(57)【要約】  本発明は、Ｃ２８とＣ２９との間において存在する、追加された二重結合を有し、ナイスタチンに対して、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上においてさらに改変されたナイスタチン誘導体である化合物を提供する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ２８とＣ２９との間において存在する、追加された二重結合を有し、ナイスタチンに対して、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上においてさらに改変されたナイスタチン誘導体あるいはその薬理学的に許容できる塩である化合物
（ただし、当該化合物は、化合物（ＩＩ）
【化１】
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、マイコヘプチン化合物（以下に示す。）
【化２】
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またはカンジジン化合物（以下に示す。）
【化３】
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ではない。）。
【請求項２】
Ｃ５位において改変された、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｃ１６において改変された、先行請求項の何れか一項に記載の化合物。
【請求項４】
Ｃ９において改変された、先行請求項の何れか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｃ１０において改変された、先行請求項の何れか一項に記載の化合物。
【請求項６】
マイコサミンのアミノ基において改変された、先行請求項の何れか一項に記載の化合物。
【請求項７】
ナイスタチンに対して、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１６またはマイコサミンのアミノ基の、少なくとも２つにおいて改変された、先行請求項の何れか一項に記載の化合物。
【請求項８】
式Ｉ´の化合物、
【化４】
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好ましくは、式（Ｉ）の化合物。
【化５】
2010531865.tif 000062
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示すか、ともにカルボニル基を形成している。；
Ｒ１'およびＲ２'は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示すか、ともにカルボニル基を形成している。：
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示すか、ともにカルボニル基を形成している。；
Ｒ３'およびＲ４'は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示すか、ともにカルボニル基を形成している。；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示す。；
Ｒ７は、水素原子、ＣＯＯＨ、アルキル基、アルコキシ基、カルボン酸エステル基またはアミド基を示す。；
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素原子、アルキルアミノ基、糖基、またはアシル基を示す。）
、あるいはそれらの薬理学的に許容できる塩
（ただし、前記化合物は、化合物（ＩＩ）
【化６】
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もしくはマイコヘプチン化合物（以下に示す。）
【化７】
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またはカンジジン化合物（以下に示す。）
【化８】
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ではない。）。
【請求項９】
Ｒ１は、水素原子、水酸基またはアルコキシ基（たとえば、−ＯＣ１−６）を示し、Ｒ２は水素原子を示し、あるいはＲ１およびＲ２は、ともにカルボニル基を形成している、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３は、水素原子、水酸基またはアルコキシ基（たとえば、−ＯＣ１−６）を示し、Ｒ４は水素原子であり、あるいはＲ３およびＲ４は、ともにカルボニル基を形成している、請求項７〜９の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ５は、水素原子、水酸基またはアルコキシ基（たとえば、−ＯＣ１−６）を示し、Ｒ６は水素原子である、請求項７〜１０の何れか一項に記載の化合物。  
【請求項１２】
Ｒ７はＣＯＯＨ、アルキル基、カルボン酸エステル基またはアミド基である、請求項７〜１１の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ８は、水素原子、アルキルアミノ基、糖基またはアシル基を示し、Ｒ９は、Ｒ８と同一であるか、あるいは水素原子であり、たとえば、Ｒ９は、水素原子である、請求項７〜１２の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ７はアルキル基（たとえばメチル）またはアミド基、たとえば式ＩＩＩのアミドである、請求項７〜１３の何れか一項に記載の化合物。
【化９】
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（式中、Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、または、水酸基、アシルオキシ基またはアミノ基で置換されてもよく、酸素原子または窒素原子によって割り込まれていてもよい、Ｃ１−１０の分岐または非分岐型のＣ１−１０のアルキル基を示し、あるいはｓＲ１０およびＲ１１は、ともに水酸基、アシルオキシ基またはアミノ基で置換されていてもよく、酸素原子または窒素原子によって割り込まれていてもよい、Ｃ１−８の環状アルキル基を形成している。）
【請求項１５】
Ｒ７は、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２またはＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、ｎは２または３である。）である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ８は、式−（ＣＨ２）ｘＮＨ２または−（ＣＨ２）ｘＮ（Ｃ１−６アルキル）２（式中、ｘは２〜６である。）のアルキルアミノ基であるか、グルコース、ガラクトース、グルコピラノース、マンノピラノース、ガラクトピラノース、フルクトピラノースおよびタガトピラノースから選択される単糖、またはラクトース、メリビオース、スクロース、マルトースおよびセロビオースから選択されるオリゴ糖である、請求項７〜１５の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１およびＲ２は、ともにカルボニル基を形成し、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は、水素原子であり、Ｒ５は、水酸基である、請求項８〜１６何れかに記載の化合物。  
【請求項１８】
Ｒ７はＣ１−６のアルキル基（たとえばメチル）であり、Ｒ８およびＲ９  の少なくとも１つ（たとえば、Ｒ８およびＲ９の両方）は水素原子である、請求項８〜１７何れかに記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ７は、アミノ基、好ましくは以下に規定される式ＩＩＩのアミノ基であり、Ｒ８およびＲ９の少なくとも１つ（たとえば、Ｒ８およびＲ９の両方）は、水素原子である、請求項８〜１８何れかに記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ８は、糖基またはアルキルアミノ基であり、Ｒ９  は水素原子である、請求項８〜１９に記載の化合物。
【請求項２１】
以下の骨格を含み、１６位のＣＯＯＨは、Ｒ７について規定されるような、アミドまたはカルボキシエステル基であってもよい、請求項８〜２０何れかに記載の化合物。
【化１０−１】
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【化１０−２】
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【化１０−３】
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【化１０−４】
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【化１０−５】
2010531865.tif 000071
【化１０−６】
2010531865.tif 000072
【化１０−７】
2010531865.tif 000073
【化１０−８】
2010531865.tif 000074
【化１０−９】
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【請求項２２】
図１において示される化合物から選択される、請求項８に記載の化合物。
【請求項２３】
化合物番号１、２、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２、２８、２９、４１、４８および５１から選択される、請求項８に記載の化合物。
【請求項２４】
化合物番号１、２、９、１１、１２、１３、１４、２１および２２から選択される、請求項８に記載の化合物。
【請求項２５】
グルタミン酸塩の形態である、先行請求項の何れかに記載の化合物。
【請求項２６】
（ｉ）ナイスタチン合成を担うポリケチドシンターゼ系をコードする遺伝子群を改変して、Ｃ２８とＣ２９との間において、二重結合を有するナイスタチン誘導体を産生することと；  
（ｉｉ）さらに、前記遺伝子群を改変して、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上において、改変されたナイスタチン誘導体を産生するか、または
（ｉｉｉ）化学反応によって、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上において、得られた誘導体を改変することと、
を含む、先行請求項の何れかに記載の化合物を製造する方法。
【請求項２７】
請求項１〜２４の何れか一項に記載の化合物と、担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物。
【請求項２８】
医薬品である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
治療において使用するための、請求項１〜２５の何れか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
真菌感染の処置用の組成物の製造のための、請求項１〜２５の何れか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３１】
請求項１〜２５の何れか一項に規定された化合物を動物に投与することを含む、動物における真菌感染の処置の方法。
【請求項３２】
殺菌剤または防腐剤としての、請求項１〜２５の何れか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のナイスタチンの誘導体およびその調製方法に関する。特に、本発明は、医薬品における、特に抗真菌剤としてのナイスタチン誘導体の使用に関係する。
【背景技術】
【０００２】
ナイスタチンは、グラム陽性菌Streptomyces nourseiの特定系統によって産生される、抗真菌物質の天然複合物である。ナイスタチンの主要構成物は、ナイスタチンA1であり、下記に示される構造を有するポリエンマクロライドである。
【０００３】
【化１】
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【０００４】
ナイスタチンは、多数の、皮膚および粘膜におけるカンジダ症の処置において使用するための専売薬（たとえば、Infestat、Nyspes、Nystamont、Nystan、MycostatinおよびNilstat）中に存在している活性剤 である。ナイスタチンは、胃腸管から、または皮膚や膜を介して、十分には吸収されないものの、通常、経口的または局所的に投与される。これは、非経口で投与された場合、ナイスタチンは毒性を有するためのである。
【０００５】
ナイスタチンは、ポリエンマクロライド系抗生物質のファミリーの一部である。このファミリーの他の物の例としては、ピマリシン、リモシジン、カンジシジン、オーレオファシン、レボリンおよびアンホテリシンが挙げられる。アンホテリシンは、一般的に最も効果的であるものとされているので、抗真菌剤として、最も広く使用されているものである。これは、幅広い抗真菌活性のスペクトラムを有するが、ナイスタチンと同様に、使用可能な投与経路と服用量を制限するといった、毒性についての大きな欠点がある。
【０００６】
そのため、マクロライドポリケチド系抗生物質における研究努力は、アンホテリシン、特に、毒性が低い新規アンホテリシン類似体の同定に傾注されている。２つの別個の手法が、一般的に採用されている。第一の手法においては、研究者は化学的改変を用いて、アンホテリシンの毒性を低減させ、および／または抗真菌活性を向上させようとする。しかしながら、アンホテリシンの全合成は採算性がないので、出発物質は、通常、Streptomyces nodosus培養から得られるアンホテリシンＢである。結果として、化学的改変は、アンホテリシンのＢ環に存在する官能基の誘導体化に集中している。
【０００７】
ごく近年では、研究者は、アンホテリシンの生合成経路を対象とした、異なる手法を採用している。この生合成経路は、異なる酵素による合成工程を含むものである。アンホテリシンの炭素鎖は、モジュラー（１型）ポリケチドシンターゼによって、酢酸単位およびプロピオン酸単位から合成され、次いで、得られたマクロライドは、酸化、グリコシル化およびヒドロキシル化を引き起こす、別の酵素によって改変される。この生合成に関与する酵素をコードする遺伝子は、同定されているので、研究者は、たとえば、遺伝子の削除、付加または修飾や、それによる上記合成に関与する酵素の削除、追加または改変によって、天然の生合成経路に変化を導入することができる。最終的な結果として、アンホテリシン分子が改変されることになる。
【０００８】
そのため、非常に多くの、改変されたアンホテリシン分子、特に化学的に改変された誘導体が、製造され、評価されている。しかしながら、このような試行にも関わらず、薬理学的特性、すなわち高い抗菌活性、低い毒性および水溶性の良好なバランスを有するといった、有望な薬剤候補は、ほとんど同定されていない。そのため、依然として、感染症および、特に発生頻度が増加している急性全身性真菌感染を処置するための新規抗生物質が必要とされている。この要求は、既存の抗真菌剤に対する耐性が向上するに伴って、益々緊急を要するものになっている。
【０００９】
おそらく、アンホテリシンよりも低い活性を有し、同様の毒性および水への不溶性を避けられないがために、ナイスタチンの改変に関する研究は、アンホテリシンに比べて、ほとんど実施されていなかった。結果として、このような研究のためには、ナイスタチンは魅力的な出発物質としてはみなされていなかった。
【００１０】
近年の研究（Organic Letters, 2006, 8 (9), 1807-1809）において、２つのナイスタチン誘導体が、マイコサミンのアミノ基における還元的アルキル化によって調製された。得られた誘導体は、ナイスタチンよりも高い抗真菌活性を有することが見出されたものの、同様に調製されたアンホテリシンＢ誘導体よりも低い活性であった。そのために、アンホテリシンＢの改変は、より有望なものであるとみなされ、評価されたこれらの誘導体の毒性は、親分子（parent molecule）と比べて、非常に低いことが示された。
【００１１】
WO01/59126において、ナイスタチン合成を担うポリケチドシンターゼおよびその他の酵素をコードする遺伝子群のクローニングおよび配列決定が開示されている。WO01/59126は、該遺伝子群に理論上実施でき、ナイスタチン構造を改変するような、多くの可能性がある操作も示唆している。この操作には、ナイスタチンのポリエン断片に由来する二重結合の削除または付加に関する改変、C16のカルボキシル基の削除または転移に関する改変、水酸基のさらなる付加に関する改変、およびマクロラクトン環の切除に関する改変が挙げられる。
【００１２】
WO01/59126において提案された１つ以上の改変を実施することにより、莫大な数（およそ1017）の異なる改変されたナイスタチン構造が調製されうることは、上述のことからただちに明らかであろう。そして、さらなる化学的改変とともに遺伝子操作によって製造された化合物のうち何れかを、さらに改変することの可能性は、理論上、100京種類の化合物が可能であることを意味する。
しかしながら、ナイスタチンについては、ほとんどの研究が実施されていないので、これらの莫大な種類の化合物の何れが、ナイスタチンおよび/またはアンホテリシン（つまり、現在使用されている活性剤）に比べて、低い毒性を示すかを示唆するデータは、利用できるものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、今回、驚くべきことに、特定のナイスタチンの誘導体は、アンホテリシンよりも顕著に低い毒性を有し、さらに有利なことに、同様の誘導体も有用な抗真菌活性を示すことが見出された。これまでに調製された改変アンホテリシン化合物の大多数のものとは違って、今回同定されたナイスタチン誘導体は、「第２世代」の誘導体である。換言すれば、これらの化合物は、ナイスタチンの誘導体の誘導体であり、ナイスタチンA1の構造に対して、２つ以上の改変を含むものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第一の側面から見ると、本発明は、Ｃ２８とＣ２９との間において存在する、追加された二重結合を有し、ナイスタチンに対して、Ｃ５位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上において、さらに改変されたナイスタチン誘導体、あるいはその薬理学的に許容できる塩である化合物を提供する。
【００１５】
別の側面から見ると、本発明は、Ｃ２８とＣ２９との間において存在する、追加された二重結合を有し、ナイスタチンに対して、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上において、さらに改変されたナイスタチン誘導体、あるいはその薬理学的に許容できる塩である化合物を提供する。
【００１６】
好ましい本発明に係る化合物は、式Ｉの化合物
【００１７】
【化２】
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【００１８】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示すか、ともにカルボニル基を形成している（たとえば、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基を示すか、ともにカルボニル基を形成している。）。；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示すか、ともにカルボニル基を形成している（たとえば、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子または水酸基示すか、ともにカルボニル基を形成している）。；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基（たとえば、水素原子または水酸基）を示す。；
Ｒ７は、水素原子、ＣＯＯＨ、アルキル基、アルコキシ基、カルボン酸エステル基またはアミド基（たとえば、ＣＯＯＨ、アルキル基、カルボン酸エステル基またはアミド基）を示す。；
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素原子、アルキルアミノ基、糖基またはアシル基を示す。；）
、あるいはそれらの薬理学的に許容できる塩である。
（ただし、前記化合物は、化合物（ＩＩ）
【００１９】
【化３】
2010531865.tif 000005
【００２０】
、または化合物マイコヘプチン（以下に示す。）
【００２１】
【化４】
2010531865.tif 000006
【００２２】
ではない。）
さらに好ましい本発明に係る化合物は、上記の条件に従う化合物であって、式（Ｉ）の化合物であるが、式中、炭素７および／または炭素１１におけるＯＨ基は、たとえば、オキソ基に変換されている。該化合物は、式（Ｉ´）、すなわち
【００２３】
【化５】
2010531865.tif 000007
【００２４】
である。
【００２５】
式中、すべての置換基は、式（Ｉ）にて規定された通りであり、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'は、それぞれ独立して、各々Ｒ1〜Ｒ4にて規定された通りであり、さらに、ただし、式（Ｉ´）の化合物は、カンジジン（以下に示す。）ではない。）
【００２６】
【化６】
2010531865.tif 000008
【００２７】
更なる側面からみると、本発明は、
（ｉ）ナイスタチン合成を担うポリケチドシンターゼ系をコードする遺伝子群を改変して、Ｃ２８とＣ２９との間において二重結合を有するナイスタチン誘導体を産生ことと、
（ｉｉ）さらに、前記遺伝子群を改変して、Ｃ１６位において、Ｃ５位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上において、改変されたナイスタチン誘導体を産生するか、または
（ｉｉｉ）化学反応によって、Ｃ５位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上において、得られた誘導体を改変することと、を含む、上述するような化合物を製造する方法を提供する。
【００２８】
さらなる態様から見ると、本発明は、
（ｉ）ナイスタチン合成を担うポリケチドシンターゼ系をコードする遺伝子群を改変して、Ｃ２８とＣ２９との間において二重結合を有するナイスタチン誘導体を産生することと、
（ｉｉ）さらに、前記遺伝子群を改変して、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上において、改変されたナイスタチン誘導体を産生するか、または
（ｉｉｉ）化学反応によって、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上において、得られた誘導体を改変することと、を含む、上述するような化合物を製造する方法を提供する。
【００２９】
また、さらなる側面から見ると、本発明は、上述するような化合物と、担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。好ましい該組成物は、医薬組成物である。
【００３０】
また、さらなる側面から見ると、本発明は、治療において使用するための、上述するような化合物を提供する。
【００３１】
真菌感染の処置用の組成物の製造のための、上述するような化合物の使用は、本発明における更なる側面を形成するものである。
【００３２】
上記に規定されるような化合物を動物に投与することを含む、動物（たとえばヒト）における真菌感染の処置方法は、本発明におけるまた更なる態様を形成するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
ここで、後述の、非限定的な実施例および図面に照らし合わせて、本発明を説明する。
【図１】図１は、本発明に係る多くの化合物の構造を示す。
【図２】図２は、Ｓ４４ＨＰ、および化合物１を産生するＥＲ５およびＮｙｓＮ が不活性化された変異体由来のＤＭＳＯ抽出物のＵＶアイソプロットを示す。
【図３】図３は、ＥＲ５およびＮｙｓＮが不活性化された変異体由来のＤＭＳＯ抽出物に由来する主要なポリエンピークのＴＯＦスペクトラムを示す。ｍ/ｚ＝980および1034でのピークは内部標準である。
【図４】図４は、Ｓ４４ＨＰを産生するGG5073SP系統(標準系統)由来のＤＭＳＯ抽出物、および化合物２を産生するＥＲ５およびＫＲ１７が不活性化された変異体由来のＤＭＳＯ抽出物のＵＶアイソプロットを示す。
【図５】図５は、ＥＲ５およびＫＲ１７が不活性化された変異体由来のＤＭＳＯ抽出物に由来する主要なポリエンピークのＴＯＦスペクトラムを示す。
【図６】図６は、Ｓ４４ＨＰを産生するGG5073SP系統(標準系統)由来のＤＭＳＯ抽出物、および化合物３を産生するＥＲ５、ＫＲ１７およびＮｙｓＮが不活性化された変異体由来のＤＭＳＯ抽出物のＵＶアイソプロットを示す。
【図７】図７は、ＥＲ５、ＫＲ１７およびＮｙｓＮが不活性化された変異体由来のＤＭＳＯ抽出物に由来する主要なポリエンピークのＴＯＦスペクトラムを示す。ｍ/ｚ＝980および1034でのピークは内部標準である。
【図８】図８は、Ｓ４４ＨＰを産生するGG5073SP系統(標準系統)由来のＤＭＳＯ抽出物、および化合物４を産生するＥＲ５およびＫＲ１５が不活性化された変異体由来のＤＭＳＯ抽出物のＵＶアイソプロットを示す。
【図９】図９は、化合物１および１１におけるin vivoでの抗真菌活性評価の結果を示す。
【図１０−１６】図１０〜１６は、本発明における種々の化合物の調製についてのスキームである。
【図１７】図１７は、播種性カンジダ症の好中球減少マウスモデルにおける、本発明に係る新規化合物のin vivoでの評価の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書において使用されるように、「ナイスタチン誘導体」との用語は、規定される特定の改変以外のナイスタチンＡ１と同一の構造を有する化合物を包含することが意図されている。このように、好ましい誘導体は、Ｃ２８〜Ｃ２９における二重結合を除いて、ナイスタチンと同一のマクロラクトン環を有し、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上における変異を除いて、ナイスタチンと同一の機能性官能基 を有する。好ましい該誘導体は、以下に示されるような、グリコシル化されたマクロラクトン環骨格を含む。：
【００３５】
【化７】
2010531865.tif 000009
【００３６】
これらの式において、Ｃ５位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１６位において、およびマイコサミンのＮ上において、改変があり得ることが理解されよう。そのため、示されているものは、存在しなければならない原子のみである。これらの形状は、存在し得る化学的な骨格を示す。
【００３７】
本明細書において使用されるように、「ポリケチドシンターゼ系」との用語は、ポリケチド合成および改変を担う酵素の集合を指す。これには、たとえばポリケチドシンターゼ、モノオキシゲナーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびアミノトランスフェラーゼが挙げられる。
【００３８】
「アルキル基」との用語は、環状型または、直鎖型もしくは分岐型の非環状型の炭化水素基を示すために、本明細書において使用される。このような官能基 は、２０までの炭素原子を含んでいてもよいが、１〜１２の炭素原子、より好ましくは１〜６の炭素原子を含む官能基が好ましい。
【００３９】
アルキル基は、非置換型であってもよいし、置換型であってもよい。置換型アルキル基において存在する置換基としては、たとえば水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基およびアミノ基が挙げられる。
【００４０】
アルキル基は、１以上の官能基で、たとえば、アリル基（Ｐｈのような）、−Ｏ−、−ＮＲ１２−または−Ｓ−で、割り込まれていてもよく、式中、Ｒ１２は、水素原子またはＣ１−６のアルキル基を示す。
【００４１】
「アルコキシ」との用語は、官能基−ＯＲ１３を示すために、本明細書において使用され、式中、Ｒ１３は、上記にて規定されるようなアルキル基である。好ましいアルコキシ基においては、Ｒ１３が１〜６の炭素原子を、より好ましくは１〜４の炭素原子を含む。好ましいアルコキシ基は、−ＯＣ１−６であり、たとえば−ＯＣＨ３である。
【００４２】
「アシルオキシ」との用語は、官能基−ＯＣＯＲ１４を示すために、本明細書において使用され、式中、Ｒ１４は、上記にて規定されるようなアルキル基である。好ましいアシルオキシ基においては、Ｒ１４は、１〜６の炭素原子であり、より好ましくは、１〜４の炭素原子である。好ましいアシルオキシ基は、−ＯＣＯＣ１−６であり、たとえば−ＯＣＯＣＨ３である。
【００４３】
「カルボン酸エステル基」との用語は、本明細書において、−ＣＯＯＲ１５を示すために使用され、式中、Ｒ１５は、上記にて規定されるようなアルキル基である。好ましいカルボン酸エステル基においては、Ｒ１５は１〜６の炭素原子であり、より好ましくは１〜４の炭素原子である。好ましいカルボン酸エステル基は−ＣＯＯＣ１−６であり、たとえば−ＣＯＯＣＨ３である。
【００４４】
「アミド基」との用語は、式ＩＩＩ：
【００４５】
【化８】
2010531865.tif 000010
【００４６】
の基を示すために、本明細書において使用され、式中、Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよい下記に規定されるようなアルキル基を示すか、ともに上記にて規定されるようなアリル環を形成する。
【００４７】
「アルキルアミノ基」との用語は、官能基−（ＣＨ２）ｘＮＲ１６Ｒ１７を示すために本明細書において使用され、式中、ｘは１〜１０、好ましくは２〜６（たとえば３）であり、Ｒ１６およびＲ１７は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−６のアルキル基である。
【００４８】
本明細書において使用される「糖」との用語は、糖類、特にオリゴ糖および単糖を示すために本明細書において使用される。本発明に係る化合物おける、該化合物中に存在する糖は、任意の数の糖単位を含んでもよいが、好ましい該化合物は、１〜１０の糖単位を、たとえば１または２の糖単位を含む。
【００４９】
「アシル」との用語は官能基−ＣＯＲ１８を示すために本明細書において使用され、式中、Ｒ１８は、上記にて規定されるようなアルキル基である。好ましいアシル基においては、Ｒ１８は置換されたアルキル基であり、たとえばアミノ置換アルキル基である。特に好ましいアシル基はアミノアシル基である。
【００５０】
上述されるように、本発明に係る化合物は、Ｃ２８とＣ２９との間において存在する、追加された二重結合を有し、ナイスタチンに対して、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の１つ以上において、さらに改変されたナイスタチン誘導体である。
【００５１】
好ましい本発明に係る化合物は、ナイスタチンに対して、Ｃ５において改変されたものである。ナイスタチンにおいては、Ｃ５は、水酸基および水素原子によって置換されており、Ｒ立体中心である。好ましい本発明に係る上記化合物においては、Ｃ５は水酸基および水素原子以外の官能基で置換され、および／またはＣ５はＳ立体中心である。好ましい上記化合物においては、Ｃ５において、異なる官能基が存在し、たとえば、Ｃ５が、２つの水酸基または２つの水素原子によって置換されていてもよい。特に、好ましい上記化合物においては、Ｃ５は、カルボニル基によって置換されている。
【００５２】
別の好ましい本発明に係る化合物は、ナイスタチンに対して、Ｃ１６において改変されたものである。ナイスタチンにおいて、Ｃ１６は、カルボン酸および水素原子によって置換されており、Ｒ立体中心である。そのため、好ましい本発明に係る化合物においては、Ｃ１６はカルボン酸基および水素原子以外の官能基によって置換されており、および／またはＣ１６はＳ立体中心である。好ましい上記化合物においては、異なる官能基が、たとえばアルキル基（たとえばメチル）および水素原子が、またはアミド基および水素原子が存在している。特に好ましい上記化合物においては、Ｃ１６は、メチル基および水素原子によって置換されている。好ましい上記化合物において、Ｃ１６はＲ立体中心である。
【００５３】
さらに好ましい本発明に係る化合物は、ナイスタチンに対して、Ｃ９において改変されたものである。ナイスタチンにおいては、Ｃ９は、２つの水素原子によって置換されている。そのため、本発明に係る化合物においては、Ｃ９は、２つの水素原子以外によって置換されている。好ましい上記化合物においては、異なる官能基が、たとえば、水酸基と、水素原子またはカルボニル基とが存在している。
【００５４】
さらに好ましい本発明に係る化合物は、ナイスタチンに対して、Ｃ７において改変され得る。ナイスタチンにおいては、Ｃ７は水酸基によって置換されている。そのため、いくつかの本発明に係る化合物は、Ｃ７は水酸基以外の官能基によって置換されている。好ましい上記化合物においては、カルボニル基が存在している。ここで、カルボニルが存在する場合、上記にて示された化合物カンジジンを除くために、ナイスタチンに対して、存在しているＣ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１６またはマイコサミンのＮにおいて、該化合物のさらなる改変も必要とされる。
【００５５】
さらに、好ましい本発明に係る化合物は、ナイスタチンに対して、Ｃ１１において改変され得る。ナイスタチンにおいて、Ｃ１１は水酸基によって置換されている。そのため、いくつかの本発明に係る化合物においては、Ｃ１１は水酸基以外の官能基によって置換されている。好ましい上記化合物においては、カルボニル基が存在している。
【００５６】
また、さらに好ましい本発明に係る化合物は、ナイスタチンに対して、Ｃ１０において改変されたものである。ナイスタチンにおいては、Ｃ１０は水酸基および水素原子によって置換されており、Ｒ立体中心である。そのため、好ましい本発明に係る化合物は、Ｃ１０は、水酸基および水素原子以外の官能基によって置換され、および／またはＣ１０はＳ立体中心である。好ましい上記化合物においては、異なる官能基、たとえば２つの水素原子、またはカルボニル基が、存在している。特に、好ましい化合物においては、Ｃ１０は２つの水素原子によって置換されている。
【００５７】
また、さらに好ましい本発明に係る化合物は、ナイスタチンに対して、マイコサミンのアミノ基において改変されたものである。ナイスタチンにおいて、マイコサミンのアミノ基は、置換されていなく、すなわち、該アミノ基は−ＮＨ2である。そのため、好ましい本発明に係る化合物においては、マイコサミンのアミノ基は、たとえば、１つ以上のアルキルアミノ基または糖基によって置換されている。
【００５８】
Ｃ５またはＣ７にてカルボニルを有する本発明に係る化合物においては、ナイスタチンに対して、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１６において、またはマイコサミンのＮにおいても、改変が存在する場合、該化合物は特に好ましい。たとえば、マイコサミンのアミンは、官能性を持され、水素以外である少なくとも１つの置換基Ｒ８／Ｒ９を有し得る。
【００５９】
本発明に係る化合物は、Ｓ４４ＨＰのような公知の材料に対して、１つだけの変化を有することができるが、理想的には、いかなる本発明に係る化合物においても、ナイスタチンに対して、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１６またはマイコサミンのＮにおいて、２つの変化を含む。好ましい化合物は、ナイスタチンに対して、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１６またはマイコサミンのＮにおいて、３つの変化を含み得る。さらに好ましい化合物は、Ｓ４４ＨＰに対して、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１６またはマイコサミンのＮにおいて、少なくとも２つの変化を含むだろう。その他の好ましい上記化合物は、マイコヘプチンに対して、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１６またはマイコサミンのＮにおいて、少なくとも２つの変化を含むだろう。さらに好ましい化合物は、カンジジンに対して、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１６またはマイコサミンのＮにおいて、少なくとも２つの変化を含むだろう。
【００６０】
特に好ましい化合物は、ナイスタチン、Ｓ４４ＨＰ、マイコヘプチンおよびカンジジンのすべてに対して、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１６またはマイコサミンのＮにおいて、少なくとも２つの変化を含むだろう。
【００６１】
特に、好ましい本発明に係る化合物は、上記にて説明された、式（Ｉ）または（Ｉ´）の化合物である。
【００６２】
好ましい式（Ｉ）の化合物においては、Ｒ１は水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示す。さらにより好ましくは、Ｒ１は、水素原子、水酸基またはアルコキシ基（たとえば、官能基−ＯＣ１−６）を、特に、水素原子または水酸基（たとえば、水酸基）を示す。好ましい上記化合物においては、Ｒ２は水素原子である。別の好ましい上記化合物においては、Ｒ１およびＲ２はともにカルボニル基を形成している。Ｃ５が立体中心である場合、そのＣ５はＲ中心であることが好ましい。
【００６３】
好ましい式（Ｉ）の化合物は、Ｒ３が、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示す化合物でもある。さらにより好ましくは、Ｒ３は水素原子、水酸基またはアルコキシ基（たとえば、−ＯＣ１−６）を、特に、水素原子または水酸基（たとえば、水素原子）を示す。好ましい上記化合物においては、Ｒ４は水素原子である。別の好ましい上記化合物においては、Ｒ３およびＲ４はともにカルボニル基を形成している。Ｃ９が立体中心である場合、そのＣ９はＲ中心であることが好ましい。
【００６４】
さらには、好ましい式（Ｉ）の化合物は、Ｒ５が水素原子、水酸基、アルコキシ基、アシルオキシ基またはアルキル基を示す化合物である。さらにより好ましくは、Ｒ５は、水素原子、水酸基またはアルコキシ基（たとえば、−ＯＣ１−６）を、特に水素原子または水酸基（たとえば水酸基）を示す。好ましい上記化合物においては、Ｒ６は水素原子である。Ｃ１０が立体中心である場合、そのＣ１０はＲ中心であることが好ましい。
【００６５】
また、さらに好ましい、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ７がＣＯＯＨ、アルキル基、カルボン酸エステル基またはアミド基を示す化合物である。好ましいカルボン酸エステル基は、−ＣＯＯＣ１−６であり、より好ましくは−ＣＯＯＣ１−４であり、たとえば−ＣＯＯＣＨ３である。
【００６６】
特に好ましい、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ７がアルキル基またはアミド基である化合物である。好ましいアルキル基は、Ｃ１−６アルキル、たとえば、メチル、エチル、プロピルまたはブチルであり、特にメチルである。
【００６７】
好ましいアミドは、上記に規定されるような式ＩＩＩのアミドである。特に好ましいアミドは、Ｒ１０およびＲ１１が、それぞれ独立して、水素原子、または、水酸基、カルボン酸エステル基またはアミノ基で置換されてもよく、酸素原子または窒素原子によって割り込まれていてもよい、Ｃ１−１０の分枝型または非分枝型のアルキル基であるか、あるいはＲ１０およびＲ１１はともに、水酸基、カルボン酸エステル基アミノ基に置換されてもよく、酸素原子または窒素原子によって割り込まれていてもよい、Ｃ１−８の環状アルキル基を形成する。
【００６８】
いくつかの好ましいアミドにおいては、Ｒ１０は水素である。さらに好ましいアミドにおいては、Ｒ１１は式ＩＶの官能基：
【００６９】
【化９】
2010531865.tif 000011
【００７０】
であり、
式中、Ｒ１８は、水素または、６までの炭素原子を含むアルキル基（たとえば、メチルまたはＣＨ（ＣＨ３）２）であり、；
ｙは、１〜６、好ましくは２〜４、たとえば３であり；
Ｚは、ＯＨ、ＮＲ１９Ｒ２０またはＣＯＯＲ２１であり、式中、Ｒ１８、Ｒ１９およびＲ２１は、それぞれ独立して、水素またはＣ１−６のアルキル（たとえば、メチル）である。
【００７１】
特に好ましいアミドにおいては、Ｒ１８は水素である。
【００７２】
他の好ましいアミドにおいては、Ｒ１０およびＲ１１はともに、環状アルキル基を、好ましくは、式Ｖの環状アルキル基
【００７３】
【化１０】
2010531865.tif 000012
【００７４】
を形成し、式中、ａ、ｂおよびｃは、１〜６、好ましくは２〜４、たとえば２を示し、Ｚは、ＩＶ関して、上記にて記載されたものである。
【００７５】
特に好ましい、式ＩＩＩのアミド基の代表的な例は、以下に示される基である。
【００７６】
【化１１】
2010531865.tif 000013
【００７７】
アミド基４，６，７，８および１０が特に好ましく、とりわけアミド基７，１０が好ましい。
【００７８】
さらに好ましい式（Ｉ）の化合物は、Ｒ８が水素原子、アルキルアミノ基、糖基、またはアシル基を示す化合物である。好ましい化合物において、Ｒ９は、Ｒ８と同一であるか、または水素原子であり、たとえば、Ｒ９は水素原子である。
【００７９】
好ましいアルキルアミノ基は、式中、ｘは２〜６（たとえば、３）である式−（ＣＨ２）ｘＮＨ２の基であるか、あるいは−（ＣＨ２）ｘＮＣ１−６ａｌｋｙｌ２のアルキル化類似体、たとえば−（ＣＨ２）ｘＮＭｅ２の基である。別の好ましい官能基は、リシン残基ＣＯＣＨ［（ＣＨ２）４ＮＨ２］ＮＨ２である。
【００８０】
好ましい糖基としては、１〜５の糖単位を、より好ましくは２または３の糖単位を含む。
【００８１】
糖基が単糖である場合、該糖基は、直線状、環状、または直線状および環状の配座異性体の混合物であってもよい。糖基が、１つより多くの単糖単位を含む場合、各単糖は、環状、直線状、または直線状および環状の配座異性体の混合物であってもよい。さらには、存在する単糖単位は、同一であっても異なっていてもよい。
【００８２】
式（１）の化合物においては、好ましい単糖は、ペントースおよびヘキソースであり、たとえば、グルコース、ガラクトース、グルコピラノース、マンノピラノース、ガラクトピラノース、フルクトピラノースおよびタガトピラノースである。好ましい二糖およびオリゴ糖としては、ラクトース、メリビオース、スクロース、マルトースおよびセロビオースが挙げられる。Ｄ-グルコース、Ｄ−ガラクトースおよびラクトースが、特に好ましい。
【００８３】
さらに好ましいアシル基（Ｒ８における）は、−（ＣＨ２）Ｐｈ（ＣＨ２）ｘＮＨ２または−（ＣＨ２）Ｐｈ（ＣＨ２）ｘＮＭｅ２であり、ｘは０または１である。
【００８４】
特に好ましい本発明に係る化合物は、式Ｉの化合物であって、式中、Ｒ１およびＲ２は、ともにカルボニル基を形成している。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、カルボニル基を形成し、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は水素原子であり、Ｒ５は水酸基である。このような化合物においては、好ましくは、Ｒ８およびＲ９のすくなくとも１つ（たとえば、Ｒ８およびＲ９の両方）が水素原子である。特に好ましくは、Ｃ１０がＲ立体中心である。
【００８５】
その他の特に好ましい本発明に係る化合物は、式Ｉの化合物であって、式中、Ｒ７は、Ｃ１−６のアルキル（たとえば、メチル）である。より好ましくは、Ｒ７はＣ１−６のアルキル（たとえば、メチル）であり、Ｒ８およびＲ９の少なくとも１つ（たとえば、Ｒ８およびＲ９の両方）は、水素原子である。このような化合物においては、好ましくは、Ｒ５は水酸基であり、Ｒ６は水素原子である。さらに好ましくは、Ｒ３およびＲ４は水素原子である。特に好ましくは、Ｃ１０はＲ立体中心である。
【００８６】
さらに別の好ましい本発明に係る化合物は、式Ｉの化合物であって、式中、Ｒ７はアミド基であり、好ましくは、上記にて規定されるような式ＩＩＩのアミド基である。より好ましくは、Ｒ７がアミド基である場合、すくなくともＲ８およびＲ９の１つ（たとえば、Ｒ８およびＲ９の両方）が水素原子である。このような化合物において、Ｒ５は、好ましくは水酸基であり、Ｒ６は水素原子である。さらにより好ましくは、Ｒ３およびＲ４は水素原子である。特に好ましくは、Ｃ１０はＲ立体中心である。
【００８７】
より好ましい本発明に係る化合物は、式Ｉの化合物であって、式中、Ｒ８は、下記に規定されるような、糖基またはアルキルアミノ基である。より好ましくは、Ｒ８が糖基またはアルキルアミノ基である場合、Ｒ９は水素原子である。このような化合物において、Ｒ７は好ましくはＣＯＯＨである。さらにより好ましくは、Ｒ５は水酸基であり、Ｒ６は水素原子であり、および／またはＲ３およびＲ４は水素原子である。特に好ましくは、Ｃ１０はＲ立体中心である。
【００８８】
式（Ｉ'）の化合物について、好ましい任意事項は、式（Ｉ）と関連して、上記にて説明したものである。さらに、好ましい式（Ｉ'）の化合物においては、Ｒ１'は水酸基であり、Ｒ２'は水素原子を示すか、あるいは、Ｒ１'およびＲ２'はともにカルボニル基を形成している。Ｃ７が立体中心である場合、そのＣ７はＲ中心であることが好ましい。
【００８９】
好ましい式（Ｉ'）の化合物も、Ｒ３'が水酸基を、Ｒ４'が水素原子を示すか、あるいは、Ｒ３'およびＲ４'はカルボニル基を示す。Ｃ１１が立体中心である場合、そのＣ１１はＲ中心であることが好ましい。
【００９０】
好ましくは、Ｒ１'／Ｒ２'またはＲ３'／Ｒ４'の一つだけが、ともに、カルボニルを示す。
【００９１】
好ましい本発明に係る化合物の代表的な例は、図１に示される。特に好ましい化合物は、化合物番号１、２、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１および２２であり、特に、化合物番号１、２、９、１１、１２、１３、１４、２１および２２であり、たとえば化合物番号１および１１である。
【００９２】
さらにより好ましい化合物は、Ｃ１６カルボキシ基がジメチルエチルアミドに変換されている化合物である。前記の同一のカルボキシ基がメチル基に変換されている化合物も好ましい。特に好ましい上記化合物としては、ポリオール領域（Ｃ５〜Ｃ１１）における変化とともに、Ｃ１６における１つの変更を有する化合物が挙げられる。
【００９３】
上述のように、本発明に係る化合物は、薬理学的に許容できる塩の形態を採り得る。このような塩としては、生理学的に許容できる有機酸または無機酸との酸付加塩が挙げられる。このような塩の形成のための好適な酸の例としては、酢酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、重硫酸、酒石酸、酪酸、エデト酸カルシウム、カムシル酸、カルボン酸、クロロ安息香酸、クエン酸、エデト酸、エジシル酸、エストリック酸、エシル酸、エシリック酸、ギ酸、フマル酸、グルセプト酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコリルアルサニル酸、ヘキサミン酸、ヘキシルレソルシノイック酸、ヒドラバミック酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、メチル硝酸、メチル硫酸、粘液酸、ムコン酸、ナプシリック酸、硝酸、シュウ酸、ｐ−ニトロメタンスルホン酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、フタル酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、スルホン酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、テオクル酸およびトルエンスルホン酸が挙げられる。グルタミン酸塩は特に好適である。代わりに、上記塩は、塩基で形成されてもよい。このような塩の形成のための好適な塩基の例としては、第一級、第二級、および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを包含する置換アミン、環状アミン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、N, N-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミンエタノール、２−ジメチルアミンエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミンおよびトリプロピルアミンが挙げられる。薬理学的に許容できる塩は、水和物であってもよい。このような塩への式Ｉの化合物からの変換の手順は、本技術分野における従来からあるものである。
【００９４】
本発明に係る非常に好ましい化合物は、以下の骨格（１６位におけるＣＯＯＨ基またはアミノ基が、所望に応じた官能性を有している。たとえば、ＣＯＯＨは、Ｒ７に置換されている。）に由来するものである。なお、一般的には、水素原子は、これらの骨格には表記しないことを留意されたい。そして、これらの水素原子は、実際に存在している（すなわち、Ｏ原子においては、水酸基を形成する）旨が理解されるであろう。:
【００９５】
【化１２−１】
2010531865.tif 000014
【００９６】
【化１２−２】
2010531865.tif 000015
【００９７】
【化１２−３】
2010531865.tif 000016
【００９８】
本発明に係る化合物においては、多くの可変体（variable）があることも理解されよう。疑義を避けるために、可変体における定義についての各開示については、本出願におけるその他の可変体のすべての定義に関連して、開示されたものとみなされることに留意されたい。特に、各可変体の好ましい任意事項は、その他の可変体についての、あまり好ましくない、および好ましい任意事項に組込まれるものである。
【００９９】
本発明に係る化合物は、好ましくは、従来の合成化学、遺伝子操作またはそれらの組み合わせを包含する当該技術において公知の手法を用いて調製され得る。上記にて述べたように、本発明の一側面は、上述した化合物を製造する方法であって、
（ｉ）ナイスタチン合成を担うポリケチドシンターゼ系をコードする遺伝子群を改変して、Ｃ２８とＣ２９との間において、二重結合を有するナイスタチン誘導体を産生することと；
（ｉｉ）さらに、前記遺伝子群を改変して、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンアミノ基の一つ以上において、さらに改変されたナイスタチン誘導体を産生するか、
（ｉｉｉ）化学反応によって、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンアミノ基の一つ以上において、得られたナイスタチン誘導体を改変することと、
を含む。
好ましい本発明に係る製造方法は、工程（ｉ）および(ｉｉ)を、すなわち、ナイスタチン合成を担うポリケチドシンターゼ系をコードする遺伝子群を改変して、Ｃ２８とＣ２９との間において、二重結合を有するナイスタチン誘導体を産生することと、さらに、前記遺伝子群を改変して、ナイスタチンに対して、Ｃ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンアミノ基の一つ以上（たとえば、Ｃ５位、Ｃ９位、Ｃ１０位またはＣ１６位の一つ以上）において改変することを含むものである。
【０１００】
二番目に好ましい本発明に係る製造方法は、工程（ｉ）および（ｉｉｉ）を含む。ナイスタチン合成を担うポリケチドシンターゼ系をコードする遺伝子群の改変は、たとえば、ＷＯ01/59126において記載されたように、従来の手法に準じて、実施されてもよい。ナイスタチン ポリケチドシンターゼ遺伝子群は、多くの繰返し単位（モジュール）をコードし、それぞれポリケチド鎖の合成における縮合サイクルを担っているものである。ポリケチド鎖の合成の開始のための「開始」単位（カルボン酸）の性状を決定するローディングモジュール（nysA ）および、さらなる「伸長」単位（鎖上に付加される次のカルボン酸）を組込む（鎖上に縮合する）ための１８個の「伸長」モジュールがある。このようなモジュールは、それぞれ、結果として前記分子の合成をもたらす多くの酵素活性（たとえば酵素）をコードする。かかるモジュールは、そのような活性を別個にコードするドメインを含むものである。モジュールとしては、典型的には、組込および伸長を担うアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン、アシルキャリア蛋白質（ＡＣP）ドメインおよびβケトアシルシンターゼ（ＫＳ）ドメインならびに、組込まれた開始単位/伸長単位の還元状態を決定するケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）およびエノイルレダクターゼ（ＥＲ）の各ドメインを含むものである。この遺伝子群は、さらに、ナイスタチンの生合成に関与するその他の酵素（または酵素活性）をコードする遺伝子（すなわち、オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）を含む。例として、チオエステラーゼ（ＴＥ）は、ＰＫＳからのポリケチドの放出を可能にするものである。さらに、本遺伝子群における遺伝子または遺伝子配列は、たとえば、モノオキシゲナーゼ（たとえば、nysN またはnysL）によるヒドロキシル化、または、グリコシル化（たとえば、グルクロノシルトランスフェラーゼ活性、たとえば、nys DI）などによって、合成分子（ポリケチド鎖）をさらに改変し得る酵素または酵素活性をコードするものであってもよい。
【０１０１】
例として、ＰＫＳのモジュールおよび／またはドメインの遺伝子群は、たとえば、挿入、欠失または不活性化によって、ドメインまたはモジュールの置換によって、あるいはドメインまたはモジュールの活性を変化させる変異によって、改変されてもよい。たとえば、モジュールおよび/またはドメインの数を改変してもよいし、あるいはそれらを、変更して活性を変化させてもよい。その他の酵素活性、たとえば、モノオキシゲナーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼをコードする、その他の遺伝子または遺伝子配列も改変されてもよい。典型的には、「還元」ドメイン（たとえば、ＥＲ，ＤＨおよび/またはＫＲ）は、一つ以上のモジュールにおいて改変されても（たとえば、不活性化されても）よいし、あるいはモノオキシゲナーゼ活性をコードする遺伝子配列（たとえば、 NysL, NysN)が改変（たとえば、不活性化）されてもよい。
【０１０２】
二重結合Ｃ２８とＣ２９との間における二重結合は、WO01/59126の実施例２において記載されたように、たとえば、ポリケチドシンターゼのモジュール５におけるＥＲドメインの不活性化によって、導入されてもよい。
【０１０３】
さらに、ポリケチドシンターゼ系をコードする遺伝子群に対する他の改変によって、ナイスタチンに対して、たとえば、Ｃ５位、Ｃ９位、Ｃ１０位、またはＣ１６位の一つ以上における改変が、導入されてもよい。該遺伝子群への更なる改変がなされた場合、この改変は、好ましくは、ナイスタチンに対して、Ｃ５位、Ｃ９位、Ｃ１０位、またはＣ１６位の一つ以上において改変を生じさせるものである。
【０１０４】
Ｃ５におけるナイスタチン構造の改変は、ナイスタチンポリケチドシンターゼのモジュール１７におけるケトレダクターゼドメインの不活性化によって、たとえば、実施例にて記載された方法によって、引き起こされるものでもよい。
【０１０５】
Ｃ９におけるナイスタチン構造の改変は、ナイスタチンポリケチドシンターゼのモジュール１５におけるケトレダクターゼドメインの不活性化によって、たとえば、実施例にて記載された方法によって、引き起こされるものでもよい。
【０１０６】
Ｃ１０におけるナイスタチン構造の改変は、Ｃ１０のヒドロキシル化を担うＮｙｓＬモノオキシゲナーゼの遺伝子の不活性化によって、たとえば、実施例にて記載された方法によって、引き起こされるものでもよい。
【０１０７】
Ｃ７におけるナイスタチン構造の改変は、ＫＲ１６ドメインの不活性化によって、引き起こされるものでもよい。
【０１０８】
Ｃ１１におけるナイスタチン構造の改変は、ＫＲ１４ドメインの不活性化によって、引き起こされるものでもよい。
【０１０９】
Ｃ１６におけるナイスタチン構造の改変は、Ｐ５４０モノヒドロゲナーゼをコードするnysNの不活性化によって、たとえば、実施例にて記載された方法によって、引き起こされるものでもよい。
【０１１０】
化学反応による、工程(ｉ)および任意で工程(ｉｉ)から得られた化合物のＣ５位、Ｃ７位、Ｃ９位、Ｃ１０位、Ｃ１１位、Ｃ１６位またはマイコサミンのアミノ基の一つ以上における改変は、公知の任意の手法によって実施されてもよい。従来の保護基化学法は、必要な際にはいつでも採用されてもよい。化学反応によって、更なる改変を導入する場合、化学反応は、好ましくはナイスタチンに対してＣ１６位および／またはマイコサミンのアミノ基において、改変を生じさせるものである。
【０１１１】
好ましい化学反応は、Ｃ１６におけるアミド形成である。ナイスタチンのＣＯＯＨ基からアミドへの変更は、適当なアミン、任意で活性化剤（たとえば、ＰｙＢＯＰ）の存在下にて、ナイスタチン誘導体を反応させることで実施されてもよい。
【０１１２】
また別の好ましい化学反応はマイコサミンのアミノ基における還元的アルキル化である。還元的アルキル化は、適当なアルデヒドでナイスタチン誘導体を反応させて、イミンを形成し、還元剤の添加によりそのイミンを、好ましくはin situで還元することで実施されてもよい。好ましい還元剤はＮａＢＨ３ＣＮである。
【０１１３】
さらに好ましい化学反応は、マイコサミンのアミノ基におけるアマドリ反応である。アマドリ反応は、適当な還元糖でナイスタチン誘導体を反応させることによって実施されてもよい。
【０１１４】
好ましい本発明に係る方法は、上述したような式（Ｉ）の化合物を与えることができる。このような方法において、Ｃ５位における改変は、ナイスタチンに対してＲ１および/またはＲ２を改変するものであり、Ｃ９位における改変は、ナイスタチンに対してＲ３および/またはＲ４を改変するものであり、Ｃ１０位における改変は、ナイスタチンに対してＲ５および/またはＲ６を改変するものであり、さらに、Ｃ１６位における改変は、ナイスタチンに対してＲ７を改変するものである。マイコサミンのアミノ基における改変は、ナイスタチンに対してＲ８および/またはＲ９を改変するものである。式Ｉの化合物に関連して好ましいものであるように、上記の好ましい方法は、式中のＲ１−Ｒ９特異的な化合物を生産するものである。
【０１１５】
該化合物は、任意の従来技術、たとえば、結晶化、クロマトグラフィーなどによって精製されてもよい。本発明に係る式Ｉの化合物は多くのキラル中心を含み、そうしたものは異なる立体異性体を含むものである。特に好ましい化合物は、図１に示される。
【０１１６】
本発明に係る化合物は、真菌の増殖を阻止するために、または殺菌するために、広範な用途において使用されてもよい。たとえば、本発明に係る化合物は、殺菌剤または防腐剤として(たとえば、食料および化粧品中において)、使用されてもよい。殺菌剤または防腐剤としての本発明に係る化合物の使用は、本発明のさらに別の側面を形成するものである。
【０１１７】
殺菌剤または防腐剤としての使用のためには、本発明に係る化合物は、単独でまたは、他の抗真菌および／または抗菌剤とともに、使用されてもよい。本発明に係る化合物は、そのもの自体で使用されてもよいし、より好ましくは担体、希釈剤または賦形剤との混合物において使用されてもよい。
【０１１８】
本発明に係る化合物は、特に、真菌感染の処置または阻止に好適である。本発明の組成物および医薬組成物は、特に、身体の内部領域および外部領域における、真菌感染の処置または阻止に適している。処置され得る身体の領域の例としては、皮膚、口腔、膣腔および胃腸管が挙げられる。本発明の化合物および組成物は、特に、侵襲的な（たとえば浸透性の)真菌感染の処置に好適である。
【０１１９】
本発明に係る化合物は、理想的なことに広い活性スペクトラムを有するものであるが、特に、Candida種、Cryptococcus種、 Aspergillus種、Colletotrichum種、Geotrichum種、Hormonema種、Lecythophora種、Paecilomyces種、Penicillium種、Rhodotorula種、Fusarium種、Saccharomyces種、Trichoderma種、Trichophyton種およびScopularilopsis種、とりわけCandida種およびCryptococcus種（たとえば、Candida種）によって引き起こされる真菌感染の処置に好適なものである。 
【０１２０】
このような処置における使用のために、本発明の化合物は、１つ以上の担体、賦形剤および／または希釈剤とともに、任意の従来の方法で、医薬組成物として調合されてもよい。具体的な医薬剤形は、所望の投与形態によるものであろうし、当業者により容易に決定されることであろう。好適な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、水、エタノール、グリセロール、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、デオキシコレート酸ナトリウム、糖類（たとえば、グルコース、スクロース、ラクトース)、デンプン（たとえば、コーンスターチ、すなわちトウモロコシデンプン）、微結晶性セルロース、糊剤（たとえばトラガカント）、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、脂肪酸（たとえば、ステアリン酸）、油脂、ワックス、炭酸カルシウム、塩化カルシウムおよびクエン酸が挙げられる。
【０１２１】
このような医薬組成物は、追加的に、１種類以上の湿潤剤、甘味剤（たとえば、砂糖、アスパルテームまたはサッカリン）、平滑剤、安定剤、エマルション剤、懸濁剤、保存剤、香味剤（たとえば、バニリン、ペパーミントオイルまたは果物のフレーバー）および／または吸収促進剤を含んでいてもよい。
【０１２２】
本発明に係る化合物は、所望により、さらに別の（たとえば、１、２または３種類の）薬理学的活性物質とともに、 投与されてもよい。本発明に係る化合物と、さらに別の（たとえば、１種類の）活性物質との組み合わせでの使用に関する利点としては、上記組成物を薬剤として使用する上で適する疾患のスペクトルを拡大しうることである。追加的にまたは代わりに、本発明に係る化合物および/またはさらに別の活性物質の服用量の低減を、有利に達成することができる。このことは、このような別の活性物質が公知の副作用と関連している場合において、特に有利である。
【０１２３】
本発明に係る組成物において使用され得るさらなる活性物質としては、他の抗真菌剤および抗生物質が挙げられる。代表的な抗生物質としては、アゾール類およびエキノカンジン類が挙げられる。また、代表的な抗生物質としては、デメクロサイクリン、トリアムシノロンアセトニド、硫酸ネオマイシン、グラミシジン、オキシテトラサイクリンおよびエリスロシンが挙げられる。
【０１２４】
本発明に基づいて使用される医薬組成物は、経口的に、経腸的に（たとえば、坐薬を使用する。）、局所的にまたは全身的に投与されてもよい。経口投与または全身投与のための組成物であることが好ましいが、選ばれる経路は、たとえば、疾患および／または処置される対象によるだろう。とりわけ、全身投与のための組成物であることが特に好ましい。
【０１２５】
上記組成物は、選択された投与経路での使用に採用される、いかなる形態で提供されてもよい。経口投与に適した態様としては、たとえば、素錠またはコーティング錠、徐放錠、チュアブル剤、軟カプセル、硬カプセル、懸濁液およびシロップ剤が挙げられる。本発明による使用に好適な形態は、錠剤、懸濁液およびシロップ剤であり、特に錠剤である。
【０１２６】
全身投与に適した形態は、たとえば、皮内、腹腔内または静脈における注射または点滴のための調剤であってもよい。中でも、静脈注射のための調剤であることが特に好ましい。
【０１２７】
局所的投与のために採用される形態としては、皮膚および粘膜への投与のための組成物（たとえば、ゲル、クリーム、スプレー、ローション、軟膏、エアロゾル）が挙げられる。
前記化合物は、坐薬または停留性浣腸剤のような、直腸または膣用の組成物として製剤化されてもよい。
【０１２８】
各用途において使用される本発明に係る化合物の量は、当業者によって容易に決定されるものである。たとえば、殺菌剤または防腐剤としての使用には、必要とされる化合物の量は、標的とする真菌の増殖の阻害する量または致死する量である。実際の量は特定の標的とする真菌および用途によるものであるが、殺菌剤または防腐剤としての使用においては、本発明に係る化合物は、殺菌剤溶液または防腐処理されるべき物において、典型的には０．５〜５重量％、より好ましくは１〜３％で使用される。
【０１２９】
真菌感染の処置での使用においては、混合物中における、本発明に係る化合物およびその他の任意の活性物質の量は、当業者によって容易に決定され得ることであり、任意のその他の活性物質の性状、投与の方法、処置されるべき疾患および対象の重量を含めた、いくつかの因子によるものである。しかしながら、一般的には、本発明に係る化合物は、組成物において、０．０１〜５０重量％、好ましくは１〜２０重量％の量で使用され得る。
【実施例】
【０１３０】
・    化合物の準備
表１にリストされる化合物を調製した。これらの化合物の各々の正確な立体化学を、図１に示す。
【０１３１】
【化１３】
2010531865.tif 000017
【０１３２】
【表１】
2010531865.tif 000018
＊グルタミン酸として
【０１３３】
Ｓ４４ＨＰの合成
この化合物は、Borgos S.E. et al., Arch Microbiol. 2006 Apr; 185(3):165-71にて記載したようにして調製した。
【０１３４】
化合物１〜４の合成
化合物１〜４は、ナイスタチン生合成遺伝子群の部位特異的変異の以下の組合せを使用した遺伝子操作により調製された（配列−Brautaset, T., et al., Chem Biol. 2000 Jun;7(6):395-403）
化合物１  ＥＲ５＋ＮｙｓＮにおける変異；
化合物２  ＥＲ５＋ＫＲ１７における変異；
化合物３  ＥＲ５＋ＫＲ１７＋ＮｙｓＮにおける変異；
化合物４  ＥＲ５＋ＫＲ１５における変異。
Borgos S.E. et al., Arch Microbiol. 2006 Apr; 185(3):165-71にて記載したようなＥＲ５不活性化ベクターを用いた。
【０１３５】
以下の構築物は、出願人により設計されて、準備された：
・    ＮｙｓＮ：
ｎｙｓＮにおいて、それぞれ変異ＣＬ３４６ＳＴおよびＣＬ３４６ＡＳを導入するためのベクターｐＳＯＫ２０１ｎｙｓＮ４．１−ＣＬ３４６ＳＴおよびｐＳＯＫ２０１ｎｙｓＮ４．１−ＣＬ３４６ＡＳ
組換えλクロ−ンＮ９５（Brautaset, T., et al., Chem Biol. 2000 Jun;7(6):395-403）の４．１ｋｂのＮｃｏＩ／ＸｂａＩ断片を、プラスミドｐＬＩＴＭＵＳ２８の対応する部位にクローニングした。得られた構築物から、全４．１ｋｂの挿入断片をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより切り出し、ｐＧＥＭ１１ｚｆ（＋）の対応する部位にクローニングした。得られたプラスミド（ｐＧＥＭ１１ｎｙｓＮ４．１と表す）から、ＮｙｓＮ活性部位を含む１．５ｋｂの領域を、以下のプライマを用いてＰＣＲ増幅した。
【０１３６】
【数１】
2010531865.tif 000019
【０１３７】
プライマにはＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線部）が導入されており、その部位を、得られたＰＣＲ断片をｐＧＥＭ１１ｚｆ（＋）の対応する部位にクローニングするために用いて、プラスミドｐＧＥＭ１１ｎｙｓＮ１．５を産生した。後者のプラスミドを、以下の変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いることにより、部位特異的変異のテンプレートとして使った（ＱｕｉｃｋＣＨａｅｎｇｅキット（ストラタジ−ン）を使用）：
【０１３８】
【数２】
2010531865.tif 000020
【０１３９】
配列中、変異したヌクレオチドを太字で示す とともに、導入された新たな制限サイト（変異ＣＬ３４６ＳＴのためのＳａｌＩ、変異ＣＬ３４６ＡＳのためのＮｈｅＩ）に下線を引いた。変異はＳａｌＩまたはＮｈｅＩ制限酵素解析により確認し、正しく変異したベクターの挿入断片全体をＤＮＡ塩基配列決定により検証した。得られたプラスミドに由来する、変異した１．３ｋｂのＦｓｐＡＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉ断片を、プラスミドｐＧＭ１１ｎｙｓＮ４．１の対応する断片を置換するために用いて、プラスミドｐＧＭ１１ｎｙｓＮ４．１−ＣＬ３４６ＳＴおよびｐＧＭ１１ｎｙｓＮ４．１−ＣＬ３４６ＡＳを産生した。後者の構築物から、変異したｎｙｓＮ遺伝子を含んでいる４．１ｋｂの挿入断片をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより切り出し、ｐＳＯＫ２０１の３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボ−ンに連結した。そして、ｎｙｓＮ不活性化プラスミドｐＳＯＫ２０１ｎｙｓＮ４．１−ＣＬ３４６ＳＴおよびｐＳＯＫ２０１ｎｙｓＮ４．１−ＣＬ３４６ＡＳを産生した。
【０１４０】
化合物１を産生する株におけるｎｙｓＮの不活性化のために、構築物ｐＳＯＫ２０１ｎｙｓＮ４．１−ＣＬ３４６ＳＴを用いた。化合物３を産生する株のｎｙｓＮの不活性化のために、構築物ｐＳＯＫ２０１ｎｙｓＮ４．１−ＣＬ３４６ＡＳを用いた。
・    ＫＲ１７：
ＮｙｓＪのＫＲ１７に変異ＹＡ５１４５ＦＥを導入するためのベクターｐＫＲ１７ｍ
プラスミドｐＬ９８Ｅ（Brautaset, T., et al., Chem Biol. 2000 Jun;7(6):395-403）の４．０ｋｂのＰｍｌＩ／ＢａｍＨＩ断片を切り出し、ベクターｐＧＥＭ３ｚｆ（＋）のＨｉｎｃＩＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結して、プラスミドｐＢＢ４．０を産生した。ＫＲ１７活性部位領域を含む１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、以下のプライマを用いて、ｐＢＢ４．０からＰＣＲ増幅した。
【０１４１】
【数３】
2010531865.tif 000021
【０１４２】
ＰＣＲ産物をＰｓｔＩ（プライマ中、下線を引引いた認識部位）およびＳａｃＩ（増幅されたＤＮＡフラグメントの認識部位）によって端消化［end-digested］し、１．４ｋｂの断片をｐＬＩＴＭＵＳ２８の対応する部位に連結した。得られたプラスミド（ｐＬＩＴ１．４）を、以下の変異誘発性オリゴヌクレオチドとともに、部位特異的変異のテンプレートとして使った。
【０１４３】
【数４】
2010531865.tif 000022
【０１４４】
配列中、変異したヌクレオチドを太字で示すとともに、導入された新たなＢｓｔＢＩ制限サイトに下線を引いた。正しい変異はＢｓｔＢＩ消化により検証し、変異したプラスミドの挿入断片全体をＤＮＡ塩基配列決定により検証した。得られたプラスミド（ｐＬＩＴ１．４ｍ）から、１０７２ｂｐのＢｃｌＩ／ＡｃｃＩＩＩ断片を切り出し、プラスミドｐＢＢ４．０の対応する断片を置換するために用いて、プラスミドｐＢＢ４．０ｍを産生した。ｐＢＢ４．０ｍの４．０ の挿入断片全体をＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩにより切り出し、プラスミドｐＳＯＫ２０１の３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボ−ンと共に連結して、ＫＲ１７不活性化ベクターｐＫＲ１７ｍを産生した。
・    ＫＲ１５：
ＮｙｓＪのＫＲ１５に変異ＹＡ１８８８ＦＥを導入するためのベクターｐＫＲ１５ｍ
ｐＬ２０Ｘ（Brautaset, T., et al., Chem Biol. 2000 Jun;7(6):395-403）の３．６ｋｂのＫｐｎＩ／ＰｍｌＩ断片を切り出し、ｐＧＥＭ３ｚｆ（＋）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ部位に連結して、ｐＫＰ３．６を産生した。後者のプラスミドを、以下のプライマを使用することにより、１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のテンプレートとして使った。
【０１４５】
【数５】
2010531865.tif 000023
【０１４６】
得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（制限サイトには、プライマ中、下線を引いた）によって端消化し、ｐＬＩＴＭＵＳ２８の対応する部位に連結して、ｐＬＩＥＨ１．１を産生した。後者のプラスミドは、以下の変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いた、部位特異的変異のテンプレートとして役立てた。
【０１４７】
【数６】
2010531865.tif 000024
【０１４８】
変異したヌクレオチドを太字で示し、導入した新たなＢｓｔＢＩ部位を下線で示した。正しい変異をＢｓｔＢＩ消化により検証し、変異したプラスミドの挿入断片全体をＤＮＡ塩基配列決定により検証した。変異したプラスミドから、１０４５ｂｐのＦｓｐＡ１／ＡｃｃＩＩＩ−断片を切り出し、ｐＫＰ３．６の対応する領域を置換するために用いて、ｐＫＰ３．６ｍｕｔを産生した。その後、ｐＫＰ３．６ｍｕｔの３．６ｋｂの挿入断片全体をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより切り出し、ｐＳＯＫ２０１の３．２ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結して、ＫＲ１５不活性化ベクターｐＫＲ１５ｍを産生した。
・    Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ株への置換ベクターの導入：
以前に記載したようにして（Brautaset, T., et al., Chem Biol. 2000 Jun;7(6):395-403）、構築した全ての不活性化ベクターをEscherichia coli ET12567 (pUZ8002) に形質転換し、その結果生じた組換株をS. noursei株に不活性化ベクターを接合するために使った。
【０１４９】
−サザンブロット＋ＰＣＲによる第１の組み換え〔crossover〕の検証
−第２の組み換え候補の選択（アプラマイシン感受性）
−サザンブロット＋ＰＣＲによる第２の組み換え候補の遺伝的特徴分析［genetic characterization］
−ｐＮＡ０による正しい第２の組み換え変異体の補完（Brautaset, T., et al., Chem Biol. 2000 Jun;7(6):395-403）
補完された組換株を発酵に供し、対応する分子の生産をＨＰＬＣおよびＭＳ−ＴＯＦ分析法を介して裏付けた。
・    化合物１
ＵＶアイソプロット
Ｓ４４ＨＰ標準物、およびＥＲ５およびＮｙｓＮが不活性化されたS. noursei変異体のＤＭＳＯ抽出物を、図２のアイソプロットに示す。
・  ＬＣ−ＭＳアイソプロット：
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８  ２．１ｘ１００ｍｍ、３．５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１５０】
移動相相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎ＃２５００６）、ｐＨ調整せず。移動相移動相Ｂ：１００％アセトニトリル（Ｒａｔｈｂｕｒｎ、ＨＰＬＣグレード）
時間          ％Ｂ
０．００      ２７
６．５０      ６５
７．３０      ６５
７．４０      ２７
１２．００    ２７
流速：０．２２ｍＬ／分
カラム温度：室温
ＴＯＦ−ＭＳパラメ−タ：
負のＡＰＩ−ＥＳイオン化
乾燥ガス：１０ｌ／分
ネブライザー圧力：４０ｐｓｉｇ
乾燥ガス温度：３５０℃
キャピラリー電圧：３０００Ｖ
フラグメンター：２００Ｖ
・  ＴＯＦ−ＭＳスペクトル
ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図３に示す。ｍ／ｚのピークは９６６および９８０であり、１０３４は内部質量標準である。化合物１（Ｃ47Ｈ75ＮＯ15）の理論的なｍ／ｚ（陰イオン）は８９２．５０６３である。このｍ／ｚは高い精度で観察され、ヘプタエン〔heptaene〕のＵＶ−ピークとよく相関する。化合物１のイオン化の際の水（１および２分子）の損失は、質量ピークにそれぞれΔｍ／ｚ＝−１８およびΔｍ／ｚ＝−３６をもたらす。
・    調製用ＬＣによる精製
精製は、調製用の逆相カラムで行った。
調製方法：
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８  ５０ｘ２５０ｍｍ、１０μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１５１】
移動層：１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎ＃２５００６）、酢酸（ＪＴベ−カ−＃６００２）でｐＨを４．０に調整。移動相Ｂ：１００％メタノール（Ｌａｂ−Ｓｃａｎ、ＨＰＬＣグレード）
時間          ％Ｂ
０．００      ７８
６．００      ７８
６．２０      １００
１１．００    １００
１１．２０    ７８
流速：８５ｍＬ／分
カラム温度：室温
調製用ＬＣによる精製の後、化合物１は、ＵＶおよびＭＳデータによって決定されたように、サンプル中のポリエンマクロライドの＞９７％を構成することが示された。
・    ＬＣ−ＭＳ方法：
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰ  ２．１ｘ５０ｍｍ、３．５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎ＃２５００６）、酢酸（ＪＴベ−カ−＃６００２）でｐＨを４．０に調整。移動相Ｂ：１００％アセトニトリル（Ｒａｔｈｂｕｒｎ、ＨＰＬＣグレード）
時間          ％Ｂ
０．００      ２７
１０．００    ５３
１０．１０    ２７
１５．００    ２７
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：室温
カルボキシル基を有さないポリエン（特に化合物１）のために、移動相Ａとして、酢酸（ＪＴベ−カ−＃６００２）でｐＨを７．０に調整した２０ｍＭ重炭酸アンモニウム（Ｆｌｕｋａ＃０９８３０）を用いて上記方法を行った。ｐＨを上昇させることにより、イオン化しうるカルボキシル基を有するポリエンと有さないポリエンとを、いくらかより良好に分離することができたからである。
・    ＭＳパラメ−タ：
負のＡＰＩ−ＥＳイオン化
乾燥ガス：１２ｌ／分
ネブライザー圧力：３５ｐｓｉｇ
乾燥ガス温度：３５０℃
キャピラリー電圧：３０００Ｖ
・    化合物２
ＵＶアイソプロット
ＧＧ５０７３ＳＰ株（Ｓ４４ＨＰを産生する）のＤＭＳＯ抽出物、およびＥＲ５およびＫＲ１７領域が不活性化された変異体のＤＭＳＯ抽出物を、図４のアイソプロットに示す。
【０１５２】
ＬＣ−ＭＳ方法およびＴＯＦ−ＭＳパラメ−タ：化合物１に関してと同じ。
【０１５３】
ＴＯＦ−ＭＳデータ
ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図５に示す。化合物２（Ｃ47Ｈ71ＮＯ17）の理論的なｍ／ｚ（陰イオン）は９２０．４６４９である。このｍ／ｚは許容される精度（＜３ｐｐｍの誤差）で観察され、ヘプタエンのＵＶ−ピークとよく相関する。
・    調製用ＬＣによる精製
精製は、調製用の逆相カラムで行った。
調製方法：
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８  ５０ｘ２５０ｍｍ、１０μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
移動層：１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎ＃２５００６）、酢酸（ＪＴベ−カ−＃６００２）でｐＨを４．０に調整。移動相Ｂ：１００％メタノール（Ｌａｂ−Ｓｃａｎ、ＨＰＬＣグレード）
時間          ％Ｂ
０．００      ７０
１５．００    ７０
１５．２０    １００
１９．００    １００
１９．２０    ７０
２２．００    ７０
流速：１００ｍＬ／分
カラム温度：室温
調製用ＬＣによる精製の後、化合物２は、ＵＶおよびＭＳデータによって決定された様に、サンプル中のポリエンマクロライドの＞９５．２％を構成することが示された。
・    化合物３
ＵＶアイソプロット
ＧＧ５０７３ＳＰ株（Ｓ４４ＨＰを産生する）のＤＭＳＯ抽出物、およびＥＲ５およびＫＲ１７領域ならびにＮｙｓＮが不活性化された変異体のＤＭＳＯ抽出物を、図６のアイソプロットに示す。
【０１５４】
ＬＣ−ＭＳ方法：
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰ  ２．１ｘ５０ｍｍ、３．５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎ＃２５００６）、酢酸（ＪＴベ−カ−＃６００２）でｐＨを４．０に調整。移動相Ｂ：１００％アセトニトリル（Ｒａｔｈｂｕｒｎ、ＨＰＬＣグレード）
時間          ％Ｂ
０．００      ２７
６．５０      ６５
７．３０      ６５
７．４０      ２７
１２．００    ２７
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：室温
・    ＴＯＦ−ＭＳパラメ−タ：化合物１に関してと同じ。
【０１５５】
ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを図７に示す。ｍ／ｚのピークは９８０であり、１０３４は内部質量標準である。化合物３（Ｃ47Ｈ73ＮＯ15）の理論的なｍ／ｚ（陰イオン）は８９０．４９０７である。このｍ／ｚは、高い精度で観察され（質量スペクトラムを参照）、ヘプタエンのＵＶ−ピークとよく相関する。化合物３のイオン化の際の水（１および２分子）の損失は、質量ピークにそれぞれΔｍ／ｚ＝−１８およびΔｍ／ｚ＝−３６をもたらす。また、カルボキシ化された類似体（示されたＭＳスペクトルのｍ／ｚ＝９２０．４６４４を有する）は、クロマトグラフィの共溶出の顕著な程度を示す。
カルボキシ化された化合物は負のＭＳモードで著しく高いイオン化効率を有することが知られているので、相対的な定量化は示されたＭＳスペクトル中の信号強度に基づいてはならない。
・    化合物４
GG5073SP株（Ｓ４４ＨＰを産生する）のＤＭＳＯ抽出物、およびＥＲ５およびＫＲ１５領域が不活性化された変異体のＤＭＳＯ抽出物を、図８のアイソプロットに示す。
【０１５６】
ＬＣ−ＭＳ方法：化合物３に関してと同じ。
・    化合物５〜２３の合成
全般
ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：６：１：０．１）の溶媒系における、メルクＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４プレート上でのＴＬＣによって、反応をモニターした。得られた生成物の純度は、ＨＰＬＣにより測定され、８０〜９０％であった。分析のための逆相ＨＰＬＣは、島津ＨＰＬＣ計測器ＬＣ１０シリーズにおいて、Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８カラム（４×２５０ｍｍ、粒径６μｍ）、注入量２０μＬおよび波長４０８ｎｍで実行した。溶媒系は、ｐＨ２．６の０．０１ＭのＨ3ＰＯ4およびアセトニトリルを含有するものであった。アセトニトリルの比率は、１．０ｍＬ／分の流速で３０分間かけて、３０％から７０％まで変化させた。
・    化合物５〜１６の合成
Ｓ４４ＨＰ（１８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）と、０．３ｍＬのＤＭＳＯに溶解した０．０６ｍｍｏｌの適当なアミン塩酸塩との混合物に、分割しながら Ｅｔ3Ｎを添加してｐＨを８〜８．５に調整し、その後１５分間でＰｙＢＯＰ−試薬を添加した。その反応混合物を室温で１時間撹拌した。つづく、ジエチルエーテル（〜３ｍＬ）の反応混合物への添加により油状の残渣が生じたので、それをジエチルエーテル（３ｍＬ×２）で連続的に振盪した。この油に５ｍＬのアセトンを添加したところ、アミドの黄色の沈殿物が形成された。その沈殿物を濾過し、アセトンで洗浄し、その後真空で乾燥した。すべてのサンプルは、９０％より高い収率で得られた。これらの化合物の分析データは、下記の表２にまとめられている。
・    化合物１７〜１９の合成
適当な単糖（Ｄ−グルコースもしくはＤ−ガラクトース）または二糖（ラクトース）（０．０８６ｍｍｏｌ）を、Ｓ４４ＨＰ（４０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に添加した。その反応混合物を２０時間３７℃に保ち、それからその溶液をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に滴下した。得られた沈殿物を濾過して取り除き、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。得られた黄色の沈殿物を、フラッシュクロマトグラフィ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：６：１：０．１））により精製した。所望の化合物を含んでいる画分を収集し、その溶液を濃縮した。ジエチルエーテルを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。すべてのサンプルは、４０〜４５％の収率で得られた。これらの化合物の分析データは下記の表２にまとめられている。
・    化合物２０の合成
４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（０．０６５ｍｍｏｌ）およびＳ４４ＨＰ（２０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＮａＢＨ3ＣＮ（４．１ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を２０時間３７℃に保持した。ジエチルエーテル（１０ｍＬ）の添加により油状の残渣が生じ、それをジエチルエーテルで連続して（３ｍＬ×２）振盪した。黄色の沈殿物が、アセトン（１０ｍＬ）を添加したところ形成された。その沈殿物を濾過して取り除き、ジエチルエーテルで洗浄し乾燥した。得られた固体を、カラムクロマトグラフィ用のメルクＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ（０．０４０〜０．０６３ｍｍ）でのフラッシュクロマトグラフィ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：６：１：０．１））により精製した。所望の化合物を含んでいる画分を収集し、その溶液を濃縮 し、ジエチルエーテルを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。
・    化合物２１および２２の合成
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−３−アミノプロピオンアルデヒド（１６０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）およびＳ４４ＨＰ（１００ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液を、ＮａＢＨ3ＣＮ（３４ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）に添加した。その反応混合物を２０時間３７℃に保ち、それからジエチルエーテル（２００ｍＬ）に滴下した。化合物の混合物である黄色の沈殿物を濾取し、直線濃度勾配システムＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＨＣＯＯＨ（３：１：０．０１）→ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：６：１：０．１）におけるカラムクロマトグラフィ用のメルクＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ（０．０４０〜０．０６３ｍｍ）でのフラッシュクロマトグラフィにより、個々の化合物を分離および精製して、黄色の固体としてＮ−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−Ｓ４４ＨＰおよびＮ，Ｎ−ジ−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−Ｓ４４ＨＰを産生した。
【０１５７】
Ｎ−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−Ｓ４４ＨＰまたはＮ，Ｎ−ジ−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−Ｓ４４ＨＰのＤＭＳＯ（３ｍＬ）溶液に、ピペリジン（０．１ｍＬ）を添加した。室温で２時間後、ジエチルエーテル（〜７ｍＬ）を添加した。油状の残渣が形成され、それをジエチルエーテルで連続して（７ｍＬ×２）振盪した。アセトン（１０ｍＬ）を添加すると化合物２１または化合物２２の黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。得られた化合物２１および２２の分析データは下記の表２にまとめられている。
・    化合物２３の合成
Ｓ４４ＨＰ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の乾燥したＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液に、Ｎα、Ｎε−ジ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−リシンＮ−オキシスクシンイミドエステル（２２１ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（１５．３μｌ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を１時間３７℃に保ち、それからＨ2Ｏ（５ｍＬ）を添加した。その混合物を、ｎ−ＢｕＯＨ（３×５ｍＬ）で抽出した。有機分画をあわせ、０．０１ＮのＨＣｌ（１×５ｍＬ）およびＨ2Ｏ（３×５ｍＬ）で洗浄した。その溶液を濃縮し、ジエチルエーテルを添加すると黄色の沈殿物ができたので、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、シリカゲル（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：４：０．５：０．０１））でのフラッシュクロマトグラフィにより精製した。所望の化合物を含んでいる画分を収集し、その溶液を濃縮し、ジエチルエーテルを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。
【０１５８】
ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の単離された黄色の固体（３０ｍｇ）に、ピペリジン（０．１ｍＬ）を添加した。室温で２時間後、ジエチルエーテル（〜７ｍＬ）を添加し、油状の残渣が形成され、ジエチルエーテルで連続して（７ｍＬ×２）振盪した。アセトン（１０ｍＬ）を添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。
【０１５９】
【表２−１】
2010531865.tif 000025
【０１６０】
【表２−２】
2010531865.tif 000026
【０１６１】
上で述べた、または下に述べる合成原理に従い、化合物２４〜２９も
合成した。加えて、以下の更なる化合物は、図１０〜１６に述べられた合成プロトコルおよびそこでのスキームならびにそれに続く説明に基づいて調製した。
【０１６２】
【化１４】
2010531865.tif 000027
【０１６３】
【表３−１】
2010531865.tif 000028
【０１６４】
【表３−２】
2010531865.tif 000029
【０１６５】
【表３−３】
2010531865.tif 000030
【０１６６】
【表４−１】
2010531865.tif 000031
【０１６７】
【表４−２】
2010531865.tif 000032
【０１６８】
【表４−３】
2010531865.tif 000033
【０１６９】
更なるＳ４４ＨＰ誘導体（化合物３０〜４８）の合成
全般
反応は、Ｉ−ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：６：１：０．１）、ＩＩ−ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（７：１：０．０１：０．０１）、ＩＩＩ−ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：濃ＮＨ4ＯＨ（１３：７：１：０．１）、ＩＶ−ＡｃＯＥｔ：ｎ−ＰｒｏＯＨ：濃ＮＨ4ＯＨ（１５：１０：１０）の溶媒系におけるメルクＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４プレート上でのＴＬＣによって、モニターした。
【０１７０】
分析のための逆相ＨＰＬＣを、ＬＣ１０シリーズの島津ＨＰＬＣ計測器、Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００−Ｃ１８カラム（４×２５０ｍｍ、粒径６μｍ）、注入量２０μＬ、波長４０８ｎｍおよび流速１．０ｍＬ／分で実行した。溶媒系は、以下からなるものであった：
Ａ−０．２％ＨＣＯＯＮＨ4  ｐＨ４．５およびＭｅＣＮ。ＭｅＣＮの比率は３０分で３０％から７０％に変化；Ｂ−０．２％ＨＣＯＯＮＨ4  ｐＨ４．５およびＭｅＣＮ：
２５→６５％、４０分；Ｃ−０．２％ＨＣＯＯＮＨ4  ｐＨ４．５およびＭｅＣＮ、３０→９０％、３０分、９０→９０％、１０分；Ｄ−アイソクラチック・システム−３５％ＭｅＣＮ；Ｅ−ｐＨ  ２．６の０．０１ＭのＨ3ＰＯ4およびＭｅＣＮ、３０→７０％、３０分；Ｆ−ｐＨ  ２．６のＨ3ＰＯ4およびＭｅＣＮ、４０→８０％、３０分。
・    Ｓ４４ＨＰの二改変誘導体
Ｎ−フルクトシル  Ｓ４４ＨＰ  Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミド（ＤＭＡＰ）−ヒドロキシプロピルアミド（ＨＰ）もしくは−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）アミド（それぞれ化合物３０、３６、４１）；Ｎ−タガトピラノシル〔tagatopyronosyl〕  Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミド（化合物３１）またはＮ−タガトピラノシル  Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＥアミド（化合物４２）（スキーム１、左側）。
【０１７１】
第１ステップ（アミド化）−Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミド（化合物１１）、ＨＰアミド（化合物１２）またはＤＭＡＥアミド（化合物４８）。
【０１７２】
Ｓ４４ＨＰ（３６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）と、０．６ｍＬのＤＭＳＯに溶解した０．１２ｍｍｏｌの適当なアミン塩酸塩との混合物に、分割しながらＥｔ3Ｎを添加してｐＨを８〜８．５に調整し、その後１５分間で０．０６ｍｍｏｌのＰｙＢＯＰ−試薬を添加した。その反応混合物を室温で１時間撹拌した。つづく、ジエチルエーテル（〜５ｍＬ）の反応混合物への添加により油状の残渣が生じたので、それをジエチルエーテル（５ｍＬ×２）で連続的に振盪した。この油に５ｍＬのアセトンを添加したところ、アミドの黄色の沈殿物が形成された。その沈澱物を濾過し、アセトンで洗浄し、その後真空で乾燥した。粗製アミド（ＨＰＬＣのデータで８５〜９０％の純度であり、塩を含有する）を、セファデックスＧ−２５（ファルマシア・ファイン・ケミカルズＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）でのカラムクロマトグラフィにより精製した。カラムは水を使用して実行した。画分の純度をＨＰＬＣによって制御することで、標的とする適当なＳ４４ＨＰアミドの純度はＨＰＬＣで＞９２％になった。
・    第２ステップ（アミドのアマドリ転位）
Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトース（０．０８６ｍｍｏｌ）を、適当なＳ４４ＨＰアミド（化合物１１、１２、４８）（０．０４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に添加した。その反応混合物を２０時間３７度に保持した。それからその反応混合物をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に滴下した。得られた沈殿物を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。粗製化合物（ＨＰＬＣデータによるところの純度は８５〜９０％であり、塩を含有する）を、セファデックスＧ−２５（ファルマシア・ファイン・ケミカルズＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）でのカラムクロマトグラフィにより精製した。カラムは水を使用して実行した。画分の純度はＴＬＣ、系ＩＶによって調節した。所望の化合物を含んでいる画分を収集し、その溶液を濃縮した。アセトンを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、アセトンで洗浄し、真空で乾燥した。化合物４１を塩酸塩として得た。化合物４１のメタノール溶液に、メタノール中０．１Ｎの塩酸を添加し、ｐＨを〜４にした。ジエチルエーテルを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。Ｓ４４ＨＰアミドのＮ−アルキル誘導体の純度は＞９２％であった。これらの化合物（３０、３６、４１、３１、４２）の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・    Ｎ−（４−Ｎ，Ｎ−ジ−メチルアミノベンジル）Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミド、−ＨＰアミドまたは−ＤＭＡＥアミド（それぞれ化合物３２、３７、４３）（スキーム１（図１０）、右側）
・    第１ステップ（アミド化）
Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミド（化合物１１）、ＨＰアミド（化合物１２）またはＤＭＡＥアミド（化合物４８）は、化合物３０（第１ステップ）について上記したようにして得た。
【０１７３】
第２ステップ（アミドの還元Ｎ−アルキル化）
４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（０．０６５ｍｍｏｌ）と適当なＳ４４ＨＰアミド（化合物１１、１２または４８）（０．０２２ｍｍｏｌ）とのＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を２時間３７℃に保ち、それからＮａＢＨ3ＣＮ（４．１ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を２０時間３７℃に保持した。ジエチルエーテル（１０ｍＬ）を添加すると油状の残渣が生じたので、それをジエチルエーテルで連続的に（１０ｍＬ×２）振盪した。アセトン（１０ｍＬ）を添加したところ、黄色の沈殿物が形成された。その沈殿物を濾取し、ジエチルエステル で洗浄し、乾燥した。塩を含有する粗製化合物を、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：６：１：０．１）の系 を用いたメルクのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィにより精製した。画分の純度はＴＬＣ、系Ｉによって調節した。所望の化合物を含んでいる画分を収集し、その溶液を濃縮した。アセトンを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、アセトンで洗浄し、真空で乾燥した。適当なＳ４４ＨＰアミドのＮ−アルキル誘導体の純度は＞９２％であった。これらの化合物の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・    Ｎ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシル）Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＥアミド、−ＨＰアミドまたは−ＤＭＡＰアミド（それぞれ化合物３９、４５、３４）（アミドのＮ−アミノアシル化、スキーム２（図１１、左側））
Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（０．０４ｍｍｏｌ）と適当なＳ４４ＨＰ  ＤＭＡＥアミド（化合物４８）、−ＨＰアミド（化合物１２）または−ＤＭＡＰアミド（化合物１１）（スキーム１を参照）（０．０２ｍｍｏｌ）との０．５ｍＬＤＭＳＯ中の混合物に、ｐＨ８に調整するためのＥｔ3Ｎを添加し、その後、０．０３ｍｍｏｌのＰｙＢＯＰ−試薬を分割しながら１５分間で添加した。その反応混合物を室温で１時間撹拌した。つづく、ジエチルエーテル（〜３ｍＬ）の反応混合物への添加により油状の残渣が生じたので、それをジエチルエーテル（３ｍＬ×２）で連続的に振盪した。この油に５ｍＬのアセトンを添加したところ、アミドの黄色の沈殿物が形成された。その沈澱物を濾過し、アセトンで洗浄し、その後真空で乾燥して、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン  Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＥアミド、−ＨＰアミドまたは−ＤＭＡＰアミド（化合物３９，４５，３４）を産生した。これらの化合物の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・    Ｎ−（Ｎ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰ  ＨＰアミドおよび−ＤＭＡＥアミド（それぞれ化合物３８および４４）（スキーム２、右側）
第１ステップ（Ｎ−［Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノ］アシル化）  ――  Ｎ−（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰ
〜＋５℃まで冷却したＮα，Ｎε−ジ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−リシン（１８０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）に、乾燥したＤＭＦ（１．２ｍＬ）ＤＣＣ（６２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）中のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（５４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加し、その反応混合物を〜＋５℃で１時間撹拌した。ＤＣＵの残渣をロシュし、得られた溶出液 をＤＭＦ（１．０）ｍＬ中のＳ４４ＨＰ（１８４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）に添加した。それから、その反応混合物に（ｉ−Ｐｒｏ）2ＥｔＮ（０．１ｍＬ、０．８１ｍｍｏｌ）を１０分間、撹拌下に滴下した。その反応混合物を室温で２時間、ＴＬＣの調節下 におけるＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（６：１：０．０１：０．０２）の系で撹拌し、それから２０ｍＬのエチルエーテルを添加した。得られた沈殿物を濾取し、エチルエーテル：アセトンの混合物（１：１、１０ｍｌ×３）で洗浄し、真空で乾燥し、２０２ｍｇの黄色の粉末を産生した。粗製化合物をメルクのシリカゲルでのカラムクロマトグラフィにより精製した。カラムはＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（９：１：０．０１：０．０２→７：１：０．０１：０．０２)の系を用いて実行した。画分の純度は系ＩＩにおけるＴＬＣによって調節した。所望の化合物を含んでいる画分を収集し、その溶液を濃縮した。アセトンを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、アセトンで洗浄し、真空で乾燥し、６０ｍｇの純粋なＮ−［Ｎα，Ｎε−ジ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−リジル］Ｓ４４ＨＰ（＞９６％、ＨＰＬＣ、Ｒｔ＝２２．８０、系Ｂ）を産生した。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル。 実測値：１５００．５４２［Ｍ−Ｈ2Ｏ＋Ｎａ］+1。Ｃ83Ｈ105Ｎ3Ｏ22  １４９５．７２（精密質量 ）と算出された。
・    第２ステップ（Ｎ−（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰのアミド化）  ――  Ｎ−（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰ  ＨＰアミドまたは−ＤＭＡＥアミド）
Ｎ−（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰ（０．０２ｍｍｏｌ）と０．０６ｍｍｏｌの３−ヒドロキシプロピルアミン塩酸塩または４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアミン二塩酸塩とを０．３ｍＬのＤＭＳＯに溶解した混合物に、分割しながら、Ｅｔ3Ｎを添加してｐＨ７〜７．５に調整し、その後１５分間で０．０３ｍｍｏｌのＰｙＢＯＰ−試薬を添加した。その反応混合物を室温で１時間、ＴＬＣの調節下 におけるＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：濃ＮＨ4ＯＨ（５：１：０．０１：０．０１）の系で撹拌した。つづく、ジエチルエーテル（〜３ｍＬ）の反応混合物への添加により油状の残渣が生じたので、それをジエチルエーテル（３ｍＬ×２）で連続的に振盪した。この油に５ｍＬのアセトンを添加したところ、アミドの黄色の沈殿物が形成された。その沈殿物を濾取し、アセトンで洗浄し、その後真空で乾燥して、適当なＮ−（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰ  ＨＰ−アミドまたは（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰ−ＤＭＡＥアミドを〜９０％の純度で（ＨＰＬＣデータ：それぞれＲｔ＝２１．４３（Ｃ）および２０．３９の（Ｂ）。ＴＬＣデータ：それぞれＲｆ＝０．４７およびＲｆ＝０．４３、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：濃ＮＨ4ＯＨ（５：１：０．０１：０．０１）産生した。
・    第３ステップ（Ｆｍｏｃ除去）
適当なＮ−（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰアミド（３０ｍｇ）をＤＭＳＯ（３ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（０．１ｍＬ）を添加した 。室温で２次亜ｋんご、ジエチルエーテル（〜７ｍＬ）を添加し、油状の残渣が形成され、ジエチルエーテル（７ｍＬ×２）で連続的に振盪した。アセトン（１０ｍＬ）を添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。化合物４４を塩酸塩として得た。化合物４４のメタノール溶液に、メタノール中０．１Ｎの塩酸を添加し、ｐＨ〜４にした。ジエチルエーテルを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。これらの２つの化合物の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・    Ｎ−（４−アミノメチルベンゾイル）Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミド、−ＨＰアミド、−ＤＭＡＥアミド（それぞれ化合物３５、４０、４６）（スキーム３、図１２、左側）。
【０１７４】
第１ステップ（Ｎ−［４−Ｆｍｏｃ−アミノメチル］ベンゾイル化）  ――  Ｎ−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチル・ベンゾイル）Ｓ４４ＨＰ
この誘導体は、化合物３８（第１ステップ）と同じ条件で得られた。４−Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノメチル安息香酸（８０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）とＳ４４ＨＰ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）とのＤＭＳＯ（３ｍＬ）溶液に、ｐＨ７に調整するためのＥｔ3Ｎ、およびＰｙＢＯＰ（９０ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を２０時間室温で保ち、それからジエチルエーテル（２００ｍＬ）を 滴下した。黄色の沈殿物を濾取し、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＨＣＯＯＨ（３：１：０．０１）の系におけるカラムクロマトグラフィ用のメルクＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ（０．０４０〜０．０６３ｍｍ）でのカラムクロマトグラフィにより精製して、Ｎ−（４−Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）ベンゾイルＳ４４ＨＰ（化合物４７）を、ＨＰＬＣデータ（Ｒｔ＝１８．１８、系Ｂ）、ＴＬＣ（Ｒｆ＝０．６１、Ｉ）によるところの純度〜９５％で産生した。
・    第２ステップ（Ｎ−［４−Ｆｍｏｃ−アミノメチル］ベンゾイルＳ４４ＨＰのアミド化）  ――  Ｎ−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチルベンゾイル）Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミド、−ＨＰアミドまたは−ＤＭＡＥアミド
この誘導体は、Ｎ−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチルベンゾイル）Ｓ４４ＨＰおよび適当なＤＭＡＰ−、ＨＰ−またはＤＭＡＥアミンから出発し、ＰｙＢＯＰ試薬を用い、化合物３８（第２ステップ）と同じ条件で得られた。その反応混合物を４時間撹拌した。ＨＰＬＣデータ：Ｎ−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチルベンゾイル）Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミド（Ｒｔ＝１５．８８、Ｂ；Ｒｆ＝０．２５、Ｉ）、Ｎ−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチルベンゾイル）Ｓ４４ＨＰ  ＨＰアミド（化合物１２）（Ｒｔ＝１７．１４、Ｂ；
Ｒｆ＝０．６０、Ｉ）、またはＮ−（４−Ｆｍｏｃ−アミノ・メチルベンゾイル）Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＥアミド（Ｒｔ＝１５．９５、Ｂ；Ｒｆ＝０．２４、Ｉ）から、その純度は８５〜９３％であった。
・    第３ステップ（Ｆｍｏｃ−除去）
この誘導体は、Ｎ−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチルベンゾイル）Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミド、−ＨＰアミドまたは−ＤＭＡＥアミドから出発し、化合物３８（第３ステップ）と同じ条件で得られた。これらの３つの化合物の分析データは、下記の表２にまとめられている。
・    Ｎ−Ｌ−リジルＳ４４ＨＰ  ＤＭＡＰ−アミド（化合物３３）（スキーム３、右側）
第１ステップ（アミド化）  ――  Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰ−アミド（化合物１１）
Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミドは、化合物３３（スキーム１、左側）について得られた。純度は〜９０％であった（ＨＰＬＣ）。
・    第２ステップ（ＤＭＡＰアミドのＮ−［Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノ］アシル化）  ――  Ｎ−（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰ−アミド
Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミド（０．０２ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）溶液に、α，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン（０．０４ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎを添加し（ｐＨ７〜７．５）、その後１５分間で０．０３ｍｍｏｌのＰｙＢＯＰ−試薬を添加した。その反応混合物を室温で１時間撹拌した。つづく、ジエチルエーテル（〜３ｍＬ）の反応混合物への添加により油状の残渣が生じたので、ジエチルエーテル（３ｍＬ×２）で連続的に振盪した。この油に５ｍＬのアセトンを添加したところ、アミドの黄色の沈殿物が形成された。その沈殿物を濾取し、アセトンで洗浄し、その後真空で乾燥して、Ｎ−（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＰアミドを〜 ９５％の純度（ＨＰＬＣデータ（Ｒｔ＝２２．０１、系Ｂ）による）産生した。
・    第３ステップ（Ｆｍｏｃ−除去）
この誘導体は、Ｎ−（Ｎα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジル）ＤＭＡＰアミド（スキーム３，第１ステップにより得られた）から出発し、化合物３８（第３ステップ）と同じ条件で得られた。これらの２つの化合物の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・    Ｓ４４ＨＰの一改変 誘導体
Ｎ−（４−アミノメチルベンゾイル）Ｓ４４ＨＰ（化合物４７）（スキーム４、図１３、Ｆｍｏｃ−除去を参照）を、Ｎ−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチルベンゾイル）Ｓ４４ＨＰ（スキーム３、第１ステップ）から出発し、化合物３８（第３ステップ）と同じ条件で得た。これらの２つの化合物の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・    Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）Ｓ４４ＨＰアミド（化合物４８）（代替法、スキーム５、図１４）
第１ステップ（Ｆｍｏｃ導入）  Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ４４ＨＰ
５００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）の粗製Ｓ４４ＨＰの、６ｍＬのＤＭＦ：ＭｅＯＨ（５：１）の撹拌溶液に、０．０５７ｍＬ（０．６５ｍｍｏｌ）のピリジンおよび３６０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃＯＳｕを分割しながら添加した。その反応混合物を室温で４時間撹拌した。つづく、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）の反応混合物への添加により、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ４４ＨＰの黄色の沈殿物が生じた。その沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。粗製のＮ−Ｆｍｏｃ−Ｓ４４ＨＰを、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：６：１：０．０５）の系におけるメルク・シリカゲルでのカラムクロマトグラフィにより精製して、〜３０％のＮ−Ｆｍｏｃ−Ｓ４４ＨＰを、ＨＰＬＣ（Ｒｔ＝２０．４９、系：ｐＨ２．６の０．０１ＭのＨ3ＰＯ4およびＭｅＣＮ、４０→８０％、３０分、ＴＬＣ０．３９（ＩＩＩ））によるところの純度９４％で産生した。
・    第２ステップ（アミド化）  Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＥアミド
１１５ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）のＮ−Ｆｍｏｃ−Ｓ４４ＨＰの、２ｍｌのＤＭＳＯの撹拌溶液に、ｐＨ７〜７．５に調整した、３７ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン塩酸塩およびＥｔ3Ｎを添加し、７８ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のＰｙＢＯＰを分割しながら添加した。その反応混合物のｐＨは、Ｅｔ3Ｎの添加により７〜７．５に保持した。その反応混合物を室温で１時間撹拌した。つづく、ジエチルエーテル（５ｍＬ）の反応混合物への添加により油状の残渣が生じたので、ジエチルエーテル（５ｍＬ）で連続的に振盪した。アセトン（１０ｍＬ）の添加により黄色の沈殿物が生じたので、それを濾取し、アセトンで洗浄し、乾燥して、ＨＰＬＣデータ（Ｒｔ＝１４．５０、系Ａ）によるところの純度〜９２％のＮ−Ｆｍｏｃ−Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＥアミドができた。
・    第３ステップ（Ｆｍｏｃ−除去）
この誘導体（化合物４８）は、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ４４ＨＰ  ＤＭＡＥアミドから出発し、化合物３８（第３ステップ）と同じ条件で得られた。この化合物の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・    純粋な化合物１：粗製化合物１のサンプルから出発した化合物１の精製（スキーム６、図１５）
第１ステップ（Ｆｍｏｃの導入および精製）  Ｎ−Ｆｍｏｃ−化合物１
２０００ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）の粗製化合物１（ＨＰＬＣデータ（系Ｂ）により、化合物１−８１．５％、Ｓ４４ＨＰ−８．２７％および同定されていない不純物〜１０％を含む）の、４０ｍＬのＤＭＳＯの撹拌溶液に、Ｅｔ3Ｎを添加してｐＨ７〜７．５に調整し、１４００ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃＯＳを分割しながら添加したが、その反応混合物のｐＨは、Ｅｔ3Ｎの添加により７〜７．５に保持した。その反応混合物を室温で２時間撹拌した。つづく、ジエチル・エーテル（２００ｍＬ）の反応混合物への添加により油状の残渣が生じたので、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ×３）で連続的に振盪した。５０ｍＬのアセトンをこの残渣に添加した後、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）を添加すると、黄色の沈殿物ができた。この沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥して、２２００ｍｇの粗製Ｎ−Ｆｍｏｃ−化合物１を産生し、これをＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：２５％ＮＨ4ＯＨ（１３：６：１：０．０５）の系におけるメルク・シリカゲルでのカラムクロマトグラフィにより精製して、ＨＰＬＣ（Ｒｔ＝１８．４４、系Ｃ）によるところの純度８６％の、６５０ｍｇ（〜３０％）のＮ−Ｆｍｏｃ−化合物１を産生した。
・    第２ステップ（Ｆｍｏｃ−除去）
Ｆｍｏｃ−化合物１（４００ｍｇ）をＤＭＳＯ（６０ｍＬ）に溶解し、１５℃のピペリジン（０．２ｍＬ）を添加した。１５℃で２時間後、ジエチルエーテル（〜５０ｍＬ）を添加した；油状の残渣が形成され、ジエチルエーテル（５０ｍＬ×３）で連続的に振盪した。アセトン（１０ｍＬ）およびジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥して、３００ｍｇの純粋な化合物１を産生した。ＨＰＬＣ用のその純粋な化合物１の一部を、塩酸塩として得た。化合物１（塩基）のメタノール溶液に、ｐＨ〜４のための、メタノール中０．１ＮのＨＣｌを添加した。ジエチルエーテルを添加すると黄色の沈殿物が生じ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥し、ＨＰＬＣデータ（塩酸、Ｒｔ＝１１．３７、系Ａ）によるところの純度は９２．１％であった。
・    化合物１の一改変誘導体（スキーム７、図１６）
Ｎ−フルクトピラノシル−化合物１（化合物４９）（アマドリ転位）
Ｄ−グルコース（０．０８６ｍｍｏｌ）を化合物１（０．０４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に添加した。その反応混合物を２０時間３７℃に保持した。それから、その反応混合物にジエチルエーテル（５０ｍＬ）を滴下した。得られた沈殿物を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。粗製化合物（ＨＰＬＣデータによるところの純度は８５〜９０％であり、塩を含有する）を、セファデックスＧ−２５（ファルマシア・ファイン・ケミカルズＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）でのカラムクロマトグラフィにより精製した。カラムは水を使用して実行した。画分の純度はＴＬＣ、系ＩＶによって調節した。所望の化合物を含んでいる画分を収集し、その溶液を濃縮した。アセトンを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、アセトンで洗浄し、真空で乾燥した。化合物４１を塩酸塩として得た。化合物４９のメタノール溶液に、ｐＨ〜４のための、メタノール中０．１ＮのＨＣｌを添加した。ジエチルエーテルを添加すると黄色の沈殿物が生じ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。Ｎ−フルクトピラノシル−化合物１（化合物４９）の分析データは、下記の表２にまとめられている。
・    Ｎ−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンジル）化合物１（化合物５０）（還元的Ｎ−アルキル化）
４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（０．０６５ｍｍｏｌ）および化合物１（０．０２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を２時間３７℃に保ち、それからＮａＢＨ3ＣＮ（４．１ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を２０時間３７℃に保持した。ジエチルエーテル（１０ｍＬ）を添加すると油状の残渣が生じたので、それをジエチルエーテル（１０ｍＬ×２）で連続的に振盪した。アセトン（１０ｍＬ）を添加したところ、黄色の沈殿物が形成された。その沈殿物を濾取し、ジエチルエステルで洗浄し、乾燥した。塩を含有する粗製化合物を、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：６：１：０．１）の系を用いたメルク・シリカゲルでのカラムクロマトグラフィにより精製した。画分の純度はＴＬＣ、系ＩＶによって調節した。所望の化合物を含んでいる画分を収集し、その溶液を濃縮した。アセトンを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、アセトンで洗浄し、真空で乾燥した。Ｎ−（４−Ｎ，Ｎ−ジ−メチルアミノベンジル）化合物１（化合物５０）の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・    Ｎ−Ｌ−リジル−化合物１（化合物５１）
第１ステップ（Ｎ−［Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノ］アシル化）
化合物１（５０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の乾燥したＤＭＦ（１ｍＬ）の溶液を１０℃に冷却し、それからＥｔ3Ｎ（７．５μｌ、０．０５５ｍｍｏｌ）およびＮα，Ｎε−ジ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン  Ｎ−オキシスクシンイミドエステル（５７ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物をこの温度で１時間撹拌した。反応の流れは、ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（６：１）の溶媒系におけるＴＬＣによって調節した。ジエチルエーテル（〜５ｍｌ）を反応混合物に添加すると黄色の沈殿物が生じたので、これを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥し、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィにより精製した（ＭｅＯＨ  ０→１０％の勾配を伴うＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ系）。所望の化合物を含んでいる画分を収集し、その溶液を濃縮し、アセトンを添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、アセトンで洗浄し、真空で乾燥した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６（ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ  ６：１）。ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１３．０８（０．２％ＨＣＯＯＮＨ4  ｐＨ４．５およびＭｅＣＮ：７５→９０％、２０分、９０→９０％、１０分）。
・    第２ステップ（Ｆｍｏｃ−除去）
ＤＭＳＯ／ＭｅＯＨ  １０：１（１ｍＬ）中の単離した黄色の固体（２２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）に、ピペリジン（４．５μｌ、０．０４５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３０分間撹拌した後に、ジエチルエーテル（〜３ｍＬ）を添加した；油状の残渣が形成され、ジエチルエーテル（３ｍＬ×２）で連続的に振盪した。アセトン（２ｍＬ）を添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。Ｎ−Ｌ−Ｌｙｓｙｌ−化合物１（化合物５１）の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・    Ｎ，Ｎ−ジ−（３−アミノプロピル）−化合物１(化合物５２)
第１ステップ（還元的Ｎ−アルキル化）
Ｎ−Ｆｍｏｃ−３−アミノプロピオンアルデヒド（１６０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）および化合物１（１００ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＮａＢＨ3ＣＮ（３４ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を２０時間３７℃に保ち、それからジエチルエーテル（２００ｍＬ）に滴下した。黄色の沈殿物を濾取し、直線濃度勾配システムＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＨＣＯＯＨ（３：１：０．０１）→ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ：ＨＣＯＯＨ（１３：６：１：０．１）におけるカラムクロマトグラフィ用のメルクＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ（０．０４０〜０．０６３ｍｍ）でのフラッシュクロマトグラフィにより精製し、Ｎ，Ｎ−ジ−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−３−アミノプロピル）化合物１の黄色の沈殿物を産生した。ＨＰＬＣデータ：Ｒｔ＝２７．４３（Ｃ）。
・    第２ステップ（Ｆｍｏｃ−除去）
Ｎ，Ｎ−ジ−［３−（Ｎ−Ｆｍｏｃ）−アミノプロピル］−Ｓ４４ＨＰのＤＭＳＯ（３ｍＬ）溶液に、ピペリジン（０．１ｍＬ）を添加した。室温で２時間後、ジエチルエーテル（〜７ｍＬ）を添加し、油状の残渣が形成され、それをジエチルエーテル（７ｍＬ×２）で連続的に振盪した。アセトン（１０ｍＬ）を添加すると黄色の沈殿物ができ、それを濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。Ｎ，Ｎ−ジ−（３−アミノプロピル）化合物１（化合物５２）の分析データは、上記の表４にまとめられている。
・  化合物１の塩
Ｌ−アスパラギン酸塩（５５）、化合物１  Ｌ−グルタミン酸塩（２９）、Ｄ−グルタミン酸塩（５４）
化合物１（１３ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を０．２ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、それから対応するアミノ酸（０．０１５ｍｍｏｌ）の０．１ｍｌの水溶液を添加した。その反応混合物を室温で１５分間保持した。ジエチルエーテル（〜２ｍｌ）を反応混合物への添加により油状の残渣が生じたので、それをジエチルエーテル（２ｍｌ×２）で連続的に振盪した。３ｍｌのアセトンをこの油に添加すると塩の黄色の沈殿物が形成された。その沈殿物を濾過し、アセトンで洗浄し、その後真空で乾燥した。
・    メチルスルホン酸塩（５６）、ジクロロ酢酸塩（５７）
対応する酸（０．０１５ｍｍｏｌ）を０．１ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、それから化合物１（１３ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の０．１ｍｌのＤＭＳＯ溶液に添加した。その反応混合物を室温で５分間保持した。ジエチルエーテル（〜２ｍｌ）の反応混合物への添加により油状の残渣を生じたので、それをジエチルエーテル（２ｍｌ×２）で連続的に振盪した。３ｍｌのアセトンをこの油に添加すると塩の黄色の沈殿物が形成された。その沈殿物を濾過し、アセトンで洗浄し、その後真空で乾燥した。
・    化合物１の塩酸塩（５３）
化合物１（１３ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の０．２ｍｌのＤＭＳＯの溶液に、０．１５ｍｌ（０．０１５ｍｍｏｌ）の０．１Ｎ  ＨＣｌの水溶液を添加した。その反応混合物を室温で５分間保持した。ジエチルエーテル（〜２ｍｌ）を反応混合物への添加により油状の残渣が生じたので、それをジエチルエーテル（２ｍｌ×２）で連続的に振盪した。３ｍｌのアセトンをこの油に添加すると塩の黄色の沈殿物が形成された。その沈殿物を濾過し、アセトンで洗浄し、その後真空で乾燥した。
【０１７５】
すべてのサンプルは、約９０％の収率で得られ、水溶性であった。
・  変化させたおよび毒性の測定
抗真菌性感受性研究（１）
酵母および糸状菌（カビ）の抗真菌性感受性テストは、それぞれ、ＮＣＣＬＳ文書Ｍ２７−Ａ［Reference method for Broth Dilution Antifungal Susceptability Testing of Yeasts、ISBN 1-56238-328-0、ペンシルバニア、１９９７年］およびＭ３８−Ａ［Reference method for Broth Dilution Antifungal Susceptability Testing of Filamentous Fungi: Approbed Standard、ISBN 1-56238-470-8、ペンシルバニア、２００２年］を用いて測定された。
・    媒体およびバッファ  この研究では、Ｌ−グルタミンおよびフェノールレッドを含み、重炭酸ナトリウムを含まず、０．２％グルコース（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、オハイオ、米国）を補充し、０．１６５Ｍのモルフォリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ；ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ、ニュージャージー、米国）で緩衝した、ｐＨ７．０のＲＰＭＩ  １６４０培地を用いた。
・    抗真菌剤  まず最初に、化合物を初期濃度１６００μｇ／ｍＬでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶化した。同じ溶媒の原液から希釈液の系列（１６００〜３．１３μｇ／ｍＬ）を調製した。それから、これらのＤＭＳＯ溶液を試験液で５０倍（最初に１０倍、それから５倍）に希釈した。最後に、それらを接種するときに２倍に稀釈して、最終的な溶媒濃度を１％にした（抗真菌剤の最終的な濃度は１６〜０．１３μｇ／ｍＬであった）。溶液は使用の直前に調製した。
・    微生物  感受性テストに用いた微生物は以下の通りだった：Candida albicans ATCC 14053、Cryptococcus humicolus ATCC 9949、Aspergillus niger ATCC 16404およびFusarium oxysporum VKM F-140 (=CMI, IMI 90473）。微生物は、ジャガイモ・グルコース寒天斜面上、５０％のグリセリン溶液中、−７０℃で保管した。短時間の保管の後、保存株を寒天斜面上に４℃で保管した。酵母の培養物 を、サブロー・グルコース（ＳＡＢ）寒天上で二次培養し、２４時間３５℃で（Candida albicans）または４８時間２５℃で（Cryptococcus humicolus）培養して、新たに育成した純粋な培養物を得た。カビの培養物は、ジャガイモ・グルコース寒天上で二次培養し、７日間３５℃で（Aspergillus niger）または２日間３５℃、その後５日間２５℃で（Fusarium oxysporum）培養し、最大の胞子形成を確実なものとした。
・    植菌物の調製
酵母用に、無菌の０．８５％の食塩水に培養物のコロニーを懸濁して、出発植菌物を調製した。得られた懸濁液をボルテックスし、５３０ｎｍにおける分光光度計の、０．５マクファーランド（１×１０６〜５×１０６  ＣＦＵ／ｍＬ）の濁度に一致するよう調整した。保存酵母懸濁液を培地で１：１０００に稀釈して、２回の試験の植菌物を得た（１×１０３〜５×１０３  ＣＦＵ／ｍＬ）。
【０１７６】
カビ用に、成熟した菌類のコロニーを無菌の０．８５％の食塩水で覆い、穏やかにこすって、保存懸濁液を調製した。１％（ｖ／ｖ）の湿潤剤Ｔｗｅｅｎ  ２０を、Aspergillus inoculumの調製用の食塩水に添加した。最後に、その懸濁液を１５秒間ボルテックスして細胞のかたまりを破壊し、それから４層の滅菌ガーゼを通して濾過した。分生胞子の懸濁液の密度を５３０ｎｍで測定し、Aspergillus nigerは０．０９〜０．１１に、Fusarium oxysporumは０．１５〜０．１７に調節した。これらの懸濁液を標準培地で１：５０に稀釈した。その１：５０の植菌物希釈液は、２×およそ０．４×１０４〜５×１０４  ＣＦＵ／ｍＬに必要な密度に相当した。
【０１７７】
植菌物定量化は、植菌物の希釈液をサブロー・グルコース寒天上に撒いて、ミリリットル当たりＣＦＵの生存数を決定することにより行った。
・    微量希釈テクニック
無菌９６穴平底のマイクロ滴定プレートを試験に用いた。１００μｍの稀釈した植菌物を、１００μｌの化合物の二重希釈液が入っている各微量希釈のウェルに分配した。薬剤フリーおよび酵母／カビフリーのコントロールも含まれていた。微量希釈トレイを、かき混ぜずに３５度℃（Candida albicansおよびカビ）または２５度℃（Cryptococcus humicolus）でインキュベートし、目視可能な増殖の有無を観察した。以下の基準を用いて、価格ウェルについて０から４の数字のスコアを付けた：０＝光学的に清澄または増殖なし、１＝わずかに増殖（増殖コントロールの２５％）、２＝増殖の顕著な低下（増殖コントロールの５０％）、３＝増殖のわずかな低下（増殖コントロールの７５％）、４＝増殖の低下なし。最小阻害濃度（ＭＩＣｓ）は４８時間の時点で読み取った。
・    試験した化合物の各々のＭＩＣは、微生物のいかなる目視可能な増殖をも抑制しうる抗真菌剤の最低濃度として定義した。場合によっては剤の間のわずかな違いを説明するために、カビのＭＩＣは追加的に、スコア＝１（増殖コントロールの２５％）についての最低限の濃度として定義した。結果を下記の表５に示す。
【０１７８】
【表５】
2010531865.tif 000034
【０１７９】
・    この結果は、本発明の化合物が抗真菌活性を有することを示してる。より具体的には、これらの試験は、多くのナイスタチン誘導体がアンホテリシンＢおよびＳ４４ＨＰに匹敵する抗真菌活性を有することを示唆している。
・    抗真菌性感受性の研究（２）
いくつかのナイスタチン誘導体の変化させたをさらに調査した。研究（１）において用いた方法は、変化させたの試験について国際的に認められている方法であるが、あまり感度は高くないため、互角の活性を有する化合物を容易には区別できない。したがって、多くのナイスタチン誘導体の変化させたを、より感度が高くなるよう設計した方法で決定した。
・    ポリエンマクロライドの生理活性を更に試験するために用いた供試生物は、ＮａＣｌを含まない（１ウェルにつき１０００ｃｆｕの植菌物を含む）１２０μｌの標準Ｍ１９培地および３０μｌの希釈したポリエンマクロライド・サンプルで増殖させた、Candida albicans ATCC 10231である。抗生物質を、供試生物の増殖を完全に抑制する結果から全く抑制しない結果までを生み出す濃度範囲を確保する系列で、ＭｅＯＨで希釈した。抗生物質の希釈液を含む供試生物培養物を、３０℃で振盪せずに９６穴マイクロタイタープレート中でインキュベートし、１２、１４および１６時間後に、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓマイクロタイタープレートリーダー上で、ＯＤ490として増殖を測定した。ＯＤを抗生物質の濃度に対してプロットし、回帰曲線の５０％成長阻害からＭＩＣ50を推定した。
【０１８０】
結果を下記の表６に示す。
【０１８１】
【表６】
2010531865.tif 000035
【０１８２】
・    この結果から、多くの本発明のナイスタチン類似体が、アンホテリシンＢおよびＳ４４ＨＰの両方と比較して、改良された変化させたを実際に有することが確認できる。
・    化合物１の塩の変化させた（表７）
以下の水溶性塩が試験された：
化合物１の塩酸塩（５３）、
化合物１のＬ−グルタミン酸塩（２９）、
化合物１のＤ−グルタミン酸塩（５４）、
化合物１のＬ−アスパラギン酸（５５）、
化合物１のジクロロ酢酸塩（５７）。
【０１８３】
【表７】
2010531865.tif 000036
【０１８４】
・  化合物誘導体の抗真菌活性（表８および９）
【０１８５】
【表８】
2010531865.tif 000037
【０１８６】
化合物５１は、親の抗生物質よりわずかに高い抗真菌活性を有する、この系統で最も有効な誘導体である。
【０１８７】
【表９】
2010531865.tif 000038
【０１８８】
in vitroでの毒性の研究
さまざまなナイスタチン誘導体の毒性を、２および５μｇ／ｍＬ、ならびに２５μＭで試験した。
【０１８９】
化合物を５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯ中で異なる濃度を有する０．１ｍＬのサンプルを調製した。そのサンプルを、２．５％のウマ血液を含有する０．９ｍＬのＰＢＳバッファ（ＰＢＳ−ＨＢ、氷上に保持）と混合し、かき混ぜずに３０分間３７℃でインキュベートした。
【０１９０】
細胞を５０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化し、溶血をＯＤ545の測定により評価した。１００％の溶血を、蒸留水中２．５％のウマ血液の懸濁液から得られたＯＤ545値として定義した。
【０１９１】
結果を下記の表１０〜１２に示す。
【０１９２】
【表１０】
2010531865.tif 000039
【０１９３】
【表１１】
2010531865.tif 000040
【０１９４】
【表１２】
2010531865.tif 000041
【０１９５】
これらの結果は、本発明の化合物がＳ４４ＨＰおよびアンホテリシンＢよりも毒性が著しく低いことを示す。したがって、本発明の化合物が副作用を起こすことなくより多い量で使用することができるため、非常に有利である。
・    化合物１および１１などのin vivoでのテスト
動物．ロシア医科学アカデミー（Russian Academies of Medical Science: RAMS)の中央農場”Kryukovo”から譲り受けた、体重２０〜２２ｇの、雑種第一代（Ｃ５７Ｂｌ／６ｘＤＢＡ／２）Ｆ１  Ｂ６Ｄ２Ｆ１の雄のマウスを用いた。動物は、プラスチック・ケージ内の飼育場で〔vivarium〕（硬材の寝床を備え、環境調整された条件にある：２４±１℃、１２／１２時間の明／暗サイクル）、容易に近づける飲料水（自由に）とともに、レンガ状の飼料の標準的な食餌により維持した。２週間の検疫期間の後、健康な動物を実験研究に用いた。
感染因子．Candida albicans（14053 ATCC株）を用いた。
抗真菌剤．化合物１および１１（ならびにその他の化合物）の溶液を即座に調製し、光の進入を避けるために、濃色のガラス・バイアル内で保持した。溶液は、以下の通りに調製した：乾燥した抗生物質（５ｍｇ）を、無菌のガラス・バイアル内で、乾燥したデオキシコール酸ナトリウム（４．１ｍｇ）と混合した。１０ｍＬのリン酸緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4−１．５９ｇ；Ｎａ2ＨＰＯ4−０．９６ｇ；Ｈ2Ｏ−１００ｍＬまで）をその混合物に添加し、その懸濁液を直ぐに、均一の懸濁液が形成されるまで、１０分間激しく振盪した。得られた懸濁液（２ｍＬ）を新しい無菌のガラス・バイアルに入れ、６ｍＬの５％の中性無菌グルコース溶液を添加し、得られた溶液（０．１２５ｍｇ／ｍＬ）を静脈内投与に用いた。
【０１９６】
アンホテリシンＢおよびＳ４４ＨＰの製剤も、同様に調製した。
・  急性毒性
化合物１および１１（ならびにその他の化合物）の急性毒性を、アンホテリシンＢおよびＳ４４ＨＰとともに、測定した。
【０１９７】
抗生製剤を、溶液の調製後１〜１．５時間以内に、マウスの尾静脈に単独で注射した。注入の速度は、１分につき０．５ｍＬを超えないものとした。各抗生物質は、０％〜１００％の致死性および３つの中間投与量の最小値の結果となる投与量の範囲内で用いた。動物はランダムにグループ分けして、各群６匹のマウスを含むようにした。毒性を特徴付ける投与量ＭＴＤおよび５０％致死量（ＬＤ50）は、統計分析プログラム「ＳｔａｔＰｌｕｓ−３．５．０．−２００５」で、リッチフィールド−ウィルコクソン（J Pharmacol Exp Ther 96:99）による「プロビット分析」の方法により算出した。結果を下記表１３に示す。
【０１９８】
【表１３−１】
2010531865.tif 000042
【０１９９】
・  in vivoでの抗真菌活性
動物を、１００万ＣＦＵ／マウス（体積０．１ｍＬ）の投与量で、Candida albicans培養物を静脈を通じて感染させた。感染から３０分後に、抗真菌剤を、０．２ｍＬの体積で（０．２ｍＬ／３０秒の速度で）様々な投与量で、静脈からマウスに導入した。各投与量は、感染の日を含む４日間（０、１、２および３日）、毎日投与した。
・    コントロールとして、無処理マウス群（同じ方法でCandida albicansに感染している）が含まれている。また、（抗真菌剤製剤と同じ量である）０．２ｍＬの溶媒（リン酸緩衝液＋５％グルコース（１：１））を静脈内に投与した、非感染動物の「プラセボ」群も含まれている。
・  「プラセボ」群のいずれにも活性は確認されなかった。また、非感染動物からはCandida albicansは全く見つからなかった。
・  実験の５日目に、マウスを計量し、安楽死させた（殺した）。ついで、無菌条件で、各マウスにおけるCandida albicansの負荷を、腎臓由来の生育可能なホモジネートを計数することにより、決定した。腎臓は、無菌的に取り出して計量してから、磁器製の乳鉢内で無菌の綱玉ですりつぶした。得られた懸濁液の希釈液を調製し、寒天サブローを入れたペトリ皿上に撒いて、３５℃の温度で２４時間インキュベートした。発生したCandida albicansのコロニーを計数してから、１ｇの腎臓組織に基づいてその量を算出した。
・    統計分析を、Microsoft Office Excel 2003を用いて行った。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−基準〔t-criterion〕による比較においてＰ≦０．０５を有意差とした。
・    結果を下記表１４および図９に示す。
【０２００】
【表１４】
2010531865.tif 000043
【０２０１】
マウスのカンジダ血症モデルにおける化合物２９，５１，４１，４８の特異的活性の研究
動物．実験において、ロシア医科学アカデミー（Russian Academies of Medical Science: RAMS)の中央農場”Kryukovo”から譲り受けた、体重１８〜２０ｇの、雑種第一代（Ｃ５７Ｂｌ／６ｘＤＢＡ／２）Ｆ１（Ｂ６Ｄ２Ｆ１）の雌のマウスを用いた。動物は、プラスチック・ケージ内の研究所の飼育場で（硬材の寝床を備えた、環境調整された室内：２４±１℃、１２／１２時間の明／暗サイクル）、容易に接近できる飲料水（自由に）とともに、レンガ状の飼料の標準的な食餌により維持した。２週間の検疫の後、健康な動物を実験研究に用いた。
・    感染因子 としてCandida albicans（14053 ATCC株）を用いた。試験した製剤 は、化合物２９、５１、４１、４８であった。比較した製剤は、アンホテリシンＢ（準ピン）であった。試験した製剤の溶液は、顧客が指定した手法で即座に調製した。
・    実験の記載
動物は３匹のマウスを収容し、０．１ｍｌの体積中１００万ＣＦＵ／マウスの投与量で、Candida albicans培養物を静脈を通じて感染させた。全ての実験において、Candida albicansの投与量は一定に保たれていたことに留意する必要がある。感染後３０分以内に、マウスに、０．２ｍｌの体積中（０．２ｍＬ／３０秒の速度で）対応する投与量で、試験する製剤の最初の静脈内への導入を行った。
・  実験は、各実験で一回の投薬（アンホテリシンおよび試験する製剤の両方について用いた）、感染の日から４日間の間（０，１，２および３日目）毎日投薬が入るように計画した。各実験には、無処理の、Candida albicansに感染した動物群が含まれている。また、健全な（感染していない）動物の「プラセボ」群も含まれており、それらには（医薬製剤 と同じ量である）０．２ｍＬの溶媒（リン酸緩衝液＋５％グルコース（１：１））を静脈内に注射した。「プラセボ」の活性に関するデータは、いかなる活性をも示さなかった。非感染動物からはCandida albicansは全く見つからなかった。
・  曝露後 の実験の５日目に、マウスを計量し、安楽死させた（殺した）。ついで、無菌条件で、Candida albicansの負荷を、腎臓由来の生育可能なホモジネートを計数することにより決定した。無菌的に取り出して計量した腎臓を、磁器製の乳鉢内で無菌の綱玉ですりつぶし、得られた懸濁液の稀釈を行い、寒天サブローを入れたペトリ皿上に撒き、３５℃の温度で４８時間インキュベートし、その後、発生したCandida albicansのコロニーを計数し、１ｇの腎臓組織に基づいてその量を算出した。第１の希釈液は１０-1であった。この培養において０の結果は５ＣＦＵ／ｇまで認容する。
・  調査する製剤の評価の基礎となる基準は、アンホテリシンＢの最大効果が担った。
・    コンピュ−タプログラムMicrosoft Office Excel 2003の助けを借りて統計処理を行った。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−基準による比較においてＰ≦０．０５を、平均値に有意と認められる差があるとした。 
・    受け取った結果を表１５に示す。アンホテリシンＢは、研究された投与量の最も高いところ（１． ２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ＭＴＤからおよそ ６２％）。で、活性の基準により認められる最大活性を示した
【０２０２】
【表１５】
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【０２０３】
遺伝子操作に基づく更なる化合物の合成
さまざまに更に操作可能な主鎖構造を調製した。上記の化学的作用を用いて、さまざまな異なる官能基を、遊離ＣＯＯＨおよびアミン基に取り付けられることができる。これらのベ−ス構造はすべて、本発明のさらに好ましい化合物を形成する（水素原子は示されていない）。
【０２０４】
【化１５】
2010531865.tif 000045
【０２０５】
ナイスタチンＰＫＳのＥＲ５およびＤＨ１５領域の不活性化、Ｃ−１０ヒドロキシル化なし
【０２０６】
【化１６】
2010531865.tif 000046
【０２０７】
ナイスタチンＰＫＳのＥＲ５およびＫＲ１６領域の不活性化
【０２０８】
【化１７】
2010531865.tif 000047
【０２０９】
ナイスタチンＰＫＳのＥＲ５およびＤＨ１５領域ならびにＮｙｓＮモノオキシゲナーゼの不活性化、Ｃ−１０ヒドロキシル化なし
【０２１０】
【化１８】
2010531865.tif 000048
【０２１１】
ナイスタチンＰＫＳのＥＲ５領域ならびにＮｙｓＮおよびＮｙｓＬモノオキシゲナーゼの不活性化、Ｃ−１０ヒドロキシル化なし
【０２１２】
【化１９】
2010531865.tif 000049
【０２１３】
ナイスタチンＰＫＳのＥＲ５およびＫＲ１４領域ならびにＮｙｓＮモノオキシゲナーゼのの不活性化
【０２１４】
【化２０】
2010531865.tif 000050
【０２１５】
ナイスタチンＰＫＳのＥＲ５領域およびＮｙｓＬモノオキシゲナーゼの不活性化
【０２１６】
【化２１】
2010531865.tif 000051
【０２１７】
ナイスタチンＰＫＳのＥＲ５およびＫＲ１６領域ならびにＮｙｓＮモノオキシゲナーゼの不活性化
・    変異体Ｂ２の構築
ＫＲ１６不活性化のための遺伝子置換ベクターの構造
組換えファ−ジＮ２０（Brautaset et al., 2000）の全１４ｋｂの挿入断片をＸｂａＩにより切り出し、プラスミドｐＧＥＭ−３ｚｆにクローニングして、ｐＬ２０Ｘを産生した。このプラスミドから、３．７ｋｂのＢａｍＨＩ断片を切り出し、ｐＧＥＭ−３ｚｆに連結して、プラスミドｐＧＥＭＢ３．７とした。そして、０．８ｋｂのＤＮＡ断片（ＫＲ１６活性部位残基Ｙ３４０４を含む）を、以下のプライマを用いてｐＧＥＭＢ３．７からＰＣＲ増幅した。
【０２１８】
【数７】
2010531865.tif 000052
【０２１９】
ＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（２つのＰＣＲプライマにおいて下線が引かれている新たな認識部位）によって末端消化し、ｐＬＩＴＭＵＳ２８の対応する部位にクローニングして、ｐＬＩＴＰＨ０．８を産生した。後者のプラスミドは、以下の変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いた、ＫＲ１６活性部位の部位特異的変異のテンプレートとして役立てた。
・  
【数８】
2010531865.tif 000053
【０２２０】
・  変異したヌクレオチドを太字で示し、導入された新たなＢｓｔＢＩ認識部位に下線を引いた。これらの２つのオリゴヌクレオチドを用いて、ＫＲ１６活性部位のＴｙｒをＰｈｅに置換し、同時に次の下流のＡｌａをＧｌｕで置換して、二重変異体ＹＡ３４０４ＦＥを産生する。正しい変異を有するプラスミドをＢｓｔＢＩ消化により確認し、クローニングされた挿入断片全体の配列決定をして、他のいかなる望ましくない変異をも解明した。正しく変異したプラスミドから、６２７ｂｐのＢｐｕ１０２Ｉ／Ｂｐｕ１０Ｉ断片を切り出し、プラスミドｐＧＥＭＢ３．７の対応する断片を置換するために用いて、プラスミドｐＧＥＭＢ３．７ｍを産生した。後者のプラスミドから、３．７ｋｂの挿入断片全体をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより切り出し、ｐＳＯＫ２０１の３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボ−ンと共に連結して、遺伝子置換ベクターｐＫＲ１６ｍを産生した。
・    遺伝子置換
後者のベクターを、二重相同組み換えによって、ｎｙｓＡ欠損S.noursei変異体ＧＧ５０７３ＳＰ（Borgos et al., 2006）に導入した。他で記載したように（Brautaset et al., 2003）、in transでｎｙｓＡ遺伝子を導入することによりポリエンの生産を回復させる前に、正しい染色体ＫＲ１６変異を、サザンブロットとともにＰＣＲ＋ＢｓｔＢＩ消化を用いて検証した。得られた変異体をＢ２と命名した。
・    変異体Ｂ７の構築
プラスミドｐＫＯｎｙｓＮ−ＣＬ３４６ＡＳ（ＰＮＡＳ−ｍａｎｕｓ参照）を、二重相同組み換えによって、ｎｙｓＡ欠損Ｂ２に導入した。他で記載したように（Brautaset et al., 2003）、in transでｎｙｓＡ遺伝子を導入することによりポリエンの生産を回復させる前に、正しい染色体ｎｙｓＮ変異を、サザンブロットとともにＰＣＲおよびＮｈｅＩ消化を用いて検証した。得られた変異体をＢ７と命名した。
・    変異体Ｂ５の構築
ＫＲ１４不活性化のための遺伝子置換ベクターの構築
プラスミドｐＬ２０Ｘの４．０のＢｃｌＩ／ＥｃｏＲＩ断片（上記の計画Ｂ２参照）を切り出し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩにより消化したｐＧＥＭ−３ｚｆに連結して、ｐＢＥ４．０を産生した。１ｋｂの断片を、以下のプライマを用いて、後者のプラスミドからＰＣＲ増幅した。
【０２２１】
【数９】
2010531865.tif 000054
【０２２２】
ＰＣＲ断片をＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（新たな認識部位はプライマにおいて下線が引かれている）により消化し、ＬＩＴＭＵＳ２８に連結して、ｐＬＩＴＨＳ１．０を産生した。後者のプラスミドは、以下の変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用した、ＫＲ１４活性部位の部位特異的変異のテンプレートとして用いた。
・  
【数１０】
2010531865.tif 000055
【０２２３】
・  変異したヌクレオチドを太字で示し、導入された新たなＢｓｔＢＩ認識部位に下線を引いた。これらの２つのオリゴヌクレオチドを用いて、ＫＲ１４活性部位のＴｙｒをＰｈｅに置換し、同時に次の下流のＡｌａをＧｌｕで置換して、二重変異体ＹＡ９１９７ＦＥを産生する。正しい変異を有するプラスミドをＢｓｔＢＩ消化により確認し、クローニングされた挿入断片全体の配列決定をして、他のいかなる望ましくない変異をも解明した。正しく変異したプラスミドから、０．７ｋｂのＦｓｅＩ／ＡｓｃＩ断片を切り出し、プラスミドｐＢＥ４．０の対応する断片を置換するために用いて、ｐＢＥ４．０ｍｕｔを産生した。後者のプラスミドから、４．０ｋｂの挿入断片全体をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより切り出し、ｐＳＯＫ２０１の３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボ−ンと共に連結して、遺伝子置換ベクターｐＫＲ１４ｍを産生した。
・    遺伝子置換
後者のベクターを、二重相同組み換えによって、ｎｙｓＡ欠損S.noursei変異体ＧＧ５０７３ＳＰ（Borgos et al., 2006）に導入した。他で記載したように（Brautaset et al., 2003）、in transでｎｙｓＡ遺伝子を導入することによりポリエンの生産を回復させる前に、正しい染色体ＫＲ１６変異を、サザンブロットとともにＰＣＲ＋ＢｓｔＢＩ消化を用いて検証した。得られた変異体をＢＳＧ０１５と命名した。
【０２２４】
次に、ｎｙｓＮ不活性化ベクターｐＫＯｎｙｓＮ−ＣＬ３４６ＡＳ（ＰＮＡＳ−ｍａｎｕｓ参照）を、二重相同組み換えによって、ｎｙｓＡ欠損ＢＳＧ０１５に導入した。他で記載したように（Brautaset et al., 2003）、in transでｎｙｓＡ遺伝子を導入することによりポリエンの生産を回復させる前に、正しい染色体ｎｙｓＮ変異を、サザンブロットとともにＰＣＲおよびＮｈｅＩ消化を用いて検証した。得られた変異体をＢ５と命名した。
・    変異体Ｂ４の構築
ｎｙｓＬ不活性化のための遺伝子置換ベクターの構築
ｎｙｓＬ遺伝子置換インフレーム欠失プラスミドｐＮＬＤ１はすでに記載されており（VolokHaen et al., 2006）、このプラスミドの４．２ｋｂのクローニングされた挿入断片は、S. nourseiのｎｙｓＮ翻訳領域を含む。ｎｙｓＬ変異をｎｙｓＮ−ＣＬ３４６ＳＴ変異のバックグラウンドに導入するため、我々は、このプラスミドも同様にこのｎｙｓＮ変異を含むように改変しなければならなかった。これは次のようにして行った：プラスミドｐＳＯＫ２０１ｎｙｓＮ４．１−ＣＬ３４６ＳＴの１０１１ｂｐのＡｇｅＩ／ＦｓｐａＩ断片（２００７年５月のBiosergenの特許出願を参照）を切り出し、プラスミドｐＮＬＤ１の対応する断片を弛緩するために用いて、遺伝子置換プラスミドｐＮＬＤ２を産生した。
・    遺伝子置換
プラスミドｐＮＬＤ２を、二重相同組み換えによって、ｎｙｓＡ−欠損化合物１に導入した。他で記載したように（Brautaset et al., 2003）、in transでｎｙｓＡ遺伝子を導入することによりポリエンの生産を回復させる前に、正しい染色体ｎｙｓＬ変異を、サザンブロットとともにＰＣＲおよびＮｈｅＩ消化を用いて検証した。得られた変異体をＢ４と命名した。
・    Ｂ１およびＢ３
ＮｙｓＪのＤＨ１５活性部位Ｈｉｓ９６６の不活性化：
目的：ｎｙｓＪ  ＤＨ１５活性部位に部位特異的変異を導入して、ＤＨ１５領域に置換変異Ｈ９６６Ｆをもたらす。
・    手順：
−  ｐＬ２０ＸをＢｃｌＩ＋ＳｐｈＩで消化し、ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化したｐＧＥＭ１１−ｚｆに３．３３ｋｂの断片をクローニングする＝ｐＤＨ１５−Ａ。
【０２２５】
−  ｐＤＨ１５−ＡをＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、対応する部位ｐＧＥＭ３−ｚｆに３．３４ｋｂの断片をクローニングする＝ｐＤＨ１５−Ｂ。
【０２２６】
ｐＤＨ１５−Ｂテンプレートおよび以下の変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いて、部位特異的変異を成し遂げる。
【０２２７】
【数１１】
2010531865.tif 000056
【０２２８】
−  変異したヌクレオチドを太字で示す。この変異はこの位置において天然のＢｔｒＩ部位を破壊する。
【０２２９】
−  ＢｒｔＩ消化およびＤＮＡ塩基配列決定により正しい変異を確認する＝ｐＤＨ１５−Ｂｍｕｔ。
【０２３０】
−  ｐＤＨ１５−Ｂの１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片−１、ｐＤＨ１５−Ｂ由来の１．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ断片−２およびｐＤＨ１５−Ｂｍｕｔ由来のＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩ断片−３を単離し、３つの断片全てを、３．１ｋｂのｐＳＯＫ２０１のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバックボ−ンと共に連結する；ｐＤＨ１５−１２３。
・    −  S.nourseiに対する遺伝子置換を続行。
【０２３１】
−  正しいS.nourseiのＤＨ１５変異の検証。
【０２３２】
−  第１の組み換えは、全ＤＮＡをＮｏｔＩで消化した後に、ｐＤＨ１５−Ａの標識化した３．３３の挿入断片をプローブとして用いたサザンブロットにより、検証することができる。野生型は５．２＋８ｋｂのシグナルをもたらす一方、正しい第１の組み換え変異体（両方の理論上の異型）は５．２＋６．４＋８ｋｂのシグナルをもたらすだろう。
【０２３３】
−  第２の組み換え変異体は、以下のプライマを用いたＰＣＲにより分析することができる。
【０２３４】
【数１２】
2010531865.tif 000057
【０２３５】
上記ＰＣＲは、８１７ｂｐの産物をもたらすだろう。親株由来のそのＰＣＲ産物はＢｔｒＩにより消化することができ、３９２ｂｐおよび４２５ｂｐの断片をもたらすが、その一方で、変異体由来のＰＣＲ産物はＢｔｒＩで切断することができない。加えて、第２の変異体は、標識化した８１７ｂｐのＰＣＲ産物をプローブとして用いたサザンブロットにより検証することができる。ＢｔｒＩにより消化した親株のＤＮＡは、０．９５ｋｂ＋０．４５ｋｂのハイブリダイズした断片をもらすが、その一方で、変異体由来のＢｔｒＩ消化ＤＮＡは、１．４ｋｂのハイブリダイズした断片をもたらすだろう。
・    変異体Ｂ１の構造
ＤＨ１５変異体をｎｙｓＡ欠損ＧＧ５０７３ＳＰ株に導入し、正しい変異体はその後、ｎｙｓＡ遺伝子をin transで補完した。
・    変異体Ｂ３の構造
ｎｙｓＮ−ＣＬ３４６ＳＴ変異体をｎｙｓＡ欠損Ｂ１−Ｓ１の遺伝子のバックグラウンドに導入し、得られた正しい変異体株はｎｙｓＡ遺伝子をin transで補完して、変異体Ｂ３−１Ｓを産生した。
・    播種性カンジダ症の好中球減少マウスモデルにおけるアンホテリシンＢおよび新規Ｓ４４ＨＰ類似体のin vivoでの有効性
マウスは、シクロホスファミド一水和物（Ｆｌｕｋａ、ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ、シグマアルドリッチ、スイス）を腹膜内に２×１００ｍｇ／ｋｇ体重で、感染の１日前に注射することにより、好中球減少性にした。
【０２３６】
Candida albicansの播種感染は、３×１０5ＣＦＵ／ｍｌの植菌物を、好中球減少マウスの側方の尾静脈を介して、抗生物質の処置の開始の２時間前に注射することにより達成した。C. albicansの感染の排除における抗生物質の有効性を、４日間の処置（１日につき１回分）の後に、腎臓の真菌の負荷の評価により判定した。結果を図１７に示す。
・  アンホテリシンＢは、最大２ｍｇ／ｋｇ（ＭＴＤのすぐ下）の量で投与された。これらの結果は、化合物２８および化合物２９がアンホテリシンＢよりかなり良好なものであることを明らかに示している。なぜならば、
１）それらは、約５〜７倍低い急性毒性を示し、
２）それらは、好中球減少マウスモデルにおける播種性カンジダ症の処置において５〜１０倍の良好な有効性を示し、
３）アンホテリシンＢの溶解性が＜１ｍｇ／ｍｌであるのに対し、それらは５％のグルコースに溶解する（＞１０ｍｇ／ｍｌ）一方、アンホテリシンＢの溶解性は＜１ｍｇ／ｍｌであるためである。
・  化合物２５および化合物２６は、カンジダ症の好中球減少マウスモデルにおいて、アンホテリシンＢよりも活性が低いが、それらは非常に低い急性毒性を示すため（アンホテリシンＢより約２０倍低い）、依然として興味深い候補と考えられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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