(57)【要約】  本発明は、メチロトローフ酵母宿主細胞中でポリペプチドを作製するための方法であって、ここでポリペプチドの発現は、メタノール誘導性プロモーターにより制御され、i）メタノール誘導性プロモーターからの転写を活性化する、正の調節因子の非天然プロモーターからの発現、及びii）メタノールの不添加、を含んでなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチロトローフ酵母宿主細胞中でポリペプチドを作製するための方法であって、ここでポリペプチドの発現は、メタノール誘導性プロモーターにより制御され、i）メタノール誘導性プロモーターからの転写を活性化する、正の調節因子の非天然プロモーターからの発現、及びii）メタノールの不添加、を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記メチロトローフ酵母宿主細胞が、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、カンジダ(Candida）、及びトルロプシス（Torulopsis）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メタノール誘導性プロモーターが、ＡＯＸ１プロモーター、ＤＨＡＳプロモーター、ＦＤＨプロモーター、ＦＭＤＨプロモーター、ＭＯＸプロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＺＺＡ１、ＰＥＸ５−，ＰＥＸ８−、ＰＥＸ１４−プロモーターからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記正の調節因子の発現が構成的である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記正の調節因子が、配列番号１に示されるＰｒｍ１又はその機能的相同体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記機能的相同体が、配列番号１と、少なくとも85％一致、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは配列番号１と少なくとも98％一致する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記正の調節因子がＧＡＰプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター又はＰＧＫプロモーターの制御下である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記正の調節因子の発現が誘導性である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記正の調節因子をコードする遺伝子が多コピー存在する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記メタノール誘導性プロモーターに、正の調節因子のための追加的な結合部位が提供される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ｍｘｒ１遺伝子が、非天然プロモーターにより制御される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ｍｘｒ１が、前記ＧＡＰプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、又はＰＧＫプロモーターの制御下である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ピキア宿主細胞が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、Ｐ．メタノリカ（P. methanolica）、Ｐ．アングスタ（P. angusta）、Ｐ．サーモメタノリカ（P. thermomethanolica）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハンゼヌラ宿主細胞が、ハンゼヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記カンジダ宿主細胞が、カンジダボイジニイ（Candida boidinii）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
正の調節因子の内因性コピーを制御する前記プロモーターが、非天然の構成的プロモーターにより置換もされる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが前記宿主細胞の非相同体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが前記宿主細胞の相同体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
メタノール誘導性プロモーターの制御下で非相同ポリペプチドの発現レベルを増加させるための方法であって、前記ｐｒｍ１遺伝子の構成的発現を提供することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチロトローフ酵母宿主細胞中でポリペプチドを作製する方法であって、ポリペプチドの発現がメタノール誘導性プロモーターにより制御される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物は、例えば医薬的及び工業的応用のためのペプチド作製のための宿主細胞として、広く工業的に使用されている。遺伝子の転写及び発現を操作できる能力は、より高い生産収率を提供することの基礎となる。
【０００３】
従来から、真核生物において遺伝子の最大発現は、染色体において、注目のポリペプチドをコードする遺伝子及び増幅選択マーカーに作動的に結合された、単一のプロモーターを含有する発現カセットを増幅することにより達成している。
【０００４】
制御された発現が望ましいことは多い。メチロトローフ酵母において特定のプロモーターは、増殖培地中のメタノールの存在に依存して、その転写誘導をすることがかなり前から知られている。このメタノールによる誘導は、追加的な因子の存在を必要とするが、この因子の正確な作用メカニズムは解明されていない。正の因子の例としては、酵母に含まれるMxr1pが知られており、a key positive regulator required for methanol utilization in Pichia pastoris (Lin-Cereghino et al., 2006, MoI Cell Biol 26(3): 883-897)に記載がある。
これらメタノール依存性プロモーターの例は、メチロトローフ酵母として知られる酵母群に属するいくつかの酵母細胞について報告されてきた。これら生物のメタノール代謝に関連する酵素の発現を制御するプロモーターは特に強く、これらのプロモーターは一般的に酵母において、タンパク質の非相同的な発現を制御するために使用される。但し、これら宿主細胞の培養のために使用される特定の炭素源は、メタノール代謝プロモーターの調節に非常に大きな影響力を有する。メタノール及びグリセロールは、メチロトローフ酵母発現系のための適切な基質と考えられているが、一方でグルコースは不適切であると考えられてきた（欧州特許第299108号）。従って、既知のメタノール代謝プロモーターからの発現の基質依存性を低減することが望まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、メチロトローフ酵母宿主細胞中でポリペプチドを作製するための方法であって、ここでポリペプチドの発現は、メタノール誘導性プロモーターにより制御され、i）メタノール誘導性プロモーターからの転写を活性化する、正の調節因子の非天然プロモーターからの発現、及びii）メタノールの不添加、を含んでなる方法を提供する。本発明はさらに、メタノール誘導性プロモーターの制御下で非相同ポリペプチドの発現レベルを増加させるための方法であって、前記ｐｒｍ１遺伝子の構成的発現を提供することを含んでなる方法を開示する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は、メタノール誘導性プロモーターからの、制御されたポリペプチド発現に関する。これらメタノール依存性プロモーターの例は、メチロトローフ酵母として知られる酵母群に属するいくつかの酵母細胞について報告されてきた。本発明との関連において、メチロトローフ酵母は、その増殖のための単独の炭素源としてメタノールを利用できる酵母群、と定義される。生物におけるメタノール代謝に関連する酵素のプロモーターは特に強く、これらのプロモーター（メタノール代謝プロモーター）は一般的に酵母において、タンパク質の非相同的な発現を制御するために使用される。
当該属に属するメチロトローフ酵母宿主細胞の既知の種としては、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、カンジダ(Candida）、及びトルロプシス（Torulopsis）からなる群から選択される。本発明によると、ある実施態様において、ピキア宿主細胞は、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、Ｐ．メタノリカ（P. methanolica）、Ｐ．アングスタ（P. angusta）、Ｐ．サーモメタノリカ（P. thermomethanolica）からなる群から選択できる。ハンゼヌラ又はカンジダ宿主細胞は、Ｈ．ポリモルファ（H. polymorpha）、及びＣ．ボイジニイ（C. boidinii）からなる群から選択できる。
すでにいくつかのプロモーターは単離され、非相同的なポリペプチドの発現は増殖培地にメタノールを添加することにより制御可能であることが文献に記載されている。限定するものではないが、当該プロモーターには、例えばＡＯＸ１プロモーター（アルコールオキシダーゼプロモーター）、ＤＨＡＳプロモーター（又はＤＡＳプロモーター）（ジヒドロキシアセトンシンターゼプロモーター）、ＦＤＨプロモーター（又はＦＭＤＨプロモーター）（ギ酸デヒドロゲナーゼプロモーター）、ＭＯＸプロモーター（メタノールオキシダーゼプロモーター）、ＡＯＸ２プロモーター、ＺＺＡ１、ＰＥＸ５−、ＰＥＸ８−、ＰＥＸ１４−プロモーターがある。具体的には、本発明において有用なプロモーターは、メタノール代謝に関連する酵素用のプロモーターである。当該プロモーターは、当業者が従来技術を用いて酵母から単離できる。上記プロモーターの全てがメチロトローフ酵母群の特定の種から既に単離されており、ホモロジー検索により、他の種からの対応するプロモーターは容易に同定できる。これは本明細書に含まれる実施例によってさらに説明する。より具体的には、当該プロモーターは、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ又はＦＭＤＨ）プロモーター、メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）プロモーター、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ又はＤＨＡＳ）プロモーター又はアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターからなる群から選択される。
通常、上記プロモーターの全ては、その誘導のためにメタノールの存在を必要とする。このメタノールによる誘導は、追加的な因子（例えば転写因子）の存在を必要とするが、当該因子の正確な作用メカニズムは解明されていない。酵母において、例えばMxr1pが、 a key positive regulator required for methanol utilization in Pichia pastoris (Lin-Cereghino et al., 2006, MoI Cell Biol 26(3): 883- 897)に記載されている。
【０００７】
本発明の発明者らは、本明細書に記載した通り、ピキアパストリス由来のＰｒｍ１遺伝子にコードされた、単一の正の因子の制御された発現は、増殖培地中にメタノールを必要とすることなく、いくつかのメタノール誘導性プロモーターから転写を十分誘導できることを発見した。本明細書に開示したように、この原理は、正の活性因子のためのモデルタンパク質としてＰｒｍ１タンパク質を用いること、及び制御された受容体ポリペプチドの発現のために、ＡＯＸ１又はＤＡＳプロモーターを用いることにより実証された。得られた結果から、増殖培地中にメタノールが存在しなくても、単にｐｒｍ１遺伝子の発現を制御するだけで、ＡＯＸ１又はＤＡＳプロモーターを誘導することが可能であることが示された。
【０００８】
本発明のある実施態様によれば、正の調節因子は、適切なプロモーターから構成的に発現される。好ましくは当該プロモーターは非天然のプロモーターであり、これは正の調節因子の発現を制御するプロモーターが通常発現を制御するプロモーターと異なることを意味する。本発明との関連において、かかる好ましいプロモーターは、「非天然」と呼ばれる。当該プロモーターは、なお宿主生物由来の可能性もあるが、問題の遺伝子、例えばｐｒｍ１遺伝子の関連においては外来である。ある具体的な実施態様によれば、プロモーターは、ＧＡＰプロモーター（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター）、ＴＥＦ１プロモーター（翻訳伸長因子ＥＦ−１アルファプロモーター）、及びＰＧＫプロモーター（ホスホグリセレートキナーゼプロモーター）からなる群から選択される。本発明による宿主細胞は、上記の非天然プロモーターにより制御される発現に加えて、通常、染色体に存在する内因性遺伝子から正の調節因子を発現する。さらなる実施態様によれば、正の調節因子をコードする遺伝子の内因性コピーは、例えば欠失により不活性化される可能性、又は遺伝子の内因性コピーを制御する通常のプロモーターが選択された非天然プロモーターに置換される可能性がある。
【０００９】
別の実施態様によれば、正の調節因子の発現は、非メタノール誘導性の誘導性プロモーターにより制御される。
【００１０】
本発明による正の調節因子は、ある実施態様によれば、本明細書に記載のＰｒｍ１である。ある具体的な実施態様によれば、Ｐｒｍ１は配列番号１もしくはその対立遺伝子多型のアミノ酸配列、又は調節因子活性を有するその断片を含んでなる。
別の具体的な実施態様によれば、Ｐｒｍ１は配列番号１もしくはその対立遺伝子多型のアミノ酸配列、又はその断片、又は調節因子活性を有する１又は数個のアミノ酸の置換体、欠失体もしくは付加体からなる。
【００１１】
本明細書で「ポリペプチド断片」なる語は、配列番号１又はその相同配列の、アミノ及び／又はカルボニル末端から１又は複数のアミノ酸が削除されたポリペプチドとして定義され、ここで当該断片は調節因子活性を有する。
【００１２】
本明細書で「対立遺伝子多型」なる語は、同じ染色体座を占める２以上の択一型の遺伝子を意味する。対立遺伝子多型は、突然変異から自然に発生し個体群に多様性をもたらすことができる。遺伝子突然変異は沈黙（silent）（コードされたポリペプチドにおいては無変化）の可能性もあり、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもある。ポリペプチドの対立遺伝子多型とは、遺伝子の対立遺伝子多型によりコードされるポリペプチドのことである。
【００１３】
２つのアミノ酸配列間、例えば２つの機能的相同体間の関連は、「相同性」パラメータにより記載される。
【００１４】
本発明の目的に応じて、２つのアミノ酸配列の配列比較は、EMBOSSパッケージのニードル（Needle）プログラム（http://emboss.org）バージョン2.8.0 を使用して決定する。ニードルプログラムは、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453 に記載される、全世界的な配列比較アルゴリズムを実行する。使用される代替マトリクスは、BLOSUM62、ギャップ開始ペナルティ（gap opening penalty）が10、及びギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）が0.5である。
【００１５】
本発明のアミノ酸配列（「発明配列」、例えば配列番号１のアミノ酸１〜９８９）及び
異なるアミノ酸配列（「外来配列」）の間における相同性の度合いは、２つの配列の配列比較における完全な一致の数を、「発明配列」の長さ又は「外来配列」の長さのいずれか短い方の長さで除算することにより算出される。結果は相同性の割合で表現される。
【００１６】
「発明配列」及び「外来配列」が、重複部分の同位置において同一のアミノ酸残基を有する場合、完全な一致が発生する（当該配列比較例では、以下これを「｜」で表示する）。配列の長さは、配列中のアミノ酸残基の数である。
【００１７】
以下の単なる仮説の配列比較例において、重複部分は、配列１のアミノ酸配列「HTWGER-NL」、又は配列２のアミノ酸配列「HGWGEDANL」である。この例において、ギャップは「−」で示される。
仮説の配列比較例
【化１】
2010516268.tif 000002
【００１８】
本発明のある実施態様によれば、Ｐｒｍ１の機能的相同体は、配列番号１と少なくとも70％一致し、具体的には配列番号１と少なくとも80％一致し、具体的には配列番号１と少なくとも85％一致し、具体的には少なくとも90％、さらに具体的には少なくとも95％、最も具体的には配列番号１と少なくとも98％一致する。
【００１９】
別の実施態様によれば、Ｐｒｍ１の機能的相同体は、少なくとも低緊縮条件下で、（i）配列番号２のヌクレオチド１〜2970、又は（ii）（i）の相補鎖とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされる。
別の実施態様によれば、Ｐｒｍ１の機能的相同体は、少なくとも中程度の緊縮条件培地で、（i）配列番号２のヌクレオチド１〜2970、又は（ii）（i）の相補鎖とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされる。
別の実施態様によれば、Ｐｒｍ１の機能的相同体は、少なくとも高緊縮条件下で、（i）配列番号２のヌクレオチド１〜2970、又は（ii）（i）の相補鎖とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされる。
別の実施態様によれば、Ｐｒｍ１の機能的相同体は、超高緊縮条件下で、（i）配列番号２のヌクレオチド１〜2970、又は（ii）（i）の相補鎖とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによりコードされる。
【００２０】
本発明による正の調節因子は、他の酵母細胞から単離されたＰｒｍ１の機能的相同体であってもよい。かかる機能的相同体は、配列番号２に示される配列を元として単離することができる。例えば配列番号２又はその断片を用いることにより、当業者に周知の方法により、異なる属又は種の菌株から、調節因子活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定及びクローン化する核酸プローブをデザインすることができる。具体的には当該プローブは、標準的なサザンブロッティング処理の後、注目の属又は種のゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、対応する遺伝子を同定及び単離するために使用できる。当該プローブはその全配列よりかなり短くすることができるが、少なくとも14、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも35、及び最も好ましくは少なくとも70ヌクレオチド長であるべきである。ただし、当該核酸プローブは、少なくとも100ヌクレオチド長であることが好ましい。例えば、当該核酸プローブは、少なくとも200ヌクレオチド、好ましくは少なくとも300ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも400ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも500ヌクレオチド長である。さらに長いプローブを使用してもよく、例えば少なくとも600ヌクレオチド、好ましくは少なくとも700ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも800ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも900ヌクレオチド長がある。ＤＮＡ及びＲＮＡの両プローブを使用することができる。当該プローブは典型的には対応する遺伝子を検出するために（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンで）標識される。
【００２１】
従って、前記他の生物から作製されたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリは、上記プローブとハイブリダイズするＤＮＡ、及び調節因子活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡのためのスクリーニングをしてもよい。前記他の生物由来のゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドのゲル電気泳動又は他の分離技術により分離してもよい。ライブラリから得たＤＮＡ又は分離されたＤＮＡを、ニトロセルロース又は他の適切な担体物質に移送及び固定化してもよい。配列番号２又はそのサブシークエンス（subsequence）と相同なクローン又はＤＮＡを同定するため、当該担体物質をサザンブロッティングで使用する。
【００２２】
本発明の目的において、ハイブリダイゼーションとは、当該ヌクレオチド配列が、配列番号２に示されたヌクレオチド配列、その相補鎖、又はそのサブシークエンスに対応する、標識された核酸プローブと、超低緊縮条件から超高緊縮条件下でハイブリダイズすることを言う。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを用いて検出できる。
【００２３】
少なくとも100ヌクレオチド長の長いプローブのための超低緊縮条件から超高緊縮条件とは、12〜24時間、任意に標準サザンブロッティング処理した後、42℃で、５×ＳＳＰＥ、0.3％ＳＤＳ、200 μg/mlのせん断及び変性サケ精子ＤＮＡ、並びに25％ホルムアミド（超低から低緊縮の場合）、35％ホルムアミド（中から中高緊縮の場合）、又は50％ホルムアミド（高から超高緊縮の場合）のいずれか中での、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、と規定される。
【００２４】
少なくとも100ヌクレオチド長の長いプローブにおいて、当該担体物質は、２×ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも45℃（超低緊縮）、より好ましくは少なくとも50℃（低緊縮）、より好ましくは少なくとも55℃（中緊縮）、より好ましくは少なくとも60℃（中高緊縮）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（高緊縮）、及び最も好ましくは70℃（超高緊縮）で、最終的に15分間ずつ３回洗浄する。
【００２５】
ある具体的な実施態様によれば、前記洗浄は、0.2×ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳを用い、好ましくは少なくとも45℃（超低緊縮）、より好ましくは少なくとも50℃（低緊縮）、より好ましくは少なくとも55℃（中緊縮）、より好ましくは少なくとも60℃（中高緊縮）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（高緊縮）、及び最も好ましくは70℃（超高緊縮）で行う。別の具体的な実施態様によれば、前記洗浄は、0.1×ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳを用い、好ましくは少なくとも45℃（超低緊縮）、より好ましくは少なくとも50℃（低緊縮）、より好ましくは少なくとも55℃（中緊縮）、より好ましくは少なくとも60℃（中高緊縮）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（高緊縮）、及び最も好ましくは70℃（超高緊縮）で行う。
【００２６】
上記の通り、本発明による正の調節因子は他の酵母細胞から単離されたＰｒｍ１の機能的相同体であってもよい。本発明のある実施態様によると、当該候補の１つは、ハンゼヌラポリモルファ（ピキアアングスタと同義）由来のｍｕｔ３遺伝子にコードされるＭｕｔ３の可能性がある。本明細書で提供する実施例において、Ｐｒｍ１はピキアパストリスにおいて過剰産生されている。しかし、ピキア中でＭｕｔ３又はハンゼヌラ中でＰｒｍ１又はハンゼヌラ中でＭｕｔ３を過剰産生することにより同じ効果を得ることができる。これはまだ試験されていない。
従って、本発明のさらなる実施態様によれば、正の調節因子はＭｕｔ３である。
【００２７】
宿主細胞に存在する正の調節因子レベルの増加は、単に宿主細胞に存在する当該調節因子をコードする遺伝子の多コピーを有することによっても提供され得る。
【００２８】
正の調節因子、Ｐｒｍ１の正確な作用メカニズムは解明されていないが、調節因子がメタノール誘導性プロモーターのプロモーター領域に結合するというのが最も可能性が高い。本発明のある具体的な実施態様によれば、非相同的ポリペプチドの発現を制御するメタノール誘導性プロモーターは、正の調節因子のための追加的な結合部位を提供し、その結果調節因子の正の効果を上昇させる。
【００２９】
細胞における正の調節因子レベルを増加させることにより提供される正の効果は、他の因子の存在に依存する可能性もあり、独立の可能性もある。当該他の因子１つとして、Ｍｘｒ１タンパク質（Lin-Cereghino et al., 2006, MoI Cell Biol 26(3): 883- 897）がある。従って、本発明によるさらなる実施態様によれば、ｍｘｒ１遺伝子の発現は、非天然プロモーター、具体的にはＧＡＰプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、及びＰＧＫプロモーターからなる群から選択されるプロモーターによっても制御される。
【００３０】
本発明の製造方法によれば、当業界で周知の方法を用い、ポリペプチドの製造に適した培養培地中で細胞を培養する。例えば、振とうフラスコ培養、及び適切な培地中、ポリペプチドを発現及び／又は単離させる条件下で行う、実験室又は工業的な発酵装置での小スケール又は大スケール発酵（連続発酵、バッチ発酵（batch）、流加発酵（fed-batch）、又は固形発酵等がある）により細胞を培養してもよい。当該培養は、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んでなる適切な培養培地中で、当業界で既知の手順で実施できる。適切な培地は、供給業者から入手可能、又は公開組成物（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）にある）から調製してもよい。ポリペプチドが培養培地に分泌される場合は、ポリペプチドは培地から直接回収できる。ポリペプチドが分泌されない場合は、細胞溶解物から回収できる。
【００３１】
前記ポリペプチドは、当業界で既知のポリペプチド特異的な方法を用いて検出してもよい。これらの検出方法は、特異的な抗体の使用、酵素産物の形成、又は酵素基質の消失を含んでもよい。例えば、本明細書に記載のポリペプチドの活性を決定するために、酵素アッセイを使用してもよい。
【００３２】
得られたポリペプチドは、当業者に既知の方法を用いて回収してもよい。例えば（限定するものではないが）従来の手順、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション、又は沈降等により、培養培地からポリペプチドを回収してもよい。
【００３３】
本発明から作製されるポリペプチドは、当業界で既知の様々な手法で精製でき、手法としては例えば（限定するものではないが）クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロ的分画、及びサイズ排除）、電気泳動の手法（例えば、調製用等電点電気泳動法）、異なる溶解性（例えば硫安沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出（例えば、Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照されたい）がある。
【００３４】
ある具体的な実施態様によれば、宿主細胞から作製されたポリペプチドは、宿主細胞に対して非相同体である。別の実施態様によれば、ポリペプチドは宿主細胞に対して相同体である。
【００３５】
本発明で観察される効果を、増殖培地へメタノール添加をせずに、選択されたプロモーターからの発現が観察できることを示す以下の実施例において説明する。メタノールの添加は、観察された宿主細胞におけるＰｒｍ１レベルの増加効果をさらに増強させる可能性がある。従って本発明のさらなる実施態様は、培地中にメタノールが存在する条件で、上記全実施態様で記載したメタノール誘導性プロモーター制御下、非相同ポリペプチドの発現レベルを増加させる方法であり、その結果Ｐｒｍ１の発現レベルは野生型細胞と比較して増加する。好ましくは、ｐｒｍ１遺伝子の発現は構成的である。
【実施例】
【００３６】
材料及び方法
菌株及びプラスミド
ピキアパストリスＧＳ１１５（遺伝子型his４、インビトロジェン（商標））を、タンパク質発現用宿主細胞として使用した。大腸菌ＤＨ５アルファ（インビトロジェン（商標））、ＴＯＰ１０（インビトロジェン（商標））又はＸＬ１０（ストラタジーン（商標））を、クローニング宿主として、発現ベクターの構築物中に使用した。プラスミドｐＰＩＣ９Ｋ及びｐＧＡＰＺα（インビトロジェン（商標））を発現プラスミド構築のために使用し、及びｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（商標））、ｐＴＢｌｕｅ（ノバジェン（商標））をＰＣＲ断片のサブクローニングのために使用した。
【００３７】
ピキアパストリスの形質転換：
ピキアパストリス菌株を、製品のプロトコル（インビトロジェン、カタログ番号#K1710-01）に従いエレクトロポレーションにより形質転換する。コンピテントセルを上記の通り調製し、40μlの一定分量中で−70℃に保つ。線状化プラスミドＤＮＡ（500ng）を40μlのコンピテントセルと混合させ、氷上で５分間保つ。氷冷した0.2cmエレクトロポレーションキュベットに細胞を移す。形質転換をBioRad（商標）GenePulser IIを用いて行う。使用したパラメータは、1500V、25μF及び200Ωであった。印加後すぐに、細胞を１mlの氷冷１Mソルビトール中に懸濁させる。混合物を、関連する選択プレートに播菌する。
【００３８】
培養及びアッセイ
ＲＤ培地（1Mソルビトール、２％デキストロース、1.34％酵母窒素塩基、４×10-5％ビオチン、0.005％のＬ−グルタミン酸、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−イソロイシン、２％ノーブル寒天（agar noble））を、his４セレクションでのピキアパストリスＧＳ115からの形質転換細胞再生のために使用した。ゼオシン耐性でのセレクションの場合は、１Mソルビトール及び100μg/mLゼオシンを補ったＹＰＤ agar（１％イーストエクストラクト、２％ペプトン、２％グルコース、２％bacto agar）を再生のために使用した。ＹＰＤ（１％イーストエクストラクト、２％ペプトン、２％グルコース）、ＹＰＧｌｙ（１％イーストエクストラクト、２％ペプトン、２％グリセロール）をピキアパストリスでのタンパク質発現のために使用した。必要であれば、メタノールを、培養の１日及び２日後の双方、終濃度１％＆又は２％（v/v）で培地に添加した。大腸菌株をＬＢ培地（1.0％トリプシン、0.5％イーストエクストラクト、1.0％NaCl）で、関連する抗体と共に培養した。
【００３９】
フィターゼアッセイ法
pH5.5の酢酸バッファ中に溶解させた7.5mMのフィチン酸ナトリウムを、0.01％Tween20含有の同じ酢酸バッファ中に、酵素サンプル溶液の1/2量と混合する。37℃で30分間インキュベーション後、停止剤含有の、10.8％硝酸に溶解させた20mM七モリブデン酸アンモニウム及び0.06％バナジウム酸アンモニウムを添加し、遊離無機リン酸との黄色化合物を作製する。遊離リン酸の量は405nmでの吸光度として光度的に測定する。フィターゼ１単位を、１分当たり１μモルの無機リン酸を放出する酵素量と定義する。
【００４０】
フィターゼプレートアッセイ
形質転換細胞を２〜５日インキュベーションした後の、培養ブロスの上清20μLを、以下のプレートにパンチした４mm孔にアプライする。プレートは、0.1M酢酸ナトリウム（pH 4.5）及び0.1％イノシトール５リン酸含有の１％アガロースプレートである。プレートを37℃で一昼夜インキュベートし、１M CaCl及び0.2M酢酸ナトリウム（pH 4.5）からなるバッファをプレート上に注ぐ。プレートを室温で１時間静置し、フィターゼ活性をクリアゾーンとして確認する。
【００４１】
ＰＣＲ条件
ＰＣＲ反応は、典型的に以下又はそれと同等の条件で実施した。
反応混合物は、2mM dNTP、10 pmolの順方向プライマー及び逆方向プライマー、2.8単位のExpand high fidelity mixture（ロシュ）、１×Expand high fidelity バッファ（ロシュ）、及び100μgのテンプレートＤＮＡを含有する。反応条件は、例えば下表の通りである。
【表１】
2010516268.tif 000003
【００４２】
実施例１：ＤＡＳ１プロモーター制御下のフィターゼ遺伝子を発現する菌株におけるＰｒｍ１の構成的発現
【００４３】
ＴＥＦ１プロモーターのクローニング及びｐＮｏ−ＴＰ10の構築
ピキアパストリス由来のＴＥＦ１（形質転換伸長因子）プロモーターのクローニングを以下の手順で実施した。酵母サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cervisiae）、カンジダアルビカンス（Candida albicanse）、及びハンゼニアスポラウバルム（Hanseniaspora uvarum）由来のＴＥＦ１タンパク質の相同領域の配列比較により、以下の縮退プライマーを設計した。
TEF1(f); 5'-ttyaartaygcntgggt-3' (タンパク質; FKYAWV) 配列番号６及び７
TEF5(r); 5'-arytgytcrtgrtgcatytc-S' (タンパク質; EMHHEQL) 配列番号８及び９
【００４４】
ＰＣＲを、4mM dNTP、10μMの各プライマー、１単位のTaqポリメラーゼ（ロシュ）、１×Taqバッファ（ロシュ）、及びＧＳ115ＤＮＡのゲノムＤＮＡを100ng含有する、50μLの反応物を用いて実施した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
【表２】
2010516268.tif 000004
【００４５】
増幅した0.7kbpの断片を精製し、ＴＡクローニングベクター、ｐＴＢｌｕｅ７にサブクローニングした。得られたプラスミドを配列決定に使用した。得られたＤＮＡ配列及び推定したアミノ酸配列を、配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示す。得られた配列が既知のＴＥＦ１タンパク質と類似点を有していたので、プロモーター配列を含んでなる上流領域（配列番号５）のクローニングを、DNA walking Speed Up premix kit（Seegene、K1501）と共に以下の具体的なプライマーを用いて実施した。
TEF-TSP1; 5'-tgacggtaacgtggtacttt-3' 配列番号10
TEF-TSP2; 5'-ggagtctcgaacttccacaa-3' 配列番号11
TEF-TSP3; 5'-agcgatgtcgatggtgatac-3' 配列番号12
【００４６】
ＰＣＲを、4mM dNTP、10μMのＴＥＦ−ＴＳＰ１プライマー、キットに含まれる2.5μMのＤＷ−ＡＧＰ２プライマー、１単位のTaqポリメラーゼ（ロシュ）、１×Taqバッファ（ロシュ）、及び100ngのゲノムＤＮＡを含有する50μLの反応混合物を用いて実施した。ＰＣＲプログラムは以下に示す通りである。
【表３】
2010516268.tif 000005
【００４７】
第二ＰＣＲを、2 mM dNTP、10μMのＴＥＦ−ＴＳＰ２プライマー、キットに含まれる10μMのＤＷ−ＡＣＰＮプライマー、0.4単位のＴａｑポリメラーゼ（ロシュ）、１×Taqバッファ（ロシュ）、及び５μLの精製した第一ＰＣＲ産物を含有する、20μLの反応混合物を用いて、以下のプログラムで実施した。
【表４】
2010516268.tif 000006
【００４８】
第三ＰＣＲを、2 mM dNTP、10μMのＴＥＦ−ＴＳＰ２プライマー、キットに含まれる10μMのUniversalプライマー、１単位のＴａｑポリメラーゼ（ロシュ）、１×Taqバッファ（ロシュ）、及び10回希釈した第二ＰＣＲ産物を含有する、50μLの反応混合物を用いて、以下のプログラムで実施した。
【表５】
2010516268.tif 000007
【００４９】
３回の多段階ＰＣＲの後、1.2kbpの断片を増幅した。この断片を、ｐＴ７Ｂｌｕｅにサブクローニングし、配列を決定した。得られた配列を配列番号５に示す。ＴＥＦ１ ＯＲＦの上流の1.2kbp領域を、さらなる実験のためのＴＥＦ１プロモーターとして使用した。
【００５０】
プラスミドｐＮｏ−ＴＰ１０は、ＴＦＥ１プロモーターの下流に細菌のフィターゼがある発現プラスミドであり、ゼオシン耐性マーカー遺伝子を保有する。ｐＮｏ−ＴＰ１０の構築は上記の通りに実施した。ＴＦＥプロモーター及びフィターゼ遺伝子を最適化したコドンを、以下のプライマーを用い、ピキアパストリスＡ９４のゲノムＤＮＡ（実施例２を参照）からクローン化した。プライマー１及び２はＴＥＦ１プロモーターの増幅のために使用し、プライマー３及び４はフィターゼ遺伝子のために使用した。
プライマー１；5'- tacagggcgcgtggggatatcggatccagctcatctaggga-3' (ＢａｍＨIは下線) (配列番号13)
プライマー２；5'- tgaagatggatgggaatctcatatggttggcgaataactaaaatgtatgt-3' (配列番号14)
プライマー３；5'- acatacattttagttattcgccaaccatatgagattcccatccatcttca-3' (配列番号15)
プライマー４；5'- taattcgcggccgccctagggaattcttactcggtgacagcgcactcggg-3' (ＥｃｏＲIは下線) (配列番号16)
【００５１】
ＰＣＲを、2 mM dNTP、10μMの各プライマー、2.8単位のExpand high fiderlity mixture（ロシュ）、１×Expand high fiderlityバッファ（ロシュ）、及び100ngのゲノムＤＮＡを含有する、50μLの反応物を用いて実施した。ＰＣＲプログラムは以下に示す通りである。
【表６】
2010516268.tif 000008
増幅した1.2kbp断片のＴＥＦ１プロモーター及び分泌シグナルを含むフィターゼ遺伝子含有の1.5kbp断片を、ゲル抽出を用いて精製し、それを第一ＰＣＲにおいて作製された重複を用いてこれらの断片を融合させるため、プライマー１及びプライマー４と共に第二回のＰＣＲに供した。ＰＣＲを、2 mM dNTP、10μMの各プライマー、2.8単位のExpand high fiderlity mixture（ロシュ）、１×Expand high fiderlityバッファ（ロシュ）、及び１μlの精製ＴＥＦ１プロモーター及び１μlの精製フィターゼ遺伝子を含有する、50μLの反応物を用いて実施した。ＰＣＲプログラムは以下に示す通りであった。
【表７】
2010516268.tif 000009
【００５２】
増幅した2.7kbp断片をｐＴ７Ｂｌｕｅにサブクローニングした。得られたプラスドは設計されたｐＴ１２〜８である。ＴＥＦ１プロモーター及びフィターゼ遺伝子を含むｐＴ１２〜８由来のＢａｍＨI−ＥｃｏＲI断片は、ＢｇｌII及びＥｃｏＲIで切断されたｐＧＡＰＺαとライゲーションされ、その結果ｐＮｏ−ＴＰ１０を得た。
【００５３】
ＤＡＳ１プロモーターのクローニング及びｐＮｏ−ＤＰ３の構築
ＤＡＳ１プロモーターは、カンジダボイジニイにおいて、メタノールにより強力に誘導性となることが知られる（Yurimoto,H. Komeda,T- Lim,C.R. Nakagawa,T- Kondo,K. Kato,N. Sakai,Y.; Biochim. Bio- phys. Acta 1493(1 -2):56-63(2000)）。ジヒドロキシアセトンシンターゼをコードするＤＡＳ１遺伝子は、カンジダボイジニイのＤＡＳ１遺伝子の相同体として、ブラスト検索によりピキアパストリスのゲノム配列において発見された（EMBL: AF086822）。以下に示すプライマーを使用するＰＣＲにより、およそ１kbのＤＡＳ１遺伝子の５'−非翻訳領域を、ピキアパストリスのゲノムＤＮＡから単離した。
プライマー43; 5'-ttttggtcatgcatgacgtcatagggagaaaaaccgagac-3' (ＮｓｉI部位は下線) (配列番号17)
プライマー44; 5'-ctcatatgttttgatgtttgatagtttga-3' (ＮｄｅI部位は下線) (配列番号18)
【００５４】
増幅した１kb断片を、ｐＣＲ2.1−ＴＯＰＯのＮｓｉI/ＮｄｅI部位にサブクローニングし、この断片（配列番号１９）の配列決定のために使用した。ＤＡＳ１プロモーター領域の１kbを、ｐＣＲ2.1−ＴＯＰＯからＮｓｉI/ＮｄｅI断片として切除し、ｐＮｏ−ＤＰ２を作製するＮｓｉI/ＮｄｅIで制限酵素処理したｐＮｏ−ＴＰ１０とライゲーションした。マーカー遺伝子をゼオシン耐性遺伝子からＨｉｓ４遺伝子に変えるため、ＤＡＳ１プロモーター及びｐＮｏ−ＤＰ２由来の細菌フィターゼ遺伝子の一部を含有する、1.4kbpのＡａｔII断片を、フィターゼ遺伝子の残りとＨｉｓ４遺伝子を含有する含有するｐＰＩＣＮｏＴ−Ｇ０１６５１由来の9.0kbのＡａｔII断片（実施例２参照）及び細菌ベクターとライゲーションする。作製されたプラスミドを、ｐＮｏ−ＤＰ３と命名した。
【００５５】
Ｐｒｍ１のクローニング及びｐＧＲｒｍの構築
我々がＰｒｍ１（メタノールの正の調節因子（positive regulator for methanol））と命名した、メタノール誘導性プロモーターの新規な正の調節因子をコードする遺伝子は、以下に示すプライマーを使用するＰＣＲによりピキアパストリスのゲノムＤＮＡから単離した。
プライマー 32; 5'-actatttcgaaatgcctcctaaacatcggctg-3', (ＢｓｔＢI部位は下線) (配列番号20)
プライマー 33; 5'-gtcgacttaactgcaaaatttattg-3' (ＳａｌIは下線) (配列番号21)
【００５６】
ＰＣＲを、１×ＬＡ ＰＣＲバッファII（タカラ）、2.5ＵのＬＡ Ｔａｑ（タカラ）、2.5mM MgCl2、2.5mM dNTP、1μMの各プライマー、100ngのゲノムＤＮＡを含む、50μLの反応物を用いて、以下のプログラムで実施した。 
【表８】
2010516268.tif 000010
【００５７】
得られた１kbの断片をｐＣＲ2.1−ＴＯＰＯにサブクローニングした。配列確認後、Ｐｒｍ１遺伝子（配列番号２）を含んでなる１kbpの断片を、ｐＧＡＰＺα(インビトロジェン）に、ＢａｔＢＩ及びＳａｌＩ制限部位を用いてクローニングし、ｐＧＰｒｍを得た。プラスミドｐＧＰｒｍはＧＡＰプロモーター制御下のＰｒｍ１遺伝子、及び選択マーカーとしてゼオシン耐性遺伝子を保有する。
【００５８】
ＤＡＳ１プロモーター下でフィターゼを発現する菌株である、ＤＡＳ４０中のＰｒｍ１の構成的発現
プラスミドｐＮｏ−ＤＰ３を、ピキアパストリスＧＳ115にｈｉｓ４セレクションで形質転換した。作製した形質転換細胞を再単離し、メタノール添加したＹＰＤ培地を用いてフィターゼ発現を試験した。メタノール存在下でフィターゼ活性を示した菌株として、形質転換細胞ＤＡＳ４０を選択した。
プラスミドｐＧＰｒｍをピキアパストリスＤＡＳ４０に形質転換し、形質転換細胞をゼオシンプレート上で単離した。作製した形質転換細胞を、30℃で２時間、攪拌しながらＹＰＤ培地で培養し、フィターゼアッセイで培養ブロスの上清中のフィターゼ活性を測定した。結果を以下の表に示す。
【表９】
2010516268.tif 000011
【００５９】
実施例２：ＡＯＸプロモーター下にフィターゼ遺伝子を発現する菌株におけるＰｒｍ１の構成的発現
培地：
ＭＤ (1.34% ＹＮＢ、4×10-5％ ビオチン、２％ デキストロース）
ＢＭＳＹ (１％ イーストエクストラクト、２％ ペプトン、100mM リン酸カリウムバッファ、pH 1.34% ＹＮＢ、4×10-5％ ビオチン、１％ ソルビトール）
ベクター：
ｐＰＩＣ−ＮｏＴは、ＡＯＸ１プロモーター下のピキアパストリス発現ベクターで、ｐＰＩＣ９Ｋ（インビトロジェン（商標））からのα分泌シグナルを除去することにより得られた。
【００６０】
ｐＰＩＣ−ＮｏＴベクターを作製するために、プラスミドｐＰＩＣ９ＫをＢａｍＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、処理した主要断片をアガロースゲルから単離した。ＢａｍＩ及びＥｃｏＲＩ部位を含有する合成ＤＮＡ断片を以下の２つのオリゴをアニーリングすることにより作製した。
NoT-1 P-GATCCTACGTAGCTGAG (配列番号22 ) 及び
NoT-2 P-AATTCTCAGCTACGTAG (配列番号23 )
上記合成ＤＮＡ断片を制限酵素処理したｐＰＩＣ９Ｋプラスミドに連結し、得られたベクターｐＰＩＣ−ＮｏＴを配列決定により確認した。
【００６１】
ＰＣＲプライマー：
【表１０】
2010516268.tif 000012
【００６２】
プラスミド：
ｐＰＩＣＮｏＴ−Ｇ０１６５１
コドン最適化シトロバクターブラアキイフィターゼ遺伝子を、ピキアパストリス中のｃｂフィターゼの発現収率を増加させるためにｐＰＩＣＮｏＴ−Ｇ０１６５１に使用した。野生型シトロバクターブラアキイフィターゼ遺伝子を、Ｐ．パストリス優先的なコドン使用頻度に基づき、レアコドンを置き換え、反復するＡＴを排除し、及びＧＣ含量を減少させるという手法で修正した。設計配列も、潜在的なイントロンを回避するために分析した。
【００６３】
修正されたα因子分泌シグナル配列と融合した、修正されたフィターゼ遺伝子（G01651）を、Ｐ．パストリスのコドンバイアスに基づき設計した。Ｐ．パストリスコドン使用頻度表は、www.kazusa.jp as well as Zhao et al, 2000 (Zhao X, Huo KK, Li YY. Synonymous condon usage in Pichia pastoris. Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16(3): 308- 311を利用した。アルギニンのレアコドンは除去した。未成熟終了を回避するため、レアコドンの置換に加えて、Ｇ＋Ｃ総含量を50％未満に減少させ、ＡＴリッチ領域を修正した。さらに、修正したコード領域中の潜在イントロンを、係属中のデンマーク特許出願PA2006 01042/ NZ10978.000-DKに記載の通りに除去した。合成遺伝子配列を、配列番号30に示す（シグナル配列のない完全なＯＲＦである）。
【００６４】
発現プラスミドｐＰＩＣＮｏＴ−Ｇ０１６５１を、以下の通りに作製した。
最適化されたα因子シグナル配列（配列番号31）にインフレームの状態で融合させた、ｃｂフィターゼの成熟形態をコードするＰＣＲ断片（配列番号30）を、以下の伸長ＰＣＲ法を模倣することにより創作した。α因子シグナルペプチドを含有する断片ＩをpJ2:G01468プラスミド（pJ2:G01468は、ＤＮＡ2.0から作製され、Ｐ．パストリスコドン使用頻度に基づいて修正された、α因子分泌シグナルと結合したプレクタシン（plectasin）の成熟形態を含有する遺伝子である）から、特異的なプライマーＯＡ−Ｎａ及びＯＡＰｈｙ−Ｒを用いて増幅させた。一方、成熟フィターゼをコードする断片IIは、プラスミドpJ2:G01651（ＤＮＡ2.0から作製され、Ｃ．ブラアキイフィターゼの成熟形態をコードする合成フィターゼ遺伝子を含有する）から、特異的プライマーＯＡＰｈｙ−Ｆ及びＯＰｈｙ−Ｃａを用いて増幅させた。その後、断片Ｉ及びIIを混合し、特定プライマーＯＡ−Ｎａ/ｂ及びＯＰｈｙ−Ｃａ/ｂでの第二ステップＰＣＲ増幅のための、テンプレートとして、標的ＰＣＲ断片を得るために使用した。ＤＮＡ断片をゲル抽出キットで精製し、その後、ｐＰＩＣ−ＮｏＴベクターに、ＢａｍＨI及びＥｃｏＲII部位でサブクローニングした。得られた発現構築物を配列決定により確認した。
【００６５】
３mLスケールでの発現テスト：
選択した形質転換細胞の発現テストを、３mLスケールで、24ディープウェルプレート（Whatman、UK）を用いて行った。各形質転換細胞をＢＭＳＹ培地で、2.5日間、28℃で、勢いよく振とうさせながら（200rpm）培養した。その後、非相同遺伝子発現を誘導するために４日間毎日、300μlの0.5％メタノールを各ウェルに添加した。培養培地のサンプルを、日々の誘導の間に採取し、フィターゼアッセイのために−20℃で保存した。
【００６６】
ＡＯＸ１プロモーター下にフィターゼを発現する菌株、Ａ９４のＰｒｍ１構成的発現
発現プラスミドｐＰＩＣＮｏＴ−Ｇ０１６５１を、ピキアパストリスＧＳ115に、his４セレクションを伴って形質転換し、１Mソルビトール含有のＭＤ agar上に作製された形質転換細胞は、再単離され３mlスケールでフィターゼ発現のための試験を行った。１つ単離したＡ９４を、メタノール存在下でフィターゼ活性を示す菌株として選択した。続いて、プラスミドｐＧＰｒｍをＡ９４に形質転換し、形質転換細胞はゼオシン耐性を伴い単離された。単離された形質転換細胞を、ＹＰＤ培地中、30℃で、２日間、振とうしながら培養し、培養上清中のフィターゼ活性を、フィターゼアッセイで測定した。結果を以下の表に示す。
【表１１】
2010516268.tif 000013
【００６７】
実施例３：ピキアパストリスＧＳ115及び派生菌株におけるＰｒｍ１の遺伝子破壊
ＰＲＭ１遺伝子の５'に対する1571bpの遺伝子断片は、以下のプライマーを用いＰＣＲで増幅した。
JP23/PRM1-5'-forw-NY: 5' GCGCGAATTCCACAGGGCTTGCTAAGAAATC 3' (配列番号32)、及び
JP26/PRM1-5'-rev - NY: 5' GAAGGGAGATTAATACAGGGC 3' (配列番号33)
ＰＲＭ１遺伝子の３'に対する1473bpの遺伝子断片は、以下のプライマーを用いＰＣＲで増幅した。
JP17/PRM1-3'-forw-NY: 5' GATTGGACCACTGCGCCAGATAC 3' (配列番号34)、及び
JP19/PRM1-3'-rev-NY: 5' GCGCGTCGACCCACCCGAGGATAAGAAGG 3' (配列番号35) 
プロモーター及びターミネーターを含む、ＨＩＳ４遺伝子を含有する3382bpの断片を、以下のプライマーを用いＰＣＲで増幅した（ＳＯＥ−ＰＣＲを意図して、断片はＰＲＭ１の５'及び３'領域と各末端において、それぞれ20bpの重複を含む）。
JP13/HIS4-forward-NY: 5' CCCTGTATTAATCTCCCTTCATCAGAATTGGTTAATTGGTTG 3' (配列番号36)、及び
JP15/HIS4-rev-NY: 5' TCTGGCGCAGTGGTCCAATCATCGATAAGCTTTAATGCGG 3' (配列番号37)
【００６８】
上記３つの遺伝子断片を、以下の順番（ＰＲＭ１−５'＋ＨＩＳ４＋ＰＲＭ１−３'）で、５'ｐｒｍ１断片及び３'ｐｒｍ１断片が側面に位置した、選択可能なＨＩＳ４マーカーを有するｐｒｍ１欠失断片を作製する、ＳＯＥ−ＰＣＲ（Splicing by Overlapping Extension PCR）を用いて融合する。
ｐｒｍ１欠失断片を、ヒスチジン不存在の最小培地上で形質転換細胞のセレクションが可能であるＧＳ115（his4マイナス表現型）に形質転換した。ｐｒｍ１遺伝子が欠失した菌株、ＰＦＪｏ435は、ＰＣＲ分析により特徴付けがなされた。正しいＰｒｍ１欠失を評価するため、３つの異なるＰＣＲ分析が行われた。
Ａ）ＰＲＭ１が欠失しなかった場合、以下のプライマーを使用するＰＣＲは、704bpの産物を提供する。
JP58/PRM1-orf-forw-test7: 5' CTGGAGCAGAGTATACAGCC 3' (配列番号38)、及び
JP59/PRM1-orf-rev-test8: 5' CTCAATAAATGCGGGTCTGTG 3' (配列番号39)
Ｂ）ＰＲＭ欠失の場合、以下のプライマーを使用する欠失特異的なＰＣＲは、1950bpの産物を提供する。
JP31/PRM1-5'-forw-test1 : 5' CCTGGTTGATCAGCTCCACC 3' (配列番号40)、及び
JP33/HIS4-rev-test3: 5' CCCGTCAAGTCAGCGTAATGC 3' (配列番号41)
Ｃ）ＰＲＭ欠失の場合、以下のプライマーを使用する欠失特異的なＰＣＲは、1550bpの産物を提供する。
JP32/PRM1-3'-rev-test2: 5' CTCCCTCTCCAGCTGCTTCG 3' (配列番号42)、及び
JP34/HIS4-forw-test4: 5' CGGTGCCTGACTGCGTTAGC 3' (配列番号43) 
菌株ＰＦＪｏ435は、ＰＣＲ ＡからＰＣＲ産物が得られなかったが、Ｂ及びＣから、予想された欠失特異的なＰＣＲ産物を得た。これはＰＦＪｏ435においてＰＲＭ１が欠失していることを示す。
【００６９】
ＧＳ115のＰｒｍ１遺伝子欠失変異体ＰＦＪｏ４３５は、ＭＭ（1.34％ ＹＮＢ、４×10-5％ ビオチン、２％ メタノール）上で増殖しないが、野生型の菌株ＧＳ115Ｈは、２日間30℃での培養後良好な増殖を示した。メタノール存在下でのＡＯＸ又はＤＡＳプロモーターからの発現レベルは、例えば、ＤＡＳ４０又はＡ９４派生体におけるＤＡＳプロモーター又はＡＯＸプロモーターの制御下のフィターゼ遺伝子発現として測定され、Ｐｒｍ１欠失派生体では減少した。減少した活性は、外因性Ｐｒｍ１遺伝子による伸長があったことが原因である。ＤＡＳプロモーターの結果は以下の示す
【表１２】
2010516268.tif 000014
【００７０】
ＤＡＳ４０及びＰＮｏ−ＤＰ２は、実施例１記載した。
ｐＮｏｒｉ12の構築を以下に示す。
【００７１】
ｐＮｏｒｉ12の構築
ＤＡＳプロモーターからのフィターゼ遺伝子及びＧＡＰプロモーターからのＰｒｍ１遺伝子の共発現のために、ｐＮｏｒｉ12を構築した。
ターミネーター部分を置き換えるため、Ｐｒｍの原ターミネーターを以下のプライマーを使用してクローニングした。
pr136; 5'-ataaattttgacagttaagtcgacctctgtaaattaattgataatttcaa-3' (配列番号44)
pr137; 5'-caatgatgatgatgatgatggtcgacgtttaaacttaattaaaagggaaatttacaagcc-3' (配列番号45)
ＰＣＲを、2 mM dNTP、10μMの各プライマー、2.8単位のExpand high fiderlity mixture（ロシュ）、１×Expand high fiderlityバッファ（ロシュ）、及び100ngのＧＳ115のゲノムＤＮＡを含有する、50μLの反応混合物を用いて実施した。ＰＣＲプログラムは以下に示す通りである。
【表１３】
2010516268.tif 000015
【００７２】
増幅された500bpの断片を、ｐＧＰｒｍのＳａｌI部位に、In-Fusion PCR cloning kit (Clontech)を用いて、ＰｒｍのＯＲＦと融合させるため挿入し、結果としてｐＮｏｒｉ11を得た。ＧＡＰ−Ｐｒｍ及びＤＡＳ−フィターゼを有する発現プラスミドを作製するため、ＤＡＳプロモーター含有のフィターゼ発現カセットを保有する3354bpのＳｎａＢI−Ｘｍａｌ断片をｐＮｏ−ＤＰ２から単離し、ｐＮｏｒｉ11の5323bpのＸｍａｌ−Ｐｍｒ１断片にライゲーションし、結果としてｐＮｏｒｉ12を得た。プラスミドｐＮｏｒｉ12は、ＧＡＰプロモーター制御下でＰｒｍ１遺伝子を、ＤＡＳプロモーター制御下でフィターゼ遺伝子を、及びセレクションマーカーとしてゼオシン耐性遺伝子を保有する。
【００７３】
実施例４：Ｍｘｒ１の構成的発現
Ｍｘｒ１は、メタノール誘導のための正の調節因子であることが報告されたピキアパストリス由来の遺伝子であり（G. P. Lin-Cereghino et al.jMOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Feb. 2006, p. 883-897 Vol. 26, No. 3）、プライマーＭｘｒ−Ｆ及びＭｘｒ−Ｒを用いるＰＣＲによりピキアパストリスのゲノムＤＮＡから単離された。プライマーの配列及びＰＣＲ条件を以下に示す。
ＰＣＲプライマー：
【表１４】
2010516268.tif 000016
ＰＣＲ条件：
【表１５】
2010516268.tif 000017
【００７４】
ＢｓｔＢI及びＸｂａIで制限酵素処理された3.5kbpのＰＣＲ断片を、同じ酵素で制限酵素処理されたｐＧＡＰＺαと混合し、その後ライゲーションした。得られたプラスミドｐＧＭｘｒは、ＧＡＰプロモーター制御下のＭｘｒ１遺伝子及び形質転換マーカーとしてのゼオシン耐性遺伝子を保有する。プラスミドｐＧＭｘｒをピキアパストリスＤＡＳ４０及び／又はＡ９４に形質転換した。形質転換細胞をゼオシンプレートで単離した。作製された形質転換細胞をＹＰＤ培地で、30℃、２日間、振とうを与える条件で培養し、培養ブロスの上清におけるフィターゼ活性を測定した。Ｍｘｒ１遺伝子の構成的発現の効果は、ｐＧＭｘｒの誘導後の形質転換細胞において、ＹＰＤ培地中でのフィターゼ活性の上昇として観察された。
【表１６】
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【００７５】
プラスミドｐＧＭｘｒは、選択マーカー遺伝子を、例えばｕｒａ３、ａｄｅ２、ａｒｇ４、ハイグロマイシン耐性遺伝子等と置き換える修正がなされ、結果としてｐＧＭｘｒ−ｍを得る。さらに、プロモーター領域は、別のプロモーター、例えばＰＧＫ１プロモーター又はＴＥＦ１プロモーターと置き換え可能で、ｐＰＭｘｒ−ｍ又はｐＴＭｘｒ−ｍを提供する。プラスミドｐＧＭｘｒ−ｍ、ｐＰＭｘｒ−ｍ又はｐＴＭｘｒ−ｍは、形質転換細胞に必要な修正をした、ピキアパストリスの形質転換細胞Ａ又は形質転換細胞３に形質転換される。新たに作製された形質転換細胞は、ＹＰＤ培地で、30℃、２日間、振とうしながら培養し、培養ブロスの上清中のフィターゼ活性を測定する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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