(57)【要約】  本発明は、少なくとも２つのドメインを含む生物学的に活性なタンパク質に関し、前記少なくとも２つのドメインの第１のドメインは、前記生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列を含み、前記少なくとも２つのドメインの第２のドメインは、好ましくは少なくとも約１００アミノ酸残基からなり、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列を含み、これにより前記ランダムコイルコンフォメーションは、前記生物学的に活性なタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性の増大を媒介する。さらに、本発明の生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子、ならびに前記核酸分子を含むベクターおよび細胞が開示される。さらに、本発明は、本発明の化合物を含む組成物、ならびに本発明の生物学的に活性なタンパク質、核酸分子、ベクターおよび細胞の特定の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのドメインを含む生物学的に活性なタンパク質であって、
（ａ）前記少なくとも２つのドメインの第１のドメインが、前記生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記少なくとも２つのドメインの第２のドメインが、好ましくは少なくとも約１００アミノ酸残基からなり、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列を含み、
これにより前記ランダムコイルコンフォメーションが、前記生物学的に活性なタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性の増大を媒介する、生物学的に活性なタンパク質。
【請求項２】
ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記第２のドメインが、アラニン、セリンおよびプロリン残基からなる、請求項１に記載の生物学的に活性なタンパク質。
【請求項３】
ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記第２のドメインが複数のアミノ酸反復を含み、前記反復がＡｌａ、Ｓｅｒ、およびＰｒｏ残基からなり、６以下の連続するアミノ酸残基が同一である、請求項１または２に記載の生物学的に活性なタンパク質。
【請求項４】
前記プロリン残基が、ランダムコイルコンフォメーションを形成する前記第２のドメインのアミノ酸の４％超および４０％未満を構成する、請求項１から３のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質。
【請求項５】
第２のドメインが、
ASPAAPAPASPAAPAPSAPA（配列番号１８）；AAPASPAPAAPSAPAPAAPS（配列番号２０）；APSSPSPSAPSSPSPASPSS（配列番号２２）、SAPSSPSPSAPSSPSPASPS（配列番号６３）、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA（配列番号２４）、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA（配列番号２６）およびASAAAPAAASAAASAPSAAA（配列番号２８）
からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこれらの配列の全部もしくは一部としてこれらの配列の円順列変異バージョンまたは（１つまたは複数の）多量体を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質。
【請求項６】
前記少なくとも２つのドメインの前記第２のドメインが、ランダムコイルコンフォメーションを形成する約１００から３０００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質。
【請求項７】
生物活性を有する前記ポリペプチドが、結合分子、抗体フラグメント、サイトカイン、成長因子、ホルモンまたは酵素からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質。
【請求項８】
前記結合分子が、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＣＤＲ由来ペプチドミメティック、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、レクチンおよびリポカリンからなる群から選択される、請求項７に記載の生物学的に活性なタンパク質。
【請求項９】
生物活性を有する前記ポリペプチドが、顆粒球コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、エリスロポエチン、凝固第ＶＩＩＩ因子、ｇｐ１２０／ｇｐ１６０、可溶性腫瘍壊死因子ＩおよびＩＩ受容体、レテプラーゼ、エキセンジン−４、アナキンラ、インターロイキン−２および好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンからなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質。
【請求項１０】
前記生物学的に活性なタンパク質の前記インビボ安定性の増大が、前記ランダムコイルを形成する第２のドメインを欠く前記生物学的に活性なタンパク質と比較して延長された前記ランダムコイルを形成する第２のドメインを含む前記生物学的に活性なタンパク質の血漿半減期である、請求項１から９のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質を含む組成物。
【請求項１２】
随意に薬学的に許容可能な担体をさらに含んでいてもよい医薬組成物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸または請求項１４に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の細胞を培養する工程、及び該培養物から前記生物学的に活性なタンパク質を単離する工程を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質の調製方法。
【請求項１７】
ホルモン欠乏関連障害、自己免疫疾患、癌、貧血、血管新生疾患、感染性／炎症性疾患、血栓症、心筋梗塞、糖尿病、および再灌流障害または他の腎臓疾患の治療用の、前記生物学的に活性なタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性が増大した医薬品を調製するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載のベクターまたは請求項１５に記載の細胞の使用。
【請求項１８】
前記生物学的に活性なタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性が増大した医薬品として使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載のベクターまたは請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載のベクターまたは請求項１５に記載の細胞を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つのドメインを含む生物学的に活性なタンパク質に関し、前記少なくとも２つのドメインの第１のドメインは、前記生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列を含み、前記少なくとも２つのドメインの第２のドメインは、好ましくは少なくとも約１００アミノ酸残基からなり、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列を含み、これにより前記ランダムコイルコンフォメーションは、前記生物学的に活性なタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性の増大を媒介する。さらに、本発明の生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子、ならびに前記核酸分子を含むベクターおよび細胞が開示される。さらに、本発明は、本発明の化合物を含む組成物、ならびに本発明の生物学的に活性なタンパク質、核酸分子、ベクターおよび細胞の特定の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒト化抗体を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）などの一般的な血漿タンパク質は、典型的には２〜３週間の長い半減期を示す。これは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）とこれらとの特異的相互作用に寄与し、エンドソームリサイクリングをもたらす（Ｇｈｅｔｉｅ（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，２５．９７〜１１３頁）。一方、薬学的目的のほとんどの他のタンパク質、特に組換え抗体フラグメント、ホルモン、インターフェロン等は、急速な（血中）クリアランスを受ける。これは特に、腎濾過の閾値約７０ｋＤａより小さいサイズのタンパク質に当てはまる（Ｃａｌｉｃｅｔｉ（２００３年）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５５：１２６１〜１２７７頁）。これらのケースでは、非修飾薬学的タンパク質の血漿半減期は１時間よりかなり短い場合があり、故にほとんどの治療適用に対し該タンパク質を本質的に役に立たなくする。薬理作用を持続させ、患者のコンプライアンス（数日または数週間延びる所要投与間隔への）も改善するため、幾つかの戦略が生物薬剤開発の目的で以前に確立された。
【０００３】
第１に、天然血漿タンパク質のリサイクリング機構が、ＩｇのＦＣ部分を有する融合タンパク質、例えばＴＮＦα受容体の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１との間のハイブリッドであるＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（１９９９年）Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ  ２１：７５〜８７頁）、または血清アルブミンを有する融合タンパク質、例えばＨＳＡとＩＦＮαの対応する融合であるＡｌｂｕｆｅｒｏｎ（登録商標）（Ｏｓｂｏｒｎ（２００２年）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０３：５４０〜５４８頁）の生成により使用されている。６００μＭの高い血漿濃度を有するアルブミンも間接的方法で活用されており、例えば連鎖球菌プロテインＧ由来の細菌アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）（Ｍａｋｒｉｄｅｓ（１９９６年）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２７７：５３４〜５４２頁）、またはファージディスプレイライブラリーからＨＳＡに対して選択されたペプチド（Ｄｅｎｎｉｓ（２００２年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７：３５０３５〜３５０４３頁；Ｎｇｕｙｅｎ（２００６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  １９：２９１〜２９７頁）との融合により、アルブミン結合機能を備えた生物薬剤用の担体ビヒクルとして役立つ。
【０００４】
第２に、生物薬剤の血漿半減期を延長するための根本的に異なる方法が、高度に溶媒和され生理的に不活性な化学ポリマーとの結合であり、故に約３〜５ｎｍの糸球体孔サイズを超えて治療タンパク質の流体力学半径を効果的に拡大する（Ｃａｌｉｃｅｔｉ（２００３年）同上）。Ｌｙｓ側鎖（Ｃｌａｒｋ（１９９６年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：２１９６９〜２１９７７年）、または特異的に導入されたＣｙｓ残基（Ｒｏｓｅｎｄａｈｌ（２００５年）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：５２〜６０頁）のどちらか無作為による、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）活性化誘導体との生化学的に穏和な条件下での共有結合は、適度に成功しており、現在、幾つかの承認薬剤に適用されている。相当する利点は特に、特定の薬理活性を有する低分子タンパク質、例えば化学的にペグ化した組換えＩＦＮ−α−２ａ（Ｈａｒｒｉｓ（２００３年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ、２：２１４〜２２１頁；Ｗａｌｓｈ（２００３年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：８６５〜８７０年）であるＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）との併用で得られている。
【０００５】
しかし、合成ポリマーと生物学的に活性なタンパク質の化学結合は、生物薬剤の開発および製造に関して欠点を有する場合がある。適切なＰＥＧ誘導体は、特に高い純度が必要であるほど高価となり、組換えタンパク質との結合は追加のインビトロ処理および精製ステップを要し、収量を低下させ製造コストを増大させる。事実、ＰＥＧは、アルデヒドおよびペルオキシドにより汚染される場合が多く（Ｒａｙ（１９８５年）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １４６：３０７〜３１２頁）、本質的に、酸素存在下での貯蔵時に化学分解する傾向がある。また、治療タンパク質の生化学的活性部位の近くのアミノ酸側鎖がペグ化プロセスにより修飾されるようになれば、該タンパク質の薬学的機能は妨害される。さらに、合成ポリマーとの化学結合は、通常、分子の不均一混合物をもたらし、インビボ活性の実質的な不均一を示す可能性がある。
【０００６】
第３に、新しいＮ−結合グリコシル化コンセンサス配列が導入された生物学的に活性なタンパク質のグリコシル化アナログの使用が、血清半減期を延長するために提案された。ＷＯ  ０２／０２５９７、Ｐｅｒｌｍａｎ（２００３年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８８：２３２７〜２３３５頁、またはＥｌｌｉｏｔｔ（２００３年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：４１４〜４２０頁を参照されたい）。しかし、記載された糖鎖改変タンパク質（glycoenginerredprotein）は、変化したインビボ活性を示した。これは、新たな炭水化物側鎖が、改変タンパク質の生物活性に影響することを示す。さらに、別の炭水化物側鎖が、得られた生物学的活性分子の抗原性を増加させる可能性があり、重大な安全上の懸念をもたらす。
【０００７】
さらに、クルーズトリパノソーマ由来人工反復配列ＰＳＴＡＤを含む融合タンパク質は、トランスシアリダーゼの血漿半減期の延長を誘導することが報告されている（Ａｌｖａｒｅｚ（２００４年）ＰＮＡＳ  ２７９：３３７５〜３３８１頁）。だが、こうしたクルーズトリパノソーマ由来反復は、液性免疫応答を誘導することが報告されている（Ａｌｖａｒｅｚ（２００４年）同上）。したがって、生物学的に活性なタンパク質の作用を延長する代替手段が望まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の根底にある技術的問題は、インビボおよび／またはインビトロ安定性が増大した生物学的に活性なタンパク質の提供である。上記技術的問題の解決は、特許請求の範囲に特徴づけられた実施形態の提供により得られる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、少なくとも２つのドメインを含む生物学的に活性なタンパク質に関し、
（ａ）前記少なくとも２つのドメインの第１のドメインは、前記生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記少なくとも２つのドメインの第２のドメインは、好ましくは少なくとも約１００アミノ酸残基からなり、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明によれば、ランダムコイルコンフォメーションを形成する／とる前記第２のドメインは、前記生物学的に活性なタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性の増大を媒介することができる。したがって、前記第２のドメインは、本明細書で後述されるように、所与の生物活性を有し、かつ／または媒介する所与のタンパク質（またはこのフラグメント）のインビボおよび／またはインビトロ安定性の増大をもたらす。
【００１１】
本明細書で以下および添付の実施例に記載されるように、静脈投与された、ランダムコイルドメイン／部分を含むように修飾された生物学的に活性なタンパク質は、驚くべきことに、非修飾の生物学的に活性なタンパク質（すなわち前記ランダムコイルドメインを欠く）と比べた場合、予期せぬ血漿半減期の延長を示すことが見出された。
【００１２】
本明細書では、用語「ランダムコイル」は、アミノ酸ポリマーを含む高分子の特定のコンフォメーションに関し、前記ポリマー構造を形成する個々のモノマー要素は、基本的に、隣接するモノマー要素方向に対してランダムに配向すると同時に、前記隣接するモノマー要素に化学結合している。特に、「ランダムコイルコンフォメーション」をとる／有する／形成するポリペプチドまたはアミノ酸ポリマーは、明確な２次および３次構造を実質的に欠く。ポリペプチドランダムコイルの性質およびこの実験的同定方法は、当業者に知られており、科学文献に記載されている（Ｃａｎｔｏｒ（１９８０年）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｍｉｔｈ（１９９６年）Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １：Ｒ９５〜Ｒ１０６頁）。
【００１３】
本発明の生物学的に活性なタンパク質は、生理学的条件でランダムコイルコンフォメーションをとる／形成するドメイン（本発明の生物学的に活性なタンパク質の前記「第２のドメイン」として本明細書で上述された）を含む。用語「生理学的条件」は当技術分野で知られており、タンパク質が通常、天然の（native）コンフォメーションをとるような状態に関する。より具体的には、用語「生理学的条件」は、典型的には高次の生物形態、特に哺乳類、最も好ましくはヒトにおいて有効なため、生物物理学的パラメータに関する。用語「生理学的条件」は、通常は哺乳類の体で（特に体液で）および特にヒトにおいて見出されるため、生化学的および生物物理学的パラメータに関する場合がある。前記「生理学的条件」は、健康な体で見出される対応するパラメータ、および病気の哺乳類またはヒト患者で見出されるパラメータに関する場合がある。例えば、病気の哺乳類またはヒト患者は、前記哺乳類または前記ヒトが発熱する場合、より高温だが、「生理学的な」温度条件を有する場合がある。タンパク質が天然のコンフォメーション／状態をとる「生理学的条件」に関して、最も重要なパラメータは、温度（ヒトの体では３７℃）、ｐＨ（ヒト血液では７．３５〜７．４５）、オスモル濃度（２８０〜３００ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ）、および必要であれば、タンパク質含量（６６〜８５ｇ／ｌ血清）である。その一方で、当業者は、生理学的条件でこれらのパラメータは変化する場合があり、例えば温度、ｐＨ、オスモル濃度、およびタンパク質含量は、血液、脳脊髄液、腹水およびリンパ液などの所与の体液または組織液で異なる場合があることを認識している（Ｋｌｉｎｋｅ（２００５年）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ、第５版、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  ＶｅｒＩａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）。脳脊髄液では、例えばオスモル濃度は、約２９０ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏであり得、タンパク質濃度は０．１５ｇ／ｌ〜０．４５ｇ／ｌの間であり得る。リンパ球では、ｐＨは約７．４であり得、タンパク質含量は３ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの間であり得る。
【００１４】
アミノ酸ポリマー配列が、本明細書で後述される方法により実験条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成する／とるかどうかを判定する場合、温度、ｐＨ、オスモル濃度およびタンパク質含量などの生物物理学的パラメータは、通常インビボで見出される生理学的条件とは異なる可能性がある。１℃〜４２℃または好ましくは４℃〜２５℃の間の温度は、インビトロでの生理学的条件下でタンパク質の生物物理学的特性および生物活性をテストし、かつ／または検証するのに有用と考えることができる。
【００１５】
特に実験的設定（例えばタンパク質構造の判定、特に円二色性（ＣＤ）測定、および当業者がタンパク質／アミノ酸ストレッチの構造特性を判定するのを可能にする他の方法における）での幾つかの緩衝液、または医薬組成物のための緩衝液、溶媒および／もしくは賦形剤は、インビトロでの「生理学的溶液」／「生理学的条件」となると考えられる。こうした緩衝液の例は、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．４）、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液または添付の実施例で使用されるもののような類似の緩衝液である。一般に、「生理学的溶液条件」となる緩衝液のｐＨは６．５〜８．５の範囲、好ましくは７．０〜８．０の範囲、最も好ましくは７．２〜７．７の範囲にあるべきであり、オスモル濃度は１００〜１０００ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの範囲、より好ましくは５０〜５００ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの範囲および最も好ましくは２００〜３５０ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏの範囲にあるべきである。場合によっては、生理学的溶液条件となる緩衝液のタンパク質含量は、生物活性自体を備えるタンパク質を無視して、０〜１００ｇ／ｌの範囲にあってよく、これにより典型的な安定化タンパク質（stabilizing protein）、例えばヒトまたはウシ血清アルブミンを使用することができる。
【００１６】
したがって、本発明の生物学的に活性なタンパク質の上記に定義された「第２のドメイン」に含まれるようなランダムコイルコンフォメーションは、液体医薬品のような医薬組成物において維持されることも本発明と関連して想定される。好ましくは、「生理学的条件」は、対応する緩衝液系、溶媒および／または賦形剤で使用されるべきである。ただし、例えば凍結乾燥または乾燥組成物（例えば医薬組成物のような）では、本発明の生物学的に活性なタンパク質の「第２のドメイン」に含まれるようなランダムコイルコンフォメーションは、一過性に現れないおよび／または検出され得ないことが想定される。しかし、前記「第２のドメイン」は、本発明のタンパク質構築物により、対応する緩衝液／溶液／賦形剤／溶媒に再溶解した後にランダムコイルを再びとる／形成するであろう。これは、例えば本発明のタンパク質構築物が凍結乾燥または乾燥されていた（例えば医薬組成物の形態で）場合である。本明細書で定義された「第１の」および「第２の」ドメインを含む、こうした凍結乾燥／乾燥された本発明のタンパク質構築物の再溶解後、ランダムコイル部分／ドメインは再び現れるので、対応する本発明の構築物を、例えば、医学的介入を必要とする哺乳類またはヒト患者に投与することができる。
【００１７】
上述のように、本発明の生物学的に活性なタンパク質は、生理学的条件で／下でランダムコイルコンフォメーションをとる／形成するドメイン（本発明の生物学的に活性なタンパク質の前記「第２のドメイン」として本明細書で上記に定義された）を含む。
【００１８】
本発明の生物学的に活性なタンパク質とは対照的に、変性タンパク質は、機能的コンフォメーションを喪失し、前記変性の結果、部分的にランダムコイルコンフォメーションをとることができるタンパク質である。タンパク質は、非生理学的な温度、ｐＨおよび／もしくは塩濃度への曝露、または尿素／塩化グアニジンのような変性剤および洗浄剤への曝露を含むさまざまな手段により変性することができる。したがって、生理学的条件下でタンパク質を試験する場合、尿素、塩化グアニジンまたはドデシル硫酸ナトリウムなど、タンパク質に対する変性効果を有することが知られている化合物の存在は避けるべきである。尿素は、ヒト血液または尿における生理学的条件下で適用するためタンパク質を調べる場合、それぞれ、１０ｍｍｏｌ／ｌまたはさらには３００ｍｍｏｌ／ｌの濃度まで許容することができる。
【００１９】
変性ポリペプチドとは対照的に、本発明のタンパク質構築物に含まれるようなランダムコイルドメイン（前記「第２のドメイン」）のアミノ酸配列は、特にインビボで、および医学的介入を必要とする哺乳類またはヒト患者に投与される場合、自然にはランダムコイルコンフォメーションをとる／有する。したがって、本発明のタンパク質構築物（上記に定義された「第１の」および「第２のドメイン」を含む）は、本明細書で特定されたアラニン、セリン、およびプロリンストレッチ（または生理学的条件下でランダムコイルを形成する／有する／とる他のアミノ酸ストレッチ）の形態で「第２の」、ランダムコイル形成／採用ドメインを含むことができるが、（例えば、凍結乾燥物または乾燥組成物のような特定の組成物の形態で）一過性にまたは一時的にランダムコイル形態ではない場合があることも想定される。ただし、本発明のタンパク質構築物のこうした「第２のドメイン」は、例えば、対応する緩衝液（好ましくは「生理学的」緩衝液／賦形剤および／または溶媒）に再溶解した後に、本明細書で定義されたランダムコイルを再びとることが重要である。前記「第２のドメイン」は、（対応する再構成後に）本発明の生物学的に活性なタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性の増大を媒介することができる。本発明の生物学的に活性なタンパク質は、本明細書で定義された別の「第２のドメイン」を含まない、同じ「目的のタンパク質」／「第１のドメイン」に比べて、長いインビボおよび／またはインビトロ半減期および安定性を有する。
【００２０】
本明細書では、用語「ドメイン」は、特定の構造および／または機能を自律的にとることができるアミノ酸配列の任意の領域／部分に関する。したがって、本発明と関連して「ドメイン」は、機能ドメインまたは構造ドメインを意味することができる。 本明細書に記載されたように、本発明のタンパク質は、生物活性を有し、かつ／または媒介する、少なくとも１つのドメイン／部分、ならびにランダムコイルコンフォメーションを形成する、少なくとも１つのドメイン／部分を含む。ただし、本発明のタンパク質はまた、２つを超えるドメインからなることができ、例えば本明細書で定義された２つのドメイン／部分間で別のリンカー構造、または例えばプロテアーゼ感受性切断部位、Ｈｉｓ６−タグもしくはＳｔｒｅｐ−タグなどの親和性タグ、シグナルペプチド、保持ペプチド、膜輸送ペプチドのような標的ペプチドのようなもう１つのドメイン／部分、または抗腫瘍毒もしくはプロドラッグ活性化等のための酵素と結合した腫瘍標的用抗体フラグメントのような別のエフェクタードメインを含むことができる。
【００２１】
アミノ酸ポリマーがランダムコイルコンフォメーションを形成する／とるかどうかを判定する方法は、当技術分野で知られている（Ｃａｎｔｏｒ（１９８０年）同上；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９３年）同上；Ｓｍｉｔｈ（１９９６年）同上）。こうした方法には、本明細書で以下に例示されるように円二色性（ＣＤ）分光法が含まれる。ＣＤ分光法は、物質による右および左円偏光の吸光度差が測定される光吸収分光法を意味する。タンパク質の２次構造は、波長が約１９０〜２５０ｎｍの間の遠紫外線スペクトルを用いるＣＤ分光法により判定することができる。これらの波長では、α−ヘリックス、平行および逆平行β−シートならびにランダムコイルコンフォメーションは各々、ＣＤスペクトルの特徴的な形状およびサイズを生じさせるため、ポリペプチドで一般に見出される異なる２次構造を分析することができる。したがって、ＣＤスペクトルを用いて、当業者は、アミノ酸ポリマーが生理学的条件でランダムコイルコンフォメーションを形成する／とるかどうかを容易に判定することができる。他の確立された生物物理学的方法には、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、吸光分析法、赤外およびラマン分光法、サイズ除外クロマトグラフィーによる流体力学的体積測定、分析的超遠心分離法または動的／静的光散乱および摩擦係数または固有粘度の測定が含まれる（Ｃａｎｔｏｒ（１９８０年）同上；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９３年）同上；Ｓｍｉｔｈ（１９９６年）同上）。
【００２２】
別の実施形態では、本発明の生物学的に活性なタンパク質は、分析的ゲル濾過（サイズ除外クロマトグラフィー、ＳＥＣとしても知られる）での測定において、少なくとも７０ｋＤａ、好ましくは少なくとも８０ｋＤａ、より好ましくは少なくとも９０ｋＤａ、さらにより好ましくは少なくとも１００ｋＤａ、特に好ましくは少なくとも１２５ｋＤａおよび最も好ましくは少なくとも１５０ｋＤａの流体力学的体積を有する。当業者は、特定のタンパク質の流体力学的体積を容易に判定することができる。こうした方法には、本明細書で以下に例示されるような動的／静的光散乱、分析的超遠心分離法または分析的ゲル濾過を含めることができる。分析的ゲル濾過は、巨大分子の流体力学的体積を測定するための当技術分野で知られる方法を代表するものである。あるいは、球状ポリペプチドの流体力学的体積は、この分子量により推定することができる。しかし、本明細書で後述されるように、上記に定義された第２のドメイン、すなわち少なくとも１００アミノ酸残基を含み、およびランダムコイルコンフォメーションを有するドメインを含む本発明のタンパク質の流体力学的体積は、分子量に基づく、対応する折り畳まれた球状タンパク質の推定流体力学的体積に比べて、予想外に高い流体力学的体積を有することが示される。
【００２３】
上記の他にも、タンパク質における２次構造を予測する理論的方法が記載されている。こうした理論的方法の一例は、Ｘ線結晶学により解析された既知のタンパク質構造に基づくα−ヘリックス、β−シート、およびターンにおける各アミノ酸の相対的頻度分析に基づく、チョウ−ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）法（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ（１９７４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２〜２４５頁）である。しかし、タンパク質２次構造の理論的予測は信頼できないことが知られている。本明細書で以下に例示されるように、チョウ−ファスマン法によりαヘリックス２次構造をとることが期待されるアミノ酸配列は、ランダムコイルを形成することが見出された。したがって、チョウ−ファスマンアルゴリズムなどの理論的方法は、所与のアミノ酸ポリマーがランダムコイルコンフォメーションをとるかどうかきわめて限定的な予測値しか持たない。
【００２４】
一実施形態では、ランダムコイルコンフォメーションをとる／有する／形成するアミノ酸配列は、少なくとも約１００アミノ酸残基、好ましくは少なくとも約１５０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも約２００アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも約２５０アミノ酸残基、特に好ましくは少なくとも約３００アミノ酸残基、より特に好ましくは少なくとも約３５０アミノ酸残基および最も好ましくは少なくとも約４００アミノ酸残基からなる。別の実施形態では、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列は、最大約１０００アミノ酸残基、好ましくは最大約９００アミノ酸残基、より好ましくは最大約８００アミノ酸残基、さらにより好ましくは最大約７００アミノ酸残基、特に好ましくは最大約６００アミノ酸残基からなる。故に、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列は、最大約５００アミノ酸残基または最大約４５０アミノ酸残基からなることができる。ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列は、最大約１２００、約１５００および最大約３０００アミノ酸残基からなることができることも本明細書では想定される。したがって、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列は、約１００〜約３０００アミノ酸残基からなることができる。特定の実施形態ではランダムコイルコンフォメーションを形成する前記アミノ酸配列は、本明細書で特徴づけられるような、すなわち以下に定義されるようにアラニン、セリンおよびプロリンを主要または固有の残基として含む約１００〜１０００アミノ酸残基からなる。したがって、本発明の主旨は、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成し、そして主としてこれら３つのアミノ酸残基からなり、これによりプロリン残基が好ましくはランダムコイル形成ドメインの約４％〜約４０％を占めるアミノ酸ポリマーの提供である。アラニンおよびセリン残基は、前記ランダムコイル形成ドメインの残りの少なくとも６０％〜９６％を含む。しかし、本明細書で以下に詳述されるように、前記ランダムコイル形成ドメインは、微量成分としてアラニン、セリン、およびプロリンとは異なるアミノ酸もさらに含み得る。
【００２５】
用語「少なくとも約１００／１５０／２００／２５０／３００／３００／３５０（等）アミノ酸残基」は、簡単なアミノ酸残基数に限定されず、さらなる１０％〜２０％の残基を含むまたは１０％〜２０％少ない残基を含むアミノ酸ストレッチも含む。例えば「少なくとも約１００アミノ酸残基」は、本発明の主旨から逸脱することなく８０〜１００および約１００〜１２０アミノ酸残基も含み得る。好ましくは、本発明の生物学的に活性なタンパク質（複数可）／ポリペプチド（複数可）の「第２のドメイン」は、最長約１０００アミノ酸残基を含む。しかし、より長い「第２のドメイン」、すなわち生理学的条件下で所望のランダムコイルコンフォメーションを提供し、最大約３０００アミノ酸残基を含む「第２のドメイン」も本発明と関連して想定される。この場合もやはり、この文脈での用語「約」は、簡単なアミノ酸残基量に限定または制限されず、本発明から逸脱することなく＋／−約１０％または＋／−約２０％を含み得る。
【００２６】
本発明と関連して、アラニンおよびセリン残基から主としてなるまたは、好ましい実施形態では主に又は固有にアラニン、セリン、およびプロリン残基からなるアミノ酸ポリマーは、驚くべきことに、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成することが見出された。したがって、本発明は、生物学的に活性なタンパク質／ポリペプチドの、本明細書で定義された「第２のドメイン」の（１つまたは複数の）部分として使用することができる、アラニン、セリン、およびプロリンからなるモジュール／配列単位／ポリマー反復／ポリマーカセット／構成単位を提供する。ただし、当業者は、アラニン、セリン、およびプロリン以外の残基が前記「第２のドメイン」に微量成分として含まれる場合も、アミノ酸ポリマーはランダムコイルコンフォメーションを形成し得ることを認識している。本明細書では用語「微量成分」は、最大１０％すなわち１００個のアミノ酸の最大１０個がアラニン、セリンおよびプロリンとは異なり得、好ましくは最大８％すなわち１００個のアミノ酸の最大８個がアラニン、セリンおよびプロリンと異なり得、より好ましくは最大６％すなわち１００個のアミノ酸の最大６個がアラニン、セリンおよびプロリンとは異なり得、さらにより好ましくは最大５％すなわち１００個のアミノ酸の最大５個がアラニン、セリンおよびプロリンとは異なり得、特に好ましくは最大４％すなわち１００個のアミノ酸の最大４個がアラニン、セリンおよびプロリンとは異なり得、より特に好ましくは最大３％すなわち１００個のアミノ酸の最大３個がアラニン、セリンおよびプロリンとは異なり得、さらにより特に好ましくは最大２％すなわち１００個のアミノ酸の最大２個がアラニン、セリンおよびプロリンとは異なり得、および最も好ましくは最大１％すなわちランダムコイル形成ドメインをコードするアミノ酸１００個の最大１個がアラニン、セリンおよびプロリンとは異なり得ることを意味する。アラニン、セリンおよびプロリンとは異なる前記アミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選択することができる。
【００２７】
本明細書に開示されるような、および本発明によるアラニン、セリン、およびプロリンからなるアミノ酸ポリマーは、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションをとることが驚くべきことに見出された。したがって、これらは、本発明の生物学的に活性なタンパク質（複数可）／ポリペプチド（複数可）、すなわち生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成し、これにより生物学的に活性な（「機能的な」）タンパク質（複数可）またはポリペプチド（複数可）に対するインビボおよび／またはインビトロ安定性の増大を媒介するポリペプチドストレッチの、本明細書で定義された「第２のドメイン」を提供するのに有利な分子である。前記ランダムコイルドメインに融合される機能的タンパク質の流体力学的体積は、本明細書で言及される、および添付の実施例でも説明される標準的方法を用いて推定することができるように、劇的に増大する。ランダムコイルドメインは、単独で安定な構造または機能をとることはないと考えられることから、これが融合される、目的の機能的タンパク質により媒介される生物活性は基本的に保存される。さらに、本明細書に開示されるようなランダムコイルドメインを形成するアミノ酸ポリマーは、特に血漿におけるタンパク質分解、免疫原性、等電点／帯電挙動、細胞表面受容体との結合および内在化に関して生物学的に不活性であると考えられるが、依然として生分解性であり、ＰＥＧなどの合成ポリマーよりも明らかな利点を提供する。
【００２８】
別の実施形態では、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションをとるアミノ酸ポリマーは、複数の「アミノ酸反復」／「アミノ酸カセット」／「カセット反復」を含む。前記「アミノ酸反復」／「アミノ酸カセット」／「カセット反復」は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＰｒｏ残基（本明細書では「ＰＡＳ」、または「ＡＰＳ」として示される）からなり、６以下の連続するアミノ酸残基は同一であり、前記プロリン残基は、ランダムコイルを形成する前記第２のドメインのアミノ酸の４％超および４０％未満を構成する。生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションをとるアミノ酸ポリマーは、複数の同一アミノ酸反復／カセット反復または複数の非同一アミノ酸反復を含み得る。Ａｌａ、ＳｅｒおよびＰｒｏ残基からなる「アミノ酸反復」、「構成単位」、「モジュール」、「反復」、「アミノ酸カセット」等の非限定例は、本明細書で以下に提供される。配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６および配列番号２８またはこれらの配列のフラグメントもしくは多量体を参照されたい。「フラグメント」は、少なくとも３個のアミノ酸を含み、および少なくとも１個のアラニン、１個のセリンおよび／または１個のプロリンを含む。
【００２９】
本発明によるアミノ酸反復は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のアミノ酸残基からなってよく、各反復は、（１または複数）のＡｌａ、Ｓｅｒ、およびＰｒｏ残基を含む。一実施形態では、本発明によるアミノ酸反復は、１００を超えるアミノ酸残基を含まない。好ましくは、本明細書で定義されたアミノ酸反復／カセット反復は、約４％を超える、好ましくは約５％を超える、さらにより好ましくは約６％を超える、特に好ましくは約８％を超える、より特に好ましくは約１０％を超える、さらにより特に好ましくは約１５％を超える、および最も好ましくは約２０％を超えるプロリン残基を含む。本明細書で定義されたこうしたアミノ酸反復／カセット反復は、好ましくは、約４０％未満または約３５％未満のプロリン残基を含む。本明細書で以下に提供されるＰＡＳ構築物も参照されたい。
【００３０】
さらに別の実施形態では、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸ポリマーは、式（Ｉ）：
Ｓｅｒｘ［Ａｌａｙ  Ｓｅｒｚ］ｎ
を有する。式（Ｉ）による前記アミノ酸ポリマーはさらに、本明細書で定義されたプロリン残基を含み、ｘは整数０〜６から独立に選択される。さらに、ｎごとに、ｙは整数１〜６から独立に選択され、各ｚは整数１〜６から独立に選択される。最後に、ｎは、前記第２のドメインが少なくとも約１００アミノ酸残基、および特に少なくとも約１００〜約３０００アミノ酸残基、好ましくは約２０００までおよびより好ましくは約１０００アミノ酸残基までからなるような任意の整数である。
【００３１】
好ましい実施形態では、ランダムコイルコンフォメーションを形成する上記に定義された「アミノ酸反復」／「アミノ酸カセット」／「カセット反復」を含むアミノ酸ポリマーは、５以下の同一の連続するアミノ酸残基、より好ましくは４以下の同一の連続するアミノ酸残基、および最も好ましくは３以下の同一の連続するアミノ酸残基を含む。
【００３２】
本明細書で上記に既に示されたように、ランダムコイルコンフォメーションを形成する本発明のアミノ酸ポリマーは、プロリン残基を含み、前記プロリン残基は、ランダムコイル形成ドメインを構成するアミノ酸の約４％超、好ましくは約５％超、さらにより好ましくは約６％超、特に好ましくは約８％超、より特に好ましくは約１０％超、さらにより特に好ましくは約１５％超、および最も好ましくは約２０％超を構成する。ランダムコイルコンフォメーションを形成する本発明のこうしたアミノ酸ポリマーは、好ましくは、ランダムコイル形成ドメインを構成するアミノ酸の約４０％未満、または約３５％未満を含む。添付実施例１３に示されるように、Ｐｒｏ残基の割合がより少ないＰＡＳ＃１Ｐ２ポリマーは、ＣＤスペクトルでは２００ｎｍ付近であまりはっきりしない極小を示す。これは、プロリン残基含量に対する、本発明によるアミノ酸ポリマーのランダムコイル特性の依存性を示すものである。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、ランダムコイルコンフォメーションを形成する上記に定義された「アミノ酸反復」／「アミノ酸カセット」／「カセット反復」を含むアミノ酸ポリマーは、ランダムコイル形成ドメインを構成するアミノ酸の、約４％を超えるが約５０％未満、好ましくは約１０％を超えるが約５０％未満、および最も好ましくは約２０％を超えるが約５０％未満のアラニン残基を含む。
【００３４】
さらに好ましい実施形態では、上記に定義された「アミノ酸反復」／「アミノ酸カセット」／「カセット反復」ランダムコイルコンフォメーションを含むことを形成するアミノ酸ポリマーは、ランダムコイル形成ドメインを構成するアミノ酸の、約４％を超えるが約５０％未満、好ましくは約１０％を超えるが約５０％未満、および最も好ましくは約２０％を超えるが約５０％未満のセリン残基を含む。
【００３５】
したがって、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸ポリマーは、ランダムコイル形成ドメインを構成するアミノ酸の、約３５％のプロリン残基、約５０％のアラニン残基、および約１５％のセリン残基を含んでよい。あるいは、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸ポリマーは、ランダムコイル形成ドメインを構成するアミノ酸の、約３５％のプロリン残基、約１５％のアラニン残基、および約５０％のセリン残基を含んでよい。本明細書で上記に使用された用語「約」は、正確な値の所与のパーセンテージにも関する。
【００３６】
AAAASSASSASSSSSAAASA（ｐｉＳＡ；配列番号２）AASAAASSAAASAAAASASS（配列番号４）、ASASASASASASSAASAASA（配列番号６）、SAASSSASSSSAASSASAAA（配列番号８）、SSSSAASAASAAAAASSSAS（配列番号１０）、SSASSSAASSSASSSSASAA（配列番号１２）、SASASASASASAASSASSAS（配列番号１４）およびASSAAASAAAASSAASASSS（配列番号１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸ポリマーが、本明細書でさらに記載される。記載されたアラニン−セリンモジュール／配列単位の多量体は、得られたアミノ酸配列がさらに、本明細書で上記に定義されたプロリン残基を含む場合にランダムコイルコンフォメーションを形成する。これらの例示されたモジュール／配列単位は、以下の配列を含む核酸分子によりコードすることができる。
GCCGCTGCTGCATCCTCTGCAAGCTCCGCTTCTTCCTCTAGCTCCGCAGCTGCATCTGCT（配列番号１）、
GCTGCTTCCGCTGCTGCTTCCTCCGCTGCTGCTTCCGCTGCTGCTGCTTCCGCTTCCTCC（配列番号３）、
GCTTCCGCTTCCGCTTCCGCTTCCGCTTCCGCTTCCTCCGCTGCTTCCGCTGCTTCCGCT（配列番号５）、
TCCGCTGCTTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTGCTTCCTCCGCTTCCGCTGCTGCT（配列番号７）、
TCCTCCTCCTCCGCTGCTTCCGCTGCTTCCGCTGCTGCTGCTGCTTCCTCCTCCGCTTCC（配列番号９）、
TCCTCCGCTTCCTCCTCCGCTGCTTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCGCTGCT（配列番号１１）、
TCCGCTTCCGCTTCCGCTTCCGCTTCCGCTTCCGCTGCTTCCTCCGCTTCCTCCGCTTCC（配列番号１３）および
GCTTCCTCCGCTGCTGCTTCCGCTGCTGCTGCTTCCTCCGCTGCTTCCGCTTCCTCCTCC（配列番号１５）。
【００３７】
好ましい実施形態では、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸ポリマーは、ASPAAPAPASPAAPAPSAPA（ＰＡＳ＃１；配列番号１８）、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS（ＰＡＳ＃２；配列番号２０）、SAPSSPSPSAPSSPSPASPS（修飾ＰＡＳ＃３；修飾された配列番号２２）、APSSPSPSAPSSPSPASPSS（ＰＡＳ＃３、配列番号２２、非修飾）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。あるいは、若干修飾されたものの活性なＰＡＳ＃３は、上記に列挙された配列SAPSSPSPSAPSSPSPASPS（配列番号６３）を有し得る。この配列は、本明細書で提供される配列番号２２の円順列変異形に相当するものであり、配列番号２２の最後のセリンが除去され、もう１つのセリンが開始アミノ酸として付加されている。従って、本発明によるこの修飾配列の多量体は基本的に、最初と最後の残基以外、非修飾配列の多量体として同じ内部反復単位を有する。したがって、この修飾ＰＡＳ＃３（配列番号６３）は、本発明により本明細書で提供されるアミノ酸ポリマーのさらなる「モジュール」／「構成単位」の一例とみなすことができる。本明細書で提供されるアミノ酸ポリマーの他の「モジュール」および（より短い）フラグメントまたは円順列変異バージョンもまた、提供される生物学的に活性なタンパク質の、本明細書で定義された「第２のドメイン」の「モジュール」、「反復」および／または構成単位として使用できることが当業者には明らかである。ただし、さらなるおよび実例となるランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸ポリマーは、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA（ＰＡＳ＃４；配列番号２４）、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA（ＰＡＳ＃５；配列番号２６）およびASAAAPAAASAAASAPSAAA（ＰＡＳ＃１Ｐ２；配列番号２８）からなる群から選択され得るアミノ酸配列を含むことができる。この場合もやはり、同様にまたはこれらの配列および本明細書で上記に提供された配列の（１つまたは複数の）フラグメントもしくは（１つまたは複数の）多量体もしくは円順列変異バージョンは、本発明の生物学的に活性なタンパク質（複数可）／ポリペプチド（複数可）の本明細書で定義された「第２のドメイン」の構成単位として、本発明と関連して使用することができる。当業者は、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成し、本明細書で定義されたアラニン、セリン、およびプロリンから主として構成される、さらなるアミノ酸ポリマーを容易に生成することができる。本発明の生物学的に活性なタンパク質（複数可）／ポリペプチド（複数可）の、本明細書で定義された「第２のドメイン」の構成単位またはモジュールとして使用されるランダムコイルコンフォメーション形成アミノ酸ポリマーの、こうした他の例およびさらなる例は、特に、上記に示された特定の「構成単位」、「ポリマーカセット」または「ポリマー反復」の組合せおよび／またはフラグメントもしくは円順列変異バージョンを含むことができる。したがって、ランダムコイルドメインの例示されたモジュール／配列単位／ポリマー反復／ポリマーカセットは、本発明によるさらなるモジュール／配列単位／ポリマー反復／ポリマーカセットを形成するため新たに結合され得る個々のフラグメントも提供することができる。
【００３８】
用語「モジュール（複数可）」、「配列単位（複数可）」、「ポリマー反復（複数可）」、「ポリマーカセット（複数可）」および「構成単位（複数可）」は、本明細書では同義語として使用され、本発明の生物学的に活性なタンパク質（複数可）／ポリペプチド（複数可）の、本明細書で定義された「第２のドメイン」を形成するのに使用され得る個々のアミノ酸ストレッチに関する。前記第２のドメインは、好ましくは少なくとも約１００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成する。
【００３９】
本発明の生物学的に活性なタンパク質／ポリペプチドのランダムコイルドメインの、上記に例示されたモジュール／配列単位／ポリマー反復／ポリマーカセット／構成単位（すなわち前記生物学的に活性なタンパク質／ポリペプチドの本明細書で定義された「第２のドメイン」）は、以下の配列を含む核酸分子によりコードすることができる。
GCCTCTCCAGCTGCACCTGCTCCAGCAAGCCCTGCTGCACCAGCTCCGTCTGCTCCTGCT（配列番号１７）、
GCTGCTCCGGCTTCCCCGGCTCCGGCTGCTCCGTCCGCTCCGGCTCCGGCTGCTCCGTCC（配列番号１９）、
GCTCCGTCCTCCCCGTCCCCGTCCGCTCCGTCCTCCCCGTCCCCGGCTTCCCCGTCC-TCC（配列番号２１）、
TCCTCCCCGTCCGCTCCGTCCCCGTCCTCCCCGGCTTCCCCGTCCCCGTCCTCCCCGGCT（配列番号２３）、
GCCGCTTCTCCAGCAGCTCCTTCTGCTCCACCAGCAGCTGCAAGCCCTGCTGCACCAAGCGCACCTCCTGCT（配列番号２５）および／または
GCCTCTGCTGCAGCACCTGCAGCAGCAAGCGCAGCTGCATCTGCTCCATCTGCAGCTGCT（配列番号２７）。
【００４０】
上記の修飾ＰＡＳ＃３（修飾配列番号２２）は、以下の核酸配列によりコードすることができる：TCCGCTCCGTCCTCCCCGTCCCCGTCCGCTCCGTCCTCCCCGTCCCCGGCTTCCCCGTCC（修飾された配列番号２１）。
【００４１】
当業者の知識により、ランダムコイルドメイン（またはこのフラグメント、またはこの多量体もしくは円順列変異バージョン）の、本明細書に記載および例示されたモジュール／配列単位／ポリマー反復／ポリマーカセット／構成単位が、遺伝子コード（縮重性質を持つ、すなわち異なるヌクレオチドトリプレットコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る）により異なる核酸配列によりコードされ得ることは、注目すべきであり本発明を制限するものではない。さらに、末端残基は、本発明によるヌクレオチド配列カセットの設計、およびこの多量体を得るために適用されるライゲーション戦略により異なる可能性がある。例えば、配列番号１８および３０で示されるような「モジュール」ＰＡＳ＃１は、それぞれ、核酸配列の配列番号１７および２９によりコードすることができる。配列番号１８とは対照的に、配列番号３０は、Ｃ末端で別のアラニンを含む。該アラニンのコドンは、添付実施例の幾つかで記載されるように、個々のヌクレオチド配列カセットが粘着末端を介してライゲートされる場合、欠失され得る。
【００４２】
上記により、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸ポリマーは、本明細書で上記に開示されている配列番号１８、２０、２２、２４、２６または２８を有するアミノ酸配列のいずれか１つからなる多量体を含むこともでき、またはアミノ酸配列の配列番号１８、２０、２２、２４、２６および２８のうち複数からなる多量体を含むこともできる。さらに、また、これらの例示された配列のフラグメントまたは円順列変異バージョンも本発明の生物学的に活性なタンパク質（複数可）／ポリペプチド（複数可）のランダムコイルドメイン（「第２のドメイン」）のさらなるモジュール／配列単位／ポリマー反復／ポリマーカセット／構成単位を構築するのに使用されることが想定される。
【００４３】
別の実施形態では、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸ポリマーは、ASPAAPAPASPAAPAPSAPA（配列番号１８）、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS（配列番号２０）、APSSPSPSAPSSPSPASPSS（配列番号２２、または修飾配列としてS-APSSPSPSAPSSPSPASPS（配列番号６３）、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA（配列番号２４）、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA（配列番号２６）およびASAAAPAAASAAASAPSAAA（配列番号２８）またはこれらの（円）順列変異配列の（１つまたは複数の）多量体からなる群から選択されるアミノ酸配列の（円）順列変異からなる多量体を含むことができる。
【００４４】
さらに別の実施形態では、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸ポリマーは、ASPAAPAPASPAAPAPSAPA（配列番号１８）、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS（配列番号２０）、APSSPSPSAPSSPSPASPSS（配列番号２２、または修飾配列としてS-APSSPSPSAPSSPSPASPS（（配列番号６３））、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA（配列番号２４）、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA（配列番号２６）およびASAAAPAAASAAASAPSAAA（配列番号２８）またはこれらの例示されたモジュール／配列単位／ポリマー反復／ポリマーカセット／構成単位の（１つまたは複数の）多量体からなる群から選択されるアミノ酸配列のフラグメント／部分からなる多量体を含むことができる。本発明の生物学的に活性なタンパク質／ポリペプチドの「第２のドメイン」を生成するため本発明により使用されるこれらの配列の「フラグメント」は、前記配列番号１８、２０、２２、２４、２６および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、さらにより好ましくは少なくとも８個、特に好ましくは少なくとも１０個、より特に好ましくは少なくとも１２個、さらにより特に好ましくは少なくとも１４個、さらにより特に好ましくは少なくとも１６個、および最も好ましくは少なくとも１８個の連続するアミノ酸からなることができる。
【００４５】
本明細書で上記に言及されたような、ランダムコイルドメインの本明細書で提供されるモジュール／配列単位／構成単位等は、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションを形成する本発明のアミノ酸ポリマーの例に過ぎない。本発明の主旨により、これらの「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」は、アラニン、セリンおよびプロリンの上記に特定された含量／画分を含む。したがって、本発明によりさらなるこうした「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」を生成することは、当業者の通常の技術内である。例えば、本明細書で特定された本発明の「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」の個々のフラグメントは、アラニン、セリンおよびプロリンの全体的分布および量に関する上記に特定された原則が尊重される限り、さらなる個々の「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」に結合することができる。この場合もやはり、これらの「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」は、さらなるアミノ酸残基も含むことができるが、最小または微量成分（個々の「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」の最大１０％、好ましくは最大２％）としてのみである。前記個々の「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」は、本発明によれば、少なくとも約１００アミノ酸残基からなる。個々の「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」は、より長いランダムコイル形成アミノ酸ポリマーを形成するために結合することができる。これにより生物学的に活性なタンパク質の本明細書で定義された「第２のドメイン」の最長は、約３０００アミノ酸である。本発明と関連して、少なくとも２つのドメインを含む生物学的に活性なタンパク質が好ましい。前記少なくとも２つのドメインの、本明細書で上記に定義された第１のドメインは、前記生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列を含み、前記少なくとも２つのドメインの、本明細書で上記に定義された第２のドメインは、少なくとも約１００アミノ酸残基から好ましくはなるアミノ酸配列、および生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションを含む。本明細書で提供され、アラニン、セリン、およびプロリンから主としてなる前記ランダムコイルコンフォメーションは、前記生物学的に活性なタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性の増大を媒介する。前記第２のドメインは、本明細書で提供されるような個々の「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」からなることができる、またはこれらの個々の、実例となる「モジュール」、「配列単位」および／または「反復」のフラグメントまたは部分を含むことができる。しかし、前記第２のドメインは、本明細書で上記に提供された教示を尊重し従い、本明細書の以下および添付の実施例で例示される、さらなるおよびまたは他の個々の「モジュール」、「配列単位」、「構成単位」および／または「反復」から構築することができる。例えば、添付実験部分は、本明細書で定義された、生理学的条件下でランダムコイル確認を提供する別の「第２のドメイン」を含むタンパク質（例えば約２００または約４００または約６００アミノ酸残基からなり、「構成単位」としてＰＡＳ＃１／配列番号１８、ＰＡＳ＃２／配列番号２０、ＰＡＳ＃３／配列番号２２、ＰＡＳ＃５／配列番号２６および／またはＰＡＳ＃１Ｐ２／配列番号２８を含むポリマー）が、非修飾の生物学的に活性なタンパク質に比べてインビボにおいてさえ、優れた血清安定性または血漿半減期を有するという十分な証拠を示す。本発明の非限定例として、非修飾ＩＦＮａ２ｂのインビボ安定性が、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションをとる、本明細書で定義された別の「第２のドメイン」を含んだ修飾ＩＦＮａ２ｂのインビボ安定性と比較された。
【００４６】
ほとんどのアミノ酸、特に疎水性アミノ酸のホモ−ポリマーは、通常、水溶液に不溶である（Ｂａｍｆｏｒｄ（１９５６年）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ−Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。幾つかの親水性アミノ酸のホモ−ポリマーは、２次構造、例えばＡｌａの場合はα−ヘリックス（Ｓｈｅｎｔａｌ−Ｂｅｃｈｏｒ（２００５年）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ８８：２３９１〜２４０２頁）およびＳｅｒの場合はβ−シート（Ｑｕａｄｒｉｆｏｇｌｉｏ（１９６８年）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ９０：２７６０〜２７６５頁）を形成するのに対し、最も固いホモオリゴペプチドであるポリ−プロリン（Ｓｃｈｉｍｍｅｌ（１９６７年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ５８：５２〜５９頁）は、水溶液でタイプＩＩトランスヘリックスを形成する（Ｃｏｗａｎ（１９５５年）Ｎａｔｕｒｅ  １７６：５０１〜５０３頁）ことが知られている。
【００４７】
ポリマー生物物理学の理論的原則により、２００アミノ酸残基の鎖のランダムコイルの直径は、ポリ−グリシンの場合、例えば、約７５Åに達するであろう。この値は、下記の数式を用い、各Ｃα−Ｃαについて、長さｌ（＝距離３．８Å）の回転可能結合数ｎ＝２００およびポリ（Ｇｌｙ）の「特性比」Ｃ∞≒２．０（Ｂｒａｎｔ（１９６７年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：４７〜６５；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、（１９９３年）同上）として、二乗平均平方根末端間距離の平均値
【００４８】
【数１】
2010531139.tif 000002
として計算できる。
この関係は、当業者であれば、ランダム鎖アミノ酸ポリマーの流体力学的体積が、（ａ）より長い鎖長ｌを用いる、または（ｂ）より大きな特性比、Ｃ∞を示すアミノ酸を用いる、のどちらかにより拡大できると期待することを示している。Ｃ∞は、分子ランダム鎖の固有の剛性に関する尺度であり、ほとんどのアミノ酸に対し一般値９を有する（Ｂｒａｎｔ（１９６７年）同上）。側鎖を欠くＧｌｙのみが、およびイミノ酸Ｐｒｏも著しく小さな値を示す。故に、ＧｌｙおよびＰｒｏ（変性条件下の）は、ランダムコイルタンパク質の次元の減少に寄与することが期待される（Ｍｉｌｌｅｒ（１９６８年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７：３９２５〜３９３５頁）。したがって、プロリン残基を含むアミノ酸ポリマーは、比較的コンパクトな流体力学的体積を有することが期待される。しかし、この教示とは対照的に、アラニン、セリン、およびプロリン残基の混合物を含む本発明のアミノ酸ポリマーの流体力学的体積は、期待される流体力学的体積と比較した場合、分析的ゲル浸透クロマトグラフィーで判定した流体力学的体積が劇的に増加することが、本明細書で示される。事実、これら３つのアミノ酸の混合物（各々が単独で、定義された２次構造を有するホモオリゴペプチドを形成する傾向がある）を含むポリペプチドが、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションをとることは驚くべきことである。こうした本発明のポリペプチドは、同じ数のＧｌｙ残基を含むホモ−ポリマーよりも大きな流体力学的半径を有し、該ポリペプチドは、本発明による生物学的に活性なタンパク質に対しより優れた可溶性を与える。
【００４９】
ＷＯ２００６／０８１２４９は、主要成分にＧｌｙ、Ａｓｎ、およびＧｌｎを、微量成分にＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、およびＡｓｎを有する２〜５００単位のアミノ酸反復を含むポリペプチドに結合する生物学的に活性なタンパク質を含む、タンパク質結合体を記載する。前記タンパク質結合体は、結合しない生物学的に活性なタンパク質と比較した場合、血漿半減期が増大または減少することが記載されている。しかし、ＷＯ２００６／０８１２４９は、特定のアミノ酸反復が、結合体の血漿半減期を減少または増大させるかどうかを予測するためのいずれの教示も提供していない。さらに、ＷＯ２００６／０８１２４９は、結合したタンパク質が、本発明に示されるようなランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸反復を含む場合、タンパク質の血漿半減期は増大し得ることを教示または示唆していない。さらに、ＷＯ２００６／０８１２４９に開示されたアミノ酸反復は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＧｌｎから選択される少なくとも２つの残基を含む。これは、選択的にＡｌａ、Ｓｅｒ、およびＰｒｏ残基からなる本発明のポリペプチド反復とは明らかに対照的である。
【００５０】
本明細書では、用語「生物活性」は、生物に対する物質の生物学的効果を記載する。したがって、本明細書では用語「生物学的に活性なタンパク質」または「生物活性を有し、かつ／または媒介するポリペプチド」は、前記タンパク質またはポリペプチドに曝露される生細胞／生物に生物学的効果を誘導することができるタンパク質またはポリペプチドに関する。ただし、本発明と関連して、用語「生物学的に活性なタンパク質」は、前記生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列、ならびにランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列の両方を含む本発明のタンパク質全体に関することに注目すべきである。
【００５１】
したがって、本明細書では用語「生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」または「生物活性を備えるアミノ酸配列」は、上記に定義された「生物活性」を媒介するまたは有する、または媒介するもしくは有することができる、本発明の生物学的に活性なタンパク質の上記に定義された「第１のドメイン」に関する。用語「生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」または「生物活性を備えるアミノ酸配列」はまた、本発明の、および前記生物学的に活性なタンパク質の「第１のドメイン」に関する「生物学的に活性なポリペプチド」または「生物学的に活性なポリペプチドストレッチ」にも関する。また、（半減期を、インビボまたはインビトロのいずれかで、延長する必要がある）任意の目的のタンパク質の機能的フラグメントも、用語「生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」または「生物活性を備えるアミノ酸配列」に含まれる。本発明の一実施形態では、本発明により生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列は、任意の「目的のタンパク質」、すなわち薬学的もしくは生物学的な目的の任意のタンパク質または治療／診断薬として有用な任意のタンパク質から推定することができる。したがって、本発明による生物学的に活性なタンパク質は、自然に生成されたポリペプチドまたは組換えＤＮＡ技術により生成されたポリペプチドから得られる生物学的に活性なアミノ酸配列を含むことができる。好ましい実施形態では、目的のタンパク質は、結合タンパク質、免疫グロブリン、抗体フラグメント、輸送タンパク質、（サイトカイン、成長因子、ホルモンまたは酵素などの）シグナル伝達タンパク質／ペプチドからなる群から選択することができる。
【００５２】
本明細書では、用語「結合タンパク質」は、潜在的結合パートナー（複数可）と潜在的結合パートナー（複数可）である複数の別の分子とを区別できるように（潜在的結合パートナー（複数可）である前記複数の別の分子プールから、前記潜在的結合パートナー（複数可）のみが結合される、または著しく結合される程度に）、前記（１つまたは複数の）潜在的結合パートナーと特異的に相互作用することができる分子に関する。潜在的結合パートナーとの結合タンパク質の結合の測定方法は、当技術分野で知られており、例えばＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定、平衡透析、プルダウンアッセイまたはビアコア装置を用いて日常的に行うことができる。本発明と関連して有用な例示的な結合タンパク質には、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などの抗体フラグメント、抗体の単離した可変領域（ＶＬ−および／またはＶＨ−領域）、ＣＤＲ、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ由来ペプチドミメティック、レクチン、リポカリン、または例えば、Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １３：１６７〜１８７頁またはＢｉｎｚ（２００５年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１２５７〜１２６８頁に記載されたさまざまなタイプのスカフォールド由来結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
他の例示的な、本発明と関連して有用な目的の生物学的に活性なタンパク質には、顆粒球コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、エリスロポエチン、凝固第ＶＩＩＩ因子などの凝固因子、ｇｐ１２０／ｇｐ１６０、可溶性腫瘍壊死因子ＩおよびＩＩ受容体、レテプラーゼなどの血栓溶解剤、エキセンジン−４、アナキンラなどのインターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−２および好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンまたはＷａｌｓｈ（２００３年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：８６５〜８７０頁またはＷａｌｓｈ（２００４年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ５８：１８５〜１９６頁に列挙されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書で上記に言及された好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ；ヒト好中球リポカリン、２４ｐ３、ウテロカリン（uterocalin）、シデロカリン（siderocalin）、またはノイ関連リポカリン（neu-related lipocalin）とも呼ばれる）は、好中球顆粒成分として最初に同定された、結合タンパク質のリポカリンファミリーのメンバーである。ＮＧＡＬは、カテコレート−型シデロホア  ＦｅＩＩＩ−エンテロケリン／エンテロバクチン（Ｇｏｅｔｚ（２００２年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：１０３３〜１０４３頁）、およびツベルクロシス・カルボキシマイコバクチン（M. tuberculosis carboxymycobactin）（Ｈｐｌｍｅｓ（２００５年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １３：２９〜４１頁）を含む、マイコバクテリアの幾つかの他のシデロホアと堅固に結合することが示された。これらのシデロホアは、ヒト体液で生じ、特殊化した細菌輸入（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｐｏｒｔ）系による鉄取り込みを可能にすることから、限界鉄濃度に反応して病原菌により分泌されるきわめて強力な鉄キレート剤である。故に、好中球は、生来の免疫系の抗菌戦略として感染部位でＮＧＡＬ（最近では「シデロカリン」とも呼ばれる）を放出するように思われる。ＮＧＡＬの生理的関連性が、対応するノックアウトマウスで調べられており、エンテロケリンを産生する細菌の成長を制限することが示された（Ｆｌｏ（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：９１７〜９２１頁）。この結果、ＮＧＡＬは、細菌の鉄取り込みを防いで作用する新種の抗菌剤として適用される可能性がある。これとは別に、ＮＧＡＬは、腎臓による鉄回収のための生理学的経路に関与することが記載された（Ｙａｎｇ（２００２年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：１０４５〜１０５６頁）。この機構は、重度の腎不全のマウスモデルにおける腎臓の虚血再灌流損傷を防ぐことが最近実証され（Ｍｏｒｉ（２００５年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１５：６１０〜６２１頁）、治療適用の別の領域を開くことができるであろう。
【００５５】
さらに別の実施形態では、本発明は、前記生物活性を有し、かつ／または媒介するポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む前記第１のドメイン、ならびにランダムコイルコンフォメーションを形成する前記第２のドメインが、ポリペプチドリンカーにより結合される、本発明の生物学的に活性なタンパク質に関する。前記第１のドメインと前記第２のドメインの間に挿入されるこのポリペプチドリンカーは、好ましくは、これらのドメインに共有結合される複数の、親水性の、ペプチド結合アミノ酸を含む。さらに別の実施形態では前記ポリペプチドリンカーは、生物活性を有し、かつ／または媒介するポリペプチドを含む前記第１のドメインの制御放出を可能にする、血漿プロテアーゼ切断部位を含む。異なるタイプまたは長さのリンカーは、特定のポリペプチドの完全な機能活性を得るための過重な負担をすることなく同定することができる。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明の生物学的に活性なタンパク質は、融合タンパク質である。本明細書に記載された融合タンパク質は、生物活性を媒介する少なくとも１つのドメイン、および単一のマルチドメインポリペプチドにおいてランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも１つの他のドメインを含むことが意図される。別の実施形態では、本発明による生物学的に活性なタンパク質は、目的のタンパク質、または生物活性を有し、かつ／もしくは媒介するポリペプチド／ポリペプチドストレッチ／アミノ酸配列が、ランダムコイルコンフォメーションを形成するアミノ酸配列に非ペプチド結合を介して結合される、タンパク質結合体であってよい。架橋タンパク質に有用な非ペプチド結合は、当技術分野で知られており、ジスルフィド結合（例えばＣｙｓ側鎖間の）、チオエーテル結合、またはスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）もしくはスルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］酪酸（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）などの化学架橋剤に誘導された非ペプチド共有結合、および非共有タンパク質−タンパク質相互作用を含めることができる。
【００５７】
本発明の「生物学的に活性なタンパク質」は、複数の「生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」も含むことができること、すなわち生物学的に活性なタンパク質の本明細書で定義された「第１のドメイン」は、本発明と関連して単一の目的の生物活性に限定されないことに注目すべきである。さらに、当業者は、本発明の生物学的に活性なタンパク質に含まれるような「生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」および「ランダムコイルドメイン／部分」を、特定の順序で構築できることを認識している。１つのランダムコイルドメイン／部分（すなわち少なくとも約１００アミノ酸残基からなり、ランダムコイルを形成するアミノ酸配列）ならびに異なる生物活性を有し、かつ／または媒介する２つのアミノ酸配列を含む本発明の「生物学的に活性なタンパク質」の非限定例、ドメインの順序は、「第１の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」−「ランダムコイルドメイン／部分」−「第２の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」となり得る。
【００５８】
したがって、および本発明と関連して、本発明の生物学的に活性なポリペプチドの、本明細書で定義された「第１の」および「第２の」ドメインの順序は、前記「第１のドメイン」（すなわち目的のタンパク質、「生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」）がアミノ（Ｎ−）末端に位置し、前記「第２のドメイン」（すなわちランダムコイルコンフォメーションを形成する／とる少なくとも約１００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むドメイン）が本発明のポリペプチドのカルボキシ（Ｃ−）末端に位置する順序に並べることができる。しかし、この順序は逆にすることもでき、例えば前記「第１のドメイン」（すなわち目的のタンパク質、「生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」）はカルボキシ（Ｃ−）末端に位置し、前記「第２のドメイン」（すなわちランダムコイルコンフォメーションを形成する／とる少なくとも約１００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むドメイン）は本発明のポリペプチドのアミノ（Ｎ−）末端に／で位置する。
【００５９】
ただし、上記で指摘されたように、生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列を含む、またはからなる、複数のドメインが、本発明のポリペプチド構築物と関連して使用されることも想定される。したがって、前記「第２のドメイン」（すなわちランダムコイルコンフォメーションを形成する／とる少なくとも約１００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むドメイン）は、目的のまたは所望の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸ストレッチである、前記「第１のドメイン」間に位置することができる。したがって、「ランダムコイルストレッチ」は、所望の生物活性を有し、かつ／または媒介する２つのドメイン間に位置することができる。本発明のポリペプチド／生物学的に活性なタンパク質の全ての実施形態と同様に、前記生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列を含む前記ドメイン（複数可）はまた、所望の生物学的機能を有する所与のタンパク質の生物学的に活性なフラグメントであってもよい。したがって、本明細書で定義された「第２のドメイン」（ランダムコイルを形成する少なくとも約１００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列）は、目的のタンパク質の２つの生物学的に活性なフラグメント間、または目的の２つのタンパク質の生物学的に活性なフラグメント間に位置することができる。ただし、「生物活性を有し、かつ／または媒介する」複数のドメインが、本発明の生物学的に活性なタンパク質に含まれる場合も、本明細書で定義された「第２のドメイン」、すなわちランダムコイルコンフォメーションを形成する少なくとも約１００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、本発明の生物学的に活性なタンパク質のＮ−またはＣ末端に位置することができる。Ｎ末端から開始する、対応する非限定例は次の通りである：
「第１の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」−「ランダムコイルドメイン／部分」−「第２の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」
または
「第１の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」−「第２の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」−「ランダムコイルドメイン／部分」
または
「ランダムコイルドメイン／部分」−「第１の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」−「第２の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」
【００６０】
対応する順序（複数可）は、表現が本発明の生物学的に活性なタンパク質／ポリペプチドのＣ末端から開始する場合にも想定される。上記の表現において本明細書では用語「ランダムコイルドメイン／部分」は、本明細書で定義された「第２のドメイン」、すなわち生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションをとる／有する少なくとも約１００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対応する。この場合もやはり、用語「第１の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸配列」は、前記生物活性または機能を有し、かつ／または媒介する完全長ポリペプチドに限定されず、この生物学的および／または薬学的に活性なフラグメントも指すことが指摘されなければならない。特に（しかしこれのみではないが）、本明細書で定義された２つ以上の「第１のドメイン」が、本発明の「生物学的に活性なタンパク質」に含まれる状況では、これらの「第１のドメイン」が、タンパク質複合体またはタンパク質複合体のこうした部分のフラグメントの異なる部分である／を表すことも想定される。
【００６１】
さらに、ランダムコイルコンフォメーションを形成する／とる少なくとも約１００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、複数のドメインは、本発明のポリペプチド構築物と関連して使用されることも想定される。したがって、目的のまたは所望の生物活性を有し、かつ／または媒介するアミノ酸ストレッチである、前記「第１のドメイン」は、２つの「第２のドメイン」（すなわちランダムコイルコンフォメーションを形成する／とる少なくとも約１００アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むドメイン）の間に位置することができる。したがって「ランダムコイルストレッチ」は、所望の生物活性を有し、かつ／または媒介するドメインのＮ末端およびＣ末端の両方に位置することができる。
【００６２】
本明細書で以下に例示されるように、ランダムコイルドメインを含むように修飾された本発明の生物学的に活性なタンパク質は、前記ランダムコイルドメインを欠く非修飾の生物学的に活性なタンパク質と比較した場合、驚くべきことにインビボおよび／またはインビトロ安定性の増大を示す。本明細書では、用語「インビボ安定性」は、生体に投与される特定の物質の、生物学的に利用可能であり生物学的に活性なままである能力に関する。インビボでは、物質は分泌、凝集、分解および／または代謝過程により除去および／または不活化され得る。したがって、本発明と関連して、インビボ安定性が増大した生物学的に活性なタンパク質は、腎臓（尿）を通じてもしくは糞便を介して十分には分泌され得ず、かつ／またはタンパク質分解に対して、特に血液、脳脊髄液、腹水およびリンパ液のような体液におけるインビボタンパク質分解に対して、より安定であり得る。一実施形態では、生物学的に活性なタンパク質のインビボ安定性の増大は、前記生物学的に活性なタンパク質の延長された血漿半減期として現れる。
【００６３】
生物学的に活性なタンパク質のインビボ安定性の測定方法は、当技術分野で知られている。本明細書で以下に例示されるように、生物学的に活性なタンパク質は、ウェスタンブロッティング法または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて血漿で特異的に検出することができる。ただし、当業者は、他の方法を目的のタンパク質の血漿半減期を特異的に測定するのに使用することができることを認識している。こうした方法には、放射活性標識された目的のタンパク質の物理的検出が含まれるが、これに限定されない。タンパク質の放射活性標識方法（例えば放射性ヨウ素化による）は、当技術分野で知られている。
【００６４】
本明細書では用語「インビトロ安定性の増大」は、生物学的に活性なタンパク質の、インビトロ環境での分解および／または凝集に抵抗する能力ならびに本来の生物活性を維持する能力に関する。生物学的に活性なタンパク質の生物活性の測定方法は当技術分野でよく知られている。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載された生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子に関する。したがって、前記核酸分子は、生物活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、およびランダムコイルコンフォメーションを形成する／とるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。さらに別の実施形態では前記核酸分子は、ランダムコイルコンフォメーションを形成する／とる、本明細書で開示されたアミノ酸配列の１つをコードする核酸配列を含むことができる。用語「核酸分子」は、本明細書では、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子などの核酸分子を含むことが意図される。前記核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。好ましくは、前記核酸分子は、ベクターに含まれてよい。
【００６６】
さらに、本明細書に記載された核酸分子またはベクターにより細胞をトランスフェクトすることが想定される。さらなる実施形態では、本発明は、発現時に本発明の生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子に関する。ただし、さらなる実施形態では、本発明は、生理学的条件下でランダムコイルコンフォメーションを全体または一部において形成する／とる本明細書で開示されたポリペプチドを、発現時にコードする核酸分子に関する。前記核酸分子は、ポリペプチドの適正な転写および翻訳を確保することが当技術分野で知られる適切な発現制御配列、ならびに細胞分泌またはオルガネラ標的を確保するシグナル配列に融合することができる。こうしたベクターは、適切な宿主細胞および適切な条件下での前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子など、さらなる遺伝子を含むことができる。
【００６７】
好ましくは、本発明の核酸分子は、本明細書に記載された生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子が、原核細胞または真核細胞での発現を可能にする発現制御配列に操作可能に結合した、組換えベクターに含まれる。前記核酸分子の発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核宿主細胞での発現を可能にする調節要素は、例えば、大腸菌のラムダＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｅｔまたはＴ７プロモーターを含む。真核細胞、好ましくは哺乳類細胞または酵母での発現を確保する可能性のある調節要素は、当業者によく知られている。これらは通常、転写開始を確保する調節配列、ならびに場合によっては、転写終了および転写物の安定化を確保するポリ−Ａシグナルを含む。別の調節要素には、転写および翻訳エンハンサー、ならびに／または天然に関連するもしくは異種のプロモーター領域を含めることができる。真核宿主細胞での発現を可能にする調節要素の例は、酵母のＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、またはＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、または哺乳類および他の動物細胞のグロビンイントロンである。転写開始に関与する要素とは別に、こうした調節要素は、コーディング領域の下流の、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位などの転写終了シグナルを含むこともできる。
【００６８】
当業者によく知られている方法を、組換えベクターを構築するのに使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ（１９８９年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙに記載された手法を参照されたい）。この文脈では、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＰＩＣＺａｌｐｈａ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）などの適切な発現ベクターが当技術分野で知られている。さらに、使用される発現系により、細胞内コンパートメントにポリペプチドを導くこと、またはこれを培養培地に分泌することができるリーダー配列を、本発明の核酸分子のコード配列に付加することができる。
【００６９】
本発明はまた、本発明の生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子を含む遺伝子組換え技術に従来使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージにも関する。したがって、本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターにも関する。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子導入もしくは標的ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを標的細胞集団に送達するのに使用することができる。本発明の核酸分子を含有するベクターは、細胞宿主のタイプにより異なるよく知られた方法により宿主細胞に移動することができる。したがって、本発明はさらに、前記核酸分子または前記ベクターを含む細胞に関する。例えば、こうした方法には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）、同上およびＡｕｓｕｂｅｌ（１９８９年）、同上に記載された手法が含まれる。したがって、塩化カルシウムトランスフェクションが、一般に原核細胞に利用されるのに対し、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは他の細胞宿主に使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）、同上を参照されたい）。さらなる代替として、本発明の核酸分子およびベクターは、標的細胞への送達のためリポソームに再構成することができる。宿主細胞にある本発明の核酸分子またはベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込むことができるか、または染色体外で維持することができる。したがって、本発明はまた、本発明の核酸分子および／またはベクターを含む宿主細胞にも関する。ポリペプチドを発現するための宿主細胞は、当技術分野でよく知られており、原核細胞のほか、例えば大腸菌細胞、酵母細胞、無脊椎動物細胞、ＣＨＯ−細胞、ＣＨＯ−Ｋ１−細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ−１サル細胞、ボーズ（Bowes）細胞などのメラノーマ細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイス由来３Ｔ３系、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞系などの真核細胞を含む。
【００７０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の（宿主）細胞を培養することと、本明細書に記載された培養物から前記生物学的に活性なタンパク質を単離することを含む、本発明の生物学的に活性なタンパク質の調製方法を含む。ランダムコイルドメインを含む本発明の生物学的に活性なタンパク質は、例えば本発明の生物学的に活性なタンパク質をコードする記載された核酸分子またはベクターを含む細胞の培養、および培養物からの前記生物学的に活性なタンパク質の単離による組換えＤＮＡ技術により生成することができる。本発明の生物学的に活性なタンパク質は、原核細胞、例えば大腸菌ＢＬ２１もしくは３Ｍ８３、または真核細胞、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）酵母株Ｘ−３３もしくはＣＨＯ細胞を含む任意の適切な細胞培養系で生成することができる。当技術分野で知られているさらなる適切な細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）のような細胞系寄託機関から得ることができる。用語「原核の」が細菌細胞を含むことを意味するのに対し、用語「真核の」は酵母、高等植物、昆虫および哺乳類の細胞を含むことを意味する。形質転換された宿主は、発酵槽で増殖および当技術分野で知られている手法により培養して最適な細胞増殖を実現することができる。さらなる実施形態では、本発明は、生物学的に活性なタンパク質の発現に適切な条件下で本発明の細胞を培養すること、および培養物または培養培地から生物学的に活性なタンパク質を単離することを含む、上記の生物学的に活性なタンパク質の調製工程に関する。
【００７１】
本発明の生物学的に活性なタンパク質は、増殖培地、細胞溶解物または細胞膜画分から単離することができる。本発明の発現ポリペプチドの単離および精製は、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、任意の従来手段（Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２年）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．）により行うことができ、モノクローナルまたはポリクローナル抗体（例えば、本発明の生物学的に活性なタンパク質と融合したタグに対する）の使用を含むことができる。例えば、該タンパク質は、添付の実施例に記載されるように、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーを用いたＳｔｒｅｐ−タグＩＩ（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２６：２７１〜３０４頁）により精製することができる。薬学的用途では、実質的には少なくとも約９０〜９５％の均一性の純粋なポリペプチドが好ましく、９８〜９９％以上の均一性が最も好ましい。生成手順に使用される宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得、または非グリコシル化され得る。
【００７２】
本発明はさらに、前記生物学的に活性なタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性が増大した医薬品の調製のための、本発明の生物学的に活性なタンパク質、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の（宿主）細胞の使用に関する。
【００７３】
さらに別の実施形態では、本発明は、前記生物学的に活性なタンパク質の改善した安定性から恩恵を受ける疾患および／または障害の治療方法（本明細書に記載された生物学的に活性なタンパク質をこうした治療を必要とする哺乳類に投与することを含む）に関する。本発明のタンパク質の生物活性に応じて、当業者は、どの疾患／障害が本発明の特定の生物学的に活性なタンパク質により治療されるかを容易に判定することができる。幾つかの非限定的な例が以下の表に挙げられている。
【００７４】
【表１】
2010531139.tif 000003
【００７５】
本発明はまた、例えば細胞ベースの遺伝子療法アプローチまたは核酸ベースの遺伝子療法アプローチのような医学的アプローチにおける、本発明の核酸分子またはベクターを含む核酸分子、ベクターおよびトランスフェクト細胞の使用にも関する。
【００７６】
さらなる実施形態では、本発明の本明細書で定義された「第１の」および「第２の」ドメインを含む本発明の生物学的に活性なタンパク質（または本発明の核酸分子またはベクターまたは宿主細胞）は、組成物の部分である。前記組成物は、１つまたは複数の本発明の生物学的に活性なタンパク質またはこれをコードおよび／もしくは発現する核酸分子、ベクターもしくは宿主細胞を含むことができる。
【００７７】
前記組成物は、医薬組成物であってよく、場合によってはさらに薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤を含むことができる。さらなる実施形態では、本発明は、医薬組成物の摂取を必要とする疾患の予防、治療、改善のための医薬組成物を調製するための、本明細書に記載された生物学的に活性なタンパク質の使用に関する。
【００７８】
さらなる実施形態では、本明細書に記載された組成物は、場合によってはさらに適切な検出手段を含む診断組成物であってよく、前記診断組成物は増大したインビボおよび／またはインビトロ安定性を有する。
【００７９】
本発明の組成物は、固体または液体形態であってよく、特に、（１つまたは複数の）粉末、（１つまたは複数の）錠剤、（１つまたは複数の）溶液または（１つまたは複数の）エアロゾルの形態であってよい。さらに、本発明の医薬品は、医薬組成物の意図された使用に応じて、さらなる生物学的に活性な剤を含み得ることが想定される。
【００８０】
適切な（医薬）組成物の投与は、さまざまな方法、例えば、非経口、皮下、腹腔内、局所、気管支内、肺内および鼻内投与により、局所治療に所望であれば病巣内投与により達成することができる。非経口投与には、腹腔内、筋肉内、皮膚内、皮下静脈内または動脈内投与が含まれる。本発明の組成物は、例えば、特に効果の出る器官のような、外部標的または内部標的部位への微粒子銃送達により、標的部位に直接投与することもできる。
【００８１】
適切な薬学的担体、賦形剤および／または希釈剤の例は、当技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどの乳剤、さまざまなタイプの湿潤剤、滅菌溶液等が含まれる。こうした担体を含む組成物は、よく知られた従来方法で処方することができる。適切な担体は、本発明の生物学的に活性なタンパク質と結合した場合に、生物学的に活性なタンパク質の生物活性を保持する任意の物質を含むこともできる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０年）第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編を参照されたい）。非経口投与製剤には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳剤）が含まれ得る。医薬組成物と関連して使用されるような緩衝液、溶媒および／または賦形剤は、好ましくは、本明細書で上記に定義されたように「生物学的」である。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳剤または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が含まれ得る。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが含まれ得る。保存剤および他の添加剤も、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどを含め存在してよい。さらに、本発明の医薬組成物は、例えば、好ましくはヒト由来の血清アルブミンまたは免疫グロブリンのような、タンパク質担体を含むことができる。
【００８２】
これらの医薬組成物は、適切な投与量で被験者に投与することができる。投与レジメンは、担当医師および臨床的因子により決定されるであろう。医学分野でよく知られているように、任意の１人の患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間および経路、全般的健康、ならびに同時投与する他剤を含む、多くの要因により決まる。薬学的に活性な物質は、投与量当たり１μｇ〜２０ｍｇ／体重ｋｇの間、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重の間の量で存在することができる。レジメンが持続注入であれば、これもまた１分当たり体重キログラム当たり１μｇ〜２０ｍｇの範囲であるべきである。ただし、特に先述の要因を考慮すれば、示された例示範囲より下または上の投与量も想定される。
【００８３】
さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に応じて、さらなる生物学的に活性な剤を含み得ることが想定される。これらのさらなる生物学的に活性な剤は、例えば抗体、抗体フラグメント、ホルモン、成長因子、酵素、結合分子、サイトカイン、ケモカイン、核酸分子および薬剤であってよい。
【００８４】
本発明は、医薬組成物に限定されないことに注目すべきである。研究でまたは診断薬（複数可）として使用される組成物も想定される。例えば、本明細書で定義されたランダムコイルドメインを含む生物学的に活性なタンパク質が、診断設定で使用されることが想定される。こうした目的のため、本明細書で定義された「第１の」および「第２の」ドメインを含む、本発明の生物学的に活性なタンパク質は、検出可能に標識することができる。こうした標識は、放射性標識（［３Ｈ］水素［１２５Ｉ］ヨウ化物または［１２３Ｉ］ヨウ化物のような）、蛍光標識（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のようなフルオロフォアを含むがこれらに限定されない）またはＮＭＲ標識（ガドリニウムキレートのような）を含むが、これらに限定されない。ここで定義された標識またはマーカーは、決して限定的な、および単に実例となる例を代表するものではない。本発明の診断組成物は、追跡実験または診断医学的設定において特に有用である。
【００８５】
さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載された生物学的に活性なタンパク質、前記生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターまたは前記核酸もしくは前記ベクターを含む細胞を含むキットを提供する。好適には、本発明のキットはさらに、場合によっては（１つまたは複数の）緩衝液、保存溶液、および／または医学的、科学的もしくは診断的アッセイおよび目的の実施に必要な残りの試薬もしくは物質を含む。さらに、本発明のキットの部分は、バイアルもしくはボトル、または容器もしくはマルチ容器ユニットにおける組合せで個別に包装することができる。
【００８６】
本発明のキットは、特に、本発明の方法を実施するのに有利に使用することができ、本明細書で言及されたさまざまな適用に、例えば、診断キットとして、研究ツールとして、または医療ツールとして使用することができる。さらに、本発明のキットは、科学的、医学的および／または診断的目的に適切な検出手段を含有することができる。キットの製造は、好ましくは当業者に知られた標準手順に従う。
【００８７】
本発明は、これより以下の非限定的図および例により説明される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ＃１（ＰＡＳ＃１；配列番号１８）、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ＃２（ＰＡＳ＃２；配列番号２０）、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ＃３（ＰＡＳ＃３；配列番号２２）、（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ＃５（ＰＡＳ＃５；配列番号２６）、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ＃１Ｐ２（ＰＡＳ＃１Ｐ２；配列番号２８およびＳｅｒ−Ａｌａ（ｐｉＳＡ；配列番号２）ポリマー配列に関する遺伝子設計を示す図である。    （Ａ）ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＳａｐＩ制限酵素認識部位と適合可能な２つの粘着末端（小文字）を有する、２つの相補的オリゴデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより得られたＰＡＳ＃１（それぞれ、配列番号２９および３０）に関する構成単位のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列。    （Ｂ）ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＳａｐＩ制限酵素認識部位と適合可能な２つの粘着末端（小文字）を有する、２つの相補的オリゴデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより得られたＰＡＳ＃２（それぞれ、配列番号３１および３２）に関する構成単位のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列。    （Ｃ）ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＳａｐＩ制限酵素認識部位と適合可能な２つの粘着末端（小文字）を有する、２つの相補的オリゴデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより得られたＰＡＳ＃３（それぞれ、配列番号３３および３４）に関する構成単位のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列。    （Ｄ）ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＳａｐＩ制限酵素認識部位と適合可能な２つの粘着末端（小文字）を有する、２つの相補的オリゴデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより得られたＰＡＳ＃５（それぞれ、配列番号３５および３６）に関する構成単位のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列。    （Ｅ）ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＳａｐＩ制限酵素認識部位と適合可能な２つの粘着末端（小文字）を有する、２つの相補的オリゴデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより得られたＰＡＳ＃１Ｐ２（それぞれ、配列番号３９および４０）に関する構成単位のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列。    （Ｆ）ＥｃｏＯ１０９ＩおよびＳａｐＩ制限酵素認識部位と適合可能な２つの粘着末端（小文字）を有する、２つの相補的オリゴデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより得られたｐｉＳＡ（それぞれ、配列番号３７および３８）に関する構成単位のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列。
【図２−１】ＩＦＮａ２ｂおよびＩＬ−１ｒａとの融合としてのＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマー配列に関するクローニング戦略を示す図である。    （Ａ）ポリマー配列（配列番号５５）をサブクローニングするのに使用される、ｐＡＳＫ７５の誘導体であるｐＡＳＫ−２ｘＳａｐＩのヌクレオチド配列ストレッチ。ヌクレオチド配列は、逆相補的配向での２つのＳａｐＩ制限酵素認識部位をコードし、図１に示された合成遺伝子カセット（棒で示された）と適合可能な突出末端に消化時につながる。認識配列は下線が引かれている。    （Ｂ）ｐＡＳＫ−２ｘＳａｐＩプラスミドへの挿入後、ｐＰＡＳ（＃１）２００をもたらす２００残基を有するＰＡＳ＃１ポリマーのヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４１および４２）。ポリマー配列に隣接するＳａｐＩ制限酵素認識部位が標識されている（認識配列は下線が引かれている）。    （Ｃ）ｐＡＳＫ−ＩＢＡ４（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ社、ゲッティンゲン）でのクローニング後、ＩＦＮａ２ｂのヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４３および４４）。融合タンパク質のクローニングに使用される単一制限酵素認識部位ＫａｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩならびにポリマー配列挿入のための単一制限酵素認識部位ＳａｐＩが標識されている（認識配列は下線が引かれている）。Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩの２つのＣ末端アミノ酸が下線が引かれている。成熟ＩＦＮａ２ｂの最初のアミノ酸が＋１で標識されている。
【図２−２】（Ｄ）ＰＡＳ＃１ポリマー配列挿入後のＩＦＮａ２ｂのＮ末端のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４５および４６）。単一制限酵素認識部位ＫａｓＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＳａｐＩが標識されている（認識配列は下線が引かれている）。融合タンパク質の部分であるＩＦＮａ２ｂの最初のアミノ酸が標識され（１）、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩの２つのＣ末端アミノ酸は下線が引かれている。    （Ｅ）ｐＡＳＫ−ＩＢＡ４（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ社、ゲッティンゲン）でのクローニング後、ＩＬ−１ｒａのヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４７および４８）。融合タンパク質のクローニングに使用される単一制限酵素認識部位ＫａｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのほか、ポリマー配列挿入のための単一制限酵素認識部位ＳａｐＩが標識されている（認識配列は下線が引かれている）。Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩの２つのＣ末端アミノ酸は下線が引かれている。成熟ＩＬ−１ｒａの最初のアミノ酸が＋１で標識されている。    （Ｆ）ＰＡＳ＃１ポリマー配列挿入後のＩＬ−１ｒａのＮ末端のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４９および５０）。単一制限酵素認識部位ＫａｓＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＳａｐＩが標識されている（認識配列は下線が引かれている）。融合タンパク質の部分であるＩＬ１ｒａの最初のアミノ酸が標識され（１）、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩの２つのＣ末端アミノ酸は下線が引かれている。
【図２−３】（Ｇ）ｐＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂのプラスミドマップ。ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ（細菌ＯｍｐＡシグナルペプチド、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ、２００残基、すなわち図１Ａに示された配列の１０反復コピーを有するＰＡＳ＃１ポリマー、ＰＡＳ（＃１）２００、およびヒトＩＦＮａ２ｂを含む）に関する構造遺伝子は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）の転写制御下にあり、リポタンパク質ターミネーター（ｔｌｐｐ）で終わる。プラスミド骨格、すなわちＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位に隣接した発現カセットの外側は、一般的なクローニングおよび発現ベクターｐＡＳＫ７５（Ｓｋｅｒｒａ（１９９４年）Ｇｅｎｅ  １５１：１３１〜１３５頁）のものと同一である。単一制限酵素認識部位が示されている。ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂの発現ベクターは、４００または６００残基、すなわち図１Ａに示された配列の２０または３０反復コピーを有するＰＡＳ＃１ポリマーが、ＰＡＳ（＃１）２００の代わりにコードされることを除いて同一である。同様に、ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂの発現ベクターは、２００、すなわちそれぞれ、図１Ｂおよび１Ｃに示された配列の１０反復コピーのＰＡＳ＃２またはＰＡＳ＃３ポリマーを保有する。同様に、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂの発現ベクターは、１９２または３８４残基、すなわち図１Ｄに示された配列の８または１６反復コピーのＰＡＳ＃５ポリマーを保有する。同様に、ＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂの発現ベクターは、１４０残基、すなわち図１Ｅに示された配列の７反復コピーのＰＡＳ＃１Ｐ２ポリマーを保有する。ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａの発現ベクターは、ＩＦＮａ２ｂの代わりにＩＬ−１ｒａのコーディング遺伝子を保有することを除いてＩＦＮａ２ｂの対応するベクターに類似している。
【図３】ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ＮＧＡＬとの融合である、図１によるＰｒｏ−Ａｌａ−ＳｅｒおよびＳｅｒ−Ａｌａポリマー配列に関するクローニング戦略を示す図である。    （Ａ）ｐＡＳＫ７５誘導体ｐＮＧＡＬ１５（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔ（２００６年）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７６４：１６１〜１７３頁）でクローニングされた、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ（イタリック体のアミノ酸配列）を保有するＮＧＡＬ変異体のＣ末端（下線）のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５１および５２）。ＥｃｏＯ１０９Ｉ制限酵素認識部位は両方のコーディング領域の接合部で導入され、合成遺伝子カセット（棒で示された）と適合可能な突出末端に消化時につながり、ｐＮＧＡＬ１５−Ｅｃｏをもたらす。発現カセットの３’末端における固有のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位が標識されている（認識配列は下線が引かれている）。    （Ｂ）ＰＡＳ＃１ポリマー配列挿入後のＮＧＡＬのＣ末端のヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５３および５４）、これに続くＳｔｒｅｐ−タグＩＩ（イタリック体）。遺伝子発現カセットの３’末端における固有のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位が標識されている（認識配列は下線が引かれている）。    （Ｃ）ｐＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００のプラスミドマップ。ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００（ＯｍｐＡシグナルペプチド、修飾ＮＧＡＬ、および２００残基を有するＰＡＳ＃１、ＰＡＳ（＃１）２００、ならびにＳｔｒｅｐ−タグＩＩを含む）に関する構造遺伝子は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）の転写制御下にあり、リポタンパク質ターミネーター（ｔｌｐｐ）で終わる。プラスミド骨格、すなわちＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位に隣接した発現カセットの外側は、一般的なクローニングおよび発現ベクターｐＡＳＫ７５（Ｓｋｅｒｒａ（１９９４年）Ｇｅｎｅ  １５１：１３１〜１３５頁）のものと同一である。単一制限酵素認識部位が示されている。ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００の発現ベクターは、ちょうど１００残基を有する図１によるＰＡＳ＃１またはｐｉＳＡポリマーがコードされることを除いて同一である。
【図４−１】精製組換えＩＦＮａ２ｂ、ＩＬ−１ｒａ、およびＮＧＡＬ、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによるこれらのポリマー融合の分析、これに続くクマシーブリリアントブルーＲ−２５０による染色を示す図である。組換えタンパク質は、ペリプラズム分泌を介して大腸菌ＢＬ２１で産生され、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーを用いてＳｔｒｅｐ−タグＩＩの手段により精製された。    （Ａ）１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、精製組換えＩＦＮａ２ｂおよびそれぞれ、２００、４００または６００残基を有するこのＰＡＳ＃１融合の分析。ゲルは、ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ各々の２μｇタンパク質試料を示す。左側の試料が２−メルカプトエタノールで還元されたのに対し、右側の対応する試料は非還元のままであった。タンパク質マーカーのサイズ（ｋＤａ）（還元状態下で適用）が左側に示されている。全ての４つのタンパク質は、還元型でそれぞれ、約２０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約１７０ｋＤａ、および約３００ｋＤａの見かけの分子サイズを有する単一の均一なバンドとして現れる。これらの値は、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂで３７．４ｋＤａ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂで５４．０ｋＤａ、およびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂで７０．５ｋＤａの計算された質量よりも有意に大きい。ＩＦＮａ２ｂ自体（計算された質量２０．９ｋＤａを有する）は正常な電気泳動移動度を示すことから、この影響は明らかに、長さの異なるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーによるものである。非還元状態でのＩＦＮａ２ｂは、２つの分子内ジスルフィド架橋によって生じるよりコンパクトな形態のため、わずかに高い電気泳動移動度を有する。    （Ｂ）１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、精製組換えＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂの分析。ゲルは、各タンパク質の２μｇ試料を示す。左側の試料が２−メルカプトエタノールで還元されたのに対し、右側の対応する試料は非還元のままであった。タンパク質マーカーのサイズ（ｋＤａ）（還元状態下で適用）が左側に示されている。２つのタンパク質は、還元および非還元状態のいずれも、それぞれ、約７５ｋＤａおよび約１２０ｋＤａの見かけの分子サイズを有する単一の均一なバンドとして現れる。これは、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂで３６．７ｋＤａ、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂで５２．６ｋＤａの計算された質量よりも有意に大きい。この影響は、この場合もやはり長さの異なるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーによるものである。
【図４−２】（Ｃ）１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、精製組換えＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂ、およびＩＦＮａ２ｂの分析。ゲルは、２−メルカプトエタノールで還元された各タンパク質の２μｇ試料を示す。タンパク質マーカーのサイズ（ｋＤａ）が左側に示されている。６つのタンパク質はそれぞれ、約７５ｋＤａ（ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂ）、約７０ｋＤａ（ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ）、約４０ｋＤａ（ＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂ）、および約２０ｋＤａ（ＩＦＮａ２ｂ）の見かけの分子サイズを有する単一の均一なバンドとして現れる。故に、ポリマー融合は、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂで３７．４ｋＤａ、ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂで３７．４ｋＤａ、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂで３８．６ｋＤａ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂで３６．７ｋＤａ、およびＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂで３１．７ｋＤａの計算された質量よりも有意に大きいサイズを示す。この影響は、この場合もやはり長さの異なるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーによるものである。    （Ｄ）１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、精製組換えＩＬ−１ｒａ、ならびにそれぞれ２００、４００または１９２および３８４残基を有するこのＰＡＳ＃１およびＰＡＳ＃５融合の分析。ゲルは、２−メルカプトエタノールで還元されたＩＬ−１ｒａ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａ各々の２μｇタンパク質試料を示す。タンパク質マーカーのサイズ（ｋＤａ）が左側に示されている。全ての５つのタンパク質は、それぞれ、約２０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、６６ｋＤａおよび約１２５ｋＤａの見かけの分子サイズを有する単一の均一なバンドとして現れる。ポリマー融合ではこれらの値は、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａで３５．３ｋＤａ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａの５１．９ｋＤａ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａで３４．６ｋＤａおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａで５０．５ｋＤａの計算された質量よりも有意に大きい。ＩＬ−１ｒａ自体（計算された質量１９．８ｋＤａを有する）は正常な電気泳動移動度を示すことから、この影響は明らかに、長さの異なるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーによるものである。
【図４−３】（Ｅ）１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、精製組換えＮＧＡＬおよびそれぞれ、１００または２００残基を有するこのＰＡＳ＃１ポリマー融合の分析。ゲルは、ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００各々の４μｇタンパク質試料を示す。左側の試料が２−メルカプトエタノールで還元されたのに対し、右側の対応する試料は非還元のままであった。タンパク質マーカーのサイズ（ｋＤａ）（還元状態下で適用）が左側に示されている。ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００は、還元および非還元状態のいずれも、それぞれ、約４５ｋＤａおよび約６０ｋＤａの見かけの分子サイズを有する単一の均一なバンドとして現れる。これは、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００で２９．８ｋＤａおよびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００で３８．１ｋＤａの計算された質量よりも有意に大きい。ＮＧＡＬ自体（計算された質量２１．５ｋＤａを有する）は正常な電気泳動移動度を示すことから、この影響は長さの異なるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーによるものである。
【図５−１】精製組換えＩＦＮａ２ｂ、ＩＬ−１ｒａ、ＮＧＡＬ、およびこれらのポリマー融合の流体力学的体積の定量分析を示す図である。    （Ａ）ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂの分析的ゲル浸透クロマトグラフィー。濃度０．２５ｍｇ／ｍｌでの各タンパク質２５０μｌを、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬカラムに適用した。２８０ｎｍでの吸収をモニターし、各クロマトグラフィーのラン（run）のピークを値１に対して正規化した。矢印はカラムの除外容積（８．０ｍｌ）を示す。
【図５−２】（Ｂ）ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂの分析的ゲル浸透クロマトグラフィー。濃度０．２５ｍｇ／ｍｌでの各タンパク質２５０μｌを、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬカラムに適用した。２８０ｎｍでの吸収をモニターし、各クロマトグラフィーのランのピークを値１に対して正規化した。矢印はカラムの除外容積（８．０ｍｌ）を示す。
【図５−３】（Ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬを用いた（Ａ）および（Ｂ）からのクロマトグラムのための較正曲線。マーカータンパク質の分子量（ＭＷ）の対数（ＲＮａｓｅ  Ａ、１３．７ｋＤａ；炭酸脱水酵素、２９．０ｋＤａ；オボアルブミン、４３．０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；トランスフェリン、８１．０ｋＤａ；アルコール脱水素酵素、１５０ｋＤａ）を、これらの溶出体積（黒丸）に対してプロットし、直線に適合させた。ＩＦＮａ２ｂおよびこの融合タンパク質（黒い四角）の観察された溶出体積から、これらの見かけの分子量を次の通りに判定した：ＩＦＮａ２ｂ：２２．５ｋＤａ（計算された質量：２０．９ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ：１７６ｋＤａ（計算された質量：３７．４ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ；３４６ｋＤａ（計算された質量：５４．０ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ：５２２ｋＤａ（計算された質量：７０．５ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ：１６２ｋＤａ（計算された質量：３６．７ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂ：２８０ｋＤａ（計算された質量：５２．６ｋＤａ）。    （Ｄ）ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂの分析的ゲル浸透クロマトグラフィー。濃度０．２５ｍｇ／ｍｌでの各タンパク質２５０μｌを、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬカラムに適用した。２８０ｎｍでの吸収をモニターし、各クロマトグラフィーのランのピークを値１に対して正規化した。矢印はカラムの除外容積（Ｖ０＝８．０ｍｌ）を示す。
【図５−４】（Ｅ）同じＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬカラムを用いた（Ｄ）からのクロマトグラムのための較正曲線。マーカータンパク質の分子量（ＭＷ）の対数（ＲＮａｓｅ  Ａ、１３．７ｋＤａ；炭酸脱水酵素、２９．０ｋＤａ；オボアルブミン、４３．０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；トランスフェリン、８１．０ｋＤａ；アルコール脱水素酵素、１５０ｋＤａ）を、これらの溶出体積（黒丸）に対してプロットし、直線に適合させた。ＩＦＮａ２ｂおよびこの融合タンパク質（黒い四角）の観察された溶出体積から、これらの見かけの分子サイズを次の通りに判定した：ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂ：１６８ｋＤａ（計算された質量：３７．４ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂ：１４６ｋＤａ（計算された質量：３８．６ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂ：６６．４ｋＤａ（計算された質量：３１．７ｋＤａ）。    （Ｆ）ＩＬ−１ｒａ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａ、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａの分析的ゲル浸透クロマトグラフィー。濃度０．２５ｍｇ／ｍｌでの各タンパク質２５０μｌを、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬカラムに適用した。２８０ｎｍでの吸収をモニターし、各クロマトグラフィーのランのピークを値１に対して正規化した。矢印はカラムの除外容積を示す。よりわかりやすくするためピークのみが示されている。
【図５−５】（Ｇ）同じＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬカラムを用いた（Ｆ）からのクロマトグラムのための較正曲線。マーカータンパク質の分子量（ＭＷ）の対数（ＲＮａｓｅ  Ａ、１３．７ｋＤａ；炭酸脱水酵素、２９．０ｋＤａ；オボアルブミン、４３．０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；トランスフェリン、８１．０ｋＤａ；アルコール脱水素酵素、１５０ｋＤａ）を、これらの溶出体積（黒丸）に対してプロットし、直線に適合させた。ＩＬ−１ｒａおよびこの融合タンパク質（黒い四角）の観察された溶出体積から、これらの見かけの分子サイズを次の通りに判定した：ＩＬ−１ｒａ：１９．８ｋＤａ（計算された質量：１８．８ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａ：１６１ｋＤａ（計算された質量：３５．３ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａ：３３６ｋＤａ（計算された質量：５１．９ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａ：１４８ｋＤａ（計算された質量：３４．６ｋＤａ）；ＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａ：３０５ｋＤａ（計算された質量：５０．５ｋＤａ）。
【図５−６】（Ｈ）ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００およびＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００の分析的ゲル浸透クロマトグラフィー。濃度０．２５ｍｇ／ｍｌでの各タンパク質２５０μｌを、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５  １０／３００ＧＬ（ＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００）またはＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００ＧＬ（ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００）カラムに適用した。２８０ｎｍでの吸収をモニターし、各クロマトグラフィーのランのピークを値１に対して正規化した。矢印はカラムの除外体積（それぞれ、７．５ｍｌおよび８．２ｍｌ）を示す。
【図５−７】（Ｉ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５  １０／３００  ＧＬおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬを用いた（Ｈ）からのクロマトグラムのための較正曲線。マーカータンパク質の分子量（ＭＷ）の対数（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５  １０／３００  ＧＬ：アプロチニン、６．５ｋＤａ；リボヌクレアーゼ、１３．７ｋＤａ；ミオグロビン、１７．６ｋＤａ；炭酸脱水酵素、２９．０ｋＤａ；オボアルブミン、４３．０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；トランスフェリン、８１．０ｋＤａ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬ：シトクロムＣ、１２．４ｋＤａ；炭酸脱水酵素、２９．０ｋＤａ；オボアルブミン、４３．０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；トランスフェリン、８１．０ｋＤａ；アルコール脱水素酵素、１５０ｋＤａ）を、これらの溶出体積（黒丸）に対してプロットし、直線に適合させた。ＩＬ−１ｒａおよびこの融合タンパク質（黒い四角）の観察された溶出体積から、これらの見かけの分子サイズを次の通りに判定した：ＮＧＡＬ：２１．５ｋＤａ（計算された質量：２１．５ｋＤａ）；ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００：７２．６ｋＤａ（計算された質量：２９．８ｋＤａ）；ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００：１０６．４ｋＤａ（計算された質量：３８．１ｋＤａ）；ＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００：５４ｋＤａ（計算された質量：２９．４ｋＤａ）。
【図６−１】円二色性（ＣＤ）分光法による、精製組換えＩＦＮａ２ｂ、ＩＬ−１ｒａ、ＮＧＡＬ、およびこれらのポリマー融合の実験的２次構造分析を示す図である。タンパク質ごとに、スペクトルを５０ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｋ−リン酸  ｐＨ７．５で室温で記録し、モル楕円率、ΘＭに対して正規化した。    （Ａ）精製組換えＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂの円二色性（ＣＤ）スペクトル。ＩＦＮａ２ｂのＣＤスペクトルは、２０８ｎｍおよび２２０ｎｍ付近に２つの負の極大を有する顕著なα−ヘリックスタンパク質の典型的特徴（Ｓｒｅｅｒａｍａ：Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（２０００年）Ｂｅｒｏｖａ、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｙ（編）Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：６０１〜６２０頁を示す。これは、細菌産生ヒトＩＦＮａ２ｂの正しいフォールディングを示している。Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーを有するこの融合タンパク質のスペクトルは、２０５ｎｍ付近に顕著な負の極小を有する特徴的な偏差を明らかにし、明らかに、ランダムコイルコンフォメーションを示している。さらに、ＩＦＮａ２ｂのα−ヘリックスの寄与から生じ、融合タンパク質の部分であってもＩＦＮａ２ｂの正しいフォールディングを示す、２２０ｎｍ付近の肩がある。    （Ｂ）それぞれの融合タンパク質のスペクトルからＩＦＮａ２ｂのスペクトルを減算して得られた、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂのモル差ＣＤスペクトル（molar difference CD spectrum）。２００、４００、および６００残基を有するＰＡＳ＃１ポリマーの差ＣＤスペクトルは全て、２００ｎｍ付近の強いを明らかにし、明らかに、緩衝水溶液中のランダムコイルコンフォメーションを示している（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：４１０８〜４１１６頁；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）ＥＭＢＯ  Ｊ  ２１：５６８２〜５６９０頁。
【図６−２】（Ｃ）ＩＦＮａ２ｂのスペクトルと共の、精製組換えＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂの円二色性（ＣＤ）スペクトル。ポリマー融合タンパク質のスペクトルは、ランダムコイルコンフォメーションを示す２０５ｎｍ付近の顕著な負の極小、および正しくフォールディングされたＩＦＮａ２ｂの寄与から生じる２２０ｎｍ付近の肩を明らかにする。    （Ｄ）ＩＦＮａ２ｂのスペクトルを減算後の、ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂのモル差ＣＤスペクトル。２００残基を各々有するＰＡＳ＃２およびＰＡＳ＃３ポリマー、ならびに１４０残基を有するＰＡＳ＃１Ｐ２ポリマーの差ＣＤスペクトルは、２００ｎｍ付近の著しい極小を明らかにし、明らかに、ランダムコイルコンフォメーションを示す（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）。
【図６−３】（Ｅ）精製組換えＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂの円二色性（ＣＤ）スペクトル。これら２つの融合タンパク質のスペクトルは、ランダムコイルコンフォメーションを示す２０５ｎｍ付近の顕著な負の極小、およびフォールディングされたＩＦＮａ２ｂの寄与から生じる２２０ｎｍ付近の肩を明らかにする。    （Ｆ）ＩＦＮａ２ｂのスペクトルを減算後の、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂのモル差ＣＤスペクトル。１９２および３８４残基を有するＰＡＳ＃５ポリマーの差ＣＤスペクトルは、２００ｎｍ付近の強い極小を明らかにし、明らかに、ランダムコイルコンフォメーションを示す（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）。
【図６−４】（Ｇ）精製組換えＩＬ−１ｒａ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａ、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａの円二色性（ＣＤ）スペクトル。４つの融合タンパク質のスペクトルは、ランダムコイルコンフォメーションを示す２００ｎｍ付近の顕著な負の極小を明らかにする。    （Ｈ）ＩＬ−１ｒａのスペクトルを減算後の、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａ、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａのモル差ＣＤスペクトル。それぞれ、２００または４００および１９２または３８４残基を有する、ＰＡＳ＃１およびＰＡＳ＃５ポリマー両方の差ＣＤスペクトルは、２００ｎｍ付近の強い極小を明らかにし、明らかに、ランダムコイルコンフォメーションを示す（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）。
【図６−５】（Ｉ）精製組換えＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００のＣＤスペクトル。ＮＧＡＬのＣＤスペクトルは、２１２ｎｍ付近に負の極大を有する顕著なβ−シートタンパク質の典型的特徴（Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上）を有する。２００ｎｍより下の正のバンドの欠如は、このマウスオルソログ２４ｐ３のＣＤスペクトル（Ｃｈｕ（１９９８年）Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  ５２：３９０〜３９７年）と一致する。以上のことから、これらのデータは、細菌産生ヒトＮＧＡＬタンパク質の正しいフォールディングを支持している。２つの融合タンパク質のスペクトルは、１９５ｎｍ付近に顕著な負の極小（ランダムコイルコンフォメーションを示す）を有する特徴的な偏差、および２００ｎｍ付近の肩（２００ｎｍで負の極小を有するＮＧＡＬの寄与から生じる）を明らかにする。後者の観察は、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーと融合した場合のＮＧＡＬタンパク質の正しいフォールディングを示す。    （Ｊ）ＮＧＡＬのスペクトルを減算後の、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００のモル差ＣＤスペクトル。１００および２００残基を有するＰＡＳ＃１ポリマーの差ＣＤスペクトルは、２００ｎｍ付近の強い極小を明らかにし、明らかに、ランダムコイルコンフォメーションを示す（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）。
【図６−６】（Ｋ）精製組換えＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００のＣＤスペクトル、およびＮＧＡＬのスペクトルを減算後のこのモル差ＣＤスペクトル。ＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００のＣＤスペクトルおよびｐｉＳＡ１００ポリマーの差ＣＤスペクトルはいずれも、２１８ｎｍ付近に負の極大を、２００ｎｍより下に正の極大を有する顕著なβ−シートタンパク質の典型的特徴（Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上）を有する。故に、差スペクトルは、同程度の長さを有するＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマー融合のものとは明らかに異なり、ポリマー融合パートナーに起因するランダムコイルコンフォメーションにより明らかに支配されている。
【図７】ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂの血清安定性テストの図である。    ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ（Ａ）およびＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ（Ｂ）の血清安定性は、濃度０．１７ｍｇ／ｍｌで８３％ｖ／ｖマウス血漿（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ギルバーツビル、ＰＡ）中で３７℃にて最大４８時間、融合タンパク質をインキュベーションして分析した。試料（６μｌ）を示された時点で採取し、５４μｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動バッファーおよびβ−メルカプトエタノール含有１５μｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーで希釈した。アリコート２５μｌ（０．３３μｇテストタンパク質に相当）および参照試料（０．１μｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、ニトロセルロースメンブレンにブロットした。組換えタンパク質を、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩを認識するＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）アルカリホスファターゼ複合体（ＩＢＡ社、ゲッティンゲン、ドイツ）と共にインキュベーションして検出し、色素産生反応により発色させた。    両方のテストタンパク質について、ブロットは全ての時点の一定強度のシグナルを明らかにする。分解産物を検出することはできず、調査した時間的経過の中でテストタンパク質濃度の低下をもたらすタンパク質凝集の徴候はなかった。
【図８】精製組換えＩＦＮａ２ｂおよび２００または４００残基を有するこのＰＡＳ＃１ポリマー融合の薬物動態を示す図である。    体重約２５ｇのＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、またはＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂタンパク質いずれかの約１２５μｌを１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度で注射し、体重（ｂ．ｗ．）ｋｇ当たり５ｍｇテストタンパク質の投与量を達成した。血液試料は示されたように採取した。透明な血漿試料のアリコートをＰＢＳで１：５に希釈した。希釈試料１０μｌ（１μｌ血漿に相当）のアリコートを、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用しニトロセルロースメンブレンにブロットした。組換えタンパク質を、マウス抗ヒトＩＦＮａ２ｂ抗体９Ｄ３（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ）と共にインキュベーション、続いて抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＭＯ）と共にインキュベーションして検出し、色素産生反応において発色させた。    左端のレーン（Ｍ）は、参照として、精製ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ（各０．１μｇ、すなわち血漿試料中ｔ＝０が期待されるような量）の混合物を示す。他のレーンは、示された時点でのＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂの血漿試料を示す。    ブロットは、最も早い時点、すなわち３０分後の全ての３つのタンパク質試料に関する最も高いシグナルを明らかにし、既に、２時間後にはもはや検出できないＩＦＮａ２ｂの急速な減衰を明らかにする。対照的に、両方のＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂは、最大６時間検出することができ（２００残基融合に比べて４００残基融合の保持が明らかに強い）、非融合ＩＦＮａ２ｂタンパク質と比較した場合、有意に長い循環を示す。特に、どちらのタンパク質試料のタンパク質分解も示されなかった。故に、目的のＩＦＮａ２ｂタンパク質だけでなくポリマー融合部分も、高い血清安定性を明らかにする。
【図９】精製組換えＩＦＮａ２ｂおよび２００または４００残基を有するこのＰＡＳ＃１ポリマー融合の薬物動態の定量分析を示す図である。    図８で調査したのと同じ動物からの血漿試料を、ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂまたはＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ濃度について、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて定量的にアッセイした。したがって、マイクロタイタープレートのウェルを、検出抗体としての抗ヒトＩＦＮａ抗体９Ｄ３（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ）でコートし、群Ａ（ＩＦＮａ２ｂを注射）、群Ｂ（ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂを注射）、および群Ｃ（ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂを注射）の動物からの血漿試料の希釈系列を適用した。結合したＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂを、検出抗体より異なるエピトープを認識する２次抗ヒトＩＦＮａ２ｂ抗体ＨＲＰ複合体（４Ｅ１０−ＨＲＰ；Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ）により検出し、続いて色素産生反応を行った。ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂの濃度を、既知の濃度で適用した同じ精製組換えタンパク質で作成した標準曲線との比較により定量化した。ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂの血漿半減期を推定するため、得られた濃度値を静脈注射後時間に対してプロットし、単一指数減衰と仮定して数値的に適合させた。    この結果、非融合ＩＦＮａ２ｂタンパク質は、５．５±１×１０−５分の半減期できわめて速いクリアランスを示した。対照的に、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂについて判定した排出相は、それぞれ、６１．７±５．４分および約６±３時間の半減期で有意に遅延し、故に非融合ＩＦＮａ２ｂに比べて、それぞれ２００および４００残基を有するＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマー融合のため１０倍および６０倍を超える延長した循環を示す。
【図１０】それぞれ、２００、４００、６００残基を有する精製組換えＩＦＮａ２ｂ  ＰＡＳ＃１ポリマー融合ならびに１９２および３８４残基を有する精製組換えＰＡＳ＃５ポリマー融合の薬物動態の定量分析を示す図である。    体重約１８ｇのＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃５）−ＩＦＮａ２ｂまたはＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂタンパク質いずれかの約１２５μｌを１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度で注射し、体重（ｂ．ｗ．）ｋｇ当たり７ｍｇテストタンパク質の投与量を達成した。血液試料は、３０分、２４０分、３６０分、および４８０後に採取した。血漿試料を、ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂまたはＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂについて、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて定量的にアッセイした。ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂの血漿半減期を推定するため、得られた濃度値を静脈注射後時間に対してプロットし、単一指数減衰と仮定して数値的に適合させた。    結果として、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂについて判定した排出相は、それぞれ、半減期６６．２±５．６分、３１６．１±７６．８分、および約４０６．８±６０分で有意に遅延し、故に非融合ＩＦＮａ２ｂに比べて、それぞれ２００、４００および６００残基を有するＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマー融合のため１０倍、６０倍および７０倍を超える延長した循環を示す（図９）。同様に、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂについて判定した排出相は、それぞれ、半減期４０．４±５．６分および約３２１±９３．６分で有意に遅延し、故に非融合ＩＦＮａ２ｂに比べて、それぞれ１９２および３８４残基を有するＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマー融合のため７倍、６０倍を超える延長した循環を示す（図９）。
【図１１】精製組換えＮＧＡＬおよび１００または２００残基を有するこのＰＡＳ＃１ポリマー融合の薬物動態を示す図である。    体重約２１０ｇのメスのウィスターラットに、ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、またはＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００タンパク質いずれかの約１０５０μｌをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度で注射し、体重（ｂ．ｗ．）ｋｇ当たり５ｍｇテストタンパク質の投与量を達成した。血液試料は示されたように採取した。透明な血漿試料のアリコートをＰＢＳで１：５に希釈した。３つの異なるタンパク質の１つを各々注射した動物からの希釈試料１．２５μｌ（０．２５μｌ血漿に相当）の３つのアリコートを混合し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用しニトロセルロースメンブレンにブロットした。組換えタンパク質を、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩを認識するＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）アルカリホスファターゼ複合体（ＩＢＡ社、ゲッティンゲン、ドイツ）と共にインキュベーションして検出し、色素産生反応において発色させた。    図１１Ａおよび１１Ｂは、群Ａ（ＮＧＡＬを注射）、群Ｂ（ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００を注射）、および群Ｃ（ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００を注射）からの異なる動物の独立した血漿試料による２つの時系列を示す。図１１Ａおよび１１Ｂの左端のレーンは分子サイズ標準を示し（左のマーカーサイズで）を示し、続くレーンは示された時点でのＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００を含有する３つの血漿試料の混合物を示し、右端のレーンは、参照としての精製ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００（各０．１μｇ）の混合物を示す。    ブロットは、最も早い時点、すなわち５分後の全ての３つのタンパク質試料に関する最も高いシグナルを明らかにし、３０分後にはもはや検出できないＮＧＡＬの急速な減衰を明らかにする。対照的に、両方のＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００は、はるかに長い期間検出することができ（１００残基融合に比べて２００残基融合の影響がわずかに強い）、非融合ＮＧＡＬタンパク質と比較した場合、有意に長期の循環を示す。特に、どちらのタンパク質試料のタンパク質分解も示されなかった。故に、目的のＮＧＡＬタンパク質だけでなくポリマー融合部分も、高い血清安定性を明らかにする。最後に、急性毒性または炎症のいずれかの徴候を示した動物はおらず、本発明による融合タンパク質の高い忍容性を示している。
【図１２】精製組換えＮＧＡＬおよび２００残基を有するこのＰＡＳ＃１ポリマー融合の薬物動態の定量分析を示す図である。    図１１Ａで調査したのと同じ動物からの血漿試料を、ＮＧＡＬまたはＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００濃度について、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。したがって、マイクロタイタープレートのウェルを、検出抗体としての抗ヒトリポカリン−２／ＮＧＡＬ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）でコートし、群Ａ（ＮＧＡＬを注射）または群Ｃ（ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００を注射）の動物からの血漿試料の希釈系列を適用した。結合したＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００を、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩを認識するＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）アルカリホスファターゼ複合体により検出し、続いて色素産生反応を行った。ＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００の濃度を、既知の濃度で適用した同じ精製組換えタンパク質で作成した標準曲線との比較により定量化した。ＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００の血漿半減期を推定するため、実験濃度値を静脈注射後時間に対してプロットし、単一指数減衰と仮定して数値的に適合させた。より明確にするために３６０分までのデータポイントのみを示す。    非融合ＮＧＡＬタンパク質は、３．１±０．２分の半減期できわめて速いクリアランスを示した。この値は、相対成長スケーリング（allometric scaling）の原則（Ｍａｈｍｏｏｄ（２００５）Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｓｃａｌｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  Ｓｃａｌｉｎｇ．Ｐｉｎｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ロックヴィル、メリーランド）によれば、この特定のタンパク質に固有である可能性のある細胞取り込みの機構を示す、ヒトにおける自然のＮＧＡＬの単量体型について記載された１０分間の半減期（Ａｘｅｌｓｓｏｎ（１９９５）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ５５：５７７〜５８８頁）と一致する。最近、低密度リポタンパク質受容体のメンバーであるメガリンは、腎臓上皮細胞におけるＮＧＡＬ受容体として作用する可能性があり、この取り込みを媒介する可能性があることが示された（Ｈｖｉｂｅｒｇ（２００５年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５７９：７７３〜７７７頁）。    対照的に、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００について判定した排出相は、末端半減期３０．９±１．３分で有意に遅延し、故に非融合ＮＧＡＬに比べて、２００残基を有するＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマー融合のため１０倍の延長した循環を示す。血漿半減期に対する減速効果は、ＮＧＡＬの場合と明らかに同様に特異的クリアランス機構の対象とはならない目的のタンパク質に対し、さらにより顕著となり得る。
【図１３】ＩＰ−１０  ＥＬＩＳＡによる、市販のイントロンＡ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社、ケニルワース、ＮＪ）、組換えＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、および組換えＦａｂフラグメント（陰性対照となる）の比較活性分析を示す図である。２×１０５ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、異なる濃度で、イントロンＡ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂまたはＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂと同様に調製したＦａｂフラグメントでインキュベートした。イントロンＡの特異的活性は、製造者のデータシートによれば２．６×１０８Ｕ／ｍｇであった。誘導されたＩＰ−１０タンパク質を、ヒトＩＰ−１０  ＥＬＩＳＡセット（ＢＤ  ＯｐｔｅＥＩＡ（商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ファーミンゲン、ＵＳＡ）により定量化した。イントロンＡおよびＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂは、類似の効果で濃度依存的にＩＰ−１０の放出を誘導する。刺激されていないＰＢＭＣおよびＦａｂフラグメントで処置したＰＢＭＣは、いずれの有意なＩＰ−１０産生も示さなかった。
【図１４】チョウ−ファスマン法（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ（１９７４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２〜２４５頁）による、Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＳｅｒおよびＳｅｒ−Ａｌａポリマー配列の２次構造の理論的予測を示す図である。この図は、バージニア大学のＳｅｑｕｅｎｃｅ  ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎおよびＳｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ予測サーバー（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２）上で実行されるようなＣＨＯＦＡＳコンピュータアルゴリズムからのアウトプットを示す。アミノおよびカルボキシ末端での境界効果を避けるため、図１による各アミノ酸配列ブロックを３つの反復コピーにペーストし、中央のブロック（囲み）に対するアウトプットのみを検討した。ｐｉＳＡポリマー配列（配列番号５６）のケースではチョウ−ファスマンアルゴリズムは、２０残基中２０残基に対し（すなわち１００％）α−ヘリックス２次構造を予測する。これは、融合タンパク質の一部であるこのポリマー配列について実験的に観察された主要なβ−シートコンフォメーションとは明らかに対照的である（図６を参照されたい）。ＰＡＳ＃１ポリマー配列（配列番号５７）のケースではチョウ−ファスマンアルゴリズムは、２０残基中１２残基に対し（すなわち６０％）、α−ヘリックス２次構造を予測する。これは、融合タンパク質の一部であるこのポリマー配列について実験的に観察された主要なランダムコイルコンフォメーションとは対照的である（図６を参照されたい）。ＰＡＳ＃５ポリマー配列（配列番号５８）のケースではチョウ−ファスマンアルゴリズムは、２４残基中２０残基に対し（すなわち８３．３％）、α−ヘリックス２次構造を予測する。この場合もやはり、これは、融合タンパク質の一部であるこのポリマー配列について実験的に観察された主要なランダムコイルコンフォメーションとは明らかに対照的である（図６を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
実施例
本発明は、さらに、本発明のより良い理解および本発明の多くの利点を提供する以下の実例となる非限定例により記載される。
【００９０】
特に指示のない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｒｕｓｓｅｌｌ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）に記載されているような組換え遺伝子技術の確立された方法が使用された。
【００９１】
以下の例は本発明を説明する：
【実施例１】
【００９２】
Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＳｅｒおよびＳｅｒ−Ａｌａアミノ酸ポリマーの遺伝子合成
本明細書で上述されたように、Ｐｒｏ、Ａｌａ、およびＳｅｒ残基からなるアミノ酸反復は、本明細書では「ＰＡＳ」と表現される（正式には「ＡＰＳ」としても知られる）。Ｐｒｏ、Ａｌａ、およびＳｅｒ残基（配列番号１８に対応するＰＡＳ＃１、配列番号２０に対応するＰＡＳ＃２、配列番号２２に対応するＰＡＳ＃３、配列番号２６に対応するＰＡＳ＃５、および配列番号２８に対応するＰＡＳ＃１Ｐ２）またはＳｅｒおよびＡｌａ（配列番号２に対応するｐｉＳＡ）を含む反復ポリマー配列をコードする遺伝子フラグメントは、相互に適合可能だが非パリンドロームな粘着末端を利用し、定方向様式でのコンカテマー形成により、図１Ａ〜Ｆに示された２つの相補的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイゼーションおよびライゲーションして得た。オリゴデオシキヌクレオチドをＩＢＡ社（ゲッティンゲン、ドイツ）から購入し、分取尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。配列番号３０、３２、３４、３６、３８および４０に表されたアミノ酸配列は、追加のアラニンを含む、それぞれ配列番号１８、２０、２２、２６、２および２８のクローニングバージョンを表している。同様に、配列番号２９、３１、３３、３５、３７および３９に表された核酸配列（配列番号３０、３２、３４、３６、３８および４０に示されたアミノ酸をコードする）は、粘着末端を介してライゲーション時に排除されるようになる、アラニンの追加のｃｇｇコドンを含む。酵素のリン酸化は、両方のオリゴデオキシヌクレオチド２００ｐｍｏｌを１００μｌ  １５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ中に混合し、１０ｕポリヌクレオチドキナーゼ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、セントレオンロット、ドイツ）の存在下、３７℃で３０分間インキュベーションして行った。８０℃で１０分間の変性後、混合物を一晩、室温まで冷却してハイブリダイゼーションを達成した。次いでこの溶液５０μｌを、１ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）および１０μｌ  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ、ならびに幾つかのケースでは５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ（全容積１００μｌ）を添加し、氷上で５０分間インキュベーションしてライゲートした。７０℃で１０分の熱不活化後、ライゲーション産物を、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の存在下、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動により単離した。エチジウムブロマイドで染色後、３００ｂｐ（ｐｉＳＡ）、４２０ｂｐ（ＰＡＳ＃１Ｐ２）、５７６ｂｐ（ＰＡＳ＃５）、および６００ｂｐ（ＰＡＳ＃１、２、３）長の構築した遺伝子セグメントに対応するバンドを励起し、フェノール抽出により単離した。
【実施例２】
【００９３】
インターフェロンα−２ｂ（ＩＦＮａ２ｂ）のＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃３、ＰＡＳ＃５、およびＰＡＳ＃１Ｐ２融合タンパク質に対する発現ベクターの構築
実施例１からのＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃３、ＰＡＳ＃１Ｐ２、およびＰＡＳ＃５をコーディングする合成遺伝子フラグメントのクローニングについては、逆相補的配向で２つのＳａｐＩ制限酵素認識部位を有するヌクレオチド配列を保有する（図２Ａ）、ｐＡＳＫ７５誘導体（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９４年）Ｇｅｎｅ  １５１：１３１〜１３５頁）のｐＡＳＫ−２ｘＳａｐＩを使用した。このベクターを、ＳａｐＩで切断し、エビアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ社、クリーブランド、ＯＨ）で脱リン酸化し、合成ＤＮＡフラグメントとライゲートした（図２Ｂ）。得られた中間体プラスミドを、ｐＰＡＳ（＃１）２００、ｐＰＡＳ（＃２）２００、ｐＰＡＳ（＃３）２００、ｐＰＡＳ（＃５）１９２、およびｐＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０と命名した。
【００９４】
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋ（１９８７年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：３７６〜３７８頁）を形質転換後、プラスミドを単離し、クローン化合成核酸インサートの配列を、制限分析、ならびにＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターキットおよび両側からの配列決定を可能にするオリゴデオシキヌクレオチドプライマーを用いた自動化二本鎖ＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ（商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ分析器、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｓｙｓｔｅｍｓ社、ヴァイターシュタッド、ドイツ）により確認した。約２００残基ポリマー配列を保有する得られたプラスミドは、ポリマー配列インサートの単純なさらなるサブクローニングを可能にする中間体ベクターの役割を果たした。
【００９５】
ＩＦＮａ２ｂのコーディング遺伝子を、オリゴデオキシヌクレオチド5'-TCTGTGGGCGCC AGCTCTTCTGCCTGTGATCTGCCTCAAACCCAC（配列番号５９）および5'-GAACCA AAGCTTATTCCTTACTTCTTAAAC（配列番号６０）をプライマーに用いて、対応するｃＤＮＡを保有するプラスミドＩＲＡＭｐ９９５Ｍ１７１３Ｑ（ＲＺＰＤ社、ベルリン、ドイツ）から増幅した。第１のプライマーが５’末端にＫａｓＩ制限酵素認識部位、続いてＳａｐＩ制限酵素認識部位（下線）を含有するのに対し、第２のプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位（下線）を含有する。増幅産物を精製し、ＫａｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、適宜切断されたベクターｐＡＳＫ−ＩＢＡ４（ＩＢＡ社、ゲッティンゲン、ドイツ）とライゲートした。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換後、プラスミドを調製し、クローン化合成核酸インサートの配列を制限分析および自動化二本鎖ＤＮＡ配列決定により確認した。Ｎ末端Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩとの融合であるＩＦＮａ２ｂをコードするプラスミドを、ｐＡＳＫ−ＩＦＮａ２ｂと命名した（図２Ｃ）。
【００９６】
ＰＡＳ（＃１）２００、ＰＡＳ（＃１）４００、およびＰＡＳ（＃１）６００との融合であるＩＦＮａ２ｂをコードする発現プラスミドの構築については、ｐＡＳＫ−ＩＦＮａ２ｂをＳａｐＩで切断し、エビアルカリホスファターゼで脱リン酸化し、ＳａｐＩによる制限消化により中間体プラスミドｐＰＡＳ（＃１）２００から単離した２００残基ポリマーの過剰な遺伝子フラグメントとライゲートした（図２Ｄ）。大腸菌ＪＭ８３（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎ．（１９８５年）Ｇｅｎｅ  ３３：１０３〜１１９頁）を形質転換後、プラスミドを調製し、インサートをコードするポリマーのサイズを制限分析により確認した。２００、４００および６００残基ポリマー配列を保有するＩＦＮａ２ｂ、すなわちＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂをコードするプラスミドを、それぞれ、ｐＡＳＫ−ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ（図２Ｇ）、ｐＡＳＫ−ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、およびｐＡＳＫ−ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂと命名した。ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂをコードするプラスミドを、各々のアミノ酸ポリマー配列をコードする適切な対応する遺伝子カセットを用いて同様の方法で構築した。
【実施例３】
【００９７】
インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）のＰＡＳ＃１およびＰＡＳ＃５融合タンパク質に対する発現ベクターの構築
ＩＬ−１ｒａのコーディング遺伝子（Ｃａｒｔｅｒ（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６３３〜６３８頁）を、オリゴデオキシヌクレオチド5'-ACGATCGGCGCCAGCTCTTCTGCCCGACCCTCTGGGAGAAAATCC（配列番号６１）および5'-CTGGGCAAGCTTACTCGTCCTCCTGGAAGTAG（配列番号６２）をプライマーに用いて、クローン化ｃＤＮＡを有するプラスミドＩＲＡＮｐ９６９Ｇ０３５０Ｄ６ＩＬ１ＲＮ（ＲＺＰＤ社、ベルリン、ドイツ）から増幅した。第１のプライマーが５’末端にＫａｓＩ制限酵素認識部位、続いてＳａｐＩ制限酵素認識部位（下線）を含有するのに対し、第２のプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位（下線）を含有する。増幅産物を精製し、ＫａｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、適宜切断されたベクターｐＡＳＫ−ＩＢＡ４（ＩＢＡ社、ゲッティンゲン、ドイツ）とライゲートした。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換後、プラスミドを調製し、クローン化合成核酸インサートの配列を制限分析および自動化二本鎖ＤＮＡ配列決定により確認した。Ｎ末端Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩとの融合であるＩＬ１ｒａをコードするプラスミドを、ｐＡＳＫ−ＩＬ１ｒａと命名した（図２Ｅ）。
【００９８】
アミノ酸ポリマー配列ＰＡＳ（＃１）２００、ＰＡＳ（＃１）４００、ＰＡＳ（＃５）１９２、およびＰＡＳ（＃５）３８４、ｐＡＳＫ−ＩＬ１ｒａとの融合であるＩＬ−１ｒａをコードする発現プラスミドの構築については、ｐＡＳＫ−ＩＬ１ｒａをＳａｐＩで切断し、エビアルカリホスファターゼで脱リン酸化し、ＳａｐＩによる制限消化により対応する中間体プラスミドｐＰＡＳ（＃１）２００およびｐＰＡＳ（＃５）１９２からそれぞれ単離した、２００残基ＰＡＳ＃１ポリマーまたは１９２残基ＰＡＳ＃５ポリマーの過剰な遺伝子フラグメントとライゲートした（図２Ｆ）。大腸菌ＪＭ８３（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎ．（１９８５年）Ｇｅｎｅ  ３３：１０３〜１１９頁）を形質転換後、プラスミドを調製し、ライゲーション時に１つまたは幾つかの反復コピーにインサートされたポリマーコード領域のサイズを、制限分析により判定した。２００または４００残基ＰＡＳ＃１ポリマー配列を保有するＩＬ−１ｒａ、すなわちＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａまたはＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａをコードするプラスミド、および１９２または３８４残基ＰＡＳ＃５ポリマー配列、すなわちＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａまたはＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａを保有するプラスミドを、それぞれｐＡＳＫ−ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａ、ｐＡＳＫ−ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａ、ｐＡＳＫ−ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａ、およびｐＡＳＫ−ＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａと命名した。
【実施例４】
【００９９】
好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）のＰＡＳ＃１およびｐｉＳＡ融合タンパク質に対する発現ベクターの構築
ＮＧＡＬのＰＡＳ＃１およびｐｉＳＡ融合タンパク質の発現ベクターの構築については、実施例１からの対応する合成遺伝子フラグメントを、間にＥｃｏＯ  １０９Ｉ制限酵素認識部位保有するＣ末端Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ（Ｓｋｅｒｒａ、（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２６：２７１〜３０４頁）と融合したＮＧＡＬ変異体（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔ（２００６年）同上）のｃＤＮＡを保有する、ｐＡＳＫ７５誘導体（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９４年）Ｇｅｎｅ  １５１：１３１〜１３５頁）でクローニングした（図３Ａ）。ｐＮＧＡＬ１５−Ｅｃｏとも呼ばれるこのベクターを、ＥｃｏＯ  １０９Ｉで切断し、エビアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ社、クリーブランド、ＯＨ）で脱リン酸化し、ＰＡＳ＃１またはｐｉＳＡをコードする合成ＤＮＡフラグメントとライゲートした（図３Ｂ）。
【０１００】
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋ（１９８７年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：３７６〜３７８頁）を形質転換後、プラスミドを調製し、クローン化合成核酸インサートの配列を、制限分析、ならびにＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターキットおよび両側からの配列決定を可能にするオリゴデオシキヌクレオチドプライマーを用いた自動化二本鎖ＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ（商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ分析器）により確認した。ＰＡＳ（＃１）１００およびＰＡＳ（＃１）２００残基ポリマー配列を保有するＮＧＡＬ、すなわちＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００をコードするプラスミドを、それぞれｐＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびｐＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００（図３Ｃ）と命名した。ｐｉＳＡ１００残基ポリマー配列を保有するＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００をコードするプラスミドを、ｐＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００と命名した。
【実施例５】
【０１０１】
ＩＦＮａ２ｂと、遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃３、ＰＡＳ＃５、およびＰＡＳ＃１Ｐ２ポリマーとの間の融合タンパク質の細菌産生および精製
ＩＦＮａ２ｂ（計算された質量：２０．９ｋＤａ）、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ（計算された質量：３７．４ｋＤａ）、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ（計算された質量：５４．０ｋＤａ）、ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ（計算された質量：７０．５ｋＤａ）、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ（計算された質量：３６．７ｋＤａ）、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂ（計算された質量：５２．６ｋＤａ）を、組換えＦａｂフラグメントの生成に関する記載された手順（Ｓｃｈｉｗｅｃｋ（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２３：５６１〜５６５頁）に続いて、１００ｍｇ／ｌアンピシリンおよび３０ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを追加した合成グルコース無機培地を含む８Ｌ卓上発酵槽を用いて、フォールディングヘルパープラスミドｐＴＵＭ４（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ（２００６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２０：２７３〜２８４頁）と共に、実施例２からの対応する発現プラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マジソン、ＵＳＡ；Ｗｏｏｄ（１９６６年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６：１１８〜１３３頁）において産生した。組換え遺伝子発現は、培養物がＯＤ５５０＝２０に達するとすぐに、５００μｇ／ｌアンヒドロテトラサイクリン（Ｓｋｅｒｒａ（１９９４年）Ｇｅｎｅ  １５１：１３１〜１３５頁）を添加して誘導した。２．５時間の誘導期間の後、細胞を遠心分離により回収し、氷冷したペリプラズム分画緩衝液（５００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０；Ｌ当たり２ｍｌおよびＯＤ５５０）で１０分間再懸濁した。１５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２５０μｇ／ｍｌリゾチームを添加後、細胞懸濁液を氷上で２０分間インキュベートし、数回遠心分離し、組換えタンパク質を含有する透明な上清を回収した。ＩＦＮａ２ｂ変異体を、Ｎ末端に融合したＳｔｒｅｐ−タグＩＩ（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２６：２７１〜３０４頁）、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５またはＳ２００  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いたゲル濾過により精製した。
【０１０２】
ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂ（計算された質量：３７．４ｋＤａ）、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂ（計算された質量：３８．６ｋＤａ）、およびＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂ（計算された質量：３１．７ｋＤａ）を、１００ｍｇ／ｌアンピシリンおよび３０ｍｇ／ｌクロラムフェニコール含有２Ｌ  ＬＢ培地による振盪フラスコ培養を用いて、フォールディングヘルパープラスミドｐＴＵＭ４と共に、実施例２からの対応する発現プラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１において２２℃で産生した。外来遺伝子発現の誘導は、ＯＤ５５０＝０．５でアンヒドロテトラサイクリンにより一晩かけて行った（典型的には回収時に約１．０のＯＤ５５０となる）。1ｍｌ当たり５０μｇリゾチームを含有する、５００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０の存在下、ペリプラズム抽出を記載されたように実施し（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔ（２００５年）同上）、続いて高塩緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）によるストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）同上）を用いて、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩにより精製した。
【０１０３】
全ての組換えＩＦＮａ２ｂタンパク質に関し、ＩＦＮａ２ｂについては０．１５ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂについては０．１ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂについては０．０６ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂについては０．０４ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂについては０．０５ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂについては０．０５ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂについては０．０８ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ＃（５）３８４−ＩＦＮａ２ｂについては０．０４ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、およびＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂについては０．０５ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１の収量で、均一なタンパク質調製物を得た（図４Ａ／Ｂ／Ｃ）。
【０１０４】
インビトロ活性アッセイについては、タンパク質調製物におけるエンドトキシン汚染をさらに除去した。したがって、精製タンパク質を、ＰＢＳ（１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．４）に対し３回透析し、５０ｍｌ  スーパーループ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を備えたＡｋｔａ精製器１０システムおよびランニング緩衝液であるＰＢＳを用いて、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ１６／２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウプサラ、スウェーデン）に適用した。組換えタンパク質を含有する流出液を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター装置（３００００ＭＷＣＯ；１５ｍｌ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、ＭＡ）を用いた限外濾過により約１．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。追加のエンドトキシン除去ステップは、ＰＢＳをランニング緩衝液に用いるＥｎｄｏＴｒａｐ（登録商標）アフィニティーカラム（Ｐｒｏｆｏｓ  ＡＧ社、レーゲンスブルク、ドイツ）を用いて実施した。最終エンドトキシン含量は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳキット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ラルブレル、フランス）を用いた測定において１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で１ＥＵ／ｍｌより少なかった。
【０１０５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、高モル濃度トリス緩衝液系（Ｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｅｒｓｏｎ（１９８６年）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５５：８３〜８８頁）を用いて実施した。本発明によるＩＦＮａ２ｂおよびこのさまざまなポリマー融合は、芳香族酸を欠くためＵＶ吸収に寄与しなかったことから、本発明によるＩＦＮａ２ｂおよびこのさまざまなポリマー融合の両方のタンパク質濃度を、２３５９０Ｍ−１  ｃｍ−１の計算された吸光係数（Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ（１９８９年）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８２：３１９〜３２６頁）を用いて２８０ｎｍでの吸光により判定した。
【実施例６】
【０１０６】
ＩＬ−１ｒａと、遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１およびＰＡＳ＃５ポリマーとの間の融合タンパク質の細菌産生および精製
ＩＬ−１ｒａ（計算された質量：１９．８ｋＤａ）、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａ（計算された質量：３５．３ｋＤａ）、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａ（計算された質量：５１．９ｋＤａ）、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａ（計算された質量：３４．６ｋＤａ）、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａ（計算された質量：５０．５ｋＤａ）を、１００ｍｇ／ｌアンピシリンおよび３０ｍｇ／ｌクロラムフェニコール含有２Ｌ  ＬＢ培地による振盪フラスコ培養を用いて、２２℃でフォールディングヘルパープラスミドｐＴＵＭ４と共に、実施例３からの対応する発現プラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１において産生した。外来遺伝子発現の誘導は、ＯＤ５５０＝０．５でアンヒドロテトラサイクリンにより一晩かけて行った（典型的には回収時に約１．０のＯＤ５５０となる）。1ｍｌ当たり５０μｇリゾチームを含有する、５００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０の存在下、ペリプラズム抽出を記載されたように実施し（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔ（２００５年）同上）、続いて高塩緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）によるストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）同上）を用いて、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩにより精製した。
【０１０７】
全ての組換えＩＬ−１ｒａタンパク質に関し、ＩＬ−１ｒａについては０．１ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａについては０．１ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａについては０．０５ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａについては０．１ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａについては０．０４ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１の収量で、均一なタンパク質調製物を得た（図４Ｄ）。
【実施例７】
【０１０８】
ＮＧＡＬと、遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１およびｐｉＳＡポリマーとの間の融合タンパク質の細菌産生および精製
ＮＧＡＬ（計算された質量：２１．５ｋＤａ）を、基本的に、実施例４に記載された８Ｌ卓上発酵槽を用いて、発現プラスミドｐＮＧＡＬ１５を保有する大腸菌ＢＬ２１において産生した。ＮＧＡＬを、Ｃ末端に融合したＳｔｒｅｐ−タグＩＩ（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２６：２７１〜３０４頁）により精製した。
【０１０９】
ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００、およびＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００（それぞれ、計算された質量：２９．８ｋＤａ、３８．１ｋＤａ、および２９．４ｋＤａ）を、１００ｍｇ／ｌアンピシリン含有２Ｌ  ＬＢ培地による振盪フラスコ培養を用いて、実施例４からの対応する発現プラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１において２２℃で産生した。外来遺伝子発現の誘導は、ＯＤ５５０＝０．５でアンヒドロテトラサイクリンにより一晩かけて行った（典型的には回収時に約１．８のＯＤ５５０となる）。1ｍｌ当たり５０μｇリゾチームを含有する、５００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０の存在下、ペリプラズム抽出を記載されたように実施し（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔ（２００５年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：４８４〜４９３頁、続いて高塩緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）によるストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー（Ｓｋｅｒｒａ（２０００年）同上）を用いて、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩにより精製した。
【０１１０】
ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００に関し、ＮＧＡＬについては０．１ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００については０．５ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１、およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００については０．８ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１の収量で、ワンステップアフィニティークロマトグラフィー（図４Ｅ）後に均一なタンパク質調製物を得た。ＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５ＨＲ  １０／３００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いたゲル濾過によりさらに精製し、０．０１ｍｇ  Ｌ−１  ＯＤ−１を得た。
【０１１１】
メスのウィスターラットにおけるインビボＰＫ試験については、エンドトキシン汚染をさらに除去した。したがって、精製ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００タンパク質を、ＰＢＳに対し３回透析し、５０ｍｌ  スーパーループ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を備えたＡｋｔａ精製器１０システムおよびランニング緩衝液であるＰＢＳを用いて、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ１６／２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に適用した。組換えタンパク質を含有する流出液を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター装置（１００００ＭＷＣＯ；１５ｍｌ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、ＭＡ）を用いた限外濾過により約１．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。追加のエンドトキシン除去ステップは、ＰＢＳをランニング緩衝液に用いるＥｎｄｏＴｒａｐ（登録商標）アフィニティーカラム（Ｐｒｏｆｏｓ  ＡＧ社、レーゲンスブルク、ドイツ）を用いて実施した。最終エンドトキシン含量は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳキット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ラルブレル、フランス）を用いた測定において１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で５．１７から２１．９ＥＵ／ｍｌの間であった。
【実施例８】
【０１１２】
分析的ゲル濾過による、ＩＦＮａ２ｂと、異なる長さの遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃３、ＰＡＳ＃５またはＰＡＳ＃１Ｐ２ポリマーとの間の組換え融合タンパク質の流体力学的体積の測定
ゲル浸透クロマトグラフィーを、ランニング緩衝液であるＰＢＳ（１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．４）によりＡｋｔａ精製器１０システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、流速１ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ＨＲ  １０／３００  ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上で実施した。実施例５に記載されたＳｔｒｅｐ−タグＩＩアフィニティークロマトグラフィーから得られた、精製ＩＦＮａ２ｂおよび２００、４００および６００残基を有するこのＰＡＳ＃１ポリマー融合、または２００残基を有するＰＡＳ＃２およびＰＡＳ＃３ポリマー、または１９２および３８４残基を有するＰＡＳ＃５ポリマー融合、または１４０残基を有するＰＡＳ＃１Ｐ２ポリマーの試料２５０μｌは、ＰＢＳ中０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で個々に適用した。全ての６つのタンパク質を、図５Ａ／Ｂ／Ｄに示されたように単一の均一なピークとして溶出した。
【０１１３】
図５Ｃ／Ｅに示されたカラムキャリブレーションについては、以下の球状タンパク質（Ｓｉｇｍａ社、ダイゼンホーフェン、ドイツ）の混合物２５０μｌを、ＰＢＳで適用した：ＲＮａｓｅ  Ａ（０．２ｍｇ／ｍｌ）、炭酸脱水酵素（０．２ｍｇ／ｍｌ）、オボアルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）およびアルコール脱水素酵素（０．４ｍｇ／ｍｌ）。
【０１１４】
結果として、２００、４００および６００残基を有するＰＡＳ＃１ポリマーならびに１９２および３８４残基を有するＰＡＳ＃５ポリマーを有する融合タンパク質は、同じ分子量を有する対応する球状タンパク質より有意に大きなサイズを示した。ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂのサイズの増大は、非融合ＩＦＮａ２ｂタンパク質に比べて、それぞれ８．４倍、１６．５倍および２４．９倍であった。対照的に、真の質量は、１．８倍、２．６倍および３．４倍大きいのみであった。ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂのサイズ増大は、非融合ＩＦＮａ２ｂタンパク質に比べて、それぞれ７．７倍および１３．３倍であった。これらのケースでは真の質量は１．８倍および２．５倍大きいのみであった。
【０１１５】
同様に、２００残基を有するＰＡＳ＃２およびＰＡＳ＃３ポリマーを有する融合タンパク質は、同じ分子量を有する対応する球状タンパク質より有意に大きなサイズを示した。ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂのサイズの増大は、非融合ＩＦＮａ２ｂタンパク質に比べて、それぞれ８倍および７倍であった。対照的に、真の質量は、両方のケースで１．８倍大きいのみであった。１４０残基を有するＰＡＳ＃１Ｐ２ポリマーを有する融合タンパク質も、同じ分子量を有する対応する球状タンパク質より大きなサイズを示した。しかし、ＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂのサイズの増大が、非融合ＩＦＮａ２ｂタンパク質に比べてちょうど３倍であったのに対し、真の質量はちょうど１．５倍大きかった。故に、プロリン残基数が減少した（ＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０で１４）ＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂのサイズの増大はあまり顕著でなかった。これは、該アミノ酸ポリマー配列のランダムコイル特性に対するＰｒｏ含量の大きな影響を示している。
【０１１６】
一般に、これらの観察は明らかに、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマー配列がランダムコイルコンフォメーションをとる場合、当然予想されるような大幅に増加した流体力学的体積（Ｓｑｕｉｒｅ（１９８１年）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ２１０：４３３〜４４２頁）の影響を示している。
【実施例９】
【０１１７】
分析的ゲル濾過による、ＩＬ−１ｒａと、異なる長さの遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１およびＰＡＳ＃５ポリマーとの間の組換え融合タンパク質の流体力学的体積の測定
ゲル浸透クロマトグラフィーを、実施例８に記載されたようにＡｋｔａ精製器１０システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、流速１ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ＨＲ  １０／３００  ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上で実施した。全ての５つのタンパク質を、図５Ｆに示されたように単一の均一なピークとして溶出した。
【０１１８】
図５Ｇに示されたようにカラムキャリブレーションについては、以下の球状タンパク質（Ｓｉｇｍａ社、ダイゼンホーフェン、ドイツ）の混合物２５０μｌを、ＰＢＳで適用した：ＲＮａｓｅ  Ａ（０．２ｍｇ／ｍｌ）、炭酸脱水酵素（０．２ｍｇ／ｍｌ）、オボアルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）およびアルコール脱水素酵素（０．４ｍｇ／ｍｌ）。
【０１１９】
結果として、２００および４００残基を有するＰＡＳ＃１ポリマーならびに１９２および３８４残基を有するＰＡＳ＃５ポリマーを有する融合タンパク質は、同じ分子量を有する対応する球状タンパク質より有意に大きなサイズを示した。ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａおよびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａのサイズの増大は、非融合ＩＬ−１ｒａタンパク質に比べて、それぞれ８倍および１７倍であった。対照的に、真の質量は、１．８倍および２．６倍大きいのみであった。ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａのサイズ増大は、非融合ＩＬ−１ｒａタンパク質に比べて、それぞれ７倍および１５倍であった。これらのケースでは真の質量は１．７倍および２．５倍大きいのみであった。
【０１２０】
この場合もやはり、これらの観察は明らかに、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマー配列がランダムコイルコンフォメーションをとる場合、当然予想されるような大幅に増加した流体力学的体積（Ｓｑｕｉｒｅ（１９８１年）同上）の影響を示している。
【実施例１０】
【０１２１】
分析的ゲル濾過による、ＮＧＡＬと、遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１およびｐｉＳＡポリマーとの間の組換え融合タンパク質の流体力学的体積の測定
ゲル浸透クロマトグラフィーを、実施例８に記載されたようにＡｋｔａ精製器１０システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、流速０．５ｍｌ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５  ＨＲ  １０／３００  ＧＬカラムまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ＨＲ  １０／３００  ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）上で実施した。全ての４つのタンパク質（ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００およびＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００）を、図５Ｈに示されたように単一の均一なピークとして溶出した。
【０１２２】
図５Ｉに示されたカラムキャリブレーションについては、以下の球状タンパク質（Ｓｉｇｍａ社、ダイゼンホーフェン、ドイツ）の混合物２５０μｌを、ＰＢＳで適用した：
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５  １０／３００  ＧＬランについては、アプロチニン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、リボヌクレアーゼ（０．４ｍｇ／ｍｌ）、ミオグロビン（０．２ｍｇ／ｍｌ）、炭酸脱水酵素（０．２ｍｇ／ｍｌ）、オボアルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）およびトランスフェリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）；
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００  ＧＬランについては、シトクロムｃ（０．２ｍｇ／ｍｌ）、炭酸脱水酵素（０．２ｍｇ／ｍｌ）、オボアルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）およびアルコール脱水素酵素（０．４ｍｇ／ｍｌ）。
【０１２３】
結果として、１００残基を有するＰＡＳ＃１ポリマーおよび、さらにより顕著な２００残基を有するバージョンを有する融合タンパク質は、同じ分子量を有する対応する球状タンパク質より有意に大きなサイズを示した。ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００のサイズの増大は、非融合ＮＧＡＬタンパク質に比べて、それぞれ３．４倍および４．９倍であった。真の質量は、それぞれ１．４倍および１．８倍大きいのみであった。これらの測定結果は、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマー配列がランダムコイルコンフォメーションをとる場合に当然予想される大きな流体力学的体積（Ｓｑｕｉｒｅ（１９８１年）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ２１０：４３３〜４４２頁）による影響を明確に示すものである。
【０１２４】
対照的に、１００残基を有するｐｉＳＡポリマーを有する融合タンパク質は、同じ分子量を有する対応する球状タンパク質に比べて有意ではないサイズの増大を示した。ＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００のサイズの増大は、真の質量が１．４倍大きかった非融合ＮＧＡＬタンパク質に比べてちょうど２．５倍であった。故に、１００残基Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーを有する融合は、１００残基Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーを有するより流体力学的体積の有意に大きな増大をもたらす。
【実施例１１】
【０１２５】
円二色性分光法による、ＩＦＮａ２ｂと融合した遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１ポリマーのランダムコイルコンフォメーションの検出
２次構造を、石英キュベット１０６−ＱＳ（０．１ｍｍパス長；Ｈｅｌｌｍａ社、ムルハイム、ドイツ）を備えたＪ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ社、グロースウムシュタット、ドイツ）を用いて分析した。スペクトルは、５０ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｋ−リン酸  ｐＨ７．５中１５．９〜３８．７μＭタンパク質溶液を用いて、１６または３２ラン（バンド幅１ｎｍ、スキャン速度１００ｎｍ／分、レスポンス４秒）を積算して室温で１９０〜２５０ｎｍを記録した。溶液のブランクを補正後、機器ソフトウェアを用いてスペクトルを平滑化し、モル楕円率ΘＭを方程式により計算した：
【０１２６】
【数２】
2010531139.tif 000004
ΘＭは測定された楕円率、ｃはタンパク質濃度［ｍｏｌ／ｌ］、ｄは石英キュベットのパス長［ｃｍ］を意味する。ΘＭ値を、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、リーディング、ＰＡ）を用いて波長に対してプロットした。組換えＩＦＮａ２ｂの円二色性（ＣＤ）スペクトルが、このα−ヘリックスバンドルタンパク質について以前に発表されたデータ（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ（１９９６年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１４５３〜１４６３頁）と一致するのに対し、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂのスペクトルは、ランダムコイルコンフォメーションの著しい寄与を明らかにする（図６Ａ）。より詳細に該ポリマー融合パートナーによる分光学的寄与を分析するため、非融合ＩＦＮａ２ｂに関してモル差ＣＤスペクトルを計算した（図６Ｂ）。結果として、１００から２００残基への増幅の増大に伴い、ランダムコイルコンフォメーションの特徴である２００ｎｍ付近の強い極小（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）を観察した。故に、組換え融合タンパク質の一部であるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ配列は、生理学的緩衝条件下でランダムコイルポリマーとして存在するように思われる。
【実施例１２】
【０１２７】
円二色性分光法による、ＩＦＮａ２ｂと融合した遺伝的にコードされたＰＡＳ＃５ ポリマーのランダムコイルコンフォメーションの検出
２次構造を、２．３〜５．１μＭタンパク質溶液を用いて実施例１１に記載されたようにＣＤにより分析した。ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂのスペクトルは、ランダムコイルコンフォメーションの著しい寄与を明らかにする（図６Ｅ）。より詳細に該ポリマー融合パートナーによる分光学的寄与を分析するため、非融合ＩＦＮａ−２ｂに関してモル差ＣＤスペクトルを計算した（図６Ｆ）。結果として、ランダムコイルコンフォメーションの特徴である２００ｎｍ付近の強い極小（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）を観察した。故に、組換え融合タンパク質の一部であるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ配列は、生理学的緩衝条件下でランダムコイルポリマーとして存在するように思われる。
【実施例１３】
【０１２８】
円二色性分光法による、ＩＦＮａ２ｂと融合した遺伝的にコードされたＰＡＳ＃２、ＰＡＳ＃３およびＰＡＳ＃１Ｐ２ポリマーのランダムコイルコンフォメーションの検出
２次構造を、１６．１〜２２．９μＭタンパク質溶液を用いて実施例１１に記載されたようにＣＤにより分析した。ＰＡＳ（＃２）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃３）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１Ｐ２）１４０−ＩＦＮａ２ｂのスペクトルは、ランダムコイルコンフォメーションの著しい寄与を明らかにする（図６Ｃ）。より詳細に該ポリマー融合パートナーによる分光学的寄与を分析するため、非融合ＩＦＮａ２ｂに関してモル差ＣＤスペクトルを計算した（図６Ｄ）。結果として、ランダムコイルコンフォメーションの特徴である２００ｎｍ付近の極小（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）を観察した。故に、組換え融合タンパク質の一部であるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ配列は、生理学的緩衝条件下でランダムコイルポリマーとして存在するように思われる。しかし、プロリン残基数の減少したＰＡＳ＃１Ｐ２ポリマーのケースでは、ランダムコイルに対するＣＤシグナルは有意に減少する。これは、アミノ酸ポリマー配列におけるＰｒｏ含量へのランダムコイル特性の依存を示している。
【実施例１４】
【０１２９】
円二色性分光法による、ＩＬ−１ｒａと融合した遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１およびＰＡＳ＃５ポリマーのランダムコイルコンフォメーションの検出
２次構造を、０．９〜３．３μＭタンパク質溶液を用いて実施例１１に記載されたようにＣＤにより分析した。組換えＩＬ−１ｒａの円二色性（ＣＤ）スペクトルが、この主にβ−シートであるタンパク質（predominantly β-sheet protein）の結晶構造（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：１９４〜２００頁）と一致するのに対し、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＬ１ｒａ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＬ１ｒａ、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＬ１ｒａのスペクトルは、ランダムコイルコンフォメーションの著しい画分を明らかにする（図６Ｇ）。より詳細に該ポリマー融合パートナーによる分光学的寄与を分析するため、非融合ＩＬ−１ｒａに関してモル差ＣＤスペクトルを計算した（図６Ｈ）。結果として、ランダムコイルコンフォメーションの特徴である２００ｎｍ付近の強い極小（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）を観察した。故に、ＩＬ−１ｒａの組換え融合タンパク質の一部であるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ配列は、生理学的緩衝条件下でランダムコイルポリマーとして存在するように思われる。
【実施例１５】
【０１３０】
円二色性分光法による、ＮＧＡＬと融合した遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１ポリマーのランダムコイルコンフォメーションの検出
２次構造を、２３〜２８μＭタンパク質溶液を用いて実施例１１に記載されたようにＣＤにより分析した。組換えＮＧＡＬのＣＤスペクトルが、以前に発表されたデータ（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔ（２００６年）同上）と一致するのに対し、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００のスペクトルは、ランダムコイルコンフォメーションの著しい寄与を明らかにする（図６Ｉ）。より詳細に該ポリマー融合パートナーによる分光学的寄与を分析するため、非融合ＮＧＡＬに関してモル差ＣＤスペクトルを計算した（図６Ｊ）。結果として、ランダムコイルコンフォメーションの特徴である２００ｎｍ付近の強い極小（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）を観察した。故に、組換え融合タンパク質の一部であるＰｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ配列は、生理学的緩衝条件下でランダムコイルポリマーとして存在するように思われる。
【実施例１６】
【０１３１】
円二色性分光法による、ＮＧＡＬと融合した遺伝的にコードされたｐｉＳＡポリマーのβ−シートコンフォメーションの検出
２次構造を、５μＭタンパク質溶液を用いて実施例１１に記載されたように分析した。ＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００のスペクトルは、β−シートコンフォメーションの著しい含量を明らかにする（図６Ｋ）。より詳細に該ポリマー融合パートナーによる分光学的寄与を分析するため、非融合ＮＧＡＬに関してモル差ＣＤスペクトルを計算した（図６Ｋ）。結果として、β−シートコンフォメーションの特徴である２１８ｎｍでの強い極小（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（１９６９年）同上；Ｓｒｅｅｒａｍａ（２０００年）同上；Ｆａｎｄｒｉｃｈ（２００２年）同上）を観察した。故に、組換え融合タンパク質の一部であるＡｌａ−Ｓｅｒポリマー配列は、生理学的緩衝条件下で主にコンパクトなβ−シート２次構造をとるように思われる。
【実施例１７】
【０１３２】
ＩＦＮａ２ｂ、ＮＧＡＬ、およびこれらのポリマー融合の２次構造の定量分析
ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂ、ＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００、およびＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００の２次構造を、複合ＣＤスペクトルのデコンボリューションに対する３３ベーススペクトルセットにより、２次構造デコンボリューションプログラムＣＤＮＮバージョン２．１（Ｂｏｈｍ（１９９２年）Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ５：１９１〜１９５頁）を用いて、実施例１１、１２、１５および１６で測定された対応するＣＤスペクトルから定量化した。前記デコンボリューションプログラムＣＤＮＮを用いて得られた結果を、以下の表に提供する：
【０１３３】
【表２】
2010531139.tif 000005
【０１３４】
組換えＩＦＮａ２ｂの主にα−ヘリカルな（predominantly α-helical）２次構造含量（α−ヘリックスバンドルタンパク質（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ（１９９６年）同上）としてのこの既知の３次元構造と一致する）に比べて、ランダムコイルおよびタンパク質全体のターンを含む構造化されていないコンフォメーションの画分は、ＩＦＮａ２ｂに融合したＰＡＳ（＃１）およびＰＡＳ（＃５）ポリマーの長さにより明らかに増大する（プログラムＣＤＮＮによるＣＤスペクトルデコンボリューションの結果を要約する、上記に示した表の最下段の行を参照されたい）。概ね似ているがそれほど顕著ではない影響を、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００について見ることができる。これらの分光学的データは、実施例８および１０で判定されたようなＩＦＮａ２ｂおよびＮＧＡＬのＰＡＳ（＃１）およびＰＡＳ（＃５）融合タンパク質の実験的に判定された流体力学的体積の拡大と一致する。これは、構造化されていないランダムコイルコンフォメーション対して当然予想される（Ｃａｎｔｏｒ（１９８０年）同上；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９３年）同上）。
【０１３５】
対照的に、ＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００融合タンパク質のケースでは、ターンおよびランダムコイルの量が組換えＮＧＡＬよりもさらに低いのに対し、逆平行β−シート量はＮＧＡＬでの３８．３％からＮＧＡＬ−ｐｉＳＡ１００での５０．０％に増大する。故に、ＳｅｒおよびＡｌａ残基のみを含むｐｉＳＡ１００ポリマーは、ランダムコイルよりむしろβ−シート構造をとる。これは、実施例１０で測定されたような流体力学的体積のそれほど有意ではない増大に反映されている。
【０１３６】
ＰＡＳ＃１、ＰＡＳ＃５、およびｐｉＳＡポリマー配列の理論的分析を、チョウ−ファスマンアルゴリズム（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ（１９７４年）同上）を用いて実施した場合、異なる結果が得られた。この分析の結果を図１４に図示する。アミノ酸ポリマーのアミノ酸組成物および配列に関係なく、このアルゴリズムは５０％を超えるα−ヘリックス２次構造を予測する。これは、実験データとは明らかに対照的である。故に、このアルゴリズムは、アミノ酸ポリマーの構造化されていないコンフォメーションを自信を持って予測するには有用ではない。
【実施例１８】
【０１３７】
ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂの血清安定性テスト
ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂの血清安定性を、濃度１ｍｇ／ｍｌでの１０μｌテストタンパク質および５０μｌマウス血漿（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ギルバーツビル、ＰＡ）を混合して分析し、テストタンパク質濃度０．１７ｍｇ／ｍｌおよび血漿濃度８３％（ｖ／ｖ）という結果となった。試料を３７℃で２４時間または４８時間インキュベートした。試料（６μｌ）を、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂのケースでは０時間、１時間、３時間、６時間、８時間、および２４時間で、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂのケースでは０時間、１時間、３時間、６時間、８時間、２４時間、３２時間、および４８時間で採取し、５４μｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１９０ｍＭグリシン、１ｇ／ｌＳＤＳ）および１５μｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２５％（ｖ／ｖ）グリセリン、７．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２５ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー、１２．５％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール）で直ちに希釈した。９５℃で５分間加熱後、これらの試料および参照試料２５μｌ（対応するテストタンパク質０．１μｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。半乾燥ブロッティング装置によりニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社、ダッセル、ドイツ）へのエレクトロトランスファー後、メンブレンをディッシュに入れ、１０ｍｌ  ＰＢＳＴ（０．１％ｖ／ｖ  トゥィーン２０含有ＰＢＳ）により２０分間に３回洗浄した。メンブレンを、２μｇ／ｍｌ卵白アビジン含有２０ｍｌ  ＰＢＳＴで１０分間インキュベートして内因性タンパク質結合ビオチン群をマスクし、次いで２０μｌのＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）アルカリホスファターゼ複合体（ＩＢＡ社、ゲッティンゲン、ドイツ）を、（１：１０００の希釈で）直接添加した。１時間のインキュベーション、ならびにメンブレンを２０ｍｌ  ＰＢＳＴおよびＰＢＳによる５分間に２回の洗浄、および２０ｍｌ  ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）による５分間に１回の洗浄の後、５μｌニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、Ｂｉｏｍｏｌ社、ハンブルグ、ドイツ；７０％ｗ／ｖ  ＤＭＦ中７５ｍｇ／ｍｌ）および３０μｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート  ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ、Ｒｏｔｈ社、カールスルーエ、ドイツ；ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍｌ）をＡＰ緩衝液１０ｍｌに添加して、バンドが現れるまで色素産生反応を（振盪せずに）実施した。メンブレンを水で洗浄し風乾して反応を停止した。
【０１３８】
両方のテストタンパク質について、ブロットは全ての時点の一定強度のシグナルを明らかにする（図７Ａ／Ｂ）。また、分解産物を検出することはできなかった。故に、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂについては２４時間、およびＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂについては４８時間の調査期間内でテストタンパク質の減少の原因となり得るタンパク質分解または凝集徴候はない。
【実施例１９】
【０１３９】
ＩＦＮａ２ｂと、遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１ポリマーとの間の組換え融合タンパク質のインビボでの延長した血漿半減期の検出
次の表に従い、成体ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ−Ｗｉｎｃｋｅｌｍａｎｎ社、ボルヒェン、ドイツ）に静脈注射した。
【０１４０】
【表３】
2010531139.tif 000006
【０１４１】
静脈投与したテストアイテムの全容積を、投与日に記録した個々の体重により計算した（例えば２５ｇ体重（ｂ．ｗ．）の動物は、１ｍｇ／ｍｌテストアイテム１２５μｌを受け取った）。血液採取は次の表に従い注射後３０分、１２０分、および３６０分に実施した：
【０１４２】
【表４】
2010531139.tif 000007
【０１４３】
各物質について、各群のうち２匹の動物に注射した。血液試料（各約１００μｌ）を尾静脈から採取し、砕いた氷の上で約２０分間保管した。４℃、１００００ｇで１０分間の遠心分離後、上清（血漿）を直ちに凍結させ−２０℃で保管した。
【０１４４】
ウェスタンブロットでの融合タンパク質の定量的検出については、透明な血漿試料の１０μｌアリコートを９０μｌ  ＰＢＳにより希釈した。この１０μｌ（１μｌ血漿に相当）を６μｌ  ＰＢＳで希釈し、１２．５％ｖ／ｖ２−メルカプトエタノールを含有する４μｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、７．５％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、２５％ｖ／ｖグリセロール、０．２５ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーと混合した。９５℃で５分間加熱後、これらの試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。半乾燥ブロッティング装置によりニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社、ダッセル、ドイツ）へのエレクトロトランスファー後、メンブレンをディッシュに入れ、１０ｍｌ  ＰＢＳＴ（０．１％ｖ／ｖ  トゥィーン２０含有ＰＢＳ）により２０分間に３回洗浄した。次いでメンブレンを、マウス抗ヒトＩＦＮａ２ｂ抗体９Ｄ３（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ；１：１０００の希釈で）２０μｌ含有２０ｍｌ  ＰＢＳＴで１０分間インキュベートした。さらに６０分間インキュベーションした後、メンブレンを１０ｍｌ  ＰＢＳＴで２０分間に３回洗浄し、次いで抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＭＯ）と共に６０分間インキュベーションした。
【０１４５】
メンブレンを２０ｍｌ  ＰＢＳＴにより５分間で２回、および２０ｍｌ  ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）により５分間に１回洗浄した後、５μｌニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、Ｂｉｏｍｏｌ社、ハンブルグ、ドイツ；７０％ｗ／ｖ  ＤＭＦ中７５ｍｇ／ｍｌ）および３０μｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート  ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ、Ｒｏｔｈ社、カールスルーエ、ドイツ；ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍｌ）をＡＰ緩衝液１０ｍｌに添加して、バンドが現れるまで色素発生反応を（振盪せずに）実施した。メンブレンを水で洗浄し風乾して反応を停止した。
【０１４６】
図８は、同等の時点からのＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂを含有する試料を示す。ＩＦＮａ２ｂが１２０分後にはもはや検出できないのに対し、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂは、３６０分までの期間検出することができる。これらのデータは、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーと融合した場合、ＩＦＮａ２ｂの血漿半減期は有意に延長することを示している。
【０１４７】
ＥＬＩＳＡでの融合タンパク質の定量的検出については、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ社、デンマーク）のウェルを、５％（ｗ／ｖ）ＮａＣＨＯ３  ｐＨ９．３中のマウス抗ヒトＩＦＮａ２ｂ抗体９Ｄ３（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ）５μｇ／ｍｌ溶液１００μｌにより４℃で一晩コートした。コーティング溶液を除去後、ウェルをＰＢＳ中２００μｌの２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１時間ブロックし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。動物ｎｏ．１／２（ＩＦＮａ２ｂ）、ｎｏ．３／４（ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ）、およびｎｏ．５／６（ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ）の血漿試料を、未処置動物由来の０．５％（ｖ／ｖ）マウス血漿を含有するＰＢＳＴで希釈系列に適用し、１時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴで２次マウス抗ヒトＩＦＮａ２ｂ抗体ＨＲＰ複合体（４Ｅ１０−ＨＲＰ；Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ）の１：１０００希釈溶液１００μｌと共に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで２回洗浄、およびＰＢＳで２回洗浄後、ペルオキシダーゼの基質としてＡＢＴＳ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、マンハイム、ドイツ）に１ｍｇ／ｍｌ  ＡＢＴＳ溶液１００μｌを添加して色素産生反応を開始し、２５℃で２０分後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。血漿試料中のＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂの濃度を、標準曲線（未処置動物由来の０．５％（ｖ／ｖ）マウス血漿を含有するＰＢＳＴにおいて、定義した濃度で対応する精製組換えタンパク質の希釈系列について判定した）との比較により定量化した。
【０１４８】
ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂの血漿半減期を推定するため、濃度値、ｃ（ｔ）をＥＬＩＳＡ測定から各時点について判定し、静脈注射後時間、ｔに対してプロットした。これらのデータは、方程式
【０１４９】
【数３】
2010531139.tif 000008
により、単一指数減衰と仮定してＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いて数値的に適合させた。ここで、τ１／２は血漿半減期、ｃ０は時点ゼロでの総血液濃度（平均動物体重を２５ｇ、およびマウスの体重に対する血液の典型的な比を０．０６４と仮定して、固定値７８μｇ／ｍｌを定めた）である。
【０１５０】
図９は、インビボでの血中クリアランス動態を示す。組換えＩＦＮａ２ｂがちょうど約５．５分の半減期で血液からの急速なクリアランスを示すのに対し、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ融合タンパク質は、それぞれ１０倍および６０倍を超える、約６１分および６時間の延長した半減期を有する。これらのデータは、上記に示したウェスタンブロット分析と一致しており、ＩＦＮａ２ｂのインビボ血漿半減期が、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーとの融合により有意に延長する（半減期はアミノ酸ポリマーの長さの増大に伴い長くなる）ことを証明している。
【実施例２０】
【０１５１】
ＩＦＮａ２ｂと、遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１およびＰＡＳ＃５ポリマーとの間の組換え融合タンパク質のインビボでの延長した血漿半減期の検出
次の表に従い、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ラルブレル、フランス）に静脈注射した。
【０１５２】
【表５】
2010531139.tif 000009
【０１５３】
静脈投与したテストアイテムの全容積を、投与日に記録した個々の体重により算出した（例えば１８ｇ体重（ｂ．ｗ．）の動物は、１ｍｇ／ｍｌテストアイテム１２５μｌを受け取った）。血液採取は次の表に従い注射後３０分、１２０分、２４０分、および４８０分に実施した：
【０１５４】
【表６】
2010531139.tif 000010
【０１５５】
各物質について、各群のうち２匹の動物に注射した。血液試料（各約１００μｌ）を尾静脈から採取し、砕いた氷の上で約２０分間保管した。４℃、１００００ｇで１０分間の遠心分離後、上清（血漿）を直ちに凍結させ−２０℃で保管した。
【０１５６】
ＥＬＩＳＡでの融合タンパク質の定量的検出については、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ社、デンマーク）のウェルを、５％（ｗ／ｖ）ＮａＣＨＯ３  ｐＨ９．３中のマウス抗ヒトＩＦＮａ２ｂ抗体９Ｄ３（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ）５μｇ／ｍｌ溶液１００μｌにより４℃で一晩コートした。コーティング溶液を除去後、ウェルをＰＢＳ中２００μｌの２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１時間ブロックし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。動物ｎｏ．１／２（ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ）、ｎｏ．３／４（ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ）、およびｎｏ．５／６（ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ）、ｎｏ．７／８（ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ）、およびｎｏ．９／１０（ＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂ）の血漿試料を、ダミーマウス血漿（未処置動物由来の）０．２５％（ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳＴで希釈系列に適用し、１時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴ中で２次マウス抗ヒトＩＦＮａ２ｂ抗体ＨＲＰ複合体（４Ｅ１０−ＨＲＰ；Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ）の１：１０００希釈溶液１００μｌと共に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで２回洗浄、およびＰＢＳで２回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌ  ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質溶液１００μｌを推奨緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、マンハイム、ドイツ）に添加して色素産生反応を開始し、２５℃で２０分間のインキュベーション後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。血漿試料中のＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂの濃度を、標準曲線（０．２５％（ｖ／ｖ）ダミーマウス血漿を含有するＰＢＳＴにおいて、定義した濃度で対応する精製組換えタンパク質の希釈系列について判定した）との比較により定量化した。
【０１５７】
ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ、ＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂ、およびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂの血漿半減期を推定するため、濃度値、ｃ（ｔ）をＥＬＩＳＡ測定から各時点について判定し、静脈注射後時間、ｔに対してプロットした。これらのデータは、方程式
【０１５８】
【数４】
2010531139.tif 000011
により、単一指数減衰と仮定してＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いて数値的に適合させた。ここで、τ１／２は血漿半減期、ｃ０は時点ゼロでの総血液濃度（平均動物体重を１８ｇ、およびマウスの体重に対する血液の典型的な比を０．０６４と仮定して、約１１６μｇ／ｍｌの値を有するはず）である。
【０１５９】
図１０は、インビボでの血中クリアランス動態を示す。ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂの半減期は約６６分であり、実施例１９におけるＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂの６１分の半減期と一致するが、７ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．に比べて低投与量の５ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．をここでは使用した。故に、マウス系および投与量の変動は、薬物動態に有意な影響を及ぼさなかった。ＰＡＳ（＃１）４００−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃１）６００−ＩＦＮａ２ｂ融合タンパク質は、アミノ酸ポリマー配列に融合されない組換えＩＦＮａ２ｂに比べて、それぞれ６０倍および７０倍を超える、約３１６分および４０６分の延長した半減期を有する。ＰＡＳ（＃５）１９２−ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡＳ（＃５）３８４−ＩＦＮａ２ｂ融合タンパク質は、それぞれ７倍および５８倍を超える、約４０分および３２１分の延長した半減期を有する。これらのデータは、ＩＦＮａ２ｂのインビボ血漿半減期が、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーとの融合により有意に延長する（半減期はアミノ酸ポリマーの長さの増大に伴い長くなる）ことを示している。
【実施例２１】
【０１６０】
ＮＧＡＬと、遺伝的にコードされたＰＡＳ＃１ポリマーとの間の組換え融合タンパク質のインビボでの延長した血漿半減期の検出
次の表に従い、成体メスウィスターラットに静脈注射した：
【０１６１】
【表７】
2010531139.tif 000012
【０１６２】
静脈投与したテストアイテムの全容積を、投与日に記録した個々の体重により算出した（例えば２１０ｇ体重（ｂ．ｗ．）の動物ｎｏ．１０４は、１ｍｇ／ｍｌＮＧＡＬ１０５０μｌを受け取った）。血液採取は次の表に従い注射後５分、１０分、３０分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分、および１４４０分に実施した：
【０１６３】
【表８】
2010531139.tif 000013
【０１６４】
各物質について、各群のうち２匹の動物を必要とし、各々が異なる時点で４つの試料を提供することで、実験を２重に実施した。血液試料（各約０．５μｌ）を軽微なエーテル麻酔下、後眼窩静脈叢（retro-orbital plexus）からパスツールピペットで採取し、リチウムヘパリン−Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）バイアルに直ちに移し、手で振盪し、砕いた氷の上で約２０分間保管した。４℃、１００００ｇで１０分間の遠心分離後、上清（血漿）を直ちに凍結させ−８０℃で保管した。動物を最終血液採取直後にエーテル吸入により屠殺した。
【０１６５】
ウェスタンブロットでの融合タンパク質の定量的検出については、透明な血漿試料の１００μｌアリコートを４００μｌ  ＰＢＳにより希釈した。この１．２５μｌ（０．２５μｌ血漿に相当）を１４．７５μｌ  ＰＢＳで希釈し、１２．５％ｖ／ｖ２−メルカプトエタノールを含有する４μｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、７．５％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、２５％ｖ／ｖグリセロール、０．２５ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーと混合した。９５℃で５分間加熱後、これらの試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。半乾燥ブロッティング装置によりニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社、ダッセル、ドイツ）へのエレクトロトランスファー後、メンブレンをディッシュに入れ、１０ｍｌ  ＰＢＳＴ（０．１％ｖ／ｖ  トゥィーン２０含有ＰＢＳ）により２０分間に３回洗浄した。次いでメンブレンを、２μｇ／ｍｌ卵白アビジン含有２０ｍｌ  ＰＢＳＴで１０分間インキュベートして内因性タンパク質結合ビオチン群をマスクし、次いで２０μｌのＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）アルカリホスファターゼ複合体（ＩＢＡ社、ゲッティンゲン、ドイツ）を、（１：１０００の希釈で）直接添加し、インキュベートを６０分間継続した。
【０１６６】
メンブレンを２０ｍｌ  ＰＢＳＴで５分間に２回、および２０ｍｌ  ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）により５分間に１回洗浄した後、５μｌニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、Ｂｉｏｍｏｌ社、ハンブルグ、ドイツ；７０％ｗ／ｖ  ＤＭＦ中７５ｍｇ／ｍｌ）および３０μｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート  ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ、Ｒｏｔｈ社、カールスルーエ、ドイツ；ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍｌ）をＡＰ緩衝液１０ｍｌにバンドが現れるまで添加して、色素発生反応を（振盪せずに）実施した。メンブレンを水で洗浄し風乾して反応を停止した。
【０１６７】
図１１は、同等の時点からのＮＧＡＬ、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００、およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００を含有する混合試料の２つの系列を示す。ＮＧＡＬが１０分後にはもはや検出できないのに対し、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）１００およびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００は、１２０分までの期間検出することができる。これらのデータは、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーと融合した場合、ＮＧＡＬの血漿半減期は有意に延長することを示している。
【０１６８】
ＥＬＩＳＡでの融合タンパク質の定量的検出については、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ社、デンマーク）のウェルを、ＰＢＳ中で抗ヒトリポカリン−２／ＮＧＡＬ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、ＭＮ）５μｇ／ｍｌ溶液５０μｌにより４℃で一晩コートした。ＰＢＳＴにより３回洗浄後、ウェルをＰＢＳＴ中２００μｌの３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで２時間ブロックし、ＰＢＳＴにより再度３回洗浄した。動物１０４／１０５（ＮＧＡＬ）および１１６／１１７（ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００）の血漿試料を、未処置動物（Ｅｌｅｖａｇｅ  Ｊａｎｖｉｅｒ社、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  ＳＴ．Ｉｓｌｅ、フランス；Ａｕｒｉｇｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、トゥツィング、ドイツ）由来の２．５％（ｖ／ｖ）ラット血漿を含有するＰＢＳＴ中で希釈系列に適用し、１．５時間インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳＴにより３回洗浄し、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）アルカリホスファターゼ複合体の１：１０００希釈液５０μｌと共に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴにより２回洗浄、およびＰＢＳにより２回洗浄後、基質としてＡＰ緩衝液に０．５μｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸５０μｌを添加して色素産生反応を開始し、２５℃で２０分後、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。血漿試料中のＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００の濃度を、標準曲線（未処置動物由来の２．５％（ｖ／ｖ）マウス血漿を含有するＰＢＳＴにおいて、定義した濃度で対応する精製タンパク質の希釈系列について判定した）との比較により定量化した。
【０１６９】
ＮＧＡＬおよびＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００の血漿半減期を推定するため、ＥＬＩＳＡ測定から判定した濃度値、ｃ（ｔ）を、静脈注射後時間、ｔに対してプロットし、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いて数値的に適合させた。方程式
【０１７０】
【数５】
2010531139.tif 000014
により、単一指数減衰と仮定した。ここで、τ１／２は血漿半減期パラメータ、およびｃ０は時点ゼロでの総血液濃度（平均動物体重を２１０ｇ、およびラットの体重に対する血液の典型的な比を０．０６４と仮定して、約８０μｇ／ｍｌの値を有するはず）である。
【０１７１】
図１２は、インビボでの血中クリアランス動態を示す。組換えＮＧＡＬがちょうど約３分の半減期で血液からの急速なクリアランスを示すのに対し、ＮＧＡＬ−ＰＡＳ（＃１）２００融合タンパク質は、１０倍の、約３１分の延長した半減期を有する。これらのデータは、上記に示したウェスタンブロット分析と一致しており、ＮＧＡＬのインビボ血漿半減期が、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒポリマーとの融合により有意に延長することを証明している。
【実施例２２】
【０１７２】
ヒトＰＢＭＣによるＩＰ−１０放出アッセイによる市販のイントロンＡおよび組換えＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂの活性比較
全容積１００μｌにおける２×１０５ヒトＰＢＭＣを、イントロンＡの希釈系列（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ケニルワース、ＮＪ）、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ、および陰性対照としての非関連組換えＦａｂフラグメントにより３７℃で２４時間刺激した。全ての３つのテストタンパク質の開始濃度は、データシートに明記されたようにイントロンＡの２．６×１０８Ｕ／ｍｇの特異的活性に関しては、１０６Ｕ／ｍｌであった。この特異的単位濃度を、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂ量および同量の組換えＦａｂフラグメントに関する等しい単位濃度を計算するのに使用した。インターフェロンアルファによる誘導時の上清における放出されたＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０；インターフェロンガンマ誘導１０ｋＤａタンパク質）濃度を、ヒトＩＰ−１０  ＥＬＩＳＡセット（ＢＤ  ＯｐｔｅＥＩＡ（商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ファーミンゲン、ＵＳＡ）により判定した。
【０１７３】
図１３は、３つのテストタンパク質活性を示す。組換えＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂがより高濃度でイントロンＡと同等の活性を示すのに対し、後者はより低濃度でより活性となり、平均して似たような活性プロフィールをもたらす。非刺激ＰＢＭＣおよびＦａｂフラグメントで刺激したＰＢＭＣは、著しい量のＩＰ−１０を放出しなかった。同様にＩＰ−１０の放出を誘導するエンドトキシンが、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂおよび実施例５に記載されたＦａｂフラグメントの両方の調製において除去されたことから、ＰＡＳ（＃１）２００−ＩＦＮａ２ｂの活性は、融合タンパク質のＩＦＮａ２ｂ部分に明らかに寄与し得る。故に、Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＳｅｒポリマーはＩＦＮａ２ｂの生物活性を妨げない。
【図１】
2010531139.tif 000015
【図２−１】
2010531139.tif 000016
【図２−２】
2010531139.tif 000017
【図２−３】
2010531139.tif 000018
【図３】
2010531139.tif 000019
【図４−１】
2010531139.tif 000020
【図４−２】
2010531139.tif 000021
【図４−３】
2010531139.tif 000022
【図５−１】
2010531139.tif 000023
【図５−２】
2010531139.tif 000024
【図５−３】
2010531139.tif 000025
【図５−４】
2010531139.tif 000026
【図５−５】
2010531139.tif 000027
【図５−６】
2010531139.tif 000028
【図５−７】
2010531139.tif 000029
【図６−１】
2010531139.tif 000030
【図６−２】
2010531139.tif 000031
【図６−３】
2010531139.tif 000032
【図６−４】
2010531139.tif 000033
【図６−５】
2010531139.tif 000034
【図６−６】
2010531139.tif 000035
【図７】
2010531139.tif 000036
【図８】
2010531139.tif 000037
【図９】
2010531139.tif 000038
【図１０】
2010531139.tif 000039
【図１１】
2010531139.tif 000040
【図１２】
2010531139.tif 000041
【図１３】
2010531139.tif 000042
【図１４】
2010531139.tif 000043
【配列表】
2010531139000001.app
【国際調査報告】
2010531139.tif 000044
2010531139.tif 000045
2010531139.tif 000046