(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１０１】
0006270981.tif 000060
を有する化合物またはそのラセミ混合物を合成する方法であって、式中、
Ｘは、
【化１０２】
0006270981.tif 000061
からなる群から選択されるか、またはそのラセミ混合物であり、
Ｙは、式：
【化１０３】
0006270981.tif 000062
で表され、式中、
Ｒ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＣＨ２からなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２からなる群から独立して選択され、該方法は、
（ａ）式１：
【化１０４】
0006270981.tif 000063
の化合物を式：
【化１０５】
0006270981.tif 000064
の化合物あるいはそのラセミ混合物とを、極性溶媒およびトリフルオロ酢酸の存在下で反応させて、式：
【化１０６】
0006270981.tif 000065
の化合物あるいはそのラセミ混合物を提供するステップ；
（ｂ）式：
【化１０７】
0006270981.tif 000066
の化合物あるいはそのラセミ混合物と水酸化ナトリウムおよび式：
【化１０８】
0006270981.tif 000067
の色素化合物とを反応させるステップであって、式中、
Ｒ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＣＨ２からなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２からなる群から独立して選択される、ステップ；ならびに
（ｃ）式：
【化１０９】
0006270981.tif 000068
の化合物あるいはそのラセミ混合物を単離するステップであって、式中、
Ｒ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＣＨ２からなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２からなる群から独立して選択される、ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）における前記色素化合物が、
【化１１０】
0006270981.tif 000069
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記極性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよび水からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
式：
【化１１１】
0006270981.tif 000070
を有する化合物を合成する方法であって、式中
Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から独立して選択され、該方法は、
（ａ）式：
【化１１２】
0006270981.tif 000071
の化合物と式：
【化１１３】
0006270981.tif 000072
の化合物とを、ジメチルホルムアミドおよびトリフルオロ酢酸の存在下で反応させて、式：
【化１１４】
0006270981.tif 000073
の化合物を提供するステップであって、式中
Ｗは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から独立して選択される、ステップ；
（ｂ）式：
【化１１５】
0006270981.tif 000074
の化合物と水酸化ナトリウムおよび式：
【化１１６】
0006270981.tif 000075
の色素化合物とを反応させるステップであって、式中、
Ｘ、ＹおよびＺは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から独立して選択される、ステップ；ならびに
（ｃ）式：
【化１１７】
0006270981.tif 000076
の化合物を単離するステップであって、式中、
Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から独立して選択される、ステップ
を含む、方法。
【請求項５】
式：
【化１１８】
0006270981.tif 000077
の化合物を固相合成するための方法であって、式中、
Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺはそれぞれ、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から独立して選択され、該方法は、固相ペプチド合成機内で、
（ａ）式：
【化１１９】
0006270981.tif 000078
の化合物であって、式中、
Ｗは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から選択される、化合物と式：
【化１２０】
0006270981.tif 000079
の化合物であって、式中、
【化１２１】
0006270981.tif 000080
は、樹脂ビーズである、化合物とを反応させるステップ；
（ｂ）式：
【化１２２】
0006270981.tif 000081
の化合物をトリフルオロ酢酸：Ｈ２Ｏ：トリイソプロピルシリルアルコールの存在下で反応させて、式：
【化１２３】
0006270981.tif 000082
の化合物を提供するステップであって、式中
Ｗは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から選択される、ステップ；
（ｃ）式：
【化１２４】
0006270981.tif 000083
の化合物と水酸化ナトリウムおよび式：
【化１２５】
0006270981.tif 000084
の色素化合物とを反応させるステップであって、式中、
Ｘ、ＹおよびＺは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から独立して選択される、ステップ；ならびに
（ｄ）式：
【化１２６】
0006270981.tif 000085
の化合物を単離するステップであって、式中、
Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から独立して選択される、ステップ
を含む、方法。
【請求項６】
式：
【化１２７】
0006270981.tif 000086
の化合物の同位体型を合成する方法であって、
該同位体型は、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃおよび１４Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の炭素同位体および／または水素同位体を含み、さらに式中、
Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から独立して選択され、
該方法は、
（ａ）式：
【化１２８】
0006270981.tif 000087
の化合物であって、式中、
Ｗは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から選択される、化合物と、式：
【化１２９】
0006270981.tif 000088
の化合物の同位体型であって、
該同位体型は、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃおよび１４Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の炭素同位体および／または水素同位体を含み、さらに式中、
Ｗは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から選択される、同位体型とを、ジメチルホルムアミドの存在下で反応させて、式
【化１３０】
0006270981.tif 000089
の化合物の同位体型を提供するステップであって、
該同位体型は、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃおよび１４Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の炭素同位体および／または水素同位体を含み、さらに式中、
Ｗは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から選択される、ステップ；ならびに
（ｂ）式：
【化１３１】
0006270981.tif 000090
の化合物の同位体型であって、
該同位体型は、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃおよび１４Ｃからなる群から選択される１つまたは複数の炭素同位体および／または水素同位体を含み、さらに式中、
Ｗは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から選択される、同位体型と、
水酸化ナトリウムおよび式：
【化１３２】
0006270981.tif 000091
の色素化合物であって、式中、
Ｘ、ＹおよびＺは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる群から独立して選択される、色素化合物とを反応させるステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９１，９２１号および２０１３年８月２６日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／５６，６２９号に関連するとともに、それらの優先権の利益を主張し、各々の内容は、その全体が本開示に参考として援用される。
【０００２】
本開示は、診断法の分野にある。本開示は、腫瘍の標的画像化に使用される化合物にコンジュゲートしているアミノ酸連結基を合成および利用する方法を提供する。アミノ酸連結基のコンジュゲーションは、化合物の特異性および検出を増大させる。診断用画像化におけるその使用のための化合物の製造方法および合成が想定される。
【背景技術】
【０００３】
悪性疾患の外科的除去は、がんの一次処置のための最も一般的で、かつ有効な治療法の一つを構成する。手術は、すべての固形腫瘍、例えば、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、結腸がん、および膵臓がんのための最良の療法の一つである。手術は米国で固形腫瘍を有する患者の５０％を治癒している一方で、化学療法および放射線療法は、すべてのがん患者の５％未満を治癒している。
【０００４】
７００，０００超の患者が、米国で毎年がん手術を受け、手術患者の４０％は、５年以内に局所領域疾患の再発を有する。この１０年間にわたる腫瘍学分野での大きな進歩にもかかわらず、この分野で克服すべき難題は、陰性断端の原発腫瘍の完全切除、転移性がん細胞を持つリンパ節の除去およびサテライト疾患の特定である。これら３つのゴールを達成することは、疾患クリアランスを改善するだけでなく、術後化学療法および放射線療法に関する決定も誘導する。
【０００５】
非標的蛍光色素は一部の腫瘍に受動的に蓄積することが示されているが、得られた腫瘍対バックグラウンド比はしばしば不十分であり、悪性組織と健康組織の間の境界を明確にすることが困難であり得る。リガンド標的蛍光色素（例えば、ＥＣ１７：葉酸−ＥＤＡ−ＦＩＴＣ）が組織を画像化するために使用されてきたが、それらの色素は組織深く侵入しないので、有効でなく、したがって、組織試料内のより深くよりはむしろ、組織の表面で特定の細胞を特定しただけである。さらに、これらの従来の蛍光色素の励起および発光スペクトルは、それがかなりのバックグラウンドノイズを発生し、その結果、標的組織が容易に検出されないようであることが示されている。さらに、上記背景技術で検討されたように、フルオレセイン系色素は、保存寿命安定性が低いという不利点を有する。ＥＣ１７は、その化合物中のチオウレア架橋の不安定性の結果として容易に分解する。さらに、ＥＣ１７は、フルオレセインを使用するので、画像化部位の周辺組織でコラーゲンからの比較的高いレベルの非特異的バックグラウンドノイズという欠点を有する。さらに、生物発色団、特にヘモグロビンによる可視光の吸収は、フルオレセインを組み込む色素の有用性をさらに制限する。これは、慣用色素が、組織中に数ミリメートルより深く埋められ得る腫瘍を容易には検出できないことを意味する。さらに、フルオレセインからの蛍光は、低ｐＨ（ｐＨ５未満）でクエンチされる。
【０００６】
色素材料が、検出および誘導手術、または他の組織画像化の提供に有用であるために、これらの欠点を克服することが重要である。
【０００７】
驚くことではないが、より定量的な腫瘍縮小を達成するための手術方法は、いまや大規模な審査の対象となっている。
【０００８】
検出可能な悪性病変のすべての切除は、すべてのがん患者のおよそ５０％で疾患の検出可能な逆戻りをもたらさず、がんの再発が見られる患者について平均余命を延ばし、または羅患率を減少させ得る。悪性病変の全切除の重要性を前提として、悪性病変が、正確かつ完全に特定されることを確実にすることは有益である。手術中の悪性組織の特定は、現在３つの方法で行われている。第１に、腫瘍塊および結節の多くは、異常な色、テクスチャ、および／または形態に基づいて視覚的に検出することができる。したがって、腫瘍塊は、斑紋状の色を示し、不規則な境界を有して非対称に見え、または健康臓器の輪郭から突き出し得る。悪性塊はまた、隣接する健康組織から可塑性、弾性または固体性の差によって触覚的に認識されてもよい。最後に、少数のがん病巣は、原発腫瘍から流入領域リンパ節中に受動的に流れる蛍光色素を使用して術中で位置付けるができる。この後者の方法論では、蛍光（センチネル）リンパ節は、これらのリンパ節にがん細胞が転移したかどうかを決定するために、視覚的に特定し、切除し、および調べることができる。
【０００９】
腫瘍の除去の重要性の認識および腫瘍塊を可視化するためのある種の特定技術の利用性にもかかわらず、多くの悪性結節は依然として検出を逃れ、疾患再発およびしばしば死をもたらす。したがって、改善された腫瘍特定の必要性がある。この動機付けは、悪性疾患の手術内可視化に対する２つの新手法の導入をもたらした。第１に、クエンチされた蛍光色素が担腫瘍動物に全身的に注射され、腫瘍特異的酵素、ｐＨ変化、または酸化還元電位の変化によるクエンチング部分の放出が引き出されて、悪性塊内の蛍光を選択的に活性化する。第２の手法では、リガンドの受容体を過剰発現するがんに付着色素を蓄積させる腫瘍特異的標的化リガンドに、蛍光色素をコンジュゲートする。この後者の目的のために使用される腫瘍標的化リガンドの例としては、卵巣、腎臓、肺、子宮内膜、乳房、および結腸の葉酸受容体（ＦＲ）陽性がんに特異性を示す葉酸、ならびに前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を発現する細胞、すなわち、前立腺がんおよび他の固形腫瘍の新生脈管系に選択的に付着蛍光色素を送達し得るＤＵＰＡが挙げられる。有利には、葉酸標的蛍光色素（葉酸フルオレセインまたはＥＣ１７）の一つが、最近ヒト卵巣がん患者で術中に試験された。この研究では、腫瘍標的蛍光色素の補助により、それなしに比べて、約５×超の悪性病変が除去され、切除された蛍光病変のすべてが、悪性であると病理学により確認された。
【００１０】
慣用蛍光技術は、可視光スペクトル（約４００〜６００ｎｍ）でプローブを使用し、これは、組織中のコラーゲンによる比較的高いレベルの非特異的バックグラウンド光を伴うので、術中画像誘導手術に最適でない。したがって、これらの慣用化合物からの信号とノイズの比は低い。さらに、生物発色団、特にヘモグロビンによる可視光の吸収は、数ミリメートルに侵入深さを制限する。したがって、組織中に数ミリメートルより深く埋められている腫瘍は、検出されないままであり得る。さらに、フルオレセインのイオン化平衡（ｐＫａ＝６．４）は、５〜９の範囲にわたってｐＨ依存性の吸収および発光をもたらす。したがって、フルオレセイン系色素の蛍光は、低いｐＨ（ｐＨ５未満）でクエンチされる。
【００１１】
例えば、臨床設定における疾患組織の特徴付けおよび測定のための光学的画像化におけるより普及した使用のための、ＥＣ１７色素の潜在的使用は、付着色素（フルオレセイン）が可視範囲で蛍光を発するという主たる欠点によって妨げられてきた。これは、ＥＣ１７および関連色素を組織におけるｉｎ  ｖｉｖｏ使用に不良とするが、組織が典型的には可視範囲で強力に自己蛍光を発し、光が組織を不十分に侵入するからである。さらに、ＥＣ１７（葉酸−エチレンジアミン−フルオレセインイソチオシアネートは、チオ尿素リンカーを含む。チオ尿素化合物が、チオ尿素連結の不安定性のために保存寿命が低いことは周知である。したがって、ＥＣ１７などの化合物は、この不安定性および関連したチオ尿素架橋の分解のために、光学的画像化における使用に最適ではない。
【００１２】
可視光（＜６００ｎｍ）におけるヘモグロビンと、ＩＲ範囲（＞９００ｎｍ）における水および脂質とによる光吸収の組合せは、組織の吸収係数が最小である、およそ６５０〜９００ｎｍの光学的画像化枠を与える。可視範囲で発光する色素に対する好適な代替は、近赤外（ＮＩＲ）で使用され得る色素を開発することであり、その理由は、近赤外領域の光は、ほとんど自己蛍光を誘発せず、組織をはるかにより効率的に透過するからである。近ＩＲ蛍光技術の別の利点は、散乱強度は波長の逆４乗に比例するので、励起光源からの散乱光からのバックグラウンドが、非常に減少することである。低いバックグラウンドの蛍光は、高感度検出に必要である。さらに、生物組織における近ＩＲ領域（６５０ｎｍ〜９００ｎｍ）の光学的に透明な枠は、生物学的構成要素を通る光の透過を必要とするｉｎ  ｖｉｖｏ画像化および細胞下検出の利用にとってＮＩＲ蛍光を貴重な技術とする。
【００１３】
より深い組織の画像化のためのＮＩＲ範囲の光の使用が可視スペクトルの光に対して好ましい一方で、当技術分野で現在使用されるＮＩＲ画像化色素は、光退色に対する感受性、不十分な化学安定性、多くの生理的分子と同じ範囲内に入る吸収および発光スペクトル（高いバックグラウンド信号および自己蛍光をもたらす）などの多くの課題および不利点を欠点としてもつ。さらに、大部分のＮＩＲ色素は、合成の間、とりわけ、アミンリンカーによってリガンドへコンジュゲートする間に安定でなく、複数の不要な副生成物を生成する。したがって、臨床用にリガンド標的ＮＩＲ画像化剤を取得することは、高価であり得る。したがって、ＮＩＲ蛍光プローブを利用する現在の画像化方法は、深い組織の画像化（表面から＞５ｍｍ）、哺乳動物組織における蛍光信号の定量化、または前臨床から臨床への翻訳時間を増大させる生産コストにおいて有効でない。
【００１４】
蛍光誘導手術への２つの有望な手法が、臨床における使用のために現在熱心に開発中である。一方の方法では、付着消光剤へのその近接のために定常状態で最小限に蛍光性である活性化可能なＮＩＲ蛍光プローブが、悪性組織での消光剤の放出後に高度に蛍光性になる。最も一般的に使用される放出メカニズムの一つは、腫瘍−濃縮プロテアーゼ（すなわち、カテプシン、カスパーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ）により特異的に開裂され得る、色素と消光剤の間のペプチド配列の組み込みを伴う。この戦略の主な利点は、活性化酵素を欠く組織における蛍光の非存在にあり、排泄経路に沿った組織（例えば、腎臓、膀胱、肝臓）を、それらが開裂酵素を偶然に発現しない限り、非蛍光性のままにさせる。このような腫瘍−活性ＮＩＲ色素はまた、悪性病変に開裂プロテアーゼが濃縮されており、かつ放出色素が腫瘍中に保持されている限り、腫瘍塊においてかなりの蛍光を発生させることができる。この方法論の主な不利点は、関連ヒドロラーゼ（これらの大部分は、自然のリモデリングを受けるか、または炎症を起こす健康組織においても発現される）の多くの腫瘍特異性不足から生じる。さらに、所望のプロテアーゼの存在量は、腫瘍塊の間で変わり、一部の悪性病変で蛍光の緩徐または無活性化、および他で蛍光の急速な発生をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、罹患した標的組織に特異的に使用することができ、組織画像化のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に対して増大した安定性および輝度を有する色素物質の合成および精製に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本開示は、腫瘍およびリンパ節の標的画像化に使用される化合物にコンジュゲートしているアミノ酸連結基を合成する方法を提供する。
【００１７】
本発明の一実施形態では、本開示は、式
【化１】
0006270981.tif 000002
（式中、Ｘは、アミノ酸またはその誘導体であり、Ｙは、近赤外（ＮＩＲ）範囲に蛍光励起および発光スペクトルを有する色素である）を有し、色素の蛍光を維持または増強する化合物、もしくはその薬学的に許容されるその塩、またはそれらの同位体を合成する方法であって、ａ）（−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）および極性溶媒の存在下、プテリン誘導体化合物とアミノ酸を混合するステップ；ｂ１）強酸を添加することによって、沈殿物を形成するステップ；ｂ２）生成した沈殿物をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）溶媒に溶解することによって、懸濁液を形成するステップ；ｃ）カニューレを介して、懸濁液を定常流としてメチルターシャリー−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）またはジエチルエーテルに移すことによって、中間体化合物を沈殿させるステップ；ｄ）中間体化合物沈殿物をメチルターシャリー−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で濾過および洗浄するステップ；ｅ）高真空条件下で中間体化合物溶液を乾燥させるステップ；ｆ）生成した中間体化合物を水で懸濁させるステップ；ｇ）水性水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加することによって、ｐＨを調整するステップ；ｈ）油浴内または周辺温度で、水溶液を蛍光色素Ｙおよび水と混合することによって、生成した混合物を得るステップ；ｉ）生成した混合物を室温に冷却するステップ；ｊ１）生成した混合物を撹拌したアセトンに添加することによって、沈殿プテロイル−アミノ酸−蛍光色素化合物を得るステップ；ｊ２）アスピレーター真空下、アセトンで洗浄した焼結漏斗上で沈殿プテロイル−アミノ酸−蛍光色素を濾過するステップ、ならびにｋ）高真空条件下で沈殿プテロイル−アミノ酸−蛍光色素化合物を乾燥させるステップを含む方法に関する。化合物のアミノ酸は、チロシン、システイン、リシン、チロシンの誘導体、システインの誘導体およびリシンの誘導体からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、アミノ酸化合物はチロシンであり、より特定の実施形態では、アミノ酸化合物は、
【化２】
0006270981.tif 000003
からなる群から選択されるチロシンの誘導体およびそれらのラセミ混合物である。
【００１８】
さらに、化合物の色素Ｙは、式：
【化３】
0006270981.tif 000004
【００１９】
（式中、Ｘ’は、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＣＨ２からなる群から独立して選択され、Ｒ’は、ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２からなる群から独立して選択される）を有してもよい。特定の実施形態では、色素Ｙは、ＬＳ２８８、ＩＲ８００、ＳＰ０５４、Ｓ０１２１、ＫＯＤＡＫ  ＩＲＤ２８、Ｓ２０７６、Ｓ０４５６およびそれらの誘導体からなる群から選択される。
【００２０】
本実施形態に加えて、プテリン誘導体は、葉酸およびプテロイン酸からなる群から選択されてもよい。極性溶媒は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）であってよい。
【００２１】
本実施形態の方法は、ｌ）沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物を水に溶解することによって、化合物を再懸濁させるステップ；ｍ）コットンを通して、生成した懸濁液を濾過するステップ；ｎ）濾過した懸濁液を定常流としてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に添加するステップ；ｏ）上清をデカントするステップ；ｐ）残留懸濁液をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で希釈するステップ；ｑ）高真空条件下で希釈液を濾過するステップ；ｒ）固体をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトンで洗浄するステップ；ならびにｓ）精製したアミノ酸−蛍光色素化合物を乾燥させるステップを含む、化合物を精製する追加のステップをさらに含んでもよい。交互の実施形態では、本方法は、ｌ）沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を、調整剤で約５〜約１０のｐＨ範囲に緩衝した水に溶解するステップ；ｍ）緩衝した沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；ｎ）アセトニトリル、および約０％〜約５０％の範囲のアセトニトリルを含む緩衝液を含む勾配でカラムを溶出することによって、カラムを平衡化するステップ；ｏ）過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびにｐ）化合物の所望の画分を単離するステップを含む、化合物の減圧精製をさらに含んでもよい。別の交互の実施形態では、ステップｍ）の調整剤は、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、リン酸一ナトリウム、およびリン酸二ナトリウムからなる群から選択される。さらに別の交互の実施形態では、本方法は、ｌ）沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を水に溶解するステップ；ｍ）沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；ｎ）緩衝用水およびアセトニトリルを含む勾配でカラムを溶出するステップ；ｏ）過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびにｐ）化合物の所望の画分を単離するステップを含む、化合物の高圧精製をさらに含んでもよい。
【００２２】
本発明の第２の実施形態では、本開示は、式：
【化４】
0006270981.tif 000005
を有する化合物を合成する方法であって、ａ）（−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下でプテロイン酸とアミノ酸を混合するステップ；ｂ１）強酸を添加することによって、沈殿物を形成するステップ；ｂ２）生成した沈殿生成物をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）溶媒に溶解することによって、懸濁液を形成するステップ；ｃ）カニューレで定常流として懸濁液をメチルターシャリー−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）に移すことによって、Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒを沈殿させるステップ；ｄ）Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒ沈殿物をメチルターシャリー−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で濾過および洗浄するステップ；ｅ）高真空条件下でＰｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒ溶液を乾燥させるステップ；ｆ）生成したＰｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒを水で懸濁させるステップ；ｇ）水性水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加することによって、ｐＨを調整するステップ；ｈ）油浴内で、Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒ水溶液をＳ０４５６蛍光色素および水と混合することによって、生成した混合物を得るステップ；ｉ）生成した混合物を室温に冷却するステップ；ｊ）生成した混合物を撹拌したアセトンに添加することによって、プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を得るステップ；ｊ２）アスピレーター真空下で、アセトンで洗浄した焼結漏斗上でプテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を濾過するステップ、ならびにｋ）高真空条件下で、アセトンを伴うプテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を乾燥させるステップを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明のこの第２の実施形態では、化合物のアミノ酸は（Ｌ）−Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ・ＨＣｌである。
【００２４】
本実施形態でのステップは時系列で行うことができる。さらに、ステップｆ）およびｈ）を組み合わせてもよい。
【００２５】
本実施形態の方法は、ｌ）沈殿プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を水に溶解することによって、化合物を再懸濁させるステップ；ｍ）コットンを通して、生成した懸濁液を濾過するステップ；ｎ）濾過した懸濁液を定常流としてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に添加するステップ；ｏ）上清をデカントするステップ；ｐ）残留懸濁液をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で希釈するステップ；ｑ）高真空条件下で希釈液を濾過するステップ；ｒ）固体をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトンで洗浄するステップ；ならびにｓ）精製したプテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を乾燥させるステップを含む、プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を精製する追加のステップをさらに含んでもよい。交互の実施形態では、本方法は、ｌ）沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を、調整剤で約５〜約１０のｐＨ範囲に緩衝した水に溶解するステップ；ｍ）緩衝した沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；ｎ）アセトニトリル、および約０％〜約２０％アセトニトリルの緩衝液を含む勾配でカラムを溶出することによって、カラムを平衡化するステップ；ｏ）過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびにｐ）化合物の所望の画分を単離するステップを含む、化合物の減圧精製をさらに含んでもよい。別の交互の実施形態では、ステップｍ）の調整剤は、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、リン酸一ナトリウム、およびリン酸二ナトリウムからなる群から選択される。さらに別の交互の実施形態では、本方法は、ｌ）沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を水に溶解するステップ；ｍ）沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；ｎ）緩衝用水およびアセトニトリルを含む勾配でカラムを溶出するステップ；ｏ）過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびにｐ）化合物の所望の画分を単離するステップを含む、化合物の高圧精製をさらに含んでもよい。
【００２６】
本発明の第３の実施形態では、本開示は、式：
【化５】
0006270981.tif 000006
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、ＺはそれぞれＨ、Ｎａ、Ｋ＋またはＮＨ４＋である）を有する固相の化合物を合成するための方法であって、
ａ）固相ペプチド合成容器内で、ピペリジン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂を膨潤させるステップ；ｂ）（−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、Ｎ１０−（トリフルオロアセチル）プテロイン酸溶液を樹脂に添加するステップ；ｃ）樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で洗浄するステップ；ｄ）樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）で膨潤させるステップ；ｅ）樹脂をアルゴン下で乾燥させるステップ；ならびにｆ）高真空条件下で、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）を用いて、生成したＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒ化合物を樹脂から切断するステップ；ｇ）ＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒ沈殿物をＳ０４５６蛍光色素および水と混合することによって、懸濁液を形成するステップ；ｈ）水性の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を懸濁液に添加することによって、生成した混合物のｐＨを調整するステップ；ｉ）生成した混合物を室温に冷却するステップ；ｊ）生成した混合物を撹拌したアセトンにカニューレで導入することによって、プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を得るステップ；ならびにｋ）高真空条件下で、アセトンを伴うプテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を乾燥させるステップを含む方法を提供する。
【００２７】
本実施形態の方法は、：ｌ）沈殿プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を水に溶解することによって、化合物を再懸濁させるステップ；ｍ）コットンを通して、生成した懸濁液を濾過するステップ；ｎ）濾過した懸濁液を定常流としてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に添加するステップ；ｏ）上清をデカントするステップ；ｐ）残留懸濁液をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で希釈するステップ；ｑ）高真空条件下で希釈液を濾過するステップ；ｒ）固体をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトンで洗浄するステップ；ならびにｓ）精製したプテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を乾燥させるステップを含む、プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を精製する追加のステップをさらに含み得る。交互の実施形態では、本方法は、ｌ）沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を、調整剤で約５〜約１０のｐＨ範囲に緩衝した水に溶解するステップ；ｍ）緩衝した沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；ｎ）アセトニトリル、および約０％〜約２０％アセトニトリルの緩衝液を含む勾配でカラムを溶出することによって、カラムを平衡化するステップ；ｏ）過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびにｐ）化合物の所望の画分を単離するステップを含む、化合物の減圧精製をさらに含んでもよい。別の交互の実施形態では、ステップｍ）の調整剤は、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、リン酸一ナトリウム、およびリン酸二ナトリウムからなる群から選択される。さらに別の交互の実施形態では、本方法は、ｌ）沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を水に溶解するステップ；ｍ）沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；ｎ）緩衝用水およびアセトニトリルを含む勾配でカラムを溶出するステップ；ｏ）過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびにｐ）化合物の所望の画分を単離するステップを含む、化合物の高圧精製をさらに含んでもよい。
【００２８】
本発明の別の態様では、本開示は、式
【化６】
0006270981.tif 000007
を有する化合物を合成する方法を提供する。
【００２９】
本発明の第４の実施形態では、本開示は、式
【００３０】
【化７】
0006270981.tif 000008
（式中、Ｃ’は任意の炭素同位体である）を有する化合物を合成する方法を提供する。
【００３１】
本発明の第５の実施形態では、本開示は、式
【化８】
0006270981.tif 000009
【００３２】
（式中、Ｃ’は任意の炭素同位体である）を有する化合物を合成する方法を提供する。本実施形態では、アミノ酸リンカーは、メチル２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートアミノ−３−（４−フェニル）プロパノエート、３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカルボネートメチルアミノ）プロパン酸、２−アミノ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ブタン酸、およびＴｅｒｔ−ブチル（２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートアミノ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノエートからなる群から選択される。特定の実施形態では、水性塩基は水酸化カリウム（ＫＯＨ）である。本実施形態の方法はまた、分取ＨＰＬＣで化合物を精製することをさらに含んでもよい。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
式
【化５１】
0006270981.tif 000010
（式中：
Ｘは、アミノ酸またはその誘導体であり、
Ｙは、近赤外（ＮＩＲ）範囲に蛍光励起および発光スペクトルを有する色素である）を有し、該色素の蛍光を維持または増強する化合物もしくはその薬学的に許容される塩またはそれらの同位体を合成する方法であって、
ａ．（−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）および極性溶媒の存在下、プテリン誘導体化合物とＸを混合するステップ；
ｂ．生成した生成物をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）溶媒に添加することによって、懸濁液を形成するステップ；
ｃ．該懸濁液を、定常流として、メチルターシャリー−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）にカニューレで導入することによって、中間体化合物を沈殿させるステップ；
ｄ．該中間体化合物の沈殿物をメチルターシャリー−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で濾過および洗浄するステップ；
ｅ．高真空条件下で該中間体化合物の溶液を乾燥させるステップ；
ｆ．生成した該中間体化合物を水で懸濁させるステップ；
ｇ．水性水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加することによって、ｐＨを調整するステップ；
ｈ．油浴内において、水溶液をＹおよび水と混合することによって生成した混合物を得るステップ；
ｉ．該生成した混合物を室温に冷却するステップ；
ｊ．該生成した混合物を撹拌したアセトンに添加することによって、沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物を得るステップ；ならびに
ｋ．高真空条件下で該アミノ酸−蛍光色素化合物を沈殿させるステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記化合物の前記アミノ酸が、チロシン、システイン、リシン、チロシンの誘導体、システインの誘導体およびリシンの誘導体からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記化合物の前記アミノ酸がチロシンである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記化合物の前記アミノ酸誘導体が、
【化５２】
0006270981.tif 000011
からなる群から選択されるチロシンの誘導体およびそれらのラセミ混合物である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記化合物のＹが、式：
【化５３】
0006270981.tif 000012
（式中、
Ｒ１は、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＣからなる群から独立して選択され、
Ｒ２は、ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２からなる群から独立して選択される）を有する、項目１に記載の方法。
（項目６）
Ｙが、ＬＳ２８８、ＩＲ８００、ＳＰ０５４、Ｓ０１２１、ＫＯＤＡＫ、Ｓ２０７６、Ｓ０４５６およびそれらの誘導体からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記プテリン誘導体が、葉酸およびプテロイン酸からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記極性溶媒がジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記化合物を精製するステップをさらに含み、
ｌ．前記沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物を水に溶解することによって、該化合物を再懸濁させるステップ；
ｍ．コットンを通して、生成した懸濁液を濾過するステップ；
ｎ．濾過した該懸濁液を定常流としてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に添加するステップ；
ｏ．上清をデカントするステップ；
ｐ．残留懸濁液をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で希釈するステップ；
ｑ．高真空条件下で希釈液を濾過するステップ；
ｒ．固体をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトンで洗浄するステップ；ならびに
ｓ．精製した該アミノ酸−蛍光色素化合物を乾燥させるステップ
を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記化合物の減圧精製をさらに含み、
ｌ．前記沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を、調整剤で約５〜約１０のｐＨ範囲に緩衝した水に溶解するステップ；
ｍ．緩衝した沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；
ｎ．アセトニトリル、および約０％〜約２０％の範囲のアセトニトリルを含む緩衝液を含む勾配で該カラムを溶出することによって、該カラムを平衡化するステップ；
ｏ．過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびに
ｐ．該化合物の所望の画分を単離するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
ステップｌ）の前記調整剤が、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、リン酸一ナトリウム、およびリン酸二ナトリウムからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記化合物の高圧精製をさらに含み、
ｌ．前記沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を水に溶解するステップ；
ｍ．沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；
ｎ．緩衝用水およびアセトニトリルを含む勾配で該カラムを溶出するステップ；
ｏ．過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびに
ｐ．該化合物の所望の画分を単離するステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
式：
【化５４】
0006270981.tif 000013
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚは、それぞれＨ、Ｎａ、Ｋ＋またはＮＨ４＋である）を有する化合物を合成する方法であって、
ａ．（−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下でプテロイン酸とアミノ酸を混合するステップ；
ｂ．生成したＰｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒ生成物をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５）溶媒に添加することによって、懸濁液を形成するステップ；
ｃ．該懸濁液を定常流としてメチルターシャリー−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）にカニューレで導入することによって、Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒを沈殿させるステップ；
ｄ．Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒ沈殿物をメチルターシャリー−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で濾過および洗浄するステップ；
ｅ．高真空条件下でＰｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒ溶液を乾燥させるステップ；
ｆ．生成した該Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒを水で懸濁させるステップ；
ｇ．水性水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加することによって、ｐＨを調整するステップ；
ｈ．油浴内で、Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒ水溶液をＳ０４５６蛍光色素および水と混合することによって生成した混合物を得るステップ；
ｉ．該生成した混合物を室温に冷却するステップ；
ｊ．該生成した混合物を撹拌したアセトンに添加することによって、プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を得るステップ；ならびに
ｋ．高真空条件下で、アセトンを伴う該プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を乾燥させるステップを含む、方法。
（項目１４）
前記アミノ酸が（Ｌ）−Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ・ＨＣｌである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ステップが時系列で行われる、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
ステップｆとｈが組み合わせられる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を精製するステップをさらに含み、
ｌ．沈殿プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を水に溶解することによって、該化合物を再懸濁させるステップ；
ｍ．コットンを通して、生成した懸濁液を濾過するステップ；
ｎ．濾過した該懸濁液を定常流としてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に添加するステップ；
ｏ．上清をデカントするステップ；
ｐ．残留懸濁液をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で希釈するステップ；
ｑ．高真空条件下で希釈液を濾過するステップ；
ｒ．固体をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトンで洗浄するステップ；ならびに
ｓ．精製した該プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を乾燥させるステップを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記化合物の減圧精製をさらに含み、
ｌ．沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を、調整剤で約５〜約１０のｐＨ範囲に緩衝した水に溶解するステップ；
ｍ．緩衝した沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；
ｎ．アセトニトリル、および約０％〜約２０％の範囲のアセトニトリルを含む緩衝液を含む勾配で該カラムを溶出することによって、該カラムを平衡化するステップ；
ｏ．過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；および
ｐ．該化合物の所望の画分を単離するステップを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
ステップｌ）の前記調整剤が、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、リン酸一ナトリウム、およびリン酸二ナトリウムからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記化合物の高圧精製をさらに含み、
ｌ．沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を水に溶解するステップ；
ｍ．沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；
ｎ．緩衝した水およびアセトニトリルを含む勾配で該カラムを溶出するステップ；
ｏ．過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびに
ｐ．該化合物の所望の画分を単離するステップを含む、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
式：
【化５５】
0006270981.tif 000014
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚは、それぞれＨ、Ｎａ、Ｋ＋またはＮＨ４＋である）を有する固相の化合物を合成する方法であって、
ａ．固相ペプチド合成容器内で、ピペリジン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂を膨潤させるステップ；
ｂ．（−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）存在下で、Ｎ１０−（トリフルオロアセチル）プテロイン酸の溶液を該樹脂に添加するステップ；
ｃ．該樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で洗浄するステップ；
ｄ．該樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）で膨潤させるステップ；
ｅ．該樹脂をアルゴン下で乾燥させるステップ；
ｆ．高真空条件下で、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）を用いて、生成したＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒ化合物を該樹脂から切断するステップ；
ｇ．ＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒ沈殿物をＳ０４５６蛍光色素および水と混合することによって、懸濁液を形成するステップ；
ｈ．水性の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を該懸濁液に添加することによって、生成した混合物のｐＨを調整するステップ；
ｉ．該生成した混合物を室温に冷却するステップ；
ｊ．該生成した混合物を撹拌したアセトンにカニューレで導入することによって、プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を得るステップ；ならびに
ｋ．高真空条件下で、アセトンを伴う該プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を乾燥させるステップを含む、方法。
（項目２２）
前記プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を精製するステップをさらに含み、
ｌ．沈殿プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を水に溶解することによって、該化合物を再懸濁させるステップ；
ｍ．コットンを通して、生成した懸濁液を濾過するステップ；
ｎ．濾過した該懸濁液を定常流としてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に添加するステップ；
ｏ．上清をデカントするステップ；
ｐ．残留懸濁液をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で希釈するステップ；
ｑ．高真空条件下で希釈液を濾過するステップ；
ｒ．固体をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）およびアセトンで洗浄するステップ；ならびに
ｓ．精製した該プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物を乾燥させるステップを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記化合物の減圧精製をさらに含み、
ｌ．沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を、調整剤で約５〜約１０のｐＨ範囲に緩衝した水に溶解するステップ；
ｍ．緩衝した沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；
ｎ．アセトニトリル、および約０％〜約２０％の範囲のアセトニトリルを含む緩衝液を含む勾配で該カラムを溶出することによって、該カラムを平衡化するステップ；
ｏ．過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびに
ｐ．該化合物の所望の画分を単離するステップを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
ステップｌ）の前記調整剤が、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、リン酸一ナトリウム、およびリン酸二ナトリウムからなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記化合物の高圧精製をさらに含み、
ｌ．沈殿アミノ酸−蛍光色素化合物の粗生成物を水に溶解するステップ；
ｍ．沈殿溶液をカラムに負荷するステップ；
ｎ．緩衝用水およびアセトニトリルを含む勾配で該カラムを溶出するステップ；
ｏ．過剰の緩衝水溶液を除去するステップ；ならびに
ｐ．該化合物の所望の画分を単離するステップを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
式
【化５６】
0006270981.tif 000015
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺはそれぞれ、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋であり、
Ｃ’は、炭素の任意の同位体である）を有する化合物を合成する方法であって、
ａ．（−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、Ｎ１０ＴＦＡ−プテロイン酸の溶液を、アミノ酸リンカーのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に混合するステップ；
ｂ．懸濁液を定常流として水性ＨＣｌにカニューレで導入することによって、中間体化合物を沈殿させるステップ；
ｃ．アスピレーター真空条件下、中間体沈殿物を水で濾過および洗浄することによって、ｐＨを調整するステップ；
ｄ．高真空条件下、該中間体沈殿物を乾燥させるステップ；
ｅ．生成した該沈殿物をＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）溶液中に懸濁させるステップ；
ｆ．懸濁液を定常流として、ジエチルエーテルにカニューレで導入することによって、プテロイン酸−アミノ酸リンカー化合物を沈殿させるステップ；
ｇ．アスピレーター真空条件下、プテロイン酸−アミノ酸リンカー沈殿物をジエチルエーテルで濾過および洗浄するステップ；
ｈ．高真空条件下、該プテロイン酸−アミノ酸リンカー沈殿物を乾燥させるステップ；
ｉ．該プテロイン酸−アミノ酸リンカー沈殿物を水に懸濁させるステップ；
ｊ．水性の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加することによって、ｐＨを調整するステップ；
ｋ．油浴内で、プテロイン酸−アミノ酸リンカー水溶液をＳ０４５６蛍光色素および水と混合することによって生成した混合物を得るステップ；
ｌ．該生成した混合物を室温に冷却するステップ；
ｍ．該生成した混合物を撹拌したアセトンに添加することによって、プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物の類似体を得るステップ；ならびに
ｎ．高真空条件下、アセトンを伴う該プテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６化合物の類似体を乾燥させるステップを含む、方法。
（項目２７）
ステップａ）の前記アミノ酸リンカーが、１３Ｃ９（Ｌ）−Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ、１４Ｃ９（Ｌ）−Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ、および（Ｌ）−Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
式：
【化５７】
0006270981.tif 000016
（式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺはそれぞれ、Ｈ、Ｎａ、またはＮＨ４＋であり、
Ｃ’は炭素の任意の同位体である）を有する化合物を合成する方法であって、
ａ．アミノ酸リンカーをジクロロメタン（ＤＣＭ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と混合することによって、溶液を得るステップ；
ｂ．該溶液を油へ濃縮するステップ；
ｃ．該油をクロロホルム（ＣＨＣｌ３）で再濃縮するステップ；
ｄ．プテロイン酸、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびＨＡＴＵの溶液を、該クロロホルム、油、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の溶液と混合するステップ；
ｅ．生成した混合物をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で希釈するステップ；
ｆ．高真空条件下、該混合物を濾過することによって、沈殿物を収集するステップ；
ｇ．該沈殿物を酢酸エチルおよびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で洗浄するステップ；
ｈ．該沈殿物を水と混合するステップ；
ｉ．水性塩基を該沈殿物の混合物に添加するステップ；ならびに
ｊ．該水性塩基−沈殿物の混合物をＳ０４５６蛍光色素および水の溶液と混合するステップを含む、方法。
（項目２９）
ステップａ）の前記アミノ酸リンカーが、メチル２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートアミノ−３−（４−フェニル）プロパノエート、３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカルボネートメチルアミノ）プロパン酸、２−アミノ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ブタン酸、およびｔｅｒｔ−ブチル（２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートアミノ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノエートからなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
ステップｉ）の前記水性塩基が水酸化カリウム（ＫＯＨ）である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記化合物を分取ＨＰＬＣで精製するステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。
【００３３】
前の記述は、以下に続く発明の詳細な説明をより良く理解できるように、本発明の特徴および技術的利点をむしろ幅広く概説したものである。本発明の追加の特徴および利点は本明細書で記載されることになり、これが本発明の特許請求の範囲の主題を形成する。当業者であれば、本明細書で開示されている任意の概念および特定の実施形態が、本発明と同じ目的を実行するための他の構造の修正または設計のベースとして容易に利用され得ることを理解すべきである。当業者であればまた、このような同等の構造体は、添付の特許請求の範囲に記述された本発明の趣旨および範囲から逸脱しないことも理解すべきである。その組織および操作方法の両方について本発明の特徴であると考えられる新規の特徴は、さらなる目的および利点と共に添付の図に関連して考慮された場合、以下の記載からより良く理解されることになる。しかし、任意の記載、図、実施例などは、例示および記載の目的のみのために提供されており、本発明の限界を定義することを決して意図するものではないことは、明示により理解されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６  ＮＩＲ色素（ＯＴＬ−００３８）化合物の論理的根拠である。４つの有利な官能基：ａ＝標的分子としてのプテリン誘導体；ｂ＝葉酸受容体に対する結合親和性を改善するためのチロシン；ｃ＝蛍光強度（輝度）を増強するためのチロシン由来のフェノール系部分；ｄ＝近ＩＲ蛍光性プローブを有するプテロイル−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６の化学構造。したがって、チロシンは、リガンド、リンカー、および近ＩＲ色素の一部として作用する。言い換えると、チロシンは、リガンド（プテリン誘導体）の結合親和性および特異性を改善するリンカーである。チロシンはまた、ＮＩＲ色素の輝度を増強する。
【００３５】
【図２】図２は、葉酸受容体に対するＯＴＬ−００３８、ＯＴＬ−００３９、および葉酸の相対結合親和性を示す。
【００３６】
図２Ａは、葉酸受容体に対する各化合物結合曲線を示すプロットである。
【００３７】
図２Ｂは、３種すべての化合物の結合親和性および相対結合親和性を例証する表である。
【００３８】
【図３】図３は、１０ｎｍｏｌのＰｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６を注射したマウスの全身蛍光画像およびｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体分布を示している。
【００３９】
図３Ａは、１０ｎｍｏｌの葉酸受容体標的ＮＩＲ化合物の静脈内注射２時間後のＫＢ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスの蛍光画像を例証している（蛍光画像と白色光画像のオーバーレイ）。
【００４０】
図３Ｂは、前に画像化した図３Ａのマウスの組織の収集後の、化合物のｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体分布を例証している
【００４１】
【図４−１】図４は、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と第２世代葉酸−ＮＩＲ化合物との直接比較を示している。
【図４−２】図４は、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と第２世代葉酸−ＮＩＲ化合物との直接比較を示している。
【図４−３】図４は、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と第２世代葉酸−ＮＩＲ化合物との直接比較を示している。
【図４−４】図４は、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と第２世代葉酸−ＮＩＲ化合物との直接比較を示している。
【００４２】
図４Ａは、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と第２世代葉酸−ＮＩＲ化合物との直接比較の全身蛍光画像を例証している。
【００４３】
図４Ｂは、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と葉酸−エチレンジアミン架橋−ＮＩＲコンジュゲートの直接比較を例証する、ｅｘ  ｖｉｖｏ組織生体分布を示している。解剖した（薄片化）腫瘍は、腫瘍中の標的造影剤の均一な取り込みを示した。
【００４４】
図４Ｃは、ヌードマウスへのコンジュゲート（１０ｎｍｏｌ）の投与２時間後の腫瘍および腎臓画像を示しており、Ｐｔｅ−Ｌ−Ｔｒｙ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）と葉酸−エチレンジアミン架橋−ＮＩＲコンジュゲートの直接比較を例証している。解剖した（薄片化）腫瘍は、腫瘍中の標的造影剤の均一な取り込みを示している。
【００４５】
図４Ｄは、葉酸−ＥＤＡ−ＬＳ２８８（ＯＴＬ−０００１）を例証している。
【００４６】
図４Ｅは、葉酸−ＥＤＡ−ＩＲ８００（ＯＴＬ−０００２）を例証している。
【００４７】
図４Ｆは、葉酸−ＥＤＡ−ＺＷ８００（ＯＴＬ−０００３）を例証している。
【００４８】
【図５】図５は、１ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８（正常な用量の１／１０）を注射したＫＢ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスの全身蛍光画像化を例証している。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息で安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウエア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎを用いて、全身画像化実験を行った。
【００４９】
【図６】図６は、葉酸受容体に対して陰性の腫瘍異種移植片（Ａ５４９腫瘍異種移植片）を有するマウスの全身蛍光画像を示す。１０ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８投与２．５時間後に全身画像化を行った。
【００５０】
【図７】図７は、葉酸受容体陰性腫瘍異種移植片（Ａ５４９腫瘍異種移植片）および葉酸受容体陽性腎臓によるＯＴＬ−００３８の侵襲性腫瘍および腎臓取り込みを例証している。注射２．５時間後にデータ分析を行った。
【００５１】
【図８−１】図８は、粗製のＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒ（０〜５０Ｂ  ｐＨ７）のＴＦＡ−プテロイル−Ｔｙｒ  ＬＣＭＳの固相合成を例証している。
【図８−２】図８は、粗製のＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒ（０〜５０Ｂ  ｐＨ７）のＴＦＡ−プテロイル−Ｔｙｒ  ＬＣＭＳの固相合成を例証している。
【００５２】
【図９】図９は、画像化化合物の固相合成に対する２ステップ反応概略図を示している。
【００５３】
【図１０】図１０は、ＯＴＬ−００３８に対するカップリング反応の分取クロマトグラムプロファイルを示している。
【００５４】
【図１１】図１１は、ＬＣ／ＭＳからのクロマトグラムおよび質量スペクトルならびに精製したＯＴＬ−００３８のＵＶプロファイルを示している。
【００５５】
【図１２Ａ】図１２は、ＬＣ／ＭＳによる（Ａ）Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）および（Ｂ）葉酸−ＥＤＡ−ＩＲ８００ＣＷの反応進行のモニタリングを例証している。
【図１２Ｂ】図１２は、ＬＣ／ＭＳによる（Ａ）Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）および（Ｂ）葉酸−ＥＤＡ−ＩＲ８００ＣＷの反応進行のモニタリングを例証している。
【００５６】
図１２Ａは、ＬＣ／ＭＳによるＰｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の反応進行のモニタリングを例証している。
【００５７】
図１２Ｂは、ＬＣ／ＭＳによる（Ｂ）葉酸−ＥＤＡ−ＩＲ８００ＣＷの反応進行のモニタリングを例証している。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
いくつかの基準が、近赤外色素を含む化合物の調製で考慮された。合成の容易さおよび化学的安定性は、主要な化学的特質である。スペクトル特性、例えば、吸収および発光スペクトルならびに量子収率が考慮された。いくつかの生物学的特性、たとえば、細胞研究における結合親和性、腫瘍を有するマウスを使用する全身動物画像化、および生体内分布が評価された。具体的には生体内分布の場合、口腔内分布につき２時間後の死亡マウス、ライブのマウス画像化および用量増加を含めた、いくつかの態様が考慮された。最後に、最大耐量（ＭＴＤ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、および一般臨床病理学分析を含めた、安全上の考慮が取り上げられた。
【００５９】
本開示は、安定であり、赤外範囲で蛍光を発光し、標的組織内に深く侵入して、葉酸受容体を発現する組織の領域の特異的で明るい特定をもたらす近赤外色素のプテロイルコンジュゲートを提供する。より具体的には、プテロイル化合物は、アミノ酸リンカーを介して近赤外色素に連結されている。さらにより具体的には、アミノ酸リンカーがチロシンまたはチロシンの誘導体である場合に、色素の蛍光の強度は維持され、またはさらには増強されることが見出された。
【００６０】
好ましい実施形態において、このようなプテロイル化合物は、組織内の腫瘍細胞に特異的に標的化することが本明細書で示される。さらに、蛍光の強度は、葉酸受容体陽性腫瘍に対して葉酸塩によって標的化される他の近赤外色素で以前に観察された強度よりも大きい。この強度の増加は、モニターされる組織からの生物試料の比較的小さい領域（例えば、比較的小さい腫瘍）の標的化するおよび明瞭な特定を可能にする。さらに、本開示の化合物の強度の増加は、色素のより低い用量／量が投与され得、なお意味ある結果をもたらすという追加された利点を与える。したがって、本開示の化合物は、より経済的な画像化技術をもたらす。さらに、慣用の画像化化合物と比較してより低い用量の本開示の化合物は、身体への異物の投与に伴う毒性および他の副作用を最小限にするという追加された利点がある。
【００６１】
さらに、小さい腫瘍の特定は、原発腫瘍のより正確で、より有効な切除をもたらし、陰性断端、ならびに転移性がん細胞を持つリンパ節の正確な特定および除去、ならびにサテライト疾患の特定を生じさせる。これらの利点のそれぞれは、処置される患者にとってのより良い臨床転帰と正に相関する。
【００６２】
具体的な実験において、リンカーとしてチロシン以外のアミノ酸の使用は、近赤外蛍光の消失を生じることがわかった。例えば、スキームＩの検討を参照されたい。具体的には、合成経路が、ＮＩＲ特性を有さない主な生成物として望ましくない副生成物４をもたらすことに留意されたい。
【００６３】
しかしながら、チロシンおよびチロシン誘導体に加えて、近赤外色素とシステインまたはシステイン誘導体とのプテロイル化合物も有用であり得ることが企図される。さらに、アミンリンカーを介した、プテロイルもしくは葉酸部分の色素への直接連結、または色素のプテロイン酸もしくは葉酸への連結も、化合物からの蛍光の強度の消失を生じさせる一方で、プテロイル（標的化部分）と近赤外色素（蛍光性部分）との間の連結部分としてのチロシンまたはチロシン誘導体の存在は、コンジュゲーテッド化合物の蛍光を維持または増強するために有利であることが企図される。本開示のチロシンベース化合物は、Ｓ０４５６を混合させる余分なアミンリンカーを必要とせず、チロシンのフェノール部分を介したコンジュゲーションのために蛍光の増強をもたらす。
【００６４】
本化合物は、蛍光媒介分子断層撮影画像化システム、例えば、深部組織における近赤外蛍光活性化を検出するように設計されたものによって使用され得る。本化合物は、分子および組織特異性を与え、高い蛍光コントラスト、より明るい蛍光信号を生じさせ、バックグラウンドの自己蛍光を減少させ、ｉｎ  ｖｉｖｏ疾患組織（例えば、がん）の改善された早期検出および分子標的評価を可能にする。本化合物は、深部組織三次元画像化標的手術、および生物試料中の標的細胞型の量を定量化する方法に使用され得る。
【００６５】
一態様において、本開示は、式、すなわち、式（Ｉ）：
【化９】
0006270981.tif 000017
【００６６】
（式中：
【００６７】
Ｘは、アミノ酸またはその誘導体であり、
【００６８】
Ｙは、近赤外範囲に蛍光励起および発光スペクトルを有する色素である）
を含み、Ｙの蛍光を維持または増強する化合物に関する。
【００６９】
一部の実施形態において、アミノ酸またはアミノ酸誘導体は、未修飾色素分子の電子スペクトルに対して、電子発光スペクトル、電子吸収スペクトル、または電子発光と吸収の両方のスペクトルでシフトを誘発する。好適には、電子スペクトルでのシフトは、深色シフト（すなわち、より長い波長／より低い周波数へのシフト）であり、これは、近赤外（ＮＩＲ）スペクトル枠における化合物の検出を改善し、および／またはバックグラウンド信号の量、自己蛍光、可視化される領域の周りの組織からの干渉を減少させるのを助ける。より具体的には、電子スペクトルにおけるこのシフトは、６員環に組み込まれている電気陰性原子を含むＮＩＲ色素で特に観察される。したがって、ある特定の実施形態において、アミノ酸またはアミノ酸（Ｘ）誘導体は、例えば、酸素、硫黄、または窒素などの電子豊富部分を含む。このようなアミノ酸の非限定的な例としては、システイン、メチオニン、トレオニン、セリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン、またはそれらの誘導体を挙げることができる。
【００７０】
この態様の実施形態において、本開示は、式Ｉ（ａ）、式Ｉ（ｂ）、式Ｉ（ｃ）、および式Ｉ（ｄ）：
【化１０】
0006270981.tif 000018
【００７１】
（式中、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓ基は、それぞれ、チロシン、システイン、セリン、およびリシンアミノ酸残基、またはそれらの誘導体を示し、Ｌは、好ましくはプテロイルまたは葉酸塩であり、Ｒｘはそれぞれ、任意選択で非存在である独立して選択された可溶化基を含む）
の化合物を提供する。
【００７２】
本態様の実施形態では、本開示は、式Ｉ（ａ１）、Ｉ（ｂ１）、Ｉ（ｃ１）、およびＩ（ｄ１）の化合物を提供する：
【化１１】
0006270981.tif 000019
【化１２】
0006270981.tif 000020
【００７３】
（式中、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓ基は、チロシン、システイン、セリン、およびリシンアミノ酸残基、またはそれらの誘導体をそれぞれ示し、Ｌは好ましくはプテロイルまたは葉酸である）。好ましくは、Ｌはプテロイルである。
【００７４】
特定の好ましい実施形態では、本開示は、式Ｉ（ａ）の化合物（式中、Ｔｙｒは、
【化１３】
0006270981.tif 000021
ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される）を提供する。
【００７５】
好適には、本明細書で開示される化合物は、約６５０ｎｍから１０００ｎｍの間の近赤外領域に、例えば、好ましくはおよそ８００ｎｍに最大光吸収波長を有する。
【００７６】
具体的な好ましい実施形態において、本明細書で開示される化合物は、特定の細胞または組織型に対して化合物を標的化するのに有効であるリガンド（Ｌ）を含み、その標的細胞または組織の画像化を可能にする。Ｌが、プテロイル部分または葉酸塩部分のいずれかであることが好ましく、Ｌがプテロイル部分であることがより好ましい。しかしながら、当業者は、特定の細胞表面タンパク質または目的の受容体タンパク質に対して化合物を標的化する何らかの他のリガンドを使用し得ることが企図される。具体的で、好ましい実施形態において、リガンドは、プテロイル：
【化１４】
0006270981.tif 000022
を含む。
【００７７】
化合物の合成
【００７８】
本明細書で開示される化合物は、文献で公知の慣用方法を使用して作製され得る。例えば、色素化合物は、以前に報告されたとおりに合成されたことを理解されたい。
【００７９】
しかしながら、具体的な好ましい実施形態において、本開示は、本明細書で開示される化合物（すなわち、式Ｉの化合物）を生成するためのより効率的な合成方法を提供する。例えば、式Ｉ（ａ）〜式Ｉ（ｄ）を有する化合物は、以下のスキームＩ、ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれで概略された一般スキームに従って調製され得る。
【００８０】
スキームＩは、標的リガンドがプテリン誘導体、例えば、葉酸またはプテロイン酸などを含む、式Ｉの化合物を生成するためにこれまで使用された合成スキームを例証している。標的リガンドがアミノ酸（リシン）を介して色素分子に連結している葉酸を含む式Ｉの化合物が特にスキームＩに例証されている。簡潔には、アミノ酸のアミノ基への付着によって修飾された葉酸リガンドは、生成物（３）および（４）を生成する条件下で色素の架橋エーテル誘導体と反応させる。しかしながら、化合物３は好ましく、望ましい化合物であるが、その合成経路は、ＮＩＲ特性を有さない、主要生成物として望ましくない副生成物４の存在をもたらすことが注目に値する。さらに、そのスペクトル特性は、ｐＨ依存性である。したがって、このスキームは、エーテル架橋色素の主たる欠点を実証する。これらの色素の慣用の生産では、収量の３０〜６０％は望ましい生成物のものであるが、一方で収量の４０〜７０％は望ましくない副生成物のものである。
【化１５】
0006270981.tif 000023
【００８１】
スキームＩＩは、単に３つの反応ステップを含み、高収率（９８％超）で生成物化合物（５）を与える合成経路を提供する。簡潔には、標的化リガンド（１）（プテロイル基とともにスキームＩＩで例証される）と、アミノ酸のアミノ基以外の基との望ましくない反応性を回避するために保護基を任意選択で含むアミノ酸またはアミノ酸誘導体（２）とは、ＨＡＴＵ［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）］／ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）／ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒系中で混合され、室温で、リガンド（１）へのアミノ官能基を介した（２）のカップリングを可能にするのに十分な時間（５分間）反応させて、（３）を得る。化合物（３）は、希酸を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの他の溶媒を含む反応混合物に添加することによって有利に沈殿させることができる。より具体的には、化合物３は、１Ｎ  ＨＣｌ（塩酸）中で沈殿させて、９８％超の純度の最終化合物を得、これらの実施形態において、費用のかかるＨＰＬＣまたはカラムクロマトグラフィーのステップは回避される。化合物をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）：水：ＴＩＰＳ（トリイソプロピルシラン）溶媒系中室温で反応させることによって、化合物のアミノ酸部分で保護基を除去するために化合物（３）を反応させて、化合物（４）を得る。化合物４を、ジエチルエーテルまたはメチル−ｔ−ブチルエーテルで沈殿させることによって精製して、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）またはカラムクロマトグラフィーなしに９８％超の純度を得た。保護基官能性を除去するために化合物（４）を塩基性水系（例えば、ＮａＯＨ、水酸化ナトリウム）中で反応させ、その後、水中わずかにモル過剰で色素（Ｓ０４５６）と、８０〜１００℃の温度で１５分間反応させて、色素と（４）との間のカップリングを可能にして、最終化合物（５）を得る。化合物５をアセトンで沈殿させて、９８％超の純粋なＰｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６を得た。ＮａＯＨが使用される場合、Ｐｔｅ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６のナトリウム塩が生成される。
【化１６】
0006270981.tif 000024
【００８２】
スキームＩＩＩは、本明細書で開示される化合物を生成するための代替の固相合成経路を提供し、スキームＩＩに記載されたものと同様の収率を与える。簡潔には、基質（１）に結合したアミノ酸（樹脂ビーズに付着した保護チロシンとして以下のスキームＩＩＩで例証される）を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン中反応させて、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基を除去し、その後、アミノ酸のアミン官能基にリガンドをカップリングさせるために十分な時間および温度でＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ中標的化リガンド（以下のプテロイルによりやはり例証される）と反応させて、（２）を与える。化合物（２）を、ＴＦＡ：水：ＴＩＰＳ溶媒系中一連の反応で基質およびアミノ酸上の任意の保護基を除去するために反応させて、（３）を与える。スキームＩＩに記載されたのと同様の最終ステップに続いて、化合物（３）を、保護基官能基を除去するために塩基性水溶液系で反応させ、その後、色素と（３）の間のカップリングを可能にする時間および温度で水中わずかにモル過剰で色素（Ｓ０４５６）と反応させて、最終化合物（４）を生成する。
【化１７】
0006270981.tif 000025
【００８３】
上記スキームは、本明細書で開示される化合物が調製され得るいくつかの非限定的な合成手法を単に例証する。当業者は、上記スキームに、本開示の範囲内である物理的特性を有する他の化合物を与える変更を特定し、組み込むことができることが理解される。例えば、上記スキームは、本明細書で開示されている化合物の標的リガンドとして葉酸およびプテロイル基を例証しているが、当業者であれば、他の標的リガンドを合成スキームに容易に組み込むことができ、図１および６に示されているような、ＰＴＥ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）などの式Ｉの代替の化合物を生成することができることを十分理解されたい。別の例として、当業者は、ポリメチン鎖の長さを調整すること、および適当なアリールまたはヘテロアリール基（例えば、インドール対ベンゾインドール）を選択すること、ならびにアミノ酸基を連結することによって、化合物の色素部分の吸収／発光波長が調節され得ることを理解する。さらなる例において、当業者は、当技術分野で一般に公知のようにポリメチン鎖の剛直を調整することによって（例えば、とりわけ、シクロヘキセン、シクロブテノンなどの環系をポリメチン鎖中に導入することによって）、色素の吸光係数および蛍光強度を変え得ることを理解する。したがって、当業者は、本明細書で開示される化合物のいずれかを作製するために適当な試薬を選択することによって、合成を変更することができ、および任意選択で化合物の特定の物理的特性を変えることができる。
【００８４】
様々な変化が、本開示において、その精神および範囲から逸脱することなしになされてもよく、したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲に示されたものだけでなく、本明細書に具体的に開示されたものに加えて実施形態を包含することが、当業者に明らかである。
【００８５】
以下に続く実施例は、本開示の特定の実施形態の例証のためだけに与えられ、添付の特許請求の範囲に対して限定的であることは意図されない。本明細書で検討されたように、本開示化合物および方法の特定の特徴は、操作性またはそれらが与える利点に必要でない様々な仕方で変更することができる。例えば、本化合物は、本化合物が用いられる特定の用途に応じて種々のアミノ酸およびアミノ酸誘導体ならびに標的化リガンドを組み込むことができる。当業者は、このような変更が添付の特許請求の範囲内に包含されることを理解する。
【実施例】
【００８６】
（実施例）
【００８７】
（実施例１）：Ｐｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の一般的合成
【００８８】
【化１８】
0006270981.tif 000026
【化１９】
0006270981.tif 000027
【００８９】
５００ｍＬ丸底フラスコに、撹拌子、プテロイン酸（１２．０ｇ、２９．４０ｍｍｏｌ、１当量）、（Ｌ）−Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（１１．６３ｇ、３５．２８ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＨＡＴＵ（１３．４５ｇ、３５．２８ｍｍｏｌ、１．２当量）を仕込み、次いでＤＭＦ（１４７ｍＬ）を添加することによって、茶色懸濁液［懸濁液Ａ］を得た。２３℃で５分間にわたり、ＤＩＰＥＡ（２０．４８ｍＬ、１１７．６２ｍｍｏｌ、４．０当量）を懸濁液Ａにゆっくりと添加した。ＤＩＰＥＡの添加の１０分間以内に懸濁液は透明な茶色の溶液になった。反応物を２３℃で２．５時間撹拌した。反応は、ＬＣ／ＭＳで判定されたように、３０分間で本質的に完了したが、さらに２．５時間撹拌した。ｍ／ｚ４０９→ｍ／ｚ６８４を示すＬＣ／ＭＳでＰｔｅ＿Ｎ１０（ＴＦＡ）＿Ｌ＿Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（図１２）の形成を確認した。ＬＣ／ＭＳ法：２０ｍＭ水性ＮＨ４ＯＡｃ中０〜５０％アセトニトリル、５分間、Ａｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ  ２．１×５０ｍｍカラムを使用。反応混合物は、３０分間にわたり、定常流として、ＨＣｌ（２．０Ｌ、０．２８Ｍ）の撹拌水溶液にカニューレを挿入することによって、Ｐｔｅ＿Ｎ１０（ＴＦＡ）＿Ｌ＿Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ・ＨＣｌの淡黄色の沈殿物を得た。アスピレーター真空下、焼結漏斗を用いて沈殿Ｐｔｅ＿Ｎ１０（ＴＦＡ）＿Ｌ＿Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ・ＨＣｌを濾過し、濾液のｐＨが３〜４の間になるまで、水で洗浄した（８×３００ｍＬ）。焼結漏斗上で、高真空下で１２時間湿った固体を乾燥させた。別個のバッチにおいて、この湿った固体（３）真空下で４８時間を乾燥させ、次いでこの固体を−２０℃で４８時間保存した。しかし、この短期保存は、３つの部分的劣化をもたらした。湿ったケーキ（５８ｇ）を５００ｍＬ丸底フラスコに移し、さらなる乾燥または精製なしに次のステップに供した。
【化２０】
0006270981.tif 000028
【００９０】
５００ｍＬ丸底フラスコに、撹拌子、Ｐｔｅ＿Ｎ１０（ＴＦＡ）＿Ｌ＿Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（５８ｇ、２９．４０ｍｍｏｌ，１当量）を湿ったケーキとして仕込んだ。ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５、２００ｍＬ）の溶液を一度に添加することによって、淡褐色懸濁液を得た。反応の内容物を２３℃で１．５時間撹拌し、ＬＣ／ＭＳでモニターした。５分間撹拌後、懸濁液は、透明な光沢のない茶色の溶液になった。ＬＣ／ＭＳ方法：２０ｍＭの水性ＮＨ４ＯＡｃ中０〜５０％アセトニトリル、５分間、Ａｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ  ２．１×５０ｍｍカラムを使用。ｍ／ｚ６８４→ｍ／ｚ５７２を示すことで、Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒ（図１２）の形成を確認した。反応時間は、Ｐｔｅ＿Ｎ１０（ＴＦＡ）＿Ｌ＿Ｔｙｒ（−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ・ＨＣｌの含水量に応じて、３０分から１．５時間まで異なる。反応混合物は、定常流として、２３℃または１００℃で、撹拌したＭＴＢＥ（１．８Ｌ）にカニューレで導入することによって、Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒの淡黄色の沈殿物を得た。アスピレーター真空下、焼結漏斗を用いて、沈殿Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒを濾過し、ＭＴＢＥ（６×３００ｍＬ）で洗浄し、高真空下で８時間乾燥させることによって、薄黄色の固体として、Ｐｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒを得た（２ステップにわたり、１４．９８ｇ、８３．９８％）。湿ったｐＨ紙（ｐＨ３〜４の間）を利用して、残留ＴＦＡの不在についてＭＴＢＥ洗浄物を試験した。反応物の収率は異なるバッチにおいて８０〜８５％の間であった。脱アシル化した副生物は、ＬＣ／ＭＳで判定した場合、３．６％として検出した。異なるバッチに対して、この不純物は、決して５％を超えなかった。
【化２１】
0006270981.tif 000029
【００９１】
２００ｍＬ丸底フラスコに、撹拌子およびＰｔｅ＿ＴＦＡ＿Ｌ＿Ｔｙｒ（１３．８５ｇ、２２．７８ｍｍｏｌ、１当量）を仕込み、次いで水（９５ｍＬ）を添加することによって、黄色の懸濁液を得た［懸濁液Ｂ］。調製したばかりの３．７５ＭのＮａＯＨ（２６．１２ｍＬ、９７．９６ｍｍｏｌ、４．３０当量）水溶液、または対応する温度での同等の塩基を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を溶媒として使用して（表１に示されている通り）、２３℃で、懸濁液Ｂに滴下添加することによって、１５分間にわたって、透明な光沢のない黄色の溶液を得た［溶液Ｂ］。ＮａＯＨの当量は、４種の供給源（固体または液相合成）および残留ＴＦＡに応じて、３．３から５．０に変化した。ｍ／ｚ５７２→ｍ／ｚ４７６を示しているＬＣ／ＭＳによってトリアニオン５の形成を確認した（図１２）一方で、湿ったｐＨ紙を利用した溶液ｐＨは９〜１０であった。反応混合物のｐＨは９〜１０の範囲であった。このｐＨは、全体的な反応の完了に対して重大である。とりわけ、１０より上のｐＨはＳ０４５６の加水分解をもたらす。過剰塩基は、Ｓ０４５６の潜在的な加水分解により反応を効率的に前進させる。生成物による加水分解の存在は、持続性の不透明な紫色／青色から赤色／茶色により目視により検出することができる。
【表１】
0006270981.tif 000030
【００９２】
沈殿したＯＴＬ−００３８生成物もまた、反応液をアセトン、アセトニトリル、イソプロパノールまたは酢酸エチル／アセトン混合物へ規則的に滴下添加することにより、崩壊させることができる。アセトンは、最適な結果をもたらす。しかし、粘性反応は、部分的不溶性および／またはＳ０４５６からの崩壊により遅い可能性があった。この反応では、水性塩基の当量が重要であった。過剰の塩基は、Ｓ０４５６の潜在的な加水分解により、反応を効率的に前進させる。この溶液相の合成は、Ｐｔｅ＿Ｎ１０（ＴＦＡ）＿Ｔｙｒ−ＯＨ・ＨＣｌ塩を提供し、生成物を加水分解するための供給源としておよそ４．１〜およそ４．８当量の塩基が望まれる。特に、１ｍＬの反応混合物が撹拌したアセトン（２０ｍＬ）中に滴下添加された場合、最良の沈殿Ｐｔｅ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６が達成された。沈殿物の濾過およびアセトン（３×１０ｍＬ）で洗浄により、ＬＣ／ＭＳクロマトグラムで判定された場合の最大の純度が得られた。
【００９３】
Ｐｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の異なる段階でのこの溶液相合成の試験中、一部の最適化された条件が認められた：
【化２２】
0006270981.tif 000031
【化２３】
0006270981.tif 000032
【化２４】
0006270981.tif 000033
液体分析：４０℃において、液体は、２７０ｎｍで８．６％および７７４ｎｍで１％喪失した。室温において、液体は、２７０ｎｍで１．４％および７７４ｎｍで０．５％喪失した。５℃において、２７０ｎｍでは安定し、７７４ｎｍではかなり安定しているようにみえ、小さな純度の劣化があった。
【化２５】
0006270981.tif 000034
【００９４】
（実施例４）：ＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒの固体相の合成
【化２６】
0006270981.tif 000035
【化２７】
0006270981.tif 000036
作業：
【００９５】
１ｇおよび５ｇスケールの樹脂（負荷量０．５６ｍｅｑ／ｇ）上でＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒの固相合成を行った。様々なパラメーター、例えば、洗浄時間、洗浄体積、洗浄液の体積、および試薬のイソプロパノール洗浄液同等物の存在または不在、ならびに沈殿用エーテルの量および／または温度などに対して反応を最適化した。
【００９６】
固相ペプチド合成容器を使用して、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂（５ｇ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）で膨張させる。デカントした後、ＤＭＦ（５０ｍＬ）を用いて膨潤手順を繰返す。ＤＭＦ（５０ｍＬ）中２０％ピペリジン（５ｍＬ）を樹脂に添加し、Ａｒ２ガスを５分間バブリングする。２回繰り返し、次いで樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（２×５０ｍＬ）で洗浄する。Ｋａｉｓｅｒ試験により遊離アミンの形成を評価する（試験は青色となるべき）。
【００９７】
樹脂をＤＭＦ中で再び膨張させる。Ｎ１０ＴＦＡ−プテロイン酸（１．３７１ｇ、１．２当量）、ＨＡＴＵ（２．１２９ｇ、２当量）、およびＤＩＰＥＡ（１．９５ｍｌ、４当量）のＤＭＦ中溶液を添加する。Ｎ２ガスを４時間バブリングし、樹脂をＤＭＦ（３×５０ｍｌ）およびｉ−ＰｒＯＨ（２×５０ｍＬ）で洗浄する。Ｋａｉｓｅｒ試験を使用してカップリング効率を評価する（青色がないことは、Ｎ１０ＴＦＡ−プテロイン酸の負荷の完了を意味する）。樹脂をＤＣＭ（５０ｍＬ）で膨張させ、アルゴン下で乾燥させる。
【００９８】
３ｍＬのＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）カクテル（３×２５ｍＬ、４５分）を使用して樹脂から最終化合物を切断し、真空下で濃縮する。Ｓ０４５６への精製およびカップリングは、実施例１５のステップＩＩＩと同様に行ってよい。様々なバッチに対するＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒの収率は、６８〜８３％の範囲であり、純度は６３〜９１％であった。
【００９９】
（実施例５）：ＴＦＡ−プテロイル＿Ｔｙｒ固相沈殿物を使用したＰｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の合成
【０１００】
５００ｍＬ丸底フラスコに、撹拌子、固相合成由来のＰｔｅ＿Ｎ１０（ＴＦＡ）＿Ｔｙｒ−ＯＨ（５ｇ、１．２当量）、Ｓ０４５６（２０．６３ｇ、２１．６４ｍｍｏｌ、１．０当量）を仕込み、次いで水（１８０ｍＬ、０．０３Ｍ）を添加して、懸濁液を得た。Ｓ０４５６蛍光色素は、水性塩基を用いた別のトリアニオン形成を介して、脱保護前または後のいずれかにＰｔｅ＿Ｎ１０（ＴＦＡ）＿Ｔｙｒ−ＯＨに添加し、依然として同等に実行可能な生成物をもたらすことができる。調製したばかりの３．７５ＭのＮａＯＨ（２６．１２ｍＬ、９７．９６ｍｍｏｌ、３．０当量）の水溶液、または対応する温度（表１に示されている通り）での同等の塩基を、懸濁液に８０℃で滴下添加し、３時間にわたり透明な光沢のない黄色の溶液を得た。反応混合物のｐＨは９〜１０の範囲であった。このｐＨは全体的な反応の完了に対して重大である。とりわけ、１０を超えるｐＨはＳ０４５６の加水分解をもたらす。生成物による加水分解の存在は、持続性の不透明な紫色／青色から赤色／茶色により目視により検出できる。反応をＬＣ／ＭＳでモニターした。ＬＣ／ＭＳ方法：２０ｍＭの水性ＮＨ４ＯＡｃ中０〜５０％アセトニトリル、５分間、Ａｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ  ２．１×５０ｍｍカラムを使用。ＯＴＬ−００３８の形成を、ｍ／ｚ４７６→ｍ／ｚ１３２６およびｍ／ｚ６６４を示すＬＣ／ＭＳで確認した（図１６Ａ）。反応混合物を室温に冷却し、次いで、カニューレを介して、定常流として撹拌したアセトン（５．５Ｌ）に移すことによって、緑色の沈殿物を得た。沈殿したＯＴＬ−００３８を、アスピレーター真空下、アセトンで洗浄した（３×１０ｍＬ）焼結漏斗上で濾過した。緑色の粉状固体を高真空下で１２時間乾燥させることによって、９２．８％純度で定量的にＯＴＬ−００３８（３１ｇ）を得た。最終生成物中の追加の塊は、残留ＮａＣｌ、ＣＦ３ＣＯＯＮａ、ＮａＯＨおよび水に起因し得る。この塩は脱塩カラムを使用して除去することができる。代わりに、Ｐｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）生成物を精製し、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法で収集した（８７％変換を生じた）。精製は、実施例１５の方法と同様に行ってもよい。
【０１０１】
沈殿したＯＴＬ−００３８生成物はまた、反応液をアセトン、アセトニトリル、イソプロパノールまたは酢酸エチル／アセトン混合物（このうちアセトンが最も良い結果をもたらすことになる）に規則的に滴下添加することによって崩壊させることができる。しかし、粘性反応物は、部分的不溶性および／またはＳ０４５６からの崩壊により、さらに遅くなる可能性がある。この反応において、当量の水性塩基が重大となる。過剰の塩基は、潜在的なＳ０４５６の加水分解により、反応を効率的に進めることになる。普通、副生物なしのきれいな反応に対して３．３当量の塩基で十分である。この固相合成からＰｔｅ＿Ｎ１０（ＴＦＡ）＿Ｔｙｒ−ＯＨが得られる（生成物を加水分解するための重大な供給源として３．３当量の塩基が必要）。特に、Ｐｔｅ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６の沈殿は、１ｍＬの反応混合物を撹拌したアセトン（２０ｍＬ）に滴加した場合、最も良く達成される。沈殿物の濾過およびアセトン（３×１０ｍＬ）での洗浄により、ＬＣ／ＭＳクロマトグラムで判定された最も高い純度が得られた。
【０１０２】
異なる段階でのＰｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の固相合成の試験中、いくつかの最適化された条件が認められた：
【化２８】
0006270981.tif 000037
【化２９】
0006270981.tif 000038
【化３０】
0006270981.tif 000039
凍結乾燥分析：４０℃において、凍結乾燥した生成物は、２７０ｎｍで４．５％および７７４ｎｍで１．１％喪失した；室温において、凍結乾燥した生成物は、１カ月目は安定しており、最初の１カ月間、室温未満で安定していた。
【０１０３】
以下の実施例は、いくつかの類似体アミノ酸リンカーのＰｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６への合成を例証している。
【０１０４】
（実施例６）：Ｐｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６の１３Ｃ類似体（ＯＴＬ−００４０）の合成
【化３１】
0006270981.tif 000040
【０１０５】
ステップＩ：Ｐｔｅ＿Ｎ１０−ＴＦＡ＿１３Ｃ９＿Ｌ−Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（８）の調製
【化３２】
0006270981.tif 000041
【０１０６】
ステップＩＩ：Ｐｔｅ＿１３Ｃ９＿Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＨ（９）の調製
【化３３】
0006270981.tif 000042
【０１０７】
ステップＩＩＩ：Ｐｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６の１３Ｃ類似体（ＯＴＬ−００４０）（１１）の調製
【化３４】
0006270981.tif 000043
【０１０８】
（実施例７）：Ｐｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６の１４Ｃ類似体（ＯＴＬ−００４１）の合成
【０１０９】
ステップＩ：Ｐｔｅ＿Ｎ１０−ＴＦＡ＿１４Ｃ９＿Ｌ−Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（１３）の調製
【化３５】
0006270981.tif 000044
【０１１０】
ステップＩＩ：Ｐｔｅ＿１４Ｃ９＿Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＨ（１４）の調製
【化３６】
0006270981.tif 000045
【０１１１】
ステップＩＩＩ：Ｐｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６の１４Ｃ類似体（ＯＴＬ−００４１）（１６）の調製
【化３７】
0006270981.tif 000046
【０１１２】
（実施例８）：Ｐｔｅ−Ｌチロシン−Ｓ０４５６の２Ｈ類似体（ＯＴＬ−００４２）の合成
【０１１３】
ステップＩ：（Ｓ）−６−（（Ｎ−（４−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−１−オキソ−３−（２，３，５，６−テトラジュウテロ−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）フェニル）プロパン−２−イル）カルバモイル）フェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド）メチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−２−アミニウムクロリド（３）の調製
【化３８】
0006270981.tif 000047
【０１１４】
ステップＩＩ：（Ｓ）−６−（（Ｎ−（４−（（１−（ヒドロキシ）−１−オキソ−３−（２，３，５，６−テトラジュウテロ−４−（ヒドロキシ）フェニル）プロパン−２−イル）カルバモイル）フェニル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド）メチル）−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−２−アミニウムクロリド（４）の調製
【化３９】
0006270981.tif 000048
【０１１５】
ステップＩＩＩ：ＯＴＬ−００４２（６）の調製
【化４０】
0006270981.tif 000049
１０ｍＬ丸底フラスコに、撹拌子および（４）（３４６ｍｇ、０．６０１ｍｍｏｌ、１当量）を仕込み、次いで水（６ｍＬ）を添加することによって、黄色の懸濁液を得た［懸濁液Ａ］。調製したばかりの３．７５ＭのＮａＯＨ（０．６８９ｍＬ、２．５８４ｍｍｏｌ、４．３０当量）の水溶液を懸濁液Ａに２３℃で滴下添加することによって、１５分間にわたり透明な光沢のない黄色の溶液を得た［溶液Ｂ］。トリアニオン５の形成をＬＣ／ＭＳで確認した一方で、湿ったｐＨ紙を利用した溶液ｐＨは９〜１０であった。２５ｍＬ丸底フラスコに、撹拌子およびＳ０４５６（５７３ｍｇ、０．６０１ｍｍｏｌ、１．０当量）を仕込み、次いで水（３ｍｌ）を添加することによって、不透明な緑色の溶液を得た［溶液Ｃ］。溶液Ｃを含有するフラスコを１０５℃油浴に挿入し、１５分間撹拌し、次いで溶液Ｂを５分間にわたり滴下添加した。内容物を４０分間撹拌した。反応をＬＣ／ＭＳでモニターした。反応混合物を室温に冷却し、次いで、カニューレを介して定常流として、撹拌したアセトン（２００ｍＬ）に移すことによって、緑色の沈殿物を得た。アスピレーター真空下、アセトン（３×５０ｍＬ）で洗浄した焼結漏斗上で沈殿物（６）を濾過した。緑色の粉状の固体を高真空下で１２時間乾燥させることによって、（６）（ＯＴＬ−００４２）を定量的に得、これをＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
【０１１６】
（実施例９）：Ｐｔｅ＿Ｔｙｒ（ＯＭｅ）＿Ｓ０４５６の合成
【０１１７】
ステップＩ：以下の概略図に示されているようなメチル２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートアミノ−３−（４−フェニル）プロパノエート（１）の調製およびＢｏｃ脱保護：
【化４１】
0006270981.tif 000050
【０１１８】
ステップＩＩ：メチル２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートアミノ−３−（４−フェニル）プロパノエートのプテロイン酸へのコンジュゲーション
【化４２】
0006270981.tif 000051
【０１１９】
ステップＩＩＩ：Ｐｔｅ＿Ｔｙｒ（ＯＭｅ）＿Ｓ０４５６の合成
【０１２０】
（実施例１０）：Ｐｔｅ＿Ｎ（Ｍｅ）Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６の合成
【０１２１】
ステップＩ：Ｔｙｒ（ＢｏｃＮＭｅ）（６）の調製およびＢｏｃ脱保護
【化４３】
0006270981.tif 000052
【０１２２】
ステップＩＩ：Ｔｙｒ（ＮＭｅ）のプテロイン酸へのコンジュゲーション
【化４４】
0006270981.tif 000053
【０１２３】
ステップＩＩＩ：Ｐｔｅ＿Ｔｙｒ（ＮＭｅ）＿Ｓ０４５６の合成
【０１２４】
（実施例１１）：Ｐｔｅ＿（Ｈｏｍｏ）Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６の合成
【０１２５】
ステップＩ：Ｔｙｒ（ＨＮＢｏｃ）（６）の調製およびＢｏｃ脱保護
【化４５】
0006270981.tif 000054
【０１２６】
ステップＩＩ：２−アミノ−４−（４−ヒドロキシフェニル）ブタン酸のプテロイン酸へのコンジュゲーション
【化４６】
0006270981.tif 000055
【０１２７】
ステップＩＩＩ：Ｐｔｅ＿（Ｈｏｍｏ）Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６の合成
【０１２８】
（実施例１２）：プテロイル−ＬＴｙｒ−Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００４５）の合成
【０１２９】
ステップＩＩ：Ｔｙｒ（ＮＮＨ２）−ＮＨＯＣＨ３のプテロイン酸へのコンジュゲーション
【化４７】
0006270981.tif 000056
【０１３０】
ステップＩＩＩ：Ｐｔｅ＿（Ｈｏｍｏ）Ｔｙｒ（ＮＨＮＨ）＿Ｓ０４５６の合成
【０１３１】
（実施例１３）：Ｐｔｅ＿Ｔｙｒ（ＯＢｎ）＿Ｓ０４５６の合成
【０１３２】
ステップＩ：Ｔｅｒｔ−ブチル（２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートアミノ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノエート（１７）の調製およびＢｏｃ脱保護
【化４８】
0006270981.tif 000057
【０１３３】
ステップＩＩ：Ｔｅｒｔ−ブチル（２−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノエートのプテロイン酸へのコンジュゲーション
【化４９】
0006270981.tif 000058
【０１３４】
ステップＩＩＩ：Ｐｔｅ＿Ｔｙｒ（ＯＢｎ）＿Ｓ０４５６の合成
【０１３５】
（実施例１４）：Ｐｔｅ＿Ｔｙｒ（ＯＮａ）＿Ｓ０４５６からのＰｔｅ＿Ｔｙｒ（ＯＢｎ）＿Ｓ０４５６の合成
【化５０】
0006270981.tif 000059
【０１３６】
（実施例１５）：Ｐｔｅ＿Ｌ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の精製：
【０１３７】
Ｐｔｅ＿Ｌ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）（３１ｇ）を水（２５０ｍＬ）に溶解し、３０分間撹拌した。この濃緑色の不透明な溶液を、コットンを通して濾過し、フラスコおよびコットンを水（５０ｍＬ）ですすぎ洗いした。次いで、この溶液を定常流として、３０分間にわたって撹拌したＩＰＡ（３．０Ｌ）に添加した。沈殿した緑色の固体を１時間沈降させた。有色の（オレンジ色／茶色）上清をデカントし（約２．５Ｌ）、残留懸濁液を３００ｍＬのＩＰＡで希釈し、アスピレーター真空下で、焼結漏斗を介して濾過した。固体をＩＰＡ（２×３００ｍＬ）およびアセトン（２×３００ｍＬ）で洗浄した。部分的に乾燥した固体を２５０ｍＬのＲＢフラスコに移し、高真空下で２４時間乾燥させることによって、３０．３ｇのＰｔｅ＿Ｌ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）を純度９２．９８％で得た。（図１２）。
【０１３８】
（実施例１６）：Ｐｔｅ＿Ｌ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の再精製
【０１３９】
Ｐｔｅ＿Ｌ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）（３０．３ｇ）を水（２５０ｍＬ）に溶解し、３０分間撹拌した。この濃緑色の不透明な溶液を、コットンを通して濾過し、フラスコおよびコットンを水（５０ｍｌ）ですすぎ洗いした。次いで、この溶液を定常流として、３０分間にわたって撹拌したＩＰＡ（３．７Ｌ）に添加した。沈殿した緑色の固体を２時間沈降させた。沈殿した固体の沈降はこの時点で認められなかった。アセトン（１Ｌ）を添加し、溶液を−２０℃で１５時間保存した。濃緑色の上清をデカントし（約４Ｌ）、残留懸濁液をアセトン（５００ｍＬ）で希釈し、アスピレーター真空下、焼結漏斗を介して濾過した。濾過は、沈殿した固体が微粒子サイズであったため、極めて遅かった。固体をアセトン（３×３００ｍＬ）で洗浄した。部分的に乾燥した固体を２５０ｍＬのＲＢフラスコに移し、高真空下で、１８時間乾燥させることによって、２６．３ｇのＰｔｅ＿Ｌ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）を純度９６．９％で得た。先にデカントした上清を、アスピレーター真空下で別々に濾過し、アセトン（３×８０ｍＬ）で洗浄し、高真空下、１５時間乾燥させることによって、３．５ｇのＰｔｅ＿Ｌ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）を得た。（図１、５および２１）
【０１４０】
（実施例１７）：Ｐｔｅ＿Ｌ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の減圧精製
【０１４１】
実施例１など、上に記載されているような粗生成物を、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、リン酸一ナトリウム、またはリン酸二ナトリウムなどの調整剤で約５〜約１０のｐＨ範囲に緩衝した水に溶解した。溶液をカラムに負荷し、０％アセトニトリル〜２０％アセトニトリルの割合を含む、アセトニトリルおよび緩衝液で構成される勾配を用いて溶出した。完了時には、カラムは緩衝液で平衡化されている。
【０１４２】
粗生成物もまた緩衝水溶液に負荷してもよく、次いで水、水／アセトニトリル０％〜２０％で溶出し、それに続いて生成物を溶出し、その後、水および緩衝液を用いた平衡化した。
【０１４３】
所望の画分は、これらに限定されないが回転蒸発、凍結乾燥および落下フィルム蒸発を含めた通常の技法による過剰の水の除去を介して単離した。受け入れ基準を満たしていない画分は上記精製を使用して再利用することができる。
【０１４４】
（実施例１８）：Ｐｔｅ＿Ｌ＿Ｔｙｒ＿Ｓ０４５６（ＯＴＬ−００３８）の高圧精製
粗生成物を水（９：１）に溶解し１．４ｋｇＣ４  １０ミクロン（またはＣ１８までの結合段階）カラム上に注入する（すなわちおよそ５〜およそ１０グラム）。緩衝した水（ｐＨ６．５の１０μｍリン酸ナトリウム）およびアセトニトリルを含む勾配０〜５０％を使用して生成物を溶出する。所望の画分は、これらに限定されないが、回転蒸発、凍結乾燥および落下フィルム蒸発を含めた、当技術分野で十分に開発された技法による過剰の水の除去を介して単離する。受け入れ基準を満たしていない画分は、同じ精製方法を使用して再利用することができる。単離した画分は、上記に概説されている低圧精製技法に従い脱塩する。
【０１４５】
（実施例１９）：ＯＴＬ−００３８およびＯＴＬ−００３９（ＯＴＬ−００３８のＤ−異性体）のｉｎ  ｖｉｔｒｏの薬品作用研究
【０１４６】
２種のリガンド−ＮＩＲ化合物を開発し、ＯＴＬ−００３８およびＯＴＬ−００３９と命名した。ＯＴＬ−００３８化合物は、リガンドであるプテロイルがＬ−チロシンにコンジュゲートしており、これがＳ０４５６に連結しているＰＴＥ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６を指す。ＯＴＬ−００３９はＯＴＬ−００３８のＤ−異性体である。両化合物の葉酸受容体に対する結合親和性および結合特異性を、葉酸受容体に対するリガンド化合物である葉酸と比較して調査した。
Ａ．材料および方法
【０１４７】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０１４８】
ＦＲ−αを過剰発現するＫＢ細胞を、２４−ウェル（１００，０００個細胞／ウェル）Ｆａｌｃｏｎプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）に播種し、１２時間にわたって単層を形成させた。各ウェルの使用済みの培地を、新鮮培地（０．５ｍＬ）中増加する濃度（０．１ｎＭ〜１μΜ）のＯＴＬ−００３９（Ｄ−異性体）およびＯＴＬ−００３８（Ｌ−異性体）、または葉酸（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ）の存在下１０ｎＭの［３Ｈ］−葉酸（トリチウム標識した葉酸）と合わせた。３７℃で１時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（３×０．５ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）ですすぎ洗いして、任意の未結合放射性物質のすべてを除去した。０．２５Ｍ水酸化ナトリウム（０．５ｍＬ）を添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、細胞をＥｃｏｌｉｔｅシンチレーションカクテル（３．０ｍＬ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ）を含有する個別のシンチレーションバイアル中に移し、液体シンチレーション分析器（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４を用いて、細胞結合放射能（％）を試験品の対数濃度に対してプロットして、相対結合親和性を計算した。
Ｂ．結果
【０１４９】
ＯＴＬ−００３９、ＯＴＬ−００３８、または葉酸に対して、研究から導かれた解離定数（ＫＤ）を計算すると、それぞれ８１．８ｎＭ、１０．４ｎＭ、および７．４ｎＭであった。相対結合親和性は、ＯＴＬ−００３９、ＯＴＬ−００３８、および葉酸に対して、それぞれ０．０９、０．７１、および１と計算された。すべての３種の試験品は、定量的に［３Ｈ］−葉酸と競合した。
【０１５０】
相対結合親和性とは、細胞上の葉酸受容体に結合している［３Ｈ］−葉酸の５０％を置き換えるのに必要とされる化合物のモル比と定義される；葉酸の相対親和性＝１；相対親和性＜１は、葉酸受容体に対してより弱い親和性を示す；相対親和性＞１は、葉酸受容体に対してより強い結合を示す。
Ｃ．結論
【０１５１】
ＯＴＬ−００３８は、葉酸受容体に対して親和性を有し、葉酸の結合親和性と十分同程度の親和性を有する（１０．４ｎＭ対７．４ｎＭ）。他方では、ＯＴＬ−００３９は、葉酸およびＯＴＬ−００３８と比較した場合、葉酸受容体に対してより低い親和性を有する。ＯＴＬ−００３８は、［３Ｈ］−葉酸と十分競合し、これは、葉酸受容体が、がん細胞上で唯一のＯＴＬ−００３８結合部位を構成し、それが葉酸受容体に対して極めて特異的であることを示している。
【０１５２】
（実施例２１）：葉酸受容体−陽腫瘍異種移植を有するマウスにおけるＯＴＬ−００３８およびＯＴＬ−００３９（ＯＴＬ−００３８のＤ−異性体）の全身画像化および生体分布
【０１５３】
ＯＴＬ−００３８（ＰＴＥ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）およびＯＴＬ−００３９（ＰＴＥ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｓ０４５６）の葉酸受容体陽性腫瘍取り込みを調べることによって、腫瘍上の標的受容体により両化合物がいかにうまく取り込まれるか判定した。化合物の組織生体分布もまた調べた。化合物の静脈内投与後、マウスにおいて両特性を２時間半調べた。
Ａ．材料および方法
細胞培養および動物の準備
【０１５４】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭の細胞株）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０１５５】
無胸腺雌ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（５週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後、研究を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
全身画像化
【０１５６】
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸塩不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向に腫瘍の増殖を測定した（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の体積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が体積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（５匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８またはＯＴＬ−００３９を静脈内注射した。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウエア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、全身画像化（無傷腫瘍）実験を行った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（インドシアニングリーン）；落射照明；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
組織生体分布
【０１５７】
全身画像化に続いて、動物を切開し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を用いて蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ；落射照明；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
Ｂ．結果
全身画像化
【０１５８】
ＯＴＬ−００３８は、葉酸受容体陽性腫瘍において主に蓄積したが、他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。
組織生体分布
【０１５９】
組織生体分布の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出して、ＩＶＩＳ撮像装置を用いて画像化することによって、全身画像化を施した同じ動物に対して行った。最大の蛍光強度が、ＦＲ陽性腫瘍で認められ、腎臓を除く他の組織には蓄積されていなかった。ＯＴＬ−００３８の腎臓取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルの葉酸受容体を発現することが公知であったので、予期された。さらに、プローブが、それらの低分子量および半減期（大部分の葉酸化合物は＜３０分の半減期を有する）のために、腎臓を通って排泄されることが可能である。
Ｃ．結論
【０１６０】
ＯＴＬ−００３８は葉酸受容体陽腫瘍異種移植および腎臓に主に蓄積した。他のすべての正常な組織は、最小のレベルまたは取り込みなしを示し、結果として優れた腫瘍と正常な組織との蛍光比をもたらした。
【０１６１】
（実施例２３）：ＯＴＬ−００３８（Ｌ−異性体）と、葉酸由来の近ＩＲ薬剤との比較分析
【０１６２】
ＯＴＬ−００３８の全身画像化および組織生体分布を、葉酸−ＬＳ２８８、葉酸−ＩＲ８００、および葉酸−ＺＷ８００と比較した。それらの化合物を、葉酸および市販の近赤外線の色素、ＬＳ２８８、ＩＲ８００、およびＺＷ８００とコンジュゲートした。
Ａ．材料および方法
細胞培養物およびマウスの準備
【０１６３】
ＫＢ細胞（ヒト鼻咽頭細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する葉酸塩不含１６４０ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０１６４】
無胸腺雌ヌードマウス（５週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、ガンマ照射した葉酸欠乏特別食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で少なくとも２週間維持し、その後研究を開始した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
全身画像化
【０１６５】
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＫＢ細胞（葉酸塩不含ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向に腫瘍の増殖を測定した（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の体積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が体積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（２匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌの試験品（ＯＴＬ−００３８、葉酸−ＬＳ２８８、葉酸−ＩＲ８００、葉酸−ＺＷ８００）を静脈内注射した。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウエア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、全身画像化（無傷腫瘍）実験を行った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（インドシアニングリーン）；落射照明；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
組織生体分布
【０１６６】
全身画像化に続いて、動物を切開し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を用いて蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ；落射照明；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
Ｂ．結果
全身画像化
【０１６７】
図５に見られるように、ＯＴＬ−００３８（Ｌ−異性体）、葉酸−ＬＳ２８８、葉酸−ＩＲ８００、葉酸−ＺＷ８００は葉酸受容体陽性腫瘍に主に蓄積したが、他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。さらに、直接的比較は、ＯＴＬ−００３８注射マウスの腫瘍蛍光強度が他の葉酸コンジュゲーテッド近ＩＲ色素で処置したマウスよりも明るい（より高い）ことを実証した（図６）。
組織生体分布
【０１６８】
組織生体分布の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出し、ＩＶＩＳ撮像装置を用いてそれらを画像化することによって、全身画像化を施した同じ動物に対して行った。図７に見られるように、最大の蛍光強度が、ＦＲ陽性腫瘍および腎臓で認められた。腎臓取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルの葉酸受容体を発現することが公知であったので、予期された。さらに、プローブが、それらの低い分子量および半減期（大部分の葉酸化合物は＜３０分の半減期を有する）のために、腎臓を通って排泄されることが可能である。
Ｃ．結論
【０１６９】
腫瘍蓄積蛍光強度において、ＯＴＬ−００３８は、葉酸−ＬＳ２８８、葉酸−ＩＲ８００、および葉酸−ＺＷ８００と比べて有利な態様を有する。ＯＴＬ−００３８は、ＬＳ２８８、ＩＲ８００、およびＺＷ８００などの他の市販の近ＩＲ色素よりも明るくなり得る。
【０１７０】
（実施例２４）：葉酸受容体−陰性腫瘍異種移植片を有するマウスにおけるＯＴＬ−００３８の全身画像化および生体分布
【０１７１】
ＯＴＬ−００３８のｉｎ  ｖｉｖｏでの特異性を決定するために、葉酸受容体に対して全身画像化および組織生体分布を行った。実験では、葉酸受容体に対して陰性である腫瘍を抱えるマウスを使用して、葉酸受容体に対するＯＴＬ−０３８化合物の特異性を特徴づけた。
Ａ．材料および方法
細胞培養物およびマウスの準備
【０１７２】
Ａ５４９細胞（肺胞基底上皮癌細胞株）をＡｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、少なくとも６継代の間５％二酸化炭素：９５％空気−加湿雰囲気中３７℃で、１０％加熱不活性ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＡ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＮＹ）を含有する１６４０ＲＰＭＩ培地を用いて単層として増殖させ、その後、それらをアッセイに使用した。
【０１７３】
無胸腺雌ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（６週齢、１８〜２０ｇ）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、正常な食餌（Ｔｅｋｌａｄ、ＷＩ）で維持した。無菌の覆い隠したラックの障壁中５匹／ケージで動物を飼った。オートクレーブした水道水および餌を必要に応じて与えた。研究期間中標準的な１２時間明暗サイクルで無菌環境において動物を飼った。耳パンチによりマウスを個別に識別した。動物手順のすべては、Ｐｕｒｄｕｅ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。動物のケアおよび研究は、動物の人道的処置についての国および国際ガイドラインに従って行った。
全身画像化
【０１７４】
７週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに、肩上にＡ５４９細胞（ＲＰＭＩ１６４０培地中１．０×１０６個／マウス）を皮下接種した。キャリパを用いて２日毎に垂直方向に腫瘍の増殖を測定し（体重は、同じスケジュールでモニターした）、腫瘍の体積を０．５×Ｌ×Ｗ２（ミリメートルで、Ｌ＝最長軸であり、Ｗ＝Ｌに垂直な軸である）として計算した。腫瘍が体積で４００〜５００ｍｍ３に達すると直ちに、動物（６匹のマウス／群）に、リン酸緩衝生理食塩水（１００μＬ）中１０ｎｍｏｌのＯＴＬ−００３８を静脈内注射した。２．５時間後、動物をＣＯ２窒息で屠殺した。次いで、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウエア付きのＣａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ、ＭＡ）を用いて、全身画像化（無傷腫瘍）実験を行った。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ（インドシアニングリーン）；落射照明；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
組織生体分布
【０１７５】
全身画像化に続いて、動物を切開し、前の通りのＩＶＩＳ撮像装置を用いて蛍光活性について、選択した組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、大腸、筋肉、皮膚、腫瘍）を分析した。画像化のための設定：ランプレベル：中；励起：７４５ｎｍ；発光：ＩＣＧ；落射照明；ビニング：４（Ｍ）、ＦＯＶ＝１２．５；ｆ−ｓｔｏｐ＝２；捕捉時間＝１秒。
Ｂ．結果
全身画像化
【０１７６】
図５に見られるように、ＯＴＬ−００３８は、葉酸受容体陰性腫瘍において蓄積せず、腎臓を除く他の組織において実質的な蛍光活性はなかった。
侵襲性の腫瘍および腎臓取り込み
【０１７７】
腫瘍および腎臓蓄積の分析は、各マウスを安楽死させ、それらの臓器を取り出して、ＩＶＩＳ撮像装置を用いて画像化することによって、全身画像化を施した同じ動物に対して行った。発明者らが予期したように、葉酸受容体陰性腫瘍中に蛍光は認められず、高い腎臓取り込みが存在した。腎臓取り込みは、腎臓の近位尿細管の頂端膜が高いレベルのＦＲを発現することが公知であったので、予想された。さらに、プローブが、それらの低い分子量および半減期（大部分の葉酸化合物は＜３０分の半減期を有する）のために、腎臓を通って排泄されることが可能である。
Ｃ．結論
【０１７８】
ＯＴＬ−００３８は、葉酸受容体に対して極めて特異的である。
【図１】
0006270981.tif 000092
【図２】
0006270981.tif 000093
【図３】
0006270981.tif 000094
【図４−１】
0006270981.tif 000095
【図４−２】
0006270981.tif 000096
【図４−３】
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【図４−４】
0006270981.tif 000098
【図５】
0006270981.tif 000099
【図６】
0006270981.tif 000100
【図７】
0006270981.tif 000101
【図８−１】
0006270981.tif 000102
【図８−２】
0006270981.tif 000103
【図９】
0006270981.tif 000104
【図１０】
0006270981.tif 000105
【図１１】
0006270981.tif 000106
【図１２Ａ】
0006270981.tif 000107
【図１２Ｂ】
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