(57)【要約】本開示は、医薬的に活性な抽出物および画分、ならびにそれを使用して真核細胞接着を増大させ、真核細胞の分化を増大させてＢ細胞、樹状細胞および軟骨細胞の数を増加させ、および未分化の造血細胞を維持する方法を提供する。これらの方法は、免疫応答を調節し、造血活性を調節し、ある型の真核組織を工学的に作製するのに有用である。本開示は、「レイシ」としても知られるＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍおよびＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｔｓｕｇａｅの成分からの医薬的に活性な抽出物および画分、ならびにそれを調製する方法を提供する。これらの抽出物および画分は、免疫応答の調節および造血活性の増大において特に活性であることが見出されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面マーカーの単核細胞発現が少なくとも１％増加するために十分量の精製レイシ抽出物を対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞表面マーカーが、ＶＣＡＭおよび／またはＮＣＡＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞表面マーカーが、未熟樹状細胞マーカーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記未熟樹状細胞マーカーが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞表面マーカーが、成熟樹状細胞マーカーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記成熟樹状細胞マーカーが、ＣＤ８３からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞表面マーカーが、造血細胞マーカーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記造血細胞マーカーが、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１３３およびＣＸＣＲ４からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞表面マーカーが、Ｂ細胞マーカーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｂ細胞マーカーが、ＣＤ１９からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記精製レイシが、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインとともに、対象に同時投与される、請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞表面マーカーのＭＳＣおよび／またはＰＬＡの発現が少なくとも１％増加するやめに十分量の精製レイシを対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項１３】
前記細胞表面マーカーが、ＢＭＰ−２、アグリカンおよびＩＬ−１からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記精製レイシが、インスリン、ＴＧＦ−Ｂ１および／またはアスコルベート−２−ホスフェートからなる群より選択される少なくとも１つの化合物とともに、対象に同時投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞プロテオームの発現を失う、対象のＭＳＣおよび／またはＰＳＡ細胞の割合が少なくとも１％減少するために十分量の精製レイシを対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項１６】
ある量の骨格形成剤と、
ある量のレイシ抽出物と
を含み、移植することができるデバイス。
【請求項１７】
ある量の単核細胞をさらに含む、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
ある量のＭＳＣおよび／またはＰＬＡ細胞をさらに含む、請求項１６に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本開示は、２００６年９月２１日に出願された米国仮出願第６０／８４６，６７６号の利益を主張するものであり、その仮出願の開示は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
本開示は、「レイシ」としても知られるＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍおよびＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｔｓｕｇａｅの成分からの医薬的に活性な抽出物および画分、ならびにそれを調製する方法を提供する。これらの抽出物および画分は、免疫応答の調節および造血活性の増大において特に活性であることが見出されている。
【背景技術】
【０００３】
細胞接着分子は、特に胚発生、神経可塑性および腫瘍転移の間の細胞間相互作用の可動化において重要な役割を演じる。細胞膜上の複合グリコシドは、幹細胞および幹細胞由来真核細胞のホーミング、可動化、分化、形態発生および接着の決定において重要な役割を演じる。したがって、正常な組織前駆細胞上の複合多糖および膜受容体発現を同定し、特徴付けることは、真核細胞および真核細胞をベースとする生物の健康、疾患の状態およびホメオスタシスの調節において重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一実施形態において、精製レイシ抽出物を対象に投与することを含む方法であって、細胞表面マーカーの単核細胞発現が少なくとも１％増加する方法が開示される。
【０００５】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、ＶＣＡＭおよび／またはＮＣＡＭである。
【０００６】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、未熟樹状細胞マーカーからなる群より選択される。
【０００７】
別の実施形態において、未熟樹状細胞マーカーは、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６からなる群より選択される。
【０００８】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、成熟樹状細胞マーカーからなる群より選択される。
【０００９】
別の実施形態において、成熟樹状細胞マーカーは、ＣＤ８３からなる群より選択される。
【００１０】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、造血細胞マーカーからなる群より選択される。
【００１１】
別の実施形態において、造血細胞マーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１３３およびＣＸＣＲ４からなる群より選択される。
【００１２】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、Ｂ細胞マーカーからなる群より選択される。
【００１３】
別の実施形態において、Ｂ細胞マーカーは、ＣＤ１９からなる群より選択される。
【００１４】
別の実施形態において、精製レイシは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインとともに、対象に同時投与される。
【００１５】
別の実施形態において、精製レイシ抽出物を対象に投与することを含む方法であって、細胞表面マーカーのＭＳＣおよび／またはＰＬＡの発現が少なくとも１％増加する方法が開示される。
【００１６】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、ＢＭＰ−２、アグリカンおよびＩＬ−１からなる群より選択される。
【００１７】
別の実施形態において、レイシは、インスリン、ＴＧＦ−Ｂ１および／またはアスコルベート−２−ホスフェートからなる群より選択される少なくとも１つの化合物とともに、対象に同時投与される。
【００１８】
別の実施形態において、精製レイシを対象に投与し、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞プロテオームの発現を失う、対象のＭＳＣおよび／またはＰＳＡ細胞の割合が少なくとも１％減少する。
【００１９】
別の実施形態において、ある量の骨格形成剤と、ある量のレイシ抽出物とを含む組合せが開示される。
【００２０】
別の実施形態において、上記の組合せは、ある量の単核細胞をさらに含む。
【００２１】
別の実施形態において、上記の組合せは、ＭＳＣおよび／またはＰＬＡ細胞のある量をさらに含む。
【００２２】
別の実施形態において、上記の組合せは、医療用デバイスをさらに含む。
【００２３】
別の実施形態において、上記の組合せは、生物に移植可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＦＡＣＳ分析により特徴付けられる、精製レイシとともにまたは精製レイシなしでインキュベートしたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の細胞表面マーカーを発現する懸濁および接着単核細胞の割合を示す図である。
【図２Ａ】インキュベーション容器上での細胞の相対的集密度の目視観察により特徴付けられる、精製レイシとともにまたは精製レイシなしでインキュベートしたときの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単核細胞マーカーの接着の量を質的に示す図である。
【図２Ｂ】インキュベーション容器上での細胞の相対的集密度の目視観察により特徴付けられる、精製レイシとともにまたは精製レイシなしでインキュベートしたときの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単核細胞マーカーの接着の量を質的に示す図である。
【図２Ｃ】インキュベーション容器上での細胞の相対的集密度の目視観察により特徴付けられる、精製レイシとともにまたは精製レイシなしでインキュベートしたときの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単核細胞マーカーの接着の量を質的に示す図である。
【図２Ｄ】インキュベーション容器上での細胞の相対的集密度の目視観察により特徴付けられる、精製レイシとともにまたは精製レイシなしでインキュベートしたときの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単核細胞マーカーの接着の量を質的に示す図である。
【図２Ｅ】インキュベートした細胞の形態の目視観察により特徴付けられる、精製レイシとともにまたは精製レイシなしでインキュベートしたときの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単核細胞の形態変化を質的に示す図である。
【図３】図３Ａは、ウェスタンブロット分析によりアッセイされる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞により発現されるＶ−ＣＡＭおよびＮ−ＣＡＭ細胞表面マーカーの相対的発現レベルを示す図である。図３Ａの軸は、次のとおりである：水平（左から右に）：ＣＤ１ａ（＋）／ＣＤ１４（−）；ＣＤ４０；ＣＤ８０；ＣＤ８３；ＣＤ８６；垂直：ＣＤマーカー発現％。図３Ｂおよび３Ｃは、ＦＡＣＳ分析により特徴付けられる、精製レイシとともにまたは精製レイシなしでインキュベートしたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の細胞表面マーカーを発現する細胞の割合を示す図である。図３Ｂの軸は、次の通りである：水平（左から右に）：ＣＤ１ａ（＋）／ＣＤ１４（−）；ＣＤ４０；ＣＤ８０；ＣＤ８３；ＣＤ８６；垂直：ＣＤマーカー発現％。図３Ｄは、ＦＡＣＳ分析により特徴付けられる、精製レイシとともにまたは精製レイシなしでインキュベートしたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ１９＋細胞表面マーカーを発現する細胞の相対的個体数を示す図である。図３Ｄの軸は、次のとおりである：水平（左から右に）：ＣＤ１ａ；ＣＤ３；ＣＤ１４；ＣＤ１６；ＣＤ１９；ＣＤ３４＋ＣＤ４５；ＣＤ５６；ＣＤ８３；垂直：対照に対する割合０；０．５；１；１．５；２；２．５；３；３．５。図３Ｅは、ＦＡＣＳ分析により特徴付けられる、精製レイシとともにまたは精製レイシなしでインキュベートしたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ８３細胞表面マーカーを発現する細胞の相対的個体数を示す図である。図３Ｅの軸は、次のとおりである：水平：ＣＤ１ａ；ＣＤ３；ＣＤ１４；ＣＤ１９；ＣＤ５６；ＣＤ８３；垂直：対照に対する割合０；０．５；１；１．５；２；２．５；３；３．５。図３Ｆおよび３Ｇは、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ、ＰＣＲ）分析により特徴付けられる、レイシ抽出物とともにまたはレイシ抽出物なしでｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした細胞により発現される種々のサイトカインの相対的レベルを示す図である。図３Ｆの軸は、次のとおりである：水平：ＩＬ−１；ＩＬ−６；ＭＣＰ−１；ＲＡＮＴＥＳ；ＧＲＯ；ＧＲＯ−１；ＭＩＰ−１；垂直：０；２０；４０；６０；８０；１００。図３Ｇの軸は、次のとおりである：水平：アンジオゲニン；ＩＬ−４；ＰＡＲＣ；垂直：０；２０；４０；６０；８０；１００。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＦＡＣＳおよび／または全ｍＲＮＡ分析により評価される、ＣＤ３４＋細胞表面マーカーおよびＣＤ３４＋／ＣＤ３８−プロテオームを発現する、レイシ抽出物とともにまたはレイシ抽出物なしでｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートしたＰＳＡおよびＭＳＣ細胞の相対数を示す図である。図４Ａの軸は、次のとおりである：垂直：０；５；１０；１５；２０；２５；水平：１日目；４日目；７日目；１２日目。図４Ｂの軸は、次のとおりである：垂直：０％；２０％；４０％；６０％；８０％；１００％；水平：ＣＤ３４＋；ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−；ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋；３８＋；３８−。図４Ｃ〜４Ｆは、ＦＡＣＳおよび／または全ｍＲＮＡ分析により評価される、ＣＤ３４＋細胞表面マーカーおよびＣＤ３４＋／ＣＤ３８−プロテオームを発現する、種々のレイシ抽出物画分とともにまたはレイシ抽出物画分なしでｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした細胞の相対数を示す図である。図４Ｃの軸は、次のとおりである：垂直：「対照に対する割合」０、１、２、３；水平：Ｆ３（１００ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ６−１０（１０ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ１１−１５（１０ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ１６−２０（１０ｕｇ／ｍｌ）。図４Ｄの軸は、次のとおりである：垂直：「対照に対する割合」０、０．５、１、１．５、２、２．５、３；水平：Ｆ３（１００ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ６−１０（１０ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ１１−１５（１０ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ１６−２０（１０ｕｇ／ｍｌ）。図４Ｅの軸は、次のとおりである：垂直：「対照に対する割合」０、０．５、１、１．５、２、２．５、３；水平：Ｆ３（１００ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ６−１０（１０ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ１１−１５（１０ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ１６−２０（１０ｕｇ／ｍｌ）。図４Ｆの軸は、次のとおりである：垂直：「対照に対する割合」０、２、４、６、８；水平：Ｆ３（１００ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ６−１０（１０ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ１１−１５（１０ｕｇ／ｍｌ）；Ｆ１６−２０（１０ｕｇ／ｍｌ）。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、（位相差顕微鏡検による）軟骨球体形成、種々の細胞プロテオーム成分および細胞表面マーカーのウェスタンブロット分析、ならびに軟骨細胞分化の形態学的および細胞計数分析により特徴付けられる、軟骨細胞の形態に分化したレイシ抽出物とともにまたはレイシ抽出物なしでｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした間葉系幹細胞の相対数を示す図である。５Ａの軸は、次のとおりである：垂直：「軟骨細胞（ＳＩＣ）数」０、５０、１００、１５０；水平：「日数」０、３、７。凡例は：対照、Ｆ３（５０ｕｇ／ｍｌ）、Ｆ３（１００ｕｇ／ｍｌ）。５Ｂの軸は、次のとおりである：垂直：「軟骨細胞」０；２００；４００；６００；８００；１０００；１２００；１４００；１６００；水平：３日目；７日目。凡例は：対照、＋Ｆ３（１００ｕｇ／ｍｌ）。
【図６】図６は、（位相差顕微鏡検による）軟骨球体形成、種々の細胞プロテオーム成分および細胞表面マーカーのウェスタンブロット分析、ならびに軟骨細胞分化の形態学的および細胞計数分析により特徴付けられる、軟骨細胞の形態に分化したレイシ抽出物とともにまたはレイシ抽出物なしでｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした間葉系幹細胞の相対数を示す図である。図６において：左側のウェスタンブロット：垂直：Ｃｈｆａ−１；ＢＭＰ−２；ＢＭＰ−４；ＰＰＡＲ−ｒ；ＩＬ−１１；水平：ＣＭのみ；ＣＭ＋Ｆ３。右側のウェスタンブロット：垂直：アグリガン（Ａｇｇｒｅｇａｎ）；ＩＩ型コラーゲン；コンドロアドヘリン；ＮＣＡＭ；ＩＣＡＭ；ＧＡＰＤＨ；水平：ＣＭのみ；ＣＭ＋Ｆ３。グラフ中：垂直の欄：「軟骨細胞（ＳＩＣ）数」０；５０；１００；１５０；水平の欄：「日」０；３；７。凡例：−対照、−Ｆ３（５０ｕｇ／ｍｌ）、−Ｆ３（１００ｕｇ／ｍｌ）。
【図７】表１は、ＴＭＳ法によりアッセイされた、レイシ粗抽出物の炭水化物の組成を示す。
【図８】表２は、十分に確立された方法によりアッセイされた、レイシ粗抽出物のアミノ酸組成を示す。
【図９】表３は、ＴＭＳ法によりアッセイされた、種々のレイシ精製画分の相対的炭水化物組成を示す。
【図１０】表４は、全ＲＮＡの分析（例えばＲＴ−ｐＣＲ）によりアッセイされた、種々のレイシ試料で処理したマウス脾細胞のサイトカイン発現を示す。
【図１１】表５は、対象の種々のサイトカインの発現のレベルをアッセイするために用いた、ＲＴ−ｐＣＲで用いた種々のプライマー配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示を説明する目的で、以下の用語は、以下に記載される関連する定義について言及することを意図する。
【００２６】
「血管新生」は、あらかじめ存在する血管からの新しい血管の成長を伴う生理的プロセスを意味する。
【００２７】
「接着細胞」は、インキュベーション培地の吸引の後にインキュベーション容器の表面に付着したままの細胞を意味する。接着細胞は、その後、インキュベーション容器の表面から、化学的および／または物理的プロセスにより、例えばトリプシン溶液の使用により分離させることができる。
【００２８】
「投与する」は、静脈内、皮下、局所、経皮、皮内、経粘膜、腹腔内、筋内、嚢内、眼窩内、心内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入を含む経口または非経口の投与、ならびに任意の医療用デバイスまたは身体内に挿入される（一時的または永続的に）物体の成分としての同時投与を意味する。
【００２９】
「アグリカン」は、プロテオグリカン、または炭水化物で修飾されたタンパク質を意味する。コラーゲンとともに、アグリカンは、軟骨、特に関節軟骨の主要な構造成分を形成する。
【００３０】
「接着している細胞の量」は、インキュベーション容器の表面に接着している細胞の相対数のアッセイを意味する。このアッセイは、インキュベーション容器の表面上の接着細胞の集密度の目視観察、または接着細胞のトリプシン処理およびその後の溶液中のトリプシン処理された細胞の代表的試料の計数のような種々の方法により行い得る。
【００３１】
「Ｂ細胞」は、Ｔ細胞により支配される細胞媒介免疫応答に対する体液性免疫応答において大きい役割を演じる任意のリンパ球のクラスを意味する。Ｂ細胞は、ほとんどの哺乳動物の骨髄で生成されるので、Ｂ細胞と呼ばれる。Ｂ細胞の主な機能は、可溶性抗原に対する抗体を作製することである。Ｂ細胞は、適応免疫系の必須成分である。
【００３２】
「ＢＭＰ−２」は、サイトカイン型の骨形態形成タンパク質を意味する。
【００３３】
「緩衝液」は、少量の酸もしくは塩基の添加、または希釈の際の水素イオンおよび水酸イオンの濃度（よってｐＨ）の変化に抵抗する溶液を意味する。緩衝液は、弱酸およびその共役塩基（より一般的）、または弱塩基およびその共役酸（あまり一般的でない）からなる。
【００３４】
「軟骨」は、関節、外耳および喉頭のような身体内の種々の部分で見出される、靭性で弾力性のある繊維状の結合組織を意味する。胚性および若年の脊椎骨格の主要な構成成分、これは成熟とともに大部分が骨に変換される。
【００３５】
「ＣＤ」は、白血球上に存在する細胞表面分子の同定および探索のために用いられるプロトコルである表面抗原分類を意味する。ＣＤ分子は、多数の様式で作用でき、しばしば、細胞にとって重要な受容体またはリガンド（受容体を活性化する分子）として作用する。シグナルカスケードが通常開始され、細胞の挙動を変更する（細胞シグナル伝達を参照されたい）。いくつかのＣＤタンパク質は、細胞シグナル伝達において役割を演じないが、細胞接着のようなその他の機能を有する。
【００３６】
「細胞表面マーカー」は、真核細胞の細胞表面に存在するタンパク質、およびその特定のタンパク質に特異的な任意の遺伝子発現生成物（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴付けられているかにかかわらず）（例えばｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を意味する。
【００３７】
「遠心分離機」は、中心軸の周りを回転して、含有された異なる比重の物質を分離するか、または液体中に懸濁されたコロイド状の粒子を分離する区画から本質的になる装置を意味する。
【００３８】
「軟骨細胞」は、軟骨で見出される真核細胞の型を意味する。軟骨細胞は、コラーゲンおよびプロテオグリカンから主になる軟骨基質を生成および維持する。軟骨細胞の前駆細胞は、間葉系幹細胞である。
【００３９】
「軟骨新生」は、それにより軟骨が形成されるプロセスを意味する。
【００４０】
「サイトカイン」は、生物においてシグナル伝達化合物として用いられるタンパク質およびペプチドの任意の群を意味する。これらの化学シグナルは、ホルモンおよび神経伝達物質に似ており、ある細胞が別の細胞と通信することを可能にするために用いられる。
【００４１】
「樹状細胞」は、哺乳動物の免疫系の部分を形成する免疫細胞を意味する。これらの主な機能は、抗原物質を加工して、それを表面上で免疫系の他の細胞に提示して、抗原提示細胞として機能する。
【００４２】
「樹状細胞マーカー」は、樹状細胞の表面上で通常見出される細胞表面分子の任意の群を意味する。
【００４３】
「分化する」は、それにより、真核細胞が「型」（例えば樹状細胞、軟骨細胞）を獲得する；例えば、遺伝的物質の変化を必要とせずに細胞形態が変化するプロセスを意味する。
【００４４】
「内皮の」は、管腔内の循環血液と血管壁の残りとの間の界面を形成する、血管の内表面を裏打ちする細胞の薄層を意味する。
【００４５】
「発現」は、それにより、ＤＮＡ配列のような遺伝子を含む遺伝情報が、タンパク質またはＲＮＡのような物理的および生物学的に機能的な遺伝子産物として実現されるプロセスを意味する。発現は、免疫学的（例えばＭＡＣＳ、ＦＡＣＳ）および／または分子生物学的（例えば全ＲＮＡ分析）技術により定量され得る。
【００４６】
「ＦＡＣＳ」は、蛍光細胞分離法（例えばフローサイトメトリー）を意味する。ＦＡＣＳは、細胞を研究し精製するために用いられる強力な方法である。流体の細流中に保持された個別の細胞が、１本または複数本のレーザビームを通過することにより、光が散乱し、蛍光色素が種々の周波数で光を放射する。フォトマルチプライヤチューブ（ＰＭＴ）は、光を電気シグナルに変換し、細胞のデータが収集される。細胞の亜集団が同定され、抗体−抗原の関係により特定の型の細胞に連結された蛍光色素の電荷に基づいて高純度（約１００％）で分類される。
【００４７】
「フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）」は、リンパ球を、血液中のその他の形成された要素から分離するための密度勾配遠心分離技術を意味する。試料は、フィコール−メトリゾ酸ナトリウムの比重の勾配上に重層する。遠心分離の後に、リンパ球は、血漿−フィコールの界面から回収される。
【００４８】
「ゲル濾過」は、タンパク質、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの、サイズに基づく分離を意味する。分子は、多孔性ビーズの床を通過して移動し、多少ビーズの中に拡散する。より小さい分子は、ビーズの孔の中にさらに拡散するので、床の中をよりゆっくりと通過して移動するが、より大きい分子は中にあまりまたはまったく入り込まないので、床の中をより速く通過する。分子量および３次元の形状がともに、保持の程度に貢献する。ゲル濾過クロマトグラフィーは、分子サイズの分析のため、混合物中の成分の分離のため、または巨大分子の調製物からの塩の除去もしくは緩衝剤交換のために用いられ得る。
【００４９】
「複合多糖」は、他の型の化学的構成成分に共有結合した炭水化物単位からなる化合物の型を意味する。
【００５０】
「糖タンパク質」は、ポリペプチド主鎖に共有結合したオリゴ糖鎖（グリカン）を含有するタンパク質を意味する。
【００５１】
「グリコシド」は、分子の糖部分が分子のある他の部分に結合した特定の分子を意味する。
【００５２】
「グリコシル化」は、糖類をタンパク質および脂質に付加するプロセスまたはその結果を意味する。
【００５３】
「ＧＭ−ＣＳＦ」は、サイトカインである、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を意味する。
【００５４】
「造血細胞」は、血液を形成する幹細胞を意味する。他の型の細胞のうち、Ｔ細胞およびＢ細胞は、これらの細胞から生じる。
【００５５】
「造血系マーカー」は、造血幹細胞の表面上に通常見出される細胞表面分子の任意の群を意味する。
【００５６】
「未熟樹状細胞」は、高いエンドサイトーシス活性および低いＴ細胞活性化能力を特徴とする樹状細胞を意味する。未熟樹状細胞は、病原体およびタンパク質の他の供給源を貪食できる。
【００５７】
「細胞マーカーの発現の増加」は、細胞表面タンパク質の特定の型またはその特定の型の細胞表面タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の量の増加を意味する。種々のタンパク質分子が、特定の真核細胞形態に関連する。発現の増加は、抗体結合細胞分類（「ＦＡＣＳ」）を用いて、または磁気活性化細胞分類（「ＭＡＣＳ」）によりアッセイできる。あるいは、発現の増加は、特定の型のＣＤ分子の生成をコードするｍＲＮＡの細胞内発現の量が間接的に決定されるＲＴ−ＰＣＲの使用によりアッセイできる。
【００５８】
「インキュベートする」は、容器（場合によりプラスチックまたはガラス）内で液体培地中にセ氏約３７度、５％二酸化炭素およびある程度の湿度の条件で真核細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長および／または維持することを意味する。インキュベートされた真核細胞には、成長培地、サイトカインおよび／または他の緩衝液もしくは他の溶液の任意の組合せが、場合によって補充される。
【００５９】
「インターロイキン」は、通信の手段として（「インター」）、白血球細胞（白血球、よって「ロイキン」）により発現されると最初は考えられていたサイトカイン（分泌されるシグナル伝達分子）の任意の群を意味する。免疫系の機能は、インターロイキンに大部分依存し、これらのいくつかの欠損はほとんど報告されておらず、それらはすべて自己免疫疾患または免疫不全を特徴とする。インターロイキンは、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２などの略号を用いて通常表記される。
【００６０】
「発現を失う」は、それにより、特定の発現される遺伝子（実現、例えば特定のタンパク質またはｍＲＮＡ配列として）が、真核細胞内でもはや存在しないか、または発現される量もしくは頻度が減少するプロセスを意味する。発現の喪失は、ＭＡＣＳもしくはＦＡＣＳ分析、または全ｍＲＮＡ分析により定量可能である。
【００６１】
「凍結乾燥する」は、腐敗しやすい物質を保存するか、またはその物質をより輸送しやすくするために典型的に用いられる凍結乾燥脱水プロセスを意味する。凍結乾燥は、物質を凍結し、次いで周囲圧力を低下させ、十分な熱を加えて物質中の凍結水を固体相から気体に直接昇華させることにより行われる。
【００６２】
「マクロファージ」は、単球とよばれる特定の白血球細胞に起源を発する組織内の細胞を意味する。単球およびマクロファージは、貪食細胞であり、ともに、脊椎動物の非特異的防御（または自然免疫）および特異的防御（または細胞性免疫）において作用する。これらの役割は、細胞破片および病原体を、静止または可動性細胞のいずれかとして貪食し（飲み込み、次いで消化する）、リンパ球およびその他の免疫細胞を刺激して、病原体に応答することである。
【００６３】
「ＭＡＣＳ」は、磁気細胞分離法を意味する。ＭＡＣＳは、希少細胞を全血から、該細胞を抗体標識常磁性ビーズに結合させることにより単離する分離法である。血液は、常磁性ビーズを捕捉する高磁場勾配を有するカラムを通過する。
【００６４】
「成熟樹状細胞」は、病原体と接触し、その細胞表面に病原体タンパク質の断片を提示できる樹状細胞を意味する。
【００６５】
「間葉」（胚性結合組織としても知られる）は、胚の中胚葉（３層の胚盤の中間層）から主に発生する組織の塊を意味する。粘稠度が粘性である間葉は、コラーゲン束および繊維芽細胞を含有する。間葉は、後に、血管、血液関連器官および結合組織に分化する。
【００６６】
「単核細胞」は、脊椎動物の骨髄で生成され、血液および組織に放出されてそこでマクロファージに発達する大きい貪食性の単核白血球を意味し、大きい、長円形またはいくらか陥没した核を含有し、多量の細胞質および多数の細胞小器官に囲まれている。本開示を説明する目的で、単核細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにあったが、その後単離され抽出された単核細胞を含む。
【００６７】
「形態」は、真核細胞、生物または生物の構成要素の外観（形状、構造、色、パターン）および／または個性を意味する。
【００６８】
「ｍＲＮＡ」は、メッセンジャーリボ核酸を意味する。ｍＲＮＡは、タンパク質生成物の化学的「青写真」をコードするＲＮＡ分子である。
【００６９】
「ＭＳＣ」は、骨髄由来幹細胞の型を意味する。
【００７０】
「ＮＣＡＭ」は、真核細胞の他の真核細胞、および種々の細胞外基質成分との結合の媒介に重要な細胞表面分子を意味する。
【００７１】
「ＰＢＭＮＣ」は、末梢血由来単核細胞を意味する。
【００７２】
「ＰＢＳ」は、緩衝剤であるリン酸緩衝食塩水を意味する。
【００７３】
「ＰＬＡ」は、脂肪（脂肪組織）由来幹細胞を意味する。
【００７４】
「分化軟骨細胞の形態を示す細胞の割合」は、分化した軟骨細胞の形態を示す造血細胞または分化可能な真核細胞の数の評価を意味する。形態のこの変化は、位相差顕微鏡検による観察、細胞表面上のＮ−ＣＡＭの存在の増加の測定（例えばｍＲＮＡまたはＦＡＣＳ分析による）、および細胞内ＢＭＰ−２、ＩＬ−１および／またはアグリカン遺伝子発現の対応する増加の測定（例えばｍＲＮＡ分析による）により定量可能である。
【００７５】
「ＣＤ３４＋、ＣＸＣＲ４＋および／またはＣＤ３８−を発現する細胞の割合」は、ＣＤ３４＋、ＣＸＣＲ＋および／またはＣＤ３８−発現の測定（例えばｍＲＮＡ、ＦＡＣＳおよび／またはＭＡＣＳ分析による）により定量可能なＣＤ３４＋、ＣＸＣＲ４＋および／またはＣＤ３８−を発現する真核細胞の数のアッセイを意味する。
【００７６】
「周皮細胞」は、小血管の壁と会合している間葉様細胞を意味する。比較的未分化の細胞と同様に、周皮細胞は、これらの血管を支持する役目をするが、これは、繊維芽細胞、平滑筋細胞、または必要であればマクロファージにも分化できる。
【００７７】
「プロテオーム」は、ｍＲＮＡ、ＭＡＣＳおよびＦＡＣＳ分析によりアッセイ可能な、所定の時間に真核細胞に存在する発現されたタンパク質の完全な組を意味する。
【００７８】
「精製レイシ」は、本明細書に参照により組み込まれる米国本出願第１１／５５３，４０２号に記載されるようにして調製されるレイシ抽出物を意味し、ここで、精製レイシは、末端フコース残基を含有する多糖類またはグリコペプチドを含む。
【００７９】
「レイシ」は、キノコＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍおよびその近縁のＧａｎｏｄｅｒｍａ  ｔｓｕｇａｅのある形の名称を意味する。
【００８０】
「幹細胞」は、血液細胞のような特異的専門細胞を生じる専門化されていない細胞を意味する。
【００８１】
「間質細胞」は、疎性結合組織で見出される器官の結合組織細胞を意味する。これらは、子宮粘膜（子宮内膜）、前立腺、骨髄前駆細胞および卵巣、ならびに造血系などと最もしばしば会合している。これらは、生物組織の支持構造を構成し、実質細胞を支持する細胞である。
【００８２】
「対象」は、限定されないが、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与を受ける、任意の真核細胞または真核細胞をベースとする生物を意味する。
【００８３】
「懸濁細胞」は、インキュベーション容器の表面に接着していないインキュベートされた真核細胞を意味する。
【００８４】
「０．１Ｎ  Ｔｒｉｓ緩衝剤」は、緩衝液を意味する。
【００８５】
「ＶＣＡＭ」は、細胞表面分子（ＣＤ−１０６としても知られる）を意味する。ＶＣＡＭ−１は、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球の接着を促進する。
【００８６】
本開示の詳細な実施形態は、本明細書に開示される。しかし、開示される実施形態は、種々の形で具体化され得る実施形態の単なる説明であることが理解されるべきである。さらに、開示の種々の実施形態に関して与えられる実施例のそれぞれは、説明を意図し、限定するものでない。さらに、図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、いくつかの図面は、特定の構成要素の細部を示すために誇張されている場合がある。よって、本明細書に開示される具体的な構造および機能の詳細は、制限するものではなく、本開示を様々に使用することを当業者に教示するための代表的な基礎にすぎないものと解釈されるべきである。
【００８７】
一実施形態において、レイシ組織をホモジナイズすることと、レイシ抽出物を水に溶解することと、レイシ抽出物／水混合物を少なくとも約２４時間、レイシ抽出物／水混合物の温度を少なくとも約セ氏４度の温度に維持しながら攪拌することと、レイシ抽出物／水混合物を、不溶性物質を除去するのに十分な時間遠心分離することと、レイシ抽出物／水混合物から水の少なくとも一部分を除去するために、遠心分離されたレイシ抽出物／水混合物から水を、少なくともセ氏約３５度の温度で蒸発させることと、得られた濃縮レイシ抽出物／水混合物を凍結乾燥することと、凍結乾燥されたレイシ抽出物を液相に再懸濁することと、再懸濁されたレイシ抽出物を精製することとを含む方法が開示される。
【００８８】
別の実施形態において、凍結乾燥されたレイシ抽出物を、０．１Ｎ  Ｔｒｉｓ緩衝剤に再懸濁する。別の実施形態において、凍結乾燥されたレイシ抽出物を再懸濁し、得られた懸濁液を、ｐＨ７．０に調整する。別の実施形態において、再懸濁されたレイシ抽出物を、ゲル濾過を用いて精製する。別の実施形態において、再懸濁されたレイシ抽出物ゲル濾過を、一連の画分として回収し、そのそれぞれを、糖成分を検出するために、アントロン分析またはフェノール−硫酸法に供する。別の実施形態において、濾過された再懸濁レイシ抽出物を、透析して過剰の塩を除去する。別の実施形態において、レイシ抽出物を、アニオン交換に供し、塩化ナトリウム溶液で溶出し、場合によって再分画する。別の実施形態において、濾過された再懸濁レイシ抽出物を、濾過の後に再び凍結乾燥する。
【００８９】
別の実施形態において、複数の単核細胞を精製レイシ抽出物と組み合わせることと、単核細胞およびレイシ抽出物を、細胞マーカーの単核細胞発現を増加させるように十分な時間インキュベートすることとを含む方法が開示される。
【００９０】
別の実施形態において、上記の組合せは、条件的培養培地をさらに含む。別の実施形態において、条件的培養培地は、ＡＩＭ−Ｖである。別の実施形態において、ＡＩＭ−Ｖ条件的培地は、無血清である。別の培地において、ＡＩＭ−Ｖ条件的培養培地には、胎児ウシ血清を補充する。別の実施形態において、ＡＩＭ−Ｖ条件的培養培地には、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを補充する。
【００９１】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、ＶＣＡＭおよび／またはＮＣＡＭである。
【００９２】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、未熟樹状細胞マーカーからなる群より選択される。別の実施形態において、未熟樹状細胞マーカーは、ＣＤ１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６からなる群より選択される。
【００９３】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、成熟樹状細胞マーカーからなる群より選択される。別の実施形態において、成熟樹状細胞マーカーは、ＣＤ８３からなる群より選択される。
【００９４】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、造血細胞マーカーからなる群より選択される。別の実施形態において、造血細胞マーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１３３およびＣＸＣＲ４からなる群より選択される。
【００９５】
別の実施形態において、細胞表面マーカーは、Ｂ細胞マーカーからなる群より選択される。別の実施形態において、Ｂ細胞マーカーは、ＣＤ１９からなる群より選択される。
【００９６】
別の実施形態において、精製レイシ抽出物と単核細胞との組合せは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインをさらに含む。
【００９７】
別の実施形態において、精製レイシ抽出物（単独または単核細胞との組合せ）は、治療を必要とする人に投与可能である。
【００９８】
別の実施形態において、十分量の精製レイシ抽出物を対象に投与して、ＢＭＰ−２、アグリカンおよびＩＬ−１からなる群より選択される細胞表面マーカーの発現を増加させることを含む方法が開示される。
【００９９】
別の実施形態において、組合せは、条件的培養培地をさらに含む。別の実施形態において、条件的培養培地は、ＡＩＭ−Ｖである。別の実施形態において、ＡＩＭ−Ｖ条件的培地は、無血清である。別の培地において、ＡＩＭ−Ｖ条件的培養培地には、ウシ胎児血清を補充する。別の実施形態において、ＡＩＭ−Ｖ条件的培養培地には、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを補充する。
【０１００】
別の実施形態において、精製レイシ抽出物は、キットオプションＴＧＦ、コンドロイチン、および／またはグルコサミン骨格形成剤の一部として提供される。別の実施形態において、医療用デバイスとともにまたは医療用デバイスなしで、１つまたは複数の骨格形成剤との組合せ試薬を同時投与することを含む組合せが開示され、該医療用デバイス内で、該試薬および／または骨格形成剤が対象に送り込まれる。
【０１０１】
別の実施形態において、ＭＳＣおよび／またはＰＬＡ細胞と精製レイシ抽出物との組合せは、インスリン、ＴＧＦ−Ｂ１および／またはアスコルベート−２−ホスフェートからなる群より選択される化合物をさらに含む。
【０１０２】
別の実施形態において、複数のＭＳＣおよび／またはＰＬＡ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで精製レイシ抽出物と組み合わせる工程と、ＭＳＣおよび／またはＰＬＡ細胞とレイシ抽出物とをある時間インキュベートする工程と、細胞プロテオームの特徴としてＣＤ３４＋、ＣＸＣＲ４＋および／またはＣＤ３８−を保持するインキュベートされたＭＳＣおよび／またはＰＳＡ細胞の割合を定量的に評価する工程とを含む方法であって、レイシ抽出物とインキュベートした全細胞数の割合としてのＣＤ３４＋、ＣＸＣＲ４＋および／またはＣＤ３８−を発現する細胞の割合が、精製レイシ抽出物なしでインキュベートした等しい全細胞数の割合としてのＣＤ３４＋、ＣＸＣＲ４＋および／またはＣＤ３８−を発現する細胞の割合と比較して増加する方法が開示される。
【０１０３】
別の実施形態において、精製レイシ抽出物（単独またはＭＳＣおよび／もしくはＰＳＡ細胞との組合せ）は、治療を必要とする人に投与可能である。
【実施例】
【０１０４】
材料。レイシ粗抽出物（アルカリ抽出（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）、中和およびエタノール沈澱により調製）を、Ｐｈａｒｍａｎｅｘ  Ｃｏ．（ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ（ｐＨ３〜１０  ＮＬ（非直線）、１８ｃｍ）およびＩＰＧ緩衝剤（ｐＨ３〜１０  ＮＬ）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｓ緩衝剤、アガロース、ヨードアセトアミドおよびアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）は、Ｍｅｒｃｋ  Ｃｏ．（Ｄａｒｍｓｔａｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、アクリルアミド、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびＴＥＭＥＤは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびグリシンは、Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から、配列決定グレードのトリプシンは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１０５】
レイシ抽出物の精製。２８ｍｇの粗抽出物を、２ｍＬのＴｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ７．０、０．１Ｎ）に溶解し、遠心分離して不溶物を除去した（７ｍｇ）。上清を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００カラム（１００ｃｍ×１．６ｃｍ）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーにより、０．１Ｎ  Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ７．０）を溶離液として用いて精製した。流速は０．５ｍＬ／分に設定し、チューブあたり７．５ｍＬを回収した。クロマトグラフィーの後に、各画分をアントロン分析に供して、糖成分を検出した。５つの画分を回収し（画分１〜５）、それぞれ透析して、過剰の塩を除去し、凍結乾燥してそれぞれ１．０、６．２、５．３、２．１および１ｍｇ未満を得た。
【０１０６】
アントロン比色法６。氷水浴中に浸漬した一連の試験管中のそれぞれ１．５ｍＬのアントロン（９，１０−ジヒドロ−９−オキソアントラセン）溶液（１００ｍＬの濃硫酸に溶解した０．２ｇのアントロン）に、１．５ｍＬの試料（２０〜４０μｇ／ｍＬのＤ−グルコースまたは等価物）を注意深く重層した。すべて添加した後に、試験管を迅速に振とうし、次いで氷水浴中に再び入れた。試験管を、沸騰水浴中で５分間加熱し、次いで冷却した。光学密度を、１時間以内に、蒸留水に対して６２５ｎｍで読み取った。標準、試薬ブランクおよび不明物（ｕｎｋｎｏｗｎ）は、他の炭水化物供給源の混入の可能性があるので、３回測定した。計算は、光学密度が炭水化物濃度に正比例するという基本に基づいて行った。
【０１０７】
脾臓細胞のマイトジェン誘発増殖および比色ＭＴＴアッセイ７。全脾臓細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（６週齢）から採集し、１０％ＦＣＳ（胎児ウシ血清）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、遠心分離して上清を除去した。回収した沈澱細胞を、まず、１ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝剤（８％  ＮＨ４Ｃｌ）に懸濁し、次いで１４ｍＬを超える同じ溶解緩衝剤を加えて、赤血球細胞を破壊した。１分後に、溶液を１５ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈して反応を停止し、遠心分離して細胞を回収し、細胞最終濃度を２×１０６細胞／ｍＬに、ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて調整した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、最終濃度：１μｇ／ｍＬ）を、得られた混合物に加えた。細胞を、レイシ抽出物（または部分精製画分）とともにまたはレイシ抽出物なしで、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中で、３７℃にて５％ＣＯ２とともに７２時間インキュベートした。細胞増殖を、ＭＴＴアッセイに基づいて測定した。
【０１０８】
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に５ｍｇ／ｍＬで溶解し、濾過して滅菌およびＭＴＴのいくつかのバッチに存在する少量の不溶性残渣の除去を行った。以下に示す時間に、２５μＬのＭＴＴ溶液を、アッセイのすべてのウェルに加え、プレートを、３７℃にて４時間インキュベートした。酸−イソプロパノール（イソプロパノール中に１００μＬの０．０４Ｎ  ＨＣｌ）をすべてのウェルに加え、完全に混合して、濃青色の結晶を溶解した。室温にて数分間後にすべての結晶を確実に溶解させ、プレートを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥＬＩＳＡリーダー（ＨＴＳ  ７０００  ｐｌｕｓ）で、５７０ｎｍの試験波長、６２０ｎｍの参照波長を用いて読み取った。プレートは、イソプロパノールの添加後１時間以内に通常は読み取った。
【０１０９】
逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）８。マウス脾臓細胞を、健康なマウス（ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス、６週齢）から無菌的に回収し、理想的細胞濃度（４×１０６細胞／ｍＬ）に調整し、１０％のＦＣＳ（胎児ウシ血清）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃にて５％  ＣＯ２とともにインキュベートした。６時間後に、細胞を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙミニキットを用いるＲＮＡ抽出に供して、約１μｇの所望のＲＮＡを得た。逆転写（ＲＴ）は、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬからのＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  Ｒ／Ｔ  ＰＣＲシステム、およびＴｈｅｍｏｓｃｒｉｐｔシステムプロトコルＩを用いて行った。反応は、次のようにして行った：８μＬのＲＮＡ、２μＬのプライマー（オリゴ（ｄＴ）２０）（配列番号２３）、２μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックスおよびＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ（０．１％ジエチルピロカーボネート処理Ｈ２Ｏ）を各チューブに加え、これを、次いで、６５℃にて５分間インキュベートし、直ちに氷上に置いた。次のものを、各チューブに８μＬの混合物として加えた：４μＬの５×ｃＤＮＡ緩衝剤、１μＬの０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１μＬのＲＮａｓｅＯｕｔ（リボヌクレアーゼ阻害剤）および１μＬのＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  Ｒ／Ｔ、および１μＬのＤＥＰＣ水。混合物を室温にて１０分間、次いで５５℃にて３０分間インキュベートして、ｃＤＮＡの最初の鎖の合成を可能にした。反応物を８５℃にて５分間インキュベートすることにより、酵素活性を停止させ、次いでチューブを氷上に１０分間置いた。試料を、ＰＣＲに使用するまで−２０℃にて保存した。
【０１１０】
各試料（３μＬ）を、各反応チューブに加え、次の試薬を４７μＬの混合物として加えた：５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝剤、４μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、２μＬの各プライマー（１０ＯＤ／ｍＬ、センスおよびアンチセンス）、３３μＬのＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ、および１μＬのＰｒｏＺｙｍｅ（登録商標）（ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから）。反応チューブを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＰＣＲ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ９６）に入れ、次の条件下で運転した：９２℃にて２分間の１サイクル（最初の変性）、次いで９１℃にて１０秒間（変性）、５９℃にて２５秒間（プライマーアニーリング）および７２℃にて２５秒間（プライマー伸長）の連続３０サイクル。反応物は、ゲル電気泳動により分析した。
【０１１１】
糖組成分析−−ＴＭＳ法。単糖分析のために、多糖抽出物／画分を、０．５Ｍメタノール性ＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて８０℃にて１６時間、加メタノール分解し、５００μＬのメタノール、１０μＬのピリジンおよび５０μＬの無水酢酸を用いて再びＮ−アセチル化し、次いで、Ｓｙｌｏｎ  ＨＴＰ（登録商標）トリメチルシリル化試薬（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を、室温にて２０分間用いて処理し、乾燥して、ヘキサンに再溶解した。トリメチルシリル化誘導体のＧＣ−ＭＳ分析を、ＨＰ５９７３  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒに接続されたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ＨＰ）Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ  ６８９０を用いて行った。試料を、ヘキサンに溶解した後に、ＨＰ−５ＭＳ融解石英キャピラリカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．、ＨＰ）にスプリットレスで注入した。カラムのヘッド圧は、約８．２ｐｓｉに維持して、ヘリウムをキャリアガスとして用いて一定流速１ｍＬ／分にした。最初のオーブン温度は、６０℃にて１分間保持し、１４０℃まで２５℃／分、２５０℃まで５℃／分で上昇させ、次いで、３００℃まで１０℃／分で上昇させた。
【０１１２】
レイシ粗抽出物の炭水化物組成分析は、主要成分としてのグルコースおよびマンノースとともに、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロースおよびラムノースを含む他の糖類が、より少量存在することを示した（表１）。粗抽出物は、１５．６％のタンパク質を含有し、そのアミノ酸分析を、表２に示した。
【０１１３】
画分３の組成および活性をさらに理解するために、これを、プロテアーゼＫで処理して、タンパク質成分を部分的に分解した。結果は、ＣｏｎＡ刺激脾臓細胞の増殖が変わらなかったことを示した。しかし、α１，２−フコシダーゼによる糖分解切断は、画分３の活性を完全に喪失させた（ＭＴＴアッセイに基づく）。対照的に、画分３の活性は、α１，３／４−フコシダーゼでの処理の後にわずかに減少した。この実験は、活性成分が、α１，２−フコース結合を有する末端フコース残基を含有する多糖またはグリコペプチドであることを確立する。まとめると、主要活性成分は、α１，２−結合を有する必須の末端フコース残基を含有する糖タンパク質である。タンパク質部分は、活性に必要でない。
【０１１４】
アミノ酸組成分析。分析は、十分に確立された方法に基づいて行った９。レイシ粗抽出物の試料（６ｍｇ）を、１ｍＬの６Ｍ  ＨＣｌおよびＴＦＡ（４／１）溶液に溶解し、１４０℃にて３時間加熱した。混合物を濃縮して、乾燥残渣を得て、１００μＬのクエン酸塩緩衝剤に溶解した。少量（４μＬ）を取り、アミノ酸分析機（Ｊｅｏｌ  ＪＬＣ−６ＡＨ）による組成分析に供した。
【０１１５】
プロテオーム研究のための試料調製。レイシ抽出物で処理したマウス脾臓細胞を、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、６５ｍＭ  ＤＴＥ、２％ｖ／ｖ均一ｐＨ勾配（ＩＰＧ）緩衝剤ｐＨ３〜１０ＮＬ（非直線）および微量のブロモフェノールブルーを含有する３５０μＬの溶解緩衝剤中で溶解した。試料を、１３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。試料中の全タンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質濃度アッセイキットを用いて測定した。５００μｇのタンパク質に等しい試料を、２次元電気泳動のための固定ｐＨ勾配ストリップ（ｐＨ３〜１０ＮＬ、１８ｃｍ）に添加した。
【０１１６】
２次元電気泳動および画像処理。分離は、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒら１０に記載されるようにして行った。等電点電気泳動は、ＩＰＧＰｈｏｒ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行った。第２次元は、１０〜１５％ポリアクリルアミド勾配ゲルで、Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  ｘＬ  ２Ｄマルチセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。タンパク質スポットは、蛍光色素Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて染色した。
【０１１７】
Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙで染色したゲルを、１０Ｍｂの画像を生成する蛍光レーザスキャナ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてスキャンした。画像を、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ（商標）ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて分析した。各ゲルについて、初期設定のスポット検出パラメータを用いて、スポットを検出し、自動で定量した。手動のスポット編集を、ゲルの目視検査に従って行った。タンパク質の添加量およびゲル染色におけるいずれの差も修正するために、相対的容量を算出した。
【０１１８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析。Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙで染色したタンパク質スポットを、ゲルから切り出し、５０％ＣＨ３ＣＮ中の２００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ８．５緩衝剤で洗浄した。ＣＨ３ＣＮ中での脱水、および高速真空遠心分離の後に、ゲルの切片を、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．５、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０％ＣＨ３ＣＮおよび５０ｎｇの配列決定グレードのトリプシンを含有する消化緩衝剤中で膨潤させた。得られたペプチドを、５０％ＣＨ３ＣＮ／５％ＴＦＡを用いて、１晩の消化の後に抽出した。ペプチド混合物の１μＬの一定量を、ＭＡＬＤＩターゲット９６ウェルプレートに入れ、数秒後に、１μＬのマトリクス溶液（５０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）を加えた。混合物を、周囲温度にて乾燥させた。陽イオン質量スペクトルを、窒素レーザを備えたＭＡＬＤＩ反射飛行時間型質量分析計Ｍ＠ＬＤＩ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＵＫ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）で測定した。報告されたスペクトルは、５０〜１００レーザ照射から取得した。
【０１１９】
フコシダーゼ処理の一般的な手法。５０ｍＭクエン酸緩衝剤（ｐＨ６．０）中のレイシ抽出物または画分３の試料１０ｍｇを、α１，２−またはα１，３／４−フコシダーゼ（５単位）で、３７℃にてある期間（２〜１２時間）処理した。混合物を沸騰水中で５分間加熱して、酵素活性を破壊し、Ｈ２Ｏに対して４℃にて透析し、凍結乾燥して活性研究のための乾燥粉末を得た。
【０１２０】
（実施例２）
材料。レイシ粗抽出物（アルカリ抽出（０．１Ｎ  ＮａＯＨ）、中和およびエタノール沈澱により調製）を、Ｐｈａｒｍａｎｅｘ  Ｃｏ．（ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。すべての化学薬品および試薬は、記載しない限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．（８１．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から得た。
【０１２１】
レイシ抽出物の精製。１００グラムのレイシ粗抽出物を、３Ｌの再蒸留水に溶解し、４℃にて２４時間攪拌し、１時間遠心分離して不溶物を除去した。得られた溶液を、３５℃にて濃縮して少容量にし、凍結乾燥して濃茶色の粉末７０ｇを得て、このうち２．５ｇを少容量のＴｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ７．０、０．１Ｎ）に溶解して、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００カラム（９５ｃｍ×２．６ｃｍ）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーにより、０．１Ｎ  Ｔｒｉｓ緩衝剤（ｐＨ７．０）を溶離液として用いて精製した。流速は０．６ｍＬ／分に設定し、チューブあたり７．５ｍＬを回収した。クロマトグラフィーの後に、各画分をアントロン分析またはフェノール−硫酸法に供して、糖成分を検出した。
【０１２２】
５つの画分を回収し（画分１〜５）、それぞれ透析して、過剰の塩を除去し、凍結乾燥して、４５０ｍｇの画分３を得た。
【０１２３】
画分３を、０．５ｍＬ／分の流速にて０．２および０．８Ｍ  ＮａＣｌで溶出するＤｉａｉｏｎ−Ｗ  Ａ３０アニオン交換体（Ｃｌ形、４０ｃｍ×３．５ｃｍ）のカラムにさらに供し、２つの画分を、それぞれＦ３Ｇ１（画分３に基づいて１１％の収率）およびＦ３Ｇ２（画分３に基づいて１０％の収率）と命名した。別の画分（Ｆ３Ｇ３、画分３に基づいて１１％の収率）は、カラムを２Ｍ  ＮａＯＨでさらに溶出したときに生じた。
【０１２４】
Ｆ３Ｇ２のゲル濾過クロマトグラフィーは、０．５ｍＬ／分の流速にて再蒸留水で溶出するＴＳＫ  ＨＷ−７５カラム（１３０ｃｍ×２．６ｃｍ）で行った。２つの画分を回収した；すなわち、Ｇ２Ｈ１（Ｆ３Ｇ２に基づいて１９％の収率）およびＧ２Ｈ２（Ｆ３Ｇ２に基づいて６９％の収率）。
【０１２５】
アントロン比色法８。氷水浴中に浸漬した一連の試験管中のそれぞれ１．５ｍＬのアントロン（９，１０−ジヒドロ−９−オキソアントラセン）溶液（１００ｍＬの濃硫酸に溶解した０．２ｇのアントロン）に、１．５ｍＬの試料（２０〜４０μｇ／ｍＬのＤ−グルコースまたは等価物）を注意深く重層した。すべて添加した後に、試験管を迅速に振とうし、次いで氷水浴中に再び入れた。試験管を、沸騰水浴中で５分間加熱し、次いで冷却した。光学密度を、１時間以内に、蒸留水に対して６２５ｎｍで読み取った。標準、試薬ブランクおよび不明物は、他の炭水化物供給源の混入の可能性があるので、３回測定した。計算は、光学密度が炭水化物濃度に正比例するという基本に基づいて行った。
【０１２６】
逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）９。マウス脾臓細胞を、健康なマウス（ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス、６週齢）から無菌的に回収し、理想的細胞濃度（３×１０６細胞／ｍＬ）に調整し、１０％のＦＣＳ（胎児ウシ血清）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃にて５％  ＣＯ２とともにインキュベートした。６時間後に、細胞を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙミニキットを用いるＲＮＡ抽出に供して、約１μｇの所望のＲＮＡを得た。逆転写（ＲＴ）は、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬからのＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  Ｒ／Ｔ  ＰＣＲシステム、およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔシステムプロトコルＩを用いて行った。反応は、次のようにして行った：１μｇのＲＮＡ、１μＬのプライマー（オリゴ（ｄＴ）２０）（配列番号２３）、および２μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックスを、０．２ｍＬの各チューブに加え、ＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ（０．１％ジエチルピロカーボネート処理Ｈ２Ｏ）を用いて全容量を１２μＬに調整した。混合物を６５℃にて５分間インキュベートし、直ちに氷上で冷却した。次のものを、各チューブに８μＬの混合物として加えた：４μＬの５×ｃＤＮＡ緩衝剤、１μＬの０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１μＬのＲＮａｓｅＯｕｔ（リボヌクレアーゼ阻害剤）および１μＬのＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  Ｒ／Ｔ、および１μＬのＤＥＰＣ水。混合物を室温にて１０分間、次いで５０℃にて１時間インキュベートして、ｃＤＮＡの最初の鎖の合成を可能にした。反応物を８５℃にて５分間インキュベートすることにより酵素活性を停止させ、次いでチューブを氷上に１０分間置いた。試料を、ＰＣＲに使用するまで−２０℃にて保存した。
【０１２７】
各試料（２μＬ）を、各反応チューブに加え、次の試薬を２５μＬの混合物として加えた：２．５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝剤、２μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、２．５μＬの１０ｍＭの各プライマー（センスおよびアンチセンス）、１３μＬのＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏ、および１μＬのＰｒｏＺｙｍｅ（登録商標）（ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＯｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから）。反応チューブを、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ  ＰＣＲ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ９６）に入れ、次の条件下で運転した：９４℃にて２分間の１サイクル（最初の変性）、次いで９４℃にて１分間（変性）、１分間のプライマーアニーリング（プライマーに応じて種々の温度、詳細は表５を参照されたい）および７２℃にて１分間（プライマー伸長）の連続２５サイクル。反応物は、ゲル電気泳動により分析した。
【０１２８】
サイトカイン発現についてのＲＴ−ＰＣＲ研究によると（表４）、Ｆ３Ｇ２での処理は、上記の１０種のサイトカインすべての著しい発現を導き、よって、このことにより、これが、画分３の主要な活性成分を含有すると結論付けた。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１の発現は、Ｆ３Ｇ１およびＦ３Ｇ３の研究において検出可能であった。これらの画分がともに、画分３またはＦ３Ｇ２とは異なって、炎症経路のみを惹起できることが興味深い。
【０１２９】
ＴＳＫ  ＨＷ−７５カラムでのＦ３Ｇ２のさらなるゲル濾過クロマトグラフィーにより、図６に示すように、２つの画分Ｇ２Ｈ１（Ｆ３Ｇ２に基づいて１９％の収率）およびＧ２Ｈ２（Ｆ３Ｇ２に基づいて６９％の収率）が得られた。ＲＴ−ＰＣＲ研究による予備的な結果は、前者の画分が、同じ量のＦ３Ｇ２およびＧ２Ｈ２よりも、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦの発現について、より高い活性を有することを示した。
【０１３０】
糖組成分析−−ＴＭＳ法。単糖分析のために、多糖抽出物／画分を、０．５Ｍメタノール性ＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて８０℃にて１６時間、加メタノール分解し、５００μＬのメタノール、１０μＬのピリジンおよび５０μＬの無水酢酸を用いて再びＮ−アセチル化し、次いで、Ｓｙｌｏｎ  ＨＴＰ（登録商標）トリメチルシリル化試薬（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を、室温にて２０分間用いて処理し、乾燥して、ヘキサンに再溶解した。トリメチルシリル化誘導体のＧＣ−ＭＳ分析を、ＨＰ５９７３  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒに接続されたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ＨＰ）Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ  ６８９０を用いて行った。試料を、ヘキサンに溶解した後に、ＨＰ−５ＭＳ融解石英キャピラリカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．、ＨＰ）にスプリットレスで注入した。カラムのヘッド圧は、約８．２ｐｓｉに維持して、ヘリウムをキャリアガスとして用いて一定流速１ｍＬ／分にした。最初のオーブン温度は、６０℃にて１分間保持し、１４０℃まで２５℃／分、１４０℃まで２５℃／分で上昇させ、次いで、３００℃まで１０℃／分で上昇させた。
【０１３１】
レイシ粗抽出物、画分３、Ｆ３Ｇ１、Ｆ３Ｇ２およびＦ３Ｇ３の炭水化物組成分析はすべて、主要成分としてのグルコースおよびマンノースとともに、フコース、ガラクトース、Ｎアセチルグルコサミンおよびキシロースを含む他の糖類のより少量の成分が存在することを示した（表３）。Ｆ３Ｇ２およびＦ３Ｇ３ではガラクトースの割合が著しく減少したことが興味深い。
【０１３２】
ＭＮＣ単離
単核細胞（ＭＮＣ）を単離するために、各臍帯血（ＣＢ）またはヒト末梢血（ＰＢ）単位を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／２ｍＭ  ＥＤＴＡで１：１に希釈し、フィコール−ハイパック溶液に注意深く添加した。２０００ｒｐｍにて４０分間、室温での密度勾配遠心分離の後に、ＭＮＣを界面から回収し、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで２〜３回洗浄した。
【０１３３】
樹状細胞（ＤＣ）培養
２×１０７ＰＢＭＮＣを、２５ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｃｌｏｎｉｎｇ）に、４ｍｌ  ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中に播種し、３７℃にて５％二酸化炭素を含む湿潤雰囲気中で１時間インキュベートした後に、非接着細胞を回収し、接着細胞を、ヒトサイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）を補充した無血清ＡＩＭ−Ｖ培地中で、Ｆ３とともに／なしで培養した。７日間の培養期間の間に、ＰＢＭＮＣは樹状細胞の形態に変化した。
【０１３４】
同時培養系でのＨＳＣ  ｅｘ−ｖｉｖｏ増殖
ＣＤ３４＋細胞を、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）ＣＤ３４単離キットを用いて濃縮した。通常、２〜５×１０５のＣＤ３４＋細胞が、１×１０８のＭＮＣから、ＦＡＣＳ分析により確認して９０〜９５％の純度で得られた。マウス間質株化細胞（ＭＳ−５）を、ＣＤ３４＋細胞の同時培養のために間質層として用いた。ＭＳ−５を、１０％ＦＢＳおよびＰＳＮ抗生物質を補充した低グルコースＤＭＥＭ中で１週間を超えて培養した。１×１０４細胞／ｍＬの密度の精製ＣＤ３４＋細胞密度を、２ｍｍｏｌ／Ｌのｌ−グルタミン、ＰＳＮ抗生物質、１０Ｕ／ｍｌの組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ；Ｒ＆Ｄ）、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ；Ｒ＆Ｄ）、５０ｎｇ／ｍＬのｆｌｔ３−リガンド（ＦＬ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）および１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン−６（Ｉｌ−６；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を補充した４ｍＬの無血清ＥＸ−ＶＩＶＯ  １０培地に再懸濁した。精製ＣＤ３４＋細胞は、ＭＳ−５フィーダーとともに、２５Ｔフラスコ中で同時培養される。８日目に、懸濁細胞を、プレートを穏やかに振とうした後に回収した。残りの弱く付着した造血細胞は、各ウェルに３ｍＬのＤＭＥＭを加えることにより完全に回収した。細胞および生細胞の総数は、血球計数器を用いて、光学顕微鏡の下でトリパンブルー非染色細胞数を計数することにより概算した。
【０１３５】
ＡＤ−ＭＳＣ単離および軟骨新生
ＡＤ−ＭＳＣは、未処理のヒト脂肪吸引物から得て、本明細書に参照により明確に組み込まれるＣｈｉｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２巻、５６０３〜５６０９頁（２００４年）に記載されるようにして培養した。簡単に、未処理の脂肪吸引物を、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄して、混入破砕物および赤血球細胞を除去した。洗浄した吸引物を、ＰＢＳ中の０．０７５％コラゲナーゼ（Ｉ型；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で、３７℃にて３０分間、穏やかに混合しながら処理した。コラゲナーゼは、等容量のＤＭＥＭ／１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を用いて不活性化し、下澄物を低速で１０分間遠心分離した。細胞の沈殿物をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁し、１００μｍメッシュフィルタを通して濾過して、破砕物を除去した。濾過物を上記で詳述したように遠心分離し、維持培地中に、通常の組織培養プレートに播種した。ＡＤ−ＭＳＣは、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ−ＬＧ（ＧＩＢＣＯ）で維持した。ＡＤ−ＭＳＣは、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ−ＬＧ（ＧＩＢＣＯ）で維持した。ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化は、軟骨新生培地で処理した：１％ＦＢＳ、６．２５μｇ／ｍｌインスリン、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ）および５０ｎＭアスコルベート−２−ホスフェートを補充したＤＭＥＭ−ＬＧ。軟骨新生分化のために、１０μｌあたり１〜２×１０５のより高い細胞密度を、軟骨球体形成のために用いた。培養の間、軟骨細胞を３日目および７日目に計数した。
【０１３６】
ＲＴ−ＰＣＲ
全細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。特定の遺伝子を、ＰＣＲにより、Ｆａｓｔ−Ｒｕｎ  Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）を用いて増幅した。
【０１３７】
ＦＡＣＳ分析
成人末梢血由来樹状細胞および臍帯血増殖ＨＳＣを、特定の表面抗原についてＦＡＣＳにより特徴決定した。採集した細胞を回収し、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリスリンにコンジュゲートした抗マーカーモノクローナル抗体を用いて、製造者の提案に従って、１００μｌリン酸緩衝剤中で、室温にて１５分間の力価で染色した。細胞表面マーカーは、樹状細胞マーカー（ＣＤ１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６）および造血系マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１３３、ＣＸＣＲ４）を含んでいた。細胞を、フローサイトメトリーシステム（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。陽性の細胞を計数し、非染色細胞のシグナルと比較した。
【０１３８】
ヒトサイトカインアレイ分析
回収したＰＢＭＮＣを、条件的培地中で７日の間に、樹状細胞に変換した。培養培地は、Ｆ３とともに／なしでヒトサイトカインＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）を補充したＡＩＭ−Ｖである。細胞により分泌されたサイトカインを、ＲａｙＢｉｏ（商標）ヒトサイトカイン抗体アレイキット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇａ）により検出した。サイトカイン抗体アレイメンブレンを、室温にて３０分間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、次いで、２ｍｌの条件的培地をメンブレンとともに１．５時間インキュベートした。メンブレンを、洗浄緩衝剤Ｉ、ＩＩを用いて洗浄し、次いで、ビオチンコンジュゲート抗体を、メンブレンに１時間加えた。洗浄の後に、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンをメンブレンに４０分間加え、次いで、Ｘ線フィルムをＡＣＬ試薬により感光させた。画像は、ＫＯＤＡＫ  １Ｄ  ３．５ソフトウェアを用いて分析し、次いで、データを標準化してＥＸＣＥＬでグラフを描いた。
【０１３９】
結果：
Ｆ３は、造血単核細胞（ＭＮＣ）における細胞接着分子（ＣＡＭ）発現に影響する：
細胞接着分子（ＣＡＭ）および接着単核細胞の共刺激因子は、真核免疫系細胞および抗癌転移の活性化に重要であることが知られている。この研究において、Ｆ３は、サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇ）、ＩＬ−４（４））の存在にかかわらず、ＡＩＭ−Ｖ（Ｍ−Ｖ）基本培養培地の下で、培養ディッシュ中のＣＢ−ＭＮＣ接着を著しく増大させ、細胞形態変化を誘導した（図１、２Ａ〜２Ｅ）。
【０１４０】
Ｆ３は、未熟樹状細胞（Ｄａｃｅｓ）形成およびＢ細胞生成を亢進する：
免疫応答を開始する単核細胞である樹状細胞、ならびにＩＬ−４と一緒にした顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）は、ＭＮＣからＤＣへの分化転換を相互に制御することが知られている。ＣＢ−ＭＮＣからＤＣへの変換に対するＦ３の影響を調べる際に、本発明者らは、Ｆ３が、ＩスーパーファミリーＣＡＭ（Ｎ−ＣＡＭおよびＶ−ＣＡＭ）発現（図３Ａ）を特異的に亢進するが、Ｉ−ＣＡＭもＰＥ−ＣＡＭも亢進しないことを見出した。Ｆ３により刺激された接着ＣＢ−ＭＮＣは、Ｃ．  Ｍ．  Ｃｈｉｅｎら（参照により本明細書に明確に組み込まれる）により以前に記載されたように、ＲＰＭＩ基本培地中でより多くのＣＤ８３＋成熟樹状細胞（ＤＣ）を作製する（図３Ｄ〜Ｅ）だけでなく、ＡＩＭ−Ｖ培地培養条件下の細胞樹状突起の成長が亢進された、より活性な未熟接着ＤＣ（ＣＤ１ａ＋、ＣＤ４０＋、ＣＤ８０＋およびＣＤ８６＋）サブセットを生成し得る結果をもたらす（図３Ｂ〜３Ｃ）。ＣＢ−およびＰＢ−ＭＮＣは、Ｆ３刺激に対して、成熟ＤＣ細胞への変換について異なる応答をする。
【０１４１】
Ｆ３は、単球を変換して、癌免疫療法のためのより未熟な活性ＤＣを作製するための効果的なアジュバントとして役立ち得る。さらに、レイシＦ３での刺激の際に、本発明者らは、ＣＤ１９＋亜集団Ｂ細胞が、ＣＢ−ＭＮＣからＤＣへの培養において著しく増大したことも見出した（図３Ｄ）。
【０１４２】
未熟ＤＣ−ＯＣ分化転換は、関節リウマチの関節液により大きく亢進されることが示されており、ＩＬ−１またはＴＮＦ−ａのような炎症誘発性サイトカイン、およびヒアルロン酸のようなＥＣＭの構成要素を伴う（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｂｌｏｏｄ．２００４年；１０４巻：４０２９〜４０３７頁、参照により明確に本明細書に組み込まれる）。Ｆ３は、樹状細胞培養中で、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の同時刺激の下に７日間で、成体血液の炎症誘発性サイトカインの上方制御、ならびにＰＡＲＫおよびアンジオゲニン発現の下方制御に影響する。ヒトサイトカインアレイにより分析して、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＭＩＰ−βは上方制御され、これとは対照的に、ＰＡＲＣ、およびアンジオゲニンサイトカインは下方制御された（図３Ｆ〜３Ｇ）。
【０１４３】
Ｆ３は、ＣＢ−またはＰＢ−ＭＮＣを接着未熟活性ＤＣに変換するための効果的なアジュバントとして役立ち（図１）、細胞培養において、ＣＤ１９＋Ｂ細胞集団に影響し得る（図３Ｄ）。
【０１４４】
ＣＢ−ＨＳＣの原始的ＣＤ３４＋造血幹細胞集団ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖のＦ３維持：
Ｓｏｖａｌａｔ  Ｈら、Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１２巻、４７３〜４８９頁（２００３年）（参照により明確に本明細書に組み込まれる）は、可動性血液中でのＨＳＣのＢＭ間質細胞への接着の減少は、定常状態の血液、骨髄および臍帯血からのものと比較して、ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−プロテオームサブセットの接着分子の下方制御によることを示した。
【０１４５】
本研究において、ＣＢからのＣＤ３４＋  ＨＳＣを単離し、５種サイトカインカクテル液体培養および間質細胞ベースの同時培養系により、ＣＤ３４＋  ＨＳＣ生存および増殖のＦ３の影響を調べるために供した。図４Ａ〜４Ｃに示すように、レイシ抽出物および特にレイシ抽出物のＦ３画分は、液体およびフィーダー同時培養系においてともに、ＣＤ３４＋  ＨＳ／ＰＣのＣＤ３８−およびＣＤ１３３＋原始ＨＳＣ亜集団を維持し、このことは、Ｆ３が、ｅｘ−ｖｉｖｏ増殖培養において、ＣＤ３４＋  ＨＳＣの原始ＣＤ３８−およびＣＤ１３３＋亜集団が分化することを妨げるための可溶性基質として働き得ることを示す。
【０１４６】
Ｆ３加水分解成分を調べることにより、本発明者らは、ＣＤ３８−およびＣＤ１３３＋原始集団（図４Ｄ〜４Ｅ）およびＣＸＣＲ４＋  ＨＳＣ  ＣＤ３４＋集団（図４Ｆ）を亢進するレイシ抽出物画分をさらに同定した。本発明者らのデータは、Ｆ３のような選択的天然グリコシドおよび／または糖タンパク質を、ｅｘ−ｖｉｖｏ増殖培養について原始ＨＳＣを未分化の状態に維持するための可溶性足場として補充することにより、液体培養中のグリコシド部分の消滅が、妨げられ得ることを示した。よって、Ｆ３のような選択的グリコシドまたは糖タンパク質は、移植のよりよい成功のために、ＣＢ−ＨＳＣのｅｘ−ｖｉｖｏ増殖同時培養物に補充して、白血球除去処理可動性ＰＢ−ＨＳＣを処理し得る。
【０１４７】
Ｆ３は、ＭＳＣ軟骨新生分化可能性に影響する
Ｎ−ＣＡＭは、神経突起伸長、軸索誘導および遊走にかかわるＣＮＳ発達において重要であり、細胞内シグナルカスケードを誘導するシグナル受容体を活性化することが示されている。Ｆａｎｇ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｂ．  Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏ．４３巻：３３５〜３４２頁（１９９９年）（参照により明確に本明細書に組み込まれる）。Ｎ−ＣＡＭ発現も、軟骨新生の初期に骨格濃縮に参加し、軟骨新生を開始する（前軟骨濃縮の形成を媒介する）ことも示されている（Ｗｉｄｅｌｉｔｚら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５６巻：３９９〜４１１頁（１９９３年）（参照により明確に本明細書に組み込まれる）。
【０１４８】
軟骨球体誘導間葉系幹細胞分化培養でのＦ３の影響を調べる際に、Ｆ３が、ＢＭＰ−２、ＩＬ−１およびアグリカン遺伝子発現の増加を伴って（図５Ａ〜５Ｃ）、間葉系軟骨球体の形成を加速して亢進することが見出された。これらの結果に基づくと、Ｆ３は、骨格形成剤とともに処方することにより、骨格リモデリング薬物として有用であり得る。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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