(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子量グリコサミノグリカン誘導体の構成単糖として、ヘキスロン酸、ヘキソサミン、デオキシヘキソース及びこれら単糖の硫酸エステルを含み、そのうち、前記ヘキスロン酸がＤ−グルクロン酸及びΔ４，５−ヘキスロン酸（４−デオキシ−スレオ−ヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸）であり、前記ヘキソサミンがＮ−アセチルガラクトサミン（２−Ν−アセチルアミノ−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース）又はその末端基還元物であり、前記デオキシヘキソースがＬ−フコースであり、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の単糖及び−ＯＳＯ３−の組成比範囲が、モル比でヘキスロン酸：ヘキソサミン：デオキシヘキソース：硫酸エステル基＝１：（１±０．３）：（１±０．３）：（３．０±１．０）であり、前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体に含まれるヘキスロン酸において、Δ４，５−ヘキスロン酸の占有比率がモル比で２．５％以上であり、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の分子量が、重量平均分子量（Ｍｗ）で３ｋＤ〜２０ｋＤの範囲であり、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の多分散指数が１．０〜１．８の範囲にあり、
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物である、低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
【化１】
0006293862.tif 000016
（式（Ｉ）中、
ｎは、平均値が２〜２０の整数であり、
−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−β１−は、−Ｄ−グルクロン酸−β１−イル−であり、
−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−β１−は、−２−デオキシ−２−Ν−アセチルアミノ−Ｄ−ガラクトース−β１−イル−であり、
Ｌ−Ｆｕｃ−α１−は、−Ｌ−フコース−α１−イル−であり、
ΔＵＡ−１−は、Δ４，５−ヘキスロン酸−１−イル（４−デオキシ−スレオ−ヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸−１−イル）であり、
Ｒは、各々独立して−ＯＨ又は−ＯＳＯ３−であり、
Ｒ’は、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ７〜Ｃ１０アリールオキシであり、
Ｒ１は、下記式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される反応基であり、且つ、前記混合物において、Ｒ１が式（ＩＩ）で表される反応基の化合物とＲ１が式（ＩＩＩ）で表される反応基の化合物との比がモル比で２：１以上であり、
【化２】
0006293862.tif 000017
式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）中、Ｒは、上記と同じであり、
Ｒ２は、下記式（ＩＶ）又は式（Ｖ）で表される反応基であり、
【化３】
0006293862.tif 000018
式（ＩＶ）又は式（Ｖ）中、Ｒは、上記と同じであり、
Ｒ３は、カルボニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、置換又は非置換の５員又は６員窒素含有複素環、又は−ＮＨＲ４であり、そのうち、−ＮＨＲ４中のＲ４は、置換又は非置換の直鎖状又は分岐鎖状Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換又は非置換のＣ７〜Ｃ１２アリール、置換又は非置換のヘテロ原子含有の複素環式アリールであり、
式（Ｖ）中、Ｒ’は、上記と同じである。）
【請求項２】
前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の重量平均分子量が５ｋＤ〜ｌ２ｋＤの範囲であり、前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体の多分散指数が１．１〜１．５の範囲にある、請求項１に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
前記薬学的に許容可能な塩は、前記低分子量グリコサミノグリカン誘導体のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、又は有機アンモニウム塩である、請求項１又は２に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
前記薬学的に許容可能な塩は、低分子量グリコサミノグリカン誘導体のナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩である、請求項３に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
請求項１に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法であって、
（１）棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンを原料とし、エステル化反応を経て前記フコシル化グリコサミノグリカンに含まれるヘキスロン酸の遊離カルボキシ基の全部又は一部をカルボン酸エステル基に変換し、カルボン酸エステル誘導体を取得し
（２）ステップ（１）で得られるカルボン酸エステル誘導体を、非水溶媒及びアルカリ性試薬の存在下でエステル基のβ−脱離反応を経て低分子量グリコサミノグリカン誘導体を取得し、
（３）ステップ（２）で得られる低分子量グリコサミノグリカン誘導体に対し、還元性末端を還元処理して末端が還元化された低分子量グリコサミノグリカン誘導体を取得し、
（４）ステップ（２）とステップ（３）で得られる低分子量グリコサミノグリカン誘導体に対し、アルカリ分解法によりカルボン酸エステル基を遊離カルボキシ基に変換するステップを含んでなる、低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項６】
前記棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンは、棘皮動物門ナマコ綱動物の体壁及び／又は内臓に由来のフコシル化グリコサミノグリカンであり、
前記棘皮動物門ナマコ綱動物として、マナマコ（Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、クリイロナマコ（Ａｃｔｉｎｏｐｙｇａ  ｍａｕｒｉｔｉａｎａ）、チリメンナマコ（Ａｃｔｉｎｏｐｙｇａ  ｍｉｌｉａｒｉｓ）、イモナマコモドキ（Ａｃａｕｄｉｎａ  ｍｏｌｐａｄｉｏｉｄｅｓ）、ジャノメナマコ（Ｂｏｈａｄｓｃｈｉａ  ａｒｇｕｓ）、アカミシキリ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｅｄｕｌｉｓ）、イシナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｎｏｂｉｌｉｓ）、ニセクロナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａ）、シナナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｉｎｉｃａ）、クロナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｖａｇａｂｕｎｄａ）、メキシコナマコ（Ｉｓｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｂａｄｉｏｎｏｔｕｓ）、ブラジルナマコ（Ｌｕｄｗｉｇｏｔｈｕｒｅａ  ｇｒｉｓｅａ）、シカクナマコ（Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｃｈｌｏｒｏｎｏｔｕｓ）、バイカナマコ（Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ  ａｎａｎａｓ）及びアデヤカバイカナマコ（Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ  ａｎａｘ）からなる群より選ばれる１種以上を用いた請求項５に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項７】
前記ステップ（１）において、更に、
（ｉ）棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカンを第４級アンモニウム塩に変換し、
（ｉｉ）前記（ｉ）で得られる第４級アンモニウム塩を非プロトン性溶媒においてハロゲン化炭化水素、ハロゲン化芳香族炭化水素と反応させることにより、カルボキシ基の全部又は一部をエステル化したエステル化誘導体を得ることを含む、請求項５に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項８】
前記ステップ（２）における非水溶媒は、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨＣｌ３、及びこれらの混合溶媒から任意に選ばれ、
前記アルカリ性試薬は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃ１〜Ｃ４ナトリウムアルコラート、エチレンジアミン、トリブチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、及びこれらの混合物から任意に選ばれる、請求項５に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項９】
前記ステップ（３）において、前記末端の還元処理により、還元性末端の糖残基を糖アルコール、糖エーテル、糖エステル、芳香環及び／又は複素環によって置換された誘導体に変換する、請求項５に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項１０】
前記ステップ（３）において、前記末端の還元処理により、還元性末端を還元アミノ化して窒素含有誘導体を形成する、請求項５に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項１１】
抗凝固効果を示す有効量で請求項１〜４の何れか１項に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩と、薬用賦形剤とを含んでなる、薬物組成物。
【請求項１２】
前記薬物組成物の形態は、注射用水溶液又は注射用凍結乾燥粉体である、請求項１１に記載の薬物組成物。
【請求項１３】
請求項１〜４の何れか１項に記載の低分子量グリコサミノグリカン誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を用いたことを特徴とする血栓症の治療薬及び／又は予防薬の製造方法。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載の薬物組成物を用いたことを特徴とする血栓症の治療薬及び／又は予防薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の技術分野に属し、具体的には、抗凝固活性を示す低分子量フコシル化グリコサミノグリカン誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｅ  ｏｆ  Ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，以下「ｄＬＦＧ」と称する。）、その製造方法、前記ｄＬＦＧ又はその薬学的に許容可能な塩を含んでなる薬物組成物、並びに、該ｄＬＦＧ及び薬物組成物の血栓症治療薬の製造における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性卒中、冠動脈疾患、静脈血栓塞栓症等の疾患を含む血栓塞栓性疾患は、人類にとって主な致死性病因である。現在、抗血栓薬による治療が臨床において血栓症を予防、治療するための基本手段となっているが、血栓溶解薬、抗凝固薬、抗血小板薬を含む抗血栓薬は、何れも出血傾向と重篤の出血症を引き起こすおそれがあるといった深刻な欠点を共通して抱えている。
【０００３】
典型的な抗凝固薬であるヘパリン（第ＩＩａ因子・第Ｘａ因子阻害剤）及びクマリン系抗凝固薬（ＶｉｔＫ拮抗薬）は、２０世紀の３０〜４０年代頃から臨床で使われ、７０年余り経った今でも深部静脈血栓症、心原性卒中、及び手術後の抗凝固において薬物治療の基本手段である。ところで、出血リスク及びそれに関連する薬物動態、薬力学的に不足があるため、これらの薬物の臨床応用が大きく制限されている。ヘパリン、クマリン系薬物は何れも広範囲に渡って血液凝固系のセリンプロテアーゼ（凝固因子）を阻害するが、薬効の個体差が比較的大きく、且つ薬効に複雑な要素が絡まっていることから、臨床で薬物を使用する際に強化した監視体制を持続する必要がある。ここ数十年以来、抗凝固薬を研究開発するに当たっての主要手段と目的の１つは、新薬の薬理学的特性と標的選択性を高め、薬物の薬効や薬力学特徴を改善することに集中し、これらの研究が積極的に行われて注目すべき進展を成し遂げている。そのうち、エノキサパリン等の低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）、及びリバロキサバン、ダビガトラン等の経口抗凝固薬が臨床応用において最も代表的なものであるが、出血傾向が低い新型抗凝固薬に対する臨床需要が相変わらず増えつつである。
【０００４】
フコシル化グリコサミノグリカン（Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，以下「ＦＧＡＧ」と称する。）は、棘皮動物であるナマコの体壁や内臓に由来のグリコサミノグリカン類似物である。ＦＧＡＧはコンドロイチン硫酸に類似した主鎖を有し、該主鎖は、ヘキスロン酸、ヘキソサミンからなる二糖構成単位［→４）Ｄ−ＧｌｃＵＡ（β１→３）Ｄ−ＧａｌＮＡｃ（β１→］が順に連結されて形成されている。ＦＧＡＧの主鎖にフコシル基による側鎖置換が存在し、通常、該フコース硫酸側鎖が（α１→３）グリコシド結合を介してＤ−ＧｌｃＵＡに結合し、ＦＧＡＧの主鎖及び側鎖糖残基におけるヒドロキシ基が硫酸によってエステル化されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ．ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，１９９２，３３：４９５９〜４９６２．Ｍｏｕｒａｏ  ｅｔ．ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１：２３９７３〜２３９８４）。
【０００５】
天然由来のＦＧＡＧは抗凝固活性を示し（Ｍｏｕｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ，２００１，１０２：１６７〜１７６．  Ｍｏｕｒａｏ  ｅｔ．ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１：２３９７３〜２３９８４）、その抗凝固活性が複数の凝固因子標的に関わり、そのうち、第Ｘ因子活性化複合体（ｆ．Ｘａｓｅ，Ｔｅｎａｓｅ）に対して最も強い阻害活性を示している（Ｓｈｅｅｈａｎ  ＆  Ｗａｌｋｅ，Ｂｌｏｏｄ，２００６，１０７：３８７６〜３８８２．Ｂｕｙｕｅ  ＆  Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４：３０９２〜３１００）。また、抗凝固活性とは別に、ＦＧＡＧは、例えば、抗炎症、抗腫瘍、血栓溶解、脂質調節活性等の比較的広い薬理活性を示すと共に（Ｔｏｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１９９６，１２６：１８５〜１９５．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，１３２（２）：３３５〜３４３．Ｂｏｒｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００７，２８２（２０）：１４９８４〜１４９９１）、抗凝固活性に対抗して血小板及び第ＸＩＩ因子を活性化させる活性も兼ね備え（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，１９８８，５９（３）：４３５〜４３９．Ｆｏｎｓｅｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，２０１０，１０３（５）：９９４〜１００４）、その広範囲に渡る薬理学作用によってＦＧＡＧの実用化が制限されている。
【０００６】
ＦＧＡＧの構造修飾は、その潜在価値を高めるための１つの手段であり、例えば、抗凝固活性を保留しつつ、その血小板活性化及び接触活性化の活性を抑制する目的で低重合体を製造することが挙げられる。中国特許公開第１０１７３５３３６Ａ号及び第１０１７２４０８６Ａ号に、低重合度のフコシル化グリコサミノグリカンを製造する方法として、水媒体において第４周期遷移金属イオンを触媒とし、且つ過酸化剤で処理する解重合方法を利用することでフコシル化グリコサミノグリカンを解重合して低重合体を製造することが開示され、該産物は、第Ｘ因子活性化複合体に対して強い阻害活性を示し、同時に良好な抗凝固・抗血栓活性を有し、出血傾向を大きく低減することができるため、血栓症の予防及び／又は治療への実用化が期待されている。また、欧州特許公報ＥＰ０８１１６３５Ａ１及びＥＰ０４０８７７０Ａ１に、プロトタイプのＦＧＡＧを過酸化水素で処理して解重合することにより分子量範囲がそれぞれ３，０００〜８０，０００、３，０００〜４２，０００の解重合産物が得られたことが開示され、これらの産物についても血管内膜過形成及び血栓性疾患の予防と治療への実用化が期待されている。これらの特許出願は、何れも過酸化剤を用いて解重合することにより低重合度のＦＧＡＧを取得した。しかし、過酸化剤処理による解重合方法は、多糖の分子量を低減し、ＦＧＡＧの化学構造特性と抗凝固活性を良好に保つことができるが、産物解重合度の制御が困難であるといった問題を抱え、通常、持続的に反応産物を採取して測定し、反応終了のタイミングを確認する必要があった。なお、非還元性末端にΔ４，５不飽和結合を有するフコシル化グリコサミノグリカン誘導体については未だに情報がないのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、抗凝固活性を示す低分子量フコシル化グリコサミノグリカン誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｅ  ｏｆ  Ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，「ｄＬＦＧ」と称する。）、その製造方法、前記ｄＬＦＧ又はその薬学的に許容可能な塩を含んでなる薬物組成物、並びに、前記ｄＬＦＧ及びその薬物組成物の血栓症治療薬の製造における用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の目的を達成すべく、本発明は、以下の技術案を提供する。
【０００９】
本発明は、まず、低分子量フコシル化グリコサミノグリカン誘導体（ｄＬＦＧ）又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。前記ｄＬＦＧの構成単糖として、ヘキスロン酸、ヘキソサミン、デオキシヘキソース及びこれら単糖の硫酸エステルを含む。そのうち、前記ヘキスロン酸が、Ｄ−グルクロン酸（Ｄ−ＧｌｃＵＡ）及びΔ４，５−ヘキスロン酸（４−デオキシ−スレオ−ヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸、ΔＵＡ）であり、前記ヘキソサミンが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（２−Ν−アセチルアミノ−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）又はその末端基還元物であり、前記デオキシヘキソースが、Ｌ−フコース（Ｌ−Ｆｕｃ）である。
【００１０】
前記ｄＬＦＧの単糖及び−ＯＳＯ３−の組成比範囲が、モル比でヘキスロン酸：ヘキソサミン：デオキシヘキソース：硫酸エステル基＝１：（１±０．３）：（１±０．３）：（３．０±１．０）である。一般的に、本発明に係るｄＬＦＧに含まれるヘキスロン酸において、ΔＵＡの占有比率がモル比で２．５％以上である。
【００１１】
本発明に係るｄＬＦＧの分子量は、高速ゲル浸透クロマトグラフィーと低角度レーザー光散乱検出器をタンデム（ＨＰＧＰＣ−ＬＡＬＬＳ）に繋いで測定できる。分子量が測定済みの一連のｄＬＦＧを標準品として用いて検量線を作成することで、高速ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）に、紫外線検出器（ＵＶＤ）及び／又は示差屈折率検出器（ＲＩＤ）を組合わせて前記ｄＬＦＧの分子量を常時測定することができる。
【００１２】
本発明に係るｄＬＦＧの分子量は、重量平均分子量（Ｍｗ）で３ｋＤ〜２０ｋＤの範囲である。本発明の好適な実施形態において、前記ｄＬＦＧの重量平均分子量が約５ｋＤ〜ｌ２ｋＤの範囲である。本発明に係るｄＬＦＧの多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ，ＰＤＩ）は、通常、１．０〜１．８の範囲にある。ここで、ＰＤＩとは前記ｄＬＦＧの重量平均分子量Ｍｗと数平均分子量Ｍｎとの比を示すものである。本発明の一好適な実施形態において、前記ｄＬＦＧのＰＤＩ値は１．１〜１．５の範囲にある。
【００１３】
そして、本発明に係る低分子量グリコサミノグリカン誘導体は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物である。
【００１４】
【化１】
0006293862.tif 000002
（式（Ｉ）中、ｎは、平均値が約２〜２０の整数であり、本発明の化合物の一好適な実施形態において、ｎは、平均値が約４〜１２の整数である。−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−β１−は、−Ｄ−グルクロン酸−β１−イル−であり、−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−β１−は、−２−デオキシ−２−Ν−アセチルアミノ−Ｄ−ガラクトース−β１−イル−であり、Ｌ−Ｆｕｃ−α１−は、−Ｌ−フコース−α１−イル−である。Ｒは、各々独立して−ＯＨ又は−ＯＳＯ３−であり、Ｒ’は、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ７〜Ｃ１２アリールオキシである。Ｒ１は、本発明に係る同族グリコサミノグリカン誘導体の非還元性末端であり、その構造式が下記式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される。
【化２】
0006293862.tif 000003
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、ΔＵＡ−１−は、Δ４，５−ヘキスロン酸−１−イル（４−デオキシ−スレオ−ヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸−１−イル）であり、Ｒは、上記と同じである。
本発明に係る同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物において、前記Ｒ１が式（ＩＩ）で評される反応基の化合物とＲ１が式（ＩＩＩ）で表される反応基の化合物との比がモル比で２：１以上である。本発明の一好適な実施形態において、前記同族グリコサミノグリカン誘導体の混合物において、非還元性末端Ｒ１が式（ＩＩ）の構造と式（ＩＩＩ）の構造とがモル比で約４：１以上である。
前記Ｒ２は、下記式（ＩＶ）又は式（Ｖ）で示される通りである。
【化３】
0006293862.tif 000004
式（ＩＶ）又は式（Ｖ）中、Ｒは、上記と同じである。Ｒ３は、カルボニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、置換又は非置換の５員又は６員窒素含有複素環、又は−ＮＨＲ４である。そのうち、Ｒ４は、置換又は非置換の直鎖状又は分岐鎖状Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換又は非置換のＣ７〜Ｃ１２アリール、置換又は非置換のヘテロ原子含有複素環式アリールである。本発明の一好適な実施形態において、前記Ｒ３は、−ＣＨＯ又は−ＣＨ２ＯＨである。式（Ｖ）中、Ｒ’は、上記と同じである。）
【００１５】
本発明に係るｄＬＦＧは、棘皮動物門ナマコ綱動物の体壁及び／又は内臓から抽出したフコシル化グリコサミノグリカン（Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ＦＧＡＧ）を、β−脱離法（β−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を利用して処理することにより得られた解重合産物、並びに、前記ＦＧＡＧｓの解重合産物の還元性末端を還元又は還元アミノ化した産物である。前記棘皮動物に由来のＦＧＡＧは、通常、以下の特徴を有する。
【００１６】
（１）  前記ＦＧＡＧは、棘皮動物門ナマコ綱動物の体壁又は内臓から抽出され、その抽出、製造方法は当業者が熟知しており、また、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，１９９２，３３：４９５９〜４９６２．Ｍｏｕｒａｏ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１：２３９７３〜２３９８４．Ｍｏｕｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ，２００１，１０２：１６７〜１７６．Ｍｏｕｒａｏ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１：２３９７３〜２３９８４．Ｔｏｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１９９６，１２６：１８５〜１９５．Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，１３２（２）：３３５〜３４３．Ｂｏｒｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００７，２８２（２０）：１４９８４〜１４９９１等を参酌することもできる。
【００１７】
（２）  前記ＦＧＡＧの構成単糖として、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）、Ｄ−Ｎ−アセチル−２−アミノ−２−デオキシガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、及びＬ−フコース（Ｆｕｃ）を含み、これらの構成単糖に置換基として硫酸エステル基を有してもよい。
【００１８】
（３）  前記ＦＧＡＧの主鎖に［−４−Ｄ−ＧｌｃＵＡ−β１−３−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ−β１−］の繰り返し構造単位を含み、Ｆｕｃ糖残基は、側鎖の形で主鎖のＧｌｃＵＡ糖残基に結合する。
【００１９】
好ましくは、前記ＦＧＡＧは、下記式（ＶＩ）に示す構造を有する。
【００２０】
【化４】
0006293862.tif 000005
（式（ＶＩ）中、ｎは、平均値が約４０〜９０の整数であり、Ｒは、各々独立して−ＯＨ又は−ＯＳＯ３−であり、Ｒ５は、−Ｈ又はＤ−ＧｌｃＵＡ−β１−であり、Ｒ６は、−ＯＨ、−４−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ又はその硫酸エステルである。）
【００２１】
本発明で言う棘皮動物門ナマコ綱動物としては、マナマコ（Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、クリイロナマコ（Ａｃｔｉｎｏｐｙｇａ  ｍａｕｒｉｔｉａｎａ）、チリメンナマコ（Ａｃｔｉｎｏｐｙｇａ  ｍｉｌｉａｒｉｓ）、イモナマコモドキ（Ａｃａｕｄｉｎａ  ｍｏｌｐａｄｉｏｉｄｅｓ）、ジャノメナマコ（Ｂｏｈａｄｓｃｈｉａ  ａｒｇｕｓ）、アカミシキリ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｅｄｕｌｉｓ）、イシナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｎｏｂｉｌｉｓ）、ニセクロナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａ）、シナナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｉｎｉｃａ）、クロナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｖａｇａｂｕｎｄａ）、メキシコナマコ（Ｉｓｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｂａｄｉｏｎｏｔｕｓ）、ブラジルナマコ（Ｌｕｄｗｉｇｏｔｈｕｒｅａ  ｇｒｉｓｅａ）、シカクナマコ（Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｃｈｌｏｒｏｎｏｔｕｓ）、バイカナマコ（Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ  ａｎａｎａｓ）、アデヤカバイカナマコ（Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ  ａｎａｘ）からなる群より選ばれる１種以上を用いるが、これらに制限されない。
【００２２】
本発明の好適な１つの実施形態として、前記棘皮動物門ナマコ綱動物として、マナマコ、ニセクロナマコ及びバイカナマコを用いることが好ましい。
【００２３】
本発明の別の１つの目的は、本発明に係るｄＬＦＧ又はその薬学的に許容可能な塩を製造する方法を提供し、該製造方法は、通常、以下のステップを含んでなる。
【００２４】
（１）  棘皮動物に由来のフコシル化グリコサミノグリカン（ＦＧＡＧ）を原料とし、エステル化反応を経て前記ＦＧＡＧに含まれるＧｌｃＵＡの遊離カルボキシ基全部又は一部をカルボン酸エステル基に変換し、ＦＧＡＧのカルボン酸エステル誘導体を得る。
【００２５】
（２）  ステップ（１）で得られるＦＧＡＧのカルボン酸エステル誘導体を、非水溶媒、アルカリ性試薬の存在下において、カルボン酸エステル基のβ−脱離反応を経て非還元性末端としてΔ４，５−ヘキスロン酸（ΔＵＡ）を含む低分子量グリコサミノグリカン誘導体（ｄＬＦＧ）を得る。
【００２６】
（３）  ステップ（２）で得られるｄＬＦＧに対し、随意に還元性末端を還元処理し、末端が還元化されたｄＬＦＧを得る。
【００２７】
（４）  ステップ（２）及びステップ（３）で得られるｄＬＦＧに対し、選択的にアルカリ分解法を利用してカルボン酸エステル及び／又はアミド基を遊離カルボキシ基に変換する。
【００２８】
本発明者によって鋭意検討を重ねた結果、天然由来のフコシル化グリコサミノグリカン（ＦＧＡＧ）はアルカリ性水溶液において比較的に安定であるが、温度上昇、アルカリ性が強くなる等の過激な反応条件において、ＦＧＡＧがβ−脱離反応の進行と同時に、フコース側鎖、主鎖糖構造及び硫酸エステル基の分解等といったグリコシル化グリコサミノグリカン構造特性の変化を伴うため、反応産物を予測しにくく、反応産物の化学構造が複雑で確認するのに手間がかかり、ＦＧＡＧに直接的にアルカリ処理を施すことでは均一な構造を有するＦＧＡＧの解重合産物を得ることが困難であることを見出した。
【００２９】
そこで、ＦＧＡＧをβ−脱離法により解重合する（以下、単に「β−脱離解重合」とも称する）目的を達成するため、本発明において、ヘキスロン酸の遊離カルボキシ基を選択的にエステル化することにより、穏やかな条件においてグリコシル化グリコサミノグリカンの特徴的構造の完全性を維持できるβ−脱離解重合法を確立した。本発明において、前記「特徴的構造の完全性」とは、分子量低下及び末端糖残基（還元性末端と非還元性末端の糖残基を含む）の化学修飾を除き、単糖の組成及び割合、繰り返し構造単位の結合方式、硫酸エステル基の数及び種類等、解重合産物の基本的な化学的構造特性が非解重合の多糖と同じであることを意味する。
【００３０】
本発明において、ＦＧＡＧカルボキシ基のエステル化産物の製造方法は、以下のとおりである。
【００３１】
（１）  例えば、Ｈ＋型のカチオン交換樹脂を用いて、ＦＧＡＧ水溶液中の中性のＦＧＡＧ塩をＨ＋型のＦＧＡＧに変換する等、イオン交換法によりＦＧＡＧを第４級アンモニウム塩に変換する。
【００３２】
（２）  得られたＨ＋型のＦＧＡＧ溶液を第４級アンモニウム塩基溶液で滴定、中和することによりＦＧＡＧの第４級アンモニウム塩溶液を得た後、該溶液を凍結乾燥してＦＧＡＧの第４級アンモニウム塩を得る。前記第４級アンモニウム塩基として、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド、ドデシルトリメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラプロピルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド、ベンジルトリエチルアンモニウムヒドロキシド等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
（３）  ＦＧＡＧの第４級アンモニウム塩を、例えば、ジメチルホルムアミド（Ｎ、Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）等の非プロトン性溶媒において化学反応量のハロゲン化炭化水素と反応させた後、反応産物を分離、精製してＦＧＡＧカルボキシエステル誘導体（第４級アンモニウム塩、該第４級アンモニウム塩をそのままβ−脱離反応に用いることができる）を得る。前記ハロゲン化炭化水素のアルキル基として、Ｃ１〜Ｃ６直鎖又は分岐鎖、飽和又は不飽和、置換又は非置換の脂肪族アルキル、置換又は非置換のＣ７〜Ｃ１２芳香族アルキル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明者による別の特許出願である中国特許出願第２０１１１０３１８７０４．Ｘ号（公開番号：ＣＮ１０２３２９３９７Ａ）にＦＧＡＧカルボキシエステル誘導体の製造方法について記載があり、関連記載を参酌することができる。
【００３５】
低分子ヘパリンを製造する際、未分画ヘパリンのカルボン酸エステル誘導体はアルカリ性水溶液中でβ−脱離反応を生じ、末端にΔＵＡを含む低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を得ることができる。本発明者の実験研究から、驚くことに、似たような条件、例えば、ＮａＯＨの水溶液において、ＦＧＡＧのカルボキシエステル化産物が完全にプロトタイプのＦＧＡＧに加水分解し、β−脱離反応が稀にしか若しくは殆ど起こらないといった現象を発見した。そこで、本発明において、ＦＧＡＧカルボキシエステル誘導体のβ−脱離反応が起こりうる非水溶媒系に注目して検討を行った。
【００３６】
上述のｄＬＦＧ又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法において、ステップ（２）における非水溶媒として、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨＣｌ３、又はこれらの混合溶媒から任意に選ぶことができる。また、前記アルカリ性試薬として、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃ１〜Ｃ４ナトリウムアルコラート、エチレンジアミン、トリブチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、ジアザビシクロ、又はこれらの混合物から任意に選ぶことができる。
【００３７】
非水溶媒を用いてＦＧＡＧカルボキシエステル誘導体のβ−脱離反応を遂行する際、解決すべき重要な技術課題の１つは、ＦＧＡＧカルボキシエステル誘導体の非水溶媒における溶解度が極めて悪く、β−脱離反応の進行が大きく影響を受けるという点である。本発明において、ＦＧＡＧカルボキシエステル誘導体の非水溶媒における溶解度を高めるため、該誘導体を更に第４級アンモニウム塩に変換させ、脱離反応の需要に対応できるＦＧＡＧカルボキシエステル誘導体の非水溶媒における溶解度を確保した。
【００３８】
エタノール等、単独の低級アルコール・ケトンを溶媒とする場合、ＦＧＡＧカルボキシエステル化産物の第４級アンモニウム塩に対する溶解性が比較的低く、また、ジメチルホルムアミド（Ｎ、Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）のような他の非水溶媒を使用する場合、触媒であるＮａＯＨの溶解度がかなり低く、反応効率がかなり影響を受ける。そこで、本発明において、アルカリ性試薬にＣ１〜Ｃ４ナトリウムアルコラートを用いることでアルカリ性試薬の非水溶媒における濃度を高め、同時にβ−脱離反応の溶媒系として混合溶媒を選び、前記反応を以下のステップに分けて行う対策を取った。すなわち、ＦＧＡＧカルボキシエステル誘導体の第４級アンモニウム塩をＤＭＦ等の適宜な非水溶媒に溶かし、また、ＮａＯＨ又は他の適宜なアルカリ触媒を無水低級アルコールに溶かした後、前記ＦＧＡＧのカルボキシエステル化産物の第４級アンモニウム塩溶液とアルカリ触媒溶液を混ぜ合わせることで透明なβ−脱離反応系を得ることができる。
【００３９】
前記アルカリ性試薬として、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃ１〜Ｃ４ナトリウムアルコラート、エチレンジアミン、トリブチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、ジアザビシクロ、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、アルカリ性試薬としてナトリウムエトキシドが好ましく、処理方法として無水エタノール溶液に化学反応量の金属ナトリウムを加え、ナトリウムエトキシド・エタノール溶液とすることが好ましい。
【００４０】
前記β−脱離反応液において、ＦＧＡＧカルボキシエステル誘導体の第４級アンモニウム塩の濃度が１〜１５０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、アルカリ触媒の濃度が０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記β−脱離反応液を用いることにより、ＦＧＡＧカルボキシエステル化産物のβ−脱離反応がスムーズに行われ、通常、室温で０．１〜８時間であれば完全に反応させることができる。β−脱離反応が終了すると、酸（例えば、塩酸）で反応液を中和してカルボキシエステル化のｄＬＦＧ産物を得ることができる。又は、反応液のアルカリ性を変えることなく、反応液に適量の水を加えてから室温で約０．５〜１時間保持することにより、解重合済のｄＬＦＧ誘導体に含まれるカルボン酸エステル基を完全に加水分解することできる。このとき、酸で反応液を中和して遊離カルボキシを含むｄＬＦＧ産物を得ることができる。
【００４１】
ＦＧＡＧカルボキシエステルの製造及びβ−脱離解重合は、通常、以下の手順に従って行う。
【００４２】
つまり、ＦＧＡＧ中性塩をＨ＋カチオン交換樹脂カラムで処理し、第４級アンモニウム塩基で滴定、中和してＦＧＡＧの第４級アンモニウム塩に変換し、非プロトン性溶媒においてハロゲン化炭化水素と室温又は加熱条件下で反応させて（カルボキシエステル化）ＦＧＡＧのカルボキシエステル化産物（第４級アンモニウム塩）を得た後、非水溶媒で溶かし、更に強塩基を加えて室温又は加熱条件下で反応させることにより（β−脱離）、ｄＬＦＧ（ＦＧＡＧのβ−脱離解重合産物）を得る。
【００４３】
理論的には、ＦＧＡＧのカルボキシエステル化率が約５％〜３０％である場合、本発明で言うβ−脱離解重合により得られる産物の分子量が約３ｋＤ〜２０ｋＤの範囲にある。しかし、実際反応に当たり実験条件の相違によってβ−脱離反応の進行度が影響されることから、カルボキシエステル化率が約１０％〜６０％のＦＧＡＧカルボキシエステル化産物を用いた場合、β−脱離反応を介して解重合する際にＭｗが約３ｋＤ〜２０ｋＤのｄＬＦＧ産物を得ることができる。
【００４４】
本発明において、β−脱離によって得られるｄＬＦＧに還元性末端が存在し、該還元性末端としては、主に−４−Ｄ−Ｎ−アセチル−２−アミノ−２−デオキシガラクトース（−４−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）で構成される。本発明において、該還元性末端を還元反応させて末端修飾を施してもよく、前記還元反応として特に限定がなく、以下のものが挙げられる。
【００４５】
（１）  水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在下で還元性末端を糖アルコールに還元する。例えば、−４−Ｄ−Ｎ−アセチル−２−アミノ−２−デオキシガラクトースの場合、反応プロセスは、下記式に示される通りである。
【００４６】
【化５】
0006293862.tif 000006
（式中、Ｒが−ＯＨ又は−ＯＳＯ３−である。）
【００４７】
（２）  有機アミンの存在下で還元性末端をアミノ基に還元し、該反応は、有機アミンと末端糖残基の１位アルデヒド基が反応してシッフ塩基を形成し、後者が還元剤の存在下で第２級アミンに還元されることである。末端−４−Ｄ−Ｎ−アセチル−２−アミノ−２−デオキシガラクトースと、炭酸水素アンモニウム及び第１級アミンとの反応を例として挙げると、反応プロセスは、下記式に示される通りである。
【００４８】
【化６】
0006293862.tif 000007
（式中、Ｒ４は、Ｈ、置換又は非置換の直鎖状又は分岐鎖状Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換又は非置換のＣ７〜Ｃ１２アリール、置換又は非置換のヘテロ原子含有複素環基である。前記ヘテロ原子としては特に限定がなく、Ｏ、Ｎ、Ｓであってもよい。）
【００４９】
（３）還元性化合物の存在下で還元性末端を還元アルキル化し、還元アルキル化された誘導体を得る。末端−４−Ｄ−−アセチル−２−アミノ−２−デオキシガラクトースと、還元剤としてピラゾロン系化合物との反応を例として挙げると、反応プロセスは、下記式に示される通りである。
【００５０】
【化７】
0006293862.tif 000008
【００５１】
アルドースの還元性末端の還元反応、還元アミノ化反応及び還元アルキル化反応は当業者には周知のことである。本発明において、前記β−脱離により得られたｄＬＦＧの還元性末端を前記還元反応において処理した後、式（ＩＶ）及び式（Ｖ）に示す末端糖残基を得ることができ、そのうち、Ｒ３がＣ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ６〜Ｃ１２アリール、置換又は非置換の５員又は６員窒素含有複素環基、又は−ＮＨＲ４（Ｒ４は、置換又は非置換の直鎖状又は分岐鎖状Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換又は非置換のＣ７〜Ｃ１２アリール、置換又は非置換のヘテロ原子含有複素環式アリールである。）であってもよい。
【００５２】
本発明に係る反応産物であるｄＬＦＧは、当分野で周知の方法（例えば、中国特許公開第１０１７３５３３６Ａ号に記載の方法等）を用いて精製してもよく、例えば、透析法又は限外濾過膜法を利用して低分子塩等の不純物を取り除き、その後、ゲルクロマトグラフィーやＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを用いて更に精製してもよい。
【００５３】
前記透析を利用して不純物を除去する際、標的ｄＬＦＧの分子量に合わせて適宜な分画分子量を有する透析膜又は限外濾過膜カセットを選ることができ、分画分子量が１０００Ｄａのものを用いるのが好ましい。透析時間は、特定の処理条件に応じて確定し、６時間以上とするのが一般的である。
【００５４】
本発明に係るｄＬＦＧ産物は、更にカチオン交換により、例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属塩及び有機アンモニウム塩等の単塩にすることができる。本発明の好適な実施形態において、前記ｄＬＦＧの単塩として、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩が挙げられる。
【００５５】
ｄＬＦＧ産物を塩に変換する際、まずサンプルを水素型に変え、その後、相応のアルカリで中和してｄＬＦＧ塩にすることができる。また、動的イオン交換を利用してカラム上で直接に塩に変換してもよく、このとき、強酸性カチオン交換樹脂を利用することができる。樹脂カラムの前処理、サンプルの注入及び溶出は、何れも慣用方法を用いることができる。
【００５６】
本発明に係るｄＬＦＧは、棘皮動物に由来のＦＧＡＧを出発原料とし、β−脱離反応を経て製造される。以上で述べたように、本発明において、出発原料であるＦＧＡＧの母体動物については特に限定がなく、マナマコ、クリイロナマコ、チリメンナマコ、イモナマコモドキ、ジャノメナマコ、アカミシキリ、イシナマコ、ニセクロナマコ、シナナマコ、クロナマコ、メキシコナマコ、ブラジルナマコ、シカクナマコ、バイカナマコ、アデヤカバイカナマコから選ぶことができる。本発明の好適な実施例形態において、前記母体動物は、マナマコ、ニセクロナマコ及びバイカナマコから選ばれる。
【００５７】
本発明に係る棘皮動物ナマコ綱に由来のＦＧＡＧの構造特性として、等モル比（約１：１±０．３）に近いＧｌｃＵＡ、ＧａｌＮＡｃ、及びフコース又はその硫酸エステルを含む。ナマコの品種及び組織材料が異なるとか、又は抽出方法が異なるとかでＦＧＡＧの単糖組成比及び多糖の硫酸化度合いに一定の差異が見られるが、これらの差異によってＦＧＡＧの基本的な構造特性が影響されるわけでもない。当然のことながら、当業者であれば、別のナマコ品種に由来の、ＦＧＡＧの基本的な構造特性を有するフコシル化グリコサミノグリカンも本発明に係るｄＬＦＧ誘導体の製造に適用可能であることが理解できる。
【００５８】
本発明に係るｄＬＦＧは、優れた抗凝固活性を有し、人コントロール血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を倍増するときの薬物濃度（ＡＰＴＴを１倍延長するときの薬物濃度）が９μｇ／ｍＬ以下である。本発明者の研究から、前記ｄＬＦＧが第Ｘ因子活性化複合体（ｆ．Ｘａｓｅ，Ｔｅｎａｓｅ）に対して強い阻害活性を示すと共に、ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）に依存的な抗トロンビン（ｆ．ＩＩａ）活性を示すことを見出した。第Ｘ因子活性化複合体が血液凝固系において内因性凝固機構の最下流に位置する標的であるため、各凝固実験系において律速因子として機能する因子である（Ｂｕｙｕｅ  ＆  Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４：３０９２〜３１００）。ＨＣ−ＩＩに依存的な抗トロンビン活性を示すデルマタン硫酸が臨床において既に抗血栓治療に使われていることから、ｄＬＦＧも血栓塞栓性疾患の治療に適用可能であると思われる。
【００５９】
本発明に係るｄＬＦＧは、血小板促進活性を示さない。なお、本発明者の研究から、天然由来のＦＧＡＧに比べ、本発明に係るｄＬＦＧが第ＸＩＩ因子を活性化する特性がなく、同時に第ＸＩＩ因子−カリクレイン系に対しても影響がなく、実験動物において血圧低下効果を示さないという驚くべき結果を得た。
【００６０】
本発明に係るｄＬＦＧの非還元性末端にΔＵΑ糖残基を有してもよく、ΔＵΑに不飽和二重結合が存在することから約２３２〜２３８ｎｍにおいて最大紫外線吸収（ＵＶ、λｍａｘ）を示し、該特性は、紫外線吸光光度法に基づいた定性・定量分析法を確立する際に極めて有用である。特に、高速液体ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＧＰＣ）を利用してサンプル中のｄＬＦＧ含有量を分析するとき、感度の比較的高いＵＶ検出器を用いて検出することができ、したがって、サンプルの品質管理、血中濃度分析等のｄＬＦＧ含有量分析に関わる技術手法を確立する際に特に有用である。
【００６１】
本発明に係るｄＬＦＧは確実な抗凝固活性を示し、抗血栓療法に適用可能である。ｄＬＦＧが良好な水溶性を示すことから、溶液製剤や凍結乾燥品を製造する際に特に便利である。多糖類成分として、経口投与する場合の生体利用度に限界があるため、非経口投与製剤にするのが好ましく、製剤製造に当たって当分野で慣用の技術手段を利用することができる。
【００６２】
したがって、本発明の別の目的は薬用組成物を提供することであり、前記薬用組成物は、本発明に係るｄＬＦＧと薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる。
【００６３】
本発明に係るｄＬＦＧは、抗凝固活性が高く、例えば、血栓性心血管疾患、血栓性脳血管疾患、肺静脈血栓、末梢静脈血栓、深部静脈血栓症、末梢動脈血栓等、症状が異なる血栓症の予防と治療に適用可能である。したがって、本発明は、前記組成物の心血管疾患の治療薬及び予防薬製造における用途を提供することができる。
【００６４】
本発明に係るｄＬＦＧは抗凝固活性が高く、例えば、血栓性心血管疾患、血栓性脳血管疾患、肺静脈血栓、末梢静脈血栓、深部静脈血栓症、末梢動脈血栓等、各種の血栓症の予防と治療に適用可能である。したがって、本発明は、前記組成物の心血管疾患の治療薬及び予防薬の製造における用途を提供することができる。
【発明の効果】
【００６５】
本発明者が鋭意検討を重ねた結果、初めてＦＧＡＧのβ−脱離解重合法を確立した。本発明者の実験検討から、プロトタイプのＦＧＡＧがアルカリ性溶液において比較的安定し、β−脱離反応を起こし難いと確認できた。カルボキシ基をエステル化した後にβ−脱離を行うことも技術手段として１つの選択肢であるが、ＦＧＡＧにフコシル基の側鎖置換があるため、多糖構造がより複雑になってしまい、その複雑な立体障害によって各官能基の化学反応特性が影響されやすく、更に、様々な化学反応条件によっては側鎖フコシル基中のグリコシド結合の安定性にバラツキが生じやすい。本発明者らは、驚くべきことに、ＦＧＡＧカルボキシエステル化産物がヘパリンエステル化産物と違ってアルカリ性水溶液においてβ−脱離反応を起こさないという現象を発見した。実際、アルカリ性水溶液中において、ＦＧＡＧカルボキシエステル化産物のエステル基は特に加水分解され易く、β−脱離反応が殆ど起こらず、ヘパリン等の典型的なグリコサミノグリカン系化合物とはかなり違った特性を示している。
【００６６】
本発明は、ＦＧＡＧカルボキシエステル化産物を非水溶媒においてβ−脱離反応させ、非還元性末端にΔ４，５不飽和結合を有するフコシル化グリコサミノグリカン解重合産物を得ることに成功した。本発明の技術方法によれば、適宜な分子量に解重合されたフコシル化グリコサミノグリカン誘導体（ｄＬＦＧ）を得ることができる。理化学及び分光学的手段を利用して化学構造を解析した結果、Δ４，５不飽和結合を除き、還元性末端の基本構造に特に変化がないことが確認できた。
【００６７】
本発明に係る方法を利用してＬＦＧを製造する場合、カルボキシエステル化及び／又はアミド化の度合いを調整することで反応産物の分子量を効果的に制御することができる。反応産物の非還元性末端にΔ４，５不飽和結合があるため、得られたｄＬＦＧは約２３２〜２４０ｎｍにおいて最大紫外線吸収（λｍａｘ）を示し、該特性を利用して産物を定量的に検出することができ、よって、化学反応の制御、産物品質の分析、及び血中濃度検出等の含有量分析に関する技術手法を確立するのに特に便利である。
【００６８】
薬理学の実験検討から、本発明に係る方法により製造されたｄＬＦＧが高い抗凝固活性を示し、人コントロール血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を延長することができ、第Ｘ因子活性化複合体（ｆ．Ｘａｓｅ，Ｔｅｎａｓｅ）の活性を阻害し、並びに、そのヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）に依存的な抗トロンビン（ａｎｔｉ−ｆ．ＸＩＩａ）活性が類似した分子量を有する過酸化解重合産物に劣らず、高い応用価値があることが実証された。また、本発明のｄＬＦＧは、過酸化剤処理による解重合産物に比べて特定構造の非還元性末端があるため、紫外線吸収特性としてλｍａｘが約２３２〜２４０ｎｍに現れ、品質管理に便利であり、製造プロセスを監視、制御し易いといった長所がある。
【００６９】
本発明者によって鋭意検討を重ねた結果、本発明に係るｄＬＦＧが抗凝固薬としての有効投与量で血小板及び第ＸＩＩ因子に対して促進活性を示さず、血小板活性化及び第ＸＩＩ因子−カリクレイン系活性化に起因する一連の有害反応を回避することのできることを見出した。また、ヘパリン系薬物を同様の抗血栓効果を示す投与量で投与する場合に比べ、本発明に係る低分子量ＦＧＡＧは、出血傾向が更に低下し、血栓症の治療及び／又は予防において有用であると認められる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＴＡＧとｄＬＦＧ−１ＡのＨＰＧＰＣ解析結果を示す図である。
【図２】図２の中の図２（ａ）がＴＡＧの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルであり、図２（ｂ）がｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図３】ＴＡＧとｄＬＦＧ−１Ａの １３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図４】ＴＡＧとｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲスペクトルである。
【図５】図５において、図５（ａ）がＴＡＧの１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹスペクトル、図５（ｂ）がＴＡＧの１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹスペクトル、図５（ｃ）がｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹスペクトル、図５（ｄ）がｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹスペクトルである。
【図６】ｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルである。
【図７】ＡＪＧ、ＬＧＧ及びＨＮＧの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図８】ＨＥＧとｄＨＥＧの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図９】ｄＬＦＧ−２Ａの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図１０】ｄＬＦＧ−１ＥのＨＣ−ＩＩに依存的な抗トロンビン活性の用量効果関係を示す図である。
【図１１】ｄＬＦＧ−１Ｅが第Ｘ因子活性化複合体活性を阻害するときの用量効果関係を示す図である。
【図１２】β―脱離法を用いてＦＧＡＧを解重合するときの基本的な反応ステップを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲がこれらに制限されるものではない。
【実施例１】
【００７２】
バイカナマコ（Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ  ａｎａｎａｓ）に由来の低分子量フコシル化グリコサミノグリカン誘導体（ｄＬＦＧ）の製造
【００７３】
１．１  材料
バイカナマコ（Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ  ａｎａｎａｓ  Ｊａｅｇｅｒ）は市販のものを使い、内臓を取り除いてから体壁を乾燥した。塩化ベンゼトニウム、塩化ベンジル、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（ΤΒΑ）、Ν、Ν−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム及びエタノール等の試薬は何れも市販の分析用試薬であった。
【００７４】
１．２  方法
（１）バイカナマコに由来のＦＧＡＧ（ＦＧＡＧ  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｌｅｎｏｔａ  ａｎａｎａｓ，ＴＡＧ）の抽出と製造：  バイカナマコの乾燥体壁３００ｇから、Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９０，２６５（９）：５０８１〜５０８５に記載の方法に従ってＴＡＧを製造し、収率が約１．５％、純度が９８％（ＨＰＧＰＣ、相対面積比較法）、重量平均分子量Ｍｗが６５，８９０Ｄａであった。
【００７５】
（２）ＴＡＧ４級アンモニウム塩の調製：  ステップ（１）で得られたＴＡＧ１．２ｇをビーカに入れ、脱イオン水４０ｍＬを加えて溶解させた。攪拌しながら７５ｍｇ／ｍＬの塩化ベンゼトニウム溶液で滴下し、溶液に白い沈殿物が現れた。滴下終了後に遠心分離にかけ、沈殿物を脱イオン水で３回洗浄し、最終沈殿物を常温で２４時間かけて真空乾燥し、ＦＧＡＧアンモニウム塩を２．６８ｇ得た。
【００７６】
（３）ＴＡＧのベンジルエステル化：  ステップ（２）で得られたＴＡＧ４級アンモニウム塩を丸底フラスコに入れ、２７ｍＬのＤＭＦを加えて溶解させた。塩化ベンジル１３．５ｍＬを加え、窒素ガス雰囲気、３５℃で攪拌しながら２５時間反応させ、反応が終了した後、反応液に飽和ＮａＣｌ３５ｍＬ、無水エタノール３００ｍＬを加え、３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上清を除去した。沈殿物を体積比が１：９の飽和ＮａＣｌ−無水エタノール２００ｍＬで３回洗浄した後、脱イオン水１００ｍＬで溶解し、３５００ｋＤの透析バッグを用いて２４時間透析して透析液を濃縮し、凍結乾燥してＦＧＡＧベンジルエステルを得た。 １Ｈ−ＮＭＲでエステル化率が７２％であると確認できた。
【００７７】
（４）ＴＡＧベンジルエステルテトラブチルアンモニウム塩の調製：  上記ステップ（３）で得られたＴＡＧベンジルエステルを、イオン交換法（Ｄｏｗｅｘ／ｒ５０Ｗ×８  ５０−１００（Ｈ），６０×３ｃｍ）により水素型に変換し、導電率計を使って監視しつつ０．４Ｍテトラブチルアンモニウムヒドロキシド溶液を滴下し、硫酸基と未エステル化のカルボキシ基を全部アンモニウム塩に変換させた。得られた溶液を凍結乾燥し、ＴＡＧベンジルエステルテトラブチルアンモニウム塩を合計１．３２６ｇ得た。
【００７８】
（５）β−脱離解重合：  上記ステップ（４）で得られたＴＡＧベンジルエステルテトラブチルアンモニウム塩８００ｍｇを８．０ｍＬのＤＭＦに溶かし、トリブチルアミン０．８ｍＬを加えて６０℃で攪拌しながら２４時間反応させた後、溶液に体積比が１：９の飽和ＮａＣｌと无水エタノールの混合液８０ｍＬを加え、３５００ｒｍｐで１５分間遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物に８ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨを加え、３０℃で４０分間反応させて残りのカルボン酸エステルを加水分解し、０．１Ｍ  ＨＣｌでｐＨを中性に調整した後に無水エタノール８０ｍＬを加え、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿物を８ｍＬの水に溶かし、水素型のイオン交換樹脂カラム（Ｄｏｗｅｘ／ｒ５０ｗ×８  ５０−１００（Ｈ），６０×３ｃｍ）にかけ、その後、０．１ＭのＮａＯＨでｐＨを中性に調整し、１ｋＤの透析バッグを用いて脱イオン水で２４時間透析し、凍結乾燥してβ−脱離解重合産物ｄＬＦＧ−１Ａを約３１０ｍｇ得た。
【００７９】
（６）ＴＡＧ及びそのβ−脱離解重合産物ｄＬＦＧ−１Ａの理化学的特性、単糖組成及びスペクトル測定
分子量：  高効ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）を用いて測定した。検出条件として、アジレント・テクノロジー社製の１２００シリーズクロマトグラフ、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｏｈｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱゲル浸透カラムを採用し、カラム温度が３５℃、移動相が０．１Ｍ塩化ナトリウム、流速が０．５ｍＬ／分間であり、アジレント社の１１００型ＲＩＤ―ＵＶＤシステムを用いて測定した。分子量確定済みの一連のＦＧＡＧを用いて検量線を作成し、ＧＰＣで分子量及び分布を算出した。
【００８０】
−ＯＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比：  電気伝導測定法を利用して測定した。
【００８１】
旋光度：  中国薬局方（２０１０版）第２部付録に記載のＶＩＥ法に従って測定を行った。
【００８２】
固有粘度：  中国薬局方（２０１０版）第２部付録に記載のＶＩＧ法に従い、ウベローデ粘度計を用いて測定した。
【００８３】
単糖組成の測定：  Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇｏｎ法によりアセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）の含有量を測定し、カルバゾール法によりグルクロン酸（Ｄ−ＧｌｃＵＡ）の含有量を測定した（張惟傑、糖複合体の生化学研究技術（第２版）、浙江大学出版社、１９９９、ｐ１９〜２０を参照可能）。４，５不飽和グルクロン酸残基（ΔＵΑ）の含有量は、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおけるＨ４の積分値とアセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）のメチル基の積分値との比により算出した。スイスブルカー社製のＡＶＡＮＣＥ  ＡＶ  ５００超伝導式核磁気共鳴装置（５００ＭＨｚ）を用いたＮＭＲスペクトル（検出条件として、溶媒がＤ２Ｏ（Ｎｏｒｅｌｌ社の９９．９Ａｔｏｍ％Ｄ）であり、内部標準物質としてトリメチルシリルプロピオン酸（ＴＳＰ−ｄ４）を使用し、温度が３００Ｋである。）を測定した。
【００８４】
紫外線吸収スペクトル（ＵＶ）の測定：  濃度が０．８５５ｍｇ／ｍＬのｄＬＦＧ溶液を用い、島津製作所製のＵＶ−２４５０を用いて１９０〜４００ｎｍの波長範囲を走査した。
【００８５】
１．３  結果
ＴＡＧ及び解重合産物ｄＬＦＧ−１Ａの理化学的特性、単糖組成の測定結果を表１に示す。ＴＡＧ及びｄＬＦＧ−１ＡのＨＰＧＰＣ解析結果を図１に示す。測定結果から、ＴＡＧに比べ、ｄＬＦＧ−１Ａの分子量及び固有粘度が大きく低下していることが確認できた。単糖組成の測定結果から、ＴＡＧとｄＬＦＧ−１Ａのヘキソサミン、ヘキスロン酸（ＵＡ、ＧｌｃＵＡとΔＵＡ両者の合計）、デオキシヘキソース（Ｆｕｃ）の組成比がさほど変わらないのが確認できた。後述の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルから、ＴＡＧにΔＵΑを含まず、ｄＬＦＧ−１Ａに含まれるΔＵＡとＧａｌＮＡｃとのモル比が約０．１８：１（モル比で、ΔＵＡが総ヘキスロン酸の約７．５％を占める。）であると確認できた。
【００８６】
【表１】
0006293862.tif 000009
【００８７】
ＵＶ分光光度計を用いて１９０ｎｍ〜４００ｎｍの波長範囲を走査した場合、ΔＵΑ不飽和結合の存在が起因となって、ｄＬＦＧが２３６ｎｍにおいて最大紫外線吸収λｍａｘを示した。
【００８８】
図２にＴＡＧ及びｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ  ＮＭＲスペクトル、図３にＴＡＧ及びｄＬＦＧ−１Ａの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル、図４にＴＡＧ及びｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ―１Ｈ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲスペクトル、図５（ａ）にＴＡＧの１Ｈ―１Ｈ  ＲＯＥＳＹスペクトル、図５（ｂ）にＴＡＧの１Ｈ―１Ｈ  ＴＯＣＳＹスペクトル、図５（ｃ）にｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ―１Ｈ  ＲＯＥＳＹスペクトル、図５（ｄ）にｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ―１Ｈ  ＴＯＣＳＹスペクトル、及び図６にｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルをそれぞれ示す。ＴＡＧの１Ｈ  ＮＭＲ及びスペクトル信号の帰属に関しては、本出願人による中国特許公開第１０２２４７４０１Ａ号の記載を参酌することもできる。
【００８９】
ＴＡＧの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて、５．２〜５．７ｐｐｍの範囲に３組の比較的強い信号ピークが現れ、硫酸エステル化パターンの異なるα−フコース末端基における水素原子による信号であると認められ、そのうち、約５．６ｐｐｍに現れる信号は、Ｌ−フコース−２，４−ジ硫酸エステル基（Ｆｕｃ２Ｓ４Ｓ）の末端基における水素原子によるものであり、約５．３０〜５．３９ｐｐｍに現れるピークは、Ｌ−フコース−３−硫酸エステル基（Ｆｕｃ３Ｓ）及びＬ−フコース（Ｆｕｃ４Ｓ）−４−硫酸エステル基の末端基における水素原子によるものであった。
【００９０】
ＧｌｃＵＡ主鎖とＧａｌＮＡｃ末端基のβ−水素信号は、約４．４〜４．６ｐｐｍに現れた。約１．０〜１．３ｐｐｍ及び１．９〜２．０ｐｐｍに、それぞれＦｕｃメチル基及びＧａｌＮＡｃアセチル基のメチル基におけるプロトン信号ピークが現れた。硫酸エステル基の置換位置における糖環水素は、約４．２〜４．８ｐｐｍの範囲内に現れ、約３．６〜４．６ｐｐｍにある信号は、硫酸エステル基の置換位置とは別の糖環水素の重ね合わせによるものであった。
【００９１】
ＴＡＧスペクトルに比べ、ｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて、約５．７６及び５．８２ｐｐｍに新たな信号ピークが現れ、関連の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルから、これらの信号がΔＵＡの４位水素特有の信号に該当すると確定できる。
【００９２】
ｄＬＦＧ−１Ａの１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル及びＴＯＣＳＹスペクトルから、ΔＵＡのＨ４、Ｈ３、Ｈ２及びＨ１プロトン信号が互いにカップリングして相関性が示された。１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹスペクトルから、Ｆｕｃがα（１，３）グリコシド結合を介してＧｌｃＵＡ及びΔＵＡに結合していることが確認できた。なお、ＧｌｃＵＡに結合するＦｕｃの末端基水素信号に比べ、ΔＵＡに結合する同類Ｆｕｃの末端基水素信号がやや高周波側に現れた（図２（ａ）、２（ｂ）におけるＦｕｃ２Ｓ４Ｓの末端基水素信号、及びΔＵＡに結合するＦｕｃ２Ｓ４Ｓの末端基水素信号の位置を参考することができる）。
【００９３】
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳを外部標準物とする）において、ＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃのＣ１ピークが約９７〜１０４ｐｐｍに現れ、ΔＵΑのＣ１ピークが約１０３．５ｐｐｍに現れ、Ｃ４の化学シフトが１０６．８ｐｐｍであり、Ｃ５の化学シフトが約１４８．５ｐｐｍであった。
【００９４】
水素スペクトル、炭素スペクトル及び関連のスペクトルの解析から、ｄＬＦＧ−１Αの主要構成単糖として、ＧｌｃＵＡとＧａｌＮＡｃがβ（１−３）とβ（１−４）グリコシド結合を介して互いに連結して多糖主鎖を構成し、主鎖の二糖構造単位になっているのが確認できた。ＧｌｃＵＡのΗ２、Η３化学シフトに基づき、更にＲＯＥＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣを合わせて解析することにより、Ｆｕｃがα（１→３）グリコシド結合を介してＧｌｃＵＡに結合するのが確認できた。このことから、ｄＬＦＧ−１Ａにおいて、非還元末端に位置するヘキスロン酸が主にΔＵＡで構成されることが実証された。
【００９５】
【表２】
0006293862.tif 000010
【実施例２】
【００９６】
ＴＡＧのβ−脱離解重合による低重合度フコシル化グリコサミノグリカン誘導体（ｄＬＦＧ）の製造
【００９７】
２．１  材料
実施例１と同様の方法を用い、バイカナマコ由来のＴＡＧを製造した。試薬は、実施例１と同じものを使用した。
【００９８】
２．２  方法
（１）ＴＡＧ第４級アンモニウム塩の調製：  実施例１に記載の方法に従い、ＴＡＧ第４級アンモニウム塩を５．０２ｇ製造した。
【００９９】
（２）ベンジルエステル化度が異なるＴＡＧベンジルエステルの調製：  ステップ（１）で得られたＴＡＧ第４級アンモニウム塩に５０ｍＬのＤＭＦを加え、攪拌して溶解させた後、塩化ベンジル２５ｍＬを加え、３５℃で攪拌しながら反応させた。所定の反応時間でサンプルを約１５ｍＬ取って、各サンプル溶液にそれぞれ体積比でｌ：９の飽和ＮａＣｌ−無水エタノール１００ｍＬを加え、３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた沈殿物を体積比がｌ：９の飽和ＮａＣｌ−無水エタノール５０ｍＬで３回洗浄した。沈殿物を脱イオン水４０ｍＬに溶かした後、分画分子量が３５００ｋＤの透析バッグを用いて２４時間透析した。透析で得られた各捕獲液が異なるエステル化度のＴＡＧベンジルエステルの溶液であり、サンプルを採って凍結乾燥し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル法によりエステル化度がそれぞれ９％、２１％、２８％、４５％及び５６％であると確定した。
【０１００】
（３）ＴＡＧベンジルエステルテトラブチルアンモニウムの調製：  ステップ（２）で得られたエステル化度が異なるＴＡＧベンジルエステルの各溶液を６ｍＬに濃縮し、交換樹脂法を利用して水素型に変えた後、導電率計で監視しつつ０．４Ｍテトラブチルアンモニウムヒドロキシド溶液を滴下し、硫酸基と未エステル化のカルボキシ基を全部テトラブチルアンモニウム塩（ｐＨを約７．５〜８．０に調整）に変換させた。得られた溶液を凍結乾燥し、エステル化度が異なるＴＡＧベンジルエステルテトラブチルアンモニウム１．５２３ｇ、１．５１８ｇ、１．４９３ｇ、１．４９０ｇ及び１．７３１ｇを得た。
【０１０１】
（４）分子量が異なるβ−脱離解重合産物ｄＬＦＧの製造：  ステップ（３）で得られたエステル化度が異なるＴＡＧベンジルエステルテトラブチルアンモニウムに対し、アンモニウム塩５０ｍｇ当たりにＤＭＦ・ＣＨ２Ｃｌ２１ｍＬと０．１Ｍ  ＮａＯＨ−ＥｔＯＨ１ｍＬの割合でＤＭＦ又はＣＨ２Ｃｌ２、及び新たに調製した１００ｍＭ  ＮａＯＨ−ＥｔＯＨを加え、透明な黄色い溶液を得た。２５℃で攪拌しながら１時間反応させた後、速やかに１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを中性に調整することにより反応を中止させ、溶液に飽和塩化ナトリウム２ｍＬ、無水エタノール２０ｍＬを加え、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿物を回収した。４ｍＬのＨ２Ｏで該沈殿物を溶解し、イオン交換樹脂法を用いて産物を水素型に変え、０．１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを７〜８に調整した。
【０１０２】
（５）分子量が異なるβ−脱離解重合産物の精製：  ステップ（４）で得られた各溶液を１ｋＤの透析バッグに移し、脱イオン水で２４時間透析し、凍結乾燥して分子量が異なるβ−脱離解重合産物ｄＬＦＧ−１Ｂ、ｄＬＦＧ−１Ｃ、ｄＬＦＧ−１Ｄ、ｄＬＦＧ−１Ｅ及びｄＬＦＧ−１Ｆを得た。
【０１０３】
（６）ｄＬＦＧ−１産物の測定：  実施例１に記載の方法を用いてｄＬＦＧ−１Ｂ、−１Ｃ、−１Ｄ、−１Ｅ及び−１Ｆの分子量、−ＯＳＯ３−／ＣＯＯ−モル比、旋光度を測定した。
【０１０４】
２．３  結果
下記表３に、ｄＬＦＧ−１Ｂ、ｄＬＦＧ−１Ｃ、ｄＬＦＧ−１Ｄ、ｄＬＦＧ−１Ｅ及びｄＬＦＧ−ｌＦの理化学的特性の測定結果を示す。測定結果から、バイカナマコ由来のＴＡＧをβ−脱離により解重合したｄＬＦＧ産物は、収率が比較的高く、なおかつ狭い分子量分布を有すると確認でき、導電率法を利用して測定した結果から、硫酸エステル基に特に変化がなく、固有粘度が分子量の低下につれて低下することが確認できた。
【０１０５】
【表３】
0006293862.tif 000011
【実施例３】
【０１０６】
品種が異なるナマコに由来のＦＧＡＧのβ−脱離解重合産物の製造
【０１０７】
３．１  材料
マナマコ（Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アカミシキリ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｅｄｕｌｉｓ）、ブラジルナマコ（Ｌｕｄｗｉｇｏｔｈｕｒｅａ  ｇｒｉｓｅａ）、ニセクロナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｌｅｕｃｏｓｐｉｌｏｔａ）、及びイシナマコ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｎｏｂｉｌｉｓ）は何れも市販のものであり、体壁を分離して乾燥させた。
【０１０８】
３．２  方法
（１）  マナマコ、アカミシキリ、ブラジルナマコ、ニセクロナマコ及びイシナマコの体壁を乾燥した後に細かに粉砕し、粉砕物をそれぞれ３００ｇ取って実施例１に記載の方法（１）に従ってＦＧＡＧを抽出し、それぞれＡＪＧ、ＨＥＧ、ＬＧＧ、ＨＬＧ及びＨＮＧと表記した。
【０１０９】
（２）  ＡＪＧ、ＨＥＧ、ＬＧＧ、ＨＬＧ及びＨＮＧをそれぞれ約１ｇ用い、実施例に記載の方法（２）〜（５）に従ってβ−脱離解重合産物ｄＬＦＧを製造し、それぞれｄＡＪＧ、ｄＨＥＧ、ｄＬＧＧ、ｄＨＬＧ及びｄＨＮＧと表記した。前記ＦＧＡＧのβ−脱離法による解重合は、図１２に示されるステップに従って行った。
【０１１０】
３．３  結果
上記ステップ（１）において、アカミシキリ、ブラジルナマコ、ニセクロナマコ及びイシナマコの乾燥体壁からＡＪＧ、ＨＥＧ、ＬＧＧ、ＨＬＧ及びＨＮＧを分離、精製する際の収率がそれぞれ約１．４％、０．９％、０．８％及び１．１％であり、重量平均分子量が何れも約５０ｋＤ〜８０ｋＤの範囲にあった。図７の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにＦＧＡＧ系化合物としてのＡＪＧ、ＬＧＧ及びＨＮＧの基本特性が示され、α−Ｌ−Ｆｕｃ、β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ及びβ−Ｄ−ＧｌｃＵＡの末端基及び関連のプロトン信号が明確に示された。
【０１１１】
上記ステップ（２）において、ＡＪＧ、ＨＥＧ、ＬＧＧ、ＨＬＧ及びＨＮＧからｄＡＪＧ（８．６ｋＤ）、ｄＨＥＧ（ｌｌ．５ｋＤ）、ｄＬＧＧ（９．３ｋＤ）、ｄＨＬＧ（１０．２ｋＤ）及びｄＨＮＧ（９．７ｋＤ）を製造する際の収率が約７０％〜９０％の範囲にあった。図８に示されるＨＥＧとｄＨＥＧの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルに、β−脱離により解重合された非還元性末端ΔＵＡの特徴的信号が現れた。
【実施例４】
【０１１２】
ｄＡＪＧ末端還元産物の製造
【０１１３】
４．１  材料
実施例３と同様にして８．６ｋＤのｄＡＪＧを製造した。水素化ホウ素ナトリウムは、市販の分析用試薬を使用した。
【０１１４】
４．２  方法
ｄＡＪＧ５００ｍｇとＮａＢＨ４２５０ｍｇをそれぞれ０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液２０ｍＬに溶解し、ＮａＢＨ４溶液をｄＡＪＧ溶液に加え、得られた溶液を室温で一晩攪拌し続けた。翌日、更に２００ｍｇＮａＢＨ４を加え、引続き５時間攪拌した。その後、余分の水素化ホウ素ナトリウムを分解するために１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを約１０．３から約２．５に調整し、後に１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ値を中性に戻した。無水エタノール１５０ｍＬを加え、遠心分離して上清を除去した後、無水エタノール５０ｍＬで２回洗浄し、沈殿物を脱イオン水２０ｍｌに溶かし、３ｋＤの透析バッグを用いて脱イオン水で一晩透析し、透析で得られた捕獲液を凍結乾燥することにより末端基が還元されたｒｄＡＪＧを得た。
【０１１５】
４．３  結果
結果として、３８６．３ｍｇのｒｄＡＪＧが得られた。ＤＮＳ（３，５−ジニトロサリチル酸）法を用いて測定した結果、ｒｄＡＪＧの末端基がほぼ全部還元されているのが確認できた。
【実施例５】
【０１１６】
ｄＬＦＧ−１Ａの末端還元アミノ化産物ｄＬＦＧ−２Ａの製造
【０１１７】
５．１  材料
実施例１で製造したｄＬＦＧ−１Ａを用い、チラミン、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等は何れも市販の分析用試薬であった。
【０１１８】
５．２  方法
（１）ｄＬＦＧ−１Ａの末端還元アミノ化：  実施例１で得られたｄＬＦＧ−１Ａ０．１ｇを３．５ｍＬの０．２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かし、攪拌しながらそれぞれ過剰量の８０ｍｇチラミンと３０ｍｇシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた後、３５℃の恒温水槽で約７２時間反応させた。反応終了後、９５％のエタノール１０ｍＬを加え、遠心分離して沈殿物を得た。次に、沈殿物を９５％のエタノール３０ｍＬで２回洗浄した後、３５ｍＬの０．１％ＮａＣｌで該沈殿物を再び溶解し、遠心分離して不溶物を除去し、上清を１ＫＤの透析バッグに入れて脱イオン水で２４時間透析し、凍結乾燥してｄＬＦＧ−２Ａを８２ｍｇ得た。
【０１１９】
（２）理化学的特性及びスペクトル特性の測定：  ＨＰＧＰＣを用いて分子量及び分布を測定した。また、−ＯＳＯ３−／−ＣＯＯ−モル比は電気伝導測定法を利用し、アセチルガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）の含有量はＥｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇｏｎ法を利用し、グルクロン酸（Ｄ−ＧｌｃＵＡ）含有量はカルバゾール法を利用してそれぞれ測定した。Ｄ−ＧａｌＮＡｃ／Ｌ−Ｆｕｃモル比については、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおけるメチルピークの積分値により算出した（実施例１の場合と同様）。ＮＭＲスペクトルは、スイスブルカー社製のＡＶＡＮＣＥ  ＡＶ  ５００超伝導式核磁気共鳴装置（５００ＭＨｚ）を用いて測定した。
【０１２０】
５．３  結果
ｄＬＦＧ−１Ａ投入量から算出したｄＬＦＧ−２Ａ産物の収率は、約８２％であった。産物の組成について解析行った結果、Ｄ−ＧａｌＮＡｃ：Ｄ−ＧｌｃＵＡ：Ｌ−Ｆｕｃ：−ＯＳＯ３−が約１．００：０．９８：１．１０：３．６０であり、Ｍｗが約８，９６９、ＰＤＩが約１．４２であると確認でき、ＬＧＣ−１Ａ構造単位の重合度が約１０である理論計算結果とほぼ一致した。ｄＬＦＧ−２Ａの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図９に示す。
【０１２１】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２０，δ［ｐｐｍ］）：７．２５（２’，６’Ｈ）；６．８３（３’，５’Ｈ）；５．６５，５．３６，５．２８（Ｌ−Ｆｕｃα１Ｈ）；３．３８（８’Ｈ）；２．８２（７’Ｈ）；２．０２（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ，ＣＨ３）；１．３０〜１．３２（Ｌ−Ｆｕｃ，ＣＨ３）。ベンゼン環における水素とΔＵＡのＨ４との積分比が約１：０．２８であることから、産物の還元性末端が全て還元アミノ化されたと認められる。
【実施例６】
【０１２２】
還元アルキル化産物ｄＨＥＧ−ＰＭＰの製造
【０１２３】
６．１  材料
ＨＥＧ：  実施例３に記載の方法のステップ（１）に従い、アカミシキリに由来のＦＧＡＧ系化合物を製造した。１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）は、純度が９９％の生化学用試薬を使用した。
【０１２４】
６．２  方法と結果
ＨＥＧ１００ｍｇを実施例１に記載の方法のステップ（３）、（４）に従って処理し、ＨＥＧベンジルエステルテトラブチルアンモニウム塩１３２ｍｇを得た。得られたＨＥＧベンジルエステルテトラブチルアンモニウム塩をＤＭＦで溶解し（最終濃度５０ｍｇ／ｍＬ）、ＥｔＯＮａ−ＥｔＯＨを加えて最終濃度が２０ｍＭになるようにし、５０℃で攪拌しながら０．５時間反応させた。その後、０．５ｍｏｌ／ＬのＰＭＰメタノール溶液１０ｍＬを加え、攪拌しながら引き続き１．５時間反応させた。水１０ｍＬを加え、攪拌しながら室温まで冷却させ、１Ｎ  ＨＣ１で反応溶液を中和した後、飽和塩化ナトリウム２０ｍＬ及び無水エタノール２００ｍＬを加えた。遠心分離にて上清を除去し、１０ｍＬのＨ２Ｏで沈殿物を再び溶解し、３ｋＤの透析バッグで透析した。その後、捕獲液を凍結乾燥し、ｄＨＥＧ−ＰＭＰ産物１０２ｍｇを得た。
【０１２５】
ｄＨＥＧ−ＰＭＰの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルから、産物の末端が全て還元アルキル化されているのが確定できた。
【実施例７】
【０１２６】
ＴＡＧ由来のｄＬＦＧの抗凝固活性
【０１２７】
７．１  材料
測定用サンプル：  一連の測定用サンプルとして、実施例１、２、５で得られたｄＬＦＧ−１Ａ〜ｌＦ、ｄＬＦＧ−２Ａ、及びＴＡＧをβ−脱離することにより得られたＭｗが約３．５ｋＤのｄＬＦＧ−１Ｇを用いた。
【０１２８】
試薬：  エノキサパリンナトリウム注射液（ＬＭＷＨ）は、サノフィ・アベンティス社製でＭｗが３５００〜５５００の範囲であり、血液凝固試験用のコントロール血漿、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）測定キット、トロンビン時間（ＴＴ）測定キット、及びプロトロンビン時間測定キット（ＰＴ、乾燥粉体）は、何れもドイツＴＥＣＯ社製のものであった。他の試薬については、何れも市販の分析用試薬を使用した。
【０１２９】
測定装置：  ドイツＴＥＣＯ社製の血液凝固測定計ＭＣ−４０００を用いた。
【０１３０】
７．２  方法
サンプルの実際状況に合わせて脱イオン水で溶解し、一連の濃度となるようにした。血液凝固測定計ＭＣ−４０００を用い、ＡＰＴＴ、ＰＴ及びΤΤ測定キットのマニュアルに記載された方法に従って一連のｄＬＦＧ化合物の抗凝固活性を測定した。
【０１３１】
７．３  結果
ｄＬＦＧ−１Ａ〜ｌＦ及びｄＬＦＧ−２Ａの抗凝固試験の結果を表４に示す。表４に示される結果から、ｄＬＦＧ−１Ａ〜ｌＦ及びｄＬＦＧ−２Ａが何れも人血漿のＡＰＴＴを著しく延長することができ、ＡＰＴＴを倍増する（時間値を１倍延長する）際に必要とされる薬物濃度が何れも９ｇｍＬ未満であり、陽性対照薬であるエノキサパリンナトリウム（９．３１μｇ／ｍＬ）を上回り、これらの誘導体が内因性凝固を効果的に抑制することのできることが実証された。
【０１３２】
試験結果から、更に、ＰＴ及びＴＴに対するｄＬＦＧ−１Ａ〜ｌＦ及びｄＬＦＧ−２Ａの影響が比較的弱く、陽性対照薬であるエノキサパリンナトリウムに及ばないと確認でき、これらの化合物が外因系凝固カスケード及び血液凝固系の共通ルートに対してさほど影響がないと実証できた。
【０１３３】
ｄＬＦＧ誘導体の分子量とＡＰＴＴ延長との間に一定の関連性が示され、分子量の増加につれて抗凝固活性も次第に高くなり、よって、分子量もｄＬＦＧ誘導体の抗凝固活性を影響する１つの要因であると確認できた。したがって、抗凝固活性の観点から、本発明に係るｄＬＦＧの分子量が重量平均分子量で３、０００Ｄａ以上であることが好ましいと確認できた。
【０１３４】
【表４】
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【実施例８】
【０１３５】
凝固因子の活性に対するｄＬＦＧの影響
【０１３６】
８．１  材料
測定用サンプル：  実施例７と同様にｄＬＦＧ−１Ａ〜ｄＬＦＧ−１Ｆを用いた。
【０１３７】
試薬：  人コントロール血漿は、ドイツＴＥＣＯ社製であり、ノキサパリンナトリウム注射液（ＬＭＷＨ）は、サノフィ・アベンティス社製でＭｗが３５００〜５５００の範囲であり、ヘパリンは、シグマ社製でＭｗが１８０００以上であった。過硫酸化コンドロイチン硫酸（ＯＳＣＳ）は、中国薬品生物製品検定所製であり、トロンビン（ＩＩａ）１００ＮＩＨＵ／ｍｇ、トロンビン測定用の発色基質（ＣＳ−０１３８）２５ｍｇ／バイアル、及びヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）１００μｇ／バイアルは、何れもフランスＨＹＰＨＥＮ  ＢｉｏＭｅｄ社製であり、第ＶＩＩＩ因子（ｆ．ＶＩＩＩ）２００ＩＵ／バイアルは、中国上海ＲＡＡＳ社製のものを使用した。第ＶＩＩＩ因子測定用キットは、フランスＨＹＰＨＥＮ  ＢｉｏＭｅｄ社製であり、構成としてＲ１がヒト第Ｘ因子、Ｒ２がヒト第ＩＸａ因子以外に、ヒトトロンビン、カルシウム及び合成リン脂質を含んでなる活性化剤、Ｒ３が第Ｘａ因子特異性の発色基質ＳＸａ−１１、及びＲ４がＴｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液であった。また、ＣＥＮＴＥＲＣＨＥＭ社製で商品名Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ８（実物は○で囲った数字で記載）ＦＸＩＩａ−５９６３を使用した。
【０１３８】
測定装置：  米国ＢｉｏＴｅｋ−ＥＬｘ社製の８０８型マイクロプレートリーダーを用いた。
【０１３９】
８．２  方法
（１）  第Ｘ因子活性化複合体（ｆ．Ｘａｓｅ，Ｔｅｎａｓｅ）阻害活性の測定：第ＶＩＩＩ因子測定用キットと第ＶＩＩＩ因子を用いて測定方法を確立した。一連の濃度を有するｄＬＦＧ−１Ａ〜ｄＬＦＧ−ｌＦ溶液又は溶媒ブランク（Ｔｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液、試薬Ｒ４）３０μＬを２．０ＩＵ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子（３０μＬ）と混ぜ合わせた後、順にキットの試薬Ｒ２（３０μＬ）、Ｒ１（３０μＬ）を加えて３７℃で２分間保持し、Ｒ３（３０μＬ）を加えて３７℃で引続き２分間保持してからＯＤ４０５を測定した。Ｓｈｅｅｈａｎ  Ｊ．Ｐ．＆  Ｗａｌｋｅ  Ｅ．Ｋ．，Ｂｌｏｏｄ，２００６，１０７：３８７６〜３８８２に記載の方法に従い、第Ｘ因子活性化複合体に対する各サンプルのＥＣ５０値を算出した。
【０１４０】
（２）  ＨＣ−ＩＩ依存的な抗トロンビン（ｆ．ＩＩａ）活性の測定：一連の濃度を有するｄＬＦＧ−１Ａ〜ｄＬＦＧ−ｌＦ溶液又は溶媒ブランク（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、試薬Ｒ４）３０μＬを９６ウェルプレートに加えた後、１μΜのＨＣ−ＩＩを３０μＬ加えて混ぜ合わせ、３７℃で１分間保持した。次に、１０Ｕ／ｍＬの第ＩＩａ因子を３０μＬ加えて３７℃で１分間保持した後、４．５ｍΜの発色基質ＣＳ−０１３８を３０μＬ加えて混合し、３７℃で引続き２分間保持した後にＯＤ４０５を測定した。溶媒ブランク（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）に基づいてΔＯＤを算出し、Ｓｈｅｅｈａｎ  Ｊ．Ｐ．＆  Ｗａｌｋｅ  Ｅ．Ｋ．，Ｂｌｏｏｄ，２００６，１０７：３８７６〜３８８２に記載の方法に従い、第ＩＩａ因子に対する各サンプルのＥＣ５０値を算出した。
【０１４１】
（３）  第ＸＩＩ因子促進活性の測定：第ＸＩＩ因子の活性は、Ｈｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９８４，６３：１４５３〜１４５９に記載の方法に若干変動を加えて測定した。一連の濃度を有するｄＬＦＧ−１Ａ〜ｄＬＦＧ−１Ｆ溶液又は溶媒ブランク（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）３０μＬを９６ウェルプレートに加えた後、濃度が３１２ｎΜのヒト凝固因子ΧΙΙ（１ｍＭ  ＮａＡｃ−ＨＣｌ及び４０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．０２％  ＮａＮ３を含み、ｐＨが５．３である）３０μＬを加えて混合し、３７℃で１分間保持した。次に、６２０ｎΜのプレカリクレイン３０μＬを加えて３７℃で１分間保持し、更に、６ｍＭのカリクレイン発色基質３０μＬを加えて混合してから３７℃で保持し、一定時間ごとにＯＤ４０５を測定してＯＤ値の変化速度を算出した。
【０１４２】
８．３  結果
凝固因子活性に対するｄＬＦＧ−１Ａ〜ｄＬＦＧ−１Ｆの影響を表５に示す。また、図１０及び図１１は、それぞれｄＬＦＧ−１ＥのＨＣ−ＩＩ依存的な抗トロンビン活性の用量効果関係及び第Ｘ因子活性化複合体に対する阻害活性を示す図である。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
表５及び図４、５に示されるように、本発明に係るｄＬＦＧ−１Ａ〜ｄＬＦＧ−１Ｆが第Ｘ因子活性化複合体に対して強い阻害活性を示し、５０％の第Ｘ因子活性化複合体活性を抑制する際の有効濃度ＥＣ５０が約０．５〜５ｎＭであった。同時に、ＨＣ−ＩＩ依存的な抗トロンビン活性も兼ね備え、約５．５〜４０ｎＭのＥＣ５０を示した。これらの化合物が強い抗凝固活性を示す原因として、第Ｘ因子活性化複合体が血液凝固系において内因系凝固機構の最下流に位置する標的であり、凝固反応の律速因子になっているためであると考えられる。
【０１４５】
最近の研究から、特異の内因系凝固因子阻害剤が抗血栓活性を示すときに出血傾向を効果的に低減することのできることが示され、したがって、本発明に係るｄＬＦＧ系化合物が抗血栓用途に適用可能であると認められる。一方、第ＸＩＩ因子が活性化されると、プレカリクレインを活性化させて低血圧等の望ましくない症状を誘発し、なお、過硫酸化コンドロイチン硫酸（ＯＳＣＳ）の生成も活発となって重篤の臨床症状を引き起こす虞があった。しかし、本発明者らの研究から、本発明に係るｄＬＦＧ−１Ａ〜ｄＬＦＧ−ｌＦがＯＳＣＳと異なり、抗凝固効果を示す有効投与量で顕著な第ＸＩＩ因子促進活性を示さないことが確認できた。
【実施例９】
【０１４６】
低分子量フコシル化グリコサミノグリカンの注射用水溶液の調製
【０１４７】
９．１  材料
実施例２と同様にし、Ｍｗが７、０６６ＤａのｄＬＦＧ−１Ｅを得た。
【０１４８】
９．２  配合
ｄＬＦＧ−１Ｅの注射用水溶液を、下記表６に示される割合で配合した。
【０１４９】
【表６】
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【０１５０】
９．３  調製方法
配合量に従って低分子量フコシル化グリコサミノグリカンナトリウム塩を秤量し、注射用水を全量で添加した後に攪拌しながら完全に溶解させ、バッチ式の加熱加圧法で滅菌処理を施した。０．６％の薬用活性炭を添加して２０分間攪拌した後、ブフナー漏斗及び３．０μｍ精密濾過膜を用いて濾過して活性炭を取り除き、熱源物質を除去した。中間体の含有量を測定し、合格となったものを０．２２μｍの精密濾過膜で濾過した。バイアルごとに１ｍＬとなるように管状バイアルに分注し、バイアルに注入する際、注入量を監視しつつ合格したバイアルのみを包装して最終製品とした。
【０１５１】
実施例１０：低分子量フコシル化グリコサミノグリカンの凍結乾燥粉体の調製
【０１５２】
１０．１  材料
実施例２と同様にし、Ｍｗが８、９６９ＤａのｄＬＦＧ−２Ａを得た。
【０１５３】
１０．２  配合
ｄＬＦＧ−２Ａの注射用水溶液を、表７に示される割合で配合した。
【０１５４】
【表７】
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【０１５５】
１０．３  調製方法
配合量に従って低分子量フコシル化グリコサミノグリカンナトリウム塩を秤量し、攪拌しながら完全に溶解させ、バッチ式の加熱加圧法で滅菌処理を施した。０．６％の薬用活性炭を添加して２０分間攪拌した後、ブフナー漏斗及び３．０μｍ精密濾過膜を用いて濾過して活性炭を取り除き、熱源物質を除去した。中間体の含有量を測定し、合格となったものを０．２２μｍの精密濾過膜で濾過した。バイアルごとに０．５ｍＬとなるように管状バイアルに分注し、開口にブチルゴム栓を押し付けて半分程度に密封した。凍結乾燥機に投入し、規定の凍結乾燥曲線に従って凍結乾燥した後、ゴム栓を全部押し付けて凍結乾燥機から取り出した。アルミ製キャップで堅固に密封し、目視で合格したか否かを判断し、合格したもののみを包装して最終製品とした。
【０１５６】
凍結乾燥は、以下の手順に従って行った。すなわち、凍結乾燥機にサンプルを投入し、内部温度を−４０℃に下げて３時間保持した。 冷却トラップ内を−５０℃までに下げ、３００μｂａｒとなるまで真空を引いた。昇華が始まると、１時間かけて定速で−３０℃に昇温し、２時間保持した。その後、２時間かけて定速で−２０℃に昇温し、２００〜３００μｂａｒの真空度で８時間保持した。次に、２時間かけて−５℃に昇温し、１５０〜２００μｂａｒの真空度で２時間保持し、再び乾燥処理した。その後、０．５時間かけて１０℃にまで昇温し、８０〜１００μｂａｒの真空度を維持しながら２時間処理した後、０．５時間かけて４０℃に昇温し、最低真空度で４時間保持した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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