(57)【要約】本発明は、幹細胞の特性を有する単離された増殖細胞を調製するための方法および特に魚(魚類)などの変温動物の成体組織からの対応する安定な細胞培養物, 及びそれで調製された細胞および細胞培養物に関する。本発明の好適な態様において、前記細胞は魚の前腎組織から得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の特性を有する成体の増殖細胞の調製のための方法であって、以下を含む方法：
変温脊椎動物の前腎または腸の幽門垂からの組織を除去すること、
除去した組織を粉砕すること、
粉砕された組織を培養すること、および
培養において持続している細胞を増殖させること。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、以下を特徴とする方法：  前記組織は、約 200 μmよりも小さい細胞凝集物が、大部分が生じる小さい組織片において維持されるように穏やかに粉砕され、粉砕された組織は最初に組織培養器中で適切な条件下で培養され、大多数の分化型の細胞は数日の過程で急速に死亡し、幹細胞から脱離し、幹細胞は続いて組織培養器の底面に接着し、残っている組織および非接着性の分化型の細胞は、大部分が最初の培地の置換の手段で分離され、残っている非接着性の細胞は、数日、好ましくは約 2〜3日の期間内でさらなる培地の置換の手段で分離される。
【請求項３】
請求項１または2に記載の方法であって、前記変温脊椎動物が魚であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項1〜3の何れか一項に記載の方法であって、培養すること及び培養において持続している細胞を増殖させることが1〜35℃で行われる方法。
【請求項５】
請求項4に記載の方法であって、培養すること及び培養において持続している細胞を増殖させることが5〜27℃, 特に17〜24℃で行われる方法。
【請求項６】
魚の前腎組織から請求項1〜5の何れか一項に記載の方法で取得可能な幹細胞の特性を有する増殖細胞であって、非制限の可分性並びに少なくとも外胚葉性および中胚葉性の胚葉の両方の細胞に分化できる特性を有する細胞。
【請求項７】
請求項6に記載の細胞であって、自己再生する能力を維持し、凍結/低温保存の後でさえも非制限的に分裂し、分化しない細胞。
【請求項８】
請求項6または7に記載の細胞であって、付着培養において増殖する能力を有する細胞。
【請求項９】
請求項6〜8の何れか一項に記載の細胞を培養培地に含んでいる細胞培養であって、実質的に分化することなく、前記細胞の安定な維持および繁殖を許容する細胞培養。
【請求項１０】
付着培養であることを特徴とする請求項9に記載の細胞培養。
【請求項１１】
請求項9または10に記載の細胞培養であって、培養培地が支持細胞層を含まない細胞培養。
【請求項１２】
請求項9〜11の何れか一項に記載の細胞培養であって、前記細胞が自己再生する能力を保持し、25継代以上の間で非制限的に分裂する細胞培養。
【請求項１３】
請求項12に記載の細胞培養であって、前記細胞が自己再生する能力を保持し、50以上（好ましくは100以上）の継代の間に非制限的に分裂する細胞培養。
【請求項１４】
請求項8〜13の何れか一項に記載の細胞培養であって、前記培養培地が1〜35℃, 好ましくは 5〜27℃の範囲の温度を有する細胞培養。
【請求項１５】
請求項6〜8の何れか一項に記載の細胞および分化培地中でそれから分化した細胞を含んでいる分化培養であって、分化培地が付加的な成長または分化因子を含まない分化培養。
【請求項１６】
請求項6〜8の何れか一項に記載の細胞または請求項9〜14の何れか一項に記載の細胞培養またはインビトロで組織様または器官様の多細胞性のシステムを開発するためにそれから得られた分化型の細胞の使用。
【請求項１７】
請求項16に記載の使用であって、前記多細胞性のシステムが幾つかのタイプの細胞を含む使用。
【請求項１８】
請求項6〜8の何れか一項に記載の細胞または請求項9〜14の何れか一項に記載の細胞培養または化合物を試験するための, 特に薬学的な薬物のスクリーニングのための, インビトロ系としてそれから得られた分化型の細胞の使用。
【請求項１９】
請求項6〜8の何れか一項に記載の細胞または請求項9〜14の何れか一項に記載の細胞培養またはインビトロで所望の物質を産生するためのインビトロ系としてそれから得られた分化型の細胞の使用。
【請求項２０】
請求項19に記載の使用であって、タンパク質（特に、低温で最適な活性を有する酵素）, 魚油または脂肪酸が産生される使用。
【請求項２１】
請求項6〜8の何れか一項に記載の細胞または請求項9〜14の何れか一項に記載の細胞培養の変温脊椎動物の生殖クローニングのため（特に、魚の育種のため）の使用。
【請求項２２】
請求項6〜8の何れか一項に記載の細胞または請求項9〜14の何れか一項に記載の細胞培養の外来の遺伝物質または他の外来のものを受け取るためのレシピエント細胞またはビヒクルとしての使用。
【請求項２３】
請求項6〜8の何れか一項に記載の細胞, およびさらに手段または前記細胞の培養のための試薬または診断上の試薬などの試薬を含んでいるキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、幹細胞の特性を有する単離された増殖細胞を調製するための方法および特に魚(魚類)などの変温動物の成体組織からの対応する安定な細胞培養物, 及びそれで調製された細胞および細胞培養物に関する。
【０００２】
幹細胞の呼称は、無期限に分裂する能力があり、適切な状況下または適切な刺激の手段で異なるタイプの細胞に分化できる細胞に関して使用される。幹細胞は、特徴的な形および特殊な機能を有している細胞に発生する潜在性を有する。生物体の外側でこれらの特殊な細胞を間接的に幹細胞を培養する手段で調製されるようにして、しばしば非常に限定的な程度でのみ培養することが可能である又は全く培養されない。
【０００３】
これまで、少数の魚種(ゼブラフィッシュおよびメダカ)からの胚性幹細胞を単離および調査することのみ可能であり[Ma et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2461-2466; Epub 2001, Febr. 13; Hong et al., 1996, Mech. Develop., 60:33-44]、僅かに非常に少数の魚の成体幹細胞の研究が知られている[Tawk and Vriz 2003, Med. Sci. (Paris) 19:465-471; Alvaro and Tsonis et al., 2006, Nat. Rev. Genet., 7:873-884]。しかしながら、これらの研究は、典型的にはインビボで、鰭, 心臓および脳での複雑な魚の組織で行われ、単離された幹細胞の回復または安定な幹細胞培養を許容しない。
【０００４】
コイの腎臓組織からの造血性幹細胞の単離 および 培養は、文献〔Developmental and Comparative Immunology, Vol. 31, No. 7, 696-707 (2007)〕に記載される。得られた幹細胞は、異なる胚葉の細胞に分化する能力がない。また、前腎は、極度に低い出現(0%近く)が原因でそれぞれの幹細胞の単離に不適切な出発原料として言及される（要約および703頁）。
【０００５】
従って、本発明は、広いスペクトルの異なる分化型の細胞を産生できる手段で、変温脊椎動物（特に、魚）の成体組織から、特定の非制限の可分性および多分化能または多能性の幹細胞の特性を有する単離された増殖細胞を回収し、その安定な増殖性の細胞培養を樹立するとの課題に基づく。
【０００６】
前記課題は、請求項１の方法および請求項6の細胞および請求項9の細胞培養を提供することによる本発明にしたがって解決される。本発明の他の側面および／または好適な態様は、更なる請求項の主題である。
【０００７】
変温脊椎動物は、魚, 両生類または爬虫類であってもよく；好ましくは魚, 特に市販の魚である。適切な種の少数の非限定的な例は、チョウザメ, ニシン, マス, サケ, ウナギ, コイである。
【０００８】
前腎組織は、好ましくは成体の出発組織として使用される;  可能な代替物は、例えば、膵臓, 腸, 腸の幽門垂, 雄性または雌性の生殖腺であろう。魚の場合、魚における造血機能を有する前腎が好ましくは使用される。哺乳類の造血性幹細胞は、成熟血液細胞に分化した後の細胞培養条件下で表面から脱離することが知られている。対照的に、本発明により調製された魚の前腎からの細胞は、脱離せず、18継代以上後になおも表面に接着し、外分泌腺から単離されたものと類似する幹細胞の特徴を有していた。この結果は、予想できなかった。
【０００９】
本発明により提供される増殖細胞は幹細胞の特性を有する。即ち、それらは非制限の可分性を示し、さらに多分化能性または多能性である、即ち、それらは少なくとも二つの胚葉(外胚葉性および中胚葉性)の細胞に自発的に分化することができる。
【００１０】
本発明による単純な方法によって成体の幹細胞の調製が許容されることは極めて驚くべきことであり、この細胞は彼等の分化ポテンシャルにおいて異なる胚葉を反映し、少なくとも多分化能と称されえる。本発明による方法で産生される幹細胞は、容易に回収され、再現性のある様式で異なるタイプの細胞に自発的に分化する。これまで、筋肉細胞, 神経膠細胞, 上皮性および内皮性の細胞が検証された; しかしながら、利用可能なタイプの細胞は、これらの及び更なるタイプの細胞に既に存在する所見に明らかに限定されるものではない。
【００１１】
支持細胞層は幹細胞の培養にも分化にもどちらにも必要とされず、その細胞は分化するために移植されなければならないということもない。本出願で使用される支持細胞の用語は、成長因子を放出する及び／又は細胞外基質を提供する又は幹細胞培養の分化を阻止することで培養される実際の細胞の成長を促進する全ての細胞を包含する。
【００１２】
本発明により調製された幹細胞が付着培養において増殖できることも注目に値する。対照的に、従来の造血性幹細胞は、典型的に浮遊培養で成長する。
【００１３】
本発明者の幹細胞培養における細胞は、自己再生する能力を維持し、6 月にわたり25継代以上の後に非制限的に分裂し、培養はなおも安定である。
【００１４】
さらにまた、本発明によりえられた幹細胞は、凍結で貯蔵（好ましくは、液体窒素）でき、何らの変化なしに区別可能性および生命力を保持できる。
【００１５】
本発明による細胞および細胞培養は、37℃（哺乳類細胞の培養に典型的）よりも低い温度で既に培養できる。適切な温度範囲は組織の供給源として使用される魚種のタイプおよび起源に依存するので、約 1〜35℃の広いスペクトルを含むことができる。出発時の生物体として使用される熱帯性の魚に関して、適切な培養温度は高い範囲（例えば、約 25〜35℃）であってもよいが、寒い地域などからの魚の細胞に関して1〜10℃であってもよい。特に温帯からの魚に関して、温度範囲は典型的には5〜27℃, 好ましくは 10〜25℃, より好ましくは 17〜24℃, 特に 18〜20℃ または 約室温の範囲内である。当業者は、容易にルーチンの実験法で各ケースでの適切または最適な温度範囲を決定する。
【００１６】
本発明により調製された幹細胞 および 幹細胞培養は、広範囲の適用を有する。
【００１７】
例は、例えば、細胞の相互作用を評価するための又は同様に異なる病毒, 化合物, 特に可能性のある薬学的な薬物, または化粧品の効果を分析するための複雑な細胞の検査システムの提供である。
【００１８】
これらの細胞システムは、好ましくは同時に試験もできるように天然の組織において並行して生じるものなどの幾つかのタイプの細胞を含む。
【００１９】
本発明により調製された幹細胞および幹細胞培養は、好ましくはインビトロで幾つかのタイプの細胞からの組織様または器官様の多細胞性のシステムを開発するためにも使用し得る。
【００２０】
さらに、これらを食物および飼料の産生に使用することができる。例えば、それらを例えば, 人工肉, フィッシュミール, 魚油またはこれらの細胞の個々の成分など, 例えば, ω脂肪酸または魚に典型的なアミノ酸組成を有するタンパク質などの魚に特異的なバイオマスを調製するために使用しえる。
【００２１】
これらの細胞, 細胞培養 および 多細胞性のシステムのより一般的な適用は、インビトロで所望の物質を産生するためのインビトロシステムの使用である。
【００２２】
これらの物質は、出発時の生物体（例えば、魚）において天然に産生される特定の物質であってもよい。特定の例は、とりわけ、食物の成熟に適用を有する可能性があるより低い温度(例えば、約 10℃)で最適な活性を有する冷温適合性酵素などの特定のタンパク質である。係る酵素は、例えば、本発明の幹細胞から自発性の又は標的とした分化において形成される分泌性細胞で産生できるだろう。
【００２３】
本発明により調製された幹細胞および細胞培養は、従来技術において基本的にしられる方法による外来の遺伝物質または他の外来のものを受け取るためのレシピエント細胞またはビヒクルとしても使用できる。外来の遺伝物質の発現によって、これらの細胞および培養における異種タンパク質の産生が許容される。
【００２４】
係る細胞および細胞培養の特別な利点は、それらが既に、例えば、1〜35℃, 好ましくは 5〜27℃ または17〜24℃, 特に 18〜20℃ または凡そ室温などの37℃(哺乳類細胞培養に典型的)よりも低い温度で良好に成長することであり、エネルギーを大量に消費する加温が不必要とされる。
【００２５】
本発明による細胞のさらに別の適用は、特に魚の育種(クローン化した魚類)のための変温脊椎動物の生殖クローニングである。
【００２６】
また、本発明の態様は、請求項6〜8の何れか一つによる細胞, およびさらなる手段または試薬（例えば、細胞の培養のための試薬または診断試薬）を含んでいるキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】魚の前腎から開始する方法の作業の流れの概略を示す図である。
【図２】本発明による方法にしたがってチョウザメから調製された中胚葉性の特性を有している分化型細胞(筋肉細胞)の免疫組織学的な検出を示す図である。前記細胞を、α-平滑筋アクチン(SMA)に対する抗体で染色した。さらに核をDAPIで染色した。
【図３】本発明による方法にしたがってチョウザメから調製された外胚葉の特性を有している神経膠細胞の免疫組織学的な検出を示す図である。前記細胞を、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）に対する抗体で染色した。さらに核をDAPIで染色した。
【図４】本発明による方法にしたがってチョウザメから調製された構造タンパク質(サイトケラチン)および翻訳マーカーのヴィジリン（vigilin）を有している分化型細胞の免疫組織学的な検出を示す図である。前記細胞を、パンサイトケラチン(赤色)およびヴィジリン(緑色)に対する抗体で染色した。さらに核をDAPIで染色した。
【００２８】
構造性のサイトケラチンタンパク質は、主に上皮性および内皮性の細胞において形成される。タンパク質ヴィジリンは、タンパク質を合成している細胞に典型的なものであり、今まで全ての幹細胞に見いだされた。
【００２９】
これらの検出とは別に、脂肪滴を貯蔵する細胞が存在すること, および様々な広範囲の細胞を示唆している複数の異なる形態の細胞を同定できることを実証することも可能であった（データ示さず）。
【００３０】
図 1に示される図に対応して、機械的、酵素的に粉砕された前腎組織が培養されて細胞が回収される。このプロセスにおいて、完全な組織ブロックは培養されないが、インタクトな細胞はca. 200 μmよりも小さく凝集し、これは培養器中に配置され、その中で所望の細胞が続いて新たに成長または形成される。
【００３１】
これらの細胞および細胞凝集物は、培養器中で数週間で培養される。培地は2〜3日毎に置換され、全ての分化型の細胞を除去する。培養において持続している細胞は、非制限の可分性を有する未分化な細胞である。
【００３２】
ここで、一方で酵素の組織消化は細胞が良好に許容すると思える37℃で生じること、他方で細胞は18〜20℃で非常に良好に成長するが、出発動物自身がたびたび理想的にはより低い温度で育つことに注意すべきである。
【００３３】
魚の前腎からの非常に高い増殖能力を有する係る初代細胞は、いまだ記載されていない。今まで、これらの細胞は、非制限の可分性が実証され、ca.6月にわたり連続的に培養で維持できた。
【００３４】
以下の限定されることのない例は、前記方法の好適に適用される工程に詳細に記載することを意図している。
【００３５】
動物細胞（特に、哺乳類細胞）を培養するための方法に通例の一般的な指示を維持すべきである。前記方法が行われる無菌の環境は、いかなる場合でも維持される（たとえ、さらに本事項の記載がなくとも）。
【００３６】
以下の緩衝剤および培地を提供しなければならない：  
HEPESストック溶液  
(pH 7.6)                      100 mlのA. bidest.に2.383 gのHEPES。  
-----------------------------------------------------------------  
HEPES/イーグル培地            90 mlの修飾イーグル培地(MEM)  
10 mlのHEPESストック溶液  
-----------------------------------------------------------------  
分離培地  
(pH 7.4)                      32 mlのHEPES/イーグル培地  
8 mlの5% BSA（A. bidest.中）  
200 μlの0.1M CaCl2 
100 μlのトラジロール(200,000 KIU)  
-----------------------------------------------------------------  
消化培地  
(pH 7.4)                      20 mlの分離培地  
4 mgのコラゲナーゼ  
-----------------------------------------------------------------  
インキュベーション培地        ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)  
-----------------------------------------------------------------  
分化培地                      380 mlのDMEM  
100 mlの54℃で30 min不活化されたFCS  
(または真菌または藻類の抽出物)  
5 mlのグルタミン (PAA Laboratories GmbH)  
5 ml  (3.5μlのβ-メルカプトエタノールを5 mlのPBS)
5 mlの非必須アミノ酸(GIBCO BRL)  
5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン(PAA)
【００３７】
［例1］
1.  組織の調製および細胞の単離
チョウザメの前腎は、頭蓋の直後ではじまっている体腔の上方の表面から除去される。次に組織は、消化培地を有するビーカーにおいて優れたハサミで粉砕された。その懸濁液は、続いてcarbogenで1 minガス処理され、37℃で20 min振盪機で200サイクル/minでインキュベーションされた。その後、培地は慎重に吸引され、組織片は各ケースで10 mlの分離培地で二回洗浄され、5〜10 mlの消化培地がもう一回組織に添加された。
【００３８】
carbogenで1 minの別のガス処理および37℃で15 min振盪機で200サイクル/minでインキュベーション後、組織片は連続的にそれらを10 ml, 5 ml および 2 ml ガラス ピペットでの処理で粉砕し、ca.200 μmのメッシュサイズを有している単層のフィルターファブリックをとおされた。かように単一化した細胞は、一回から二回インキュベーション培地(37℃)で洗浄され、各回5 min、90 g(800 rpm)で遠心分離された。最終的に得られたペレットは、インキュベーション培地に再懸濁され、組織培養皿（25 cm2）に分配された。
【００３９】
2.  細胞の培養
単離された細胞を有する組織培養皿は、18〜20℃および5% CO2で恒温器で培養された。培地は、3〜4日毎に置換された。そのプロセスにおいて、全ての非接着性および多くの分化型の細胞が除去された。
【００４０】
一旦細胞が底面を完全にカバーしたら（したがってコンフルエントである）、最初はおおよそ培養の10日目に、細胞は2 mlのPBS, 1 mlのトリプシン および 2 mlのインキュベーション培地からなる溶液で37℃で継代された。そのプロセスにおいて、細胞は培養皿の底面から脱離する。細胞懸濁物は、5 分間遠心分離され、上清が吸引された。そして、細胞は5 mlのインキュベーション培地中に再懸濁され、中サイズの細胞培養ビン(75 cm2)にうつされ、10 mlのインキュベーション培地が添加された。培地の置換は、三日毎に行った。
【００４１】
培養の十四日目に、細胞をもう一度継代した。しかし、この際は6 mlのPBS, 2 mlのトリプシンおよび6 mlのインキュベーション培地である。細胞懸濁物は、5 分間遠心分離され、上清が吸引された。そして、細胞は15 mlのインキュベーション培地中に再懸濁され、各ケースで３つの中サイズの細胞培養ビンにうつされ、10 mlのインキュベーション培地が添加された。
【００４２】
細胞は、さらに培養され、継代され、細胞がセミコンフルエントからコンフルエントの状態を達すると播種された。
【００４３】
分化に関して、細胞は、（例えば、上記の表に示された組成物を有している）分化培地に移され、既知の培養条件下で分化される。さらなる分化および成長因子は分化に必ずしも必要とされない。というのも、本発明による細胞は、自発的に異なるタイプの細胞に分化できるからである。それにもかかわらず, 特定のタイプの細胞を標的とした分化を促進するために、このような分化および成長因子を加えることは有利である。幹細胞の特定のタイプの細胞への分化を特異的に促進する因子は、全範囲のタイプの細胞に関して従来技術において知られており、既知のプロトコールと同様に行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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