(57)【要約】本発明は、ピルボイル(pyruvoyl)類似体と抗酸化剤(anti-oxidant)の併用療法に関し、それぞれの物質の単独投与時に比べ、著しく増加した小膠細胞の活性、及び炎症反応を起こすサイトカインの活性抑制による脳組織の損傷抑制効果、並びに運動能力及び神経学的損傷の改善効果を示すだけではなく、損傷発生６時間以後にも長時間持続的に高い神経保護効果を奏することができる。
2010540624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、
（１）化学式１のピルボイル(pyruvoyl)類似体と、
（２）化学式２のアセチルサリチル酸類似体、化学式３の５−アミノサリチル酸類似体、化学式４のフルオキセチン類似体及びこれらの薬剤学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤と、
を含むことを特徴とする、神経保護剤。
[化学式１]
【化１】
2010540624.tif 000014
(式中、Ｒ１は、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ６−Ｃ１２)アリール、(Ｃ１−Ｃ６)アルコキシ、(Ｃ６−Ｃ１２)アリールオキシ、(Ｃ６−Ｃ１２)アル(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ６−Ｃ１２)アル(Ｃ１−Ｃ６)アルキルオキシ、ＮＲ２１Ｒ２２または(Ｃ１−Ｃ６)アルキルチオであり、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ６−Ｃ１２)アリール、(Ｃ６−Ｃ１２)アル(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ６−Ｃ１２)アリールカルボニルまたは(Ｃ１−Ｃ６)アルキルカルボニルであって、前記Ｒ１、Ｒ２１及びＲ２２のアルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルアルキル、アルアルキルオキシ、アリールカルボニルまたはアルキルカルボニルは、ハロゲン、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル(Ｃ６−Ｃ１２)アリールオキシ及びヒドロキシからなる群から選択される一つ以上の置換基がさらに置換可能である。)
[化学式２]
【化２】
2010540624.tif 000015
(式中、Ｒ２は、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキルカルボニルまたは(Ｃ６−Ｃ１２)アリールカルボニルであり、前記Ｒ２のアリールカルボニルは、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ヒドロキシ及びハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキルからなる群から選択される一つ以上の置換基がさらに置換可能であり、Ｒ３は、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキルまたは(Ｃ６−Ｃ１２)アリールであって、Ｒ４は、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロゲン、(Ｃ１−Ｃ６)アルコキシ、ヒドロキシまたはニトロである。)
[化学式３]
【化３】
2010540624.tif 000016
(式中、Ｒ５乃至Ｒ９は、それぞれ独立して、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、(Ｃ１−Ｃ６)アルコキシ、ＣＦ３またはニトロであり、ｎは、０乃至４の整数であって、Ｘは、ＣＨ２、Ｏ、ＳまたはＳＯである。)
[化学式４]
【化４】
2010540624.tif 000017
(式中、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキルまたは(Ｃ６−Ｃ１２)アリールである。)
【請求項２】
脳虚血、脳梗塞、脳卒中、ハンチントン病、ルゲリック病または血管性痴呆を予防または治療するための、請求項１に記載の神経保護剤。
【請求項３】
ピルボイル類似体が、
エチルピルベート(ピルボイルオキシエタン)、
プロピルピルベート、
イソプロピルピルベート、
ｎ−ブチルピルベート、
ｓｅｃ−ブチルピルベート、
イソブチルピルベート、
ｔ−ブチルピルベート、
ペンチルピルベート、
ヘキシルピルベート、
ヘプチルピルベート、
オクチルピルベート、
フェニルピルベート、
４−(４−トリフルオロメチルフェニルオキシ)フェニルピルベート、
(４−トリフルオロメチル)−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルピルベート、
(４−トリフルオロメチル)フェニルピルベート、
(４−トリフルオロメチル)ベンジルピルベート、
ピルボイルアミノエタン、
ピルボイルアミノメタン、
ピルボイルアミノプロパン、
ピルボイルアミノブタン、
ピルボイルアミノペンタン、
ピルボイルアミノベンゼン、
ピルボイルアミノ(４−トリフルオロメチル)ベンゼン、
ピルボイルアミノ(４−トリフルオロメチルフェニル)メタン、
ピルボイルアミノ(４−トリフルオロメチル−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル)メタン、
ピルボイルアミノ(４−トリフルオロメチルー２，３，５，６−テトラフルオロ)ベンゼン、
ピルボイルアミノカルボニル(４−トリフルオロメチル)ベンゼン、
ピルボイルアミンジエタン、
ピルボイルアミンジブタン、
ピルボイルアミンジヘキサン、
ピルボイルアミンジオクタン、
ピルボイル(４−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシフェニルカルボニル)(エチル)アミン、
ピルボイル(４−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシフェニル)(エチル)アミン、
ピルボイル(４−トリフルオロメチルフェニル)(エチル)アミン、
ピルボイルチオエタン、及び
ピルボイルプロパンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の神経保護剤。
【請求項４】
５−アミノサリチル酸類似体が、
２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニルエチルアミノ) 安息香酸、
５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ) 安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−フェニルスルホニルエチルアミノ) 安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−(４−ヨードフェノキシ)エチルアミノ) 安息香酸、
５−(２−(４−ブロモフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(３−フェノキシプロピルアミノ) 安息香酸、
５−(２−(２，６−ジクロロ−４−フルオロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
５−(３−(４−フルオロフェノキシ)プロピルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
５−(２−(２，６−ジクロロ−４−フルオロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
５−(２−(４−クロロ−２−メチルフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−ｐ−トリルオキシエチルアミノ)安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−フェノキシエチルアミノ)安息香酸、
５−(２−(２，６−ジフルオロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、及び
２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の神経保護剤。
【請求項５】
薬剤学的に許容される塩が塩酸塩であることを特徴とする、請求項１または２に記載の神経保護剤。
【請求項６】
ピルボイル類似体が１〜６０ｍｇ/ｋｇの容量で、抗酸化剤が１〜４０ｍｇ/ｋｇの容量で投与されることを特徴とする、請求項１または２に記載の神経保護剤。
【請求項７】
ピルボイル類似体と抗酸化剤が単一または別途の単位剤形内に含まれていることを特徴とする、請求項１または２に記載の神経保護剤。
【請求項８】
ピルボイル類似体と抗酸化剤が同時または順次投与されることを特徴とする、請求項１または２に記載の神経保護剤。
【請求項９】
静脈内または経口投与されることを特徴とする、請求項１または２に記載の神経保護剤。
【請求項１０】
有効成分として、
（１）化学式１のピルボイル(pyruvoyl)類似体と、
（２）化学式２のアセチルサリチル酸類似体、化学式３の５−アミノサリチル酸類似体、化学式４のフルオキセチン類似体及びこれらの薬剤学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤と、
を含むことを特徴とする、神経保護用薬剤キット。
[化学式１]
【化５】
2010540624.tif 000018
[化学式２]
【化６】
2010540624.tif 000019
[化学式３]
【化７】
2010540624.tif 000020
[化学式４]
【化８】
2010540624.tif 000021
(上記化学式１乃至４において、Ｒ１乃至Ｒ１１、ｎ及びＸは、それぞれ請求項１に記載の定義と同一である。)
【請求項１１】
有効成分として、
（１）化学式１のピルボイル(pyruvoyl)類似体と、
（２）化学式２のアセチルサリチル酸類似体、化学式３の５−アミノサリチル酸類似体、化学式４のフルオキセチン類似体及びこれらの薬剤学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤と、
を含むことを特徴とする、神経保護用薬剤パッケージ。
[化学式１]
【化９】
2010540624.tif 000022
[化学式２]
【化１０】
2010540624.tif 000023
[化学式３]
【化１１】
2010540624.tif 000024
[化学式４]
【化１２】
2010540624.tif 000025
(上記化学式１乃至４において、Ｒ１乃至Ｒ１１、ｎ及びＸは、それぞれ請求項１に記載の定義と同一である。)
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経保護(neuroprotection)のための併用療法(combination  therapy)に関し、より詳細には、ピルボイル(pyruvoyl)類似体と抗酸化剤(anti-oxidant)を併用することにより、脳虚血後の脳組織梗塞の抑制、並びに運動能力及び神経学的損傷の改善効果を極大化することができる薬剤及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中(Stroke)は、単一疾患としては韓国人の死亡原因第１位の主要脳血管系疾患である。脳虚血後、脳神経細胞が損傷を受ける過程は、中枢神経系の重要な興奮性アミノ酸(excitatory amino acid)神経伝達物質の過度なる分泌によるグルタメート受容体(NMDAまたは非−NMDA受容体)の持続的な興奮により、細胞内外のカルシウムの正常的な動的平衡が破壊されて神経毒性が起こり、再灌流過程で過剰生成される酸化窒素(NO)と遊離酸素基(O2−)などの活性酸素種による細胞損傷及びミトコンドリアから起こる様々な過程を含む。脳神経系で虚血−再灌流が進行されると、興奮毒性による急性神経細胞の死滅過程に続いて、数時間乃至数日にかけて徐々に進行される遅延性損傷が生じる。遅延性神経細胞死は、時間の経過から新しい遺伝子の発現を伴い、神経炎症反応とその結果で進行される第２次的な脳組織損傷過程である。この場合、早いうちに適切な治療をすれば、非可逆的細胞損傷を減らすことが可能である。
【０００３】
現在臨床で使用されている脳卒中治療剤としては、組織プラスミノゲン活性剤(tissue plasminogen activator：以下、‘tPA')とウロキナーゼ(urokinase)などの血栓溶解剤、血小板抑制剤、脳血管拡張剤、カルシウムイオンチャンネルＩ抑制剤などの多様な機序を有したものがある。しかしながら、これらは、発病後３時間以内に投与しなければならず、また非特異的出血、ヒブリノーゲン溶解などの副作用を伴うと報告された。
【０００４】
ピルベート(pyruvate)は、細胞の解糖作用(glycolysis)の最後の段階でピルベートキナーゼ(pyruvate kinase)により主に形成されて、アラニン(alanine)のアミノ基転移過程などの他の代謝過程を通じても形成される。最近、ピルベートが細胞内の代謝中間生成物としての役割をするだけではなく、抗酸化作用と遊離基除去機能を行うことが報告された。現在まで報告されたピルベートの作用機序は、（１）ＴＣＡ回路の中間産物及び代謝物質(metabolic substance)としての役割、（２）CH3CCOOO-+ H2O2 → CH3COO- + H2O + CO2の過程による過酸化水素の除去、（３）活性酸素種の一つである水酸化ラジカル(hydroxyl radical, 以下‘OH’)除去、及び（４）ピルベート自体のイノトロピック(inotropic)機能と筋小胞体(sarcoplasmic reticular) ATPase活性化機能などである。このようなピルベートの細胞保護機能は、多様な組織疾病状態で研究されたが、塩化ピルベートを静脈注射で投与し、過酸化水素により誘導された急性腎臓疾患で最初に保護効果を確認して以来、心筋、腸、肝などで虚血関連ストレスにおける保護効果が報告されて、ガラクトース(galactose)、または糖尿による白内障(cataract)、及び大脳虚血と内出血などの動物モデルにおける保護効果も報告された。しかしながら、ピルベートは、水溶液上で（１）非常に低い溶解度と非常に高い不安定性を示す点と、（２）パラピルベート(parapyruvate)に転換され、最終的にＴＣＡ回路の強力な阻害剤となってしまう点により、治療剤としての実用化に深刻な限界を有している。
【０００５】
上記のようなピルベートの限界を克服するために、多様なピルベート類似体(pyruvate derivatives)、例えば、下記化学式Ａのアルキルピルベートが研究された。
[化学式Ａ]
【化１】
2010540624.tif 000003
【０００６】
その中でも、エチルピルベート(ethyl pyruvate、以下‘ＥＰ’ともいう)は、以下のような長所を有しており、ピルベートの強力且つ効率的な代替物質とされる可能性が大きい：第一、エステル類似体であるため、脂肪親和性が高く細胞透過度が著しく高い。第二、塩水(saline)や水には溶解度が低いが、カルシウム溶液(リンガー(Ringer)溶液)で溶解度が著しく増加する。第三、カルシウム溶液(リンガー溶液)で二量体(dimer)になりつつ、エノレートアニオン(anionic enolate)を形成して安定化し、ピルベートの前駆体役割をすることができる。第四、食品添加剤として許可されているだけ、安全性の高い物質である。
【０００７】
本発明者らは、脳卒中動物モデルにおいてＥＰが優れた神経保護効果を示し、脳卒中治療剤としての可能性が高いことを提示して、ＥＰを有効成分として含有する脳神経保護剤に対して大韓民国第６８６，６５２号を獲得した。即ち、ＥＰを虚血−再灌流後１２時間内に腹腔投与すると、梗塞の大きさを５０％以下に減らすことができ、２４時間後に処置した場合も、梗塞の大きさを２０％程度減らすことができることを明らかにした。また、ローターロッド実験を通じて、梗塞抑制効果が運動機能回復と併行することを確認し、この過程で小膠細胞の活性抑制、炎症促進性サイトカインの発現抑制など、ＥＰの抗炎症効果を観察して、第１次培養細胞を使用してＥＰの抗酸化機能を確認した。特に、ＥＰの後処置効果は、現在まで報告されたいかなる候補物質より優れて、なお、ＥＰは、細胞内に存在している天然物質であるという長所がある。このようなＥＰの高い細胞透過度と安全性に基づいた多様な機能から、ＥＰは、脳卒中のような複合的な機序で進行される疾病に最も効果的に適用できると思われる。
【０００８】
下記化学式Ｂのアセチルサリチル酸(acetylsalicylic acid、商品名：アスピリン(aspirin))は、心血管疾患の治療と予防に効果を奏すると証明された薬物の一つである。
[化学式Ｂ]
【化２】
2010540624.tif 000004
【０００９】
アセチルサリチル酸は、非可逆的な血小板凝集抑制機能を通じて血管遮蔽を抑制する。即ち、血小板凝集の強力な誘導剤であると同時に血管収縮剤であるトロンボキサンＡ２(thromboxane A2、以下、‘TXA2’)の形成に必須酵素であるシクロオキシゲナーゼ−１(cyclooxygenase-1、以下、‘COX-1’)とシクロオキシゲナーゼ−２(cyclooxygenase-2、以下、‘COX-2’)を非可逆的にアセチル基で置換させることにより、血小板凝集を抑制して、その結果、虚血状態の脳神経系で塞栓(emboli)の大きさを減らし、血管収縮を抑制する。ＮＦ−ｋＢ抑制による抗炎症効果、または抗酸化作用などによる神経系保護作用も報告されており、細胞内のＡＴＰ損失を遅延させ、低酸素症(hypoxia)による損傷を抑制することが知られている。ＴＸＡ２の抑制のためには、低い容量(≧30mg/日)のアセチルサリチル酸でも十分であるが、抗炎症または抗酸化作用などによる神経系保護作用を効果的に行うためには、相対的に高い容量(3〜6g/日)が必要である。アスピリンの服用量による心血管系疾患関連効能に関するメタ分析(meta-analysis)結果を見ると、７５〜３２５ｍｇのアスピリンを毎日服用すれば、長期的に心血管疾患の治療と予防に効果があると報告されている。
【００１０】
また、下記化学式Ｃの５−アミノサリチル酸類似体は、強力な抗酸化効果、または抗酸化及び抗炎症効果を有し、急性及び退行性脳神経系疾患の予防及び治療に適用可能であることが知られている(特許文献１〜３)。
[化学式Ｃ]
【化３】
2010540624.tif 000005
式中、Ｒ１乃至Ｒ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１−４アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、ＣＦ３またはニトロを示し、ｎは、０〜４の整数であって、Ｘは、ＣＨ２、Ｏ、ＳまたはＳＯを示す。
【００１１】
下記化学式Ｄのフルオキセチン(fluoxetine；化学名：Ｎ−メチル−[４−(トリフルオロメチル)フェノキシ]ベンゼンプロパンアミン)は、イーライリリー製薬会社により開発され(特許文献４)、１９８７年ＦＤＡ(Food and Drug Administration:米国食品医薬局)から承認をもらった以後、全世界的に最もよく使用される抗鬱剤である。
[化学式Ｄ]
【化４】
2010540624.tif 000006
【００１２】
フルオキセチンは、脳において人間の感情を調節する神経伝達物質であるセロトニン(serotonin)を増加させる作用をして、既存の抗鬱剤から発生する不眠症、体重増加、視力障害、心臓不整脈、口腔乾燥症、便秘などの抗コリン性副作用を著しく減少させて、一日一回だけ、飲食の摂取に関係なく服用できる簡便性と、大部分の医薬品と併用投与できることが長所である。フルオキセチンは、脳卒中の発病後、多くの患者たちが経験する脳卒中後鬱病(post-stroke depression, PSD)の治療にもよく使用され、鬱病の緩和と共に、運動機能と認知機能の回復にも効果があると知られている。また、鬱病の治療の他に、強迫性障害、過食症、対人恐怖症、盗癖、天災地変後によく現れる外傷後ストレス症候群、発作的な症状を示すパニック障害などにも効果があって、安全性の高い物質である。神経細胞に有害な活性酸素群や酸化窒素の生成は、様々な神経細胞の死滅を誘発するが、これは、局部性及び虚血性脳卒中のような多くの神経系疾患と外傷性頭部損傷に関連すると報告されており、フルオキセチンは、多様な脳神経保護効果を示すと報告されている。
【００１３】
一方、脳卒中のように多様な機序で進行される疾患に対しては、一種以上の薬剤を一緒に投与する併用療法の必要性が高い。これと同時に、発病後、一定な時間が経過した後処置した場合でもその効果が期待できる後処置薬剤の開発が非常に重要である。しかし、前記化学式Ａのアルキルピルベートと前記化学式Ｂ乃至Ｄのアセチルサリチル酸、５−アミノサリチル酸類似体及びフルオキセチンから選択される抗酸化剤の併用、及び併用による脳神経保護、特に脳卒中予防及び治療効果については全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許公開第２００５−２３９８９６号
【特許文献２】大韓民国特許第７５１，８８８号
【特許文献３】大韓民国特許第６６８，１１１号
【特許文献４】米国特許第４，０１８，８９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、脳卒中後、神経系損傷の多様な機序で相対的優位を示す薬剤の併用投与を通じて、脳虚血後の脳組織梗塞を抑制し、運動能力及び神経学的損傷を改善する効果を極大化すると同時に、発病後、一定な時間が経過した後処置した場合でも、有効な治療効果が得られる方案を模索した。その結果、ピルボイル(pyruvoyl)類似体と抗酸化剤の併用投与が前記目的に符合することを確認し、本発明を完成した。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、有効成分としてピルボイル(pyruvoyl)類似体と抗酸化剤を含む神経保護剤を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、有効成分としてピルボイル(pyruvoyl)類似体と抗酸化剤を含む神経保護用薬剤キットを提供することである
【００１８】
また、本発明の他の目的は、ピルボイル(pyruvoyl)類似体と抗酸化剤を含む神経保護用薬剤パッケージを提供することである
【課題を解決するための手段】
【００１９】
第一、有効成分として、（１）化学式１のピルボイル(pyruvoyl)類似体と、（２）化学式２のアセチルサリチル酸類似体、化学式３の５−アミノサリチル酸類似体、化学式４のフルオキセチン類似体及びこれらの薬剤学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤と、を含む神経保護剤に関する。
[化学式１]
【化５】
2010540624.tif 000007
(式中、Ｒ１は、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ６−Ｃ１２)アリール、(Ｃ１−Ｃ６)アルコキシ、(Ｃ６−Ｃ１２)アリールオキシ、(Ｃ６−Ｃ１２)アル(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ６−Ｃ１２)アル(Ｃ１−Ｃ６)アルキルオキシ、ＮＲ２１Ｒ２２または(Ｃ１−Ｃ６)アルキルチオであり、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ６−Ｃ１２)アリール、(Ｃ６−Ｃ１２)アル(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、(Ｃ６−Ｃ１２)アリールカルボニルまたは(Ｃ１−Ｃ６)アルキルカルボニルであって、前記Ｒ１、Ｒ２１及びＲ２２のアルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルアルキル、アルアルキルオキシ、アリールカルボニルまたはアルキルカルボニルは、ハロゲン、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル(Ｃ６−Ｃ１２)アリールオキシ及びヒドロキシからなる群から選択される一つ以上の置換基がさらに置換可能である。)
[化学式２]
【化６】
2010540624.tif 000008
(式中、Ｒ２は、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキルカルボニルまたは(Ｃ６−Ｃ１２)アリールカルボニルであり、前記Ｒ２のアリールカルボニルは、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ヒドロキシ及びハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキルからなる群から選択される一つ以上の置換基がさらに置換可能であり、Ｒ３は、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキルまたは(Ｃ６−Ｃ１２)アリールであって、Ｒ４は、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロゲン、(Ｃ１−Ｃ６)アルコキシ、ヒドロキシまたはニトロである。)
[化学式３]
【化７】
2010540624.tif 000009
(式中、Ｒ５乃至Ｒ９は、それぞれ独立して、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、(Ｃ１−Ｃ６)アルコキシ、ＣＦ３またはニトロであり、ｎは、０乃至４の整数であって、Ｘは、ＣＨ２、Ｏ、ＳまたはＳＯである。)
[化学式４]
【化８】
2010540624.tif 000010
(式中、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、水素、(Ｃ１−Ｃ６)アルキルまたは(Ｃ６−Ｃ１２)アリールである。)
【００２０】
第二、本発明は、有効成分として、（１）化学式１のピルボイル(pyruvoyl)類似体と、（２）化学式２のアセチルサリチル酸類似体、化学式３の５−アミノサリチル酸類似体、化学式４のフルオキセチン類似体及びこれらの薬剤学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤と、を含む神経保護用薬剤キットに関する。
【００２１】
第三、本発明は、有効成分として、（１）化学式１のピルボイル(pyruvoyl)類似体と、（２）化学式２のアセチルサリチル酸類似体、化学式３の５−アミノサリチル酸類似体、化学式４のフルオキセチン類似体及びこれらの薬剤学的に許容される塩からなる群から選択される一つ以上の抗酸化剤と、を含む神経保護用薬剤パッケージに関する。
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明は、有効成分としてピルボイル(pyruvoyl)類似体と抗酸化剤(anti-oxidant)を併用することにより、小膠細胞の活性、及び炎症反応を起こすサイトカインの活性を抑制し脳組織の損傷を抑制することにおいて、それぞれの単独使用時に比べ、著しく増加された効果を提供する。さらに、それぞれの単独使用時に比べ、損傷発生から長時間、例えば６〜２４時間経過後にも持続的な効果を提供する。したがって、本発明の薬剤は、各種脳血管系疾患である脳虚血、脳梗塞、脳卒中、ハンチントン病、ルゲリック病または血管性痴呆に活用でき、特に、脳卒中の予防または治療により効果的に使用できる。
【００２４】
本発明において、ピルボイル(pyruvoyl)類似体は、
エチルピルベート(ピルボイルオキシエタン)、
プロピルピルベート、
イソプロピルピルベート、
ｎ−ブチルピルベート、
ｓｅｃ−ブチルピルベート、
イソブチルピルベート、
ｔ−ブチルピルベート、
ペンチルピルベート、
ヘキシルピルベート、
ヘプチルピルベート、
オクチルピルベート、
フェニルピルベート、
４−(４−トリフルオロメチルフェニルオキシ)フェニルピルベート、
(４−トリフルオロメチル)−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルピルベート、
(４−トリフルオロメチル)フェニルピルベート、
(４−トリフルオロメチル)ベンジルピルベート、
ピルボイルアミノエタン、
ピルボイルアミノメタン、
ピルボイルアミノプロパン、
ピルボイルアミノブタン、
ピルボイルアミノペンタン、
ピルボイルアミノベンゼン、
ピルボイルアミノ(４−トリフルオロメチル)ベンゼン、
ピルボイルアミノ(４−トリフルオロメチルフェニル)メタン、
ピルボイルアミノ(４−トリフルオロメチル−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル)メタン、
ピルボイルアミノ(４−トリフルオロメチルー２，３，５，６−テトラフルオロ)ベンゼン、
ピルボイルアミノカルボニル(４−トリフルオロメチル)ベンゼン、
ピルボイルアミンジエタン、
ピルボイルアミンジブタン、
ピルボイルアミンジヘキサン、
ピルボイルアミンジオクタン、
ピルボイル(４−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシフェニルカルボニル)(エチル)アミン、
ピルボイル(４−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシフェニル)(エチル)アミン、
ピルボイル(４−トリフルオロメチルフェニル)(エチル)アミン、
ピルボイルチオエタン、及び
ピルボイルプロパンからなる群から選択される。
【００２５】
本発明で薬剤学的に許容される塩は、薬剤学的に許容される酸付加塩を含むことができ、前記塩化合物の水和物を始めとした溶媒和物も本発明の範囲に含まれる。薬剤学的に許容される酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸または亜リン酸のような無機酸類と、脂肪族モノ及びジカルボキシレート、フェニル−置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエート及びアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族及び芳香族スルホン酸類のような無毒性有機酸から得られる。具体的な例としては、サルフェート、ピロサルフェート、バイサルフェート、サルファイト、バイサルファイト、ニトレート、ホスフェート、モノハイドロゲンホスフェート、ジハイドロゲンホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェートクロライド、ブロマイド、ヨーダイド、フルオライド、アセテート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホーメート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオレート、オキサレート、マロネート、スクシネート、スベレート、セバケート、フマレート、マレート、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキサン−１，６−ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホネート、トルエンスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、キシレンスルホネート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、ラクテート、β−ヒドロキシブチレート、グリコレート、マレート、タルトレート、メタンスルホネート、プロパンスルホネート、ナフタレン−１−スルホネート、ナフタレン−２−スルホネートまたはマンデレートが挙げられて、特に塩酸塩がより好ましい。
【００２６】
また、アセチルサリチル酸類似体は、アセチルサリチル酸、２−(２−ヒドロキシ−４−(トリフルオロメチル)ベンゾイルオキシ)−４−(トリフルオロメチル)安息香酸、及び２−(２−(２−オキソプロパノイルオキシ)−４−(トリフルオロメチル)ベンゾイルオキシ)−４−(トリフルオロメチル)安息香酸からなる群から選択される。
【００２７】
また、５−アミノサリチル酸類似体は、
２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニルエチルアミノ)安息香酸、
５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−フェニルスルホニルエチルアミノ)安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−(４−ヨードフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸、
５−(２−(４−ブロモフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(３−フェノキシプロピルアミノ)安息香酸、
５−(２−(２，６−ジクロロ−４−フルオロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
５−(３−(４−フルオロフェノキシ)プロピルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
５−(２−(２，６−ジクロロ−４−フルオロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
５−(２−(４−クロロ−２−メチルフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−ｐ−トリルオキシエチルアミノ)安息香酸、
２−ヒドロキシ−５−(２−フェノキシエチルアミノ)安息香酸、
５−(２−(２，６−ジフルオロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸、及び
２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸からなる群から選択されることが好ましい。
【００２８】
また、フルオキセチン類似体は、フルオキセチン、３−(４−(トリフルオロメチル)フェノキシ)−Ｎ−メチル−３−フェニルプロパン−１−アミン、３−(４−(トリフルオロメチル)フェノキシ)−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−フェニルプロパン−１−アミン、Ｎ−(３−(４−(トリフルオロメチル)フェノキシ)−３−フェニルプロピル)−Ｎ−フェニルベンゼンアミン、及びＮ−(３−(４−(トリフルオロメチル)フェノキシ)−３−フェニルプロピル)−Ｎ−フェニルベンゼンアミンからなる群から選択される。
【００２９】
本発明において、ピルボイル類似体と抗酸化剤は、単一または別途の単位剤形(unit dosage form)内に含まれることができ、同時投与されるか、一定な時間間隔をおいて、または時間間隔無しに順次投与できる。したがって、二つの有効成分を一緒にまたは別途に、薬剤学的に許容される通常的な担体と共に配合し、投与目的に応じて、錠剤、硬質または軟質カプセル剤、顆粒剤、チューイン錠、丸剤、粉末、エリキシル、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップのような経口投与用製剤、またはエアロゾル、サシェ、滅菌注射溶液または滅菌粉末などのような非経口投与用製剤の形態で剤形化することができる。経口投与の目的で、本発明の有効成分を錠剤、カプセル剤、顆粒剤、チューイン錠、丸剤、粉末、エリキシル、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップなどの製剤に剤形化する場合は、アラビアゴム、玉蜀黍澱粉、微細結晶性セルロースまたはゼラチンのような結合剤、リン酸二カルシウムまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、玉蜀黍澱粉またはジャガイモ澱粉のような崩解剤、ステアル酸マグネシウムのような潤滑剤、スクロースまたはサッカリンのような甘味剤、及びペパーミント、メチルサリチル酸塩またはフルーツ香のような香味剤を含むことができる。単位剤形がカプセル剤である場合は、上記成分の他にも、ポリエチレングリコールまたは脂肪油のような液状担体を含むことができる。また、非経口投与のための溶液または懸濁液形態の注射剤は、非経口的に、例えば皮下、静脈内、筋肉内または腹腔内に投与できる。一般に、注射可能な溶液または懸濁液は、水、塩水、水性デキストロース及び関連砂糖溶液剤、非揮発性オイル、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールのようなグリコール類などの薬剤学的に許容される液状担体中に、有効量の有効成分を均質に混合して製造することができる。その他にも、必要に応じて、抗細菌剤、キレート剤、緩衝剤、保存剤のような補助剤を含めることができる。前記薬剤学的に許容される担体としては、薬剤学的に純粋で、実質的に無毒性であり、有効成分の作用を阻害しない任意のあらゆる補助剤が使用できる。
【００３０】
本発明において、ピルボイル類似体は１〜６０ｍｇ/ｋｇの容量で、抗酸化剤は１〜４０ｍｇ/ｋｇの容量で投与されることが好ましいが、これは、投与対象の年齢、性別、食餌、健康状態、状態の重症度、投与方法、投与時間、薬剤混合などにより適宜増減できる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によると、ピルボイル(pyruvoyl)類似体と多様な抗酸化剤を併用投与することにより、それぞれの物質の単独投与時に比べ、著しく増加した小膠細胞の活性、及び炎症反応を起こすサイトカインの活性抑制による脳組織の損傷抑制効果、並びに運動能力及び神経学的損傷の改善効果を示す。さらに、抗酸化剤の場合、損傷発生６時間以後に処置時、その効果が著しく落ちて、ピルボイル類似体の場合も、損傷発生６時間以後からその効果がだんだん落ちる傾向を示すのに対し、併用投与により、損傷発生６時間以後にも、長時間持続的に高い神経保護効果を奏することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これは、本発明の理解を助けるためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
製造例１：ピルボイルアミノエタンの製造
【化９】
2010540624.tif 000011
２Ｍ濃度のエチルアミン(14.1mL, 28.2mmol)を、ジクロロメタン(40mL)を使用して溶かした。溶液にトリエチルアミン(4.0mL, 28.2mmol)を入れて５分間攪拌した後、反応溶液にピルボイルクロライド(3.0g, 28.2mmol)を滴下して、常温で攪拌した。２０分後、水を入れて反応終了した後、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液でｐＨ７になるように調整した。水層をジクロロメタンで３回抽出した後、有機層を蒸留水と塩水で３回洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥した後、減圧蒸留してジクロロメタンを除去した後、分離精製してピルボイルアミノエタン(620mg, 19%)を製造した。
透明オイル；1H NMR (CDCl3) δ 3.34 (q, 2H), 2.47 (s, 3H), 1.26 (t, 3H)
【００３４】
製造例２：ピルボイルアミンジエタンの製造
【化１０】
2010540624.tif 000012
ジエタンアミン(2.9mL, 28.2mmol)を、ジクロロメタン(40mL)を使用して溶かした。溶液にトリエチルアミン(4.0mL, 28.2mmol)を入れて５分間攪拌した後、反応溶液にピルボイルクロライド(3.0g, 28.2mmol)を滴下して、常温で攪拌した。２０分後、水を入れて反応終了した後、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７になるように調整した。水層をジクロロメタンで３回抽出した後、有機層を蒸留水と塩水で３回洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥した後、減圧蒸留してジクロロメタンを除去した後、分離精製してピルボイルアミンジエタン(650mg, 16%)を製造した。
透明オイル；1H NMR (CDCl3) δ 3.44 (q, 2H), 3.32 (q, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.21 (m, 6H)
【００３５】
製造例３：ピルボイルチオエタンの製造
【化１１】
2010540624.tif 000013
エタンチオール(2.33g, 37.6mmol)を、ジクロロメタン(40mL)を使用して溶かし、反応溶液を０℃に冷却した後、１０分間攪拌した。ピルボイルクロライド(2.01g, 18.8mmol)を滴下して、１０分間攪拌した。常温に徐々に昇温した後、無水硫酸ナトリウムを用いて水分を除去し、減圧濾過、減圧蒸留した。分離精製してピルボイルチオエタン(1.11g, 45%)を得た。
透明オイル；1H NMR (CDCl3) δ 2.94 (q, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.30 (t, 3H)
【００３６】
比較例：エチルピルベート(EP)の脳梗塞抑制効果の評価
脳卒中動物モデルを使用して、ＥＰの神経保護効果を調べるために、ロンガ(Longa)方法(1989)によるラット局所虚血モデルを使用した。ナイロン縫合糸(suture)を使用して、中大脳動脈(middle cerebral artery, MCA)を１時間結さつし、脳卒中(middle cerebral artery occlusion, MCAO)動物モデルを製作した。脳虚血の起こった脳で治療効果があるかどうかを調べるために、ラットを、再灌流後に首を切って、全体の脳は、金属性脳鋳型を使用し、２ｍｍ切片の冠状に切った。切片は、直ぐに１％ＴＴＣ(2,3,5-tryphenyl tetrazolium chloride)に浸して染色した。３７℃で１５分間４％パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)溶液に保管された各セクションの脳虚血部位は、Quantity Oneプログラム(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を利用して測定、分析した。１時間ＭＣＡＯモデルを適用して、１、５、１０及び２０ｍｇ/ｋｇ濃度のＥＰを静脈投与した。
【００３７】
（１） 時間別、濃度別、脳切片における虚血部位の測定
５ｍｇ/ｋｇのＥＰを、ＭＣＡＯモデルに再灌流６時間後に投与した場合、脳梗塞を確認した結果、白色を帯びる梗塞部位が対照区動物に比べて減少したことが分かる(図１)。１時間ＭＣＡＯモデルに、ＥＰを１、５、１０及び２０ｍｇ/ｋｇ濃度で再灌流６時間後に静脈投与した場合、１ｍｇ/ｋｇでは、虚血部位の体積に変化がなく、５、１０及び２０ｍｇ/ｋｇでは、虚血部位の体積が、それぞれ対照区動物の３３．６％、４１．７％及び６１．６％に減少された(図２)。神経保護効果の効果的な時間範囲を調べるために、ＥＰを５ｍｇ/ｋｇ濃度でＭＣＡＯモデルに、再灌流３０分前、及び再灌流３０分後、６、９、１２時間後に静脈投与した場合、虚血部位の体積がそれぞれ９．０％と１７．５％、３４．０％、５８．７％及び５８．０％に減少された(図３)。これは、ＥＰをＭＣＡＯモデルに投与すると、脳虚血の起こった脳において相当な神経保護効果を奏するということを示す結果である。
【００３８】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
（２−１）ローターロッドテスト
脳虚血による損傷後の運動機能退化と認知欠陥は、以前報告されたことがあるが(Yamamoto M. et al., Brain Res. 452: 323-328, 1988; Roger D.C. et al., Stroke 28: 2060-2065, 1997)、ＭＣＡＯで損傷を受けたラットの運動機能を、ローターロッドテストを利用し、ラットがローターロッドに留まる時間をもって測定した。
【００３９】
１時間のＭＣＡＯから２４時間経過後まで、それぞれのラットが５ｒｐｍ速度のローターロッドに留まっている時間を測定した。次いで、それぞれのラットが、１０ｒｐｍと１５ｒｐｍの速度で作動されるローターロッドに留まっている時間を１時間間隔で測定した。その結果、ＥＰは、ＭＣＡＯ後の運動機能損傷を改善した(図４)。即ち、ＭＣＡＯ/再灌流２４時間後、正常群とシャム手術した群とは、５ｒｐｍ速度のローターロッドで現れる行動には何の差もなかった。１時間ＭＣＡＯ後、再灌流させた脳虚血ラットのローターロッド上における行動は著しく退化したが、時間変化によってローターロッドで過ごす時間が短くなった。５ｍｇ/ｋｇのＥＰを、ＭＣＡＯ/再灌流６時間後に静脈投与すると、ラットがローターロット上に体をかなり長い時間保持することから、運動能力が相当部分回復されたことが分かる。この点数は、反復実験を通じて得られて、１時間間隔で１０ｒｐｍと１５ｒｐｍに回転速度を増加させた状態で、反復実験を行って確認した。
【００４０】
（２−２）神経学的欠損の評価
神経学的欠損の評価は、ＭＣＡＯ/再灌流の二日後に行われた。変形された体位反射とヘミパレシス((hemiparesis)テスト(Bederson J.B. et al., Stroke 17; 472-476)と、前脚の位置決めテストを含んだ５種類の運動テストを運動機能評価に使用した。体位反射を４点数体系(Bederson J.B. et al., Stroke 17; 472-476)で採点した(０：正常機能、１：胴体の屈めと反対側の尻尾で動物を持ち上げる。２：反対側に回転、休む時は正常姿勢、３：休む時、反対側に横になる、４：自発的な運動性無し)。前脚の位置決めは、以前技術された方法(De Ryck M. et al., Stroke 20; 1388-1390)によって採点した(０：即刻的で完璧な位置決め、１：遅滞あるいは不完全な位置決め、２：位置決めをない)。体位反射と前脚位置決めに対する点数をそれぞれの動物に対して合算した。これを含み、総点１８点の運動能力損傷点数を測定した。その結果、ＥＰは、ＭＣＡＯ/再灌流に伴う神経学的欠陥を抑制する効果を示した(図５)。
【実施例１】
【００４１】
エチルピルベート(EP)とアセチルサリチル酸の併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、濃度別、脳切片における虚血部位の測定
ＥＰとアセチルサリチル酸の併用療法の効果を調べるために、ＥＰとアセチルサリチル酸をそれぞれ５ｍｇ/ｋｇ、１０ｍｇ/ｋｇと２０ｍｇ/ｋｇの濃度で同時に投与した。ＥＰ  ５ｍｇ/ｋｇとアセチルサリチル酸５ｍｇ/ｋｇを併用投与した場合、それぞれを１０ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かり、この際、５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合、最も優れた梗塞抑制効果を示して、１０ｍｇ/ｋｇに濃度をさらに高めた場合は、それ以上効果が増進しなかった。これは、ＥＰとアセチルサリチル酸の効能が相互補完的であることを示唆する(図６及び図７)。
【００４２】
ＥＰとアセチルサリチル酸の併用療法による効果の増進が持続される時間帯範囲(window)を調べるために、時間帯別同時投与の効果を調べた。１時間ＭＣＡＯの３０分前、及び３０分後、６、９、１２時間後にＥＰ(５ｍｇ/ｋｇ)とアセチルサリチル酸(５ｍｇ/ｋｇ)の同時投与を行って、再灌流から２４時間が経過した後、ＴＴＣ染色を通じて脳梗塞体積を測定した。３０分前の処置の場合、ＥＰによる効果が非常に高く、追加効果を測定することが難しいと予想されたが、３０分後の処置で効果が有意に増進されることが観察された。６時間後の処置の効果は、上記と同様に増進効果を示し、このような増進効果は、再灌流９時間後の処置の時も観察された(図８)。
【００４３】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
（２−１）ローターロッドテスト
前記比較例に記載の方法によりローターロッドテストを行った。５ｍｇ/ｋｇのアセチルサリチル酸をＭＣＡＯ/再灌流６時間後に静脈投与すると、運動能力が正常の３０％程度に回復されて、５ｍｇ/ｋｇのＥＰをＭＣＡＯ/再灌流６時間後に静脈投与すると、運動能力が正常の７０％程度に回復された。これに比べ、ＥＰとアセチルサリチル酸を併用投与すると、運動能力が８０％程度まで回復された(図９)。
【００４４】
（２−２）神経学的欠損の評価
前記比較例に記載の方法により、神経学的欠損を評価した。神経症的損傷において、６時間後にアセチルサリチル酸のみを投与した場合は、弱い効果を示すが、ＥＰを投与した場合は、神経症的損傷が６０％程度好転される結果を示した。ＥＰとアセチルサリチル酸を併用投与すると、それぞれを投与した場合に比べ、運動能力損傷が７２％程度まで著しく回復された(図１０)。このことから、ＥＰとアセチルサリチル酸の併用投与は、ＭＣＡＯ/再灌流に伴われる神経学的欠陥の抑制に、著しく増進された効果を示すことが分かる。即ち、脳梗塞抑制効果と共に機能的回復が伴われて、機能的回復も相互補完的であることを示唆する。
【実施例２】
【００４５】
エチルピルベート(ＥＰ)と塩化２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートの併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートの併用療法の効果を調べるために、各薬剤を５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の５分、４、６、１２時間後に同時に静脈投与した。４時間後に投与した場合、ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートは、脳梗塞をそれぞれ４８％及び３０％抑制して、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞を７６％まで抑制し、非常に高い補完効果を示した(図１１)。このような補完効果は、６時間後までも持続された(図１２)。
【００４６】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。神経症的損傷については、早いうちに投与した場合ほど、効果的な回復を示した。４時間後に塩化２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートを投与した場合は、若干の神経症的損傷回復効果を示したが、ＥＰを投与した場合は、神経症的損傷が４０％回復される結果を示した。４時間後にＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートを併用投与した場合は、神経症的損傷が５０％程度回復されて、ＥＰより効果が１０％増進されることを確認した(図１３)。即ち、ＥＰや２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートの単独投与時よりＥＰと 塩化２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートを併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す。
【実施例３】
【００４７】
エチルピルベート(ＥＰ)と塩化２−ヒドロキシ−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニルエチルアミノ)ベンゾエートの併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニルエチルアミノ)ベンゾエートの併用療法の効果を調べるために、各薬剤を５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の３０分、６、１２時間後に静脈投与した。６時間後にＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニルエチルアミノ)ベンゾエートを併用投与した場合、それぞれを５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かった。即ち、ＥＰと２−ヒドロキシ−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニルエチルアミノ)ベンゾエートは、脳梗塞の大きさをそれぞれ６６％及び５８％に抑制したのに対し、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞の大きさを７４％程度に抑制し、ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニルエチルアミノ)ベンゾエートの効能が相互補完的であることを示唆している(図１４)。
【実施例４】
【００４８】
エチルピルベート(ＥＰ)と塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ＥＰと塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の併用療法の効果を調べるために、各薬剤を５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の３０分、６、１２時間後に静脈投与した。６時間後にＥＰと塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸を併用投与した場合、それぞれを５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かった。即ち、ＥＰと塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸は、脳梗塞の大きさをそれぞれ６６％及び５５％に抑制したのに対し、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞の大きさを７２％程度に抑制し、ＥＰと塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の効能が相互補完的であることを示唆している(図１５)。
【００４９】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。神経症的損傷については、早いうちに投与した場合ほど、効果的な神経症的損傷の回復を示した。６時間後に塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸を投与した場合は、若干の神経症的損傷の回復効果を示すが、ＥＰを投与した場合は、神経症的損傷が４０％回復される結果を示した。６時間後にＥＰと塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸を併用投与した場合は、神経症的損傷が４５％程度回復されて、ＥＰの結果より効果が５％増進されることを確認した(図１６)。即ち、ＥＰや塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の単独投与時より、ＥＰと塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸を、再灌流６時間後に併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す。
【実施例５】
【００５０】
エチルピルベート(ＥＰ)と塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ＥＰと塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の併用療法の効果を調べるために、各薬剤を５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の３０分、６、１２時間後に静脈投与した。６時間後にＥＰと塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸を併用投与した場合、それぞれを５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かった。ＥＰと塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸は、脳梗塞の大きさをそれぞれ６６％及び６１％に抑制したのに対し、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞の大きさを７４％程度に抑制し、ＥＰと塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の効能が相互補完的であることを示唆している(図１７)。
【００５１】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。神経症的損傷については、早いうちに投与した場合ほど、効果的な神経症的損傷の回復を示した。６時間後に塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸を投与した場合は、神経症的損傷の回復効果が微弱であるが、ＥＰを投与した場合は、神経症的損傷が４０％回復される結果を示した。６時間後にＥＰと塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸を併用投与した場合は、神経症的損傷が５２％程度回復されて、ＥＰの結果より効果が１２％増進されることを確認した(図１８)。即ち、ＥＰや塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の単独投与時より、ＥＰと塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸を、再灌流６時間後に併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す(図１８)。
【実施例６】
【００５２】
エチルピルベート(ＥＰ)と塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ＥＰ塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の併用療法の効果を調べるために、各薬剤を５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の３０分、６、１２時間後に静脈投与した。６時間後にＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸を併用投与した場合、それぞれを５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かった。ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸は、脳梗塞の大きさをそれぞれ６６％及び６４％に抑制したのに対し、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞の大きさを７８％程度に抑制し、ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の効能が相互補完的であることを示唆している(図１９)。
【００５３】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。神経症的損傷については、早いうちに投与した場合ほど、効果的な神経症的損傷の回復を示した。６時間後に塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸を投与した場合は、ＥＰと類似した神経症的損傷の回復効果を示し、ＥＰを投与した場合は、神経症的損傷が４０％回復される結果を示した。６時間後にＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸を併用投与した場合は、神経症的損傷が５５％程度回復されて、ＥＰに比べ効果が１５％増進されることを確認した(図２０)。即ち、ＥＰや塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の単独投与時より、ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸を、再灌流６時間後に併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す。
【実施例７】
【００５４】
エチルピルベート(ＥＰ)と塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ＥＰ塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の併用療法の効果を調べるために、各薬剤を５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の３０分、６、１２時間後に静脈投与した。６時間後にＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸を併用投与した場合、それぞれを５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かった。ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸は、脳梗塞の大きさをそれぞれ６６％及び５３％に抑制したのに対し、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞の大きさを６９％程度に抑制し、ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の効能が相互補完的であることを示唆している(図２１)。
【００５５】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。神経症的損傷については、早いうちに投与した場合ほど、効果的な神経症的損傷の回復を示した。６時間後に塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸を投与した場合は、神経症的損傷の回復効果が微弱であって、ＥＰを投与した場合は、神経症的損傷が４０％回復される結果を示した。６時間後にＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸を併用投与した場合は、神経症的損傷が４３％程度回復されて、ＥＰに比べ効果が３％増進されることを確認した(図２２)。即ち、ＥＰや塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の単独投与時より、ＥＰと塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸を、再灌流６時間後に併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す。
【実施例８】
【００５６】
ＥＰと塩化フルオキセチンの併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、濃度別、脳切片における虚血部位の測定
ＥＰと塩化フルオキセチンの併用療法の効果が各薬剤の容量増加により再現されるかを調べるために、ＥＰと塩化フルオキセチンを１ｍｇ/ｋｇ、２ｍｇ/ｋｇ、５ｍｇ/ｋｇ、１０ｍｇ/ｋｇ、２０ｍｇ/ｋｇの濃度でそれぞれ処置した。１時間局所虚血動物モデルを製作した後、再灌流６時間にＥＰと塩化フルオキセチンを多様な濃度で静脈投与し、脳梗塞の大きさを測定した。二つの薬剤とも、５ｍｇ/ｋｇの濃度で梗塞の大きさを最も効果的に減少させて、１０ｍｇ/ｋｇに濃度を増加させた場合、梗塞抑制効果の増進が観察されなかった(図２３)。
【００５７】
ＥＰと塩化フルオキセチンの併用療法の効果を調べるために、各薬剤を５ｍｇ/ｋｇの容量で 再灌流３０分、６時間、１２時間後に静脈投与した。６時間後に投与した場合、それぞれを５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果がさらに大きく現れた。ＥＰと塩化フルオキセチンの効能がそれぞれ６６％及び５９％であり、併用投与した場合、７６％の脳梗塞抑制効果を示し、相互補完的であることを示唆している(図２４)。
【００５８】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。６時間後にＥＰと塩化フルオキセチンを併用投与した場合、ＥＰを単独投与した場合に比べ、１０％程度優れた神経学的欠陥抑制効果を示した(図２５)。即ち、ＥＰや塩化フルオキセチンの単独投与時より、ＥＰと塩化フルオキセチンを再灌流６時間後に併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と共に運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す。
【実施例９】
【００５９】
ピルボイルアミンジエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸(triflusal)の併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ピルボイルアミンジエタン(製造例２)と２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸の併用療法の効果を調べるために、各薬剤を２．５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の３０分、６、１２時間後に静脈投与した。６時間後にピルボイルアミンジエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸を併用投与した場合、それぞれを２．５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かった。ピルボイルアミンジエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸は、脳梗塞の大きさをそれぞれ４０％及び２３％に抑制したのに対し、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞の大きさを６０％程度に抑制し、ピルボイルアミンジエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸の効能が相互補完的であることを示唆している(図２６)。
【００６０】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。６時間後にピルボイルアミンジエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸を併用投与した場合、ＥＰを単独投与した場合に比べ、３０％程度優れた神経学的欠陥抑制効果を示した。即ち、ピルボイルアミンジエタンや２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸の単独投与時より、ピルボイルアミンジエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸を再灌流６時間後に併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と共に運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す。
【実施例１０】
【００６１】
ピルボイルアミンジエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸(HTB)の併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ピルボイルアミンジエタン(製造例２)と２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸の併用療法の効果を調べるために、各薬剤を２．５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の３０分、６、１２時間後に静脈投与した。６時間後にピルボイルアミンジエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸を併用投与した場合、それぞれを２．５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かった。ピルボイルアミンジエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸は、脳梗塞の大きさをそれぞれ３１％及び３０％に抑制したのに対し、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞の大きさを４２％程度に抑制し、ピルボイルアミンジエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸の効能が相互補完的であることを示唆している(図２７)。
【００６２】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。６時間後にピルボイルアミンジエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸を併用投与した場合、ＥＰを単独投与した場合に比べ、１７％程度優れた神経学的欠陥抑制効果を示した。即ち、ピルボイルアミンジエタンや２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸の単独投与時より、ピルボイルアミンジエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸を再灌流６時間後に併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と共に運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す。
【実施例１１】
【００６３】
ピルボイルアミノエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸(triflusal)の併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ピルボイルアミノエタン(製造例１)と２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸の併用療法の効果を調べるために、各薬剤を２．５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の３０分、６、１２時間後に静脈投与した。６時間後にピルボイルアミノエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸を併用投与した場合、それぞれを２．５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かった。ピルボイルアミノエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸は、脳梗塞の大きさをそれぞれ２０％及び２３％に抑制したのに対し、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞の大きさを５４％程度に抑制し、ピルボイルアミノエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸の効能が相互補完的であることを示唆している(図２８)。
【００６４】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。６時間後にピルボイルアミノエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸を併用投与した場合、ＥＰを単独投与した場合に比べ、１８％程度優れた神経学的欠陥抑制効果を示した。即ち、ピルボイルアミノエタンや２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸の単独投与時より、ピルボイルアミノエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸を再灌流６時間後に併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と共に運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す。
【実施例１２】
【００６５】
ピルボイルアミノエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸(HTB)の併用投与時、脳梗塞抑制効果の評価
（１）時間別、脳切片における虚血部位の測定
ピルボイルアミノエタン(製造例１)と２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸の併用療法の効果を調べるために、各薬剤を２．５ｍｇ/ｋｇの容量で再灌流の３０分、６、１２時間後に静脈投与した。６時間後にピルボイルアミノエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸を併用投与した場合、それぞれを２．５ｍｇ/ｋｇの濃度で投与した場合に比べ、梗塞抑制効果に優れていることが分かった。ピルボイルアミノエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸は、脳梗塞の大きさをそれぞれ２５％及び３０％に抑制したのに対し、二つの薬剤を併用投与した場合、脳梗塞の大きさを４９％程度に抑制し、ピルボイルアミノエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸の効能が相互補完的であることを示唆している(図２９)。
【００６６】
（２）個体水準の脳虚血改善の確認
前記比較例に記載の方法によって神経学的欠損を評価した。６時間後にピルボイルアミノエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸を併用投与した場合、ＥＰを単独投与した場合に比べ、１２％程度優れた神経学的欠陥抑制効果を示した。即ち、ピルボイルアミノエタンや２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸の単独投与時より、ピルボイルアミノエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸を再灌流６時間後に併用投与した場合、著しい脳梗塞体積の減少と共に運動機能増進を示し、前記二つの薬剤の効能が相互補完的であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】局所虚血動物モデルに、中大脳動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, 以下‘MCAO’)後エチルピルベート(ethyl pyruvate, 以下‘EP’)を投与し、ＴＴＣ染色により脳切片の虚血を観察した写真である。
【図２】ＥＰの濃度による脳切片の虚血を示したグラフである。
【図３】ＥＰの投与時間による全体虚血の体積を示したグラフである。
【図４】ＥＰ投与後、ローターロッド試験結果を示したグラフである。
【図５】ＥＰ投与後、位置反射及び前脚位置決め(forelimb placing)試験結果を示したグラフである。
【図６】ＭＣＡＯ後、ＥＰ及びアセチルサリチル酸をそれぞれ単独投与または併用投与し、ＴＴＣ染色で脳切片の虚血を観察した写真である。
【図７】ＥＰ及びアセチルサリチル酸の濃度による脳切片の虚血を示したグラフである。
【図８】ＥＰ及びアセチルサリチル酸の投与時間による全体虚血の体積を示したグラフである。
【図９】ＥＰ及びアセチルサリチル酸の併用投与後、ローターロッド試験結果を示したグラフである。
【図１０】ＥＰ及びアセチルサリチル酸の併用投与後、位置反射及び前脚位置決め(forelimb placing)試験結果を示したグラフである。
【図１１】ＭＣＡＯ後、ＥＰ及び塩化２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートの投与時間による全体虚血の体積を示したグラフである。
【図１２】ＭＣＡＯ後、ＥＰ及び塩化２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートの投与時間による全体虚血の体積 を示したグラフである。
【図１３】ＥＰ及び塩化２−ヒドロキシ−５−(２，３，５，６−テトラフルオロ−４−(トリフルオロメチル)ベンジルアミノ)ベンゾエートの併用投与後、位置反射及び前脚位置決め(forelimb placing)試験結果を示したグラフである。
【図１４】ＭＣＡＯ後、ＥＰ及び塩化２−ヒドロキシ−５−(４−(トリフルオロメチル)フェニルエチルアミノ)ベンゾエートを併用投与し、ＴＴＣ染色により脳切片の虚血を観察した写真である。
【図１５】ＭＣＡＯ後、ＥＰ及び塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の投与時間による全体虚血の体積を示したグラフである。
【図１６】ＥＰ及び塩化５−(２−(４−クロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の併用投与後、位置反射及び前脚位置決め(forelimb placing)試験結果を示したグラフである。
【図１７】ＭＣＡＯ後、ＥＰ及び塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の投与時間による全体虚血の体積を示したグラフである。
【図１８】ＥＰ及び塩化５−(２−(２，４−ジクロロフェノキシ)エチルアミノ)−２−ヒドロキシ安息香酸の併用投与後、位置反射及び前脚位置決め(forelimb placing)試験結果を示したグラフである。
【図１９】ＭＣＡＯ後、ＥＰ及び塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の投与時間による全体虚血の体積を示したグラフである。
【図２０】ＥＰ及び塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(２，４，５−トリクロロフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の併用投与後、位置反射及び前脚位置決め(forelimb placing)試験結果を示したグラフである。
【図２１】ＭＣＡＯ後、ＥＰ及び塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の投与時間による全体虚血の体積を示したグラフである。
【図２２】ＥＰ及び塩化２−ヒドロキシ−５−(２−(４−メトキシフェノキシ)エチルアミノ)安息香酸の併用投与後、位置反射及び前脚位置決め(forelimb placing)試験結果を示したグラフである。
【図２３】ＭＣＡＯ後、塩化フルオキセチンを投与し、ＴＴＣ染色により脳切片の虚血を観察した写真及び塩化フルオキセチンの濃度による脳切片の虚血を示したグラフである。
【図２４】ＥＰ及び塩化フルオキセチンの投与時間による全体虚血の体積を示したグラフである。
【図２５】ＥＰ及び塩化フルオキセチンの併用投与後、位置反射及び前脚位置決め(forelimb placing)試験結果を示したグラフである。
【図２６】ＭＣＡＯ後、ピルボイルアミンジエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸(triflusal)を併用投与し、ＴＴＣ染色により脳切片の虚血を観察した写真である。
【図２７】ＭＣＡＯ後、ピルボイルアミンジエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸(HTB)を併用投与し、ＴＴＣ染色により脳切片の虚血を観察した写真である。
【図２８】ＭＣＡＯ後、ピルボイルアミノエタンと２−アセトキシ−４−(トリフルオロメチル)安息香酸(triflusal)を併用投与し、ＴＴＣ染色により脳切片の虚血を観察した写真である。
【図２９】ＭＣＡＯ後、ピルボイルアミノエタンと２−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチル安息香酸(HTB)を併用投与し、ＴＴＣ染色により脳切片の虚血を観察した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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