(57)【要約】  本発明は、改変された、ポルフィリンに基づく酸素運搬タンパク質（例えば、ヘモグロビン）に関し、該タンパク質は、その未改変状態では電子伝達の低親和性部位および１以上のタンパク質アミノ酸を介した還元剤とヘム４価鉄（ferryl haem iron）との間の高親和性電子伝達を有することが示されている。本発明は、この経路を強化するための改変を含むそのようなタンパク質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変された、ポルフィリンに基づく酸素運搬タンパク質であって、その未改変状態での該タンパク質は、電子伝達の低親和性部位、および１以上のタンパク質アミノ酸を介した還元剤とヘム４価鉄（ferryl haem iron）との間の高親和性電子伝達を有し、該タンパク質は、鉄イオンに対する高親和性電子伝達経路を強化または導入するための改変を含む、上記タンパク質。
【請求項２】
哺乳動物ヘモグロビン鎖サブユニットである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
β鎖サブユニットまたはβ鎖スーパーファミリーのメンバーである、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ヒトまたはβ、γもしくはδ鎖である、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
Ｐｈｅ４１の置換により改変されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記改変がＰｈｅ４１＞Ｔｙｒである、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
アミノ酸の挿入により改変されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記挿入が、ヘモグロビンのＣ−ヘリックスへの酸化還元活性アミノ酸の挿入である、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
ＮＯ結合を減少させる非野生型残基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質の二量体、四量体または多量体を含むタンパク質。
【請求項１１】
前記二量体、四量体または多量体が架橋されている、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
２つのαグロビンサブユニットおよび請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質の２つのサブユニットを含むタンパク質。
【請求項１３】
保護基にコンジュゲート化されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
保護基が抗酸化酵素である、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
保護基がポリアルキレンオキシドである、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１６】
生理学的に許容される担体中に請求項１〜１５のいずれか１項に記載のタンパク質を含む組成物。
【請求項１７】
治療が必要な被験体に、有効量の請求項１６に記載の組成物を投与するステップを含む、ヒト被験体の治療方法。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１９】
プロモーターと機能的に連結された請求項１８に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法であって、請求項２０に記載の宿主細胞においてタンパク質を発現させて請求項１〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質を回収するステップ、および場合により該タンパク質を修飾して請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のタンパク質を提供するステップを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、改変された酸素運搬化合物、例えばヘモグロビンおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
献血された血液の患者への輸血はいくつかの不都合を有する。第１に、患者の血液型の不足が存在する。第２に、献血された血液が感染性物質、例えば肝炎ウイルスおよびＨＩＶで汚染されている危険がある。第３に、献血された血液は保存期間が限られている。さらに、戦場または民間非常時のように、血液が容易に入手できない状況が存在する。
【０００３】
輸液の代替法には、代用血液の使用が含まれる。代用血液は、血液量を維持するために必要な膠質浸透圧も提供する酸素運搬溶液である。２タイプの代用物、フッ化炭素乳剤およびヘモグロビン溶液が近年研究されている。
【０００４】
ヘモグロビンは、赤血球内に存在する場合、それぞれヘム分子を担持する２つのαグロビン鎖および２つのβグロビン鎖から構成される。１つのα様グロビン鎖および１つのβ様グロビン鎖は結合して非常に安定な二量体を形成する。α様およびβ様グロビン遺伝子は関連グロビン遺伝子のファミリーに属し、異なる発生段階で発現され、酸素圧、ｐＨ、および胚〜胎児〜新生児の発達によって調節される。そして、２つの二量体は逆平行様式で並び、四量体を形成する。四量体を形成する二量体の結合は、二量体に会合する単量体の結合の場合ほど強くない。したがって、四量体は分離して二量体を形成する傾向を有し、四量体、二量体、および単量体の間には常に平衡が存在する。高濃度のグロビンでは、主要な形式は四量体であり；希釈されると、二量体が主要な形式になる。この平衡はまた、結合力が部分的に静電気力であるため、溶媒、塩、ｐＨおよび他の要因によっても影響される。
【０００５】
しかし、ネイティブのヘモグロビンを代用血液として使用するには障害がある。第１に、大用量が必要とされ、組換え手段によるかまたは提供者のヒトもしくは回収された非ヒト血液由来のタンパク質の大量生産が必要とされる。第２に、感染性物質および毒性物質を含まないヘモグロビンを取得することが重要である。第３に、ヘモグロビンは通常、６８，０００分子量の四量体であるが、それは解離してα−β二量体を形成しうる。二量体は腎臓によって高速に排出され、無細胞のヘモグロビンの滞留時間は非常に短くて代用血液として有用でない。
【０００６】
これらの困難を回避するいくつかのアプローチが講じられている。これらのアプローチには、組換えＤＮＡ系を介するヘモグロビンの発現、ヘモグロビンの化学修飾、およびヘモグロビン変異体の製造が含まれる。ヘモグロビンおよびその変異体は種々の細胞系で発現されており、該細胞系としては、大腸菌（E. coli）、酵母および哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞が挙げられる。
【０００７】
いくつかの天然に存在するヘモグロビン変異体が公知である。変異体には、自家重合する変異体、四量体の解離を妨げる変異体、およびアルカリで安定な変異体が含まれる。また、低下した酸素親和性を示す３０を超える天然に存在するヘモグロビン変異体が存在する。そのような変異体のいくつかの例がＷＯ８８／０９１７９９に開示されている。
【０００８】
ヘモグロビンの使用を改善する別のアプローチは、追加のポリマーを付加して血液中でのタンパク質の安定性を改善することによるこのタンパク質の改変である。例えば、ＵＳ５，９００，４０２では、非抗原性ポリマー、好ましくはポリアルキレンオキシドまたはポリエチレングリコールの使用が記載されている。
【０００９】
ヘモグロビン（および実際にはミオグロビンまたは他の酸素運搬タンパク質）は酸素輸送および貯蔵に関与するため、それらは、この機能の結果として（タンパク質のポルフィリン環中に存在する鉄イオンの酸化還元特性のせいで）、活性酸素種の生成に関与する。オキシ誘導体（Ｆｅ（ＩＩ））の自己酸化は、非機能的ヘム３価鉄（ferric haem）（Ｆｅ（ＩＩＩ））およびスーパーオキシドイオン（Ｏ２・−）を生じさせ、その後、それが不均化してＨ２Ｏ２が生じる。これらの化学種はタンパク質および／またはヘム基を最終的に損傷させうる。この損傷を生じさせる経路中の必須の中間体はヘム４価鉄（ferryl haem）（Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−）であり、それ自体はヘムとＨ２Ｏ２および過酸化脂質の反応から形成される。タンパク質／ポルフィリンに基づくラジカルカチオン（Ｐ＋・）は、以下の式（１）に記載されるようにヘム３価鉄および過酸化物からのヘム４価鉄の形成と同時に生じる。
【００１０】
Ｐ−Ｆｅ（ＩＩＩ）＋Ｈ２Ｏ２→Ｐ・＋Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−＋Ｈ２Ｏ   （１）
【００１１】
ヘム４価鉄およびラジカルはまた、一時的に存在するにもかかわらず、非常に毒性でありうる。これらの酸化カスケードは以下の理由により損傷性でありうる：（ｉ）過酸化物が、細胞の損傷を生じさせることが知られている強力な酸化剤であるため、（ｉｉ）ヘム４価鉄およびタンパク質に基づくラジカルがともに、水素原子の抽出によって、脂質、核酸およびアミノ酸の酸化を惹起しうるため、および（ｉｉｉ）ヘム改変が、タンパク質架橋分子種に対して非常に毒性のヘムを生じさせ、ヘムの喪失および「遊離」鉄の放出を生じさせうるため。
【００１２】
ヘモグロビン媒介性過酸化損傷の可能性は、特にタンパク質が赤血球の保護環境から取り出される時はいつでも存在する。これは、例えば自発的赤血球溶血中に、または溶血性貧血（例えば鎌状赤血球貧血）において生じる。ミオグロビンは圧挫（横紋筋融解）後に、以前に考えられたように遊離鉄によって触媒されるフェントン化学ではなく、まさしくこの過酸化機構によって腎臓損傷を誘発することが示されている（Holt et al, (1999) Increased lipid peroxidation in patients with rhabdomyolysis. Lancet 353, 1241; Moore, et al (1998) A causative role for redox cycling of myoglobin and its inhibition by alkalinization in the pathogenesis and treatment of rhabdomyolysis-induced renal failure. J. Biol. Chem. 273, 31731-31737）。
【００１３】
また最近、くも膜下出血において、ヘモグロビンが赤血球から放出された場合にｉｎ ｖｉｖｏで同様の損傷を引き起こしうることが示されている（Reeder, et al (2002) Toxicity of myoglobin and haemoglobin: oxidative stress in patients with rhabdomyolysis and subarachnoid haemorrhage. Biochem. Soc. Trans. 30, 745-748）。さらにまた、（代用血液として開発された）無細胞ヘモグロビンの非制御ヘム媒介性酸化反応は、直接または細胞シグナル伝達経路との相互作用を介して重要な潜在的毒性経路であることが明らかになっている（Alayash, A. I. (2004) Oxygen therapeutics: can we tame haemoglobin? Nat. Rev. Drug Discovery 3, 152-159）。４価鉄ヘモグロビンの毒性は虚血／再潅流の内皮細胞培養モデル系［McLeod, L. L. and Alayash, A. I. (1999) Detection of a ferryl-haemoglobin intermediate in an endothelial cell model after hypoxia-reoxygenation. Am. J. Physiol. 277, H92-H99］およびグルタチオン等の抗酸化機構を欠く細胞（D'Agnillo & Alayash (2000) Interactions of haemoglobin with hydrogen peroxide alters thiol levels and course of endothelial cell death. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1880-H1889）において実証されている。
【００１４】
４価鉄ヘモグロビンはアポトーシス性および壊死性細胞死を含む細胞傷害を引き起こしうる。化学的に改変されたヘモグロビンでのラット腸の潅流は、局在化した酸化ストレスを引き起こし、放射性標識アルブミンの腸間膜の漏出を生じさせることが示されている（Baldwin et al (2002) Comparison of effects of two haemoglobin-based O2 carriers on intestinal integrity and microvascular leakage. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283, H1292-H1301）。重要なことに、ヘム鉄がシアン化物でブロックされていて酸化還元反応に入ることができない、このヘモグロビンのシアンメト誘導体（cyanomet derivative）は、細胞の変化を生じさせなかった。
【００１５】
ＵＳ５，６０６，０２５では、ヘモグロビン代用血液に関連する再潅流傷害および他の遊離ラジカル媒介性プロセスを低減するための１つのアプローチとして、ヘモグロビンとスーパーオキシドジスムターゼおよび／またはカタラーゼのコンジュゲーションが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ８８／０９１７９９
【特許文献２】ＵＳ５，９００，４０２
【特許文献３】ＵＳ５，６０６，０２５
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Holt et al, (1999) Increased lipid peroxidation in patients with rhabdomyolysis. Lancet 353, 1241; Moore, et al (1998) A causative role for redox cycling of myoglobin and its inhibition by alkalinization in the pathogenesis and treatment of rhabdomyolysis-induced renal failure. J. Biol. Chem. 273, 31731-31737
【非特許文献２】Reeder, et al (2002) Toxicity of myoglobin and haemoglobin: oxidative stress in patients with rhabdomyolysis and subarachnoid haemorrhage. Biochem. Soc. Trans. 30, 745-748
【非特許文献３】Alayash, A. I. (2004) Oxygen therapeutics: can we tame haemoglobin? Nat. Rev. Drug Discovery 3, 152-159
【非特許文献４】McLeod, L. L. and Alayash, A. I. (1999) Detection of a ferryl-haemoglobin intermediate in an endothelial cell model after hypoxia-reoxygenation. Am. J. Physiol. 277, H92-H99
【非特許文献５】D'Agnillo & Alayash (2000) Interactions of haemoglobin with hydrogen peroxide alters thiol levels and course of endothelial cell death. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1880-H1889
【非特許文献６】Baldwin et al (2002) Comparison of effects of two haemoglobin-based O2 carriers on intestinal integrity and microvascular leakage. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283, H1292-H1301
【発明の概要】
【００１８】
発明の開示
本発明者らの研究は、ヘモグロビン（Ｈｂ）およびミオグロビン（Ｍｂ）中で４価鉄（ＩＶ）分子種が生成されるメカニズム、およびこのイオンが酸化ストレスの生成に関与するメカニズムをさらに詳細に調査した。
【００１９】
本発明者らは、特定の生物種（ヒトを含む）由来のミオグロビンおよびヘモグロビンが外因性還元剤から４価ヘム鉄への電子伝達の２つの別個の経路を示すことを発見した。低親和性経路（典型的に＞５ｍＭ）は、タンパク質内の疎水性ポケットにおける還元剤から４価ヘム鉄への直接の電子伝達である。第２の高親和性経路（典型的に＜１００μＭであるが、＜１０μＭであることもよくある）は、１以上のタンパク質アミノ酸を介する還元剤と４価ヘム鉄の間の電子伝達を含む。このタンパク質を介する高親和性経路はネイティブのヒトミオグロビンおよびヘモグロビンαサブユニットに存在するが、ヒトヘモグロビンβサブユニットおよびアメフラシ（Aplysia）ミオグロビンには存在しない。この電子伝達を可能にするアミノ酸の例は、それぞれミオグロビンおよびヘモグロビンα鎖中のＴｙｒ１０３およびＴｙｒ４２である。
【００２０】
本発明者らの知見は、抗酸化特性を有することが本発明者らによって観察されている、多数の鉄キレート剤によるＭｂ４価鉄の還元に関するプロファイルにおける共通点の観察に基づく。還元剤濃度の関数としてプロットされた４価鉄減衰の速度定数に対するこれらの還元剤の効果は、二重直角双曲線関数として表される複雑な曲線を示す。本発明者らはまた、現在、さらに古典的な還元剤、例えばアスコルビン酸もまた、この二重直角双曲線濃度依存を示すことを見出している。２つの双曲線は、異なる親和性を有する還元剤の２つの結合部位を表す。動力学的モデルの使用、シミュレーションおよび選択されたネイティブタンパク質および操作されたタンパク質の使用により、本発明者らは、この濃度依存性が、還元剤からヘム鉄への２つの別個の電子伝達経路を表すと解釈した。
【００２１】
この高親和性経路は、ヘモグロビンのα鎖、およびミオグロビン中に存在するが、第４２位と等価の位置のチロシン残基を欠いている他のポルフィリンに基づく酸素運搬タンパク質においては同様に活性ではないようである。これは、特にβヘモグロビンの場合である。
【００２２】
本発明では、本発明者らは、Ｔｙｒ４２と等価のアミノ酸、または４価鉄イオンへの高親和性電子伝達経路を構成することが可能な任意の他の残基の導入によってそのようなタンパク質にこの経路を導入することを提案する。そのような改変は、この経路を介して還元される４価鉄イオンの能力を高める。有効なことに、そのような改変は、４価鉄イオンがより高速に還元され、ゆえに周囲組織または基質、例えば脂質を損傷させるその能力を減らすようにする。
【００２３】
ゆえに、本発明は、改変されたポルフィリンに基づく酸素運搬タンパク質であって、４価鉄イオンへの高親和性電子伝達経路を強化または導入するための改変を含む、タンパク質を提供する。
【００２４】
該タンパク質は好ましくはヘモグロビンβ鎖（Ｈｂβ）である。該改変は、Ｐｈｅ４１に対する改変、特にＰｈｅ４１がＴｙｒによって置換される改変でありうる。
【００２５】
本発明はまた、これらのタンパク質をコードする核酸、その製造方法および治療方法における該タンパク質の使用を提供する。本発明の前記態様および他の態様を以下でさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】還元剤デフェリプロンでの、種々のミオグロビン分子種の４価鉄還元の濃度依存性を示す。アメフラシミオグロビン（黒四角）ではなくウマミオグロビン（黒丸）は二重直角双曲線濃度依存を示す。
【図２】還元剤デフェリプロンを用いた場合の組換えマッコウクジラミオグロビンの濃度依存性を示す。マッコウクジラミオグロビンのＴｙｒ１０３＞Ｐｈｅ突然変異体（黒三角）ではなく野生型マッコウクジラミオグロビン（黒菱形）は二重直角双曲線濃度依存を示す。
【図３】タンパク質電子伝達経路を介する高親和性を有するヘムタンパク質の還元に関する、提案される２部位のモデルを示す。還元剤（ｘＨ）は親和性ＫＤ１およびＫＤ２で４価鉄酸化状態（Ｐ−［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−］２＋（Ｐはタンパク質を示す））のミオグロビン上の２つの候補部位に結合する。これらの２つの部位からのみ、還元剤から４価鉄への電子伝達が生じうる。高親和性結合部位はチロシン１０３に位置するかまたはチロシン１０３に近接し（ＰｘＨ−［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−］）、それによりタンパク質を介する４価ヘム鉄への電子の伝達（ｋｍａｘ≒０．０１ｓ−１）が可能になり、３価鉄タンパク質（Ｐ−Ｆｅ（ＩＩＩ））が生成する。低親和性部位はヘムポケット中に位置し、還元剤とヘム４価鉄の間で直接、電子伝達を可能にする（Ｐ−［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−］ｘＨ）。このモデルはまた、両部位が還元剤によって充填されることを可能にする（ＰｘＨ−［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−］ｘＨ）。動力学的シミュレーションでは、１部位での結合が第２の部位への結合の親和性に影響しないと仮定される。該モデルはまた、酸化された還元剤が再生されるステップを含む。
【図４】結晶構造から得られるウマミオグロビン（Ｃ）の公知の電子導入部残基（electron conduit residue）Ｔｙｒ１０３と比較した、αヒトヘモグロビン（Ａ）、βヒトヘモグロビン（Ｂ）中のタンパク質を介する電子伝達を導入または排除できる残基の位置を示す。ウマミオグロビンのＴｙｒ１０３はヘムに近接して表面曝露されており、それにより外因性還元剤から４価ヘム鉄への電子導入部として機能するために理想的になっている。ヒトヘモグロビンαサブユニットはほぼ同じ空間的環境中にチロシンを有する（Ｔｙｒ４２）が、ヒトヘモグロビンβ中のこの残基は酸化還元不活性なフェニルアラニンである。
【図５】アスコルビン酸による野生型４価鉄ヒトヘモグロビン還元の濃度依存性を示す。４価鉄ミオグロビン（１０μＭ）をｐＨ７．４のリン酸ナトリウム中でアスコルビン酸と反応させた。αサブユニット（黒丸）およびβサブユニット（白丸）の４価鉄還元速度定数を、二重指数関数に近似することによって算出する。βサブユニットではなくαサブユニットは二重直角双曲線濃度依存を示す。
【図６】アスコルビン酸による組換えα−Ｔｙｒ４２＞Ｖａｌ４価鉄ヒトヘモグロビン還元の濃度依存性を示す。４価鉄ミオグロビン（１０μＭ）をｐＨ７．４のリン酸ナトリウム中でアスコルビン酸と反応させた。αサブユニット（黒丸）およびβサブユニット（白丸）の４価鉄還元速度定数を、二重指数関数に近似することによって算出する。αサブユニットおよびβサブユニットはともに単一（single）直角双曲線濃度依存を示す。
【図７】アスコルビン酸による組換えα−Ｔｙｒ４２＞Ｔｒｐ４価鉄ヒトヘモグロビン還元の濃度依存性を示す。４価鉄ミオグロビン（１０μＭ）をｐＨ７．４のリン酸ナトリウム中でアスコルビン酸と反応させた。αサブユニット（黒丸）およびβサブユニット（白丸）の４価鉄還元速度定数を、二重指数関数に近似することによって算出する。αサブユニットおよびβサブユニットはともに単一直角双曲線濃度依存を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
ポルフィリンに基づく酸素運搬タンパク質
ポルフィリンに基づく酸素運搬タンパク質とは、そのネイティブ形態においてポルフィリン分子を担持し、かつ単独で、または複合体において、ポルフィリン分子に結合している酸素を運搬しかつ放出する任意のポリペプチド鎖を表す。そのようなタンパク質の変異体、例えば野生型のポルフィリンに基づく酸素運搬タンパク質の天然に存在する突然変異体または合成突然変異体もまた、本発明によって想定される。
【００２８】
ポルフィリンに基づく酸素運搬タンパク質は、そのネイティブ状態において、ヘモグロビンαサブユニット、例えば配列番号１のタンパク質またはその哺乳動物ホモログ中に存在する高親和性酸素伝達経路を欠いている。この経路は電子伝達経路を介して媒介され、該経路はＣへリックスの第７位のチロシン残基を含む（当技術分野において知られているように、ヘモグロビンサブユニットタンパク質は、以下の表１に記載される通り、個々のヘリックスの残基またはヘリックス間残基を参照することによっても番号付けされる（ＵＳ５，０２８，５８８（該文献の内容は参照により本明細書に組み入れられる）に基づく）。ゆえに、ヒトヘモグロビンα鎖のＴｙｒ４２は当技術分野において残基Ｃ７としても特定される。したがって、他のヘモグロビンα鎖の等価の残基もまた、第Ｃ７位に存在する。）。該経路は、１以上のタンパク質アミノ酸を介する還元剤と４価ヘム鉄の間の電子伝達である。このタンパク質を介する高親和性経路はネイティブのヒトミオグロビンおよびヘモグロビンαサブユニットに存在するが、ヒトヘモグロビンβサブユニットには存在しない。
【００２９】
改変対象の酸素運搬タンパク質は哺乳動物のヘモグロビンサブユニットを含むが、非哺乳動物のヘムタンパク質および該タンパク質が酸素を運搬するように改変されている他の遺伝子改変タンパク質を含んでよい。これらのタンパク質は、バルク溶液中の還元剤からヘム４価鉄へのタンパク質を介する高親和性電子経路を導入するように改変された配列（アミノ酸残基の置換（残基の挿入を含んでもよい））を有する組換えタンパク質である。
【００３０】
ヒトヘモグロビンβサブユニット等のタンパク質中に高親和性経路を導入することによって、代用血液とともに投与される還元剤、例えばアスコルビン酸、尿酸またはデフェリプロンがこれらのヘムタンパク質の非常に毒性の４価鉄酸化状態を高速に還元することを可能にし、ゆえに基質、例えば脂質およびＤＮＡの酸化を制限することによって、代用血液の毒性を減少させることができることが予測される。
【００３１】
ゆえに本発明は、その天然状態で高親和性経路を有しない任意のヘモグロビンサブユニットに適用可能である。一態様では、該タンパク質は、以下で配列番号２として配列が記載されているヒトヘモグロビンβ鎖である。使用することができる他のヘモグロビンサブユニットは、残基４２／Ｃ７と等価の位置でチロシン残基を有しない脊椎動物または非脊椎動物のヘモグロビンサブユニットである。
【００３２】
脊椎動物のヘモグロビンには、哺乳動物のヘモグロビンが含まれる。哺乳動物のヘモグロビンは特に高度に保存されている。ヒトβ鎖のホモログの例には、βグロビンスーパーファミリーのメンバー、例えばそれぞれヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）またはヘモグロビンＡ２（ＨｂＡ２）中に見出されるγまたはδヘモグロビンが含まれる。そのようなホモログのこれらの例および他の非限定的な例には、表２の哺乳動物種のホモログが含まれ、それらもすべてＰｈｅ４２残基を有する。該配列はオンラインデータベースから入手することができる。該データベースには、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓタンパク質データバンク（ｐｄｂ）によるデータベースが含まれる。これらのｐｄｂリファレンスは、ヘモグロビンβ−ファミリーサブユニットタンパク質および、適切な場合には、対応するαサブユニットタンパク質の配列を提供する。β−ファミリーサブユニット配列を、その対応するαサブユニットとともにもしくは単独で、または別のβ−ファミリーサブユニットタンパク質と組み合わせて使用することができる。
【表１】
2010531659.tif 000002
【００３３】
他の脊椎動物ヘモグロビンαサブユニットホモログには、Ｐｈｅ４２と等価の残基を有する、鳥類、爬虫類および魚類のヘモグロビンが含まれる。そのようなサブユニットの非限定的な例には、表３に記載されるサブユニットが含まれる。表３では、カラム３に哺乳動物のβ鎖サブユニットのＰｈｅ４２に相同なアミノ酸残基の位置が示されている。
【表２】
2010531659.tif 000003
【００３４】
他の非脊椎動物真核生物βヘモグロビンホモログは、節足動物または他の多細胞生物（例えば軟体動物、線虫および非線虫）および単細胞生物のホモログにおいて特定することができる。
【００３５】
酸素運搬タンパク質の改変
高親和性電子伝達経路を導入するための置換または挿入によって酸素運搬タンパク質を改変することができる。
【００３６】
特に、かつ図５に示されるように、ヘモグロビンのβサブユニットのフェニルアラニンはヘムに近接して位置し、表面曝露されており、それが酸化還元活性基であれば、外因性還元剤から４価ヘム鉄への電子導入部として機能するために理想的になっている。ゆえに本発明は、類似の位置で酸化還元活性残基を提供するための挿入または置換を提供する。
【００３７】
酸化還元活性アミノ酸は、例えば、チロシン、トリプトファンまたはヒスチジンでありうる。チロシンが特に好ましい。
【００３８】
ゆえに一態様では、本発明は、タンパク質中に酸化還元活性残基を配置してタンパク質が高親和性電子伝達経路を示すように改変されている哺乳動物のβグロビンサブユニットを提供する。この経路の存在は、タンパク質が還元剤に対して二重直角双曲線濃度依存を有することを示すことによって観察することができる。
【００３９】
一態様では、第Ｃ７位が、酸化還元活性アミノ酸、特に上記の酸化還元活性アミノ酸を導入するように置換されている。あるいはβグロビンサブユニットは、タンパク質内に、例えばＣヘリックス内に、例えばＣ６残基とＣ７残基の間またはＣ７残基とＣＤ１残基の間にこの残基を導入するための挿入を含んでよい。そのような挿入は、タンパク質のＣヘリックスの追加の改変、例えば第Ｃ１〜Ｃ６位の残基の欠失または置換と組み合わせてよい。
【００４０】
分子モデリング法を使用して、４価ヘム鉄の付近に同様に位置しかつ酸化還元活性アミノ酸を導入するように置換することができる、哺乳動物のヘモグロビンのβ鎖中の他の位置を特定することもできる。
【００４１】
他の改変
一実施形態では、野生型酸素運搬タンパク質の弱化改変（attenuating modification）に加えて、タンパク質は、１以上（例えば１〜５、例えば１または２）の追加の置換、または１〜５、例えば１、２または３アミノ酸（連続でも不連続でもよい）の欠失もしくは挿入を含んでよい。これらは、該タンパク質の追加の特性、例えばその酸素親和性または協同性、安定性および組立て率の強化、ヘム喪失率または自己酸化率の減少、またはタンパク質分解による分解および凝集への耐性、一酸化窒素に対するその結合または組換え手段によって可溶型として製造されるその能力に影響する変異であってよい。そのような改変は、それ自体は、当技術分野において公知であり、本発明のタンパク質に組み入れることができる。
【００４２】
好ましい態様では、改変は、一酸化窒素（ＮＯ）の結合を低減する改変である。ＮＯ結合を制限するが依然として酸素輸送を可能にするいくつかのヘモグロビン変異体が公知である。一酸化窒素との低減された反応率を有するいくつかのヘモグロビンβ鎖変異体がＵＳ６，４５５，６７６（該文献の内容は参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている。
【００４３】
特に、弱化改変に加えて以下の変化を酸素運搬タンパク質に含ませることができる：
Ｂ１３（Ｌｅｕ＞ＰｈｅまたはＴｒｐ）；Ｇ１２（Ｌｅｕ＞ＰｈｅまたはＴｒｐ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ）およびＥ４（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ４（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）；Ｂ１４（Ｌｅｕ＞ＰｈｅまたはＴｒｐ）；Ｇ８（Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ）およびＧ１２（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｔｒｐ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｍｅｔ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｍｅｔ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｐｈｅ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｉｌｅ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｐｈｅ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｐｈｅ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｐｈｅ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｍｅｔ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｍｅｔ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｍｅｔ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｔｒｐ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｉｌｅ）；Ｅ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｔｒｐ）；Ｅ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）；Ｅ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｐｈｅ）；Ｅ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｐｈｅ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞ＰｈｅまたはＴｒｐ）；Ｅ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞ＬｅｕまたはＴｒｐ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞ＰｈｅまたはＴｒｐ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞ＴｒｐまたはＰｈｅ）およびＧ１２（Ｌｅｕ＞ＴｒｐまたはＭｅｔ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞ＴｒｐまたはＰｈｅ）およびＢ１３（Ｌｅｕ＞ＴｒｐまたはＭｅｔ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＢ１３（Ｌｅｕ＞ＴｒｐまたはＭｅｔ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ）およびＢ１３（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞ＴｒｐまたはＰｈｅ）およびＧ１２（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ）およびＧ１２（Ｌｅｕ＞Ｍｅｔ）；Ｇ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＧ１２（Ｌｅｕ＞ＴｒｐまたはＭｅｔ）；またはＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＢ１３（Ｌｅｕ＞ＴｒｐまたはＭｅｔ）。
【００４４】
上記で使用した番号付けはヘリックス鎖の番号付けに基づき、該番号付けは、ヒトβ鎖に関する表１の一次配列の番号付けと相互参照することができる。他の酸素運搬タンパク質中の等価の位置で前記改変を施してもよい。
【００４５】
タンパク質多量体
一実施形態では、酸素運搬タンパク質は多量体形態で存在する。そのような形態は、循環中のタンパク質の寿命を延長するか、酸素運搬能力を改善するか、または副作用を低減することができる。
【００４６】
ヘモグロビンβサブユニットタンパク質の場合、そのような形態には、四量体ヘモグロビンタンパク質が含まれる。この形態では、２つのβ鎖が２つのα鎖と四量体を形成する。場合により、２以上のサブユニットは、例えば化学的架橋を介して、または組換え発現の結果として、共有結合によって互いに連結されている。
【００４７】
α鎖は野生型α鎖、例えば配列番号１のヒトα鎖または脊椎動物もしくは非脊椎動物の相同α鎖でありうる。脊椎動物α鎖には、哺乳動物、鳥類、爬虫類および魚類α鎖が含まれる。そのようなα鎖には、表２〜４において上記で参照されるβ鎖と関連して見出され、かつその配列がｐｄｂエントリーから入手可能であるα鎖が含まれる。
【００４８】
α鎖は、１以上の（例えば１〜５、例えば１または２）の追加の置換、または１〜５、例えば１、２または３アミノ酸（連続でも不連続でもよい）の欠失もしくは挿入を含んでよい。これらは、タンパク質の追加の特性、例えば他のタンパク質とのその相互作用、一酸化窒素に対するその結合または組換え手段によるその生産を促進することに影響する変異であってよい。
【００４９】
一態様では、例えば欠失または酸化還元不活性残基での置換によって第４２位のチロシン残基を除去するようにα鎖を改変することができる。酸化還元不活性残基としてここで想定されるアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンが含まれる。
【００５０】
一酸化窒素に対する結合を改変する、想定されるα鎖の具体的変化には、以下の変化が含まれる：
Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）およびＥ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞ＰｈｅまたはＴｒｐ）およびＥ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞ＰｈｅまたはＴｒｐまたはＬｅｕ）およびＥ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞ＰｈｅまたはＴｒｐ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ）およびＥ４（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ４（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｐｈｅ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｔｒｐ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｐｈｅ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｐｈｅ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｉｌｃ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ７（Ｈｉｓ＞Ｇｌｎ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｂ１０（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）およびＥ１１（Ｖａｌ＞Ｔｒｐ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｐｈｅ）；Ｅ１１（Ｖａｌ＞Ｌｅｕ）およびＧ８（Ｌｅｕ＞Ｔｒｐ）；Ｂ１３（Ｍｅｔ＞ＰｈｅまたはＴｒｐ）；Ｇ１２（Ｌｅｕ＞ＰｈｅまたはＴｒｐ）；またはＢ１４（Ｐｈｅ＞Ｔｒｐ））。
【００５１】
上記で使用した番号付けはヘリックス鎖の番号付けに基づき、該番号付けは、ヒトα鎖に関する表１の一次配列の番号付けと相互参照することができる。他の酸素運搬タンパク質中の等価の位置で前記改変を施してもよい。
【００５２】
共有結合または非共有結合によって互いにおよび／または他の酸素運搬タンパク質と結合している他の高次形態を提供してもよい。例えば、多量体化ヘモグロビンサブユニット鎖または架橋鎖はそれ自体当技術分野において公知であり、これらのアプローチを本発明に適用することができる。
【００５３】
保護基
別の態様では、本発明の酸素運搬タンパク質は、単量体形態であるか多量体形態であるかにかかわらず、保護基にコンジュゲート化することができる。そのようなものとして種々のタイプの保護基が当技術分野において公知であり、本発明において使用することができる。保護基がタンパク質である場合、この保護基を、例えば酸素運搬タンパク質のＮ末端またはＣ末端での融合体として作製することができる。あるいは、タンパク質を酸素運搬タンパク質と共発現させるか、または別々に発現させて、架橋剤を使用する化学的手段によって２つのタンパク質を連結することができる。
【００５４】
例えば、保護基の１つのクラスは酵素的抗酸化タンパク質である。これらには、カタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）が含まれる。任意の好適なカタラーゼまたはＳＯＤを使用することができるが、好ましくはこれらはヒト酵素である。組換えによってまたは当技術分野において慣用の任意の他の手段によって該酵素を製造することができる。
【００５５】
ＵＳ５，６０６，０２５（該文献の内容は参照により本明細書に組み入れられる）では、そのような酵素とヘモグロビンのコンジュゲーションが記載されており、そのような方法を本発明において使用することができる。ゆえに、酸素運搬蘇生液（oxygen-carrying resuscitative fluid）として使用するための架橋ヘモグロビンの製造に好適であると以前に報告されている任意の好適な不活性架橋試薬を使用することができる。該試薬は、例えばグルタールアルデヒド、ジアスプリン（diasprin）誘導体、ポリアルデヒド、例えばオリゴ糖の酸化的開環から得られるもの、二リン酸エステル、三リン酸エステル、等である。目的の酵素はヘモグロビンのグロビン鎖上の化学基と類似の化学基を有し、架橋試薬との反応によって架橋された場合にそれらがヘモグロビンと適切に化学結合するようになっている。
【００５６】
酸素運搬タンパク質および酵素的抗酸化タンパク質の相対量は広い範囲にわたって変動し、酸素運搬タンパク質は主要な成分を構成する。酵素（群）の総重量は、好適には、酸素運搬タンパク質の重量に基づいておよそ０．１〜１０％の範囲内であり、好ましくは約０．５〜２．５％の範囲内である。一実施形態のように、ＳＯＤおよびカタラーゼがともにポリヘモグロビン（polyhaemoglobin）に化学的に結合している場合、ＳＯＤとカタラーゼの重量比は、好適には約１：１〜５：１、好ましくは約１．５：１〜２．５：１である。
【００５７】
上記酵素基と同様に、または別の方法で使用することができる保護基の別のクラスは非抗原性ポリマー基、例えばポリアルキレンオキシド保護基である。そのような基は、単量体の酸素運搬タンパク質、または二量体もしくはより高次の形態である場合のこれらのタンパク質に対して使用してもよい。
【００５８】
例えば、ＵＳ５，９００，４０２（該文献の内容は参照により本明細書に組み入れられる）では、酸素運搬タンパク質に対するポリアルキレンオキシド、最も好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコンジュゲーションが記載されている。
【００５９】
コンジュゲートは、好ましくは、ポリアルキレンオキシドのヒドロキシル末端と酸素運搬タンパク質のリシン残基の遊離アミノ基とを共有結合によって結合することによって形成される。例えば、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカルボナート−Ｈｂコンジュゲートを開示している米国特許第５，２３４，９０３号を参照されたい。ポリマーを酸素運搬タンパク質とコンジュゲート化するための他の方法は当技術分野において公知であり、アミドまたはエステル結合を介することによる方法等の方法もまた本発明とともに使用するために好適である。ヘモグロビンリシンのεアミノ基の修飾が好ましいが、他のコンジュゲーション方法も想定される。ヘモグロビンとポリマーとの間の任意の原子による共有結合が可能である。さらに、非共有結合によるコンジュゲーション、例えば親油性または親水性相互作用もまた想定される。
【００６０】
酸素運搬タンパク質の共有結合によるコンジュゲート化に好適な活性化ポリマーの追加の例は米国特許第５，３４９，００１号；同第５，３２１，０９５号；同第５，３２４，８４４号および同第５，６０５，９７６号ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ９５／１１９２４号および同第ＷＯ９６／０００８０号（各文献の開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【００６１】
コンジュゲートは、好ましくは、ポリアルキレンオキシドとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ポリアルキレンオキシドには、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマー等が含まれる。該ポリマーは、モノメトキシ基の代わりにＣ２−４，アルキルで遠位をキャップすることもできる。
【００６２】
本明細書中での使用に好適であるよう、ポリアルキレンオキシドは室温で水溶性でなければならない。約２００〜約１００，０００ダルトンの（数平均）分子量を有するポリアルキレンオキシド鎖を使用することができる。例えば、好ましいＰＡＯは約１，０００〜約３０，０００の分子量を有するが、約２，０００〜約２５，０００の分子量を有するＰＡＯがより好ましい。いくつかの特に好ましい本発明のコンジュゲートは、約５，０００ダルトンの分子量を有するポリアルキレンオキシド鎖を含む。
【００６３】
非抗原性ポリマー基のストランドと酸素運搬タンパク質の数の比は、約１：１〜約２０：１、好ましくは約５：１〜１５：１、例えば約１０：１であってよい。該鎖は、上記で指定したサイズ範囲のものであってよい。
【００６４】
全体として、コンジュゲーション前の酸素運搬タンパク質の単量体の分子量は約１７，０００Ｄａである。そのようなタンパク質を上記非抗原性ポリマー基にコンジュゲート化する場合、コンジュゲートは、約３０重量％〜６０重量％、例えば約４５重量％〜５５重量％のタンパク質（すなわち酸素運搬タンパク質またはこのタンパク質と酵素基のコンジュゲート）であり、残りは非抗原性ポリマー基である。
【００６５】
ゆえに本発明の典型的な実施形態は本発明の酸素運搬タンパク質と約２，０００〜約２５，０００の分子量を有する４５重量％〜５５重量％のポリアルキレンオキシドとのコンジュゲートである。この実施形態の一態様では、酸素運搬タンパク質は、Ｐｈｅ４１の位置に改変が存在するヘモグロビンβ鎖であってよい。この実施形態の別の態様では、ポリアルキレンオキシドはＰＥＧである。別の態様では、酸素運搬タンパク質は、Ｐｈｅ４１の位置に弱化改変が存在するヘモグロビンα鎖であり、かつポリアルキレンオキシドはＰＥＧである。
【００６６】
上記実施形態では、酸素運搬タンパク質は単量体または２以上の単位の多量体の形態であってよい。
【００６７】
組成物
本発明の酸素運搬タンパク質は、望ましくは、哺乳動物、特にヒトへの投与に好適な生理学的に許容される担体を含む組成物として製剤化される。一般に、そのような担体は、保存期間中に生理的ｐＨでかつ安定に溶液を維持するために使用されるバッファーおよび保存剤を含む滅菌溶液である。該担体は、ハンクス液またはリンゲル液、生理食塩水、生理食塩水およびグルコースからなる混合物、およびヘパリン添加クエン酸ナトリウム−クエン酸−デキストロース溶液等の生理学的に適合性のバッファーでありうる。本発明の酸素運搬タンパク質は、コロイド様代用血漿および血漿増量液、例えば直鎖多糖類（例えばデキストラン）、ヒドロキシエチルデンプン、平衡流動ゼラチン（balanced fluid gelatin）、および他の血漿タンパク質と混合することができる。さらに、酸素運搬タンパク質を水溶性の生理学的に許容されるポリマー性代用血漿と混合してよく、その例には、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）、ポリビニルピロリドン、およびエチレンオキシド−ポリプロピレングリコール縮合物が含まれる。
【００６８】
本発明の組成物はさらに、抗酸化特性を有する１以上の化合物を含んでよい。これらの化合物には、アスコルビン酸および尿酸が含まれる。抗酸化剤は任意の好適な濃度で含ませることができ、その濃度は抗酸化剤の使用目的および性質にしたがって変動する。例えば、尿酸の好適な濃度は５０〜４００マイクロモル濃度の範囲内であり、アスコルビン酸では、５０〜２００マイクロモル濃度の範囲内であるが、必要であれば、さらに少量または多量を使用してもよい。
【００６９】
組成物は、酸素運搬タンパク質の崩壊によって放出される鉄の封鎖に役割を果たす鉄キレート剤を含んでもよい。そのような鉄キレート剤の例には、デスフェリオキサミンおよびデフェリプロンが含まれる。鉄キレート剤またはその混合物は例えば１０〜５０００マイクロモル濃度の濃度で存在させてよい。
【００７０】
酸素運搬タンパク質の投与
本発明のタンパク質を代用血液として使用することができる。必要とされる酸素レベルの回復、維持または補充（replacement）にそれが有用である多数の状態が存在する。これらには、外傷；虚血（例えば心臓発作、卒中、または脳血管外傷によって引き起こされる虚血）；血液希釈（術前に除去された血液を補充するための代用血液が必要とされる）；敗血性ショック；癌（例えば低酸素の腫瘤の内核に酸素を送達するため）；慢性貧血；鎌形赤血球貧血；心臓麻痺；および低酸素症が含まれる。ゆえに、前述の状態を治療するための方法において本発明の酸素運搬タンパク質およびその組成物を使用することができる。
【００７１】
本発明の酸素運搬タンパク質およびその組成物を臓器灌流においてｅｘ ｖｉｖｏで使用してもよい。移植前にｅｘ ｖｉｖｏで臓器中の酸素含量の維持が、許容される状態での臓器の維持に必要とされる臓器灌流において、代用血液は特に有用である。臓器には、心臓、肝臓、肺、腎臓が含まれる。
【００７２】
上述の方法のいずれかにおいて使用される本発明の酸素運搬タンパク質の濃度および量は医師の判断に従い、医師は患者の状態および治療の性質を考慮に入れる。典型的に、０．１〜６ｇ／ｄｌ、例えば０．１〜４ｇ／ｄｌの濃度の酸素運搬タンパク質を使用することができる。酸素運搬タンパク質は、通常、静脈内投与される。
【００７３】
一酸化窒素生成を強化する無害の試薬（例えばアルギニン）の共投与もまた想定される。
【００７４】
核酸
本発明はまた、本発明の改変された酸素運搬タンパク質をコードする核酸を提供する。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖でありうる。
【００７５】
本発明の核酸は単離および／もしくは精製された形態であるか、またはそれが天然に伴う物質を含まないかもしくは実質的に含まず、例えば、１以上の発現用調節配列（群）は除外される場合があるが、ヒトゲノム中で該遺伝子に隣接する核酸を含まないかもしくは実質的に含まない。
【００７６】
一般に、本発明の核酸は、酸素運搬タンパク質をコードする野生型配列の改変によって取得することができる。野生型ヘモグロビンおよび他の酸素運搬タンパク質の核酸配列は当技術分野において公知であり、広く入手可能である。一般に、組換え技術、例えば部位特異的突然変異誘発を使用して公知の野生型配列を改変し、該配列が本発明の改変された酸素運搬タンパク質をコードするようにすることができる。
【００７７】
哺乳動物の核酸の野生型配列を、異種系、例えば細菌または酵母細胞での発現のためにコドン使用を最適化するように改変することもできる。
【００７８】
本発明の核酸を組換え複製可能ベクターに組み込むことができる。該ベクターを使用して、適合性宿主細胞中で該核酸を複製することができる。ゆえに別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸を作製する方法であって、本発明の核酸を複製可能ベクターに導入し、適合性宿主細胞にベクターを導入し、かつベクターの複製を生じさせる条件下で宿主細胞を培養することによる方法を提供する。
【００７９】
好ましくは、ベクター中の本発明の核酸は、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことが可能な制御配列に機能的に連結されている。すなわち該ベクターは発現ベクターである。
【００８０】
用語「機能的に連結されている」とは、上記構成要素がその目的の様式で機能することを可能にする関係におかれている並列状態を表す。コード配列に「機能的に連結」されている制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲーションされている。
【００８１】
適切な調節配列を含有する好適なベクターを選択または構築することができ、該調節配列には、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列が必要に応じて含まれる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えば’ファージファージミドまたはバキュロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、またはＰＡＣであってよい。ベクターには、遺伝子治療ベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えばＨＩＶまたはＭＬＶ）またはαウイルスベクターに基づくベクターが含まれる。
【００８２】
ベクターには、複製起点、場合により酸素運搬タンパク質の発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターの調節因子を備えることができる。ベクターには、１以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合のアンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターについてネオマイシン耐性遺伝子を含ませてよい。ベクターを例えばＲＮＡの生成のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで使用するか、または宿主細胞のトランスフェクトまたは形質転換に使用してよい。種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系が周知である。好適な宿主細胞には、細菌、真核細胞、例えば哺乳動物細胞および酵母、およびバキュロウイルス系が含まれる。当技術分野において異種ポリペプチドの発現に利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞および多数の他の細胞が含まれる。
【００８３】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターの対象である宿主細胞と適合するように選択することができる。例えば、酵母プロモーターには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターが含まれる。哺乳動物プロモーターには、重金属、例えばカドミウムに応答して誘導することができるメタロチオネインプロモーターが含まれる。ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターを使用してもよい。すべてのこれらのプロモーターは当技術分野で容易に利用可能である。
【００８４】
ベクターは、他の配列、例えば挿入核酸の発現を駆動するためのプロモーターまたはエンハンサー、酸素運搬タンパク質が融合体として産生されるようにする核酸配列および／または宿主細胞中で産生されるポリペプチドが細胞から分泌されるようにする分泌シグナルをコードする核酸を含んでよい。
【００８５】
遺伝子治療に使用される本発明のポリペプチドを生成するためのベクターには、本発明のミニ遺伝子配列を担持するベクターが含まれる。
【００８６】
宿主細胞および酸素運搬タンパク質の生成
本発明の宿主細胞、例えば上記で本明細書中に記載される宿主細胞は、酸素運搬タンパク質の発現を生じさせる条件下で培養することができ、次いでタンパク質を回収して、実質的に単離された形態のタンパク質を得る。
【００８７】
該タンパク質をヘムの供給源とともに製造するか、または回収期間中もしくは回収後に好適なヘム供給源、例えばフェロプロトポルフィリンまたはフェリプロトポルフィリン（ヘミン）と混合して機能的酸素運搬タンパク質を得ることができる。
【００８８】
例えば、ＵＳ５，８０１，０１９（該文献の内容は参照により本明細書に組み入れられる）では、酵母細胞でのヘモグロビンサブユニットの多量体を含む種々の改変ヘモグロビンの発現および回収が記載されている。そのような方法を本発明において酸素運搬タンパク質を製造するために使用することができる。
【００８９】
酸素運搬タンパク質がヘモグロビンβ鎖サブユニットである場合、それを相補的サブユニット、例えばα鎖サブユニットと共発現させることができる。共発現されたタンパク質は、分離されたタンパク質の形態またはβ鎖サブユニットとの融合体の形態であってよい。
【００９０】
発現後、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差を非限定的に含む標準的方法を使用するか、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的技術によって該タンパク質を回収する。
【実施例】
【００９１】
実施例
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。
【００９２】
実施例１
アメフラシではなくウマ由来のミオグロビンは、４価鉄還元速度論によって測定される、タンパク質を介する高親和性電子伝達経路を有する
この実施例では、異なる動物種由来のミオグロビンの４価鉄ヘムの、３価鉄ヘムタンパク質への還元の速度論を動力学的に調査して、タンパク質を介する高親和性経路の存在または不存在を決定した。手順にしたがって、ｐＨ７．４の５ｍＭリン酸ナトリウム中のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Poole, Dorset, UK）製の３価鉄ウマミオグロビン（ゲルろ過によってさらに精製されている）、または組換え３価鉄アメフラシミオグロビンＭｂ（２０μＭ）をＨ２Ｏ２（２０μＭ）と２５℃で１５分間反応させた。この時点で、硫化ナトリウム（１ｍＭ）の添加によって測定された場合、３価鉄ミオグロビンから４価鉄ミオグロビンへの変換は９５％を超えた。カタラーゼ（１０ｎＭ）を加えて未反応Ｈ２Ｏ２を除去し、さらに１分間反応させておいた。使用されるｐＨでは、４価鉄ヘムタンパク質は数時間安定である。次いで還元剤をｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸ナトリウムに１：１容量比で加えて、４価鉄ミオグロビンの終濃度が１０μＭになるようにした。他の強いバッファー（例えばｐＨ５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム）を使用して、４価ヘム鉄が不安定である他の値にｐＨをジャンプさせることができる。反応が完了するまで光学スペクトルを追跡した。最小二乗法を使用して時間経過（４２５ｎｍ〜４０８ｎｍ）を単一指数関数に近似した。次いでこれらの速度定数を還元剤濃度の関数としてプロットし、このプロファイルを二重直角双曲線に近似（最小二乗法）した（図１）：
【数１】
2010531659.tif 000004
【００９３】
式中、ｋａおよびｋｂは各双曲線の最大速度であり、ＫＤ１およびＫＤ２は解離定数であり、Ｓは還元剤の濃度であり、およびＡＲは４価鉄自己還元（auto-reduction）の速度定数である。
【００９４】
ウマ由来の４価鉄ミオグロビン還元に関して観察された速度定数の変化に対する還元剤の濃度の依存性は二重直角双曲線依存を示すが、これはアメフラシミオグロビンでは観察されない。ウマ由来のミオグロビンは第１０３位および第１４６位の２つのチロシン残基を有するが、アメフラシミオグロビンはチロシン残基を有しない。
【００９５】
実施例２
ヘムに近接するチロシン残基はタンパク質を介する高親和性の電子伝達経路にとって重要である
野生型および組換えマッコウクジラミオグロビンおよび組換えＴｙｒ１０３＞Ｐｈｅマッコウクジラミオグロビンを過酸化物と反応させ、デフェリプロンによる４価ヘム鉄還元の速度論を実施例１に記載されるように決定した。タンパク質を介する電子伝達経路は、野生型マッコウクジラミオグロビンにおいて明らかであるが、Ｔｙｒ１０３＞Ｐｈｅ突然変異体では観察されない（図２）。このことは、ヘムと外部環境を接続する酸化還元活性チロシンの存在が高親和性経路の重要な構成要素であることを示す。
【００９６】
図１および図２のデータは２部位モデルによって合理的に説明することができる。該モデルでは、還元剤（ｘＨ）はその４価鉄酸化状態でミオグロビン上の２つの候補部位に親和性ＫＤ１およびＫＤ２で結合する（Ｐ−［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−］２＋（式中、Ｐはタンパク質を示す））（図３）。これらの２つの部位からのみ、還元剤から４価鉄への電子伝達が生じうる。高親和性結合部位はＴｙｒ１０３に位置するかまたはＴｙｒ１０３に近接し（ＰｘＨ−［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−］）、それによりタンパク質を介する４価ヘム鉄への電子の伝達（ｋｍａｘ≒０．０１ｓ−１）が可能になり、３価鉄タンパク質（Ｐ−Ｆｅ（ＩＩＩ））が生成する。低親和性部位はヘムポケット中に位置し、還元剤と４価鉄ヘムの間で直接、電子伝達を可能にする（Ｐ−［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−］ｘＨ）。このモデルはまた、両部位が還元剤によって充填されることを許容する（ＰｘＨ−［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ２−］ｘＨ）。動力学的シミュレーションでは、１つの部位での結合が第２の部位への結合の親和性に影響しないと仮定される。該モデルは、酸化された還元剤が再生されるステップを含む。このモデルはまた、結晶構造に基づく他のヘムタンパク質に関する予測を可能にする。ヒトヘモグロビンのαサブユニットの構造は、ミオグロビンと比較して類似の空間的位置のチロシン（Ｔｙｒ４２）を示し、それはヘムに近接して表面曝露されており、それにより外因性還元剤から４価ヘム鉄への電子導入部として機能するために理想的になっている（図４）。ヒトヘモグロビンβ中の対応する残基は酸化還元不活性フェニルアラニンである。ゆえに、該モデルでは、βサブユニットではなくヒトヘモグロビンαサブユニットがタンパク質を介する高親和性の電子伝達経路を有することが予測される。
【００９７】
実施例３
ヒトヘモグロビンの異種サブユニットは異なる４価鉄還元機構を示す
組換えヒトヘモグロビンを過酸化物と反応させ、アスコルビン酸による４価ヘム鉄還元の速度論を実施例１に記載されるように決定した。４価ヘム鉄還元の時間経過はミオグロビンで観察されるように単一指数関数的ではないが、２つの速度定数を生成する二重指数関数を使用して説明することができる。該速度定数の一方はαサブユニットの４価鉄還元に関して観察される速度定数であり、他方はβサブユニットの４価鉄還元に関して観察される速度定数である。４価鉄還元の速度論（図５）は、サブユニットが還元剤に対して非常に異なる挙動を示し、αサブユニットに割り当てられたヘモグロビンサブユニットの一方のみが高親和性電子伝達経路を示すことを示す。
【００９８】
実施例４
α−Ｔｙｒ４２の部位特異的突然変異誘発はタンパク質を介する高親和性の電子伝達経路を排除し、４価ヘム鉄還元の速度を減少させる
部位特異的突然変異誘発を使用してα遺伝子の突然変異体を作製した。プライマー配列は表５（下記）に見出せる。以下のＰＣＲプログラム：９５℃２分；９５℃３０秒 ５５℃１分 ７２℃５分 １６サイクル；７２℃１０分でのＰＣＲ反応において、高フィデリティーの酵素、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ（Finnzymes）またはＰｆｕ  ＵｌｔｒａＴＭ（Stratagene）を製造元の仕様書にしたがって使用した。次いでＤｐｎＩ（Fermentas）を使用して鋳型ＤＮＡを消化し、標準的手順を使用して突然変異プラスミドを大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１ ＤＥ３に形質導入した。得られたクローンをＢｉｇＤｙｅＴＭターミネーターｖ．３．０（Applied Biosystems）を用いて配列決定して正確な配列を確認した。
【００９９】
本質的に下記実施例５に記載されるように、改変α鎖をコードするプラスミドを有する大腸菌を培養し、標準的方法を使用して改変α鎖を回収した。
【表３】
2010531659.tif 000005
【０１００】
α−Ｔｙｒ４２＞Ｖａｌ（図６）またはα−Ｔｙｒ４２＞Ｔｒｐ（図７）突然変異を有する組換えヒトヘモグロビンを過酸化物と反応させ、実施例１に記載されるようにアスコルビン酸による４価鉄ヘム還元の速度論を決定した。両突然変異体において、αサブユニットの４価鉄還元の速度に対する効果が劇的であり、第１の双曲線の不存在によって示されるようにタンパク質を介する高親和性経路が喪失する。そして、α−Ｔｙｒ４２から部分的酸化還元活性トリプトファンへの突然変異は、１０μＭアスコルビン酸濃度でαサブユニットの４価鉄還元の速度を２倍減少させ、α−Ｔｙｒ４２から酸化還元不活性バリンへの突然変異は、１０μＭアスコルビン酸濃度でαの４価鉄還元の速度を１２倍減少させる。
【０１０１】
実施例５
Ｈｂβ鎖の部位特異的突然変異誘発
上記実施例４に記載の方法を使用して、以下のプライマーペアを使用してヒトヘモグロビンβ鎖のβ鎖突然変異体を作製し、β−Ｐｈｅ４１＞Ｔｙｒ突然変異を導入した：
【表４】
2010531659.tif 000006
【０１０２】
ヒトヘモグロビンα鎖およびβ鎖の遺伝子を大腸菌（Escerichia coli）での発現に最適化し、ベクターｐＥＴＤｕｅｔにクローニングして、ＨｂｐＥＴＤｕｅｔを得た。上記のように、部位特異的突然変異誘発を使用してα遺伝子およびβ遺伝子の突然変異体を作製した。以下のＰＣＲプログラム：９５℃２分；９５℃３０秒 ５５℃１分 ７２℃５分 １６サイクル；７２℃１０分でのＰＣＲ反応において、高フィデリティーの酵素、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Finnzymes）またはＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ（Stratagene）を製造元の仕様書にしたがって使用した。次いでＤｐｎＩ（Fermentas）を使用して鋳型ＤＮＡを消化し、標準的手順を使用して突然変異プラスミドを大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３に形質導入した。得られたクローンをＢｉｇＤｙｅターミネーターｖ．３．０（Applied Biosystems）を用いて配列決定して正確な配列を確認した。
【０１０３】
プラスミドＨｂｐＥＴＤｕｅｔを有する大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３を、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む１ＬのＴＢ培地を含有する２Ｌフラスコ中で３７℃および１２０ｒｐｍでＯＤ６２０≧１まで培養した。次いで０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加えることによってヘモグロビンの発現を誘導した。また、タンパク質収率を改善するために０．３ｍＭ δ−アミノレブリン酸およびＣＯガスを加えた。誘導後に培養条件を２２℃および６０ｒｐｍに変更した。細胞を回収し、ｐＨ６．０の１０ｍＭ ＮａＰバッファーに再懸濁した後、超音波処理して細胞を破壊した。ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（GE Healthcare）のイオン交換クロマトグラフィーを使用してヘモグロビンを精製した。サンプルをカラムにアプライした後、吸光度がベースラインに戻るまでｐＨ６．０の１０ｍＭ ＮａＰバッファーで洗浄した。ｐＨ７．２の７０ｍＭ ＮａＰバッファーでヘモグロビンを溶出させ、ＶｉｖａＳｐｉｎカラム（Vivascience）を使用して濃縮した。次いで濃縮サンプルを、溶出バッファーを使用してＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ゲルろ過カラム（GE Healthcare）にアプライした。ヘモグロビン含有画分を上記のように濃縮し、必要時まで−８０℃で保存した。
【０１０４】
突然変異型α鎖およびβ鎖を含む組換えヘモグロビンを試験して、α鎖からβ鎖への高親和性電子伝達経路の移動を実証した。
【表５】
2010531659.tif 000007
2010531659.tif 000008
【０１０５】
配列：
配列番号１（Ｈｂα）
2010531659.tif 000009
【０１０６】
配列番号２（Ｈｂβ）
2010531659.tif 000010
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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