(57)【要約】  本発明は、細菌の生物的防除の分野に関する。より詳細には、本発明は、γ−カプロラクトン（ＧＣＬ）及び４−ヘプタノリド（ＨＴＮ）等の、ＮＡＨＬを不活化する細菌の増殖を促進する化学物質の同定、並びに土壌添加剤におけるその使用に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2010516667.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２及びＲ３は、水素原子、直鎖若しくは分枝のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、１つ若しくは複数の二重結合を有する、直鎖若しくは分枝のＣ２〜Ｃ２０アルキレン基、又はＣ１〜Ｃ２０アルコキシ基であり、但し、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つは、アルキル基、アルキレン基及びアルコキシ基から成る群から選択される）
の化合物の中から選択される少なくとも１つの化合物を含有する、土壌添加剤。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３が、直鎖又は分枝のＣ２〜Ｃ１４アルキル基である、請求項１に記載の土壌添加剤。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３が、直鎖又は分枝のＣ２〜Ｃ８アルキル基である、請求項２に記載の土壌添加剤。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３が、直鎖又は分枝のＣ２〜Ｃ６アルキル基である、請求項３に記載の土壌添加剤。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３のうちの３つが水素原子であり、且つその他がアルキル基又はアルキレン基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の土壌添加剤。
【請求項６】
Ｒ１が式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−（１≦ｎ≦６）のアルキル基である、請求項５に記載の土壌添加剤。
【請求項７】
以下の化合物：
式（ＩＩ）：
【化２】
2010516667.tif 000015
のγ−カプロラクトン（ＧＣＬ）
式ＩＩＩ：
【化３】
2010516667.tif 000016
の４−ヘプタノリド（ＨＴＮ）
式ＩＶ：
【化４】
2010516667.tif 000017
のγ−オクタラクトン（ＧＯＬ）
のうちの少なくとも１つを含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の土壌添加剤。
【請求項８】
少なくとも１つのＮＡＨＬ分解細菌株をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の土壌添加剤。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＮＡＨＬ分解細菌株が、デルフチア属、ロドコッカス属、オクロバクテリウム属、シュードモナス属、リゾビウム属、シノリゾビウム属、バシラス属、コマモナス属及びバリオボラックス属の中から選択される属に属する、請求項８に記載の土壌添加剤。
【請求項１０】
少なくとも１つのデルフチア・アシドボランス株及び／又は少なくとも１つのロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythroplis）株を含む、請求項８又は９に記載の土壌添加剤。
【請求項１１】
γ−カプロラクトン（ＧＣＬ）及び４−ヘプタノリド（ＨＴＮ）から成る群から選択される少なくとも１つの化合物、並びに少なくとも１つのＮＡＨＬ分解細菌株を含み、該ＮＡＨＬ分解細菌株の増殖が該化合物によって刺激される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の土壌添加剤。
【請求項１２】
前記細菌株が、デルフチア、ロドコッカス、シュードモナス、リゾビウム及びシノリゾビウムから成る群から選択される、請求項１１に記載の土壌添加剤。
【請求項１３】
複合細菌群集においてＮＡＨＬ分解細菌株の増殖を促進するための、式（Ｉ）：
【化５】
2010516667.tif 000018
（式中、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２及びＲ３は、水素原子、直鎖若しくは分枝のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、１つ若しくは複数の二重結合を有する、直鎖若しくは分枝のＣ２〜Ｃ２０アルキレン基、又はＣ１〜Ｃ２０アルコキシ基であり、但し、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つは、アルキル基、アルキレン基又はアルコキシ基である）
の化合物の使用。
【請求項１４】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３が、直鎖又は分枝のＣ２〜Ｃ１４アルキル基である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３が、直鎖又は分枝のＣ２〜Ｃ８アルキル基である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３が、直鎖又は分枝のＣ２〜Ｃ６アルキル基である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３のうちの３つが水素原子であり、且つその他がアルキル基又はアルキレン基である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
Ｒ１が式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−（１≦ｎ≦６）のアルキル基である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記化合物が、γ−カプロラクトン（ＧＣＬ）、４−ヘプタノリド（ＨＴＮ）及びγ−オクタラクトン（ＧＯＬ）から成る群から選択される、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
バイオフィルム形成を予防するための、及び／又は複合環境における病原細菌由来の病原性因子のＮＡＨＬ依存性発現を予防するための、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記複合環境が、土壌、細菌に侵される可能性が高い表面、又は配管材料、パイプ、サイロ、発酵槽若しくは濾過器の内部である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の土壌添加剤の、バイオフィルム形成及び／又は病原細菌由来の病原性因子のＮＡＨＬ依存性発現から植物を保護するための、使用。
【請求項２３】
水耕栽培において植物を保護するための、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
土耕栽培において植物を保護するための、請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記植物が、ジャガイモ植物、トマト植物、レタス、米、バジル（basilica）、ビートから成る群から選択される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
或る化合物が、少なくとも１つのデルフチア株及び／又は少なくとも１つのロドコッカス株を含有する細菌群集においてＮＡＨＬ分解細菌を刺激することが可能であるか否かを判定する方法であって、
（ｉ）試験する前記化合物を強化した合成培地中で、前記細菌群集の試料をインキュベートする工程と、
（ｉｉ）試験する前記化合物の代わりに、請求項１３で規定した式ＩＩ〜式Ｖの化合物のうちの１つ、好ましくは式ＩＩの化合物（ＧＣＬ）又は式ＩＩＩの化合物（ＨＴＮ）を強化した以外は、（ｉ）と同じ合成培地中で、前記細菌群集の試料をインキュベートする工程と、
（ｉｉｉ）式ＩＩ〜式Ｖの化合物のうちの１つも、試験する前記化合物も添加していない、（ｉ）と同じ合成培地中で、前記細菌群集の試料をインキュベートする工程と、
（ｉｖ）１２時間、好ましくは少なくとも２０時間のインキュベーション時間後に、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）で述べた条件で得られた群集それぞれがＣ６−ＨＳＬ等のＮＡＨＬ化合物を分解する性能を比較する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の生物的防除の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＮＡＨＬを不活化する細菌の増殖を促進する化学物質の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＮＡＨＬ）は、多数の細菌集団及び細菌集合体における細胞間情報伝達に不可欠なシグナルである。細菌のタンパク質センサ（ＬｕｘＲファミリー）がＮＡＨＬの臨界濃度を感知することにより、特定遺伝子の発現が制御される。細胞クオラムを、ＮＡＨＬシグナルの感知を介した遺伝子発現と結び付ける調節経路は、クオラムセンシング（ＱＳ）と呼ばれる（非特許文献１）。ＱＳを通じて調節される機能は非常に多様であり（非特許文献２）、動物及び植物の病原体、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）又はシュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）の病原性に関与する。
【０００３】
ＮＡＨＬ分解酵素活性は、最初に幾つかの細菌で発見され（非特許文献３；非特許文献４）、現在は、アグロバクテリウム属、ボセア属、コマモナス属、デルフチア属、シュードモナス属、ラルストニア属、スフィンゴピキシス属及びバリオボラックス属に属するプロテオバクテリア（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）並びにアクチノバクテリア門及びファーミキューテス門、例えば、アルスロバクター属、バシラス属、ロドコッカス属及びストレプトマイセス属（非特許文献３；非特許文献１３；非特許文献７；非特許文献１０；非特許文献１４；非特許文献１５）で報告されている。これらのＮＡＨＬ分解細菌は、土壌、根圏及びバイオフィルム等の異なる環境から採取された。目立ったところでは、タバコ（Nicotiana tabacum）の根圏中のＮＡＨＬ分解細菌及びＮＡＨＬ産生細菌の多様性に関する詳細な分析（非特許文献１１）から、これら２つの機能的集合体が同一環境中に共存することが示唆されている。さらに、同一属（アグロバクテリウム、シュードモナス、スフィンゴピキシス及びバリオボラックス）に属する幾つかの細菌分離株は、ＮＡＨＬ産生菌又はＮＡＨＬ分解菌のいずれかであり得る。幾つかの属、例えば、アグロバクテリウム及びシュードモナスにおいて、これら２つのアンタゴニスト機能は、同一分離株で同時発現し得るため、高度に（sophisticated）調節されているが、このことは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの場合で探索されている（非特許文献１６、非特許文献１７）。
【０００４】
過去何年にもわたって、ＱＳを標的とする抗病原性戦略が文献に登場した（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。これらは、以下のアプローチを含む：
ＮＡＨＬシグナルの合成の阻害：例えば、トリクロサンは、それ自体がＮＡＨＬの合成に必要な脂肪酸の合成を抑制する抗生物質分子である（非特許文献２２）。しかしながら、ＮＡＨＬに対して特異的ではないため、この抗生物質に対する耐性が現れる。
【０００５】
ＮＡＨＬシグナルの感知の阻害：ハロゲン化フラノン等のＮＡＨＬアナログを用いて、細菌受容体によるＮＡＨＬシグナル認識を妨害することができる（非特許文献２３）。
【０００６】
遺伝子組換え生物によるＮＡＨＬシグナルの酵素分解：微生物又はトランスジェニック植物において外因性のラクトナーゼ又はアシラーゼを発現させる組換えベクターが提案されている（非特許文献２４；特許文献１；特許文献２）。例えば、バシラス種由来のａｉｉＡ遺伝子によってコードされる外因性のラクトナーゼを発現するトランスジェニック植物は、未改変の対応物よりも、ＮＡＨＬを産生する病原細菌による感染に対して耐性がある。しかしながら、トランスジェニック植物の入手が必要なため、このアプローチは実施が容易ではない。
【０００７】
バシラス属、ロドコッカス属及びデルフチア属に属する細菌株等の、生物的防除剤として使用する（非特許文献７；非特許文献１２）ＮＡＨＬ分解細菌の単離。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１３９４９５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０１５５０８８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Fuqua, W.C., Winans, S.C., and Greenberg, E.P. (1994) Quorum sensing in bacteria: the LuxR/LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J. Bacteriol. 176: 269-275
【非特許文献２】Whitehead, N.A., Barnard, A.M., Slater, H., Simpson, N.J., and Salmond, G.P.C. (2001) Quorum-sensing in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Rev 25: 365-404
【非特許文献３】Dong, Y.H., Xu, J.L., Li, X.Z., and Zhang, L.H. (2000) AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Proc Natl Acad Sci USA 97: 3526-3531
【非特許文献４】Leadbetter, J.R., and Greenberg, E.P. (2000) Metabolism of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus. J Bacteriol 182: 6921-6926
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【非特許文献６】Lin, Y.H., Xu, J.L., Hu, J., Wang, L.H., Ong, S.L., Leadbetter, J.R., and Zhang, L.H. (2003) Acyl-homoserine lactone acylase from Ralstonia strain XJ12B represents a novel and potent class of quorum-quenching enzymes. Mol Microbiol 47: 849-860
【非特許文献７】Uroz, S., d'Angelo-Picard, C., Carlier, A., Elasri, M., Sicot, C., Petit, A., Oger, P., Faure, D., and Dessaux, Y. (2003) Novel bacteria degrading N-acylhomoserine lactones and their use as quenchers of quorum-sensing-regulated functions of plant-pathogenic bacteria. Microbiology 149: 1981-1989
【非特許文献８】Flagan, S., Ching, W.K., and Leadbetter, J.R. (2003) Arthrobacter strain VAI-A utilizes acyl-homoserine lactone inactivation products and stimulates quorum signal biodegradation by Variovorax paradoxus. Appl Environ Microbiol 69: 909-916
【非特許文献９】Hu, J.Y., Fan, Y., Lin, Y.H., Zhang, H.B., Ong, S.L., Dong, N., Xu, J.L., Ng, W.J., and Zhang, L.H. (2003) Microbial diversity and prevalence of virulent pathogens in biofilms developed in a water reclamation system. Res Microbiol 154: 623-629
【非特許文献１０】Park, S.Y., Lee, S.J., Oh, T.K., Oh, J.W., Koo, B.T., Yum, D.Y., and Lee, J.K. (2003) AhlD, an N-acylhomoserine lactonase in Arthrobacter sp., and predicted homologues in other bacteria. Microbiology 149: 1541-1550
【非特許文献１１】d'Angelo-Picard, C., Faure D., Penot, I. and Dessaux, Y. (2005) Diversity of N-acylhomoserine lactone-producing and -degrading bacteria in soil and tobacco rhizosphere. Environ Microbiol 7: 1796-1808
【非特許文献１２】Jafra S, Przysowa J, Czajkowski R, Michta A, Garbeva P, Van der Wolf JM. (2006) Detection and characterization of bacteria from the potato rhizosphere degrading N-acyl-homoserine lactone. Can J Microbiol. Oct; 52(10): 1006-1015
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【非特許文献１４】Park, S.Y., Kang, H.O., Jang, H.S., Lee, J.K., Koo, B.T., and Yum, D.Y. (2005) Identification of extracellular N-acylhomoserine lactone acylase from a Streptomyces sp. and its application to quorum quenching. Appl Environ Microbiol 71: 2632-2641
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【非特許文献１７】Chevrot R., Rosen R., Haudecoeur E., Cirou A., Shelp B.J., Ron E., and Faure D. (2006) GABA controls the level of quorum-sensing signal in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci USA 103: 7460-7464
【非特許文献１８】Dong, Y.H., Wang, L.H., Xu, J.L., Zhang, H.B., Zhang, X.F., and Zhang, L.H. (2001) Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase. Nature 411: 813-817
【非特許文献１９】Zhang, L.H. (2003) Quorum-quenching and proactive host defense. Trends Plant Sci 8: 238-244
【非特許文献２０】Molina, L., Constantinescu, F., Michel, L., Reimmann, C, Duffy, B., and Defago, G. (2003) Degradation of pathogen quorum-sensing molecules by soil bacteria: a preventive and curative biological control mechanism. FEMS Microbiol Ecol 1522: 1-11
【非特許文献２１】Rasmussen, T.B., Givskov, M. (2006) Quorum-sensing inhibitors as anti-pathogenic drugs. Int J Med Microbiol 296: 149-161
【非特許文献２２】Hoang TT and Schweizer HP. (1999) Characterization of Pseudomonas aeruginosa enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI): a target for the antimicrobial triclosan and its role in acylated homoserine lactone synthesis. J Bacteriol. 181(17): 5489-97
【非特許文献２３】Manefield M, de Nys R, Kumar N, Read R, Givskov M, Steinberg P, Kjelleberg S. (1999) Evidence that halogenated furanones from Delisea pulchra inhibit acylated homoserine lactone (AHL)-mediated gene expression by displacing the AHL signal from its receptor protein. Microbiology. Feb; 145 (Pt 2): 283-91
【非特許文献２４】Dong YH and Zhang LH. (2005) Quorum sensing and quorum-quenching enzymes. J Microbiol. Feb; 43 Spec No: 101-9
【発明の概要】
【００１０】
本文脈において、本発明者らは、ＮＡＨＬ分解細菌の増殖を促進する化学物質を適用することによって、天然の細菌集合体の代謝多様性をＮＡＨＬ分解細菌を促進するように操作することができるか否かについて検討した。下記の通り、本発明者らは、ＮＡＨＬ分解細菌を実際、特異的に刺激することができることを示し、細菌集団を操作することによってＱＳ依存性の植物病原体を制御する有望な戦略を与えた。
【００１１】
第１の実施の形態によれば、本発明は、式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
2010516667.tif 000002
【００１３】
（式中、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２及びＲ３は、水素原子、直鎖若しくは分枝のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、１つ若しくは複数の二重結合を有する、直鎖若しくは分枝のＣ２〜Ｃ２０アルキレン基、又はＣ１〜Ｃ２０アルコキシ基であり、但し、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つは、アルキル基、アルキレン基又はアルコキシ基である）
の化合物の中から選択される少なくとも１つの化合物を含有する、土壌添加剤に関する。
【００１４】
本発明の好ましい実施の形態によれば、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３は、直鎖若しくは分枝のＣ２〜Ｃ１４、好ましくはＣ２〜Ｃ８、より好ましくはＣ２〜Ｃ６アルキル基、又は１つ若しくは２つの二重結合を有する、直鎖若しくは分枝のＣ２〜Ｃ１４、好ましくはＣ２〜Ｃ８、より好ましくはＣ２〜Ｃ６アルキレン基である。
【００１５】
本発明による土壌添加剤の特定の実施の形態において、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３は、ヒドロキシル及びケトンから成る群から選択される１つ又は複数の基で置換される、本明細書中に上記で規定したアルキル基又はアルキレン基である。
【００１６】
本発明の別の好ましい実施の形態によれば、本発明による土壌添加剤中に存在する化合物は、以下の化合物の中から選択される：
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３のうちの３つが水素原子であり、且つその他がアルキル基又はアルキレン基であり；好ましくは、Ｒ１が式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−（１≦ｎ≦６）のアルキル基である、化合物。
【００１７】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３のうちの２つが水素原子であり、且つその他がそれぞれ、アルキル基又はアルキレン基であり；好ましくは、Ｒ１が式ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−（１≦ｎ≦６）のアルキル基であり、且つＲ２がメチル基である、化合物。
【００１８】
Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２又はＲ３のうちの１つが水素原子であり、且つその他がそれぞれ、アルキル基又はアルキレン基であり；好ましくは、Ｒ１及びＲ’１がメチル基であり、且つＲ２がＣＨ３−ＣＯ−（ＣＨ２）２である、化合物。
【００１９】
本発明による土壌添加剤の好ましい例としては、少なくとも以下の化合物が挙げられる：
式（ＩＩ）：
【００２０】
【化２】
2010516667.tif 000003
【００２１】
のγ−カプロラクトン（ＧＣＬ）
式ＩＩＩ：
【００２２】
【化３】
2010516667.tif 000004
【００２３】
の４−ヘプタノリド（ＨＴＮ）
式ＩＶ：
【００２４】
【化４】
2010516667.tif 000005
【００２５】
のγ−オクタラクトン（ＧＯＬ）
式Ｖ：
【００２６】
【化５】
2010516667.tif 000006
【００２７】
の４−ヒドロキシ−４−メチル−３−（３−オキソブチル）吉草酸γ−ラクトン
本発明による土壌添加剤は、好ましくは、少なくともγ−カプロラクトン（ＧＣＬ）又は４−ヘプタノリド（ＨＴＮ）を含有する。
【００２８】
或る特定の状況において、当業者は、ＮＡＨＬ分解細菌の増殖を促進する化合物の他に、かかる細菌の幾つかの株のうちの１つの添加を選ぶことができる。これは、例えば、植物病原体に汚染される可能性が高い水耕栽培、又は天然にはＮＡＨＬ分解細菌が存在しない特定の土壌での場合が考えられ得る。それゆえ、本発明は、上記のような土壌添加剤であって、少なくとも１つのＮＡＨＬ分解細菌株、とりわけその増殖がγ−カプロラクトン（ＧＣＬ）又は４−ヘプタノリド（ＨＴＮ）によって促進されるＮＡＨＬ分解細菌株をさらに含む、土壌添加剤にも関する。本実施の形態により使用することができるＮＡＨＬ分解細菌株の非限定的な例は、デルフチア属、ロドコッカス属、オクロバクテリウム属、シュードモナス属、リゾビウム属、シノリゾビウム属、バシラス属、コマモナス属及びバリオボラックス属の中から選択される属に属する細菌である。本発明の土壌添加剤に含有することができる好ましい株は、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）及びロドコッカス、例えば、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythroplis）Ｗ２細菌株（Uroz et al., 2003）である。当然のことながら、幾つかの株を組み合わせて使用することができる。
【００２９】
本発明の別の態様は、複合細菌群集において、ＮＡＨＬ分解細菌株の増殖を促進するための、式（Ｉ）：
【００３０】
【化６】
2010516667.tif 000007
【００３１】
（式中、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２及びＲ３は、水素原子、直鎖若しくは分枝のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、１つ若しくは複数の二重結合を有する、直鎖若しくは分枝のＣ２〜Ｃ２０アルキレン基、又はＣ１〜Ｃ２０アルコキシ基であり、但し、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２及びＲ３のうちの少なくとも１つは、アルキル基、アルキレン基又はアルコキシ基である）
の化合物の使用である。当然のことながら、土壌添加剤に関して上記したものと同じ特定の好ましい化合物も、本発明の本態様の一部である。
【００３２】
特に、これらの化合物は、バイオフィルム形成の予防、及び／又は複合環境における病原細菌由来の病原性因子のＮＡＨＬ依存性発現の予防のために使用することができる。本発明により処理することができる、かかる複合環境の非限定的な例は、土壌、細菌に侵される可能性が高い表面、及び配管材料、パイプ、サイロ、発酵槽又は濾過器の内部である。
【００３３】
別の好ましい態様によれば、本発明は、バイオフィルム形成及び／又は病原細菌由来の病原性因子のＮＡＨＬ依存性発現から植物を保護するための、上記のような土壌添加剤の使用に関する。本発明の本態様は、水耕栽培又は土耕栽培のいずれかにおける植物の保護に使用することができる。本発明が標的とすることができる植物病原体の例は、エルウィニア種、とりわけエルウィニア・カロトボーラ及びエルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysantemi：黒脚病菌）、バークホルデリア種、とりわけバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia：セパシア菌）、バークホルデリア・グルメ（Burkholderia glumae：イネもみ枯細菌病菌）、バークホルデリア・プランタリ（Burkholderia plantarii：イネ苗立枯細菌病菌）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea sterwartii）及びラルストニア・ソラナセラム（Ralstonia solanacearum）である。したがって、本発明の利益を享受することができる植物の非限定的な例は、ジャガイモ植物、トマト植物、レタス、米、バジル（basil）、ビートである。
【００３４】
或る化合物が、少なくとも１つのデルフチア株及び／又は少なくとも１つのロドコッカス株を含有する細菌群集においてＮＡＨＬ分解細菌を刺激することが可能であるか否かを判定する方法も、本発明の一部である。かかる方法は、
（ｉ）試験する上記化合物を強化した合成培地中で、前記細菌群集の試料をインキュベートする工程と、
（ｉｉ）試験する前記化合物の代わりに、式ＩＩ〜式Ｖの化合物のうちの１つ、好ましくは式ＩＩの化合物（ＧＣＬ）又は式ＩＩＩの化合物（ＨＴＮ）を強化した以外は、（ｉ）と同じ合成培地中で、上記細菌群集の試料をインキュベートする工程と、
（ｉｉｉ）式ＩＩ〜式Ｖの化合物のうちの１つも、試験する前記化合物も添加していない、（ｉ）と同じ合成培地中で、上記細菌群集の試料をインキュベートする工程と、
（ｉｖ）１２時間、好ましくは少なくとも２０時間のインキュベーション時間後に、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）で述べた条件で得られた群集それぞれがＣ６−ＨＳＬ等のＮＡＨＬ化合物を分解する性能を比較する工程と、
を含み得る。
【００３５】
本方法を実施する場合、当業者は、工程（ｉ）で得られた細菌群集が、工程（ｉｉ）で得られた細菌群集と少なくとも同程度に効率よく、上記ＮＨＬ化合物を分解することができれば、被験化合物がＮＡＨＬ分解細菌を刺激することが可能であると考える。当然のことながら、工程（ｉ）〜工程（ｉｉｉ）は、同時に又は逐次的に実施することができる。
【００３６】
本発明を、以下の図面及び実施例によってさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本研究で使用した第１の分子セットの構造を示す図である。ヘキサノイルホモセリンラクトン（Ｃ６−ＨＳＬ）の置換は以下の通りである：Ｒ１はＨであり、且つＲ２はＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３である。その他の化合物は、ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）、γ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）、γ−バレロラクトン（ＧＶＬ）、γ−カプロラクトン（ＧＣＬ）、４−ヘプタノリド（ＨＴＮ）、γ−ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）、コハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）、コハク酸（ＳＡ）、無水コハク酸（ＳＡＮ）、２-ピロリドン（２ＰＲ）、δ−バレロラクタム（ＤＶＭ）、６−カプロラクタム（６ＣＭ）、６−カプロラクトン（６ＣＬ）、Ｌ−ホモセリン（ＨＳ）、２−アセチルブチロラクトン（ＡＢＬ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、テトラヒドロフルフリルアルコール（ＴＨＡ）。
【図２】細菌群集によるＣ６−ＨＳＬ不活化の動態を示す図である。唯一の炭素供給源としての指定化合物（マンニトールはＭａｎと略記する）の強化後に得られた異なる細菌群集を、Ｃ６−ＨＳＬシグナルを不活化する能力に関して試験した（動態開始時に２５μＭ）。動態の各点（０時間、１時間、２時間、３時間、５時間及び２４時間）で、非接種対照（Ｃ）を用いて、残存Ｃ６−ＨＳＬの割合を推定した。同時に実施した動態を同一グラフに示す。細菌は、非植生土壌（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）及び根圏土壌（Ｅ）に由来した。値は４連の平均である。
【図３】本研究で使用した第２の分子セットの構造を示す図である。略語：ＵＧＬ：ウンデカン酸γ−ラクトン；ＧＯＬ：γ−オクタラクトン；ＷＬ：ウイスキーラクトン；ＧＤＬ：γ−デカラクトン；ＧＮＬ：γ−ノナラクトン；ＤＮＬ：δ−ノナラクトン；ＤＤＬ：δ−デカラクトン；ＥＤＬ：ε−デカラクトン。
【図４】細菌群集によるＮＡＨＬ不活化の動態を示す図である。（Ａ）ＮＡＨＬは、初期濃度２５μＭのＣ６−ＨＳＬである。（Ｂ）ＮＡＨＬは、初期濃度２００ｎＭの３−オキソ−オクタノイルホモセリンラクトン（ＯＣ８−ＨＳＬ）である。唯一の炭素供給源としての指定化合物（マンニトールはＭａｎと略記する）の強化後に得られた異なる細菌群集を、ＮＡＨＬシグナルを不活化する能力に関して試験した。各時間（０時間、１時間、３時間及び５時間）で、非接種対照（Ｃ）を用いて、残存ＮＡＨＬの割合を推定した。
【図５】マンニトール群集、６ＣＬ群集、ＧＣＬ群集及びＨＴＮ群集によるＯＣ８−ＨＳＬの不活化を示す図である。
【図６】ジャガイモ塊茎でのマセレーションアッセイを示す図である。ジャガイモ塊茎には、陰性対照としてのＮａＣｌ溶液（ａ）、又は陽性対照としてのエルウィニア・カロトボーラ６２７６（ｆ）、又はマンニトール（ｂ）、６ＣＬ（ｃ）、ＧＣＬ（ｄ）若しくはＨＴＮ（ｅ）の存在下での増菌手順に由来する細菌群集、又はエルウィニア・カロトボーラ６２７６と、マンニトール群集との混合物（ｇ）、６ＣＬ群集との混合物（ｈ）、ＧＣＬ群集との混合物（ｉ）、ＨＴＮ群集との混合物（ｊ）を感染させた。ＧＣＬ群集及びＨＴＮ群集の存在下で生物的防除活性が観察された。
【図７】ジャガイモ根圏におけるＮＡＨＬ分解株及びＮＡＨＬ産生株の割合を示す図である。ＮＡＨＬ分解菌及びＮＡＨＬ産生菌の割合は、ＧＣＬ又は６ＣＬによる処理の前（Ｄ０；白色の棒）、１４日後（Ｄ１４；黒色の棒）及び２８日後（Ｄ２８；灰色の棒）にジャガイモ根圏から採取した培養可能細菌（ＣＦＵ／根の新鮮重のｇ）から推定した。未処理バッチを２つの独立した実験セットにおける対照として使用した。３連の平均を示す。統計的に異なる値（スチューデントｔ検定；０．０５）は、異なる文字で表記する。
【図８】ジャガイモ植物の水耕栽培の水耕溶液（Ａ）及び植物組織（Ｂ）におけるＧＣＬの濃度を示す図である。
【図９】ＨＴＮによる処理後のジャガイモ根圏中のＮＡＨＬ分解株及びＮＡＨＬ産生株の割合を示す図である。ＮＡＨＬ分解菌及びＮＡＨＬ産生菌の割合は、処理前（Ｄ０；白色の棒）、第１の処理から１４日後（Ｄ１４；濃い灰色の棒）、２８日後（Ｄ２８；黒色の棒）及び第１の処理から４２日後、すなわち、第２の処理から１４日後（Ｄ４２；灰色の棒）にジャガイモ根圏から採取した培養可能細菌（ｃｆｕ／根の新鮮重のｇ）から推定した。文字は、統計的に異なる値を示す（スチューデントｔ検定；０．０５）。
【図１０】ＧＣＬの資化及びＮＡＨＬ分解能を示す図である。各円は、未処理バッチ又は処理の開始から１４日後（Ｄ１４）及び２８日後（Ｄ２８）のＧＣＬ処理（０．１ｍＬ／Ｌ及び０．４ｍＬ／Ｌ）バッチ由来の９０個の分離株を示す。各部分は、ＧＣＬを唯一の炭素供給源として資化し、且つＣ６−ＨＳＬシグナルを不活化した細菌（斜線）、ＧＣＬを資化しただけの細菌（灰色）、ＮＡＨＬシグナルを不活化しただけの細菌（黒色）及びＧＣＬの資化も、ＮＡＨＬシグナルの不活化もしなかった細菌（白色）の比率を示す。
【図１１】ＤＧＧＥ分析を示す図である。ＧＣＬ（０．１ｍＬ／Ｌ及び０．４ｍＬ／Ｌ）の適用から１４日後（パネルＡ）及び２８日後（パネルＢ）に、同一バッチ由来の２つの試料に関してＤＧＧＥ分析を実施した。図で番号を付したバンドをシークエンシングにより分析した。各配列又は配列の群に関しては、最も近縁なｒｒｓ配列のうちの１つを示した。Ｇｅｎｂａｎｋ番号、類似度指数（ＳＩ）（リボゾームデータベースプロジェクト（Ribosomal Database Project）http://rdp.cme.msu.edu/で算出されたもの）並びに由来となる細菌の名称及び分類学的位置によって同定した（Ｂａｃｔ、細菌；ＢＣ、バクテロイデス門／クロロビウム門（Chlorobi：緑色硫黄細菌門）の群；Ｆｉｒｍ、ファーミキューテス門；α、α−プロテオバクテリア；β、β−プロテオバクテリア；及びγ、γ−プロテオバクテリア）。
【図１２】５６日間の温室でのジャガイモ植物栽培に対する、ＧＣＬ（０．４ｍｇ／ｍＬ）処理の影響を示す図である。時間軸（Ａ）は、（０日目、１８日目及び４９日目の）異なるＧＣＬ処理並びに（処理前の０日目、７日目、２８日目、４９日目及び５６日目の）根圏試料の分析を示す。植物は、Ｄ０からＤ１７まで水耕バッチで栽培した後、塊茎形成までの長期栽培が可能な水耕系に移した。各時間に、３つの試料（Ｄ０及びＤ７）及び４つの試料（Ｄ２８、Ｄ４９及びＤ５６）を分析した：ＣＦＵの数／根のｇ（Ｂ）並びにアシル−ＨＳＬ産生株（Ｃ）及びアシル−ＨＳＬ分解株の割合を推定した。異なる文字は、２つの条件である未処理条件とＧＣＬ処理条件との間での有意差を示す（スチューデントｔ検定；α＝０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３８】
以降の実験データは、下記の材料及び方法を用いて得られたものである：
化学物質及び細菌培地
すべての化学物質はSigma-Aldrich-Flukaから購入した。キングＢ（King et al., 1954）、トリプティックソイ寒天（ＴＳＡ）（AES、仏国）及びＴＹ（０．５％トリプトン、０．３％酵母エキス）を細菌用の富栄養培地とした。塩化アンモニウム（１ｇ／Ｌ）を唯一の窒素供給源として、また、別の炭素供給源を指定する場合を除き、マンニトール（２ｇ／Ｌ）を唯一の炭素供給源として用いたＡＢ（Chilton et al., 1974）を最少培地とした。寒天は１５ｇ／Ｌで添加した。アンピシリン（４０ｍｇ／Ｌ）及びクロラムフェニコール（１３ｍｇ／Ｌ）を補充したキングＢ寒天平板上の蛍光性シュードモナス菌をＵＶ（３１２ｎｍ）下で計数した。
細菌の増菌及び土壌からの単離
Gif-sur-Yvette（仏国）のCNRS試験圃場（Merantaise）由来の非滅菌土壌を、滅菌砂Ｌｏｉｒｅ  Ｒｉｖｅｒと混合し、ポット（直径２０ｃｍ）に分配した。それらのうちの幾つかに、タバコ（Nicotiana tabacum cv. Samson）の殺菌した種子を蒔いた。ポットを、長日条件（１６時間）下、１７℃（夜）及び２４℃（昼）の温室（CNRS、Gif-sur-Yvette）内にランダムに入れ、水道水で毎日水やりした。非植生土壌又は根圏（３ヶ月生育した植物）土壌１ｇを、滅菌した０．８％  ＮａＣｌ  １０ｍｌに再懸濁した。土壌懸濁液を、アクチジオン（１００ｍｇ／Ｌ）及びマンニトール又は図１に示す１７個の分子のうちの１つを補充したＡＢ培地に希釈した（１／５０）。振盪（１８０ｒｐｍ）させながら２５℃で３日間インキュベートした後、細胞培養物を、さらなる２日間の増菌工程用の新しいＡＢ培地に希釈した（１／５０）。この段階で、細菌群集をＮａＣｌ（０．８％）中で２回洗浄し、その細胞密度を６００ｎｍでの吸光度（OD）で調整し、そのＣ６−ＨＳＬを不活化する能力を比較した。次いで、これらの群集由来の細菌を、対応する炭素供給源を補充したＡＢ寒天平板での２回の連続した単離、及びＴＹ寒天平板での第３の単離によって精製した。かかる分離株をＮＡＨＬ産生及びＮＡＨＬ分解に関して試験した。
バッチ実験由来の細菌単離
非滅菌バッチ（４０ｃｍ×６０ｃｍ×８ｃｍ）は、０．８０ｇ／Ｌの窒素、０．５６ｇ／Ｌのリン（Phosphore）及び１．４８ｇ／Ｌのカリウムを主要構成成分として含む、栄養液Ｈｙｄｒｏｂｌｏｏｍ（Cellmax、英国）１３Ｌを含有した。この溶液は、濃縮原液から公共の給水系由来の非滅菌水で希釈した（×２５０）。滅菌条件下で実施した栽培から採取した１００個のジャガイモ（Solanum tuberosum var. Allians）植物を、バッチカバーの孔（相互に３ｃｍの間隔）に入れた。植生バッチを、自然光の下、１０℃〜１５℃（夜）及び２５℃〜３０℃（日）の温室（Comite Nord Plants de Pomme de Terre、Bretteville-du-Grand-Caux）内に入れた。４週間後、６ＣＬ（０．１ｍＬ／Ｌ）及びＧＣＬ（０．１ｍＬ／Ｌ及び０．４ｍｌ／Ｌ）を添加し（Ｄ０）、細菌集団を、処理開始から１４日後（Ｄ１４）及び２８日後（Ｄ２８）に分析した。未処理バッチを対照として使用した。根１ｇ（新鮮重）を１０ｍＭの滅菌ＭｇＳＯ４  １０ｍＬに再懸濁し、希釈し、ＴＳＡ平板及びキングＢ平板上に広げ、全培養可能細菌及び蛍光性シュードモナスをそれぞれ単離した。各バッチから、各時間Ｄ０、Ｄ１４及びＤ２８に３つの試料を分析し；各試料から、ＴＳＡ平板由来の３０個の分離株及びキングＢ平板由来の３０個の蛍光性分離株を、ＮＡＨＬシグナルの産生及び不活化から個々に試験した。
ＮＡＨＬ産生菌及びＮＡＨＬ分解菌の同定
先述の通り、９６穴マイクロウェルプレートで増殖した細菌の分離株を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスバイオセンサＮＴ１（ｐＺＮＬＲ４）によるＮＡＨＬの産生及びＣ６−ＨＳＬシグナルの不活化から個々に試験した（d'Angelo-Picard et al. 2004）。唯一の炭素供給源としてＧＣＬを含むＡＢ培地での増殖を、９６穴マイクロウェルプレート上で６００ｎｍでモニターした。
ｒｒｓ同定及びＤＧＧＥ（変性ゲル勾配電気泳動）分析
ｒｒｓ遺伝子の５'末端を、プライマーｐＡ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ）（配列番号１）及びプライマー５１８ｒ（５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ）（配列番号２）を用いて増幅し、ＧｅｎｏｍｅＥｘｐｒｅｓｓ（Meylan、仏国）によってｐＡプライマーを用いてシークエンシングした。少なくとも４００ｂｐをNCBIデータベースにかけた。幾つかの配列比較により、種レベルでの分離株の同定が可能であったが、本研究では均一性のため属レベルのみを保存した。
【００３９】
根系（約１０ｇ）に随伴する細菌集団の構造を、ＰＣＲ増幅したｒｒｓ領域（大腸菌配列の３４１位〜５３４位）のＤＧＧＥによって分析した。各バッチから２つの試料を分析した。ＤＧＧＥ分析は、先述されているように、Microbial Insights（米国テネシー州ロックフォード）によって実施された（d'Angelo-Picard et al., 2004）。各系統のバンド位置を、０（なし）及び１（あり）の値に変換し、マトリクスに集約した。プロファイルの類似度は、ＤｉｓｔＡＦＬＰソフトウェア（http://pbil.univ-lyonl.fr/ADE-4/microb）を用いてＤｉｃｅアルゴリズムにより算出した。選択したバンドの配列同定は、NCBIの体系的分類（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/）に従い、リボソームデータベースプロジェクト（http://rdp.cme.msu.edu/）の配列一致機能を用いて実施した。
実施例１：ＮＡＨＬシグナルを不活化する細菌群集の増菌
実施例１Ａ：第１の化合物セット
ＮＡＨＬの保存コアとの幾つかの構造的相関又は代謝的相関を示す１７個の化合物（図１）を、非植生土壌１ｇを接種した合成培地中の唯一の炭素供給源として個々に使用した。２回の増菌サイクル後、得られた細菌群集を、そのＣ６−ＨＳＬを不活化する能力に関して比較した（図２Ａ〜図２Ｄ）。無水コハク酸（ＳＡＮ）及びコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）での増菌から得られた群集を除いて、すべての群集は、ＮＡＨＬとは構造的に非相関な糖アナログであるマンニトールを用いて実施した増菌から得られた群集よりも、強力なＮＡＨＬ分解活性を示した。コハク酸（ＳＡ）、２−アセチルブチロラクトン（ＡＢＬ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、６−カプロラクタム（６ＣＭ）、δ−バレロラクタム（ＤＶＭ）及び２−ピロリドン（２ＰＲ）で増殖した細菌群集が、２４時間のインキュベーション時間後に、導入したＣ６−ＨＳＬのうち５０％〜８０％を不活化したのに対し、γ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）、γ−ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）、γ−バレロラクトン（ＧＶＬ）、γ−カプロラクトン（ＧＣＬ）、６−カプロラクトン（６ＣＬ）、４−ヘプタノリド（ＨＴＮ）、ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）、ホモセリン（ＨＳ）及びテトラヒドロフラン（ＴＨＡ）での増菌から得られた群集は、Ｃ６−ＨＳＬシグナルの９０％超を消失させた。中でも、ＨＴＮ群集、６ＣＬ群集、ＧＨＢ群集及びＴＨＡ群集は、５時間のインキュベーション時間後に、Ｃ６−ＨＳＬシグナルの９０％超を不活化した。同様の結果が、根圏土壌を起源とする細菌群集に関して観察された（図２Ｅ）。この場合、ＨＴＮ群集、ＴＨＡ群集、６ＣＬ群集及びＧＣＬ群集が、Ｃ６−ＨＳＬに対して最も活性であった。
実施例１Ｂ：第２の化合物セット
次いで、上記と同様に、さらなる化合物（図３）を土壌細菌群集の唯一の炭素供給源として個々に試験した。２回の増菌サイクル後、得られた細菌群集を、Ｃ６−ＨＳＬ（図４Ａ）又はＯＣ８−ＨＳＬ（図４Ｂ）を不活化する能力に関して比較した。
【００４０】
ＮＡＨＬ分解群集を得るのに最も効率のよい化合物は、ＨＴＮ、ＧＣＬ及びＧＯＬであった。
実施例２：ＮＡＨＬシグナルを不活化する細菌群集の構造
マンニトール群集、ＧＢＬ群集、ＧＣＬ群集、６ＣＬ群集、ＨＴＮ群集、ＴＨＡ群集及びＴＨＦ群集から採取した細菌を、それらのＮＡＨＬシグナルを産生及び不活化する能力に関して個別に試験した。この目的のため、２８０個の独立した増菌培養物（enrichments）から採取した２８０個の分離株の集合（すなわち、各培養物からは、１つの分離株だけを選択した）を上記２つの表現型に関してスクリーニングした。ＮＡＨＬ産生細菌が、マンニトール群集（被験株のうち１０％）並びにＧＢＬ群集（１２％）、ＴＨＡ群集（１３％）及びＴＨＦ群集（４１％）では検出されたのに対し、ＧＣＬ群集、６ＣＬ群集及びＨＴＮ群集由来の分離株には全く存在しなかった。ＮＡＨＬを不活化する細菌を、ＧＣＬ群集、６ＣＬ群集、ＨＴＮ群集、ＴＨＡ群集及びＴＨＦ群集から採取した。ＧＣＬ群集、６ＣＬ群集及びＨＴＮ群集は、ＮＡＨＬ分解細菌がより豊富であった（４０％〜５０％）。これらのうちの５３個を、それらのｒｒｓ遺伝子の５’領域の配列を決定することによって特性化した。ＨＴＮ群集由来の１７個すべての分離株は、ロドコッカス属に属したのに対し、６ＣＬ群集及びＧＣＬ群集由来の分離株は、デルフチア属（同定株のうち８０％）、クリセオバクテリウム属（１０％）、ロドコッカス属（７％）、及びラルストニア属（３％）と相関した。
実施例３：エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia caratovora）に対する細菌群集の生物的防除活性
マンニトール群集、６ＣＬ群集、ＧＣＬ群集及びＨＴＮ群集を、植物病原体エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora subsp. atroseptica）６２７６が産生する主要なＮＡＨＬであるＯＣ８−ＨＳＬを不活化する（inactivated）能力、及びジャガイモのマセレーションアッセイにおける本病原体に対する生物的防除活性に関して比較した。６ＣＬ群集、ＧＣＬ群集及びＨＴＮ群集の存在下では、Ｃ６−ＨＳＬシグナル及びＯＣ８−ＨＳＬシグナルが、マンニトール群集の存在下よりも急速に不活化した（図５）。さらに、ＧＣＬ群集及びＨＴＮ群集は、エルウィニア・カロトボーラ６２７６に対する生物的防除活性を示したのに対し、６ＣＬ群集及びマンニトール群集は示さなかった（図６）。
実施例４：水耕植物栽培におけるＮＡＨＬ分解細菌の増殖刺激
ジャガイモ（Solanum tuberosum var. Allians）の水耕栽培において、ＧＣＬ処理及び６ＣＬ処理及びＨＴＮ処理の効率を評価した。植物は、滅菌条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで栽培した後、非滅菌環境のBretteville-du-Grand-Caux（仏国）の温室内のバッチに入れた。とりわけ、非滅菌栄養液を使用し、天然細菌の供給源として機能させた。第１の実験（植物なし）において、栄養液の２つのバッチには、６ＣＬ又はＧＣＬ（１ｍＬ／Ｌ）を補充した。栄養液中のＮＡＨＬ分解細菌の比率を、処理前及び１４日後に評価した。この割合は、６ＣＬ処理バッチでは１０±２から３０±２へと、ＧＣＬ処理バッチでは１０±２から７０±２へと増加した。６ＣＬ処理バッチ及びＧＣＬ処理バッチから、１０個のＮＡＨＬ分解細菌を、それらのｒｒｓ配列によって同定した：９つはデルフチア属に属し、その他はロドコッカス属に属した。
【００４１】
若い植物は、高濃度（１ｍＬ／Ｌ）のＧＣＬ及び６ＣＬに対して感受性であるため（データは示さず）、ＧＣＬ及び６ＣＬ（０．１ｍＬ／Ｌ）を補充した植生バッチで、第２の予備実験を行った。ＮＡＨＬ分解細菌の比率の増加が、ＧＣＬ補正から２８日後に観察されたが、６ＣＬの補正後には観察されなかった（表１）。ｒｒｓシークエンシングで特性化した３２個のＮＡＨＬ分解細菌において（表１）、それらのほとんどはまた、デルフチア属及びロドコッカス属に属した。実験終了時（Ｄ２８）、６ＣＬ処理バッチ及びＧＣＬ処理バッチでの観察（各バッチで３つの同定属）と比較して、未処理バッチでは、ＮＡＨＬ分解細菌の多様性がより高度であった（７つの同定属）。まとめると、本実験セットの非植生バッチ及び植生バッチに関して得られた結果から、ＧＣＬ補充により、ジャガイモ根圏の細菌集合体において、デルフチア及びロドコッカスを含むＮＡＨＬ分解細菌の比率が増加し得ることが示唆された。
【００４２】
【表１】
2010516667.tif 000008
【００４３】
上記予備実験の妥当性を確認するために、植生バッチに対する６ＣＬ処理及びＧＣＬ処理の影響の２つの詳細且つ独立した分析を、２つの引き続いた実験セットにおいて同様の条件下で実施した。６ＣＬ（０．１ｍＬ／Ｌ）及びＧＣＬ（０．１ｍＬ／Ｌ及び０．４ｍＬ／Ｌ）の適用前（Ｄ０）及び適用から１４日後（Ｄ１４）及び２８日後（Ｄ２８）に、培養可能細菌の合計数、並びにＮＡＨＬ分解分離株及びＮＡＨＬ産生分離株の割合を求めた。未処理バッチを対照として使用した。２つの実験において、細胞密度（ＣＦＵ／根のｇ）は、０．４ｍＬ／ＬでＧＣＬを適用してから１４日後まで一貫して増加した（図７）。しかしながら、ＮＡＨＬ産生細菌の比率の繰り返し可能な変化は観察されなかった。対照的に、ＮＡＨＬ分解細菌の比率の増加は、ＧＣＬ（０．１ｍＬ／Ｌ及び０．４ｍＬ／Ｌ）適用から１４日後まで定常的に認められた。ＧＣＬの濃度がより高い場合には、両方の実験において、かかる増加は処理から２８日後にも依然として観察された。未処理バッチ及び６ＣＬ処理バッチにおいて、ＮＡＨＬ分解細菌の比率が、すべての実験時にほぼ同様のレベルに保たれたため、ＧＣＬとは対照的に、６ＣＬは調査した根圏のＮＡＨＬ分解細菌に対しては格別な効果がないことが示唆された。
【００４４】
ＧＣＬアッセイの場合、水耕溶液及び植物組織の両方における未処理バッチ及び処理バッチのＧＣＬのレベルをＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって評価した。ＧＣＬは、経時的に急速に減少した（図８）。ＧＣＬの適用から１４日後、水耕溶液中のＧＣＬ濃度は、このアッセイで検出可能な最低濃度のＧＣＬである、１０−５ｍｇ／ｍＬ未満であった。未処理植物組織では、ＧＣＬを２×１０−５ｍｇ／ｍＬ〜４×１０−５ｍｇ／ｍＬの低レベルで検出した。ＧＣＬの適用から２８日後、処理試料及び未処理試料の両方でＧＣＬ濃度は同様であった。
【００４５】
上記と同じ条件下、さらなる実験を行い、植生バッチに対するＨＴＮ（０．１ｍＬ／Ｌ及び０．４ｍＬ／Ｌ）処理の影響を判定した。本実験では、第１の処理から２８日後に第２の処理を実施し、培養可能細菌の合計数、並びにＮＡＨＬ分解分離株及びＮＡＨＬ産生分離株の割合を、この処理から１４日後、すなわち、第１の処理から４２日後（Ｄ４２）に判定した。本アッセイから、ＨＴＮがＮＡＨＬ分解細菌の増殖を刺激することができることが確認された（図９）。
実施例５：ＮＡＨＬ不活化及びＧＣＬの資化は一部連関する。
【００４６】
上記観察から、ＧＣＬを唯一の炭素供給源として資化する性能と、ＮＡＨＬを不活化する能力との間に代謝的連関があるという仮説についての評価を試みた。未処理バッチ及びＧＣＬ処理バッチから（Ｄ１４及びＤ２８に）回収した分離株において、細菌がＧＣＬを唯一の炭素供給源として資化する能力を、株ごとに求めた。各株がＮＡＨＬシグナルを不活化する（又はしない）性能に関して結果を詳しく調べた。本分析（図１０）から、細菌分離株の４つのカテゴリーが出現した：ＧＣＬの資化も、ＮＡＨＬシグナルの不活化もしない細菌；ＮＡＨＬシグナルの不活化だけをする細菌；ＧＣＬの資化だけをする細菌；及びＧＣＬを資化し、且つＮＡＨＬを不活化する細菌。最後の群は処理バッチだけで検出され、幾つかのＮＡＨＬ分解細菌以外はすべてＧＣＬ資化性細菌でもあった。したがって、ＧＣＬの資化とＮＡＨＬ不活化との連関が実証された。
実施例６：ＮＡＨＬ分解細菌及びＧＣＬ資化性細菌の多様性
ＮＡＨＬ分解株の多様性に対するＧＣＬ及び６ＣＬの影響を、実験開始時（Ｄ０）及び１４日後及び２８日後に、２つの第１の実験セットからサンプリングした２６２個のＮＡＨＬ分解株を比較することによって評価した。分離株をｒｒｓシークエンシングによって同定した（表２）。Ｄ０では、ＮＡＨＬ分解分離株のほとんどが、デルフチアと同定された。しかしながら、Ｄ１４及びＤ２８では、未処理バッチでアグロバクテリウム分離株が支配的であったのに対し、処理バッチではアグロバクテリウム分離株は検出されなかった。中でも、より頻繁に計数された細菌は、デルフチア及びロドコッカスであった。これらすべてのデルフチア分離株及びロドコッカス分離株は、唯一の炭素供給源としてのＧＣＬで増殖した。しかしながら、ＧＣＬを資化し、且つＮＡＨＬシグナルを不活化しなかった１６個の分離株（図１０）は、アシドボラックス（７分離株）、ミクロバクテリウム（３分離株）、シュードモナス（２分離株）、アゾスピリルム（１分離株）、スタフィロコッカス（１分離株）、フラボバクテリウム（１分離株）及びアクロモバクター（１分離株）と同定された。
【００４７】
【表２】
2010516667.tif 000009
【００４８】
ＮＡＨＬ分解株の多様性に対するＨＴＮの影響を分析するために、５０個のＮＡＨＬ分解株を、実験開始時（Ｄ０）及び１４日後及び４２日後に、第３の実験セットからサンプリングした。分離株をｒｒｓシークエンシングによって同定した（表３）。Ｄ０では、分析した５つのＮＡＨＬ分解分離株すべてが、アグロバクテリウムと同定された。しかしながら、Ｄ１４及びＤ４２では、ロドコッカス分離株が処理バッチで支配的であり、ここでは、デルフチア及びシノリゾビウム菌も検出された。
【００４９】
【表３】
2010516667.tif 000010
【００５０】
実施例７：他の細菌群に対するＧＣＬ及び６ＣＬの影響
培養可能細菌を扱う上記データの他に、上述した第２の実験セット由来のＤ１４及びＤ２８の試料（ＧＣＬ処理バッチ及び未処理バッチ）に関してＤＧＧＥ分析を実施した。本アプローチにより、ＧＣＬ適用後の細菌集団の劇的なリモデリングが明らかとなった（図１１）。かかる変化は、最高濃度のＧＣＬ（０．４ｍＬ／Ｌ）存在下で最も目立っていた。０．４ｍＬ／ＬのＧＣＬで処理したバッチでは、幾つかの同定したバンドはより強いか、又は単に存在するのみであった。これらのバンドのヌクレオチド配列は、フラボバクテリウム属、アシドボラックス属、サーモモナス属と相関した。未処理バッチにおいて、幾つかの他のバンドはより強いか、又は単に存在するのみであった。この場合、それらは、フレキシバクター属、アシドボラックス属、キサントモナス属、サーモモナス属、及び性質不明のロドシクルス科細菌と近縁な細菌に由来していた。サーモモナス属及びアシドボラックス属と相関する幾つかの異なるバンドが、未処理試料及びＧＣＬ処理試料中に存在しないか、又は存在した。この特徴から、亜属レベルでの細菌集団の構造の変化が示唆された。目立ったところでは、アシドボラックス属及びフラボバクテリウム属に属するｒｒｓ配列を、ＧＣＬを資化し、且つＮＡＨＬシグナルを不活化しない細菌（図１０）、及びＧＣＬで処理したバッチに現れたＤＧＧＥバンド（図１１）の中から同定した。
実施例８：長期栽培が可能な水耕系でのジャガイモ植物栽培に対するＧＣＬ処理の影響
温室で栽培したジャガイモ植物を、Ｄ０、Ｄ１８及びＤ４９にＧＣＬ（０．４ｍｇ／Ｌ）で処理し、根圏試料を、Ｄ０（処理前）、Ｄ７、Ｄ２８、Ｄ４９及びＤ５６に分析した。植物は、Ｄ０からＤ１７まで水耕バッチで栽培した後、塊茎形成までの長期栽培が可能な水耕系に移した。図１２は、Ｄ２８、Ｄ４９及びＤ５６でのアシル−ＨＳＬ分解菌の割合に対するＧＣＬ処理の明確な効果を示す。
上記実施例に関する考察
ＮＡＨＬシグナルを不活化する細菌は、分類学的に多様であり（α−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリア、γ−プロテオバクテリア、ファーミキューテス門及びアクチノバクテリア門）、根圏土壌中（d'Angelo-Picard et al., 2004；d'Angelo-Picard et al., 2005）及び水耕植物栽培中の全培養可能細菌のうちの５％〜１５％であり得る（図７）。ＮＡＨＬ分解細菌は、植物界（planta）においてクオラムセンシング情報伝達を調節する役割を果たす（Chevrot et al., 2006）と共に、ＮＡＨＬ由来化合物に割り当てられた抗生物質活性を消失させる（Kaufmann et al., 2005）と提唱されてきた。さらに、これらの細菌は、エルウィニア等の幾つかの病原体に由来する幾つかの病原性因子のＮＡＨＬ依存性発現から植物を保護することを可能にする有望な生物的防除剤を構成する（Uroz et al, 2003；Dong et al, 2004）。分解性化学物質の適用は、ＮＡＨＬ分解細菌の増殖を刺激する価値あるツールであるため、ジャガイモの水耕栽培の根圏中のかかる細菌の割合を増加させ得ることを、本研究は示している。
【００５１】
ＮＡＨＬ、ＧＣＬ、６ＣＬ、ＨＴＮ及びＧＯＬの保存コアと構造的に相関する２５個のアッセイした分子において（図１及び図３）、土壌及び根圏試料からの増菌手順後にＮＡＨＬ分解細菌の増殖が刺激された（図２及び図４）。さらに、ＧＣＬ又はＨＴＮを水耕植物栽培に適用すると、全培養可能細菌中のＮＡＨＬ分解細菌の割合が有意に増加することが観察された（図７及び図９）。増殖が刺激されたこれらの細菌のほとんどはまた、唯一の炭素供給源としてＧＣＬを使用可能であった（図１０）。それらは、それらのｒｒｓ遺伝子の部分配列により示唆されるように、ロドコッカス属及びデルフチア属、最も好ましくはロドコッカス・エリスロポリス種及びデルフチア・アシドボランス種（表２及び表３）に属する。興味深いことに、これら２つの種の分離株がＮＡＨＬシグナルを不活化することは既に知られていた。デルフチア属の場合、ＮＡＨＬの不活化に必要な酵素の性質についてはほとんど知られておらず（Jafra et al., 2006）；ＮＡＨＬ分解株であるＡ２０７及びＡ３１７の２つのｒｒｓ部分配列のみが、S. Jafra, P. Garbeva及びJ.M. Van der WolfによってＧｅｎｂａｎｋに登録されている（ＡＹ５８００８１及びＡＹ５８１６７６）。対照的に、ロドコッカス属のＮＡＨＬ分解株が特に興味深いのは（Uroz et al., 2003；Park et al., 2006）、以下の少なくとも３つの酵素活性によってＮＡＨＬの構造を変化させることができるからである：ＮＡＨＬのＧＢＬ環を開環するラクトナーゼ（Park et al., 2006）；ＨＳ及び脂肪酸を放出するアシラーゼ、及び幾つかのＮＡＨＬに関して３−オキソ置換をヒドロキシルに還元するオキシドレダクターゼ（Uroz et al., 2003；Uroz et al., 2005）。
【００５２】
ＧＣＬ適用のさらに予想外の効果は、土壌及び根圏中のＮＡＨＬ分解細菌の広い多様性（α−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリア、γ−プロテオバクテリア、ファーミキューテス門及びアクチノバクテリア門）で評価した、限られた数のＮＡＨＬ分解種、とりわけロドコッカス・エリスロポリス及びデルフチア・アシドボランスの増殖の刺激である。これら２つの種は、２つの別個の環境、土耕栽培及び水耕栽培において、ＧＣＬの適用後に出現した。したがって、ＧＣＬ適用の効率は、補正された環境におけるこれら２つの種の自然発生に依存し得る。さらに、ロドコッカス及びデルフチアが存在しない自然環境において、これらの属から選択した分離株の接種が実行可能であると考えられる。しかしながら、ロドコッカス・エリスロポリス及びデルフチア・アシドボランスは、土壌及び根圏、例えば、農薬（例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、ハロゲン化化合物及び油汚染物質を導入した土壌では非常に一般的である（Muller et al., 2001；Uroz et al., 2003；Hamamura et al., 2006）。これらの生体異物が、かかる環境中のＮＡＨＬ分解細菌の出現を増加させるか否かは依然として検討の余地がある。
【００５３】
幾つかのロドコッカス株及びデルフチア株の増殖の有意な刺激の他に、ＮＡＨＬ分解根圏細菌中のアグロバクテリウム・ツメファシエンス分離株の割合の減少が観察された（表２）。この特徴から、ＮＡＨＬ分解細菌のレベル及び多様性が共に、ＧＣＬ処理後に変化したことが示唆される。対照的に、ジャガイモの水耕栽培の根圏中の培養可能細菌のうちの約１０％である蛍光性シュードモナス菌では、ＮＡＨＬ分解細菌のレベルが変化しないことが認められた。ＤＧＧＥ分析からはまた、ＧＣＬ処理バッチ中の細菌集合体の構造の有意な変化（図１１）も明らかとなった。ＧＣＬ適用によって増殖が刺激された同定属は、フラボバクテリウム、アシドボラックス、サーモモナスと近縁であった。しかしながら、これらすべてのＤＧＧＥ同定細菌がＧＣＬ及び／又はＮＡＨＬを加水分解する能力は予測することができず、ＧＣＬを資化し、且つＮＡＨＬシグナルを不活化しなかった幾つかの細菌の分離株（図１０）は、ｒｒｓシークエンシング後にアシドボラックス及びフラボバクテリウムと同定した。ＧＣＬを資化するが、ＮＡＨＬに対して不活性な細菌は、ＮＡＨＬ分解細菌の増殖の刺激物質としてのＧＣＬの効果を妨害するため、最も望ましくない細菌に含まれる。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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【００５６】
【表６】
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【配列表フリーテキスト】
【００５７】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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