(57)【要約】  本発明は、核酸とアビジンとの高親和性相互作用によって形成される中心核からなる新規なナノ組織化複合体であって、前記核を水溶液中、生理食塩水中においてさえ安定化し、核自体を全体的または部分的に覆うことが可能な適当なポリマー剤によって更なる非特異的かつ不要な相互作用から核を保護する前記ナノ組織化複合体を開示するものである。得られたナノ複合体は、水溶液中で安定でありナノ粒子の特徴を有することが示された。更に、ナノ複合体はバイオテクノロジー分野及びナノ医療における使用に有用な特性を示した。
2010531652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のアビジン単位と１以上の核酸分子との間の高親和性相互作用によって得られる核を含むナノ組織化複合体であって、前記核が、下記一般式（Ｉ）： 
ＮＢｎＡｖｙ（Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ）ｚ          （Ｉ）
［式中、
ＮＢは、１本鎖または２本鎖の核酸の１個の核酸塩基であり；
Ａｖは、アビジン単位であり；
Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂは、ビオチン化された表面保護剤であって、ＰＡが少なくとも１個または２個の官能化可能な残基を有するポリマー単位であり、その内の１つが直接またはスペーサーＸを介して共有結合により、ビオチン残基Ｂにそのカルボキシル官能基を介して結合しているビオチン化表面保護剤であり；
ｎは、１６〜１０，０００，０００で変化する数であり；
ｙは、１以上の整数であり、かつｎに対して（０．０００１）・ｎ〜（０．０４５４）・ｎであり、ただし（０．０００１〜０．０４５４）・ｎの範囲に含まれる値が１未満である場合には、ｙは１に等しく；
ｚは、１以上の整数であり、かつｙに対して（０．０２）・ｙ〜（４）・ｙであり、ただし（０．０２〜４）・ｙの範囲に含まれる値が１未満である場合には、ｚは１に等しく；
ａは、０〜５０の数であり；
ｂは、１〜１２８の数である。］
で表わされるビオチン化された表面保護剤によって安定化されている前記ナノ組織化複合体。
【請求項２】
ｎが３０〜１００，０００である、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項３】
ｎが３，０００〜５０，０００である、請求項２に記載のナノ組織化複合体。
【請求項４】
ｙが（０．０００１）・ｎ〜（０．０３５７）・ｎである、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項５】
ｙが（０．０１）・ｎ〜（０．０３５７）・ｎである、請求項４に記載のナノ組織化複合体。
【請求項６】
ｚが（０．４）・ｙ〜（４）・ｙである、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項７】
ａが０〜１０である、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項８】
前記１本鎖または２本鎖の核酸が、１本鎖または２本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリマーの任意の配列、１本鎖の形態またはＲＮＡもしくは相補的なＤＮＡ鎖とハイブリダイズしたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリマーの任意の配列、及び、一部または全部の塩基が化学的に修飾されているそれらの配列からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項９】
ＰＡが任意の分子量の親水性ポリマーの直線状単位である、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１０】
前記ポリマー単位ＰＡが、場合により置換された酸化ポリエチレンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＯまたはＰＥＧ）、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのコポリマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリロイルモルホリン（ＰａｃＭ）、ポリオキサミン、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、乳酸とグリコール酸とのコポリマー（ＰＬＧＡ）からなる群から選択される、請求項９に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１１】
前記ポリマー単位ＰＡが、４００〜４０，０００の分子量を有する、請求項９に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１２】
前記ポリマー単位ＰＡが、１，０００〜２０，０００の分子量を有する、請求項１１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１３】
前記ポリマー単位ＰＡが、下記式（ＩＩＩ）：
−（ＣＲ１Ｒ２ＣＲ３Ｒ４Ｏ）ｍ−            （ＩＩＩ）
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ及びチオアリールオキシであり、
ｍは２〜９００の整数である。］
で表わされる置換ポリオキシエチレン（ＰＥＯ）である、請求項１０に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１４】
ｂが１以外である場合、前記ポリマー単位ＰＡが、少なくとも３個の官能基を有する更なる多官能性リガンドによって互いに結合され、その内の１個が直接、またはスペーサーＸを介して間接的にビオチンＢに結合し、残りの官能基はポリマー単位ＰＡに結合する、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１５】
前記多官能性リガンドが、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、及びデンドリマーからなる群から選択される、請求項１４に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１６】
前記ポリマー単位ＰＡが２個の官能化可能な残基を有する場合、第２の前記残基は遊離しているかまたは保護基によって保護される、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１７】
前記ポリマー単位ＰＡが２個の官能化可能な残基を有する場合、第２の前記残基は、リガンド、糖、発色団または蛍光団、薬剤、放射性核種に対するキレート剤、抗体、ペプチド、タンパク質及び酵素から選択される化合物に、前記第２の官能基を介して更に共有結合する、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１８】
前記スペーサーＸが、下記一般式（ＩＩ）：
Ｙ−Ｒ−Ｙ’            （ＩＩ）
［式中、
Ｙ，Ｙ’は、同じか互いに異なり、−ＣＯＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、ＳＯ２−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＣＯ−、−ＣＯＳ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、ＨＮ−ＳＯ−ＮＨ−であり、
Ｒは、炭素原子数が１〜２０の、場合に応じて置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリールでありうる。］
で表わされる２官能性化合物である、請求項１に記載のナノ組織化複合体。
【請求項１９】
Ｒが、炭素原子数が５〜２０の、場合に応じて置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリールでありうる、請求項１８に記載のナノ組織化複合体。
【請求項２０】
ｚが４未満である場合に、互いに同じかまたは異なり、かつ前記保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂとは異なるビオチン化化合物を更に含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノ組織化複合体。
【請求項２１】
請求項１乃至２０のいずれか１項に記載のナノ組織化複合体を含むナノ粒子。
【請求項２２】
少なくとも１０ｎｍの寸法を有する、前記請求項に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
前記寸法が５０〜１，０００ｎｍである、請求項２２に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
請求項１に記載のナノ組織化複合体を調製するための方法であって、
ａ）アビジンＡｖを、アビジンＡｖに対する核酸塩基ＮＢの化学量論的に所定のモル比で核酸と混合することによって自己組織化された一次核ＮＢｎＡｖｙを調製する工程と；
ｂ）ビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂを、工程ａ）で得られた前記一次核と混合し、前記一次核はＢ−Ｘａ−ＰＡｂのビオチンＢに対するアビジンＡｖの化学量論的に所定のモル比で加えられる工程とを少なくとも含む前記方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のナノ組織化複合体を調製するための方法であって、
ａ）アビジンＡｖを、アビジンＡｖに対するＢ−Ｘａ−ＰＡｂのビオチンＢの化学量論的に所定のモル比で表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂと混合することによって接合化合物Ａｖｙ（Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ）ｚを調製する工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた前記接合化合物を、核酸塩基ＮＢに対するアビジンＡｖの化学量論的に所定のモル比で加えられた核酸と混合する工程とを少なくとも含む前記方法。
【請求項２６】
核酸塩基とアビジンとの前記混合工程が、０℃〜５０℃の温度で無塩水溶液中で実施され、アビジンに対する核酸塩基ＮＢの前記化学量論的に所定のモル比が０．４４〜０．０００１である、請求項２４または２５に記載のナノ組織化複合体の調製法。
【請求項２７】
アビジンに対する核酸塩基ＮＢの前記化学量論的に所定のモル比が０．１３３〜０．００４４である、請求項２６に記載のナノ組織化複合体の調製法。
【請求項２８】
前記表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂの添加が、０℃〜５０℃の温度の水溶液中で実施され、Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂに対するアビジンの前記化学量論的に所定のモル比が４〜０．０２である、請求項２４または２５に記載のナノ組織化複合体の調製法。
【請求項２９】
ビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂを調製する更なる工程を含む、請求項２４または２５に記載のナノ組織化複合体の調製法。
【請求項３０】
工程ａ）で得られた化合物、または工程ｂ）で得られたナノ組織化複合体をアビジンモノマーから精製する更なる工程を含む、請求項２４または２５に記載のナノ組織化複合体の調製法。
【請求項３１】
互いに同じかまたは異なるビオチン化化合物を前記ナノ複合体に更に加える更なる工程を含む、請求項２４または２５に記載のナノ組織化複合体の調製法。
【請求項３２】
バイオテクノロジー分野またはナノ医療における請求項１乃至２０に記載のナノ組織化複合体の使用。
【請求項３３】
インビトロ及びインビボ診断における検出手段としての請求項３２に記載のナノ組織化複合体の使用。
【請求項３４】
表面分子の局在化及びパターン形成における増幅手段としての請求項３２に記載のナノ組織化複合体の使用。
【請求項３５】
薬剤をターゲティングするための手段としての請求項３２に記載のナノ組織化複合体の使用。
【請求項３６】
ａ）アビジンＡｖを、Ａｖに対する核酸塩基ＮＢの化学量論的に所定のモル比で核酸と混合することによって自己組織化された一次核ＮＢｎＡｖｙを調製すること；
ｂ）ビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂを、工程ａ）で得られた前記一次核と混合し、前記一次核はＢ−Ｘａ−ＰＡｂに対するアビジンＡｖの化学量論的に所定のモル比で加えられること、および、場合に応じて、
ｃ）互いに同じかまたは異なる更なるビオチン化化合物を、工程ｂ）で得られたナノ組織化複合体に加えることによって得られる請求項１乃至２０のいずれか１項に記載のナノ組織化複合体。
【請求項３７】
前記調製法が、請求項２６乃至３１のいずれか１項に記載のものである、請求項３６に記載のナノ組織化複合体。
【請求項３８】
ａ）アビジンＡｖを、アビジンＡｖに対するＢ−Ｘａ−ＰＡｂのビオチンＢの化学量論的に所定のモル比で表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂと混合することによって接合化合物Ａｖｙ（Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ）ｚを調製する工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた前記接合化合物を、核酸塩基ＮＢに対するアビジンＡｖの化学量論的に所定のモル比で加えられた核酸と混合する工程と、場合に応じて、
ｃ）互いに同じかまたは異なる更なるビオチン化化合物を、工程ｂ）で得られたナノ組織化複合体に加える工程とによって得られる請求項１乃至２０のいずれか１項に記載のナノ組織化複合体。
【請求項３９】
前記調製法が、請求項２６乃至３１のいずれか１項に記載のものである、請求項３８に記載のナノ組織化複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なナノ組織化複合体（以下、ナノ複合体又はナノ組織体とも称する）に関し、より詳細には、核酸、アビジン及びポリマーのナノ組織体、バイオテクノロジー分野及びナノ医療におけるその使用並びにその調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アビジンは４分子のビオチンに対して極めて高い親和性（Ｋｄ＝〜１０−１５Ｍ）で結合する能力によって主として知られる４量体糖タンパク質である。実用的視点からみた場合、ビオチンに対するアビジンの高い多重親和性は、多くのバイオテクノロジー分野における用途においてアビジンが分子装置として使用されている根拠をなすものである（アビジン−ビオチン技術）（非特許文献１および２）。この性質に関し、アビジンは分子架橋として機能しうるものであり、異なる生物学的又は化学的単位が１分子のビオチンに共有結合する場合に、これらを互いに安定的に連結する。
【０００３】
アビジン−ビオチン技術の最も一般的な用途は分析を目的としたものであり、より詳細には、抗体または検体に対して高い親和性を有する他の任意の分子（リガンド／抗原）に結合する能力、またはマーカーシステム（蛍光団、光／色を放射可能な酵素、放射性核種など）に結合する能力に通常基づいた検出及び定量化システムのためのものである；他の用途としては、アビジン−ビオチン複合体で形成された分子架橋を用いてしばしば実施される手法である、特定の化学的／生化学的物質による表面の官能基化があり、別の用途としては、非経口手段によって投与された薬剤や診断用要素の体内の特定の部位へのターゲティングがある（非特許文献３）。
【０００４】
従来のアビジン−ビオチン技術の主な難点の１つは、システムの中心核を形成する１個のアビジン分子に結合可能なビオチンの最大数（４個）にある。より多くのビオチン分子を結合することができる中心核を得ることができれば、理論上、システムの可能性を広げることが可能である。
【０００５】
こうした拡張された能力は、複数のアビジン分子を１個の単位（本明細書ではポリアビジン単位と定義する）に結合することによって実現することができる。これに関し、ポリアビジン核を得るための異なる技術的手法が文献に記載されている。一般的に採用され、現在利用されている手法は、マイクロスフェアまたはナノスフェアの表面（ポリスチレンなどの異なるポリマー、または金などの金属からなる）を複数のアビジン分子でコーティングすることに基づいたものか、アビジンの共有結合架橋による化学的「重合化」に基づいたものである。
【０００６】
したがってポリアビジン単位を形成する目的で現在利用されている手法は、アビジン単位間で共有結合を形成させることを目的とした化学合成法か、あるいはアビジン分子をポリマー又は金属の核の表面に接着させる非特異的な吸着法のいずれかに基づいたものである。しかしながらこれらのシステムはいずれも共通の特定の問題点を有している。具体的には、このようにして得られたポリアビジンは、ａ）ポリアビジンを得る方法に依存する特定の多分散度、ｂ）アビジン活性の一部損失によって常に特徴付けられる。実際的な言い方をすれば、アビジンの不活性化がビオチンに対する（したがって他のあらゆるビオチン化されたリガンドに対する）結合能の低下につながるのに対して、多分散度は、性質が統計学的に定義され、したがって厳密に定義されない生成物につながる。
【０００７】
前述の方法によって得られるポリアビジンの別の共通の問題点は、ポリアビジンは、その組織化に用いられる材料（例、化学重合化用のリンカー、または非特異的吸着用のポリマーもしくは金属中心核）が天然由来のものではなかったり、常に生体適合性のものとは限らずしたがって毒性を有する可能性があることから特定の生物医学的環境では使用できないことである。このため、これらの方法によって得られるポリアビジンは、ポリアビジンを構成する要素に関連した毒性のリスクをともないうるものであり、これによりアビジン組織体とヒトまたは動物の組織との生体内での接触が想定されるような場合には医薬／診断環境におけるポリアビジンの利用可能性が限定されてしまう。
【０００８】
近年、アビジンに特有の更なる性質が脚光を浴びている。その性質とは核酸に対して高い親和性で結合する能力である（非特許文献４）。こうした結合は、更にこのタンパク質の特定の領域が関与するが、ビオチン結合部位は直接関与しない高い親和性相互作用によるものである。この相互作用の後、アビジンはＤＮＡ上に組織的に自己組織化し、化学量論的に規定された凝集体を形成する。この凝集体内では、核酸の塩基対に対するアビジンの化学量論的な比が１８±４となるように核酸がアビジン分子によって被覆されている。これらの複合体は高い希釈度（［ＤＮＡ］＝１０ｐＭ）で溶液中、電解質の存在下で安定である。
【０００９】
生理条件下での相互作用の安定性を考慮すれば上記の組織体は上記に述べたものに一部類似しており、事実上ポリアビジンと呼ぶことが可能である。この組織体は安定であり、生物及び生体分解性由来の要素のみからなり、組織体中に含まれるアビジンのビオチンに対する結合能は維持されている。
【００１０】
しかしながら、従来のアビジン−ビオチンシステムの性能を向上させるための手段としてのこれらのポリアビジンシステムの実際的な効果は、こうしたポリアビジンシステムを再現可能かつ多分散度の低い、一定のコロイドサイズを有する別個の凝集体の形で得ることができるかに依存する。巨視的な観点からは、アビジン−核酸組織体は組織体が存在する条件に応じて異なる形状及び幾何学構造を取りうるものと考えられる。例えば、緩衝性水性環境下でアビジンと核酸を混合することによって、大径の凝集体が得られる（＞＞１ミクロン）が、この凝集体は多分散度が高く、幾何学構造は不明瞭であり、実際的な観点からはまったく使用不可能である。これに対し、無塩環境かつ特定の濃度及びタンパク質に対する核酸の比の条件下では、１個の核酸分子を複数のアビジン分子が囲むトロイドまたはロッド形状のナノ粒子構造を得ることが可能である。この場合、ナノ組織体は多分散度が低く、そのサイズは使用する核酸の種類及び長さのみに依存する。しかしながら前出の文献に述べられている（非特許文献４）この後者の構成は、安定的かつ無塩水溶液中で単離可能であり、電解質の存在下では急速に凝集し、その後に多分散性の大型の凝集体がやはり得られるが、これも実際的な目的では事実上使用不可能である。
【００１１】
アビジン／ビオチンシステムの一般的な分析または生物医学的用途はいずれも生理食塩水環境中での生物認識反応をともなうことから、上記に述べたアビジンと核酸の複合体は、必要とされる緩衝条件下で別個の安定した状態で存在し得ないために実用的ではない。
【００１２】
いずれの場合においても、凝集は多くの小径の粒子に共通する一般的な問題であり、特に粒子がコロイドの範囲（＜１ミクロン−ナノ粒子）である場合には問題となる。凝集は、粒子の表面特性（電荷の種類及び密度、疎水性、親水性など）及び粒子が懸濁される媒質の種類（無機溶媒、水性溶媒、緩衝液の種類、イオン強度、ｐＨなど）に依存しており、様々な技術的解決策を用いて凝集を防止または遅らせることができる。
【００１３】
懸濁媒質が水溶液である場合、最も一般的に用いられる方法は、粒子表面に共有結合されるか吸着させられた親水性ポリマーを使用して粒子表面を周辺環境から部分的または完全に隠すことである。これにより立体障害が生ずるとともにエンタルピーが増大し、粒子が互いに不可逆的に相互作用することを防止する。例えば、非経口的手段によって投与される抗腫瘍剤の担体として用いられるリポソーム性ナノ粒子の表面を保護する目的で親水性ポリマーを使用する（非特許文献５）。
【００１４】
親水性ポリマーが付着した異なる表面間（すなわちナノ粒子間）の非特異的相互作用を防止する際の親水性ポリマーの効果は、ａ）ポリマー鎖の長さ、及びｂ）グラフト密度の２つのパラメータに関連する（非特許文献６〜８）。したがって各システムについて、上記のパラメータの一方または他方または両方を変化させることによって同様の凝集防止効果を実現することができる。
【００１５】
表面であるかナノ粒子であるかによらず、各システムは異なる性質（化学的性質、曲率角度など）によって特徴付けられることから、表面保護効果を最適化するためには表面保護効率をその都度測定しなければならない点は注意を要する。前述したように、最適化の際には、ポリマーの種類、その長さ及び付着密度、とりわけグラフト法を含む異なるパラメータが考慮される（非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Wilchek M and Bayer EA, Analytical Biochemistry. 1988, 171: 1-32
【非特許文献２】Wilchek M and Bayer EA, Methods Enzymol. 1990, 184: 14-45
【非特許文献３】Goldenberg DM, Sharkey RM, Paganelli G, Barbet J, and Chatal JF. J. Clin. Oncol. 2006, 24: 823-834
【非特許文献４】Morpurgo M, Radu A, Bayer EA, and Wilchek M, Journal of Molecular Recognition. 2004, 17: 558-566
【非特許文献５】Cattel L, Ceruti M, et al. Tumori,2003, 89:237-249
【非特許文献６】Jeon SI, Lee JH et al. J. Colloidal and Interface Sci. 1991, 142: 149-158
【非特許文献７】Jeon SI and Andrade JD J. Colloidal and Interface Sci. 1991, 142: 159-166
【非特許文献８】Sofia SJ, Premnath V et al. Macromolecules 1998, 31: 5059-5070
【非特許文献９】Owens DE and Peppas NA Int. J. Pharm. 2006, 307: 93-102
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
このため、特定の粒子システムで得られた結果を、別のものに直接流用することはできず、したがって文献に既に述べられている情報をアビジンと核酸からなるナノ粒子システムに直接当てはめることはできない。
【００１８】
したがってこれらのシステムの表面保護の態様は、本発明の範囲において初めて記載されるものである。本発明の一態様は、核酸及びアビジンからなる、水性／生理食塩水環境において安定なナノ粒子を得ることにある。
【００１９】
本発明の更なる一態様は、前記の安定したシステムが他のビオチン化された要素を認識可能である点、これらのシステム自体が薬理活性を有するか、第３の要素（例、受容体）を認識可能であるか、あるいはそれ自体でまたは溶液中の他の試薬とともにシグナル（例、蛍光、色、放射性、光子）を発生することが可能である点である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明者らによって提供されるナノ組織化複合体は、公知の技術において以前に報告されている難点の解決を図るものであることから、上記の目的を達成するものである。
【００２１】
詳細には、得られるナノ組織化複合体は定性的かつ定量的組成物の観点から高度に規定されたものであり、電解質の存在下においても安定である。
【００２２】
第１の態様において本発明の目的は、１以上のアビジン単位と１以上の核酸分子との間の高親和性相互作用によって得られる核を含むナノ組織化複合体であり、前記核は、下記一般式（Ｉ）で表わされるビオチン化された表面保護剤によって安定化されている。
【００２３】
ＮＢｎＡｖｙ（Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ）ｚ          （Ｉ）
【００２４】
［式中、
−ＮＢは、１本鎖または２本鎖の核酸の１個の核酸塩基であり；
−Ａｖは、アビジン単位であり；
−Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂは、ビオチン化された表面保護剤であって、ＰＡが少なくとも１個または２個の官能化可能な残基を有するポリマー単位であり、その内の１つが直接またはスペーサーＸを介して共有結合により、ビオチン残基Ｂにそのカルボキシル官能基を介して結合しているビオチン化表面保護剤であり；
−ｎは、１６〜１０，０００，０００で変化する数であり；
−ｙは、１以上（≦）の整数であり、かつｎに対して（０．０００１）・ｎ〜（０．０４５４）・ｎに変化し得る。（０．０００１〜０．０４５４）・ｎの範囲に含まれる値が１未満（＞）である場合には、ｙは１に等しい（＝）；
−ｚは、１以上（≦）の整数であり、かつｙに対して（０．０２）・ｙ〜（４）・ｙに変化し得る。（０．０２〜４）・ｙの範囲に含まれる値が１未満（＞）である場合には、ｚは１に等しい（＝）；
−ａは、０〜５０で変化する数である；
−ｂは、１〜１２８で変化する数である。］
【００２５】
本発明のナノ組織化複合体は、本発明の別の目的であるナノ粒子の形態である。
【００２６】
本発明の更なる目的は、体内の特定の部位に生物活性分子をターゲティング及び濃縮するためのナノ医療の分野におけるインビトロ及びインビボの診断の手段として、表面上に分子を局在化させる一般的なナノ技術の分野において、及び、場合に応じてコロイド懸濁液中に存在するかまたは表面上に局在化させた中心核上に性質の異なる複数の化学的または生物学的機能を共局在化させることを必要とするあらゆる用途（生物医学及び工学）における式（Ｉ）のナノ組織化複合体の使用である。
【００２７】
本発明のなお更なる目的は、一般式（Ｉ）のナノ組織化複合体の調製法である。
【００２８】
本発明によって達成することが可能な効果は、非限定的な説明を目的として与えられる以下の特定の実施形態の詳細な説明を以下の図面とともに参照することで当業者により明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Ａ）Ａｖ−ｐＥＧＦＰ  ３（例１及び２の試料１）；Ｂ）Ａｖ−ｐＥＧＦＰ  ３−Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ−ＩＶ−３０（例２の試料２６）；Ｃ）Ａｖ−ＧｅｎＮＢ  ２−Ｂ（例４の試料３１）；Ｄ）Ａｖ−ＧｅｎＮＢ  ２−Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ  ＩＶ−３０（例４の試料３５）のナノ組織化複合体の粒子の粒度分布（強度で重み付けしたガウス分析）を示す図である。
【図２】例２の異なるナノ組織化複合体の緩衝溶液中での凝集の動力学を、使用したＢ−Ｘａ−ＰＡｂの種類及びその量の関数として示した図である。異なる配合物の組成を表２にまとめて示す。Ａ：Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ  Ｉ、ビオチン結合部位（ＢＢＳ）の全飽和率（％）＝０（●）、２０（○）、３０（■）、４０（□）、５０（▲）、６０（△）％；Ｂ：Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ  ＩＩａ、ＢＢＳの飽和率（％）＝０（●）、２０（○）、３０（■）、４０（□）、５０（▲）、６０（△）％；Ｃ：Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ  ＩＩｂ、ＢＢＳの飽和率（％）＝０（●）、２０（○）、３０（■）、４０（□）、５０（▲）、６０（△）％；Ｄ：Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ  ＩＩＩ、ＢＢＳの飽和率（％）＝０（●）、２０（○）、３０（■）、４０（□）、５０（▲）、６０（△）％；Ｅ：Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ  ＩＶ、ＢＢＳの飽和率（％）＝０（●）、２０（○）、３０（■）、４０（□）、５０（▲）、６０（△）％。
【図３】モノマー形態及び核酸とのナノ複合化形態のアビジンを比較した、ドットブロット蛍光検出によるアッセイで使用した膜の蛍光顕微鏡画像を示す図である。１．３μｇ／ｍｌのアビジン−ビオチン−Ａｌｅｘａ溶液を用いてインキュベーションを実施した。Ａ１：アビジンモノマー（例５の試料３８）；Ａ２：Ａｖ−ｐＥＧＦＰ  １．５  Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ  ＩＶ−２５（例５の試料３９）；Ａ３：Ａｖ−ｐＥＧＦＰ  ０．７５  Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ  ＩＶ−２５（例の試料４０）。
【図４】モノマー形態及び核酸とのナノ複合化形態のアビジンを比較した、ドットブロット蛍光検出による更なるアッセイで使用した膜の蛍光顕微鏡画像を示す図である。モノマー形態（例５及び６の試料３８）及びナノ組織体の形態（例６の試料４１）で５μｇ／ｍｌのアビジン−ビオチン−Ａｌｅｘａ溶液を用いてインキュベーションを実施した。
【図５】酵素（ＨＲＰ）結合検出システムを用いたドットブロットにおいてモノマー形態（○）及び核酸とのナノ複合化形態（●）のアビジンの検出効率を比較した図である。ビオチン−ＨＲＰとインキュベートし、モノマー形態（例５、６及び７の試料３８）及びナノ組織体の形態（例７の試料４２）の５μｇ／ｍｌのアビジン溶液中で予めインキュベートした膜をＤＡＢ基質で現像することによってスポットが検出された。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に説明する発明は、複数のアビジン単位を１以上の核酸分子上に核形成させた後、表面保護剤の添加によって安定化させることによって生理食塩水中で別個の安定した形態として維持され、更なる非特異的な相互作用を生じ得ないようにすることによって得られたポリアビジンの核を含むナノ粒子の形態のナノ組織化複合体の取得及び応用に関するものである。
【００３１】
本発明のナノ組織化複合体によれば、表面上に保護要素が存在することによって、ａ）生理食塩水環境中での凝集、及びｂ）溶液中での他の分子との非特異的相互作用、のリスクに対して安定化した別個のナノ粒子が得られる。
【００３２】
前記保護要素は、制御かつ高度に規定された量で粒子表面上にそれ自体存在する。更に、発明者らによって開発された調製法に基づく表面保護は、核酸−アビジン自己組織化複合体を破壊することなく、かつ、組織化されたアビジンがビオチンに結合する全体の能力を改変することなく（すなわち、ビオチン結合部位を改変することなく）生じる。
【００３３】
これらのナノ粒子の粒径は、より多くのアビジン単位の組織化核となる核酸の長さによって確立され、したがって異なる粒径及びアビジンの異なる電荷によって特徴付けられる粒子を、核形成核酸（ＮＡ）のサイズを適宜変化させることによって得ることが可能である。
【００３４】
ａ）核形成核酸（ＮＡ）の種類及びサイズ、
ｂ）アビジンと核酸塩基との比、
ｃ）表面上に存在する保護剤の性質及び量、を変化させることによって使用者が前記粒子の特性を正確に規定し、その性質を調節することが可能である。
【００３５】
本発明の目的では、発明の対象となる化合物は、１以上の核酸分子に対する複数のアビジン単位の高親和性相互作用による第２の核形成によって得られる核を含み、下記一般式（Ｉ）によって表わされるビオチン化された表面保護剤によって安定化されたナノ組織化複合体である。
【００３６】
ＮＢｎＡｖｙ（Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ）ｚ          （Ｉ）
【００３７】
［式中、
−ＮＢは、１本鎖または２本鎖の核酸の１個の核酸塩基であり；
−Ａｖは、アビジン単位であり；
−Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂは、ビオチン化された表面保護剤であって、ＰＡが少なくとも１個または２個の官能化可能な残基を有するポリマー単位であり、その内の１つが直接またはスペーサーＸを介して共有結合により、ビオチン残基Ｂにそのカルボキシル官能基を介して結合しているビオチン化表面保護剤であり；
−ｎは、１６〜１０，０００，０００で変化する数であり；
−ｙは、１以上（≦）の整数であり、かつｎに対して（０．０００１）・ｎ〜（０．０４５４）・ｎに変化し得る。（０．０００１〜０．０４５４）・ｎの範囲に含まれる値が１未満（＞）である場合には、ｙは１に等しい（＝）；
−ｚは、１以上（≦）の整数であり、かつｙに対して（０．０２）・ｙ〜（４）・ｙに変化し得る。（０．０２〜４）・ｙの範囲に含まれる値が１未満（＞）である場合には、ｚは１に等しい（＝）；
−ａは、０〜５０で変化する数であり、好ましくは１〜１０である；
−ｂは、１〜１２８で変化する数である。］
【００３８】
ｚが４未満である場合、したがって核ＮＢｎＡｖｙ上に存在するビオチン結合部位が、保護剤（Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ）のビオチンＢとの結合によって飽和していない場合には、本発明のナノ複合体は保護剤とは異なる更なるビオチン化化合物を結合部位に結合させることができる。
【００３９】
したがって、ＮＢは、核酸が１本鎖であるか２本鎖であるかによらず、全塩基数としてｎが１６〜１０，０００，０００で変化するｎに等しい数の核酸塩基（ＮＢ）からなる核酸を意味する。好ましくは、核酸は、塩基数が３０〜１００，０００で変化する、より好ましくは３，０００〜５０，０００で変化する塩基からなる。
【００４０】
したがって「核酸」なる用語は、
ｉ）１本鎖（ｓｓ）又は２本鎖（ｄｓ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリマーの任意の配列、
ｉｉ）１本鎖形態として、またはＲＮＡもしくは相補的ＤＮＡ鎖とハイブリダイズしたリボ核酸（ＲＮＡ）ポリマーの任意の配列、
ｉｉｉ）一部または全部の塩基が化学的に修飾された上記の各項に記載の配列、のことを同等に意味する。
【００４１】
更に、式（Ｉ）のナノ組織化複合体において使用可能な核酸は、線状または環状、弛緩状、コイル状またはスーパーコイル状であってよい。
【００４２】
「アビジン」なる用語に関し、アビジンとは、鶏卵もしくは別の同様の供給源（一般的な鳥類の卵）または組み換え技術により、グリコシル化型または脱グリコシル化型として得られるものとして定義される。上記に述べたように１本鎖または２本鎖の核酸上に組織化されうるものであれば、他の化学的または遺伝子的に改変されたアビジンの形態も含まれる。
【００４３】
ＮＢの数ｎと核酸上に自己組織化するアビジン単位の数ｙとの間の関係を考慮すると、ｙは好ましくは（０．０００１）・ｎ〜（０．０３５７）・ｎであり、より好ましくは（０．０１）・ｎ〜（０．０３５７）・ｎである。例えば、ｎ＝１０，０００である場合、ｙは１０〜３５７で変化し得て、好ましくは１００〜３５７であり得る。またｎ＝１００，０００である場合、ｙは１０〜３，５７０であり、好ましくは１，０００〜３，５７０である。
【００４４】
更に、ビオチン化された表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂに関し、
−Ｂは、ビオチンを意味し、
−ＰＡは、直接またはスペーサーＸを介して共有結合により、ビオチンのカルボキシル基を介してビオチンに結合することが可能な任意の分子量の親水性ポリマーの直線状単位を好ましくは意味する。ＰＡが２個の官能化可能な残基を有する場合、これらの残基の内の第２のものは遊離しているかまたは例えばメトキシ基などの当業者に知られる保護基によって保護されている。
ｂが１よりも大きい場合、したがってＰＡが複数のポリマー単位からなる親水性ポリマーを表す場合、これらのポリマー単位は、３以上（３≦）の数の官能基を有する更なるリガンドによって互いに結合される。官能基の内の１個はスペーサーＸまたはビオチンＢに結合し、残りの他の官能基はポリマー単位ＰＡに結合する。
【００４５】
−Ｘは、下記一般式（ＩＩ）の２官能性分子からなるスペーサーである。
【００４６】
Ｙ−Ｒ−Ｙ’            （ＩＩ）
【００４７】
［式中、
Ｙ，Ｙ’は、同じか互いに異なり、−ＣＯＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、ＳＯ２−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＣＯ−、−ＣＯＳ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、ＨＮ−ＳＯ−ＮＨ−であり、
Ｒは、炭素原子数が１〜２０、好ましくは５〜２０であり、場合に応じて置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリールでありうる。］
【００４８】
したがって、スペーサーＸとビオチンＢとの間の結合、及びスペーサーＸと親水性ポリマーＰＡとの間の結合は独立して、アミド結合、アミノ結合、カルバミド結合、エステル結合、ケトン結合、エーテル結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、尿素結合、チオ尿素、スルホンまたはスルホキシド結合でありうる。
【００４９】
アビジン単位の数ｙとビオチン化された表面保護剤の単位Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂの数ｚとの間の関係を考慮すると、ｚは（０．０２）・ｙ〜（４）・ｙであり、好ましくは（０．４）・ｙ〜（４）・ｙである。
【００５０】
例えば、ｎ＝１０，０００かつｙ＝３５７（０．０３５７・ｎ）であるような粒子では、ｚは７〜１，４２９、好ましくは１４３〜１，４２９で変化し；ｎ＝１０，０００かつｙ＝１００であるような粒子では、ｚは２〜４００、より好ましくは４０〜４００で変化し；ｎ＝５０，０００かつｙ＝１，７８６（＝０．０３５７・ｎ）であるような粒子では、ｚは３６〜７，１４３、より好ましくは７１４〜７，１４３で変化し、ｎ＝５０，０００かつｙ＝５００（ｙ＝０．０１・ｎ）であるような粒子では、ｚは１０〜２，０００、より好ましくは２００〜２，０００で変化する。
【００５１】
本発明の式（Ｉ）のナノ組織化複合体においては、ポリマー単位ＰＡは生体適合性であり、好ましくは親水性ポリマーであって、ポリマー単位ＰＡの分子量が好ましくは４００〜４０，０００、より好ましくは１，０００〜２０，０００であるような公知のポリマー（非特許文献９）である。前記ポリマー単位は、場合により置換された酸化ポリエチレンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＯまたはＰＥＧ）、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのコポリマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリロイルモルホリン（ＰａｃＭ）、ポリオキサミン、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、乳酸とグリコール酸とのコポリマー（ＰＬＧＡ）からなる群から好ましくは選択される。
【００５２】
より好ましくはポリマーＰＡは、置換されたポリオキシエチレン（ＰＥＯ）であり、したがって下記式（ＩＩＩ）により特徴付けられる。
【００５３】
−（ＣＲ１Ｒ２ＣＲ３Ｒ４Ｏ）ｍ−            （ＩＩＩ）
【００５４】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、独立して水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ及びチオアリールオキシであり得る、ｍは２〜９００の整数である。］
【００５５】
ポリマーが複数のポリマー単位からなり、それらが３個以上（≦）の官能基を有する多官能性リガンドによって互いに結合されている場合、前記リガンドはリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、デンドリマーであってよい。「デンドリマー」なる用語は、より小型の分子またはポリマー核からなる中心核の周囲に繰り返される分枝からなる対称性高分子化合物を意味する。デンドリマーの外部に存在する官能基は、その数が分枝の数に依存し、例えばＰＡポリマーなどの他の分枝によってそれ自体が官能化されうる。
【００５６】
更にポリマー単位ＰＡが２官能性である場合、ポリマー単位ＰＡは第２の遊離官能基を介して、ナノ組織化複合体が目的とする用途に適した化合物、特にリガンド、糖、発色団または蛍光団、薬剤、放射性核種に対するキレート剤、ペプチド、抗体、タンパク質、酵素などから選択される化合物に更に共有結合してもよい。
【００５７】
本発明のナノ組織化複合体の調製法では、水溶液中で連続した３工程を含む：すなわち、第１の工程では、アビジンと核酸のみからなり、本発明の複合体の中心核を構成するナノ粒子を得る。続く２工程では、場合に応じてビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂを調製するが、主として表面保護剤を第１の工程で得られた核酸−アビジンナノ粒子に付加することを含む。
【００５８】
したがって、一般式ＮＢｎＡｖｙ（Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ）ｚ  （Ｉ）のナノ組織化複合体の調製法は、
ａ）アビジンＡｖを、核酸塩基に対するアビジンの所定の化学量論的モル比で核酸と混合することによって自己組織化された一次核ＮＢｎＡｖｙを調製する工程と、
ｂ）ビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂを上記で得られた一次核と混合する工程とを少なくとも含む。
【００５９】
場合により、本発明のナノ組織体の調製法ではビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂの調製もまた含み得る。
【００６０】
第１の工程は、好ましくはいずれも無塩水溶液としたアビジン溶液と核酸溶液とを、攪拌下に混合することによって実施する。この第１の工程では、核酸塩基ＮＢに対するアビジンのモル比は、０．４４〜０．０００１の範囲であり、好ましくは０．１３３〜０．００４４、より好ましくは０．０４４である。各試薬は０〜５０℃の温度で１〜６００秒の時間、連続攪拌下に混合する。
【００６１】
ビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂは、合成によって調製するか、市販されている場合には購入してもよい。合成によるＢ−Ｘａ−ＰＡｂの調製法では、当業者には周知の従来の生物学的接合（bioconjugation）技術を用い、化学的手段によってビオチン分子をポリマーＰＡｂに接合することを含む。次いで、上記で調製または購入したビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂを、溶液中に存在するビオチン結合部位の濃度に対して化学量論的に制御された量で加える。溶液中のビオチン結合部位はそれ自体アビジン濃度に対するものである。したがってアビジン：Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂのモル比は４〜０．０２である。
【００６２】
ビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂの添加はまた、水溶液中で０〜５０℃の制御された温度で１〜１２０分の時間、攪拌下で実施される。
【００６３】
更に、本発明のナノ組織化複合体は工程ａ）と工程ｂ）とが実質的に逆転された方法によって調製することもできる。したがってその調製法は、
ａ）ビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂをアビジンに対するビオチンの所定の化学量論的モル比でアビジンに加えること、
ｂ）核酸を、核酸塩基に対するアビジンの所定の化学量論的モル比で上記の工程で得られた接合体Ａｖｙ（Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ）ｚに加えることを含みうる。
【００６４】
調製条件は第１の方法について上記に述べたものと同様である。
【００６５】
必要に応じ、上記の工程に加えて、ナノ組織化複合体が第１の方法または第２の方法のいずれかによって調製されるかに関わらず、調製法が更に、第１の工程の残渣として溶液中に最終的に存在するアビジンのモノマーから粒子を精製することを更に含んでもよい。精製は工程ａ）または工程ｂ）の後に実施することができる。
【００６６】
溶液中に存在するアビジンモノマーからのナノ組織化複合体の精製は、例えば限外濾過やサイズ排除クロマトグラフィーなどの公知の方法によって実施することができる。限外濾過の場合、１００ｋＤａ以上（≦）のカットオフ値によって特徴付けられる適当なシステムを用いる。サイズ排除クロマトグラフィーの場合、２００ｋＤａ未満（＞）のサイズのタンパク質分子を保持するのに適したクロマトグラフィー媒質を使用する。
【００６７】
核のアビジン上に存在するビオチン結合部位が、ビオチン化表面保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂによって飽和していない場合、調製法は、互いに同じかまたは異なる更なるビオチン化化合物を加える更なる任意の工程を含んでもよい。
【００６８】
上記に述べた調製法によれば、任意の粒径のナノ粒子の性質を有するナノ組織化複合体を得ることができる。特に上記のナノ組織化複合体は、少なくとも１０ｎｍの粒径、好ましくは５０〜１０００ｎｍの粒径を有するナノ粒子の形態である。
【００６９】
本明細書で述べるナノ粒子の形態のナノ組織化複合体の使用は、「増幅」システムとして機能する、今日知られているアビジン−ビオチンシステムのすべての用途にわたる。これらの用途の例としては、ａ）インビトロ診断における検出手段として；ｂ）表面上における分子の局在化及びパターン形成の増幅手段として（たとえば、マイクロアレイ、タンパク質チップおよびＤＮＡ）；ｃ）インビボ診断の器具として；ｄ）薬剤の能動的または受動的ターゲティングのシステムとしての使用が挙げられる。
【００７０】
こうした使用は、アビジン上に存在し、保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂのビオチンの結合によって飽和していないビオチン結合部位を介してナノ組織体表面上に更に導入することが可能なビオチン化化合物の性質に依存する。
【実施例】
【００７１】
実験の部
本発明のナノ組織化化合物の調製法及びその特徴付けの幾つかの例を、非限定的な例示として以下に示す。
【００７２】
詳細には、上記に述べた調製法によって得られたナノ組織化化合物を、
ａ）光散乱法及び電子顕微鏡法を用いたそのサイズ、
ｂ）光散乱法を用いた分散度、
ｃ）更なるビオチン化官能基を導入するために利用可能なビオチン結合部位の数；この評価法は文献に記載のＨＡＢＡアッセイを用いて実施した（Green NM Biochem. J. 1965, 94: 23C-24C）。
ｄ）光散乱法を用いた緩衝媒質中での凝集速度、
ｅ）光散乱法を用いた、凍結及び解凍ならびに凍結乾燥に対する安定性、によって特徴付け（キャラクタリゼーション）した。
【００７３】
例１：表面保護剤を添加せずに異なるモル比のプラスミドＤＮＡ及びアビジンを用いて得られるナノ組織体の調製及びキャラクタリゼーション
【００７４】
アビジン（Ａｖ、ベロボ社（Belovo）、ベルギー）及び核酸（ｐＮＭ、プラスミドｐ−ＥＧＦＰ  Ｃ１（クローンテック（Clonetech）社Ｎｏ．６０８４−１）（４．７Ｋｂ））を下記表１に示すような異なるモル比で混合することによって複合体を調製した。
【００７５】
各溶液は氷浴中、０℃にて１時間、平衡状態となるまで静置し、遠心（１５０００ｒｐｍで５分）した後、溶液中のナノ組織体のサイズを、スペクトラ・フィジックス社（Spectra Physics）製Ｓｔａｂｉｌｉｔｅ２０１７レーザ、パシフィック・サイエンティフィック社（Pacific Scientific）製「Ｎｉｃｏｍｐ３７０コンピューティングオートコリレータ」、及び試料の温度を制御するためのシステムからなる装置システムを使用し、光散乱法によって分析した。
【００７６】
表１  アビジン：プラスミドポリ核酸のモル比、及び脱イオン水中での粒子の寸法特性
【表１】
2010531652.tif 000003
【００７７】
第１の試料について測定した粒度分布を図１に示す。図より、この組織体は中程度の多分散度によって特徴付けられることが分かる。表１のデータは、ｙ／ｎ比が減少するにしたがってナノ組織体のサイズ及び多分散度が増大することを更に示しているが、これは、この値が減少するにしたがって組織体中の核酸分子の濃縮度が小さくなることを示すものである。しかしながら、ｙ／ｎが変化する際のサイズの変化は約７０〜２００ｎｍの値の範囲内に限定されている。
【００７８】
例２：プラスミドＤＮＡ、アビジン及び表面保護剤を用いて得られるナノ組織体の調製及びキャラクタリゼーション
【００７９】
表２に示すように０〜２．４の間で変化するＢ−Ｘａ−ＰＡｂ：アビジンのモル比を用い、例１で述べたようにして調製した試料１のＡＶ−ｐＥＧＦＰ３に異なる表面保護剤（Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ）を異なる量で加えた。５種類の異なるＢ−Ｘａ−ＰＡｂ保護剤を使用した（Ｉ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩ及びＩＶ）。その化学式を以下に示す。
【化１】
2010531652.tif 000004
【００８０】
上記の各保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂを下記に述べるように合成し、特徴付けした。
Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂＩは、ビオチンの６−アミノ−ｎ−ヘキシルアミドをモノメトキシポリエチレングリコール２０００のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートと縮合することによって得た（Monfardini C, Schiavon O et al. Bioconjugate Chemistry 1995, 6: 62-69）。
Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂＩＩａは、α−アミノ−ω−メトキシ−ポリエチレングリコール５０００（フルカ社（Fluka）カタログＮｏ．０６６７９）をビオチニル−ｎ−ヘキサノールアミドのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートと縮合することによって得た（Morpurgo M, Bayer EA et al. J. Biochem. Biophys. Meth. 1999, 38: 17-28）。
Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂＩＩｂは、モノメトキシポリエチレングリコール５０００を２０００の代わりに使用し、Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂＩと同様にして得た。
Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂＩＩＩは、モノメトキシポリエチレングリコール２０００のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートを２，６−ジアミノヘキサン酸のアミドのアミノ基、及びビオチニル−ｎ−ヘキシルジアミン（２，６−ジアミノ−ヘキサン酸（６−ビオチニルアミドヘキシル）−アミド）と縮合することによって得た。
Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂＩＶは、モノメトキシポリエチレングリコール５０００を２０００の代わりに使用し、Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂＩＩＩと同様にして得た。
組織化溶液中の最終的なナノ組織化複合体の寸法を例１で述べたように光散乱法によって測定した。サイズの結果を表２及び図１にまとめて示す。
【００８１】
表２  例２に述べる関連ナノ組織体の組織化溶液の組成及び寸法特性
【表２】
2010531652.tif 000005
【００８２】
すべての試料は、無塩、無イオン水中で最初に調製した後、ＰＢＳ緩衝液中で希釈し、凝集速度を光散乱法によって測定した。凝集の動力学を図２に示す。図から、Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ がナノ組織体の表面に導入されると塩含有環境ではナノ組織体の凝集を、完全に阻害するまで遅らせることが分かる。各Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂの保護効果は、Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂの表面濃度が高くなるほど大きくなる。保護効果はＢ−Ｘａ−ＰＡｂの種類にも依存し、Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂＩＶ及びＢ−Ｘａ−ＰＡｂＩＩｂが試験を実施したすべてのものの中で最も効果が高かった。
【００８３】
例３：プラスミドＤＮＡ及びアビジンを用いて得られるナノ組織体の調製及びキャラクタリゼーション、ならびに限外濾過による精製
Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５４６−ビオチン（モレキュラープローブズ社（Molecular probes）Ｎｏ．Ａ１２９２３）を、例１で述べたようにして調製した試料１のＡｖ−ｐＥＧＦＰ３に全ビオチン結合部位の２％を飽和させるのに必要な量に等しい量で加えた。調製した生成物を、アビジンモノマーは通過するがナノ組織化されたアビジンは通過しないようにＶｉｖａｓｐｉｎ１００Ｋ  ＰＥＳ膜（ザルトリウス社（Sartorius）、カットオフ値１００，０００Ｄａ）を用いて異なる限外濾過工程に供した。上清及び濾液中のアビジン濃度をＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５４６蛍光団のシグナルに基づいて蛍光により求めた。４回の限外濾過工程後に得られた上清を光散乱法によって分析した。ナノ粒子システム中のアビジン：ＮＢ比を、存在するＤＮＡが限外濾過の前に存在したＤＮＡと同じであるものと仮定して、ナノ粒子システム中に存在するアビジン濃度から計算した。
【００８４】
表３  アビジン：核酸塩基の比（ｙ／ｎ）で表わした、ナノ粒子含有溶液の精製前後の組成
【表３】
2010531652.tif 000006
【００８５】
表に示された結果から、調製段階で導入された過剰なアビジンモノマーを限外濾過処理によって除去することが可能であることが明らかである。粒径は、精製前に記録された粒径よりも若干大きくなっている。この差（統計的に有意ではない）は、例１で既に述べたように、溶液中のｙ／ｎ比が低下するにしたがって、記録されるＤＮＡのパッキングレベルが低くなることに恐らく起因するものと考えられる。
【００８６】
例４：表面保護剤の添加及び非添加時の異なるモル比のゲノムＤＮＡ及びアビジンを用いて得られるナノ組織体の調製及びキャラクタリゼーション
【００８７】
アビジン（Ａｖ、ベロボ社（Belovo）、ベルギー）及び断片化した細菌のゲノム核酸（Ｇｅｎ  ｐＮＢ、シグマ社（Sigma）、カタログＮｏ．Ｄ１７６０）（平均サイズ＝約１６〜２４Ｋｂ）の水溶液をモル比を変えて（表４を参照）混合することによってナノ複合体を調製した。
【００８８】
各溶液は０℃の氷浴中で１時間静置し、遠心（１５，０００ｒｐｍで５分）後、溶液中のナノ組織体の寸法（表４）を例１で述べたように光散乱法によって分析した。
【００８９】
表４  アビジン：ゲノム核酸：Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂのモル比、及び脱イオン水中での粒子の寸法特性
【表４】
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【００９０】
例５：ドットブロット蛍光検出におけるモノマー形態及び核酸とのナノ複合化形態のアビジンの効果の第１の比較
【００９１】
ビオチン化抗体（抗ｈＰＳＭＡ）をニトロセルロース膜上にスポット（１μｌ）することによって不動化した。２％ｗ／ｖのＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含むＰＢＳに浸漬することによって膜をブロッキングした後、全ビオチン結合部位の２５％が飽和するような量のビオチン−Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標名）を予め加えたアビジンを含む溶液（１．３μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ／ＢＳＡに加えたもの）で処理した。この溶液中のアビジンをモノマー形態またはナノ組織化形態で使用した（表５）。
【００９２】
表５  ドットブロット蛍光アッセイで使用した検出用アビジン溶液の組成特性
【表５】
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【００９３】
室温で２時間インキュベートした後、膜をＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した（図３）。図から、ナノ組織化アビジンは、膜上に不動化した試料を検出するうえでより効果的であることが分かる。
【００９４】
例６：ドットブロット蛍光検出におけるモノマー形態及び核酸とのナノ複合化形態のアビジンの効果の第２の比較
【００９５】
異なる量のビオチン化ＢＳＡ（１０、５、２、１、０．５及び０．２ｐｍｏｌのビオチン／スポットにそれぞれ対応した１００、５０、２０、１０、５、２ｎｇのタンパク質）をニトロセルロース膜上にスポット（０．１μｌ）することによって不動化した。２％ｗ／ｖのＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含むＰＢＳに浸漬して膜をブロッキングした後、全ビオチン結合部位の４０％が飽和するような量のビオチン−Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標名）を予め加えたアビジンを含む溶液（５μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ／ＢＳＡに加えたもの）で処理した。この溶液中のアビジンをモノマー形態またはナノ組織化形態で使用した（表６）。
【００９６】
表６  第２のドットブロット蛍光アッセイで使用した検出用溶液の組成特性
【表６】
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【００９７】
室温で２時間インキュベートした後、膜をＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した（図４）。図から、アビジンモノマーを使用した場合の検出限界は１ｐｍｏｌのビオチンに等しいのに対して、アビジンをナノ粒子形態で使用した場合には、ビオチンは０．２ｐｍｏｌ以下の量であっても視認されることが分かる。ナノ組織体システムによる検出限界はこの実験では得られなかった。
【００９８】
例７：  Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂ保護剤の非存在下及び存在下におけるナノ組織体の凍結／解凍に対する安定性
【００９９】
例４で得た、ゲノムＤＮＡを用いて得られたナノ組織体の試料を凍結−解凍サイクルに供した。解凍後に溶液中に存在する粒子の粒径の測定値を処理前の同じ調製物の測定値と比較した。結果を表７に示す。
【０１００】
表７  凍結／解凍の前後のナノ組織体の寸法特性
【表７】
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【０１０１】
この結果より、保護剤なしの粒子は凍結−解凍プロセスに対する耐性がなく、凍結−解凍プロセス後に不可逆的に凝集すると考えられる。これに対し表面上に保護剤Ｂ−Ｘａ−ＰＡｂが存在する場合には凝集が阻害される。
【０１０２】
例８：酵素結合検出システムにおけるモノマー形態及び核酸とのナノ複合化形態のアビジンの効果の比較
【０１０３】
異なる量のビオチン化ＩｇＧ（ＩｇＧ−Ｂ）（０．０５４、０．１８、０．６、２．０、６．７及び２２．３ｎｇのタンパク質）をニトロセルロース膜上にスポット（０．５μｌ）することによって不動化した。２％ｗ／ｖのＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含むＰＢＳに膜を浸漬してブロッキングした後、アビジンを含む溶液（５μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ／ＢＳＡに加えたもの）で処理した。この溶液中のアビジンをモノマー形態またはナノ組織体形態で使用した（表７）。室温で１時間インキュベートした後、膜をＰＢＳで洗い、ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、４μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ／ＢＳＡに加えたもの）とともにインキュベート（１時間）した。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で膜を現像した。スポット密度をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析し、図５のグラフに変換した。図から、アビジンモノマーを使用した場合の検出限界は０．６ｎｇのＩｇＧ−Ｂに等しいのに対して、アビジンをナノ粒子形態で使用した場合には、ＩｇＧは０．０５４ｎｇ以下の量であっても視認されることが分かる。ナノ組織体システムによる検出限界はこの実験では得られなかった。
【０１０４】
表７  酵素結合ドットブロットアッセイで使用した検出用アビジン溶液の組成特性
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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