(57)【要約】  顕微鏡的対象物のイメージング方法は、半導体ナノクリスタルのイメージを様々なz-変位で分析することによって、2つ以上の半導体ナノクリスタルの相対深度を決定することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡的対象物をイメージングする方法であって：
少なくとも第1及び第2の半導体ナノクリスタルと結合した顕微鏡的対象物を、光学顕微鏡の光場に配置すること；
該第1及び第2の半導体ナノクリスタルの第1蛍光イメージを、第1の焦点深度で記録すること；
該第1及び第2の半導体ナノクリスタルの第2蛍光イメージを、第1の焦点深度と異なる第2の焦点深度で記録すること；及び
少なくとも部分的に該第1及び第2蛍光イメージに基づいて、該第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対深度を算出することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対深度を算出することが、第1の半導体ナノクリスタルの半径を、それが第1及び第2蛍光イメージのそれぞれに現れるように測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記半径を測定することが、半径方向強度プロファイルを決定することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
半径方向強度プロファイルを1つ以上のガウス曲線でフィッティングさせることをさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記半径を測定することが、複数の異なる角度で半径を測定することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記半径方向強度プロファイルを決定することが、複数の異なる角度について積分した半径方向強度プロファイルを算出することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項７】
半径方向強度プロファイルを1つ以上のガウス曲線でフィッティングさせることをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
第1の半導体ナノクリスタルの測定された半径を、第1の半導体ナノクリスタルの相対深度と相関を取ることをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項９】
少なくとも部分的に第1及び第2蛍光イメージに基づいて、第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対的な三次元座標を決定することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも部分的に第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対的な三次元座標に基づいて、前記対象物の三次元座標を決定することをさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記対象物が生物学的構造を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的構造が細胞を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記第1の半導体ナノクリスタルが、生体分子に対して特異的親和性を有する部分と結合される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも1つの半導体ナノクリスタルの位置を、時間の関数として追跡することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記位置を追跡することが、半導体ナノクリスタルの三次元座標を決定することを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ナノクリスタルの位置を三次元において決定する方法であって：
半導体ナノクリスタルの蛍光イメージを記録すること；
該ナノクリスタルイメージの中心からx-及びy-座標を決定すること；及び
該ナノクリスタルイメージの半径からz-座標を決定することを含む、前記方法。
【請求項１７】
前記x-、y-及びz-座標が、各々個別に±15 nm以下の精度を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記x-、y-及びz-座標が、各々個別に±10 nm以下の精度を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記x-及びy-座標のうちの少なくとも1つが±5 nm以下の精度を有し、z-座標が±10 nm以下の精度を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記ナノクリスタルイメージの半径からz-座標を決定することが、半径方向強度プロファイルを決定することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記半径方向強度プロファイルを決定することが、複数の異なる角度について積分した半径方向強度プロファイルを算出することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
半径方向強度プロファイルを1つ以上のガウス曲線でフィッティングさせることをさらに含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
半導体ナノクリスタルの蛍光イメージを記録することが、単一蛍光イメージにおいて複数の半導体ナノクリスタルの蛍光イメージを記録することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
半導体ナノクリスタルの蛍光イメージを記録することが、第1の発光波長又は波長の範囲で、ある領域の第1蛍光イメージを記録すること、及び第2の発光波長又は波長の範囲で、該領域の第2蛍光イメージを記録することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
z-方向において該領域を移動すること、及び第1の発光波長又は波長の範囲で、該領域の第1イメージを記録する工程及び第2の発光波長又は波長の範囲で、該領域の第2イメージを記録する工程を繰り返すことをさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
顕微鏡的対象物をイメージングするための装置であって：
ナノ位置決めステージに配置される顕微鏡的対象物をイメージングするように構成された対物レンズ；
該顕微鏡的対象物と結合した少なくとも第1及び第2の半導体ナノクリスタルからの蛍光を同時に励起するように構成された光源；及び
該第1及び第2の半導体ナノクリスタルの第1蛍光イメージを第1の焦点深度で記録し、かつ該第1及び第2の半導体ナノクリスタルの第2蛍光イメージを第1の焦点深度と異なる第2の焦点深度で記録するように構成されたカメラを含む、前記装置。
【請求項２７】
第1の半導体ナノクリスタルの半径を、それが第1及び第2蛍光イメージのそれぞれに現れるように測定することによって、第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対深度を算出するように構成されたコンピュータシステムをさらに含む、請求項26記載の装置。
【請求項２８】
前記コンピュータシステムが、複数の異なる角度について積分した半径方向強度プロファイルを算出すること及び該半径方向強度プロファイルを1つ以上のガウス曲線でフィッティングさせることによって、半径を測定するようにさらに構成されている、請求項27記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(優先権の主張)
本出願は、2007年9月26日に出願された表題「単一半導体ナノクリスタルの高分解能３Dイメージング（HIGH-RESOLUTION 3D IMAGING OF SINGLE SEMICONDUCTOR NANOCRYSTALS）」の米国仮特許出願番号第60/975,319号に対し優先権を主張する。それは全体において引用により取り込まれている。
【０００２】
(連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発)
米国政府は、NIH助成金番号6898935及びSMA/CSB助成金番号6898104に従い、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００３】
(技術分野)
本発明は、単一半導体ナノクリスタルの高分解能３Dイメージングに関する。
【背景技術】
【０００４】
半導体ナノクリスタルは、可視及び近赤外波長、大きいモル吸光係数及び高量子収率を通じて調整可能な狭い発光スペクトルを有する光安定性蛍光団である。これらの特性により、半導体ナノクリスタルは、生物学的、生医学的及び環境的関係において、標識化及び光学的検出のための強力なツールとなる。半導体ナノクリスタルの異例な輝度及び光安定性は、それらに、単一分子レベルでの生物学的事象の分析に関して、大きな可能性を与える。しかし、細胞標識化用途のために設計される現状のナノクリスタルは、サイズ、非特異的結合、及び誘導体化能の間の相容れない調整に悩まされる。
【０００５】
一般に、ナノクリスタルは、有機配位子の層によって囲まれる無機ナノ粒子を含む。この有機配位子シェルは、処理、特定の他の部位への結合、様々な基板への結合のために、ナノクリスタルに欠かせないものである。ナノクリスタルは、アルキルホスフィン及びアルキルホスフィンオキシドなどの大過剰量の配位子を含むそれらの成長溶液中で、著しく劣化することなく長期間、保存することができる。最も多くの用途、特に水性用途のため、ナノクリスタルは、それらの成長溶液外で処理され、様々な化学的環境に移されなければならない。しかし、それらの成長溶液から取り出されるとき、ナノクリスタルは多くの場合、その高い蛍光性を失い、又は不可逆的に凝集される。
【発明の概要】
【０００６】
(要旨)
単一粒子追跡は、細胞表面タンパク質の動作について、アンサンブル平均の簡略化なしに先例のない理解を提供することができる。しかし、単一粒子追跡は、蛍光団の光退色、プローブ多価性、標識プローブのサイズ、及び標的からのプローブの解離によって複雑化される。半導体ナノクリスタルは、輝度及び光安定性の単一粒子追跡に関して固有の利点を有する。
【０００７】
レンズ系光学顕微鏡は、光の波長の約半分のみの分解能を提供することができ、可視光について約数百ナノメートルである。ナノクリスタルベースの追跡方法は、三次元のナノメートル空間分解(例えば、約10nm)を提供する。前記追跡方法は、マイクロメートル又はナノメートルスケールの追跡対象物及び構造(例えば生物学的対象物及び構造)に用いることができる。ウシ大動脈内皮細胞上のグリコカリックスと呼ばれる〜350nm厚さの多糖類層を三次元的にマッピングする方法、及び該多糖類層の機械的特性を流動下で研究する方法。
【０００８】
一態様において、顕微鏡的対象物をイメージングする方法は、少なくとも第1及び第2の半導体ナノクリスタルと結合した顕微鏡的対象物を、光学顕微鏡の光場に配置すること、該第1及び第2の半導体ナノクリスタルの第1蛍光イメージを第1の焦点深度で記録すること、該第1及び第2の半導体ナノクリスタルの第2蛍光イメージを第1の焦点深度と異なる第2の焦点深度で記録すること、及び少なくとも部分的に該第1及び第2蛍光イメージに基づいて、該第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対深度を算出することを含む。
【０００９】
第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対深度を算出することは、第1の半導体ナノクリスタルの半径を、それが第1及び第2蛍光イメージのそれぞれに現れるように測定することを含むことができる。半径を測定することは、局所強度最大の半径を測定することを含むことができる。複数の局所強度最大がある場合、最も大きな半径を有する局所強度最大を選択することができる。半径を測定することは、複数の異なる角度で半径を測定することを含むことができる。半径を測定することは、半径方向強度プロファイルを決定することを含むことができる。半径方向強度プロファイルを決定することは、複数の異なる角度について積分した半径方向強度プロファイルを算出することを含むことができる。当該方法は、半径方向強度プロファイルを1つ以上のガウス曲線でフィッティングさせることを含むことができる。
【００１０】
当該方法は、第1の半導体ナノクリスタルの測定された半径を、第1の半導体ナノクリスタルの相対深度と相関を取ることを含むことができる。当該方法は、少なくとも部分的に第1及び第2蛍光イメージに基づいて、第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対的な三次元座標を決定することを含むことができる。当該方法は、少なくとも部分的に第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対的な三次元座標に基づいて、該対象物の三次元座標を決定することを含むことができる。
【００１１】
対象物は、生物学的構造を含むことができる。生物学的構造は、細胞を含むことができる。第1の半導体ナノクリスタルは、生体分子に対して特異的親和性を有する部分と結合することができる。
当該方法は、少なくとも1つの半導体ナノクリスタルの位置を、時間の関数として追跡することを含むことができる。位置を追跡することは、半導体ナノクリスタルの三次元座標を決定することを含むことができる。
【００１２】
別の態様において、ナノクリスタルの位置を三次元において決定する方法は、半導体ナノクリスタルの蛍光イメージを記録すること、該ナノクリスタルイメージの中心からx-及びy-座標を決定すること、及び該ナノクリスタルイメージの半径からz-座標を決定することを含む。
x-、y-及びz-座標は、各々個別に±15 nm以下の精度、又は±10 nm以下の精度を有することができる。いくつかの実施態様において、x-及びy-座標のうちの少なくとも1つは±5 nm以下の精度を有し、z-座標は±10 nm以下の精度を有することができる。
【００１３】
ナノクリスタルイメージの半径からz-座標を決定することは、半径方向強度プロファイルを決定することを含むことができる。半径方向強度プロファイルを決定することは、複数の異なる角度について積分した半径方向強度プロファイルを算出することを含むことができる。当該方法は、半径方向強度プロファイルを1つ以上のガウス曲線でフィッティングさせることを含むことができる。
【００１４】
半導体ナノクリスタルの蛍光イメージを記録することは、単一蛍光イメージにおいて複数の半導体ナノクリスタルの蛍光イメージを記録することを含むことができる。
半導体ナノクリスタルの蛍光イメージを記録することは、第1の発光波長又は波長の範囲で、ある領域の第1蛍光イメージを記録すること、及び第2の発光波長又は波長の範囲で、該領域の第2蛍光イメージを記録することを含むことができる。
【００１５】
当該方法は、z-方向において該領域を移動すること、及び第1の発光波長又は波長の範囲で、該領域の第1イメージを記録する工程及び第2の発光波長又は波長の範囲で、該領域の第2イメージを記録する工程を繰り返すことを含むことができる。
別の態様において、顕微鏡的対象物をイメージングするための装置は、ナノ位置決めステージに配置される顕微鏡的対象物をイメージングするように構成された対物レンズ、該顕微鏡的対象物と結合した少なくとも第1及び第2の半導体ナノクリスタルからの蛍光を同時に励起するように構成された光源、及び第1及び第2の半導体ナノクリスタルの第1蛍光イメージを第1の焦点深度で記録し、かつ第1及び第2の半導体ナノクリスタルの第2蛍光イメージを第1の焦点深度と異なる第2の焦点深度で記録するように構成されたカメラを含む。
【００１６】
当該装置は、第1の半導体ナノクリスタルの半径を、それが第1及び第2蛍光イメージのそれぞれに現れるように測定することによって、第1及び第2の半導体ナノクリスタルの相対深度を算出するように構成されたコンピュータシステムを含むことができる。当該コンピュータシステムは、さらに複数の異なる角度について積分した半径方向強度プロファイルを算出すること及び半径方向強度プロファイルを1つ以上のガウス曲線とフィッティングさせることによって、半径を測定するように構成することができる。
本発明の他の特徴、目的及び効果は、説明及び図面から、並びに請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、落射蛍光顕微鏡システムの模式図である。
【図２】図2は、様々なz-変位でのナノクリスタルの一連の蛍光顕微鏡イメージである。
【図３】図3は、様々なz-変位での単一ナノクリスタルのフォールスカラーイメージである。
【図４】図4は、ナノクリスタルのデフォーカスイメージの半径を決定する方法を例示する。
【図５】図5は、ナノクリスタルのデフォーカスイメージの半径r0を決定する方法を例示する。
【図６】図6A及び6Bは、半径r0と個々のナノクリスタルのz-変位との間の関係を表しているグラフである。図6Cは、ナノクリスタルについて測定されたz-変位を時間の関数として表しているグラフである。
【図７】図7Aは、標識化細胞の概略図である。図7Bは、細胞標識、r0及びz-変位がどのように関連するかを表す概略図である。
【図８】図8は、様々なz-変位での標識化細胞の一連の蛍光顕微鏡イメージである。
【図９】図9は、固定したz-変位での標識化細胞の一連の蛍光顕微鏡イメージであり、適当な位置で異なる発光波長フィルタを用いて記録した。
【図１０】図10A〜10Bは、標識化細胞上のナノクリスタルの相対的な位置を表しているグラフである。
【図１１】図11は、ナノクリスタルの相対的な位置及び標識化細胞上の細胞組織のモデルを表しているグラフである。
【図１２】図12は、フローセルを表す概略図である。
【図１３】図13Aは、ナノクリスタルの時間依存的な位置を表している蛍光顕微鏡イメージ及びグラフである。図13Bは、ナノクリスタルの時間依存的な位置を表しているグラフである。
【図１４】図14は、フローセルにおいて印加される剪断応力とナノクリスタル変位との間の関係を表しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
(詳細な説明)
細胞イメージングの一つの目的は、生細胞において単一生体分子の変化を観察することである。インビトロでの単一分子イメージングは、miRNA又はウイルス粒子などの低含量の生体分子を検出し、感度において究極点となるその能力を証明している(例えば、Neely, L.A.らの論文, (2006). Nat. Methods 3, 41-46；及びAgrawal, A.らの論文, (2006). Anal. Chem. 78, 1061-1070を参照されたい。その各々は引用により取り込まれている。)。半導体ナノクリスタルは、細胞の単一分子の変化を追跡する際に特定の利点を提供する。単一半導体ナノクリスタルは、TIRFを必要とすることなく、広い領域の蛍光顕微鏡で容易に認識されるだけの十分な輝度があり、極めて光安定性である(Gao, X.らの論文 (2005). Curr.Opin.Biotechnol. 16, 63-72、それは全体において引用により取り込まれている。)。
【００１９】
通常の光学顕微鏡は、数百ナノメートルサイズの対象物の分解に制限される。デフォーカスイメージングは、粒子の深度を高分解能で位置決めすることができる。例えば、M. Speidel, A. Jonas及びF. E., Opt. Lett. 28, 69 (2003) ("Speidel")を参照されたい。それは全体において引用により取り込まれている。簡潔に言うと、目的対象物の明確な半径は、焦点が合っているときに、以下により表すことができる：
r 〜 0.61λ/NA
式中、NAは対物レンズの開口数である。対象物がz-方向(すなわち、焦点面に対して直角)において変位するにつれて、該対象物のイメージは焦点をぼかされる。対象物が発光源であり、発光波長と比べて小さい場合、z変位が増加するにつれて、干渉環(interference rings)が明確になる。Speidelにて説明されるように、z変位は、最も外側の干渉環r0の半径と線形相関がある。
【００２０】
部分的にそれらの小さいサイズのために、半導体ナノクリスタルの顕微鏡イメージングは、非常に高い有効解像度を提供することができる：干渉環の中心は、二次元ガウスフィッティングにより正確に測定することができ、イメージング平面内で亜回折限界分解能(sub-diffraction limited resolution)を提供する。従って、単離された発光体は、従来の設計規則が示唆するものより非常に高い分解能を有する顕微鏡の焦点面に位置し、並びにz-方向に位置することができる。一例において、単一ナノクリスタルの軌跡は、約4nm精度で追跡することができる。M. Jonas, Y. Yao, P. T. C. So,及びC. F. Dewey, IEEE Transactions on Nanobioscience 5, 246 (2006)を参照されたい；またYildiz, A.らの論文, Science 300, 2061-2065 (2003)を参照されたい。その各々は全体において引用により取り込まれている。静止しているナノクリスタルに関して、〜1.3 nmのx,y精度が示されている(Thompson, R.E. らの論文, Biophys J. 82, 2775-2783, 2002、それは全体において引用により取り込まれている)。
【００２１】
図2〜6に示すイメージ及びデータは、滑らかなカバーガラスの一部分上にスピンコートしたナノクリスタルに関して記録したものである(原子間力顕微鏡測定からのRMS粗さ〜1nm)。λ＝514nm線のAr-イオンレーザを、〜20W/cm2の典型的強度を有する励起源として使用した。イメージは、100X油浸系対物レンズ(Nikon, Plan Apo, NA=1.4)及び90nmの有効なピクセルサイズを有する増感CCDカメラ(Pentamax, Princeton Instruments)を用いて撮影した；各ピクセルによりキャプチャーされる実際のイメージは、使用するポスト対物倍率によって変更することができる。
【００２２】
図2は、z-変位の異なる値でのナノクリスタル領域の蛍光顕微鏡イメージを示す。図3は、z-変位の異なる値での単一半導体ナノクリスタルのフォールスカラーイメージを示す。色は、CCD検出器で測定される強度を示す。ナノクリスタルが焦点が合うときに、個々のナノクリスタルからの蛍光は明るいスポットとして現れる。ナノクリスタルが圧電駆動ステージを用いて焦点面から遠ざけられるにつれて、各ナノクリスタルからの発光の回折のために複雑な環模様が形成する。
【００２３】
図4は、干渉縞の半径r0を決定するための1つの方法を例示する。イメージの中心を含む「スライス」を取り、得られるプロファイルをガウス曲線(すなわち、形式f(r) = exp[-k(r-r0)2］を有する曲線がガウス曲線である)にフィッティングする。半径r0を、中心のピークと最も外側のガウス曲線との間の距離として算出する。図4に示すように、イメージごとに2以上の「スライス」を取ることが可能である。図4の右下のプロット線は、r0とz変位との間の直線相関を示す。
【００２４】
図5は、r0を決定する別の方法を例示する。角θの関数としての光子強度の積分を、半径距離に対してプロットし、最も外側の環の中心、すなわちr0を算出するために、多重ガウス関数にフィッティングする(フィッティング結果を赤い曲線として示す)。
図6に示すように、r0とz-変位間との間の測定された相関は線形である。図6に示される一致のため、〜50nm(検出器のピクセルサイズの近く)のr0の変化は、90nmのz-変位に相当する。z-変位の分解能は、同じイメージ平面で幾つかのナノクリスタルの測定された環サイズの標準偏差に基づいて、約8nmであった。図6A及び図6Bに関して0半径に対する補間は、それぞれ13.740μm及び13.750μmであり、10nmの相違は平面に堆積したナノクリスタルと一致する。
【００２５】
最終的な動的試験は、0.1Hz方形波を用いて50±1nm垂直に顕微鏡スライドを移動させることによって行った。図6Cに示される結果は、イメージ分析の反復認識による単一ナノクリスタルの測定された位置の平均及び標準偏差を示す。赤線で示すように、図6Cの2つの変位の平均の相違は54nmであった。各平均の標準偏差は、ノイズのあるイメージ上での当該分析手順の反復率の測定として取り、9nmであった。
【００２６】
回折パターンの波長依存性のため、異なる発光波長を有するナノクリスタルは個別に較正した。しかし、イメージングシステムの色収差を調査(同時に3つの異なる発光ナノクリスタルをイメージングすることによって)したとき、結果は、傾斜(slope)Δz/Δrが波長から独立であることを示した。傾斜Δz/Δrは、顕微鏡対物レンズに依存する。
【００２７】
ナノクリスタルコアは、高温の配位剤中で有機金属前駆体を熱分解することによって調製することができる。例えば、Murray, C.B.らの論文 J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 8706, 及びMikulec, F., Ph.D. Thesis, MIT, Cambridge, 1999を参照されたい。その各々は全体において引用により取り込まれている。裸のナノクリスタルコア上のシェル層の成長は、従来のオーバーコーティング手順の単純な変更によって実施されることができる。例えば、 Peng, X.らの論文 J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7019, Dabbousi, B.O.らの論文 J. Phys. Chem. B 1997, 101, 9463, 及びCao, Y. W. 及びBanin, U. Angew. Chem. Int. Edit. 1999, 38, 3692を参照されたい。その各々は全体において引用により取り込まれている。
【００２８】
配位剤は、ナノクリスタルの成長の制御に役立ち得る。配位剤は、ドナー孤立電子対を有する化合物であり、例えば、成長するナノクリスタルの表面に配位するのに利用できる孤立電子対を有する。配位剤は、溶媒とすることができる。配位剤は、成長するナノクリスタルを安定化させることができる。代表的な配位剤としては、アルキルホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アルキルホスホン酸、又はアルキルホスフィン酸があるが、ピリジン、フラン、及びアミンなどの他の配位剤も、ナノクリスタルの生成に適し得る。適切な配位剤の例としては、ピリジン、トリ-n-オクチルホスフィン（TOP）、及びトリ-n-オクチルホスフィンオキシド（TOPO）がある。工業用のTOPOを使用することができる。
【００２９】
ナノクリスタルの外部表面は、成長プロセス中に使用された配位剤から誘導される化合物の層を含むことができる。過剰な競合配位基へ繰り返し曝露することによって表面を改質し、被覆層を形成することができる。例えば、成長時に使用した配位剤でキャップされたナノクリスタルの分散は、ピリジンなどの配位性有機化合物を用いて処理され、ピリジン、メタノール、及び芳香族中では容易に分散するが、脂肪族溶媒中ではもはや分散しない結晶を生成することができる。そのような表面交換プロセスは、例えばホスフィン、チオール、アミン、及びホスフェートを含めた、ナノクリスタルの外部表面と配位、又は結合できる任意の化合物を用いて実施することができる。ナノクリスタルは、該表面に対して親和性を示し且つ懸濁液又は分散媒体に対して親和性を有する部位を末端とする短鎖ポリマーに曝露されることができる。そのような親和性は、懸濁液の安定性を改善し、ナノクリスタルの凝集を妨げる。
【００３０】
単座配位アルキルホスフィン及びアルキルホスフィンオキシドは、効率的にナノクリスタルを不動態化する。用語ホスフィンは、下記のホスフィン及びホスフィンオキシドに関連することに注意されたい。チオール又はホスホン酸などの他の従来の配位子は、長期間に渡って初期の高いナノクリスタル発光を維持する単座配位ホスフィンより非効果的であり得る。例えば、ナノクリスタルの光ルミネセンスは、チオール又はホスホン酸で配位子交換された後、一貫して減弱するか又は消光する。
【００３１】
配位子交換は、一相又は二相法によって行うことができる。配位子交換の前に、ナノクリスタルを、メタノール添加によって、それらの成長溶液から沈殿させることができる。過剰な配位剤(例えば、トリオクチルホスフィン)を含む上清を廃棄することができる。沈殿したナノクリスタルは、ヘキサン中で再分散することができる。基本的にすべての過剰配位剤がナノクリスタルから分離されるまで、沈殿及び再分散を繰り返すことができる。ナノクリスタル及び導入される配位子が同じ溶媒中に可溶である場合、一相プロセスを用いることができる。過剰な新しい配位子を有する溶液を、ナノクリスタルと混合することができる。配位子交換が終了するまで、該混合液を高温で撹拌することができる。一相方法は、例えば、オクチル修飾オリゴマーホスフィン又はメタクレート修飾オリゴマーホスフィンを交換するために用いることができ、その双方は、ヘキサンなどの、ナノクリスタルと混合可能な溶媒に溶解する。ナノクリスタル及び新しい配位子が共通溶剤を有しない場合、二相配位子交換プロセスが好ましい。ナノクリスタルをジクロロメタンなどの有機溶媒に溶解し、新しい配位子を水溶液に溶解することができる。ナノクリスタルを、例えば、超音波処理によって有機相から水相に移動させることができる。当該移動は、吸収及び発光光分析でモニターすることができる。類似の二相配位子交換過程は以前に報告されている。例えば、その全体において引用により取り込まれているWang, Y.A.らの論文 2002 J. Am. Chem. Soc 124, 2293を参照されたい。
【００３２】
ナノクリスタルは、狭いサイズ分布を有するナノクリスタルの集団のメンバーであることができる。ナノクリスタルは、球形、棒状、円盤状、又は他の形状とすることができる。ナノクリスタルは、半導体材料のコアを含むことができる。ナノクリスタルは、式ＭＸを有するコアを含むことができ、ここでMは、カドミウム、亜鉛、マグネシウム、水銀、アルミニウム、ガリウム、インジウム、タリウム、又はそれらの混合物であり、Xは、酸素、硫黄、セレン、テルル、窒素、リン、ヒ素、アンチモン、又はそれらの混合物である。
【００３３】
ナノクリスタルのコアを形成する半導体は、II-VI族の化合物、II-V族の化合物、III-VI族の化合物、III-V族の化合物、IV-VI族の化合物、I-III-VI族の化合物、II-IV-VI族の化合物、又はII-IV-V族の化合物、例えばZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、AlN、AlP、AlAs、AlSb、GaN、GaP、GaAs、GaSb、GaSe、InN、InP、InAs、InSb、TlN、TlP、TlAs、TlSb、PbS、PbSe、PbTe、又はそれらの混合物を含むことができる。
【００３４】
コアは、該コアの表面上にオーバーコーティングを有することができる。オーバーコーティングは、該コアの組成物とは異なる組成物を有する半導体物質であってもよい。ナノクリスタルの表面上の半導体物質のオーバーコートは、II-VI族の化合物、II-V族の化合物、III-VI族の化合物、III-V族の化合物、IV-VI族の化合物、I-III-VI族の化合物、II-IV-VI族の化合物、又はII-IV-V族の化合物、例えばZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、AlN、AlP、AlAs、AlSb、GaN、GaP、GaAs、GaSb、GaSe、InN、InP、InAs、InSb、TlN、TlP、TlAs、TlSb、PbS、PbSe、PbTe、又はそれらの混合物を含むことができる。オーバーコーティング材料は、コア材料のバンドギャップより大きいバンドギャップを有することができる。あるいは、オーバーコーティング材料は、コア材料の価電子帯及び伝導帯にエネルギーにおいて中間のバンド(すなわち価電子帯又は伝導帯)を有することができる。例えば、表題「半導体ナノクリスタルへテロ構造(Semiconductor Nanocrystal Heterostructures」の米国特許出願公開番号第20040110002号を参照されたい。それは全体において引用により取り込まれている。
【００３５】
ナノクリスタルからの発光は、狭いガウス発光バンド(Gaussian emission band)とすることができ、ナノクリスタルのサイズ、ナノクリスタルの組成、又はその両方を変化させることによって、紫外領域、可視領域、又は赤外領域のスペクトルの全波長範囲にわたって調整することができる。例えば、CdSeは、可視領域において調整することができ、InAsは、赤外領域において調整することができる。
【００３６】
ナノクリスタルの集団は、狭いサイズ分布を有することができる。該集団は、単分散にすることができ、ナノクリスタルの直径について15％rms未満の偏差、好ましくは10％未満の偏差、より好ましくは5％未満の偏差を示すことができる。可視において発光するナノクリスタルのために、半値全幅（FWHM）が約10nm〜100nmの範囲である狭い範囲のスペクトル発光を観察することができる。半導体ナノクリスタルは、2%、5%、10%、20%、40%、60%、70%又は80%を超える発光量子効率を有することができる。
【００３７】
半導体ナノクリスタルの調製方法は、高温の配位溶媒に注入されるジメチルカドミウムなど有機金属試薬の熱分解を含む。これは、個々の核形成を可能にし、巨視量のナノクリスタルの制御された成長をもたらす。ナノクリスタルの調製及び操作は、例えば、米国特許第6,322,901号に記載されており、その全体は本明細書中に引用により取り込まれている。ナノクリスタルの製造方法は、コロイド成長プロセスであり、単分散粒子集団を生成することができる。コロイド成長は、Ｍドナー及びＸドナーを高温配位溶媒に急速に注入することによって生じる。この注入により核が生成され、その核は、ナノクリスタルを形成する制御された様式で成長させることができる。反応混合物は、ナノクリスタルを成長させ、かつアニールするために、穏やかに加熱されることができる。試料中のナノクリスタルの平均サイズとサイズ分布との両方が、成長温度に依存する。安定した成長を維持するために必要な成長温度は、平均結晶サイズの増加に伴って増加する。ナノクリスタルは、ナノクリスタルの集団のメンバーである。個々の核形成及び制御された成長の結果、得られるナノクリスタルの集団は、狭い単分散の直径分布を有する。単分散の直径分布は、サイズと呼ぶこともできる。核形成に続く、配位溶媒中でのナノクリスタルの制御された成長及びアニーリングのプロセスは、一様な表面誘導体化及び規則的なコア構造を生じさせることもできる。サイズ分布が鋭くなるにつれて、安定した成長を維持するために、温度を上昇させることができる。より多くのMドナー又はXドナーを添加することによって、成長期間を短縮することができる。
【００３８】
オーバーコーティングプロセスは、例えば米国特許第6,322,901号に記載されている。その全体は本明細書中に引用により取り込まれている。オーバーコーティング中に反応混合物の温度を調節し、コアの吸収スペクトルをモニタリングすることによって、高い発光量子効率と狭いサイズ分布とを有するオーバーコートされた材料を得ることができる。
【００３９】
Mドナーは、無機化合物、有機金属化合物、又は元素金属とすることができる。無機化合物M含有塩は、ハロゲン化金属、カルボン酸金属、炭酸金属、水酸化金属又は金属アセチルアセトネートなどの金属ジケトネートであることができる。例えば、米国特許第6,576,291号を参照されたい。それは全体において引用により取り込まれている。Mは、カドミウム、亜鉛、マグネシウム、水銀、アルミニウム、ガリウム、インジウム、又はタリウムである。Xドナーは、Mドナーと反応して一般式MXを有する物質を生成することができる化合物である。通常、Xドナーは、カルコゲニドドナー又はプニクタイドドナー、例えば、ホスフィンカルコゲニド、ビス（シリル）カルコゲニド、二酸素、アンモニウム塩、又はトリス（シリル）プニクタイドである。適切なＸドナーは、二酸素、ビス（トリメチルシリル）セレニド（(TMS)2Se）、トリアルキルホスフィンセレニド（例えば（トリ-n-オクチルホスフィン）セレニド（TOPSe）又は（トリ-n-ブチルホスフィン）セレニド（TBPSe）など）、トリアルキルホスフィンテルリド（例えば（トリ-n-オクチルホスフィン）テルリド（TOPTe）又はヘキサプロピルホスホラストリアミドテルリド（HPPTTe）など）、ビス（トリメチルシリル）テルリド（(TMS)2Te）、ビス（トリメチルシリル）スルフィド（(TMS)2S））、トリアルキルホスフィンスルフィド（例えば（トリ-n-オクチルホスフィン）スルフィド（TOPS）など）、アンモニウム塩（例えばハロゲン化アンモニウム（例えばNH4Cl）など）、トリス（トリメチルシリル）ホスフィド（(TMS)3P）、トリス（トリメチルシリル）アルセニド（(TMS)3As）、又はトリス（トリメチルシリル）アンチモニド（(TMS)3Sb）を含む。特定の実施態様において、Mドナー及びXドナーは、同一分子内の成分とすることができる。
【００４０】
反応の成長段階中のサイズ分布は、粒子の吸収線幅をモニタリングすることによって評価することができる。粒子の吸収スペクトルの変化に応じた反応温度の修正により、成長中、鋭い粒子サイズ分布の維持が可能になる。より大きな結晶を成長させるために、結晶成長中に、核形成溶液に反応物を添加することができる。反応物は、より大きな結晶を発達させるために、結晶成長の間、核形成溶液に加えられることが可能である。特定のナノクリスタル平均直径で成長を停止させ、150Å未満の平均ナノクリスタル直径を有する集団を得ることができる。ナノクリスタルの集団は、15Å〜125Åの範囲の平均直径を有することができる。
【００４１】
粒子サイズ分布を、その全体において本明細書中に引用により取り込まれている米国特許第6,322,901号に記載されているように、メタノール/ブタノールなどのナノクリスタルに対する貧溶媒を用いるサイズ選択的沈殿法によって、さらに精製することができる。例えば、ナノクリスタルを、10％ブタノールのヘキサン溶液中に分散させることができる。メタノールを、乳光が持続するまで、攪拌溶液に滴下して加えることができる。遠心分離による上清と凝集物との分離により、試料中の最大結晶に富んだ沈殿物が生成される。この手順を、吸光スペクトルのさらなる鋭利化が認められなくなるまで繰り返すことができる。サイズ選択的沈殿法は、ピリジン/ヘキサン及びクロロホルム/メタノールを含めた種々の溶媒/非溶媒のペアで実施することができる。サイズ選択されたナノクリスタル集団は、平均直径から15％rms以下の偏差、好ましくは10％rms以下の偏差、より好ましくは5％rms以下の偏差を有することができる。
【００４２】
ナノクリスタルの外部表面は、成長プロセス中に使用された配位剤から誘導される化合物の層を含むことができる。過剰な競合配位基へ繰り返し曝露することによって表面を改質し、被覆層を形成することができる。例えば、成長時に使用した配位剤でキャップされたナノクリスタルの分散は、ピリジンなどの配位性有機化合物を用いて処理され、ピリジン、メタノール、及び芳香族中では容易に分散するが、脂肪族溶媒中ではもはや分散しない結晶を生成することができる。そのような表面交換プロセスは、例えばホスフィン、チオール、アミン、及びホスフェートを含めた、ナノクリスタルの外部表面と配位、又は結合できる任意の化合物を用いて実施することができる。ナノクリスタルは、該表面に対して親和性を示し且つ懸濁液又は分散媒体に対して親和性を有する部位を末端とする短鎖ポリマーに曝露されることができる。そのような親和性は、懸濁液の安定性を改善し、ナノクリスタルの凝集を妨げる。ナノクリスタル配位化合物は、例えば、米国特許第6,251,303号に記載されている。この文献は全体においてを引用により取り込まれている。
【００４３】
より具体的には、配位子は下記式を有することができる：
【化１】
2010540939.tif 000003
式中:kは、2、3、又は5であり、nは、k−nが０未満にならないような1、2、3、4、又は5でありＸは、O、S、S＝O、SO2、Se、Se＝O、N、N＝O、P、P＝O、As、又はAs＝OでありY及びLはそれぞれ、独立して、アリール、ヘテロアリール、或いは少なくとも1つの二重結合、少なくとも1つの三重結合、又は少なくとも1つの二重結合及び一つの三重結合を任意に含む直鎖又は分枝C2-12炭化水素鎖である。炭化水素鎖は、一種以上のC1-4アルキル、C2-4アルケニル、C2-4アルキニル、C1-4アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、C3-5シクロアルキル、3〜5員環ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、C1-4アルキルカルボニルオキシ、C1-4アルキルオキシカルボニル、C1-4アルキルカルボニル、又はホルミルによって任意に置換することができる。また、炭化水素鎖は、-O-、-S-、-N(Ra)-、-N(Ra)-C(O)-O-、-O-C(O)-N(Ra)-、-N(Ra)-C(O)-N(Rb)-、-O-C(O)-O-、-P(Ra)-、又は-P(O)(Ra)-によって任意に中断することができる。Ra及びRbはそれぞれ、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、又はハロアルキルである。
アリール基は、置換又は非置換の環状芳香族基である。例としては、フェニル、ベンジル、ナフチル、トリル、アントラシル、ニトロフェニル、又はハロフェニルがある。ヘテロアリール基は、環の中に1つ以上のヘテロ原子を有するアリール基であり、例えばフリル、ピリジル、ピロリル、フェナントリルである。
【００４４】
他の配位子は、米国特許第6,319,426；6,306,610；6,921,496；7,160,613；7,190,870；及び7,229,690号に記載されている。その各々は全体において引用により取り込まれている。
適切な配位子を、商業的に購入することができ、又は例えば、全体において引用により取り込まれているJ. March「有機化学特論(Advanced Organic Chemistry)」に記載されている通常の合成有機技法によって調製することができる。
【００４５】
透過型電子顕微鏡（TEM）は、ナノクリスタル集団のサイズ、形状、及び分布に関する情報を提供することができる。粉末Ｘ線回折（XRD）パターンは、ナノクリスタルの結晶構造の種類及び質に関する最も完全な情報を提供することができる。また、粒子径はＸ線コヒーレンス長を介してピーク幅に反比例するので、サイズの見積りも可能である。例えば、ナノクリスタルの直径は、透過型電子顕微鏡によって直接測定することができ、又は、例えばシェラーの式を使用してＸ線回折データから評価することができる。また、UV/Vis吸収スペクトルから見積もることも可能である。
【実施例】
【００４６】
λ=514nm線のAr-イオンレーザーを、〜20 W/cm2の典型的強度を有する励起源として使用した。イメージは、100x油液浸系対物レンズ(Nikon, Plan Apo)及び増感CCDカメラ(Pentamax, Princeton Instruments)を用いて撮影した。当該方法は、オフフォーカスモードの標準落射蛍光ビデオイメージング(図1に示すように)を使用した。100msの時間分解能で粒子の追跡を可能にする。
【００４７】
最初のウシ大動脈内皮細胞(BAEC-77、継代10-15)を、10%ウシ胎児血清、1%L-グルタミン及び1%ペニシリン-ストレプトマイシンで補充したDMEMで培養した。播種前に、細胞培養フラスコ及びガラススライドを、室温で、0.2%ゼラチンを用いて被覆した。マイクロ流体チャンバー(Ibidi提供)を、微小環境の細胞接着を促進するために、フィブロネクチンで被覆した。細胞培養を、37℃を維持した加湿インキュベーター中、5%CO2及び95%空気で保持した。
【００４８】
3組のCdSe/ZnS(コア/シェル)ナノクリスタルを、本実験において、NC655、NC605及びNC565において、それぞれ、λ=655nm、605nm及び565nm周囲を中心とする発光波長で使用した。ストレプトアビジンで被覆したNC655ナノクリスタルは、Quantum Dot社提供のものであり；IgGで被覆したNC605ナノクリスタルは、Invitrogen提供のものであり；PEG-OHで被覆したNC565ナノクリスタルは、研究室で合成した。
【００４９】
細胞単層が集密に達した後、3層のナノクリスタルを図7Aに示すように細胞に接着した。細胞を、37℃で15分間、5nM NC565とともに培地中でインキュベートし、該ナノクリスタルがエンドサイトーシスを介して細胞内ベシクルに組み込まれるようにした。溶液中の過剰なナノクリスタルを除去するために、DPBS中で5回素早くすすいだ後、細胞を、氷上で10分間冷却し、2%ヤギ血清及び2%BSAで20分間ブロックして、非特異的なバックグラウンド染色を減らした。グリコカリックス層のヘパラン硫酸グリコサミノグリカン(HSGAG)を標識化するために、細胞を、5μg/mLヘパラン硫酸ビオチン抗体(US Biological)で20分間インキュベートし、DPBSで3回洗浄した。続いて、細胞を15分間、2nM NC655とともにインキュベートし、その後、DPBSで洗浄した。グリコカリックス染色の完了後に、細胞を3回洗浄し、15分間、30μg/ml PECAM-1 IgG抗体(AbD Serotec)とともにインキュベートした。最後に、QD605を最終濃度2 nMで加え、血小板/内皮細胞接着分子1(PECAM-1、CD31と同じ)を染色した。細胞標識化手順は、NC565を除いて、インキュベーション手順の間、ナノクリスタルのエンドサイトーシスを制限するために氷上で行った。調製した細胞サンプルを、ナノ位置決めステージ(Physik Instrumente, P-527)上に移し、直ちに室温でイメージ化した。
【００５０】
図7Aは、内皮細胞のナノクリスタル標識化の概略図である。細胞内ベシクル(NC565, 緑色)、膜PECAM-1(NC605, オレンジ色)、及びグリコカリックス(NC655, 赤色)を、上記のように標識化した。NC565を成長培地に加え、エンドサイトーシスを介して細胞に取り込んだ；NC605-IgG粒子は、IgG相互作用を解して抗体結合PECAM分子に接着した；NC655-ストレプトアビジンは、ビオチン被覆ヘパリン硫酸グリコサミノグリカン抗体を認識した。
【００５１】
最初に個々の細胞を、NC565シグナルで識別し、その後、PECAM結合ナノクリスタルのイメージ及び同じ細胞上のグリコカリックス結合ナノクリスタルを、発光スペクトルフィルターを切り替えることにより記録することができた。細胞を適切に選択して、該ステージをx及びy位置に固定した。その後、ナノ位置決めを、対象物の焦点面が細胞体のちょうど外側で培地に収まるように、基準位置に配置した。カメラは、5Hzのフレーム速度でイメージを捕えるようにセットした。焦点面が細胞の方及び細胞を通して移動するように、該ステージを移動させ、それによってナノクリスタル発光の環模様が変化し、より深いz-位置のナノクリスタルが現れ始める。図7Bを参照されたい。図8は、細胞体を通して走査された対象物として、1つの細胞において検出された約10のNC565含有ベシクルの例を挙げる。NC565シグナルの収集を終了した後、発光フィルタを切替え、当該手順を繰り返し、NC605及びNC655データで収集した。
【００５２】
同じz-位置で記録した3つの異なる波長でのイメージを比較したとき（図9）、環模様は、ベシクル(NC565)がスキャン平面から最も離れ、一方、グリコカリックス(NC655)がスキャン平面に最も近いことを示した。当該データからの3つの層の相対的位置は、細胞構造により確認された。すなわち、グリコカリックスが最も外側の層であり、ベシクルが細胞の内側に位置する。
【００５３】
データ処理後、各ナノクリスタルの正確な位置を決定することができる。x,y位置は、中心スポットのガウスフィッティングにより算出し、z位置は、環半径を較正曲線に相関させて算出する。この方法により、単一細胞と結合した、7つのベシクル結合ナノクリスタル、8つのPECAM結合ナノクリスタル、及び13のグリコカリックス結合ナノクリスタルの正確な位置を決定した(図10A〜10B)。ベシクル結合ナノクリスタルとグリコカリックス結合ナノクリスタルとの間の最大z-距離は、公知の細胞体の高さと同じオーダーの、およそ3.5μmであった。PECAM結合ナノクリスタル(黄色マーカー)近くのz = 4μmでの参照平面(透明な青)を挿入することにより、グリコカリックス結合ナノクリスタル(赤色マーカー)を膜の細胞外面上に存在するように区別した。
3D空間において、グリコカリックス層をマップして、グリコカリックス結合ナノクリスタルと膜との間の相対距離を比較することによって層の厚みを推定することができる。2つの可能な方法を後述する。
【００５４】
グリコカリックス厚さは、グリコカリックス-PECAMナノクリスタル対のz-差から、当該対の2つのナノクリスタル間の膜粗さがごくわずかであると仮定して、直接に得ることが可能である。マップされた全てのナノクリスタルの厳重な検査(図10A-B)は、基準を満たした1つのグリコカリックス-PECAM対を示した。図10B右パネルにおいて強調されるように、この対において、PECAM結合ナノクリスタルはx = 5.17μm、y = 5.54μm及びz = 4.16μmに位置し；一方、グリコカリックス結合ナノクリスタルはx = 5.71μm、y = 4.19μm及びz = 4.45μmに位置した。PECAM結合ナノクリスタルがx,y平面においてグリコカリックス結合ナノクリスタルに十分に近いと仮定して、2つの間のz-差は、Δz = 0.29μmであり、この位置でのグリコカリックス厚の推定値を提供した。
【００５５】
第2の方法は、図11に示すように、報告されたAFM測定値と一致する細胞体の楕円形状を仮定すること、及び8つのPECAM結合ナノクリスタルの位置を楕円表面にフィッティングさせることによって細胞膜の連続表面をシミュレーションすることを含む。楕円体のパラメータは、細胞形状の物理的な範囲に含まれる。従って、膜より上の個々のグリコカリックス結合ナノクリスタルのz-距離は、それをナノクリスタルの右下の膜のz-位置と(すなわち、同じx,y位で)比較することにより算出した。Δzの平均は、0.35±0.17μmの細胞上の平均グリコカリックス厚の推定値を与え、方法1の結果の大きさと同じオーダーであった。
【００５６】
関連した応用で、グリコカリックスの剛性率を決定した。図12において表されるシステムを用いることにより、BAECを周期的なせん断流動(0.25Hz)に曝した。グリコカリックスは、上記の通りにナノクリスタルで標識化した。図13Aは、図12のシステムを用いて記録したイメージを示す。黄色矢印により強調されたナノクリスタルの時間依存的x-及びy-位置は、右でグラフに示した。図13Bは、重ねた印加流動の時間形跡(オレンジ線)とともに、y-位置データの詳細を示す。ナノクリスタルの変位は、印加した流動に密接に一致する。平均変位は、108±77nmであった。印加されたせん断応力は、流動及びチャンバー寸法に基づいて、15ダイン/cm2であると算出された。グリコカリックスの剛性率の予備推定値は、3.7Pa〜7.5Paの範囲であった。比較のために、細胞自体は、使用した方法に応じて、50Pa〜600Paオーダーの剛性率を有する。
【００５７】
図14は、5つの異なるナノクリスタルのせん断応力とナノクリスタル変位との関係を図示するデータを示す。この情報から、グリコカリックスの剛性率Gは、6.7±3.3Paであると決定した。
他の実施態様は、添付の請求項の範囲内である。
【図１】
2010540939.tif 000004
【図２】
2010540939.tif 000005
【図３】
2010540939.tif 000006
【図４】
2010540939.tif 000007
【図５】
2010540939.tif 000008
【図６】
2010540939.tif 000009
【図６Ｃ】
2010540939.tif 000010
【図７Ａ】
2010540939.tif 000011
【図７Ｂ】
2010540939.tif 000012
【図８】
2010540939.tif 000013
【図９】
2010540939.tif 000014
【図１０Ａ】
2010540939.tif 000015
【図１０Ｂ】
2010540939.tif 000016
【図１１】
2010540939.tif 000017
【図１２】
2010540939.tif 000018
【図１３Ａ】
2010540939.tif 000019
【図１３Ｂ】
2010540939.tif 000020
【図１４】
2010540939.tif 000021
【国際調査報告】
2010540939.tif 000022