(57)【要約】本発明の目的は、ヒトＧＳＴＴ１に対する抗体（抗ｈＧＳＴＴ１）を生体液中で検出するための免疫学的分析方法である。本発明はまた、生体液中における抗ＧＳＴＴ１の存在に関連した病理学的状態の診断、予後、経過観察、およびモニタリングのための前記免疫学的分析方法の使用に関し、前記方法を実施するためのツールキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＧＳＴＴ１に対する抗体（抗ｈＧＳＴＴ１）を生体液中で検出するための免疫学的分析方法であって、
ａ）抗原特性に対するマーカーであるｈＧＳＴＴ１組換えタンパク質を異種生物中で発現および精製する段階；
ｂ）抗原特性に対するマーカーである前記ｈＧＳＴＴ１組換えタンパク質を支持体中に固定化する段階；
ｃ）生体液中に存在し、前記ｈＧＳＴＴ１組換えタンパク質に対する特異性を有する抗体が、該物質と結合して抗原−抗体複合体を形成する条件下において、抗原特性に対するマーカーである前記ｈＧＳＴＴ１組換えタンパク質を前記試験生体液と接触させる段階；
ｄ）前記抗原−抗体複合体から、非結合抗体および前記生体液のその他の成分を分離する段階；
ｅ）ポジティブコントロールによって定められた抗ＧＳＴＴ１抗体の量と正に相関する、前記生体液中で検出された抗原−抗体複合体の量を測定する段階
を含む、免疫学的分析の方法。
【請求項２】
前記ｈＧＳＴＴ１組換えマーカータンパク質が、発現され、少なくとも５個のヒスチジンアミノ酸を有するポリペプチド配列と融合されて、イオン交換アフィニティクロマトグラフィにより精製が可能であることを特徴とする、請求項１に記載のヒトＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中で検出するための免疫学的分析方法。
【請求項３】
前記ｈＧＳＴＴ１組換えマーカータンパク質が、微生物中、特に、ｐＣＡＳＢ−ＧＳＴＴ１プラスミドを有する大腸菌株中で発現され、精製されることを特徴とする、請求項１および請求項２に記載のヒトＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中で検出するための免疫学的分析方法。
【請求項４】
前記ｈＧＳＴＴ１組換えマーカータンパク質が固定化される前記支持体が、前記固定化およびそれに続く前記抗ＧＳＴＴ１抗体の結合の分析を可能とする任意の表面であり、好ましくは、マルチウェル培養プレートのウェル、ナイロン膜、セルロースフィルター、ニトロセルロース膜、着色マイクロ粒子、蛍光マイクロ粒子、ガラス表面、または金属支持体であることを特徴とする、請求項１から３に記載のヒトＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中で検出するための免疫学的分析方法。
【請求項５】
前記ｈＧＳＴＴ１組換えマーカータンパク質および前記抗ｈＧＳＴＴ１抗体の固定化のための前記支持体が、平坦な表面上のポリペプチドマイクロマトリックスであることを特徴とする、請求項４に記載のヒトＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中で検出するための免疫学的分析方法。
【請求項６】
前記抗原−抗体複合体の検出段階が、ウェスタンブロットを用いて行われることを特徴とする、請求項１から５に記載のヒトＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中で検出するための免疫学的分析方法。
【請求項７】
前記抗原−抗体複合体の検出段階が、ＥＬＩＳＡ法を用いて行われることを特徴とする、請求項１から５に記載のヒトＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中で検出するための免疫学的分析方法。
【請求項８】
前記抗原−抗体複合体の検出段階が、ｈＧＳＴＴ１組換えマーカータンパク質でコーティングしたコード化マイクロ粒子を用いて行われることを特徴とする、請求項１から５に記載のヒトＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中で検出するための免疫学的分析方法。
【請求項９】
生体液中における抗ＧＳＴＴ１抗体の存在に関連する病理学的状態の診断、生体液中における抗ＧＳＴＴ１抗体の存在に関連する病理学的状態の発症の予後、または生体液中における抗ＧＳＴＴ１の存在に関連する状態の経過観察およびモニタリングのための、ＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中にて検出するための免疫学的分析方法の使用。
【請求項１０】
抗ＧＳＴＴ１の存在が検出される前記生体液が、血液派生物であることを特徴とする、請求項９に記載の免疫学的分析方法の使用
【請求項１１】
前記病理学的状態が、移植されたもの（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、移植片（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、または輸液由来の、細胞、組織、または臓器の拒絶反応であることを特徴とする、請求項９および１０に記載の免疫学的分析方法の使用。
【請求項１２】
前記移植された臓器が、肝臓、腎臓、心臓、骨髄、または前記ｈＧＳＴＴ１配列を発現するその他の任意の臓器であることを特徴とする、請求項１１に記載の免疫学的分析方法の使用。
【請求項１３】
前記移植された臓器が、肝臓であることを特徴とする、請求項１２に記載の免疫学的分析方法の使用。
【請求項１４】
前記移植された臓器が、腎臓であることを特徴とする、請求項１２に記載の免疫学的分析方法の使用。
【請求項１５】
前記病理学的状態が、ｈＧＳＴＴ１配列を発現するドナーから輸血または任意の血液派生物の移植を受けた患者の拒絶反応であることを特徴とする、請求項１１に記載の免疫学的分析方法の使用。
【請求項１６】
ＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中で検出するための免疫学的分析方法を実施するためのツールキットであって、
ａ）ｈＧＳＴＴ１組換え抗原特性マーカータンパク質が固定化された支持体、
ｂ）前記ｈＧＳＴＴ１組換え抗原特性マーカータンパク質が固定化された支持体と接触させた場合に、血清サンプル中の抗ｈＧＳＴＴ１抗体の結合を可能とする指示分子、好ましくは、酵素、フルオロフォア、着色マイクロ粒子、または蛍光マイクロ粒子と結合したヒト抗ＩｇＧ二次抗体、
ｃ）前記ヒトＩｇＧ二次抗体と結合した前記指示分子の活性を検出するための手段、
ｄ）抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含むヒトコントロール血清、
ｅ）ヒト抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含まないヒトコントロール血清
を含むことを特徴とする、ツールキット。
【請求項１７】
ａ）ＥＬＩＳＡ法を用いた抗原−抗体複合体の検出に適し、各ウェル中に前記ｈＧＳＴＴ１組換え抗原特性マーカータンパク質が固定化されているマルチウェルプレート；
ｂ）ペルオキシダーゼと結合したヒト抗ＩｇＧ二次抗体のバイアル
ｃ）ペルオキシダーゼ酵素活性指示基質、好ましくは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、を有するバイアル；
ｄ）抗ｈＧＳＴＴ１抗体で不活性化されたヒト血清の希釈サンプルからなるポジティブコントロール；
ｅ）抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含まないヒト血清の希釈サンプルからなるネガティブコントロール；
ｆ）分析サンプル、前記結合二次抗体、前記コントロール、および前記対応する酵素指示基質の希釈を行うための緩衝溶液
からなることを特徴とする、請求項１６に記載のツールキット。
【請求項１８】
ａ）ＥＬＩＳＡ法を用いた抗原−抗体複合体の検出に適し、各ウェル中に前記ｈＧＳＴＴ１組換え抗原特性マーカータンパク質が固定化されているマルチウェルプレート；
ｂ）アルカリホスファターゼと結合したヒト抗ＩｇＧ二次抗体のバイアル；
ｃ）ペルオキシダーゼ酵素活性指示基質、好ましくはｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム、を有するバイアル；
ｄ）抗ＧＳＴＴ１抗体で不活性化されたヒト血清の希釈サンプルからなるポジティブコントロール；
ｅ）抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含まないヒト血清の希釈サンプルからなるネガティブコントロール；
ｆ）分析サンプル、前記結合二次抗体、前記コントロール、および前記対応する酵素指示基質の希釈を行うための緩衝溶液
からなることを特徴とする、請求項１６に記載のツールキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療および健康技術の一部であり、本出願の範囲は、自己免疫プロセスの診断、および移植拒絶反応の阻止のための分析システムの範囲にある。これは、生物医学的研究および臨床研究の分野の研究者にとって興味深いものでもあり得る。
【０００２】
発明の目的
本発明の目的は、ヒトＧＳＴＴ１に対する抗体（抗ｈＧＳＴＴ１）を生体液中で検出するための免疫学的分析方法である。さらに、本発明の目的は、生体液中における抗ＧＳＴＴ１の存在に関連する病理学的状態の診断、発症の予後、経過観察、およびモニタリングのための前記免疫学的分析方法の使用、ならびに前記方法を実施するためのツールキットである。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫現象の範囲内において、移植患者における細胞もしくは組織の寛容または拒絶反応に関する研究により、この両プロセスの多因子性の性質が明らかとなった。したがって、例えば、非自己認識および同種免疫反応の現象が確認されており、それにより、移植された物質中で発現された遺伝子が、レシピエント内で抗体（同種抗体）の出現を誘発し、特定の移植片の拒絶反応を引き起こすことになる（Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２６，５３５−５３９）。最近、新しい形態の肝臓移植片拒絶反応の存在が初めて報告され、これは主として小児に影響を及ぼすものである。これは、慢性肝炎に典型的な組織学的変化、高濃度のＩｇＧ、臓器非特異的抗体の出現、および免疫抑制治療に対する反応の存在を特徴とする疾患を引き起こす。したがって、移植後ｄｅ  ｎｏｖｏ肝炎と命名される（Ｋｅｒｋａｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）．Ｌａｎｃｅｔ，３５１，４０９−４１３；Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３０，５３−５７）。臨床的に他の種類の肝炎と区別することができないことから、移植後ｄｅ  ｎｏｖｏ肝炎の鑑別診断は困難であり、患者に不快感をもたらすこととなる生検を必要とする場合が多い。生検により、架橋壊死（門脈−門脈（ｐｏｒｔｏ−ｐｏｒｔａｌ）および門脈−中心静脈（ｐｏｒｔｏ−ｃｅｎｔｒａｌ））、小葉中心性損傷（ｃｅｎｔｒｉｌｏｂｕｌａｒ  ｄａｍａｇｅ）、および門脈周囲遮断（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎｓ）などの、稀な組織学的変化が明らかとなり、その他の血清学的、放射線学的、および分子生物学的データと合わせて、診断を確認する手助けとなる（Ｓａｌｃｅｄｏ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ（２００２）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３５，３４９−３５６）。その発生を制御するメカニズムは未知であるが、種々の研究により、移植後ｄｅ  ｎｏｖｏ肝炎が、ドナーの臓器中で発現される抗原に対する同種免疫タイプの反応によって引き起こされるとする仮説が支持されている（Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２６，５３５−５３９；Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）．Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ，１０，１１６６−１１７２；Ｒｏｄｒiｇｕｅｚ−Ｍａｈｏｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２００７）．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，８３，１１２６−１１２９）。このように、この新しい病態の発症において重要な役割を担っていると考えられ、アロゲン（ａｌｌｏｇｅｎ）として作用するタンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＴ１（ＧＳＴＴ１）が同定された。ＧＳＴＴ１は細胞解毒作用に関与する酵素であり、赤血球、肝臓、腎臓、およびその他の組織中での発現レベルが高い。このタンパク質は、ポジティブ対立遺伝子またはヌル対立遺伝子の２つの対立遺伝子を有する単純な多型遺伝子によってコードされ、コーカサス集団の２０％、およびその他の人種の個人の１１〜５８％に存在しないことが説明される（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ（２０００）．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０，５５７−５６５；Ｌａｎｄｉ，Ｓ．，（２��００）．Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ，４６３，２４７−２８３）。肝臓移植を受けた患者のうち、移植後ｄｅ  ｎｏｖｏ肝炎に典型的な臨床的症状および分析による徴候が見られる患者の研究により、ＧＳＴＴ１に対する抗体（抗ＧＳＴＴ１）が高いレベルで存在することが明らかとなっている。このようなケースの遺伝子分析により、ドナーはＧＳＴＴ１陽性であり、その結果として、移植された肝臓がこの酵素を発現することが示された。対照的に、レシピエント患者はＧＳＴＴ１遺伝子を欠いていた（Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２６，５３５−５３９；Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）．Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ，１０，１１６６−１１７２；Ｒｏｄｒiｇｕｅｚ−Ｍａｈｏｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２００７）．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，８３，１１２６−１１２９）。この研究は、移植後ｄｅ  ｎｏｖｏ肝炎の同種免疫の仮説を強固にするものであり；ＧＳＴＴ１の不適合性がその発症の基本的要素として示されており、移植拒絶反応マーカーとして抗ＧＳＴＴ１抗体が示唆されている。さらに、実質臓器の移植を受けたことはないが、かつて輸血が必要であったか、または妊娠をした患者において、抗ＧＳＴＴ１抗体の存在が実証された（Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３７，１４５７−１４５８；Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）．Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ，４６，３４５−３５０；Ｗｉｃｈｍａｎｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４６，１５０５−１５０９）。このような患者のうちの何人かの場合には、ＧＳＴＴ１に対する抗体の出現と同種免疫反応の発生との間に、有害な臨床的症状との相関があることが確認された（Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００７）．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，６９，３９６）。
【０００４】
現存の抗ＧＳＴＴ１抗体の検出方法には、間接免疫蛍光試験およびウェスタンブロット試験で構成されている（Ｒｏｄｒiｇｕｅｚ−Ｄiａｚ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３８，１４６７−１４７０；Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３７，３９６８−３９６９）。間接免疫蛍光試験では、分析サンプルの種々の希釈物を、特異的抗原を有する細胞または組織と接触させ、スライド上に固定する。このように、サンプル中に存在する抗体は、スライド上に曝露された抗原と結合し、抗原−抗体複合体を形成する。このような複合体の検出は、フルオレセインで標識した他のヒト抗免疫グロブリン抗体との結合、および得られた蛍光の顕微鏡による観察によって行われる。顕微鏡により肉眼で視認可能である蛍光を発生させることができるサンプルの最大希釈を、抗体数（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｕｎｔ）とする（Ｗｈｅａｔｌｅｙ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ（１９９８）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，５７，３１３−３３２）。ウェスタンブロット試験では、分析サンプルを、特異的抗原を十分なレベルで発現することができるＧＳＴＴ１のｃＤＮＡを持つクローニングベクターで遺伝子組換えされた細菌からの細胞抽出物を含有するニトロセルロース膜またはポリフッ化ビニリデン膜に接触させる。この場合、形成された抗原−抗体複合体の検出は、酵素、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼと融合したその他の抗体との結合によって行われ、これにより特異的な基質の存在下にて、比色反応または化学発光反応が起こる。結果は、膜中にて反応の有無に応じて、抗体に対する陽性または陰性として解釈される（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１５，８８−９８）。間接免疫蛍光およびウェスタンブロットの技術はともに、抗体の検出に有効である。しかし、これらは半定量的であり、複雑であり、自動化が容易ではなく、労力を要する分析方法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第一の目的は、ヒトＧＳＴＴ１に対する抗体（抗ＧＳＴＴ１）を生体液中で検出するための免疫学的分析方法であって、
（ａ）抗原特性マーカーであるｈＧＳＴＴ１組換えタンパク質を異種生物中で発現および精製する段階；
（ｂ）抗原特性マーカーである前記ｈＧＳＴＴ１組換えタンパク質を支持体に中に固定化する段階；
（ｃ）生体液中に存在し、前記ｈＧＳＴＴ１組換えタンパク質に対する特異性を有する抗体が、該物質と結合して抗原−抗体複合体を形成する条件下において、抗原特性に対するマーカーである前記ｈＧＳＴＴ１組換えタンパク質を前記試験生体液と接触させる段階；
（ｄ）前記抗原−抗体複合体から、非結合抗体および前記生体液のその他の成分を分離する段階；
（ｅ）ポジティブコントロールによって定められた抗ＧＳＴＴ１抗体の量と正に相関する、生体液中で検出された抗原−抗体複合体の量を測定する段階
を含む方法。
【０００６】
ｈＧＳＴＴ１組換えマーカータンパク質は、少なくとも５個のヒスチジンアミノ酸を有するポリペプチド配列と融合されて、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製が可能となり、微生物中、特に、ｐｃＡＳＢ−ＧＳＴＴ１プラスミドを有する大腸菌株の中で自身を発現する。
【０００７】
前記ｈＧＳＴＴ１組換えマーカータンパク質が固定化される支持体は、前記固定化およびそれに続く抗ＧＳＴＴ１抗体の結合分析を可能とする任意の表面であり、好ましくは、マルチウェル培養プレートのウェル、ナイロン膜、セルロースフィルター、ニトロセルロース膜、着色マイクロ粒子、蛍光マイクロ粒子、ガラス表面、または金属支持体である。ｈＧＳＴＴ１組換えマーカータンパク質および抗ＧＳＴＴ１抗体の固定化のための支持体は、平坦な表面上のポリペプチドマイクロマトリックスである。
【０００８】
抗原−抗体複合体の検出段階は、ＥＬＩＳＡ法によるウェスタンブロットを用いて、またはｈＧＳＴＴ１組換えマーカータンパク質でコーティングしたコード化マイクロ粒子によって行うことができる。
【０００９】
さらに、本発明の目的は、生体液中における抗ＧＳＴＴ１抗体の存在に関連する病理学的状態の診断、生体液中における抗ＧＳＴＴ１抗体の存在に関連する病理学的状態の発症の予後、または生体液中における抗ＧＳＴＴ１の存在に関連する状態の経過観察およびモニタリングのための、ＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中にて検出するための免疫学的分析方法の使用である。
【００１０】
抗ＧＳＴＴ１の存在が検出される生体液は、血液派生物であり、病理学的状態は、移植されたもの（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、移植片（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、または輸液由来の、細胞、組織、または臓器の拒絶反応であり、移植された臓器が肝臓、腎臓、心臓、骨髄、またはｈＧＳＴＴ１配列が発現されるその他の任意の臓器である場合に特に適しており、移植された臓器が肝臓もしくは腎臓であり、ｈＧＳＴＴ１タンパク質を発現するドナーから輸血または任意の血液派生物の移植を受けた患者の場合により適している。
【００１１】
最後に、本発明の目的はまた、ｈＧＳＴＴ１に対する抗体を生体液中で検出するための免疫学的分析方法を実施するためのツールキットである。キットには以下のものが含まれる：
ａ）ｈＧＳＴＴ１組換え抗原特性マーカータンパク質が固定化された支持体、
ｂ）前記ｈＧＳＴＴ１組換え抗原特性マーカータンパク質が固定化された支持体と接触させた場合に、血清サンプル中の抗ｈＧＳＴＴ１抗体の結合を可能とする指示分子、好ましくは、酵素、フルオロフォア、着色マイクロ粒子、または蛍光マイクロ粒子と結合したヒト抗ＩｇＧ二次抗体、
ｃ）前記ヒトＩｇＧ二次抗体と結合した前記指示分子の活性を検出するための手段、
ｄ）抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含むヒトコントロール血清、
ｅ）ヒト抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含まないヒトコントロール血清。
【００１２】
好ましくは、キットは、以下のものを含む：
ａ）ＥＬＩＳＡ法を用いた抗原−抗体複合体の検出に適し、各ウェル中にｈＧＳＴＴ１組換え抗原特性マーカータンパク質が固定化されたマルチウェルプレート、
ｂ）ペルオキシダーゼと結合したヒト抗ＩｇＧ二次抗体のバイアル、
ｃ）ペルオキシダーゼ酵素活性指示基質、好ましくは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、を有するバイアル、
ｄ）抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含むヒト血清の希釈サンプルからなるポジティブコントロール、
ｅ）抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含まないヒト血清の希釈サンプルからなるネガティブコントロール、
ｆ）分析サンプル、結合二次抗体、コントロール、および対応する酵素指示基質の希釈を行うための緩衝溶液。
【００１３】
もしくは、キットは、以下のものを含む：
ａ）ＥＬＩＳＡ法を用いた抗原−抗体複合体の検出に適し、各ウェル中にｈＧＳＴＴ１組換え抗原特性マーカータンパク質が固定化されたマルチウェルプレート、
ｂ）アルカリホスファターゼと結合したヒト抗ＩｇＧ二次抗体のバイアル、
ｃ）アルカリホスファターゼ酵素活性指示基質、好ましくはｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム、を有するバイアル、
ｄ）抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含むヒト血清の希釈サンプルからなるポジティブコントロール、
ｅ）抗ｈＧＳＴＴ１抗体を含まないヒト血清の希釈サンプルからなるネガティブコントロール、
ｆ）分析サンプル、結合二次抗体、コントロール、および対応する酵素指示基質の希釈を行うための緩衝溶液。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトＧＳＴＴ１組換えタンパク質の精製の分析を示す図である。Ｍ、分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ）；１、培地の不溶性タンパク質；２、培地の可溶性タンパク質；３、カラムに保持されなかったタンパク質；４、５、および６、それぞれ、１回目、２回目、および３回目の洗浄で排出されたタンパク質；７〜１８、イミダゾール勾配での連続溶出。
【図２】ウェスタンブロット試験による抗ＧＳＴＴ１抗体の検出を示す図である。Ｍ、分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ）；１〜６、種々の量のヒトＧＳＴＴ１組換え体：それぞれ、５００ｎｇ、１０００ｎｇ、２００ｎｇ、４０ｎｇ、８ｎｇ、および１．６ｎｇ。
【図３】間接ＥＬＩＳＡタイプの試験による抗ＧＳＴＴ１抗体の検出を示す図である。１および２、抗ＧＳＴＴ１抗体（ＧＳＴＴ１）を含むサンプル；３および４、ＧＳＴＴ１抗体を含まないサンプル（コントロール）；５、核抗原に対する抗体（ＡＮＡ）を含むサンプル；６、抗ＨＬＡクラスＩ抗体（ＨＬＡ−Ｉ）を含むサンプル；７、抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体（ＨＬＡ−ＩＩ）を含むサンプル；８、抗ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ抗体（ＨＬＡ−Ｉ／ＨＬＡ−ＩＩ）を含むサンプル。示したデータは、分析した各サンプルあたり、３つの値の平均値に相当する。
【図４】肝臓移植を受けた患者における拒絶反応に対するマーカーの検出を示す図である。１〜８、表１に示す、分析サンプル；９、＋コントロール；１０、−コントロール。示したデータは、分析した各サンプルあたり、３つの値の平均値に相当する。
【図５】腎臓移植を受けた患者における拒絶反応に対するマーカーの検出を示す図である。１〜８、表２に示す、分析サンプル；９、＋コントロール；１０、−コントロール。示したデータは、分析した各サンプルあたり、３つの値の平均値に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ヒトＧＳＴＴ１配列を発現するドナーから前記配列を持たない移植患者へ移植された異種細胞群の拒絶反応を診断するための、微生物、好ましくは大腸菌で発現され単離されたヒトＧＳＴＴ１の使用に関する。前記細胞群は、組織であっても臓器であってよく、好ましくは肝臓もしくは腎臓に関連するものであり、または血液のような生体液の一部であってもよい。拒絶反応は、移植を受けた個体の血清中におけるｈＧＳＴＴ１ポリペプチド配列と結合する抗体の存在によって検出されることがある。ｈＧＳＴＴ１に対する抗体の存在を決定する診断メカニズムは、マルチウェルプレートのウェル、膜、蛍光、着色、および／もしくは磁気マイクロ粒子であってよい表面へ単離された前記ポリペプチド配列を固定化すること、または、移植を受けた個体の血清抗体の結合の検出を可能とする免疫学的試験において通常実施されるその他のいずれかのタイプの固定化であろう。好ましくは、前記試験は、希釈されたヒト血清のサンプルが配置され、結果的に酵素、および比色基質または蛍光基質と結合したヒト抗ＩｇＧ抗体となる、ウェルへ接着されたＧＳＴＴ１タンパク質を有するマルチウェルプレートを含むＥＬＩＳＡキットを用いて行われるべきである。
【００１６】
本発明の目的は、移植片の拒絶反応に対するマーカーであるヒトＧＳＴＴ１に対する抗体もしくは抗ＧＳＴＴ１の検出のための組換えポリペプチド物質の使用、および前記拒絶反応の診断およびモニタリングにおけるこれらの適用を含む。本発明の目的である前記方法は、ヒトＧＳＴＴ１組換え体の使用が、表面に固定化された抗原として特徴付けられていることから、いくつかの科学刊行物に記載されている現存の方法（Ｒｏｄｒiｇｕｅｚ−Ｄiａｚ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３８，１４６７−１４７０）を改良するものであり、免疫学的試験および市販のシステムにおける使用の可能性の範囲を広げるものである。
【００１７】
具体的には、本発明は、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓｔａｇ）を有する組換えポリペプチド物質であるヒトＧＳＴＴ１タンパク質の使用について記載するものであり、該タンパク質は、微生物、好ましくは大腸菌中にて大量に産生され、これまでの最新技術で用いられるものについて改変され、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）法により精製される。
【００１８】
本発明の目的の最も新規な特徴は、以下の点にまとめることができる：
１．移植片の拒絶反応に対するマーカーとしての抗ＧＳＴＴ１抗体の検出を、患者からの生物学的サンプル中で、好ましくは血清の形態で行うことができる。
２．ヒト抗ＧＳＴＴ１抗体の検出のための抗原として単離ヒトＧＳＴＴ１組換え体（高純度）を使用することにより、細菌に由来するその他のタンパク質に対するその他の抗体との非特異的反応のリスクが最小限に抑えられ、したがって、分析されたサンプルの解釈において偽陽性および誤差の出現が回避される。
３．抗ＧＳＴＴ１抗体検出のための、感度が良く、短時間であり、容易に再現可能であり、自動化も可能であり、多数のサンプルの同時分析さえ可能とするメカニズムの開発を容易にする目的で、本発明は、本技術分野の任意の技術に対する種々の通常の免疫学的試験で単離されたヒトＧＳＴＴ１組換え体の使用を含む。分析のタイプに応じて：
ｉ）単離されたヒトＧＳＴＴ１（ｒｈＧＳＴＴ１）組換え体が、以下のいずれかの表面上に固定化する：
（ａ）ＥＬＩＳＡ試験用には、既に様々な製造元から市販されている種々のポリマー製のマルチウェルプレート上に固定化される。
（ｂ）ウェスタンブロット、ドットブロット試験、または免疫クロマトグラフィストリップ試験用には、紙、または、ニトロセルロースなどのセルロース誘導体、またはポリフッ化ビニリデンもしくはナイロンなどのその他のポリマー化合物から作られた膜の上に固定化される。
（ｃ）ルミネックスタイプの試験、または流体マトリックス上の多重試験に基づくその他の技術用には、ポリスチレンもしくはシリコーン、またはコポリマーなどの種々のポリマー化合物のマイクロ粒子またはナノ粒子上に固定化される。
（ｄ）クロマトグラフィ支持体または電気泳動ゲル中での相互作用試験用には、セルロース、ポリアクリルアミド、またはアガロースなどのポリマー中に固定化される。
（ｅ）バイオセンサー、スライドグラス上でのマイクロマトリックス、およびその他の種類の高度な免疫学的試験用には、タンパク質の固定化を可能とするその他の表面を用いることができる。
ｉｉ）分析サンプルを前記表面と接触させ、それによって、サンプルの抗ＧＳＴＴ１抗体が、曝露されたヒトＧＳＴＴ１組換え体と結合し、抗原−抗体複合体が形成される。
ｉｉｉ）前記抗原−抗体複合体は、以下のような免疫学的試験における通常の技術を用いて検出される：
（ａ）顕微鏡、スキャナー、フローサイトメーター、またはバイオテクノロジーにおいて通常用いられるその他の装置によって検出可能である、蛍光分子と、または蛍光産物、発光産物、もしくは燐光産物を生じる酵素と結合させたその他の抗体のヒト抗体定常領域に結合すること。
（ｂ）特異的基質の存在下で、比色反応、蛍光反応、または化学発光反応を起こすアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素と結合したその他の抗体のヒト抗体定常領域に結合すること（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１５，８８−８９）。
ｉｖ）抗原−抗体複合体の検出は、分析されたサンプル中の抗ＧＳＴＴ１抗体の存在を示すものである。
【実施例】
【００１９】
実施例１．ヒトＧＳＴＴ１組換え体の産生および精製
本実施例は、ヒトＧＳＴＴ１組換えタンパク質を単離された形で得ることができる方法について述べる。プラスミドを構築して、６−Ｈｉｓタグに結合したヒトＧＳＴＴ１タンパク質を細菌中にて発現させる。これを用いて、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ法（ＩＭＡＣ）によるヒトＧＳＴＴ１組換え体の産生および精製を行うことができる。
【００２０】
細菌中における発現のプラスミドの構築は、以下のようにして行う。まず、Ｕｎｉ−Ｚａｐ  ＸＲベクター発現ライブラリーのスクリーニングによって得られたクローンから（Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００１）．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２６，５３５−５３９）、ＧＳＴＴ１酵素をコードする配列を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）、ならびにプライマーとして、オリゴヌクレオチド、ＣＬＯＮＴ１−Ｆ（配列番号１）およびＣｌｏｎｔ１−Ｒ（配列番号２）を用い、ＰＣＲを用いて増幅する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ０００８５３）。得られたＰＣＲ産物を、ＢａｎＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化し、得られた断片を、同一の酵素で既に消化しておいたｐｃＡＳｂプラスミド(ｗｗｗ．ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ．ｃｏｍ）中へクローン化する。このようにして、Ｈｉｓタグに結合したヒトＧＳＴＴ−１組換え体を発現するｐｃＡＳＢ−ＧＳＴＴ１プラスミドが得られる。
【００２１】
続いて、ヒトＧＳＴＴ１組換え体を精製するために、ｐｃＡＳＢ−ＧＳＴＴ１プラスミドを市販の細菌株ＲＥＧ−１（Ｂｉｏｍｅｄａｌ、品番ＢＳ−３２６２）へ形質転換する。この形質転換体を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地中の培養物を作製し、６００ｎｍでの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）が０．８〜１．０に達するまで３７℃でインキュベートして振とうし、続いて、２ｍＭのサリチル酸塩の存在下にて、３０℃でさらに４時間インキュベートして振とうする。４℃、５０００ｇでの１０分間の遠心分離によって細胞を回収し、０．２５ｍｇ／ｍｌ／リゾチームを添加した市販の溶解液ＰＲＯＬＹＳＥ  １×（Ｂｉｏｍｅｄａｌ、品番ＲＳ−３４０６）の溶液中に再懸濁する。得られた懸濁液を環境温度にて１５分間インキュベートし、定期的に振とうし；−８０℃で１時間凍結させ、これを３７℃にて解凍した後、氷中にて複数の超音波パルスにより超音波処理する。４℃、９０００ｇでの１０分間の遠心分離によって細胞残留物を除去した後、培養物の可溶性タンパク質と共に上清を除去する。これを、５０ｍＭ  ｐＨ８．０  リン酸カリウムバッファー、１．５Ｍ  ＮａｃＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭ  イミダゾールからなるカラム平衡バッファーの６カラム容量分で予備平衡化を行ったＩＭＡＣ樹脂カラム（ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ（商標）カートリッジ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に２回通す。次に、２０カラム容量分のカラム平衡バッファーでカラムを３回洗浄する。最後に、５０ｍＭ  ｐＨ８．０  リン酸カリウムバッファー、１．５Ｍ  ＮａｃＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなるバッファーの１カラム容量分を、イミダゾールの濃度を２０ｍＭから３００ｍＭまで次第に増加させながら繰り返しアプライすることにより、ヒトＧＳＴＴ１組換えタンパク質を溶出する。精製の結果は、クーマシーによって染色した１２％のアクリルアミドゲル中のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し（図１）、溶出物の純度を、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定する。作製された量（培養物１リットルあたりの精製タンパク質８．２８ｍｇ）および高い純度（９６％超）の両方により、このヒトＧＳＴＴ１組換え体を種々のタイプの試験へ適用することが可能となり、細菌由来のその他のタンパク質との非特異的反応のリスクが最小限に抑えられる。
【００２２】
実施例２．ウェスタンブロットタイプの試験にて精製されたヒトＧＳＴＴ１組換え体を抗原として用いた抗ＧＳＴＴ１抗体の検出方法
以下の実施例は、抗ＧＳＴＴ１抗体の存在を検出することができる方法を示すものである。このために、実施例１に記載したヒトＧＳＴＴ１組換え体を抗原として用いたウェスタンブロットタイプの試験を行う。
【００２３】
種々の量のヒトＧＳＴＴ１組換えタンパク質について、１２％アクリルアミドでのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに掛ける。次に、ゲルのタンパク質を、セミドライ転写システム（ＳＶ２０−ＳＤＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてポリフッ化ビニリデン膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ転写する。蒸留水で膜を２回、５分間洗浄した後、１時間または２時間環境温度にて乾燥させる。次に、膜を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０から成り０．５％スキムミルクを添加したバッファーにて１：１００に希釈した抗ＧＳＴＴ１抗体を含有する血清サンプルと共に、４℃で一晩インキュベートする。膜を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる洗浄バッファーで５分間、３回洗浄した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌから成り０．５％スキムミルクを添加したバッファーにて１：１０００に希釈した抗ヒトＩｇＧ−ＡＰ結合抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）の溶液と共に、１時間環境温度にてインキュベートする。最後に、膜をさらに洗浄バッファーにより５分間、３回洗浄した後、膜上に形成された抗原−抗体複合体を、比色基質（ＳＩＧＭＡ−ＦＡＳＴ−ＢＣＩＰ／ＮＢＴシステム、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって出現させる。この試験の結果を図２に示す。理解することができるように、非常に少量（４０ｎｇ）のヒトＧＳＴＴ１組換え体から、サンプルは反応し、陽性シグナルを発生させることができる。
【００２４】
実施例３．ヒトＧＳＴＴ１組換え体を抗原としてＥＬＩＳＡタイプの試験に用いた、抗ＧＳＴＴ１抗体検出のための装置の開発
本実施例は、ＥＬＩＳＡタイプの試験（酵素結合免疫吸着アッセイ）に基づいて、マルチウェルプレートの表面上に固定化された実施例１で記載したヒトＧＳＴＴ１組換え体を用いることによって、抗ＧＳＴＴ１抗体の検出を可能とする装置の作製方法について述べる。
【００２５】
まず、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなるバッファー中に溶解した１μｇ／ｍｌのヒトＧＳＴＴ１組換え体の溶液を調製する。次に、１００μｌのこのＧＳＴＴ１溶液、および１００μｌの１００ｍＭ  ｐＨ９．６  炭酸ナトリウムバッファーを、マルチウェルプレート（Ｍａｒｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート、Ｎｕｎｃ）の各ウェルへ添加する。次に、このプレートを３７℃で１時間、続いて４℃で一晩、最後に３７℃で３０分間インキュベートする。内容物を除去した後、ウェルを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０からなる洗浄バッファーの３００μｌで２回洗浄し、各洗浄では、環境温度にて５分間のインキュベーションを行い、最後にはウェル内に液体が残留していないことを確認する必要がある。次に、洗浄バッファーに溶解した５％スキムミルクからなるブロッキング溶液の３００μｌを各ウェルに添加し、プレートを環境温度にて１時間または２時間インキュベートする。その間に、以下の抗体を含有するヒト血清サンプルのブロッキング溶液中での１：５００希釈物を調製する：
・抗ＧＳＴＴ１抗体（ＧＳＴＴ１）
・核抗原に対する抗体（ＡＮＡ）
・抗ＨＬＡクラスＩ抗体（ＨＬＡ−Ｉ）
・抗ＨＬＡクラスＩ抗体（ＨＬＡ−ＩＩ）
・抗ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ抗体（ＨＬＡ−Ｉ／ＨＬＡ−ＩＩ）
・抗体を含まないサンプル（コントロール）
【００２６】
内容物を除去した後、１００μｌの希釈サンプルをウェルへ添加し、プレートを環境温度にて１時間インキュベートする。内容物を除去した後、ウェルを３００μｌの洗浄バッファーで５回洗浄し、ウェル内に液体が残留していないことを確認する。次に、ブロッキング溶液で１：５０００に希釈した抗ヒトＩｇＧ−ＡＰ抗体結合体（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む溶液の１００μｌを各ウェルへ添加し、プレートを環境温度にて１時間インキュベートする。内容物を除去した後、ウェルを３００μｌの洗浄バッファーで５回洗浄し、ウェル内に液体が残留していないことを確認する。次に、１００ｍＭ  グリシン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＺｎＣｌ2  ｐＨ１０．４からなるバッファーに溶解した１μｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む溶液の１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを環境温度で１時間暗所にてインキュベートする。各ウェルへ２５μｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨを添加して反応を停止させた後、４０５ｎｍの波長での吸光度の読み取りを行う。この試験の結果を図３に示す。理解されるように、得られた吸光度の値から、抗ＧＳＴＴ１抗体を含有するサンプル（ＧＳＴＴ１）と抗ＧＳＴＴ１抗体を含有しないサンプル（コントロール）との間に著しい差（最大５倍までの増加）があることが分かる。さらに、ＥＬＩＳＡ試験では、その他のタイプの非ＧＳＴＴ１抗体（ＡＮＡ、ＨＬＡ−Ｉ、ＨＬＡ−ＩＩ、およびＨＬＡ−Ｉ／ＨＬＡ−ＩＩ）を含むサンプルとの非特異的反応または交差反応が生じず、この方法の高い特異性を示している。
【００２７】
実施例４．ＥＬＩＳＡタイプの試験を用いた抗ＧＳＴＴ１抗体の検出による、肝臓移植片に対する拒絶反応の診断
本実施例は、マルチウェルプレートに固定化されたヒトＧＳＴＴ１組換え体を用いるＥＬＩＳＡタイプの装置が、肝臓移植片に対する拒絶反応を有する患者の診断および経過観察を、同種免疫反応マーカー、抗ＧＳＴＴ１抗体の検出によって可能とする方法を示すものである。
【００２８】
表１に示す、間接免疫蛍光法および／またはウェスタンブロット法で測定された種々の抗ＧＳＴＴ１抗体数を有する肝臓の移植を受けた患者からの一連のヒト血清は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｏｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｉｒｇｅｎ  ｄｅｌ  Ｒｏｃiｏ（スペイン、セビリア）から提供され、実施例３に記載するようなＥＬＩＳＡタイプの試験のサンプルとして用いる。抗ＧＳＴＴ１抗体を含有するサンプル（コントロール＋）および抗体を含有しない別のサンプル（コントロール−）を基準として用いる。
【００２９】
【表１】
2010540921.tif 000002
【００３０】
得られた結果を図４に示す。理解されるように、提案されたＥＬＩＳＡ試験は、非常に低い抗体数（１／４０）から抗ＧＳＴＴ１抗体の存在を検出することが可能である。さらに、抗ＧＳＴＴ１抗体を含有し、ウェスタンブロット分析では陰性と見なされるサンプル（サンプル７）は、ポジティブコントロールと類似の値を示している。このことは、現在利用可能である抗ＧＳＴＴ１抗体の検出についてのその他のシステムに対して、ＥＬＩＳＡ試験の感度が向上していることを示しており、これは、特に、天然の決定因子のみを認識するために、ウェスタンブロットでの偽陰性血清においても陽性を検出するためである。
【００３１】
実施例５．ＥＬＩＳＡタイプの試験を用いた抗ＧＳＴＴ１抗体の検出による腎臓移植に対する拒絶反応の診断
本実施例は、固定化されたヒトＧＳＴＴ１組換え体を有するマルチウェルプレートを用いるＥＬＩＳＡタイプのキットにより、同種免疫反応マーカーである抗ＧＳＴＴ１抗体の検出によって腎臓移植に対する拒絶反応を有する患者の診断および経過観察を可能とする方法を示すものである。
【００３２】
表２に示す、間接免疫蛍光法および／またはウェスタンブロット法（Ｗｉｃｈｍａｎｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４６，１５０５−１５０９；Ａｇｕｉｌｅｒａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３７，３９６８−３９６９）で測定された種々の抗ＧＳＴＴ１抗体数を有する腎臓の移植を受けた患者からの種々のヒト血清は、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｏｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｉｒｇｅｎ  ｄｅｌ  Ｒｏｃiｏ（スペイン、セビリア）から提供され、実施例３に記載するようなＥＬＩＳＡタイプの試験に用いる。抗ＧＳＴＴ１抗体を含有するサンプル（コントロール＋）および抗体を含有しない別のサンプル（コントロール−）を参照として用いる。
【００３３】
【表２】
2010540921.tif 000003
【００３４】
得られた結果を図５に示す。理解されるように、ＥＬＩＳＡ試験は、ウェスタンブロット分析では陰性と見なされる非常に低い抗体数（１／８０）から抗ＧＳＴＴ１抗体の存在を検出することが可能である。このことは、現在利用可能である抗ＧＳＴＴ１抗体の検出についてのその他のシステムに対して、ＥＬＩＳＡ試験の感度が向上されていることを示している。観察されるように、記載したＥＬＩＳＡ試験は、非常に低い抗体数（１／８０）から抗ＧＳＴＴ１抗体の存在を検出することができる。さらに、抗ＧＳＴＴ１抗体を含有し、ウェスタンブロット分析では陰性と見なされるサンプル（サンプル４、５、および６）は、ポジティブコントロールと類似の値を示している。このことは、現在利用可能である抗ＧＳＴＴ１抗体の検出についてのその他のシステムに対するＥＬＩＳＡ試験の感度の良さを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
バイオテクノロジーの通常の技術を用いることで、本発明は以下のものに用いることができる：
１．以下の技術に基づいて、抗ＧＳＴＴ１抗体の検出を可能とするキットまたは装置の設計：
ａ．ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）
ｂ．ウェスタンブロットまたはドットブロット
ｃ．免疫クロマトグラフィストリップ
ｄ．タンパク質マイクロアレイまたはアレイ（マイクロマトリックスまたはマトリックス）
ｅ．フローサイトメーター
ｆ．特異的磁気分離のための常磁性マイクロ粒子
ｇ．抗原−抗体結合を定量的な方法で検出するバイオセンサー
２．例えば以下に起因するものなど、同種免疫タイプの反応の診断およびモニタリングのための、これらの装置の臨床レベルでの使用：
ａ．ヒトＧＳＴＴ１を発現しない患者における、異種細胞、組織、または臓器の移植片の拒絶反応
ｂ．従来の反応によって説明されない、胎児もしくは新生児での溶血反応（経胎盤経路）、Ｒｈ不適合、または赤血球群がより少ない
ｃ．ＧＳＴＴ１対立遺伝子陽性の胎児を妊娠中のＧＳＴＴ１対立遺伝子陰性の母における不耐性のケース
ｄ．ＧＳＴＴ１対立遺伝子陰性の移植患者におけるＧＳＴＴ１血液派生物の投与に対する不耐性
【００３６】
配列表
配列番号１
長さ：２６ヌクレオチド
種類：ＤＮＡ
配列：
ａｔｇｇａｔｃｃａｔ  ｇｇｇｔｃｔｇｇａｇ  ｃｔｃｔａｃ      ２６
配列番号２
長さ：２６ヌクレオチド
種類：ＤＮＡ
配列：
ｇｔａａｇｃｔｔｔｃ  ａｃｃｇｇａｔｃａｔ  ｇｇｃｃａｇ      ２６
【図１】
2010540921.tif 000004
【図２】
2010540921.tif 000005
【図３】
2010540921.tif 000006
【図４】
2010540921.tif 000007
【図５】
2010540921.tif 000008
【配列表】
2010540921000001.xml
【国際調査報告】
2010540921.tif 000010
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