(57)【要約】  本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、より具体的にはヒトの医療に関する。特に、本発明は、癌患者の治療に使用するワクチン組成物を説明する。本発明に記載のワクチン組成物は、活性因子として、ヒト組換え上皮増殖因子(hrEGF)と組換えタンパク質P64Kとの化学結合物を有する。加えて、制御され再現性のある方法で前記化学結合物を製造する結合反応を行うための特定の条件が記載されている。他の実施形態において、本発明は、より高純度の治療用組成物ばかりでなく、ヒトにおける抗EGF抗体価の有意な上昇を引き起こす、免疫原生作用の驚くべき増強を与える化学結合物の精製方法に関する。さらに、本発明は、1以上の用量形態(結合型EGF-P64Kの合計ミリグラム/バイアル)でワクチン製剤を製造する方法を提供する。このワクチン製剤の形態の融通性により、注射回数および/または予防接種部位を増やすことを必要とせずに、患者への予防接種量を増やすことができる。最後に、本発明は、非経口経路で投与する、癌治療用ワクチンを製造する衛生的方法を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性因子として複合体型hrEGF-rP64Kを含むワクチン組成物であって、各P64Kタンパク質分子がhrEGF分子2つに結合している前記ワクチン組成物。
【請求項２】
rP64K担体タンパク質とhrEGFとの間のコンジュゲート比が12.04:24.05ナノモルである、請求項1記載のワクチン組成物。
【請求項３】
hrEGFポリマーまたは遊離型hrEGFなどの他の分子種を含まない複合体化hrEGF-rP64Kの均一混合物である、請求項1記載のワクチン組成物。
【請求項４】
複合体型hrEGF-rP64Kの均一混合物がグルタルアルデヒドを含まない、請求項1記載のワクチン組成物。
【請求項５】
複合体型hrEGF-rP64Kの均一混合物が、さらに、水酸化アルミニウムまたはモンタニドを含む群から選択される適切なアジュバントを含む、請求項1記載のワクチン組成物。
【請求項６】
アジュバントがモンタニドである、請求項5記載のワクチン組成物。
【請求項７】
アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項5記載のワクチン組成物。
【請求項８】
複合体型hrEGF-rP64Kの均一混合物が、免疫した哺乳動物の血清において、抗EGF抗体力価の少なくとも10倍の上昇を引き起こすことができる、請求項1記載のワクチン組成物。
【請求項９】
複合体型hrEGF-rP64Kの均一混合物が、ヒトの血清において、抗EGF抗体力価の少なくとも10倍の上昇を引き起こすことができる、請求項1記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
複合体型hrEGF-rP64Kの均一混合物が、ヒトの血清において、抗EGF抗体力価の少なくとも100倍の上昇を引き起こすことができる、請求項1記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
衛生基準に基づく請求項1記載のワクチン組成物の製造方法であって、EGFを担体タンパク質rP64Kに共有結合させるための適切な条件ならびに、生物学的に不活性な結合物および他の化学的不純物も除去するための、限外濾過膜を用いるこの分子複合体の精製を含む前記方法。
【請求項１２】
結合反応が、最初に、結合反応器中、あらかじめ濃縮したhrEGFタンパク質(>6mg/mL)とP64Kタンパク質(≧1mg/mL)を混合し、次いでこの混合物にPBS/MgCl2溶液(pH6.8〜7.2)およびグルタルアルデヒド0.5％結合溶液を加え、前記混合物を攪拌しながら2時間22℃±2℃でインキュベートする単一段階からなる、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質hrEGFとrP64Kとの間の結合のパラメータが、rP64K分子1つに対してhrEGF分子2つのコンジュゲート比に固定される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
孔径50〜100kDaを有する膜を用いる限外濾過法/透析濾過法により複合体タンパク質が精製される、請求項11記載のワクチン組成物の製造方法。
【請求項１５】
孔径50kDaを有する膜を用いる限外濾過法/透析濾過法により複合体タンパク質が精製される、請求項14記載のワクチン組成物の製造方法。
【請求項１６】
孔径100kDaを有する膜を用いる限外濾過法/透析濾過法により複合体タンパク質が精製される、請求項14記載のワクチン組成物の製造方法。
【請求項１７】
活性因子として複合体タンパク質hrEGFrP64Kを含むワクチン組成物であって、請求項15記載の方法により精製される前記ワクチン組成物。
【請求項１８】
活性因子として複合体タンパク質hrEGFrP64Kを含むワクチン組成物であって、請求項16記載の方法により精製される前記ワクチン組成物。
【請求項１９】
活性因子として複合体タンパク質hrEGFrP64Kを含むワクチン組成物であって、総タンパク質の最終濃度が1〜12mg/mLの範囲である前記ワクチン組成物。
【請求項２０】
ヒトEGFに対する免疫反応を誘導する作用剤の製造のための、請求項17記載のワクチン組成物の使用。
【請求項２１】
ヒトEGFに対する免疫反応を誘導する作用剤の製造のための、請求項18記載のワクチン組成物の使用。
【請求項２２】
上皮性腫瘍の治療に有用な作用剤の製造のための、請求項17記載のワクチン組成物の使用。
【請求項２３】
上皮性腫瘍の治療に有用な作用剤の製造のための、請求項18記載のワクチン組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーに関し、特にヒトの健康に関する。一実施形態において、本発明は、感染防御および/または治療用癌ワクチンについて説明し、主として、主に上皮由来の腫瘍の増殖との腫瘍学的関連性が広く明らかにされている上皮増殖因子(EGF)に対する免疫反応の有意な増加を誘導するワクチン組成物について説明する。
【背景技術】
【０００２】
リガンドを含むEGF受容体(EGFR)系は、特に細胞増殖を調節する分子複合体であり、上皮性腫瘍の無制限な増殖に影響を及ぼす。
腫瘍形成過程において、EGRFの活性化のためのパラクリンおよびオートクリン過程の調節解除は、増殖因子の過剰発現ばかりでなく、この受容体の合成増加および/または変異を含む。
【０００３】
EGFは53アミノ酸のポリペプチドであり、見かけの分子量は6045Daである。このペプチドは、Cohen S. J. Biol. Chem. 20 (1962) 237, 1.555) により初めて単離精製された。
EGFはEGFRリガンドファミリーのメンバーである。このファミリーは、構造的および機能的に関連するタンパク質を含む。このファミリーの他のメンバーには、トランスフォーミング成長因子(TGF)、アンフィレギュリン(AR)、クリプトール(criptol)(CR1)、ヘパリン結合性増殖因子、ベータセルリンおよびエピレギュリンがある。他方では、ポックスウイルスのファミリーは、EGFに関連するタンパク質を含む。中でも、ワクシニアウイルス増殖因子(VGF)は最も解析されている。
これらの分子は、すべてEGFRに結合でき、結果として受容体が活性化されるので、EGFRリガンドとして知られ、正常細胞および腫瘍細胞の増殖に関与している。
【０００４】
EGFRは170kDaの糖タンパク質である。この遺伝子は、すでにクローニングされ、配列決定されている。この受容体の細胞内ドメインは、分子のチロシンキナーゼ活性と関連し、v-erb-B癌遺伝子によりコードされるタンパク質と構造的相同性を示し、悪性形質転換過程に関与している(HELDIN C.H. (1984), CELL 37, 9-20.)。
EGFRおよびそのリガンドの系と癌との関連に関する近年の実験的根拠により、この系は癌免疫療法の大変魅力的な標的となっている。
【０００５】
これまでの結果により、EGFベースのワクチンを用いる能動免疫療法の、癌に対する有効性が明らかにされている。実際、担体タンパク質に結合されているhrEGFを用いるワクチン接種により免疫原性が得られ、毒性が欠除していることに関して前臨床および臨床的根拠が得られている(Gonzalez and cols. (1996), Vaccine Research 5(4), 233-243.)。
EP 0 657 175には、自己免疫作用によりEGF依存性腫瘍の増殖を抑制する、担体タンパク質に連結された自己EGFを含むワクチン組成物が記載されている。
EP 0 657 175に記載されているワクチン組成物は、担体タンパク質(P64Kタンパク質、コレラ毒素B鎖、破傷風トキソイドタンパク質および/またはモノクローナル抗体)に連結されたEGFを含むコンジュゲートワクチンであり、結果として異種の、再現性の低い複合体種の混合物が得られる。
【０００６】
本発明に記載の新規ワクチン組成物は、活性因子として自己EGFを含み、均一な化学組成を有し、規定の純度を有し、より高い免疫原性を誘導し、実質的に増加した臨床活性を有し、より少ない予防接種で治療効果を得ることを特徴とする。
驚くべきことに、本発明のワクチン組成物において自己抗原量が低いことがヒトにおいて低いEGF抗体価を誘導するのではなく、反対に、寧ろ抗EGF抗体価の有意な上昇をもたらす。ワクチン組成物におけるEGFおよびその誘導体の量の低さは膜濾過に基づく精製方法の開発により得られたが、これもまた本発明の対象である。
【０００７】
さらにまた、本発明は、臨床効果がより高く、予防接種がより少ない、均一で再現性のあるワクチン組成物を提供するが、このことは、既述のワクチン組成物と比較して癌治療および患者にとって優れた利点を意味する。
本発明のワクチン組成物はまた、水酸化アルミニウムまたはモンタニド(Montanide)などの適切なアジュバントを含むこともできる。
他の実施形態において、本発明は、ヒトにおける非経口経路での使用に適する前記ワクチン組成物の製造のための衛生的方法に関する。
本方法は、hrEGFを担体タンパク質P64Kに共有結合させるための適切な方法ならびに、生物学的に不活性な(免疫原性作用のない)複合体種および他の化学的不純物を除去するための、一連の50〜100kDaの限外濾過膜を用いるこの複合体種の精製を含む。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、バイオテクノロジーに関し、より具体的にはヒトの医療に関する。特に、本発明は、癌患者の治療に使用するワクチン組成物を説明する。本発明に記載のワクチン組成物は、活性因子として、ヒト組換え上皮増殖因子(hrEGF)と組換えタンパク質P64Kとの化学的複合体を有する。加えて、制御され再現性のある方法で前記化学的複合体を製造する結合反応を行うための特定の条件が記載されている。他の実施形態において、本発明は、より高純度の治療用組成物ばかりでなく、ヒトにおける抗EGF抗体価の有意な上昇を引き起こす、免疫原生作用の驚くべき増強を与える化学的複合体の精製方法に関する。さらに、本発明は、いくつかの用量形態(結合型EGF-P64Kの合計ミリグラム/バイアル)でワクチン製剤を製造する方法を提供する。このワクチン製剤の形態の融通性により、注射回数および/または予防接種部位を増やすことを必要とせずに、患者への予防接種量を増やすことができる。なお、本発明は、非経口経路で投与する、癌治療用ワクチンを製造する衛生的方法を含む。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、自己EGFをベースとした新規ワクチン組成物であって、規定の純度および均一な化学組成を有し、強力な免疫原性および実質的に上昇した臨床活性を誘導することができるワクチン組成物を開示する。さらに、本発明のワクチン組成物を用いれば、治療量を増やさなければいけないときに、注射回数を増やすことなく治療量を増やすことができる。なぜなら、本発明のワクチン組成物を製造する方法によって、有効であることが分かっている複合体種hrEGF-rP64Kの濃度を増加させることができるからである。
驚くべきことに、以前報告された異種EGFベースワクチンと比較して、新規精製方法により自己抗原量が減少するにもかかわらず、本発明のワクチン組成物は自己EGFに対する免疫反応の有意な増加を誘導することができることを本発明者らは見出した。
【００１０】
限外濾過膜精製法を用いて自己抗原量を減少させることにより得られるワクチン組成物は、免疫学的に活性な種(結合種hrEGF-rP64K)が60kDaより高い分子量を示す均一な組成物である。このワクチン組成物は、図4に示すように、生物活性を有する種が、全ワクチン組成物に相当する全クロマトグラム面積の90%以上に相当することを特徴とする分子排除クロマトグラフィープロフィールを示す。
本ワクチン組成物の質量分析により、その構造的特徴が明らかになった。2つの異なるロットのペプチドマップは、その位置においても比率においても、ロット間で高い相同性を示す(図5)。ロット間のこの高い相同性により、化学結合のパラメータに加えて精製方法のパラメータの正確さが確認されたが、これらは共に本発明に記載されている。さらに、本発明のワクチン組成物由来の主要ペプチドの配列が質量分析により明らかになった(表3)。
本ワクチン組成物において、EGFとP64Kタンパク質の間のコンジュゲート比は1:2であり、これはP64K分子1つに対しEGF分子2つを意味する。
【００１１】
ワクチン組成物を得るための方法論
自己EGF量を減少させる精製手順
ワクチン組成物におけるhrEGF量の減少がその免疫作用を増強させることを証明する実験的所見に基づいて、結合種の不均一混合物におけるhrEGF量を減少させる方法(ワクチン組成物において高分子量の複合体種(免疫学的に活性な種)を濃縮し、グルタルアルデヒドを取り除く方法)が開発されている。
【００１２】
本発明において、次の2段階からなる、50〜100kDaの範囲の限外濾過膜を用いる精製方法が開発され、記載される。
最初の段階において、グルタルアルデヒドを除去し、過剰の自己タンパク質(遊離型または種々のサイズの結合型hrEGF-hrEGF)を除去するために、継続的に緩衝液を交換する(透析濾過)。この段階において、緩衝液を10〜15回交換する。
第2段階は、精製された化学的複合体の濃縮である。この濃縮において、その組成物の90%以上が免疫原性種hrEGF-rP64Kに相当する。
この濃縮段階において、化学的複合体の初期量を、最終タンパク質濃度(結合種hrEGF-rP64K)1〜12mg/mLに到達するまで減少させる。このワクチン組成物の活性因子の濃度範囲(1ミリリットルに対する結合型hrEGFrP64Kの合計ミリグラム)におけるこの融通性は、癌治療にとって優れた利点である。このことにより、患者に予防接種回数の増加および/または予防接種部位数の増加をもたらさずに投与量を増やすことができる。
化学的複合体の精製の質をモニタリングする目的で、保持液および透過液のpHおよび伝導率を評価した。Lowry D.H. and col. J. Biol Chem 191: 495-498, 1951 により記載された方法によりタンパク質濃度も測定し、ゲル濾過クロマトグラフィー(HPLC-FG)の分析から均一性パーセントも測定した。
この方法の特異性により、製造されたワクチン組成物が均一な組成および規定の純度を有し、主に存在する免疫学的活性種が結合型hrEGF-rP64Kであることを特徴とすることが確実になる。
【００１３】
驚くべきことに、過剰の遊離型またはポリマー型の自己タンパク質(hrEGF)の除去は抗EGF抗体濃度(1/1000希釈で)を減少させず、むしろマウスをhrEGFポリマーおよび遊離型hrEGFで免疫化したときの10倍以上にまで抗EGF抗体濃度を顕著に増加させることができる。ワクチン組成物において自己タンパク質量を減少させると、患者において、抗EGF抗体の最高力価を少なくとも2倍にする。抗体価のこの増加は、EP 0657 175に記載されているワクチン組成物の1回あたり4.8mgの投与を受ける患者と比較して半分量の予防接種(2.4mg)の投与を受ける患者においても観察される。本発明に記載のワクチン組成物は、免疫学的に活性なタンパク質1ミリグラムあたり、他のワクチン組成物と比較して大きな免疫学的活性を有することをこれらの結果は示している。
【００１４】
組換えタンパク質P64K(rP64K)とヒト組換え上皮増殖因子(hrEGF)との間の化学的複合体の製造
タンパク質hrEGFとrP64Kの間の化学結合反応の条件の評価および最適化から出発して、両者間の高い結合効率を確実にするために、高いモル比の自己タンパク質、すなわちrP64K 1モルに対してhrEGF 10モルを必要とする結合方法が開発される。化学結合中その効率を確実にするために過剰の自己タンパク質が必要であるが、続いて既述のように高い均一性を有するワクチン組成物を製造することを可能にするための限外濾過膜による精製方法によりそれらの過剰なタンパク質は除去される。両タンパク質間の適切な化学結合を確実にするための本発明に記載の方法は一段階からなり、最初に、結合反応器中、あらかじめ濃縮したhrEGFタンパク質(＞6mg/mL)とタンパク質rP64K(≧1mg/mL)を混合する。このタンパク質混合物にPBS/MgCl2溶液(pH6.8〜7.2)および0.5％グルタルアルデヒド結合用溶液を加える。22℃±2℃で2時間、この混合物の攪拌を続ける。反応混合物中のhrEGFの最終タンパク質濃度は0.82mg/mLであり、タンパク質rP64Kの最終タンパク質濃度は0.89mg/mLである。結合反応中の全タンパク質濃度は2mg/mLであり、反応混合物中のグルタルアルデヒドの最終濃度は0.05%である。
本発明に記載のワクチン組成物は、水酸化アルミニウムまたはモンタニドなどの適切なアジュバントと共に用いることができる。
【００１５】
他の側面において、本発明は、利点の中で特に、非経口経路で投与するワクチン組成物の製造のための衛生的方法であって、化学的複合体の精製法を数時間で実施することを可能にし、製造されるワクチン組成物量の増加を容易にするための、結合中のワクチン組成物の微生物汚染の機会を最小限にする前記方法に関する。以下の実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１６】
実施例1において、本発明に記載のワクチン組成物の分子解析を説明する。分子解析には、結合反応において形成される複合体種のHPLC-FGによるクロマトグラフィーによる同定、タンパク質hrEGFとrP64Kの間のコンジュゲート比の測定およびこの新規ワクチン組成物を解析するためのペプチドマップの説明が含まれる。
実施例2において、本発明に記載の新規ワクチン組成物の免疫原性を評価するために行う、マウスにおけるバイオアッセイを説明する。
実施例3において、肺上皮由来の腫瘍の治療における本ワクチン組成物の臨床用途における効果を説明する。
実施例4において、本発明に記載の方法と同じ結合方法および精製を用いた、異なる効力に調節されたワクチン組成物(結合型hrEGF-rP64Kの合計ミリグラム/バイアル)の製造を説明する。
実施例5において、50kDaの限外濾過膜を用いる化学的複合体の精製方法による、結合反応に用いるグルタルアルデヒドの除去を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ホモオリゴマー複合体化rP64K-rP64Kのクロマトグラムと精製されていない化学的複合体化EGF-P64Kのクロマトグラムとのオーバーラップを示す図である。円内には、両クロマトグラム間のプロフィールの一致が示されている。X軸は、試料の各成分の溶離までの時間を示し、Y軸は、タンパク質濃度の指標としての試料の各成分の216nmにおける強度値を示す。
【図２】限外濾過により製造されたワクチン組成物のSDS-PAGE電気泳動分離後の、アルカリホスファターゼに結合させた抗EGF抗体による免疫検出を示す図である。ライン1:分子量マーカー、ライン2 ワクチン組成物。
【図３】ホモオリゴマー複合体化hrEGF-hrEGFに相当するクロマトグラムと精製されていない化学的複合体化hrEGF-rP64Kに相当するクロマトグラムとのオーバーラップを示す図である。円内には、両クロマトグラム間の種の一致が示されている。X軸は、各成分の溶離時間を示し、Y軸は、タンパク質濃度の指標としての、各試料の成分の216nmにおける強度値を示す。
【図４】本発明のワクチンに対応するクロマトグラフィープロフィールである。陰領域は、hrEGF-rP64K結合種に相当する。X軸は、各画分の溶離時間を表し、Y軸は、タンパク質濃度の指標としての、試料の各成分の216nmにおける強度値を表す。
【図５】複合体化hrEGF-rP64Kに対応するクロマトグラフィー画分のペプチドマップである。これらは、限外濾過膜により独立して精製された2つのワクチン組成物からの結果である。X軸は時間を表し、Y軸はミリ単位の強度を表す。
【図６】異なる免疫原（従来のワクチン組成物、限外濾過により精製されたワクチン組成物および限外濾過精製法から生成する透過液）で免疫したマウスにおける抗hrEGF抗体価である。X軸は各動物からの血清希釈液に相当し、Y軸はタンパク質濃度の指標としての、各試料の405nmにおける吸光値を表す。
【図７】50kDa限外濾過膜を用いる精製方法により製造されたワクチン組成物(ワクチン組成物A)および透析精製法を用いたワクチン組成物(ワクチン組成物B)の残留グルタルアルデヒド量の定量の際に得られた、HPLC-RPによるクロマトグラフィープロフィールである。
【実施例１】
【００１８】
本発明に記載のワクチン組成物(ワクチン組成物A)の分子解析
1.1本発明に記載のワクチン組成物のクロマトグラフィーによる解析
限外濾過により精製されたワクチン組成物のクロマトグラフィーによる解析のために、指標としてホモオリゴマー複合体化hrEGF-hrEGFおよびrP64K-rP64Kを用いた。ホモオリゴマー複合体種(hrEGF-hrEGFおよびrP64K-rP64K)により示されたクロマトグラフィープロフィールと、タンパク質hrEGFとrP64Kの間の化学結合反応により製造された精製されていない複合体種により示されたクロマトグラフィープロフィールとを比較した。ホモオリゴマー複合体化rP64K-rP64Kのプロフィールと、タンパク質hrEGFとrP64Kの間の化学結合(限外濾過で精製されていない化学的複合体)により製造されたもののプロフィールとを図1に示す。丸で囲んだ領域は複合体種hrEGF-rP64Kに属する。rP64Kに結合したhrEGF分子の寄与のため、複合体化rP64K-rP64Kのプロフィールは、化学的複合体化hrEGF-rP64Kのプロフィールとは完全な一致は見せない。
限外濾過により精製されたワクチン組成物の、還元条件下での変性電気泳動およびウェスタンブロットを行った後に得られた結果を図2に示す。アルカリホスファターゼに結合させた抗EGF抗体を用いて発色を行った。EGFは見かけの分子量6kDaのタンパク質であり、従って、それはゲルの下方の領域に位置するはずである。6kDaより上とみられる分子量のタンパク質に相当する領域における抗EGF抗体を用いる免疫検出による同定により、hrEGF分子は複合体種hrEGF-rP64Kに相当するゲルの領域にrP64Kと共に存在することが確認される。
【００１９】
精製されていない化学的複合体化hrEGF-rP64のクロマトグラフィープロフィールとホモオリゴマー複合体化hrEGF-hrEGFのクロマトグラフィープロフィールとを比較すると、両プロフィール間に一致が存在することを認めることができる。この根拠により、谷の後ろに、遊離型hrEGFばかりでなく、hrEGF間で結合したhrEGF種(EGFポリマー)に相当する領域が存在することが確認される(図3)。
本発明の対象であるワクチン組成物の分子排除クロマトグラフィープロフィール(図4)は、複合体種hrEGF-rP64Kに相当する面積がクロマトグラムの全面積の90%以上を構成していることを示しており(影つき領域)、このことは前記のワクチン組成物の高い均一性を明らかにしている。
【００２０】
1.2.本発明に記載のワクチン組成物におけるタンパク質hrEGFとrP64Kの間のコンジュゲート比
ワクチン組成物におけるhrEGFとrP64Kの結合比を測定することを目的として、構成タンパク質のそれぞれのモル数を測定した。このために、50kDa限外濾過過程からワクチン組成物を得、rhEGF-rP64K複合体種に相当するクロマトグラフィー画分を採取した。これらの画分をアミノ酸分析にかけた。
【００２１】
2つの方法によりコンジュゲート比の測定を行った。
1．  1つの方法は、ワクチン組成物中のフェニルアラニン(Phe)およびトレオニン(Thr)(rP64K分子にのみ存在するアミノ酸)の量の測定に基づく。これらのアミノ酸量をrP64K量の測定のために用いた。このrP64K量から出発して、混合物のアミノ酸の全量を考慮して、EGF量を測定した。
2．  他の方法は、アミノ酸配列を用いる各タンパク質の相対量の直接測定ならびにアミノ酸(アスパラギン+アスパラギン酸(Asx)、グルタミン+グルタミン酸(Glx)、グリシン(Gly)およびアラニン(Ala))(酸加水分解に対して高度に安定な残基であり、タンパク質の定量に一般的に用いられる)の定量に基づく。
表1および2に、各方法により得られた結果を示す。
【００２２】
表1:フェニルアラニン(Phe)およびトレオニン(Thr)量を測定する方法に基づく、限外濾過により精製されたワクチン組成物のアミノ酸組成の測定を行う、hrEGFとrP64Kタンパク質の間の結合比の測定
2010531817.tif 000002
【００２３】
表2:アミノ酸(アスパラギン+アスパラギン酸(Asx)、グルタミン+グルタミン酸(Glx)、グリシン(Gly)およびアラニン(Ala))の相対量の測定方法に基づく、限外濾過により精製されたワクチン組成物のアミノ酸組成の測定を行う、hrEGFとrP64Kタンパク質の間の結合比の測定
2010531817.tif 000003
【００２４】
両方法により得られた結果は、本発明に記載のワクチン組成物の、hrEGF:rP64Kタンパク質間のコンジュゲート比の測定値の一致を示している。算出されたコンジュゲート比は(1:2)であった。これはrP64K分子1つに対しhrEGF分子2つを意味する。
【００２５】
1.3.本発明に記載のワクチン組成物を解析するためのペプチドマップ
本発明に記載のワクチン組成物の構造を解析し、方法の再現性を明らかにするために、エンドプロテアーゼGlu-Cを用いて複合体化hrEGF-rP64K画分の消化後に得られたペプチドマップを作成し解析した。得られたマップの画分のそれぞれを、質量分析法により同定し配列解析した。
図5に、独立して得られた2つのワクチン組成物から出発して得られたペプチドマップを示す。図において、ペプチドの位置およびその相対比率において顕著な類似性が認められる。2つのワクチン組成物から出発して得られたこれらのペプチドマップ間の再現性は、(本発明に記載の)化学結合および精製法が行われる条件に関して制御が存在していることを示している。
MALDI法(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)およびESI-MS方法(エレクトロスプレーイオン化/電子噴霧イオン化)による各画分の分析により、マップの各画分で得られるペプチドの同定を行った。表3に、主要ペプチドの配列を示す。
【００２６】
表3.エンドプロテアーゼGlu-Cを用いるEGF-P64K結合種画分の消化後に得られた主要ペプチドのアミノ酸組成。MALDIおよびESI-MSによりアミノ酸組成を測定した
2010531817.tif 000004
2010531817.tif 000005
【実施例２】
【００２７】
本発明に記載のワクチン組成物の免疫原性
本実施例において、EP 0657 175に記載のワクチン組成物(ワクチン組成物Bと呼ぶ)と比較した、前述のワクチン組成物(ワクチン組成物A)の免疫原性を評価する生物活性アッセイについて説明する。
アッセイのために、アジュバントMONTANIDE ISA 51と共に、単一用量の免疫原(透析により得られる従来のワクチン組成物であって、UF/DFによる精製処理から限外濾過膜により精製され、透析により製造されるワクチン組成物、複合体種hrEGF-hrEGFが存在している)の油中水型エマルジョン(50/50%v/v)200μLをマウス10匹に接種した。各免疫原に用いたタンパク質用量を表4に示す。
接種後、14日目に動物から血清採取を行い、ELISAにより抗EGF抗体価の評価を行った。アッセイの陽性基準は、405nmにおける測定吸光度が得られたブランクからの平均値の2倍以上でなければならないとした。血清に代わりにウェルに遮断緩衝液を加えることによりブランクとした。統計プログラムを用いて、データの分析にマン・ホィットニー検定を適用した。
【００２８】
表4:生物活性アッセイに対応する、動物に接種される、評価される免疫原およびタンパク質濃度
2010531817.tif 000006
【００２９】
図6に、評価される各免疫原の免疫原生作用の根拠としての生物活性アッセイの結果を示す。hrEGFホモポリマー複合体および遊離型hrEGFに相当する免疫原成分は関連する生物活性を示していない。なぜなら、それらの応答はアッセイの陽性基準以下のレベルだからである。これらの結果は、EGFがそれ自体では免疫原生反応を引き起こさないという仮説を裏付けている。
¨マン・ホィットニー検定¨を適用した全結果の統計分析(表5)は、ワクチン組成物Bを接種した動物群で得られる力価と比較して、ワクチン組成物Aを接種した動物群で得られる抗hrEGF抗体価は高い有意差(1/1000でp=0.0004、1/100でp=0.0006)を示した。限外濾過膜を用いて精製されたワクチン組成物Aは、透析膜に基づく精製方法により製造されたワクチン組成物Bよりも、タンパク質1ミリグラム当たりより高い免疫原生作用を示すことをこの事は示している。
ワクチン組成物Aは、hrEGFポリマーおよび遊離型hrEGFに相当する複合体で免疫したときに得られる抗EGF抗体濃度と比較して、10倍高い抗EGF抗体濃度の増加を生じる(1/1000希釈で)。
EP 0657175に記載のワクチン組成物と比較するとき、本発明に記載のワクチン組成物は、2倍の抗rhEGF抗体濃度の増加を生じる。
【００３０】
表5:統計報告:両方のワクチン組成物の免疫原性をマウスにおける抗hrEGF抗体価により評価するために用いたマン・ホィットニー検定
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【実施例３】
【００３１】
上皮由来の肺腫瘍の治療における、本発明に記載のワクチン組成物の評価
患者において、透析による精製方法により製造されたワクチン組成物Bにより誘導される免疫原性と比較したワクチン組成物Aにより誘導される免疫原性を評価することが本実施例の目的である。
本研究において、進行期非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘍患者を治療した。患者を2群に分けた(製剤Bで予防接種した患者および本発明に記載の製剤Aで予防接種した患者)。各群における患者当たりのワクチン組成物用量は次のとおりである:製剤Bをワクチン接種する患者には接種部位当たり総タンパク質1.2mgを投与し、製剤Bをワクチン接種する患者には予防接種部位当たり総タンパク質0.6mgを投与した。両群に対してワクチン接種部位は4箇所とした。試験開始の少なくとも4週間前にすべての患者に腫瘍特異的治療を行った。筋肉内経路によりワクチン接種を行い、毎月続けた。
【００３２】
両群の患者の体液性免疫反応を、患者の血清を用いて評価した。この結果を評価するための主要な変数は特異的抗EGF抗体価とした。ELISAによりこのパラメータを測定した。陽性値には、陰性対照よりも2倍以上高い吸光値を示す値を用いた。報告した抗体価は、陽性血清の最大希釈である。
表6に示すように、各群における患者の免疫反応の分析により、製剤Aで治療した患者群における最大抗体価の幾何平均は1:56421に相当し、製剤Bで免疫した患者群においては、1:23515であることが示された。このことは、製剤Bで得られた力価と比較して、本発明に記載のワクチン組成物は、最大抗体価の幾何平均を2倍に増加させたことを意味する。
歴史的には、免疫しなかった患者は抗自己EGF抗体価1:500を示す。従って、本発明に記載のワクチン組成物(ワクチン組成物A)は、非免疫患者において、少なくとも100倍の抗EGF抗体価の増加を引き起こす。
【００３３】
表6.患者の血清における抗EGF抗体価の測定による、両方のワクチン組成物の免疫原性の幾何平均の分析結果
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【００３４】
本発明に記載のワクチン組成物Aで免疫した患者群はワクチン接種当たりの総タンパク質の半分量(2.4mg)が投与されたが、ワクチン組成物B(総タンパク質4,8mg)で免疫した患者群により示された抗EGF抗体価の幾何平均よりも大きな抗EGF抗体価の幾何平均を示したことを強調することが重要である。これは驚くべき結果である。これらの結果は、過剰の自己タンパク質hrEGFは、ポリマー型であれ遊離型であれ、ワクチン組成物の免疫原性を高めることには寄与せず、化学的複合体化hrEGF-rP64Kの免疫作用を弱めることを証明している。
【実施例４】
【００３５】
異なる効力(バイアル当たりの総タンパク質濃度)に調節されたワクチン組成物の製造
異なる効力(バイアル当たりの総タンパク質濃度)を有するワクチン組成物を製造する能力を明らかにするために、下記のような精製法を行った:
アッセイ1:透析濾過を行うとき、精製された化学的複合体をタンパク質の最終濃度2mg/mLにまで濃縮した。
アッセイ2:透析濾過を行うとき、精製された化学的複合体をタンパク質の最終濃度5mg/mLにまで濃縮した。
アッセイ3:透析濾過を行うとき、精製された化学的複合体をタンパク質の最終濃度12mg/mLにまで濃縮した。
【００３６】
すべてのアッセイにおいて、用いた化学的複合体の全量は1500mLであった。膜間圧力差1.5バールで、透析濾過中7回の緩衝液交換を行って実施した。この評価の実施に当たって、2つの選択基準を設定した:
第1の基準を、ワクチン組成物の均一性パーセントが>80%に到達することとした。
第2の基準を、精製操作中、沈殿タンパク質が存在しないこととした。
表7に示した結果は、異なるタンパク質濃度/mLに調節したワクチン組成物は、高レベルの均一性(90.92%、96.79%および95.50%の結合型種hrEGFrP64K)が保証され、タンパク質の沈殿を生じなかったことを示している。
【００３７】
表7:異なる最終タンパク質濃度に調節したワクチン組成物における均一性パーセントに相当する数値
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【実施例５】
【００３８】
本発明のワクチン組成物からのグルタルアルデヒドの除去
結合剤(グルタルアルデヒド)の除去を評価するために、C-8カラムを用いる逆相クロマトグラフィー分離法(HPLC-RP)により、ワクチン組成物Bおよびワクチン組成物Aにおいて残留グルタルアルデヒド量を定量した。
この方法は、最初に過塩素酸で試料中に含まれるタンパク質を沈殿させ、後にフェニルヒドラジンと反応させることを必要とする。
初期濃度530mg/mLすなわち530ppmからの両ワクチン組成物におけるこの不純物の残留量は、0.2ug/mL以下すなわち0.002ppm以下、(これらの数値はこの不純物に対して達成された最大濃度限界)であったことを図7は示している。両製剤ともこの不純物に対する設定された仕様を満たすとしても、ワクチン組成物A(化学的複合体の精製のために限外濾過法を用いて製造される)は、より少ない量のグルタルアルデヒドを含み、このことは、このワクチン組成物を使用する患者に大きな安全性を提供することを図7は示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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