(57)【要約】本発明は細胞増殖の調節に関する。より具体的には、本発明はＷｎｔ経路の阻害剤、並びにＷｎｔ経路シグナル伝達の活性化を特徴とする障害の診断および治療におけるその使用、並びにＷｎｔ経路シグナル伝達により媒介される細胞事象の調節に関する。本発明はＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質又はＲｏｒ蛋白質から誘導されたＦｒｚドメイン成分、及び、Ｆｃ免疫グロブリン成分を含むキメラＷｎｔ拮抗体、ならびに、癌を包含する細胞性Ｗｎｔシグナル伝達障害及びＷｎｔ媒介障害の治療及び診断的検出におけるその使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記成分：
（ａ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分、及び、
（ｂ）Ｆｃドメイン、
を含むＷｎｔ拮抗体であって、
該Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分が（ｉ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）蛋白質、（ｉｉ）分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質（ｓＦＲＰ）、及び（ｉｉｉ）Ｒｏｒ蛋白質よりなる群から選択される蛋白質由来のポリペプチドを含み、そして、
更にＷｎｔ拮抗体が少なくとも１時間インビボで活性であるＷｎｔ拮抗体。
【請求項２】
前記Ｗｎｔ拮抗体が少なくとも５時間インビボで活性である請求項１記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項３】
（ａ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分、及び、
（ｂ）Ｆｃドメイン、
を含むＷｎｔ拮抗体であって、
該Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分が（ｉ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）蛋白質、（ｉｉ）分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質（ｓＦＲＰ）、及び（ｉｉｉ）Ｒｏｒ蛋白質よりなる群から選択される蛋白質由来のポリペプチドを含み、そして、
更に該Ｗｎｔ拮抗体が少なくとも１日のインビボ半減期を有するＷｎｔ拮抗体。
【請求項４】
前記Ｗｎｔ拮抗体が少なくとも２日のインビボ半減期を有する請求項３記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項５】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分がｈＦｒｚ１（配列番号１８）、ｈＦｒｚ２（配列番号１９）、ｈＦｒｚ３（配列番号２０）、ｈＦｒｚ４（配列番号２１）、ｈＦｒｚ５（配列番号２２）、ｈＦｒｚ６（配列番号２３）、ｈＦｒｚ７（配列番号２４）、ｈＦｒｚ８（配列番号２５）、ｈＦｒｚ９（配列番号２６）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号２７）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＦｒｚポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む請求項１〜４の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項６】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分がｓＦＲＰ１（配列番号２８）、ｓＦＲＰ２（配列番号２９）、ｓＦＲＰ３（配列番号３０）、ｓＦＲＰ４（配列番号３１）、及びｓＦＲＰ５（配列番号３２）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるｓＦＲＰポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む請求項１〜４の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項７】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分がｈＲｏｒ１（配列番号３３）、及びｈＲｏｒ２（配列番号３４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＲｏｒポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む請求項１〜４の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項８】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分がｈＦｒｚ１（配列番号５０）、ｈＦｒｚ２（配列番号５１）、ｈＦｒｚ３（配列番号５２）、ｈＦｒｚ４（配列番号５３）、ｈＦｒｚ５（配列番号５４）、ｈＦｒｚ６（配列番号５５）、ｈＦｒｚ７（配列番号５６）、ｈＦｒｚ８（配列番号５７）、ｈＦｒｚ９（配列番号５８）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号５９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｆｒｚポリペプチドを含む請求項１〜４の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項９】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分がｓＦＲＰ１（配列番号６０）、ｓＦＲＰ２（配列番号６１）、ｓＦＲＰ３（配列番号６２）、ｓＦＲＰ４（配列番号６３）、及びｓＦＲＰ５（配列番号６４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟ｓＦｒｐポリペプチドを含む請求項１〜４の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項１０】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分がｈＲｏｒ１（配列番号６５）、及びｈＲｏｒ２（配列番号６６）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｒｏｒポリペプチドを含む請求項１〜４の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項１１】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分がｈＦｒｚ１（配列番号３５）、ｈＦｒｚ２（配列番号３６）、ｈＦｒｚ３（配列番号３７）、ｈＦｒｚ４（配列番号３８）、ｈＦｒｚ５（配列番号３９）、ｈＦｒｚ６（配列番号４０）、ｈＦｒｚ７（配列番号４１）、ｈＦｒｚ８（配列番号４２）、ｈＦｒｚ９（配列番号４３）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号４４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロＦｒｚポリペプチドを含む請求項１〜４の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項１２】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分がｓＦＲＰ１（配列番号４５）、ｓＦＲＰ２（配列番号４６）、ｓＦＲＰ３（配列番号４７）、ｓＦＲＰ４（配列番号４８）、及びｓＦＲＰ５（配列番号４９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロｓＦｒｐポリペプチドを含む請求項１〜４の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項１３】
Ｆｃ成分がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４よりなる群から選択される免疫グロブリンに由来する請求項１〜１２の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項１４】
ＦｃがＩｇＧ１免疫グロブリンに由来する請求項１３に記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項１５】
前記Ｆｃが配列番号６７又は配列番号６８に示すＦｃ配列を含む請求項１４に記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項１６】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分をＦｃドメインに連結するリンカーを更に含む請求項１〜１５の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項１７】
前記リンカーがＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号６９）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号７１）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号７２）、及びＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号７３）よりなる群から選択されるペプチドを含む請求項１６に記載のＷｎｔ拮抗体。
【請求項１８】
【化３３】
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よりなる群から選択されるポリペプチドを含むＷｎｔ拮抗体。
【請求項１９】
少なくとも１つの製薬上許容しうる担体又は賦形剤及び請求項１〜１８の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体の何れかを含む組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８に記載のＷｎｔ拮抗体の何れかをコードする核酸配列。
【請求項２１】
核酸が作動可能に連結している制御配列を含有するベクターを更に含む請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
宿主細胞を更に含む請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
哺乳動物、昆虫、大腸菌及び酵母細胞よりなる群から選択される請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１９に記載の組成物及び容器を含む製造物品であって、Ｗｎｔ拮抗体は容器内に含有され、そして該容器は更に（ａ）該容器に固定されたラベル、又は（ｂ）Ｗｎｔ媒介障害の治療処置又は診断検出のための組成物の使用を指示するＷｎｔ拮抗体の使用に言及した該容器内の添付文書（パッケージインサート）を含む製造物品。
【請求項２５】
有効量の請求項１〜１８に記載のＷｎｔ拮抗体の何れかに細胞を接触させることを含む細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害する方法。
【請求項２６】
前記細胞が哺乳動物内に含有され、そして投与される量が治療有効量である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｗｎｔシグナル伝達が体細胞突然変異を介したＷｎｔシグナル伝達成分の活性化に起因する請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
Ｗｎｔシグナル伝達の阻害は、細胞の増殖の阻害をもたらす請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が癌細胞である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｗｎｔ媒介障害をそれに罹患した哺乳動物において治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜１８の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体を哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記障害が異常なＷｎｔシグナル伝達活性に関連する細胞増殖性障害である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記異常なＷｎｔシグナル伝達活性がＷｎｔ蛋白質の増大した発現に起因する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞増殖性障害が癌である請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌が結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、神経膠腫、及び髄芽細胞腫よりなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１８の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体に試料を接触させることを含む、Ｗｎｔ蛋白質の存在を検出するための方法であって、（ａ）複合体の存在、又は（ｂ）Ｆｚ／Ｆｃ拮抗体とＷｎｔ蛋白質との間の結合レベルがＷｎｔ蛋白質及び／又はシグナル伝達の存在を示す方法。
【請求項３６】
更にＷｎｔシグナル伝達のレベルが異常であるかどうかを決定することを含み、更に試料中の結合レベルを生理学的に正常なＷｎｔシグナル伝達を有することが分かっている第２の試料中のレベルと比較することを含み、試料中の結合のレベルが第２の試料中の結合のレベルより高値又は低値であることが異常なＷｎｔシグナル伝達を示すものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記異常なＷｎｔシグナル伝達が更にＷｎｔ媒介障害の存在を示すものである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｗｎｔ媒介障害が癌である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
有効量の請求項１〜１８の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体に細胞を接触させることを含む、活性化された、又は過剰なＷｎｔシグナル伝達を特徴とする細胞におけるＷｎｔ標的遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項４０】
治療有効量の請求項１〜１８の何れかに記載のＷｎｔ拮抗体を投与することを含む、Ｗｎｔ媒介癌を治療処置する方法であって、拮抗体の投与が、何れのその後の癌のサイズ増大又は重症度の進行を停止させる方法。
【請求項４１】
前記Ｗｎｔ拮抗体の投与が癌のサイズ又は重症度の低減をもたらす請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｗｎｔ拮抗体の投与が癌の腫瘍負荷量を低減する請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｗｎｔ拮抗体の投与が癌を殺傷する請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
細胞増殖性障害の治療のための医薬の製造におけるＷｎｔ拮抗体の使用であって、該Ｗｎｔ拮抗体が：
（ａ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分、及び、
（ｂ）Ｆｃドメイン、
を含み、
該Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分が（ｉ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）蛋白質、（ｉｉ）分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質（ｓＦＲＰ）、及び（ｉｉｉ）Ｒｏｒ蛋白質よりなる群から選択される蛋白質に由来するポリペプチドを含み、そして、
更に該Ｗｎｔ拮抗体が少なくとも１時間インビボで活性である使用。
【請求項４５】
前記Ｗｎｔ拮抗体が少なくとも５時間インビボで活性である請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
細胞増殖性障害の治療のための医薬の製造におけるＷｎｔ拮抗体の使用であって、該Ｗｎｔ拮抗体が：
（ａ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分、及び、
（ｂ）Ｆｃドメイン、
を含み、
該Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分が（ｉ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）蛋白質、（ｉｉ）分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質（ｓＦＲＰ）、及び（ｉｉｉ）Ｒｏｒ蛋白質よりなる群から選択される蛋白質に由来するポリペプチドを含み、そして、
更に該Ｗｎｔ拮抗体が少なくとも１日のインビボ半減期を有する上記使用。
【請求項４７】
前記Ｗｎｔ拮抗体が少なくとも２日のインビボ半減期を有する請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分を前記Ｆｃドメインに連結するリンカーを更に含む請求項４４〜４７の何れかに記載の使用。
【請求項４９】
前記リンカーがＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号６９）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号７１）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号７２）、及びＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号７３）よりなる群から選択されるペプチドである請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記細胞増殖性障害が癌である請求項４４〜４９の何れかに記載の使用。
【請求項５１】
前記癌が結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、神経膠腫、及び髄芽細胞腫よりなる群から選択される請求項５０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本願は、２００６年９月８日に出願された米国仮特許出願第６０／８２５，０６３号および２００７年７月２０日に出願された同第６０／９５１，１７５号に対する優先権および利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８２５，０６３号および同第６０／９５１，１７５号の両方は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して細胞増殖の調節に関する。より具体的には、本発明はＷｎｔ経路の阻害剤、並びにＷｎｔ経路シグナル伝達の活性化を特徴とする障害の診断および治療におけるその使用、並びにＷｎｔ経路シグナル伝達により媒介される細胞事象の調節に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の発癌との関連は特定のネズミ乳腺腫瘍における早期の観察及び実験の結果として開始された。Ｗｎｔ−１プロトオンコジーンはウィルスＤＮＡ配列の挿入によりマウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）により誘導される乳腺腫瘍から当初は発見されている。非特許文献１。そのようなウィルス組み込みの結果は腫瘍の形成をもたらすＩｎｔ−１の未調節発現であった。非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４。その後の配列分析によれば、Ｉｎｔ−１は発生に関与することが示唆されていたショウジョウバエの遺伝子であるＷｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｇ）の哺乳動物相同体であったことが明らかにされ、そして用語はそこで組み合わせられ、この蛋白質ファミリーを識別するために「Ｗｎｔ」が造語された。
【０００４】
分泌リガンドのヒトＷｎｔ遺伝子ファミリーは現在では少なくとも１９メンバーが計上されている（例えば
【０００５】
【化１】
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【０００６】
【化２】
2010504081.tif 000004
）。各メンバーは種々の程度の配列同一性を有するが、全てが高度に保存されたスペーシングを示す２３〜２４の保存されたシステイン残基を含有する。非特許文献５；非特許文献６。Ｗｎｔ蛋白質は小型（即ち３９〜４６ｋＤａ）のアシル化された分泌糖蛋白質であり、胚発生及び成熟組織の両方において重要な役割を果たしている。胎生学的な発生の間、Ｗｎｔ蛋白質の発現は細胞増殖の制御及び幹細胞の運命の決定を介したパターンニングにおいて重要となる。Ｗｎｔ分子はまたパルミトイル化されるため、アミノ酸配列単独の分析により別様に予測されるよりもより疎水性である。非特許文献７。パルミトイル化の部位はまた、機能のためにも必須であると考えられる。
【０００７】
Ｗｎｔ蛋白質は７回通過膜貫通受容体のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）ファミリーを活性化するリガンドとして作用する。非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０。Ｆｒｚファミリーには１０種の既知メンバー（例えばＦｒｚ１、Ｆｒｚ２、Ｆｒｚ３、・・・Ｆｒｚ１０）が存在し、各々がシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の存在を特徴としている。非特許文献１１。種々のＷｎｔ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ相互作用の間には多大な程度の無差別性が存在するが、Ｗｎｔ−Ｆｒｚ結合は活性なシグナル伝達複合体を形成するためにｈＬＤＬ受容体関連蛋白質（ＬＲＰ５及びＬＲＰ６）及び膜及び細胞質蛋白質ディスヘベルド（Ｄｓｈ）を組み込む必要もある。
【０００８】
ＷｎｔからＦｒｉｚｚｌｅｄへの結合はカノニカルなＷｎｔシグナル伝達経路を介してβ−カテニンの安定化及び増大した転写活性をもたらす［非特許文献１２；非特許文献１３］か、或いは、非カノニカルなシグナル伝達、例えばＷｎｔ／平面細胞極性（Ｗｎｔ／ＰＣＰ）又はＷｎｔ−カルシウム（Ｗｎｔ／Ｃａ２＋）経路を介するかの何れかにより、シグナル伝達を活性化できる。非特許文献１４。
【０００９】
カノニカルなＷｎｔシグナル伝達経路はＷｎｔシグナル伝達経路のうちで最も癌の発生に関連している。非特許文献１５。この経路の正常な活性化は蛋白質β−カテニンの安定化及び上昇したレベルを最終的にもたらす一連の下流の事象を開始させる。この蛋白質は通常は不活性な細胞質蛋白質であり、そしてｅ−カドヘリンを包含する蛋白質に結合した細胞膜において観察される。Ｗｎｔリガンドの不在下においては、ホスホリル化細胞質β−カテニンは通常は急速に分解される。カノニカルな経路の活性化により、未ホスホリル化β−カテニンが核に輸送され、そこでそれは更に種々の標的遺伝子の転写活性化をもたらす。これらの標的遺伝子の転写におけるその後のアップレギュレーションは細胞の変化をもたらし、続いてそのような標的遺伝子の未調節の発現が腫瘍の発生をもたらす。異常なＷｎｔシグナル伝達は発癌における必要な前駆体であると考えられるため、Ｗｎｔシグナル伝達の有効な阻害剤は癌治療薬として多大な関心を持たれている。
【００１０】
リガンド−受容体相互作用に対する拮抗体としての可溶性受容体の使用は当該分野で知られている。そのような分子はシグナル伝達経路の初期の受容体活性化工程を防止するような様式でそれらが遊離リガンドに結合するとき、有効な治療用拮抗体となり得る。Ｗｎｔへの結合を示すＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の可溶性最小細胞外ドメイン（ＥＣＤ）フラグメントが結晶学的データに基づいて識別されている。非特許文献１６。しかしながら、そのようなＦｒｉｚｚｌｅｄフラグメントはＷｎｔリガンドへの結合は示さなかったものの、そのようなフグはそれらがインビボで急速に分解されるために治療薬には不適当である。
【００１１】
潜在的なＷｎｔ拮抗体としての免疫グロブリンＦｃにカップリングさせた可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメインの使用が提案されている。非特許文献１７；非特許文献１８。しかしながら、本発明の前に、可溶性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体−Ｆｃ融合治療薬を創る試みは成功していない。例えば、Ｆｒｚ８ＣＲＤ（Ｆｒｚ（１７３）−Ｆｃ、配列番号１１３）の残基１〜１７３に基づいた１つのそのようなキメラは準最適な効能を有しており（図１２）、そしてインビボでは不安定であった（図１１）。更に、Ｆｒｚ（１７３）−Ｆｃキメラは腫瘍体積の増大の速度を低減したのみであった（開始腫瘍体積の縮小とは逆）。更に、Ｆｃ融合物の創生は一般的には生じる構築物のインビボの安定性を向上させるための１つの手法として知られているが、効果的な治療用のＦｃ構築物の作成は多くの問題、例えば新しい蛋白質構築物の不適切な蛋白質折り畳み及び標的に対する融合構築物の立体障害のために困難となる場合がある。
【００１２】
即ち、Ｗｎｔリガンド誘導細胞シグナル伝達を阻害するように作用する増大したインビボの安定性を有するＷｎｔ拮抗体治療薬が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｎｕｓｓｅ等、Ｃｅｌｌ１９８２；３１：９９−１０９
【非特許文献２】Ｖａｎｏｏｙｅｎ，Ａ．等、Ｃｅｌｌ１９８４；３９：２３３−２４０
【非特許文献３】Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．等、Ｎａｔｕｒｅ１９８４；３０７：１３１−１３６
【非特許文献４】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ等、Ｃｅｌｌ１９８８；５５：６１９−６２５
【非特許文献５】ＭｃＭａｈｏｎ，ＡＰ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２；８：２３６−２４２
【非特許文献６】Ｍｉｌｌｅｒ，ＪＲ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００２；３（１）：３００１．１−３００１．１５
【非特許文献７】Ｗｉｌｌｅｒｔ．Ｋ．等、Ｎａｔｕｒｅ２００３；４２３：４４８−５２
【非特許文献８】Ｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｗ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６：１２：３８２−３８４
【非特許文献９】ＹａｎｇＳｎｙｄｅｒ，Ｊ．等、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９９６；６：１３２０−１３０６
【非特許文献１０】Ｂｈａｎｏｔ，Ｐ．等、Ｎａｔｕｒｅ１９９６；３８２：２２５−２３０
【非特許文献１１】Ｈｕａｎｇ等、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：２３４．１−２３４．８
【非特許文献１２】Ｐｅｉｆｅｒ、Ｍ．等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１９９４；１２０：３６９−３８０
【非特許文献１３】Ｐａｐｋｏｆｆ，Ｊ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６；１６：２１２８−２１３４
【非特許文献１４】Ｖｅｅｍａｎ，Ｍ．Ｔ．等、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ２００３；５：３６７−３７７
【非特許文献１５】Ｉｌｙａｓ，Ｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００５；２０５：１３０−１４４
【非特許文献１６】Ｄａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ４１２：８６−９０（２９９１）
【非特許文献１７】Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｏｐｐｏｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｃｔ．２５，２００５
【非特許文献１８】Ｈｓｉｅｈ，Ｊ−Ｃ．等、ＰＮＡＳ，９６：３５４６−３５５１（１９９９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は組成物、及び癌などのＷｎｔ媒介障害を診断および治療する方法における、そして細胞性Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する場合におけるそれらの使用を提供する。具体的には、本発明はＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）蛋白質、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質（ｓＦＲＰ）又は他の蛋白質（例えばＲｏｒ−１、−２等）、及び免疫グロブリンＦｃドメインから誘導されるポリペプチドなどのＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分を含むキメラ分子であるＷｎｔ拮抗体、及びＷｎｔ媒介障害を診断及び治療する方法における、そして細胞性Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する場合におけるそれらの使用を提供する。
【００１５】
本発明の１つの態様は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分及びＦｃドメインを含むＷｎｔ拮抗体を提供する。Ｗｎｔ拮抗体のＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はＦｒｚ蛋白質、ＦＲＰ蛋白質、又はＲｏｒ蛋白質から誘導されるポリペプチドを含む。１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも５時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１日のインビボ半減期を有する。更に別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも２日のインビボ半減期を有する。
【００１６】
更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号１８）、ｈＦｒｚ２（配列番号１９）、ｈＦｒｚ３（配列番号２０）、ｈＦｒｚ４（配列番号２１）、ｈＦｒｚ５（配列番号２２）、ｈＦｒｚ６（配列番号２３）、ｈＦｒｚ７（配列番号２４）、ｈＦｒｚ８（配列番号２５）、ｈＦｒｚ９（配列番号２６）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号２７）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＦｒｚポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｓＦＲＰ１（配列番号２８）、ｓＦＲＰ２（配列番号２９）、ｓＦＲＰ３（配列番号３０）、ｓＦＲＰ４（配列番号３１）、及びｓＦＲＰ５（配列番号３２）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるｓＦＲＰポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＲｏｒ１（配列番号３３）、及びｈＲｏｒ２（配列番号３４）、及びそれらの活性な変異体よりなる群から選択されるＲｏｒポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。
【００１７】
なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号５０）、ｈＦｒｚ２（配列番号５１）、ｈＦｒｚ３（配列番号５２）、ｈＦｒｚ４（配列番号５３）、ｈＦｒｚ５（配列番号５４）、ｈＦｒｚ６（配列番号５５）、ｈＦｒｚ７（配列番号５６）、ｈＦｒｚ８（配列番号５７）、ｈＦｒｚ９（配列番号５８）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号５９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｆｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号６０）、ｓＦＲＰ２（配列番号６１）、ｓＦＲＰ３（配列番号６２）、ｓＦＲＰ４（配列番号６３）、及びｓＦＲＰ５（配列番号６４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟ｓＦｒｐポリペプチド、又はｈＲｏｒ１（配列番号６５）、及びｈＲｏｒ２（配列番号６６）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｒｏｒポリペプチドを含む。
【００１８】
なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号３５）、ｈＦｒｚ２（配列番号３６）、ｈＦｒｚ３（配列番号３７）、ｈＦｒｚ４（配列番号３８）、ｈＦｒｚ５（配列番号３９）、ｈＦｒｚ６（配列番号４０）、ｈＦｒｚ７（配列番号４１）、ｈＦｒｚ８（配列番号４２）、ｈＦｒｚ９（配列番号４３）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号４４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロＦｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号４５）、ｓＦＲＰ２（配列番号４６）、ｓＦＲＰ３（配列番号４７）、ｓＦＲＰ４（配列番号４８）、及びｓＦＲＰ５（配列番号４９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロｓＦｒｐポリペプチドを含む。
【００１９】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４よりなる群から選択される免疫グロブリンから誘導されるＦｃ成分を含む。別の実施形態においては、ＦｃはＩｇＧ１免疫グロブリンから誘導される。更に別の実施形態においては、Ｆｃ配列は配列番号６７又は配列番号６８に示すＦｃ配列を含む。
【００２０】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は更に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分をＦｃドメインに連結するリンカーを含む。１つのそのような実施形態において、リンカーはＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号６９）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号７１）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号７２）、及びＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号７３）などのペプチドリンカーである。
【００２１】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は
【００２２】
【化３】
2010504081.tif 000005
よりなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【００２３】
本発明の別の態様は少なくとも１つの製薬上許容しうる担体又は賦形剤及び上記したＷｎｔ拮抗体を含む組成物を提供する。
【００２４】
本発明の更に別の態様は上記したＷｎｔ拮抗体の何れかをコードする核酸配列を提供する。１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体をコードする核酸は更に、核酸が作動可能に連結する制御配列を含有するベクターを含む。別の実施形態においては、ベクターは哺乳動物、昆虫、大腸菌、又は酵母細胞などの宿主細胞中に含有される。
【００２５】
本発明の別の態様は少なくとも１つの製薬上許容しうる担体又は賦形剤、及び上記したＷｎｔ拮抗体を含む製造物品を提供し、該Ｗｎｔ拮抗体は容器中に含有され、該容器は更に（ａ）容器に固定されたラベル、又は（ｂ）Ｗｎｔ媒介障害の治療処置又は診断検出のための組成物の使用を指示するＷｎｔ拮抗体の使用に言及した容器内部の添付文書（パッケージインサート）を含む。
【００２６】
本発明の更に別の態様は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分及びＦｃドメインを含む有効量のＷｎｔ拮抗体に細胞を接触させることを含む、細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害する方法を提供する。Ｗｎｔ拮抗体のＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はＦｒｚ蛋白質、ＦＲＰ蛋白質、又はＲｏｒ蛋白質にから誘導されるポリペプチドを含む。１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも５時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１日のインビボ半減期を有する。更に別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも２日のインビボ半減期を有する。
【００２７】
この態様の更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号１８）、ｈＦｒｚ２（配列番号１９）、ｈＦｒｚ３（配列番号２０）、ｈＦｒｚ４（配列番号２１）、ｈＦｒｚ５（配列番号２２）、ｈＦｒｚ６（配列番号２３）、ｈＦｒｚ７（配列番号２４）、ｈＦｒｚ８（配列番号２５）、ｈＦｒｚ９（配列番号２６）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号２７）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＦｒｚポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｓＦＲＰ１（配列番号２８）、ｓＦＲＰ２（配列番号２９）、ｓＦＲＰ３（配列番号３０）、ｓＦＲＰ４（配列番号３１）、及びｓＦＲＰ５（配列番号３２）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるｓＦＲＰポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＲｏｒ１（配列番号３３）、及びｈＲｏｒ２（配列番号３４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＲｏｒポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。
【００２８】
なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分は（配列番号５０）、ｈＦｒｚ２（配列番号５１）、ｈＦｒｚ３（配列番号５２）、ｈＦｒｚ４（配列番号５３）、ｈＦｒｚ５（配列番号５４）、ｈＦｒｚ６（配列番号５５）、ｈＦｒｚ７（配列番号５６）、ｈＦｒｚ８（配列番号５７）、ｈＦｒｚ９（配列番号５８）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号５９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｆｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号６０）、ｓＦＲＰ２（配列番号６１）、ｓＦＲＰ３（配列番号６２）、ｓＦＲＰ４（配列番号６３）、及びｓＦＲＰ５（配列番号６４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟ｓＦｒｐポリペプチド、又はｈＲｏｒ１（配列番号６５）、及びｈＲｏｒ２（配列番号６６）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｒｏｒポリペプチドを含む。
【００２９】
なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号３５）、ｈＦｒｚ２（配列番号３６）、ｈＦｒｚ３（配列番号３７）、ｈＦｒｚ４（配列番号３８）、ｈＦｒｚ５（配列番号３９）、ｈＦｒｚ６（配列番号４０）、ｈＦｒｚ７（配列番号４１）、ｈＦｒｚ８（配列番号４２）、ｈＦｒｚ９（配列番号４３）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号４４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロＦｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号４５）、ｓＦＲＰ２（配列番号４６）、ｓＦＲＰ３（配列番号４７）、ｓＦＲＰ４（配列番号４８）、及びｓＦＲＰ５（配列番号４９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロｓＦＲＰポリペプチドを含む。
【００３０】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４よりなる群から選択される免疫グロブリンから誘導されるＦｃ成分を含む。別の実施形態においては、ＦｃはＩｇＧ１免疫グロブリンから誘導される。更に別の実施形態においては、Ｆｃ配列は配列番号６７又は配列番号６８に示される。
【００３１】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は更に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分をＦｃドメインに連結するリンカーを含む。１つの実施形態において、リンカーはＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号６９）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号７１）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号７２）、及びＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号７３）などのペプチドリンカーである。
【００３２】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は
【００３３】
【化４】
2010504081.tif 000006
よりなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【００３４】
本方法の１つの実施形態において、細胞は哺乳動物内に含有され、そして投与される量は治療有効量である。別の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達は体細胞突然変異を介したＷｎｔシグナル伝達成分の活性化に起因する。別の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害は細胞の成長の阻害をもたらす。更に別の実施形態においては、細胞は癌細胞である。
【００３５】
本発明の別の態様はＷｎｔ媒介障害をそれに罹患した哺乳動物において治療する方法であって、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分及びＦｃドメインを含む治療有効量のＷｎｔ拮抗体を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。Ｗｎｔ拮抗体のＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はＦｒｚ蛋白質、ＦＲＰ蛋白質、又はＲｏｒ蛋白質から誘導されるポリペプチドを含む。１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも５時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１日のインビボ半減期を有する。更に別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも２日のインビボ半減期を有する。
【００３６】
この態様の別の実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号１８）、ｈＦｒｚ２（配列番号１９）、ｈＦｒｚ３（配列番号２０）、ｈＦｒｚ４（配列番号２１）、ｈＦｒｚ５（配列番号２２）、ｈＦｒｚ６（配列番号２３）、ｈＦｒｚ７（配列番号２４）、ｈＦｒｚ８（配列番号２５）、ｈＦｒｚ９（配列番号２６）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号２７）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＦｒｚポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｓＦＲＰ１（配列番号２８）、ｓＦＲＰ２（配列番号２９）、ｓＦＲＰ３（配列番号３０）、ｓＦＲＰ４（配列番号３１）、及びｓＦＲＰ５（配列番号３２）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるｓＦＲＰポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＲｏｒ１（配列番号３３）、及びｈＲｏｒ２（配列番号３４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＲｏｒポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。
【００３７】
なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分は（配列番号５０）、ｈＦｒｚ２（配列番号５１）、ｈＦｒｚ３（配列番号５２）、ｈＦｒｚ４（配列番号５３）、ｈＦｒｚ５（配列番号５４）、ｈＦｒｚ６（配列番号５５）、ｈＦｒｚ７（配列番号５６）、ｈＦｒｚ８（配列番号５７）、ｈＦｒｚ９（配列番号５８）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号５９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｆｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号６０）、ｓＦＲＰ２（配列番号６１）、ｓＦＲＰ３（配列番号６２）、ｓＦＲＰ４（配列番号６３）、及びｓＦＲＰ５（配列番号６４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟ｓＦｒｐポリペプチド、又はｈＲｏｒ１（配列番号６５）、及びｈＲｏｒ２（配列番号６６）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｒｏｒポリペプチドを含む。
【００３８】
なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号３５）、ｈＦｒｚ２（配列番号３６）、ｈＦｒｚ３（配列番号３７）、ｈＦｒｚ４（配列番号３８）、ｈＦｒｚ５（配列番号３９）、ｈＦｒｚ６（配列番号４０）、ｈＦｒｚ７（配列番号４１）、ｈＦｒｚ８（配列番号４２）、ｈＦｒｚ９（配列番号４３）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号４４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロＦｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号４５）、ｓＦＲＰ２（配列番号４６）、ｓＦＲＰ３（配列番号４７）、ｓＦＲＰ４（配列番号４８）、及びｓＦＲＰ５（配列番号４９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロｓＦｒｐポリペプチドを含む。
【００３９】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４よりなる群から選択される免疫グロブリンから誘導されるＦｃ成分を含む。別の実施形態においては、ＦｃはＩｇＧ１免疫グロブリンから誘導される。なお更なる実施形態においては、Ｆｃ配列は配列番号６７又は配列番号６８に示される。
【００４０】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は更に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分をＦｃドメインに連結するリンカーを含む。１つの実施形態において、リンカーはＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号６９）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号７１）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号７２）、及びＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号７３）などのペプチドリンカーである。
【００４１】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は
【００４２】
【化５】
2010504081.tif 000007
よりなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【００４３】
本方法の１つの実施形態において、障害は異常なＷｎｔシグナル伝達活性に関連する細胞増殖性障害である。別の実施形態においては、異常なＷｎｔシグナル伝達活性はＷｎｔ蛋白質の増大した発現に起因する。更に別の実施形態においては、細胞増殖性障害は癌、例えば結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、神経膠腫、及び髄芽細胞腫である。
【００４４】
本発明のさらに別の態様は上記したＷｎｔ拮抗体に試料を接触させることを含む、Ｗｎｔ蛋白質の存在を検出するための方法であって、複合体の存在、又はＷｎｔ拮抗体とＷｎｔ蛋白質との間の結合レベルが、Ｗｎｔ蛋白質及び／又はシグナル伝達の存在を示す方法を提供する。１つの実施形態において、方法は更にＷｎｔシグナル伝達のレベルが異常であるかどうかを決定することを含み、方法は更に試料中の結合レベルを生理学的に正常なＷｎｔシグナル伝達を有することが分かっている第２の試料中のレベルと比較することを含む。試料中の結合のレベルが第２の試料中のものより高値又は低値であることは異常なＷｎｔシグナル伝達を示す。更に別の実施形態においては、異常なＷｎｔシグナル伝達は更にＷｎｔ媒介障害、例えば癌の存在を示す。
【００４５】
本発明の別の態様は、有効量の上記Ｗｎｔ拮抗体に細胞を接触させることを含む、活性化された、又は過剰なＷｎｔシグナル伝達を特徴とする細胞におけるＷｎｔ標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。
【００４６】
本発明の更に別の態様は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分及びＦｃドメインを含む、治療有効量のＷｎｔ拮抗体を投与することを含む、Ｗｎｔ媒介癌を治療処置する方法を提供する。Ｗｎｔ拮抗体のＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はＦｒｚ蛋白質、ＦＲＰ蛋白質、又はＲｏｒ蛋白質から誘導されるポリペプチドを含む。１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも５時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１日のインビボ半減期を有する。更に別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも２日のインビボ半減期を有する。
【００４７】
この態様の更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号１８）、ｈＦｒｚ２（配列番号１９）、ｈＦｒｚ３（配列番号２０）、ｈＦｒｚ４（配列番号２１）、ｈＦｒｚ５（配列番号２２）、ｈＦｒｚ６（配列番号２３）、ｈＦｒｚ７（配列番号２４）、ｈＦｒｚ８（配列番号２５）、ｈＦｒｚ９（配列番号２６）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号２７）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＦｒｚポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｓＦＲＰ１（配列番号２８）、ｓＦＲＰ２（配列番号２９）、ｓＦＲＰ３（配列番号３０）、ｓＦＲＰ４（配列番号３１）、及びｓＦＲＰ５（配列番号３２）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるｓＦＲＰポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＲｏｒ１（配列番号３３）、及びｈＲｏｒ２（配列番号３４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＲｏｒポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。
【００４８】
なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分は（配列番号５０）、ｈＦｒｚ２（配列番号５１）、ｈＦｒｚ３（配列番号５２）、ｈＦｒｚ４（配列番号５３）、ｈＦｒｚ５（配列番号５４）、ｈＦｒｚ６（配列番号５５）、ｈＦｒｚ７（配列番号５６）、ｈＦｒｚ８（配列番号５７）、ｈＦｒｚ９（配列番号５８）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号５９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｆｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号６０）、ｓＦＲＰ２（配列番号６１）、ｓＦＲＰ３（配列番号６２）、ｓＦＲＰ４（配列番号６３）、及びｓＦＲＰ５（配列番号６４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟ｓＦｒｐポリペプチド、又はｈＲｏｒ１（配列番号６５）、及びｈＲｏｒ２（配列番号６６）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｒｏｒポリペプチドを含む。
【００４９】
なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号３５）、ｈＦｒｚ２（配列番号３６）、ｈＦｒｚ３（配列番号３７）、ｈＦｒｚ４（配列番号３８）、ｈＦｒｚ５（配列番号３９）、ｈＦｒｚ６（配列番号４０）、ｈＦｒｚ７（配列番号４１）、ｈＦｒｚ８（配列番号４２）、ｈＦｒｚ９（配列番号４３）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号４４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロＦｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号４５）、ｓＦＲＰ２（配列番号４６）、ｓＦＲＰ３（配列番号４７）、ｓＦＲＰ４（配列番号４８）、及びｓＦＲＰ５（配列番号４９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロｓＦｒｐポリペプチドを含む。
【００５０】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４よりなる群から選択される免疫グロブリンから誘導されるＦｃ成分を含む。別の実施形態においては、ＦｃはＩｇＧ１免疫グロブリンから誘導される。更に別の実施形態においては、Ｆｃ配列は配列番号６７又は配列番号６８に示される。
【００５１】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は更に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分をＦｃドメインに連結するリンカーを含む。１つの実施形態において、リンカーはＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号６９）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号７１）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号７２）、及びＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号７３）などのペプチドリンカーである。
【００５２】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は
【００５３】
【化６】
2010504081.tif 000008
よりなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【００５４】
拮抗体の投与は何れかの後の癌のサイズ増大又は重症度進行を停止させる。１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体の投与は癌のサイズ又は重症度の低減をもたらす。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体の投与は癌の腫瘍負荷を低減する。更に別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体の投与は癌を殺傷する。
【００５５】
本発明の別の態様は、細胞増殖性障害の治療のための医薬の製造におけるＷｎｔ拮抗体の使用を提供する。Ｗｎｔ拮抗体はＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分及びＦｃドメインを含む。Ｗｎｔ拮抗体のＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はＦｒｚ蛋白質、ＦＲＰ蛋白質、又はＲｏｒ蛋白質から誘導されるポリペプチドを含む。１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも５時間インビボで活性である。別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも１日のインビボ半減期を有する。更に別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は少なくとも２日のインビボ半減期を有する。
【００５６】
この態様の更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号１８）、ｈＦｒｚ２（配列番号１９）、ｈＦｒｚ３（配列番号２０）、ｈＦｒｚ４（配列番号２１）、ｈＦｒｚ５（配列番号２２）、ｈＦｒｚ６（配列番号２３）、ｈＦｒｚ７（配列番号２４）、ｈＦｒｚ８（配列番号２５）、ｈＦｒｚ９（配列番号２６）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号２７）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＦｒｚポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｓＦＲＰ１（配列番号２８）、ｓＦＲＰ２（配列番号２９）、ｓＦＲＰ３（配列番号３０）、ｓＦＲＰ４（配列番号３１）、及びｓＦＲＰ５（配列番号３２）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるｓＦＲＰポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＲｏｒ１（配列番号３３）、及びｈＲｏｒ２（配列番号３４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるＲｏｒポリペプチド由来の最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインを含む。
【００５７】
なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分は（配列番号５０）、ｈＦｒｚ２（配列番号５１）、ｈＦｒｚ３（配列番号５２）、ｈＦｒｚ４（配列番号５３）、ｈＦｒｚ５（配列番号５４）、ｈＦｒｚ６（配列番号５５）、ｈＦｒｚ７（配列番号５６）、ｈＦｒｚ８（配列番号５７）、ｈＦｒｚ９（配列番号５８）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号５９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｆｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号６０）、ｓＦＲＰ２（配列番号６１）、ｓＦＲＰ３（配列番号６２）、ｓＦＲＰ４（配列番号６３）、及びｓＦＲＰ５（配列番号６４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟ｓＦｒｐポリペプチド、又はｈＲｏｒ１（配列番号６５）、及びｈＲｏｒ２（配列番号６６）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される成熟Ｒｏｒポリペプチドを含む。
【００５８】
なお更なる実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号３５）、ｈＦｒｚ２（配列番号３６）、ｈＦｒｚ３（配列番号３７）、ｈＦｒｚ４（配列番号３８）、ｈＦｒｚ５（配列番号３９）、ｈＦｒｚ６（配列番号４０）、ｈＦｒｚ７（配列番号４１）、ｈＦｒｚ８（配列番号４２）、ｈＦｒｚ９（配列番号４３）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号４４）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロＦｒｚポリペプチド、又はｓＦＲＰ１（配列番号４５）、ｓＦＲＰ２（配列番号４６）、ｓＦＲＰ３（配列番号４７）、ｓＦＲＰ４（配列番号４８）、及びｓＦＲＰ５（配列番号４９）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択されるプロｓＦｒｐポリペプチドを含む。
【００５９】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４よりなる群から選択される免疫グロブリンから誘導されるＦｃ成分を含む。別の実施形態においては、ＦｃはＩｇＧ１免疫グロブリンから誘導される。更に別の実施形態においては、Ｆｃ配列は配列番号６７又は配列番号６８に示される。
【００６０】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は更に、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分をＦｃドメインに連結するリンカーを含む。１つの実施形態において、リンカーはＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号６９）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号７１）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号７２）、及びＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号７３）などのペプチドリンカーである。
【００６１】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体は
【００６２】
【化７】
2010504081.tif 000009
よりなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【００６３】
１つの実施形態において、細胞増殖性障害は癌、例えば結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、白血病、神経膠腫、又は髄芽細胞腫である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は「オフ」即ち不活性状態、並びに「オン」即ち活性状態の両方におけるカノニカルなＷｎｔシグナル伝達経路の省略された概要である。
【図２】図２はヒト免疫グロブリンドメインのＦｃ領域に連結したＦｒｉｚｚｌｅｄ細胞外ドメインを示す模式的ダイアグラムである。
【図３Ａ】図３は１７種の既知のＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質細胞外ドメインのアライメントである。図３Ａは１０種のプロＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号３５〜４４）及び５種のプロｓＦＲＰ蛋白質（配列番号４５〜４９）の細胞外ドメインのアライメントを示し、図３Ｂは１０種の成熟Ｆｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号５０〜５９）及び５種の成熟ｓＦＲＰ蛋白質（配列番号６０〜６４）の細胞外ドメインのアライメント、並びに成熟Ｒｏｒ蛋白質（配列番号６５〜６６）の細胞外ドメインを示す。同様の残基は灰色で囲んであり、同一の残基はアスタリスクで示している。同様の残基は、酸性、塩基性、極性及び非極性として分類している。図３Ｂにおいて、最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインは２つの囲まれた矢印の線の間に示す（配列番号１８〜３４）。
【図３Ａ−１】図３は１７種の既知のＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質細胞外ドメインのアライメントである。図３Ａは１０種のプロＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号３５〜４４）及び５種のプロｓＦＲＰ蛋白質（配列番号４５〜４９）の細胞外ドメインのアライメントを示し、図３Ｂは１０種の成熟Ｆｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号５０〜５９）及び５種の成熟ｓＦＲＰ蛋白質（配列番号６０〜６４）の細胞外ドメインのアライメント、並びに成熟Ｒｏｒ蛋白質（配列番号６５〜６６）の細胞外ドメインを示す。同様の残基は灰色で囲んであり、同一の残基はアスタリスクで示している。同様の残基は、酸性、塩基性、極性及び非極性として分類している。図３Ｂにおいて、最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインは２つの囲まれた矢印の線の間に示す（配列番号１８〜３４）。
【図３Ａ−２】図３は１７種の既知のＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質細胞外ドメインのアライメントである。図３Ａは１０種のプロＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号３５〜４４）及び５種のプロｓＦＲＰ蛋白質（配列番号４５〜４９）の細胞外ドメインのアライメントを示し、図３Ｂは１０種の成熟Ｆｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号５０〜５９）及び５種の成熟ｓＦＲＰ蛋白質（配列番号６０〜６４）の細胞外ドメインのアライメント、並びに成熟Ｒｏｒ蛋白質（配列番号６５〜６６）の細胞外ドメインを示す。同様の残基は灰色で囲んであり、同一の残基はアスタリスクで示している。同様の残基は、酸性、塩基性、極性及び非極性として分類している。図３Ｂにおいて、最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインは２つの囲まれた矢印の線の間に示す（配列番号１８〜３４）。
【図３Ｂ】図３は１７種の既知のＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質細胞外ドメインのアライメントである。図３Ａは１０種のプロＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号３５〜４４）及び５種のプロｓＦＲＰ蛋白質（配列番号４５〜４９）の細胞外ドメインのアライメントを示し、図３Ｂは１０種の成熟Ｆｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号５０〜５９）及び５種の成熟ｓＦＲＰ蛋白質（配列番号６０〜６４）の細胞外ドメインのアライメント、並びに成熟Ｒｏｒ蛋白質（配列番号６５〜６６）の細胞外ドメインを示す。同様の残基は灰色で囲んであり、同一の残基はアスタリスクで示している。同様の残基は、酸性、塩基性、極性及び非極性として分類している。図３Ｂにおいて、最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインは２つの囲まれた矢印の線の間に示す（配列番号１８〜３４）。
【図３Ｂ−１】図３は１７種の既知のＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質細胞外ドメインのアライメントである。図３Ａは１０種のプロＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号３５〜４４）及び５種のプロｓＦＲＰ蛋白質（配列番号４５〜４９）の細胞外ドメインのアライメントを示し、図３Ｂは１０種の成熟Ｆｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号５０〜５９）及び５種の成熟ｓＦＲＰ蛋白質（配列番号６０〜６４）の細胞外ドメインのアライメント、並びに成熟Ｒｏｒ蛋白質（配列番号６５〜６６）の細胞外ドメインを示す。同様の残基は灰色で囲んであり、同一の残基はアスタリスクで示している。同様の残基は、酸性、塩基性、極性及び非極性として分類している。図３Ｂにおいて、最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインは２つの囲まれた矢印の線の間に示す（配列番号１８〜３４）。
【図３Ｂ−２】図３は１７種の既知のＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質細胞外ドメインのアライメントである。図３Ａは１０種のプロＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号３５〜４４）及び５種のプロｓＦＲＰ蛋白質（配列番号４５〜４９）の細胞外ドメインのアライメントを示し、図３Ｂは１０種の成熟Ｆｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質（配列番号５０〜５９）及び５種の成熟ｓＦＲＰ蛋白質（配列番号６０〜６４）の細胞外ドメインのアライメント、並びに成熟Ｒｏｒ蛋白質（配列番号６５〜６６）の細胞外ドメインを示す。同様の残基は灰色で囲んであり、同一の残基はアスタリスクで示している。同様の残基は、酸性、塩基性、極性及び非極性として分類している。図３Ｂにおいて、最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメインは２つの囲まれた矢印の線の間に示す（配列番号１８〜３４）。
【図４】図４はＦｒｚ（１５６）−Ｆｃ及びＦｒｚ（１７３）−Ｆｃキメラ構築物の配列を示す。図４Ａはより長いＦｒｚ（１７３）−Ｆｃ配列（配列番号１１３）を示す。太字で示してあるもの（即ち最初の２４個のＮ末端アミノ酸残基）はリーダーシグナル配列である。残基２５〜２７は成熟蛋白質中には存在しても不在でもよいアラニン残基である。箱で囲んだ文字で示すもの（即ち残基１５７〜１７３）はより短い（Ｆｒｚ１５６）キメラ構築物からより長い（Ｆｒｚ１７３）ものを区別するＦｒｚ８受容体の追加配列である。リンカー配列（即ち残基１７４〜１８２）は下線を付し、Ｆｃドメイン配列は斜体で示す（即ち残基１８３〜４０９）。図４Ｂはより短いＦｒｚ（１５６）−Ｆｃ（配列番号７４）を示す。太字で示してあるもの（即ち最初の２４個のＮ末端アミノ酸残基）はリーダーシグナル配列である。残基２５〜２７は成熟蛋白質中には存在しても不在でもよいアラニン残基である。リンカー配列（即ち残基１５７〜１６４）は下線を付し、Ｆｃドメイン配列は斜体で示す（即ち残基１６５〜３９１）。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｈは数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物をコードする核酸配列を示す
【化８】
2010504081.tif 000010
。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｈは数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物をコードする核酸配列を示す
【化８】
2010504081.tif 000011
。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｈは数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物をコードする核酸配列を示す
【化８】
2010504081.tif 000012
。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｈは数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物をコードする核酸配列を示す
【化８】
2010504081.tif 000013
。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｈは数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物をコードする核酸配列を示す
【化８】
2010504081.tif 000014
。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｈは数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物をコードする核酸配列を示す
【化８】
2010504081.tif 000015
。
【図５Ｇ】図５Ａ〜５Ｈは数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物をコードする核酸配列を示す
【化８】
2010504081.tif 000016
。
【図５Ｈ】図５Ａ〜５Ｈは数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物をコードする核酸配列を示す
【化８】
2010504081.tif 000017
。
【図６Ａ】図６Ａ〜６ＥはヒトＦｒｚ、ｓＦＲＰ、及びＲｏｒ蛋白質の全長アミノ酸配列を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６ＥはヒトＦｒｚ、ｓＦＲＰ、及びＲｏｒ蛋白質の全長アミノ酸配列を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６ＥはヒトＦｒｚ、ｓＦＲＰ、及びＲｏｒ蛋白質の全長アミノ酸配列を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６ＥはヒトＦｒｚ、ｓＦＲＰ、及びＲｏｒ蛋白質の全長アミノ酸配列を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ〜６ＥはヒトＦｒｚ、ｓＦＲＰ、及びＲｏｒ蛋白質の全長アミノ酸配列を示す。
【図７Ａ】図７（Ａ、Ｂ及びＣ）は数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物のアミノ酸配列を示す
【化９】
2010504081.tif 000018
。太字によるＦｒｚ１−Ｆｃ（最初の２８個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ２−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ３−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ４−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ５−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、及びｓＦＲＰ−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）は非ネイティブのリーダー配列を示す。リンカーは下線を付し、リンカーに続くＦｃドメインは斜体で示す。
【図７Ｂ】図７（Ａ、Ｂ及びＣ）は数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物のアミノ酸配列を示す
【化９】
2010504081.tif 000019
。太字によるＦｒｚ１−Ｆｃ（最初の２８個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ２−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ３−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ４−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ５−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、及びｓＦＲＰ−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）は非ネイティブのリーダー配列を示す。リンカーは下線を付し、リンカーに続くＦｃドメインは斜体で示す。
【図７Ｃ】図７（Ａ、Ｂ及びＣ）は数種のＷｎｔ拮抗体キメラ構築物のアミノ酸配列を示す
【化９】
2010504081.tif 000020
。太字によるＦｒｚ１−Ｆｃ（最初の２８個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ２−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ３−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ４−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、Ｆｒｚ５−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）、及びｓＦＲＰ−Ｆｃ（最初の３１個のＮ末端アミノ酸残基）は非ネイティブのリーダー配列を示す。リンカーは下線を付し、リンカーに続くＦｃドメインは斜体で示す。
【図８】図８はＦｒｉｚｚｌｅｄ細胞外ドメインのアライメントを示し、ここで黒色は全受容体に渡って保存された残基を示し、灰色は相同な群に渡って保存された残基を示す。
【図９】図９は全長及び細胞外ドメインの配列の実体の両方に基づいてファミリーに群分けされたＦｒｉｚｚｌｅｄを示す。
【図１０】図１０はＣＨＯ細胞から発現及び精製された精製ＦｒｉｚｚｌｅｄＦｃ融合蛋白質の試料を示す。試料は非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分離し、クーマシー染色により画像化した。
【図１１Ａ】図１１は２種の異なるＦｒｚ８−ＦｃキメラＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃ及びＦｒｚ（（１５６）−Ｆｃの血清中の安定性の比較を示す。図１１Ａはキメラを注射した無胸腺ヌードマウスの血清中の漸増時点において存在しているキメラ蛋白質を検出するために使用されるヒトＦＣに関するイムノブロットである。図１１Ｂは相対的ルシフェラーゼ活性としてＹ軸上に示すＴＯＰｇｌｏｗ活性を計測することによりアッセイされるキメラ蛋白質のＷｎｔ阻害活性を示す。
【図１１Ｂ】図１１は２種の異なるＦｒｚ８−ＦｃキメラＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃ及びＦｒｚ（（１５６）−Ｆｃの血清中の安定性の比較を示す。図１１Ａはキメラを注射した無胸腺ヌードマウスの血清中の漸増時点において存在しているキメラ蛋白質を検出するために使用されるヒトＦＣに関するイムノブロットである。図１１Ｂは相対的ルシフェラーゼ活性としてＹ軸上に示すＴＯＰｇｌｏｗ活性を計測することによりアッセイされるキメラ蛋白質のＷｎｔ阻害活性を示す。
【図１２】図１２はＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃキメラを用いる治療から得られる経時的な腫瘍体積のグラフである。
【図１３Ａ】図１３は単回用量の蛋白質の投与の後のＦｒｚ８−Ｆｃに関する薬物動態（ＰＫ）データを示す。図１３Ａは２０又は５ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｖ．又は２０ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｐ．の両方により得られる７日目以降における血清中の検出を示すＦｒｚ８−Ｆｃで処置したマウス由来の未希釈血清のイムノブロットである。図１３Ｂ及び１３Ｃは薬物動態試験から求められたＦｒｚ８−Ｆｃ血清中レベルのグラフによる総括である。図１３ＤはＦｒｚ８−Ｆｃの薬物動態の二相性モデルに関するパラメータの総括である。
【図１３Ｂ】図１３は単回用量の蛋白質の投与の後のＦｒｚ８−Ｆｃに関する薬物動態（ＰＫ）データを示す。図１３Ａは２０又は５ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｖ．又は２０ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｐ．の両方により得られる７日目以降における血清中の検出を示すＦｒｚ８−Ｆｃで処置したマウス由来の未希釈血清のイムノブロットである。図１３Ｂ及び１３Ｃは薬物動態試験から求められたＦｒｚ８−Ｆｃ血清中レベルのグラフによる総括である。図１３ＤはＦｒｚ８−Ｆｃの薬物動態の二相性モデルに関するパラメータの総括である。
【図１３Ｃ】図１３は単回用量の蛋白質の投与の後のＦｒｚ８−Ｆｃに関する薬物動態（ＰＫ）データを示す。図１３Ａは２０又は５ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｖ．又は２０ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｐ．の両方により得られる７日目以降における血清中の検出を示すＦｒｚ８−Ｆｃで処置したマウス由来の未希釈血清のイムノブロットである。図１３Ｂ及び１３Ｃは薬物動態試験から求められたＦｒｚ８−Ｆｃ血清中レベルのグラフによる総括である。図１３ＤはＦｒｚ８−Ｆｃの薬物動態の二相性モデルに関するパラメータの総括である。
【図１３Ｄ】図１３は単回用量の蛋白質の投与の後のＦｒｚ８−Ｆｃに関する薬物動態（ＰＫ）データを示す。図１３Ａは２０又は５ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｖ．又は２０ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｐ．の両方により得られる７日目以降における血清中の検出を示すＦｒｚ８−Ｆｃで処置したマウス由来の未希釈血清のイムノブロットである。図１３Ｂ及び１３Ｃは薬物動態試験から求められたＦｒｚ８−Ｆｃ血清中レベルのグラフによる総括である。図１３ＤはＦｒｚ８−Ｆｃの薬物動態の二相性モデルに関するパラメータの総括である。
【図１４Ａ】図１４は二量体Ｆｃドメインに連結された場合のＷｎｔ３ａシグナル伝達を遮断するＦｒｚ８−ＥＣＤの増強された能力を示す。図１４ＡはＦｒｚ８（１５６）−ＦＣの２つの異なる調製品のＷｎｔ３ａ阻害アッセイのＩＣ５０のグラフである。図１４Ｂは単離されたＦｒｚ８（１５６）ＣＲＤ（ＥＣＤ）の純度を確認するゲルである。示されているのは：（ａ）非還元Ｆｒｚ８ＥＣＤ（レーン１）；（ｂ）分子量マーカー（レーン２）；及び還元Ｆｒｚ８ＥＣＤ（レーン３）である。
【図１４Ｂ】図１４は二量体Ｆｃドメインに連結された場合のＷｎｔ３ａシグナル伝達を遮断するＦｒｚ８−ＥＣＤの増強された能力を示す。図１４ＡはＦｒｚ８（１５６）−ＦＣの２つの異なる調製品のＷｎｔ３ａ阻害アッセイのＩＣ５０のグラフである。図１４Ｂは単離されたＦｒｚ８（１５６）ＣＲＤ（ＥＣＤ）の純度を確認するゲルである。示されているのは：（ａ）非還元Ｆｒｚ８ＥＣＤ（レーン１）；（ｂ）分子量マーカー（レーン２）；及び還元Ｆｒｚ８ＥＣＤ（レーン３）である。
【図１５Ａ】図１５はＦｒｚ８−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの直接結合を示す。図１５Ａは固定化されたＦｒｚ８−Ｆｃへの精製された可溶性Ｗｎｔ３ａの結合を示すＢＩＡｃｏｒｅセンソグラムである。図１５Ｂは固定化されたＦｒｚ８−Ｆｃによる精製された可溶性Ｗｎｔ３ａの免疫沈降である。
【図１５Ｂ】図１５はＦｒｚ８−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの直接結合を示す。図１５Ａは固定化されたＦｒｚ８−Ｆｃへの精製された可溶性Ｗｎｔ３ａの結合を示すＢＩＡｃｏｒｅセンソグラムである。図１５Ｂは固定化されたＦｒｚ８−Ｆｃによる精製された可溶性Ｗｎｔ３ａの免疫沈降である。
【図１６Ａ】図１６はＯＣＴＥＴ（商標）システムを用いながら計測した場合のＷｎｔリガンドへの数種のＦｒｚ−Ｆｃキメラの直接の結合を示す。図１６ＡはＦｒｚ１−Ｆｒｚ１０−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの結合から得られたデータを示し、図１６ＢはｓＦＲＰ−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの結合から得られたデータを示す。図１６ＣはＦｒｚ１−Ｆｒｚ１０−Ｆｃキメラ及びｓＦＲＰ−ＦｃキメラへのＷｎｔ５ａの結合から得られたデータを示す。
【図１６Ｂ】図１６はＯＣＴＥＴ（商標）システムを用いながら計測した場合のＷｎｔリガンドへの数種のＦｒｚ−Ｆｃキメラの直接の結合を示す。図１６ＡはＦｒｚ１−Ｆｒｚ１０−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの結合から得られたデータを示し、図１６ＢはｓＦＲＰ−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの結合から得られたデータを示す。図１６ＣはＦｒｚ１−Ｆｒｚ１０−Ｆｃキメラ及びｓＦＲＰ−ＦｃキメラへのＷｎｔ５ａの結合から得られたデータを示す。
【図１６Ｃ】図１６はＯＣＴＥＴ（商標）システムを用いながら計測した場合のＷｎｔリガンドへの数種のＦｒｚ−Ｆｃキメラの直接の結合を示す。図１６ＡはＦｒｚ１−Ｆｒｚ１０−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの結合から得られたデータを示し、図１６ＢはｓＦＲＰ−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの結合から得られたデータを示す。図１６ＣはＦｒｚ１−Ｆｒｚ１０−Ｆｃキメラ及びｓＦＲＰ−ＦｃキメラへのＷｎｔ５ａの結合から得られたデータを示す。
【図１７Ａ】図１７はＴＯＰｇｌｏｗルシフェラーゼＴＣＦレポータープラスミドで一過性にトランスフェクトしたＷｎｔ刺激細胞に対するＷｎｔ拮抗体の作用を示す。図１７ＡはＷｎｔ３ａにより刺激された細胞を示し、図１７ＢはＷｎｔ−５ａにより刺激された細胞を示す。Ｗｎｔ５ａで処置すべき細胞はレポーターに加えてＦｒｚ４及びＬｒｐ５でトランスフェクトした。２３９（ヒト腎）細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ又は１ｕｇ／ｍｌのＷｎｔ５ａで活性化した。次に細胞を未処置のままとするか、ＰＢＳ中、対照Ｆｃで処置、又は精製されたＦｒｚ−Ｆｃ蛋白質で処置し、そしてルシフェラーゼ応答に関してアッセイした。
【図１７Ｂ】図１７はＴＯＰｇｌｏｗルシフェラーゼＴＣＦレポータープラスミドで一過性にトランスフェクトしたＷｎｔ刺激細胞に対するＷｎｔ拮抗体の作用を示す。図１７ＡはＷｎｔ３ａにより刺激された細胞を示し、図１７ＢはＷｎｔ−５ａにより刺激された細胞を示す。Ｗｎｔ５ａで処置すべき細胞はレポーターに加えてＦｒｚ４及びＬｒｐ５でトランスフェクトした。２３９（ヒト腎）細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ又は１ｕｇ／ｍｌのＷｎｔ５ａで活性化した。次に細胞を未処置のままとするか、ＰＢＳ中、対照Ｆｃで処置、又は精製されたＦｒｚ−Ｆｃ蛋白質で処置し、そしてルシフェラーゼ応答に関してアッセイした。
【図１８】図１８はルシフェラーゼＴＣＦレポータープラスミドで安定にトランスフェクトしたＵ２ＯＳ（ヒト骨肉腫）細胞におけるＷｎｔ拮抗体によるＷｎｔシグナル伝達の阻害を示す。細胞における初期Ｗｎｔシグナル伝達はＷｎｔ３ａ活性化により得た。
【図１９Ａ】図１９は培養された奇形腫細胞及び腫瘍異種移植片におけるＷｎｔ標的遺伝子の発現に対するＦｒｚ８−Ｆｃの作用を示す。図１９ＡはＷｎｔ３ａ及びＦｒｚ８−Ｆｃで処置したＰＡ−１細胞系におけるＷｎｔ標的遺伝子の発現を示す。Ｗｎｔ３ａ、Ｆｒｚ８−Ｆｃ、又は対照Ｆｃ蛋白質で処置したＰＡ−１細胞から単離したＲＮＡをマイクロアレイ分析に供し、そして外から添加されたＷｎｔ３ａ、Ｆｒｚ８−Ｆｃ及び対照Ｆｃ蛋白質に応答した指定遺伝子の発現レベルの変化をプロットした。柱状グラフは３ウェルの平均発現レベル；棒グラフは標準誤差（Ｓ）を示す。図１９ＢはＰＢＳ対照と相対比較した場合の、ＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ又はＦｒｚ８−Ｆｃを与えたマウスに由来するＮＴｅｒａ−２腫瘍におけるＷｎｔ標的遺伝子ＡＰＣＤＤ１、Ｇａｄ−１、及びＦｚｄ５の相対的発現を示す。データは指定数の腫瘍の平均発現レベルを示し、二度実施した少なくとも２つの独立したｑＲＴ−ＰＣＲ実験の代表値である。相当する培養細胞への精製されたＷｎｔ３ａの添加による各遺伝子の発現の調節も示す。
【図１９Ｂ】図１９は培養された奇形腫細胞及び腫瘍異種移植片におけるＷｎｔ標的遺伝子の発現に対するＦｒｚ８−Ｆｃの作用を示す。図１９ＡはＷｎｔ３ａ及びＦｒｚ８−Ｆｃで処置したＰＡ−１細胞系におけるＷｎｔ標的遺伝子の発現を示す。Ｗｎｔ３ａ、Ｆｒｚ８−Ｆｃ、又は対照Ｆｃ蛋白質で処置したＰＡ−１細胞から単離したＲＮＡをマイクロアレイ分析に供し、そして外から添加されたＷｎｔ３ａ、Ｆｒｚ８−Ｆｃ及び対照Ｆｃ蛋白質に応答した指定遺伝子の発現レベルの変化をプロットした。柱状グラフは３ウェルの平均発現レベル；棒グラフは標準誤差（Ｓ）を示す。図１９ＢはＰＢＳ対照と相対比較した場合の、ＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ又はＦｒｚ８−Ｆｃを与えたマウスに由来するＮＴｅｒａ−２腫瘍におけるＷｎｔ標的遺伝子ＡＰＣＤＤ１、Ｇａｄ−１、及びＦｚｄ５の相対的発現を示す。データは指定数の腫瘍の平均発現レベルを示し、二度実施した少なくとも２つの独立したｑＲＴ−ＰＣＲ実験の代表値である。相当する培養細胞への精製されたＷｎｔ３ａの添加による各遺伝子の発現の調節も示す。
【図２０】図２０は図１９に示す遺伝子発現のリアルタイム定量的ＰＣＲ分析のために使用したプライマー及びプローブのアクセッション番号及び配列を示す（実施例９）。
【図２１】図２１はＷｎｔ動物モデルを作成するためにトランスフェクションにおいて使用したベクター構築物を記載する直線的な模式図である。
【図２２Ａ】図２２は腹腔内（ＩＰ）投与による無胸腺ヌードマウスにおけるＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片に対するＦｒｚ８−Ｆｃの効能を示す。図２２Ａは週２回腹腔内注射によりＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）又はＦｒｚ８−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を投与されたＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片を保有するヌードマウスから得たデータを示すグラフである。平均の腫瘍体積を経時的にプロットし、投与日をＸ軸上矢印で示す。図２２Ｂは４投与群における経時的な平均腫瘍体積及び平均変化率（％）の表による集計である。
【図２２Ｂ】図２２は腹腔内（ＩＰ）投与による無胸腺ヌードマウスにおけるＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片に対するＦｒｚ８−Ｆｃの効能を示す。図２２Ａは週２回腹腔内注射によりＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）又はＦｒｚ８−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を投与されたＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片を保有するヌードマウスから得たデータを示すグラフである。平均の腫瘍体積を経時的にプロットし、投与日をＸ軸上矢印で示す。図２２Ｂは４投与群における経時的な平均腫瘍体積及び平均変化率（％）の表による集計である。
【図２３Ａ】図２３は静脈内（ＩＶ）投与による無胸腺ヌードマウスにおけるＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片に対するＦｒｚ８−Ｆｃの効能を示す。図２３Ａは週３回静脈内注射によりＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）又はＦｒｚ８−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を投与されたＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片を保有するヌードマウスから得たデータを示すグラフである。平均の腫瘍体積を経時的にプロットし、投与日をＸ軸上矢印で示す。図２３Ｂは４投与群における経時的な平均腫瘍体積及び平均変化率（％）の表による集計である。
【図２３Ｂ】図２３は静脈内（ＩＶ）投与による無胸腺ヌードマウスにおけるＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片に対するＦｒｚ８−Ｆｃの効能を示す。図２３Ａは週３回静脈内注射によりＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）又はＦｒｚ８−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を投与されたＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片を保有するヌードマウスから得たデータを示すグラフである。平均の腫瘍体積を経時的にプロットし、投与日をＸ軸上矢印で示す。図２３Ｂは４投与群における経時的な平均腫瘍体積及び平均変化率（％）の表による集計である。
【図２４Ａ】図２４はＭＭＴＶＷｎｔ腫瘍試験から単離された血清中の種々のＷｎｔ拮抗体のＴＯＰｇｌｏｗアッセイにおけるＷｎｔシグナル伝達拮抗体活性を示す棒グラフである。Ｘ軸の試料は投与、マウス試験番号及び希釈に応じて群Ａ〜Ｅ（図２４Ａ）又はＡ〜Ｆ（図２４Ｂ）に示す。ＴＯＰＧＬＯＷ遺伝子レポーターアッセイにおける相対的ルシフェラーゼ活性をＹ軸に示す。ＮＡ（対照）を除き、全試料を約４０ｎｇ／ｍＬの精製されたＷｎｔ３ａで処置する。全ての他の蛋白質対照は５μｇ／ｍｌで培地中に存在させる。図２４ＡはＩＰ処置マウスから単離した血清の試験結果を示し、ＩＶ投与のものは図２４Ｂに示した。
【図２４Ｂ】図２４はＭＭＴＶＷｎｔ腫瘍試験から単離された血清中の種々のＷｎｔ拮抗体のＴＯＰｇｌｏｗアッセイにおけるＷｎｔシグナル伝達拮抗体活性を示す棒グラフである。Ｘ軸の試料は投与、マウス試験番号及び希釈に応じて群Ａ〜Ｅ（図２４Ａ）又はＡ〜Ｆ（図２４Ｂ）に示す。ＴＯＰＧＬＯＷ遺伝子レポーターアッセイにおける相対的ルシフェラーゼ活性をＹ軸に示す。ＮＡ（対照）を除き、全試料を約４０ｎｇ／ｍＬの精製されたＷｎｔ３ａで処置する。全ての他の蛋白質対照は５μｇ／ｍｌで培地中に存在させる。図２４ＡはＩＰ処置マウスから単離した血清の試験結果を示し、ＩＶ投与のものは図２４Ｂに示した。
【図２５】図２５は外から添加したＷｎｔ３ａの不在下（図２５Ａ）又は存在下（図２５Ｂ）における指定した奇形腫瘍細胞系における種々のＷｎｔ拮抗体のＴＯＰｇｌｏｗアッセイにおけるＷｎｔシグナル伝達拮抗体活性を示す。各細胞系について、活性は何れの処置も不在（ＮＡ）で観察されたものに対して表され；少なくとも２つの独立した実験の代表値とした。相対的ルシフェラーゼ活性（Ｙ軸）はＷｎｔ阻害剤の存在下又は不在下における種々の癌細胞系によるＴＯＰｇｌｏｗアッセイから測定した。
【図２６Ａ】図２６は無胸腺ヌードマウスにおけるＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍作用を示す。図２６Ａは手順のフローチャートであり、図２６Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフであり、投与日はＸ軸上で矢印により示す。図２６Ｃは試験の第２０日における群中の全動物の屠殺時における平均腫瘍重量をプロットしたグラフである。図２６Ｄ及び２６Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２６Ｂ】図２６は無胸腺ヌードマウスにおけるＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍作用を示す。図２６Ａは手順のフローチャートであり、図２６Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフであり、投与日はＸ軸上で矢印により示す。図２６Ｃは試験の第２０日における群中の全動物の屠殺時における平均腫瘍重量をプロットしたグラフである。図２６Ｄ及び２６Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２６Ｃ】図２６は無胸腺ヌードマウスにおけるＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍作用を示す。図２６Ａは手順のフローチャートであり、図２６Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフであり、投与日はＸ軸上で矢印により示す。図２６Ｃは試験の第２０日における群中の全動物の屠殺時における平均腫瘍重量をプロットしたグラフである。図２６Ｄ及び２６Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２６Ｄ】図２６は無胸腺ヌードマウスにおけるＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍作用を示す。図２６Ａは手順のフローチャートであり、図２６Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフであり、投与日はＸ軸上で矢印により示す。図２６Ｃは試験の第２０日における群中の全動物の屠殺時における平均腫瘍重量をプロットしたグラフである。図２６Ｄ及び２６Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２６Ｅ】図２６は無胸腺ヌードマウスにおけるＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍作用を示す。図２６Ａは手順のフローチャートであり、図２６Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフであり、投与日はＸ軸上で矢印により示す。図２６Ｃは試験の第２０日における群中の全動物の屠殺時における平均腫瘍重量をプロットしたグラフである。図２６Ｄ及び２６Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２７】図２７はＴＯＰｇｌｏｗアッセイにより測定した場合のＮＴｅｒａ２腫瘍試験における種々の動物から単離した血清のＷｎｔシグナル伝達拮抗体活性を示す棒グラフである。Ｙ軸は対照及びＦｒｚ８−ＦｃＷｎｔ拮抗体に関するＴＯＰｇｌｏｗアッセイによる相対的ルシフェラーゼ活性（Ｙ軸）を示す。追加的な精製されたＷｎｔ又はＷｎｔコンディショニング培地は細胞には添加しなかった。
【図２８Ａ】図２８は無胸腺ヌードマウスにおけるＰＡ−１腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍効能を示す。図２８Ａは手順のフローチャートであり、図２８Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフである。図２８Ｃは屠殺時における平均腫瘍重量のグラフである。平均腫瘍重量±ＳＥＭは群の関数としてプロットする。図２８Ｄ及び２８Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２８Ｂ】図２８は無胸腺ヌードマウスにおけるＰＡ−１腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍効能を示す。図２８Ａは手順のフローチャートであり、図２８Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフである。図２８Ｃは屠殺時における平均腫瘍重量のグラフである。平均腫瘍重量±ＳＥＭは群の関数としてプロットする。図２８Ｄ及び２８Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２８Ｃ】図２８は無胸腺ヌードマウスにおけるＰＡ−１腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍効能を示す。図２８Ａは手順のフローチャートであり、図２８Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフである。図２８Ｃは屠殺時における平均腫瘍重量のグラフである。平均腫瘍重量±ＳＥＭは群の関数としてプロットする。図２８Ｄ及び２８Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２８Ｄ】図２８は無胸腺ヌードマウスにおけるＰＡ−１腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍効能を示す。図２８Ａは手順のフローチャートであり、図２８Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフである。図２８Ｃは屠殺時における平均腫瘍重量のグラフである。平均腫瘍重量±ＳＥＭは群の関数としてプロットする。図２８Ｄ及び２８Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２８Ｅ】図２８は無胸腺ヌードマウスにおけるＰＡ−１腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置の抗腫瘍効能を示す。図２８Ａは手順のフローチャートであり、図２８Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフである。図２８Ｃは屠殺時における平均腫瘍重量のグラフである。平均腫瘍重量±ＳＥＭは群の関数としてプロットする。図２８Ｄ及び２８Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【図２９】図２９はＴＯＰｇｌｏｗアッセイにより測定した場合のＦｒｚ８−Ｆｃ又はＦｒｚ５−Ｆｚで処置したマウスにおけるＷｎｔシグナル伝達阻害を示す。Ｙ軸は対照及びＦｒｚ８−Ｆｃ及びＦｒｚ５−ＦｚＷｎｔ拮抗体に関するＴＯＰｇｌｏｗアッセイによる相対的ルシフェラーゼ活性（Ｙ軸）を示す。
【図３０】図３０はＦｒｚ８−Ｆｃ及びＦｒｚ５−Ｆｚ処置腫瘍における低減されたＡｘｉｎ２発現を示し、図３０ＡはＧＡＰＤＨの発現に対して規格化された発現を示し、図３０Ｂはｒｐ１１９の発現に対して規格化された発現を示す。
【図３１Ａ】図３１はβ−カテニンの免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色に関するＩＨＣ光学顕微鏡写真を示し、腸及び皮膚などの再生性組織に対するＦｒｚ８−Ｆｃ処置が正常であることを示している。図３１ＡはＰＢＳ（Ａ−１）、対照蛋白質（Ａ−２）及びＦｒｚ８−Ｆｃ（Ａ−３）処置マウスの小腸におけるβ−カテニンに関するＩＨＣを示す。図３１ＢはＰＢＳ（Ｂ−１）、対照蛋白質（Ｂ−２）及びＦｒｚ８−Ｆｃ（Ｂ−３）処置マウスの皮膚におけるβ−カテニンに関するＩＨＣを示す。
【図３１Ｂ】図３１はβ−カテニンの免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色に関するＩＨＣ光学顕微鏡写真を示し、腸及び皮膚などの再生性組織に対するＦｒｚ８−Ｆｃ処置が正常であることを示している。図３１ＡはＰＢＳ（Ａ−１）、対照蛋白質（Ａ−２）及びＦｒｚ８−Ｆｃ（Ａ−３）処置マウスの小腸におけるβ−カテニンに関するＩＨＣを示す。図３１ＢはＰＢＳ（Ｂ−１）、対照蛋白質（Ｂ−２）及びＦｒｚ８−Ｆｃ（Ｂ−３）処置マウスの皮膚におけるβ−カテニンに関するＩＨＣを示す。
【図３２Ａ】図３２はヒト乳癌における活性Ｗｎｔシグナル伝達を説明している。図３２ＡはＷｏｎｇ等、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９６：１４５（２００２）において最初に報告された正常（Ａ−１）、低悪性度（Ａ−２）及び高悪性度（Ａ−３）のヒト乳腺腫瘍におけるＷｎｔ発現（インビトロハイブリダイゼーションにより示す）を示す。
【図３２Ｂ１】図３２はヒト乳癌における活性Ｗｎｔシグナル伝達を説明している。図３２Ｂは乳癌患者におけるβ−カテニンの核（Ｂ−１）及び細胞質（Ｂ−２）局在化（ＩＨＣにより示す）を示す。示したβ−カテニン発現パターンと相関している患者生存確率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存区画（Ｂ−３）も同様に示す。このデータはＬｉｎ等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）９７（８）４２６２−６６（２０００）において最初に報告されている。
【図３２Ｂ２】図３２はヒト乳癌における活性Ｗｎｔシグナル伝達を説明している。図３２Ｂは乳癌患者におけるβ−カテニンの核（Ｂ−１）及び細胞質（Ｂ−２）局在化（ＩＨＣにより示す）を示す。示したβ−カテニン発現パターンと相関している患者生存確率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存区画（Ｂ−３）も同様に示す。このデータはＬｉｎ等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）９７（８）４２６２−６６（２０００）において最初に報告されている。
【図３２Ｂ３】図３２はヒト乳癌における活性Ｗｎｔシグナル伝達を説明している。図３２Ｂは乳癌患者におけるβ−カテニンの核（Ｂ−１）及び細胞質（Ｂ−２）局在化（ＩＨＣにより示す）を示す。示したβ−カテニン発現パターンと相関している患者生存確率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存区画（Ｂ−３）も同様に示す。このデータはＬｉｎ等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）９７（８）４２６２−６６（２０００）において最初に報告されている。
【図３２Ｃ】図３２はヒト乳癌における活性Ｗｎｔシグナル伝達を説明している。図３２Ｃは浸潤性の腺管癌腫、ｈｅｒ−２陰性の患者から単離した組織と比較した場合の癌を有さない患者に由来する正常乳房におけるＷｎｔ−１の発現のマイクロアレイ分析である。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
Ｉ．定義
「Ｗｎｔ蛋白質」とはＷｎｔシグナル伝達を活性化させるようにＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合するＷｎｔシグナル伝達経路成分のリガンドである。Ｗｎｔ蛋白質の具体例は少なくとも１９メンバー、例えば
【００６６】
【化１０】
2010504081.tif 000021
【００６７】
【化１１】
2010504081.tif 000022
を包含する。各メンバーが種々の程度の配列同一性を有しているが、各々は高度に保存されたスペーシングを示す２３〜２４の保存システイン残基を含有する。ＭｃＭａｈｏｎ，ＡＰ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．８：２３６−２４２（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒ，ＪＲ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．３（１）：３００１．１−３００１．１５（２００２）。本発明の目的のためには、Ｗｎｔ蛋白質及びその活性な変異体はＦｒｉｚｚｌｅｄ  ＥＣＤ又はそのようなＦｒｚ  ＥＣＤのＣＲＤ成分に結合する蛋白質である。
【００６８】
「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ」（Ｆｒｚ）蛋白質はＷｎｔ蛋白質に結合し、そして更に他の膜関連Ｗｎｔシグナル伝達成分と複合体を形成してＷｎｔシグナル伝達を下流の細胞内成分に伝達する７通過膜貫通受容体であるＷｎｔシグナル伝達経路成分である。Ｆｒｚ蛋白質はＦｒｚ１、Ｆｒｚ２、Ｆｒｚ３、Ｆｒｚ４、Ｆｒｚ５、Ｆｒｚ６、Ｆｒｚ７、Ｆｒｚ８、Ｆｒｚ９、及びＦｒｚ１０を包含する。ヒト全長Ｆｒｚ蛋白質の例は
【００６９】
【化１２】
2010504081.tif 000023
を包含する（図６Ａ〜６Ｃ）。
【００７０】
「分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質」（ｓＦＲＰ）はＷｎｔ蛋白質に結合する分泌細胞外ポリペプチドであるＷｎｔシグナル伝達経路成分である。ｓＦＲＰ蛋白質はｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２、ｓＦＲＰ３、ｓＦＲＰ４、及びｓＦＲＰ５を包含する。ヒト全長ｓＦＲＰ蛋白質の例はｓＦＲＰ１（ＮＰ＿００３００３）（配列番号１１）、ｓＦＲＰ２（ＮＰ＿００３００４）（配列番号１２）、ｓＦＲＰ３（ＮＰ＿００１４５４）（配列番号１３）、ｓＦＲＰ４（ＮＰ＿００３００５）（配列番号１４）、及びｓＦＲＰ５（ＮＰ＿００３００６）（配列番号１５）を包含する（図６Ｃ〜６Ｄ）。
【００７１】
「Ｒｏｒ」蛋白質は哺乳動物相同体Ｒｏｒ１及びＲｏｒ２を包含し、これらは細胞外のＦｒｉｚｚｌｅｄ様システインリッチドメイン（ＣＲＤ）並びに膜近位クリングルドメインを特徴とする。Ｒｏｒ蛋白質は発生形態形成において重要な役割を果たしており、そして細胞骨格の異なる種々の成分に関連している。Ｒｏｒ１はストレス繊維に沿ったＦ−アクチンと共局在化しており、Ｒｏｒ２は部分的に微小管と共局在化している。Ｒｏｒ１及びＲｏｒ２は約５８％の全体的配列同一性を共有している。Ｒｏｒには黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）ファミリー蛋白質Ｄｌｘｉｎ−１に関連しており、そしてその細胞内分布を調節する。Ｒｏｒ１蛋白質はＲｏｒ１及びＲｏｒ２を包含する。ヒト全長Ｒｏｒ蛋白質の例はｈＲｏｒ１（ＮＰ＿００５００３）（配列番号１６）及びｈＲｏｒ２（ＮＰ＿００４５５１）（配列番号１７）である（図６Ｄ〜６Ｅ）。
【００７２】
「Ｆｒｚドメイン成分」とはＦｒｚ蛋白質、ｓＦＲＰ蛋白質、Ｒｏｒ蛋白質、又はＷｎｔ蛋白質と結合できる他の蛋白質から誘導されたポリペプチドである。蛋白質「から誘導される」ポリペプチドとはレファレンス蛋白質配列内、又は蛋白質の活性な変異体の配列内に存在し得るアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。Ｆｒｚドメイン成分の例は、Ｆｒｚ１、Ｆｒｚ２、Ｆｒｚ３、Ｆｒｚ４、Ｆｒｚ５、Ｆｒｚ６、Ｆｒｚ７、Ｆｒｚ８、Ｆｒｚ９、Ｆｒｚ１０、ｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２、ｓＦＲＰ３、ｓＦＲＰ４、ｓＦＲＰ５、Ｒｏｒ１、又はＲｏｒ２及びそれらの活性変異体などの、Ｆｒｚ蛋白質、ｓＦＲＰ蛋白質、又はＲｏｒ蛋白質の細胞外ドメインの最少システインリッチドメイン（ＣＲＤ）「ＣＲＤ（ＥＣＤ）」を包含する。ＣＲＤ（ＥＣＤ）は１００〜２５０アミノ酸の保存された構造的モチーフであり、そして１０個の高度に保存されたシステインにより定義される。ヒトＣＲＤ（ＥＣＤ）の特定の例は図３Ｂにおける箱で囲まれた文字において示されており、そして以下の配列番号、即ち
【００７３】
【化１３】
2010504081.tif 000024
で表される。
【００７４】
Ｆｒｚドメイン成分の更なる例はＦｒｚ１、Ｆｒｚ２、Ｆｒｚ３、Ｆｒｚ４、Ｆｒｚ５、Ｆｒｚ６、Ｆｒｚ７、Ｆｒｚ８、Ｆｒｚ９、Ｆｒｚ１０、ｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２、ｓＦＲＰ３、ｓＦＲＰ４、又はｓＦＲＰ５及びそれらの活性変異体などのプロＦｒｚ又はプロｓＦＲＰから誘導されるプロＦｒｚドメインを包含する。ヒトプロＦｒｚドメインの特定の例は図３Ａに記載されており、以下の配列番号、即ち
【００７５】
【化１４】
2010504081.tif 000025
で表される。
【００７６】
Ｆｒｚドメイン成分の更なる例はＦｒｚ１、Ｆｒｚ２、Ｆｒｚ３、Ｆｒｚ４、Ｆｒｚ５、Ｆｒｚ６、Ｆｒｚ７、Ｆｒｚ８、Ｆｒｚ９、Ｆｒｚ１０、ｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２、ｓＦＲＰ３、ｓＦＲＰ４、ｓＦＲＰ５、Ｒｏｒ１又はＲｏｒ２及びそれらの活性変異体などの成熟Ｆｒｚ、ｓＦＲＰ又はＲｏｒ蛋白質から誘導される成熟Ｆｒｚドメインを包含する。ヒト成熟Ｆｒｚドメインの特定の例は図３Ｂに記載されており、以下の配列番号、即ち      
【００７７】
【化１５】
2010504081.tif 000026
【００７８】
【化１６】
2010504081.tif 000027
で表される。
【００７９】
「Ｗｎｔ拮抗体」とはＷｎｔ蛋白質に結合し、そして細胞性Ｗｎｔシグナル伝達又はそれから生じる生理学的症状を減衰させることにより活性となるＦｒｚドメイン成分及び免疫グロブリンＦｃドメインを含むキメラポリペプチドである。
【００８０】
特定の実施形態においては、ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４Ｆｃドメインである。１つの実施形態において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインの具体例は図４、５及び図７、配列番号６７及び配列番号６８に示す。
【００８１】
一部の実施形態においてはＦｒｚドメイン成分及びＦｃドメインはリンカーにより融合される。「リンカー」という用語はＦｃドメインにＦｒｚドメイン成分を係留させる成分を指す。本発明における使用に適するリンカーはＷｎｔ拮抗体分子の蛋白質ドメインの発現、分泌及び折り畳みの妨害が最小限又は皆無であり、そして立体的又は他の手段を介したＦｃドメインのエフェクタ機能又はＦｒｚドメインのＷｎｔ蛋白質相互作用機能（例えば、Ｗｎｔ蛋白質への結合）の何れの妨害も最小限又は皆無である。特定の実施形態においては、リンカーは短鎖ペプチド配列である。リンカー配列は、活性のために必要な最小限の残基以外のＦｒｚドメイン成分又はＦｃドメインの何れかに由来する追加的アミノ酸残基を包含してもよい。好ましいリンカーは良好な血清安定性を与えることになり、そしてプロテアーゼ切断に対して抵抗性である。有用なリンカーの具体例は図４、図５及び図７に示す通りであり、配列ＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号６９）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号７１）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号７２）、及びＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号７３）を包含する。上記した通り、これらのリンカーは活性のために必要な最小限の残基以外のＦｒｚドメイン成分又はＦｃドメインの何れかに由来する追加的アミノ酸残基を包含してよい。これらのリンカーは、Ｆｒｚドメイン成分又はＦｃドメイン成分に由来するもの以外の追加的アミノ酸残基を含んでいてもよい。
【００８２】
「Ｗｎｔシグナル伝達経路成分」はＷｎｔ蛋白質及びＦｒｚ受容体の間の相互作用に起因するシグナルを伝導する成分である。Ｗｎｔシグナル伝達経路は複雑であり、広範なフィードバック調節が関与しているため、Ｗｎｔシグナル伝達経路の多数かつ恐らくは未発見のメンバーが存在する。例示されるＷｎｔシグナル伝達経路成分は、膜関連蛋白質ＬＲＰ５及びＬＲＰ６、アキシン（Ａｘｉｎ）、及びディシェヴェルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）、細胞外Ｗｎｔ相互作用蛋白質ｓＦＲＰ、ＷＩＦ−１、ＬＲＰ不活性化蛋白質Ｄｋｋ及びＫｍ、細胞質蛋白質β−カテニン、β−カテニン「分解複合体」のメンバーＡＰＣ、ＧＳＫ３β、ＣＫＩα、及びＰＰ２Ａ、核輸送蛋白質ＡＰＣ、ｐｙｇｏｐｕｓ及びｂｃｌ９／ｌｅｇｌｅｓｓ、及び転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦ、Ｇｒｏｕｃｈｏ及び種々のヒストンアセチラーゼ、例えばＣＢＰ／ｐ３００及びＰｒｇ−１を包含する。
【００８３】
「Ｗｎｔ媒介障害」とは、異常なＷｎｔシグナル伝達を特徴とする障害、状態、又は疾患である。特定の態様において、異常なＷｎｔシグナル伝達は同様の非疾患の細胞又は組織におけるＷｎｔシグナル伝達のレベルを超過する疾患であることが疑われる細胞又は組織におけるＷｎｔシグナル伝達のレベルである。特定の態様において、Ｗｎｔ媒介障害は癌を包含する
「癌」という用語は未調節の細胞成長／増殖を典型的には特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指す。癌の例は、限定しないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、及び白血病を包含する。癌のより特定的な例は、限定しないが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、肺、例えば非小細胞（ＮＳＣＬＣ）、乳腺、卵巣、子宮頸部、子宮内膜、前立腺、結腸直腸、腸のカルチノイド、膀胱、胃、膵臓、肝臓（肝細胞）、肝臓の芽腫、食道、肺の腺癌、中皮腫、滑膜肉腫、骨肉腫、頭部頸部扁平上皮細胞癌、若年性鼻咽頭血管線維腫、脂肪肉腫、甲状腺、黒色腫、基底細胞癌腫（ＢＣＣ）、髄芽細胞腫、及び類腱腫を包含する。
【００８４】
「制御配列」という用語は特定の宿主生物において作動可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する制御配列は例えば、プロモータ、場合によりオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を包含する。真核生物の細胞はプロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサを利用することが分かっている。
【００８５】
核酸はそれが別の核酸配列と機能的な関係となるように配置されている場合に「作動可能に連結」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーに関するＤＮＡはそれがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白質として発現されるとそのポリペプチドに関するＤＮＡに作動可能に連結しており；プロモータ又はエンハンサはそれがコード配列の転写に影響するとその配列に作動可能に連結しており；或いは、リボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置づけられているとコード配列に作動可能に連結している。一般的に、「作動可能に連結」とは連結されるべきＤＮＡ配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合は、隣接し、そして読み取り相内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは隣接する必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の慣行に従って使用する。
【００８６】
「活性な」ポリペプチド、変異体ポリペプチド、又はそのフラグメントは活性なポリペプチドのネイティブ又は天然に存在する成分の生物学的活性を保持している。生物学的活性とは活性なポリペプチドのネイティブ又は天然に存在する対応物により媒介される機能を指す。例えば、結合又は蛋白質−蛋白質相互作用は生物学的活性を構成する。特定の意味においては、活性なＷｎｔシグナル伝達経路の成分は他のＷｎｔシグナル伝達経路の成分との相互作用を介してシグナルを効果的に伝導することができるものである。別の意味においては、活性なＷｎｔ拮抗体はＷｎｔ拮抗体の投与の前のレベルと比較して、Ｗｎｔシグナル伝達又はそれから生じる生理学的状態を検出可能に減衰させるものである。
【００８７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者が容易に決定できるものであり、そして一般的にプローブの長さ、洗浄温度、及び塩濃度に応じた経験的な計算である。一般的により長いプローブは適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般的に、相補鎖がそれらの融点未満の環境に存在する場合に変性したＤＮＡが再度アニーリングする能力に依存している。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高値であるほど、使用できる相対温度が高値となる。結果として、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントとするのに対し、より低い温度はその傾向が小さい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関する追加の詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照できる。
【００８８】
「高ストリンジェンシー条件」とは、本明細書においては、（１）洗浄のために低いイオン強度及び高い温度、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で使用するもの；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤、例えばホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド＋０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ６．５＋７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で使用するもの；或いは（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＣＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストランサルフェートを４２℃で使用する溶液中の一夜ハイブリダイゼーション＋４２℃における０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の１０分間洗浄、次いで５５℃におけるＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣよりなる１０分間の高ストリンジェンシーの洗浄により識別してよい。
【００８９】
「中ストリンジェンシー条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されているように識別してよく、そして上記したものよりも低ストリンジェントの洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば温度、イオン強度、及び％ＳＤＳ）の使用を包含する。中ストリンジェント条件の例は２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストランサルフェート、及び２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断処理サケ精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃での一夜インキュベート、次いで約３７〜５０℃での１×ＳＣＣ中のフィルタの洗浄である。プローブ長等の因子に適合するために必要に応じて温度、イオン強度等を調節する方法は当業者の知る通りである。
【００９０】
「エピトープタグ化」という用語は「タグポリペプチド」に融合されたポリペプチドを指す。タグポリペプチドは対する抗体を作成できるエピトープを与えるために十分な残基を有するが、それが融合されるポリペプチドの活性を妨害しない程度に十分に短いものである。タグポリペプチドは好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に架橋しないようにかなり独特でもある。適当なタグポリペプチドは一般的に少なくとも６アミノ酸残基、通常は約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。例示されるエピトープタグ配列はＨＡ、ＧＤ、ｃ−ｍｙｃ、ポリＨｉｓ及びＦＬＡＧを包含する。
【００９１】
「治療する」又は「治療」又は「軽減」とは治療的な処置及び予防的又は防止的な手段の両方をさし、ここで、目的は標的化された病理学的な疾患又は状態又は障害を防止又は緩徐化（減少）させることである。治療を必要とする者は、既に障害を有する者、並びに障害を有し易いもの、又は障害を防止（予防）すべき者を包含する。Ｗｎｔ媒介障害が癌である場合、対象又は哺乳動物は、本発明の方法によって有効量のＷｎｔ拮抗体を投与された後に患者が以下の１つ以上における観察及び／又は計測可能な低減又はこれらの不在、即ち、癌細胞の数の低減、又は癌細胞の不在；腫瘍サイズの低減；軟組織又は骨内への癌の拡張を包含する周辺臓器内への癌細胞の浸潤の阻害（即ちある程度まで緩徐化、及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（即ちある程度まで緩徐化、及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度までの阻害；及び／又は特定の癌に関連する１つ以上の症状のある程度までの緩解；低減した罹患率及び死亡率、及びクオリティオブライフ問題の改善を示す場合に良好に「治療された」、又は低減された腫瘍負荷を示すとされる。Ｗｎｔ拮抗体は、既存の癌細胞を成長抑制及び／又は殺傷することができる範囲で、細胞成長阻害性及び／又は細胞毒性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は患者により実感されてもよい。
【００９２】
障害の良好な治療及び改善を評価するための上記パラメータは医師の良く知る常套的な手順により容易に計測できる。癌療法のために、効能は例えば疾患の進行までの時間（ＴＤＰ）を評価すること及び／又は応答速度（ＲＲ）を測定することにより計測することができる。転移は病期決定試験によるか、又は骨スキャン並びにカルシウムレベル及び骨への拡張を測定する他の酵素に関する試験により測定できる。ＣＴスキャンも、骨盤及びその領域のリンパ節への拡張を検討するために実施できる。既知方法による胸部Ｘ線及び肝酵素レベルの測定を用いてそれぞれ肺及び肝臓への転移を検討する。疾患をモニタリングするための他の常套的な方法は経直腸超音波測定（ＴＲＵＳ）及び経直腸針生検（ＴＲＮＢ）を包含する。
【００９３】
「慢性」投与とは、延長された時間に渡り初期の治療作用（活性）が維持できるように急性の様式とは逆の連続的な様式における薬剤の投与を指す。「間欠」投与は連続又は継続的とは逆に、周期的であるか、定期的な中断に付される治療である。
【００９４】
「哺乳動物」とは哺乳動物に分類される何れかの動物、例えばヒト、家畜及び牧畜、及び、動物園、競技用、又は愛玩用の動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９５】
別の治療薬１つ以上「と組み合わせた」投与は、同時及び何れかの順序における連続した投与を包含する。
【００９６】
「担体」とは本明細書においては、使用される用量及び濃度で曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である製薬上許容しうる担体、賦形剤、又は安定化剤を包含する。頻繁には生理学的に許容しうる担体は水性のｐＨ緩衝された溶液である。生理学的に許容される担体の例は緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；蛋白質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジン；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン；キレート形成剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成性の対イオン、例えばナトリウム；及び／又はノニオン系界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）を包含する。
【００９７】
Ｗｎｔ拮抗体の「有効量」とは、具体的に記載した目的を実行するために十分な量である。「有効量」は記載した目的との関連において実験的に、そして常套的な様相において決定してよい。
【００９８】
「治療有効量」という用語は対象又は哺乳動物においてＷｎｔ媒介障害を「治療」するために有効なＷｎｔ拮抗体の量を指す。癌の場合は、治療有効量の薬品は、癌細胞の数を低減；腫瘍サイズを低減；周辺臓器内への癌細胞浸潤を阻害（即ちある程度まで緩徐化、及び好ましくは停止）；腫瘍転移を阻害（即ちある程度まで緩徐化、及び好ましくは停止）；腫瘍成長をある程度までの阻害；及び／又は１つ以上の癌関連症状をある程度まで緩解してよい。「治療」の本明細書における定義を参照できる。薬品は、既存の癌細胞の成長抑制及び／又は殺傷を行う範囲で、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性であり得る。
【００９９】
Ｗｎｔ拮抗体の「成長阻害量」とはインビトロ又はインビボの何れかで細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長を阻害することができる量である。新生物性細胞成長を阻害する目的の、Ｗｎｔ拮抗体の「成長阻害量」は実験的に、そして常套的な様相において決定してよい。
【０１００】
Ｗｎｔ拮抗体の「細胞毒性量」とはインビトロ又はインビボの何れかで細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の破壊を誘発することができる量である。新生物性細胞成長を阻害する目的のためのＷｎｔ拮抗体の「細胞毒性量」は実験的に、そして常套的な様相において決定してよい。
【０１０１】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は互換的に、そして最も広範な意味において使用され、例えばモノクローナル抗体（例えば全長又は未損傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば所望の生物学的活性を示す二重特異性抗体）を包含し、そして特定の抗体フラグメントも本明細書においてより詳しく説明する通り包含してよい。抗体はキメラ、ヒト、ヒト化又は親和性成熟のものであることができる。
【０１０２】
何れかの脊椎動物種に由来する軽鎖はその定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型の一方に割り当てられ得る。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラス又はアイソタイプに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、それぞれα、δ、ε、γ及びμと記載される重鎖を有している。γ及びαのクラスは更に、ＣＨの配列及び機能における比較的小さい相違点に基づいてサブクラスに分割され、例えばヒトは以下のサブクラス、即ちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元配置はよく知られており、そして一般的に例えばＡｂｂａｓ等、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈＥｄ．（２０００）に記載されている。抗体は１つ以上の他の蛋白質又はペプチドとの抗体の共有結合又は非共有結合により形成されるより大型の融合分子の部分であってよい。
【０１０３】
「抗体フラグメント」は未損傷の抗体の一部分、好ましくは未損傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（米国特許５，６４１，８７０）；Ｚａｐａｔａ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成した多重特異性抗体を包含する。
【０１０４】
抗体のパパイン消化は２つの同一の抗原結合フラグメント、即ち「Ｆａｂ」フラグメント、及び残余の「Ｆｃ」フラグメントを生じさせ、容易に結晶化する能力を反映した表記である。Ｆａｂフラグメントは重鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）に沿った全軽鎖よりなる。各Ｆａｂフラグメントは抗原結合に関して一価であり、即ち、それは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は単一の大型のＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせ、これは二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド連結Ｆａｂフラグメントに概ね相当し、そしてなお抗原に交差結合できる。Ｆａｂ’フラグメントは抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを包含するＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における追加的な残基を殆ど有さないことによりＦａｂフラグメントとは異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ’に関する本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として製造された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
【０１０５】
Ｆｃフラグメントはジスルフィドにより共に保持された両方の重鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクタ機能はＦｃ領域における配列により決定され、この領域は細胞の特定の型において見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分でもある。
【０１０６】
「Ｆｖ」は完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは堅固な非共有結合的会合における１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変領域ドメインよりなる。
【０１０７】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、少量で存在する場合がある可能な天然に存在する突然変異を除き、集団を含む個々の抗体が同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原に対して指向されている。種々の異なる決定基（エピトープ）に対して指向された種々の異なる抗体を典型的には包含するポリクローナル抗体調製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向されている。
【０１０８】
特にモノクローナル抗体の定義に包含される「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種から誘導されるか、特定の抗体クラス又はサブクラスに帰属する抗体における相当配列に同一又は相同であるが、鎖の残余は別の種から誘導されるか、特定の抗体クラス又はサブクラスに帰属する相当配列に同一又は相同である抗体、並びにそのような抗体のフラグメントを意味するが、ただしこれは、それらが所望の生物学的活性を呈する限りにおいてそのような意味を有するものとする。米国特許４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１０９】
非ヒト（例えばげっ歯類）抗体の「ヒト化」型とは非ヒト抗体から誘導される最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の抗体特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（レシピエント抗体）の超可変領域由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は相当する非ヒト残基により置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体内にもドナー抗体内にも存在しない残基を含んでよい。このような修飾は抗体の性能を更に精鋭化させるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、そしてＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は場合により、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含むことにもなる。詳細についてはＪｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照できる。更に又、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）を参照できる。
【０１１０】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、本明細書においては互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指し、例えば限定しないがＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ヌクレオチドはデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又は、その類縁体、又はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼにより、又は合成反応により重合体に取り込まれ得る何れかの基質であり得る。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びその類縁体を含んでよい。存在する場合は、ヌクレオチド構造に対する修飾は重合体の組み立ての前又は後に付与してよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてよい。ポリヌクレオチドは合成後に更に例えば標識とのコンジュゲーションにより修飾されていてよい。他の型の修飾は、例えば類縁体による１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの「キャップ」置換、ヌクレオチド間修飾、例えば未荷電連結（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カーバメート等）、及び荷電連結（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、懸垂部分、例えば蛋白質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）、インターカレータ（例えばアクリジン、ソラレン等）、キレート形成剤（例えば金属、放射活性金属、ホウ素、酸化性金属等）、アルキル化剤、修飾連結部（例えばアルファアノマー核酸等）を包含する。更に、糖に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホネート基、ホスフェート基により置き換えられているか、標準的な保護基により保護されているか、又は、別のヌクレオチドへの追加的連結部を作成するために活性化されていてよく、或いは、固体又は半固体の支持体にコンジュゲートされていてよい。５’及び３’末端のＯＨはホスホリル化され得るか、又は、アミンもしくは炭素原子１〜２０個の有機キャッピング基部分により置換され得る。他のヒドロキシルはまた標準的な保護基に誘導体化されていてよい。ポリヌクレオチドはまた当該分野で一般的に知られたリボース又はデオキシリボース糖の類縁体形態、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボース、炭素環糖類縁体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類縁体及び非塩基性ヌクレオチド類縁体、例えばメチルリボシドを含有してよい。１つ以上のホスホジエステル連結部は別の連結基により置き換えられていてよい。これらの代替的連結基は、例えばホスフェートがＰ（Ｏ）−Ｓ−（チオエート）、Ｐ（Ｓ）−Ｓ−（ジチオエート）、（Ｏ）ＮＲ２−（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２−（ホルムアセタール）で置き換えられている実施形態を包含し、ここで各Ｒ又はＲ’は独立して、Ｈ又は場合によりエーテル結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルキル連結部を含有する置換又は未置換のＣ１〜２０アルキルである。ポリヌクレオチド中の全連結部が同一である必要はない。前期はＲＮＡ及びＤＮＡを包含する本明細書に記載する全てのポリヌクレオチドに適用する。
【０１１１】
「ペプチド」という用語は一般的にペプチド結合により連結されたアミノ酸の隣接する比較的短い配列を指す。必然ではないが典型的には、ペプチドは約２〜５０アミノ酸、４〜４０アミノ酸、又は１０〜３０アミノ酸の長さを有する。「蛋白質」という用語は一般的に「ポリペプチド」のより長い形態を指すが、２つの用語は本明細書における一部の文脈においては互換的であってよく、また、互換的に使用され、そして一般的により長い、恐らくはより複雑なアミノ酸配列を指す（例えば多重配列、二次及び高次の構造）
ポリペプチドの「領域」とは２つ以上のアミノ酸残基の隣接配列である。別の実施形態においては、領域は少なくとも約３、５、１０、１５又はそれより多い隣接アミノ酸残基である。
【０１１２】
「Ｃ末端領域」、「Ｃ末端配列」及びその変形は本明細書においてはＣ末端（一般的に３’）の端部に位置するか、それに近接しているアミノ酸配列を指す。一般的に、配列は遊離カルボキシル基を有するアミノ酸を包含する。１つの実施形態において、Ｃ末端領域又は配列はＣ末端に最も近接して位置する約１〜１５残基を包含するポリペプチドの領域を指す。
【０１１３】
「Ｎ末端領域」、「Ｎ末端配列」及びその変形は本明細書においてはＮ末端（概して５’）の端部に位置するか、それに近接しているアミノ酸配列を指す。概して、配列は遊離アミノ基を有するアミノ酸を包含する。１つの実施形態において、Ｎ末端領域又は配列はポリペプチドのＮ末端に最も近接して位置する約１〜１５残基を包含するポリペプチドの領域を指す。
【０１１４】
「内部領域」、「内部配列」及びその変形は、ポリペプチド内に位置するアミノ酸配列であって、その配列の部分ではない１つ以上のアミノ酸によりそのＮおよびＣ末端の両方においてフランキングされているものを指す。概して、配列は遊離のカルボキシル又はアミノ基の何れかを有するアミノ酸を包含しない。
【０１１５】
「リガンド」とは、蛋白質又は別の分子、例えば受容体における特定の部位と結合相互作用することができる天然に存在する、又は合成の分子又は部分を指す。ＷｎｔリガンドはＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体と特異的に相互作用する分子である。「受容体」は細胞表面又は膜に位置する場合が多いが、必須ではない。
【０１１６】
「融合蛋白質」とは共に共有結合的に連結している２つの部分を有するポリペプチドを指し、ここで、各部分は異なる蛋白質から誘導されている。２つの部分は単一のペプチド結合により直接、又は１つ以上のアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを介して連結されていてよい。一般的に、２つの部分及びリンカーは相互に読み枠内にあることになり、そして組み換え手法を用いて製造される。
【０１１７】
「腫瘍細胞の成長を阻害する」Ｗｎｔ拮抗体又は「成長阻害性の」Ｗｎｔ拮抗体は異常なＷｎｔシグナル伝達活性を有する腫瘍細胞の計測可能な成長阻害をもたらすものである。好ましい成長阻害性のＷｎｔ拮抗体は、適切な対照と比較した場合に、異常なＷｎｔシグナル伝達活性を有する腫瘍細胞の成長を２０％超、好ましくは約２０〜約５０％、そしてさらに好ましくは５０％超（例えば約５０〜約１００％）阻害し、ここで対照とは典型的には試験すべきＷｎｔ拮抗体分子で処置されていない癌細胞である。１つの実施形態において、成長阻害は細胞培養物中約０．１〜３０μｇ／ｍｌ又は約０．５ｎＭ〜２００ｎＭのＷｎｔ拮抗体濃度において計測することができ、その場合成長阻害はＷｎｔ拮抗体への腫瘍細胞の曝露後１〜１０日に測定する。インビボの腫瘍細胞の成長阻害は後述する実験実施例のセクションにおいて説明するように種々のやり方で測定できる。Ｗｎｔ拮抗体は約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重のＷｎｔ拮抗体の投与が抗体の初回投与から約５日間〜３か月以内に、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍サイズ又は細胞増殖における低減をもたらす場合にインビボで成長阻害性である。特定の態様においては、腫瘍サイズは治療開始時のそのサイズに対して低減される。
【０１１８】
「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語はある程度の異常な細胞増殖を伴う障害を指す。１つの実施形態において、細胞増殖性障害は癌である。
【０１１９】
「腫瘍」とは、本明細書においては、悪性又は良性に関わらず、全ての新生物性の細胞の成育及び増殖、及び、全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。
【０１２０】
「細胞死を誘導する」Ｗｎｔ拮抗体分子は生存細胞を非生存性にするものである。細胞は同じ組織型の正常な細胞と比較して異常なＷｎｔシグナル伝達活性を有するものである。好ましくは、細胞は本明細書において定義する通り癌細胞である。インビトロの細胞死は抗体依存生細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）により誘導される細胞死と区別するために補体及び免疫エフェクタ細胞の不在下で測定してよい。即ち、細胞死に関するアッセイは熱不活性化血清を用いて（即ち補体不在下において）そして免疫エフェクタ細胞の不在下において実施してよい。Ｗｎｔ拮抗体が細胞死を誘導するかどうかを調べるためには、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅ等、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：１−１１（１９９５）参照）又は７ＡＡＤの取り込みにより評価される膜の完全性の喪失を未処置細胞に対して評価することができる。好ましい細胞死誘導抗体、オリゴペプチド又は他の有機性の分子はＢＴ４７４細胞におけるＰＩ取り込みアッセイにおいてＰＩ取り込みを誘導するものである。
【０１２１】
「標識」という単語は本明細書においては、直接又は間接的に抗体、オリゴペプチド又は他の有機性の分子にコンジュゲートすることにより「標識された」抗体、オリゴペプチド又は他の有機性の分子を形成する検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体検出可能であってよく（例えば放射性同位体標識又は蛍光標識）、或いは、酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒してよい。
【０１２２】
「細胞毒性剤」という用語は本明細書においては、細胞の機能を阻害又は抑制、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。用語は放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、酵素及びそのフラグメント、例えば核溶解酵素、抗生物質及び毒素、例えば小分子毒素又は細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素並びにそのフラグメント及び／又は変異体、及び、以下に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を包含する。他の細胞毒性剤は以下に記載する。殺腫瘍剤は腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【０１２３】
「化学療法剤」とは癌の治療において有用な化学物質である。化学療法剤の例はアルキル化剤類、例えばチオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン類、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ；エチレンイミン類及びメチラメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロロメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン類；ベツリン酸；カンプトテシン（例えば合成類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン及び９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えばアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類縁体）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テミポシド；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類縁体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；窒素マスタード類、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸酸化メクロレタミン、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン；抗生物質、例えばエネジン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩ及びカリケアマイシンオメガＩＩ（例えばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ジネマイシン、例えばジネマイシンＡ；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連の色素蛋白質エネジン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オーソラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（例えばモルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮���体、例えばメトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類縁体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類縁体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、デキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗アドレナル類、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシノイド類、例えばマイタンシン及びアンサミトシン類；マイトグアゾン；マイトキサトロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピアルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｂｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＡＶＲＡＸＡＮＥＴＭＣｒｅｍｏｐｈｏｒ−非含有、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｅｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類縁体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノヴァントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類、例えばレチン酸；カペシタラビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記物���の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体；並びに上記物質の二種以上の組み合わせ、例えばＣＨＯＰ、即ちシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの併用療法の略称、及びＦＯＬＦＯＸ、即ち５−ＦＵ及びロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を用いた治療レジメンの略称等を包含する。
【０１２４】
この定義に同様に包含されるものは癌の成長を促進することが可能であるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害する作用を有し、そして、全身投与又は身体全体投与の形態となる場合が多い抗ホルモン剤である。それらはそれら自体がホルモンであってよい。例として、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（例えばＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン類；エストロゲン受容体ダウンレギュレート剤（ＥＲＤ）；卵巣を抑制又はシャットダウンする機能を有する薬剤、例えば黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）作動薬、例えばＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン；他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４（５）−イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲステロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタニー、ファドゾロール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アラストロゾールを包含する。更に、化学療法剤のこのような定義にはビスホスホネート類、例えばクロドロネート（例えばＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチロロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネート；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及び表皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの異常な細胞増殖に関与するとされるシグナル伝達経路内の遺伝子の発現を阻害するもの；ワクチン類、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチン類、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＬＵＰＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブジトシレート（ＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤、ＧＷ５７２０１６としても既知）；及び上記物質の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体も包含される。
【０１２５】
「成長阻害剤」とは、本明細書において使用する場合は、インビトロ又はインビボの何れかにおいて細胞、特にＷｎｔシグナル伝達活性を有する癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指す。即ち、成長阻害剤はＳ期における細胞の割合を有意に低減するものであってよい。成長抑制剤の例は細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置において）妨げる薬剤、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤を包含する。伝統的なＭ期遮断剤はビンカ類（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシンエトポシド及びブレオマイシンを包含する。Ｇ１を停止させる薬剤はまたＳ期停止にまで作用を波及させるものがあり、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル及びａｒａ−Ｃが挙げられる。更に詳細な説明はＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １の表題「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇ」、Ｎｙｒａｊａｎｕ等（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ１９９５），ｐ．１３に記載されている。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は共にイチイの木から誘導される抗癌剤である。ヨーロッパイチイから誘導されたドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）はパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類縁体である。パクリタキセル及びドセタキセルはチュブリン二量体からの微小管の組み立てを促進し、そして脱重合を抑制することにより微小管を安定化させ、これが細胞における有糸分裂を阻害する。
【０１２６】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの全化学名は（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
【０１２７】
「添付文書（パッケージインサート）」という用語は、治療用製品の市販品パッケージ内に慣用的に包含されている説明書を指し、それはそのような治療用製品の使用に関わる適応症、用途、用量、投与、禁忌、及び／又は警告に関する情報を含有する。
ＩＩ．特定の実施形態の説明
本明細書に記載したＷｎｔ拮抗体はインビトロでＷｎｔリガンドに結合することができ、そしてＷｎｔ刺激細胞シグナル伝達を阻害又は抑制させることができる。更に、Ｗｎｔ拮抗体は長いインビボ半減期を有し、そしてインビボで抗腫瘍活性を呈し、マウスＭＭＴＶ乳腺腫瘍モデルにおいてＷｎｔ−１駆動腫瘍の成長を阻害する。Ｗｎｔ拮抗体は又ヒト奇形腫瘍細胞系から誘導される腫瘍異種移植片のマウスでの成長を阻害することができる。Ｗｎｔ拮抗体で処置したマウスから採取した再生組織は生理学的な基準内にあると考えられた。Ｗｎｔ拮抗体はインビトロのヒト腫瘍細胞系におけるオートクリンＷｎｔシグナル伝達を阻害することもできる。
【０１２８】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体蛋白質は全長及び細胞外のドメイン配列の実態に基づいてファミリーに分類することができる。この分類は図８及び９に示すアライメントとして説明される。この図における下線を付した残基は全てのＦｒｚ受容体に渡って保存されており、斜線を付した残基は相同な分類に渡って保存されている。Ｆｒｚ蛋白質は以下のファミリー、即ち１）全長配列に関して６８〜７７％及びＥＣＤに関して９０％の共有相同性を有するＦｒｚ１、Ｆｒｚ２、及びＦｒｚ７；２）全長配列に関して５７％及びＥＣＤに関して８０％の共有相同性を有するＦｒｚ５及びＦｒｚ８；３）全長配列に関して６１％及びＥＣＤに関して７４％の共有相同性を有するＦｒｚ９及びＦｒｚ１０；４）全長配列に関して４９％及びＥＣＤに関して５０％の共有相同性を有するＦｒｚ３及びＦｒｚ６；及び、５）Ｆｒｚ４（Ｆｒｚ１０に対し、全長配列に関して４６％及びＥＣＤに関して４８％の共有相同性を有する）に分類できる。Ｆｒｚ１、Ｆｒｚ２、及びＦｒｚ７のファミリーはまたショウジョウバエＦｒｚ１と多大な相同性を有し、そしてＦｒｚ５及びＦｒｚ８のファミリーはショウジョウバエＦｒｚ２と多大な相同性を有し、それぞれ平板細胞の極性及びＷｎｔシグナル伝達を担っている。
【０１２９】
ＷｎｔリガンドＦｒｉｚｚｌｅｄ結合挙動はＦｒｉｚｚｌｅｄファミリー内に集約されていると考えられる。Ｗｎｔ３ａ及びＷｎｔ５ａの両方は他のＦｒｚ蛋白質に対して最も速くＦｒｚ５、Ｆｒｚ８及びＦｒｚ４に結合するのに対し、Ｗｎｔ３ａはより緩徐な速度でＦｒｚ１、Ｆｒｚ２、及びＦｒｚ７に結合する。Ｗｎｔ５ａの結合挙動の幅及び直線性は、ＯＣＴＥＴ（商標）結合アッセイで調べると、Ｗｎｔ３ａ結合に対してより低い結合親和性を示す。高親和性及び低親和性受容体両方の存在は、急性期及び長期のシグナル伝達のための能力を付与し得る。
【０１３０】
Ｗｎｔリガンド誘導シグナル伝達を阻害するＷｎｔ拮抗体の能力も、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー内に集約されていると考えられる。Ｆｒｚ５及びＦｒｚ８の両方はＷｎｔ３ａシグナルの完全な阻害及びＷｎｔ５ａシグナルの多大な阻害を細胞系アッセイで示している（実施例７）。Ｆｒｚ４、Ｆｒｚ２及びＦｒｚ７はＷｎｔ３ａシグナルの多大な阻害を示す。この所見はｄＦｒｚ２（Ｆｒｚ５及びＦｒｚ８と相同性を有する）がＷｎｔ経路を強力に活性化し、そしてｄＦｒｚ１（Ｆｒｚ１、Ｆｒｚ２及びＦｒｚ７と相同性を有する）がＷｎｔ経路を微弱に活性化できるというショウジョウバエにおける観察結果を反映している。
【０１３１】
作用の特定の理論に制約されないが、本明細書に提示したデータは、Ｗｎｔ拮抗体を使用して作成した細胞系Ｗｎｔシグナル伝達阻害データがＷｎｔ拮抗体へのＷｎｔリガンドの直接の結合を計測することにより得られるデータと相関していることを示しており、これはＷｎｔ拮抗体がＷｎｔリガンドに直接結合し、これによりそれらが細胞上の全長Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合することを妨げていることを示している。本明細書に提示したデータは更に、Ｗｎｔ拮抗体のインビボのＷｎｔシグナル伝達遮断活性を予測するためにインビトロの活性を使用できることを確認するものである。
【０１３２】
実施例において記載するＦｒｚ８−Ｆｃを用いた試験において示される通り、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン及び免疫グロブリンＦｃドメインの両方を含むＷｎｔ拮抗体は驚くべきことにＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン単独を超えたＷｎｔリガンドへの増大した結合親和性を示している。例えば図１４はＦｚＥＣＤドメインをＦｚ（１５６）−Ｆｃ構築物に変換した場合に結合親和性が２桁を超えて増大していることを示している。Ｆｃへのコンジュゲーションが結合親和性の２桁上昇をもたらした安定で高度に有効なＷｎｔシグナル伝達阻害剤としてのＦｚ（１５６）−Ｆｃ構築物の発見は、多いに予測不能で非自明であった。
Ａ．本発明の組成物及び方法
１．ポリペプチド
本発明は癌を包含するＷｎｔ媒介障害の治療のため、及び細胞性Ｗｎｔシグナル伝達の阻害のための組成物及び方法に関する。本発明の１つの態様はＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）ドメイン成分及び免疫グロブリンＦｃドメインを含むキメラ分子であるＷｎｔ拮抗体を提供する。この態様の特定の実施形態においては、Ｆｒｚドメイン成分及びＦｃドメインはリンカーを介して融合される。別の態様は、細胞性Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するため、及び癌などのＷｎｔ媒介障害の治療のためのこれらのＷｎｔ拮抗体の使用を提供する。
【０１３３】
１つの態様において、本発明は細胞外ドメインの最少システインリッチドメイン（ＣＲＤ）、即ち「ＣＲＤ（ＥＣＤ）」を含むＦｒｚドメイン成分を有するキメラ分子であるＷｎｔ拮抗体を提供する。ＣＲＤ（ＥＣＤ）は１００〜２５０アミノ酸の保存された構造的モチーフであり、そして１０個の高度に保存されたシステインにより定義される。この蛋白質ドメインはＷｎｔシグナル伝達ファミリーの２つのクラス、即ちＦｒｉｚｚｌｅｄとして知られる内在性の膜Ｗｎｔ受容体蛋白質、及びＦｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質（ｓＦｒｐ）として知られる分泌細胞外蛋白質において観察される。
【０１３４】
１つの態様において、本発明はＦｒｚ１、Ｆｒｚ２、Ｆｒｚ３、Ｆｒｚ４、Ｆｒｚ５、Ｆｒｚ６、Ｆｒｚ７、Ｆｒｚ８、Ｆｒｚ９、又はＦｒｚ１０などのＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質のＣＲＤ（ＥＣＤ）を含むＦｒｚドメイン成分を有するキメラ分子であるＷｎｔ拮抗体を提供する。そのようなＣＲＤ（ＥＣＤ）の例は図３Ｂに示す通りである。特定の実施形態においては、Ｆｒｚドメイン成分はｈＦｒｚ１（配列番号１８）、ｈＦｒｚ２（配列番号１９）、ｈＦｒｚ３（配列番号２０）、ｈＦｒｚ４（配列番号２１）、ｈＦｒｚ５（配列番号２２）、ｈＦｒｚ６（配列番号２３）、ｈＦｒｚ７（配列番号２４）、ｈＦｒｚ８（配列番号２５）、ｈＦｒｚ９（配列番号２６）、及びｈＦｒｚ１０（配列番号２７）、並びにそれらの活性変異体よりなる群から選択される。
【０１３５】
或いは、Ｆｒｚドメイン成分は、例えば、ｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２、ｓＦＲＰ３、ｓＦＲＰ４、又はｓＦＲＰ５などの分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質（ｓＦＲＰ）に由来するＣＲＤ（ＥＣＤ）を含む。そのようなＣＲＤ（ＥＣＤ）の例は図３Ｂに示す通りである。特定の実施形態においては、Ｆｒｚドメイン成分はｓＦＲＰ１（配列番号２８）、ｓＦＲＰ２（配列番号２９）、ｓＦＲＰ３（配列番号３０）、ｓＦＲＰ４（配列番号３１）、ｓＦＲＰ５（配列番号３２）、及びそれらの活性変異体のＣＲＤ（ＥＣＤ）よりなる群から選択される。
【０１３６】
或いは、Ｆｒｚドメイン成分は、例えば、受容体チロシンキナーゼＲｏｒ１及びＲｏｒ２のＣＲＤ（ＥＣＤ）を含む。そのようなＣＲＤ（ＥＣＤ）の例は図３Ｂに示す通りである。特定の実施形態においては、Ｆｒｚドメイン成分はｈＲｏｒ１（配列番号３３）及びｈＲｏｒ２（配列番号３４）、並びにそれらの活性変異体のＣＲＤ（ＥＣＤ）よりなる群から選択される。
【０１３７】
別の態様において、Ｆｒｚドメイン成分はプロＦｒｚ又はプロｓＦｒｚ配列であり、その例は図３Ａに示す通りである。特定の実施形態においては、Ｆｒｚドメイン成分は
【０１３８】
【化１７】
2010504081.tif 000028
【０１３９】
【化１８】
2010504081.tif 000029
、及びそれらの活性変異体よりなる群から選択される。
【０１４０】
更に別の態様において、Ｆｒｚドメイン成分は成熟Ｆｒｚ、ｓＦＲＰ又はｈＲｏｒ配列から誘導され、その例は図３Ｂに示す通りである。特定の実施形態においては、Ｆｒｚドメイン成分は
【０１４１】
【化１９】
2010504081.tif 000030
、及びそれらの活性変異体よりなる群から選択される。
【０１４２】
特定の実施形態において、キメラＷｎｔ拮抗体分子のＦｒｚドメイン成分及び免疫グロブリンＦｃドメインはリンカーを介して融合される。１つの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。別の実施形態においては、リンカーはＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号６９）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号７１）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号７２）、及びＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号７３）よりなる群から選択される。場合により、リンカーは活性のために必要な最小限の残基以外のＦｒｚドメイン成分又はＦｃドメインの何れかに由来する追加的アミノ酸残基を包含してよい。これらのリンカーは、Ｆｒｚドメイン成分又はＦｃドメイン成分由来のもの以外の追加的アミノ酸残基を含んでよい。
【０１４３】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体はＦｒｚ８ＣＲＤ（ＥＣＤ）及びＦｃドメインを含むＦｒｚ８−Ｆｃキメラである。一部の実施形態においては、Ｆｒｚ８−Ｆｃキメラは更にペプチドリンカーなどのリンカーを含む。別の実施形態において、Ｆｒｚ８−Ｆｃは更にリーダー配列を含む。特定の実施形態においては、Ｆｒｚドメイン成分はＦｒｚ８蛋白質のアミノ酸１〜１５６を含む（配列番号８）。別の実施形態においては、Ｆｃ成分はヒトＦｃである。別の実施形態においては、Ｆｃ成分はヒトＩｇＧＦｃである。更に別の実施形態においては、Ｆｒｚ８−ＦｃはヒトＩｇＧＦｃにリンカーとともに融合されたＦｒｚ８蛋白質のアミノ酸１〜１５６を含むＦｒｚドメイン成分を有する。更に別の実施形態においては、Ｆｒｚ８−Ｆｃは図４Ｂに示すアミノ酸配列を有するキメラである（配列番号７４）。実施例及び添付図面において使用する場合、特段の記載が無い限り、「Ｆｒｚ８−Ｆｃ」とは図４Ｂに示すキメラを指す（配列番号７４）。
【０１４４】
更なる実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体はＦｒｚ５ＣＲＤ（ＥＣＤ）及びＦｃドメインを含むＦｒｚ５−Ｆｃキメラである。一部の実施形態においては、Ｆｒｚ５−Ｆｃキメラは更にペプチドリンカーなどのリンカーを含む。別の実施形態において、Ｆｒｚ５−Ｆｃは更にリーダー配列を含む。特定の実施形態においては、Ｆｒｚドメイン成分はＦｒｚ５蛋白質のアミノ酸２７〜１５５を含む（配列番号５）。別の実施形態においては、Ｆｃ成分はヒトＦｃである。別の実施形態においては、Ｆｃ成分はヒトＩｇＧＦｃである。なお更なる実施形態においては、Ｆｒｚ５−Ｆｃはリーダー配列及びヒトＩｇＧＦｃにリンカーによって融合した成熟Ｆｒｚ５蛋白質のアミノ酸２７〜１５５を含むＦｒｚドメイン成分を有する。更なる実施形態においては、Ｆｒｚ５−Ｆｃは図７Ａに示すアミノ酸配列を有するキメラである（配列番号７５）。実施例及び添付図面において使用する場合、特段の記載が無い限り、「Ｆｒｚ５−Ｆｃ」とは図７Ａに示すキメラを指す（配列番号７５）。
【０１４５】
同様に、別の実施形態は各々該当するＦｒｚ又はｓＦＲＰ蛋白質に由来するＦｒｚＣＲＤ（ＥＣＤ）を含むＦｒｚドメイン成分及びＦｃ成分を含むＦｒｚ１−Ｆｃ、Ｆｒｚ２−Ｆｃ、Ｆｒｚ３−Ｆｃ、Ｆｒｚ４−Ｆｃ、Ｆｒｚ６−Ｆｃ、Ｆｒｚ７−Ｆｃ、Ｆｒｚ９−Ｆｃ、Ｆｒｚ１０−Ｆｃ、ｓＦＲＰ１−Ｆｃ、ｓＦＲＰ２−Ｆｃ、ｓＦＲＰ３−Ｆｃ、ｓＦＲＰ４−Ｆｃ、及びｓＦＲＰ５−Ｆｃキメラを包含する。一部の実施形態においては、Ｆｒｚ−Ｆｃキメラは更にペプチドリンカーなどのリンカーを含む。別の実施形態においては、これらのキメラはリーダー配列を含む。一部の実施形態においては、Ｆｃ成分はヒトＦｃである。別の実施形態においては、Ｆｃ成分はヒトＩｇＧＦｃである。別の実施形態においては、これらのキメラはリーダー配列及びヒトＩｇＧＦｃにリンカーによって融合したＦｒｚＣＲＤ（ＥＣＤ）を有する。更なる実施形態においては、これらのキメラは図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに示すアミノ酸配列を有する（配列番号７６〜８８）。実施例及び添付図面において使用する場合、特段の記載が無い限り、「Ｆｒｚ１−Ｆｃ、Ｆｒｚ２−Ｆｃ、Ｆｒｚ３−Ｆｃ、Ｆｒｚ４−Ｆｃ、Ｆｒｚ６−Ｆｃ、Ｆｒｚ７−Ｆｃ、Ｆｒｚ９−Ｆｃ、Ｆｒｚ１０−Ｆｃ、ｓＦＲＰ１−Ｆｃ、ｓＦＲＰ２−Ｆｃ、及びｓＦＲＰ４−Ｆｃ」とは図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに示す各々のキメラを指す（配列番号７６〜８５、及び８７）。
【０１４６】
Ｗｎｔ拮抗体はインビボで安定である。Ｆｃ成分に付着したＦｒｉｚｚｌｅｄドメインを利用した以前の構築物はインビボで急速に分解され、治療用化合物としての使用に不適当であった（Ｈｓｉｅｈ，Ｊ−Ｃ．等、ＰＮＡＳ、９６：３５４６−３５５１（１９９９））。本明細書に記載したＷｎｔ拮抗体は従来の構築物よりも実質的により長い時間インビボで安定なまま残存する。実施例４（図１３）に示す通り、Ｆｒｚ８−ＦｃＷｎｔ拮抗体は約４日間のインビボ半減期を示している。従って、本発明は哺乳動物に投与された後少なくとも１日、２日、３日、又は４日のインビボ半減期を有するＷｎｔ拮抗体を可能にする。
【０１４７】
更に、実施例３（図１１）に示す通り、Ｗｎｔ拮抗体は従来の構築物よりも実質的により長い間インビボの活性を保持している。１つの実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は哺乳動物に投与された後、少なくとも３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４４時間、４８時間、５２時間、５６時間、６０時間、６４時間、６８時間、７２時間、８０時間、９０時間、又は１００時間、活性である。活性は例えば実施例３及び１１に記載する通りＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力に関してＷｎｔ拮抗体投与哺乳動物の血清を試験することによるか、又は当該分野で知られた方法を用いるかにより計測する。
２．核酸
本発明の１つの態様は本明細書に記載したＷｎｔ拮抗体をコードする核酸を提供する。特定の実施形態においては、核酸は
【０１４８】
【化２０】
2010504081.tif 000031
のＣＲＤ（ＥＣＤ）を含むＷｎｔ拮抗体をコードする。
【０１４９】
別の実施形態においては、核酸は
【０１５０】
【化２１】
2010504081.tif 000032
から選択されたプロＦｒｚ又はプロｓＦＲＰ蛋白質を含むＷｎｔ拮抗体をコードする。
【０１５１】
更に別の実施形態において、核酸は
【０１５２】
【化２２】
2010504081.tif 000033
から選択された成熟Ｆｒｚ、ｓＦＲＰ又はｈＲｏｒ蛋白質を含むＷｎｔ拮抗体をコードする。
【０１５３】
更に別の実施形態において、核酸は
【０１５４】
【化２３】
2010504081.tif 000034
【０１５５】
【化２４】
2010504081.tif 000035
を含むＷｎｔ拮抗体をコードする。
【０１５６】
１つの特定の実施形態において、核酸はＦｒｚ８−Ｆｃをコードし、そして配列番号１２２に示す核酸配列を含む（図５Ｄ）。別の実施形態において、核酸はＦｒｚ５−Ｆｃをコードし、そして配列番号１１９に示す核酸配列を含む（図５Ｃ）。更に別の実施形態において、核酸はＦｒｚ１−Ｆｃ、Ｆｒｚ２−Ｆｃ、Ｆｒｚ３−Ｆｃ、Ｆｒｚ４−Ｆｃ、Ｆｒｚ６−Ｆｃ、Ｆｒｚ７−Ｆｃ、Ｆｒｚ９−Ｆｃ、Ｆｒｚ１０−Ｆｃ、ｓＦＲＰ１−Ｆｃ、ｓＦＲＰ２−Ｆｃ、ｓＦＲＰ３−Ｆｃ、ｓＦＲＰ４−Ｆｃ、又はＦＲＰ５−Ｆｃをコードし、そして、図５に示す核酸配列を含む（Ａ−Ｈ）。例えば、核酸は
【０１５７】
【化２５】
2010504081.tif 000036
を含む。
【０１５８】
本発明の別の態様は上記した核酸に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
３．Ｗｎｔ拮抗体変異体
本明細書に記載したＷｎｔ拮抗体ポリペプチドに加えて、Ｗｎｔ拮抗体変異体を製造できることも意図している。そのような変異体は、コードＤＮＡ内に適切なヌクレオチド変化を導入することによるか、及び／又は所望の変異体の合成により製造できる。アミノ酸変化はＷｎｔ拮抗体の翻訳後のプロセスを改変する場合があることは当業者の知る通りであり、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化、又は膜アンカリング特性の改変が挙げられる。
【０１５９】
Ｗｎｔ拮抗体変異体は例えば１つ以上のドメイン中のアミノ酸残基における突然変異又はアミノ酸変異体であって、依然として生物学的活性を保持しているものを包含する。Ｗｎｔ拮抗体変異体は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は付加を有するが、依然として生物学的活性を保持しているＷｎｔ拮抗体も包含する。アミノ酸残基の付加又は欠失は特に、Ｆｒｚドメイン成分及びＦｃドメインが連結されているアミノ酸配列を包囲する領域において、そのような領域がリンカーを含有するか否かに関わらず、生じる場合がある。Ｗｎｔ拮抗体変異体はレファレンスＷｎｔ拮抗体ポリペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。一般的にそのような変異体は実質的にはレファレンス配列よりもＷｎｔ蛋白質に対して同じかそれより大きい、例えば当該分野で受け入れられている結合アッセイの定量単位／尺度に基づいて、少なくとも０．７５Ｘ、０．８Ｘ、０．９Ｘ、１．０Ｘ、１．２５５Ｘ、１．５Ｘの結合親和性を呈する。
【０１６０】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体変異体は
【化Ｃ２６】
2010504081.tif 000037
【０１６１】
のＣＲＤ（ＥＣＤ）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＦｒｚドメイン成分を含むキメラ分子である。
【０１６２】
別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体変異体は
【０１６３】
【化２７】
2010504081.tif 000038
から選択されたプロＦｒｚ又はプロｓＦＲＰ蛋白質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＦｒｚドメイン成分を含むキメラ分子である。
【０１６４】
更に別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体変異体は
【０１６５】
【化２８】
2010504081.tif 000039
から選択された成熟Ｆｒｚ、ｓＦＲＰ又はｈＲｏｒ蛋白質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＦｒｚドメイン成分を含むキメラ分子である。
【０１６６】
更に別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体変異体は
【０１６７】
【化２９】
2010504081.tif 000040
【０１６８】
【化３０】
2010504081.tif 000041
と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＦｒｚドメイン成分を含むキメラ分子である。
【０１６９】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは２つの配列を整列させる場合にレファレンス（親）ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。％アミノ酸同一性を決定するためには、配列を整列させ、そして必要に応じてギャップを導入することにより最大％配列同一性を達成し；保存的置換は配列同一性の部分とはみなさない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列アライメント手順は当該分野で良く知られている。頻繁には公的に入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを用いることによりペプチド配列を整列させる。比較すべき配列の全長に渡る最大アライメントを達成するために必要ないずれかのアルゴリズムを包含するアライメントを計測するための適切なパラメータは当業者が決定できる。
【０１７０】
アミノ酸配列を整列させる場合、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（代替的には、所定のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有するか含む所定のアミノ酸配列Ａとして表現することもできる）は以下の通り計算できる。
【０１７１】
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ×１００
式中、
ＸはＡ及びＢの配列アライメントプログラム又はアルゴリズムのアライメントにより完全一致と採点されたアミノ酸残基の数であり、
そして、
ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。
【０１７２】
「単離された」又は「精製された」ペプチド、ポリペプチド、蛋白質又は生物学的に活性なフラグメントは、その天然の環境の成分から分離及び／又は回収されている。夾雑成分としては、ポリペプチドの診断上又は治療上の使用を典型的には妨害すると考えられる物質を包含し、そして酵素、ホルモン、及び他の蛋白質性又は非蛋白質性の物質を包含してよい。好ましくは３０乾燥重量％未満の望ましくない夾雑物質（夾雑物）、好ましくは２０％、１０％未満、そして好ましくは５％未満の夾雑物を有する調製品が実質的に単離されたとみなされる。単離された、組み換え産生されたペプチド／ポリペプチド、又はその生物学的に活性な部分は好ましくは実質的に培地不含であり、即ち培地はペプチド／ポリペプチド調製品の体積の好ましくは２０％未満、好ましくは約１０％未満、そして好ましくは約５％未満に相当する。夾雑物の例は細胞破砕物、培地、及びペプチド／ポリペプチドのインビトロ合成の間に使用及び生成された物質を包含する。
【０１７３】
本明細書に記載するＷｎｔ拮抗体における変異は、例えば米国特許第５，３６４，９３４号に記載された保存的及び非保存的突然変異に関する手法及び指針の何れかを用いながら行うことができる。変異はネイティブの配列の抗体又はポリペプチドと比較した場合にアミノ酸配列における変化をもたらす抗体又はポリペプチドをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合により、変異は、１つ以上のＷｎｔ拮抗体ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸の何れかの他のアミノ酸による置換による。どのアミノ酸残基を所望の活性に悪影響を及ぼさずに挿入、置換又は欠失させ得るかを決定する場合の手掛かりは、Ｗｎｔ拮抗体の配列を相同な既知の蛋白質分子のものと比較すること、及び、高相同性の領域において生じたアミノ酸配列変化の数を最小限にすることにより発見してよい。アミノ酸置換は１つのアミノ酸を同様の構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸により置き換えること、例えばロイシンのセリンによる置き換え、即ち保存的なアミノ酸の置き換えの結果であることができる。挿入、欠失又は置換は場合により約１〜５アミノ酸の範囲内であってよい。許容される変異は、配列内のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成すること、及び、生じた変異体を全長又は成熟ネイティブ配列により呈される活性に関して試験することにより決定してよい。
【０１７４】
Ｗｎｔ拮抗体は多くの従来の手法の何れかにより製造してよい。所望のペプチドフラグメントは化学合成してよい。代替法においては、例えば特定のアミノ酸残基により定義される部位において蛋白質を切断することが知られている酵素で蛋白質を処理することによるか、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望のフラグメントを単離することによる酵素的消化によって、抗体又はポリペプチドのフラグメントを形成する。更に別の適当な手法では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により所望の抗体又はポリペプチドのフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを単離して増幅することを含む。ＤＮＡフラグメントの所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドはＰＣＲにおいては５’及び３’プライマーにおいて使用される。
【０１７５】
特定の実施形態においては、目的の保存的置換は好ましい置換という見出しで表Ａに示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、次に、表Ａにおいて命じた例示的置換とされているか、又はアミノ酸クラスに言及しながら後に説明される、より実質的な変化を導入し、そして生成物をスクリーニングする。
【表Ａ】
2010504081.tif 000042
【０１７６】
Ｗｎｔ拮抗体の機能又は免疫学的実体における実質的な修飾は、（ａ）例えばシート又は螺旋状のコンホーメーションとしての置換域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するその作用が有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は共通の側鎖の特性に基づいて以下の通り分割される。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを他のクラスと交換することを必然的に課する。そのように置換された残基は、保存的置換の部位内に、又は、より好ましくは、残余の（非保存の）部位内に導入されてもよい。
【０１７７】
変異は当該分野で知られた方法、例えばオリゴヌクレオチド媒介（部位指向性）突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を用いて実施できる。部位指向性突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等、Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］又は他の既知の手法をクローニングされたＤＮＡに対して実施することにより本発明のＷｎｔ拮抗体を製造することができる。
【０１７８】
スキャニングアミノ酸分析もまた隣接配列に沿った１つ以上のアミノ酸を発見するために使用できる。好ましいスキャニングアミノ酸は相対的に小型の中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸はアラニン、グリシン、セリン及びシステインを包含する。アラニンは典型的にはそれがベータ炭素を超えて側鎖を排除し、そして変異体の主鎖のコンホーメーションを改変する可能性が低いことから、このグループ内では好ましいスキャニングアミノ酸である［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。また、アラニンは典型的には、それが最も一般的なアミノ酸であることから好ましい。更に、それは埋没及び曝露された位置の両方において頻繁に存在する［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＮＹ）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が十分量の変異体を与えない場合は、アイソテリックアミノ酸を使用できる。
【０１７９】
Ｗｎｔ拮抗体の適切なコンホーメーションを維持することに関与しない何れかのシステイン残基も、一般的にセリンで置換されることにより、分子の酸化安定性を向上させ、そして異常な架橋を抑制することができる。逆に、システイン結合をＷｎｔ拮抗体に添加することによりその安定性を向上させてよい（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントの場合）。
【０１８０】
置換変異体の特に好ましい型においては、親抗体（例えばヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換する。一般的に、その後の開発のために選択される得られた変異体はそれらの作成元となった親抗体に対して向上した生物学的特性を有することになる。そのような置換変異体を形成するための好都合な方法では、ファージ提示法を用いた親和性突然変異を行う。慨すれば、数種の超可変領域部位（例えば６〜７部位）を突然変異させることにより各部位において全ての可能なアミノ酸置換を発生させる。このようにして発生した抗体変異体は、フィラメントファージ粒子から一価の様相において、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として提示される。次にファージ提示された変異体を本明細書に開示する通りそれらの生物学的活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域を発見するためには、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施することにより抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を発見できる。代替的に、又は追加的に、Ｗｎｔ拮抗体とＷｎｔ蛋白質との間の接点を識別するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することも有利な場合がある。そのような接触残基及び近隣残基は本明細書において精査している手法に従った置換の候補となる。そのような変異体を形成したのち、変異体のパネルを本明細書に記載するスクリーニングに付し、そして１つ以上の該当するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をその後の開発のために選択してよい。
【０１８１】
Ｗｎｔ拮抗体の共有結合修飾は本発明の範囲に包含される。共有結合修飾の１つの型はＷｎｔ拮抗体の標的化されたアミノ酸残基をＷｎｔ拮抗体の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応することができる有機性の誘導体化剤に反応させることを包含する。二官能性物質を用いた誘導体化は、例えば、Ｗｎｔ拮抗体を精製するための方法における使用のための水溶性の支持体マトリクス又は表面にＷｎｔ拮抗体を架橋させる場合に有用である。一般的に使用されている架橋剤は、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルアラニン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル、例えばジスクシンイミジルエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、二官能性マレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの物質を包含する。
【０１８２】
他の修飾はグルタミニル及びアスパラギニル残基からそれぞれ相当するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニン、及びヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化を包含する。
【０１８３】
本発明の範囲内に包含されるＷｎｔ拮抗体の共有結合修飾の別の型はＷｎｔ拮抗体のＦｒｚ、Ｗｎｔ又はｓＦＲＰポリペプチドドメインのネイティブのグリコシル化パターンを改変することを含む。「ネイティブのグリコシル化パターンを改変する」とは成分ドメインのネイティブの配列に存在する１つ以上の炭水化物部分を欠失させること（伏在するグリコシル化部位を除去することによるか、又は化学的及び／又は酵素的手段によりグリコシル化を欠失させることによる）、及び／又は、ネイティブ配列の成分ドメインには存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加させることとして定義される。更に、この句には存在する種々の炭水化物部分の性質及び比率の変化が関与するネイティブ蛋白質のグリコシル化における定性的変化も包含される。
【０１８４】
抗体及び他のポリペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ連結又はＯ連結である。Ｎ連結とはアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリン以外の何れかのアミノ酸であるトリペプチド配列、即ちアスパラギン−Ｘ−セリン、及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。即ちポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在することは、潜在的なグリコシル化部位を生じさせる。Ｏ連結グリコシル化は、糖の１つであるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用してよい。
【０１８５】
Ｗｎｔ拮抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、アミノ酸配列をそれが１つ以上の上記トリペプチド配列を含有するように改変することにより達成される（Ｎ連結グリコシル化部位の場合）。改変は、元の（即ち前変異体の）Ｗｎｔ拮抗体の配列の配列への１つ以上のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換により行ってよい。この配列は場合により、ＤＮＡレベルにおける変化を介して、特に、所望のアミノ酸に翻訳することになるコドンが形成されるように予め選択された塩基における配列をコードするＤＮＡを突然変異させることにより改変してもよい。
【０１８６】
Ｗｎｔ拮抗体上の炭水化物部分の数を増やす別の手段はポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的なカップリングによる。そのような方法は当該分野で知られており、例えば１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０１８７】
Ｗｎｔ拮抗体上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、又はグリコシル化の標的として作用するアミノ酸残基に関してコードしているコドンの突然変異的置換により達成してよい。化学的な脱グリコシル化手法は当該分野で知られており、そして、例えばＨａｋｉｍｕｄｄｉｎ等、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）及びＥｄｇｅ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断はＴｈｏｔａｋｕｒａ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）により記載されている通り種々のエンド−及びエキソグリコシダーゼの使用により達成できる。
【０１８８】
Ｗｎｔ拮抗体の共有結合修飾の別の型は、米国特許４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２又は４，１７９，３３７に記載の様式において、種々の非蛋白質性の重合体の１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに配列を連結することを含む。抗体又はポリペプチドは、例えばコアセルベーション手法によるか又は界面重合により（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）により製造されたマイクロカプセル中、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルジョン中に捕獲してもよい。そのような手法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．編（２０００）に開示されている。
【０１８９】
本発明のＷｎｔ拮抗体は、別の非相同ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＷｎｔ拮抗体を含む別のキメラ（即ちＦｒｚ−、ｓＦＲＰ−又はＲｏｒ−Ｆｃキメラ）の性質を有する分子を形成するやり方で修飾してもよい。
【０１９０】
１つの実施形態において、そのようなキメラ分子は抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを与えるタグポリペプチドとのＷｎｔ拮抗体の融合物を含む。エピトープタグは一般的にＷｎｔ拮抗体のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。Ｗｎｔ拮抗体のこのようなエピトープタグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出できる。更に、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体を用いたアフィニティ精製、又はエピトープタグに結合するアフィニティマトリクスの別の型によりＷｎｔ拮抗体を容易に精製可能にする。種々のタグポリペプチド及びその各々抗体は当該分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−Ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）］；及び単純疱疹ウィルス糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が包含される。他のタグポリペプチドはＦｌａｇ−ペプチド［Ｈｏｐｐ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）］；アルファチュブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０蛋白質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）］を包含する。
【０１９１】
代替実施形態において、Ｗｎｔ拮抗体は変異体Ｆｃ成分を含む。例えばＦｃ領域はヒンジシステインの位置を包含する１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含んでいるヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでよい。１つの実施形態においてそのような変異体はレファレンスＦｃポリペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１９２】
１つの実施形態において、Ｆｃ領域変異体は改変された新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合活性を呈する場合がある。そのような変異体Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、４００、４１３、４１５、４２４、４３３、４３４、４３５、４３６、４３９又は４４７の何れか１つ以上においてアミノ酸修飾を含んでよく、Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデクスのナンバリングである。ＦｃＲｎに対する低減された結合を有するＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２５２、２５３、２５４、２５５、２８８、３０９、３８６、３８８、４００、４１５、４３３、４３５、４３６、４３９又は４４７の何れか１つ以上においてアミノ酸修飾を含んでよい（ＥＵインデクス／Ｋａｂａｔナンバリング）。或いは、ＦｃＲｎに対して増大した結合を示す変異体はＦｃ領域のアミノ酸位置２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の何れか１つ以上においてアミノ酸修飾を含んでよい（ＥＵインデクス／Ｋａｂａｔナンバリング）。
【０１９３】
他の実施形態においては、Ｆｃ領域変異体はＦｃγＲに対する低減した結合を示してよく、Ｆｃ領域の位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９においてアミノ酸修飾を含む（ＥＵインデクス／Ｋａｂａｔナンバリング）。
【０１９４】
更に別の実施形態において、Ｆｃ領域変異体はＦｃγＲＩＩに対する低減した結合を示してよく、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８又は４３９の何れか１つ以上においてアミノ酸修飾を含む（ＥＵインデックス／Ｋａｂａｔナンバリング）。
【０１９５】
更なる実施形態において、Ｆｃ領域変異体はＦｃγＲＩＩに対する増強された結合を示してよく、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８又は４３９の何れか１つ以上においてアミノ酸修飾を含む（ＥＵインデックス／Ｋａｂａｔナンバリング）。
【０１９６】
なお更なる実施形態においては、目的のＦｃ領域変異体はＦｃγＲＩＩＩに対する低減された結合を示してよく、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２３９、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５、又は４３７の１つ以上においてアミノ酸修飾を含む（ＥＵインデックス／Ｋａｂａｔナンバリング）。
【０１９７】
なお更なる実施形態において、改変された（即ち向上又は軽減された）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を有するＦｃ領域変異体がＷＯ９９／５１６４２に記載されている。そのような変異体は、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３３１、３３３又は３３４の１つ以上においてアミノ酸置換を含んでよい。また、Ｆｃ領域変異体に関してはＤｕｎｃａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許５，６４８，２６０；米国特許５，６２４，８２１及びＷＯ９４／２９３５１を参照できる。
Ｂ．Ｗｎｔ拮抗体の製造
以下の説明は主にＷｎｔ拮抗体ポリペプチドコード核酸を含有するベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を培養することによるＷｎｔ拮抗体ポリペプチドの製造に関する。当然ながら当該分野で良く知られている代替法もそのようなＷｎｔ拮抗体を製造するために使用してよいことを意図している。例えば適切なアミノ酸配列又はその部分は固相技術を用いながら直接ペプチド合成により製造してよい［例えばＳｔｅｗａｒｔ等、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）参照］。インビトロでの蛋白質合成は手動法を用いるか、又は自動により行ってよい。自動合成は例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いながら製造元の取扱説明書を使用して達成してよい。Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドの種々の部分を別個に化学合成し、そして化学的又は酵素的な方法を用いて組み合わせることにより所望の配列を製造してよい。
１．Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
拮抗体の配列又はＷｎｔ拮抗体の何れかの所望の成分ドメイン、例えばＦｒｚ又はｓＦＲＰをコードするＤＮＡは、そのような配列を保有し、そして検出可能なレベルでそれを発現すると考えられている組織から製造したｃＤＮＡライブラリから得てよい。従って、ヒトＦｒｚ又はｓＦＲＰ配列ＤＮＡはヒト組織から製造したｃＤＮＡライブラリから好都合に得ることができる。所望のＤＮＡ配列遺伝子は、ゲノムライブラリから、又は既知の合成手順（例えば自動核酸合成）により得てもよい。
【０１９８】
ライブラリは目的の遺伝子又はそれによりコードされる蛋白質を識別するように設計されたプローブ（例えば少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）を用いてスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている標準的な手順を用いながら実施してよい。Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチド及びその成分をコードする遺伝子を単離するための代替的手段はＰＣＲ法を使用することである［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上出；  Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ等、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５）］。
【０１９９】
ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための手法は当該分野で良く知られている。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は偽陽性が最小限となるように十分な長さのものであり、そして十分に明確である必要がある。オリゴヌクレオチドは好ましくはそれがスクリーニングされているライブラリ中のＤＮＡへのハイブリダイゼーション時に検出されることができるように標識される。標識方法は当該分野で良く知られており、３２Ｐ−標識ＡＴＰのような放射性標識の使用、ビオチニル化、又は酵素標識を包含する。ハイブリダイゼーション条件、例えば中ストリンジェンシー及び高ストリンジェンシー等は上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等に記載されている。
【０２００】
そのようなライブラリスクリーニング法において識別された配列はＧｅｎＢａｎｋなどの公的なデータベース又は他の私的な配列データベースに寄託されそこから入手できる他の既知配列と比較し、そして整列させることができる。分子の指定領域内、又は全長配列に渡る配列同一性（アミノ酸又はヌクレオチドレベルの何れかにおける）は当該分野で知られた方法を用いながら、そして本明細書に記載する通り、決定することができる。
【０２０１】
Ｆｃ免疫グロブリンドメインをコードするＤＮＡ配列は所望のＦｃサブタイプのｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞から誘導してよい。
【０２０２】
蛋白質コード配列を有する核酸は本明細書において最初に開示された推定アミノ酸配列を用いて選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすること、そして必要に応じて、ｃＤＮＡに逆転写されていないと考えられるｍＲＮＡの前駆体及びプロセシング中間体を検出するための上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等において記載されている従来のプライマー伸長手順を用いることにより得てよい。
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞はＷｎｔ拮抗体ポリペプチド産生に関して本明細書に記載した発現ベクター又はクローニングベクターを用いてトランスフェクト又は形質転換し、そしてプロモータの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜変性された従来の栄養培地中で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨなどは予定外の実験を行うことなく当業者が選択できる。一般的に、細胞培養の生産性を最大限にするための原理、プロトコル及び実際の手法はＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，編（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ等、上出に記載されている。
【０２０３】
真核生物細胞のトランスフェクション及び原核生物細胞の形質転換の方法は当該分野で知られる通りであり、例えばＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションである。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適切である標準的手法を用いて実施する。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等に記載されている塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、又はエレクトロポレーションが一般的には原核生物に対して使用されている。Ｓｈａｗ等、Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されている通り、特定の植物細胞の形質転換のためにはアグロバクテリウム・ツメファシエンスによる感染が使用される。そのような細胞壁を有さない哺乳動物細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒＥｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈澱方法を使用できる。哺乳動物細胞宿主系トランスフェクションの一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母への形質転換は典型的にはＶａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎ等、Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）及びＨｓｉａｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法、例えば核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、未損傷細胞との細菌プロトプラスト融合、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチンも使用してよい。哺乳動物細胞を形質転換するための種々手法に関してはＫｅｏｗｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）ａｎｄ  Ｍａｎｓｏｕｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照できる。
【０２０４】
本明細書に記載したベクターにおいてＤＮＡをクローニング又は発現させるための適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、又はより高次の真核生物の細胞を包含する。適当な原核生物は、例えば限定しないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性の生物、例えば腸内細菌科、例えば大腸菌を包含する。種々の大腸菌株が公的に入手可能であり、例えば大腸菌Ｋ１２菌株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）が挙げられる。他の適当な原核生物宿主細胞は腸内細菌科、例えばエシェリシア、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウイニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばサルモネラ・チフィムリウム、セラチア、例えばセラチア・マルセスカンス、及びシゲラ、並びにバチルス、例えばＢ・サブチルス及びＢ・リシェニフォルミス（例えば１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ・リシェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えばＰ・アエルギノーサ、及びストレプトマイセスを包含する。これらの例は例示に過ぎず、限定するものではない。菌株Ｗ３１１０は組み換えＤＮＡ産物発酵のための共通した宿主菌株であることから、特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小限の量の蛋白質分解性酵素を分泌する。例えば菌株Ｗ３１１０は宿主にとって内因性である蛋白質をコードする遺伝子における遺伝子突然変異を起こすように修飾してよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０菌株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０菌株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡＥ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｄｅｇＰｏｍｐＴｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０菌株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡＥ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｄｅｇＰｏｍｐＴｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０菌株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異を有する菌株３７Ｄ６である大腸菌Ｗ３１１０菌株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許４，９４６，７８３に開示されている突然変異体ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌株が包含される。或いは、クローニングのインビトロでの方法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適当である。
【０２０５】
全長の抗体、抗体フラグメント、及び抗体融合蛋白質は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクタ機能が必要でない場合、例えば治療用抗体が細胞毒性剤（例えば毒素）にコンジュゲートされており、そしてイムノコンジュゲート自体が腫瘍細胞破壊において有効性を示す場合には、細菌中で生産することができる。全長の抗体は循環系中でより長い半減期を有する。大腸菌中での生産はより急速であり、そして経費効率的である。細菌中の抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許５，６４８，２３７（Ｃａｒｔｅｒ等）、米国特許５，７８９，１９９（Ｊｏｌｙ等）、及び米国特許５，８４０，５２３（Ｓｉｍｍｏｎｓ等）を参照することができ、これは翻訳開始領域（ＴＩＲ）並びに発現及び分泌を最適化するためのシグナル配列を記載しており、これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる。発現後、抗体を可溶性画分において大腸菌細胞ペーストから単離し、そしてアイソタイプに応じて例えばプロテインＡ又はＧカラムを通過させて精製できる。最終精製は例えばＣＨＯ細胞において発現された抗体を精製するための過程と同様に実施できる。
【０２０６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核生物の微生物もＷｎｔ拮抗体ポリペプチドコードベクターのためのクローニング又は発現宿主として適している。サッカロマイセス・セレビシアエは一般的に使用されている真核生物宿主微生物である。他にはスキゾサッカロマイセスポンベ（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０［１９８１］；１９８５年５月２日公開のＥＰ１３９，３８３）；クルイベロマイセス宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））、例えばＫ・ラクチス（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）：７３７−７４２［１９８３］）、Ｋ・フラジリス（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ・ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ・ウイケラミ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ・ワルチ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ・ドロソフィララム（ＡＴＣＣ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、Ｋ・サーモトレランス、及びＫ・マルキシアヌス；ヤロウイア（欧州特許４０２，２２６）；ピチア・パストリス（欧州特許１８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ等、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｃａｓｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３［１９７９］）；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えばニュロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００３５７）及びアスペルギルス宿主、例えばＡ・ニズランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎ等、Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４［１９８４］）及びＡ・ニガー（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：４７５−４７９［１９８５］）が包含される。メチロトロピックな酵母が本発明において適当であり、そして限定しないがハンセヌラ、カンジダ、クロエケラ、ピチア、サッカロマイセス、トルロプシス及びロドトルラよりなる属から選択したメタノールでの成長が可能な酵母を包含する。酵母のこのクラスの例である特定の種のリストはＣ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に記載されている。
【０２０７】
グリコシル化Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドの発現のための適当な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例は昆虫細胞、例えばドロソフィリアＳ２及びスポドプテラＳｆ９、並びに植物細胞、例えばメンカ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養物を包含する。多くのバキュロウィルス菌株及び変異体及びスポドプテラ・フルギペルダ（イモムシ）、アエデス・アエギプチ（カ）、アエダス・アルドピクタス（カ）、ドロソフィリア・メラノガスター（ミバエ）、及びボンビックス・モリなどの宿主に由来する相当する許容性の昆虫宿主細胞が識別されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株が公的に入手可能であり、例えばオートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体及びボンビックス・モリＮＰＶのＢｍ−５菌株が挙げられ、そしてそのようなウィルスは特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために本発明に従ってここでウィルスとして使用してよい。
【０２０８】
しかしながら、脊椎動物細胞において最大の利益がもたらされており、そして培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の増殖が常套的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例はＳＶ４０で形質転換されたサル腎ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎細胞系（２９３又は懸濁培養物中の成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ等、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ等、ＡｎｎａｌｓＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーマ系統（ＨｅｐＧ２）である。
【０２０９】
宿主細胞はＷｎｔ拮抗体ポリペプチド生産用の上記発現又はクローニングベクターで形質転換し、そしてプロモータの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に変性された従来の栄養培地中で培養する。
３．複製可能なベクターの選択及び使用
本発明の１つの態様はクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、又は発現のために複製可能なベクター内に挿入されたＷｎｔ拮抗体ポリペプチドをコードする核酸（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を使用可能とする。種々のベクターが公的に入手できる。ベクターは例えばプラスミド、コスミド、ウィルス粒子、又はファージであってよい。適切な核酸配列を種々の手順によりベクター内に挿入してよい。一般的に、ＤＮＡは当該分野で知られた手法を用いて適切な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。ベクター成分は一般的に１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサエレメント、プロモータ、及び転写終止配列を包含するがこれらに限定されない。これらの成分の１つ以上を含有する適当なベクターの構築は当該分野で知られた標準的なライゲーション手法を用いる。
【０２１０】
Ｗｎｔ拮抗体は直接的のみならず、成熟蛋白質又はポリペプチドのＮ末端における特定の切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドであってよい、非相同ポリペプチドとのポリペプチドの融合物として組み換え生産してよい。一般的にシグナル配列はベクターの成分であってよく、又はそれはベクター内に挿入されるＷｎｔ拮抗体ポリペプチドコードＤＮＡの一部分であってよい。シグナル配列は例えばアルカリホスファターゼ、ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーよりなる群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌のためには、シグナル配列は例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロマイセス及びクルイベロマイセスのα−因子リーダーを包含し、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスファターゼリーダー、Ｃ・アルビカンスグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開の欧州特許３６２，１７９）、又は１９９０年１１月１５日公開のＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであってよい。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列、例えば同じか関連する種の分泌ポリペプチドに由来するシグナル配列、並びにウィルス分泌リーダーを用いて蛋白質の分泌を指向してよい。
【０２１１】
発現及びクローニングベクターは両方とも１つ以上の選択された宿主細胞においてベクターを複製可能とする核酸配列を含有する。そのような配列は種々の細菌、酵母及びウィルスに関してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が大部分のグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、そして種々のウィルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶ又はＰＢＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【０２１２】
発現及びクローニングベクターは典型的には選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含有する。典型的な選択遺伝子は（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性の欠損を補償し、又は（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養を供給する蛋白質をコードしており、例えばバチルスのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【０２１３】
哺乳動物細胞のための適当な選択可能なマーカーの例は、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼなどの、Ｗｎｔ拮抗体コード核酸の取り込み能力を有する細胞の識別を可能にするものである。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適切な宿主細胞はＵｒｌａｕｂ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）に記載の通り製造及び増殖させたＤＨＦＲ活性欠損のＣＨＯ細胞系である。酵母で使用するための適当な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ等、Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等、Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子はトリプトファン中で成長する能力を欠いた酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ４４０７６又はＰＥＰ４−１のための選択マーカーを与える［Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）］。
【０２１４】
発現及びクローニングベクターは通常はｍＲＮＡ合成を指向するためにＷｎｔ拮抗体コード核酸配列に作動可能に連結したプロモータを含有する。種々の潜在的宿主細胞により認識されるプロモータはよく知られている。原核生物の宿主で使用するのに適するプロモータはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモータ系［Ｃｈａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；欧州特許３６，７７６］及びハイブリッドプロモータ、例えばｔａｃプロモータ［ｄｅＢｏｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］を包含する。細菌系における使用のためのプロモータもまたＷｎｔ拮抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結したＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【０２１５】
酵母宿主と共に使用するための適当なプロモータ配列の例は３−ホスホグセレートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０）］又は他の解糖系酵素［Ｈｅｓｓ等、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモータを包含する。
【０２１６】
成長条件により制御される転写の追加的利点を有する誘導プロモータである他の酵母プロモータはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ及びマルトース及びガラクトースの利用を担う酵素のプロモータ領域である。酵母発現において使用するための適当なベクター及びプロモータはＥＰ７３，６５７においても記載されている。
【０２１７】
哺乳動物宿主細胞中におけるベクターからのＷｎｔ拮抗体ポリペプチドの転写は例えばポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノムから、非相同哺乳動物プロモータ、例えばアクチンプロモータ又は免疫グロブリンプロモータから、そして、熱ショックプロモータから得られたプロモータによりにより制御されるが、このようなプロモータが宿主細胞系と適合することを条件とする。
【０２１８】
より高等な真核生物によるＷｎｔ拮抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はベクター中にエンハンサ配列を挿入することにより増大させてよい。エンハンサは通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントであり、これはプロモータに対してその転写を増大させるように作用する。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサ配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら典型的には、真核生物細胞ウィルス由来のエンハンサを使用することになる。例としては複製起点の後期側上のＳＶ４０エンハンサ（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウィルス早期プロモータエンハンサ、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサ及びアデノウィルスエンハンサが包含される。エンハンサはＷｎｔ拮抗体ポリペプチドコード配列に対して５’又は３’の位置においてベクター内にスプライスしてよいが、好ましくはプロモータから５’側の部位に位置する。
【０２１９】
真核生物宿主細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞）中で使用する発現ベクターはまた転写の終止のため、及びｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含有する。そのような配列は真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’側、場合によっては３’側の未翻訳の領域から一般的に得られる。これ等の領域はＷｎｔ拮抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分内のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
【０２２０】
組み換え脊椎動物細胞培養物中のＷｎｔ拮抗体ポリペプチドの合成に適合させるために適するさらに別の方法、ベクター及び宿主細胞はＧｅｔｈｉｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉ等、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；欧州特許１１７，０６０；及び欧州特許１１７，０５８に記載されている。
４．宿主細胞の培養
本発明の１つの態様はＷｎｔ拮抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。本発明のＷｎｔ拮抗体ポリペプチドを製造するために使用する宿主細胞は種々の培地中で培養してよい。市販の培地、例えばＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコの変性イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が宿主細胞の培養のために適している。更に、Ｈａｍ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５（１９８０）、米国特許４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５又は５，１２２，４６９；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；米国特許Ｒｅ．３０，９８５に記載されている培地の何れかを宿主細胞の培地として使用してよい。これらの培地の何れもホルモン及び／又は成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（マイクロモルの範囲における終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補給してよい。何れかの他の必要な補給物も、当該分野で知られた適切な濃度において包含させてよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、そして当業者の知る通りである。
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺勉子増幅及び／又は発現は直接試料中で、例えばｍＲＮＡの転写を定量するための従来のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、又はインサイチュハイブリダイゼーションにより、本明細書において提供された配列に基づいて適切に標識されたプローブを用いながら計測してよい。或いは特定のデュプレックス、例えばＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドデュプレックス又はＤＮＡ−蛋白質デュプレックスを認識できる抗体を使用してよい。次に抗体を標識してよく、そして、表面上のデュプレックスの形成時にデュプレックスに結合した抗体の存在が検出できるようにデュプレックスを表面に結合させる試験を実施してよい。
【０２２１】
或いは、遺伝子発現を免疫学的方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養アッセイにより計測することにより、遺伝子産物の発現を直接定量してよい。試料流体の免疫組織学的染色及び／又はアッセイのために有用な抗体はモノクローナル又はポリクローナルのいずれかであってよく、そして何れかの哺乳動物において製造してよい。好都合には、抗体は本明細書にて識別したＦｒｚ、ｓＦＲＰ又はＲｏｒ配列に対して、又は本明細書にて提供したＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対して、又はＷｎｔ拮抗体に融合され特定の抗体エピトープをコードしている外因性配列に対して作成してよい。
６．Ｗｎｔ拮抗体の精製
Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドの形態は培地から、又は宿主細胞溶解物から回収してよい。膜結合の場合は、それは適当な洗剤溶液（例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を用いるか、又は酵素的分解により、膜から放出され得る。Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドの発現において使用される細胞は種々の物理的又は化学的な手段、例えば凍結−解凍のサイクリング、超音波処理、機械的崩壊、又は細胞溶解剤により崩壊することができる。
【０２２２】
組み換え細胞蛋白質又はポリペプチドからＷｎｔ拮抗体ポリペプチドを精製することが必要な場合がある。以下の手順は適当な精製手順の例であり、例えばイオン交換カラム上の分画；エタノール沈澱；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィ；等電点クロマトグラフィ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈澱；例えばセファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過；ＩｇＧなどの夾雑物を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；及びＷｎｔ拮抗体のエピトープタグ化形態に結合するための金属キレートカラムが挙げられる。蛋白質精製の種々の方法を使用してよく、そしてそのような方法は当該分野で知られており、そして例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択される使用工程は、例えば、使用される生成課程の特性、及び生成される具体的なＷｎｔ拮抗体ポリペプチドに依る。
【０２２３】
組み換え手法を使用する場合、Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドは細胞内で、ペリプラズム空間において生成することができ、或いは培地中に直接分泌させることができる。Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドを細胞内で生成させる場合、第１工程として、何れかの粒状破砕物、即ち宿主細胞又は溶解フラグメントを例えば遠心分離又は超音波処理により除去する。Ｃａｒｔｅｒ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７（１９９２）は大腸菌のペリプラズム空間内に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。慨すれば、細胞ペーストを約３０分間酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）の存在下に解凍する。細胞破砕物は遠心分離により除去できる。Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドを培地中に分泌させる場合は、そのような発現系由来の上澄みは一般的に先ず市販の蛋白質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦを前の工程の何れかに含むことにより蛋白質分解を阻害してよく、そして抗生物質を含むことにより有害な夾雑物の成長を抑制してよい。
【０２２４】
細胞から製造したＷｎｔ拮抗体ポリペプチド組成物は例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィを用いて精製してよく、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製手法である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適性は抗体中に存在する何れかの免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依る。プロテインＡはヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスアイソタイプに対して、そしてヒトγ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓ等、ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが結合するマトリクスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリクスも使用できる。力学的に安定なマトリクス、例えば制御された細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンはアガロースで達成できるよりも速い流速及び短いプロセシング時間を可能にする。Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドがＣＨ３ドメインを含む場合は、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。蛋白質精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上の分画、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィ、ヘパリンＳＷＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィ、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上のクロマトグラフィ、等電点クロマトグラフィ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈澱も回収すべき抗体に応じて使用される。
【０２２５】
何れかの予備的な精製工程の後、目的の抗体及び夾雑物を含む混合物を、好ましくは低塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍ塩）において実施される約２．５〜２．４のｐＨの溶離緩衝剤を用いた低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに付してよい。
Ｃ．医薬品製剤
本明細書の１つの態様はＷｎｔ拮抗体及び少なくとも１つの製薬上許容しうる担体又は賦形剤を含む組成物を使用可能とする。本発明に従って使用するＷｎｔ拮抗体の治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態において、任意の製薬上許容しうる担体、賦形剤、又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編（２０００））に所望の純度を有するＷｎｔ拮抗体を混合することにより、保存用として製造される。「製薬上許容しうる担体」は医薬品投与に適合する種々多様な溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗カビ剤、等張性吸収遅延剤などを包含する。適当な担体又は希釈剤の追加的な例は、水、食塩水、Ｆｉｎｇｅｒ溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを包含するがこれらに限定されない。リポソーム及び非水性のビヒクル、例えば固定油を使用してもよい。従来の培地又は物質が活性化合物と不適合である場合を除き、これらの組成物の使用が意図される。補助的な活性化合物を組成物に配合することもできる。
【０２２６】
許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は使用される用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして緩衝剤、例えば酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機性の酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；蛋白質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン、親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート形成剤、例えばＥＤＴＡ；等張剤、例えばトレハロース及び塩化ナトリウム；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール；界面活性剤、例えばポリソルベート；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−蛋白質複合体）；及び／又はノニオン系界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。抗体は好ましくは抗体を５〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。
【０２２７】
製剤は本明細書においては治療すべき特定の適応症のために必要に応じて１種より多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含有してよい。例えば特定のＷｎｔ拮抗体に加えて、１つの製剤中には、例えばＷｎｔ蛋白質上の異なるエピトープをまったく異なるＷｎｔ蛋白質に結合させる追加的な抗体、又はＷｎｔ媒介障害の拡大に影響する成長因子などの何らかの他の標的に対する抗体を包含させることが望ましい場合がある。代替的に、又は追加的に、組成物は更に化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤を含んでよい。そのような分子は意図される目的のために有効である量で適宜組み合わせて存在させる。
【０２２８】
活性成分は、例えばコアセルベーション法によるか、又は界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又は、マクロエマルジョン中に捕獲してよい。そのような手法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編（２０００）に記載されている。
【０２２９】
インビボ投与のために使用される製剤は滅菌されている必要がある。これは滅菌濾過膜を介する濾過により容易に達成される。
【０２３０】
本明細書における治療用組成物は概して、滅菌された取り出し口を有する容器、例えば皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静脈内投与溶液用のバッグ又はバイアル内に充填される。
【０２３１】
投与経路は既知方法に従い、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、又は患部内経路による注射又は注入、局所投与、又は除放性システムによるものが挙げられる。
【０２３２】
本発明の医薬組成物の用量及び所望の薬品濃度は、想定される特定の用途に応じて変動し得る。適切な用量又は投与経路の決定は医師のよく知る通りである。動物実験はヒトの治療のための有効用量の決定のための信頼性の高い指針を与える。有効用量の種間での尺度調節はＭｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”，Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｋｏｂｉ等編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１９８９、ｐｐ．４２−９６に記載される原則に従って行うことができる。
【０２３３】
本発明の物質又は分子のインビボ投与を行う場合は、通常の用量は投与経路に応じて、一日当たり約１０ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ哺乳動物体重又はそれより高値、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日に変動してよい。特定の用量及び送達方法に関する指針は文献に記載されており、例えば米国特許４，６５７，７６０；５，２０６；３４４；又は５，２２５，２１２を参照できる。異なる製剤は異なる治療化合物及び異なる障害に対して有効であることが期待され、ある臓器又は組織を標的化する投与は、別の臓器又は組織に対するものとは異なる様式での送達を必要とする場合がある。
【０２３４】
物質又は分子の除放性投与が物質又は分子の投与を必要とする何れかの疾患又は障害の治療のために適している放出特性を有する製剤において望まれる場合は、物質又は分子のマイクロカプセル化が意図される。除放性調製品の適当な例は抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリクスを包含し、このマトリクスは形状付与された物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。除放性のための組み換え蛋白質のマイクロカプセル化はヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−α、γ（ｒｈＩＦＮ−α、−γ）、インターロイキン−２、及びＭＮｒｇｐ１２０を用いて良好に実施されている。Ｊｏｈｎｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：７９５−７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．，２７：１２２１−１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７５５−７５８（１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ，“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ”、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ編（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５），ｐｐ．４３９−４６２；ＷＯ９７／０３６９２、ＷＯ９６／４００７２、ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許５，６５４，０１０。
【０２３５】
これらの蛋白質の除放性製剤は、生体適合性及び広範な生体分解性を有することから乳酸グリコール酸共（ＰＬＧＡ）重合体を用いて開発してよい。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸はヒト体内で急速なクリアランスに付されることができる。更に、この重合体の分解性はその分子量及び組成に応じて数カ月から数年に調節できる。Ｌｅｗｉｓ，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ”，Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ（編）、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０），ｐｐ．１−４１。
【０２３６】
除放性マトリクスの別の例はポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドよりなる注射可能な微小球）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。
Ｄ．Ｗｎｔ媒介障害の治療方法
本発明は治療有効量のＷｎｔ拮抗体を哺乳動物に投与することを含む、Ｗｎｔ媒介障害を、それに罹患した哺乳動物において治療する方法を使用可能とする。１つの実施形態において、障害はＷｎｔシグナル伝達の活性の異常な、例えば増大した発現に関連する細胞増殖性障害である。別の実施形態において、障害は、Ｗｎｔ蛋白質の増大した発現に起因する。更に別の実施形態においては、細胞増殖性障害は、癌、例えば結腸直腸癌、乳癌、ＨＳＣに関連する種々の障害に関連する癌、例えば白血病及び種々の他の血液関連癌、及びニューロン増殖性障害に関連する癌、例えば脳腫瘍、例えば神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、及び松果体領域の腫瘍である。
【０２３７】
Ｗｎｔ拮抗体の投与による細胞増殖性障害の治療は以下の事象の１つ以上において観察可能及び／又は計測可能な低減又はこれらの事象の不在、即ち：癌細胞の数の低減又は癌細胞の不在；腫瘍サイズの低減；軟組織及び骨への癌の拡張を包含する周辺臓器内への癌細胞の浸潤の阻害（即ちある程度まで緩徐化、及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（即ちある程度まで緩徐化、及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度までの阻害；及び／又は特定の癌に関連する症状１つ以上のある程度までの緩解；低減した罹患率及び死亡率、及びクオリティオブライフ問題の改善をもたらす。Ｗｎｔ拮抗体は、既存の癌細胞を成長抑制及び／又は殺傷する範囲で、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、患者により実感されてもよい。
【０２３８】
障害の成功裏の治療及び改善を評価するための上記パラメータは医師の良く知る常套的な手順により容易に計測できる。癌療法のためには効能は例えば疾患の進行までの時間（ＴＤＰ）を評価すること及び／又は応答速度（ＲＲ）を測定することにより計測することができる。転移は病期試験によるか、又は骨スキャン並びにカルシウムレベル及び骨への拡張を測定する他の酵素に関する試験により測定できる。ＣＴスキャンも骨盤及びその領域のリンパ節への拡張を検討するために実施できる。既知方法による胸部Ｘ線及び肝酵素レベルの測定を用いてそれぞれ肺及び肝臓への転移を検討する。疾患をモニタリングするための他の常套的な方法は経直腸超音波測定（ＴＲＵＳ）及び経直腸針生検（ＴＲＮＢ）を包含する。
【０２３９】
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体の投与は腫瘍負荷を低下させる（例えば癌のサイズ又は重症度を低減する）。更に別の特定の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体の投与は癌を殺傷する。
Ｅ．細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の阻害方法
本発明は有効量のＷｎｔ拮抗体に細胞を接触させることを含む細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害する方法を提供する。１つの実施形態において、細胞は哺乳動物、好ましくはヒト内に含有され、そして投与される量は治療有効量である。更に別の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害は更に細胞の成長の阻害をもたらす。更なる実施形態においては、細胞は癌細胞である。
【０２４０】
細胞増殖の阻害は当該分野で知られた方法を用いて計測される。例えば、細胞増殖を計測するための好都合な試験はＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）ルミネセント細胞生存性アッセイであり、これはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）より販売されている。そのアッセイは代謝的に活性な細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づいて培養物中の生存細胞の数を測定する。Ｃｒｏｕｃｈ等（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：８１−８８、米国特許６６０２６７７を参照できる。アッセイは９６及び３８４ウェルのフォーマットで実施してよく、これにより自動化された高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適合できる。Ｃｒｅｅ等（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ６：３９８−４０４を参照できる。アッセイ手順では培養細胞に直接単一試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）試薬）を添加する。これにより、細胞が溶解し、ルシフェラーゼ反応により生じたルミネセントシグナルが発生する。ルミネセントシグナルは存在するＡＴＰの量に比例しており、これは培養物中に存在する生存細胞の数に直接比例している。データはルミノメータ又はＣＣＤカメラ画像化装置により記録できる。ルミネセンス出力は相対光単位（ＲＬＵ）として表示する。
Ｆ．Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を調節する方法
本発明は有効量のＷｎｔ拮抗体を細胞に接触させることを含む、活性化された、又は過剰なＷｎｔシグナル伝達を特徴とする細胞におけるＷｎｔ標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。１つの実施形態において、Ｗｎｔ標的遺伝子はＷｎｔシグナル伝達の結果として過剰発現され、そしてＷｎｔ拮抗体との接触の結果、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を低減させる。別の実施形態においては、Ｗｎｔ標的遺伝子はＡｘｉｎ２、ＡＰＣＤＤ１、Ｇａｄ１、Ｓａｘ１、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ＰＰＡＲデルタ、ガストリン、クラステリン、サバイビン、シクロオキシゲナーゼ、ｆｒａ−１、オステオポンチン、ｕＰＡＲ、クラウジン−１、ＣＤ４４、ＭＭＰ−７／９／１１／１４／２６、ＩＧＦＢＰ−４、Ｍｅｔ、ＢＭＰ４、ｓｏｘ−９、ヒストンデアセチラーゼ２、ＶＥＧＦよりなる群から選択される。更に別の実施形態においては、Ｗｎｔ標的遺伝子はＷｎｔシグナル伝達の結果として過小発現され、そしてＷｎｔ拮抗体との接触の結果、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を回復させる。更なる実施形態においては、Ｗｎｔ標的遺伝子はレフティ１、レフティ２、ｓＦＲＰ１、Ｆｚｄ５、ｆａｓ抗原、カスパーゼ３、インテグリンβ７、アルファｅインテグリン、ｈａｔｈ１、脂肪酸結合蛋白質２、ｍｕｃ−２、クルッペル様因子−４、カーボニックアンヒドラーゼ−１１、エフリンＢ１、ＥｐｈＢ２Ｒ、ＥｐｈＢ３Ｒ、ｍｕｃ−３、組織適合性２、Ｑ領域遺伝子座、β２−マイクログロブリンよりなる群から選択される。
【０２４１】
標的遺伝子の発現は本明細書に記載する、そして後述する実施例に記載するものを包含する当該分野で知られた方法を用いながら測定される。
Ｇ．Ｗｎｔ蛋白質の存在を検出する方法
本発明はＷｎｔ拮抗体に試料を接触させることを含む、試料中のＷｎｔ蛋白質の存在を検出する方法を提供し、Ｗｎｔ拮抗体とＷｎｔ蛋白質との間の複合体の存在又は結合レベルはＷｎｔ蛋白質及び／又はＷｎｔシグナル伝達の存在を示す。１つの実施形態において、方法は更にＷｎｔシグナル伝達のレベルが異常であるかどうかを決定することを含む。この実施形態においては、試料中のＷｎｔ蛋白質の結合のレベルはＷｎｔ蛋白質発現及び／又はＷｎｔシグナル伝達が生理学的に正常であることが分かっている第２の試料中のレベルと比較される。生理学的に正常な試料よりも高値又は低値である第２の試料と比較した被疑試料中の結合のレベルは異常なＷｎｔシグナル伝達を示す。別の実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達の存在又は異常なＷｎｔシグナル伝達は癌などのＷｎｔ媒介障害の存在を示す。
Ｈ．Ｗｎｔ経路及びそれに関連する障害
１．Ｗｎｔシグナル伝達経路：
Ｗｎｔシグナル伝達経路は種々のレベルの経路制御をおこなう多数の蛋白質の関与する非常に複雑なシグナル伝達過程である。経路のこの多重レベルの堅固な制御は細胞生物学におけるその重要性を示す。複雑な調節機序にも関わらず、経路の初期シグナルはＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）受容体へのＷｎｔの結合により生じる。有効なシグナルは更にＬＲＰ（ＬＤＬ受容体関連蛋白質）クラス、特にＬＲＰ５及びＬＲＰ６の追加的な単回通過膜貫通分子の存在を必要とする。Ｗｎｔは更にＬＲＰと結合することによりＦｒｉｚｚｌｅｄと三量体複合体を形成してよい。次にＬＲＰの細胞質のテール部が別の下流成分であるＡｘｉｎと相互作用する。ディスヘベルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）、即ちＦｒｉｚｚｌｅｄと直接相互作用する細胞質成分は、Ａｘｉｎと相互作用する場合もあり、これによりＦｒｉｚｚｌｅｄ、ＬＲＰ、Ｄｓｈ及びＡｘｉｎのテトラプレックスの複合体が形成される。Ａｘｉｎとのこの相互作用はＷｎｔシグナル伝達経路の後の下流の活性に関わる「分解複合体」（後述）からβ−カテニンを放出させる。
【０２４２】
細胞の外部においては、Ｗｎｔシグナル伝達はＷｎｔに結合することができ、そのためそれをその受容体から隔離させることができる種々の蛋白質により阻害される。この群に属するものは、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白質（ｓＦＲＰ、Ｊｏｎｅｓ等、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ２００２；２４：８１１−８２０）及びＷｎｔ阻害剤因子−１（ＷＩＦ−１、Ｈｓｉｅｈ，Ｊ．Ｃ．等、Ｎａｔｕｒｅ１９９９；３９８：４３１−４３６）である。ヒトにおいては、ｓＦＲＰファミリーは５つのメンバー（例えばｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２、・・ｓＦＲＰ−５）よりなり、各々がシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含有しており、これはＦｒｚ受容体のＣＲＤと３０〜５０％の配列相同性を共有している。（Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ，Ｈ．Ｓ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９７；９４：１３６３６−１３６４１）。ｓＦＲＰはＦｒｚ受容体と機能阻害複合体を形成し、そしてそのため天然の拮抗体であると考えられているが、生物学的に複雑であり、そして一部の場合においてはＷｎｔ活性をアゴナイズするように作用する場合さえある。（Ｕｒｅｎ，Ａ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：４３７４−４３８２）。
【０２４３】
細胞外Ｗｎｔ阻害剤の別のクラスはディッコフ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ，Ｄｋｋ）である。［Ｂｒｏｔｔ，Ｂ．Ｋ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００２；２２：６１００−６１１０；Ｆｅｄｉ，Ｐ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：１９４６５−１９４７２］。Ｄｋｋファミリーの３つのメンバー（例えばＤｋｋ−１、Ｄｋｋ−２及びＤｋｋ−４）はカノニカルな経路の必須成分である細胞表面受容体ＬＲＰ−５及びＬＲＰ−６の活性化を介してＷｎｔシグナル伝達に拮抗することができる。［Ｍａｏ，Ｊ．Ｈ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ２００１；７：８０１−８０９；Ｐｉｎｓｏｎ，Ｋ．Ｉ．等、Ｎａｔｕｒｅ２０００；４０７：５３５−５３８］。ＤｋｋはＬＲＰ５／６との三元複合体および１回通過膜貫通受容体Ｋｒｅｍｅｎ１（Ｋｒｍ−１）又はＫｒｅｍｅｎ２（Ｋｒｍ−２）を形成する［Ｍａｏ等、Ｇｅｎｅ２００３；３０２：１７９−１８３；Ｍａｏ等、Ｎａｔｕｒｅ２００２；４１７：６６４−６６７；Ｍａｏ等、Ｎａｔｕｒｅ２００１；４１１：３２１−３２５］。次にこの複合体がエンドサイトーシスを受け、これにより細胞表面からＬＲＰ５／６受容体が除去される。その結果ＤｋｋはカノニカルなＷｎｔシグナル伝達に選択的に拮抗するが、非カノニカルなシグナル伝達には影響しない。
【０２４４】
カノニカルなＷｎｔシグナル伝達活性化の特徴は蛋白質β−カテニンの上昇したレベルである。β−カテニンは構成的に生産され、そして単量体蛋白質のプールとして細胞質内に存在する［Ｐａｐｋｏｆｆ，Ｊ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６；１６：２１２８−２１３４］。β−カテニンの細胞質レベルを制御するための一次的機序はリクルートメント時の大型の多重蛋白質複合体（「分解複合体」）への直接の物理的分解を介する。この複合体の中央の足場はＡｘｉｎ、並びにβ−カテニンへの結合部位、腺腫様結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）、カゼインキナーゼＩα（ＣＫＩα）及び蛋白質ホファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）により与えられる［Ｈｉｎｏｉ，Ｔ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：３４３９９−３４４０６；Ｉｋｅｄａ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２０００；１９：５３８−５４５；Ｙａｍａｍｏｔｏ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：１０６８１−１０６８４；Ｋｉｓｈｉｄａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：１０８２３−１０８２６；Ｉｋｅｄａ等、ＥＭＢＯＪ．１９９８；１７：１３７１−１３８４］。形成後、Ａｘｉｎ及びＡＰＣ並びにＰＰ２ＡのＧＳＪ３β媒介ホスホリル化により複合体を安定化させる。次にＧＳＪ３βがβ−カテニンをホスホリル化することによりそれをβ−トランスデューシンリピート含有蛋白質（β−ＴｒＣＰ）により認識可能とし、これによりそれをユビキシン化及びプロテオソーム分解に標的化することができる。［Ａｂｅｒｌｅ等、ＥＭＢＯＪ．１９９７；１６：３７３９−８０４；Ｌａｔｒｅｓ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９９９；１８：８４９−５４；Ｌｉｕ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９９；９６：６２７３−８］。
【０２４５】
Ａｘｉｎ／ＡＰＣ／ＧＳＫ３βとの複合体形成はβ−カテニンの分解のための一次的機序であるが、代替の分解経路にはＳｉａｈ−１及びＡＰＣのＣ末端との複合体形成により誘導されるユビキチン化が関与することが分かっている。［Ｍａｔｓｕｚａｗａ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ２００１；７：９１５−９２６；Ｌｉｕ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ２００１；７：９２７−９３６］。転写因子としてのその役割に加えて、β−カテニンは更に細胞接着に関与している。［Ｎｅｌｓｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２００４；３０３：１４８３−１４８７；Ｉｌｙａｓ等、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９７；１８２：１２８−１３７］。β−カテニンはそれがＥ−カドヘリン及びα−カテニンとも複合体形成するアドヘレンズ接合部としても知られている細胞内接触の細胞表面部位において観察することができる。即ちＥ−カドヘリン発現の何れかの増大はβ−カテニンを細胞膜に指向させることになり、これにより細胞質内レベルを枯渇させ、それによりＷｎｔシグナル伝達を阻害することになる。更に、Ｅ−カドヘリン−カテニン複合体の分解は遊離β−カテニンの細胞質内レベルを増大させることができ、これにより転写活性を刺激する。［Ｎｅｌｓｏｎ等、上出］。即ちβ−カテニンを遊離させることによる細胞表面受容体ｃＲＯＮ、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）及びｃ−ＥｒｂＢ２の活性化は、カノニカルなＷｎｔシグナル伝達を刺激することもできる。Ｗｎｔシグナル伝達の作用を活性化又は促進することができる他のシグナル伝達経路が挙げられる。例えば、インテグリンシグナル伝達はβ−カテニンの核輸送をもたらし得る［Ｅｇｅｒ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２００４；２３：２６７２−２６８０］が、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）を介したシグナル伝達は使用可能なＧＳＫ３βを「吸い取る」ことによりＷｎｔシグナル伝達を活性化することができ、これにより「分解複合体」の形成を抑制する。
【０２４６】
カノニカルなシグナル伝達においては、初期工程はＬＲＰ５／６の存在下でのＦｒｚへのＷｎｔの結合を含む。［Ｍａｏ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ２００１；７：８０１−９０９；Ｐｉｎｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ２０００；４０７：５３５−５３８］。この三量体複合体の形成は２つの下流の帰結事象を有している。第１のものはディスヘベルド（Ｄｓｈ）の細胞表面へのリクルートメントおよびカゼインキナーゼＩε（ＣＩε）によるそのホスホリル化である。［Ｋｉｓｈｉｄａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：３３１４７−３３１５５］。ホスホリル化されたＤｓｈはＦｒａｔ１及びＧＳＫ３βと複合体を形成することができ、次にこれがＧＳＫ３βの活性を阻害することができる。第２に、Ｗｎｔ／Ｆｒｚ／ＬＲＰ５／６トリプレックスはＡｘｉｎのＬＲＰ５／６媒介分解を促進する。これの正味の作用はβ−カテニンのホスホリル化を担っている分解複合体の脱安定化である。ホスホリル化不在下においてはβ−カテニンはユビキチン化されず、このため分解を免れ、これにより細胞内レベル及び核への転座のための利用性が増大する。
【０２４７】
β−カテニンが核に輸送される様相は完全に明確化されていないが、核輸送蛋白質ＡＰＣとの相互作用［Ｒｏｓｉｎ−Ａｒｂｅｓｆｅｌｄ等、Ｎａｔｕｒｅ２０００；４０６：１００９−１０１２；Ｎｅｕｆｅｌｄ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２０００；９７：１２０８５−１２０９０］並びにｐｙｇｏｐｕｓ及びＢｃｌ９／ｌｅｇｌｅｓｓの関与が示唆されている。［Ｔｏｗｎｓｌｅｙ等、ＮａｃｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌ．２００４；６：６２６−６３３］。
【０２４８】
核内に入れば、β−カテニンはＴ細胞特異的転写因子／リンパ様エンハンサ結合因子−１（ＴＣＦ／ＬＥＦ）ＤＮＡ結合蛋白質との結合のために転写リプレッサＧｒｏｕｃｈｏを置き換える。β−カテニンによる置き換えの不在下ではＴＣＦ／ＬＥＦ複合体はＧｒｏｕｃｈｏと複合体形成し、Ｗｎｔの「標的遺伝子」の発現を抑制する。Ｇｒｏｕｃｈｏの阻害作用は更に、転写活性化に対向するＤＮＡを生成すると考えられている種々のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）との相互作用により媒介される。［Ｃａｖａｌｌｏ等、Ｎａｔｕｒｅ１９９８；３９５：６０４−８；Ｃｈｅｎ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９９９；１３：２２１８−３０］。ＴＣＦ転写リプレッサ複合体から転写活性化複合体への変換では更にヒストンアセチラーゼ、例えばＣｒｅｂ結合蛋白質（ＣＢＰ）／ｐ３００並びに他の活性化因子、例えばＢｒｇ−１のリクルートメントが起こる。［Ｔａｋａｍａｒｕ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００；１４９：２４９−５４；Ｂａｋｅｒ等、Ｃｅｌｌ２００２；１０９：４７−６０；Ｂｒａｎｔｊｅｓ等、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；３８３：２５５−２６１；Ｒｏｏｓｅ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ−Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ１９９９；１４２４：Ｍ２３−Ｍ３７］。β−カテニン−ＴＣＦ複合体とクロマチンとの間の相互作用もＬｅｇｌｅｓｓ（Ｂｃｌ９）及びＰｙｇｏｐｕｓにより媒介される場合がある。Ｋｒａｍｐｓ等、Ｃｅｌｌ２００２；１０９：４７−６０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２；４：３６７−７３；Ｐａｒｋｅｒ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２００２；１２９；２５６５−７６。
【０２４９】
「オフ」即ち不活性状態ならびに「オン」即ち活性状態の両方におけるカノニカルなＷｎｔシグナル伝達経路の略記による総括を図１に示す。
２．Ｗｎｔシグナル伝達活性ン関連する障害
Ｗｎｔシグナル伝達経路の脱調節は種々のＷｎｔシグナル伝達経路成分をコードする遺伝子における体細胞突然変異により引き起こされる場合がある。例えば異常なＷｎｔシグナル伝達活性は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）［Ｙｏｕ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２００４；２３：６１７０−６１７４］、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）［Ｌｕ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００４；１０１：３１１８−３１２３］、胃癌［Ｋｉｍ等、Ｅｘｐ．Ｏｎｃｏｌ．２００３；２５：２１１−２１５；Ｓａｉｔｏｈ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００２；９：５１５−５１９］、頭部頚部扁平細胞癌（ＨＮＳＣＣ）［Ｒｈｅｅ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２００２；２１：６５９８−６６０５］、結腸直腸癌［Ｈｏｌｃｏｍｂｅ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ−Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２００２；５５：２２０−２２６］、卵巣癌［Ｒｉｃｋｅｎ等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ２００２；１４３：２７４１−２７４９］、基底細胞癌（ＢＣＣ）［ＬｏＭｕｚｉｏ等、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２；２２：５６５−５７６］及び乳癌におけるＷｎｔリガンド過剰発現に関連している。更に、ｓＦＲＰ及びＷＩＦ−１などの種々のＷｎｔリガンド調節分子の低減は乳癌［Ｋｌｏｐｏｃｋｉ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２００４；２５：６４１−６４９；Ｕｇｏｌｉｎｉ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２００１；２０：５８１０−５８１７；Ｗｉｓｓｍａｎｎ等、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００３；２０１：２０４−２１２］、膀胱癌［Ｓｔｏｅｈｒ等、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００４；８４：４６５−４７８；Ｗｉｓｓｍａｎｎ等、上出］、中皮腫［Ｌｅｅ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２００４；２３：６６７２−６６７６］、結腸直腸癌［Ｓｕｚｕｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ２００４；３６：４１７−４２２；Ｋｉｍ等、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００２；１：１３５５−１３５９；Ｃａｄｗｅｌｌ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４：８８３−８８８］、前立腺癌［Ｗｉｓｓｍａｎ等、上出］、ＮＳＣＬＣ［Ｍａｚｉｅｒｅｓ等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４；６４：４７１７−４７２０］、及び肺癌［Ｗｉｓｓｍａｎ等、上出］に関連している。本発明のＷｎｔ拮抗体分子によりＷｎｔシグナル伝達を拮抗することは、これらの癌を治療処置すると期待される。
【０２５０】
Ｆｒｚ−ＬＲＰ受容体複合体の種々の成分の過剰発現に起因する持続的な異常Ｗｎｔシグナル伝達も、特定の癌に関連付けられている。例えばＬＲＰ５過剰発現は骨肉腫［Ｈｏａｎｇ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２００４；１０９：１０６−１１１］に関連付けられているのに対し、Ｆｒｚ過剰発現は前立腺［Ｗｉｓｓｍａｎｎ等、上出］、ＨＮＳＣＣ［Ｒｈｅｅ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２００２；２１：６５９８−６６０５］、結腸直腸［Ｈｏｌｃｏｍｂｅ等、上出］の癌、卵巣癌［Ｗｉｓｓｍａｎ等、上出］、食道［Ｔａｎａｋａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９８；９５：１０１６４−１０１６９］及び胃［Ｋｉｒｉｋｏｓｈｉ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２００１；１９：１１１−１１５］癌などの癌に関連付けられている。更に、ディスヘベルドなどのＷｎｔシグナル伝達経路の成分の過剰発現は前立腺癌［Ｗｉｓｓｍａｎ等、上出］、乳癌［Ｎａｇａｈａｔａ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２００３；９４：５１５−５１８］、中皮腫［Ｕｅｍａｔｓｕ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３：４５４７−４５５１］及び子宮頚癌［Ｏｋｉｎｏ等、Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２００３；１０：１２１９−１２２３］などの癌に関連付けられている。Ｆｒａｔ−１の過剰発現は膵臓癌、食道癌、子宮頸癌、乳癌及び胃癌などの癌に関連付けられている。［Ｓａｉｔｏｈ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２００２；２０：７８５−７８９；Ｓａｉｔｏｈ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ  ２００１；１９：３１１−３１５］。Ａｘｉｎ機能損失（ＬＯＦ）突然変異は肝細胞癌［Ｓａｔｏｈ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２０００；２４：２４５−２５０；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００２；２１：４８６３−４８７１］及び髄芽細胞腫［Ｄａｈｍｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１；６１：７０３９−７０４３；Ｙｏｋｏｔａ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００２；１０１：１９８−２０１］に関連付けられている。本発明のＷｎｔ拮抗体とのＷｎｔ−Ｆｒｚ相互作用の遮断はＦｒｚ又はＬＲＰの過剰発現に関連する癌を軽減すると期待される。
【０２５１】
最後に多数の癌がβ−カテニンにおける機能獲得突然変異又はＡＰＣにおける機能喪失突然変異などの「分解複合体」の崩壊を介してβ−カテニンを活性化することに関連付けられている。β−カテニンの分解の低減は細胞内の機能的β−カテニンのより多い量をもたらし、次にこれは標的遺伝子の増大した転写を引き起こし、結果として異常な細胞増殖をもたらす。例えばβ−カテニンをコードする遺伝子（即ちＣＴＮＮＢ１）における突然変異は胃癌［Ｃｌｅｍｅｎｔｓ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２；６２：３５０３−３５０６；Ｐａｒｋ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：４２５７−４２６０］、結腸直腸癌［Ｍｏｒｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７；２７５：１７８７−１７９０；Ｉｌｙａｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７；９４：１０３３０−１０３３４］、腸カルチノイド［Ｆｕｊｉｍｏｒｉ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１；６１：６６５６−６６５９］、卵巣癌［Ｓｕｎａｇａ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００１；３０：３１６−３２１］、肺腺癌［Ｓｕｎａｇａ等、上出］、子宮内膜癌［Ｆｕｋｕｃｈｉ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８；５８：３５２６−３５２８；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；９０：５５−５９；Ｍｉｒａｂｅｌｌｉ−Ｐｒｉｍｄａｈｌ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：３３４６−３３５１］、肝細胞癌［Ｓａｔｏｈ等、上出；Ｗｏｎｇ等、Ｃａｎｃｅｒ  ２００１；９２：１３６−１４５］、胚芽細胞腫［Ｋｏｃｈ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：２６９−２７３］、髄芽細胞腫［Ｋｏｃｈ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００１；９３：４４５−４４９］、膵臓癌［Ａｂｒａｈａｍ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  ２００２；１６０：１３６１−１３６９］、甲状腺癌［Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｓｔａｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：１８１１−１８１５；Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｓｔａｎ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  ２００１；１５８：９８７−９９６］、前立腺癌［Ｃｈｅｓｉｒｅ等、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２０００；４５：３２３−３３４；Ｖｏｅｌｌｅｒ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８；５８：２５２０−２５２３］、黒色腫［Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００２；１００：５４９−５５６］、毛質性上皮腫［Ｃｈａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１９９９；２１：４１０−４１３］、ウイルムス腫瘍［Ｋｏｅｓｔｅｒｓ等、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ２００３；１９９：６８−７６］、膵臓芽腫［Ａｂｒａｈａｍ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  ２００１；１５９：１６１９−１６２７］、脂肪肉腫［Ｓａｋａｍｏｔｏ等、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ  Ｍｅｄ．２００２；１２６：１０７１−１０７８］、若年性鼻咽頭血管線維腫［Ａｂｒａｈａｍ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００１；１５８：１０７３−１０７８］、類腱腫［Ｔｅｊｐａｒ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９９；１８：６６１５−６６２０；Ｍｉｙｏｓｈｉ等、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８；１０：５９１−５９４］、滑膜肉腫［Ｓａｉｔｏ等、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  ２０００；１９２：３４２−３５０］などの癌に関連付��られている。機能損失突然変異は結腸直腸癌［Ｆｅａｒｏｎ等、Ｃｅｌｌ  １９９０；６１：７５９−７６７；Ｒｏｗａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０００；９７：３３５２−３３５７］、黒色腫［Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００２；１００：５４９−５５６；Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７；２７５：１７９０−１７９２］、髄芽細胞腫［Ｋｏｃｈ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００１；９３：４４５−４４９；Ｈｕａｎｇ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  ２０００；１５６：４３３−４３７］及び類腱腫［Ｔｅｊｐａｒ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９９；１８：６６１５−６６２０；Ａｌｍａｎ等、Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９７；１５１：３２９−３３４］などの癌に関連付けられている。β−カテニンの異常な活性に起因し、これによりＷｎｔ経路を活性化させる癌は本発明のＷｎｔ拮抗体による治療に適している。
３．Ｗｎｔシグナル伝達及び発癌
Ｗｎｔ経路は多くの転写終点又は標的遺伝子を有する。これらの大多数は特定の型に対して特異的であり、それは発生シグナル伝達経路では通常である。これはシグナルではなく細胞が応答の性質を決定する細胞外シグナルによる遺伝子制御の基本的な機序と合致している。しかしながら、細胞型特異的遺伝子に加えて、Ｗｎｔシグナル伝達は、より広汎に誘導される遺伝子、例えばＷｎｔシグナル伝達経路の成分及びＷｎｔ−β−カテニン−ＴＣＦカスケードにより活性化される可能性が最も高い遺伝子も制御する。
【０２５２】
正常な細胞の生理学から新生物性の変化を特徴とするものへの遷移は癌の発生に伏在する事象をより良く理解するための検討において旺盛に研究されている対象であった。即ちβ−カテニンによる標的遺伝子の不適切な活性化は、標的遺伝子自身に体細胞突然変異がない場合であっても、生物において疾患状態をもたらす場合がある。Ｉｌｙａｓは「不適切な幹細胞表現型／無制限の複製能力」、「アポトーシスの回避」、「組織侵襲及び転移」、「成長シグナルの自己充足」、「成長阻害剤に対する非感受性」、「終末分化の失敗」、「免疫応答の回避」、及び「持続的血管形成」を包含する大部分の悪性疾患により獲得される表現型のＨａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇリストの改良版を作成している。Ｉｌｙａｓ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ２００５；２０５：１３０−１４４；Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｅｌｌ  ２０００；１００：５７−７０。β−カテニンの標的遺伝子を包含するＷｎｔシグナル伝達により調節される遺伝子又はマイクロアレイ分析により示される改変された発現の分析は、直接又は標的遺伝子に対する作用を介した異常なＷｎｔシグナル伝達に起因する混乱がこれら全てを「新生物性表現型」とすることができることを示している。Ｉｌｙａｓ，Ｍ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  ２００５；２０５：１３０−１４４。Ｗｎｔシグナル伝達の例示される標的のリストを表１に示す。アップレギュレートされる遺伝子標的は太字で示し、ダウンレギュレートされるものは斜体で示す。活性化された及び／又は過剰なＷｎｔシグナル伝達の結果に起因するそのような標的遺伝子の異常な発現は本発明のＷｎｔ拮抗体の適用により改善され得る。
【０２５３】
【表１】
2010504081.tif 000043
癌はますます「幹細胞」疾患（Ｔａｉｐａｌｅ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２００１；４１１：３４９−５４）、即ち幹細胞の不適切な活性化及び／又は維持として捉えられつつある。Ｗｎｔシグナル伝達は幹細胞の維持のために必須であることがわかっている［Ｈｅ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２００４；３６：１１１７−１１２１；Ｒｅｙａ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２００３；４２３：４０９−４１４；Ｗｉｌｌｅｒｔ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２００３；４２３：４４８−４５２］。腸においては、ＴＣＦ４はβ−カテニンに関する主要な核結合因子であり、そしてＴＣＦ４ノックアウトマウスが小腸において幹細胞を発生することができないということは、幹細胞の維持におけるカノニカルなＷｎｔシグナル伝達の役割を裏付けている［Ｋｏｒｉｎｅｋ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８；１９：３７９−８３；Ｐｉｎｔｏ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００３；１７：１７０９−１３；Ｋｕｈｎｅｒｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．ＵＳＡ  ２００４；１０１：６６−７１］。
【０２５４】
多数の生物学的過程に対するＷｎｔシグナル伝達の作用はマトリクスメタロプロテイナーゼ遺伝子（ＭＭＰ）により説明されている。ＭＭＰ７、ＭＭＰ１４及びＭＭＰ２６はβ−カテニンの標的を指向することが分かっている［Ｍａｒｃｈｅｎｋｏ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；３６：９４２−９５６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００２；２１：５８６１−５８６７；Ｂｒａｂｌｅｔｚ等、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １９９９；１５５：１０３３−１０３８］が、他のＭＭＰは腸の腺腫により直接発現されることが観察されている［Ｐａｏｎｉ等、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００３；１５：２２８−２３５］。ＭＭＰは間質コラーゲンを分解する蛋白質分解酵素であり、これにより腫瘍細胞は表現型「組織侵襲及び転移」を獲得できるようになる。酵素的活性は間質における潜伏性の成長因子の放出も可能にし、これは腫瘍細胞自体により分泌される他の成長因子と一緒になって「成長シグナルの自己充足」に寄与する。［Ｃｏｕｓｓｅｎｓ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２；２９５：２３８７−２３９２；Ｅｇｅｂｌａｄ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ２００２；２：１６１−１７４］。ＭＭＰはオステオポンチン（二次的なＷｎｔ誘導標的）［Ｐａｏｎｉ等、上出］に対しても作用してフラグメントを放出し、それはβ−カテニンの直接の標的である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と一緒になって「持続的血管形成」の特徴に寄与する。［Ｚｈａｎｇ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１；６１：６０５０−６０５４；Ａｇｎｉｈｏｔｒｉ等、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：２８２６１−２８２６７］。
【０２５５】
Ｗｎｔシグナル伝達経路はリガンド受容体相互作用の下流のレベルにおいて活性化され得るが、細胞外リガンド−受容体相互作用成分の阻害は、Ｗｎｔシグナル伝達を開始させる事象が下流で生じた場合であっても腫瘍形成性を低減するのに有効であることを示唆する強力な証拠がある。例えばＩｌｙａｓは最近の研究において数種の結腸直腸癌細胞系におけるＷｎｔシグナルの阻害が低減された腫瘍形成性をもたらしたことを報告している。［Ｉｌｙａｓ上出］。更に、作動不能なＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体（Ｆｒｚ７エクトドメイン）の癌細胞系（ＳＫ−ＣＯ−１）へのトランスフェクションは正常なβ−カテニン表現型を回復させた。この細胞系はホモ接合ＡＰＣ−／−突然変異により活性なＷｎｔシグナル伝達を有している。更に、そのような細胞はインビボで転移された場合に腫瘍形成を示していない。Ｖｉｎｃａｎ等、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２００５；７３：１４２−１５３。このことは細胞外レベルにおけるＷｎｔシグナル伝達の抑制は下流の細胞内Ｗｎｔシグナル伝達経路成分の活性化に起因するＷｎｔシグナル伝達をダウンレギュレートすることができることを明らかにしている。このことは更に、Ｗｎｔ−Ｆｒｚ相互作用を阻害する本発明のＷｎｔ拮抗体などの阻害剤はＷｎｔシグナル伝達が活性化される特定の様式に関わらず、何れかのＷｎｔ媒介障害に対して治療上の利益を有することを示唆している。
４．結腸癌における異常なＷｎｔシグナル伝達
Ｗｎｔシグナル伝達成分ＡＰＣの欠損は当初は遺伝性の癌症候群である家族性の腺腫様ポリープ（ＦＡＰ）において手がかりであることが発見された。１つの欠損性のＡＰＣ対立遺伝子を受け継いでいるＦＡＰ患者は多数の結腸ポリープ、又は腺腫を、生涯の早期の年代において発症する。そのようなポリープは第２のＡＰＣ対立遺伝子が不活性化される上皮細胞のクローン性の派生物として発生する。これらのＦＡＰ腺腫の累積的な作用は最終的には腺癌の発生をもたらし、これはＫ−ｒａｓ、ｐ５３及びＳｍａｄ４などの追加のオンコジーン又は腫瘍サプレッサ遺伝子における突然変異の様々な程度の秩序を有する蓄積として顕在化する。更に、ＡＰＣの損失は大部分の散発性の結腸直腸癌においても生じる。Ｋｉｎｚｌｅｒ等、Ｃｅｌｌ８７：１５９−１７０（１９９６）。β−カテニンの安定化、そして最終的な核輸送、およびＷｎｔシグナル伝達をもたらすことによるＡＰＣの突然変異性の不活性化は、従って、上皮細胞を形質転換する。興味深いことに、通常ではＷｎｔシグナル伝達時にのみ転写されるｐＴＯＰＦＬＡＳＨなどのコンカテマー化されたＴＣＦ結合部位を含有するレポータープラスミドはβ−カテニン／ＴＣＦ−４転写複合体の構成的活性化を介してＡＣＰ突然変異体癌細胞において不適切に転写される。ＡＰＣが突然変異されない別の例の結腸直腸癌においては、足場蛋白質Ａｘｉｎ−２が突然変異される［Ｌｉｕ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２６：１４６−１４７（２０００）］か、又はβ−カテニンがＮ末端Ｓｅｒ／Ｔｈｒ破壊モチーフが除去されるように突然変異される。［Ｍｏｒｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１７８７−１７９０（１９９７）］。即ち、直腸結腸癌は、ＡＰＣにおける欠失だけでなく、β−カテニン／ＴＣＦ−４の転写活性化の適切でない持続と関係している。ＴＣＦ−４突然変異はｃｒｙｐｔ幹細胞及び先祖細胞における欠損性ＡＰＣ発現を介して観察される通り、結腸直腸癌において同じ標的遺伝子の活性化をもたらす（マイクロアレイ分析により示される）ことが更に報告されている。Ｖａｎ  ｄｅＷｅｔｅｒｉｎｇ等、Ｃｅｌｌ  １１１：２４１−２５０（２００２）。一旦Ｗｎｔカスケードが活性化されると、ＡＰＣ−／−腺腫細胞はその先祖状態を無限に維持する。その結果、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化は結腸直腸癌の発癌において必要な前駆体であり、そして、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害はこの障害の発症を処置及び／又は抑制するための有効な手段となり得る可能性が高くなる。
５．造血幹細胞におけるＷｎｔシグナル伝達
造血幹細胞は多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）からの系列拘束先祖細胞の過程において循環系の成人血液細胞を生じさせる。更に、Ｗｎｔシグナル伝達はＨＳＣの自己更新及び維持に寄与し、そして機能不全のＷｎｔシグナル伝達はＨＳＣに起因する種々の障害、例えば白血病及び種々の他の血液関連癌を担っていると考えられる。Ｒｅｙａ等、Ｎａｔｕｒｅ４３４：８４３−８５０（２００５）；Ｂａｂａ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：５９９−６０９（２００５）；Ｊａｍｉｅｓｏｎ等、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５１（７）：６５７−６６７（２００４）。幹細胞が拘束骨髄様先祖細胞に変換されるに従ってＷｎｔシグナル伝達は通常では低減される。Ｒｅｙａ等、Ｎａｔｕｒｅ４２３：４０９−４１４（２００３）。
【０２５６】
Ｗｎｔリガンド自身がＨＳＣにより生産されるのみならず、Ｗｎｔシグナル伝達は活性でもあり、オートクリン又はパラクリンの調節を示唆している。Ｒａｔｔｉｓ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１１：８８−９４（２００４）；Ｒｅｙａ等、Ｎａｔｕｒｅ４２３：４０９−４１４（２００３）。更に、β−カテニン及びＷｎｔ３ａの両方ともネズミＨＳＣ及び先祖細胞の自己更新を促進するが、ヒト造血先祖細胞へのＷｎｔ５Ａの適用はインビトロでの未分化先祖細胞の増殖を促進する。Ｒｅｙａ等、上出；Ｗｉｌｌｅｒｔ等、Ｎａｔｕｒｅ４２３：４４８−４５２（２００３）；Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ等、Ｂｌｏｏｄ  ９２：３１８９−３２０２（１９９８）。
【０２５７】
ＨＳＣに加えて、胚性幹細胞、表皮幹細胞及び上皮幹細胞は未分化の増殖状態の維持に関してＷｎｔシグナル伝達に応答性又は依存性であることが分かっている。Ｗｉｌｌｅｒｔ等、上出；Ｋｏｒｉｎｅｋ等、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３７９−３８３（１９９８）；Ｓａｔｏ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：５５−６３（２００４）；Ｇａｔ等、Ｃｅｌｌ  ９５：６０５−６１４（１９９８）；Ｚｈｕ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６：２２８５−２２９８（１９９９）。従って、本発明のＷｎｔ拮抗体によるＷｎｔシグナル伝達の阻害は機能不全の造血に起因する疾患、例えば白血病及び種々の血液関連の癌、例えば急性、慢性、リンパ様及び骨髄性の白血病、骨髄形成不全症候群及び骨髄増殖性障害の治療における治療法となり得る。これらには骨髄腫、リンパ腫（例えばホジキン及び非ホジキン型）、慢性及び非進行性の貧血、進行性及び症候性の血球不全、真性赤血球増加症、本態性又は原発性の血小板血症、特発性骨髄線維症、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、成熟細胞性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症が包含される。
６．白血病におけるＷｎｔシグナル伝達
Ｗｎｔシグナル伝達経路の未調節活性化は白血病の発症の前駆状態である。Ｒｅｙａ等、上出。Ｗｎｔシグナル伝達に依存しているものとしての骨髄様及びリンパ様の系列の両方のオンコジーン成長を裏付ける実験証拠が存在している。Ｗｎｔシグナル伝達は骨髄性白血病の慢性及び急性の形態の両方を調節する場合における関与が示唆されている。慢性骨髄性白血病患者由来の顆粒球−マクロファージ先祖細胞（ＧＭＰ）及び治療に抵抗性の患者由来の急性転化細胞は活性化されたＷｎｔシグナル伝達を呈している。Ｊａｍｉｅｓｏｎ等、上出。更に、Ａｘｉｎの異所性の発現を介したβ−カテニンの阻害はインビトロにおいて白血病細胞の再プレーティング能力を低下させ、慢性骨髄性白血病前駆状態は成長及び更新に関するＷｎｔシグナル伝達に依存していることを示唆している。更に、Ｗｎｔ過剰発現はＧＭＰに長期自己更新の幹細胞様特性を獲得させている。Ｊａｍｉｅｓｏｎ等、上出。これらの所見は更に、Ｗｎｔシグナル伝達は血液系列の正常な発生のために必要であるが、ただし異常なＷｎｔシグナル伝達は先祖細胞の形質転換をもたらすという仮説を裏付けている。本発明のＷｎｔ拮抗体はこれらの型の白血病を治療する場合に有用であり得る。
【０２５８】
最近の研究は、リンパ様新生物もＷｎｔシグナル伝達により影響され得ることを示唆している。Ｗｎｔ−１６はＥ２Ａ−ＰｂＸ転座を担持しているＢ細胞白血病細胞系において過剰発現され、オートクリンＷｎｔ活性が発癌に寄与し得ることを示唆している。ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ，等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１４６４−１１４６９（１９９９）。正常なＢ細胞先祖細胞の成長及び生存におけるＷｎｔシグナル伝達の役割はこの見解を更に裏付けている。Ｒｅｙａ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：１５−２４（２０００）；Ｒａｎｈｅｉｍ等、Ｂｌｏｏｄ  １０５：２４８７−２４９４（２００５）。Ｗｎｔに対するオートクリンの依存性は終末分化したＢ細胞の癌である多発性骨髄腫の増殖の調節に関して提案されている。Ｄｅｒｋｓｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：６１２２−６１２７（２００４）。原発骨髄腫及び骨髄腫細胞系はまた安定化を発現することも分かっている（即ち分解複合体とは独立している）。Ｗｎｔシグナル伝達成分における如何なる突然変異も存在しなかったが、数種の成分、例えばＷｎｔ−５Ａ及びＷｎｔ−１０Ｂの過剰発現は、腫瘍の依存性及び癌の自己更新が必ずしもＷｎｔシグナル伝達経路成分中に生じる突然変異に依存しておらず、むしろ経路自体の構成的活性化のみに依存していることを示唆している。Ｒｅｙａ等、上出。過剰発現されたＷｎｔに結合することを介して、本発明のＷｎｔ拮抗体はＢ細胞白血病の治療において有効な治療薬となり得る。
【０２５９】
自己更新性の多能性幹細胞の骨髄様先祖細胞への遷移はＷｎｔシグナル伝達のダウンレギュレーションを伴う。Ｒｅｙａ等、Ｎａｔｕｒｅ４２３：４０９−４１４（２００３）。同様に、リンパ様先祖細胞におけるβ−カテニンの安定な発現は、それらの細胞が何れかの細胞型に典型的に関連しているマーカーを欠いていたにもかかわらず、多数の分化選択肢を回復させている。Ｂａｂａ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３：５９９−６０９（２００５）。即ち、本発明のＷｎｔ拮抗体によるＷｎｔシグナル伝達の阻害は、白血病、例えば骨髄様及びリンパ様の白血病、例えば急性及び慢性の骨髄性白血病、並びに急性及び慢性のリンパ性白血病を治療する場合に有効な治療法となり得ることが強く示唆されている。
７．神経障害における異常なＷｎｔシグナル伝達
β−カテニンを介したＷｎｔシグナル伝達の活性化は神経先祖細胞のサイクリング及び拡張を増大できること、そして、そのようなシグナル伝達の損失は先祖細胞コンパートメントの損失をもたらすことが観察されている。Ｃｈｅｎｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７：３６５−３６９（２００２）；Ｚｅｃｈｎｅｒ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５８：４０６−４１８（２００３）。Ｗｎｔシグナル伝達の正常な活性化はニューロン幹細胞の自己更新を促進する場合があるということのみから、異常なＷｎｔ経路活性化は神経系においては腫瘍形成性であると考えられる。この結論を裏付けている実験証拠は、小脳の小児脳腫瘍である髄芽細胞腫がβ−カテニン及びＡｘｉｎの両方において突然変異を含有しているとい発見であり、これにより、髄芽細胞腫は未制御のＷｎｔシグナル伝達に応答して形質転換されることになる原始的先祖細胞から生じることを示唆している。Ｚｕｒａｗｅｌ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：８９６−８９９（１９９８）；Ｄａｈｍｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７０３９−７０４３（２００１）；Ｂａｅｚａ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６３２−６３６（２００３）。即ち、本発明のＷｎｔ拮抗体によるＷｎｔシグナル伝達の阻害は種々のニューロン増殖性障害、例えば脳腫瘍、例えば神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、下垂体腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、松果体領域腫瘍、及び非癌性の神経線維腫症の治療において有効な治療法となり得ることが強く示唆されている。
８．乳癌における異常なＷｎｔシグナル伝達
幹細胞が明確に単離されている乳腺組織においては、先祖細胞の運命又は維持におけるＷｎｔの制御的役割は、Ｗｎｔトランスジェニックマウス発症乳腺腫瘍の研究により示唆されている。これらの腫瘍は幹細胞及び先祖細胞の特性を有する個々の細胞の出現頻度を増大させており、これは他のオンコジーンを過剰発現するマウスに由来する腫瘍とは明確な対照をなしている。［Ｌｉｕ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：４１５８−４１６３（２００４）；Ｌｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：１５８５３−１５８５８（２００３）］。このことはＷｎｔ経路が形質転換に関して幹細胞及び先祖細胞を標的化するその能力において特有であることを示唆しており、そして正常な乳腺上皮の自己更新における重要な役割を示唆している。即ち本発明のＷｎｔ拮抗体によるＷｎｔシグナル伝達の阻害は乳癌の治療における有効な治療法となり得る。
【０２６０】
図３２はヒト乳癌における活性なＷｎｔシグナル伝達の説明である。図３２ＡはＷｏｎｇ等、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １９６：１４５（２００２）により最初に報告された正常（Ａ−１）、低等級（Ａ−２）及び高等級（Ａ−３）のヒト乳腺腫瘍におけるＷｎｔ−１発現（インビトロハイブリダイゼーションにより示されたもの）を示している。図３２Ｂは乳癌患者におけるβ−カテニンの核（Ｂ−１）及び細胞質（Ｂ−２）の局在（ＩＨＣにより示されたもの）を示す。また、示したβ−カテニン発現パターンに相関する患者の生存確率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロット（Ｂ−３）を示す。このデータはＬｉｎ等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）９７（８）：４２６２−６６（２０００）において最初に報告されている。図３２Ｃはｈｅｒ−２陰性の浸潤性腺管癌を有する患者から単離した組織と比較した場合の癌を有さない患者に由来する正常な乳房におけるＷｎｔ−１の発現のマイクロアレイ分析である。
９．加齢におけるＷｎｔシグナル伝達
Ｗｎｔシグナル伝達経路は加齢及び加齢関連障害において重要な役割を果たすこともできる。
【０２６１】
Ｂｒａｃｋ  Ａ  Ｓ，等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７（５８３９）：８０７−１０（２００７）において報告されている通り、加齢マウス由来の筋幹細胞はそれらが増殖を開始する際に筋原性から腺維原性に変換されることが観察されている。この変換は加齢筋原性先祖細胞におけるカノニカルなＷｎｔシグナル伝達経路活性の増大を伴い、そしてＷｎｔ阻害剤により抑制され得る。更に、加齢マウス由来の血清の成分はＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質に結合し、そして加齢細胞における上昇したＷｎｔシグナル伝達を説明することができる。Ｗｎｔ３Ａの幼弱再生筋肉への注射は結合組織の増殖を低減させ沈着を増大させている。
【０２６２】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、更に、加齢が加速されたＫｌｏｔｈｏマウスモデルを用いた試験において加齢過程に関与することが示されており、この場合、Ｋｌｏｔｈｏ蛋白質はＷｎｔ蛋白質と物理的に相互作用し、阻害していることが測定された。Ｌｉｕ  Ｈ，等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７（５８３９）：８０３−６（２００７）。細胞培養モデルにおいては、Ｗｎｔ−Ｋｌｏｔｈｏ相互作用はＷｎｔの生物学的活性の抑制をもたらしたのに対し、Ｋｌｏｔｈｏ欠損動物由来の組織及び臓器は増大したＷｎｔシグナル伝達の根拠を示している。
【０２６３】
従って、Ｗｎｔ拮抗体は加齢の作用を低減するため、及び加齢関連疾患を治療するための治療薬として使用できる。
Ｉ．特定の製剤の投与様式
１．概論
医薬組成物は意図される投与経路、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（即ち局所）、経粘膜、及び直腸投与に適合するように製剤される。非経腸、皮内、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、滅菌希釈液、例えば注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成の溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は重炭酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、及び張力を調節するための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースを包含する。ｐＨは酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて調節できる。非経腸製剤はガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、又は多用量バイアル中に充填することができる。
２．注射用製剤
注射に適する医薬組成物は滅菌された水溶液（水溶性の場合）又は分散体、及び滅菌された注射溶液又は分散体の用時製造のための滅菌粉末を包含する。静脈内投与のためには、適当な担体は生理食塩水、殺菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）又はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を包含する。全ての場合において、組成物は滅菌されている必要があり、そしてシリンジを用いて投与されるように流体性である必要がある。そのような組成物は製造及び保存の間安定である必要があり、そして細菌及びカビなどの微生物による汚染に対して保存される必要がある。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリコール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）及び適当な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流体性は例えばレシチンなどのコーティングの使用によるか、分散体の場合は必要な粒径を維持することによるか、そして界面活性剤を使用することにより維持することができる。種々の抗細菌剤及び抗カビ剤；例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールは微生物汚染に対応できる。等張剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール及び塩化ナトリウムを組成物中に包含させることができる。吸収を遅延させることができる組成物はモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの物質を包含できる。
【０２６４】
滅菌注射用溶液は必要に応じて成分の一種又は組み合わせとともに適切な溶媒中に必要量で活性化合物（例えば本発明の何れかの物質／分子）を組み込むことにより製造できる。一般的に、分散体は基本分散媒体及び他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことにより製造する。滅菌された注射用溶液の製造のための滅菌粉末の場合、製造方法は、滅菌された溶液に由来する活性成分及び何れかの所望の成分を含有する粉末を与える真空乾燥及び凍結乾燥を包含する。
３．全身投与
全身投与は経粘膜又は経皮であることもできる。経粘膜又は経皮投与のためには、標的障壁を通過できる浸透剤を選択する。経粘膜浸透剤は洗剤、胆汁酸、及びフシジン酸誘導体を包含する。経鼻スプレー又は座薬は経粘膜投与のために使用できる。経皮投与のためには、活性化合物は軟膏、膏薬、ゲル剤又はクリーム剤に製剤される。
【０２６５】
化合物は座薬（例えばカカオ脂又は他のグリセリドなどの基剤を使用）又は直腸送達のための貯留型浣腸の形態において製造することもできる。
４．担体
１つの実施形態において、活性化合物は身体からの急速な排除に対抗して化合物を保護する担体とともに製造され、例えば制御放出製剤、例えばインプラント及びマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。生体分解性又は生体適合性の重合体を使用することができ、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が挙げられる。そのような物質はＡＬＺＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及びＮＯＶＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｅｌｓｉｎｏｒｅ，ＣＡ）から商業的に入手でき、或いは当該分野で知られる通り製造できる。リポソーム懸濁液も製薬上許容しうる担体として使用できる。これらはＥｐｐｓｔｅｉｎ等及び米国特許４，５２２，８１１に記載のものなどの当該分野で知られた方法に従って製造できる。
５．単位用量
単位剤型の経口製剤又は非経腸組成物を作成することにより投与及び用量均一性を促進することができる。単位剤型は必要な製薬用担体と組み合わせて治療有効量の活性化合物を含有する、治療すべき対象に対する単回用量として適する物理的に個別の単位を指す。単位剤型の仕様は活性化合物の特有の性質及び特定の所望の治療効果並びに活性化合物の配合の固有の限界により決定され、そしてそれに直接依存している。
６．遺伝子療法組成物
核酸分子はベクター内に挿入し、そして遺伝子療法ベクターとして使用できる。遺伝子療法ベクターは例えは静脈内注射、局所投与（Ｎａｂｅｌ  ａｎｄ  Ｎａｂｅｌ，米国特許５，３２８，４７０、１９９４）により、又は定位注射（Ｃｈｅｎ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９１：３０５４−７（１９９４））により対象に送達できる。遺伝子療法ベクターの薬学的調製品は許容される希釈剤を包含することができ、又は遺伝子送達ビヒクルを包埋する緩徐放出マトリクスを含むことができる。或いは完全な遺伝子送達ベクターを組み換え細胞から未損傷で製造できる場合、例えばレトロウィルスベクターの場合は、薬学的調製品は遺伝子送達系を製造する１つ以上の細胞を包含できる。
７．用量
医薬組成物及び方法は、Ｗｎｔ拮抗体の投与において通常適用される他の治療活性化合物を更に含んでよい。
【０２６６】
Ｗｎｔ拮抗体の投与を必要とする状態の治療又は防止においては、適切な用量レベルは一般的に、一日当たりキログラム患者体重当たり約０．０１〜５００ｍｇであり、これは単回又は多数回用量として投与できる。好ましくは、用量は一日当たり約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは一日当たり約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。適当な用量レベルは一日当たり約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、一日当たり約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は一日当たり約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであってよい。この用量範囲において用量は一日当たり０．０５〜０．５、０．５〜５、又は５〜５０ｍｇ／ｋｇであってよい。経口投与のためには、組成物は好ましくは活性成分１．０〜１０００ミリグラム、特に治療すべき患者への投薬の兆候的調節のためには活性成分１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０及び１０００．０ミリグラムを含有する錠剤の形態で提供される。化合物は一日当たり１〜４回、好ましくは一日当たり１回又は２回のレジメンで投与してよい。
【０２６７】
しかしながら何れかの特定の患者に対する特定の用量レベル及び投薬頻度は変動してよく、使用する特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全体的な健康、性別、食餌、投与の様式及び時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、特定の状態の重症度、及び治療を受けている宿主を包含する種々の因子に依る。
８．組成物用キット
組成物（例えば医薬組成物）はキット、容器、パック又はディスペンサに、投与に関する説明書とともに包含することができる。キットとして供給する場合、組成物の異なる成分は別個の容器にパッケージし、そして使用直前に添加混合してよい。そのような成分のパッケージングは個々に活性化合物の機能を損失することなく長期の保存を可能にする。
【０２６８】
キットは特定の試験、例えば診断試験又は組織タイピングの実施を促進する別個の容器に試薬を包含してよい。
（ａ）容器又はベッセル
キットに包含される試薬は、種々の異なる成分の生命が保存され、容器の材料により吸着又は改変されることがないような何れかの種類の容器に供給することができる。例えば密封ガラスアンプルは中性の非反応性気体、例えば窒素下でパッケージされている凍結乾燥されたモジュレータ物質／分子及び／又は緩衝剤を含有してよい。アンプルは何れかの適当な材料、例えばガラス、有機重合体、例えばポリカーボネート、ポリスチレンなど、セラミック、金属又は試薬を保持するために典型的に使用される他の材料よりなっていてよい。適当な容器の他の例はアンプルと同様の物質から作製されてよい簡素なビン、及びアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた内部よりなっていてよいエンベロープを包含する。他の容器は試験管、バイアル、フラスコ、ビン、シリンジ等を包含する。容器は滅菌されたアクセスポートを有してよく、例えば皮下注射針で穿刺することができる栓を有するビンが挙げられる。他の容器は除去時に成分の混合を許容する容易に除去可能な膜により分離された２つのコンパートメントを有してよい。除去可能な膜はガラス、プラスチック、ゴム等であってよい。
（ｂ）説明書
キットは又説明書とともに供給してよい。説明は紙又は他の基体に印刷してよく、及び／又は電子的に読み取り可能な媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＺＩＰディスク、ビデオテープ、レーザーディスク、オーディオテープなどとして供給してよい。詳細な説明はキットに物理的に備わっていなくてもよく；代わりに、ユーザーはキットの製造元又は販売元により特定されるインターネットのウエブサイトを指定されてもよく、又は電子メールで供給されてもよい。
９．併用療法
特定の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体を含む医薬品製剤は少なくとも１つの追加的な治療薬及び／又はアジュバントと組み合わせて投与してよい。特定の実施形態においては、追加的治療薬は化学療法剤、成長阻害剤、又は細胞毒性剤、例えば毒素、例えばマイタンシノイド、カリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体、核分解酵素などである。
【０２６９】
上記したこのような併用療法は併用投与（二種以上の治療薬が同じ又は別個の製剤中に包含される場合）及び個別投与を包含し、その場合、Ｗｎｔ拮抗体の投与は追加的治療薬及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に行うことができる。Ｗｎｔ拮抗体は放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
１０．医薬
本発明はＷｎｔ媒介障害を治療するために有用な医薬の製造における使用のためのＷｎｔ拮抗体を提供する。特定の態様において、Ｗｎｔ媒介障害は癌である。
【０２７０】
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を説明するために記載する。当業者の知る通り、以下の実施例に開示した手法は本発明の実施において良好に機能することを本発明者等が見出した手法の代表であり、従ってその実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができる。しかしながら、開示された特定の実施形態において多くの変更が可能であり、そしてなお本発明の精神及び範囲から逸脱することなく類似又は同様の結果が得られることは当業者であれば本開示を鑑みれば当然のことである。明細書全体を通じて引用した全ての参考文献は参照により全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【０２７１】
（実施例１）
一般プロトコル
哺乳動物細胞培養
ヒト腎上皮（ＨＥＫ）２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７３）、ヒト卵巣ＰＡ１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７２）を５０／５０のＤｕｌｂｅｃｃｏ変性イーグル高グルコース培地、１０％ウシ胎児血清添加Ｈａｍ’ｓＦ１２中で成長させた。ヒト奇形腫誘導ＮＴｅｒ２（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１９７３）及びＴｅｒａ２（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１０６）細胞を１５％ウシ胎児血清添加ＭｃＣｏｙ培地中で維持し、そしてＮＣＣＩＴ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２０７３）を１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ中で維持した。全ての細胞系に更に２ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを３７℃５％ＣＯ２において補給した。
トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクションのための準備において、トランスフェクション前２４時間、（１）５００，０００ＨＥＫ２９３及び（２）１００，０００ＰＡ１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７２）、ＮＣＣＩＴ、ＮＴｅｒａ２又はＴｅｒａ２細胞を１２ウェルディッシュ（Ｎｕｃ）の各ウェル中に投入した。細胞を、０．３７５μｇＴＯＰｇｌｏｗ（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｃａｔ＃２１−２０４）、０．０５ｍｇＬＥＦ１、０．０１ｍｇＳＶ４０ＲＬ＋Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）でトランスフェクトし、２４時間に後トランスフェクトした。培地を交換し、細胞は未処理とするか、又はＷｎｔ３ａ単独、Ｗｎｔ５ａ単独又は血清試料で更に２０〜２４時間処理した後に採取した。全ての希釈は指定した細胞系に対し完全培地中において行った。細胞は５０〜１００μｌの１×ＳＪＣ溶解緩衝剤（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１０％グリセロール、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＮａＶＯ４及びプロテアーゼ阻害剤）中に採取し、そして２連の１０μｌをＤｕａｌ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐａｒｔ  ＃  ＴＭ０５８）を用いてアッセイし、そしてＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において検出した。ルシフェラーゼ活性はＲｅｎｉｌｌａ活性に対して規格化した。
【０２７２】
（実施例２）
Ｆｒｚ−Ｆｃキメラ分子の構築
クローニング及び発現
Ｆｒｚ８（１７３）−Ｆｃ及びＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ
図４Ａ及びＢはＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ及びＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃキメラ構築物の配列を示す。図４Ａはより長いＦｒｚ８（１７３）配列を示す。灰色で示すもの（即ち最初の２４Ｎ末端アミノ酸残基）はリーダーシグナル配列である。下線を付しているもの（即ち残基２５〜２７）は成熟蛋白質において存在又は不在であってよいアラニン残基である。箱で囲んだ文字で示すもの（即ち残基１５７〜１７３）はより短いＦｒｚ８（Ｆｒｚ１５６）キメラ構築物からより長いＦｒｚ８（Ｆｒｚ１７３）ものを区別するＦｒｚ８受容体の追加的配列である。太字で示されているもの（即ち残基１７４〜１８２）はリンカー配列であり、斜体の配列（即ち残基１８３〜４０９）はＦｃ領域である。図４Ｂはより短いＦｒｚ（１５６）最小ＣＲＤ（ＥＣＤ）ドメイン配列を示す。灰色で示すもの（即ち最初の２４Ｎ末端アミノ酸残基）はリーダーシグナル配列である。下線を付したもの（即ち残基２５〜２７）は成熟蛋白質において存在又は不在であってよいアラニン残基である。太字で示されているもの（即ち残基１５７〜１６４）はリンカー配列であり、斜体の配列（即ち残基１６５〜３９１）はＦｃ領域である。
【０２７３】
Ｆｒｚ８（１５６）−Ｆｃ構築物は以下の通り構築した。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８残基１〜１５６をコードするｃＤＮＡをｐＲＫ誘導プラスミドのＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。ネイティブのヒトｃＤＮＡが好ましいが、同一の蛋白質配列をコードする代替配列（例えばネズミ）を使用してもよい。このクローニング手順においては、Ｆｒｚ８のカルボキシル末端をヒトＩｇＧエフェクタドメイン（Ｆｃ）のアミノ末端に短いリンカー領域（例えば残基ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ）（配列番号７０）を介して融合することによりＦｒｚ８−Ｆｃ融合物を作成した。最終構築物はＦｒｚ８の１５６残基をコードしている。クローニングは標準的な分子生物学の手法を用いて実施した（Ａｕｓｕｂｅｌ等（編），２００３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４  Ｖｏｌｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）。蛋白質はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させた。
【０２７４】
或いは前記したものとは異なる長さのＦｒｚ８の長さ（例えば１〜１７３）をコードするｃＤＮＡを使用してよい。更に、代替のリンカー配列（例えばＥＳＧＧＧＧＶＴ）（配列番号６９）を使用してもよい。
Ｆｒｚ−Ｆｃ及びＦｒｐ−Ｆｃ構築物
Ｆｒｚ１、Ｆｒｚ２、Ｆｒｚ３、Ｆｒｚ４、Ｆｒｚ５、Ｆｒｚ６、Ｆｒｚ７、Ｆｒｚ９、Ｆｒｚ１０、ｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２、ｓＦＲＰ３、ｓＦＲＰ４、又はｓＦＲＰ５を含むＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン成分を有するＷｎｔ拮抗体のための構築物はＦｒｚ８に関して記載した手順と同様の様相で構築した。Ｆｒｚ２、Ｆｒｚ３、Ｆｒｚ４、Ｆｒｚ５及びｓＦＲＰ３はＸｈｏＩ及びＡｓｃＩを用いてｐＲＫ誘導プラスミド中にサブクローニングした。Ｆｒｚ１、Ｆｒｚ６、Ｆｒｚ７、Ｆｒｚ９、Ｆｒｚ１０、及びｓＦＲＰ４はＣｌａＩ及びＸｈｏＩを用いてｐＲＫ誘導プラスミド中にサブクローニングし、そしてｓＦｒｐ１、ｓＦｒｐ２、及びｓＦｒｐ５はＣｌａＩ及びＡｓｃＩを用いてｐＲＫ誘導プラスミド中にサブクローニングした。Ｆｒｚ８構築物の場合と同様、Ｆｒｚドメインのカルボキシ末端をヒトＩｇＧエフェクタドメイン（Ｆｃ）のアミノ末端に短いリンカー領域を介して融合することによりキメラＷｎｔ拮抗体を作成した。図７（Ａ、Ｂ及びＣ）はこれらの構築物に関する例示されるアミノ酸配列を示す。リーダーシグナル配列は太字で示し、斜体は非ネイティブのリーダー配列を示す。リンカーには下線を付し、Ｆｃ成分は斜体で示す。
【０２７５】
図５（Ａ−Ｈ）（配列番号：１１５−１２９）はこれらのＷｎｔ拮抗体構築物に関する例示される核酸配列を示す。
【０２７６】
インビボの活性又は安定性を最適化するため、又は他の有利な特性、例えば増大した可溶性、向上した結合特性を得るために、代替の構築物を製造することができる。これらの構築物は上記したＷｎｔ拮抗体のリンカーとは異なるリンカーを包含してよい。例えば、Ｆｒｚ３−Ｆｃキメラ蛋白質（配列番号１１４）の代替構築物はＢｓｔＸＩ及びＸｈｏＩを用いてｐＲＫ誘導プラスミド内にＦｒｚ３ドメインをサブクローニングすること、及びＦｃドメインにＦｒｚ３ドメインを融合させるためにＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号７０）ペプチドリンカーを用いることにより作成されている。
蛋白質単離
Ｗｎｔ拮抗体キメラ蛋白質はＰＲＯＳＥＰ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）プロテインＡコンジュゲート樹脂を用いたアフィニティクロマトグラフィにより＞９０％純度まで単離した。より高次の凝集物はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（登録商標）（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ゲル濾過カラム上を通過させることにより二量体から分離した。蛋白質の実体及びシグナル配列を除去するためのアミノ末端のプロセシングはエドマン分解により確認した。最終蛋白質の純度は９８％より高値であると推定される（図１０）。精製後の物質の内毒素レベルは完全であり、１．０ＥＵ／ｍｇ未満であった。
【０２７７】
（実施例３）
Ｆｒｚ８−Ｆｃキメラ分子の血清安定性
Ｆｒｚ８（１７３）−Ｆｃキメラ構築物の血清安定性の初期の試験は構築物が限定されたインビボ半減期を有することを示した。インビボの不安定性はＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体成分のＥＣドメイン（ＥＣＤ）におけるプロテアーゼ切断部位の存在に起因すると考えられた。実施例２に記載したＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ構築物はＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃを超えた上昇した血清安定性を示した。無胸腺ヌードマウスにＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃ又はＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃの何れかの１０ｍｇ／ｋｇを静脈内注射した。血清を特定の時点において収集し、総蛋白質及び活性蛋白質に関して分析した。図１１Ａは１μＬの血清中に存在する蛋白質を検出するために使用したヒトＦｃに関するイムノブロットを示し、そして各々の精製された蛋白質２５μｇの場合と比較した（Ｐ）。Ｆｒｚ８（１５６）−Ｆｃは投与後７２時間の血清中に検出可能であったのに対し、Ｆｒｚ８（１７３）−Ｆｃは３０分超過後には検出されなかった。
【０２７８】
収集した血清中のＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ及びＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃの活性はＨＥＫ２９３細胞におけるＷｎｔ３ａ依存性ＴＯＰｇｌｏｗレポーター活性の阻害を計測することにより試験した。相当するインビトロ力価は２．５μｇ／ｍｌにおける精製されたＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ及びＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃでの処置において観察されたが、蛋白質投与後３０分に収集されたＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃ処置マウスの血清からは僅か部分的な阻害活性のみが回収された。対照的に、より強力な阻害活性が投与後２４時間までＦｒｚ８（１５６）−Ｆｃ処置マウスの血清からは回収することができ、少なくとも７２時間検出可能な阻害レベルであった（図１１Ｂ）。これらの試験はＦｒｚ８（１５６）分子がＦｒｚ８（１７３）に基づいた分子よりもインビボでより安定であることを示している。
【０２７９】
更に、Ｆｒｚ８（１７３）−Ｆｃは準最適な効能を有しており、そして開始腫瘍体積の収縮とは相反して腫瘍体積の増大速度を低減するのみの作用を示している。この準最適な効能はＦｒｚ８（１７３）−Ｆｃ分子を包含する種々のＷｎｔシグナル伝達成分−Ｆｃキメラ拮抗体での処置に起因する経時的な腫瘍体積のグラフを示す図１２に示す通りである。このアッセイにおいては、ＭＭＴＶ−ＷＮＴ−１腫瘍は無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪パッド内に移植し、そして薬剤をＸ軸上に矢印で示す時点においてＩＶ投与した。
【０２８０】
（実施例４）
Ｆｒｚ８（１５６）−Ｆｃのインビボ薬物動態
Ｆｒｚ８（１５６）−Ｆｃのインビボ薬物動態は、ヌードマウスに１，５、又は２０ｍｇ／ｋｇｉｖ又は２０ｍｇ／ｋｇｉｐにおいてこの蛋白質の単回用量を投与することにより試験した。図１３に示す通り、そして以下に記載する本実施例において更に考察する通り、Ｆｒｚ８−Ｆｃ試薬は全ての用量でヌードマウスにおいて二相性の排出を示した。単回ＩＶ又はＩＰ用量の後、Ｆｒｚ８−Ｆｃは（１）曝露での用量比例増大；（２）ＩＰ投薬後の迅速な吸収；（３）約２５〜３０ｍｌ／日のクリアランス；及び（４）約４日間の半減期を示している。生体利用性係数、ＡＵＣＩＰ／ＡＵＣＩＶ＝９２％。
動物プロトコル
雌性無胸腺ヌードマウスを投与する薬剤の性質及び投与様式に基づいて、１２匹４群に分割する。群１：Ｆｒｚ８−Ｆｃ１ｍｇ／ｋｇ、静脈内（ＩＶ）；群２：Ｆｒｚ８−Ｆｃ５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ；群３：Ｆｒｚ８−Ｆｃ２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ；及び群４：Ｆｒｚ８−Ｆｃ２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ＩＰ）。各動物には群の表記に従ってＦｒｚ８−ＦｃのＩＶ又はＩＰボーラス用量を投与した。投与した用量体積（５〜１０ｍＬ／ｋｇ）は投薬溶液の濃度及び各動物の体重に応じて変動する。ＩＶ投薬は尾部静脈を介して投与する。
【０２８１】
以下の手順に従って各動物から血液約１２５μＬを収集する。血清はＥＬＩＳＡアッセイまで−７０℃において保存する。試料はｎ＝３動物／時点となるように採取する。投与前試料収集及び／又はブランクマウス血清収集のために余剰動物を使用する。採血は交互に眼を使用しながら各動物につき最初の二時点において眼窩後方出血により行う。最終時点では、血液は心臓穿刺により収集し、そして約１ｍｌを２つの試験管に分取する。一方の試料はＦｒｚ８−Ｆｃ濃度の測定のために使用し、他方は研究用に保存する。各動物には各採血時点の後に液体交換として１０ｍｌの食塩水をＩＰボーラス投与する。眼窩後方出血はイソフロラン麻酔下に実施し、終末出血はケタミン／キシラジンカクテル下に行う。動物は最終血液採取後に麻酔下に頚部切断により安楽死させる。
結果
図１３Ａは２０又は５ｍｇ／ｋｇＩＶ又は２０ｍｇ／ｋｇＩＰの両方に起因する７日以降の血清中の検出を示すＦｒｚ８−Ｆｃで処置したマウス由来の未希釈血清のイムノブロットである。試料は４、７、１０又は１４日に個々のマウスから採取した。対照用に、未処置マウスからも血清試料を採取し、Ｆｒｚ８−Ｆｃ蛋白質を２０μｇ／ｍｌまで添加し、試料を３７℃で２時間インキュベートし、そして次にＳＤＳローディング緩衝剤（２ｈと表示）で処理し；未処置マウス由来の未希釈血清も陰性対照として同様に泳動させた（Ｓと表記）。
【０２８２】
図１３Ｂ及び１３Ｃは薬物動態試験から求めた場合のＦｒｚ８−Ｆｃ血清レベルのグラフ総括である。特定期間の時間は１６日間（図１３Ｂ）及び２日間（図１３Ｃ）に渡る評価を包含する。Ｆｒｚ８−Ｆｃは全用量でヌードマウスにおける二相性の排出投与を呈していた。曲線は予測された濃度を示し、個々のデータポイントはＥＬＩＳＡで調べた個々のマウスに由来するＦｒｚ８−Ｆｃ蛋白質の平均の血清レベルを示す。１３ＤはＦｒｚ８−Ｆｃの薬物動態の二相性モデルに関するパラメータの総括である。ｉｐ又はｉｖ経路のいずれかにより２０ｍｇ／ｋｇを投与した場合、蛋白質の相当する血清レベルが注射当日内で達成され、そして蛋白質は７日間まで血清中で検出可能であった。２０ｍｇ／ｋｇでｉｐ投与したのち、蛋白質は迅速に吸収され、Ｔｍａｘは約８時間、生体利用性（ＡＵＣＩＰ／ＡＵＣＩＶ）は９２％であった。蛋白質のクリアランスは約２５〜３０ｍＬ／ｄ／ｋｇであり半減期は約４日間であった。
【０２８３】
（実施例５）
Ｆｒｚ−Ｆｃ分子の結合親和性
Ｆｒｚ８（１５６）ドメインへのＦＣドメインの付加は二桁を超えてＷｎｔ３ａに対する結合親和性の増大をもたらしている。図１４は二量体Ｆｃドメインに連結された場合のＷｎｔ３ａシグナル伝達を遮断するＦｒｚ８−ＥＣＤの増強された能力を示す。図１４ＡはＦｒｚ８（１５６）−ＦＣの２つの異なる調製品のＷｎｔ３ａ阻害アッセイのＩＣ５０グラフである。図１４Ｂは単離されたＦｒｚ８（１５６）ＣＲＤ（ＥＣＤ）の純度を確認するゲルである。図示しているのは、（ａ）非還元Ｆｒｚ８ＥＣＤ（レーン１）；（ｂ）分子量マーカー（レーン２）；及び還元されたＦｒｚ８ＥＣＤ（レーン３）である。このゲルは結合アッセイに使用されたＦｒｚ８ＥＣＤが未損傷であり、そしてほぼ予測された分子量において泳動されていることを示している。
【０２８４】
（実施例６）
Ｆｒｚ−Ｆｃキメラの結合活性
ＥＬＩＳＡ
Ｗｎｔ拮抗体のＰＫ評価のために、３８４ウェルのＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）のウェルをウサギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ，ＰＡ）でＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした（２５μｇ／ウェル）。４℃で一夜インキュベートした後、ウサギ抗ヒトＦｃ溶液を静かに移し、そしてプレートを遮断緩衝剤（０．５％ＢＳＡ及び１０ｐｐｍプロクリン含有ＰＢＳ）４０μｌ／ウェルで遮断した。穏やかに浸透しながら室温で６０分間インキュベートした後、ウサギ抗ヒトＦｃコーティングプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び１０ｐｐｍプロクリン）で３回洗浄した。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ標準物質（０．７８〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲の連続希釈物）及びアッセイ緩衝剤（０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び１０ｐｐｍプロクリンを含有するＰＢＳ）中アッセイ範囲にまで希釈した試料を試験プレートに添加した（２５μｌ／プレート）。穏やかに浸透しながら室温で１２０分間インキュベートした後、アッセイプレートを洗浄緩衝剤で６回洗浄した。残存する結合Ｆｒｚ−Ｆｃはアッセイ希釈剤中に希釈した（２５μｌ／ウェル）セイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。適切な発色（１０〜２５分間）の後、酵素反応を１Ｍリン酸（２５μｌ／ウェル）で停止させた。アッセイプレートを４５０ｎｍの波長で読み取り、レファレンス波長は６３０ｎｍであった。試料濃度は４−パラメータアルゴリズムを用いた標準曲線フィットに試料ＯＤを比較することにより求めた。
ＢＩＡｃｏｒｅ
図１５はＦｒｚ８（１−１５６）−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの直接結合を示す。このキメラ蛋白質は一般的にＣｈｅｎ，Ｙ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）に記載されている通り約１７００応答単位においてＢｉｏｃｏｒｅ（商標）（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）ＣＭ５センサーチップにカップリングされているアミンである。慨すればカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）  Ｉｎｃ．）を発売元の説明書に従って塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化した。１Ｍエタノールアミン注入を行うことにより未反応基を遮断した。次にＷｎｔ３ａを推定濃度０．５μｇ／ｍｌで注入し、そして時間の関数としての応答単位の変化により結合を評価した。Ｗｎｔ３ａはＦｒｚ８−Ｆｃに結合することがわかった。図１５に示す通り、Ｗｎｔ３ａとＦｒｚ８−Ｆｃとの会合は対照蛋白質（大腸菌発現非ネイティブＷｎｔ３ａ）を超えた１０００応答単位の高度に有意な増大をもたらしている。
ＯＣＴＥＴ
ＷｎｔリガンドＷｎｔ３ａ及びＷｎｔ５ａと相互作用するＷｎｔ拮抗体の能力はＯＣＴＥＴ（商標）−ＯＫシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて計測した。このシステムはバイオセンサー表面で結合している蛋白質の計測を可能にする。アッセイでは先ず、０．５％ＣＨＡＰＳによるリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１０分間抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的バイオセンサーと共にＷｎｔ拮抗体分子（２０ｕｇ／ｍｌ）の１つをインキュベートした。未結合のＷｎｔ拮抗体はＰＢＳ０．５％ＣＨＡＰＳ中１．５分間洗浄することにより除去した。次にＷｎｔ３ａ又はＷｎｔ５ａ（５．０ｕｇ／ｍｌ）の何れかをアッセイに添加し、そして０．５％ＣＨＡＰＳによるＰＢＳ中５分間バイオセンサー表面に結合したＷｎｔ拮抗体分子と共にインキュベートした。Ｗｎｔ拮抗体分子とＷｎｔリガンドとの間の相互作用は同じ緩衝剤中でモニタリングした。全アッセイ工程は１５０ｕＬの体積において室温で実施した。図１６はこの結合アッセイの結果を示しており、ここで図１６ＡはＦｒｚ１−Ｆｒｚ１０−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの結合から得られたデータを示し、図１６ＢはｓＦＲＰ−ＦｃキメラへのＷｎｔ３ａの結合から得られたデータを示し、そして図１６ＣはＦｒｚ１−Ｆｒｚ１０−Ｆｃキメラ及びｓＦＲＰ−ＦｃキメラへのＷｎｔ５ａの結合から得られたデータを示す。
【０２８５】
ＯＣＴＥＴ（商標）アッセイは、Ｗｎｔ３ａ及びＷｎｔ５ａの両方が他のＦｒｚ蛋白質に対してＦｒｚ８−Ｆｃ、Ｆｒｚ５−Ｆｃ及びＦｒｚ４−Ｆｃに最速で結合し、Ｗｎｔ３ａがＦｒｚ１−Ｆｃ、Ｆｒｚ２−Ｆｃ及びＦｒｚ７−Ｆｃにより緩徐な速度で結合していることを示している。Ｗｎｔ５ａ結合曲線の幅及び直線性はこの結合アッセイで調べた場合、Ｗｎｔ３ａ結合と対してより低値の結合親和性を示唆している。ＯＣＴＥＴ（商標）結合データの幅はｓＦＲＰ−Ｆｃ蛋白質がＦｒｚ１、Ｆｒｚ２及びＦｒｚ７で観察されたものと同様であり、そしてＦｒｚ５及びＦｒｚ８で観察されたものより幾分低いＷｎｔ３ａに対する親和性を有することを示唆している。
【０２８６】
（実施例７）
Ｗｎｔ拮抗体によるＷｎｔシグナル伝達の阻害−細胞アッセイ
細胞アッセイはＴＯＰｇｌｏｗレポータープラスミドでトランスフェクトした２９３（ヒト腎）細胞を用いて実施した。トランスフェクションのための準備において、トランスフェクション前２４時間、５００，０００ＨＥＫ２９３を１２ウェルディッシュ（Ｎｕｃ）のウェル中に投入した。細胞を、０．３７５μｇＴＯＰｇｌｏｗ（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｃａｔ＃２１−２０４）、０．０５ｍｇＬＥＦ１、０．０１ｍｇＳＶ４０ＲＬ＋Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）でトランスフェクトし、２４時間に後トランスフェクトした。培地を交換し、細胞は未処理とするか、又はＷｎｔ３ａ単独、Ｗｎｔ５ａ単独又はＷｎｔ拮抗体で更に２０〜２４時間処理した後に採取した。全ての希釈は指定した細胞系に完全培地中において行った。細胞は５０〜１００μｌの１×ＳＪＣ溶解緩衝剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＮａＶＯ４及びプロテアーゼ阻害剤）中に採取し、そして１０μｌを二度、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐａｒｔ  ＃  ＴＭ０５８）を用いてアッセイし、そしてＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において検出した。ルシフェラーゼ活性はＲｅｎｉｌｌａ活性に対して規格化した。
【０２８７】
Ｗｎｔ５ａで処置すべき細胞は、レポーターに加えてＦｒｚ４及びＬｒｐ５でトランスフェクトした。これらの追加的成分の存在は、Ｗｎｔ５ａによるＷｎｔ経路活性化をカノニカル経路の場合のように可能とする。Ｍｉｋｅｌｓ  ＡＪ，ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ  Ｒ．，ＰＬＯＳＢｉｏｌ．４：ｅ１１５（２００６）。Ｗｎｔ３ａ活性化細胞は１００ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａで処置し、Ｗｎｔ５ａ活性化細胞は１ｕｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ５ａで処置した。
【０２８８】
図１７Ａ及びＢに示す通り、Ｆｒｚ−Ｆｃ拮抗体は様々な程度にまでＷｎｔシグナル伝達を阻害した。Ｆｒｚ５−Ｆｃ及びＦｒｚ８−Ｆｃは両方ともＷｎｔ３ａシグナルの完全な阻害を示し、そしてＷｎｔ５ａシグナルを有意に阻害した。Ｆｒｚ４−Ｆｃ、Ｆｒｚ２−Ｆｃ及びＦｒｚ７−ＦｃはＷｎｔ３ａシグナルの有意な阻害を示した。
【０２８９】
（実施例８）
Ｗｎｔ拮抗体の相対的ＩＣ５０
Ｗｎｔ拮抗体の相対的ＩＣ５０を、実施例７に記載したＴＯＰｇｌｏｗルシフェラーゼＴＣＦレポータープラスミドで安定にトランスフェクトしたＵ２ＯＳ（ヒト骨肉腫）細胞におけるＷｎｔ拮抗体によるＷｎｔシグナル伝達の阻害を計測することにより調べた。細胞における初期Ｗｎｔシグナル伝達はＷｎｔ３ａ活性化と共に得られた。Ｆｒｚ−Ｆｃの３倍連続希釈物を一夜細胞に適用した（図１８）。このアッセイで測定された通り、Ｗｎｔ３ａはＦｒｚ８−Ｆｃ、Ｆｒｚ５−Ｆｃ及びＦｒｚ４−Ｆｃにナノモル未満のＩＣ５０（Ｆｒｚ８−ＦｃのＩＣ５０は０．０４ｎＭ、Ｆｒｚ−５ＦｃのＩＣ５０は０．２０ｎＭそしてＦｒｚ−４のＩＣ５０は０．４８ｎＭ）、そしてＦｒｚ２−Ｆｃ及びＦｒｚ７−ＦｃにナノモルレベルのＩＣ５０（Ｆｒｚ２−ＦｃのＩＣ５０は１．２ｎＭ、Ｆｒｚ２−ＦｃのＩＣ５０は１．４ｎＭ）で結合している。
【０２９０】
（実施例９）
薬剤応答の薬力学マーカーとしてのＷｎｔ標的遺伝子
β−カテニンの免疫組織化学的分析の代替として、Ｗｎｔの転写標的を用いてＷｎｔシグナル伝達活性の阻害をモニタリングした。オートクリンＷｎｔシグナル伝達を有する細胞系は既知Ｗｎｔ標的遺伝子の増大した発現を示し、この発現をＷｎｔ３ａ並びにＦｒｚ８−Ｆｃのインビトロ投与により調節した。ＮＴｅｒａ−２細胞のＲＮＡ分析によれば、Ｆｒｚ８−Ｆｃ処置は試験したＷｎｔ標的遺伝子の発現に影響することを示している。即ち、これらの遺伝子の発現は処置効能の指示子として追跡することができる。これらの観察の延長として、これらのＷｎｔ標的遺伝子の発現は、Ｗｎｔシグナル伝達により駆動され抗Ｗｎｔ治療薬に対する有望な候補である癌を識別するための診断ツールとして使用できる。
インビトロ
精製されたＷｎｔ３ａ、Ｆｚ８ＣＲＤ−Ｆｃ又は対照蛋白質で処置したＰＡ−１細胞に対するインビトロ比較遺伝子発現分析を実施することにより奇形腫細胞におけるＷｎｔシグナル伝達のインビボ阻害を示すためのＷｎｔ標的遺伝子の適性を調べた。Ｗｎｔ３ａ、Ｆｒｚ８−Ｆｃ又は対照Ｆｃ蛋白質で処置したＰＡ−１細胞から単離されたＲＮＡをマイクロアレイ分析に付し、そして外因性に添加されたＷｎｔ３ａ、Ｆｒｚ８−Ｆｃ及び対照Ｆｃ蛋白質に応答した指定遺伝子の発現レベルの変化を測定した。マイクロアレイ分析のために、細胞に指定蛋白質を三度投与し、全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。アレイ分析はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３遺伝子チップセットにて実施した（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ  Ｂ，等、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２００６；２４：２０５−９）。特異的プローブ及びプライマーセットを図２０に示す。
【０２９１】
Ａｘｉｎ２、ＡＰＣＤＤ１及びＧａｄ１などのＷｎｔシグナル伝達の予め識別されている標的の発現レベルを、Ｗｎｔ３ａ処置によりアップレギュレートするか、又はＦｒｚ８−Ｆｃ処置によりダウンレギュレートした（図１９Ａ）。更に、Ｌｅｆｔｙ２（Ａ）、Ｌｅｆｔｙ１（Ｂ）、ｓＦＲＰ１及びＦｚｄ５などの一部の遺伝子をＷｎｔ３ａによりダウンレギュレートし、Ｆｒｚ８−ＦｃによるＷｎｔシグナル伝達の阻害によりアップレギュレートした（図１９Ａ）。その後のｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析により、これらの転写物をＮＴｅｒａ−２、Ｔｅｒａ−２及びＮＣＣＩＴ細胞においてもＷｎｔ３ａ及びＦｚ８ＣＲＤ−Ｆｃにより同様に調節した。
インビボ
ＡＰＣＤＤ１、Ｇａｄ１及びＦｚｄ５は上記したインビトロ分析において最も一貫して調節された遺伝子であり、そしてそのため、インビボ腫瘍異種移植片試験のためのＷｎｔ応答性の潜在的マーカーとして選択した。
【０２９２】
腫瘍組織ＲＮＡを効能試験終了時に収集した異種移植片標本から精製し、Ｗｎｔ応答性転写物の定量的逆転写−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析をＲｕｂｉｎｆｅｌｄ  Ｂ，等、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２００６；２４：２０５−９により以前に報告されたとおり実施した。各遺伝子の倍々誘導はΔΔＣｔ法を用いて測定し、結果はグルタルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼに対して相対的に表示した。特異的プローブ及びプライマーセットを図２０に示す。全ての反応は二度行い、そして少なくとも２のアッセイの平均±ＳＥＭをプロットした。
【０２９３】
インビトロで観察された作用と同様に、治療用量のＦｒｚ８−Ｆｃでの処置はＡＰＣＤＤ１及びＧａｄ１に関する遺伝子発現を低減し、ＮＴｅｒａ−２異種移植片由来の腫瘍におけるＦｚｄ５の発現を増大させた（図１９Ｂ）。ＣＤ４ｈＦｃ処置の後には全ての遺伝子の一般的な非特異的ダウンレギュレーションがあったが、これらの変化はＦｒｚ８−Ｆｃ処置腫瘍で観察されたものと比較して統計学的に有意ではなかった。これらの観察結果はインビボのＦｒｚ８−Ｆｃの抗腫瘍形成作用は標的遺伝子に対するものであり、そしてこれらの遺伝子の発現レベルは潜在的な抗Ｗｎｔ治療薬の効能をモニタリングするために使用できることを示している。
【０２９４】
（実施例１０）
自家移植片及びヒト異種移植片を有するマウスにおける腫瘍成長に対するＷｎｔ拮抗体の阻害作用
本実施例に示す試験はＷｎｔ拮抗体がＷｎｔ発現腫瘍を治療する場合に有用であることを示している。Ｗｎｔ−１−ＭＭＴＶモデルの場合における大部分は完全な腫瘍の後退は強力にＷｎｔ駆動性である腫瘍に対するＷｎｔ拮抗体の作用を説明している。しかしながら、ＰＡ−１及びＮＴｅｒ２腫瘍に対するＷｎｔ拮抗体の有意な作用はまた、完全にＷｎｔ駆動性ではない場合がある腫瘍を治療する強力な治療潜在能力を反映している。
動物
雌性Ｃ５７Ｂ１６マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍の継代のために使用した。マウスの維持及びインビボの操作法はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ認可プロトコルを用いて実施した。
ＭＭＴＶ−Ｗｎｔモデル−自家移植片
図２１はＷｎｔ動物モデルを作成するためにトランスフェクションにおいて使用したベクター構築物を説明する直線的な模式図である。この構築物は、Ｔｓｕｊｏｍｏｔｏ等、Ｃｅｌｌ５５：６１９−６２５（１９８８）及びＬｉ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９：１００２−１００９（２０００）に記載されている通り、ＭＭＴＡウィルス挿入を用いた場合に観察される構成的Ｗｎｔシグナル伝達活性化を模倣している。
マウスにおけるＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニック腫瘍の継代
ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニックマウス由来の腫瘍を乳房脂肪パッド内への外科的移植により６〜１０代に渡りＣ５７Ｂ１６マウスにおいて連続継代した。腫瘍組織をトランスジェニックマウスから無菌的に収集し、ＨＢＳＳで洗浄し、裁断して小片とした。レシピエントマウスをケタミン（７０〜８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（７．５〜１５ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔し、腫瘍断片を第３乳房脂肪パッドに皮膚吻合下に挿入し、皮膚を創傷クリップを用いて閉鎖した。腫瘍は最大１０継代まで継代し、最初の２継代の後は、腫瘍組織を組織学的に検査することによりそれが乳房起源であり、そしてＷｎｔを発現し続けていることを確認した。乳腺癌はマウスにおいて６〜１２か月で発症する。これらのマウスから単離した腫瘍を用いて後に記載する移植モデルを作成した。
インビボ試験
ＭＭＴＶ−ＷｎｔモデルにおけるＷｎｔ拮抗体の効能を試験するインビボの試験のために、浸解した腫瘍組織から得た細胞の皮下注射により腫瘍細胞を導入した。腫瘍組織はＷｎｔトランスジェニックマウス由来の腫瘍を移植したマウスから無菌的に収集し（上記）、ＰＢＳ又はＨＢＳＳで洗浄し、裁断して小片とし、細胞解離キット（Ｓｉｇｍａ）を用いながらＨＢＳＳ中に浸解した。細胞を滅菌ＨＢＳＳ中で二回洗浄し、ＨＢＳＳ中５０％マトリゲル溶液に懸濁した。細胞懸濁液を１５０μｌ／マウスを超えない容量で無胸腺ヌードマウスの乳房脂肪パッド内に皮下接種した。
【０２９５】
ＮＴｅｒａ２又はＰＡ−１動物モデルを用いたインビボ試験のためには、細胞を記載した通り成長させ、成長が対数期になった時点で採取した。細胞をＨＢＳＳ中５０％マトリゲル溶液中に懸濁し、そして８×１０６個／マウス（ＮＴｅｒａ２）又は１０×１０６個／マウス（ＰＡ−１）の何れかの濃度において無胸腺ヌードマウス内に皮下接種した。
【０２９６】
腫瘍は毎日モニタリングし、接種の７〜１２日後に計測した。動物を１５０〜２５０ｍｍ３の範囲の同一平均腫瘍体積の群に分割した。Ｗｎｔ拮抗体での処置は群分けの１〜２日後に開始し、そしてマウスには１日１回、Ｗｎｔ拮抗体、陰性対照蛋白質ＣＤ４−Ｆｃ、又はＰＢＳの１００〜２００μＬを腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）投与した。その後の薬剤処置を毎週２〜３回反復し、そして３〜４週間継続した。腫瘍は毎週２回計測し、腫瘍体積が２５００ｍｍ３に達した時点で動物を屠殺した。血液は眼窩静脈出血により試験期間中に採取し、血清は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のイムノブロッティング及びＨＲＰ又は蛍光コンジュゲート抗ヒトＦｃを用いた検出により治療薬のレベルに関して、そして、実施例７に記載する通りＴＯＰｇｌｏｗ活性のＷｎｔ３ａ活性化を阻害するその能力により治療薬の活性に関して試験した。
自家移植片腫瘍
腫瘍自家移植片の成長に対するＷｎｔ拮抗体の阻害作用
ｉｐ又はｉｖ経路の何れかによるＦｒｚ８−Ｆｃでの処置は急速な腫瘍の後退と投与過程の間の持続的な阻害をもたらしたのに対し、陰性対照蛋白質ＣＤ４−ＦｃはＰＢＳ処置に対して作用を有さなかった。処置マウスは投与終了後３週間モニタリングし、最終的には腫瘍の再生が観察された。
【０２９７】
図２２は腹腔内（ＩＰ）投与による無胸腺ヌードマウスにおけるＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片に対するＦｒｚ８−Ｆｃの効能を説明する。図２２ＡはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１腫瘍移植片を保有するヌードマウスに週２回腹腔内注射によりＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）又はＦｒｚ８−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を投与した場合を示すグラフである。各群マウス１１匹であり、群の平均腫瘍体積は処置開始前に２２６ｍｍ３であった。平均の腫瘍体積を経時的にプロットし、そして処置日をＸ軸上矢印で示す。第２５日において、対照群を屠殺し、投与群への薬剤投与を停止した。図２２Ｂは４投与群における経時的な平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。図２２Ｂにおいて注意すべき点は、Ｆｒｚ８−Ｆｃ拮抗体処置後の平均腫瘍体積は処置開始後第５日において２２６ｍｍから約２１９ｍｍ３、第１８日には約６７ｍｍ３まで腫瘍体積の低下をもたらしている。これは腫瘍サイズのそれぞれ４％及び７０％の低減を示している。本試験においては、Ｆｒｚ−Ｆｃ拮抗体を投与した腫瘍は対照動物と比較して腫瘍サイズの後退を示した。このことは本発明のＦｒｚ−Ｆｃ拮抗体が単剤として殺腫瘍性であり、そして抗癌治療薬として有用であることを明らかにしている。
【０２９８】
図２３は静脈内（ＩＶ）投与による無胸腺ヌードマウスにおけるＭＭＴＶ−Ｗｎｔ腫瘍移植片に対するＦｒｚ８−Ｆｃの効能を説明する。図２３ＡはＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１腫瘍移植片を保有するヌードマウスに週３回静脈内注射によりＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）又はＦｒｚ８−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を投与した場合を示すグラフである。各群マウス１１匹であり、群の平均腫瘍体積は処置開始前に２２６ｍｍ３であった。本試験における第４の群（ハイバー群）には週３回静脈内注射によりＦｒｚ８−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した試験開始時に３７５ｍｍ３の平均腫瘍体積を有するマウス１０匹を包含していた。平均の腫瘍体積を経時的にプロットし、そして処置日をＸ軸上矢印で示す。第２５日において、対照群動物を屠殺し、処置群への薬剤投与を停止した。図２３Ｂは４投与群における経時的な平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。注意すべき点は、Ｆｒｚ８−Ｆｃで処置した全マウスにおいて腫瘍負荷は平均２２６ｍｍ３から処置開始後第４日において１７９ｍｍ３の平均体積にまで、そして第１８日には約７３ｍｍ３まで低減している。これは腫瘍サイズのそれぞれ２１％及び６７％の低減を示している。ハイバー群に関しては、腫瘍体積は平均３７６ｍｍ３から処置第４日には２２５ｍｍ３に、そして第１８日には５３ｍｍ３に低減している。これは腫瘍サイズのそれぞれ３９％及び８６％の低減を示している。
Ｗｎｔシグナル伝達に対する投与マウスから得た血清の阻害作用
処置マウスから単離した血清に由来するＷｎｔシグナル伝達の阻害は図２４に報告する通りであり、図２４ＡはＩＰ処置マウスから単離した血清の結果を示し、ＩＶ投与のものは図２４Ｂに示す。データはＴＯＰｇｌｏｗアッセイ（実施例７に記載）におけるＷｎｔシグナル伝達拮抗体活性を示す棒グラフとして示す。この試料は投与、マウス試験番号及び希釈に従って群として存在している。ＴＯＰｇｌｏｗ遺伝子レポーターアッセイにおける相対的ルシフェラーゼ活性はＹ軸上に示す。ＮＡ（対照）を除く全ての試料に約４０ｎｇ／ｍＬの精製されたＷｎｔ３ａを投与している。全ての他の蛋白質対照は５μｇ／ｍｌで培地中存在している。
ヒト異種移植片腫瘍
Ｗｎｔ拮抗体により天然に誘導されたヒト腫瘍モデルの阻害はヒト癌の治療におけるそれらの有用性の更なる指示子として機能すると考えられる。ヒト腫瘍誘導細胞系を、Ｗｎｔ拮抗体活性を試験する場合の有用性の指標として、ＰＡ−１奇形腫細胞系において観察されたものと同様のオートクリンＷｎｔシグナル伝達の証拠に関して試験した。奇形腫誘導ＮＴｅｒａ−２、Ｔｅｒａ−２、及びＮＣＣＩＴ細胞系はＦｒｚ８−Ｆｃにより阻害できる基礎Ｗｎｔシグナル伝達を呈したのとは対照的に、２９３細胞はＦｒｚ８−Ｆｃにより阻害されない低い基礎シグナル伝達を呈した（図２５Ａ）。しかしなお、４種全ての奇形腫細胞系はＷｎｔ受容体を発現したと考えることができ、その理由はＷｎｔ３ａ処置によりシグナル伝達が更に刺激され、これはＦｒｚ８−Ｆｃにより遮断され得るためである（図２５Ｂ）。これらの結果は奇形腫細胞系がＷｎｔを発現し、それがそれらの腫瘍形成性に寄与していることを示している。従ってこれらの系を無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍形成に関して評価し、そして腫瘍形成の一貫性に基づいてＮＴｅｒａ−２及びＰＡ−１をインビボ効能試験のために選択した。
ＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片に対するＷｎｔ拮抗体の阻害作用
Ｗｎｔ拮抗体Ｆｒｚ８−ＦｃによるＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片を呈しているマウスの治療は対照マウスに比して、約５０％の腫瘍体積の低減及び約７０％の腫瘍質量の低減をもたらした。
【０２９９】
図２６は無胸腺ヌードマウスにおけるＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８−Ｆｃ処置の抗腫瘍効能を示す。ＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片を担持した無胸腺ヌードマウスに１５ｍｇ／ｋｇ／日の初期用量のＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ及びＦｒｚ８−Ｆｃ、次いで１０ｍｇ／ｋｇ／日の後続用量を週３回腹腔内注射により投与した。各群はマウス２０匹とし、群の平均腫瘍体積は投与開始前に２００ｍｍ３であった。試験の第４の群はＦｒｚ８−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を週３回腹腔内注射により処置した試験開始時３３６ｍｍ３の平均腫瘍体積を有するマウス１０匹を包含していた。図２６Ａは例示的手順のフローチャートであり、図２６Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフであり、ここで処置日はＸ軸上で矢印により示す。図２６Ｃは試験の第２０日における群中の全動物の屠殺時における平均腫瘍重量をプロットしたグラフである。図２６Ｄ及び２６Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
Ｗｎｔシグナル伝達に対するＮＴｅｒａ２腫瘍異種移植片を有するマウスから得た血清の阻害作用
図２７はＮＴｅｒａ２腫瘍試験における種々の動物から単離した血清のＦｒｚ８−ＦｃＷｎｔ拮抗体のＴＯＰｇｌｏｗアッセイにおけるＷｎｔシグナル伝達拮抗体活性を示す棒グラフである。総体的ルシフェラーゼ活性（Ｙ軸）は対照及びＦｒｚ８−ＦｃＷｎｔ拮抗体によるＴＯＰｇｌｏｗアッセイから計測した。追加的な精製Ｗｎｔ又はＷｎｔコンディショニング培地は細胞には添加しなかった。これらの結果は低減されたＷｎｔシグナル伝達がＦｒｚ８−ＦｃＷｎｔ拮抗体で処置されたこれらのマウスにおける腫瘍サイズの低減に関連していることを示している。
ＰＡ−１腫瘍異種移植片の成長に対するＷｎｔ拮抗体の阻害作用
Ｗｎｔ拮抗体Ｆｒｚ８−ＦｃによるＰＡ−１腫瘍異種移植片を呈しているマウスの治療は治療１２日以内で腫瘍成長の有意な低減をもたらした。このモデルでは、腫瘍は約５０％より小型であり、治療期間の終了時には対照マウスにおける腫瘍よりも有意に小型の塊であった。
【０３００】
図２８は無胸腺ヌードマウスにおけるＰＡ−１腫瘍異種移植片の成長に対するＦｒｚ８−Ｆｃ処置の抗腫瘍効能を示す。ＰＡ−１腫瘍異種移植片を担持した無胸腺ヌードマウスに１５ｍｇ／ｋｇ／日のＰＢＳ、ＣＤ４−Ｆｃ及びＦｒｚ−Ｆｃ、次いで１０ｍｇ／ｋｇ／日の後続用量を週３回腹腔内注射により投与した。各群はマウス１３匹とし、そして群の平均腫瘍体積は処置開始前に１６８ｍｍ３であった。図２８Ａは例示的手順のフローチャートであり、図２８Ｂは経時的な平均腫瘍体積をプロットしたグラフであり、ここで処置日はＸ軸上で矢印により示す。図２８Ｃは屠殺時における平均腫瘍重量のグラフである。マウスは細胞接種後第５８日（治療開始後第３２日）に屠殺し、そして腫瘍を摘出して計量した。平均腫瘍重量±ＳＥＭを群の関数としてプロットする。図２８Ｄ及び２８Ｅはそれぞれ平均腫瘍体積及び腫瘍体積の平均変化率（％）の表による集計である。
【０３０１】
（実施例１１）
ＭＭＴＶ腫瘍を移植されＦｒｚ８−Ｆｃ及びＦｒｚ５−ＦｃＷｎｔ拮抗体によって処置されたマウスにおけるＷｎｔシグナル伝達
Ｗｎｔシグナル伝達に対するＦｒｚ８−Ｆｃ及びＦｒｚ５−ＦｃＷｎｔ拮抗体の作用
Ｆｒｚ５−ＦｃはＦｒｚ８−Ｆｃと同様に効果的にＷｎｔ３ａ誘導シグナル伝達を阻害する。
【０３０２】
ＭＭＴＶ腫瘍（約４００〜８００ｍｍ３サイズ）を有する無胸腺ヌードマウスをＦｒｚ８−Ｆｃ、Ｆｒｚ５−Ｆｃ、又は陰性対照としてのＣＤ４−Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇで処置した。処置後５時間に、マウスから心臓穿刺により血清を収集し、Ｗｎｔ３ａにより活性化された２９３細胞に対するＷｎｔ阻害作用に関して分析し、そして実施例７に記載する通りＴＯＰｇｌｏｗによりトランスフェクトした。ＮＡ（対照）を除く全試料を約４０ｎｇ／ｍＬの精製されたＷｎｔ３ａで処置する。全ての他の蛋白質対照は５μｇ／ｍｌで培地中に存在させる。図２９はＦｒｚ８−Ｆｃ又はＦｒｚ５−Ｆｃで処置したマウスにおける阻害のレベルを示す。Ｆｒｚ８−Ｆｃ又はＦｒｚ５−Ｆｃでの処置は同等レベルのＷｎｔ３ａ誘導シグナル伝達阻害をもたらした。
Ａｘｉｎ２発現に対するＦｒｚ８−Ｆｃ及びＦｒｚ５−ＦｃＷｎｔ拮抗体の作用
Ｆｒｚ８−Ｆｃ及びＦｒｚ５−ＦｃはＷｎｔ標的遺伝子Ａｘｉｎ２の調節により測定した場合にインビボのＷｎｔシグナル伝達を阻害する。
【０３０３】
ＭＭＴＶ腫瘍（約４００〜８００ｍｍ３サイズ）を有する無胸腺ヌードマウスをＦｒｚ８−Ｆｃ、Ｆｒｚ５−Ｆｃ、又は陰性対照としてのＣＤ４−Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇで処置した。処置後５時間に、マウスから心臓穿刺により血清を収集した。ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡＥＡＳＹキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて腫瘍細胞からＲＮＡを抽出し、実施例９に記載する通りＡｘｉｎ２の発現に関して分析した。Ａｘｉｎ２の低減したレベルがＦｒｚ８−Ｆｃ又はＦｒｚ５−Ｆｃで処置したマウスから得られた試料中で観察され、これらの化合物がインビボのＷｎｔシグナル伝達を阻害できることを示していた。図３０はＦｒｚ８−Ｆｃ及びＦｒｚ５−Ｆｚ処置腫瘍における低減されたＡｘｉｎ２発現を示し、図３０ＡはＧＡＰＤＨの発現に対して規格化した発現を示し、図３０Ｂはｒｐ１１９の発現に対して規格化した発現を示す。
【０３０４】
（実施例１２）
Ｗｎｔ拮抗体を投与した再生組織
Ｗｎｔシグナル伝達は皮膚、腸及び造血細胞などの再生性の組織の自己更新において重要な役割を果たしており、Ｄｋｋ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害は成熟マウスにおけるこれらの組織の構造に悪影響を与える場合がある。以下の実施例は抗腫瘍効能を得るために使用される条件と同条件下のＦｒｚ８−Ｆｃへの曝露がマウスにおける腸及び皮膚に何らかの影響を有しているかどうかを調べるものである。組織は週３回１４処置後にＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１腫瘍モデル（実施例１０に記載）における処置マウスから収集し、切片を免疫組織化学的操作によりβ−カテニン蛋白質に関して染色した。皮膚及び種々の腸コンパートメントの分析によりこれらの組織の構造が全ての群の処置マウスにおいて形態学的に正常であるらしいことを示し、腸パネート細胞（図３１Ａ）及び皮膚毛包（図３１Ｂ）における細胞質及び核のβ−カテニン染色の典型的なパターンが伴っていた。更に、週３回９処置後のＮＴｅｒａ−２モデルを用いた場合の動物から収集された皮膚及び腸の組織学的及び免疫組織化学的分析も、対照群と投与群との間に差がないことを示していた。このことは腫瘍成長を阻害できる治療レジメンによるＦｒｚ８−Ｆｃによる治療が皮膚及び腸の組織更新に対して悪影響を有さないことを示唆している。
【０３０５】
（実施例１３）
本実施例はＷｎｔ拮抗体を製造する種々の方法を記載する。
大腸菌におけるＷｎｔ拮抗体の発現
本実施例は大腸菌における組み換え発現によるＷｎｔ拮抗体の未グリコシル化形態の製造を説明する。
【０３０６】
Ｗｎｔ拮抗体をコードするＤＮＡ配列を、初めに、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅する。プライマーは選択された発現ベクター上の制限酵素部位に相当する制限酵素部位を含有する必要がある。種々の発現ベクターを使用してよい。適当なベクターの例はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含有するｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導；Ｂｏｌｉｖａｒ等、  Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７）参照）である。ベクターを制限酵素で消化し、脱ホスホリル化する。次にＰＣＲ増幅した配列をベクター内にライゲーションする。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモータ、ポリｈｉｓリーダー（最初の６ＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位）、Ｗｎｔ拮抗体コーディング領域、ラムダ転写終結因子、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を包含する。
【０３０７】
次にライゲーション混合物を用いて選択された大腸菌をＳａｍｂｒｏｏｋ等、上出に記載される方法を用いて形質転換する。形質転換体はＬＢプレート上で成長するそれらの能力により識別し、次に抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析及びＤＮＡ配列決定により確認する。
【０３０８】
選択されたクローンは抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地中で一夜成長させることができる。一夜培養物はその後より大規模の培養物に接種するために使用してよい。次に細胞を所望の光学密度まで成長させ、その間、発現プロモータを作動させる。
【０３０９】
更に数時間細胞を培養したのち、細胞を遠心分離により採取する。遠心分離により得た細胞ペレットは当該分野で知られた種々の薬剤で可溶化することができ、可溶化されたＷｎｔ拮抗体蛋白質は次に、蛋白質の堅固な結合を可能にする条件下で金属キレート形成カラムを用いて精製することができる。
【０３１０】
Ｗｎｔ拮抗体は以下の手順を用いながらポリＨｉｓタグ化形態において大腸菌内で発現してよい。Ｗｎｔ拮抗体をコードするＤＮＡを選択されたＰＣＲプライマーを用いて初めに増幅する。プライマーは選択された発現ベクター上の制限酵素部位に相当する制限酵素部位、及び、効率的で信頼性の高い翻訳の開始、金属キレート形成カラム上での迅速な精製、及びエンテロキナーゼの蛋白質分解的除去を提供する他の有用な配列を含有する。ＰＣＲ増幅ポリＨｉｓタグ化配列を次に発現ベクター内にライゲーションし、これを用いて菌株５２に基づいた大腸菌宿主（Ｗ３１１０  ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎ  ｇａｌＥ  ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））を形質転換する。形質転換体は、初めに、３〜５のＯＤ６００に到達するまで振とうしながら３０℃において５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で成長させる。次に培養物をＣＲＡＰ培地（水５００ｍＬ中３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母エキス、５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄハイケースＦＳ並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）グルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４を混合することにより製造）中に５０〜１００倍希釈し、そして振とうしながら３０℃において約２０〜３０時間成長させる。試料を除去してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認し、バルク培養物全体を遠心分離して細胞をペレット化する。細胞ペレットを精製及び再折り畳みまで凍結する。
【０３１１】
０．５〜１Ｌの発酵物に由来する大腸菌ペースト（６〜１０ｇペレット）を７Ｍのグアニジン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８の緩衝剤中１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁する。固体の硫酸ナトリウム及びナトリウムテトラチオネートをそれぞれ終濃度０．１Ｍ及び０．０２Ｍとなるように添加し、溶液を４℃で一夜攪拌する。この工程により全てのシステイン残基がスルフィトール化により遮断された変性蛋白質をもたらす。溶液を３０分間Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心分離機において４０，０００ｒｐｍで遠心分離する。上澄みを金属キレートカラム緩衝剤（６Ｍグアニジン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）３〜５容量で希釈し、０．２２ミクロンのフィルタで濾過することにより清澄化する。清澄化された抽出液は金属キレートカラム緩衝剤中で平衡化させた５ｍｌ  ＱｉａｇｅｎＮｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムにロードする。カラムを追加的な５０ｍＭイミダゾール含有緩衝剤（Ｇａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｕｔｒｏｌ等級）ｐＨ７．４で洗浄する。２５０ｍＭイミダゾール含有緩衝剤で蛋白質を溶出させる。所望の蛋白質を含有する画分を合わせ、４℃で保存する。蛋白質濃度はそのアミノ酸配列に基づいて計算された消光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸光度により推定する。
【０３１２】
蛋白質は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２．５Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、２０ｍＭグリシン及び１ｍＭ  ＥＤＴＡよりなる新しく製造した再折り畳み緩衝剤中に緩徐に試料を希釈することにより再折り畳みさせる。再折り畳み容量は最終蛋白質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択する。再折り畳み溶液は１２〜３６時間４℃で穏やかに攪拌する。再折り畳み反応はＴＦＡを終濃度０．４％（ｐＨ約３）となるように添加することによりクエンチする。蛋白質を更に精製する前に、溶液を０．２２ミクロンのフィルタで濾過し、アセトニトリルを２〜１０％終濃度となるように添加する。再折り畳み蛋白質は１０〜８０％のアセトニトリル勾配を用いた溶離により０．１％ＴＦＡの移動相緩衝剤を用いたポーラスＲ１／Ｈ逆相カラム上のクロマトグラフィに付す。Ａ２８０吸光度を有する画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析し、均質な再折り畳み蛋白質を含有する画分をプールする。一般的に大部分の蛋白質の正しく再折り畳みされた物質種は、それら物質種がそれらの疎水性の内部を逆相樹脂との相互作用から遮蔽された状態で最も圧縮されているため、アセトニトリルの最低濃度において溶出する。凝集した物質種は通常はより高いアセトニトリル濃度で溶出する。誤って折りたたまれた形態の蛋白質を所望の形態から分割することに加えて、逆相工程も、試料から内毒素を除去する。
【０３１３】
所望の折りたたまれたＷｎｔ拮抗体ポリペプチドを含有する画分を合わせ、そして溶液に指向された穏やかな窒素流を用いてアセトニトリルを除去する。蛋白質は透析によるか、又は製剤緩衝剤中で平衡化したＧ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂を用いたゲル濾過により２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ６．８＋０．１４Ｍ塩化ナトリウム及び４％マンニトールとなるように製剤し、そして滅菌濾過する。
哺乳動物細胞におけるＷｎｔ拮抗体の発現
本実施例は哺乳動物細胞における組み換え発現によるＷｎｔ拮抗体の潜在的にグリコシル化された形態の製造を説明する。
【０３１４】
ベクターｐＲＫ５（１９８９年３月５日公開の欧州特許３０７，２４７参照）を発現ベクターとして使用した。場合によりＷｎｔ拮抗体ＤＮＡを選択された制限酵素でｐＲＫ５内にライゲーションすることにより、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上出に記載されているようなライゲーション法を用いてＷｎｔ拮抗体ＤＮＡの挿入を可能にする。本実施例の目的のために、得られたベクターはｐＲＫ５−ＷＡと称する。
【０３１５】
１つの実施形態において、選択された宿主細胞は２９３細胞であってよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１５７３）をウシ胎児血清及び場合により栄養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中組織培養プレート中でコンフルエントとなるまで成長させる。約１０μｇのｐＲＫ−ＷＡＤＮＡをＶＡＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ等、Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２）］約１μｇと混合し、そして５００μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ  ＣａＣｌ２に溶解する。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＮａＰＯ４を滴下し、２５℃で１０分間沈殿を形成させる。沈殿を懸濁させ、２９３細胞に添加し、３７℃で約４時間沈降させる。培地を吸引し、ＰＢＳ中２０％グリセロール２ｍｌを３０秒間添加した。次に２９３細胞を血清不含培地で洗浄し、新しい培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
【０３１６】
トランスフェクションの約２４時間後、培地を除去し、培地（単独）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含有する培地と交換する。１２時間のインキュベーションの後、コンディショニングされた培地を収集し、スピンフィルタにて濃縮し、そして１５％ＳＤＳゲル上にロードさせた。プロセシングされたゲルを乾燥し、Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドの存在を明らかにするための選択された期間に渡ってフィルムに露光させてよい。トランスフェクトされた細胞を含有する培地を更にインキュベート（血清不含培地中）してよく、そして培地を選択されたバイオアッセイにおいて試験する。
【０３１７】
代替の手法において、Ｗｎｔ拮抗体はＳｏｍｐａｒｙｒａｃ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）に記載のデキストランサルフェート法を用いて一過性に２９３細胞内に導入してよい。２９３細胞はスピナーフラスコにて最大密度となるまで成長させ、そして７００μｇのｐＲＫ５−ＷＡＤＮＡを添加する。細胞を、初めに、遠心分離によりスピナーフラスコから濃縮し、そしてＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を４時間細胞ペレットにてインキュベートする。細胞を９０秒間２０％グリセロールで処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含有するスピナーフラスコ内に再導入する。約４日間の後、コンディショニングされた培地を遠心分離し、濾過することにより細胞及び破砕片を除去する。次に発現されたＷｎｔ拮抗体を含有する試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィなどの何れかの選択された方法により精製する。
【０３１８】
別の実施形態においては、Ｗｎｔ拮抗体はＣＨＯ細胞中で発現できる。ｐＲＫ５−ＷＡをＣａＰＯ４又はＤＡＥＡ−デキストランなどの既知試薬を用いながらＣＨＯ内にトランスフェクトすることができる。上記した通り細胞培養物をインキュベートすることができ、培地を培地（単独）又は３５Ｓ−メチオニンなどの放射標識を含有する培地と交換する。Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドの存在を測定した後、培地を血清不含培地と交換する。好ましくは培地を約６日間インキュベートし、次にコンディショニングされた培地を採取する。次に発現されたＷｎｔ拮抗体を含有する培地を何れかの選択された方法により濃縮及び精製することができる、
エピトープタグ化Ｗｎｔ拮抗体は、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。Ｗｎｔ拮抗体はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてよい。サブクローンインサートはＰＣＲを受けてバキュロウィルス発現ベクター内にポリｈｉｓタグなどの選択されたエピトープタグと共にインフレームに融合させることができる。ポリｈｉｓタグ化Ｗｎｔ拮抗体インサートは次に、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲなどの選択マーカーを含有するＳＶ４０駆動ベクター内にサブクローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０駆動ベクターによりトランスフェクト（上記）することができる。標識は発現を確認するために上記した通り実施してよい。次に発現されたポリＨｉｓタグ化Ｗｎｔ拮抗体を含有する培地をＮｉ２＋キレートアフィニティクロマトグラフィなどの何れかの選択された方法により濃縮及び精製することができる。
【０３１９】
Ｗｎｔ拮抗体はＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞において一過性発現手順により、又はＣＨＯ細胞において別の安定な発現手順により発現させてもよい。
【０３２０】
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の手順を用いて実施する。蛋白質を該当する蛋白質の可溶性形態に関するコード配列（例えば細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ２ドメインを含有するＩｇＧ１定常領域配列に融合されている、及び／又はポリＨｉｓタグ化形態にあるＩｇＧ構築物（イムノアドヘシン）として発現させる。
【０３２１】
ＰＣＲ増幅の後、該当するＤＮＡをＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ３．１６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）に記載の標準的手法を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現ベクターはｃＤＮＡの好都合なシャトル作用を可能にするための目的のＤＮＡの５’及び３’の適合制限部位を有するように構築する。ＣＨＯ細胞における発現のために使用されるベクターはＬｕｃａｓ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：９（１７７４−１７７９（１９９６）に記載されており、そして目的のｃＤＮＡ及びジヒドロフォレート還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモータ／エンハンサを使用する。ＤＨＦＲ発現はトランスフェクション後のプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
【０３２２】
所望のプラスミドＤＮＡ１２マイクログラムを市販のトランスフェクション試薬ＳＵＰＥＲＦＥＣＴｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ＤＯＳＰＥＲ（登録商標）又はＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて約１０×１０６個のＣＨＯ細胞に導入する。細胞はＬｕｃａｓ等、上出に記載の通り成長させる。約３×１０７個の細胞を以下に記載する通り後の成長および製造のためにアンプル中に凍結する。
【０３２３】
プラスミドＤＮＡを含有するアンプルをウォーターバス内に入れ、回転混合することにより解凍する。内容物をピペットで培地１０ｍＬを含有する遠心分離管に入れ、５分間１０００ｒｐｍで遠心分離する。上澄みを吸引し、細胞を選択培地（０．２μｍフィルタ処理ＰＳ２０＋５％０．２μｍ透析済みウシ胎児血清）１０ｍｌ中に再懸濁する。次に細胞を選択培地９０ｍＬを含有する１００ｍＬのスピナー中に分取する。１〜２日後、細胞を１５０ｍＬの選択成長培地で満たされた２５０ｍＬスピナーに移し、そして３７℃でインキュベートする。更に２〜３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーに３×１０５個／ｍＬを播種する。遠心分離及び生産培地中の再懸濁により細胞培地を新しい培地と交換する。何れかの安定なＣＨＯ培地を使用してよいが、１９９２年６月１６日に発行された米国特許５，１２２，４６９に記載の生産培地を実際には使用してよい。３Ｌの生産スピナーに１．２×１０６個／ｍＬを播種する。第０日において、細胞数、ｐＨを測定する。第１日において、スピナーを採取し、濾過空気パージを開始する。第２日にスピナーを採取し、温度を３３℃に変更し、そして５００ｇ／Ｌグルコース３０ｍＬ及び１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルジョン、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６５医療等級エマルジョン）０．６ｍｌを採取する。生産を通じて、ｐＨは概ね７．２に維持されるように調節する。１０日後、又は生存性が７０％未満に低下するまで、細胞培養物を遠心分離及び０．２２μｍフィルタ濾過により採取する。濾液は４℃で保存するか、又は、即座に精製用カラムにロードする。
【０３２４】
ポリＨｉｓタグ化構築物に関しては、蛋白質はＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。精製の前に、イミダゾールをコンディショニングされた培地に５ｍＭの濃度となるまで添加する。コンディショニング培地は４℃で４〜５ｍｌ／分の流量において０．３Ｍ  ＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４緩衝剤で平衡化させた６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラム上に送液する。ローディング後、カラムを追加の平衡化緩衝剤で洗浄し、０．２５Ｍイミダゾール含有平衡化緩衝液で蛋白質を溶離させる。高度に精製された蛋白質はその後、２５ｍｌのＧ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ及び４％マンニトールを含有する保存緩衝剤ｐＨ６．８中に脱塩し、そして−８０℃において保存する。
【０３２５】
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）構築物を以下の通りコンディショニングされた培地から精製する。コンディショニングされた培地を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ６．８で平衡化されている５ｍｌプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に送液する。ローディング後、カラムを平衡化緩衝剤で十分洗浄した後に、１００ｍＭクエン酸ｐＨ３．５で溶離させる。溶離した蛋白質は２７５μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ９）を含有する試験管に１ｍｌ画分ずつ収集することにより即座に中和する。高度に精製された蛋白質はその後、ポリＨｉｓタグ化蛋白質に関して上記した通り保存緩衝剤中に脱塩する。均質性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより、そしてエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定により評価する。
酵母におけるＷｎｔ拮抗体の発現
以下の方法は酵母におけるＷｎｔ拮抗体の組み換え発現を記載する。
【０３２６】
第１に、酵母発現ベクターをＷｎｔ拮抗体の細胞内生産又は分泌のためにＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータから構築する。Ｗｎｔ拮抗体及びプロモータをコードするＤＮＡをＷｎｔ拮抗体の細胞内発現を指向するために選択されたプラスミドの適当な制限酵素部位内に挿入する。分泌のために、Ｗｎｔ拮抗体をコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータ、ネイティブのＷｎｔ拮抗体シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は例えば酵母アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及びＷｎｔ拮抗体の発現のためのリンカー配列（必要な場合）をコードするＤＮＡと共に選択されたプラスミド内にクローニングすることができる。
【０３２７】
酵母菌株ＡＢ１１０などの酵母細胞を次に上記した発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養することができる。形質転換された酵母の上澄みは、１０％トリクロロ酢酸による沈澱及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、その後のクーマシーブルー染色によるゲルの染色により分析することができる。
【０３２８】
組み換えＷｎｔ拮抗体はその後、遠心分離により発酵培地から酵母細胞を除去すること、そして次に選択されたカートリッジフィルタを使用して培地を濃縮することにより、単離精製できる。Ｗｎｔ拮抗体を含有する濃縮物は更に選択されたカラムクロマトグラフィ樹脂を用いて精製してよい。
バキュロウィルス感染昆虫細胞におけるＷｎｔ拮抗体の発現
以下の方法はバキュロウィルス感染昆虫細胞におけるＷｎｔ拮抗体の組み換え発現を記載する。
【０３２９】
Ｗｎｔ拮抗体に関してコードする配列をバキュロウィルス発現ベクター内に含有されるエピトープタグの上流に融合させる。そのようなエピトープタグはポリｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（例えばＩｇＧのＦｃ領域）を包含する。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販のプラスミドから誘導したプラスミドを包含する種々のプラスミドを使用してよい。慨すれば、Ｗｎｔ拮抗体、又はＷｎｔ拮抗体のコード配列の所望の部分をコードする配列、例えば膜貫通蛋白質の細胞外ドメインをコードする配列、又は蛋白質が細胞外である場合は成熟蛋白質をコードする配列を、５’及び３’領域に対して相補なプライマーを用いたＰＣＲにより増幅する。５’プライマーはフランキングする（選択された）制限酵素部位を取り込んでよい。次に産物をこれらの選択された制限酵素で消化し、そして発現ベクター内にサブクローニングする。
【０３３０】
組み換えバキュロウィルスは上記プラスミド及びＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ（商標）ウィルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）内にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬより販売）を用いて同時トランスフェクトすることにより作成する。２８℃で４〜５日インキュベートした後、放出されたウィルスを採取し、その後の増幅に使用する。ウィルス感染及び蛋白質発現はＯ’Ｒｅｉｌｌｅｙ等、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）に記載の通り実施する。
【０３３１】
発現されたポリｈｉｓタグ化Ｗｎｔ拮抗体は次に例えば以下の通りＮｉ２＋−キレートクロマトグラフィにより精製できる。Ｒｕｐｅｒｔ等、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：１７５−１７９（１９９３）により記載される通り組み換えウィルス感染Ｓｆ９細胞から抽出液を製造する。慨すれば、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用緩衝剤（２５ｍＬ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％ＮＰ−４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）に再懸濁し、そして氷上で２０秒間２回超音波処理する。超音波処理物は遠心分離により清澄化し、そして上澄みをローディング緩衝剤（５０ｍＭホスフェート、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）中に５０倍希釈し、０．４５μｍフィルタを通して濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎより販売）を５ｍＬの床容量で作製し、水２５ｍＬで洗浄し、ローディング緩衝剤２５ｍｌで平衡化する。濾過した細胞抽出液を０．５ｍＬ／分でカラムにロードする。カラムはローディング緩衝剤でベースラインのＡ２８０となるまで洗浄し、その時点で画分の収集を開始する。次にカラムを２次洗浄緩衝剤（５０ｍＭホスフェート；３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄し、これにより非特異的結合蛋白質を溶離させる。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを２次洗浄緩衝剤中０〜５００ｍＭのイミダゾール勾配を用いて展開する。１ｍＬ画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色、又はアルカリホスファターゼにコンジュゲートしたＮｉ２＋−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウエスタンブロットにより分析する。溶出したＨｉｓ１０−タグ化Ｗｎｔ拮抗体を含有する画分をプールし、ローディング緩衝剤に対して透析する。
【０３３２】
或いはＩｇＧタグ化（又はＦｃタグ化）Ｗｎｔ拮抗体の精製は例えばプロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィを包含する既知のクロマトグラフィ手法を用いながら実施できる。
アフィニティクロマトグラフィを用いたＷｎｔ拮抗体ポリペプチドの精製
ネイティブ又は組み換えのＷｎｔ拮抗体ポリペプチドは蛋白質精製の分野の種々の標準的手法により精製してよい。例えば、プロ−、成熟、又はプレ−Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドを目的のＷｎｔ拮抗体ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィにより精製する。一般的に、イムノアフィニティカラムは活性化されたクロマトグラフィ樹脂にＷｎｔ拮抗体ポリペプチドを共有結合的にカップリングすることにより構築される。或いは、Ｆｃドメインを含有するＷｎｔ拮抗体はＰｒｏＳｅｐＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）などの固定化されたプロテインＡ樹脂を用いて培地から直接精製してよい。
【０３３３】
ポリクローナル免疫グロブリンを、硫酸アンモニウムを用いた沈殿によるか、又は固定化されたプロテインＡ上（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の精製により免疫血清から製造する。同様に、モノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡ上のクロマトグラフィによりマウス腹水から製造する。部分精製された免疫グロブリンをＣｎＢｒ活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などのクロマトグラフィ樹脂に共有結合させる。製造元の説明書に従って、抗体を樹脂にカップリングさせ、樹脂を遮断し、そして誘導体樹脂を洗浄する。
【０３３４】
そのようなイムノアフィニティカラムは可溶性形態においてＷｎｔ拮抗体を含有する細胞から画分を製造することによるＷｎｔ拮抗体ポリペプチドの精製において利用してよい。この調製品は全細胞、又は洗剤添加による示差的遠心分離を介して得られたサブ細胞画分の可溶化により、又は当該分野で良く知られている他の方法により、誘導される。或いはシグナル配列を含有する可溶性Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチドは細胞を成長させている培地中に有用な量において分泌させてよい。
【０３３５】
可溶性Ｗｎｔ拮抗体ポリペプチド含有調製品はイムノアフィニティカラムを通過し、そしてカラムをＷｎｔ拮抗体ポリペプチドの優先的吸収が可能な条件下（例えば洗剤存在下の高イオン強度緩衝剤）で洗浄する。次に、抗体／Ｗｎｔ拮抗体結合を崩壊させる条件下（例えば低ｐＨ緩衝剤、例えば約ｐＨ２〜３、又は高濃度のカオトロピックな物質、例えば尿素又はチオシアネートイオン）にカラムを溶離し、そしてＷｎｔ拮抗体ポリペプチドを収集する。
文献
【０３３６】
【化３１】
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【０３３７】
【化３２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２９】
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【図３０】
2010504081.tif 000115
【図３１Ａ】
2010504081.tif 000116
【図３１Ｂ】
2010504081.tif 000117
【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ１】
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【図３２Ｂ２】
2010504081.tif 000120
【図３２Ｂ３】
2010504081.tif 000121
【図３２Ｃ】
2010504081.tif 000122
【配列表】
2010504081000001.app
【国際調査報告】
2010504081.tif 000123
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