(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレート上に細胞を置くための自動化された細胞プレーティングユニット；および
前記自動化されたプレーティングユニット上の前記細胞を、ｉＰＳＣを作製するためのリプログラミング因子と接触させるための自動化された誘導ユニット
を含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための自動化されたシステムであって、
前記自動化された細胞プレーティングユニットおよび前記自動化された誘導ユニットは融解および感染用液体取扱い機に含まれ、
第１の自動顕微鏡および生成された前記ｉＰＳＣを選択的に選別し単離するための自動細胞選別用液体取扱い機を備える自動化されたコロニー同定用液体取扱い機が、磁気選別ユニットを含み、
前記液体取扱い機は、さらに第１のインキュベーター、第２のインキュベーター、第２の自動顕微鏡、自動遠心分離機および自動開蓋機に接続されたロボティクス輸送レールに接続されており、
コントローラソフトウェアを含む、前記自動化されたシステム。
【請求項２】
前記磁気選別ユニットが、ｉＰＳ特異的マーカーを同定することによって、前記自動化された誘導ユニットにより作製された前記ｉＰＳＣを、選択的に選別および単離する、請求項１に記載の自動化されたシステム。
【請求項３】
前記単離したｉＰＳＣを増殖させ、かつ前記増殖させたｉＰＳＣを選択するための増殖ユニットをさらに含む、請求項２に記載の自動化されたシステム。
【請求項４】
前記単離したｉＰＳＣを凍結させるための凍結ユニットをさらに含む、請求項１に記載の自動化されたシステム。
【請求項５】
前記ｉＰＳＣの培養密度を確認し、前記ｉＰＳＣが培養密度の特徴を有しているか否かを決定する培養密度確認ユニット
をさらに含む、請求項１に記載の自動化されたシステム。
【請求項６】
前記培養密度確認ユニットが、前記ｉＰＳＣの前記培養密度を定期的に確認する、請求項５に記載の自動化されたシステム。
【請求項７】
前記培養密度確認ユニットが、経時的に、より高頻度で、前記ｉＰＳＣの前記培養密度を定期的に確認する、請求項５に記載の自動化されたシステム。
【請求項８】
前記培養密度確認ユニットが、前記培養密度の特徴が７０％〜１００％の範囲に入っているか否かを確認する、請求項５に記載の自動化されたシステム。
【請求項９】
前記自動化された誘導ユニットが、ウイルスベクターを使用してリプログラミングを開始する、請求項１に記載の自動化されたシステム。
【請求項１０】
前記自動化された誘導ユニットが、レトロウイルスまたはセンダイウイルスを使用して、リプログラミングを開始する、請求項９に記載の自動化されたシステム。
【請求項１１】
前記自動化された誘導ユニットが、小分子、ペプチド、タンパク質または核酸を使用してリプログラミングを開始する、請求項１に記載の自動化されたシステム。
【請求項１２】
前記細胞を電気穿孔するための電気穿孔ユニットをさらに含む、請求項１に記載の自動化されたシステム。
【請求項１３】
前記自動化された細胞プレーティングユニットで使用される細胞を得るための細胞バンキングユニットをさらに含む、請求項１に記載の自動化されたシステム。
【請求項１４】
前記バンキングユニットが、
生検材料をプレート上に置くための生検材料プレーティングユニット；
細胞を生育するための増殖および継代ユニット；ならびに
マイコプラズマの存在を試験するためのマイコプラズマ試験ユニット
を含む、請求項１３に記載の自動化されたシステム。
【請求項１５】
前記マイコプラズマ試験ユニットが、発光法（glow luminescence）試験装置を含む、請求項１４に記載の自動化されたシステム。
【請求項１６】
増殖させた細胞を分配するための分配ユニット；ならびに
前記細胞を保存するための貯蔵および回収システム
をさらに含む、請求項１４に記載の自動化されたシステム。
【請求項１７】
前記貯蔵および回収システムが前記細胞を凍結する、請求項１６に記載の自動化されたシステム。
【請求項１８】
前記増殖ユニットが、より高品質のクローンを自動的に増殖させかつ選択する、請求項３に記載の自動化されたシステム。
【請求項１９】
前記細胞が体細胞である、請求項１に記載の自動化されたシステム。
【請求項２０】
前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１９に記載の自動化されたシステム。
【請求項２１】
より高品質のクローンが、固定する前よりも少ない枚数のプレートに固定される、請求項１８に記載の自動化されたシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は基本的に、分化した成体細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製するための自動化されたシステム、より具体的には、組織試料から体細胞を単離し、そのような細胞をリプログラミングすることで分化した成体細胞からｉＰＳＣ株を作製し、他の細胞の中からリプログラミングされた多能性成体細胞を同定し、そして同定したリプログラミングされた細胞を増殖させるための自動化されたシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
幹細胞は、長期間にわたり、細胞分裂を介して自己再生する性質の特定していない細胞であり、特定の機能をもった細胞、つまり分化細胞へと誘導可能な細胞である。このような性質によって幹細胞は、様々な病状で損傷をうけた細胞や組織を取り替えるための治療で応用するのに大いに将来性がある。胚性幹（ＥＳ）細胞は初期胚の胚盤胞に由来し、内胚葉、外胚葉、および中胚葉（三胚葉）へと発生する能力を有する（つまり、ＥＳは「多能性」である）。インビトロでＥＳ細胞は、自発的に様々な種類の組織に分化する傾向にあり、それらの分化方向を制御するのは難しい可能性がある。ヒトＥＳ細胞を回収するために胚の破壊に関連する倫理的な問題は未だ解決しておらず、これらの問題は研究および治療での応用対する歯止めとなっている。
【０００３】
成体幹（ＡＳ）細胞は分化した組織中に見られる。成体組織から得られた幹細胞は通常、より限定された範囲の細胞を形成する能力（つまり、「多分化能性」）を有し、典型的には、それらが見られた組織の細胞型にしか分化しないが、最近の報告では、特定の種類のＡＳ細胞には、一定の可塑性があることを示している。また、その増殖能も一般的には限定的である。
【０００４】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、分化した成体細胞から実験的な手法によって作製される。ｉＰＳＣは重要なツール、例えば医学研究を実施するのに重要なツールであると広く認識されている。これまでのｉＰＳＣ作製技術は時間がかかり、労働集約的である。分化した成体細胞、例えば、線維芽細胞をリプログラミングし、培養して、単一のクローンを構成する個々のコロニーを形成させる。今までは、これらの細胞型を同定することが非常に難しかった。なぜならば、細胞の大部分が完全にはリプログラミングされていないｉＰＳＣのクローンだったからである。ｉＰＳＣのクローンに関しては、細胞質に対して核の比率が高い細胞を含む、境界のはっきりとした所望のコロニーを、細胞の形態に基づいて選択するのが標準的である。クローンを同定したら、非常に薄いガラス製の道具を使ってそれらを手動で取り出し、そして、細胞の「フィーダー」層、一般的には、マウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養する。この工程は通常、リプログラミングベクターを導入した１４〜２１日後に行われる。その後、クローンをさらに１４〜２１日間、またはそれ以上の期間増殖させ、その後、分子的な解析を行う。
【０００５】
他の研究者らは、完全にリプログラミングされた成体線維芽細胞とその下流の分化能を迅速に、かつ、より正確に同定および解析するための技術の開発に焦点を当てている（Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｃｅｌｌ １４４： ４３９−４５２（非特許文献１）； Ｂｏｕｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９： ２７９−２８６（非特許文献２））。例えば、２０１１年６月１３日に出願され、同定のための蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の使用と、表面タンパク質のユニークな発現パターンによって特定されたユニークな小集団のその場での選別について記載している、共有の米国特許第１３／１５９，０３０号（特許文献１）も参照のこと。
【０００６】
従って幹細胞は、治療への応用、医学研究、臨床試験などへの、細胞の供給源として魅力的である。しかしながら当該分野では、一般的な条件で、これらおよび他の要求を満たす、再現性のあるｉＰＳＣ細胞株を迅速に作製・単離するための自動化されたシステムへの長期にわたるニーズが依然として残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第１３／１５９，０３０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｃｅｌｌ １４４： ４３９−４５２
【非特許文献２】Ｂｏｕｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９： ２７９−２８６
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、成体組織由来の体細胞を使用し、これらの体細胞、例えば、成体線維芽細胞から、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製するためのシステムを提供する。一態様においてこのシステムは、出発点として、これまでに単離されている体細胞も利用する。
【００１０】
本発明は、ｉＰＳＣを生成および単離するための自動化されたシステムを提供し、このシステムは、
プレート上に体細胞を置くための、体細胞プレーティングユニット；および
体細胞プレーティングユニット上の体細胞と、ｉＰＳＣを作製するためのリプログラミング因子とを接触させることによって、体細胞を自動的にリプログラミングするための誘導ユニット
を含む。
【００１１】
一実施形態においてこのシステムは、誘導ユニットで作製されたｉＰＳＣを、例えば、ｉＰＳＣ特異的マーカー、例えば細胞表面マーカーを同定することによって、選択的に選別および単離するための選別ユニットをさらに含む。例示的な一例においては、体細胞は線維芽細胞である。
【００１２】
さらに、一態様において本発明は、幹細胞、例えば、ｉＰＳＣ、胚性幹（ＥＳ）細胞または間葉幹（ＭＳ）細胞から、分化した成体細胞を生成および単離するための自動化されたシステムを提供し、このシステムは、
プレート上に幹細胞を置くための幹細胞プレーティングユニット；および
幹細胞プレーティングユニット上の細胞と、分化した成体細胞を作製するためのリプログラミング因子とを接触させることによって、幹細胞を自動的にリプログラミングするための誘導ユニット
を含む。一実施形態においてこのシステムは、誘導ユニットで作製された分化した成体細胞を選択的に選別および単離するための選別ユニットをさらに含む。
【００１３】
一態様において本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から、分化した成体細胞を生成および単離するための自動化されたシステムを提供し、このシステムは、
プレート上にｉＰＳＣを置くためのｉＰＳＣプレーティングユニット；および
ｉＰＳＣプレーティングユニット上のｉＰＳＣと、分化した成体細胞を作製するためのリプログラミング因子とを接触させることによって、ｉＰＳＣを自動的にリプログラミングするための誘導ユニット
を含む。さらなる態様においてこのシステムは、分化した成体細胞に特異的なマーカーを同定することで、誘導ユニットで作製された分化した成体細胞を選択的に選別および単離する選別ユニットを含む。
【００１４】
本発明はまた、本発明のシステムを使用して作製されたｉＰＳＣ、分化細胞または分化転換した細胞を提供する。さらに、本発明のｉＰＳＣまたは分化細胞から得られた細胞集団を含むアレイも本明細書に包含される。例えば、このような分化細胞には、造血細胞、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞、およびニューロン細胞が含まれる。別の態様では、本発明のシステムによって生成される細胞バンクも包含される。
[本発明1001]
プレート上に細胞を置くための細胞プレーティングユニット；および
前記プレーティングユニット上の前記細胞を、ｉＰＳＣを作製するためのリプログラミング因子と接触させることによって、細胞を自動的にリプログラミングするための誘導ユニット
を含む、ｉＰＳＣを生成するための自動化されたシステム。
[本発明1002]
ｉＰＳ特異的マーカーを同定することによって、前記誘導ユニットにより作製された前記ｉＰＳＣを、選択的に選別および単離するための選別ユニットをさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1003]
前記単離したｉＰＳＣを増殖させ、かつ前記増殖させたｉＰＳＣを選択するための増殖ユニットをさらに含む、本発明1002のシステム。
[本発明1004]
前記単離したｉＰＳＣを凍結させるための凍結ユニットをさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1005]
前記ｉＰＳＣの培養密度を確認し、前記ｉＰＳＣが培養密度の特徴を有しているか否かを決定する培養密度確認ユニット
をさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1006]
前記培養密度確認ユニットが、前記ｉＰＳＣの前記培養密度を定期的に確認する、本発明1005のシステム。
[本発明1007]
前記培養密度確認ユニットが、経時的に、より高頻度で、前記ｉＰＳＣの前記培養密度を定期的に確認する、本発明1005のシステム。
[本発明1008]
前記培養密度確認ユニットが、前記培養密度の特徴が70％〜100％の範囲に入っているか否かを確認する、本発明1005のシステム。
[本発明1009]
前記誘導ユニットが、ウイルスベクターを使用してリプログラミングを開始する、本発明1001のシステム。
[本発明1010]
前記誘導ユニットが、レトロウイルスまたはセンダイウイルスを使用して、リプログラミングを開始する、本発明1009のシステム。
[本発明1011]
前記誘導ユニットが、小分子、ペプチド、タンパク質または核酸を使用してリプログラミングを開始する、本発明1001のシステム。
[本発明1012]
前記細胞を電気穿孔するための電気穿孔ユニットをさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1013]
前記選別ユニットが磁気選別ユニットを含む、本発明1001のシステム。
[本発明1014]
前記プレーティングユニットで使用される細胞を得るための細胞バンキングユニットをさらに含む、本発明1001のシステム。
[本発明1015]
前記バンキングユニットが、
生検材料をプレート上に置くための生検材料プレーティングユニット；
細胞を生育するための増殖および継代ユニット；ならびに
マイコプラズマの存在を試験するためのマイコプラズマ試験ユニット
を含む、本発明1014のシステム。
[本発明1016]
前記マイコプラズマ試験ユニットが、発光法（glow luminescence）試験装置を含む、本発明1015のシステム。
[本発明1017]
増殖させた細胞を分配するための分配ユニット；ならびに
前記細胞を保存するための貯蔵および回収システム
をさらに含む、本発明1015のシステム。
[本発明1018]
前記貯蔵および回収システムが前記細胞を凍結する、本発明1017のシステム。
[本発明1019]
前記増殖ユニットが、より高品質のクローンを自動的に増殖させかつ選択する、本発明1003のシステム。
[本発明1020]
前記細胞が体細胞である、本発明1001のシステム。
[本発明1021]
前記体細胞が線維芽細胞である、本発明1020のシステム。
[本発明1022]
プレート上に細胞を置くための幹細胞プレーティングユニット；および
前記幹細胞プレーティングユニット上の前記細胞を、分化した成体細胞を作製するためのリプログラミング因子と接触させることによって、細胞を自動的にリプログラミングするための誘導ユニット
を含む、幹細胞から分化した成体細胞を生成するための自動化されたシステム。
[本発明1023]
前記誘導ユニットで作製された前記分化した成体細胞を選択的に選別および単離するための選別ユニットをさらに含む、本発明1022のシステム。
[本発明1024]
前記単離した分化した成体細胞を増殖させ、かつ前記増殖させた分化した成体細胞を選択するための増殖ユニット
をさらに含む、本発明1023のシステム。
[本発明1025]
前記単離した分化した成体細胞を凍結するための凍結ユニットをさらに含む、本発明1024のシステム。
[本発明1026]
前記幹細胞が、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞または間葉幹細胞である、本発明1022のシステム。
[本発明1027]
前記分化した成体細胞の培養密度を確認し、前記分化した成体細胞が培養密度の特徴を有しているか否かを決定する培養密度確認ユニット
をさらに含む、本発明1024のシステム。
[本発明1028]
前記培養密度確認ユニットが前記分化した成体細胞の培養密度を定期的に確認する、本発明1027のシステム。
[本発明1029]
前記誘導ユニットがウイルスベクターを使用してリプログラミングを開始する、本発明1022のシステム。
[本発明1030]
前記誘導ユニットがレトロウイルスまたはセンダイウイルスを使用してリプログラミングを開始する、本発明1029のシステム。
[本発明1031]
前記誘導ユニットが小分子、ペプチド、タンパク質または核酸を使用してリプログラミングを開始する、本発明1022のシステム。
[本発明1032]
前記細胞を電気穿孔するための電気穿孔ユニットをさらに含む、本発明1022のシステム。
[本発明1033]
前記選別ユニットが磁気選別ユニットを含む、本発明1022のシステム。
[本発明1034]
前記細胞プレーティングユニットで使用される細胞を得るためのバンキングユニットをさらに含む、本発明1022のシステム。
[本発明1035]
前記バンキングユニットが、
生検材料をプレート上に置くための生検材料プレーティングユニット；
細胞を生育するための増殖および継代ユニット；ならびに
マイコプラズマの存在を試験するためのマイコプラズマ試験ユニット
を含む、本発明1034のシステム。
[本発明1036]
増殖させた分化した成体細胞を分配するための分配ユニット；ならびに
前記分化した成体細胞を保存するための貯蔵および回収システム
をさらに含む、本発明1035のシステム。
[本発明1037]
前記貯蔵および回収システムが前記細胞を凍結させる、本発明1036のシステム。
[本発明1038]
プレート上にｉＰＳＣを置くためのｉＰＳＣプレーティングユニット；および
前記ｉＰＳＣプレーティングユニット上の前記ｉＰＳＣと、分化した成体細胞を作製するためのリプログラミング因子とを接触させることによって、ｉＰＳＣを自動的にリプログラミングするための誘導ユニット
を含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化した成体細胞を生成するための自動化されたシステム。
[本発明1039]
前記分化した成体細胞に特異的なマーカーを同定することにより、前記誘導ユニットで作製された前記分化した成体細胞を選択的に選別および単離するための選別ユニット
をさらに含む、本発明1038のシステム。
[本発明1040]
前記単離した分化した成体細胞を増殖させ、かつ前記増殖させた分化した成体細胞を選択するための増殖ユニット
をさらに含む、本発明1038のシステム。
[本発明1041]
前記単離した分化した成体細胞を凍結するための凍結ユニットをさらに含む、本発明1038のシステム。
[本発明1042]
前記誘導ユニットがウイルスベクターを使用して分化を開始する、本発明1038のシステム。
[本発明1043]
前記誘導ユニットがレトロウイルスまたはセンダイウイルスを使用して分化を開始する、本発明1042のシステム。
[本発明1044]
前記誘導ユニットが小分子、ペプチド、タンパク質または核酸を使用して分化を開始する、本発明1038のシステム。
[本発明1045]
前記プレーティングユニットで使用される分化細胞を得るためのバンキングユニットをさらに含む、本発明1038のシステム。
[本発明1046]
前記細胞バンキングユニットが、
生検材料をプレート上に置くための生検材料プレーティングユニット；
細胞を生育するための増殖および継代ユニット；ならびに
マイコプラズマの存在を試験するためのマイコプラズマ試験ユニット
を含む、本発明1038のシステム。
[本発明1047]
本発明1001のシステムを使用して作製された人工多能性幹細胞。
[本発明1048]
本発明1001のシステムを使用して作製された人工多能性幹細胞の集団。
[本発明1049]
本発明1001、1022または1038のいずれかのシステムから作製された前記細胞を含むアレイ。
[本発明1050]
前記アレイが、少なくとも6、24、96、384、1536サイズのアレイである、本発明1049のアレイ。
[本発明1051]
前記分化細胞が、造血幹細胞、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞、およびニューロン細胞からなる群より選択される、本発明1022または1038のシステム。
[本発明1052]
本発明1001、1022または1038のいずれかのシステムによって作製された細胞バンク。
[本発明1053]
より高品質のクローンが、固定する前よりも少ない枚数のプレートに固定される、本発明1019のシステム。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】線維芽細胞バンクを獲得するための工程を示す。
【図２】線維芽細胞バンクから幹細胞アレイを得るための工程を示す。
【図３】ｉＰＳＣを作製するためのシステム内における工程を示すフローチャートである。
【図４Ａ】自動化されたリプログラミング過程の間の、マルチウェル組織培養を介した、患者試料のフローの例を示す。
【図４Ｂ１】自動化されたリプログラミング過程の間の、マルチウェル組織培養を介した、患者試料のフローの例を示す。
【図４Ｂ２】自動化されたリプログラミング過程の間の、マルチウェル組織培養を介した、患者試料のフローの例を示す。
【図４Ｃ】自動化されたリプログラミング過程の間の、マルチウェル組織培養を介した、患者試料のフローの例を示す。
【図５Ａ】そのワークフローを達成するための機器構成の例を示している。
【図５Ｂ】そのワークフローを達成するための機器構成の例を示している。
【図５Ｃ】そのワークフローを達成するための機器構成の例を示している。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、自動化された生検増殖追跡システムを示す。図６Ａでは、生検または廃棄された組織を、６ウェルディッシュの複数のウェルにプレーティングし、栄養を供給し、撮影し、継代し、かつ増殖させた線維芽細胞を凍結する自動化されたシステムで維持する。典型的な試料用の画像解析インターフェースの例を示す。図６Ｂ：細胞数を、それぞれ独立して生成された検量線に由来する線形回帰に基づくコンフルエンスの測定値から推定する。図６Ｃ：本発明者らの自動化されたシステムで維持した典型的な生検材料の増殖の細胞数の例を示す。各ウェルの患者の試料について推定した細胞数をそれぞれ独立してプロットし（上段）、その試料に由来する全細胞数を計算した（下段）。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、自動化されたｉＰＳＣのリプログラミングを表している、ＦＡＣＳ解析とグラフを示す。リプログラミングされたヒト線維芽細胞の多能性表面マーカーの発現レベルを３週間にわたって観察して、リプログラミングの動力学を観察し、限定された細胞集団を単離するのに最適な時点を決定した。図７Ａは、解析に用いたＦＡＣＳのゲーティングスキームである。図７Ｂは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃなどのリプログラミング因子を導入するためのウイルスベクターを利用したリプログラミングを行っている全時点で、従来型の多能性表面マーカーであるＳＳＥＡ４とＴＲＡ−１−６０を共に発現しており、線維芽細胞マーカーであるＣＤ１３を保持している細胞の実質的な割合である。箱ひげ図は、１３１回の実験（レトロウイルス、ｎ＝６６、センダイウイルス、ｎ＝６５）からのデータの集合を示している。センダイウイルスを介したリプログラミングでは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ−１−６０二重陽性の細胞がより多く作製されたが、（Ｃ）ＣＤ１３の表面からの除去に遅れが見られる。（Ｄ）本発明者らの自動化されたシステムを用い、センダイ／Ｃｙｔｏｔｕｎｅのシステムによってリプログラミングされた患者の細胞株の染色パターンの例である。感染の７日後と１３日後（ｄｐｉ）の両方で、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ−１−６０二重陽性の細胞の半分超が、ＣＤ１３を消失していた。加えて、アッセイを行った両時点で、ＣＤ１３陰性／Ｎａｎｏｇ陽性の細胞がこの画分に含まれている。このことは、ＣＤ１３に対する陰性選択によって、これらの細胞が単離できることを示唆している。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、ｉＰＳＣの濃縮およびクローンの選別を示すための、ＦＡＣＳによる選別前の解析および自動化されたシステムの一部分を示す。図８Ａでは、線維芽細胞マーカーによる陰性選択によって、リプログラミングされていない細胞集団をｉＰＳＣの培養物から枯渇させることができることを示している。この例では、ＴＲＡ−１−６０陽性のｉＰＳＣには触れずに、確立された２％のｉＰＳＣを含む培養物から、線維芽細胞は効率的に除去される。図８Ｂでは、同時に２４個の試料を選別することができるＨａｍｉｌｔｏｎの液体処理機に組み合わせた、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭｕｌｔｉＭＡＣＳシステムを示している。図８Ｃは、抗線維芽細胞磁気陰性選択工程（９６ウェルの撮影用プレートに限界希釈でプレーティングして実施）から得られた、ｉＰＳＣが濃縮された画分の図である。多能性表面マーカーであるＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ−１−８１を、細胞が生きている状態で染色して、これらのプレートをスクリーニングする。Ｃｅｌｉｇｏソフトウェアを用いた、単一つのコロニーを確認することができる自動化された画像解析により、ＴＲＡ−１−６０陽性ｉＰＳＣの入ったウェルを同定する。表面マーカーが陽性で、コロニーを１つしか含んでいないという２つの基準を満たしたウェルを、継代、増殖およびＱＣ用に選択した。
【図９】図９Ａ〜Ｂに、本明細書に記載の得点表アッセイの図解を示す。品質管理スクリーンの第一段階では、多能性の分化と導入遺伝子マーカーのパネルを使用して、最初の３クローンの組を選択する。図９Ａに、２つのヒトＥＳＣ株（センダイ陽性対照、線維芽細胞陰性対照）、および５回目と１０回目の継代の時点でＦＡＣＳ選別を行ったｉＰＳＣ株について、ＨＫ遺伝子の発現を使って正規化した後の転写産物の量を示す。アッセイは全て、同様の条件で維持した正常なヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣ株のパネルに対して行われる。図９Ｂでは、本発明者らの品質管理スクリーンの第二段階を図解する。ここではさらに８３種類の胚葉／細胞系列マーカーを使用して、胚様体アッセイでの分化能をモニタリングする。単一のＥＢを生成し、プールして、胚様体得点表アッセイにおける胚葉マーカーの発現解析用にＲＮＡを回収する。９種類の異なる胚性幹細胞株から回収したＥＢにおける遺伝子発現の、クラスターデンドログラム解析を示している。正規化を行った後、６個のＥＢを直接溶解して生成したデータを、大量培養で調製したＥＢから抽出・生成したトータルＲＮＡに由来するデータと都合の良いように比較する。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、ＣＮＶ用のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイを利用した、ｉＰＳＣの高処理系における核型分析を示す。図１０Ａは、ＢＣ１ ｉＰＳＣについてのｎＣｏｕｎｔｅｒ核型アッセイの例である。図１０Ｂは、染色体腕が、一部増加および消失している１０１６線維芽細胞についてのｎＣｏｕｎｔｅｒ核型アッセイの例である。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰ６．０チップを使ったデータとの比較は、１番染色体のｑ腕の一部で（上段、１ｑ２１．２〜１ｑ４３）コピー数が増加し、６番染色体の長腕の一部で減少していることを（下段、６ｑ１６．３〜６ｑ２６）示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ｉＰＳＣおよび分化細胞を作製するための自動化されたシステムの作製に基づいている。本発明のシステムは、標準化されたｉＰＳＣ株作製の効率および再現性を大きく向上させる。典型的には、研究者は手作業でｉＰＳＣを生成しており、そのため、研究者の交代によって細胞の有用性が限られ、多量の細胞を生成することができない。本発明のシステムは、組織または細胞試料を受け取るところから、詳細に特徴の明らかになったｉＰＳＣ株の大量のストックを保存するところまでを完全に自動化したシステムにより、これらの問題を克服するものである。このシステムにより、多くの提供源からの多数の細胞を一貫して不変的に生成することができ、このことによって、多くの疾患の治療法および治癒法を発見するためのｉＰＳＣ技術の使用が促進されるだろう。
【００１７】
一実施形態では、本発明のワークフローシステムにはｉＰＳＣを生成および単離するための自動化されたシステムが含まれ、この自動化されたシステムは、
プレート上に細胞を置くための、体細胞、例えば線維芽細胞プレーティングユニット；および
プレーティングユニット上の細胞と、ｉＰＳＣを作製するためのリプログラミング因子とを接触させることによって、自動的にリプログラミングするための誘導ユニット
を含む。さらなる実施形態では、本発明のシステムは、誘導ユニットで作製されたｉＰＳＣを、ｉＰＳＣ特異的マーカー、例えば細胞表面マーカーまたは形質転換用ベクターに導入された緑色蛍光タンパク質を同定することによって、選択的に選別および単離するための、選別ユニットを含む。体細胞は、細胞株、生検材料または血液などを含む他の組織試料から得ることができる。
【００１８】
別の実施形態において本発明は、幹細胞、例えば、ｉＰＳＣ、胚性幹（ＥＳ）細胞または間葉幹（ＭＳ）細胞から、分化した成体細胞を生成および単離するための自動化されたシステムを提供し、この自動化されたシステムは、
プレート上に細胞、例えば、ｉＰＳＣ、ＥＳまたはＭＳ細胞を置くための幹細胞プレーティングユニット；および
幹細胞プレーティングユニット上の細胞と、分化した成体細胞を作製するためのリプログラミング因子とを接触させることによって、細胞を自動的にリプログラミングするための誘導ユニット
を含む。一実施形態においてこのシステムはさらに、誘導ユニットで作製された分化した成体細胞を、分化した成体細胞に特異的なマーカーを同定することで、選択的に選別および単離するための選別ユニットを含む。
【００１９】
一層さらに別の実施形態では、本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から、分化した成体細胞を生成および単離するための自動化されたシステムを提供し、この自動化されたシステムは、
プレート上にｉＰＳＣを置くためのｉＰＳＣプレーティングユニット；および
ｉＰＳＣプレーティングユニット上のｉＰＳＣと、分化した成体細胞を作製するためのリプログラミング因子とを接触させることによって、ｉＰＳＣを自動的にリプログラミングするための誘導ユニット
を含む。一実施形態においてこのシステムはさらに、誘導ユニットで作製された分化した成体細胞を、分化した成体細胞に特異的なマーカーを同定することで、選択的に選別および単離するための選別ユニットを含む。
【００２０】
本発明は、分化した成体細胞からｉＰＳＣを作製するための自動化されたワークフローシステムを提供する。大まかには、本発明のワークフローシステムは、成体分化細胞（例えば、単離した試料または組織試料）から出発して、ｉＰＳＣまたは多能性細胞由来の成体細胞のいずれかを生じる、新しいワークフローシステムを提供する。一実施形態では、成体分化細胞は、好ましくは、生検から得られた、例えば皮膚生検材料由来の線維芽細胞である。成体線維芽細胞を、自動化とロボティクスを組み込み、独創的なワークフローによって、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に変換する。本発明のワークフローシステムは、並行して数千個ものｉＰＳＣを生成し、その結果、時間枠を、これまでに必要とされてきた数年という長さから、数ヶ月へと短縮することが可能である。本発明のワークフローシステムは、出発材料に関して、任意の細胞単離システムに適用可能であり、また、例えば、直接的なまたは間接的なリプログラミングおよび分化転換に適用することもできる。本発明のワークフローシステムでは、大きさが６、２４、９６、３８４、１５３６以上のアレイ由来の細胞の細胞アレイを使用した作製も実施できる。本発明のワークフローシステムは柔軟で、何回も繰り返すことができ、また、細胞型および組織の点でも柔軟である。本明細書の説明は、例示的な体細胞である線維芽細胞を使って示しているが、本明細書中にも記載したように、本システムでは、他の細胞型も使用される。実施例はその様式に限定することを意図するものではない。
【００２１】
ワークフローシステム
ワークフローシステムは、それぞれ独立して操作される、４つのユニットに分けられる。
（１）隔離所体細胞単離および成長（システム１）；
（２）隔離所アッセイ（システム２）；
（３）融解、感染および同定（システム３、４、および５）；ならびに
（４）維持、ＱＣ、増殖、および凍結（システム６、７、および８）
【００２２】
加えて、線維芽細胞を保存するための、自動化された−８０貯蔵および回収システム、および１．４ｍＬマトリックスのスクリューキャップ型チューブに入れた、最終的なクローンも本システムの一部である。各ユニットを動作させるシステム、ならびに工程および操作について以下で説明する。
【００２３】
システム１、パートＡ：隔離所での体細胞の単離および成長ワークフロー、生検処理のためのマイコプラズマ予備試験
１．技師は、１週間当たり４０個の生検材料を６ウェルディッシュにプレーティングする；
２．６ウェルプレートを、２００枚のプレートを入れることができる隔離所インキュベーター中で維持する；
３．一体化されたＣｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ血球計算器を使用して、定期的に培養密度を確認する。
【００２４】
これらの自動化された工程を実施するのに使用してもよいシステムの構成部品としては、一例ではあるが、全てＨａｍｉｌｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｏｂｏｔｉｃｓから入手可能な、ＳＴＡＲｌｅｔ Ｍａｎｕａｌ Ｌｏａｄ、１０００μｌのピペット操作チャネルのある、４／８／１２ｃｈ．／ＭＰＨ用、８チャネル用のＭｏｄｕｌａｒ Ａｒｍ、およびｉＳＷＡＰプレート取扱い機が含まれる。遠心分離が必要であるか、望ましい場合には、ＡｇｉｌｅｎｔのＶ Ｓｐｉｎマイクロプレート用遠心器を使用することができる。ソフトウェアは、Ｃｅｌｉｇｏ ＡＰＩソフトウェアであってよい。インキュベーターは、Ｃｙｔｏｍａｔ インキュベーターであってよい。プレートの取扱い用には、Ｃｙｔｏｍａｔ ２４バーコードリーダー、Ｃｙｔｏｍａｔ ２３ｍｍ台、およびＣｙｔｏｍａｔ ４００ｍｍ移動用ステーションを使用することができる。プレートを傾けるためには、Ｍｕｌｔｉ Ｆｌｅｘ傾きモジュールを使用してもよい。システムのコントローラは、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＸＰの作動システムで動かす、Ｄｅｌｌ ＰＧであってよい。キャリアパッケージはＱ Ｇｒｏｗｔｈ キャリヤーパッケージであってよい。
【００２５】
システム１、パートＢ：隔離所の成長ワークフロー、マイコプラズマ試験
１．インキュベーターから、隔離所Ｇｒｏｗｔｈ ＳＴＡＲｌｅｔのデッキに戻し、ＥＬＩＳＡを利用したマイコプラズマ試験用に、培地をウェルからプレートに回収する。
２．９６ウェルアッセイプレートを隔離所アッセイＳＴＡＲｌｅｔに手動で移す。
【００２６】
システム１、パートＣ：マイコプラズマ試験を通過した後の隔離所成長ワークフロー
１．増殖させた線維芽細胞を、複数の凍結用バイアルに分配し、フタをして、−８０℃のＳＡＭに移す。
【００２７】
これらの自動化された工程を実施するのに使用してもよいシステムの構成部品は、ＳＴＡＲｌｅｔ Ａｕｔｏ Ｌｏａｄを使用しても良い以外は、隔離所の成長ワークフローで使用したものと同じ構成部品から選択することができる。スペクトル収集装置としてはＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｌリーダーを使用することができる。
【００２８】
システム２：隔離所アッセイのワークフロー
１．発光法（glow luminescence method）を用いるＬｏｎｚａ ＭｙｃｏＡｌｅｒｔによる試験。
２．スペクトル収集装置による発光プレートの測定。
【００２９】
これらの自動化された工程を実施するのに使用してもよいシステムの構成部品には、全てＨａｍｉｌｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｏｂｏｔｉｃｓから入手可能な、ＳＴＡＲｌｅｔ Ｍａｎｕａｌ Ｌｏａｄ、１０００μｌのピペット操作チャネルのある、４／８／１２ｃｈ．／ＭＰＨ用、８チャネル用のＭｏｄｕｌａｒ Ａｒｍ、およびｉＳＷＡＰプレート取扱い機が含まれる。発光アッセイ用には、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴリーダーを使用してもよい。システムのコントローラは、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＸＰの作動システムで動かすことのできるＤｅｌｌ ＰＧであってよい。キャリアパッケージは、Ｑ Ｇｒｏｗｔｈ キャリヤーパッケージであってよい。
【００３０】
システム３、４、および５：融解、感染および同定
融解モジュールと感染モジュール
１．−８０℃のＳＡＭから凍結用チューブを回収する（６１、１９０）
２．加温ブロック上で融解する（１２２）
３．フタを取る（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃａｐｐｅｒ Ｄｅｃａｐｐｅｒ）（１２６）
４．培地を加えて凍結保護物質を希釈する（１２２）
５．短時間遠心する（１２８）
６．プレーティングデータ中に再懸濁する（１２２）
７．６ウェルの１ウェル当たり１つの試料をプレーティングする（６２、１２２）
８．インキュベーターに移動する（１３０、１３２）
９．線維芽細胞を約３〜４日間回復させる
１０．Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ血球計算器で培養密度を確認する（１２４）１１．リプログラミング当日に、全ウェルの線維芽細胞を継代する（１２２）
１２．バッチ内で、トリプシンをウェルに通過させる（１２２）
１３．Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ血球計算器で細胞を計数する（１２４）
１４．２４ウェルプレートの１〜３つのウェルに一定数の細胞をプレーティングし、最小限の枚数の２４ウェルプレートに試料を固定する（６４、１２２）
１５．一晩、プレートをインキュベーターに戻す（１３０、１３２）
１６．プレートを回収し、チューブ形式内のウイルスを融解し、２４ウェルプレートに入っている線維芽細胞のそれぞれのウェルに加える（１３０、１２２）
１７．毎日、培地の一部を交換する（１２２）
【００３１】
磁気選別モジュール
１８．アキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）で培養物を回収し、単一細胞の懸濁液にする（１３４）
１９．染色用緩衝液で希釈する（１３４）
２０．線維芽細胞表面マーカーに対する磁気ビーズで染色する（１３４）
２１．洗浄工程（１３４）
２２．磁気（Ｄｙｎａｌビーズの場合）またはカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉシステムの場合）にかける（１３４、１３６）
２３．磁気を帯びてない画分を回収し、新しいウェルに移す（１３４）
２４．Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ血球計算器で細胞を計数する（１２４）
２５．継代培地に入れた細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにつき１〜１０個移すことで、細胞を適切な密度に希釈する（６６、１３４）
２６．４℃のインキュベーターから、新しいマトリゲルまたはマトリックスでコーティングされている９６ウェルプレートを回収する（１４２）
２７．細胞を計数した数に基づいて、例えば、感染１回分のプレート１枚当たり２つの細胞を、９６ウェルマトリックスプレートに分配する（６６、１３４）
２８．プレートをインキュベーターに戻す（１３２）
２９．毎日、培地の一部を交換する（１２２）
【００３２】
コロニー同定モジュール
３０．９６ウェルプレートを、インキュベーターからコロニー同定用の液体取扱い機に戻す（６６、１３２、１３８）
３１．多能性表面マーカーを使った生細胞染色を行う（１３８）
３２．Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ血球計算器で撮影（１４０）
３３．コロニーの境界が明確で、単一のマーカーに陽性なコロニーの入ったウェルを同定する（１４０）
３４．技師は当たりを再確認して、継代用に最初の試料から６つの試料を選択し、プレートおよび陽性ウェルのＩＤを回収する。
３５．単一のマーカー陽性コロニーが入ったウェルを選ぶ（１３８）
３６．４℃のインキュベーターから、新しいマトリゲルまたはマトリックスでコーティングされている９６ウェルプレートを回収する（６８、１４２）
３７．選択したウェルを回収し、新しい９６ウェルマトリックスプレートに継代して、最小限の枚数のプレートにクローンを固定し、それぞれを継代培地中でプレーティングする（６８、１３８）
３８．毎日、培地の一部を交換する（１２２）
【００３３】
これらの自動化された工程を実施するのに使用してもよいシステムの構成部品は、１つ以上のＣＯＲＥ ９６ ＰＲＯＢＥ ＨＥＡＤ ＩＩ（１０００μｌモデル）のプローブヘッドを加える以外は、隔離所の成長ワークフローで使用されているものと同じものから選択することができる。
【００３４】
システム６、７、および８：維持、ＱＣ、増殖、および凍結
維持モジュール
３９．コロニーが十分に高い密度になるまで、９６ウェルのマトリックスでコーティングされている新しいプレート中に１：１で連続して継代していく（６８〜７２、１６０）
４０．毎日、９６チップヘッドを使っておよそ７５％の培地を交換することで、全てのプレートに栄養を供給する（１６０）
４１．Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ血球計算器を用い、コロニーの密度と成長速度を定期的にモニタリングする（１６６）
４２．プレートを複製し、クローンＱＣ用のプレートを作製する（７４〜８６、１６０）
４３．最終目標は、性質の良くないクローンを排除し、最初の試料よりも２〜３倍品質の高いクローンを残すための複数のＱＣアッセイで使用するために、複数のプレート上でクローンを増殖させることである。
４４．ＱＣ工程に合格したクローンを選んで再度整列させ、最小限の枚数のプレートに固定する。同時に、合格しなかったクローンは除去する（８０、８６、１６０）。
４５．この過程を行っている間は毎日、栄養の供給を行う（１６０）
【００３５】
ＱＣモジュール
４６．細胞を回収する（７４、１５０）
４７．細胞を計数する（１６４）
４８．Ｖ型底プレートに、一定数の細胞（細胞数は、１ウェル当たり５０００〜１００００個の範囲）をプレーティングする。１株につき、２〜６つの複製を準備する（８４、１５０）
４９．インキュベーターに戻す（１ｇ凝集）（１７２）
５０．２日後に培地の交換を行う（１５０）
５１．インキュベーター中でさらに１２日間インキュベートする（１７２）
５２．２日毎に培地を一部交換する（１５０）
５３．ウェル中に胚様体を残したままウェルから培地を除去するために、核酸調製ステーションに移動させる（８４、１９２）
５４．各試料の複製をまとめて混合するためにＲＮＡ溶解緩衝液で再懸濁し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイでの解析に使用できるプレートを作製する（８４、１９２）
【００３６】
凍結モジュール
５５．継代し、増殖させた後の９６ウェルプレートから始める（８８）
５６．インキュベーター中で６日間インキュベートする（１７２）
５７．毎日、培地の一部を交換する（１５４）
５８．インキュベーターからプレートを取り出す（８８、１６２）
５９．培地を除去する（完全に除去する）（１５４）
６０．冷えた予備凍結培地（成長培地で希釈したマトリゲル）を加える（１５４）
６１．インキュベーター中で１時間インキュベートする（１７２）
６２．培地を除去する（完全に除去する）（１５４）
６３．冷やした凍結培地を少量加える（１５４）
６４．プレートを密閉する（８８、１６４）
６５．試料を−８０℃の貯蔵庫に移し、凍結させる（１９０）
６６．気相の液体窒素中で保存する
【００３７】
凍結バイアルの保存
６７．継代し、増殖させた後の９６ウェルプレートから始める（９０）
６８．６日間インキュベートする（１７２）
６９．毎日、培地の一部を交換する（１５４）
７０．ウェルを１：１の割合で２４ウェルプレートに継代する（９２、１５４）
７１．６日間インキュベートする（１７２）
７２．毎日、培地の一部を交換する（１５４）
７３．ウェルを１：１の割合で６ウェルプレートに継代する（９４、１５４）
７４．４〜６日間インキュベートする（１７２）
７５．毎日、培地の一部を交換する（１５４）
７６．インキュベーターからプレートを取り出す（１６２）
７７．培地の一部を予備凍結培地に置換する（１５４）
７８．インキュベーター中で１時間インキュベートする（１７２）
７９．通常の継代の場合、細胞を凍結用に回収する（１５４）
８０．マトリックスチューブに移す。１ウェルにつき、チューブは２〜３本（９６、１５４）
８１．短時間遠心して、培地を除去する（１６８、１５４）
８２．冷凍結培地を加える（１５４）
８３．チューブのフタをする（１７０）
８４．試料を−８０℃の貯蔵庫に移す（１９０）
【００３８】
これらの自動化された工程を実施するのに使用してもよいシステムの構成部品は、隔離所の成長ワークフローで使用したものと同じものから選択することができる。
【００３９】
本明細書で使用する場合「成体」は、胎生期以降、つまり、新生児期からその生命の終わりまでの間にいる生物を意味し、例えば、分娩後の胎盤組織、羊水および／または臍帯血から得られた細胞が含まれる。
【００４０】
本明細書で使用する場合「成体分化細胞」という用語は、ある生物の成体から得られ、本発明で記載の自動化されたシステムを使ったｉＰＳＣの作製を受け入れることができる、広い範囲の分化した細胞型を包含する。この成体分化細胞は「線維芽細胞」であることが好ましい。線維芽細胞（より活性の低い形態では「線維細胞」とも呼ばれる）は、間葉に由来する。それらの機能には、細胞外マトリックス成分の前駆体、例えばコラーゲンの分泌がある。組織学的には、線維芽細胞は高度に枝分かれした細胞であるが、線維細胞は一般に、より小さく、紡錘型であると記載されることが多い。いかなる組織由来の線維芽細胞と線維細胞も、本発明において、自動化されたワークフローシステムの出発材料として使用することができる。
【００４１】
本明細書で使用する場合「人工多能性幹細胞」、つまりｉＰＳＣという用語は、その幹細胞が、誘導されたまたは変化した、つまり、リプログラミングされた分化成体細胞から、三胚葉、つまり、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の全ての組織に分化可能な細胞へと作製されたものであることを意味する。作製されたｉＰＳＣとは、それらが、自然に見られる細胞ではないことを意味する。
【００４２】
本発明において有用な哺乳類の体細胞としては、例としてではあるが、成体幹細胞、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒上皮細胞、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、角化細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、他の既知の筋細胞、および基本的に、全ての生きている体細胞が挙げられる。特定の実施形態では、線維芽細胞が使用される。本明細書で使用する場合、体細胞という用語は、成体幹細胞を含むことも意図する。成体幹細胞とは、特定の組織の全ての細胞型を生じることが可能な細胞である。成体幹細胞の例としては、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉幹細胞が挙げられる。
【００４３】
本発明の利点の一つとしては、移植、創薬アッセイ、または疾患モデリングでの使用に適した同質遺伝的な、つまり同一遺伝子のヒト細胞を、本質的に制限なく供給できるということが挙げられる。ｉＰＳＣは、免疫拒絶を回避しながら、患者に特異的に合わせられる。そのため、現行の移植方法に伴う重大な問題、例えば、宿主対移植片または移植片対宿主拒絶によって生じ得る、移植した組織に対する拒絶反応が、ｉＰＳＣによって取り除かれる。創薬に用いる場合、この細胞は、それぞれの患者の化学物質に対する反応、または疾患モデルにおける個々の患者の疾患症状を示す。ｉＰＳＣのうちの数種、またはヒト由来の体細胞から誘導したｉＰＳＣから調製した完全に分化した体細胞は、細胞のライブラリーとして、ｉＰＳＣバンクで保管することができ、また、そのライブラリー中の１種類以上のｉＰＳＣを使用して、幹細胞治療を受ける患者による拒絶反応を生じない体細胞、組織、または臓器を調製することができる。
【００４４】
本発明のｉＰＳＣを、いくつかの異なる細胞型に分化させて、当該分野において知られている方法により、様々な障害を治療してもよい。例えば、ｉＰＳＣを誘導して、造血幹細胞、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿路細胞、ニューロン細胞、などに分化させてもよい。次いで分化細胞を、病状の予防または治療のために、患者の体内に移植して戻すか、あるいは、先進的な医学研究または創薬アッセイに使用してもよい。従って、本発明の方法を、特定の細胞型／組織の増強もしくは置換、または細胞の脱分化が望まれる、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中／発作、虚血、末梢血管病、アルコール性肝疾患、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病、癌、関節炎、創傷治癒、免疫不全、再生不良性貧血、貧血、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、リソソーム蓄積病、多発性硬化症、脊髄損傷、遺伝性障害、および同様の疾患、を患っている対象の治療として、または治療法の開発に使用することができる。
【００４５】
「全能性」という用語は、成体内の全ての細胞、ならびに胚体外組織、例えば胎盤を作製する発生能を有する細胞を指す。受精卵（接合体）は、桑実胚（受精後、１６細胞期まで）の細胞（割球）と同様に、全能性である。
【００４６】
本明細書で使用する場合「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、分化条件で、全三胚葉、つまり、内胚葉（例えば、消化管組織）、中胚葉（血液、筋肉、および血管など）、および外胚葉（例えば皮膚や神経）の特徴を示す細胞型に分化する発生能を有する細胞を指す。多能性細胞の発生能は全能性細胞のものよりも低い。全三胚葉に分化する細胞の能力は、例えば、ヌードマウスのテラトーマ形成アッセイで決定することができる。いくつかの実施形態では、多能性の証拠は、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現でも確認することができるが、細胞または本明細書に記載の組成物および方法を使用して生成した細胞集団の多能性に関する好ましい試験は、その細胞が三胚葉のそれぞれの細胞に分化する発生能を有することを実証することである。いくつかの実施形態では、多能性細胞を、「未分化細胞」と命名する。従って、「多能性」または「多能性状態」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞が全三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に分化するための能力をもたらす、細胞の発生能を指す。当業者であれば、所与の細胞型を生じる胚葉または細胞系列を認識する。多能性状態にある細胞は、典型的には、長期間にわたって、例えば１年を超えて、または３０回を超える継代の間にわたって、インビトロで分裂する能力を有する。
【００４７】
「多分化能性細胞」の参照に関して使用される「多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、３つ全てではなく、１つ以上の胚葉の細胞に分化する発生能を有する細胞を指す。従って多分化能細胞は、「部分的に分化した細胞」と言うこともできる。多分化能細胞は当該分野において良く知られており、多分化能性細胞の例としては、成体幹細胞、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞が挙げられる。「多分化能性」とは、ある細胞が、所与の細胞系列（他の細胞系列ではなく）の、多くの型の細胞を形成し得ることを示している。例えば、多分化能性の造血細胞は、多くの異なる型の血液細胞（赤、白、血小板など）を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。従って「多分化能性」という用語は、全能性および多能性未満の、一定の範囲の発生能を有する細胞の状態を指す。
【００４８】
本明細書で使用する場合「幹細胞」または「未分化細胞」という用語は、自己再生する特徴と、複数の細胞型に分化する発生能を有するが、その発生能に関して特定の意味（つまり、全能性、多能性、多分化能性など）を持たない未分化または部分的に分化した状態にある細胞を指す。幹細胞は、その発生能を維持しながら、増殖および、より多くのそのような幹細胞を生じることができる。原理的には、自己再生は２つの主要なメカニズムのいずれかによって起こり得る。幹細胞は非対照に分裂する場合があり、これは、不可避の非対照分化として知られている。この場合、娘細胞の１つは親幹細胞の発生能を保持し、もう一方の娘細胞は、他のいくつかの個別の特定の機能、表現型および／または親細胞由来の発生能を示す。娘細胞自体を誘導して増殖させ、後代を生成することができ、これがその後、親由来の発生能を有する細胞を１つ以上維持しながら、１つ以上の成熟した細胞型へと分化する。分化細胞は多分化能性細胞に由来し得、多分化能細胞自体は多分化能性細胞などから由来する。このような多分化能性細胞はそれぞれ、幹細胞と見なすことができ、それら幹細胞のそれぞれが生じ得る細胞型の範囲、つまり発生能は、相当に多様になる可能性がある。あるいは、ある集団の幹細胞の一部は対称的に２つの幹細胞に分裂する場合があり、これは確率論的な分化として知られている。その場合、その集団に含まれる幹細胞の一部は完全に維持され、他の細胞は分化した後代のみを生じる。従って、「幹細胞」という用語は、特定の環境では、より特化したまたは分化した表現型に分化する発生能を有し、かつ、特定の環境では、実質的に分化せずに増殖する能力を保持した細胞の小集団を指す。いくつかの実施形態において幹細胞という用語は、一般に、その子孫（後代細胞）が分化によって、例えば、胚性細胞および組織の進行性の多様化で生じるような、個々の特徴を完全に獲得することによって、多くは異なる方向に特殊化している天然に存在する親細胞を指す。一部の分化細胞は、高い発生能を有する細胞を生じる能力ももつ。そのような能力は、天然のものである場合も、または様々な因子を処理することで人工的に誘導されたものである場合もある。幹細胞として生じた細胞は、分化した表現型に向かって進んでいくかも知れないが、「逆方向に」誘導し、幹細胞の表現型を再び発現させることができ、当業者には、「脱分化」または「リプログラミング」または「逆分化（ｒｅｔｒｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」と呼ばれることが多い。
【００４９】
本明細書で使用する場合「胚性幹細胞」という用語は、天然に存在する、胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指す（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第５，８４３，７８０号；同第６，２００，８０６号；同第７，０２９，９１３号；同第７，５８４，４７９号を参照のこと）。そのような細胞は同様に、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内部細胞塊から得ることができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第５，９４５，５７７号、同第５，９９４，６１９号、同第６，２３５，９７０号を参照のこと）。胚性幹細胞は多能性であり、発生する間に、三つの一次胚葉全て（外胚葉、内胚葉および中胚葉）の誘導体を生じる。言い換えれば、胚性幹細胞は、特定の細胞型に所与の十分かつ必須の刺激を与えた場合、成体の２００を上回る細胞型のそれぞれに発生することができる。胚性幹細胞は胚体外膜つまり胎盤には寄与せず、すなわち全能性ではない。
【００５０】
本明細書で使用する場合、胚性幹細胞に特徴的な性質を、「胚性幹細胞表現型」と定義する。従って、ある細胞が、胚性幹細胞表現型をもたない他の細胞から区別できる胚性幹細胞に固有の性質を１つ以上有する場合、その細胞は胚性幹細胞の表現型を有する。特徴的な胚性幹細胞の表現型の性質の例としては、特定の細胞表面または細胞内マーカー（タンパク質およびマイクロＲＮＡを含む）の発現、遺伝子発現プロファイル、メチル化のプロファイル、脱アセチル化のプロファイル、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件への応答性などが挙げられるがこれらには限定されない。いくつかの実施形態では、その細胞が「胚性幹細胞表現型」を有しているか否かの決定は、その細胞の１つ以上の特徴を、同じ実験室内で培養した胚性幹細胞株の１つ以上の特徴と比較することで行われる。
【００５１】
本明細書で使用される「体性幹細胞」という用語は、胚以外の組織、例えば胎性、若齢、および成体の組織に由来する、任意の多能性または多分化能性幹細胞を指す。天然の体性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、および心筋を含む様々な成体組織から単離されている。これらの体性幹細胞はそれぞれ、遺伝子発現、因子応答性、および培養中での形態によって特徴付けることができる。天然に存在する体性幹細胞の例としては、神経幹細胞、神経堤幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、および膵臓幹細胞が挙げられるがこれらには限定されない。本明細書に記載のいくつかの態様では、「体性多能性細胞」とは、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、１つ以上のリプログラミング因子と接触させる、または１つ以上のリプログラミング因子を誘導することで、その発生能を変化させた、つまり多能性の状態まで発生能を高めた体細胞、またはその体細胞の後代を指す。
【００５２】
本明細書で使用する「前駆細胞」という用語は、高い発生能をもつ細胞を、つまり、分化によって生じ得る細胞よりも、より原始的な（例えば、発生経路または進行のより初期の工程にある）細胞の表現型を有する細胞を指す。前駆細胞は有意なまたは非常に高い増殖能を有することが多い。前駆細胞は、発生経路や、その細胞が発生・分化する環境に応じて、より低い発生能をもつ複数の個別の細胞、つまり分化した細胞型を生じるか、または、単一の分化した細胞型を生じる可能性がある。
【００５３】
本明細書で使用する場合「体細胞」という用語は、生殖細胞、着床前の胚に存在する細胞もしくは着床前胚から得られた細胞、またはそのような細胞のインビトロでの増殖によって生じた細胞以外の全ての細胞を指す。言い換えると、体細胞とは、生殖系列細胞の対語として、生物の体を形成する全ての細胞を指す。哺乳類では、生殖系列細胞（「配偶子」としても知られている）は精子と卵子であり、これらは受精の間に融合して、接合体と呼ばれる細胞を生成する。哺乳類の胚全体は、この接合体から発生する。哺乳類の体内にある他のそれぞれの細胞型（生殖母細胞で、未分化、多能性、かつ、胚性幹細胞である精子と卵子以外）が体細胞（内部の器官、皮膚、骨、血液、および体細胞から作られている結合組織）である。いくつかの実施形態において体細胞は、「非胚性体細胞」であり、これは、その体細胞が胚には存在しない、または胚から得られた細胞ではないこと、および、胚細胞のインビトロでの増殖によって生じたものではないことを意味している。いくつかの実施形態において体細胞は「成体体細胞」であり、これは、その細胞が胚または胎児以外の器官に存在する、または胚もしくは胎児以外の器官から得られた細胞であること、あるいは、そのような細胞のインビトロでの増殖によって生じたものであることを意味している。別段の指定のない限り、体細胞をリプログラミングするための本明細書に記載の組成物および方法は、インビボおよびインビトロの両方で実施することができる（この場合、インビボでは、体細胞は対象の体内に存在して実施され、インビトロでは、培養中で維持されている、単離された体細胞を用いて実施される）。
【００５４】
「分化細胞」という用語は、本明細書では、その天然の形態において、多能性でない全ての体細胞を包含すると定義されよう。従って、「分化細胞」という用語は、部分的に分化した細胞、例えば多分化能性細胞もしくは安定で多能性でない、部分的にリプログラミングされた細胞、または、本明細書に記載の組成物および方法のいずれかを使用して作製した、部分的に分化した細胞も包含する。いくつかの実施形態では、分化細胞は、安定で中間的な細胞、例えば、多能性でなく、部分的にリプログラミングされた細胞である。培養中に多数の初代細胞を置くことによって、完全に分化した特徴のいくつかが失われる可能性があることに留意されたい。従って、そのような分化細胞または体細胞を単に培養するだけでは、これらの細胞は、非分化細胞（例えば未分化細胞）または多能性細胞にはならない。分化細胞（安定で多能性でない、部分的にリプログラミングされた細胞の中間体を含む）の多能性への移行には、培養に置いた際に部分的に分化した性質の消失を誘導する刺激を超える、リプログラミング刺激が必要である。リプログラミングされた細胞は、いくつかの実施形態では部分的にリプログラミングされた細胞は、発生能がより低く、通常、限られた回数の分裂しかできない親細胞と比較して、成長能を失うこと無く、長期間にわたって継代し続けられるという特徴も有する。いくつかの実施形態において「分化細胞」という用語は、その細胞が細胞分化過程におかれている場合には、あまり特殊化していない細胞型（つまり、発生能が高い細胞型）（例えば、未分化細胞またはリプログラミングされた細胞）に由来する、より特殊化した細胞型（つまり、発生能の低い細胞型）も指す。
【００５５】
本明細書で使用する場合「リプログラミング」という用語は、細胞または細胞集団（例えば、体細胞）の発生能を、反転させる過程を指す。言い換えると、リプログラミングとは、細胞がより高い発生能の状態になるように誘導する過程を、つまり、より未分化な状態へと戻す過程を指す。リプログラミングする細胞は、リプログラミングの前には、部分的に分化したまたは完全に分化した細胞のいずれであってもよい。本明細書に記載の態様のいくつかの実施形態では、リプログラミングとは、分化した状態が、多能性の状態に完全にまたは部分的に逆転すること、つまり、細胞の発生能が高まることを包含する。いくつかの実施形態では、リプログラミングとは、その細胞が胚性幹細胞の同等の発生能を有するように、つまり、胚性幹細胞の表現型を示すように、体細胞を多能性の状態に誘導することを包含する。いくつかの実施形態においてリプログラミングは、細胞の分化した状態の部分的な逆転または発生能の部分的な向上、例えば体細胞または単能性細胞の多能性状態への変化も包含する。リプログラミングはまた、本明細書に記載の操作などの操作をさらに行った場合の、多能性状態への完全なリプログラミングに対する感受性がより高い状態にする、細胞の分化状態の部分的な逆転も包含する。そのような操作によって、細胞またはその細胞の後代で、リプログラミングに寄与するまたはリプログラミングを維持する特定の遺伝子の内生の発現が誘導される場合がある。一定の実施形態では、本明細書に記載の合成の修飾されたＲＮＡおよびその方法を用いた細胞のリプログラミングによって、多分化能性状態にあると仮定される細胞（例えば、多分化能性細胞）が生じる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成の修飾されたＲＮＡおよびその方法を用いた細胞（例えば体細胞）のリプログラミングによって、多能性様状態または胚性幹細胞表現型と仮定される細胞が生じる。本明細書では、得られた細胞を「リプログラミングされた細胞」、「体性多能性細胞」、および「ＲＮＡ誘導性体性多能性細胞」と呼ぶ。本明細書では「部分的にリプログラミングされた体細胞」という用語は、本明細書で開示の方法によって、発生能が低い細胞からリプログラミングされた細胞を指す。部分的にリプログラミングされた細胞が、多能性の状態に完全にはリプログラミングされておらず、多能性ではない、安定な中間的な状態にある。そのような部分的にリプログラミングされた細胞は、多能性細胞よりは低いが分化能を有する細胞であると本明細書では定義する。部分的にリプログラミングされた細胞は、例えば、三胚葉のうちの１つか２つには分化できるが３つ全部の胚葉には分化できない。
【００５６】
本明細書で使用する場合「リプログラミング因子」という用語は、発生能を変化させる因子であると本明細書では定義する。このような因子には例えば、その発現が細胞、例えば体細胞がより分化していないまたは未分化の状態にリプログラミングするのに寄与する、遺伝子、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または小分子がある。リプログラミング因子は、任意の遺伝子、タンパク質、ＲＮＡまたは小分子などであって、インビトロでの細胞のリプログラミング法においてそのうちの１つ以上と置き換えることができるものなどの、例えば、細胞を多能性状態にリプログラミングする転写因子（例えばＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ−２８、ｃ−ＭＹＣなど）であってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成の修飾されたＲＮＡおよびその方法を用いた外生のリプログラミング因子の発現は、細胞をリプログラミングされた状態または部分的にリプログラミングされた状態で安定に維持するのに、外生の１つ以上のリプログラミング因子の発現が必要なくなるように、内生の１つ以上のリプログラミング因子の発現を誘導する。本明細書で使用する場合「インビトロでの多能性状態へのリプログラミング」とは、核移行もしくは細胞質移行または例えば、卵母細胞、胚、生殖細胞、または多能性細胞との細胞融合を必要としないおよび／または伴わない、インビトロでのリプログラミング方法を指す。リプログラミング因子は、「脱分化因子」と言い換えることもできる。脱分化因子は発生能を変化させる因子を指し、本明細書では、細胞を脱分化させて、より分化していない表現型へと誘導する、例えばタンパク質またはＲＮＡであると定義する。つまり、脱分化因子は、細胞の発生能を向上させる。
【００５７】
本明細書で使用する場合「分化因子」という用語は発生能を変化させる因子を指し、本明細書では、細胞を分化させて所望の細胞型へと誘導する因子、例えばタンパク質、ＲＮＡ、または小分子、と定義する。つまり、分化因子は細胞の発生能を低下させる。いくつかの実施形態では、分化因子は細胞型特異的ポリペプチドであってよく、しかしながらこのことは必須ではない。特定の細胞型への分化には、２つ以上の分化因子が同時におよび／または連続して発現することが必要である。本明細書に記載のいくつかの態様では、細胞または細胞集団の発生能をまず、本明細書に記載の合成の修飾されたＲＮＡを使用したリプログラミングまたは部分的なリプログラミングによって向上させ、次に、そのようなリプログラミングによって生成された細胞またはその後代細胞を、分化因子をコードしている１つ以上の合成の修飾されたＲＮＡと接触させるか、または分化因子をコードしている１つ以上の合成の修飾されたＲＮＡを誘導することで、分化を誘導して、リプログラミングによって生成された細胞またはその後代細胞の発生能を低下させる。
【００５８】
細胞個体発生に関する用語「分化する」または「分化している」とは、その発生過程によって、細胞が中間的な前駆細胞から、発生経路をさらに進行していく発生の過程を指す相対語である。従っていくつかの実施形態では、本明細書で定義する用語としてのリプログラミングされた細胞は、分化系列限定的な前駆細胞（例えば中胚葉幹細胞）に分化し、これがその後、さらに発生経路を進行して他の型の前駆細胞（例えば、組織特異的前駆体、例えば、心筋細胞前駆体）に分化し、次いで、特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持していてもあるいは保持していなくてもよい、最終段階の分化細胞になる可能性がある。
【００５９】
本明細書で使用する場合「多能性の中間的な細胞を形成せずに」という用語は、ある１つの細胞型が別の細胞型へと、好ましくは一工程で、分化転換することを指す。従って、多能性の中間的な細胞を形成せずに、分化した表現型または細胞の発生能を変化させる方法は、細胞をまず脱分化（またはリプログラミング）し、次いで、別の細胞型へと分化させることを必要としない。その代わりに、その細胞型は、より分化していない表現型を経ずに、１つの細胞型から別の細胞型へと、単に「転換」する。従って、分化転換とは、細胞の発生能の変化であって、その変化によって、細胞が同じような発生能をもつ異なる細胞へと誘導されること、例えば、肝臓細胞から膵臓細胞への転換、膵臓α細胞から膵臓β細胞への転換などを指す。本発明のシステムおよび方法は細胞の分化転換にも好適である。
【００６０】
「発現」という用語は、例えば、適用できる場合には、転写、翻訳、折り畳み、修飾およびプロセシングなどを含むがこれらには限定されない、ＲＮＡおよびタンパク質の生産、場合によりタンパク質の分泌に関与する細胞内過程を指す。「発現産物」には、遺伝子に由来するＲＮＡ転写産物、および遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物の翻訳によって得られるポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において発現産物は、ポリペプチドをコードしていない配列の転写産物、例えばマイクロＲＮＡである。
【００６１】
本明細書で使用する場合「転写因子」という用語は、ＤＮＡ結合ドメインを介してＤＮＡの特定の部位に結合し、ＤＮＡからＲＮＡへの遺伝情報の転写を制御するシステムの一部であるタンパク質を指す。
【００６２】
本明細書で使用する場合「小分子」という用語は、分子量が約１０，０００ｇ／ｍｏｌ未満のペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、有機もしくは無機化合物（例えば、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物）、分子量約５，０００ｇ／ｍｏｌ未満の有機もしくは無機化合物、分子量約１，０００ｇ／ｍｏｌ未満の有機もしくは無機化合物、または分子量約５００ｇ／ｍｏｌ未満の有機もしくは無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学上許容可能な形態を含むがこれらには限定されない、化学物質を指す。
【００６３】
本明細書で使用する場合「外生の」という用語は、核酸（例えば、転写因子をコードしている合成の修飾されたＲＮＡ）、またはタンパク質（例えば、転写因子）が人の手を介して、導入される核酸やタンパク質が通常では見られない、または少量しか存在しない細胞または生物などの生体システムに導入されたことを指す。ある因子（例えば、転写因子をコードしている合成の修飾されたＲＮＡ、またはタンパク質、例えば、ポリペプチド）は、中間的な前駆体、またはその物質を受け継ぐ後代に導入されている場合、外生だと見なされる。一方で「内生の」という用語は、その生体システムまたは細胞に天然の因子または発現産物を指す（例えば、遺伝子、例えばＳＯＸ２の内生の発現とは、細胞内の内生遺伝子によるＳＯＸ２ポリペプチドの生産を指す）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成の修飾されたＲＮＡを含む組成物および方法を用いて、細胞に１つ以上の外生因子、例えば発生能を変化させる因子を導入すると、細胞もしくはその後代細胞を新しい発生能で維持するのに必要な因子または遺伝子産物の、その細胞または後代細胞における内生の発現が誘導される。
【００６４】
本明細書で使用する場合「単離された細胞」という用語は、その細胞が最初に見られた生物から取り出された細胞、またはそのような細胞の子孫を指す。必要に応じてその細胞は、例えば他の細胞の存在下で、インビトロで培養される。必要に応じて、細胞はその後、第二の生物に導入されるか、あるいは単離した（または細胞もしくは細胞集団の由来となった）もとの生物に再導入される。
【００６５】
本明細書で使用する場合、単離された細胞集団に関する「単離された集団」という用語は、雑多なまたは不均一な細胞集団から取り出され、分離された細胞の集団を指す。いくつかの実施形態において単離された集団は、その細胞を単離または濃縮したもとの不均一な集団と比較して「実質的に純粋」な細胞集団である。いくつかの実施形態において単離された集団は、その多能性細胞の由来である体細胞の不均一な集団と比較して、実質的に純粋な、単離された多能性細胞の集団である。
【００６６】
本明細書で使用する場合「合成の修飾されたＲＮＡ」または「修飾されたＲＮＡ」という用語は、本明細書の以下で定義する、少なくとも１つの改変したヌクレオシドを含む、インビトロで生産されたＲＮＡ分子を指す。本発明の方法は修飾されたＲＮＡを必要としない。合成の修飾されたＲＮＡ組成物は、細胞、組織、臓器などの天然の供給源から単離された、そのような修飾を含むｍＲＮＡを包含せず、インビトロ技術を用いて合成した、合成の修飾されたＲＮＡのみを包含する。「合成の修飾されたＲＮＡ」または「修飾されたＲＮＡ」という用語に使われる「組成物」という用語は、複数種の異なる、合成の修飾されたＲＮＡ分子（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも９０、少なくとも１００種類、またはそれ以上の、合成の修飾されたＲＮＡ分子）を包含する。いくつかの実施形態では、合成の修飾されたＲＮＡの組成物は、他の薬剤（例えば、インターフェロンの発現または活性の阻害剤、形質転換試薬など）をさらに含む場合がある。それらの大部分は、異なる配列（例えば、異なるポリペプチドをコードしている配列）の、合成の修飾されたＲＮＡ、異なる改変を有する同じ配列の合成の修飾されたＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００６７】
本明細書で使用する場合「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２個のアミノ酸（例えば、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、少なくとも２００個、少なくとも２２５個、少なくとも２５０個、少なくとも２７５個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、少なくとも５０００個、少なくとも６０００個、少なくとも７０００個、少なくとも８０００個、少なくとも９０００個、少なくとも１０、０００個、またはそれ以上のアミノ酸）を含むアミノ酸の多量体を指す。本明細書では「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は同じ意味で使われる。本明細書で使用する場合「ペプチド」という用語は、比較的短いポリペプチド、典型的には、長さが約２個〜６０個のアミノ酸のポリペプチドを指す。
【００６８】
マイクロアレイ、特に「細胞アレイ」は現在、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質および小分子などの生体分子の大きなライブラリーを、その生物学的機能に関してスクリーニングするのに、および細胞や遺伝子の機能の基礎的な研究に必要とされている。学界と産業界両方の多くの研究施設で、スクリーニング効率、速度および質の高い、先進的な高密度アレイが必要とされている。次世代マイクロアレイと細胞アレイのそれぞれが開発されたことで、多くのスクリーニングが今後、可能にまたはより効果的に利用可能になるだろう。作製されるアレイは、典型的には、標準的なマイクロプレート取扱いロボットや顕微鏡での操作性が確保されるように、一般的なマイクロタイタースケールのプレートに適合することが望ましい。理想的にはアレイは、同一の条件における単位としてアッセイする必要のある細胞株のコレクションである可能性があるが、細胞株の遺伝子型だけは例外である。例としては、正常なｉＰＳＣ株および疾患特異的ｉＰＳＣ株、またはそれらの分化した誘導体（互いに、マイクロタイタープレートの隣りあったウェルにプレーティングされている）のコレクションが挙げられる。これにより、研究者らは、単一の因子（例えば小分子）が複数の遺伝子型におよぼす活性を同時に探索して、適切なアッセイにより、その因子の遺伝子型特異的な効果を発見することができる。
【００６９】
一実施形態では、本発明のシステムを使用して、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層とフィーダー再生の両方で培養し、確立したｉＰＳＣ細胞株への分化を誘導した細胞から、完全にリプログラミングされた細胞が濃縮された細胞集団を得ることもできる。本発明のシステムはさらに、高処理系での操作用に、完全にリプログラミングされたまたは分化したｉＰＳＣ細胞の規定された小集団を、９６ウェルプレート中に生きたまま選別することを可能にする。
【００７０】
図１に、生検材料のプレーティング（２）、増殖および継代（４）（液体取扱いロボットによる回転培養）、ＱＣ（６）（自動化されたマイコプラズマ試験）、および（８）液体取扱いロボットによる自動凍結を含む、システム１によって実施される工程を示す。
【００７１】
図２に、システム２、３、および４によって実施される工程を示す。自動化されたシステムによって線維芽細胞をプレーティングし（１０）、自動化されたシステムでリプログラミング因子を導入し（１２）、自動的な選別および単離によって、ｉＰＳＣを単離し（１４）、自動化されたシステムで所望のクローンを選択して増殖させ（１６）、マーカーアッセイおよび胚様体アッセイにより、多能性の状態を自動的に品質確認し（ＱＣ）（１８）、次いで、所望の細胞を自動的に凍結・貯蔵する（２０）。
【００７２】
図３は、システム１に含まれる工程（２２）から（６０）を示すフローチャートである。
【００７３】
図３に、ワークフローの一例と、生検材料から線維芽細胞生成までの決定木を図示する。ワークフローは、隔離所の段階（５８）とＣｌｅａｎの段階（６０）に分けられる。生検が設備に投入されたら、技師が生検材料を６ウェルプレートにプレーティングし（２２）、プレートを自動インキュベーターに集める（２４）。所定の時間が経過し、生検材料がプレートに接着したら、液体取扱いロボットが、栄養を供給し、自動顕微鏡で増殖密度を確認するためにプレートを自動インキュベーターから取り出す（２６）。プレートをインキュベーターに戻し、成長させる（２８）。液体取扱い機によって、インキュベーターからプレートを取り出し、培地を、抗生物質および抗真菌剤を含まない培地と交換する（３０）。ロボットによって、プレートはインキュベーターに戻され、さらに５日間インキュベートする（３２）。その後、ロボットによってプレートが取り出され、マイコプラズマ試験用に培地を娘プレートに回収する（３４）。マイコプラズマ試験用に、娘プレートを隔離所アッセイシステムに移動する（３６）。アッセイの陽性シグナルに基づいて選択を行う（３８）。マイコプラズマアッセイの結果、６ウェルプレートの全てのウェルが陽性であったら（４０）それらは廃棄する。６ウェルプレートの全てのウェルが陰性で、マイコプラズマを含まなかったら、そのプレートを隔離所からｃｌｅａｎ成長システムに移す（４６）。いくつかのウェルが陽性で、いくつかのウェルが陰性の場合、陰性のウェルを隔離所中で維持する（４２）。陰性のウェルを新しいプレートに継代し（４４）、インキュベーターに移し、陽性のウェルを含むもとのプレートを廃棄する。これらの培養物を、マイコプラズマの再検査まで進める（２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８）。Ｃｌｅａｎ培養の成長をモニタリングし（５０）、継代し（５２）そして凍結バイアル中で凍結させる（５４、５６）。
【００７４】
図４Ａ、４Ｂ１、４Ｂ２、および４Ｃに、自動化されたリプログラミング過程を行っている間の、マルチウェル組織培養プレートを介した患者試料のフローの例を図示する。各図の上段は、ワークフローのそれぞれの工程（７０、８８、９８）によって実施される手順のフローを説明するフローチャートである。各図の下段のマルチウェル細胞培養プレートは、プレートマップと共に示されている。例えば、灰色のウェルまたは試料の名前の付いているウェルのグループは、試料の入ったウェルを表している（６１〜６８、７２〜８６、８８〜９６）。手順を介した試料の、プレート間またはウェル間の移動は、矢印で示すように、左から右方向に進行する。図４Ａに示すように、自動化されたｉＰＳＣの誘導過程は、患者試料と対照の線維芽細胞試料（６１）が、６ウェルプレートの個々のウェルにプレーティングされた時点から開始される（６２）。これらの試料を、リプログラミング因子をコードしているウイルスを用いた感染用またはリプログラミング因子を細胞に導入するための他の手段用に、所定の細胞数で２４ウェルプレートの個々のウェルに継代する（６４）。次の工程では、セルソーティングまたは、好ましくは、磁気ビーズを使用した濃縮によって、リプログラミングされた試料からリプログラミングされていない細胞を除き、９６ウェルプレートの複数のウェルに同じ密度でプレーティングする（６６）。この例では、そのようなプレートのうちの２枚を示している。この例では、６つのウェル（ウェルの中央に書いた点で示す）を、自動撮像装置を使った免疫蛍光解析アッセイによって、多能性表面マーカー陽性で、単一のクローンを含むものと同定する（６６）。これらのクローンを継代し、選んで、最小限の９６ウェルプレートに再配列させた（６８）。例として示す図では、出発材料それぞれにつき６つのクローンを示しており、かつ、１６種の出発材料由来のクローンを９６ウェルプレートに並べることができることを示している。プレートの処理を促進するために、この選ぶ工程を複数回の継代にわたって行い、最小限の数のプレート上にクローンを固定することができる。図４Ｂ１および４Ｂ２に示すように、これらのクローンを、ウェル内の幹細胞コロニーの培養密度がそれぞれの出発材料と同程度になるまで、順次継代する（７２）。次に各プレート上の試料を重複プレート上で複製して（７４〜８６）、品質管理（６）および適切な幹細胞特徴を示すクローンの選択が行えるようにする。ＱＣ過程を開始するには、このシステムによって、個々のクローンの多能性状態を決定するために必要とされる多能性品質管理アッセイ用のプレートを１枚と（７４）、さらに継代を続けるために、もう１枚のプレートを生成する（７６）。さらに継代を続けるためのプレートを、再度、さらなる品質管理と増殖用に、３枚のプレートに継代する（７８、８０、８２）。１枚のプレートは、核型と遺伝的多様性の解析を行うＱＣアッセイ用に回収する（７８）。２枚目のプレート（８２）は、ｖ底プレートに継代し、ｉＰＳクローンの分化能を評価するＱＣアッセイ用に、胚様体を形成させる（８４）。最後のプレート（８０）はさらに増殖を続ける。前述の多能性ＱＣアッセイによる品質管理に合格しなかった個々のクローン（図４ではウェル中の「×」で示す）についてはそれ以上継続しない。図４Ｂ２で示す例では、固定した単一の９６ウェルプレート（８６）には、それぞれにつき３つのｉＰＳクローンとして３２種類まで、またはクローン１つとして９６種類までのｉＰＳ細胞株（または分化した細胞株）が含まれる。残りのクローンは、残りが１〜３クローンになるまで、できるだけ少数のプレートに固定する（８６〜９２）。図４Ｃに示すように、これらを、プレートに接着させながら凍結保存するために増殖させるか（８８）、あるいはさらに増殖させて（９２〜９４）、その後凍結用バイアル中で凍結保存する（９６）。多能性マーカーを用いたスクリーニングからの任意のまたは全ての情報を図４Ａに示す（７０）。図４Ｂ１に示した品質管理アッセイは、単独でまたは組み合わせて用いることで、自動化された過程において、どのクローンを固定および整列用に選択するかを決定することができる。
【００７５】
成体細胞をｉＰＳＣ株を形成するように、形質移入および形質転換またはリプログラミングする方法は一般的に、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７ Ｃｅｌｌ， １３１： ８６１−８７２， ２００７， Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ． ３１８， ｐｐ． １９１７−１９２０が知られている。ｉＰＳＣは、リプログラミング因子によって体細胞から誘導される。リプログラミング因子とは、例えば、転写因子を含むことを想定している。成体細胞をリプログラミングするための方法には、例えば、特定の転写因子の組み合わせ、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４とｃ−Ｍｙｃ遺伝子の組み合わせを導入・発現させることが含まれる。他の研究者らは、成体細胞を形質転換またはリプログラミングするのに、他の転写因子の組み合わせを使用してもよいことを示している。このような他の転写因子には、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６ Ｃｅｌｌ， １２６： ６６３−６７６ ａｎｄ Ｈｕｉｑｕｎ Ｙｉｎ， ｅｔ ａｌ． ２００９， Ｆｒｏｎｔ． Ａｇｒｉｃ． Ｃｈｉｎａ ３（２）： １９９-２０８（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、例えば、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ｈＴｅｒｔおよびＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原が挙げられる。
【００７６】
別の態様では、翻訳されたときに、所望の１つまたは複数のタンパク質をもたらすＲＮＡを細胞に直接導入することで、ｉＰＳＣを生成することができる。高等真核細胞は外来の「非自己」ＲＮＡに対する細胞の防御機構を進化させてきた。このような防御機構は最終的に、細胞内タンパク質合成の全体的な阻害を引き起こし、その結果、細胞毒性が生じる。この反応には部分的に、Ｉ型またはＩＩ型インターフェロンの生産が伴い、通常、「インターフェロン応答」または「細胞の自然免疫応答」と呼ばれている。この細胞の防御機構は通常、合成ＲＮＡを異物と見なし、そして、この細胞の自然免疫応答を誘導する。ＲＮＡを用いた、外因性の誘導されたタンパク質の持続的なまたは反復した発現を達成する能力が、この自然免疫応答の誘導によって妨害されている特定の態様では、この反応を回避するまたは低減する様式によって改変されている合成ＲＮＡを使用することが望ましい。自然免疫応答の回避または低減によって、例えば細胞の発生に関する表現型を改変するのに必要な、外因性の導入されたＲＮＡからの持続的な発現が可能になる。一態様において、持続的な発現は、標的細胞またはその後代に、合成の修飾されたＲＮＡを繰り返し導入することで達成される。本発明の方法には、天然のＲＮＡまたは合成ＲＮＡが含まれる。
【００７７】
一態様では、細胞内で目的のタンパク質の外生の発現を誘導するために、天然の、修飾した、または合成のＲＮＡを細胞に導入することができる。本明細書に記載の修飾した合成のＲＮＡを用いた、目的のタンパク質の外生の発現を誘導する能力は、例えば、目的のタンパク質を産生する細胞または生物の能力が損なわれるまたは妨げられる、細胞または生物の内生の遺伝的欠損によって引き起こされる障害の治療に有用である。従っていくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡを含む組成物および方法を、遺伝子治療の目的で使用することができる。
【００７８】
記載のＲＮＡは、細胞の運命および／または発生能を変化させるのに、好都合に使用することができる。外生のＲＮＡからタンパク質を発現する能力は、細胞の発生能を変化または逆転することのいずれか、つまり細胞のリプログラミング、およびより分化した表現型への、細胞の方向付けられた分化を可能にする。細胞の発生能の変化において重要な面は、細胞またはその直接の後代において、１つ以上の発生能を変化させる因子が持続的かつ長期間にわたって発現することが必要だということである。これまでは、そのような持続的な発現は、ＤＮＡまたはウイルスベクターを細胞に導入することによって達成されてきた。これらの方法は、挿入性の突然変異が生成される恐れのあることから、治療への応用には制限される。
【００７９】
本明細書に記載の外生のＲＮＡから、所望のタンパク質またはタンパク質を長期間にわたって発現する能力によって、最も恩恵をこうむる分野の一つが、当初より分化した表現型をもっている細胞からの、多能性または多分化能性の細胞の生成である。この態様では、リプログラミング因子をコードしているＲＮＡが、より分化していない表現型、つまりより高い発生能をもつ細胞へとリプログラミングするのに使用される。
【００８０】
幹細胞技術の主要な目標は、幹細胞を所望の細胞型に分化させること、つまり方向性付けられた分化、または分化転換を介して細胞を生成することである。本明細書に記載の組成物および方法は、細胞のリプログラミングに有用なだけでなく、この、細胞の所望の表現型への方向付けられた分化および分化転換にも適用できる。すなわち、リプログラミングに関する本明細書に記載の同じ技術が、直接、リプログラミングされた細胞、または任意の他の幹細胞、もしくはさらに言えば前駆細胞の、所望の細胞型への分化に適用可能である。
【００８１】
本明細書に記載のこの態様および全てのそのような態様のいくつかの実施形態では、合成の修飾されたＲＮＡ分子は、少なくとも２つの修飾されたヌクレオシドを含む。そのような一実施形態では、２つの修飾されたヌクレオシドは、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２'−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２'フルオロウリジン、シュードウリジン、２'−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、２'デオキシウリジン（２'ｄＵ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'−Ｏ−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２'−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２'−Ｏ−トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２'−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２'−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群より選択される。本明細書に記載のこの態様およびそのような全ての態様の、そのような一実施形態では、少なくとも２つの修飾されたヌクレオシドは、５−メチルシチジン（５ｍＣ）およびシュードウリジンである。（例えば参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｓｓｉらに付与されている米国特許第２０１２／００４６３４６号を参照のこと）。
【００８２】
本発明の方法で使用される遺伝子、タンパク質またはＲＮＡには、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−ＭＹＣ、１−ＭＹＣ、ｎ−ＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ、およびＬＩＮ２８が含まれるがこれらには限定されない。
【００８３】
成体線維芽細胞のｉＰＳＣへのリプログラミングには、単一の転写因子が、特定の小分子経路阻害剤と共に使用できることも分かっている。そのような経路阻害剤としては、例えば、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦｂ）経路阻害剤のＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド）とＡ−８３−０１［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド］、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）と微小管関連タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路の阻害剤であるＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド）、ＧＳＫ３阻害剤で、βカテニンを安定化することでＷｎｔシグナル伝達を活性化する、ＣＨＩＲ９９０２１［６−（（２−（（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）エチル）アミノ）ニコチノニトリル］、リシン−特異的脱メチル化酵素１であるパルナート（Ｐａｒｎａｔｅ）（別名トラニルシプロミン（ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ））、３'−ホスホイノシチド−依存性キナーゼ−１（ＰＤＫ１）の小分子活性剤であるＰＳ４８［（２Ｚ）−５−（４−クロロフェニル）−３−フェニル−２−ペンテン酸］、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の酪酸ナトリウムおよびバルプロ酸、ミトコンドリアの酸化（例えば、２，４−ジニトロフェノール）、解糖代謝（フルクトース２，６−二リン酸およびシュウ酸）、ＨＩＦ経路の活性化（Ｎ−オキサロイルグリシンおよびケルセチン）を調節する小分子（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７： ６５１−６５５）が挙げられる。Ｚｈｕらは、Ｏｃｔ４およびＰａｒｎａｔｅとＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせが、成体ヒト表皮角化細胞のリプログラミングに十分であることを示している。
【００８４】
個々のプロトコールは異なるが、リプログラミングのプロトコールは一般的に、組織試料、例えば、皮膚生検由来の分化した成体細胞を増殖させること、およびそれらを上述したようなリプログラミング因子と接触させること、例えば、それらに感染させること、つまり、例えば、多能性転写因子の転写産物を含むウイルス構築物などの発現ベクターで形質転換することから構成される。当該分野で知られている方法、例えば、組織を機械的に破砕し、その後酵素を使って解離させて線維芽細胞を放出させる方法、によって線維芽細胞を得て、その後、この線維芽細胞を当該分野で知られている方法、例えばＤｉｍｏｓ ｅｔ． ａｌ．， ２００８， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ． ３２１ （５８９３）： １２１８−１２２１に記載されている方法によって培養する。
【００８５】
本発明の例示的な態様では、ベクター、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクターを使用するが、いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子を細胞に移行させることを含む形質移入の技術に、ベクターは必要ではない。
【００８６】
線維芽細胞への発現ベクターを使った形質移入は、所望のベクターと共に提供される説明に従って行われる。一定の期間おいた後（例えば、形質移入の約２〜約１０日後の範囲）、細胞を分離し、ＣＤ１３ＮＥＧ、ＳＳＥＡ４ＰＯＳおよびＴｒａ−１−６０ＰＯＳ表面マーカーに対する、蛍光標識した抗体と接触させる。分離され抗体で標識された細胞を次に、リン酸緩衝生理食塩水で再懸濁し、ｉＰＳＣクローンの自動的な選別と単離に移る。表面マーカー陽性細胞を標識の色または有無によって選別し、組織培地の入った無菌的なチューブ、またはＭＥＦもしくは細胞を含まない生物学的なマトリックスでコーティングしたマルチウェル（６〜９６ウェルの）組織培養用プレートに直接入れて、コロニーの形成が目で確認できるようになるまで培養する。
【００８７】
その後、生じたコロニーを顕微鏡下で観察することで、または必要に応じて、蛍光でタグを付けた抗体で標識されたクローンを蛍光顕微鏡で観察することで、ｉＰＳＣであることをさらに確認する。一定の実施形態では必要に応じて、選別と同定を容易にするために、ベクターの１つ以上によって、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現マーカーも挿入する。多能性ＥＳ細胞系と一致する形態的な特徴を有する複数の個別のコロニーを培養物から回収し、個別に増殖させてモノクローナルな培養物を形成する。
【００８８】
本発明のシステムの好ましい一実施形態では、ｉＰＳＣであることを早い段階で確認し、同定するために、処理した細胞を遺伝的解析にかける。好ましくは、この遺伝的解析はサザンブロット法によって行われるが、マイクロアレイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、全ゲノム配列決定、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリーを含むがこれらには限定されない、他の当該分野で知られている方法を使用してもよい。アルカリホスファターゼの酵素活性の検出、細胞膜表面マーカーであるＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１の発現が陽性であること、およびリプログラミングされたヒト線維芽細胞でのＫＬＦ４、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２転写因子の発現によっても、そのクローンがｉＰＳＣであることを確認できる。全てのマーカーが存在することが好ましい。
【００８９】
当該分野で知られている形質移入用ベクターのいずれもがリプログラミング因子として使用でき、それらには例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびそれらの組み合わせなどのＲＮＡが含まれる。用いることができる他の発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、細菌性ファージ、センダイウイルスおよびそれらの組み合わせが挙げられる。使用されるベクターが、例えば非複製性に改変されたセンダイウイルスベクターなどの、複製しないベクターであることが好ましい。好ましいセンダイウイルスベクターは、複製能力がないと同時に、ベクターが保持しているタンパク質をコードしている核酸の生産的な発現を可能にすることを維持しており、それによって、ワクチンが他の細胞へまたは体内へ制御されていない状態で拡がる可能性を全て防いでいる。この種のセンダイベクターは、ＣｙｔｏＴｕｎｅ（商標）−ｉＰＳＣセンダイウイルスベクターキット（ＤＮＡＶＥＣ、ＤＶ−０３０１）として市販されている。
【００９０】
そのようなベクターを成体線維芽細胞に挿入するためには、当該分野で知られている形質移入法のいずれをも、例えば、電気穿孔法、遺伝子銃、などを用いてもよい。必要に応じて、化学的な形質移入も、形質移入剤、例えば、ポリマー、リン酸カルシウム、陽イオン脂質、例えば、リポフェクション法などの手段によって行われる。ベクターまたは他の薬剤を成体線維芽細胞に運ぶためには、細胞透過性ペプチドも必要に応じて使用される。簡単に説明すると、細胞透過性ペプチドには、タンパク質由来のペプチド、例えば、タンパク質形質導入ドメインおよび／またはベクターまたは他の薬剤（ペプチドを含む）を細胞に運ぶ両親媒性ペプチドが挙げられる。細胞透過性ペプチドの対象は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２００９ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １５７： １９５-２０６によってまとめられている。他の細胞透過性ペプチドも当該分野で知られており、また、Ｈｅｉｔｚ（上記）に開示されている。他の細胞透過性技術、例えば、リポソームおよびナノ粒子なども、本発明の方法に用いてもよいことが想定される。リポソームおよびナノ粒子に関しても、Ｈｅｉｔｚ（上記）に記載されている。
【００９１】
形質転換した細胞を同定するために、抗体を使用することもできる。ヒト多能性幹細胞の集団を同定し、特徴解析するためには、幹細胞特異的表面タンパク質に対する４つの抗体、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１が一般的に使用されている。発生段階特異的胚抗原３および４（ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４）は、ヒト２１０２Ｅｐ細胞に存在するガングリオシドの、連続した領域を認識する、２つのモノクローナル抗体である（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０： ３２９−３３７； Ｋａｎｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｅｍｂｏ Ｊ ２： ２３５５−２３６１）。Ｔｒａ−１−６０とＴｒａ−１−８１抗体は、最初は、ヒト胎児性癌腫（ＥＣ）細胞に対して産生されたが（ＰＷ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３： ３４７−３６１）、その後、ポドカリキシン（シアロムチンのＣＤ３４関連ファミリーのメンバー）と同定された、ケラタン硫酸化糖タンパク質の炭水化物エピトープを特異的に認識することが分かった（Ｂａｄｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９： ４７１５−４７１９； Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２： ｅ２３７； Ｓｃｈｏｐｐｅｒｌｅ ａｎｄ ＤｅＷｏｌｆ， ２００７， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５： ７２３−７３０）。他のいくつかの表面マーカーが、ＥＳ細胞で発現していること、また、ＣＤ３２６またはＥｐＣａｍ（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２： １１３−１２４）、ＣＤ２４（熱安定成抗原）およびＣＤ１３３（Ｂａｒｒａｕｄ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８５， ２５０−２５９）（Ｇａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｂｌｏｏｄ １０９： １７４３−１７５１）が含まれることが示されている。Ｃｈａｎら（２００９、上記）は、４つのレトロウイルス因子の形質導入を介したリプログラミングによる、線維芽細胞からの真性ｉＰＳＣの同定は、ライブセルイメージングによって達成でき、かつ、長期にわたる観察によって、線維芽細胞が細胞表面マーカーＣＤ１３およびＤ７Ｆｉｂの発現を消失し、多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４およびＴｒａ−１−６０の発現を獲得することを報告した（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９，上記）。
【００９２】
また、ｉＰＳＣを含む組成物、例えば、本発明の自動化されたシステムによって調製される有効量のｉＰＳＣを含み、研究ツールまたは医薬組成物として用いられる組成物も本発明の範囲内であると想定される。
【００９３】
本発明はさらに、ｉＰＳＣを投与することによる、それを必要とする動物または人の疾患または障害の治療、例えば、本発明の自動化されたシステムで作製したｉＰＳＣ、またはそれらに由来する分化細胞を投与することによる、治療法および／または組織／臓器の修復方法に関する。適切な分化細胞（外胚葉、中胚葉または内胚葉細胞系列の）を、本発明の方法で作製したｉＰＳＣから誘導してもよい。投与経路は、治療する臓器／障害の種類によって、当業者が決定することができる。例えば、ｉＰＳＣまたはそれら由来の分化細胞を、注入（懸濁液として）または生分解性のマトリックスへの移植によって投与することができる。
【００９４】
加えて本発明は、ｉＰＳＣ、それら由来の分化転換した細胞または分化した細胞と、例えば、１つ以上の目的の医用薬剤とを接触させること、および、その後、使用した医用薬剤が接触した細胞に及ぼす影響を検出することによる、医用薬剤を試験する方法に関する。効率を上げるために、医用薬剤を、一連のｉＰＳＣまたはそれら由来の分化細胞に使用する。目的の１つ以上の医用薬剤に、好ましくまたは好ましくなく反応する細胞または組織型の同定を可能にするために、細胞は、組織源、分化した細胞型、または対立遺伝子源の点で、様々なものであってよい。
【００９５】
さらに、本発明の自動化されたシステムによって作製されるｉＰＳＣは、遺伝的欠損、例えば骨形成不全症、真性糖尿病、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、様々な運動神経疾患（ＭＮＤ）（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ））などを修正するために遺伝子を導入するための媒体として使用してもよい。
【００９６】
本発明の自動化されたシステムによって作製されるｉＰＳＣを使用して、生物医学的な研究用の特定の細胞型を提供することもでき、同様に直接または前駆体として、細胞を用いたアッセイ用の、例えば細胞毒性研究（被検化合物が細胞毒性に及ぼす影響を決定するための研究）用の特定の細胞型を産生することもで、細胞を化合物で処理し、その細胞に対する化合物の影響、例えば細胞の分化に対する影響を観察および／または記録することで、被検化合物の催奇性または発癌性を決定することもできる。
【００９７】
以下の非限定的な実施例を参照することで本発明をより深く理解できるだろう。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を完全に例示するために提示されるものである。しかしながら、以下の実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものでは一切ない。
【実施例】
【００９８】
実施例１
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃは、ワークフローを達成するために必要とされる機器構成の例を図示している。図５Ａに、線維芽細胞バンクの自動的な増殖および品質管理用のシステム構成を示す。図５Ｂは、患者試料、例えば線維芽細胞を自動的に融解するため、リプログラミング因子を患者試料、例えば線維芽細胞に自動的に導入するため、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳを使った自動化セルソーティング、および自動的なコロニーの同定および再配列のためのシステムの構成を示している。図５Ｃは、ｉＰＳクローンの自動的な増殖、自動的な胚様体産生、および自動的な凍結用のシステム構成を示している。
【００９９】
線維芽細胞バンクの自動的な誘導
一例として、線維芽細胞バンクを誘導するために使用されたハードウェアの構成は、以下のハードウェア部品に接続したＨａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｌｅｔ液体取扱いロボット（１００）を含む：細胞培養のインキュベートを可能にするＣｙｔｏｍａｔ ２４ ＣＧＬＳ自動インキュベーター（１０８）、自動的に画像を収集し、解析するためのＣｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ 血球計算器（１０２）、プレートまたはチューブに入った細胞を遠心分離するためのＡｇｉｌｅｎｔ Ｖ−Ｓｐｉｎ自動遠心分離機（１０６）、および凍結用チューブのフタを自動で開け閉めするＨａｍｉｌｔｏｎ Ｃａｐｐｅｒ ＤｅＣａｐｐｅｒ（１０４）。これらの部品はさらに、全ての装置と通信し、細胞培養用ウェアとハードウェア部品間での細胞の操作を制御するＰＣ内のプログラム可能なソフトウェアによって制御される（１１８）。コントローラソフトウェアはさらに、計画設定ソフトウェア（１２０）と通信して、システムの相互作用を関連させる。Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｌｅｔ（１００）は、４／８／１２チャネルのピペット操作、８チャネルのピペット操作用のＭｏｄｕｌａｒ Ａｒｍ、ｉＳＷＡＰプレート取扱い機、プレートおよびフタ取扱い用のＣＯ−ＲＥ Ｇｒｉｐｐｅｒ、Ｍｕｌｔｉ Ｆｌｅｘ傾きモジュール、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｈｅａｔｅｄ Ｓｈａｋｅｒ２．０、ならびに、プレートおよびフタ置き場、ピペット台、娘プレート台および培地を保持するための窪みを含む液体取扱いプラットフォームを柔軟に配置するためのキャリヤーパッケージを備えている。Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ（１０２）は、画像化ユニットおよび画像収集と画像解析を制御するためのＰＣ内のプログラム可能なソフトウェアで構成されている。Ｃｅｌｉｇｏは撮影している間に培養プレートを動かさず、プレーティングされている生検材料の撹拌が抑えられるため、Ｃｅｌｉｇｏが好ましい。Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃａｐｐｅｒ Ｄｅｃａｐｐｅｒ（１０４）とＡｇｉｌｅｎｔのＶ−Ｓｐｉｎ遠心分離機（１０６）は、細胞培養プレートを操作している間、動作環境を無菌的に維持するために、ＮｕＡｉｒｅ ＢＳＬ ＩＩバイオセイフティーキャビネット（１１０）内に設置されたＨａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｌｅｔの中に置かれる。
【０１００】
自動化されたシステムでのプレートの取扱いを制御するには、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ＳＴＡＲ ＶＥＮＵＳ ＴＷＯ Ｂａｓｅ Ｐａｃｋ ４．３ソフトウェア（１１８）とＶＥＮＵＳ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｓｃｈｅｄｕｌｅｒ ５．１（１２０）とを、遠心分離機（１０６）、Ｃａｐｐｅｒ Ｄｅｃａｐｐｅｒ（１０４）、Ｃｅｌｉｇｏ（１０２）、およびＣｙｔｏｍａｔ ２４（１０８）用の付属している個々のハードウェア部品のドライバーと、システムの動作に一体化するためのＣｙｔｏｍａｔトランスファーステーションと併せて使用する。付属のコントローラソフトウェア（１１８）を使用してプログラムした以下の方法はシステムの機能性に必要であり、また、患者の皮膚生検材料からの線維芽細胞株の誘導を達成するための規定の順序に組み込むこともできる。
１．６ウェル生検材料プレート（２２、２４）をＳＴＡＲｌｅｔ（１００）に負荷し、Ｃｙｔｏｍａｔインキュベーター（１０８）に移す。
２．Ｃｅｌｉｇｏ（１０２）で培養密度を確認し（２６、２８）、ＳＴＡＲｌｅｔ（１００）上で培地を交換する。
３．Ｃｅｌｉｇｏ（１０２）で培養密度を確認する（２８）
４．ＳＴＡＲｌｅｔ（１００）で、培地を全部変える（３０）
５．ＳＴＡＲｌｅｔ（１００）とＡｇｉｌｅｎｔ Ｖ−Ｓｐｉｎ遠心分離機（１０６）を使ってアッセイプレートを準備する（３４）
６．ＳＴＡＲｌｅｔ（１００）上で継代する（４４）
７．ＳＴＡＲｌｅｔ（１００）上で継代および選ぶ（４２）
８．ＳＴＡＲｌｅｔ（１００）上で、継代、回収および凍結する
９．Ｃｙｔｏｍａｔ（１０８）からＳＴＡＲｌｅｔ（１００）にプレートを戻す（４６、４０）
【０１０１】
隔離所アッセイシステムでの自動化されたマイコプラズマ試験
ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴリーダー（１１４）に接続したＨａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｌｅｔ液体取扱いロボット（１１２）から成る、別の独立したハードウェア構成を用いて線維芽細胞バンクのマイコプラズマ試験を実施する。これらの部品はさらに、全ての装置と通信し、細胞培養用ウェアとハードウェア部品間での細胞の操作を制御するＰＣ内のプログラム可能なソフトウェアによって制御される（１１６）。Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｌｅｔ（１１２）は、４／８／１２チャネルのピペット操作、８チャネルのピペット操作用のＭｏｄｕｌａｒ Ａｒｍ、ｉＳＷＡＰプレート取扱い機、プレートおよびフタ取扱い用のＣＯ−ＲＥ Ｇｒｉｐｐｅｒ、ならびにプレートおよびフタ置き場、ピペット台、娘プレート台および、アッセイに必要な試薬を保持するための窪みを含む液体取扱いプラットフォームを柔軟に配置するためのキャリヤーパッケージを備えている。
【０１０２】
自動化されたシステムでのプレートの取扱いを制御するには、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ＳＴＡＲ ＶＥＮＵＳ ＴＷＯ Ｂａｓｅ Ｐａｃｋ ４．３ソフトウェア（１１６）を、システムの操作を一体化するためのＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴリーダー（１１４）用の付属しているハードウェア部品のドライバーを併せて使用する。ＭｙｃｏＡｌｅｒｔマイコプラズマ検出アッセイ（３６）の実施と、データを解析してアッセイ結果（３８）を決定することを可能にする方法を、このソフトウェアを使ってプログラムする。
【０１０３】
リプログラミングされた細胞を融解、感染および同定するための自動化されたシステム
線維芽細胞を融解し、リプログラミングウイルスを線維芽細胞に感染させ、プログラミングされた細胞を磁気ソートし、及び幹細胞コロニーを同定するために必要とされるハードウェア構成は、３つのＨａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲ液体取扱いユニット（１２２、１３６、１３８）、２つのＣｙｔｏｍａｔ ４８Ｃインキュベーター（１３２）、１つのＣｙｔｏｍａｔ ２Ｃ４２５インキュベーター（１４２）、２つのＣｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ 血球計算器（１２４、１４０）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃａｐｐｅｒ Ｄｅｃａｐｐｅｒ（１２６）、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｖ−Ｓｐｉｎ（１２８）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ磁気分離装置（１３６）から構成される。液体取扱い機であるＣｅｌｉｇｏ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃａｐｐｅｒ ＤｅＣａｐｐｅｒおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｖ−Ｓｐｉｎは全て、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒａｃｋ Ｒｕｎｎｅｒロボティクスレール（１３０）によって繋げられている。ＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲはそれぞれ、４／８／１２チャネルピペット操作用、８チャネルのピペット操作用のＭｏｄｕｌａｒ Ａｒｍ、ｉＳＷＡＰプレート取扱い機、プレートおよびフタ取扱い用のＣＯ−ＲＥ Ｇｒｉｐｐｅｒ、培地を交換している間にプレートを傾けるための、１つ以上のＭｕｌｔｉ Ｆｌｅｘ傾きモジュール、１つ以上のＨａｍｉｌｔｏｎ Ｈｅａｔｅｄ Ｓｈａｋｅｒ ２．０、ならびにプレートおよびフタ置き場、ピペット台、娘プレート台および培地を保持するための窪みを含む液体取扱いプラットフォームを柔軟に配置するためのキャリヤーパッケージを備えている。ＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲ液体取扱い機の内の１つ（１２２）は、９６ウェルピペット操作用ヘッドも備えている。Ｃｅｌｉｇｏのうちの１つ（１４０）とＣｙｔｏｍａｔ ２Ｃインキュベーター（１４２）はＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲのうちの１つ（１３８）と直接繋がっており、自動化セルソーティングを促す。ＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲは、細胞培養プレートを操作している間、動作環境を無菌的に維持するために、ＮｕＡｉｒｅ ＢＳＬ ＩＩバイオセイフティーキャビネット（１４４、１４６、１４８）内に設置される。残りの部品は、細胞培養プレートを装置間で移動させる間、動作環境を無菌的に維持するために、Ｈｅｐａフィルターの付いたフードで覆われている。Ｃｙｔｏｍａｔ ４８Ｃインキュベーター（１３２）は、Ｒａｃｋ Ｒｕｎｎｅｒ輸送用レール（１３０）によって、システムのその他の部品と接続されている。
【０１０４】
自動化されたシステムでのプレートの取扱いを制御するには、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ＳＴＡＲ ＶＥＮＵＳ ＴＷＯ Ｂａｓｅ Ｐａｃｋ ４．３ソフトウェアコントローラ（１５０、１５２、１５４）とＶＥＮＵＳ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｓｃｈｅｄｕｌｅｒ ５．１（１５６）を、ＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲ（１２２、１３４、１３８）、遠心分離機（１２８）、Ｃａｐｐｅｒ／ｄｅｃａｐｐｅｒ（１２６）、２つのＣｅｌｉｇｏ（１４０、１２４）、Ｒａｃｋ Ｒｕｎｎｅｒ（１３０）、およびＣｙｔｏｍａｔ ２４（１３２）、Ｃｙｔｏｍａｔ ２Ｃ（１４２）全ての、それぞれに付属のハードウェア部品用のドライバーと併せて、および、システムの動作を一体化するためのＣｙｔｏｍａｔトランスファーステーションと併せて使用する。付属のコントローラソフトウェア（１５０、１５２、１５４）を使用してプログラムした以下の方法はシステムの機能性に必要であり、かつ線維芽細胞からｉＰＳのコロニーを誘導するために、規定の順序に組み込むこともできる。
１．マイコプラズマを含まない６ウェル生検材料プレート（４８）をＳＴＡＲ（１２２）に負荷し、ｃｌｅａｎの成長条件（６０）でＣｙｔｏｍａｔインキュベーター（１３２）に移す。
２．Ｃｅｌｉｇｏ（１２４）で培養密度を確認し（５０）、ＳＴＡＲ（１２２）上で培地を交換する。
３．ＳＴＡＲ（１２２）上で、継代、回収（５２）および凍結（５４、５６）する。
４．融解法：線維芽細胞の入った凍結用チューブ（６１）をＳＴＡＲ（１２２）に負荷して融解し、その後チューブのフタを開け（１２６）、線維芽細胞を洗浄し、次いで、細胞をプレーティング培地で再懸濁し、線維芽細胞を６ウェルプレートにプレーティングし（６２）、Ｃｙｔｏｍａｔインキュベーター（１３２）に移す。
５．ＳＴＡＲｌｅｔ（１２２）上で、培地全部を変える。
６．Ｃｅｌｉｇｏ（１２４）で培養密度を確認する。
７．ＳＴＡＲｌｅｔ（１２２）上で、２４ウェルプレート（６４）に入っている線維芽細胞を継代し、播種する。
８．ＳＴＡＲｌｅｔ（１２２）で線維芽細胞（６４）に感染するための方法
９．ＳＴＡＲのウェルに一定量の培地を加える方法（１２２、１３８、１４４）
１０．ＳＴＡＲで、培地の半量を交換する方法（１２２、１３８、１４４）
１１．Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（１３６）およびＣｅｌｉｇｏ（１２４）に付属のＳＴＡＲ（１４４）における、磁気を用いた選別、希釈およびプレーティングの方法（６６）
１２．ＳＴＡＲ（１２２、１３８、１４４）で、培地の４分の３量を交換する方法
１３．ＳＴＡＲ（１３８）およびＣｅｌｉｇｏ（１４０）を使用して、生きた状態でコロニーを免疫細胞化学的染色し、そのコロニーを自動的に画像化する方法（６６）
１４．ＳＴＡＲ（１３８）の選択したウェルから、コロニーを回収し、選び、再度プレーティグする方法（６８）
１５．Ｃｙｔｏｍａｔ（１３２）からプレートをＳＴＡＲｌｅｔ（１２２、１３８、１４４）に戻す。
【０１０５】
リプログラミングされた細胞を、増殖、品質管理、および凍結させるための自動化されたシステム
リプログラミングされた幹細胞のコロニーを増殖させ、品質管理アッセイ用にコロニーのプレートを生成し、かつ凍結貯蔵用にプレートとチューブを作製するために必要とされるハードウェア構成は、３つのＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲ液体取扱いユニット（１５０、１５４、１６０）、Ｃｙｔｏｍａｔ ２４Ｃインキュベーター（１７２）、１つのＣｙｔｏｍａｔ ２Ｃ４２５インキュベーター（１７４）、１つのＣｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ血球計算器（１６６）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃａｐｐｅｒ Ｄｅｃａｐｐｅｒ（１７０）、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｖ−Ｓｐｉｎ（１６８）、およびＡｇｉｌｅｎｔ ＰｌａｔｅＬｏｃプレート密封機（１６４）から構成される。液体取扱い機であるＣｅｌｉｇｏ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃａｐｐｅｒ ＤｅＣａｐｐｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｖ−Ｓｐｉｎ、およびＡｇｉｌｅｎｔ ＰｌａｔｅＬｏｃプレート密封機は全て、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒａｃｋ Ｒｕｎｎｅｒロボティクスレール（１６２）によって繋がれている。ＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲおよびＳＴＡＲｌｅｔは、４／８／１２チャネルのピペット操作用、８チャネルのピペット操作用のＭｏｄｕｌａｒ Ａｒｍ、ｉＳＷＡＰプレート取扱い機、プレートおよびフタ取扱い用のＣＯ−ＲＥ Ｇｒｉｐｐｅｒ、培地を交換している間にプレートを傾けるための１つ以上のＭｕｌｔｉＦｌｅｘ傾きモジュール、１つ以上のＨａｍｉｌｔｏｎ Ｈｅａｔｅｄ Ｓｈａｋｅｒ ２．０、ならびに、プレートおよびフタ置き場、ピペット台、娘プレート台および培地を保持するための窪みを含む液体取扱いプラットフォームを柔軟に配置するためのキャリヤーパッケージを備えている。ＳＴＡＲのうちの１つ（１６０）は、９６チャネルマルチチャネルピペット操作ヘッドも備えており、培地の交換と継代を促進する。Ｃｙｔｏｍａｔ ２ＣおよびＣｙｔｏｍａｔ ２４Ｃインキュベーターは、ＨａｍｉｌｔｏｎＲａｃｋ Ｒｕｎｎｅｒ輸送用レール（１６２）でＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲと繋がれており、自動的な培地交換を促進する。ＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲは、細胞培養プレートを操作している間の動作環境を無菌的に維持するために、ＮｕＡｉｒｅ ＢＳＬ ＩＩバイオセイフティーキャビネット（１７６、１７８、１８０）内に設置されている。残りの部品は、細胞培養プレートを装置間で移動させる間、動作環境を無菌的に維持するために、Ｈｅｐａフィルターの付いたフードで覆われている。
【０１０６】
自動化されたシステムでのプレートの取扱いを制御するには、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ＳＴＡＲ ＶＥＮＵＳ ＴＷＯ Ｂａｓｅ Ｐａｃｋ ４．３ソフトウェアコントローラ（１８２、１８４、１８６）とＶＥＮＵＳ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｓｃｈｅｄｕｌｅｒ ５．１（１８８）を、遠心分離機、開蓋機、プレート密封機、Ｃｅｌｉｇｏ、およびＣｙｔｏｍａｔインキュベーター用のそれぞれに付属のハードウェア部品用のドライバーと、システムの動作を一体化するためのＣｙｔｏｍａｔトランスファーステーションとを併せて使用する。以下の方法はシステムの機能に必要であり、かつ品質管理アッセイ用にプレートに入った細胞培養を増殖させるために、およびプレートまたは凍結用バイアル中での凍結用に、規定の順序に組み込むことができる。
１．前述の段階からプレート（６８）を受け取り、Ｃｙｔｏｍａｔインキュベーター（１７２）に入れる、ＳＴＡＲ（１６０）での負荷方法。
２．傾きモジュールと８−チャネルのピペット操作アームを使い、ＳＴＡＲ（１５０、１５４、１６０）上で、培地全量を変える。
３．ＳＴＡＲ（１５０、１５４、１６０）およびＣｙｔｏｍａｔインキュベーター（１７２）へ、およびＳＴＡＲ（１５０、１５４、１６０）およびＣｙｔｏｍａｔインキュベーター（１７２）から、プレートを移動させるのに関連する方法により、Ｃｅｌｉｇｏ（１６６）で培養密度を確認する。
４．ＳＴＡＲ（１５０、１５４、１６０）上で、９６ウェルプレート（６８〜９０）に入っているｉＰＳＣを継代および播種する方法
５．ＳＴＡＲ（１５０、１５４、１６０）上で、培地を部分的に交換する方法
６．ＳＴＡＲ（１５０、１５４、１６０）上で、選択した９６ウェルのウェルから、新しい９６ウェルプレート（８０、８２、８６、８８）に、コロニーを回収し、選び、再度プレーティングする方法。
７．ＳＴＡＲ（１５４）で、選択した９６ウェルのウェルから新しい２４ウェルプレート（９０、９２）に、コロニーを回収し、選び、再度プレーティングする方法。
８．ＳＴＡＲ（１５４）上で、選択した２４ウェルのウェルから新しい６ウェルプレート（９２、９４）に、コロニーを回収し、選び、再度プレーティングする方法。
９．ＳＴＡＲ（１５４）上で、凍結プレート（８８）内の細胞を、継代、回収および分配する。
１０．ＳＴＡＲ（１５４）上で、凍結用チューブ（９６）内の細胞を、継代、回収および分配する。
１１．プレートを、Ｃｙｔｏｍａｔ ２４Ｃ（１７２）またはＣｙｔｏｍａｔ ２Ｃ（１７４）からＳＴＡＲ（１５０、１５４、１６０）に戻す。
【０１０７】
実施例２
リプログラミング用線維芽細胞バンクの作製
患者試料からｉＰＳＣを誘導するワークフローでの第一工程は、成体細胞を得て、増殖させることである。この工程は例えば、皮膚パンチ生検材料または廃棄された皮膚組織を得て、次いで、そのような組織から線維芽細胞を単離し、培養物を増殖させることによって達成される。本発明者らのワークフローにおいてこの工程は、システム１と２から構成される自動化されたシステムで達成される。システム１と２（１００〜１２０）、およびシステム３（１２２〜１３２、１５４、１９０）の自動化部品は、患者試料由来の凍結用チューブ（６１）に入った状態で保存される線維芽細胞バンクを誘導するのに必要とされる工程を実施し、この工程には、患者の生検材料をプレーティングすること（２、２２〜２４）、増殖させ、継代すること（４、２６〜３２）（液体取扱いロボット上での回転生産）、ＱＣ（６、３４〜４６）（自動化されたマイコプラズマに関する試験）、および液体取扱いロボットを使った自動的な凍結（８、４８〜５６）を含む。例えば、生検材料から線維芽細胞を生産するためのワークフローおよび決定木は、隔離所（５８）およびＣｌｅａｎ段階（６０）の２つに分けられる。生検材料が設備に投入されたら、技師が生検材料を６ウェルプレートにプレーティングし（２２）、プレートを自動インキュベーターに集めて（２４）、隔離所ワークフローを開始させる。所定の時間が経過し、生検材料がプレートに接着したら、液体取扱いロボットが、栄養を供給し、プレーティングした組織からの成体線維芽細胞の成長の増殖密度を自動顕微鏡で確認するために、プレートを自動インキュベーターから戻す（２６）。プレートをインキュベーターに戻し、成長を続けさせる（２８）。液体取扱い機によって、インキュベーターからプレートを取り出し、培地を、抗生物質および抗真菌剤を含まない培地と交換して（３０）、マイコプラズマ試験に備える。ロボットによって、プレートはインキュベーターに戻され、さらに５日間インキュベートされる（３２）。その後、ロボットによってプレートが取り出され、マイコプラズマ試験用に培地を娘プレートに回収する（３４）。マイコプラズマ試験用に、娘プレートを隔離所アッセイシステムに移動する（３６）。アッセイの陽性シグナルに基づいて選択を行う（３８）。マイコプラズマアッセイの結果、６ウェルプレートの全てのウェルが陽性であったら（４０）それらは廃棄する。６ウェルプレートの全てのウェルが陰性で、マイコプラズマを含まなかったら、そのプレートを、隔離所から、システム３、４、５によって提供されるｃｌｅａｎ成長環境に移す（４６）。いくつかのウェルが陽性で、いくつかのウェルが陰性の場合、陰性のウェルを隔離所中で維持する（４２）。陰性のウェルを新しいプレートに継代し（４４）、インキュベーターに移し、陽性のウェルを含むもとのプレートを廃棄する。これらの培養物を、工程に沿って、マイコプラズマの再検査まで進める（２４〜３８）。Ｃｌｅａｎ培養物の成長をモニタリングし（５０）、継代し（５２）そして凍結バイアル中で凍結させる（５４、５６、６１）。
【０１０８】
幹細胞アレイの作製
ｉＰＳＣを作製するには、凍結用チューブに入った線維芽細胞（６１）を自動化されたシステムでプレーティングし（１０）、自動化されたシステムでリプログラミング因子を導入し（１２）、システム内での自動的な選別および単離によってｉＰＳＣを単離し（１４）、所望のクローンを自動化されたシステムで選択し（１６）、および自動化されたシステムで増殖させ（１６）、マーカーアッセイおよび胚様体アッセイによる多能性状態に関する自動化されたシステム（ＱＣ）によって自動的に品質確認を行い（１８）、その後、自動化されたシステムによって、所望の細胞を自動的に凍結させ、貯蔵する（２０）。これらの工程は、自動化されたシステム３、４、５、６、７、および８（１２２〜１９２）で達成される。
【０１０９】
例えば、自動化されたｉＰＳの誘導過程は、凍結用チューブに入った９６種類の患者試料および対照の線維芽細胞試料（６１）が、６ウェルプレートの個々のウェルにプレーティングされた時点で開始される（６２）。これらを、リプログラミング因子をコードしているウイルスを用いた感染用に、一定の細胞数で２４ウェルプレートの個々のウェルに継代する（６４）。次の工程では、セルソーティングまたは磁気ビーズを使った濃縮によって、リプログラミングされた試料から、リプログラミングされていない細胞を除去し、９６ウェルプレートの複数のウェルに、均一な密度でプレーティングする（６６）。この実施例では、６つのウェル（６６）が、多能性表面マーカー陽性の、単一のクローンを含んでいると同定される。これらのクローンを選び、最小限の数の９６ウェルプレートに固定する（６８）。これらのクローンを、ウェル内での培養密度が各出発材料と同程度になるまで、順次継代する（７２）。次に各プレート上の試料を重複プレート上で複製する（７４、７６）。プレートのうちの１枚は、個々のクローンの多能性状態を決定するのに必要とされる多能性品質管理アッセイ用のもので（７４）、もう１枚のプレートはさらに継代を続ける（７６）。継代を続けるプレートを再度、３枚のプレートに継代する（７８、８０、８２）。１枚のプレートは、核型と遺伝的多様性を評価するためのＱＣアッセイ用に回収し（７８）、１枚のプレート（８２）は、ｉＰＳクローンの分化能を評価するためのＱＣアッセイに必要な胚様体を形成させるためにｖ底プレートに継代し（８４）、最後のプレート（８０）はさらに増殖を続ける。前述の多能性ＱＣアッセイによる品質管理を通過しなかった個々のクローンについては、それ以上工程を進めず、図４Ｂ２および４Ｃではウェル中の「×」で示している（８０、８２、９０）。残りのクローンを、残りが１〜３クローンになるまで、できるだけ少数のプレートに固定する（８６）。これらのクローンを、プレートに接着させながら凍結保存するために増殖させるか（８８）、または、さらに増殖させ（９２、９４）、その後凍結用バイアル中で凍結保存する（９６）。
【０１１０】
分化した成体細胞を生成するために、胚性幹細胞（ＥＳ）を本発明の自動化されたシステムで使用することも想定される。ＥＳ細胞は、初期胚の胚盤胞に由来し、内胚葉、外胚葉、および中胚葉（三胚葉）に発生する能力を有する（つまり、ＥＳ細胞は「多能性」である）。インビトロでは、ＥＳ細胞は自発的に様々な種類の組織に分化する傾向にあり、その分化の方向を制御するのは容易ではない。しかしながら、ＥＳ細胞の分化を、特定の種類の分化した娘細胞へと誘導することに関しては一定の進展が見られている。例えば、段階的な分化の決まった時期に細胞培養物に加えられる規定の因子を使って、ヒトＥＳ細胞の分化を機能的な中脳ドーパミン作動性ニューロンへと誘導することが、現在では可能である（例えば、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１１ Ｎａｔｕｒｅ， Ｎｏｖ． ６． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０６４８ （Ｅｐｕｂ）を参照のこと）。分化は均一ではないので、さらに解析または操作するためには、目的の集団を単離する必要が残る。本明細書に記載する過程および使用装置は、最初に多能性の胚性幹細胞を誘導・増殖させ、その後、それらの分化した誘導体の小集団を、自動化された磁気による細胞単離などの自動化法によって単離するために使用することもできる。
【０１１１】
例えば、ヒト胚盤胞全体を、自動化された過程に適用可能なマルチウェルプレートのマトリックス上にプレーティングすることができる。プレーティングされたこれらの胚盤胞から増殖したものを、人工多能性幹細胞の単離について記載のロボティクスを用いた装置および方法によって実施されるのと同じ自動化された磁気単離手法によって単離してもよい。得られたヒト胚性幹細胞株を、本明細書に記載したものと同じ自動化された手法を用いて、増殖、選択（品質管理アッセイによる）、および凍結することができる。
【０１１２】
さらに、多能性幹細胞（胚盤胞由来のもの、または規定の因子もしくは体細胞核移植によって誘導されたもののいずれか）を用いて、分化した誘導体を記載のワークフローおよび使用装置によって単離することができる。分化した誘導体は、細胞運命の変化を誘導するために必要とされるかまたは自発的な分化の後に必要とされる因子を直接処理することで、得ることができる。例えば、ＴＧＦβ経路の阻害剤を使用して、多能性幹細胞を神経細胞の運命へと誘導することができる。続いて、表面抗原、例えばＮＣＡＭの磁気ビーズ免疫標識により、神経細胞でないものから、神経細胞を単離することができる。記載のワークフローおよび使用装置を使用して、ニューロンなどの分化した細胞を、磁気を用いて単離、選別、培養、および増殖させることができる。この過程は、目的の細胞型に特異的な細胞表面抗原を認識する抗体が存在する他の分化した細胞型、例えば心臓の細胞にも応用できる。
【０１１３】
多能性幹細胞は、本発明の自動化されたシステムで分化した成体細胞を生成するためにも使用されることが想定される。具体的には、間葉幹（ＭＳ）細胞を使用して、本発明の自動化されたシステムで、分化した成体細胞を生成することができる。ＭＳ細胞は、骨髄、血液、真皮、骨膜および胎盤で見られ、脂肪、骨、軟骨、弾性組織、筋肉、および繊維状の結合組織など、間葉の特定の型の組織または結合組織に分化することができる、形成性の多能性芽細胞または胚様細胞である。これらの細胞が進入する特定の分化経路は、機械的な影響による様々な要因、および／または内因性の生理活性物質、例えば成長因子、サイトカイン、および／または宿主組織によって確立される局所的な微小環境条件に依存している。例としては、ＭＳ細胞が軟骨修復に関して軟骨細胞の特性をもつ分化細胞へと分化することが上げられる。例えば、米国特許第８，０４８，６７３号を参照のこと。
【０１１４】
染色体試験
いくつかの態様では、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｌｅｘ２アッセイキットは、その集団の中では変化の見られない４００の遺伝子座を標的とするために使用され、細胞株同一性の「フィンガープリント」追跡と併用される一体化された分子の核型解析を可能にする。分子の核型解析では平均して、染色体腕１本当たり８つのプローブを使用し、ｉＰＳＣ株の細胞培養誘導の経過中および増殖中のゲノムの安定性を確認する。個々のゲノムを明確に同定することができる一般的な３０のコピー数多型（ＣＮＶ）に基づいて、全ての細胞株について同一性解析も実施する。
【０１１５】
多能性解析
一態様では、例えばＣｅｌｉｇｏ自動撮像装置でモニタリングされる、表面マーカー染色を行い、細胞がＴｒａ−１−６０表面マーカー陽性であることを示す。ＰＳＣ株は、多能性遺伝子を有意なレベルで示さなくてはならない。一実施例において本発明者らは、多能性に関する６つのマーカー（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＺＦＰ４２、およびＳｏｘ２）を含む、１００遺伝子のプローブセット（以下で説明する）を使用する。この解析を行うには、細胞の試料を溶解し、ＲＮＡを回収する。本発明者らは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｌｅｘ２アッセイキットを使用して、複数の試料における発現レベルと、数百もの遺伝子標的の発現レベルを同時に解析する。これにより、ＰＳＣを高処理系で解析する事が可能になる。ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイは定量的であるため、選択基準は、同一の条件で生育・解析される、確立したｈＥＳＣ株の対照パネルと比較して、ある範囲に入った発現レベルに基づく。多能性遺伝子発現の基準を満たした細胞株は、胚様体（ＥＢ）アッセイにおいて、インビトロでさらに増殖・分化させる。
【０１１６】
ＥＢ形成遺伝子の発現アッセイ
ヒト多能性細胞株では一般的に、後成的な変化や転写レベルでの変化があり、この変化が細胞株の有用性に大きな影響を及ぼす可能性があることが分かっている。例証となる実施例では、遺伝子マーカーのパネルには、以下が含まれる：
三胚葉のそれぞれから選択された、８３種の異なる遺伝子マーカー（８３）
５種のレトロウイルス導入遺伝子（検出プローブ１つを含む４因子、１プローブ）
５種のセンダイ導入遺伝子（４因子＋ベクターのみ、５）
Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＺＦＰ４２（多能性、Ｓｏｘ２は胚葉群、６プローブ）
性別マーカーＳＲＹ、ＸＩＳＴ（２）−ドナーの性別と一致することが必須。そうでなければその細胞株は拒絶される。
ハウスキーピング遺伝子、ＡＣＴＢ、ＰＯＬＲ２Ａ、ＡＬＡＳ１（３プローブ）。
【０１１７】
ｈＰＳＣ細胞株の増殖および保存
自動的な増殖
初期の細胞を６ウェルプレートの２つの別々のウェルにプレーティングし、その後、それらをＣＯ２インキュベーター内に置いて、培養密度が最大９５％になるまで成長させることで、細胞株を増殖させる。
【０１１８】
保存
まず、バイアルをＳＡＭ−８０冷凍庫に置き、徐々に冷やす。このシステムは自動的に温度をモニタリングし、システムにアクセスのあった時間を記録する。
【０１１９】
次に、長期間の保存用にバイアルを液体窒素に沈める。モニタリングに関する品質管理についてはこの提言の後半で詳述する。各バイアルには個別に、固有の２Ｄバーコードを付け、一覧をＬＩＭＳ内で追跡する。
【０１２０】
ｈＰＳＣ株の特徴解析
ｉＰＳＣおよびＥＢ遺伝子発現解析−ＥＢアッセイにおいて胚葉分化をモニタリングするための系統分化アッセイ得点表（１００遺伝子）を含むプローブセット、多能性マーカー、性別マーカーおよび導入遺伝子の発現
凍結融解解析
細胞を回収後、計数し、６ウェルプレートの１つのウェルにプレーティングする。コロニーが出現した当日とその５日後に撮影する。コロニーの倍加時間は３６時間以下でなければならない。
【０１２１】
表面マーカー解析
Ｃｅｌｉｇｏ自動撮像装置を用いたＴｒａ−１−６０染色の高密度撮像を使う自動化されたシステムにより、表面マーカー解析を実施する。
【０１２２】
ｉＰＳＣおよびＥＢの遺伝子発現解析
多能性遺伝子の発現-ｉＰＳＣクローンは、多能性遺伝子を有意なレベルで示さなくてはならない。本発明者らは、多能性に関する６つのマーカー（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＺＦＰ４２、およびＳｏｘ２）を含む、１００遺伝子マーカーのプローブセット（以下で説明する）を使用する。この解析を行うには、細胞の試料を溶解し、ＲＮＡを回収する。本発明者らは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｌｅｘ２アッセイキットを使用して、複数の試料における発現レベルと、数百もの遺伝子標的の発現レベルを同時に解析する。これにより、ｉＰＳＣを高処理系で解析する事が可能になる。ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイは定量的であるため、選択基準は、同一の条件で生育・解析される、確立したｈＥＳＣ株の対照パネルと比較して、ある範囲に入った発現レベルに基づく。選択したクローンのうち、多能性遺伝子発現の基準を満たしたものは、胚様体アッセイにおいて、インビトロでさらに増殖・分化させる。
【０１２３】
ＥＢ形成の遺伝子発現アッセイ−ヒト多能性幹細胞株に存在する後成的な変動の特性および規模をはっきりとさせるために、確立されている２０種の胚性幹細胞（ＥＳＣ）株と、近年誘導され、機能解析が行われた、１２種のｉＰＳＣ株について、３種類のゲノムアッセイを行った。細胞株の包括的な特徴解析の実施に関わる実験的な負担を低減するための工程として、および、既存の標準的なアッセイの正確性を高めるために、これらの試験から得られたデータを全て、３種類のゲノムアッセイを使用して、バイオインフォマティクスの得点表にまとめる。これにより、任意の多能性細胞株の質と有用性を高処理系で予測することが可能になる。この得点表を使用して、本発明者らのｉＰＳＣ株由来の各クローンから形成されたＥＢの遺伝子発現データを解析する。分化能を試験するには、自動化されたシステムを使用して、９６ウェルのｖ底プレート内でＥＢを生成し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｌｅｘ２アッセイキット用にＲＮＡを回収する。
三胚葉のそれぞれから選択された、８３種の異なる遺伝子マーカー（８３）
５種のレトロウイルス導入遺伝子（検出プローブ１つを含む４因子、１プローブ）
５種のセンダイ導入遺伝子（４因子＋ベクターのみ、５）
Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＺＦＰ４２（多能性、Ｓｏｘ２は胚葉群、６プローブ）
性別マーカーＳＲＹ、ＸＩＳＴ（２）
ハウスキーピング遺伝子、ＡＣＴＢ、ＰＯＬＲ２Ａ、ＡＬＡＳ１（３プローブ）
【０１２４】
核型および同一性解析
細胞株を承認する前であって、かつ、各増殖の最後に、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｌｅｘ２アッセイキットを使用して、細胞株同一性の「フィンガープリント」追跡と併用した一体化された分子の核型解析を可能にする４００の遺伝子座を標的とする。分子の核型解析では平均して、染色体腕１本当たり８つのプローブを使用し、ｉＰＳＣ株の細胞培養誘導の経過中および増殖中のゲノムの安定性を確認する。「フィンガープリント」による同一性の追跡解析は、多型性の遺伝子座で共通の３０種のコピー数多型（ＣＮＶ）に基づいた特徴の組み合わせに依存し、これによって、個々のゲノムを明確に同定することができる。加えて、関連があることが分かっている組織提供者は理論的に類似したＣＮＶを有する可能性があることから、誤同定を避けるために、これらを同じバッチでは処理しない。同一性解析のデータと最初のＣＮＶのデータを相互参照し、本発明者らのＬＩＭＳシステムが全細胞株を正確に追跡していることを担保する。
【０１２５】
凍結融解解析
凍結融解解析
凍結保存後、１本のバイアルを融解する。回復させた後、細胞を計数し、６ウェルプレートの１つのウェルにプレーティングする。培養物を毎日観察する。コロニーが出現した当日とその５日後に撮影する。コロニーは、最初に観察された日から５日以内に、直径が少なくとも２倍にならなければならない。
【０１２６】
自動的な生検材料の増殖の追跡
本発明のシステムを使用すれば、自動化されかつ追跡可能な画像解析によって、生検材料ならびに他の組織源の増殖を追跡することができる。図６に示すように、画像と成長速度は、生産過程の間追跡される。図６Ａでは、生検または廃棄された組織が６ウェルディッシュの複数のウェルにプレーティングされ、栄養を供給し、撮像し、継代し、増殖した線維芽細胞を凍結する自動化されたシステムによって維持される。典型的な試料に関する、画像解析インターフェースの例を示す。提供された試料ごとに１枚のプレートを使用し、相互汚染を最小限に抑える。（Ｂ）それぞれ独立して生成した検量線に由来する直線回帰に基づいて、培養密度から細胞数を補外する。（Ｃ）本発明者らの自動化されたシステムで維持した、典型的な生検材料の増殖に関する細胞数の例である。患者試料１つにつき、補外した細胞数を、各ウェル当たりで独立してプロットすることで（上段）、その試料の増殖全体を算出することができる（下段）。
【０１２７】
図７は、ＦＡＣＳ解析と、自動化されたｉＰＳＣのリプログラミングを図示するグラフを示している。リプログラミングされたヒト線維芽細胞における多能性表面マーカーの発現レベルを３週間にわたって追跡し、リプログラミングの動力学を観察し、規定の細胞集団を単離するのに最適な時点を決定した。（Ａ）解析に用いたＦＡＣＳのゲーティングを示す図。（Ｂ）レトロウイルスまたはセンダイベクターのいずれかを用いてリプログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ）を導入するリプログラミングを行っている全時点で、従来型の多能性表面マーカーであるＳＳＥＡ４とＴＲＡ−１−６０を両方発現していて、かつ、線維芽細胞マーカーであるＣＤ１３を保持している細胞の実質的な割合。１３１回の実験（レトロウイルス、ｎ＝６６、センダイウイルス、ｎ＝６５）のデータの集合を示す箱ひげ図。センダイウイルス介在性のリプログラミングでは、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ−１−６０二重陽性細胞がより多く見られたが、（Ｃ）表面からのＣＤ１３の排出に遅れが認められる。（Ｄ）Ｓｅｎｄａｉ／Ｃｙｔｏｔｕｎｅシステムを用いた、本発明者らの自動化されたシステムでリプログラミングされた患者の細胞株の染色パターンの例。７および１３ｄｐｉの両方で、ＳＳＥＡ４／ＴＲＡ−１−６０二重陽性細胞の半数超がＣＤ１３を消失している。加えて、アッセイを実施した両時点で、ＣＤ１３陰性／Ｎａｎｏｇ陽性細胞がこの画分に存在している。このことは、これらの細胞をＣＤ１３に対する陰性選択で単離可能なことを示唆している。
【０１２８】
図８は、ＦＡＣｓによる選別前の解析および、濃縮とｉＰＳＣクローンの選択を実証するための自動化されたシステムの一部を示している。（Ａ）リプログラミングされていない細胞集団は、線維芽細胞マーカーを使ったｉＰＳＣ培養物からの陰性選択で除去することができる。この戦略では、ｉＰＳＣは影響を受けないまま残される。この例では、確立されたｉＰＳＣを２％含有する培養物から、ＴＲＡ−１−６０陽性のｉＰＳＣには何ら影響を及ぼさずに、線維芽細胞だけが効率的に除去される。（Ｂ）Ｈａｍｉｌｔｏｎ液体取扱い機に組み込まれているＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭｕｌｔｉＭＡＣＳシステムによって、２４の試料を並行して選別することができる。（Ｃ）抗線維芽細胞抗体を結合させた磁気ビーズを用い、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳシステム上で、陰性選択で選択した、新たに誘導したｉＰＳＣのコロニーの例。位相差、Ｓｙｔｏｘによる核染色、ＴＲＡ−１−６０を使った表面マーカー染色および核のＮａｎｏｇ染色（データは示さない）。（Ｄ）抗線維芽細胞を使った磁気による陰性選択の工程で濃縮されたｉＰＳ画分を、限界希釈で、９６ウェル撮像プレートにプレーティングする。これらのプレートを、多能性表面マーカーであるＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ−１−８１に関する生細胞染色を使ってスクリーニングする。単一のコロニーを確認可能なＣｅｌｉｇｏソフトウェア使った自動的な画像解析により、ＴＲＡ−１−６０陽性ｉＰＳＣの入っているウェルを同定する。単一のコロニーが入っているということと、表面マーカー陽性であるということの両方の基準を満たすウェルを、継代・増殖およびＱＣ用に選択する。（Ｅ）（データは示していない）−成体線維芽細胞への自動化されたセンダイ感染によって作製したコロニー。
【０１２９】
ｉＰＳＣの誘導は、修飾したｍＲＮＡの自動的な形質移入によっても実証されてきた。修飾されたｍＲＮＡを含む形質移入用混合物を自動的に送達した１０日後、ｉＰＳＣのコロニーが、ＢＪ線維芽細胞から効率的に回収された。さらに２日間培養した後、同じウェルをＴＲＡ−１−６０で染色し、未分化細胞を同定した。ウェル中のｉＰＳＣは、これらが未分化のｉＰＳＣであることを示している。自動化されたシステム上で、磁気ビーズによる除去を用いたリプログラミングされていない細胞からの精製によって単離されたｉＰＳＣのコロニーを、効率的に回収した。
【０１３０】
遺伝子発現に関する高処理系での得点表アッセイを作成した。本発明者らの品質管理スクリーニングの第一段階では、多能性分化のパネルと導入遺伝子マーカーを使用して、３クローンの初期セットを選択する。図９Ａに、２種のＨＥＳＣ株（センダイ陽性対照と線維芽細胞陰性対照）および５回目と１０回目の継代の時点でアッセイしたＦＡＣＳでの選別に由来するｉＰＳ株の、ＨＫ遺伝子の発現に対して正規化した後の転写産物の値を示す。アッセイは全て、同様の条件で維持した正常なＨＥＳＣ株およびｉＰＳ株のパネルと比較して行う。このシステム上で、９６ウェルのＶ底プレート内で生成された胚様体の画像の例は示していない。矢印はＥＢを示す。図９Ｃに、さらに８３種の胚葉／分化系列マーカーを使用して、胚様体アッセイでの分化能をモニタリングする、本発明者らの品質管理スクリーニングの第二段階を図示している。単一のＥＢを作製して蓄え、胚様体得点表アッセイで胚葉マーカーの発現解析を行うためのＲＮＡを生成する。９つの異なる胚性幹細胞株から収集したＥＢにおける遺伝子発現のクラスターデンドログラム解析を示す。正規化した後、６つのＥＢを直接溶解して得られたデータを、大量培養から調製したＥＢから抽出・精製したトータルＲＮＡから生成したデータと好ましく比較する。
【０１３１】
図１０では、ＣＮＶに関するＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイに基づいた、ｉＰＳＣの高処理系での核型解析を示している。図１０Ａは、ＢＣ１ｉＰＳＣに関するｎＣｏｕｎｔｅｒ核型アッセイの例であり；図１０Ｂは、染色体腕の部分的な増加と減少を伴う１０１６線維芽細胞に関するｎＣｏｕｎｔｅｒ核型アッセイの例である。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰ ６．０チップのデータとの比較は、１番染色体のｑ腕の一部にコピー数の増加があること（上段、１ｑ２１．２〜１ｑ４３）、および６番染色体の長腕の一部にコピー数の減少があること（下段、６ｑ１６．３〜６ｑ２６）を示している。
【０１３２】
本発明の好ましい実施形態について説明してきたが、本発明はこれらの実施形態には限定されず、かつ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。
【図１】
0006257520.tif 000002
【図２】
0006257520.tif 000003
【図３】
0006257520.tif 000004
【図４Ａ】
0006257520.tif 000005
【図４Ｂ１】
0006257520.tif 000006
【図４Ｂ２】
0006257520.tif 000007
【図４Ｃ】
0006257520.tif 000008
【図５Ａ】
0006257520.tif 000009
【図５Ｂ】
0006257520.tif 000010
【図５Ｃ】
0006257520.tif 000011
【図６】
0006257520.tif 000012
【図７】
0006257520.tif 000013
【図８】
0006257520.tif 000014
【図９】
0006257520.tif 000015
【図１０】
0006257520.tif 000016