(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体との併用でのがんの治療のための医薬であって、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体を含み、該ヒトＨＥＲ３に結合する抗体が、配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含む軽鎖可変ドメインとを含み、該ヒトＨＥＲ３に結合する抗体が、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であること及びＡｓｎ２９７で糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とし、前記ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体がペルツズマブであり、ここで、がんはＨＥＲ２正常がんであり且つＨＥＲ３を発現する、医薬。
【請求項２】
がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、膵臓がん、又は頭頚部がんである、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ヒトＨＥＲ３に結合する抗体との併用でのがんの治療のための医薬であって、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体を含み、該ヒトＨＥＲ３に結合する抗体が、配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含む重鎖可変ドメインと、配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含む軽鎖可変ドメインとを含み、該ヒトＨＥＲ３に結合する抗体が、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であること及びＡｓｎ２９７で糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とし、前記ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体がペルツズマブであり、
ここで、がんはＨＥＲ２正常がんであり且つＨＥＲ３を発現する、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＥＲ３抗体と特定の抗ＨＥＲ抗体の併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＨＥＲ３（ＥｒｂＢ−３、ＥＲＢＢ３、ｃ−ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｅｒｂＢ３、受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−３、配列番号１７）は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲとしても知られている）、ＨＥＲ２及びＨＥＲ４も含む、受容体型チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーをコードする(Kraus, M.H. et al, PNAS 86 (1989) 9193-9197; Plowman, G.D. et al, PNAS 87 (1990) 4905-4909; Kraus, M.H. et al, PNAS 90 (1993) 2900-2904）。原型的な上皮増殖因子受容体と同様、膜貫通受容体ＨＥＲ３は、細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）及びＣ末端リン酸化ドメインからなる。この膜結合タンパク質は、細胞外ドメイン内にＨＥＲ３、ヘレグリン（ＨＲＧ）結合ドメインを有するが、活性なキナーゼドメインは持たない。よって、それはこのリガンドを結合することはできるが、タンパク質リン酸化を介して細胞にシグナルを伝達することはできない。しかしながら、それは、キナーゼ活性を有する他のＨＥＲファミリーのメンバーとは、ヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体化は、その細胞内ドメインのリン酸基転移及び受容体媒介性シグナル伝達経路の活性化をもたらす。ＨＥＲファミリーメンバー間の二量体形成は、ＨＥＲ３のシグナル伝達の潜在能力を増大させ、シグナルの多様化だけでなくシグナル増幅のための手段である。ＨＥＲファミリーメンバー間の、例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を介した最も重要な分裂促進的シグナルの一つを誘導する(Sliwkowski M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Alimandi M, et al, Oncogene. 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622)。
【０００３】
本遺伝子の発現及び／又はそのタンパク質の発現は、前立腺、膀胱及び乳腺の腫瘍を含む多くのがんで報告されている。異なったアイソフォームをコードする選択的転写スプライスバリアントの特徴が明らかにされてきている。一アイソフォームは膜間領域を欠き、細胞の外に分泌される。この形態は、膜結合型の活性を調節するように作用する。付加的なスプライスバリアントも報告されているが、特徴が十分明らかにされていない。
国際公開第９７／３５８８５号はＨＥＲ３抗体に関する。国際公開第２００３／０１３６０２号は、ＨＥＲ抗体を含むＨＥＲ活性のインヒビターに関する。国際公開第２００７／０７７０２８号、国際公開第２００８／１００６２４号、国際公開第２０１１０７６６８３号、国際公開第２０１１０４４３１１号、国際公開第２０１１１３６９１１号、国際公開第２０１２０１９０２４号、国際公開第２０１２０２２８１４号、国際公開第２０１２０３１１９８号、国際公開第２０１２０４４６１２号、国際公開第２０１２０５２２３０号、国際公開第２０１２０５９８５８号はＨＥＲ３抗体に関する。
【０００４】
ヒトＨＥＲ２は、１８５−ｋＤａの増殖因子受容体を表し、ｎｅｕやｃ−ｅｒｂＢ−２とも称され(Slamon, et al., Science 235 (1987) 177-182; Swiss-Prot P04626)、その機能がヒト乳がん細胞における腫瘍性形質転換と関連している。乳がん患者の２０−３０％で該タンパク質の過剰発現が確認されており、それは、疾患の局所的な進行、腫瘍再発可能性の増大、及び患者の生存期間の短縮と相関関係がある。胃、子宮内膜、唾液腺、非小細胞肺、膵臓、卵巣、腹膜、前立腺又は結腸直腸のがんを有する患者のうちの３０−４０％もの患者も、該タンパクを過剰発現し得る。
【０００５】
ＨＥＲ受容体は、一般に、ＨＥＲリガンドを結合することができる細胞外ドメイン、疏水性膜貫通ドメイン、保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化することができるいくつかのチロシン残基を内包するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、四つのドメイン、すなわちドメインＩ（およそ１−１９５のアミノ酸残基）、ドメインＩＩ（およそ１９６−３２０のアミノ酸残基）、ドメインＩＩＩ（およそ３２１  ４８８のアミノ酸残基）、及びドメインＩＶ（およそ４８９−６３２のアミノ酸残基）（シグナルペプチドを含まない残基番号付け）を含む。Garrett, et al., Mol. Cell. 11 (2003) 495-505, Cho, et al., Nature 421 (2003) 756-760, Franklin, et al., Cancer Cell 5 (2004) 317-328, 又はPlowman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (1993) 1746-1750、及び国際公開第２００６／００７３９８号を参照。
【０００６】
トラスツズマブ（商品名ハーセプチン（登録商標）として市販されている）は、ＨＥＲ２過剰発現／ＨＥＲ２遺伝子増幅転移性乳がんの治療のために使用される組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である。トラスツズマブは、Hudziak et al., MoI. Cell. BioL 9 (1989) 1165-1172に記載のマウス抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５と同じＨＥＲ２のエピトープに特異的に結合する。トラスツズマブは、ｒｈｕＭＡｂ ４Ｄ５又はトラスツズマブと呼ばれ、マウス抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化型であり、事前に広範囲な抗癌治療を受けていた、ＨＥＲ２が過剰発現する転移性乳がんの患者において、臨床的に活性である。(Baselga, et al, J. Clin. Oncol. 14 (1996) 737-744)。トラスツズマブ及びその調製方法は米国特許第５８２１３３７号に記載されている。
【０００７】
ペルツズマブ（オムニターグ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ）（登録商標））は、ＨＥＲ２が陽性がんの治療のために使用されるもう一つの組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である。ペルツズマブは、トラスツズマブとは異なるＨＥＲ２の細胞外ドメイン上のエピトープ、２Ｃ４エピトープに特異的に結合する。ペルツズマブは、ＨＥＲ２二量体化阻害剤（ＨＤＩ）の新しいクラスの薬剤のうちの最初のものである。ＨＥＲ２細胞外ドメインに結合することを通して、ペルツズマブは、ＨＥＲ２の（他のＨＥＲファミリーメンバーとの）二量体化を阻害し、それによって腫瘍の増殖と進行に関連する下流のシグナル伝達経路及び細胞プロセスを阻害する(Franklin, M.C., et al. Cancer Cell 5 (2004) 317−328及びFriess, T, et al. Clin Cancer Res 11 (2005) 5300−5309)。ペルツズマブは、（ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４又はペルツズマブと呼ばれる）マウス抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４の組換えヒト化型であり、それは、それぞれの調製方法とともに国際公開第０１／００２４５号及び国際公開第２００６／００７３９８号に記載されている。
【０００８】
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインの領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Harlow及びDavid Lane編， Antibodies, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)に記載されているような通常のクロスブロッキングアッセイが実施され得る。或いは、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープ（例えば、ＨＥＲ２のおよそ残基２２からおよそ残基５８４までの領域における任意の一又は複数の残基）に結合するかどうかを評価するために、エピトープマッピングが実施され得る。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩＩの残基を含む。２Ｃ４及びペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin, et al., Cancer Cell 5 (2004) 317-328も参照。
【０００９】
ヒトＨＥＲ１（ｒ Ｅｒｂ−Ｂ１又はヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）としても知られている）（配列番号１９）は、ｃ−ｅｒｂＢがん原遺伝子でコード化された１７０ｋＤａの膜貫通型受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を示す(Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235; Herbst, R.S., 及びShin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611)。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３は、ＥＧＦＲの配列を提供している。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、及びＰ００５３３−４で同定されたものを含むがこれらに限定されない、ＥＧＦＲのアイソフォーム及び変異体（例えば、選択的ＲＮＡ転写物、切除型、多型等）も存在する。ＥＧＦＲは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン及びエピレギュリン等のリガンドに結合することが知られている（Herbst, R.S.,及びShin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, J.,及びBaselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565)。ＥＧＦＲは、細胞増殖、分化、細胞の生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂誘発、及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化を含むがこれらに限定されず、数多くの細胞プロセスを、チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を介して調節する(Atalay, G., et al., Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, A.S.及びHerbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, R.S.及びShin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235)。
【００１０】
ＨＥＲ１の過剰発現が、膀胱、脳、頭頚部、膵臓、肺、乳房、卵巣、結腸、前立腺及び腎臓のがんを含む数多くのヒト悪性状態において報告されている。(Atalay, G., et al., Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Herbst, R.S.,及びShin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235)。これらの状態の多くにおいて、ＥＧＦＲの過剰発現が患者の予後の悪さと相関しているか、又は関連している。(Herbst R.S.,及びShin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235)。ＨＥＲ１は、正常組織の細胞、特に、皮膚、肝臓及び消化管の上皮組織においても、悪性細胞におけるよりも一般的に低いレベルではあるが、発現される(Herbst, R.S.,及びShin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611)。
【００１１】
国際公開第２００６／０８２５１５号は、がん治療のための、ラットモノクローナル抗体ＩＣＲ６２に由来するヒト化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体及びそれらの糖鎖改変型について言及している。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、抗ＨＥＲ３抗体と、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体との併用療法、又は抗ＨＥＲ３抗体と、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体との併用療法を提供する。一実施態様において、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを更に特徴とする。
【００１３】
本発明の一態様は、ヒトＨＥＲ３に結合してヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体との併用でのがんの治療における使用のための抗体であり、ここでがんは、ＨＥＲ２正常がんである。
【００１４】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする。
【００１５】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする。
【００１６】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であることを特徴とする。
【００１７】
一実施態様において、上記のヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを更に特徴とする。
【００１８】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体はペルツズマブである。
【００１９】
一実施態様において、がんはＨＥＲ３発現によって特徴付けられる。
【００２０】
一実施態様において、がんは、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、膵臓がん、又は頭頚部がん、乳がんである。
【００２１】
驚くべきことに、上記抗ＨＥＲ３抗体と、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体との併用療法は、ＨＥＲ２正常発現のがんの腫瘍増殖を、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体が単独投与された場合は低から中程度の腫瘍増殖阻害しか示さない腫瘍においてでさえ、強い腫瘍増殖阻害を示すことが見出された。
【００２２】
本発明の別の態様は、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体との併用でのがんの治療における使用のための、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であり、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体と、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体のうちの少なくとも一方の抗体がＡｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする。
【００２３】
一実施態様において、ＨＥＲ３に結合する抗体と、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体の両方が、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする。
【００２４】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする。
【００２５】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であることを特徴とする。
【００２６】
一実施態様において、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号２０であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号２１であることを特徴とする。
【００２７】
一実施態様において、がんはＨＥＲ３発現によって特徴付けられる。
【００２８】
一実施態様において、がんはＨＥＲ１発現によって更に特徴付けられる。
【００２９】
一実施態様において、がんは、肺がん又は乳がん、結腸直腸がん、或いは頭頚部がんである（一実施態様において、ＨＥＲ３及びＨＥＲ１発現によって特徴付けられる）。
【００３０】
驚くべきことに、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体とヒトＨＥＲ１に結合する抗体のうちの少なくとも一方の抗体がＡｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする、上記抗ＨＥＲ３抗体とヒトＨＥＲ１に結合する抗体との併用療法は、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体が単独投与された場合は低から中程度の腫瘍増殖阻害しか示さない腫瘍においてでさえ、強い腫瘍増殖阻害を示すことが発見された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ−１Ｂ】異なる濃度でのＭＣＦ７細胞における受容体リン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害率（％）。
【図１Ｃ】異なる濃度でのＭｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞における受容体リン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害率（％）。
【図２】Ｍａｂ  ２０５を用いた治療（１０ｍｇ／ｋｇ  ｑ７ｄｘ３、ｉ．ｐ．）が、頭頚部がんＦａＤｕ  ＳＣＣＨＮが移植された異種移植片の腫瘍静止状態をもたらした。
【図３】Ｍａｂ  ２０５を用いた治療（１０ｍｇ／ｋｇ  ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）が、ＨＥＲ２正常乳がんＭＡＸＦ４４９を移植した異種移植片の腫瘍静止状態をもたらした。
【図４】Ｍａｂ  ２０５を用いた治療（２５ｍｇ／ｋｇ  ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）が、７１７７  ＮＳＣＬＣを移植した異種移植片の腫瘍静止状態をもたらした、
【図５】ペルツズマブと併用でＭａｂ  ２０５．１０．２を用いたＨＥＲ２正常乳がん細胞ＺＲ−７５−１異種移植片の治療が、腫瘍増殖阻害をもたらした。
【図６】ＢｘＰＣ３ヒト膵臓腺癌皮下異種移植片を有するＳＣＩＤベージュマウス（各群につきｎ＝１０）におけるＲＧ７１１６のインビボ有効性。（Ａ）マウスは、２４日目からＲＧ７１１６の週５回腹腔内投与で治療され、腫瘍サイズはノギスを用いて計測された。０．３ｍｇ／ｋｇ以上でＲＧ７１１６は非常に有効であり、腫瘍増殖を有意に抑制した。マウスは５６日目に屠殺され、外植腫瘍組織は、ウェスタンブロッティングによってＨＥＲ３及びｐＨＥＲ３の発現（Ｂ）、並びに免疫組織化学によってＨＥＲ３発現（Ｃ）を検査された。ＲＧ７１１６の有効用量は、ＨＥＲ３リン酸化及び下方制御された膜ＨＥＲ３レベルを阻害した。
【図７】ＨＥＲ３シグナル阻害により媒介された腫瘍増殖阻害。（Ａ）ＮＳＣＬＣ細胞株又は患者由来の腫瘍組織断片を、ＳＣＩＤベージュマウス又はＢａｌｂ／ｃヌードマウス（各群につきｎ＝１０）内に皮下異種移植片として樹立し、ＲＧ７１１６の週４−６回投与（１０−２５ｍｇ／ｋｇ）で治療した。かなりのＴＧＩが、黒色の棒（検査された異種移植モデルの半数における完全寛解を含む）で示される通り、肺扁平上皮モデルにおいて、及び灰色の棒で示される通り（＊はｃ−Ｍｅｔ高発現モデルを、†はＫＲＡＳ変異体モデルを示す）、腺癌モデルにおいて観察された。（Ｂ）完全寛解が２２ｍｇ／ｋｇのＲＧ７１１６の６サイクルで達成された、患者由来の扁平上皮腫瘍異種移植片（ＬＸＦＥ７７２）のうちの一つに関する経時変化。９５日目まで腫瘍は検出できなかった。ＲＧ７１１６と他の抗ＨＥＲ抗体との組み合わせが、有効性を向上させた。ＲＧ７１１６を、頭頚部がん皮下異種移植モデル（ＦａＤｕ細胞；図７Ｃ）においてＧＡ２０１（糖鎖改変された抗ＨＥＲ１抗体（ＥＧＦＲ））と組み合わせた場合、また、患者由来の乳がん腫瘍皮下異種移植モデルＭＡＸＦ  ４４９（図７Ｄ）においてペルツズマブ（抗ＨＥＲ２）と組みわせた場合、腫瘍の完全寛解が達成された。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、本明細書に記載の併用療法における使用のための抗体を含む。
【００３３】
本発明は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号９、若しくは軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０、若しくは軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１１であることを特徴とする、本明細書に記載の併用療法における使用のための、本発明に記載の抗体又はそのヒト化型を更に含む。
【００３４】
本発明は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号９、若しくは軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０、若しくは軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１１であることを特徴とする、本明細書に記載の併用療法における使用のための、本発明に記載の抗体を更に含む。
【００３５】
一実施態様において、本発明による抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、本明細書に記載の併用療法における使用のための抗体である。
【００３６】
一実施態様において、本発明による抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号９、若しくは軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１１であることを特徴とする、本明細書に記載の併用療法における使用のための抗体である。
【００３７】
一実施態様において、本発明による抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴する、本明細書に記載の併用療法における使用のための抗体である。
【００３８】
一実施態様において、本発明による抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であることを特徴とする、本明細書に記載の併用療法における使用のための抗体である。
【００３９】
一実施態様において、そのような抗体はモノクローナルである。一実施態様において、そのような抗体はヒト化されているか、又はヒトである。一実施態様において、そのような抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの抗体である。一実施態様において、そのような抗体はＩｇＧ１サブクラスのモノクローナルヒト化抗体である。一実施態様において、そのような抗体は、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする、抗体である。
【００４０】
本発明は、本明細書に記載の併用療法における使用のための、それぞれＶＨ及びＶＬ又はＣＤＲを有するヒト化抗体Ｍａｂ  ２０５．１０．１、Ｍａｂ  ２０５．１０．２及びＭａｂ  ２０５．１０．３を含む。
【００４１】
0006257646.tif 000002
【００４２】
0006257646.tif 000003
【００４３】
一実施態様において、そのような抗体は、ヒト起源の定常領域、例えば、配列番号１２から１６、好ましくは配列番号１２から１３の定常領域を含む。
【００４４】
用語「抗体」は、全抗体及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、抗体の構造の様々な形態を包含する。本発明による抗体は、好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は更に、本発明の特性が保持されている限り、遺伝子操作された抗体である。
【００４５】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例は、ダイアボディ、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴、すなわち、ＶＬドメインと共に会合することができること、又は各抗原に結合するＶＬドメインの特徴、すなわち、ＶＨドメインと共に機能性抗原結合部位と会合し、その結果、本発明による抗体の特性を提供する、単鎖ポリペプチドを含む。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を指す。
【００４７】
用語「キメラ抗体」は、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域と、異なる供給源又は種由来の定常領域の少なくとも一部を含む、モノクローナル抗体を指す。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明によって包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが元々の抗体のものから改変されたか、又は変化されたものである。そのような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体を作製するための方法は、今や当該技術分野でよく知られている一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５２０２２３８号及び米国特許第５２０４２４４号を参照のこと。
【００４８】
用語「ヒト化抗体」又は「抗体のヒト化型」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのものと比較して異なった特異性を有する免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変された抗体を指す。好ましい実施態様では、「ヒト化抗体」を調製するために、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域中にグラフトされる。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; 及び Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。重鎖可変フレームワーク領域と軽鎖可変フレームワーク領域は、同一又は異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であり得る。ヒト重鎖可変フレームワーク領域及び軽鎖可変フレームワーク領域は、例えば、Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology (2000) - 付録 1P  A.1P.1-A.1P.37にリスト化されており、また、IMGT、国際免疫遺伝学的情報システム(the international ImMunoGeneTics information system)(登録商標) (http://imgt.cines.fr) 、又はhttp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.ukから入手可能である。場合によって、フレームワーク領域はさらなる突然変異により改変され得る。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上述した抗原認識配列を示すＣＤＲに相当する。好ましくは、そのようなヒト化型は、ヒト定常領域によりキメラ化される（例えば、配列番号１２−１６の配列を参照）。本明細書で使用する用語「ヒト化抗体」は、本発明による特性、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関する特性を生じるように、例えば「クラススイッチ」、すなわち、Ｆｃ部分の変化又は変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）によって、定常領域が改変されているヒト化抗体も含む。
【００４９】
本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は当該技術分野でよく知られている(van Dijk, M.A., 及び van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体はまた、内因性の免疫グロブリン産生がない場合に、免疫されると、ヒト抗体の全レパートリー又は選択物を産生することができる、トランスジェニック動物（例えば、マウス）で産生され得る。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入すると、抗原曝露によってヒト抗体が産生される（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M.D., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーでも産生され得る（Hoogenboom, H.R., 及び Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）。ヒトモノクローナル抗体の調製のために、Cole, A.ら及びBoerner, P.らの技法も利用することができる(Cole, A., et al., Monoclonal Antibodies 及び Cancer Therapy, Liss, A.L., p. 77 (1985); 並びに Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。本発明によるヒト化抗体について既に述べたように、本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語はまた、本発明による特性、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関する特性を生じるように、例えば、「クラススイッチ」、すなわち、Ｆｃ部の変化又は変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）によって定常領域が改変されているヒト抗体を含む。
【００５０】
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ＮＳＯ細胞若しくはＣＨＯ細胞等の宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、或いは宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体等、組換え手段により調製、発現、作製又は単離されたすべてのヒト抗体を含むことが意図される。そのような組換えヒト抗体は、再配列された形態で可変領域及び定常領域を有する。本発明による組換えヒト抗体はインビボ体細胞超変異に供されている。したがって、組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し、且つそれらに関連しているが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然に存在しないであろう配列である。
【００５１】
本明細書において使用される用語「ヒトＨＥＲ３に結合する」、「ヒトＨＥＲ３に特異的に結合する」、又は「抗ＨＥＲ３抗体」は相互に置き換え可能であり、ＫＤ値が、２５℃で１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様においては２５℃で１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性でヒトＨＥＲ３抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、２５℃で、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な結合アッセイにより決定される。結合親和性のＫＤ値を決定する方法は実施例２ｂに記載される。したがって、本明細書において使用される「ヒトＨＥＲ３に結合する抗体」は、２５℃でＫＤが１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下（一実施態様においてはＫＤが１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ−１．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌ）の結合親和性でヒトＨＥＲ３抗原に特異的に結合する抗体を指す。
【００５２】
本明細書において使用される用語「ヒトＨＥＲ２に結合する」、「ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する」、又は「抗ＨＥＲ２抗体」は相互に置き換え可能であり、ＫＤ値が、２５℃で１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様においては２５℃で１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性でヒトＨＥＲ２抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、２５℃で、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な結合アッセイにより決定される。結合親和性のＫＤ値を決定する方法は実施例２ｂに記載される。したがって、本明細書において使用される「ヒトＨＥＲ２に結合する抗体」は、２５℃でＫＤが１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下（一実施態様においてはＫＤが１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ−１．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌ）の結合親和性でヒトＨＥＲ２抗原に特異的に結合する抗体を指す。
【００５３】
細胞表面のＨＥＲ受容体のペアリングは、二量体化と呼ばれる。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４を含む他のＨＥＲファミリーメンバーと二量体化し、ＨＥＲ２：ＨＥＲ３二量体化は、最も強い分裂促進シグナルを生成し、細胞生存及び増殖を調節する二つの主要な経路（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路及びホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路）を活性化すると考えられている。本明細書において使用される用語「ヒトＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体」とは、ヒトＨＥＲ２抗原に特異的に結合して、リガンド依存的なＨＥＲ２とＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４とのヘテロ二量体化を阻害／ブロック、特にＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体化を阻害する、抗ＨＥＲ２抗体を指す（例えば、PERJETA Prescribing Information. Genentech, Inc. June 2012. Baselga J, et al; N Engl J Med. 2012;366:109-119;  Baselga J, et al Nat Rev Cancer. 2009;9:463-475; Hynes NE, et al Nat Rev Cancer. 2005;5:341-354; Yarden Y, et al, Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2:127-137; Hsieh AC, et al, Br J Cancer. 2007;97:453-457; Soltoff SP, et al, Mol Cell Biol. 1994;14:3550-3558を参照のこと）。ＨＥＲ２二量体化を阻害するそのような抗ＨＥＲ２抗体の例は、例えば、ペルツズマブ（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４又はペルツズマブと呼ばれる）が一例として記載されている、国際公開第０１／００２４５号及び国際公開第２００６／００７３９８号で説明されている。
【００５４】
本明細書において使用される用語「ヒトＨＥＲ１に結合する」、「ヒトＨＥＲ１に特異的に結合する」、又は「抗ＨＥＲ１抗体」は相互に置き換え可能であり、ＫＤ値が、２５℃で１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様においては２５℃で１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性でヒトＨＥＲ２抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、２５℃で、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅｎ）等の標準的な結合アッセイにより決定される。結合親和性のＫＤ値を決定する方法は実施例２ｂに記載される。したがって、本明細書において使用される「ヒトＨＥＲ２に結合する抗体」は、２５℃でＫＤが１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ以下（一実施態様においてはＫＤが１．０ｘ１０−８ｍｏｌ／ｌ−１．０ｘ１０−１３ｍｏｌ／ｌ）の結合親和性でヒトＨＥＲ２抗原に特異的に結合する抗体を指す。
【００５５】
ヒトＨＥＲ３（ＥｒｂＢ−３、ＥＲＢＢ３、ｃ−ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｅｒｂＢ３、受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−３、シグナルペプチドを含む配列番号１７）は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲとしても知られている）、ＨＥＲ２及びＨＥＲ４も含む、受容体型チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーをコードする(Kraus, M.H. et al, PNAS 86 (1989) 9193-9197; Plowman, G.D. et al, PNAS 87 (1990) 4905-4909; Kraus, M.H. et al, PNAS 90 (1993) 2900-2904)。原型的な上皮増殖因子受容体と同様、膜貫通受容体ＨＥＲ３は、細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）及びＣ末端リン酸化ドメインからなる。この膜結合タンパク質は、細胞外ドメイン内にＨＥＲ３、ヘレグリン（ＨＲＧ）結合ドメインを有するが、活性なキナーゼドメインは持たない。よって、それはこのリガンドを結合することはできるが、タンパク質リン酸化を介して細胞にシグナルを伝達することはできない。しかしながら、それは、キナーゼ活性を有する他のＨＥＲファミリーのメンバーとは、ヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体化は、受容体媒介性シグナル伝達経路の活性化及び細胞内ドメインのリン酸基転移をもたらす。ＨＥＲファミリーメンバー間の二量体形成は、ＨＥＲ３のシグナル伝達の可能性を増大させ、シグナル多様化だけでなくシグナル増幅のための手段である。ＨＥＲファミリーメンバー間の、例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を介した最も重要な分裂促進的シグナルの一つを誘導する(Sliwkowski M.X., et al, J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Alimandi M, et al, Oncogene. 10 (1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276 (2001) 42153-421561; Singer, E., J. Biol. Chem. 276 (2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8 (2006) 613-622）。
【００５６】
ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ２０５．１０．２及びＭａｂ２０５．１０．３は、ＨＥＲ３への結合についてへレグリン（ＨＲＧ）リガンドと競合することを示した。
【００５７】
本遺伝子の発現及び／又はそのタンパク質の発現は、前立腺、膀胱及び乳腺の腫瘍を含む多くのがんで報告されている。種々のアイソフォームをコードする選択的転写スプライスバリアントの特徴が明らかにされてきている。一アイソフォームは膜間領域を欠き、細胞の外に分泌される。この形態は、膜結合型の活性を調節するように作用する。付加的なスプライスバリアントも報告されているが、特徴が十分明らかにされていない。
【００５８】
本発明による用語「ヒトＨＥＲ２」は、ヒト乳がん細胞において腫瘍性形質転換の機能を有し、ｎｅｕ及びｃ−ｅｒｂＢ−２とも称される１８５−ｋＤａ増殖因子受容体（Slamon, et al., Science 235 (1987) 177-182; Swiss-Prot P04626；シグナルペプチドを含む配列番号１８）を指す。ＨＥＲ受容体は、一般に、ＨＥＲリガンドを結合することができる細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化することができるいくつかのチロシン残基を内包するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、四つのドメイン、すなわちドメインＩ（およそ１−１９５のアミノ酸残基）、ドメインＩＩ（およそ１９６−３２０のアミノ酸残基）、ドメインＩＩＩ（およそ３２１  ４８８のアミノ酸残基）、及びドメインＩＶ（およそ４８９−６３２のアミノ酸残基）（シグナルペプチドを含まない残基番号付け）を含む。Garrett, et al., Mol. Cell. 11 (2003) 495-505, Cho, et al., Nature 421 (2003) 756-760, Franklin, et al., Cancer Cell 5 (2004) 317-328, 又はPlowman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (1993) 1746-1750及び国際公開第２００６／００７３９８号を参照。
【００５９】
ペルツズマブ（オムニターグ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ）（登録商標））は、ＨＥＲ２が陽性がんの治療のために使用されるもう一つの組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である。ペルツズマブは、トラスツズマブとは異なるＨＥＲ２の細胞外ドメイン上のエピトープ、２Ｃ４エピトープに特異的に結合する。ペルツズマブは、ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）の新しいクラスの薬剤のうちの最初のものである。ＨＥＲ２細胞外ドメインへの結合により、ペルツズマブはＨＥＲ２の二量体化（特に他のＨＥＲファミリーメンバーとの、リガンド活性化ヘテロ二量体化）を阻害し、それによって腫瘍の増殖と進行に関連する下流のシグナル伝達経路及び細胞プロセスを阻害する（Franklin, M.C., et al. Cancer Cell 5 (2004) 317−328 及び Friess, T, et al. Clin Cancer Res 11 (2005) 5300−5309）。ペルツズマブは、マウス抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４の組換えヒト化型（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４又はペルツズマブとも称される）であり、国際公開第０１／００２４５号及び国際公開第２００６／００７３９８号の各調製方法とともに説明されている。
【００６０】
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインの領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Harlow及びDavid Lane編, Antibodies, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988）に記載されているような通常のクロスブロッキングアッセイが実施され得る。或いは、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープ（例えば、ＨＥＲ２のおよそ残基２２からおよそ残基５８４までの領域における任意の一又は複数の残基）に結合するかどうかを評価するために、エピトープマッピングが実施され得る。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩＩの残基を含む。２Ｃ４及びペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin, et al., Cancer Cell 5 (2004) 317-328も参照。
【００６１】
用語「ヒトＨＥＲ１」（ｒ  Ｅｒｂ−Ｂ１又はヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）としても知られている（シグナルペプチドを含む配列番号１９））は、ｃ−ｅｒｂＢがん原遺伝子によりコードされる１７０ｋＤａの膜貫通型受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を示す（Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235; Herbst, R.S.及びShin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３は、ＥＧＦＲの配列を提供している。Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、及びＰ００５３３−４により同定されたものを含むがこれらに限定されない、ＨＥＲ１のアイソフォーム及び変異体（例えば、選択的ＲＮＡ転写物、切断型、多型等）も存在する。ＨＥＲ１は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、アンフィレギュリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン及びエピレギュリンを等のリガンドに結合することが知られている（Herbst, R.S., 及び Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, J.及び Baselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565）。ＨＥＲ１は、細胞の増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂誘発、及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化を含むがこれらに限定されず、数多くの細胞プロセスを、チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を介して調節する（Atalay, G., et al., Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, A.S.及びHerbst, R.S., Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, R.S.及びShin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235)。
【００６２】
国際公開第２００６／０８２５１５号は、がん治療のための、ラットモノクローナル抗体ＩＣＲ６２に由来するヒト化抗ＨＥＲ１モノクローナル抗体及びその糖鎖改変型について言及している。ラットモノクローナル抗体ＩＣＲ６２に由来するそのようなヒト化糖鎖改変型抗体ＩＣＲ６２の一例は、ＧＡ２０１である（国際公開第２００６／０８２５１５号に記載）。ＧＡ２０１は、重鎖可変ドメインＶＨとして配列番号２０のアミノ酸配列（重鎖可変ドメインＶＨ、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−Ｉ−ＨＨＤ）を含み、軽鎖可変ドメインＶＬとして配列番号２１のアミノ酸配列（軽鎖可変ドメインＶＬ、ヒト化＜ＥＧＦＲ＞ＩＣＲ６２−Ｉ−ＫＣ）を含むことを特徴とする、糖鎖改変型抗ＨＥＲ１抗体であり、また、前記抗体は、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを更に特徴とする、抗体である。
【００６３】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を含む。いくつかの実施態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等の分子の化学的に活性な、表面の配置（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）を含み、また、いくつかの実施態様において、特異的な３次元構造的特性及び／又は特異的な荷電特性を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「本発明による抗体の可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインの対の各々を意味する。可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、三つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続された、配列が広く保存されている四つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、β−シートコンフォメーションをとり、また、ＣＤＲは、β−シート構造を接続するループを形成し得る。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によりその三次元構造が保持され、もう一方の鎖に由来するＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、それ故、本発明のさらなる目的を提供する。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。本発明の抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な度合で寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。三つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）並びに三つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）がある。用語「ＣＤＲＨ１」はＫａｂａｔに従い算出された重鎖可変領域のＣＤＲ１領域を示す。ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、重鎖（Ｈ）又は軽鎖（Ｌ）の各領域を意味する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、該領域がKabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991）により、配列間の差異に従って定義されたアミノ酸配列の蓄積されたデータベースとの比較によって決定される。
【００６６】
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を発揮する。「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知であり、抗体のパパイン切断に基づいて定められる用語である。抗体又は免疫グロブリンは、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスに分類され、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分類されることがある。重鎖定常領域に応じて、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）並びにＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）に直接関与する。用語「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始されるプロセスを示す。Ｃ１ｑの抗体への結合は、いわゆる結合部位での、明確なタンパク質−タンパク質相互作用によって生じる。このような結合部位は当該技術分野で知られており、例えば、Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R.及び Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324,ＥＰ０  ３０７  ４３４により記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ，Ｅ．ＡのＥＵインデックスに従い番号付け、下記参照)である。通常、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、補体活性化、並びにＣ１ｑ及びＣ３結合を示す一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。
【００６７】
一実施態様において、本発明による抗体はヒト起源由来のＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域のすべての他の部分を含む。本明細書で使用される場合、用語「ヒト起源由来のＦｃ部分」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、例えば、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラスの変異Ｆｃ部分（好ましくはＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃ部分、又はヒトＩｇＧ４サブクラスの変異Ｆｃ部分（好ましくはＳ２２８Ｐに変異を有する）のいずれかであるＦｃ部分を指す。好ましいものは、配列番号１３（ヒトＩｇＧ１サブクラス）、配列番号１４（変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラス）のヒト重鎖定常領域である。
【００６８】
一実施態様において、本発明による抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体、又はヒトＩｇＧ３サブクラスの抗体である。一実施態様において、本発明による抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。
【００６９】
一実施態様において、本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野において周知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．により記載されている（例えば、Johnson, G.及びWu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218参照）。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１２のカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００７０】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を示す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸が、別の核酸と機能的関係に置かれる場合、その核酸は「動作可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結されており、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に動作可能に連結されており、または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されているならば、コード配列に動作可能に連結されている。一般に、「動作可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が同一線上にあり、分泌リーダーの場合は、近接していて、リーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、一般的な手法に従って使用される。本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は互換的に用いられ、すべてのこのような名称には子孫が含まれる。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、初代の対象細胞と、導入回数に関係なく、これに由来する培養物とを含む。また、すべての子孫が、意図的な変異又は意図しない変異の影響で、ＤＮＡ含有物において正確に同一であるわけではない。元々の形質転換細胞についてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
【００７２】
本明細書に記載の抗ＨＥＲ３抗体は、好ましくは定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。そのような定常鎖は当該技術分野でよく知られており、例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)により記載されている。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１２のカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号１３から１６を含む。
【００７３】
別の態様において、各併用療法のための抗ＨＥＲ３抗体が提供され、ここで該抗体は、上述の任意の実施態様に記載のＶＨ、及び上述の任意の実施態様に記載のＶＬを含む。一実施態様において、該抗体は、配列番号８にＶＨ配列、及び配列番号１０にＶＬ配列を含み、一又は複数の以下の特性（実施例３及び２に記載のアッセイで決定）を有する：
-抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＣＦ７細胞、ＦａＤｕ細胞、又はＭｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞におけるＨＥＲ３のリン酸化を阻害する（一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１．０μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％（一実施態様では、少なくとも９０％）のＭＣＦ７細胞におけるＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％（一実施態様では、少なくとも９０％）のＦａＤｕ細胞におけるＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも６０％（一実施態様では、少なくとも７０％）のＭｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞におけるＨＥＲ３のリン酸化阻害を示す）。
-抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害する（一実施態様では、０．５０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、一実施態様では、０．３５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、抗ＨＥＲ３抗体が、Ｍｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞におけるＡＫＴのリン酸化を阻害する）。
-抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の増殖を阻害する（一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の増殖を阻害する）。
-抗ＨＥＲ３抗体が、５．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値、一実施態様では３．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値で、ＨＥＲ３に結合する。
【００７４】
別の態様において、各併用療法のための抗ＨＥＲ３抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０２５５０１０号に記載の通り、二重特異性抗ＨＥＲ３／抗−ＨＥＲ１抗体である。一実施態様において、二重特異性抗ＨＥＲ３／抗ＨＥＲ１抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０２５５０１０号に開示されている特徴的なアミノ酸配列、すなわち、Ａ）（ａ）ＬＳＧＤＷＩＨのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＶＧＥＩＳＡＡＧＧＹＴＤのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）ＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；並びに（ｄ）ＮＩＡＴＤＶＡのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＳＥＰＥＰＹＴのアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又はＢ）（ａ）米国特許出願公開第２０１０／０２５５０１０号に開示されている配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン；（ｂ）米国特許出願公開第２０１０／０２５５０１０号に開示されている配列番号２９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
【００７５】
用語「抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）」は、エフェクター細胞の存在下での、本発明の抗体によるヒト標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣは、エフェクター細胞、例えば、新鮮に単離されたＰＢＭＣ、又は単球又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞若しくは持続的に増殖するＮＫ細胞株のようなバフィーコートから精製されたエフェクター細胞の存在下で、本発明の抗体を用いてＨＥＲ３発現細胞の調製物を治療することによって、好ましくは測定される。
【００７６】
モノクローナル抗体のＡＤＣＣのような細胞媒介性エフェクター機能は、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180,及び米国特許第６６０２６８４号に記載されているように、それらのオリゴ糖成分を操作することにより高めることができる。最も一般的に使用される治療用抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインにおいて、Ａｓｎ２９７に保存されたＮ結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合二分岐オリゴ糖はＣＨ２ドメイン間に包埋されて、ポリペプチド骨格を有する広範な接触部を形成し、それらの存在は、抗体が、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を媒介するのに必須である（Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., 及び Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32).。Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、及び国際公開第９９／５４３４２号は、二分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内での過剰発現が、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増大させることを示した。Ａｓｎ２９７における糖質の構成の変更又はその除去もまた、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合に影響を及ぼす(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147)。
【００７７】
糖鎖操作によりモノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を向上させる方法は、例えば、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、国際公開第９９／１５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第１９９７／０２８２６７号、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号、米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号及び国際公開第２０００／０６１７３９号、又は、例えば、Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., et al, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473；国際公開第０３／０５５９９３号及び米国特許出願公開第２００５／０２４９７２２号で報告されている。
【００７８】
本発明の一実施態様において、本発明による抗体は、（抗体が、ＩｇＧ１又はＩＧ３サブクラスのＦｃ部分を含むならば）Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化され、それよって前記糖鎖内のフコースの量が８０％以下（位置番号はＫａｂａｔによる）、例えば、８０％から１％であり、すなわちアフコシル化されている。別の実施態様では、前記糖鎖内のフコースの量は６５％以下であり、一実施態様では５％から６５％であり、一実施態様では０％から６５％であり、また、一実施態様では前記糖鎖内のフコースの量は０％である。そのような抗体は、以下「アフコシル化抗体」又は「非フコシル化抗体」と称される。そのようなアフコシル化抗体は、高められたＡＤＣＣを示す一方、他の抗体特性は実質的に影響を受けずに保持されている。
【００７９】
更なる実施態様において、前記糖鎖内のＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）の量は１％以下であり、及び／又はＮ末端アルファ−１，３−ガラクトースの量は１％以下である。糖鎖は、ＣＨＯ細胞において組換え的に発現した抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合グリカンの特性を好ましくは示す。
【００８０】
本発明の「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域のおよそ２９７位に位置するアミノ酸アスパラギンを意味する。抗体の些細な配列差異に基づき、Ａｓｎ２９７は、２９７位から数アミノ酸上流又は下流（通常はせいぜい±３アミノ酸）に、すなわち２９４位から３００位にも位置し得る。
【００８１】
用語「糖鎖がＣＨＯ細胞において組換え的に発現した抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ結合グリカンの特性を示す」は、本発明の全長親抗体のＡｓｎ２９７における糖鎖が、フコース残基を除き、未改変のＣＨＯ細胞で発現した同様の抗体のもの、例えば国際公開第２００６／１０３１００号で報告されているもの、と同様の構造及び糖残基配列を有することを示す。
【００８２】
本願内で使用される用語「ＮＧＮＡ」は、糖残基Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸を示す。
【００８３】
ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、２個までのＧａｌ残基で終結するコアフコシル化二分岐複合型オリゴ糖グリコシル化として、Ａｓｎ２９７で生じる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのヒト定常重鎖領域は、Kabat, E., A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991),及びBrueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-52７に詳細に報告されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１（α−１，６−若しくはα−１，３−）、又はＧ２グリカン残基と命名される（Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えばRoutier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207によって記載されている。非糖修飾のＣＨＯ宿主細胞において組換え的に発現した抗体は、通常、少なくとも８５％の量でＡｓｎ２９７でフコシル化されている。全長親抗体の修飾されたオリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体であってもよい。好ましくは、二分された、還元／非フコシル化オリゴ糖はハイブリッドである。別の実施態様において、二分された、還元／非フコシル化オリゴ糖は複合体である。
【００８４】
本発明によれば、「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（例えば、ＬＣ／ＭＳシステム）により測定され平均値として算出される、Ａｓｎ２９７に結合したすべての糖構造物（例えば、複合体構造物、ハイブリッド構造物及び高マンノース構造物）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での、糖鎖内の前記糖の量を意味する（例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号参照）。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、Ｎ−グリコシターゼＦで治療された試料（例えば、それぞれ複合体構造物、ハイブリッド構造物、並びにオリゴマンノース構造物及び高マンノース構造物）において同定されたすべての糖構造物に対する、フコース含有構造物のパーセンテージである。
【００８５】
本発明の抗体は、好ましくは組換え手段により産生される。そのような方法は当該技術分野において広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現、それに続く抗体ポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。タンパク質発現について、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸は、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、適切な原核宿主細胞又は真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞において実施され、抗体は細胞から（上清から、又は細胞溶解後に）回収される。抗体の組換え産生は当該技術分野でよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の文献に記載されている。抗体は、全細胞中、細胞溶解物中に、又は部分的に精製された形態で、若しくは実質的に純粋な形態で存在しうる。カラムクロマトグラフィー及び他に当該技術分野でよく知られているものを含む標準的な技術により、例えば他の細胞核酸若しくはタンパク質等の他の細胞成分又は他の夾雑物を除去するために、精製が実施される（Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照）。ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現システム（ＨＥＫ  ２９３）は、Schlaeger, E.-J.及びChristensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83、及びSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等、一般的な免疫グロブリン精製手順により、培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、一般的な手順を使用し、容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源としての機能を果たし得る。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され、ついで、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞中にトランスフェトされ、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。前記細胞株から得ることができる抗体は、本発明の好ましい実施態様である。アフコシル化された抗体は、好ましくは上述した糖鎖改変により調製される。
【００８６】
本発明の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、発現ベクターコンストラクトが形成されるように、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列及び転写終結配列と組合せられたものである。重鎖発現コンストラクト及び軽鎖発現コンストラクトを単一のベクターに組み込み、宿主細胞内にコトランスフェクション、連続トランスフェクション、又は別々のトランスフェクションを行い、次いでその宿主細胞を融合させて、両方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成させることができる。
【００８７】
本発明の一態様において、組み合わせ抗体は、各抗体を含む薬学的組成物として投与される。別の態様において、本発明は、組成物、例えば、薬学的担体と共に製剤された、本発明の抗体を含有する薬学的組成物を提供する。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「薬学的担体」には、生理学的に適合する、任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は点滴）に好適である。
【００８９】
本発明の組成物は、当該技術分野において知られている多様な方法により投与され得る。当業者により認識されているように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化するものである。特定の投与経路によって本発明の化合物を投与するためには、化合物を、その不活性化を防止する物質でコーティングするか、又はその不活性化を防止する物質と共に投与することが必要である。例えば、化合物は、リポソーム又は希釈剤等の適切な担体中で被検体に投与され得る。薬学的に許容される希釈剤は、生理食塩水及び緩衝水溶液を含む。薬学的担体は、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液若しくは分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で知られている。
【００９０】
本明細書で使用される語句「非経口投与」（「ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ」及び「ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ」）は、経腸投与及び局所投与以外の、通常注射による投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射並びに点滴を含む。
【００９１】
本明細書で使用される用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病（任意の、上記がんの難治性型、又は上記がんの一又は複数の組合せを含む）であり得る。
【００９２】
本発明の別の態様は、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体との併用でのがん治療のための、本発明による抗ＨＥＲ３抗体であり、ここにおいて、がんはＨＥＲ２正常がんである。本発明の別の態様は、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体との併用でのがん治療のための医薬の製造のための、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体の使用であり、ここで、がんはＨＥＲ２正常がんである。本発明の別の態様は、本発明による抗ＨＥＲ３抗体を、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体との併用で、治療を必要としているがん患者に投与することによる、前記患者の治療方法であり、ここで、がんはＨＥＲ２正常がんである。一実施態様において、ａ）この組み合わせで使用される抗ＨＥＲ３抗体は、ＶＨとして配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＶＬとして配列番号１０のアミノ酸配列を含むことを特徴とし、ｂ）この組み合わせで使用される抗ＨＥＲ２抗体はペルツズマブであり、また、ｃ）がんは、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、膵臓がん、或いは頭頸部がん（又は一実施態様では乳がん）である。
【００９３】
本発明の別の実施態様は、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体との併用でのがんの治療のための、本発明による抗ＨＥＲ３抗体であり、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体とヒトＨＥＲ１に結合する抗体の両方の抗体が、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする。本発明の別の態様は、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体との併用でのがんの治療のための医薬の製造のための、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体の使用であり、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体とヒトＨＥＲ１に結合する抗体の両方の抗体が、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする。本発明の別の態様は、本発明による抗ＨＥＲ３抗体を、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体との併用で治療を必要としているがん患者に投与することによる、前記患者の治療方法であり、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体とヒトＨＥＲ１に結合する抗体の両方の抗体が、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする。一実施態様において、ａ）この組み合わせで使用される抗ＨＥＲ３抗体は、ＶＨとして配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＶＬとして配列番号１０のアミノ酸配列を含むことを特徴とし、ｂ）この組み合わせで使用される抗ＨＥＲ１抗体は、ＶＨとして配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬとして配列番号２１のアミノ酸配列を含むことを特徴とし、また、ｃ）がんは、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、又は頭頸部がんである。
【００９４】
本発明の好ましい一実施態様において、上述のすべてのがんはＨＥＲ３発現により更に特徴付けられる。ＨＥＲ３発現は、ＨＥＲ３タンパク質及び／又は遺伝子の発現（増幅）を指す。ＨＥＲ３の発現量は、免疫組織化学的方法により検出され得るが、前記ＨＥＲ３遺伝子の増幅状態は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）等のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で測定され得る。タンパク質発現アッセイ及び遺伝子増幅検出のための、対応するアッセイ及びキットは、当該技術分野でよく知られている。或いは、ｑＲＴ−ＰＣＲ等他の方法も、ＨＥＲ３の遺伝子発現量を検出するために使用され得る。ＨＥＲ３の発現量は、特に、免疫組織化学的方法により検出され得る。そのような方法は当該技術分野でよく知られている（例えば、下記のＨＥＲ２発現量に関する類似の方法及び試験を参照）。
【００９５】
好ましい一実施態様において、がんは、高い（増加した）ｐＨＥＲ３：ＨＥＲ３比によって特徴付けられる（例えば、新鮮な凍結腫瘍組織のＩＨＣによる解析；前臨床設定でウェスタンブロット、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング法が、リン酸化ＨＥＲ３特異的抗体（αホスホ−ＨＥＲ３  クローン  ２１Ｄ３［Ｔｙｒ１２８９］；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃４７９１）又は抗ＨＥＲ３抗体（αＨＥＲ３クローン  Ｃ−１７；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、＃ｓｃ−２８５）を使用して実施された）。例えば、電気化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＲＰＮ２２０９）を用いてシグナルが検出され得、ＨＥＲ３抗体の各濃度について算出されたＨＥＲ３受容体リン酸化の阻害率が試験される。腫瘍におけるＨＥＲ３リン酸化の解析のためには、腫瘍溶解物を調製し、等量（２０μｇ／レーン）をＳＤＳページで分離する。ＨＥＲ３及びリン酸化ＨＥＲ３（ｐＨＥＲ３）のウェスタンブロッティングは上述の通り実施される。
【００９６】
抗ＨＥＲ２抗体がＨＥＲ２の二量体化を阻害する、ＨＥＲ３抗体と抗ＨＥＲ２抗体との併用療法の文脈では、本明細書で使用される用語「ＨＥＲ２正常がん」は、正常レベルのＨＥＲ２を有する、すなわちＨＥＲ２陽性がんの定義のようなＨＥＲ２過剰発現がない、又はＨＥＲ２発現に対して陰性ではないがん細胞を含むがん／腫瘍性組織等を指す。本発明の目的のためには、「ＨＥＲ２正常がん」は、免疫組織化学（ＩＨＣ）のスコアが２＋であり、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の増幅比が＜２．０（即ち、ＩＳＨ陰性）であるか、或いは免疫組織化学（ＩＨＣ）のスコアが１＋であり、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の増幅比が＜２．０（即ち、ＩＳＨ陰性）である。したがって、患者から得られた乳房組織生検試料若しくは乳房組織切除試料中に、又は転移性部位由来の組織中に、免疫組織化学的方法等で検出される低（ＩＨＣ  １＋）又は中程度（ＩＨＣ  ２＋）のＨＥＲ２（タンパク質）発現量が見出され、且つ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法で検出されるＨＥＲ２遺伝子増幅がない（腫瘍細胞あたりのＨＥＲ２遺伝子のコピーが≦４コピーであるか、若しくはＣＥＰ１７シグナル数に対するＨＥＲ２遺伝子のコピー数の比率が＜２．０のように、ＩＳＨ陰性）のであれは、ＨＥＲ２正常がんが存在する。一実施態様において、「ＨＥＲ２正常がん」は、免疫組織化学（ＩＨＣ）のスコアがＨＥＲ２（２＋）で、ＩＳＨ陰性、或いは免疫組織化学（ＩＨＣ）のスコアがＨＥＲ２（１＋）で、ＩＳＨ陰性（ＩＨＣ  １＋／ＩＳＨ陰性、又はＩＨＣ  ２＋／ＩＳＨ陰性）と定義される。
【００９７】
ＨＥＲ２の発現量は免疫組織化学的方法で検出され得、一方、前記ＨＥＲ２遺伝子増幅状態は蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法）等のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で測定され得る。タンパク質発現アッセイ及び遺伝子増幅検出のための、対応するアッセイ及びキットは、当該技術分野でよく知られている。或いは他の方法、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲがＨＥＲ２の遺伝子発現量を検出するために使用され得る。
【００９８】
ＨＥＲ２の発現量は、特に、免疫組織化学的方法により検出され得る。これらの方法は当該技術分野でよく知られており、対応する市販のキットが利用可能である。本発明に従って利用され得る例示的キットは、特に、Ｄａｋｏ社が製造販売するＨｅｒｃｅｐｔＴｅｓｔＴＭ、又はＶｅｎｔａｎａ  ＰａｔｈｗａｙＴＭと呼ばれる試験キットである。ＨＥＲ２タンパク質の発現量は、提供される試薬を用いて、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔＴＭの手順に従うことによって評価することができる。当業者は、免疫組織化学的方法によってＨＥＲ２の発現量を決定するための更なる手段及び方法を知っているであろう；例えば、国際公開第２００５／１１７５５３号を参照されたい。したがって、ＨＥＲ２の発現量は、容易に且つ再現性よく、過度の負担なしに当業者によって決定され得る。しかし、正確で再現性のある結果を確保するためには、試験手順の妥当性を確保することができる専門の実験室で試験を行わなければならない。
【００９９】
ＨＥＲ２の発現量は、低い発現量、中程度の発現量、及び高い発現量に分類することができる。本発明の文脈で、ＨＥＲ２正常疾患は、ＨＥＲ２の低又は弱い発現量（例えば、ＩＨＣによるＨＥＲ２（１＋又は２＋））及びＩＳＨ陰性により定義され、例えば、がん患者の試料において決定される。したがって、免疫組織化学とｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションとを用いた並行試験が好ましい。
【０１００】
本明細書中でＨＥＲ２（０）、ＨＥＲ２（＋）、ＨＥＲ２（＋＋）及びＨＥＲ２（＋＋＋）と示されている、ＨＥＲ２発現量を表す、乳がんにおけるＩＨＣ染色パターンを評価するための推奨されるスコアリングシステムは、以下の通りである：
下記のＩＨＣ染色パターンが、乳がんにおけるＨＥＲ２状態の決定のために推奨される（Ｄａｋｏ社製Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔの添付文書を参照）。
【０１０１】
0006257646.tif 000004
【０１０２】
上記のＩＨＣ染色パターンは、乳がんにおけるＨＥＲ２状態決定において慣用的に使用される。本明細書で使用されるＨＥＲ２（＋）、ＨＥＲ２（＋＋）及びＨＥＲ２（＋＋＋）なる用語は、用語ＨＥＲ２（１＋）、ＨＥＲ２（２＋）及びＨＥＲ２（３＋）に相当する。本明細書の文脈で用いられる「正常なＨＥＲ２タンパク質発現量」は、スコア１＋（上に示した表によると「陰性評価」）、及びスコア２＋の「弱い陽性」である。本明細書で上に詳述したように、タンパク質発現量の評価（すなわち、表に示したようなスコアリングシステム）は、免疫組織化学的方法によって得られる結果に基づくものである。したがって、標準として又は慣用的に、ＨＥＲ２状態は、ＦＤＡ承認の入手可能な２つの市販のキット、すなわちＤａｋｏ  ＨｅｒｃｅｐｔｅｓＴＭ及びＶｅｎｔａｎａ  ＰａｔｈｗａｙＴＭのうちの一つを用いて免疫組織化学によって評価される。これらは、発現量を、０（一細胞当たり＜２００００個の受容体、ＩＨＣ染色による可視の発現なし）、１＋（一細胞当たり〜１０００００個の受容体、部分的な膜染色、ＨＥＲ２過剰発現細胞の＜１０％）、２＋（一細胞当たり〜５０００００個の受容体、弱から中程度の完全な膜染色、ＨＥＲ２過剰発現細胞の＞１０％）、及び３＋（一細胞当たり（〜２００００００個の受容体、強い完全な膜染色、ＨＥＲ２過剰発現細胞の＞１０％）に階層化する半定量アッセイである。
【０１０３】
或いは、ＨＥＲ２タンパク質発現量を評価するための更なる方法、例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法に基づく各種検出システム等が使用され得る。
【０１０４】
下記のＩＨＣ染色パターンが、胃がんにおけるＨＥＲ２状態の決定のために推奨される（Ｄａｋｏ社製Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔの添付文書を参照）：
【０１０５】
0006257646.tif 000005
【０１０６】
ＨＥＲ２正常疾患は、ＨＥＲ２の低又は弱い発現量（例えば、ＩＨＣによるＨＥＲ２（１＋又は２＋））及びＩＳＨ陰性によって定義される。
【０１０７】
上記に従い、評価する試料は、上で定義したＨＥＲ２正常がんを有する患者由来の（患者から得られた）ものであり得る。例えば、試料は、腫瘍性組織、腫瘍（単数又は複数）から得られ、したがって、乳房腫瘍等のＨＥＲ２発現腫瘍であることが疑われる腫瘍細胞（単数若しくは複数）又は腫瘍組織（単数若しくは複数）である。当業者は、当該技術分野で知られている標準的な手法や本明細書に開示されている方法を用いて、そのような腫瘍及び／又は対応するがんに罹患している個体／患者を同定できる立場にある。一般的に、前記腫瘍細胞又はがん細胞は、任意の生物学的供給源／生物体、特に、上記のがんに罹患している任意の生物学的供給源／生物体から得られうる。好ましくは、本発明の文脈で特に有用な細胞は、ヒト細胞である。これらの細胞は、例えば生検から、又は生物学的試料から得られうる。腫瘍／がん／腫瘍細胞／がん細胞は固形腫瘍／がん／腫瘍細胞／がん細胞である。上記に従い、がん／腫瘍細胞は、乳房のがん／腫瘍細胞であり得、又は前記試料は乳房のがん／腫瘍細胞等のがん／腫瘍細胞を含む。上記に従い、前記腫瘍／がんは乳房のがん／腫瘍であり得る。
【０１０８】
ヒトＨＥＲ３に結合する抗体とヒトＨＥＲ１に結合する抗体の両方（又は少なくとも一方）が、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする、抗ＩＨＥＲ３抗体の抗ＨＥＲ１抗体との併用療法の文脈において、ＨＥＲ１発現はＨＥＲ１タンパク質及び／又は遺伝子発現（増幅）を指す。ＨＥＲ１の発現量は、免疫組織化学的方法により検出され得るが、前記ＨＥＲ１遺伝子の増幅状態は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）等のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で測定され得る。タンパク質発現アッセイ及び遺伝子増幅検出のための、対応するアッセイ及びキットは、当該技術分野でよく知られている。或いは、ｑＲＴ−ＰＣＲ等の他の方法も、ＨＥＲ１の遺伝子発現量を検出するために使用され得る。ＨＥＲ１の発現量は、特に、免疫組織化学的方法により検出され得る。そのような方法は当該技術分野でよく知られている（例えば、上記のＨＥＲ２発現量に関する類似の方法及び試験を参照）。本明細書に記載の抗体の組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤等のアジュバントを含有してもよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順、並びに種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の封入の両方により確実にすることができる。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウム等を組成物中に含めることが望ましいこともあり得る。更に、注射用医薬形態の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる作用物質を含めることによってもたらされ得る。
【０１０９】
選択された投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られている一般的な方法により薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１１０】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性でなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するために効果的な有効成分の量を得るために、多様であってもよい。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療の期間、使用される特定の組成物と併用して用いられる他の薬物、化合物及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態、及び既往歴、並びに医学の技術分野において周知である同様の要因を含む多様な薬物動態因子に依存するであろう。
【０１１１】
組成物は、無菌でなければならず、注射器によって送達できる程度にまで流動性でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張緩衝生理食塩水である。
【０１１２】
適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトールやソルビトール等のポリアルコール類、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【０１１３】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「治療する」は、部分的若しくは完全に、患者における腫瘍の増殖、腫瘍転移又は他の発がん若しくは腫瘍性細胞の進行を止め、軽減し、阻害し、又は予防することを意味する。特に断らない限り、本明細書で使用する用語「治療」は、治療する行為を指す。
【０１１４】
語句「治療方法」又はこれと同義の用語は、例えばがんに適用される場合、患者におけるがん細胞の数を減少させ、又は消滅させるように、又はがんの症状を緩和するように設計された手順又は行動方針を指す。がん又は他の増殖性疾患の「治療方法」は、がん細胞若しくは他の疾患が実際に消滅され、細胞の数若しくは疾患が実際に低減され、又はがん若しくは他の疾患の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味するとは限らない。がんの治療方法は、しばしば、成功の確率が低くても、患者の既往歴や推定生存期間を前提として、総合的に有益な行動方針であると考えられる治療方法が実施される。
【０１１５】
対象化合物の量又は併用量が、研究者、獣医、医師若しくは他の臨床家が求める組織、系、動物若しくはヒトの生物学的又は医学的奏功を引き出す量である、治療的有効量で抗体が患者に投与されることは自明である。
【０１１６】
用語「併用で」は、抗ＨＥＲ３抗体が、抗ＨＥＲ２抗体（又は抗ＨＥＲ１抗体）に加えて投与される、「共投与」を指す。「共投与」は、第一の抗体が同時に又は連続的に第二の抗体に加えて投与されることを意味する。共投与は、同時であっても、又は任意の順序で連続的であってもよく、両方（又はすべて）の活性剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間があることが好ましい。両方の抗体が同時に投与される場合、用量は、同じ日に一回の投薬で、例えば一回の連続的注入の間に、投与される。両方の抗体が連続的に投与される場合、用量は、同じ日に、例えば、二つの別々の連続的注入のように、二回別々に投与されるか、又は、抗体の一方は１日目に投与され、第二の抗体は２日目から７日目、好ましくは２日目から４日目に投与される。第一の抗体及び第二の抗体の維持用量に関して、用語「共投与」は、治療サイクルが両方の抗体について適切ならば、維持用量が同時に投与される（例えば一回の連続的注入の間に）ことを意味する。或いは前記維持用量は、１日又は数日以内に連続して、例えば、第一の抗体の維持用量は３週毎に、第二の抗体の維持用量は２週毎に投与される。また、両方の抗体について他の治療サイクル（通常１−４週間、好ましくは２−３週間）も使用され得る。
【０１１７】
抗体の共投与の量及び投与のタイミングは、治療される患者のタイプ（人種、性別、年齢、体重等）及び状態、並びに治療される疾患又は状態の重症度に依存する。通常、典型的な用量の抗体が使用される。例えば、本発明の抗体の投与のための用量は、一若しくは複数の別々の投与により、又は連続的注入により、抗体の約１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）であり得る。典型的な一日量は、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。好ましい態様において、抗体は、約１ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、２週から３週毎に投与される。トラスツズマブの好ましい用量は、連続的注入として４ｍｇ／ｋｇの初回負荷量が投与され、その後疾患の進行が認められるまで連続的注入として２ｍｇ／ｋｇから６ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２ｍｇ／ｋｇの注入で３週毎に投与される。
【０１１８】
本発明の文脈では、追加の他の細胞傷害剤、化学療法剤若しくは抗がん剤、又はそのような薬剤の効果を高める化合物が本発明の併用療法において使用され得る。そのような薬剤は、例えば以下を含む：シクロホスファミド（ＣＴＸ；例えば、シトキサン（登録商標））、クロラムブシル（ＣＨＬ；例えば、ロイケラン（登録商標））、シスプラチン（ＣｉｓＰ；例えば、プラチノール（登録商標））、ブスルファン（例えば、ミレラン（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ等のアルキル化剤又はアルキル化作用を有する薬剤；メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；例えば、べプシド（登録商標））、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（例えば、ゼロータ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）等の代謝拮抗剤；アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；例えば、アドリアマイシン（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン等の抗生物質；、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチン、及び同類のもの）等のアルカロイド；及び、パクリタキセル（例えば、タキソール（登録商標））や、パクリタキセル誘導体等の他の抗腫瘍剤、細胞増殖抑制剤、デキサメサゾン（ＤＥＸ；例えば、デカドロン（登録商標））等のグルココルチコイド、並びに、プレドニゾン等のコルチコステロイド、ヒドロキシウレア等のヌクレオシド酵素阻害剤、アスパラギナーゼ、ロイコボリンや他の葉酸誘導体等のアミノ酸除去酵素、並びに、類似の様々な抗腫瘍剤。以下の薬剤も、追加の薬剤として使用されてもよい：アミホスチン（例えば、エチオール（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン  リポ（例えば、ドキシル（登録商標））、ゲムシタビン（例えば、ジェムザール（登録商標））、ダウノルビシン  リポ（例えば、ダウノキソーム（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えば、タキソテール（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトセシン、ＣＰＴ  １１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ  ７−エチル−カンプトセシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロン  ベータ、インターフェロン  アルファ、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル。一実施態様において、本発明の併用療法は、このような追加の細胞傷害剤、化学療法剤若しくは抗がん剤、又はこのような薬剤の効果を高める化合物なしで使用される。
【０１１９】
本発明の文脈では、抗ホルモン剤が本発明の併用療法において使用され得る。本明細書で使用される用語「抗ホルモン剤」は、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く天然若しくは合成の有機化合物又はペプチド化合物を含む。抗ホルモン剤として、例えば、ステロイド受容体拮抗物質、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、他のアロマターゼ阻害剤、４２−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（例えば、フェアストン（登録商標））等の抗エストロゲン；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン等の抗アンドロゲン；並びに上記のいずれの、薬学的に許容される塩、酸又は誘導体；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、並びに黄体ホルモン（ＬＨ）及びＬＨＲＨ（黄体ホルモン放出ホルモン）等の糖タンパク質ホルモンの作用物質及び／又は拮抗物質；ゾラデックス（登録商標）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）として市販されているＬＨＲＨ作用物質である酢酸ゴセレリン；ＬＨＲＨ拮抗物質Ｄ−アラニンアミド  Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−アラニル−４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニル−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−アラニル−Ｌ−セリル−Ｎ６−（３−ピリジニルカルボニル）−Ｌ−リシル−Ｎ６−（３−ピリジニル−カルボニル）−Ｄ−リシル−Ｌ−ロイシル−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−リシル−Ｌ−プロリン（例えば、Ａｎｔｉｄｅ（登録商標）、Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ）；ＬＨＲＨ拮抗物質である酢酸ガニレリクス；ステロイド性抗アンドロゲンでる酢酸シプロテロン（ＣＰＡ）及びＭｅｇａｃｅ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）として市販されている酢酸メゲストロール；Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）として市販されている非ステロイド性抗アンドロゲンであるフルタミド（２−メチル−Ｎ−［４，２０−ニトロ−３−（トリフルオロメチル）フェニルプロパンアミド）；非ステロイド性抗アンドロゲンであるニルタミド、（５，５−ジメチル−３−［４−ニトロ−３−（トリフルオロメチル−４’−ニトロフェニル）−４，４−ジメチル−イミダゾリジン−ジオン）；並びにＲＡＲ（レチノイン酸受容体）、ＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）、ＴＲ（甲状腺受容体）、ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）及び類似のものの拮抗物質等の他の非許容受容体拮抗物質が挙げられる。一実施態様において、本発明の併用療法はこのような追加の抗ホルモン剤なしで使用される。
【０１２０】
化学療法レジメンにおける上記細胞傷害剤及び他の抗癌剤の使用は、一般に、がん治療の分野において特徴が明らかにされており、本明細書におけるその使用も、耐性及び有効性のモニタリング並びに投与経路及び投与量の制御について、幾らか調節した上で、同様に考慮される。例えば、細胞傷害剤の実際の用量は、組織培養法を用いることにより決定される患者の培養細胞応答に応じて変化し得る。一般に、用量は、追加の他の薬剤の非存在下で使用される量と比較して減らされる。
【０１２１】
有効な細胞傷害剤の典型的な用量は、製造者によって推奨される範囲であってよく、インビトロ反応又は動物モデルにおける反応により指示される場合、最大約１桁までの範囲で濃度又は量を減らすことができる。したがって、実際の用量は、医師の判断、患者の状態、及び初代培養悪性細胞若しくは組織培養試料のインビトロ応答性に基づくか、又は適切な動物モデルにおいて観察される応答に基づく治療法の有効性によって決まる。
【０１２２】
本発明の文脈では、例えば、米国特許第６０８０７６９号、第６１９４４３８号、第６２５８８２４号、第６５８６４４７号、第６０７１９３５号、第６４９５５６４号、第６１５０３７７号、第６５９６７３５号、及び第６４７９５１３号、並びに国際特許公開第０１／４０２１７号に開示及び特許請求されている化合物を含む、酵素ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼの阻害剤及び受容体チロシンキナーゼＰＤＧＦＲの阻害剤を含む追加の抗増殖剤が、本発明の併用療法において使用され得る。一実施態様において、本発明の併用療法はこのような追加の抗増殖剤なしで使用される。
【０１２３】
本発明の文脈では、本発明の併用療法に加えて電離放射線の有効量が実施され得、及び／又は放射性医薬品が使用されてもよい。放射線源は、治療されるべき患者の外部又は内部のいずれかにあってよい。放射線源が患者に対して外部である場合、治療は外部照射療法（ＥＢＲＴ）として知られている。放射線源が患者に対して内部である場合、治療は近接照射療法（ＢＴ）と称される。本発明の文脈で使用される放射性原子は、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、及びインジウム−１１１を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。本発明のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤が抗体である場合、このような放射性同位体で該抗体を標識することも可能である。一実施態様において、本発明の併用療法はこのような追加の電離放射線なしで使用され得る。
【０１２４】
放射線療法は、切除不可能若しくは手術不可能な腫瘍及び／又は腫瘍転移物を抑制するための標準的な治療である。放射線療法が化学療法と併用された場合に、改善した結果が見られた。放射線療法は、標的領域に送達された高用量の放射線が腫瘍組織及び正常組織の両方において生殖細胞の死をもたらすという原理に基づいている。放射線投与レジメンは、一般的に、放射線吸収用量（Ｇｙ）、時間及び細分化の観点から定義され、がん専門医によって注意深く定められる必要がある。患者が受ける放射線量は、様々な考慮に依拠することになるが、二つの最も重要なことは、体の他の重要な構造又は臓器に対する腫瘍の位置及び腫瘍が広がる程度である。放射線療法を受ける患者の典型的な治療過程は、約１．８から２．０Ｇｙの単回一日画分で週に５日、総用量で１０から８０Ｇｙ患者に投与される、１から６週間にわたる治療スケジュールである。本発明の好ましい実施態様において、ヒト患者の腫瘍が本発明の併用療法と放射線とを用いて治療される場合に相乗効果がある。換言すれば、本発明の併用療法又は単独療法を構成する薬剤よる腫瘍増殖の阻害は、放射線と組合わされた時に、場合により追加の化学療法剤又は抗癌剤と組合わされた時に、亢進される。アジュバント放射線療法のパラメーターは、例えば、国際特許公開第９９／６００２３号に包含されている。
【０１２５】
前記抗体は、既知の方法に従って、ボーラスとして静脈内投与により、又はある一定時間かけての連続的注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、若しくは腱鞘内経路で、患者に投与される。該抗体の静脈内投与又は皮下投与が好ましい。
【０１２６】
本発明は、容器と、抗ＨＥＲ３抗体を含む容器内の組成物と、前記抗ＨＥＲ３抗体を、ＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗ＨＥＲ２抗体と併用でＨＥＲ２正常がんの患者に投与するように該組成物の使用者に対して指示する添付文書とを含む製品を更に提供する。
【０１２７】
本発明は、容器と、抗ＨＥＲ３抗体を含む容器内の組成物と、前記抗ＨＥＲ３抗体を、ＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗ＨＥＲ２抗体と併用でがんの患者に投与するように該組成物の使用者に対して指示する添付文書とを含む製品を更に提供する。
【０１２８】
本発明は、容器と、抗ＨＥＲ３抗体を含む容器内の組成物と、前記抗ＨＥＲ３抗体を、抗ＨＥＲ１抗体と併用でがん患者に投与するように該組成物の使用者に対して指示する添付文書とを含む製品を更に提供し、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体と、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体の両方が、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする。
【０１２９】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指し、このような治療製品の使用に関する、指示、用法、用量、投与、禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１３０】
一実施態様において、製品の容器は、薬学的に許容される担体を更に含み得る。製品は無菌の希釈剤を更に含んでもよく、それは、好ましくは、別個の追加の容器に保存される。
【０１３１】
以下に本発明の一連の実施態様を列挙する：
１．ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体との併用での、がんの治療における使用のためのヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、ここで、がんはＨＥＲ２正常がんである。
２．ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする実施態様１に記載の抗体。
３．ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ、軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１１であることを特徴とする実施態様１に記載の抗体、或いはそのヒト化型。
４．ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする実施態様１に記載の抗体。
５．ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１１であることを特徴とする実施態様１に記載の抗体。
６．ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする実施態様１に記載の抗体。
７．ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であることを特徴とする実施態様１に記載の抗体。
８．ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする実施態様１から７の何れか一に記載の抗体。
９．ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体がペルツズマブである、実施態様１から８の何れか一に記載の抗体。
１０．がんがＨＥＲ３発現により特徴付けられる、実施態様１から９の何れか一に記載の抗体。
１１．がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、膵臓がん、又は頭頚部がん、乳がんである、実施態様１から１０のいずれか一に記載の抗体。
【０１３２】
以下に、本発明の別の一連の実施態様を列挙する：
１．ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体との併用でのがん治療のための医薬の製造のための、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体の使用であって、ここで、がんはＨＥＲ２正常がんである。
２．実施態様１に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体である。
３．実施態様１に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ、軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１１であることを特徴とする抗体、或いはそのヒト化型である。
４．実施態様１に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体である。
５．実施態様１に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１１であることを特徴とする抗体である。
６．実施態様１に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体である。
７．実施態様１に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であることを特徴とする抗体である。
８．実施態様１から７の何れか一に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする抗体である。
９．実施態様１から８の何れか一に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体はペルツズマブである。
１０．がんがＨＥＲ３発現により特徴付けられる、実施態様１から９の何れか一に記載の使用。
１１．がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、膵臓がん、又は頭頚部がん、乳がんである、実施態様１から１０の何れか一に記載の使用。
【０１３３】
以下に、本発明の別の一連の実施態様を列挙する：
１．ＨＥＲ２正常がんの患者の治療方法であって、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体と併用でヒトＨＥＲ３に結合する抗体を共投与することを含む方法。
２．実施態様１に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインが配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体である。
３．実施態様１に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ、軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であるか、又はその軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１１であることを特徴とする抗体、或いはそのヒト化型である。
４．実施態様１に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体である。
５．実施態様１に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１１であることを特徴とする抗体である。
６．実施態様１に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体である。
７．実施態様１に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であることを特徴とする抗体である。
８．実施態様１に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする抗体である。
９．実施態様１に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ２に結合し、且つＨＥＲ２の二量体化を阻害する抗体はペルツズマブである。
１０．がんがＨＥＲ３発現により特徴付けられる、実施態様１から９に記載の何れか一の方法。
１１．がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、膵臓がん、又は頭頚部がん、乳がんである、実施態様１から１０に記載の何れか一の方法。
【０１３４】
以下に、本発明の別の一連の実施態様を列挙する：
１．ヒトＨＥＲ１に結合する抗体との併用でのがんの治療における使用のための、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体と、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体のうちの少なくとも一方の抗体がＡｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする抗体。
２．ＨＥＲ３に結合する抗体と、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体の両方が、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする、実施態様１に記載の抗体。
３．ヒトＨＥＲ３に結合する抗体が、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする実施態様１又は２に記載の抗体。
４．ヒトＨＥＲ３に結合する抗体が、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であることを特徴とする実施態様１又は２に記載の抗体。
５．ヒトＨＥＲ１に結合する抗体が、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号２０であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号２１であることを特徴とする実施態様３又は４に記載の抗体。
６．がんがＨＥＲ３発現により特徴付けられる、実施態様１から５の何れか一に記載の抗体。
７．がんがＨＥＲ１発現により特徴付けられる、実施態様６に記載の抗体。
８．がんが、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、又は頭頚部がんである、実施態様１から８の何れか一に記載の抗体。
【０１３５】
以下に、本発明の別の一連の実施態様を列挙する：
１．ヒトＨＥＲ１に結合する抗体との併用でのがんの治療のための医薬の製造のための、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体と、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体のうちの少なくとも一方の抗体がＡｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする抗体である。
２．実施態様１に記載の使用であって、ここで、ＨＥＲ３に結合する抗体と、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体の両方が、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする抗体である。
３．実施態様１又は２に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体である。
４．実施態様１又は２に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であることを特徴とする抗体である。
５．実施態様３又は４に記載の使用であって、ここで、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号２０であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号２１であることを特徴とする抗体である。
６．がんがＨＥＲ３発現により特徴付けられる、実施態様１から５の何れか一に記載の使用。
７．がんがＨＥＲ１発現により特徴付けられる、実施態様６に記載の使用。
８．がんが、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、又は頭頚部がんである、実施態様１から８の何れか一に記載の使用。
【０１３６】
以下に、本発明の別の一連の実施態様を列挙する：
１．ヒトＨＥＲ１に結合する抗体と併用でヒトＨＥＲ３に結合する抗体を共投与することを含むがんの患者の治療方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体と、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体のうちの少なくとも一方の抗体がＡｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする抗体である。
２．実施態様１に記載の方法であって、ここで、ＨＥＲ３に結合する抗体と、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体の両方が、Ａｓｎ２９７において糖鎖でグリコシル化されていて、それにより前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下であることを特徴とする抗体である。
３．実施態様１又は２に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインとして配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体である。
４．実施態様１又は２に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号８であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号１０であることを特徴とする抗体である。
５．実施態様３又は４に記載の方法であって、ここで、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号２０であり；且つ軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号２１であることを特徴とする抗体である。
６．がんがＨＥＲ３発現により特徴付けられる、実施態様１から５の何れか一に記載の方法。
７．がんがＨＥＲ１発現により特徴付けられる、実施態様６の方法。
８．がんが、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、又は頭頚部がんである、実施態様１から８の何れか一に記載の方法。
【０１３７】
以下の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されるが、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順で改変がなされ得る。
【０１３８】
配列表の説明
配列番号１      重鎖ＣＤＲ３Ｈ、Ｍａｂ  ２０５．１０
配列番号２      重鎖ＣＤＲ２Ｈ、Ｍａｂ  ２０５．１０
配列番号３      重鎖ＣＤＲ１Ｈ、Ｍａｂ  ２０５．１０
配列番号４      軽鎖ＣＤＲ３Ｌ、Ｍａｂ  ２０５．１０
配列番号５      軽鎖ＣＤＲ２Ｌ、Ｍａｂ  ２０５．１０
配列番号６      軽鎖ＣＤＲ１Ｌ（変異体１）、Ｍａｂ  ２０５．１０
配列番号７      軽鎖ＣＤＲ１Ｌ（変異体２）、Ｍａｂ  ２０５．１０
配列番号８      重鎖可変ドメインＶＨ、Ｍａｂ  ２０５．１０
配列番号９      軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍａｂ  ２０５．１０．１
配列番号１０    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍａｂ  ２０５．１０．２
配列番号１１    軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍａｂ  ２０５．１０．３
配列番号１２    ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号１３    ＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号１４    Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａで変異したＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号１５    ＩｇＧ４由来のヒト重鎖定常領域
配列番号１６    Ｓ２２８Ｐで変異したＩｇＧ４由来のヒト重鎖定常領域
配列番号１７    ヒトＨＥＲ３（シグナルペプチドを含む）
配列番号１８    ヒトＨＥＲ２（シグナルペプチドを含む）
配列番号１９    ヒトＨＥＲ１（シグナルペプチドを含む）
配列番号２０    抗ＨＥＲ１抗体ＧＡ２０１の重鎖可変ドメインＶＨ
配列番号２１    抗ＨＥＲ１抗体ＧＡ２０１の軽鎖可変ドメインＶＬ
【実施例】
【０１３９】
実施例１
免疫化
ＮＭＲＩマウスをｈＨＥＲ３−ＥＣＤ（社内）で免疫し、ｈｕ−ＨＥＲ３−ＥＣＤで追加免疫した。免疫応答を、ＨＥＲ１／２／３−ＥＣＤ−ＥＬＩＳＡに対して血清試料を試験することによりモニタリングした。十分な力価の抗ＨＥＲ３免疫グロブリンを有するマウスからの脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３  Ａｇ８．６５３との融合により、後の不死化のために凍結させた。一回融合させ、ハイブリドーマ上清を、交差反応を示さないが、ＨＥＲ３−ＥＣＤに結合するＨＥＲ１／２／−ＥＣＤ−ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、抗ＨＥＲ３選択的ハイブリドーマを選択した。適切なハイブリドーマを、単一細胞ＦＡＣＳ選別によりクローニングした。異なったハイブリドーマからの単一細胞クローンをインビトロで培養し、特徴付けのために組織培養培地中に抗体を作製した。ＨＥＲ３リン酸化、ＡＫＴリン酸化、及びＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の腫瘍細胞増殖を阻害する抗体の能力を測定することにより、抗体を選択した（以下の実施例を参照）。得られた抗体から一つを更にヒト化させ、それぞれＶＨ及びＶＬ又はＣＤＲを有する以下の抗体、Ｍａｂ  ２０５．１０．１、Ｍａｂ  ２０５．１０．２及びＭａｂ  ２０５．１０．３を得た。
【０１４０】
0006257646.tif 000006
【０１４１】
0006257646.tif 000007
【０１４２】
一実施態様において、このような抗体は、ヒト起源の定常領域、例えば配列番号１２−１３を用いて調製した。
【０１４３】
実施例２
結合アッセイ
ａ）ヒトＨＥＲ３  ＥＣＤへの結合に関する抗原特異的ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）に融合した可溶性ヒトＨＥＲ３細胞外ドメインをストレプトアビジンプレート上に捕捉させた。ＳＰＢ−ＣＤＣＰ１に対する抗体の最適な結合性を定めるために、ドイツ、ベルンリードのＭｉｃｒｏＣｏａｔ社（ＩＤ番号１７３４７７６−００１）から納入された３８４ウェルのポリスチレンプレート（ＮＵＮＣ、ストレプトアビジンでコーティング）を、純粋で段階希釈されたＨＥＫ２９３上清（ＢＳＡ／ＩＭＤＭバッファー：１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ画分Ｖ、Ｒｏｃｈｅ  １０７３５０７８００１、Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地に溶解）でコーティングした。マウスキメラ２０５抗体の較正曲線を使用し、マイクロタイタープレートのストレプトアビジン結合能力に関するＨＥＫ２９３上清の最適希釈係数を同定した。標準的なコーティングについて、ＳＢＰ−ＨＥＲ３含有ＨＥＫ２９３上清を希釈し（１：１５から１：４０）、２〜８０℃で一晩インキュベートした（ウェル当たり２５μｌ）。残りの未結合ＳＢＰ−ＨＥＲ３を除去するために、マイクロタイタープレートを徹底的に洗浄する必要がある。
【０１４４】
本発明の抗体を、未希釈か又は１２段階希釈を使用して試験した。ウェル当たり１２．５μｌの各試料を、室温で９０分インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ２０）２５μｌを使用して徹底的に洗浄した後、ヒト抗体用のＨＲＰと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、コード番号１０９−０３６−０９８、１：１００００希釈）を添加し、１時間インキュベートした。徹底的に洗浄した後、抗体の結合を、ＡＢＴＳ錠（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号１１１２４２２）で検出した。４０５ｎｍ／４９２ｎｍでの吸光度を標準的な光度計を使用して測定した。
【０１４５】
表は異なる抗体の相対的結合比を示している。
【０１４６】
0006257646.tif 000008
【０１４７】
ｂ）バイアコア分析によるヒトＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）断片への抗ＨＥＲ３抗体の結合の特徴付け：
親和性測定のために、３０μｇ／ｍｌの抗Ｆｃγ抗体（ヤギ由来、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＳＰＲ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００）での標準的なアミンカップリング及びブロッキング化学によってＣＭ−５センサーチップの表面に結合させた。コンジュゲート後、５μＬ／分の流速で抗ＨＥＲ３抗体を、続いて３０μＬ／分でヒトＨＥＲ３  ＥＣＤの希釈系列（０ｎＭから１００００ｎＭ）を２５℃で注入した。結合実験用のランニングバッファーとして、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを使用した。ついで、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０溶液の６０秒パルスでチップを再生させた。
【０１４８】
熱力学的パラメーターの計算（ＫＤ、ＨＥＲ３に対する結合定数）を、ラングミュラー１：１結合モデルを使用して算出した。
【０１４９】
0006257646.tif 000009
【０１５０】
競合結合アッセイ（バイアコア）において、Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ２０５．１０．２及びＭａｂ２０５．１０．３はすべて同じエピトープへの結合性を示した。国際公開第２００７／０７７０２８号に記載の抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１−７、Ｕ−５３及びＵＵ１−５９、並びに国際公開第２００８／１００６２４号に記載のＡｂ＃６をこのようなアッセイで調べ、抗体Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ２０５．１０．２及びＭａｂ２０５．１０．３とは異なるエピトープに結合することが明らかとなった。
【０１５１】
実施例３
ａ）ＭＣＦ７、ＦａＤｕ及びＭｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の阻害
次のプロトコルに従い、アッセイをＭＣＦ７細胞及びＦａＤｕ細胞において実施した：１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた６ウェルプレートに、５０００００細胞／ウェルで細胞を播種する。２４時間インキュベートする。吸引により培地を除去し、０．５％のＦＣＳを含有する５００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０と共に一晩インキュベートする。０．５％のＦＣＳを含有する５００μｌのＲＰＭＩ１６４０中に抗体を添加する。１時間インキュベートする。１０分間、ＨＲＧ−１ｂ（最終濃度５００ｎｇ／ｍｌ）を添加する。細胞を溶解させるために培地を除去し、８０μｌの氷冷トリトン−Ｘ−１００細胞溶解バッファーを添加し、氷上で５分インキュベートする。１．５ｍｌの反応チューブに溶解物を移した後、４℃で１５分、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、新たな反応チューブに上清を移す。ＳＤＳ充填バッファーに同量のタンパク質を含有する試料をＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に対して半乾燥ウェスタンブロットを用いてブロットした。１ｘＮＥＴバッファー＋０．２５％のゼラチンにより１時間膜をブロックし、抗体αホスホ−ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３（Ｔｙｒ１２８９）（２１Ｄ３）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４７９１によりｐＨＥＲ３を、抗体αＥｒｂＢ３（Ｃ−１７）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、＃ｓｃ−２８５によりＨＥＲ３を、それぞれ検出する。洗浄及びＰＯＤ結合二次抗体によるシグナル検出の後、バンドをデンソメーターでスキャンした。抗ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ２０５．１０．２及びＭａｂ２０５．１０．３、並びに国際公開第２００７／０７７０２８号に記載の抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１−７、Ｕ−５３及びＵ１−５９、及び国際公開第２００８／１００６２４号に記載のＡｂ＃６について調べた。ＭＣＦ７細胞における受容体リン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害率（％）を以下及び図１Ａに示す。
【０１５２】
0006257646.tif 000010
【０１５３】
更なる実験において、抗ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ２０５．１０．２、並びに国際公開第９７／３５８８５号に記載の抗ＨＥＲ３抗体８Ｂ８．２Ｄ９、及び国際公開第２００３／０１３６０２号に記載の１Ｂ４Ｃ３と２Ｄ１Ｄ１２についても調べた。ＭＣＦ７細胞における受容体リン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害率（％）を以下及び図１Ｂに示す。
【０１５４】
0006257646.tif 000011
【０１５５】
ＦａＤｕ細胞における受容体リン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害率（％）を以下に示す。
【０１５６】
0006257646.tif 000012
【０１５７】
更なる実験では、抗ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ２０５．１０．２、並びに国際公開第９７／３５８８５号に記載の抗ＨＥＲ３抗体８Ｂ８．２Ｄ９、並びに国際公開第２００３／０１３６０２号に記載の１Ｂ４Ｃ３と２Ｄ１Ｄ１２、及び１０５．５型（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０５−４７、国際公開第２００３／０１３６０２号でα−ＨＥＲＥＣＤと命名）を、Ｍｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞において調べた。Ｍｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞におけるアッセイを、ＭＣＦ７及びＦａＤｕ細胞について上述のプロトコルに従い実施した。細胞数及び培地の体積を、１２ウェルプレートに適合させた。Ｍｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞における受容体リン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害率（％）を以下と図１Ｃに示す。
【０１５８】
0006257646.tif 000013
【０１５９】
ｂ）ＡＫＴリン酸化（ＥＬＩＳＡ）
アッセイを、次のプロトコルに従い、ＭＣＦ７細胞で実施した：１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた９６ウェルプレートに、３００００細胞／ウェルでＭＣＦ７細胞を播種し、２４時間インキュベートする。清浄なペーパータオルで軽くたたくことにより培地を除去し、２００μｌの無血清培地で注意深く洗浄し、０．５％のＦＣＳを含有する１００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０と共に一晩インキュベートする。上述の通りに培地を除去し、０．５％のＦＣＳを含有する１００μｌのＲＰＭＩ  １６４０に抗体を添加し、１．５時間インキュベートする。ＨＲＧ−１ｂ（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を１０分間添加する。上述の通りに培地を除去する。細胞を溶解させるために１００μｌの氷冷細胞溶解バッファーを氷上に添加し、約５ｘ．ピペッティングすることにより再懸濁させる。４℃で１０分、３０００ｒｐｍでプレートを遠心分離し、新たなポリプロピレンプレートに８０μｌの上清（又はアリコート）を移し、ＬＮ２においてショック凍結させる。アッセイまで−８０℃で保存する。
【０１６０】
ＡＫＴ１、２（ホスホ−Ｓｅｒ４７３）ＥＩＡキットアッセイデザイン＃９００−１６２：試料（１：１０希釈）を、ＡＫＴのＮ末端に対して特異的なマウスＭＡＢでコーティングしたプレートに添加する。振盪させつつ、室温で１時間インキュベートする。５ｘ洗浄し、振盪させつつ室温で１時間、ビオチン化抗ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）と共にインキュベートする。５ｘ洗浄し、振盪させつつ室温で３０分、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートする。５ｘ洗浄し、振盪させつつ室温で３０分、ＴＭＢ基質と共にインキュベートする。停止させ、４５０ｎｍで読み取る。
【０１６１】
Ｍａｂ  ２０５．１０．２は、ＡＫＴリン酸化阻害のＩＣ５０が０．０６μｇ／ｍｌを示した。
【０１６２】
ＭＣＦ７細胞で記載した通りに実施したＭｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞におけるｐＡＫＴ  ＥＬＩＳＡでは、Ｍａｂ  ２０５．１０．２はＡＫＴリン酸化阻害のＩＣ５０が０．２８μｇ／ｍｌを示し、他のすべての分析で抗体は、５０を超える（＞）ＩＣ５０を示した。
【０１６３】
0006257646.tif 000014
【０１６４】
ｃ）腫瘍細胞増殖の阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞（ＶＩＩヒト乳癌細胞、ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−２５）を使用し、細胞増殖アッセイにおける、ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ２０５．１０．２及びＭａｂ２０５．１０．３の抗腫瘍効果を評価した。ウェル当たり２００００細胞を、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養培地の入った滅菌９６ウェル組織培養プレートに播種し、３７℃±１℃で５％±１％のＣＯ２とともに１日インキュベートした。該細胞は、約１．５日の倍加時間でゆっくりと増殖する細胞である。抗ＨＥＲ３抗体を希釈系列に添加し、更に６日間インキュベートした。ついで、細胞生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）により得られた結果を用いて評価した。細胞生存率がコントロールの５０％超まで低下した場合、ＩＣ５０値を、各抗体濃度について３回の平均を使用して算出した；一方、最も高い濃度で細胞生存性の阻害率が５０％を下回った場合、ＩＣ５０は算出できず、ＩＣ５０［μｇ／ｍｌ］が最も高い濃度を超えることが示される。また、国際公開第２００７／０７７０２８号に記載の抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１−５９、及び国際公開第２００８／１００６２４号に記載のＡｂ＃６についても調べた。
【０１６５】
0006257646.tif 000015
【０１６６】
更なる実験において、国際公開第９７／３５８８５号に記載の抗ＨＥＲ３抗体８Ｂ８．２Ｄ９、及び国際公開第２００３／０１３６０２号に記載の１Ｂ４Ｃ３についても調べた。
【０１６７】
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【０１６８】
実施例５
１μｇ／ｍｌの特異的溶解液によるＫＬＰ−４腫瘍細胞におけるインビトロＡＤＣＣ（％）
標的細胞ＫＰＬ４（ＡＤＣＣ）（乳癌、ＲＰＭＩ１６４０＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋１０％のＦＣＳ中で培養）を、指数関数的増殖期にトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＃２５３００−０５４）を用いて集めた。洗浄工程及び細胞数と生存率のチェックの後、カルセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｃ３１００ＭＰ；１バイアルを、５０μｌのＤＭＳＯに再懸濁させ、５ｍｌの培地中細胞数を５Ｍｉｏとした）を用い、必要とされるアリコートを細胞インキュベーター中で３７℃で３０分間、標識した。その後、ＡＩＭ−Ｖ培地で細胞を３回洗浄し、細胞数と生存率をチェックし、細胞数を０．３Ｍｉｏ／ｍｌに調整した。
【０１６９】
一方、エフェクター細胞としてのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、製造者のプロトコル（洗浄工程を４００ｇで１ｘ、３５０ｇで２ｘ、各１０分）に従い、密度勾配遠心分離法（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｈ８８８９）により調製した。細胞数及び生存率をチェックし、細胞数を１５Ｍｉｏ／ｍｌに調整した。
【０１７０】
１００μｌのカルセイン染色された標的細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、５０μｌの希釈されたアフコシル化抗体（Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ２０５．１０．２、Ｍａｂ２０５．１０．３、調製は以下を参照）を添加し、そして５０μｌのエフェクター細胞を添加した。いくつかの実験では、標的細胞を、１０ｍｇ／ｍｌのＲｅｄｉｍｕｎｅ濃度でＲｅｄｉｍｕｎｅ（登録商標）ＮＦ液（ＺＬＢ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）と混合した。
【０１７１】
抗体なしに標的細胞とエフェクター細胞を同時培養した、自然溶解液（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  Ｌｙｓｉｓ）と、標的細胞のみの１％のトリトンＸ−１００溶解液である、最大溶解液（ｍａｘｉｍａｌ  ｌｙｓｉｓ）がコントロールとされた。プレートを、加湿された細胞インキュベーター中、３７℃で４時間インキュベートした。
【０１７２】
標的細胞の死滅を、製造者の使用説明書に従って細胞傷害性検出キット（ＬＤＨ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ  ＃１  ６４４  ７９３）を使用し、ダメージを受けた細胞から放出されるＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）を測定することにより評価した。簡単に述べると、各ウェルからの１００μｌの上清を、透明な平底の９６ウェルプレートにおいて、キットからの１００μｌの基質と混合した。基質の呈色反応のＶｍａｘ値を、少なくとも１０分間、４９０ｎｍにてＥＬＩＳＡリーダーで測定した。特異的抗体媒介死滅率を、次のようにして算出した：（（Ａ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）ｘ１００[式中、Ａは特異的抗体濃度でのＶｍａｘの平均であり、ＳＲは自然放出のＶｍａｘの平均であり、ＭＲは最大放出のＶｍａｘの平均である]。
【０１７３】
付加的な結果として、インタクトな標的細胞のカルセイン保持を、残存標的細胞をホウ酸塩バッファー（５ｍＭのホウ酸ナトリウム＋０．１％のトリトン）に溶解させ、蛍光プレートリーダーでカルセイン蛍光を測定することによって評価した。Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ２０５．１０．２、Ｍａｂ２０５．１０．３は、１μｇ／ｍｌの特異的溶解液によって約４０−６０％のＡＤＣＣ［ＫＰＬ−４］を示した。
【０１７４】
アフコシル化抗体（Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ２０５．１０．２、Ｍａｂ２０５．１０．３）を、二つは抗体発現用、一つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、及び一つはマンノシダーゼＩＩ発現用（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）で、それぞれ４：４：１：１の比率である四つのプラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞にコトランスフェクトすることにより調製した。
【０１７５】
完全抗体（ｆｕｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の重鎖ＤＮＡ配列及び軽鎖ＤＮＡ配列を、ＭＰＳＶプロモーターの制御下、且つ合成ポリＡ部位の上流で、各ベクターがＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を有する哺乳動物発現ベクター（一つは軽鎖用、一つは重鎖用）にサブクローニングする。抗体が、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用し、抗体の重鎖及び軽鎖発現ベクターを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ細胞をコトランスフェクトすることにより産生された。指数関数的に増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、リン酸カルシウム法によりトランスフェクトさせた。糖鎖操作抗体の作製のために、該細胞を、二つは抗体発現用、一つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、及び一つはマンノシダーゼＩＩ発現用で、それぞれ４：４：１：１の比率である四つのプラスミドにコトランスフェクトさせた。細胞を、１０％のＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培養培地を使用し、Ｔフラスコ中で粘着性の単層培養物として増殖させ、それらが５０から８０％コンフルエントになった時にトランスフェクトさせた。Ｔ１５０フラスコでのトランスフェクションのために、１５００万個の細胞を、（最終１０％Ｖ／Ｖで）ＦＣＳを補充した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地にトランスフェクションの２４時間前に播種し、５％ＣＯ２雰囲気にて一晩、３７℃のインキュベーター中に細胞を置いた。作製されるすべての抗体について、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、１８８μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ（二つは抗体発現用（一つは軽鎖、一つは重鎖）、一つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、及び一つはマンノシダーゼＩＩ発現用（ゴルジマンノシターゼＩＩ発現ベクター）で、それぞれ４：４：１：１の比率である四つのプラスミド）と、最終体積が９３８μｌまでの水と、９３８μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液とを混合することにより調製した。この溶液に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４の溶液１８７６μｌ、ｐＨ７．０５を添加し、すぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間放置した。懸濁液を、２％のＦＣＳを補充した４６ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりに、二つのＴ１５０フラスコ分けた。
【０１７６】
前記細胞を、３７℃、５％ＣＯ２にて約１７から２０時間インキュベートし、次いで培地を１０％ＦＣＳのＤＭＥＭ２５ｍｌと取り換えた。調整された培養培地を、２１０ｘｇで１５分間遠心分離することによりトランスフェクションの７日後に収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖでアジ化ナトリウムを添加し、４℃で保持した。
【０１７７】
分泌されたアフコシル化抗体を精製し、抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖を、例えばＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより（例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載したようにして）分析した。この分析のために、オリゴ糖を、ＰＶＤＦ膜に固定されたか、又は溶液中にある抗体を用い、ＰＮＧアーゼＦ消化により抗体から酵素的に放出させた。放出されたオリゴ糖を含有する得られた消化溶液は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析用に直接調製されるか、又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析用に試料を調製する前に、ＥｎｄｏＨグリコシターゼで更に消化させた。Ａｓｎ２９７での、糖鎖内のフコースの分析量は５０−２０％であった。
【０１７８】
実施例６
抗ＨＥＲ３単剤療法のインビボ抗腫瘍効果
抗体Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ２０５．１０．２、Ｍａｂ２０５．１０．３のインビボ抗腫瘍効果は、ＳＣＩＤベージュ又はヌードマウスに移植された種々の腫瘍起源（例えば、肺がん、ＳＣＣＨＮ、乳がん、及び膵臓がん）の細胞及び断片ベースのモデルにおいて検出可能であった。実施例として、データを、ＳＣＣＨＮ異種移植モデルＦａＤｕ（細胞株ベース）、乳がんモデルＭＡＸＦ４４９（断片ベース）、及びＮＳＣＬＣモデル７１７７（断片ベース）について示す。
【０１７９】
試験剤
アフコシル化されたＭａｂ２０５．１０．２（図２、３、４においてはＭａｂ  ２０５と表示）は、ドイツ、ペンツベルグのＲｏｃｈｅの原液として提供された。抗体バッファーはヒスチジンを含んでいた。抗体溶液を、注射前に原液からバッファー中に適切に希釈した。
【０１８０】
細胞株及び培養条件
ＦａＤｕヒトＨＮＳＣＣ細胞を、最初にＡＴＣＣから得た。腫瘍細胞株を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭのＮＥＡＡを補充したＭＥＭイーグル培地において、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で常套的に培養した。培養継代を、３日毎に分けて、トリプシン／ＥＤＴＡ  １ｘを用いて実施した。
【０１８１】
腫瘍断片
腫瘍断片を、最初に患者から取り出し、ヌードドナーマウスに皮下移植した。次に、腫瘍断片をインビボで連続継代する。前臨床試験用に、小さな腫瘍断片がドナーマウスから作成され、更なるヌードマウス（ＭＡＸＦ４４９、７１７７）に皮下的に配された。
【０１８２】
動物
メスのＳＣＩＤベージュ又はヌードマウスをブリーダーから購入し（例えば、ドイツ、ズルツフェルトのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、毎日、１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体のいない条件下で保持した。実験的な研究プロトコルが審査され、地方自治体により承認された。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために動物施設の検疫部に保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。ダイエット食（Ｐｒｏｖｉｍｉ  Ｋｌｉｂａ  ３３３７）及び水（ｐＨ２．５−３に酸性化）が適宜与えられた。
【０１８３】
モニタリング
動物は、臨床症状、及び副作用の検出のために毎日制御された。実験期間を通して、モニタリングのために動物の体重を記録した。
【０１８４】
動物の治療
細胞又は断片の移植後に動物をランダム化した後、平均腫瘍サイズが約１００−１５０ｍｍ３である場合、動物の治療を開始した。抗体を、モデルに応じて、３−６週間、週１回、１０又は２５ｍｇ／ｋｇをｑ７ｄで、単剤として腹腔内投与した。対応するビヒクルを同じ日に投与した。
【０１８５】
抗体の効果
Ａ）ＦａＤｕ  ＨＮＳＣＣ異種移植片
ＦａＤｕ  ＨＮＳＣＣ（頭頚部扁平上皮がん）異種移植片を有するマウスを、試験１４日目から３５日目にＭａｂ２０５．１０．２抗体で治療した。結果として、Ｍａｂ２０５．１０．２抗体での治療は、皮下ＦａＤｕ異種移植片の腫瘍静止を伴う有意な抗腫瘍効果を示した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は９８％と算出された。
【０１８６】
Ｍａｂ  ２０５を用いた治療（１０ｍｇ／ｋｇをｑ７ｄｘ３、ｉ．ｐ．）は、ＦａＤｕ  ＨＮＳＣＣＨＮが移植された異種移植片は腫瘍静止に至った（図２参照）。
【０１８７】
Ｂ）ＭＡＸＦ４４９乳がん異種移植片
ＭＡＸＦ４４９乳がん異種移植片を有するマウスを、試験６４日目から９１日目に抗体Ｍａｂ２０５．１０．２で治療した。結果として、Ｍａｂ２０５．１０．２抗体での治療は、ＭＡＸＦ４４９異種移植片の腫瘍静止を伴う有意な抗腫瘍効果を示した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は１００％超であった。
【０１８８】
Ｍａｂ  ２０５を用いた治療（１０ｍｇ／ｋｇをｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）は、ＭＡＸＦ４４９乳がんが移植された異種移植片は腫瘍静止に至った（図３参照）。
【０１８９】
Ｃ）７１７７  ＮＳＣＬＣ異種移植片
７１７７  ＮＳＣＬＣ異種移植片を有するマウスを、試験２８日目から５６に目に抗体Ｍａｂ２０５．１０．２で治療した。結果として、Ｍａｂ２０５．１０．２抗体での治療は、７１７７  ＮＳＣＬＣ異種移植片の腫瘍静止を伴う有意な抗腫瘍効果を示した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は１００％超であった。
【０１９０】
Ｍａｂ  ２０５を用いた治療（２５ｍｇ／ｋｇ  ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）により、７１７７  ＮＳＣＬＣが移植された異種移植片は腫瘍静止に至った（図４参照）。
【０１９１】
実施例７
ペルツズマブと併用での抗ＨＥＲ３療法のインビボ抗腫瘍効果
ＨＥＲ２正常がん細胞株でありＨＥＲ３を発現するヒト乳がん細胞株ＺＲ−７５−１を、メスのＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）接種した（動物あたり５×１０６細胞）。動物には、全身的に１７β−エストラジオールペレットが補給され、抗生物質ｃｅｆｏｃｅｉｎ（２０ｍｇ／ｋｇ）が全試験期間を通して週一回の間隔で皮下投与された。
【０１９２】
腫瘍細胞接種後４０日目に、動物をランダム化し、３つの治療群と一つのビヒクル群に分け、すべての群で〜１００ｍｍ３の平均腫瘍体積となった。ランダム化の日に、Ｍａｂ２０５．１０．２（１０ｍｇ／ｋｇ）、ペルツズマブ（３０ｍｇ／ｋｇの初回量に続く１５ｍｇ／ｋｇの維持量）、Ｍａｂ２０５．１０．２＋ペルツズマブの組み合わせの腹腔内投与による治療を週一回の間隔で開始した。動物を、治療開始から４１日目で最後（６回目）の投薬から６日目にあたる、８１日目に屠殺した。
【０１９３】
原発腫瘍の腫瘍体積（ＴＶ）は、ＮＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：米国国立がん研究所）のプロトコル（腫瘍体積（ＴＶ）＝（長さｘ幅２）／２）[式中、「長さ」及び「幅」はミリ単位の腫瘍塊の長短径である]（Corbett et al., 1997）に従って計算された。計算は、ステージ分類から試験終了（腫瘍接種後８１日目）まで行われた。
【０１９４】
治療期間中の腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）の計算のため、各治療群がそれぞれのビヒクルコントールと比較された。ＴＶｄａｙ  ｚは、定義された試験日（ｄａｙ  ｚ）の個々の動物の腫瘍体積を表し、ＴＶｄａｙ  ｘは、ステージ分類日（ｄａｙ  ｘ）の個々の動物の腫瘍体積を表す。
【０１９５】
以下の式が適用された：
0006257646.tif 000017
【０１９６】
0006257646.tif 000018
【０１９７】
実施例８
ペルツズマブと併用での抗ＨＥＲ３（Ｍａｂ２０５．１０．２＝ＲＧ７１１６）療法のインビボ抗腫瘍効果
皮下異種移植モデルを、いずれかのヒト腫瘍細胞株（ＢｘＰＣ３、ＱＧ５６、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＨＣＣ８２７、ＨＣＣ８２７ＧＲ、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＦａＤｕ）を使用することにより、又はヒト腫瘍組織断片を移植することにより作製した。細胞株及び断片は、高ｐＨＥＲ３／ＨＥＲ３比（ウェスタンブロット法により分析）に基づいて選択された。すべての実験は、ドイツ動物保護法（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚｇｅｓｅｔｚ）のガイドラインに従って実施された。
【０１９８】
細胞株ベースの異種移植モデルでは、細胞（５−１０ｘ１０６細胞）をメスＳＣＩＤ／ベージュ（ＢｘＰＣ３、ＱＧ５６、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＦａＤｕ）又はＢａｌｂ／ｃヌードマウス（ＨＣＣ８２７、ＨＣＣ８２７ＧＲ、ＮＣＩ−Ｈ１９７５）（いずれもドイツのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。マウス（一群につきｎ＝１０）を２１〜２４日目（モデルによる）にランダム化し、その後治療が始まると原発腫瘍のサイズによって階層化した。（本実施例ではＲＧ７１１６と略される）Ｍａｂ２０５．１０．２での治療（用量１０−２５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝２−５用量）を週１回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。生理食塩水をビヒクルコントロールとして使用した。腫瘍体積を週１回ノギスで測定（１／２（長さｘ（幅）２））し、コントロール動物と比較した腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）を、捕捉資料に記載の通りに算出した。
【０１９９】
患者由来の皮下腫瘍異種移植モデル（ＰＤＸ）を、Ｏｎｃｏｎｔｅｓｔ社（ドイツ、フライブルク）又はＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｅｒｌｉｎ−Ｂｕｃｈ社（ドイツ、ベルリン）において、ＮＭＲＩヌードマウスへの小さなヒト腫瘍断片の移植により評価した。マウスをランダム化（一群につきｎ＝１０）し、細胞ベースのモデルと同様の治療を実施した。
【０２００】
同所性細胞株ベースの異種移植マウスモデルを、ＡＤＣＣの寄与を評価するために使用した。したがって、ＨＥＲ３組換えＡ５４９−Ｂ３４トランスフェクタント細胞を、メスのＳＣＩＤベージュマウス（Ｔａｃｏｎｉｃｓ）に静脈内注射（３ｘ１０６細胞）した。肺の腫瘍増殖のエビデンスが実験動物において確認された場合、マウスを２３日目にランダム化した（一群につきｎ＝１５）。マウスは１０−１３週毎に、ＲＧ７１１６又は糖操作されていないＲＧ７１１６又は生理食塩水コントロールを２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に注射された。終了基準は、歩行障害を伴う病気であった。生存期間中央値は、群の動物の少なくとも５０％が死んだ実験日と定義された。生存データは、カプラン・マイヤー曲線を用いて表され、各治療群間の生存期間中央値の差異はペアワイズログランク検定により比較された。
【０２０１】
ＲＧ７１１６治療は、マウス異種移植腫瘍の高いＴＧＩをもたらした。
ＲＧ７１１６のインビボ活性は、種々の腫瘍実体（膵臓、ＴＮＢＣ、ＳＳＣＨＮ及びＮＳＣＬＣ）を表す皮下マウス異種移植モデルを用いて調べた。すべてのモデルは、有意にリン酸化されているＨＥＲ３を発現し、このことは、ＨＥＲ３がこれらのモデルにおいて活性化されていることを示す；したがって、細胞増殖はＨＥＲ３のシグナル伝達に依存し得る。皮下異種移植モデルは、腫瘍部位に免疫エフェクター細胞を欠いているため、ＨＥＲ３シグナル伝達阻害を介して媒介される抗腫瘍効果のみを示し、すなわち、ＡＤＣＣの寄与はない。
【０２０２】
ＲＧ７１１６は、ＢｘＰＣ３マウス異種移植モデル（図６Ａ）において、用量依存的なＴＧＩを示した。０．３から２５ｍｇ／ｋｇの範囲の腹腔内投与が非常に効果的であり、コントロールマウスと比較して＞９０％のＴＧＩをもたらした。０．１ｍｇ／ｋｇの用量でのみ、達成されたＴＧＩが部分的であった。試験の終了時（５６日目）、マウスを屠殺し、ＨＥＲ３及びｐＨＥＲ３が存在するかどうか、外植された腫瘍組織を調べた。ｐＨＥＲ３のレベルが、用量０．３−２５ｍｇ／ｋｇの単剤ＲＧ７１１６で治療したマウスにおいては、コントロール動物と比べて有意に低下した（図４Ｂ）。無効量（０．１ｍｇ／ｋｇ）のＲＧ７１１６のみが、ＨＥＲ３のリン酸化を完全に阻害しなかった。外植組織を免疫組織化学法により調べたところ、ＲＧ７１１６の有効量は、ビヒクルコントロール及び０．１ｍｇ／ｋｇのＲＧ７１１６（図４Ｃ）で治療された腫瘍外植片と比べ、膜ＨＥＲ３のレベルを、ウェスタンブロッティング法の場合と同じ反応速度でダウンモジュレートしたようであった。
【０２０３】
ＨＥＲ３陽性ヒトＮＳＣＬＣ（腺癌及び扁平上皮）モデル（細胞株及び断片ベース）において、単剤ＲＧ７１１６は、強力なＴＧＩを誘導した（図７）。１０−２５ｍｇ／ｋｇの用量のＲＧ７１１６を週１回、４−６サイクルでの治療は、５／６扁平上皮ＮＳＣＬＣモデルにおいて、３／６での腫瘍静止又は完全寛解（図７Ａ）を含む強力なＴＧＩをもたらした。図５Ｂは、完全寛解を達成した扁平ＮＳＣＬＣモデル（ＬＸＦＥ７２２）の一例を示している。単剤ＲＧ７１１６が腫瘍増殖を阻害しなかったＬＸＦＥ６４６モデルにおいて、ＲＧ７１１６をＨＥＲ１標的療法と組み合わせた場合、腫瘍静止が達成された（データは示されていない）。かなりのＴＧＩ（＞５０％）が５／１０腺癌ＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいても観察された（図７Ａ）。
【０２０４】
ｃ−Ｍｅｔの発現状態及びＫＲＡＳ変異状態は、すべてのＮＳＣＬＣ腫瘍モデルについて知られていた。ｃ−Ｍｅｔ（ＨＣＣ８２７、Ｌｕ７３９７及びＮＣＩ−Ｈ４４１）を過剰発現した三つの腺癌細胞株では、ＨＥＲ３シグナル阻害により媒介されるＲＧ７１１６の有効性が低かった一方、二つのＫＲＡＳ変異モデル（Ａ５４９とＬＸＦＡ９８３）では、＞５０％のＴＧＩが観察された。同じくｃ−Ｍｅｔを過剰発現した３番目のＫＲＡＳ変異細胞株（ＮＣＩ−Ｈ４４１）では、ＴＧＩは観察全く観察されなかった。
【０２０５】
更に、ＲＧ７１１６の有効性は、ＨＥＲ１（ＦａＤｕ細胞、ＨＥＲ１を発現する）又はＨＥＲ２（ＭＡＸＦ４４９細胞、ＨＥＲ２正常がん細胞）がそれぞれ好ましいヘテロ二量体化のパートナーであるモデルにおいて、ＨＥＲ１を標的とする抗体（ＲＧ７１６０［ＧＡ２０１］；図７Ｃ）又はＨＥＲ２を標的とする抗体（ペルツズマブ；図７Ｄ）と組み合わせた場合に向上した。いずれの例においても、併用療法は、持続的且つ完全な腫瘍縮小をもたらした。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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