、TRIM24発現を標的とするshRNA発現プラスミドを形質転換したMCF7乳癌細胞系統の細胞培養皿の写真を示す。左方のペトリ皿は、コントロールのshRNAを形質転換した細胞のコロニー形成を示し、右方のペトリ皿は、TRIM24発現を標的とするshRNA発現プラスミドを形質転換した細胞のコロニー形成を示す。（ｂ）は、コロニー形成アッセイによる、72時間経過後の生育の評価結果を示した図である。
【図１５】左方のパネルは、同数のマウスのES細胞をプレーティングし、48時間後にアルカリフォスファターゼ活性を測定される細胞培養皿を示す。コントロールのsiRNA処理細胞に対する、siRNAにより誘導されたmES細胞の自然発生的な分化によるTRIM24の一過的な枯渇を示す。右方のパネルには、そのデータのグラフ図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明を記載する前に、この発明の理解を助ける、多数の定義を提供する。ここに記載の全ての引用文献は、この発明に援用するものである。ここに記載の専門用語は、この発明の分野における当業者が一般的に理解する内容のものを指す。
【００３８】
ここでいう「癌」とは、腫瘍又は腫瘍と関連した組織又は細胞を言うものである。一般に、腫瘍は、通常の組織及び通常の細胞とは異なる特性を有する。その特性は、以下に限定されるものではないが、ある程度の退生、細胞形態の変化、形態の不規則化、細胞接着性の減少、転移能、血管形成の増大、細胞侵襲性の増大、細胞アポトーシスの減少、及び、細胞悪性腫瘍の増大である。「癌」と言う用語は、肉腫、癌腫、腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、ポリープ、悪性転換、腫瘍などを含む。ここでいう「p53関連癌（又はその類似）」とは、通常の細胞に比してp53の発現又は機能が変化した癌を言うものである。発現又は機能の変化はp53遺伝子の突然変異によるものである、又は、p53の発現又は機能に直接的又は間接的に影響する突然変異又は遺伝子発現の変化によるものである可能性がある。
【００３９】
ここでいう「通常」とは、「通常細胞」等の文脈で使用され、病気になっていない細胞、特には癌細胞ではない細胞を言うものである。一般に、そのような細胞は健康な対象、すなわち、癌となっていない対象から得られる。しかし、個人とはいえ、特定のタイプ（例えば、B細胞）の癌性の細胞、又は、癌性ではなく、「通常」の、脾臓等のその他のタイプの細胞がある。そのことから、癌を有する対象物から、通常の細胞を得ることも可能である。
【００４０】
通常の細胞を「コントロール」の細胞（又は「コントロール」）として使用し、病気になっていない又は少なくとも癌ではない細胞におけるTRIM24などの、特定の遺伝子の発現を検出及び／又は定量化することができる。通常細胞における遺伝子の発現レベルは、「通常の」、「コントロールの」又は「基本の」レベルの発現である。このように、この発明に従うと、一般に、癌細胞におけるTRIM24の発現は、通常の、健康なコントロール細胞の、好適には同一の細胞系統における、TRIM24発現の基本レベルと比較される。
【００４１】
「モジュレータ」は、（例えば遺伝子、エンザイムなどの）標的分子の活性に影響を与える（例えば化学物質/構成要素）分子を意味する用語である。活性の変更は、モジュレータ無し或いは同様な条件下での通常又は規定レベルの活性に対する相対的なものであり、通常／基本活性の増大又は減少を示すものである。モジュレータは、ここに記載の任意の分子を指すものであり、例えば、小分子薬、抗体又は核酸である。この発明において、標的分子はp53遺伝子、RNA又はタンパク質であり、モジュレータは、（通常は的状赤血球の中で、しかし、それは、in vitroでの調節を含む）p53及び／又はTRIM24の活性を調節する能力によって分類されるものである。p53及び／又はTRIM24の調節は、当業者にとって公知のいかなる手段にもよって評価されることができ、例えば、p53及び／又はTRIM24によって制御された遺伝子発現の変化を特定することにより評価することができる。有利には、この発明に従うモジュレータは、TRIM24遺伝子、RNA又はタンパク質を介してp53活性に影響を及ぼすものである。従って、例えば、モジュレータは、TRIM24遺伝子の発現を変化させることによって、（その分解を触媒することで）TRIM24 のRNAの発現を変化させることによって、TRIM24タンパク質の酵素活性を抑制することによって、又は、TRIM24タンパク質の構造又は活性に変化を引き起こすことによって、作用するものである。このように、「モジュレータの活性」は、（例えばp53またはTRIM24などの）標的の活性を、通常／基本活性に対し変化させることを意味するものである。
【００４２】
「後成的発現修飾」とは、ゲノムの化学物質マーキングをいうものである。後成的発現マークは、（限定されるが）ヒストンのメチル化またはアセチル化による、DNAと関係しているタンパク質と同様に、DNA（例えばメチル化、「インプリント」）の共有結合性修飾を含むことができる。（母の又は親の染色体からの）起源の親特異的な遺伝子発現は、哺乳類にしばしば見られ、それは後成的発現修飾によるものである。親の生殖細胞系において、後成的発現修飾は、安定的な遺伝子サイレンシングまたは活性化を引き起こす場合がある。
【００４３】
TRIM24の「誘導体」又は「ホモログ」は、本願明細書において、 TRIM24に実質的に類似した配列同一性を有する（例えばmRNAなどの）ポリヌクレオチド及び／又はポリペチドをいうものである。好適には、配列同一性が比較される TRIM24は、ヒトTRIM24である。誘導体及びホモログは、他の種からのオルソログ配列及び機能的に同等性を呈する突然変異体を含むものをいう。実質的に類似した配列相同性は、対応する（例えば、ヒトのTRIM24 などの）TRIM24に対し50％、60％、70％、80％又は90％の相同性を有する水準の配列をいうものである。好適には、対応する（例えば、ヒトのTRIM24 などの）TRIM24に対し92％、95％又は約98％の相同性を有する水準の配列である。ある好適な実施形態では、TRIM24に対し高い相同性を有するポリペプチドは、ヒトのTRIM24に対し99％又は100％の相同性を有するものである。配列の相同性の率は、従来の方法により求めることができる（例えば、Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915; and Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402）。また、ここに記載の配列相同性の水準は、ポリペプチド配列及び（DNA又はRNAの）ポリヌクレオチド配列の双方をいうものであることには留意されたい。
【００４４】
ここでいう「単離された」を、核酸又はポリペプチド配列に適用すると、生体又は起源から取り出した配列を言うものである。一般的に、ポリペプチド又はポリヌクレオチド／核酸分子は、精製された状態かを問わず、それが生産された環境から単離されたものである。このように、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチドは、100％の純度では無く、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％又は90％の純度である。精製、単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチドは、少なくとも80％の純度であることが好ましく、更に好ましくは少なくとも90％の純度であり、更に好ましくは少なくとも95％の純度であり、又は、更に好ましくは少なくとも98％（例えば99％）の純度である。ここに記載の「単離された」とは、ポリペプチドに対し使用すると、ネイティブな形態、変性した形態、二量体／複量体、グリコシル化した、結晶化した又は誘導体化した形態などの異なる物理形態にあるポリペプチドを含むものである。この発明の、核酸分子／ポリヌクレオチド／(例えば、核酸プローブ、RNAi分子などの)オリゴヌクレオチド及び（抗体又はその断片などの）ポリペプチド／ペプチドが単離されることが好ましく、より好ましくは、それらが精製されている。
【００４５】
この発明は、p53相互作用（例えば、結合）タンパク質としてのTRIM24を同定するものであり、TRIM24は、癌細胞のタイプによって、異なる発現を示すものである。したがって、TRIM24に基づく方法及び組成物は、癌の発見及び／又は診断のために提供されるものである。特に、ここに記載のデータでは、複数の癌の種類によって、通常の細胞に対して比較すると、TRIM24が異なる発現を示す。特定の癌細胞のタイプでは、対応する通常の細胞のタイプ（乳癌、レチナール癌、大腸癌及び前立腺癌）に対し、TRIM24の発現が上方制御され、また、対応する通常の細胞のタイプ（腎臓癌）に対し、TRIM24の発現が下方制御される。また、この発明は、増殖能に大きく影響するp53を発現させる癌細胞のサブセットにおいて、TRIM24活性又は発現を抑制するものである。
【００４６】
TRIM24は、例えば肺発生時において、発生的に調節されるものである（Torres-Padilla & Zernicka-Goetz, 2006, J. Cell Biol., 174(3): 329-338）。
【００４７】
ここに記載のデータは、TRIM24の発現が、癌及び発生の鍵となる遺伝子の発現に影響を及ぼし、TRIM24を抗癌治療の標的として同定したものであることを更には示すものである。
【００４８】
（3要素モチーフ含有（Tripartite Motif-Containing）24 タンパク質 (TRIM24)）
TRIM24は、N末端領域にRBCC（ING finger-B boxes-coiled coil）モチーフを有し、充分に保存されなかった中央領域、C末端領域にPHDフィンガー及びブロモドメインを有する、3要素モチーフ含有（Tripartite Motif-Containing：TRIM）ファミリーに属するタンパク質である（Le Douarin et al., 1996, EMBO J., 15: 6701-6715）。TRIMファミリータンパク質の他のメンバーは、TRIM28及びTRIM33を含み、その細胞内活性により、転写媒介要素（transcription intermediary factors：TIF）として知られている。現在までのところ、TRIMタンパク質は、全く異なる細胞活性及び機能を呈することを示している。
【００４９】
TRIM24の2種のアイソフォームは、マウスおよびヒトにおいて報告されている（Le Douarin et al., 1995, EMBO J., 14: 2020-2033）。両アイソフォームは、RING、BBOX、BBC、PHD及びBROMOドメインの認識された機能ドメインを含む。しかし、長い方のアイソフォームは、図1の下線部分に示すヒトのTRIM24のcDNA及びRNAの102の塩基対（bp）配列をコードする34個のアミノ酸の挿入を含む（図2の下線部分に示す）。これらの2つのアイソフォームの機能には違いがなかったことが報告されていることから、異なるアイソフォームの有意差は不明である。このように、ここに記載されているように、TRIM24という用語は、TRIM24の公知のアイソフォームすなわち長いアイソフォーム及びヒトのTRIM24の短いアイソフォームを言うものである。
【００５０】
TRIM24（TIFタンパク質）は、エストロゲン、レチノイン酸及びビタミンＤを含む、複数の核酸レセプタ（NRs）の活性化機能（Activation Function）2（AF2）活性化ドメインとリガンド依存型の方法で相互作用して転写制御を媒介するものであるとされている（Thenot et al., 1997, J. Biol. Chem., 272(18): 12062-12068; Le Douarin et al., 1995, EMBO. J., 14(9): 2020-2033）。適当なNRと結合する場合に、TRIM24は核小体に局在することとなる（Le Douarin et al., 1997, Biochem Soc Trans., 25: 605-612）。Fraserら (1998, J. Biol. Chem., 273: 16199-16204)によって、TRIM24がキナーゼ活性を有し、そのものが適当なNRにより過剰リン酸化されていることが報告されている。かかる翻訳後修飾は、TRIM24の機能に対し大変重要な役割を果すものである。例えば、翻訳後修飾は酵素活性、安定性及びタンパク質-タンパク質（又はタンパク質-核酸）間相互作用に影響することが知られている。他のTRIM24ファミリーのメンバーは、互いに関連又は他のTRIMタンパク質、例えばPMLと関することが示されている。また、TRIM24は、それ自体及び／又は他のTRIMタンパク質と相互作用してホモダイマー又はヘテロダイマー或いはマルチマーを形成する。
【００５１】
また、TRIM24が、転写機構を介してではなく、クロマチンリモデリングの機構によって転写を調節することが示唆された。この点に関して、Le Douarinらは、TRIM24がヘテロクロマチン関連タンパク質と相互作用することを示した（1996, EMBO J., 15: 6701-6715）。  接合体（1細胞）ステージにおける第一の転写波における遺伝子発現の調節にTRIM24が関連することを示すデータとかかる観察により、TRIM24の後成的発現（例えばクロマチンリモデリング）の好適な証拠を提供する(Torres-Padilla & Zemicka-Goetz, 2007, J. Cell Biol., 174: 329-338)。
【００５２】
しかし、TRIM24に対してなされた研究からは、その詳細な細胞における機能が解明されていない。特に、TRIM24の酵素活性及び細胞内における効果が完全に同定されていない。
【００５３】
胚発生と癌の類似は、その双方において分裂及び分化が鍵となる因子であることから、しばしば引用されることとなる。胚発生において、遺伝子のヌクレオチド配列にコード化されている情報無しで、細胞または多細胞器官からその子孫まで情報の伝達を可能にすることから、（通常はDNAまたはクロマチン構造の化学修飾によって決められる）後成的調整が重要な要素であると考えられている。例えば、遺伝子発現は、ゲノムDNAと関係するヒストンのメチル化又はアセチル化を介して調整される。後成的発現修飾は、生体の通常の発達において異なる時間に起こり、また、癌細胞への正常細胞の形質転換の間にも起こる（Feinberg & Vogelstein, 1983, Nature, 301 : 89-92）。そのことから、過去に示唆されたTRIM24の癌への関係は推論的なものに過ぎなかった。
【００５４】
この発明は、過去に知られていないTRIM24の細胞内での役割、すなわち、53と相互に作用するその能力と、in vivoにてp53の調節を行うことを同定するものである。また、この発明は、TRIM24の癌、特にはp53腫瘍抑制タンパク質の関連する癌への関連の証拠を提供するものである。
【００５５】
（p53とTRIM24との相互作用）
この発明において、タンデムなアフィニティ精製（TAP）は、 腫瘍学の最も確立した腫瘍サプレッサー遺伝子のうちの1つであるp53の新しい結合パートナーを同定するために使用された。
【００５６】
まず、エピトープタグ、内生p53タンパク質が発現した「ノックイン」マウス、タンデムなアフィニティ精製（TAP）タグが付されたp53（TAP-p53）マウスが遺伝子標的法により作られた。野生型のマウスのp53は11のエキソンを有する。
【００５７】
また、mES細胞は集められ、末端のエキソンにTAPタグを挿入すると同時に、p53の最後のイントロンにポジティブ選抜するためにloxP-flanked PGK-neo（すなわち、ネオマイシン遺伝子はpgk-1プロモーターにより転写される）を挿入して設計された標的ベクターと形質転換した。上述したように、TAP-タグは、タバコエッチ病ウィルス（TEV）プロテアーゼ切断部位によって分離された、Protein A及びカルモジュリン結合タンパク質モチーフを有する短いペプチドを有する。また、一過的なcre発現によりp53-TAPアレルが形成され、neoカセットが取り除かれる。かかるアレルは、末端のイントロンにloxP部位を有し、p53のC末端にTAPタグを融合している点において、野生型のアレルと異なる。１つの野生型及びp53-TAPアレルを有するmES細胞は、（従来の方法により）胚盤胞に導入され、p53-TAPノックインマウスが作られる。
【００５８】
このマウスにおいて、p53を内生のp53プロモーターの制御下にて発現させることにより、p53が内生調節レベルとなる。
【００５９】
また、mES細胞（p53TAP/+）は、とりわけ、p53タンパク質の研究に使用することができる。また、必要に応じて、TAPタグによりTAP-p53を精製し、ネイティブ且つ機能的なp53タンパク質複合体を事実上通常の細胞から分離することができる。
【００６０】
更に、p53を精製するために、TAP-p53細胞は、ストレス因子として機能し、p53の活性を増大させるドキソルビシンの処理が施された。この点につき、ストレスを介したp53の誘導は、mRNAレベルではなく、例えば、（転写後調節などの）p53の安定性及び／又は活性に影響するタンパク質のレベルで達成される。このように、ドキソルビシンによるp53の誘導後、p53のmRNAのレベルは変化しない。ES細胞の抽出準備後、p53相互作用（すなわち共精製）タンパク質を得るために、TAPタグによるタンデムアフィニティ精製が用いられた。集められたタンパク質精製物は、SDAPAGEにより分離され、銀染色された（図3参照）。TAP-p53溶出フラクションに特異的に存在するバンドは黒の三角にて示され、これらのタンパク質のバンドは、マススペクトルメトリペプチド解析に処され、p53共精製タンパク質が同定された。未処理のmES細胞から同様に準備された試料は、コントロールとして処理された（データ不図示）。TEV（タバコエッチウィルスプロテアーゼ）処理により溶出されなったビーズに結合したタンパク質をレーン3（野生型p53）及びレーン4（TAP-p53）に示す。これらのバンドは、単なるTAP-p53タンパク質の相互作用による共精製により得られないが、実験によりプルダウンされるタンパク質を示す。また、図3に示すタンパク質のバンドは、TAP-p53（a）、p53（b）、IgG重鎖（c）及び軽鎖（e）、及びTEVプロテアーゼ（d）を示す。
【００６１】
この研究から、4つの蛋白質は、単離されて及び質量分析によって同定された。同定された蛋白質のうちの2つは、公知のp53相互に作用している蛋白質の、mdm2及びp53結合タンパク質1であったことから、このシステムの正当性を立証された。他のp53相互作用タンパク質として同定されたのがTRIM24である。しかし、興味深いことに、p53相互作用タンパク質はドキソルビシンの非存在下で同定されず、p53依存的であった。
【００６２】
従って、TRIM24は、p53と近密に関連し、強く相互作用するタンパク質として同定された。このことは全く予想だにしない結果であり、過去にTRIM24/p53タンパク質タンパク質間相互作用の報告もない。事実、Torres- PadillaとZernicka-Goetzにより報告されたように（2007, J. Cell Biol., 174: 329-338）、過去の研究では、同定された細胞内因子がTRIM24により（すなわちアンチセンスによりTRIM24の発現をノックダウンすることにより）影響されるかが同定されず、p53との関係を示唆するに過ぎなかった。また、この研究の結果は、mdm2（又はヒトのhdm2）がp53と結合することによってのみ起こる、過去に認識されたTRIM28 とp53との間接的な相互作用と整合するものである。
【００６３】
TRIM24がp53に結合するための多数のTRIM24の領域がある。例えば、TRIM24は、ヒストンタンパク質のアセチル化された又はメチル化されたレジン残基に夫々好適に相互作用するBROMO及びPHDタンパク質タンパク質相互作用ドメインを有する。P53がアセチル化及びメチル化の双方の標的であることは公知であり、そのことから、これら認識された相互作用モチーフと少なくとも部分的にTRIM24がp53と相互作用する。また、TRIMファミリーのRBCCモチーフは、（E3ユビキチンDNAリガーゼなどの）タンパク質修飾物として機能する際に基質結合及び特異性を発揮することが知られている。
【００６４】
また、従来技術のp53腫瘍サプレッサーと比較すると、この研究の結果は生理学的に適切である。一般に、従来技術の研究は、p53の過剰発現及び／又は連続した培養条件下における腫瘍由来細胞系統の分析に依存してきた。そのような従来のシステムは、人工産物を導入し、略真性の有意差が得られなくなるように非生理学的な相互作用を促進する。一方、TAP-p53マウスの細胞系統は、通常のp53の発現レベルを示す。このように、精製実験から生理学的に重要なp53相互作用タンパク質を検出できる。
【００６５】
従って、この相互作用の同定は、発生的及び疾患過程におけるTRIM24の役割を示し、特に腫瘍学において、特に、p53と関係している癌のための癌治療のための新規の標的を提供するものである。
【００６６】
また、p53は、リン酸化、アセチル化及びユビキチンを介した分解など多数の転写後工程により制御されていることは周知である（Yang et al., 2004, Oncogene, 23: 2096-2106）。この点につき、p53と相互作用して調節することが知られているタンパク質であるmdm2は、p53をユビキチン化及びネジル化（neddylation）して修飾するRINGドメインを有する（Xirodimas et al., 2004, Cell, 118: 83-97）。RINGモチーフはE3リガーゼ活性を有すると特徴付けられている。特定のE3リガーゼは、ユビキチン活性を有し、他のものはSUMO化を触媒するものである。SUMO化はユビキチン化と類似しているが、関連するユビキチンタンパク質ではなく、標的へはSUMO（small Ubiquitin-related Modifier）タンパク質をい付加する。一般に、E3リガーゼの触媒活性は、E1及びE2リガーゼの存在下において、複合体として機能し、標的タンパク質中の特定のアミノ酸残基へのユビキチン/SUMO部分の付加を触媒する。
【００６７】
また、TRIM24はRINGドメインを有することから、一度p53と結合すると、TRIM24は、多数の異なる化学修飾により、p53の活性又は安定性を調節する。例えば、TRIM24は、p53のユビキチン化、SUMO化及び／又はネジル化（neddylation）を触媒するものである。
【００６８】
従って、この発明は、p53の転写後調節を触媒する、TRIM24の任意の酵素活性を同定する方法に関係するものである。また、この発明は、TRIM24の任意の酵素活性を調節する分子、すなわち、p53の活性の変化に影響する分子を同定する方法を提供するものである。
【００６９】
（TRIM24の癌との関係）
上述の実験により、公知の癌細胞種におけるTRIM24の発現レベルが調査された。
【００７０】
Gene Expression Omnibus（GEO）及びCancer Genome Anatomy Project（CGAP）を調べるためにバイオインフォマティックスのサーチがなされた。得られたデータは、（i）房上皮に対する乳癌細胞系統、（ii）第一の大腸癌からの系統に対する転移性大腸癌に由来した 細胞系統、（iii）通常の網膜細胞に対するレチナール癌、及び、（iv）アンドロゲン反応しする前立腺癌細胞系統に対するアンドロゲンに反応しない前立腺癌細胞系統において、TRIM24が上方制御されていることを示している。興味深いことに、腎臓の腫瘍において、TRIM24の発現が通常の腎臓の細胞に比して低減していた。
【００７１】
従って、関心対象の癌は、関心対象から得られた生体試料におけるTRIM24の発現レベルを検出する及び／又は定量することにより、検出及び／又は診断される。このように、この発明は、関心対象の癌の存在を検出及び／又は診断する方法に関するものであり、該方法は、（i）患者の生体試料を提供するステップと、（ii）生体試料中のTRIM24の発現レベルを検出及び／又は定量するステップと、（iii）コントロール試料に対する生体試料のTRIM24のレベルを比較し、コントロール試料に対する生体試料のTRIM24の発現量が異なる場合に、患者に癌があることを示すステップとを含む。一般に、コントロール試料に対する超過したTRIM24の発現が癌の存在を示すものとなる。癌は、例えば、TRIM24の発現がコントロール試料よりも少なくとも1.5倍になったとき、好適には、TRIM24の発現がコントロール試料よりも少なくとも2.0倍になったとき、更に好適にはTRIM24の発現がコントロール試料よりも少なくとも3.0倍になったとき、更に好適には、TRIM24の発現がコントロール試料よりも少なくとも4.0倍又は5.0倍になったとき、検出及び／又は診断される。一般に、コントロール試料は、（癌ではない）健康な個人由来の対応する非形質転換細胞のコントロールを有する。また、生体試料は、組織、全血液、血清、細胞質、唾液、脳脊髄液、腹水液、胸膜液及び尿から選択される生体ソースから得られた細胞を含む好ましい。より最適には、試料は、組織または血液試料である。生体試料は、疑わしい腫瘍のバイオプシーから得られる細胞を有利にも含むことができる。一般に、コントロールの試料は健康な個人から得られる。また、生体試料は、関心対象から得られた元の試料の抽出物がこの発明の方法に付されるように、TRIM24の発現を検出及び／又は定量する前に処理又は処置されることには留意されたい。また、かかる方法は、in vitroにて行われることが好ましい。
【００７２】
TRIM24の発現は、TRIM24の発現を同定、検出、測定又は定量する適切なシステムを使用して、検出及び／又は定量される。好適には、かかる方法は、TRIM24核酸又は部分、断片、バリアント又はその相補鎖；TRIM24 mRNA又はその断片の一部；TRIM24 cDNA；TRIM24ポリペプチド又はその断片の一部、及びTRIM24の生体活性の１つ以上の検出及び／又は定量のレベルから選択される。好適には、かかる方法は、TRIM24 mRNA、TRIM24ポリペプチド又はTRIM24生物活性のレベルを検出及び／又は定量することを含む。ある実施形態において、かかる方法は、TRIM24 mRNAレベル又はTRIM24ポリペプチドの検出及び／又は定量に関するものであり、より好適には、TRIM24 mRNAのレベルを検出及び／又は定量するものである。
【００７３】
この発明のある実施形態において、TRIM24の発現は、生体試料又はその抽出物をポリ核酸プローブと接触させ、TRIM24のmRNA又はその断片の一部と強力なハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイゼーションさせる方法により検出及び／又は定量される。更なる実施形態において、前記TRIM24のmRNA又はその断片の一部は、配列ID番号1又は図1に示す配列の少なくとも18個のコンティグ塩基を含む。TRIM24の発現が検出及び／又は定量される、ある好適な方法は、遺伝子発現マイクロアレイ分析である。その他の好適な方法は、（例えば、リアルタイム定量RTPCRなどの）RTPCRにより、特には、TRIM24の発現の定量を行う方法である。
【００７４】
この発明に従うポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズするTRIM24 DNA又はmRNAの配列のことを、「標的」配列と簡便に呼ぶこととする。強力な条件下でハイブリダイズする場合には、ポリヌクレオチドプローブは、実質的に標的のTRIM24 DNA又はmRNA配列と実質的に相補している。最も好ましくは、ポリヌクレオチドプローブは、標的配列と完全に相補している。
【００７５】
他の実施形態では、TRIM24の発現は、TRIM24ポリペプチド又はその断片の一部と特異的に認識する生物試料又はその抽出物を抗体又はその抗原結合部位と接触させる方法により検出及び／又は定量される。好適な実施形態では、TRIM24ポリペプチドはその断片の一部は、配列ID番号2の少なくとも8個の連続したアミノ酸を有する。
【００７６】
この発明の実施形態において、生体試験試料とコントロール試料との間のTRIM24の発現の違いは、乳癌、レチナール癌、前立腺癌、アンドロゲンに反応する前立腺癌、大腸癌、急性リンパ芽球白血病及び腎癌と関連がある。ある実施形態において、胸部組織のTRIM24発現レベルの増大の検出は、乳癌に関連するものであり、レチナール組織のTRIM24発現レベルの増大の検出は、レチナール癌と関連があり、結腸組織のTRIM24発現レベルの増大の検出は、大腸癌と関連があり、そして、前立腺の組織のTRIM24発現レベルの増大の検出は、前立腺癌と関連がある。他の実施形態において、腎組織のTRIM24発現のレベルの減少の検出は、腎癌と関連がある。
【００７７】
好適には、癌の検出及び／又は診断は、癌の進行（すなわち予後）のin vitroでの診断特定を含むものである。かかる実施形態では、（一般に、患者からとられた腫瘍性の組織である）関心対象の試料中のTRIM24発現のタイムコースにおける変化がモニタリングされ、かかる変化は癌の進行と関連するものである。かかるこの発明の方法は、（i）タイムコースにある複数の患者の生体試料を提供するステップと、（ii）多数の生体試料におけるTRIM24の発現レベルを検出及び／又は定量するステップと、（iii）1つ以上のコントロール試料に対する多数の生体試料のタイムコースのTRIM24のレベルを比較し、患者の癌の進行を特定するステップとを含む。好適には、関心対象は、哺乳類であり、更に好ましくはヒトである。
【００７８】
また、この発明は、癌の進行（すなわち予後）の診断特定に関するものであり、該方法は、（i）タイムコースにある複数の患者の生体試料を提供するステップと、（ii）多数の生体試料におけるTRIM24の発現レベルを検出及び／又は定量するステップと、（iii）1つ以上のコントロール試料に対する多数の生体試料のタイムコースのTRIM24のレベルを比較し、患者の癌の進行を特定するステップとを含む。ある実施形態において、1つ以上のコントロール試料に対するタームコースをとった多数のTRIM24の発現量の差の増大は、患者の癌の進行を示すものである。すなわち、試験のタームコースにわたってTRIM24発現が（コントロール試料に対し）増大する場合には、患者の癌の進行があることを示している。
【００７９】
（TRIM24発現及び活性の細胞への影響）
TRIM24は、転写のコリレプレッサー又はコアクチベータとして知られていることから、かかるTRIM24は、NRシグナル経路において役割を果たすことから証拠付けられているように、細胞への影響の鍵となるものである。従って、TRIM24の上方制御又は下方制御は、１つ以上の下流における効果を引き起こすものである。癌化及びその進行の新たな機構の可能性を調査するため、癌治療における新たな標的を見つけるため、及び/或いは、新たな検出又は診断方法を提供するために、TRIM24の細胞における相互作用及び効果が調査された。
【００８０】
具体的には、TRIM24とp53との物理的な相互作用が生理学的に関連した効果を有するかを特定するため、及び、TRIM24の細胞ストレスの応答を介したp53に対する役割の可能性を特定するために、マウスのTRIM24 mRNAを特異的に認識するsiRNAがTRIM24 mRNAの分解を触媒し、マウスのES細胞においてTRIM24をノックダウンさせるために使用された。
【００８１】
4種のsiRNA分子、siRNA1:5'- AAACUGACCUGUCGAGACUUU-3' (センス鎖：配列ID番号3)5'p- AGUCUCGACAGGUCAGUUUUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号22)、siRNA2:5'- GCAAGCGGCUGAUUACAUAUU-3' (センス鎖：配列ID番号4)5'p- UAUGUAAUCAGCCGCUUGCUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号23)、siRNA3:5'- UAAGUUCAGUGACGACUCAUU-3' (センス鎖：配列ID番号5) 5'p- UGAGUCGUCACUGAACUUAUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号24)、及び、siRNA4:5'- UAGAGCACGUCAUGCAUUUUU-3' (センス鎖：配列ID番号6)5'p- AAAUGCAUGACGUGCUCUAUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号25)は、マウスのTRIM24 mRNAを特異的な標的とするように設計された。上述のsiRNA分子のセンス鎖は、マウスのTRIM24 mRNA配列（遺伝子座：S78221）における、夫々1018〜1036、1433〜1451、3369〜3387及び1368〜1387の核酸を標的とする。ヒトのTRIM24 mRNA配列と同等の領域は、直ちに同定され、かかる同等の領域は、ヒトのTRIM24をノックダウンするsiRNA分子を標的とするに適当な配列を提供するものである。コントロールとして、真核生物の配列と相同性が無いことが知られているsiRNA分子のプールが使用された（Dharmacon）。特に、マウスのTRIM24をターゲットとすることができないコントロールのsiRNA分子が使用された。
【００８２】
従来技術の標準的な手法により、実施例に記載されているように、lipofectamine（登録商標）2000システム（インビトロジェン）を使用して、4種のsiRNAのプールはmES細胞に導入された。mES細胞集団に対して、細胞ストレスを誘導し、次いで、p53の発現を誘導する、ドキソルビシンの有無の条件にて、平行して実験が行われた。細胞集団はTRIM24特異的なsiRNA分子又はコントロールsiRNAのプールと形質転換され、ドキソルビシン処理前に48時間培養された。mES細胞に形質転換した。細胞試料は、ドキソルビシンを処理したもの（又は空のコントロール）において、5時間後及び12時間後に、RNAが抽出された。RNAの抽出物は、TRIM24、p53、p21、perp、mdm2、nanog及び18S rRNAの発現レベルを得るための当業者が知る標準的な方法のリアルタイムRTPCRの試験に供された。夫々に対応するタンパク質が、TRIM24とは間接的に、p53の活性に影響すると考えられていることから、p21、perp、mdm2及びnanogは発現測定値のために選択された。18S rRNAの測定は、細胞数を計測するため及びRNA抽出の効率を測定するために使用され、夫々の遺伝子の発現レベルは18S rRNA発現のレベルに対して標準化された。
【００８３】
TRIM24ノックダウン実験の結果を図4〜6に示し、それらのデータは、独立したsiRNAノックダウン実験の和の平均値である。
【００８４】
詳細には、図4は、マウスの肺幹（mES）細胞におけるTRIM24（1）、p53（2）、p21（3）、mdm2（4）、perp（5）及びnanog(6)のmRNAレベルが示されている。第一に、観察されたTRIM24特異的なsiRNA分子は、コントロールのsiRNA分子に対しTRIM24発現に対し顕著に減少しており、そのことは、この実験の有効性の証拠となるものである。かかるデータは、ドキソルビシン処理に応答したTRIM24発現の減少がmES細胞におけるp21及びmdm2遺伝子発現のp53を介した活性化の顕著な増大を導く。TRIM24のノックダウンによるp21発現の変化は、5時間後のp値が0.003であり、12時間後のp値が0.034である。また、mdm2発現におけるp値はともに0.05であった。一方、nanog遺伝子の発現がTRIM24の下方制御により実質的に変化しなかった。TRIM24のノックダウンのperp遺伝子の発現への影響は減少させることにあり、TRIM24が欠乏すると、発現が増大することとなる。
【００８５】
なお、p53の発現レベルは、TRIM24のノックダウンにより顕著に変化するものではないことには留意されたい。この観察結果は、TRIM24が、転写レベルではなく、（例えば、ここに記載されているように、p53に結合することによる）転写後調節によりp53の活性を調節するものと思われていたことから、全くもって驚くほどのものではない。
【００８６】
図5は、ｍES細胞においてTRIM24特異的なsiRNAを用いてTRIM24のmRNAを欠乏させている同様の実験の結果を示すものである。
【００８７】
上述に記載の実験から、mES細胞を、ドキソルビシン処理を施した（+）又は施していない（-）、コントロールsiRNA分子（A）又はTRIM24ターゲッティングsiRNA分子（B）により処理し、TRIM24（1）、p53（2）、p21（3）、mdm2（4）、perp（5）及びnanog(6)のmRNAレベルが示されている。上述のデータに従い、TRIM24細胞の欠乏は遺伝子発現のp53調節活性を増大させる。特に、TRIM24のノックダウン及びドキソルビシンの存在下にてp21及びmdm2の発現は顕著に増大し、ドキソルビシンによりp53が活性化した場合に、遺伝子発現が減少するnanogは、TRIM24の欠乏時にコントロールレベルまで減少する。これまでの結果に対し、この研究結果では、perp発現は、TRIM24特異的なsiRNAが存在するか否かによらず比較的変化しなかった。
【００８８】
図6は、マウス胚繊維芽（MEF）細胞を用いた以外は、図4及び5と同様の実験結果を示すものである。しかし、この場合、nanogの発現は分析されず、p53発現に対しポジティブ（p53+/+）又はネガティブ(p53-/-)であるMEF細胞と並行して実験が行われた。図4のデータに示されるように、ドキソルビシンによりp53の発現が明確に誘導されるが、p53（2）の発現レベルがTRIM24のノックダウンにより大きく影響されないことが明らかとなった。最も顕著なことに、p53応答遺伝子すなわちp21(3)、mdm2(4)及びperp(5)の発現レベルがTRIM24の欠乏により上方制御されることが、p53+/+細胞のデータから直ちに明らかとなった。P53（-/-）における、これらの遺伝子の発現レベルの減少は、p21、mdm2及びperp遺伝子の活性化がp53に依存していることを明らかとしている。
【００８９】
このように、これらのデータは、TRIM24がタンパク質レベルにおけるp53のネガティブレギュレータであることを支持するものである。
【００９０】
その説明として、oct4のゲノムワイドマッピングと、マウス及びヒトES細胞のクロマチンに対するnanog相互作用から、多分化能に必要な幹細胞要素となるこれらタンパク質は、TRIM24遺伝子自体に結合するであろうことが示唆されている（Loh et al., 2006, Nature Genetics, 38: 431-440）。
【００９１】
また、昨今の証拠は、p53が、自己回復、多分化能の状態において、重要な役割を果たしていることを示唆している。この点に関して、幹細胞要素nanogは、（前述したように、）p53により直接的に抑制され、分化シグナル又はストレスシグナルの無い安定状態に維持される（Lin, et al., 2005, Nature Cell Biol., 7: 165-171 ; Qin et al., 2007, J. Biol. Chem. 282: 5842-5852）。直接的にnanogクロマチン構造に作用するユビキタスコリプレッサが、p53のnanog遺伝子との相互作用の領域を標的としていると思われている。nanogが幹細胞維持の必須の要素であるようなので、nanog発現のp53を介した調節は、分化及びストレスシグナルに対する応答に挿入され、特に幹細胞の集団において、損傷を受けたDNAの伝播を回避することができる。P53機能のレギュレータとするTRIM24のかかる同定は、幹細胞におけるゲノムの安定性及び幹細胞維持の制御のサーベイランスの潜在的な洞察を提供するものである。このことは、反対に、TRIM24が、特に癌幹細胞に関して、腫瘍の標的となることを意味している。
【００９２】
これらの結果は、50％を超えるヒトの癌において発現及び／又は突然変異の変化していることから、p53が標準的な腫瘍サプレッサー遺伝子であると想定でき、特に有意である。また、全ての癌においてp53が欠乏しているわけではないことから（多くは、p53の異常な発現を示す）、TRIM24がp53のネガティブレギュレータであるとする驚くべき同定は、TRIM24を標的とする新たな癌治療の関与の巨大な可能性を提供するものであることには留意されたい。この点において、近年の研究結果は、p53の発現が癌を退縮させると報告している。例えば、この研究において、Xueらは、老化及び腫瘍除去（clearance）は、マウスの肝臓癌腫のp53の回復によって引き起こされると報告している（2007, Nature, 445(7128): 656-660）。同様に、Venturaらは、(2007), Nature, 445(7128): 661-665において、p53機能の復元が、ヒトの癌のモデルであるマウスにおいて、in vivoにおける腫瘍の退縮につながると報告している。
【００９３】
理論に束縛されずに、TRIM24がp53活性を負に調節する機構が複数存在することが想定される。第一に、ここに記載のデータは、TRIM24によるp53の調節は、遺伝子による調節ではなく、一例として、直接的なタンパク質タンパク質間相互作用を介していることを示唆している。１つのモデルにおいて、TRIM24とp53との単純な非酵素的なタンパク質タンパク質間相互作用は、p53活性を阻害するに充分である。また、その代替えとして、TRIM24を介したp53の抑制は、p53の酵素的な修飾によるものである。TRIM24により、P53を酵素学的に修飾する少なくとも2種（4種まで）の機構がある。例えば、過去には、TRIM24はタンパクキナーゼとして機能すると報告されている（Fraser et al., 1998, J. Biol. Chem., 273: 16199-16204）。また、TRIM24は、（証明されていないが、）標的のポリペプチドのユビキチン化、SUMO化又はネジル化を触媒する、E3様ユビキチンリガーゼ活性を有すると予想される、RINGドメインを含むものとして公知である。
【００９４】
この点に関しては、リン酸化及びユビキチン結合の双方がp53の翻訳後修飾に重要であることが知られており、更に最近では、p53がネジル化（neddylation）によって調節されることができることが知られている（Xirodimas et al., 2004, Cell, 118: 83-97）。TR1M24がリン酸化、ユビキチン化、SUMO化及び／又はネジル化によってp53を修飾することができるどうかを、かかる活性を測定する一般的な手法により実験的に試験することができる。例えば、キナーゼ及び／又はユビキチナーゼ活性はin vitro及び／又はin vivoにて測定することができる。
【００９５】
また、TRIM24内のBROMO及びPHDドメインの存在が、（夫々BROMO及び／又はPHD相互作用モチーフを介して）アセチル化又はメチル化したレジン残基を介してTRIM24がp53と相互作用することを示唆している。また、当業者にとって公知の慣例実験を使用して、TRIM24-p53相互作用がアセチル化及び／又はメチル化を介するかどうかを特定するために使用されることができ、例えば、  BROMOドメインの結合に関連する手法については、Jacobson et al., (2000), Science, 288(5470): 1422-1425を参照し、PHDドメインを介した相互作用との関連には、Martin et al., (2006), Mol. Cell. Biol., 26(21): 7871-7879を参照する。
【００９６】
一旦、何らかのTRIM24を介したp53翻訳後修飾が同定されると、適切なTRIM24活性の小分子インヒビターを同定するために、ハイスループットアッセイを使用することが可能となる。同定された適切な活性を有する任意の小分子インヒビターは、p53に関連した癌（すなわち癌のモデル）を治療する治療薬として、或いはTRIM24とp53のシグナル経路を研究するために使用することができる。
【００９７】
（TRIM24ポリペプチドの検出）
また、この発明は、関心対象から得られた生体試料をTRIM24の発現を検出及び／又は定量する工程を含む、関心対象における癌の存在を検出及び／又は診断する方法に関する。かかる検出及び／又は定量する手段は、TRIM24ポリペプチド又はその断片の一部を検出及び／又は定量する手段を含む。
【００９８】
このように、TRIM24ポリペプチドは、完全長TRIM24ポリペプチド、或いは、TRIM24の連続した少なくとも6個のアミノ酸の断片とすることができる。好適には、TRIM24ポリペプチド又はその断片は、配列ID番号2に由来するものである（図2参照）。より好適には、TRIM24ポリペプチドの断片又は一部は、配列ID番号2の少なくとも8個、少なくとも10個、少なくとも12個、又は少なくとも15個の連続した配列を含むものである。更に好適には、TRIM24ポリペプチドの断片又は一部は、配列ID番号2の16個の連続した配列を含むものである。一般に、TRIM24のC末端配列は、かかる領域がTRIMファミリー間での保存率が低いことから、「TRIM24特異的な抗体の選抜に有利には使用される。例えば、TRIM24 抗体を作製するためのヒトのTRIM24（NP_003843）の公知のC末端領域は、KRLKSIEERQLLKである。
【００９９】
しかし、場合によっては、TRIM24ポリペプチド又はその一部の断片の変異体又は由来物を検出又は定量する必要がある。その場合、変異体又は由来物は、配列ID番号2或いはここに記載の一部又は断片に対し50％、60％、70％、80％又は90％の相同性を有する配列をいうものである。マウスまたはヒトのTRIM24は、それらの完全長配列に対し、凡そ93％の相同性を有する。そのことから、好適には、ヒトのTRIM24の変異体又は由来物は、配列ID番号2或いはここに記載の一部又は断片と少なくとも93％、少なくとも95％、少なくとも98％又は少なくとも99％の相同性を有する配列である。TRIM24には、（上述したように、）短鎖又は長鎖のアイソフォームがあり、そのことから、この発明は、上述の配列相同性を有する、TRIM24のアイソフォームの短鎖及び／又は長鎖の変異体又は由来物を包含するものである（図2に記載）。
【０１００】
この発明の一態様は、生体試料中の癌細胞を検出及び／又は診断する方法に関するものである。一実施形態において、そのまま又は変性した形態のTRIM24ポリペプチド或いはその断片又は一部は、抗体または抗原結合部位を使用して検出及び／又は定量することができる。好適には、抗体又はその抗原結合部位は、TRIM24ポリペプチド、ポリペプチド断片又はその一部、或いは、ポリペプチド、ポリペプチド断片又はその一部を含む又は示す細胞の検出を可能とするラベルと結合させる。このように、癌細胞、ポリペプチド又は断片への抗体又はその抗原結合部位の結合において、結合現象を検出することができる。
【０１０１】
例えば、関心対象又は患者から得られた生体試料は、抗体又はその抗原結合部位を、生体試料中の、ポリペプチド、ポリペプチド断片又はその一部、或いは、ポリペプチド、ポリペプチド断片又はその一部を含む又は示す細胞に対し有効に結合させる条件下において、（蛍光ラベル又は放射性マーカーなどの）適切なラベルが付された抗体又はその抗原結合部位と接触させる。試料中のTRIM24ポリペプチド又はその断片は、ラベルによる検出法により検出することができる。
【０１０２】
このように、この発明の方法は、有利には、同一の抗体又はその抗原結合部位を使用して、患者の多様な癌の種類をスクリーニングするために使用することができる。この点につき、抗体を、細胞膜を貫通させ、細胞内に挿入することを可能とする方法は当業者には公知である。
【０１０３】
また、この発明の方法は、例えば、抗体又はその抗原結合部位を、ペアレンタルインジェクション（parental injection）により投与することにより、対象をin vivoにてスクリーニングすることにも使用し得ることには留意されたい。しかし、該方法は、in vitro、例えば、関心対象から事前に得られた生体試料に対して実施されることが好ましい。
【０１０４】
更に、抗体又はその抗原結合部位は、TRIM24に特異的であることが好ましい。TRIM24に特異的なポリクローナル抗体は、当業者に公知の標準的な技術により準備することができる。このように、この発明に拠れば、（例えば、TRIM24の16個のアミノ酸領域の）TRIM24エピトープに選択的に結合するポリクローナル抗体は、ヒト又はマウスのTRIM24由来のオリゴペプチドに対して使用される。或いは、TRIM24ポリペプチド又はそのエピトープ断片に対するモノクローナル抗体は、例えば、Galfre & Milstein, 1981 , Methods Enzymol., 73(Pt B): 3-46に記載の手法により準備することができる。最も好適には、エピトープは、ヒトのTRIM24由来するものであり、抗体は、ヒトのTRIM24に由来するものである。
【０１０５】
その他の態様において、この発明は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及びその抗原結合部位である、TRIM24結合分子又はTRIM24活性修飾分子自体に関するものである。
【０１０６】
モノクローナル抗体は、従来から知られている、例えば、Kohler & Milstein (1975, Nature, 256: 495)に記載の技術により製造することができる。説明すると、in vitro又はin vivoにて事前に抗原により免疫された免疫細胞（リンパ細胞）は哺乳類（例えばマウス）の脾臓から得られる。抗体を分泌しているリンパ細胞は、マウスのミエローマ細胞、又は、形質転換した細胞と融合し、培養細胞にて無限に複製でき、不死の免疫グロブリン分泌細胞系統を作ることができる。得られた融合細胞（すなわちハイブリドーマ）は培養され、得られたコロニーは、所望のモノクローナル抗体を作製するためにスクリーニングされる。適当な抗体を作製する抗体は、クローニングされ、そして、特にはin vitroにて、生育され、モノクローナル抗体が作製される。
【０１０７】
哺乳類のリンパ細胞は、（ここに記載の）抗原、TRIM24ポリペプチド又はその断片により（マウスなどの）動物のin vivo免疫により免疫される。免疫処置は、数週間の間隔にて必要に応じて繰り返され、充分なタイターの抗体が得られる。最後の抗原注入後、動物は殺され、脾臓細胞が取り除かれる。哺乳類のミエローマ細胞との融合は、ポリエチレングリコール（PEG）や他の融合剤を用いて、例えば、Milstein & Kohler (1976, Eur. J. Immunol., 6: 511) に記載の一般的な公知の技術により行われる。
【０１０８】
一般的に、作製される不死の細胞系統はマウスのものであるが、当業者が知る、ラットやヒトなどの、その他の哺乳類細胞由来のものとすることもできる。
【０１０９】
また、従来から知られている手法により、ポリクローナル抗体を作製することも可能である。説明すると、（上記）抗原をウサギの皮下に投与して、例えば、免疫前血清を得るために最初に採血される。免疫応答を増大させるために、注入された物質はアジュバントを含めることができ、例えば、抗原を含んでいる粉末にされたアクリルアミドゲルを投与することができる。ウサギは、最初の抗原を投与してから2週間後に採血され、抗体応答を増大させるために6週間の間、2週間毎に計3回抗原が投与される。血清の試料は、それぞれの抗原ブーストの10日後に集められ、対応する抗原を使用してポリクローナル抗体は血清からアフィニティークロマトグラフィによって回収することができる（例えば、Harlow et al., eds, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988を参照）。
【０１１０】
全ての抗体に加え、この発明の方法は、かかる抗体の抗原結合部位又は断片を更に含むものである。そのような抗原結合部位は、タンパク質分解性断片化法などの、従来の手法により作製可能である、Fab断片、F(ab')2断片及びFv断片を含むものである（Goding, 1983, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, N.Y. Academic Press, pp 98-118）。
【０１１１】
TRIM24発現のレベルは、個人の固形の腫瘍から採取した試料から特定することができる。一般的に、かかる試料は、疑わしい又は公知の腫瘍のバイオプシーにより得られる。ある例においては、腫瘍組織の試料中のTRIM24のレベルを個人において比較して標準化することできることから、腫瘍近傍の通常（すなわち非腫瘍性の）組織のバイオプシーを行うことが好ましい。なお、集団内には、遺伝子発現について多型変異が存在し、この発明の診断方法が内部標準を含むことは有効な任意の特長であることには留意されたい。
【０１１２】
また、この発明は、癌性細胞を殺す又は除去するに適した、抗体又はその抗原結合部位などの生物剤を更に含むものである。そのような場合、抗体又はその抗原結合部位は、第二の部分と共役し、標的とする癌細胞を殺すように作用する。抗体特異的な抗原を含む標的とする細胞を殺す好適な機構、例えば、アポトーシスを誘導することは、当業者の知るものである。例えば、Tse & Rabbitts (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(22): 2266-12271) には、特異的な抗原が存在する場合に、抗体により、細胞内の抗体カスパーゼ融合タンパク質を介して細胞を殺すことが記載されている。
【０１１３】
（TRIM24ポリヌクレオチドの検出）
TRIM24ポリヌクレオチド（例えばmRNA）の発現レベルは、当業者に周知の多数の技術によって特定される。例えば、TRIM24発現は細胞内のTRIM24のmRNAレベルを観察することにより特定される。
【０１１４】
全量RNAは、単一のステップのRNA抽出手順により試料中の細胞から抽出することができる（例えば、Chomczynski & Sacchi, 1987, Anal. Biochem., 162: 156）。Trizol（登録商標）試薬などの全量RNA抽出試薬も好適である（インビトロジェンライフテクノロジー社（Invitrogen, Life Technologies, Inc.））。
【０１１５】
RNAが抽出される試料のTRIM24 mRNAの検出のための適切な方法は、以下に限定されないが、RT-PCR、RNase保護アッセイ及びノーザンブロット解析(Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)を含むものである。また、プローブは、好適には基質中に固定され、マイクロアレイのアレイの一部を形成し、TRIM24の発現に加え、多くの異なるバイオマーカーについて試料をスクリーニングすることが可能となる。
【０１１６】
この発明によれば、TRIM24の核酸配列のホモロジーは、配列の相同性のみに限定されるものではない。多数の核酸配列は、明らかに低い配列の相同性を有していたとしても、互いに生物学的に重要なホモロジーを示す。約500bp以上の核酸分子における、強力なハイブリダイゼーションの条件の溶液は、溶解点以下の25〜30℃における約１MのNa+を含むものである（例えば、65℃にて、 5 x SSPE、0.5% SDS。また、Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing参照）。
【０１１７】
また、この発明の方法は、強力なハイブリダイゼーションの条件下にて、TRIM24 cDNA、mRNA又はその断片にハイブリダイズするポリヌクレオチドの変異体又は断片を含むことが好ましい。より好ましくは、ポリヌクレオチドの変異体又は断片は、TRIM24に特異的である。
【０１１８】
このように、この発明に従う方法にて使用されるポリヌクレオチドは、完全に固有のTRIM24のcDNA核酸配列（配列ID番号1）、又はその断片を含むものである。好適には、ポリヌクレオチドが配列ID番号1の配列の断片の場合には、配列ID番号1の少なくとも12個の連続した塩基、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、又は、少なくとも50個の連続した塩基である。ある実施形態では、断片又はプローブは、配列ID番号1の少なくとも100個、少なくとも150個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも500個の連続塩基を有利には含んでいる。例えば、ここに開示のsiRNA分子の配列は、TRIM24のmRNAとアニールし、この発明の方法及びシステムに使用できるプローブが標的となり有用である。
【０１１９】
（癌の治療）
また、この発明は、癌の治療を行う方法及び組成物に関する。TRIM24の発現及び／又は活性を抑制する試薬は、以下に限定されないが、siRNA(又はshRNA)、リボザイム、小分子、及び、抗体又はその抗原結合部位を含むものである。核酸に基づく技術のレビューとしては、例えば、Kurreck, J. (2003) "Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications", Eur. J. Biochem. 270: 1628-1644を参照する。TRIM24を阻害する試薬は、例えば、TRIM24の遺伝子発現に作用する又はTRIM24の生物活性を修飾又は阻害することにより、TRIM24の発現及び／又は生物活性を間接的に阻害する。有利には、TRIM24のインヒビターとして使用される試薬は、TRIM24に直接的に作用し、TRIM24の発現に（例えば、転写又はmRNA安定性などの）mRNAレベル、或いは、（例えば、翻訳又は生物活性などの）タンパク質レベルで影響する。
【０１２０】
（１） アンチセンス核酸配列は、TRIM24のmRNA配列と相補的であり、in vivoにてTRIM24のmRNA配列とハイブリダイズする。アンチセンス核酸配列は、TRIM24のmRNA配列（図1のcDNAに対応する：配列ID番号1）の全て又は一部とハイブリダイズする短鎖のDNA又はRNA分子の形態にある。一般的に、アンチセンス配列は、選択された標的核酸配列と少なくとも、90％、93％、95％、98％、99％又は100％相補する、少なくとも12個核酸である。アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、上述の対応する標的の核酸配列の相同性にて、核酸を12個、15個、18個、20個、30個、40個、50個、100個、200個又はそれ以上の個数の適当な長さとすることができる。
【０１２１】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾したヌクレオチド（又はヌクレオチド派生物）を含み、例えば、化学的に修飾されているが、自然のヌクレオチドA、C、G、T及びUに類似している。化学修飾は、例えば、内生のエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼにより分解を抑制し、in vivoでのオリゴヌクレオチドの半減期を増大させ、オリゴヌクレオチドの運搬を延ばし、オリゴヌクレオチドの生物活性を増大させる点において有利である。一般的に、アンチセンスの分子は、修飾した又は自然のヌクレオチドの混合物を含み、特には、3'モスト（most）及び／又は5'モスト(most)ヌクレオチド（例えば、各ストランドの2つの最も外側のヌクレオチド）は、in vivoにおけるアンチセンス分子の半減期を増大させるように修飾される。付加的に又は代替的に、アンチセンス分子の基礎（backbone）は、ヌクレアーゼによる分解の抵抗を増大させるために、化学的に修飾される。一般的な基礎的な修飾は、スホロチオネート結合に対する一つ以上のホスホジエステル結合の変更にある。アンチセンス分子は、好適には、ヌクレアーゼの存在下におけるアンチセンス分子の半減期を増大させるように、5'キャップ構造及び／又はpolyA 3'テールを更には具える。
【０１２２】
アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、in vivoにおける標的組織及び細胞におけるTRIM24の発現を抑制するために使用することができ、或いは、かかる分子は、ex vivo処理の使用することができ、又は、in vitro診断試験にて使用することができる。
【０１２３】
特定の標的遺伝子に対するアンチセンス分子の設計及び合成の要件、細胞内にてアンチセンス分子を導入及び発現させる方法、及び、そのようなアンチセンス分子を修飾する手段は当業者には公知である。
【０１２４】
例えば、治療にて使用されるアンチセンス分子は、患者の腫瘍の部位に直接投与される。腫瘍細胞の遺伝子治療ベクターによる形質転換は、例えば、適当なリポソーム運搬システム又はウィルスベクターを使用することにより達成することができる（Hughes, 2004, Surg. Oncol., 85(1): 28-35）。
【０１２５】
（２）  TRIM24などの標的遺伝子を特異的に下方制御するその他の手段は、RNAインターフェアレンスを使用する方法である。勿論、RNAiは、長鎖の二本鎖RNA分子により誘導され、Dicer酵素により、5'及び3'端に2個のヌクレオチドのオーバーハングを有する、21〜23のヌクレオチド長のdsRNAへと処理される。結果として得られる短鎖のdsRNA分子は、small interfering RNA(siRNA)として知られている。これらの短鎖siRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に取り込まれ、タンパク質RNA複合体が標的RNAを分解する内生のヌクレアーゼを誘導する。
【０１２６】
短鎖（例えば19〜23bp）のdsRNA分子は、RNAiを誘導し、かかる分子は、in vivoにおける遺伝子機能の選択的な不活性化を可能とし、例えば、そのことは、Elbashir et al. (2001 , Nature, 411 : 494-498)に記載されている。かかる技術は、in vivoにて細胞内におけるTRIM24 mRNAの効果的で特異的なターゲッティング及び分解を行う（ここに記載されており、図4に参照する）手段を提供するものである。従って、この発明は、siRNA分子とそれを使用して、腫瘍細胞におけるTRIM24発現を減少又は消失させることを提供するものである。
【０１２７】
適当な二本鎖siRNA分子は、アニールして任意の適当な長さの二本鎖領域を形成する、2本の実質的に相補となるオリゴヌクレオチドストランド、すなわちセンス（非標的）鎖及びアンチセンス（標的）鎖から形成される。二本鎖となった領域は17〜29のヌクレオチドであり、好適には、18〜25のヌクレオチドであり、最も好適には、19〜21のヌクレオチドである。或いは、siRNA分子は、短鎖RNA分子（すなわちshRNA分子）の短いヘアピン構造（すなわち、折畳みステムループ構造：fold-back stem-loop structure）により作り出すことができ、それが細胞内プロセッシングを行うsiRNAとなる。そのようなアプローチは、1本のみRNA分子の合成を必要としており、より単純な構造であり、アニーリング工程に要する時間が短縮され、得られる分子は、その二本鎖の相当物よりも安定していることから、RNAi治療に有効である。
【０１２８】
また、siRNA又はshRNA分子の二本鎖（相補）領域は、相補性のミスマッチ領域を含まないことが好ましい。しかし、1つや2つのミスマッチは一般的に耐え得るものである。好適には、ミスマッチは、siRNA分子の非標的（センス）鎖（又は、shRNA分子の非標的/センス部分）にあることが好ましい。ミスマッチはRNA鎖の末端にある場合も耐え得るものである（以下に記載）。
【０１２９】
siRNA分子の2本鎖（又は、shRNA分子の2つの相補領域）は、鎖の3'又は5’端のオーバーハング無しにアニールする。しかし、1ヌクレオチドの3'又は5’端のオーバーハングが発生する場合もある。一般的に、オーバーハングは、対応する鎖の一方又は双方の3’端に生じる。1個、2個又は3個のヌクレオチドの3'オーバーハングが適当であり、有利には、夫々の鎖において2個のヌクレオチドの3'オーバーハングである。なお、オーバーハングが存在する場合には、オーバーハングしているヌクレオチド、特には、標的鎖にあるヌクレオチドは、標的配列に相補している必要が無い。このように、オーバーハングしているヌクレオチドは、siRNA分子の（例えば、ヌクレアーゼ耐性などの）特性を高めるために選択することが好ましく、また、製造を容易とするうえで好ましい。一般的に、siRNA分子は、2つのヌクレオチドdTdT又はUUの3'オーバーハングを有する。
【０１３０】
この発明に従うshRNA分子を使用する場合には、2つの相補領域（又は部分）を分離するループは3〜23ヌクレオチド長である。一般的に、ループは、10個のヌクレオチド以下であり、より好ましくは7個以下のヌクレオチドである。
【０１３１】
アンチセンス及びリボザイム技術を使用した場合と同様に、in vivoにおけるsiRNA又はshRNA分子は、化学的に修飾したヌクレオチド又は1つ以上の修飾した基礎的なリンクを含むことが好ましい。
【０１３２】
好適には、この発明にて使用されるsiRNA分子は、例えば、図1に示すヒトのTRIM24である、TRIM24 mRNA鎖に固有の配列を標的としている。同様に、実施例に記載の1種以上のsiRNA分子（siRNA1〜4）を使用して、マウスのTRIM24をRNAiの標的とすることが好ましい。siRNAの標的となる適当な配列長は、配列ID番号1の凡そ17〜23個の連続ヌクレオチド、好適には19〜23個の連続ヌクレオチド、より好適には19〜21個の連続ヌクレオチドである。
【０１３３】
好適には、siRNA分子のアンチセンス鎖、又はshRNA分子のアンチセンス部分は、標的のヌクレオチド配列を実質的に相補する。ここでいう「実質的に相補」とは、siRNA分子から得られるアンチセンス鎖が標的配列と充分効果的にアニールし、in vivoにて標的のmRNAの分解を引き起こすに充分に相補している配列を言うものである。より好適には、相補性において、3個以下のミスマッチを有し、更に好適には、2個又は1個のミスマッチを有する。より好適には、siRNA又はshRNAのアンチセンス鎖又は部分と、標的の配列との間の相補性においてミスマッチが存在しない。しかし、オーバーハングしているヌクレオチドがある場合には、それらは標的配列を相補する必要は無い。
【０１３４】
公知の配列データベースを用いて、siRNAの標的とされる好適なTRIM24配列を決定することは、当業者の能力の範囲内にある。特に好適な実施形態では、標的配列は、動物ゲノムに固有なものが選択され、より好適には、ヒトのゲノムに固有のものが選択される。
【０１３５】
また、特定の配列又は遺伝子を標的とするsiRNA又はshRNAを購入することが可能である。TRIM24を標的とする購入可能なshRNA分子は、TRCN0000021259、TRCN0000021260、TRCN0000021261、TRCN0000021262及びTRCN0000021263 (Sigma-Aldrich, Dorset, UK)である。
【０１３６】
TRCN0000021259(クローンID: NM_003852.2-1128s1c1 ; アクセッション番号: NM_003852.3, NM_015905.2; 領域:CDS;  TRIM24アイソフォーム)は、5'- CCGGCGCATGAAACTTATGCAACAACTCGAGTTGTTGCATAAGTTTCATGCGTTTTT-3'の配列を有する。かかる分子は、TRIM24のCDSを標的とし、（上記）下線部分は図1に（太字にて）示すTRIM24のcDNAのヌクレオチド1230〜1251に対応する。
【０１３７】
TRCN0000021260 (クローンID: NM_003852.2-2762s1c1 ; アクセッション番号: NM_003852.3, NM_015905.2; 領域: CDS; TRIM24アイソフォーム)は、5'- CCGGCCATGAAATGAGCCTGGCTTTCTCGAGAAAGCCAGGCTCATTTCATGGTTTTT -3'の配列を有する。かかる分子は、TRIM24のCDSを標的とし、（上記）下線部分は図1に（太字にて）示すTRIM24のcDNAのヌクレオチド2965〜2986に対応する。
【０１３８】
TRCN0000021261 (クローンID: NM__003852.2-2217s1c1; アクセッション番号: NM_003852.3, NM_015905.2; 領域: CDS; TRIM24アイソフォーム) は、5'- CCGGCCTGTTGTTATAGTGAAGCAACTCGAGTTGCTTCACTATAACAACAGGTTTTT -3'配列を有する。かかる分子は、TRIM24のCDSを標的とし、（上記）下線部分は図1に（太字にて）示すTRIM24のcDNAのヌクレオチド2421〜2441に対応する。
【０１３９】
TRCN0000021262 (クローンID: NM__003852.2-1222s1c1 ; アクセッション番号: NM_003852.3, NM_015905.2;領域: CDS; TRIM24アイソフォーム)は 5'-CCGGGCAGCAGTACAGCATTACTTTCTCGAGAAAGTAATGCTGTACTGCTGCTTTTT -3'の配列を有する。かかる分子は、TRIM24のCDSを標的とし、（上記）下線部分は図1に（太字にて）示すTRIM24のcDNAのヌクレオチド1323〜1344に対応する。
【０１４０】
TRCN0000021263 (クローンID: NM_003852.2-2622s1c1; アクセッション番号: NM_003852.3, NM_015905.2; Region: CDS; TRIM24アイソフォーム)は5'- CCGGCGAGACTTATCTAAACCAGAACTCGAGTTCTGGTTTAGATAAGTCTCGTTTTT -3'の配列を有する。かかる分子は、TRIM24のCDSを標的とし、（上記）下線部分は図1に（太字にて）示すTRIM24のcDNAのヌクレオチド2826〜2846に対応する。
【０１４１】
TRIM24のmRNAを標的とするこの発明に従うsiRNA又はshRNA分子は、CGCATGAAACTTATGCAACAAC、GCCATGAAATGAGCCTGGCTTT、CCTGTTGTTATAGTGAAGCAA、GGCAGCAGTACAGCATTACTTT及びCGAGACTTATCTAAACCAGAAから選択される配列の、少なくとも19個の連続した塩基を含む。
【０１４２】
この発明は、薬剤として使用される、TRCN0000021259、TRCN0000021260、TRCN0000021261 、TRCN0000021262及びTRCN0000021263を含み、動物、好適にはヒトの癌を治療するためにTRIM24の発現を下方制御することが好ましい。この発明は、p53のシグナル調節経路を修飾するために、shRNA分子である、TRCN0000021259、TRCN0000021260、TRCN0000021261、TRCN0000021262及びTRCN0000021263を使用することを更に含むものである。また、この発明は、薬剤として使用され、好適には、動物、好適にはヒトの癌を治療するためにTRIM24の発現を下方制御するCGCATGAAACTTATGCAACAAC、GCCATGAAATGAGCCTGGCTTT、CCTGTTGTTATAGTGAAGCAA、GGCAGCAGTACAGCATTACTTT及びCGAGACTTATCTAAACCAGAAから選択される少なくとも19個の連続した配列を標的とするsiRNA及びshRNA分子を含むものである。また、上述したsiRNA及びshRNA分子を癌の治療に治療する方法を更に含む。
【０１４３】
例えば、この発明に従う好適なsiRNA分子は、
(a) 5'- CGCATGAAACTTATGCAACAAC-3' (センス鎖)及び5’- GTTGTTGCATAAGTTTCATGCG-3' (アンチセンス鎖);
(b) 5'- GCCATGAAATGAGCCTGGCTTT -3' (センス鎖)及び5'- AAAGCCAGGCTCATTTCATGGC-S' (アンチセンス鎖);
(c) 5'- CCTGTTGTTATAGTGAAGCAA -3' (センス鎖)及び5’- TTGCTTCACTATAACAACAGG-3' (アンチセンス鎖);
(d) 5'- GGCAGCAGTACAGCATTACTTT -3' (センス鎖)及び5'- AAAGTAATGCTGTACTGCTGCC-3' (アンチセンス鎖);
(e) 5’- CGAGACTTATCTAAACCAGAA -3' (センス鎖)及び5'- TTCTGGTTTAGATAAGTCTCG-S' （アンチセンス鎖)を含む。
【０１４４】
或いは、この発明の方法及び治療に使用するsiRNA分子は、上述の(a)〜（e）に記載の任意の配列の19、20又は21個の連続したヌクレオチドを含むものである。
【０１４５】
マウスのTRIM24を標的とする適当なsiRNA分子は、siRNA1:5'- AAACUGACCUGUCGAGACUUU-3' (センス鎖：配列ID番号3)及び5'p- AGUCUCGACAGGUCAGUUUUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号22)、siRNA2:5'- GCAAGCGGCUGAUUACAUAUU-3' (センス鎖：配列ID番号4)及び5'p- UAUGUAAUCAGCCGCUUGCUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号23)、siRNA3:5'- UAAGUUCAGUGACGACUCAUU-3' (センス鎖：配列ID番号5)及び5'p- UGAGUCGUCACUGAACUUAUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号24)、siRNA4:
5'- UAGAGCACGUCAUGCAUUUUU-3' (センス鎖：配列ID番号6)及び5'p- AAAUGCAUGACGUGCUCUAUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号25)から選択される。
【０１４６】
上述の夫々のsiRNA分子には、例えば、dTdT又はUUの、2塩基の3'オーバーハングを含むことができる。童謡に、上述のsiRNA分子には、前述したように、核酸又は基礎となる結合に対し、1つ以上の修飾を含めることができる。
【０１４７】
（３）  TRIM24の生体活性及び／又は機能のインヒビターには、（上述に記載の）抗体、小分子、多糖類及び問うタンパク質が含まれる。TRIM24の生体活性及び／又は機能のインヒビターは、TRIM24タンパク質への直接的な結合し、又は、TRIM24を制御して調節する経路を阻害して、TRIM24機能を阻害するなどの多数の機構により機能する。
【０１４８】
抗体及びTRIM24ポリペプチドに特異的に結合する断片は、癌を治療するために使用することができる。この発明は、癌細胞に対して細胞毒性を有する他の部分に融合した、抗体及び抗体断片の使用を含むものである。なお、上述の方法により、抗TRIM24抗体を準備する。
【０１４９】
また、（高い水準にて）優勢阻害形態のTRIM24、例えば、癌細胞などにおいて、p53の調節能が欠如しており、内生のTRIM24を阻害するように修飾したTRIM24を発現させることにより、TRIM24活性を阻害し得る可能性もある。好適には、そのような優勢阻害形態のTRIM24は、p53に対する結合能は有しているが、例えば、ユビキチン化するなどの、化学的な修飾により、p53の分解を誘導されないようにすることができる。
【０１５０】
（４）  また、標的とする細胞に特異的なゲノム配列に結合するpoly zincフィンガーペプチドなどの、人工的な転写因子により、内生の遺伝子発現をノックダウンすることも可能である（Isalan & Choo, 2001, Methods Enzymol., 340: 593-609; and Beerli et al, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95: 14628-33）。一般的に、人工的なpoly zincフィンガータンパク質は、標的遺伝子の上流の配列を特異的に認識し、標的遺伝子の発現を変化させるための（例えば、KRAB抑制ドメインなどの抑制ドメイン、VP64などの活性化ドメインなどの）転写調節ドメインを有するように設計される。好適には、かかるこの発明の人工的な転写因子は、TRIM24遺伝子の上流のゲノム配列、好適には、公知の5'プロモーター配列を標的とし、TRIM24を下方制御する（例えば、KRABなどの）転写抑制ドメインを有する。そのことから、例えば、Reynolds et al., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(4): 1615-20, and Papworth et al., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(4): 1621-6に記載されているように、任意選択的に、標的細胞すなわち癌細胞内におけるTRIM24発現は、例えば、（例えば、6個のzincフィンガーを有する）poly zincフィンガータンパク質などの設計された人工転写因子により抑制される。
【０１５１】
この発明の製剤は、規定された標準に合致するよう調製され、経口、静脈、局所又はその他の標準的な経路を介して投与される。製剤は、タブレット状、ピル状、ローション状、ゲル状、液状、粉末状、座薬状、懸濁液状、リポソーム状、微小粒子状などの形体としたり、公知のその他の適当な製剤としたりできる。
【０１５２】
このように、この発明は、上述にて同定したsiRNA及びshRNA分子の夫々は、癌を治療する医薬品の製品として使用することを含むものである。好適には、癌は、乳癌、レチナール癌、前立腺癌、アンドロゲン過敏性前立腺癌、大腸癌、急性リンパ芽球白血病及び腎癌から選択される。
【０１５３】
（創薬：Drug discovery）
形質転換細胞系統を作製し、TRIM24タンパク質を組み換えて夫々を又は組み合わせて発現させ、精製したタンパク質を薬剤のスクリーニングに使用することができる。TRIM24又はその断片を過剰発現している細胞系統を使用して、例えば、（小分子などの）化合物、抗体又はその他の生体物質のライブラリーに対するはハイスループットスクリーニング法を実施することができる。これらのスクリーニングアッセイは、表現型の変化を同定する細胞をベースとしたアッセイとしたり（GPCR FLIRにおけるカルシウムシグナルのスクリーニングに類似している）、放射性リガンド結合及び蛍光偏光のアフィニティをベースとしたスクリーニングに使用される高水準に精製したタンパク質のソースとして使用したりもできる。創薬スクリーニングに使用される好適なTRIM24の断片は、例えば、TRIM24のRINGドメイン、BROMOドメイン及び／又はPHDフィンガードメインを含むものである（例えば、Le Douarin et al., 1996, EMBO J., 5: 6701- 6715を参照）。
【０１５４】
TRIM24に対し、例えば、ユビキチン化又はSUMO化活性などのTRIM24の酵素活性の阻害に効果があると同定された、小分子及び／又は抗体（又はその抗原結合部位）は、治療薬として使用するに適当である。例えば、TRIM24のE3ユビキチンリガーゼ活性を阻害し得る小分子は、TRIM24によるp53の調整津を阻害する物質として有用である。治療薬は、当業者に公知の任意の方法により調製される。
【０１５５】
細胞システムにおけるTEIM24の発現（増大又は現象）の操作は、上述に記載したように、下流の創薬の標的となる関連遺伝子の同定に使用することができる。コントロール、すなわちTRIM24により制御されたもの（例えば、上述したp53とTRIM24との相互作用に関連した経路）、と相互作用する信号伝達経路の解明は、創薬のアプローチに対し「システム生物学」の更なる適用を可能とする。
【０１５６】
（i）  TRIM24酵素活性のインヒビターのスクリーニング
第一に、アッセイは、単離されたTRIM24（又はTRIM24断片）が酵素活性を示すように設計された。得られたデータ及びTRIM24の配列要素から、TRIM24のRINGドメインのE3ユビキチンリガーゼ活性を介したユビキチン化によりp53の活性が調節（例えば、抑制）されていることがわかった。特には、TRIM24タンパク質のファミリーに対するE3リガーゼ活性のアッセイは、当業者に公知である（Vichi et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(6): 1945-1950）。かかるアッセイは、TRIM24又はその断片のユビキチン化活性をアッセイするように修正することができる。
【０１５７】
例えば、当業者に公知の手法により、（例えばRINGドメインなどの）酵素活性を有すると仮定される領域を含む全長TRIM24又はその断片を、発現し、精製し、単離することができる。例えば、全長TRIM24は、細菌から細菌発現ベクターを用いて発現させることができ、例えば、発現産物をGST融合タンパク質とし、それを精製し、単離されたTRIM24を得ることができる。或いは、TRIM24又はその断片は、例えば、バキュロウィルス発現ベクターを用いた昆虫細胞からの発現などの、他の適当なシステムにより発現させることができる。
【０１５８】
ユビキチン化/SUMO化の活性は、基質、ユビキチン、E1ユビキチン活性化酵素、E2ユビキチン接合酵素及びE3ユビキチンリガーゼ酵素の存在に依存する。このように、（上述の）Vichi et al.に記載にされているように、in vitroでのE3ユビキチンリガーゼ活性のアッセイは、精製したTRIM24（又はその断片）を、哺乳類のE1及びE2酵素、ATP、ユビキチン/SUMO及びタンパク質基質と組み合わせることにより構成されるものである。
【０１５９】
反応混合液は、好適な、pH、温度及び時間の条件下（例えば、pH7.4、30℃/60分）にてインキュベートして、反応を停止し、反応生成物を分析する前に、基質のユビキチン化を可能とする。例えば、反応性生物は、SDSポリアクリルアミドゲルにより分離して、ニトロセルロース膜に移して、ユビキチン特異的な抗体によりプローブ処理をし、及び／又は、タンパク質バンドを染色して可視化した。或いは、反応性生物を（例えば、MALDI-TOF質量分析などの）質量分析により分析することも可能である。
【０１６０】
TRIM24のE3ユビキチンリガーゼ活性の基質は、E2ユビキチン接合酵素そのものであり、及び／又はTRIM24はそのものをユビキチン化/SUMO化する、すなわち、自動にてユビキチン化/SUMO化する。しかし、いくつかのRINGドメインを含むタンパク質のE3ユビキチンリガーゼ活性は基質特異性がある。従って、異なるE2ユビキチン接合酵素または付加的な基質（例えば、フリーのGST）を使用して複数の類似したアッセイを行うことが好ましい。また、p53（またはp53タグタンパク質）を、ユビキチン化/SUMO化の基質として使用することが好ましい。この方法では、以下に示すように、TRIM24のp53を修飾する能力が確かめられ、更には、かかる活性の治療レギュレータ候補のアッセイを開発することができる。
【０１６１】
次いで、TRIM24のE3ユビキチン/SUMOリガーゼ活性の小分子インヒビターを同定するスクリーニングが行われる。好適には、かかるスクリーニングは、p53のユビキチン化/SUMO化のアッセイにて、TRIM24のE3リガーゼ活性を阻害する小分子を検出するように設計された。しかし、TRIM24のモジュレータ（例えば、インヒビター）を同定するためには、p53はアッセイにて必要とされない。
【０１６２】
例えば、（例えば、96ウェル又は384ウェルフォーマットの）マルチウェルのE3リガーゼ活性アッセイのスクリーニングは、例えば、TRIM24（又はその断片）に加え、夫々のウェルに小分子（薬）を含み、p53に対するE3リガーゼ活性に必要な更なる反応物を標的とする。かかる反応生成物は、上述した方法（又はハイスループットに適当な分析の代替え方法）により、p53のユビキチン化/SUMO化を阻害する分子を検出するために、分析された。好適には、スクリーニングは、自動化された小分子のハイスループットスクリーニングである。
【０１６３】
TRIM24の触媒活性に影響を与えるものとして同定された、小分子薬、ポリアミン、アプタマ、抗体（又はその断片）又は（例えば、siRNA分子などの）核酸を含む任意の分子は、p53の存在に関わりなく、TRIM24のモジュレータとして同定される。
【０１６４】
（ii）p53のTRIM24修飾のモジュレータのスクリーニング
TRIM24が、p53に結合する及び／又は、例えば、上述のユビキチン化又はSUMO化などにより、p53を化学的に修飾することにより、p53の活性を抑制することがここに提案されている。（既に説明したように）図4〜6は、（例えば、RNAi技術を使用したTRIM24 RNAをノックダウンすることよる）TRIM24の阻害は、p21、perp及びmdm2などのp53応答遺伝子の上方制御によるとの1つの結果を示している。従って、TRIM24に特異的なRNAi分子は、p53のTRIM24調節の小分子モジュレータであると考えられ、また、TRIM24に特異的なRNAi分子は、（p53応答遺伝子の上方制御として示される）p53活性のモジュレータとして考えられる。従って、この発明の一態様は、TRIM24活性の（好適には小分子である）モジュレータ、好適には、p53活性のモジュレータである。そのようなモジュレータは、好適は、（ヒトなどの）動物の癌を治療するため、特には、TRIM24活性の上方制御に関連した癌、或いは、p53活性の下方制御に関連した癌を治療するために使用される。公知の癌の50％は異常なp53活性を示すことから、この発明において同定された小分子は癌を治療するにあたり相当な有用性を提供するものである。
【０１６５】
更なるp53活性の小分子モジュレータを同定するために、p53及びTRIM24（又はその断片）の存在下にてp53応答遺伝子の上方制御を行う分子を同定するアッセイが設計された。また、そのようなモジュレータが、TRIM24によるp53の抑制を阻害することによりp53活性を上方制御することが好ましい。
【０１６６】
かかるアッセイを作り出すためには、第一に、p53応答プロモーターの制御下にあるレポーターコンストラクトが発現する発現コンストラクトが必要である。
【０１６７】
p53応答レポーターコンストラクトは、当業者に公知である（例えば、Thomborrow & Manfredi, 1999, J. Biol. Chem., 274(47): 33747-33756; Miyashita & Reed, 1995, Cell, 80: 293-299; Datto et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 28623-28628を参照）。そのようなレポーターコンストラクトは、適切なレポーター遺伝子の上流にp53応答プロモーターを挿入することにより作り出すことができる。P53応答プロモーターは、例えば、p21、perp、mdm2、bax又はmaspinの5'プロモーター領域などの、公知のp53応答遺伝子からプロモーター配列（又は少なくとも最小プロモーター配列）をクローニングすること、或いは、p53応答プロモーターを、適切なレポーター遺伝子の上流に公知のp53応答因子を挿入して人工的に合成することにより得られる。
【０１６８】
p53応答因子は、既に説明されており（Thomborrow & Manfredi, supra; el- Deiry et al., 1992, Nat. Genet, 1 : 45-49; Funk et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 2866-2871; Halazonetis et al., 1993, EMBO J., 12: 1021-1028）、重鎖DNAのトップとボトムで異なる5'-RRRCW-3'ペンタマーの4つのリピート形成する、0〜13塩基に分離された5'-RRRCWWGYYY-3' (配列ID番号26)（Rはプリンであり、Yはピリミジンであり、Wはアデニン又はチミンである）の2つのパリンドロームデカマーである。
【０１６９】
好適なレポーター遺伝子は、真核細胞にて適切に発現し、直ちに検出可能な、CAT、LacZ、ルシフェラーゼ又は（GFP様の派生物を含む）GFPなどとすることができる。好適には、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼである。好適には、ルシフェラーゼ（又はその他のレポーター）は、p53応答因子の制御下、又は、例えば  上記のDatto et al.に記載のp21 5'プロモーター配列の制御下にて発現する。
【０１７０】
p53は、例えば、サイトメガロウィルス（CMV）プロモーターなどの、好適な真核細胞のプロモーターの制御下にある、p53をコードした遺伝子を含むベクターなどの、p53発現ベクターを使用することにより真核細胞にて発現させることができる。好適なp53発現ベクターは、当業者に公知であり、好適には、野生型のヒトのp53を真核細胞にて発言させるものである（Thomborrow & Manfredi, supra; Baker et al., 1990, Science, 249: 912-915; Srivastava et al., 1993, Oncogene, 8: 2449-2456）。
【０１７１】
また、好適には、TRIM24は、上述のp53発現ベクター、又は異なる発現ベクターにより、適当な真核細胞にて発現する。CMVプロモーターなどの真核生物のプロモーターの転写制御下にあるTRIM24をコードした遺伝子を有するベクターは、既に記載されている。発現ベクターがCMVなどの因子の制御下にあることから、例えば、その他又は同一のベクターにおいて、CMV RNAポリメラーゼ酵素を提供することが重要である可能性がある。
【０１７２】
好適には、選抜マーカーを含む発現コンストラクトを用いて、対応するコンストラクトを有する細胞の選抜を行う。好適な選抜マーカー及び形質転換した細胞の選抜システムは当業者に公知である。
【０１７３】
p53活性のモジュレータのアッセイは、当業者に公知の方法を用いて行われる。また、例えば、p21プロモータールシフェラーゼレポーターコンストラクトとp53発現ベクターとともに、真核細胞にコトランスフォーメーションされる。好適な真核細胞は、Jurkat細胞である。例えば、48時間後に細胞は回収され、ルミノメータを用いたルシフェラーゼ活性の測定などの、レポーター発現の分析に供される。このことは、p53のみにより駆動するレポーターコンストラクトの発現レベルを提供する。平行した実験では、細胞に対し、p53及びTRIM24を発現する発現ベクター並びにレポーターコンストラクトをコトランスフォーメーションした。これらの細胞にて検出されたルシフェラーゼ活性は、p53の活性に対するTRIM24の効果を示しており、ここにより詳細に記載の結果から、TRIM24の非存在下よりも低下していることが予想される。
【０１７４】
p53のTRIM24による調節のレギュレータ（次いで、p53活性のモジュレータ）を検出するために、（ライブラリーの）小分子の存在下に上記の試験が行われ、TRIM24及びp53が単独にて存在する場合よりも増大又は減少したレポーター（ルシフェラーゼ）を発現する細胞（の集団）が同定された。（自動化された）小分子ライブラリーからの小分子などの候補小分子のハイスループットスクリーニングを実施することにより、のTRIM24−p53相互作用を上方制御又は下方制御するモジュレータが同定される。好適には、TRIM24及びp53の存在下にて、p53応答レポーターコンストラクトの発現を上方制御する小分子は、この方法により同定される。そのような分子は、p53に対するTRIM24の効果を調節、好適にはp53に対するTRIM24の効果を阻害するものであると考えられる。これら分子は、癌、好適にはTRIM24の上方制御に関係する癌を治療する治療薬候補である。
【０１７５】
従って、その他の態様において、この発明は、（TRIM24を介した）p53活性の小分子モジュレータを検出/同定/単離する方法であり、かかる方法は、モジュレータがp53を調節するTRIM24の活性に対し相互作用及び影響するかどうかを特定するステップを含むものである。好適には、かかる方法は、例えば、p53応答プロモーターの影響下にあるレポーター遺伝子の発現の増大にて示されるように、p53の活性を上方制御する、TRIM24及びp53のモジュレータを同定するものである。
【０１７６】
また、この発明は、例えば、かかるp53のモジュレータを含む医薬品組成物などの組成物及び個人（例えばヒト）の癌の治療、特にはTRIM24の上方制御に関連した癌の治療におけるその使用を可能とするものである。
【０１７７】
TRIM24及びp53のモジュレータは、他に記載されているp53 RNAi分子を含むものである。
【０１７８】
（キット）
この発明によれば、任意のポリヌクレオチド、抗体又はその抗原結合部位は、関心対象における癌の検出及び／又は診断をするキットに含まれている。また、キットは、必要としている患者の治療に使用できるように提供されるものであり、例えば、キットは、ここに記載の癌を治療することができる治療薬/剤を追加又は代替えしたものとすることができる。また、キットは、p53応用経路を操作するためのものとして提供することができ、例えば、キットは、TRIM24の発現又は活性を阻害する、又は、TRIM24のp53との相互作用（結合）を阻害する、ここに記載の小分子又は物質を追加又は代替えしたものとすることができる。
【０１７９】
一般的に、かかるキットは、（i）TRIM24のcDNA、mRNA及び／又はTRIM24のcDNA又はmRNAのポリヌクレオチド断片を特異的に認識できる（ここに記載の）1つ以上のポリヌクレオチド、及び／又は、（ii）TRIM24ポリペプチドを特異的に認識する1つ以上の抗体又はその抗原結合部位を具える。
【０１８０】
ある実施形態において、TRIM24のポリペプチド、ポリヌクレオチド又はその断片を特異的に認識することができる1つ以上のポリヌクレオチド、抗体又はその抗原結合部位は、検出されたTRIM24のポリヌクレオチド又はポリペプチドの分量の検出及び／又は定量を可能とするために、ラベル（或いは修飾）される。ポリヌクレオチド又はポリペプチド（例えば抗体）に接合する好適なラベルは、当業者に公知であり、蛍光ラベルを含むものである。
【０１８１】
従って、この発明は、関心対象から得られた組織の試料中の癌を検出及び／又は診断する診断キットに関するものであり、該キットは、試料中のTRIM24の発現レベルを特定することを可能とする、TRIM24のポリペプチド又はmRNAに特異的に結合することができる少なくとも1つのTRIM24結合分子を具えるものである。一実施形態において、診断キットのTRIM24結合分子は、強力なハイブリダイゼーション条件下にて、配列ID番号1の少なくとも18個のコンティグ塩基に対しハイブリダイズが可能である少なくとも1つのポリヌクレオチドプローブを具える。ある実施形態において、ポリヌクレオチドプローブは、例えば、マイクロアレイの一部として、基板上にて固定される。
【０１８２】
或いは、対象の癌を検出及び／又は診断する診断キットのTRIM24結合分子は、TRIM24ポリペプチド又はその一部を特異的に認識する抗体又はその抗原結合部分を少なくとも具える。また、抗体又はその抗原結合部位は、配列ID番号2の少なくとも連続した8個のアミノ酸を特異的に認識することが好ましい。
【０１８３】
この発明のキットは、該キットの使用方法を更に含むことが好ましい。
【０１８４】
この発明は、以下の制限対象とはならない実施例において更に記載されている。
【実施例】
【０１８５】
（実験に使用される材料と方法）
この発明の実施例では、当業者であれば使用し得る、従来の化学的、分子生物学的、微生物学的、組換えDNA及び免疫学的な技術が採用されている。また、そのような技術は、例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, & A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak & James O<1>D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press; and D. M. J. Lilley & J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press.に記載されている。
【０１８６】
（TAP-p53形質転換マウスの作製）
形質転換マウスは、例えば、以下の、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, by Andras Nagy (Editor), Marina Gertsenstein (Editor), Kristina Vintersten (Editor), Richard Behringer (Editor), Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (December 15, 2002); and Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Editor), Oxford University Press, USA; 2nd edition (February 15, 2000)に記載の従来の手法により作製することできる。
【０１８７】
野生型マウスp53遺伝子座は、11のエキソンを含む。ターゲッティングベクターは、loxPの側面に位置されたPGKネオ・カセットをp53の最後のイントロンに挿入し、同時に、末端エキソンにTAPタグをフレームに挿入するように設計されている。次いで、p53-TAPアレルを作り出すために、ES細胞の一過性cre発現を用いて、ネオ・カセットが取り除かれた。このアレルは、末端イントロンにおける単一のloxP部位及びp53のＣ末端のTAP-タグ融合が存在する点で、野生型アレルとは異なる。1つの野生型及びp53-TAPアレルを含んでいるES細胞は、胚盤胞インジェクション及びp53-TAP ノックインマウスの作製のために使用された。更に、mES細胞（p53TAP/+）は、TAP-p53精製のために使用された。
【０１８８】
(SDS-PAGE及び銀染色)
Dignam et al., (1983) Nucleic Acids Res., 11:1475-89に記載の方法によりタンパク質の抽出が行われ、7.5％ポリアクリルアミドゲルから10μｇのタンパク質溶解物が分離された。タンパク質は、変性ゲル電気泳動により分離され (Laemmli U.K., 1970, Nature, 227:680-5)、銀染色により可視化された(Morrissey, J. H., 1981, Anal. Biochem. 117: 307-310)。
【０１８９】
（マススペクトロメトリー）
関心対象である同定されたタンパク質は、従来技術の一般的な方法の、マススペクトロメトリーにより確かめられた（Jung et al., 2005, Mol. Endocrinol., 19(10): 2451-2465）。
【０１９０】
この研究は、p53との密な関連を示した4つのタンパク質の同定につながった。これらのタンパク質、mdm2及びp53結合性タンパク質1は、p53相互作用タンパク質として公知であり、その制御系も実証されている。他のp53相互作用タンパク質として同定されたのがTRIM24（配列ID番号2のヒトのTRIM24）である。しかし、興味深いことに、p53相互作用タンパク質はドキソルビシンの非存在下で同定されず、p53依存的であった。
【０１９１】
従って、TRIM24は、p53と近密に関連し、強く相互作用するタンパク質として同定された。
【０１９２】
（RNAi形質転換）
以下の核酸配列にて示す、マウスのTRIM24に対する4種の二本鎖siRNAが作製された（Dharmacon RNA Technologies, Chicago, IL, USA）。
siRNA1:
5'- AAACUGACCUGUCGAGACUUU-3' (センス鎖：配列ID番号3)
5'p- AGUCUCGACAGGUCAGUUUUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号22)
siRNA2:
5'- GCAAGCGGCUGAUUACAUAUU-3' (センス鎖：配列ID番号4)
5'p- UAUGUAAUCAGCCGCUUGCUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号23)
siRNA3:
5'- UAAGUUCAGUGACGACUCAUU-3' (センス鎖：配列ID番号5)
5'p- UGAGUCGUCACUGAACUUAUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号24)
siRNA4:
5'- UAGAGCACGUCAUGCAUUUUU-3' (センス鎖：配列ID番号6)
5'p- AAAUGCAUGACGUGCUCUAUU-3' (アンチセンス鎖：配列ID番号25)
【０１９３】
TRIM24のmRNAのRNAノックダウンを行うために、（上記の）4種のsiRNA分子のプールをlipofectamine（登録商標）2000試薬システム（インビトロジェン）を使用し、製造業者取り扱い説明書に従い、mES細胞に形質転換した。siRNAの終濃度が100nMとなるよう、トランスフェクションする20pmolのsiRNAにつき、1μlのlipofectamine 2000が使用される。1.5×105個のmES細胞は、siRNA分子のプールにより形質転換される。次いで、細胞は、ドキソルビシン（0.5μg/ml）を処理する前に、又はネガティブコントロールの媒質にて、37℃にて48時間培養される。
【０１９４】
細胞試料は、ドキソルビシンを処理した又は（ネガティブ）媒質コントロールにおいて、5時間後及び12時間後に、分析に供された。
【０１９５】
（TRIM24を標的としない）コントロールsiRNA分子を用いた平行した実験が行われた。
【０１９６】
（RNAの単離、逆転写PCR（RT-PCR）及びリアルタイムPCR）
全RNAは、Trizol（登録商標）試薬（インビトロジェン）を使用して単離され、DNasel（インビトロジェン）によって、製造業者の取り扱い説明書に従い、処理された。RNAは、分光測定法により定量された（NanoDrop）。製造業者の取り扱い説明書に従い、ランダムヘキサマー（ABGene）及び1μlのSuperscript（登録商標）（インビトロジェン）を用いて全RNAのうちの500ngを逆転写した。3μlの反応混合液（200μl希釈）をPCR反応に用いた。全てのPCR反応は、標準的なプロトコールに従い、Sybrgreen PCR Master Mix（アプライドバイオシステム）を取り入れているアプライドバイオシステム7500 Fast Machineを用いて実施された（Chao et al., 2003, J. Biol. Chem., 278: 41028-41033を参照）。
【０１９７】
リアルタイムPCRのためのサイクルは、以下の通りであり、perp以外の全ての遺伝子について、95℃/10分を1サイクル、95℃/30秒、55℃/30秒、72℃/40秒を40サイクルにて行った。なお、perpについては、上記のPCR反応条件において、55℃を60℃に変えて実施した。
【０１９８】
マウスのTRIM24、p53、p21、mdm2、perp、nanog及び18SのrRNAの検出及び定量は、以下のプライマー配列を用いて実施された。
TRIM24
(フォワードプライマー) 5'-GCAAGCGGCTGATTACATACA-3' (配列ID番号45)
(リバースプライマー) 5'-TGGTCACAGGAGAAGCATCAC-3' (配列ID番号46)
p53
(フォワードプライマー) 5'-ACATGACGGAGGTCGTGAGA-3' (配列ID番号47)
(リバースプライマー) 5'-TTTCCTTCCACCCGGAT AAG-3' (配列ID番号48)
p21 
(フォワードプライマー)5'-TCTCAGGGCCGAAAACG-3' (配列ID番号49) 
(リバースプライマー) 5'-CGCTTGGAGTGATAGAAATCTG-3' (配列ID番号50)
mdm2
(フォワードプライマー)5'-ATTGCCTGGATCAGGATTCAGTT-3' (配列ID番号51 )
(リバースプライマー) 5'-ACCTCATCATCCTCATCTGAGA-3' (配列ID番号52)
Perp
(フォワードプライマー)5'-TCATCCTGTGCATCTGCTTC-3' (配列ID番号53)
(リバースプライマー)5'-GGGTTATCGTGAAGCCTGAA-3' (配列ID番号54)
nanog 
(フォワードプライマー)5'-TCCAGCAGATGCAAGAACTC-3' (配列ID番号55) 
(リバースプライマー) 5'-GTGCTGAGCCCTTCTGAATC-S' (配列ID番号56)
18S rRNA
(フォワードプライマー)5'-TCAAGAACGAAAGTCGGAGGTT-3'(配列ID番号57)
(リバースプライマー)5'-GGACATCTAAGGGCATCACAG-3' (配列ID番号58)
【０１９９】
夫々の遺伝子について、18S rRNA水準に対する平均的な閾値（Ct）が求められた。同様な実施が、マウスの肺繊維芽（MEF）細胞について実施された。以下に詳細に説明するように、リアルタイムPCRの結果を図4〜6に示す。
【０２００】
TRIM24のノックダウンの結果、mES及びMEF細胞におけるp53応答遺伝子の発現の顕著に増大している旨のデータが示されている。これらの結果は、TRIM24がp53に対しネガティブな調節活性を有することを示すものである。特に強いp53依存的な発現を示したものは、MEF細胞においてp21、mdm2及びperpであり、mES細胞においてp21及びmdm2であった（図4〜6）。図6において、この効果がp53依存的である旨が示されており、p53非存在下では、上記の遺伝子の発現が上方制御されていない。このことは、特に、TRIM24の下方制御はp53の発現そのものに影響するものではなく、TRIM24はp53を、RNAレベルではなく、タンパク質レベルにて調節しているモデルを示している。
【０２０１】
最終的に、かかる実験は、p53の活性を調整するTRIM24を標的とし、（TRIM24の下方制御を介した）p53の活性を調整するためにRNAiを使用することの有効性を示すものである。
【０２０２】
また、かかるデータは、例えば、癌を治療、特にはp53に関係した癌の治療のために、TRIM24の発現又は活性を下方制御して、p53の活性を低下させることの適用性を示唆している。
【０２０３】
（抗体の作製）
上述した一般的な手法により、TRIM24ポリペプチド配列（配列ID番号2）に対するアフィニティ精製したウサギのポリクローナル抗体が準備された。抗体の標的とするTRIM24ポリペプチドの適当な領域は、C末端領域にある。最も好適には、ほとんど又は全てのTIF1タンパク質には存在しないTRIM24内のエピトープ配列である。
【０２０４】
（乳癌細胞における発現）
MCF7（p53ポジティブ乳癌）細胞に対し、FLAGタグTRIM24発現コンストラクトを形質転換し、（DNA損傷応答経路を介してp53を誘導する）ドキソルビシンの+/-（添加/非添加）条件にて培養された。MCF細胞を配した６ウェルプレートのウェル毎に、Flag-Trim24プラスミドを形質転換した。形質転換して24時間後に、細胞をドキソルビシン（0.5μg/ml）により24時間処理した。次いで、細胞が集められ、タンパク質溶解物が、説明の免疫ブロット法に供された。
【０２０５】
p53及びTRIM24タンパク質のレベルは、ウェスタンブロット法により評価され、その結果が、図７のグラフ図に示されている。このことは、空の/モック発現ベクターにより細胞を形質転換したときには、予想されるように、ドキソルビシン処理によりp53タンパク質が上方制御されることを示している。かかる上方制御は、TRIM24タンパク質の増加に伴い減少する（プラトー効果に起因する）。このことは、TRIM24のp53に対する負の調節効果と整合している。
【０２０６】
６ウェルプレートの各ウェルのMCF細胞は、空のベクター或いはhMdm2又はFlag-Trim24(500ng)を発現させるプラスミドにより形質転換された。形質転換24時間後に、細胞は、（10又は20μMの）MG132により8時間処理された。次いで、細胞は集められ、タンパク質溶解物が説明に準じて免疫ブロット法に供された。コントロールベクターにより形質転換した細胞では、ウェスタンブロット法の評価結果から明らかなように、MG132がp53タンパク質のレベルの実質的に増大させている（図8参照）。一方、TRIM24又はMDM2タンパク質のいずれかの過剰発現は、p53レベルの増大を減じた。このことは、これらタンパク質が、プロテアソームから独立した機構又はMG132（velcade）により阻害されない過程を介して、p53タンパク質に対する負の調節効果を示すことと整合する。
【０２０７】
（ヒトの癌細胞系統におけるTRIM24のsiRNAノックダウン）
Clustal2.0.5プログラムは、公共のドメインにて利用可能な、ヒトのTRIM24タンパク質をコードする転写産物の複数の配列アライメントを作るために使用された。siRNA配列は、図9に示すように、TRIM24の全てのアイソフォーム/バリアントに共通するように設計された。下線を付した部分がsiRNAの標的を示すものである。A*は、全ての転写産物に共通の配列を示す。A-は、アライメント過程において、CLUSTALにより挿入されたギャップを示す。配列の最後の番号は、塩基対の数を示す。
【０２０８】
図9に示す、siRNA標的配列は、図10の表に示す、siRNA配列を設計するために使用される。
【０２０９】
TRIM24ノックダウンの効果は、図10に示すsiRNA配列のみにより形質転換したHCT116、PC3、A549、MCF1及びT47D癌細胞系統について評価された。
第一日目に、細胞はGreinerのmicroclear collagen coated 384ウェルプレート又はFortitudeの384ウェルプレート（HCT116）上に以下の濃度にて、すなわち、HCT116：1500又は2000細胞/ウェル、C3：1000又は1500細胞/ウェル、A549：1000又は1500細胞/ウェル、MCF7：1500又は2000細胞/ウェル、T47D：3500又は4000細胞/ウェルにて、自動蒔きされた。
第二日目に、１つのウェル当り0.076μlのDharmafect2を使用して、30nMにて、siRNAすなわち、Ambion/AB Silencer及びSilencer Select LibraryからのTRIM24を標的とする7種のsiRNAの形質転換が実施された。
第四日目に、細胞は観察され、読み込み用に準備された。定量的なリアルタイムRT-PCR（qRT-PCR）のために、細胞は溶解、凍結され、Invitec（Invisisorb96ウェルプレートキット）による標準的なプロトコールによりRNAが抽出された。次いで、Applied Biosystems社の標準的な試薬及び方法を用いてqRT-PCRが行われ、そして、Sybrgreenインターカレーション検査法を使用した。逆転写反応は、ABI社のランダムヘキサマー及びHigh Capacity cDNA試薬を用いて行われた。qPCRのステップは、500nMの配列特異的プライマーを含む11μl量のQuantace qPCRマスターミックスを用いて行われた。反応は、ABI7920HTシステムを用いて行われ、処理を施した試料に対するネガティブすなわち非特異的なsiRNAを形質転換した試料を比較することにより、18S rRNAの“ハウスキーピング”の増幅レベルに対する、ポジティブな標的であるmRNAの相対的な下方制御を算出する。
【０２１０】
データを図11のグラフ図に示す。上方の黒い線分は、非形質転換細胞における100％の発現レベルを示し、下方の黒い線分は70％抑制したレベルを示す。その結果、異なる細胞系統の異なる配列間においていくつかのバリエーションがあったものの、全7種のsiRNAについてTRIM24の転写レベルが大きく低下していた。
【０２１１】
適切な形質転換条件及びTRIM24転写レベルのノックダウンするsiRNA配列を得るために、形質転換が繰り返し、ヘキスト染色して、自動顕微鏡観察捕捉法及び自動画像分析によって多数の細胞核を評価した。
【０２１２】
また、形質転換４日後の細胞はパラホルムアルデヒドにより固定され、４℃にて一晩保存された。５日後には、細胞は洗浄され、（核を検出するために）ヘキスト染色され、最終洗浄された後に、４℃にて保存された。Molecular DeviceのImageXpress Microシステムを用いて、ウェル毎に４箇所で１０倍に拡大され、貯蔵され、自動画像補足が行われた。画像分析は、特定の細胞タイプ及び染色濃度のパラメータを適用し、DefiniensのCallengerを用いて行われた。
【０２１３】
データは、ネガティブ、すなわち、非特異的なsiRNAにより標準化され、図12に示すように％表示されている。図中の大きな十字は、100％レベルを示す。TRIM24のノックダウンの結果は、HCT116、A549及びMCF7細胞の細胞数の顕著な減少を招く。TRIM24のノックダウンは、異なる細胞タイプにわたる相当のレベルの標的遺伝子の発現にも関わらず、PC3及びT47D細胞に影響しない。
【０２１４】
TRIM24のノックダウンは、全ての細胞系統が野生型のp53を発現するHCT116、A546及びMCF7細胞の細胞数の減少を招く。他の2種の細胞系統は、非突然変異型p53（PC3）又は突然変異型p53（T47D）を発現する。これらのデータは、p53との相互作用に依存しているTRIM24の効果と整合するものである。
【０２１５】
適切な形質転換条件及びTRIM24転写レベルのノックダウンするsiRNA配列を得るために、形質転換が繰り返し、抗チューブリン染色を行い、自動顕微鏡観察捕捉法及び自動画像分析によって多数の細胞核を評価した。
【０２１６】
形質転換の４日後、細胞はパラホルムアルデヒドに固定され、非特異的な部位はブロックされ、試料はチューブリンに対する第一の抗体とともに４℃にて一晩インキュベートされた。５日後には、細胞は洗浄され、sFITCとリンクした第二の抗体とともに４℃の餡所にてインキュベートされ、最終洗浄に付された。Molecular DeviceのImageXpress Microシステムを用いて、ウェル毎に４箇所で１０倍に拡大され、貯蔵され、自動画像補足が行われた。画像分析は、特定の細胞タイプ及び染色濃度のパラメータを適用し、DefiniensのCallengerを用いて行われた。
【０２１７】
データは、ネガティブ、すなわち、非特異的なsiRNAにより標準化され、図12に示すように％表示されている。図中の大きな十字は、100％レベルを示す。集合の程度は、以下のように算出される。
ウェル底部における波美テーションの程度；公式
｛［FITCピクセル数］+［（全ての）核のピクセル数］/361920｝*100％
【０２１８】
図13に示すように、TRIM24のノックダウンの結果は、HCT116及びMCF7細胞の細胞数の顕著な減少及びA549のそれよりは小さな減少を招く。TRIM24のノックダウンは、異なる細胞タイプにわたる相当のレベルの標的遺伝子の発現にも関わらず、PC3及びT47D細胞に影響しない。
【０２１９】
TRIM24のノックダウンは、全ての細胞系統が野生型のp53を発現するHCT116、A546及びMCF7細胞の細胞数の減少を招く。他の2種の細胞系統は、非突然変異型p53（PC3）又は突然変異型p53（T47D）を発現する。
【０２２０】
これらのデータは、p53との相互作用に依存しているTRIM24の効果と整合するものである。
【０２２１】
（ヒトの乳癌細胞におけるTRIM24のshRNAノックダウン）
TRIM24は、MCF7乳癌細胞系統におけるTRIM24を標的としているshRNA発現プラスミドの安定的な形質転換により減少した。コロニー形成アッセイによる72時間後の生育及び評価の結果を図14にグラフ図として示す。この結果は図12及び13に示す細胞増殖の結果と整合するものである。
【０２２２】
（多分化能細胞におけるTRIM24のsiRNAノックダウン）
マウスのES(mES)細胞を、分化を抑制するために、LIFの存在下にて生育した。同一数の細胞がプレーティングされ、48時間後にアルカリフォスファターゼ活性が定量された。siRNAによるTRIM24の一時的な消耗は、コントロールsiRNA処理された細胞と比較して、mES細胞の自然発生的な分化を誘導した（図15）。これらのデータは、mES細胞の多分化能の維持にTRIM24が有意な役割を有することを示している。そのような効果は、癌の幹細胞のモデルに重要である。癌幹細胞のTRIM24の消耗がmES細胞と同じ効果を有し、このタンパク質の抑制は、癌幹細胞自己複製の代価で癌幹細胞分化を促進することによって、有用な治療的な介入を提供するものである。
【０２２３】
（オンラインリソース）
Gene Expression Omnibus (GEO) at NCBI :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Oncomine :
http://www.oncomine.org/main/index.jsp
Biocarta pathways:
http://www.biocarta.com/genes/index.asp
ENTREZ GENE:
http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene
ENTREZ Homologene:
http://www.ncbi.nlm. nih.gov/entrez/query .fcgi?db=homologene
【０２２４】
この発明に従う特定の実施形態を詳細に説明しているが、これは一例であるに過ぎず、例示目的のためのものである。上述の実施形態は、請求項に記載の範囲を限定するものでは無い。また、この発明の請求項に記載の発明の精神と範囲から逸脱することなく、種々の置換、変更及び修飾が可能であることには留意されたい。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010531662.tif 000028
2010531662.tif 000029
2010531662.tif 000030
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