(57)【要約】  【解決手段】  目的タンパク質を送達するための組成物及びその方法が提供される。  【選択図】      図１Ａ
2010540411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者の神経障害を治療する方法であって、治療有効量の以下：
ａ）治療用ポリペプチドおよび前記治療用ポリペプチドの電荷と逆の少なくとも１つの電荷を含む合成ポリマーを含む少なくとも１つの複合体、および
ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリア、
を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記合成ポリマーが、少なくとも１つの非イオン性セグメントおよび少なくとも１つのポリイオンセグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記合成ポリマーが負に帯電し、前記治療用ポリペプチドがｐＨ７．４で正味の正電荷を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記合成ポリマーが正に帯電し、前記治療用ポリペプチドがｐＨ７．４で正味の負電荷を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリイオンセグメントが、ポリアルキレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリアルキレンアクリル酸、およびそのコポリマーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用ポリペプチドが、酵素、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記治療用ポリペプチドが中枢神経系治療活性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記治療用ポリペプチドおよび合成ポリマーが化学的に架橋している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記治療用ポリペプチドが、内分泌因子、成長因子、視床下部放出因子、神経栄養因子、パラクリン因子、神経伝達物質ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、エンドルフィン、ポリペプチドアンタゴニスト、ＣＮＳ細胞によって発現した受容体のアゴニスト、リソソーム蓄積症ポリペプチド、および抗アポトーシス性タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療用ポリペプチドが、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療用ポリペプチドが、ブチリルコリンエステラーゼ再賦活薬、アセチルコリンエステラーゼ再賦活薬、コリンエステラーゼ再賦活薬、有機リン酸塩のスカベンジャー、およびカルバミン酸塩インヒビターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの複合体が血液脳関門を通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
治療を必要とする患者の神経障害を治療する方法であって、治療有効量の以下：
ａ）治療用ポリペプチドおよび前記治療用ポリペプチドの電荷と逆の少なくとも１つの電荷を含む合成ポリマーを含む少なくとも１つの複合体を含む単離細胞、および
ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリア、
を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１４】
前記合成ポリマーが、少なくとも１つの非イオン性セグメントおよび少なくとも１つのポリイオンセグメントを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記合成ポリマーが負に帯電し、前記治療用ポリペプチドがｐＨ７．４で正味の正電荷を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記合成ポリマーが正に帯電し、前記治療用ポリペプチドがｐＨ７．４で正味の負電荷を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリイオンセグメントが、ポリアルキレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリアルキレンアクリル酸、およびそのコポリマーからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療用ポリペプチドが、酵素、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療用ポリペプチドが中枢神経系治療活性を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療用ポリペプチドおよび前記合成ポリマーが化学的に架橋している、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療用ポリペプチドが、内分泌因子、成長因子、視床下部放出因子、神経栄養因子、パラクリン因子、神経伝達物質ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、エンドルフィン、ポリペプチドアンタゴニスト、ＣＮＳ細胞によって発現した受容体のアゴニスト、リソソーム蓄積症ポリペプチド、および抗アポトーシス性タンパク質からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療用ポリペプチドが、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療用ポリペプチドが、ブチリルコリンエステラーゼ再賦活薬、アセチルコリンエステラーゼ再賦活薬、コリンエステラーゼ再賦活薬、有機リン酸塩のスカベンジャー、およびカルバミン酸塩インヒビターからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が血液脳関門を通過する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞を治療される前記患者から単離する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が免疫細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫細胞が、単球、マクロファージ、骨髄由来単球、樹状細胞、リンパ球、Ｔ細胞、好中球、好酸球、および好塩基球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫細胞が、単球およびマクロファージからなる群から選択される少なくとも１つの細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫細胞が骨髄由来の単球である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの目的のタンパク質および前記目的のタンパク質の電荷と逆の少なくとも１つの電荷を含む合成ポリマーを含む少なくとも１つの複合体を含む単離細胞。
【請求項３１】
前記合成ポリマーが、少なくとも１つの非イオン性セグメントおよび少なくとも１つのポリイオンセグメントを含む、請求項３０に記載の単離細胞。
【請求項３２】
前記細胞が免疫細胞である、請求項３０に記載の単離細胞。
【請求項３３】
前記免疫細胞が、単球、マクロファージ、骨髄由来単球、樹状細胞、リンパ球、Ｔ細胞、好中球、好酸球、および好塩基球からなる群から選択される、請求項３２に記載の単離細胞。
【請求項３４】
前記免疫細胞が、単球およびマクロファージからなる群から選択される、請求項３３に記載の単離細胞。
【請求項３５】
前記細胞が骨髄由来の単球である、請求項３３に記載の単離細胞。
【請求項３６】
前記目的のタンパク質が神経障害の治療用である、請求項３３に記載の単離細胞。
【請求項３７】
請求項３０に記載の少なくとも１つの細胞および少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリアを含む単離組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００７年５月１１日出願の米国特許仮出願第６０／９２８，８８４号および２００７年１２月５日出願の米国特許仮出願第６１／００５，４６３号の優先権を主張する。上記出願は、本明細書中で参照として組み込まれる。
【０００２】
本発明は、治療薬を患者、特に、中枢神経系（ＣＮＳ）に送達するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、生物学において最も制限される関門の１つである。多くの因子が相互に作用してこの制限的関門を生み出す。電子顕微鏡研究により、脳血管内皮細胞と他の内皮細胞修飾物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）との間の密着結合（例えば、飲作用の減少、細胞内窓（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）の欠如）が血漿限外濾過液の形成を阻止することが証明されている。ＢＢＢの酵素活性は、いくつかの物質、具体的にはモノアミンおよびいくつかの小ペプチドの侵入をさらに制限する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。飽和性血液脳関門排出系（ｐ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）など）も小分子および脂溶性物質の蓄積を防止する（非特許文献６；非特許文献７）。末梢因子（タンパク質結合／可溶性受容体、酵素分解、クリアランス、および組織による隔離など）も提示の制限によって物質がＢＢＢを通過する能力に影響を及ぼし、これらの因子は外因的に投与された物質に特に重要である（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂａｒａｎｃｚｙｋ−Ｋｕｚｍａ  ａｎｄ  Ａｕｄｕｓ（１９８７）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．，７：８０１−８０５
【非特許文献２】Ｈａｒｄｅｂｏ  ａｎｄ  Ｏｗｍａｎ（１９９０）Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＢＢ，ｐｐ．４１−５５（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ
【非特許文献３】Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ．（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６１：３３３−３４１
【非特許文献４】Ｂｒｏｗｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７０：６７５−６８０
【非特許文献５】Ｂｒｏｗｎｌｅｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９９３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６０：７９３−８０３
【非特許文献６】Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｍ．（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，４１：８１−９２
【非特許文献７】Ｓｃｈｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：２５１７−２５２４
【非特許文献８】Ｂａｎｋｓ  ａｎｄ  Ｋａｓｔｉｎ（１９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．２２３−  ２４２（Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．）Ｆｏｒｔ  ａｎｄ  Ｃｌａｉｒ，Ｐａｒｉｓ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に従って、患者の神経障害を治療する諸方法を提供する。これらの方法は、治療有効量のａ）治療用ポリペプチドおよび治療用ポリペプチドの電荷と逆の少なくとも１つの電荷を含む合成ポリマーを含む少なくとも１つの複合体、およびｂ）少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与する工程を含む。特定の実施形態では、合成ポリマーは、少なくとも１つの非イオン性セグメントおよび少なくとも１つのポリイオンセグメントを含む。さらに別の実施形態では、投与される複合体は、血液脳関門を通過する。
【０００６】
本発明の別の態様では、患者の神経障害を治療する諸方法は、治療有効量の治療用ポリペプチドおよび治療用ポリペプチドの電荷と逆の少なくとも１つの電荷を含む合成ポリマーを含む少なくとも１つの複合体を含む単離細胞、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与する工程を含む。特定の実施形態では、該合成ポリマーは、少なくとも１つの非イオン性セグメント、および少なくとも１つのポリイオンセグメントを含む。さらに別の実施形態では、投与される細胞は血液脳関門を通過する。該投与される細胞を、治療される患者から単離することができる。特定の実施形態では、該細胞は、免疫細胞（例えば、単球、またはマクロファージ、または骨髄由来単球、または樹状細胞、またはリンパ球、またはＴ細胞、または好中球、または好酸球、または好塩基球など）である。
【０００７】
本発明のさらに別の態様によれば、少なくとも１つの目的のタンパク質および該目的のタンパク質の電荷と逆の少なくとも１つの電荷を含む合成ポリマーを含む少なくとも１つの複合体を含む単離細胞を提供する。その細胞を含む組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、ポリペプチド−ポリイオン複合体構造（ナノザイムとも呼ばれる）の模式図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、種々のＺでの酵素／ポリイオン複合体のゲル遅延度アッセイ画像である。サンプルを、未変性条件下で（ＳＤＳなし）ポリアクリルアミドゲル（７．５％）のゲル電気泳動に供した。レーン１：酵素のみ；レーン２〜４：Ｚが漸増した（０．５、２、４）酵素／ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体。
【図１Ｃ】図１Ｃ〜Ｅは、種々の条件下でのカタラーゼ−ポリイオン複合体のキュムラント直径（図１Ｃ〜Ｅ）およびゼータ電位（図１Ｃ）の変化を示すグラフである。図１Ｃ：ＰＢＳ溶液中のＺ；図ＩＤ：イオン強度（Ｚ＝１、ｐＨ７．４）；図１Ｅ：ｐＨ（Ｚ＝１、［ＮａＣｌ］＝０．１５Ｍ）。
【図１Ｄ】図１Ｃ〜Ｅは、種々の条件下でのカタラーゼ−ポリイオン複合体のキュムラント直径（図１Ｃ〜Ｅ）およびゼータ電位（図１Ｃ）の変化を示すグラフである。図１Ｃ：ＰＢＳ溶液中のＺ；図ＩＤ：イオン強度（Ｚ＝１、ｐＨ７．４）；図１Ｅ：ｐＨ（Ｚ＝１、［ＮａＣｌ］＝０．１５Ｍ）。
【図１Ｅ】図１Ｃ〜Ｅは、種々の条件下でのカタラーゼ−ポリイオン複合体のキュムラント直径（図１Ｃ〜Ｅ）およびゼータ電位（図１Ｃ）の変化を示すグラフである。図１Ｃ：ＰＢＳ溶液中のＺ；図ＩＤ：イオン強度（Ｚ＝１、ｐＨ７．４）；図１Ｅ：ｐＨ（Ｚ＝１、［ＮａＣｌ］＝０．１５Ｍ）。
【図１Ｆ】図１Ｆはカタラーゼ−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）のＴＥＭ画像である。バーは１００ｎｍを示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ポリイオン複合体中のカタラーゼの酵素活性を示すグラフである。種々のＺを有するポリイオン複合体中のカタラーゼ活性を、過酸化水素分解比によって決定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。カタラーゼのみと比較したカタラーゼ−ポリイオン複合体活性の統計的有意性を、アスタリスクで示す：（＊）Ｐ<０．０５。カタラーゼの酵素活性は広範なブロックコポリマーで変化せず、Ｚ＝５０のみで有意に減少した。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体のゲル電気泳動アッセイの画像である。レーン番号は、表１中のサンプル番号に対応している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々の組成でのＨｏｒ  ＢＣｈＥのみおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体のゲル電気泳動アッセイの画像である。レーン番号は、表２中のサンプル番号に対応している。
【図３】図３は、種々のＺ＋／−において（○）Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）および（■）Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）混合物中で形成された粒子の直径を示すグラフである。ＢＣｈＥ濃度は０．１５ｍｇ／ｍｌであった（２３℃、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））。
【図４Ａ】図４Ａは、種々の希釈度での、（Ａ）Ｈｏｒ  ＢＣｈＥのみ、および（Ｂ）Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（７）複合体（Ｚ＋／−＝１０．３）のゲル電気泳動アッセイの画像である。Ｈｏｒ  ＢＣｈＥの初濃度は０．１６７ｍｇ／ｍｌであった。
【図４Ｂ】図４Ｂは、種々の希釈度（１：１０００、１：５０００、および１：２５０）での、（Ａ）Ｈｕ  ＢＣｈＥのみ；（Ｂ）非架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−  ＰＥＯ（２）複合体（Ｚ＋／−＝１．２）；および（Ｃ）架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥ０（２）複合体（Ｚ＋／−＝１．２；架橋比８５％）のゲル電気泳動アッセイの画像である。Ｈｕ  ＢＣｈＥの初濃度は０．１５ｍｇ／ｍｌであった。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、種々の希釈度：１０００倍、５００倍、および２５０倍でのＨｕ  ＢＣｈＥのみ（レーンＡ）；非架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（レーンＢ）（Ｚ＋／−＝１．２）；および架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（レーンＣ）（Ｚ＋／−＝１．２）のゲル電気泳動アッセイの画像を示す。架橋比は、それぞれ、図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃで８５％、４０％、および２０％であった。Ｈｕ  ＢＣｈＥの最終濃度は０．１５ｍｇ／ｍｌであった。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、種々の希釈度：１０００倍、５００倍、および２５０倍でのＨｕ  ＢＣｈＥのみ（レーンＡ）；非架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（レーンＢ）（Ｚ＋／−＝１．２）；および架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（レーンＣ）（Ｚ＋／−＝１．２）のゲル電気泳動アッセイの画像を示す。架橋比は、それぞれ、図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃで８５％、４０％、および２０％であった。Ｈｕ  ＢＣｈＥの最終濃度は０．１５ｍｇ／ｍｌであった。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、種々の希釈度：１０００倍、５００倍、および２５０倍でのＨｕ  ＢＣｈＥのみ（レーンＡ）；非架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（レーンＢ）（Ｚ＋／−＝１．２）；および架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（レーンＣ）（Ｚ＋／−＝１．２）のゲル電気泳動アッセイの画像を示す。架橋比は、それぞれ、図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃで８５％、４０％、および２０％であった。Ｈｕ  ＢＣｈＥの最終濃度は０．１５ｍｇ／ｍｌであった。
【図６】図６は、５００倍希釈での種々の架橋比の架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（Ｚ＋／−＝１．２）のゲル電気泳動アッセイの画像である。Ｈｕ  ＢＣｈＥの最終濃度は０．１５ｍｇ／ｍｌであった。
【図７】図７は、ＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体を静脈内注射したマウスの画像を示す。ＩＶＩＳ  ２００画像化システムを使用して、６８０標識ＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体の静脈内（尾静脈）注射後の種々の時間間隔においてマウス中のＡｌｅｘａ  ６８０蛍光を検出した。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、それぞれＨｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体およびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体のゲル電気泳動アッセイの画像を示す。該レーン番号は、表９中に示すサンプル番号に対応している。Ｈｕ  ＢＣｈＥおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥの濃度は０．１５ｍｇ／ｍｌであった。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、それぞれＨｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体およびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体のゲル電気泳動アッセイの画像を示す。該レーン番号は、表９中に示すサンプル番号に対応している。Ｈｕ  ＢＣｈＥおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥの濃度は０．１５ｍｇ／ｍｌであった。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、それぞれＺ＋／−＝１．０またはＺ＋／−＝２．０、架橋比４０％での架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体のゲル電気泳動アッセイの画像である。レーンＡは、Ｈｕ  ＢＣｈＥのみである。レーンＢは、非架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体である。レーンＣは、架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体である。レーンＤは、Ｈｏｒ  ＢＣｈＥのみである。レーンＥは、非架橋Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体である。レーンＦは架橋Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体である。ＢＣｈＥの最終濃度は０．０００３ｍｇ／ｍｌであった。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、それぞれＺ＋／−＝１．０またはＺ＋／−＝２．０、架橋比４０％での架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体のゲル電気泳動アッセイの画像である。レーンＡは、Ｈｕ  ＢＣｈＥのみである。レーンＢは、非架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体である。レーンＣは、架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体である。レーンＤは、Ｈｏｒ  ＢＣｈＥのみである。レーンＥは、非架橋Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体である。レーンＦは架橋Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体である。ＢＣｈＥの最終濃度は０．０００３ｍｇ／ｍｌであった。
【図１０】図１０は、ＢＭＭにおけるポリペプチド−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）または対応するＰＥＩ−ＰＥＧ濃縮物の細胞傷害性を示すグラフである。細胞を、種々の濃度のポリペプチド−ポリイオン複合体またはブロックコポリマーと２４時間インキュベートし、洗浄し、新鮮な培地中にて３７℃で４８時間インキュベートした。細胞生存を、スルホローダミン−Ｂ（ＳＲＢ）アッセイによって決定した。Ｍｉｃｒｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｒｅａｄｅｒ  ＢＴ２０００にて４９０ｎｍの吸光度を測定し、得られた値を、ポリペプチド−ポリイオン複合体を添加しなかったコントロール細胞について得られた値に対する比率として示した。全ての測定を８回繰り返した。ＢＭＭにおけるカタラーゼのみまたはカタラーゼとＰＥＩ−ＰＥＧとのポリイオン複合体の細胞傷害効果は認められなかった。
【図１１Ａ】図１１Ａは、単球における「裸の（ｎａｋｅｄ）」カタラーゼおよびカタラーゼ−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）の蓄積速度のグラフである。細胞を、種々の時点でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識酵素または酵素−ポリイオン複合体で処理した。インキュベーション後、細胞内容物を回収し、蛍光分光光度計（λｅｘ＝５８０ｎｍ、λｅｍ＝６１７ｎｍ）によって蛍光量を測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、種々のＺでのＢＭＭ中のカタラーゼ−ポリイオン複合体蓄積を示す棒グラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＢＭＭ中のＲＩＴＣ標識カタラーゼ−ポリイオン複合体の細胞内局在の画像を示す。カバーガラス上で増殖させた細胞に、カタラーゼ／ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体（Ｚ＝１）を２４時間ロードした。インキュベーションした後、該細胞を固定し、Ｆ−アクチン特異的オレゴングリーン４８８ファロイジンおよび核染色剤ＴｏＰｒｏ−３で染色した。共焦点蛍光顕微鏡システムＡＣＡＳ−５７０によって画像を得た。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＢＭＭからのカタラーゼ−ポリイオン複合体の放出プロフィールを示すグラフである。細胞にカタラーゼ／ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体（Ｚ＝１）を１時間ロードし、ＰＢＳで洗浄し、種々の時間間隔で無カタラーゼ培地とインキュベートした。カタラーゼの培地への放出量および細胞中に保持される量を、蛍光分光光度法によって計算した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、培地中のＢＭＭから誘発されたカタラーゼ放出を示すグラフである。成熟ＢＭＭにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識カタラーゼ−  ポリイオン複合体（Ｚ＝１）を予め１時間ロードし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、１０μＭ酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）を含む、もしくは含まない無カタラーゼ培地と種々の時間間隔でインキュベートした。培地へのカタラーゼの放出量を、蛍光分光光度法によって計算した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。インキュベーション培地へのＰＭＡの添加により、培地への酵素放出が５０％増加した。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＢＭＭ中の分解に対するカタラーゼの酵素活性の保存を示すグラフである。図１３Ａでは、「裸の」カタラーゼまたはカタラーゼ−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）をＢＭＭにロードし、細胞を洗浄し、細胞を洗浄し、種々の時間間隔で無カタラーゼ培地とインキュベートした。ＢＭＭから放出されたカタラーゼの活性を、分光光度法によって決定した。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＢＭＭ中の分解に対するカタラーゼの酵素活性の保存を示すグラフである。図１３Ｂでは、種々の組成物とのカタラーゼポリイオン複合体（Ｚ）を該細胞にロードし、無カタラーゼ培地中で２時間インキュベートした。次いで、該培地を回収し、分光光度法によってカタラーゼ活性について評価した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。カタラーゼのみと比較したカタラーゼ−ポリイオン複合体活性の統計的有意性をアスタリスクで示した：（＊）Ｐ<０．０５、（＊＊）ｐ<０．００５。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＢＭＭから放出されたカタラーゼ−ポリイオン複合体による小膠細胞誘導性ＲＯＳの調整のスキームである。ブロックコポリマー（２ｍｇ／ｍｌ；図１４Ｃ）または「裸の」カタラーゼもしくはカタラーゼ−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）（図１４Ｂおよび図１４Ｄ）をＢＭＭにロードした。次いで、細胞を洗浄し、クレブスリンゲル緩衝液中で２時間インキュベートした。並行して、マウス小膠細胞を、２００ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α（４８時間）（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）または０．５μＭ  Ｎ−α−ｓｙｎ（図１４Ｄ）のいずれかで刺激した。次いで、放出された酵素とともに、ＢＭＭから回収した上清にＡｍｐｌｅｘ  ＲｅｄおよびＨＲＰ溶液を補足し、それらを活性化小膠細胞に添加した。コントロール活性化小膠細胞を、新鮮な培地（図１４Ｂ）または０．５μＭ凝集Ｎ−α−ｓｙｎ（図１４Ｄ）とインキュベートした。小膠細胞によって生成され、ＢＭＭから放出されたカタラーゼによって分解されたＨ２Ｏ２量を、蛍光によって検出した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）を示す。活性化小膠細胞（コントロール）と比較したＢＭＭから放出されたカタラーゼ−ポリイオン複合体またはカタラーゼによって分解されたＨ２Ｏ２量の統計的有意性を、以下のアスタリスクで示す：（＊）ｐ<０．０５、（＊＊）、ｐ<０．００５。
【図１４Ｂ】ブロックコポリマー（２ｍｇ／ｍｌ；図１４Ｃ）または「裸の」カタラーゼもしくはカタラーゼ−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）（図１４Ｂおよび図１４Ｄ）をＢＭＭにロードした。次いで、細胞を洗浄し、クレブスリンゲル緩衝液中で２時間インキュベートした。並行して、マウス小膠細胞を、２００ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α（４８時間）（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）または０．５μＭ  Ｎ−α−ｓｙｎ（図１４Ｄ）のいずれかで刺激した。次いで、放出された酵素とともに、ＢＭＭから回収した上清にＡｍｐｌｅｘ  ＲｅｄおよびＨＲＰ溶液を補足し、それらを活性化小膠細胞に添加した。コントロール活性化小膠細胞を、新鮮な培地（図１４Ｂ）または０．５μＭ凝集Ｎ−α−ｓｙｎ（図１４Ｄ）とインキュベートした。小膠細胞によって生成され、ＢＭＭから放出されたカタラーゼによって分解されたＨ２Ｏ２量を、蛍光によって検出した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）を示す。活性化小膠細胞（コントロール）と比較したＢＭＭから放出されたカタラーゼ−ポリイオン複合体またはカタラーゼによって分解されたＨ２Ｏ２量の統計的有意性を、以下のアスタリスクで示す：（＊）ｐ<０．０５、（＊＊）、ｐ<０．００５。
【図１４Ｃ】ブロックコポリマー（２ｍｇ／ｍｌ；図１４Ｃ）または「裸の」カタラーゼもしくはカタラーゼ−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）（図１４Ｂおよび図１４Ｄ）をＢＭＭにロードした。次いで、細胞を洗浄し、クレブスリンゲル緩衝液中で２時間インキュベートした。並行して、マウス小膠細胞を、２００ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α（４８時間）（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）または０．５μＭ  Ｎ−α−ｓｙｎ（図１４Ｄ）のいずれかで刺激した。次いで、放出された酵素とともに、ＢＭＭから回収した上清にＡｍｐｌｅｘ  ＲｅｄおよびＨＲＰ溶液を補足し、それらを活性化小膠細胞に添加した。コントロール活性化小膠細胞を、新鮮な培地（図１４Ｂ）または０．５μＭ凝集Ｎ−α−ｓｙｎ（図１４Ｄ）とインキュベートした。小膠細胞によって生成され、ＢＭＭから放出されたカタラーゼによって分解されたＨ２Ｏ２量を、蛍光によって検出した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）を示す。活性化小膠細胞（コントロール）と比較したＢＭＭから放出されたカタラーゼ−ポリイオン複合体またはカタラーゼによって分解されたＨ２Ｏ２量の統計的有意性を、以下のアスタリスクで示す：（＊）ｐ<０．０５、（＊＊）、ｐ<０．００５。
【図１４Ｄ】ブロックコポリマー（２ｍｇ／ｍｌ；図１４Ｃ）または「裸の」カタラーゼもしくはカタラーゼ−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）（図１４Ｂおよび図１４Ｄ）をＢＭＭにロードした。次いで、細胞を洗浄し、クレブスリンゲル緩衝液中で２時間インキュベートした。並行して、マウス小膠細胞を、２００ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α（４８時間）（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）または０．５μＭ  Ｎ−α−ｓｙｎ（図１４Ｄ）のいずれかで刺激した。次いで、放出された酵素とともに、ＢＭＭから回収した上清にＡｍｐｌｅｘ  ＲｅｄおよびＨＲＰ溶液を補足し、それらを活性化小膠細胞に添加した。コントロール活性化小膠細胞を、新鮮な培地（図１４Ｂ）または０．５μＭ凝集Ｎ−α−ｓｙｎ（図１４Ｄ）とインキュベートした。小膠細胞によって生成され、ＢＭＭから放出されたカタラーゼによって分解されたＨ２Ｏ２量を、蛍光によって検出した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）を示す。活性化小膠細胞（コントロール）と比較したＢＭＭから放出されたカタラーゼ−ポリイオン複合体またはカタラーゼによって分解されたＨ２Ｏ２量の統計的有意性を、以下のアスタリスクで示す：（＊）ｐ<０．０５、（＊＊）、ｐ<０．００５。
【図１５】図１５は、ＭＰＴＰ処置マウスにおける１２５Ｉ標識カタラーゼ−ポリイオン複合体の分布を示すグラフである。マウスに、カタラーゼ−ポリイオン複合体（Ｚ＝１、５０μＣｉ／マウス）をロードしたＢＭＭ（１０×１０６細胞／マウス）またはカタラーゼ−ポリイオン複合体のみ（コントロール群）を注射した。２４時間後、マウスを屠殺し、種々の器官中の放射能量を測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。カタラーゼ−ポリイオン複合体のみの群と比較したＢＭＭロードしたカタラーゼ−ポリイオン複合体輸送の統計的有意性をアスタリスクで示す：（＊＊）ｐ<０．００５。
【図１６】図１６は、ＢＭＭにロードし、ＭＰＴＰ中毒性マウスに静脈内注射したＡｌｅｘａ  ６８０標識ポリペプチド−ポリイオン構造の長期にわたる生体分布の画像を示す。
【図１７】図１７は、カタラーゼをロードしたポリペプチド−ポリイオン構造を含むＢＭＭの投与によるＭＰＴＰ誘導性ドーパミン作動性神経喪失に対する神経保護を示すグラフである。コントロールマウスでＮＡＡレベルの有意な減少が認められ、カタラーゼ−ポリイオン複合体／ＢＭＭ処置マウスでわずかに増加した（ｎ＝４）。
【図１８】図１８は、末梢投与したＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体がＩＣＶ  Ａｎｇｌｌ媒介性の血圧増加を阻害することを示すグラフである。ＩＣＶ注射ＡｎｇＩＩ後の平均動脈圧（ＭＡＰ）ピークの変化を、無ＣｕＺｎＳＯＤまたはＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体の脛動脈内投与の０、１、２、および５日後に測定した。
【図１９】図１９は、カタラーゼポリイオン複合体をロードしたＢＭＭによるＭＰＴＰ誘導性ドーパミン作動性神経喪失に対する神経保護を示すグラフである。
【図２０】図２０は、種々の架橋剤を使用したカタラーゼ／ポリイオン複合体のゲル遅延度アッセイの画像である。サンプルを、変性条件下（ＳＤＳを使用）でのポリアクリルアミドゲル（１０％）のゲル電気泳動に供した。レーン：１−分子量マーカー；２−カタラーゼのみ；および３−ＥＤＣと架橋したポリイオン複合体；４−ＧＡと架橋したポリイオン複合体；５−ＢＳ３と架橋したポリイオン複合体。
【図２１】図２１は、使用した種々のリンカーについてのＳＯＤ／ポリイオン複合体のゲル遅延度アッセイの画像である。サンプルを、変性条件下（ＳＤＳを使用）でのポリアクリルアミドゲル（１０％）のゲル電気泳動に供した。レーン：１−分子量マーカー；２−ＳＯＤのみ；３−非架橋ポリイオン複合体；および４−ＥＤＣと架橋したポリイオン複合体；５−ＧＡと架橋したポリイオン複合体；６−ＢＳ３と架橋したポリイオン複合体。
【図２２Ａ】図２２Ａは、使用した種々のリンカーについてのカタラーゼ／ＳＯＤ／ポリイオン複合体のゲル遅延度アッセイの画像である。サンプルを、変性条件下（ＳＤＳを使用）でのポリアクリルアミドゲル（１０％）のゲル電気泳動に供した。レーン：１−非架橋複合体；２−ＧＡと架橋したポリイオン複合体；３−ＥＤＣと架橋したポリイオン複合体；４−ＢＳ３と架橋したポリイオン複合体；および５−ＥＤＣ−Ｓ−ＮＨＳと架橋したポリイオン複合体。カタラーゼに対する抗体を使用して視覚化を行った。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、種々の使用リンカーについてのカタラーゼ／ＳＯＤ／ポリイオン複合体のゲル遅延度アッセイの画像である。サンプルを、変性条件下（ＳＤＳを使用）でのポリアクリルアミドゲル（１０％）のゲル電気泳動に供した。レーン：１−非架橋複合体；２−ＧＡと架橋したポリイオン複合体；３−ＥＤＣと架橋したポリイオン複合体；４−ＢＳ３と架橋したポリイオン複合体；および５−ＥＤＣ−Ｓ−ＮＨＳと架橋したポリイオン複合体。ＳＯＤに対する抗体を使用して視覚化を行った。
【図２３】図２３は、カタラーゼポリイオン複合体をロードしたＬｉ−ＣＯＲ標識ＢＭＭの生体分布の画像を示す。ＢＭＭを、ＢＡＬＢ／Ｃマウスから単離し、成熟まで（１２日間）成長させ、Ｌｉ−ＣＯＲで標識し、カタラーゼポリイオン複合体とともに２時間ロードした。ロードしたＢＭＭを、流動食で２４時間保持した剪毛ＢＡＬＢ／Ｃ（５０ｍｌｎ／マウス）に静脈注射した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に従って、目的のタンパク質／ポリペプチドの部位特異的および／または持続的送達のための組成物および諸方法を提供する。より具体的には、該組成物は、目的のポリペプチドと, 目的のタンパク質の正味の電荷と逆の正味の電荷を有する合成ポリマーとのポリイオン複合体を含む。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、該複合体の合成ポリマーはブロックコポリマーである。より具体的には、該合成ポリマーは、少なくとも１つのポリイオンセグメントおよび少なくとも１つの非イオン性水溶性ポリマーセグメントを含むブロックコポリマーである。ブロックコポリマーは、最も簡潔には少なくとも２つの異なるポリマーセグメントの複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と定義される（Ｔｉｒｒｅｌ，Ｍ．Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｏｄｄａｒｄ  Ｅ．Ｄ．ａｎｄ  Ａｎａｎｔｈａｐａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｋ．Ｐ．（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，ｐｐ．５９−１２２，１９９２）。最も簡潔なブロックコポリマー構造は、その末端で連結してＡ−Ｂ型ジブロックが得られる２つのセグメントを含む。その末端による２つ以上のセグメントのその後の結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）により、Ａ−Ｂ−Ａ型トリブロック、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−型マルチブロック、またはさらなるマルチセグメントＡ−Ｂ−Ｃ−構造が得られる。１つまたはいくつかの反復単位が異なるポリマーセグメントに連結するブロックコポリマー中の主鎖を定義することができる場合、該コポリマーは、例えば、Ａ（Ｂ）ｎ型のグラフト構造を有する。より複雑な構造には、例えば、１つの中心に連結した２つ以上のポリマーセグメントを有する（ＡＢ）ｎまたはＡｎＢｍスターブロック（ｓｔａｒｂｌｏｃｋ）が含まれる。本発明の代表的なブロックコポリマーは、式Ａ−ＢまたはＢ−Ａ（式中、Ａはポリイオンセグメントであり、Ｂは非イオン性水溶性ポリマーセグメントである）を有するであろう。該ブロックコポリマーのセグメントは、約２〜約１０００個の反復単位またはモノマーを有することができる。
【００１１】
複合体の好ましいサイズは、約５ｎｍ〜約５００ｎｍ、より好ましくは約５ｎｍ〜約２５０ｎｍ、より好ましくは約１０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、さらにより好ましくは約１０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、さらにより好ましくは約２０ｎｍ〜約１００ｎｍである。これらの複合体は凝集せず、生理学的ｐＨおよびイオン強度の水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４））中への分散後少なくとも１時間好ましいサイズ範囲内のままである。これらのサイズは、動的光散乱によって有効径（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）として測定することができる（例えば、Ｂａｔｒａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１８：１４９８−１５０６を参照のこと）。水溶液中での分散後、これらの複合体は安定なままであることが好ましい（すなわち、少なくとも２時間、好ましくは１２時間、さらにより好ましくは２４時間凝集および／または沈殿しない）。
【００１２】
該ブロックコポリマーのポリイオンセグメントは、目的のタンパク質と逆の正味電荷を有する。例えば、目的のタンパク質が正味の負電荷を有する場合、ポリイオンセグメントは適切なｐＨで正味の正電荷を有するであろう。該ポリイオンセグメントは、ポリカチオン（すなわち、特定のｐＨで正味の正電荷を有するポリマー）またはポリアニオン（すなわち、特定のｐＨで正味の負電荷を有するポリマー）であり得る。特定の実施形態では、該ポリイオンセグメントは、少なくとも３電荷、好ましくは少なくとも１０電荷、より好ましくは少なくとも１５電荷を有する。好ましい実施形態では、該電荷は相互に近接している。実際、理論に拘束されないが、高分子電解質の電荷の間の距離が一定の臨界値未満である場合、溶液中に存在する小さな対イオンはかかる高分子電解質の鎖上に縮合し得ると考えられる。例えば、高分子電解質水溶液における「ビエルム長」は、約７Åである（Ｍａｎｎｉｎｇ（１９８０）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９：３７−５９を参照のこと）。かかる対イオンは、高分子電解質の逆帯電したポリイオンとの反応中に外液に放出され、したがって、高分子電解質複合体の形成のための「駆動力（ｄｒｉｖｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ）」を得ることができる（Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓ．Ｗ．Ｋｉｍ，Ｒ．Ｍａｈａｔｏ，Ｅｄｓ．）Ｔａｙｌｏｒ  &  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１６４−１８９）。
【００１３】
該ポリイオンセグメントの重合度は、典型的には、約１０〜約１００，０００である。より好ましくは、重合度は、約２０〜約１０，０００、さらにより好ましくは約１０〜約１，０００、さらにより好ましくは約１０〜約２００である。該ポリイオンセグメントと無関係に、該非イオン性水溶性ポリマーセグメントの重合度は、約１０〜約１００，０００である。より好ましくは、該重合度は、約２０〜約１０，０００、さらにより好ましくは約１０〜約１，０００、さらにより好ましくは約１０〜約２００である。
【００１４】
該ポリイオンセグメントは、ポリカチオンセグメントおよびポリアニオンセグメントを含む。ポリカチオンセグメントの例としては、１つもしくは複数のモノマー（第一級アミン、第二級アミン、および／または第三級アミン（それぞれ部分的または完全に四級化し、それにより、第四級アンモニウム塩を形成することができる）が含まれるが、これらに限定されない）から誘導される単位を含むポリマー、コポリマー、およびそれらの塩が挙げられるが、これらに限定されない。これらのモノマーの例としては、カチオン性アミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、およびオルニチンなど）、アルキレンイミン（例えば、エチレンイミン、プロピレンイミン、ブチレンイミン、ペンチレンイミン、ヘキシレンイミン、およびスペルミンなど）、ビニルモノマー（例えば、ビニルカプロラクタムおよびビニルピリジンなど）、アクリラートおよびメタクリラート（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリラート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリラート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアクリラート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリラート、ｔ−ブチルアミノエチルメタクリラート、アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムハライド、アクリルオキシエチル−ジメチルベンジルアンモニウムハライド、およびメタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムハライドなど）、アリルモノマー（例えば、ジメチルジアリルアンモニウムクロリド）、脂肪族イオン、または複素環イオン、または芳香族イオンが挙げられる。
【００１５】
該ポリカチオンおよびポリカチオンセグメントを、それ自体がカチオン性でなくてよいモノマー（例えば、４−ビニルピリジンなど）の重合によって生成し、次いで、モノマー単位の種々の化学反応（例えば、アルキル化など）によってポリカチオン形態に変換することができ、それにより、イオン性基が出現し得る。モノマー単位の不完全な変換により、イオン性基を持たない単位の一部を有するコポリマー（例えば、ビニルピリジンとＮ−アルキルビニルピリジニウムハライドとのコポリマーなど）を得ることができる。
【００１６】
ポリカチオンセグメントは、２つ以上のモノマー単位型（カチオン性単位と少なくとも１つの他の単位型（例えば、カチオン性単位、アニオン性単位、双性イオン性単位、親水性非イオン性単位、および／または疎水性単位が含まれる）との組み合わせが含まれる）を含むコポリマーであり得る。かかるポリカチオンセグメントを、２つ以上の化学的に異なるモノマー型の共重合によって得ることができる。かかるコポリマーを使用する場合、他の成分と反応した場合に複合体が形成されるように、該荷電基を相互に十分に近接させるべきである。好ましい実施形態では、該ポリマーまたはポリマーブロックが事実上主にカチオン性のままであるように、非カチオン性単位の一部が比較的低い。該ポリカチオン含有ポリマーは、異なる構造の２つ以上のポリマー（異なる重合度、骨格構造、および／または官能基を含むポリマーなど）の混合物であり得る。
【００１７】
ポリアニオンセグメントのとしては、１つもしくは複数のモノマー（不飽和エチレンモノカルボン酸、不飽和エチレンジカルボン酸、スルホン酸基、そのアルカリ金属塩、およびそのアンモニウム塩を含むエチレンモノマーが含まれる）に由来する単位を含むポリマーおよびそれらの塩が挙げられるが、これらに限定されない。これらのモノマーの例としては、アクリル酸、メタクリル酸、アスパラギン酸、α−アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、シトラジン酸、シトラコン酸、ｔｒａｎｓ−桂皮酸、４−ヒドロキシ桂皮酸、ｔｒａｎｓ−グルタコン酸、グルタミン酸、イタコン酸、フマル酸、リノール酸、リノレン酸、マレイン酸、核酸、ｔｒａｎｓ−β−ヒドロムコン酸、ｔｒａｎｓ−ｔｒａｎｓ−ムコン酸、オレイン酸、１，４−フェニレンジアクリル酸、ホスフェート２−プロペン−１−スルホン酸、リシノール酸、４−スチレンスルホン酸、スチレンスルホン酸、２−スルホエチルメタクリラート、ｔｒａｎｓ−トラウマチン酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンゼンスルホン酸、ビニルリン酸、ビニル安息香酸、およびビニルグリコール酸など、ならびにカルボキシル化デキストラン、スルホン酸化デキストラン、およびヘパリンなどが含まれる。ポリアニオンの例としては、ポリマレイン酸、ポリアミノ酸（例えば、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、およびそれらのコポリマー）ポリアクリル酸、およびポリメタクリル酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
該ポリアニオンおよびポリアニオンセグメントを、それ自体がアニオン性や親水性でなくてもよいモノマー（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルメタクリラートまたはシトラコン酸無水物など）の重合によって生成し、次いで、モノマー単位の種々の化学反応（例えば、加水分解）によってポリアニオンに変換することができ、それにより、イオン性基が出現し得る。モノマー単位の不完全な変換により、イオン性基を持たない単位の一部を有するコポリマー（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルメタクリラートとメタクリル酸とのコポリマーなど）を得ることができる。
【００１９】
該ポリアニオンセグメントは、２つ以上のモノマー単位型を含むコポリマー（アニオン性単位と少なくとも１つの他の単位型（アニオン性単位、カチオン性単位、双性イオン性単位、親水性非イオン性単位および／または疎水性単位が含まれる）との組み合わせが含まれる）であり得る。かかるポリアニオンおよびポリアニオンセグメントを、２つ以上の化学的に異なるモノマー型の共重合によって得ることができる。かかるコポリマーを使用する場合、他の成分と反応した場合に複合体が形成されるように、該荷電基を相互に十分に近接させるべきである。好ましい実施形態では、該ポリマーまたはポリマーブロックの大部分が事実上アニオン性且つ親水性のままであるように、非アニオン性単位の一部が比較的低い。該ポリアニオン含有ポリマーは、異なる構造の２つ以上のポリマー（異なる重合度、骨格構造、および／または官能基を含むポリマーなど）の混合物であり得る。
【００２０】
１つの好ましい実施形態では、該ポリイオンセグメントは、リジン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸、およびそれらの塩のポリマーまたはコポリマーからなる群から選択されるポリペプチドである。かかる合成ポリイオンの例としては、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、およびそれらの塩が挙げられる。別の好ましい実施形態では、ポリイオンセグメントは、ポリアクリル酸、ポリアルキレンアクリル酸、ポリアルキレンイミン、ポリエチレンイミン、ポリホスフェート、およびそれらの塩からなる群から選択される。
【００２１】
該非イオン性水溶性ポリマーセグメントを、ポリエチレンオキシド、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマー、ポリサッカリド、ポリアクリルアミド、ポリグリセロールグリセロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジンＮ−オキシド、ビニルピリジンＮ−オキシドとビニルピリジンとのコポリマー、ポリオキサゾリン、およびポリアクロイルモルホリン、またはその誘導体からなる群から選択することができる。好ましくは、非イオン性ポリマーセグメントは、無毒且つ非免疫原性である。特定の実施形態では、該水溶性ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；またはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーである。該非イオン性水溶性ポリマーセグメントがポリ（エチレンオキシド）である場合、かかるポリマーの好ましい分子量は、約３００〜約２０，０００、より好ましくは約１，５００〜約１５，０００、さらにより好ましくは約２，０００〜約１０，０００、さらにより好ましくは約４，０００〜約１０，０００である。
【００２２】
該ポリイオンセグメントおよび非イオン性水溶性ポリマーセグメントは、異なる末端基を含むことができる。例えば、該合成方法により、異なる末端基を含むことができる。
【００２３】
本発明の複合体は、ナノスケールサイズの粒子に自発的に自己集合する。理論に拘束されないが、該形成された粒子はコアシェル形態を有すると考えられる。該粒子のコアはタンパク質−ポリイオン複合体を含み、該親水性シェルは該コポリマーの非イオン性水溶性セグメントを含む。実際、該ポリイオン電荷の中和により、疎水性ドメインが形成され、水媒体中で分離する傾向がある。しかしながら、該水溶性非イオン性セグメントは、凝集および巨視的相分離を防止する。結果として、これらの複合体は、ナノサイズの粒子に自己集合し、安定な水分散液を形成する。
【００２４】
目的のポリペプチドまたはタンパク質のための保護ナノコンテナ（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｎａｎｏｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を構築するために、ブロックコポリマーを、ポリイオンセグメント（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２，０００Ｄａ））と非イオン性水溶性セグメント（例えば、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ、１０，０００Ｄａ））との結合によって合成する（Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１０：８５１−６０）。複合体を、緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４））中での目的のタンパク質の溶液（例えば、カタラーゼ（１ｍｇ／ｍｌ））のブロックコポリマー溶液（例えば、ＰＥＩ−ＰＥＧ（２ｍｇ／ｍｌ））に添加することによって形成し、わずかに乳白色の分散液を生成することができる。
【００２５】
特定の実施形態では、該粒子を、生理学的なｐＨ７．４の等張液中の体内の細胞に投与する。しかしながら、該複合体を、投与前にｐＨ７．４未満またはｐＨ７．４超で調製することができる。本発明の多くの目的のポリペプチドは、陽性基および陰性基の両方を含む両性高分子電解質であると認識される。かかるポリペプチドの陽性基および陰性基のバランスは、その化学構造および外液のｐＨに依存する。等電点（ｐＩ）未満のｐＨで、該ポリペプチドは正に帯電し得る。ｐＩを超えるｐＨで、該ポリペプチドは負に帯電し得る。したがって、本発明の複合体を、ｐＨ未満でのポリペプチドのポリアニオンとの反応によって生成することができる。これらの複合体を、ｐＩを超えるポリペプチドのポリカチオンとの反応によって調製することもできる。これらの複合体の調製後、溶液のｐＨを、さらなる投与に望ましいｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）に変更することができる。いくつかの場合、該ポリペプチドは、相互に近接して存在する複数の陽性基または陰性基を有する部位またはドメインを含むことができる。かかるポリペプチドは、ｐＨ未満およびｐＨ超の両方で正電荷のポリイオン（例えば、ポリペプチド中に複数の陰性基を有する部位の場合のポリカチオンまたは複数の陽性基を有する部位の場合のポリアニオン）と複合体を形成することができる。
【００２６】
該複合体のコアを架橋することができる。該架橋は、該ポリペプチド、またはポリイオン、またはポリペプチドおよびポリイオンの両方の官能基を化学的に連結することができる（ポリペプチドとポリイオンとの間の連結が含まれる）。該架橋剤は切断性または分解性を示し、体内または細胞内で切断することができる。当該分野で公知の種々の架橋方法を架橋に適用することができる（Ｇ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９９６，７８５  ｐ．）。架橋剤の例としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＤＥＣ）、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、ホルムアルデヒド、ジビニルスルホン、ポリ酸無水物、ポリアルデヒド、多価アルコール、カルボジイミド、エピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ビス−またはポリ−エポキシ架橋剤（例えば、１，２，３，４−ジエポキシブタンまたは１，２，７，８−ジエポキシオクタン）およびＧ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９９６）で引用された架橋剤が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、該ポリペプチド−ポリイオン複合体の架橋比は、約４０％〜約７５％、好ましくは約４０％〜約６０％、より好ましくは約４０％〜約５０％である。該ポリペプチド−ポリイオン複合体中の過剰なブロックコポリマーの存在により、複合体安定性に必要な架橋比を減少し得る。
【００２７】
本発明のポリペプチド−ポリイオン複合体を、哺乳動物被験体、特にヒトに投与することができる。本発明のポリペプチド−ポリイオン複合体は、特に、患者が神経変性または神経炎症性の疾患または障害を有する場合、ＢＢＢを通過して目的のポリペプチドをＣＮＳに送達させることができることを以下に示す。理論に拘束されないが、該ポリペプチド−ポリイオン複合体の粒子を、哺乳動物被験体の身体に投与後、脳に到達することができる循環細胞に取り込むことができ、ポリペプチドの一部がこれらの細胞によって脳に送達される。より具体的には、該循環細胞は、免疫系細胞（単球またはマクロファージ、好ましくは骨髄由来単球、樹状細胞、リンパ球、好ましくはＴ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、およびその組み合わせなど）であり得る。
【００２８】
さらに、理論に拘束されないが、本発明の複合体は細胞内でポリペプチドを保護すると考えられる。同時に、ブロックコポリマーによって誘導される特異的コア−シェル構造に起因して、該複合体は宿主細胞に対して無毒であり、細胞の機能的特性を損なわない。特に、該複合体は、細胞が疾患部位に進行する能力を損なわない。
【００２９】
理論に拘束されないが、複合体の循環時間が長いか、循環細胞中に捕捉され得るとも考えられる。結果として、ＢＢＢへの循環複合体の曝露が増加し、脳に送達されるポリペプチドの注射用量の比率が増加し得る。多くの病態により、ＢＢＢの透過性が減少し得る。これにより、ポリペプチドの脳送達をさらに増加させることができる。
【００３０】
さらに、理論に拘束されないが、複合体が神経細胞および／または神経末梢突起に結合するかこれらに侵入し、逆行性輸送として公知の過程（Ｚｗｅｉｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，６：６１５−６２５；米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号）または類似の過程によって脳に輸送することができるとも考えられる。本発明の複合体、特に、コポリマー中のイオン性ポリマー鎖と非イオン性ポリマー鎖との組み合わせの固有の構造により、該ポリペプチドを保護し、細胞および組織の損傷を最小にし、複合体の脳への自由な移動を容易にする。
【００３１】
本発明のポリペプチド−ポリイオン複合体を、非経口（皮下、静脈内、および腹腔内が挙げられるが、これらに限定されない）で投与することができる。さらに、該ポリペプチド−ポリイオン複合体を、神経系に、特に、髄腔内、または脳内、または硬膜外に直接投与することができる。該ポリペプチド−ポリイオン複合体を、筋肉内、または皮内、または頸動脈内に投与することもできる。異なる投与方法の組み合わせを使用することができる。
【００３２】
本発明の別の実施形態によれば、該ポリペプチド−ポリイオン複合体を細胞にロードし、次いで、これを治療薬として患者に投与することができる。より具体的には、該細胞は循環細胞、特に免疫系細胞である。免疫系細胞としては、単球、マクロファージ、骨髄由来単球、樹状細胞、リンパ球、Ｔ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、および／またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ロードした該細胞は、特に該患者が神経変性または神経炎症性の疾患または障害を有する場合、ＢＢＢを通過して目的のポリペプチドを送達させることができる。当該分野で利用可能な細胞単離および分離技術を使用して、該細胞を哺乳動物被験体から単離することができる。以下の記載のように、該細胞の該ポリペプチド−ポリイオン複合体とのインキュベーションによって該細胞に該ポリペプチド−ポリイオン複合体をロードすることができる。ロードした該細胞を、非経口で（皮下、静脈内、および腹腔内が挙げられるが、これらに限定されない）投与することができる。これに加えて、ロードした該細胞を、神経系に、特に、髄腔内、または脳内、または硬膜外に直接投与することができる。該ポリペプチド−ポリイオン複合体を、筋肉内、または皮内、または頸動脈内に投与することもできる。異なる投与方法の組み合わせを使用することができる。
【００３３】
星状膠細胞および内皮細胞との脳単核食細胞（ＭＰ；血管周囲および実質性マクロファージおよび小グリア細胞）の活性化によって実行される神経炎症は、パラクリン経路を介して、非常に多岐にわたる疾患（アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、ＨＩＶ関連神経認知障害（ＨＡＮＤ）、および海綿状脳症および卒中など）における神経損傷を加速するように作用し得る。これらの障害では、ＣＮＳ炎症性浸潤は複雑且つ多面的である。先天免疫の最初のレスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）またはＭＰ細胞要素がカスケードを設定し、その後に適応免疫系の活性化および漸増に関与し、最終的に、神経変性に関与する。結局、小グリア細胞は、損傷に応答するＣＮＳ中の一次ＭＰであり、その主な機能は脳の保護である。活性化小グリア細胞は、神経毒性因子（キノリン酸、スーパーオキシドアニオン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、一酸化窒素、アラキドン酸、およびその代謝産物、ケモカイン、炎症促進性サイトカイン、および興奮毒（グルタミン酸塩が含まれる）が含まれる）の産生による神経変性に関連する炎症過程に関与する。他方では、小グリア細胞の神経保護機能は、ニューロトロフィンを生成して細胞外間隙中に存在する興奮毒を除去および排除する能力によって調節することができる。実際、脳損傷後の脳生存は、小グリア細胞活性によって影響を確実に受けることが公知である。本発明は特定の理論に制限されないが、これらの共通の神経変性機構を、ポリペプチド−ポリイオン複合体の免疫細胞輸送を使用した治療効果のために使用することができると考えられる。好ましい実施形態では、単核食細胞の辺縁趨向および血管外遊走によってＢＢＢを通過する並外れた能力を有する単核食細胞を使用する。
【００３４】
本発明の上記実施形態の代表的な方法は、以下の工程を含む：患者から標的細胞を単離する工程、ポリペプチド−ポリイオン複合体と該単離細胞とをインキュベーションする工程、および該患者に該細胞を戻す工程。本発明は特定の理論に制限されないが、このアプローチのための１つの要因は、ポリペプチド−ポリイオン複合体が食細胞のリソソーム内で非常に攻撃的なタンパク質分解からその被輸送物を保護する能力であると考えられる。コア−シェルポリペプチド−ポリイオン複合体は、循環細胞がＢＢＢを通過してペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）を脳に輸送する能力を変化させないとさらに考えられる。
Ｉ．定義
【００３５】
本発明の理解を深めるために、以下の定義を提供する。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリマー」は、２つ以上の反復する単位またはモノマーの化学結合から形成される分子を示す。用語「ブロックコポリマー」は、最も簡潔には、各ポリマーセグメントが２つ以上の同種の隣接単位を含む少なくとも２つの異なるポリマーセグメントの複合物をいう。
【００３７】
用語「単離タンパク質」または「単離および精製タンパク質」は、本明細書中で時折使用される。この用語は、主に、本発明の単離核酸分子の発現によって生成されたタンパク質をいう。あるいは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように天然に会合する他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質をいうことができる。「単離した」は、他の化合物または物質との人工混合物もしくは合成混合物、または基本的活性を妨害せず、例えば、不完全な精製または安定剤の添加に起因して存在し得る夾雑物の存在を排除することを意味しない。
【００３８】
「ポリペプチド」および「タンパク質」を本明細書中で時折交換可能に使用し、アミノ酸の分子鎖を示す。用語「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を含む。本用語には、ポリペプチドの発現後修飾物（例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など）も含まれる。さらに、タンパク質フラグメント、アナログ、変異タンパク質、またはバリアントタンパク質、および融合タンパク質などは、ポリペプチドの意味の範囲内に含まれる。
【００３９】
用語「単離した」は、「実質的に純粋な」形態で存在するように天然に会合する環境から十分に分離されたタンパク質、または核酸、または化合物、または細胞をいうことができる。「単離した」は、他の化合物または物質との人工混合物もしくは合成混合物、または基本的活性を妨害せず、例えば、不完全な精製に起因して存在し得る夾雑物の存在を排除することを必ずしも意味しない。
【００４０】
「薬学的に許容可能な」は、連邦政府もしくは州政府の規制機関による承認、または動物、より詳細にはヒトでの使用について米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを示す。
【００４１】
「キャリア」は、例えば、本発明の活性薬剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、防腐剤（例えば、チメロゾール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝液（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液）、水、水溶液、オイル、増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助剤またはビヒクルをいう。適切な薬学的キャリアは、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ），２０００；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；およびＫｉｂｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９９９に記載されている。
ＩＩ．治療薬
【００４２】
本発明の好ましい実施形態が、ポリマー複合体内に含まれるタンパク質を含む一方で、該ポリマー複合体への目的の他の治療薬または化合物をカプセル化することも本発明の範囲内である。かかる薬剤または化合物としては、ポリペプチド、ペプチド、核酸、および化合物（合成および天然の薬物など）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、該治療薬は、ポリペプチドまたはタンパク質である。本発明の説明を通してポリペプチド−ポリイオン複合体を参照している一方で、タンパク質の使用も本発明の範囲内であることが意図される。多くの場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」を、本明細書中で交換可能に使用する。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、ポリマー複合体中の目的のタンパク質は治療タンパク質であり、すなわち、疾患、障害、病変、および／またはこれらに関連する症状の改善および／または治癒を達成する。タンパク質としては、（特に、ＣＮＳの）神経障害（神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（ＨＤ）、卒中、外傷、感染症、髄膜炎、脳炎、グリオーマ、癌（脳転移が含まれる）、ＨＩＶ−１関連認知症（ＨＡＤ）、ＨＩＶ関連神経認知障害（ＨＡＮＤ）、麻痺、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）、多発性硬化症（ＭＳ）、ＣＮＳ関連心血管疾患、プリオン病、肥満、代謝障害、炎症性疾患、代謝障害、およびリソソーム蓄積症（ＬＳＤ；ゴーシェ病、ポンぺ病、ニューマン・ピック、ハンター症候群（ＭＰＳ  ＩＩ）、ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ  Ｉ）、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、サンフィリッポ症候群（ＭＰＳ  ＨＩＡ）、テイ・サックス病、サンドホフ病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィ、およびファブリー病などであるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）に対して治療的価値が有し得る。治療活性タンパク質としては、脳への投与によって疾患、障害、病変、および／またはこれらに関連する症状の改善および／または治癒を達成することができる酵素、抗体、ホルモン、成長因子、他のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で有用な神経活性ポリペプチドとしては、内分泌因子、成長因子、視床下部放出因子、神経栄養因子、パラクリン因子、神経伝達物質ポリペプチド、上記ポリペプチド（神経栄養因子および成長因子など）のいずれかに結合する抗体および抗体フラグメント、これらのポリペプチドの受容体（神経栄養因子受容体など）に結合する抗体および抗体フラグメント、サイトカイン、エンドルフィン、ポリペプチドアンタゴニスト、ＣＮＳ細胞によって発現した受容体のアゴニスト、およびリソソーム蓄積症に関与するポリペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、該治療タンパク質はＣＮＳでその効果を発揮する。別の特定の実施形態では、該治療タンパク質は、それのみでＢＢＢを通過しない。
【００４４】
特異的タンパク質の例としては、カタラーゼ、テロメラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタミナーゼ、サイトカイン、エンドルフィン（例えば、エンケファリン）、成長因子（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管成長因子（ＶＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、腫瘍壊死因子−Ｂ（ＴＧＦ−Ｂ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、および種々のインターロイキンなど）、抗アポトーシス性タンパク質（ＢＣＬ−２およびＰＩ３キナーゼなど）、アミロイドβ結合剤（例えば、抗体）、α−、β−、および／またはγ−セクレターゼのモジュレーター、血管作用性腸管ペプチド、レプチン、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−ｓｕｌｔａｔａｓｅ）（Ｉ２Ｓ）、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、および神経伝達物質（例えば、Ｓｃｈａｐｉｒａ，Ａ．Ｈ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６１．Ｓ５６−６３；Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２６５：９３−９９；Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  ．（１９９１）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．３０：４９３−４９７；Ｋｏｌｉａｔｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．３０：８３１−８４０；Ｄｏｇｒｕｋｏｌ−Ａｋ  ｅｔ  ａｌ  ．（２００３）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２４：４３７−４４４；Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ．３：１３２−１３８；Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．７１：１４１３−１４１９；Ｍｕｅｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｐｐｌ  ．９１：９８−９９；Ｗｒａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ．１４４：５８１−５８８；Ｗｉｃｋｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．１２７Ａ：１５８−１６６；Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ（２００４）Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ．１４４：Ｓ１５−１９；Ａｕｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．７８：１６３−１７４；Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ  ．（２００４）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．６：８５−９２を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。リソソーム蓄積症は、酵素が欠損して細胞の天然のリサイクリング機能が阻止される遺伝性遺伝子欠損である（Ｅｎｎｓ  ａｎｄ  Ｈｕｈｎ，（２００８）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｆｏｃｕｓ  ２４：Ｅ１２）。これにより、種々の進行性の身体的および／または知的退行が発症し、これらの欠損酵素の脳への送達によってこれらの疾患を治療することができると考えられる。リソソーム蓄積症に関与する種々の酵素または欠損酵素���機能を果たすことができる酵素を、本発明の諸方法を使用して送達させることができる。
【００４５】
１つの実施形態では、本発明を、ブチリルコリンエステラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ、コリンエステラーゼ再賦活薬（例えば、オキシム化合物）、有機リン酸塩のスカベンジャーおよびカルバミン酸塩インヒビターの脳送達に基づいた兵器剤（ｗａｒｆａｒｅ  ａｇｅｎｔ）由来の急性神経毒性に対する治療方法として使用することができる。ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）は多くのエステル含有薬物（コカインおよびサクシニルコリンなど）も加水分解するので、本発明の複合体内のＢＣｈＥは、コカイン嗜癖および毒性に対して治療的価値を有する（例えば、Ｃａｒｍｏｎａ  ｅｔ．ａｌ．（１９９９）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．，２８：３６７−３７１；Ｃａｒｍｏｎａ（２００５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１７：１８６−１９０）。
【００４６】
本発明の諸方法は、１つまたはいくつかの有用なポリペプチドを含むポリペプチド複合体の使用または単独または細胞とともに同時または個別に投与することができる異なるポリペプチドを含むいくつかの複合体の使用を含む。該複合体は、同一の組成物中に存在するか、個別の組成物中に存在し得る。
ＩＩＩ．投与
【００４７】
本明細書中に記載のポリペプチド−ポリイオン複合体および該ポリペプチド−ポリイオン複合体を含む細胞を、一般に、薬学的調製物として患者に投与する。本明細書中で用語「患者」を使用する場合、それは、ヒト被験体または動物被験体をいう。これらのポリペプチド−ポリイオン複合体およびこれを含む細胞を、医師の指導の下で治療的に使用することができる。
【００４８】
該ポリペプチド−ポリイオン複合体および／または本発明のポリペプチド−ポリイオン複合体を取り込んだ細胞を含む薬学的調製物を、任意の薬学的に許容可能なキャリアとの投与のために都合よく処方することができる。例えば、複合体および細胞を、許容可能な溶剤（水、または緩衝化生理食塩水、またはエタノール、またはポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはオイル、または界面活性剤、または懸濁剤、またはその適切な混合物など）を使用して処方することができる。選択した溶剤中の該ポリペプチド−ポリイオン複合体および／または該細胞の濃度は様々であってよく、溶剤を薬学的調製物の所望の投与経路に基づいて選択することができる。いかなる慣用の溶剤または薬剤が投与すべきポリペプチド−ポリイオン複合体または細胞と不適合でない限りは、薬学的調製物におけるその使用が意図される。
【００４９】
特定の患者への投与に適切な本発明のポリペプチド−ポリイオン複合体および／または細胞の用量および投薬レジメンを、患者の年齢、性別、体重、一般的病状、ならびにポリペプチド−ポリイオン複合体または細胞が投与される特定の容態およびその重症度を考慮する医師が決定することができる。該医師は、投与経路、薬学的キャリア、およびポリペプチド−ポリイオン複合体または細胞の生物活性も考慮することができる。
【００５０】
適切な薬学的調製物の選択はまた、選択した投与方法に依存する。例えば、該ポリペプチド−ポリイオン複合体または本発明のポリペプチド−ポリイオン複合体を含む細胞を、血液脳関門に近接した領域へ直接注射することによって投与することができる。この例では、薬学的調製物は、注射部位と適合する溶剤中に分散させたポリペプチド−ポリイオン複合体または細胞を含む。
【００５１】
本発明のポリペプチド−ポリイオン複合体または細胞を、血流への静脈内注射、または経口投与、または皮下注射、もしくは筋肉内注射、もしくは腹腔内注射などの任意の方法によって投与することができる。注射用の薬学的調製物は、当該分野で公知である。ポリペプチド−ポリイオン複合体または細胞の投与方法として注射を選択する場合、十分な量の分子または細胞がその標的細胞に到達して生物学的効果を発揮することを確認する工程を取らなければならない。
【００５２】
薬学的に許容可能なキャリアとの本質的混合物中の有効成分としての本発明の複合体または細胞を含む薬学的組成物を、従来の薬学的配合技術にしたがって調製することができる。該キャリアは、投与（例えば、静脈内、経口、直接注射、頭蓋内、および硝子体内）に望ましい調製物の形態に応じて広範な種々の形態を取ることができる。
【００５３】
本発明の薬学的調製物を、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、投薬単位形態で処方することができる。本明細書中で使用する場合、「投薬単位形態」は、治療を受ける患者に適切な薬学的調製物の物理的に分離した単位をいう。各投薬量は、選択された薬学的キャリアと組み合わせた場合に所望の効果が得られるように計算された有効成分量を含むべきである。その適切な投薬単位を決定する手順は、当業者に周知である。
【００５４】
投薬単位を、該患者の体重に基づいて比例的に増減させることができる。特定の病的状態を緩和するのに適切な濃度を、当該分野で公知の投薬濃度曲線によって決定することができる。
【００５５】
本発明によれば、ポリペプチド−ポリイオン複合体またはこの複合体を含む細胞の投与に適切な投薬単位を、動物モデルにおける分子または細胞の毒性の評価によって決定することができる。種々の濃度のポリペプチド−ポリイオン複合体または細胞を含む薬学的調製物をマウスに投与することができ、該処置の結果として認められた有利な結果および副作用に基づいて最小および最大の投薬量を決定することができる。適切な投薬単位を、他の標準的な薬物と組み合わせた該ポリペプチド−ポリイオン複合体または細胞の治療有効性によって決定することもできる。ポリペプチド−ポリイオン複合体の投薬単位を、検出された効果にしたがって個別にまたは各処置と組み合わせて決定することができる。
【００５６】
該ポリペプチド−ポリイオン複合体または細胞を含む薬学的調製物を、病的症状が軽減または緩和するまでの適切な間隔（例えば、少なくとも１日２回以上）で投与し、その後に投薬量を維持レベルに減少させることができる。特定の症例における適切な間隔は、通常、患者の容態に依存する。
【００５７】
以下の実施例は、本発明の例示的な実施方法を提供し、本実施例は、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
【００５８】
実施例
【実施例１】
【００５９】
アルツハイマー病およびパーキンソン病（ＡＤおよびＰＤ）（Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｒ．Ｄ．（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｗｏｍｅｎｓ  Ｍｅｄ．，４４：１７４−８５；Ｇｏｚｅｓ，Ｉ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４：７００−５；Ｋｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ４２：１０８３−１００）、感染症（髄膜炎、脳炎、プリオン病、およびＨＩＶ関連認知症）（Ｂａｃｈｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ．，１０５３：２４７−５７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０５：６６−７６）、卒中（Ｋｏｌｉａｔｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３０：８３１−４０；Ｄｏｇｒｕｋｏｌ−Ａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２４：４３７−４４）、リソソーム蓄積症（Ｄｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，３：９５４−６６；Ｕｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：１２６５８−６３）、肥満（Ｂａｎｋｓ，Ｗ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，９：８０１−８０９；Ｂａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．，１０：２９７−３０８）、およびＣＮＳの他の代謝性疾患および炎症性疾患中の罹患脳組織への治療用ポリペプチドの送達が早急に必要であり、この必要性はどれだけ誇張してもしすぎることはない。
【００６０】
神経系の代謝性疾患および変性疾患の重要な要素は、炎症を含む（Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，５：６３６−４１）。かかる炎症活性は深刻である。何故なら、この炎症活性によって炎症誘発性生成物および活性酸素種（ＲＯＳ）が過剰に産生され、これにより、部分的に細胞死および神経変性が起こるからである。炎症誘発性サイトカインおよびエイコサノイドの産生または形成を阻害するターゲティングされた抗酸化剤または薬物の使用などによって疾患中に神経炎症活性に影響を及ぼすことにより、ＲＯＳおよび他の神経毒のレベルを減少させ、それにより、疾患の転帰を改善することができる（Ｐｒａｓａｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２：７６１−７０）。しかし、薬物がＢＢＢを透過するだけでなく、進行中の疾患機構に影響を及ぼすのに十分な濃度に至らなければならないので、かかるアプローチは制限されている。さらに、炎症機構が疾患初期の事象の可能性が高いので、治療方法を初期且つ頻繁に使用しなければならない。薬物送達の制限は、神経系障害の新規の治療パラダイムの開発で直面する主な障壁の１つである。
【００６１】
かかる疾患の１つにはＰＤがあり、これは６５歳以上の第２の最も一般的な神経変性障害である。この疾患は、ＳＮｐｃ内のドーパミン作動性ニューロンの喪失および線条体に対するその神経支配に起因する神経伝達物質ドーパミンの欠如によって特徴づけられる。ＰＤ神経病理学は、脳の炎症、小グリア細胞活性化、およびその後の分泌性神経毒性活性（細胞損傷および細胞死において重要な役割を果たすＲＯＳ産生が含まれる）を含む（ＭｃＧｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３８：１２８５−９１；Ｂｕｓｃｉｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：７７６−９；Ｅｂａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，４８：１−１９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：６１４５−５０）。ＰＤ脳は、抗酸化性酵素および抗酸化剤レベルが減少し（Ａｍｂａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３２：１１４−８；Ｒｉｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５２：５１５−２０；Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１２１：１１１−５）、それにより、酸化ストレスおよび関連する神経変性を管理する能力が減少する。多くの証拠によって、ＰＤの実験および動物モデルにおいて抗酸化剤が炎症反応を阻害し、ドーパミン作動性ニューロンを保護することができるという概念が支持されている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：１７６３−７１；Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：１４６６９−７４；Ｋｕｒｋｏｗｓｋａ−Ｊａｓｔｒｚｅｂｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ．，２：１２１３−８；Ｔｅｉｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｙｎａｐｓｅ  ３９：１６７−７４；Ｆｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３６０：２５６−６１；Ｆｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３５８：３５１−９；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２９１９４−８）。カタラーゼは、全ての公知の酵素で最も高い代謝回転率の１つで過酸化水素（公知のＲＯＳ）の水と酸素分子への変換を触媒する。多くの証拠により、抗酸化剤が炎症反応を阻害し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでドーパミン作動性ニューロンを最高９０％保護することができることが示唆されている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：１７６３−７１；Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：１４６６９−７４；Ｋｕｒｋｏｗｓｋａ−Ｊａｓｔｒｚｅｂｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ．，２：１２１３−８；Ｔｅｉｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｙｎａｐｓｅ  ３９：１６７−７４；Ｆｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｕｎｙｎ．Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．���ｈａｒｍａｃｏｌ．，３６０：２５６−６１；Ｆｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｕｎｙｎ．Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３５８：３５１−９；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２９１９４−８）。ＰＤのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでは、カタラーゼは、ＲＯＳの毒作用から初代培養小脳顆粒細胞を救済することが示された（Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２：７６１−７０；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，２８：３７３−８０）。さらに、低分子量カタラーゼアクチベーターであるラサギリンは、ＰＤマウスモデルにおいて神経保護を誘導した（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌ  ．Ｔｅｒａｔｏｌ．，２４：６７５−８２）。低分子量抗酸化剤を使用した臨床試験はほとんど行われておらず、これらの臨床試験では、ＰＤ進行速度の阻害のためにＲ−トコフェロールおよびデプレニルが最も広く使用されている（Ｇｒｏｕｐ，Ｔ．Ｐ．Ｓ．（１９９３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．，３２８：１７６−１８３）。しかし、上記のように、ほとんどの試験で有意な改善を示すことができなかった。これは、ＢＢＢを通過するＲ−トコフェロールの輸送量の制限および疾患発症後の薬物を使用した時期に起因する（Ｐａｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４７：１０３７−４２）。
【００６２】
材料と方法
材料。ウシ肝臓由来のカタラーゼ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（２Ｋ、分岐、５０％水溶液）、スルホローダミン−Ｂ（ＳＲＢ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。メトキシポリ（エチレングリコール）エポキシ（Ｍｅ−ＰＥＧ−エポキシ）を、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから購入した。
【００６３】
ＭＰＴＰ。１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）−中毒症レシピエントＣ５７ＢＬ／６について、マウスを記載のように処置した（Ｂｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：９４３５−４０）。１２時間後、ＭＰＴＰ処置マウスに、５０μＣｉ／マウスの１２５Ｉ標識ポリペプチド−ポリイオン複合体を静脈注射した。２４時間後、マウスを屠殺し、主な器官（脳、脾臓、肝臓、肺、および腎臓）中の放射量を、１４８０γカウンターＷｉｚａｒｄ  ３（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）によって検出した。酵素の送達量を、全器官の注射用量に対する比率として示した。
【００６４】
ＰＥＩ−ＰＥＧ複合物。コポリマーを、変更した手順（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：１２６−３８）を使用して、ＰＥＩとＭｅ−ＰＥＧ−エポキシとの結合によって合成した。簡潔に述べれば、Ｍｅ−ＰＥＧ−エポキシ水溶液を５％ＰＥＩを含む水に添加し、室温で一晩インキュベートした。過剰なＰＥＩから（および低分子量残渣から）精製するために、得られた複合物を、カットオフ６０００〜８０００ＤａのＳｐｅｃｔｒａＰｏｒｅメンブレン中で水（２回置換）に対して４８時間透析し、次いで、真空下で濃縮した。最終精製のために、複合物を２０ｍＬの１００％メタノールに溶解し、次いで、４００ｍＬのエーテルに滴下した。該沈殿物を遠心分離し（４００ｇ、５分間）、エーテルで２回洗浄し、エキシケーター（ｅｘｉｃａｔｏｒ）中で乾燥させた。該生成物の詳細な特徴づけを、報告されたように分光光度法および質量分析によって行った（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：１２６−３８）。
【００６５】
ブロックイオノマー複合体。所定量のカタラーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）およびブロックコポリマー（２ｍｇ／ｍＬ）を、個別に室温のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した。該酵素の溶液を、撹拌しながらブロックコポリマー溶液に滴下した。＋／−電荷比（Ｚ）を、ｐＨ７．４でプロトン化したＰＥＩ−ＰＥＧのアミノ基量（Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，９：８０５−８１２）をカタラーゼ中のグルタミンおよびアスパラギン酸の総量で割ることによって計算した。物理化学的方法の組み合わせ（電気泳動保持（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、および透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ））を使用して、以前に記載したように、得られたナノ粒子の組成、サイズ、分散安定性、形態学、形状、および構造を特徴づけた（Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０：８５１−６０；Ｌｅｍｉｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．，８：９１−１０５；Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ  ．（２００４）Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．，１２：５１７−２６；Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７：１４３−５７）。
【００６６】
電気泳動保持。ポリイオン複合体の形成を、アクリルアミドゲルシフトアッセイによって試験した。種々のＺでの酵素複合体を、５ｍＭ  トリス、５０ｍＭグリシン（ｐＨ８．３）を含む７．５％アクリルアミドゲルに、複合体を保持するための未変性条件下（ＳＤＳの非存在下）でロードした。タンパク質バンドを、ウサギポリクローナル抗カタラーゼ抗体（Ａｂ  １８７７，Ａｂｅａｍ  Ｉｎｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；１：６０００）および二次西洋ワサビペルオキシダーゼ抗ウサギＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ；１：１５００）で視覚化した。該特異的タンパク質バンドを、化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して視覚化した。
【００６７】
光散乱の測定。ポリペプチド−ポリイオン複合体の有効流体力学直径およびゼータ電位を、以前の記載のように（Ｂｒｏｎｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：８３３９−８３４３；Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ  ．（１９９９）Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ．Ｂ−Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  １６：２９１−３０４）、「ＺｅｔａＰｌｕｓ」ゼータ電位分析器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用する光子相関分光法によって測定した。
【００６８】
ＴＥＭ。ＰＢＳ中の１滴のカタラーゼ／ＰＥＩ−ＰＥＧ分散液（Ｚ＝１）を、Ｆｏｒｍｖａｒコーティング銅グリッド（１５０メッシュ，Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）上に配置した。ポリペプチド−ポリイオン複合体を含む乾燥させたグリッドを、硫酸バナジルで染色し、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ２０１透過型電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ／ＦＥＩ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｉａｒｃｌｉｆｆ  Ｍａｎｏｒ，ＮＹ）を使用して視覚化した。
【００６９】
カタラーゼおよびカタラーゼ活性。ポリマーナノ粒子中の酵素活性を、種々の電荷比でのカタラーゼまたはカタラーゼ−ポリイオン複合体による過酸化水素の分解の反応速度を使用して研究し、２４０ｎｍでの吸光度の変化のモニタリングによって決定した（Ｈ２Ｏ２の吸光係数は４４×１０６Ｍ−１ｃｍ１）。
【００７０】
カタラーゼ−ポリイオン複合体の１２５Ｉ標識化。１２５Ｉ標識カタラーゼ−ポリイオン複合体を得るために、該タンパク質溶液を含むＰＢＳ（１ｍｇ／ｍＬ）を、ヨード−ＢＥＡＤＳヨウ素化試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の存在下でＮａ１２５Ｉ（１ｍＣｉ）と１５分間インキュベートし、次いで、Ｄ−ｓａｌｔ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して非結合標識から精製した。１２５Ｉ標識カタラーゼ（４００μＣｉ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ）に、ＰＥＩ−ＰＥＧブロックコポリマー（Ｚ＝１）を補足した。
【００７１】
統計分析。全実験について、データを平均±ＳＥＭとして示す。群間の有意差の検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した多重比較（Ｆｉｓｈｅｒの対比較）を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して行った。最小ｐ値０．０５が、全検定の有意レベルとして予想された。
結果
【００７２】
ブロックイオノマー複合体は、ブロックイオノマーを逆に帯電した界面活性剤または高分子電解質と混合させることによって自発的に形成される（Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７２：８５−９１；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，６：６３９−６４３；Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２８：５２９４−５２９９；Ｂｒｏｎｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３０：３５１９−３５２５）。該ポリイオン電荷の中和によって疎水性ドメインが形成され、水媒体中でポリイオン複合体ミセルのコア中に分離される。ブロックイオノマーの水溶性非イオン性セグメント（例えば、ＰＥＧ）により、凝集および巨視的相分離が防止される。その結果、これらの複合体はナノスケールサイズの粒子に自己集合し、安定な水分散液を形成する（図１Ａ）。カタラーゼは、生理学的条件下で正味の負電荷を有する。したがって、該酵素（１ｍｇ／ｍＬ）と正に帯電したＰＥＩ−ＰＥＧ（２ｍｇ／ｍＬ）との混合によってリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）中でポリイオン複合体を得た。
【００７３】
カタラーゼとＰＥＩ−ＰＥＧの複合体を種々の＋／−電荷比（Ｚ＝０〜４）で得た。これらを、未変性条件下で電気泳動に供し、次いで、ニトロセルロース膜に移した。該タンパク質のバンドを、カタラーゼに対する抗体を使用して視覚化した（図１Ｂ）。コポリマーが増加するにつれてバンドの強度が減少した。これにより、ゲルに侵入することができない複合体が形成されたことが示唆され、これをＤＬＳによって確認した。ＰＥＩ−ＰＥＧのカタラーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）への添加により、比較的低い多分散度指数（約０．１〜０．２）を有するナノスケールサイズの粒子が得られた一方で、カタラーゼのみについては粒子は検出されなかった。  
【００７４】
粒子サイズは、電荷比、イオン強度、およびｐＨに依存した（図１、Ｃ、Ｄ、およびＥ部分）。ＰＢＳ中で、有効径は電荷比の増加につれて増加し、電荷比（Ｚ）１以上にて約９０〜１００ｎｍで安定化した（図１Ｃ）。該ゼータ電位は、ブロックコポリマー量の増加に伴って増加した（図１Ｃ）。一定の電荷比（Ｚ＝１）で、塩の非存在下にて６００ｎｍ超の巨大な凝集体が形成された（図１Ｄ）。塩の添加によって粒子サイズが減少し、このサイズは、ＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍに到達した時に約９０ｎｍで安定化した。巨大な非平衡の高分子電解質複合体の凝集体がカタラーゼとＰＥＩ−ＰＥＧ溶液を混合するや否や形成される可能性が高い。塩の非存在下で、低いポリイオンの交換率のために、これらの凝集体は平衡化できず、「凍結した」ままであった（Ｋａｂａｎｏｖ，Ｖ．（１９９４）Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，３６：１４３−１５６；Ｋａｂａｎｏｖ，Ｖ．（２００３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｂｕｌｋ．Ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ  Ｔｈｉｎ  Ｆｉｌｍｓ（Ｄｅｃｈｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｎｏｆｆ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）ｐｐ  ４７−８６，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  &  Ｃｏ．ＫＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。塩を添加するにつれて該ポリイオン交換が加速されて、小（平衡）粒子が形成された。これらの粒子はおよそｐＨ７．４〜１１．５の範囲で安定であったが、ｐＨがこの範囲未満に減少するかこの範囲を超えて増加した場合に不可逆的に凝集した（図１Ｅ）。この範囲内で、該カタラーゼおよびＰＥＩ−ＰＥＧは逆に帯電していた。該複合体の凝集体は、低ｐＨでのカタラーゼのプロトン化および電荷反転（ｐＩ＝６．５）または高ｐＨでのＰＥＩの脱プロトン化と関連していた。概して、ポリペプチド−ポリイオン複合体粒子は、生理学的ｐＨおよびイオン強度下で安定であった。これらの条件下で、該粒子は、ほぼ球形であった（図１Ｆ）。その後の細胞の負荷、送達、および放出実験のために使用した電荷比で、カタラーゼの酵素活性の変化は認められなかった（図１Ｇ）。
【００７５】
ポリペプチド−ポリイオン複合体がヒトＰＤを反映する活動的な神経炎症性疾患を有する脳亜領域に到達することができるかどうかを決定するために、ＭＰＴＰモデルを使用した。ＭＰＴＰにより、ヒトおよび非ヒト霊長類において重篤且つ不可逆的なパーキンソン症候群が発症し（Ｌａｎｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ．９：４８５−５０７）、黒質線条体神経変性の自己永続的過程が開始される（Ｌａｎｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６：５９８−６０５）。マウスでは、ＭＰＴＰにより、ＰＤのほとんどの生化学的および病理学的特質（ＳＮｐｃおよび対応する線条体中でのドーパミン作動性ニューロンの特異的変性（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｔｒａｎｓｍ．１０８：１２６３−８２）およびグリア細胞炎症（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２４：３９５−４０１）が含まれる）が再現される。
【００７６】
ＭＰＴＰ中毒Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、１２５Ｉ標識カタラーゼを含む遊離ポリペプチド−ポリイオン複合体を静脈内注射した。注射の２４時間後、脳および他の組織中で放射能が検出可能であった。
【実施例２】
【００７７】
グラフト構造のカチオン性ブロックイオノマー（ＰＬＬ骨格上にグラフティングした約１．４ＰＥＯ鎖を含むポリ−Ｌ−リジン−グラフト−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）））を使用して、ブチリルコリンエステラーゼＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ複合体を調製した。１Ｈ  ＮＭＲ分析によるとＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）の推定分子量は約２４，０００ｇ／ｍｏｌである。ヒトＢＣｈＥ（Ｈｕ  ＢＣｈＥ）およびウマ血清由来のＢＣｈＥ（Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ）の両サンプルを本研究で使用した。
【００７８】
Ｈｕ  ＢＣｈＥのＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）との複合体を、緩衝液（リン酸緩衝液、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中でブロックイオノマーとタンパク質成分との簡潔な混合によって調製した。組成物間の化学量論的電荷比に近い混合物の組成を研究し、表１に示した。混合物の組成を、シアル酸／リジンモル比（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）のアミノ基の濃度をＢＣｈＥ中のシアル酸単位の濃度で割ることによって計算した）に関して示した。ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）混合物の組成も、タンパク質中のカルボキシル基（グルタミン酸、アスパラギン酸、およびシアル酸）の総量に関して示し、タンパク質中のカルボキシル基の総濃度に対するＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）中のアミノ基濃度の比（Ｚ＋／−）として計算した。
【００７９】
【表１】
2010540411.tif 000003
【００８０】
ブロックイオノマー複合体へのＨｕ  ＢＣｈＥの取り込み程度を、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用してモニタリングした。図２Ａは、Ｈｕ  ＢＣｈＥおよびＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）の混合物について認められたゲル電気泳動パターンを示す。Ｈｕ  ＢＣｈＥのバンド強度は、該混合物中のコポリマー量が増加するにつれて有意に減少した。これにより、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥ０（２）コポリマーがＨｕ  ＢＣｈＥに結合してその電荷を中和することが証明された。実質的に完全な複合体移動の遅延が、Ｚ＋／−＝１．０付近のＨｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）混合物の組成で認められた。
【００８１】
Ｈｏｒ  ＢＣｈＥとＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）との複合体を、表２に示す混合物と類似の方法および組成で調製した。ブロックイオノマー複合体へのＨｏｒ  ＢＣｈＥの取り込み程度を、未変性ＰＡＧＥを使用してモニタリングした。図２Ｂは、Ｈｏｒ  ＢＣｈＥおよびＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）の混合物で認められるゲル電気泳動パターンを示す。過剰なブロックイオノマーで混合物中に（Ｚ＋／−＝６．２）複合体へのＨｏｒ  ＢＣｈＥの完全な固定化が認められた。Ｈｏｒ  ＢＣｈＥとＰＬＬ鎖あたりのＰＥＯのグラフティング密度（ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が約６．６鎖であるＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯコポリマー（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（７）と示す）との複合体について類似のデータが得られた。
【００８２】
【表２】
2010540411.tif 000004
【００８３】
両型のＢＣｈＥとＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）との複合体を、動的光散乱によってさらに特徴づけた。全複合体型の研究についてのデータを、図３にまとめている。タンパク質のみよりもわずかに大きなサイズの粒子が全てのＢＣｈＥ／ブロックイオノマー混合物中で検出された。
【００８４】
Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体の分子量（Ｍｗ）を、沈降平衡分析によって測定した。２０℃、回転子速度４０００ｒｐｍ、沈降時間２４時間で全ての測定を行った。得られた沈降平衡パターンを、ＵＶ吸収光学系を使用して記録した。平均タンパク質部分比体積０．７３ｃｍ３／ｇを、測定した沈降平衡からの分子量の計算のために使用した。計算した分子量を、表３に示す。
【００８５】
【表３】
2010540411.tif 000005
【００８６】
これらのデータにより、Ｈｕ  ＢＣｈＥおよびＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）から形成された複合体が１つのタンパク質分子からなることも示唆される。タンパク質のみと比較して認められた複合体の分子量の増加は、タンパク質四量体あたり約２〜３鎖のＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）コポリマーの結合と対応する。
【００８７】
該複合体に取り込まれたＨｕ  ＢＣｈＥの活性を、ブチリルチオコリンヨージドの加水分解に基づいたアッセイを使用して決定し、表４に示す。過剰なブロックイオノマーの存在下でさえ、該複合体に取り込まれたＢＣｈＥの酵素活性の変化は認められなかった。ＢＣｈＥ活性の決定に非常に低濃度の酵素または複合体（ＢＣｈＥベースで０．００２５ｍｇ／ｍｌ）を必要とするので、複合体がかかる希釈度でその完全性を保持することを確認する必要があった。種々の希釈度の複合体を、ＰＡＧＥ技術およびその後のゲルのＫａｒｎｏｖｓｋｙ&Ｒｏｏｔｓ活性染色を使用して試験した（Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｌ．Ｒｏｏｔｓ（１９６４）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ，Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，１２：２１９−２２１）。この「直接染色（ｄｉｒｅｃｔ−ｃｏｌｏｒｉｎｇ）」  チオコリン法は、低濃度のＢＣｈＥで高感度である。典型的なゲル電気泳動パターンを、図４Ａに示す。これらのデータは、ＢＣｈＥとブロックイオノマーの複合体が、希釈度が非常に高い場合に、解離することを示す。
【００８８】
【表４】
2010540411.tif 000006
【００８９】
ブロックイオノマー複合体の多分子コア−シェル構造を、ポリマー鎖間の架橋の形成によって強化することができる。得られた架橋複合体は、本質的に、希釈の際に安定であり、ｐＨ、イオン強度、溶媒組成、および構造劣化を伴わない剪断力の変化などの環境上の課題に耐え得るナノスケールの単一分子である。したがって、該ＢＣｈＥ／ブロックイオノマー複合体の安定性をさらに増加させるために、該複合体構造に架橋を導入した。グルタルアルデヒド（ＧＡ）（アミン反応性ホモ官能性（ｈｏｍｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋剤）を、これらの研究で使用した。ＧＡのアルデヒド基とブロックイオノマーのタンパク質およびポリリジンセグメントの両方の第一級アミノ基との間のイミン（シッフ塩基）の形成に起因して架橋が起こる。
【００９０】
該複合体に架橋を導入するために、Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（Ｚ＋／−＝１．２、ＢＣｈＥベースで０．１５ｍｇ／ｍｌ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を、０．２５％ＧＡ水溶液で処理した。ＧＡ量を、ＧＡ溶液中のアルデヒド基の総量対ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯコポリマー中のリジン残基の総数として定義された標的化架橋比（８５％）に基づいて計算した。該複合体の架橋溶液を、室温で５時間保持した。希釈に対する架橋複合体の安定性を、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ&Ｒｏｏｔｓ法を使用して評価した。該架橋複合体を、それぞれ、１０００倍、５０００倍、および２５０倍に希釈した。同程度に希釈したＨｕ  ＢＣｈＥおよび元の非架橋複合体を、コントロールとして使用した。ゲル電気泳動パターンを図４Ｂに示す。１０００倍まで希釈した架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体に対応するレーン中にＢＣｈＥバンドが認められた。対照的に、複合体−前駆体の希釈により、完全に解離して遊離ＢｃｈＥが放出された。これらのデータにより、コア中にＢｃｈＥを捕捉するブロックイオノマー複合体の安定性を、複合体コア中の架橋の導入によって有意に増加させることができることが示唆される。
【００９１】
架橋複合体に取り込まれたＨｕ  ＢＣｈＥの酵素活性を、基質としてブチリルチオコリンヨージドを使用してさらに評価した。ブチリルチオコリンヨージドは、架橋複合体を透過するのに十分に小さな分子であるので捕捉された酵素と反応できる。データを表５に示す。これらのデータは、ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ複合体の架橋によって複合体に捕捉されたＢＣｈＥの酵素活性が喪失する（例えば、ＢＣｈＥの初期非活性の７５％の減少が認められた）ことを示した。概して、ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ複合体のコアの架橋により、得られたＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ複合体が希釈に対して十分に耐性を示す。
【００９２】
【表５】
2010540411.tif 000007
【００９３】
種々の架橋を複合体に導入するために、Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（Ｚ＋／−＝１．２、ＢＣｈＥベースで０．１５ｍｇ／ｍｌ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を、ＧＡ水溶液で処理した。表６に示すように、種々の濃度の３μＬのＧＡ溶液を、１２０μＬの複合体溶液に添加した。ＧＡ量を、該ＧＡ溶液中のアルデヒド基の総量対ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯコポリマー中のリジン残基の総数として定義された標的化架橋比に基づいて計算した。標的化架橋の程度が、正確なアミド化の程度よりもむしろ、より低いと予想される起こり得る理論上の最大架橋量を示すことに注目すべきである。該標的化架橋度は、１０％から１００％まで様々であった。混合物を、室温で５時間保持した。
【００９４】
【表６】
2010540411.tif 000008
【００９５】
希釈に対する架橋複合体の安定性を、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ&Ｒｏｏｔｓ法を使用して評価した。架橋複合体を、１０００倍、５０００倍、および２５０倍に希釈した。同程度に希釈したＨｕ  ＢＣｈＥおよび元の非架橋複合体を、コントロールとして使用した。種々の架橋比（８５％、４０％、および２０％）の複合体についての代表的なゲル電気泳動パターンを、図５Ａ〜５Ｃに示す。８５％および４０％の標的化架橋比で調製した複合体は安定であり、１０００倍までの希釈の際に解離しなかった。標的化架橋８５％（図５Ａ）および４０％（図５Ｂ）を有する架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体に対応するレーン中にＢＣｈＥバンドは認められなかった。複合体−前駆体の希釈により、完全に解離して遊離ＢｃｈＥが放出された（レーンＢ）。標的化架橋比２０％で調製した複合体は、より高い希釈度で部分的に解離した（図５Ｃ）。実際、遊離ＢＣｈＥに対応するバンドは、２５０倍希釈した架橋複合体に対応するレーン中で認められた。
【００９６】
図６は、種々の架橋比および５００倍希釈で調製したＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体（Ｚ＋／−＝１．２）について認められたゲル電気泳動パターンを示す。遊離ＢＣｈＥのバンドは、架橋比３０％以下の架橋複合体に対応するバンド中に出現した。これらのデータにより、希釈の際の複合体の分解を防ぐために少なくとも４０％の標的化架橋比で、ＢＣｈＥ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥ０（２）複合体に架橋が好ましく導入されることが示唆される。
【００９７】
架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体の分子量（Ｍｗ）を、沈降平衡分析によって測定した。２０℃、回転子速度６０００ｒｐｍ、沈降時間２４時間で全ての測定を行った。得られた沈降平衡パターンを、ＵＶ吸収光学系を使用して記録した。平均タンパク質部分比体積０．７３ｃｍ３／ｇを、測定した沈降平衡からの分子量の計算のために使用した。計算した分子量を、表７に示す。架橋複合体の分子量は、複合体−前駆体の分子量に匹敵する。これらのデータにより、架橋反応が各複合体粒子内で進行し、複合体の粒子間の架橋および凝集が起こらないことが示唆される。
【００９８】
【表７】
2010540411.tif 000009
【００９９】
架橋複合体に取り込まれたＨｕ  ＢＣｈＥの酵素活性を、基質としてブチリルチオコリンヨージドを使用してさらに評価した。データを表８に示す。これらのデータは、ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ複合体の架橋が複合体のコアに取り込まれたＢＣｈＥの活性に影響を及ぼすことを示した。架橋比の増加により、酵素活性が喪失した。例えば、ＢＣｈＥの初期非活性の７５％の減少は、標的化架橋比８５％で認められ、架橋１００％で活性は認めれなかった。対照的に架橋比４０％では、観察された活性の減少はむしろ小さかった（２０％）。結論として、ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ複合体コアの化学的架橋は、複合体のイオン性コアに取り込まれたタンパク質の活性を保存しながら希釈に対する複合体の安定性を調整するための有効なツールである。
【０１００】
【表８】
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【０１０１】
ポリマー複合体によって送達されたＢＣｈＥのｉｎ  ｖｉｖｏでの移動および局在化を、光学的画像を使用してブチリルコリンエステラーゼヌリザイゴート（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｔｅ）（ＢＣｈＥ−／−）マウスで評価した。ＢＣｈＥ−／−ノックアウトマウスを、ＢＣＨＥ遺伝子の一部を遺伝子ターゲティングで削除することによって作成した（受入番号Ｍ９９４９２；Ｌｉ  ｅｔ．ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３２４：１１４６−１１５４）。近赤外蛍光プローブＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（Ｌｉ−ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を使用して、Ｈｏｒ  ＢＣｈＥを標識した。標識度は、タンパク質四量体あたり１つの色素分子と計算された。標識Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ（Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＩＲＤｙｅ）を含む複合体を調製するために、１６μＬのＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＩＲＤｙｅ溶液を、５７μＬのＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）および８μＬの１０×ＰＢＳ緩衝液（０．１Ｍリン酸緩衝液、Ｃ（ＮａＣｌ）＝１．４Ｍ、ｐＨ７．４）と混合した。得られた複合体を、グルタルアルデヒドを使用してさらに架橋した。グルタルアルデヒドの添加量を、４０％の標的化架橋度に基づいて計算した。混合物を室温で５時間保持した。Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ&Ｒｏｏｔｓ法で確認したところ、その架橋されたＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＩＲＤｙｅ／  ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）複合体は、希釈に対して安定であった。架橋手順によってポリマー複合体に取り込まれたＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＩＲＤｙｅの酵素活性の全般的な認められた減少は、約３５％であった。
【０１０２】
画像化を行なう前に、動物の腹部および背部区域の毛をＮａｉｒクリームを使用して除去した。マウスを、特別な精製飼料で維持して、標準的な動物用飼料によって誘導される胃内および腸内の干渉蛍光シグナルを減少させた。２つの注射経路（髄腔内（ＩＴ）および筋肉内（ＩＭ））を使用した。動物を麻酔し、次いで、架橋複合体に取り込んだ標識タンパク質つまりＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＩＲＤｙｅを投与した。ＩＶＩＳ  ２００撮像装置を使用して、Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＩＲＤｙｅのｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光を４８時間追跡した。ポリマー複合体に取り込まれたＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＩＲＤｙｅの蓄積は、複合体のＩＴ注射の２．５時間後に脳内で認められた。Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＩＲＤｙｅに対応する蛍光シグナルはまた、該複合体の筋肉注射の４８時間後にマウスの脳内で検出された。
【０１０３】
脳内の送達ＢＣｈＥ酵素の最終活性を決定するために、マウスを安楽死させ、分析のために脳組織を切り出した。脳関連ＢＣｈＥ活性を、Ｅｌｌｍａｎアッセイを使用して決定した（Ｄｕｙｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９９：５２８−５３５）。活性単位を、ｐＨ７．０、２５℃で１分間あたりに加水分解されたブチリルチオコリン量（μモル）と定義した。データを表９に示す。
【０１０４】
【表９】
2010540411.tif 000011
【実施例３】
【０１０５】
以下の手順を使用して、生きている動物内のＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体の生体分布を研究した。
【０１０６】
タンパク質の標識化。ＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎＳＯＤ；２ｍｇ）を、１ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：０．１Ｍリン酸カリウム、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に室温で溶解した。１００μｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（Ｋ２Ｈ２ＰＯ４）を溶液に添加して、溶液のｐＨをｐＨ８．５に上昇させた。得られた溶液を、反応色素Ａｌｅｘａ  ６８０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ｃａｔ  ＃  Ａ−２０１７２）を含むバイアルに移し、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。
【０１０７】
標識ＣｕＺｎＳＯＤの精製。反応混合物（１ｍｌ）を、溶離緩衝液としてリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を使用してＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（０．５×２６ｃｍ）に供した。２つの有色バンドは、非結合色素からの標識タンパク質の分離を示した。最初の有色バンド（淡青色）が、約３０分間で８個の画分（１５０μｌの各画分）に回収された。Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡアッセイを使用して決定した該タンパク質濃度は、０．７５ｍｇ／ｍｌであった。該標識タンパク質溶液を凍結乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０１０８】
タンパク質を取り込んだポリイオン複合体の調製。＋／−電荷比（Ｚ）＝２：１のＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体を得るために、５００μｌのＡｌｅｘａ  ６８０標識ＣｕＺｎＳＯＤ（１ｍｇ／ｍｌ）を含む生理学的緩衝液を、８３０μｌのポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ブロックコポリマー（ＰＥＩ−ＰＥＧ、２ｍｇ／ｍｌ）の溶液に撹拌しながら滴下した。該＋／−電荷比（Ｚ）を、ｐＨ７．４でプロトン化したＰＥＩ−ＰＥＧのアミノ基量をＣｕＺｎＳＯＤ中のグルタミンおよびアスパラギン酸の総量で割ることによって計算した。得られたＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体溶液を、さらなる使用前に少なくとも１時間インキュベートした。
【０１０９】
マウス内のＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体の生体分布の視覚化。実験前に、ＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスを、３０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でのペントバルビタールの腹腔内注射を使用して麻酔し、剪毛し、脱毛した（毛による蛍光ブロッキングを軽減するため）。該マウスを、流動食で７２時間保持した（固形食由来の胃内および腸内の自己蛍光を排除するため）。該マウスにＡｌｅｘａ−６８０標識ＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体を尾静脈注射した。次いで、該マウスを６６％亜酸化窒素および残りの酸素と共に１．５％イソフルラン混合物を使用して麻酔し、撮像カメラ中に配置した。ＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体の生体分布を、ＩＶＩＳ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｇａｓ  Ａｎａｓｔｈｅｓｉａ  Ｓｙｓｔｅｍによって検出されるようにＡｌｅｘａ−６８０のｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光の測定によって決定した。Ａｌｅｘａ  ６８０標識ＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体は、ＩＶ注射の１時間後に脳内に蓄積し始め、注射７時間後にピークに達し、注射後少なくとも２４時間上昇したままであった（図７）。これらのデータは、末梢投与したＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体が脳に局在することを示す。
【実施例４】
【０１１０】
ブロック構造を有するＰＬＬ−ＰＥＯコポリマーを使用して、ブロックコポリマー複合体中にＢＣｈＥを取り込んだ。ポリ−Ｌ−リジン−グラフト−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ）を合成した（例えば、Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ  ．（１９９５）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２８：５２９４を参照のこと）。分子量５，６００ｇ／ｍｏｌおよびかなり狭い分子量分布１．２７を有するα−メトキシ−ω−アミノ−ポリ（エチレングリコール）（Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ブロックコポリマー合成のためのマクロイニシエーター（ｍａｃｒｏｉｎｉｔｉａｔｏｒ）として使用した。ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯを、Ｖａｒｉａｎ  ５００  ＭＨｚ分光計で溶媒としてＤ２Ｏを使用して１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって特徴づけた。ＰＬＬセグメントの長さは、２５と計算された。ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯの推定分子量は、約２４，０００ｇ／ｍｏｌである。このポリマーを、ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯと示した。ＰＥＯのメチレンプロトン（ＯＣＨ２ＣＨ２：δ＝３．６２ｐｐｍ）およびＰＬＬのε−メチレンプロトン（（ＣＨ２）３ＣＨ２ＮＨ３：δ＝２．９ｐｐｍ）のピーク強度比を測定してＰＬＬセグメントの重合度を計算し、３６と決定された。ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯの推定分子量は約１０，２００ｇ／ｍｏｌである。このポリマーを、ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯと示した。
【０１１１】
逆滴定を行ってＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ溶液中のアミノ基濃度を決定した。５ｍｇ／ｍｌのＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ溶液中のアミノ基濃度は、６．１ｍＭと計算された。
【０１１２】
ヒトＢＣｈＥ（Ｈｕ  ＢＣｈＥ）およびウマ血清由来のＢＣｈＥ（Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ）の両サンプルを使用して、ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯとの複合体を調製した。混合物の種々の組成での緩衝液（リン酸緩衝液、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中でのブロックコポリマーとタンパク質成分との簡単な混合によって複合体を調製し、これを表１０に示す。該ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ混合物の組成を、タンパク質中のカルボキシル基（グルタミン酸、アスパラギン酸、およびシアル酸）の総量に関して示し、タンパク質中のカルボキシル基の全濃度に対するＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ中のアミノ基濃度の比率（Ｚ＋／−）として計算した。
【０１１３】
【表１０】
2010540411.tif 000012
【０１１４】
ブロックイオノマー複合体へのＢＣｈＥの取り込み程度を、未変性ＰＡＧＥを使用してモニタリングした。図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ混合物について認められたゲル電気泳動パターンを示す。両方の場合、混合物中のブロックコポリマー量が増加するにつれてＢＣｈＥバンドの強度が減少した。これは、該ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯブロックコポリマーが該ＢＣｈＥに結合し、その電荷を中和することを証明していた。実質的に完全なゲル中の複合体移動の遅延が、Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ混合物の両方についておよそＺ＋／−＝２．０で認められた。グラフト構造のＰＬＬ−ＰＥＯコポリマー（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥ０（２）またはＰＬＬ−ｇ−ＰＥ０（７））を使用したブロックイオノマー複合体へのウマ血清由来のＢＣｈＥ（Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ）の取り込みには混合物中に過剰なコポリマーの存在（Ｚ＋／−＝６．２）が必要であることに注目すべきである。
【０１１５】
両型のＢＣｈＥとＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯとの複合体を、動的光散乱によってさらに特徴づけた。全複合体型の研究についてのデータを、図１１にまとめる。タンパク質のみよりもわずかに大きなサイズの粒子がＢＣｈＥ／ブロックコポリマー混合物中で検出された。
【０１１６】
【表１１】
2010540411.tif 000013
【０１１７】
複合体の安定性に及ぼすＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体コアの架橋の影響を、さらに解明した。グルタルアルデヒド（ＧＡ）（アミン反応性ホモ官能性架橋剤）を、これらの研究で使用した。該複合体に架橋を導入するために、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のＨｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体（Ｚ＋／−＝１．０、ＢＣｈＥベースで０．１５ｍｇ／ｍｌ）両方を、０．００８％ＧＡ水溶液で処理した。ＧＡ量を、ＧＡ溶液中のアルデヒド基の総量対ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯコポリマー中のリジン残基の総数として定義された標的化架橋比（４０％）に基づいて計算した。架橋剤を添加した該複合体溶液を、室温で５時間保持した。希釈に対する該架橋複合体の安定性を、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ&Ｒｏｏｔｓ法を使用して評価した。架橋複合体を、５００倍希釈した。同一程度に希釈したＢＣｈＥサンプルおよび元の非架橋複合体を、コントロールとして使用した。該ゲル電気泳動パターンを図９Ａに示す。これらのデータは、Ｚ＋／−＝１．０の組成および標的化架橋比４０％で調製したＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体は希釈に耐えられずに分離することを示す。遊離ＢＣｈＥに対応するバンドは、架橋複合体に対応する全レーン（それぞれ、図９ＡのレーンＣおよびＦ）およびその非架橋前駆体（それぞれ、図９ＡのレーンＢおよびＥ）で認められた。
【０１１８】
別の実験では、Ｚ＋／−＝２．０（ＢＣｈＥベースで０．１５ｍｇ／ｍｌ）で調製したＨｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体を、標的化架橋度４０％を達成するために０．０１６％ＧＡ溶液で処理した。架橋複合体を、５００倍希釈した。同一程度に希釈したＢＣｈＥサンプルおよび元の非架橋複合体を、コントロールとして使用した。該ゲル電気泳動パターンを図９Ｂに示す。図９Ｂで認められるように、Ｚ＋／−＝２．０の架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯおよびＨｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体にそれぞれ対応するレーンＣおよびＦにＢＣｈＥバンドは認められなかった。対照的に、複合体−前駆体の希釈により、完全に解離して遊離ＢｃｈＥが放出された（図９ＢのレーンＢおよびＥ）。したがって、少量の過剰なブロックコポリマーを含む該ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体は良好な複合体コアの架橋に必要なようである。
【０１１９】
非架橋および架橋ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体に取り込まれたＢＣｈＥの酵素活性を、基質としてブチリルチオコリンヨージドを使用してさらに評価した。該データを表１２に示す。架橋Ｈｏｒ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体（Ｚ＋／−＝２）に取り込まれたＨｏｒ  ＢＣｈＥの酵素活性は実質的に変化しなかった。さらに、非架橋複合体溶液中で測定したＢＣｈＥ活性と比較して、架橋Ｈｕ  ＢＣｈＥ／ＰＬＬ−ｂ−ＰＥＯ複合体の場合、Ｈｕ  ＢｃｈＥの酵素活性は減少しなかった。
【０１２０】
【表１２】
2010540411.tif 000014
【実施例５】
【０１２１】
神経炎症反応によって誘導されたケモカイン勾配の確立の結果として、脳への侵入が起こる（Ｋａｄｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｅｕｒｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．，８：２５−５０；Ｇｏｒａｎｔｌａ  ｅｔ  ａｌ  ．（２００６）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．，８０：１１６５−１１７４）。したがって、細胞ベースの送達の有用性を試験するためのＰＤ用モデル系を作製した。第１に、多岐にわたる炎症の合図を使用して、小グリア細胞からのＲＯＳ産生を刺激し、ニトロ化αシヌクレイン（Ｎ−α−ｓｙｎ）（ＰＤ中に細胞外放出されて免疫活性化を誘発すると考えられている）を含めた（Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ，Ｈ．（２００６）Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２７：１１６２；Ｍｏｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  ．（２００６）Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，６：２６１−２８１；Ｅｌ−Ａｇｎａｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１７：１９４５−７）。第２に、１−メチル−４−フェニル−ｌ，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）誘導性炎症は、脳へのＢＭＭ侵入のための勾配としての機能を果たした。炎症の合図の後、白血球が漏出および走化性によって脳に動員することが十分に報告されている（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｒａｉｎ  １２０：４３５−４４；Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１３２：５０７−２４；Ｂｌａｍｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ  ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：８１５３−９；Ｐｅｒｓｉｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５５：１５９９−６１１；Ｋｕｂｙ，Ｊ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｆｒｅｅｍａｎ，ＷＨ．ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。単球−マクロファージは、脳傍細胞間隙を通過し、それにより、脳内皮細胞の結合複合体を通過することができる（Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８：１８６５−８２；Ｌｏｓｓｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ．，１９：５３５−６４）。その有効な武器は、外来粒子の貪食およびエキソサイトーシスによる貪食物質の遊離からなる。それぞれが一緒になって、これらの特徴により、マクロファージをキャリアとして活用して、神経炎症過程に影響を及ぼすことが可能となる（Ｄａｌｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  ．Ａｃｔａ  １０２４：３５２−６６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１０３：１８５−９７；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：５２２６−３１；Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ  ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２７８：５９−６７）。
【０１２２】
ここで、ＢＭＭを、脳へのカタラーゼの治療濃縮物の輸送のためのビヒクルとして使用することができる。このアプローチの成功のための主な障害は、マクロファージが貪食した粒子を効率よく分解するという点である（Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２７８：５９−  ６７）。したがって、細胞キャリア内の酵素活性を保護することが極めて重要である。高分子ナノキャリー（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｃａｒｒｙ）（ナノスフェア、リポソーム、ミセル、ナノ粒子）への取り込みにより、かかる保護を得ることができる（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍ．，２０：５９５−６０５；Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１８：１１５７−１１６６；Ｇｒｅｆ  ｅｔ  ａｌ．；（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１６００−１６０３；Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６５−７；Ｊａｔｕｒａｎｐｉｎｙｏ（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１５：３４４−８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８２：１８９−２１２；Ｋｗｏｎ，Ｇ．Ｓ．（２００３）Ｃｒｉｔ．ＲｅＶ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，２０：３５７−４０３；Ｍｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９：１４３０−８；Ｒｏｕｓｓｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１２５：２５５−６４；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１１．Ｓ８１−９１；Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１５：５０−６０）。以前の研究により、高分子間電解質複合体の使用によって酵素を固定することができることが証明されている（Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｒｕｓｓｉａｎ），１１：５８２−５９６；Ｋａｂａｎｏｖ，Ｖ．（１９９４）Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，３６：１８３−１９７；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｐｈｙｓ  ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０８：１４８５−１４９０）。該酵素−高分子電解質複合体を、酵素をイオン性および非イオン性の水溶性ブロックを含む反対の電荷をもつブロック高分子電解質と自己集合することによってナノスケールで調製することができる（Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７２：８５−９１；Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ  ．（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２５：１５３０６−７）。得られたナノ粒子は、水溶性非イオン性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）のシェルに囲まれたタンパク質−高分子電解質複合体のコアを含む。現在の研究では、ポリヌクレオチド送達のために以前に使用されたカチオン性ブロックコポリマーであるポリエチレンイミン−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＩ−ＰＥＧ）との反応によってカタラーゼを固定している（Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，９：８０５−  ８１２）。得られたカタラ���ゼのブロックイオノマー複合体は、ＢＭＭによって取り込まれる。かかる修飾によってＢＭＭ中での分解からカタラーゼを保護し、ＢＭＭが外部媒体中に少なくとも４〜５日間ポリペプチド−ポリイオン複合体を放出し、ＰＤのＭＰＴＰモデルなどにおいてＢＭＭがポリペプチド−ポリイオン複合体を脳に送達することができるという証拠をここに示す。
【０１２３】
材料と方法
材料。実施例１と同一。
【０１２４】
ＢＭＭ。記載のようにマウス大腿骨（Ｃ５７ＢＬ／６、雌マウス）から抽出した骨髄細胞（Ｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０８：２８２７−３５）を、１０００Ｕ／ｍＬマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）（Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を補足した培地中で１０日間培養した。単球培養物の純度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用したフローサイトメトリーによって決定した。
【０１２５】
小グリア細胞。Ｃ５７ＢＬ／６  新生仔（１〜３日齢）から脳を取り出し、氷冷ＨＢＳＳで洗浄し、小片にすりつぶした。上清を２．５％トリプシンおよびＤＮアーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と置換し、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、１ｍＬの氷冷ＦＢＳを１０ｍＬ  ＨＢＳＳと共に添加した。混合物を遠心分離し（５分間、１５００ｒｐｍ、４℃）、ＭＣＳＦを含む完全培地をペレットに添加した。成熟するまで細胞を培養した（典型的には１０日間）。
【０１２６】
ＭＰＴＰ。実施例１と同一。
【０１２７】
ＰＥＩ−ＰＥＧ複合物。実施例１と同一。
【０１２８】
ブロックイオノマー複合体。実施例１と同一。
【０１２９】
電気泳動保持。実施例１と同一。
【０１３０】
光散乱測定。実施例１と同一。
【０１３１】
ＴＥＭ。実施例１と同一。
【０１３２】
カタラーゼおよびカタラーゼ活性。実施例１と同一。
【０１３３】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４およびローダミンイソチオシアナート（ＲＩＴＣ）でのカタラーゼの標識。負荷および放出研究のために、メーカーのプロトコールに従って、酵素をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４タンパク質標識キット（Ａ１０２３９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識した。共焦点顕微鏡法研究のために、カタラーゼをＲＩＴＣで標識した。簡潔に述べれば、カタラーゼを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、ＲＩＴＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＳＯにて室温で２時間処理した。標識したカタラーゼを、ＰＢＳを含むＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（１×２０ｃｍ）による溶離速度０．５ｍＬ分−１でのゲル濾過によって低分子量残渣から精製し、凍結乾燥させた。
【０１３４】
ＢＭＭ中のポリペプチド−ポリイオン複合体の蓄積および放出。２４ウェルプレート（２．５×１０６細胞／プレート）上で増殖させたＢＭＭ（Ｂａｔｒａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１５：１５２５−１５３２；Ｂａｔｒａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１６：７９３−８０２）を、アッセイ緩衝液（１２２ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭグルコース、３ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）と共に約２０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、該細胞を、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識酵素（０．７ｍｇ／ｍｌ）を含むアッセイ緩衝液のみまたはポリペプチド−ポリイオン複合体にて種々の時点で処理した。インキュベーション後、該細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、Ｔｒｉｔｏｎ×１００（１％）中に溶解した。ＢＭＭから放出されたポリペプチド−ポリイオン複合体の測定のために、負荷したＢＭＭを、種々の測定点で新鮮な培地とインキュベートした。各サンプル中の蛍光を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＲＦ５０００  蛍光分光光度計（λｅｘ５８０ｎｍ、λｅｍ６１７ｎｍ）によって測定した。ポリペプチド−ポリイオン複合体の量をタンパク質含有量について正規化し、負荷実験についてのタンパク質ｍｇあたりの酵素μｇおよび培地ｍＬあたりの酵素μｇを平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）としてとして示す。
【０１３５】
ポリペプチド−ポリイオン複合体の細胞内局在化。チャンバースライド中で増殖させた単球（Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，６：６３９−６４３）を、ＲＩＴＣ標識ポリペプチド−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）に３７℃で２４時間曝露した。インキュベーション後、該細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、Ｆ−アクチン特異的オレゴングリーン４８８ファロイジンおよび核染色（ＴｏＰｒｏ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））で染色した。標識細胞を、アルゴンイオンレーザー（励起波長、４８８ｎｍ）および対応するフィルターセットを備えた共焦点蛍光顕微鏡システム  ＡＣＡＳ−５７０（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｏｋｉｍｏｓ，ＭＩ）によって試験した。ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ，Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ）およびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用してデジタル画像を得た。
【０１３６】
抗酸化剤活性の測定。成熟マウスＢＭＭに酵素のみまたは酵素−ポリイオン複合体（Ｚ＝１）を１時間ロードし、ＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地を該細胞に添加した。種々の時間間隔後、該培地を回収し、ＢＭＭから放出された酵素の抗酸化剤活性を、過酸化水素の分解率によってアッセイした。
【０１３７】
Ａｍｐｅｘ  Ｒｅｄ  Ｄｙｅ蛍光アッセイ。９６ウェルプレートに播種したマウス小膠細胞（０．１×１０６細胞／ウェル）を、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（２００ｎｇ／ｍＬ）で４８時間またはニトロ化α−シヌクレイン（Ｎ−α−ｓｙｎ）（０．５μＭ）のいずれか一方で刺激して、ＲＯＳ産生を誘導した。並行して、２４ウェルプレート中で増殖させたＢＭＭに、「裸の」カタラーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）またはカタラーゼ−ポリイオン複合体を１時間ロードし、次いで、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒクレブス−リンゲル緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８６ｍＭ  ＫＣｌ、５．５ｍＭグルコース、５．７ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５４ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）と２時間インキュベートして、細胞から上清に放出されたカタラーゼを回収した。インキュベーション後、「裸の」カタラーゼまたはカタラーゼ−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭから回収した上清に、Ａｍｐｅｘ  Ｒｅｄ  Ｄｙｅストック液（１０Ｕ／ｍＬ  ＨＲＰ、１０ｍＭ  Ａｍｐｅｘ  Ｒｅｄ）を補足した。小グリア細胞のＮ−α−ｓｙｎ刺激のために、上清に０．５μＭ凝集Ｎ−α−ｓｙｎも補足した。得られた溶液を活性化小膠細胞に添加し、「裸の」カタラーゼまたはカタラーゼ−ポリイオン複合体によるＲＯＳの分解をλｅｘ＝５６３ｒｕｎ、λｅｍ＝５８７ｎｍでの蛍光によって測定した。ＲＯＳ分解に及ぼす非ロードＢＭＭまたはＰＥＩ−ＰＥＧのみをロードしたＢＭＭから回収した上清の影響を、コントロール実験と比較して評価した。
【０１３８】
カタラーゼポリペプチド−ポリイオン複合体の１２５Ｉ標識。実施例１と同一。１２５Ｉ標識カタラーゼ（４００μＣｉ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍｌ）にＰＥＩ−ＰＥＧブロックコポリマー（Ｚ＝１）を補足し、成熟単球（１ｍＬの培地中に８０×１０６ＢＭＭ）に３７℃で２時間ロードした。インキュベーション後、ロードした単球を、氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１３９】
統計分析。実施例１と同一。
【０１４０】
結果
該ポリペプチド−ポリイオン複合体の製造は、上の実施例１に記載されている。最初に、スルホローダミン−Ｂ（ＳＲＢ）細胞生存アッセイを使用して、ポリペプチド−ポリイオン複合体（およびカタラーゼまたはコポリマーのみ）では広範な濃度にわたってＢＭＭ細胞傷害性を誘導しないことが証明された（０．０３〜１０００μｇカタラーゼ／ｍＬ；図１０）。蓄積速度により、遊離カタラーゼおよびポリペプチド−ポリイオン複合体のＢＭＭ中への迅速な取り込みが示唆された（図１１Ａ）。特に、遊離酵素は、ポリペプチド−ポリイオン複合体のほぼ２倍の速度でＢＭＭ中に取り込まれた。６０分の時点で、ＢＭＭへのポリペプチド−ポリイオン複合体のローディングは約３０μｇカタラーゼ／１０６細胞であった。６０分でのポリペプチド−ポリイオン複合体の取り込みは、電荷比が増加するにつれて減少し（図１１Ｂ）、これはＰＥＧコロナの影響に起因し得る。共焦点顕微鏡法のデータにより、ポリペプチド−ポリイオン複合体中へのＢＢＭに投与されたＲＩＴＣ標識カタラーゼの小胞および／または細胞質の局在化が示唆された（図１１Ｃ）。
【０１４１】
成熟ＢＭＭに、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識カタラーゼ−ポリイオン複合体をプレローディングし（６０分間）、新鮮な培地中にて異なる時間間隔で培養した。ロードした該ＢＭＭは、外部の培地中にカタラーゼを少なくとも４〜５日間放出した（図１２Ａ）。同一期間中、該細胞に会合した該酵素の量は比例的に減少した。ポリペプチド−ポリイオン複合体ロードしたＢＭＭの１０μＭ酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）（タンパク質キナーゼＣ経路およびＲＯＳ生成の強力な活性化剤）への曝露（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８０：３６０−３６６）により、培地中での酵素放出が約５０％増強された（図１２Ｂ）。これにより、ＢＭＭからのポリペプチド−ポリイオン複合体の放出は細胞活性化に依存し得ることが示唆された。
【０１４２】
「裸の」カタラーゼまたはカタラーゼ−ポリイオン複合体をロードしたＢＢＭを新鮮な培地中に入れ、異なるインキュベーション時間間隔で培地中に放出された該酵素の活性を決定した。放出後に事実上不活性であった遊離カタラーゼをロードしたＢＭＭと対照的に、カタラーゼ−ポリイオン複合体をロードした該細胞は、少なくとも２４時間活性な酵素を放出した（図１３Ａ）。放出された該酵素の最大活性は、化学量論比（Ｚ＝１）で調製されたカタラーゼ−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭで認められた（図１３Ｂ）。以上を総合すると、これは、ＰＥＩ−ＰＥＧを有するブロックイオノマー複合体中のカタラーゼの取り込みによってＢＭＭから活性なカタラーゼが保護され、持続的に放出されることを示す。
【０１４３】
小グリア細胞のＲＯＳ産生に及ぼすカタラーゼナノ処方物（ｎａｎｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の抗酸化能力を評価するために、「裸の」カタラーゼまたはカタラーゼ−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭを、クレブス−リンゲル緩衝液中で２時間インキュベートし、得られた上清を回収し、ＴＮＦ−α（２００ｎｇ／ｍＬ）刺激小膠細胞に添加した。カタラーゼまたはカタラーゼ−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭから回収した上清中のカタラーゼは、小グリア細胞によって過酸化水素を分解した（図１４Ａ）。カタラーゼ−ポリイオン複合体によってより高い影響が認められ、これは、キャリア細胞中に酵素活性を保存する能力と一致した。さらに、非ロードＢＭＭ（図１４Ｂ）またはＰＥＩ−ＰＥＧのみをロードしたＢＭＭ（図１４Ｃ）から回収した上清は、たとえあったとしても、過酸化水素レベルにほとんど影響を及ぼさなかった。これらの所見をＰＤで典型的に見出される刺激によって活性化された小グリア細胞中で再現することができるかどうかを決定するために、細胞を０．５μＭ  Ｎ−α−ｓｙｎで刺激した。ＰＤ中に細胞質体として存在する凝集したＮ−α−ｓｙｎはドーパミン作動性ニューロンの死滅後に放出され、これはレヴィ小体の主成分である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１９：５３３−４２）。これらの凝集タンパク質が、小グリア細胞活性化のための刺激としての機能を果たすとの仮説が立てられる（Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ，Ｈ．（２００６）Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２７：１１６２；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１００：５０３−１９）。再度、過酸化水素レベルは、カタラーゼ−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭの上清の添加によって有意に減少した（図１４Ｄ）。以上を総合すると、本研究により、ＢＭＭから放出されたカタラーゼ−ポリイオン複合体が小グリア細胞の活性化に起因する酸化ストレスを弱めることができることが示唆される。実際、ＢＭＭから放出されたカタラーゼ−ポリイオン複合体は、「裸の」カタラーゼよりも有意に大量にＨ２Ｏ２を減少させ、それにより、ポリイオン複合体がＢＭＭ中にカタラーゼの酵素活性を有効に保存することを示す。
【０１４４】
カタラーゼ−ポリイオン複合体を保有するＢＭＭがヒトＰＤを反映する活動的な神経炎症性疾患を有する脳小領域に到達することができるかどうかを決定するために、ＭＰＴＰモデルを使用した。２つのＭＰＴＰ中毒Ｃ５７Ｂ１／６マウス群に、１２５Ｉ標識カタラーゼを含む遊離ポリペプチド−ポリイオン複合体を静脈内投与するか、養子移入されたカタラーゼ−ポリイオン複合体がロードされたＢＭＭを投与した。注射２４時間後、カタラーゼ−ポリイオン複合体のみで処置した群と比較して、養子移入を受けた群の脾臓、肝臓、肺、腎臓、および脳の放射能レベルが有意に増加した（図１５）。養子移入後、注射用量の約０．６％が脳内で見出され、これは遊離カタラーゼ−ポリイオン複合体を注射した動物で見出された量の２倍であったことに注目すべきである。以上を総合すると、これらのデータにより、酵素−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭの養子移入が脳およびマクロファージ組織移動部位であると知られる他の末梢組織への送達を増加させることができるという証拠が得られる。
【０１４５】
脳への治療用ポリペプチドの効率的な輸送が、神経変性疾患および神経炎症性疾患の良好な治療に必要である。この目的を達成するために、強力な抗酸化剤であるカタラーゼの送達のためのビヒクルとしてＢＭＭを使用することができるかどうかを試験した。実際、マクロファージおよび小グリア細胞ならびに他の単核食細胞がコロイド状ナノ粒子（例えば、リポソームまたはナノサスペンション（ｎａｎｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ））を細胞内に取込み、その後に薬物を組織の損傷部位、または感染部位、または罹患部位に輸送して放出することができることが以前より知られている（Ｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０８：２８２７−３５；Ｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５８：１４８−１５８；Ｇｏｒａｎｔｌａ  ｅｔ  ａｌ  ．（２００６）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．，８０：１１６５−１１７４；Ｄａｌｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０２４：３５２−６６；Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２６１：４３−５５）。
【０１４６】
さらに、ＢＭＭがＢＢＢを通過する能力も調査した（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４８：４０５−１５；Ｓｉｍａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１８：９９８−１０００；Ｍａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１３２：８１−９３；Ｓｔｒｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，５７：５６３−８１；Ｋｏｋｏｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，１９：４７１−８；Ｋｕｒｋｏｗｓｋａ−Ｊａｓｔｒｚｅｂｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓ）５９：１−８；Ｋｕｒｋｏｗｓｋａ−Ｊａｓｔｒｚｅｂｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１５６：５０−６１；Ｓｉｍａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １１：３２７−３５）。特に、ＰＤのＭＰＴＰマウスモデルにおいて単球が脳に浸潤することが証明された（Ｋｏｋｏｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，１９：４７１−８；Ｋｕｒｋｏｗｓｋａ−Ｊａｓｔｒｚｅｂｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓ）５９：１−８；Ｋｕｒｋｏｗｓｋａ−Ｊａｓｔｒｚｅｂｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１５６：５０−６１）。実際、ＭＰＴＰ毒性は、中脳、層、中隔、および海馬への単球浸潤率の一過性全般的増加を刺激した。これらの以前の研究では、脳中の単球−マクロファージの最大蓄積が、ＭＰＴＰ処置の１日後に認められた。これらのデータに基づいて、ＭＰＴＰ処置マウスに養子移入されたカタラーゼロード単球がＰＤ中で最も冒されやすい脳領域（黒質および線条体が含まれる）に酵素を送達させることができるようである。
【０１４７】
ＢＭＭ内のカタラーゼの分解を阻止するために、該タンパク質を、カチオン性ブロックコポリマーであるＰＥＩ−ＰＥＧを有するブロックイオノマー複合体中に固定した。得られたナノ粒子のサイズは約６０〜１００ｎｍであり、生理学的条件下（ｐＨ、イオン強度）で安定であった。ＢＭＭ中の高ローディングを達成しカタラーゼ活性を保存するために、該カタラーゼ−ポリイオン複合体の組成および構造を変化させた。外来粒子の内在化および開口分泌は、マクロファージにおける最も基本的な機能の１つである（Ｓｔｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，２：ｄｌ９７−２０６）。ＢＭＭが比較的短い期間に（約４０〜６０分間）かなりの量のポリペプチド−ポリイオン複合体を蓄積し（約３０μｇカタラーゼ／１０６細胞）、その後に外部の培地中に４〜５日間放出し続けることができることを本明細書中で証明した。これにより、養子移入後のカタラーゼ−ポリイオン複合体をロードした細胞がカタラーゼを脳に到達させて放出するのに十分な時間を有することができることも示唆される。さらに、単球およびマクロファージの活性化によって開口分泌を刺激することができると報告されている（Ｓｃｈｏｒｌｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：１９８−２０７；Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，４１９−４６；Ｃａｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｎａｔｕｒｅ  ２４７：４６−８）。上記の諸実験は、ＢＭＭによるポリペプチド−ポリイオン複合体の放出をＰＭＡの刺激によって増強することができることを示す。ブロックイオノマー複合体が宿主細胞内のカタラーゼ活性を保護することも上記で証明する。特に、該酵素−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭは、少なくとも２４時間培地に活性な酵素を放出した。さらに、ポリペプチド−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭから回収した培養上清は、Ｎ−α−ｓｙｎまたはＴＮＦ−αのいずれか一方で活性化された小グリア細胞によって産生されたＲＯＳに対するアッセイで強力な抗酸化剤を有していた。したがって、これらの細胞培養モデルは、ポリペプチド−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭが神経変性過程に関連する酸化ストレスを軽減することができることを示す。最後に、ポリペプチド−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭの養子移入によって組織への標識酵素の送達を増加させることができる（ＭＰＴＰ処置マウスの脳内の酵素量の２倍増加が含まれる）というｉｎ  ｖｉｖｏでの証拠を示す。興味深いことに、かなりの量の標識酵素が該ポリペプチド−ポリイオン複合体のみの注射後の脳内にも見出された。該ポリペプチド−ポリイオン複合体を循環単球によって取り込み、次いで、該酵素を脳に運搬することができる可能性がある。
【実施例６】
【０１４８】
画像の可視化およびｉｎ  Ｖｉｖｏ画像化システム（ＩＶＩＳ）研究。ＢＡＬＢ／ＣマウスにＭＰＴＰ（ＰＤ関連ニューロン炎症（ｎｅｕｒｏｎｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を誘導するため）を注射し、剪毛した（毛による蛍光ブロッキングを軽減するため）。Ａｌｅｘａ  ６８０標識ポリペプチド−ポリイオン複合体（ＰＥＩ−ＰＥＯ；Ｚ＝１）をＢＭＭにロードし、次いで、該単球をＭＰＴＰ処置マウスに静脈投与した（５０ｍｌｎ／マウス）。該マウスを、種々の時間間隔でＩＶＩＳを使用して撮像した（図１６）。ＭＰＴＰ中毒脳内にかなりの量のポリペプチド−ポリイオン複合体が見出された。有意に、非ＭＰＴＰコントロールマウスの脳内に蛍光は検出されなかった。これは、ＢＭＭがＢＢＢを通過し炎症部位へのポリペプチド−ポリイオン複合体送達を容易にしたことを示す。
【０１４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのポリペプチド−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭの毒性についての組織病理学的評価。Ｃ５７ＢＬ／６健常マウスに、ポリペプチド−ポリイオン複合体（１０ｍｌｎ／マウス）またはＰＢＳ（コントロール群）をロードした単球を注射した。４８時間後、脳、肝臓、脾臓、および腎臓を剖検で回収した。コード化された（ｃｏｄｅｄ）Ｈ&Ｅ染色器官の切片を、光学顕微鏡によって調べた。アポトーシスの兆候、ＢＢＢ破壊の兆候、脳内の神経細胞死のニューロン炎症反応の兆候；大滴性脂肪症（ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）および肝細胞の壊死；肝臓の胆汁分泌停止の兆候；または腎臓における急性尿細管壊死の兆候が見出されなかった。
【０１５０】
マウスにおけるＭＰＴＰ誘導性ドーパミン作動性神経喪失に対するＢＭＭにロードしたポリペプチド−ポリイオン複合体の神経保護。ポリペプチド−ポリイオン複合体の神経保護効果を評価するために、ＭＰＴＰ中毒性マウスにポリペプチド−ポリイオン複合体ロードしたＢＭＭを静脈注射し、ＳＮｐｃおよび層（ヒト疾患で最も影響をうける領域）中の脳神経代謝産物Ｎ−アセチルアスパルタート（ＮＡＡ）のレベルを、処置７日目にモニタリングした。ＭＰＴＰ注射により、コントロールマウスのＳＮｐｃおよび層中のＮＡＡが有意に喪失した（図１７）。対照的に、ＢＭＭにロードしたポリペプチド−ポリイオン複合体で処置したＭＰＴＰ中毒性マウス中のＮＡＡレベルは減少しなかった。さらなる研究では、ＭＰＴＰで中毒にされ、次いで、カタラーゼ−ポリイオン複合体をロードしたＢＭＭを静脈内投与したマウスの脳に、特にＳＮｐｃおよび層に、２日後のコントロールマウスに対するアストロサイトーシスによって測定したところ、炎症レベルの減少が見出された。上記は、カタラーゼ−ポリイオン複合体がＭＰＴＰ誘導性ドーパミン作動性神経変性中に神経保護能力を有することを示す。
【実施例７】
【０１５１】
ＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体の末梢投与は、中枢投与したＡｎｇＩＩの急性血圧応答を阻害する。
【０１５２】
実施例３に記載のＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体を使用して、末梢投与したＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体が脳内のＡｎｇＩＩシグナル伝達を調整することができるという証拠を得た。具体的には、該実験は、ＩＣＶ投与したＡｎｇＩＩ（１００ｎｇ）によって誘導された血圧の急性増加に及ぼす末梢投与した（頸動脈内）ＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体の影響を調べた。ＩＣＶ  ＡｎｇＩＩ誘導性の平均動脈圧（ＭＡＰ）の変化を、ＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体または遊離ＣｕＺｎＳＯＤの脛動脈内投与の０、１、２、および５日後にウサギにおいて記録した。ＩＣＶ投与ＡｎｇＩＩ後のＭＡＰの変化は、０日目の応答と比較してＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体処置の１日後および２日後に劇的に減少した（図１８）。対照的に、活性であるが細胞膜を介して通過できない遊離ＣｕＺｎＳＯＤタンパク質での処置は、ＩＣＶ  ＡｎｇＩＩ誘導性血圧応答に影響を及ぼさなかった（図１８）。これらのデータは、末梢投与されたＣｕＺｎＳＯＤ−ポリイオン複合体がＣＮＳ中のＡｎｇＩＩ感受性ニューロンを透過し、中枢ＡｎｇＩＩ媒介性心血管応答を調整することができることを示す。実際、本発明の特定の実施形態では、ａ）銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎＳＯＤ）およびＣｕＺｎＳＯＤの電荷と逆の少なくとも１つの電荷を含む合成ポリマーを含む少なくとも１つの複合体およびｂ）少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物の投与を含む、高血圧症患者の治療方法を提供する。特定の実施形態では、ＣｕＺｎＳＯＤ  およびＣｕＺｎＳＯＤの電荷と逆の少なくとも１つの電荷を含む合成ポリマーを含む複合体は、患者に投与される細胞内に含まれる。
【実施例８】
【０１５３】
脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、等電点１０．２３を有する分子量２７．３ｋＤａの塩基性神経栄養タンパク質である。ＢＤＮＦは、中性ｐＨで正味の正電荷（＋９．５）を有する（Ｐｈｉｌｏ  ｅｔ．ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２７８４０−２７８４６）。したがって、陰イオン性ブロックコポリマーであるＰＥＯ−ｂ−ポリ（メタクリル酸ナトリウム）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＡ）（カルボキシル基のｐＫａは５．２である）を使用して、該ポリイオン複合体にＢＤＮＦを取り込んだ。ブロックコポリマーおよびタンパク質成分を含む緩衝液の簡単な混合によって複合体を調製した。混合物中のポリマー／タンパク質比を、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＡのカルボキシル基の計算した全濃度をタンパク質中のリジン残基およびアルギニン残基の全濃度で割ることによって計算した。混合の際、これらの系は透明なままであり、沈殿は認められなかった。
【０１５４】
ハーセプチン（トラスツズマブ）は、ヒト化抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｃ−ｅｒｂＢ２）モノクローナル抗体である。ハーセプチンは、ＨＥＲ２を過剰発現する原発性および頭蓋転移性乳癌に対して有効であることが示された。しかし、脳転移した患者では、血液脳関門がその使用を制限する（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ｅｔ．ａｌ．（２００６）ＰＮＡＳ，１０３：１１７１９−１１７２３）。
【０１５５】
ハーセプチンは、等電点８．４５を有する分子量１４５．５ｋＤａの塩基性タンパク質である。ハーセプチンは、中性ｐＨで正味の正電荷（＋１２）を有する。陰イオン性ブロックコポリマーであるＰＥＯ−ｂ−ポリ（メタクリル酸ナトリウム）（ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＡ）（カルボキシル基のｐＫａは５．２である）を使用して、ポリイオン複合体にハーセプチンを取り込んだ。ブロックコポリマーおよびタンパク質成分を含む緩衝液の簡単な混合によって複合体を調製した。該混合物中のポリマー／タンパク質比を、ＰＥＯ−ｂ−ＰＭＡのカルボキシル基の計算した全濃度をタンパク質中のリジン残基およびアルギニン残基の全濃度で割ることによって計算した。混合の際、これらの系は透明なままであり、沈殿は認められなかった。
【０１５６】
レプチンは１８．７ｋＤのタンパク質ホルモンであり、エネルギーの取り込みおよびエネルギーの消費の調節（食欲の調節（減少）および代謝の調節（増加）が含まれる）で重要な役割を果たす。レプチンは、生理学的ｐＨで等電点５．８５および正味の負電荷（約−２）を有する。ＰＬＬ骨格上にグラフティングされた約１．４ＰＥＯ鎖を含むグラフト構造のカチオン性ブロックイオノマーであるｐｏｌｙ−Ｌ−リジン−グラフト−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２））を使用して、レプチン−ポリイオン複合体を調製した。該グラフトポリマーおよびタンパク質成分を含む緩衝液の簡単な混合によって複合体を調製した。該混合物中のポリマー／タンパク質比を、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＯ（２）のアミノ基の全濃度をタンパク質中のアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基の全濃度で割ることによって計算した。混合の際、これらの系は透明なままであり、沈殿は認められなかった。
【実施例９】
【０１５７】
カタラーゼポリイオン複合体をロードした単球によるＭＰＴＰ中毒性マウスにおける炎症の防止。
【０１５８】
ＰＤについて特徴づけられた病理学的変化の誘導のために、雄Ｃ７ＢＬ／６レシピエントマウスに、２時間毎の４回の腹腔内注射によって、１８ｍｇの遊離塩基ＭＰＴＰ／ｋｇ体重をＰＢＳで投与した（ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））。コントロールマウスに、１８時間後に生理食塩水を静脈注射し、ＭＰＴＰ中毒マウスの半分にカタラーゼポリイオン複合体（１０ｍｌｎ／マウス）をロードした単球を静脈注射し、残りの半分のマウスに生理食塩水を静脈注射した。ニューロン死の活動期および神経炎症活動のピークは、ＭＰＴＰ注射の２日後に起こる。したがって、２日後、ナイーブマウス、ＭＰＴＰ中毒マウス、およびＭＰＴＰ中毒化後にカタラーゼをロードした単球で処置したマウスの中脳領域を単離し、脳を瞬間冷凍し、ＯＣＴ培地に包埋した。免疫組織学的分析を、４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定し、その後スクロース溶液中にて４℃で４８時間固定した厚さ３０μｍのインタクトなスライスにおいて行った。組織スライスを、０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で保存し、染色前にＰＢＳで３回洗浄した。次いで、組織スライスを、７％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中で１時間ブロッキングした。
【０１５９】
小グリア細胞活性化（Ｍａｃ−１染色）のために、切片にした組織を、７％ＮＧＳで２００倍希釈したラットＣＤ１１ｂ一次抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）にて４℃で一晩免疫染色する。サンプルを、７％ＮＧＳで２００倍希釈したヤギ抗ラット二次抗体  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と室温で４５分間インキュベートした。
【０１６０】
アストロサイトーシスについて、組織切片を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む５％ＮＧＳ（正常ヤギ血清）のＰＢＳ液にて１０分間透過処理し、５％ＮＧＳで１時間ブロッキングし、次いで、５％ＮＧＳで１０００倍希釈したウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質一次抗体と４℃で１８時間インキュベートした。サンプルを、２００倍希釈したヤギ抗ウサギ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と室温で４５分間インキュベートした。該スライスを、Ａｑｕａｍｏｕｎｔ中に固定した。蛍光分析によって免疫反応性を評価した。蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ；ＮＩＨ）を使用して計算した。領域を、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、ＣＤ１１ｂ発現レベルの関数として計算した。
【０１６１】
【表１３】
2010540411.tif 000015
【０１６２】
表１３に示したデータは、ＭＰＴＰ注射によって黒質緻密部内に有意な炎症を生じ、それにより、小グリア細胞活性化およびアストロサイトーシスが起こることを明確に示す。対照的に、カタラーゼをロードした単球でのＭＰＴＰ注射マウスの処置により、神経炎症が健常動物におけるレベルに防止された（表１３）。
【０１６３】
マウスにおけるＭＰＴＰ誘導性ドーパミン作動性神経喪失に対するカタラーゼポリイオン複合体をロードした単球の神経保護効果。
【０１６４】
ＭＰＴＰ中毒性マウスにおけるＰＤの進行にもたらされた黒質および線条体におけるカタラーゼ増大神経保護の影響を定量的且つ非浸潤的に評価するために、神経Ｎ−アセチルアスパルタート（ＮＡＡ）レベルを評価する新規の神経画像を、磁気共鳴分光学的画像化（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ）（ＭＲＳＩ）によって読み出した。
【０１６５】
この目的のために、最初に、マウスをＭＰＴＰ注射前にプレスキャニングした。次いで、該マウスの半分に、カタラーゼポリイオン複合体をロードしたＢＭＭ（２５ｍｌｎ  ＢＭＭ／１００μｌ／マウス）を注射した。ＰＢＳを注射したＭＰＴＰ処置マウスは、最大神経変性のコントロールとしての機能を果たした。ＳＮｐｃおよび層中の脳神経代謝産物Ｎ−アセチルアスパルタート（ＮＡＡ）を、処置７日後にＭＲＳＩによって評価した。ＭＲＩおよびＭＲＳＩを、アクティブに分離した７２ｍｍ体積送信コイル（ｖｏｌｕｍｅ  ｃｏｉｌ  ｔｒａｎｓｍｉｔ）および研究室で組み立てた１．２５×１．５ｃｍ受信表面コイルを使用して３００．４１  ＭＨｚで操作するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ７Ｔ／２１ｃｍシステムで取得した。ＭＲ画像を、２０ｍｍ  ＦＯＶ、２５枚の連続する厚さ０．５ｍｍのスライス、交互的なスライスの順序、１２８×１２８マトリックス、８エコー、エコー間隔１２ｍｓを使用して取得し、ＣＰＭＧ位相循環ＲＦリフォーカシングパルスを使用してリフォーカシングして、組織学を使用したＴ２マッピングおよび同時記録のための８画像を形成した。３つの直交スライス選択的リフォーカシングパルスを使用してリフォーカシングした数値的に最適化された二重励起を使用して分光学的画像を得た（体積選択性リフォーカシングを使用した二重励起、ＢＥＶＲ）。名目上のボクセルサイズ１μｌが得られるＳＮｐｃを含むスライスの４つの平均値を使用した視野（ＦＯＶ）２０ｍｍにわたる２４×２４空間符合化を使用した８×４．２×１．５ｍｍの目的体積の選択によって分光学的画像を得た。総取得時間は８０分である。ＭＲＳＩ処理。分光学的画像を、次元をコード化する相でフーリエ変換し、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ，Ｎａｎｔｉｃｋ，ＭＡ）を使用して再フォーマットした。ｊＭＲＵＩパッケージ中のＡＭＡＲＥＳを使用して、スペクトルをフィッティングした。モデルパラメーターおよび制約を、ファントム由来のスペクトルを使用して得た。
【０１６６】
ＴＲ＝１ｓ、ＮＡ＝１、およびレシーバゲイン＝１０００を除いて同一方法のスペクトルパラメーターを使用して非抑制水（ｕｎｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｗａｔｅｒ）分光学的画像を得る。該非抑制水を、水抑制ＭＲＳＩデータからの代謝産物濃度を定量するために各ボクセルの内部標準として使用する。データソースを隠された技術者がデータをフィッティングする。各レシーバゲインでの水信号振幅に対する代謝産物の比の校正を、ファントム研究で行った。Ｍａｔｌａｂ（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ，Ｎａｎｔｉｃｋ，ＭＡ）を使用して計算し、代謝産物濃度をＡＳＣＩＩ（データベース開発のため）およびバイナリ（ＭＲＩ重複のため）代謝産物マップとして出力した。
【０１６７】
図１９に示すように、ＭＰＴＰ注射によってコントロールマウスのＳＮｐｃおよび層中のＮＡＡが有意に喪失した。対照的に、ポリペプチド−ポリイオン複合体ロードしたＢＭＭで処置したＭＰＴＰ中毒性マウスにおけるＮＡＡレベルは減少しなかった。これらの結果は、マウスＰＤモデルにおいてロードした細胞が脳の損傷領域に有意なレベルで到達して活性カタラーゼを放出し、その後に神経保護効果を生じることができることを示した。
【実施例１０】
【０１６８】
種々のタイプの細胞キャリア中のカタラーゼポリイオン複合体の蓄積。
【０１６９】
ＢＭＭに加えて（ｂｅｓｉｄｅ）、炎症状態下で脳に浸潤することも証明された樹状細胞（ＤＣ）またはＴリンパ球などの他の細胞キャリアを、カタラーゼポリイオン複合体の送達のために使用することができる。ＢＭＭと同様にローディング試験を行った。簡潔に述べれば、ＤＣまたはＴ−リンパ球を、１×１０６細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識カタラーゼポリイオン複合体（＋／−電荷比（Ｚ）＝１）と種々の時間間隔でインキュベートした。次いで、該細胞を洗浄し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で破壊した。ＢＭＭ中の蛍光の蓄積量をアッセイし、細胞量について正規化した（表１４）。
【０１７０】
【表１４】
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【０１７１】
ＢＭＭと同様に、両細胞はかなりの量のカタラーゼナノ粒子（それぞれ、１０６個のＤＣ、Ｔリンパ球、およびＢＭＭあたり１１２μｇ、２１μｇ、および３０μｇ）を迅速に（１時間）取り込むことを証明する。これにより、種々の細胞キャリア系を使用して、カタラーゼポリイオン複合体の良好な脳送達を確実にすることが可能である。
【実施例１１】
【０１７２】
カタラーゼポリイオン複合体の架橋
複合体を安定化するために、ブロックコポリマーをタンパク質と架橋する種々の架橋剤を使用した。
【０１７３】
グルタルアルデヒド
カタラーゼポリイオン複合体を得るために、０．５ｍｌのカタラーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含む６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を、０．５ｍｌのブロックコポリマー（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含む同一の緩衝液と混合した。次いで、４μｌ（１００倍過剰（ＮＨ２基の量））のグルタルアルデヒド（Ｆｌｕｋａ、＃４９６３２、２５％水溶液）を、強く撹拌しながら該混合物に添加した。該混合物を、室温で２時間インキュベートした。次いで、７．５μｌの水素化ホウ素ナトリウム溶液（５×１０−２Ｍ）を含む１Ｍ  ＮａＯＨを、２０分間隔で２回に分けて添加した。該混合物を室温で１時間さらにインキュベートし、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によって精製した。
【０１７４】
Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）
カタラーゼポリイオン複合体を、上記のように得た。次いで、１．５ｍｇ  ＥＤＣ（３０倍過剰（ＣＯＯ−基の量））を、強く撹拌しながら該混合物に添加した。該混合物を、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、該混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によってさらに精製した。
【０１７５】
ビス−（スルホスクシンイミジル）スベリン酸ナトリウム塩（ＢＳ３）
カタラーゼポリイオン複合体を上記のように得た。次いで、２ｍｇ  ＢＳ３（７倍過剰（リジン基の量））を、強く撹拌しながら該混合物に添加した。該混合物を、室温で３時間インキュベートした。インキュベーション後、該混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によってさらに精製した。
【０１７６】
カタラーゼポリイオン複合体の架橋を、ウェスタンブロットによって確認した。サンプルを、変性条件下（ＳＤＳを使用）でのポリアクリルアミドゲル（１０％）のゲル電気泳動に供し、非架橋複合体を破壊した。次いで、ゲルをブロッティングし、タンパク質バンドをカタラーゼに対する一次抗体（ａｂｅａｍ、ａｂｌ８７７）で視覚化した。図２０は、種々のリンカーを使用して架橋したカタラーゼ／ポリイオン複合体の画像を示す。レーン１：後者（ｌａｔｔｅｒ）；レーン２：カタラーゼのみ；ライン３：ＥＤＣと架橋したカタラーゼポリイオン複合体；ライン４：ＧＡと架橋したカタラーゼポリイオン複合体；ライン５：ＢＳ３と架橋したカタラーゼポリイオン複合体。
【０１７７】
図２０で認められるように、ＧＡと完全に結合し、それにより、カタラーゼバンドが存在しなかった。これはゲルに侵入しない巨大な複合体に起因する（ライン４、カタラーゼバンドなし）。架橋剤としてのＥＤＣの使用によっても架橋したが（ライン３）、いくつかの遊離カタラーゼバンドが存在するので、これらの条件下で完全な結合が行われなかった。ＢＳ３との架橋により（ライン５）、ゲルに侵入するより小さな複合体が生成されたが、遊離カタラーゼバンド（ライン２）と比較して遅延した。
【０１７８】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ポリイオン複合体の架橋
類似の架橋複合体を、ＳＯＤおよびブロックコポリマーを使用して得た。
【０１７９】
ＧＡ
ＳＯＤポリイオン複合体を得るために、０．５ｍｌのＳＯＤ（１ｍｇ／ｍｌ）を含む６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を、０．５ｍｌのブロックコポリマー（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含む同一の緩衝液と混合した。次いで、１０μｌ（１００倍過剰（ＮＨ２基の量））のＧＡを、強く撹拌しながら該混合物に添加した。該混合物を、室温で２時間インキュベートした。次いで、５μｌの水素化ホウ素ナトリウム溶液（５×１０−２Ｍ）を含む１Ｍ  ＮａＯＨを、２０分間隔で２回に分けて添加した。該混合物を室温で１時間さらにインキュベートし、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によって精製した。
【０１８０】
ＥＤＣ
ＳＯＤポリイオン複合体を上記のように得た。次いで、１．５ｍｇ  ＥＤＣ（１２倍過剰（ＣＯＯ−基の量））を、強く撹拌しながら該混合物に添加した。該混合物を、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、該混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によってさらに精製した。
【０１８１】
ＢＳ３
ＳＯＤポリイオン複合体を上記のように得た。次いで、１．７ｍｇ  ＢＳ３（４．５倍過剰（リジン基の量））を、強く撹拌しながら該混合物に添加した。該混合物を、室温で３時間インキュベートした。インキュベーション後、該混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によってさらに精製した。
【０１８２】
ＳＯＤポリイオン複合体の架橋を、ウェスタンブロットによって確認した。サンプルを、変性条件下（ＳＤＳを使用）でのポリアクリルアミドゲル（１０％）のゲル電気泳動に供し、非架橋複合体を破壊した。次いで、ゲルをブロッティングし、タンパク質バンドをＳＯＤに対する一次抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈａｅｍ，＃  ５７４５９７）で視覚化した。図２１は、種々のリンカーを使用して架橋したＳＯＤ／ポリイオン複合体の画像を示す。レーン１：後者；レーン２：ＳＯＤのみ；ライン３：非架橋ＳＯＤポリイオン、ライン４：ＥＤＣと架橋したＳＯＤポリイオン複合体；ライン５：ＧＡと架橋したＳＯＤポリイオン複合体；ライン６：ＢＳ３と架橋したＳＯＤポリイオン複合体。
【０１８３】
図２１で認められるように、いくつかの遊離ＳＯＤバンドが存在するので、ＥＤＣとの架橋（ライン４）は、これらの特定の条件下で完全に結合しなかった。対照的に、ＧＡ（ライン５）およびＢＳ３（ライン６）と完全に結合し、それにより、巨大な複合体がゲルに侵入できないためＳＯＤバンドは認められなかった。
【０１８４】
カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体の架橋
概して、混合カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体を得るために、第１に、カタラーゼおよびＳＯＤをｐＨ６．８で混合し（このｐＨでカタラーゼは負に帯電し（ＰＩ７．２８）、ＳＯＤは正に帯電している（ＰＩ  ６．３２））。次いで、上記合成と同様に、該ブロックコポリマーを添加し、種々のリンカーを使用して、該ブロックコポリマーを該タンパク質に結合させた。
【０１８５】
ＧＡ
カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体を得るために、１ｍｇのカタラーゼおよび１．３３ｍｇのＳＯＤを６０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．８）に溶解した。次いで、１．３ｍｇのブロックコポリマーを該混合物に添加し、室温で１０分間インキュベートした。５μｌ（９倍過剰（ＮＨ２基の量））のＧＡを、強く撹拌しながら該混合物に添加した。該混合物を、４℃で一晩（８時間）インキュベートした。次いで、６．５μｌの水素化ホウ素ナトリウム溶液（５×１０−２Ｍ）を含む１Ｍ  ＮａＯＨを、２０分間隔で２回に分けて添加した。該混合物を室温で１時間さらにインキュベートし、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によって精製した。
【０１８６】
ＥＤＣ
カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体を上記のように得た。次いで、１０ｍｇのＥＤＣ（２０倍過剰（ＣＯＯ−基の量））を、強く撹拌しながら該混合物に添加した。該混合物を、４℃で一晩（８時間）インキュベートした。インキュベーション後、該混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によってさらに精製した。
【０１８７】
ＢＳ３
カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体を上記のように得た。次いで、８．６ｍｇのＢＳ３（１０倍過剰（リジン基の量））を、強く撹拌しながら該混合物に添加した。該混合物を、室温で３時間インキュベートした。インキュベーション後、該混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によってさらに精製した。
【０１８８】
ＥＤＣ−スルホ−ＮＨＳ
中間体ＥＤＣ複合体を安定化するために、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を使用した。この目的のために、カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体を上記のように得た。次いで、１０ｍｇのＥＤＣ（２０倍過剰（ＣＯＯ−基の量））を、強く撹拌しながら該混合物に添加した。ＥＤＣの添加後、２ｍｇスルホ−ＮＨＳを添加し、反応混合物を、室温で３時間インキュベートした。インキュベーション後、該混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラムでのゲル濾過によってさらに精製した。
【０１８９】
カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体の架橋を、ウェスタンブロットによって確認した。サンプルを、変性条件下（ＳＤＳを使用）でのポリアクリルアミドゲル（１０％）のゲル電気泳動に供した。次いで、ゲルをブロッティングし、タンパク質バンドを個別にカタラーゼおよびＳＯＤに対する一次抗体で視覚化した。図２２Ａは、カタラーゼに対する抗体を使用して標識した種々のリンカーを使用して架橋したカタラーゼ／ＳＯＤ／ポリイオン複合体の画像を示す。レーン１：非架橋カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体；ＧＡと架橋したカタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体（ＥＤＣ；ライン５：ＧＡと架橋したＳＯＤポリイオン複合体（レーン２）；ＥＤＣ（ライン３）；ＢＳ３（ライン４）；ＥＤＣ−Ｓ−ＮＨＳ（ライン５）。該図で認められるように、ＧＡと完全に結合し（ライン２）、ＥＤＣとの架橋（ライン３）により、不完全に結合した（いくつかの遊離カタラーゼバンドが存在する）。ＢＳ３リンカーの使用（ライン４）により、ゲルに侵入することができる複合体が得られたが、非架橋カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体と比較して遅延した。スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用した中間体ＥＤＣ複合体の安定化（ライン５）により、ＥＤＣのみ（ライン３）と比較して有意により良好な架橋が得られた。
【０１９０】
図２２Ｂは、ＳＯＤに対する抗体で標識した種々のリンカーを使用して架橋したカタラーゼ／ＳＯＤ／ポリイオン複合体の画像を示す。レーン１：非架橋カタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体；ＧＡと架橋したカタラーゼ／ＳＯＤポリイオン複合体（ＥＤＣ；ライン５：ＧＡと架橋したＳＯＤポリイオン複合体（レーン２）；ＥＤＣ（ライン３）；ＢＳ３（ライン４）；ＥＤＣ−Ｓ−ＮＨＳ（ライン５）。
【０１９１】
該結果は、カタラーゼに対する抗体で染色したゲルから得たデータを確認した。ＧＡと完全に結合した（ライン２）；ＥＤＣとの架橋（ライン３）によって不完全に結合した（遊離ＳＯＤが有意に染色する）。ＢＳ３リンカー（ライン４）およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをＥＤＣと共に使用して（ライン５）、ほとんど完全に結合した。
【実施例１２】
【０１９２】
ＭＰＴＰ中毒性マウス中のＢＭＭ生体分布の視覚化
実験前に、ＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスを、３０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でのペントバルビタールの腹腔内注射を使用して麻酔し、剪毛し、脱毛した（毛による蛍光ブロッキングを軽減するため）。該マウスを、流動食で７２時間保持した（固形食由来の胃内および腸内の自己蛍光を排除するため）。該マウスに、２時間毎の４回の腹腔内注射によって１８ｍｇの遊離塩基ＭＰＴＰ／ｋｇ体重をＰＢＳで投与した（ＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））。１８時間後、該マウスにカタラーゼポリイオン複合体をロードしたＬｉ−ＣＯＲ標識ＢＭＭ（５０ｍｌｎ／マウス）を尾静脈注射した。次いで、該マウスを６６％亜酸化窒素および残りの酸素と共に１．５％イソフルラン混合物を使用して麻酔し、撮像カメラ中に配置した。カタラーゼポリイオン複合体をロードした標識ＢＭＭの生体分布を、ＩＶＩＳ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｇａｓ  Ａｎａｓｔｈｅｓｉａ  Ｓｙｓｔｅｍによって検出するようにＬｉ−ＣＯＲのｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光の測定によって決定した。カタラーゼポリイオン複合体をロードしたＬｉ−ＣＯＲ標識ＢＭＭは、ＩＶ注射の２時間後に脳内に蓄積し始め、注射４〜７時間後にピークに達し、注射後少なくとも４８時間上昇したままであった（図２３）。これらのデータは、末梢投与したカタラーゼポリイオン複合体をロードしたＢＭＭがＭＰＴＰ中毒化マウスの脳内に到達し、かなりの量で蓄積することができたことを示す。
【０１９３】
いくつかの刊行物および特許書類を上記明細書を通して引用し、本発明が関連する最新技術を説明している。これらの各引用の開示全体は、本明細書中で参考として援用される。
【０１９４】
本発明の一定の好ましい実施形態を上に記載し、具体的に例示しているが、本発明はかかる実施形態に制限されることを意図しない。以下の特許請求の範囲に記載のように、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、種々の修飾形態を施すことができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2010540411.tif 000018
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2010540411.tif 000020
【図１Ｅ】
2010540411.tif 000021
【図１Ｆ】
2010540411.tif 000022
【図１Ｇ】
2010540411.tif 000023
【図２Ａ】
2010540411.tif 000024
【図２Ｂ】
2010540411.tif 000025
【図３】
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【図４Ａ】
2010540411.tif 000027
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2010540411.tif 000029
【図５Ｂ】
2010540411.tif 000030
【図５Ｃ】
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【図６】
2010540411.tif 000032
【図７】
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【図８Ａ】
2010540411.tif 000034
【図８Ｂ】
2010540411.tif 000035
【図９Ａ】
2010540411.tif 000036
【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
2010540411.tif 000039
【図１１Ｂ】
2010540411.tif 000040
【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
2010540411.tif 000042
【図１２Ｂ】
2010540411.tif 000043
【図１３Ａ】
2010540411.tif 000044
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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