(57)【要約】  本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質からなる全体表面抗原を含み、生産された抗原がウイルス様粒子を形成するＨＢＶワクチン、前記全体表面抗原に加えてＨＢＶコア抗原をさらに含むＨＢＶ複合抗原ワクチン、およびこれらの製造方法に関する。これらのワクチンは、様々なエピトープを提供し、強力な体液性免疫反応および細胞性免疫反応を誘導するために優れた免疫原生を有するため、治療用ワクチンとして用いられる。
2010516807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の３種の表面タンパク質（Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質）から構成され、ｐｒｅＳ１およびｐｒｅｓＳからなるｐｒｅＳ抗原が、Ｓ抗原間の結合によって形成される粒子の表面に位置した、ＨＢＶの組み換え全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）およびＨＢＶのコア抗原を含むＨＢＶワクチン。
【請求項２】
ＨＢＶのコア抗原はＨＢＶのコア抗原をコードするヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを大腸菌に形質転換して培養することにより得られることを特徴とする、請求項１に記載のＨＢＶワクチン。
【請求項３】
ＨＢＶのコア抗原をコードするヌクレオチドは配列番号６の塩基配列を有することを特徴とする、請求項２に記載のＨＢＶワクチン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチンと免疫補助剤を含む、ＨＢＶワクチン組成物。
【請求項５】
免疫補助剤がミョウバン(alum)、コロイド金、またはこれらの両方ともであることを特徴とする、請求項４に記載のＨＢＶワクチン組成物。
【請求項６】
免疫補助剤がミョウバンおよびコロイド金を全て含むことを特徴とする、請求項４に記載のＨＢＶワクチン組成物。
【請求項７】
ワクチンが治療用ワクチンであることを特徴とする、請求項６に記載のＨＢＶワクチン組成物。
【請求項８】
ＨＢＶの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ３’−ＵＴＲ全体ヌクレオチドをｐＳＧＭベクター（受託番号ＫＣＣＭ１０２０２）に挿入することにより製造される、ＨＢＶの３種の表面タンパク質（Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質）を同時発現する組み換え発現ベクター。
【請求項９】
ＨＢＶの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ３’−ＵＴＲ全体ヌクレオチドは配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする、請求項８に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８の組み換え発現ベクターで形質導入された細胞。
【請求項１１】
受託番号ＫＣＴＣ １１０５８ＢＰであることを特徴とする、請求項１０に記載の形質導入細胞。
【請求項１２】
下記段階を含むＨＢＶワクチンの製造方法：
１）ＨＢＶの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ３’−ＵＴＲ全体ヌクレオチドをｐＭＳＧベクター（受託番号ＫＣＣＭ １０２０２ベクター）に導入する段階、
２）段階１）で製造された発現ベクターを動物細胞に形質導入する段階、および
３）形質導入された動物細胞を培養して組み換え全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）タンパク質を得る段階。
【請求項１３】
段階１）のポリヌクレオチドは配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
段階３）の形質導入された動物細胞が受託番号ＫＣＴＣ １１０５８ＢＰの形質転換体であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
４）得られた全体表面抗原タンパク質を免疫補助剤と混合する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
免疫補助剤がミョウバン、コロイド金、またはこれらの両方ともであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
下記段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法：
４）ＨＢＶコア抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに導入する段階、
５）段階４）で製造された発現ベクターを宿主細胞に形質導入する段階、および
６）形質導入された宿主細胞を培養して組み換えＨＢＶコアタンパク質を得る段階。
【請求項１９】
段階６）で得たＨＢＶコア抗原タンパク質を、段階３）で得たＨＢＶ全体表面抗原タンパク質と混合する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載のＨＢＶワクチンの製造方法。
【請求項２０】
段階４）のポリヌクレオチドは配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＢＶのコア抗原を暗号化するポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
段階４）の宿主細胞が原核細胞であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記原核細胞がＥ．ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
混合した抗原タンパク質を免疫補助剤と混合する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
免疫補助剤がミョウバン、コロイド金、またはこれらの両方ともであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１０または１１の細胞を培養する段階を含む、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質からなる組み換えＨＢＶ全体表面抗原を製造する方法。
【請求項２６】
請求項２５の方法で製造された組み換えＨＢＶ全体表面抗原と組み換えＨＢＶコア抗原とを混合する段階を含む、ＨＢＶワクチンの製造方法。
【請求項２７】
前記Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質は一つの発現ベクターから同時に発現することを特徴とする、請求項１に記載のＨＢＶワクチン。
【請求項２８】
前記発現ベクターは、ＨＢＶの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ３’−ＵＴＲ全体ヌクレオチドをｐＭＳＧベクター（受託番号ＫＣＣＭ １０２０２）に挿入することにより製造される、請求項２７に記載のＨＢＶワクチン。
【請求項２９】
ＨＢＶの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ３’−ＵＴＲ全体ヌクレオチドは配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする、請求項２８に記載のＨＢＶワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ：Hepatitis B Virus）のｐｒｅＳ抗原とＳ抗原からなる全体表面抗原を含むＨＢＶワクチン、前記全体表面抗原に加えてＨＢＶコア抗原をさらに含むＨＢＶ複合抗原ワクチン、およびこれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＢＶ感染は急性肝炎および慢性肝炎を引き起こす。ＨＢＶに感染した大部分のヒトは、約１〜２ヶ月後には完全に治る。この際、約１０％は完治せず、慢性感染状態が維持されて慢性肝炎患者になる。また、５歳以下の幼児または新生児がＨＢＶに感染すると、９５％以上が保菌者になる。慢性肝炎状態が維持される場合、肝硬化症または肝癌に進むおそれがある。慢性ＨＢＶ感染患者からは血中でＨＢｓＡｇが検出されるが、これに対する免疫反応が誘導されない免疫寛容状態にあるので、ａｎｔｉ−ＨＢｓ抗体が現れない。したがって、慢性ＨＢＶ感染治療の最終目標は、患者の肝と血中からＢ型肝炎ウイルスを除去し、血清中のａｎｔｉ−ＨＢｓ抗体を陽性に誘導することにある。
【０００３】
治療ワクチンは、免疫寛容状態を解消して感染源に対する人体免疫反応を誘導し、感染した状態を回復させる免疫治療剤であって、慢性感染性疾患の治療に適する。治療ワクチンの要件としては、免疫寛容状態を解消させて免疫反応を誘導することができなければならず、感染源を除去しうる程度に強力な体液性免疫反応と細胞性免疫反応を誘導することができなければならないことである。
【０００４】
ＨＢＶ感染後、自然治癒される場合にはポリクローナル免疫反応が誘導されたが、慢性肝炎患者ではオリゴクローナル免疫反応のみが誘導された。よって、治療ワクチンは、ポリクローナル免疫反応を誘導することができるように、様々なエピトープを提供することが可能な抗原を含むことが必要である。
【０００５】
ＨＢＶの外皮遺伝子は、ｐｒｅＳ（ｐｒｅＳ１とｐｒｅＳ２）およびＳ部位から構成されており、転写の後、３つの各開始コドンで選択的翻訳(alternate translation)によって３つの外皮タンパク質（Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質）が生産される。Ｌタンパク質は、ＨＢＶのサブタイプに応じて、ｐｒｅＳ１ ＡＵＧコドンで翻訳が開始してｐｒｅＳ１ドメイン、ｐｒｅＳ２ドメインおよびＳドメインを全て含む、約４００個のアミノ酸から構成される。Ｍタンパク質は、ｐｒｅＳ２で翻訳が開始してｐｒｅｓＳドメインおよびＳドメインを含む約２８１個のアミノ酸から構成される。Ｓタンパク質は、Ｓドメインのみを含む約２２６個のアミノ酸から構成され、最も多い量が生産されてウイルス粒子の主な構成成分をなす。これらの外皮タンパク質のＳドメイン部位が互いに結合して粒子を形成しながらＳ抗原をなす。Ｍタンパク質とＬタンパク質に含まれたｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２ドメインは、粒子の外側に位置し、高い免疫反応を誘導するｐｒｅＳ抗原として作用する。
【０００６】
前述したように、様々なエピトープを提供するためには、ｐｒｅＳ抗原全体およびＳ抗原全体を提供する全体表面抗原ワクチンが、Ｓ抗原のみを含むワクチンより有用である。特に、動物実験およびヒト実験の両方ともにおいて、ｐｒｅＳ抗原およびＳ抗原が共に使用された場合はＳ抗原のみを使用した場合より免疫原性が高いため、抗体をさらに速く形成させるものと確認されている。すなわち、ｐｒｅＳ抗原とＳ抗原を全て含むワクチンは、Ｓ抗原のみを含むワクチンより高い免疫原性を有し、防御効果を速く誘導することができるので、より機能が向上したＨＢＶワクチンであって、慢性Ｂ型肝炎の治療用ワクチンとしてさらに適する。
【０００７】
ところが、従来の商業的に利用可能な大部分のＨＢＶワクチンは、Ｓ抗原のみを含有しているだけである。これはサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)などの真核細胞で表現抗原を発現させる場合、ｐｒｅＳ抗原を同時に発現させることが技術的に難しかったためである。
【０００８】
また、サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)などの真核細胞でｐｒｅＳ抗原の一部（特にｐｒｅＳ２）をＳ抗原と同時に発現させた試みがあるが、十分な免疫原性を持たなかった。
【０００９】
一方、ｐｒｅＳ遺伝子を別途に発現させてｐｒｅＳ抗原を生産した後、これをＳ抗原と混合してＨＢＶ抗原を製造する他のいろんな試みがあった。しかし、生産された線形可溶性の形態のｐｒｅＳ抗原の免疫性が高くなかった。よって、ｐｒｅＳ抗原とＳ抗原が同時に発現することにより、Ｓ抗原の結合からなる粒子の外側にｐｒｅＳ抗原が位置する全体表面抗原に比べて免疫原性を高める効果は微々たるものであった。
【００１０】
したがって、免疫誘導性を向上させるために、ｐｒｅＳ抗原がＳ抗原と共に発現し、Ｓ抗原からなる粒子の外側にｐｒｅＳ抗原が位置する。最近、イスラエルで開発したＨＢＶワクチンの場合、全体表面抗原、すなわちｐｒｅＳ抗原とＳ抗原を全て含んでいると知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、ｐｒｅＳ抗原とＳ抗原を同時に粒子の形態で含むＨＢＶ外皮抗原を生産できるＣＨＯ細胞株を開発することに成功した。 本発明者らはＨＢＶの全体外皮遺伝子を特定のベクターに導入することにより、３種の表面タンパク質（Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質）がＨＢＶ慢性患者の血液から発見される粒子の形態で発現した。この抗原を使用して組み換え全体表面抗原を含む強力なＨＢＶワクチンを開発した。さらに、検出可能な量のＨＢＶ特異抗原なしで血液中でＨＢＶ抗原を生産する形質転換マウスに強力な免疫反応を誘発することに著しく効果的であることが明らかになった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、ＨＢＶの３種の表面タンパク質（Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質）からなる粒子形態の全体表面抗原を含むＨＢＶワクチンを提供することにある。
【００１３】
好ましくは、本発明の目的は、Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２およびＳ抗原タンパク質をコードする全体外皮遺伝子を含む一つの発現ベクターから同時発現したＬタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質から構成され、 Ｓ抗原間の結合からなる粒子の外側にｐｒｅＳ抗原が位置するＨＢＶ全体表面抗原を含むワクチンを提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前述したＨＢＶワクチンの製造方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、ＨＢＶの３種の表面タンパク質（Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質）を全て発現することが可能な組み換え発現ベクターを提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、前記組み換え発現ベクターで形質導入された細胞を提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、前記ＨＢＶワクチンを用いた慢性ＨＢＶ感染を治療するのに適合な免疫療法を提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、前記ワクチンに組み換えＨＢＶコア抗原および／または免疫補助剤を追加することにより、体液性免疫反応および細胞性免疫反応が全て増加したＨＢＶ複合抗原ワクチンを提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】組み換え全体表面抗原（Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質）を発現する発現ベクターの概要図である。
【図２】精製された組み換え全体表面抗原（Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットの写真である。
【図３】精製された組み換え全体表面抗原を、Ｎ−糖鎖を除去する酵素Ｎ−グリコシダーゼで処理したウエスタンブロットの写真である。
【図４】精製された組み換え全体表面抗原の電子顕微鏡写真である。
【図５】精製された組み換えコア抗原（ｃｏｒｅ Ａｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットの写真である。
【図６】精製された組み換えコア抗原の電子顕微鏡写真である。
【図７】本発明に係る全体表面抗原を含むＨＢＶワクチンと既存ワクチンの抗体価を比較した図である。
【図８】本発明に係る全体表面抗原を含むＨＢＶワクチンと既存ワクチンのＥＤ５０を比較した図である。
【図９】正常マウスにおける本発明に係る複合抗原ワクチンの体液性免疫反応の誘導を示す。
【図１０】正常マウスにおける本発明に係る複合抗原ワクチンの細胞性免疫反応の誘導を示す。
【図１１】ｐｒｅＳでコートされたコロイド金コンジュゲート(colloidal gold conjugate)の電子顕微鏡写真を示す。
【図１２】正常マウスにおけるコロイド金による体液性免疫反応の誘導を示す。
【図１３】正常マウスにおけるコロイド金による細胞性免疫反応の誘導を示す。
【図１４】正常マウスにおける本発明に係る治療ワクチンによる体液性免疫反応の誘導を示す。
【図１５】正常マウスにおける本発明に係る治療ワクチンによる細胞性免疫反応の誘導を示す。
【図１６】形質転換マウスにおける本発明に係る治療ワクチンによる体液性免疫反応の誘導をＥＬＩＳＰＯＴ法で示す。
【図１７】形質転換マウスにおける本発明に係る治療ワクチンによる細胞性免疫反応の誘導をＥＬＩＳＰＯＴ法で示す。
【図１８】形質転換マウスにおける本発明に係る治療ワクチンによる細胞性免疫反応の誘導をＥＬＩＳＡ法で示す。
【図１９】治療ワクチンによる血中表面抗原（ウイルス様粒子）の減少を示す。
【図２０】治療ワクチンによるウイルス遺伝子発現の減少とインターフェロン−ｇ発現の増加を示す。
【図２１】形質転換マウスにおける本発明に係る治療ワクチンによる体液性免疫反応の誘導を示す。
【図２２】形質転換マウスにおける本発明に係る治療ワクチンによる細胞性免疫反応の誘導をＥＬＩＳＰＯＴ法で示す。
【図２３】形質転換マウスにおける本発明に係る治療ワクチンによる細胞性免疫反応の誘導をＥＬＩＳＡ法で示す。
【図２４】本発明に係る治療ワクチンによる血中表面抗原（ウイルス様粒子）の減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
一様態において、本発明は、ＨＢＶのＬタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質からなる粒子形態の組み換え全体表面抗原を含むＨＢＶワクチンを提供する。
【００２１】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、３つの選択的翻訳開始コドンから生産される３つの相互関連のある外皮タンパク質(envelope protein)から構成される。ＨＢｓＡｇの主要成分であるＳタンパク質は、２２６個のアミノ酸からなり、糖化有無に応じてｐ２４とｇｐ２７と命名される。中間サイズのＭタンパク質は、ＳドメインのＮ末端部位にｐｒｅＳ２ドメインとしての５５個のアミノ酸が追加された形態であって、糖化有無に応じてｇｐ３３とｇｐ３６と命名される。最も大きいサイズのタンパク質であるＬタンパク質は、ＳドメインとｐｒｅＳ２ドメインからなるＭタンパク質のＮ末端にｐｒｅＳ１ドメインとしての１１９個のアミノ酸が追加された形態であって、糖化有無に応じてｐ３９とｇｐ４２と命名される。実際、ウイルスの外皮ＨＢｓＡｇ粒子ではこれらのＬタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質のＳドメインが分子間ジスルフィド結合によりお互い共有連結されてウイルス粒子を形成する。
【００２２】
免疫反応を誘導するにおいて、Ｓ、ｐｒｅＳ２、ｐｒｅＳ１ドメインそれぞれの重要性が確実に解明されてはいないが、ｐｒｅＳ抗原に対する免疫反応がＳ抗原に対する免疫原性を増加させることが報告された(ref. Milich DR et al Science 228: 1195-1199, 1985; Milich DR et al J Immunol 23: 511-523, 1986; Milich DR et al Proc Natl. Acad Sci USA 85: 1610-1614, 1988)。また、ｐｒｅＳ抗原に対する抗体は肝細胞がＢ型肝炎ウイルスに感染する段階でブロック付着(block attachment)、エンドサイトーシス(endocytosis)、および膜透過(membrane penetration)過程を防ぐことができるという報告がある(Neurath AR et al. Nature 315: 154-156, 1985; Neurath AR et al. Vaccine 4: 35-37, 1986; Gerlich WH et al. Vaccine 8: S63-S68, 1990)。したがって、ｐｒｅＳ抗原とＳ抗原を同時に含む第３世代ＨＢＶワクチンは、Ｓ抗原のみを含むワクチンに比べて優れた免疫誘導力を有する。
【００２３】
本発明によれば、一つの発現ベクターから同時発現したＳタンパク質、Ｍタンパク質およびＬタンパク質から構成され、ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２からなるｐｒｅＳ抗原が、Ｓ抗原間の結合によって形成される粒子の外側に位置するＨＢＶ組み換え全体表面抗原を含むＨＢＶワクチンを製造することができる。このような抗原を含む本発明のワクチンは、１種の抗原、すなわちＳ抗原のみを含むワクチンまたはＳ抗原と、ｐｒｅＳ抗原を含んでもｐｒｅＳ抗原がＳ抗原とは別途に発現して混合形態で存在する既存のワクチンに比べて免疫誘導力が一層強いため、治療用ワクチンとして適する。
【００２４】
公知のＨＢＶワクチンの中でも、第２世代ＨＢＶワクチンの場合にはＳ抗原のみを含み、第３世代ＨＢＶワクチンの場合にもこれらの３つの表面抗原を全て含むのではなく、このうちｐｒｅＳ抗原の一部とＳ抗原のみを含み、あるいはｐｒｅＳ抗原とＳ抗原を共に含むとしても、ｐｒｅＳ抗原が微々たる水準で含む。これは精製過程でｐｒｅＳの一部の損失に起因する。したがって、生産された表面抗原が全体表面抗原と見られない程度であり、あるいはｐｒｅＳ抗原とＳ抗原が別途に発現して混合形態で存在する。したがって、公知のＨＢＶワクチンから生産された表面抗原はｐｒｅＳ抗原がＳ抗原と同時発現し、かつＳ抗原間の結合によって形成された粒子の外側に位置する、全体表面抗原を形成したのではなかった。
【００２５】
本発明は、前述したように同時発現した３形態のＨＢＶの表面タンパク質を全て実質的な水準で含むことにより、２２nmおよび４２nm粒子および赤色形態を含むウイルス様粒子を形成する全体表面抗原を含む組み換えＨＢＶワクチンを提供する。
【００２６】
本発明において、用語「全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）」とは、同時発現したＨＢＶの３つの表面タンパク質であるＬタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質から構成され、ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２からなるｐｒｅＳ抗原が、Ｓ抗原間の結合によって形成される粒子の外部表面に位置する形態の抗原を意味する。
【００２７】
好適な様態において、本発明は、前述したＨＢＶの全体表面抗原に加えてＨＢＶのコア抗原をさらに含むＨＢＶワクチンを提供する。
【００２８】
ＨＢＶのコア抗原は、ウイルス様粒子を形成し、高い免疫原性を示し、細胞性免疫を強く誘導するという特徴がある。よって、ＨＢＶの全体表面抗原の他にコア抗原をさらに含むワクチンは、免疫誘導力がより強いため、治療ワクチンとして有用なものと予想された。これを本願の実施例３で確認した。すなわち、ＨＢＶの全体表面抗原のみを含むワクチンに比べてＨＢＶの全体表面抗原とコア抗原を共に含むワクチンは細胞性免疫反応を誘導する効果がさらに優れたことが明らかになった。よって、ＨＢＶの全体表面抗原とコア抗原を含むワクチンが治療ワクチンとしてさらに適することを確認した。
【００２９】
より詳細に述べたように、前記ＨＢＶのコア抗原をさらに含むワクチンは、本発明の方法によって得られるＨＢＶの全体表面抗原にＨＢＶのコア抗原を混合することにより製造できる。本発明の実施例では、ＨＢＶの全体表面抗原のみを含む本発明に係るＨＢＶワクチンを単一抗原ワクチンと略称し、ＨＢＶの全体表面抗原とコア抗原を共に含む本発明に係るＨＢＶワクチンを複合抗原ワクチンと略称する。
【００３０】
別の様態において、本発明は、ＨＢＶ慢性患者の血液中のＨＢＶから現れたようにＨＢＶ外皮タンパク質を構成する全体表面タンパク質を同時に効率的に発現する組み換え発現ベクターを提供する。
【００３１】
前述したように、本発明のもっとも強力なＨＢＶワクチンは、一つの発現ベクターから３つの表面タンパク質が同時に発現することにより製造することができるものであって、前記組み換え発現ベクターは、ＨＢＶの外皮遺伝子、すなわちｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２およびＳ部位をコードする全体ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、前記塩基配列は、ＨＢＶの全体外皮遺伝子の形態で提供でき、より好ましくは配列番号１で表されるＨＢＶの外皮遺伝子である。
【００３２】
また、好ましくは、本発明に係る前記組み換え発現ベクターを製造するためのベクターとして、韓国特許出願第１０−２０００−００４３９９６号およびＰＣＴ／ＫＲ０1／０１２８５号に開示されたｐＭＳＧベクター（ＫＣＣＭ１０２０２）を使用することができる。ｐＭＳＧベクターは、β-グロビンＭＡＲ相補性配列；ＳＶ４０ウイルスのプロモーター；および特定の塩基配列を有する転写終結因子を含むベクターである。この発現ベクターは、動物細胞にて、外来遺伝子のタンパク質発現を効果的に行うことができる。前記発現ベクターは、様々な動物細胞で外来の組み換えタンパク質を効果的に発現させることができるうえ、動物タンパク質の固有構造と機能を維持する組み換えタンパク質を生産することができると前記特許出願に開示されている。ｐＭＳＧベクターに関するより詳細な事項は、前述した韓国特許出願第１０−２０００−００４３９９６号を参照されたい。前記特許出願明細書の全体内容は参考資料として本願明細書に含まれる。
【００３３】
本発明の具体的な実施例では、ＨＢＶの全体表面抗原をコードする全体外皮遺伝子を前述のｐＭＳＧベクターに挿入することにより、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質が全て発現するか否かを確認した（図２参照）。また、このように生産された組み換えＬ、ＭおよびＳタンパク質は、ウイルス様粒子を形成し（図４参照）、表面抗原としてのｐｒｅＳ（ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２）抗原とＳ抗原を全て提供することができることを確認した（実施例１．１参照）。
【００３４】
別の様態において、本発明は、前記発現ベクターを導入した宿主細胞を提供する。宿主細胞としては、これに限定されないが、動物細胞を使用することが好ましく、さらに好ましくはＣＨＯ(Chinese Hamster Ovary)細胞、肝細胞(Hepatocyte)、ＨＥＫ(Human Embryonic Kidney)細胞、およびＨＬＦ(Human Lung Fibroblast)細胞よりなる群から選択することができ、特に好ましくはＣＨＯ細胞である。
【００３５】
本発明の好適な実施例では、本発明によってＨＢＶの全体外皮遺伝子を含む発現ベクターをＣＨＯ細胞に形質導入し、これからＬタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質を大量生産することができることを確認した（実施例１．１および図２参照）。よって、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質を同時発現することができる、本発明に係る発現ベクターをＣＨＯ細胞に形質導入させた細胞株をＣＨＯ ＤＧ４４／Ｌ−ＨＢｓＡｇ（Ｊ２．１）−Ｇ１０１と命名し、これを２００６年１２月２８日付で韓国大田広域市魚隠洞に所在の韓国生命工学研究院生物資源センター(Korean Collection for Type Cultures)に受託番号ＫＣＴＣ １１０５８ＢＰとして寄託した。
【００３６】
別の様態において、本発明は、ＨＢＶの全体表面抗原を含むＨＢＶワクチンを製造する方法を提供する。
【００３７】
前述したように、本発明に係るＨＢＶの全体外皮遺伝子を含む組み換え発現ベクターを形質導入した細胞株は、３種の外皮タンパク質であるＬタンパク質、Ｍタンパク質およびＳタンパク質を同時に発現し、これらの同時発現したｐｒｅＳ抗原は、Ｓ抗原間の結合によって形成される粒子の表面に位置してウイルス様粒子を形成する。よって、本発明に係るＨＢＶの全体表面抗原を含むＨＢＶワクチンは、前記細胞株から発現したＨＢＶの全体表面抗原タンパク質を精製して製造できる。
【００３８】
具体的に、本発明に係るＨＢＶワクチンの製造方法は、
１）ＨＢＶのｐｒｅＳおよびＳ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに導入する段階、
２）段階１）の発現ベクターを宿主細胞に形質導入する段階、および
３）前記形質導入された宿主細胞を培養して組み換えＨＢＶの全体表面抗原（ｐｒｅＳ抗原およびＳ抗原）タンパク質を得る段階を含む。
【００３９】
好ましくは、段階１）のポリヌクレオチドは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の全体外皮遺伝子の形態であり、さらに好ましくは、ＨＢＶ全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ３−ＵＴＲ全体ヌクレオチドであり、特に好ましくは配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。好ましくは、段階１）の発現ベクターはｐＭＳＧベクター（ＫＣＣＭ １０２０２）である。宿主細胞は、これに限定されないが、好ましくはＣＨＯ細胞を使用することができる。
【００４０】
ＨＢＶの全体表面抗原の他にＨＢＶのコア抗原をさらに含むワクチンは、前述したＨＢＶワクチンの製造方法によって得られるＨＢＶの全体表面抗原と当業界における公知の遺伝子組み換え方式を用いて製造できるＨＢＶのコア抗原を混合することにより容易に製造できる。具体的には、前記１）〜３）の段階を含むＨＢＶワクチンの製造工程に下記４）〜６）の段階をさらに含む方法によって、ＨＢＶの全体表面抗原とコア抗原を含む本発明に係るＨＢＶワクチンを製造することができる：
４）ＨＢＶコア抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに導入する段階、
５）段階４）で製造された発現ベクターを宿主細胞に形質導入する段階、および
６）形質導入された宿主細胞を培養して組み換えＨＢＶコアタンパク質を得る段階。
【００４１】
好ましくは、段階４）における発現ベクターは、これに限定されないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＧＥＸ発現ベクター、ｐＥＴ発現ベクター、ｐＩＬ２０発現ベクターおよびｐＥＴ１１ａ発現ベクターなどを使用することができる。前記発現ベクターは、原核細胞または眞核細胞としての宿主細胞に形質導入させることができる。好適な宿主細胞としては、これらに限定されないが、E.coli、B.subtilisなどの原核細胞と、サッカロミセスセレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラポリモルファ(Hansenular polymorpha)などの真核細胞を挙げることができる。これらの中でも、Ｅ．Coliに形質導入することが特に好ましい。
【００４２】
別の様態において、本発明は、免疫補助剤を含むＨＢＶワクチン組成物を提供する。
【００４３】
本発明において、免疫補助剤とは、それ自体はワクチンの免疫原に対する特異的な免疫を誘発することができないが、抗原と共に作用するとき、免疫系を刺激して免疫反応を上昇させる作用をする基質または添加物を意味する。すなわち、抗原と免疫補助剤を共に用いたワクチンは、抗原単独によって誘導されるよりさらに強力な免疫反応を誘導する。
【００４４】
本発明では、アルミニウム化合物（硫酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど）のような免疫補助剤を使用することができる。また、金コロイドを免疫補助剤として使用することができる。特に、本願発明者は、以前の研究（特許出願１０−２００６−００５７０４０）で、コロイド金が細胞性免疫反応を著しく増加させるアジュバントとして使用できることを解明しことがある。本発明に係るＨＢＶワクチンを慢性Ｂ型肝炎の治療剤として使用する場合には、細胞性免疫反応の誘導がより要求され、このような細胞性免疫反応の誘導に金コロイドをアジュバントとして含む場合には、より効果的な治療ワクチンになれることを確認した（実施例５．２および図１３参照）。
【００４５】
さらに好ましくは、免疫補助剤としてミョウバンとコロイド金を共に使用することができる。ミョウバンは、体液性免疫を増加させる機能を果たすので、ミョウバンと金コロイドを免疫補助剤として共に使用する場合、ミョウバンによる体液性免疫だけでなく、金コロイドによって細胞性免疫反応も共に誘導されて非常に効果的な治療ワクチンになれる。本発明に係るＨＢＶ複合抗原ワクチンの場合、ミョウバンおよび金コロイド免疫補助剤を共に使用した場合、体液性免疫および細胞性免疫が全て非常に効果的に誘導されることを確認した（実施例６．２および図１５参照）。
【００４６】
本発明の別の様態では治療用ＨＢＶワクチンを提供する。慢性肝炎患者の場合は、免疫寛容状態を解消して感染源に対する人体免疫反応を誘導し、感染した状態を回復させる治療ワクチンを免疫治療剤として使用することが好ましい治療方法である。本発明に係るＨＢＶワクチンは、様々なエピトープを提供することにより、オリゴクローナル免疫反応(oligoclonal immune response)のみを誘導した慢性肝炎患者においてポリクローナル免疫反応(polyclonal immune response)を誘導する。また、本発明のＨＢＶワクチンは、強力な体液性免疫反応だけでなく、細胞性免疫反応を効果的に誘導する。したがって、本発明のＨＢＶワクチンは治療用として適する。好ましくは、本発明のＨＢＶワクチンは前記免疫補助剤を共に含む。前記免疫補助剤としては、ミョウバン、金コロイド、またはこれらの両方ともを使用することができる。
【００４７】
本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができ、人体または獣医用として剤形化されて様々な経路で投与できる。投与経路は、経口、腹腔、静脈、筋肉、皮下、皮内などの経路で投与できる。好ましくは、注射剤に剤形化して投与する。注射剤は、たとえば生理食塩液、リンガー液などの水性溶剤、およびたとえば植物油、高級脂肪酸エステル（たとえば、オレイン酸エチルなど）、アルコール類（たとえば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）などの非水性溶剤などを用いて製造することができ、変質防止のための安定化剤（たとえば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなど）、乳化剤、ｐＨ調節のための緩衝剤、微生物の発育を阻止するための保存剤（たとえば、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコールなど）などの薬学的担体を含むことができる。
【００４８】
本発明の組成物は薬学的有効量で投与する。用語「薬学的有効量」とは、ワクチン効果を示すことができる程度の十分な量と、副作用または深刻もしくは過度な免疫反応を起こさない程度の量を意味する。正確な投与濃度は、投与される抗原によって異なり、患者の年齢、体重、健康、性別患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法などの医薬分野によく知られている要素に応じて当業者により容易に決定でき、１回〜数回投与可能である。
【００４９】
別の様態において、本発明は、前記ワクチン組成物を用いて慢性Ｂ型肝炎ウイルスを治療する方法を提供する。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００５１】
実施例１．ＨＢＶワクチンの製造
１．１．組み換え全体表面抗原（ｐｒｅＳおよびＳ抗原；Ｌ−ＨＢｓＡｇ）の製造
（１）−１  クローニング
ＨＢＶゲノムを含むベクター（ＨＢＶ ３１５、Korean Biochem. J. 17:70-79, 1984）を鋳型として外皮遺伝子のコード領域(coding region)（ｐｒｅＳ１−ｐｒｅＳ２−Ｓ）およびポリアデニル化部位を含む３−ＵＴＲ全体（配列番号１）をＰＣＲ法によって増幅して発現ベクターに導入した。この際、ＰＣＲ反応は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、ＨＢｓＡｇのコード部位と３−ＵＴＲ全体が増幅されるようにプライマーを製作した（前方プライマー：５−ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＡＡ ＴＣＴ ＣＧＧ ＧＡＡ−３（配列番号２）、後方プライマー：５−ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＴＡ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＡＧ−３（配列番号３）、下線部分はＢｇｌII認識配列である）。約２．７５ｋｂｐサイズのＰＣＲ産物を得てＢｇｌII酵素で線形化したｐＭＳＧベクター（韓国特許出願第１０−２０００−００４３９９６号およびＰＣＴ／ＫＲ０１／０１２８５号参照）とリゲーション反応させた。このように製作したベクター（ｐＭＳＧ−Ｌ−ＨＢｓＡｇ）の概要図を図１に示した。これをＣＨＯ細胞にトランスフェクションして形質転換体を得、全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ、配列番号４）の発現をウエスタンブロット法で比較して高発現率の高い形質転換体を選別した。選別された形質転換体をＣＨＯ ＤＧ４４／Ｌ−ＨＢｓＡｇ（Ｊ２．１）−Ｇ１０１と命名し、２００６年１２月２８日付で韓国大田広域市魚隠洞に所在の韓国生命工学研究院生物資源センター(Korean Collection for Type Cultures)に寄託し、受託番号ＫＣＴＣ １１０５８ＢＰを与えられた。
【００５２】
（１）−２  浮遊培養細胞株の確立
選別された細胞株をＴ−１７５フラスコに５×１０５個接種した。Ｔ−フラスコで付着して１０％血清培地の条件で成長した細胞を０．２５％トリプシンで取り外した後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して残留トリプシンを除去し、無タンパク質培地（ＨｙＱ ＳＦＭ４ＣＨＯ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）に単一細胞でよく懸濁した。これを１００ｍＬの培養体積で２５０ｍＬのスピナーフラスコに接種して３７℃で８０ｒｐｍ速度で培養した。初期の細胞濃度を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬにして接種し、細胞成長が約１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに到達するとき、同じ初期濃度で連続継代培養することにより、浮遊培養に適応された細胞株を確保した。
【００５３】
（２）培養
ＭＣＢ(Master Cell Bank)から継代培養して接種用細胞を準備した。この際、培養培地は無血清培地（ＨｙＱ ＳＦＭ４ＣＨＯ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を基本培地として２５０ｍＬのスピナーフラスコに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種した後、３４℃で８０ｒｐｍの速度で培養した。培養３日後、培養された細胞を１Ｌのスピナーフラスコで継代培養して細胞数を増やした後、これを７．５Ｌの生物培養器に接種してｐＨ７．２、３４℃および８０ｒｐｍの攪拌速度で培養した。培養３日後、クエン酸とＨｙＱ ＬＳ１０００を添加して３日間さらに培養した。
【００５４】
（３）精製
生物培養器で培養された培養液を遠心分離して回収した後、０．４５μｍのフィルターを通過させて不純物を除去した。これを、平衡化させておいたフェニル−セファロースクロマトグラフィー(Phenyl-Sepharose chromatography)、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー(Sepharose chromatography)、セファロース４ＦＦクロマトグラフィー(Sepharose 4 FF chromatography)を経て精製した。精製された全体表面抗原は、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質およびＬタンパク質から構成されており、糖化有無に応じて６つの組み換えタンパク質からなることを確認した（図２）。図２Ａは精製された全体表面抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であり、図２Ｂは精製された表面抗原をそれぞれ抗−Ｓ抗体（レイン１）、抗−ｐｒｅＳ１抗体（レイン２）、および抗−ｐｒｅＳ２抗体（レイン３）でウエスタンブロックした図である。糖化有無は、糖鎖を除去することが可能な酵素Ｎ−グリコシダーゼＦを用いてＳ抗原部分とＭタンパク質のｐｒｅｓＳ２部分にＮ−糖化がなされたことを確認した（図３）。また、電子顕微鏡写真で精製されたＬ−ＨＢｓＡｇがウイルス様粒子の形態を成していることを確認した（図４）。
【００５５】
１．２ 組み換えコア抗原（ＨＢｃＡｇ）の製造
（１）クローニング
コア抗原のＣ末端にあるアルギニンクラスター(arginine cluster)を除いたアミノ酸配列１番〜１４９番を組み換えタンパク質（配列番号５）で発現した。前記タンパク質をコードする核酸配列を配列番号６で示した。ＨＢＶゲノムを含むベクター（ＨＢＶ３１５）を鋳型として、この部分に該当する遺伝子をＰＣＲ法で増幅してｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターの制限酵素ＮｄｅIおよびＢａｍＨI切断部位に挿入してｐＥＴ１１ａ−ｃｏｒｅ発現ベクターを製作した。コア遺伝子のＰＣＲ増幅には、前方(forward)プライマー：５−ＣＣＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＣＣＧ ＴＡ−３（配列番号７）と後方(reverse)プライマー：５−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＡＧＴ ＴＴＣ ＣＧＧ−３（配列番号８）が使用された。ｐＥＴ１１ａ−ｃｏｒｅ発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して発現を確認し、高発現率の生産クローンを選別した。
【００５６】
（２）形質転換生産菌株の培養
生産菌株の最適の生産条件を５Ｌの発酵槽を用いて確立した。培地は２％バクトトリプトン、１％酵母エキス、２％ ＮａＣｌ、２％グルコース、１．３３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．４％（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．１７％クエン酸、０．１２％ ＭｇＳＯ４、０．０１％チアミン−ＨＣｌ、および０．０３７１％アンピシリンを使用し、１１時間３７℃で培養した後、０．０５ｍＭ／ｇ ｃｅｌｌとなる条件でＩＰＴＧ(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を添加した。ＩＰＴＧ添加の後、１８時間誘導させてから細胞を収穫した。
【００５７】
（３）組み換えタンパク質の精製
細胞を収穫した後、溶解バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）で３回洗浄した後、溶媒バッファを入れてソニケーショを介して細胞を破砕した。遠心分離によって上澄液を収去した後、６５℃で３０分間加熱した後、さらに遠心分離して上澄液を分離し、３０％硫酸アンモニウムを添加してコア抗原を沈殿させた。遠心分離の後、沈殿物を５０ｍＭ Ｔｒｉs−Ｃｌ（ｐＨ７．６）に溶かした後、ブチルセファロースカラム(Butyl sepharose column)を介してコア抗原のみを純粋分離した。
【００５８】
精製された組み換えコア抗原は、粒子形態の多重合体を確認した（図５）。図５Ａは精製された組み換えコア抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果であり、図５Ｂは精製された組み換えコア抗原のウエスタンブロット図である。変性条件と非変性条件を比較して多重合体を確認した。また、電子顕微鏡写真によって、精製された組み換えコア抗原が粒子形態を成していることを確認した（図６）。
【００５９】
精製された組み換えコア抗原は、ウイルス様粒子を形成して免疫原性の高い形態で発現した。下記実施例では細胞性免疫を強く誘導する特徴があることを確認した。
【００６０】
実施例２．組み換え全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）の免疫原性の比較
本発明によって開発された組み換え全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）が高い免疫原生を有しかつ優れた防御効果を誘導することを解明するために、公知の第２世代ワクチンと比較するために動物免疫実験を行った。
【００６１】
２．１．免疫原性の比較
（１）目的：組み換えＬ−ＨＢｓＡｇ抗原によって誘導される抗体価と免疫反応が誘導される時期を比較した。
【００６２】
（２）材料および方法
（ａ）実験動物：６週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス
（ｂ）試験ワクチン
実施例１−１によって製造および精製された全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）をミョウバンに吸着して試験ワクチンを製造した。比較群として、ハンセヌラポリモルファで生産された組み換えＳ抗原を含んだワクチン（Ｈｅｐａｖａｘ−Ｇｅｎｅ、緑十字ワクチン）、およびＣＨＯ細胞で発現したｐｒｅＳ抗原を含まない組み換えＳ抗原（Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Ｈｕａｌｔｏｎ社）を使用した。各試験ワクチンはドース(dose)当たり抗原０．５μｇを使用した。
【００６３】
（ｃ）免疫グループおよび免疫条件
−免疫グループ
１．実験群１：ハンセヌラポリモルファで生産された組み換えＳ抗原（Ｈｅｐａｖａｘ−ｇｅｎｅ、緑十字ワクチン）
２．実験群２：ＣＨＯ細胞で生産された組み換えＳ抗原（Recombinant Hepatitis  B Vaccine、中国Ｈｕａｌｔｏｎ社）
３．実験群３：実施例１−１によって製造および精製されたＣＨＯ細胞で生産された組み換えＬ−ＨＢｓＡｇ抗原
−投与方法：各試験ワクチンを２週間隔で３回筋肉注射した。
【００６４】
（ｄ）免疫反応分析方法
各試験ワクチンによって誘導された体液性免疫反応を分析するために、Ｄｉａｓｏｒｉｎ ｋｉｔを用いて抗体価をインターナショナルユニット（ｍＩＵ／ｍＬ）で決定した。
【００６５】
（３）結果
本発明に係る組み換えＬ−ＨＢｓＡｇは、既存のワクチンに使用される組み換えＳ抗原より高い体液性免疫反応を誘導して高い抗体価を示した（図７）。すなわち、組み換えＬ−ＨＢｓＡｇは、既存の抗原に比べて免疫原性が高いことを確認した。また、ハンセヌラポリモルファで生産されたＳ抗原に比べて、抗体反応が先に現れるので、速い防御効果を誘導することができる。
【００６６】
２．２．ＥＤ５０の比較
（１）目的：実施例１−１によって製造および精製された組み換えＬ−ＨＢｓＡｇ抗原の免疫原性を実験動物５０％においてセロコンバージョン(sero-conversion)の起こるＥＤ５０(Effective Dose 50)で比較した。
【００６７】
（２）材料および方法
（ａ）実験動物：６週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス。
【００６８】
（ｂ）試験ワクチン
実施例１−１によって製造および精製された全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）をミョウバンに吸着して試験ワクチンを製造した。比較群として、酵母で生産された組み換えＳ抗原（Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Ｋａｎｇｔａｉ社）、およびＣＨＯ細胞で発現したｐｒｅＳ抗原を含まない組み換えＳ抗原（Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Ｈｕａｌｔｏｎ社）を使用した。
【００６９】
各ワクチンを希釈してドース当たりの抗原が０．１５６μｇ、０．３１２μｇ、０．６２５μｇ、１．２５μｇ、２．５μｇ、５μｇずつ含むように準備した。
【００７０】
（ｃ）免疫グループおよび免疫条件
−免疫グループ：各実験群をさらに希釈された試験ワクチンに該当するように小グループに分け、各小グループ当たり１０匹ずつの動物を用いて免疫した。
【００７１】
１．実験群１：酵母で生産された組み換えＳ抗原（Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Ｋａｎｇｔａｉ社）（実験群１−１：０．１５６μｇ投与、実験群１−２：０．３１２μｇ投与、実験群１−３：０．６２５μｇ投与、実験群１−４：１．２５μｇ投与、実験群１−５：２．５μｇ投与、実験群１−６：５μｇ投与）
２．実験群２：比較群として実施例２−１で使用した、ＣＨＯ細胞で生産された組み換えＳ抗原（Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Ｈｕａｌｔｏｎ社）（実験群２−１：０．１５６μｇ投与、実験群２−２：０．３１２μｇ投与、実験群２−３：０．６２５μｇ投与、実験群２−４：１．２５μｇ投与、実験群２−５：２．５μｇ投与、実験群２−６：５μｇ投与）。
【００７２】
３．実験群３：ＣＨＯ細胞で生産された、実施例１−１によって製造および精製された組み換えＬ−ＨＢｓＡｇ抗原（実験群３−１：０．１５６μｇ投与、実験群３−２：０．３１２μｇ投与、実験群３−３：０．６２５μｇ投与、実験群３−４：１．２５μｇ投与、実験群３−５：２．５μｇ投与、実験群３−６：５μｇ投与）
−投与方法：希釈された試験ワクチンを１回腹腔注射した。
【００７３】
（ｄ）免疫反応分析方法 
各個体から誘導された体液性免疫反応は、Ｄｉａｓｏｒｉｎ ｋｉｔを用いて抗体価をインターナショナルユニット（ｍＩＵ／ｍＬ）で決定し、決定された抗体が１０ｍＩＵ／ｍＬの場合をセロコンバージョンの起こったものと定義した。各グループで免疫された個体の５０％でセロコンバージョンを誘導することが可能な試験ワクチン量（ＥＤ５０）を決定した。
【００７４】
（３）結果
実施例１−１によって製造および精製された組み換えＬ−ＨＢｓＡｓを使用したワクチンのＥＤ５０が既存のワクチンと比較して最も低い値を示した。すなわち、本発明に係る組み換えＬ−ＨＢｓＡｇは既存の抗原より体液性免疫反応を効果的に誘導することができることを確認した（図８）。
【００７５】
実施例３．ＨＢＶワクチンの免疫反応比較
３．１  免疫実験の条件および分析方法
（１）目的：本発明によって製造されたＨＢＶワクチンの効能を確認するために、ＨＢＶ全体表面抗原のみを含むワクチン（以下、「単一抗原ワクチン」という）またはＨＢＶ全体表面抗原とコア抗原を共に含むワクチン（以下、「複合抗原ワクチン」という）をマウスに免疫し、誘導された免疫反応を分析した。
【００７６】
（２）材料および方法
（ａ）実験動物：６週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス
（ｂ）試験ワクチン
−実施例１で製造および精製された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原それぞれをミョウバンに吸着させて単一抗原ワクチンを製造し、複合抗原ワクチンはミョウバンに吸着された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原とを混合して使用した。ドース当り各抗原０．５μｇを使用した。
【００７７】
（ｃ）免疫グループおよび免疫条件
−免疫グループ
１．実験群１：ＰＢＳ(Phosphate buffered saline)で免疫した陰性対照群(negative control)
２．実験群２：ミョウバンに吸着させた組み換え全体表面抗原
３．実験群３：ミョウバンに吸着させた組み換えコア抗原
４．実験群４：ミョウバンに吸着させた組み換え表面抗原と組み換えコア抗原（複合抗原ワクチン）
−投与方法：各試験ワクチンを２週間隔で３回にわたって筋肉注射した。
【００７８】
（ｄ）免疫反応分析方法
１）体液性免疫反応の分析
免疫前と免疫投与後２週目に血清を分離し、生成された抗体をＥＬＩＳＡ法で分析することにより、抗体価を決定した。抗体を分析するために、まず精製された各抗原を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１００ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度でコートした後、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（１％）で１時間ブロッキングした。マイクロプレートを洗浄した後、各ウェルに順次希釈血清を入れて２時間３７℃で反応させた後、２次抗体として抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰを入れて１時間同一の条件で反応させる。洗浄の後、発色試薬を入れて２０分間常温で反応させた後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。抗体価は、陰性対照群のＯＤ値の３倍に相当するＯＤ値で示す抗体希釈倍数の逆数で定義した。
【００７９】
２）細胞性免疫反応の分析
最終免疫の後、マウスから脾臓(spleen)を摘出して全体脾細胞(splenocyte)を分離および培養し、インターフェロン−γを分泌する脾細胞をＥＬＩＳＰＯＴ法で測定して細胞性免疫反応を確認した。
【００８０】
３次免疫を行った２週後にそれぞれのマウスから分離した脾臓を細胞ストレーナー(cell strainer)に入れて破砕した後、ＲＢＣ溶解バッファを用いて赤血球を完全に除去し、しかる後に、脾細胞のみを純水分離した。分離された脾細胞を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍに１Ｘグルタミンと１Ｘ抗生物質を添加）で培養した。各抗原に特異的な免疫反応を観察するために、培養培地にコア抗原と全体表面抗原をそれぞれ１μｇ／ｍＬの濃度で添加して抗原特異的免疫細胞のみを分化するように刺激した後、細胞性免疫反応の指標となるインターフェロン−γを分泌する細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴ法で分析した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【００８１】
３．２ 体液性免疫反応に対する効果
組み換え全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）と組み換えコア抗原とを混合した複合抗原ワクチンを投与した場合、組み換え全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）を単独で使用した場合と比較して表面抗原に対する抗体形成が速く行われた（図９）。組み換えコア抗原を混合する場合、表面抗原に対する免疫反応を増加させる効果を示した。ところが、最終免疫後には、単一抗原ワクチンと複合抗原ワクチンが同じ抗体価を示した。
【００８２】
３．３  細胞性免疫反応に対する効果
組み換え全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）と組み換えコア抗原とを混合した複合抗原ワクチンを投与した場合、組み換え全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）を単独で使用した場合、あるいは組み換えコア抗原を単独で免疫した場合と比較して高い細胞性免疫反応を示した（図１０）。したがって、コア抗原を追加した場合より効率的に細胞性免疫反応を誘導することができた。したがって、細胞性免疫反応の誘導が必須的な治療ワクチンの場合、複合抗原ワクチンを使用することが適する。
【００８３】
実施例４．コロイド金アジュバントの製造
４．１．コロイド金(Colloidal gold)の製造
Ｆｒｅｎｓ(Frens G, Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions. Nature Phys. Sci. 241:20, 1973)によって開発されたクエン酸ナトリウム法(Sodium citrate procedure)を基本としてコロイド金を製造した。塩化金（Gold chloride：ＨＡｕＣｌ４３Ｈ２Ｏ）０．２ｇを１０ｍＬの蒸留水に溶かして２％の金ストック溶液(gold stock solution)を準備した。１００ｍＬの蒸留水を攪拌しながら加熱して沸かした。ここに２％の金ストック溶液１ｍＬを入れて最終濃度０．０２％の金溶液を作り、加熱と攪拌を約５分間持続した。１０％クエン酸ナトリウム溶液を最終濃度が０．０３２〜０．０３６％となるように入れ、５〜１０分間加熱と攪拌を持続した。この際、溶液は、初期には灰色を呈するが、益々紫色に変わり、１〜３分後には赤色を呈した。これを水浴に入れて冷やし、ＯＤ５４０とＯＤ６００-を測定した。ＯＤ５４０は粒子の数または金粒子の濃度を意味し、２〜４の値を示した。ＯＤ-６００は粒子サイズ(particle size)または粒子の質(quality of particle)を意味し、０．５５〜０．７５の値を示した。製造されたコロイド金の粒子サイズは約１０〜４０ｎｍであった。
【００８４】
４．２．コロイド金コンジュゲート(Colloidal gold conjugate)の製造
製造されたコロイド金溶液に１００ｍＭの炭酸ソーダ一水和物(sodium carbonate monohydrate)（または別のバッファ）を添加して溶液をｐＨが７．５となるように滴定した後、コロイド金溶液を攪拌しながら溶液１ｍＬ（２００μｇのコロイド金を含む）当り２０μｇの牛血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）または１０μｇのｐｒｅＳ抗原を添加した後、常温で１５分間持続的に攪拌した。遠心分離の後、上澄液を除去し、滅菌したＰＢＳ(Phosphate Buffered Saline)バッファで３回洗浄し、吸着されていないＢＳＡあるいはｐｒｅＳ抗原を除去した後、ＰＢＳに再び希釈して４℃に保管した。ｐｒｅＳタンパク質がコートされたコロイド金コンジュゲートの電子顕微鏡写真を図１１に示した（ＪＥＭ１０１０、６７．０ｋ）。タンパク質の吸着度合いは、ＢＳＡまたはｐｒｅＳ抗原を吸着させた後、遠心分離し、上澄液に残っているタンパク質の量を定量して確認した。
【００８５】
実施例５．コロイド金アジュバントの免疫反応誘導効果
５．１ 免疫実験の条件および分析方法
（１）目的：アジュバントとして、コロイド金複合体の効能を確認するために、マウスに免疫し、誘導された免疫反応を分析した。
【００８６】
（２）材料および方法
（ａ）実験動物：６週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス
（ｂ）試験ワクチン
−試験ワクチンは、精製された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原をミョウバンに吸着させて製造し、ドース当り各抗原０．５μｇを使用した。また、ミョウバンに吸着されていない自由抗原０．５μｇを２００μｇのコロイド金コンジュゲートと混合して使用した。
【００８７】
（ｃ）免疫グループおよび免疫条件
−免疫グループ
１．実験群１：ＰＢＳ(Phosphate buffered saline)で免疫した陰性対照群
２．実験群２：ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原で免疫
３．実験群３：ミョウバンに吸着していない組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原をコロイド金コンジュゲートと混合して免疫
−投与方法：各試験ワクチンを２週間隔で２回にわたって筋肉注射した。
【００８８】
（ｄ）免疫反応分析方法
１）体液性免疫反応の分析
実施例３で記述したように、ＥＬＩＳＡ法で体液性免疫反応を分析した。
【００８９】
２）細胞性免疫反応の分析
２次免疫後２週以内に全てのマウスから脾臓を摘出して全体脾細胞を分離および培養し、細胞性免疫反応を確認した。それぞれのマウスから分離した脾臓を細胞ストレーナーに入れて破砕した後、ＲＢＣ溶解バッファを用いて赤血球を完全に除去した後、脾細胞のみを純粋分離した。分離された脾細胞を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍに１Ｘグルタミンと１Ｘ抗生物質を添加）で培養した。各抗原に特異的な免疫反応を観察するために、培養培地にコア抗原と全体表面抗原をそれぞれ１μｇ／ｍＬの濃度で添加して抗原特異的免疫細胞のみを分化するように刺激した後、細胞から分泌されたサイトカイン（細胞性免疫反応の指標でインターフェロン−ｇを分析）をＥＬＩＳＡ方法で分析した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【００９０】
５．２ コロイド金コンジュゲートのアジュバント効能確認
（１）体液性免疫反応に及ぶ影響
ワクチン抗原を投与した実験群（実験群２および３）は全て、ワクチンを与えていない陰性対照群（実験群１）と比較して、抗原特異的な抗体形成である抗−ＨＢｓ抗原と抗−ＨＢｃ抗体が誘導された。ところが、誘導された抗体は、ミョウバンをアジュバントとして使用した場合（実験群２）がコロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した場合（実験群３）より高い抗体形成を示した（図１２）。ミョウバンは、周知の如く、体液性免疫反応を強力に誘導することが可能なアジュバントであり、本特許で使用したコロイド金コンジュゲートも、体液性免疫反応を誘導することが可能な機能があることが確認された。ところが、治療ワクチン用アジュバントは細胞性免疫反応を誘導しなければならないので、２つのアジュバントによって誘導された細胞性免疫反応を比較した。
【００９１】
（２）細胞性免疫反応に及ぶ影響
コロイド金コンジュゲートによって細胞性免疫反応が誘導されたかを確認するために、２次免疫の後、それぞれマウスから脾細胞を分離してコア抗原あるいは表面抗原特異的なインターフェロン−ｇの生産をＥＬＩＳＡ方法で確認した。ミョウバンをアジュバントとして使用した場合（実験群２）は、各抗原に対するインターフェロン−ｇの生産が、免疫していない対照群に比べて２．５倍増加したが、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した場合にはこれよりさらに高かった（図１３）。特に、表面抗原に特異的な細胞性免疫反応は、ミョウバンを使用したときより４倍さらに高かった。すなわち、Ｂ型肝炎ウイルス抗原に対する免疫反応がコロイド金コンジュゲートをアジュバントとして用いて免疫したとき、治療ワクチンに必要な細胞性免疫反応がよく誘導され、ウイルスの除去に必要なインターフェロン−ｇの生産が増加した。したがって、コロイド金コンジュゲートは、細胞性免疫反応を強力に誘導することができ、効果的な治療ワクチンの開発にアジュバントとして用いることができる。
【００９２】
実施例６．治療ワクチンの免疫反応最適化
６．１ 免疫実験の条件および分析方法
（１）目的：体液性免疫反応と細胞性免疫反応を全て最大に誘導するために、治療ワクチンの組成を比較した。
【００９３】
（２）材料および方法
（ａ）実験動物：６週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス
（ｂ）試験ワクチン
−精製された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原をミョウバンに吸着してドース当り各抗原０．５μｇを使用した。また、ミョウバンに吸着された各抗原０．５μｇと、ＢＳＡでコートされたコロイド金コンジュゲート２００μｇととを混合して免疫した。
【００９４】
（ｃ）免疫グループおよび免疫条件
−免疫グループ
１．実験群１：ＰＢＳで免疫した陰性対照群
２．実験群２：ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原で免疫
３．実験群３：ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原をコロイド金コンジュゲートと混合して免疫
−投与方法：各試験ワクチンを２週間隔で２回にわたって筋肉注射した。
【００９５】
（ｄ）免疫反応分析方法
試験ワクチンによって誘導された体液性免疫反応および細胞性免疫反応は、実施例３および５に提示された方法で分析した。
【００９６】
６．２ 誘導された免疫反応の分析
（１）体液性免疫反応に及ぶ影響
ワクチン抗原を投与した実験群（実験群２、３）は、ワクチンを与えていない陰性対照群（実験群１）と比較して抗原特異的な抗体形成が誘導された。この際、誘導された抗体は、ミョウバンに吸着された試験ワクチンのみを免疫した場合（実験群２）と、コロイド金コンジュゲートをアジュバントと混合して免疫した場合（実験群３）との間にはあまり大きい差異がなかった（図１４）。すなわち、この実験結果、ミョウバンとコロイド金コンジュゲートを共に使用して体液性免疫反応を高めることができた。
【００９７】
（２）細胞性免疫反応に及ぶ影響
コロイド金コンジュゲートが細胞性免疫反応を誘導したかを確認するために、２次免疫の後、各マウスから脾細胞を分離してインターフェロン−ｇの生産をＥＬＩＳＡ方法で確認した。
【００９８】
ミョウバンに吸着したワクチン抗原を免疫した場合（実験群２）、各抗原に対するインターフェロン−ｇの生産が陰性対照群と比較して約２倍増加したが、コロイド金コンジュゲートを抗原と共に免疫した場合（実験群３）には、コア抗原に対するインターフェロン−ｇの生産は２．５倍増加し、表面抗原に対するインターフェロン−ｇの生産は４．５倍さらに増加した（図１５）。これより、ミョウバンは体液性免疫反応を強力に誘導するアジュバントであり、コロイド金コンジュゲートは実施例４のように細胞性免疫反応を強力に誘導することが可能なアジュバントであることが確認された。したがって、ワクチン抗原をミョウバンに吸着した後、コロイド金コンジュゲートと共に免疫すると、体液性免疫反応と細胞性免疫反応を全て最適化することが可能な治療ワクチンの開発が可能であろうと思われる。
【００９９】
実施例７．形質転換マウスを用いた試験ワクチンの効能確認（１）
７．１ 免疫実験の条件および分析方法
（１）目的：正常マウスで確立された治療ワクチンの組成を形質転換マウス（ＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２）を用いて治療ワクチンの効能を分析した。
【０１００】
（２）材料および方法
（ａ）実験動物
６週齢のＨＢｓＡｇ／ＨＬＡ−Ａ２形質転換雌マウスを使用した(Loirat D et al HBsAg/HLA-A2 transgenic mice : a model for T cell tolerance to hepatitis B surface antigen in chronic hepatitis B virus infection International Immunology 15 : 1125-1136, 2003)。この動物モデルは、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子がトランスジェニックされて持続的に発現し、血液内に表面抗原からなるウイルス様粒子を分泌する。また、トランスジェニックされた表面抗原遺伝子を自体遺伝子として認識し、これに対する免疫反応を誘導せず免疫寛容状態を示す。したがって、このモデルはＨＢＶ感染状態でこれに対する十分な免疫反応を誘導することができないため、ウイルスを除去することができず、感染状態が持続される慢性肝炎患者と類似のモデルである。
【０１０１】
（ｂ）ワクチン抗原およびアジュバント
精製された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原をミョウバンに吸着させてワクチン抗原として使用し、治療ワクチン用アジュバントとして、ＢＳＡがコートされたコロイド金コンジュゲートを使用した。
【０１０２】
（ｃ）免疫グループおよび条件
−免疫グループ
１．実験群１：ＰＢＳ(Phosphate buffered saline)を免疫した陰性対照群
２．実験群２：ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原で免疫
３．実験群３：ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原をコロイド金コンジュゲートと混合して免疫
−投与方法：各試験ワクチンを２週間隔で３回にわたって筋肉注射した。
【０１０３】
（ｄ）血清内のウイルス様粒子の分析
免疫前と３次免疫後に血清を分離し、血清内の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなるウイルス様粒子の量をＧｅｎｅｄｉａ ＨＢｓＡｇ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ３．０（緑十字）を用いて分析した。
【０１０４】
（ｅ）体液性免疫反応の分析
免疫前と３次免疫後に血清を分離し、抗原特異的な抗体の生成を実施例４に提示された方法によって分析した。また、誘導された抗体のサブタイプを決定してＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の比率を決定した。
【０１０５】
（ｆ）細胞性免疫反応の分析
実施例４に提示された方法で脾細胞を分離、培養することにより、細胞性免疫反応の指標であるインターフェロン−ｇが誘導されることをＥＬＩＳＡ法とＥＬＩＳＰＯＴ法で分析した。
【０１０６】
（ｇ）肝におけるインターフェロン−ｇと表面抗原遺伝子の発現分析
マウスの肝から全体ＲＮＡを抽出して遺伝子の発現度合いをＲＴ−ＰＣＲ法によって分析した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて分離し、次のプライマーとＯｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて表面抗原遺伝子（配列番号９、１０を使用）およびインターフェロン−ｇ遺伝子（配列番号１１、１２を使用）の発現度合いを確認した。この際、β−ａｃｔｉｎ遺伝子（配列番号１３、１４を使用）の発現度合いを陰性対照群として使用した。
【０１０７】
Ｓ−（Ｆ） ５’−ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＣＡ ＴＣＡ ＧＧ−３’（配列番号９）
Ｓ−（Ｒ） ５’−ＴＴＡ ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＡＣ ＣＣＴ ＡＡＧ−３’（配列番号１０）
ＩＮＦ−γ（Ｆ） ５’−ＡＧＣ ＧＧＣ ＴＧＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＧＴ ＡＧ−３’（配列番号１１）
ＩＮＦ−γ（Ｒ） ５’−ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＴ ＴＴＣ ＡＧＣ ＴＧＴ ＡＴＡ ＧＧＧ−３’（配列番号１２）
β−ａｃｔｉｎ（Ｆ） ５’−ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＣ−３’（配列番号１３）
β−ａｃｔｉｎ（Ｒ） ５’−ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ＣＡＣ ＧＴＧ Ｃ−３’（配列番号１４）
７．２ コロイド金コンジュゲートの治療ワクチン用アジュバント効能確認
１）免疫寛容の解消
使用された形質転換マウスモデルは、表面抗原遺伝子を自体遺伝子として認識し、これに対する免疫反応を誘導せず免疫寛容状態を示す。ここに治療ワクチンを投与した結果、表面抗原に対する免疫寛容を解消することにより、体液性免疫反応および細胞性免疫反応が誘導された。
【０１０８】
（ａ）体液性免疫反応の誘導
免疫前と３次免疫後に分離した血清を用いて表面抗原に対する抗体生成の度合いを確認した。陰性対照群（実験群１）では、血液内に抗原の濃度が高く維持されるにも拘らず、表面抗原に対する抗体は全く現れなかった。ワクチン抗原が投与された場合（実験群２および実験群３）、表面抗原に対する免疫寛容が解消されて表面抗原に対する抗体が生成されたことを確認することができた。ＢＳＡがコートされたコロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した場合（実験群３）、ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合（実験群２）に比べて、誘導された抗体がやや低かったが、あまり大きい差異はなかった（図１６）。ところが、誘導された抗体のイソタイプ(isotype)を決定してＩｇＧ２ａとＩｇＧ１間の比率を比較した結果、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した実験群３が、ミョウバンのみを使用した実験群２に比べてさらに高かった（図１７）。すなわち、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用すると、免疫反応がＴｈ１側に誘導されることが分かった。
【０１０９】
（ｂ）細胞性免疫反応の誘導
ウイルスを除去するためには、強い細胞性免疫反応が必須的であると知られている。したがって、治療ワクチンが免疫寛容を解消し、表面抗原に特異的な細胞性免疫反応を誘導することができるかを確認するために、免疫の後に脾細胞を分離して、細胞性免疫反応の指標であるインターフェロン−ｇの生成をＥＬＩＳＰＯＴ法とＥＬＩＳＡ法で比較した。正常マウスを使用した実施例５と同様に、遺伝子操作マウスを使用した動物免疫実験においても、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして用いた実験群３で高い細胞性免疫反応が誘導された（図１８のＡおよびＢ）。
【０１１０】
２）血中の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなるウイルス様粒子の減少
免疫前と免疫後の血清を分離して、血液内の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなるウイルス様粒子の量を分析した。既に報告したように、陰性対照群では血液内のウイルス様粒子の量が約４０％程度自然的に減少した。ところが、治療ワクチンを免疫した場合には、ウイルス様粒子の量が急激に減少した。また、ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合（実験群２）よりコロイド金コンジュゲートを共に免疫した場合（実験群３）、３次免疫の後に最も低いウイルス様粒子の量が観察された（図１９）。ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合（実験群２）、一時的な抗原の減少を示したが、ウイルス感染細胞を除去するための細胞性免疫反応を誘導することができないので、ウイルスの完全な除去が難しいだろうと思われる。
【０１１１】
３）肝における細胞性免疫反応によるウイルス遺伝子発現の減少
Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞からウイルスを除去するためには、インターフェロン−ｇを分泌し、細胞溶解活性(cytolytic activity)を持つ免疫細胞が肝に移動してウイルス遺伝子の転写を抑制し、あるいは感染細胞を直接破壊する過程が必要である。したがって、抗原特異的な細胞性免疫反応が実際マウスの肝でも起こるかを確認するために、マウスの肝から全体ＲＮＡを抽出してインターフェロン−ｇ遺伝子の発現度合いをＲＴ−ＰＣＲ法で分析した。対照群（実験群１）と実験群２では、インターフェロン−ｇ遺伝子の発現率が低かったが、コロイド金コンジュゲートを使用した実験群３ではインターフェロン−ｇ遺伝子が約３〜４倍高く発現することを確認することができた（図２０）。また、生成されたインターフェロン−ｇによって肝細胞内のウイルス遺伝子、すなわち表面抗原遺伝子の発現が抑制されるかを確認するために同一の方法で表現抗原遺伝子の発現を比較した。対照群（実験群１）およびミョウバンに吸着された抗原のみを免疫した実験群２では表面抗原遺伝子の発現が高く維持されたが、実験群３では表面抗原遺伝子の発現が抑制されることを確認することができた（図２０）。
【０１１２】
本発明の治療ワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスの抗原に対して免疫寛容を示す個体で免疫寛容を克服し、体液性免疫反応および細胞性免疫反応を誘導することができた。特に、アジュバントとして使用したコロイド金によって誘導された強力な細胞性免疫反応によって、肝細胞におけるウイルス遺伝子の発現が抑制され且つ血液内のウイルス様粒子が除去されるということを確認した。したがって、コロイド金をアジュバントとして使用した本発明の治療ワクチンは、慢性肝炎患者への投与の際に免疫寛容を解消して抗原特異的な免疫反応を誘導し、ウイルスを除去することができるという効能があるだろうと思われる。
【０１１３】
実施例８．形質転換マウスを用いた試験ワクチンの効能確認（２）
８．１  免疫実験の条件および分析方法
治療ワクチン用アジュバントとして、ＨＢＶ表面抗原タンパク質の一部であるｐｒｅＳタンパク質でコートされたコロイド金コンジュゲートを使用した。実験動物、免疫グループおよび分析方法などは実施例７と同一であった。
【０１１４】
８．２  ｐｒｅＳでコートされたコロイド金コンジュゲートの治療ワクチン用アジュバント効能の確認
１）免疫寛容の解消
ｐｒｅＳでコートされたコロイド金コンジュゲートを治療ワクチン用アジュバントとして使用した場合にも、ＢＳＡでコートされたコロイド金コンジュゲートを使用した実施例６と同様に免疫寛容が解消され、体液性免疫反応および細胞性免疫反応が誘導された。
【０１１５】
（ａ）体液性免疫反応の誘導
免疫前と３次免疫後に分離した血清を用いて、表面抗原に対する抗体生成の度合いを確認した。陰性対照群（実験群１）では、血液内に抗原の濃度が高く維持されるにも拘らず、表面抗原に対する抗体は全く現れなかった。ワクチン抗原が投与された場合（実験群２および実験群３）、表面抗原に対する免疫寛容が解消されて表面抗原に対する抗体が生成されたことを確認することができた。ＢＳＡがコートされたコロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した場合（実験群３）、ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合（実験群２）と比較したとき、誘導された抗体の量がやや低かったが、あまり大きい差異はなかった（図２１）。ところが、誘導された抗体のイソタイプを決定してＩｇＧ２ａとＩｇＧ１間の比率を比較した結果、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した実験群３がミョウバンのみを使用した実験群２に比べてさらに高かった（図２２）。すなわち、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用すると、免疫反応がＴｈ１側に誘導されることが分かった。
【０１１６】
（ｂ）細胞性免疫反応の誘導
ウイルスを除去するためには、強い細胞性免疫反応が必須的であると知られている。したがって、治療ワクチンが免疫寛容を解消し、表面抗原に特異的な細胞性免疫反応を誘導することができるかを確認するために、免疫後に脾細胞を分離して、細胞性免疫反応の指標であるインターフェロン−ｇの生成をＥＬＩＳＰＯＴ法とＥＬＩＳＡ法で比較した。正常マウスを使用した実施例５と同様に、遺伝子操作マウスを使用した動物免疫実験においても、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した実験群３で高い細胞性免疫反応が誘導された（図２３のＡおよびＢ）。
【０１１７】
２）血中の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなるウイルス様粒子の減少
免疫前と３次免疫後に血清を分離し、血液内の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなるウイルス様粒子の量を分析した。既に報告されたように、陰性対照群では血液内のウイルス様粒子の量が自然的に減少した。ところが、治療ワクチンを免疫した場合にはウイルス様粒子の量が急激に減少した。また、ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合（実験群２）よりコロイド金コンジュゲートを共に免疫した場合（実験群３）、３次免疫の後に最も低いウイルス様粒子の量が観察された（図２４）。ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合（実験群２）、一時的な抗原の減少を示したが、細胞性免疫反応を誘導することができないので、ウイルスの完全な除去が難しいものと思われる。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
上述したように、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２およびＳ抗原からなる全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）を含むＨＢＶワクチン、および前記全体表面抗原と組み換えコア抗原を含むＨＢＶ複合抗原ワクチンを提示した。これらのワクチンが免疫補助剤としてコロイド金をさらに含む場合、強力な細胞性免疫を誘発してＢ型肝炎ウイルスの治療用ワクチンとして有用に使用できる。
【受託番号】
【０１１９】
ＫＣＴＣ １１０５８ＢＰ
【図１】
2010516807.tif 000003
【図２】
2010516807.tif 000004
【図３】
2010516807.tif 000005
【図４】
2010516807.tif 000006
【図５】
2010516807.tif 000007
【図６】
2010516807.tif 000008
【図７】
2010516807.tif 000009
【図８】
2010516807.tif 000010
【図９】
2010516807.tif 000011
【図１０】
2010516807.tif 000012
【図１１】
2010516807.tif 000013
【図１２】
2010516807.tif 000014
【図１３】
2010516807.tif 000015
【図１４】
2010516807.tif 000016
【図１５】
2010516807.tif 000017
【図１６】
2010516807.tif 000018
【図１７】
2010516807.tif 000019
【図１８】
2010516807.tif 000020
【図１９】
2010516807.tif 000021
【図２０】
2010516807.tif 000022
【図２１】
2010516807.tif 000023
【図２２】
2010516807.tif 000024
【図２３】
2010516807.tif 000025
【図２４】
2010516807.tif 000026
【配列表】
2010516807000001.app
【国際調査報告】
2010516807.tif 000027
2010516807.tif 000028
2010516807.tif 000029
2010516807.tif 000030