(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺機能低下症を発症するリスクのあるイヌを同定する方法であって、イヌが、ＢＩＣＦ２Ｓ２２９１８２６、ＢＩＣＦ２Ｐ６４４９４０、ＢＩＣＦ２Ｓ２３６２０６４７、ＢＩＣＦ２Ｐ１０１０２５２、ＢＩＣＦ２Ｓ２２９９０８３、ＢＩＣＦ２Ｐ３２５１５８、ＢＩＣＦ２Ｇ６３０６１９８４８、ＢＩＣＦ２Ｇ６３０６６４６７２、ＢＩＣＦ２Ｓ２３０９６８２、ＢＩＣＦ２Ｐ６７６０１９、ＴＩＧＲＰ２Ｐ２５９８６８＿ｒｓ８８２６８７９、ＢＩＣＦ２Ｓ２３４１２４２４、ＢＩＣＦ２Ｐ８９１７３７、ＢＩＣＦ２Ｇ６３０４３２２２、ＢＩＣＦ２Ｇ６３０４４１７０、ＢＩＣＦ２Ｐ１０４９５１５、ＢＩＣＦ２Ｇ６３０４４５８０、ＢＩＣＦ２Ｇ６３０４４７０２、ＢＩＣＦ２Ｓ２３１３９６２８、ＢＩＣＦ２Ｐ７７７６３５、ＢＩＣＦ２Ｐ１２８１９４５、ＢＩＣＦ２Ｐ７８２０９２、ＢＩＣＦ２Ｇ６３０７３４８１０、ＢＩＣＦ２Ｇ６３０７４１３３９、ＢＩＣＦ２Ｐ１１７１４９５、ＢＩＣＦ２Ｐ９８９２６６、およびＢＩＣＦ２Ｓ２２９５５３２５から選択される、一つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を示すかどうかを調べることを含む、方法。
【請求項２】
甲状腺機能低下症が、リンパ性甲状腺炎、および甲状腺の特発性萎縮から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一つ以上のＳＮＰの存在がＳＮＰマイクロアレイによって同定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
当該ＳＮＰが、ＢＩＣＦ２Ｐ６７６０１９、ＴＩＧＲＰ２Ｐ２５９８６８＿ｒｓ８８２６８７９、ＢＩＣＦ２Ｓ２３４１２４２４、およびＢＩＣＦ２Ｐ８９１７３７から選択される一つ以上のＳＮＰを含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
甲状腺機能低下症を発症するリスクのあるイヌを同定するための診断キットであって、表１に列挙した一塩基多型（ＳＮＰ）から選択される一つ以上のＳＮＰを認識する配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを、使用説明書と共に含む、キット。
【請求項６】
甲状腺機能低下症が、リンパ性甲状腺炎、および甲状腺の特発性萎縮から選択される、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
ＳＮＰが、ＢＩＣＦ２Ｐ６７６０１９、ＴＩＧＲＰ２Ｐ２５９８６８＿ｒｓ８８２６８７９、ＢＩＣＦ２Ｓ２３４１２４２４、およびＢＩＣＦ２Ｐ８９１７３７から選択される一つ以上のＳＮＰである、請求項５または６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
イヌの甲状腺機能低下症は、最も一般的なイヌの内分泌性の問題である。これは、甲状腺ホルモン（Ｔ３／Ｔ４）の不足によって特徴づけられる。代謝性の結果には、体重増加、嗜眠、寒冷不耐症、心拍低下、および熱サイクルの欠如が含まれる。イヌは、典型的に、脱毛や外観の脆化を示したり、皮膚が乾燥したり、熱くなったり、腫れぼったくなったり、暗く着色したりする。イヌの中には、二次性の脂漏症を発症するものもある。発症率の推定値は、１５６匹中１匹から５００匹中１匹の範囲である。疾病の発症は、典型的に中年である（４−６歳）。現在の治療は、典型的に甲状腺ホルモンの補給によってなされ、一般的には合成Ｌ−チロキシン（Ｌ−Ｔ４）による。治療の効果があるイヌの予後は良好である；しかしながら、甲状腺機能低下症は、進行性の疾病であり、治療の効果があるイヌは定期的にモニターし、投薬用量を必要に応じて調整するべきである。一次性の甲状腺機能低下症には二つの組織学的分類がある。一つ目は、リンパ性甲状腺炎であり、甲状腺組織のリンパ球浸潤によって特徴づけられ、二つ目は、特発性萎縮であり、甲状腺組織がほとんど破壊されているリンパ性甲状腺炎末期と考えられている。イヌの甲状腺機能低下症は自己免疫症状と考えられており、甲状腺ホルモンおよびサイログロブリンに対する抗体が、発症したイヌの血清においてしばしば発見される。甲状腺機能低下症には、種の素因もまた存在し、このことは当該疾病には何らかの遺伝性の構成要素があること、および遺伝子関連解析によって当該疾病に何らかの洞察を与え得ることを示す。
【０００２】
甲状腺機能低下症の的確な診断は、課題を提示する。一般的に正常レベルの遊離のＴ４はイヌが甲状腺機能低下症でないことを示すが、一回の試験での低めの正常レベルの、または正常レベルより低いＴ４が必ずしも甲状腺機能低下性であることを意味するのではない。より的確な診断は、甲状腺ホルモンに対する自己抗体と共に遊離のＴ３およびＴ４と総Ｔ３およびＴ４をも評価する全甲状腺パネル試験によって得ることができる。サイログロブリンの自己抗体アッセイもまた使用可能であるが、当該抗体は、自己免疫甲状腺炎のイヌの約５０％においてのみ、検出可能なレベルで存在している。ある組織は、イヌが繁殖に適しているかどうかを同定するのを助けるため、甲状腺機能低下性の登録を継続しているが、イヌの甲状腺機能低下症の特異的な遺伝子マーカーは明らかになっていない。診断はしばしば、イヌをすでに繁殖させた後に明らかとなる。甲状腺機能低下症は進行性の自己免疫疾患であるため、イヌが当該症状の潜在的保因者であると同定するのに加えて、当該疾病の発症初期にイヌを診断して治療することに利点がある。当該疾病のリスクが上昇しているイヌを同定して治療する、改善された方法が必要とされている。
【０００３】
他のイヌの自己免疫疾患または症状には、リンパ性甲状腺炎および甲状腺の特発性萎縮、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、または天疱瘡が含まれる。甲状腺機能低下症の場合のように、特に初期の治療が決定的に重要であるため、不可逆的な組織または器官の損傷が生じる前に、当該疾病のリスクが上昇しているイヌを同定して治療する、改善された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
ある実施形態では、本発明は、自己免疫疾患または症状、例えば甲状腺機能低下症または症状、例としてリンパ性甲状腺炎および甲状腺の特発性萎縮を発症するリスクのあるイヌを同定する方法であって、下記の表１に列挙した一塩基多型（ＳＮＰ）、またはイヌの第１９染色体のＴＮＩＰ３遺伝子の遺伝子座上または付近のＳＮＰから選択される一つ以上のＳＮＰをイヌが示すかどうかを調べることを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は当該方法を実行するための診断キットを提供する。別の実施形態では、本発明は、自己免疫疾患または症状の治療または予防の方法であって、有効な量の茶抽出物を、それを必要とするイヌに投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は茶抽出物を含むイヌの食餌またはサプリメントを提供する。
【０００５】
本発明のさらなる適用範囲は、以下に提供される詳細な説明から明らかであろう。詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、例証のみを目的とすることを意図し、本発明の範囲を限定することを意図していないことは、理解されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
以下の好ましい実施形態の説明は、単にあくまで例示するものであり、当該発明、その適用、または使用を限定することを意図したものでは決してない。
【０００７】
全体を通して使用されているように、範囲は、当該範囲内にあるそれぞれの、および全ての値を述べるための省略表現として使用されている。当該範囲内のいずれの値も、その範囲の終端として選択することができる。加えて、本明細書に引用されている全ての参考文献は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。本開示の定義と引用した参考文献の定義とに矛盾が生じた際は、本開示が支配する。
【０００８】
特に他に記載されない限り、本明細書の当該部分または他の部分で示した全ての割合および量は、重量パーセントを指していると理解されるであろう。与えられた量は、物質の有効重量（active weight）に基づいている。
【０００９】
本発明に関して、「治療する」または「治療」という用語は、本明細書で用いられる場合、当該用語が適用される疾患または症状の進行を、または当該疾患または症状の一つ以上の症候を、回復する、軽減する、緩和する、または阻害することを意味している。本明細書および添付した請求項で使用される場合、単数形である「a」、「an」、および「the」は、文脈が他を明確に指示しない限り、複数を包含する。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は、自己免疫疾患または症状を発症するリスクのあるイヌを同定する方法であって、以下の表１に列挙した一塩基多型（ＳＮＰ）、およびイヌの第１９染色体のＴＮＩＰ３遺伝子の遺伝子座上または付近のＳＮＰから選択される一つ以上のＳＮＰをイヌが示すかどうかを調べることを含む方法（方法１）を提供する。例えば、以下の方法である。
１．１．自己免疫疾患が、甲状腺機能低下症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、Ｉ型糖尿病、あるいは天疱瘡から選択される、方法１。
１．２．自己免疫疾患または症状が、甲状腺機能低下症または症状、例えばリンパ性甲状腺炎および甲状腺の特発性萎縮である、方法１または１．１。
１．３．一つ以上のＳＮＰの存在を、下記から選択される方法によって測定する、上記に記載のいずれかの方法。（ｉ）配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用するハイブリダイゼーション方法（例えば、ダイナミックアレルスペシフィックハイブリダイゼーション（dynamic allele-specific hybridization）、モレキュラービーコン、ＳＮＰマイクロアレイ）、（ｉｉ）制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ポリメラーゼ連鎖反応方法（例えば、ＳＮＰの検出を可能にする特異的なプライマーを用いたテトラプライマーＡＲＭＳ−ＰＣＲ）、単一ヌクレオチド不適正塩基対の検出を可能にするフラップエンドヌクレアーゼ、プライマー伸長技術（例えば、ＳＮＰヌクレオチドの隣接した上流の塩基にプローブをハイブリダイゼーションした後、ＤＮＡポリメラーゼがＳＮＰヌクレオチドに相補的な塩基を付加することによってハイブリダイズしたプライマーを伸長させる「ミニシーケンス」反応を行う）、ＳＮＰを含む領域を増幅するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いる５’−ヌクレアーゼ、およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを例とする酵素に基づく技術、（ｉｉｉ）一本鎖高次構造多型分析、温度勾配ゲル電気泳動、変性高速液体クロマトグラフィー、全増幅産物の高分解能融解、ＤＮＡ不適正塩基対結合タンパク質の利用、およびＳＮＰｌｅｘ（Applied Biosystems）のような市販のシステムを例とする、ＤＮＡの物理的特性に基づく増幅後の方法。
１．４．一つ以上のＳＮＰを、ＳＮＰマイクロアレイ、例えばIllumina CanineHD BeadChip（http://res.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_caninehd.pdf）を用いて同定する、上記に記載のいずれかの方法。
１．５．ＳＮＰが第１９染色体のＴＮＩＰ３遺伝子の遺伝子座上または付近の一つ以上のＳＮＰを含む、前述のいずれかの方法。
１．６．ＳＮＰが表１で同定されたＳＮＰのうちの一つ以上から選択される、前述のいずれかの方法。
１．７．ＳＮＰがＢＩＣＦ２Ｐ６７、ＴＩＧＲＰ２Ｐ２、ＢＩＣＦ２Ｓ２３、およびＢＩＣＦ２Ｐ８９から選択される一つ以上のＳＮＰを含む、前述のいずれかの方法。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は自己免疫疾患または症状、例えば甲状腺機能低下症または症状、例としてリンパ性甲状腺炎および甲状腺の特発性萎縮を発症するリスクのあるイヌを同定するための、表１に列挙した一塩基多型（ＳＮＰ）および第１９染色体のＴＮＩＰ３遺伝子の遺伝子座上または付近のＳＮＰから選択される一つ以上のＳＮＰを認識する配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを、使用説明書と共に含む診断キット（キット１）を提供する。
１．１．自己免疫疾患が、甲状腺機能低下症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、Ｉ型糖尿病、または天疱瘡から選択される、キット１。
１．２．自己免疫疾患または症状が、甲状腺機能低下症または症状、例えばリンパ性甲状腺炎および甲状腺の特発性萎縮である、キット１または１．１。
１．３．ＳＮＰが第１９染色体のＴＮＩＰ３遺伝子の遺伝子座上または付近の一つ以上のＳＮＰを含む、上記に記載のいずれかのキット。
１．４．ＳＮＰが表１で同定されたＳＮＰのうちの一つ以上から選択される、前述のいずれかのキット。
１．５．ＳＮＰがＢＩＣＦ２Ｐ６７、ＴＩＧＲＰ２Ｐ２、ＢＩＣＦ２Ｓ２３、およびＢＩＣＦ２Ｐ８９から選択される一つ以上のＳＮＰを含む、前述のいずれかのキット。
【００１２】
別の実施形態では、本発明はイヌの自己免疫疾患または症状、例えば甲状腺機能低下症または症状、例としてリンパ性甲状腺炎および甲状腺の特発性萎縮の治療または予防の方法を提供するものであり、本方法は、方法１（本文参照）のいずれかの方法によって、甲状腺機能低下症または症状を発症するリスクのあるイヌを同定すること、および免疫Ｔ細胞レパートリーを形成する上で重要であり、その機能障害が自己免疫疾患を引き起こし得る転写因子ＮＦ−κＢを制御するのに有効な量の抗炎症薬または天然物／機能性成分を、当該方法で同定したイヌに投与することを含む。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、イヌの自己免疫疾患または症状、例えばＴＮＦαおよび／またはインターロイキン６（ＩＬ−６）によって媒介される自己免疫症状、例えば甲状腺機能低下症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、Ｉ型糖尿病、または天疱瘡から選択される自己免疫疾患または症状の治療または予防の方法であって、有効な量の茶抽出物を、それを必要とするイヌに投与することを含む方法（方法２）を提供する。例えば、以下の方法である。
２．１．このような治療が必要なイヌが、方法１（本文参照）のいずれかの方法を用いて、自己免疫疾患または症状を有する、またはその発症リスクが上昇しているイヌとして同定される、方法２。
２．２．自己免疫疾患または症状が甲状腺機能低下症、例えばリンパ性甲状腺炎および甲状腺の特発性萎縮である、方法２または２．１。
２．３．茶抽出物が最大血漿濃度１−２μｇ／ｍｌを提供するのに十分な量で提供される、前述のいずれかの方法。
２．４．茶抽出物が、茶抽出物を含み、イヌにとって美味かつ栄養的に完全な食餌の形態で投与される、上記に記載のいずれかの方法。
２．５．茶抽出物が食事１（本文参照）のいずれかに従った食事の形態で投与される、上記に記載のいずれかの方法。
２．６．茶抽出物がカフェイン除去されている、上記に記載のいずれかの方法。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、有効な量の茶抽出物を含むイヌの食餌（食餌１）を提供する。例えば、食餌はイヌにとって美味かつ栄養的に完全であり、例えばイヌは自己免疫症状を有しており、あるいはその発症リスクが上昇しており、例えば、自己免疫症状はＴＮＦαおよび／またはインターロイキン６（ＩＬ−６）によって媒介され、例えば、自己免疫症状は甲状腺機能低下症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円板状エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、Ｉ型糖尿病、または天疱瘡から選択され、例として、食餌はイヌの甲状腺の健康を維持するための食餌である。例えば、以下の食餌である。
１．１．イヌにとって美味かつ栄養的に完全である食餌１。
１．２．茶抽出物の量が０．１−５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１−１ｍｇ／ｋｇである、食餌１または１．１。
１．３．茶抽出物がカフェイン除去されている、上記に記載のいずれかの食餌。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明はイヌの自己免疫疾患または症状の治療または予防を目的とした食餌、例えば食餌１（本文参照）のいずれかの製造のための、茶抽出物の使用を提供する。
【００１６】
さらなる実施形態では、本発明は例えば方法２（本文参照）のいずれかに従ったイヌの自己免疫疾患または症状の治療または予防において使用するための茶抽出物を提供する。
【００１７】
さらなる実施形態では、本発明は有効な量の茶抽出物をイヌに投与することを含む、イヌの甲状腺の健康を維持するための方法（方法３）を提供する。例えば、以下の方法である。
３．１．イヌが甲状腺機能低下症または症状、例えばリンパ性甲状腺炎および甲状腺の特発性萎縮を有する、あるいはその発症リスクが上昇している方法３。
３．２．イヌが自己免疫疾患または症状を有する、またはその発症リスクが上昇していると、方法１（本文参照）のいずれかの方法を用いて同定される、方法３または３．１。
３．３．茶抽出物が最大血漿濃度１−２μｇ／ｍｌを提供するのに十分な量で提供される、上記に記載のいずれかの方法。
３．４．茶抽出物が、茶抽出物を含み、イヌにとって美味かつ栄養的に完全な食餌の形態で投与される、上記に記載のいずれかの方法。
３．５．茶抽出物が食餌１（本文参照）のいずれかに従った食餌の形態で投与される、上記に記載のいずれかの方法。
３．６．茶抽出物がカフェイン除去されている、上記に記載のいずれかの方法。
３．７．茶抽出物がイヌにとって美味かつ栄養的に完全な食餌の形態で投与され、その食餌が茶抽出物を含み、その食餌が少なくとも一ヶ月にわたって、例えば少なくとも６ヶ月にわたって、例えば少なくとも１年にわたって投与される、上記に記載のいずれかの方法。
【００１８】
別の実施形態では、本発明はイヌの甲状腺の健康を維持する目的で、食餌、例えば食餌１（本文参照）のいずれかの食餌を製造するための、茶抽出物の使用を提供する。
【００１９】
さらなる実施形態では、本発明は例えば方法３（本文参照）のいずれかの方法に従ってイヌの甲状腺の健康を維持する上で使用するための、茶抽出物を提供する。
【実施例】
【００２０】
［実施例１］
ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を、臨床的に甲状腺機能低下症と診断された５０匹のイヌと、５６６匹のコントロールに行った。Illumina’s Infinium HD CanineHD ビーズチップでイヌの遺伝子型を同定すると、イヌゲノム上にわたって均一に間隔が開いた１７０，０００個を超える一塩基多型が示された。甲状腺機能低下性の表現型と高度に重要な関連性がある（ｐ値（ｐ）が１０７または１０８の桁数）一つ以上のＳＮＰを含む、特定の遺伝子座を同定し、表１に示した。
［表１−1］
0006293895.tif 000002
［表１−２］
0006293895.tif 000003
【００２１】
上記に列挙した重要なＳＮＰ遺伝子マーカーの遺伝子型解析は、イヌの甲状腺機能低下症の発症に対する罹患率を同定するための有用な方法を提供する。
【００２２】
特に着目したのは、第１９染色体上に位置するＴＮＩＰ３遺伝子の中および周囲に４つの重要なマーカーがある遺伝子座だった。ＴＮＩＰ３遺伝子は、Ａ２０に結合するタンパク質をコードし、当該タンパク質は、転写因子である核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化を引き起こすシグナル伝達経路を制御するタンパク質である。ＴＮＩＰ３の過剰発現は、Ａ２０との相互作用とは独立して、ＮＦ−κＢ活性を減少させることができ、このことは、ＴＮＩＰ３の過剰発現が、Ａ２０に依存する方法および依存しない方法のどちらでも、免疫機能を制御することができることを示す。ＴＮＩＰ３は、イヌまたはヒトの甲状腺機能低下症または他のいずれの自己免疫疾患とも関連していない。しかしながら、Ａ２０は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、セリアック病／潰瘍性大腸炎、および乾癬のようなヒトの自己免疫疾患と関連している。またＮＦ−κＢ活性を減少させることができると知られている、ＴＮＩＰ３のパラログであるＴＮＩＰＩもまた、乾癬性関節炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスのようなヒトの自己免疫疾患と関連している。ＮＦ−κＢは、Ｔｈ１７や制御性Ｔ細胞のような、自己免疫を制御する細胞の分化と発達に関連していることが知られている。このことは、ＴＮＩＰ３の正常機能の破損がイヌの自己免疫の発達と甲状腺機能低下症の発症とに寄与するＮＦ−κＢの機能変化を引き起こし得るという考えを支持する。さらに、ＮＦ−κＢ活性を減少させることによって、ＴＮＩＰ３遺伝子の欠陥を補うことができる食品添加物またはサプリメントは、イヌの甲状腺機能低下症の進行をもたらす自己免疫の発達および／または進行を遅らせることができる可能性がある。
【００２３】
ＮＦ−κＢによって誘導される重要な遺伝子の一つは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）である。ＴＮＦαは次に、フィードフォワードメカニズムによって、抑制が効いていない時に炎症や自己免疫機能障害に寄与し得る、ＮＦ−κＢを活性化する。実際、ＴＮＦαのレベルの上昇が、甲状腺機能低下症のヒトの血清において見られる。さらに、甲状腺機能低下症が合成甲状腺ホルモンによる治療によって治療される際は、ＴＮＦαのレベルはベースラインには戻らない。このことは、ＴＮＦαのレベルが上昇した自己免疫症状が、甲状腺機能低下症の根底にある原因であり、単に甲状腺ホルモンの減少による影響ではないことを示している。実際、ＴＮＦαはイヌの甲状腺機能低下症をインビボおよびインビトロで効果的に治療するための良好なバイオマーカーであるかもしれない。
【００２４】
イヌの単球細胞株ＤＨ−８２をリポ多糖（ＬＰＳ）で処理すると、ＮＦ−κＢは迅速に活性化され、ＴＮＦαのレベルは処理後２時間で５０−６０倍に誘導される。ＬＰＳはＴＮＩＰ３遺伝子発現を誘導し、当該発現は処理後４時間で最大値になりＴＮＦα発現の減少と一致する。ＴＮＦαおよびＴＮＩＰ３のレベルは共に、処理後８時間までに減少し、このことはＮＦ−κＢ活性化が減弱していることを示す。
【００２５】
どのように栄養成分／サプリメントがＴＮＦαの誘導を阻害できるかの例として、ＤＨ−８２細胞を、冷水紅茶抽出物の量を徐々に増やして処理した。茶抽出物は、ＴＮＦαおよび炎症性サイトカインであるインターロイキン６（ＩＬ−６）両方のＬＰＳ誘導性発現を、およそ２μｇ／ｍｌの５０％有効濃度で、用量依存的に阻害した。