(57)【要約】  本願は、テルペンに由来し、抗菌活性を有し、式（I）または（II）で表される新規分類の化合物に関する：【化１】2010504310.tif 000031          式中、AはNR1、O、S、CR2R3またはR-(CH2)n-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2であり、R1、R2およびR3は置換基であり、nは1以上、特に2である。  本発明は、個々に使用される式（I）または式（II）の両方の化合物、該２つの化合物の混合物、および主に治療のための、少なくとも１の前記化合物もしくは前記混合物を含んでなる組成物に関する。特定の実施形態によると、個々に使用される（I）または（II）の化合物、両化合物の混合物、および本発明の組成物は、難しいＣに関連する消化性の感染症の治療において使用される。ある特定の実施形態において、式（I）の化合物は、細菌により産生される化合物であるマルガウシンである。【選択図】      なし
2010504310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（I）または（II）の化合物：
【化１】
2010504310.tif 000017
式中、AはNR1、S、CR2R3およびR-(CH2)n-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2であり、R1、R2およびR3は置換基であり、nは1以上、特に2である。
【請求項２】
請求項１に記載の式（I）または（II）の化合物であって、Aは、NH、S、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である化合物。
【請求項３】
次式（I）または（II）の化合物を調製する方法であって、
ａ）細菌株を培養する工程と；
ｂ）培養上清から式（I）または（II）の化合物を精製する工程と
を含んでなる方法：
【化２】
2010504310.tif 000018
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である。
【請求項４】
請求項３に記載の調製方法であって、前記細菌株は、2006年9月15日にCNCMに寄託され、受付番号CNCM I-3669のJPL84である方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の調製方法であって、産生される化合物は
【化３】
2010504310.tif 000019
である方法。
【請求項６】
次式（I）または（II）の化合物であって、
【化４】
2010504310.tif 000020
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびRは、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である
ａ）細菌株を培養する工程と；
ｂ）培養上清から式（I）または（II）の化合物を精製する工程
とを含んでなる方法により得られる化合物。
【請求項７】
請求項６に記載の化合物であって、前記細菌株は、2006年9月15日にCNCMに寄託され、受付番号CNCM I-3669のJPL84である方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の化合物であって、次式で表される化合物。
【化５】
2010504310.tif 000021
【請求項９】
請求項８に記載の化合物であって、1位の炭素はCH2であり、3位の炭素はCHであり、最後の位置の炭素はCH3であることを特徴とする化合物。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の化合物であって、化学的に製造された同一の化合物とは異なるC12／C13比を有する化合物。
【請求項１１】
以下を含んでなる組成物：
ａ）次式（I）もしくは（II）の化合物または該化合物の混合物；
【化６】
2010504310.tif 000022
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である
および
ｂ）少なくとも１の薬学的に許容可能な媒体。
【請求項１２】
以下を含んでなる組成物：
ａ）次式（I）もしくは（II）の化合物または該化合物の混合物；
【化７】
2010504310.tif 000023
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である
ならびに
ｂ）微生物に対して活性を有する少なくとも１の第２の分子、および任意に、薬学的に許容可能な媒体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、前記微生物に対して活性を有する少なくとも１の第２の分子は抗生剤であることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物であって、式（I）の化合物および式（II）の化合物を含んでなることを特徴とする組成物：ここで、Aは、前記２つの化合物において同一であり、NH、S、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である組成物。
【請求項１５】
薬物としての使用のための、式（I）または（II）の化合物：
【化８】
2010504310.tif 000024
式中、Aは、NH、O、S、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である。
【請求項１６】
抗生剤または殺菌剤としての使用のための、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
細菌、好ましくはグラム陽性菌の感染症の治療または予防における使用のための、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
クロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症のような、クロストリジウム属に由来する細菌による感染症の治療または予防において使用するための、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
抗生剤治療に続くクロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症の治療または予防において使用するための、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
腸内細菌フローラの平衡の修復において使用するための、請求項１７または１８に記載の化合物。
【請求項２１】
薬剤としての使用のための、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組成物から選択される組成物または次式（I）もしくは（II）の化合物を含んでなる組成物：
【化９】
2010504310.tif 000025
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項２２】
抗生剤または殺菌剤としての使用のための、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
細菌性の感染症、好ましくはグラム陽性菌感染症の治療または予防における使用のための、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
クロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症のような、クロストリジウム属に由来する細菌による感染症の治療または予防において使用するための、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
抗生剤治療に続くクロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症の治療または予防において使用するための、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
腸内細菌フローラの平衡の修復において使用するための、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２７】
細菌性の感染症の闘病において使用する組成物を製造するための、請求項１５に記載の式（I）または（II）の化合物の使用。
【請求項２８】
医療機器の含浸のための、請求項１５に記載の式（I）または（II）の化合物の使用。
【請求項２９】
医療機器の含浸のための、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組成物から選択される組成物、または次式（I）もしくは（II）の化合物を含んでなる組成物の使用：
【化１０】
2010504310.tif 000026
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項３０】
次式（I）または（II）の化合物を含浸させた医療機器：
【化１１】
2010504310.tif 000027
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項３１】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組成物または次式（I）もしくは（II）の化合物を含んでなる組成物を含浸させた医療機器：
【化１２】
2010504310.tif 000028
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項３２】
カテーテル、包帯、骨接合剤、大脳シャントまたは心臓弁である、請求項３０または３１に記載の機器。
【請求項３３】
次式（I）または（II）の化合物を産生することができる細菌株：
【化１３】
2010504310.tif 000029
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項３４】
2006年9月15日にCNCMに寄託され、受付番号CNCM I-3669のJPL84である、請求項３３に記載の細菌株。
【請求項３５】
請求項３３または３４に記載の細菌株に由来する株であって、式（I）または（II）の化合物を産生する能力を有することを特徴とする株。
【請求項３６】
請求項３５に記載の株であって、次式の化合物を産生する能力を有することを特徴とする株：
【化１４】
2010504310.tif 000030
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2であり、１位の炭素はCH2であり、３位の炭素はCHであり、最後の位置の炭素はCH3である。
【請求項３７】
生物学的なサンプルまたは表面の細菌プロフィールを修飾する方法であって、前記サンプルまたは前記表面を請求項１５に記載の少なくとも１の式（I）もしくは（II）の化合物、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組成物または式（I）もしくは（II）の化合物を含んでなる組成物と接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、以下の式（I）または（II）で表され、テルペンに由来し、抗菌活性を有する新規分類の化合物に関する：
【化１】
2010504310.tif 000003
【０００２】
式中において、Ａは、NR1、O、S、CR2R3およびR-(CH2)n-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2であり、R1、R2、R3は置換基であり、ｎは１以上であり、特に２である。
【背景技術】
【０００３】
医薬の分野において、抗生物質によりもたらされる進歩には疑問を投げかける。そのような抗生物質に耐性を有する病原菌の存在および増殖があるためである。最も抗生物質を使用する国の１つであるフランスでは、多くの抗生物質耐性細菌が確認されてきた。これら２つの事象の間の原因と結果の関係は、明らかに見えるが、厳密には示されていない。最も重要な例には、最も耐性の細菌の１つであるブドウ球菌（例えばメチリシン耐性黄色ブドウ球菌）ならびにペニシリン耐性肺炎連鎖球菌、バンコマイシン耐性腸球菌、多剤耐性サルモネラ菌および多耐性の結核桿菌（tuberculosis bacillae）が含まれる。
【０００４】
さらに、腸内フローラにおける不均衡は、感染と闘うための抗菌治療（antibiotherapy）に続いて生じ得る。そのような不均衡自体は、消化性の感染（下痢）、特にクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）に関連する消化性の感染（ＩＣＤまたはクロストリジウム・ディフィシルに関連する疾患に対するＣＤＡＤ）を引き起こす。クロストリジウム・ディフィシルは、成人における院内感染の下痢の主要な原因であるグラム陽性嫌気性桿菌であり（抗生物質投与後の下痢の場合には約１５％〜２５％、偽膜性大腸炎の場合には９５％以上）（Hurley et al. Arch. Intern. Med 2002; 162: 2177-84）、自然に、臨床で使用される抗生物質のほとんどに対して部分的に耐性である。メトロニダゾールまたはバンコマイシンに基づく経口的な治療は、最初に使用される。患者の再発の２５％の場合、治療は長期にわたり、費用がかかる。ちょうどアメリカ合衆国において、抗菌治療の結果として生じる下痢の症例は、１９８７年〜１９９８年の間に、１００００患者／日当り１２．２例、または１０００の入院患者当り７〜８例である（http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/infDis/Cdiff_CCJM02_06.pdf）。フランスおよびヨーロッパでは、最も病原性の高い株がこれらの領域に広がっているため、クロストリジウム・ディフィシルによるこの感染にますます敏感になっている。高い病原性の株により引き起こされるクロストリジウム・ディフィシルの流行は、２００６年３月にフランスで起こった（情報源：Institut Francais de Veille Sanitaire; Euro Surveill. 2006 11: E060914.1）。この型の感染症に感染した人々は、０．６％〜１％のケースで死亡した。これらの数値が上昇し、アメリカ合衆国は、患者当り３６６９〜７２３４ドルのオーダーのコストを見積もった。
【０００５】
さらに、最近の相対的に少数の医用材料は、抗菌剤で保護されている。抗菌剤を含浸させたカテーテルは、最もデータが存在する医療装置である。本質的に、分子の２つの組み合わせがある：クロルヘキシジンとスルファジアジン銀またはミノサイクリンとリファンピシン。初めの２つのインビボでの効力は、議論の余地があり、時間的に制限がある（＜１０日）と報告されている。さらに、そのような分子で保護されたカテーテルの使用に関連したアナフィラキシーの例が述べられている（Terazawa et al. Anesthesiology, 1998 Nov; 89(5): 1296-8; Kluger Anaesth Intensive Care, 2003 Dec; 31(6): 697-8; Stephens et al. Br J Anaesth, 2001 Aug; 87(2):306-8）。カテーテルの外面のみならず内面（またはルーメン）にもクロルヘキシジンおよびスルファジアジン銀を含浸させた新世代のカテーテルは、コロニー形成を減少させることが示されている（Rupp ME et al, Ann Intern Med. 2005 Oct 18; 143(8): 570-80）。しかしながら、研究では、敗血症の場合における有意な減少を示すことができなかった。ミノサイクリンおよびリファンピシンで処理されたカテーテルは、より効果的であるように思われるが、予防の目的のための繰り返しの使用により耐性菌の出現を必ず引き起こし、結果として治療段階において使用できなくなるというリスクにより、その使用は制限される。この最後の点は、リファンピシンが人工補綴物の感染症において有効である稀な全身性の抗生物質であるため、なおいっそおう心配である。
【０００６】
１億５千万より多い静脈カテーテルが、アメリカ合衆国の病院およびクリニックにおいて毎年挿入されている、すなわち、５００万の中心静脈カテーテルである。この同じ国において、８００００のステントが毎年使用されている。２００４年のカテーテルおよびステントに対する市場は、１３０億１千万ドルであり、１年当り１２．３％増加している（http://www.marketresearch.com）。この進歩は、薬剤の７％より早い（http://www.interphanna.ch/fr/1926.asp）。２００９年には、市場は約２３０億ドルに達するであろうと推定されている。リスクを低下させることができる医療機器に対する大きな要求があることにも留意するべきである。再狭窄のリスクを低下させるタクロリムスで処理されたステントの使用は、通常のカテーテルよりも早く増加している。感染を制限する分子で処理されたステントは、好機を見出されるべきである。静脈移植の市場は、１年当り５億ドルのオーダーである（北アメリカを除く）（http://www.alpha-research.com/coinoanv.html）。これらのデータは、最近の調査においてまとめられている（Raad et al, Arch Intern Med 2002, 162, 871-879）：
・リファンピシンは、単独で、またはミノサイクリンと組み合わせて、医療機器の処理のためにしばしば使用される。リファンピシンは、増殖の遅い細菌、特にカテーテル、ステントおよび静脈移植の感染症の最も頻繁な原因であるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌において活性を有する珍しい抗菌剤の１つであるため、これら２つの分子の組み合わせは効果的な方法である。多施設治験において、それらは感染のリスクを８０％低下させ、それらの使用は、８５０のカテーテル、中心静脈カテーテルを使用することにより、病院としては５０００００ドルの節約になるはずだと見積もっている。しかしながら、そのようなカテーテルの使用は、予防治療と関連して、リファンピシン耐性菌を選択することに対する懸念により遅れている；
・広範な抗菌スペクトルを有する銀塩も、医療機器の処理のために使用されている。この処理については、種々の研究において述べられており、１０日未満の挿入で、カテーテルのコロニー形成を防止することにおいて、効果がないかまたは相対的に効果があるとされている。それらは、より長い期間挿入されるカテーテルにおいて効力がない。コラーゲンは、銀塩をキレートし、それらの活性を阻害するように思われる。さらに、それらは過敏反応の原因でもある；
・クロルヘキシジン−スルファジアジン銀の組み合わせ：この組み合わせを用いたカテーテルの処理は、非常に効果的であるとは思われず、それらの長期間の必要性については熱く議論されている。
【発明の概要】
【０００７】
本願は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、炭疽菌およびクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）のような細菌に対して、抗菌活性、特に広範なグラム陽性スペクトルを伴う抗菌活性を有する新規分類の化合物に関する。この分類の化合物は、低い分子量を有し、インビトロおよびインビボで毒性がなく、既知の耐性と交差反応しない。好ましくは、この分類の抗菌化合物には、細菌株に由来する培養上清から単離され得るマルガウシンが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、マルガウシンの化学式である。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
本発明は、次式（I）または（II）の化合物に関する：
【化２】
2010504310.tif 000004
【００１０】
式中、ＡはNR1、O、S、CR2R3およびR-(CH2)n-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2であり、R1、R2、およびR3は置換基であり、nは１以上であり、特に２である。
【００１１】
本明細書に記載されている式（I）および（II）は、以下の位置に置換基を有する式を包含する：
・Ａを構成する原子上（例えば、R1、R2およびR3）；および／または
・位置１および／または３および／または５（最後の位置）における炭素上（例えば、X1、X’1、X2、X3またはX’3）。
【化３】
2010504310.tif 000005
【００１２】
本発明のある特定の実施形態において、Ａは、NH、O、S、CH2およびR-(CH2)n-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2であり、n＝2である。  
ある特定の実施形態において、上記式において、１位の炭素はCH2であり、３位の炭素はCHであり、最後の位置の炭素はCH3である。
【００１３】
本発明は、次式（I）または（II）を有する化合物に関する：
【化４】
2010504310.tif 000006
【００１４】
式中、Ａは、NH、O、S、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である。
【００１５】
ある特定の実施形態において、本発明は、それ自体、Schank et al (Chemistry of free cyclic vicinal tricarbonyl compounds (“1,2,3-triones”). Part 2. Redox reactions of 1 ,2,3-triones with ene-1 ,2-diols (“reductones”), 2-alkoxy-en-1-ols, ene-1,2-diamines, and related species. Helvetica Chimica Acta (2002), 85(5), 1295-1326) に記載されている方法により化学的に合成される混合物を想定していない、すなわち、本発明は、次式（III）および（IV）の化合物の混合物には関しない：
【化５】
2010504310.tif 000007
【００１６】
１位の炭素はCH2であり、３位の炭素はCHであり、最後の位置の炭素はCH3であり、Schank et al.により述べられた条件下で合成される。対照的に、本発明は、以下の実施例に示す方法を用いて細菌およびその混合物により産生される化合物に関し、生成の態様に関わらず（特に、合成または微生物による）、前記化合物または本願明細書に記載されている混合物の組成物または適用における前記化合物および混合物、特にマルガウシンの使用に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、式（I）または（II）の化合物に関する：
【化６】
2010504310.tif 000008
【００１８】
式中、Aは、NR1、O、S、CR2R3およびR-(CH2)n-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、N、O、SまたはCであり、R1、R2、およびR3は置換基であり、nは１以上であり、特に２である。好ましくは、Ａは、NH、O、S、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である。
【００１９】
Ａを構成する原子上の置換基の存在または非存在ならびに１および／または３および／または５位における炭素上の置換基の存在または非存在に関する特定の形態は、独立して結合されてよい。
【００２０】
「本発明の化合物」という表現は、式（I）の化合物および式（II）の化合物の両方を包含し、すなわち、調製方法に関わらず、個々に扱われる。ある特定の実施形態において、本発明は、本願明細書中に記載されている式（I）の化合物、特に微生物により産生される式（I）の化合物、およびその使用に関する。
【００２１】
本発明は、Schankらによる方法を用いた化学合成により得られる混合物を除き、化合物（I）および（II）の比率に関わらず、これら２つの異性化合物の混合物にも関する。該混合物は、形態（I）および（II）のそれぞれの抗菌活性が均等でなくても、これら２つの形態を含んでよい。ある特定の実施形態において、前記混合物は、形態（I）および（II）を含んでなり、任意に、１つの形態のみが抗菌活性を有する。本発明の混合物の特定の実施形態において、形態（I）は抗菌活性を有する。
【００２２】
本発明は、式（I）または（II）の化合物を調製するための方法、特に、（ａ）細菌株を培養することと、（ｂ）特に精製により、培養上清から式（I）または（II）の化合物を回収することを含んでなるマルガウシンの調製方法にも関する。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明の方法に関して使用される細菌株は、ＪＰＬ８４またはＪＰＬ８６株であり、産生する化合物は、式（I）の化合物である。
【００２４】
「培養する」という用語は、細菌株、特にＪＰＬ８４株、または本明細書において定義されているような誘導株を、その生存または増殖を可能にする培養条件下に維持することを意味する。ある特定の実施形態において、培養は、式（I）もしくは（II）またはそれらの混合物の産生を伴うか、またはその産生を助長する。「培養する」という用語は、同じ意味の「発酵する」と互換可能に使用されてよい。
【００２５】
いずれの液体栄養培地も、与えられた細菌株、ＪＰＬ８４または誘導株を培養するのに適し、前記培地には、炭素源、窒素源および無機塩が含まれる。１つの実施形態において、酵母抽出物に基づく寒天培地であるＣＹＥ培地（casitone酵母抽出物）が好ましく、その組成は、例えば、ペプトン10 g/l、酵母抽出物1 g/lおよびCaCl2 1 g/lである。
【００２６】
当業者に既知の他の培養条件は、修飾されてよく、例えば、温度、培養の撹拌の存在または非存在、および培養の曝気の存在または非存在である。ある特定の実施形態において、細菌株、特にＪＰＬ８４株または誘導株は、０℃〜４５℃の範囲、好ましくは２０〜３７℃の範囲、より好ましくは２８℃の温度で、撹拌および曝気を伴って培養される（好気培養）。
【００２７】
上記条件下において、好ましい培養期間は、望ましい抗生剤の産生が最適化または最大化される時間に依存して、この培養期間は、培養が開始される時間に関連して計算される。それ故、前記培養期間は約１５〜２４時間であり、好ましくは１８〜２０時間の範囲である。
【００２８】
「精製」という用語は、培養上清の他の成分から望ましい抗生剤を単離することができるいずれかの技術を意味する。非限定的な実施例によると、溶媒抽出、沈殿、逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー等、またはこれらの技術の２以上の組み合わせが利用されてよい。
【００２９】
本発明の方法は、培養ステップ（ａ）と精製ステップ（ｂ）との間に任意のステップを含んでもよく、例えば遠心分離により、培養上清から細胞または他の細胞性細片を分離することからなる。
【００３０】
任意に、精製された抗生剤は、その後、有機酸または無機酸との標準反応により、薬学的に許容可能な無毒の塩を含む塩（塩形態）に変換されてよい。これらの塩は、特にＡとＮが等しい場合に得られる。
【００３１】
さらに、精製された抗生剤またはその塩は、凍結乾燥により、無水形態で得られてよい。
【００３２】
本発明は、本明細書に記載されている細菌を培養することを含む方法により得られる、上述した式（I）または（II）の化合物またはそれらの混合物も想定している。
【００３３】
上述した式（I）および（II）の異性体の混合物は、例えば、Schankらによる出版物（Chemistry of free cyclic vicinal tricarbonyl compounds (“1 ,2,3-triones”). Part 2. Redox reactions of 1,2,3-triones with ene-1,2-diols (“reductones”), 2-alkoxy-en-1-ols, ene-1,2-diamines, and related species. Helvetica Chimica Acta (2002), 85(5), 1295-1326）において開示されているような化学的合成により得ることもできる。この合成により、結果として混合物が生成され、そこから式（I）または（II）の化合物の１つが単離される。
【００３４】
本発明の化合物が上述したような細菌の培養方法により得られる場合、微量のその細菌性の産物を保存し、そのそれぞれのＣ１２／Ｃ１３比に違いが見られることにより、化学合成により産生された同じ化合物と区別することができる。化学的に合成された式（I）の化合物または式（II）の化合物は、細菌的な方法により得られた式（I）の化合物または式（II）の化合物とは異なったＣ１２／Ｃ１３比を有し、特に、本明細書において挙げられている細菌から得られる式（I）の化合物または式（II）の化合物とは異なる。特定の実施形態において、化学的に合成されたマルガウシンは、細菌的な方法により得られたマルガウシンとは異なるＣ１２／Ｃ１３比を有し、特に、本明細書において挙げられている細菌から得られるマルガウシンとは異なる。
【００３５】
少なくとも１の上述した式（I）または（II）の化合物を含んでなる組成物は、Schankらにより公開された方法を用いた化学合成により得られた場合の式（I）および（II）の化合物の混合物を除いて、本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
特定の実施形態において、本発明による組成物は、上述した細菌を用いた産生方法により得られる式（I）または（II）の少なくとも１の化合物、特に、株ＪＰＬ８４から得られる少なくとも１の式（I）の化合物を含んでなる。
【００３７】
さらに、本発明は、少なくとも１のトランスポーターおよび／または媒体、ならびに式（I）または（II）の化合物を含んでなる組成物に関する：
【化７】
2010504310.tif 000009
【００３８】
式中、Aは、NR1、O、S、CR2R3およびR-(CH2)n-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2であり、R1、R2、およびR3は置換基であり、nは１以上であり、特に２である。特定の実施形態において、前記組成物は、少なくとも１の媒体および少なくとも式（I）の化合物、特にマルガウシン（式IIIの化合物）を含んでなる。この組成物において、前記化合物は、化学合成または細菌の培養を含んでなる方法により得られる。
【００３９】
「媒体」と言う用語は、抗菌剤を組成物中に配合することを可能にするいずれかの物質を意味する。１つの好ましい実施形態において、前記媒体は、生理学的に許容可能な物質または物質の組み合わせであり、生物（例えば、ヒトでない哺乳動物、好ましくはヒト）と接触する組成物の使用に適しており、好ましくは毒性がない。そのような生理学的に許容可能な媒体の例は、水、生理食塩水、水と混和する溶媒、糖、結合剤、賦形剤、色素、植物油もしくは鉱油、水溶性ポリマー、表面活性剤、増粘剤もしくはゲル化剤、化粧用の薬剤、保存剤、アルカリ化剤もしくは酸化剤等である。本発明の特定の組成物は、医薬組成物であり、すなわち、それらは、治療または予防の目的で、生物に投与または適用するために構築される。これらの医薬組成物は、局所または全身の投与、特に注射による投与のための薬学的に許容可能な媒体を含み、摂取により生物に接触して適用され、固体の形態、ゲルの形態、液体の形態またはエアロゾルの形態で使用される。あるいは、本発明の組成物は、上述した生物と接触する物質に適用される。特定の実施形態において、前記組成物は、薬学的に許容可能な媒体およびマルガウシンを含んでなる。
【００４０】
本発明は、本明細書で定義されている少なくとも１の式（I）または（II）の化合物を、適切な場合には、本明細書で定義されているトランスポーターおよび／または媒体と共に含んでなり、さらに、異なり、微生物に対して活性を有する少なくとも１の第２の分子を含んでなる組成物にも関する。「活性分子」という表現は、化学的または生物学的な化合物、特に低分子量の化合物、例えば、微生物の活性を破壊し、中和し、または増殖を阻害する能力を有するペプチドを意味する。この活性分子は、例えば、抗生剤または殺菌剤であってよい。前記活性分子は、好ましくは、グラム陰性菌に対して活性を有する化合物および／または殺真菌性の化合物および／または以下の表３に挙げる化合物または以下の化合物：銀塩、ミノサイクリン、クロルヘキシジン、スルファジアジン、リファンピシン等から選択される。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明の化合物が単独もしくは混合物として、または本発明の組成物がクロストリジウム・ディフィシルに関する消化性の感染症を治療するために使用される場合、それを、例えば表６に挙げるような他の抗生剤と組み合わせて投与する必要はない。ＩＣＤの治療において、本発明の化合物は、いずれにしても腸内フローラを乱すことなく、クロストリジウム・ディフィシルに対して殺菌活性を有し；他の抗生剤と共に投与することは、腸内フローラを保存することに関して、本発明の化合物の驚くべき効果を相殺し得る。  もう１つの実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも２の上述した式（I）または（II）の化合物を含んでなるが、それらの構造、すなわちそれらの原子組成または種々の置換基の位置は相互に異なる。例として、前記組成物は、元素Ａの性質、元素Ａ上に位置する置換基および／または１位、３位および／または５位の置換基において異なる少なくとも２の式（I）の化合物を含んでなる。本発明の他の組成物は、元素Ａの性質、元素Ａ上に位置する置換基および／または１位、３位および／または５位の置換基において異なる、少なくとも２の式（II）の化合物を含んでなる。
【００４２】
本発明は、少なくとも１の式（I）の化合物および式（II）の化合物を含んでなる組成物も想定しており、ここで、Ａは前記２つの化合物で同一であり、NH、S、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である、すなわち、二重結合の位置に関して同じ化合物の２つの異性体を含んでなる。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、媒体またはトランスポーターも含んでなる。
【００４４】
本発明は、式（I）または（II）の化合物を、個々に用いて、または上述した混合物もしくは組成物として、薬剤として、特に抗生剤（微生物を殺し、または増殖を阻害する）および／または殺菌剤（細菌を殺し、または増殖を阻害する）として使用することにも関する。
【００４５】
特定の実施形態において、個々に用いられる、または本発明の混合物もしくは組成物として使用される式（I）または（II）の化合物は、グラム陽性菌（グラム染色）または脂質を含むいくつかの層で構成される薄い壁を有する細菌に対して殺菌活性を有する、すなわち、前記化合物は、前記細菌を殺し、またはそれらの増殖を阻害する。
【００４６】
特定の実施形態において、個々に用いられる、または本発明の混合物または組成物として使用される式（I）または（II）の化合物は、クロストリジウム属の細菌により引き起こされる感染を治療するために使用される。さらに、個々に用いられる、または本発明の混合物または組成物として使用される式（I）または（II）の化合物は、クロストリジウム・ディフィシルにより引き起こされる感染症、好ましくはクロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症（ＩＣＤ）、例えば、単純な下痢、抗生物質投与後の下痢、または偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）を治療するために使用される。好ましくは、薬剤としての使用は、式（I）または式（III）の化合物に関する。
【００４７】
本発明は、本発明の化合物、混合物または組成物に関し、特に、薬剤、好ましくは抗菌剤もしくは殺菌剤として使用するための、マルガウシンまたはそれを含んでなる組成物に関する。
【００４８】
その治療における使用または治療方法において（少なくとも１の式（I）または（II）の化合物を、個々に、または本発明の混合物もしくは組成物として生物に投与することを含む）、前記化合物、それを含んでなる混合物もしくは組成物は、固体の形態（カシェ剤、散剤、小ゲル（gelule）、ピル、坐剤、急速放出錠剤、胃耐性錠剤、遅延放出錠剤）、ゼラチン状の形態（ゲル、ポマード、クリーム、小卵（ovule））、液体形態（シロップ、注射用液、目薬）またはエアロゾル形態（スプレー、蒸気、ガス）であってよい。その薬剤の形態に依存して、本発明の化合物、混合物または組成物は、経口で、経口腔粘膜で、鼻に、眼に、耳に（耳の中に）、膣に、直腸に、非経口的に（静脈内、筋肉内、もしくは皮下）、経皮的に（transcutaneously, transdermallyもしくはpercutaneously）または皮膚性に投与されてよい。個々に、または本発明の混合物もしくは組成物として使用される式（I）または（II）の化合物の殺菌活性を腸内で促進することができる１つの投与形態または薬剤形態は、本発明の特定の実施形態を構成する。
【００４９】
投与量は、他の抗生剤または抗生剤の組み合わせについて通常使用される量である。指標によると、患者の年齢または体重、感染症の重篤度または段階、１日の投与回数または投与形態に依存して、30 mg/kg/日〜100 mg/kg/日の量で投与されてよく；主に成人においては、1g/日〜10g/日が通常である。
【００５０】
本発明は、細菌感染、特に今日まで投与されてきた抗生剤に耐性のある疾患の治療または予防治療において、細菌感染との闘いにおいて使用するための組成物の製造のために、個々に、または混合物として、式（I）または（II）の化合物を使用することにも関する。
【００５１】
「耐性疾患」という表現は、その由来が完全に、または部分的に細菌性であるいずれかの感染症を意味する。特に、本明細書において使用される「耐性疾患」という表現は、単独で使用されても、本発明の他の化合物もしくは他の活性分子と組み合わせて使用されても、少なくとも１の原因病原体が本発明の抗菌化合物に感受性である感染を包含する。引用される例は、多耐性の疾患（いくつかの分類の抗生剤に耐性）またはグラム陽性菌により引き起こされる全ての感染症である。
【００５２】
「治療」という用語は、少なくとも１の本発明の化合物または本発明の組成物を用いて得られる治療的な効果（微生物の死滅）、ならびに患者において（微生物の存在に関連して）見られる症状の改善または患者の状態の改善の両方を包含する。「治療」という用語は、感染の結果として生じる症状のような、１次的または２次的な感染点に適用可能である。
【００５３】
本発明の化合物、混合物および組成物は、特に院内感染の治療において使用される。
【００５４】
「予防」という用語は、予防の目的で、少なくとも１の本発明の化合物、混合物または組成物を使用することを意味し、すなわち、感染もしくは感染の疑いの後の症状の発現を予防すること、微生物またはその帰結による感染症、特に、細菌、特にグラム陽性菌による感染、特にクロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症のようなクロストリジウム属の細菌による感染症を予防することに向けられている。
【００５５】
本発明の化合物、混合物または組成物は、上述した薬剤形態および投与形態を使用する治療および予防において使用される。特定の実施形態において、使用される化合物は、マルガウシンまたは少なくともマルガウシンを含んでなる本明細書において定義されているいずれかの組成物である。
【００５６】
本発明は、化粧品、食品または家畜への適用（家畜、家禽、ブタ、ヒツジ、ウシもしくはペット）における本発明の化合物、混合物または組成物の使用にも関する。
【００５７】
単独で、または本発明の混合物もしくは組成物として使用される本発明の式（I）または（II）の化合物は、特に、クロストリジウム属の細菌、特に毒素産生性の形態、例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ノーヴィ菌（Clostridium novyi）、ヒストリチクス菌（Clostridium histolyticum）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、悪性水腫菌（Clostridium septicum）、クロストリジウム・ソルデリー（Clostridium sordellii）、クロストリジウム・ラモーザム（Clostridium ramosum）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Clostridium bifermentans）、クロストリジウム・パラパーフリンジェンス（Clostridium paraperfringens）、死体菌（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム・クロストリジフォルメ（Clostridium clostridiiforme）、クロストリジウム・イノキュウム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・リモーザム（Clostridium limosum）、クロストリジウム・パラプトリフィカム（Clostridium paraputrificum）、スポロゲネス菌（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム・サブテルミナレ（Clostridium subterminale）、クロストリジウム・テルチウム（Clostridium tertium）、クロストリジウム・バラティ（Clostridium baratii）、クロストリジウム・アルゲンチネンス（Clostridium argentinense）、ショーボー菌（Clostridium chauvoei）、溶血クロストリジウム（Clostridium haemolyticum）またはクロストリジウム spp.に対して有効である。クロストリジウム・ディフィシル菌に関して、本発明は、伝染性の株PCR-リボタイプ027のようなクロストリジウム・ディフィシルの毒素産生性形態により引き起こされる感染症の治療も想定している。一方で、クロストリジウム・ディフィシル（0.05μg/mlのオーダーのＭＩＣ）のようなクロストリジウム属の細菌における特に効果的な作用のため、他方では、腸内フローラの他の細菌と比較してクロストリジウム属の細菌に対するより優れた活性（３０倍以上の活性）のため、単独で、または本発明の混合物もしくは組成物として使用される本発明の式（I）または（II）の化合物、および特にマルガウシン（III）は、種々の腸内細菌集団（微生物フローラ）間の平衡を修復することにおいて有用である。本発明は、単独で、または本発明の混合物もしくは組成物として使用される本発明の式（I）または（II）の化合物、特にマルガウシン（III）を、クロストリジウム属の細菌による感染症、特にＩＣＤのようなクロストリジウム・ディフィシルによる感染症を治療するために使用することも想定している。１つの実施形態において、個々に、または本発明の混合物もしくは組成物として使用される本発明の式（I）または（II）の化合物は、ＩＤＳの継続的な抗菌治療に使用される。好ましい実施形態において、この化合物は、マルガウシンまたはマルガウシンを含んでなる組成物である（式（III）の化合物）。
【００５８】
本発明において特に想定される治療方法および予防用法は、クロストリジウム・ディフィシルにより引き起こされる感染症に罹患している患者、特に、（ａ）ＩＣＤに罹患している患者；（ｂ）重篤なＩＣＤに罹患している患者、（ｃ）ＩＣＤの再発に罹患している患者を対象とし、前記再発は、クロストリジウム・ディフィシルの株が前の発症のものと同じであっても異なっても、前の発症から８週以内に現れるＩＣＤの新しい発症により特徴付けられる。前記治療方法および予防方法は、院内のＩＣＤ（入院患者または４週間未満前に病院を去った非入院患者）およびコミューンのＩＣＤの両方に対して適用可能である。特に、これらの方法は、病院、老人ホームもしくは医療−社会（medico-social）施設の患者、ＩＣＤに関するリスクファクターを有する全ての患者、すなわち抗菌治療を受けている患者（９０％より多いケース）、６５歳以上の患者、重篤なサブジェイセント（subjacent）疾患の患者、鼻腹胃挿管を受けた患者、抗潰瘍剤を受けた患者および長期入院の患者に向けられている。
【００５９】
本発明は、医療機器（または医用材料）を含む装置の含浸のための、個々に、または上述した混合物もしくは組成物として使用される式（I）または（II）の化合物の使用にも関する。「含浸」という用語は、少なくとも１の本発明の化合物、混合物または組成物の適用を意味し、装置にそれを浸透させる（深くまたは表面に）ことを意味する。本発明は、本発明の化合物（個々に、混合物または組成物として）を浸透させた装置にも関する。特定の実施形態において、前記装置は医療装置であり、すなわち医学的な使用のための装置であり、その非限定的な例は、カテーテル、包帯、骨接合剤、大脳シャント、心臓弁等である。医用のための好ましい装置は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリド、ポリカーボネート、ポリウレタン、アクリレートもしくはメタクリレートまたはポリアミド、または製織により得られる材料のような重合材料から作られる装置である。ある特定の実施形態において、これらの装置は生体適合性である。
【００６０】
もう１つの実施形態において、前記含浸させた装置は、包帯のように、家庭的または工業的な使用のための布である。
【００６１】
本発明は、少なくとも１の本発明の式（I）または（II）の化合物を産生する能力を有する細菌株にも関する。特定の実施形態において、前記株は、以下のセクションＡ（方法および装置）で開示されている発酵条件下で本発明の化合物を産生する。これらの株は、個々に、または混合物として、式（I）または（II）の化合物、特にマルガウシンを産生し得る。例えば、そのような株は、受付番号CNCM I-3669で9月15日にTreaty of Budapest at the C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; Institut Pasteur; 25, rue du Docteur Roux; 75724 Paris Cedex 15; France)に寄託されたJPL84である。１つの実施形態において、先行する実施形態と組み合わせて、または組み合わせないで、前記細菌株はバチルス株である。
【００６２】
本発明は、上述した株に由来する株、特にJPL84株またはJPL86株に由来するいずれかの株にも関し、それらは、式（I）または（II）の化合物を産生する能力を有し、特に、マルガウシンを産生する能力を有する。「誘導体」という用語は、天然の状態においては見出されず、遺伝子型を修飾することにより天然株から得られる株、特に、本発明の式（I）または（II）の化合物を産生し続ける組み換え（組み換え株）により得られる株を意味する。特定の実施形態において、前記組み換え株は、天然株よりも本発明の化合物を多量に産生する。遺伝の修飾は、特に、酵素の修飾および本発明の化合物の産生および分泌に関する他のタンパク質からなる。
【００６３】
本発明は、生物学的なサンプルまたは表面の細菌プロフィールを調節するための方法にも関し、該方法は、細菌プロフィールを調節することができる条件下で、前記生物学的なサンプルまたは前記表面を、個々に、または混合物もしくは組成物として使用される少なくとも１の式（I）または（II）の化合物と接触させることを含んでなり；前記方法は、調節を確立するための第２のステップを含んでもよい。
【００６４】
本発明に関して、「細菌プロフィールを調節する」という表現は、本発明の化合物または組成物との接触の前後の間の、生物学的なサンプルまたは表面に存在する種々の細菌株の比を修飾することを意味する。
【００６５】
本発明の方法は、医療サービス（例えば病院の環境）における対象物の表面のような種々の対象物の表面を処理するのに適している。
【００６６】
前記生物学的なサンプルまたは表面が本発明の化合物に対して感受性である細菌のみを含む場合、または生物学的なサンプルまたは表面に含まれる株が本発明の組成物に対して感受性である場合、「細菌プロフィールを調節する」という表現は、細菌活性を中和すること、特に全ての細菌を死滅させること、すなわち細菌プロフィールを除去することを包含する。
【００６７】
対照的に、サンプルまたは表面が本発明の化合物または組成物に対して耐性またはほとんど感受性のない株および同じ化合物に対して感受性の株を含んでなる場合、「細菌プロフィールを調節する」という表現は、本発明の化合物に耐性の株とより感受性の株との間の比の調節を同期させることを意味する。例えば、本発明の化合物の添加は、グラム陽性菌を減少させ、グラム陽性／グラム陰性の株の比を調節する。
【実施例】
【００６８】
方法および装置
ＪＰＬ８４株
次式（III）の化合物であるマルガウシンは、フランスのAgout regionにおける排泄物から２００５年に単離された株、ＪＰＬ８４株により産生される：
【化８】
2010504310.tif 000010
【００６９】
式中において、１位の炭素はCH2であり、３位の炭素はCHであり、末端の炭素はCH3である。この株は、２００６年９月１５日にC. N. C. M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; Institut Pasteur, Paris, France)に寄託され、受付番号はCNCM I-3669である。RNA 16Sをコードする遺伝子のシークエンシングが行われ; the JPL84株はバチルスsp.の株であった。前記株は、1 lの水中における10gのカジトン（casitone）、1gの酵母抽出物、1gの CaCl2 およびアガロースゲルを含む斜位のCYE培地アガーゲル（CYEアガー）において、4℃に維持された。
【００７０】
発酵または培養
この株の発酵は、10 g/lのペプトン、1 g/lの酵母抽出物および1 g/lのCaCl2を含むCYE培地において行った。マルガウシンを産生するために、発酵は、10 lの上述したCYE培地中で、28℃で撹拌および曝気しながら行った。14時間の発酵後にマルガウシンは産生され始め、18〜20時間でピークに達した。抗菌剤の産生は、モニターされ、黄色ブドウ球菌に対するアガーゲルにおける拡散試験(CIP 76.25)および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量された。
【００７１】
精製
分子は、逆相クロマトグラフィーにより精製した：アセトニトリル(10% v/v) ならびに固定ビーズ (Amberlite XAD-16) を培養液に加えた。12時間撹拌しながら4℃に維持した。XAD-16ビーズが培養液から分離され、水および水／メタノール混合物(50/50) で洗浄し、メタノール (100%)で溶出した。この溶出物を減圧蒸留により濃縮した。最後に、マルガウシンを、H2O/0.1% TFA 直線勾配および20％〜80％のアセトニトリル/0.1% TFAのアセトニトリル/0.1% TFAを用いて、C18分離カラムにおいて、流速10 ml/minで30分、逆相HPLCにより精製した。凍結乾燥の後、30mgのマルガウシンを10Lの培養液から得た。
【００７２】
構造の決定
分子式は、分光学的な技術の組み合わせにより決定された：1次元および２次元のＮＭＲおよび質量分析法。
【００７３】
13C, DEPT, 1H, COSY, HMQCおよびHMBC分析は、1H について300 MHz および13C について75 MHz で動作する直接的な5 mm QNP プローブを備えたBruker Advance DPX-300を有するCD3OD媒質中において行われ、表１に示されている。
【００７４】
生物学的特性
ａ．最小阻止濃度（ＭＩＣ）の決定および多耐性細菌における試験
最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、CLSI/NCCLS スタンダード (National Committee for Clinical Laboratory Standards (2003))に従って、ミュラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ）中における微量希釈により、参照株に対して評価された。希釈抗菌感受性についての方法は、好気的に増殖する細菌に対して試験する−第６版: Approved standard M07-A6.  NCCLS, Villanova, PA, USA。
【００７５】
ＭＩＣは、37℃で18時間培養した後、細菌株の全ての目に見える培養が阻害されるマルガウシンの最低濃度として決定される。  
マルガウシンの抗菌活性は、表２および３に示す。
【００７６】
ｂ．マルガウシンのインビトロ毒性の評価
マルガウシンのインビトロ毒性は、乳癌細胞株(MCF7)において測定され; 簡単に言うと、96ウェル培養皿(dist)は、10％胎児ウシ血清を含むRPMI培地において、MCF7 細胞 (ATCC HTB-22(商標), 約10000 細胞/ウェル)と共に培養された(t=0)。t+1 (培養の開始に対して)において、試験分子が加えられた。t+2において、Heeg K et al (J Immunol Methods 1985, March 18; 77(2): 237-46)に従ってMTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド) を組み込むことにより、細胞毒性が測定された。細胞毒性の結果は、表４に示す。
【００７７】
ｃ．マルガウシンのインビボ毒性の評価
３匹の雌の25gのOF1マウスに、腹腔内投与により、10％メタノールおよび90％ H2O中の 12.5 mg/ml のマルガウシンの溶液200μlを投与した(すなわち100 mg/kgの用量)。マウスの生存は、T24、T48、T72およびT96 (時間)において行った。
【００７８】
ｄ．細菌感染症におけるマルガウシンのインビトロでの効果の測定
分子は、細菌の腹腔内投与によりOF1マウスを感染させた後、黄色ブドウ球菌による敗血症のモデルにおいて試験した。
【００７９】
全部で11匹の雌の25 g OF1マウス(Charles River)について、時間T0において、3匹のマウスは、LB + 5% ムシン(mucine)200μlの腹腔内投与を受け(飼育状態をモニタリング)、8匹のマウスは、LB培地 + 5% ムシン中の黄色ブドウ球菌Smith (108 CFU/ml)の細菌懸濁液200μlの腹腔内投与を受けた（感染マウス）。
【００８０】
8匹の感染マウスは、2のバッチに分けられた：t＋3時間において、5匹のマウスは、10％メタノールおよび90％ H2O中のマルガウシンの溶液12.5 mg/ml (すなわち100 mg/kgの用量)を投与され、残りの3匹のマウスは、マルガウシンの投与を受けなかった(感染モニタリング)。  
マウスの生存は、24および48時間にチェックされた。
【００８１】
Ｂ.結果
構造
構造分析は、マルガウシンの実験式がC12H18O3であることを示した。  
ESI-MS分析は、マルガウシンについて210Daの分子量を与えた。
【００８２】
13C NMRは5のシグナルを示し(40.4, 71.6, 95.6, 105.0および170.2)、1H NMRは２つの群のシグナルを示した (表１):
・13Cスペクトル上の目に見える共鳴を有する炭素に結合したプロトンに対応する3 1Hシグナル ( 2.66, 3.63および5.81 ppm)を伴う第１の群、全てのシグナルはシングレットである；
・13Cスペクトル上の目に見えない共鳴を有する炭素に結合した、前記第１の群とほぼ同一の化学シフトを有する21Hシグナルを伴う第２の群。それらは、マルガウシンのアルコール形態に対応する。
【００８３】
3.63ppmにおける保護されていないメチレン基は、酸素原子およびα位におけるカルボニル基の存在に起因する。
【００８４】
プロトンはα位から四級炭素またはヘテロ原子に存在するため、ＣＯＳＹスペクトルは、いずれの相関関係も示さなかった。
【００８５】
２つの四級炭素(170.2 および105 ppm)、メチン (95.6 ppm)、メチレン (71.6 ppm) および２つの均等なメチル基 (40.4 ppm)の存在は、DEPTスペクトルから推測される（表１）。
【００８６】
13C-1H結合を介してこれらの炭素に結合したプロトンの帰属は、HMQCスペクトルを用いて得られた。マルガウシンの構造は、HMBCスペクトルおよび連結ピーク(linked peak)C1/H3、C2/H3およびC2/H5とのその長い距離のスカラー相互作用により確認された。
【表１】
2010504310.tif 000011
【００８７】
NMRデータと質量情報との組み合わせは、分子が対称的であることを示す。m/z＝211の分子イオンにおいて行われたMS/MS実験は、図１に示された構造と完全に一致する一連のフラグメントを産生した（得られたイオン：193, 175, 169, 165, 153, 151, 147, 141, 133, 129, 123, 119, 111 , 109, 105, 95, 93, 91, 85, 83, 81, 79, 71, 69, 67, 65, 57, 55, 43）。UV吸収スペクトルは、２つの極大λmax：269および330を示した。
【００８８】
マルガウシンの構造は、図１に示し、1,1’-オキシビス[4-メチルペント-3-エン-2-オン]と命名される。
【００８９】
最小阻止濃度（ＭＩＣ）
種々のグラム陽性またはグラム陰性菌ならびに酵母に対するマルガウシンのＭＩＣを測定し、表２に示した。
【００９０】
マルガウシンは、グラム陽性菌に対してのみ活性があるが、グラム陰性菌に対する抗菌活性もカンジダ・アルビカンス（酵母）に対する抗真菌活性も有さない。非常に重要なことには、本実験は、大腸菌toIC株（グラム陰性菌）がマルガウシンに対して感受性であることを示している。このtoIC株は、流出ポンプ系に関して不完全であり、グラム陰性菌に対するマルガウシンの不活性の原因は、細菌壁（グラム陰性菌については脂質層を含むいくつかの層で構成され、グラム陽性菌についてはムレインの単一の薄い層で構成される）の透過の問題に関係すると仮定され得ることを意味する。さらに、表２は、分子がグラム陽性菌に対して、3.125μg/mlの低い濃度、クロストリジウム・ディフィシルに対しては0.05μg/mlで有効であることを示す。
【表２】
2010504310.tif 000012
【００９１】
最後に、マルガウシンが黄色ブドウ球菌の種々の株(H1, H3, H4, H7, H9, H16およびH18)のような多耐性のグラム陽性菌に対しても活性を有することを示した（表３）。
【表３】
2010504310.tif 000013
【００９２】
（Ｒ：関係する抗菌剤に耐性の株；Ｓ：関係する抗菌剤に感受性の株；Ｌ：関係する抗菌剤に中間の耐性を有する株；−：試験せず；＊：上述した方法で測定したＭＩＣ）。
【００９３】
交差耐性は、商業的な抗菌剤について観察されなかった；さらに、ランダム変異の後でも、突発性の耐性株は単離されなかった。
【００９４】
インビトロおよびインビボでの毒性
グラム陽性菌と闘うためのインビボでのマルガウシンの使用を想定する前に、毒性試験がインビトロ（細胞培養）およびインビボ（動物）において行われた。
【００９５】
最初に、表４に示すように、1〜100mg/mlの濃度のマルガウシンで処理したMCF7細胞の細胞培養において細胞毒性がないことが測定された。実際に、マルガウシンで処理された培養における細胞の数は、対照培養（抗菌剤なし）の場合と同じであった。
【表４】
2010504310.tif 000014
【００９６】
さらに、100mg/kgの用量で動物にマルガウシンを投与した場合、3匹のマウスで毒性が生じず、96時間後も生きていた。それ故、これらの結果は、マルガウシンがインビトロで無害であることを示す。
【００９７】
結果として、マルガウシンは、100mg/kgの濃度では、インビトロおよびインビボの両方で真核細胞に対して毒性がない。
【００９８】
インビボでの効果
最後に、インビボでのマルガウシンの効果を、黄色ブドウ球菌を伴う敗血症のマウスモデルにおいて評価した。その結果を表５にまとめる。
【表５】
2010504310.tif 000015
【００９９】
（−：なし；＋：あり）
これらの結果は、黄色ブドウ球菌による感染症は、抗菌剤を投与されないマウスの100％で致死的であることを示す。対照的に、100mg/kgのマルガウシンを投与された5匹のマウスのうち3匹は生存した。
【０１００】
結論として、これらの結果は、一方でインビトロＭＩＣ試験を示し、他方でマルガウシンがブドウ球菌のようなグラム陽性菌に対してインビボで抗菌活性を有することを示す。
【０１０１】
クロストリジウム・ディフィシルに対するいくつかの分子のＭＩＣの比較
以下の表６は、現在使用されている、または臨床試験中である（第III相）他の分子のクロストリジウム・ディフィシルに対して測定された最小阻止濃度（μg/ml）を示す。
【表６】
2010504310.tif 000016
【０１０２】
クロストリジウム・ディフィシルの感染におけるマルガウシンのインビトロ効果
前記分子は、大腸炎を誘発するためにクリンダマイシン（体重当り10 mg/kg）を皮下注射した後、クリストリジウム・ディフィシルによる感染のモデル（体重60g〜80gのゴールデンシリアンハムスター（20動物のバッチ））において試験された。クリンダマイシンの投与と同時に、または投与してから24時間後に、ハムスターは、クロストリジウム・ディフィシルの病原性臨床株を経口的に接種された（動物当り105株）。あるいは、前記クロストリジウム・ディフィシルの病原性株は、株ATCC 43255であった。
【０１０３】
クロストリジウム・ディフィシルの接種の1時間後、ハムスターは、胃管栄養法によりマルガウシンで処理された（体重当り10〜200 mg/kg）。この処理は、1日1回同じ量のマルガウシンで3日間繰り返された。
【０１０４】
対照は、同じ条件下で使用された：20動物のバッチは、クリストリジウム・ディフィシルによる感染はなく、および／またはマルガウシンにより処理されない。  
前記実験は、現在進行中である：動物は30日間観察され、瀕死の動物がカウントされ、屠殺される。
【０１０５】
結論
新規化合物であるマルガウシンは、抗菌活性を有し、細菌株により産生されることが確認された。この化合物は、構造的に特徴付けられ、低分子量である。さらに、マルガウシンは、広範なグラム陽性スペクトルを有し、無毒であり、動物感染モデルにおいて有効であり、いずれの既知の耐性とも交差しない。類似の構造を有し、抗菌活性を有する他の化合物も、本明細書中で示されており、抗生剤としての適用に対するこの群の化合物の重要性を示している。
【０１０６】
クロストリジウム・ディフィシルのようなクロストリジウム属の細菌における低濃度（0.05μg/mlオーダーのMIC）での特に効果的な活性のため、本発明の化合物または組成物、特にマルガウシンは、クロストリジウム・ディフィシルに関する消化性の感染、特に抗菌治療に続くクロストリジウム・ディフィシルによる腸管の感染症に対して高い治療ポテンシャルを示す。さらに、市販の抗生剤と比較して、本発明の化合物または組成物は、腸内フローラの他の細菌の３０倍以上の活性をクロストリジウム・ディフィシル菌に対して示す。これらの結果は、本発明の化合物または組成物を、市販の抗生剤と比較してクロストリジウム・ディフィシルによる感染の治療において選択される抗生剤とする。
【０１０７】
比較を目的として、クロストリジウム・ディフィシルによる感染症を治療するために現在使用されている分子を以下に示す：
（ａ）バンコマイシンは、最も重篤なケースを治療するために使用される（クロストリジウム・ディフィシルに対して1μg/mlのオーダーのMIC）：しかしながら、バンコマイシンは、他の最も重篤な細菌性の感染症、特にスタフィロコッカスによる感染症の治療に既に使用されており、多くの耐性株の出現を導く；耐性の拡大および新規の耐性株の出現を避けるために、その使用は、医療コミュニティによりできるだけ制限されている；
（ｂ）メトロニダゾールは、第１選択薬として使用されるが、25％の患者に対して不活性であり、頻繁な再発が記録されている（25％のケース）；さらに、メトロニダゾールはバンコマイシンよりも安価であるが、多くの副作用を伴う。
【０１０８】
現在臨床試験中の他の分子も、本発明の化合物と比較されている：
（ａ）ニタゾキサニド（第III相、Romark Laboratories LC）、作用がメトロニダゾールに類似している分子；しかしながら、この分子は、妊娠中または授乳中の女性には奨められない；
（ｂ）リファキシミン（キシファキサン）（第III相、Salix Pharmaceuticals）、リファンピシンに由来する分子；その最小阻止濃度（MIC）は、クロストリジウム・ディフィシルについて0.08〜0.2μg/mlのオーダーであり、この分子は、多くの自然発生の耐性を生じる；
（ｃ）リピアルマイシン（OPT-80）（第III相、Optimer Pharmaceuticals）、最小阻止濃度（MIC）は、クロストリジウム・ディフィシルに対して0.06〜0.2μg/mlである（Antimicrob Agents Chemother, 2004 Dec; 48(12); 4898-902）。
【０１０９】
結論として、本発明の化合物またはそれを含んでなる組成物、特にマルガウシンは、クロストリジウム・ディフィシル（ICD）に関連する消化性の感染症の治療において、既に市販されている、または現在臨床試験中の治療的な分子に対する魅力的な代替の提案を構成する。
【図１】
2010504310.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月22日(2009.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（I）または（II）の化合物：
【化１】
2010504310.tif 000033
式中、AはNR1、S、CR2R3およびR-(CH2)n-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2であり、R1、R2およびR3は置換基であり、nは1以上、特に2である。
【請求項２】
請求項１に記載の式（I）または（II）の化合物であって、Aは、NH、S、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である化合物。
【請求項３】
次式（I）または（II）の化合物を調製する方法であって、
ａ）細菌株を培養する工程と；
ｂ）培養上清から式（I）または（II）の化合物を精製する工程と
を含んでなる方法：
【化２】
2010504310.tif 000034
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である。
【請求項４】
請求項３に記載の調製方法であって、前記細菌株は、2006年9月15日にCNCMに寄託され、受付番号CNCM I-3669のJPL84である方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の調製方法であって、産生される化合物は
【化３】
2010504310.tif 000035
である方法。
【請求項６】
次式（I）または（II）の化合物であって、
【化４】
2010504310.tif 000036
（式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である）
ａ）細菌株を培養する工程と；
ｂ）培養上清から式（I）または（II）の化合物を精製する工程
とを含んでなる方法により得られる化合物。
【請求項７】
請求項６に記載の化合物であって、前記細菌株は、2006年9月15日にCNCMに寄託され、受付番号CNCM I-3669のJPL84である方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の化合物であって、次式で表される化合物。
【化５】
2010504310.tif 000037
【請求項９】
請求項８に記載の化合物であって、1位の炭素はCH2であり、3位の炭素はCHであり、最後の位置の炭素はCH3であることを特徴とする化合物。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の化合物であって、化学的に製造された同一の化合物とは異なるC12／C13比を有する化合物。
【請求項１１】
以下を含んでなる組成物：
ａ）次式（I）もしくは（II）の化合物または該化合物の混合物；
【化６】
2010504310.tif 000038
（式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である）
および
ｂ）少なくとも１の薬学的に許容可能な媒体。
【請求項１２】
以下を含んでなる組成物：
ａ）次式（I）もしくは（II）の化合物または該化合物の混合物；
【化７】
2010504310.tif 000039
（式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である）
ならびに
ｂ）微生物に対して活性を有する少なくとも１の第２の分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、さらに薬学的に許容可能な媒体を含んでなる組成物。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の組成物であって、前記微生物に対して活性を有する少なくとも１の第２の分子は抗生剤であることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物であって、式（I）の化合物および式（II）の化合物を含んでなることを特徴とする組成物：ここで、Aは、前記２つの化合物において同一であり、NH、S、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である。
【請求項１６】
薬物としての使用のための、式（I）または（II）の化合物：
【化８】
2010504310.tif 000040
式中、Aは、NH、O、S、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SまたはCH2である。
【請求項１７】
抗生剤または殺菌剤としての使用のための、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
細菌性の感染症の治療または予防における使用のための、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
グラム陽性菌の感染症の治療または予防における使用のための、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
クロストリジウム属に由来する細菌による感染症の治療または予防において使用するための、請求項１８または１９に記載の化合物。
【請求項２１】
クロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症の治療または予防において使用するための、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
抗生剤治療に続くクロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症の治療または予防において使用するための、請求項２０または２１に記載の化合物。
【請求項２３】
腸内細菌フローラの平衡の修復において使用するための、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
薬剤としての使用のための、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物から選択される組成物または次式（I）もしくは（II）の化合物を含んでなる組成物：
【化９】
2010504310.tif 000041
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項２５】
抗生剤または殺菌剤としての使用のための、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
細菌性の感染症の治療または予防における使用のための、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
グラム陽性菌感染症の治療または予防における使用のための、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
クロストリジウム属に由来する細菌による感染症の治療または予防において使用するための、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
クロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症の治療または予防において使用するための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
抗生剤治療に続くクロストリジウム・ディフィシルに関連する消化性の感染症の治療または予防において使用するための、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
腸内細菌フローラの平衡の修復において使用するための、請求項２６〜２９のいずれか１項
に記載の組成物。
【請求項３２】
細菌性の感染症の闘病において使用する組成物を製造するための、請求項１６に記載の式（I）または（II）の化合物の使用。
【請求項３３】
医療機器の含浸のための、請求項１６に記載の式（I）または（II）の化合物の使用。
【請求項３４】
医療機器の含浸のための、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物から選択される組成物、または次式（I）もしくは（II）の化合物を含んでなる組成物の使用：
【化１０】
2010504310.tif 000042
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項３５】
次式（I）または（II）の化合物を含浸させた医療機器：
【化１１】
2010504310.tif 000043
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項３６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物または次式（I）もしくは（II）の化合物を含んでなる組成物を含浸させた医療機器：
【化１２】
2010504310.tif 000044
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項３７】
カテーテル、包帯、骨接合剤、大脳シャントまたは心臓弁である、請求項３５または３６に記載の機器。
【請求項３８】
次式（I）または（II）の化合物を産生することができる細菌株：
【化１３】
2010504310.tif 000045
式中、Aは、NH、S、O、CH2およびR-(CH2)2-R’から選択され、RおよびR’は、相互に独立して、NH、O、SもしくはCH2である。
【請求項３９】
2006年9月15日にCNCMに寄託され、受付番号CNCM I-3669のJPL84である、請求項３８に記載の細菌株。
【請求項４０】
請求項３８または３９に記載の細菌株に由来する株であって、式（I）または（II）の化合物を産生する能力を有することを特徴とする株。
【請求項４１】
請求項４０に記載の株であって、次式の化合物を産生する能力を有することを特徴とする株：
【化１４】
2010504310.tif 000046
式中、１位の炭素はCH2であり、３位の炭素はCHであり、最後の位置の炭素はCH3である。
【請求項４２】
生物学的なサンプルまたは表面の細菌プロフィールを修飾する方法であって、前記サンプルまたは前記表面を請求項１６に記載の少なくとも１の式（I）もしくは（II）の化合物、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物または式（I）もしくは（II）の化合物を含んでなる組成物と接触させることを含む方法。
【国際調査報告】
2010504310.tif 000047
2010504310.tif 000048
2010504310.tif 000049
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