(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ａ）で表される構造を有するヒアルロン酸誘導体であり
【化１】
0006285882.tif 000010
（上記一般式（Ａ）において、Ｚはその一端は隣接するカルボニル基と一体としてアミド基またはエステル基を形成し、他の一端はヒアルロン酸のカルボキシル基またはヒドロキシル基と結合を形成しうる官能基であり、前記の一端の官能基および前記の他の一端の官能基は炭素数２〜４の２価の炭化水素基で結合されている。）、かつ、
前記一般式（Ａ）で表される構造のうち、下記一般式（Ｂ）で表される部分の化学構造が、２，３−ジヒドロキシベンゾイル基、３，４−ジヒドロキシベンゾイル基、２，３，４−トリヒドロキシベンゾイル基、３，４，５−トリヒドロキシベンゾイル基、または２，３−ジヒドロキシ−５−メチル−ベンゾイル基である前記ヒアルロン酸誘導体。
【化２】
0006285882.tif 000011
【請求項２】
前記一般式（Ａ）で表される構造が、ヒアルロン酸構造が有する全カルボキシル基あたり１〜９０モル％導入されている請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項３】
ヒアルロン酸誘導体の粘度平均分子量が１，０００〜１５，０００，０００である請求項１または２に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体を含む医療用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織接着剤、膝関節軟骨損傷治療用等の用途に極めて有用な新規のヒアルロン酸誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療用の組織接着剤は、主に外科手術において、創傷部を迅速かつ簡便に貼り合わせるために用いられている。実際に手術で使用される接着剤は主に、シアノアクリレート系、ゼラチン−アルデヒド系、フィブリングルー系に大別される。このうち、シアノアクリレート系やゼラチン−アルデヒド系は生体内に存在しない原料を基にした、合成系の接着剤であり、接着剤の反応時、および分解時にアルデヒド化合物が関与することから、毒性が高く、患部の治癒も遅いといった問題点がある。一方、フィブリングルー系の組織接着剤は、生体親和性が高いものの接着力が低く、また血清成分を使用するため、未知のウィルス感染などの危険性を否定することができない。また、二液系の接着剤が使用されることが多く、接着前の準備に時間がかかることや使用時に目的の場所のみに塗布することが困難であった（例えば、特許文献１〜４、非特許文献１参照。）。
特に、これらの接着剤は一度、接着剤が硬化すると再度接着することはできず、接着剤をさらに塗布する必要があった。
【０００３】
膝関節軟骨損傷治療用のヒアルロン酸においては、これまでヒアルロン酸の生体吸収性を改善するため、ヒアルロン酸を架橋していた。このときの架橋方法には、共有結合からなる化学架橋以外に、静電相互作用によるイオン架橋、ファンデルワールス力、疎水性相互作用による物理架橋を含む。この架橋剤には非生体吸収性物質が使用されていることが多く、より安全性に優れた間接軟骨損傷治療用材料が求められている。さらに、架橋されたヒアルロン酸は非常に粘度が高くなるため、注射器を用いて関節内に打ち込むために粘度を下げる必要があり、低粘度のヒアルロン酸を混合して粘度を低下させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５６０８７５１号公報
【特許文献２】特許第５６０８７５１号公報
【特許文献３】特許第４５００２６３号公報
【特許文献４】特許第４５１１４７０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】A.I.Neto, et.al, Small, 2014-10,No12,2459-2469
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は生体適合性に優れ、かつ安全な、接着性を有するヒアルロン酸誘導体を提供することにある。本発明の別な目的は生体組織との接着性を有し、接着面を一度剥がしても再び接着できる、即ち繰り返して使用可能で、十分な接着性を有するヒアルロン酸誘導体を提供することにある。本発明のさらに別の目的は本発明の上記ヒアルロン酸化合物からなる医療用製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は鋭意検討した結果、以下に示すヒアルロン酸誘導体により上記課題を解決することができることを見出し、本発明に到達した。すなわち本発明は、下記一般式（Ａ）で表される構造を有するヒアルロン酸誘導体である。
【０００８】
【化１】
0006285882.tif 000002
【０００９】
（上記一般式（Ａ）において、ｎは２以上の整数であり、Ａｒは炭素数４以上の炭化水素基であり、Ｚはその一端は隣接するカルボニル基と一体としてアミド基またはエステル基を形成し、他の一端はヒアルロン酸のカルボキシル基またはヒドロキシル基と結合を形成しうる官能基であり、前記の一端の官能基および前記の他の一端の官能基は炭素数２〜４５０の２価の炭化水素基またはオキシアルキレン基で結合されている。）
【００１０】
更に本発明は、前記一般式（Ａ）において、少なくとも２つのＨＯ基が、官能基Ａｒ上で隣接する炭素原子に結合している前記のヒアルロン酸誘導体である。
更に本発明は、前記一般式（Ａ）で表される構造が、ヒアルロン酸構造が有する全カルボキシル基あたり１〜９０モル％導入されている前記のヒアルロン酸誘導体である。
更に本発明は、ヒアルロン酸誘導体の粘度平均分子量が１，０００〜１５，０００，０００である前記のヒアルロン酸誘導体である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のヒアルロン酸誘導体は、高い接着性を活かした組織接着用途に利用できる。特に、生体組織上で体液により膨潤しているとき、接着面を一度剥がしても、接着面を可逆的に接着することができ、且つ接着力を高いレベルで維持することができる。故に本発明のヒアルロン酸誘導体を組織接着剤として用いた生体組織は、繰り返して使用することが可能となる。また、生体組織への接着性能が高いことより、高い滞留性が求められる用途、例えば関節治療、術後組織の癒着防止剤あるいは皮膚の保湿剤、創傷被覆材等にも使用することができる。
【００１２】
また本発明のヒアルロン酸誘導体を膝関節軟骨損傷治療用のヒアルロン酸製剤として用いたとき、架橋構造を形成しゲル化させた製剤に比べ、粘度が低く膝関節に注入しやすい利点がある。また、組織接着性が高いことから、滞留性も向上することが予想できる。そして、生体組織への接着性が向上することや、皮膚表面に保水し、乾燥を防ぐことができることから、化粧品等のスキンケア材料、形成外科領域に於ける皮膚のシワ取り用途や美容整形用途の皮内注、さらに眼科領域に於ける眼科用手術補助剤、点眼薬の効果を持続させるための添加剤等の用途においても、効果が長続きすることが予想できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例、比較例において行う接着力の評価を行う、ずりせん断破壊試験用のサンプルの平面図である。
【図２】実施例、比較例において行う接着力の評価を行う、ずりせん断破壊試験用のサンプルの側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳述する。なお、これらの実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
【００１５】
本発明はヒアルロン酸および、下記一般式（Ａ）で表される構造を含むヒアルロン案誘導体である。
【００１６】
【化２】
0006285882.tif 000003
【００１７】
（上記一般式（Ａ）において、ｎは２以上の整数であり、Ａｒは炭素数４以上の炭化水素基であり、Ｚはその一端は隣接するカルボニル基と一体としてアミド基またはエステル基を形成し、他の一端はヒアルロン酸のカルボキシル基またはヒドロキシル基と結合を形成しうる官能基であり、前記の一端の官能基および前記の他の一端の官能基は炭素数２〜４５０の２価の炭化水素基またはオキシアルキレン基で結合されている。）
【００１８】
（ヒアルロン酸と一般式（Ａ）の化学構造）
本発明で使用されているヒアルロン酸は、例えば動物組織から抽出したもの、または発酵法で製造したものどちらでも使用できる。発酵法で使用する菌株はストレプトコッカス属のヒアルロン酸生産能を有する微生物であり、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（特開昭６３−１２３３９２号公報）、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（特開平２−２３４６８９号公報）が挙げられる。これらの変異株を用いて培養、精製されたものを用いる。またヒアルロン酸の分子量は、約１×１０５〜１×１０７ダルトンのものが好ましい。なお本発明でいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する。
【００１９】
一般式（Ａ）において、ヒドロキシル基（ＯＨ）ｎは１つの一般式（Ａ）で表される官能基について、２個以上含まれており、好ましくは２〜１０個であり、より好ましくは２〜６個、更により好ましくは２〜４個であり、もっと好ましくはｎ＝２、すなわちヒドロキシル基が２個の場合である。一般式（Ａ）において、ヒドロキシル基がこれらの数値範囲内にあることにより、生体組織との接着力を向上することができる。ヒドロキシル基が１個以下の場合には、生体組織との十分な接着力を発揮することができない。好ましくは少なくとも２つのヒドロキシル基が官能基Ａｒ上で隣接する炭素原子に結合していることが生体組織との接着力を発揮することができる観点から好ましい。
【００２０】
官能基Ａｒは、炭素数４個以上の炭化水素基を表す。Ａｒ基は脂肪族基であっても、脂環族基であってもよい。炭素数が６個以上の場合には、芳香族基が含まれていてもよい。具体的には、脂肪族基、脂環族基としてはｎ個のヒドロキシル基を有する、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、へプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノニルデシル基、エイコシル基、トリアコンチル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロへプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、シクロウンデシル基、シクロドデシル基、シクロトリデシル基、シクロテトラデシル基、シクロペンタデシル基、シクロヘキサデシル基、シクロヘプタデシル基、シクロオクタデシル基、シクロノニルデシル基、シクロエイコシル基、シクロトリアコンチル基を挙げることができる。更に脂環族にあっては、環の数は２個以上であってもよく、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６個、さらにより好ましくは１〜４個である。また更にこれらの脂肪族基、脂環族基にあっては、１個または２個以上の不飽和結合を含むパルミトレイル基、エライジル基、オレイル基、リノレイル基、エライリノレイル基、リノレニル基、エライドリノレニル基等であってもよい。これらの脂肪族基、脂環族基の官能基の中で好ましくは、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。
【００２１】
芳香族基としてはｎ個のヒドロキシル基を有する、フェニル基、ベンジル基、トリル基、キシリル基、トリメチルフェニル基、ナフチル基、アントラニル基、フェナンスレン基、ビフェニル基、アズレニル基、クリセニル基、ピレニル基、コロネル基、ケクレン基、トリフェニル基、トリスフェニル基、テトラフェニル基を挙げることができ、これらの官能基の１又は２以上の水素原子が炭素数１〜８個のアルキル基もしくはシクロアルキル基、またはフェニル基、もしくはナフチル基に置換されていたり、これらの官能基の１又は２以上の不飽和結合部分に更にフェニル基、ナフチル基の炭素−炭素結合部分が結合しているような芳香族基を挙げることができる。これらの芳香族基の官能基の中で好ましくは、炭素数６〜１２個の芳香族炭化水素基であることであり、より好ましくはフェニル基、ナフチル基である。これらの構造を組み合わせた炭素数４以上の炭化水素基のうち、好ましくは炭素数４〜３２個、さらに好ましくは４〜２６個、さらにより好ましくは５〜１６個、さらにより好ましくは６〜１２個である。
【００２２】
また、上記一般式（Ａ）で表される構造のうち、下記一般式（Ｂ）で表される部分の化学構造が、３，４−ジヒドロキシベンゾイル基であることが好ましい。
【００２３】
【化３】
0006285882.tif 000004
（上記一般式（Ｂ）における、ｎ、Ａｒは一般式（Ａ）に同じである。）
【００２４】
更に一般式（Ａ）における、上記一般式（Ｂ）で表される部分の化学構造として更により好ましいのは、2,3-dihydroxybenzoyl基、3,4-dihydroxybenzoyl基、2,3,4-trihydroxybenzoyl基、3,4,5-trihydroxybenzoyl基、または2,3-dihydroxy-5-methyl-benzoyl基である。上述したような２以上のヒドロキシル基を有する各種のベンゾイル基を採用すると、当該官能基部分が酸化反応によりキノン体に変化し、接着力が低下することを抑制することができる。すなわち、例えば長期間保存後であっても接着力が維持発現できる観点から好ましい。
【００２５】
一般式（Ａ）におけるＺの部分は、その一端は隣接するカルボニル基と一体としてアミド基またはエステル基を形成し、他の一端はヒアルロン酸のカルボキシル基またはヒドロキシル基と結合を形成しうる官能基であり、前記の一端の官能基および前記の他の一端の官能基は、炭素数２〜４５０の２価の炭化水素基またはオキシアルキレン基で結合されている２価の官能基である。これらのうち、官能基Ｚの一端であり、カルボニル基と隣接する側の官能基としては、アミノ基成分またはヒドロキシル基成分（アルコール成分）を挙げることができる。これらのアミノ基成分またはヒドロキシル成分とはアミノ基またはヒドロキシル基の１つの水素がカルボニル基に置換された官能基となることを表している。官能基Ｚの他の一端は、ヒアルロン酸のカルボキシル基またはヒドロキシル基と結合を形成しうる官能基であり、具体的には、アミノ基成分、ヒドロキシル基成分（アルコール成分）、カルボキシル基成分、イソシアネート基成分を挙げることができる。好ましくは官能基Ｚが有する２つの末端官能基が、ジアミン成分、アミノアルコール成分、またはジアルコール成分であることである。これらの他の一端を構成する官能基成分もヒアルロン酸に含まれているカルボキシル基やヒドロキシル基と結合し、エステル、アミド、ウレタン、エーテル基を介してヒアルロン酸と化学結合されることを表す。
【００２６】
更に、末端官能基を除くＺ基は炭素数２〜４５０の２価の炭化水素基であることが好ましく、好ましくは炭素数２〜４５０の２価の脂肪族炭化水素基である。炭化水素基または脂肪族炭化水素基の炭素数は好ましくは２〜２００、より好ましくは２〜１００、更により好ましくは４〜５０である。具体的な官能基としては、より好ましくは、エチレン基、１，２−プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基等のブチレン基、ペンタメチレン基。ネオペンチレン基などのペンチレン基、ヘキサメチレン基等のヘキシレン基、ヘプタメチレン基等のへプチレン基、オクタメチレン基等のオクチレン基、デカメチレン基等のデシレン基を挙げることができる。また炭素数２〜４５０のオキシアルキレン基とは、ジメチレングリコール基、ジエチレングリコール基、トリエチレングリコール基、ジプロピレングリコール基、トリプロピレングリコール基、ジテトラメチレングリコール基、トリテトラメチレングリコール基、ジネオペンチルグリコール基、トリネオペンチレングリコール基、ポリエチレングリコール基、ポリテトラメチレングリコール基等を挙げることができる。これらのオキシアルキレン基のうちポリエチレングリコール基、ポリテトラメチレングリコール基である場合には、そのオキシアルキレン基部分の数平均分子量は６０〜１００００が好ましく、２００〜６０００がより好ましく、３００〜５０００が更により好ましい。
【００２７】
また上記一般式（Ａ）で表される官能基以外に、ヒアルロン酸のカルボン酸に対して、生体組織を構成または含まれている化合物である、アミノ酸のようなモノペプチド成分、またはジペプチド成分がヒアルロン酸のカルボキシル基に導入されていてもよい。そのようなアミノ酸としては、アラニン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン等を挙げることができ、ジペプチドとしてはカルノシン、アンセリン、ホモアンセリン、キョートルフィン、バレニン、アステルパーム、グロリン、バレチン等を挙げることができる。更に生体脂質を形成している化合物の１種であるフォスファチジルエタノールアミンがヒアルロン酸のカルボキシル基、ヒドロキシル基に結合していても良い。
【００２８】
ここでヒアルロン酸に結合し得るフォスファチジルエタノールアミンとしては、動物組織から抽出したもの、または合成して製造したものどちらでも使用できる。フォスファチジルエタノールアミンとしては、例えばジラウロイルフォスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン、ジアラキドイルフォスファチジルエタノールアミン、ジベヘノイルフォスファチジルエタノールアミン、ジリグノセロイルフォスファチジルエタノールアミン、ジセロチオイルフォスファチジルエタノールアミン、ジモンタノイルフォスファチジルエタノールアミン、ジラウロオレオイルフォスファチジルエタノールアミン、ジミリストオレオイルフォスファチジルエタノールアミン、シパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン、ジネルボノイルフォスファチジルエタノールアミン、ジキメノイルフォスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルフォスファチジルエタノールアミン、ジヒラゴノイルフォスファチジルエタノールアミン、ジアラキドノイルフォスファチジルエタノールアミン、ジドコサヘキサエノイルフォスファチジルエタノールアミンを挙げることができる。その中でも、溶解性の面からジオレオイルフォスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００２９】
フォスファチジルエタノールアミンは、生体に安全な物質であり、本発明のヒアルロン酸化合物誘導体に導入する官能基としてヒアルロン酸を水素結合あるいは疎水性相互作用を利用した物理架橋等により架橋を促進する。そのため、フォスファチジルエタノールアミノ基を導入した本発明のヒアルロン酸化合物誘導体は、これらの架橋により後述するハイドロゲルや不溶性成型体にも形成することができる。
【００３０】
（ヒアルロン酸誘導体中における一般式（Ａ）の官能基の導入率）
本発明におけるヒアルロン酸における結合性を有する官能基のモル数に対する、一般式（Ａ）で表される官能基群のモル数の比率、即ち官能基の導入率（置換度）は、ヒアルロン酸に構造を構成している全カルボキシル基量に対して１〜９０モル％であり、好ましくは５〜８０モル％、より好ましくは１０〜７０モル％、更により好ましくは１８〜４９モル％である。但し、ヒアルロン酸における官能基とは具体的には６員環に結合しているカルボキシル基に限定されず、カルボキシル基もしくはヒドロキシル基、またはヒアルロン酸末端にのみ存在するヒドロキシル基のうちの１種または２種以上の官能基を表す。すなわち、一般式（Ａ）はヒアルロン酸の末端ヒドロキシル基とエステル、エーテル基などで結合していても、環状６員環に結合しているカルボキシル基と、エステル基、アミド基により結合していてもよい。好ましくは後者であり、側鎖として上記一般式（Ａ）で表されている化学構造式を有する基がヒアルロン酸と結合している場合である。側鎖に導入する上記式（Ａ）の構造や導入率によって、接着性能は変化し、目的に応じた最適な接着性能を持つヒアルロン酸誘導体を設計し、かつ製造することができる。
【００３１】
また上述したアミノ酸のようなモノペプチド成分、またはジペプチド成分がヒアルロン酸構造を構成している全カルボキシル基量に対して１〜８０モル％であり、好ましくは５〜７０モル％、より好ましくは１０〜５０モル％、更により好ましくは１８〜４０モル％である。これらモノペプチド成分の導入によっても、接着性能は変化し、目的に応じた最適な接着性能を持つヒアルロン酸誘導体を得ることができる。但し、アミノ酸はヒアルロン酸のカルボキシル基１当量に対して、５当量以下であり、アミノ酸の結合のみでポリペプチドと呼べるほど十分な鎖長を有するものではない。
【００３２】
（平均分子量）
本発明のヒアルロン酸誘導体の粘度平均分子量は１０００〜１５００万であり、好ましくは低分子量領域では１１００〜１００００、高分子量領域では１０万〜１０００万であり、より好ましくは低分子量領域では２０００〜８０００、高分子量領域では５０万〜１０００万であり、更により好ましくは低分子量領域では３０００〜７０００、高分子量領域では８０万〜１０００万である。このとき、本発明のヒアルロン酸誘導体としては、共有結合からなる化学架橋や、静電相互作用によるイオン架橋、ファンデルワールス力、疎水性相互作用による物理架橋などの架橋構造を有し、粘度平均分子量が測定できないヒアルロン酸誘導体を含む。
低分子量側は、接着性に加えて皮膚表面から体内に吸収されるような美容用途や保水力を向上させるための添加剤用途で好ましく、高分子量側は接着性に加え、潤滑性が求められる膝関節軟骨損傷治療用などの用途において好ましい。
【００３３】
（粘弾性）
本発明のヒアルロン酸誘導体の好ましい粘弾性としては、温度３０℃の条件で、レオメーターとよばれる動的粘弾性測定装置を用い、角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃで測定したときの絶対粘度が、０．５〜１００Ｐａ・ｓｅｃが好ましく、さらに好ましくは２〜３０Ｐａ・ｓｅｃである。この範囲が注入型ゲルとしての取り扱い性の良さと体内での滞留性を同時に満足させられる範囲であるが、使用目的により適宜変更できる。
【００３４】
（一般式（Ａ）で表される官能基部分の製造方法）
上記式（Ａ）で表される化合物は、例えば、プロトカテク酸エチルとエチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、２−アミノエタノール、４−アミノエタノール、エチレングリコール、テトラエチレングリコール等から通常用いられている合成方法により製造できる。さらに、上記式（Ａ）で表される構造を側鎖に有するヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸ナトリウムと、プロトカテク酸とジアミン等より合成された化合物を適切な溶媒に溶解し、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride等を用いて反応させ、その後精製を行うことによって、製造できる。
【００３５】
（利用法）
本発明のヒアルロン酸誘導体は使用目的に応じて、種々の形態で提供できる。例えば、純水やリン酸緩衝生理食塩水の溶液の形態でも利用可能である。また、種々の成形体に加工することも可能で、例えばスポンジの如き多孔体、不織布、フィルム、シート等の形状に成形することができる。成形体を製造する方法としては、例えば凍結乾燥法、乾式製膜、湿式製膜、凝固紡糸、スパンボンド法、メルトブロー法、フラッシュ紡糸法などが挙げられる。
【００３６】
本発明のヒアルロン酸誘導体は、高い接着性を活かした組織接着用途に利用できる。特に、生体組織上で体液により膨潤しているとき、接着面を一度剥がしても、接着面を可逆的に接着できる。また、生体組織への接着性能が高いことより、高い滞留性が求められる用途、例えば膝関節軟骨損傷治療用途、関節治療用途、術後組織の癒着防止剤用途あるいは皮膚の保湿剤用途、創傷被覆材用途等の医療用製剤にも使用することができる。
【００３７】
本発明のヒアルロン酸誘導体が、接着面を一度剥がし、再度接着させた場合であっても優れた接着力を維持していることは実に驚くべき現象であり、そのような効果が奏する詳細な理由は不明であるが、水分を含有しているヒアルロン酸自身は元来粘弾性を有しており、そのヒアルロン酸の有するその粘弾性を損なうことなく、接着力を改善する官能基の種類、量を導入したものと思われる。さらに本発明で採用した官能基群により、本発明のヒアルロン酸誘導体は、同じ分子量のヒアルロン酸ナトリウム等と比較して粘度が低いので、注射器により直接患部に投与するという使用方法も可能となる。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例により、本発明の詳細をより具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
以下の実施例に使用したヒアルロン酸ナトリウムは鶏冠由来、あるいはストレプトコッカス属由来のヒアルロン酸ナトリウムである。鶏冠由来のヒアルロン酸ナトリウムは粘度平均分子量が１，０００，０００Ｄａのヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）、粘度平均分子量が１，６００，０００〜２，９００，０００Ｄａのヒアルロン酸ナトリウム（キユーピー（株）製）等が市販されている。ストレプトコッカス属由来のヒアルロン酸ナトリウムは粘度平均分子量が１，８００，０００〜２，２００，０００Ｄａのヒアルロン酸ナトリウム（キッコーマンバイオケミファ（株）製）等が市販されており、これらを購入して用いた。
【００３９】
更に以下に示す実施例、比較例のうち、実施例１〜１５、実施例１９、比較例１については粘度平均分子量１００万Ｄａのヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）を、実施例１６では粘度平均分子量が１６０万〜２２９０万Ｄａのヒアルロン酸ナトリウム（キユーピー（株）製）を、実施例１７〜１８では粘度平均分子量が１８０万〜２２０万Ｄａのストレプトコッカス属由来のヒアルロン酸ナトリウム（キッコーマンバイオケミファ（株）製）をそれぞれ使用してヒアルロン酸誘導体を合成し、以下の評価を行った。
その他の試薬については、テトラヒドロフラン、プロトカテク酸エチル、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、グルタミン酸、ヒスチジン、β−アラニル−Ｌ−ヒスチジン（L-Carnosine）は和光純薬工業（株）製を、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride（以下ＥＤＣと称する。）は東京化成工業（株）製を使用した。
【００４０】
（ア）化学構造の特定
一般式（Ａ）で表される官能基等を導入したヒアルロン酸誘導体の官能基種類の特定、官能基の導入量（カルボキシル基の置換度）については、１Ｈ−ＮＭＲ（Bruker Biospin製  AVANCE III HD 500）測定を行い、その得られたスぺクトルを解析して求めた。具体的には、得られたＮＭＲスペクトルのヒアルロン酸由来のメチルカルボニルアミノ基中のメチル基の水素原子に係る積分値と側鎖のカルボキシル基に導入した官能基のベンゼン環の水素原子に係る積分値より、ヒアルロン酸の側鎖に導入された官能基の定量を行い、側鎖のカルボキシル基に対する置換度を算出した。
【００４１】
（イ）粘度平均分子量
ヒアルロン酸誘導体を０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム１００ｍＬに溶かした水溶液の流下時間が０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液の試液の流下時間の２．０〜２．４倍となる量を求め，０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液の試液に溶かして正確に１００ｍＬとし，試料溶液（１）とした．試料溶液（１）を１６ｍＬ，１２ｍＬ及び８ｍＬずつを正確に量り，それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム試液を加えて正確に２０ｍＬとし，試料溶液（２），試料溶液（３）及び試料溶液（４）とする．試料溶液（１），試料溶液（２），試料溶液（３）及び試料溶液（４）につき，ウベローデ型粘度計を用いて３０℃で試験を行った。
粘度平均分子量は、下記式に基づいて、算出した。
【００４２】
・原料のヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量が８０万〜１２０万のとき、以下式を用いて、粘度平均分子量を求めた。なお［η］はヒアルロン酸誘導体の固有粘度を表す。
【数１】
0006285882.tif 000005
【００４３】
・原料のヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量が１５０万〜３９０万のとき、以下式を用いて、粘度平均分子量を求めた。なお［η］はヒアルロン酸誘導体の固有粘度を表す。
【数２】
0006285882.tif 000006
【００４４】
（ウ）接着力評価、再接着時の接着力評価
接着性能を評価するために、ブタモモ肉を使ったずりせん断破壊試験を行った。使用したブタモモ肉は２０ｍｍ×６０ｍｍ、厚み２ｍｍの大きさにカットし２枚の試験片を切り出した。その２枚の試験片の重なり部分が２０ｍｍ×２０ｍｍとなるようにして（図１、図２参照。）、テンシロン万能試験機を用いて試験を行った。
接着剤として用いるヒアルロン酸誘導体は次の方法でシート状のサンプルにした。まず、ヒアルロン酸誘導体の目付量が２．５ｍｇ／ｃｍ２となるように、ヒアルロン酸誘導体の水溶液を凍結乾燥し、シート状に加工した。このヒアルロン酸誘導体のシート状サンプルを１０ｍｍ×２０ｍｍの大きさに切り出し、ずりせん断破壊試験用のサンプルとし、ブタモモ肉で挟み試験用サンプルを作成した。
【００４５】
作成した試験用サンプルは冷蔵庫中で１２時間保管し、室温に戻した後、ずりせん断破壊試験に用いた。引張試験は５０ｍｍ／分の一定速度で行い、サンプルのチャック間距離は５０ｍｍとした。
また実施例２，９においては、上記方法で一旦接着力を測定したずりせん断破壊試験用サンプルをはがし、接着剤やヒアルロン酸誘導体シート状サンプル、その他の接着剤となるものを新たに付けることなく、２枚の試験片を同じ位置同士が重なり部分となるように再度貼り合わせ、再度接着力を測定評価した。
【００４６】
（エ）絶対粘度
実施例１で得たヒアルロン酸誘導体、および市販のヒアルロン酸ナトリウムを１ｗｔ％の濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、粘弾性測定装置（レオメータ）ティー・エイ・インスツルメント・ジャパン製ＲＦＳＩＩＩを用いて角速度１０Ｒａｄ／Ｓｅｃ、温度３０℃で絶対粘度を測定した。絶対粘度が低い素材は、注射器を用いてヒアルロン酸誘導体を患部に直接投与すると言った利用法も可能となる。
【００４７】
［実施例１〜６、実施例１６〜１７］
プロトカテク酸エチル１８２重量部をエチレンジアミン３００重量部に溶解し、窒素雰囲気下で１３０℃で還流した。二十時間反応させた後、減圧することにより、系中からエチレンジアミンを除去した。得られた生成物はクロロホルムで精製し、Ｎ−（２−アミノエチル）−３，４−ジヒドロキシベンズアミド（以下、Ｃ２アミンと称する。）１８６重量部（収率９５％）を得た。同様の方法でＮ−（４−アミノブチル）−３，４−ジヒドロキシベンズアミド（以下、Ｃ４アミンと称する。）も合成した。
【００４８】
次に数平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム３００重量部をテトラヒドロフラン／水＝１／１（ｖ／ｖ）１２０００００重量部に溶解し、０．１ＭのＨＣｌ溶液を用いて、ｐＨ＝５．５に調整した。その後、Ｃ２アミン３７重量部（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００等量に対し、２５等量）とＥＤＣ３６重量部を添加し、三時間反応させた。
その後、透析精製を行い、凍結乾燥し目的物を得た。確認は１Ｈ−ＮＭＲ（Bruker Biospin製  AVANCE III HD 500）により行い、目的物の生成を確認し、カルボキシル基に導入された置換基の種類と置換度を算出し、また置換基導入後の粘度平均分子量を測定した。
【００４９】
Ｃ２アミンの置換度の異なるヒアルロン酸誘導体のサンプルについては、表１に記載した官能基の種類、置換度となるように上記方法と同様にして合成し、１Ｈ−ＮＭＲ測定、粘度平均分子量、接着力評価を行った。なお、実施例１で用いたヒアルロン酸ナトリウムと、実施例１で得られたヒアルロン酸誘導体については、上述した方法により絶対粘度の測定を行い、上述のように実施例２については、再接着時の接着力評価も行った。結果を表１、表２、表３に纏めた。
【００５０】
［実施例７〜１５、実施例１８〜１９、比較例１］
粘度平均分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウム３００重量部をテトラヒドロフラン／水＝１／１（ｖ／ｖ）１２０００００重量部に溶解し、０．１ＭのＨＣｌ溶液を用いて、ｐＨ＝５．５に調整した。その後、Ｃ２アミン３７重量部（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００等量に対し、２５等量）とＥＤＣ１４４重量部、グルタミン酸２８重量部（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００等量に対し、２５等量）を添加し、三時間反応させた。
その後、透析精製を行い、凍結乾燥し目的物を得た。確認は１Ｈ−ＮＭＲ（Bruker Biospin製  AVANCE III HD 500）により行い、目的物の生成を確認し、カルボキシル基に導入された置換基の種類と置換度を算出し、また置換基導入後の粘度平均分子量を測定した。
【００５１】
Ｎ−（アミノエチル）−３，４−ジヒドロキシベンズアミド（Ｃ２アミン）やグルタミン酸の導入量の異なるサンプル、および、ヒスチジン、Ｌ−Ｃａｒｎｏｓｉｎｅ等を導入したサンプルについても、上記方法と同様にして合成し、１Ｈ−ＮＭＲ測定、粘度平均分子量、接着力評価を行った。上述のように実施例９については、再接着時の接着力評価も行った。なお実施例１９においては、上記のグルタミン酸、ヒスチジン、Ｌ−Ｃａｒｎｏｓｉｎｅの代わりに、Ｌ−α−ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミンを表１に示した置換度となるような量用いてヒアルロン酸誘導体を合成した。結果を表１、表２に纏めた。
【００５２】
［比較例２］
生体用接着剤の比較サンプルとして帝人ファーマで販売しているフィブリングルー系の組織接着剤であるボルヒール（登録商標）をヒアルロン酸誘導体の代わりに用いた。ボルヒールを使用方法説明書通りに使用し、実施例１等と同じ大きさのブタモモ肉の試験片を同様の操作にて接着し、ずりせん断破壊試験を行い、接着力を評価した。結果を表１に纏めた。なお、この比較例２のずりせん断破壊試験用のサンプルは、実施例２，９のような再度接着力評価を試みたところ、接着剤の類を使用することなく、再度貼り合わせることができなかった。結果を表１、表２に纏めた。
【００５３】
［比較例３］
精製ヒアルロン酸ナトリウムの比較サンプルとして、生化学工業株式会社アルツディスポ（登録商標）関節注２５ｍｇを精製し、凍結乾燥し、実施例１と同様のシート状のサンプルを作成した。実施例１のＣ２アミンを導入したヒアルロン酸誘導体のシート状サンプルの代わりに、上記のヒアルロン酸ナトリウムのシート状サンプルを用いて、ずりせん断破壊試験を行い実施例１と同様に接着力を評価した。結果を表１に纏めた。
【００５４】
［参考例１］（ブタモモ肉の引張強度試験）
参考例として、２０ｍｍ×６０ｍｍ、厚み２ｍｍの大きさにカットしたブタモモ肉試験片１枚のみを用いて、接着力評価と同じ操作にてテンシロン万能試験機を用いて試験を行った。結果を表１に掲載した。
【００５５】
【表１】
0006285882.tif 000007
【００５６】
【表２】
0006285882.tif 000008
【００５７】
【表３】
0006285882.tif 000009
【００５８】
表１〜３に示したように、本発明のヒアルロン酸誘導体は、接着力に優れ、再接着時においてもその接着力を維持することができ、加えて一般式（Ａ）等の官能基の修飾をすることにより衆力前と比べて、絶対粘度を低下させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のヒアルロン酸誘導体は、高い接着性を活かした組織接着用途に利用できる。特に、生体組織上で体液により膨潤しているとき、接着面を一度剥がしても、接着面を可逆的に接着することができ、且つ接着力を高いレベルで維持することができる。故に繰り返して使用することが可能となる。また、生体組織への接着性能が高いことより、高い滞留性が求められる用途、例えば関節治療、術後組織の癒着防止剤あるいは皮膚の保湿剤、創傷被覆材等にも使用することができ、更に高分子量であっても粘度が低いので、注射器を用いて患部に打ち込むという使用方法も可能となる。このような材料を提供することができることは、医療分野等において産業上の意義は大きい。
【符号の説明】
【００６０】
１  所定の大きさにカットしたブタモモ肉の試験片の一方
２  所定の大きさにカットしたブタモモ肉の試験片の他方
３  ２つの試験片を接着している本発明のヒアルロン酸誘導体等からなるシート状サンプル
【図１】
0006285882.tif 000012
【図２】
0006285882.tif 000013