(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラシノコッカス目由来の微細藻類細胞から得ることができるゲル形成性多糖類であって、免疫系障害の処置における使用のための、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む１０メガＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーであるゲル形成性多糖類。
【請求項２】
前記免疫系障害が、湿疹、乾癬およびアトピー性皮膚炎を包含する炎症性皮膚状態、過敏性腸症候群、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する腸管の炎症状態、または喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、慢性閉塞性肺障害、急性呼吸促迫症候群もしくはアレルギー性鼻炎を包含する呼吸器系の炎症状態から選択される、請求項１に記載のゲル形成性多糖類。
【請求項３】
プラシノデルマ・シンギュラリス（Prasinoderma singularis）またはプラシノコッカス・カプスラタスから得ることができる、請求項１又は２に記載のゲル形成性多糖類。
【請求項４】
重量で約
２０〜３０％のグルコース
３０〜６０％のガラクトース
４〜１９％のアラビノース
２〜６％のウロン酸および１〜１０％の他の糖単位
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のゲル形成性多糖類。
【請求項５】
他の糖単位が、
ラムノース
キシロースおよび
マンノース
を含む、請求項４に記載のゲル形成性多糖類。
【請求項６】
約１７〜３５重量％の硫酸エステル含量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のゲル形成性多糖類。
【請求項７】
約２０重量％の硫酸エステル含量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のゲル形成性多糖類。
【請求項８】
多糖類が与えられていない好中球と比べて、好中球における好中球のエラスターゼ活性を約６０〜９０％阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のゲル形成性多糖類。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の多糖類を含む栄養補助食品。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の多糖類を含む化粧品調製物。
【請求項１１】
基礎担体または皮膚保湿物質を含む、請求項１０に記載の化粧品調製物。
【請求項１２】
プラシノコッカス目由来の微細藻類細胞から得ることができるゲル形成性多糖類の誘導体であって、
前記ゲル形成性多糖類が、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む１０メガＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーであり、
前記誘導体が、約２ｋＤａ〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する、ゲル形成性多糖類の誘導体。
【請求項１３】
２〜１０ｋＤａの範囲内の分子量を有する、請求項１２に記載の誘導体。
【請求項１４】
重量で約
３０〜４０％のグルコース
３０〜４０％のガラクトース
８〜１４％のアラビノース
７〜１１％のウロン酸および
１〜１０％の他の糖単位
を含む、請求項１３に記載の誘導体。
【請求項１５】
２０〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する、請求項１２に記載の誘導体。
【請求項１６】
重量で約
２５〜２８％のグルコース
３５〜５５％のガラクトース
８〜１７％のアラビノース
４〜６％のウロン酸および
１〜５％の他の糖単位
を含む、請求項１５に記載の誘導体。
【請求項１７】
好中球のエラスターゼ放出を約７０〜９０％阻害する、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１８】
誘導体が与えられていない好中球と比べて、好中球活性酸素種産生を約３０〜４０％阻害する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１９】
誘導体が与えられていないケラチノサイトと比べて、ヒトケラチノサイトのＩＬ−８遺伝子発現およびＩＬ８放出を約７０〜１００％阻害する、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項２０】
請求項１２〜１９のいずれかに記載の誘導体を含む化粧品調製物。
【請求項２１】
請求項１２〜１９のいずれかに記載の誘導体を含む栄養補助食品。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれかに記載の多糖類または請求項１２〜１９のいずれかに記載の誘導体を含む組成物。
【請求項２３】
−  プラシノコッカス目由来の微細藻類細胞、特に、プラシノデルマ・シンギュラリスまたはＰ．カプスラタス細胞を培養するステップと、
−  培養物の細胞画分または分泌画分から多糖類またはその誘導体を単離するステップと
を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の多糖類または請求項１２〜１９のいずれかに記載の誘導体を調製する方法。
【請求項２４】
プラシノコッカス目由来の微細藻類細胞から得ることができるゲル形成性多糖類を含む、免疫系障害の処置剤であって、
前記ゲル形成性多糖類が、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む１０メガＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーである、免疫系障害の処置剤。
【請求項２５】
前記免疫系障害が、湿疹、乾癬およびアトピー性皮膚炎を包含する炎症性皮膚状態、過敏性腸症候群、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する腸管の炎症状態、または喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、慢性閉塞性肺障害、急性呼吸促迫症候群もしくはアレルギー性鼻炎を包含する呼吸器系の炎症状態から選択される、請求項２４に記載の免疫系障害の処置剤。
【請求項２６】
プラシノコッカス目由来の微細藻類細胞から得ることができるゲル形成性多糖類の誘導体を含む、免疫系障害の処置剤であって、
前記ゲル形成性多糖類が、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む１０メガＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーであり、
前記誘導体が、約２ｋＤａ〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する、免疫系障害の処置剤。
【請求項２７】
前記誘導体が、２〜１０ｋＤａの範囲内の分子量を有する、請求項２６に記載の免疫系障害の処置剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、乾癬および皮膚病状態における炎症性障害などの、免疫系の障害の処置における予防的および／または治療的な使用のための、微細藻類のプラシノコッカス・カプスラタス（Prasinococcus capsulatus）およびＰ．カプスラタス関連株から得ることができる多糖類を含む組成物に関する。さらに、微細藻類のプラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連藻類株から得ることができる多糖類の誘導体、ならびに例えば、乾癬および皮膚病状態における炎症性障害などの、免疫系の障害の処置における予防的および／または治療的なそのような誘導体の使用が提供される。
【０００２】
化粧品および栄養組成物の調製における、微細藻類、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連藻類株から得ることができる多糖類およびその誘導体の使用も提供される。
【背景技術】
【０００３】
大型藻類（Macroalgae）（海藻）は、開発されて、アルギン酸塩およびカラゲナン（carageenan）等の長い伝統のある産物ならびにフコイダン等のより最近の産物を提供してきた。しかし、微細藻類は、未だこのように顕著に活用されておらず、微細藻類に由来するこのような産物は相対的にほとんど特徴づけされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０３１１６１（Ａ１）号パンフレット
【特許文献２】ノルウェー特許第３２０９５０号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｓｈｉｔａら、Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｇｅｎ．Ｅｔ  Ｓｐ．Ｎｏｖ．、Ａ  Ｎｅｗ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｃｏｃｃｏｉｄ  Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｔｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３９、５７１〜５８２（１９９３）
【非特許文献２】Ｍｉｙａｓｈｉｔａら、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｎｅｗｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｏｃｃｏｉｄ  ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｔｅ、Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ．Ｊ．Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１３６〜１３９（１９９５）
【非特許文献３】Ｈｉｇａｓｈｉら、（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋ５  ｈｅｐａｒｏｓａｎ，  ａ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８６（２０１１）１３６５〜１３７０）
【非特許文献４】Ｓｉｅｂｕｒｔｈら、Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｃｅａｎｉｃ  ｕｌｔｒａｐｌａｎｋｔｅｒ，  Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ），  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ‘‘ｇｏｌｇｉ−ｄｅｃａｐｏｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ’’  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｅｗｌｙ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ‘‘ｃａｐｓｕｌａｎ’’．Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．３５、１０３２〜１０４３（１９９９）
【非特許文献５】Ｇｕｉｌｌａｒｄ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｒｙｔｈｅｒ  Ｊ．１９６２  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍａｒｉｎｅ  ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ  ｄｉａｔｏｍｓ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：２２９〜２３９
【非特許文献６】Ｒｏｔａ  Ｃら、２００５  Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｐａｒｉｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４４（２）：１９３〜２０３
【非特許文献７】Ｐｅｔｉｔ  ＡＣら、２００６  Ｆｒｅｅ−ｒａｄｉｃａｌ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｌｌｉｃ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｄｅｅｐ−ｓｅａ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｖｅｎｔ  ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅ  ａｎｎｅｌｉｄ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６４：５９７〜６０２
【非特許文献８】Ｔｅｒｈｏ  Ｔ＆Ｈａｒｔｉａｌａ  Ｋ（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７１）４１（２）：４７１〜４７６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様において、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連藻類株から得ることができるゲル形成性多糖類であって、免疫系障害、特に、炎症状態である免疫系障害の処置における使用のための、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む６７０ｋＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーであるゲル形成性多糖類が提供される。
【０００７】
本発明者らは、本発明の多糖類およびその誘導体の組成を決定するために様々な方法を試みた。本発明者らは、多糖類の立体配置に関する理論による制約を望むことなく、本明細書に詳述されている方法を用いて、記載されている通りに多糖類および誘導体を特徴づけた。従って、実施形態において、多糖類または誘導体は、本明細書に記載されている方法を用いて特徴づけられる場合、本明細書に記載されている単糖類および硫酸エステル組成を提供する。
【０００８】
比較的近年に発見された種であるプラシノコッカス・カプスラタスは、多糖類を産生することを示した（Ｍｉｙａｓｈｉｔａら、Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｇｅｎ．Ｅｔ  Ｓｐ．Ｎｏｖ．、Ａ  Ｎｅｗ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｃｏｃｃｏｉｄ  Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｔｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３９、５７１〜５８２（１９９３）およびＭｉｙａｓｈｉｔａら、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｎｅｗｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｏｃｃｏｉｄ  ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｔｅ、Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ．Ｊ．Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１３６〜１３９（１９９５））。
【０００９】
適切には、プラシノコッカス・カプスラタス関連株は、プラシノコッカス（Prasinococcales）目の株を包含することができる。実施形態において、プラシノコッカス・カプスラタス関連株は、プラシノデルマ・シンギュラリス（Prasinoderma singularis）を包含することができる。実施形態において、該多糖類は、微細藻類の細胞壁に結合した多糖類でもよい、および／または微細藻類のホモジネート（homengenate）に存在してもよい、および／または分泌多糖類もしくはエキソ多糖類でもよい。多糖類は、単離、精製または半精製された形態で提供することができる。実施形態において、多糖類は、少なくとも５０重量％の多糖類、より好ましくは７５重量％超の多糖類、より好ましくは８５重量％超、より好ましくは約９５重量％となるように、細胞バイオマスから分離された精製材料でもよい。
【００１０】
実施形態において、免疫系障害は、内部または外部刺激に対する血管細胞および組織の応答が、不十分、過剰または慢性の障害である。炎症状態において、この応答は一般に、過剰および／または慢性であり、免疫細胞（好中球およびＴ細胞等）の活性化の増加および維持をもたらすが、免疫細胞は、組織に浸潤し、炎症促進性メディエーターの産生を増加させ、炎症の持続をもたらす恐れがある。例えば、エラスターゼ等、好中球プロテアーゼの活性を低下させることにより、血液および内皮細胞からの炎症促進性タンパク質（サイトカイン）および活性酸素種の分泌を低下させることにより、ならびに作用する組織への血液細胞浸潤を低下させることにより、多糖類を用いてこの活性化の効果を緩和させることができると判定された。
【００１１】
本発明の実施形態において、本明細書に記載されている多糖類は、湿疹、乾癬およびアトピー性皮膚炎を包含する炎症性皮膚状態の処置における使用ができる。
【００１２】
本発明の実施形態において、本明細書に記載されている多糖類は、腸管の炎症状態の処置における使用のため、特に、過敏性腸症候群、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する腸障害の処置における使用ができる。
【００１３】
本発明の実施形態において、本明細書に記載されている多糖類は、喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、慢性閉塞性肺障害、急性呼吸促迫症候群またはアレルギー性鼻炎を包含する呼吸器炎症状態の処置における使用ができる。
【００１４】
本発明における使用のための多糖類の実施形態は、次の特徴（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）のうち少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５種によって特徴づけることができる。
（ｉ）分子量範囲
（ｉｉ）単糖組成
（ｉｉｉ）免疫調節活性
（ｉｖ）硫酸エステル含量（分子の分子量のパーセンテージとして）
（ｖ）粘性／ゲル形成性特性
【００１５】
＜分子量範囲＞
本発明における使用のための多糖類は、典型的には、６７０ｋＤａまたは６７０ｋＤａを超える分子量を有する。
【００１６】
実施形態において、本発明の多糖類は、６７０ｋＤａ〜４０メガＤａの範囲内の分子量を有し得る。実施形態において、本発明の多糖類は、１メガＤａを超える若しくは１メガＤａに等しい、５メガＤａを超える若しくは５メガＤａに等しい、１０メガＤａを超える若しくは１０メガＤａに等しい、１５メガＤａを超える若しくは１５メガＤａに等しい、２０メガＤａを超える若しくは２０メガＤａに等しい、２５メガＤａを超える若しくは２５メガＤａに等しい、３０メガＤａを超える若しくは３０メガＤａに等しい、３５メガＤａを超える若しくは３５メガＤａに等しい、または４０メガＤａの分子量を有し得る。
【００１７】
実施形態において、本発明の多糖類は、約
２０〜３０％のグルコース
３０〜６０％のガラクトース
４〜１９％のアラビノース
２〜６％のウロン酸
および僅かなパーセンテージ（１〜１０％）の他の糖、より詳細には、
１〜４％のラムノース
１〜３％のキシロース
１〜１０％のマンノース
（重量％）を含むことができる。
【００１８】
実施形態において、本発明の多糖類は、約
２５〜２９％のグルコース
３５〜４７％のガラクトース
１４〜１５％のアラビノース
４〜６％のウロン酸
および僅かなパーセンテージ（１〜４％）の他の糖、より詳細には、
２．４％のラムノース
１．８％のキシロース
３．３％のマンノース
（重量％）を含むことができる。
【００１９】
実施形態において、本発明における使用のための多糖類は、約１７〜３５重量％、１７〜３０重量％、適切には、２５〜３０重量％、適切には、１７〜２５重量％の硫酸エステル含量を有し得、適切には、多糖類は、約２０重量％、適切には約１９重量％の硫酸エステル含量を有し得る。
【００２０】
実施形態において、本発明における使用のための多糖類は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける免疫調節活性を実証することができ、例えば、多糖類は、多糖類が与えられていない好中球と比べて、好中球のエラスターゼ活性を約６０〜９０％、特に、６０〜８０％阻害することができる。
【００２１】
皮膚の炎症状態の処置に治療的に有用であるのみならず、本明細書に記載されている多糖類の実施形態を用いて、体内免疫系障害、特に、腸管炎症状態および呼吸器状態、例えば、腸障害、過敏性腸症候群、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する腸管炎症状態、ならびに喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、慢性閉塞性肺障害、急性呼吸促迫症候群またはアレルギー性鼻炎を包含する呼吸器状態を処置することができると考えられる。そのような状態の処置は、多糖類の経口摂取または多糖類の吸入によってもよい。さらに、患者が、潜在的に免疫系障害を有するが、症状を呈していない場合、本明細書に記載されている多糖類を与えて、症状のリスクを最小化できると考えられる。
【００２２】
従って、本発明の第２の態様は、Ｐ．カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連株から得ることができる多糖類を含む栄養補助食品であって、ゲル形成性多糖類が、主としてグルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む、６７０ｋＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーである栄養補助食品を提供する。
【００２３】
その上、治療的な利益が必要とされない場合、本発明者らは、多糖類が、使用者に化粧品的な利点を有用に提供し得ることを考慮する。
【００２４】
従って、本発明の第３の態様は、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連株から得ることができる多糖類を含む化粧品調製物であって、ゲル形成性多糖類が、主としてグルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む、６７０ｋＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーである化粧品調製物である。
【００２５】
これから分かる通り、本発明の第１の態様の多糖類の実施形態は、本発明の第２および第３の態様において用いることができる。
【００２６】
＜多糖類の誘導体およびその使用＞
本発明者らは、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連株から得ることができるゲル形成性多糖類であって、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む、６７０ｋＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーであるゲル形成性多糖類の誘導体もまた、免疫系障害、特に、炎症性応答を促進する免疫系障害の処置において用いることができることを決定した。
【００２７】
従って、本発明の第４の態様は、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連株由来のゲル形成性多糖類の誘導体（オリゴ糖）であって、ゲル形成性多糖類が、主としてグルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む、６７０ｋＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーであり、前記誘導体が、約２ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲内、または約２〜２０ｋＤａの範囲内、または約２０〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する誘導体を提供する。
【００２８】
これから分かる通り、本発明の第１の態様の多糖類の実施形態を用いて、本発明の第４の態様の誘導体を形成することができる。
【００２９】
実施形態において、誘導体は、２〜１０ｋＤａの範囲内の分子量を有する低分子量断片となり得る。実施形態において、誘導体は、２０〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する多糖類のより大型断片を含むことができる。
【００３０】
実施形態において、２〜１０ｋＤａ前後の多糖類の低分子量断片は、約
３０〜４０％のグルコース
３０〜４０％のガラクトース
８〜１４％のアラビノース
７〜１１％のウロン酸
および僅かなパーセンテージ（１〜１０％）、適切には、僅かなパーセンテージ（１〜４％）の他の糖単位
（重量％）を含むことができる。
【００３１】
実施形態において、２〜１０ｋＤａ前後の多糖類の低分子量断片は、約
３５％のグルコース
３５％のガラクトース
１１％のアラビノース
９％のウロン酸
および僅かなパーセンテージ（１〜１０％）、適切には、僅かなパーセンテージ（１〜４％）の他の糖単位
（重量％）を含むことができる。
【００３２】
実施形態において、多糖類の大型断片（２０〜６０ｋＤａ前後）は、
２５〜２８％のグルコース
３５〜５５％、適切には、３５〜４５％のガラクトース
８〜１７％のアラビノース、適切には、１５％のアラビノース
４〜６％のウロン酸
および僅かなパーセンテージ（１〜４％）の他の糖単位
（重量％）を含むことができる。
【００３３】
実施形態において、多糖類の大型断片（２０〜６０ｋＤａ前後）は、
２５％のグルコース
５０％のガラクトース
１５％のアラビノース
５％のウロン酸
および僅かなパーセンテージ（１〜５％）の他の糖単位
（重量％）を含むことができる。
【００３４】
実施形態において、本発明の多糖類の誘導体は、重量で約
８．４％のアラビノース
０．７％のラムノース
２．０％のキシロース
２．２％のＧａｌＡ（ガラクツロン酸）
５７．９％のガラクトース
２４．６％のグルコース
３．８％のＧｌｃＡ（グルクロン酸）
を含むことができる。
【００３５】
適切には、実施形態において、本発明の多糖類の誘導体は、約２０〜３０重量％、適切には、２５〜３０重量％の硫酸エステル含量を有し得る。
【００３６】
実施形態において、多糖類のオリゴ糖誘導体は、誘導体が与えられていない好中球と比べて、好中球のエラスターゼ放出を約７０〜９０％、適切には、８０〜９０％阻害することができる。
【００３７】
実施形態において、多糖類の誘導体は、誘導体が与えられていない好中球と比べて、好中球活性酸素種（ＲＯＳ）産生を約３０〜４０％阻害することができる。実施形態において、オリゴ糖誘導体は、誘導体が与えられていないケラチノサイトと比べて、ヒトケラチノサイトのＩＬ−８遺伝子発現および放出を約７０〜１００％阻害することができる。この活性は、エラスターゼ放出を約６０〜７５％阻害するが、ＲＯＳ産生において有意な効果を持たない、十分に特徴づけされた多糖類抗凝固薬ヘパリンに匹敵する。活性は、エラスターゼ放出を約７０〜９０％、ケラチノサイトＩＬ−８放出を約８０〜９０％阻害する、海藻多糖類フコイダンにも匹敵する。
【００３８】
実施形態において、多糖類のオリゴ糖誘導体は、誘導体が与えられていないヒトケラチノサイトと比べて、ヒトケラチノサイトのＩＬ６およびＩＬ１７Ｃ放出を約５０〜７０％阻害することができる。実施形態において、多糖類のオリゴ糖誘導体は、誘導体が与えられていないヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と比べて、ヒトＰＢＭＣからのインターフェロンガンマの放出を約５０〜７０％阻害することができる。実施形態において、オリゴ糖は、誘導体が与えられていない好中球および単球と比べて、ヒト好中球の走化性を約５０〜７０％、ＴＨＰ−１（単球）細胞の走化性を約３０〜５０％阻害することができる。実施形態において、多糖類のオリゴ糖誘導体は、誘導体が与えられていない対照と比べて、イミキモド誘導性マウス皮膚炎症を用量依存的様式で阻害することができる。
【００３９】
約とは、明示した値の１〜２０％以内、より詳細には、１０％以内、さらにより詳細には、５％以内、さらになおより詳細には、２％以内を意味する。
【００４０】
本発明の誘導体の実施形態は、免疫系障害、特に、炎症性応答を促進する免疫系障害、より具体的には、湿疹、乾癬およびアトピー性皮膚炎を包含する皮膚状態の処置における使用ができる。
【００４１】
本発明の誘導体の実施形態は、体内免疫系障害、特に、腸管炎症状態および呼吸器状態、例えば、腸障害、過敏性腸症候群、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する腸管炎症状態ならびに喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、慢性閉塞性肺障害、急性呼吸促迫症候群またはアレルギー性鼻炎を包含する呼吸器状態の処置における使用ができる。
【００４２】
そのような処置におけるそのような誘導体の使用は、本発明のさらに別の態様を提供する。
【００４３】
適切には、誘導体の実施形態は、Ｈｉｇａｓｈｉら、（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋ５  ｈｅｐａｒｏｓａｎ，  ａ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８６（２０１１）１３６５〜１３７０）に記載されている方法等、多糖類の加水分解もしくは酵素による加水分解またはフリーラジカルもしくは光化学的方法を包含する本技術分野において公知のいずれかの方法によって調製することができる。
【００４４】
本発明の誘導体の実施形態は、ラジカル法または光化学法によって調製された、脱重合された多糖類でもよい。
【００４５】
誘導体の実施形態は、約２５〜３０重量％の硫酸エステル含量を有するオリゴ糖でもよい。
【００４６】
好ましくは、本発明のオリゴ糖誘導体は、本発明の未変性多糖類材料に等しいまたはそれを越える免疫調節性を有し得る。
【００４７】
本発明の第５の態様において、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連株由来の多糖類の少なくとも１種の誘導体を含む化粧品調製物であって、ゲル形成性多糖類が、主としてグルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む、６７０ｋＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーであり、前記誘導体が、２ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲内または約２０〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する化粧品調製物が提供される。
【００４８】
実施形態において、誘導体は、２〜１０ｋＤａの範囲内の分子量を有する低分子量断片でもよい。実施形態において、誘導体は、２０〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する多糖類の大型断片を含むことができる。
【００４９】
実施形態において、誘導体の大型断片および低分子量断片の組み合わせを提供し得る。
【００５０】
本発明の第６の態様において、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連株由来の多糖類の少なくとも１種の誘導体を含む栄養補助食品であって、ゲル形成性多糖類が、主としてグルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む、６７０ｋＤａを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーであり、前記誘導体が、２ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲内または約２０〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する栄養補助食品が提供される。
【００５１】
実施形態において、誘導体は、２〜１０ｋＤａの範囲内の分子量を有する低分子量断片でもよい。実施形態において、誘導体は、２０〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する多糖類の大型断片を含むことができる。
【００５２】
実施形態において、誘導体の大型断片および低分子量断片の組み合わせを提供し得る。
【００５３】
＜組成物＞
適切には、本明細書に論述する多糖類または誘導体は、組成物の一部として提供することができる。そのような組成物は、経口、局所、直腸または非経口、経鼻または経肺投与（吸入による）に適し得る。実施形態において、組成物は、用途に応じて皮膚への局所適用向けでも、摂取向けでもよい。
【００５４】
実施形態において、直ぐに使える状態の（ready-for-use）組成物は、錠剤、カプセル、カシェー（cachet）の形態でもよい、あるいは例えば、投与前に水に懸濁するまたは食品に振りかけることのできる分散性顆粒でもよい。組成物は、単位剤形にて簡便に提供することができ、食品および食品サプリメントの調製に関しては食品業界において周知の方法、または医薬、例えば、局所医薬としての使用に関しては製薬業界に公知の方法のいずれかによって調製することができる。
【００５５】
局所投与のための組成物は、例えば、ゲル、クリームまたは軟膏として提供され得る。そのような組成物は、皮膚に直接的に塗布することができる、あるいは処置しようとする区域に適用することのできる包帯、ガーゼ、メッシュその他等、適した支持体に運搬させることができる。
【００５６】
食品製造技術分野の当業者に公知の方法として、粉末形態における活性薬剤および他の成分の乾式混合、全構成成分を含有するエマルションの噴霧乾燥またはペレットもしくは顆粒を形成するための押し出し技術の使用が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、組成物は、液体強壮剤（tonic）の形態でもよい。
【００５７】
多糖類または誘導体は、薬学的に許容される塩または薬学的に許容される溶媒和化合物として提供され得る。実施形態において、多糖類または誘導体は、単独で、または企図される投与経路および標準薬務（pharmaceutical practice）に関して選択される医薬担体、賦形剤もしくは希釈剤との混合物において投与することができる。医薬担体は、本発明の多糖類またはその誘導体と組み合わせることによって適用を容易にすることのできる、有機または無機、天然または合成いずれかの生理学的に許容される担体となり得る。
【００５８】
実施形態において、多糖類または誘導体は、いずれかの適した結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）、担体（複数可）または緩衝安定剤（buffer stabiliser）（複数可）と混合することができる。
【００５９】
本発明の組成物は、処置されている状態の必要に応じて選択される１種または複数のさらに別の活性化合物を含有することもできる。例えば、組成物は、本発明の産物によって標的化されるものとは別個の経路または機序を標的化する、さらに別の活性化合物を含むことができる。これは、有効性の改善、例えば、相乗効果をもたらし得る。実施形態において、多糖類または誘導体は、ビタミンＤと組み合わせて提供することができる。
【００６０】
薬用化粧品または化粧品調製物
実施形態において、本発明の多糖類または誘導体は、薬用化粧品、即ち、医学的または薬物様利益を有するとされる生物学的活性成分を有する化粧製品として提供することができる。
【００６１】
あるいは、本発明の多糖類または誘導体は、皮膚の外観および機能を改善するが、臨床効果を持たない化粧品として提供することができる。
【００６２】
適切には、薬用化粧品または化粧品調製物として使用するための組成物は、皮膚クリーム、ゲル、セラム（serum）、洗浄薬（wash）、リンス、シャンプー、コンディショナー、ムースその他等が挙げられるがこれらに限定されない、本技術分野において公知のものとして提供することができる。
【００６３】
本発明の化粧品調製物の実施形態は、例えば、皮膚への局所投与のためのクリーム、セラム、ゲルまたは軟膏として提供することができる。実施形態において、化粧品調製物は、皮膚に張りを与える（toning）／滑らかにするのに使用するため、または皮膚の色を変更するための、アンチエイジング皮膚調製物としての使用向けでもよい。そのような調製物は、適切には、皺の見た目、日焼けによる損傷等、老化に関連すると考慮される効果を最小化し、皮膚の弾力を増加させることができる。そのような化粧品組成物において、多糖類またはその誘導体は、典型的には、基礎担体または皮膚保湿物質と組み合わせて提供することができる。適切には、基礎担体は、組成物の他の成分と適合性であり、化粧品の使用者にとって有害ではない。典型的には、そのような調製物は、保存料、香料または抗酸化剤をさらに含むことができる。その上、そのような調製物は、水、湿潤剤、アルコール、油、着色料等も含むことができる。
【００６４】
実施形態において、化粧品調製物は、本発明における使用のための多糖類を含んだ状態で提供することができる。好ましい実施形態において、化粧品調製物は、本明細書に記述されている誘導体を用いて提供することができる。
【００６５】
＜栄養補助食品＞
実施形態において、本発明の栄養補助食品は、栄養補助食品を与えた対象における健康な腸管を促進することができる。適切には、栄養補助食品の実施形態は、腸における筋痙攣または不快感を減少させることができる。実施形態において、栄養補助食品は、本発明における使用のための多糖類を含んだ状態で提供することができる。好ましい実施形態において、栄養補助食品は、本明細書に記述されている誘導体を用いて提供することができる。
【００６６】
実施形態において、本発明の栄養補助食品は、経口服用されるためのカプセル形態に製剤化することができる。実施形態において、栄養補助食品は、機能性食品（neutraceutical）組成物の一部として提供することができる。
【００６７】
＜多糖類の調製＞
実施形態において、本発明における使用のための多糖類またはそのような多糖類の誘導体は、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連株の培養物の細胞画分または分泌画分から単離された多糖類となり得る。
【００６８】
実施形態において、本発明における使用のための多糖類またはそのような多糖類の少なくとも１種の誘導体は、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連株の培養物の細胞画分から単離することができる。
【００６９】
実施形態において、本発明における使用のための多糖類またはそのような多糖類の少なくとも１種の誘導体は、プラシノコッカス・カプスラタスまたはＰ．カプスラタス関連株の培養物の分泌画分から単離することができる。
【００７０】
実施形態において、プラシノコッカス・カプスラタスの培養物は、プラシノコッカス・カプスラタス藻類株ＣＣＭＰＩＩ９４でもよい。この藻類株は、公的に入手可能である。培養物は、適切には、本技術分野において公知の藻類培養培地において増殖させることができ、藻類培地中に供給されている窒素、ビタミン、シリカまたは微量金属は、当業者に公知の通りに修正することができる。藻類培養培地は、基本海水または合成海水を用いることができる。
【００７１】
実施形態において、ｆ／２増殖培地は、次の組成で用いることができる：
保存液：
微量元素：              ｇ／リットル  ビタミンミックス：            ｇ／リットル
Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ  ４．１６    ビタミンＢ１２                ０．０００５
（シアノコバラミン）
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ      ３．１５    チアミンＨＣｌ（ビタミンＢ１）０．１
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ      ０．０１    ビオチン                      ０．０００５
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．０２２
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ      ０．０１
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ      ０．１８
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．００６
【００７２】
そのような培養培地は、Ｓｉｅｂｕｒｔｈら、Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｃｅａｎｉｃ  ｕｌｔｒａｐｌａｎｋｔｅｒ，  Ｐｒａｓｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ），  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ‘‘ｇｏｌｇｉ−ｄｅｃａｐｏｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ’’  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｅｗｌｙ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ‘‘ｃａｐｓｕｌａｎ’’．Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．３５、１０３２〜１０４３（１９９９）およびＧｕｉｌｌａｒｄ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｒｙｔｈｅｒ  Ｊ．  １９６２  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍａｒｉｎｅ  ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ  ｄｉａｔｏｍｓ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：２２９〜２３９によって記述されている。
【００７３】
適した培地は、９５０ｍｌの濾過海水（塩分２９〜３２ｐｐｔ）に次のものを添加することにより作製することができる。
培地：
ｇ／リットル
ＮａＮＯ３                        ０．０７５
ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ          ０．００５６５
微量元素保存液                    １ｍＬ
ビタミンミックス保存液            １ｍＬ
【００７４】
典型的には、ｐＨを８．０に設定し（培地１リットル当たり２ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）、培地を海水で１リットルに作ることができる。培地をオートクレーブ（例えば、１２１℃、１５分間）により滅菌し、２〜８℃で貯蔵することができる。
【００７５】
上述のＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏの８０％を、１００ｍｇグリセロリン酸ナトリウム／リットルをプラスして用い、バイオマスを増加させるために、２倍の濃度のＮａＮＯ３およびビタミンを含めた場合、Ｐ．カプスラタス培養物の変種を用いることができる。
【００７６】
本発明のさらに別の態様において、本発明における使用のための多糖類または多糖類の誘導体を産生するための方法であって、
微細藻類、適切には、プラシノコッカス・カプスラタス、特に、プラシノコッカス・カプスラタス藻類株ＣＣＭＰＩＩ９４の培養物を培養するステップと、
培養培地から微細藻類バイオマスを分離するステップと、
培養培地を濃縮し、脱塩するステップと、
培養培地を乾燥させるステップと
を含む方法が提供される。
【００７７】
適切には、培地からの微細藻類バイオマスの分離は、遠心分離によるものとなり得る。代替的な実施形態において、分離は、適切には、濾過、凝結または接線流濾過によって行うことができる。適切には、濃縮は、接線流濾過によるものとなり得る。実施形態において、これは、１００ｋＤａ膜を用いることによるものとなり得る。ダイアフィルトレーションも行われる場合、これは、培地の脱塩を可能にし得る。
【００７８】
適切には、培地からの多糖類の分離は、
沈殿、
透析、
接線流濾過および／または
イオン交換クロマトグラフィー
によって達成することができる。
【００７９】
実施形態において、分離は、イオン交換クロマトグラフィーによって達成され、濃縮は、接線流濾過によって達成される。
【００８０】
分離後に、培地画分を乾燥させることができる。乾燥は、例えば、凍結乾燥および熱乾燥、減圧もしくは真空を用いて室温（２０度Ｃ）で乾燥させる棚（shelf）乾燥、噴霧乾燥、回転乾燥またはスピンフラッシュ（spin flash）乾燥を用いて行うことができる。
【００８１】
適切には、乾燥は、濃縮および脱塩された培地の噴霧乾燥によるものとなり得る。
【００８２】
細胞（細胞ペレット）を加工して、標的多糖類を抽出することもでき、例えば、抽出ステップは、熱水抽出ステップもしくは酵素消化ステップまたは別の適した抽出プロトコールとなり得る。
【００８３】
抽出は、例えば、加圧破壊、ボールミル粉砕、超音波処理またはブレンド（高速またはワーリング（Waring））を用いて行うことができる。
【００８４】
好ましい実施形態において、方法は、フリーラジカル法または光化学法により未変性多糖類を脱重合した後、サイズ排除クロマトグラフィーまたは接線流クロマトグラフィーを用いて分画することにより、規定の分子量のオリゴ糖画分を生成することによって調製される、多糖類の誘導体（複数可）をもたらすことができる。
【００８５】
＜処置＞
多糖類、その誘導体または多糖類もしくはその誘導体を含有する組成物を用いて、多数の病状を処置することができる。処置は、ヒトまたは非ヒト動物に利益をもたらし得る任意の投与計画を包含する。処置は、現存する状態に対するものであっても、予防的（防止的処置）であってもよい。処置は、治癒的、軽減的または予防的効果を包含することができる。
【００８６】
適切には、多糖類、その誘導体または多糖類もしくはその誘導体を含有する組成物は、錠剤またはカプセルとして提供することができる。適切には、多糖類、その誘導体または多糖類もしくはその誘導体を含有する組成物は、徐放性製剤において投与することができる。適切には、多糖類、その誘導体または多糖類もしくはその誘導体を含有する組成物は、ヒトを包含する動物に栄養補助食品として与えることができるが、これは、動物に保護的利益をもたらす、および／または、動物、特にヒトの免疫応答を調節するため、特に炎症性応答を調節するために治療的に用いられよう。
【００８７】
＜投与＞
本発明は、薬として用いるための本発明の多糖類もしくは誘導体またはこれを含有する組成物を提供する。薬は、ヒト利用または獣医学的利用のためのものとなり得る。適切には、獣医学的利用において、動物患者は、陸生動物、より適切には、コンパニオンアニマルまたは競技用（performance）動物となり得る。適切には、患者は、ヒトとなり得る。適切には、多糖類の誘導体または多糖類もしくはその誘導体を含有する組成物は、患者に局所的に適用することができ、例えば、皮膚に塗布することができる。
【００８８】
本発明の産物は、経口、局所、直腸または非経口、経鼻または経肺（吸入による）経路によって投与することができる。典型的には、医師は、個々の患者に最も適した実際の投薬量を決定し、投薬量は、特定の患者の年齢、体重および応答に応じて変動するであろう。一般に、本発明の産物の治療的有効一日経口用量は、１〜５０ｍｇ／ｋｇ（処置しようとする対象の体重）、好ましくは、１０〜２０ｍｇ／ｋｇに及ぶ可能性がある。上述の投薬量は、平均症例の例示的なものである。当然ながら、より高いまたは低い投薬量範囲が正当である個々の事例が存在する場合もあり、このような投薬量範囲も本発明の範囲内に入る。
【００８９】
従って、免疫系の障害、特に、炎症状態、より詳細には、湿疹、乾癬およびアトピー性皮膚炎を包含する皮膚の炎症状態、および／または体内免疫系障害、特に、腸管炎症状態および呼吸器状態、例えば、腸障害、過敏性腸症候群、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する腸管炎症状態ならびに喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、慢性閉塞性肺障害、急性呼吸促迫症候群またはアレルギー性鼻炎を包含する呼吸器状態の処置のための、本発明の第１の態様の多糖類または本発明の第４の態様の誘導体の投与方法であって、治療的有効量の多糖類および／または誘導体を、それを必要とする対象に与えるステップを含む方法が提供される。
【００９０】
本発明の各態様の好ましい特色および実施形態は、文脈がそれ以外を要求しない限り、変更すべきところは変更した（mutatis mutandis）他の態様のそれぞれに関するものである。
【００９１】
本文に引用されている各文書、参考文献、特許出願または特許は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体を明確に援用する、即ち、読み手には、これらを本文の一部として解釈および考慮されたい。本文に引用されている文書、参考文献、特許出願または特許が、本文に繰り返されていない理由は、単に簡潔さを求めただけのことである。引用されている材料または本文に含有されている情報の参照は、材料または情報が、いずれかの国における共通の一般知識の一部または公知であることの許容として理解するべきではない。
【００９２】
本明細書を通して、文脈がそれ以外を要求しない限り、用語「含む」もしくは「包含する」、または「含み」もしくは「含んでいる」、「包含し」もしくは「包含している」等の変種は、記されている整数または整数群を包含するが、その他のいかなる整数または整数群も除外しないことを暗示すると理解されよう。
【００９３】
次に、図面を参照しつつ、本発明の実施形態を単なる一例として記述する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１ａおよび図１ｂは、純度および分子量を示す、Ｐ．カプスラタス多糖類の実例ＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラムを図解する図であり、（ａ）は、屈折率検出を用いた多糖類のＨＰＬＣ−サイズ排除解析由来の実例クロマトグラムであり、試料は、Ｂｉｏｓｅｐ  ４０００カラム（最高標準６７０ｋＤａ）の分解能を超えており、（ｂ）は、光ダイオードアレイ検出を用いた多糖類のサイズ排除解析由来の実例クロマトグラムおよび等高線図であり、試料は、用いたＢｉｏｓｅｐ  ４０００カラムの分解能を超える。低波長のみにおける最小吸光度。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、屈折率検出を用いたＹＭＣ１２０  Ｄｉｏｌカラムに基づく純度および分子量を示す、Ｐ．カプスラタス多糖類誘導体の２種の実例ＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラムを図解する図であり、６．５分後のピークは、移動相バッファーに関連する。実例バッチは、プロセスの優れた再現性およびＬＭＷ材料の１→８ｋＤａ範囲を示す。
【図３】図３ａ、図３ｂ、図３ｃおよび図３ｄは、メタノリシス−ＴＭＳ誘導体化ＧＣ−ＦＩＤ方法を用いた、Ｐ．カプスラタス多糖類および多糖類誘導体の単糖類解析由来の実例クロマトグラムを図解する図であり、（ａ）は、メタノリシス−ＴＭＳ  ＧＣ−ＦＩＤ方法に用いた混合単糖類標準の実例クロマトグラムと、下の表形式データであり；（ｂ）は、混合標準および内部標準比との比較に基づく主要な単糖類ピークを示す、Ｐ．カプスラタス多糖類の単糖類解析由来の実例クロマトグラムと、下の表形式データであり；（ｃ）は、混合標準および内部標準比との比較に基づく主要単糖類ピークを示す、多糖類誘導体（大型多糖類断片２０〜６０ｋＤａ）の単糖類解析由来の実例クロマトグラムと、下の表形式データであり；（ｄ）は、混合標準および内部標準比との比較に基づく主要単糖類ピークを示す、多糖類誘導体（小型多糖類断片２〜１０ｋＤａ）の単糖類解析由来の実例クロマトグラムと、下の表形式データである。  図３ｅは、メタノリシス−ＧＣ−ＦＩＤ方法をＴＦＡ−加水分解−ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ方法と比較する、Ｐ．カプスラタス多糖類および多糖類誘導体の単糖類解析由来の実例データの表を図解する図であり、小型の多糖類誘導体（２〜１０ｋＤａ）およびＨＭＷ未変性多糖類の反復試料は、異なる調製物を表す。データを％単糖組成として示す。両方の方法が、類似の単糖類の存在を示すが、パーセンテージは変動する。ＴＦＡ／ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ方法由来の実例データは、全試料におけるガラクトースの存在を示すが、メタノリシス−ＴＭＳ  ＧＣ−ＦＩＤ方法よりも低いパーセンテージである。この結果は、加水分解に用いたより強酸条件（ＴＦＡ）によるものと思われる。  図３ｆおよび図３ｇは、単糖組成を決定するための、Ｐ．カプスラタス多糖類および多糖類誘導体のＴＦＡ処理加水分解産物の実例ペーパークロマトグラムを図解する図であり、（ｆ）は、単糖組成を図解するＴＦＡ−ＨＰＡＥＣ単糖類解析方法（図３ｅに示すデータ）由来のＰ．カプスラタス多糖類加水分解産物のペーパークロマトグラフィー由来の実例結果を図解する。各マーカーは、２５μｇである。溶媒、酢酸エチル：ピリジン：水８：２：１、染色：フタル酸水素アニリン（図中、Ｘｙｌ＝キシロース、Ｆｕｃ＝フコース、Ａｒａ＝アラビノース、Ｍａｎ＝マンノース、Ｇｌｃ＝グルコース、Ｇａｌ＝ガラクトース、ＧａｌＡ＝ガラクツロン酸、Ｒｉｂ＝リボース、Ｒｈａ＝ラムノース、Ｓａｍｐ＝Ｐ．カプスラタス多糖類試料）。Ｐ．カプスラタス多糖類および多糖類誘導体において同定された主な単糖類は、図３ｂ〜図３ｅに示すデータを支持する。図３ｇは、単糖組成を図解するＴＦＡ−ＨＰＡＥＣ単糖類解析方法（図３ｅ）由来のＰ．カプスラタス加水分解産物のペーパークロマトグラフィー由来の実例結果を図解する図である。各マーカーは、２５μｇである。溶媒、ブタノール：酢酸：水１２：３：５、染色：フタル酸水素アニリン（図中、Ｘｙｌ＝キシロース、Ｆｕｃ＝フコース、Ａｒａ＝アラビノース、Ｍａｎ＝マンノース、Ｇｌｃ＝グルコース、Ｇａｌ＝ガラクトース、ＧａｌＡ＝ガラクツロン酸、Ｒｉｂ＝リボース、Ｒｈａ＝ラムノース、Ｓａｍｐ＝Ｐ．カプスラタス多糖類試料）。Ｐ．カプスラタス多糖類および多糖類誘導体において同定された主な単糖類は、図３ｂ〜図３ｆに示すデータを支持する。
【図４】図４は、沈降平衡を用いたＰ．カプスラタス多糖類の実例分子量推定を図解する図であり、沈降平衡技法を用いたＰ．カプスラタス未変性多糖類の近似分子量の実例計算が提示されている。０．１Ｍ  ＮａＣｌにおける０．５ｍｇ／ｍｌの試料を実験に付した。沈降平衡による分子量解析の前に、沈降速度実験を行って不均一性を評価した。１４００ｒｐｍのロータースピードで１ｍｍカラムを用いてデータ適合を達成した。Ｐ．カプスラタス未変性多糖類は、３８．６２メガダルトンの分子量を有すると計算された。
【図５】図５は、フリーラジカル脱重合後の、Ｐ．カプスラタス多糖類誘導体の精製を示す実例サイズ排除クロマトグラムを図解する図である。サイズ排除クロマトグラフィー精製は、（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０樹脂）を用い、脱重合後にＰ．カプスラタス多糖類誘導体を脱塩した。２１４ｎｍ（薄青色）（ｉ）、Ａ２８０（紺青色（ｉｉ））（上パネル）における吸光度および導電率（緑色）（ｉｉｉ）（下パネル）をモニターした。３ｍｌ画分を３０分以降に収集し、ＵＶモニターおよび画分収集器の間に３ｍｌ遅延がある。主ピークにおいて２種の広いサイズ範囲が見られ、これらを収集した：  ４３〜６１分間＝大型断片誘導体（２０〜６０ｋＤａ）  ６１〜８１分間＝小型の断片誘導体（２〜１０ｋＤａ）。  １００分後の材料溶出（塩ピーク  −  緑色（ｉｉｉ）との共溶出）は単糖類である。
【図６】図６は、ヒト好中球のエラスターゼ活性におけるＰ．カプスラタス多糖類および多糖類の誘導体の効果を図解する図であり、ヒト好中球のエラスターゼ活性におけるＰ．カプスラタス多糖類および多糖類誘導体の効果の実例データが示されている（全試料０．１ｍｇ／ｍｌ）。データは、産物の数個のバッチ由来の平均エラスターゼ活性±ＳＤ、対照と比べた％を図解する。藻類多糖類および誘導体による処理は、エラスターゼ活性の低下をもたらす。
【図７】図７は、ヒト好中球ＲＯＳ産生におけるＰ．カプスラタス多糖類および多糖類の誘導体の効果を図解する図であり、ヒト好中球活性酸素種（ＲＯＳ）産生におけるＰ．カプスラタス多糖類および多糖類誘導体の効果の実例データが示されている（全試料０．１ｍｇ／ｍｌ）。データは、産物の数個のバッチ由来の平均ＲＯＳシグナル±ＳＤ、対照と比べた％を図解する。藻類多糖類および誘導体による処理は、ＲＯＳの低下をもたらす。
【図８】図８は、ＢＨＫ細胞生存率におけるＰ．カプスラタス多糖類および多糖類の誘導体の効果を図解する図であり、ＢＨＫ細胞生存率におけるＰ．カプスラタス多糖類および多糖類誘導体の効果の実例データが提供されている（全試料０．１ｍｇ／ｍｌ）。データは、産物の数個のバッチ由来の平均細胞生存率±ＳＤ、対照と比べた％を図解する。藻類多糖類および誘導体による処理は、観察された細胞生存率に効果を生じない。
【図９】図９ａおよび図９ｂは、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１ベータまたは１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦアルファによる刺激後の、初代ヒトケラチノサイトによるＩＬ８放出またはＩＬ８遺伝子発現におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の効果を図解する図であり、（ａ）は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１ベータによる刺激後の、初代ヒトケラチノサイトからのＩＬ８放出におけるＰ．カプスラタス多糖類および多糖類誘導体の効果の実例データである（全試料０．１ｍｇ／ｍｌ）。データは、ＩＬ１ベータのみの対照と比べた％放出±ＳＤを図解する。フコイダンおよびヘパリン処理を比較のために用いる。多糖類による処理は、ケラチノサイトからのＩＬ８分泌の低下をもたらす；（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファによる刺激後の、初代ヒトケラチノサイトによるＩＬ８遺伝子発現におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の効果の実例データを示す図である（全試料０．１ｍｇ／ｍｌ）。データは、検量用試料としてＴＮＦアルファのみの対照、ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた、％相対遺伝子発現±ＳＤを図解する。フコイダン処理を比較のために用いる。多糖類誘導体による処理は、ケラチノサイトによるＩＬ８遺伝子発現の低下をもたらす。
【図１０】図１０は、初代ヒトケラチノサイトからのＩＬ８放出におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の効果を図解する図であり、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１７Ａまたはその両方の組み合わせによる刺激後の初代ヒトケラチノサイトからのＩＬ８放出におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体（２〜１０ｋＤａ）の効果の実例データが提示されている。データは、対照ウェル（刺激なしまたはサイトカインのみ）および小型の多糖類誘導体、フコイダンまたはＮＦ−κＢ阻害剤ＳＣ−５１４で処理したウェルに関する、ｐｇ／ｍｌ単位のケラチノサイトＩＬ８放出を図解する。多糖類誘導体による処理は、ケラチノサイトからのＩＬ８分泌の低下をもたらす。
【図１１】図１１ａおよび図１１ｂは、初代ヒトケラチノサイトによるＩＬ８、ＩＬ１７ＣおよびＩＬ６放出におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の用量依存的効果を図解する図であり、（ａ）１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦａ＆５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ１７Ａで刺激されたケラチノサイトからのＩＬ８放出におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体（２〜１０ｋＤａ）の効果の実例データが提示されている。データは、多糖類が、用量依存的様式でＩＬ８の放出を阻害することを示す。これは、類似の用量において、ＮＦ−κＢ阻害剤（ＳＣ−５１４）およびＭＡＰＫ  ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）よりも優れた効力を有する。低分子量（ＬＭＷ）ヘパリンを比較のために示す；（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦａ＆５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ１７Ａ＆１０マイクロＭヒスタミンで刺激したケラチノサイトからのＩＬ１７Ｃ＆ＩＬ６放出におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体（２〜１０ｋＤａ）の効果の実例データを示す図である。データは、多糖類が、用量依存的様式でＩＬ１７Ｃ＆ＩＬ６の放出を阻害することを示す。低分子量（ＬＭＷ）ヘパリンを比較のために示す。
【図１２】図１２は、初代ヒト末梢血単核細胞によるＩＦＮガンマ放出におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の用量依存的効果を図解する図であり、１０マイクロｇ／ｍｌフィトヘマグルチニンおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ１ベータで刺激した末梢血単核細胞からのインターフェロンガンマ（ＩＦＮガンマ）の放出におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体（２〜１０ｋＤａ）の効果の実例データが提供されている。データは、多糖類が、用量依存的様式でＩＦＮガンマ放出を阻害することを示す。この効果は、血液細胞培養の長さに応じて変動する。低分子量（ＬＭＷ）ヘパリンを比較のために示す。
【図１３】図１３は、初代ヒト好中球走化性におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の効果を図解する図であり、ＩＬ８で刺激した好中球の走化性におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の効果の実例データが提示されている（全試料０．１ｍｇ／ｍｌ）。相対発光単位±ＳＤは、各処理における遊走した好中球（発光シグナルにより可視化）の数を示し、ＩＬ８のみは対照である。多糖類誘導体による処理は、好中球走化性の低下をもたらす。
【図１４】図１４は、ＴＨＰ−１（単球）走化性におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の用量依存的効果を図解する図であり、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質）で刺激したＴＨＰ−１（前単球細胞株）の走化性におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体（２〜１０ｋＤａ）の効果の実例データが提示されている。多糖類による処理は、ＴＨＰ−１走化性の用量依存的低下をもたらす。調製物間にいくつかの変種が存在し、より大型断片はより優れた阻害（６０〜７０％）を示すが、これは非特異的効果となり得る。
【図１５】図１５は、マウス皮膚炎症におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の用量依存的効果を図解する図であり、９日間のＩＭＱ処理および多糖類投薬後の、イミキモド（ＩＭＱ）で誘導したマウス皮膚炎症におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体（２〜１０ｋＤａ）の効果の実例データが提示されている。上皮およびケラチノサイト増殖ならびに白血球浸潤を包含する組織学的パラメータのスコア化によって、炎症を測定する。多糖類は、用量依存的様式の皮膚炎症阻害を示す。  ＊は、ダネットの事後（post hoc）解析によるＡＮＯＶＡによる統計的有意性を表示する。
【図１６】図１６ａは、本発明のＰ．カプスラタス多糖類およびその多糖類誘導体の特徴的な特色の総括表を図解する図である。  図１６ｂは、２種の異なる解析方法に基づく、Ｐ．カプスラタス多糖類の計算された硫酸エステル含量を図解する図である：硫黄のＩＣＰ−ＯＥＳ（続いて、硫酸エステルへと数学的に変換）と比較した、硫酸エステルの生化学的プレートアッセイ（Ｔｅｒｈｏ方法）。％検出された硫酸エステルは、２種の方法の間で十分に一致しており、多糖類の高い硫酸エステル含量を確認する。
【実施例】
【００９５】
（実施例１）−プラシノコッカス・カプスラタス株培養物の増殖
実験室において、５０または１００ｍＬのｆ／２培地において、連続光、外界（実験室）温度（１年を通じて１８〜２８℃範囲）でＰ．カプスラタス株培養物を維持した。大規模の実験用培養物を用意するために、始めにストック培養物を２５０ｍｌまたは５００ｍｌのｆ／２培地に播種し、対数期まで増殖させた。１１６℃で３０分間オートクレーブしたｆ／２培地を含有する、ＰＴＦＥ空気吸入口および空気排出口フィルターを有するベントスクリューを備える１０または２０リットル透明ポリカーボネートカーボイ（carboy）に、２５０ｍｌまたは５００ｍｌ培養物を播種した。無機リン酸塩および微量金属を単独でオートクレーブし、オートクレーブ後に培地のバルクに別々に加えた。
【００９６】
異なるレベルの照明および温度で、異なる量のＣＯ２／空気ミックスを用いることができる。具体的には、白色蛍光灯管を用いた連続照明で、外界（実験室）温度：年間を通した１８〜２８℃温度範囲にて、１０および２０Ｌの培養物に空気を活発に拡散させた。
【００９７】
あるいは、多くの異なるパイロットおよび大規模培養系を用いて、Ｐ．カプスラタスを増殖させることができる。具体的には、２００リットルのパイロットスケール微細藻類光バイオリアクターシステム（国際特許、国際公開第２０１１／０３１１６１（Ａ１）号パンフレット；ノルウェー特許第３２０９５０号明細書）を、ｆ／２増殖培地、空気および１〜２％ＣＯ２のエアレーションおよび連続照明（≦３５０マイクロｍｏｌ／ｍ２／秒；７〜１０ｃｍ光路）で、１８〜２８℃の間の温度範囲にて用いた。
【００９８】
（実施例２）−培養培地からの多糖類の収集
多糖類は、様々な遠心分離および濾過技法によって培養培地から得ることができる。具体的には、高密度実験用培養物（１０〜２０リットル）を収集し、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３Ｌ−Ｒ遠心分離機の４×６００ｍｌ遠心分離ポットに移した。遠心分離は、バッチ毎に４５００ｇで２時間行った。遠心分離ポットにおいて藻類細胞をペレット化する一方、培養培地（上清）を移した。Ｗｈａｔｍａｎ  ｎｏ．３フィルターを用いて、真空濾過により上清をさらに清澄化した（残渣細胞を除去するため）。
【００９９】
続いて、この上清を、０．１ｍ２  ５ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｔ−シリーズ膜を備えるＰａｌｌ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅを用いて直交流濾過に付した。多糖類のＭＷを下回るのであれば、他のＭＷＣＯを用いてもよい。解凍後に膜を通して循環させる前に、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３フィルターを通して試料を再濾過した。本来の容量の×１０に濃縮されるまで濃縮液を再循環させた。続いて、これを本来の容量へと再希釈し、これを反復して、塩および培地構成成分が透過液に除去されることを確実にした。プロセスにおいて導電率をモニターした。濃縮液（retenate）試料を収集し、Ｂｕｃｈｉ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｂ−２９０を用いて噴霧乾燥させて、乾燥多糖類粉末をもたらした。いずれかの適切な技法を用いたさらに別のＭＷＣＯにより標的多糖類を単離してもよいが、具体的には、遠心分離による３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた分離により高ＭＷ画分を生成した。
【０１００】
あるいは、多くの異なるパイロットおよび大規模システムを用いて、大規模培養の培養培地から多糖類を収集することができる。具体的には、ディスクスタックＷｅｓｔｐｈａｌｉａ遠心分離機を用いて、２０〜６０リットル／時間で流れる２００リットル光バイオリアクターから培養物を分離した。微細藻類光バイオリアクターからディスクスタック遠心分離機へと培養物を直接的にポンプ送りし、培地構成成分をＩＢＣに収集した。
【０１０１】
続いて、上清を、５ミクロンフィルター（ＰＵＲＴＲＥＸ  ＰＸ０５−９  ７／８）を用いて前濾過し、ＧＲ６０Ｐ  ２５ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を備えるＣｏｍｂｉ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍ３８−Ｈ−２．２５−３（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ）を用いた直交流濾過に付した。試料を×１０濃縮し、次に３容量の水（６００リットル）をダイアフィルター（diafilter）に加えた（塩、培地構成成分および低分子量材料の除去）。その間中、導電率をモニターし、濃縮液試料を収集した。多くの異なる大規模乾燥システムを用いて、多糖類含有濃縮液をさらに噴霧乾燥させることができる。具体的には、２．３〜２．７ｋｇ／時間で噴霧化し、サイクロン（cyclone）およびバッグフィルターから乾燥した多糖類を回収することにより、入口温度２００℃および出口温度９０〜９９℃を有するＭｏｂｉｌｅ  Ｍｉｎｏｒ噴霧乾燥システム（ＧＥＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いた。
【０１０２】
（実施例３）−細胞ペレットからの多糖類の収集
培地の除去から得られた細胞ペレットを加工して、標的多糖類を生成することができる。この操作は、熱水抽出技法、酵素消化または様々な他の抽出プロトコールによって行うことができる。具体的には、細胞を５０ｍＬ無菌チューブに移し、２時間１０，０００ｇで遠心分離した。残存する上清を除去し、後の抽出および加工のために細胞を凍結して貯蔵した。加工するために、細胞を溶解し、標準抽出技法を用いて産物を取り出すことができる。具体的には、抽出前に細胞を３回凍結融解した。次に、これを等容量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８と混合し、１００容量の試料に対し１容量の酵素の濃度で酵素アルカラーゼ（alcalase）２．５Ｌ  ＤＸ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）と混合し、一晩６０℃で撹拌しつつインキュベートした。試料を取り出し、１０，０００ｇでスピンして細胞デブリをペレット化し、上清を取り出した。この上清を、１０容量バッチの水を用いて４回交換しつつ、３６時間かけて８ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を用いて水に対して透析した。脱塩した上清を凍結または噴霧乾燥して、多糖類試料を生成することができる。いずれかの適切な技法を用いたさらに別のＭＷＣＯにより標的多糖類を単離してもよいが、具体的には、遠心分離による３００ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた分離により高ＭＷ画分を生成した。
【０１０３】
（実施例４）−脱重合およびオリゴ糖精製
高分子量標的多糖類は、酵素消化または酸加水分解等の技法を用いて、より小型の断片へと脱重合することができる。具体的には、熱い多糖類溶液へと過酸化水素を導入して、グリコシド結合を攻撃するフリーラジカルを生成することによって、これを脱重合することができる（Ｒｏｔａ  Ｃら、２００５  Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｐａｒｉｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４４（２）：１９３〜２０３およびＰｅｔｉｔ  ＡＣら、２００６  Ｆｒｅｅ−ｒａｄｉｃａｌ  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｌｌｉｃ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｄｅｅｐ−ｓｅａ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｖｅｎｔ  ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅ  ａｎｎｅｌｉｄ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６４：５９７〜６０２．）。鍵となる変数は、過酸化水素対多糖類の比、温度およびｐＨ制御である。固体の多糖類試料を、およそ２ｍｇ／ｍｌとなるよう水に加え、溶解し、ウォーターバスにおいて撹拌しつつ６０℃に温めた。銅塩溶液を加えて０．０１Ｍ濃度とした。水酸化ナトリウムを含有するポンプに接続されたｐＨコントローラを用いて、試料をｐＨ７．５に設定した。この時点において、一定の流速、例えば、０．５ｍｌ／分で容器へと過酸化水素をポンプ移送することにより反応を開始し、必要に応じて水酸化ナトリウム用ポンプを作動させることにより、ｐＨ７を維持するようにｐＨコントローラを設定した。反応を所望の期間行ったらポンプを停止し、２０％酢酸（５マイクロＬ／ｍｌ反応液）を用いてｐＨを下げ、６０ｍｇ／ｍｌ反応液のキレックス（chelex）１００（Ｓｉｇｍａ）を加え、透明になるまで回転スターラーにおいて反応液を混合する。キレックスから全反応液を取り出し、−２０℃で貯蔵した。Ｑ−セファロース（sepharose）（ＧＥ）陰イオン交換を用いてあらゆる残存銅イオンをナトリウムイオンと交換し、続いてベンチカラムならびにＡ２１４、Ａ２８０および導電率の検出器を備えるＢｕｃｈｉ  Ｓｅｐａｃｏｒｅシステムを用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ３０（ＧＥ）によるサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩／分離することにより、反応液から産物を精製した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ塩化ナトリウム移動相においてＱ−セファロースカラムを平衡化し、続いて脱重合反応液をロードし、移動相でさらに２０〜３０分間洗浄し、これらは全て１０ｍｌ／分で行った。続いて、結合した多糖類を５Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出させ、収集した。サイズ排除ベンチカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ３０へと、１ｍｌ／分で水を移動相として、５ｍｌバッチにおいて溶離液を加えた。１２０分間かけて分離を行い、Ｐｈａｒｍａｃｉａ画分収集器を用いて３ｍｌ画分を収集した。異なる多糖類分子量範囲の画分を同定し、プールし、凍結乾燥した。具体的には、通常、２〜１０ｋＤａおよび２０〜６０ｋＤａ誘導体を表す２種のサイズ範囲を収集したが、他のサイズを収集してもよい。誘導体の保存液をサイズ排除ＨＰＬＣカ���ム（Ｂｉｏｓｅｐ４０００、ＹＭＣ  Ｄｉｏｌ３００またはＹＭＣ  Ｄｉｏｌ１２０）に注入して、近似分子量を確認した（後述を参照）。
【０１０４】
（実施例５）−近似分子量の決定
屈折率（Ｗａｔｅｒｓ  ２４１０）および光ダイオードアレイ（２１０〜３８０ｎｍ）検出（Ｗａｔｅｒｓ  ９９６）によるＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ（２６９５）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、多糖類および多糖類誘導体の分子量を推定した。３０〜３７℃で、０．２ミクロンで濾過した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．９％ＮａＣｌの移動相において、ＹＭＣ３００−ＤｉｏｌまたはＢｉｏｓｅｐ４０００サイズ排除カラムのいずれかを平衡化した。移動相に２０マイクロＬを注入し、０．５または１ｍｌ／分（ＹＭＣ３００またはＢｉｏｓｅｐ４０００）流して、１０または１５分間無勾配分離することにより、デキストラン標準（Ｆｌｕｋａ：１２、２７、５０、８０、２７０、６７０ｋＤａ）を用いてカラムを較正した。式Ｋａｖ＝（保持時間−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）を用いて、Ｋａｖ対分子量をプロットすることにより、検量線を作成した。０．１ｍｇ／ｍｌ溶液２０マイクロＬの試料を移動相に注入し、標準の通り流した。ブランクベースライン減算ありまたはなしで、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｗａｔｅｒｓソフトウェアを用いてデータを手作業で組み入れた。試料の保持時間を検量線と比較して、上述の式を用いて近似分子量を計算した。
【０１０５】
さらに、未変性Ｐ．カプスラタス多糖類の分子量は、沈降平衡技法により推定することができる。具体的には、走査型吸収オプティクスを備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ｉ分析用遠心分離機（ＡＵＣ）を用いた沈降平衡を用いた。水に溶解した０．１Ｍ塩化ナトリウムに０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう試料を再懸濁した。沈降速度実験を行って、試料確認および不均一性を評価し、評価は、その後の沈降平衡のパラメータを必要とした。回転スピード１４００ｒｐｍの１ｍｍカラムにおいて沈降平衡を行った。
【０１０６】
（実施例６）−近似硫酸エステル含量の決定
様々な方法を用いて、標的多糖類および多糖類誘導体の硫酸エステル含量を決定することができる。具体的には、Ｔｅｒｈｏ  Ｔ＆Ｈａｒｔｉａｌａ  Ｋ（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７１）４１（２）：４７１〜４７６）による方法に基づき、硫酸エステル決定を行った。２５μｌの水に溶解した１ｍｇ／ｍｌ試料または対照（コンドロイチンＳｉｇｍａ  Ｃ４３８４またはヘパリンＳｉｇｍａ  Ｈ３３９３）を、反応バイアルに置いた。１Ｍ  ＨＣｌを加えて０．５〜１Ｍ  ＨＣｌの最終濃度とし、バイアルを１００℃で２時間加熱した。真空下６０〜６５℃にて乾燥するまで（通常１〜２時間）Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ（ＲＣＴ６０冷蔵トラップを備えるＪｏｕａｎ  ＲＣ１０／１０）を用いて、加水分解した試料を回転蒸発した。乾燥した加水分解産物を、２５０マイクロＬの水に溶解した（０．１ｍｇ／ｍｌ）。
【０１０７】
１ｍＭ硫酸から標準を調製して、０．０４８、０．０９６、０．１９２、０．２８８、０．３８４、０．４３２、０．４８μｇ硫酸エステルのアッセイ濃度を得た。１００マイクロＬの各試料、標準、対照またはブランク（水のみ）をピペット採取してエッペンドルフ（eppendorf）に入れ、これに４００マイクロＬのエタノールを加え、徹底的に混合した。１２５マイクロＬのこの混合液を、９６ウェルアッセイプレートに１組３ウェルで加え、５０μｌ  ＢａＣｌ２バッファー（新鮮に調製された０．２Ｍ酢酸、０．１ｍＭ塩化バリウム、１．６ｍＭ炭酸水素ナトリウム、全て無水エタノールに溶解）を各ウェルに加え、続いて７５μｌロジゾン酸ナトリウム溶液（新鮮に調製された０．０５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルビン酸、無水エタノールに溶解）を加えた。プレートを中程度のスピードで３０秒間振盪し、暗所で１０分間インキュベートし、再度振盪した。Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いて、吸光度マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｐｏｗｅｒ  Ｗａｖｅ  ＨＴ）において５２０ｎｍの色強度を測定した。ブランクの平均吸光度から試料、標準または対照毎の平均吸光度を減算することにより、吸光度を計算した。硫酸標準毎の硫酸エステル濃度に対しブランクの吸光度をプロットすることにより、検量線を作成し、試料および対照の硫酸エステル含量を内挿した。希釈および容量に対しこの値を補正して、％硫酸エステル＝（（平均ΔＡ５２０×４０）／５０）×１００を得る。
【０１０８】
硫酸エステル決定は、誘導結合プラズマ発光分析（ＩＣＰ−ＯＥＳ）によっても行った。１０ｍｇの多糖類を１ｍｌの水に再懸濁し、次に硝酸：塩酸（王水）において抽出した。試料を霧状にし、生じたエアロゾルを励起が行われるプラズマトーチへと運んだ。硫黄に特徴的な原子線スペクトルを高周波誘導結合プラズマにより発生させた。格子（grating）分光光度計によりスペクトルを分散させ、光電子増倍管により線の強度をモニターした。光電子増倍管からの光電流を加工し、硫黄標準（複数点較正）により硫黄含量を計算し、数式により硫酸エステル値に変換した。
【０１０９】
（実施例７）−単糖組成の決定
単糖組成は、多数の異なる方法を用いて決定することができる。具体的には、メタノリシスおよびトリメチルシラン（ＴＭＳ）誘導体化と、続く水素炎イオン化検出によるＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１４（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いた組成解析により、単糖組成を決定した。炉型乾燥器において４５０℃６時間で反応バイアルを熱浄化した。１００マイクロｇの試料（１０ｍｇ／ｍｌ溶液として）をバイアルに移し、５ｎｍｏｌのｓｃｙｌｌｏ−イノシトール内部標準を各試料に加えた。ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール（Ｉ８１３２  Ｓｉｇｍａ）、アラビノース（Ａ３１３１  Ｓｉｇｍａ）、キシロース（Ｘ−１５００  Ｓｉｇｍａ）、マンノース（Ｍ６０２０  Ｓｉｇｍａ）、フコース（Ｆ２２５２  Ｓｉｇｍａ）、ラムノース（Ｒ３８７５  Ｓｉｇｍａ）、ガラクトース（Ｇ０７５０  Ｓｉｇｍａ）、グルコース、グルコサミン（Ｇ４８７５）、ガラクトサミン（Ｇ０５００）、グルクロン酸（Ｇ５２６９）、ガラクツロン酸（４８２８０  Ｆｌｕｋａ）、シアル酸（全て１００ｍＭ保存液として調製）を含有する、５ｎｍｏｌの各単糖類標準を含有するバイアルも用意した。真空下６０〜６５℃で乾燥するまで（通常１〜２時間）、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ（ＲＣＴ６０冷蔵トラップを備えるＪｏｕａｎ  ＲＣ１０／１０）において全バイアルを乾燥させた。４０マイクロＬの無希釈メタノールを加え、上述の通りに試料を再度乾燥させ、次に１００マイクロＬの０．５ＭメタノールＨＣｌに再懸濁した。バイアルを８５℃のヒートブロックにおいて４時間加熱した。冷却後に、２０マイクロＬの無希釈ピリジンを加えてＨＣｌを中和し、次に２０マイクロＬの無希釈無水酢酸を加えて、あらゆる遊離一級アミンを再度Ｎ−アセチル化した（３０分間、室温）。続いて、バイアルを再度乾燥させ（上述の通りｓｐｅｅｄ  ｖａｃで）、４０マイクロＬの無希釈メタノールを加えて洗浄し、バイアルを再乾燥させた（１０〜３０分間、上述の通りｓｐｅｅｄ  ｖａｃで）。続いて、４０マイクロＬの無希釈ＴＭＳ試薬を加え、徹底的に混合して試料を再懸濁した。バイアルを密封し、水素炎イオン化検出によるＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１４に１マイクロＬを注入（３００℃スプリットレス注入）する前に、少なくとも１０分間放置した。カラムは、ＺＢ５−ｍｓ、３０ｍ×０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．×０．２５μｍフィルム厚であった。作成されたクロマトグラムを解析した。２０〜３０個のピークが同定されるまで、試料毎に面積カットオフを手作業で調整した。ピーク面積および保持時間は、単糖類標準と相関した。
【０１１０】
各ピークを次の通りに計算した：
比＝ピーク面積／内部標準ピーク面積；
標準比＝標準面積／標準毎の内部標準面積；
ｎモル＝（５ｎモル／標準比）×試料比；
本来の試料に存在する各単糖類の％＝ｎモル／総ｎモル×１００
【０１１１】
Ｐ．カプスラタス多糖類の単糖組成は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）加水分解と、続くパルスアンペロメトリック検出による高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）によっても決定された。Ｐ．カプスラタス多糖類および誘導体の試料を、およそ１０ｍｇ／ｍｌとなるよう２Ｍ  ＴＦＡに再懸濁した。これを加熱ブロックにおいて１２０℃で１時間インキュベートし、３０分後に活発に振盪した。続いて、これを遠心分離し、上清を回収した。ペレットを０．５ｍｌの水で洗浄し、再遠心分離し、洗浄液を本来の上清と共にプールした。回収された溶液を真空中で乾燥してＴＦＡを除去し、乾燥残渣を１ｍｌの水に再懸濁した。試料の１／１０希釈を、標準単糖類、二糖類およびウロン酸の希釈系列と共に、Ｄｉｏｎｅｘ  ＰＡ１カラムに注入した。（このミックスは、フコース、ラムノース、アラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、マンノース、リボース、セロビオース、マルトース、ガラクツロン酸、グルクロン酸を含有した。）。試料を勾配により分離し、ＰＡＤにより分解した。標準との比較により単糖類の回収を計算した。
【０１１２】
１０マイクロＬのＴＦＡ加水分解産物（名目上１００〜１６０マイクロｇの多糖類）を２枚のＷｈａｔｍａｎナンバー２０ペーパー上にもロードした。単糖類標準ミックス  −  リボース、ラムノース、キシロース、フコース、アラビノース、マンノース、グルコース、ガラクトース、ガラクツロン酸  −  もロードした。電荷による分離を用いて一方のシートをブタノール／酢酸／水１２：３：５移動相において３０時間、他方のシートを酢酸エチル／ピリジン／水８：２：１移動相において３日間泳動することにより、ペーパークロマトグラフィーを行った。シートをフタル酸水素アニリンで染色して、単糖類を可視化した。
【０１１３】
（実施例８）−細胞毒性の決定
様々な異なる細胞ベースのスクリーニングアッセイを用いて、標的材料の細胞毒性を決定することができる。具体的には、ＢＨＫ細胞株（ハムスター腎臓線維芽細胞ＥＣＡＣＣ  ８５０１１４３３）の代謝活性における多糖類および多糖類誘導体の効果を測定することにより、細胞毒性を試験する。９０％コンフルエントのＢＨＫ細胞を収集し、９６ウェルホワイトマイクロプレートにおいて、１００マイクロＬの新鮮に調製された培養培地（グラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ）、１０％ウシ胎仔血清、５％トリプトースリン酸ブロス（Tryptose Phosphate Broth）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）における１×１０４細胞／ウェルで蒔く。これを１時間３７℃で５％ＣＯ２において放置して、ウェルに＞８０％接着させる。１１マイクロＬの、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に溶解した１ｍｇ／ｍｌ多糖類（poysaccharide）試料、ＨＢＳＳのみ対照、フコイダン（１ｍｇ／ｍｌ、ＨＢＳＳに溶解）対照およびドキソルビシン（１０マイクロｇ／ｍｌ、１マイクロｇ／ｍｌ、ＨＢＳＳに溶解）対照を、１組３ウェルに加え、プレートを１６〜１８時間３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベートした。プレートを３０分間室温に戻し、その後、１００マイクロＬのＣｅｌｌ  ｔｉｔｒｅ  ｇｌｏｗ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加える。プレートをプレート振盪機において２分間混合し、次に１０分間室温でインキュベートする。プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ３）においてＧｅｎ５ソフトウェアを用いて、ウェル毎の生じた発光を測定する。試料または対照毎の平均発光を計算する。ＨＢＳＳ対照ウェルを１００％代謝活性として指定し、これに対して試料発光値を計算する：％活性＝（被験ウェル／対照ウェル）＊１００。フコイダンおよびドキソルビシン対照は、確立された値の内となるべきである。
【０１１４】
（実施例９）−好中球のエラスターゼ活性における効果
好中球エラスターゼ酵素活性における多糖類の効果の測定のために異なるプロトコールが可能である。具体的には、多糖類と刺激された新鮮に単離されたヒト好中球とのインキュベーションと、続く放出された酵素と標識された基質との反応およびプレートリーダーにおける比色分析測定により、エラスターゼ活性を測定した。新鮮に単離されたヒト好中球をＨＢＳＳ（ＣａおよびＭｇ不含）に再懸濁し、血球計算器において細胞を計数した。細胞を遠心分離し、ＨＢＳＳに再懸濁して、２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度を得た。２２マイクロＬの試料、対照またはＨＢＳＳをマイクロチューブに加え、続いて：２５マイクロＬのサイトカラシンＢ（ＨＢＳＳに溶解した４０ｍｇ／ｍｌ、最終濃度５ｍｇ／ｍｌとなる）；２５マイクロＬのＴＮＦα（ＨＢＳＳに溶解した８０ｎｇ／ｍｌ、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなる。非刺激対照にはＴＮＦαの代わりに２５マイクロＬのＨＢＳＳを用いる）；１５０マイクロＬの好中球懸濁液（あるいは培地のみ対照群には、細胞の代わりに１５０マイクロＬのＨＢＳＳを加える）を加えた。内容物を穏やかに混合し、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、２５マイクロＬのｆＭＬＰ（ＨＢＳＳに溶解した１マイクロｇ／ｍｌ、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなる）を加える、あるいはＨＢＳＳを非刺激対照群に加える。チューブをさらに４５分間３７℃でインキュベートした。チューブをＨｅｒａｅｕｓ  Ｂｉｏｆｕｇｅにおいて５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞をペレット化し、２５マイクロＬの上清を、９６ウェルブラックマイクロプレートに１組３ウェルで移す。１５０マイクロＬのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５および２０マイクロＬの好中球エラスターゼ基質１（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５に溶解した０．５ｍｇ／ｍｌ）を、基質を含有しないブランクウェルを除く各ウェルに加えた。プレートを予熱した（３７℃）プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  ＨＴ）に移し、Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いて４０５ｎｍでの読み取りを５分毎に１時間行った。１０分間および１時間の間の４個のデータ点にわたりＶｍａｘを計算した。試料、対照またはブランク毎に平均Ｖｍａｘを計算した。対照ウェル（基質で刺激した細胞、但し被験試料なし）Ｖｍａｘを１００％として指定し、これに対して試料および対照を計算して、％エラスターゼ活性を得る：％活性＝（被験ウェルＶｍａｘ／対照ウェルＶｍａｘ）＊１００。
【０１１５】
（実施例１０）−ケラチノサイトのサイトカイン放出および遺伝子発現における効果
ケラチノサイト細胞における多糖類および多糖類誘導体の効果は、炎症促進性刺激ありまたはなしで、様々な異なる増殖培地において、広範な異なる細胞株または初代細胞を用いて評価することができる。得られたサイトカイン放出は、マルチプレックスアレイまたはＥＬＩＳＡ等、異なる方法により評価することができる。具体的には、カルシウムおよびサプリメントを含有する完全ケラチノサイト増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ  Ｃ２００１１）において３７℃、５％ＣＯ２で７０〜９０％コンフルエントになるまで初代ケラチノサイト（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ  Ｃ１２００３）を増殖させた。これをトリプシン処理により収集し、洗浄し、２４ウェルプレート組織培養プレートのウェルにウェル当たり３０，０００細胞で播種した。ほぼ８０〜９０％コンフルエントとなるまで（ほぼ５６時間）細胞を増殖させ、次に培地を、０．５ｍＭカルシウムを含む基本培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ  Ｃ２０２１１）にさらに１６〜１８時間交換した。次いで試料（ＨＢＳＳに溶解した１ｍｇ／ｍｌ）、対照（ＨＢＳＳに溶解したフコイダン１ｍｇ／ｍｌ）またはブランク（ＨＢＳＳ媒体のみ）を、ウェル（×１０希釈）に炎症促進性刺激を加える６〜８時間前に加えた、あるいはＳＣ５１４およびＳＢ２０３５８０（それぞれＮｆｋＢおよびＭＡＰＫ  ｐ３８阻害剤）の場合は１〜２時間前に加えた。炎症促進性刺激は、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦアルファもしくは１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ１ベータもしくは２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ１７Ａのいずれかまたは１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦアルファおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ１７両方の組み合わせであった。他の刺激は、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦアルファおよび５０ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ１７Ａの組み合わせまたは１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦアルファ、５０ｍｇ／ｍｌ  ＩＬ１７Ａおよび１０マイクロＭヒスタミンの組み合わせであった。細胞をさらに１６〜１８時間インキュベートし、その時点で上清を収集し、−８０℃で貯蔵した。収集の際に、上清をＰＢＳと置き換えて細胞を洗浄し、次にこれを３５０マイクロＬのＲＮＡｅａｓｙ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）と置き換えた。バッファー、溶解した細胞および細胞内容物を、−８０℃における貯蔵のためのチューブに移した。
【０１１６】
収集された上清を、ＥＬＩＳＡによりヒトＩＬ８、ＩＬ６またはＩＬ１７Ｃ含量に関して解析した（ＩＬ８およびＩＬ６はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ；ＩＬ１７ＣはＲ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。アッセイは、マイクロプレートリーダー（Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いたＢｉｏＴｅｋ  ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  ＨＴ）でＡ４５０−６３０ｎｍにおいて読み取り、検量線を読み取ることにより定量化を行った。無刺激対照におけるサイトカインの濃度を、被験ウェルおよび刺激した対照ウェルにおける濃度から減算した。刺激した対照ウェルをＩＬ８の１００％分泌として指定し、これに対して試料を計算した：％分泌＝（補正した被験ウェルｐｇ／ｍｌ／補正した対照ウェルｐｇ／ｍｌ）＊１００。
【０１１７】
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  Ｐｌｕｓキットを用いて細胞ライセートからＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを分光光度計で定量化して、濃度範囲を点検した。ＲＴステップに先立ち酵素消化によりゲノムＤＮＡを除去しつつ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ逆転写キット（ＲＮＡの出発容量は４マイクロＬ）を用いることによりｃＤＮＡを作製した。ＩＬ８（Ｑｉａｇｅｎ）またはハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨ（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかのプライマーを含有するＰＣＲ反応液（１または２マイクロＬ）およびＱｉａｇｅｎ  ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  ＰＣＲマスターミックス（２５マイクロＬ反応容量）にｃＤＮＡを加えた。標準設定（６０℃アニーリングおよび伸長、４０サイクル）を用いたＭｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ機械（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）においてＰＣＲを行った。ＭｘＰｒｏソフトウェアを用いて被験および対照試料のサイクル閾値（Ｃｔ）を得た。標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の比較（ΔΔＣＴ方法による比較発現、標的およびハウスキーピング遺伝子ＰＣＲは、比較できる増幅効率を示す）により、標的遺伝子の相対発現を評価し、刺激された対照ウェルｃＤＮＡを検量用試料（１００％遺伝子発現）として指定した。
【０１１８】
（実施例１１）−刺激されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのサイトカイン放出における効果
ＰＢＭＣからのサイトカインの放出における物質の効果は、多くの異なる細胞フォーマット、刺激および持続時間を用いて測定することができる。具体的には、単離されたＰＢＭＣとのインキュベーションによりＰ．カプスラタス多糖類誘導体の効果を測定した。ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）勾配遠心分離により新鮮血からＰＢＭＣを単離し、変法ＨＢＳＳ培地（ＰＡＡ）において洗浄し、完全ＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＡＡ）に再懸濁した。２００，０００個のＰＢＭＣを、培地のみ対照と共に９６ｖウェルポリプロピレンプレートに加えた。選択された濃度の多糖類を、対照ＳＣ５１４およびＳＢ２０３５８０（それぞれＮｆｋＢおよびＭＡＰＫ  ｐ３８阻害剤）と共に細胞に加え、１時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（１０マイクロｇ／ｍｌ）およびＩＬ１ベータ（１０ｎｇ／ｍｌ）を、無刺激対照を除く各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２または３日間インキュベートした。培地を収集するために、プレートを１０００ｒｐｍで遠心分離し、サイトカイン解析に先立ち、−８０℃における貯蔵のために上清をさらに別のプレートに移した。ＥＬＩＳＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）により、収集された上清をインターフェロンガンマ（ＩＦＮガンマ）含量に関して解析した。マイクロプレートリーダー（Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いたＢｉｏＴｅｋ  ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  ＨＴ）で４５０−６３０ｎｍにおけるアッセイを読み取り、検量線を読み取ることにより定量化を行った。無刺激対照におけるサイトカインの濃度を、被験ウェルおよび刺激した対照ウェルにおける濃度から減算した。刺激された対照ウェルをＩＦＮガンマの１００％分泌として指定し、この対照に対して試料を計算した＝（補正した被験ウェルｐｇ／ｍｌ／補正した対照ウェルｐｇ／ｍｌ）＊１００。
【０１１９】
（実施例１２）−好中球からの酸化バーストにおける効果
異なる細胞、刺激および基質を用いた、免疫細胞からの活性酸素種の産生を測定するための多数のプロトコールが存在する。具体的には、ヒト好中球を用いて多糖類および多糖類誘導体による酸化バーストの阻害を測定し、ヒト好中球を試薬ＤＣＦＨ−ＤＡで染色した。新鮮に単離されたヒト好中球を、ＨＢＳＳ（ＣａおよびＭｇ不含）に再懸濁し、血球計算器において細胞を計数した。ＨＢＳＳにおいて１×１０６となるよう細胞を再懸濁し、ＨＢＳＳに溶解した４０マイクロＭの等容量のＤＣＦＨ−ＤＡと混合し、３０分間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。１００マイクロＬの染色細胞は、ブランク（ＨＢＳＳのみ）および非染色細胞対照の１組３ウェルは別として、ブラック９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに加えた。２０マイクロＬの１ｍｇ／ｍｌの試料、ＨＢＳＳまたは対照（塩化ジフェニレンヨードニウム（diphenyleneiodium chloride）（ＤＰＩ）１マイクロＭ濃度、ＨＢＳＳに溶解）を、染色細胞を含有する１組３ウェルに加えた。刺激なし対照ウェルを除き、５０マイクロＬのＰＭＡ（ＨＢＳＳにおける４ｎＭ）の添加により細胞を刺激してＲＯＳ産生させた。蛍光プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ３）において３７℃でＲＯＳによるＤＣＦＨ−ＤＡの酸化により生じた蛍光を測定し、４８５／５２８ｎｍ動態を１０分毎に２．５時間読み取った。平均蛍光を計算し、ブランク処理した。ＰＭＡ刺激細胞の平均蛍光データを１００％応答として指定し、これに対し試料および対照を評価した：％酸化バースト＝（試料蛍光／ＰＭＡ刺激細胞蛍光）＊１００。
【０１２０】
（実施例１３）−血液細胞走化性における効果
走化性アッセイは、異なる走化性物質により、異なる種類の免疫細胞を用いて行うことができる。具体的には、好中球の走化性における多糖類および多糖類誘導体の効果を測定した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを用いて新鮮血からヒト好中球を単離する。ＢＳＡ  ０．１％、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）を含むＨＢＳＳにおける２．５×１０６／ｍｌの９０マイクロＬの新鮮に単離された好中球を、ポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）の各ウェルにおいて、１０マイクロＬの被験化合物（選択された濃度、例えば、２〜５０マイクロＭ）または媒体対照と混合し、３０分間プレインキュベートする。細胞および被験化合物をプレインキュベートしつつ、走化性９６ウェルプレート（３ミクロンメッシュ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の下部チャンバーを調製する。ＢＳＡ  ０．１％、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳにおいて、要求される用量（例えば、０．３７ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度）でＩＬ８（Ｓｉｇｍａ）を調製する。下部アッセイチャンバー毎に２３５マイクロＬを加える。陰性対照のため、ＩＬ８の代わりに２３５マイクロＬのＨＢＳＳ（Ｃａ／Ｍｇ、ＢＳＡ  ０．１％、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有）を用いる。続いて、下部アッセイチャンバーを３７℃、ＣＯ２  ５％で３０〜６０分間インキュベートして、培地を前平衡化する。次に、上部ウェルを慎重に下部に移し、ポリプロピレンプレインキュベーションプレートの各ウェル由来の７５マイクロＬの好中球を、走化性プレートの上部チャンバーにおけるウェルに加える。プレート全体を３７℃、ＣＯ２  ５％で３０分間インキュベートする。
【０１２１】
インキュベーターからアッセイプレートを取り出す。上部ウェル内容物を廃棄し、上部ウェルを、室温でウェル当たり１８０マイクロＬのＡｃｃｕｔａｓｅ酵素（Ｓｉｇｍａ）を含有するホワイト９６ウェルプレートに移す。プレートを、プレート振盪機に５分間室温で置く。上部チャンバーを廃棄し、メーカーの説明書に従ってＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏｗ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてホワイトプレートに存在する細胞数を測定する（実施例８も参照）。メッシュ（mesh）細胞およびＡｃｃｕｔａｓｅを含有する９６ウェル発光プレートのウェル毎に、１００マイクロＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を加え、プレート振盪機において２分間ＲＴで混合し、次に１０分間ＲＴでインキュベートする。Ｇｅｎ  ５ソフトウェアを用いてＳｙｎｅｒｇｙ  ２プレートリーダーにおいて発光シグナルを測定する。培地プラス細胞のみ対照に対してデータをブランク処理し、ＩＬ８のみ走化性１００％対照との比較により％遊走を計算する。
【０１２２】
さらに、ＴＨＰ−１ヒト前単球細胞株（ＨＰＡ  ８８０８１２０１）を用いて、単球の走化性に対するＰ．カプスラタス多糖類誘導体の効果も評価した。選択された濃度の多糖類誘導体（１組３ウェル）を、９６ｖウェルポリプロピレン（ＰＰ）プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）において、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミンおよび０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＡＡ）における２×１０６／ｍｌのＴＨＰ−１細胞と混合した。細胞単独の対照も３点用意した。細胞および多糖類を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。同培地における２３５マイクロＬの１０ｎｇ／ｍｌの単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、陰性対照としてアッセイ培地を用いて、９６ウェル５ミクロンメッシュ走化性プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の下部チャンバーに加えた。上部プレートを再装着し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートして、培地を前平衡化した。７５マイクロＬのＴＨＰ−１細胞（ほぼ１５０，０００細胞）および被験試料を、ＰＰプレートからＭＣＰ−１含有走化性プレートの上部チャンバーへと移すことにより、アッセイを行った。慎重に操作して、移行前に細胞が完全に懸濁され、十分に混合されたことを確実にした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１２０分間インキュベートした。上部チャンバーから培地を除去し、１８０マイクロＬのＡｃｃｕｔａｓｅ酵素（Ｓｉｇｍａ）を含有するプレートに膜を移し、５分間振盪し、膜を廃棄することにより、走化性を測定した。１００マイクロＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  −  好中球走化性に関する）を、アッセイプレートの下部ウェルおよびＡｃｃｕｔａｓｅ含有プレートに加えた。これを２分間振盪し、１０分間インキュベートし、次に、２００マイクロＬのウェル内容物をホワイト９６ウェルプレートに移し、Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いてＳｙｎｅｒｇｙ  ２プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）において発光を測定した。培地および細胞のみ対照を用いてデータをブランク処理し、下部チャンバーおよびＡｃｃｕｔａｓｅ試料から値をプールし、細胞のみＭＣＰ−１対照ウェル（１００％走化性）との比較により％走化性を計算した。
【０１２３】
（実施例１４）−イミキモド（ＩＭＱ）処理ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける皮膚炎症における効果
異なる種類のマウス、遺伝的誘導因子および外部刺激を用いた、マウスモデルにおける皮膚炎症における被験物質の効果を評価するための多数のプロトコールが存在する。具体的には、ＩＭＱ誘導によるＢＡＬＢ／ｃマウスモデルを用いて、皮膚炎症におけるＰ．カプスラタス多糖類誘導体の効果を評価した。被験群は、未処置プラス媒体群、ＩＭＱのみ群、ＩＭＱプラス媒体群、３種の異なる濃度（１、０．１、０．０１％）の多糖類プラス媒体群およびシクロホスファミド対照（１０ｍｇ／ｋｇ、０．５％ＣＭＣに溶解）を包含し、１群当たり８匹のマウスであった。ポリアクリル酸ナトリウム塩、グリセロール、パラベンおよびイミダゾリジニルウレア（＝媒体）を含有する水性ゲルに多糖類を溶解した。５０ｍｇのＩＭＱクリーム（５％）塗布の４時間前に、５００マイクロＬの被験ゲルをマウスの剪毛した背中に毎日塗布した。未処置マウス被験群の場合、ワセリンを用い、シクロホスファミドを１日１回経口投薬した。皮膚外観（鱗屑形成（scaling）、ひだ形成（folding）、紅斑）の観察を毎日行って、疾患活性指数を得た。投薬を４日間反復し、その後、各群由来の４匹のマウスをサンプリングし、続いて実験を９日目まで行い、残存する全マウスをサンプリングした。全マウス由来の皮膚試料をホルマリンに固定し、包埋し、切片作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。上皮過形成、ケラチノサイト増殖（角化症）、白血球浸潤および血管新生の増加に関してスライドをスコア化した。スコアを被験薬剤に対してプロットして、ＩＭＱプラス媒体対照と比較した多糖類処置の効果を決定した。
【０１２４】
特定の実施例を参照しつつ、本発明を特に示し説明してきたが、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、その形態および詳細において様々な変更を行ってよいことを理解されよう。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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