(57)【要約】  本発明は、リグノセルロース分解活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼ、及び／又はグルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチド、これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに、これらポリヌクレオチド及びポリペプチドを製造及び使用する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、サトウキビバガスを酵素的に処理する（加水分解する）ことができる、すなわちサトウキビバガスの分解用、又はバイオマス加工用のポリペプチド、及びこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにこれらポリヌクレオチド及びポリペプチドを製造及び使用する方法を提供する。ある実施態様では、本発明は、本発明のポリペプチドの熱安定型及び耐熱型を提供する。本発明のポリペプチドは、多様な医薬的、農業的及び工業的関係で用いることができる。例えば、本発明は、砂糖工場で処理されるサトウキビのバガス成分中の多糖類を加水分解することができる多酵素系を提供する。本発明は、リグノセルロース系残留物の醗酵性糖へのバイオ変換用酵素を提供し、さらにこれら糖類は、エタノール及び燃料（バイオ燃料、例えばバイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール及びバイオディーゼルを含む）製造用のフィードストックケミカルとして用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）−（j）を含む、単離、合成又は組換え核酸：
（a）配列番号:1、配列番号:3、 配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191、配列番号:193、配列番号:195、配列番号:197、配列番号:199、配列番号:201、配列番号:203、配列番号:205、配列番号:207、配列番号:209、配列番号:211、配列番号:213、配列番号:215、配列番号:217、配列番号:219、配列番号:221、配列番号:223、配列番号:225、配列番号:227、配列番号:229、配列番号:231、配列番号:233、配列番号:235、配列番号:237、配列番号:239、配列番号:241、配列番号:243、配列番号:245、配列番号:247、配列番号:249、配列番号:251、配列番号:253、配列番号:255、配列番号:257、配列番号:259、配列番号:261、配列番号:263、配列番号:265、配列番号:267、配列番号:269、配列番号:271、配列番号:273、配列番号:275、配列番号:277、配列番号:279、配列番号:281、配列番号:283、配列番号:285、配列番号:287、配列番号:289、配列番号:291、配列番号:293、配列番号:295、配列番号:297、配列番号:299、配列番号:301、配列番号:303、配列番号:305、配列番号:307、配列番号:309、配列番号:311、配列番号:313、配列番号:315、配列番号:317、配列番号:319、配列番号:321、配列番号:323、配列番号:325、配列番号:327、配列番号:329、配列番号:331、配列番号:333、配列番号:335、配列番号:337、配列番号:339、配列番号:341、配列番号:343、配列番号:345、配列番号:347、配列番号:349、配列番号:351、配列番号:353、配列番号:355、配列番号:357、配列番号:359、配列番号:361、配列番号:363、配列番号:365、配列番号:367、配列番号:369、配列番号:370、配列番号:372、配列番号:373、配列番号:375、配列番号:376、配列番号:378、配列番号:379、配列番号:381、配列番号:382、配列番号:384、配列番号:385、配列番号:387、配列番号:388、配列番号:390、配列番号:391、配列番号:393、配列番号:394、配列番号:396、配列番号:397、配列番号:399、配列番号:400、配列番号:402、配列番号:403、配列番号:405、配列番号:406、配列番号:408、配列番号:409、配列番号:411、配列番号:412、配列番号:414、配列番号:415、配列番号:417、配列番号:418、配列番号:420、配列番号:421、配列番号:423、配列番号:425、配列番号:427、配列番号:429、配列番号:431、配列番号:433、配列番号:435、配列番号:437、配列番号:439、配列番号:441、配列番号:443、配列番号:445、配列番号:447、配列番号:449、配列番号:451、配列番号:453、配列番号:455、配列番号:457、配列番号:459、配列番号:461、配列番号:463、配列番号:465、配列番号:467、配列番号:469及び／又は配列番号:471、配列番号:480、配列番号:481、配列番号:482、配列番号:483、配列番号:484、配列番号:485、配列番号:486、配列番号:487、配列番号:488、配列番号:489と配列番号:700の間の全ての奇数番号の配列番号、配列番号:707、配列番号:708、配列番号:709、配列番号:710、配列番号:711、配列番号:712、配列番号:713、配列番号:714、配列番号:715、配列番号:716、配列番号:717、配列番号:718、及び／又は配列番号:720に対して、少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは前記より高いか又は完全な（100%）配列同一性（相同性）を、少なくとも約20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、若しくはそれより長い残基の領域にわたって、又はcDNA、転写物（mRNA）若しくは遺伝子の完全長にわたって有する核酸配列（ポリヌクレオチド）であって、
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードするか、又は配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192、配列番号:194、配列番号:196、配列番号:198、配列番号:200、配列番号:202、配列番号:204、配列番号:206、配列番号:209、配列番号:210、配列番号:212、配列番号:214、配列番号:216、配列番号:218、配列番号:220、配列番号:222、配列番号:224、配列番号:226、配列番号:228、配列番号:230、配列番号:232、配列番号:234、配列番号:236、配列番号:238、配列番号:240、配列番号:242、配列番号:244、配列番号:246、配列番号:248、配列番号:250、配列番号:252、配列番号:254、配列番号:256、配列番号:258、配列番号:260、配列番号:262、配列番号:264、配列番号:266、配列番号:268、配列番号:270、配列番号:272、配列番号:274、配列番号:276、配列番号:278、配列番号:280、配列番号:282、配列番号:284、配列番号:286、配列番号:288、配列番号:290、配列番号:292、配列番号:294、配列番号:296、配列番号:298、配列番号:300、配列番号:302、配列番号:304、配列番号:306、配列番号:308、配列番号:310、配列番号:312、配列番号:314、配列番号:316、配列番号:318、配列番号:320、配列番号:322、配列番号:324、配列番号:326、配列番号:328、配列番号:330、配列番号:332、配列番号:334、配列番号:336、配列番号:338、配列番号:340、配列番号:342、配列番号:344、配列番号:346、配列番号:348、配列番号:350、配列番号:352、配列番号:354、配列番号:356、配列番号:358、配列番号:360、配列番号:362、配列番号:364、配列番号:366、配列番号:368、配列番号:371、配列番号:374、配列番号:377、配列番号:380、配列番号:383、配列番号:386、配列番号:389、配列番号:392、配列番号:395、配列番号:398、配列番号:401、配列番号:404、配列番号:407、配列番号:410、配列番号:413、配列番号:416、配列番号:419、配列番号:422、配列番号:424、配列番号:426、配列番号:428、配列番号:430、配列番号:432、配列番号:434、配列番号:436、配列番号:438、配列番号:440、配列番号:442、配列番号:444、配列��号:446、配列番号:448、配列番号:450、配列番号:452、配列番号:454、配列番号:456、配列番号:458、配列番号:460、配列番号:462、配列番号:464、配列番号:466、配列番号:468、配列番号:470、及び／又は配列番号:472、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490から配列番号:700の間の全ての偶数番号の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721、及び／又は酵素的に活性なその部分配列（フラグメント）と特異的に結合する抗体を生成することができるポリペプチド又はペプチドをコードし、ここで、場合によって前記リグノセルロース系活性が、グリコシルトランスフェラーゼ、セルラーゼ、セルロース分解活性、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ又はアラビノフラノシダーゼ活性を含み、
さらに場合によって、前記配列同一性が、配列比較アルゴリズムによる分析によって、又は目視精査によって決定され、
さらに場合によって、前記配列比較アルゴリズムがBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムを含み、その場合、フィルタリング設定はblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他の全てのオプションは規定値に設定される、前記核酸配列；
（b）ストリンジェントな条件下で（a）の核酸とハイブリダイズする核酸配列（ポリヌクレオチド）であって、前記核酸がリグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードし、さらに場合によって、前記リグノセルロース系活性が、グリコシルトランスフェラーゼ、セルラーゼ、セルロース分解活性、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ又はアラビノフラノシダーゼ活性を含み、
さらに前記ストリンジェントな条件が、0.2ｘSSCにて約65℃の温度で約15分間の洗浄を含む洗浄工程を含み、
さらに場合によって、前記核酸が、長さが少なくとも約20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000若しくはそれより大きい残基であるか又は遺伝子、cDNA若しくは転写物（mRNA）の完全長である、前記核酸配列；
（c）配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192、配列番号:194、配列番号:196、配列番号:198、配列番号:200、配列番号:202、配列番号:204、配列番号:206、配列番号:209、配列番号:210、配列番号:212、配列番号:214、配列番号:216、配列番号:218、配列番号:220、配列番号:222、配列番号:224、配列番号:226、配列番号:228、配列番号:230、配列番号:232、配列番号:234、配列番号:236、配列番号:238、配列番号:240、配列番号:242、配列番号:244、配列番号:246、配列番号:248、配列番号:250、配列番号:252、配列番号:254、配列番号:256、配列番号:258、配列番号:260、配列番号:262、配列番号:264、配列番号:266、配列番号:268、配列番号:270、配列番号:272、配列番号:274、配列番号:276、配列番号:278、配列番号:280、配列番号:282、配列番号:284、配列番号:286、配列番号:288、配列番号:290、配列番号:292、配列番号:294、配列番号:296、配列番号:298、配列番号:300、配列番号:302、配列番号:304、配列番号:306、配列番号:308、配列番号:310、配列番号:312、配列番号:314、配列番号:316、配列番号:318、配列番号:320、配列番号:322、配列番号:324、配列番号:326、配列番号:328、配列番号:330、配列番号:332、配列番号:334、配列番号:336、配列番号:338、配列番号:340、配列番号:342、配列番号:344、配列番号:346、配列番号:348、配列番号:350、配列番号:352、配列番号:354、配列番号:356、配列番号:358、配列番号:360、配列番号:362、配列番号:364、配列番号:366、配列番号:368、配列番号:371、配列番号:374、配列番号:377、配列番号:380、配列番号:383、配列番号:386、配列番号:389、配列番号:392、配列番号:395、配列番号:398、配列番号:401、配列番号:404、配列番号:407、配列番号:410、配列番号:413、配列番号:416、配列番号:419、配列番号:422、配列番号:424、配列番号:426、配列番号:428、配列番号:430、配列番号:432、配列番号:434、配列番号:436、配列番号:438、配列番号:440、配列番号:442、配列番号:444、配列番号:446、配列番号:448、配列番号:450、配列番号:452、配列番号:454��配列番号:456、配列番号:458、配列番号:460、配列番号:462、配列番号:464、配列番号:466、配列番号:468、配列番号:470、及び／又は配列番号:472、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490から配列番号:700の間の全ての偶数番号の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721、又は酵素的に活性なその部分配列（フラグメント）の配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
（d）少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有し、かつそのリグノセルロース系活性を保持する、（a）、（b）又は（c）の核酸（ポリヌクレオチド）であって、
場合によって前記保存的アミノ酸置換が、同様な特徴を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含み、さらに場合によって保存的置換が、別の脂肪族アミノ酸による脂肪族アミノ酸の置換、スレオニンによるセリンの置換若しくはその逆、別の酸性残基による酸性残基の置換、別のアミド基保有残基によるアミド基保有残基の置換、別の塩基性残基による塩基性残基の交換、又は別の芳香族残基による芳香族残基の置換を含む、前記核酸；
（e）リグノセルロース系活性を有するが、シグナル配列、プレプロドメイン、ドッケリンドメイン、及び／又は炭水化物結合モジュール（CBM）を欠くポリペプチドをコードする（a）、（b）、（c）又は（d）の核酸（ポリヌクレオチド）であって、
場合によって前記炭水化物結合モジュール（CBM）が、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナナーゼ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュール及び／又はアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含むか、又はそれらから成る、前記核酸；
（f）リグノセルロース系活性を有し、さらに異種配列を含むポリペプチドをコードする（a）、（b）、（c）、（d）又は（e）の核酸（ポリヌクレオチド）；
（g）（f）の核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記異種配列が、（i）異種シグナル配列、異種炭水化物結合モジュール、異種ドッケリンドメイン、異種触媒ドメイン、又はその組合せ；（ii）前記異種シグナル配列、炭水化物結合モジュール、又は触媒ドメイン（CD）が異種リグノセルロース系酵素に由来する（ii）の配列；又は（iii）タグ、エピトープ、誘導ペプチド、切断可能配列、検出可能部分又は酵素；をコードする配列を含むか、又はそれらから成る、前記核酸；
（h）（g）の核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記異種炭水化物結合モジュール（CBM）が、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナナーゼ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュール及び／又はアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含むか、又はそれらから成る、前記核酸；
（i）（g）の核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記異種シグナル配列が、コードされたタンパク質を空胞、小胞体、葉緑体、又はデンプン顆粒へ誘導する、前記核酸；又は
（j）（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）又は（i）と十分に（完全に）相補性である核酸（ポリヌクレオチド）。
【請求項２】
リグノセルロース系活性が以下の（a）−（w）を含む、請求項1に記載の単離、合成又は組換え核酸：
（a）グリコシルヒドロラーゼ活性、セルラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、β-グルコシダーゼ及び／又はマンナナーゼ活性、又はそのいずれかの組合せ；
（b）可溶性オリゴマーの発酵性モノマー糖への加水分解（分解）を含む活性；
（c）可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーのモノマーへの加水分解（分解）を含む活性であって、場合によって前記モノマーがキシロース、アラビノース及びグルコースを含む、前記活性；
（d）植物バイオマス多糖類の加水分解（分解）の触媒活性；
（e）より小さな分子量の多糖類若しくはオリゴマー又はモノマーを生成する、グルカン又はリグニンの加水分解（分解）の触媒活性；
（f）1,4-ベータ-D-グリコシド結合の加水分解の触媒活性；
（g）エンド-1,4-ベータ-エンドセルラーゼ活性を含むエンドセルラーゼ活性；
（f）セルロース、セルロース誘導体、リケニン又は穀物中の1,4-ベータ-D-グリコシド結合の加水分解を含む、1,4-ベータ-D-グリコシド結合加水分解活性であって、場合によって前記セルロース誘導体がカルボキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースを含むか、又は前記穀物がベータ-D-グルカン又はキシログルカンを含む、前記1,4-ベータ-D-グリコシド結合加水分解活性；
（g）グルカナーゼ結合の加水分解の触媒活性；
（h）β-1,4-及び／又はβ-1,3-グルカナーゼ結合の加水分解の触媒活性；
（i）エンド-グルカン結合の加水分解の触媒活性；
（j）エンド-1,4-ベータ-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ活性の加水分解の触媒活性；
（k）内部エンド-β-1,4-グルカナーゼ結合及び／又はβ-1,3-グルカナーゼ結合の加水分解の触媒活性；
（l）内部β-1,3-グルコシド結合の加水分解の触媒活性；
（m）グルコピラノースを含む多糖類の加水分解の触媒活性；
（n）1,4-β-グリコシド結合D-グルコピラノースを含む多糖類の加水分解の触媒活性；
（o）セルロース、セルロース誘導体又はヘミセルロースの加水分解の触媒活性；
（p）（o）の活性であって、前記セルラーゼ活性（セルロース、セルロース誘導体又はヘミセルロースの加水分解）が、サトウキビバガス、トウモロコシ線維、トウモロコシ種子線維、木材、木材廃棄物、木材パルプ、紙パルプ、木材製品若しくは紙製品、植物バイオマス、種子を含む植物バイオマス、穀物、塊茎、植物廃棄物、又は食物若しくは飼料加工若しくは工業的加工の副産物、茎、トウモロコシ、トウモロコシの穂軸、実を除いた茎葉、草類、インディアングラス又はスイッチグラス中のセルロース又はヘミセルロースの加水分解（分解）を含む、前記（o）の活性；
（q）飼料、食物製品又は飲料中のグルカンの加水分解の触媒活性；
（r）（q）の活性であって、前記飼料、食物製品又は飲料が、穀物系動物飼料、麦芽汁若しくはビール、ドウ、果実又は野菜である、前記（q）の活性；
（s）微生物細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、又はセルロース部分を含む任意の植物材料中のグルカンの加水分解の触媒活性；
（t）（a）から（s）のいずれかの活性であって、前記活性が熱安定性又は耐熱性である前記活性；
（u）（t）のいずれかの活性であって、前記活性が、約37℃から約95℃、又は約55℃から約85℃、又は約70℃から約75℃、又は約70℃から約95℃、又は約90℃から約95℃の範囲の温度を含む条件下で安定性又は耐性を示すか、又は約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、又は約37℃から約95℃、96℃、97℃、98℃若しくは99℃の範囲の温度でリグノセルロース系活性を保持する、前記活性；
（v）（t）のいずれかの活性であって、活性が、37℃を超える温度から約95℃、約55℃を超える温度から約85℃、又は約70℃から約75℃、又は90℃を超える温度から約95℃の範囲の温度に暴露した後で、又は約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、又は約37℃から約95℃、96℃、97℃、98℃若しくは99℃の範囲の温度に暴露した後で安定性又は耐性を示す、前記活性；又は
（w）（a）から（s）のいずれかの活性であって、前記酵素が、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5若しくはpH4又はそれより酸性を含む条件下で、又は約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5若しくはpH11又はそれより塩基性のpHを含む条件下で活性を有する、前記活性。
【請求項３】
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブであって、以下の（a）−（d）のいずれかの前記核酸プローブ：
（a）請求項1に記載の核酸配列（ポリヌクレオチド）の少なくとも20、30、40、50、60、75、100、125、150若しくは200又はそれより大きい連続する塩基であって、前記プローブが結合又はハイブリダイゼーションによって前記核酸を同定する、前記連続する塩基を含むプローブ；
（b）（a）のプローブであって、前記プローブが、少なくとも約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、約60から100、又は約50から150の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、前記（a）のプローブ；
（c）（a）又は（b）のプローブであって、配列番号:1、配列番号:3、 配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191、配列番号:193、配列番号:195、配列番号:197、配列番号:199、配列番号:201、配列番号:203、配列番号:205、配列番号:207、配列番号:209、配列番号:211、配列番号:213、配列番号:215、配列番号:217、配列番号:219、配列番号:221、配列番号:223、配列番号:225、配列番号:227、配列番号:229、配列番号:231、配列番号:233、配列番号:235、配列番号:237、配列番号:239、配列番号:241、配列番号:243、配列番号:245、配列番号:247、配列番号:249、配列番号:251、配列番号:253、配列番号:255、配列番号:257、配列番号:259、配列番号:261、配列番号:263、配列番号:265、配列番号:267、配列番号:269、配列番号:271、配列番号:273、配列番号:275、配列番号:277、配列番号:279、配列番号:281、配列番号:283、配列番号:285、配列番号:287、配列番号:289、配列番号:291、配列番号:293、配列番号:295、配列番号:297、配列番号:299、配列番号:301、配列番号:303、配列番号:305、配列番号:307、配列番号:309、配列番号:311、配列番号:313、配列番号:315、配列番号:317、配列番号:319、配列番号:321、配列番号:323、配列番号:325、配列番号:327、配列番号:329、配列番号:331、配列番号:333、配列番号:335、配列番号:337、配列番号:339、配列番号:341、配列番号:343、配列番号:345、配列番号:347、配列番号:349、配列番号:351、配列番号:353、配列番号:355、配列番号:357、配列番号:359、配列番号:361、配列番号:363、配列番号:365、配列番号:367、配列番号:369、配列番号:370、配列番号:372、配列番号:373、配列番号:375、配列番号:376、配列番号:378、配列番号:379、配列番号:381、配列番号:382、配列番号:384、配列番号:385、配列番号:387、配列番号:388、配列番号:390、配列番号:391、配列番号:393、配列番号:394、配列番号:396、配列番号:397、配列番号:399、配列番号:400、配列番号:402、配列番号:403、配列番号:405、配列番号:406、配列番号:408、配列番号:409、配列番号:411、配列番号:412、配列番号:414、配列���号:415、配列番号:417、配列番号:418、配列番号:420、配列番号:421、配列番号:423、配列番号:425、配列番号:427、配列番号:429、配列番号:431、配列番号:433、配列番号:435、配列番号:437、配列番号:439、配列番号:441、配列番号:443、配列番号:445、配列番号:447、配列番号:449、配列番号:451、配列番号:453、配列番号:455、配列番号:457、配列番号:459、配列番号:461、配列番号:463、配列番号:465、配列番号:467、配列番号:469及び／又は配列番号:471、配列番号:480、配列番号:481、配列番号:482、配列番号:483、配列番号:484、配列番号:485、配列番号:486、配列番号:487、配列番号:488、配列番号:489と配列番号:700の間の全ての奇数番号の配列番号、配列番号:707、配列番号:708、配列番号:709、配列番号:710、配列番号:711、配列番号:712、配列番号:713、配列番号:714、配列番号:715、配列番号:716、配列番号:717、配列番号:718、及び／又は配列番号:720の配列の連続する塩基を含む、前記（a）又は（b）のプローブ
（d）さらに検出可能物質を含む（a）、（b）又は（c）のプローブ；
（e）（d）のプローブであって、前記検出可能物質が、放射性同位元素、蛍光色素、又は検出可能な生成物の形成を触媒することができる酵素を含む、前記（d）のプローブ。
【請求項４】
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅させるための増幅プライマー対であって、
（a）請求項1に記載の核酸配列又はその部分配列を含む核酸を増幅することができるか；
（b）配列番号:１などの最初の（5'の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又はそれより大きい残基によって示される配列を有する第一のメンバー、及び前記第一のメンバーの相補鎖の最初の（5'）の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又はそれより大きい残基によって示される配列を有する第二のメンバーを含むか；又は
（c）前記増幅プライマー対のメンバーが、前記配列の少なくとも10から50の連続する塩基、又は前記配列の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又はそれより大きい連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、（a）又は（b）の増幅プライマー対を含む、前記増幅プライマー対。
【請求項５】
以下の（a）−（f）を含む、リグノセルロース系酵素をコードする単離又は組換え核酸：
（a）請求項4に記載の増幅プライマー対を用いるポリヌクレオチドの増幅によって生成される核酸；
（b）前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、（a）の核酸；
（c）前記核酸が遺伝子ライブラリーによって生成される、（a）の核酸；
（d）前記遺伝子ライブラリーが環境ライブラリーである、（c）の核酸；
（e）リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードするが、シグナル活性、プレプロドメイン、ドッケリンドメイン、及び／又は炭水化物結合モジュール（CBM）を欠く、（a）、（b）、（c）又は（d）の核酸であって、場合によって前記炭水化物結合モジュール（CBM）が、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナナーゼ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュール及び／又はアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含むか、又はそれらから成る、前記核酸；又は
（f）リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードし、さらに異種配列を含む、（a）、（b）、（c）、（d）又は（e）の核酸。
【請求項６】
請求項5に記載の核酸によってコードされる単離、合成又は組換えリグノセルロース系酵素。
【請求項７】
請求項4に記載の増幅プライマー対による鋳型核酸の増幅を含む、リグノセルロース系酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する方法。
【請求項８】
請求項1又は5に記載の核酸配列を含む核酸を含む発現カセット。
【請求項９】
請求項1又は5に記載の核酸配列を含む核酸、又は請求項8に記載の発現カセットを含むベクターであって、場合によって前記ベクターが発現ベクター又はクローニングベクターを含む、前記ベクター。
【請求項１０】
請求項1又は5に記載の核酸配列を含む核酸、又は請求項8に記載の発現カセットを含むクローニングビヒクルであって、場合によって、前記クローニングビヒクルが、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ又は人工染色体を含む、さらに場合によって前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はアデノ関連ウイルスベクターを含む、さらに場合によって前記クローニングビヒクルが、細菌人工染色体（BAC）、プラスミド、バクテリオファージP1由来ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）又は哺乳動物人工染色体（MAC）を含む、前記クローニングビヒクル。
【請求項１１】
以下を含む、形質転換させ、感染させた形質転換又は宿主細胞：
（a）請求項1又は5に記載の核酸配列を含む核酸、又は請求項8に記載の発現カセット、請求項9に記載のベクター、又は請求項10に記載のクローニングビヒクル；
（b）（a）の細胞であって、前記細胞が、細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は植物細胞である、前記（a）の細胞；
（c）（b）の植物細胞であって、前記植物細胞が、以下の属、アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラガス（Asparagus）、アトロパ（Atropa）、アヴェナ（Avena）、ブラシカ（Brassica）、シトルス（Citrus）、シトルルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルタムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コッフェア（Coffea）、クルシフェラエ（Cruciferae）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cucurbita）、ダウクス（Daucus）、エラエイス（Elaeis）、フラガリア（Fragaria）、グリシン（Glycine）、ゴッシピウム（Gossypium）、ヘリアントゥス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピヌス（Lupinus）、リコペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホット（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ（Nicotiana）、オレア（Olea）、オリザ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パンニセツム（Pannisetum）、ペルセア（Persea）、ファゼオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラナム（Solanum）、ソルガム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Triticum）、ヴィシア（Vicia）、ヴィチス（Vitis）、ヴィグナ（Vigna）又はゼア（Zea）の植物に由来する、前記植物細胞；
（d）（b）の植物細胞であって、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、オイルシード、アブラナ、ダイズ、イネ、オオムギ、草、タバコに由来する、前記植物細胞。
【請求項１２】
請求項1又は5に記載の核酸配列、又は請求項8に記載の発現カセット、請求項9に記載のベクター、又は請求項10に記載のクローニングビヒクルを含むトランスジェニック非ヒト動物であって、前記トランスジェニック非ヒト動物がマウス、ラット、ブタ、ウシ又はヤギである、前記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
以下を含むトランスジェニック植物：
（a）請求項1又は5に記載の核酸配列、又は請求項8に記載の発現カセット、請求項9に記載のベクター、又は請求項10に記載のクローニングビヒクル；
（b）（a）のトランスジェニック植物であって、トウモロコシ、ソルガム、ジャガイモ、トマト、コムギ、オイルシード、アブラナ、ダイズ、イネ、オオムギ、草、タバコである、前記（a）のトランスジェニック植物；
（c）（a）のトランスジェニック植物であって、前記植物が、以下の属、アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラガス（Asparagus）、アトロパ（Atropa）、アヴェナ（Avena）、ブラシカ（Brassica）、シトルス（Citrus）、シトルルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルタムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コッフェア（Coffea）、クルシフェラエ（Cruciferae）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cucurbita）、ダウクス（Daucus）、エラエイス（Elaeis）、フラガリア（Fragaria）、グリシン（Glycine）、ゴッシピウム（Gossypium）、ヘリアントゥス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピヌス（Lupinus）、リコペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホット（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ（Nicotiana）、オレア（Olea）、オリザ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パンニセツム（Pannisetum）、ペルセア（Persea）、ファゼオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラナム（Solanum）、ソルガム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Triticum）ヴィシア（Vicia）、ヴィチス（Vitis）、ヴィグナ（Vigna）又はゼア（Zea）に由来する、（a）のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
以下を含むトランスジェニック種子：
（a）請求項1又は5に記載の核酸配列、又は請求項8に記載の発現カセット、請求項9に記載のベクター、又は請求項10に記載のクローニングビヒクル；
（b）（a）のトランスジェニック種子であって、トウモロコシの種子、コムギの穀粒、オイルシードの種子、ナタネ、ダイズの種子、ヤシの実、ヒマワリの種子、ゴマの種子、コメ、オオムギ、落花生、タバコの種子である、前記（a）のトランスジェニック種子；
（c）（a）のトランスジェニック種子であって、以下の属、アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラガス（Asparagus）、アトロパ（Atropa）、アヴェナ（Avena）、ブラシカ（Brassica）、シトルス（Citrus）、シトルルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルタムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コッフェア（Coffea）、クルシフェラエ（Cruciferae）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cucurbita）、ダウクス（Daucus）、エラエイス（Elaeis）、フラガリア（Fragaria）、グリシン（Glycine）、ゴッシピウム（Gossypium）、ヘリアントゥス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピヌス（Lupinus）、リコペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホット（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ（Nicotiana）、オレア（Olea）、オリザ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パンニセツム（Pannisetum）、ペルセア（Persea）、ファゼオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラナム（Solanum）、ソルガム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Triticum）、ヴィシア（Vicia）、ヴィチス（Vitis）、ヴィグナ（Vigna）又はゼア（Zea）の植物に由来する、（a）のトランスジェニック種子。
【請求項１５】
請求項1又は5に記載の核酸配列に相補性であるか、又は前記とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、場合によって前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、又は約60から100塩基の長さを有し、場合によって前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNAi又はリボザイムを含む、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
細胞内の酵素メッセージの翻訳を阻害する方法であって、前記方法が、請求項1又は5に記載の核酸配列に相補性であるか、又は前記とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、又は前記を細胞で発現させる工程を含む、前記翻訳の阻害方法。
【請求項１７】
請求項1に記載の核酸配列の部分配列を含む二本鎖干渉RNA（RNAi）分子であって、場合によって前記RNAiがsiRNA又はmiRNAを含み、さらに場合によってRNAi分子は、長さが約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26又はそれより大きい二重鎖ヌクレオチドである、前記RNAi分子。
【請求項１８】
請求項17に記載の二本鎖干渉RNA（RNAi）分子を細胞に投与するか、又は前記を細胞内で発現させる工程を含む、リグノセルロース系酵素又はメッセージ（mRNA）の細胞内の発現を阻害する方法。
【請求項１９】
以下の（a）−（i）のいずれかのポリペプチド：
（a）配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192、配列番号:194、配列番号:196、配列番号:198、配列番号:200、配列番号:202、配列番号:204、配列番号:206、配列番号:209、配列番号:210、配列番号:212、配列番号:214、配列番号:216、配列番号:218、配列番号:220、配列番号:222、配列番号:224、配列番号:226、配列番号:228、配列番号:230、配列番号:232、配列番号:234、配列番号:236、配列番号:238、配列番号:240、配列番号:242、配列番号:244、配列番号:246、配列番号:248、配列番号:250、配列番号:252、配列番号:254、配列番号:256、配列番号:258、配列番号:260、配列番号:262、配列番号:264、配列番号:266、配列番号:268、配列番号:270、配列番号:272、配列番号:274、配列番号:276、配列番号:278、配列番号:280、配列番号:282、配列番号:284、配列番号:286、配列番号:288、配列番号:290、配列番号:292、配列番号:294、配列番号:296、配列番号:298、配列番号:300、配列番号:302、配列番号:304、配列番号:306、配列番号:308、配列番号:310、配列番号:312、配列番号:314、配列番号:316、配列番号:318、配列番号:320、配列番号:322、配列番号:324、配列番号:326、配列番号:328、配列番号:330、配列番号:332、配列番号:334、配列番号:336、配列番号:338、配列番号:340、配列番号:342、配列番号:344、配列番号:346、配列番号:348、配列番号:350、配列番号:352、配列番号:354、配列番号:356、配列番号:358、配列番号:360、配列番号:362、配列番号:364、配列番号:366、配列番号:368、配列番号:371、配列番号:374、配列番号:377、配列番号:380、配列番号:383、配列番号:386、配列番号:389、配列番号:392、配列番号:395、配列番号:398、配列番号:401、配列番号:404、配列番号:407、配列番号:410、配列番号:413、配列番号:416、配列番号:419、配列番号:422、配列番号:424、配列番号:426、配列番号:428、配列番号:430、配列番号:432、配列番号:434、配列番号:436、配列番号:438、配列番号:440、配列番号:442、配列番号:444、配列番号:446、配列番号:448、配列番号:450、配列番号:452、配列番号:454��配列番号:456、配列番号:458、配列番号:460、配列番号:462、配列番号:464、配列番号:466、配列番号:468、配列番号:470、及び／又は配列番号:472、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490から配列番号:700の間の全ての偶数番号の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721、及び／又は酵素的に活性なその部分配列（フラグメント）に対して、少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは前記より高いか又は完全な（100%）配列同一性（相同性）を、少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、150、200、250、300、若しくはそれより長い残基の領域にわたって、又は前記ポリペプチド若しくは酵素の完全長にわたって有するアミノ酸配列であって、
ここで、前記核酸はリグノセルロース系を有するポリペプチドをコードし、さらに場合によって、前記リグノセルロース系活性が、グリコシルトランスフェラーゼ、セルラーゼ、セルロース分解活性、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ又はアラビノフラノシダーゼ活性を含み、
場合によって、前記配列同一性が、配列比較アルゴリズムによる分析によって、又は目視精査によって決定され、さらに場合によって、前記配列比較アルゴリズムがBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムを含み、その場合、フィルタリング設定はblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他の全てのオプションは規定値に設定される、前記アミノ酸配列、を含む単離、合成又は組換えポリペプチド；
（b）請求項1に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離、合成又は組換えポリペプチドであって、（i）リグノセルロース系活性を有し、さらに場合によって、前記リグノセルロース系活性が、グリコシルトランスフェラーゼ、セルラーゼ、セルロース分解活性、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ又はアラビノフラノシダーゼ活性を含むか、又は（ii）配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192、配列番号:194、配列番号:196、配列番号:198、配列番号:200、配列番号:202、配列番号:204、配列番号:206、配列番号:209、配列番号:210、配列番号:212、配列番号:214、配列番号:216、配列番号:218、配列番号:220、配列番号:222、配列番号:224、配列番号:226、配列番号:228、配列番号:230、配列番号:232、配列番号:234、配列番号:236、配列番号:238、配列番号:240、配列番号:242、配列番号:244、配列番号:246、配列番号:248、配列番号:250、配列番号:252、配列番号:254、配列番号:256、配列番号:258、配列番号:260、配列番号:262、配列番号:264、配列番号:266、配列番号:268、配列番号:270、配列番号:272、配列番号:274、配列番号:276、配列番号:278、配列番号:280、配列番号:282、配列番号:284、配列番号:286、配列番号:288、配列番号:290、配列番号:292、配列番号:294、配列番号:296、配列番号:298、配列番号:300、配列番号:302、配列番号:304、配列番号:306、配列番号:308、配列番号:310、配列番号:312、配列番号:314、配列番号:316、配列番号:318、配列番号:320、配列番号:322、配列番号:324、配列番号:326、配列番号:328、配列番号:330、配列番号:332、配列番号:334、配列番号:336、配列番号:338、配列番号:340、配列番号:342、配列番号:344、配列番号:346、配列番号:348、配列番号:350、配列番号:352、配列番号:354、配列番号:356、配列番号:358、配列番号:360、配列番号:362、配列番号:364、配列番号:366、配列番号:368、配列番号:371、配列番号:374、��列番号:377、配列番号:380、配列番号:383、配列番号:386、配列番号:389、配列番号:392、配列番号:395、配列番号:398、配列番号:401、配列番号:404、配列番号:407、配列番号:410、配列番号:413、配列番号:416、配列番号:419、配列番号:422、配列番号:424、配列番号:426、配列番号:428、配列番号:430、配列番号:432、配列番号:434、配列番号:436、配列番号:438、配列番号:440、配列番号:442、配列番号:444、配列番号:446、配列番号:448、配列番号:450、配列番号:452、配列番号:454、配列番号:456、配列番号:458、配列番号:460、配列番号:462、配列番号:464、配列番号:466、配列番号:468、配列番号:470、及び／又は配列番号:472、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490から配列番号:700の間の全ての偶数番号の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721、及び／又は酵素的に活性なその部分配列（フラグメント）の配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を生成することができるという点で免疫原性活性を有する、前記ポリペプチド；
（c）少なくとも1つのアミノ酸残基の保存的置換を含む、（a）又は（b）のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（d）（c）のアミノ酸配列を含み、前記保存的置換が、別の脂肪族アミノ酸による脂肪族アミノ酸の置換、スレオニンによるセリンの置換若しくはその逆、別の酸性残基による酸性残基の置換、別のアミド基保有残基によるアミド基保有残基の置換、別の塩基性残基による塩基性残基の交換、若しくは別の芳香族残基による芳香族残基の置換、又はその組合せを含み、
さらに場合によって前記脂肪族残基が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はその合成等価物を含み、前記酸性残基がアスパラギン酸、グルタミン酸又はその合成等価物を含み、アミド基を含む残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、又はその合成等価物を含み、塩基性残基がリジン、アルギニン、又はその合成等価物を含むか、又は前記芳香族残基がフェニルアラニン、チロシン、又はその合成等価物を含む、（c）のポリペプチド；
（e）リグノセルロース系活性を有するが、シグナル配列、プレプロドメイン、ドッケリンドメイン、及び／又は炭水化物結合モジュール（CBM）を欠く（a）、（b）、（c）又は（d）のポリペプチドであって、
場合によって前記炭水化物結合モジュール（CBM）が、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナナーゼ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュール及び／又はアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含むか、又はそれらから成る、前記ポリペプチド；
（f）リグノセルロース系活性を有し、さらに異種配列を含む（a）、（b）、（c）、（d）又は（e）のポリペプチド；
（g）（f）のポリペプチドであって、前記異種配列が、（i）異種シグナル配列、異種炭水化物結合モジュール、異種ドッケリンドメイン、異種触媒ドメイン、又はその組合せ；（ii）前記異種シグナル配列、炭水化物結合モジュール、又は触媒ドメイン（CD）が異種リグノセルロース系酵素に由来する（ii）の配列；又は（iii）タグ、エピトープ、誘導ペプチド、切断可能配列、検出可能部分又は酵素；を含むか、又はそれらから成る、前記（f）のポリペプチド；
（h）（g）のポリペプチドであって、前記異種炭水化物結合モジュール（CBM）が、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナナーゼ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュール及び／又はアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含むか、又はそれらから成る、前記（g）のポリペプチド；
（i）（g）のポリペプチドであって、前記異種シグナル配列が、コードされたタンパク質を空胞、小胞体、葉緑体、又はデンプン顆粒へ誘導する、前記（g）のポリペプチド。
【請求項２０】
前記リグノセルロース系活性が以下の（a）−（w）を含む、請求項19に記載の単離、合成又は組換えポリペプチド、又は請求項6に記載のリグノセルロース系酵素：
（a）グリコシルヒドロラーゼ活性、セルラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、β-グルコシダーゼ及び／又はマンナナーゼ活性、又はそのいずれかの組合せ；
（b）可溶性オリゴマーの発酵性モノマー糖への加水分解（分解）を含む活性；
（c）可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーのモノマーへの加水分解（分解）を含む活性であって、場合によって前記モノマーがキシロース、アラビノース及びグルコースを含む、前記活性；
（d）植物バイオマス多糖類の加水分解（分解）の触媒活性；
（e）より小さな分子量の多糖類若しくはオリゴマー又はモノマーを生成する、グルカン又はリグニンの加水分解（分解）の触媒活性；
（f）1,4-ベータ-D-グリコシド結合の加水分解の触媒活性；
（g）エンド-1,4-ベータ-エンドセルラーゼ活性を含むエンドセルラーゼ活性；
（f）セルロース、セルロース誘導体、リケニン又は穀物中の1,4-ベータ-D-グリコシド結合の加水分解を含む、1,4-ベータ-D-グリコシド結合加水分解活性であって、場合によって前記セルロース誘導体がカルボキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースを含むか、又は前記穀物がベータ-D-グルカン又はキシログルカンを含む、前記1,4-ベータ-D-グリコシド結合加水分解活性；
（g）グルカナーゼ結合の加水分解の触媒活性；
（h）β-1,4-及び／又はβ-1,3-グルカナーゼ結合の加水分解の触媒活性；
（i）エンド-グルカン結合の加水分解の触媒活性；
（j）エンド-1,4-ベータ-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ活性の加水分解の触媒活性；
（k）内部エンド-β-1,4-グルカナーゼ結合及び／又はβ-1,3-グルカナーゼ結合の加水分解の触媒活性；
（l）内部β-1,3-グルコシド結合の加水分解の触媒活性；
（m）グルコピラノースを含む多糖類の加水分解の触媒活性；
（n）1,4-β-グリコシド結合D-グルコピラノースを含む多糖類の加水分解の触媒活性；
（o）セルロース、セルロース誘導体又はヘミセルロースの加水分解の触媒活性；
（p）（o）の活性であって、前記セルラーゼ活性（セルロース、セルロース誘導体又はヘミセルロースの加水分解）が、サトウキビバガス、トウモロコシ線維、トウモロコシ種子線維、木材、木材廃棄物、木材パルプ、紙パルプ、木材製品若しくは紙製品、植物バイオマス、種子を含む植物バイオマス、穀物、塊茎、植物廃棄物、又は食物若しくは飼料加工若しくは工業的加工の副産物、茎、トウモロコシ、トウモロコシの穂軸、実を除いた茎葉、草類、インディアングラス又はスイッチグラス中のセルロース又はヘミセルロースの加水分解（分解）を含む、前記（o）の活性；
（q）飼料、食物製品又は飲料中のグルカンの加水分解の触媒活性；
（r）（q）の活性であって、前記飼料、食物製品又は飲料が、穀物系動物飼料、麦芽汁若しくはビール、生地、果実又は野菜である、前記（q）の活性；
（s）微生物細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、又はセルロース部分を含む任意の植物材料中のグルカンの加水分解の触媒活性；
（t）（a）から（s）のいずれかの活性であって、前記活性が熱安定性又は耐熱性である前記活性；
（u）（t）のいずれかの活性であって、前記活性が、約37℃から約95℃、又は約55℃から約85℃、又は約70℃から約75℃、又は約70℃から約95℃、又は約90℃から約95℃の範囲の温度を含む条件下で安定性又は耐性を示すか、又は約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、又は約37℃から約95℃、96℃、97℃、98℃若しくは99℃の範囲の温度でリグノセルロース系活性を保持する、前記活性；
（v）（t）のいずれかの活性であって、活性が、37℃を超える温度から約95℃、約55℃を超える温度から約85℃、又は約70℃から約75℃、又は90℃を超える温度から約95℃の範囲の温度に暴露した後で、又は約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、又は約37℃から約95℃、96℃、97℃、98℃若しくは99℃の範囲の温度に暴露した後で安定性又は耐性を示す、前記活性；又は
（w）（a）から（s）のいずれかの活性であって、前記酵素が、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5若しくはpH4又はそれより酸性を含む条件下で、又は約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5若しくはpH11又はそれより塩基性のpHを含む条件下で活性を有する、前記活性。
【請求項２１】
請求項19又は請求項6に記載の単離、合成若しくは組換えポリペプチド又はリグノセルロース系酵素であって、前記ポリペプチド又は酵素が少なくとも1つのグリコシル化部位を含み、場合によって前記グリコシル化がN-結合グリコシル化であり、さらに場合によって前記ポリペプチドがP.パストリス（pastoris）又はS.ポンベ（pombe）で発現された後でグリコシル化される、前記ポリペプチド又は酵素。
【請求項２２】
請求項19に記載のポリペプチド又は請求項6に記載のリグノセルロース系酵素を含むタンパク質調製物であって、前記タンパク質調製物が液体、固体又はゲルを含む、前記タンパク質調製物。
【請求項２３】
請求項19に記載のポリペプチド又は請求項6に記載のリグノセルロース系酵素、及び第二のドメインを含むヘテロダイマーであって、場合によって前記第二のドメインがポリペプチドを含み、さらに前記ヘテロダイマーが融合タンパク質であり、さらに場合によって前記第二のドメインが、エピトープ、異種酵素、検出可能なタンパク質若しくはペプチド、免疫原性タンパク質若しくはペプチド又はタグを含む、前記ヘテロダイマー。
【請求項２４】
請求項19に記載のポリペプチド又は請求項6に記載のリグノセルロース系酵素を含むホモダイマー。
【請求項２５】
固定化ポリペプチド若しくは酵素又は固定化核酸であって、前記ポリペプチドが請求項19に記載の配列又は請求項6に記載のリグノセルロース系酵素を含むか、又は前記核酸が、請求項1若しくは5に記載の核酸配列又は請求項3に記載のプローブを含み、場合によって前記ポリペプチド又は核酸が、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、石墨粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ、又はキャピラリー管上に固定される、前記固定化ポリペプチド若しくは酵素又は核酸。
【請求項２６】
請求項25に記載の固定化ポリペプチド又は固定化核酸を含むアレイ。
【請求項２７】
請求項19に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離、合成又は組換え抗体であって、場合によって前記抗体がモノクローナル又はポリクローナル抗体である、前記抗体。
【請求項２８】
請求項19に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマ。
【請求項２９】
以下の工程を含む、リグノセルロース系活性を有するポリペプチドを単離又は同定する方法：
（a）請求項27に記載の抗体を提供する工程：
（b）ポリペプチドを含むサンプルを提供する工程；
（c）工程（b）のサンプルを工程（a）の抗体と、前記抗体が前記ポリペプチドと特異的に結合することができる条件下で接触させ、それによってリグノセルロース系活性を有するポリペプチドを単離又は同定する工程。
【請求項３０】
以下の工程を含む、抗セルラーゼ又は抗リグノセルロース系酵素抗体を製造する方法：
（a）液性免疫応答を生じるために十分な量で請求項1又は5に記載の核酸を非ヒト動物に投与し、それによって抗リグノセルロース系酵素又は抗セルラーゼ抗体を生成する工程；又は
（b）液性免疫応答を生じるために十分な量で請求項19に記載のポリペプチドを非ヒト動物に投与し、それによって抗リグノセルロース系酵素又は抗セルラーゼ抗体を生成する工程。
【請求項３１】
以下の工程を含む、組換えポリペプチドを製造する方法：
（A）（a）プロモーターに機能的に連結させた核酸を提供する工程であって、前記核酸が請求項1又は5に記載の核酸配列を含む、前記工程；及び（b）工程（a）の核酸をポリペプチドの発現を可能にする条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを製造する工程；
（B）（A）の方法であって、前記方法が、さらに工程（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて工程（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換細胞で組換えポリペプチドを製造する工程を含む、前記（A）の方法；又は
（C）（A）又は（B）の方法であって、前記プロモーターが、ウイルス系、細菌系、哺乳動物系若しくは植物プロモーター；又は植物プロモーター；又はジャガイモ、コメ、トウモロコシ、コムギ、タバコ、若しくはオオムギプロモーター；又は構成的プロモーター若しくはCaMV35Sプロモーター；又は誘導性プロモーター；又は組織特異的プロモーター若しくは環境調節性若しくは発生制御性プロモーター；又は種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的、若しくは器官脱離誘導プロモーター；又は種子優先プロモーター、トウモロコシガンマゼインプロモーター又はトウモロコシADP-gppプロモーターを含むか又はそれらから成る、前記（A）又は（B）の方法。
【請求項３２】
以下の工程を含む、リグノセルロース系活性を有するポリペプチドを同定する方法：
（a）請求項19に記載のポリペプチド又は請求項6に記載のリグノセルロース系酵素を提供する工程；
（b）リグノセルロース系酵素の基質を提供する工程；及び
（c）前記ポリペプチドを工程（b）の基質と接触させ、さらに基質量の低下又は反応生成物量の増加を検出し、基質量の低下又は反応生成物量の増加によって、リグノセルロース系酵素活性を有するポリペプチドを検出する工程。
【請求項３３】
以下の工程を含む、リグノセルロース系酵素の基質を同定する方法：
（a）請求項19に記載のポリペプチドを提供する工程；
（b）試験基質を提供する工程；及び
（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験基質と接触させ、さらに基質量の低下又は反応生成物量の増加を検出し、基質量の低下又は反応生成物量の増加によって、前記試験基質をリグノセルロース系酵素の基質として同定する工程。
【請求項３４】
以下の工程を含む、試験化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法：
（a）核酸又は前記核酸を含むベクターを、前記核酸のポリペプチドへの翻訳を許容する条件下で発現させる工程であって、前記核酸が請求項1又は5に記載の核酸配列を有する、前記工程；
（b）試験化合物を提供する工程；
（c）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；及び
（d）工程（b）の試験化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する工程。
【請求項３５】
以下の工程を含む、試験化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法：
（a）請求項19に記載のポリペプチドを提供する工程；
（b）試験化合物を提供する工程；
（c）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；及び
（d）工程（b）の試験化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する工程。
【請求項３６】
以下の工程を含む、リグノセルロース系活性の調節物質を同定する方法：
（a）請求項19に記載のポリペプチドを提供する工程；
（b）試験化合物を提供する工程；
（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験化合物と接触させ、リグノセルロース系酵素の活性を測定し、試験化合物の非存在下でのリグノセルロース系酵素活性と比較して、試験化合物の存在下で測定された活性に変化があれば、試験化合物がリグノセルロース系酵素活性を調節するという決定がなされる工程。
【請求項３７】
前記リグノセルロース系酵素活性が、リグノセルロース系酵素の基質を提供し、基質量の低下若しくは反応生成物量の増加、又は基質量の増加若しくは反応生成物量の低下を検出することによって測定され、
場合によって、試験化合物の非存在下での基質量若しくは反応生成物量と比較して、試験化合物の存在下での基質量の低下若しくは反応生成物量の増加があれば、試験化合物がリグノセルロース系活性のアクチベーターとして同定され、
場合によって、試験化合物の非存在下での基質量若しくは反応生成物量と比較して、試験化合物の存在下での基質量の増加若しくは反応生成物量の低下があれば、試験化合物がリグノセルロース系活性のインヒビターとして同定される、請求項97に記載の方法。
【請求項３８】
プロセッサー及びデータ保存装置を含むコンピュータシステムであって、前記データ保存装置にはポリペプチド配列又は核酸配列が保存されてあり、前記ポリペプチド配列は請求項19に記載の配列、請求項1若しくは5に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、場合によって、前記方法はさらに、配列比較アルゴリズム、及び少なくとも1つの参照配列が保存されているデータ保存装置を含むか、又はさらに前記配列中の1つ以上の特徴を識別するアイデンティファイアーを含み、さらに場合によって、前記配列比較アルゴリズムは多型性を表示するコンピュータプログラムを含む、前記コンピュータシステム。
【請求項３９】
ポリペプチド配列又は核酸配列が保存されているコンピュータ読み出し可能媒体であって、前記ポリペプチド配列が、請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは5に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記コンピュータ読み出し可能媒体。
【請求項４０】
以下の工程を含む、配列の特徴を識別する方法：
（a）配列内の1つ以上の特徴を識別するコンピュータプログラムを用いて配列を読み取る工程であって、前記配列がポリペプチド配列又は核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列が、請求項19に記載のポリペプチド、請求項1若しくは5に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；及び（ｂ）前記コンピュータプログラムにより配列内の1つ以上の特徴を識別する工程。
【請求項４１】
第一の配列と第二の配列を比較する方法であって、前記方法が、
（a）配列を比較するコンピュータプログラムを用いて第一の配列及び第二の配列を読み取る工程であって、前記第一の配列がポリペプチド配列又は核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列が、請求項19に記載のポリペプチド又は請求項1若しくは5に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；及び（ｂ）第一の配列と第二の配列との間の相違を前記コンピュータプログラムにより決定する工程を含み、
場合によって、前記方法はさらに、第一の配列と第二の配列との間の相違を決定する工程を含むか、又は場合によって前記方法はさらに、多型性を識別する工程を含むか、又は場合によって、前記方法はさらに、配列内の1つ以上の特徴を識別するアイデンティファイアーの使用を含み、さらに場合によって、前記方法は、コンピュータプログラムを用いて第一の配列を読み取り、さらに前記配列内の1つ以上の特徴を識別する工程を含む、前記第一の配列と第二の配列を比較する方法。
【請求項４２】
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸をサンプルから単離又は回収する方法であって、前記方法が、
（a）請求項4に記載の増幅プライマー対を提供する工程；
（b）サンプルから核酸を単離するか、又はサンプル中の核酸がハイブリダイゼーションのために前記増幅プライマー対に接近することができるように前記サンプルを処理する工程；及び
（c）工程（b）の核酸を工程（a）の増幅プライマー対と一緒にして、サンプル由来の核酸を増幅し、それによってリグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸をサンプルから単離又は回収する工程を含み、
場合によって、前記サンプルは環境サンプルであり、又は場合によって前記サンプルは、水サンプル、液体サンプル、土壌サンプル、大気サンプル又は生物学的サンプルを含み、
さらに場合によって、前記生物学的サンプルは、細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞又は哺乳動物細胞に由来する、前記核酸の単離又は回収方法。
【請求項４３】
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸をサンプルから単離又は回収する方法であって、前記方法が、
（a）請求項1に記載の核酸配列又は請求項3に記載のプローブを含むか若しくは前記から成るポリヌクレオチドプローブを提供する工程；
（b）サンプルから核酸を単離するか、又はサンプル中の核酸がハイブリダイゼーションのために工程（a）のポリヌクレオチドプローブに接近することができるように前記サンプルを処理する工程；
（c）工程（b）の単離核酸又は処理サンプルを工程（a）のポリヌクレオチドプローブと一緒にする工程；及び
（d）工程（a）のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによってリグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸をサンプルから単離又は回収する工程を含み、
場合によって、前記サンプルが環境サンプルであり、又は場合によって前記サンプルが、水サンプル、液体サンプル、土壌サンプル、大気サンプル又は生物学的サンプルを含み、
さらに場合によって、前記生物学的サンプルが、細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞又は哺乳動物細胞に由来する、前記核酸の単離又は回収方法。
【請求項４４】
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種を生成する方法であって、前記方法が、
（a）請求項1又は請求項5に記載の核酸配列を含む鋳型核酸を提供する工程；及び
（b）鋳型内で1つ以上のヌクレオチドを改変し、欠失させ、若しくは付加し、又は前記を組合せて、鋳型核酸変種を生成する工程を含み、
場合によって、前記方法がさらに、変種核酸を発現させてリグノセルロース系活性を有する変種ポリペプチドを生成する工程を含み、
さらに場合によって、前記改変、付加又は欠失が、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）、組換え、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNAによる変異導入、ウラシル含有鋳型による変異導入、ギャップ含有二重鎖による変異導入、ポイントミスマッチ修復による変異導入、修復欠損宿主株による変異導入、化学的変異導入、放射源による変異導入、欠失による変異導入、制限-選別変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマーの生成及び前記の組合せを含む方法によって導入され、
さらに場合によって、前記方法が、鋳型核酸によってコードされるポリペプチドのものとは変化した若しくは異なる活性又は変化した若しくは異なる安定性を有するリグノセルロース系酵素が得られるまで反復繰り返される、前記核酸変種を生成する方法。
【請求項４５】
請求項44に記載の方法であって、
（A）前記リグノセルロース系酵素変種が、（a）耐熱性であり、上昇温度に暴露した後でいくらかの活性を保持するか；（b）鋳型核酸によってコードされたリグノセルロース系酵素と比較してグリコシル化が増加しているか；又は（c）鋳型核酸によってコードされるリグノセルロース系酵素は高温下で活性を示さないが、前記リグノセルロース系酵素変種は前記高温下でリグノセルロース系酵素活性を有するか；又は
（B）前記方法が、（a）鋳型核酸のコドン使用頻度から変化したコドン使用頻度を有するリグノセルロース系酵素が得られるまで、又は（b）鋳型核酸のメッセージ発現又は安定性より高いレベル又は低いレベルのメッセージ発現又は安定性を有するリグノセルロース系酵素遺伝子が得られるまで反復繰り返される、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸においてコドンを改変し、宿主細胞でのその発現を高める方法であって、前記方法が、
（a）請求項1又は5に記載の核酸配列を含む、リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する工程；及び
（b）工程（a）の核酸において非優先又は低優先コドンを同定し、前記コドンをそれと同じアミノ酸をコードする、優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置き換え、それによって核酸を改変して宿主細胞内でのその発現を高める工程を含み、
ここで、優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、非優先又は低優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンである、前記方法。
【請求項４７】
以下の工程を含む、リグノセルロース系酵素をコードする核酸においてコドンを改変する方法：
（a）請求項1又は5に記載の核酸配列を含む、リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する工程；及び
（b）工程（a）の核酸においてコドンを同定し、前記コドンをそれと同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置き換え、それによってリグノセルロース系酵素をコードする核酸のコドンを改変する工程。
【請求項４８】
リグノセルロース系酵素をコードする核酸においてコドンを改変する方法であって、前記方法が、
（a）請求項1又は5に記載の核酸配列を含む、リグノセルロース系酵素をコードする核酸を提供する工程；及び
（b）工程（a）の核酸において非優先コドン又は低優先コドンを同定し、前記コドンをそれと同じアミノ酸をコードする、優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置き換え、それによって核酸を改変して宿主細胞内でのその発現を高める工程を含み、
ここで、優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、非優先又は低優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンである、前記方法。
【請求項４９】
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸においてコドンを改変し、宿主細胞内でのその発現を低下させる方法であって、前記方法が、
（a）請求項1又は5に記載の核酸配列を含む、リグノセルロース系酵素をコードする核酸を提供する工程；及び
（b）工程（a）の核酸において少なくとも1つの優先コドンを同定し、前記コドンをそれと同じアミノ酸をコードする、非優先コドン又は低優先コドンで置き換え、それによって核酸を改変して宿主細胞内でのその発現を低下させる工程を含み、
ここで、優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、非優先又は低優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンであり、
場合によって、前記宿主細胞が、細菌細胞、菌類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞である、前記方法。
【請求項５０】
複数の改変されたリグノセルロース系酵素の活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する方法であって、前記改変された活性部位又は基質結合部位が、第一の活性部位又は第一の基質結合部位をコードする配列を含む第一の核酸に由来し、
（a）第一の活性部位又は第一の基質結合部位をコードする配列を含む第一の核酸を提供する工程であって、前記第一の核酸配列が、ストリンジェントな条件下で請求項1に記載の核酸配列（ポリヌクレオチド）とハイブリダイズする配列を含み、さらに前記核酸がリグノセルロース系酵素の活性部位又はリグノセルロース系酵素の基質結合部位をコードする、前記工程；
（b）第一の核酸内の複数の標的コドンで天然に存在するアミノ酸変種をコードする変異原性オリゴヌクレオチドセットを提供する工程；及び
（c）前記変異原性オリゴヌクレオチドセットを用いて、各アミノ酸コドンで変異を導入された一連のアミノ酸変種をコードする、活性部位コード変種核酸又は基質結合部位コード変種核酸のセットを生成し、それによって複数の改変されたリグノセルロース系酵素の活性部位又は基質結合部位をコードする核酸ライブラリーを作製する工程、
を含み、
場合によって、変異原性オリゴヌクレオチド又は変種核酸が、最適化定方向進化システム、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、または合成連結再アッセンブリ（SLR）、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNAによる変異導入、ウラシル含有鋳型による変異導入、ギャップ含有二重鎖による変異導入、ポイントミスマッチ修復による変異導入、修復欠損宿主株による変異導入、化学的変異導入、放射源による変異導入、欠失による変異導入、制限-選別変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマーの生成及び前記の組合せを含む方法によって生成される、前記核酸ライブラリーを作製する方法。
【請求項５１】
以下の工程を含む、小分子を作製する方法：
（a）小分子を合成又は改変することができる複数の生合成酵素を提供する工程であって、前記酵素の１つが、請求項1又は請求項5に記載の核酸配列を含む核酸によってコードされるリグノセルロース系酵素を含む、前記工程；
（b）工程（a）の酵素の少なくとも1つのための基質を提供する工程；及び
（c）複数の生物触媒反応を促進する条件下で工程（b）の基質を前記酵素と反応させ、一連の生物触媒反応によって小分子を生成する工程。
【請求項５２】
小分子を改変する方法であって、前記方法が、
（a）リグノセルロース系酵素を提供する工程であって、前記酵素が、請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1または請求項5に記載の配列を含む核酸配列によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；
（b）小分子を提供する工程；及び
（c）リグノセルロース系酵素によって触媒される酵素反応を促進する条件下で工程（a）の酵素を工程（b）の小分子と反応させ、それによってリグノセルロース系酵素反応で小分子を改変する工程を含み、
場合によって、工程（b）が工程（a）の酵素のための複数の小分子基質を提供する工程を含み、それによって、リグノセルロース系酵素で触媒される少なくとも1つの酵素反応によって生成される改変小分子ライブラリーを作製することができ；
さらに場合によって、前記方法がさらに、前記酵素による複数の生物触媒反応を促進する条件下で複数の追加の酵素を提供し、複数の酵素反応によって生成される改変小分子ライブラリーを形成する工程を含み；
さらに場合によって、前記ライブラリーを試験して所望の活性を示す特定の改変小分子がライブラリーに存在するか否かを決定する工程を含み、場合によって前記ライブラリーを試験する工程がさらに、所望の活性を有する特定の改変小分子の有無について改変小分子の部分を試験し、所望の活性を有する特定の改変小分子を生成する少なくとも1つの特異的生物触媒反応を同定することによって、ライブラリー内の複数の改変小分子の一部分を生成するために用いられた生物触媒反応の全てを1つを除いて系統的に排除する工程を含む、前記小分子の改変方法。
【請求項５３】
リグノセルロース系酵素の機能的フラグメントを決定する方法であって、（a）リグノセルロース系酵素を提供する工程であって、前記酵素が、請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1または請求項５に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；及び
（b）工程（a）の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、リグノセルロース系活性について残留部分配列を試験し、それによってリグノセルロース系酵素の機能的フラグメントを決定する工程を含み、
場合によって、前記リグノセルロース系酵素活性が、リグノセルロース系酵素の基質を提供して基質の量の低下又は反応生成物の量の増加を検出することによって測定される、前記機能的フラグメントを決定する方法。
【請求項５４】
リアルタイム代謝フラックス分析を使用する、新規な又は改変された表現型の全細胞操作のための方法であって、前記方法が、
（a）細胞の遺伝的構成を改変することによって改変細胞を作製する工程であって、ここで前記遺伝的構成が、請求項1または請求項5に記載の核酸配列を含む核酸を細胞に添加することによって改変される、前記工程；
（b）前記改変細胞を培養して、複数の改変細胞を作製する工程；
（c）前記細胞の少なくとも1つの代謝パラメーターを、工程（b）の細胞培養をリアルタイムでモニターすることによって測定する工程；及び
（d）工程（c）のデータを分析して、前記測定パラメーターが、同様な条件下における未改変細胞の対応する測定と異なるか否かを決定し、それによってリアルタイム代謝フラックス分析を用いて細胞内の操作された表現型を同定する工程を含み、
場合によって、前記細胞の遺伝的構成が、細胞内の配列の欠失若しくは配列の改変又は遺伝子発現のノックアウトを含む方法によって改変され、
さらに場合によって、前記方法がさらに、新規に操作された表現型を含む細胞を選別する工程を含み、
さらに場合によって、前記方法がさらに選別細胞を培養し、それによって新規に操作された表現型を含む新規細胞株を作製する工程を含む、前記全細胞操作のための方法。
【請求項５５】
以下の（a）又は（b）のアミノ酸配列のアミノ末端残基1から12、1から13、1から14、1から15、1から16、1から17、1から18、1から19、1から20、1から21、1から22、1から23、1から24、1から25、1から26、1から27、1から28、1から28、1から30、1から31、1から32、1から33、1から34、1から35、1から36、1から37、1から38、1から40、1から41、1から42、1から43、又は1から44に示されるアミノ酸配列から成る、単離、合成又は組換えシグナル（又はリーダー）配列（シグナルペプチド（SP））：
（a）請求項19に記載のアミノ酸配列；又は
（b）配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192、配列番号:194、配列番号:196、配列番号:198、配列番号:200、配列番号:202、配列番号:204、配列番号:206、配列番号:209、配列番号:210、配列番号:212、配列番号:214、配列番号:216、配列番号:218、配列番号:220、配列番号:222、配列番号:224、配列番号:226、配列番号:228、配列番号:230、配列番号:232、配列番号:234、配列番号:236、配列番号:238、配列番号:240、配列番号:242、配列番号:244、配列番号:246、配列番号:248、配列番号:250、配列番号:252、配列番号:254、配列番号:256、配列番号:258、配列番号:260、配列番号:262、配列番号:264、配列番号:266、配列番号:268、配列番号:270、配列番号:272、配列番号:274、配列番号:276、配列番号:278、配列番号:280、配列番号:282、配列番号:284、配列番号:286、配列番号:288、配列番号:290、配列番号:292、配列番号:294、配列番号:296、配列番号:298、配列番号:300、配列番号:302、配列番号:304、配列番号:306、配列番号:308、配列番号:310、配列番号:312、配列番号:314、配列番号:316、配列番号:318、配列番号:320、配列番号:322、配列番号:324、配列番号:326、配列番号:328、配列番号:330、配列番号:332、配列番号:334、配列番号:336、配列番号:338、配列番号:340、配列番号:342、配列番号:344、配列番号:346、配列番号:348、配列番号:350、配列番号:352、配列番号:354、配列番号:356、配列番号:358、配列番号:360、配列番号:362、配列番号:364、配列番号:366、配列番号:368、配列番号:371、配列番号:374、配列番号:377、配列番号:380、配列番号:383、配列番号:386、配列番号:389、配列番号:392、配列番号:395、配列番号:398、配列番号:401、配列番号:404、配列番号:407、配列番号:410、配列番号:413、配列番号:416、配列番号:419、配列番号:422、配列番号:424、配列番号:426、配列番号:428、配列番号:430、配列番号:432、配列番号:434、配列番号:436、配列番号:438、配列番号:440、配列番号:442、配列番号:444、配列番号:446、配列番号:448、配列番号:450、配列番号:452、配列番号:454��配列番号:456、配列番号:458、配列番号:460、配列番号:462、配列番号:464、配列番号:466、配列番号:468、配列番号:470、及び／又は配列番号:472、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490から配列番号:700の間の全ての偶数番号の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721、及び／又は酵素的に活性なその部分配列（フラグメント）。
【請求項５６】
請求項55に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列（シグナルペプチド（SP））又はリーダー配列を含む少なくとも1つの第一のドメイン、及び異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも1つの第二のドメインを含むキメラポリペプチドであって、前記異種ポリペプチド又はペプチドが、前記シグナルペプチド（SP）又はリーダー配列に天然では随伴せず、
さらに場合によって、前記異種ポリペプチド又はペプチドがリグノセルロース系酵素ではなく、さらに場合によって、前記異種ポリペプチド又はペプチドが、シグナルペプチド（SP）又はリーダー配列に対してアミノ末端、カルボキシ末端、又は前記の両端に存在する、前記キメラポリペプチド。
【請求項５７】
キメラポリペプチドをコードする単離、合成又は組換え核酸であって、前記キメラポリペプチドが、請求項55に記載のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド（SP）又はリーダー配列を含む少なくとも1つの第一のドメイン、及び異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも1つの第二のドメインを含み、前記異種ポリペプチド又はペプチドが、シグナルペプチド（SP）又はリーダー配列に天然では随伴しない、前記核酸。
【請求項５８】
以下を含む単離、合成又は組換え核酸：
（a）リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする配列及び異種シグナル（又はリーダー）配列（シグナルペプチド（SP））であって、前記核酸が請求項1又は請求項5に記載の核酸配列を含む、前記（a）の配列；
（b）（a）の配列であって、前記シグナル（又はリーダー）配列（シグナルペプチド（SP））が別のリグノセルロース系酵素又は非リグノセルロース系酵素に由来する、前記（a）の配列；又は
（c）（a）の配列であって、前記異種シグナル配列が、コードされたタンパク質を空胞、小胞体、葉緑体又はデンプン顆粒へ誘導する、前記（a）の配列。
【請求項５９】
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離、合成又は組換え核酸であって、前記配列がシグナル配列を含まず、さらに前記ポリペプチドコード核酸が請求項1又は請求項5に記載の核酸配列を含む、前記単離、合成又は組換え核酸。
【請求項６０】
リグノセルロース系酵素をグリコシル化し、それによってリグノセルロース系酵素の耐熱性又は熱安定性を高める工程を含む、リグノセルロース系ポリペプチドの耐熱性又は熱安定性を高める方法であって、前記ポリペプチドが、請求項1又は請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチドの少なくとも30の連続するアミノ酸を含む、前記方法。
【請求項６１】
以下の（A）又は（B）を含む、組換えリグノセルロース系酵素を細胞で過剰発現させる方法：
（A）請求項1に記載の核酸配列を含むベクターを発現させる工程であって、過剰発現が、高活性プロモーター、二シストロン性ベクターの使用によって、又はベクターの遺伝子増幅によって達成される、前記工程；又は
（B）（A）の方法であって、前記高活性プロモーターが、ウイルス系、細菌系、哺乳動物系若しくは植物プロモーター；又は植物プロモーター；又はジャガイモ、コメ、トウモロコシ、コムギ、タバコ、若しくはオオムギプロモーター；又は構成的プロモーター若しくはCaMV35Sプロモーター；又は誘導性プロモーター；又は組織特異的プロモーター若しくは環境調節性若しくは発生制御性プロモーター；又は種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的、若しくは器官脱離誘導プロモーター；又は種子優先プロモーター、トウモロコシガンマゼインプロモーター又はトウモロコシADP-gppプロモーターであるか又はそれらを含む、前記（A）の方法。
【請求項６２】
以下の工程を含む、トランスジェニック植物を作製する方法：
（A）（a）異種核酸配列を細胞に導入し、それによって形質転換植物細胞を作製する工程であって、ここで、前記異種核酸配列が請求項1に記載の核酸配列を含む、前記（a）の工程；及び（b）前記形質転換細胞からトランスジェニック植物を作製する工程；
（B）（A）の方法であって、工程（A）（a）がさらに、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーション又はマイクロインジェクションによって異種核酸配列を導入する工程を含む、前記（A）の方法；
（C）（A）又は（B）の方法であって、DNA粒子ボンバードメントによって、又はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主の使用によって、異種核酸を植物組織へ直接導入する工程を含む、前記（A）又は（B）の方法；又は
（C）（A）、（B）又は（C）の方法であって、前記植物が単子葉植物又は双子葉植物であるか、又は前記植物が、単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス（Miscanthus）であるか、又は前記植物が、双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスである、前記（A）、（B）又は（C）の方法。
【請求項６３】
以下の工程を含む、植物細胞で異種核酸配列を発現させる方法：
（A）（a）プロモーターに機能的に連結させた異種核酸配列により植物細胞を形質転換する工程であって、ここで、前記異種核酸配列が請求項1又は請求項5に記載の核酸配列を含む、前記（a）の工程；及び（b）前記異種核酸配列が前記植物細胞で発現される条件下で前記植物を生育させる工程；
（B）（A）の方法であって、前記植物が単子葉植物又は双子葉植物であるか、又は前記植物が、単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス（Miscanthus）であるか、又は前記植物が、双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスである、前記（A）の方法；又は
（C）（A）又は（B）の方法であって、前記プロモーターが、ウイルス系、細菌系、哺乳動物系又は植物プロモーター；又は植物プロモーター；又は、ジャガイモ、コメ、トウモロコシ、コムギ、タバコ又はオオムギプロモーター；又は、構成的プロモーター又はCaMV35Sプロモーター；又は、誘導性プロモーター；又は、組織特異的プロモーター又は環境により調節されるか、又は発育により調節されるプロモーター；又は、種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的、若しくは器官脱離誘導プロモーター；又は、種子優先プロモーター、トウモロコシゼインプロモーター又はトウモロコシADP-gppプロモーターであるか、又はそれらを含む、前記（A）又は（B）の方法。
【請求項６４】
以下の工程を含む、セロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー、又はリグノセルロース-、リグニン-、キシラン-、グルカン-、若しくはセルロース-含有組成物を加水分解、分解又は破壊する方法：
（A）（a）請求項19に記載のリグノセルロース系活性を有するポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を提供する工程；（b）リグノセルロース、リグニン、キシラン、セルロース及び／又はグルカンを含む組成物を提供する工程；及び（c）リグノセルロース系酵素が、リグニン-、キシラン-、セロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー、又はグルカン-若しくはセルロース-含有組成物を加水分解、分解又は破壊する条件下で、工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と接触させる工程；
（B）（A）の方法であって、前記組成物が、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は動物細胞を含む、前記（A）の方法；
（C）（A）又は（B）の方法であって、前記ポリペプチドが、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する、前記（A）又は（B）の方法；
（D）（A）、（B）又は（C）の方法であって、前記（A）（a）のポリペプチドが組換えポリペプチドである、前記（A）、（B）又は（C）の方法；
（E）（D）の方法であって、前記組換えポリペプチドが、加水分解されるべきリグノセルロース-、キシラン-、リグニン-、グルカン-、又はセルロース-含有組成物内の異種組換えポリペプチドとして生成される、前記（D）の方法；
（F）（D）の方法であって、前記組換えポリペプチドが、細菌、酵母、植物、昆虫、菌類及び動物において前記組換えポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドの発現によって生成され、さらに場合によって、前記生物が、S.ポンベ（pombe）、S.セレビシアエ（cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）sp.、バチルス（Bacillus）sp.、又はラクトバチルス（Lactobacillus）sp.から選択される、前記（D）の方法；又は
（G）（A）から（F）の方法であって、前記リグノセルロース-、リグニン-、キシラン-、グルカン-又はセルロース-含有組成物が、単子葉植物若しくは双子葉植物又は植物生成物；又は単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ；スイッチグラス若しくはミスカンタス（Miscanthus）；又は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスを含む、前記（A）から（F）の方法。
【請求項６５】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含むパン生地又はパン製品であって、場合によって前記ポリペプチドがグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する、前記パン生地又はパン製品。
【請求項６６】
パン生地をコンディショニングする方法であって、前記方法が、パン生地又はパン製品を、請求項19に記載の少なくとも1つのポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品と、パン生地のコンディショニングのために十分な条件下で接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項６７】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む飲料であって、場合によって前記ポリペプチドがエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する、前記飲料。
【請求項６８】
飲料を製造する方法であって、前記方法が、請求項19に記載の少なくとも1つのポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を、飲料の粘性を低下させるために十分な条件下で飲料又は飲料前駆材料に加える工程を含み、場合によって、前記飲料又は飲料前駆材料が麦芽汁又はビールである、前記方法。
【請求項６９】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む、食物、飼料、又は食物若しくは飼料サプリメント、又は栄養性サプリメントであって、場合によって、前記ポリペプチドがグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する、前記食物、飼料、又は食物若しくは飼料サプリメント、又は栄養性サプリメント。
【請求項７０】
以下の工程を含む、動物の食品中の栄養性サプリメントとしてリグノセルロース系酵素を利用する方法：
（A）(a) 請求項19に記載の少なくとも1つのポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含むリグノセルロース系酵素を含有する栄養性サプリメントを製造する工程；又は（b）前記栄養性サプリメントを動物に投与し、前記動物によって摂取される飼料又は食物に含まれるキシランの利用を高める工程；
（B）（A）の方法であって、前記動物がヒトであるか、又は前記動物が反芻動物若しくは単胃動物である、前記（A）の方法；
（C）（A）又は（B）の方法であって、前記リグノセルロース系酵素が、細菌、酵母、植物、昆虫、菌類、動物、S.ポンベ（pombe）、S.セレビシアエ（cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）sp.、バチルス（Bacillus）sp.、及びラクトバチルス（Lactobacillus）sp.から成る群から選択される生物で、前記リグノセルロース系酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって製造される、前記（A）又は（B）の方法。
【請求項７１】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む、熱安定性組換えリグノセルロース系酵素を含む食用デリバリーマトリックス又はペレットであって、場合によって、前記ポリペプチドがグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する、前記食用デリバリーマトリックス又はペレット
【請求項７２】
リグノセルロース系酵素サプリメントを動物又はヒトにデリバーする方法であって、前記方法が、顆粒状の食用担体及び熱安定性組換えリグノセルロース系酵素を含む食用酵素デリバリーマトリックス又はペレットを製造する工程（ここで前記ペレットは、その中に含まれるリグノセルロース系酵素を水性媒体中に容易に分散させ、さらに前記組換えリグノセルロース系酵素は、請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む）；及び前記食用酵素デリバリーマトリックス又はペレットを動物又はヒトに投与する工程を含み、
ここで場合によって、前記顆粒状食用担体が、穀物胚芽、油の搾りかすである穀物胚芽、干し草、アルファルファ、チモシー、ダイズ外皮、ひき割りヒマワリ種子及びひき割りコムギから成る群から選択される担体を含み、
さらに場合によって、食用担体が油の搾りかすの穀物胚芽を含み、
さらに場合によって、前記リグノセルロース系酵素が、グリコシル化されてペレット化条件下で熱安定性を提供し、
さらに場合によって、前記デリバリーマトリックスが、穀物胚芽及びリグノセルロース系酵素を含む混合物をペレット化することによって形成され、
さらに場合によって、前記ペレット化条件が、蒸気の適用を含み、さらに場合によって、前記ペレット化条件が、約80℃を超える温度の約5分間の適用を含み、前記酵素が、少なくとも350から約900ユニット/ミリグラム酵素の比活性を保持する、前記リグノセルロース系酵素サプリメントのデリバリー方法。
【請求項７３】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む、リグノセルロース系酵素含有組成物であって、場合によって、前記ポリペプチドが、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する、前記リグノセルロース系酵素含有組成物。
【請求項７４】
請求項19に記載のリグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるセルラーゼ若しくはリグノセルロース系酵素、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む、木材、木材パルプ、木材廃棄物又は木材製品であって、場合によって、前記セルラーゼ活性が、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む、前記木材、木材パルプ、木材廃棄物又は木材製品。
【請求項７５】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む、紙、紙パルプ又は紙製品であって、場合によって、前記ポリペプチドが、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する、前記紙、紙パルプ又は紙製品
【請求項７６】
紙、木材、木材廃棄物又は木材製品中のセルロースの量を低下させる方法であって、前記方法が、紙、木材又は木材製品を、請求項19に記載のリグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるリグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品と接触させる工程を含み、場合によって、前記セルラーゼ活性が、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む、前記セルロース量を低下させる方法。
【請求項７７】
請求項19に記載のリグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるリグノセルロース系酵素又はセルラーゼ、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む洗剤組成物であって、
場合によって、前記ポリペプチドが、非水性液体組成物、鋳造固体、顆粒形、粒子形、圧縮錠剤、ゲル形、ペースト又はスラリー形として処方され、
さらに場合によって、前記リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ活性が、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む、前記洗剤組成物
【請求項７８】
請求項19に記載のリグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるリグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む、医薬組成物又は食餌用サプリメントであって、
場合によって、前記リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼが、錠剤、ゲル、ピル、インプラント、リキッド、スプレー、散剤、食物、飼料ペレットとして、又はカプセル化処方物として処方され、
さらに場合によって、前記リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ活性が、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含み、場合によって前記組成物がさらにグルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ-1（β-グルコシダーゼ）又はグルコースオキシダーゼ-2（β-キシロシダーゼ）を含む、前記医薬組成物又は食餌用サプリメント。
【請求項７９】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む燃料であって、場合によって、前記ポリペプチドが、リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ活性、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有し、場合によって前記組成物がさらに、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ-1（β-グルコシダーゼ）又はグルコースオキシダーゼ-2（β-キシロシダーゼ）を含み、
場合によって、前記燃料が植物材料に由来し、前記材料が場合によってジャガイモ、ダイズ（ナタネ）、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、エンバク、コムギ、ビート、又はサトウキビを含み、
さらに場合によって、前記燃料が液体又は気体を含み、
さらに場合によって、前記燃料がバイオ燃料又は合成燃料であるか、又は前記燃料がバイオエタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール又はバイオブタノールを含むか、又は前記燃料が、ガソリン-エタノール、メタノール、プロパノール及び／又はブタノール混合物を含む、前記燃料。
【請求項８０】
（A）セロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー、リグニン、リグノセルロース、キシラン、グルカン、セルロース又は発酵性糖を含む組成物を、請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品と接触させる工程を含む、燃料の製造方法；
（B）セロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー、リグニン、リグノセルロース、キシラン、グルカン、セルロース又は発酵性糖を含む組成物が植物、植物生成物又は植物誘導体を含む、前記（A）記載の燃料の製造方法；
（C）前記植物又は植物生成物が、サトウキビの植物若しくはサトウキビ生成物、ビート若しくはサトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、コメ又はオオムギを含む、前記（A）又は（B）記載の燃料の製造方法；
（D）前記植物が単子葉植物又は双子葉植物であるか、又は前記植物が、単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス又はミスカンタス（Miscanthus）であるか、又は前記植物が、双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ又はルピナスである、前記（C）の燃料の製造方法；
（E）前記ポリペプチドが、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有し、場合によって前記組成物がさらに、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ-1（β-グルコシダーゼ）又はグルコースオキシダーゼ-2（β-キシロシダーゼ）を含む、前記（A）、（B）、（C）又は（D）記載の燃料の製造方法；または、
（F）前記燃料が液体及び／又は気体を含むか、又は前記燃料がバイオ燃料及び／又は合成燃料を含むか、又は前記燃料がバイオエタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール及び／又はバイオブタノール、及び／又はガソリン-エタノール、-メタノール、-ブタノール及び／又は-プロパノール混合物を含む（A）、（B）、（C）、（D）又は（E）記載の方法。
【請求項８１】
（A）セロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー、リグニン、リグノセルロース、キシラン、グルカン、セルロース又は発酵性糖を含む組成物を、請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品と接触させる工程を含む、バイオエタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール及び／又はバイオブタノールを製造する方法；
（B）前記組成物が植物、植物生成物又は植物誘導体を含み、さらに場合によって前記植物又は植物生成物が、サトウキビの植物若しくはサトウキビ生成物、ビート若しくはサトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、コメ又はオオムギを含む、（A）記載の方法；
（C）前記ポリペプチドが、リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有し、場合によって前記組成物がさらに、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ-1（β-グルコシダーゼ）又はグルコースオキシダーゼ-2（β-キシロシダーゼ）を含む、（A）又は（B）記載の方法；
（D）前記植物が単子葉植物又は双子葉植物であるか、又は前記植物が、単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス又はミスカンタス（Miscanthus）であるか、又は前記植物が、双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ又はルピナスである、（A）、（B）又は（C）記載の方法；または、
（E）バイオエタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール及び／又はバイオプロパノールを液体燃料及び／又は気体燃料として加工及び／又は処方する工程をさらに含み、場合によって前記燃料がバイオ燃料及び／又は合成燃料を含むか、又は前記燃料が、バイオエタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール及び／又はバイオプロパノール；及び／又はガソリン-エタノール、-メタノール、-ブタノール及び／又は-プロパノール混合物を含む、（A）、（B）、（C）又は（D）記載の方法。
【請求項８２】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む、セルロース系及びヘミセルロース系ポリマーの代謝性炭素部分への解重合のための酵素集合物又は“カクテル”であって、
場合によって、前記ポリペプチドが、リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有し、場合によって前記組成物がさらに、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ-1（β-グルコシダーゼ）又はグルコースオキシダーゼ-2（β-キシロシダーゼ）を含む、前記酵素集合物又は“カクテル”。
【請求項８３】
バイオマス材料を加工する方法であって、前記方法が、セルロース又は発酵性糖を含む組成物を、請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品と接触させる工程を含み、
場合によって、前記リグノセルロース含有バイオマスが農業作物に由来するか、食品又は飼料製造の副産物であるか、リグノセルロース系廃棄物であるか、又は、植物残留物又は紙廃棄物若しくは紙製品廃棄物であり、場合によって、前記ポリペプチドが、リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有し、場合によって前記組成物がさらに、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ-1（β-グルコシダーゼ）又はグルコースオキシダーゼ-2（β-キシロシダーゼ）を含み、
さらに場合によって、前記植物残留物が、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ若しくはトウモロコシの穂軸、実を除いたトウモロコシの茎葉、干し草、わら、木材、木材チップ、木材パルプ、木材廃棄物及びおが屑であり、
さらに場合によって、前記紙廃棄物が、廃棄若しくは使用済みコピー用紙、コンピューター印刷用紙、ノート類用紙、便箋用紙、タイプライター用紙、新聞、雑誌、厚紙及び紙製包装材を含み、
さらに場合によって、前記バイオマス材料の加工が、バイオアルコール、バイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノールを生じる、前記バイオマスの加工方法。
【請求項８４】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む酪農製品であって、場合によって前記酪農製品が、ミルク、アイスクリーム、チーズ又はヨーグルトを含み、さらに場合によって、前記ポリペプチドが、リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する、前記酪農製品。
【請求項８５】
以下の工程を含む、酪農製品の舌触り及び風味を改善する方法：（a）請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を提供する工程；（b）酪農製品を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチド及び工程（b）の酪農製品を、前記リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼが前記酪農製品の舌触り及び風味を改善することができる条件下で接触させる工程。
【請求項８６】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む布地又は織物であって、場合によって、前記布地又は織物がセルロース含有線維を含み、さらに場合によって、前記ポリペプチドが、リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する、前記布地又は織物。
【請求項８７】
以下の工程を含む、固体又は液体の動物排泄物を処理する方法：
（a）請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を提供する工程；（b）固体又は液体の動物排泄物を提供する工程；（c）工程（a）のポリペプチド及び工程（b）の固体又は液体の排泄物を、前記プロテアーゼが前記排泄物を処理することができる条件下で接触させる工程。
【請求項８８】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含む処理済排泄物であって、場合によって、前記ポリペプチドが、リグノセルロース系酵素及び／又はセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する、前記処理済排泄物。
【請求項８９】
リグノセルロース系活性を有するポリペプチドを含む消毒剤であって、前記ポリペプチドが、請求項19に記載の核酸配列、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含み、場合によって、前記ポリペプチドが、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する、前記消毒剤。
【請求項９０】
リグノセルロース系酵素、セルラーゼ及び／又はセルロース分解活性を有するポリペプチドを含む生物系解毒剤又は生物兵器防衛剤であって、前記ポリペプチドが、請求項19に記載の配列、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、又は請求項91から93若しくは請求項96に記載の組成物若しくは製品を含み、場合によって、前記ポリペプチドが、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する、前記生物系解毒剤又は生物兵器防衛剤。
【請求項９１】
以下を含む組成物又は製品：
（a）（i）エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI（CBH I）、セロビオヒドロラーゼII（CBH II）及びβ-グルコシダーゼの各々から少なくとも1つ；（ii）キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ及びアラビノフラノシダーゼの各々から少なくとも1つ；又は（iii）（i）又は（ii）の少なくとも1つの組合せ；を含むリグノセルロース系酵素の混合物（又は“カクテル”）であって、請求項19に記載の少なくとも1つの酵素を含む、前記混合物（“カクテル”）；
（b）（i）エンドグルカナーゼ、リグノセルロース系酵素、セロビオヒドロラーゼI（CBH I）、セロビオヒドロラーゼII（CBH II）、アラビノフラノシダーゼ及びキシラナーゼの各々から少なくとも1つ；（ii）（i）の混合物であって、前記グルコースオキシダーゼがグルコースオキシダーゼ-1又はβ-グルコシダーゼである、前記（i）の混合物；又は（iii）（i）又は（ii）の混合物であって、前記グルコースオキシダーゼがグルコースオキシダーゼ-2又はβ-キシロシダーゼである、前記（i）又は（ii）の混合物；を含むヘミセルロース-及びセルロース-加水分解性酵素の混合物（又は“カクテル”）であって、請求項19に記載の少なくとも1つの酵素を含む、前記混合物（又は“カクテル”）；
（c）エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI（CBH I）、セロビオヒドロラーゼII（CBH II）、アラビノフラノシダーゼ、キシラナーゼ、グルコースオキシダーゼ-1（β-グルコシダーゼ）及びグルコースオキシダーゼ-2（β-キシロシダーゼ）の各々から少なくとも1つを含む、ヘミセルロース-及びセルロース-加水分解性酵素の混合物（又は“カクテル”）であって、請求項19に記載の少なくとも1つの酵素を含む、前記混合物（又は“カクテル”）；
（d）（1）内部β-1,4-結合を切断してより短いグルコオリゴ糖を生じるエンドグルカナーゼ；（2）“エキソ”態様で連続的に作用してセロビオースユニット（β-1,4グルコース-グルコース二糖類）を遊離させるセロビオヒドロラーゼ；及び（3）短いセロオリゴ糖（例えばセロビオース）からグルコースモノマーを遊離させるβ-グルコシダーゼ；を含む酵素の混合物（又は“カクテル”）であって、請求項19に記載の少なくとも1つの酵素を含む、前記混合物（又は“カクテル”）；
（e）配列番号:34、配列番号:360、配列番号:358及び配列番号:371；又は配列番号:358、配列番号:360、配列番号:168；又は配列番号:34、配列番号:360、配列番号:214；又は配列番号:360、配列番号:90、配列番号:358を含む酵素の混合物（又は“カクテル”）；又は
（f）表4に示す酵素の組合せを含む、酵素の混合物（又は“カクテル”）。
【請求項９２】
請求項91に記載の組成物又は製品であって、
（a）前記エンドグルカナーゼが配列番号:4を含み、前記セロビオヒドロラーゼIが配列番号:16、配列番号:30又は配列番号:356を含み、前記セロビオヒドロラーゼIIが配列番号:282を含み、β-グルコシダーゼが配列番号:124を含み、キシラナーゼが配列番号:262、又は前記の任意の組合せであるか、
（b）（a）の酵素の組合せであって、少なくとも1つの酵素が、追加された炭水化物結合ドメイン（CBM）を含む、請求項91に記載の組成物又は製品。
【請求項９３】
以下を含む組成物又は製品：（a）請求項91に記載の酵素又は請求項19に記載の少なくとも1つのリグノセルロース系酵素、及びバイオマス材料の混合物（又は“カクテル”）；（b）（a）の混合物であって、前記バイオマス材料が農作物に由来するリグノセルロース系材料を含むか、又は前記バイオマス材料が食品又は飼料製造の副産物であるか、又は前記バイオマス材料がリグノセルロース系廃棄物であるか、又は前記バイオマス材料が植物残留物又は紙廃棄物又は紙製品廃棄物であるか、又は前記バイオマス材料が植物残留物を含む、前記（a）の混合物；（c）（a）又は（b）の混合物であって、前記植物残留物又はバイオマス材料が、サトウキビバガス、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ若しくはトウモロコシの穂軸、実を除いたトウモロコシの茎葉、草類を含み、場合によって前記草類が、インディアングラス若しくはスイッチグラス、干し草、わら、木材、木材チップ、木材パルプ、木材廃棄物、及び／又はおがくずを含むか、又は前記紙廃棄物が、廃棄若しくは使用済みコピー用紙、コンピューター印刷用紙、ノート類用紙、便箋用紙、タイプライター用紙、新聞、雑誌、厚紙及び紙製包装材を含む、前記（a）又は（b）の混合物。
【請求項９４】
以下の（a）及び（b）の工程を含む、バイオマス材料の加工方法：
（a）（i）（A）酵素の混合物（“カクテル”）又は（B）請求項91から93又は請求項96に記載の組成物若しくは製品、及び（ii）バイオマス材料を提供する工程であって、前記酵素の混合物（“カクテル”）が、（I）請求項19に記載の少なくとも1つのリグノセルロース系酵素；又は（II）ヘミセルロース-及びセルロース-加水分解性酵素を含む酵素の混合物（又は“カクテル”）を含む（I）の混合物であって、前記セルロース-加水分解性酵素が、少なくとも1つのグルコースオキシダーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII及びβ-グルコシダーゼを含み、さらに前記ヘミセルロース-加水分解性酵素が、少なくとも1つのキシラナーゼ、β-キシロシダーゼ及びアラビノフラノシダーゼを含む、前記混合物；を含み、
さらに場合によって、前記酵素が、グルコースオキシダーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性含む、前記工程；及び
（b）前記酵素の混合物を前記バイオマス材料と接触させる工程。
【請求項９５】
前記リグノセルロース含有バイオマスが農作物に由来するか、食品又は飼料製造の副産物であるか、リグノセルロース系廃棄物であるか、又は、植物残留物若しくは植物材料、又は紙廃棄物もしくは紙製品廃棄物であり、さらに場合によって前記植物残留物若しくは植物材料が、サトウキビバガス、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ若しくはトウモロコシの穂軸、実を除いたトウモロコシの茎葉、干し草若しくはわら、木材、木材廃棄物、木材チップ、木材パルプ、木材廃棄物及びおがくずであり、さらに場合によって前記紙廃棄物が、廃棄若しくは使用済みコピー用紙、コンピューター印刷用紙、ノート類用紙、便箋用紙、タイプライター用紙、新聞、雑誌、厚紙及び紙製包装材を含み、さらに場合によって、前記バイオマス材料の加工によってバイオエタノールが生成される、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
以下を含む酵素の混合物又はカクテル：
（a）請求項19に記載の少なくとも1つのリグノセルロース系酵素；
（b）表4に示す酵素の組合せ；
（c）エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI（CBH I）、セロビオヒドロラーゼII（CBH II）及びβ-グルコシダーゼの各々から少なくとも1つ；（ii）キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ及びアラビノフラノシダーゼの各々から少なくとも1つ；又は（iii）（i）又は（ii）から少なくとも1つの組合せ；であって、請求項19に記載の少なくとも1つの酵素を含む、前記混合物；
（d）（i）エンドグルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼI（CBH I）、セロビオヒドロラーゼII（CBH II）、アラビノフラノシダーゼ及びキシラナーゼの各々から少なくとも1つ；（ii）（i）の混合物であって、前記グルコースオキシダーゼがグルコースオキシダーゼ-1又はβ-グルコシダーゼである、前記（i）の混合物；及び／又は（iii）（i）又は（ii）の混合物であって、前記グルコースオキシダーゼがグルコースオキシダーゼ-2又はβ-キシロシダーゼである、前記（i）又は（ii）の混合物；を含む少なくとも1つのヘミセルロース-及びセルロース-加水分解性酵素であって、請求項19に記載の少なくとも1つの酵素を含む、前記混合物； 
（e）エンドグルカナーゼ；セロビオヒドロラーゼI（CBH I）；セロビオヒドロラーゼII（CBH II）；アラビノフラノシダーゼ；キシラナーゼ；グルコースオキシダーゼ-1（β-グルコシダーゼ）；及び／又はグルコースオキシダーゼ-2又はβ-キシロシダーゼの各々から少なくとも1つを含む、少なくとも1つのヘミセルロース-及び／又はセルロース-加水分解性酵素であって、（c）の混合物が、請求項19に記載の少なくとも1つの酵素を含む、前記混合物； 
（f）少なくとも1つの（1）内部β-1,4-結合を切断してより短いグルコオリゴ糖を生じるエンドグルカナーゼ；（2）“エキソ”態様で連続的に作用してセロビオースユニット（β-1,4グルコース-グルコース二糖類）を遊離させるセロビオヒドロラーゼ；及び／又は（3）短いセロオリゴ糖（例えばセロビオース）からグルコースモノマーを遊離させるβ-グルコシダーゼ；であって、請求項19に記載の少なくとも1つの酵素を含む、前記（d）の混合物；
（g）配列番号:34、配列番号:360、配列番号:358及び配列番号:371；又は配列番号:358、配列番号:360、配列番号:168；又は配列番号:34、配列番号:360、配列番号:214；又は配列番号:360、配列番号:90、配列番号:358の酵素組合せ。
【請求項９７】
以下の工程を含むバイオマス材料を加工する方法：
（a）（i）請求項96に記載の酵素の混合物を提供する工程；及び（ii）前記酵素混合物をバイオマス材料と接触させる工程；
（b）（a）の工程であって、リグノセルロース含有バイオマスが農作物に由来するか、食品又は飼料製造の副産物であるか、リグノセルロース系廃棄物であるか、又は、植物材料、ある工程の植物副産物又は植物残留物又は紙廃棄物若しくは紙製品廃棄物である、前記（a）の工程；
（c）（a）又は（b）の工程であって、前記ポリペプチドが、グルコースオキシダーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する、前記（a）又は（b）の工程；
（d）（a）、（b）又は（c）の工程であって、前記バイオマス材料が、サトウキビバガス、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ若しくはトウモロコシの穂軸、実を除いたトウモロコシの茎葉、干し草若しくはわらを含む植物残留物、木材、木材チップ、木材パルプ、紙廃棄物、木材廃棄物及び／又はおがくずである、前記（a）、（b）又は（c）の工程；
（e）（d）の工程であって、前記紙廃棄物が、廃棄若しくは使用済みコピー用紙、コンピューター印刷用紙、ノート類用紙、便箋用紙、タイプライター用紙、新聞、雑誌、厚紙及び紙製包装材を含む、前記（d）の工程；
（f）（a）、（b）、（c）、（d）又は（e）の工程であって、さらに、バイオマス材料を加工して炭水化物、バイオエタノール及び／又はアルコールを生成する工程を含む、前記（a）、（b）、（c）、（d）又は（e）の工程。
【請求項９８】
以下のキメラポリペプチド：
（a）第一のドメイン及び少なくとも第二のドメインを含み、第一のドメインが請求項19に記載の酵素を含み、第二のドメインが異種若しくは改変炭水化物結合ドメイン（CBM）、異種若しくは改変ドッケリンドメイン、異種若しくは改変プレプロドメイン、又は異種若しくは改変活性部位を含む、キメラポリペプチド；
（b）炭水化物結合ドメイン（CBM）が、セルロース結合モジュール又はリグニン結合ドメインである、（a）のキメラポリペプチド；
（c）CBMが酵素の触媒ドメインに類似する、（a）又は（b）のキメラポリペプチド；
（d）少なくとも1つのCBMがポリペプチドの触媒ドメイン近くに配置される、（a）、（b）又は（c）のキメラポリペプチド；
（e）少なくとも1つのCBMが、前記ポリペプチドの触媒ドメインのC-末端近く、又は前記ポリペプチドの触媒ドメインのN-末端近く、又はその両方に配置される、（d）のキメラポリペプチド；
（f）組換えキメラタンパク質である、（a）、（b）、（c）又は（e）のいずれかのキメラポリペプチド。
【請求項９９】
以下のいずれかのキメラポリペプチド：
（a）リグノセルロース系酵素活性を有する請求項19に記載のポリペプチド、及び少なくとも1つの異種若しくは改変炭水化物結合ドメイン（CBM）又は少なくとも1つの内部再編成CBM、又はその任意の組合せを含むキメラポリペプチド；
（b）異種若しくは改変又は内部再編成CBMが、CBM_1、CBM_2、CBM_2a、CBM_2b、CBM_3、CBM_3a、CBM_3b、CBM_3c、CBM_4、CBM_5、CBM_5_12、CBM_6、CBM_7、CBM_8、CBM_9、CBM_10、CBM_11、CBM_12、CBM_13、CBM_14、CBM_15、CBM_16、又はCBM_1からCBM_48のCBMファミリー由来のCBMのいずれか；グリコシルヒドロラーゼ結合ドメイン；表5又は表6に示されるCBM；又はその任意の組合せを含むか、又は前記から成る、（a）のキメラポリペプチド；
（c）CBMが、セルロース結合モジュール又はリグニン結合ドメインを含む、（a）又は（b）のキメラポリペプチド；
（d）少なくとも1つのCBMが前記ポリペプチドの触媒ドメイン近くに配置される、（a）、（b）又は（c）のキメラポリペプチド；
（e）少なくとも1つのCBMが、ポリペプチドの触媒ドメインのC-末端近く、又はポリペプチドの触媒ドメインのN-末端近く、又はその両方に配置される、（d）のキメラポリペプチド；
（f）組換えキメラタンパク質である、前記（a）、（b）、（c）又は（e）のいずれかのキメラポリペプチド。
【請求項１００】
請求項19に記載のポリペプチド、又は請求項1若しくは請求項5に記載の核酸によってコードされるポリペプチドの部分配列を含むか、又は前記から成る炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）モチーフを含むか、又は前記から成る、単離、合成及び／又は組換え炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）であって、前記炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）が、CBM_1、CBM_2、CBM_2a、CBM_2b、CBM_3、CBM_3a、CBM_3b、CBM_3c、CBM_4、CBM_5、CBM_5_12、CBM_6、CBM_7、CBM_8、CBM_9、CBM_10、CBM_11、CBM_12、CBM_13、CBM_14、CBM_15、CBM_16、又はCBM_1からCBM_48のCBMファミリー由来のCBMのいずれかを含むか、又は前記から成る、前記単離、合成及び／又は組換え炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）。
【請求項１０１】
以下を含むか、又は以下から成るから単離、合成及び／又は組換え炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）：
（a）表5及び配列表に示される少なくとも1つの炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）；
（b）表6及び配列表に示される少なくとも1つの炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）；
（c）請求項100に記載の少なくとも1つの炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）；又は
（c）前記の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
EFS-WEBにより提出した配列表に関する記載
本出願は、正式に認可され、MPEP§1730II.B.2(a)(A)に規定されているUSPTO EFS-WEBにより電子出願された。本電子出願は、電子提出された配列表を含む（前記配列表の全内容は全ての目的のために参照により本明細書に含まれる）。本配列表は、電子出願の.txtファイルで以下のとおり識別される：
2010516296.tif 000002
本発明は、分子及び細胞生物学ならびに生化学に関する。ある特徴では、本発明は、リグノセルロース分解性（リグノセルロース系）活性、例えばリグニン分解性及びセルロース分解活性を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに前記ポリヌクレオチド及びポリペプチドを製造及び使用する方法を提供する（前記リグノセルロース分解活性は、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む）。ある実施態様では、本発明は、本発明のポリペプチドの熱安定型及び耐熱型を提供する。本発明のポリペプチド及び核酸は、多様な医薬、農業及び工業環境において、例えばバイオマス（例えばリグノセルロース性残留物）を発酵性糖に生物変換するための酵素として用いられる。この場合、ある特徴では、前記の糖は、エタノール及び燃料、例えばバイオ燃料（例えば合成液体燃料又はガス燃料（エタノール、メタノールなどを含む））の製造のための化学的供給材料として用いられる。
【背景技術】
【０００２】
バイオマス（例えばリグノセルロース性残留物を含む素材）の発酵性糖へのバイオ転換には大きな関心が寄せられている。これらの糖は、バイオ燃料（前記はクリーン燃焼する再生可能なエネルギー供給源である）を製造するための化学的供給材料として順次用いることができる。したがって、バイオマスを加工してクリーンな燃焼を示す再生可能燃料を製造するための非化学的手段が産業で希求されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、リグノセルロース分解（リグノセルロース系）活性（例えばリグニン分解及びセルロース分解活性）を有するポリペプチド（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）、及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む）、それらをコードする核酸、並びにそれらを製造及び使用する方法を提供する。本発明は、任意のバイオマス、例えばリグノセルロース系残留物を発酵性糖又は多糖類に生物変換する酵素を提供する。これらの糖又は多糖類は、アルコール（例えばエタノール、プロパノール、ブタノール及び／又はメタノール）を製造するための化学的供給材料として、さらに、燃料、例えばバイオ燃料（例えば合成液体又はガス（例えばシンガス））の製造に用いることができる。
ある特徴では、本発明の酵素は、基質（例えばリグノセルロース系残留物、セルロース、バガス）の加水分解プロセスの改善のために触媒速度が向上している。触媒速度におけるこの効率の向上は、糖又は多糖類の製造効率の向上をもたらし、前記は、工業、農業又は医療での応用、例えばバイオ燃料又はアルコール（例えばエタノール、プロパノール及び／又はメタノール）の製造に有用でありえる。ある特徴では、本発明の酵素で加水分化することによって製造される糖類は、アルコール（例えばエタノール、プロパノール、ブタノール及び／又はメタノール）の製造及び／又は燃料の製造のために微生物によって利用されえる。
ある特徴では、本発明は、リグノセルロース系活性を有する高度に活性なポリペプチド、例えばグリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）、及び／又はアラビノフラノシダーゼを含む、触媒速度が向上したポリペプチドを提供する。
【０００４】
本発明は、工業、農業又は医療での応用、例えば酵素コストが削減された、例えばバイオマスからバイオ燃料への変換プロセスにおけるコストが削減された、本発明の酵素を用いるバイオマスからバイオ燃料への変換を提供する。したがって、本発明は、バイオアルコール、バイオ燃料、及び／又はバイオ燃料（例えばバイオエタノール、プロパノール、ブタノール及び／又はメタノール）含有組成物（バイオアルコールを含有する合成液体又はガス燃料を含む）を任意のバイオマスから製造する効率的なプロセスを提供する。
ある特徴では、本発明の酵素（本発明の酵素“カクテル”を含む）（“カクテル”は本発明の少なくとも1つの酵素を含む酵素混合物を意味する）は、リグノセルロース系バイオマス、又はセルロース及び／又はヘミセルロースを含む任意の組成物（リグノセルロース系バイオマスはまたリグニンを含む）、例えば種子、穀物、塊茎、植物廃棄物（例えば干し草又はわら、例えば稲わら若しくは麦わら、又は任意の穀物植物の乾燥茎）、又は食品加工若しくは工業処理の副産物（例えば茎）、トウモロコシ（穂軸、茎葉などを含む）、草類（例えばインディアングラス、例えばソルガストルム・ヌータンス（Sirghastrum nutans）、又はスイッチグラス、例えばパニクム（Panicum）（キビ属）種、例えばパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum））、木材（ウッドチップ、加工時廃棄物、例えば木材廃棄物を含む）、紙、パルプ、再生紙（例えば新聞紙）（単子葉又は双子葉植物、又は単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ若しくはその部分（例えばケイントップ（cane top））、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス（Miscanthus）（ススキ）；又は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、ナタネ、アマ、ワタ、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ、ルピナスを含む）の主成分を加水分解するために用いられる。
【０００５】
ある特徴では、本発明の酵素は、β-1,4結合グルコース部分の直鎖を含むセルロース、及び／又は植物間で変動する混成構造としてのヘミセルロースを加水分解するために用いられる。ある特徴では、本発明の酵素は、アラビノース、ガラクトース、グルクロン酸及び／又はマンノースの断続的分枝を有するβ-1,4結合キシロースの骨格を含むヘミセルロースの加水分解に用いられる。ある特徴では、本発明の酵素は、非炭水化物成分を含むヘミセルロース（例えばキシロースのアセチル基及びアラビノースのフェルラ酸エステル）の加水分解に用いられる。ある特徴では、本発明の酵素は、リグニンに共有結合したヘミセルロース、及び／又はジフェルレート架橋により他のヘミセルロース鎖と共役したヘミセルロースの加水分解に用いられる。
ある特徴では、本発明の組成物及び方法はバイオマスの酵素消化で用いられ、多くの多様な酵素（セルラーゼ及びヘミセルラーゼを含む）の使用を含むことができる。本発明の実施に用いられるリグノセルロース系酵素は、セルロースをモノマー糖（グルコースを含む）に消化することができる。ある特徴では、本発明の実施に用いられる組成物は、酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）、セロビオヒドロラーゼ、及び／又はアラビノフラノシダーゼ、又はヘミセルロースをモノマー糖に消化することができる他の酵素）の混合物を含むことができる。本発明の混合物は、本発明の酵素のみを含むか若しくは本発明の酵素から成ることも可能であるが、本発明の少なくとも1つの酵素及びまた別の酵素（前記はまたリグノセルロース系酵素であるか及び／又は任意の他の酵素（例えばグルコースオキシダーゼ）でもよい）を含むこともできる。
【０００６】
ある特徴では、本発明の実施に用いられる組成物は、以下の少なくとも3つの異なる酵素タイプの混合物である“セルラーゼ”を含む：（1）エンドグルカナーゼ、内部β-1,4結合を切断し、より短いグルコオリゴ糖を生じる、（2）セロビオヒドロラーゼ、“エキソ”態様で作用して連続処理的にセロビオースユニット（β-1,4グルコース、グルコース二糖類）を遊離させる、及び（3）β-グルコシダーゼ、短いセロオリゴ糖（例えばセロビオース）からグルコースモノマーを遊離させる。
ある特徴では、本発明の酵素は、グルカナーゼ（例えばエンドグルカナーゼ）活性（例えば内部エンド-β-1,4及び／又はβ-1,3-グルカナーゼ結合の加水分解を触媒する）を有する。ある特徴では、前記エンドグルカナーゼ活性（例えばエンド-1,4-ベータ-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ活性）は、セルロース、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース）リケニンの1,4-及び／又はβ-1,3-ベータ-D-グリコシド結合、混合ベータ-1,3グルカン（例えば穀類のベータ-D-グルカン又はキシログルカン及びセルロース部分を含む他の植物材料のベータ-1,4結合の加水分解を含む。
ある特徴では、本発明の酵素は、エンドグルカナーゼ（例えばエンドベータ-1,4-グルカナーゼ、EC3.2.1.4；エンド-ベータ-1,3(1)-グルカナーゼ、EC3.2.1.6；エンド-ベータ-1,3-グルカナーゼ、EC3.2.1.39)活性を有し、セルロース及びグルカンの内部β-1,4-及び／又はβ-1,3-グルコシド結合を加水分解して、より小さな分子量のグルコース及びグルコースオリゴマーを生成することができる。本発明は、本発明のこれらの酵素を用いて、より小さな分子量のグルコース及びグルコースオリゴマーを製造する方法を提供する。
【０００７】
ある特徴では、本発明の酵素は、グルカン、例えば1,4-β-及び／又は1,3-グリコシド-結合D-グリコピラノースから形成される多糖類の生成に用いられる。ある特徴では、本発明のエンドグルカナーゼは、食品工業で、例えば焼成並びに果実及び野菜の加工のために、農業廃棄物の分解で、動物飼料の製造で、パルプ及び紙の製造、織物製造、並びに家事用及び工業用洗浄剤で使用される。ある特徴では、本発明の酵素（例えばエンドグルカナーゼ）は、微生物、例えば菌類及び／又は細菌によって生成される。
ある特徴では、本発明の酵素（例えばエンドグルカナーゼ）は、穀類の主要な非デンプン性多糖類であるベータ-グルカン（β-グルカン）の加水分解に用いられる。多糖類のグルカン含有量は種類及び生育条件に応じて顕著に変動しえる。この多糖類の物理化学的特性は、酸化条件下では粘稠溶液又はゲルすら生じるようなものである。さらにまた、グルカンは高い水結合能力を有する。これらの特徴は全て、いくつかの産業（発酵、焼成、動物の栄養補給を含む）に問題を提示している。発酵における適用では、グルカンの存在は、麦芽汁のろ過性及び混濁形成問題を生じる。焼成（特にクッキー及びクラッカー）における適用では、グルカンは粘着な生地を生じ、前記は機械生産が困難でビスケットサイズを低下させる。したがって、本発明の酵素（例えばエンドグルカナーゼ）は、β-グルカン含有組成物のβ-グルカン量を減少させるために用いられ、例えば、本発明の酵素は、溶液又はゲルの粘度を低下させるために、組成物（例えばβ-グルカン含有組成物）の水結合能力を低下させるために、発酵過程で（例えば麦芽汁のろ過性を高め、さらに混濁形成を低下させるために）、生地の粘着性を低下させるために（例えばクッキー、パン、ビスケットなどの製造用）用いられる。
【０００８】
さらにまた、炭水化物（例えばβ-グルカン）は、焼成製品の急激な再水和に関係し、パリパリした食感の低下及び保存期間の低下をもたらす。したがって、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、パリパリした食感を維持するために、前記食感を高めるために、又はその消失速度を遅らせるために、さらに任意の炭水化物含有食物、飼料又は飲料（例えばβ-グルカン含有食物、飼料又は飲料）の保存期間を延長するために用いられる。
本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、（例えば動物、例えば反芻獣又はヒトの）腸内容物（例えば穀類食を含むもの）の粘度の低下のために用いられる。したがって、また別の特徴では、本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、食物又は飼料の消化性及び動物（ヒト又は家畜）の成長速度にプラスの影響を与えるために用いられ、さらにある特徴では、より高い飼料変換効率を得るために用いられる。単胃動物の穀物食飼料に関する適用については、ベータ-グルカンは腸内容物の粘度に対する寄与因子であり、したがって飼料の消化性及び動物の成長速度に悪影響を及ぼす。反芻動物にとって、これらのベータ-グルカンは線維摂取の実質的成分であり、グルカンのより完全な消化は飼料効率の向上を促進するであろう。したがって、本発明は、本発明のエンドグルカナーゼを含む動物飼料及び食物を提供し、さらにある特徴では、これらの酵素は動物の消化管、例えば胃及び／又は腸で活性を有する。
【０００９】
本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、セルロース又は任意のベータ-1,4-結合グルカンを含む合成又は天然の物質（任意の植物材料で見出されるものを含む）の消化に用いられる。本発明の酵素、例えばエンドグルカナーゼは、任意の供給源（全ての生物学的供給源を含み、例えば植物バイオマス、例えば、トウモロコシ、穀物、草類（例えばインディアングラス、例えばソルガストルム・ヌータンス、又はスイッチグラス、例えばパニクム種、例えばパニクム・ヴィルガツム）；又は単子葉若しくは双子葉、又は単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ若しくはその部分（例えばケイントップ）、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス；又は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、ナタネ、アマ、ワタ、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ、ルピナス；又は木材又は木材加工副産物、例えば木材廃棄物）に由来するセルロースを、例えば木材加工で、パルプ及び／又は製紙工業で、織物製造で、並びに家事用及び工業用洗浄剤で、及び／又はバイオマス廃棄物処理で消化するために、市販の酵素として用いられる。
ある特徴では、本発明は、本発明の酵素、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む組成物（例えば医薬組成物、食物、飼料、薬剤、食餌用サプリメント）を提供する。これらの組成物は多様な形態、例えばピル、カプセル、錠剤、ゲル、ゲルタブ、ローション、ピル、注射可能物、インプラント、リキッド、スプレー、粉末、食品、添加物、サプリメント、飼料若しくは飼料ペレットとして、又は任意のタイプの被包化形、若しくは任意のタイプの処方物として処方することができる。
【００１０】
本発明は、配列番号:1、配列番号:3、 配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:147、配列番号:149、配列番号:151、配列番号:153、配列番号:155、配列番号:157、配列番号:159、配列番号:161、配列番号:163、配列番号:165、配列番号:167、配列番号:169、配列番号:171、配列番号:173、配列番号:175、配列番号:177、配列番号:179、配列番号:181、配列番号:183、配列番号:185、配列番号:187、配列番号:189、配列番号:191、配列番号:193、配列番号:195、配列番号:197、配列番号:199、配列番号:201、配列番号:203、配列番号:205、配列番号:207、配列番号:209、配列番号:211、配列番号:213、配列番号:215、配列番号:217、配列番号:219、配列番号:221、配列番号:223、配列番号:225、配列番号:227、配列番号:229、配列番号:231、配列番号:233、配列番号:235、配列番号:237、配列番号:239、配列番号:241、配列番号:243、配列番号:245、配列番号:247、配列番号:249、配列番号:251、配列番号:253、配列番号:255、配列番号:257、配列番号:259、配列番号:261、配列番号:263、配列番号:265、配列番号:267、配列番号:269、配列番号:271、配列番号:273、配列番号:275、配列番号:277、配列番号:279、配列番号:281、配列番号:283、配列番号:285、配列番号:287、配列番号:289、配列番号:291、配列番号:293、配列番号:295、配列番号:297、配列番号:299、配列番号:301、配列番号:303、配列番号:305、配列番号:307、配列番号:309、配列番号:311、配列番号:313、配列番号:315、配列番号:317、配列番号:319、配列番号:321、配列番号:323、配列番号:325、配列番号:327、配列番号:329、配列番号:331、配列番号:333、配列番号:335、配列番号:337、配列番号:339、配列番号:341、配列番号:343、配列番号:345、配列番号:347、配列番号:349、配列番号:351、配列番号:353、配列番号:355、配列番号:357、配列番号:359、配列番号:361、配列番号:363、配列番号:365、配列番号:367、配列番号:369、配列番号:370、配列番号:372、配列番号:373、配列番号:375、配列番号:376、配列番号:378、配列番号:379、配列番号:381、配列番号:382、配列番号:384、配列番号:385、配列番号:387、配列番号:388、配列番号:390、配列番号:391、配列番号:393、配列番号:394、配列番号:396、配列番号:397、配列番号:399、配列番号:400、配列番号:402、配列番号:403、配列番号:405、配列番号:406、配列番号:408、配列番号:409、配列番号:411、配列番号:412、配列番号:414、配列番号:415、配列番号:417、配列番��:418、配列番号:420、配列番号:421、配列番号:423、配列番号:425、配列番号:427、配列番号:429、配列番号:431、配列番号:433、配列番号:435、配列番号:437、配列番号:439、配列番号:441、配列番号:443、配列番号:445、配列番号:447、配列番号:449、配列番号:451、配列番号:453、配列番号:455、配列番号:457、配列番号:459、配列番号:461、配列番号:463、配列番号:465、配列番号:467、配列番号:469及び／又は配列番号:471、配列番号:480、配列番号:481、配列番号:482、配列番号:483、配列番号:484、配列番号:485、配列番号:486、配列番号:487、配列番号:488、配列番号:489と配列番号:700の間の全ての奇数の配列番号、配列番号:707、配列番号:708、配列番号:709、配列番号:710、配列番号:711、配列番号:712、配列番号:713、配列番号:714、配列番号:715、配列番号:716、配列番号:717、配列番号:718、及び／又は配列番号:720（前記にはcDNAコード配列及びゲノム（例えば“gDNA”）配列が含まれる）を含み、さらにまた表1から4の配列（これらの配列はいずれも“本発明の例示的核酸”である）及び下記の例示（これら配列もまた配列表に示されている）を含む本発明の例示的核酸に対して、少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは前記より高いか又は完全な（100%）配列同一性（相同性）を、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500又はそれより長い残基の領域にわたって；又はタンパク質コード領域（例えばcDNA）若しくはゲノム配列から成る領域にわたって有し、さらにこれらの核酸配列及びそれらがコードするポリペプチドのいずれも“本発明の配列”に包含される、核酸配列を含む単離、合成又は組換え核酸を提供する。
【００１１】
また別の特徴では、本発明のこれらの核酸は、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする。また別の実施態様では、本発明の核酸は、本発明の例示的ポリペプチド（下記に列挙）と特異的に結合することができる抗体（又は任意のその結合フラグメント）を生成することができるポリペプチドをコードすることができるか、又はこれらの核酸は、リグノセルロース系酵素をコードする核酸の同定若しくは単離のためのプローブとして用いることができるか、又はリグノセルロース系酵素を発現する核酸の発現を阻害するために用いることができる（これらの特徴のいずれも“本発明の核酸”と称される）。ある特徴では、前記配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析によって又は目視精査によって決定される。
【００１２】
本発明の核酸にはまた、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192、配列番号:194、配列番号:196、配列番号:198、配列番号:200、配列番号:202、配列番号:204、配列番号:206、配列番号:209、配列番号:210、配列番号:212、配列番号:214、配列番号:216、配列番号:218、配列番号:220、配列番号:222、配列番号:224、配列番号:226、配列番号:228、配列番号:230、配列番号:232、配列番号:234、配列番号:236、配列番号:238、配列番号:240、配列番号:242、配列番号:244、配列番号:246、配列番号:248、配列番号:250、配列番号:252、配列番号:254、配列番号:256、配列番号:258、配列番号:260、配列番号:262、配列番号:264、配列番号:266、配列番号:268、配列番号:270、配列番号:272、配列番号:274、配列番号:276、配列番号:278、配列番号:280、配列番号:282、配列番号:284、配列番号:286、配列番号:288、配列番号:290、配列番号:292、配列番号:294、配列番号:296、配列番号:298、配列番号:300、配列番号:302、配列番号:304、配列番号:306、配列番号:308、配列番号:310、配列番号:312、配列番号:314、配列番号:316、配列番号:318、配列番号:320、配列番号:322、配列番号:324、配列番号:326、配列番号:328、配列番号:330、配列番号:332、配列番号:334、配列番号:336、配列番号:338、配列番号:340、配列番号:342、配列番号:344、配列番号:346、配列番号:348、配列番号:350、配列番号:352、配列番号:354、配列番号:356、配列番号:358、配列番号:360、配列番号:362、配列番号:364、配列番号:366、配列番号:368、配列番号:371、配列番号:374、配列番号:377、配列番号:380、配列番号:383、配列番号:386、配列番号:389、配列番号:392、配列番号:395、配列番号:398、配列番号:401、配列番号:404、配列番号:407、配列番号:410、配列番号:413、配列番号:416、配列番号:419、配列番号:422、配列番号:424、配列番号:426、配列番号:428、配列番号:430、配列番号:432、配列番号:434、配列番号:436、配列番号:438、配列番号:440、配列番号:442、配列番号:444、配列番号:446、配列番号:448、配列番号:450、配列番��:452、配列番号:454、配列番号:456、配列番号:458、配列番号:460、配列番号:462、配列番号:464、配列番号:466、配列番号:468、配列番号:470、及び／又は配列番号:472、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490から配列番号:700の間の全ての偶数番号の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721の配列（又はその部分配列、若しくは酵素的に活性なフラグメント）を有する本発明のポリペプチド（例えば酵素）を含む、本発明の例示的ポリペプチド（又はペプチド）（表1から4に示す配列、及び配列表に示す配列（これらの配列のいずれも“本発明の例示的酵素／ポリペプチド（又は核酸）”である）並びにその酵素的に活性な部分配列（フラグメント）及び／又は免疫学的に活性なその部分配列（例えばエピトープ又は免疫原）（いずれも“本発明のペプチド”）及びその変種（これらの配列はいずれも本発明のポリペプチド及びペプチドに包含される）を含む）をコードする単離、合成又は組換え核酸が含まれる。
【００１３】
ある実施態様では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する。
ある特徴では、本発明は、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼ）をコードする核酸を提供し、前記は、それらが混合培養に由来するという点において共通の新規性を有する。本発明は、混合培養から単離された、セルロース又はオリゴ糖加水分解（分解）酵素をコードする核酸を提供し、前記核酸は本発明のポリヌクレオチド、例えば、本発明の例示的核酸、例えば配列番号:1、配列番号:3などから配列番号:471まで、配列番号:480、配列番号:481、配列番号:482、配列番号:483、配列番号:484、配列番号:485、配列番号:486、配列番号:487、配列番号:488、配列番号:489と配列番号:700の間の全ての奇数の配列番号、配列番号:707、配列番号:708、配列番号:709、配列番号:710、配列番号:711、配列番号:712、配列番号:713、配列番号:714、配列番号:715、配列番号:716、配列番号:717、配列番号:718及び／又は配列番号:720（表1から3、及び配列表を参照されたい）に対して、少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%。35%、40%、45%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは前記より高いか又は完全な（100%）配列同一性を、少なくとも約50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150若しくはそれより長い領域にわたって、又はコード配列（例えばcDNA）若しくはゲノム配列（例えばエクソン及びイントロンを含む）の完全長にわたって有する配列を含む。
【００１４】
ある特徴では、本発明は、リグノセルロース系酵素をコードする核酸、例えばセルラーゼ酵素、エンドグルカナーゼ酵素、セロビオヒドロラーゼ酵素、β-グルコシダーゼ酵素（ベータ-グルコシダーゼ酵素）、キシラナーゼ酵素、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）酵素及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素をコードする；及び／又はグルコースオキシダーゼ酵素をコードする核酸（本発明の例示的ポリヌクレオチド配列（表1から4及び配列表をまた参照されたい）を含む）、及び前記によってコードされるポリペプチド（本発明の酵素、例えば本発明の例示的ポリペプチド、例えば、配列番号:2、配列番号:4などから配列番号:472まで、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490と配列番号:700の間の全ての偶数の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721（配列表、及び表1から4をまた参照されたい）を含む）であって、それらが共通の供給源、例えば環境系供給源に由来するという点で共通の新規性を有する前記ポリペプチドを提供する。下記の表2及び3は、本発明の例示的酵素のいくつかの最初の供給源を示す。
ある特徴では、本発明はまた、リグノセルロース系酵素をコードする、例えばグリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ酵素、セロビオヒドロラーゼ酵素、β-グルコシダーゼ酵素（ベータ-グルコシダーゼ酵素）、キシラナーゼ酵素、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素をコードする；及び／又はグルコースオキシダーゼ酵素をコードする核酸であって、前記が環境系供給源、例えば混合環境系供給源に由来するという点で共通の新規性を有する前記核酸を提供する。
ある特徴では、配列比較アルゴリズムはBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、前記アルゴリズムでは、フィルタリング設定はblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他の全てのオプションは規定値に設定される。
【００１５】
本発明のまた別の特徴は、本発明の核酸配列、前記と実質的に同一の配列、及び前記と相補的な配列の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500又はそれより長い連続する塩基を含む単離、合成又は組換え核酸である。
ある特徴では、本発明の前記単離、合成又は組換え核酸は、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性；及び／又はグルコースオキシダーゼ活性（前記は熱安定性である）を有するポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは、約37℃から約95℃、約55℃から約85℃、約70℃から約95℃、又は約90℃から約95℃の温度範囲を含む条件下でリグノセルロース系活性を保持することができる。前記ポリペプチドは、約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約95℃、96℃、97℃、98℃又は99℃、約55℃から約85℃、約70℃から約75℃、又は約90℃から約99℃、又は95℃、96℃、97℃、98℃若しくは99℃、又はそれより高い温度でリグノセルロース系活性を保持することができる。
別の特徴では、単離、合成又は組換え核酸は、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性；及び／又はグルコースオキシダーゼ活性を有し、可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーをモノマーキシロース、アラビノース及びグルコースに加水分解（分解）することができ、耐熱性であるポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは、37℃より高い温度から約95℃の範囲、又は55℃から約85℃の範囲のいずれかの温度に暴露した後でリグノセルロース系活性又はグルコースオキシダーゼ活性を保持することができる。前記ポリペプチドは、約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約95℃、96℃、97℃、98℃又は99℃、約55℃から約85℃、約70℃から約75℃、又は約90℃から約95℃、又はそれより高い範囲の温度に暴露した後でリグノセルロース系活性を保持することができる。ある特徴では、前記ポリペプチドは、約pH4.5又はそれより高いpHで90℃を超える温度から約99℃の範囲の温度、又は95℃、96℃、97℃、98℃又は99℃に暴露した後でリグノセルロース系活性を保持する。
【００１６】
本発明は、本発明の例示的核酸配列、例えば配列番号:1、配列番号:3などから配列番号:471まで、配列番号:480、配列番号:481、配列番号:482、配列番号:483、配列番号:484、配列番号:485、配列番号:486、配列番号:487、配列番号:488、配列番号:489と配列番号:700の間の全ての奇数の配列番号、配列番号:707、配列番号:708、配列番号:709、配列番号:710、配列番号:711、配列番号:712、配列番号:713、配列番号:714、配列番号:715、配列番号:716、配列番号:717、配列番号:718及び／又は配列番号:720（表1から3、及び配列表を参照されたい）、又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む、本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離、合成又は組換え核酸を提供する。ある特徴では、前記核酸は、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するか、又は可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーをモノマーキシロース、アラビノース及びグルコースに加水分解（分解）することができるポリペプチドをコードする。前記核酸は、長さが少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200又はそれより長い残基であるか、又は完全長の遺伝子若しくは転写物（例えばcDNA）であってもよい。ある特徴では、前記ストリンジェントな条件は、約65℃の温度で約15分間の0.2ｘのSSCによる洗浄を含む洗浄工程を含む。
【００１７】
本発明は、リグノセルロース系活性（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性）を有するか、又は可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーをモノマーキシロース、アラビノース及びグルコースに加水分解（分解）することができるポリペプチドをコードする核酸を同定又は単離するための核酸プローブを提供し、ここで前記プローブは、本発明の配列、又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む配列の少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、又はそれより長い連続する塩基を含み、ここで前記プローブは結合又はハイブリダイゼーションによって前記核酸を同定する。前記プローブは、本発明の配列、又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む配列の少なくとも約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、又は約60から100の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含みえる。
本発明は、リグノセルロース系活性（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性）を有するか、又は可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーをモノマーキシロース、アラビノース及びグルコースに加水分解（分解）することができるポリペプチドをコードする核酸を同定又は単離するための核酸プローブを提供し、ここで前記プローブは、本発明の核酸、例えば、本発明の例示的核酸と少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは前記より高いか又は完全な（100%）配列同一性を有するポリヌクレオチドの少なくとも約10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000又はそれより長い残基の配列を含む核酸を含む。ある特徴では、前記配列同一性は、配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、又は目視精査によって決定される。また別の特徴では、前記プローブは、本発明の核酸配列又はその部分配列の少なくとも約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、又は約60から100の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００１８】
本発明は、リグノセルロース系活性（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性）を有する、又は可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーをモノマーキシロース、アラビノース及びグルコースに加水分解（分解）することができるポリペプチドをコードする核酸を増幅（例えばPCRによって）するための増幅プライマー対を提供し、ここで、前記プライマー対は、本発明の配列、又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む核酸を増幅することができる。増幅プライマー配列対の一方又は各メンバーは、前記配列の少なくとも約10から50若しくはそれより長い連続する塩基、又は前記配列の約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、若しくはそれより長い連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む。本発明は増幅プライマー対を提供し、ここで、前記プライマー対は、本発明の核酸の最初の（5'の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36又はそれより長い残基によって示される配列を有する第一のメンバー、及び前記第一のメンバーの相補鎖の最初の（5'の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36又はそれより長い残基によって示される配列を有する第二のメンバーを含む。
【００１９】
本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いる増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成される、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼをコードするセルラーゼを提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いる増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成される、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼをコードするセルラーゼを提供する。本発明は、リグノセルロース系活性を有する酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼをコードする核酸を、本発明の増幅プライマー対を用いる増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成する方法を提供する。ある特徴では、前記増幅プライマー対は、ライブラリー、例えば遺伝子ライブラリー、例えば環境ライブラリーから核酸を増幅する。
本発明は、リグノセルロース系活性を有するポリペプチド（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼ）、又は可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーをモノマーキシロース、アラビノース及びグルコースに加水分解（分解）することができるポリペプチドをコードする核酸を増幅する方法を提供し、前記方法は、本発明の核酸配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を増幅することができる増幅プライマー配列対を用いて鋳型核酸を増幅する工程を含む。
【００２０】
本発明は、本発明の核酸又はその部分配列を含む発現カセットを提供する。ある特徴では、前記発現カセットは、プロモーターに機能的に連結された前記核酸を含む。前記プロモーターは、ウイルス系、細菌系、哺乳動物系、又は植物系プロモーターでありえる。ある特徴では、植物プロモーターは、ジャガイモ、コメ、トウモロコシ、コムギ、タバコ又はオオムギのプロモーターでありえる。前記プロモーターは構成性プロモーターでありえる。前記構成性プロモーターはCaMV35Sを含むことができる。別の特徴では、プロモーターは誘導性プロモーターでありえる。ある特徴では、前記プロモーターは、組織特異的プロモーター、又は環境により調節されるか若しくは発育により調節されるプロモーターでありえる。したがって、例えばプロモーターは、例えば種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的、又は器官脱離誘導プロモーターでありえる。ある特徴では、内因性又は異種シグナル配列をコードする本発明の核酸は、誘導性プロモーター、環境により調節されるか又は発育により調節されるプロモーター、組織特異的プロモーターなどを用いて発現される（下記の考察を参照されたい）。また別の特徴では、プロモーターは、種子優先プロモーター、例えばトウモロコシのガンマゼインプロモーター又はトウモロコシのADP-gppプロモーターを含む。ある特徴では、シグナル配列は、コードされた本発明のタンパク質を空胞、小胞体、葉緑体、又はデンプン顆粒に誘導する。
ある特徴では、前記発現カセットはさらに植物又は植物ウイルス発現ベクターを含むことができる。本発明は、本発明の発現カセット（例えばベクター）又は本発明の核酸を含むクローニングビヒクルを提供する。前記クローニングビヒクルは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ又は人工染色体でありえる。前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はアデノ関連ウイルスベクターを含むことができる。前記クローニングビヒクルは、細菌人工染色体（BAC）、プラスミド、バクテリオファージP1由来ベクター（PAC）、酵母人工染色体（YAC）又は哺乳動物人工染色体（MAC）を含むことができる。
【００２１】
本発明は、本発明の核酸若しくは本発明の発現カセット（例えばベクター、プラスミドなど）、又は本発明のクローニングビヒクル（例えば人工染色体）を含む形質転換細胞を提供する。ある特徴では、形質転換細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は植物細胞が可能である。ある特徴では、前記植物細胞は、ダイズ、アブラナ、オイルシード、トマト、サトウキビ、穀物、ジャガイモ、コムギ、イネ、トウモロコシ、タバコ、又はオオムギの細胞が可能である。前記植物細胞はまた単子葉植物又は双子葉植物が可能で、単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、インディアングラス、スイッチグラス若しくはミスカンタス；又は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスである。
本発明は、本発明の核酸又は本発明の発現カセット（例えばベクター）を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。ある特徴では、前記動物はマウス、乳牛、ラット、ブタ、ヤギ又はヒツジである。
本発明は、本発明の核酸又は本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック植物を提供する。前記トランスジェニック植物は、任意の穀物植物、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、オイルシード、アブラナ、ダイズ、イネ、オオムギ、又はタバコである。前記トランスジェニック植物は単子葉植物又は双子葉植物が可能であり、単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス；又は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスである。
本発明は、本発明の核酸又は本発明の発現カセット（例えばベクター）を含むトランスジェニック種子を提供する。前記トランスジェニック種子は、穀物植物、トウモロコシの種子、コムギの穀粒、オイルシード、ナタネ、ダイズの種子、ヤシの実、ヒマワリの種子、ゴマの種子、落下生又はタバコの種子である。トランスジェニック種子はまた、単子葉植物又は双子葉植物に由来することが可能であり、単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス；又は双子葉系のオイルシード、ダイズ、キャノーラ、ナタネ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスである。
【００２２】
本発明は、本発明の核酸に対して相補的な核酸配列、又は前記とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素メッセージの翻訳を細胞内で阻害する方法を提供し、前記方法は、本発明の核酸に対して相補的な核酸配列、又は前記とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、又は前記を細胞内で発現させる工程を含む。ある特徴では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、又は約60から100塩基、例えば長さが10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100又はそれより長い塩基である。本発明は、リグノセルロース系酵素メッセージの翻訳を細胞内で阻害する方法を提供し、前記方法は、本発明の核酸に対して相補的な核酸配列、又は前記とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、又は前記を細胞内で発現させる工程を含む。
本発明は、本発明の配列の部分配列を含む、二本鎖の阻害性RNA（RNAi又はRNA干渉）分子（転写阻害用の小さな干渉性RNA又はsiRNA、及び翻訳阻害用マイクロRNA又はmiRNAを含む）を提供する。ある特徴では、前記siRNAは、長さが約21から24残基、又は少なくとも約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100又はそれより大きい二重鎖ヌクレオチドである。本発明は、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性の発現を細胞内で阻害する、例えば可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーをモノマーキシロース、アラビノース及びグルコースに加水分解（分解）することができる方法を提供し、前記方法は、二本鎖の阻害性RNA（siRNA又はmiRNA）を細胞に投与するか、又は細胞内で発現させる工程を含み、ここで前記RNAは、本発明の配列の部分配列を含む。
【００２３】
本発明は、本発明の例示的ポリペプチド又はペプチドに対して、少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは前記より高いか又は完全な（100%）配列同一性（相同性）を、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、若しくはそれより長い残基の領域にわたって、又は前記ポリペプチドの完全長にわたって有するアミノ酸配列を含む単離、合成又は組換えポリペプチドを提供する。ある特徴では、前記配列同一性は、配列比較アルゴリズムによる分析によって又は目視精査によって決定される。本発明の例示的ポリペプチド又はペプチドには、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:66、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:143、配列番号:146、配列番号:148、配列番号:150、配列番号:152、配列番号:154、配列番号:156、配列番号:158、配列番号:160、配列番号:162、配列番号:164、配列番号:166、配列番号:168、配列番号:170、配列番号:172、配列番号:174、配列番号:176、配列番号:178、配列番号:180、配列番号:182、配列番号:184、配列番号:186、配列番号:188、配列番号:190、配列番号:192、配列番号:194、配列番号:196、配列番号:198、配列番号:200、配列番号:202、配列番号:204、配列番号:206、配列番号:209、配列番号:210、配列番号:212、配列番号:214、配列番号:216、配列番号:218、配列番号:220、配列番号:222、配列番号:224、配列番号:226、配列番号:228、配列番号:230、配列番号:232、配列番号:234、配列番号:236、配列番号:238、配列番号:240、配列番号:242、配列番号:244、配列番号:246、配列番号:248、配列番号:250、配列番号:252、配列番号:254、配列番号:256、配列番号:258、配列番号:260、配列番号:262、配列番号:264、配列番号:266、配列番号:268、配列番号:270、配列番号:272、配列番号:274、配列番号:276、配列番号:278、配列番号:280、配列番号:282、配列番号:284、配列番号:286、配列番号:288、配列番号:290、配列番号:292、配列番号:294、配列番号:296、配列番号:298、配列番号:300、配列番号:302、配列番号:304、配列番号:306、配列番号:308、配列番号:310、配列番号:312、配列番号:314、配列番号:316、配列番号:318、配列番号:320、配列番号:322、配列番号:324、配列番号:326、配列番号:328、配列番号:330、配列番号:332、配列番号:334、配列番号:336、配列番号:338、配列番号:340、配列番号:342、配列番号:344、配列番号:346、配列番号:348、配列番号:350、配列番号:352、配列番号:354、配列番号:356、配列番号:358、配列番号:360、配列番号:362、配列番号:364、配列番号:366、配列番号:368、配列番号:371、配列番号:374、配列番号:377、配列番号:380、配列番号:383、配列番号:386、配列番号:389、配列番号:392、配列番号:395、配列番号:398、配列番号:401、配列番号:404、配列番号:407、配列番号:410、配列番号:413、配列番号:416、配列番号:419、配列番号:422、配列番号:424、配列番号:426、配列番号:428、配列番号:430、配列番号:432、配列番号:434、配列番号:436、配列番号:438、配列番号:440、配列番号:442、配列番号:444、配列番号:446、配列番号:448、配列番号:450、配列番号:452、配列番号:454、配列番号:456、配列番号:458、配列番号:460、配列番号:462、配列番号:464、配列番号:466、配列番号:468、配列番号:470、及び／又は配列番号:472、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490から配列番号:700の間の全ての偶数番号の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721の配列（表1から4、及び配列表に示す全配列（これらの配列はいずれも“本発明の例示的酵素/ポリペプチド”である）を含む）、並びに前記（例えば“本発明のペプチド”）の部分配列（“酵素的に活性なフラグメント”を含む）及び前記の変種（これらの配列のいずれも本発明のポリペプチド及びペプチドに包含される）が含まれる。
【００２４】
例示的ポリペプチドにはまた、長さが少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600若しくはそれより長い残基のフラグメント、又は酵素の完全長に及ぶものが含まれる。本発明のポリペプチド又はペプチド配列には、本発明の核酸によってコードされる配列が含まれる。本発明のポリペプチド又はペプチド配列には、本発明の抗体が特異的に結合するポリペプチド又はペプチド（例えばエピトープ）、又は本発明の抗体を生成することができるポリペプチド又はペプチド（例えば免疫原）が含まれる。
ある特徴では、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を有する。また別の特徴では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも1つのリグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする。
ある特徴では、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性は熱安定性である。前記ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲、又は95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃、又はそれより高い温度を含む条件下でリグノセルロース系活性を保持することができる。いくつかの実施態様では、本発明の熱安定性ポリペプチドは、約pH3.0、約pH3.5、約pH4.0、約pH4.5、約pH5.0、約pH5.5、約pH6.0、約pH6.5、約pH7.0、約pH7.5、約pH8.0、約pH8.5、約pH9.0、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5、約pH11.0、約pH11.5、約pH12.0又はそれより高いpHで上記に記載の範囲の温度においてリグノセルロース系活性を保持する。
【００２５】
別の特徴では、リグノセルロース系酵素活性は耐熱性である。前記ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲、又は95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃、又はそれより高い温度に暴露した後でリグノセルロース系活性を保持することができる。いくつかの実施態様では、本発明の耐熱性ポリペプチドは、約pH3.0、約pH3.5、約pH4.0、約pH4.5、約pH5.0、約pH5.5、約pH6.0、約pH6.5、約pH7.0、約pH7.5、約pH8.0、約pH8.5、約pH9.0、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5、約pH11.0、約pH11.5、約pH12.0又はそれより高いpHで上記に記載の範囲の温度に暴露した後でリグノセルロース系酵素活性を保持する。
本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチド又はペプチド配列、前記と実質的に同一の配列、及び前記と相補的な配列の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150又はそれより長い連続した塩基を含む単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチドを提供する。前記ペプチドは、免疫原性フラグメント、モチーフ（例えば結合部位）、シグナル配列、プレプロ配列又は活性部位でありえる。
【００２６】
本発明は、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、マンナナーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性をコードする配列及びシグナル配列を含む単離、合成又は組換え核酸を提供し、ここで前記核酸は本発明の配列を含む。前記シグナル配列は、別のリグノセルロース系酵素、及び／又はグルコースオキシダーゼ酵素又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ、非β-グルコシダーゼ（非ベータ-グルコシダーゼ）、非キシラナーゼ、非マンナナーゼ、非β-キシロシダーゼ、非アラビノフラノシダーゼ、及び／又は非グルコースオキシダーゼ（すなわち異種）酵素に由来することができる。本発明は、リグノセルロース系活性、及び／又はグルコースオキシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離、合成又は組換え核酸を提供し、ここで前記配列はシグナル配列を含まず、前記核酸は本発明の配列を含む。ある特徴では、本発明は、シグナル配列の全部又は部分を欠く本発明のポリペプチドを含む単離、合成又は組換えポリペプチドを提供する。ある特徴では、前記単離、合成又は組換えポリペプチドは、異種シグナル配列、例えば異種リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ；及び／又はグルコースオキシダーゼ酵素シグナル配列又は非セルラーゼ、例えば非エンドグルカナーゼ、非セロビオヒドロラーゼ、非β-グルコシダーゼ（非ベータ-グルコシダーゼ）、非キシラナーゼ、非マンナナーゼ、非β-キシロシダーゼ、非アラビノフラノシダーゼシグナル配列を含む本発明のポリペプチドを含むことができる。
【００２７】
ある特徴では、本発明は、本発明のシグナル配列及び／又は炭水化物結合ドメイン（CBM）を含む第一のドメイン及び少なくとも第二のドメインを含む、キメラ（例えばマルチドメイン組換え体）タンパク質を提供する。前記タンパク質は融合タンパク質である。前記第二のドメインは酵素を含むことができる。前記タンパク質は非酵素であってもよく、例えば前記キメラタンパク質は本発明のシグナル配列及び／又はCBM並びに構造タンパク質を含むことができる。
本発明はキメラポリペプチドを提供し、このキメラポリペプチドは以下の（i）及び（ii）を含む：（i）本発明の炭水化物結合ドメイン（CBM）、シグナルペプチド（SP）、プレプロ配列及び／又は触媒ドメインを含む（又は前記から成る）少なくとも第一のドメイン；及び（ii）異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも第二のドメイン、ここで前記異種ポリペプチド又はペプチドは、前記CBM、シグナルペプチド（SP）、プレプロ配列及び／又は触媒ドメイン（CD）に天然の状態では随伴しない。ある特徴では、前記異種ポリペプチド又はペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素ではない。前記異種ポリペプチド又はペプチドは、CBM、シグナルペプチド（SP）、プレプロ配列及び／又は触媒ドメイン（CD）に対しアミノ末端、カルボキシ末端、又はそれらの両端にあってもよい。
【００２８】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする単離、合成又は組換え核酸を提供し、ここで前記キメラポリペプチドは、本発明のCBM、シグナルペプチド（SP）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（CD）を含むか若しくは前記から成る少なくとも第一のドメイン；及び異種ポリペプチド又はペプチドを含む少なくとも第二のドメインを含み、ここで前記異種ポリペプチド又はペプチドは、CBM、シグナルペプチド（SP）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（CD）に天然では随伴していない。
本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明の例示的ポリペプチド、例えば配列番号:2、配列番号:4などから配列番号:472、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490から配列番号:700の間の全ての偶数番号の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721（表1から4、及び配列表を参照されたい）の残基1から14、1から15、1から16、1から17、1から18、1から19、1から20、1から21、1から22、1から23、1から24、1から25、1から26、1から27、1から28、1から28、1から30、1から31、1から32、1から33、1から34、1から35、1から36、1から37、1から38、1から40、1から41、1から42、1から43、1から44、1から45、1から46又は1から47（で示される配列）の配列から成る又は前記配列を含む、単離、合成又は組換えシグナル配列（例えばシグナルペプチド）を提供する。ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドの最初の14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70又はそれより大きいアミノ末端残基を含むシグナル配列を提供する。
【００２９】
ある特徴では、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性は、約37℃で約1から約1200ユニット/mgタンパク質、又は約100から約1000ユニット/mgタンパク質の範囲の比活性を含む。別の特徴では、前記リグノセルロース系酵素活性は、約100から約1000ユニット/mgタンパク質、又は約500から約750ユニット/mgタンパク質の比活性を含む。あるいは、前記リグノセルロース系酵素活性は、37℃で約1から約750ユニット/mgタンパク質、又は約500から約1200ユニット/mgタンパク質の範囲の比活性を含む。ある特徴では、前記リグノセルロース系酵素活性は、37℃で約1から約500ユニット/mgタンパク質、又は約750から約1000ユニット/mgタンパク質の範囲の比活性を含む。また別の特徴では、前記リグノセルロース系酵素活性は、37℃で約1から約250ユニット/mgタンパク質の範囲の比活性を含む。あるいは、前記リグノセルロース系酵素活性は、37℃で約1から約100ユニット/mgタンパク質の範囲の比活性を含む。
別の特徴では、前記耐熱性は、上昇温度に加熱した後で、前記リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素の37℃の比活性の少なくとも半分の保持を含む。あるいは、前記耐熱性は、上昇温度に加熱した後で、約1から約1200ユニット/mgタンパク質、又は約500から約1000ユニット/mgタンパク質の範囲の37℃の比活性の保持を含むことができる。別の特徴では、前記耐熱性は、上昇温度に加熱した後で、約1から約500ユニット/mgタンパク質の範囲の37℃の比活性の保持を含むことができる。
【００３０】
本発明は、本発明の単離、合成又は組換えポリペプチドを提供し、ここで前記ポリペプチドは少なくとも1つのグリコシル化部位を含む。ある特徴では、グリコシル化部位はN-結合グリコシル化でもよい。ある特徴では、前記ポリペプチドは、P.パストリス（pastoris）又はS.ポンベ（pombe）で発現させた後でグリコシル化することができる。
ある特徴では、前記ポリペプチドは、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5若しくはpH4又は前記より強い酸性を含む条件下で保持することができる。別の特徴では、前記ポリペプチドは、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5若しくはpH11又は前記より強い塩基性を含む条件下でリグノセルロース系酵素活性を保持することができる。ある特徴では、前記ポリペプチドは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5若しくはpH4又は前記より強い酸性を含む条件に暴露した後で、リグノセルロース系酵素活性を保持することができる。別の特徴では、前記ポリペプチドは、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5若しくはpH11又は前記より強い塩基性を含む条件に暴露した後で、リグノセルロース系酵素活性を保持することができる。
ある特徴では、リグノセルロース系酵素、例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素は、アルカリ性条件、例えば腸（例えば小腸）のアルカリ性条件下で活性を有する。ある特徴では、前記ポリペプチドは、胃の酸性pHに暴露した後で活性を保持することができる。
【００３１】
本発明は、本発明のポリペプチド（ペプチドを含む）を含むタンパク質調製物を提供し、ここで前記タンパク質調製物は、液体、固体又はゲルを含む。本発明は、本発明のポリペプチド及び第二のタンパク質又はドメインを含むヘテロダイマーを提供する。前記ヘテロダイマーの第二のメンバーは、異なるリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素、別個の酵素又は別のタンパク質であってもよい。ある特徴では、前記第二のドメインはポリペプチドであってもよく、さらに前記へテロダイマーは融合タンパク質であってもよい。ある特徴では、前記第二のドメインはエピトープ又はタグでもよい。ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドを含むホモダイマーを提供する。
本発明は、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性を有する固定化ポリペプチド（ペプチドを含む）を提供し、ここで前記固定化ポリペプチドは、本発明のポリペプチド、本発明の核酸によってコードされたポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び第二のドメインを含むポリペプチドを含む。ある特徴では、前記ポリペプチドは、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、石墨粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ、又はキャピラリー管上に固定することができる。
本発明はまた、本発明の固定化核酸（本発明のプローブを含む）を含むアレイを提供する。本発明はまた、本発明の抗体を含むアレイを提供する。
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされたポリペプチドと特異的に結合する単離、合成又は組換え抗体を提供する。本発明のこれらの抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。本発明は、本発明の抗体、例えば本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマを提供する。本発明は、これらの抗体をコードする核酸を提供する。
【００３２】
本発明は、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを単離又は同定する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（a）本発明の抗体を提供する工程；（b）ポリペプチドを含むサンプルを提供する工程；及び（c）工程（b）のサンプルを工程（a）の抗体と、抗体がポリペプチドと特異的に結合することができる条件下で接触させ、それによって前記リグノセルロース酵素活性を有するポリペプチドを単離又は同定する工程。
本発明は、抗グルコースオキシダーゼ、抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ、抗β-グルコシダーゼ（抗ベータ-グルコシダーゼ）、抗キシラナーゼ、抗マンナナーゼ、抗β-キシロシダーゼ又は抗アラビノフラノシダーゼ酵素抗体を作製する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：本発明の核酸又は本発明のポリペプチド若しくはその部分配列を、液性免疫応答を生じさせるために十分な量で非ヒト動物に投与し、それによって抗グルコースオキシダーゼ又は抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ、抗β-グルコシダーゼ（抗ベータ-グルコシダーゼ）、抗キシラナーゼ、抗マンナナーゼ、抗β-キシロシダーゼ又は抗アラビノフラノシダーゼ酵素抗体を作製する工程。本発明は、抗グルコースオキシダーゼ又は抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ、抗β-グルコシダーゼ（抗ベータ-グルコシダーゼ）、抗キシラナーゼ、抗マンナナーゼ、抗β-キシロシダーゼ及び／又は抗アラビノフラノシダーゼ免疫応答（細胞性又は液性）を生じさせる方法を提供し、前記方法は、本発明の核酸又は本発明のポリペプチド若しくはその部分配列を、免疫応答（細胞性又は液性）を生じさせるために十分な量で非ヒト動物に投与する工程を含む。
【００３３】
本発明は以下の工程を含む組換えポリペプチドを製造する方法を提供する：（a）プロモーターに機能的に連結された本発明の核酸を提供する工程；及び（b）工程（a）の核酸をポリペプチドの発現を可能にする条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを製造する工程。ある特徴では、前記方法は、さらに宿主細胞を工程（a）の核酸で形質転換し、続いて工程（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換細胞で組換えポリペプチドを製造する工程を含むことができる。
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドを同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチド、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）リグノセルロース系酵素の基質を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種を工程（b）の基質と接触させて基質の量の低下又は反応生成物の量の増加を検出する工程（ここで基質の量の低下又は反応生成物の量の増加によって、リグノセルロース系酵素活性を有するポリペプチドが検出される。ある特徴では、前記基質は、セルロース含有又は多糖類含有（例えば可溶性セロオリゴ糖含有及び／又はアラビノキシランオリゴマー含有）化合物である。
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素の基質を同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）試験基質を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験基質と接触させて基質の量の低下又は反応生成物の量の増加を検出する工程（ここで基質の量の低下又は反応生成物の量の増加によって、試験基質がリグノセルロース系酵素の基質と同定される）。
【００３４】
本発明は、以下の工程を含む、試験化合物が特異的にポリペプチドと結合するか否かを決定する方法を提供する：（a）核酸又は前記核酸を含むベクターを、前記核酸のポリペプチドへの翻訳を許容する条件下で発現させるか（ここで前記核酸は本発明の核酸を含む）、又は本発明のポリペプチドを提供する工程；（b）試験化合物を提供する工程；（c）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；及び（d）工程（b）の試験化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する工程。
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性の調節物質を同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）試験化合物を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験化合物と接触させてリグノセルロース系酵素の活性を測定する工程（ここで、試験化合物の非存在下でのリグノセルロース系酵素活性と比較して、試験化合物の存在下で測定された活性に変化があれば、試験化合物が前記リグノセルロース系酵素活性を調節すると決定される）。ある特徴では、リグノセルロース系酵素活性は、リグノセルロース系酵素の基質を提供し、基質量の低下若しくは反応生成物量の増加、又は基質量の増加若しくは反応生成物量の低下を検出することによって測定することができる。試験化合物の非存在下での基質量若しくは反応生成物量と比較して、試験化合物の存在下での基質量の低下若しくは反応生成物量の増加によって、試験化合物はリグノセルロース系酵素活性のアクチベーターと同定される。試験化合物の非存在下での基質量若しくは反応生成物量と比較して、試験化合物の存在下での基質量の増加若しくは反応生成物量の低下によって、試験化合物はリグノセルロース系酵素活性のインヒビターと同定される。
【００３５】
本発明は、プロセッサー及びデータ保存装置を含むコンピュータシステムを提供し、前記データ保存装置には本発明のポリペプチド配列又は核酸配列（例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド又はペプチド）が保存されている。ある特徴では、前記コンピュータシステムはさらに、配列比較アルゴリズム、及び少なくとも1つの参照配列が保存されているデータ保存装置を含むことができる。別の特徴では、前記配列比較アルゴリズムは多型性を表示するコンピュータプログラムを含む。ある特徴では、前記コンピュータシステムはさらに、前記配列における1つ以上の特徴を識別するアイデンティファイアーを含むことができる。本発明は、本発明のポリペプチド配列又は核酸配列が保存されているコンピュータ読み出し可能媒体を提供する。本発明は、以下の工程を含む配列の特徴を識別する方法を提供する：（a）配列内の1つ以上の特徴を識別するコンピュータプログラムを用いて配列を読み取る工程（前記配列は本発明のポリペプチド配列又は核酸配列を含む）；及び（ｂ）前記コンピュータプログラムにより配列内の1つ以上の特徴を識別する工程。本発明は、以下の工程を含む第一の配列と第二の配列を比較する方法を提供する：（a）配列を比較するコンピュータプログラムを用いて第一の配列及び第二の配列を読み取る工程（前記第一の配列は本発明のポリペプチド配列又は核酸配列を含む）；及び（ｂ）第一の配列と第二の配列との間の相違を前記コンピュータプログラムにより決定する工程。第一の配列と第二の配列との間の相違を決定する前記工程はさらに多型性を同定する工程を含みことができる。ある特徴では、前記方法はさらに、配列内の1つ以上の特徴を同定するアイデンティファイアーを含むことができる。別の特徴では、前記方法は、コンピュータプログラムを用いて第一の配列を読み取り、前記配列内の1つ以上の特徴を同定する工程を含むことができる。
【００３６】
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を、サンプル（例えば環境サンプル）から単離又は回収する方法を提供する：（a）リグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列対を提供する工程（前記プライマー対は本発明の核酸を増幅することができる）；（b）サンプル（例えば環境サンプル）から核酸を単離するか、又はサンプル中の核酸がハイブリダイゼーションのために前記増幅プライマー対に接近することができるように前記サンプル（例えば環境サンプル）を処理する工程；及び（c）工程（b）の核酸を工程（a）の増幅プライマー対と一緒にして、サンプル（例えば環境サンプル）の核酸を増幅し、それによってリグノセルロース系酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸をサンプル（例えば環境サンプル）から単離又は回収する工程。前記増幅プライマー配列対の一方又は各メンバーは、本発明の増幅プライマー配列対（例えば本発明の配列の少なくとも約10から50の連続する塩基を有する）を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を、サンプル（例えば環境サンプル）から単離又は回収する方法を提供する：（a）本発明の核酸又はその部分配列を含むポリヌクレオチドプローブを提供する工程；（b）サンプル（例えば環境サンプル）から核酸を単離するか、又はサンプル中の核酸がハイブリダイゼーションのために工程（a）のポリヌクレオチドプローブに接近することができるように前記サンプル（例えば環境サンプル）を処理する工程；（c）工程（b）の単離核酸又は処理サンプル（例えば環境サンプル）を工程（a）のポリヌクレオチドプローブと一緒にする工程；及び（d）工程（a）のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによってリグノセルロース系活性を有するポリペプチドをコードする核酸をサンプル（例えば環境サンプル）から単離又は回収する工程。前記サンプル（例えば環境サンプル）は、水サンプル、液体サンプル、土壌サンプル、固体サンプル、大気サンプル又は生物学的サンプルを含むことができる。ある特徴では、生物学的サンプルは、細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞又は哺乳動物細胞に由来しえる。
【００３７】
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種を生成する方法を提供する：（a）本発明の核酸を含む鋳型核酸を提供する工程；及び（b）鋳型内で1つ以上のヌクレオチドを改変し、欠失させ、若しくは付加し、又は前記を組合せて、鋳型核酸変種を生成する工程。ある特徴では、前記方法はさらに、変種核酸を発現させて、リグノセルロース系酵素ポリペプチド変種を生成する工程を含むことができる。前記改変、付加又は欠失は、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GENE SITE SATURATION MUTAGENESIS又はGSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）、染色体飽和変異導入（CSM）又は前記の組合せを含む方法によって導入することができる。別の特徴では、前記改変、付加又は欠失は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNAによる変異導入、ウラシル含有鋳型による変異導入、ギャップ含有二重鎖による変異導入、ポイントミスマッチ修復による変異導入、修復欠損宿主株による変異導入、化学的変異導入、放射源による変異導入、欠失による変異導入、制限-選別変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマーの生成及び前記の組合せを含む方法によって導入される。
【００３８】
ある特徴では、前記方法は、鋳型核酸によってコードされるポリペプチドの活性又は安定性から変化した若しくは異なる活性又は変化した若しくは異なる安定性を有するリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素が得られるまで反復繰り返すことができる。ある特徴では、前記リグノセルロース系酵素ポリペプチド変種は耐熱性であり、上昇温度に暴露した後である程度の活性を保持する。別の特徴では、前記リグノセルロース系酵素ポリペプチド変種は、鋳型核酸によってコードされたリグノセルロース系酵素と比較してグリコシル化が増加している。あるいは、変種ポリペプチドは、高温下でリグノセルロース系酵素活性を有し、ここで鋳型核酸によってコードされるリグノセルロース系酵素は前記高温下で活性を示さない。ある特徴では、本発明は、鋳型核酸のコドン使用頻度から変化したコドン使用頻度を有する、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素のコード配列が得られるまで反復繰り返すことができる。別の特徴では、前記方法は、鋳型核酸のメッセージ発現又は安定性より高いレベル又は低いレベルのメッセージ発現又は安定性を有するリグノセルロース系酵素遺伝子が得られるまで反復繰り返すことができる。
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸でコドンを改変して、宿主細胞でその発現を高める方法を提供する：（a）リグノセルロース系酵素活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；及び（b）工程（a）の核酸で非優先又は低優先コドンを同定し、前記コドンをそれと同じアミノ酸をコードする、優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置き換え（ここで、優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、非優先又は低優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンである）、それによって核酸を改変して宿主細胞内でのその発現を高める工程。
【００３９】
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸でコドンを改変する方法を提供する：（a）本発明の核酸を提供する工程；及び（b）工程（a）の核酸でコドンを同定し、前記コドンをそれと同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置き換え、それによってリグノセルロース系酵素をコードする核酸のコドンを改変する工程。
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸でコドンを改変する方法を提供する：（a）リグノセルロース系酵素ポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；及び（b）工程（a）の核酸で非優先コドン又は低優先コドンを同定し、前記コドンをそれと同じアミノ酸をコードする、優先コドン又は中立的に使用されるコドンで置き換え（ここで、優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、非優先又は低優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンである）、それによって核酸を改変して宿主細胞内でのその発現を高める工程。
本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸でコドンを改変する方法を提供する：（a）本発明の核酸を提供する工程；及び（b）工程（a）の核酸で少なくとも1つの優先コドンを同定し、前記コドンをそれと同じアミノ酸をコードする、非優先コドン又は低優先コドンで置き換え（ここで、優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、非優先又は低優先コドンは、宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンである）、それによって核酸を改変して宿主細胞内でのその発現を低下させる工程。ある特徴では、前記宿主細胞は、細菌細胞、菌類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞である。
【００４０】
本発明は、以下の工程を含む、複数の改変されたリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素の活性部位又は基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する方法を提供する（ここで、前記改変された活性部位又は基質結合部位は、第一の活性部位又は第一の基質結合部位をコードする配列を含む第一の核酸に由来する）：（a）第一の活性部位又は第一の基質結合部位をコードする配列を含む第一の核酸を提供する工程（ここで、前記第一の核酸配列は、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸とハイブリダイズする配列を含み、さらに前記核酸はリグノセルロース系酵素の活性部位又はリグノセルロース系酵素の基質結合部位をコードする）；（b）第一の核酸内の複数の標的コドンで天然に存在するアミノ酸変種をコードする変異原性オリゴヌクレオチドセットを提供する工程；及び（c）前記変異原性オリゴヌクレオチドセットを用いて、各アミノ酸コドンで変異を導入された一連のアミノ酸変種をコードする、活性部位コード変種核酸又は基質結合部位コード変種核酸のセットを生成し、それによって複数の改変されたリグノセルロース系酵素の活性部位又は基質結合部位をコードする核酸ライブラリーを作製する工程。ある特徴では、前記方法は、最適化定方向進化システム、遺伝子部位飽和変異導入(商標)（GENE SITE SATURATION MUTAGENESISTM又はGSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ及び前記の組合せを含む方法によって、工程（a）の第一の核酸に変異を導入する工程を含む。別の特徴では、前記方法は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNAによる変異導入、ウラシル含有鋳型による変異導入、ギャップ含有二重鎖による変異導入、ポイントミスマッチ修復による変異導入、修復欠損宿主株による変異導入、化学的変異導入、放射源による変異導入、欠失による変異導入、制限-選別変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマーの生成及び前記の組合せを含む方法によって、工程（a）の第一の核酸に変異を導入する工程を含む。
【００４１】
本発明は以下の工程を含む小分子の製造方法を提供する：（a）小分子を合成又は改変することができる複数の生合成酵素を提供する工程（ここで前記酵素の１つは、リグノセルロース系酵素、例えば本発明の核酸によってコードされるグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を含む）；（b）工程（a）の酵素の少なくとも1つのための基質を提供する工程；及び（c）複数の生物触媒反応を促進する条件下で工程（b）の基質を前記酵素と反応させ、一連の生物触媒反応によって小分子を生成する工程。本発明は以下の工程を含む小分子を改変する方法を提供する：（a）リグノセルロース系酵素を提供する工程（ここで前記酵素は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド又は前記の部分配列を含む）；（b）小分子を提供する工程；及び（c）リグノセルロース系酵素によって触媒される酵素反応を促進する条件下で工程（a）の酵素を工程（b）の小分子と反応させ、リグノセルロース系酵素反応によって小分子を改変する工程。ある特徴では、前記方法は、工程（a）の酵素のための複数の小分子基質を含み、それによりリグノセルロース系酵素によって触媒される、少なくとも1つの酵素反応によって生成される改変小分子ライブラリーを生成することができる。ある特徴では、前記方法は、前記酵素による複数の生物触媒反応を促進する条件下で複数の追加の酵素を含み、複数の酵素反応によって生成される改変小分子ライブラリーを形成することができる。別の特徴では、前記方法はさらに、所望の活性を示す特定の改変小分子がライブラリーに存在するか否かを決定するためにライブラリーを試験する工程を含むことができる。ライブラリーを試験する工程はさらに、所望の活性を有する特定の改変小分子の有無について改変小分子の部分を試験し、所望の活性を有する特定の改変小分子を生成する少なくとも1つの特異的生物触媒反応を同定することによって、ライブラリー内の複数の改変小分子の一部分を生成するために用いられた生物触媒反応の全てを、1つを除いて系統的に排除する工程を含むことができる。
【００４２】
本発明は、以下の工程を含む、本発明の酵素の機能的フラグメントを決定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は前記のフラグメントを提供する工程；及び（b）工程（a）の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、リグノセルロース系酵素活性について残留部分配列を試験し、それによって酵素の機能的フラグメントを決定する工程。ある特徴では、リグノセルロース系酵素活性は、基質を提供して基質の量の低下又は反応生成物の量の増加を検出することによって測定される。
本発明は、リアルタイム代謝フラックス分析を使用する、新規な又は改変された表現型のための全細胞操作方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）細胞の遺伝的構成を改変することによって改変細胞を作製する工程（ここで、前記遺伝的構成は本発明の核酸を細胞に付加することによって改変される）；（b）前記改変細胞を培養して、複数の改変細胞を作製する工程；（c）少なくとも1つの代謝パラメーターを、工程（b）の細胞をリアルタイムでモニターすることによって測定する工程；及び（d）工程（c）のデータを分析して、前記測定パラメーターが、同様な条件下における未改変細胞の対応する測定と異なるか否かを決定し、それによって細胞内の操作された表現型をリアルタイム代謝フラックス分析により同定する工程。ある特徴では、細胞の遺伝的構成は、細胞内の配列の欠失若しくは配列の改変又は遺伝子発現のノックアウトを含む方法によって改変することができる。ある特徴では、前記方法はさらに、新規に操作された表現型を含む細胞を選別する工程を含むことができる。別の特徴では、前記方法は、選別細胞を培養し、それによって新規に操作された表現型を含む新規細胞株を作製する工程を含むことができる。
本発明は、リグノセルロース系酵素の耐熱性又は熱安定性を高める方法を提供する。前記方法は、リグノセルロース系酵素ポリペプチドをグリコシル化し、それによってリグノセルロース系酵素ポリペプチドの耐熱性又は熱安定性を高める工程を含む（ここで、前記ポリペプチドは、本発明のポリペプチドの少なくとも30の連続するアミノ酸、又は本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドを含む）。ある特徴では、前記リグノセルロース系酵素の比活性は、約37℃を超える温度から約95℃の範囲の温度で熱安定性又は耐熱性でありえる。
【００４３】
本発明は、組換えグルコースオキシダーゼ及び／又はリグノセルロース系酵素ポリペプチドを細胞で過剰発現させる方法を提供する。前記方法は、本発明の核酸又は本発明の核酸配列を含む核酸を含むベクターを発現させる工程を含み、ここで、前記配列の同一性は、配列比較アルゴリズムによる分析又は目視精査によって決定され、過剰発現は、高活性プロモーター又は二シストロン性ベクターの使用によって、またはベクターの遺伝子増幅によって達成される。
本発明は、以下の工程を含む、トランスジェニック植物の作製方法を提供する：（a）異種核酸配列を細胞に導入し、それによって形質転換植物細胞を作製する工程（ここで、前記異種核酸配列は本発明の核酸配列を含む）；及び（b）前記形質転換細胞からトランスジェニック植物を作製する工程。ある特徴では、工程（a）はさらに、植物プロトプラストのエレクトロポレーション又はマイクロインジェクションによって異種核酸配列を導入する工程を含むことができる。別の特徴では、工程（a）はさらに、異種核酸配列をDNA粒子ボンバードメントによって植物組織へ直接導入する工程を含むことができる。あるいは、工程（a）はさらに、異種核酸をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主を用いて植物細胞DNAに導入する工程を含むことができる。ある特徴では、植物細胞は、サトウキビ、ビート、ダイズ、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ、コメ、コムギ、タバコ又はオオムギの細胞でもよい。細胞は、単子葉植物又は双子葉植物由来でも、又は単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス；又は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナス由来でもよい。
【００４４】
本発明は、以下の工程を含む、植物細胞で異種核酸配列を発現させる方法を提供する：（a）プロモーターに機能的に連結させた異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程（ここで前記異種核酸配列は本発明の核酸を含む）；（b）前記異種核酸配列が植物細胞で発現される条件下で前記植物を生育させる工程。本発明は、以下の工程を含む、植物細胞で異種核酸配列を発現させる方法を提供する：（a）プロモーターに機能的に連結させた異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程（ここで前記異種核酸配列は本発明の核酸を含む）；（b）前記異種核酸配列が植物細胞で発現される条件下で前記植物を生育させる工程。ある特徴では、前記プロモーターは以下であるか、又は以下を含む：ウイルス系、細菌系、哺乳動物系又は植物プロモーター；又は植物プロモーター；又は、ジャガイモ、コメ、トウモロコシ、コムギ、タバコ又はオオムギプロモーター；又は、構成的プロモーター又はCaMV35Sプロモーター；又は、誘導性プロモーター；又は、組織特異的プロモーター又は環境により調節されるか、又は発育により調節されるプロモーター；又は、種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的、若しくは器官脱離誘導プロモーター；又は、種子優先プロモーター、トウモロコシゼインプロモーター又はトウモロコシADP-gppプロモーター。ある特徴では、植物細胞は単子葉植物又は双子葉植物に由来するか、又は前記植物は単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス、又は植物は、双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスである。
本発明は、以下の工程を含む、セロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー、又はグルカン含有若しくはセルロース含有組成物を加水分解、分解又は破壊する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチドを提供する工程；（b）セルロース又はグルカンを含む組成物を提供する工程；及び（c）セルラーゼが、セロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー、又はグルカン含有若しくはセルロース含有組成物を加水分解、分解又は破壊する条件下で、工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と接触させる工程（ここで、場合によって前記組成物は、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は動物細胞を含む）。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
【００４５】
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む飼料又は食物を提供する。ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む食物、飼料、液体（例えば飲料、例えばフルーツジュース又はビール）、パン若しくは生地又はパン製品、又は飲料の前段階物質（例えば麦芽汁）を提供する。本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、動物用食物サプリメント又は栄養性サプリメントを提供する。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
ある特徴では、食物サプリメント又は栄養性サプリメント中のポリペプチドはグリコシル化することができる。本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、食用デリバリーマトリックスを提供する。ある特徴では、前記デリバリーマトリックスはペレットを含む。ある特徴では、前記ポリペプチドはグリコシル化することができる。ある特徴では、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性は耐熱性である。別の特徴では、前記リグノセルロース系酵素活性は熱安定性である。
本発明は、本発明のポリペプチドを含む食物、飼料又は栄養性サプリメントを提供する。本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を、動物又は人間の食事の栄養性サプリメントとして利用する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：本発明のポリペプチドの少なくとも30の連続するアミノ酸を含む本発明のリグノセルロース系酵素を含有する栄養性サプリメントを調製する工程；及び前記栄養性サプリメントを動物に投与する工程。前記動物は、人間でも、反芻獣でも単胃動物でもよい。前記リグノセルロース系酵素は、リグノセルロース系酵素をコードするポリヌクレオチドの宿主生物（例えば細菌、酵母、植物、昆虫、菌類及び／又は動物）での発現によって調製されえる。前記生物はまたS.ポンベ、S. cerevisiae（セレビシアエ）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス（Streptomyces）sp.、バチルス（Bacillus）sp.及び／又はラクトバチルス（Lactobacillus）sp.でもよい。ある特徴では、前記植物細胞はまた単子葉植物又は双子葉植物が可能で、単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、インディアングラス、スイッチグラス若しくはミスカンタス；又は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスである。
【００４６】
本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素、例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素の熱安定性組換え体を含む、食用酵素デリバリーマトリックスを提供する。本発明は、以下の工程を含む、リグノセルロース系酵素サプリメントを動物又は人間にデリバーする方法を提供する：顆粒状の食用担体及び熱安定性組換えリグノセルロース系酵素を含むペレット形状の食用酵素デリバリーマトリックスを調製する工程（ここで前記ペレットは、その中に含まれるリグノセルロース系酵素を水性媒体中に容易に分散させる）；及び前記食用酵素デリバリーマトリックスを動物に投与する工程。本発明の組換えリグノセルロース系酵素は、本発明の少なくとも1つのポリペプチドの全部又は部分配列を含むことができる。前記リグノセルロース系酵素をグリコシル化して、ペレット化条件で熱安定性を提供することができる。前記デリバリーマトリックスは、穀物胚芽及びリグノセルロース系酵素を含む混合物をペレット化することによって形成することができる。前記ペレット化条件は上記の適用を含むことができる。前記ペレット化条件は、80℃を超える温度を約15分間適用する工程を含むことができ、前記酵素は、酵素1ミリグラム当たり少なくとも350から約900ユニットの比活性を保持する。
ある特徴では、本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素、例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。ある特徴では、前記医薬組成物は消化補助として機能する。
【００４７】
ある種の特徴では、セルロース含有化合物を、本発明のリグノセルロース系酵素活性を有する本発明のポリペプチドと約pＨ3.0から9.0、10.0、11.0又はそれより高い範囲のpHで接触させる。他の特徴では、セルロース含有化合物を、リグノセルロース系酵素と約55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃又はそれより高い温度で接触させる。
本発明は、酵素サプリメント、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼサプリメントを動物又は人間にデリバーする方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：顆粒状の食用担体及び本発明の熱安定性組換え酵素を含む食用酵素デリバリーマトリックス又はペレットを調製する工程（ここで前記ペレットは、その中に含まれるセルラーゼ酵素、及び本発明の組換え酵素又は本発明の核酸によってコードされたポリペプチドを水性媒体中に容易に分散させる）；及び前記食用酵素デリバリーマトリックス又はペレットを動物に投与する工程。さらに場合によって前記顆粒状食用担体は、穀物胚芽、油の搾りかすの穀物胚芽、干し草、アルファルファ、チモシー、ダイズの外皮、ひき割りヒマワリ種子、ひき割りコムギ（wheat midd）から成る群から選択され、さらに場合によって、前記食用担体は油の搾りかすの穀物胚芽を含み、さらに場合によって、本発明の酵素はグリコシル化されてペレット化条件で熱安定性を提供し、さらに場合によって、前記デリバリーマトリックスは穀物胚芽及びセルラーゼを含む混合物をペレット化することによって形成され、さらに場合によって、前記ペレット化条件は上記の適用を含み、さらに場合によって、前記ペレット化条件は約80℃を超える温度の約5分間の適用を含み、前記酵素は、少なくとも350から約900ユニット/ミリグラム酵素の比活性を保持する。
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、セルロース-又はセルロース誘導体-組成物を提供する。ここで、また別の実施態様では、前記ポリペプチドは、グリコシルヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【００４８】
本発明は、本発明の酵素、本発明の核酸によってコードされる酵素を含む木材、木材パルプ若しくは木材製品、又は木材廃棄物を提供し、ここで、場合によって本発明の酵素の活性は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む。
本発明は、本発明のポリペプチド、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む紙、紙パルプ若しくは紙製品、又は紙廃棄物、副産物若しくはリサイクル材料を提供し、ここで、場合によって前記ポリペプチドは、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する。
本発明は、紙、木材又は木材製品中のセルロースの量を低下させる方法を提供し、前記方法は、紙、木材若しくは木材製品又は木材廃棄物を本発明の酵素又は本発明の核酸によってコードされる酵素と接触させる工程を含み、ここで、場合によって前記酵素は、グリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む。
本発明は、本発明の酵素又は本発明の核酸によってコードされる酵素を含む洗剤組成物を提供し、ここで、場合によって前記ポリペプチドは、非水性液状組成物、鋳造固体、顆粒形、粒子形、圧縮錠剤、ゲル形、ペースト又はスラリー形として処方される。ある特徴では、前記活性は、グリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む。
【００４９】
本発明は、本発明の酵素又は本発明の核酸によってコードされるセルラーゼを含む医薬組成物又は食餌用サプリメントを提供し、ここで、場合によって前記酵素は、錠剤、ゲル、ピル、インプラント、リキッド、スプレー、散剤、食物、飼料ペレットとして、又はカプセル化処方物として処方される。ある特徴では、前記活性は、グリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む。
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む燃料を提供し、ここで、場合によって前記燃料は植物材料に由来し、前記材料は、場合によってジャガイモ、ダイズ（ナタネ）、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、エンバク、コムギ、ビート、又はサトウキビに由来する。前記植物材料は単子葉植物又は双子葉植物に由来することができ、又は単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス；又は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスに由来することができる。前記燃料は、バイオアルコール、例えばバイオエタノール又はガソリン-エタノール混合物、バイオメタノール又はガソリン-メタノール混合物、バイオブタノール又はガソリン-ブタノール混合物、又はバイオプロパノール又はガソリン-プロパノール混合物を含むことができる。ある特徴では、前記活性は、グリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む。
本発明は燃料又はアルコールの製造方法を提供し、前記方法は、本発明の酵素、又は本発明の酵素を含む組成物、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の混合物若しくは“カクテル”又は製品のいずれかを、バイオマス、例えばセルロースを含む組成物、発酵性糖または多糖類、例えばリグノセルロース系材料と接触させる工程を含む。また別の実施態様では、セルロース又は発酵性糖を含む組成物は、植物、植物製品、植物廃棄物又は植物誘導体を含み、さらに植物、植物廃棄物又は植物製品はサトウキビ若しくはサトウキビ製品、ビート若しくはサトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、コメ又はオオムギを含むことができる。また別の実施態様では、前記燃料は、バイオエタノール若しくはガソリン-エタノール混合物、バイオメタノール若しくはガソリン-メタノール混合物、バイオブタノール又はガソリン-ブタノール混合物、又はバイオプロパノール又はガソリン-プロパノール混合物を含む。本発明の酵素は植物又は種子の部分、例えばトランスジェニック植物又は種子であってもよく、ある特徴では、本発明の酵素は、本発明のこの方法による燃料又はアルコールへの加水分解又は変換の標的である、まさにバイオマス（例えば植物、種子、植物廃棄物）中で異種組換え酵素として発現される。ある特徴では、前記活性は、グリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む。
【００５０】
本発明は、バイオ燃料、例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール若しくはバイオプロパノール又はその混合物を含むか、又は前記から成るものの製造方法を提供し、前記方法は、本発明の酵素を含む組成物、又は本発明のポリペプチドを含む発酵性糖若しくはリグノセルロース系材料、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の混合物若しくは“カクテル”又は製品のいずれかを、バイオマス、例えばセルロース、発酵性糖又は多糖類を含む組成物、例えばリグノセルロース系材料と接触させる工程を含む。また別の実施態様では、本発明の酵素を含む組成物及び／又は加水分解されるべき材料は、植物、植物廃棄物、植物製品又は植物誘導体を含む。又別の実施態様では、前記植物、植物廃棄物、植物製品又は植物誘導体は、サトウキビ若しくはサトウキビ製品（例えばケイントップ）、ビート若しくはサトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、コメ又はオオムギを含む。ある特徴では、前記植物は単子葉植物又は双子葉植物であるか、又は前記植物は単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ（サトウキビの部分、例えばケイントップを含む）、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス；又は前記植物は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、アブラナ、亜麻、綿、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ若しくはルピナスである。ある特徴では、本発明の酵素は、グリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【００５１】
本発明は、セルロース系及びヘミセルロース系ポリマーを代謝可能な炭素部分に脱ポリマー化するための、本発明のポリペプチド又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む酵素集合物又は“カクテル”を提供する。ある特徴では、本発明の酵素は、グリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。本発明の酵素集合物又は“カクテル”は、組成物の形態（例えば処方物、液体又は固体）で、例えば製品として存在する。
本発明は、以下を含む組成物（製品、酵素集合物又は“カクテル”を含む）を提供する：（a）リグノセルロース系酵素、例えばヘミセルロース及びセルロース加水分解酵素（本発明の少なくとも1つの酵素を含む）、例えば下記表4に示されさらに実施例4で考察される本発明の酵素の組合せ。例えば、本発明の例示的混合物、“カクテル”又は“酵素集合物”は、表4に明瞭に示されているように、例示的酵素群、配列番号:34、配列番号:360、配列番号:358及び配列番号:371；又は例示的酵素群、配列番号:358、配列番号:360、配列番号:168；又は例示的酵素群、配列番号:34、配列番号:360、配列番号:214；又は例示的酵素群、配列番号:360、配列番号:90、配列番号:358などである。
本発明は、リグノセルロース含有バイオマス材料を加工する方法を提供し、前記方法は、セルロース、リグニン又は発酵性糖を含む組成物を、少なくとも1つの本発明のポリペプチド、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の酵素集合物、製品若しくは“カクテル”と接触させる工程を含む。ある特徴では、リグノセルロースを含む前記バイオマス材料は農作物に由来するか、食品又は飼料製造の副産物であるか、リグノセルロース系廃棄物であるか、又は植物廃棄物、紙廃棄物又は紙製品廃棄物である。ある特徴では、本発明の酵素は、グリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。ある特徴では、前記植物残留物は、穀粒、種子、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ若しくはトウモロコシの穂軸、実を除いたトウモロコシの茎葉、干し草、わら（例えば稲わら若しくは麦わら、又は任意の穀物植物の乾燥茎）、及び／又は草類（例えばインディアングラス又はスイッチグラス）を含む。ある特徴では、前記草類は、インディアングラス若しくはスイッチグラス、木材パルプ及びおがくず、又は木材廃棄物であり、さらに場合によって前記紙廃棄物は、廃棄若しくは使用済みコピー用紙、コンピューター印刷用紙、ノート類用紙、便箋用紙、タイプライター用紙、新聞、雑誌、厚紙及び紙製包装材を含む。ある特徴では、バイオマス材料の加工はバイオ燃料、例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノールを生じる。
【００５２】
本発明は、本発明のポリペプチド、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の酵素集合物、製品若しくは“カクテル”を含む酪農製品を提供する。ある特徴では、前記酪農製品は、ミルク、アイスクリーム、チーズ又はヨーグルトを含む。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
本発明は、以下の工程を含む、酪農製品の舌触り及び風味を改善する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチド、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の酵素集合物、製品若しくは“カクテル”を提供する工程；（b）酪農製品を提供する工程；及び（c）工程（a）のポリペプチド及び工程（b）の酪農製品を、本発明のポリペプチドが前記酪農製品の舌触り及び風味を改善することができる条件下で接触させる工程。
本発明は、本発明のポリペプチド、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の酵素集合物、製品若しくは“カクテル”を含む布地又は織物を提供し、ここで、場合によって前記布地又は織物はセルロース含有線維を含む。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、及び／又はセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
【００５３】
本発明は、以下の工程を含む、固体又は液体の動物排泄物を処理する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチド、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の酵素集合物、製品若しくは“カクテル”を提供する工程；（b）固体又は液体の動物排泄物を提供する工程；（c）工程（a）のポリペプチド及び工程（b）の固体又は液体排泄物を、前記プロテアーゼが前記排泄物を処理することができる条件下で接触させる工程。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
本発明は、本発明のポリペプチド、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の酵素集合物、製品若しくは“カクテル”を含む処理済排泄物を提供する。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
本発明は、グルコースオキシダーゼ及び／又はセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む消毒剤を提供し、ここで、前記ポリペプチドは、本発明の配列、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の酵素集合物、製品若しくは“カクテル”を含む。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
本発明は、リグノセルロース系活性、例えばセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む生物兵器防衛又は生物系解毒剤を提供し、ここで、前記ポリペプチドは、本発明の配列、又は本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、又は本発明の酵素集合物、製品若しくは“カクテル”を含む。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
【００５４】
本発明は、本発明の酵素（例えば本発明のヘミセルロース及びセルロース加水分解酵素）の混合物を含む組成物（本発明の酵素集合物及び製品を含む）及びバイオマス材料を提供し、ここで場合によって、前記バイオマス材料は農作物に由来するリグノセルロース系材料を含むか、又は前記バイオマス材料は食品又は飼料製造の副産物であるか、又は前記バイオマス材料はリグノセルロース系廃棄物であるか、又は前記バイオマス材料は植物残留物又は紙廃棄物又は紙製品廃棄物であるか、又は前記バイオマス材料は植物残留物を含み、さらに場合によって前記植物残留物は、穀粒、種子、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ若しくはトウモロコシの穂軸、実を除いたトウモロコシの茎葉、草類を含み、場合によって草類は、インディアングラス若しくはスイッチグラス、干し草、わら（例えば稲わら若しくは麦わら、又は任意の穀物植物の乾燥茎）、木材、木材チップ、木材パルプ、木材廃棄物、及び／又はおがくずを含み、さらに場合によって前記紙廃棄物は、廃棄若しくは使用済みコピー用紙、コンピューター印刷用紙、ノート類用紙、便箋用紙、タイプライター用紙、新聞、雑誌、厚紙及び紙製包装材を含む。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
本発明は、以下の工程を含むバイオマス材料を加工する方法を提供する：本発明の酵素集合物（“カクテル”）若しくは製品、又は本発明のヘミセルロース及びセルロース加水分解酵素の混合物を提供する工程（ここで前記セルロース加水分解酵素は、少なくとも1つのエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII及びβ-グルコシダーゼを含み、さらに前記ヘミセルロース加水分解酵素は、少なくとも1つのキシラナーゼ、β-キシロシダーゼ及びアラビノフラノシダーゼ活性を含む）；及び前記酵素混合物をバイオマス材料と接触させる工程、ここで場合によって、リグノセルロースを含む前記バイオマス材料は農作物に由来するか、食品又は飼料製造の副産物であるか、リグノセルロース系廃棄物であるか、又は植物残留物又は紙廃棄物又は紙製品廃棄物であり、さらに場合によって前記植物残留物は、穀粒、種子、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ若しくはトウモロコシの穂軸、実を除いたトウモロコシの茎葉、草類であり、場合によって草類は、インディアングラス若しくはスイッチグラス、干し草又はわら（例えば稲わら若しくは麦わら、又は任意の穀物植物の乾燥茎）、木材、木材廃棄物、木材チップ、木材パルプ及び／又はおがくずであり、さらに場合によって前記紙廃棄物は、廃棄若しくは使用済みコピー用紙、コンピューター印刷用紙、ノート類用紙、便箋用紙、タイプライター用紙、新聞、雑誌、厚紙及び紙製包装材を含み、さらに場合によって前記方法は、バイオマス材料を加工して、バイオ燃料（例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノール）、アルコール及び／又は糖（糖類）を生成する工程をさらに含む。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
【００５５】
本発明は、以下の工程を含むバイオマス材料を加工する方法を提供する：本発明の混合物（本発明の酵素集合物（“カクテル”）又は製品を含む）を提供する工程；及び前記酵素混合物をバイオマス材料と接触させる工程、ここで場合によって、リグノセルロースを含む前記バイオマス材料は農作物に由来するか、食品又は飼料製造の副産物であるか、リグノセルロース系廃棄物であるか、又は植物残留物又は紙廃棄物又は紙製品廃棄物であり、さらに場合によって前記植物残留物は、種子、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ若しくはトウモロコシの穂軸、実を除いたトウモロコシの茎葉、草類（インディアングラス又はスイッチグラス）、干し草、穀粒、わら（例えば稲わら若しくは麦わら、又は任意の穀物植物の乾燥茎）、サトウキビ、バガス、サトウダイコンパルプ、かんきつ類パルプ及びかんきつ類の皮、木材、木材薄め液（wood thinning）、木材チップ、木材パルプ、パルプ廃棄物、木材廃棄物、木材削り屑及びおがくず、建築及び／又は取り壊し廃棄物及び屑（例えば木材、木材削り屑及びおがくず）を含み、さらに場合によって前記紙廃棄物は、廃棄若しくは使用済みコピー用紙、コンピューター印刷用紙、ノート類用紙、便箋用紙、タイプライター用紙、新聞、雑誌、厚紙及び紙製包装材、並びにリサイクル紙材料を含む。さらにまた、都市ゴミ、例えば市町村の固形廃棄物の紙部分、市町村の木材廃棄物、及び市町村の植物廃棄物も、糖、デンプン及び／又はセルロースを含む他の材料とともに用いることができる。場合によって、前記バイオマス材料の加工は、バイオ燃料（例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノール）を生じる。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
【００５６】
本発明は、第一のドメイン及び少なくとも第二のドメインを含むキメラポリペプチドを提供し、ここで第一のドメインは本発明の酵素を含むか又は本発明の酵素から成り、第二のドメインは異種配列、例えば異種ドメイン、例えば異種若しくは改変炭水化物結合ドメイン又は異種若しくは改変ドッケリンドメインを含む。又別の実施態様では、炭水化物結合ドメイン又はモジュール（CBM）は、セルロース結合モジュール又はリグニン結合ドメインであり、さらに場合によって第二のドメインは、酵素の触媒ドメインの近くに付加される。ある特徴では、前記CBMは本発明のCBMを含むか、又は本発明のCBMから成る。また別の実施態様では、第二のドメインは、ヘパリン及び／又はフィブロネクチン結合ドメイン、例えばフィブロネクチンIII型ドメイン（例えばFN3など）を含むか、又は前記から成る。
又別の実施態様では、第二のドメインは、酵素の触媒ドメインのC-末端近くに付加される。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
本発明は、（a）第一のドメイン及び少なくとも第二のドメインを含むキメラポリペプチド（ここで第一のドメインは、本発明の酵素及び／又は炭水化物結合ドメイン/モジュール（CBM）を含むか又は前記から成り、第二のドメインは、異種若しくは改変炭水化物結合ドメイン（CBM）、異種若しくは改変ドッケリン（dockerin）ドメイン、異種若しくは改変プレプロドメイン、又は異種若しくは改変活性部位を含む）；（b）（a）のキメラポリペプチド（ここで、前記炭水化物結合ドメイン（CBM）は、セルロース結合モジュール又はリグニン結合ドメインを含むか、又は前記から成る）；（c）（a）又は（b）のキメラポリペプチド（ここで、前記CBMは酵素の触媒ドメインの近くに存在する）；（d）（a）、（b）又は（c）のキメラポリペプチド（ここで、少なくとも1つのCBMは本ポリペプチドの触媒ドメイン近くに配置される）；（e）（d）のキメラポリペプチド（ここで少なくとも1つのCBMは本ポリペプチドの触媒ドメインのC-末端近く、又は本ポリペプチドの触媒ドメインのN-末端近く、又はその両方に配置される）；（f）（a）、（b）、（c）又は（e）のいずれかのキメラポリペプチド（ここで前記キメラポリペプチドは組換えキメラタンパク質を含むか、又は前記から成る）を提供する。
【００５７】
本発明は、（a）リグノセルロース系酵素活性を有する本発明のポリペプチド、及び少なくとも1つの異種若しくは改変炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）（例えばグリコシルヒドロラーゼドメイン）、又は少なくとも1つの内部再編CBM、又はその組合せを含むか又は前記から成るドメインを含むキメラポリペプチド；（b）（a）のキメラポリペプチド（ここで前記異種又は改変又は内部再編CBMは、CBM_1、CBM_2、CBM_2a、CBM_2b、CBM_3、CBM_3a、CBM_3b、CBM_3c、CBM_4、CBM_5、CBM_5_12、CBM_6、CBM_7、CBM_8、CBM_9、CBM_10、CBM_11、CBM_12、CBM_13、CBM_14、CBM_15、CBM_16又はCBM_1からCBM_48のCBMファミリー由来のCBMのいずれか；グリコシルヒドロラーゼ結合ドメイン；本発明のCBM（例えば本明細書に記載するもの、本発明のCBMはまた配列表に記載されている）；又はその任意の組合せを含む）；（c）（a）又は（b）のキメラポリペプチド（ここで前記CBMは、セルロース結合モジュール又はリグニン結合ドメインを含む）；（d）（a）、（b）又は（c）のキメラポリペプチド（ここで、前記少なくとも1つのCBMは本ポリペプチドの触媒ドメイン近くに配置される）；（e）（d）のキメラポリペプチド（ここで、前記少なくとも1つのCBMは、本ポリペプチドの触媒ドメインのC-末端近く、又は本ポリペプチドの触媒ドメインのN-末端近く、又はその両方に配置される）；（f）（a）、（b）、（c）又は（e）のいずれかのキメラポリペプチド（ここで前記キメラポリペプチドは組換えキメラタンパク質である）を提供する。
本発明は、（a）表5及び配列表に示される少なくとも1つのCBM；（b）表6及び配列表に示される少なくとも1つのCBM；又は（c）その組合せを含むか、又は前記から成る、単離、合成及び／又は組換え炭水化物結合ドメイン-モジュールを提供する。また別の実施態様では、本発明の炭水化物結合ドメイン-モジュール（CBM）は、本発明の任意の酵素の任意の部分配列（本発明の例示的酵素の任意の部分配列を含む）、例えば配列番号:2、配列番号:4などを含むか、または前記から成る（ここで前記部分配列は、CBMモチーフ、例えばCBM_1、CBM_2、CBM_2a、CBM_2b、CBM_3、CBM_3a、CBM_3b、CBM_3c、CBM_4、CBM_5、CBM_5_12、CBM_6、CBM_7、CBM_8、CBM_9、CBM_10、CBM_11、CBM_12、CBM_13、CBM_14、CBM_15、CBM_16、又はCBM_1からCBM_48のCBMファミリー由来のCBMのいずれかを含むか、又は前記から成る）。
本発明の1つ以上の特徴の詳細は、添付の図面および以下の記述で説明される。本発明の他の特徴、目的および利点はこれらの記述および図面並びに特許請求の範囲から明白であろう。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC寄託物は、いずれの目的についても参照により明白に本明細書に含まれる。
以下の図面は本発明の特徴の例示であって、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】コンピュータシステムのブロック図である。
【図２】新規なヌクレオチド又はタンパク質配列とデータベースの配列を比較し、前記新規配列とデータベース配列との間の相同性レベルを決定する方法の１つの特徴を示す流れ図である。
【図３】2つの配列が相同であるか否かを決定するためのコンピュータ処理の１つの特徴を示す流れ図である。
【図４】配列中に特徴が存在するか否かを検出するためのアイデンティファイヤープロセス300の１つの特徴を示す流れ図である。
【図５Ａ】下記に詳細に記述されているように、本発明の少なくとも1つの酵素又は酵素混合物の使用を取り入れた、本発明の例示的なサトウキビ処理方法を示す。図5Aは、本発明の少なくとも1つの酵素又は酵素混合物の使用を取り入れた、例示的な糖からエタノールへの製法を示す。
【図５Ｂ】下記に詳細に記述されているように、本発明の少なくとも1つの酵素又は酵素混合物の使用を取り入れた、本発明の例示的なサトウキビ処理方法を示す。図5Bは、本発明の少なくとも1つの酵素又は酵素混合物の使用を取り入れた、本発明の例示的な製法を示す。
【図５Ｃ】下記に詳細に記述されているように、本発明の少なくとも1つの酵素又は酵素混合物の使用を取り入れた、本発明の例示的なサトウキビ処理方法を示す。図5Cは、本発明の少なくとも1つの酵素又は酵素混合物の使用を取り入れることができる、本発明の例示的製法、ドライミル製法の概要を示す。
【図６】下記実施例5に詳細に記述されているように、本発明の酵素を同定するための例示的プロトコル、グルコース定量用グルコースオキシダーゼアッセイを示す。
【図７】下記実施例4に詳細に記述されているように、0.1%AVICEL(商標)基質の37℃消化を含む条件下における種々の例示的混合物の酵素活性の結果をまとめたデータを示す。
【図８】下記実施例4に詳細に記述されているように、0.23%バガスの37℃消化を含む条件下における種々の例示的混合物の酵素活性の結果をまとめたデータを示す。
【図９Ａ】図9Aは、下記実施例14に詳細に記述されているように、例示的β-グルコシダーゼ活性から得られた標準曲線を示す。
【図９Ｂ】図9Bは、下記実施例14に詳細に記述されているように、例示的β-グルコシダーゼ活性アッセイのための酵素活性計算をどのようにEXCELTMでセットアップすることができるかを示す。
【図１０】図10Aは、下記実施例14に詳細に記述されているように、例示的β-グルコシダーゼ活性から得られた標準曲線を示す。図10Bは、下記実施例14に詳細に記述されているように、例示的β-グルコシダーゼ活性アッセイのための酵素活性計算をどのようにEXCELTMでセットアップすることができるかを示す。
【図１１】下記実施例14に詳細に記述されているように、本発明のベータ-グルコシダーゼ酵素についての製造及び精製の概要から得られたデータを示す表1を例示する。
【図１２】12Aは、下記実施例14に詳細に記述されているように、FPLCの方法によって上清及びペレット細胞分画から精製された、本発明の例示的な配列番号:548、配列番号:564及び配列番号:560のPAGE電気泳動を示す。図12Bは、下記実施例14に詳細に記述されているように、FPLCの方法によって上清及びペレット細胞分画から精製された、配列番号:530及び配列番号:566のPAGE電気泳動を示す。
【図１３】表7を説明し、下記実施例14に詳細に記述されているように、3つの異なる方法によって決定した、本発明の精製ベータ-グルコシダーゼのタンパク質濃度を示す。
【図１４】表8を説明し、下記実施例14に詳細に記述されているように、本発明の精製ベータ-グルコシダーゼの比活性を示す。
【図１５】表1を説明し、下記実施例14に詳細に記述されているように、本発明の例示的ベータ-グルコシダーゼの比活性を示す。
【図１６】下記実施例15に詳細に記述されているように、本発明の被検ベータ-グルコシダーゼ酵素の各々について経験的に選択した酵素希釈を用いた初期速度カイネティクスのデータを示す。
【図１７】下記実施例15に詳細に記述されているように、本発明の例示的な配列番号:556、配列番号:560及びA.ニゲル（niger）のベータ-グルコシダーゼのPAGE電気泳動を示す。
【図１８】下記実施例15に詳細に記述されているように、本発明の例示的酵素を用いた、pH5で種々の温度における2mMのセロビオースの加水分解を示すデータを例示する。
【図１９】下記実施例15に詳細に記述されているように、本発明の例示的酵素を用いた、pH7で種々の温度における2mMのセロビオースの加水分解を示すデータを例示する。
【図２０】下記実施例17に詳細に記述されているように、3つのサンプル調製物についてのアレンジメント例を示す。
【図２１】下記実施例17に詳細に記述されているように、MU-グルコピラノシドから4-メチルウンベリフェロンを遊離させる、本発明の例示的セルラーゼ酵素活性アッセイについてのSPECTRAMAXTMデータを要約した表である。
【図２２】下記実施例17に詳細に記述されているように、本発明の例示的セルラーゼ酵素活性アッセイについての動力学的活性データを要約した表である。
【図２３】下記実施例17に詳細に記述されているように、本発明の酵素“カクテル”又は混合物で用いることができる3つの酵素によるコムギのアラビノキシランの消化生成物（消化プロフィル）を示すデータを例示する。
【図２４】下記実施例20に詳細に記述されているように、本発明のアラビノフラノシダーゼが本発明のキシラナーゼとどのように相乗作用してコムギのアラビノキシランを消化するかを示すデータをグラフによって例示する。
【図２５】下記実施例20に詳細に記述されているように、コムギのアラビノキシラン消化における例示的キシラナーゼ（配列番号:719）に対するベータ(β)-キシロシダーゼ（図中に表示）の促進作用を示すデータをグラフによって例示する。
【図２６】下記実施例20に詳細に記述されているように、基質としてトウモロコシの種子線維を用いた場合の本発明の例示的酵素のフェルラ酸エステラーゼ活性を示すデータをグラフによって例示する。
【図２７】下記実施例20に詳細に記述されているように、基質としてアセチル化キシランを用いた場合の本発明の例示的アセチルキシランエステラーゼ（配列番号:640、配列番号:650及び配列番号:688）の活性アッセイを示すデータをグラフによって例示する。
【図２８】下記実施例20に詳細に記述されているように、基質としてアルド-ウロン酸混合物を用いた場合の本発明の例示的アセチルキシランエステラーゼ（配列番号:648、配列番号:654及び配列番号:680）のアルファ(α)-グルクロニダーゼ活性アッセイを示すデータをグラフによって例示する。  種々の図面中の同じ参照記号は同じ要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
発明の詳細な説明
ある特徴では、本発明は、いずれかのリグノセルロース分解性（リグノセルロース系）活性（リグニン分解性及びセルロース分解活性を含み、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼ及び／又はβ-グルコシダーゼ活性を含む）を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに前記ポリヌクレオチド及びポリペプチドを製造及び使用する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、リグノセルロース系活性、例えばグルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えばバイオマスの糖化において可溶性オリゴマーを発酵性モノマー糖に変換する酵素を含む）を提供する。ある特徴では、本発明のポリペプチドの活性は、可溶性セロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーのモノマーキシロース、アラビノース及びグルコースへの酵素的加水分解（又は分解）を含む。ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドの熱安定型及び耐熱型を提供する。本発明のポリペプチドは、種々の医薬的、農業的及び工業的関係で用いることができる。
ある特徴では、本発明は、触媒速度が速められ、したがって基質の加水分解プロセスが改善されたリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ）を提供する。ある特徴では、本発明は、比較的過酷な条件（例えば高い若しくは低い温度又は塩条件及び／又は酸性若しくは塩基性条件（生理学的状態よりも高い若しくは低いpH又は温度を含む））下で活性なリグノセルロース系酵素を提供する。この触媒速度の効率の強化は、ある実施態様では、エタノール製造のために微生物が利用する糖の生成効率の増進をもたらす。ある特徴では、本発明の酵素を生成する微生物は、糖加水分解性、例えばエタノール生成微生物とともに用いられる。したがって、本発明は、バイオ燃料、例えばバイオアルコール（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノール）の製造及び（例えばバイオ燃料を利用する輸送用の）アルコール系“クリーン燃料”の製造のための方法を提供する。
【００６０】
ある特徴では、本発明は、本発明の酵素、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む組成物（例えば酵素調製物、飼料、薬剤、食餌用サプリメント）を提供する。これらの組成物は多様な形態として、例えば液体、ゲル、ピル、錠剤、スプレー、散剤、食物、飼料ペレット又はカプセル化形（ナノカプセル化形を含む）として処方することができる。
例えばあるポリペプチドがセルラーゼ活性（例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性）を有するか否かを決定するために、セルラーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を測定するアッセイは、当分野では周知であり、さらに本発明の範囲内に包含される；例えば以下を参照されたい：W.L. Baker, A. Panow, Estimation of cellulase activity using a glucose-oxidase-Cu(II) reducing assay for glucose, J Biochem Biophys Methods. 1991 Dec, 23(4):265-73；K.R. Sharrock, Cellulase assay methods: a review, J Biochem Biophys Methods. 1988 Oct, 17(2):81-105；J.H. Carder, Detection and quantitation of cellulase by Congo red staining of substates in a cup-plate diffusion assay, Anal Biochem. 1986 Feb 15, 153(1):75-9；G.A. Canevascini, A Cellulase assay coupled to cellobiose dehydrogenase, Anal Biochem. 1985 Jun, 147(2):419-27；J.S. Huang, J. Tang, Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal Biochem. 1976 Jun, 73(2):369-77。
本発明で用いられる反応条件のpHは、本発明が提供するまた別の可変パラメーターである。ある種の特徴では、反応のpHは約3.0未満から約9.0以上の範囲に管理され、ある実施態様では、本発明の酵素はそのような酸性又は塩基性条件下で活性を有する。他の特徴では、本発明の方法は、約pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.5、8.0、8.5、9.0若しくは9.5、又はそれより高いpHで実施され、さらにある実施態様では、本発明の酵素はそのような酸性又は塩基性条件下で活性を有する。アルカリ性条件下で管理される反応条件はまた、例えばいくらかの工業的又は製薬における本発明の酵素の利用で有利でありえる。
【００６１】
本発明は、多様な形態及び処方を有する、本発明のリグノセルロース系酵素（グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む）を含む組成物（医薬、添加物及びサプリメントを含む）を提供する。本発明の方法では、本発明のリグノセルロース系酵素はまた、多様な形態及び処方で用いられる。例えば、精製リグノセルロース系酵素は、バイオ燃料、例えばバイオアルコール（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノール）の製造で利用される酵素調製物で、又は医薬、食品、飼料若しくは食餌用補助物質での利用で用いることができる。あるいは、本発明の酵素は、バイオ燃料、例えばバイオアルコール（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノール）の製造、クリーン燃料の製造、生物系廃棄物の処理、食物、化学物質、医薬、サプリメント、液体、食品又は飼料などの処理のための方法で直接又は間接的に用いることができる。
あるいは、リグノセルロース系酵素、例えば、本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼポリペプチドは、当分野で公知の方法を用いて、微生物（細菌、酵母、ウイルス、菌類など）で発現させることができる。本発明の酵素を発現する微生物は、植物、植物部分（例えば種子）又は生物を基にして、又は前記の内部で生存することができる。他の特徴では、本発明のリグノセルロース系酵素は、本発明の方法で使用する前に固相に固定することができる。固相に酵素を固定する方法は、当分野で一般的に、例えば以下の文献で知られている：J Mol Cat B；Enzymatic 6(1999) 29-39；Chivata et al. Biocatalysis: Immobilized cells and enzymes, J Mol Cat, 1986、37:1-24；Sharma et al. Immobilized Biomaterials Techniques and Applications, Angew Chem Int Ed Engl 1982, 21:837-54；Laskin (ed.), Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology。
【００６２】
核酸、プローブ及び阻害性分子
本発明は、単離、合成及び組換え核酸を提供する。例えば、表1、2及び3、並びに下記実施例を参照されたい。さらに、本発明の例示的核酸及びポリペプチドの配列は配列表に示されてあり、前記にはまた、本発明の例示的ポリペプチドをコードする核酸（例えば表1、2及び3並びに配列表を参照されたい）が記載され、前記核酸には、発現カセット、例えば発現ベクター、ウイルス、人工染色体又は任意のビヒクル（いずれも本発明の核酸を含む）が含まれる。
配列表で、配列番号:1−472については、奇数番号はタンパク質をコードする核酸配列を表し、偶数番号はアミノ酸配列を表す。配列表の見方は、要約すれば以下のとおりである：
−配列番号:1−472：奇数番号はタンパク質をコードする核酸配列を表し、偶数番号はアミノ酸配列を表す；
−配列番号:473−479はアミノ酸配列を表し、配列番号:480−488はヌクレオチド配列を表す；
−配列番号:489−700：奇数番号はタンパク質をコードする核酸配列を表し、偶数番号はアミノ酸配列を表す；
−配列番号:701−706はリンカーであり、全てアミノ酸配列である；
−配列番号:707−717はゲノム（又はgDNA）配列であり、初めに菌類から得られた酵素のいくつかの配列（いずれもヌクレオチド）である；
配列番号:718−721：偶数番号はヌクレオチド配列を表し、奇数番号はアミノ酸配列を表す。
表1Aに列挙した配列については、配列番号:370、配列番号:373、配列番号:376、配列番号:379、配列番号:382、配列番号:385、配列番号:388、配列番号:391、配列番号:394、配列番号:397、配列番号:400、配列番号:403、配列番号:406、配列番号:409、配列番号:412、配列番号:415、配列番号:418及び配列番号:421は例示的な酵素のコード、又はcDNA配列であり、配列番号:369、配列番号:372、配列番号:375、配列番号:378、配列番号:381、配列番号:399、配列番号:402、配列番号:405、配列番号:408、配列番号:411、配列番号:414、配列番号:417及び配列番号:420は例示的なゲノム（又は“gDNA”）配列であり、さらに配列番号:371、配列番号:374、配列番号:377、配列番号:380、配列番号:383、配列番号:386、配列番号:389、配列番号:392、配列番号:395、配列番号:398、配列番号:401、配列番号:404、配列番号:407、配列番号:410、配列番号:413、配列番号:416、配列番号:419及び配列番号:422は例示的なタンパク質（アミノ酸）配列である。
【００６３】
要約すれば：
表1A
2010516296.tif 000003
表1B
2010516296.tif 000004
【００６４】
上記の表1A及び1Bに列挙した配列は最初に菌類から得られた。すなわち、本発明のこれらの例示的配列は菌類由来核酸及び酵素である。
下記表2及び3は、本発明の例示的核酸及びポリペプチドの選択した特徴（酵素活性を含む）を記載した図表であり、相同性（配列同一性）分析によって本発明の酵素の活性を確認するために、公開データベースと本発明の例示的配列の配列同一性比較を含む。表2及び3に記載された全配列（本発明の全ての例示的配列）を2セットのデータベースに対してBLAST検索に付した（詳細は下記に記載）。第一のデータベースセットはNCBI（National Center for Biotechnology Information）により利用可能である。これらのデータベースに対する検索結果はいずれも、“NRの詳細”、“NRアクセッションコード”、“NR値”又は“NR由来生物”の見出しの欄に提示されている。“NR”はNCBIによって維持されている非重複ヌクレオチドデータベースを指す。このデータベースは、GenBank、GenBankアップデート及びEMBLアップデートの混成データベースである。“NRの詳細”欄の記載は、任意のあるNCBI記録の定義行を指し、前記は、配列の説明、例えば由来生物、遺伝子の名称／タンパク質の名称、又は配列の機能のいくらかの説明（したがって相同性（配列同一性）分析によって本発明の列挙した例示酵素の活性を確認する）を含む。“NRアクセッションコード”欄の記載は、配列記録に与えられた固有のアイデンティファイアーに該当する。“NR値”欄の記載は期待値（E値）に該当し、前記は、クエリー配列（本発明の配列）とデータベース配列との間で見出されるアラインメントスコアと同じような妥当なアラインメントスコアが、目下のBLAST検索で実施した比較数と同じ数のランダム配列間の比較で見出されうる確率を表す。“NR由来生物”欄の記載は、もっとも近いBLAST（配列相同性）ヒットとして認定された配列の供給源生物を指す。第二のデータベースセットは、包括的にGENESEQTMデータベースとして知られており、トムソン・ダーウェント（Thomson Derwent, Philadelphia, PA）を介して利用できる。このデータベースに対する検索の結果はいずれも、“GENESEQTMタンパク質の詳細”、“GENESEQTMタンパク質アクセッションコード”、“GENESEQTMタンパク質E値”、“GENESEQTM DNAの詳細”、“GENESEQTM DNAアクセッションコード”、“GENESEQTM DNA E値”の見出しの欄に提示されている。これらの欄で見出される情報は、前記情報がNCBIデータベースの代わりにGENESEQTMデータベースに対するBLAST検索に由来するという点を除いて、上記に記載のNR欄で見出される情報と共通する。さらにまた、この表は、“予想EC番号”欄を含んでいる。EC番号は、生物化学及び分子生物学の国際評議会（IUBMB）の酵素命名委員会によって立案された標準化酵素命名法にしたがって酵素のタイプに対して割り当てられる番号である。“予想EC番号”欄の結果は、Kegg（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）データベースに対するBLAST検索によって決定される。最高のBLAST一致がe-6以下のE値を有する場合、前記最高の一致に割り当てられるEC番号が表に記載される。最高ヒットのEC番号は、本発明の配列のありうるEC番号への手引きとして用いられる。“クエリーDNA長”及び“クエリータンパク質長”欄は、NCBI又はGENESEQTMデータベースのどちらかに対して検索又は問合わせを実施した本発明の配列のそれぞれヌクレオチド数又はアミノ酸数に当てはまる。“GENESEQTM又はNR DNA長”及び“GENESEQTM又はNRタンパク質長”欄は、BLAST検索から得られた最高一致の配列におけるそれぞれヌクレオチド数又はアミノ酸数に該当する。これらの欄で提供される結果は、NCBIデータベース又はGENESEQTMデータベースから低い方のE値を回答した検索から得られたのものである。“GENESEQTM又はNRタンパク質%ID”及び“GENESEQTM又はNR DNA %ID”欄は、本発明の配列と最高BLAST一致の配列との間のパーセント配列同一性に該当する。これらの欄に提供される結果は、NCBIデータベース又はGENESEQTMデータベースから低い方のE値を回答した検索から得られたものである。
【００６５】
本発明の例示的配列の活性は、とりわけ下記の表2及び3に列挙される（表4及び5もまた参照されたい。これらにはそれぞれ本発明の例示的酵素混合物及びCBMが列挙されている）。表の理解をさらに容易にするために、例えば表2の最初の列、“配列番号”の見出しで、番号369-371は、例えば配列番号:369（これは、上記で説明したようにゲノム配列である）によってコードされる、配列番号:371に示される配列を有する本発明の例示的ポリペプチドを表し；“相同性による酵素活性”は、最高（最も近い）BLASTヒットに基づく酵素の活性の割り当てであり；“実験による酵素活性”は、実験プロトコルによって決定される、広い解釈の酵素活性であり；“GHファミリー”は、列挙した例示的酵素のグリコシルヒドロラーゼファミリーを示し；“PASCによる活性”は、下記に記載するリン酸膨潤セルロース基質（PASC）に対する列挙酵素の実験的に決定した活性であり；“シグナルP切断部位”は、下記に記載の模範シグナルP（上掲書（Nielsen, 1997）を参照）によって決定される、列挙の例示的酵素のシグナル配列（又は“シグナルペプチド”、又はSP）であり；“予想シグナル配列”は、アミノ末端からカルボキシ末端までを列挙し（例えば表2の第二の列のポリペプチド配列番号:38については、シグナルペプチドは“MVKSRKISILLAVAMLVSIMIPTTAFA”である）；“供給源”は供給源微生物であって前記から最初に本発明の例示的核酸及びポリペプチドが得られた。
【００６６】
【表２−１】
2010516296.tif 000005
2010516296.tif 000006
2010516296.tif 000007
2010516296.tif 000008
2010516296.tif 000009
2010516296.tif 000010
【００６７】
【表２−２】
2010516296.tif 000011
2010516296.tif 000012
2010516296.tif 000013
2010516296.tif 000014
2010516296.tif 000015
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2010516296.tif 000029
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2010516296.tif 000033
2010516296.tif 000034
【００６８】
表３
【表３−１】
2010516296.tif 000035
2010516296.tif 000036
2010516296.tif 000037
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2010516296.tif 000072
【表３−２】
2010516296.tif 000073
2010516296.tif 000074
2010516296.tif 000075
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2010516296.tif 000095
2010516296.tif 000096
【表３−３】
2010516296.tif 000097
2010516296.tif 000098
2010516296.tif 000099
2010516296.tif 000100
2010516296.tif 000101
2010516296.tif 000102
2010516296.tif 000103
2010516296.tif 000104
【００６９】
本発明で選択した例示的ポリペプチド及び核酸の最初の供給源は以下のとおりである：
2010516296.tif 000105
2010516296.tif 000106
2010516296.tif 000107
2010516296.tif 000108
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2010516296.tif 000110
2010516296.tif 000111
2010516296.tif 000112
2010516296.tif 000113
【００７０】
本発明はまた、本発明の核酸を用いて、新規なリグノセルロース系酵素（セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼを含む）のポリペプチド配列を発見、同定、又は単離する方法を含む。本発明はまた、本発明の核酸を用いて、リグノセルロース系酵素のコード遺伝子の発現及び転写を阻害する方法を含む。
さらにまた本発明の核酸を改変する方法が提供される。前記方法は、例えば合成連結再アッセンブリ、最適化定方向進化システム及び／又は飽和変異導入(例えばGENE SITE SATURATION MUTAGENESIS（又はGSSM）)によって本発明の核酸の変種を作製する工程を含む。“飽和変異導入”、GENE SITE SATURATION MUTAGENESIS（又はGSSM）という用語は、下記に詳細に記載するように、縮退オリゴヌクレオチドプライマーを用いて点変異をポリヌクレオチドに導入する方法を含む。“最適化定方向進化システム”又は“最適化定方向進化”という用語は、関連核酸配列（例えば関連遺伝子）のフラグメントの再アッセンブリのための方法を含み、下記で詳細に説明される。“合成連結再アッセンブリ”又は“SLR”という用語は、非確率的態様でオリゴヌクレオチドフラグメントを連結する方法を含み、下記で詳細に説明される。“変種”という用語は、1つ以上の塩基対、コドン、イントロン、エクソン、又はアミノ酸において（それぞれ）改変され、しかもなお本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼの生物学的活性を保持する、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。変種は多数の手段（例えば、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、GSSM、及び前記の任意の組合せのような方法が含まれる）によって作製することができる。
【００７１】
本発明の核酸は、例えばcDNAライブラリーのクローニング及び発現、メッセージ又はゲノムDNAのPCRによる増幅などによって生成、単離及び／又は操作することができる。例えば、本発明の例示的配列は、最初は環境系供給源から誘導された。したがって、ある特徴では、本発明は、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素をコードする核酸、並びにそれらによってコードされるポリペプチドを提供し、前記は、共通の起源（例えば環境系、混合培養又は細菌起源）に由来するという点で共通の新規性を有する。
本発明の方法を実施する場合、本明細書に記載するように鋳型核酸を操作することによって相同な遺伝子を改変することができる。本発明は、当分野で公知の任意の方法又は装置を一緒に用いて実施することができ、それらは、学術文献及び特許文献に詳細に記載されている。個々のポリペプチド又はタンパク質“のコード配列”又は前記“をコードするヌクレオチド配列”は、適切な調節配列の制御下に置かれたときポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳される核酸配列である。“遺伝子”という用語は、ポリペプチド鎖の生成に必要なDNAセグメントを意味する。前記には、コード領域に先行及び後続する領域（リーダー及びトレイラー）とともに、適切な場合には個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）が含まれる。プロモーター配列は、プロモーターで転写を開始させるRNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写すれば、コード配列に“機能的に連結”されている。本明細書で用いられる“機能的に連結”とは、2つ以上の核酸（例えばDNA）セグメント間の機能的関係を指す。前記は、転写調節配列と転写される配列との機能的関係に適用することができる。例えば、適切な宿主細胞又は他の発現系においてプロモーターがコード配列の転写を促進又は調節したら、前記プロモーターは前記コード配列（例えば本発明の核酸）に機能的に連結されている。ある特徴では、プロモーター転写調節配列は、転写される配列（例えば本発明の配列）に機能的に連結され、さらに前記転写される配列と物理的に連続し、すなわちそれらはcis-作動性である。しかしながら、いくつかの転写調節配列（例えばエンハンサー）は、必ずしも、それらが転写を強化するコード配列と物理的に連続して又は近接して配置される必要はない。本発明の核酸の転写を“駆動”させるために用いられるプロモーターには、例えばウイルス系、細菌系、哺乳動物系又は植物プロモーター；又は植物プロモーター；又はタバコ、コメ、トウモロコシ、コムギ、タバコ、若しくはオオムギプロモーター；又は構成的プロモーター若しくはCaMV35Sプロモーター；又は誘導性プロモーター；又は組織特異的プロモーター若しくは環境調節性若しくは発生制御性プロモーター；又は種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的、若しくは器官脱離誘導プロモーター；又は種子優先プロモーター、トウモロコシガンマゼインプロモーター又はトウモロコシADP-gppプロモーターが含まれる。
【００７２】
本発明のある特徴は、本発明の配列の1つ、又は本発明の核酸の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400若しくは500又はそれより大きい連続塩基を含むフラグメントを含む単離、合成又は組換え核酸である。前記単離、合成又は組換え核酸は、DNA（cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAを含む）を含むことができる。前記DNAは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖はコード鎖でも非コード鎖でもよい。あるいは、前記単離、合成又は組換え核酸はRNAを含む。
本発明の単離、合成又は組換え核酸を用いて、本発明のポリペプチドの1つ、又は本発明のポリペプチドの1つの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150又はそれより大きい連続したアミノ酸を含むフラグメントを調製することができる。したがって、本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチドの1つ、又は本発明のポリペプチドの1つの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150又はそれより大きい連続したアミノ酸を含むフラグメントをコードする、単離、合成又は組換え核酸である。これらの核酸のコード配列は、本発明の核酸の1つのコード配列と同一であってもよいが、遺伝暗号の重複又は縮退の結果として、本発明のポリペプチドの1つの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150又はそれより大きい連続したアミノ酸を有する本発明のポリペプチドの1つをコードする種々のコード配列であってもよい。遺伝暗号は当業者には周知であり、以下の文献（B. Lewin, Genes VI, Oxford University Press, 1997）の214ページで入手することができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：本発明の核酸のコード配列及び追加のコード配列（例えばリーダー配列プロプロテイン配列）及び非コード配列（例えばイントロン又はコード配列の3'及び／又は5'非コード配列）。したがって、本明細書で用いられるように、“ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド”という用語は、ポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドとともに、追加のコード及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００７３】
ある特徴では、本発明の核酸配列は、通常の技術、例えば位置特異的変異導入又は当業者に周知の他の技術を用いて変異を導入し、本発明のポリヌクレオチドにサイレント変化を導入することができる。本明細書で用いられる、“サイレント変化”には、例えばポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を変更しない変化が含まれる。そのような変化は、宿主生物で頻繁に出現するコドン又はコドン対を導入することにより、前記ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞によって生成されるポリペプチドレベルを高めるために所望されえる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切端をもたらすヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチドに関する。そのようなヌクレオチド変化は、例えば、位置特異的変異導入、化学的なランダム変異導入、エキソヌクレアーゼIIIによる欠失及び他の組換え体DNA技術を用いて導入することができる。あるいは、そのようなヌクレオチド変化は天然では対立遺伝子座変種を生じさせることができる。前記変種は、本発明の配列（又は前記と相補的な配列）の1つの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400又は500の連続する塩基を含むプローブと、本明細書で提供される高い、中等度の又は低いストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする核酸を同定することによって単離される。
【００７４】
一般的技術
本発明の実施に用いられる核酸は、RNA、siRNA、miRNA、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルス又は前記のハイブリッドのいずれであれ、種々の供給源から単離するか、遺伝的に操作するか、増幅させるか、及び／又は組換えにより発現／作製することができる。これらの核酸から作製された組換えポリペプチド（例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）は、個々に単離またはクローニングして、所望の活性について試験することができる。任意の組換え発現系（細菌、哺乳動物、酵母、昆虫又は植物細胞発現系を含む）を用いることができる。
あるいは、これら核酸は周知の化学的合成技術によってin vitroで合成することができる。前記技術は例えば以下に記載されている：Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (9179) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; US Patent No. 4,458,066。
本発明は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、前記のいずれかのフラグメントとして、ゲノム若しくは合成起源又は誘導体のDNA、cDNA、gDNA、RNA（メッセージ）、RNAiなど（前記はいずれも一本鎖でも二本鎖でもよく、センス鎖でもアンチセンス（相補）鎖でもよい）、ペプチド核酸（PNA）又は任意のDNA様若しくはRNA様物質（天然若しくは合成起源）のために“核酸”又は“核酸配列”を包含する。本発明は、任意のセンス若しくはアンチセンス配列、ペプチド核酸（PNA）、任意のDNA様若しくはRNA様物質（天然又は合成起源）（iRNA、リボヌクレオタンパク質（例えば二本鎖iRNA、例えばiRNP）を含む）を含む“核酸”又は“核酸配列”を包含する。本発明は、天然のヌクレオチドの公知のアナローグを含有する核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを包含する。本発明は、合成骨格を含む核酸様構造物を包含し、前記は、本発明の合成核酸の可能な1つの実施態様である（例えば以下を参照されたい：Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197；Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698；Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156）。“オリゴヌクレオチド”には、一本鎖のポリデオキシヌクレオチド又は2本の相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖（前記は化学的に合成することができる）が含まれる。本発明は、合成核酸及び／又は5'ホスフェートを含まないオリゴヌクレオチドを包含する。前記は、したがってキナーゼの存在下でATPを含むホスフェートを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結することができない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントと連結することができる。合成核酸及び／又はオリゴヌクレオチドのまた別の構造、及びそれらを製造する方法は当分野では周知であり、いずれも本発明の実施及び使用のために取り込まれている。
【００７５】
本発明は、本発明の“組換え体”のポリヌクレオチド（及びタンパク質）を提供し、さらにある特徴では、組換え核酸は、天然の環境では前記組換え核酸が隣接していない“骨格”核酸に隣接している。ある特徴では、“濃縮”されているとは、核酸は、核酸の骨格分子集団中で核酸挿入物の数の約1%、5%、10%、15%、20%、25%又はそれより多くに相当するであろう。ある特徴では、骨格分子は、例えば発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組み込み用核酸、及び対象の核酸挿入物の維持又は操作のために用いられる他のベクター若しくは核酸を含む。ある特徴では、濃縮された核酸は、組換え骨格分子集団中で核酸挿入物の数の約1%、5%、10%、15%、20%、25%又はそれより多くに相当する。ある特徴では、濃縮核酸は、組換え骨格分子集団中で核酸挿入物の数の約50%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、63%、64%、65%、66%、67%、68％、69％70%、71％、72％、73％、74％、75％又はそれより多くに相当する。ある特徴では、濃縮核酸は、組換え骨格分子集団中で核酸挿入物の数の約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99%又はそれ以上に相当する。
核酸操作のための技術、例えばサブクローニング、プローブ標識（例えばクレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を用いるランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは学術文献及び特許文献に詳細に記載されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)。
本発明の実施に用いられる核酸のまた別の有用な入手及び操作手段はゲノムサンプルからのクローニングであり、さらに所望する場合は、例えばゲノムクローン又はcDNAクローンから単離し又は増幅させた挿入物のスクリーニング及び再クローニングである。本発明の方法で用いられる核酸源には、例えば、哺乳動物の人工染色体（MAC）（例えば以下を参照されたい：U.S. Patent Nos. 5,721,118; 6,025,155）、ヒト人工染色体（例えば以下を参照されたい：Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、P1人工染色体（例えば以下を参照されたい：Woon (1998) Genomics 50:306-316）、P1由来ベクター（PAC）（例えば以下を参照されたい：Kern (1997) Biotechniques 23:120-124）、コスミド、組換えウイルス、ファージ又はプラスミドに含まれるゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーが含まれる。
【００７６】
ある特徴では、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチド又はそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列とともに適切な相においてアッセンブリングされる。
本発明は融合タンパク質及びそれらをコードする核酸を提供する。本発明のポリペプチドは、異種ペプチド又はポリペプチド、例えばN-末端の識別ペプチド（所望の特徴、例えば安定性増強又は生成の簡素化を付与する）と融合させることができる。本発明のペプチド及びポリペプチドはまた、例えばより免疫原性の高いペプチドを製造するために、組換え合成ペプチドをより容易に単離するために、抗体及び抗体発現B細胞を同定及び単離するために、1つ以上の追加のドメインが連結された融合タンパク質として合成し発現させることも可能である。検出及び精製促進ドメインには、例えば、金属キレートペプチド、例えばポリヒスチジン鎖及びヒスチジン-トリプトファンモジュール（固定金属による精製を可能にする）、プロテインAドメイン（固定免疫グロブリンによる精製を可能にする）、及びFLAGS伸張／アフィニティ精製系（Immunex Corp, Seatle WA）で利用されるドメインが含まれる。精製ドメインとモチーフ含有ペプチド又はポリペプチドとの間に切断可能なリンカー配列（例えばXa因子又はエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA））を取り込むことによって、精製が容易になる。例えば、発現ベクターは、6ヒスチジン残基に連結されたエピトープコード核酸配列を含むことができ、前記ヒスチジン残基の後にはチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位が続く（例えば以下を参照されたい：Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414）。前記ヒスチジン残基は検出及び精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質の残りの部分から前記エピトープを精製する手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクター及び融合タンパク質の利用に関する技術は学術文献及び特許文献に詳細に記載されている（例えば以下を参照されたい：Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53）。
【００７７】
転写及び翻訳制御配列
本発明は、RNAの合成／発現を誘導または調節するために、発現（例えば転写または翻訳）制御配列、例えばプロモーター又はエンハンサーに機能的に連結された本発明の核酸（例えばDNA）配列を提供する。発現制御配列は発現ベクター内に存在することができる。例示的な細菌プロモーターにはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PL及びtrpが含まれる。例示的な真核細胞プロモーターにはCMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルスのLTR及びマウスのメタロチオネインIが含まれる。
本明細書で用いられる、“プロモーター”という用語には、コード配列の転写を細胞（例えば植物細胞又は動物細胞）内で駆動することができる全ての配列が含まれる。したがって本発明の構築物で用いられるプロモーターには、cis-作動性転写制御エレメント及び調節配列が含まれ、前記は、遺伝子の転写のタイミング及び／又は速度の調節又は調整に必要である。例えば、プロモーターはcis-作動性転写制御エレメントであってもよい。前記にはエンハンサー、プロモーター、転写終了因子、複製起点、染色体組み込み配列、5'及び3'非翻訳領域、又はイントロン配列が含まれ、前記は転写の調節に必要である。これらのcis-作動性配列は、タンパク質又は他のバイオ分子と相互作用して、転写を実行する（ターンオン／オフ、調節、調整など）。“構成的”プロモーターは、ほとんどの環境条件及び発育若しくは細胞分化の条件下で持続的に発現を駆動するプロモーターである。“誘導性”又は“調節”プロモーターは、環境条件又は発育条件の影響下で本発明の核酸の発現を誘導する。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼしえる環境条件の例には、嫌気的条件、上昇温度、乾燥又は光の存在が含まれる。
【００７８】
“組織特異的”プロモーターは、例えば植物又は動物の特定の細胞又は組織又は器官でのみ活性を有する転写制御エレメントである。組織特異的調節は、ある組織に特異的なタンパク質をコードする遺伝子が発現されることを担保するある種の固有因子によって達成することができる。そのような因子は、特定の組織の発育を可能にするために哺乳動物及び植物に存在することが知られている。
細菌でのポリペプチドの発現に適したプロモーターには、大腸菌のlac又はtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPRプロモーター、ラムダPLプロモーター、糖分解酵素（例えば3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK））をコードするオペロン由来のプロモーター、及び酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTR、及びマウスのメタロチオネインIプロモーターが含まれる。原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターもまた用いることができる。細菌でポリペプチド又はそのフラグメントを発現させるために適切なプロモーターには、大腸菌のlac又はtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPRプロモーター、ラムダPLプロモーター、糖分解酵素（例えば3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK））をコードするオペロン由来のプロモーター、及び酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。菌類プロモーターにはα-因子プロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTR、及びマウスのメタロチオネインIプロモーターが含まれる。原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターもまた用いることができる。
【００７９】
組織特異的植物プロモーター
本発明は、植物の部分（例えば種子、葉、根又は種子）で又は組織特異的態様で発現させることができる発現カセットであって、例えば本発明のリグノセルロース系酵素、例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を部分特異的又は組織特異的態様で発現させることができるものを提供する。本発明はまた、本発明のリグノセルロース系酵素を時期特異的及び／又は組織特異的態様で発現する植物又は種子を提供する。前記組織特異性は、種子特異性、茎特異性、葉特異性、根特異性、果実特異性などであってもよい。本発明の核酸は、例えば発現カセット（例えばベクター、プラスミドなど）中の任意のプロモーターに機能的に連結することができる。前記プロモーターは、植物、植物部分（例えば根、茎、種子又は果実）又は植物の種子で極めて高い発現を提供し、前記には、植物の任意の部分で活性を有する（ただし植物の一部分、全体でなくても植物の部分でもまた高レベルの発現を示す）プロモーター、あるいは植物の全体ではなく部分で、例えば組織特異的態様で、高レベルで本発明の核酸を発現させることができるプロモーターが含まれる。ある特徴では、前記プロモーターは構成的であり、構成的な高レベル発現をもたらすか、あるいは前記プロモーターは誘導性でもよい。すなわち、前記プロモーターは、例えば化学物質の適用、誘導性物質又はタンパク質を生成する因子の感染によって、又は、植物がある種の遺伝子及びプロモーターのオン及びオフを内因的に切り替える、通常の又は誘導された成熟又は生育過程によって、本発明の核酸の高レベルの発現を誘導することができる。
【００８０】
ある特徴では、構成的プロモーター（例えばCaMV 35Sプロモーター）を、植物の特定の部分若しくは種子又は植物全体での発現のために用いることができる。例えば、過剰発現のために、植物（例えば再生植物）のいくらか又は全ての組織での核酸の発現を誘導する、植物プロモーターフラグメントを利用することができる。そのようなプロモーターは、本明細書では“構成的”プロモーターと称され、ほとんどの環境条件及び発育又は細胞分化の状態下で活性を有する。構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sの転写開始領域（カリフラワーモザイクウイルスプロモーターについては例えばUSPN 5,110,732を参照されたい）；アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のT-DNA由来1'-又は2'-プロモーター；及び当業者に公知の多様な植物遺伝子に由来する他の転写開始領域が含まれる。
本発明の実施に用いることができるプロモーター、エンハンサー及び／又は他の転写若しくは翻訳調節モチーフには、当分野で公知の任意の植物、動物又は微生物の遺伝子に由来するものが含まれ、例えば以下が含まれる：アラビドプシス（Arabidopsis）由来ACT11（Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139）；アラビドプシス由来Cat3（GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet.  251:196-203）；ブラシッカ・ナプス（Brassica napus）由来ステアロイル-アシル担体タンパク質をコードする遺伝子（Genbank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol. 104:1167-1176）；トウモロコシのGPc1（GenBank No. X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 209:551-565）；トウモロコシのGPc2（GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112）；米国特許4,962,028号、5,633,440号に記載の植物プロモーター。
【００８１】
本発明は、ウイルス由来の組織特異的、誘導性又は構成的プロモーター及び／又はエンハンサーを用いる。前記には例えば以下が含まれえる：トバモウイルスのサブゲノムプロモーター（Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683）；イネのツングロバシリフォームウイルス（RTBV）（前記は、強力な篩部特異的レポーター遺伝子の発現を駆動するそのプロモーターにより、感染したイネの篩部細胞でのみ複製する）；キャッサバ葉脈モザイクウイルス（CVMV）プロモーター（空胞エレメント、葉の葉肉細胞及び根端で最高の活性を有する）（Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139）。ある特徴では、本発明は、セストラムイエローリーフカーリングウイルスのプロモーターを利用する（例えば以下に記載されている：USPN 7,166,770；10th IAPTC&B Congress "Plant Biotechnology 2002 and beyond." Kononova, et al.. p. 237-238. Jun. 24, 2002）ある特徴では、本発明は、トウモロコシの内乳特異的プロモーターを利用する（例えばUSPN 7,157,623に記載されている）。ある特徴では、本発明は、ジンクフィンガータンパク質の発現を調節するプロモーターを利用する（例えばUSPN 7,151,201に記載されている）。ある特徴では、本発明は、トウモロコシのプロモーターを利用する（例えばUSPN 7,138,278に記載されている）。ある特徴では、本発明は、植物で異種核酸配列を高レベルで転写することができる“アーセリン”プロモーター（アーセリン-3、アーセリン-4及びアーセリン-5プロモーターを含む）を利用する（例えばUSPN 6,927,321に記載されている）。ある特徴では、本発明は、植物の胚特異的プロモーターを利用する（例えば米国特許（USPN）6,781,035、6,235,975に記載されている）。ある特徴では、本発明は、ジャガイモの塊茎特異的発現のためのプロモーターを利用する（例えばUSPN 5,436,393に記載されている）。ある特徴では、本発明は、葉特異的発現のためのプロモーターを利用する（例えばUSPN 6,229,067に記載されている）。ある特徴では、本発明は、葉肉特異的発現のためのプロモーターを利用する（例えばUSPN 6,610,840に記載されている）。
種子優先調節配列（例えば種子特異的プロモーター）が、例えば米国特許7,081,566号、7,081,565号、7,078,588号、6,566,585号、6,642,437号、6,410,828号、6,066,781号、5,889,189号、5,850,016号に記載されている。
ある特徴では、本植物プロモーターは、リグノセルロース系酵素の発現、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素発現核酸の発現を特定の組織、器官又は細胞タイプで誘導するか（すなわち組織特異的プロモーター）、そうでなければより厳密な環境若しくは発育制御下又は誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。転写に影響を及ぼしえる環境条件には、嫌気的条件、上昇温度、光の存在、又は化学物質/ホルモンの噴霧が含まれる。例えば、本発明は、トウモロコシの乾燥誘導性プロモーター（上掲書（Busk, 1997)）；ジャガイモの寒冷、乾燥及び高塩誘導性プロモーター（Kirch (1997) Plant Mol Biol 33:897-909）を取り入れている。
【００８２】
任意の組織特異的被調節コード配列、任意の植物の遺伝子及び／又は転写調節配列（プロモーター及びエンハンサーを含む）を用いて本発明を実施することができる。前記は例えば組織特異的プロモーター及びエンハンサー及びコード配列；又はプロモーター及びエンハンサー又は遺伝子を含み、これらには、種子貯蔵タンパク質（例えばナピン、クルシフェリン、ベータ-コングリシニン及びファセオリン）、ゼイン又は油体タンパク質（例えばオレオシン）をコードするコード配列又は遺伝子、又は脂肪酸生合成に必要な遺伝子（アシル担体タンパク質、ステアロイル-ACPデサチュラーゼ及び脂肪酸デサチュラーゼ（fad2-1）を含む）；及び胚発生時に発現される他の遺伝子（例えばBce4（例えば以下を参照されたい：EP 255378及びKridl (1991) Seed Science Research 1:209））；及びこれらの遺伝子及びタンパク質コード配列に密接に関係するプロモーター及びエンハンサーが含まれる。
本発明の実施に用いることができる例示的な組織特異的プロモーター及びエンハンサーには、以下の植物遺伝子に由来する組織特異的プロモーター及びエンハンサーが含まれる：レクチン（例えば以下を参照されたい：Vodkin (1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138:87; Lindstrom (1990) Der. Genet. 11:160）、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば以下を参照されたい：Kyozuka (1994) Plant Cell 6(6):799-810; Dennis (1985) Nucleic Acids Res. 13(22):7945-57）、トウモロコシの集光複合体（例えば以下を参照されたい：Simpson, (1986) Science, 233:34; Bansal (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654）、トウモロコシの熱ショックタンパク質（例えば以下を参照されたい：Odell et al., (1985) Nature, 313:810）、エンドウマメの小サブユニットRuBPカルボキシラーゼ（例えば以下を参照されたい：Poulsen et al., (1986) Mol. Gen. Genet., 205:193-200; Cashmore et al., (1983) Gen. Eng. of Plants, Plenum Press, New York, 29-38）、Tiプラスミドマンノピンシンターゼ（例えば以下を参照されたい：Langridge et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3219-3223）、Tiプラスミドノパリンシンターゼ（Langridge et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3219-3223）、ペチュニアカルコンイソメラーゼ（例えば以下を参照されたい：vanTunen (1988) EMBO J. 7:1257）、インゲンマメのグリシン富裕タンパク質1（例えば以下を参照されたい：Keller (1989) Genes Dev. 3:1639）、切端CaMV 35s（例えば以下を参照されたい：Odell (1985) Nature 313:810）、ジャガイモのパタチン（例えば以下を参照されたい：Wenzler (1989) Plant Mol. Biol. 13:347）、根の細胞（例えば以下を参照されたい：Yamamoto (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449）、トウモロコシのゼイン（例えば以下を参照されたい：Reina (1990) Nucleic Acids Res. 18:6425; Kriz (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90; Wandelt (1989) Nucleic Acids Res., 17:2354; Langridge (1983) Cell, 34:1015; Reina (1990) Nucleic Acids Res., 18:7449）、ADP-gppプロモーター（例えば以下を参照されたい：U.S. Patent No. 7,102,057）、グロブリン-1（例えば以下を参照されたい：Belanger (1991) Genetics 129:863）、α-チューブリン、cab（例えば以下を参照されたい：Sullivan (1989) Mol. Gen. Genet., 215:431）、REPCase（例えば以下を参照されたい：Hudspeth & Grula, (1989) Plant Molec Biol 12:579-589）、R遺伝子複合体関連プロモーター（例えば以下を参照されたい：Chandler (1989) Plant Cell 1:1175）、カルコンシンターゼプロモーター（例えば以下を参照されたい：Franken (1991) EMBO J., 10:2605）、及び／又はダイズ熱ショック遺伝子プロモーター（例えば以下を参照されたい：Lyznik (1995) Plant J. 8(2):177-86）。
【００８３】
ある特徴では、本発明は、種子特異的発現のために種子特異的転写調節エレメントを使用する（例えばエンドウマメのヴィシリンプロモーターの使用を含む）（例えば以下を参照されたい：Czako (1992) Mol Gen Genet., 235:33；US Patent No. 5,625,136）。成熟葉での発現に有用な他のプロモーターは、老化開始でスイッチが入るプロモーター、例えばアラビドプシスのSAGプロモーターである（例えば以下を参照されたい：Gan (1995) Science 270:1986）。
ある特徴では、本発明は、開花時又は開花中から果実の発育期間を通して、少なくとも完熟の開始まで発現される果実特異的プロモーターを用いる（前記は例えば米国特許4,943,674号に記載されている）。ある特徴では、本発明は、綿の線維で優先的に発現されるcDNAクローンを用いる（例えば以下に記載されている：John (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:5769）。ある特徴では、本発明は、果実の発育中に弁別的な発現を示すトマトのcDNAクローンを使用する（例えば以下に記載されている：Mansson et al., Gen. Genet., 200:356 (1985)；Slater et al., Plant Mol. Biol., 5:137 (1985)）。ある特徴では、本発明は、ポリガラクツロナーゼ遺伝子（果実が熟れるときに活性を示す）のためのプロモーターを使用する。ポリガラクツロナーゼ遺伝子は、例えば米国特許4,535,060号、4,769,061号、4,801,590号、5,107,065号に記載されている。
本発明の実施に用いられる他の組織特異的プロモーターの例には、葉の損傷（例えばカミキリムシによる損傷）後の葉の細胞で、塊茎で（例えばパパチン遺伝子プロモーター）、及び線維細胞で発現を誘導するプロモーターが含まれる（例えば発育により調節される線維細胞タンパク質の例はE6である（例えば以下を参照されたい：John (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769））。E6遺伝子は線維でもっとも活性が強いが、低レベルの転写物が葉、胚珠及び花で見出される。
ある特徴では、組織特異的プロモーターは、発育期の一定の時間枠内でのみ当該組織内で転写を促進する。例えば以下を参照されたい：Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800（前記文献はアラビドプシスのLEAFY遺伝子の特徴を明らかにしている）；さらにまた以下を参照されたい：Cardon (1997) Plant J 12:367-77（前記は転写因子SPL3について述べている（SPL3は、A.タリアナ（thaliana）の花の認証（identity）遺伝子AP1のプロモーター領域内の保存された配列モチーフを認識する）、及びMandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, pp 995-1004（前記は分裂組織のプロモーターeIF4について述べている）。
【００８４】
特定の組織の生存期間を通して活性を有する組織特異的プロモーターを用いてもよい。ある特徴では、本発明の核酸は、主として綿の線維細胞でのみ活性を有するプロモーターに機能的に連結される。ある特徴では、本発明の核酸は、綿の線維細胞の伸張期に主として活性を有するプロモーターに機能的に連結される（例えば上掲書（Rinehart 1996）に記載されている）。核酸は、綿の繊維細胞で優先的に発現されるように、Fb12A遺伝子プロモーターに機能的に連結することができる（同書）。さらにまた以下を参照されたい：John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773；John, et al., U.S. Patent Nos. 5,608,148 ＆ 5,602,321（前記は、綿の線維特異的プロモーター及びトランスジェニックな綿の木の構築のための方法を述べている）。
根特異的プロモーターもまた本発明の核酸の発現に用いることができる。根特異的プロモーターの例にはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター（DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60）が含まれる。本発明の核酸を発現させるために用いることができる他のプロモーターには、胚珠特異的、胚特異的、内乳特異的、珠皮特異的、種子外皮特異的プロモーター、又は前記の何らかの組合せ；葉特異的プロモーター（例えば以下を参照されたい：Busk (1997) Plant J. 11:1285-1295、前記はトウモロコシの葉特異的プロモーターについて述べている）；アグロバクテリウム・リゾゲネス（rhizogenes)由来のORF13（前記は根で高い活性を示す）（例えば上掲書(Hansen, 1997)を参照されたい）；トウモロコシの花粉特異的プロモーター（例えば以下を参照されたい：Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161 168）；果実が熟している間、老化及び葉の脱離中に活性を示し、さらに活性は下がるが花の脱離中にも活性を示すトマトのプロモーターを用いることができる（例えば以下を参照されたい：Blume (1997) Plant J. 12:731 746）；ジャガイモのSK2遺伝子のめしべ特異的プロモーター（例えば以下を参照されたい：Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425 431）；エンドウマメのBlec4遺伝子（前記は、トランスジェニックなアルファルファの栄養期茎頂及び生殖器茎頂の表皮組織で活性を有し、活発に成長しているシュート又はひげ根の表皮層に外来遺伝子の発現を誘導するために有用なツールとなる）；胚珠特異的BEL1遺伝子（例えば以下を参照されたい：Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944）；及び／又は米国特許5,589,583号（Klee）に記載のプロモーター（前記文献は、分裂組織及び／又は急速に分裂中の細胞で高レベルの転写を付与することができる植物プロモーター領域について述べている）が含まれる。
【００８５】
ある特徴では、植物ホルモン、例えばオーキシンに暴露されたときに誘導されえる植物プロモーターが、本発明の核酸の発現に用いられる。例えば、本発明は、ダイズ（Glycine max L.）のオーキシン応答エレメントE1プロモーターフラグメント（AuxRE）を（Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407）；オーキシン応答アラビドプシスGST6プロモーター（サリチル酸及び過酸化水素にもまた応答性である）を（Chen (1996) Plant J. 10: 955-966）；タバコのオーキシン誘導性parCプロモーターを（Sakai (1996) 37:906-913）；植物ビオチン応答エレメントを（Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937）；及びストレスホルモンアブシジン酸応答性プロモーター（Sheen (1996) Science 274:1900-1902）を用いることができる。
本発明の核酸はまた、植物に適用することができる化学試薬に暴露したとき誘導されえる植物プロモーターに機能的に連結することができる。例えばベンゼンスルホンアミド除草剤解毒物質によって活性化される、トウモロコシのIn2-2プロモーターを用いることができる（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）。種々の除草剤解毒物質の適用によって、別個の遺伝子発現パターン（根、排水組織及び茎頂分裂組織での発現を含む）が誘導される。コード配列は、例えばテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に置くか（例えばアヴェナ・サティヴァ L.（Avena sativa L.）（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むトランスジェニックタバコに関して報告されている（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473））、又はサリチル酸応答性エレメントの制御下に置くことができる（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）。化学的に（例えばホルモン又は農薬により）誘導されるプロモーター（すなわち野外でトランスジェニック植物に適用することができる化学物質に応答するプロモーター）を用いて、本発明のポリペプチドの発現を、植物又は植物部分（例えば果実又は種子）の特定の発育又は成熟時期に誘導することができる。したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする誘導性のタンパク質コード配列（例えば遺伝子）を含むトランスジェニック植物を提供する（いずれの選択肢も広い宿主域又は限定宿主域（例えば標的植物種（例えばトウモロコシ、コメ、オオムギ、ダイズ、トマト、コムギ、ジャガイモ又は他の作物）に限定される）を含むことができる。ある特徴では、前記誘導性タンパク質コード配列（例えば遺伝子）は、作物（植物部分、例えば果実又は種子を含む）の発育又は成熟の任意の時期に誘導することができる。
【００８６】
当業者には、組織特異的植物プロモーターが、機能的に連結された配列の発現を標的組織以外の組織で駆動することができることは理解されよう。したがって、ある特徴では、組織特異的プロモーターは、標的組織又は細胞タイプで優先的に発現を駆動するが、他の組織でも同様にある程度の発現を誘導することができるプロモーターである。
本発明の核酸はまた、化学的試薬に暴露されたときに誘導されえる植物プロモーターに機能的に連結することができる。これらの試薬には、トランスジェニック植物に適用、例えば噴霧することができる、例えば除草剤、合成オーキシン又は抗生物質が含まれる。ある特徴では、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼの誘導性発現、例えば本発明の酵素コード核酸の誘導性発現は、リグノセルロース系酵素発現の最適な量又は発現タイミング及び／又は活性に関して植物の選別を可能にする。したがって植物部分の発育を制御することができる。このようにして、本発明は、植物及び植物部分の収穫を容易にする手段を提供する。例えば、種々の実施態様で、トウモロコシのIn2-2プロモーター（ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒物質によって活性化される）が用いられる。種々の除草剤解毒物質の適用によって、根、排水組織及び茎頂分裂組織における発現を含む、別個の遺伝子発現パターンが誘導される。本発明のコード配列はまた、例えばアヴェナ・サティヴァ L.（Avena sativa L.）（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むトランスジェニックタバコに関して報告されているように（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473））、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に置くか、又はサリチル酸応答性エレメントの制御下に置かれる（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）。
いくつかの特徴では、適切なポリペプチド発現は、コード領域の3'末端にポリアデニル化領域を要求しえる。このポリアデニル化領域は、天然の遺伝子から、他の種々の植物（又は動物又はその他）の遺伝子から、又はアグロバクテリウムのT-DNAから誘導することができる。
【００８７】
発現ベクター及びクローニングビヒクル
本発明は、本発明の核酸、例えば本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素、又は本発明の抗体をコードする配列を含む、発現カセット、発現ベクター及びクローニングビヒクルを提供する。
本明細書で用いられる“発現カセット”という用語は、そのような配列に適合しえる宿主で、構造遺伝子（すなわちタンパク質コード配列、例えば本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）の発現に影響を及ぼすことができるヌクレオチド配列を指す。
本発明の発現カセットは、前記ポリペプチドコード配列（例えば本発明の酵素又は抗体）及び場合によって他の配列（例えば転写終了シグナル、シグナル配列又はCBHコード配列など）と機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターを含むことができる。
発現の実行に必要又は有益な追加の因子（例えばエンハンサー、アルファ-因子）もまた用いることができる。したがって、本発明の発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、“裸のDNA”の組換えベクターの任意の形態、人工染色体などを含むことができる（前記を構成するか、又は前記の内部に収納されてもよい）。
【００８８】
ある特徴では、本発明のベクターは、ポリペプチドコード配列（例えば本発明の酵素又は抗体のコード配列）及び核酸を含み、前記は、細胞に感染することができ、細胞をトランスフェクトすることができ、又は永久的に細胞に形質導入することができる。本発明のベクターは裸の核酸であっても、タンパク質又は脂質との核酸複合体であってもよい。本発明のベクターは、ウイルス又は細菌の核酸及び／又はタンパク質及び／又は膜（例えば細胞膜、ウイルスの脂質エンベロープなど）を含むことができる。本発明のベクターは、DNAフラグメントが結合され複製できるようになっているレプリコン（例えばRNAレプリコン、バクテリオファージ）を含むことができる。したがって、本発明のベクターには、RNA、自律的自己複製環状又は直鎖状DNA若しくはRNA（例えばプラスミド、ウイルスなど、（例えば以下を参照されたい：U.S. Patent No. 5,217,879）が含まれ（ただしこれらに限定されない）、さらに発現及び非発現プラスミドの両方が含まれる。
本発明の組換え微生物又は細胞培養は、“発現ベクター”を含むことができ（“発現ベクター”の宿主となることができ）、前記は、染色体外環状及び／又は直鎖状DNA、及び／又は宿主染色体に取り込まれてあるDNAの一方及び両方を含むことができる。ある特徴では、ベクターは宿主細胞（例えば植物細胞）によって維持されるか、あるいはベクターは、有糸分裂中に自律的構造物として細胞によって安定的に複製されるか、又は宿主ゲノム内に取り込まれる。
本発明の発現ベクター及びクローニングビヒクルは、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、人工染色体（例えば酵母又は細菌人工染色体）、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘、仮性狂犬病及びSV40の誘導体）、P1-系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び対象の特定の宿主（例えば、杆菌、アスペルギルス（Aspergillus）及び酵母）に特異的な任意の他のベクターを含むことができる。本発明のベクターには、染色体DNA、非染色体DNA及び合成DNA配列が含まれえる。適切な多数のベクターが当業者によく知られており、さらに市場で入手できる。
例示的ベクターには以下が含まれる：細菌系：pQETMベクター（Qiagen）、 pBLUESCRIPTTMプラスミド、pNHベクター、lambda-ZAPベクター（Stratagene）、 ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核細胞系：pXT1、pSG5 （Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかしながら他のいずれのプラスミド又は他のベクターも、それらが複製可能で宿主内で生存可能であるかぎり用いることができる。低コピー数又は高コピー数ベクターも本発明に関して用いることができる。本発明の実施に用いられるプラスミドは市場で入手可能であるか、制約なく公的に入手可能であるか、又は入手可能なプラスミドから公表された方法にしたがって構築することができる。本明細書に記載のプラスミドと等価のプラスミドが当分野で公知であり、当業者には明白であろう。
【００８９】
発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写終了因子を含むことができる。前記ベクターはまた、発現増幅のための適切な配列を含むことができる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終了配列、及び5'フランキング非転写配列を含むことができる。いくつかの特徴では、SV40のスプライス及びポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝エレメントを提供することができる。
ある特徴では、発現ベクターは1つ以上の選別可能なマーカー遺伝子を含み、ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする。そのような選別可能マーカーには、真核細胞培養の場合にジヒドロフォレートレダクターゼをコードする遺伝子又はネオマイシン耐性を付与する遺伝子、大腸菌でテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及びS.セレビシアエ（cerevisiae）TRP1遺伝子が含まれる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（CAT）ベクター又は選別可能マーカーを含む他のベクターを用いて、所望される任意の遺伝子から選択することができる。
ある特徴では、真核細胞でポリペプチド又はそのフラグメントを発現するためのベクターは、発現レベルを高めるためのエンハンサーを含む。エンハンサーは、cis-作動性DNAエレメントであり、長さが約10から約300bpでありえる。それらは、プロモーターに作用してその転写を増進させる。例示的エンハンサーには、複製起点の後期側100bpから270bpのSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
核酸配列は多様な方法によってベクターに挿入することができる。一般的には、配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物及びベクターの消化に続いてベクターの所望の位置に連結される。あるいは、挿入物及びベクターの両者の平滑端を連結してもよい。例えばAusbel and Sambrookによって記載されているように、多様なクローニング技術が当分野では公知である。そのような方法及び他の方法も当業者の技術範囲内と考えられる。
【００９０】
ベクターはプラスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態で存在しえる。他のベクターには、染色体、非染色体及び合成DNA配列、SV40の誘導体；細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド；プラスミドとファージDNA、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病）の組合せから誘導されたベクターが含まれる。原核細胞及び真核細胞宿主とともに使用される多様なクローニング及び発現ベクターが例えばSambrookによって記載されている。
使用することができる具体的な細菌ベクターには、周知のクローニングベクターpBR322 (ATCC 37017)、pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)、GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA)、pQE70、pQE60、pQE-9 (Qiagen)、pD10、psiX174 pBLUESCRIPT II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、DR540、pRIT5 (Pharmacia)、pKK232-8及びpCM7の遺伝的エレメントを含む市場で入手可能なプラスミドが含まれる。具体的な真核細胞ベクターには、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、及びpSVL (Pharmacia)が含まれる。しかしながら、他のいずれのベクターも宿主細胞で複製及び生存可能であるかぎり用いることができる。
本発明の核酸は、発現カセット、ベクター又はウイルスで、さらに一過性又は安定的に植物細胞及び種子で発現させることができる。例示的なある一過性発現系は、エピソーム発現系、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）のウイルスRNAを用い、ウイルスRNAは、スーパーコイルDNAを含むエピソームミニ染色体の転写によって核内で生成される（例えば以下を参照されたい：Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1633-1637）。あるいは、コード配列（すなわち本発明の配列の全体又は部分フラグメント）は植物宿主細胞ゲノムに挿入されて、宿主染色体DNAの統合された部分となることができる。センス又はアンチセンス転写物はこのようにして発現させることができる。本発明の核酸由来の配列（例えばプロモーター又はコード領域）を含むベクターは、選別可能な表現型を植物細胞又は種子に付与するマーカー遺伝子を含むことができる。前記は、例えば抗生物製剤耐性、例えば抗生物質耐性（例えばカナマイシン、G418、ブレオマイシン、ヒグロマイシン耐性）、又は除草剤耐性（例えばクロロスルフロン又はバスタ耐性）をコードすることができる。
【００９１】
植物で核酸及びタンパク質を発現させることができる発現ベクターは当分野では周知であり、例えばアグロバクテリウムspp.、ジャガイモウイルスX（例えば以下を参照されたい：Angell (1997) EMBO J. 16:3675-3684）、タバコモザイクウイルス（例えば以下を参照されたい：Casper (1996) Gene 173:69-73）、トマトのブッシースタント（bushy stunt）ウイルス（例えば以下を参照されたい：Hillman (1989) Virology 169:42-50）、タバコエッチ（etch）ウイルス（例えば以下を参照されたい：Dolja (1997) Virology 234:243-252）、インゲンマメのゴールデンモザイクウイルス（例えば以下を参照されたい：Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37:471-476）、カリフラワーモザイクウイルス（例えば以下を参照されたい：Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101）、トウモロコシAc/Ds転移因子（例えば以下を参照されたい：Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302；Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194）及びトウモロコシサプレッサー-ミューテーター（Spm）転移因子（例えば以下を参照されたい：Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725）及びその誘導体に由来するベクターが含まれえる。
ある特徴では、発現ベクターは、2つの複製系を有し、2つの生物（例えば発現のために哺乳動物細胞又は昆虫細胞で、さらにクローニング及び増幅のために原核細胞宿主）で維持されることを可能にすることができる。さらにまた、発現ベクターの組み込みのために、前記発現ベクターは宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも1つの配列を含むことができる。前記は、発現構築物にフランキングする2つの相同な配列を含むことができる。組み込みベクターは、ベクター内での組み込みのための適切な相同配列を選択することによって、宿主細胞の特定の遺伝子座に誘導することができる。組み込みベクターの構築は当分野では周知である。
本発明の発現ベクターはまた、選別可能マーカー遺伝子を含み、形質転換された細菌株の選別を可能にすることができる。前記は、例えば細菌を薬剤（例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対して耐性にする遺伝子である。選別可能マーカーにはまた、生合成遺伝子（例えばヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路）が含まれるえる。
【００９２】
発現ベクターのDNA配列は、RNA合成を誘導するために適切な発現制御配列（プロモーター）に機能的に連結される。特に列挙される細菌プロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PL及びtrpが含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルス由来LTR、及びマウスメタロチオネイン-Iが含まれる。適切なベクター及びプロモーターの選別は当業者の技術レベル範囲内であろう。発現ベクターはまた翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び翻訳終了因子を含む。ベクターはまた発現を増幅するための適切な配列を含むことができる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（CAT）又は選別可能マーカーを有する他のベクターを用いて所望の任意の遺伝子から選択することができる。さらにまた、ある特徴の発現ベクターは1つ以上の選別可能マーカー遺伝子を含み、形質転換宿主細胞選別のために表現型の特徴を提供する。前記は、真核細胞培養の場合例えばジヒドロフォレートレダクターゼ又はネオマイシン耐性、大腸菌では例えばテトラサイクロン又はアンピシリン耐性である。
哺乳動物発現ベクターはまた、複製起点、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終了配列、及び5'フランキング非転写配列を含むことができる。いくつかの特徴では、SV40スプライス及びポリアデニル化部位由来のDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝エレメントを提供することができる。
真核細胞でポリペプチド又はそのフラグメントを発現するためのベクターはまた、発現レベルを高めるためのエンハンサーを含むことができる。エンハンサーは、cis-作動性DNAエレメントであり、通常は長さが約10から約300bpであり、プロモーターに作用してその転写を増進させる。例には、複製起点の後期側100bpから270bpのSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
【００９３】
さらにまた、発現ベクターは1つ以上の選別可能マーカー遺伝子を含み、ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする。そのような選別可能マーカーには、真核細胞培養の場合ジヒドロフォレートレダクターゼをコードする遺伝子又はネオマイシン耐性を付与する遺伝子、大腸菌では例えばテトラサイクロン又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及びS.セレビシアエのTRP1遺伝子が含まれる。
いくつかの特徴では、本発明のポリペプチドの1つ、又は少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150又はそれより大きい連続するアミノ酸を含むそのフラグメントをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチド又はそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列と一緒に適切な相においてアッセンブリングされる。ある特徴では、前記核酸は、本発明のポリペプチドの1つ、又は少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150又はそれより大きい連続するアミノ酸を含むそのフラグメントが、異種ペプチド又はポリペプチド、例えばN-末端の識別ペプチド（所望の特徴、例えば安定性増強又は精製の簡素化を付与する）と融合した融合ポリペプチドをコードすることができる。
適切なDNA配列は多様な方法によってベクターに挿入することができる。一般的には、DNA配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物及びベクターの消化に続いてベクターの所望の位置に連結される。あるいは、挿入物及びベクターの両者の平滑端を連結してもよい。多様なクローニング技術が以下に記載されている：Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997；及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)。そのような方法及び他の方法は当業者の技術範囲内であると考えられる。
ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態で存在しえる。他のベクターには、染色体、非染色体及び合成DNA配列、SV40の誘導体；細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNA、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病）の組合せから誘導されたベクターが含まれる。原核細胞及び真核細胞宿主とともに使用される多様なクローニング及び発現ベクターが以下に記載されている：Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)。
【００９４】
宿主細胞及び形質転換細胞
本発明はまた、本発明の核酸、例えば本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素又は本発明のベクターをコードする配列を含む形質転換細胞を提供する。
本発明は、異種核酸配列、例えば本発明の核酸及び多様な組換え構築物（例えば発現カセット）が挿入された、植物又は植物細胞を含む“トランスジェニック植物”、及びこれらの細胞に由来する植物細胞培養（プロトプラストを含む）を提供する（例えば以下を参照されたい；U.S. Patent Nos. 7,045,354、6,127,145、5,693,506）。
宿主細胞は、当業者にとって周知の宿主細胞のいずれでもよく、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞が含まれる。例示的細菌細胞には、エスケリキア（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、又はバチルス（Bacillus）の任意の種が含まれ、前記には、例えば大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）が含まれる。例示的な酵母細胞には、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、クルイヴェロミセス（Kluyveromyces）、ハンセヌラ（Hansenula）、アスペルギルス（Aspergillus）、又はシュワンニオミセス（Schwanniomyces）の任意の種が含まれ、前記にはピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイヴェロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、又は糸状菌、例えばトリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルスsp.（アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フォエニシス（Aspergillus phoenicis）、アスペルギルス・カルボナリウス（Aspergillus carbonarius）を含む）が含まれる。例示的昆虫細胞には、スポドプテラ（Spodoptera）、又はドロソフィラ（Drosophila）の任意の種が含まれ、前記にはドロソフィラS2及びスポドプテラSf9が含まれる。例示的な動物細胞には、CHO、COS、又はボウズメラノーマ、又はマウス若しくはヒトの任意の細胞株が含まれる。適切な宿主の選択は当業者の能力の範囲内である。広範囲の高等植物種を形質転換する技術は周知であり、技術文献及び学術文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477；U.S. Patent No. 5,750,870。
【００９５】
また別の実施態様では、本発明のポリペプチドは、細胞使用系及び／又は部分精製若しくは実質精製型、又は混合物若しくは他の処方を含む、多様な形態で工業的プロセス、例えばバイオ燃料加工及び製造で用いられる。ある特徴では、産業的（例えば“アップスケール”）酵素生産系が用いられ、本発明は、当分野で公知の任意のポリペプチド生産系を利用することができる。前記生産系には任意の細胞使用発現系が含まれ、前記系は、多数の株（任意の真核細胞又は原核細胞系（任意の昆虫、微生物、酵母、細菌及び／又は菌類発現系を含む）を含む）を含む。これらのまた別の発現系は周知で、文献で考察されており、いずれも本発明の酵素の製造及び使用のために産業的に利用することが意図されている。例えばバチルス種を工業的生産に利用することができる（例えば以下を参照されたい：Canadian Journal of Microbiology, 2004 Jan., 50(1):1-17）。あるいは、ストレプトミセス種（例えばS.リビダンス（lividans）、S.コエリコラー（coelicolor）、S.リモスス（limosus）、S.リモスス（rimosus）、S.ロゼオスポルス（roseosporus）、及びS.リビダンス）を工業的及び持続的生産宿主として用いることができる（例えば以下を参照されたい：Appl Environ Microbiol. 2006 August; 72(8): 5283-5288）。アスペルギルス株（例えば、アスペルギルス・フォエニシス（Aspergillus phoenicis）、A.ニゲル（A. niger）及びA.カルボナリウス（A. carbonarius）を用いて本発明を実施、例えば本発明の酵素（例えばベータ-グルコシダーゼ）を製造することができる（例えば以下を参照されたい：World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2001, 17(5):455-461）。いずれのフサリウム種（Fusarium sp.）（例えばフサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）を含む）も本発明の実施のための発現系で用いることができる（例えば以下を参照されたい：Royer et al. Bio/Technology, 1995, 13:1479-1483）。いずれのアスペルギルス種（例えばA.ニデュランス（A. nidulans）、A.フミガツス（A. fumigatus）、A.ニゲル又はA.オリザエ（A. oryzae）、A.ニゲルCBS513.88のゲノムを含む）も本発明の実施のための発現系で用いることができる。CBS513.88は産業的に用いられる酵素製造の親株であって最近その配列が決定された（例えば以下を参照されたい：Nat Biotechnol. 2007 Feb;25(2):221-31）。同様に、アスペルギルス・オリザエのゲノム配列決定が最近完了した（Nature. 2005 Dec 22;438(7071):1157-61）。本発明の実施、例えば工業的応用（例えばバイオ燃料製造）で使用される酵素の発現に用いることができるまた別の菌類発現系については、例えば以下を参照されたい：Advances in Fungal Biotechnology for Industry, Agriculture, and Medicine. Edited by Jan S. Tkacz & Lene Lange. 2004. Kluwer Academic & Plenum Publishers, New York；及び、例えばHandbook of Industrial Mycology. Edited by Zhiqiang An. 24 Sept. 2004. Mycology Series No. 22. Marcel Dekker, New York；及び、例えば、Talbot  (2007) “Fungal genomics goes industrial”, Nature Biotechnology 25(5):542；及びUSPN 4,885,249、5,866,406、国際特許公開公報WO/2003/012071。
【００９６】
ベクターは、多様な技術（形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃又はTi媒介遺伝子移転を含む）によって宿主細胞に導入することができる。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションが含まれる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., 1986, Basic Methods in Molecular Biology）。
ある特徴では、本発明の核酸又はベクターはスクリーニングのために細胞に導入される。したがって、核酸は、その後の核酸の発現に適した態様で細胞に導入する。導入方法は、主として標的の細胞タイプによって決定される。例示的方法には、CaPO4沈殿、リポソーム融合、リポフェクション（例えばLIPOFECTINTM）、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが含まれる。候補核酸は安定的に宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよいが（例えばレトロウイルス導入による）、一過性又は安定的に細胞質に存在することもできる（すなわち標準的な調節配列、選別マーカーなどを利用する伝統的なプラスミドを用いることによる）。多くの医薬的に重要なスクリーニングはヒト又は哺乳動物のモデル細胞標的を必要とするので、そのような標的にトランスフェクトすることができるレトロウイルスベクターを用いることができる。
適切な場合には、操作した宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換対の選別又は本発明の遺伝子の増幅に適切なように改変した通常の栄養媒体中で培養することができる。適切な宿主株を形質転換し、さらに前記宿主株を適切な細胞密度に増殖させた後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度シフト又は化学的誘導）によって誘導し、さらに前記細胞を追加の期間培養して、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを生成させることができる。
【００９７】
遠心によって細胞を採集し、物理的又は化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現に用いた微生物細胞を任意の通常的な方法（凍結-融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む）によって破壊することができる。そのような方法は当業者には周知である。発現ポリペプチド又はそのフラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって、組換え細胞培養から回収及び精製することができる。タンパク質の折りたたみ工程を必要に応じて用い、ポリペプチドの立体配置を完成させる。所望の場合は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程のために用いることができる。
宿主細胞内の構築物を通常の態様で用いて、組換え配列によってコードされる遺伝子生成物を製造することができる。製造工程で用いられる組換え体の宿主に応じて、ベクターを含む宿主細胞により生成されるポリペプチドはグリコシル化される場合も、又はグリコシル化されない場合もありえる。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含むことも含まないこともある。
無細胞翻訳系もまた、本発明のポリペプチドの製造に利用することができる。無細胞翻訳系は、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸に機能的に連結させたプロモーターを含むDNA構築物から転写されたmRNAを利用することができる。いくつかの特徴では、DNA構築物はin vitro転写反応を実施する前に直鎖化してもよい。続いて転写されたmRNAを適切な無細胞翻訳抽出物、例えばウサギ網状赤血球抽出物とともにインキュベートして、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを生成する。
【００９８】
発現ベクターは、1つ以上の選別可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選別のための表現型の特徴（例えば真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼ又はネオマイシン耐性、又は例えば大腸菌ではテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性）を提供することができる。
対象のポリヌクレオチド（例えば本発明の核酸）を含む宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換対の選別又は本発明の遺伝子の増幅に適切なように改変した通常の栄養媒体中で培養することができる。培養条件、例えば温度、pHなどは、発現のために選択した宿主細胞に関して以前に用いられたものであり、当業者には明白であろう。続いて、特定の酵素活性を有することが確認されたクローンの配列を決定して、強化された活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を確認することができる。
本発明は、組換えリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を細胞内で過剰発現させる方法を提供する。前記方法は、本発明の核酸、例えば本発明の例示的配列に対して少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれより高い配列同一性を、少なくとも約100残基の領域にわたって有する核酸配列を含む核酸、又は本発明の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含むベクターを発現させる工程を含み、ここで前記配列同一性は、配列比較アルゴリズムによる分析によって又は目視精査によって決定される。過剰発現は、任意の手段（例えば高活性プロモーター、二シストロン性ベクターの使用）によって、又は前記ベクターの遺伝子増幅によって実施することができる。
本発明の核酸は、任意のin vitro又はin vivo発現系で発現又は過剰発現させることができる。植物、細菌、昆虫、酵母、菌類又は哺乳動物培養を含む任意の細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現又は過剰発現させることができる。例示的植物細胞培養系には、コメ、トウモロコシ、タバコ（例えばタバコBY-2細胞）由来の培養系、又は任意のプロトプラスト細胞培養系が含まれる（例えば以下を参照されたい：U.S. Patent Nos. 7,045,354、5,693,506、5,407,816）。
【００９９】
過剰発現は、プロモーター、エンハンサー、ベクター（例えばレプリコンベクター、二シストロン性ベクターの使用（例えば以下を参照されたい：Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:295-8））、培地、培養系などの適切な選択によって実施できる。ある特徴では、選別マーカー（例えばグルタミンシンターゼ（例えば以下を参照されたい：Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66:55-63）を細胞系で使用する遺伝子増幅を用いて、本発明のポリペプチドが過剰発現される。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞を含む、当業者に周知のいずれの宿主細胞でもよい。適切な宿主の選択は当業者の技術範囲内である。
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃又はTi媒介遺伝子移転を含む、多様な技術のいずれかを用いて宿主細胞に導入することができる。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションが含まれる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., 1986, Basic Methods in Molecular Biology）。
適切な場合には、操作した宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選別又は本発明の遺伝子の増幅に適切なように改変した通常の栄養媒体中で培養することができる。適切な宿主株を形質転換し、さらに前記宿主株を適切な細胞密度に増殖させた後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度シフト又は化学的誘導）によって誘導し、さらに前記細胞を追加の期間培養して、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを生成させることができる。
遠心によって細胞を採集し、物理的又は化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現に用いた微生物細胞を任意の通常的な方法（凍結-融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む）によって破壊することができる。そのような方法は当業者には周知である。発現ポリペプチド又はそのフラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって、組換え細胞培養から回収及び精製することができる。タンパク質の折りたたみ工程を必要に応じて用い、ポリペプチドの立体配置を完成させる。所望の場合は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程のために用いることができる。
【０１００】
多様な哺乳動物細胞培養系もまた組換えタンパク質の発現に用いることができる。哺乳動物発現系の例には、サル腎線維芽細胞のCOS-7系統（以下に記載されている：Gluzman, Cell 1981, 23:175）及び適合ベクターからタンパク質を発現させることができる他の細胞系統、例えばC127、3T3、CHO、HeLa及びBHK細胞系統が含まれる。
宿主細胞内の構築物を通常の態様で使用して、組換え配列によってコードされた遺伝子生成物を製造することができる。組換え体の製造工程で用いられる宿主に応じて、ベクターを含む宿主細胞により生成されるポリペプチドはグリコシル化される場合も、又はグリコシル化されない場合もありえる。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含むことも含まないこともある。
あるいは、本発明のポリペプチド又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150又はそれより大きい連続するアミノ酸を含むそのフラグメントは、例えば下記に考察するように通常のペプチド合成装置によって合成により製造してもよい。他の特徴では、ポリペプチドのフラグメント又は部分は、対応する完全長のポリペプチドをペプチド合成によって製造するために利用することができる。したがって、前記フラグメントは完全長ポリペプチドを製造するための中間体として利用することができる。
無細胞翻訳系もまた、本発明のポリペプチドの1つ又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150又はそれより大きい連続するアミノ酸を含むそのフラグメントを、前記ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むDNA構築物から転写されたmRNAを用いて製造するために利用することができる。いくつかの特徴では、DNA構築物はin vitro転写反応を実施する前に直鎖化してもよい。続いて転写されたmRNAを適切な無細胞翻訳抽出物、例えばウサギ網状赤血球抽出物とともにインキュベートして、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを生成する。
【０１０１】
核酸の増幅
本発明を実施するとき、本発明の核酸及び本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素をコードする核酸、又は本発明の改変核酸を、増幅、例えばPCRによって再生させることができる。増幅はまた本発明の核酸のクローニング又は改変のために用いることができる。したがって、本発明は、本発明の核酸の増幅のための増幅プライマー配列対を提供する。当業者は、これら配列の任意の部分又は完全長のための増幅プライマー配列対を設計することができる。
ある特徴では、本発明は、本発明の増幅プライマー対によって増幅された核酸を提供する。例えばプライマー対は、本発明の核酸の最初（5'）の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24若しくは25又はそれより大きい残基、及びその相補鎖の最初（5'）の約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24若しくは25又はそれより大きい残基によって示されるものである。本発明は、本発明のリグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列対を提供し、ここで、前記プライマー対は、本発明の配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む核酸を増幅することができる。前記増幅プライマー配列対の一方又は各メンバーは、前記配列の少なくとも約10から50又はそれより大きい連続する塩基、又は前記配列の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24若しくは25又はそれより大きい連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明は増幅プライマー対を提供し、ここで、前記プライマー対は、本発明の核酸の最初（5'）の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24若しくは25又はそれより大きい残基によって示される配列を有する第一のメンバー、及び第一のメンバーの相補鎖の最初（5'）の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24若しくは25又はそれより大きい残基によって示される配列を有する第二のメンバーを含む。
【０１０２】
本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いて、増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された、本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いて、増幅、例えばPCRによって、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を製造する方法を提供する。ある特徴では、前記増幅プライマー対は、ライブラリー（例えば遺伝子ライブラリー、例えば環境ライブラリー）から核酸を増幅する。
増幅反応はまた、サンプル中の核酸の定量（例えば細胞サンプル中のメッセージの量）、核酸の標識（例えば前記をアレイ又はブロットに適用するために）、核酸の検出、又はサンプル中の特異的な核酸の量の定量にも用いることができる。本発明のある特徴では、細胞又はcDNAライブラリーから単離されたメッセージが増幅される。
当業者は適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選別及び設計することができる。増幅方法はまた当分野で周知であり、例えばポリメラーゼ連鎖反応、PCR（例えば以下を参照されたい：PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990)；及びPCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば以下を参照されたい：Wu (1989) Genomics 4:560；Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117）、転写増幅（例えば以下を参照されたい：Kwoh (1989)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173）、及びセルフサステイン配列複製（例えば以下を参照されたい：Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）、Qベータレプリカーゼ増幅（例えば以下を参照されたい：Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491）、自動化Qベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば以下を参照されたい：Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271）、及び他のRNAポリメラーゼ媒介技術（例えばNASBA（Cangene, Mississauga, Ontario））が含まれる（さらに以下もまた参照されたい：Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316；Sambrook；Ausubel；U.S. Patent Nos. 4,683,195、4,683,202；Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564）。
【０１０３】
核酸及びポリペプチドにおける配列同一性の決定
本発明は、本発明の例示的核酸（表1から3及び配列表もまた参照されたい）に対して、少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは前記より高いか又は完全な（100%）配列同一性（相同性）を、少なくとも約50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1500、1550若しくはそれより大きい残基の領域にわたって有する配列を含む核酸を提供する。本発明は、本発明の例示的ポリペプチド（表1から3及び配列表もまた参照されたい）に対して、少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは前記より高いか又は完全な（100%）配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを提供する。配列同一性（相同性）の程度は、任意のコンピュータプログラム及び付属のパラメーターを規定値パラメーターとともに用いて決定することができる（前記プログラムには本明細書に記載したものが含まれ、例えばBLASTP又はBLASTN、BLAST2.2.2又はFASTAヴァージョン3.0T78である）。
【０１０４】
本発明の核酸配列は、本発明の例示的配列及び前記と実質的に同一の配列の、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400若しくは500又はそれより長い連続するヌクレオチドを含むことができる。本発明の核酸配列の相同な配列及びフラグメントは、これら配列に対して少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は前記より高い配列同一性（相同性）を有する配列を指す。相同性（配列同一性）は、任意のコンピュータプログラム（BLASTP又はBLASTN、BLAST2.2.2、FASTAヴァージョン3.0T78を含む）を用いて決定することができる（また別の特徴では前記プログラムは規定値パラメーターを用いることができる）。相同な配列にはまた、本発明の核酸配列内のチミジンがウリジンによって置換されているRNA配列が含まれる。相同な配列は本明細書に記載の任意の方法を用いて入手できるが、またシークェンシングエラーの修正からも得ることができる。本発明の核酸配列は伝統的な一文字様式（以下の成書の裏表紙の内側を参照されたい：Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd Ed., W. H Freeman & Co., New York）又は配列内の個々のヌクレオチドを記す任意の他の様式で表すことができることは理解されよう。
種々の特徴では、本明細書認定の配列比較（配列同一性決定）プログラムは、本発明のこの特徴、すなわち核酸又はポリペプチド配列が本発明の範囲内のものであるか否かを決定するために用いられる。しかしながらタンパク質及び／又は核酸の配列同一性（相同性）は、当分野で公知の任意の配列比較アルゴリズム又はプログラムを用いて判定することができる。そのようなアルゴリズム及びプログラムには以下が含まれる（ただしこれらに全く限定されない）：TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA及びCLUSTALW（例えば以下を参照されたい：Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988；Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990；Thompson Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994；Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996；Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990；Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993）。
【０１０５】
ある特徴では、相同性又は配列同一性は、配列分析ソフト（例えば、ジネティクスコンピュータグループ（University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）の配列分析ソフトウェア）を用いて測定される。そのようなソフトは、相同性又は配列同一性の程度を種々の欠失、置換及び他の改変に対して取り決めることによって類似の配列を比較する。ある特徴では、2つ以上の核酸又はポリペプチド配列の関係で“相同性”及び“同一性”という用語は、比較ウィンドウ又は指定の領域上で、多数の配列比較アルゴリズムを使用するか又は手動アラインメント及び目視精査による測定にしたがって最大一致を求めて比較及びアラインメントを実施したとき、特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する2つ又は3つ以上の配列又は部分配列を指す。ある特徴では、配列比較の場合、一方の配列は参照配列として機能し、前記に対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、テスト配列および参照配列はコンピュータに入力され、部分配列同等物が必要な場合に指定され、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。規定値プログラムパラメーターを用いることができるが、また別のパラメーターを指定することもできる。続いて配列比較アルゴリズムは、前記のプログラムパラメーターを基にして参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１０６】
本明細書で用いられる“比較ウィンドウ”は、20から600、通常は約50から約200、より通常は約100から約150から成る群から選択される任意数の連続する箇所のセグメントに対する参照を含み、前記ウィンドウにおいて、ある配列が同じ数の連続した箇所の参照配列と前記2つの配列を最適にアラインメントした後で比較される。比較のために配列をアラインメントする方法は当分野で周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えばSmith & Watermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)）によって、Needleman & Wunschの相同性又は配列同一性アラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443 (1970)）によって、Pearson & Lipmanの類似性検索方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)）によって、前記アルゴリズムのコンピュータによる実施によって（GAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、又は手動アラインメントと目視精査によって実施できる。相同性又は同一性決定のための他のアルゴリズムには、BLASTプログラム（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）の他に、例えばALIGN、AMAS（Analysis of Multiply Aligned Sequences）、AMPS（Protein Multiple Sequence Alignment）、ASSET（Aligned Segment Statistical Evaluation Tool）、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN（Biological Sequence Comparative Analysis Node）、BLIMPS（BLocks IMProved Searcher）、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanアルゴリズム、DARWIN、ラスベガスアルゴリズム、FNAT（Forced Nucleotide Alignment Tool）、フレームアライン、フレームサーチ、DYNAMIC、FILTER、FSAP（Fristensky Sequence Analysis Package）、GAP（Global Alignment Program）、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC（Sensitive Sequence Comparison）、LALIGN（Local Sequence Alignment）、LCP（Local Content Program）、MACAW（Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench）、MAP（Multiple Alignment Program）、MBLKP、MBLKN、PIMA（Pattern-Induced Multi-Sequence Alignment）、SAGA（Sequence Alignment by Genetic Algorithm）及びWHAT-IFが含まれる。前記のようなアラインメントプログラムはまたゲノムデータベースのスクリーニングに用いられ、実質的に同一の配列をもつポリヌクレオチド配列を同定することができる。多数のゲノムデータベースが利用可能で、例えばヒトゲノムの実質的部分がヒトゲノム配列決定プロジェクトの一部分として利用可能である（Gibbs, 1995）。少なくとも21の他のゲノムが既に配列決定されており、前記にはM. ゲニタリウム（genitalium）（Fraser et al., 1995）、M. ジャナスキイー（jannaschii）（Bult et al., 1996）、H. インフルエンザ（Fleischmann et al. 1995）、大腸菌（Blattner et al. 1997）、酵母（S. cerevisiae）（Mewes et al. 1997）及びＤ．メラノガスター（melanogaster）（Adams et al., 2000）が含まれる。顕著な進展がモデル生物（例えばマウス、C. エレガンスおよびアラビドプシス種（Arabidopsis sp））のゲノム配列決定で達成された。いくつかの機能的情報の注釈をもつゲノム情報を含むデータベースが種々の機関で維持されており、インターネットでアクセスすることができる。
【０１０７】
ある特徴では、BLAST及びBLAST2.0アルゴリズムが用いられ、前記は、それぞれ以下に記載されている：Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及びAltschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410。BLAST分析を実施するソフトは、National Center for Biotechnology Informationから公開されている。このアルゴリズムは、クエリー配列内の長さがWの短いワードを識別することによって高スコアをもつ配列対（HSP）をまず初めに同定することを必要とする。前記は、データベース配列中の同じ長さを持つワードとアラインメントを実施したとき、一致するかまたはいくらかの正の値をもつ閾値スコアTの条件を満たす。Tは近傍ワードスコア閾値と称される（Altschul (1990)上掲書）。これらの最初の近傍ワードヒットはそれらを含むより長いHSPを見つけるための検索開始のシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターM（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞0）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ下降したとき；累積スコアが、1つまたは2つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの累積のために0またはそれ以下になったとき；又はどちらかの配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは前記アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、規定値として11のワード長、10の期待値（E）、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、3のワード長および10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。
BLASTアルゴリズムはまた2つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば以下を参照されたい：Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性測定の1つは最小合計確率（P(N)）であり、前記は2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって生じる確率を提供する。例えば、テスト核酸と参照核酸の比較で最小合計確率が約0.2未満、ある特徴では、好ましくは約0.01未満、ある特徴ではもっとも好ましくは約0.001未満であるならば、前記核酸は参照配列と類似であると考えられる。
【０１０８】
ある特徴では、タンパク質及び核酸配列相同性（又は配列同一性）はベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Basic Local Alignment Search Tool, “BLAST”）を用いて評価される。特に、5つの特別なBLASTプログラムを用いて以下のタスクが実行される：
（1）BLASTP及びBLAST3はアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較する；
（2）BLASTNはヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；
（3）BLASTXはクエリーヌクレオチド配列（その両方の鎖）の仮想的な6フレーム翻訳生成物をタンパク質配列データベースと比較する；
（4）TBLASTNはクエリータンパク質配列（両方の鎖）を全ての6リーディングフレームで翻訳されるヌクレオチド配列データベースと比較する；さらに
（5）TBLASTXはヌクレオチドクエリー配列の6フレーム翻訳物をヌクレオチド配列データベースの6フレーム翻訳物と比較する。
BLASTプログラムは類似のセグメントを同定することによって相同な配列を同定する。前記セグメントは、本明細書ではクエリーアミノ酸または核酸配列とテスト配列間の“高スコアセグメントペア”と称され、ある特徴では、タンパク質または核酸配列データベースから得られる。高スコアセグメントペアは、ある特徴では、スコアリングマトリックス（その多くは当業界で公知である）によって同定される（すなわちアラインメントが実施される）。ある特徴では、使用されるスコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである（Gonnet et al., Science 256:1443-1445 (1992); Henikoff and Henikoff, Proteins 17:49-61 (1993)）。ある特徴では、好ましさは劣るが、PAM又はPAM250もまた用いることができる（例えば以下を参照されたい：Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation）。BLASTプログラムは米国立医学図書館（U.S. National Library of Medicine）から入手できる。
上記のアルゴリズムとともに用いられるパラメーターは、調査される配列の長さ及び相同性の程度に応じて調整することができる。いくつかの特徴では、前記パラメーターは、ユーザーの指示のない状態でアルゴリズムによって使用される規定値パラメーターでもよい。
【０１０９】
コンピュータシステム及びコンピュータプログラム製品
本発明は、本発明の核酸及びポリペプチド配列を記録又は保存させたコンピュータ、コンピュータシステム、コンピュータ読み出し可能媒体、コンピュータプログラム製品などを提供する。さらにまた、例えば、in silicoで配列同一性（核酸が本発明の範囲内に含まれるか否かを決定するために）、構造相同性、モチーフなどを決定及び確認するために本発明の方法を実施する際に、本発明の核酸又はポリペプチド配列は、コンピュータが読み出しアクセスすることができる任意の媒体に保存、記録することができ、又は前記媒体で操作することができる。
本明細書で用いられる“記録”及び“保存”という用語はコンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを指す。当業者は、コンピュータ読み出し可能媒体に情報を記録するための任意の公知の方法を容易に利用して、本発明の1つ以上の核酸及び／又はポリペプチド配列を含む製品を製造することができる。本明細書で用いられるように、“コンピュータ”、“コンピュータプログラム”及び“プロセッサ”という用語は、最も広い一般的な関係で用いられ、下記に詳細に記載する全ての装置を包含する。個々のポリペプチド又はタンパク質“のコード配列”又は前記を“コードする配列”とは、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳される核酸配列である。
本発明のポリペプチドには、本発明の例示的配列及び前記と実質的に同一の配列、並びに前述の配列のいずれかの部分配列（フラグメント）が含まれる。ある特徴では、実質的に同一又は相同なポリペプチド配列は、本発明の例示的配列（表1から3もまた参照されたい）と少なくとも50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、又は完全な（100%）配列同一性（相同性）を有するポリペプチド配列を指す。
相同性（配列同一性）は、本明細書に記載のコンピュータプログラム及びパラメーターのいずれかを用いて決定できる。本発明の核酸又はポリペプチド配列は、コンピュータが読み出しアクセスすることができる任意の媒体に保存、記録することができ、又は前記媒体で操作することができる。本明細書で用いられるように、“記録”及び“保存”という用語はコンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを指す。当業者は、コンピュータ読み出し可能媒体に情報を記録するための任意の公知の方法を容易に利用して、本発明の1つ以上の核酸配列、本発明の1つ以上のポリペプチド配列を含む製品を製造することができる。本発明の別の特徴は、少なくとも2、5、10、15若しくは20又は前記を超える本発明の核酸又はポリペプチド配列が記録されたコンピュータ読み出し媒体である。
【０１１０】
本発明のまた別の特徴は、1つ以上の本発明の核酸配列が記録されたコンピュータ読み出し可能媒体である。本発明のまた別の特徴は、1つ以上の本発明のポリペプチド配列が記録されたコンピュータ読み出し可能媒体である。本発明のまた別の特徴は、少なくとも2、5、10、15若しくは20又は前記を超える、上述の本発明の核酸又はポリペプチド配列が記録されたコンピュータ読み出し媒体である。
コンピュータ読み出し可能媒体には、磁気により読み出し可能な媒体、光学的に読み出し可能な媒体、電子的に読み出し可能な媒体及び磁気/光学媒体が含まれる。例えば前記コンピュータ読み出し可能媒体はハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、CD-ROM、多用途デジタルディスク（DVD）、ランダムアクセスメモリー（RAM）、又は読み出し専用メモリー（ROM）の他、当業者に公知の他のタイプの媒体であろう。
本発明の特徴は、システム（例えばインターネット使用システム）、例えば本明細書に記載の配列情報を保存し、これを操作するコンピュータシステムを含む。コンピュータシステム（100）の一例が図1の組み立て分解図に示されている。本明細書で用いられる“コンピュータシステム”は、本発明の核酸配列のヌクレオチド配列、または本発明のポリペプチド配列の分析に用いられるハードウェア構成部分、ソフトウェア構成部分及びデータ保存構成部分を指す。ある特徴では、コンピュータシステム（100）は、配列データを処理し、これにアクセスし、さらに前記を操作するプロセッサーを含む。プロセッサ（105）は周知のタイプの中央演算ユニットのいずれか、例えばインテル社（Intel Corporation）のペンチアムIII又はサン（Sun）、モトローラ（Motorola）、コンパック（Compaq）、AMD又はインターナショナル・ビジネス・マシーン（IBM）の類似のプロセッサーでありえる。
ある特徴では、コンピュータシステム（100）は汎用システムであり、プロセッサー（105）及び1つ以上のデータ保存用内部データ保存構成部分（110）、並びに前記データ保存構成部分に保存されたデータを検索するための1つ以上のデータ検索装置を含む。従来の利用可能なコンピュータシステムのいずれも適切であることは当業者には理解されよう。
【０１１１】
特にある特徴では、コンピュータシステム（100）は、バス（メインメモリー（115）（ある特徴ではRAMとして提供されている）に連結されている）に連結されたプロセッサー（105）、及び1つ以上の内部データ保存装置（110）（例えばハードドライブ及び／又はそれにデータが記録された他のコンピュータ読み出し可能媒体）を含む。いくつかの特徴では、コンピュータシステム（100）はさらに、内部データ保存装置（110）に保存されたデータを読み取るための1つ以上のデータ検索装置（118）を含む。
データ検索装置（118）は、例えばフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、又は遠隔データ保存システムに連結することができる（例えばインターネットを介して）モデムであろう。いくつかの特徴では、内部データ保存装置（110）は取り外し可能なコンピュータ読み出し可能媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどで、制御ロジック及び／又はそれに記録されたデータを含んでいる。コンピュータシステム（100）は便利には、データ検索装置にいったん挿入されたデータ保存構成部分から前記制御ロジック及び／又はデータを読み出すための適切なソフトを含むか、または前記ソフトによってプログラムされる。
コンピュータシステム（100）は、コンピュータのユーザーに結果を表示するために用いられるディスプレー（120）を含む。コンピュータシステム（100）は他のコンピュータシステム（125a−c）とネットワークまたは広域ネットワークで連結され、コンピュータシステム（100）への中央アクセスを提供することができることは留意されるべきであろう。
本発明の核酸配列のヌクレオチド配列又は本発明のポリペプチド配列にアクセスし前記を処理するためのソフト（例えば検索ツール、比較ツール又はモデリングツールなど）は実行時にはメインメモリー（115）に存在するであろう。
【０１１２】
いくつかの特徴では、コンピュータシステム（100）はさらに、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列（コンピュータ読み出し可能媒体に保存されている）を参照ヌクレオチドまたはポリペプチド配列（コンピュータ読み出し可能媒体に保存されている）と比較するための配列比較アルゴリズムを含むことができる。“配列比較アルゴリズム”は、データ保存手段内に保存されている他のヌクレオチド配列及び／又は化合物とヌクレオチド配列を比較するためにコンピュータシステム（100）に（端末又は遠隔端末から）提供される1つ以上のプログラムを指す。例えば、配列比較アルゴリズムは、コンピュータ読み出し可能媒体に保存されている本発明の核酸配列のヌクレオチド配列又は本発明のポリペプチド配列を、コンピュータ読み出し可能媒体に保存されている参照配列と比較し、相同性または構造モチーフを認定することができる。
図2は、新規なヌクレオチド又はタンパク質配列を配列データベースと比較して、新規な配列とデータベースの配列との間の相同性レベルを決定するためのプロセス（200）の1つの特徴を示す流れ図である。前記配列データベースは、コンピュータシステム（100）内に保存された個人的データベースでも、公的データベース（例えばインターネットを介して利用可能なGENBANK）でもよい。
プロセス（200）は開始状態（201）で始まり、続いて、比較されるべき新規な配列がコンピュータシステム（100）内のメモリーに保存される状態（202）に移行する。上記で考察したように、前記メモリーは任意のタイプのメモリー（RAMまたは内部保存装置を含む）でありえる。
続いてプロセス（200）は状態（204）に移行し、ここで配列データベースが分析及び比較のために開かれる。続いてプロセス（200）は、データベースに保存されている第一の配列がコンピュータのメモリーに読み出される状態（206）に移行する。続いて比較が状態（210）で実施され、第一の配列が第二の配列と同じであるか否かが決定される。この工程は、新規な配列とデータベースの第一の配列との間の正確な比較の実施に限定されないことに留意することが重要である。2つのヌクレオチド配列またはタンパク質配列を（たとえそれらが同一ではなくても）比較する周知の方法を当業者は心得ている。例えばギャップを1つの配列に導入してこれら2つのテスト配列間の相同性レベルを高めることができる。比較時にギャップまたは他の特徴を配列に導入するか否かを制御するパラメーターは通常はコンピュータシステムのユーザーによって入力される。
【０１１３】
いったん2つの配列の比較が状態（210）で実施されたら、決定の状態（210）で前記2つの配列が同じか否かの決定が下される。もちろんのこと、“同じ”という用語は完全に同一である配列に限定されない。ユーザーによって入力された相同性パラメーター内にある配列は、プロセス（200）で“同じ”と示される。
2つの配列が同じであるという決定が下されたら、プロセス（200）は状態（214）に移行し、ここでデータベース由来の配列の名称がユーザーに表示される。前記状態はディスプレーされた名称の配列が入力した相同性の特徴を満たすことをユーザーに知らせる。保存配列の名称がいったんユーザーに表示されたら、プロセス（200）は、それ以上の配列がデータベースに存在するか否かの決定が下される決定状態（218）に移行する。それ以上データベースに配列が存在しない場合には、プロセス（200）は終了状態（220）で終了する。しかしながらデータベースにさらに配列が存在する場合は、プロセス（200）は状態（224）に移行し、前記状態でポインターは、データベースの次の配列に移動し前記新たな配列と比較することができる。このようにして、新たな配列はアラインメントを実施されデータベースの各配列と比較される。
配列が相同でないという決定が決定状態（212）で下された場合、プロセス（200）は直ちに決定状態（218）に移行し、データベース内に比較されるべき他の配列が存在するか否かが決定されることは留意されよう。
したがって、本発明のある特徴は、プロセッサー、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列が保存されているデータ保存装置、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列と比較するための参照ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列が検索できるように保存されたデータ保存装置、及び比較を実施するための配列コンペアラーを含むコンピュータシステムである。前記配列コンペアラーは、比較される配列間の相同性レベルを示すか、または本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列コード内の構造モチーフを同定するか、またはこれら核酸コード及びポリペプチドコードと比較される配列内の構造モチーフを同定することができる。いくつかの特徴では、前記データ保存装置には、本発明の核酸配列、又は本発明のポリペプチド配列の少なくとも2、5、10、15、20、25、30若しくは40又は前記を超える配列が保存されえる。
【０１１４】
また別の特徴は、本発明の核酸配列（又は本発明のポリペプチド配列）と参照ヌクレオチド配列との間の相同性レベルを決定する方法である。前記方法は、核酸コード又はポリペプチドコード、及び参照ヌクレオチド又はポリペプチド配列をコンピュータプログラム（前記は相同性レベルを決定する）により読み取り、核酸コード又はポリペプチドコードと参照ヌクレオチド又はポリペプチド配列との間の相同性を前記コンピュータプログラムにより決定することを含む。前記コンピュータプログラムは、相同性レベルを決定するための多数のコンピュータプログラムのいずれでもよいが、特に本明細書に列挙されたものが含まれる（例えば規定値パラメーターまたは任意の改変パラメーターを用いるBLAST2N）。前記方法は上記に記載したコンピュータシステムを用いて実行することができる。前記方法はまた、上記に記載した本発明の核酸配列、又は本発明のポリペプチド配列の少なくとも2、5、10、15、20、25、30若しくは40又は前記を超える配列をコンピュータプログラムを用いてより読み取り、さらに核酸コード又はポリペプチドコードと参照ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列との間の相同性を決定することによって実施することができる。
図3は、2つの配列が相同であるか否かを決定するコンピュータシステムのプロセス（250）のある特徴を示す流れ図である。プロセス（250）は開始状態（252）で開始し、続いて比較されるべき第一の配列がメモリーに保存される状態（254）に移行する。続いて比較されるべき第二の配列が状態（256）でメモリーに保存される。続いてプロセス（250）は状態（260）に移行し、前記状態（260）で第一の配列中の第一の記号が読み取られ、続いて状態（262）に移行し、前記状態（262）で第二の配列の第一の記号が読み取られる。前記配列がヌクレオチド配列の場合、前記記号は通常はA、T、C、G又はUのいずれかであることは理解されよう。前記配列がタンパク質配列の場合は、前記記号は一文字のアミノ酸コードであり、それによって第一及び第二の配列は容易に比較することができる。
【０１１５】
続いて2つの記号が同じものであるか否かの決定が決定状態（264）で下される。それらが同じものである場合、プロセス（250）は状態（268）に移行し、前記状態（268）で第一および第二の配列の次の記号が読み取られる。続いて、前記次の記号が同じものであるか否かの決定が下される。それらが同じものである場合には、プロセス（250）は2つの記号が同じでなくなるまでこのループを繰り返す。次の2つの記号が同じでないという決定が下された場合、プロセス（250）は決定状態（274）に移行して、いずれかの配列に読み取られるべき記号がそれ以上存在するか否かが決定される。
読み取られるべき記号がそれ以上存在しない場合は、プロセス（250）は状態（276）に移行し、第一および第二の配列間の相同性レベルがユーザーに表示される。相同性レベルは、第一の配列内の記号の総数のうち同じであった配列間の記号の割合を計算することによって決定される。したがって、第二の配列の各記号と最初の100ヌクレオチド配列内の各記号のアラインメントが達成された場合、相同性レベルは100％であろう。
あるいは、コンピュータプログラムは、本発明に示された核酸配列のヌクレオチド配列を1つ以上の参照ヌクレオチド配列と比較して、本発明の核酸コードが参照核酸配列と1つ以上の位置で異なるか否かを決定するコンピュータプログラムであってもよい。場合によってそのようなプログラムは、参照ポリヌクレオチド配列又は本発明の核酸配列のいずれかの配列に対して挿入、欠失または置換されたヌクレオチドの長さ又はそれらが何であるかを記録する。ある特徴では、コンピュータプログラムは、本発明の核酸配列が、参照ヌクレオチド配列に対して一ヌクレオチド多型性（SNP）を含むか否かを決定するプログラムであってもよい。
【０１１６】
したがって、本発明の別の特徴は、本発明の核酸配列が、参照ヌクレオチド配列と1つ以上のヌクレオチドで異なるか否かを決定する方法であり、前記方法は以下の工程を含む：核酸配列間の相違を同定するコンピュータプログラムを使用して核酸コード及び参照ヌクレオチド配列を読み取る工程、及び核酸コードと参照ヌクレオチド配列との間の相違を前記コンピュータプログラムにより同定する工程。いくつかの特徴ではコンピュータプログラムは一ヌクレオチド多形性を同定するプログラムである。前記方法は上記に述べたコンピュータシステムによって実施することができ、前記方法は図3に示されている。前記方法はまた、コンピュータプログラムを使用することにより本発明の核酸配列の少なくとも2、5、10、15、20、25、30若しくは40又は前記を超える配列及び参照ヌクレオチド配列を読み取り、さらにコンピュータプログラムにより核酸コードと参照ヌクレオチド配列との間の相違を同定することによって実施することができる。
他の特徴では、前記コンピュータ使用システムはさらに、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列内の特徴を同定するアイデンティファイヤーを含むことができる。“アイデンティファイヤー”は、本発明の核酸配列または本発明のポリペプチド配列内のある種の特徴を同定する1つ以上のプログラムを指す。ある特徴では、アイデンティファイヤーは、本発明の核酸配列内のオープンリーディングフレーム（ORF）を同定するプログラムを含むことができる。
【０１１７】
図4は、配列内の1つの特徴の存在を検出するためのアイデンティファイヤープロセス（300）のある特徴を示す流れ作業図である。プロセス（300）は開始状態（302）で開始し、続いて状態（304）に移行し、前記状態（304）で特徴についてチェックされるべき第一の配列がコンピュータシステム（100）のメモリー（115）に保存される。プロセス（300）は続いて状態（306）に移行し、前記状態（306）で配列の特徴のデータベースが開かれる。そのようなデータベースは各特徴の属性リストを前記特徴の名称とともに含むであろう。例えば、特徴の名称は“開始コドン”であり、その属性は“ATG”であろう。別の例では、特徴の名称は“TAATAAボックス”であり、特徴の属性は“TAATAA”であろう。そのようなデータベースの例は、ウィスコンシン大学のGenetics Computer Groupによって作製されている。あるいは、前記特徴は構造的なポリペプチドモチーフ、例えばアルファへリックス、ベータシートまたは機能的ポリペプチドモチーフ、例えば酵素触媒ドメイン（CD）または活性部位、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフまたは当業者に公知の他のモチーフであろう。
特徴のデータベースが状態（306）で開かれると直ちにプロセス（300）は状態（308）に移行し、前記状態（308）で第一の特徴がデータベースから読み取られる。続いて第一の特徴の属性と第一の配列との比較が状態（310）で実施される。続いて、前記特徴の属性の比較が第一の配列内で見出されるか否かの決定が決定状態（316）で下される。前記属性が見出された場合、プロセス（300）は状態（318）に移行し、前記状態（318）で見出された特徴の名称がユーザーに表示される。
続いてプロセス（300）は決定状態（320）に移行し、前記状態（320）でそれ以上の特徴がデータベースに存在するか否かの決定が下される。特徴がそれ以上存在しない場合は、プロセス（300）は終了状態（324）で終了する。しかしながら、それ以上の特徴がデータベースに存在する場合、プロセス（300）は状態（326）で次の配列特徴を読み取り、状態（310）に戻り、前記状態で次の特徴の属性が第一の配列に対して比較される。第一の配列で前記特徴の属性が決定状態（316）で見出されない場合、プロセス（300）は直接決定状態（320）に移行し、特徴がそれ以上データベースに存在するか否かを決定することは留意されるべきである。
【０１１８】
したがって、本発明のまた別の特徴は、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列内の特徴を同定する方法であり、前記方法は以下の工程を含む：本発明の核酸コード又はポリペプチド配列を、それらに存在する特徴を同定するコンピュータプログラムを使用して読み取る工程及び核酸コード内の特徴を前記コンピュータプログラムにより同定する工程。ある特徴では、コンピュータプログラムはオープンリーディングフレームを同定するコンピュータプログラムを含む。前記方法は、ただ1つの配列又は少なくとも2、5、10、15、20、25、30若しくは40又は前記を超える本発明の核酸配列若しくはポリペプチド配列をコンピュータプログラムの使用により読み取り、さらに前記コンピュータプログラムを用いて核酸コード又はポリペプチドコード内の特徴を同定することによって実施することができる。
本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列は、種々のデータプロセッサプログラムで多様な様式で保存し操作することができる。例えば、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列は、当業者に周知の多様なデータベースプログラム（例えばDB2（商標）、SYBASE（商標）又はORACLE（（商標）））でワードプロセッシングファイル（例えばマイクロソフトワード（WORD（商標））又はワードパーフェクト（WORDPERFECT（商標））のテキストとして、又はアスキーファイルとして保存することができる。さらにまた、多くのコンピュータプログラム及びデータベースを配列比較アルゴリズム、アイデンティファイヤー、または本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列と比較するべき参照ヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の供給源として用いることができる。以下のリストは、本発明の核酸配列又は本発明のポリペプチド配列に関して有用なプログラム及びデータベースの手引きを提供することを意図し、本発明を限定しようとするものではない。
【０１１９】
使用することができるプログラム及びデータベースには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：MacPattern（EMBL）、DiscoveryBase（Molecular Applications Group）、GeneMine （Molecular Applications Group）、Look（Molecular Applications Group）、MacLook（Molecular Applications Group）、BLASTおよびBLAST2（NCBI）、BLASTNおよびBLASTX（Alyschul et al. J. Mol. Biol. 215:403, 1990）、FASTA（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444,1988）、FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990)、Catalyst（Molecular Simulations Inc.）、Catalyst/SHAPE（Molecular Simulations Inc.）、Cerius2.DBAccess（Molecular Simulations Inc.）、HypoGen（Molecular Simulations Inc.）、Insight II（Molecular Simulations Inc.）、Discover（Molecular Simulations Inc.）、CHARMｍ（Molecular Simulations Inc.）、Felix（Molecular Simulations Inc.）、DelPhi（Molecular Simulations Inc.）、QuanteMN（Molecular Simulations Inc.）、Homology（Molecular Simulations Inc.）、Modeler（Molecular Simulations Inc.）、ISIS（Molecular Simulations Inc.）、Quanta/Protein Design（Molecular Simulations Inc.）、WebLab（Molecular Simulations Inc.）、WebLab Diversity Explorer（Molecular Simulations Inc.）、Gene Explorer（Molecular Simulations Inc.）、SeqFold（Molecular Simulations Inc.）、MDL Available Chemicals Directoryデータベース、MDL Drug Data Reportデータベース、Comprehensive Medical Chemistryデータベース、Derwent's World Drug Indexデータベース、BioByteMasterFileデータベース、Genbankデータベース。他の多くのプログラムおよびデータベースも本発明の開示が提供された当業者には明白であろう。
上記のプログラムを用いて検出することができるモチーフには、ロイシンジッパーをコードする配列、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファヘリックス、ベータシート、コードされたタンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関与する配列（例えばホメオボックス）、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位及び酵素切断部位が含まれる。
【０１２０】
核酸のハイブリダイゼーション
本発明は、本発明の例示的配列（例えば配列番号:1、配列番号:3などから配列番号:471、配列番号:480、配列番号:481、配列番号:482、配列番号:483、配列番号:484、配列番号:485、配列番号:486、配列番号:487、配列番号:488、配列番号:489と配列番号:700の間の全ての奇数番号の配列番号、配列番号:707、配列番号:708、配列番号:709、配列番号:710、配列番号:711、配列番号:712、配列番号:713、配列番号:714、配列番号:715、配列番号:716、配列番号:717、配列番号:718、及び／又は配列番号:720;表1から3及び配列リストをまた参照されたい）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離、合成または組換え核酸を提供する。前記ストリンジェントな条件は、高度にストリンジェントな条件、中等度にストリンジェントな条件、及び／又は低度にストリンジェントな条件であり、本明細書に記載されている高ストリンジェンシー条件および軽減ストリンジェンシー条件を含む。ある特徴では、下記に考察されるように、ある核酸が本発明の範囲内のものであるか否かを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。
“ハイブリダイゼーション”は、核酸鎖が相補的な鎖と塩基対形成によって結合する過程を指す。ハイブリダイゼーション反応は鋭敏で選択性があり、低い濃度でしか存在しないサンプルにおいてさえ問題の特定の配列を同定することができる。適切にストリンジェントな条件は、例えば前ハイブリダイゼーション溶液又はハイブリダイゼーション溶液中の塩若しくはホルムアミドの濃度によって、またはハイブリダイゼーション温度によって規定することができ、当分野でよく知られている。また別の特徴では、ストリンジェンシーは、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、又はハイブリダイゼーション温度の上昇によって高めることができる。また別の特徴では、本発明の核酸は、本明細書に示す種々の（例えば高度、中等度および低度の）ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
【０１２１】
ある特徴では、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約37℃から42℃で約50％のホルムアミドを含む。ある特徴では、ハイブリダイゼーション条件は、約30℃から35℃で約35％から25％のホルムアミドの軽減ストリンジェンシー条件を含む。ある特徴では、ハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェンシー条件、例えば50%のホルムアミド、5XのSSPE、0.3%SDS、及び200μg/mLのせん断変性サケ精子DNA中で42℃を含む。ある特徴では、ハイブリダイゼーション条件はこれらの軽減ストリンジェンシー条件を含むが、ただし35℃の緩和温度でホルムアミドは35%である。個々のストリンジェンシーレベルに対応する温度範囲は、対象の核酸のプリン対ピリミジン比を計算し、したがって温度を調整することによってさらに狭めることができる。上記範囲及び条件の多様な型は当分野では周知である。
また別の特徴では、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって定義される本発明の核酸は、本発明の核酸の約5残基から完全長の間であろう。例えばそれらは、長さが少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000又はそれより大きい残基でありえる。完全長より短い核酸もまた含まれる。これらの核酸は、例えばハイブリダイゼーションプローブ、標識プローブ、PCRオリゴヌクレオチドプローブ、siRNA又はmiRNA（一本鎖または二本鎖）、アンチセンス配列、または抗体結合ペプチド（エピトープ）、モチーフ、活性部位などをコードする配列として有用である。
ある特徴では、本発明の核酸は、約37℃から42℃で約50％のホルムアミドの条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって規定される。ある特徴では、本発明の核酸は、約30℃から35℃で約35％から25％のホルムアミドの条件を含む軽減ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって規定される。
【０１２２】
あるいは、本発明の核酸は、42℃、約50％ホルムアミド、5XのSSPE、0.3%SDS及び反復配列阻止核酸（例えばcot-1又はサケ精子DNA（例えば200n/mＬのせん断変性サケ精子DNA））の条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって規定される。ある特徴では、本発明の核酸は、35℃又は42℃の緩和温度で約35％又は40%のホルムアミドを含む軽減ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって規定される。
核酸のハイブリダイゼーション反応では、具体的なストリンジェンシーレベルを達成するために用いられる条件は、ハイブリダイズさせる核酸の性質に応じて変動するであろう。例えば核酸のハイブリダイズ領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC対AT含有量）及び核酸のタイプ（例えばRNA対DNA）はハイブリダイゼーションの条件の選択で考慮することができる。さらにまた考慮されることは、核酸の1つが、例えばフィルターに固定されているか否かということである。
ハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシー、中等度ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー条件下で実施することができる。核酸のハイブリダイゼーションの例として、固定された変性核酸を含むポリマーメンブレンを、先ず初めに0.9MのNaCl、50mMのNaH2PO4（pH7.0）、5.0mMのNa2EDTA、0.5%SDS、10Xのデンハルト溶液及び0.5mg/mLのポリリボアデニル酸から成る溶液中で45℃、30分予備ハイブリダイズさせる。続いて、約2ｘ107cpm（比活性4−9ｘ108cpm/μg）の32P末端標識オリゴヌクレオチドプローブを前記溶液に添加する。12から16時間インキュベートした後、前記メンブレンを0.5%のSDSを含む、1ｘのSET（150mMのNaCl、20mMのトリス-塩酸（pH7.8）、1mMのNa2EDTA）中で30分、室温で洗浄し、続いて前記オリゴヌクレオチドプローブのTm−10℃で新しい1ｘのSETで30分洗浄する。続いて前記メンブレンでオートラジオグラフィー用フィルムを感光させハイブリダイゼーションシグナルを検出する。前述の全てのハイブリダイゼーションは高ストリンジェンシー条件下にあると考えられるであろう。
【０１２３】
ハイブリダイゼーションの後、フィルターを洗浄して非特異的に結合した検出可能なプローブを一切除去することができる。フィルターの洗浄に用いられるストリンジェンシーはまた、ハイブリダイズされる核酸の性質、ハイブリダイズされる核酸の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC対AT含有量）及び核酸のタイプ（例えばRNA対DNA）に応じて変動しえる。ストリンジェンシーがだんだんと高くなる洗浄条件の例は以下のとおりである：2ｘのSSC、0.1%のSDS、室温で15分（低ストリンジェンシー）；0.1ｘのSSC、0.5%のSDS、室温で30分から1時間（中等度ストリンジェンシー）；0.1ｘのSSC、0.5%のSDS、ハイブリダイゼーション温度から68℃で15から30分（高ストリンジェンシー）；及び0.15MのNaCl、72℃で15分（超高ストリンジェンシー）。最後の低ストリンジェンシー洗浄は、0.1ｘのSSCで室温にて実施することができる。前述の例は、フィルターの洗浄で用いることができる1組の条件の単なる例示である。種々のストリンジェンシーの洗浄レシピが多数存在することは当業者には知られていよう。いくつかの他のが以下で提供される。
ある特徴では、ハイブリダイゼーション条件は、1ｘの150mM NaCl、20mMトリス塩酸（pH7.8）、1mMのNa2EDTA、0.5%SDSを含む溶液で室温にて30分の洗浄、続いて新しい溶液で30分の洗浄を含む洗浄工程を含む。
プローブとハイブリダイズした核酸は、オートラジオグラフィー又は他の通常的な技術によって同定される。
上記の方法は、プローブ配列に対して配列同一性（相同性）のレベルが低下した核酸を同定するために改変することができる。例えば、検出可能なプローブに対して配列同一性（相同性）が低下した核酸を得るために、軽減されたストリンジェンシー条件を用いることができる。例えば、約1MのNa＋濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃まで5℃ずつ下げることができる。ハイブリダイゼーション後に、フィルターをハイブリダイゼーション温度で2ｘのSSC、0.5％SDSで洗浄することができる。前記の条件は、50℃より上で“中等度”の条件、50℃未満で“低い”条件と考えられる。“中等度”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが55℃で実施される場合である。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが45℃で実施される場合である。
【０１２４】
あるいは、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含む緩衝液（例えば6ｘのSSC）中で42℃の温度で実施することができる。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度を50%から0%まで5%ずつ減少させ、プローブに対して相同性レベルが低下したクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーションの後でフィルターを6ｘのSSC、0.5％SDSにより50℃で洗浄することができる。前記の条件は、25％を超えるホルムアミドで“中等度”の条件、25％より低いホルムアミドで“低い”条件と考えられる。“中等度の”ハイブリダイゼーション条件の具体的な条件は、上記のハイブリダイゼーションが30％のホルムアミドで実施されるときである。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な条件は、上記のハイブリダイゼーションが10％のホルムアミドで実施されるときである。
しかしながら、ハイブリダイゼーションの様式の選択は決定的なものではなく、ある核酸が本発明の範囲内に包含されるか否かを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明に包含される核酸を同定するために用いられる洗浄条件には例えば以下が含まれる：pH７で約0.02Mの塩濃度、及び少なくとも約50℃又は約55℃から約60℃の温度；又は約0.15MのNaClの塩濃度で72℃、約15分；又は約0.2ｘのSSCの塩濃度で少なくとも約50℃又は約55℃から約60℃の温度で約15から約20分；又はハイブリダイゼーション複合体を、0.1％のSDSを含む約2ｘのSSCの塩濃度を有する溶液で室温にて15分2回洗浄し、続いて0.1％のSDSを含む約0.1ｘのSSCで68℃にて15分2回洗浄する；又は前記と同等な条件。SSC緩衝液及び同等な条件に関してはSambrook, Tijssen及びAusubelの著書を参照されたい。
【０１２５】
これらの方法は本発明の核酸の単離又は同定に用いることができる。例えば、前述の方法を用いて、本発明の配列の1つ、又はその連続する少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、300、400又は500塩基を含むフラグメント、及びそれらに相補的な配列から成る群から選択される核酸配列に対して、少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は前記より高いか配列同一性（相同性）を有する配列を有する核酸配列を単離又は同定することができる。配列同一性（相同性）はアラインメントアルゴリズムを用いて測定することができる。例えば、相同なポリヌクレオチドは、本明細書に記載したコード配列の1つの天然に存在する対立遺伝子座変種のコード配列を有することができる。そのような対立遺伝子座変種は、本発明の核酸と比較したとき1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有することができる。さらにまた、上記の方法を用いて、本発明のポリペプチド又は前記の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100又は150の連続するアミノ酸を含むフラグメントに対して、配列アラインメントアルゴリズム（例えば規定値パラメータを用いるFASTAバージョン3.0t78アルゴリズム）を用いて決定したとき、少なくとも約99%、95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、又は少なくとも50%の配列同一性（相同性）を有するポリペプチドをコードする核酸を単離することができる。
【０１２６】
オリゴヌクレオチドプローブおよびその使用方法
本発明はまた、例えば、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性をもつポリペプチドをコードする核酸若しくはそのフラグメントを同定、増幅又は単離するために、又はリグノセルロース系酵素遺伝子を同定するために用いることができる核酸プローブを提供する。ある特徴では、前記プローブは、本発明の核酸の少なくとも10の連続する塩基を含む。あるいは、本発明のプローブは、本発明の核酸の配列の少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150又は約10から50、約20から60、約30から70の連続する塩基であってもよい。前記プローブは、結合及び／又はハイブリダイゼーションによって核酸を同定する。前記プローブは、下記で考察される、例えばキャピラリーアレイを含む本発明のアレイで用いることができる。本発明のプローブはまた他の核酸又はポリペプチドの単離に用いることができる。
本発明の単離、合成又は組換え核酸、前記と相補的な配列、又は本発明の配列の1つの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400若しくは500の連続する塩基を含むフラグメント、又は前記と相補的な配列はまた、生物学的サンプル（例えば土壌サンプル）が、本発明の核酸を有する生物又は前記核酸が得られた生物を含むか否かを決定するために用いることができる。そのような方法では、前記核酸が単離された生物を潜在的に保有する生物学的サンプルを入手し、前記サンプルから核酸を入手する。前記プローブがサンプル中に存在する相補的配列のいずれかと特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、前記核酸を前記プローブと接触させる。
必要な場合には、相補性配列を含まないコントロール配列とともに相補性配列を含むことが判明しているサンプルの相補性配列とプローブを接触させることによって、プローブが特異的にハイブリダイズすることができる条件を決定することができる。ハイブリダイゼーションの条件（例えばハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド濃度またはハイブリダイゼーションの温度）を変化させて、プローブが相補性核酸と特異的にハイブリダイズすることができる条件を確認することができる。
【０１２７】
前記核酸が単離された生物をサンプルが含む場合、プローブの特異的なハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションは、プローブを検出可能な薬剤、例えば放射性同位元素、蛍光染料、又は検出可能な生成物の形成を触媒することができる酵素で標識することによって検出できる。
標識プローブを用いてサンプル中の相補性核酸の存在を検出する多くの方法が当業者にはよく知られている。前記方法にはサザンブロット、ノーザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション法及びドットブロットが含まれる。前記方法の各々のプロトコルは以下に提供されている：Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. （1997）；及びSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）。
あるいは、2つ以上のプローブ（そのうちの少なくとも1つは核酸サンプルに存在する任意の相補性配列と特異的にハイブリダイズすることができる）を増幅反応で用いて、サンプルが本発明の核酸配列を含む生物（例えば前記核酸が単離された生物）を含むか否かを決定することができる。ある特徴では、前記プローブはオリゴヌクレオチドを含む。ある特徴では、前記増幅反応はPCR反応を含むことができる。PCRプロトコルは上掲書（Ausubel及びSambrook）に記載されている。あるいは、増幅はリガーゼ連鎖反応、3SR又は鎖置換反応を含むことができる（以下を参照されたい：F. Barany, “The Ligasa Chain Reaction in a PCR World”, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991；E. Fahy et al., “Self-sustained Sequence Replication (3SR): An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR”, PCR Methods and Applications 1:25-33, 1991；及びG.T. Walker et al., “Strand Displacement Amplification an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique”, Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992）。そのような方法では、サンプル中の核酸をプローブと接触させ、増幅反応を実施し、生成された一切の増幅生成物を検出する。増幅生成物は、反応生成物のゲル電気泳動を実施し、前記ゲルをインターカレーション試薬（例えば臭化エチジウム）で染色することによって検出することができる。あるいは1つ以上のプローブを放射性同位元素で標識し、ゲル電気泳動の後で放射性増幅生成物の存在をオートラジオグラフィーによって検出してもよい。
【０１２８】
本発明の配列の末端近くの配列に由来するプローブもまた染色体ウォーキング法で用いて、本発明の配列の近傍に位置するゲノム配列を含むクローンを同定することができる。そのような方法は、さらに別のタンパク質をコードする遺伝子を前記宿主生物から単離することを可能にする。
ある特徴では、本発明の単離、合成又は組換え核酸、前記と相補的な配列、又は本発明の配列の1つの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400若しくは500又はそれより大きい連続する塩基を含むフラグメント、若しくは前記と相補的な配列をプローブとして用いて関連核酸を同定及び単離することができる。いくつかの特徴では、前記関連核酸は、前記核酸が単離された生物以外の生物に由来するcDNA又はゲノムDNAであってもよい。例えば前記の他の生物は関連する生物でもよい。そのような方法では、プローブが特異的に関連配列とハイブリダイズすることができる条件下で、核酸サンプルを前記プローブと接触させる。続いて、関連生物に由来する核酸とプローブのハイブリダイゼーションが上記に記載した方法のいずれかを用いて検出される。
検出可能なプローブとハイブリダイズする核酸（例えばcDNA又はゲノムDNA）を同定するために用いられるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーレベルを変動させることによって、プローブに対して種々のレベルの相同性を有する核酸を同定及び単離することができる。ストリンジェンシーは、プローブの融解温度より低い種々の温度でハイブリダイゼーションを実施することによって変動させることができる。融解温度（Tm）は、（所定のイオン強度およびpHの下で）標的配列の50％が完全に相補性のプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、個々のプローブのTmに等しいか又はそれより約5℃低くなるように選択される。プローブの融解温度は以下の等式を用いて計算できる。
長さが14から70ヌクレオチドのプローブの場合、融解温度（Tm）は下記式を用いて計算される：Tm＝81.5＋16.6（log[Na＋]）＋0.41（G+Cの割合）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。
ハイブリダイゼーションがホルムアミド含有溶液中で実施される場合、融解温度は以下の等式を用いて計算できる：Tm＝81.5＋16.6（log[Na＋]）＋0.41（G+Cの割合）−（0.63％ホルムアミド）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。
前ハイブリダイゼーションは、6ｘのSSC、5ｘのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μgの変性フラグメント化サケ精子DNA、または6ｘのSSC、5ｘのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μgの変性フラグメント化サケ精子DNA、50％ホルムアミド中で実施することができる。SSC及びデンハルト溶液のための組成は例えば上掲書（Sambrook）に挙げられている。
ある特徴では、ハイブリダイゼーションは、検出可能プローブを上記に挙げた前ハイブリダイゼーション溶液に添加することによって実施される。プローブが二本鎖DNAを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前にそれを変性させる。ある特徴では、前記プローブが、それと相補的または相同な配列を含むcDNA又はゲノムDNAとハイブリダイズできるように十分な時間、前記ハイブリダイゼーション溶液とフィルターを接触させる。長さが200ヌクレオチドを超えるプローブの場合、ハイブリダイゼーションはTmより15−25℃低い温度で実施できる。より短いプローブの場合（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）、ハイブリダイゼーションはTmより5−10℃下で実施できる。ある特徴では、6ｘのSSC中でのハイブリダイゼーションが約68℃で実施される。通常では、50％ホルムアミド含有溶液中でのハイブリダイゼーションの場合、ハイブリダイゼーションは約42℃で実施される。
【０１２９】
セルラーゼ酵素の発現阻害
本発明は、本発明の核酸（例えばセルラーゼコード核酸）と相補的な核酸（例えばアンチセンス配列）、例えばアンチセンス、siRNA、miRNA、リボザイムを含む核酸を提供する。アンチセンス配列を含む本発明の核酸は、セルラーゼ酵素コード遺伝子の輸送、スプライシング又は転写を阻害することができる。前記阻害は、ゲノムDNA又はメッセンジャーRNAを標的とすることにより達成することができる。標的とされた核酸の転写又は機能は、例えばハイブリダイゼーション及び／又は切断によって阻害することができる。本発明によって提供されるある例示的阻害物質セットには、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素の遺伝子又はメッセンジャーに結合することができるオリゴヌクレオチドが含まれる（いずれの事例でもリグノセルロース系酵素の生成又は機能を防止又は阻害する）。前記の結合は配列特異的ハイブリダイゼーションによることができる。別の有用な阻害物質の種類には、リグノセルロース系酵素メッセージの不活化又は切断をもたらすオリゴヌクレオチドが含まれる。前記オリゴヌクレオチドはそのような切断を惹起する酵素活性を有することができる（例えばリボザイム）。前記オリゴヌクレオチドは化学的に改変するか、または相補性核酸を切断することができる酵素若しくは組成物と結合させることができる。多くのそのような様々なオリゴヌクレオチドのプールを所望の活性を有するものについてスクリーニングすることができる。したがって、本発明は、リグノセルロース系酵素発現を核酸及び／又はタンパク質レベルで阻害する種々の組成物を提供する。前記は、例えば本発明のリグノセルロース系酵素配列を含むアンチセンス、siRNA、miRNA及びリボザイム、並びに本発明の抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ-グルコシダーゼ抗体である。
リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素発現の阻害は多様な工業的用途を有しえる。例えば、リグノセルロース系酵素発現の阻害は腐敗を抑制又は防止することができる。ある特徴では、リグノセルロース系酵素の発現及び／又は活性を阻害する本発明の組成物（例えば抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、siRNA及びmiRNA）を使用して腐敗が抑制又は防止される。したがって、ある特徴では、本発明は、腐敗を遅らせるか又は防止するために、植物又は植物生成物（例えば穀物、穀粒、果実、種子、根、葉など）に本発明の抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、siRNA及びmiRNAを適用することを含む方法及び組成物を提供する。これらの組成物はまた、植物（例えばトランスジェニック植物）又は別の生物（例えば本発明のリグノセルロース系酵素コード配列（例えば遺伝子）で形質転換された細菌又は他の微生物）によって発現させることもできる。
リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）の発現を阻害する本発明の組成物（例えばアンチセンス、iRNA、リボザイム、抗体）は、医薬組成物として、例えば抗病原体薬剤として、または他の治療薬において、例えば抗菌剤（例えばサルモネラ用）として用いることができる。
【０１３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド：本発明は、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）メッセージと結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。前記は、ある特徴では、mRNAを標的とすることによってリグノセルロース系酵素活性を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなリグノセルロース系酵素のオリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするための遺伝子ウォーキング／RNAマッピングプロトコルは当業界で周知である。例えば以下を参照されたい：Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183。この文献はRNAマッピングアッセイについて記載し、前記アッセイは標準的な分子技術を基にして、強力なアンチセンス配列選別のための容易で信頼できる方法を提供する。さらにまた以下を参照されたい：Smith (2000) Eur. J. Phar. Sci. 11:191-198。
天然に存在する核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれの長さでもよい。例えば、また別の特徴では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約5から100、約10から80、約15から60、約18から40である。最適な長さは日常的なスクリーニングによって決定できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の濃度であってよい。最適濃度は日常的なスクリーニングによって決定できる。この潜在的課題を解決することができる極めて多様な合成、非天然ヌクレオチド及び核酸類似体が知られている。例えば、非イオン性骨格（例えばN-（2-アミノエチル）グリシンユニット）を含むペプチド核酸（PNA）を用いることができる。ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた用いることができる（それらは以下に記載されている：WO97/03211; WO96/39154；Mata (1997) Toxicol. App. Pharmacol. 144:189-197；Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)）。本発明によって提供される合成DNA骨格類似体をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドにはまた、上記で述べたようにホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、3'-チオアセタール、メチレン(メチルイミノ)、3'-N-カルバメート及びモルホリノカルバメート核酸が含まれる。
コンビナトリアル化学による方法を用いて膨大な数のオリゴヌクレオチドを生成することができる。前記オリゴヌクレオチドは、任意の標的（例えば本発明のセンス及びアンチセンスリグノセルロース系酵素配列（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素配列）に対し適切な結合親和性及び特異性を有する特定のオリゴヌクレオチドについて迅速にスクリーニングすることができる（例えば以下を参照されたい：Gold (1995) J. Biol. Chem. 270:13581-13584）。
【０１３１】
阻害性リボザイム：本発明は、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）メッセージと結合することができるリボザイムを提供する。これらのリボザイムは、例えばmRNAを標的にすることによりリグノセルロース系酵素活性を阻害することができる。リボザイムを設計し、標的誘導のためにリグノセルロース系酵素特異的アンチセンス配列を選別する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなリボザイムを設計することができる。リボザイムは、リボザイムの標的RNA結合部分を介して標的RNAと結合（前記標的RNA結合部分は標的RNAを切断するRNAの酵素部分の極めて近傍に保持されている）することによって機能する。したがって、リボザイムは、相補性塩基対形成により標的RNAを認識し、これと結合する。正確な部位にいったん結合したら、リボザイムは酵素として機能し標的RNAを切断して、これを不活化する。切断がコード配列内で発生すれば、そのような態様での標的RNAの切断は、コードされるタンパク質の合成を指令するその能力を破壊するであろう。リボザイムがそのRNA標的と結合し、これを切断した後、リボザイムは前記RNAから遊離し、新たな標的と結合及び切断を繰り返すことができる。
いくつかの環境下では、リボザイムの酵素的性質は他の技術、例えばアンチセンス技術（アンチセンス技術では、核酸分子は核酸標的に単に結合してその転写、翻訳又は別の分子との結合を妨げるだけである）に比べて有利であろう。なぜならば、治療達成に必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれよりも低くてもよいからである。この潜在的な利点はリボザイムの酵素として機能する能力に影響を及ぼす。したがって、ただ1つのリボザイム分子が多くの標的RNA分子を切断することができる。ある特徴では、リボザイムは特異性が高い阻害剤であり、阻害の特異性は塩基対形成による結合メカニズムだけでなく、リボザイムが結合するRNAの発現を前記リボザイム分子が阻害するメカニズムにも左右される。すなわち、阻害はRNA標的の切断によって生じ、したがって特異性は、非標的RNAの切断速度に対する標的RNAの切断速度の比と定義される。この切断メカニズムは、塩基対形成に関与する要因に加えて更に別の要因に左右される。したがって、リボザイム作用の特異性は、同じRNA部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド結合の特異性よりもはるかに高いであろう。
【０１３２】
本発明のリボザイム、例えば酵素リボザイムRNA分子は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、肝炎デルタウイルスモチーフ、グループIイントロンモチーフ及び／又はRNAガイド配列と結合したRNaseP様RNAモチーフとして生成することができる。ハンマーヘッドモチーフの例はRossi（Aids Research and Human Retroviruses 8:183 (1992)）によって、ヘアピンモチーフの例はHampel（Biochmistry 28:4929 (1989)およびNuc. Acids Res. 18:299 (1992)）によって、肝炎デルタウイルスモチーフの例はPerrotta（Biochemistry 31:16 (1992)）によって、RNasePモチーフの例はGuerrier-Takada（Cell 35:849 (1983)）によって、さらにグループIイントロンの例はCech（US Pat. No. 4,987,071）によって記載されている。前記の特定のモチーフの記載はそれらに限定することを意図したものではない。当業者は、本発明のリボザイム、たとえば本発明の酵素RNA分子は、標的遺伝子のRNA領域の1つ以上と相補的な固有の基質結合部位を有することができることを理解していよう。本発明のリボザイムは、基質結合部位内又はその周辺に前記分子にRNA切断活性を付与するヌクレオチド配列を有するであろう。
【０１３３】
RNA干渉（RNAi）：ある特徴では、本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）の配列を含むRNA阻害分子、いわゆる“RNAi”分子を提供する。RNAi分子は二本鎖RNA（dsRNA）分子、例えばsiRNA及び／又はmiRNAを含むことができる。RNAi分子、例えばsiRNA及び／又はmiRNAはリグノセルロース系酵素遺伝子の発現を阻害することができる。ある特徴では、RNAi分子、例えばsiRNA及び／又はmiRNAは、長さが約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又はそれより大きい二重鎖ヌクレオチドである。本発明はいずれの特定の作用メカニズムにも限定されないが、RNAiは細胞内に入り、類似または同一の配列を有する一本鎖RNA（ssRNA）（内因性mRNAを含む）の分解を引き起こすことができる。細胞が二本鎖RNA（dsRNA）に暴露されるとき、相同遺伝子に由来するmRNAは、RNA干渉（RNAi）と称される過程によって選択的に分解される。RNAiの背後に存在しえる基本的なメカニズムは、特定の遺伝子配列と一致する二本鎖RNA（dsRNA）の短い破片（短小干渉性RNAと称される）への分解である。前記短小干渉性RNAは、その配列と一致するmRNAの分解の引き金となる。ある特徴では、本発明のRNAiは遺伝子サイレンシング療法で用いられる（例えば以下を参照されたい：Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046）。ある特徴では、本発明は、本発明のRNAi、例えばsiRNA及び／又はmiRNAを用いて選択的にRNAを分解する方法を提供する。前記方法はin vitro、ex vivo又はin vivoで実施することができる。ある特徴では、本発明のRNAi分子を用いて細胞、器官又は動物で機能低下変異を作出することができる。選択的にRNAを分解するためにRNAi分子、例えばsiRNA及び／又はmiRNAを製造および使用する方法は当業界では周知である。例えば、米国特許第6,506,559号、第6,511,824号、第6,515,109号及び第6,489,127号を参照されたい。
【０１３４】
核酸の改変−本発明の変種酵素の作製
本発明は、本発明の核酸（例えばリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）をコードする核酸）の変種を作製する方法を提供する。本方法は、鋳型核酸によってコードされたリグノセルロース系酵素の活性又は安定性と変異した若しくは異なる活性または変異した若しくは異なる安定性を有するリグノセルロース系酵素を生成するために繰り返し又は多様な組合せで用いることができる。本方法はまた、例えば遺伝子／メッセージ発現、メッセージ翻訳又はメッセージ安定性における変種を作製するために繰り返し又は多様な組合せで用いることができる。別の特徴では、細胞の遺伝的構成は、例えば相同遺伝子のex vivo改変とそれに続く前記遺伝子の細胞への再挿入により改変される。
本発明の核酸は任意の手段、例えばランダム若しくは確率論的な方法、又は非確率論的な若しくは“定方向進化”の方法によって改変できる（例えば米国特許6,361,974号を参照されたい）。遺伝子のランダム変異導入の方法は当業界で周知である（例えば以下を参照されたい：US Pat. No. 5,830,696）。例えば変異原を用いて遺伝子をランダムに変異させることができる。変異原には、例えば紫外線若しくはガンマ線照射、又は化学的変異原、例えばマイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレンが含まれ、単独または併用して組換えによって修復されやすいDNA破壊を誘導する。他の化学的変異原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン又はギ酸が含まれる。その他の変異原は、ヌクレオチド前駆体の類似物質、例えばニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2−アミノプリン又はアクリジンである。これらの薬剤はPCR反応にヌクレオチド前駆体の代わりに添加され、それによって前記配列を変異させることができる。インターカレーション薬剤（例えばプロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなど）もまた用いることができる。
【０１３５】
分子生物学の任意の技術、例えばランダムPCR変異導入（例えば以下を参照されたい：Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467−5471）又はコンビナトリアルマルチカセット変異導入（combinatorial multiple cassette mutagenesis）（例えば以下を参照されたい：Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196）を用いることができる。あるいは、核酸（例えば遺伝子）をランダムに又は“確率論的に”フラグメント化した後で再アッセンブリングすることもできる（例えば米国特許第6,291,242号、同6,287,862号、同6,287,861号、同5,955,358号、同5,830,721号、同5,824,514号、同5,811,238号、同5,605,793号を参照されたい）。また別の特徴では、改変、付加又は欠失が、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、GENE SITE SATURATION MUTAGENESIS（又はGSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNAによる変異導入、ウラシル含有鋳型による変異導入、ギャップ含有二重鎖による変異導入、ポイントミスマッチ修復による変異導入、修復欠損宿主株による変異導入、化学的変異導入、放射源による変異導入、欠失による変異導入、制限-選別変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマーの生成及び／又はこれらの組合せ並びに他の方法によって導入される。
【０１３６】
以下の文献は、本発明の方法に取り入れることができる多様な反復組換え手順及び／又は方法を記載している：Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties", Tiumor Tageting 4:1-4；Ness (1999) NatureBiotechnology 17:893-896；Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling", Nature Biotechnology 17:793-797；Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding", Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290；Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling", Nature Biotechnology 17:259-264；Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution", Nature 391:288-291；Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate dtoxification pathway by DNA shuffling", Nature Biotechnology 15:436-438；Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screenig", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509；Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”, Current Opinion in Biotechnology 8:724-733；Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling", Nature Medicine 2:100-103；Crameri et al. (1996) "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”, Nature Biotechnology 14:315-319；Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor `headpiece dimer`" Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp.447-457; Crameri and Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18:194-195；Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53；Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510；Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549-553；Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391；及びStemmer （1994） "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。
【０１３７】
多様性を生成する変異導入方法には例えば以下が含まれる：部位特異的変異導入(Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374；Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462；Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201；Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237:1-7；及び Kunkel （1987） "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin))；ウラシル含有鋳型を用いる変異導入 (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492；Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382；及びBass et al. 1988, "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245)；オリゴヌクレオチド誘導変異導入（Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983)；Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987)；Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500；Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500；及び Zoller & Smith （1987) "Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154:329-350）；ホスホロチオエート改変DNA変異導入(Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764；Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 1985；Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698；Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 16:791-802；及びSayers et al. （1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803-814）；ギャップをもつ二重鎖DNAを用いる変異導入(Kramer et al. (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456；Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA" 154:350-367；Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207；及びFritz et al. （1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999）。
【０１３８】
本発明を実施するために用いることができるさらに別の方法には以下が含まれる：点ミスマッチ修復(Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887)、修復欠損宿主株を用いる変異導入(Carter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; and Carter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403)、欠失変異導入(Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), restriction-selection and restriction-selection and restriction-purification (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423)、全遺伝子合成による変異導入(Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34:315-323;およびGrundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale `shot-gun` gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316)、二本鎖開裂修復(Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181)。上記の方法の多くに関する更なる詳細は” Enzymology”（Volume 154）で見出すことができる。この文献にはまた種々の変異導入方法に関する問題を解決するための有用な管理に関する記述がある。
【０１３９】
本発明の実施に用いることができる方法は例えば以下に記載されている：U.S. Pat. No. 5,605,793（Stemmer, Feb. 25, 1997, "Methods for In Vitro Recombination）；U.S. Pat. No. 5,811,238 (Stemmer et al.,Sep. 22, 1998, "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination")；U.S. Pat. No. 5,830,721（Stemmer et al., Nov. 3, 1998, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"）；U.S. Pat. No. 5,834,252（Stemmer, et al., Nov. 10, 1998, "End-Complementary Polymerase Reaction"）；U.S. Pat. No. 5,837,458（Minshull, et al., Nov. 17, 1998, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"）；WO 95/22625（Stemmer and Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"）；WO 96/33207（Stemmer and Lipschutz, "End Complementary Polymerase Chain Reaction"）；WO 97/20078（Stemmer and Crameri, "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"）；WO 97/35966（Minshull and Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"）；WO 99/41402（Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"）；WO 99/41383（Punnonen et al. "Antigen Library Immunization"）；WO 99/41369（Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering"）； WO 99/41368（Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"）；EP 752008（Stemmer and Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"）；EP 0932670（Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"）；WO 99/23107（Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"）；WO 99/21979（Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors"）；WO 98/31837（del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"）；WO 98/27230（Patten and Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"）；WO 98/27230（Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection"）；WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries"；WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences"；WO 98/42832（Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers"）；WO 99/29902（Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences"）；WO 98/41653（Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library"）；WO 98/41622（Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling"）；及びWO 98/42727（Pati and Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination"）
【０１４０】
本発明の実施に用いることができる方法（種々の多様性を作出する方法に関する詳細を提供する）は例えば以下に記載されている："SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES"（Patten et al.,1999年9月28日出願、U.S. Ser. No. 09/407,800)；"EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION"（del Cardayre et al., 米国特許6,379,964号)；"OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION"（Crameri et al., 米国特許6,319,714号; 6,368,861号; 6,376,246号; 6,423,542号; 6,426,224号およびPCT/US00/01203；"USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING"（Welch et al., 米国特許6,436,675号）；"METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS"（Selifonov et al., 2000年1月18日出願、PCT/US00/01202) および、例えば "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS"（Selifonov et al., 2000年7月18日出願、U.S. Ser. No. 09/618,579)；"METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS"（Selifonov and Stemmer, 2000年1月18日出願PCT/US00/01138)；および "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION"（Affholter, 2000年9月6日出願、U.S. Ser. No. 09/656,549)；および米国特許6,177,263号；同6,153,410号。 
非確率論的又は“定方向進化”的方法（例えば飽和変異導入（例えばGENE SITESATURATION MUTAGENESIS（又はGSSM））、合成連結再アッセンブリ（SLR）又は前記の組合せを含む）を用いて本発明の核酸を改変し、新規な又は変異した特性（例えば強酸または強アルカリ条件下、高温または低温条件下などでの活性）を有するリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）が作製される。改変された核酸によってコードされるポリペプチドは、グルカン加水分解又は他の活性について試験する前に活性についてスクリーニングすることができる。任意の試験様式又はプロトコルを、例えばキャピラリーアレイ台を用いることができる。例えば米国特許第6,361,974号、同6,280,926号、同5,939,250号を参照されたい。
【０１４１】
遺伝子部位飽和変異導入（GENE SITE SATURATION MUTAGENESIS（又はGSSM）：本発明はまた、本明細書又は米国特許6,171,820号及び同6,579,258号に記載されているように、遺伝子部位飽和変異導入（又はGSSM）を用いて酵素を作製する方法を提供する。遺伝子部位飽和変異導入（又はGSSM）によるアプローチは、前記ポリペプチドの端から端までの各アミノ酸においてありえる全てのアミノ酸変化を完遂するために用いられる。用いられるオリゴは、相同な配列、縮退N, N, G/Tを含むトリプレット、及び別の相同な配列を含む。したがって、各オリゴの縮退性はその中に含まれるN, N, G/Tカセットの縮退性から誘導される。そのようなオリゴの使用によりえられる重合生成物は、前記N,N,G/T配列が20アミノ酸全てをコードすることができるので、前記ポリペプチドの端から端まで各アミノ酸部位においてありえる全てのアミノ酸変化を含む。提示したように、別個の縮退オリゴが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの各コドンで変異を導入するために用いられる。
ある特徴では、ポリヌクレオチド（例えば本発明のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）又は抗体）に点変異を導入し、一組の子孫ポリペプチドを生成するために縮退N,N,G/T配列を含むコドンプライマーが使用される（前記一組の子孫ポリペプチドでは、アミノ酸の各箇所（例えば改変の標的となる酵素活性部位又はリガンド結合部位の一アミノ酸残基）で単一アミノ酸置換の全てが出現する。これらのオリゴヌクレオチドは、連続する第一の相同な配列、縮退N,N,G/T配列及び場合によって第二の相同な配列を含むことができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用することによって得られる下流の子孫の翻訳生成物には、N,N,G/T配列の縮退性が20アミノ酸全てに対するコドンを含むので、ポリペプチドの端から端まで各アミノ酸においてありえる全てのアミノ酸変化が含まれる。ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴヌクレオチド（例えば１つの縮退N,N,G/Tカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型中の各原型コドンを全範囲のコドン置換に付すために用いられる。また別の特徴では、少なくとも2つの縮退カセットが（同じヌクレオチドまたは別個のヌクレオチドとして）、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも2つの原型コドンを全範囲のコドン置換に付すために用いられる。例えば2つ以上のN,N,G/T配列を1つのオリゴヌクレオチドに取り入れて、2つ以上の部位でアミノ酸置換を導入することができる。N,N,G/T配列のこの多重性は完全に連続していてもよいし、または1つ以上の別のヌクレオチド配列によって分離されてあってもよい。別の特徴では、付加および欠失の導入に役立つオリゴヌクレオチドを単独又はN,N,G/T配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失及び／又は置換の任意の組合せ又は並べ換えを導入してもよい。
【０１４２】
ある特徴では、2つつ以上の連続するアミノ酸の位置の同時変異は、連続するN,N,G/Tトリプレット（すなわち縮退(N,N,G/T)ｎ配列）を含むオリゴヌクレオチドを用いて実施される。別の特徴では、N,N,G/T配列よりも縮退性の小さい縮退カセットが用いられる。例えば、いくつかの事例では、ただ1つのＮ（Ｎは前記トリプレットの第一、第二または第三番目の位置に存在できる）を含む縮退トリプレット配列を（オリゴヌクレオチドとして）用いることができる。任意の組合せおよび並べ換えを含む他のいずれの塩基もトリプレットの残りの2つの位置で用いることができる。あるいはいくつかの事例では、縮退N,Ｎ,Ｎ,トリプレット配列を（例えばオリゴとして）用いることができる。
ある特徴では、縮退トリプレット（例えばN,N,G/Tトリプレット）の使用によって、ポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸の位置について天然アミノ酸の全範囲の（合計20アミノ酸）系統的で容易な生成が可能になる（別の特徴では、前記方法はまた、各アミノ酸残基、コドン、位置の可能な全ての置換よりも少ない置換の生成も含む）。例えば、100アミノ酸のポリペプチドの場合、2000個の別個の種（すなわち各位置につき20個の可能なアミノ酸Ｘ100個のアミノ酸位置）が生成される。縮退N,N,G/Tトリプレットを含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドセットを使用することによって、32個の個々の配列が20個の可能な天然のアミノ酸を全てコードすることができる。したがって、親のポリヌクレオチド配列が少なくとも1つの前記のようなオリゴヌクレオチドを用いて飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個のそれぞれ別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異導入では非縮退オリゴヌクレオチドを使用したとき、各反応容器につきただ1つの子孫ポリペプチド生成物が生じるだけである。場合によって非縮退オリゴヌクレオチドを開示の縮退プライマーとともに用いることができる。例えば、非縮退オリゴヌクレオチドを用いて対象のポリヌクレオチドで特定の点変異を生成することができる。これは、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異、並びに終止コドン及びポリペプチドフラグメントの対応する発現を生じさせる点変異を生成する1つの手段を提供する。
【０１４３】
ある特徴では、各飽和変異導入反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異を導入されるコドンの位置に一致する特定の１つのアミノ酸位置において20個全ての天然アミノ酸が提示されるように、少なくとも20の子孫ポリペプチド（例えばリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）分子をコードするポリヌクレオチドを含む（他の特徴では20個未満の天然の組合せが用いられる）。各飽和変異導入反応容器から生成される32倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば適切な宿主（例えば大腸菌宿主）に例えば発現ベクターを用いてクローニングする）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより好ましい特性の変化を提示させることによって個々の子孫ポリペプチドが同定されたとき（例えば親のポリペプチドと比較したときアルカリ性または酸性条件下でグルカンの加水分解活性が増加する）、前記子孫ポリペプチドを配列決定し、その中に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
ある特徴では、本明細書に開示したように、親のポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置に飽和変異導入を用いて変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変化が2つ以上のアミノ酸位置で同定できることがある。これら好ましいアミノ酸置換の全て又は一部分の組合せを含む1つ以上の新規な子孫分子を生成することができる。例えば、2つの具体的な好ましいアミノ酸変化が、ポリペプチドの3つのアミノ酸位置の各々で同定されるならば、順列は各位置及び3つの位置で3つの可能性を含む（最初のアミノ酸から変化のないもの及び2つの好ましい変化をもつそれぞれのもの）。したがって、3ｘ3ｘ3、または合計27の可能性が存在し、これらは以前に調べられた7つ−6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）及びいずれの位置においても変化のないものを含む。
【０１４４】
さらに別の特徴では、スクリーニングと併せて、位置飽和変異導入をシャッフリング、キメラ化、組換え及び他の変異導入方法と一緒に用いることができる。本発明は任意の突然変異導入方法の使用を提供する。前記方法には反復態様で用いられる飽和変異導入が含まれる。ある実施態様では、任意の変異導入方法がスクリーニングと併用して反復使用される。
本発明はまた、点変異をポリヌクレオチドに導入して、全範囲の単一アミノ酸置換が各アミノ酸の位置で出現する一組の子孫ポリペプチドを作製するために専有コドンプライマー（縮退N,N,N配列を含む）の使用を提供する（遺伝子位置飽和変異導入（GENE SITE SATURATION MUTAGENESISTM又はGSSM））。使用されるオリゴは、連続する第一の相同配列、縮退N,N,N配列及び、ある特徴では（必ずというわけではない）第二の相同な配列を含む。そのようなオリゴヌクレオチドを使用することによって得られる下流の子孫翻訳生成物には、N,N,N配列の縮退は20の全てのアミノ酸のためのコドンを含むので、前記ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化が含まれる。
ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴ（１つの縮退N,N,Nカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型中の本来のコドンの各々を全範囲のコドン置換に付すために用いられる。また別の特徴では、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも2つの本来のコドンを全範囲のコドン置換に付すために、少なくとも2つの縮退N,N,Nカセットが（同じオリゴまたは別個のオリゴで）用いられる。したがって、2つ以上のN,N,N配列を1つのオリゴ内に含ませ、2つ以上の部位でアミノ酸置換を導入することができる。この複数のN,N,N配列は連続していてもよいし、又は1つ以上のさらに別のヌクレオチド配列によって分離されてあってもよい。別の特徴では、付加及び欠失の導入に役立つオリゴを単独又はN,N,N配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失及び／又は置換の任意の組合せまたは並べ換えを導入することができる。
【０１４５】
ある特徴では、連続するN,N,Nトリプレット（すなわち縮退(N,N,N)ｎ配列）を含むオリゴを用いて、2つ以上の連続するアミノ酸位置で同時に変異を導入することが可能である。別の特徴では、本発明は、N,N,N配列よりも少ない縮退性を有する縮退カセットの使用を提供する。例えば、ただ1つのNのみを含む縮退トリプレットを使用する（例えばオリゴとして）ことを所望することが可能である（この場合Nはトリプレットの第一番目、第二番目又は三番目の位置に存在することができる）。あるいは、いくつかの事例では、縮退N,N,Nトリプレット配列、N,N,G/T又はN,N,G/Cトリプレット配列を使用する（例えばオリゴとして）ことを所望することができる。
ある特徴では、縮退トリプレット（例えばN,N,G/T又はN,N,G/Cトリプレット配列）の使用はいくつかの理由で有利である。ある特徴では、本発明は、ポリペプチド中の各々及び全てのアミノ酸の位置でありえるアミノ酸（合計20アミノ酸について）の全範囲の置換が系統的且つそこそこに容易に得られる手段を提供する。したがって、100アミノ酸のポリペプチドについて、本発明は系統的にかつそこそこ容易に2000個の別個の種（すなわち各位置に付き20の可能なアミノ酸X 100個のアミノ酸の位置）を作製する方法を提供する。縮退N,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列を含むオリゴの使用により、20の可能なアミノ酸をコードする32個の配列が提供されることは理解されよう。したがって、1つのそのようなオリゴを用いて親のポリヌクレオチド配列が飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、位置特異的変異導入において非縮退オリゴを使用した場合、反応容器に付きただ1個の子孫ポリペプチド生成物しか得られない。
本発明はまた、非縮退オリゴの使用を提供する。場合によって、前記オリゴは開示した縮退プライマーと一緒に用いることができる。いくつかの状況では、対象のポリヌクレオチドで特定の点変異を作製するためには、非縮退オリゴを用いることが有利であることは理解されよう。これによって、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異及び終止コドンを生成させる点変異並びにポリペプチドフラグメントの対応する発現をもたらす手段が提供される。
【０１４６】
したがって、本発明のある特徴では、飽和変異導入の各反応容器は、20アミノ酸の全てが、親のポリヌクレオチドで変異が導入されたコドンの位置に対応する特定の１つのアミノ酸の位置で提示されるように、少なくとも20の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。飽和変異導入の各反応容器から生成された32倍の縮退子孫ポリペプチドはクローン増幅に付すことができ（例えば発現ベクターを用いて適切な大腸菌宿主でクローニングできる）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。（親のポリペプチドと比較したとき）個々の子孫ポリペプチドが好ましい特性変化を示すことがスクリーニングによって確認されたら、前記の配列を決定して、前記配列に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を確認することができる。
ある特徴では、飽和変異導入を用いて親のポリペプチド中の各々及び全てのアミノ酸の位置に変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変異が2つ以上のアミノ酸の位置で確認される。これら好ましいアミノ酸置換の全て又は部分が組み合わされた1つ以上の新規な子孫分子を作製することができる。例えば、あるポリペプチド中の3つのアミノ酸の位置の各々で2つの特定のアミノ酸の変異が同定された場合、順列は各位置で3つの可能性（最初のアミノ酸から変化のないもの及び2つの好ましい変化をもつそれぞれのもの）を含む。したがって、合計3ｘ3ｘ3、又は27の可能性が存在し、これらは以前に調べられた7つ−6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）及びいずれの位置においても変化のないものを含む。
本発明は、また別の変異導入プロセスと組み合わされた飽和変異導入の使用を提供する。前記別の変異導入プロセスは例えば、ハイブリッドポリヌクレオチドを組換え及び還元的再組合せによって生成することができるように2つ以上の関連ポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入するプロセスである。
遺伝子の配列全体に変異を導入すること以外にも、本発明は、変異導入を用いてポリヌクレオチド中の多数の塩基の各々を置換することができる。この場合、変異を導入される塩基の数は、ある特徴では15から100,000のいずれかである。したがって、分子の端から端まで全ての位置に変異を導入する代わりに、全ての塩基または所定の数の塩基（ある特徴では合計で15から100,000になるサブセット）に変異を導入することができる。ある特徴では、ポリヌクレオチド配列の端から端まで各位置又は位置群に変異を導入するために、別々のヌクレオチドが用いられる。変異を導入される3つの位置から成る群はコドンであってもよい。前記変異は、変異原プライマー（異種カセットを含み、変異原カセットとも称される）を用いて導入することができる。例示的カセットは1つから500の塩基を有することができる。そのような異種カセットの各ヌクレオチドの位置はN、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G、又はEで、ここでEはA、C、GまたはTではない任意の塩基である（Eはデザイナーオリゴと称することができる）。
【０１４７】
ある特徴では、飽和変異導入は、変異を導入される所定のポリヌクレオチド配列（この場合変異を導入される配列は、ある特徴では長さが約15から100,000塩基である）中の完全な一組の変異原カセット（この場合各カセットはある特徴では長さが約1−500塩基である）に変異を導入することを含む。したがって、変異群（1から100変異の範囲である）が変異を導入される各カセットに導入される。1回の飽和変異導入の実施中に、1つのカセットに導入される変異群は、第二のカセットに導入される第二の変異群とは異なっていても同じであってもよい。そのような群の例は、欠失、付加、特定コドン群及び特定ヌクレオチド群である。
ある特徴では、変異を導入される所定配列には完全な遺伝子、経路、cDNA、完全なオープンリーディングフレーム（ORF）及び完全なプロモーター、エンハンサー、リプレッサー/トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーターまたは任意のポリヌクレオチド機能群が含まれる。一般的には、この目的のための“所定配列”は、15塩基のポリヌクレオチド配列及び15塩基から15,000塩基の長さのポリヌクレオチド配列のいずれかのポリヌクレオチドでありえる（本発明では特に15から15,000の間の全てのものが含まれる）。コドン群の選択で考慮しなければならないことには、縮退変異原カセットによってコードされるアミノ酸のタイプが含まれる。
ある特徴では、変異原カセットに導入することができる変異群では、本発明は特に縮退コドン置換及びそれによってコードされるポリペプチドライブラリーを提供する。前記は縮退オリゴを用いて提供され、前記オリゴは各位置で2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、、14、15、16、17、18、19および20アミノ酸をコードする。
【０１４８】
合成連結再アッセンブリ（SLR）：本発明は、“合成連結再アッセンブリ”、または簡潔に“SLR”、“定方向進化プロセス”と称される、新規なまたは変異した特性を有するポリペプチド、例えば本発明のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）又は抗体を生成する非確率論的遺伝子改変系を提供する。
SLRは、オリゴヌクレオチドフラグメントを非確率論的に一緒に連結する方法である。この方法は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル、連結、またはキメラ化されるのではなく、非確率論的にアッセンブリングされるという点で確率的オリゴヌクレオチドシャッフリングとは異なる。例えば、米国特許6,773,900号、同6,740,506号、同6,713,282号、同6,635,449号、同6,537,776号を参照されたい。ある特徴では、SLRは以下の工程を含む：（a）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程（前記鋳型ポリヌクレオチドは相同な遺伝子をコードする配列を含む）；（b）複数の構築ブロックポリヌクレオチドを提供する工程（前記構築ブロックポリヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドとあらかじめ定められた配列で交差再アッセンブリングを生じるように設計され、構築ブロックポリヌクレオチドは前記相同な遺伝子の変種である配列および前記変種配列とフランキングする前記鋳型ポリヌクレオチドと相同な配列を含む）；（c）前記構築ブロックポリヌクレオチドが前記鋳型ポリヌクレオチドと交差再アッセンブリングして相同な遺伝子配列変種を含むポリヌクレオチドを生成できるように、構築ブロックポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドと一緒にする工程。
SLRは、再編成を実施されるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することを必要としない。したがって、本方法は、10１００を超える種々のキメラを含む子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率論的に作製するために用いることができる。SLRを用いて10１０００を超える種々の子孫キメラを含むライブラリーの作製に用いることができる。したがって、本発明の特徴は、設計によって選択された全体的なアッセンブリの順番にしたがって完成されたキメラ核酸分子セットを製造する非確率論的方法を含む。この方法は以下の工程を含む：互いに適合する連結可能な有用な末端を有する複数の特別な核酸構築ブロックを設計に従って作製する工程、及び、設計した全体的なアッセンブリの順番が達成されるように前記核酸構築ブロックをアッセンブリングする工程。
【０１４９】
アッセンブリングされる互いに適合する核酸構築ブロックの末端は、これらが前記構築ブロックをあらかじめ定めた順序で結合させることができるならば、このタイプの指定されたアッセンブリに対して“利用可能”であると考えられる。したがって、前記核酸構築ブロックが結合される全体的なアッセンブリの順番は、連結させることができる末端の設計によって特定される。2つ以上のアッセンブリ工程が用いられる場合、核酸構築ブロックが結合される全体的アッセンブリの順番は、前記アッセンブリ工程の一連の順番によって特定される。ある特徴では、アニールされた構築片が酵素（例えばリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼ））で処理され、前記構築片の共有結合が達成される。
ある特徴では、オリゴヌクレオチド構築ブロックの設計は、祖先核酸配列鋳型セットを分析することによって得られる（祖先核酸配列は完成したキメラポリヌクレオチドの子孫セットを製造する基礎として機能する）。したがって、これら親のオリゴヌクレオチド鋳型は、変異（例えばシャッフリング又はキメラ化）を導入しようとする核酸構築ブロックの設計に役立つ配列情報源として機能する。この方法のある特徴では、複数の親核酸鋳型の配列でアラインメントを実施して1つまたは2つ以上の境界点が選択される。前記境界点は相同領域に位置し、1つ以上のヌクレオチドを含むことができる。これらの境界点は好ましくは少なくとも2つの祖先鋳型によって共有される。それによって前記境界点は、親ポリヌクレオチドの再編成のために作製されるオリゴヌクレオチド構築ブロックの境界線を引くために用いることができる。祖先分子中で同定され選別される境界点は、完成キメラ子孫分子のアッセンブリにおける潜在的キメラ形成点として機能する。境界点は、少なくとも2つの親ポリヌクレオチド配列によって共有される相同領域（少なくとも1つの相同なヌクレオチド塩基を含む）でありえる。あるいは、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも半分によって共有される相同領域であるか、または親ポリヌクレオチド配列の少なくとも2/3によって共有される相同領域であり得る。さらに好ましくは、有用な境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも3/4によって共有される相同領域であるか、または境界点は親ポリヌクレオチド配列のほぼ全てによって共有されえる。ある特徴では、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の全部によって共有される相同領域である。
ある特徴では、連結再アッセンブリ工程は、子孫キメラポリヌクレオチドの網羅的ライブラリーを作製するために網羅的に実施される。換言すれば、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが、完成キメラ核酸分子セットに提示される。同時に、別の特徴では、各組合せにおけるアッセンブリの順番（すなわち完成したキメラ核酸の各々の配列の5'から3'方向における各構築ブロックのアッセンブリの順番）は上記に記載したように意図的（または非確率論的）である。本発明の非確率論的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性は極めて低くなる。
【０１５０】
別の特徴では、前記連結再アッセンブリ方法は系統的に実施される。例えば、前記方法は、系統的に区画化された子孫分子のライブラリーを作製するために実施され、前記区画化ライブラリーは、系統的に（例えば1つずつ）スクリーニングすることができる区画を有する。換言すれば、本発明は、連続工程によるアッセンブリング反応の選択的および慎重な使用と併せて特定の核酸構築ブロックを選択的および慎重に使用することによって、特定の子孫生成物セットがいくつかの反応容器の各々で生成される仕組みの達成を提供する。前記によって系統的な調査およびスクリーニング方法の実施が可能になる。したがって、これらの方法は、潜在的に膨大な数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。特に祖先分子間で低レベルの相同性しか存在しないときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な態様でのキメラ化の実施を可能にするその能力のために、これらの方法は膨大な数の子孫分子を含むライブラリー（またはセット）の生成を提供する。本発明の連結再アッセンブリの非確率論的性質のために、生成される子孫分子は好ましくは、設計に従って選択された全体的なアッセンブリの順番を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含む。飽和変異導入および最適化された定方向進化方法もまた種々の子孫分子種の生成に用いることができる。本発明は、境界点、核酸構築ブロックのサイズ及び数並びに結合の設計の選択に関して選択と制御の自由を提供することは理解されよう。さらにまた、分子間相同性の要求は、本発明を実施し易くするために大きく緩和されることもまた理解されよう。実際、境界点はほとんどまたはまったく分子間相同性がない領域でも選択できる。例えば、コドンの揺らぎのために（すなわちコドンの縮退のために）、対応する祖先鋳型で本来コードされるアミノ酸を変更することなく核酸中にヌクレオチド置換を導入することができる。あるいは、コドンを変更して本来のアミノ酸のコードを変更してもよい。本発明は、分子間相同性を有する境界点の出現傾向を高めるために、したがって構築ブロック間で達成される結合数を高めるために（生成される子孫キメラ分子数の増加を可能にする）、前記のような置換の核酸構築ブロックへの導入を提供する。
【０１５１】
合成遺伝子再アッセンブリー：ある特徴では、本発明は、合成遺伝子再アッセンブリと称される非確率的方法を提供する。この方法は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル、連結、又はキメラ化されるのではなく、非確率論的にアッセンブリングされるという点を除けば確率論的シャッフリングといくぶん関連する。
合成遺伝子再アッセンブリ法は、シャッフリングされるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することを必要としない。本発明は、10１００を超える種々のキメラを含む子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率論的に作製するために用いることができる。おそらく、合成遺伝子再アッセンブリーを用いて10１０００を超える種々の子孫キメラを含むライブラリーを作製することができる。
したがって、ある特徴では、本発明は、設計によって選択された全体的なアッセンブリの順番にしたがって完成されたキメラ核酸分子セットを製造する非確率論的方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：互いに適合する連結可能な有用な末端を有する複数の特別な核酸構築ブロックを設計に従って作製する工程、及び、設計した全体的なアッセンブリの順番が達成されるように前記核酸構築ブロックをアッセンブリングする工程。
アッセンブリングされる互いに適合する連結可能な核酸構築ブロックの末端は、これらが前記構築ブロックをあらかじめ定めた順序で結合させることができるならば、このタイプの指定されたアッセンブリに対して“利用可能”であると考えられる。したがって、ある特徴では、前記核酸構築ブロックが結合される全体的なアッセンブリの順番は、連結させることができる末端の設計によって特定され、2つ以上のアッセンブリ工程が用いられる場合、核酸構築ブロックが結合される全体的アッセンブリの順番は、前記アッセンブリ工程の一連の順番によって特定される。本発明のある特徴では、アニールされた構築片が酵素（例えばリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼ））で処理され、前記構築片の共有結合が達成される。
【０１５２】
また別の特徴では、核酸構築ブロックの設計は、祖先核酸鋳型セットの配列を分析することによって得られる（祖先核酸鋳型は完成したキメラ核酸分子の子孫セットを製造する基礎として機能する）。したがって、これら祖先核酸鋳型は、変異が導入される（すなわちキメラ化またはシャッフルされる）核酸構築ブロックの設計に役立つ配列情報源として機能する。
ある実施態様では、本発明は、関連遺伝子の１つのファミリー及びそれらによってコードされる関連性生物のファミリーのキメラ化を提供する。特にある実施態様では、前記コードされる生成物は酵素である。本発明のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）はここに記載した方法に従って変異が導入される。
したがって本発明の特徴に従えば、複数の祖先核酸鋳型（例えば本発明のポリヌクレオチド）の配列でアラインメントを実施して1つ以上の境界点が選択される。前記境界点は相同領域に位置することができる。前記境界点は作製される核酸構築ブロックの境界線を引くために用いることができる。したがって、祖先分子中で同定され選別される境界点は、子孫分子のアッセンブリにおける潜在的キメラ形成点として機能する。
ある特徴では、有用な境界点は、少なくとも2つの祖先鋳型によって共有される相同領域（少なくとも1つの相同なヌクレオチド塩基を含む）であるが、前記境界点は、祖先鋳型の少なくとも半分、祖先鋳型の少なくとも2/3、祖先鋳型の少なくとも3/4、及びある特徴では祖先鋳型のほぼ全てによって共有されえる。ある特徴では、さらに有用な境界点は、祖先鋳型の全部によって共有される相同領域である。
ある特徴では、遺伝子再アッセンブリ工程は網羅的ライブラリーを作製するために網羅的に実施される。換言すれば、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが、完成キメラ核酸分子セットで提示される。同時に、各組合せにおけるアッセンブリの順番（すなわち完成したキメラ核酸の各々の配列の5'から3'方向における各構築ブロックのアッセンブリの順番）は設計にしたがう（または非確率論的である）。本方法の非確率論的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性は極めて低くなる。
【０１５３】
別の特徴では、前記方法は、例えば系統的に区画化されたライブラリーを作製するために実施される遺伝子再アッセンブリプロセスを提供する。前記ライブラリーは、系統的に（例えば1つずつ）スクリーニングすることができる区画を有する。換言すれば、本発明は、連続工程によるアッセンブリング反応の選択的および慎重な使用と併せて特定の核酸構築ブロックを選択的および慎重に使用することによって、特定の子孫生成物セットがいくつかの反応容器の各々で生成される実験的な仕組みの達成を提供する。前記によって系統的な調査およびスクリーニング方法の実施が可能になる。したがって、前記は、潜在的に膨大な数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。
特に祖先分子間で低レベルの相同性しか存在しないときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な態様でのキメラ化の実施を可能にするその能力のために、本方法は膨大な数の子孫分子を含むライブラリー（またはセット）の生成を提供する。本発明の遺伝子再アッセンブリの非確率論的性質のために、生成される子孫分子は、ある特徴では、設計に従って選択された全体的なアッセンブリの順番を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含む。特にある特徴では、そのように作製されたライブラリーは103を超える種々の子孫分子種から10１０００を超える種々の子孫分子種を含む。
ある特徴では、記載のように生成された完成キメラ核酸分子セットはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特徴にしたがえば、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、前記は人工遺伝子でもよい。別の特徴にしたがえば、このポリヌクレオチドは遺伝子経路であり、前記は人工遺伝子経路でもよい。本発明は、本発明により作製された1つ以上の人工の遺伝子が人工の遺伝子経路（例えば真核生物（植物を含む）で作働できる経路）に取り込まれたものを提供する。
【０１５４】
また別の実施態様では、構築ブロックが作製される工程の合成的な性質によって、in vitro過程（例えば変異導入により）またはin vivo過程（例えば宿主生物の遺伝子スプライシング能を利用することにより）で場合によって後で除去することが可能なヌクレオチド（例えば1つ以上のヌクレオチドで、例えばコドンまたはイントロンまたは調節配列であろう）を設計または導入することが可能になる。多くの事例で、有用な境界点を創出できるという潜在的な利点以外にも他の多くの理由からこれらヌクレオチドの導入はまた望ましいものでありえることは理解されよう。
したがって、別の特徴にしたがえば、本発明によって、核酸構築ブロックを用いてイントロンを導入することができる。したがって、本発明によって、機能的なイントロンを本発明の人工遺伝子に導入することができる。また本発明によって、本発明の人工遺伝子経路に機能的イントロンを導入することができる。したがって、本発明は、人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの生成を提供する。
本発明はまた、1つの（又は２つ以上の）人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの生成を提供する。ある特徴では、人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングで機能を発揮する態様とほぼ同じように遺伝子スプライシングのために1つ以上の宿主細胞で機能する。本発明は、組換え及び／又はスプライシングのために宿主生物に導入されるべき人工イントロン含有ポリヌクレオチドの作製方法を提供する。
本発明を用いて作製された人工遺伝子はまた、また別の核酸との組換えのための土台として機能することができる。同様に、本発明を用いて作製された人工遺伝子経路はまた、また別の核酸との組換えのための土台として機能することができる。ある特徴では、前記組換えは、人工の、イントロン含有遺伝子と核酸（組換えのパートナーとして機能する）との間の相同領域によって促進されるか、または前記相同領域で生じる。ある特徴では、前記組換えパートナーはまた、本発明によって生成された核酸（人工遺伝子または人工遺伝子経路を含む）でありえる。組換えは、人工遺伝子内に人工的に導入された1つ（または2つ以上）のイントロンに存在する相同性領域によって促進されるか、または前記領域で生じる。
【０１５５】
本発明の合成遺伝子再アッセンブリの方法は、複数の核酸構築ブロック（その各々はある特徴では2つの連結可能末端を有する）を利用する。各核酸構築ブロックの2つの連結可能末端は2つの平滑端であるか（すなわち各々はヌクレオチドのオーバーハングをもたない）、またある特徴では１つの平滑端及び1つのオーバーハングを有するか、ある特徴では2つのオーバーハングを有することができる。ある特徴では、この目的のために有用なオーバーハングは3'のオーバーハングでも5'のオーバーハングでもよい。したがって、核酸構築ブロックは3'オーバーハングを有するか、あるいは5'オーバーハングを有するか、あるいは2つの3'オーバーハング又は2つの5'オーバーハングを有することができる。核酸構築ブロックがアッセンブリングされて完成キメラ核酸分子が形成される全体的な順序は、意図的な実験設計によって決定され、ランダムではない。
ある特徴では、核酸構築ブロックは、2つの一本鎖核酸（一本鎖オリゴとも称される）を化学的に合成し、それらをアニールさせるためにそれらを接触させて二本鎖核酸構築物を形成することによって作製される。二本鎖核酸構築ブロックのサイズは変動しえる。これら構築ブロックのサイズは小さくても大きくてもよい。構築ブロックの例示的サイズは1塩基対（いずれのオーバーハングも含まない）から100,000塩基対（いずれのオーバーハングも含まない）の範囲である。他の例示的なサイズ範囲もまた提供される。前記は1bpから10,000bp（その間の全ての整数値を含む）の下限から、2bpから100,000bp（その間の全ての整数値を含む）の上限を有する。
【０１５６】
本発明で有用な二本鎖核酸構築ブロックを作製することができる多くの方法が有り、これらは当業者に公知であり、当業者は容易にこれらを実施できる。ある特徴にしたがえば、二本鎖核酸構築物は、先ず初めに2つの一本鎖核酸を作製し、さらにそれらをアニールさせて二本鎖核酸構築ブロック形成することによって作製される。二本鎖核酸構築ブロックの2つの鎖は、オーバーハングを形成するものは別として全てのヌクレオチドと相補的であり得る。したがって、オーバーハングを除いてミスマッチを含まない。別の特徴にしたがえば、二本鎖核酸構築ブロックの2つの鎖は、オーバーハングを形成するものは除いて、全ヌクレオチドより少ないヌクレオチドにおいて相補的である。したがって、この特徴にしたがえば、二本鎖核酸構築物を用いてコドンの縮退を導入することができる。ある特徴では、コドンの縮退は、本明細書に開示した位置飽和変異導入により、1つ以上のN,N,G/Tカセット、または別には1つ以上のN,N,Nカセットを用いて導入される。
本発明のin vivo組換え方法は未知のハイブリッドプールまたは特定のポリヌクレオチド配列の対立遺伝子座プールで手当たり次第に実施することができる。しかしながら、前記特定のポリヌクレオチドのDNA又はRNAの実際の配列を知ることが必須というわけではない。遺伝子の混合集団内での組換えを用いるアプローチは、任意の有用なタンパク質、例えば本発明のセルラーゼ又はその変種の作出に有用でありえる。このアプローチを用いて、変異した特異性又は活性を有するタンパク質を作出することができる。前記アプローチはまた、ハイブリッド核酸配列、例えばプロモーター領域、イントロン、エキソン、エンハンサー配列、遺伝子の31非翻訳領域または51非翻訳領域の作出に有用でありえる。したがって、このアプローチを用いて発現速度が増した遺伝子を作出することができる。このアプローチはまた、反復DNA配列の研究で有用である。最後に、このアプローチは本発明のリボザイムまたはアプタマーの作製に有用でありえる。
ある特徴では、本明細書に開示した発明は、高度に複雑な直鎖状配列（例えばDNA、RNA又はタンパク質）の組換えによる定方向分子進化を可能にする還元的組合せ、組換え及び選別サイクルを繰り返して使用することを意図する。
【０１５７】
最適化定方向進化系：本発明は、新規な又は変異した特性をもつポリペプチド、例えば本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素、又は抗体を生成するために、“最適化定方向進化系”と称される非確率論的遺伝子改変系を提供する。ある特徴では、最適化定方向進化は、組換えによる核酸の定方向分子進化を可能にする、還元的再組合せ、組換え及び選別の反復サイクルの使用を意図する。
最適化定方向進化は、進化させたキメラ配列の大きな集団の作出を可能にし、この場合、作出された集団には予め定められた数の交差事象を含む配列がきわめて豊富に存在する。交差事象は、一方の親の変種から別の親の変種へ配列のシフトが生じるキメラ配列内の点である。そのような点は、通常は2つの親に由来するオリゴヌクレオチドが一緒に連結されて単一の配列を形成する結合部に存在する。本方法は、最終的なキメラ配列集団が選択した数の交差事象を豊富に含むことができるようにオリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、予め定められた数の交差事象を含むキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
さらにまた、本方法は、他の系と比較して膨大な量の可能なタンパク質変種スペースの探索のための簡便な手段を提供する。以前には、反応中に例えば10１３個のキメラ分子が生成された場合、そのような膨大な数の変種の特定の活性についてテストすることは極めて困難であろう。さらにまた、子孫集団の顕著な部分が、特定の活性のレベルが増加している可能性が少ないタンパク質を生じる非常に大きな数の交差事象を含むであろう。本方法を用いることによって、キメラ分子集団は特定の数の交差事象を含む変種を豊富に含むことができる。したがって、反応中になお10１３個のキメラ分子が生成されても、更なる分析のために選別される分子の各々は、例えば3つの交差事象だけを含む可能性が高くなる。生成された子孫集団が予め定めた数の交差事象を持つように偏らせることができるので、キメラ分子間の機能的変種に対する境界が減少する。これによって、最初の親のポリヌクレオチドに由来するどのオリゴヌクレオチドが特定の属性に影響を及ぼすために必要かを計算するときにより操作しやすい数の変数が提供される。
【０１５８】
キメラ子孫ポリヌクレオチドを作製する１つの方法は、それぞれの親の配列のフラグメント又は部分に対応するオリゴヌクレオチドを作製することである。各オリゴヌクレオチドは、ある特徴では、固有の重複領域を含み、その結果、前記オリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって、各オリゴヌクレオチドフラグメントが正しい順番でアッセンブリングされた新規な変種が生成される。本発明のこれらの方法を実施するためのまた別にプロトコルは、米国特許6,773,900号、同6,740,506号、同6,713,282号、同6,635,449号、同6,605,449号、同6,537,776号、同6,361,974号で見出すことができる。
各親変種のために作出されるオリゴヌクレオチドの数は、最終的に作製されるキメラ分子で生じる交差の総数と関係がある。例えば、3つの親ヌクレオチド配列変種が提供され、連結反応を経て高温でより高い活性をもつキメラ変種を見つけることができるであろう。1つの例として、50個のオリゴヌクレオチド配列を含むセットを各親変種のそれぞれの部分に対応して作製することができる。したがって、連結アッセンブリ工程の間に、キメラ配列の各々の中に50個までの交差事象が存在することができよう。生成されたキメラポリヌクレオチドの各々が交互に各親変種由来のオリゴヌクレオチドを含む確率は非常に低い。各オリゴヌクレオチドフラグメントが連結反応で同じモル濃度で存在するならば、いくつかの位置で同じ親に由来するオリゴヌクレオチドが互いに並んで連結され、したがって交差事象を生じない可能性がある。各親に由来する各オリゴヌクレオチドの濃度がこの例のいずれの連結工程でも一定に保たれるならば、同じ親変種に由来するオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で連結され、交差を生じないチャンスは1/3（3つの親と仮定した）である。
【０１５９】
したがって、親変種セットの数、各変種に対応するオリゴヌクレオチドの数、及び連結反応の各工程における各変種の濃度が与えられたならば、確率濃度関数（probability density function (PDF)）を決定して連結反応の各工程で生じる可能性がある交差事象をもつ集団を予測することができる。PDFの決定の根拠となる統計学および数学は以下に記載される。これらの方法を用いることによって、前記の確率濃度関数を決定することができ、したがって個々の連結反応から生じる予め定めた数の交差事象のためにキメラ子孫集団の濃度を高めることができる。さらにまた、交差事象の標的数は予め定めることができ、続いて、予め定めた交差事象数に集中する確率濃度関数をもたらす連結反応の各工程における各親オリゴヌクレオチドの出発量を算出するために前記系をプログラミングすることができる。これらの方法は、組換えによりポリペプチドをコードする核酸の定方向分子進化を可能にする還元的再組合せ、組換え及び選別の反復サイクルを用いることを意図する。前記の系は進化したキメラ配列の大集団の作製を可能にし、前記作製された集団は、予め定めた数の交差事象を含む配列が顕著に濃縮されている。交差事象は、一方の親変種からもう一方の親変種へ配列のシフトが生じるキメラ配列中の点である。そのような点は通常は2つの親に由来するオリゴヌクレオチドが一緒に連結されて単一の配列を形成する結合部に存在する。前記方法は、最終的なキメラ配列集団が選択した数の交差事象に富むことができるようにオリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、予め定めた数の交差事象を含むキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
さらにまた、これらの方法は、他の系と比較して膨大な量の可能なタンパク質変種空間の探索のための簡便な手段を提供する。本明細書に記載した方法を用いることによって、特定の数の交差事象を含む変種についてキメラ分子集団を濃縮することができる。したがって、反応中になお10１３個のキメラ分子が生成されても、更なる分析のために選別される分子の各々は、例えば3つの交差事象だけを含む可能性が高くなる。生成された子孫集団が予め定めた数の交差事象を持つように偏らせることができるので、キメラ分子間の機能的変種に対する境界線が減少する。これによって、最初の親のポリヌクレオチドに由来するどのオリゴヌクレオチドが特定の属性に影響を及ぼすために必要かを計算するときにより操作しやすい数の変数が提供される。
ある特徴では、前記方法は、それぞれの親の配列のフラグメントまたは部分に対応するオリゴヌクレオチドを作製することによって、キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を生成する。各オリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって各オリゴヌクレオチドフラグメントが正しい順番でアッセンブリングされた新規な変種が生じるように、ある特徴では、各オリゴヌクレオチドは固有のオーバーラップ領域を含む。例えばまた、米国特許6,773,900号、同6,740,506号、同6,713,282号、同6,635,449号、同6,605,449号、同6,537,776号、同6,361,974号を参照されたい。
【０１６０】
交差事象の決定：本発明の特徴は、所望の交差事象の確立濃度関数（PDF）、再アッセンブリングされる親遺伝子の数及び再アッセンブリでのフラグメント数を入力としての受け取るシステム及びソフトを含む。このプログラムの出力結果は、再アッセンブリングされた遺伝子を製造するためのレシピを決定するために用いることができる“フラグメントPDF”及びこれら遺伝子の概算交差PDFである。本明細書に記載されるプロセッシングは、ある特徴では、MATLABTM（The Mathworks, Natick, Massachusetts）、プログラミング言語及びテクニカルコンピューティングのための発展環境で実施される。
【０１６１】
反復工程：本発明のいずれの工程も何度も繰り返すことができる。例えば、変異した又は新規なセルラーゼ、例えば本発明のエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼを同定し、再度単離し、再度改変し、再度活性について試験することができる。この工程は、所望の表現型が生成されるまで何度も繰り返すことができる。例えば、完全な生化学的同化作用または異化作用経路（例えばリグノセルロース系酵素活性を含む）を細胞内に高度な操作によりもたらすことができる。
同様に、特定のオリゴヌクレオチドが所望の属性（例えば新規なリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素表現型）について全く影響を与えないと決定されたならば、除去される配列を含むより大きな親オリゴヌクレオチドを合成することによって前記オリゴヌクレオチドは可変要素として除去することができる。配列をより大きな配列内に取り込むことによって一切の交差事象が防止されるので、子孫ポリヌクレオチド中にはこの配列の変型はもはや全く存在しないであろう。どのオリゴヌクレオチドが所望の属性と最も関係があり、どのオリゴヌクレオチドが無関係であるかを決定するこの反復行為は、特定の属性又は活性を提供する可能性があるタンパク質の全てについてより効率的な探索を可能にする。
【０１６２】
in vivoシャッフリング：多様な特徴において、分子のin vivoシャッフリングが、本発明のポリペプチド（例えば抗体又は本発明のセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼなど）の変種を提供するために、本発明の方法で使用される。in vivoシャッフリングは、マルチマーを組みかえる細胞の天然の特性を利用して実施することができる。in vivo組換えは分子の多様性をもたらす主要な天然の経路を提供してきたが、一方遺伝子組み換えは以下を含む比較的複雑な過程のままである：1）相同性の認識；2）鎖の切断、鎖の侵襲、および組換えキアズマの生成をもたらす代謝工程；及び最終的に3）別個の組換え分子へのキアズマの解離。キアズマの形成は相同な配列の認識を必要とする。
別の特徴では、本発明は、少なくとも第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを製造する方法を含む。本発明を用い、少なくとも1つの部分的な配列相同性領域を共有する少なくとも第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチド（一方又は両方が本発明の例示的リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素コード配列）を適切な宿主細胞に導入することによってハイブリッドヌクレオチドを生成することができる。前記部分的配列相同性領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを生成する配列再編成をもたらす過程を促進する。本明細書で用いられる“ハイブリッドポリヌクレオチド”という用語は、本発明の方法により得られる、少なくとも2つの原型ポリヌクレオチド配列由来の配列を含む任意のヌクレオチド配列である。そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列統合を促進する分子間組換え事象により生じる。さらにまた、そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子内のヌクレオチド配列を変異させるために反復配列を利用する分子内還元的再組合せ方法により生成することができる。
【０１６３】
ある特徴では、in vivo再組合せは、包括的に“組換え”と称される“分子間”プロセス（細菌では一般的に“RecA-依存”現象と見られる）に集約される。本発明は、配列を組換えさらに再組合せを生じる宿主細胞の組換えプロセス、または細胞内の擬似反復配列の複雑性を欠失によって減少させる再帰的プロセスを仲介する細胞の能力を必要とするであろう。“還元的再組合せ”のこのプロセスは“分子内”Rec-A非依存プロセスによって生じる。
本発明の別の特徴では、新規なポリヌクレオチドは、還元的再組合せのプロセスによって作製することができる。本方法は、連続配列を含む構築物の生成（原型コード配列）、それらの適切なベクターへの挿入及びそれに続く適切な宿主へのそれらの導入を必要とする。個々の分子実体の再組合せは、相同性領域を有する構築物中の連続配列間または擬似反復ユニット間のコンビナトリアルプロセスによって生じる。再組合せプロセスは組換え及び／又は反復配列の複雑性及び程度の減少をもたらし、新規な分子種の生成をもたらす。多様な処理を適用して、再組合せの速度を速めることができる。これらの処理には、紫外線又はDNA損傷性化学物質による処理及び／又は“遺伝的不安定性”レベルの強化を示す宿主細胞株の使用が含まれよう。したがって、再組合せプロセスは相同な組換え又は自身の進化を誘導する擬似反復配列の自然の特性を必要とすることがあろう。
反復配列又は“擬似反復”配列は遺伝的不安定性において役割を果たす。ある特徴では、“擬似リピート”はそれらの原型ユニットの構造に制限されないリピートである。擬似反復ユニットは構築物中で配列のアレイ（すなわち類似配列の連続ユニット）として提示されえる。いったん連結されると、連続配列間の結合点は本質的に見えなくなり、生成された構築物の擬似反復特性は今や分子レベルで連続性である。細胞の欠失プロセスは、生成構築物が擬似反復配列間の複雑性を低下させるために実施される。擬似反復ユニットは、スリップ事象を発生させることができる鋳型のレパートリーを実際的には無制限に提供する。ある特徴では、擬似リピートを含む構築物は、擬似反復ユニット内の実質的にはいずれの場所でも欠失（及び潜在的には挿入）事象が発生できるように十分な分子の弾性を効果的に提供する。
擬似反復配列が全て同じ向き（例えば頭尾連結またはその逆）で連結されるとき、細胞は個々のユニットを区別することができない。結果的に、再帰的プロセスが配列全体で発生することが可能である。対照的に、例えばユニットが頭尾連結ではなく頭頭連結で提示されるとき、本発明は近傍のユニットの末端の輪郭を明らかにし、その結果欠失形成は分離されてある別個のユニットが失われるのを促進するであろう。したがって、配列が同じ向きで存在することは本発明の方法に関しては好ましい。擬似反復配列のランダムな向きは再組合せの効率の低下をもたらすが、前記配列の一定の向きは最高の効率を提供するであろう。しかしながら、同じ向きの連続配列の数が減少することによって効率は低下するが、それによって新規な分子の効果的な回収のために十分な弾性はなお提供されえる。構築物は、より高い効率を可能にするために同じ向きの擬似反復配列を用いて作製することができる。
【０１６４】
配列は、以下を含む多様な方法のいずれかを用いて頭尾の向きでアッセンブリすることができる：
a）ポリ-Aヘッド及びポリ-Tテールを含むプライマー（一本鎖として作製されたとき、前記は方向性を提供する）を利用することができる。これは、プライマーの最初の数塩基をRNAから作製（したがってRnaseHで容易に除去できる）することにより達成される。
b）固有の制限切断部位を含むプライマーを利用することができる。マルチ部位、固有配列一式、並びに反復合成及び連結工程が要求されるであろう。
c）プライマーの内部数塩基をチオール化し、さらにエキソヌクレアーゼを用いて適切なテールを有する分子を生成することができる。
ある特徴では、再組合せされた配列の回収は反復インデックス（RI）が低下したクローニングベクターを同定することを必要とする。続いて再組合せされたコード配列を増幅によって回収することができる。生成物を再クローニングして発現させる。RIが低下したクローニングベクターの回収は以下によって実施することができる：
1）複雑性が低下したときにのみ構築物が安定的に維持されるベクターの使用。
2）物理的方法による短縮ベクターの物理的回収。この場合には、クローニングベクターは、標準的なプラスミド単離方法及びアガロースゲルでの、又は標準的な方法を使用する低分子量カットオフによるカラムサイズ分画を用いて回収されるであろう。
3）挿入物のサイズが低下したときに選別することができる分断遺伝子を含むベクターの回収。
4）発現ベクター及び適切な選別を用いる直接選別技術の使用。
関連生物から得られたコード配列（例えば遺伝子）は高度な相同性を示すことが可能で、極めて多様なタンパク質生成物をコードしえる。このような配列タイプは、擬似リピートとして本発明で特に有用である。下記に例示する例はほぼ同一の原型コード配列（擬似リピート）の再組合せを示しているが、しかしながら本方法はそのようなほぼ同一のリピートに限定されない。
【０１６５】
下記の例は本発明の例示的方法を示す。3つの固有種に由来するコード核酸配列（擬似リピート）が記載されている。各配列は別個の一組の特性を有するタンパク質をコードする。前記配列の各々はただ1つの塩基対又は数塩基対が配列内の固有の位置で異なっている。擬似反復配列は別々に又は包括的に増幅され、ランダム連結によりアッセンブリされ、それによって連結分子集団において全ての可能な入れ替え及び組合せが入手できる。擬似リピートの数はアッセンブリ条件によって制御することができる。構築物中の擬似反復ユニットの平均数は反復インデックス（RI）と定義される。
いったん形成されたら、構築物は公表されているプロトコルにしたがってアガロースゲルでサイズ分画し（又は分画せずに）、クローニングベクターに挿入し、適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。続いて細胞を増殖させ、“還元的再組合せ” を起こさせる。所望する場合は、還元的再組合せ過程の速度はDNA損傷の導入によって速めることができる。RIの低下が“分子内メカニズム”により反復配列間の欠失形成によって仲介されるか、または“分子間メカニズム”により組換え様事象によって仲介されるかは重要ではない。最終目標は分子の再組合せによる全ての可能な組合せである。
場合によって、本方法はシャッフルされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングし、予め定めた巨大分子（例えばタンパク質性レセプター、オリゴ糖、ビリオン又は他の予め定めた化合物若しくは構造）と結合または相互作用するか、又は前記との特定の反応を触媒する能力を有する個々のシャッフルされたライブラリーメンバー（例えば酵素の触媒ドメイン）を同定するさらに別の工程を含む。
そのようなライブラリーから同定されたポリペプチドを治療、診断、研究及び関連する目的（例えば触媒、水溶液の浸透圧を高めるための溶質など）に用いることができ、及び／又は1つ以上の更なるシャッフリング及び／又は選別サイクルに付すことができる。
【０１６６】
別の特徴では、組換え若しくは再組合せ前又はそれらの間に、本発明の方法によって生成されたポリヌクレオチドを原型ポリヌクレオチドへの変異の導入を促進する薬剤又はプロセスに委ねることができる。そのような変異の導入は生成されるハイブリッドポリヌクレオチド及びそれらからコードされるポリペプチドの多様性を高めるであろう。変異導入を促進する薬剤又はプロセスには以下が含まれるえる（ただしこれらに限定されない）：(+）-CC-1065又は合成類似体、例えば(+)-CC-1065-(N3-アデニン)（Sun and Hurley, 1992）；DNA合成を阻害することができるN-アセチル化又は脱アセチル化4'-フルオロ-4-アミノビフェニル付加物（例えば以下を参照されたい：van de Poll et al. (1992)）；またはDNA合成を阻害することができるN-アセチル化または脱アセチル化-アミノビフェニル付加物（さらにまた例えば以下を参照されたい：van de Poll et al. (1992), pp.751-758）；三価クロム、三価クロム塩、DNA複製を阻害することができる多環式芳香族炭化水素（PAH）DNA付加物、例えば7-ブロモメチル-ベンゾ[a]アントラセン（“BMA”）、トリス（2,3-ジブロモプロピル）ホスフェート（“トリス-BP”）、1,2-ジブロモ-3-クロロプロパン（“DBCP”）、2-ブロモアクロレイン（2BA）、ベンゾ[a]ピレン-7,8-ジヒドロジオール-9-10-エポキシド（“BPDE”）、白金(II)ハロゲン塩、N-ヒドロキシ-2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]-キノリン（“N-ヒドロキシ-IQ”）およびN-ヒドロキシ-2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-f]-ピリジン（“N-ヒドロキシ-PhIP”）。PCR増幅を遅くするかまたは停止させるための例示的手段は、紫外線(+)-CC-1065および(+)-CC-1065-(N3-アデニン）から成る。特に包含される手段はDNA付加物またはポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプール由来のDNA付加物を含む）であり、前記は、更なる処理の前にポリヌクレオチドを含む溶液を加熱することを含む過程によって遊離または除去することができる。
また別の特徴では、本発明は、生物学的活性を有する組換えタンパク質を製造する方法を意図し、前記方法はハイブリッド又は再組合せされたポリヌクレオチドの生成を提供する本発明の条件下で、野生型タンパク質をコードする二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含むサンプルを処理することを含む。
【０１６７】
配列変種の作製：本発明はまた、本発明の核酸（例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）配列の変種を作製するさらに別の方法を提供する。本発明はまた、本発明の核酸およびポリペプチドを用いてリグノセルロース系酵素を単離するさらに別の方法を提供する。ある特徴では、本発明は本発明のリグノセルロース系酵素コード配列（例えば遺伝子、cDNAまたはメッセージ）の変種を提供する。前記変種は、任意の手段（例えばランダム若しくは確率的方法、または非確率的若しくは上記に記載した“定方向進化”方法を含む）によって変異させることができる。
前記単離変種は天然に存在するものでもよい。変種はまたin vitroで生成することもできる。変種は遺伝子工学技術、例えば部位特異的変異導入、化学的ランダム変異導入、エキソヌクレアーゼIII欠失方法及び標準的クローニング技術を用いて生成することができる。あるいは、そのような変種、フラグメント、類似体又は誘導体は、化学的合成又は改変方法を用いて生成することができる。変種を作製する他の方法もまた当業者にはよく知られていよう。前記には、天然の単離物から得られた核酸配列を改変して、それらの工業的価値または実験室利用を高める特徴をもつポリペプチドをコードする核酸を生成する方法が含まれる。そのような方法では、天然の単離物から得られた配列に対して1つ以上のヌクレオチドの相違を有する多数の変種配列が生成され、特徴が決定される。これらのヌクレオチドの相違は、天然の単離物の核酸によってコードされるポリペプチドに対してアミノ酸変化をもたらすことができる。
【０１６８】
例えば、変種は変異性PCRを用いて作製することができる。変異性PCRのある特徴では、PCRは、DNAポリメラーゼの複写信頼性が低く、高率の点変異がPCR全長にわたって得られるような条件下で実施される。変異性PCRは例えば以下に記載されている：D.W. Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989); R.C. Caldwell & G.F. Joyce, PCR Methods Applic. 2:28-33 (1992)。簡単に記せば、前記の方法では、変異を導入される核酸は、PCRプライマー、反応緩衝液、MgCl２、MnCl２、Taqポリメラーゼおよび適切な濃度のdNTPと混合され、PCR生成物の全長にわたって高率の点変異が達成される。例えば、前記反応は、20fmoleの突然変異を導入されるべき核酸、30pmoleの各PCRプライマー、反応緩衝液（50mMのKCL、10mMのトリス（pH8.3）及び0.01％のゼラチンを含む）、7mMのMgCl２、0.5mMのMnCl２、5単位のTaqポリメラーゼ、0.2mMのdGTP、0.2mMのdATP、1mMのdCTPおよび1mMのdTTPを用いて実施される。PCRでは、94℃で1分、45℃で1分及び72℃で1分の30サイクルが実施される。しかしながら、これらのパラメーターは適宜変動させることができることは理解されよう。変異核酸は適切なベクターでクローニングされ、前記変異核酸によってコードされたポリペプチドの活性が評価される。
ある特徴では、変種は、関心のある任意のクローニングされたDNAで位置特異的変異を生じるオリゴヌクレオチド特異的変異導入を用いて生成することができる。オリゴヌクレオチド変異導入は例えば以下に記載されている：Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57。簡単に記せば、前記の方法では、クローン化DNAに導入されるべき1つ以上の変異をもつ複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが合成され、変異を導入される前記クローン化DNAに挿入される。ある特徴では、変異を導入されたDNAを含むクローンを回収し、その中でコードされるポリペプチドの活性を評価する。
【０１６９】
変種を作製するまた別の方法はアッセンブリPCRである。アッセンブリPCRは、小さなDNAフラグメント混合物からPCR生成物をアッセンブリングすることを必要とする。多数の様々なPCR反応が同じバイアル中で並行して生じ、1つの反応の生成物が別の反応の生成物をプライミングする。アッセンブリPCRは例えば米国特許第5,965,408号に記載されている。
ある特徴では、セクシュアルPCR変異導入が本発明の変種作製の例示的方法である。セクシュアルPCR変異導入のある特徴では、強制相同性組換えが、異なるが高度の相関性を有するDNA配列をもつDNA分子間においてin vitroで生じる。前記は、DNA分子のランダムなフラグメント化とそれに続くPCR反応におけるプライマーの伸長による交差の固定の結果である。セクシュアルPCR変異導入は例えば以下に記載されている：Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。簡単に記せば、前記の方法では、組換えられるべき複数の核酸をDNaseで消化して平均サイズが50−200ヌクレオチドのフラグメントを生成する。所望の平均サイズをもつフラグメントを精製し、PCR混合物に再懸濁する。PCRは、前記核酸フラグメント間の組換えが促進される条件下で実施される。PCRは、例えば以下によって実施できる:前記精製フラグメントを10−30ng/μＬの濃度で溶液（0.2Mの各dNTP、2.2mMのMgCl２、50mMのKCl、10mMのトリス塩酸（pH9.0）および0.1％トリトンX-100）に再懸濁する。100μＬの反応混合物につき2.5単位のTaqポリメラーゼを添加し、PCRを以下の方式を用いて実施する：94℃60秒、94℃30秒、50−55℃30秒、72℃30秒（30−45回）および72℃で5分。しかしながら前記パラメーターは適宜変動させることができることは理解されよう。いくつかの特徴では、オリゴヌクレオチドをPCR反応に含ませることができる。他の特徴では、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントをPCR反応の最初のセットで用い、Taqポリメラーゼをその後のPCR反応セットで用いることができる。組換え配列を単離し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０１７０】
ある特徴では、変種はin vivo変異導入によって作製される。いくつかの特徴では、細菌株（例えば大腸菌株）で対象の配列を増殖させることによって、対象の配列中でランダム変異が生成される。前記大腸菌株はDNA修復経路の1つ以上の変異を含む。そのような“ミューテーター”株は野生型の親よりも高いランダム変異率を有する。これらの株の1つでDNAを増殖させることによって、最終的にはDNA内部にランダム変異が生成されるであろう。in vivo変異導入に使用するために適したミューテーター株は、例えばPCT公開広報WO91/16427（1991年10月31日公開、発明の名称”Methods for Phenotype Creation from Multiple Gene Populations”）に記載されている。
変種はまたカセット変異導入を用いて生成することができる。カセット変異導入では、二本鎖DNA分子の小さな領域が、天然の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド“カセット”で置き換えられる。前記オリゴヌクレオチドはしばしば完全におよび／または部分的に任意抽出された天然の配列を含む。
再帰的アンサンブル変異導入もまた変種の生成に用いることができる。再帰的アンサンブル変異導入は、表現型が関連性をもつ変異体の多様化集団（そのメンバーはアミノ酸配列が異なる）を生成するために開発されたタンパク質工学（タンパク質変異導入）のためのアルゴリズムである。前記方法はフィードバックメカニズムを用いて、コンビナトリアルカセット変異導入（combinatorial cassette mutagenesis）の連続一巡工程を制御する。再帰的アンサンブル変異導入は例えば以下に記載されている：Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815。
【０１７１】
いくつかの特徴では、変種はエクスポネンンシャルアンサンブル変異導入を用いて生成される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は、高い割合の固有で機能的な変異体を含むコンビナトリアルライブラリーを生成する方法である。前記変異導入では、残基の小グループが並行して任意抽出され、機能的タンパク質を生じるアミノ酸がそれぞれ変更された位置で同定される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は例えば以下に記載されている：Delagrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552。ランダム及び部位特異的変異導入は例えば以下に記載されている：Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455。
いくつかの特徴では変種はシャッフリングの方法によって生成される。前記では、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分が融合され、例えば米国特許第5,965,408号（1996年7月9日出願、発明の名称”Methods of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis”）、及び同第5,939,250号（1996年5月22日出願、発明の名称"Production of Enzymes Having Desirede Activities by Mutagenesis”）に記載されたようなキメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列が生成される。
本発明のポリペプチドの変種は、本発明の配列のポリペプチドの1つ以上のアミノ酸残基が保存又は非保存アミノ酸残基（ある特徴では保存アミノ酸残基）で置換されれた変種でありえる。さらにそのような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものでも、そうでないものでもよい（例えば置換は合成残基を用いてもよい）。
ある特徴では、保存的置換は、同様な特徴を有する別のアミノ酸によってポリペプチド内のあるアミノ酸が置換されるものである。ある特徴では、本発明の保存的置換は以下の置換を含む：脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン）の別の脂肪族アミノ酸による置換；セリンのスレオニンによる置換又はその逆；酸性残基（例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸）の別の酸性残基による置換；アミド基をもつ残基（例えばアスパラギン及びグルタミン）の別のアミド基をもつ残基による置換；塩基性残基（例えばリジン及びアルギニン）の別の塩基性残基による交換；及び芳香族残基（例えばフェニルアラニン、チロシン）の別の芳香族残基による置換。
他の変種は、本発明のポリペプチドの1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含む変種である。ある特徴では、他の変種は、前記ポリペプチドが別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と結合しているものである。さらに別の変種は、追加のアミノ酸が前記ポリペプチドに融合されているものである。前記追加されるアミノ酸は例えばリーダー配列、分泌配列、前タンパク質配列、又は前記ポリペプチドの精製、濃縮若しくは安定化を促進する配列である。
いくつかの特徴では、フラグメント、誘導体及び類似体は、本発明のポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持している。他の特徴では、前記フラグメント、誘導体又は類似体は前タンパク質を含み、前記前タンパク質部分の切断によって前記フラグメント、誘導体又は類似体は活性化されて活性なポリペプチド生成することができる。
【０１７２】
宿主細胞で高レベルのタンパク質発現を達成するコドンの最適化：本発明は、コドン使用頻度を改変するために、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素コード核酸を改変する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、リグノセルロース系酵素をコードする核酸のコドンを改変して宿主におけるその発現を増加又は低下させる方法を提供する。本発明はまた、宿主細胞でのその発現を高めるために改変されたリグノセルロース系酵素をコードする核酸、そのように改変されたリグノセルロース系酵及び前記改変リグノセルロース系酵素を製造する方法を提供する。前記方法は、“非優先”または“低優先”コドンをリグノセルロース系酵素コード核酸で同定し、さらにこれら非優先若しくは低優先コドンの1つ以上を、前記コドンと同じアミノ酸をコードする“優先コドン”で置き換えることを含み、核酸内の少なくとも1つの非優先または低優先コドンが同じアミノ酸をコードする優先コドンによって置き換えられてある。優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度に提示されるコドンであり、非優先または低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである。
本発明の核酸、発現カセット及びベクターの発現のための宿主細胞には細菌、酵母、菌類、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が含まれる（上記考察を参照されたい）。したがって、本発明は、これら全ての細胞でコドン使用頻度を最適化する方法、コドン改変核酸及びコドン改変核酸によって生成されるポリペプチドを提供する。例示的な宿主細胞には、細菌、例えばエスケリキア（Escherichia）、ラクトコッカス（Lactococcus）、サルモネラ（Salmonella）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、又はバチルス（Bacillus）の任意の種が含まれ、前記には、例えば大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）が含まれる。例示的な宿主細胞にはまた真核生物、例えば種々の菌類、例えば酵母、例えば、ピキア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、クルイヴェロミセス（Kluyveromyces）、ハンセヌラ（Hansenula）、アスペルギルス（Aspergillus）、又はシュワンニオミセス（Schwanniomyces）の任意の種が含まれ、前記にはピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイヴェロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、又は糸状菌、例えばトリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルスsp.（アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）を含む）、さらに哺乳動物細胞及び細胞株、並びに昆虫細胞及び細胞株が含まれる。したがって、本発明はまたこれら生物及び種での発現のために最適化された核酸及びポリペプチドを含む。
例えば、細菌細胞から単離されたリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素をコードする核酸のコドンは、前記リグノセルロース系酵素が由来した細菌とは異なる細菌細胞、酵母、菌類、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞で前記核酸が最適に発現できるように改変される。コドンを最適化する方法は当業界において周知で、例えば以下を参照されたい：US Pat. No. 5,795,737；Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118；Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188；Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253（マウス系におけるコドンの最適化を記載）。さらにまた以下を参照されたい：Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253（マウス系におけるコドンの最適化を記載）；Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24（酵母におけるコドンの最適化を記載）；Feng (2000) Biochemistry 39:15339-15409（大腸菌におけるコドンの最適化を記載）；Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264（大腸菌における分泌に影響するコドン使用頻度の最適化を記載）。
【０１７３】
非ヒトトランスジェニック動物
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド（例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）、発現カセット若しくはベクター、又はトランスフェクト若しくは形質転換された細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。本発明はまた、これらの非ヒトトランスジェニック動物の作製方法及び使用方法を提供する。
前記トランスジェニック非ヒト動物は、例えば本発明の核酸を含むイヌ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ（全てのブタ類、去勢食用ブタ及び関連動物を含む）、ウシ、ラット及びマウスでありえる。これらの動物は、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性の研究のためのin vivoモデルとして、又はリグノセルロース系酵素活性をin vivoで変化させる薬剤のスクリーニングのためのモデルとして用いることができる。非ヒトトランスジェニック動物で発現されるべきポリペプチドのコード配列は、構成的であるように、又は組織特異的、発育特異的もしくは誘導性転写調節因子の制御下にあるように設計することができる。
非ヒトトランスジェニック動物は当分野で公知の任意の方法を用いて設計及び作製することができる。例えば以下を参照されたい：US Patent No. 6,211,428、6,187,992、6,156,952、6,118,044、6,111,166、6,107,541、5,959,171、5,922,854、5,892,070、5,880,327、5,891,698、5,639,940、5,573,933、5,387,742、5,087,571（形質転換細胞及び卵並びにトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ及びウシの作製及び使用について記載されている）。さらにまた例えば以下を参照されたい：Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157（トランスジェニック乳牛のミルク中の組換えタンパク質の製造について記載）；Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461（トランスジェニックヤギの作製を示す）。米国特許第6,211,428号は、DNA配列を含む核酸構築物をその脳で発現する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の作製および使用について記載している。米国特許第5,387,742号は、クローニングした組換え配列又は合成DNA配列のマウス受精卵への注入、前記注入卵の偽妊娠雌への移植、及びトランスジェニックマウスの妊娠期間満了までの成育について記載している。米国特許第6,187,992号はトランスジェニックマウスの作製及び使用を記載している。
“ノックアウト動物”もまた本発明の方法の実施に用いることができる。例えば、ある特徴では、本発明のトランスジェニック又は改変動物は“ノックアウト動物”、例えば内因性遺伝子を発現しないように操作された“ノックアウトマウス”を含む（前記内因性遺伝子は、本発明のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）又は本発明のリグノセルロース系酵素を含む融合タンパク質を発現する遺伝子で置き換えられている）。
【０１７４】
トランスジェニック植物および種子
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド(例えばリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）、発現カセット、ベクター及び／又はトランスフェクト若しくは形質転換された細胞を含むトランスジェニック植物及び種子（並びにそれらに由来する植物部分、例えば果実、根など）を提供する。
本発明は、本発明の核酸を含む形質転換、形質導入、感染及びトランスジェニック植物を提供し、さらに、本発明を実施するために、例えば植物又は植物部分（全植物、植物廃棄物、植物副産物、植物部分（たとえば葉、茎、花、根など）、植物プロトプラスト、種子、並びに植物細胞及び子孫及び前記の細胞培養を含む）からバイオ燃料及び／又はアルコール又は糖を生成するためにこれら植物を用いる。ある特徴では、本発明の実施（本発明の細胞及び植物並びに方法を含む）で用いられる植物の種類は、形質転換技術に馴染みやすい高等植物の種類と同じように広く、被子植物（単子葉植物及び双子葉植物）とともに、裸子植物（種々の倍数性レベル（ポリプロイド、ジプロイド、ハプロイド及び半接合状態を含む）の植物を含む）が含まれる。
本発明はまた、本発明の核酸及び／又はポリペプチドを含む植物生成物、例えば油、種子、根、葉、抽出物、果実、花粉など、及び／又はわら又は干し草などを提供する。前記トランスジェニック植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。本発明はまたこれらトランスジェニック植物及び種子の製造方法及び使用方法を提供する。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は当分野で公知の任意の方法にしたがって構築できる。例えば米国特許第6,309,872号、5,508,468号、7,151,204号及び7,157,623号（トウモロコシ又はZea mays）；同7,141,723号（Cruciferae及びBrassica）；同6,576,820号及び6,365,807号（トランスジェニックなイネ）を参照されたい。
本発明の核酸及び発現構築物は任意の手段によって植物細胞に導入できる。例えば、核酸又は発現構築物は所望の植物宿主のゲノムに導入することができるが、また前記核酸または発現構築物はエピソームであってもよい。所望の植物のゲノム中への導入は、宿主のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）の生成が内因性の転写又は翻訳制御エレメントによって調節できるようなものであろう。本発明はまた、例えば相同組換えによる遺伝子配列の挿入によって内因性遺伝子の発現が破壊された“ノックアウト植物”を提供する。“ノックアウト”植物を作製する手段は当分野で周知であり、例えば以下を参照されたい：Strepp (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373；Miao (1995) Plant J. 7:359-365。下記のトランスジェニック植物についての考察を参照されたい。
【０１７５】
本発明の核酸を用いて、所望の属性を本質的に任意の植物（例えば澱粉生成植物、例えばジャガイモ、トマト、ダイズ、テンサイ、トウモロコシ、コメ、オオムギなど）に植物での一過性又は安定的発現（例えば安定なトランスジェニック植物として）によって付与することができる。本発明の核酸を用いて植物の代謝経路を操作し、宿主のリグノセルロース系酵素の発現を最適化又は変化させることができる。本発明の核酸は、植物のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）活性を変化させることができる。あるいは、本発明のリグノセルロース系酵素をトランスジェニック植物の製造に用いて、前記植物によって天然に産生することができない化合物を製造することができる。これによって製造コストを下げるか、又は新規な生成物を製造することができる。
ある特徴では、トランスジェニック植物製造の第一の工程は、植物細胞での発現のための発現構築物を作製することを含む。これらの技術は当分野では公知である。これらにはプロモーター、リボソームのmRNAへの効率的な結合を促進するためのコード配列の選別及びクローニング、並びに適切な遺伝子ターミネーター配列の選別が含まれる。例示的な構成的プロモーターの1つはカリフラワーモザイクウイルスに由来するCaMV35Sであり、これは一般的には植物で高度な発現をもたらす。他のプロモーターはより特異的であり、植物の内部環境または外部環境の合図に反応する。例示的な光誘導性プロモーターは、主要な葉緑素a/b結合タンパク質をコードするcab遺伝子に由来するプロモーターである。
ある特徴では、核酸は改変されて植物細胞でのより強い発現が達成される。例えば、本発明の配列は植物で認められるA-Tヌクレオチド対の割合と比較して高いA-Tヌクレオチド対をもつ可能性が高い（植物のいくつかはG-Cヌクレオチド対を好む）。したがって、コード配列内のA-Tヌクレオチドを、アミノ酸配列を顕著に変化させることなくG-Cヌクレオチドに置換して、植物細胞における遺伝子生成物の産生を高めることができる。
【０１７６】
選別可能なマーカー遺伝子を遺伝子構築物に付加し、トランスジーンを組み込むことに成功した植物細胞又は組織を同定することができる。これは、植物細胞での遺伝子の取り込み及び発現の達成が稀な事象であり、標的組織又は細胞のわずかな割合で生じるだけであるので必要であろう。選別可能なマーカー遺伝子は、通常は植物にとって有毒である物質（例えば抗生物質又は除草剤）に対して耐性を提供するタンパク質をコードする。前記適切な抗生物質又は除草剤を含む培地で増殖させたとき、選別可能なマーカー遺伝子を組み込んだ植物細胞だけが生存するであろう。他の挿入遺伝子の場合のように、マーカー遺伝子もまた適切な機能のためにプロモーター及びターミネーター配列を必要とする。
ある特徴では、トランスジェニック植物又は種子の作製は、本発明の配列及び場合によってマーカー遺伝子の標的発現構築物（例えばプラスミド）への取り込みをプロモーター及びターミネーター配列の適切な配置とともに含む。前記工程は、適切な方法により改変遺伝子を前記植物に移す工程を含むことができる。例えば、構築物は植物細胞のゲノムDNAに、例えば植物細胞のプロトプラストのエレクトロポレーション及びマイクロインジェクションのような技術を用いて直接導入することができる。または、構築物は弾道的方法（例えばDNA粒子ボンバードメント）を用いて植物組織に直接導入してもよい。例えば以下を参照されたい：Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69（トランスジーンのコムギへの導入のための粒子ボンバードメントの使用を考察する）；及びAdam (1997)（上掲書）（YACの植物細胞への導入のための粒子ボンバードメントの使用について記載）。例えばRinehart (1997)（上掲書）は粒子ボンバードメントを用いてトランスジェニックなワタの植物を作製した。粒子を加速する装置は米国特許第5,015,580号に記載されており、さらにBioRad（Biolistics）PDS-2000粒子加速装置が市販されている。さらに以下もまた参照されたい：米国特許第5,608,148号（John）；及び米国特許第5,681,730号（Ellis）（裸子植物の粒子仲介形質転換を記載している）。
【０１７７】
ある特徴では、プロトプラストを固定し、核酸（例えば発現構築物）を注入することができる。プロトプラストから植物を再生させることは穀類では容易ではないが、マメ類では体細胞の胚形成を用いてプロトプラスト由来カルスから植物の再生が可能である。遺伝子銃技術を用いて、器官を形成した組織を裸のDNAで形質転換することができる。この場合、DNAはタングステンの微小発射体上に被覆され、細胞のサイズの1/100に発射される。前記発射体はDNAを細胞及び細胞内小器官の奥深くに運ぶ。続いて形質転換組織を再生のために誘導する（通常は体細胞胚形成による）。この技術はいくつかの穀類種（トウモロコシ及びイネを含む）で成功した。
核酸、例えば発現構築物は組換えウイルスを用いて植物細胞に導入することができる。植物細胞はウイルスベクター、例えばタバコモザイクウイルス由来ベクターを用いて形質転換することができる（Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999）。以下を参照されたい：”Use of viral replicons for the expression of genes in plants”, Mol. Biotechnol. 5:209-221。
【０１７８】
あるいは、核酸（例えば発現構築物）を適切なT-DNAフランキング領域と結合させて、一般的なアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主ベクターに導入することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのビルレンス機能は、細胞が前記細菌に感染したとき植物細胞DNAに前記構築物及び隣接するマーカーの挿入を誘導するであろう。アグロバクテリウム・ツメファシエンス仲介形質転換技術（バイナリーベクターの無毒化及び使用を含む）は学術文献に詳しく記載されている。例えば以下を参照されたい：Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803;Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995)。A.ツメファシエンス細胞中のDNAは細菌の染色体とともに、Ti（腫瘍誘導；tumor-inducing）プラスミドとして知られている別の構造物中に含まれる。Tiプラスミドは、T-DNA（約20kbの長さ）と称される一続きのDNA（感染過程で植物細胞に移される）および一連のvir（virulence、ビルレンス）遺伝子（関連過程を誘導する）を含む。A.ツメファシエンスは創傷からのみ植物に感染する。植物の根または茎が傷を受けたとき、植物はある種の化学的シグナルを発し、それに応答してA.ツメファシエンスのvir遺伝子は活性化され、TiプラスミドのT-DNAの植物染色体への移転に必要な一連の事象を誘導する。続いてT-DNAは創傷から植物細胞に進入する。１つの推測は、T-DNAは、植物DNAが複製または転写されるまで待機し、続いて自身を裸の植物DNAに挿入するということである。A.ツメファシエンスをトランスジーンベクターとして使用するために、T-DNAの腫瘍誘導部分を除去し、一方T-DNAボーダー領域及びvir遺伝子は維持する必要がある。続いてトランスジーンをT-DNAボーダー領域間に挿入する（前記領域でトランスジーンは植物細胞に移され、植物染色体に組み込まれる）。
本発明は、本発明の核酸を用いる単子葉植物（重要な穀類を含む）の形質転換を提供する（Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218）。さらにまた、例えば以下を参照されたい：Horsch (1984) Science 233:496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803; Thykjaer (1997) 上掲書; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148（ゲノムDNAへのT-DNAの組み込みについて考察する）。さらにまた以下を参照されたい：米国特許第5,712,135号（D'Halluin）（穀類または他の単子葉植物の細胞内で機能を有する遺伝子を含むDNAの安定な組み込みのための方法を開示する）。
【０１７９】
ある特徴では、第三の工程は、取り込まれた標的遺伝子を次の世代に伝達することができる植物体の選別及び再生を含むことができる。そのような再生技術は、組織培養の増殖培地でのある種の植物ホルモンの操作を利用することができる。ある特徴では、前記方法は、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された抗生剤及び／又は除草剤マーカーを利用する。培養プロトプラストから植物を再生することについては以下に記載されている：Evans et al., Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp.124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983；及びBinding, Regenration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985。さらにまた米国特許7,945,354号を参照されたい。再生はまた植物カルス、外植片、器官又はその部分からも達成することができる。そのような再生技術は一般的には以下に記載されている：Klee (1987) Ann. Rev. of Phys. 38:467-486。トランスジェニック組織（例えば未熟胚）から全植物を得るために、前記胚を栄養及びホルモンを含む一連の培養液中で環境制御条件下（組織培養として公知の方法）において増殖させることができる。いったん全植物が形成され種子が生じたら、子孫の評価を開始する。
ある特徴では、発現カセットがトランスジェニック植物に安定的に取り込まれた後、前記カセットは有性交配によって他の植物に導入することができる。交配される種に応じて、多くの標準的育種技術のいずれも用いることができる。本発明の核酸のトランスジーン発現は表現型の変化を生じるので、本発明の組換え核酸を含む植物を第二の植物と有性交配して最終生成物を得ることができる。したがって、本発明の種子は、本発明の2つのトランスジェニック植物間の交配、又は本発明の植物と他の植物間の交配から誘導することができる。所望の効果（例え本発明のポリペプチドを発現させて開花の態様が変化した植物を作製する）は、両方の親植物が本発明のポリペプチド（例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）を発現するときに強化される。所望の効果は将来の植物世代に標準的な繁殖手段によって伝えることができる。
【０１８０】
ある特徴では、本発明の核酸及びポリペプチドは任意の植物または種子で発現又は挿入される。本発明のトランスジェニック植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。本発明のトランスジェニック単子葉植物の例は、牧草、例えばメドーグラス（meadow grass（ブルーグラス、Poa））、飼い葉用草類、例えばフェスチュカ（festuca）、ロリウム（lolium）、テンペレートグラス、例えばアグロスチス（Agrostis）、及び穀類、例えばコムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、コメ、ソルガムおよびトウモロコシ（コーン）である。ある特徴では、単子葉種子特異的プロモーターを含むトランスジェニック単子葉植物及び種子は、本発明の酵素の製造に用いられる。トランスジェニック植物からトランスジェニック単子葉種子を生産する方法は、例えば米国特許7,157,629号に記載されている。植物種子でのタンパク質の生産及び種子優先調節配列（例えば種子特異的プロモーター）はまた、米国特許7,081,566号、同7,081,565号、同7,078588号、同6,566,585号、同6,642,437号、同6,410,828号、同6,066,781号、同5,889,189号、同5,850,016号に記載されている。
本発明のトランスジェニック双子葉植物の例は、タバコ、豆類（例えばルピナス）、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウマメ、インゲンマメ及びダイズ、並びに十字架植物（Brassicaceae科）、例えばカリフラワー、アブラナ、及び近縁のモデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である。したがって、本発明のトランスジェニック植物及び種子には以下の属に由来する種を含む（ただしこれらに限定されない）広範囲の植物が含まれる：アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラガス、アトロパ（Atropa）、アベナ（Avena）、ブラシッカ（Brassica）、シトラス、シトラルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルサムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コフェア（Coffea）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cuurbita）、ダウクス（Daucus）、エレイス（Elaris）、フラガリア（Fragaria）、グリシン（Glycine）、ゴッシピウム（Gossypium）、ヘリアンサス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピナス、リコペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホット（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ、オレア（Olea）、オリザ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パニセツム（Panisetum）、ペルセア（Persea）、ファゼオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラナム（Solanum）、ソルガム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Triticum）、ビシア（Vicia）、ビチス（Vitis）、ビグナ（Vigna）、及びゼア（Zea）。さらにまた、本発明は、これらの属のいずれかに由来する形質転換、感染又は形質導入細胞及び細胞培養、並びに、本発明の核酸、発現カセット（例えばベクター）及び／又はポリペプチドを含実、安定的に又は一過性に形質転換、感染又は形質導入されたこれらの細胞を提供する。
【０１８１】
また別の実施態様では、本発明の核酸は、線維細胞を含む植物で（例えばトランスジェニック植物として）発現され、前記植物には、例えばワタ、シルクコットンツリー（Kapok、Ceiba pentandra）、ヤナギ（desert willow）、クレオソートブッシュ、ウィンターファット、バルサ、カラムシ、ケナフ、アサ、ロゼレ（roselle）、ジュート、サイザル（sisal abaca）及びアマが含まれる。また別の実施態様では、本発明のトランスジェニック植物はゴシピウム（Gossypium）属のメンバー（一切のゴシピウム種のメンバー、例えばG.アルボレウム（arboreum）；G. ヘルバセウム（herbaceum）；G. バルバデンス（barbadense）；G. ヒルスタム（hirsutum）を含む）でありえる。
本発明のトランスジェニック植物（並びに細胞及びそれらに由来する細胞培養）には、クルシフェラエ（Cruciferae）及びブラシカ（Brassica）、コンポジタエ（Compositae）に属する植物（例えばヒマワリ）及び豆類植物（例えばエンドウマメ）が含まれえる。本発明のトランスジェニック植物はまたトランスジェニックな樹木及びそれらの部分（例えば任意の木材、葉、樹皮、根、パルプ又は紙製品を含む）が含まれ、例えば米国特許7,141,422号（トランスジェニックなポプラの種について記載）を参照されたい。
本発明はまた、大量の本発明のポリペプチド、例えばリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）又は抗体を製造するために用いることができるトランスジェニック植物（及び細胞、並びにそれらから誘導される細胞培養）を提供する。例えば以下を参照されたい：Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348；Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296（オーキシン誘導性二方向性マンノピンシンターゼ（mas1',2'）プロモーターを用い、アグロバクテリウム・ツメファシエンス仲介リーフディスク形質転換法により母乳タンパク質のベータカゼインのトランスジェニックなジャガイモによる生産を記載）。
公知の方法を用いて、当業者は、形質導入植物でトランスジーンのmRNA又はタンパク質の増減を検出することによって、本発明の植物をスクリーニングすることができる。mRNA又はタンパク質の検出及び定量手段は当分野で周知である。
【０１８２】
ポリペプチド及びペプチド
ある特徴では、本発明は、本発明の例示的配列（上記で定義）、例えば配列番号:2、配列番号:4などから配列番号:472、配列番号:473、配列番号:474、配列番号:475、配列番号:476、配列番号:477、配列番号:478、配列番号:479、配列番号:490から配列番号:700の間の全ての偶数番号の配列番号、配列番号:719及び／又は配列番号:721（表1から4、及び配列表もまた参照されたい）の配列を有するタンパク質、酵素的に活性なそのフラグメント（部分配列）（リグノセルロース系酵素活性を有する）及び／又は免疫学的に活性なその部分配列（例えばエピトープ又は免疫原、例えば本発明の例示的ポリペプチドと特異的に結合することができる抗体を誘引（又は生成）することができるもの）に対して、少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは前記より高いか又は完全な（100%）配列同一性、又は相同性を有する単離、合成又は組換えポリペプチドを提供する。
パーセント配列同一性はポリペプチドの完全長に及ぶことができるが、また同一性は、少なくとも約15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700又はそれより大きい残基の領域にわたることもできる。本発明のポリペプチドはまた、例示的ポリペプチドの完全長よりも短くてもよい。また別の特徴では、本発明は、サイズがポリペプチドの約5から完全長の間の範囲のポリペプチド（ペプチド、フラグメント）、例えば酵素（例えばリグノセルロース分解性（リグノセルロース系）活性、例えばリグニン分解性及びセルロース分解活性を有するポリペプチド、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を含む）を提供する。例示的なサイズは、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700又はそれより大きい残基の、例えば本発明の例示的リグノセルロース系酵素の連続する残基である。本発明のペプチド（例えば本発明の例示的ポリペプチドの部分配列）は、例えば標識プローブ、抗原（免疫原）、寛容誘導源、モチーフ、リグノセルロース系酵素活性部位（例えば“触媒ドメイン”）、シグナル配列及び／又はプレプロドメインとして有用でありえる。
【０１８３】
また別の特徴では、本発明は、リグノセルロース分解性（リグノセルロース系）活性、例えばリグニン分解性及びセルロース分解活性を有するポリペプチドを提供し、ある実施態様では、本発明の酵素（グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ（β-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む）は、リグノセルロース分解性（リグノセルロース系）活性と相関性を有する固有の構造エレメント（例えばアミノ酸残基）を共有するポリペプチド類のメンバーである。これらの共有構造エレメントは、リグノセルロース系酵素の日常的な作出のために、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ変種の日常的な作出のために用いることができる。本発明のリグノセルロース系酵素のこれら共有構造エレメントを、本発明のポリペプチド類の範囲内に包含されるリグノセルロース系酵素変種の日常的作出のための道標として用いることができる。
本発明のリグノセルロース分解性又はリグノセルロース系酵素、例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素は、セルロースの完全若しくは部分的分解及び／又は加水分解を触媒することができる任意のポリペプチド又は酵素（例えば本発明の例示的ポリペプチド、表2又は3及び下記実施例もまた参照されたい）、又はセルロース、ヘミセルロース若しくはリグノセルロース性物質（例えばセルロース、ヘミセルロース及びリグニンを含むバイオマス材料）の任意の改変又は加水分解を触媒することができる任意のポリペプチド又は酵素を包含するが、ただし前記に限定されない。
【０１８４】
グルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドはまた、例えば本発明の酵素の混合物（“アンサンブル”又は“カクテル”）として、例えば本発明の方法又は本発明の組成物（例えば本発明のサプルメント、栄養補助物、飼料、食品として）の実施で用いることができる。ある特徴では、本グルコースオキシダーゼは、EC1.1.3.4に分類される活性を有することができ、ベータ-D-グルコース（六単糖（グルコース）の異性体）と結合することができ、及び／又は前記糖のその代謝物への分解を促進することができ、さらに、ある実施態様では、前記はマルチマー型（例えばダイマータンパク質として）存在することができる（前記ダイマータンパク質は、ベータ-D-グルコースのD-グルコノ-1,5-ラクトンへの酸化を触媒することができ、続いてグルコン酸へ加水分解することができる）。本発明の全ての及び任意のポリペプチドのまた別の実施態様にはマルチマー型、例えばダイマー型（ホモダイマー及び／又はヘテロダイマー）が含まれる。表2及び3は、本発明の例示的ポリペプチドの例示的酵素活性の要旨であり、例えば、これらの図表に示したとおり、また別の特徴ではこれらの例示的ポリペプチドは列挙した多様な活性（ただしこれらに限定されない）を有する。
また別の実施態様では、グリコシドヒドロラーゼ活性（グリコシダーゼ活性とも称することができる）を有する本発明のポリペプチドはグリコシド結合の加水分解を触媒して、さらに小さな2つの糖を生じ、したがってバイオマス（例えばセルロース及びヘミセルロース）の加水分解又は分解に有用である。グリコシドヒドロラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドはまた、抗病因メカニズムにおける抗菌防御方法（誘導リゾチームを含む）で、例えばウイルスノイラミノダーゼ（前記はグリコシルヒドロラーゼである）を標的とするか又は前記に対抗するために有用でありえる。グリコシドヒドロラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドはまた、正常な細胞機能の等価物として、例えばN-結合糖タンパク質生合成に必要なマンノシダーゼのトリミングで有用でありえる。本発明のグリコシドヒドロラーゼは、O-又はS-グリコシドの加水分解を触媒する酵素としてEC3.2.1に分類することができる。本発明のグリコシドヒドロラーゼはまた、固定酵素若しくは転化酵素として、又はエキソ作用性若しくはエンド作用性酵素として分類することができ、したがって、いくつかの実施態様では、本発明のグリコシドヒドロラーゼ酵素は、その基質（例えば少糖類／多糖類）の非還元末端又は中央で作用することができる。
【０１８５】
また別の実施態様では、セルラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、エンドグルカナーゼ、エンド-1,4-ベータ-グルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、エンド-1,4-ベータ-D-グルカナーゼ、ベータ-1,4-グルカナーゼ及び／又はベータ-1,4-エンドグルカンヒドロラーゼ活性を有するものとして分類することができる。また別の実施態様では、本発明のポリペプチドのセルラーゼ活性は、内部結合を破壊して、セルロースの結晶構造を崩壊させ個々のセルロース多糖類鎖を露出させるエンドセルラーゼ活性、又はエンドセルラーゼによって生じた露出鎖の末端から2ないし4ユニットを切断して四糖類又は二糖類（例えばセロビオース）を生成するエキソセルロース活性を含む。また別の実施態様では、本発明のポリペプチドのセルラーゼ活性はエキソ-セルラーゼ又はセロビオヒドロラーゼ活性を含み、前記活性は、セルロースの還元末端から連続的に作用するか、及び／又はセルロースの非還元末端から連続的に作用することを含む活性を含む。また別の実施態様では、本発明のポリペプチドのセルラーゼ活性は、エンド-セルラーゼ生成物を個々の単糖類に加水分解するセロビアーゼ又はベータ-グルコシダーゼ活性を含む。また別の実施態様では、本発明のポリペプチドのセルラーゼ活性は、例えばセロビオースデヒドロゲナーゼのように、ラジカル反応によってセルロースを解重合する酸化的セルラーゼ活性を含む。また別の実施態様では、本発明のポリペプチドのセルラーゼ活性は、水の代わりにホスフェートを用いてセルロースを解重合するセルロースホスホリラーゼ活性を含む。ある特徴では、本発明の酵素はセルロースをベータ-グルコースに加水分解することができる。
また別の実施態様では、本発明のポリペプチドはキシラナーゼ活性を有し、前記活性は、直鎖状多糖類ベータ-1,4-キシランのキシロースへの加水分解（分解）を含む活性を含み、ある特徴では、したがってヘミセルロース（植物の細胞壁の主要成分）を分解することができる。
【０１８６】
酵素活性の測定又は特性決定のためのアッセイ：酵素の活性、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ又は関連活性を測定若しくは特性決定するためのアッセイ、例えばポリペプチドが本発明の範囲内に包含されるか否かを決定するためのアッセイは当分野では周知であり、例えば以下を参照されたい：Thomas M. Wood, K. Mahalingeshwara Bhat, “Methods for Measuring Cellulase Activities”, Methods in Enzymology, 160, 87-111 (1988)；U.S. Patent Nos: 5,747,320；5,795,766；5,973,228；6,022,725；6,087,131；6,127,160；6,184,018：6,423,524；6,566,113；6,921,655。
いくつかの特徴では、本発明のポリペプチドはまた別の酵素活性を有する。例えば、前記ポリペプチドは、エンドグルカナーゼ／セルラーゼ活性；キシラナーゼ活性；プロテアーゼ活性などを有することができる。換言すれば、本発明の酵素は、それらが緩やかな基質特異性を有するという点で多機能性でありえる。実際、本明細書に示した実験は、本発明の酵素の2つの例示的グルコースオキシダーゼは緩やかな基質特異性を有するという点で多機能性であることを明示している（上記の考察を参照されたい）。
本明細書で用いられる、“アミノ酸”又は“アミノ酸配列”はオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列、又はこれらのいずれかのフラグメント、部分若しくはサブユニット、並びに天然に存在する分子及び合成分子を指す。本明細書で用いられる、“アミノ酸”又は“アミノ酸配列”にはオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列、又はこれらのいずれかのフラグメント、部分若しくはサブユニット、並びに天然に存在する分子及び合成分子が含まれる。本明細書で用いられる、“ポリペプチド”という用語は、ペプチド結合又は改変ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸、すなわちペプチドイソステアーを指し、20個の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外の改変アミノ酸を含むことができる。ポリペプチドは、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング）によって、または化学的修飾技術（当業界で周知である）によって改変することができる。改変はポリペプチドの任意の場所（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端を含む）で生じえる。あるポリペプチドで同じタイプの改変が同程度又は種々の程度で存在しえることは理解されよう。さらにまた、あるペプチドが多くのタイプの改変を有することもできる。改変にはアセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合環状化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストール化、酸化、ポリエチレングリコール化、グルカンヒドロラーゼプロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA仲介付加が含まれる（例えば以下を参照されたい：T.E. Creighton, Proteins−Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)）。本発明のペプチド及びポリペプチドにはまた、下記でさらに詳細に記載されるように全ての“模倣体”及び“ペプチド模倣体”形が含まれる。
【０１８７】
本明細書で用いられるように、“単離”という用語は、物質（例えば本発明のタンパク質又は核酸）がその本来の環境（例えば、物質が天然に存在する場合はその天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に出現するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然の系に一緒に存在する物質のいくつか又は全てから分離されている前記と同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分であってもよく、及び／又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であってもよく、それでもなおそのようなベクター又は組成物は前記の天然の環境の一部分ではないという点で、それらのポリヌクレオチドは単離されたものである。本明細書で用いられるように、“精製される”という用語は完全な純度を要求せず、むしろ相対的な定義と考えられている。ライブラリーから得られる個々の核酸は電気泳動による均質度まで通常的に精製されている。これらのクローンから得られる配列は、ライブラリーからも又は人間の全DNAからも直接入手することはできないであろう。本発明の精製核酸はその生物体のゲノムDNAの残余のものから少なくとも104−106倍精製されてある。ある特徴では、“精製される”という用語はまた、ゲノムDNAの残余のものから、又はライブラリー若しくは他の環境中の他の配列から少なくとも１桁、例えばある特徴では、2又は3桁、又は4若しくは5桁精製された核酸を含む。
【０１８８】
“組換え”ポリペプチド又はタンパク質は、組換えDNA技術によって生成された、すなわち所望のポリペプチド又はタンパク質をコードする外因性DNA構築物によって形質転換された細胞から生成されたポリペプチド又はタンパク質を指す。“合成”ポリペプチド又はタンパク質は、化学合成によって調製されたものである。化学的な固相ペプチド合成もまた本発明のポリペプチド又はフラグメントの合成に用いることができる。そのような方法は、1960年代から当分野で知られており（Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963）（さらにまた以下を参照されたい：Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12）、近年では、市場で入手可能な実験室ペプチド設計及び合成キットとして利用されている（Cambridge Research Biochemicals）。そのような市販の実験室キットは、一般的にはH. M. Geysenら（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984)）の教示を利用しており、多数の“ロッド”または“ピン”（前記はいずれも一枚のプレートに連結されている）の先端でのペプチドの合成を提供する。
【０１８９】
2つの核酸又はポリペプチドの関係で“実質的に同一”という語句は、公知の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかまたは目視精査により、最大一致のための比較及びアラインメントを実施したとき、例えば少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高いヌクレオチド又はアミノ酸残基（配列）同一性を有する2つ以上の配列を指す。また別の特徴では、実質的同一性は少なくとも約100残基以上の領域にわたって存在し、もっとも一般的には、配列は少なくとも約150−200残基又はそれより大きい残基にわたって実質的に同一である。いくつかの特徴では、配列はコード領域の全長にわたって実質的に同一である。
さらにまた、“実質的に同一”なアミノ酸配列は、1つ以上の保存的若しくは非保存的アミノ酸置換、欠失又は挿入によって参照配列と異なる配列である。ある特徴では、置換は、分子の活性部位ではない部位で生じるか、あるいは、置換は、前記ポリペプチドがその機能的（酵素的）特性を本質的に維持していることを条件に、分子の活性部位である部位で生じる。保存的アミノ酸置換は、例えばあるアミノ酸を同じクラスの別のアミノ酸で置換する（例えば疎水性アミノ酸（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）で別の疎水性アミノ酸を置換、又は極性アミノ酸で別の極性アミノ酸を置換、例えばアルギニンでリジンを置換、グルタミン酸でアスパラギン酸を置換、又はグルタミンでアスパラギンを置換）。1つ以上のアミノ酸を例えばリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼポリペプチド）から欠失させて、その生物学的活性を顕著に変更することなく、前記ポリペプチドの構造を改変させることができる。例えば、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼポリペプチド酵素）の生物学的活性に必要でないアミノ末端又はカルボキシル末端のアミノ酸を除去することができる。本発明の改変ポリペプチド配列は、多数の方法によってリグノセルロース系酵素の生物学的活性についてアッセイすることができる。前記方法は、改変ポリペプチド配列を基質と接触させ、アッセイにおいて前記改変ポリペプチドが特異的基質の量を減少させるか、又は機能的なリグノセルロース系酵素ポリペプチドと基質との酵素反応のバイオ生成物を増加させるかを決定する工程を含む。
【０１９０】
本明細書で用いられる“フラグメント”は、少なくとも２つの別個の構造物として存在することができる天然に存在するタンパク質の部分である。フラグメントは、天然に存在するタンパク質と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を有しえる。天然に存在するタンパク質と異なる三次元構造を有するフラグメントもまた含まれる。この例は、“プロ型”分子、例えば切断によっ改変され顕著に高い活性をもつ成熟酵素を生じることができる低活性の前タンパク質である。
ある特徴では、本発明は、タンパク質及びペプチド（例えば本発明のセルラーゼ）の結晶（三次元）構造物を提供する。前記構造物は、例えば以下の文献に記載されているように、当分野で周知の日常的なプロトコルを用いて作製され分析される：MacKenzie (1998) Crystal structure of the family 7 endoglucanase I (Cel7B) from Humicola insolens at 2.2 A resolution and identification of the catalytic nucleophile by trapping of the covalent glycosyl-enzyme intermediate, Biochem. J. 335:409-416；Sakon (1997) Structure and mechanism of endo/exocellulase E4 from Thermomonospora fusca, Nat. Struct. Biol 4:810-818；Varrot (1999) Crystal structure of the catalytic core domain of the family 6 cellobiohydrolase II, Cel6A, from Humicola insolens, at 1.92 A resolution, Biochem. J. 337:297-304（前記文献は、本発明のセルラーゼ変種の日常的な作製のための手引きとして、及び本発明の範囲内に包含される酵素種の識別のための手引きとして固有の構造成分を例示及び確認している。
本発明のポリペプチド及びペプチドは天然の供給源から単離しても、合成しても、又は組換えによって生成してもよい。ペプチド及びタンパク質は組換えによってin vitro又はin vivoで発現させることができる。本発明のペプチド及びポリペプチドは当業界で公知の任意の方法を用いて作製及び単離することができる。本発明のポリペプチド及びペプチドはまた、全体又は部分を当分野で周知の化学的方法を用いて合成してもよい。例えば以下を参照されたい：Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223；Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232；A.K. Banga, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA。例えばペプチド合成は種々の固相技術を用いて実施でき（例えば以下を参照されたい：Roberge (1995) Science 269:202；Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13）、さらにABI431Aペプチド合成装置（Perkin Elmer）を製造業者によって提供される指示にしたがって用いて、自動合成を実施することができる。
【０１９１】
本発明のペプチド及びポリペプチドはまたグリコシル化することができる。グリコシル化は化学的又は細胞の生合成メカニズムによって翻訳後に実施することができる（後者は公知のグリコシル化モチーフの使用を含む）。前記グリコシル化は前記配列にとって天然であってもよいが、又はペプチドとして添加しても、核酸コード配列で添加してもよい。前記グリコシル化はO-結合でもN-結合でもよい。
本発明のペプチド及びポリペプチド（上記で定義されたとおり）は、全ての“模倣体”及び“ペプチド模倣体”形を含む。“模倣体”及び“ペプチド模倣体”という用語は、実質的に本発明のポリペプチドと同じ構造及び／又は機能的特徴を有する合成化学物質を指す。前記模倣体は完全に合成された非天然アミノ酸類似体で構成されていても、又は部分的に天然のペプチドアミノ酸及び部分的に非天然のアミノ酸類似体のキメラ分子であってもよい。前記模倣体はまた任意の量の天然アミノ酸の保存的置換を含むことができるが、ただしそのような置換が前記模倣体の構造及び／又は活性を実質的に変化させない場合に限られる。本発明のポリペプチド類の保存的変種又はそのメンバー（例えば、本発明の例示的配列と約50%以上の配列同一性を有する）である本発明のポリペプチドに関しては、日常的な実験によって模倣体が本発明の範囲内に包含されるものであるか否か、すなわちその構造及び／又は機能が実質的に改変されていないかどうかが決定されるであろう。したがって、ある特徴では、模倣体組成物は、それがリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）活性を有するならば、本発明の範囲内のものである。
【０１９２】
本発明のポリペプチド模倣体組成物は任意の組合せの非天然構造成分を含むことができる。また別の特徴では、本発明の模倣体組成物は以下の3つの構造基の1つまたは全てを含む：a）天然のアミド結合（“ペプチド結合”）以外の残基結合基；b）天然に存在するアミノ酸残基の代わりに非天然残基；又はc）二次構造模倣を誘導する（すなわち二次構造、例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス構造などを誘導又は安定化させる）残基。例えば本発明のポリペプチドは、その残基の全て又はいくつかが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって結合されるとき模倣体と特徴付けることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合、他の化学的結合、またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能基性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又はN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）によって結合される。通常のアミド結合（“ペプチド結合”）の代用となることができる結合基には例えば以下が含まれる：ケトメチレン（例えば-C(=O)-NH-の代わりに-C(O=)-CH２-）、アミノメチレン（CH２-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH２-O）、チオエーテル（CH２-S）、テトラゾール（CN４）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド又はエステル（例えば以下を参照されたい：Spatola (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.7, pp267-357, “Peptide Backbone Modifications”, Marcell Dekker, NY）。
【０１９３】
本発明のポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに全て又はいくつかの非天然の残基が含まれることによって模倣体と特徴付けられる。非天然残基は学術文献及び特許文献に詳しく記載されている。天然のアミノ酸残基の模倣体として有用な例示的な非天然組成物のいくつか及び基準は以下で述べる。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば以下によって置き換えることによって生成することができる：D-またはL-ナフチルアラニン；D-またはL-フェニルグリシン；D-またはL-2チエネイルアラニン；D-またはL-１、-2,3-、または4-ピレネイルアラニン；D-またはL-3チエネイルアラニン；D-またはL-(2-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(3-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(2-ピラジニル)-アラニン；D-またはL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン；D-p-フルオロ-フェニルアラニン；D-またはL-p-ビフェニルフェニルアラニン；D-またはL-p-メトキシ-ビフェニルフェニルアラニン；D-またはL-2-インドール(アルキル)アラニン；およびD-またはL-アルキルアラニン（前記アルキルはメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、iso-ブチル、sec-イソチル、iso-ペンチルまたは非酸性アミノ酸で置換されていてもよく、置換されてなくてもよい）。非天然アミノ酸の芳香環には、例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香環が含まれる。
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば陰性荷電を維持している非カルボキシレートアミノ酸、（ホスホノ）アラニン、硫酸スレオニンによって置換することにより生成できる。カルボキシル側鎖基（例えばアスパルチル又はグルタミル）はまた、カルボジイミド（R'-N-C-N-R'）、例えば1-シクロヘキシル-3(2-モルホリニル-(4-エチル）カルボジイミド又は1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメソールペンチル)カルボジイミドとの反応によって選択的に改変することができる。アスパルチル又はグルタミルもまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することができる。塩基性アミノ酸の模倣体は、（リジンおよびアルギニンの他に）アミノ酸オルニチン、シトルリン又は（グアニジノ）-酢酸または(グアニジノ)アルキル-酢酸（アルキルは上記で定義されたとおり）による置換によって生成することができる。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-部分を含む）でアスパラギン又はグルタミンを置換することができる。アスパラギニル及びグルタミニル残基は、対応するアスパルチル又はグルタミル残基に脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニルを例えば1つ以上の通常の試薬（例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロ-ヘキサンジオン又はニンヒドリンを含む）と、好ましくはアルカリ性条件下で反応させることによって生成することができる。チロシン残基模倣体はチロシルを例えば芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンと反応させることによって生成することができる。N-アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを用いてO-アセチルチロシル種及び3-ニトロ誘導体をそれぞれ形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を例えばアルファ-ハロアセテート（例えば2-クロロ酢酸又はクロロアセトアミド）及び対応するアミンと反応させてカルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生成することによって達成できる。システイン残基模倣体はまた、システイン残基を例えばブロモ-トリフルオロアセトン、アルファ-ブロモ-ベータ-(5-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；メチル2-ピリジルジスルフィド；p-クロロ水銀ベンゾエート；2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール；又はクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることによって生成することができる。リジン模倣体は、リジニルをコハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させることによって（さらにアミノ末端残基を変化させることによって）生成することができる。リジン及び他のアルファ-アミノ含有残基模倣体はまた、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロ-ベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4-ペンタンジオンとの反応、及びグキオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応によって生成することができる。メチオニンの模倣体は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって生成することができる。プロリンの模倣体には、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、3-又は４-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-又は４-メチルプロリン又は3,3-ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体はヒスチジルを例えばジエチルプロカーボネート又はパラ-ブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成することができる。他の模倣体には、例えばプロリン及びリジンのヒドロキシル化；セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのアルファ-アミノ基のメチル化；N-末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化またはN-メチルアミノ酸による置換；又はC-末端カルボキシル基のアミド化によって生成することができるものが含まれる。
【０１９４】
ある特徴では、残基、例えば本発明のポリペプチドのアミノ酸はまた反対のキラリティーをもつアミノ酸（又はペプチド模倣体残基)によって置換することができる。ある特徴では、L型構造で天然に存在するいずれのアミノ酸（前記化学物質の構造に応じてRまたはSとも呼ぶことができる）も、同じ化学構造型であるが反対のキラリティーのアミノ酸又はペプチド模倣体（D-アミノ酸と称されるが、またR-またはS-型とも称される）で置換することができる。
本発明はまた、天然の過程（例えば翻訳後プロセッシング、例えばリン酸化、アセチル化など）又は化学的改変技術のどちらかによって本発明のポリペプチドを改変する方法、及び生成された改変ポリペプチドを提供する。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含むポリペプチド内のいずれの場所でも起こりえる。あるポリペプチドで同じタイプの改変が同じ程度または種々の程度でいくつかの部位で存在することができることは理解されよう。さらにまたあるポリペプチドが多くのタイプの改変を含むことも可能である。ある特徴では改変には以下が含まれる：アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付加、ヘム成分の共有結合による付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合による付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合による付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合による付加、架橋環形成、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストリエーション、酸化、PEG化、タンパク分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、及びタンパク質へのトランスファーRNA仲介アミノ酸付加、例えばアルギニル化。例えば以下を参照されたい：T.E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C.  Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)。
【０１９５】
固相ペプチド化学合成法もまた本発明のポリペプチドまたはフラグメントの合成に用いることができる。前記の方法は1960年代初頭より当分野で公知であり（R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963；さらにまた以下を参照されたい：J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Snthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp.11-12）、さらに最近は市販の実験室ペプチド設計及び合成キット（Canbridge Research Biochemicals）として用いられている。そのような市販の実験室キットは一般的にはH.M. Geysenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998 (1984)）の教示を利用し、多数の“ロッド"又は“ピン”（これらは全て一枚のプレートにつながっている）の先端でペプチドを合成させる。前記のような系を利用するときは、ロッド又はピンを含むプレートはさかさまにされ、対応するウェル又はレザーバーの第二のプレートに挿入される。前記ウェル又はレザーバーは適切なアミノ酸をピンまたはロッドの先端に結合又は固着させるために溶液を含んでいる。そのような工程（すなわちロッドまたはピンの先端をさかさまにして適切な溶液に挿入する工程）を繰り返すことによって、アミノ酸は所望のペプチドに構築される。さらにまた、多数のFMOCペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチド又はフラグメントのアッセンブリーはアプライドバイオシステムズ社のモデル431A（商標）自動ペプチド合成装置を用いて固相上で実施できる。前記のような装置は、直接合成又は一連のフラグメント（前記フラグメントは他の公知の技術を用いて結合させることができる）の合成によって本発明のペプチドの容易な入手を提供する。
【０１９６】
本発明のポリペプチドには活性形又は不活性形のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）が含まれる。例えば、本発明のポリペプチドには、“成熟”前、又は“活性な”成熟タンパク質を生じる前タンパク質処理酵素（例えば前タンパク質コンバターゼ）によるプレプロ配列の処理前の前タンパク質が含まれる。本発明のポリペプチドには、他の理由のために（例えば翻訳後プロセッシング事象（例えばエンド-若しくはエキソ-ペプチダーゼ又はプロテイナーゼ作用、リン酸化事象、アミド化、グリコシル化または硫酸化、ダイマー形成事象など）による“活性化”前）、活性をもたないリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）が含まれる。本発明のポリペプチドには、前記酵素の全ての活性形（活性な部分配列（例えば触媒ドメインまたは活性部位）を含む）が含まれる。
本発明には、固定されたリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）、抗セルラーゼ（例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ-グルコシダーゼ抗体）及びそれらのフラグメントが含まれる。本発明は、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）活性を阻害する方法を提供する。前記は負の優性変異体又は本発明の抗セルラーゼ抗体（例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ-グルコシダーゼ抗体）を用いることによって実施される。本発明には、本発明のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）を含むヘテロ複合体（例えば融合タンパク質、ヘテロダイマーなど）が含まれる。
【０１９７】
本発明のポリペプチドは、種々の条件下で（例えば極端なpH及び／又は温度、酸化剤など）、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）活性を有することができる。本発明は、種々の触媒効率および安定性（例えば温度、酸化剤及び洗浄条件の変化に対して）を有するまた別のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）調製物をもたらす方法を提供する。ある特徴では、リグノセルロース系酵素変種は、位置特異的変異導入及び／又はランダム変異導入の技術を用いて作製することができる。ある特徴では、定方向進化を用い、また別の特異性および安定性を有する極めて多様なリグノセルロース系酵素変種を作製することができる。
本発明のタンパク質はまた、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）調節物質、例えばリグノセルロース系酵素活性の活性化物質または阻害物質を識別するための研究用試薬として有用である。簡単に記せば、テストサンプル（化合物、ブロス、抽出物など）をリグノセルロース系酵素アッセイに添加し、基質の切断を阻害するそれらの能力を測定する。このようにして識別された阻害物質を工業及び研究で用いて、望ましくないタンパク質分解を低下または防止することができる。リグノセルロース系酵素に関しては阻害物質を混合して活性スペクトルを広げることができる。
本発明の酵素はまた、タンパク質消化又はタンパク質の配列決定において研究用試薬として有用である。例えば、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）を用い、例えば自動配列決定装置による配列決定のためにさらに小さなフラグメントにポリペプチドを分解することができる。
【０１９８】
本発明はまた、本発明の核酸、ポリペプチド及び抗体を用いて新規なリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）を発見する方法を提供する。ある特徴では、発現によるリグノセルロース系酵素の発見のためにファージミドライブラリーをスクリーニングする。別の特徴では、発現によるリグノセルロース系酵素の発見のためにラムダファージライブラリーをスクリーニングする。ファージ又はファージミドライブラリーのスクリーニングは、毒性クローンの検出、基質への接近の改善、宿主操作の必要性の緩和（ライブラリーの大量の排除により生じる一切の偏りの可能性を無視することによる）及び低いクローン密度でのより迅速な増殖を可能にすることができる。ファージ又はファージミドライブラリーのスクリーニングは液相でも固相でもよい。ある特徴では、本発明は液相でのスクリーニングを提供する。それによって、アッセイ条件でのより大きな融通性、追加される基質の融通性、弱いクローンに対するより高い感度及び固相スクリーニングをしのぐ自動化の容易さが提供される。
本発明は、本発明のタンパク質及び核酸並びに機械による自動化を用いて、何千もの生触媒反応及びスクリーニングアッセイを短時間で（例えば毎日）実施でき、同様に高度な正確性及び再現性を担保できるスクリーニング方法を提供する（下記のアレイに関する考察を参照されたい）。結果として、誘導化合物ライブラリーを数週間で作製することができる。分子（小分子を含む）の改変に関する更なる教示については、PCT/US94/09174、U.S. Pat. No. 6,245,547を参照されたい。
【０１９９】
ある特徴では、本発明のポリペプチド又はフラグメントは、生化学的濃縮又は精製工程により得られる。潜在的に相同なポリペプチド又はフラグメントの配列は、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）アッセイ（例えば下記の実施例1、2及び3を参照されたい）、ゲル電気泳動及び／又はマイクロシークェンシングによって決定することができる。本発明のポリペプチド又はフラグメントと推定されるものの配列は、上述のプログラムのいずれかを用いて、本発明の例示的ポリペプチド又はそのフラグメント（少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは 150又はそれより大きい連続するアミノ酸を含む）と比較することができる。
本発明のまた別の特徴は、本発明のポリペプチドの酵素機能を保持している、本発明のフラグメント又は変種を識別するアッセイである。例えば前記ポリペプチドのフラグメント又は変種を用いて生化学反応（前記反応は本発明のポリペプチドの酵素活性を前記フラグメント又は変種が保持していることを表示する）を触媒することができる。フラグメント又は変種が本発明のポリペプチドの酵素活性を保持しているか否かを決定するアッセイは以下の工程を含む：ポリペプチドフラグメント又は変種を基質分子と前記ポリペプチドフラグメント又は変種が機能できる条件下で接触させる工程、及び基質レベルの減少または前記ポリペプチドと基質との間の反応の特異的反応生成物レベルの増加を検出する工程。
本発明は、酵素の固有の触媒特性を利用する。化学的変換における生物触媒（すなわち精製酵素、粗酵素、非生細胞又は生細胞）の使用は、特定の出発化合物と反応する個々の生物触媒の特定を必要とするが、本発明は選択した生物触媒及び反応条件を使用する（前記生物触媒及び反応条件は、多くの出発化合物、例えば小分子に存在する官能基に特異的である）。各生物触媒は1つの官能基又は関連するいくつかの官能基に特異的であり、この官能基を含む多くの出発化合物と反応することができる。
【０２００】
ある特徴では、前記生触媒反応はただ1つの出発化合物に由来する誘導体集団を生成する。これらの誘導体をさらにもう1回の生触媒反応に付して誘導体化合物の第二の集団を生成することができる。生触媒反応による誘導体形成を繰り返す度に原型小分子又は化合物から数千の変種が生成されえる。
酵素は、分子の残り部分に影響を与えることなく出発化合物の特異的部位で反応する。前記は伝統的な化学的方法を用いて達成することは非常に困難な過程である。生触媒反応のこの高度な特異性は、ライブラリー内のただ1つの活性化合物を同定する手段を提供する。前記ライブラリーは、それを作製するために用いられる生触媒反応シリーズ（いわゆる“生合成歴”）によって特徴付けられる。生物学的活性についてのライブラリーのスクリーニング及び生合成歴のトレーシングによって活性な化合物を生成する特異的連続反応が同定される。前記連続反応を繰り返し、合成された化合物の構造を決定する。この同定の態様は、他の合成及びスクリーニングの方法と違って固定化技術を必要とせず、化合物は溶液中で自由な状態で合成され、実質的に任意のタイプのスクリーニングアッセイを用いて試験することができる。官能基に対する酵素反応の高度な特異性は、生触媒反応により作製されるライブラリーを構築する特異的な酵素反応の“トラッキング”を可能にすることは特筆に値する。
ある特徴では、工程は機械による自動化を用いて実施され、毎日何千もの生触媒反応及び／又はスクリーニングアッセイの実施を可能にするとともに、高レベルの正確さと再現性が担保される。機械による自動化をまたセルラーゼ活性のスクリーニングに用いて、ポリペプチドが本発明の範囲内に包含されるか否かを決定することができる。結果として、ある特徴では、“従来の”化学的又は酵素的スクリーニング方法を用いた場合には数年を要するような誘導体化合物ライブラリーが数週間で作製されえる。
特にある特徴では、本発明は小分子の改変方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド及び／又は酵素的に活性なその部分配列（フラグメント）を小分子と接触させ、改変小分子を生成する工程を含む。所望の活性を示す改変小分子がライブラリー内に存在するか否かを決定するために、改変小分子ライブラリーを試験する。ライブラリーの一部分の作製に用いられた生触媒反応の各々を系統的に排除し、さらに所望の活性を有する改変小分子の有無についてライブラリーの前記部分で生成された小分子を試験することによって、所望の活性を有する改変小分子を生成する特異的な生触媒反応を識別する。所望の活性を有する改変小分子を生成する特異的な生触媒反応は場合によって繰り返される。前記生触媒反応を、小分子の構造内で見出される別個の構造成分と反応する生物触媒群を用いて実施する。各々の生物触媒は1つの構造成分又は関連構造成分群に対して特異的であり、各生物触媒は前記別個の構造成分を含む多くの種々の小分子と反応する。
【０２０１】
リグノセルロース系酵素シグナル配列の炭水化物結合ドメイン、並びにプレプロ及び触媒ドメイン：本発明は、リグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）であって、同種又は異種シグナル配列（例えばシグナルペプチド（SP））、プレプロドメイン、炭水化物結合ドメイン及び／又は触媒ドメイン（CD））を含むもの又は前記を含まないものを提供する。本発明のSP、プレプロドメイン及び／又はCDは単離、合成又は組換えペプチドであってもよいが、また融合タンパク質の部分（例えばキメラタンパク質の異種ドメイン）であってもよい。これらの酵素はマルチドメイン構築物であってもよく、例えば本発明の酵素は1つ以上又は多数のドメイン（例えばSP、プレプロドメイン、炭水化物結合ドメイン及び／又は触媒ドメイン）がその配列に添加されてあっても、又はその配列中にスプライスされて（例えば融合（キメラ）タンパク質として）、その内因性の等価ドメイン（例えば内因性SP、プレプロドメイン、炭水化物結合ドメイン及び／又は触媒ドメイン）と置き換わっていてもよい。本発明は、これらのマルチドメイン又は置換ドメイン酵素、並びに本発明のポリペプチドに由来する個々の触媒ドメイン（CD）、炭水化物結合ドメイン、プレプロドメイン及びシグナル配列（SP、例えば本発明のポリペプチドのアミノ末端残基を含む／から成る配列を有するペプチド）をコードする単離、合成又は組換え核酸を提供する。
本発明は、本発明のポリペプチド、例えば本発明の例示的ポリペプチド（表3及び4、並びに配列リストを参照されたい）の残基1から14、1から15、1から16、1から17、1から18、1から19、1から20、1から21、1から22、1から23、1から24、1から25、1から26、1から27、1から28、1から28、1から30、1から31、1から32、1から33、1から34、1から35、1から36、1から37、1から38、1から40、1から41、1から42、1から43、1から44、1から45、1から46若しくは1から47の又はそれより大きい配列（で示される配列）から成る又は前記配列を含む、単離、合成又は組換えシグナル配列（例えばシグナルペプチド）を提供する。
ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドの最初の14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70又はそれより大きいアミノ末端残基を含むシグナル配列を提供する。
例えば、上記の表3及び4は、例えば配列番号:2の配列（例えば配列番号:1によってコードされる）を有するポリペプチドの場合のように、本発明の例示的シグナル（リーダー）配列を示す。前記ポリペプチドは、配列番号:2のアミノ末端33残基又はMSRNIRKSSFIFSLLTIIVLIASMFLQTQTAQAを含む（又は前記から成る）シグナル配列を有する。
さらに別の例示的シグナル配列は、上記表3及び4に同様に示され、これらは例示的シグナル配列であり、本発明はこれらの例示的配列に限定されず、例えば配列番号:2のためのまた別の配列は以下であってもよい：MSRNIRKSSFIFSLLTIIVLIASMFLQTQTAQ、又はMSRNIRKSSFIFSLLTIIVLIASMFLQTQTAなど。
表1から4及び配列リストはまた本発明の例示的配列に関する他の情報（上記で詳細に考察した）を示す。
【０２０２】
本発明には、本発明のポリペプチドを含むポリペプチドが含まれ、前記にはシグナル配列（すなわちシグナルペプチド（SP）、例えば上記及び／又は表1から4に示される）、プレプロドメイン、炭水化物結合ドメイン及び／又は触媒ドメイン（CD）を含むもの及び含まないものがある。本発明には、異種シグナル配列、プレプロドメイン、炭水化物結合ドメイン及び／又は触媒ドメインを有するポリペプチドが含まれる。例えば、本発明のポリペプチドには、それらの内因性シグナル（リーダー）配列、プレプロドメイン、炭水化物結合ドメイン及び／又は触媒ドメインが、別の類似の酵素又は完全に別個の酵素に由来する機能的に等価の異種ドメイン配列で置き換えられている酵素が含まれる。SPドメイン、プレプロドメイン、炭水化物結合ドメイン及び／又は触媒ドメイン配列（例えば異種ドメインとして用いられる本発明の配列を含む）は、タンパク質の内部、又はアミノ末端若しくはカルボキシ末端に配置されえる。
ある特徴では、本発明の実施に用いられる異種シグナル配列は、コードされたタンパク質（例えば本発明の酵素）を液胞、小胞体、葉緑体又はデンプン顆粒に誘導する。ある特徴では、本発明のシグナル配列は、コードされたタンパク質（例えば本発明の酵素）を空胞、小胞体、葉緑体又はデンプン顆粒に誘導する。
本発明はまた、本発明の酵素の部分配列を含む、単離、合成又は組換えシグナル配列、炭水化物結合ドメイン、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（例えば“活性部位”）を含む。本発明のシグナル配列を含むポリペプチドは、本発明のリグノセルロース系酵素（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）でも、又は別のリグノセルロース系酵素（本発明のものではない）でも、又は別の酵素若しくは他のポリペプチドであってもよい。
ある特徴では、本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素に由来するシグナル配列、炭水化物結合ドメイン、プレプロ配列及び／又は触媒ドメインをコードする核酸配列であって、異なるリグノセルロース系酵素又は場合によって別の酵素の核酸配列に機能的に連結されたものを提供する。非リグノセルロース系酵素に由来するシグナル配列（SP）、炭水化物結合ドメイン、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメインもまた用いることができる。
【０２０３】
本発明はまた、本発明のシグナル配列、炭水化物結合ドメイン（又はモジュール“CBM”）、プレプロ配列及び／又は触媒ドメイン（活性部位）及び1つ以上の異種配列を含む単離、合成又は組換えポリペプチドを提供する。ある特徴では、前記異種配列は、当該配列が（例えばマルチドメイン融合タンパク質として）結合されてある酵素又はドメインと天然の状態では結合していない配列であるか、又は内因性ドメインではあるが、改変及び／又は分子内で再編成（再配置）された配列である。シグナル配列、炭水化物結合ドメイン（CBM）、プレプロ配列及び／又は触媒ドメインが天然の状態では結合されていない配列は、異種配列（酵素）に対して内部に存在するか、または前記異種配列（例えば酵素）のアミノ末端、カルボキシ末端及び／又は両端に存在しえる。例えば、ある特徴では、異種又は改変若しくは再配置されたCBM、シグナル配列及び／又は活性部位（例えば“少なくとも1つのCBM”）は、本発明の触媒ドメイン、CBM及び／又はシグナル配列のキメラポリペプチドの近くに、（例えば、少なくとも1つの触媒ドメイン、CBM及び／又はシグナル配列が配置されている場合は）、例えば前記ポリペプチドの触媒ドメインのC-末端近くに、又は前記ポリペプチドの触媒ドメインのN-末端近くに配置される。また別の実施態様では、“近くに”という用語は、触媒ドメイン、CBM、活性部位又はC-末端若しくはN-末端から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、、14、15、16、17、18、19若しくは20残基又は前記を超える残基だけ離れて配置されることを意味する。
ある特徴では、本発明は、本発明のシグナル配列（SP）、CBM、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメインを含むポリペプチドを含む（又は前記から成る）単離、合成又は組換えポリペプチドを提供するが、ただし前記ポリペプチドは、それが天然の状態で結合しているいずれの配列とも結合していないことを条件とする（前記ポリペプチドは、例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素である）。
【０２０４】
植物シグナル配列：本発明の実施に用いられる内因性又は異種シグナル配列には任意の植物シグナル配列（シグナルペプチド、SP）が含まれえる（注記：いずれのSPも本発明の実施に用いることができ、さらにSPという用語には、ポリペプチドを導き又は誘導することができる成分が含まれ、ウイルス由来、細菌由来、哺乳動物由来又は合成起源のSNが含まれる）。いずれのシグナル配列（植物シグナル配列を含む）のコード配列も、キメラポリペプチド（例えば酵素）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、小胞体への誘導及びアポプラスト（形質膜外の自由な拡散スペース）への分泌のための、トウモロコシのγ-ゼインN-末端シグナル配列を含むことができる（例えば以下を参照されたい：Torrent (1997) Plant Mol Biol 34(1):139-149）。本発明の全てのポリペプチド（これらのキメラタンパク質を含む）に関して、本発明はそれらをコードする核酸を提供する。
本発明の実施に用いることができる別の例示的シグナル配列は、小胞体内にポリペプチドを保持するためのアミノ酸配列モチーフSEKDELである（例えば以下を参照されたい：Munro (1987) Cell 48(5):899-907）。例えば、ある特徴では、本発明は、モチーフSEKDELに機能的に連結されたトウモロコシγ-ゼイン由来N-末端配列を含む本発明の酵素及びこのキメラ配列をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、蝋様アミロプラスト誘導ペプチドと機能的に連結された本発明のポリペプチドを提供する（したがってこのポリペプチドは、蝋様アミロプラスト誘導ペプチドとの融合によりアミロプラスト又はデンプン顆粒に誘導されるであろう）（例えば以下を参照されたい：Klosgen (1986), Klosgen (2001) Biochim Biophys Acta 1541(1-2):22-33；Qbadou (2003) J. Cell Sci. 116 (Pt 5):837-846）。
別の特徴では、超好熱性プロセッシング酵素をコードするポリヌクレオチドが、葉緑体（アミロプラスト）輸送ペプチド（CTP）及びデンプン結合ドメインの形態にあるCBH（例えばwaxy遺伝子に由来する）と機能的に連結される（例えば以下を参照されたい：Klosgen (1991) Mol. Gen. Genet. 225(2):297-304；Gutensohn (2006) Plant Biol. (Stuttg). 8(1):18-30；Ji (2004) Plant Biotechnol. J. 2(3):251-260）。デンプン結合ドメインは当分野では周知であり、いずれのデンプン結合ドメインも、例えば本発明の酵素と結合した異種ドメインとして、又は本発明の酵素の部分として（例えば組換えキメラタンパク質として）本発明の実施に用いることができる（例えば以下を参照されたい：Firouzabadi Planta (2006) Oct. 13th Epub；Ji (2004 ) Plant Biotechnol J 2(3):251-260）。別の特徴では、本発明の酵素は、酵素をデンプン結合ドメイン（例えば蝋様デンプン結合ドメイン）に機能的に連結することによってデンプン顆粒へ誘導されるように設計される。この連結は、本発明の酵素と結合させた他の異種ドメインの場合のように、組換えキメラタンパク質、又は例えばリンカーとの化学的結合、又は静電的結合が可能である。ある特徴では、本発明は、デンプン結合ドメイン（例えばwaxyデンプン結合ドメイン）を含むα-アミラーゼ融合ポリペプチドと機能的に連結された、N-末端アミロプラスト誘導配列（例えばwaxy由来）を含む融合ポリペプチド（組換えキメラタンパク質）を提供する。
【０２０５】
炭水化物結合モジュール（CBM）：上記で考察したように、ある特徴では、本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素は、組換え又はキメラ（例えばマルチドメイン）酵素であり、少なくとも1つ（例えば複数を含むことができる）の炭水化物結合モジュール（CBM）を含み、前記モジュールは異種炭水化物結合モジュールでも又は内因性炭水化物結合モジュールでもよく、この場合、炭水化物結合モジュール（CBM）は公知の任意のモジュール（又は“ドメイン”）（グリコシルヒドロラーゼ結合ドメイン、及び／又はセルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナナーゼ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュール（Gunnarson (2006) Glycobiology 16:1171-1180）、アラビノフラノシダーゼ結合モジュールなどを含む）でもよい。また別の実施態様では、炭水化物結合モジュールは、本発明の別のリグノセルロース系酵素由来であっても、又は本発明のリグノセルロース系酵素由来でなくてもよい。例えば、前記ドメインは当該酵素にとって“異種”であり、例えば米国特許出願公開公報20060257984号、同20060147581号；USPN 7,129,069に記載のモジュールが含まれる。したがって、本発明のキメラ（例えばマルチドメイン）酵素は、酵素自身の配列内で再編成又は多重化された内因性炭水化物結合モジュールを有していても、または酵素自身の内因性モジュールが交換又は置き換えられてあってもよいが、また酵素の配列内で（内部又はカルボキシ-及び／又はアミノ-末端で）1つ以上の別の炭水化物結合モジュールがスプライスされてあってもよい。
したがって、本発明のポリペプチドは、3つの主要なタイプ（A、B及びC）に割り振られている、任意の炭水化物結合モジュールを含むことができる。又は本発明のキメラポリペプチドは、異種、又は改変若しくは内部再編成CBM（CBM_1、CBM_2、CBM_2a、CBM_2b、CBM_3、CBM_3a、CBM_3b、CBM_3c、CBM_4、CBM_5、CBM_5_12、CBM_6、CBM_7、CBM_8、CBM_9、CBM_10、CBM_11、CBM_12、CBM_13、CBM_14、CBM_15、CBM_16、又はCBM_1からCBM_48のCBMファミリー由来のCBMのいずれかを含む）、又はその任意の組合せを含むことができる。
【０２０６】
本発明のキメラ又はハイブリッド（例えば組換え）酵素は、異種又は再編成内因性モジュールとして、これらの他に任意のタイプの1つ又はいくつかを含むことができ、前記には以下のモジュール又はモジュールメンバーのいずれかが含まれる：CBM_1からCBM_48のCBMファミリー、及び／又はタイプAモジュール（平坦な結合面を有し、不溶性結晶グルカンと結合する）、タイプBモジュール（結合裂を提示し遊離した単一炭水化物鎖に対して親和性を有する）、タイプCモジュール（溶媒に露出した結合スロットを有し、単糖類及び二糖類と結合する能力を有する）。例えば以下を参照されたい：Protein Engineering Design and Selection (2004) 17(3):213-221；Coutinho (1999) Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In “Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering”, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12；Tomme (1989) FEBS Lett. 243, 239-243；Gilkes (1988) J. Biol. Chem. 263, 10401-10407；Tomme (1995) in Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler, J.N. & Penner, M., eds.), Cellulose-binding domains: classification and properties. pp. 142-163, American Chemical Society, Washington；Henrissat (1997) Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. Curr. Op. Struct. Biol. 7:637-644；Coutinho (2003) An evolving hierarchical family classification for glycosyltransferases. J. Mol. Biol. 328:307-317；Boraston (2004) Carbohydrate-binding modules: fine-tuning polysaccharide recognition. Biochem. J. 382:769-781）。このように、CBMは当分野ではその特性がよく調べられている。
【０２０７】
ある特徴では、本発明のSP、炭水化物結合ドメイン、触媒ドメイン及び／又はプレプロ配列は、日常的なスクリーニングプロトコル又は本発明のリグノセルロース系酵素又は他のポリペプチドの配列同一性分析を用いて識別される。例えば、本発明のポリペプチドの配列に対する付加又は欠失又は改変がもたらす、タンパク質誘導経路における前記ポリペプチドの作用態様、基質（例えば炭水化物、例えばセルラーゼ又はリグニン）に結合する能力、加水分解する能力などに対する影響によって、本発明の新規なドメインが識別されるであろう（タンパク質が仕分けされ、それらの適切な分布場所に輸送される経路はしばしばタンパク質誘導経路と称される）。本発明のシグナル配列は、長さが約10から65、又はそれより大きいアミノ酸残基まで変動しえる。種々のシグナル配列（SP）、炭水化物結合ドメイン、触媒ドメイン及び／又はプレプロ配列の認識方法が当業者には知られている。例えば、ある特徴では、新規なリグノセルロース系酵素シグナルペプチドは、SignalPと称される方法によって識別される。SignalPは、シグナルペプチド及びそれらの切断部位の両方を認識する総合ニューラルネットワークを用い、前記は例えば以下に記載されている：Nielsen (1997)“Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.” Protein Engineering 10:1-6。“プレプロ”ドメイン配列及びシグナル配列を識別する方法は当分野では周知であり、例えば以下を参照されたい：Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2):115-136。例えば、プレプロ配列を識別するために、タンパク質を細胞外間隙から精製し、N-末端タンパク質配列を決定し、プロセッシングされていない形態と比較する。別の実施態様では、異種SPは酵母のシグナル配列を含む。本発明のリグノセルロース系酵素は、ベクター（例えばpPICシリーズベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA））中に異種SP及び／又はプレプロを含むことができる。下記の実施例7には、炭水化物結合モジュール配列を識別するための例示的な日常的プロトコルが記載されている。
【０２０８】
ハイブリッド（キメラ）リグノセルロース系酵素及びペプチドライブラリー：ある特徴では、本発明は、融合ペプチドとして、ハイブリッドリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を提供し、ある特徴では、前記はまたペプチドライブラリーを含み、ある実施態様では、これらのペプチドライブラリーは本発明の配列を含むか、又は本発明の配列から成る（本発明の酵素の部分配列）。本発明のペプチドライブラリーを用いて、標的のペプチド調節物質（例えばアクチベーター又はインヒビター）、例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素基質、レセプター、補助因子、調節物質などを単離することができる。本発明のペプチドライブラリーを用いて、標的の正規の結合パートナー、例えばリガンド、例えばサイトカイン、ホルモン、補助因子、調節物質などを識別することができる。ある特徴では、本発明は、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメイン及び／又は触媒ドメイン（CD）又はその組合せ及び異種配列（上記参照）を含むキメラタンパク質を提供する。
ある特徴では、本発明の融合タンパク質（例えばペプチド部分）は、構造的に安定化されて（直鎖状ペプチドと比べて）、標的に対するより高い結合親和性を可能にする。本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素と他のペプチド（公知のペプチド及び任意のペプチド）との融合を提供する。それらは、リグノセルロース系酵素の構造が顕著には損なわれず、さらにペプチドが代謝的又は立体的、配座的に安定化される態様で融合される。これによって、細胞内でのその存在及びその量の両者が容易にモニターされるペプチドライブラリーの作製が可能になる。
【０２０９】
本発明のアミノ酸配列変種は、所望の変動を有する予め決定した性質、例えばそれらを天然に存在する形態から区別する特色（例えば本発明のリグノセルロース系酵素配列における対立遺伝子座変動又は種間変動）を特徴とする。ある特徴では、本発明の変種は、天然に存在するアナローグと質的に同じ生物学的活性を示す。あるいは、本発明の変種は、改変された特色を有するように選別することができる。ある特徴では、アミノ酸配列変動を導入する部位又は領域は予め定められるが、変異それ自体は予め決定されない。例えば、ある部位における変異の達成を最適化するために、ランダム変異を標的コドン又は領域で実施し、発現したリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素の変種を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングする。既知の配列を有するDNAの予め定めた部位で置換変異を導入するための技術は周知であり、本明細書ではM13プライマー変異導入及びPCR変異導入が考察される。変異体のスクリーニングは、例えばグルカン加水分解アッセイを用いて実施することができる。また別の特徴では、アミノ酸置換はただ1つの残基であってもよく、挿入は約1から20アミノ酸の規模でありえるが、それよりも顕著に大きい挿入も実施することができる。欠失は約1から約20、30、40、50、60、70残基又はそれより大きい範囲でもよい。最適な特性を有する最終的な誘導体を得るために、置換、欠失、挿入又はその任意の組合せを用いることができる。一般的には、これらの変更は数アミノ酸で実施し、分子の改変を最低限にとどめる。しかしながらより大きな変更もある種の環境下では容認される。
【０２１０】
本発明は、ポリペプチド骨格の構造、二次又は三次構造（例えばアルファヘリックス又はベータシート構造）が改変された、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を提供する。ある特徴では、電荷又は疎水性が改変されている。ある特徴では、側鎖の大きさが改変されている。機能又は免疫学的同一性における実質的な変更は、保存性が低い置換を選択することによって実施される。例えば、変更される領域のポリペプチド骨格の構造（例えばアルファヘリックス又はベータシート構造）；分子の電荷又は疎水性部位（前記は活性部位に存在しえる）；又は側鎖に対してより顕著な影響を与える置換を実施してもよい。本発明は、本発明のポリペプチド内で以下のような置換を提供する：（a）親水性残基（例えばセリル又はスレオニル）が疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニル）によって置換される（またはその逆）；（b）システイン又はプロリンが、任意の他の残基によって置換される（またはその逆）；（c）陽性荷電の側鎖を有する残基（例えばリシル、アルギニル又はヒスチジル）が陰性荷電残基によって置換される（またはその逆）；又は（d）大きな側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）が側鎖をもたない残基（例えばグリシン）によって置換される（またはその逆）。変種は質的に同じ生物学的活性（すなわち、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性）を有するが、ただし変種を選別して、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素の特徴を必要とされるように改変することができる。
【０２１１】
ある特徴では、本発明のリグノセルロース系酵素は、エピトープ若しくは精製タグ、シグナル配列又は他の融合配列などを含む。ある特徴では、本発明のリグノセルロース系酵素を任意のペプチドと融合させて、融合ポリペプチドを生成することができる。本明細書の“融合”又は“機能的に連結”とは、任意のペプチドとリグノセルロース系酵素が、リグノセルロース系酵素構造の安定性の混乱が最小限にとどめられる（例えばリグノセルロース系酵素活性を保持する）ような態様で一緒に連結されることを意味する。融合ポリペプチド（又は融合ポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチド）は、多数のループに多数のペプチドを含む更なる成分を同様に含むことができる。
ある特徴では、ペプチド及びそれらをコードする核酸は、例えばヌクレオチド／残基頻度において全体的に又は位置ごとにランダム化される (完全なランダム化、又は偏りを有するランダム化）。“ランダム化”とは、各核酸及びペプチドがそれぞれ、本質的に任意のヌクレオチド及びアミノ酸から成ることを意味する。ある特徴では、ペプチドを生じる核酸は化学的に合成され、したがって任意の位置に任意のヌクレオチドを取り込むことができる。したがって、核酸が発現されペプチドを形成するとき、任意のアミノ酸残基が任意の位置に取り込まれえる。ランダム化核酸が作製されるように合成プロセスを設計して、核酸の全長にわたって可能な組合せの全て又は大半を形成させることができ、したがってランダム化核酸のライブラリーを作製することができる。このライブラリーは、構造的に十二分に多様なランダム化発現生成物集団を提供し、確率論的に十分な範囲の細胞性応答に影響を及ぼして所望の応答を示す1つ以上の細胞を提供することができる。したがって、本発明は、その集団メンバーの少なくとも1つが、ある分子、タンパク質又は他の因子に親和性を与える構造を有しえるほど十分に大きい相互作用ライブラリーを提供する。
【０２１２】
本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチド（例えばハイブリッドリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）をコードすることができるキメラポリペプチドを生成するための方法及び配列を提供する。ある特徴では、原型ポリヌクレオチド（例えば本発明の例示的核酸）は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする。ある特徴では、本発明の方法は、原型ポリヌクレオチドの配列を組み込む細胞プロセスを利用することによって、新規なハイブリッドポリペプチドを産出するが、このとき組み込みは、得られたハイブリッドポリヌクレオチドが、生物学的に活性な原型ポリペプチド（例えば本発明の酵素又は抗体）に由来するが、前記とは異なる活性を示すポリペプチドをコードするように行われる。例えば、原型ポリヌクレオチドは、異なる微生物に由来するか又は異なる微生物で見出される特定の酵素（例えばリグノセルロース系酵素）をコードすることができる。ある生物又は変種に由来する第一のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、例えば特定の環境条件（例えば高塩濃度）下で効率的に機能する。異なる生物又は変種に由来する第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は異なる環境条件（たとえば超高温）下で効率的に機能することができる。第一及び第二の原型ポリヌクレオチドに由来する配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、原型ポリヌクレオチドによってコードされる両酵素の特徴を示す酵素をコードすることができる。したがって、本発明のハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、第一及び第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素の各々によって共有される環境条件（例えば高塩濃度及び極端な温度）下で効率的に機能することができる。
【０２１３】
ある特徴では、本発明の方法によって作製されるハイブリッドポリペプチドは、原型酵素で示されていない特殊化された酵素活性を示すことができる。例えば、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドの組換え及び／又は還元的再組み合わせに続いて、得られたハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされるハイブリッドポリペプチドを特殊化された非リグノセルロース系酵素活性について、例えばペプチダーゼ、ホスホリラーゼ、アミダーゼ、ホスホリラーゼなど、原型酵素の各々から得られた活性についてスクリーニングすることができる。ある特徴では、ハイブリッドポリペプチドは、原型の親ポリペプチドからハイブリッドポリペプチドを区別する化学的機能性、例えばハイブリッドポリペプチドが機能する温度、pH又は塩濃度を確認するためにスクリーニングされる。
ある特徴では、本発明は、以下の工程によって生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドを製造し、さらにそのようなポリペプチドを活性強化についてスクリーニングする方法に関する：
1）機能的に連結されている少なくとも第一のポリヌクレオチド及び機能的に連結されている第二のポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞に導入する工程（前記少なくとも第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチドは少なくとも1つの部分的配列相同性を共有する）；
2）機能的に連結されたハイブリッドポリヌクレオチドを生じる、配列再構成を促進する条件下で前記宿主細胞を増殖させる工程；
3）前記ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされるハイブリッドポリペプチドを発現させる工程；
4）強化された生物学的活性の識別を容易にする条件下でハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする工程；及び
前記ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する工程。
【０２１４】
リグノセルロース系酵素の単離及び発見
本発明は、リグノセルロース系酵素及び前記をコードする核酸を単離及び発見する方法を提供する。ポリヌクレオチド又は酵素は、個々の生物（“単離株”）、規定の培地（“栄養培地”）で増殖させた生物集積物、又は非培養生物（“環境サンプル”）から単離することができる。前記生物は、例えばin vivoバイオパンニング（下記考察を参照）によって単離することができる。環境サンプルから新規な生物活性をコードするポリヌクレオチドを誘導する、培養に頼らない手法を用いることがもっとも好ましい。なぜならば、前記手法は生物多様性を有する未利用資源に近づくことを可能にするからである。ポリヌクレオチド又は酵素はまた多数の生物のいずれからも（例えば細菌）単離することができる。ポリヌクレオチド又は酵素は、全細胞の他に、これらの生物（例えば細菌）の培養に由来する粗酵素抽出物からもまた単離することができる。
ある特徴では、“環境ライブラリー”は環境サンプルから作製される。前記ライブラリーは、適切な原核細胞宿主で増殖することができるクローニングベクター中に保管された、天然に存在する生物の集積ゲノムである。この特徴では、クローン化DNAは先ず初めに環境サンプルから直接抽出されるので、ライブラリーは、純粋培養で増殖させることができる原核細胞の小部分に限定されない。ある特徴では、これらのサンプルに存在する環境DNAの標準化によって、最初のサンプルに存在する全ての種のDNAの均等な提示が可能になる。これによって、優勢な種よりも数桁少ない可能性があるサンプルの微量成分から重要な遺伝子を発見する効率を劇的に高めることができる。
ある特徴では、1つ以上の非培養微生物から作製される遺伝子ライブラリーが、重要な活性についてスクリーニングされる。生物活性を有する重要な分子をコードする可能性がある経路は、遺伝子発現ライブラリーの形の原核細胞で最初に捕捉される。ある特徴では、重要な活性をコードするポリヌクレオチドはそのようなライブラリーから単離され、宿主細胞に導入される。新規な又は強化された活性を有する潜在的に活性なバイオ分子を生じる組換え及び／又は還元的再組合せを促進する条件下で、前記宿主細胞を増殖させる。
【０２１５】
in vivoバイオパンニングは、FACS系機器及び非光学（例えば磁力）系機器を用いて実施することができる。ある特徴では、複雑な遺伝子ライブラリーは、転写されたRNAを安定化させるエレメントを含むベクターを用いて構築される。例えば、二次構造、例えばヘアピン（前記はRNAの転写領域にフランキングするように設計される）を生じる配列の導入は、それらの安定性を高め、したがって細胞内でのそれらの半減期を延長するであろう。バイオパンニングプロセスで用いられるプローブ分子は、標的分子とのプローブの結合時にのみ蛍光を発するレポーター分子で標識されたオリゴヌクレオチドから成る。これらのプローブは、いくつかの形質転換方法の1つを用いてライブラリーから組換え細胞に導入される。プローブ分子は、転写された標的mRNAと結合して、DNA/RNAへテロデュープレックス分子を生じる。プローブと標的との結合によって蛍光シグナルが発生し、前記シグナルはスクリーニングプロセスでFACS機器によって検出及び仕分けされる。
ある特徴では、サブクローニングを実施して重要な配列をさらに単離する。サブクローニングでは、DNAの一部分を増幅し、一般的には制限酵素によって所望の配列を切り出し、この所望の配列をレシピエントベクターに連結して増幅する。サブクローニングの各工程で、前記部分を重要な活性について試験し、構造タンパク質をコードするDNAが排除されていることを確認する。挿入物はサブクローニングの各工程で、例えばベクターに連結する前にゲル電気泳動によって、又はレシピエントベクターを含む細胞及び前記を含まない細胞を例えば抗生物質（前記はレシピエントベクターを含まない細胞を殺すであろう）を含む選択培地に加えて精製することができる。ベクターでcDNA挿入物をサブクローニングする具体的な方法は当分野では周知である（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989）。別の特徴では、本発明の酵素はサブクローンである。そのようなサブクローンは、例えば長さ、変異、タグ又は標識が親クローンと異なることがある。
【０２１６】
ポリヌクレオチドを発見、単離又は調製することができる微生物には、原核微生物（例えば真正細菌及び古細菌）及び下等な真核微生物（例えば菌類、いくらかの藻類及び原生動物）が含まれる。ポリヌクレオチドは、サンプル、例えば環境サンプルから発見、単離又は調製することができ、この事例では、核酸は、微生物を培養することなく回収されるか、又は1つ以上の培養微生物から回収されえる。ある特徴では、そのような微生物は、エクストレモフィル、例えば超好熱菌、低温菌、低栄養菌、好塩菌、好圧性菌及び好酸性菌であろう。エクストロモフィル系微生物から単離された酵素をコードするポリヌクレオチドを用いてもよい。本発明の酵素は、陸上の温泉又は深海の熱水噴出孔で見出されるもののように100℃を超える温度で機能することができるか、又は、北極海で見出されるもののように0℃未満の温度で、例えば死海で見出されるもののように飽和食塩環境で、石炭堆積物及び硫黄に富む地熱温泉で見出されるもののように0に近いpH値で、又は下水汚泥で見出されるもののように11を超えるpH値で機能することができる。ある特徴では、本発明の酵素は、広範囲の温度及びpHを通して高い活性を示す。
上述のように選別及び単離したポリヌクレオチドは適切な宿主細胞に導入される。適切な宿主細胞は、組換え及び／又は還元的再組合せを促進することができる任意の細胞である。ある特徴では選別したポリヌクレオチドは既に適切なコントロール配列を含むベクター内に存在する。前記宿主細胞は、高等な真核細胞（例えば哺乳動物細胞）でも、下等な真核細胞（例えば酵母細胞）でもよいが、ある特徴では、宿主細胞は原核細胞（例えば細菌細胞）でありえる。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって実施することができる。
例示的な宿主には以下が含まれる：細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌；菌類細胞、例えば酵母；昆虫細胞、例えばドロソフィラS2及びスポドプテラSf9；動物細胞、例えばCHO、COS又はボウズメラノーマ；アデノウイルス；及び植物細胞（上記の考察を参照されたい）。適切な宿主細胞の選択は、本明細書の開示から当業者の技術範囲内にあると考えられる。
【０２１７】
種々の哺乳動物細胞培養系を組換えタンパク質の発現に用いることができる。哺乳動物発現系の例には、サル腎線維芽細胞のCOS-7株（”SV40-trnsformed simian cells support the replication of early SV40 mutants” (Gluzman, 1981)に記載されている）及び適合しえるベクターを発現することができる他の細胞株（例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター及びエンハンサー、並びに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終了配列及び5'フランキング非転写配列を含むであろう。SV40スプライス部位及びポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝エレメントを提供することができる。
別の特徴では、本発明の核酸、ポリペプチド及び方法が、生化学経路で、または、1つ以上のオペロン又は遺伝子クラスター又はその部分から生化学的経路をコードする新規なポリヌクレオチドを作製するために用いられる。例えば、細菌及び多くの真核細胞は、その生成物が関連する過程に必要とされる遺伝子を調節するために協調的なメカニズムを有する。前記遺伝子は、“遺伝子クラスター”と称される構造を有するクラスターを単一の染色体上に形成し、ただ１つの調節配列（全クラスターの転写を開始するただ1つのプロモーターを含む）の制御下で一緒に転写される。したがって、遺伝子クラスターは、通常それらの機能に関して同一又は関連する隣接する遺伝子の一群である（遺伝子クラスターによってコードされる生化学的経路の例はポリケチドである）。
【０２１８】
ある特徴では、遺伝子クラスターDNAは種々の生物から単離され、ベクター、例えば発現調節配列含むベクターに連結される（前記調節配列は、連結された遺伝子クラスターに由来する検出可能なタンパク質又はタンパク質関連アレイ活性の生成を制御および調節することができる）。外因性DNAの導入に対して格別に大きな収容能力を有するベクターの使用が、そのような遺伝子クラスターに関して使用するためには特に適切であり、大腸菌のF因子（または稔性因子）を含む例示として本明細書に記載されている。大腸菌のこのF因子は、接合時のそれ自体の高頻度の伝達に影響を与えるプラスミドであり、大きなDNAフラグメント、例えば混合微生物サンプル由来の遺伝子クラスターの安定的な増殖の達成に理想的である。ある特徴では、“フォスミド”又は細菌人工染色体（BAC）ベクターと称されるクローニングベクターが使用される。これらは大腸菌のF因子に由来し、ゲノムDNAの大きなセグメントを安定的に組み込むことができる。非培養の混合環境サンプル由来のDNAとともに組み込まれたとき、これは、安定な“環境DNAライブラリー”の形態にある大きなゲノムフラグメントを獲得することを可能にする。本発明で使用されるまた別のベクターのタイプはコスミドベクターである。最初コスミドベクターは、ゲノムDNAの大きなセグメントのクローニング及び増殖のために設計された。コスミドベクターでのローニングは以下に詳細に記載されている：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)。いったん適切なベクターに連結したら、種々のポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターを含む2つ以上のベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。遺伝子クラスターによって共有される部分的な配列相同性を有する領域は、ハイブリッド遺伝子クラスターを生じる配列再構成を生じるプロセスを促進するであろう。続いて、原型遺伝子クラスターには見出されない強化された活性について、新規なハイブリッド遺伝子クラスターをスクリーニングすることができる。
多様な酵素活性についてスクリーニングする方法は当業者には公知であり、本明細書を通して考察されてあり、例えば下記実施例1、2及び3を参照されたい。そのような方法は、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを単離するときに利用することができる。
ある特徴では、本発明は、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素、又はこれらの酵素の活性を改変する化合物を、全細胞アプローチ（下記考察を参照されたい）を用いて発見及び／又は単離する方法を提供する。ゲノムDNAライブラリーに由来する、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素をコードするクローンをスクリーニングすることができる。
【０２１９】
スクリーニングの方法論及び“オンライン”モニター装置
本発明の方法の実施に際して、多様な装置及び方法論を本発明のポリペプチド及び核酸と併せて用いて、例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性についてポリペプチドをスクリーニングし、リグノセルロース系酵素活性の潜在的調節物質（例えば活性化物質又は阻害物質）として化合物をスクリーニングし、本発明のポリペプチドと結合する抗体について、本発明の核酸とハイブリダイズする核酸について、本発明のポリペプチドを発現する細胞ついてスクリーニングすることなどが可能である。そのような様式には、例えば質量分光光度計、クロマトグラフ（例えば高速HPLC及び他の液体クロマトグラフィー様式）及びより小型の様式（例えば1536-ウェルプレート、384-ウェルプレート）などが含まれる。高処理スクリーニング装置を適合させて、本発明の方法の実施に用いてもよい（例えば米国特許出願20020001809、20050272044を参照されたい）。
【０２２０】
キャピラリーアレイ：本発明の核酸又はポリペプチドは、アレイに固定又は塗布することができる。アレイを用いて、組成物（例えば小分子、抗体、核酸など）のライブラリーを、本発明の核酸又はポリペプチドとの結合能力又は前記の活性の調節能力についてスクリーニング又はモニターすることができる。キャピラリーアレイ（例えばGIGAMATRIXTM, Verenium Corporation, San Diego, CA）及び例えば米国特許出願No. 20020080350A1；WO0231203A；WO0244336Aに記載されたアレイ）は、サンプル保持及びスクリーニングのためのまた別の装置を提供する。ある特徴では、キャピラリーアレイは、隣接するキャピラリーのアレイを形成する複数のキャピラリーを含み、ここで各キャピラリーはサンプル保持のために管腔を仕切る少なくとも1つの壁を構成する。管腔は、円筒形、四角形、六角形又は、前記壁が液体又はサンプルの保持のための管腔を形成することができるかぎり他の任意の幾何学形で在り得る。キャピラリーアレイのキャピラリーは接近して一緒に保持され平面構造を形成することができる。キャピラリーは、溶融（その場合キャピラリーは例えばガラスで製造される）、接着剤による接着、縛るか又は隣同士を留め金で固定することによって一緒に束ねることができる。さらにまた、キャピラリーアレイは、アレイ中の隣接するキャピラリー間に沈積された間隙物質を含むことができ、それによって複数の貫通孔を含む硬い平板状装置を形成する。
キャピラリーアレイは、任意の数の個々のキャピラリー、例えば100から4,000,000本の範囲のキャピラリーで形成できる。さらに、約100,000本又はそれ以上の個々のキャピラリーを有するキャピラリーアレイを、標準的な研究室用装置に適合させるためにマイクロタイター（Microtiter(商標)）プレートの標準的サイズ及び形状に形成することができる。管腔は手動で満たされるか、又は毛細管作用若しくは細い注射針によるマイクロインジェクションを用いて自動的に満たされる。問題のサンプルは続いて更なる分析または特性決定のために個々のキャピラリーから除去される。例えば、細い注射針様プローブが液体通路に配置される(前記液体通路は添加のためまたは管腔から物質を引き出すために選択されるキャピラリーを有する)。
【０２２１】
一容器スクリーニングアッセイでは、キャピラリーアレイへの挿入の前にアッセイ成分は混合され、対象溶液が得られる。アレイの少なくとも一部分が対象溶液中に浸されたとき、管腔は毛細管作用によって満たされる。各キャピラリーにおける化学反応又は生物学的反応及び／又は活性が検出可能な事象についてモニターされる。検出可能な事象はしばしば“ヒット”と称され、これは通常は光学的検出によって“無ヒット”をもたらすキャピラリーと区別される。したがって、キャピラリーアレイは大量の並行的な“ヒット”の検出を可能にする。
複数容器スクリーニングアッセイでは、ポリペプチド又は核酸、例えばリガンドは第一の成分に導入することができる。前記第一の成分はキャピラリーアレイのキャピラリーの少なくとも一部分に導入される。続いて、気泡を第一の成分の後ろのキャピラリーに導入することができる。続いて、第二の成分をキャピラリーに導入することができ、この場合第二の成分は前記気泡によって第一の成分と分離される。続いて、キャピラリーの両側に水圧をかけて気泡を壊すことによって第一の成分および第二の成分を混合することができる。続いて、前記2つの成分の反応または無反応から生じる検出可能な事象についてキャピラリーアレイをモニターする。
結合スクリーニングアッセイでは、問題のサンプルは検出可能な粒子で標識された第一の液体としてキャピラリーアレイのキャピラリーに導入することができ、この場合、キャピラリーの管腔は前記検出可能粒子を管腔と結合させるための結合物質で被覆される。続いて、第一の液体をキャピラリー管から除去することができ（この場合、結合した検出可能粒子はキャピラリー内に維持される）、さらに第二の液体をキャピラリー管に導入することができる。続いて、前記粒子と第二の液体との反応または無反応から生じる検出可能な事象についてキャピラリーをモニターする。
【０２２２】
アレイ又は“バイオチップ”：本発明の核酸又はポリペプチドはアレイに固定または塗布することができる。アレイを用いて、（例えば小分子、抗体、核酸などの）組成物ライブラリーを、本発明の核酸またはポリペプチドと結合するその能力または前記の活性を調節するその能力についてスクリーニングまたはモニターすることができる。例えば本発明のある特徴では、モニターされるパラメーターは、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素遺伝子の転写物の発現である。細胞の1つ以上または全ての転写物が、細胞の転写物を含むサンプルのハイブリダイゼーションによって測定することができ、又細胞の代表的な核酸若しくは細胞の転写物と相補的な核酸はアレイ若しくは“バイオチップ”上に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。マイクロチップ上の核酸“アレイ”を用いることによって、細胞の転写物のいくつかまたは全てを同時に定量することができる。あるいは、ゲノム核酸を含むアレイはまた、本発明の方法によって新規に操作された株の遺伝子型の決定に用いることができる。“ポリペプチドアレイ”はまた、複数のタンパク質の同時定量に用いることができる。本発明は公知の任意の“アレイ”（“マイクロアレイ”又は“核酸アレイ”又は“ポリペプチドアレイ”又は“抗体アレイ”又は“バイオチップ”又はその変型とも称される）を用いて実施することができる。アレイは一般的には複数の“スポット”又は“標的エレメント”である。各標的エレメントは一定量の1つ以上の生物学的分子、例えばオリゴヌクレオチドを含み、それらはサンプル分子（例えばmRNA転写物）と特異的に結合させるため基質表面の一定領域に固定されている。
【０２２３】
本明細書で用いられる“アレイ”若しくは“マイクロアレイ”又は“バイオチップ”若しくは “チップ”という用語は複数の標的エレメントであり、下記でさらに詳細に考察されるように、各標的エレメントは一定量の1つ以上のポリペプチド（抗体を含む）又は核酸を含み、それらは基質表面の一定領域に固定されている。
本発明の方法を実施するとき、任意の公知のアレイ及び／又はアレイの製造及び使用方法の全体若しくは部分又はその変型を取り入れることができる。それらは例えば以下に記載されているようなものである：米国特許第6,277,628号；第6,277,489号；第6,261,776号；第6,258,606号；第6,054,270号；第6.048,695号；第6,045,996号；第6,022,963号；第6,013,440号；第5,965,452号；第5,959,098号；第5,856,174号；第5,830,645号；第5,770,456号；第5,632,957号；第5,556,752号；第5,143,854号；第5,807,522号；第5,800,992号；第5,744,305号；第5,700,637号；第5,556,752号；第5,434,049号。さらにまた例えば以下を参照されたい：WO99/5173；WO99/09217；WO97/46313；WO96/17958。さらにまた例えば以下を参照されたい：Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174；Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092；Kern (1997) Biotechniques 23:120-124；Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes＆ Cancer 20:399-407；Bowtell (1999) Nature Genetis Supp. 21:25-32。さらにまた以下を参照されたい：米国特許出願公開広報第20010018642号；同第20010019827号；同第20010016322号；同第20010014449号；同第20010014448号；同第20010012537号；同第20010008765号。
【０２２４】
抗体及び抗体系スクリーニング方法
本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素と特異的に結合する単離、合成又は組換え抗体を提供する。これらの抗体を用いて、本発明のリグノセルロース系酵素又は関連するポリペプチドを単離、識別又は定量することができる。これらの抗体を用いて本発明の範囲内に包含される他のポリペプチド又は他の関連するリグノセルロース系酵素を単離することができる。これらの抗体はリグノセルロース系酵素の活性部位と結合するように設計することができる。したがって、本発明は、本発明の抗体を用いてリグノセルロース系酵素を阻害する方法を提供する（本発明の抗セルラーゼ、例えば抗エンドグルカナーゼ、抗セロビオヒドロラーゼ及び／又は抗ベータ-グルコシダーゼ酵素組成物の応用に関しては上記の考察を参照されたい）。
“抗体”という用語には、１つの免疫グロブリン遺伝子若しくは複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントから誘導されたか、前記にならって作製されたか、または前記によって実質的にコードされたペプチド又はポリペプチドであって、抗原又はエピトープに特異的に結合することができるものが含まれる。例えば以下を参照されたい：Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)；Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273；Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97。抗体という用語は、抗原に結合する能力を保持する抗原結合部分、すなわち“抗原結合部位”（例えばフラグメント、部分配列、相補性決定領域（CDR））を含み、（i）Fabフラグメント（VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価のフラグメント）；（ii）F(ab')2フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント）；（iii）VHおよびCH1ドメインから成るFdフラグメント；（iv）抗体の1つの腕のVLおよびVHドメインから成るFvフラグメント；（v）dAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）（VHドメインから成る）；および（vi）単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。単鎖抗体もまた関連する場合には“抗体”という用語に含まれる。
本発明は、本発明のポリペプチドの免疫原性フラグメント（部分配列）を含む、本発明の酵素のフラグメント（例えばペプチド）を提供する。本発明は、本発明のポリペプチド又はペプチド及びアジュバント又は担体などを含む組成物を提供する。
抗体は、免疫沈澱、染色、イムノアフィニティーカラムなどで用いることができる。所望の場合は、特異的な抗原をコードする核酸配列を、免疫とそれに続くポリペプチド又は核酸の単離、増幅又はクローニング及びポリペプチドの本発明のアレイ上への固定によって作製することができる。あるいは、本発明の方法を用いて、改変されるべき細胞により産生される抗体の構造を改変することができる。例えば抗体の親和性を強化又は低下させることができる。さらにまた、抗体を製造又は改変する能力は本発明の方法により細胞を操作して付与した表現型であり得る。
【０２２５】
免疫、抗体（ポリクローナル及びモノクローナル）の製造及び単離の方法は当業者には公知で、さらに学術文献および特許文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.) Lang Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, Monoclonal Antibodies: Priciples and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York。抗体はまた、動物を用いる従来のin vivo方法以外でも、in vitroで例えば組換え抗体結合部位発現ファージディスプレーライブラリーを用いて作製することができる。例えば以下を参照されたい：Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45。本発明のポリペプチド又はその少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150の連続するアミノ酸を含むフラグメントはまた、前記ポリペプチド又はフラグメントと特異的に結合する抗体の作製に用いることができる。得られた抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィー方法で用いて、前記ポリペプチドを単離又は精製するか、または前記ポリペプチドが生物学的サンプルに存在するか否かを決定することができる。そのような方法では、本発明のポリペプチドの1つ、又はその少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150の連続するアミノ酸を含むフラグメントと特異的に結合することができる抗体と、タンパク質調製物（例えば抽出物）又は生物学的サンプルを接触させる。
イムノアフィニティーの方法では、抗体を固相（例えばビーズ又は他のカラムマトリックス）に付着させる。抗体が本発明のポリペプチドの1つ又はそのフラグメントと特異的に結合する条件下で、前記タンパク質調製物を前記抗体と接触させる。洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出させる。
【０２２６】
生物学的サンプル中のタンパク質の抗体との結合能力は、当業者に周知の多様な方法のいずれかを用いて決定できる。例えば、結合は抗体を検出可能な標識（例えば蛍光物質、酵素標識または放射性同位元素）で標識することによって決定できる。あるいは、抗体とサンプルとの結合は、前記のような検出可能な標識をその上に保持する二次抗体を用いて検出してもよい。具体的なアッセイにはELISAアッセイ、サンドイッチアッセイ、放射能免疫アッセイ及びウェスタンブロットが含まれる。
本発明のポリペプチド又はその少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150の連続するアミノ酸を含む前記のフラグメントに対して作製されるポリクローナル抗体は、動物に前記ポリペプチドを直接注射することによって、または動物（例えば非ヒト動物）に前記ポリペプチドを投与することによって得ることができる。そのようにして得られた抗体は前記ポリペプチド自体と結合することができる。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも完全な天然のポリペプチドと結合することができる抗体の作製に用いることができる。続いて前記のような抗体を用いて、当該ポリペプチドを発現している細胞から前記ポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体の調製の場合、継続的な細胞株培養によって生成される抗体を提供するいずれの技術も用いることができる。その例にはハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975）、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983）およびEBV-ハイブリドーマ技術（Cole (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）が含まれる。
単鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を利用して、本発明のポリペプチド又はその少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150の連続するアミノ酸を含むフラグメントに対する単鎖抗体を生成することができる。あるいは、トランスジェニックマウスを用いて、これらポリペプチド又はそのフラグメントに対するヒト化抗体を発現させることができる。
本発明のポリペプチド又はその少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100若しくは150の連続するアミノ酸を含むフラグメントに対して作製された抗体を他の生物及びサンプルに由来する類似のポリペプチドのスクリーニングに用いることができる。そのような技術では、前記生物由来のポリペプチドを抗体と接触させ、前記抗体と特異的に結合するポリペプチドが検出される。上記に記載したいずれの方法も抗体結合の検出に用いることができる。そのようなスクリーニングアッセイの１つが以下に記載されている：”Methods for Measuring Cellulase Activities”., Methods in Enzymology, vol.160, pp. 87-116。
【０２２７】
キット
本発明は、前記組成物（例えば本発明の核酸、発現カセット、ベクター、細胞、トランスジェニック種子若しくは植物若しくは植物部分、ポリペプチド（例えばセルラーゼ酵素）及び／又は抗体）を含むキットを提供する。前記キットはまた、本明細書に記載されたような本発明の方法論及び工業、医療及び酪農における使用を教示する指示資料を含むことができる。
【０２２８】
全細胞操作及び代謝パラメーター測定
本発明の方法は、細胞の遺伝的構成を改変することによって、新規な表現型（例えば新規な又は改変されたリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素活性）を有する新規な細胞株を開発するために、細胞の全細胞進化又は全細胞操作を提供する。米国特許出願20040033975を参照されたい。
前記遺伝的構成は、本発明の核酸、例えば本発明の酵素のコード配列を細胞に加えることによって改変することができる。例えばWO0229032、WO0196551を参照されたい。
新規な表現型を検出するために、改変細胞の少なくとも1つの代謝パラメータを“リアルタイム”または“オンライン”時間枠でモニターする。ある特徴では、複数の細胞（例えば細胞培養）が“リアルタイム”又は“オンライン”でモニターされる。ある特徴では、複数の代謝パラメータが“リアルタイム”又は“オンライン”でモニターされる。代謝パラメータは、本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を用いてモニターできる。
代謝フラックス分析（MFA）は公知の生化学的フレームワークを基にしている。線形独立代謝行列は、質量保存の法則及び細胞内代謝に関する擬似定常状態仮説（pseudo-steady state hypothesis, PSSH）に基づいて構築される。本発明の方法の実施に際して、以下を含む代謝ネットワークが確立される：
−全ての経路の基質、生成物及び中間代謝物の実体；
−前記経路の代謝物を変換する全ての化学反応、前記経路の反応の化学量論の実体；
−前記反応を触媒する全ての酵素、前記酵素反応のカイネティクスの実体；
−経路の成分間の調節的相互反応、例えばアロステリック相互反応、酵素-酵素相互反応など；
−酵素の細胞内区画局在性または前記酵素の分子レベルを超えるその他の機構；および
−代謝物、酵素またはエフェクター分子の何らかの濃度勾配またはそれらの移動に対する拡散障壁の存在。
ある株について前記代謝ネットワークがいったん確立されたら、オンライン代謝物データが利用可能ならば行列記法よって数学的提示を導入し、細胞内代謝フラックスを概算することができる。代謝表現型は細胞内の完全な代謝ネットワークの変化を必要とする。代謝表現型は、環境条件、遺伝的調節、発育状態および遺伝子型などに対応する経路の利用変化に左右される。本発明の方法のある特徴では、オンラインMFA計算の後で、細胞の動的態様、それらの表現型及び他の特性が前記経路の利用を精査することによって分析される。例えば、酵母の発酵時にグルコースの供給が増加し、酸素が減少する場合、呼吸経路の利用は低下及び／又は停止し、発酵経路の利用が優先的になるであろう。細胞培養の生理的状態の制御は前記経路分析の後で可能になるであろう。本発明の方法は、基質供給、温度、誘発物質などをどのように変化させるか、細胞の生理的条件を制御して所望の方向にどのように誘導するかを決定することによって発酵の操作方法の決定に役立てることができる。本発明の方法の実施に際して、MFAの結果はまた、代謝の操作又は遺伝子シャッフリングなどのための実験及びプロトコルの設計のために転写物データ及びタンパク質データと比較することができる。
本発明の方法の実施では、任意の改変表現型又は新規な表現型（細胞の新規な又は改善された特性を含む）を付与しこれを検出することができる。代謝又は増殖の任意の特徴をモニターすることができる。
【０２２９】
mRNA転写物発現のモニタリング：本発明のある特徴では、操作された表現型は、細胞内でのmRNA転写物（例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素のメッセージ）の発現の増加若しくは減少、又は新規転写物（例えばリグノセルロース系酵素）の生成を含む。この発現増加又は低下は、本発明のリグノセルロース系酵素の存在について試験するか、又はリグノセルロース系酵素活性のアッセイによって追跡することができる。mRNA転写物（又はメッセージ）はまた、当業界で公知の任意の方法（例えばノザンブロット、定量的増幅反応、アレイへのハイブリダイゼーションなどなどを含む）によって検出及び定量することができる。定量的増幅反応は、例えば定量的PCR（例えば定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（又はRT-PCR）を含む）；定量的リアルタイムRT-PCR（又は“リアルタイムカイネティックRT-PCR”）を含む（例えば以下を参照されたい：Kreuzer (2000) Br. J. Haematol. 114:313-318; Xia (2001) Transplantation 72:907-914）。
本発明のある特徴では、操作される表現型は相同遺伝子のノックアウト発現によって作出される。前記遺伝子のコード配列又は1つ以上の転写制御エレメント（例えばプロモータまたはエンハンサー）をノックアウトすることができる。したがって転写物の発現は完全に除去されるか、または単に減少させることができる。
本発明のある特徴では、操作される表現型は相同遺伝子の発現の増加を含む。前記は、負の制御エレメント（cis-又はtrans-で作用する転写調節エレメントを含む）のノックアウト、又は正の制御エレメントの変異導入によって実施できる。細胞の1つ以上又は全ての転写物を、細胞の転写物又は細胞の転写物に対応する核酸若しくは前記と相補的な核酸を含むサンプルのハイブリダイゼーションによって、又はアレイ上に固定した核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。
【０２３０】
ポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸の発現のモニタリング：本発明のある特徴では、操作される表現型は、細胞内でのポリペプチド（例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）の発現の増加若しくは低下、又は新規なポリペプチドの生成を含む。前記の発現増加又は低下は、存在するリグノセルロース系酵素の量の決定又はリグノセルロース系酵素活性のアッセイによって追跡することができる。ポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸はまた、当業界で公知の任意の方法（例えば核磁気共鳴（NMR）、分光光度法、ラジオグラフィー（タンパク質放射能標識）、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高拡散クロマトグラフィー、多様な免疫学的方法、例えば免疫沈澱、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイ、ゲル電気泳動（例えばSDS-PAGE）、抗体による染色、蛍光活性化細胞分類装置（FACS）、熱分解質量分析法、フーリエ変換赤外線分光分析、ラマン分光分析、並びにLC-エレクトロスプレーおよびcap-LC-タンデム-エレクトロスプレー質量分析などを含む）によって検出及び定量することができる。新規な生物活性はまた、米国特許第6,057,103号に記載された方法又はその変法を用いてスクリーニングできる。さらにまた以下で詳細に考察されるように、細胞のポリペプチドの1つ以上又はその全てはタンパク質アレイを用いて測定することができる。
【０２３１】
工業、エネルギー、製薬及び他の応用
本発明のポリペプチド（例えばリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）はセルロースの分解を触媒することができる。本発明の酵素は高度に選択的な触媒でありえる。本発明は、例えば製薬又は栄養性（食事用）サプリメント工業、エネルギー工業（例えば“クリーンな”バイオ燃料の製造のため）、食物及び飼料工業（例えば食品及び飼料製品並びに食品及び飼料添加物の製造方法で）において、本発明の酵素を用いる工業的プロセスを提供する。ある特徴では、本発明は、医学係工業で、例えば医薬品又は食事用補助物質若しくはサプリメント、又は食品サプリメント及び添加物の製造のために本発明の酵素を用いるプロセスを提供する。さらにまた、本発明は、バイオ燃料製造（例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノールを含み、したがって“クリーンな”燃料の製造を含む）で本発明の酵素を使用する方法を提供する。
本発明の酵素は、完璧な立体選択性、領域選択性及び化学的選択性を有する反応を触媒することができる。本発明のリグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素は、多様な溶媒中で機能するように、極端なpH（例えば高pH及び低pH)、極端な温度（例えば高温及び低温）、極端な塩レベル（例えば高塩濃度及び低塩濃度）で作用するように、さらに前記酵素の天然の生理学的な基質とは構造的に無関係の化合物との反応を触媒するように操作することができる。
【０２３２】
バイオマスの変換及びクリーンなバイオ燃料の製造：本発明は、酵素（酵素の混合物（又は“カクテル”）を含む）、及びバイオマス又は任意のリグノセルロース系材料（例えばセルロース、ヘミセルロース及びリグニンを含む任意の組成物）の発酵性糖（及び／又は単糖類）及び最終的に燃料（例えばバイオエタノール、メタノール、プロパノール又はブタノールなど）、飼料、食品及び化学品又は任意の他の有用な製品への変換のための方法を提供する。したがって、本発明の組成物及び方法は、効率的で持続的な石油系製品使用の代替物又は添加物を、例えばバイオ燃料（例えばアルコール、例えばバイオエタノール、メタノール、プロパノール又はブタノールなど）及びガソリンの混合物として提供する。
本発明は、本発明の酵素及び抗体を発現する生物を、例えば細胞、細胞培養、又はトランスジェニック植物若しくは植物部分（例えば種子又は果実）として、本発明のポリペプチドの合成を目的とする“製造工場”（例えば本発明のポリペプチドのスケールアップ、高収量製造のための手段として）のために、又は天然のバイオマス変換、加工又は他の操作を含む化学反応サイクルに本発明の酵素又は抗体を参画させるために提供する。
ある特徴では、酵素及び変換方法は、酵素アンサンブル（“混合物”又は“カクテル”）として、リグノセルロース系、セルロース系及び／又はヘミセルロース系ポリマーの代謝可能な炭素成分（糖及びアルコールを含む）への効率的な加水分解（例えば解重合）のために用いられる。例示的酵素カクテルは本明細書に記載されているが、しかしながら、本発明は、本発明の少なくとも1つの酵素（任意の組合せ）を含む酵素混合物を含む組成物を包含し、さらに別の実施態様では、本発明の混合物（“アンサンブル”又は“カクテル”）はまた、任意の他の酵素、例えばグルコース、オキシダーゼ、ホスホリラーゼ及びアミダーゼなどを含むことができる。上記で考察したように、本発明は、これらの重要で新規な“バイオマス変換”、“バイオマス加工”及び代替エネルギー又はバイオ燃料製造、工業的プロセスを可能にする酵素の発見方法及びもっとも効率的な使用方法を提供する。
【０２３３】
ある特徴では、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及び／又はβ-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）活性は、リグノセルロース系バイオマスを単糖類に変換するプロセスで用いられる（前記単糖類は最終的にはバイオアルコール、例えばエタノール、メタノールなどに変換される）。したがって、本発明は、リグノセルロース系バイオマスを含む組成物からバイオ燃料（例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール又はバイオブタノールを含む）を製造する方法を提供する。リグノセルロース系バイオマス材料は、農産物から、食品又は飼料製造の副産物として、又はリグノセルロース系廃棄物（例えば植物残留物（例えばサトウキビバガス又はトウモロコシ繊維（例えばトウモロコシ種子繊維）及び紙くず）として入手できる。本発明のポリペプチドによる処理に適した植物残留物の例には、サトウキビ（例えばバガス、ケイントップ）、穀物、種子、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ若しくはトウモロコシの穂軸、実を除いたトウモロコシの茎葉、トウモロコシ繊維、干し草又はわら（例えば稲わら又はコムギのわら、又は任意の穀物植物の乾燥茎）、牧草（例えばインディアングラス、例えばソルガストルム・ヌータンス（Sirghastrum nutans）、又はスイッチグラス、例えばパニクム（Panicum）種、例えばパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum））、テンサイパルプ、かんきつ類パルプ、かんきつ類果皮などの他に、ウッドシンニング、木材廃棄物、木材チップ、木材パルプ、パルプ廃棄物、木材削り屑、おが屑、建築及び／又は解体廃棄物、及び廃物（例えば木材、木材削り屑及びおが屑）が含まれる。本発明のポリペプチドによる処理に適した紙又は木材廃棄物の例には、廃棄若しくは使用済みコピー用紙、コンピューター印刷用紙、ノート類用紙、便箋用紙、タイプライター用紙などの他に、新聞、雑誌、厚紙及び紙製包装材及びリサイクル紙材料が含まれる。さらにまた、都市廃棄物、例えば自治体の固形廃棄物の紙部分、自治体の木材廃棄物及び自治体の草木廃棄物とともに、糖、デンプン及び／又はセルロースを含む他の材料を用いることができる。
【０２３４】
リグノセルロースバイオマス材料（例えば農作物、食品又は飼料製造副産物、リグノセルロース系廃棄産物、植物残留物、サトウキビバガス、トウモロコシ又はトウモロコシ繊維、廃棄木材又は紙に由来する）を処理又は加工するために用いられる本発明の酵素は、前記材料への直接添加に加えて、バイオマス材料上又は材料内で生存している微生物（例えばウイルス、植物、酵母など）によって、又はバイオマス自体によっても（例えばトランスジェニック植物又は種子などとして）生成することができる。ある特徴では、本酵素を生成する微生物は、加工されるべきバイオマス材料に（例えば噴霧、感染などによって）添加することが可能であるが（これが唯一の酵素供給源であってもよい）、また別の形態で（例えば精製酵素として、又は培養（例えば細菌、酵母又は昆虫細胞培養）の粗溶解物若しくは任意の他の処方物として）添加される酵素を補充してもよく、またはトランスジェニック植物中の異種組換えタンパク質として酵素の存在を補充することができる。あるいは、植物は、裸のDNA、プラスミド、ウイルスなどによる一過性感染、形質転換又は形質導入による組換えによって酵素を発現するように操作することができる。あるいは、酵素を植物又は植物の種子（トウモロコシのように）で生成させ、続いて酵素を前記植物から単離するか、又はこの植物を直接加工に用いてもよい。また別の実施態様では、本発明の酵素をバッチの処理プロセスでバッチ供給プロセスによって添加するか、プロセスを通して連続的に及び／又は周期的に添加することができる。
本発明の酵素及び方法は、任意の糖製造プロセスと一緒に、例えば典型的な甘蔗糖製造プラントで用いることができる。この場合サトウキビの加工は、図5A及び5B（ともに本発明のプロセスの糖からバイオアルコール（例えばエタノール、メタノールなど）への例示的な材料供給を示す）及び5C（本発明の例示的なドライミリングプロセス）に示すように、サトウキビから甘蔗糖（シュクロース）の製造が中心である。図5A、5B及び／又は5Cに示す工程の1つ、いずれか、いくつか又は全てにおいて本発明の1つ以上のポリペプチド（例えば酵素）を添加することができる。本発明のこれら例示的プロセスにおける他の生成物にはエタノール、バガス及び糖蜜が含まれえる。ある特徴では、バガス（サトウキビの残留繊維性成分）は、プロセス蒸気の発生でボイラーのための燃料源として用いられる。また別の特徴では、糖蜜は2つの形態で（非食用形（動物には食用；ブラックストラップ）又は（人間の）食用シロップとして）製造される。ブラックストラップ糖蜜は主として動物の飼料添加物として用いられるが、前記はまたエタノールの製造にも用いられる。食用糖蜜シロップは、メープルシロップ、転化糖又はトウモロコシシロップと混ぜ合わせることができる。
【０２３５】
ある例示的プロセスでは、キビを粉砕機に入れ、液の抽出のために準備する。粉砕プロセスは2工程（キビの堅い構造の破壊及びキビのすり潰し）として実施することができる。吸水膨潤は、押しつぶしたキビに水を適用して液の抽出を促進するプロセスである。押しつぶし工程後の残余物質はバガスと称され、前記をボイラーで燃焼させて蒸気及び電気を発生させる。抽出液をろ過して大きな粒子を除去し、続いて清澄化する。生砂糖の製造では、清澄化はほとんど例外なく熱及び石灰を用いて実施され、さらに少量の可溶性リン酸化物もまた添加することができる。石灰は有機酸の中和のために添加され、温度を約95℃に上昇させる。重い沈殿物が形成され、前記をクラリファイアーで液から分離させる。清澄化した液をさらに処理することなくエヴァポレーターに移す。蒸発は2段階、すなわち、最初は液を濃縮するためにエヴァポレーターで、続いて砂糖を結晶化させるために真空パンでで実施する。エヴァポレーターステーションでは、典型的には約65%の固体及び35%の水を含むシロップが生成される。蒸発の後、前記シロップを石灰、リン酸及びポリマーフロックレントを添加することによって清澄化し、さらに気爆し、クラリファイアーでろ過する。シロップは、クラリファイアーから結晶化のために真空パンに送られる。このパンでシロップを蒸発させ、結晶化プロセスが開始する。リカーと結晶の混合物（白下として知られている）の体積が容量いっぱいに達したとき、内容物をクリスタライザー移す。クリスタライザーから白下Aを高速遠心機に移し、遠心機でリカー（A糖蜜）を結晶から分離する。A糖蜜を真空パンに戻し、再度煮沸してB白下を得る。このB白下から遠心後に結晶及びB糖蜜の二番バッチが得られる。B糖蜜はA糖蜜よりもはるかに純度が低く、B糖蜜を再煮沸して低級白下Cを生成する。このC白下をクリスタライザーに送り、その後遠心機に送る。第三段階から得られた最後の糖蜜（ブラックストラップ糖蜜）は重く粘稠な物質であり、主としてエタノール製造及びウシの飼料添加物として用いられる。混合したA及びB白下から得られた甘蔗糖を冷却し、精糖装置に送る。
【０２３６】
ある特徴では、本発明の酵素及び方法は、バイオマスからバイオアルコール（例えばエタノール、メタノールなど）を製造する、例えば以下の工程を含む、より“伝統的な”手段と一緒に用いることができる：乾燥リグノセルロース系材料をリアクターで強酸の希薄溶液及び金属塩を含む触媒に委ねることによってリグノセルロース系材料を加水分解する工程；前記工程によって、セルロースの加水分解の活性化エネルギー又は温度を低下させることができ、より高い糖収量を得ることができる（例えば米国特許6,660,506号、6,423,145号を参照されたい）。
本発明の酵素の使用を含むまた別の例示的方法は、ヘミセルロース、セルロース及びリグニンを含むリグノセルロース系材料を、セルロースからグルコースへの大きな解重合をもたらすことなく主としてヘミセルロースの解重合を達成するために選択した温度及び圧力で水性媒体中での第一段階の加水分解工程に前記材料を委ねることによって加水分解する工程を含む。この工程はスラリーを生じ、このスラリーでは、水性液相はヘミセルロースの解重合から生じた溶解単糖類を含み、固相はセルロース及びリグニンを含む。第二段階の加水分解工程は、セルロースの少なくとも主要部分が解重合されるような条件を含むことができ、そのような工程はセルロースの解重合生成物の溶解／可溶化物を含む水性液相を生じる。例えば米国特許5,536,325号を参照されたい。本発明の酵素はこの例示的プロセスの任意の段階で添加することができる。
本発明の酵素の使用を含むまた別の例示的方法は以下の工程を含む：約0.4%から2%の強酸による希酸加水分解の1つ以上の段階によるリグノセルロース含有バイオマス材料の加工；及び酸加水分解バイオマス材料の未反応固体リグノセルロース系成分をアルカリ性リグニン分解（delignification）によって処理して、生物分解性熱塑性物質及び誘導体のための前駆体を生成する工程。米国特許6,409,841号を参照されたい。本発明の酵素はこの例示的プロセスの任意の段階で添加することができる。
【０２３７】
本発明の酵素の使用を含むまた別の例示的方法は以下の工程を含む：予備加水分解リアクターでリグノセルロース系材料を予備加水分解する工程；固体リグノセルロース系材料に酸性液を添加して混合物を形成する工程；この混合物を反応温度に加熱する工程；リグノセルロース系材料の少なくとも約20%のリグニンを含む可溶化部分及びセルロースを含む固体分画に前記リグノセルロース系材料を分別するために十分な時間、反応温度を維持する工程；固形分画中のセルロースが酵素消化をより受けやすい反応温度で又は前記反応温度近くで固形分画から可溶化部分を取り出す工程；及び可溶化部分を回収する工程。米国特許5,705,369号を参照されたい。本発明の酵素はこの例示的プロセスの任意の段階で添加することができる。
本発明は、本発明の酵素又は方法を用いることによって生成された燃料等級アルコールと混合した液体炭化水素系内燃機関燃料組成物（例えば点火燃焼モーター用）を製造する方法を提供する。ある特徴では、本発明の酵素を使用することによって製造した燃料は、液体石炭ガス-又は液体天然ガス-エタノール混合物を含む。ある特徴では、補助溶媒はバイオマス誘導2-メチルテトラヒドロフラン（MTHF）である。例えば米国特許6,712,866号を参照されたい。
リグノセルロース系材料から砂糖及び／又はエタノールを製造することを目的とするリグノセルロースの酵素的分解のための本発明の方法はまた、バイオマス材料の超音波処理の使用を含むことができる。例えば米国特許6,333,181号を参照されたい。
本発明の酵素を用いて、バイオアルコール（例えばエタノール、メタノールなど）を含むバイオ燃料を製造するまた別の例示的プロセスは、少なくともヘミセルロース及びセルロースを含むリグノセルロース系供給材料を含む出発材料を前処理する工程を含む。ある特徴では、出発材料は、ジャガイモ、ダイズ（ナタネ）、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、エンバク、コムギ、テンサイ若しくはサトウキビ、又は食品若しくは飼料の副産物の成分若しくは廃棄物を含む。出発材料（“供給材料”）は、ヘミセルロース及びセルロースの少なくとも部分的な加水分解を達成するために、植物の繊維構造を破壊する条件下で反応させられる。破壊条件には、例えば出発材料をpH0.5から2.5にて180℃から270℃の平均温度に約5秒から60分の間、又はpH0.5から2.5にて220℃から270℃の温度に約5秒から120秒、又は等価の条件に付すことが含まれえる。これによって、酵素（例えば本発明のセルラーゼ酵素）消化のためのアクセス性が高められた供給材料が得られる（米国特許6,090,595号）。
リグノセルロース系材料のセルラーゼによる加水分解のための例示的条件は、約30℃から48℃の間の温度及び／又は約4.0から6.0のpHでの反応を含む。他の例示的条件には約30℃から60℃の間の温度及び約4.0から8.0のpHが含まれる。
【０２３８】
バイオ燃料及び生物学的に製造されるアルコール：本発明は、本発明の組成物（例えば、酵素及び核酸、並びにトランスジェニック植物、動物、種子及び微生物）及び方法を用いて、バイオ燃料及び合成燃料（液体及び気体（例えば合成ガス）を含む）、及び生物学的に製造されるアルコール、並びにそれらを製造する方法を提供する。本発明は、本発明の酵素、核酸、トランスジェニック植物、動物（例えば微生物、例えば細菌又は酵母）及び／又は種子を含むバイオ燃料及び生物学的に製造されるアルコールを提供する。ある特徴では、これらのバイオ燃料及び生物学的に製造されるアルコールはバイオマスから製造される。
本発明は、本発明の方法により生物学的に製造されるアルコール（例えばエタノール、メタノール、プロパノール及びブタノール）を提供する（アルコール燃料を生じる発酵（加水分解）による本発明の微生物及び酵素の作用を含む）。
【０２３９】
液体又は気体ガソリンとしてのバイオ燃料：本発明は、バイオ燃料及び気体又はガソリンの形態の合成燃料（例えば合成ガス）を提供する。ある特徴では、天然のバイオマス変換のため、例えばバイオ燃料（例えばバイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール又はバイオメタノール）又は合成燃料（液体形又は気体として、例えば“合成ガス”）の製造のためにバイオマスを加水分解するための化学反応サイクルのために、本発明の酵素を使用する工程を含む。
例えば、本発明は、バイオ燃料ガス及び合成ガス燃料（“合成ガス”）を製造する方法を提供する。前記燃料は、バイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール及び／又はバイオメタノールを含み、前記は本発明のポリペプチドを用いて生成されるか、又は本発明の方法を用いて生成され、ある特徴では、本発明のバイオ燃料ガスは天然のガス（前記もまたバイオマスから生成することができる）、例えば水素又は炭化水素系ガス燃料と混合される。
ある特徴では、本発明は、バイオマスを合成燃料、例えば合成ガス（ガス化によってバイオマスから生成された合成ガス）に加工する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、サトウキビ（例えばバガス）からエタノール、プロパノール、ブタノール及び／又はメタノールガスを製造する方法を提供する。ある特徴では、この燃料又はガスは、内燃機関燃料（例えば自動車、トラック、飛行機、船、小型エンジンなどの燃料）として用いられる。ある特徴では、本発明は、植物（例えばトウモロコシ）又は植物生成物（例えば干し草又はわら（例えば稲わら若しくはコムギのわら又は任意の穀物植物の乾燥茎））又は農業廃棄物からエタノール、プロパノール、ブタノール及び／又はメタノールを製造する方法を提供する。セルロース系エタノール、プロパノール、ブタノール及び／又はメタノールは、植物（例えばトウモロコシ）又は植物生成物（例えば干し草又はわら）又は農業廃棄物（例えばイオゲン社（Iogen Corporation, Ontario, Canada）によって加工されたもの）から製造することができる。
ある特徴では、本発明の方法又は組成物を用いて製造されるエタノール、プロパノール、ブタノール及び／又はメタノールは、燃料（例えばガソリン）添加物（例えば酸素付加物）として用いるか、又は燃料としての直接使用することができる。例えば、本発明の方法によって製造されたエタノール、プロパノール、ブタノール及び／又はメタノール（燃料を含む）は、エチル第三ブチルエーテル（ETBE）又はETBE混合物（例えばバイオ燃料として47%エタノールを含むETBE、又はMTBE（メチル第三ブチルエーテル）と混合することができる。別の特徴では、本発明の方法によって製造されたエタノール、プロパノール、ブタノール及び／又はメタノール（燃料を含む）は以下と混合することができる：
【０２４０】
2010516296.tif 000114
【０２４１】
本発明の方法によって（例えば本発明の酵素を用いて）製造されたブタノール及び／又はエタノールは、“A.B.E.”（アセトン、ブタノール、エタノール）発酵を用いてさらに加工することができる。ある特徴では、ブタノールが唯一の液体生成物である。ある特徴では、このブタノール及び／又はエタノールを既存のガソリンエンジンで“直接”燃焼させて（エンジン又は自動車に改変を加えることなく）、エタノールよりも多くのエネルギーを発生させ、腐食性を軽減し、水溶性を低下させ、さらに既存のインフラを使って流通させることができる。
本発明はまた混合アルコールを提供し、この場合、前記アルコールの1つ、いくつか又は全部が本発明の少なくとも1つの方法（例えば本発明の酵素を用いる）を含むプロセスによって製造され、前記混合アルコールは、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール及びヘプタノールの混合物、例えばECALENETM（Power Energy Fuels, Inc., Lakewood, CO）、例えば以下を含む：
【０２４２】
2010516296.tif 000115
【０２４３】
ある特徴では、これらアルコールの1つ、いくつか又は全部が、本発明の酵素を用いて本発明のプロセスによって製造され、前記プロセスはさらに、バイオマスから液体（biomass-to-liquid）技術、例えば合成ガス製造のためのガス化プロセスとそれに続く触媒による合成又は混合アルコール燃料へのバイオマスのバイオ変換を含むことができる。
本発明はまた、“ガスから液体（gas to liquid）”、若しくはGTL；又は“石炭から液体”若しくはCTL；又は“バイオマスから液体”若しくはBTL；又は“油砂から液体”若しくはOTLプロセス含む（又は前記に取り入れられた）、本発明の酵素の使用を含むプロセスを提供し、ある特徴では、本発明のこれらプロセスの1つは、例えばいわゆる“フィッシャートロプシュ”プロセスを用いてバイオマスからバイオ燃料（例えば合成燃料）を製造する工程を含む（フィッシャートロプシュプロセスは、一酸化炭素と水素が多様な形態の液体炭化水素に変換される触媒的化学反応で、使用される典型的な触媒は鉄及びコバルト系であり、このプロセスの主要な目的は、合成潤滑油として又は合成燃料として使用する合成石油代替物を製造することである）。ある特徴では、本発明の合成バイオ燃料は酸素を含むことができ、高品質のジーゼル及びガソリンの添加物として用いることができる。
【０２４４】
サトウキビバガスのための酵素的プロセス：本発明は、サトウキビ（サッカルム（Saccharum））、サトウキビの部分（例えばケイントップ）及び／又はサトウキビバガスを酵素的に加工する（加水分解する）ことができる、すなわちサトウキビの分解用、又はバイオマス加工用ポリペプチド、及びこれら酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにこれらポリヌクレオチド及びポリペプチドの製造及び使用を提供する。本発明は、リグノセルロース系残留物（サトウキビバガス、又は製糖業若しくは関連する工業の任意の廃棄物を含む）をリグノセルロース系加水分解生成物に加工するポリペプチド及び方法を提供する（前記生成物はそれ自体燃料であってもよいが、さらに加工してバイオ燃料になるもの（液体又は気体燃料を含む）であってもよい）。本発明は、サトウキビ加工のための酵素及び方法を提供するので、本発明はまた、アルコール（任意の用途用）及び／又はバイオ燃料（例えばバイオエタノール）に加えて、食用糖、ガラパ（garapa）、ラパデュラ（rapadura, papelon）、ファレルナム（falernum）、糖蜜、ラム酒、カサーシャ（cachaca）を製造する方法を提供する。したがって、本発明はまた、食用糖、ガラパ、ラパデュラ（papelon）、ファレルナム、糖蜜、ラム酒、カサーシャ、アルコール、バイオ燃料（例えばバイオエタノールなど）、及び前記の中間体（本発明のポリペプチドを含む）を提供する。
ある特徴では、バイオ変換のための基質としてサトウキビ（例えばバガス）を用いるいくつかの利点は以下のとおりである：
１．サトウキビ（例えばバガス）は高い炭水化物含量を有する（セルロース、40−50%、及びヘミセルロース、20−30%）；
２．サトウキビ（例えばバガス）は加工の場所で収集される；
３．サトウキビ（例えばバガス）は安価な基質であり、供給は季節性であるがサトウキビ工場内で定常的に生成される。
本発明は、サトウキビ（例えばバガス）中のセルロース及びヘミセルロースを加水分解するポリペプチド及び前記を加水分解する方法を提供する（セルロース及びヘミセルロースはリグニンと結合し、リグニンは、微生物及び微生物に付随する酵素系による攻撃から多糖類を保護する障壁として機能しえる）。リグノセルロースの構造的特徴（例えばリグニン障壁及びセルロース結晶性）のために、ある特徴では、予備処理プロセスを用いてバイオマス中の多糖類成分への本発明の酵素の接近を強化して、構築ブロック単糖類（例えばヘキソース及びペントース糖）への変換収量を高める。本発明の酵素を用いる、本発明のある例示的な系では、生成された糖は効率的な発酵によりエタノールが生成され、加水分解されなかった炭水化物及びリグニンの燃焼は、製糖装置へ燃料を供給するために十分な蒸気を提供する。
【０２４５】
また別の特徴では、本発明のプロセスは多様な予備処理を利用する。前記予備処理は3つのカテゴリー、物理的、化学的及び多重性（物理的＋化学的）に分類することができる。任意の化学物質（例えば酸、アルカリ、気体、セルロース溶媒、アルコール、酸化剤及び還元剤）を予備処理剤として用いることができる。これらの化学物質の中でとりわけ、アルカリがもっとも好まれる予備処理剤である。なぜならば、前記は比較的安価であり、セルロースの分解が少ないからである。一般的なアルカリ、水酸化ナトリウム及び石灰もまた予備処理剤として用いることができる。水酸化ナトリウムはバイオマスの消化性を顕著に高めるが、前記はリサイクルが困難であり、比較的高価であり、さらに取扱いに危険が伴う。対照的に、石灰は多くの利点を有する。すなわち前記は安全で非常に安価であり、さらに二酸化炭素で洗浄水を炭酸塩化することによって回収できる。
ある特徴では、本発明は、サトウキビ、例えばバガス、精糖所で加工されたサトウキビ成分で多糖類を加水分解することができる多酵素系（本発明の少なくとも1つの酵素を含む）を提供する。ある特徴では、サトウキビ、例えばバガスは、微生物（例えばトランスジェニック動物、植物、形質転換微生物）によって生成された本発明の酵素によって、及び／又は本発明の酵素を発現する副産物（例えば収穫された植物、果実、種子）によって加工される。ある特徴では、前記酵素は、植物又は燃料に加工されるべきバイオマスによって生成された組換え酵素である（例えば本発明は、本発明の酵素を含むトランスジェニックサトウキビバガスを提供する）。ある特徴では、これらの組成物及び生成物は、天然のバイオマス変換のため、例えばバイオマスを加水分解してバイオ燃料（例えばバイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール、バイオメタノール）、液体又は気体の形態の合成燃料（例えば“合成ガス”）を生成するために化学反応サイクルを含む、本発明の方法で用いられる。
【０２４６】
ある特徴では、本発明は、有機物質の嫌気性菌による嫌気的消化プロセスによって生成されるバイオ燃料、例えばバイオガスを提供し、この場合、前記プロセスは本発明の酵素又は本発明の方法の使用を含む。このバイオ燃料、例えばバイオガスは、生物分解性廃棄物から製造されるか、又はガス収量を補うために嫌気的消化物に補給されるエネルギー作物の使用によって製造することができる。この固体産出物、消化物はまたバイオ燃料として用いることができる
ある特徴では、本発明は、バイオ燃料（例えばメタンを含むバイオガス）を提供し、この場合、前記方法は本発明の酵素又は本発明の方法の使用を含む。このバイオ燃料（例えばバイオガス）は、工業的嫌気性消化装置及び機械的な生物学的処理系で回収することができる。埋立地ガスは、本発明の酵素又は方法を用いてさらに加工することができる。加工前には、埋立地ガスは、天然に生じる嫌気性消化から埋立地で生成されるクリーン度の低い形態のバイオガスであろう。逆説的であるが、埋立地ガスが大気中に放出される場合、強力な温室効果ガスである。
本発明は、多様な廃棄物から生物学的に生成される油及びガスの製造方法を提供し、この場合、前記方法は本発明の酵素又は本発明の方法の使用を含む。ある特徴では、これらの方法は、メタン及び石油に類似する他の油を抽出するために熱による解重合を含む。例えば、グリーンヒューエルテクノロジーズ社（GreenFuel Technologies Corporation, Cambridge, MA）が設計した、無害な光合成藻類を利用するバイオリアクター系は、煙突の煙道ガスを取り入れて、バイオ燃料、例えばバイオディーゼルバイオガス及び石炭に匹敵する乾燥燃料を製造する。
本発明は、生物学的に生成される油（原油を含む）及びディーゼルエンジンで使用することができるガスを製造する方法を提供し、この場合、前記方法は本発明の酵素又は本発明の方法の使用を含む。ある特徴では、これらの方法は、石油（例えば原油）を灯油、石油、ディーゼル及び他の分画に精製することができる。
本発明は、以下から生物学的に生成される油を（本発明の酵素又は本発明の方法を用いて）製造する方法を提供する：
−純正植物油（straight vegetable oil, SVO）、
−植物廃油（WVO）；ほとんど営業用調理場で大量に生じる料理用油及び獣油の廃棄物、
−石油ディーゼルエンジンで直接使用可能な、動物の脂肪及び植物油のエステル交換から得られるバイオディーゼル、
−ノンオイル系物質を含む複雑な有機物質、例えば古タイヤ、もみがら、木材及びプラスチックのような廃物の熱による解重合によりバイオガス及び炭素固体と併せて生物学的に誘導される原油、
−熱分解油；前記は、バイオマス、木材廃棄物などから熱のみでフラッシュピロリーシスプロセスで生成されえる（この油は通常の燃料系又は内燃エンジンで用いる前に処理を必要とするかもしれない）、
−木材、木炭及び乾燥糞。
【０２４７】
動物飼料及び食品又は飼料添加物：人間のための食事用補助物質若しくはサプリメント、又は食品サプリメント及び添加物を提供することに加えて、本発明はまた、本発明のポリペプチド、例えばリグノセルロース系活性を有するタンパク質（例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）を用いて、動物の飼料及び食品、並びに食品及飼料添加物を処理するための組成物及び方法を提供する。本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素及び／又は本発明の抗体を含む動物の飼料、食品及び添加物を提供する。前記動物は任意の農場動物又は任意の動物である。
本発明の動物飼料添加物は顆粒化された酵素生成物（前記は容易に飼料成分と混合することができる）でもよい。あるいは、本発明の飼料添加物はプレミックスの成分を構成することができる。本発明の顆粒化酵素生成物は被覆されてもされてなくてもよい。酵素顆粒の粒子サイズは飼料及びプレミックス成分のそれに適合させることができる。これは、酵素を飼料に取り込ませるために確実で簡単な手段を提供する。あるいは、本発明の動物飼料添加物は安定化された液体組成物であってもよい。前記は水性または油性スラリーでもよい。例えば米国特許6,245,546号を参照されたい。
リグノセルロース系酵素（例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）は、動物飼料又は食品の改変で、in vitro（飼料又は食品の成分を改変することによって）又はin vivoで食品又は飼料を加工することができる。本発明のポリペプチドは動物飼料又は食品組成物に添加することができる。
【０２４８】
ある特徴では、本発明の酵素は別の酵素と一緒に添加される。別の酵素は例えば以下である：ベータ-ガラクトシダーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド-ベータ-1,4-ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ-ラッカーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及び／又はグルコースオキシダーゼ。これらの酵素の消化産物は、動物によってより消化されやすい。したがって、リグノセルロース系酵素（例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）は、飼料又は食品の利用可能なエネルギーに寄与するか、又はセルロースを分解することにより飼料又は食品の消化性に寄与することができる。
ある特徴では、リグノセルロース系酵素（例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）は、トランスジェニックな飼料作物（例えばトランスジェニック植物、種子など）、例えば穀粒、穀類、トウモロコシ、ダイズ、アブラナの種子、ルピンなどで前記酵素を直接発現させることによって供給することができる。上記で考察したように、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物、植物部分及び植物細胞を提供する。ある特徴では、前記核酸は、本発明のリグノセルロース系酵素が回収可能な量で産生されるように発現される。リグノセルロース系酵素はいずれの植物又は植物部分からも回収することができる。あるいは、前記組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分は、食品又は飼料の質を改善するために、例えば栄養価、賞味性を改善するために用いることができる。
【０２４９】
ある特徴では、本発明の酵素マトリックスは別個の複数の粒子、ペレット又は顆粒の形態を有する。“顆粒”とは、例えばペレット化、抽出又は同様な凝縮によって圧縮又は凝縮され、マトリックスから水分が除去された粒子を意味する。そのような粒子の圧縮又は凝縮は粒子の粒子間結合を促進する。例えば、顆粒は穀粒系基質をペレットミルでペレット化することによって製造することができる。そのようにして製造されたペレットは、動物飼料のアジュバントとして使用するために適した顆粒サイズに磨り潰すか砕かれる。マトリックスそれ自体は動物の飼料での使用が承認されているので、前記は動物飼料における酵素のデリバリーのための希釈剤として用いることができる。
ある特徴では、本発明の酵素マトリックス及び方法に含まれる、リグノセルロース系酵素（例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素）は、本明細書に記載したように熱安定性リグノセルロース系酵素であり、したがって上昇温度及び蒸気がペレット化酵素デリバリーマトリックスの製造に用いられる製造時にリグノセルロース系酵素の不活化に対し耐性を示す。本発明の酵素デリバリーマトリックスを含む飼料の消化時に、水性の消化液は活性酵素の放出を引き起こすであろう。他のタイプの熱安定性酵素及び熱安定性栄養性サプリメントもまた、任意のタイプの水性条件下で放出されるデリバリーマトリックスに取り込ませることができる。
ある特徴では多くの種々の目的のために（例えば動物の飼料に香り又は栄養性サプリメントを添加するため、胃の中で動物飼料サプリメント及び酵素の放出を遅らせるためなど）、本発明の酵素マトリックス粒子にコーティングを適用することができる。ある特徴では、前記コーティングは、機能的な目的を達成するために、例えばマトリックス粒子から酵素の緩徐な放出を所望するか、または酵素が放出される条件を制御することを所望するときはいつでも適用することができる。コーティング物質の組成は、前記コーティングが感受性を有する因子（例えば熱、酸若しくは塩基、酵素又は他の化学物質）によって選択的に分解されるようなものである。あるいは、前記のような種々の分解因子に感受性を有する2つ以上のコーティングを連続的にマトリックス粒子に適用してもよい。
【０２５０】
本発明はまた、酵素放出マトリックスの製造を目的とする。本発明にしたがえば、前記方法は、酵素放出マトリックスとしての使用に適した粒子サイズの穀粒系基質の複数の別個の粒子を提供することを含み、この場合、前記粒子は、リグノセルロース系酵素、例えば本発明のアミノ酸配列によってコードされるグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を含む。ある特徴では、前記方法は、酵素放出マトリックスを凝縮又は圧縮して顆粒にすることを含み、ある特徴では前記はペレット化によって達成される。カビの抑制剤及び粘着剤を使用するときは、それらは任意の適切なときに添加することができ、ある特徴では前記は穀粒系基質のペレット化の前に所望の割合で穀粒系基質と混合される。ペレットミルの飼料中の水分含有量は、ある特徴では完成製品中の水分含有量に関して上記で述べた範囲であり、ある特徴では約14−15％である。ある特徴では、水分は酵素の水性調製物の形で供給材料に添加され、前記供給材料を前記の水分含有量にする。ペレットミル中の温度は、ある特徴では蒸気により約82℃にされる。ペレットミルは供給材料に十分な成果が付与される任意の条件下で操作され、ペレットが提供される。前記ペレット形成過程自体は、酵素含有組成物から水を除去するための費用効率のよい工程である。
本発明の組成物及び方法は、プレビオティクス（前記は高分子量糖類、例えばフルクトオリゴ糖（FOS）、ガラクトオリゴ糖（GOS）、GRAS（Generally Recognized As Safe, 安全であると一般的に周知されている）物質である）の投与と併せて実施することができる。これらのプレビオティクスは、いくつかの共生乳酸菌（LAB）によって代謝されえる。前記は大半の腸管微生物にとって非消化性である。
【０２５１】
食品処理及び食品加工：本発明は、本発明の酵素を含む食品及び飼料、並びに食品及び飼料を加工するときに本発明の酵素を使用する方法を提供する。セルラーゼ、例えば本発明のエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素は、食品加工工業で多数の用途を有する。本発明は、セルロース含有組成物（例えば植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、若しくは動物細胞、又は任意の植物若しくは植物部分、又は任意の食品又は飼料、廃棄物などを含む）を加水分解する方法を提供する。
例えば、本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素を含む飼料又は食品を、例えば飼料、液体（例えば飲料、例えば果実ジュース又はビール）、パン若しくはドウ、又はアルコール飲料（例えばビール）又は飲料前駆物質（例えば麦芽汁）として提供する。
本発明の食品処理方法はまた、例えば以下のような他の酵素を任意に組み合わせて使用する工程を含むことができる：トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド-ベータ-1,4-ラッカーゼ、アミログリコシダーゼ、他のグリコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ-ラッカーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ及び／又はグルコースオキシダーゼ。
【０２５２】
ある特徴では、本発明は、液体（液化）及び顆粒デンプンを加水分解する酵素及び方法を提供する。そのようなデンプンは、任意の供給源、例えばテンサイ、サトウキビ、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ、ミロ、ソルガム、ライ麦又はブルガー（bulgher）から誘導することができる。本発明は、任意の植物デンプン源、例えば穀粒デンプン源（例えばバイオ燃料（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノールのようなバイオアルコールを含む）の製造のために有用である）に応用することができる（植物デンプン源には、任意の他の穀粒又は液化に適切なデンプンを産生することが知られている植物源が含まれる）。本発明の方法は、任意の天然の材料、例えば米、発芽した米、トウモロコシ、オオムギ、ミロ、コムギ、豆類、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ及びサツマイモから、デンプンを液化する工程（例えばバイオアルコール（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノール）を含むバイオ燃料の製造する工程）を含む。この液化プロセスは、実質的にデンプンを加水分解してシロップを精製する。液化の温度範囲は、デンプンの液化に有効であることが判明している任意の液化温度でよい。例えば、デンプンの温度は、約80℃から約115℃、約100℃から約110℃、及び約105℃から約108℃であろう。本発明の酵素及び方法を用いて製造されたバイオアルコールは、食品及び飼料中での使用（又はそれらの製造での使用）に加えて、下記で考察するように燃料として又は燃料中（例えば自動車燃料）で用いことができる。
【０２５３】
廃棄物処理：本発明は、廃棄物処理で使用される酵素を提供する。セルラーゼ、例えば本発明のエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素は、多様な廃棄物処理又は関連する工業的用途、例えば燃料の生成のためにバイオマス変換に関連する廃棄物処理で用いることができる。例えば、ある特徴では、本発明は、本発明のリグノセルロース系酵素を用いる固形及び／又は液体廃棄物の消化方法を提供する。前記方法は、実質的に未処理の固形廃棄物の体積及び容積を減少させることを含むことができる。固形廃棄物は、制御温度で酵素溶液（本発明のリグノセルロース系酵素を含む）の存在下で酵素消化過程を用いて処理することができる。前記は、添加微生物による相当な細菌発酵無しに反応を生じる。前記固形廃棄物は液化廃棄物及び何らかの残留固形廃棄物に変換される。生じた液化廃棄物は前記残留固形廃棄物から分離することができる。例えば米国特許5,709,796号を参照されたい。
ある特徴では、本発明の組成物及び方法は、例えば動物の排泄物溜めで（例えばブタ農場で）、他の農作物、食品若しくは飼料加工で、織物及び／又は布地加工、洗浄若しくはリサイクリング、又は他の工業的プロセスで臭気除去、臭気予防、又は臭気除去のために用いられる。
バイオマス（例えばリグノセルロース系材料）の燃料（例えば、バイオアルコール（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノール又はバイオプロパノール）を含むバイオ燃料）への変換のための本発明の酵素及び方法は、自治体の固体廃棄物素材の処理／リサイクリングを含むことができる。前記廃棄物素材には、自治体から直接得られる廃棄物、又は以前に埋め立てられその後回収された自治体の固体廃棄物、又は下水汚泥（例えば相当量のセルロース系物質を含む下水汚泥ケーキの形のもの）が含まれる。下水汚泥ケーキは通常は相当量のリサイクル可能物質（アルミニウム、ガラス、プラスチックなど）を含まないので、それらは濃硫酸で直接処理し（前記廃棄物中のセルロース系成分の重金属含有量を減少させるため）、エタノール生成系で加工することができる。
【０２５４】
廃棄物素材から有機及び無機物質を回収するために本発明の酵素を使用するまた別の例示的方法は、固体有機物質を殺菌し、加熱及び加圧することによって柔軟化する工程を含む。この例示的プロセスは、最初に廃棄物素材を攪拌し、続いて加熱及び加圧することによって実施してもよい（前記処理は前記素材を殺菌し、その中に含まれる有機物質を柔軟化する）。ある特徴では、加圧下での加熱後に、穴あきチャンバーから圧を突然逃がして、柔軟化させた有機物質を容器の穴から外側に押出し、したがって固体無機物質から有機物質を分離することができる。柔軟にし殺菌した有機物質を続いて発酵チャンバーで、例えば本発明の酵素を用いて発酵させ、例えばマッシュを形成する。前記マッシュを、遠心、蒸留カラム及び／又は嫌気的消化装置によって更なる加工に付して、燃料（例えばエタノール及びメタノール）及び動物飼料サプリメントを回収することができる。例えば米国特許6,251,643号を参照されたい。
本発明の酵素はまた、工業廃棄物又は動物生産施設などから生じる廃棄物の臭気を軽減するためのプロセス、例えば予備処理で用いることができる。例えば、本発明の酵素を廃棄物保持施設で動物排泄物の処理に用いて、大量の有機物質の効率的な分解を強化するとともに臭気を軽減させることができる。このプロセスはまた、硫化物利用細菌及び有機物消化細菌及びリシン酵素（本発明の酵素に加えて）の接種を含むことができる。例えば米国特許5,958,758号を参照されたい。
本発明の酵素はまた、例えば米国特許5,833,857号に記載されているように、危険な水性廃棄物のバイオ治療を目的とする移動システム（例えばバッチ型リアクター）で用いることができる。バッチ型リアクターは、細菌（例えば本発明の酵素を発現する）が、リアクターに供給される栄養物によって効率的な状態で維持されている、循環能力を有する大きな容器であろう。そのようなシステムは、廃水がリアクターに送られるか、又は排水中にリアクターを組み立てることができるような状況で用いることができる。本発明の酵素はまた、小型又は一時的な遠隔地で使用される処理システム、例えば可動性で高体積高効率の多用途廃棄物処理システムで使用することができる。
本発明の廃棄物処理方法は、他の酵素、例えば他のリグノセルロース系酵素の任意の組合せの使用を含むことができる。前記他のリグノセルロース系酵素は例えば以下の酵素である：グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド-ベータ-1,4-ラッカーゼ、アミログルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ-ラッカーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ、及び／又はグルコースオキシダーゼ。
【０２５５】
洗剤組成物：
本発明は、1つ以上の本発明のポリペプチド（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）を含む洗剤組成物、並びにこれらの組成物の製造及び使用方法を提供する。本発明は、洗剤組成物を製造及び使用する方法の全てを含んでいる。例えば、米国特許6,413,928号、同6,399,561号、同6,365,561号、同6,380,147号を参照されたい。前記洗剤組成物は、1要素および2要素水性組成物、非水性液体組成物、鋳造固形物、顆粒形、粒状形、圧縮錠剤、ゲル及び／又はペースト及びスラリー形であろう。本発明はまた、これら洗剤組成物を用いて、広い食べ物の汚れ、食べ物の残鎖及び他の微量の食品組成物の皮膜を迅速に除去することができる方法を提供する。本発明の酵素は、デンプンの多糖類の触媒的加水分解の手段によってデンプン質のしみの除去を促進することができる。本発明の酵素は、台所用洗剤として、布地の洗濯洗剤として用いることができる。
実際の活性酵素含有量は、前記洗剤溶液が所望の酵素活性を有すると仮定して、洗剤組成物の製造方法によって左右され重要ではない。ある特徴では、最終溶液に存在するグルコシダーゼの量は、製剤組成物1gにつき約0.001mgから0.5mgの範囲である。本発明の方法及び組成物で使用するために選択される具体的な酵素は、最終的な利用条件（製品の物理的形態、使用pH、使用温度、並びに分解及び改変されるべき汚れのタイプを含む）によって左右される。酵素は、与えられた使用条件のいずれに対しても最適の活性及び安定性を提供するように選択することができる。ある特徴では、本発明のポリペプチドは、約4から約12の範囲のpH、約20℃から約95℃の範囲の温度で活性を有する。本発明の洗剤は、陽イオン性、半極性非イオン性又は双性イオン性界面活性剤又は前記の混合物を含むことができる。
【０２５６】
本発明の酵素（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）は、粉末または液体洗剤として処方できる（約0.01から約5重量％（好ましくは0.1から0.5重量％）のレベルで4.0から12.0のpHを有する）。これらの洗剤組成物はまた、他の酵素、例えば公知のプロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ又はエンドグルカナーゼ、及び／又はグルコースオキシダーゼをビルダー及び安定化剤とともに含むことができる。通常の洗浄組成物への本発明の酵素の添加は、特別な使用制限を全く生じない。換言すれば、pHが上記範囲内にあり、温度が記載の酵素の変性温度より低い限り、前記洗剤に適した任意の温度及びpHがまた本発明の組成物に適切である。さらにまた、本発明のポリペプチドは、洗剤を含まない洗浄組成物で、単独で又はビルダー及び安定化剤と一緒に用いることができる。
本発明は、硬質表面を洗浄する洗剤組成物、織物を洗浄する洗剤組成物、皿を洗浄する組成物、口内洗浄組成物、歯磨き組成物、及びコンタクトレンズ洗浄溶液を含む洗浄組成物を提供する。
【０２５７】
ある特徴では、本発明は、洗浄のために十分な条件下で対象物を本発明のポリペプチドと接触させることを含む対象物の洗浄方法を提供する。本発明のポリペプチドは洗剤添加物として混合することができる。本発明の洗剤組成物は、本発明のポリペプチドを含む例えば手洗いまたは機械による洗濯洗剤組成物として処方することができる。汚れの付着した織物の予備処理に適した洗濯添加物は本発明のポリペプチドを含むことができる。織物の柔軟化組成物は本発明のポリペプチドを含むことができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、一般的な家庭用硬質表面洗浄作業に使用される洗剤組成物として処方することができる。また別の特徴では、本発明の洗剤添加物及び洗剤組成物は、1つ以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、別のグルコシダーゼ、カーボヒドラーゼ、又はエンドグルカナーゼ、及び／又はグルコースオキシダーゼ、別のセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラクターゼ及び／又はペルオキシダーゼ、及び／又はグルコースオキシダーゼを含むことができる。本発明の酵素の特性は、選択した洗剤に適合するように選択され（すなわち、最適pH、他の酵素及び非酵素成分に対する適合性など）、さらに酵素は有効量で存在する。ある特徴では、本発明の酵素を用いて悪臭を有する物質が布地から除去される。本発明の実施で用いることができる種々の洗剤組成物及び前記を製造する方法は、例えば米国特許6,333,301号、同6,329,333号、同6,326,341号、同6,297,038号、同6,309,871号、同6,204,232号、同6,197,070号、同5,856,164号に記載されている。
本発明の洗剤及び関連する方法はまた、例えば以下の他の酵素の任意の組合せの使用を含むことができる：トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド-ベータ-1,4-ラッカーゼ、アミログリコシダーゼ、他のグリコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ-ラッカーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はグルコースオキシダーゼ。
【０２５８】
織物及び布地の処理：本発明は、本発明の1つ以上のポリペプチド（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）を用いて織物及び布地を処理する方法を提供する。本発明のポリペプチドは任意の織物処理方法で用いることができる（前記方法は当業界では周知で、例えば米国特許6,077,316号を参照されたい）。例えば、ある特徴では、織物の感触及び外観は、織物を溶液中で本発明の酵素と接触する工程を含む方法によって改善される。ある特徴では、織物は加圧下で前記溶液で処理される。
ある特徴では、本発明の酵素は、布地を織っている間若しくは織った後で、又は糊抜き工程中に、または1つ以上の追加の織物加工工程中に適用される。布地が織られている間、糸は強い機械的緊張に暴露される。織機で布を織る前に、縦糸はしばしば糊付けデンプン又はデンプン誘導体で被覆され、その引張り強度が高められ破損が防止される。本発明の酵素は、これらの糊付けデンプン又はデンプン誘導体を除去するために適用される。布地を織り上げた後、織物は糊抜き工程に進むことができる。前記工程の後に1つ以上の追加の織物加工工程が続く。糊抜きは“糊”を布地から除去する作業である。機織り後に、前記糊コーティングは更なる織物加工の前に除去され、均質で耐洗浄性を担保する必要がある。本発明は、本発明の酵素の作用による糊の酵素的加水分解を含む糊抜きの方法を提供する。
【０２５９】
本発明の酵素（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）を、例えば水性組成物中で洗剤添加物として用いて、綿を含む織物を糊抜きすることができる。本発明は、インジゴ染色デニム織物及び衣類で柔軟な（stonewashed）外観を生じる方法を提供する。衣類の製造のために、布地を裁断し縫製して衣類または衣料を作ることができ、その後で仕上げ処理される。特にデニムのジーンズ製造の場合、種々の酵素仕上げ方法が開発されている。デニムの衣料の仕上げは酵素による糊抜き工程で開始し、その間衣料はアミロース分解酵素作用に付されて、柔軟さが織物に提供され、さらに綿をその後の酵素仕上げ工程に馴染みやすくさせる。本発明は、本発明の酵素を用いて、デニム衣料の仕上げ（例えば“バイオストーニングプロセス”）、酵素による糊抜き及び織物に柔軟さを提供する方法を提供する。本発明は、糊抜き及び／又は仕上げプロセスでデニム医療を迅速に柔軟にする方法を提供する。
本発明はまた、本発明の酵素（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）を含む消毒薬を提供する。
本発明の織物または布地の処理過程はまた、例えば以下の他の酵素の任意の組合せの使用を含むことができる：トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド-ベータ-1,4-ラッカーゼ、アミログリコシダーゼ、他のグリコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ-ラッカーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はグルコースオキシダーゼ。
【０２６０】
紙又はパルプの処理：本発明の酵素（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）は、紙若しくはパルプの処理又は紙の脱インクで用いることができる。例えばある特徴では、本発明は、本発明の酵素を用いる紙の処理方法を提供する。ある特徴では、本発明の酵素を用いて紙のデンプンを改変し、それによって紙を液化形に変換することができる。別の特徴では、リサイクルコピー用紙の紙成分は化学的及び酵素的に脱インクされる。ある特徴では、本発明の酵素は他の酵素（他のセルラーゼ（他のエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及び／又はベータ-グルコシダーゼを含む）を含む）と組み合わせて用いられる。木材、木材廃棄物、紙、紙製品又はパルプは、以下の3つのプロセスに従うことによって処理することができる：1）本発明の酵素の存在下での分解、2）脱インク化学物質及び本発明の酵素による分解、及び／又は3）本発明の酵素による浸漬後に分解。本発明の酵素により処理されたリサイクル紙は、トナー粒子の除去によりセルラーゼのみで処理された紙と比較してより高い輝度を有しえる。本発明はいずれの特定のメカニズムにも限定されないが、本発明の酵素の効果は、パルプ懸濁液中での表面活性剤としてのその反応態様による可能性がある。
本発明は、本発明の1つ以上のポリペプチドを用いる紙及び紙パルプの処理方法を提供する。本発明のポリペプチドは任意の紙処理方法又はパルプ処理方法で用いることができる。それら方法は当分野で周知であり、例えば米国特許6,241,849号、6,066,233号、5,582,681号を参照されたい。例えばある特徴では、本発明は、染料を含む印刷紙の脱インク及び脱色方法を提供する。前記方法は、印刷用紙をどろどろにしてパルプスラリーを得る工程及び本発明の酵素（他の酵素もまた添加することができる）の存在下でパルプスラリーからインクを除去する工程を含む。ある特徴では、本発明は、パルプ（例えば二次繊維から製造されたパルプ）の濾水度を強化する方法を提供する。前記方法は、本発明の酵素（他の酵素、例えばペクチナーゼ酵素もまた加えることができる）を含む酵素混合物をパルプに加え、酵素処理パルプを生じる反応を引き起こす条件下で処理することによって実施される。酵素処理パルプの濾水度は、輝度を低下させることなく二次繊維パルプの最初の濾水度よりも高められる。
本発明の紙、木材、木材廃棄物若しくはパルプの処理又はリサイクルプロセスはまた、例えば以下の他の酵素の任意の組合せの使用を含むことができる：トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド-ベータ-1,4-ラッカーゼ、アミログリコシダーゼ、他のグリコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ-ラッカーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はグルコースオキシダーゼ。
【０２６１】
パルプ再生−リグノセルロース系材料の処理：本発明はまたリグノセルロース系繊維を処理する方法を提供し、この方法では、繊維は、その特性を改善するために十分な量の本発明のポリペプチド（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）で処理される。本発明の酵素はまた、デンプン強化紙及び厚紙廃棄物からリグノセルロース系物質（例えばパルプ、紙及び厚紙）を製造又はリサイクルするとき、特に７より高いpHでパルプ再生又はリサイクルが行われ、さらに本発明の酵素が強化デンプンの分解により廃棄物素材の分解を促進することができる場合に用いることができる。本発明の酵素は、デンプン被覆印刷紙から製紙パルプを製造する方法で有用でありえる。この方法は、例えばWO95/14807の記載にしたがって実施することができる。例示的方法は、紙を分解してパルプを製造する工程、分解の前、最中及び後にデンプン分解酵素で処理する工程、並びに分解及び酵素処理後にパルプからインク粒子を分離する工程を含む。米国特許6,309,871号及びその中に引用されている他の米国特許もまた参照されたい。したがって、本発明は、リサイクルした紙パルプから酵素的にインクを除去する方法を提供し、この方法では、繊維表面から効果的にインクを除去するために有効な量で前記ポリペプチドが適用される。
【０２６２】
醸造及び発酵：本発明は、本発明の酵素（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）を含むビールの醸造（例えば発酵）方法を提供する。ある例示的方法では、デンプンを含む原料を分解し加工してモルトを生成する。本発明の酵素はこの発酵方法の任意の時点で用いられる。例えば、本発明の酵素はオオムギモルトの加工時に用いることができる。ビール醸造の主要な原料はオオムギモルトである。これは三段階プロセスであってもよい。第一に、オオムギの穀粒を浸漬して水分含有量を例えば約40%あたりに高めることができる。第二にこの穀粒を15−25℃で3から6日間インキュベートすることによって発芽させることができる（このときジベレリンの制御下で酵素合成が促進される）。この時期に、酵素レベルは顕著に上昇する。ある特徴では、本発明の酵素は前記方法のこの段階で（又は任意の他の段階で）添加される。酵素の作用により発酵性還元糖の増加がもたらされる。これは離開力（DP）として表され、DPは、12℃にて5日間でおよそ80から190に上昇しえる。
本発明の酵素は、例えば米国特許5,762,991号、5,536,650号、5,405,624号、5,021,246号、4,788,066号に記載されているように、任意のビール製造方法で用いることができる。
【０２６３】
地下形成物に由来する生産液の流れの向上：本発明はまた、本発明の酵素（例えばセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）を用いる方法を含み、前記方法は、粘稠でデンプンを含有する、生産活動中に生成される害性液を除去することによって、地下形成物に由来する生産液の流れを向上させる。これらの液体は、完備した掘削孔（well bore）を取り囲む地下形成物内で見出しえる。したがって、本発明のこの方法は、掘削孔から流出することができる生産液を生じる。本発明のこの方法はまた、ある形成物由来の生産液流を予想流速より低下させる害性液の問題にも向けられる。ある特徴では、本発明は、水性液と本発明のポリペプチドを一緒に混合し、この酵素処理物を掘削孔内の所望の位置にポンプで送り、粘稠でデンプンを含有する害性液を前記酵素処理物によって分解し、それによって前記害性液を地下形成物から掘削孔表面へ除去することによって、（本発明の酵素を用いる）酵素処理物を処方する方法を提供する。この方法では、前記酵素処理物は、デンプン含有液のアルファ-グリコシド結合の攻撃に有効である。
本発明の地下形成物の酵素処理方法はまた、例えば以下のような他の酵素を任意に組み合わせて使用する工程を含むことができる：トリプトファナーゼ若しくはチロシンデカルボキシラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、他のセルラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド-ベータ-1,4-ラッカーゼ、アミログリコシダーゼ、他のグリコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リポオキシゲナーゼ、ベータ-ラッカーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-ラッカーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシロラッカーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、他のセロビオヒドロラーゼ及び／又はグルコースオキシダーゼ。
【０２６４】
医薬組成物及び食事用サプリメント：本発明はまた、本発明のセルラーゼ（例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する酵素）を含む、医薬組成物及び食事用サプリメント（例えば食事用補助物質）を提供する。前記セルラーゼ活性は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む。ある特徴では、前記医薬組成物及び食事用サプリメント（例えば食事用補助物質）は、例えば高いセルロース又はリグノセルロース系成分を含む食品及び飼料の消化性の改善を目的として、経口摂取のために処方される。
歯周治療用化合物は、本発明の酵素（例えば米国特許6,776,979号に記載されたもの）を含むことができる。酸性腸症候群の治療及び予防のための組成物並びに方法は、本発明の酵素（例えば米国特許6,468,964号に記載されたもの）を含むことができる。
別の特徴では、創傷包帯、インプラントなどは、抗菌性（例えば抗生物質作用を有する）酵素（本発明の酵素（例えば本発明の例示的配列を含む）を含む）を含む。本発明の酵素はまた、アルギネート包帯、抗菌性バリヤー包帯、熱傷包帯、圧迫バンド、診断ツール、ゲル包帯、ヒドロセレクチブ包帯、ヒドロセル（泡）包帯、ヒドロコロイド包帯、I.V包帯、インサイスドレープ、低付着性包帯、臭い吸収包帯、ペースト包帯、術後包帯、瘢痕管理、皮膚管理、透過性フィルム包帯及び／又は創傷閉鎖で用いることができる。本発明の酵素は、創傷洗浄、創傷床調製物で用いて、圧迫潰瘍、脚部潰瘍、熱傷、糖尿病性の足の潰瘍、瘢痕、IV固定、外科創傷及び小さな創傷を治療することができる。本発明の酵素を用いて、酵素的に挫滅組織を除去する無菌的組成物（例えば軟膏）を製造することができる。多様な特徴で、セルラーゼは錠剤、ゲル、インプラント、リキッド、スプレー、食品、飼料ペレットとして、又はカプセルで被包化した処方物として処方される。
【０２６５】
生物防衛への応用：他の特徴では、本発明の酵素及び抗体（リグノセルロース系活性を有する酵素（セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む）を含む）は、生物防衛において、例えば芽胞又は微生物（例えば細菌、菌類、酵母など）（リグノセルロース系物質又は本発明のポリペプチドによる加水分解に感受性を有する任意の生物学的ポリマーを含む）の破壊のために用いることができる。生物防衛への応用における本発明の酵素及び抗体（リグノセルロース系活性を有する酵素（セルラーゼ、エンドグルカナーゼなどの活性を有するポリペプチドを含む）を含む）の使用は、それらを極めて迅速に製造することができるという点、及び／又はこれまで知られていないか又は将来の生物兵器のいずれに対しても極めて迅速に開発を進めることができるという点で甚だしい利点を提供する。さらにまた、リグノセルロース系活性を有する酵素（セルラーゼなどの活性を有するポリペプチドを含む）を、作用が受けた環境又は物質（衣類又は個体を含む）の汚染除去に用いることができる。したがって、ある特徴では、本発明は、リグノセルロース系活性を有するポリペプチド（セルラーゼなどの活性を有するポリペプチドを含む）（この場合、前記ポリペプチドは、本発明の配列（例えば本発明の例示的配列を含む）を含む）、又は本発明の核酸（例えば本発明の例示的配列を含む）によってコードされるポリペプチドを含む、生物兵器防衛剤若しくは生物兵器解毒剤、又は消毒剤、及びそれらを製造し使用する方法を提供する。ある特徴では、前記ポリペプチドは、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を含む活性を有する。
【０２６６】
参考文献
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【０２６７】
実施例
以下の実施例は例示のために提供され、本発明を制限しようとするものではない。
【実施例１】
【０２６８】
GIGAMATRIXTMスクリーニングを用いる例示的スクリーニングプロトコル
本発明は、リグノセルロース系活性を有する酵素をスクリーニングする方法を提供する。これら記載の方法はまた、酵素が必須の活性を有するか否か、及び前記が本発明の範囲内のものであるか否かの決定にも用いることができる。ある特徴では、本発明の方法は、ヴェレニウム社（Verenium Corporation）が特許権を有するGIGAMATRIXTMプラットフォームを用いる（例えば以下を参照されたい：PCT特許公開公報WO01/3853；米国特許出願No.20050046833、No.20020080350；米国特許6,918,738号；意匠D480,814号）。例えば、ある特徴では、GIGAMATRIXTMは、ポリペプチドがリグノセルロース系活性を有するか否か、及び前記が本発明の範囲内のものであるか否かを決定するため、又はリグノセルロース系活性を有するポリペプチド、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及び／又はβ-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）活性を有するポリペプチドを識別及び単離するための方法で用いられる。
GIGAMATRIXTMプラットフォームは、通常の96ウェルプレートの寸法を有する、100,000ウェルプレートによる超高処理スクリーンを含むことができる。この実施例では、GIGAMATRIXTMスクリーンは2つの基質（メチルウンベリフェリルセロビオシド（MUC）及びメチルウンベリフェリルラクトシド（MUL））の使用を実行したが、任意のリグノセルロース系活性に特異的又は決定的な基質（セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及び／又はβ-グルコシダーゼのための基質を含む）はいずれも用いることができる。
基質が細胞内に拡散するので、種々のクローンのファージミド型をスクリーニングすることができ、さらに蛍光がより容易に検出できると考えられた。ベータ-ガラクトシダーゼを欠く宿主株を、ラクトシド基質に対する活性を低くするために用いることができる。ラクトシド基質はより少ないヒットを生じることができ、セロビオース基質よりも特異的であると考えることができる。さらにまた、ラクトシド基質は、より低いベータ-ガラクトシダーゼヒットを生じることができる。二次スクリーニングは、寒天プレートにクローンをプレートする工程、続いて培地及びMULを含む384ウェルプレートにコロニーをピッキングする工程から成ることができる。続いて個々のクローンを一晩増殖させ、蛍光を測定する。続いてもっとも活性なヒットを配列決定のためにピッキングする。
【０２６９】
酵素及び基質活性の性状決定
GIGAMATRIXTMスクリーンで発見されたヒットを、先ず初めにセロヘキサオースに対してスクリーニングし、セルロースオリゴマーに対する作用パターンを決定することができる。抗生物質を含むTB培地でクローンを一晩増殖させることができる。続いて細胞を溶解し、溶解物を遠心によって清澄にすることができる。サブクローンをOD600＝0.5まで増殖させ、適切な誘導物質で誘導し、続いてさらに3時間増殖させてから細胞を溶解し溶解物を清澄にすることができる。ゲノムクローンは、サブクローンよりも一般的に活性は低いが、より広範囲のクローンで活性を判定できるより容易な方法である。最初の調査は、終末点反応のために薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて実施することができ、前記は通常24時間泳動させる。酵素はまたリン酸膨潤セルロース（PASC）で試験することができる（PASCは、酸処理による膨潤によりいっそう非晶質になる結晶質セルロースである）。
PASCに対して活性を有するセルラーゼはまた、セロトリオース及び／又はグルコースと同様にセロビオースを遊離させることができる。GIGAMATRIXTMによる発見から得られたクローンはまたPASCに対し、さらにセルロース系基質（例えばセロヘキサオース（例えばSeikagaku, Japan））に対して試験することができる。薄層クロマトグラフィー（TLC）実験を用いて、クローンがセロヘキサオースを加水分解することを示すことができる。これらのクローンのうち、いくつかが最終生成物としてグルコースを生成することができる。いくつかの酵素がセロビオース及び／又はより大きなフラグメントを生成することができるが、生成物パターンの正確な特性をTLC実験から見分けることができないときは、キャピラリー電気泳動（CE）法もまた用いることができる。
【実施例２】
【０２７０】
配列に基づく発見
本発明は、本発明の核酸配列を例えばハイブリダイゼーション及び／又は増幅（例えばPCR）プライマーとして用いて、バイオマス（例えばバガス、トウモロコシ繊維）分解性酵素（リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む）を識別及び単離する方法を提供する。
本発明は、リグノセルロース系活性（例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）、キシラナーゼ、キシロシダーゼ（例えばβ-キシロシダーゼ）及び／又はアラビノフラノシダーゼ活性）を有するか、又はセロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーをモノマーのキシロース、アラビノース及びグルコースに加水分解（分解）することができるポリペプチドをコードする核酸（転写物及び遺伝子を含む）を、例えばPCRにより、増幅するための増幅プライマー対を提供し、前記プライマー対は、本発明の配列又はそのフラグメント若しくは部分配列を含む核酸を増幅することができる。増幅プライマー配列対の一方又は各メンバーは、前記配列の少なくとも約10から50、若しくはそれより大きい連続する塩基、又は前記配列の約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36若しくはそれより大きい連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明は増幅プライマー対を提供し、前記プライマー対は、本発明の核酸の最初の（5'の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36又はそれより長い残基によって示される配列を有する第一のメンバー、及び前記第一のメンバーの相補鎖の最初の（5'の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36又はそれより長い残基によって示される配列を有する第二のメンバーを含む。
【実施例３】
【０２７１】
リグノセルロース系酵素の遺伝子操作及びスクリーニング
本実施例では、本発明の酵素の遺伝子操作のための例示的プロトコルについて述べる。本発明の操作酵素又は“最適化”酵素は、バイオマス（例えばバガス、トウモロコシ繊維）から単糖類、燃料及び／又は化学物質若しくは他の有用な石油系生成物への変換に用いることができる。本発明の操作酵素又は“最適化”酵素は、天然のバイオマス変換を含む化学反応サイクルに参画させるために、生物（例えば微生物、例えば細菌）で発現させることができる。ある特徴では、本発明のこの操作酵素又は“最適化”酵素は、セルロース系及びヘミセルロース系ポリマーの代謝性炭素成分への効率的な解重合のために“酵素アンサンブル”で用いられる。上記で考察したように、本発明は、これらの重要で新規な“バイオマス変換”及び代替エネルギーの工業的プロセスを可能にするもっとも効率的な酵素を発見し利用する方法を提供する。
メタゲノム発見及び定方向進化の非確率的方法（“DIRECTEVOLUTION(商標)”（例えば米国特許6,939,689号に記載）と称される（前記はGENE SITE SATURATION MUTAGENESIS（又はGSSM）（上記で考察、米国特許6,171,820号及び6,579,258号も参照のこと）を含む））、及びTunable GeneReassembly（TGR）（例えば米国特許6,537,776号を参照のこと）技術を用いて、リグノセルロース系バイオマス材料（例えばセルロース）を単糖類（例えばグルコース）、セロビオヒドロラーゼ及び他の含水炭素へ還元するための酵素成分を発見及び最適化することができる。
ある実施態様では、酵素発見スクリーニングは、ヴェレニウム社のGIGAMATRIXTM高処理発現スクリーニングプラットフォーム（上記で考察）を用いて実施され、酵素を識別、例えば基質としてメチルウンベリフェリルセロビオシドを用いてセロビオヒドロラーゼを識別することができる。AVICEL(商標)微晶質セルロース（MCC, FMC Corporation, Philadelphia, PA）に対する活性について、ヒットの性状を調べることができる。
ある特徴では、GENE SITE SATURATION MUTAGENESIS（遺伝子部位飽和変異導入）（又はGSSM）技術を用いて、最適化のための候補として酵素を選択することができる。ある実施態様では、GSSM進化を実施する前に、シグナル配列（存在する場合）を除去し、開始メチオニンを添加する。上記で考察したように、GSSM技術は、タンパク質の全アミノ酸を他の19のアミノ酸に連続的態様で迅速に変異させることができる。変異体はファイバー系アッセイを用いてスクリーニングし、単一アミノ酸変化を提示する潜在的アップミュータントを識別することができる。これらのアップミュータントを、アップミュータントを組み合わせた新規なライブラリーにまとめることができる。このライブラリーをスクリーニングして、いくつかの候補酵素を製品化のために識別することができる。
【０２７２】
アップミュータントのブレンド
遺伝子再アッセンブリ（Tunable GeneReassembly（TGR））技術を用いて、GSSMアップミュータント（酵素コード配列変種）を“ブレンド”（一緒に混合して最適な結果を達成すること）して、所望の活性又は特性を有する酵素を構築し、続いてスクリーニング（例えばGSSM）を用いて最良の所望の活性又は特性（例えば耐熱性）を有する候補を識別することができる。活性についてのアッセイは、野生型よりもアップミュータントの活性の高さを示すために反応物をさらに希釈することができる点を除いて、GSSMスクリーニングの場合と同じであってよい。
【実施例４】
【０２７３】
バイオマスの加工／変換のための酵素混合物又は“カクテル”
本発明は、リグノセルロース系物質を含むバイオマス（例えばバガス又はトウモロコシ繊維）を有用な生成物、例えばリグニン又は単糖類（例えばグルコース）（前記を続いてエタノールに加工することができる）に加工する、酵素の新規な組合せ物又は混合物又は“カクテル”を提供する。本実施例では、バイオマス（例えばバガス）を発酵性糖に消化することを目的とする、本発明の酵素混合物又は“カクテル”及びそれらの開発について述べる。ある特徴では、前記酵素混合物又は“カクテル”は、本発明の少なくとも1つの例示的酵素を含む。本発明の混合物（“アンサンブル”又は“カクテル”）はまた、任意の他の酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、ホスホリラーゼ、及びアミダーゼなどを含むことができる。
ある実施態様では、本発明の酵素混合物又は“カクテル”を用いて、リグノセルロース系物質（例えばセルロース又は任意のβ-1,4-結合グルコース成分及び／又はヘミセルロース又は、アラビノース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸の分枝及び／又はフェルラ酸エステル基を介するリグニンとの結合を有する任意のβ-1,4-結合キシロース骨格を含む任意の分枝ポリマー）を加水分解する。したがって、多様な特徴において、本発明の方法及び組成物は、糖及び結合の多様性に起因する、ヘミセルロースのモノマー糖類への消化の複雑さ及び問題に差し向けられる。
【０２７４】
例示的なコンビナトリアル酵素スクリーニングプロトコル
1．酵素パネルプレートの調製：
1.1．凍結乾燥タンパク質粉末を50%グリセロールに25mg/mLのタンパク質濃度で再懸濁させる；
1.2．各酵素200μLを96ウェルプレートに整列配置する；
1.3．-20℃で保存；
2．酵素カクテルプレートを調製：
2.1．定常酵素の11.11X溶液を蒸留水（総酵素濃度0.1mg/mL）で調製；
2.2．2枚の96ウェルプレートのウェルに27μLを分注（高用量及び低用量）；
2.3．酵素パネルプレートから3μLを高用量プレートへ移し、よく混合する；
2.4．3μLを高用量プレートから低用量プレートへ移し、よく混合する；
3．基質緩衝溶液を調製；
3.1．1.11X濃度のpH制御緩衝液、アジ化ナトリウム及びキシラナーゼ（それぞれ55.56mM、5.56mM及び0.32mg/mL）が所望される；
3.2．0.1%のセルロースの1X濃度の基質（基質バッチのセルロース濃度に応じて、約2%の前処理ひき割りバガス）が所望される；
4．停止プレートを調製：
4.1．150mMの炭酸ナトリウム緩衝溶液（pH10）を作製；
4.2．384ウェルプレートに60μL/ウェルを分注；
5．消化プレートを調製：
5.1．2枚の96ウェルプレートに基質緩衝液を180μL/ウェルで分注（高用量及び低用量プレート）；
5.2．20μLを高用量カクテルプレートから高用量消化プレートへ移し、ピペットで混合する；
5.2.1．基質を短時間落ち着かせ、消化プレートから20μLを停止プレートへT＝0時間のために写す；
5.3．5.2の工程を低用量カクテルプレートについて繰り返す；
5.4．消化プレートをシールして、37℃で4時間インキュベートする；
5.5．消化プレートを3000rpmで1分遠心して、上清をプレートの底に沈殿させる；
5.6．消化プレートから20μLを停止プレートへT＝4時間のために移す；
5.7．グルコース及びセロビオース標準物を停止プレートに添加する；
6．β-グルコシダーゼ消化：
6.1．125mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）でβ-グルコシダーゼ（ほぼ35mg/mL）の溶液を調製して、384ウェルプレートに36μL/ウェルを分注；
6.2．APRICOTTMシステム（Process Analysis and Automation Ltd， Hampshire， UK）を用い、停止プレートから4μLをβ-グルコシダーゼプレートに移し、室温で3時間インキュベートする；
7．グルコースオキシダーゼ（GO）アッセイ：
7.1．2XのGOアッセイ溶液を調製；
7.1.1．100mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）、2U/mLのグルコースオキシダーゼ、0.2U/mLのセイヨウワサビペルオキシダーゼ、0.1mMのアンプレックスレッド（Amplex Red）をよく混合する；
7.2．β-グルコシダーゼプレートに直ちに40μL/ウェルを添加し、室温で25−30分インキュベート；
7.3．分光光度計にて530nm/595nm励起/発光を読み取る。
酵素活性の個々のスクリーニングのためのアッセイ（例示的大規模酵素消化能アッセイを含む）は、下記の実施例5に記載されている。
以下の表4は、本発明のいくつかの例示的酵素“カクテル”又は混合物及びそれらの性状の要旨である。
【０２７５】
【表４−１】
2010516296.tif 000116
【０２７６】
本発明のまた別の酵素“混合物”又は“カクテル”は、例示的酵素、配列番号:34；配列番号:360；配列番号:358；及び配列番号:371の以下のいくつかの組合せを含む。以下の図表は、0.1%のAVICEL(商標)基質で37℃消化を含む条件下での種々の例示的混合物の酵素活性の結果の要旨である（この場合総酵素用量は20mg/gセルロースで一定に維持された）：
【０２７７】
酵素ID    B：配列番号:34、C：配列番号:360、D：配列番号:358、F：配列番号:371
2010516296.tif 000117
【０２７８】
0.1%のAVICEL(商標)基質で37℃消化を含む条件下での種々の例示的混合物の酵素活性の結果をまとめたデータは図7に示されている。
本発明のまた別の酵素“混合物”又は“カクテル”は、例示的酵素、配列番号:358；配列番号:360；配列番号:168の以下のいくつかの組合せを含む。以下の図表は、0.1%のAVICEL(商標)基質で37℃消化を含む条件下での種々の例示的混合物の酵素活性の結果の要旨である（この場合総酵素用量は20mg/gセルロースで一定に維持された）：
【０２７９】
酵素ID
A：      配列番号:358（例えば配列番号:357によってコードされる）
B：      配列番号:360（例えば配列番号:359によってコードされる）
C：      配列番号:168（例えば配列番号:367によってコードされる）
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0.23%のバガスで37℃消化を含む条件下での種々の例示的混合物の酵素活性の結果をまとめたデータは図8に示されている。
【０２８０】
酵素B及び酵素Cは一緒になって相乗的作用を有する。それぞれでは酵素Bは0.2%の変換を提供し、酵素Cは0.8%の変換を提供し、したがってそれらを一緒用いることによって1%の変換が提供されると予想されるが、その代わりに酵素B及び酵素Cの組合せは2.4%の変換、明瞭な相乗作用を提供する。本発明の混合物又は“カクテル”を含む本発明の他の組成物もまた、本実施例に記載するように、バイオマスの加水分解（例えばバガスの変換）に関して相乗作用を提供することができる。
【実施例５】
【０２８１】
本発明の酵素の活性についての特性決定
本実施例では、本発明の酵素を性状決定及び識別するまた別の例示的スクリーニングプロトコルについて述べる。例えば、本実施例は、本発明の例示的酵素が、どのようにして識別され、さらにバイオマス、例えば植物バイオマス、例えばバガス又はトウモロコシ繊維（例えばトウモロコシ種子繊維）の加水分解のためにリグノセルロース系酵素として用いられるかを述べる。ある特徴では、本発明の例示的酵素は、単独で又はグリコシルヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及び／又はβ-グルコシダーゼとして組み合わせて、セルロース又はセルロース含有組成物、例えば植物バイオマス、例えばサトウキビバガス、トウモロコシ繊維又は他の植物廃棄物（例えば干草又はわら、例えば稲わら若しくはコムギわら、又は任意の穀物植物の乾燥茎）を、例えば処理（例えば糖化）するために、又は農業副産物を加工するために用いられる。
【０２８２】
グルコース定量のためのグルコースオキシダーゼアッセイ
本例示的プロトコルは、グルコース定量のためのグルコースオキシダーゼアッセイ、すなわち複雑な混合物（例えば供給材料、繊維サンプル、バガス、トウモロコシ繊維若しくは他の植物廃棄物又は農業副産物）中のグルコース濃度を間接的に測定する蛍光酵素結合アッセイについて述べる。炭水化物の酵素的加水分解時に生成されるグルコースは、グルコースオキシダーゼにより酸化される。この酸化はペルオキシダーゼ及び蛍光色素と共役し、生成された蛍光はグルコース標準曲線と比較することによって定量される。図6に示したアッセイ模式図は、FADがグルコースオキシダーゼと結合し添加成分とは結合しないことを示している。
以下の材料がこの例示的アッセイのために必要である：
−粉末化グルコースオキシダーゼ（例えばA.ニゲル、Sigma Cat#G7141）；
−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（液体：例えばSigma Cat#P6140）；
−AMPLEX REDTM（10-アセチル3,7ジヒドロキシフェノキサジン；例えばMolecular Probes Cat#A12222）；
−グルコース；
−リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5、50mM）；
−ジメチルスルホキシド（DMSO）；
−黒色マイクロタイタープレート；
−蛍光プレートリーダー（例えばTecan, SpectraMaxなど）
特に明記しない限り、pH7.5のリン酸ナトリウム緩衝液での以下のストック溶液が必要である。これらストック溶液はいずれも、推奨温度で保存されるとき数週間安定である。
−グルコースオキシダーゼ：100U/mLの溶液を作製し、4℃で保存；
−セイヨウワサビ（HR）ペルオキシダーゼ：40U/mLの溶液を作製し、4℃で保存；
−AMPLEX REDTM（10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン）：5mgを3.880mLのDMSOに溶解して5mM溶液（AMPLEX REDTMの分子量（MW）は257.25である）を作製し、-20℃にて黒色ビン中でこの溶液を保存する；
−グルコース：微生物の増殖及び前記グルコースストック溶液の消耗を防ぐために、10mMのアジ化ナトリウム中で調製し、凍結して保存する。
【０２８３】
作業用の試薬ストックは分析直前に作製すべきである。各反応で45μLの試薬を使用すると仮定して、手許のサンプル数から必要な試薬体積を計算する。例えば100サンプルでは作業用ストック試薬は4.5mLである。必要とするよりもわずかに多い試薬を作製し、最後のサンプル列で空気を吸引することを回避する。AAO作業用ストック試薬は、1%（v/v）の各ストック酵素溶液（1%の100U/mLグルコースオキシダーゼ及び1%の20U/mLのHRペルオキシダーゼ）及び1%の蛍光試薬（5mMの10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン又はAMPLEX REDTM）を含む前記燐酸ナトリウム緩衝液である。
ピペットで前記酵素反応プレートから5μLを黒色のマイクロタイタープレート（例えば96ウェル又は384ウェルプレート）に移し、さらに45μLの作業用ストック試薬を加える。わずかに異なる時間インキュベートしたプレートを比較できるように、必ずプレートにグルコース標準曲線を加える。暗所で約15−20分インキュベートし、蛍光プレートリーダーで終末点を読み取る。レゾルフィン（Amplex Redの生成物）の推奨される励起及び発光スペクトルは545nm励起/590nm発光である。蛍光はレゾルフィンのpKa 辺り（ほぼ6.0）で減少するので、アッセイpHは6.5より低くならないように注意しなければならない。
【０２８４】
例示的特性決定アッセイ：CBH活性スクリーニングのためのPASCアッセイ
この例示的アッセイは、酵素がセロビオヒドロラーゼ活性を有するか否か、さらに本発明の範囲内に包含されるか否かを決定するために用いることができる。ある実施態様では、本アッセイの目的は、セロビオヒドロラーゼのサブクローンが、基質としてPASC（リン酸膨潤セルロース（Phosphoric Acid Swollen Cellulose））を用いたとき活性を示すか否かを決定することである。
例示的アッセイ条件：
−100μLの反応体積；
−50mMのpH5の緩衝液（酢酸ナトリウム）又は50mMのpH7の緩衝液（リン酸ナトリウム）；
−0.75%のPASC（中性pH）；
−20μLの酵素調製物可溶性分画（反応で1：5希釈）；
−陽性コントロール及び陰性コントロールを加える；
−金属箔片を用いて96ウェルPCRプレートで反応；
−サーモサイクラー（又はヒートブロック）を用いて37℃で一晩反応
例示的分析：
−グルコースオキシダーゼ分析（SPECTRAMAXTMリーダーを用いて545/590で蛍光を測定）
材料：
−96ウェルPCRプレート（反応に使用）；
−黒色底を有する黒色384ウェルプレート（グルコースオキシダーゼ検出に使用）；
−金属箔シール；
−1.5%PASCストック溶液；
−CBHサブクローンサンプル（溶解し遠心）；
−MEGAZAYMETM（Wicklow, Ireland）CBHIサンプル（陽性コントロール）；
−挿入サンプルのないベクター（陰性コントロール）；
−500mMでpH5の酢酸ナトリウムのストック溶液；
−500mMでpH7のリン酸ナトリウムのストック溶液；
−サーモサイクラー又はヒートブロック（反応に37℃）；
−グルコースオキシダーゼ検出のためのSPECTRAMAXTM蛍光リーダー（Molecular Devices Corporation, Sunnyvate, CA）
【０２８５】
グルコースオキシダーゼキット：
1）800mM、pH7.4のリン酸緩衝液ストック、
2）精製β-グルコシダーゼ（例えば本発明の例示的な配列番号:424の酵素、例えば配列番号:423によってコードされる）、
3）2500／250 U/mLのグルコースオキシダーゼ／セイヨウワサビ（HR）ペルオキシダーゼカクテル、
4）50mMのAmplex redストック（光感受性）
【０２８６】
PASC反応のための例示的プロトコル：
1）20μLの陰性コントロール（挿入物を含まないベクター）を96ウェルPCRプレートのウェルA1及びC1に添加する。A1はpH5での反応のための陰性コントロールで、C1はpH7での反応のための陰性コントロールである。
2）CBHIストック（Megazayme）を1：20に希釈する（20μLストック＋380μLの水）。
3）20μLの希釈CBHIをウェルのA2及びC2に添加する。A2はpH5での反応のための陽性コントロールで、C2はpH7での反応のための陽性コントロールである。
4）20μLのCBHサブクローンサンプルをA及びC列に添加する（サンプルが10を超える場合、B及びD列にも添加を続ける）。A列はpH5の反応であり、C列はpH7の反応である。
5）20μLのオートクレーブした水を、サンプルを含むA及びC列のウェルに添加する。
6）10μLの500mM、pH5の緩衝液ストックをA列に添加する（反応時50mM）。
7）10μLの500mM、pH7の緩衝液ストックをC列に添加する（反応時50mM）。
8）はさみを用いて、200μLライニン（Rainin）ピペットチップの先端をクリップする。ピペットチップはPASC溶液を引き出すために改変する必要がある。
9）サンプルを含む全てのウェルに50μLの1.5%PASCストックを添加する。ピペットでウェルを混合する。
10）PCRプレートのウェルを金属箔でシールして、サーモサイクラー（またはヒートブロック）にプレートを静置する。
11）PCRプレートを37℃で一晩インキュベートする。
グルコースオキシダーゼ分析のための例示的プロトコル：
1）37℃インキュベーターからPCRプレートを取り出し、4,000RPMでプレートを5分遠心する（エッペンドルフ遠心機を使用）。
2）マルチチャンネルピペットを使って、25μLの反応上清を黒色384ウェル検出プレートに移す。ペレットは絶対に検出プレートに移さないようにする（上清のみ）。
3）2Xのグルコースオキシダーゼカクテルを作製する（体積はサンプル数に左右される）：
2010516296.tif 000119
−グルコースオキシダーゼ（GO）はシグマ（Sigma）（#G7141-50KU）由来である。全50,000ユニットを5mLの50mMリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解する。
−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）はシグマ（#P2088-5KU）由来である。全50,000ユニットを5mLの50mMリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解する。
−GO及びHRPを続いて等体積で一緒にする（2500/250 GO/HRP）。
−Amplex Redはモレキュラー・プローブ（Molecular Probe）（＃A22177）由来である。10mgのバイアルを0.777mLのDMSOに溶解して50mMストックを得る。光を防いで-20℃で保存する。
4）2Xのグルコースオキシダーゼカクテル25μLを、反応上清を含む384ウェルの検出プレートのウェルに加える。よく混合し、さらに泡を形成させないようにする。
5）検出プレートを30分室温でインキュベートする。インキュベーション中は光からプレートを保護する。
6）SPECTRAMAXTM蛍光プレートリーダーにより545/590nmでプレートを読みとる。
7）テキストファイルとしてデータをセーブしてデータを保存する。EXCELTMシートでデータを開き、結果を分析する。
8）データ分析：
＊“活性あり”と思われるCBHサブクローンは、陰性コントロールの545/590値よりもはるかに高い値を示さねばならない。例えば、陰性コントロールが1000である場合、値が1200のサンプルは活性ありとは考えられない。逆に、陰性コントロールが1000である場合、2500の値を有するサンプルは活性ありと考えられよう。
＊陽性コントロールと同様か又は高い値を示すサンプルは“高い活性あり”と考えられる。
＊全ての活性なCBHサブクローンは、より関係の強い基質（AVICEL(商標)微晶質セルロース（MCC）（FMC Corporation, Philadelphia, PA）又はバイオマス標的、例えばバガス、トウモロコシ繊維など）を用いてさらに性状が決定される。
＊グルコースオキシダーゼデータの解釈は比較的主観的であり、したがって、実験を実施するたびに、信頼できる陽性及び陰性コントロールを持つことが非常に重要である。
【０２８７】
例示的CBH特性決定アッセイ
この実施例アッセイは、酵素がセルラーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（CBH）活性を有するか否か、さらに本発明の範囲内に包含されるか否かを決定するために用いることができる。この例示的活性によるスクリーニングは、セロビオヒドロラーゼ及び他のセルラーゼを識別及びスクリーニングするためである。微晶質セルロース（AVICEL(商標)）に対する活性についてラムダライブラリーを384ウェルプレートでスクリーニングし、さらにセルラーゼ活性は、β-グルコシダーゼ及びInvitrogenのグルコースオキシダーゼグルコース検出アッセイを含む酵素結合反応で検出する。
【０２８８】
一次スクリーニング
調製：
1．十分な量の大腸菌宿主をOD1のMgSO4中で調製し、力価を測定する。
2．増幅ラムダライブラリーの力価を測定する。
3．自動機械のためにプレートにバーコード標識を付す。
4．自動機械のスケジュールを設定する。
5．十分な量のプレート、被覆寒天、試薬、オートクレーブ済み試薬ビンがあることを確認する。
計算：
1．どれくらいのスクリーニング培養が必要か？例：145枚のプレートをウェル当たり25μLでスクリーニングする場合、10枚の余剰プレート分の安全クッションと合わせて、約1.5リットルのスクリーニング培養が必要であろう。
2．どれくらいの大腸菌宿主調製物が必要か？培養は開始時のOD600が約0.03であるべきである。例：1.5リットルの培養の場合、45mLのOD1宿主調製物が必要であろう。
3．どれくらいのライブラリーが必要か？例：ウェル当たり2クローンの開始時播種密度の場合、0.08ファージ/μL（すなわち25μLに2ファージ）の出発濃度が必要であろう。1.5リットルの培養の場合、1.2 x 105ファージクローンが必要であろう。例えば、ライブラリーの力価が1.2 x 106/μLである場合、このスクリーンの場合1/100稀釈の8μLを添加する必要があろう。ラムダライブラリーを希釈するためにSM緩衝液を使用する。
4．どれくらいのNZY及びAVICEL(商標)が必要か？スクリーニング培養におけるAVICEL(商標)は1XのNZY培地でほぼ5%であるべきである。例：1.5リットル培養の場合、577mLの13％懸濁AVICEL(商標)ストックが必要である。さらにまた、最終濃度が1XのNZYを得るために、2XのNZYが750mL必要である。さらにまた1.5リットルにするために蒸留水が適量必要とされる（本実施例の場合128mL）。
【０２８９】
1日目
1．適切な滅菌容器で計算量の大腸菌宿主及びラムダファージを一緒にする。穏やかに混合し室温で25分ファージを吸着させる。
2．しばらくして、適切な滅菌容器で、計算体積の、2X NZY培地、13％の懸濁AVICEL(商標)ストック及び滅菌水を一緒にする。AVICEL(商標)はNZYの存在下で凝集して、“凝乳”の外観を呈する。大きな塊にならないよう可能なかぎり完全に、攪拌バーにより高速で前記懸濁物を混合する。
3．細胞/ファージ懸濁物をNZY/AVICEL(商標)スクリーニング培地と一緒にし、穏やかに混合する。前記がスクリーニング培養液である。
4．同時力価：無菌的な2059本のチューブに250μLのOD1大腸菌調製物を500μLのスクリーニング培養液と一緒にし、7mLの溶融トップ寒天を加え、150mmのNZYプレートで平板を作成し、37℃でO/Nインキュベーションを実施する。2/ウェルの播種密度の場合、前記によって約40プラークが得られるはずである。
【０２９０】
a.次の日：プレートのプラークを数え、以下を用いてスクリーニングしたクローンに関する記録を最新にする：(2 x (プラーク数))*(9.6mL x (スクリーニングしたプレート数))。
5．無菌的なTITERTEKTM（Huntsville, Alabama）ヘッドを用い、スクリーニング培養の残りを、バーコードを付した384ウェルプレートの各ウェルに25μLずつロードする。可能な場合は前記操作を層流フードで実施する。
6．コントロールプレート：スクリーニングするライブラリー毎にアッセイコントロールを有する、少なくとも2枚の384ウェルプレートを準備する。
a.以下の最終濃度を有する培養液を準備する：5％の懸濁AVICEL(商標)；1XのNZY；OD600が0.03の大腸菌宿主。
b.一方のバッチに、およそ0.2−0.4ファージ/μLの濃度で陽性コントロールファージ“D7”を培養液に加え、別のバッチに、同じ濃度で陰性コントロールファージ“N38”（0GL7）を加える。
c.黒色384ウェルプレートに各ウェル25μLずつ、陽性コントロールは1−12縦列、陰性コントロールは13−24縦列に分注する。
7．384ウェルプレートを37℃で一晩、湿潤なインキュベーターでインキュベートする。全ウェル及び全プレートに対して蒸発／濃縮に関する問題を最小限にするために、全ての必要な注意を払う。
【０２９１】
2日目
1．スクリーニングするプレート数に対して自動機械操作スクリプトを準備する：
a.カクテル添加とプレート読み取りの間で30分の室温インキュベーション；
b.各プレートの最初の読み取りには560/610フィルターセットを使用；
c. 各プレートの第二（参照）の読み取りにはUV/ブルーフィルターセットを使用。
2．2Xのアッセイカクテルを準備する（蓋を堅く閉め、遮光する）。一般的には、1日目のスクリーニング培養液のために要した量とほぼ同じ体積が要求されるであろう。自動機械に設置するまで、Amplex RedへのDMSOの添加及びカクテル混合物へのAmplex Redの添加を行わない。これによってAmplex Redの酸化が減るであろう。以下の組成物を順に添加する。
2010516296.tif 000120
3．インキュベートしたプレート、アッセイカクテル及び無菌的TITERTEKTMヘッドを自動機械操作のためにもってくる。
4．インキュベーター1の回転式コンベヤーにバーコードを外側に向けてプレートを積み重ね、カラム1から開始してカラムの下側へ向けて充填していく。注記：コントロールプレートは、各ライブラリーの最初の位置及び最後のプレートの後に置く。
5．TITERTEKTMヘッドをTITERTEKTM1に取り付ける。
6．留め金装置を用いて傾けた状態のアッセイビンを設置し、金属箔で覆い、アルゴン又は窒素ガスノズルをビン内に差し入れる。
7．チュービングを準備する。
8．コンピュータにログオンし、運転を開始する。
a.560/610nmのための発光／励起フィルター及びUV/ブルーフィルターをチェックする。
3日目
1．各プレートについて、液に起因する人工産物を軽減させるために、青色の読みで赤色の読みを割ることにより赤色の読みを標準化する。
2．チェリーピッカーのためのヒットのリストを作成する。
【０２９２】
例示的二次スクリーニング−自動方法
1日目
1．チェリーピッカーが指定ヒットをCP_Master96ウェルコースタープレートの200μL/ウェルSM緩衝液へコロニーピックする。
2．ブレークアウトが完了するまで一次スクリーニングプレートを4℃で保存する。
2日目
1．CP_Masterプレート由来の一次ヒットの各々の5μLを大腸菌とともに90mmのNZYプレートへプレートする。
2．“D7”陽性コントロール及び“N38”陰性コントロール（プレート当たり50−100プラークを目指す）を別々の90mmのNZYプレートにプレートする。
3．プレートを37℃にて乾燥インキュベーターでインキュベートする。
3日目
1．384ウェルSec_Masterプレートに1XのNZY中の5％懸濁AVICEL(商標)＋OD0.03の大腸菌宿主を25μL/ウェルで添加する。
2．プレートをコロニーピッカーへ移動させ、一次ヒットプレート当たり16プラークを“コロニーピック”し、384ウェルプレートのカラムにプレートする（カラム1−20）。
3．“D7”陽性コントロールをカラム21に、“N38”陰性コントロールをカラム22にプレートする。
4．37℃に設定した湿潤インキュベーターで一晩インキュベートする。
4日目
1．一次スクリーニングについて記載したように2Xのアッセイカクテルを調製する。
2．上述のように自動機械でアッセイを実施する。
3．チェリーピッカーが二次ヒットを96ウェルSec_PCRプレートへコロニーピックする。
4．ファージストックを4℃で保存。
【０２９３】
例示的二次スクリーニング−手動方法
1．一次スクリーニングプレートがチェリーピッカーによりコロニーピックされなかった場合、一次スクリーニングプレートから各ヒットの1μLを採取し、500μLのSM緩衝液で前記を希釈する。この希釈物の1μLを記載のように大腸菌宿主とともにNZY寒天プレートにプレートする。
2．チェリーピッカーでコロニーピックされたヒットを用いる場合、CP_Masterプレートの各ヒットの0.5μLを記載のようにプレートする。
3．“D7”陽性コントロール及び“N38”陰性コントロール（プレート当たり50−100プラークを目指す）を別々の90mmのNZYプレートにプレートする。
4．プレートを37℃にて乾燥インキュベーターでインキュベートする。
2日目
1．コロニーピッキングのために384ウェルレシピエントプレートを準備する。OD600が0.03の大腸菌宿主とともに以下の懸濁物（1XのNZY中の5％懸濁AVICEL(商標)）を25μL/ウェルで分注する。
2．滅菌爪楊枝又は滅菌ピペットチップを用い、各単離プラークの表面に穏やかにタッチし、384ウェルのレシピエントプレートに移す。一次ヒットに付き16単離株（1カラム分）をコロニーピックする。
3．37℃に設定した湿潤インキュベーターで一晩インキュベートする（“プレートをブレークアウト”させる）。
3日目
1．一次スクリーニングで記載したように2Xのアッセイカクテルを調製する。
2．“ブレークアウトしたプレート”に2Xのアッセイカクテルを25μL/ウェルで添加し、室温で30分インキュベートし（遮光する）、続いて蛍光を535/595nm及び360/465nmの両方で読み取る。
3．赤色の読みを青色で割って、一切の二次ヒットを識別する。
4．二次ヒットが確認されたら、陽性単離株に相当するウェルの内容物を吸引し、1mLのSM緩衝液＋100μLのCHCl3を添加する。ヴォルテックスミキサーで攪拌し、ファージストックを4℃で保存する。
【０２９４】
試薬及び供給：
2X NZY濃縮物、13％懸濁AVICEL(商標)：
130グラムのAVICEL(商標)微晶質セルロース（FMC Biopolymaer（Philadelphia, PA）：タイプPH105、NF/EPグレード）を清浄な高速ブレンダーに測りいれ、18MΩ蒸留水を１L計量線（約916mL）まで加える。蓋を閉めて高速で20分混ぜ合わせる。上清をオートクレーブ可能容器に移し、30分の“液体”サイクルを用いてオートクレーブする。室温で保存する。
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4、800mMストック）：
リン酸緩衝液ストックは800mMで作成し、1Mストックで時々生じる沈殿を回避する。1リットルの800mM緩衝液のために、90.7グラムのNa2HPO4（MW 141．96）を22.2グラムのNaH2PO4・H2O（MW 137.99）と一緒にし、約950mLの蒸留水に溶解する。必要ならNaOH又はリン酸でpHを7.4に調整し、続いてろ過滅菌又はオートクレーブする。
配列番号:424酵素−コントロール；GO/HRPミックス：
グルコースオキシダーゼ：Sigma #G7141-50KU。全50,000ユニットを5mLの50mMリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解する。
ホースラディッシュペルオキシダーゼ：Sigma #P2088-5KU。全5,000ユニットを5mLの50mMリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解する。
グルコースオキシダーゼ及びHRP溶液を一緒にする。無菌的注射筒を用いて、等体積（10mL）の滅菌グリセロールを添加する。よく混合する。これによってGOが2,500U/mL、HRPが250 U/mLの最終濃度を有する溶液20mLが得られる。
Amplex Red：
モレキュラー・プローブ（Molecular Probe）＃A22177（10 x 10mgバイアル、MW＝257.25）。10mgの各バイアルを0.777mLのDMSOに溶解して50mMストックを作成する。必要に応じてプールする。未使用ストックは遮光して-20℃で保存する。
黒色384ウェルプレート：
コースター384ウェルプレート3709          Fisher 07-200-652
【０２９５】
大腸菌宿主培養の調製
必要な成分：
−大腸菌宿主のO/N培養又は画線接種プレート。液体培養及び画線接種プレートのためにはLB培地＋20μg/mLのテトラサイクリン抗生物質を用いる。
−滅菌250mL振盪フラスコ；
−20μg/mLテトラサイクリン補充LB；
−滅菌遠心管
−滅菌10mM MgSO4溶液；
プロトコル：
1．滅菌250mLフラスコに、1mLの大腸菌宿主の一晩培養を含む100mLのLB培地＋20μg/mLのテトラサイクリンを接種。
2．前記培養を37℃／240rpmシェーカーでOD600＝0.8−1.0（典型的には2−4時間）になるまで増殖させる。
3．培養を1,100 x gで10分遠心する（例えばエッペンドルフ5810Rで2351rpm）。
4．ペレットを10mM MgSO4にてOD600＝1.0に穏やかに再懸濁する。
5．調製した宿主細胞を氷上又は4℃で保存する。宿主調製物は約1週間良好であるはずである。
【０２９６】
ラムダファージのプレーティングのための一般的プロトコル
必要な成分：
−OD1宿主調製物；
−無菌的ファルコン（Falcon）2054チューブ（又は150mmプレートを使用する場合は2059チューブ）；
−溶融NZYトップ寒天、50℃に平衡化；
−NZYプレート、室温に温める；
OD1宿主調製物及び溶融トップ寒天の必要量は使用するNZYプレートのサイズに左右される。一般的ガイドラインは以下のとおりである：
2010516296.tif 000121
一般的プロトコル
1．推奨量のOD1宿主調製物（上記の表を参照）を2054又は2059チューブへ分注。
2．必要な体積のラムダファージストックをピペットで注意深く分注宿主細胞へ加え、ヴォルテックスミキサーで穏やかに混合する。
3．室温で15分インキュベートすることによって（振盪不要）、ファージを宿主に吸着させる。
4．適切な体積の50℃溶融トップ寒天（上記の表を参照）をチューブに添加し、迅速にNZYプレート上に注ぎ入れることによってファージをプレートする。トップ寒天が固まる前に、注意深くプレートを側面から側面に傾けて滑らかで均等な分布を担保する。
5．プレートをひっくり返し、乾燥37℃インキュベーターで一晩インキュベートする。いくつかのNZYプレートは非常に水分が多いことに留意されたい。インキュベーション時の水分の問題を防ぐために、これらのプレートはインキュベーターに入れる前に水分を逃がす必要がある。
【０２９７】
ラムダファージの力価測定
1．SM緩衝液でライブラリーの10-5、10-6及び10-7の希釈を作成する。力価が105/μL未満（＜108/mL）の古いライブラリーについてはさらに控えめな希釈が必要であろうということに留意されたい。
2．3つのファルコン2054チューブの各々にOD1宿主調製物の100μLをピペットで加える。
3．宿主細胞を含む別々の2054チューブに各希釈の100μLを注意深く加える。上記のラムダファージの平板培養のための一般的プロトコルの工程3−5に記載したように吸着、プレート作成及びインキュベーションを実施する。
4．プラークを数え、ライブラリーストックの力価（pfu/μL）を計算する。可能な場合、50−200プラークを生じる希釈を用いる。例えば、10-6の希釈の100μLを含むプレートが157プラークを生じる場合、ライブラリー力価は約1.6 x 106pfu/μLである。
以下の表は、これら例示的プロトコルから得られたデータの要旨である。表の理解を容易にするために、（本発明の）“例示的酵素”と表示した欄は、例えば第一の列の“7、8”は、配列番号:8のアミノ酸配列を有し、例えば配列番号:7の核酸配列によってコードされる酵素と読む。“Avicel”は上記に記載したAVICEL(商標)である。GHファミリーは“グリコシルヒドロラーゼ”ファミリーを意味する。“True”及び“False”は、表示の条件においてそれぞれ“酵素活性有り”又は“活性無し”を表す。反応時間は分である。
【０２９８】
【表４−２】
2010516296.tif 000122
表つづき
【表４−３】
2010516296.tif 000123
表つづき
【表４−４】
2010516296.tif 000124
表つづき
【表４−５】
2010516296.tif 000125
表つづき
【表４−６】
2010516296.tif 000126
表つづき
【表４−７】
2010516296.tif 000127
表つづき
【表４−８】
2010516296.tif 000128
表つづき
【表４−９】
2010516296.tif 000129
表つづき
【表４−１０】
2010516296.tif 000130
表つづき
【表４−１１】
2010516296.tif 000131
【０２９９】
セルラーゼの最初のスクリーニングのための例示的アッセイ
一酵素消化のための例示的プロトコル（37℃及び55℃）：
1．調製：10試験サンプル毎に、通常以下が必要である：2枚の96ウェルプレート（37℃及び55℃での消化用）、2枚の透明な384ウェルプレート（対応するタイムポイント用）及び酵素希釈のために96深底ウェルの利用可能スペース。
2．レイアウト：一般的には各プレートに10酵素サンプル＋陽性及び陰性コントロール。各サンプルは1カラムを占める。典型的なスクリーニングレイアウトを以下に示す（本プロトコルのある詳細が下記レイアウトとして与えられる）。
列B：pH5での0.1mg/mLの酵素
列C：pH5での1.0mg/mLの酵素
列D：pH7での0.1mg/mLの酵素
列E：pH7での1.0mg/mLの酵素
列F：pH9での0.1mg/mLの酵素
列G：pH9での1.0mg/mLの酵素
3．1.2Xの基質緩衝溶液を作成する。以下は最終濃度0.4％AVICEL(商標)の消化用である：50mM緩衝液及び5mMのアジ化ナトリウム。被検12サンプル（10試験＋2コントロール）毎に、10mLずつの下記緩衝液が必要であろう。アジ化ナトリウムが、消化反応時の一切の夾雑微生物の増殖阻害のために添加される。
a.懸濁AVICEL(商標)0.48％；60mM酢酸ナトリウム、pH5.0；6mMアジ化ナトリウム、
b.懸濁AVICEL(商標)0.48％；60mM燐酸ナトリウム、pH7.0；6mMアジ化ナトリウム、
c.懸濁AVICEL(商標)0.48％；60mM燐酸ナトリウム、pH9.0；6mMアジ化ナトリウム。
4．1.2Xの基質緩衝溶液を2枚の96ウェルプレートに175μL/ウェルで添加する。これらは消化プレートであろう。マルチチャンネルピペットを使用する。AVICEL(商標)は迅速に沈み、したがって毎回ピペットで溶液を容器からピペットで量り取り、96ウェルプレートに液を移す前に液をピペットで上下させて均質な懸濁物を形成させる。上記のレイアウトに示したように（列B及びCにpH5、列D及びEにpH7、列F及びGにpH9）一並びに配置する。
5．2枚の384ウェルのタイムポイントプレートを35μL/ウェルの停止溶液を用いて準備する。TITERTEKTMを使用する。各プレートの全ウェルを35μLの停止溶液で満たす。
6．6Xの酵素溶液を作成する。96ウェルプレートで、各酵素ストックの0.6mg/mL及び6mg/mL希釈を作成する。各サンプルにつき前記2つの希釈でそれぞれ250μLを作成する。水で酵素ストックを希釈し、それらを消化プレートで所望の順番でプレートの2つの列（上列0.6mg/mL、下列6mg/mL）に一並びに配置する。陽性及び陰性コントロールもまた12サンプルの間に含ませる。
7．酵素を基質に添加し、直ちに0タイムポイントを取る。マルチチャンネルピペットを用い、希釈プレートの上列から6X酵素サンプルの35μLを取り、両消化プレートの列B、D及びFに移す（上記レイアウト参照）。注意深くピペットで液を上下させ完全に混合し、続いて直ちに384ウェルのタイムポイントプレートの上部左の4つの停止液に各消化溶液の35μLを移す。ピペットで液を上下させて停止液と混合する。ピペット操作のミスを最小限にするように注意を払うならば、消化プレートの各列について、酵素移動及び停止液移動の両方に同じ12ピペットを用いてもよいことに留意されたい。384ウェルタイムポイントプレートを次のタイムポイントまで4℃でロボリッド（robo-lid）を用いて保存する。
8．インキュベートする。一方の消化プレートを37℃に、他方を55℃に置き、ロボリッド及び湿らしたパーパータオルで湿潤にしたジッパー密閉式バッグを用いる。
9．3−5時間後に別のタイムポイントを取る。最初に消化プレートを遠心して、蓋で凝結した水分を下に引きおろす（3200 x g、１分未満）。35μLに設定したマルチチャンネルを用いて、ピペットで液を上下させてAVICEL(商標)を均等に懸濁させ、続いて35μLをタイムポイントプレートの上部右の4つに移し、停止液と混合する。ピペット操作ミスを最小限にするために注意する。このタイムポイントの消化時間の長さに注意する。
10．ほぼ24時間で三番目のタイムポイントを取る。2日目に、上記に記載したように三番目のタイムポイントを取る。下部の左の4つに入れて、停止液と混合する。このタイムポイントの消化時間の長さに注意する。
11．ほぼ48時間で最後のタイムポイントを取る。3日目にインキュベーターからプレートを取り出す。上記に記載したように最後のタイムポイントを取り、タイムポイントプレートの下部右の4つで停止液と混合する。消化時間の長さに注意し、それを96ウェル消化プレートの蓋に書き入れる。BCA及びグルコースアッセイのためのタイムポイントプレートを使用する。金属箔シールを消化プレートに適用し、後でCE/HPLC分析に使用するために-20℃で保存する。
【０３００】
グルコースオキシダーゼ（＋β-グルコシダーゼ）アッセイのための例示的プロトコル：
この例示的プロトコルは、消化反応物を39倍（各タイムポイントの停止液との2倍希釈を含む）希釈し、したがって消化生成物中のグルコース等価物の濃度が25から400μMの範囲にあると予想されるときに適切である。より高濃度のグルコースもまた検出できるが、標準物の直線範囲を超えるであろう。
以下は反応を停止させた各384ウェルプレート（例えばタイムポイントプレート）について実施されるべきである。
1．APRICOTTMがセットアップされ、384ウェル多重物が取り付けられ、さらに新しいチップが取り付けられていることを確認する
2．反応を停止させた反応プレートを2,000 x gで1分遠心する。
3．標準曲線を添加する：GOアッセイを実施するときは、セロビオース（CB）標準物をβ-グルコシダーゼ活性の管理のために用いる。β-gluc工程が正確に実施されているときは、CB（グルコース等価物として表される）はグルコース標準物と同じ勾配を示すはずである。
a.96深底ウェルプレートで希釈を作成し、それらをアッセイプレートへ所望のように移すため一並びに配置するのが便利である。
b.標準物は水で希釈することができる。
c.200μMのCB溶液及び400μMのグルコース溶液を作成する。各々の4連続2倍段階希釈を実施する。0μM溶液を含めれば、グルコース及びCBの両方について6ポイントの標準曲線を入手できるだろう。
d.例示的プロトコル：
i.96深底ウェルプレートの1つのウェルで、200μMのCB溶液1mLを作成する。別のウェルで、400μMのグルコース溶液1mLを作成する。
ii.連続希釈を作成するために、各標準物に隣接する5ウェルの各々に0.5mLの水を添加する。
iii.各標準物の2-1の4連続希釈を作成する（0.5mL＋0.5mLの水）。 “0μM”ポイントとして標準物を含まない最後のウェルを残しておくことを忘れないこと。
e.各希釈の35μL/ウェルを、列A、B、O及びPのように、タイムポイントプレートの未使用領域の35μLの停止液に移す。各標準物を4つずつ添加する。
4．TITERTEKTM MULTIDROPTMを用いて、新しく作成したβ-グルコシダーゼ溶液を黒色の384ウェルプレートに35μL/ウェルで添加する。
5．APRICOTTMを用いて、タイムポイントプレートから4μL/ウェルをβ-グルコシダーゼプレートに移して混合する（これらの移転工程のための例示的ApricotプログラムはDYCAICOTMと呼ばれる）。いったん混合したら、最終pHはおよそ7.5であるべきである。このタイムポイントプレートは、いずれかのアッセイを繰り返す必要がある場合に、金属箔を用いて-20℃で保存する。
6．プレートを2000 x gで数秒間遠心して気泡を除く。
7．β-グルコシダーゼプレートを室温で2−3時間インキュベートする。
8．TITERTEK MULTIDROPTMを用いて新しく作成した2XのGOアッセイ溶液を40μL/ウェルで黒色のβ-グルコシダーゼ処理プレートに添加する（前記溶液は使用直前に作成する）。
9．アッセイプレートを室温で遮光しながら30分インキュベートする（必要な場合、プレートを2000 x gで数秒間遠心して気泡を除く）。
10．レゾルフィン検出のために530/595nmで蛍光を読み取る。
11．データはエクセルテンプレートを用いた分析のためにテキストファイルとしてセーブする。
【０３０１】
BCAアッセイのための例示的プロトコル：
1．BEAVERTM（Tansun Limited, UK）ヒーターを予備加熱する（底＝70℃、上部＝75℃）。
2．APRICOTTMがセットアップされ、384ウェル多重物が取り付けられていることを確認する。プログラムを数回実行して洗浄装置を完全に準備させる。
3．標準物：GOアッセイについて述べたようにタイムポイントプレートに標準物を添加する。過去において、BCAアッセイで検査サンプルに存在するバックグラウンドタンパク質に似せるために、標準物希釈用に（BSAのような）0.1mg/mLタンパク質溶液が用いられたことに留意されたい。これは、消化物として比較的純粋な高レベルのタンパク質を用いるときにのみ相関性を有する。
4．タイムポイントプレートを3200 x gで5分、4℃にて遠心して、サンプルに存在するAVICEL(商標)を沈殿させる。
5．各タイムポイントプレートについて、2枚の新しい透明な384ウェルプレートをBCAアッセイのために用いる（デュープリケートプレート）。したがって、合計4枚のプレートが37゜及び55゜の両方のタイムポイントをカバーするために必要であろう。
6．TITERTEK MULTIDROPTMを用い、新しく混合したA＋B溶液の15μL/ウェルを各アッセイプレートに添加する。
7．APRICOTTMを用い、15μLの酵素消化物の上清をタイムポイントプレートからアッセイプレートへデュープリケートで移す。AVICEL(商標)を移さないようにする（懸濁AVICEL(商標)はバックグラウンドを生じる）。APRICOTTMには混合工程があることを確認すること。BEAVERTMヒーターには2枚のプレートのためのスペースしかないので、37゜及び55゜のタイムポイントアッセイに約40分の時差をつける必要がある。
8．直ちにアッセイプレートにフォームリッド（foam lid）を適用してBEAVERTMヒーター上に置く。
9．厳密に35分インキュベートする。
10．インキュベーションが完了したら、ただちにプレートを氷上に置き、フォームリッドを本来の蓋に置き換え、迅速に遠心にとりかかる。
11． 3200 x gで5分、4℃にて遠心する。4℃でのこの遠心はプレートを急速に冷却させる。
12．562nmで吸収を読み取る。
13．データはEXCELTMテンプレートによる分析のためにテキストファイルとしてセーブする。
【０３０２】
溶液：
13％懸濁AVICEL(商標)：
130グラムのAVICEL(商標)微晶質セルロース（FMC Biopolymaer：タイプPH105、NF/EPグレード）を清浄な高速ブレンダーに測りいれ、18MΩ蒸留水を1Lの計量線（約916mL）まで加える。蓋を閉めて高速で20分混ぜ合わせる。上清をオートクレーブ可能容器に移し、30分の“液体”サイクルを用いてオートクレーブする。室温で保存する。
停止溶液：
（400mMの炭酸緩衝液、pH10）
下記のBCA溶液Aについての指示にしたがうが、BCA成分は添加しない。続いて2倍希釈して、400mMのカーボネート溶液1リットルを作成する。
BCA溶液A（800mMカーボネート
（pH10）中の5mMのBCA）
2010516296.tif 000132
1．攪拌バーを含む500mLビーカーで、32グラムの炭酸ナトリウム一水和物*を12グラムの重炭酸ナトリウムと混合する。
2．18MΩ水を約450mLまで加え、磁力攪拌装置に完全に溶解するまで置く（約15−30分）。
3．975mgのBCA試薬を添加し、完全に溶解するまで攪拌を続ける。
4．体積を18MΩ水で500mLに調整する。
5．ろ過滅菌する。
6．4℃で保存。2−3週間ごとに新しく作成する。
−あるいは、上記工程1で無水炭酸ナトリウム27.35グラム（FW106）を用いてもよい。
【０３０３】
BCA溶液B
2010516296.tif 000133
1．攪拌バーを含む500mLビーカーで、620mgの硫酸第二銅五水和物を630mgのL-リジンと混合する。
2．18MΩ水を約450mLまで加え、磁力攪拌装置に完全に溶解するまで置く（約15−30分）。
3．体積を18MΩ水で500mLに調整する。
4．ろ過滅菌する。
5．4℃で保存。2−3週間ごとに新しく作成する。
β-グルコシダーゼ：
2010516296.tif 000134
*タイムポイントプレートの高pH溶液はいったんβ-グルコシダーゼ溶液で10倍に希釈され、最終pHは7.5近くになるべきであり、前記は配列番号:424にとって適切である。
**この酵素のHisタグ付加型もまた用いることができる。
2XのGOアッセイ溶液：
2010516296.tif 000135
列挙した順番で成分を添加し、直ちにアッセイに使用する。
【０３０４】
GO/HPRミックス：
−グルコースオキシダーゼ：Sigma #G7141-50KU。全50,000ユニットを5mLの50mMリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解する。
−ホースラディッシュペルオキシダーゼ：Sigma #P2088-5KU。全5,000ユニットを5mLの50mMリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解する。
グルコースオキシダーゼ及びHRP溶液を混合する。滅菌注射筒を用い、等体積（10mL）の無菌的グリセロールを添加する。よく混合する。これは、GOが2,500U/mL、HRPが250U/mLの最終濃度の溶液20mLを提供する。1mLのチューブに適量を分注し、-20℃で保存する。
50mMのAmplex Red：
モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）#A22177（10 x 10mgバイアル；MW＝257.25）。各10mgバイアルを0.777mLのDMSOに溶解して50mMストックを得る。光を防いで-20℃で保存する。
任意の10mMストック：インビトロゲン（Invitrogen）#A12222；MW＝257.25。全5mgを1.94 mLのDMSOに溶解する。0.5mLチューブ当たり250μLを分注し、光を防いで-20℃で凍結する。
アジ化ナトリウム：
シグマ（Sigma）#S2002（FW65.01）；注意必要；前記は有毒であり、発癌性である。濃縮ストック（例えば1M）を水で作成する。抗微生物添加物として使用するために、典型的な濃度は0.02−0.05%（w/v）であり、前記は3から8mMである。
【０３０５】
例示的酵素消化能力アッセイ−大規模アッセイ
大規模酵素消化能力アッセイはまた、本発明の酵素の認定及び本発明の酵素の性状決定に用いることができる。例示的な大規模酵素消化能力アッセイは以下のとおりである。
例示的大規模酵素消化能力アッセイはガラスの10mLクリンプトップ（crimp-top）バイアルで実施した。水分含有量及び糖組成はアッセイの前に決定した。250 dw mg±10mgのせん断バガスを前記ガラスバイアルに量り入れ、所定量の100mMのNaOAc緩衝液を最終酵素濃度に応じて添加した。前記NaOAc緩衝液のpHは5.0であり、前記緩衝液は増殖阻害物質として10mMのNaN3を含んでいた。バガス混合物はシーリング無しで蓋をし、37℃インキュベーターで約20分予備加熱した後で適量の酵素溶液を添加した。大規模反応における酵素の添加はセルロース1g当たり25mgの総タンパク質である。全反応体積は5mLである。いったん酵素溶液を添加したら、バイアルをシールし、ロータリーに留め金で留めた。2、4、6及び24時間に約200μLのサンプルを抜き取った。このサンプルを13,200rpmで5分間遠心した。上清を384ウェルプレートで4倍希釈した。反応生成物の糖組成を公知の標準物質に対してRI-HPLCにより分析し、バガス中の理論的セルロース価を基準にセルロース変換を算出した。
【実施例６】
【０３０６】
本発明の酵素の同定及び特性決定
本実施例では、本発明の酵素の同定及び特性決定のための例示的方法について述べる。前記例示的方法は、多様なバイオマス（例えばサトウキビ植物繊維（“バガス”とも称される）、バガスの完全な分解（“加水分解”）のためには多数の酵素を必要とする）の複雑な構造を効率的に処理（“加水分解”）するために設計された、本発明の酵素の混合物（“カクテル”）で用いられるべき酵素を含む。
また別の特徴では、酵素の種々の組合せが試験され、バガス基質（又は任意のバイオマス基質）を所望のレベルに加水分解するために必要な最適の組合せが決定される。酵素の分類は、モデル基質に対して以前に決定されたそれらの活性を基準にし、必ずしも既知の酵素に対するそれらの配列同一性（配列類似性／相同性）によらない。例えば、セルロースからセロビオースを遊離させる酵素は、たとえ配列からそれがエンドグルカナーゼにもっとも類似しているとしても、セロビオヒドロラーゼと考えられるであろう。
酵素の発見
原核細胞酵素：
既知酵素の多くが、非標識又は標識基質（例えば非標識又は標識基質AVICELTM）による機能的スクリーニングによって原核細胞ライブラリーから発見された。機能的スクリーニングはまた、任意のアッセイ又はプロトコル（例えばキシラントラップなど）の使用を含むことができる。環境由来サンプル（例えば土壌、大気又は水サンプルを含む）から得られる遺伝子ライブラリーを遺伝子発現に用いることができ、前記は、順次リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及び／又はβ-グルコシダーゼ（ベータ-グルコシダーゼ）活性（例えばバガス分解性、又はトウモロコシ繊維（トウモロコシの種子繊維）分解性活性を含む）についてスクリーニングされる（前記環境サンプルは、例えば農地、例えばサトウキビ畑から得られ、任意の環境由来サンプルで直接的又は間接的に見出される任意の微生物（例えば植物（例えばサトウキビ、トウモロコシ）の微生物、昆虫関連微生物などを含む）を含む）。
【０３０７】
菌類の酵素：
機能的スクリーニングは、細菌ライブラリーに加えて菌類ライブラリーを含むであろう。リグノセルロース系活性（バイオマス分解性、例えばバガス分解性又はトウモロコシ種子繊維分解性活性を含む）を有する酵素が菌類源から認定されるであろう（もっとも良好な性能を示すバイオマス分解酵素の多くは菌類で確認され、したがって菌類はバガスに特異的な繊維分解酵素の良好な供給源でありえよう）。
効率的にバガスを分解する菌類はおそらく、一緒になって良好に働くように進化してきた酵素レパートリーを有するであろう。同じ微生物由来の多数のバガス分解酵素が、異なる生物から単離された酵素と比較して、バガスの分解に適用されて相乗的に働くということはありえることである。これらの理由から、本実施例の例示的酵素発見の方法は菌類遺伝子に焦点が当てられる。
ある実施態様では、菌類のバガス分解酵素の発見は、ヴェレニウム社（Verenium Corporation's）のハイ・スループット培養技術を利用し、環境サンプルから固有の微生物を単離しアレイを作成する。菌類によって分泌される酵素が活発にバイオマス基質（例えばバガス又はトウモロコシ繊維（例えばトウモロコシ種子繊維）基質）を分解し増殖するとき、それら酵素の認定について複数のアプローチの組合せが評価される。ある実施態様では、高度に活動的な菌類に由来する繊維分解酵素の大半又は全てを単離することによって、植物又は微生物で異種発現させたときに一緒になって良好な相乗作用を示す酵素の効率的な組合せが提供される。
基質の予備処理：
最初に、バイオマス基質（例えばバガス又はトウモロコシ繊維基質）の単純なベンチスケール的予備処理を実施して評価する。
【０３０８】
アプリケーションアッセイにおける例示的な酵素の評価
ある実施態様では、アプリケーションアッセイを用いて、未処理又は予備処理バイオマス基質（例えばバガス又はトウモロコシ繊維（例えばトウモロコシ種子繊維）基質）に対する酵素及び酵素組合せの活性が決定される。これは、バイオマス基質から遊離される糖を定量及び識別する分析技術の利用を含むことができる。繊維基質の正確な糖組成を決定するために確立された方法もバイオマス（例えばバガス又はトウモロコシ繊維）に対して応用することができる。この情報を用いて酵素処理後の基質の分解の程度を決定することができる。
酵素の最良の組合せが統計的に決定されるであろう。この戦略は、1つ以上の酵素の実体を固定するか、又は基質の予備処理を含むことができる。基準酵素（市販調製物及び／又は既存の繊維分解酵素のサブクローン）を用いて、このアッセイを発展させその有効性を実証する。
CBH及びベータ-グルコシダーゼのような酵素（前記はセロビオース及びグルコースによってそれぞれ強く阻害される）に対して、生成物阻害を測定することができる。
【０３０９】
A．酵素の発見
a．原核細胞酵素のための例示的な機能的スクリーニング戦略
−機能的アッセイを用いて、対応するサンプル部位（例えばトウモロコシ又はサトウキビ畑）に由来する原核細胞遺伝子ライブラリーを標的酵素活性（例えばグリコシルヒドロラーゼなど）についてスクリーニングする。
−異なる蛍光発光団（例えば4-メチル-ウンベリフェリル及びレゾルフィン結合基質）による酵素スクリーニングの多重化によって、同時に多数の酵素についてスクリーニングすることができる。
b．菌類株のための例示的なスクリーニング戦略
−ハイ・スループット培養から新規な菌類をスクリーニングし、in vivoで効率的に標的バイオマス（例えばトウモロコシ繊維又はバガス）を分解する株を探索するトウモロコシ種子繊維プロジェクトで上位菌類株を同定する。
−同定された株の実体及び多様性を18S分析によって決定することができる。
−活発にバイオマス分解性（例えばバガス分解性）酵素を生成する培養から完全長cDNA発現ライブラリーを作製する。
−特にこれらの株が標的バイオマス（例えばトウモロコシ繊維又はバガス）を活発に分解する場合、これらの株に由来する培養液に存在する遺伝子の大半又は全てをクローニングするために鋭意努力する。これらの遺伝子の全てをクローニングするために用いることができる例示的なアプローチは、以下の方法の組合せを含むことができる：
1．（a）配列依存アプローチによってcDNAライブラリーをスクリーニングするか、及び／又は（b）基質結合ドメイン（SBD）によってgDNAライブラリーをスクリーニングし、ゲノムクローンをアスペルギルスに直接配置し、cDNAヴァージョンの生成プロセスで宿主によってイントロンスプライシングを実施してスプライスクローンを確認する；
2．これらの株を標的バイオマス（例えばトウモロコシ繊維又はバガス）基質で増殖させ、プロテオミック分析により培養液に分泌されたタンパク質を識別する。
【０３１０】
B．例示的な酵素の特性決定
a．新規に発見された遺伝子のバイオインフォマティクスによる特性決定
−ドメイン構造、酵素のクラス及びファミリー
−シグナル配列、稀なコドンなど
b．新規に発見された遺伝子のサブクローニング、並びに特性決定及びアプリケーションテストのためのタンパク質発現の最適化
c．標準的プロトコルによる全てのサブクローンの酵素の特性決定
−選択した（又は全ての）酵素の調製物の比活性をモデル基質で決定する。この情報をアプリケーションアッセイにおける酵素添加の計算に用いることができる。
C．アプリケーションアッセイにおける例示的な酵素評価
a．また別のアッセイ開発戦略：
−標的バイオマス（例えばトウモロコシ繊維又はバガス）基質の分布；
−反応様式の条件；
−関連する全ての糖を決定するための培地スループットアッセイ（例えば還元糖アッセイ）；
−詳細な分析（HPLC/ELSD、LC/MSなど）を高レベルの糖遊離を示すサンプルで実施することができる。遊離される糖を定量し同定する方法、及び何が未消化で残留するかが利用される。ある実施態様では、繊維基質の糖組成を定量し、遊離される糖の％として酵素の性能が評価される。
−酵素のコンビナトリアルな評価のための例示的戦略には、特定の酵素クラスに対する初期調査のための酵素的又は化学的な前処理が含まれえる。
b．基準酵素によるアッセイの有効性の実証：これはいくつかの標的性能基準及びアプリケーションアッセイで添加されるべき酵素単位に関する情報を提供するであろう。
c．アプリケーションアッセイにおける全ての酵素の評価：標的バイオマス（例えばトウモロコシ繊維又はバガス）基質から大半の糖の遊離をもたらす酵素及び酵素の組合せを認定する。
D．植物細胞（トランスジェニック植物）における酵素の評価
ある実施態様では、各加水分解酵素クラスの有望な候補を植物（宿主植物細胞、植物組織及び／又はトランスジェニック植物の両方を含む）での発現に付す。これらの植物発現酵素（例えばヒドロラーゼ）が、標的バイオマス（例えばトウモロコシ繊維又はバガス）のアプリケーションアッセイで試験されるであろう。
E．酵素活性の進化、最適化
ある実施態様では、さらに酵素性能に応じて、酵素のいくつか又は全てが“最適化”される（すなわち、パラメーター（例えばある基質に対する酵素の生産性、最適温度、最適pH、安定性、比活性、生成物阻害など）の改善のために配列修正される）。最適化は、ヴェレニウム社の特許製品GENE SITE SATURATIOB MUTAGENESIS（又はGSSM）及び／又はGENEREASSEMBLYTM技術を用いる進化を含むことができる。
【実施例７】
【０３１１】
本発明のマルチドメイン酵素
本実施例では、とりわけ本発明のマルチドメインポリペプチド（例えば酵素）（及びそれらをコードする核酸）の設計及び製造について述べる。
本発明は、少なくとも1つの（例えば複数の）炭水化物結合モジュールを含むマルチドメイン酵素である、リグノセルロース系酵素、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼ酵素を提供する。前記炭水化物結合モジュールは異種又は同種炭水化物結合モジュール（CBM）であることができ、さらに、別のリグノセルロース系酵素に由来する公知の任意のCBMモジュール、例えばセルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナナーゼ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュール、アラビノフラノシダーゼ結合モジュールなどであってもよい。本実施例は、炭水化物結合モジュール（例えばセルロース結合モジュール）の日常的な識別のための例示的プロトコルについて記載した。
CBM結合アッセイの材料：
例示的CBM結合アッセイ（セルロース及びキシロース用）のための基質はAVICEL(商標)微晶質セルロース（MCC）及びエンバクキシラン（Oat-Spelt Xylan）（Sigma， X−0627）である。セルロース結合モジュールは、精製CBM-GST融合タンパク質又はCBMを含む溶解物のどちらかである。BSAをアッセイのコントロールとして選択した。
CBM結合アッセイプロトコル：
CBM結合アッセイは、200μLの総反応体積で1.5mLのエッペンドルフチューブで実施した。前記反応体積は、50mMトリスHCl緩衝液（pH8.0）中に1mgの基質（Avicel MCC又はエンバクキシラン）及び0.1mgのCBMを含んでいた。反応を室温で1時間実施した後、10,000rpmで5分の遠心によって、上清に残留する未結合CBMを沈殿中に残る結合CBMから分離した。次に同じ緩衝液でペレットを3回洗浄し、SDSローディング緩衝液を加え、10分間煮沸して結合CBMをペレットから遊離させた。最後に結合CBM及び未結合CBMをSDS PAGEによって検出した。
【０３１２】
CBMの定義：
上記に特記したように、任意の炭水化物結合モジュール（CBM）、例えばセルロース結合モジュールを本発明の酵素に取り入れることができ、多くのそのようなモジュールは当分野で周知であり、例えば炭水化物活性酵素のウェブサイトでは、炭水化物結合モジュールは、炭水化物結合活性を有する、控えめな折り目を有する炭水化物活性酵素内の連続するアミノ酸配列と定義されている。いくつかの例外は、セルロソームの骨組みタンパク質中のCBM及び独立した推定的CBMの稀な事例である。大きな酵素内のモジュールとして存在する炭水化物結合モジュール、例えばセルロース結合モジュールの要件は、このクラスの炭水化物結合タンパク質を他の非触媒性の糖結合タンパク質（例えばレクチン及び糖輸送タンパク質）から区別させる。
CBMは、最初に発見された、セルロースと結合するいくつかのモジュールを基にしてセルロース結合ドメインと以前には分類された。しかしながら、炭水化物活性酵素でまた別のモジュールが次々と発見され、それらはセルロース以外の他の炭水化物と結合し、それ以外はCBMの基準に適合し、したがって、より包括的な用語を用いてこれらポリペプチドを再分類する必要がある。セルロース結合ドメインの以前の分類はアミノ酸類似性を基準にしていた。CBDの分類は“型”と呼ばれ、ローマ数字で番号を付された（例えばCBD I型又はII型）。
グリコシドヒドロラーゼの分類が達成され、これらのグループは今やファミリーと称され、下記に示すようにアラビア数字で番号が付与される。また別の実施態様では、本発明の酵素は、これら炭水化物結合モジュール（例えばセルロース結合モジュール）のいずれか又は全てのうちの1つのメンバー又は複数のメンバーを、本発明の任意の酵素又はペプチドと（例えば前記酵素又はペプチド内でスプライシングされた配列又は付加された配列として）連結されたドメインとして含む。
【０３１３】
CBM1：
ほぼ例外なく菌類で見出される約40残基のモジュール。セルロース結合機能が多くの事例で示され、約10.4オングストローム離れた3つの芳香族残基によって成立しているようであり、さらに前記は平坦な表面を形成する。唯一の非菌類CBM1は藻類の非加水分解性多糖類結合タンパク質に存在し、前記タンパク質は４つの反復するCBM1モジュールを含む。キチンとの結合が１つの事例で示された。
CBM2（CBM2a、CBM2b）：
約100残基のモジュールで、多数の細菌酵素で見出される。セルロース結合機能が多くの事例で示された。これらのモジュールのいくつかはキチン又はキシランとも結合することが示された。
CBM3（CBM3a、CBM3b、CBM3c）：
細菌酵素で見出される150残基。セルロース結合機能が多くの事例で示された。1つの事例で、キチンとの結合が報告された。
CBM5 12：
約40−60残基。これらモジュールの大半は、その機能がキチンとの結合であるキチナーゼで見出される。CBM5ファミリーとは遠いが関係がある。
CBM10：
約50残基のモジュール。セルロース結合機能が1つの事例で示された。
これら炭水化物結合モジュール（CBM）アッセイの結果は下記の表5及び6に示されている。表5及び6に要約されているこれらの結果は、本発明の例示的ポリペプチドのいくつかにおける機能的CBMの存在を示している。前記の表はまた、本発明のこれらCBMに付随する活性を表示している。
本発明は、酵素を含むキメラポリペプチドを提供する。本キメラポリペプチドは、本発明のポリペプチド配列（例えば本発明の酵素（本発明のポリペプチドの酵素的に活性な部分配列（フラグメント）を含む）を含む）を含み、前記は任意の組合せのCBM（下記に列挙する例示的CBMを含む）を含む。例えば、リグノセルロース系活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼ、セルロース分解活性、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-キシロシダーゼ又はアラビノフラノシダーゼ活性を有する本発明のキメラポリペプチドは、1つ、2つ若しくは数個の異種又は内在的に再編成されたCBMを含み、さらにこれらの異種又は内在的再編成CBMは、配列の内部及び／又はアミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端に配置されえる。本発明のキメラポリペプチドが組換えタンパク質である場合は、前記キメラポリペプチドは、フランキング及び／又は内部異種若しくは内在的再編成CBMコード配列をコードする組換えキメラコード配列を構築することによって作成することができ、これらキメラ核酸コード配列もまた本発明の配列である。
【０３１４】
【表５−１】
2010516296.tif 000136
【０３１５】
表５のつづき
【表５−２】
2010516296.tif 000137
【０３１６】
【表６】
2010516296.tif 000138
【実施例８】
【０３１７】
本発明の単子葉及び双子葉植物最適化遺伝子
本実施例では、とりわけ、双子葉及び／又は単子葉細胞及び／又は植物での最適発現のために設計又は“最適化”した、本発明の核酸配列の設計及び製造について述べる。双子葉及び単子葉植物の合成遺伝子をVector NTI9.0TMの逆翻訳プログラムを用いて設計した。単子葉植物又は双子葉植物のための優先コドンを用いて、４つのタンパク質配列を単子葉最適化及び双子葉最適化コード配列に逆翻訳した。クローニング及び細胞内区画への弁別的標的化のために、追加の配列を各セルラーゼ遺伝子コード配列の5'及び3'末端に付加した。これらの配列にはBamHIクローニング部位、Kozak配列、及び5'末端のN-末端シグナル配列が含まれていた。空胞又はER標的化配列及びSacIクローニング部位を3'末端に付加した。サイレント変異を導入して、クローニング戦略に干渉する一切の制限部位を除去した。合成遺伝子はGENEARTTM（ドイツ）によって合成した。
例示的な配列番号:360（CBH1タンパク質）をコードする双子葉植物最適化遺伝子は配列番号:480であり、例示的な配列番号:358（CBH2タンパク質）をコードする双子葉植物最適化遺伝子は配列番号:481であり、例示的な配列番号:168（エンドグルカナーゼ）をコードする双子葉植物最適化遺伝子は配列番号:482であり、さらに例示的な配列番号:34（CBH1タンパク質）をコードする双子葉植物最適化遺伝子は配列番号:487である。例示的な配列番号:360をコードする単子葉植物最適化遺伝子は配列番号:483であり、例示的な配列番号:358をコードする単子葉植物最適化遺伝子は配列番号:484であり、例示的な配列番号:168をコードする単子葉植物最適化遺伝子は配列番号:485であり、さらに例示的な配列番号:34をコードする単子葉植物最適化遺伝子は配列番号:486である。
【実施例９】
【０３１８】
植物発現ベクターの構築
本発明は、本発明の核酸（本発明の酵素をコードする核酸を含み、さらに前記酵素コード配列に相補的な配列を含む）を含む多様な植物発現系（ベクター、組換えウイルス、人工染色体などを含む）を提供し、本実施例ではこれら実施態様のいくつかの製造について述べる。
トランスジェニック植物でセルラーゼの発現を指令することができる発現ベクターが、単子葉及び双子葉植物の両方の最適化セルラーゼのために設計された。双子葉植物最適化セルラーゼ遺伝子の発現を駆動するために、タバコ発現ベクターでは構成的プロモーターセストルム（Cestrum）イエローリーフカールウイルス（CYLCV）プロモーター＋リーダー配列（配列番号:488）を用いた。タバコで発現させたセルラーゼは、ダイズ（Glycine max）のグリシニンGY1シグナル配列（配列番号:473）及び小胞体（ER）保持配列（配列番号:474）との融合によりERへ標的化された。タバコ発現セルラーゼは、セルラーゼ遺伝子を、C-末端でスポラミン液胞標的化配列（配列番号:475）と（Plant Phys 1997, 114:863-870）、さらにN-末端でGY1シグナル配列と融合させることによって液胞へ標的化された。セルラーゼのプラスチド標的化は、N-末端に融合させたシアノフォラ・パラドキサ（Cyanophora paradoxa）のフェレドキシン-NADP＋レダクターゼ（FNR）に由来する輸送ペプチドによって達成された（FEBS Letters 1996, 381:153-155）。
ダイズのグリシニンGY1プロモーター及びシグナル配列（GenBank Accession X15121）を用いて、セルラーゼのダイズ種子特異的発現を駆動させた。ダイズにおけるセルラーゼの標的化は、ER保持配列（配列番号:474）又はβ-コングリシニン（Plant Phys 2004, 134:625-639）由来のタンパク質貯蔵液胞（PSV）配列（配列番号:477）のどちらかのC-末端付加を必要とした。
【０３１９】
トウモロコシのPepCプロモーター（The Plant Journal 1994, 6(3):311-319）を用いて、各単子葉植物最適化セルラーゼのトウモロコシの葉特異的発現を駆動させた。セルラーゼ遺伝子は、ガンマゼイン27kDシグナル配列（配列番号:478）とN-末端で融合させてERへ標的化し、さらにオオムギのポリアミンオキシダーゼ（配列番号:479）由来の液胞配列ドメイン（VSD）と融合させて葉の液胞へセルラーゼを標的化した（Plant Phys 2004, 134:625-639）。あるいは、VSDの代わりにER保持配列（配列番号:474）を用いて、ERでセルラーゼを保持させた。プラスチド標的化構築物は、上記に記載のFNR輸送ペプチドを含んでいた。トウモロコシ最適化セルラーゼの各々は、トウモロコシ種子の内乳での発現のためにコメのグルテリンプロモーターの後ろでクローニングした。上記で述べたように、追加の配列が、ER又は内乳へタンパク質を標的化するために付加された。ベクターの成分情報は表7に示されている。全ての発現カセットは、当分野で公知の組換えDNA技術を用いてタバコ、ダイズ及びトウモロコシを形質転換するために、バイナリーベクターでサブクローニングされた。
【０３２０】
本発明は、本発明の核酸（本発明の酵素をコードする核酸を含み、さらに前記酵素コード配列に相補的な配列を含む）を含む多様な植物発現系（ベクター、組換えウイルス、人工染色体などを含む）を、種々の特定植物（タバコ、トウモロコシ及び／又はダイズを含む）で使用するために提供し、本実施例はこれら実施態様のいくつかの製造について述べる。
【０３２１】
表7：トランスジェニックタバコ、トウモロコシ及びダイズでの生産のために用いられた植物発現ベクター
【表７−１】
2010516296.tif 000139
2010516296.tif 000140
2010516296.tif 000141
【実施例１０】
【０３２２】
本発明の酵素の特性決定
ある実施態様では、本発明はβ-グリコシダーゼ活性を有するポリペプチド、例えばβ-グリコシダーゼ活性を有する酵素を提供する。前記ポリペプチドは、単独で又は例えば“カクテル”若しくは混合物として併用して、多様な工業的用途で、例えばバイオマス変換（例えばバイオ燃料生産）のために用いることができる。本実施例では、本発明のいくつかの例示的ポリペプチド（例えば酵素）の選択した特性について特性が決定される。
【０３２３】
基質特異性及び酵素活性の特性
【表７−２】
2010516296.tif 000142
【０３２４】
表つづき
【表７−３】
2010516296.tif 000143
【０３２５】
表つづき
【表７−４】
2010516296.tif 000144
【０３２６】
表つづき
【表７−５】
2010516296.tif 000145
【０３２７】
表つづき
【表７−６】
2010516296.tif 000146
【０３２８】
表つづき
【表７−７】
2010516296.tif 000147
【０３２９】
表つづき
【表７−８】
2010516296.tif 000148
【０３３０】
表つづき
【表７−９】
2010516296.tif 000149
【０３３１】
表つづき
【表７−１０】
2010516296.tif 000150
【０３３２】
表つづき
【表７−１１】
2010516296.tif 000151
【０３３３】
表つづき
【表７−１２】
2010516296.tif 000152
【０３３４】
表つづき
【表７−１３】
2010516296.tif 000153
【０３３５】
表つづき
【表７−１４】
2010516296.tif 000154
【０３３６】
表つづき
【表７−１５】
2010516296.tif 000155
【実施例１１】
【０３３７】
トランスジェニック植物のタンパク質分析
本発明は、本発明の発現系（本発明のベクター、組換えウイルス、人工染色体などを含む）含むか、及び／又は本発明の核酸（本発明の酵素をコードする核酸を含み、さらに前記酵素コード配列に相補的な配列を含む）を含む、トランスジェニック植物（並びに細胞及び種子、並びにそれらトランスジェニック植物に由来する植物部分）を提供し、本実施例ではこれらの実施態様のいくつかの作製について述べる。
タンパク質抽出物は、約100mgの葉の組織、又は非トランスジェニック及びトランスジェニック植物由来のトウモロコシ並びにダイズの種子から作製した粉から入手した。葉の材料は、スチールの小球を含みドライアイス上で予備冷却した96ディープウェルブロックに入れた。GENO/GRINDERTM（SPEC/CERTIPREPTM, Metuchen, New Jersey）を用いて、サンプルを粉に挽き微細粉末にした。ほぼ10−20個の種子を一つに集め、KLECOTMグラインダー（Gracia Machine Company, Visalia, CA）を用いて粉に挽き微細粉末にすることにより粉末サンプルを調製した。サンプルは、250−500μLのウェスタン抽出緩衝液（WEB＝12.5mMホウ酸ナトリウム（pH10）；2%BME；及び1%SDS）又はアッセイ緩衝液のどちらかで、室温にて約30分抽出し、続いて13,000rpmで5分遠心した。
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、100μLのWEBサンプルをエッペンドルフチューブに移し、25μLの4XのBioRad LDS又は改変BIORADTM（Hercules, CA）ローディング緩衝液（2：1比の4XのBioRad LDS：BME）を添加することによって実施した。サンプルを10分、70℃で加熱し、直ちに氷上に5分置く。サンプルを短時間遠心し、氷上に戻す。サンプル抽出物（5−10μL）を、MOPS緩衝液を用い、BioRad 4−12%Bis/Trisタンパク質ゲル（18ウェル）で泳動した。
イムノブロット分析は、冷蔵したNUPAGETM転写緩衝液（Invitrogen）を用い、100ボルトにて30分、SDS-PAGEゲルをニトロセルロース膜に移すことによって実施した。ブロットに移された総タンパク質量はポンソー染色（Sigma）を用いて可視化した。ポンソー染色に続いて、3%のドライミルクを含むTBST洗浄緩衝液（30mMトリス塩酸（pH7.5）、100mMのNaCl及び0.05%トゥイーン20）中で膜を30分ブロッキングし、続いてTBSTで5分間3回洗浄し、さらに3%ドライミルクを含むTBST洗浄緩衝液中にて1μg/mLのポリクローナルヤギ又はウサギ一次抗体を加え、2時間から一晩前記ブロットをインキュベートした。一晩のインキュベーションに続いて、ブロットをTBST緩衝液で1回に5分、3回洗浄した。二次抗体（ウサギ-AP又はヤギ-AP）は1：8000（TBSTにて）に希釈し、ブロットに30分添加した。二次抗体中でのインキュベーションの後で、ブロットを再び1回に5分、3回洗浄した。Moss BCIP/NBTアルカリホスファターゼ基質を添加することにより、免疫反応バンドの可視化を実施した。BCIP/NBT基質中でのインキュベーションの後、ブロットを十分に水洗いし、風乾した。
活性分析に用いたサンプル抽出物のウェスタンブロット分析によって、免疫反応性タンパク質の蓄積と酵素活性との間の相関性（実施例12に記載）が明示された。ER標的化配列を有するCBH1（構築物15936）は、完全長酵素の予想サイズ（56.6kD）付近を泳動するバンドとして検出された。二番目に小さな約51kDのバンドもまたウェスタンブロットで検出された。葉の空胞に誘導されたCBH1（構築物15935）は51kDタンパク質としてもっぱら蓄積した。構築物15935及び15936で作製したトランスジェニック植物についてのウェスタンブロットデータは下記の表8に要約されている。
ウェスタンブロット分析を用いて、構築物15942及び構築物15944を用いて作製したトランスジェニックトウモロコシ植物をスクリーニングした。トウモロコシの葉で発現した、ER標的化配列を含む配列番号:360CBH1（構築物15944）は、完全長酵素の予想サイズ（57kD）付近を泳動するバンドとして検出された。51kD付近に集中する二番目の広いバンドもまた検出された。液胞標的化配列番号:360CBH1（構築物15942）は、57kDのマイナーバンドとともにほぼ51kDの広いバンドを示す。ウェスタンブロットデータは、構築物15942については下記の表9で、さらに構築物15944については下記の表10で要約されている。
【実施例１２】
【０３３８】
トランスジェニック事象後の酵素の抽出及び活性分析
ある実施態様では、本発明の単離若しくは組換え酵素又は他のポリペプチドが、本発明のトランスジェニック植物、細胞、種子及び／又は植物部分から採集される。本実施例では例示的な実施態様について述べる。
以下の緩衝液のうちの1つの5から10mLを用いて、トランスジェニック植物のほぼ100mgの新しい葉の組織又は種子の粉を抽出した：（A）100mMの酢酸ナトリウム、0.02%のトゥイーン、0.02%のアジ化ナトリウム（pH4.75）、1%のPVP及びCOMPLETETMプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Roche）；（B）100mM酢酸ナトリウム、1mg/mLのBSA、0.02%トゥイーン及び0.02%のアジ化ナトリウム（pH4.75）；又は（C）100mMの酢酸ナトリウム（pH5.3）、100mMのNaCl、1mg/mLゼラチン、1mMのEDTA、0.02%のトゥイーン-20TM、0.02%のアジ化ナトリウム。葉又は種子からタンパク質を抽出するまた別の緩衝液は当分野では周知である。サンプルをベンチトップローテーターに30分置き、続いて3000rpmで10分遠心した。新しい葉のサンプルの場合、抽出された総タンパク質量は、ピアス（Pierce）BCAプロトコル（製品文書で概略されたとおり）によって測定した。セルラーゼ活性アッセイは以下の基質の1つを用いて実施した：pNP-ラクトシド、メチルウンベリフェリル-ラクトシド（MUL）、カルボキシメチル-セルラーゼ、エンバクβグルカン、リン酸処理セルロース（PASC）、AVICEL、又は以前に公表されたプロトコルにしたがいセルラーゼ活性を測定するために用いられた他の市販の基質（例えば以下を参照されたい：Methods in Enzymology, Vol 160）。トランスジェニック植物について得られた酵素活性データは、下記の表8から10に概略されている。
【０３３９】
表8：タバコの液胞（構築物15935）及びER（構築物15936）に標的化された双子葉植物最適化配列番号:360を発現するトランスジェニックタバコにおけるセロビオヒドロラーゼI（CBH1）活性の概要。サンプルは緩衝液（A）で抽出され、CBH1活性は、基質としてメチルウンベリフェリル-ラクトシドによりアッセイされた。
2010516296.tif 000156
ND＝決定せず
【０３４０】
表9：トウモロコシの葉の液胞に標的化された単子葉植物最適化配列番号:360を発現するトランスジェニックトウモロコシ（構築物1942）におけるセロビオヒドロラーゼI（CBH1）活性の概要。サンプルは緩衝液（A）で抽出され、CBH1活性は、基質としてメチルウンベリフェリル-ラクトシドによりアッセイされた。
2010516296.tif 000157
【０３４１】
表10：トウモロコシの葉のERに標的化された単子葉植物に最適化された本発明の例示的配列番号:360を発現するトランスジェニックトウモロコシ（構築物15944）におけるセロビオヒドロラーゼI（CBH1）活性の概要。サンプルは緩衝液（A）で抽出され、CBH1活性は、基質としてメチルウンベリフェリル-ラクトシドによりアッセイされた。
2010516296.tif 000158
2010516296.tif 000159
ND＝決定せず
【実施例１３】
【０３４２】
結晶セルロースの結合及び加水分解アッセイ
ある実施態様では、本発明の単離、合成又は組換え酵素若しくは他のポリペプチドは、セルロース（例えば結晶セルロース）と結合する、及び／又は、セルロースの加水分解を触媒する。本実施例では、例示的実施態様及びアッセイについて述べる（前記アッセイは、あるポリペプチドが酵素活性（例えばヒドロラーゼ活性、例えばセルラーゼ活性）を有するか否かの決定に用いることができる）。
AVICELTM微晶質セルロース（MCC）結合アッセイ：約100mgの葉の組織を5mLのアッセイ緩衝液（A）で上記のように抽出した。抽出に続いて、約250μLのサンプルを25mgのAVICELTM MCCと0分及び60分インキュベートした。0タイムポイントサンプルは、抽出物を添加する前に氷上に置いたエッペンドルフチューブに添加し、直ちに処理した。サンプルは、ベンチトップヴォルテックス上で60分室温にてインキュベートした。インキュベーション後、サンプルをエッペンドルフ遠心機により13000rpmで5分遠心した。上清を注意深く除去し、AVICELTM MCCを氷冷水で3回洗浄した。最後の洗浄の後、80μLのウェスタン抽出緩衝液（WEB）及び25μLのBioRad 4Xローディング緩衝液をサンプルに添加した。サンプルをヴォルテックスミキサーで攪拌してから70度に10分置いた。AVICELTM MCCを13000rpmでペレットにし、上清を取り出し、上記に記載したようにウェスタンブロットによって分析した。
構築物15935（Nt22-16A、Nt22-19A）及び構築物15936（Nt23-11A、Nt23-23B、Nt23-30B）で誘導したトランスジェニック植物を、Avicel MCC結合アッセイで上記パラグラフに記載したように分析した。植物Nt22-16A、Nt23-11A及びNt23-23Bはウェスタンブロット分析で陽性であったが、植物Nt22-19A及びNt23-30BはAVICELTM MCC結合アッセイで陰性であった。このデータは上記の表8で要約されている。
AVICELTM MCC加水分解アッセイ：Klecoグラインダーを用いて、トランスジェニックな葉のサンプルを凍結乾燥してから粉に挽き微細粉末にした。粉にした約150mgの葉の材料を測りとり、4mLの緩衝液AでRTにて30分抽出した。サンプルを遠心し、上清を取り出した。葉の各抽出物の1mL、菌類発現配列番号:360若しくはトリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）CBH1（Megazyme International）酵素、又は非発現トランスジェニック抽出物に添加した菌類酵素を50mgのAvicel MCCに添加し、サンプルを37度のヴォルテックスにかけた。タンパク質濃度はBCA試薬（Pierce）を用いて測定した。100μLのデュープリケートサンプルを0、24、48及び72時間で取り出した。糖分析はHPLC分析により実施した。構築物15944（ERに誘導される例示的配列番号:360CBH1）で形質転換したトランスジェニックトウモロコシで得られたデータは下記の表11に示されている。
トランスジェニック植物由来のタンパク質抽出物は、総タンパク質含有量については等価であったが、前記データは、トランスジェニック植物における例示的配列番号:360の発現について相対的レベルは示していない。表11のデータは、植物発現セルラーゼがAVICELTM MCCアッセイ（セルラーゼと基質の結合及びその後のセルラーゼ活性を示す）において活性を有することを示している。
【０３４３】
表11：AVICELTM MCCからセロビオースの遊離
2010516296.tif 000160
Mega Tr＝市販CBH1、メガザイム（Megazyme）TrCBH1
【実施例１４】
【０３４４】
β-グルコシダーゼ活性アッセイ
ある実施態様では、本発明の単離、合成又は組換え酵素若しくは他のポリペプチドはβ-グルコシダーゼ活性を有する。本実施態様では、pNP-β-D-グルコピラノシド基質によりβ-グルコシダーゼ酵素の活性を測定するために設計した例示的アッセイについて述べる。この例示的アッセイは、あるポリペプチドがβ-グルコシダーゼ活性を有するか、さらに本発明の範囲内に包含されるか否かの決定に用いることができる。
酵素活性はU/mLで記載される。タンパク質濃度（mg/mL）が利用可能である場合、この価は酵素の比活性（U/mg）の計算に用いられよう。
ユニットの定義：活性1ユニットは、規定のアッセイ条件（例えばpH及び温度）下で1分当たり1μmoleのp-ニトロフェノールを遊離させるために必要な酵素の量と定義される。
プロトコル（例示的ポリペプチド配列番号:560が例として用いられる）：
1．透明な96ウェルプレートを用いる。反応成分の迅速な同時添加のために、さらにもっとも間隔の短いカイネティクスの読み取りを提供するために全てのサンプルを適切に配置する。全てのサンプルをデュープリケートで用いる。各プレートに標準曲線（デュープリケート）を加える。
2．標準曲線調製物：50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で10mMのp-NP溶液を希釈する。各希釈（0、0.0625、0.125、0.25、0.5及び1.0mM）につき少なくとも500μLを作成する。
3．サンプル調製物：試験されるべき各酵素サンプルについて、未希釈サンプルを先ずアッセイする。サンプルの希釈が必要な場合には、50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で連続希釈を作成する。各希釈につき少なくとも100μL調製する。
4．基質調製物：酵素反応で基質が限定されることを避けるために、pNP-β-D-グルコピラノシドの量は、アッセイされる各酵素について経験的に決定されるべきである。例えば、配列番号:560については、基質は、20mMの最終濃度で用いるべきである。最終反応体積は200μLであろう（工程9を参照されたい）。試験されるべき各酵素サンプル及び各希釈のために、150μLのリン酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH7.0）、及び40μLの100mM pNp-β-D-グルコピラノシド（最終濃度20mM）から成る190μLの溶液を調製する。例えば、2つの酵素サンプルで4つの異なる希釈をデュープリケートで試験する場合、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）3.0mL及び100mMのpNp-β-D-グルコピラノシド溶液0.8mLから成る溶液3.8mLを準備する。水浴中にて37℃で5分、溶液を前インキュベートし、前記を96ウェルプレートに分注する直前にピペッティング皿（basin）に配置する（工程6参照）。
5．標準曲線のローディング：水浴中にて37℃で5分、標準曲線希釈サンプルを前インキュベートする。前記を200μL/ウェルで透明な96ウェルプレートにデュープリケートでロードする。プレートをSPECTRAMAXTMトレーに置き、蓋を取る。
6．基質のローディング：工程4で準備した溶液をピペッティング皿に手早く移し、さらに工程4で準備した基質を190μL/ウェルで透明な96ウェルプレートにデュープリケートでロードする。プレートをSPECTRAMAXTMトレーに置き、蓋を取る。
7．カイネティクスの読み取り前の37℃平衡化：酵素サンプルを添加する前に、標準曲線及び基質を含む96ウェルプレートを37℃で1分インキュベートする。
8．SPECTRAMAXTMのセットアップ：37℃でのカイネティクスの読み取りのために準備する。以下のSPECTRAMAXTM設定を選択する：（1）吸収405nm（A405）；（2）タイミング：読み取りと読み取りの間の間隔を最小限にして（これは各プレートで読み取りを実施するウェル列（ストリップ）の数に左右されるであろう）、合計10分間の読み取りを行う：（3）オートミキシング及びブランキング：“最初の読み取りの前のオートミキシング”は“on”にし、“読み取りの間のオートミキシング”及び“読み取り前のブランキング”は“off”にする：（4）“自動較正1回”：この機能は“on”にする：（6）“自動読み取り”：この機能は“off”にする。標準曲線サンプルがカイネティクスの読み取りに加えられ、それらサンプルが同じ条件下で読み取られることを確認する。
9．酵素を添加しカイネティクスの読み取りを開始する。10μLの各酵素希釈（デュープリケート）をウェル（工程6で分注した190μLの溶液を含む）に手早く添加する。迅速な同時添加及びサンプルの混合のためにマルチチャンネルピペットを使用する。直ちにカイネティクスの読み取りを開始し、データをセーブする。VmaxはプログラムによってmU/分で計算されることを確認する。
【０３４５】
計算：
標準曲線
1．標準曲線用データを収集するために最初のカイネティクスの読み取りを用いる（標準曲線はまさに終末点測定である）。先ず初めにmM値をμmoleに変換する；例えば1.0mMのp-NPの200μL＝0.2μmoleである。標準物の各点のために、デュープリケートサンプルの平均及び標準偏差を計算し、平均RFU値からバックグラウンドを差し引く。最低限4つのデータ点が信頼できる標準曲線の作成に必要である。
2．バックグラウンドを差し引いた平均値を用いて、x軸がμmole、y軸がA405の分散プロットを作成する。
3．直線回帰を用いて、A405を存在するp-NPμmoleに相関させる直線関数を作成する。バックグラウンドが差し引かれているのでｙ切片を0に近づける。R値が0.998未満の場合は、標準曲線で最高の濃度を表すデータ点を除くように試みる。それにもかかわらず、最低限4つのデータ点は標準曲線に含まれねばならない。MS EXCELTMでは、学術表記法の直線関数を小数点2位でフォーマットする。標準曲線の例は図9Aに示されている。
酵素活性
1．β-グルコシダーゼ活性のそれぞれの測定のために、標準曲線の感受性範囲にもっとも一致する希釈を用いる。この希釈の範囲内で、カイネティクスの直線範囲内に入るデータ点のみを用いて、Vmax（VmaxはSPECTRAMAXTMソフトで自動的に（mU/分として）計算される）を得る。平均及び標準偏差を各デュープリケートペアについて計算する。標準偏差は5%未満であるべきである。続いて平均mU/分を1000で割ってU/分を得る。
2．直線関数を用いて、Vmax U/分の値をμmole/分で表したβ-グルコシダーゼ活性単位（標準曲線の勾配で割ったU/分）に変換し、続いて前記値を各ウェルの反応に添加した酵素の体積（0.01mL）で割り、最後に酵素の希釈係数を乗じて、μmole/分値をU/mL値に変換する。
3．比活性（U/mgタンパク質）を得るために、U/mL値をタンパク質濃度（mg/mL）で割る。
4．図9Bは、標準曲線の勾配が25.90と仮定して、EXCELTMでどのように計算を設定することができるかを示している（アッセイでは配列番号:560及び20mMのpNP-β-D-グルコピラノシドが用いられる）。
試薬：
p-NP標準物
p-ニトロフェノール（4-ニトロフェノール）（Sigma N7660、10mM溶液）：4℃で遮光して保存する。標準曲線用の希釈は、アッセイで用いられる緩衝液で作成する（例えば50mMのリン酸ナトリウム（pH7.0））。
pNP-β-D-グルコピラノシド基質（pNP-G）
pNP-β-D-グルコピラノシド（FW 301.3/mol、Sigma N-7006）：100mMのストック溶液10mLを作成するために、0.3013gの粉末を15mLの円錐遠心管に量り入れ、前記粉末を5.0mLのDMSOに溶解させる。最終体積を10mLに蒸留水で調節する。前記遠心管を数分間ヴォルテックスミキサーで攪拌して溶液が完全に混合したことを担保する。溶液は透明であるはずである。濁っている場合は、熱い水浴中で加熱し、さらに全ての物質が溶解するまで穏やかにヴォルテックスミキサーで攪拌する。小分けし、遮光して-20℃で保存する。
【０３４６】
プロトコル（例示的ポリペプチド配列番号:564を例として用いる）：
本実施例のアッセイは、pH5.0及び37℃のアッセイ条件下でpNP-β-D-グルコピラノシド基質を用い、β-グルコシダーゼ活性を決定することを目的とする。酵素活性はU/mLで記載される。タンパク質濃度（mg/mL）が利用可能な場合、この値を用いて酵素比活性（U/mg）を計算できよう。
1．透明な96ウェルプレートを用い、さらに反応成分の迅速な同時添加のために全てのサンプルの適切な配置、及びカイネティクスの読み取りの間隔を最短にすることを図る。全てのサンプルをデュープリケートで用いる。同様に標準曲線も各プレートにデュープリケートで加える。
2．標準曲線調製物：50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）で10mMのp-NP溶液を希釈する。以下の希釈の各々について少なくとも500μLを作成する：5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625及び0.078125mM。注記：1.0mM＝1.0μmole/mL。
3．サンプル調製物：試験されるべき各酵素サンプルについて、未希釈サンプルを先ずアッセイする。サンプルの希釈が必要な場合には、50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）で連続希釈を作成する。例えば精製した配列番号:564は100倍に希釈するべきである。各酵素希釈につき少なくとも100μL調製する。50μLのサンプルを各反応で用いる。
4．基質調製物：100mMのストック濃度を使用に利用できる。酵素反応で基質が限定されることを避けるために、pNP-β-D-グルコピラノシドの量は、アッセイされる各酵素について経験的に決定されるべきである。例えば、配列番号:564については、20mMの基質を用いてアッセイされるべきである。アッセイされる各サンプルの最終反応体積は1mLであろう。例えば以下がサンプルのために要求される：（i）100mMの基質200μL；（ii）750μLのリン酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH5.0）；（iii）50μLの希釈酵素
5．反応停止プレート調製物：アッセイはpH5.0で実施されるので、適切に吸収を読み取るために反応停止工程が必要である。400mMのNa2CO3（pH10.0）の200μLを各ウェルに含む透明な96ウェルプレートを準備する。各アッセイプレートの最初の2つのカラムにデュープリケートで標準物希釈を各々50μL添加する。
6．前インキュベーション：1.5mLのエッペンドルフチューブに、750μLの緩衝液及び50μLの酵素を添加し、37℃で5分インキュベートする。別個に基質もまた37℃でインキュベートする。
7．反応の開始：タイマーを使用し、以下のタイムポイントでサンプルの適量を採取する：0、2、4、8、18、28、38及び48分。反応を開始するために、緩衝液及び酵素を含む反応チューブに200μLの基質を添加する。完全に混合し、最初のタイムポイント（t＝0分）のために直ちに50μL量を採取し、反応停止プレートにデュープリケートで添加する。各タイムポイントで同じようにする。タイムポイントを採取したとき、直ちに反応チューブを37℃に戻す。全てのタイムポイントについて反応停止プレートの色の変化を観察する。
8．SPECTRAMAXTMのセットアップ：37℃での読み取りのために準備する。以下のSPECTRAMAXTM設定を選択する：（1）吸収405nm（A405）；（2）ウェル列（ストリップ）：サンプルをロードしたウェル列（ストリップ）のみを読み取るように選択する。読み取りが完了したらデータをセーブする。
【０３４７】
計算：
標準曲線
1．標準曲線の計算用データを収集するために終末点の読みを用いる。先ず初めに0.05（反応停止プレートに添加した体積）を掛けることによって、p-NP希釈（mM）をμmoleのp-NPに変換する；例えば1.0mMのp-NPの0.05mL＝0.05μmoleである。各標準物希釈について、デュープリケートサンプルの平均及び標準偏差を計算し、平均吸収値からバックグラウンドを差し引く。最低限4つのデータ点が信頼できる標準曲線の作成に必要である。
2．バックグラウンドを差し引いた平均値を用いて、x軸がμmoleのp-NP、y軸がA405の分散プロットを作成する。
3．直線回帰傾向線（linear regression trend line）を用いて、A405を存在するp-NPのμmoleに相関させる直線関数を作成する。バックグラウンドが差し引かれているのでｙ切片を0に近づける。R値が0.998未満の場合は、標準曲線で最高の濃度を表すデータ点を除くように試みる。それにもかかわらず、最低限4つデータ点は標準曲線に含まれねばならない。MS Excelでは、学術表記法の直線関数は小数点2位でフォーマットする。標準曲線の例は図10Aに示されている。
酵素比活性の計算
β-グルコシダーゼ活性の測定のために、標準曲線の感受性範囲ともっとも一致する希釈を用いる。各酵素の比活性計算用データを収集するために終末点の読みを用いる。
1．各酵素希釈のために、各タイムポイントで、デュープリケートサンプルの平均及び標準偏差を計算し、平均吸収値からバックグラウンド（タイムポイント0分における吸収）を差し引く。標準偏差は5%未満であるべきである。1.00を超える吸収は、吸収データの信頼できる範囲に存在しないので計算に用いるべきではない。繰り返せば、最低限4つのデータ点が信頼できる反応速度曲線の作成に必要である。
2．バックグラウンドを差し引いた平均値を用いて、x軸が時間（分）、y軸がA405の分散プロットを作成する。
3．直線回帰傾向線を用いて、48分に及ぶタイムコースにおけるA405に関する直線関数を作成する。バックグラウンドが差し引かれているのでｙ切片を0に近づける。R値が0.998未満の場合は、範囲外の可能性があるデータ点を除くよう試みる。
4．続いて下記に示すように表を作成する：
a．勾配［Δ吸収/分］−反応速度
b．酵素の最終希釈−最初の酵素の希釈*（100）
c．反応に添加した酵素の体積−0.05mL
d．勾配比［μmole/分］−（反応速度の勾配/標準曲線の勾配）
e．酵素活性［U/mL］−（勾配比/反応時の酵素体積）*希釈因子
f．タンパク質濃度［mg/mL］−A280スキャンの値
g．比活性［U/mg］−（酵素活性/タンパク質濃度）
5．図10Bは、標準曲線の勾配が256.91と仮定して、EXCELTMでどのように計算を設定することができるかを示している（アッセイでは配列番号:564−100x及び20mMのpNP-β-D-グルコピラノシドが用いられる）。
−標準曲線及び終末点吸収は、標準物とサンプル間の感度が一致するように、同じ読み取りでSpectraMaxにより一緒に測定するべきである。
−直線状の吸収を得るために標的範囲を決定する。常に新しいp-NP標準物の希釈を作成する。
−標準曲線及びサンプルの測定のために同じ緩衝液（pH5.0）を用いる。p-NPは温度及びpHの変化に非常に鋭敏である。
試薬：
p-NP標準物
p-ニトロフェノール（4-ニトロフェノール）（Sigma N7660、10mM溶液）：4℃で遮光して保存する。標準曲線用の希釈は、アッセイで用いられる緩衝液で作成する（例えば50mMのリン酸ナトリウム（pH5.0））。
pNP-β-D-グルコピラノシド基質（pNP-G）
pNP-β-D-グルコピラノシド（FW 301.3/mol、Sigma N-7006）：100mMのストック溶液10mLを作成するために、0.3013gの粉末を15mLの円錐遠心管に量り入れ、前記粉末を5.0mLのDMSOに溶解させる。最終体積を10mLに蒸留水で調節する。前記遠心管を数分間ヴォルテックスミキサーで攪拌して溶液が完全に混合したことを担保する。溶液は透明であるはずである。濁っている場合は、熱い水浴中で加熱し、さらに全ての物質が溶解するまで穏やかにヴォルテックスミキサーで攪拌する。小分けし、遮光して-20℃で保存する。
【０３４８】
β-グルコシダーゼの評価
−67のベータ-グルコシダーゼの特性を部分的に決定し、本発明のこれら酵素のうち36を以下の基準にしたがいさらに評価した：（1）セロビオース及び蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-ベータ-D-グルコピラノシド（4-MU-GP）に対するpH5及び7並びにT＝37−90Cにおける活性；（2）異種宿主での発現；（3）T＝60−80C、pH5での残留活性；及び（4）生成物阻害のレベル。以下を含む、本発明の8つのベータ-グルコシダーゼを多数の選別基準を基にして認定した：配列番号:556、配列番号:566、配列番号:530、配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560、配列番号:586及び配列番号:558。
−本発明のこれらベータ-グルコシダーゼのHis-タグ型を作製し、大腸菌でバッチ発酵により生成した。タンパク質の精製は、本発明の5つの例示的酵素について完了させた。pNP-ベータ-D-グルコピラノシド基質（pNP-G）を用いる、吸収基準活性アッセイを開発し、本発明の例示的酵素の比活性の決定に用いた。メガザイムI A.ニゲルベータ-グルコシダーゼを全ての実験で基準酵素として用いた。いくつかの酵素は、選択アッセイ条件下で、市販の基準酵素よりも極めて高い比活性を示した。
−マルチ酵素カクテルで使用するためにもっとも適切なベータ-グルコシダーゼの選別を完成させるために、高い比活性を有する本発明のベータ-グルコシダーゼについて生成物阻害及びT＝60−80Cでの残留活性を決定することができる。
ベータ-グルコシダーゼの特性の決定：
概論：本実験の主要な目的は以下のとおりである：（1）MS1基準を満たすように設計される、4酵素カクテルで使用するβ-グルコシダーゼの同定；（2）コンビナトリアルアッセイで使用することができるいくつかの酵素の同定。
67のベータ-グルコシダーゼの特性を部分的に決定した。これら酵素のうち36を以下の基準にしたがいさらに評価した：（1）セロビオース及び蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-ベータ-D-グルコピラノシド（4-MU-GP）に対するpH5及び7並びにT＝37−90Cにおける活性；（2）異種宿主での発現；（3）T＝60−80C、pH5での残留活性；及び（4）生成物阻害のレベル。以下の本発明の8つのベータ-グルコシダーゼを多数の選別基準を基にして認定した：配列番号:556、配列番号:566、配列番号:530、配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560、配列番号:586及び配列番号:558。
タンパク質の精製を強化するために、全ての本発明の例示的ベータ-グルコシダーゼ（配列番号:556、配列番号:566、配列番号:530、配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560、配列番号:586及び配列番号:558）のHis-タグ型を作製した。発現を振盪フラスコで判定し、最適誘導条件を発酵プロトコルに移した。前記例示的酵素はバッチ発酵（10Lスケール）で製造し、材料を回収しタンパク質をFPLC法によって精製した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ、ゲルデンシトメトリー及びA280吸収を含むいくつかの方法によって決定した。pNP-ベータ-D-グルコピラノシド基質（pNP-G）を用いる、吸収基準活性アッセイを開発した。このアッセイを用いて本発明のベータ-グルコシダーゼの比活性を決定した。全ての実験で市販のA.ニゲルベータ-グルコシダーゼを基準酵素として用いた。上記に概略した目的にもっともよく適合するベータ-グルコシダーゼの選択を達成するために、高い比活性を有する本発明の酵素の精製タンパク質調製物を用いて、生成物阻害及びT＝60−80Cの残留活性が決定されるであろう。
【０３４９】
方法／結果：
（1）タンパク質発現、製造、及び精製
本発明の全ての酵素のHis-タグ型を位置特異的変異導入によって作製した（前記変異は原型サブクローン中のpSE420のORFとC'-末端の6X-Hisタグとの間の停止コドンを除去した）。
配列番号:558を除く全ての酵素を大腸菌宿主（GAL631及びRosetta Gami株）で発現させ、10Lのバッチ発酵によって製造した。これらのタンパク質のいくつかは、可溶性及び不溶性分画の両方で発現され、徹底的な問題対策の後で上清（S）及び細胞ペレット（P）の両方から回収された。“S”及び“P”という呼称は、タンパク質の精製及び活性アッセイが提示される以下のセクションで対応するものと並んで用いられるであろう。本発明の全ての酵素の発現はまた、ピキア・パストリス（Picia pastoris）x33宿主（ベクターpPICZα及びpGAPα）でも判定した。全てのサブクローンが可溶性タンパク質を産生したが、発現及び活性があまりに低く、酵素の特性決定にピキア産生材料は使用できなかった。配列番号:558は最初ピキア・パストリスx33で産生され、良好な発現（純度35%）を示したが、高レベルの生成物阻害もまた示した。配列番号:558のHis-タグ型はピキアではほとんど発現を示さず、それ以上特性を調べなかった。
FPLCタンパク質精製は、大腸菌で産生された本発明の7酵素のうち5つについて達成された（配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560、配列番号:530及び配列番号:566）。His-タグ付加酵素構築物を用い、それぞれの凍結乾燥粉末1グラムを10.0mLの緩衝液A（20mMトリス塩酸、500mMのNaCl、pH8.0）に再懸濁し、同じ緩衝液に一晩透析した。透析の後、各サンプルの10mLをHISTRAPTMの5mLカラムにロードし、HISTRAPTMの5mLプロトコルを用いて溶出させた。HISTRAPTM法は、5カラム体積の緩衝液Aによる未結合タンパク質の洗浄、及び緩衝液B（20mMトリス塩酸、500mMのNaCl、1Mイミダゾール、pH8.0）のリニアグラディエントを用いる20カラム体積に及ぶ結合タンパク質の溶出を必要とする。前記工程の間中2mL/分の流速を維持し、1mLの溶出分画を96深底ウェルプレートに採集した。FPLCデータを基にして最適分画（それらはクロマト図のピーク下に存在する）を選択し、酵素活性及び発現／純度を試験した。活性は4-MU-GP蛍光アッセイを用いて試験した。選択分画はまたPAGEゲルで泳動し、純度を試験した。
発酵回収及びタンパク質精製の努力の要旨は表1に示されている。本発明のこれらの例示的酵素のいずれも十分量（“全凍結乾燥粉末”並びに“粉末1g及び全ロット中の精製タンパク質の予想mg”）で生成され、対応する酵素の詳細な生物学的性状決定を可能にした。
表1は（図11に図示される）、本発明のベータ-グルコシダーゼ酵素についての産生及び精製の要旨から得られたデータを示す。
【０３５０】
（2）タンパク質濃度の決定
三方法（ブラッドフォードアッセイ、ゲルデンシトメトリー及びA280nm吸収）を用いて、精製タンパク質の濃度を決定した。活性の性状を決定する前に、全てのFPLC精製タンパク質を50mMのNaPi（pH8.0）で透析した。結果は図11の表で要約されている。
ブラッドフォード比色アッセイは595nmでタンパク質の吸収を測定する。精製タンパク質サンプルをアッセイの色素試薬に添加し、色の変化を観察し、595nmの吸収を読み取った。BSAタンパク質標準物を0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、及び0.5mg/mLで用いて未知濃度を決定した。酵素のタンパク質濃度は、BSA標準物を用いて作成した直線状曲線に“もっともよく一致する線”から外挿によって得られる。
ゲルデンシトメトリーよるタンパク質の純度の判定及び濃度の決定のために、4−12％のトリス-グリシンPAGEゲル（Invitrogen）のレーン当たり5μLの酵素をロードし、電気泳動を2XのMES緩衝液にて200V、50分実施した。各サンプルのロードされたタンパク質量は下記に記載されている。BSAタンパク質標準物（Pierce）が、各レーン当たり0.25、0.50、1.00、1.50及び2.00μgの全量で全てのゲルにロードされた。ゲルをALPHAIMAGE(商標)ソフトを用いてスキャンし、タンパク質濃度をBSA標準物曲線を基準にして決定した。
図12A：FLPC法によって上清及びペレット細胞分画から精製された配列番号:548、配列番号:564及び配列番号:560のPAGE電気泳動：
レーン1−シーブルー(商標)マーカープラス2ラダー（Invitrogen）
レーン2−配列番号:548（P）、0.07μg
レーン3−配列番号:548（S）、0.12μg
レーン4−配列番号:564（P）、0.23μg
レーン5−配列番号:564（S）、0.41μg
レーン6−配列番号:560（P）、0.54μg
レーン7−配列番号:560（S）、0.37μg
レーン8−BSA標準物、2.0μg
レーン9−BSA標準物、1.5μg
レーン10−BSA標準物、1.0μg
レーン11−BSA標準物、0.50μg
レーン12−BSA標準物、0.25μg
図12B：FLPC法によって上清及びペレット細胞分画から精製された配列番号:530及び配列番号:566のPAGE電気泳動：
レーン1−シーブルー(商標)マーカープラス2ラダー（Invitrogen）
レーン2−配列番号:530（P）、0.18μg
レーン3−配列番号:530（S）、0.12μg
レーン4−N/A
レーン5−配列番号:566（S）、0.07μg
レーン6−N/A
レーン7−ブランク
レーン8−BSA標準物、2.00μg
レーン9−BSA標準物、1.50μg
レーン10−BSA標準物、1.00μg
レーン11−BSA標準物、0.50μg
レーン12−BSA標準物、0.25μg
タンパク質濃度の決定にA280吸収を用いるときは、図11に図示したとおり、表1に示した材料の1mLを石英のキュベットに入れ、A200−A320nmで5nm幅によりスキャンした。A280値及びモル吸光係数（εm）（前記はベクターNTiソフトを用いて個々のアミノ酸配列を基に決定された）を用いてタンパク質濃度を計算した（C＝mg/mL；C＝（A280 x MW／(εm)）；MW＝タンパク質の分子量）。A260／A280比を計算し、タンパク質純度の概算に用いた（約0.5：0.7の比は高度に純粋なタンパク質と予想される）。表1（図11）に示す*サンプルは濃縮された。
図13に図示する表2は、3つの異なる方法によって決定した精製ベータ-グルコシダーゼのタンパク質濃度を示す。
上記に記載した3つのそれぞれ別個の方法を用いて入手した値（mg/mL）はサンプルの大半について一致し、特にゲルデンシトメトリー及びA280吸収によって決定した数字を比較したとき一致した。これら3つの方法は、タンパク質濃度の概算に異なるパラメーターを用い、さらにブラッドフォードアッセイによる概算は過大評価の傾向があるので、A280吸収によって決定されたmg/mL値がタンパク質の比活性の計算に用いられる。
【０３５１】
（3）ベータ-グルコシダーゼ比活性の決定
pNP-ベータ-D-グルコピラノシド基質（pNP-G）を用いる吸収に基づく活性アッセイを開発し、本発明の酵素の比活性の決定に用いた。1ユニットの活性は、規定のアッセイ条件下で毎分1μmoleのp-ニトロフェノールを遊離させるために要求される酵素の量と定義される。酵素活性はU/mLで表される。タンパク質濃度（mg/mL）が判明しているとき、酵素比活性（U/mg）はこれらの値を用いて決定できよう。
完全な活性試験のために、精製タンパク質調製物を連続的態様で希釈し、20mMのpNP-GとpH7、T＝37℃で10分間インキュベートした。市販のA.ニゲルβ-グルコシダーゼを基準酵素として用いた。10mMのp-ニトロフェノール（p-NP）を用い50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH７）で0.0625、0.125、0.25、0.5及び1μmole/mLに希釈し標準曲線を作成した。検出アッセイでp-NP標準曲線の直線範囲内に留まる吸収を得るために酵素ローディングを調節した。酵素活性を決定しU/mLで表した。A280吸収によって決定したタンパク質濃度を用い、比活性を計算した。結果の要旨は図14に図示される表3に示されている。選択したアッセイ条件下で、今日までに性状決定した5つの酵素のうち4つが、市販の基準酵素よりも高い比活性を示した（表3/図14）。配列番号:548及び配列番号:560は、基準酵素と比較して約4−5倍高い比活性を示した。配列番号:564及び配列番号:530は、基準酵素よりも約15倍性能が優れていた。酵素を可溶性又は不溶性細胞分画から精製したとき、顕著な相違は観察されなかった。本発明のベータ-グルコシダーゼは広いpH範囲にわたって活性を示すと仮定し、pNP-Gアッセイは、実際的な理由のためにpH7で実施した。しかしながら、A.ニゲルのベータ-グルコシダーゼはより低いpHで最適活性を示すので、比活性比較はpH5で繰り返されるであろう。表1に示したサンプル*は濃縮された。
表3又は図14は、本発明の精製ベータ-グルコシダーゼの比活性を示している。
【０３５２】
概要
本発明の5つのベータ-グルコシダーゼをバッチ発酵で製造し、タンパク質をFPLC法で精製した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ、ゲルデンシトメトリー及びA280吸収を含むいくつかの方法によって決定した。本発明の5つのベータ-グルコシダーゼの比活性を決定し、市販のA.ニゲルベータ-グルコシダーゼ調製物（Megazymeより購入し基準酵素として用いた）と比較した。
今日までに性状決定した5つの酵素のうち4つが、選択したアッセイ条件下で市販の基準酵素よりも優れた性能を示した（表3）。これらの酵素のうち2つ（配列番号:564及び配列番号:530）は基準酵素よりも約15倍高い比活性を示した。配列番号:548及び配列番号:560は、基準酵素と比較したとき約4−5倍高い比活性を示した。配列番号:564、配列番号:548及び配列番号:530の非Hisタグ型（配列番号:564、配列番号:548及び配列番号:530）は、半精製タンパク質をセロビオース基質により評価したとき、それぞれ500、400及び200mMのグルコースの存在下で生成物阻害を示した。
タンパク質濃度の正確な決定はきわめて骨が折れることが判明した。しかしながら、本実験で用いた3つの別個の方法により得られた値（mg/mL）は、サンプルの大半について、特にゲルデンシトメトリー及びA280吸収によって決定した数字を比較したとき一致した（表2）。これら3つの方法は、タンパク質濃度の概算に異なるパラメーターを用い、さらにブラッドフォードアッセイによる概算は過大評価の傾向があるので、A280吸収によって決定されたmg/mL値をタンパク質の比活性の計算に用いた。
【０３５３】
本発明のベータ-グルコシダーゼの更なる特性決定
本実施例で述べる実験の主要な目的は以下である：（1）前処理サトウキビバガスのセルロース成分を効率的に分解するために設計されるマルチ酵素カクテルで使用される本発明の例示的β-グルコシダーゼ酵素の同定；（2）ハイスループットコンビナトリアルアッセイで使用することができる本発明のいくつかの酵素の同定。
67のベータ-グルコシダーゼの特性を部分的に決定し、これら酵素のうち36を以下の基準にしたがいさらに評価した：（1）セロビオース及び蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-ベータ-D-グルコピラノシド（4-MU-GP）に対するpH5及び7並びにT＝37−90Cにおける活性；（2）異種宿主での発現；（3）T＝60−80C、pH5での残留活性；及び（4）グルコースによる生成物阻害のレベル。以下の本発明の8つの酵素を多数の選別基準により認定した：本発明の例示的酵素、配列番号:556、配列番号:566、配列番号:530、配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560、配列番号:586及び配列番号:558。
タンパク質の精製を強化するために、本発明のこの8つの例示的酵素のHis-タグ型を作製し、大腸菌のバッチ発酵（10Lスケール）で製造した。タンパク質精製は、本発明の8つの例示的酵素のうち5つ（配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560、配列番号:566及び配列番号:530）について連続して達成し、pH７における比活性を吸収基準活性アッセイ及びpNP-ベータ-D-グルコピラノシド基質を用いて決定した。市販のA.ニゲルベータ-グルコシダーゼを基準酵素として用いた。pH7で市販の基準酵素より顕著に高い比活性を示す4つの酵素を認定した（本発明の例示的酵素、配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560及び配列番号:530）。
また別に生化学的性状決定を本発明の5つの例示的酵素（ベータ-グルコシダーゼ）に関して実施し、マルチ酵素カクテル及び高処理コンビナトリアルアッセイでの使用に適した最終的候補を選択した。pH5での比活性、グルコース存在下（0から2M）における生成物阻害、60℃での残留活性、及びpHプロフィル（pH4から8での比活性）を、ここに記載するように決定した。
【０３５４】
方法／結果：
（1）pH5でのベータ-グルコシダーゼ比活性の決定
pNP-ベータ-D-グルコピラノシド基質（pNP-G）を用いる吸収基準活性アッセイを開発し、本発明の例示的酵素の比活性の決定に用いた。1ユニットの活性は、規定のアッセイ条件下で毎分1μmoleのp-ニトロフェノールを遊離させるために要求される酵素の量と定義される。酵素活性はU/mLで表される。タンパク質濃度（mg/mL）が判明しているとき、酵素比活性（U/mg）はこれらの値を用いて決定できよう。
完全な活性試験のために、精製タンパク質調製物を50mMのリン酸ナトリム緩衝液（pH5）で連続的態様にて希釈し、20mMのpNP-GとT＝37℃で48分間インキュベートした（総反応体積1mL）。50μLのアリコットを0、2、4、8、18、28、38及び48分のタイムポイントで採取し、各ウェルに200μLの400mM Na2CO3（pH10）を含む、96ウェルの反応停止プレートに添加した。市販のA.ニゲルβ-グルコシダーゼを基準酵素として用いた。10mMのp-ニトロフェノール（p-NP）を用い、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH5）で0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5及び1.0μmole/mLに希釈して標準曲線を作成した。吸収を405nmで測定した（終末点の読み取り）。検出アッセイでp-NP標準曲線の直線範囲内に留まる吸収を得るために酵素ローディングを調節した。酵素活性を決定しU/mLで表した。A280吸収によって決定したタンパク質濃度を用い、比活性を計算した。結果は表1に要約され、図15に図示されている。
本発明の5つの選択酵素のうち2つ（配列番号:564及び配列番号:530）が、A.ニゲルと比較して高い比活性をpH5で示した。本発明の他の3つの例示的酵素は、基準酵素と比較して低い比活性をpH5で示した（表1／図15）。
表1（図15に図示）は、本発明の例示的ベータ-グルコシダーゼの比活性を示す。
（2）グルコースの存在下における生成物阻害
本実験の目的は、種々の濃度のグルコースの存在下における生成物阻害レベル及び酵素活性について本発明のベータ-グルコシダーゼを評価することであった。グルコースの用量は0から300mM（“低用量”）及び0から2M（“高用量”）で、p-NPG基質に対する比活性を先のセクションに記載したように決定した（37℃及びpH5で48分の反応）。グルコース濃度は、プロセスの前提（20%固体の加水分解）及び半精製酵素で実施した生成物阻害実験で得られた先の結果を基に選択した。各酵素について、グルコースの非存在下での比活性を100%と称した。
本発明の5つの例示的酵素の全てが本実験で調べた全てのグルコース濃度の存在下においてpH5で活性を維持し、性能は基準酵素のA.ニゲルより顕著に優れていた。20%の固体のバガス（約50%のセルロース含有量）及び50%の酵素変換と仮定した商業的プロセスでは、約280mMのグルコース（50g/L）が1kgの出発材料から生成されるであろう（本実験の“低用量”と等価である）。この実験で試験した本発明の5つの例示的酵素の全てが、市販の基準酵素によって維持された25%未満の活性と比較して、300mMのグルコースの存在下で50%以上の活性を維持した。同様な傾向が、より高いグルコース濃度の存在下で観察された。例えば1M以上のグルコースの蓄積は、50%以上の固体で稼動させるプロセス（実際には達成は非常に困難であろう）で予想される。しかしながら、そのような過酷な条件下ですら、本発明の5つの例示的酵素の全てが20%以上の活性を維持し、一方、市販の基準酵素は5%未満の活性に留まった。
グルコースの存在下における配列番号:560及び配列番号:566の比活性の増加は多くの実験で繰り返し観察された。この現象については理解されていないが、現時点では更なる究明を行わない。
【０３５５】
（3）60℃における残留ベータ-グルコシダーゼ活性
本発明の4つの例示的ベータ-グルコシダーゼ（配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560及び配列番号:530）及び市販のA.ニゲルベータ-グルコシダーゼをpH5で60℃にて0−4時間インキュベートした（1mLの反応体積、300rpmの攪拌）。1時間毎にアリコットを取り出し、本報告のセクション（1）で述べたようにp-NPGで残留酵素活性についてアッセイした。各酵素について、0時間の比活性を100%とした。
4つの試験酵素のうち3つ（配列番号:548、配列番号:564及び配列番号:530）が、長時間（2時間以上）60℃に暴露した後で顕著な活性の低下を示した。これらの酵素は60℃で4時間後に50%以上の活性を失い、一方、市販の基準酵素は約70%の活性を維持した。この発見は、セロビオース及び蛍光基質に対するアッセイで、粗タンパク質調製物（凍結乾燥させた細菌溶解物）により得られた以前の結果と矛盾する。粗酵素としてアッセイしたとき（問題のタンパク質は総タンパク質の10%以下で存在する）、4酵素はいずれも60℃4時間後に90%を超える活性を維持した。残留宿主タンパク質が上昇温度で何らかの安定化作用を提供した可能性がある。しかしながら、この結果は、意味のある酵素の特性決定を実施するために精製タンパク質調製物を得ることの必要性を力説している。
（4）例示的ベータ-グルコシダーゼのpHプロフィルの決定
本発明の5つの例示的酵素（配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560、配列番号:566及び配列番号:530のベータ-グルコシダーゼ）及び市販のA.ニゲルベータ-グルコシダーゼの比活性を、pH4、5、6、7及び8にてp-NPG基質で決定した。50mMのリン酸ナトリウム緩衝液をpH4及び5に調節した点を除き、pH4及び5で実施されるアッセイは上記で述べたように実行した。pH6、7及び8で実施されるアッセイは上記のように実行した。簡単に記せば、精製タンパク質調製物を連続的態様で希釈し、20mMのpNP-Gと一緒にpH6、7及び8で10分間、T＝37℃にてインキュベートした。市販のA.ニゲルベータ-グルコシダーゼを基準酵素として用いた。50mMのリン酸ナトリウム（pH6、7及び8）で10mMのp-ニトロフェノール（p-NP）を0.0625、0.125、0.25、0.5及び1μmole/mLに希釈し標準曲線を作成した。検出アッセイでp-NP標準曲線の直線範囲内に留まる吸収を得るために酵素ローディングを調節した。酵素活性を決定しU/mLで表した。A280吸収によって決定したタンパク質濃度を用い、比活性（U/mg）を計算した。pH4−8の範囲にわたって測定した比活性は下記の表2に要約されている。
pH4−8の範囲にわたって維持された比活性を基準にすれば、本発明の例示的な被検ベータ-グルコシダーゼのいずれも基準酵素より性能が優れていた。配列番号:564及び配列番号:530は強いpH5至適（下記表2）及び狭いpHプロフィルを示す（pH6で14−18%の比活性を維持し、pH7では11%の比活性を維持した）。基準酵素は強いpH4−5至適を示し、pH6では5%の比活性及びpH7では1%の比活性しか示さない。配列番号:548、配列番号:560及び配列番号:566は、配列番号:564及び配列番号:530よりも基準酵素により類似するpH4−5プロフィルを示す。
【０３５６】
表2：pH4−8におけるベータ-グルコシダーゼ及び基準酵素の比活性
2010516296.tif 000161
【０３５７】
概要：
いくつかの実施態様及び適用でマルチ酵素カクテルとしての使用に適した本発明のベータ-グルコシダーゼの選択を実施した。本発明の5つの例示的酵素を選択し、pH5におけるそれらの比活性、グルコースの存在下（0−2M）における生成物阻害、60℃での残留活性、及びpHプロフィル（pH4−8での比活性）を決定するためにさらに特性を調べた。
本発明の選択酵素は、基準酵素（MegazymeのA.ニゲルβ-グルコシダーゼ）よりも、考慮されたすべてのパラメーターで顕著に優れていた（ただし高温に長く暴露した後（60℃で4時間）の残留活性を除く）。これらの酵素はpH5で高い比活性を示し、グルコースによる生成物阻害はほとんど示さない。本発明の例示的選択酵素は広いpH範囲にわたって活性を維持し、多様な適用で用いることができよう。いくつかのベータ-グルコシダーゼの性状決定の要旨は下記の表3に示されている。
【０３５８】
表3：性状決定の要旨
2010516296.tif 000162
SA：比活性；表1及び2に示す数字は小数第一位以下を四捨五入。
【０３５９】
選択したベータ-グルコシダーゼの試験のまとめ
2010516296.tif 000163
【実施例１５】
【０３６０】
本発明のベータ-グルコシダーゼの特性決定
本実験の主要な目的は、本発明の例示的β-グルコシダーゼの特性を決定して、4-酵素カクテルに混合することができる最適な酵素を同定することであった。より高い温度での酵素活性及び残留安定性、良好な比活性、及び低い生成物阻害又はその欠如が、候補酵素のランキングのための主要な選別基準として選択された。67のβ-グルコシダーゼ酵素の収集物を、種々のpH及び温度で代用蛍光基質（pNP-β-グルコピラノシド）を用いて評価した。本発明の14酵素を最良候補として認定し、セロビオース基質によるさらに詳細な評価のために選択した。これらの酵素のうち今日までに10酵素で評価が完了した。サブクローン発酵由来の半精製タンパク質調製物を分析で用いた。前記分析には以下が含まれる：（1）種々のpH及び温度条件下での酵素活性の決定、（2）比活性の半定量的分析、及び80℃までの温度での残留活性の決定。分析は、いくつかの酵素用量及び基質濃度、並びに下記のセクションに記載したpH及び温度条件で実施した。タイムポイントは、0.5−4時間の反応時間にわたって設定し、遊離グリコースをAMPLEX RED(商標)グルコースオキシダーゼアッセイを用いて測定した。PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は反応で用いたタンパク質量の概算のために実施した。
方法／結果：
（1）pH5及びpH7並びに37℃から90℃の温度範囲におけるベータ-グルコシダーゼの活性
サブクローン発酵由来の半精製凍結乾燥タンパク質調製物を50%グリセロールで再構成して25mg/mLの総タンパク質濃度を得た。続いてタンパク質調製物を40倍（グリセロールによる酵素阻害を避けるために経験的に決定した）に希釈して反応に用いた。反応は、pH5及びpH7、並びに37、40、50、60、70及び90℃で1時間実施した。2mMのセロビオース基質を用いた。反応体積は50μLであった（基質及び酵素は1：1比で存在）。この実験では以下の10酵素を評価した：配列番号:556、配列番号:566、配列番号:542、配列番号:548、配列番号:564、配列番号:532、配列番号:560、配列番号:592、配列番号:586及び配列番号:576。結果は図18に示されている。
図18は、本発明の例示的酵素を用いて、pH5で種々の温度による2mMのセロビオースの加水分解データを示す。
図19は、本発明の例示的酵素を用いて、pH7で種々の温度による2mMのセロビオースの加水分解データを示す。
以下は、本実験で得られた結果による結論である：
（1）試験した本発明の例示的酵素の大半が、pH7よりもpH5でより良好な性能を示した；
（2）本発明のいくつかの例示的酵素が、前記温度範囲にわたってpH5で強い活性を示し、さらに詳細な分析のために選択された（配列番号:556、配列番号:566、配列番号:542、配列番号:548及び配列番号:560）；
（3）配列番号:556は全ての温度で顕著に活性を維持し、配列番号:560は90℃まで活性を有した；
（4）これらの酵素が4-酵素カクテルで被る反応条件に類似する、温度60℃及びpH5を今後の実験の条件として選択した。
【０３６１】
（2）選択した本発明のベータ-グルコシダーゼの比活性の半定量的測定
半精製タンパク質調製物をここで述べる実験で用いたので、比活性の厳密な決定は実際的ではなかった（この初期のスクリーニングで精製タンパク質は利用可能ではなかった）。半定量的態様で比活性を決定するために、各選択酵素について多数の希釈物を調製し、セロビオース消化は、10mM基質（基質制限を回避するために経験的に決定した量）を用いpH5にて60℃で16分実施した。反応体積は50μLであった（基質及び酵素は1：1の比で存在）。この目的は、全ての酵素について選択した反応条件で比較可能な速度カイネティクスを達成することであった。各タンパク質調製物のベータ-グルコシダーゼの量を概算するために、平行してPAGEを実施した。調製物中のタンパク質量が最も少なく（最大希釈）、さらに他のものに匹敵する速度を有する酵素が、試験条件下で最良の比活性を有すると考えられた。
メガザイムβ-グルコシダーゼ（純粋なタンパク質調製物）もまたこれらの実験で評価したが、この実験で用いた本発明の酵素が精製されていないことから、本発明の例示的ベータ-グルコシダーゼとの直接的比較は実施できなかった。本実験の結果は図16（セロビオース消化）及び図17（PAGE電気泳動）に示されている。
図16：試験した本発明のベータ-グルコシダーゼ酵素の各々について経験的に選択した酵素希釈物による初期速度カイネティクスのデータを示す。
図17：本発明の例示的酵素（配列番号:556、配列番号:560）及びA.ニゲルのベータ-グルコシダーゼのPAGE電気泳動を示す。各サンプルの1μL等価物を各レーンに添加した。矢印は、各サンプル中のベータ-グルコシダーゼに対応するタンパク質バンドを示す。
以下は、本実験で得られた結果に基づく結論である：
（1）配列番号:556及び配列番号:560は、試験した本発明の全てのベータ-グルコシダーゼ酵素のうちで最良の性能を示した（配列番号:556及び配列番号:560は、より低希釈で用いた他の酵素で得られた初期速度に匹敵する初期速度を最高酵素希釈で有した）；
（2）ここに示した半定量的分析を基準にして、配列番号:556及び配列番号:560は極めて類似する比活性を有した。これら2つの酵素について示されたPAGE電気泳動データによれば、各酵素の類似量が、反応で用いられたタンパク質調製物に存在していた。図17に示したゲルをデンシトメトリースキャンに付したとき、ほぼ1mg/mLの配列番号:556酵素及び0.7mg/mLの配列番号:560酵素が、ゲルローディングのために10倍に希釈した、対応するタンパク質調製物に存在していた（配列番号:560調製物に存在するベータ-グルコシダーゼよりも1.5倍のベータ-グルコシダーゼが配列番号:556調製物に存在していた）。配列番号:556は、セロビオース消化反応で配列番号:560よりも1.5倍高い希釈で類似の反応速度を達成したので（1200倍対800倍、50μLの反応体積で各酵素について25μLの体積が用いられたので）、これら2つの酵素の比活性は非常に類似しているように思われる。図16に示した濃度のBSA標準物がデンシトメトリースキャンでの計算に用いられた。
（3）メガザイム精製タンパク質調製物中に存在するベータ-グルコシダーゼの量はほぼ1mg/mLと概算された。この酵素は比較可能なセロビオース消化速度を達成するために非常に高度に希釈したが（配列番号:556及び配列番号:560のそれぞれ1200倍又は800倍に対して2500倍）、その相対的な比活性は、大いに異なる純度の配列番号:556及び配列番号:560タンパク質調製物がセロビオース消化で用いられたために、配列番号:556及び配列番号:560と比較することができなかった；
（4）比活性の同様な半定量的測定は、配列番号:566、配列番号:542及び配列番号:548については実施できなかった。なぜならばこれらの酵素で利用可能なタンパク質調製物の純度が低いために対応するタンパク質バンドをPAGEゲルで識別することができなかったからである。このことは、配列番号:556及び配列番号:560に匹敵する速度を達成するために、これらの酵素ではるかに多量の材料が必要であるということと一致する。
【０３６２】
（3）高温での4時間のセロビオース消化における選択ベータ-グルコシダーゼの残留活性
サブクローン発酵由来の半精製タンパク質調製物を希釈して、先のセクションで述べたように比較可能な反応速度を達成した：配列番号:556は1200倍、配列番号:566は400倍、配列番号:542は250倍、配列番号:548は300倍、配列番号:560は800倍。メガザイムA.ニゲルベータ-グルコシダーゼは2500倍に希釈した。10mMのセロビオースを基質として用い、消化反応は、60℃、70℃及び80℃で実施し、1時間ごとにタイムポイントを設定した。反応体積は50μLであった（基質及び酵素は1：1の比で存在）。
以下は、本実験で得られた結果に基づく結論である：
（1）配列番号:556及び配列番号:560は、4時間の反応時間にわたって全ての温度で活性を維持した；
（2）4時間の反応の最後に、60℃、70℃及び80℃でこれら2つの酵素の活性には顕著な相違はなかった（全ての温度で類似するグルコース量が遊離された）；
（3）全時間にわたって遊離されたグルコースを基にして、各酵素の60%を超える活性が4時間維持されたように思われる。この発見は、2つの酵素が高温で安定であることを間接的に示唆し、したがって4-酵素カクテルに混合するために適切でありえよう；
（4）配列番号:566及び配列番号:542は、70℃及び80℃で活性の顕著な低下を示し、配列番号:548は70℃で約50%の活性を維持し80℃では活性を示さなかった；
（5）75%を超える活性の低下が70℃でメガザイムベータ-ガラクトシダーゼについて観察され、この酵素は80℃では活性を示さなかった。
概要：
本発明の10の例示的ベータ-グルコシダーゼをここで考察するいくつかの実験で評価し、必要なときにはメガザイム（Megazayme）から購入したA.ニゲル由来ベータ-グルコシダーゼの市販調製物と比較した。本発明の例示的酵素の配列番号:556及び配列番号:560は、90℃までは高い反応性を示し、さらにpH5、80℃で4時間の反応において60%を越える活性を維持した。本発明のこれら2つの酵素は、試験条件下の70℃及び80℃で市販のメガザイムβ-グルコシダーゼよりも優れた性能を示し、この時点で4-酵素カクテルの第一の候補と考えられる。本発明のベータ-グルコシダーゼの比活性は、これらの実験に用いたタンパク質調製物の純度が低いために正確に決定することができなかった。生成物阻害については、ここで考察されている実験で評価した全ての酵素について現在調査中である。
同様な性状決定は、本発明の他の酵素、例えば代用基質（pNP-ベータ-グルコシダーゼ）により得られたデータを基にして上位酵素と認定された残りの他の4つのベータ-グルコシダーゼを用いて実施できる。本発明の他の酵素を種々のpH及び温度でのセロビオースによる性状決定に付して、4-酵素カクテルに利用可能な最良の酵素を認定することができる。性能上位酵素をタンパク質精製に付し、より正確に比活性を決定することができる。最良の性能を有する酵素（ここで考察した全基準に基づいて選択されるであろう）を4-酵素カクテルに取り入れ、コンビナトリアルスクリーニングで前処理バガスを用いて評価することができる。
【実施例１６】
【０３６３】
本発明のベータ-グルコシダーゼの特性決定
これらの実験の主要な目的は、（1）4-酵素カクテルで使用する本発明のβ-グルコシダーゼの認定、及び（2）コンビナトリアルアッセイで使用可能な本発明のいくつかの酵素の認定である。
67のベータ-グルコシダーゼの特性を部分的に決定した。比活性、pH及び温度プロフィルを基準にして、これら酵素のうち36を、以下を含む4工程選別プロセスでさらに選別した：
（1）pH5及び7並びにT＝37−90℃におけるセロビオース及び蛍光基質4-メチルウンベリフェリルベータ-D-グルコピラノシド（4-MU-GP）での活性の決定；
（2）発現評価；
（3）pH5、T＝60−80℃における残留活性の決定；
（4）生成物阻害の決定。
市販のA.ニゲルのベータ-グルコシダーゼを基準酵素として全ての実験で用いたが、ただし直接比較は、利用可能なタンパク質調製物の品質における顕著な相違のために困難であろう（凍結乾燥細菌溶解物に対し市販の調製物は90%を超える純粋なタンパク質である）。セロビオースを基質として用いたときは、酵素活性はグルコースオキシダーゼアッセイによって決定した。
方法／結果：
（1）pH5及び7並びに温度37−90℃におけるベータ-グルコシダーゼの活性
サブクローン発酵由来の半精製凍結乾燥タンパク質を50%グリセロールで再構成し、25mg/mLの総タンパク質濃度を得た。その後、タンパク質調製物を0.5mg/mLに希釈して反応で用いた。反応は、pH5及びpH7、並びに37、40、50、60、70、80及び90℃で、10mMセロビオース基質の存在下で1時間実施した（反応体積は50μL；基質及び酵素は1：1の比で存在した）。
試験した本発明の36酵素の大半がpH5至適を示した。以下の本発明の例示的酵素を含む17酵素が50℃以上で活性を有していた：配列番号:556、配列番号:540、配列番号:546、配列番号:566、配列番号:550、配列番号:530、配列番号:542、配列番号:554、配列番号:548、配列番号:564、配列番号:526、配列番号:560、配列番号:592、配列番号:586、配列番号:588、配列番号:578及び配列番号:558（表1）。これら酵素のうち以下の14が60℃以上で活性を有していた：配列番号:556、配列番号:540、配列番号:546、配列番号:566、配列番号:542、配列番号:554、配列番号:548、配列番号:564、配列番号:526、配列番号:560、配列番号:592、配列番号:588、配列番号:578及び配列番号:558。36酵素のうち13は活性が低いか、又は明白な活性を示さなかった。
【０３６４】
（2）ベータ-グルコシダーゼの発現及び徹底的な活性の性状決定
半精製凍結乾燥タンパク質調製物の0.5mg/mL総タンパク質濃度の等価物をSDS-PAGEにロードし、タンパク質発現及び純度を決定した。Invitrogenの4−12%NU-PAGE(商標)ゲルを用い、2XのMES緩衝液にて200V、5分電気泳動を実施した。ゲルを処理し、タンパク質濃度をデンシトメトリーによって概算した。徹底した活性試験のために、0.5mg/mLの半精製凍結乾燥タンパク質調製物（細菌細胞溶解物）をpH5で30分、10mMのセロビオース（T＝37℃及び50℃）及び1mMの4-MU-GP（T＝37℃）とともにインキュベートした。市販のA.ニゲルβ-グルコシダーゼ（0.4cg/mLでローディング）を基準酵素として用いた。A.ニゲルβ-グルコシダーゼ調製物は90%を超える純粋なタンパク質を含んでいるので、酵素ローディングは、検出アッセイでグルコース標準曲線の直線範囲内に留まる吸収を得ることができるように調節した。酵素活性を測定し、遊離グルコース（セロビオース基質）のμMまたはU/mL（4-MU-GP基質）として表した。
50℃以上で活性を示した本発明の17の酵素のうち10酵素はまた3%を超える純度で発現された。これらの酵素はセロビオース及び4-MU-GPで一連の活性を示した。発現及び活性の結果を下記の表1に要約する：
【０３６５】
表1：17の選択ベータ-グルコシダーゼの発現及び活性
2010516296.tif 000164
【０３６６】
表1に要約した結果から、以下の8つの酵素を発現の最適化及び大規模タンパク質製造のために選択した：配列番号:556、配列番号:566、配列番号:530、配列番号:548、配列番号:564、配列番号:560、配列番号:586及び配列番号:558。
【０３６７】
（3）pH5及びT＝60−80℃で0−4時間後の残留活性
表1に列挙した17酵素の半精製凍結乾燥調製物（細菌溶解物）（総タンパク質0.25mg/mL）及び市販のA.ニゲルβ-グルコシダーゼ（1.0μg/mLの純粋なタンパク質、基準酵素）を、pH5にて60、70及び80℃で0−4時間インキュベートした（1mLの反応体積、200rpmで攪拌）。アリコットを1時間毎に取り出し、セロビオース（10mM、反応時間1時間、pH5、60℃）及び4-MU-GP（1mM、反応時間20分、pH5、RT）による残留酵素活性をアッセイした。
結果は表2及び図1に要約されている。試験した17の酵素のうち7つが60℃以上で残留活性を維持した（配列番号:556、配列番号:560、配列番号:566、配列番号:530、配列番号:548、配列番号:564及び配列番号:554）。これらの酵素のうち6つが60℃で4時間後に90%の活性を維持し、配列番号:554は60℃で2時間後に25%の活性を維持した。配列番号:556は80℃で4時間後に90%の活性を維持し、市販の基準酵素（A.ニゲルβ-グルコシダーゼ）よりも性能が優れていた。基準酵素は60℃では活性を維持したが、70℃で1時間後に20%未満の活性を保持し、80℃で1時間後には活性を失った。
【０３６８】
表2：60−80℃で4時間後の残留ベータ-グルコシダーゼ活性
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【０３６９】
（4）0−500mMのグルコースの存在下における生成物阻害
5mMのセロビオース及び半精製凍結乾燥酵素調製物（総タンパク質0.5mg/mL）及びA.ニゲルβ-グルコシダーゼ（0.025mg/mL、基準酵素）を含む消化反応物に、0、25、50、100、200、300、400及び500mMのグルコースを加え（総反応体積50μL）、pH5、60℃で1時間インキュベートした。反応は、等体積の50mMのNa2CO3緩衝液（pH10）の添加によって停止させた。1時間の消化後に残ったセロビオース基質の量及び各サンプル中に存在するグルコースの量をHPLCによって分析した。
結果は下記の表3に要約されている。試験した本発明の13酵素のうち3つ（配列番号:566、配列番号:548及び配列番号:564）は、市販の基準酵素より性能が優れており、300mM以上のグルコースの存在下で活性を維持した。配列番号:566及び配列番号:564はもっとも低い生成物阻害を示し、400mM以上のグルコースの存在下で活性を維持した。10%の固体及び50%の酵素変換でブラジル産バガス（ほぼ50%のセルロース含有量）を加水分解すると仮定した商業的プロセスでは、約139mMのグルコース（25g/L）が1kgの出発材料から生成されよう。表3に列挙した本発明の8酵素（配列番号:556、配列番号:540、配列番号:566、配列番号:530、配列番号:542、配列番号:548、配列番号:564及び配列番号:592）及びMegazymeのA.ニゲルβ-グルコシダーゼはこれらの条件下で活性を維持すると期待される。しかしながら、20%以上の固体を要求するプロセスでは、市販の基準酵素は阻害されるが、配列番号:566、配列番号:548及び配列番号:564は活性を維持するはずである。
【０３７０】
表3：グルコースの存在下における生成物阻害
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NT：試験せず
【０３７１】
概要：
本実験で述べた例示的な4工程選別プロセスを用いて、本発明のいくつかのベータ-グルコシダーゼを認定した。本発明のこれらの酵素は、コンビナトリアルスクリーニング及び酵素カクテル（例えば4-酵素カクテル）で用いることができる。これらの実験で個々の選別基準を基にして認定された本発明の例示的酵素候補物を下記の表4に列挙する：
【０３７２】
表4：個々の選別基準を基にして最良の性能を示す酵素
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【実施例１７】
【０３７３】
本発明の酵素結合セルラーゼ発見スクリーニング
本実施例では本発明の例示的な酵素結合セルラーゼ発見スクリーニングについて述べる。この具体的な実施例では、本スクリーニングは、本発明の例示的酵素、配列番号:580（β-グルコシダーゼ）を用いる。タンパク質1ミリグラム当たりの活性は、精製の首尾により調製物毎に変動するであろう。本発見スクリーニングのより良好な標準化のために、この酵素の個々のバッチの活性は今後U/mLで示す。本プロトコルは実施の仕方を示す。
ユニットの定義
この実施例のためには、ユニットの定義は、配列番号:580の酵素の1ユニットによって、室温（ほぼ22℃）、pH7.5でMU-グルコピラノシド基質から毎分1.0μmolの4-メチルウンベリフェロンが遊離されることを意味する。
プロトコル
1．黒色の96ウェルプレートを用いる。サンプルの迅速な同時添加のために全てのサンプルの適切な配置、及びカイネティクスの読み取りの間隔を最短にすることを企図する。図20は、3つのサンプル調製物の配置例を示し、この場合読み取り範囲はB1−E12である。
2．標準曲線のための希釈を作成する。4-MUを50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で希釈する。0、1、2、4、8及び16μMの各希釈につき300μLを作成する。
3．酵素サンプルの希釈を作成する。試験する各酵素サンプルについて、連続2倍希釈を作成する。典型的には1/500で開始する（すなわち1/500、1/1000、1/2000、1/4000,1/8000及び1/16000）。希釈液として50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）を用いて各150μLの希釈を作成する。
4．2Xの基質を調製する。前記ストック基質を50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で希釈することによってMU-β-グルコピラノシド基質の2mM溶液を調製する。約1mLのこの溶液を試験する酵素サンプルの各々について作成する。前記溶液をピペッティング皿に配置する。
5．標準曲線をロードする。黒色96ウェルプレートに100μL/ウェルでデュープリケートとしてロードする。
6．酵素をロードする。各酵素を各ウェル当たり50μLでデュープリケートとしてロードする。
7．SPECTRAMAXTMをセットアップする。360/465nmのEx/Emによる室温でのカイネティクスの読み取りのための設定を行う。30秒間隔で合計5分の読み取りを行う。PMT感度を“中”に設定する。標準曲線サンプルが同じ条件下で読み取られるように、カイネティクスの読み取りに含まれていることを確認する。
8．基質を添加し、カイネティクスの読み取りを開始する。プレートをSPECTRAMAXTMトレーに置き、蓋を外す。酵素サンプルを含むウェルに手早く50μLの2X基質溶液を添加する。サンプルの迅速な同時添加及び攪拌のためにマルチチャンネルピペットを使用する。直ちにカイネティクスの読み取りを開始し、データをセーブする。VmaxがプログラムによってmRFU/分で計算されることを確認する。
このセルラーゼ酵素活性実験（MU-グルコピラノシドから4-メチルウンベリフェロンを遊離させる）のSPCTRAMAXTMデータを“プレート2”として要約した、図21の表を参照されたい。
【０３７４】
計算
標準曲線
1．標準曲線用データを収集するために最初のカイネティクスの読み取りを用いる（標準曲線はまさに終末点測定であるからである）。先ず初めにμM値をμmolに変換する；例えば25μMの100μL＝0.0025μmolである。標準物の各点のために、デュープリケートサンプルの平均及び標準偏差を計算し、平均RFU値からバックグラウンドを差し引く。
2．バックグラウンドを差し引いた平均値を用いて、x軸が4-MUのμmole、y軸がRFUの分散プロットを作成する。
3．直線回帰を用いて、RFUを存在する4-MUのμmolに相関させる直線関数を作成する（バックグラウンドが差し引かれているのでｙ切片を0に近づける）。注記：R値が0.998未満の場合は、標準曲線で最高の濃度を表すデータ点を除くように試みる。MS EXCELTMでは、学術表記法の直線関数を小数点2位でフォーマットする。
このセルラーゼ酵素活性実験（MU-グルコピラノシドから4-メチルウンベリフェロンを遊離させる）のカイネティクス活性データを要約した、図22の表を参照されたい。
【０３７５】
酵素活性
1．β-グルコシダーゼ活性のそれぞれの測定のために、標準曲線の感受性範囲にもっとも一致する希釈を用いる。この希釈の範囲内で、カイネティクスの直線範囲内に入るデータ点のみを用いて、Vmax（VmaxはSPECTRAMAXTMソフトで（mRFU/分として）自動的に計算される）を得る。平均及び標準偏差を各デュープリケートペアについて計算する。続いて平均mRFU/分を1000で割ってRFU/分を得る。
2．直線関数を用いて、この値をμmol/分で表したβ-グルコシダーゼ活性ユニット（勾配で割ったRFU/分）に変換し、続いて希釈係数を乗じて、μmol/分で表されたVmaxに変換する。
3．算出したユニットを用い、使用した希釈係数を前記に乗じ、続いてウェルに添加した体積（0.05mL）で割って、U/mLで表された活性を得る。
4．以下は配列番号:580を例として用い、標準曲線の勾配が2,717,377と仮定して、EXCELTMで全ての計算をどのように設定することができるかを示す：
【０３７６】
2010516296.tif 000168
【０３７７】
−標準曲線及びカイネティクスは、標準物とサンプル間の感度が一致するように、同じ読み取りで一緒にSpectraMaxにより測定しなければならない
−4-MU標準物に疑義がある場合は、良好なストックから新しい希釈を作成する。
−標準曲線及びサンプルの測定のために同じ緩衝液pHを用いる。4-MUの蛍光はpHに大きく左右される。
試薬
4-MU
4-メチルウンベリフェロン（Sigma M1381, FW 176.2）：DMSOで50mMのストック溶液を作成し、遮光して-20℃で保存する。
MU-β-グルコピラノシド
4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコピラノシド（Sigma M3633, FW 338.3）：DMSOで50mMのストック溶液を作成する。少量ずつ小分けしたものを遮光して-20℃で保存する。
【実施例１８】
【０３７８】
CBMキメラ酵素の構築
ある実施態様では、本発明はキメラ（例えばマルチドメイン組換え）タンパク質を提供する。前記タンパク質は、本発明のシグナル配列及び／又は炭水化物結合ドメイン（CBM）を含む第一のドメイン、及び少なくとも1つの第二のドメインを含む。前記タンパク質は融合タンパク質であってもよい。第二のドメインは酵素を含むことができる。前記タンパク質は非酵素タンパク質でもよい。例えばキメラタンパク質は本発明のシグナル配列及び／又はCBM及び構造タンパク質を含むことができる。この実施例では、本発明のCBMを含むポリペプチドを作製する例示的プロトコルについて述べる。
CBMスワッピングライブラリーの構築：
GENEASSEMBLYTM技術（Verenium Corporation, San Diego, CA）により、GENEREASSEMBLYTM変種ライブラリー（1080変種）を6つのCBHI触媒ドメイン（下記の表1参照）、菌類及び細菌のGHに由来する30のCBM（下記の表2を参照）、及びGH遺伝子から抽出した6つの天然のリンカー（下記の表3を参照）を用いて構築した。
CBH変種を表すDNAフラグメントのライブラリーを、以下を含むアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）用の発現ベクターでクローニングした：
a）形質転換A.ニゲル宿主に抗生物質耐性を付与するマーカー遺伝子、
b）A.ニゲルゲノムと相同性を有し、相同組換えにより発現カセットのゲノムへの安定的組込みを誘導する2つのDNA領域（前記の1つはまた転写ターミネーターとして機能する）、
c）CBHの発現を駆動するプロモーター、及び
d）大腸菌宿主に抗生物質耐性を付与するマーカー遺伝子を含む大腸菌レプリコン。
CBH変種のスクリーニングに用いられるベクター（pDC-A1）はpGBFin-5（例えば米国特許7,220,542号に記載）の再構築物であり、前記をベクターの総サイズを減少させるために改造した。pGBFin-5の2.1kbの3' Gla領域を0.54kbに短縮し、gpdプロモーターは同じままであるが、2.24kbのamdS配列は、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする1.02kbのhygB遺伝子によって置き換えられていた。2.0kbのグルコアミラーゼプロモーター glaは、原型配列の3' 末端を表す1.15kbに短縮された。pGBFin-5の2.3kbの3' Gla領域もまた原型配列の5' 末端を表す1.1kbフラグメントに短縮された。pDC-A1のための大腸菌レプリコンはpUC18から採取した。全体的には、原型の12.5kbのpGBFin-5発現ベクター（発現を意図する遺伝子挿入物を含まない）は7.2kbベクター（挿入物を含まない）に短縮された。
CBH変種ORF DNAプールと前記ベクターとの連結のあと、この連結混合物を用いてキメラに対しコンピテントな大腸菌Stbl2を形質転換させた。個々の大腸菌形質転換体を96ウェルプレートにピックし、ウェル当たり200μLのLB＋アンピシリン（100μg/mL）で液体培養として30℃で増殖させた。続いてこの細胞を用いて、コロニーPCRによる配列決定反応のための鋳型を生成した。クローンライブラリーから得られた配列データを分析してCBHの固有変種を確認した。続いて、この選別変種を含む大腸菌形質転換体を用いて96ウェル様式で再度アレイを作成し、このアレイを用いて、全発現カセット（大腸菌レプリコンを除くpDC-A1の内容物）の直鎖DNAを、3' 末端及び3'” Gla領域とハイブリダイズするプライマーを用いPCRによって調製した。続いて各クローンから得られた約1μgのPCR生成物を用いて、96ウェルプレートの1つのウェルで（すなわち1ウェルに1クローン）、A.ニゲルCBS153.88プロトプラストをPEG-仲介形質転換により形質転換した。同じ96ウェル様式の再生寒天（各ウェルにつき200μLのPDA＋シュクロース（340g/L）及びヒグロマイシ（200μg/mL））で形質転換体を選別した。30℃で7日間インキュベートした後、ピンツールを用いて、PDA＋ヒグロマイシン（200μg/mL）を含む96-ウェルプレートで形質転換体を複製した。さらに7日間30℃でインキュベートした後、各ウェルの芽胞を用いて、96ウェルプレートの各ウェルの200μLの液体培養液に接種した。このプレートを30℃で7日間インキュベートし、各ウェルの上清（分泌されたCBHを含む）を回収した。
変種を含む発現構築物で形質転換したアスペルギルスを増殖させるために用いた培養液は以下の組成を有していた：NaNO3、3.0g/L；KCl、0.26g/L；KH2PO4、0.76g/L；4MのKOH、0.56mL/L；D-グルコース、5.0g/L；カザミノ酸、0.5g/L；微量成分溶液、0.5mL/L；ビタミン溶液5mL/L；ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（それぞれ10,000U/mL及び10,000μg/mL）、5.0mL/L；マルトース、66.0g/L；ソイトーン、26.4g/L；(NH4)2SO4、6.6g/L；NaH2PO4.H2O、0.44g/L；MgSO4.7H2O、0.44g/L；アルギニン、0.44g/L；トゥイーン80、0.035mL/L；プリューロニックアシッド消泡剤、0.0088mL/L；MES、18.0g/L。前記微量成分溶液は100mL中に以下の組成を有していた：ZnSO4.7H2O、2.2g；H3BO3、1.1g；FeSO4.7H2O、0.5g；CoCl2.6H2O、0.17g；CuSO4.5H2O、0.16g；MnCl2.4H2O、0.5g/L；NaMoO4.2H2O、0.15g/L；EDTA、5g/L。前記ビタミン溶液は500mL中に以下の組成を有していた：リボフラビン、100mg；サイアミンHCl、100mg；ニコチンアミド、100mg；ピリドキシンHCl、50mg；パントテン酸、10mg；ビオチン、0.2mg。
【０３７９】
一次アッセイプロトコル
ひき割り（60メッシュ）バガス基質（pBG10Cと称される）を、50mM酢酸緩衝液（pH5）で最終0.2%セルロースに希釈する。前記を96ウェルの“基質”プレートに200μL/ウェルで添加した。96ウェルの“カクテル”プレートで、10Xの酵素カクテルを作成した。前記10X酵素カクテルは、本発明の例示的酵素、配列番号:90（Eg）、配列番号:358（CBHII）、及びA.ニゲルで増殖させたCBHI CBM上清を含んでいた。最終用量は、4mg Eg/gセルロース、2mg CBHII/gセルロースで、CBHIは変動する。反応を開始させるために、22μLの酵素カクテルを200μLの基質緩衝液に添加する。この消化は37℃で実施する。タイムポイントは0から48時間で実行する。タイムポイントは、384ウェルの“トップ”プレート（200mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH10））に反応物を移すことによって実行される。次に一晩のβ-グルコシダーゼ消化を“トップ”プレートで実施し、セロビオースをグルコースに分解させる。
続いて、グルコースオキシダーゼ（GO）アッセイを実施し、生成された総グルコース量を測定する。CBM変異体は、それらが陰性コントロール（ベクターのみ）の平均の2倍のGOシグナルを示す場合に活性を有すると考えられた。これによって159の活性クローンが得られた。
【０３８０】
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【０３８１】
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【０３８２】
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【０３８３】
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【実施例１９】
【０３８４】
バイオマスの糖化
ある実施態様では、本発明は、バイオマスの糖化のために、リグノセルロース系活性を有するポリペプチド（可溶性オリゴマーを発酵性単糖類に変換する酵素を含む）を提供する。ある特徴では、本発明のポリペプチドの活性は、可溶性のセロオリゴ糖及びアラビノキシランオリゴマーのモノマーキシロース、アラビノース及びグルコースへの酵素的加水分解（分解）を含む。ある特徴では、本発明の例示的酵素は、セルロース又はセルロース含有組成物（例えば植物バイオマス、例えばサトウキビバガス、トウモロコシ繊維又は他の植物廃棄材料（例えば干し草、わら（例えば稲わら又は麦わら）又は任意の穀類植物の任意の乾燥茎）、又は加工若しくは農業副産物）の糖化のためのプロセスで用いられる。本実施例では、本発明の例示的な糖化プロセスについて述べる。
糖化反応の実施：
方法
蒸気爆発バガス(steam exploded bagasse)の250dw mgを10mLのガラスのクリンプトップバイアルに量り入れた（5%固体）。最終基質含有量が5%固体となるように、ある体積のMES緩衝最少培養液（pH5.6）を酵素ローディングに応じて各バイアルに添加した。酵素カクテルを10mg酵素/グラム固体でバガス混合物に添加した（前記酵素カクテルは等量の各酵素成分（1：1：1）を有する）。総反応体積は5mLであった（したがって反応当り2.5mgの総酵素）。0時間サンプル200μLを反応から取り出し-20℃で凍結した。バイアルを密封し、クリップで留め、37℃の振盪インキュベーターに置いた。200μLのサンプルを24、48及び90時間で取り出した。サンプルを融解し、13,200rpmで5分遠心し、上清を10倍希釈した。これらの反応生成物の糖組成を公知の標準物に対してHPLCによって分析した。変換は、バガス基質の理論的セルロース値に基づいて算出した。
【０３８５】
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【０３８６】
96ウェルプレートアッセイ−バガス変換パーセント：
方法
蒸気爆発バガスをMES緩衝最少培養液（pH5.6）に0.4%セルロースで再懸濁した。200μLの基質緩衝液を96ウェルプレートの各ウェルに添加した。等量の各酵素成分を含む酵素カクテルを水で0.432mg酵素/mLで調製した。カクテルの22.22μLを基質に添加し、最終ローディングが12mg酵素/gセルロースとなるようにピペットで混合した。消化プレートを4000rpmで1分間遠心し、15μLの上清を、384ウェルプレート（“停止プレート”）の45μLの炭酸ナトリウム溶液（200mM、pH10）に移した。消化プレートを密封し、37℃でインキュベートした。さらに新たなタイムポイントを22及び70時間で実行した。
ベータ-グルコシダーゼ及びGOアッセイ工程は実施例5で実質的に述べた。変換は、バガス基質の理論的セルロース値に基づいて算出した。
【０３８７】
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【０３８８】
割合の最適化（D.O.E.）：
方法
蒸気爆発バガスをMES緩衝最少培養液（pH5.6）に1%固体で再懸濁した。160μLの基質緩衝液を96ウェルプレートの各ウェルに、2金属BBとともに添加した。酵素カクテルを、所望の酵素比に応じた各成分の体積を用いて調製した。カクテルの40μLを基質に添加し、最終ローディングが25mg酵素/gセルロースとなるようにピペットで混合した。消化プレートを4000rpmで1分間遠心し、20μLの上清を、384ウェルプレート（“停止プレート”）の60μLの炭酸ナトリウム溶液（150mM、pH10）に移した。消化プレートを密封し、250rpmで攪拌しながら35℃でインキュベートした。さらに新たなタイムポイントを7、26及び50時間で実行した。ベータ-グルコシダーゼ及びGOアッセイ工程は、実質的に実施例5で述べたとおりであった。変換は、バガス基質の理論的セルロース値に基づいて算出した。
【０３８９】
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【０３９０】
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【０３９１】
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【０３９２】
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【０３９３】
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【０３９４】
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【０３９５】
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【０３９６】
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【０３９７】
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【０３９８】
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【０３９９】
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【０４００】
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【実施例２０】
【０４０１】
バイオマス変換用酵素“カクテル”
ある実施態様では、本発明は、バイオマスの加工又は“変換”用、例えばバイオ燃料（例えばバイオエタノール、バイオブタノール、バイオプロパノール、バイオディーゼルなど）製造用の酵素“カクテル”又は混合物（“カクテル”は、本発明の少なくとも1つの酵素を含む酵素の混合物を意味する）を提供する。本発明の酵素“カクテル”又は混合物を用いて、リグノセルロース系バイオマス、又はセルロース及び／又はヘミセルロース（リグノセルロース系バイオマスはまたリグニンを含む）を含む任意の組成物（例えば種子、穀粒、塊茎、植物廃棄物（例えば干し草、わら（例えば稲わら又は麦わら）又は任意の穀類植物の任意の乾燥茎）、又は食品加工若しくは工業的加工（例えば茎）の副産物、トウモロコシ（穂軸、茎葉などを含む）、牧草（例えばインディアングラス、例えばソルガストルム・ヌータンス（Sirghastrum nutans）、又はスイッチグラス、例えばパニクム（Panicum）種、例えばパニクム・ヴィルガツム（Panicum virgatum））、木材（ウッドチップ、加工時廃棄物、例えば木材廃棄物を含む）、紙、パルプ、再生紙（例えば新聞紙）（単子葉又は双子葉植物、又は単子葉系のトウモロコシ、サトウキビ若しくはその部分（例えばケイントップ（cane top））、イネ、コムギ、オオムギ、スイッチグラス若しくはミスカンタス（Miscanthus）；又は双子葉系のオイルシード作物、ダイズ、キャノーラ、ナタネ、アマ、ワタ、ヤシ油、サトウダイコン、落花生、樹木、ポプラ、ルピナスを含む）の主要成分を加水分解することができる。
本発明の酵素“カクテル”又は混合物は、酵素（例えばフェルラ酸エステラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アルファ-グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、キシロシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びベータ-グルカナーゼなど）の任意の組合せを含むことができ、また別の実施態様では、前記“カクテル”又は混合物の少なくとも1つ、又はいくつか、又は全部が本発明の酵素である。
例えば、図23は、本発明の酵素“カクテル”又は混合物において用いることができる本発明の3つの酵素（例示的な配列番号:664；配列番号:630；配列番号:628）によるコムギのアラビノキシラン消化生成物（消化プロフィル）を示すデータを図説している（これら3つの酵素は、初めに種々のコクリオボルス（Cochliobolus）から誘導したキシラナーゼである）。各酵素を用いてコムギのアラビノキシランを消化し、得られた生成物をキャピラリー電気泳動で分析した。
図24は、本発明のアラビノフラノシダーゼ（例示的な配列番号:686、配列番号:682、配列番号:660、配列番号:662）が、どのようにして本発明のキシラナーゼと相乗的に働いてコムギのアラビノキシランを消化するかを示すデータをグラフで表している。この図はまた本発明の例示的“カクテル”又は混合物を示している。本発明の例示的アラビノフラノシダーゼは、キシラナーゼ（例えばポリペプチド配列番号:719）とともに、又は前記キシラナーゼの非存在下でコムギのアラビノキシランを消化するために用いられた。基質消化量は、糖を還元するBCAアッセイにより測定された。
図25は、コムギのアラビノキシラン消化で、例示的キシラナーゼ配列番号:719を超える、本発明のベータ（β）-キシロシダーゼ、配列番号:550、配列番号:700、配列番号:698、配列番号:622、配列番号:672、配列番号:626、配列番号:632、配列番号:636、配列番号:656、及び配列番号:696（図中で表示されている）の促進作用を示すデータをグラフで表している。コムギのアラビノキシランを、キシラナーゼ配列番号:719と組み合わせた個々のβ-キシロシダーゼで消化し、BCAアッセイを用いて生成された還元糖を定量した。配列番号:719のキシラナーゼ単独を超える％増加が認められた。
図26は、基質としてトウモロコシの種子繊維を用いたフェルラ酸エステラーゼ（FAE）活性を示すデータをグラフで表している。トウモロコシ種子繊維を、配列番号:719のキシラナーゼとともに又は前記キシラナーゼの非存在下でフェルラ酸エステラーゼ（FAE）の配列番号:640で消化し、生成されたフェルラ酸をHPLCで測定した。FAE 配列番号:640とキシラナーゼ配列番号:719との混合物は、本発明の例示的混合物である。
図27は、本発明の例示的アセチルキシランエステラーゼ、配列番号:640、配列番号:650及び配列番号:688を用い、基質としてアセチルキシランを用いた活性アッセイのデータをグラフで表している。アセチル化キシランのアセテート遊離を用いて、アセチルキシランエステラーゼ活性を示した。前記の図は、500μgのアセチル化キシラン反応（pH5、24時間インキュベーション）によるエステラーゼ活性を示す。
図28は、本発明の例示的アセチルキシランエステラーゼ、配列番号:648、配列番号:654及び配列番号:680を用い、基質としてアルド-ウロン酸混合物を用いたアルファ（α）-グルクロニダーゼ活性アッセイを示すデータをグラフで表している。LC-MSを用いてグルクロン酸の遊離を検出し、アルド-ウロン酸混合物のα-グルクロニダーゼ活性を示した。
これまで本発明の多数の特徴について述べてきた。それにもかかわらず、多様な修正が本発明の範囲を外れることなく為しえることは理解されよう。したがって、他の特徴も本特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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