(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉの化合物。
【化１】
0006401791.tif 000026
式中、
Ｒ１は水素又はメトキシであり、
Ｒ２はエチルであってＲ３はベンジルであるか、或いはＲ２はメチルであってＲ３はイソプロピルである。
【請求項２】
Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２はエチルであってＲ３はベンジルである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２がメチルであってＲ３がイソプロピルである、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２がエチルであってＲ３がベンジルである、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がメチルであってＲ３がイソプロピルである、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の式Ｉの化合物の調製に使用するための前駆体化合物であって、次の式ＩＩ前駆体化合物。
【化２】
0006401791.tif 000027
式中、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、請求項１乃至請求項５のいずれか１項でＲ１、Ｒ２及びＲ３について定義した通りであり、ＬＧは脱離基である。
【請求項７】
ＬＧが、クロロ、ブロモ、ヨード、トシレート（ＯＴｓ）、ノシレート（ＯＮｓ）、メシレート（ＯＭｓ）又はトリフレート（ＯＴｆ）である、請求項６記載の前駆体化合物。
【請求項８】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の式Ｉの化合物を調製するための方法であって、請求項６又は請求項７記載の前駆体化合物を適切な［１８Ｆ］フルオリド源と反応させて式Ｉの化合物を得ることを含む、方法。
【請求項９】
自動化されている、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法を実施するためのカセットであって、
（ｉ）請求項６又は請求項７記載の前駆体化合物を含有する容器と、
（ｉｉ）適切な［１８Ｆ］フルオリド源を用いて、工程（ｉ）の容器を溶出する手段と
を備えるカセット。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の式Ｉの化合物を生体適合性担体と共に哺乳類への投与に適した形態で含む、放射性医薬組成物。
【請求項１２】
被験体における輸送タンパク質（ＴＳＰＯ）発現の分布及び／又は程度を決定するためのインビボイメージング方法に使用するための、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の式Ｉの化合物を含むインビボイメージング剤であって、
インビボイメージング方法が、
（ｉ）インビボイメージング剤を被験体に投与する工程と、
（ｉｉ）インビボイメージング剤を、被験体で発現したＴＳＰＯに結合させる工程と、
（ｉｉｉ）インビボイメージング剤の放射性同位体から発生する信号を、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）を用いて検出する工程と、
（ｉｖ）信号の位置及び／又は量を表す画像を生成する工程と、
（ｖ）被験体におけるＴＳＰＯ発現の分布及び程度を決定する工程であって、ＴＳＰＯの発現がインビボイメージング剤から発生する信号と直接相関する工程と
を含む、
インビボイメージング剤。
【請求項１３】
インビボイメージング方法が、ＴＳＰＯ病態に対処するための薬剤を投与することを含む被験体の治療中に繰返し実施される、請求項１２記載のインビボイメージング剤。
【請求項１４】
ＴＳＰＯがアップレギュレートされた病態の診断方法に使用するための、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の式Ｉの化合物を含むインビボイメージング剤であって、
診断方法が、
（ｉ）インビボイメージング剤を被験体に投与する工程と、
（ｉｉ）インビボイメージング剤を、被験体で発現したＴＳＰＯに結合させる工程と、
（ｉｉｉ）インビボイメージング剤の放射性同位体から発生する信号を、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）を用いて検出する工程と、
（ｉｖ）信号の位置及び／又は量を表す画像を生成する工程と、
（ｖ）被験体におけるＴＳＰＯ発現の分布及び程度を決定する工程であって、ＴＳＰＯの発現が化合物から発生する信号と直接相関する工程と、
（ｖｉ）ＴＳＰＯ発現の分布及び程度を特定の臨床像に帰属させる工程と
を含む、
インビボイメージング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボイメージング、特に輸送タンパク質（ＴＳＰＯ、正式には末梢ベンゾジアゼピン受容体として公知である）のインビボイメージングに関する。公知のＴＳＰＯ結合放射性トレーサーに関する問題を克服するインドール系インビボイメージング剤が提供される。本発明はまた、本発明のインビボイメージング剤の合成に有用な前駆体化合物、及び前駆体化合物の合成方法を提供する。本発明の他の態様は、本発明のインビボイメージング剤の合成方法であって、本発明の前駆体化合物の使用を含む合成方法、方法を実施するためのキット、及び自動型の方法を実施するためのカセットを含む。加えて、本発明は、本発明のインビボイメージング剤を含む放射性医薬組成物、及びインビボイメージング剤の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＳＰＯは、末梢組織及びグリア細胞に主に局在することが公知であるが、その生理的機能は依然として解明されていない。細胞内では、ＴＳＰＯは、ミトコンドリア外膜上に局在することが公知であるが、これは、ミトコンドリア機能の調節及び免疫系における潜在的な役割を示している。さらに、ＴＳＰＯは、細胞増殖、ステロイド産生、カルシウム流及び細胞呼吸に関与すると仮説されている。
【０００３】
正常組織及び罹患組織におけるＴＳＰＯ発現を調べる研究において、Ｃｏｓｅｎｚａ−Ｎａｓｈａｔら（２００９  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ；３５（３）：３０６−３２８）は、正常脳におけるＴＳＰＯ発現が最小であることを確認した。同論文では、疾患状態では、実質ミクログリア、マクロファージ及びいくつかの肥大アストロサイトにおいて、ＴＳＰＯの上昇が存在しているが、ＴＳＰＯの分布は、疾患、病期、及び病変への近接度、又は感染との関係に応じて異なることを実証した。罹患脳では、ミクログリア及びマクロファージは、ＴＳＰＯを発現する主要な細胞型であり、ヒトでは、アストロサイトもＴＳＰＯを発現し得る。
【０００４】
ＴＳＰＯ選択的リガンド（Ｒ）−［11Ｃ］ＰＫ１１１９５を使用する陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングは、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症の一般的な指標として広く使用されている。しかしながら、ＴＳＰＯイメージング剤としての（Ｒ）−［11Ｃ］ＰＫ１１１９５には、高い非特異的結合、低い脳透過性、高い血漿タンパク結合及び合成困難を含む多数の制限がある。さらに、その放射性標識代謝物の役割は不明であり、結合の定量は複雑なモデリングを必要とする。
【０００５】
（Ｒ）−［11Ｃ］ＰＫ１１１９５に伴う問題によって、［18Ｆ］−ＦＥＰＰＡ、［18Ｆ］ＰＢＲ１１１、［11Ｃ］−ＰＢＲ２８、［11Ｃ］−ＤＰＡ７１３、［11Ｃ］−ＤＡＡ１１０６及び［11Ｃ］−ＡＣ−５１２６を含む次世代のＴＳＰＯ結合ＰＥＴトレーサーの開発が促され、より高特異的な信号〜非特異的な信号及びより多い脳取り込みがいくらか実証された（Ｃｈａｕｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００８  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ；３５：２３０４−２３１９）。しかしながら、より最近では、ＰＥＴ結果の被験体内変動が、この新世代トレーサーにおいて観察されている。これらのトレーサーは、３つの方法の１つで、異なる被験体由来の脳組織におけるＴＳＰＯに結合する。高親和性結合体（ＨＡＢ）及び低親和性結合体（ＬＡＢ）は、それぞれ高親和性又は低親和性のいずれかを有する単一のＴＳＰＯ結合部位を発現する。混合型親和性結合体（ＭＡＢ）は、ほぼ等しい数のＨＡＢ及びＬＡＢ結合部位を発現する（Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ；５２：２４−３２）。Ｏｗｅｎら（Ｊ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ２０１２；３２：１−５）は、ＴＳＰＯの多型（Ａｌａ１４７Ｔｈｒ）が、結合に関して観察された被験体内変動の原因であることを実証した。
【０００６】
Ｆｕｊｉｔａら（Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ  ２００８；４０：４３−５２）は、健常志願者において［11Ｃ］ＰＢＲ２８イメージングを行ったところ、イメージングした１２人の被験体の２人に脳活動の経時変化が認められ、これは、ＴＳＰＯの欠如又は遮断によって模倣することができた。これら２人の被験体の全身イメージングは、被験体が［11Ｃ］ＰＢＲ２８の結合部位を欠如するか、又はＴＳＰＯ受容体を欠如すると思われるため、腎臓、肺及び脾臓に対する結合は無視できるものであることを示した。
【０００７】
［11Ｃ］ＰＢＲ２８のインビボイメージングを調べる別の研究（Ｋｒｅｉｓｌ  ｅｔ  ａｌ  ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ  ２０１０；４９：２９２４−２９３２）では、ＴＳＰＯの密度が高い器官における取り込みは、ＬＡＢがＨＡＢよりも５０％〜７５％低いことが示されたのに対して、取り込みにおける［11Ｃ］ＰＫ１１１９５の差は、心臓及び肺においてのみ見られた。インビトロアッセイにおける［3Ｈ］ＰＢＲ２８は、ＬＡＢでは、ＨＡＢよりも１０倍以上低いＴＳＰＯ親和性を示した。サルでは、サルの脳における［11Ｃ］ＰＫ１１１９５インビボ特異的結合は、［11Ｃ］ＰＢＲ２８について報告されたものよりも約８０倍低かった。これらの結果により、ＬＡＢにおける［11Ｃ］ＰＢＲ２８の非結合は低いＴＳＰＯ親和性が原因であり、［11Ｃ］ＰＫ１１１９５の比較的低いインビボ特異的結合は、末梢器官における非結合の検出を曖昧にし得るという結論が裏付けられた。
【０００８】
Ｍｉｚｒａｈｉら（２０１２  Ｊ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂｏｌ；３２：９６８−９７２）は、［18Ｆ］ＦＥＰＰＡが、結合基間においてインビボイメージング特性の明確な差異を示すことを実証した。
【０００９】
信号を容易に解釈することができないため、ＨＡＢ、ＭＡＢ及びＬＡＢの存在は、ＴＳＰＯ放射性リガンドの有用性に関する問題を提起している。この問題を克服する戦略を開発することが望ましいであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０４１９５３号
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＴＳＰＯに結合する化合物であって、公知の化合物と比較して改善された結合特性を有する化合物を提供する。特に、本発明の化合物は、ＨＡＢ、ＭＡＢ及びＬＡＢの不均一な結合の問題に対処する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一態様では、本発明は、次の式Ｉの化合物を提供する
【００１３】
【化１】
0006401791.tif 000002
式中、
Ｒ1は水素又はメトキシであり、
Ｒ2はエチルであってＲ3はベンジルであるか、或いはＲ2はメチルであってＲ3はイソプロピルである。
【００１４】
「メトキシ」という用語は、置換基−Ｏ−ＣＨ3をいう。
【００１５】
「エチル」という用語は、置換基−ＣＨ2−ＣＨ3をいう。
【００１６】
「ベンジル」という用語は、置換基−ＣＨ2−フェニルをいう。
【００１７】
「メチル」という用語は、置換基−ＣＨ3をいう。
【００１８】
「イソプロピル」という用語は、置換基−ＣＨ2（ＣＨ3）2をいう。
【００１９】
式Ｉの好ましい一実施形態では、Ｒ1はメトキシである。
【００２０】
式Ｉの別の好ましい実施形態では、Ｒ1は水素である。
【００２１】
式Ｉの好ましい一実施形態では、Ｒ2はエチルであってＲ3はベンジルである。
【００２２】
式Ｉの別の好ましい実施形態では、Ｒ2はメチルであってＲ3はイソプロピルである。
【００２３】
式Ｉの好ましい化合物は、以下の通りである。
【００２４】
【化２】
0006401791.tif 000003
別の態様では、本発明は、本明細書で定義される式Ｉの化合物の調製に使用するための前駆体化合物であって、次の式ＩＩの前駆体化合物を提供する。
【００２５】
【化３】
0006401791.tif 000004
式中、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、好ましい実施形態を含む本明細書の上記Ｒ1、Ｒ2及びＲ3について定義した通りであり、ＬＧは脱離基である。
【００２６】
本発明との関連では、「脱離基」は、置換又は置換放射性フッ素化反応中に安定種として置換される原子又は原子群をいう。適切な脱離基の例は、ハロゲンであるクロロ、ブロモ及びヨード、並びにスルホン酸エステルであるメシレート、トシレート、ノシレート及びトリフレートである。一実施形態では、脱離基は、メシレート、トシレート及びトリフレートから選択され、好ましくはメシレートである。
【００２７】
以下のスキーム１は、それ自体が本発明の前駆体化合物であり得る化合物、又は少数の容易な追加の工程によって前駆体化合物（異なる前駆体化合物）に変換し得る化合物を得る方法を示す一般的な反応スキームである。スキーム１のＲ11〜14及びＹ11〜12は、式ＩＩについて定義した通りである。
【００２８】
【化４】
0006401791.tif 000005
或いは、以下のスキームＩａに示す一般的な合成経路を使用し得る。
【００２９】
【化５】
0006401791.tif 000006
上記スキーム１ａでは、−ＬＧ−ＰＧは、保護された脱離基を表し、Ｒ11〜13は、適切には及び好ましくは、上記式ＩＩについて示されている通りである。この合成経路では、環の下部の位置の塩素が、１つの異性体のみが生成される唯一の方法で環化を引き起こす。国際公開第２００３／０１４０８２号では、類似の方法が開示されている。しかしながら、本発明のものと類似の前駆体化合物を得るために、国際公開第２００３／０１４０８２号の教示を使用したところ、収率が低かった。環化工程で使用する溶媒系を変更することによって、この問題を克服した。国際公開第２００３／０１４０８２号では、環化工程は、トルエン中で行われているのに対して、本発明者らは、トルエンに代えてジエチルエーテルを使用すると、最適な収率が得られることを見出した。環化工程の生成物はジエチルエーテルに溶解するのに対して、非環化出発化合物は溶解しない。したがって、非環化出発化合物は、ＺｎＣｌ2と共に反応容器の底部に残存し、環化生成物は、反応容器の上部のジエチルエーテル中に移動する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、本明細書で定義される式Ｉの化合物を調製するための方法であって、本明細書で定義される式ＩＩの前駆体化合物を適切な［18Ｆ］フルオリド源と反応させて、式Ｉの化合物を得ることを含む方法を提供する。
【００３１】
用語「適切な［18Ｆ］フルオリド源」は、求核置換反応でＬＧを置換する化学形態の［18Ｆ］フルオリドを意味する。［18Ｆ］−フルオリドイオン（18Ｆ-）は、通常、核反応18Ｏ（ｐ，ｎ）18Ｆから水溶液として得られ、典型的には、カチオン性対イオンを追加し、続いて水を除去することによって反応性になる。
【００３２】
［18Ｆ］フルオリドの溶解度を維持するために、適切なカチオン性対イオンは、無水反応溶媒内で十分な溶解度を有するべきである。典型的に使用される対イオンとしては、大きいが軟質の金属イオン（例えば、ルビジウム又はセシウム）、クリプタンド（例えば、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ（商標）２．２．２（Ｋ２２２））と錯体形成したカリウム、又はテトラアルキルアンモニウム塩が挙げられる。好ましい対イオンは、クリプタンド（例えば、Ｋ２２２）と錯体形成したカリウムであり、その理由は、無水溶媒における溶解度が優れており、［18Ｆ］フルオリドの反応性を増強するからである。
【００３３】
周知の18Ｆ標識技術のより詳細な議論は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（２００３；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ：Ｍ．Ｊ．Ｗｅｌｃｈ  ａｎｄ  Ｃ．Ｓ．Ｒｅｄｖａｎｌｙ，Ｅｄｓ．）の第６章に見られ得る。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明の式Ｉの化合物を調製するための方法は、自動化されている。好都合なことに、［18Ｆ］−放射性トレーサーは、自動放射合成装置によって自動的に調製し得る。Ｔｒａｃｅｒｌａｂ  ＭＸ（商標）及びＦＡＳＴｌａｂ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＦＤＧＰｌｕｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｉｏｓｃａｎ）並びにＳｙｎｔｈｅｒａ（登録商標）（ＩＢＡ）を含め、このような装置のいくつかの市販例がある。このような装置は、一般的に、放射化学を実施する（多くの場合には使い捨ての）「カセット」（「カートリッジ」と称されることもある）であって、放射性合成を実施するための装置に取り付けられるものを含む。カセットは、通常、流体経路、反応容器、及び試薬バイアルを受け入れるためのポート、並びに放射性合成後のクリーンアップ工程に使用される任意の固相抽出カートリッジを含む。
【００３５】
別の態様では、本発明は、本発明の自動化方法を実施するためのカセットであって、
（ｉ）本明細書で定義される式ＩＩの前駆体化合物を含有する容器と、
（ｉｉ）適切な［18Ｆ］フルオリド源を用いて、工程（ｉ）の容器を溶出する手段
を含むカセットを提供する。
【００３６】
本発明のカセットはまた、適宜、
（ｉｉｉ）過剰な［18Ｆ］フルオリドを除去するためのイオン交換カートリッジ、及び／又は
（ｉｖ）［18Ｆ］標識反応混合物を精製するための１以上の固相抽出カートリッジ
を含む。
【００３７】
本発明のカセットについて、式ＩＩの前駆体化合物及び適切な［18Ｆ］フルオリド源の適切な好ましい実施形態は、本明細書で先に定義した通りである。
【００３８】
本発明の別の態様は、哺乳類への投与に適切な放射性医薬組成物であって、生体適合性担体と共に、本明細書で定義される式Ｉの化合物を含む放射性医薬組成物である。「生体適合性担体」は、組成物が生理的に許容し得る（すなわち、毒性及び過度の不快感を伴わずに哺乳類の体に投与し得る）ように、式Ｉの化合物が懸濁又は溶解される流体（特に、液体）である。生体適合性担体は、適切には、注入可能な担体液体、例えばパイロジェンフリーの注射用滅菌蒸留水；水溶液、例えば（有利には、注射用最終生成物が等張性又は非低張性であるようにバランスし得る）生理食塩水；１以上の浸透圧調節物質（例えば、血漿カチオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例えば、グリセロール）又は他の非イオン性ポリオール材料（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）の水溶液である。生体適合性担体はまた、エタノールなどの生体適合性有機溶媒を含み得る。このような有機溶媒は、より親油性の化合物又は製剤を可溶化するのに有用である。好ましくは、生体適合性担体は、パイロジェンフリーの注射用蒸留水、等張食塩水又はエタノール水溶液である。静脈内注射用の生体適合性担体のｐＨは、適切には、４．０〜１０．５の範囲である。
【００３９】
医薬組成物は、緩衝液；薬学的に許容し得る可溶化剤（例えば、シクロデキストリン又は界面活性剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｗｅｅｎ又はリン脂質）；薬学的に許容し得る安定剤又は抗酸化剤（例えば、エタノール、アスコルビン酸、ゲンチシン酸又はパラ−アミノ安息香酸）などの追加成分を適宜含有し得る。
【００４０】
放射性医薬組成物は、非経口的に（すなわち、注射によって）投与し得る。式Ｉの化合物が放射性医薬組成物として提供される場合、化合物の調製方法は、適切には、有機溶媒の除去、生体適合性緩衝液の追加、及び任意選択的な追加成分を含む工程をさらに含む。非経口投与の場合、放射性医薬組成物が無菌性かつ非発熱性であることを確認するための工程も行う必要がある。
【００４１】
本発明の放射性医薬組成物について、式Ｉの化合物の適切な好ましい実施形態は、本明細書で先に定義した通りである。
【００４２】
本発明の式Ｉの化合物は、優れたＴＳＰＯ結合親和性を有する。したがって、別の態様では、本発明は、被験体におけるＴＳＰＯ発現の分布及び／又は程度を決定するためのインビボイメージング方法であって、
（ｉ）本明細書で定義される式Ｉの化合物を被験体に投与する工程と、
（ｉｉ）化合物を、被験体で発現したＴＳＰＯに結合させる工程と、
（ｉｉｉ）化合物の放射性同位体から発生する信号を、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）を用いて検出する工程と、
（ｉｖ）信号の位置及び／又は量を表す画像を生成する工程と、
（ｖ）被験体におけるＴＳＰＯ発現の分布及び程度を決定する工程であって、ＴＳＰＯの発現が化合物から発生する信号と直接相関する工程と
を含むインビボイメージング方法を提供する。
【００４３】
式Ｉの化合物の「投与」は、好ましくは、非経口的に、最も好ましくは静脈内的に行われる。静脈内経路は、インビボイメージング剤を被験体の体全体に送達し、したがって被験体で発現しているＴＳＰＯと接触させるための最も効率的な方法に相当する。さらに、静脈内投与は、実質的な身体的介入及び実質的な健康リスクに相当しない。本発明の式Ｉの化合物は、好ましくは、本明細書で定義される本発明の医薬組成物として投与される。本発明のインビボイメージング方法はまた、本発明のインビボイメージング剤を予め投与した被験体に対して実施される上記工程（ｉｉ）〜（ｖ）を含むと理解し得る。
【００４４】
投与工程の後かつ検出工程の前に、式Ｉの化合物をＴＳＰＯに結合させる。例えば、被験体がインタクトな哺乳類である場合、式Ｉの化合物は、哺乳類の体全体を動的に移動して、その様々な組織と接触する。式Ｉの化合物がＴＳＰＯと接触すると、ＴＳＰＯを有する組織からの式Ｉの化合物のクリアランスが、ＴＳＰＯを有しない組織又はより少ないＴＳＰＯを有する組織からよりも長い時間を要するように、特異的な相互反応が起こる。ＴＳＰＯを有する組織に結合した式Ｉの化合物と、ＴＳＰＯを有しない組織又はより少ないＴＳＰＯを有する組織に結合した式Ｉの化合物との間の比の結果として、ＴＳＰＯに特異的に結合した式Ｉの化合物の検出が可能になると、特定の時点に到達するであろう。理想的なこのような比は、約２：１である。
【００４５】
本発明の方法の「検出」工程は、信号に対して感受性の検出器によって、放射性同位体から発生する信号を検出することを含む。この検出工程はまた、信号データの取得と理解し得る。陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）は、本発明の方法に使用するための適切なインビボイメージング手順である。
【００４６】
本発明の方法の「生成」工程は、取得した信号データに再構成アルゴリズムを適用してデータセットを得るコンピュータによって実施される。次いで、このデータセットを操作して、放射性同位体から発生する信号の位置及び／又は量を示す画像を生成する。放出された信号は、生成した画像を評価することによって「決定」工程を行い得るように、ＴＳＰＯの発現と直接相関する。
【００４７】
本発明の「被験体」は、任意のヒト又は動物被験体であり得る。好ましくは、本発明の被験体は、哺乳類である。最も好ましくは、被験体は、インビボのインタクトな哺乳類の体である。特に好ましい一実施形態では、本発明の被験体は、ヒトである。インビボイメージング方法は、健常被験体において、又はＴＳＰＯの異常発現に関連する病態（以下「ＴＳＰＯ病態」）を有することが公知の被験体、もしくはＴＳＰＯ病態を有すると疑われる被験体において、ＴＳＰＯを研究するために使用し得る。好ましくは、方法は、ＴＳＰＯ病態を有することが公知の被験体、又はＴＳＰＯ病態を有すると疑われる被験体のインビボイメージングに関し、したがって病態の診断方法に有用である。
【００４８】
インビボイメージングが有用なこのようなＴＳＰＯ病態の例としては、多発性硬化症、ラスムッセン脳炎、脳血管炎、ヘルペス脳炎、ＡＩＤＳ関連認知症、パーキンソン病、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、虚血性脳卒中、末梢神経損傷、癲癇、外傷性脳損傷、急性ストレス、慢性ストレス、神経障害性疼痛、肺炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチ、原発性線維筋痛症、神経損傷、アテローム性動脈硬化症、腎炎、虚血再灌流障害、及び癌、特に結腸、前立腺又は乳房の癌が挙げられる。本発明の式Ｉの化合物は、脳への取り込みが良好であるため、ＣＮＳのインビボイメージングに特に適切である。
【００４９】
別の実施形態では、本発明のインビボイメージング方法は、ＴＳＰＯ病態に対処するための薬剤を投与することを含む被験体の治療中に繰返し実施し得る。例えば、本発明のインビボイメージング方法は、ＴＳＰＯ病態に対処するための薬剤による治療の前後途中に実施し得る。この方法では、治療の効果は、経時的にモニタリングし得る。ＰＥＴは、病変の比較的小さな変化さえも経時的に観察し得るような、優れた感受性及び分解能を有し、これは、治療モニタリングに特に有利である。
【００５０】
別の態様では、本発明は、本明細書で定義されるインビボイメージング方法に使用するための式Ｉの化合物を提供する。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で定義されるインビボイメージング方法に使用するための本明細書で定義される放射性医薬組成物の製造に使用するための、本明細書で定義される式Ｉの化合物を提供する。
【００５２】
さらに別の態様では、本発明は、ＴＳＰＯがアップレギュレートされた病態の診断方法であって、ＴＳＰＯ発現の分布及び程度を特定の臨床像に帰属させる追加の工程（ｖｉ）と共に、本明細書で定義されるインビボイメージング方法を含む診断方法を提供する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、本明細書で定義される診断方法に使用するための、本明細書で定義される式Ｉの化合物を提供する。
【００５４】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で定義される診断方法に使用するための本明細書で定義される放射性医薬組成物の製造に使用するための、本明細書で定義される式Ｉの化合物を提供する。
【００５５】
次に、一連の非限定的な実施例によって、本発明を説明する。
【００５６】
実施例の簡単な説明
実施例１では、本発明の化合物と比較するために使用した従来技術の化合物を説明する。
【００５７】
実施例２では、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−Ｎ−エチル−９−（２−フルオロエチル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキサミド（本発明の非放射性化合物１）の合成を説明する。
【００５８】
実施例３では、（Ｓ）−Ｎ−イソプロピル−Ｎ−メチル−９−（２−フルオロエチル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキサミド（本発明の非放射性化合物２）の合成を説明する。
【００５９】
実施例４では、（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−Ｎ−エチル−９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキサミド（本発明の非放射性化合物３）の合成を説明する。
【００６０】
実施例５では、（Ｓ）−Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピル−９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキサミド（本発明の非放射性化合物４）の合成を説明する。
【００６１】
実施例６では、結合体／非結合体アッセイにおけるラセミ化合物の試験を説明する。
【００６２】
実施例７では、結合体／非結合体アッセイにおける分割エナンチオマーの試験を説明する。
【００６３】
実施例で使用される略語のリスト
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ｈ  時間
ｍｉｎ  分
ＮＭＲ  核磁気共鳴
ＰＥＩ  ポリエーテルイミド
ＳＦＣ  超臨界流体クロマトグラフィー
Ｔｅｍｐ  温度
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
【実施例】
【００６４】
実施例１：従来技術の化合物
実施例１（ｉ）：ＰＫ１１１９５
【００６５】
【化６】
0006401791.tif 000007
ＰＫ１１１９５は市販されている。
【００６６】
実施例１（ｉｉ）：Ｎ−（２−メトキシベンジル）−Ｎ−（４−フェノキシピリジン−３−イル）アセトアミド（ＰＢＲ２８）
【００６７】
【化７】
0006401791.tif 000008
非放射性ＰＢＲ２８は市販されている。
【００６８】
実施例１（ｉｉｉ）：非放射性９−（２−フルオロ−エチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボン酸ジエチルアミド（「ＧＥ１８０」として公知）
【００６９】
【化８】
0006401791.tif 000009
従来技術の化合物９−（２−フルオロ−エチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボン酸ジエチルアミド（「ＧＥ１８０」として公知である）の非放射性バージョンを、Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１２  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｓ；２２：１３０８−１３１３）並びに国際公開第２０１０／１０９００７号の実施例２及び１４に記載されている方法に従って調製した。
【００７０】
実施例２：（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−Ｎ−エチル−９−（２−フルオロエチル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキサミド（本発明の非放射性化合物１）の合成
【００７１】
【化９】
0006401791.tif 000010
Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１２  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｓ；２２：１３０８−１３１３）に記載されているように、ラセミ化合物を合成した。
【００７２】
以下の条件を使用してＳ−エナンチオマーを分離するために、ＳＦＣキラル分離を使用した。
【００７３】
【表１】
0006401791.tif 000011
Ｓ−エナンチオマー：保持時間：３．３分、純度９８％
Ｒ−エナンチオマー：保持時間：７．４分、純度１００％。
【００７４】
実施例３：（Ｓ）−Ｎ−イソプロピル−Ｎ−メチル−９−（２−フルオロエチル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキサミド（本発明の非放射性化合物２）の合成
【００７５】
【化１０】
0006401791.tif 000012
Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１２  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｓ；２２：１３０８−１３１３）に記載されているように、ラセミ化合物を合成した。
【００７６】
以下の条件を使用してＳ−エナンチオマーを分離するために、ＳＦＣキラル分離を使用した。
【００７７】
【表２】
0006401791.tif 000013
Ｓ−エナンチオマー：保持時間：３．５分、純度９９％
Ｒ−エナンチオマー：保持時間：７．２分、純度９９％。
【００７８】
実施例４：（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−Ｎ−エチル−９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキサミド（本発明の非放射性化合物３）の合成
【００７９】
【化１１】
0006401791.tif 000014
実施例４（ｉ）：Ｎ−（２−クロロ−５−メトキシフェニル）−２−フルオロアセトアミド
【００８０】
【化１２】
0006401791.tif 000015
フルオロアセチルクロリド（３ｇ、３１，１ｍｍｏｌ）の溶液を、２−クロロ−５−メトキシアニリン（５ｇ、３１，７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４，５ｍｌ、３２，３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍｌ）氷冷溶液に滴下し、一晩撹拌して放置した。水（５０ｍｌ）を追加し、二相混合物を２分間撹拌し、次いで分離した。ジクロロメタン（２０ｍｌ）で水相を抽出し、合わせた有機相を硫酸マグネシウム（５ｇ）で脱水した。蒸発後、粗固形物を次の工程で使用した。
【００８１】
実施例４（ｉｉ）：２−クロロ−Ｎ−（２−フルオロエチル）−５−メトキシアニリン
【００８２】
【化１３】
0006401791.tif 000016
滴下漏斗及び温度計を装着したアルゴン下の乾燥フラスコに、Ｎ−（２−クロロ−５−メトキシフェニル）−２−フルオロアセトアミド（５，４８ｇ、２５，２ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１００ｍｌ）及び水素化ホウ素ナトリウム（２，２８８ｇ、６０，５ｍｍｏｌ）を充填した。温度を３０℃未満に維持しながら、ヨウ素（６，４０ｇ、２５，２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１３ｍｌ）溶液を２時間かけて追加した。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌し、翌日、温度を３時間かけて４０℃に上昇させた。ろ過後、温度を３０℃未満に維持しながら、ｐＨ２の１０％塩酸（１０ｍｌ）で混合物をクエンチし、続いて、１０％水酸化ナトリウム（１０ｍｌ）でクエンチした。水（２００ｍｌ）を追加し、混合物を蒸発させてＴＨＦを除去した。ジクロロメタン（５０ｍｌ）で水相を２回抽出し、水で有機相を１回洗浄し、硫酸マグネシウム（５ｇ）で脱水し、蒸発させて、透明な油状物質を得た。ジクロロメタンを用いてシリカ（５．５×１６ｃｍ）で粗生成物を精製し、３．８６ｇの表題化合物を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ，４００  ＭＨｚ（ＣＤＣｌ3，２５℃）：７．２０  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７  Ｈｚ），６．４０  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８  Ｈｚ），６．３３  ｐｐｍ（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７  Ｈｚ，２．８  Ｈｚ），４．６９  ｐｐｍ（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝４７．２  Ｈｚ，４．９  Ｈｚ），３．８０  ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ），３．５２  ｐｐｍ（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝２５．６  Ｈｚ，４．９  Ｈｚ）。
【００８３】
実施例４（ｉｉｉ）：エチル３−（（２−クロロ−５−メトキシフェニル）（２−フルオロエチル）アミノ）−２−オキソシクロヘキサンカルボキシレート
【００８４】
【化１４】
0006401791.tif 000017
２−クロロ−Ｎ−（２−フルオロエチル）−５−メトキシアニリン（３，８６ｇ、１８，９５ｍｍｏｌ）を、アルゴン下の乾燥フラスコ中のＴＨＦ（９０ｍｌ）に溶解し、−４０℃に冷却した。カリウムヘキサメチルジシラジド（５５，１ｇ、２７６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４５ｍｌ）に溶解し、温度を−４０℃未満に維持しながら、３０分間かけて滴下した。１５分後、温度を−４０℃未満に維持しながら、エチル３−ブロモ−２−オキソシクロヘキサンカルボキシレート（２９，９ｇ、１２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍｌ）溶液を５０分間かけて追加した。追加の完了後、冷却浴を除去し、混合物を周囲温度で４時間撹拌した。温度を２０〜２５℃に維持しながら、ブライン（６５ｍｌ）を追加し、続いて６Ｍ塩酸（２０ｍｌ、１２０ｍｍｏｌ）を追加した。相を分離し、有機相を油状物質に蒸発させて、酢酸エチル（５０ｍｌ）に溶解した。酢酸エチル（５０ｍｌ）で水相を抽出し、合わせた有機相を水（１００ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、油状物質に蒸発させた。粗生成物を次の工程で使用した。
【００８５】
実施例４（ｉｖ）：エチル８−クロロ−９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキシレート
【００８６】
【化１５】
0006401791.tif 000018
先の工程の粗物質を、アルゴン下の乾燥フラスコ中のジエチルエーテル（１２０ｍＬ）に溶解した。塩化亜鉛（１０，２４ｇ、７５ｍｍｏｌ）を追加し、混合物を一晩還流した。暗褐色の均一な溶液を冷却し、１２％塩酸（６０ｍｌ、２３７ｍｍｏｌ）を徐々に追加した。酢酸エチル（５０ｍｌ）で混合物を３回抽出し、５０ｍｌの水で有機相を３回洗浄した。ＭｇＳＯ4で有機相を脱水し、油状物質に蒸発させた。ジクロロメタンを用いてシリカ（６×２０ｃｍ）で粗生成物を精製し、３．２ｇの表題化合物を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ，４００  ＭＨｚ（ＣＤＣｌ3，２５℃）：６．７９  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４  Ｈｚ），６．１９  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４  Ｈｚ），４．７５・４．６０  ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），４．５２  ｐｐｍ（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４５  Ｈｚ，５．４５  Ｈｚ），４．４７・４．３０  ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），４．０３・３．９２  ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），３．６３  ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ），２．６４・２．４７  ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），１．９４・１．６７  ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ），１．０８  ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１  Ｈｚ）。
【００８７】
実施例４（ｖ）：エチル９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキシレート
【００８８】
【化１６】
0006401791.tif 000019
エチル８−クロロ−９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキシレート（３，２ｇ、９，０４ｍｍｏｌ）をメタノール（７５ｍｌ）及びトリエチルアミン（１，３８７ｍｌ、９，９５ｍｍｏｌ）に溶解した。アルゴンでフラスコをフラッシュし、パラジウム炭素１０％（９，６２ｇ、９，０４ｍｍｏｌ）を追加した。フラスコを排気し、水素で２回フラッシュし、次いで、水素充填バルーンを装着して一晩撹拌した。翌日、混合物をろ過し、油状物質に蒸発させた。油状物質を酢酸エチルに溶解し、水で洗浄した。ＭｇＳＯ4で有機相を脱水し、油状物質に蒸発させた。粗生成物を次の工程で使用した。
1Ｈ  ＮＭＲ，４００  ＭＨｚ（ＣＤＣｌ3，２５℃）：７．０３  ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），６．８３  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），６．４５  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），４．７３・４．６７  ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），４．６１・４．５５  ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），４．３１  ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２  Ｈｚ），４．２５  ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，５．２  Ｈｚ），４．１６  ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１，１４．２  Ｈｚ），４．１  ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６  Ｈｚ），３．８１  ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ），２．７９・２．６１  ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ）２．１５・１．９３（ｍ，３Ｈ）１．９３・１．８１  ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）１．２４  ｐｐ（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０６  Ｈｚ）。
【００８９】
実施例４（ｖｉ）：９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボン酸
【００９０】
【化１７】
0006401791.tif 000020
エチル９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキシレート（２，７５ｇ、８，６１ｍｍｏｌ）をエタノール（３５ｍｌ）に溶解し、水酸化ナトリウム（４，１３ｇ、１０３ｍｍｏｌ）の水溶液（２０ｍｌ）を追加し、混合物を一晩還流した。エタノールを蒸発させた後、冷却しながら塩酸で混合物をｐＨ１に調整した。酢酸エチル（２×５０ｍｌ）でスラリーを抽出し、蒸発乾固し、２．２５ｇの表題化合物を得た。粗生成物を次の工程で使用した。
1Ｈ  ＮＭＲ，４００  ＭＨｚ（ＣＤＣｌ3，２５℃）：１０  ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ  ｍ，１Ｈ），７．０９  ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），６．９２  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），６．５７  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），４．７４・４．６８  ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），４．６２・４．５６  ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），４．３３  ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２  Ｈｚ），４．２７  ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２  Ｈｚ），４．１８・４．１２  ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ），３．９６  ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ），２．８５・２．５９  ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ）２．３９・２．２９（ｍ，１Ｈ）２．２９・２．１４  ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）２．０６・１．９３（ｍ，１Ｈ），１．９０・１．７７（ｍ，１Ｈ）。
【００９１】
実施例４（ｖｉｉ）：９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボニルクロリド
【００９２】
【化１８】
0006401791.tif 000021
９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボン酸（２ｇ、６，８７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２５ｍｌ、３８９ｍｍｏｌ）に懸濁し、塩化オキサリル（１，８０３ｍｌ、２０，６０ｍｍｏｌ）をアルゴン下で追加した。暗色な溶液を周囲温度で１．５時間撹拌し、次いで、褐色の泡状物質に蒸発させた。粗生成物を次の工程で使用した。
【００９３】
実施例４（ｖｉｉｉ）：Ｎ−ベンジル−Ｎ−エチル−９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキサミド
【００９４】
【化１９】
0006401791.tif 000022
９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボニルクロリド（５３２ｍｇ、１，７１６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍｌ）に溶解し、Ｎ−エチルベンジルアミン（６９６ｍｇ、５，１５ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を一晩撹拌し、希塩酸／ＤＣＭ及び水／ＤＣＭで処理した。有機相を蒸発乾固し、得られた固体をエタノール（２５ｍｌ）に溶解し、一晩放置した。形成された結晶性沈殿物を回収し、乾燥して、４７０ｍｇのラセミ化合物を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ，４００  ＭＨｚ（ＣＤＣｌ3，２５℃）：７．４４−７．２２  ｐｐｍ（ｂｒｏａｄ  ｍ，５Ｈ），７．０４  ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），６．８６  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），６．４７  ｐｐｍ（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ，８．０  Ｈｚ），４．９６・４．５２  ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ），４．３８・４．２３  ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），３．９０・３．２２  ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ），２．９１・２．５８  ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），２．３５・１．７２  ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ），１．３３  ｐｐｍ（ｔ，２．２Ｈ，Ｊ＝７．２  Ｈｚ），１．１５  ｐｐｍ（ｔ，０．８Ｈ，Ｊ＝７．２  Ｈｚ）。
【００９５】
公知のエナンチオマーの分離技術（例えば、ＳＦＣ）を使用して、Ｓ−エナンチオマーを得る。
【００９６】
実施例５：（Ｓ）−Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピル−９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボキサミド（本発明の非放射性化合物４）の合成
【００９７】
【化２０】
0006401791.tif 000023
上記工程４（ｉ）〜（ｖｉｉ）を行い、次いで、９−（２−フルオロエチル）−５−メトキシ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−４−カルボニルクロリド（０，５３２ｇ、１，７１６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍｌ）に溶解し、Ｎ−メチル−イソ−プロピルアミン（０，４４９ｇ、５，１５ｍｍｏｌ）を滴下した。混合物を一晩撹拌し、希塩酸／ＤＣＭ及び水／ＤＣＭで処理した。有機相を蒸発乾固し、得られた固体をエタノール（２５ｍｌ）に溶解し、一晩放置した。形成された結晶性沈殿物を回収し、乾燥して、２８５ｍｇのラセミ化合物を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ，４００  ＭＨｚ（ＣＤＣｌ3，２５℃）：  ６．９２  ｐｐｍ（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），６．７５  ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ），６．３６  ｐｐｍ（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ，８．０  Ｈｚ），４．７０・４．１３  ｐｐｍ（ｍ，６Ｈ），３．７１  ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ），３．６１  ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．２），３．５８・３．４７  ｐｐｍ（ｍ，０．５Ｈ），３．３６・３．１１  ｐｐｍ（ｍ，１．５Ｈ），２．７７・２．５２  ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），２．２３・１．５５  ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ）１．３２・１．２４（ｍ，３Ｈ），１．１９・１．０６（ｍ，６Ｈ）。
【００９８】
公知のエナンチオマーの分離技術（例えば、ＳＦＣ）を使用して、Ｓ−エナンチオマーを得る。
【００９９】
実施例６：ラセミ化合物の結合体／非結合体アッセイ
４つのドナー全血サンプルから得られたヒト血小板から、膜タンパク質を調製した。ＰＢＲ２８結合親和性に基づいて、これらのドナーサンプルの２つは、高親和性を有することを予め特定し、２つは、低親和性を有することを予め特定した。１０ｍｌの緩衝液１（０．３２ｍＭスクロース、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４、４℃）中で、血小板ペレットをホモジナイズした。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−ＭＣ遠心分離機において、ホモジネートを４℃、４８，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを少なくとも１０ｍｌの緩衝液２（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４、４℃）に再懸濁し、緩衝液２中、４℃、４８，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって洗浄した。膜を２ｍｌの緩衝液２に懸濁し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ｃａｔ  ＃５００−０００２）を使用して、タンパク質濃度を決定した。使用するまで、アリコートを−８０℃で保存した。
【０１００】
膜懸濁液のアリコートを解凍し、アッセイ緩衝液３（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４、３７℃）でホモジナイズした。競合結合実験の場合、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００ワークステーションによって、１００μＭ〜１ｎＭの範囲の１１系列希釈で、非標識ＰＢＲ２８（ＡＢＸ  ｃａｔ  ＃１６５３）又はＰＫ１１１９５を希釈し、５ｎＭ［3Ｈ］ＰＫ１１１９５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃａｔ  ＃ＮＥＴ８８５００１ＭＣ）を含有する非結合９６ウェルマイクロプレートに追加した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ２０００ワークステーションによって、１μＭ〜０．０１ｎＭの範囲の１１系列希釈で、非放射性化合物１を希釈した。１００μＭ〜１ｎＭの範囲の１１系列希釈で、ＧＥ１８０及び非放射性化合物２を希釈した。全結合及び非特異的結合の評価も実施した。３０μｇ／ｍＬに希釈した血小板膜１６０μＬを最終容量２００μＬ／ウェルでアッセイプレートに追加した。アッセイプレートを３７℃で少なくとも１時間インキュベートし、０．１％ＰＥＩ生理食塩水に６０分間予め浸漬したＧＦ／Ｂガラス繊維プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ；ｃａｔ  ＃６００５１７７）に対してろ過することによって、インキュベーションを終了した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  １９６によって、氷冷緩衝液４（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１．４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４、４℃）でアッセイプレートを５〜６回リンスした。次いで、プレートを乾燥し、底部を密封し、５０μＬのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ  ２０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｃａｔ  ＃６０１３６２１）を各ウェルに追加した。上部を密封した後、プレートを少なくとも３０分間平衡化し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＴＸによって捕捉した放射能をカウントした。化合物１及び化合物２をラセミ化合物として使用した。この［3Ｈ］ＰＫ１１１９５競合結合アッセイでは、すべての化合物を３回反復で試験し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０を使用してデータを分析することによって、化合物の親和性を決定し、低親和性：高親和性の比を計算した。
【０１０１】
【表３】
0006401791.tif 000024
実施例７：分割エナンチオマーの結合体／非結合体アッセイ
化合物１及び化合物２をエナンチオマーに分割し、実施例６に記載されているように４つのヒトドナー全血サンプルから単離した血小板を使用して、競合結合アッセイを実施した。競合結合アッセイは、実施例６と同じアッセイ手順に従っており、本発明の化合物１及び化合物２分割エナンチオマーと共に従来技術の化合物ＰＫ１１１９５、ＰＢＲ２８及びＧＥ１８０を、１００μＭ〜１ｎＭの範囲の１１系列希釈で使用した。［3Ｈ］ＰＫ１１１９５競合結合アッセイでは、すべての化合物を３回反復で試験し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０を使用してデータを分析することによって、化合物の親和性を決定し、低親和性：高親和性の比を計算した。
【０１０２】
【表４】
0006401791.tif 000025