(57)【要約】  本発明は、タンパク質固定用ペプチドハイブリッドを用いたタンパク質単分子膜の製造方法に関するもので、詳細には、特定タンパク質に親和性を有して結合するオリゴペプチドにＰＥＧリンカー及び適切な反応基を導入して溶解度を改善し、固体基板の間に十分な空間を提供することで、多様な固体基板に特定タンパク質が効果的に結合するように製造されたタンパク質固定用ペプチドハイブリッドに関するものである。本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドは、多くの種類の固体上表面で抗体に配向性を付与して固定するのみならず、抗体の由来またはアイソタイプ別に異なる結合親和力を有して抗体を固定することができるので、本発明のハイブリッドを用いた表面処理技術は、多様な免疫センサー及び免疫チップの製作に利用可能である。
2010540620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定タンパク質に対する親和性を有する長さ７ないし１７アミノ酸からなるオリゴペプチド及び前記オリゴペプチドに共有結合で連結されたＰＥＧからなる、タンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項２】
前記タンパク質が、抗体であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項３】
前記オリゴペプチドが、長さ１３ないし１７アミノ酸からなることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項４】
前記オリゴペプチドが、配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項５】
前記ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）が、分子量６０ないし３０００であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項６】
前記ハイブリッドが、下記構造式１ないし３で表わされることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
＜構造式１＞
Ｈ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯＸＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ−ＣＯＮＨ2
（ｎ＝１〜５０；Ｘ＝ＤＤ、ＤＥ、ＥＥまたはＥＤ；Ｃ＊：ジスルフィド結合；ＸＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ：配列番号１ないし４；配列番号１：ＤＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号２：ＤＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号３：ＥＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号４：ＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ）
＜構造式２＞
（ＲＴＹ）4Ｋ2ＫＧＮＨＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ２2Ｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ2
（ｎ＝１〜５０；（ＲＴＹ）4Ｋ2ＫＧ：構造式４）
＜構造式３＞
Ｈ2ＮＧＨＷＲＧＷＶＳ−ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−Ｃｙｓ−ＮＨ2
（ｎ＝１〜５０；ＧＨＷＲＧＷＶＳ：配列番号５）
＜構造式４＞
【化１】
2010540620.tif 000006
【請求項７】
前記ハイブリッドが、構造式１で表わされることを特徴とする請求項６に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項８】
前記ハイブリッドが、下記構造式１ａで表わされることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
＜構造式１ａ＞
Ｈ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ−ＣＯＮＨ2
（Ｃ＊：ジスルフィド結合；ＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ：配列番号４）
【請求項９】
１）カルボキシル基を含む固体基板のカルボキシル基を活性化させる工程と、
２）請求項１ないし請求項８のいずれか一項のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを、工程１）のカルボキシル基が活性化した固体基板に付着させる表面処理工程と、
３）工程２）の表面処理された固体基板にタンパク質を結合させる工程と
からなるタンパク質単分子膜の製造方法。
【請求項１０】
前記固体基板が、ＣＭ−５  Ａｕセンサーチップ、磁性微細粒子、ガラス板、金ナノ粒子、ＰＬＧＡなどの生分解性有機高分子ナノ粒子または各種（マイクロ）ウェルプレートからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項８のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドのいずれか一つで表面処理されたタンパク質固定用基板。
【請求項１２】
請求項６ないし請求項８のいずれか一項のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理された固体基板に、前記ハイブリッドを媒介にして抗体が固定された免疫センサー。
【請求項１３】
請求項１２の免疫センサーに固定された抗体に試料を加えて、前記抗体と前記抗体に特異的に結合する抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程を含む、抗原の検出方法。
【請求項１４】
前記抗原抗体反応検出が、ＳＰＲ、酵素免疫分析、蛍光プローブを用いた蛍光分析法によって行われることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原に特異的に結合する抗体発色酵素コンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記発色酵素によって発色反応する基質を加えて前記発色を測定することによって行われることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記発色酵素が、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）及びルシフェラーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原に特異的に結合する抗体蛍光プローブコンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記蛍光を測定することによって行われることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光プローブが、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びローダミンからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１）前記免疫センサーに固定された抗体に特異的に結合する抗原を加えた後に洗浄する工程と、
２）工程１）の洗浄された免疫センサーに試料を加えた後に洗浄する工程と、
３）前記抗体と抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程と
を含む、試料中の抗体の検出方法。
【請求項２０】
工程３）の抗原抗体反応検出が、ＳＰＲ、酵素免疫分析、蛍光プローブを用いた蛍光分析法によって行われることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程３）が、前記抗体に結合する２次抗体発色酵素コンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記発色酵素によって発色反応する基質を加えて前記発色を測定することによって行われることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記発色酵素が、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）及びルシフェラーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程３）が、前記抗体に結合する２次抗体蛍光プローブコンジュゲートを結合させて洗浄した後に前記蛍光を測定することによって行われることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光プローブが、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びローダミンからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質固定用ペプチドハイブリッドを用いたタンパク質単分子膜の製造方法に関するもので、詳細には、特定タンパク質に親和性を有して結合するオリゴペプチドにＰＥＧリンカー及び適切な反応基を導入して溶解度を改善し、固体基板の間に十分な空間を提供することで多様な固体基板に特定タンパク質が効果的に結合するように製造されたタンパク質固定用ペプチドハイブリッドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応を用いた免疫センサー、タンパク質チップ、診断キットなどの応用分野で、抗体は大部分多様な無機性（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ）固体物質表面に固定化された形態で使用される。抗体固有の結合特性及び活性を損なわずに抗体の抗原結合部位が表面によく露出するように、配向性を調節しながら多様な固体基板に抗体を単分子膜形態で固定化させる技術は、チップやセンサーの検出感度と直接的に関連するので非常に重要である。
【０００３】
現在まで固体基質表面に抗体を固定させる方法は、物理的吸着またはタンパク質の共有結合に依存している。しかし、このような方法で抗体を固定すると、たびたびタンパク質の変性、無作為的な配向性（Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）、抗体の無作為的な化学的修飾等によって抗原との結合力が減少するという問題が発生する。
【０００４】
このような問題点を克服するために、抗体と特異的に結合する微生物由来の抗体結合タンパク質（プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／ＧまたはプロテインＬ）を用いた抗体固定化技術が開発されてきた。前記タンパク質は、抗原抗体反応に関与しない抗体の特定部位に強く結合して、該当の抗体を固体基板に固定させることによって抗原のアプローチを容易にする。また、前記タンパク質と抗体との結合には別途の化学的修飾が必要ではないので、抗体の固有機能を害さないという長所がある。しかし、抗体結合タンパク質を固体基板に固定させる過程でタンパク質の配向性の調節が難しく、抗体の固定効率を最適化するのに問題があった。そこで最近では、遺伝子工学的な方法及び化学的方法で抗体結合タンパク質を改変することによって、前記問題を克服する研究に焦点が合わせられている。
【０００５】
このような抗体結合タンパク質を用いた抗体固定化方法は、物理的吸着に比べて色々な長所があることはあるが、これもタンパク質なので各種物理・化学的環境に対して敏感に反応して変性することが憂慮されるので、長期保存が難しいという問題がある。また、場合によって、タンパク質の特定部位に化学的修飾が必要な場合、所望する部位に特異的に反応させることがほとんど不可能であるという問題もある。このような問題点を克服できる方法として、固体基板に対する固定が容易で安定性が高い低分子物質を用いる抗体固定化方法の開発が切望されている。そこで、デンドリマー、鉄イオンまたはカリックスクラウン（ｃａｌｉｘｃｒｏｗｎ）誘導体等を用いた抗体固定化方法が開発されたが、前記の方法は、抗体に対する配向性調節及び選択性なしにすべての種類のタンパク質に同程度の結合を示し、結合力も非常に強くすることができないという短所がある。
【０００６】
そこで、本発明者等は、既存の抗体結合タンパク質や抗体固定用低分子物質の短所を克服できる新しい形態のタンパク質固定用低分子物質を開発するために、広範囲の文献の調査を通じて、抗体分離用吸着材料及び抗体結合を通じて疾病治療目的に既に使用されている低分子物質を検索した。その中から、比較的選択的に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に結合する３種類のペプチド分子を候補物質として選定した（ＤｅＬａｎｏ  ＷＬ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年，第２８７巻，ｐ．１２７９−１２８３；Ｙａｎｇ  Ｈ等，Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ，２００６年，第６６（Ｓｕｐｐｌ．１）巻，ｐ．１２０−１３７；Ｆａｓｓｉｎａ  Ｇ等，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，１９９８年，第１１巻，ｐ．１２８−１３３）。前記ペプチドの化学構造改変を通じてタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを完成した後、前記タンパク質固定用ペプチドハイブリッドによる免疫センサー、及び抗体チップ製造用固体基板での抗体及び抗原に対する結合能力を確認することで本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、抗体固定時に発生する固体基板への非特異的な結合を減少させ、抗体の配向性を調節して均一な表面特性を有するバイオチップや免疫センサー開発に利用することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、特定タンパク質に対する親和性を有する長さ７ないし１７アミノ酸からなるオリゴペプチド及び前記オリゴペプチドに共有結合で連結されたＰＥＧからなるタンパク質固定用ハイブリッドを提供する。
【０００９】
また、本発明は、
１）カルボキシル基を含む固体基板のカルボキシル基を活性化させる工程と、
２）本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを、工程１）のカルボキシル基が活性化した固体基板に付着させる表面処理工程と、
３）工程２）の表面処理された固体基板にタンパク質を結合させる工程と
からなるタンパク質単分子膜の製造方法、及びそれによって製造された本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたタンパク質固定用基板を提供する。
【００１０】
また、本発明は、本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理された固体基板に、前記ハイブリッドを媒介にして抗体が固定された免疫センサーを提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記免疫センサーに固定された抗体に試料を加えて、前記抗体と前記抗体に特異的に結合する抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程を含む、抗原の検出方法を提供する。
【００１２】
同時に、本発明は、
１）前記免疫センサーに固定された抗体に特異的に結合する抗原を加えた後、洗浄する工程と、
２）工程１）の洗浄された免疫センサーに試料を加えた後、洗浄する工程と、
３）前記抗体と抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程と
を含む、試料中の抗体の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドは、多くの種類の固体表面上で抗体に配向性を付与して固定することだけではなく、抗体の由来またはサブタイプ別に異なる結合親和力を有して抗体を固定できるので、本発明のハイブリッドを用いた表面処理技術は、多様な免疫センサー及び免疫チップの製作に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドが固体基板に抗体を固定する原理を示した図である。
【図２】本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたデキストランＣＭ−５  Ａｕセンサーチップに、ヒト、ウサギ、マウス及びヤギ由来抗体及びＢＳＡを適用させながら、表面プラズモン共鳴法によって結合程度を測定した結果を示した図：  ａ：構造式１のハイブリッドで表面処理されたチップでの結果、及び  ｂ：構造式２のハイブリッドで表面処理されたチップでの結果。
【図３】本発明の１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたデキストランＣＭ−５  Ａｕセンサーチップにヒト及びマウス由来抗体を適用させながら、表面プラズモン共鳴法によって結合程度を測定した結果を示した図：  ａ：ヒト由来抗体ＨＩｇＧ１、ＨＩｇＧ２、ＨＩｇＧ３を適用させながら表面プラズモン共鳴法によって結合程度を測定した結果、及び  ｂ：マウス由来抗体ＭＩｇＧＡ、ＭＩｇＧ１、ＭＩｇＧ２、ＭＩｇＧ３を適用させながら表面プラズモン共鳴法によって結合程度を測定した結果。
【図４】本発明の１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドとヒト、ウサギ、マウス及びヤギ由来抗体と間の結合親和力を示した図：  ａ：本発明の１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたデキストランＣＭ−５  Ａｕセンサーチップに、ヒトＩｇＧ１（ａｎｔｉ  ＣＲＰ）抗体を１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ及び１，０００ｎＭの濃度で適用させながら、表面プラズモン共鳴法によって結合程度を測定した結果、及び  ｂ：本発明の１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドとＨＩｇＧ１、ウサギＩｇＧ、ＭＩｇＧ３抗体の結合親和力。
【図５】本発明の１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたデキストランＣＭ−５  Ａｕセンサーチップに固定された抗体の抗原結合程度を測定した結果を示した図である。
【図６】１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップ上に固定された抗ＣＲＰ抗体チップ（ペプチドハイブリッド−抗−ＣＲＰ）と、化学的方法に固定された抗−ＣＲＰ抗体チップ（化学的抗−ＣＲＰ）との抗原抗体結合力を比べた図である。
【図７】１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理された磁性微細粒子にヒト、マウス、ヤギ及びウサギ由来抗体を適用させた後、結合程度をＰＡＧＥで分析した結果を示した図である。
【図８】１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたガラス板に、ヒト、マウス、ヤギ及びウサギ由来抗体を適用させた後、結合程度をＰＡＧＥで分析した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１６】
本発明は、特定タンパク質に対する親和性を有する長さ７ないし１７アミノ酸からなるオリゴペプチド及び前記オリゴペプチドに共有結合で連結されたＰＥＧからなるタンパク質固定用ハイブリッドを提供する。
【００１７】
前記タンパク質は、当業者が所望するすべてのタンパク質が許容され、特に、医療、研究用及び産業用タンパク質、例えば、抗原、抗体、細胞受容体、酵素、構造タンパク質、血清、細胞タンパク質からなる群から選択される生物学的活性を有する多様なタンパク質を挙げることができ、抗体であることが好ましい。前記タンパク質が抗体の場合、前記オリゴペプチドは抗体のＦｃに対する親和性を有するものである。
【００１８】
本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドは、多くの種類の固体表面上に前記タンパク質を配向性を有して固定するために、長さ７ないし１７アミノ酸からなるものであり得、長さ１３ないし１７アミノ酸からなるものであることが好ましい。また、前記ペプチドは、構造式１ないし３で表わされるペプチドハイブリッドの部分構造として含まれる配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列（配列番号１：ＤＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号２：ＤＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号３：ＥＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号４：ＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；構造式４：（ＲＴＹ）4Ｋ2ＫＧ；配列番号５：ＧＨＷＲＧＷＶＳ，Ｃ＊：ジスルフィド結合）を有することができる（表１参照）。前記ペプチドは、ヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部位と結合することが知られている（ＤｅＬａｎｏ  ＷＬ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年，第２８７巻，ｐ．１２７９−１２８３；Ｙａｎｇ  Ｈ等，Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ，２００６年，第６６（Ｓｕｐｐｌ．１）巻，ｐ．１２０−１３７；Ｆａｓｓｉｎａ  Ｇ等，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，１９９８年，第１１巻，ｐ．１２８−１３３）。
【００１９】
構造式１
Ｈ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯＸＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ−ＣＯＮＨ2
（ｎ＝１〜５０；Ｘ＝ＤＤ、ＤＥ、ＥＥまたはＥＤ；Ｃ＊：ジスルフィド結合；ＸＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ：配列番号１ないし４；配列番号１：ＤＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号２：ＤＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号３：ＥＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号４：ＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ）
【００２０】
構造式２
（ＲＴＹ）4Ｋ2ＫＧＮＨＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ２2Ｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ2
（ｎ＝１〜５０；（ＲＴＹ）4Ｋ2ＫＧ：構造式４）
【００２１】
構造式３
Ｈ2ＮＧＨＷＲＧＷＶＳ−ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−Ｃｙｓ−ＮＨ2
（ｎ＝１〜５０；ＧＨＷＲＧＷＶＳ：配列番号５）
【００２２】
構造式４
【化１】
2010540620.tif 000003
【００２３】
前記ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）は、分子量が６０ないし３０００であることが好ましい。ＰＥＧを導入するように設計されたペプチドハイブリッドは、水を用いた緩衝溶液でのハイブリッドの溶解度を改善して、配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドと固体基板との間に十分な空間を提供することにより、抗体が効果的に結合できる空間を提供できる（図１参照）。
【００２４】
本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドは、多様な化学的修飾が可能であり、好ましくは表１の配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む構造式１ないし３で表わされるタンパク質固定用ペプチドハイブリッドであり得、最も好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドを含む構造式１ａで表わされるタンパク質固定用ペプチドハイブリッドである。
【００２５】
構造式１ａ
Ｈ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ−ＣＯＮＨ2
（Ｃ＊：ジスルフィド結合；ＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ：配列番号４）
【００２６】
前記化学的修飾は、光反応性機能グループや、チオール特異性機能グループ（マレイミドなど）、ビオチン、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＩＤＡ（イミノ二酢酸）、マルトースまたは特定反応性機能グループ（ジエン、ジエノフィル）などを含むディールス・アルダー反応基質によって多様に可能である。本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドは、前記化学的修飾を通じてタンパク質の付加結合または特定生理活性物質のコンジュゲーションなどに利用でき、このような修飾は、以後に抗体治療剤開発に適用されて特定化合物、生理活性ペプチド及びタンパク質のような治療物質や放射性アイソトープを癌細胞のような所望する部位に運ぶのに、非常に有用に用いることができる。また、本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドは、前記タンパク質が抗体の場合、本発明の好ましい実施例で抗体の由来またはサブタイプ別に異なる結合程度を有して抗体を固定できる。構造式１で表わされたタンパク質固定用ペプチドの場合、ヒト及びウサギ由来抗体と強く結合でき（図２ａ参照）、特に構造式１ａで表わされるタンパク質固定用ペプチドの場合、ヒト由来ＨＩｇＧ１（Ｋd＝８５ｎＭ）及びＨＩｇＧ２並びにウサギ由来のＩｇＧ（Ｋd＝３０５ｎＭ）と強く結合できる（図３及び図４参照）。
【００２７】
また、本発明は、
１）カルボキシル基を含む固体基板のカルボキシル基を活性化させる工程と、
２）本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを工程１）の固体基板に付着させる表面処理工程と、
３）工程２）の表面処理された固体基板にタンパク質を結合させる工程と
からなるタンパク質単分子膜の製造方法、及びそれによって製造された本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたタンパク質固定用基板を提供する。
【００２８】
前記固体基板は、ＣＭ−５  Ａｕセンサーチップ、磁性微細粒子、ガラス板、金ナノ粒子、ＰＬＧＡなど生分解性有機高分子ナノ粒子または各種（マイクロ）ウェルプレート（（ｍｉｃｒｏ）ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）からなる群から選択されるいずれか一つであり得る。前記固体基板は、カルボキシル基を有することを特徴とするが、前記カルボキシル基を活性化させると、本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドの末端アミノ基と反応して前記ハイブリッドを固定できる。本発明の表面処理によって固体基板は、配向性が調節されるようにタンパク質を結合させることができ、固体基板表面の均一性を増加させることができる。本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを用いたタンパク質単分子膜の製造方法は、前記タンパク質が抗体の場合、既存の抗体結合タンパク質（プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／ＧまたはプロテインＬ）を用いた方法と比較して、物理的・化学的に安定して、多様な化学的修飾が可能でその用途が非常に広範囲であるだけでなく、既存の低分子化合物を用いた方法と比較しても、抗体に対する非常に高い選択性と結合力を示すことをその特徴とする。
【００２９】
前記ハイブリッドは、好ましくは表１の配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む構造式１ないし３で表わされたタンパク質固定用ペプチドハイブリッドであり得、最も好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドを含む構造式１ａで表わされたタンパク質固定用ペプチドハイブリッドである。
【００３０】
前記抗体は、ヒト、ウサギ、マウスまたはヤギ由来免疫グロブリンＧであり得、構造式１ａで表わされるタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理される場合、抗体は、ヒト由来またはウサギ由来免疫グロブリンＧであることが好ましい。
【００３１】
本発明の方法で表面処理された多様な固体基板は、多様な抗体を固定化できる。本発明の方法で１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを用いて表面処理されたＣＭ−５  Ａｕセンサーチップ（図２ないし図６参照）、磁性微細粒子（図７参照）及びガラス板（図８参照）に共通して、ヒト由来及びウサギ由来のＩｇＧが効果的に固定化され、マウス及びヤギ由来のＩｇＧはよく結合しないことを確認した。また、本発明の方法は、微細粒子を基盤とするバイオセンサーの構築にも利用でき、ガラス板表面処理後、室温で数ヶ月保管後にも、よく維持された抗体結合能力を有し得ることが立証された。
【００３２】
また、本発明は、本発明のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理された固体基板に、前記ハイブリッドを媒介にして抗体が固定された免疫センサーを提供する。
【００３３】
本発明の１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップ上に抗ＣＲＰ抗体を固定した後、抗原であるＣＲＰを流しながら、抗原抗体結合程度を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定した結果、抗−ＣＲＰ抗体が抗原であるＣＲＰと結合することを確認した（図５参照）。また、ペプチドで処理したチップ表面が非常に安定しているので、２０ｍＭ  ＮａＯＨで表面を洗浄してペプチド部分を再生した後、再び抗体と抗原の結合に用いても、抗体結合能力に大きな影響を与えないことを観察した。
【００３４】
１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップ上に固定された抗−ＣＲＰ抗体チップと、化学的方法でチップ上に固定された抗−ＣＲＰ抗体チップの抗原抗体結合力とを比較した結果、１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップ上に固定された抗−ＣＲＰ抗体チップが、化学的方法で固定された抗−ＣＲＰ抗体チップよりも、約１．６倍さらに効果的にＣＲＰと結合することを確認した（図６参照）。
【００３５】
また、本発明は、前記免疫センサーに固定された抗体に試料を加えて、前記抗体と前記抗体に特異的に結合する抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程を含む、抗原の検出方法を提供する。
【００３６】
前記免疫センサーは、カルボキシル基が活性化した固体基板をタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理した後、検出しようとする抗原に特異的な抗体を固定化させることによって得られる。
【００３７】
前記抗原抗体反応検出は、ＳＰＲ、酵素免疫分析、蛍光プローブを用いた蛍光分析法によって行なうことができる。前記抗原に特異的に結合する抗体発色酵素コンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記発色酵素によって発色反応する基質を加えた後、前記発色を測定することで行なうことができる。前記発色酵素は、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）及びルシフェラーゼからなる群から選択できるが、これらに限定されない。また、前記抗原に特異的に結合する抗体蛍光プローブコンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記蛍光を測定することによって行なうことができる。前記蛍光プローブは、６−ＦＡＭ、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群から選択されるいずれか一つであり得るが、これらに限定されない。
【００３８】
前記抗原抗体反応の検出は、前記免疫センサーの固体基板の種類によって変化し得る。すなわち、前記固体基板がＣＭ−５  Ａｕセンサーチップの場合、前記免疫センサーに抗原を一定速度で注入しながら表面プラズモン共鳴法によって抗原抗体結合の程度を測定できる。また、前記固体基板が磁性微細粒子の場合、前記磁性微細粒子自体を緩衝溶液でボイルした後、ＰＡＧＥ法で確認した（図７参照）。同時に、前記固体基板がガラス板の場合、抗体蛍光プローブコンジュゲートをペプチド表面に処理することにより、抗体からの蛍光を測定して確認した（図８参照）。
【００３９】
同時に、本発明は、
１）前記免疫センサーに固定された抗体に特異的に結合する抗原を加えた後に洗浄する工程と、
２）工程１）の洗浄された免疫センサーに試料を加えた後、洗浄する工程と、
３）前記抗体と抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程と
を含む、試料中の抗体の検出方法を提供する。
【００４０】
前記工程３）の抗原抗体反応検出は、ＳＰＲ、酵素免疫分析、蛍光プローブを用いた蛍光分析法によって行うことができる。工程３）は、前記抗体に結合する２次抗体発色酵素コンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記発色酵素によって発色反応する基質を加えた後、前記発色を測定することにより行うことができる。前記発色酵素は、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）及びルシフェラーゼからなる群から選択できるが、これらに限定されない。また工程３）は、前記抗体に結合する２次抗体蛍光プローブコンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記蛍光を測定することによって行うことができる。前記蛍光プローブは、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５  及びローダミンからなる群から選択されるいずれか一つであり得るが、これらに限定されない。
【００４１】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００４２】
但し、下記実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるのではない。
【００４３】
＜実施例１＞ペプチドハイブリッドの製造
本発明者等は、表１の配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む構造式１ないし３で表わされるペプチドハイブリッドからタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを製造した。
【００４４】
下記表１の配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む構造式１ないし３で表わされるペプチドハイブリッドの部分構造に含まれている配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列（配列番号１：ＤＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号２：ＤＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号３：ＥＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号４：ＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；構造式４：（ＲＴＹ）4Ｋ2ＫＧ；配列番号５：ＧＨＷＲＧＷＶＳ，Ｃ＊：ジスルフィド結合）を有するペプチドは、ヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部位と結合することが知られている（ＤｅＬａｎｏ  ＷＬ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年，第２８７巻，ｐ．１２７９−１２８３；Ｙａｎｇ  Ｈ等，Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ，２００６年，第６６（Ｓｕｐｐｌ．１）巻，ｐ．１２０−１３７；Ｆａｓｓｉｎａ  Ｇ等，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ，１９９８年，第１１巻，ｐ．１２８−１３３）。水を用いた緩衝溶液でのハイブリッドの溶解度を改善して、配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドと固体基板との間に十分な空間を提供することによって抗体が効果的に結合するようにするために、前記ハイブリッドにＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を導入するように設計した。設計されたペプチドハイブリッドは、固相合成法で合成され、ＨＰＬＣ分析の結果、９７％の純度に精製された製品をＢｉｏＦｕｔｕｒｅ（韓国）から購入して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を通じてその構造を確認した。
【００４５】
＜構造式１＞
Ｈ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯＸＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ−ＣＯＮＨ2
（ｎ＝１〜５０；Ｘ＝ＤＤ、ＤＥ、ＥＥまたはＥＤ；Ｃ＊：ジスルフィド結合；ＸＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ：配列番号１ないし４；配列番号１：ＤＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号２：ＤＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号３：ＥＥＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ；配列番号４：ＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ）
【００４６】
＜構造式１ａ＞
Ｈ2Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ−ＣＯＮＨ2
（Ｃ＊：ジスルフィド結合；配列番号４：ＥＤＤＣ＊ＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣ＊Ｔ）
【００４７】
＜構造式２＞
（ＲＴＹ）4Ｋ2ＫＧＮＨＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＣＨ2ＣＨ２2Ｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ2
（ｎ＝１〜５０；（ＲＴＹ）4Ｋ2ＫＧ：構造式４）
【００４８】
＜構造式３＞
Ｈ2ＮＧＨＷＲＧＷＶＳ−ＮＨ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−Ｃｙｓ−ＮＨ2
（ｎ＝１〜５０；ＧＨＷＲＧＷＶＳ：配列番号５）
【００４９】
＜構造式４＞
【化２】
2010540620.tif 000004
【００５０】
【表１】
2010540620.tif 000005
【００５１】
＜実施例２＞抗体試料及び試薬の準備
ヒト（ＨＩｇＧ１、ＨＩｇＧ２、ＨＩｇＧ３）、ウサギ、マウス（ＭＩｇＧＡ、ＭＩｇＧ１、ＭＩｇＧ２、ＭＩｇＧ３）、ヤギなど多様な由来及び異なるアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）を有する様々な免疫グロブリンＧと、抗体固定に用いた（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、エタノールアミン、無水コハク酸−ＤＭＦなどの溶液は、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）から購入した。Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びウサギ抗−ＣＲＰ抗体は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米国）から購入し、抗体標識に用いたＣｙ３−モノ  ＮＨＳ  エステルは、ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、韓国）から購入した。表面プラズモン共鳴の測定のためのＣＭ−５  Ａｕセンサーチップは、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（スウェーデン）から、磁性微細粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅTM  カルボン酸）は、ＤＹＮＡＬ（米国）から、ガラス板はコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ、韓国）から購入した。
【００５２】
＜実施例３＞デキストランチップ上に配向性固定されたタンパク質固定用ペプチドハイブリッドの抗体結合力
＜３−１＞タンパク質固定用ペプチドハイブリッドの配向性固定化
表面にカルボキシル基を有する固体基板に実施例１で得たタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを固定化した。
【００５３】
デキストランＣＭ−５  Ａｕセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン）上に、０．２Ｍ  ＥＤＣと０．０５Ｍ  ＮＨＳとを混合したＰＢＳ緩衝溶液を７μｌ／分の速度で流して、センサーチップ表面のカルボキシル基を活性化させた。続いて、１００μＭのペプチドハイブリッドを含むＰＢＳ緩衝液を同一速度で３０分間流した。前記ペプチドハイブリッドは、ＮＨＳエステル形態で活性化したセンサーチップ上で末端アミノ基の反応を通じて結合した。最後に、前記ペプチドハイブリッドと反応しない未反応表面を、ｐＨ８．５、１Ｍエタノールアミノ溶液を用いて不活性化させた。
【００５４】
＜３−２＞抗体結合力の測定
実施例３−１の方法で得たタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップと実施例２の抗体とを結合させた。
【００５５】
実施例２の多様な動物細胞由来抗体または対照群のＢＳＡを５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ緩衝溶液に含むように製作された抗体溶液及び対照群を、１０μｌ／分の速度で実施例３−１のチップ表面のペプチドハイブリッドと結合させて、結合程度をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器を用いて表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定した。
【００５６】
その結果、構造式１で表わされるタンパク質固定用ペプチドハイブリッドは、多様な種類の抗体と強く結合することを示したが（図２ａ）、構造式２ないし３で表わされたタンパク質固定用ペプチドハイブリッドは、２００ＲＵ以下の低い反応値を示した（図２ｂ）。
【００５７】
特に、構造式１ａ（構造式１で、ｎ＝２、Ｘ＝ＥＤ）で表わされたハイブリッド（以下、１ａ）処理の場合、ヒト由来ＩｇＧ（ＨＩｇＧ１ないし３の混合組成物）及びウサギ由来のＩｇＧは、ほとんど飽和状態（１２０００ＲＵ）で結合することが示された。しかし、前記１ａは、マウス（ＭＩｇＧ１ないし３の混合組成物）及びヤギ由来の抗体とは微量のみ結合して、抗体ではない他のタンパク質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とは結合しないことが確認された（図２ａ）。
【００５８】
さらに、ヒト由来のＨＩｇＧ１及びＨＩｇＧ２は、１ａで表面処理されたチップ上に効果的に結合する一方で、ＨＩｇＧ３の場合は、微量のみが結合することを確認した（図３ａ）。一方、マウス由来の抗体では、ＭＩｇＧ３はある程度結合するが、ＭＩｇＧＡ、ＭＩｇＧ１及びＭＩｇＧ２は、ほとんど結合しなかった（図３ｂ）。
【００５９】
＜３−３＞１ａの結合親和度測定
実施例３−１ないし３−２で抗体結合力が確認された１ａと抗体の間の結合親和力を測定した。
【００６０】
実施例３−１の１ａが表面処理されたチップ上に実施例３−２の方法でＨＩｇＧ１、ウサギＩｇＧ、ＭＩｇＧ３抗体を、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ及び１，０００ｎＭの濃度で含む抗体溶液を、１０μｌ／分の速度で実施例３−１のチップ表面のペプチドハイブリッドと結合させて、結合程度をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器を用いて表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定した。
【００６１】
その結果、点線で表記したＳＰＲセンサーグラム実験値を得た。前記実験値は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００に内蔵されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて非線形回帰法（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）で分析し、実線で表記した理論的グラフを得た（図４ａ）。前記理論的グラフから図４ｂに提示された動力学定数を得ることができ、それぞれの点線と該当の実線がよく一致することから、計算結果が正確であることが分かった。
【００６２】
また、１ａがヒト由来のＨＩｇＧ１と強力に結合して（Ｋd＝８５ｎＭ）、ウサギ由来のＩｇＧとは多少低い結合親和力を有することを確認した（Ｋd＝３０５ｎＭ）（図４ｂ）。すなわち、１ａハイブリッドを利用すると、抗体を由来またはアイソタイプ別に結合程度を異なるように調節してチップ表面に固定できることを確認した。
【００６３】
＜実施例４＞１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドによって固定された抗体の抗原結合力
１ａハイブリッドによって固定された抗体の抗原結合力を測定した。
【００６４】
＜４−１＞抗原抗体結合確認
実施例３−１の方法で得た１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップ上に、ウサギ抗−ＣＲＰ抗体を５μｇ／ｍｌの濃度で含むＰＢＳ緩衝溶液を、１０μｌ／分の速度で流しながら固定した後、同一濃度のＣＲＰを含むＰＢＳ緩衝溶液を流しながら、抗原抗体結合程度をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器を用いて表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定した。２０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液を用いてチップ表面を再生させて、抗原抗体結合測定実験を繰り返した。
【００６５】
その結果、抗−ＣＲＰ抗体が抗原であるＣＲＰとよく結合することを確認した（図５）。また、ペプチドで処理したチップ表面が非常に安定しているので、２０ｍＭ  ＮａＯＨで表面を洗浄してペプチド部分を再生した後、再び抗体と抗原の結合に用いても抗体結合能力に大きく影響を与えないことを確認した。
【００６６】
＜４−２＞配向性調節に対する抗原抗体結合
デキストランＣＭ−５  Ａｕセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン）上に、０．２Ｍ  ＥＤＣと０．０５Ｍ  ＮＨＳとを混合した緩衝溶液を７μｌ／分の速度で流して、センサーチップ表面のカルボキシル基を活性化させた。続いて、５μｇ／ｍｌの抗−ＣＲＰ抗体を含むＰＢＳ緩衝液を同一速度で３０分間流した。前記抗体は、ＮＨＳエステル形態で活性化したセンサーチップの上で、末端アミノ基の反応を通じて結合した。最後に、前記抗体と反応しない未反応表面を、ｐＨ８．５、１Ｍエタノールアミン溶液を用いて不活性化させた。
【００６７】
前記方法で得た化学的方法で固定された抗−ＣＲＰ抗体チップと、実施例３−１の方法で得た１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップ上に固定された抗−ＣＲＰ抗体チップに、５μｇ／ｍｌの抗原であるＣＲＰを含むＰＢＳ緩衝溶液を１０μｌ／分の速度で流しながら、抗原抗体結合程度をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器を用いて表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定した。
【００６８】
その結果、１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理されたチップ上に固定された抗−ＣＲＰ抗体チップが、化学的方法で固定された抗−ＣＲＰ抗体チップと比較して、ＣＲＰと約１．６倍さらに効果的に結合した（図６）。
【００６９】
＜実施例５＞磁性微細粒子に配向性固定された１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドの抗体結合力
＜５−１＞１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドの配向性固定化
表面にカルボキシル基を有する磁性微細粒子に、実施例１で得て実施例３によって抗体結合力が確認された１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを固定化した。
【００７０】
カルボキシル基を有する磁性微細粒子に、ＮＨＳ（０．４Ｍ）、ＥＤＣ（０．２Ｍ）を含むｐＨ６、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝溶液を適用して表面を活性化した。磁石を用いて磁性微細粒子のみを回収し、活性化した磁性微細粒子を０．２ｍｇ／ｍｌ濃度の１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドと室温で１時間反応させた。対照群には、活性化した磁性微細粒子とＰＢＳのみを反応させた。未反応の活性エステル基は、ｐＨ８．５、１Ｍ  エタノールアミンを用いて不活性化させた。１ａが付かない磁性微細粒子及び１ａが導入された磁性微細粒子は、ＰＢＳを用いて反覆洗浄した後、最終濃度が５ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ緩衝溶液に希釈した。
【００７１】
＜５−２＞抗体結合力の測定
１ａが導入された磁性微細粒子と抗体との結合を確認するために、磁性微細粒子の最終濃度は２ｍｇ／ｍｌ、実施例３−２で用いたものと同一の抗体は０．１ｍｇ／ｍｌになるように混合した後、結合を誘導した。室温で１時間反応させた後、磁石を用いて磁性微細粒子を容器の底に引き寄せながら上澄み液を除去した後、再び緩衝液で５回反覆希釈して、反応しない抗体をすべて除去した。続いて、抗体を含んだ磁性微細粒子を、還元剤（２−メルカプトエタノール）を含むＰＡＧＥサンプル緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）に入れて加熱し、抗体鎖を微細粒子で分離させた後、ＰＡＧＥで分析した。
【００７２】
磁性微細粒子に結合した抗体の量は、１０％ＳＤＳを含む１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。２％微細粒子ＰＢＳ緩衝液、各２０μｌを５μｌのサンプル緩衝液（ｐＨ６．８；６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５％グリセロール、２％ＳＤＳ、１４．４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１％ブロモフェノールブルー、Ｈ2Ｏ）と混合した後、９０℃で１０分間加熱後、１５μｌのサンプルを取ってポリアクリルアミドゲル上の各ウェル（ｗｅｌｌ）に移した。常温で一時間２００Ｖの一定電圧を加えてサンプルを移動させた後、ゲルを染色溶液（０．５％クーマシーブルー、４５％メタノール、１０％酢酸水溶性溶液）に浸して、常温で３０分間染色した後、脱色溶液（１０％メタノール、１０％酢酸水溶性溶液）に移して、常温で３時間ゆっくり振盪して過量の染色試薬を洗浄、除去した。
【００７３】
その結果、ＰＢＳで反覆洗浄後にも、１ａ抗体結合用ペプチドハイブリッドで表面処理された磁性微細粒子に結合した抗体が結合していることを確認した（図７）。また、実施例３の結果と同様に、前記１ａが導入された磁性微細粒子は、ヒト由来のＨＩｇＧ及びウサギ由来のＩｇＧに効果的に結合するが、マウス及びヤギ由来のＩｇＧとはよく結合しないことを確認した。
【００７４】
＜実施例６＞ガラス板に配向性固定された１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドの抗体結合力
１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドの抗体結合力を測定した。
【００７５】
＜６−１＞１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッドの配向性固定化
ガラス板を９５％の硫酸と５％の過酸化水素（容積比３：１）との混合溶液で６０℃で３０分間処理した後、蒸留水とエタノールで洗浄した。洗浄したガラス板を１％ＡＰＴＳに浸して、室温で４時間反応させてアミノ基を導入した。アミノ基が導入されたガラス板を１Ｍ  無水コハク酸−ＤＭＦ溶液中で３７℃で４時間反応させて、ガラス板上にカルボキシル基を生成させた。ガラス板を蒸留水及びエタノールで洗浄して、窒素ガスを用いて乾燥した後、真空乾燥器に入れて保管した。カルボキシル基が導入されたガラス板を、０．１Ｍ  ＥＤＣと０．０２５Ｍ  ＮＨＳとの混合溶液で１５分間処理して表面を活性化した。活性化したガラス板は、蒸留水で洗浄して窒素ガスで乾燥させた。１ａタンパク質固定用ペプチドハイブリッド溶液の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるように、４０％グリセロールを含むＰＢＳ緩衝溶液に溶解して、１μｌずつをガラス板上に点滴して２時間反応させた。ガラス板に残っている未反応活性型のエステルは、ｐＨ８．５、１Ｍエタノールアミンを用いて不活性化させ、ＰＢＳ緩衝溶液で洗浄した。
【００７６】
＜６−２＞抗体結合力の測定
１ａが導入されたガラス板と抗体との結合を、Ｃｙ３に標識された抗体を用いてその結合力を確認した。
【００７７】
まず、ＨＩｇＧ（ＨＩｇＧ１ないしＨＩｇＧ３の混合物）、ＭＩｇＧ（ＭＩｇＧ１ないしＭＩｇＧ３の混合物）、ウサギＩｇＧ及びヤギＩｇＧのＰＢＳ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）各１００μｌに、３．３４ｍＭ  Ｃｙ３−モノＮＨＳエステル−ＤＭＦ溶液５μｌを加えて常温で３０分間反応させた後、すぐにミニゲルカラム（ＰＤ−１０  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，米国）に通過させて過量の蛍光染料を除去して、タンパク質部分のみを取って次の実験に用いた。前記Ｃｙ３で標識された抗体を、０．０１％ツイーン２０と０．１μｇ／ｍｌ  ＢＳＡとを含むＰＢＳ緩衝溶液で最終１ｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。
【００７８】
１ａが導入されたガラス板上に、前記Ｃｙ３で標識された抗体溶液を５０μｌずつ点滴して常温で１時間反応させた後、ＰＢＳＴ、ＰＢＳ及び蒸留水を用いて順番に洗浄して、窒素ガスを用いて乾燥した後、ＧｅｎＰｉｘ  ４２００（Ａｘｏｎ，米国）カメラを用いてガラス板に残っている蛍光イメージを観察した。
【００７９】
その結果、１ａが導入されたガラス板上にヒト及びウサギ由来の抗体がよく結合する一方で、マウス及びヤギ由来の抗体はよく結合しないことが分かった（図８）。
【００８０】
また、１ａが導入されたガラス板を室温で数ヶ月間保管した後にも、抗体と結合する能力が維持されたことから、前記表面処理が非常に安定した構造からなるものであることが分かった。
【図２】
2010540620.tif 000007
【図３】
2010540620.tif 000008
【図４】
2010540620.tif 000009
【図５】
2010540620.tif 000010
【図１】
2010540620.tif 000011
【図６】
2010540620.tif 000012
【図７】
2010540620.tif 000013
【図８】
2010540620.tif 000014
【配列表】
2010540620000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月7日(2010.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定タンパク質に対する親和性を有する長さ７ないし１７アミノ酸からなるオリゴペプチド及び前記オリゴペプチドに共有結合で連結されたＰＥＧからなる、タンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項２】
前記タンパク質が、抗体であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項３】
前記オリゴペプチドが、長さ１３ないし１７アミノ酸からなることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項４】
前記オリゴペプチドが、配列番号１ないし５及び構造式４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項５】
前記ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）が、分子量６０ないし３０００であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項６】
前記ハイブリッドが、下記構造式１ないし３で表わされることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
＜構造式１＞
2010540620.tif 000015
＜構造式２＞
2010540620.tif 000016
＜構造式３＞
2010540620.tif 000017
＜構造式４＞
【化１】
2010540620.tif 000018
【請求項７】
前記ハイブリッドが、構造式１で表わされることを特徴とする請求項６に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
【請求項８】
前記ハイブリッドが、下記構造式１ａで表わされることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一項に記載のタンパク質固定用ペプチドハイブリッド。
＜構造式１ａ＞
2010540620.tif 000019
【請求項９】
１）カルボキシル基を含む固体基板のカルボキシル基を活性化させる工程と、
２）請求項１ないし請求項８のいずれか一項のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドを、工程１）のカルボキシル基が活性化した固体基板に付着させる表面処理工程と、
３）工程２）の表面処理された固体基板にタンパク質を結合させる工程と
からなるタンパク質単分子膜の製造方法。
【請求項１０】
前記固体基板が、ＣＭ−５  Ａｕセンサーチップ、磁性微細粒子、ガラス板、金ナノ粒子、ＰＬＧＡなどの生分解性有機高分子ナノ粒子または各種（マイクロ）ウェルプレートからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項８のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドのいずれか一つで表面処理されたタンパク質固定用基板。
【請求項１２】
請求項６ないし請求項８のいずれか一項のタンパク質固定用ペプチドハイブリッドで表面処理された固体基板に、前記ハイブリッドを媒介にして抗体が固定された免疫センサー。
【請求項１３】
請求項１２の免疫センサーに固定された抗体に試料を加えて、前記抗体と前記抗体に特異的に結合する抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程を含む、抗原の検出方法。
【請求項１４】
前記抗原抗体反応検出が、ＳＰＲ、酵素免疫分析、蛍光プローブを用いた蛍光分析法によって行われることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原に特異的に結合する抗体発色酵素コンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記発色酵素によって発色反応する基質を加えて前記発色を測定することによって行われることを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発色酵素が、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）及びルシフェラーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原に特異的に結合する抗体蛍光プローブコンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記蛍光を測定することによって行われることを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光プローブが、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びローダミンからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１）前記免疫センサーに固定された抗体に特異的に結合する抗原を加えた後に洗浄する工程と、
２）工程１）の洗浄された免疫センサーに試料を加えた後に洗浄する工程と、
３）前記抗体と抗原との間の抗原抗体反応を検出する工程と
を含む、試料中の抗体の検出方法。
【請求項２０】
工程３）の抗原抗体反応検出が、ＳＰＲ、酵素免疫分析、蛍光プローブを用いた蛍光分析法によって行われることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程３）が、前記抗体に結合する２次抗体発色酵素コンジュゲートを結合させて洗浄した後、前記発色酵素によって発色反応する基質を加えて前記発色を測定することによって行われることを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記発色酵素が、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）及びルシフェラーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程３）が、前記抗体に結合する２次抗体蛍光プローブコンジュゲートを結合させて洗浄した後に前記蛍光を測定することによって行われることを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光プローブが、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びローダミンからなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【国際調査報告】
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