(57)【要約】【課題】本発明の一側面は、反復した定置洗浄サイクルに耐えることが可能な、新規なクロマトグラフィーマトリックスを提供することである。【解決手段】  本発明はスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）由来のドメインＣ、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含むクロマトグラフィーリガンドに関する。クロマトグラフィーリガンドは過酷な定置洗浄（ＣＩＰ）条件に耐える好都合なキャパシティーを提示し、そして抗体のＦａｂフラグメントを結合することが可能である。リガンドはアルギニンまたはシステインのような末端カップリング基を提供されて、ビーズまたは膜のような不溶性キャリアへのカップリングを促進してもよい。本発明は、抗体の単離においてリガンドを使用するプロセス、ならびにアルカリによる洗浄ステップおよび／または再生を含んでいてもよい精製プロトコルに関する。【選択図】図１
2010504754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）由来の１つ以上のドメインＣユニット、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、実質的にアルカリに安定なクロマトグラフィーリガンド。
【請求項２】
０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で５時間インキュベーション後に、本来の結合キャパシティーの少なくとも９５％を保持している、請求項１に記載のリガンド。
【請求項３】
抗体のＦａｂ部分への結合が可能である、請求項１または２に記載のリガンド。
【請求項４】
ドメインＣ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１によって定義されるアミノ酸配列に対応する、先の請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項５】
ドメインＣ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２によって定義されるアミノ酸配列に対応する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項６】
末端カップリング基を付加的に含み、該基が好ましくは少なくとも１つの窒素および／またはイオウ原子を含む、先の請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項７】
末端基がアルギニンまたはシステインを含む、請求項６に記載のリガンド。
【請求項８】
少なくとも２つのドメインＣユニット、または少なくとも２つのその機能的フラグメントもしくは変異体を含む、請求項１〜７のいずれか１項に定義された多量体型クロマトグラフィーリガンド。
【請求項９】
少なくとも２つのドメインＣユニット、または少なくとも２つのその機能的フラグメントもしくは変異体に加え、さらに好ましくはアルカリに安定である１つ以上の他のタンパク質を基礎にしたユニットを含む、請求項８に記載のリガンド。
【請求項１０】
場合によりリンカーセグメントを介してカップリングする２〜８個のドメインＣユニットを含む、請求項８に記載のリガンド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項で定義されたリガンドをコードする核酸配列。
【請求項１２】
請求項１１に定義された核酸配列を含む発現系。
【請求項１３】
少なくとも１つの不溶性キャリアにカップリングした請求項１〜１０のいずれか１項に定義されたリガンドからなる、クロマトグラフィーマトリックス。
【請求項１４】
少なくとも１つの不溶性キャリアにカップリングした請求項１〜１０のいずれか１項に定義されたリガンドを含む、Ｆａｂフラグメント‐結合クロマトグラフィーマトリックス。
【請求項１５】
キャリアが実質的に球状の粒子からなる、請求項１４に記載のマトリックス。
【請求項１６】
キャリアが多孔性である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のマトリックス。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項によって定義されたリガンドを提供すること；および少なくとも１つの多孔性キャリアに該リガンドをカップリングすることを含む、クロマトグラフィーマトリックスを作製する方法。
【請求項１８】
カップリングがリガンドの窒素またはイオウ原子を介して実行される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上の標的化合物を単離するプロセスであって、該化合物を含む液体とクロマトグラフィーマトリックスを接触させること；該化合物をマトリックス上に存在する１つ以上のスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）ドメインＣ、またはその機能的フラグメントもしくは変異体からなるリガンドに吸着させること；および場合によりリガンドからそれらを放出する液体マトリックスを横切ることにより該化合物を溶出することを含む、プロセス。
【請求項２０】
１つ以上の標的化合物を単離するプロセスであって、該化合物を含む液体とクロマトグラフィーマトリックスを接触させること；該化合物をマトリックス上に存在する、少なくとも２つのスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）ドメインＣユニット、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む多量体であるリガンドに吸着させること；および場合により、リガンドから該化合物を放出する液体マトリックスを横切ることにより該化合物を溶出することを含む、方法。
【請求項２１】
標的化合物がタンパク質、好ましくは抗体である、請求項１９または２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
リガンドが請求項１〜１０のいずれか１項に定義された通りである、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２３】
アルカリに安定なイムノグロブリン吸着剤としての、ＳｐＡのドメインＣ、またはその機能的フラグメントの使用。
【請求項２４】
標的化合物がマトリックスから溶出される請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のプロセスを含む請求項２３に記載の使用であって、２〜３００回実行され、場合により間の洗浄ステップ；マトリックスのアルカリ再生；および最後に請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のプロセスを反復することを伴う、使用。
【請求項２５】
再生が水酸化ナトリウム、好ましくは約０．５Ｍ  ＮａＯＨとのインキュベーションによって実行される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
Ｆａｂフラグメント結合吸着剤としての、ＳｐＡのドメインＣ、またはその機能的フラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクロマトグラフィーの分野、より明確には抗体単離における使用に適した新規アフィニティーリガンドに関する。従って、本発明は、そのようなアフィニティーリガンド、本発明に記載のリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックス、および本発明に記載のリガンドが使用される抗体単離のプロセスを包含する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーという用語は、１つの相は固定され、他の相は移動する、２つのお互いに混和しない相の接触に基づいた、密接に関連した１群の分離法を包含する。クロマトグラフィーが高い関心の的である一領域はバイオテクノロジー分野、たとえば薬物および診断薬の大規模で経済的な生産である。一般に、タンパク質は細胞内で、または周辺環境への分泌により細胞培養によって生産される。使用される細胞株は生きている微生物であるため、それらは、糖、アミノ酸、成長因子などを含む複合増殖培地で育てられなければならない。細胞に与えられた化合物の混合物から、および他の細胞成分から、たとえばヒトの治療薬としての使用のために十分な純度で所望するタンパク質を分離することは難しい問題を提示する。
【０００３】
そのような分離において、第１のステップでは、細胞および／または細胞の破片は通常濾過により除去される。いったん関心のあるタンパク質を含む不純物を除かれた溶液が得られれば、溶液中の他の成分からのその分離はしばしば異なる分離原理に基づいた異なるクロマトグラフィーステップの組み合わせを使用して、しばしば実施される。そうして、そのようなステップは電荷、疎水性の程度、アフィニティー特性、サイズなどに基づいて、混合物からタンパク質を分離する。いくつかの異なるクロマトグラフィーマトリックス、たとえばイオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、アフィニティークロマトグラフィーおよび固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のためのマトリックスがこれらの技術のそれぞれに対して利用可能であり、含まれる特有のタンパク質に対する精製スキームの適応を可能にする。医学分野で常に増大する関心の的である例証となるタンパク質は、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）のような抗体としても公知のイムノグロブリンタンパク質である。
【０００４】
すべてのプロセス技術におけるように、重要な目的は生産コストを低く保つことである。結果として、改善されたクロマトグラフィー技術が頻繁に提示され、可能な場合、マトリックスは再使用される。しかし、クロマトグラフィーマトリックスのそれぞれの使用は実施したばかりの操作の多少の痕跡を残すことになるため、マトリックスを本来の形状にクリーニングする、および／または回復させるために多くの異なるクリーニングプロトコルが利用可能である。除去が必要であることが一般的に公知の物質は、たとえば、溶出されないタンパク質およびタンパク質凝集物、ならびにウイルス、エンドトキシンなどのような潜在的に危険性のある物質であり、それらは細胞培養物に由来してもよい。最も一般的に使用されるクリーニングはバッファーによる簡単な洗浄である。マトリックスのいっそう効率的なクリーニングの場合、酸および／または塩基による処理が頻繁に使用される。よりいっそう効率的にマトリックスを回復させるために、定置洗浄（Ｃｌｅａｎｉｎｇ  Ｉｎ  Ｐｌａｃｅ）（ＣＩＰ）として公知のアルカリプロトコルが一般的に使用される。標準ＣＩＰは、１Ｍ  ＮａＯＨ、ｐＨ１４によるマトリックスの処理を含む。そのような過酷な処理は、先に論じた種類の望ましくない付着物を効率的に除去することになるが、なおその上に多少のクロマトグラフィーマトリックス物質を損なう可能性がある。たとえば、リガンドがタンパク質であるか、タンパク質を基礎にしている多くのアフィニティーマトリックスは標準ＣＩＰに耐えられるはずがなく、少なくともそれらの本来の特性を維持できない。アルカリ条件におけるアスパラギンおよびグルタミン残基の構造改変、たとえば脱アミドおよびペプチドバックボーンの開裂はアルカリ溶液中でのタンパク質の処理による活性損失の主要な理由であること、およびアスパラギンが２つの中で最も感受性が高いことは公知である。また、脱アミド速度は高度に特殊であり、コンホメーション依存的であること、およびタンパク質における最も短い脱アミド半減期は、配列‐アスパラギン‐グリシン‐および‐アスパラギン‐セリンに関連していることが公知である。Ｇｕｌｉｃｈ，Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｎｙｇｒｅｎ，Ｕｈｌｅｎ  ａｎｄ  Ｈｏｂｅｒ（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８０，１６９−１７８を参照されたい。アルカリ条件に対する安定性はタンパク質リガンドの中に工学的に作ることができる。
【０００５】
実証されたアルカリ感受性にもかかわらず、プロテインＡは抗原に対するイムノグロブリンの親和性に著しく影響を与えることなく、ＩｇＧに結合する能力のゆえにアフィニティークロマトグラフィーマトリックスにおいてリガンドとして広範に使用される。公知のようにプロテインＡは細菌スタフィロコッカスアウレウス細胞壁の構成物質である。ＳｐＡとしても公知のそのようなスタフィロコッカスプロテインはＦｃ領域において抗体に結合可能な、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣとしてＮ‐末端から順番に示される５つのドメイン、およびいずれの抗体にも結合しないＣ‐末端領域（または「Ｘ」領域）からなる。Ｊａｎｓｓｏｎら（Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｕｈｌｅｎ  ａｎｄ  Ｎｙｇｒｅｎ（１９９８）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０，６９−７８：“Ａｌｌ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｈｏｗ  Ｆａｂ  ｂｉｎｄｉｎｇ”）は後に、すべての個々のＳｐＡドメインはまた、Ｆａｂ領域においてある種の抗体に結合することを示している。
【０００６】
米国特許第５，１５１，３５０号（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）は、プロテインＡおよびプロテインＡ‐様物質をコードする遺伝子のクローニングおよび発現に関する。ヌクレオチド配列が解析されたこの遺伝子のクローニングは１９８２年に初めて可能になり、種々の宿主‐ベクターシステムにおけるクローニングのための多量のプロテインＡ‐様物質およびヌクレオチド配列が得られた。
【０００７】
組換え系におけるプロテインＡの生産が成し遂げられたため、付加的なその遺伝的操作が提案されている。たとえば、米国特許第５，２６０，３７３号（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）は支持物への接着、そしてより明確にはアルギニンを介したカップリングを促進するための組換えプロテインＡの遺伝的操作を記載する。さらに、米国特許第６，３９９，７５０号（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）はシステインを介して支持物にカップリングしている、別の組換えプロテインＡリガンドを記載する。
【０００８】
しかし、感受性および結合キャパシティーを維持するために、先に論じた種類のプロテインＡクロマトグラフィーマトリックスは、慣用のＣＩＰより緩和な条件でクリーニングされる必要がある。これに関連して、クリーニングはクロマトグラフィーマトリックスの寿命に密接に関連することが理解される。たとえば、性能低下が許容可能である場合、好感度のマトリックスが標準ＣＩＰによりクリーニングされてもよい。それゆえに、選択性のような優れた特性を提示するが、ＣＩＰに使用されるアルカリ条件にいっそう耐性のあるプロテインＡのクロマトグラフィーマトリックスを提供するための努力がなされてきた。
【０００９】
従って、米国特許第６，８３１，１６１号（Ｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ）は、１つ以上のアスパラギン（Ａｓｎ）残基が改変されてアルカリ安定性を増している、固定化タンパク質性アフィニティーリガンドを使用したアフィニティー分離の方法に関する。この特許はまた、タンパク質分子内のＡｓｎ残基を改変し、アルカリ条件におけるタンパク質の安定性を増すこと、およびタンパク質分子のランダム化により結合特性を改変することにより安定化されたコンビナトリアルタンパク質を作る方法、ならびにランダム化ステップとは別個のステップにおいてアルカリ条件におけるタンパク質の安定性が１つ以上のそのＡｓｎ残基の改変によって増しているコンビナトリアルタンパク質を記載する。
【００１０】
さらに、ＷＯ０３／０８０６５５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、少なくとも１つのアスパラギン残基がグルタミンまたはアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異しているイムノグロブリン結合タンパク質に関する。この特許出願に従って、そのようないっそう特殊な突然変異は、約１３〜１４に至るまでのｐＨ値において親分子に比較して増大した化学的安定性を与える。変異したタンパク質はたとえば、相補性決定領域以外（ＣＤＲ）のイムノグロブリン分子の領域への結合が可能なプロテインＡのようなタンパク質、および好ましくはスタフィロコッカスプロテインＡのＢ−ドメインに由来しうる。本発明はまた、記載された、リガンドしての変異したイムノグロブリン結合タンパク質を含む、アフィニティー分離のためのマトリックスに関する
いっそうアルカリに安定なプロテインＡを基礎にしたクロマトグラフィーリガンドに関する先に記載の成果にもかかわらず、この分野における高度に特殊な分離のための改善されたリガンドおよびクロマトグラフィーマトリックス、ならびに抗体のいっそう容易な大規模製造が可能な代わりとなる野生型リガンド構築の必要性が存在する。
【００１１】
そのような改善されたクロマトグラフィーマトリックスの一例は米国第２００６／０１３４８０５号（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ）に記載され、該特許は抗体‐結合タンパク質リガンドが固定化されている多孔性粒子からなる分離マトリックスに関する。より明確には、開示されたクロマトグラフィーマトリックスはとりわけ抗体の高キャパシティー精製に適したマトリックスを提供するために、リガンド密度；ゲル相分布係数（Ｋａｖ）；および粒子サイズに関して最適化されている。開示されたマトリックスのリガンドはプロテインＡ、プロテインＧおよび／またはプロテインＬのような抗体‐結合タンパク質を含んでいてもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，１５１，３５０号
【特許文献２】米国特許第５，２６０，３７３号
【特許文献３】米国特許第６，３９９，７５０号
【特許文献４】米国特許第６，８３１，１６１号
【特許文献５】ＷＯ０３／０８０６５５
【特許文献６】米国出願第２００６／０１３４８０５号
【特許文献７】米国特許第５，０８４，５５９号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｇｕｌｉｃｈ，Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｎｙｇｒｅｎ，Ｕｈｌｅｎ  ａｎｄ  Ｈｏｂｅｒ（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８０，１６９−１７８
【非特許文献２】Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｕｈｌｅｎ  ａｎｄ  Ｎｙｇｒｅｎ（１９９８）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０，６９−７８
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４）
【非特許文献４】Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅＬ′Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０〜７５（１９８８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の一側面は、反復した定置洗浄サイクルに耐えることが可能な、新規なクロマトグラフィーマトリックスを提供することである。このことは、添付の特許請求の範囲に定義された、ＳｐＡ由来のドメインＣに基づいたアフィニティーリガンドによって成し遂げられてもよい。
【００１５】
本発明の別の側面は、イムノグロブリンを精製する経済的なプロセスを提供することである。このことは、反復した定置洗浄サイクルに耐えることが可能なアフィニティークロマトグラフィーリガンドを使用するプロセスによって成し遂げられてもよい。
【００１６】
本発明の付加的な側面および利点は以下の詳細な開示から明らかになる。
定義
ドメインＣまたは「その機能的フラグメントもしくは変異体」という用語は、Ｆｃ領域においてＩｇＧへの結合特性を有する、ＳｐＡドメインＣのフラグメントまたは変異体を包含する。
【００１７】
「抗体」および「イムノグロブリン」という用語は、本明細書では相互に交換可能に使用され、抗体および抗体のフラグメントを含む融合タンパク質も含むことが理解される。
【００１８】
「Ｆｃ‐結合タンパク質」という用語は、抗体の結晶化可能な部分（Ｆｃ）に結合することが可能なタンパク質を意味し、たとえばプロテインＡおよびプロテインＧ、または上記結合特性を維持しているそのいずれかのフラグメントもしくは融合タンパク質を含む。
【００１９】
「Ｆａｂフラグメント」という用語は抗体の可変部分を表し；それゆえ「Ｆａｂ‐結合リガンド」はＦａｂ‐結合を介して完全な抗体；またはＦａｂフラグメントとしても公知の可変部分を含む抗体フラグメントのいずれかに結合可能である。
【００２０】
「クロマトグラフィー」という用語は、本明細書ではクロマトグラフィーの原理を利用するどんな種類の分離にも使用され、それゆえバッチおよびＨＰＬＣ法を含む。
【００２１】
「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、本明細書ではリガンドが「ロック‐キー」様式で生物学的親和性により標的と相互作用する、特殊な様式のクロマトグラフィーに使用される。アフィニティークロマトグラフィーにおける有用な相互作用の例としては、たとえば酵素‐基質相互作用、ビオチン‐アビジン相互作用、抗体‐抗原相互作用などが挙げられる。
【００２２】
「タンパク質を基礎にした」リガンドという用語は、本明細書ではペプチドもしくはタンパク質；またはペプチドの一部もしくはタンパク質の一部を含むリガンドを意味する。
【００２３】
抗体の「分離」という用語は、本明細書では他の抗体、および他の成分のような他のタンパク質を含む混合物からの特殊な生成物抗体の精製；ならびに生成物液体からの抗体の分離、すなわち、望ましくない抗体を除去することを包含するように使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は他のタンパク質を基にしたリガンドに比較した、本発明に記載のリガンドのアルカリ安定性試験の結果を示す。
【図２】図２は他のタンパク質を基にしたリガンドに比較した、本発明に記載のリガンドのＦａｂ‐結合特性試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
従って、本発明は新規クロマトグラフィーリガンドに関する。タンパク質を基礎にし、アフィニティーリガンドとして公知の種類の、本発明に記載のクロマトグラフィーリガンドはスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）由来のドメインＣの全部または一部を含む。第１の側面では、本発明はスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）の１つ以上のドメインＣユニット、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含むクロマトグラフィーリガンドに関する。一態様では、本発明のクロマトグラフィーリガンドは実質的にアルカリに安定である。これに関連して、「実質的にアルカリに安定」という用語は、リガンドがその結合キャパシティーを失わずにアルカリ洗浄を使用した反復した定置洗浄サイクルに耐えることが可能であることを意味すると理解される。
【００２６】
特定の態様では、本発明はスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）由来のドメインＣを含むが、ＳｐＡの他のドメインはいずれも含まないクロマトグラフィーリガンドである。
【００２７】
代わりの側面では、本発明はスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）由来の１つ以上のドメインＣユニット、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含むクロマトグラフィーリガンドに関し、該クロマトグラフィーリガンドは以下でより詳細に論じられるように、抗体のＦａｂ部分に結合することが可能である。
【００２８】
先に論じたように、ＪａｎｓｓｏｎらはドメインＣがただプロテインＡの一部であるだけでなく、イムノグロブリン吸着剤としての別個の役割を果たしうることをすでに示している。本発明者らは、ドメインＣのイムノグロブリン結合特性はクロマトグラフィーリガンドとしてのその使用に対する要求を十分満たしていることを確証している。その上先に論じたように、Ｇｕｌｉｃｈらは、アルカリ条件におけるアスパラギンおよびグルタミン残基が、アルカリ溶液中での処理によるプロテインＡ活性の損失にとっての主要な理由であることを示していた。結果として、６つものアスパラギン残基を含むドメインＣリガンドが、プロテインＡに比較して多少の実質的なアルカリ安定性を提示することは全く期待されなかった。
【００２９】
しかし、以下の実験部分および図１に示すように、本発明者らは非常に驚くべきことに、２０時間もの長時間のアルカリ条件におけるインキュベーションにより、ＳｐＡドメインＣが市販のプロテインＡ製品（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標），ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に比較して、はるかに改善されたアルカリ安定性を提示することを示している。実際、ドメインＣリガンドはアスパラギン残基が他のアミノ酸に変異していて、アルカリ安定として市販されている製品（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のアルカリ安定性の値に類似する値を提示する。
【００３０】
このことに加え、先に論じたように、とりわけアルカリ‐感受性脱アミド速度は高度に特殊でコンホメーション依存的であること、および最も短い脱アミドハーフタイムは配列‐アスパラギン‐グリシン‐および‐アスパラギン‐セリンに関連していることが示されている。非常に驚くべきことに、本発明のドメインＣリガンドは、慣用のドメインＣ残基の番号付けを使用した残基２８と２９間の１つのアスパラギン‐グリシン結合にもかかわらず、本明細書で提示された好都合なアルカリ安定性を提示した。
【００３１】
一態様では、本発明に記載のリガンドは本来のイムノグロブリン結合キャパシティーから約１０％より多くを、そして好ましくはわずか５％を逸脱することなく、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で少なくとも１０時間耐えることが可能である。それゆえ、５時間後に、該リガンドは本来のイムノグロブリン結合キャパシティーから約１０％より多くを、そして好ましくはわずか５％を逸脱しないことになる。言い換えると、本発明の一態様は先に記載のリガンドであり、そしてそれは０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での５時間インキュベーション後に本来の結合キャパシティーの少なくとも９５％を保持している。
【００３２】
好都合な態様では、本発明に記載のリガンドは本来のイムノグロブリン結合キャパシティーから約２０％より多くを、そして好ましくはわずか１０％を失うことなく、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で少なくとも１５時間耐えることが可能である。いっそう好都合な態様では、本発明に記載のリガンドは本来のイムノグロブリン結合キャパシティーから約３０％より多くを、そして好ましくはわずか１５％を失うことなく、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で少なくとも２０時間耐えることが可能である。言い換えると、本発明の一態様は先に記載のリガンドであり、そしてそれは０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での１５時間インキュベーション後に本来の結合キャパシティーの少なくとも８０％を、好都合には少なくとも９０％を保持している。
【００３３】
当業者は、たとえば実施例に記載のように、候補リガンドと水酸化ナトリウムをインキュベーションし、その後慣例のクロマトグラフィー実験により結合キャパシティーを試験することによって、アルカリ安定性を容易に試験することができる。
【００３４】
当業者が容易に理解するように、本発明に記載のクロマトグラフィーリガンドは、本明細書でＣｗｔと表され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１で示される野生型ＳｐＡドメインＣアミノ酸配列からなっていてもよい。代わりの態様では、本発明のクロマトグラフィーリガンドはＳｐＡドメインＣの機能的フラグメント、たとえば野生型ＳｐＡドメインＣ配列に比較して３〜６位のＡｓｎ‐Ｌｙｓ‐Ｐｈｅ‐Ａｓｎが欠失している、本明細書でＣｄｅｌと表される配列を開示するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２で示されるものからなる。さらに代わりの態様では、ＳｐＡドメインＣの変異体はたとえば野生型ＳｐＡドメインＣアミノ酸配列のどちらかの末端に１つ以上のアミノ酸を添加することにより；または突然変異がイムノグロブリン結合およびアルカリ安定性に関連する本明細書に記載の特性を実質的に妨害しないならば、野生型ＳｐＡドメインＣアミノ酸配列のそのような突然変異により作製される。従って、特定の態様では、本発明に記載のクロマトグラフィーリガンドは付加的に突然変異Ｇ２９Ａを含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１で示されるＳｐＡドメインＣを含む。あるいは、この態様に記載のクロマトグラフィーリガンドは、結果として２５位における突然変異（すなわちＧ２５Ａ）を含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２で示される欠失したＳｐＡドメインＣを含む。当業者が理解するように、野生型配列に比較したアミノ酸のそのような付加、突然変異または欠失は、好ましくはＳｐＡドメインＣリガンドのフォールディングパターンに実質的に影響を与えるべきではない。
【００３５】
従って、一態様では、本発明に記載のリガンドのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１によって定義される配列である。特定の態様では、本発明に記載のリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１で示されるアミノ酸の少なくとも６０％、好都合には少なくとも８０％、いっそう好都合には少なくとも９０％、そして最も好都合には少なくとも９５％、たとえば約９８％を含む。特定の態様では、本発明に記載のリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１で示されるアミノ酸の少なくとも３５、好都合には少なくとも４６、いっそう好都合には少なくとも５２、そして最も好都合には少なくとも５５、たとえば５７を含む。
【００３６】
代わりの態様では、本発明に記載のリガンドのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２によって定義される配列である。特定の態様では、本発明に記載のリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２で示されるアミノ酸の少なくとも４０％、好都合には少なくとも７７％、いっそう好都合には少なくとも％、そして最も好都合には少なくとも９４％、たとえば約９８％を含む。特定の態様では、本発明に記載のリガンドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２で示されるアミノ酸の少なくとも３１、好都合には少なくとも４２、いっそう好都合には少なくとも４８、そして最も好都合には少なくとも５１、たとえば５３を含む。
【００３７】
先の背景技術の段落で論じたように、方法はある種のアミノ酸、好ましくは窒素および／またはイオウ原子を含むアミノ酸によるタンパク質リガンドのカップリングに容易に利用可能であり、たとえば米国特許第６，３９９，７５０号または米国特許第５，０８４，５５９号を参照されたい。従って、一態様では、本発明に記載のリガンドはさらに末端のカップリング基を含み、該基は好ましくは１つ以上の窒素および／またはイオウ原子を含む。好都合な態様では、末端のカップリング基はアルギニンまたはシステインからなる。一態様では、カップリング基はＣ末端領域の中にある。
【００３８】
さらに、本発明はまた、少なくとも２つのドメインＣユニット、または先に定義されたその機能的フラグメントもしくは変異体からなる多量体型クロマトグラフィーリガンド（「多量体」とも示す）に関する。一態様では、この多量体はＳｐＡに由来するユニットを全く含まない。特定の態様では、多量体は他のタンパク質を基礎にしたユニットを全く含まない。別の態様では、多量体は抗体またはＦａｂフラグメントのような標的とのいずれかの実質的な相互作用が可能な他のユニットを全く含まず、従ってそれは他のリガンドユニットを全く含まない。当業者が理解するように、多量体を作ることがユニット間のリンカーとして１つ以上のペプチドを添加することを必要としてもよい。従って、本発明に記載のドメインＣユニットだけを含むように限定された多量体は、多量体の構築を可能にするリンカーを付加的に含んでいてもよく、そのような多量体では、それぞれのドメインＣユニットが標的の結合に関与することが可能であるように十分に暴露されている。
【００３９】
別の態様では、多量体は１つ以上の付加的なユニットを含み、それらはドメインＣとは異なり、そして好ましくはタンパク質を基礎にし、ドメインＣのように等しくアルカリ安定である。従って多量体では、本発明に記載のリガンドは反復されてもよく、および／または他のタンパク質のような他の供給源由来の他のユニットと結合してもよい。一態様では、多量体は２〜８ユニット、たとえば４〜６ユニットからなる。一態様では、１つ以上のリンカー配列が多量体ユニット間に挿入される。そのようなリンカーはたとえば、実際のリガンドユニットがそれらのフォールディングパターンを維持できるように挿入されてもよい。このような状況におけるリンカーは公知であり、当業者は本明細書で論じられたリガンドの特性を妨害しない適切なアミノ酸および鎖長を容易に決定しうる。特定の態様では、本発明に記載のクロマトグラフィーリガンドはドメインＣ以外の他のＳｐＡドメインを全く含まない。
【００４０】
第２の側面では、本発明は先に記載のクロマトグラフィーリガンドをコードする核酸配列に関する。従って、本発明はリガンドをコードするＲＮＡおよびＤＮＡのような本発明のヌクレオチド配列のすべての形態を包含する。本発明はプラスミドのようなベクターを包含し、それはコーディング配列に加え、本発明に記載のリガンドの発現のために必要なシグナル配列を含む。一態様では、ベクターは本発明に記載の多量体リガンドをコードする核酸を含み、ここではそれぞれのユニットをコードする別個の核酸が相同、または非相同ＤＮＡ配列を有していてもよい。この側面はまた、本発明に記載のリガンドをコードする核酸配列を含む発現系を包含する。発現系はたとえば、本発明のリガンドを発現するように改変されている原核生物宿主細胞系、たとえば大腸菌であってもよい。代わりの態様では、発現系は酵母のような、真核生物宿主細胞系である。
【００４１】
当業者が認識するように、本発明に記載のリガンドは代わりにタンパク質合成法によって生産されてもよく、ここではリガンドは予め決定された配列に従って一度に１つずつアミノ酸を添加する自動プロセスによって得られる。好都合な態様では、アミノ酸配列の一部が合成され、お互いに連結されて本発明に記載のリガンドが作製される。そのような合成および連結手順は当業者に公知である。
【００４２】
第３の側面では、本発明は不溶性キャリアにカップリングした先に記載のリガンドからなるクロマトグラフィーマトリックスに関する。そのようなキャリアはビーズまたは不規則型のような１つ以上の粒子；膜；フィルター；キャピラリー；モノリス；およびクロマトグラフィーにおいて一般的に使用されるいずれか他の形態であってもよい。従って、マトリックスの好都合な態様では、キャリアは、ビーズとしても公知の、実質的に球状の粒子からなる。適切な粒子サイズは５〜５００μｍ、たとえば１０〜１００μｍ、たとえば２０〜８０μｍの直径範囲であってもよい。代わりの態様では、キャリアは膜である。高い吸着キャパシティーを得るために、キャリアは好ましくは多孔性であり、そしてリガンドは外部表面並びに小孔表面にカップリングする。従って、本発明に記載のマトリックスの好都合な態様では、キャリアは多孔性である。
【００４３】
キャリアは有機または無機物質から作られてもよい。一態様では、キャリアは架橋された炭水化物物質のような天然のポリマー、たとえばアガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ジェラン（ｇｅｌｌａｎ）、アルギネートなどから作製される。天然のポリマーキャリアは容易に作製され、場合により標準法、たとえば逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４））に従って架橋される。代わりの態様では、キャリアは架橋された合成ポリマーのような合成ポリマーまたはコポリマー、たとえばスチレンまたはスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどから作製される。そのような合成ポリマーキャリアは容易に作製され、場合により標準法に従って架橋される。たとえば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅＬ′Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０〜７５（１９８８））を参照されたい。天然または合成ポリマーキャリアはまた、たとえば多孔性粒子の形状で、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎのような商業的供給源から得ることができる。さらに代わりの態様では、キャリアはシリカのような無機ポリマーから作製される。無機多孔性および非多孔性キャリアは当該技術分野で公知であり、標準法に従って容易に作製される。
【００４４】
第４の側面では、本発明はクロマトグラフィーマトリックスを作製する方法に関し、該方法は先に記載のリガンドを提供すること；およびキャリアにリガンドをカップリングすることを含む。好都合な態様では、カップリングはリガンドの窒素またはイオウ原子を介して実行される。手短に述べると、リガンドは直接的に；またはキャリア表面とリガンド間の適切な距離を提供するスペーサーエレメントを介して間接的にキャリアにカップリングしてもよい。多孔性または非多孔性表面へのタンパク質リガンドの固定化の方法は当該技術分野で公知であり；たとえば先に論じた米国特許第６，３９９，７５０号を参照されたい。
【００４５】
第５の側面では、本発明は１つ以上の標的化合物を単離するプロセスに関し、該プロセスは上記化合物を含む液体をクロマトグラフィーマトリックスに接触させること；マトリックス上に存在する１つ以上のスタフィロコッカスプロテインＡ（ＳｐＡ）ドメインＣ、および／またはその機能的フラグメントもしくは変異体からなるリガンドに上記化合物を吸着させること；そして場合によりリガンドから化合物を遊離する上記の液体マトリックスを横切ることにより上記化合物を溶出することを含む。従って、この態様では、リガンドはドメインＣまたはその機能的フラグメントもしくは変異体以外の他のＳｐＡに由来するドメインを全く含まない。代わりの態様では、上記リガンドは２つ以上のＳｐＡドメインＣユニット、またはその機能的フラグメントもしくは変異体を含む多量体である。
【００４６】
好都合な態様では、リガンドは先に記載のリガンドである。標的化合物はどんな有機化合物、生物分子または他の生物学的物質、たとえば抗体のようなタンパク質；ペプチド；原核細胞または真核細胞のような細胞；ＤＮＡ、たとえばプラスミド、およびＲＮＡのような核酸；ウイルス；などであってもよい。好都合な態様では、標的化合物はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのような、１つ以上のモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。一態様では、標的化合物はＦａｂフラグメントのような、抗体のフラグメントである。さらに別の態様では、標的化合物は、少なくとも一部分が抗体または抗体フラグメントである融合タンパク質である。
【００４７】
一態様では、クロマトグラフィーマトリックスは使い捨てが可能な製品であり、そしてプロセスの目的が生成物液体から抗体のような標的化合物を除去することである場合、溶出は必要とされない。この態様は、液体、たとえば、医学的液体、または組換え動物由来のミルクのような多くの抗体が産生される液体からの所望しない抗体の除去に関するものであってもよい。
【００４８】
代わりの態様では、吸着された化合物が所望する生成物である場合、溶出ステップはプロセスの中に含まれる。吸着のための最も適切な条件を得るために、液体試料は適切なバッファーまたは水のような他の液体と組み合わせて移動相を提供する。本発明の方法は、好都合にはアフィニティークロマトグラフィー、とりわけ当該技術分野で公知であるプロテインＡクロマトグラフィーにとって慣用の条件下でラン（ｒｕｎ）される。
【００４９】
第６の側面では、本発明はアルカリに安定なイムノグロブリン吸着剤としてのＳｐＡのドメインＣ、またはその機能的フラグメントもしくは変異体の使用に関する。この状況では、「アルカリに安定な」とは、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中での初めの５時間のインキュベーション中に吸着剤のアルカリ安定性がＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のようにアルカリに安定であるとして市販される製品のアルカリ安定性より約１０％、たとえば約５％より低くないことを意味すると理解される。好都合な態様では、吸着剤は先に記載のリガンドである。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅは、そのような時間および条件後に最低限の劣化を提示するべきであるため、吸着剤の抗体結合キャパシティーはそのような時間および条件後に本来の結合キャパシティーの約１０％、たとえば５％より低いべきではない。この状況では、「本来の」という用語はいずれかのアルカリ再生前のそのキャパシティーを表し、比較は、本明細書に開示された種類の手順を使用した並列実験として実行される。
【００５０】
一態様では、本発明に記載の使用は、抗体がマトリックスから溶出される、先に記載のプロセスを含み、そしてそれは少なくとも１回、たとえば２〜３００回実行され、場合により間の洗浄ステップ；マトリックスのアルカリ再生；および抗体を単離するプロセスを最後に反復することを伴う。洗浄は適切なバッファー、たとえばカラムを平衡化するために使用されるバッファーによって行われてもよい。好都合な態様では、再生は０．５Ｍ  ＮａＯＨとのインキュベーションによって実行される。
【００５１】
本発明はまた、先に論じた１つ以上の標的化合物を精製する方法を包含し、該方法は、本発明に記載のクロマトグラフィーマトリックスを使用した精製に加えて、１つ以上のクロマトグラフィーステップを含む。この側面に記載の方法は、たとえば本発明のマトリックスを使用した第１のクロマトグラフィーステップ；イオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用した中間クロマトグラフィーステップ；および最後にイオン交換、ＨＩＣまたは逆相クロマトグラフィーを使用した仕上げステップを含んでいてもよい。特定の態様では、このプロセスは本明細書に記載のドメインＣリガンドを有するクロマトグラフィーマトリックスに先行するステップを含む。そのような先行ステップは、たとえば、慣用の濾過、沈殿、凝集、または細胞破片および他の所望しない成分を除去するための他のステップを含んでいてもよい。
【００５２】
代わりの態様では、本発明に記載の使用は、イムノアッセイのような分析的または診断的使用である。
図面の詳細な説明
図１は他のタンパク質に基づいたリガンドに比較した本発明に記載のリガンドのアルカリ安定性試験の結果を示す。実施例１に記載のように、Ｘ軸はインキュベーション期間を時間で示し；一方Ｙ軸は０．５Ｍ  ＮａＯＨ中でＸ時間後に残っているキャパシティーを表す。より明確には、プロテインＡ‐含有製品ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）（黒菱形）：いっそうアルカリ安定として市販される、より最近のプロテインＡ製品ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅ（Ｘ）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１によって定義されるＳｐＡ由来のドメインＣ（白三角）；および最後にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２によって定義されるＳｐＡ由来のドメインＣの欠失した態様（黒四角）。図１から明らかなように、本発明に記載のドメインＣリガンドはアルカリ安定製品ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅに十分に匹敵するアルカリ安定性を示す。
【００５３】
図２は他のタンパク質に基づいたリガンドに比較した、本発明に記載のリガンドのＦａｂ‐結合特性試験の結果を示す。この図から明らかなように、ＳｐＡに由来するドメインＣを含むクロマトグラフィーリガンド（ＣｗｔおよびＣｄｅｌ）は他の試験されたリガンドよりずっと高いレベルのＦａｂ‐結合を提示する。
【実施例】
【００５４】
本実施例は説明の目的だけに提供され、添付の特許請求の範囲に定義される本発明を限定するものと解釈するべきではない。
実施例１：４種のプロテインＡ‐由来リガンドのアルカリ安定性のカラム研究
この実施例では、２種が比較用であり、２種が本発明に記載のものである、４種のクロマトグラフィーマトリックスのアルカリ安定性が一連のクロマトグラフィーラン（ｒｕｎ）を通して試験される：
‐ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）（両方はタンパク質を基礎にしたリガンドを含む比較製品、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）および
‐Ｃｗｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１で定義される、ＳｐＡ由来の野生型ドメインＣ）、およびＣｄｅｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２で定義される、ＳｐＡ由来の欠失した野生型ドメインＣ）。
【００５５】
ＩｇＧ‐結合キャパシティーは初期、および０．５Ｍ  ＮａＯＨ中でのインキュベーションステップ後に測定された。インキュベーション時間は１から５時間まで変化し、蓄積インキュベーション時間は２０時間であった。
【００５６】
本発明に記載のリガンドは標準手順に従ってアガロース粒子状に固定され、カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填された。２つのマトリックス、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって製造された、モノクローナル抗体精製のために市販される製品である。両製品のリガンドはＩｇＧ‐結合スタフィロコッカスアウレウスプロテインＡを基礎にする。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）リガンドは基本的には組換えプロテインＡであり、５つの相同ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）からなる。比較して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅリガンドはドメインＢアナログ「Ｚ」に由来する４つのドメインからなり、そしてそれは今度はタンパク質工学的操作法により高いｐＨに対して安定化されている。結果として、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅは０．５Ｍ  ＮａＯＨに至るまでの定置洗浄（ＣＩＰ）条件に耐える。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅリガンドはアガロース粒子にカップリングしている。
【００５７】
リガンドＣｗｔおよびＣｄｅｌは、標準手順に従ってマトリックスへのカップリングのためのＣ‐末端システイン残基を持つ同一ドメインのテトラマーとして構築された。
材料＆方法
標的化合物
皮下注入または筋肉内注射用の１０ｘ１０ｍｌ  注入液、溶液、ＧＡＭＭＡＮＯＲＭ（登録商標）１６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ｎｏ．００８６６４）、ヒト正常イムノグロブリンがクロマトグラフィー実験における標的化合物として使用された。
クロマトグラフィーカラム
以下の表１に概説されたリガンドカップリングおよびカラム充填が実行された。
表１：実験１で使用されたカラム
【００５８】
【表１】
2010504754.tif 000003
【００５９】
「カラムＩＤ」はそれぞれのカラムに与えられた特有の番号を表す。これらの番号はクロマトグラフィー法に含まれ、結果ファイルの記録の中に見いだすことができる。たとえば、表１の初めのカラムは「ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  U６６９０８２  カラム４  ２００６０３１０（９．）」と呼ばれた。「カラムｎｏ．」は充填番号であり、すなわち同じマトリックスのバッチにより充填されたカラムは、充填時に異なるカラムｎｏ．を与えられた。カラム容積はベッド高を測定することにより見積もられた。
バッファーおよび溶液
バッファーＡ：５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２
バッファーＢ：５０ｍＭ  クエン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．５
器具および実験室設備
クロマトグラフィーシステム：ＡＫＴＡ（登録商標）ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
カラムハードウェア：Ｔｒｉｃｏｎ（登録商標）５／１００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
真空脱気装置：ＣＴ２００３−２、２チャンネル脱気装置、ＣｈｒｏｍＴｅｃｈ  ＡＢ
分光光度計：ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
遠心分離機：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）Ａｖａｎｔｉ（登録商標）Ｊ−２０  ＸＰＩ、ＪＬＡ８．１０００ローター
ｐＨメーター（バッファーＡ）：ＢｅｃｋｍａｎΦ３６０ｐＨ／Ｔｅｍｐ／ｍＶ  Ｍｅｔｅｒ
ｐＨメーター（バッファーＢ）：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐＨ  Ｍｅｔｅｒ  ＣＧ８４２、ＳＣＨＯＴＴ
ヘリウム：ＡＧＡ  Ｇａｓ  ＡＢ，１０１Ｈ２０５７７７０８，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
バッファーおよび試料のためのフィルター：７５ｍｍボトルトップフィルター（Ｂｏｔｔｌｅ  Ｔｏｐ  Ｆｉｌｔｅｒ）−５００ｍｌ、０．２μｍポアサイズ、Ｎａｌｇｅｎｅ
０．５Ｍ  ＮａＯＨのためのフィルター：７５ｍｍボトルトップフィルター−５００ｍｌ、０．４５μｍポアサイズ、Ｎａｌｇｅｎｅ
ソフトウェア
ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（登録商標）１０はＵＮＩＣＯＲＮ（登録商標）５．０１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって制御された。クロマトグラフィーラン（ｒｕｎ）間にシステムを制御することとは別に、ＵＮＩＣＯＲＮは方法プログラミングおよび結果の評価に使用された。
バッファー作製
バッファーＡ：リン酸水素ナトリウムおよびＮａＣｌは水に溶かした。ｐＨメーターはｐＨ４、ｐＨ７およびｐＨ１０標準バッファーを使用して較正した。ｐＨはｐＨが７．２に到達するまでバッファーにＮａＯＨ（ａｑ）を添加しながらモニターした。バッファーは濾過し、使用前にヘリウムで脱気した。
【００６０】
バッファーＢ：クエン酸およびＮａＣｌを水に溶かした。ｐＨメーターはｐＨ７およびｐＨ２標準バッファーを使用して較正した。ｐＨはｐＨが２．５に到達するまでバッファーにＮａＯＨ（水溶液）を添加しながらモニターした。バッファーは濾過し、使用前にヘリウムで脱気した。
０．５Ｍ  ＮａＯＨの作製
ＮａＯＨ（固体）は水に溶かして０．５Ｍにした。溶液は濾過し、使用前にヘリウムで脱気した。
試料作製
実験１
３０ｍｌ  Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（１６５ｍｇ／ｍｌ）は４９５０ｍｌのバッファーＡで１ｍｇ／ｍｌに希釈した。試料は０．２μｍを通して濾過し、滅菌した５リットルボトルに入れた。
【００６１】
ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して３回の２８０ｎｍ測定が試料に対して実行された：１．２５７３ＡＵ、１．２４３２ＡＵおよび１．２１０１ＡＵ。平均吸光度：１．２３６９ＡＵ。
【００６２】
２８０ｎｍにおける吸光度はＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１０でも測定された。試料はバイパスモードでシステムを通してシステムポンプから注入された。１０ｍｍ  ＵＶウェルを使用し、流速は０．８３ｍｌ／分であった。２８０ｎｍでの吸光度は１５１０ｍＡＵであった。この値はキャパシティー計算をするときに参照として使用された。
方法の説明
通常、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅのＣＩＰサイクルはＣＩＰ溶液（通常０．１〜０．５Ｍ  ＮａＯＨ）との１０〜１５分間の接触時間を含む。この研究におけるＣＩＰサイクルの量を減らすために、より長い接触時間が使用された。カラムは１、２および５時間間隔でインキュベーションされ、全接触時間は２０時間であった。これは８０〜１２０サイクル、１０〜１５分間の接触時間に相当する。
【００６３】
ＣＩＰインキュベーションの前に、カラム毎に２回の初期キャパシティー測定が実施された。キャパシティー測定後、カラムは０．５Ｍ  ＮａＯＨ中でインキュベーションされた。それぞれのＣＩＰインキュベーション後、カラム毎に１回のキャパシティー測定が実行された。
【００６４】
概要を述べると、実験は以下のように計画された：
・カラム毎の２回の初期キャパシティー測定
・ＣＩＰインキュベーション、１時間。
・カラム毎の１回のキャパシティー測定。
・ＣＩＰインキュベーション、２時間。
・カラム毎の１回のキャパシティー測定。
・ＣＩＰインキュベーション、２時間。
・カラム毎の１回のキャパシティー測定。
・ＣＩＰインキュベーション、５時間。
・カラム毎の１回のキャパシティー測定。
・ＣＩＰインキュベーション、５時間。
・カラム毎の１回のキャパシティー測定。
・ＣＩＰインキュベーション、５時間。
・カラム毎の１回のキャパシティー測定。
システム設定
実験は室温で実行した。しかし、試料は微生物の増殖を回避するために氷上に保持した。冷たい試料を室温に温めたときの気泡の形成を回避するために、試料とポンプの間に脱気装置が接続された。ＵＶ検出のためにＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１０は１０ｍｍ  ＵＶセルを備えた。
【００６５】
バッファーと試料はシステムポンプから注入した。下記の注入口が使用された：
・試料：Ｂポンプ（注入口Ｂ１）
・バッファーＡ：Ａポンプ（注入口Ａ１１）
・バッファーＢ：Ａポンプ（注入口Ａ１２）
・０．５Ｍ  ＮａＯＨ：Ａポンプ（注入口Ａ１３）
キャパシティー測定、詳細な説明
（カラム毎に１回のキャパシティー測定からなる）キャパシティー測定の前に、試料はバイパス様式で、すなわちカラムを使用せずにポンプから注入された。この目的はそれぞれのキャパシティー測定にとって「新鮮な」試料を得ること、およびＣＩＰインキュベーション中に、室温でチューブおよびポンプ中に残っていた初めの試料の容量の第１のカラムに対する負荷を回避することである。
【００６６】
それぞれのカラムに対するキャパシティー測定法は以下の部分から構成された：
・カラム容積（ＣＶ）の５倍のバッファーＡによるカラムの平衡化。
・試料負荷。動的結合キャパシティーは関心のあるクロマトグラフィー媒体で充填されたパックに試料を負荷することによって決定される。媒体が試料によって次第に飽和される場合、２８０ｎｍでの吸光度レベルはカラムを通過する非結合試料のために増加することになる。この方法では、試料はＵＶ２８０ｎｍ曲線が試料の２８０ｎｍにおける吸光度の１５％に到達するまでカラムに負荷された。
・非結合試料の洗い流し。ＵＶ２８０ｎｍ曲線が試料の２８０ｎｍにおける吸光度の１０％未満に減少するまでカラムは洗浄された。
・溶出。結合物質は１０ＣＶのバッファーＢにより溶出された。
・５ＣＶバッファーＡによる再平衡化
試料負荷の流速は０．８３ｍｌ／分であった。
ＣＩＰインキュベーション
それぞれのキャパシティー測定後、２回の初期測定のうちの１回目を除いて、ＣＩＰインキュベーションが実行された。ＣＩＰインキュベーション法では、３ＣＶの０．５Ｍ  ＮａＯＨが０．８３ｍｌ／分の流速でそれぞれのカラムを通して注入された。この後、システムは中断された。中断の長さはＣＩＰインキュベーション時間の長さ、すなわち１時間、２時間または５時間に依存した。しかし、システムがカラムを通してＮａＯＨを注入するために必要な時間は中断時間から減じられた。ＣＩＰインキュベーション後、３ＣＶのバッファーＡが０．８３ｍｌ／分の流速でそれぞれのカラムを通して注入され、ＮａＯＨが除去された。この手順により、すべてのカラムが同じ時間、ＮａＯＨに暴露された。３ＣＶのバッファーＡによるさらに１回の洗浄サイクルが最後に実行された。
クロマトグラフィーの結果の評価
キャパシティーは、２８０ｎｍにおける吸光度が試料の吸光度の１０％に到達するまでカラムに適用された試料の容量を測定することによって決定された。デッドボリューム、すなわちカラム容量、ミキサーおよびポンプからＵＶセルまでの管は、この容量から減じられた。カラムの無い遅れ容量は１，０２ｍｌに決定された。キャパシティー値は蓄積されたＣＩＰインキュベーション時間に対してプロットされた。相対キャパシティー値はＣＩＰサイクル後のキャパシティー値をスタートキャパシティー値の平均で割ることにより獲得された。相対キャパシティー値は異なるマトリックス間のいっそう容易な比較に使用された。
表２．結果  実験１‐キャパシティー（ｍｇ  Ｇａｍｍａｎｏｒｍ／ｍｌ  クロマトグラフィーマトリックス（ゲル））
【００６７】
【表２】
2010504754.tif 000004
【００６８】
実験２：Ｆａｂ‐結合の試験
異なるクロマトグラフィー媒体のＦａｂ‐結合キャパシティーは９６‐ウェルフィルタープレートアッセイで評価した。液体およびクロマトグラフィー媒体はプレートボルテックスインストルメントで１分間混合した。ウェルの底は液体とクロマトグラフィー媒体の粒子を保持するフィルターから構成された。遠心分離した場合、液体はフィルターを通過し、フィルタープレートの底に接着した別個の９６‐ウェル回収ＵＶ‐プレートに集められた。集められた液体の２８０ｎｍでの吸光度はプレートリーダーで測定され、Ｆａｂの検出および見積に使用された。異なるステップ、たとえば洗浄、溶出に由来する液体は異なるプレートに集められ、別個に測定されて、個々の画分のＦａｂの量を測定することを可能にした。
【００６９】
１０％スラリーがそれぞれのクロマトグラフィー媒体から作製された。
【００７０】
フィルタープレートは２００μｌスラリー／ウェル、すなわち、２０μｌ／ウェルを負荷された。
【００７１】
平衡化‐５ｘ２００μｌＰＢＳで洗浄
試料インキュベーション‐ＰＢＳ中の１００μｌヒトポリクローナルＦａｂ／カッパ、ＩｇＧフラグメント（Ｂｅｔｈｙｌ）、１５分間
洗浄‐５ｘ１００μｌ  ＰＢＳ
溶出‐３ｘ１００μｌ  ０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ３．０
ＣＩＰ‐０．５Ｍ  ＮａＯＨにより２ｘ１０分
ＵＶ＠２８０ｎｍによる液体を含むプレートの分析
実験２の結果は図２に提示される。
【図１】
2010504754.tif 000005
【図２】
2010504754.tif 000006
【配列表】
2010504754000001.app
【国際調査報告】
2010504754.tif 000007
2010504754.tif 000008
2010504754.tif 000009
2010504754.tif 000010
2010504754.tif 000011
2010504754.tif 000012
2010504754.tif 000013