(57)【要約】  本発明は、細胞又は組織のプロテオーム中に含まれる標的タンパク等の被検体中に含まれる標的成分に対する小分子又は他の化合物の結合親和性の評価及び／又は定量化のための方法に関する。【選択図】図１ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物に対する被検体の標的成分の結合を評価する方法であって、
（ａ）前記化合物が固定化されている固体支持体に前記被検体の第１分割量を接触させるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）と同種の固体支持体に前記被検体の第２分割量を接触させ、続いて、該固体支持体から前記被検体の第２分割量を分離するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）と同種の固体支持体にステップ（ｂ）で分離した被検体を再び接触させるステップ；
（ｄ）ステップ（ａ）及び（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を決定するステップ；及び、
（ｅ）ステップ（ａ）において前記固体支持体に結合した標的成分量と、ステップ（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量とを比較するステップを具える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、表面に前記化合物が固定化されていないステップ（ａ）と同種の固体支持体に前記被検体の第３分割量を接触させるステップと、前記固体支持体に結合した標的成分量の決定するステップとをさらに具え、
前記ステップ（ｅ）は、ステップ（ａ）及び（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量と、表面に前記化合物が固定化されていない前記固体支持体に結合した標的成分量と比較するステップをさらに具える方法。
【請求項３】
化合物に対する被検体の標的成分の結合を評価する方法であって、
（ａ）前記化合物が固定化されている固体支持体に前記被検体の第１分割量を接触させるステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）と同種の固体支持体であるが、ステップ（ａ）より高い濃度で前記化合物が固定化されている固体支持体に前記被検体の第２分割量を接触させるステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）と同種の固体支持体であるが、ステップ（ｂ）より高い濃度で前記化合物が固定化されている固体支持体に任意に前記被検体の第３分割量を接触させるステップ；
（ｄ）ステップ（ａ）及び（ｂ）において前記固体支持体に結合した標的成分量、及び、前記方法がステップ（ｃ）を具える場合にはステップ（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を決定するステップ；
（ｅ）ステップ（ａ）及び（ｂ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を、及び、前記方法がステップ（ｃ）を具える場合にはステップ（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を比較するステップを具える方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、ステップ（ａ）及び（ｂ）において前記化合物が前記固体支持体の表面に固定化される濃度の比率が、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、又は、約１：１０から選択される方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において前記化合物が前記固体支持体の表面に固定化される濃度の比率が、約１：２：４、約１：３：９、約１：４：１６、約１：５：２５、約１：６：３６、約１：７：４９、約１：８：６４、約１：９：８１、又は、約１：１０：１００から選択される方法。
【請求項６】
請求項３乃至５のいずれかに記載の方法において、ステップ（ａ）と同種であるが、前記化合物が固定化されていない固体支持体に前記被検体の第４分割量を接触させ、当該固体支持体に結合した標的成分量を決定するステップをさらに具え、
前記ステップ（ｅ）は、ステップ（ａ）及び（ｂ）において、前記固体支持体に結合した標的成分量を比較し、さらに、前記方法がステップ（ｃ）を具える場合にはステップ（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量と表面に化合物が固定化されていない固体支持体に結合した標的成分量と比較するステップをさらに具える方法。
【請求項７】
競合化合物に対する被検体の標的成分の結合を評価する方法であって、
（ａ）所定の結合親和性で標的成分に結合する化合物が固定化されている固体支持体に前記被検体の第１分割量を接触させるステップであって、前記競合化合物の存在下で該接触を行なうステップ；
（ｂ）前記競合化合物の存在下でステップ（ａ）と同種の固体支持体に前記被検体の第２分割量を接触させるステップであって、該競合化合物の濃度がステップ（ａ）より高いステップ；
（ｃ）前記競合化合物の存在下でステップ（ａ）と同種の固体支持体に前記被検体の第３分割量を任意に接触させるステップであって、該競合化合物の濃度がステップ（ｂ）より高いステップ；
（ｄ）ステップ（ａ）及び（ｂ）において前記固体支持体に結合した標的成分量、及び、前記方法がステップ（ｃ）を具える場合にはステップ（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を決定するステップ；及び、
（ｅ）ステップ（ａ）及び（ｂ）において前記固体支持体に結合した標的成分量、及び、前記方法がステップ（ｃ）を具える場合にはステップ（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を比較するステップを具える方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、ステップ（ａ）乃至（ｃ）において、前記接触させるステップより前に前記被検体に前記競合化合物を加える方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の方法において、前記競合化合物の非存在下でステップ（ａ）と同種の固体支持体に前記被検体の第４分割量を接触させるステップをさらに具え、
ステップ（ｅ）が、ステップ（ａ）及び（ｂ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を比較し、前記方法がステップ（ｃ）を具える場合にステップ（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量と前記競合化合物の非存在下で前記固体支持体に結合した標的成分量とを比較するステップをさらに具える方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載の方法において、前記被検体の標的成分が検出可能な標識を用いて標識される方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記検出可能な標識が各分割量において異なる方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の方法において、前記被検体の標的成分がペプチド又はタンパクであり、前記標識をＳＩＬＡＣ（細胞インキュベーション液中のアミノ酸を用いた安定同位体標識）によって行い、ステップ（ｄ）による前記決定を質量分析法を用いた定量的タンパク分析によって行う方法。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の方法において、ステップ（ｄ）による前記決定は、前記結合した標的成分をサンプル中に混合し、さらに、前記サンプル中の異なって標識された標的成分を検出することによって行われる方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記サンプルに混合する前に前記固体支持体から前記標的成分を溶出させる方法。
【請求項１５】
請求項７乃至１４のいずれかに記載の方法において、前記固体支持体の表面に固定化された前記競合化合物と前記化合物とが同一である方法。
【請求項１６】
請求項７乃至１４のいずれかに記載の方法において、前記固体支持体の表面に固定化された前記競合化合物と前記化合物とが異なる方法。
【請求項１７】
請求項１乃至１６のいずれかに記載の方法において、ステップ（ｅ）の比較を用いて前記化合物に対する前記標的成分の結合親和性を決定する方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、ステップ（ｅ）の比較を用いて前記競合化合物のＩＣ５０値を決定する方法。
【請求項１９】
請求項１７又は１８の方法において、ステップ（ｅ）の比較を用いて前記標的成分に対する前記固定化された化合物及び／又は前記競合化合物の結合のＫｄ値を決定する方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９のいずれかに記載の方法において、前記接触ステップ時に前記化合物が前記標的成分と比較してモル過剰で存在する方法。
【請求項２１】
請求項１乃至２０に記載の方法において、各接触ステップを同時に行なう方法。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法において、前記被検体が、プロテオーム、異なる種類のプロテオームの混合物、細胞抽出物若しくは細胞溶解物、組織抽出物若しくは組織溶解物、細胞インキュベーション液上澄み、組織インキュベーション液上澄み、又は、体液からなる群より選択される方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記プロテオームが１つの細胞又は細胞インキュベーション液、細胞混合物、組織、器官又は生命体に存在するか又はこれらに由来するものである方法。
【請求項２４】
請求項１乃至２３のいずれかに記載の方法において、前記固体支持体に結合する化合物及び／又は前記競合化合物が、酵素、ポリペプチド、ペプチド、抗体及びその断片、オリゴ糖若しくは多糖、プロテオグリカン、化学成分、小分子薬剤、代謝産物、又は、プロドラッグから選択される方法。
【請求項２５】
請求項１乃至２４のいずれかに記載の方法において、前記固定化された化合物が前記固体支持体上に規定濃度で存在する方法。
【請求項２６】
請求項１乃至２５のいずれかに記載の方法において、前記固体支持体が、フィルタ、スライドガラス、シリコン表面、ビーズ及びカスタマイズされた化学的マイクロアレイからなる群より選択される方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法において、前記ビーズが、任意にエポキシ活性化又はＮＨＳ活性化されたセファロースビーズであるか、又は、アガロースビーズである方法。
【請求項２８】
請求項１乃至２７のいずれかに記載の方法において、前記固定化された化合物は、吸着、吸収、イオン性結合、共有結合、アミノ基若しくはカルボキシル基若しくは水酸基、（ストレプト）アビジンとビオチンとの相互作用若しくはチオールと金との相互作用によって、前記固体支持体の表面に固定化される方法。
【請求項２９】
請求項１乃至２８のいずれかに記載の方法において、前記標識が、放射性標識、染料標識、抗体で検知可能な標識、酵素標識、燐光性マーカー、蛍光性マーカー、化学発光マーカー、ホスファターゼ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ＴＡＰ、ペルオキシダーゼ、及び、検出可能な質量を有する標識からなる群より選択される方法。
【請求項３０】
請求項１乃至２９のいずれかに記載の方法において、前記接触ステップを基本的に生理的な条件下で行なう方法。
【請求項３１】
請求項１乃至３０のいずれかに記載の方法において、前記接触ステップが、適切な緩衝剤、及び、任意にＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、ｃＧＭＰ、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ、ＡＤＰ又はｃＡＭＰ等の補助因子を用いて行われる方法。
【請求項３２】
請求項１０、１１又は１３乃至３１のいずれかに記載の方法において、ステップ（ｄ）による前記決定ステップは、放射能検出法、蛍光検出方法、発光検出法、染料検出法、酵素検出法、及び、質量分析法から選択される方法による標識を検出するステップを具える方法。
【請求項３３】
請求項１乃至３２のいずれかに記載の方法において、前記方法は、前記固定化された化合物及び／又は前記競合化合物に対する前記被検体の多くの標的成分の結合を同時に評価するステップを具える方法。
【請求項３４】
請求項１乃至３３のいずれかに記載の方法において、前記方法の全体又は少なくとも一部を高生産性様式で行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は組織のプロテオームに含まれる標的タンパク等の被検体内に含まれる標的成分に対する小分子又は他の化合物の結合親和性の評価及び／又は定量のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の医薬品工業は、新薬開発工程における２つの根本的課題（すなわち、疾病干渉の適切なタンパク標的の同定、及び、特にこれらの標的に作用する高品質薬剤候補の同定）に直面している。これら２つの課題は薬剤設計を成功させるために最も重要である。
【０００３】
低分子量化合物を用いた介入は、ヒト疾患の治療のための代表的な基本治療概念である。プロテインキナーゼスーパーファミリー酵素の種々のメンバーは、ヒト癌等の重篤な疾病の発病及び進行に関係する情報伝達プロセスにおける重要な役割により、広く、触媒現象の機能を乱す小分子の標的とされてきた。これらの薬剤開発努力は、遺伝子化学的アプローチによる細胞信号の分析用の多くのツールを提供してきた。古典的な遺伝子不活性化とは対照的に、小分子阻害は、迅速に、調整可能に、ほとんどの場合可逆的な方法で選択的にプロテインキナーゼの触媒能力を調節することができる。さらに、プロテインキナーゼによって形成された多くのタンパク間相互作用は小分子拮抗薬の存在下で保持されており、したがって、それらの触媒現象の機能から分析することができる。
【０００４】
これらの長所に疑う余地はないが、キナーゼ阻害用に開発された小分子拮抗薬は、様々なプロテインキナーゼ又は他の酵素ファミリーのメンバーの触媒ドメインにもみられる共通の構造的特徴により、無傷の細胞のいくつかの標的を不活性化する能力がある。キナーゼ阻害剤の選択性は、多数の組み換えタンパクキナーゼについてインビトロ活性分析又は結合分析を並行して行うことによって評価することができる（Ｆａｂｉａｎ，Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，３２９−３６  (２００５)；Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５１  ，９５−１０５  (２０００）)。このアプローチは、疑う余地なく薬選択性に関する有用な量的データを提供するが、主として２つ限界がある。第１に、プロテインキナーゼ補体（＝カイノーム（ｋｉｎｏｍｅ））の大部分に加えて、他の酵素クラスからの潜在的な標的は、過小評価されるか、又は、これらのスクリーニングフォーマットとともに消失する。第２に、もしかするとさらに重要なことには、選択性パネルに含まれている組み換えキナーゼ回収物は、例えば、キナーゼ阻害剤の生物学的効果を調査する細胞系で発現される潜在的な標的の細胞プロフィールと一致しない。
【０００５】
これらの欠点はプロテオミクス手法によりに対処することができ、該手法は、例えば質量分析法（ＭＳ）によるタンパク同定と共に、標的タンパクの選択作用浄化のために、固定化された化合物（例えばキナーゼ阻害剤）を用いる。この直接的な技術は、細胞抽出物中の様々なキナーゼ阻害剤の標的成分を同定するためにうまく用いられてきた。しかしながら、ＭＳのデータから細胞内結合相手に対する阻害剤の親和性を推測することができなかったという意味において、標的成分の同定は限定的であった。さらに量的情報を得るために、観察される細胞内薬剤作用に関連する可能性のある強力に阻害される阻害剤標的を同定する第２のインビトロ活性分析を用いることが必要であった。しかしながら、必要とされる組み換えタンパクのすべてが入手可能ではないこと、又は、インビトロ活性分析を確立することが難しいという事実により、小分子薬剤の全対象標的スペクトルを評価することは実際上困難である。
【０００６】
小分子干渉の標的とされる細胞内タンパクについての総合的な知識は、分子レベルの化学生物学的相互作用を説明するための必要条件である（Ｄａｕｂ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２，２１５−２４（２００４）；Ｆａｂｉａｎ，Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，３２９−３６  （２００５））。質量分析法（ＭＳ）と共に親和性精製技術を用いることによって、固定化された小分子阻害剤が結合するタンパクを同定することに成功してきているが、これらの従来のプロテオミクス手法は、細胞内標的親和性の情報を提供するものではない（Ｇｏｄｌ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００，１５４３４−９（２００３）；Ｂｒｅｈｍｅｒ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５，３７９−８２（２００５）；  Ｄａｕｂ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７５４，１８３−９０（２００５））。
【０００７】
したがって、化合物の対象成分の相互作用（例えば、阻害対象タンパクの相互作用）の直接的質的及び／又は量的評価、又は、測定を可能にするプロテオミクス手法が必要である。高生産性の用途に応用できる前述の方法も必要性である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記課題は本発明に係る方法によって解決される。これらの方法により、第２のインビトロ結合又は活性分析を用いる必要なく、阻害剤等の対象化合物の細胞内結合相手に対する結合親和性を直ちに質的に又は定量的に決定することができる。本発明の方法は、固定化化合物の多数の細胞内対象をその親和性によって順位付けることができ、さらに、さらなる固定化をせずに個別の阻害剤について競合的結合特性を評価することができる。本明細書においてキナーゼ阻害剤の１００個を超える細胞内標的を用いて例示的に証明する。新しい方法は広く適用可能であり、様々な生物系において、薬理的及び薬物動態学的相互作用、及び／又は、任意の種類の小分子又は他の対象化合物の機能を簡易に迅速に特性評価を行うことができる。
【０００９】
したがって、１つの態様において、本発明は、化合物に対する被検体の標的成分の結合を評価する方法であって、（ａ）前記化合物が表面に固定化されている固体支持体に前記被検体の第１分割量を接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で用いる種類の固体支持体に前記被検体の第２分割量を接触させ、続いて、前記固体支持体から被検体の第２分割量を分離するステップ；（ｃ）ステップ（ａ）で用いる種類の固体支持体にステップ（ｂ）で分離した被検体を再接触させるステップ；（ｄ）ステップ（ａ）及び（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を決定するステップと；（ｅ）ステップ（ａ）において固体支持体に結合した標的成分量とステップ（ｃ）において固体支持体に結合した標的成分量とを比較するステップを具える方法を提供する。本明細書においてこの態様の方法をＩＶＡ２（インビトロアソシエイション：設定２）の方法と称する。
【００１０】
厳密に義務的ではないが、上記方法は、ステップ（ａ）で用いる種類の固体支持体に前記被検体の第３分割量を接触させるステップであって、該固体支持体は、前記化合物が表面に固定化されていないステップと、前記固体支持体に結合している標的成分量を決定するステップとをさらに具えていてもよい。このステップを、固定化された対象化合物に対する特異的結合に対比するものとして、固体支持体に対する被検体の標的成分のおそらく非特異的である結合が決定されることによるネガティブコントロールとして機能させてもよい。
【００１１】
従って、上記方法のステップ（ｅ）は、ステップ（ａ）及び（ｃ）において固体支持体に結合した標的成分量と、前記化合物が表面に固定化されていない前記固体支持体に結合した標的成分量とを比較するステップをさらに具えていてもよい。あるいは、ステップ（ｅ）は、ステップ（ａ）及び（ｃ）において固体支持体に結合した標的成分量と、標的成分が固体支持体に非特異的に結合した量であって、該量は、事前に決定されるか若しくは独立試験において決定され、又は、既に存在するデータ（例えば、文献から入手可能なデータ又は未取得のデータ）からの計算又は外挿法等の他の手段によって決定される量と、を比較するステップを具えていてもよい。
【００１２】
１つの好ましい実施形態において、接触ステップ（ａ）及び（ｂ）、並びに、好ましくは上記方法の第３分割量に関する接触ステップを同時に行う。あるいは、接触ステップ（ａ）及び再接触ステップ（ｃ）、並びに、好ましくは上記方法の第３分割量に関する接触ステップを同時に行なってもよい。
【００１３】
さらなる関連態様において、本発明は、化合物に対する被検体の標的成分の結合を評価するための方法であって、（ａ）前記化合物が表面に固定化されている固体支持体に前記被検体の第１分割量を接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で用いる種類の固体支持体であって、表面にステップ（ａ）よりも高い濃度で前記化合物が固定化されている固体支持体に前記被検体の第２分割量を接触させるステップ；（ｃ）ステップ（ａ）で用いる種類の固体支持体であって、表面にステップ（ｂ）よりも高い濃度で前記化合物が固定化されている固体支持体に前記被検体の第３分割量を接触させるステップ；（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を決定するステップ；及び、（ｅ）ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において固体支持体に結合した標的成分量を比較するステップを具える方法を提供する。本明細書においてこの態様による方法をＩＶＡ１（インビトロアソシエイション：設定１）による方法と称する。
【００１４】
任意のステップ（ｃ）が存在していなくても、上記方法により結合親和性についての有用な質的及び量的情報が提供されるので、上記方法のステップ（ｃ）が厳密に義務的ではないことは理解されるであろう。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、ＩＶＡ１による方法は上述のステップ（ｃ）を含む。
【００１５】
また、本発明のこの態様に関して、これもまた厳密に義務的ではないが、さらにネガティブコントロールを含んでいることが有用である場合がある。したがって、上記方法は、前記化合物が表面に固定化されていない、ステップ（ａ）の種類の固体支持体に前記被検体の第４分割量を接触させるステップと、前記固体支持体に結合した標的成分量を決定するステップとを具えていてもよい。これは、固定化された対象化合物に対する特異的結合に対比するものとして、固体支持体に対する被検体の標的成分のおそらく非特異的である結合を決定することができる。
【００１６】
従って、ＩＶＡ１による方法のステップ（ｅ）は、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において固体支持体に結合した標的化合物の量と、化合物が表面に固定化されていない固体支持体に結合した標的成分量とを比較するステップをさらに具えていてもよい。あるいは、ステップ（ｅ）は、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において固体支持体に結合した標的成分量と、標的成分が固体支持体に非特異的に結合した量であって、該量は、事前に決定されるか若しくは独立試験において決定され、又は、既に存在するデータ（例えば、文献から入手可能なデータ又は未取得のデータ）からの計算又は外挿法等の他の手段によって決定される量と、を比較するステップを具えていてもよい。
【００１７】
この態様の好ましい実施形態において、接触ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）、並びに、好ましくは上記方法の第４分割量に関する接触ステップを同時に行なう。あるいは、接触ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）、並びに、好ましくはまた上記方法の第４分割量に関する接触ステップを連続的に行なってもよい。
【００１８】
説明されているか又は特許請求の範囲に記載されているＩＶＡ１又はＩＶＡ２による本発明の方法を組み合わせてもよいことは理解されるであろう。具体的には、固定化された化合物に対する被検体の標的成分の結合をＩＶＡ１による方法でまず決定又は評価してもよく、続いて、ＩＶＡ２による方法でさらに評価してもよい。
【００１９】
またさらなる関連態様において、本発明は、競合化合物に対する被検体の標的成分の結合を評価する方法であって、（ａ）規定の結合親和性で標的成分に結合する化合物が固定化されている固体支持体に被検体の第１分割量を接触させるステップであって、前記接触が前記競合化合物の存在下で行われるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で用いる種類の固体支持体に前記被検体の第２分割量を接触させるステップであって、前記競合化合物の濃度がステップ（ａ）よりも高いステップ；（ｃ）ステップ（ａ）で用いる種類の固体支持体に前記被検体の第３分割量を接触させるステップであって、前記競合化合物の濃度がステップ（ｂ）よりも高いステップ；（ｄ）ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で前記固体支持体に結合した標的成分量を決定するステップ；及び、（ｅ）ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量を比較するステップを具える方法を提供する。本明細書においてこの態様による方法をＩＶＡ（インビトロアソシエイション）競合方法と称する。
【００２０】
任意のステップ（ｃ）が存在しなくても、上記方法により結合親和性についての有用な質的又は量的情報が提供されるので、上記方法のステップ（ｃ）が厳密に義務的ではないことは理解されるであろう。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、ＩＶＡ競合方法は上述のステップ（ｃ）を含む。
【００２１】
また、本発明のこの態様によれば、予め決定した結合親和性で固定化された化合物が標的成分に結合してもよいことが理解されるであろう。好ましい実施形態において、ＩＶＡ１及び／又はＩＶＡ２による本発明の方法のいずれかによって結合親和性（例えばＫｄ値）を決定するか又は決定しておく。                                        
【００２２】
あるいは、固定化された化合物が標的成分に結合するときの規定の結合親和性は、事前に決定されるか若しくは独立試験において決定され、又は、既に存在するデータ（例えば、文献から入手可能なデータ又は未取得のデータ）からの計算又は外挿法等の他の手段によって決定されてもよい。
【００２３】
本発明のＩＶＡ競合方法は、ステップ（ａ）で用いる種類の固体支持体に前記被検体の第４分割量を接触させるステップであって、前記固体支持体の表面には規定の結合親和性を有する化合物が固定化されているが、競合化合物が存在しない状態で接触を行なうステップをさらに具えていてもよい。この場合、上記方法のステップ（ｅ）は、好ましくは、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において前記固体支持体に結合した標的成分量と、競合化合物の非存在下で前記固体支持体に結合した標的成分量と比較するステップをさらに具える。
【００２４】
好ましくは、ここに記載されている本発明の方法のいずれによっても被検体中の標的成分が検出可能標識で標識される。検出可能標識は各分割量中において同一であってもよいが、各分割量において検出可能標識が異なること、すなわち、第１分割量の標的成分が第２分割量等の標的成分と異なる標識を有することが好ましい。これは、異なる種類の検出可能標識を用いて分割量を直接的に標識すること、又は、被検体が組織、組織インキュベーション、細胞、細胞インキュベーション又は体液に由来する場合には、異なる検出可能標識を用いたインビトロ又はインキュベーション中の代謝標識によって容易に達成されうる。
【００２５】
異なる検出可能標識を用いて本発明の方法で用いられるそれぞれの分割量中の標的化合物を異なって標識する場合、好ましくは、１サンプル内に標的成分を結合させて、該サンプル中の異なって標識されている標的成分量を検出することにより、本発明の方法による任意のステップ（ｄ）の決定を行う。この点において、前記サンプルにそれらを結合させる前に固体支持体から標的成分を溶出させることが有利である可能性がある。
【００２６】
化合物に対する標的成分の結合親和性を質的又は量的に決定又は算出するために、本発明の方法の任意のステップ（ｅ）による比較を用いてもよいことが理解されるであろう。
【００２７】
また、本発明による方法によって、固定化された化合物及び／又は競合化合物に対する、被検体内にみられる多数の標的成分の結合を同時に評価及び決定してもよいことが理解されるであろう。
【００２８】
本発明による方法が高生産性スクリーニング手法に適用するのに特に適していることが更に理解されるであろう。したがって、本発明の別の実施形態において、高生産性様式における全体又は少なくとも一部において、明細書及び／又は特許請求の範囲に記載されている方法を行う。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ】図１は、本発明による好ましい方法の略図である。図１ａは、ＩＶＡ１（インビトロアソシエイション：設定１）−固定化された小分子阻害剤に対する細胞内標的タンパクの量依存的結合の定量を示す。
【図１ｂ】図１は、本発明による好ましい方法の略図である。図１ｂは、ＩＶＡ２（インビトロアソシエイション：設定２）−最高リガンド濃度における並列的な２段階の連続的親和性精製、及び、固定化された阻害剤を有しないコントロールビーズを用いたさらなるインキュベーションによって解決されるＩＶＡ１の欠点を示す。
【図１ｃ】図１は、本発明による好ましい方法の略図である。図１ｃは、固定化されたリガンドが分析された生物抽出物中の標的タンパクに対してモル過剰で存在することを確認するコントロール試験を示す。
【図２ａ】図２は、定量化学的ＭＳ手法によって同定される阻害剤Ｖ１６７４２の特異的細胞内標的を示す図である。図２ａは、エポキシ活性化セファロースに１級アミノ基を経由して結合している化合物Ｖ１６７４２の化学構造を表す。
【図２ｂ】図２は、定量化学的ＭＳ手法によって同定される阻害剤Ｖ１６７４２の特異的細胞内標的を示す図である。図２ｂは、量的ＭＳによって同定されるＶ１６７４２の細胞内標的をＫｄ値基準で最高から最低までの親和性標的で整列した。各クラス（高い親和性、中程度の親和性、低い親和性）に由来する１つの標的のためのＩＶＡ１及びＩＶＡ２設定に対応する代表的なＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＦＴ−ＭＳスキャンを示す。定量に用いたモノアイソトピックピークを図１に示されている構想に従って異なる矢印で示す。
【図２ｃ】図２は、定量化学的ＭＳ手法によって同定される阻害剤Ｖ１６７４２の特異的細胞内標的を示す図である。図２ｃは、質量分析法による結果の確認を表す。コントロールマトリックス又は図１に表されているＩＶＡ１（量依存的結合）若しくはＩＶＡ２設定（ＩＶＡの第２丸の中の濃縮）によるＶ１６７４２マトリックスのいずれかを用いたＨｅＬａ細胞からの全溶解物のインビトロ会合。ＪＮＫ２（高親和性標的）、ＲＩＰＫ２（中程度親和性標的）、ＥＲＫ２（低親和性標的）、及び、ＲＯＣＫ２（ＩＶＡ２において著しく濃縮されていない極低親和性標的）に対する特異抗体を用いてマトリックスから溶出した結合タンパク質を免疫ブロットした。
【図２ｄ】図２は、定量化学的ＭＳ手法によって同定される阻害剤Ｖ１６７４２の特異的細胞内標的を示す図である。図２ｄは、阻害剤Ｖ１６７４２の特異性プロフィールを示す。キナーゼ系統樹はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の著書である。ＴＫ、非レセプターチロシンキナーゼ；ＲＴＫ、レセプターチロシンキナーゼ；ＴＫＬ、チロシンキナーゼ様キナーゼ；ＣＫ、カゼインキナーゼファミリー；ＰＫＡ、プロテインキナーゼＡファミリー；ＣＡＭＫ、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ；ＣＤＫ、サイクリン依存性キナーゼ；ＭＡＰＫ、マイトジェン活性化タンパキナーゼ；ＣＬＫ、ＣＤＫ様キナーゼ。図に示されている異なる大きさの円は、高い結合親和性、中程度の結合親和性、又は、低い結合親和性を有するＶ１６７４２のキナーゼ標的を表す。
【図３ａ】図３は、固定化された阻害剤（Ｖ１６７４２）に結合への競合に関しての対象阻害剤（ＳＢ２０３５８０）についてのＩＣ５０決定を表す図である。図３ａは、選択性分析のための競合的結合手法の略図：ＳＢ２０３５８０標的の固定化された小分子阻害剤Ｖ１６７４２への結合の量依存的阻害の定量的ＭＳのための試験計画を示す。
【図３ｂ】図３は、固定化された阻害剤（Ｖ１６７４２）に結合への競合に関しての対象阻害剤（ＳＢ２０３５８０）についてのＩＣ５０決定を表す図である。図３ｂは、最上位のＳＢ２０３５８０標的タンパク（ＲＩＰＫ２）に由来する代表的なペプチドのＭＳのスペクトルを示す。これは、Ｖ１６７４２樹脂の中程度の親和性により保持されている。
【図３ｃ】図３は、固定化された阻害剤（Ｖ１６７４２）に結合への競合に関しての対象阻害剤（ＳＢ２０３５８０）についてのＩＣ５０決定を表す図である。図３ｃは、競合選択性プロフィールの免疫ブロット分析を示す。上昇させた濃度のＳＢ２０３５８０の存在下で固定化されたＶ１６７４２ビーズとともにＨｅｌａ細胞溶解物のＩＶＡ反応を行なった。マトリックスから溶出した結合タンパク質をＳＢ２０３５８０標的に対する指標抗体（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いて免疫ブロットし、質量分析の結果を確認した。
【図４】図４は、量的化学プロテオミクスによる標的特有の解離定数の評価を示す図である。（ａ）は、通常の又は安定同位体で標識されたアルギニン及びリジンを用いてＨｅＬａ細胞をＳＩＬＡＣエンコードしたものを表す。細胞溶解物を調製し、該細胞溶解物を、コントロール樹脂（Ｃ）を用いてインキュベートするか、又は、ＡＸ１４５９６を含むビーズ（ＡＸ）を用いた１又は２のインビトロ会合に供した。３つの溶出画分を溜め、定量ＬＣ−ＭＳによって分析することによって特定の結合剤を同定し、また、結合していない標的画分（＝ｒ）、及び、結合している標的画分（１−ｒ）を決定した。モル過剰の捕獲分子の存在下で結合平衡に達したとき、ＡＸ１４５９６の濃度とともに増加するそれらの比は、固定化されたＡＸ１４５９６についての標的に特有な解離定数（＝Ｋｉ）に等しく、また、キレート剤の存在によりＭｇ２＋−ＡＴＰ複合体が破壊された。（ｂ）は、異なる濃度のゲフィチニブの存在下でＡＸ１４５９６ビーズを用いてＳＩＬＡＣエンコードされた細胞内溶解物をインキュベートしたものを表す。結合タンパク質画分を示されているように組み合わせ、さらに、並列的ＬＣ−ＭＳ試験で定量的に評価した。ＡＸ１４５９６樹脂からのゲフィチニブ依存性タンパク脱離についてのＩＣ５０値を決定し、続いて、ゲフィチニブについて標的に特有な解離定数を算出した。
【図５ａ】図５は、量的阻害剤プロファイリングのための細胞のキナーゼパネルを示す図である。（ａ）は、図４に略説されている方策によって、固定化されている非選択的キナーゼ阻害剤ＶＩ１６７４２について、細胞内標的成分の結合親和性を決定したものを表す。ＨｅＬａ細胞に由来するＶＩ１６７４２と相互作用するプロテインキナーゼをヒトカイノームの系統樹において示す。赤い円の大きさはそれぞれの結合親和性を示している。いくつかのＶＩ１６７４２キナーゼ標的成分について、代表的なペプチドのＭＳスペクトル及び決定したＫｉ値を示す。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）から許可を得てキナーゼ系統樹を編集した。
【図５ｂ】図５は、量的阻害剤プロファイリングのための細胞のキナーゼパネルを表す図である。（ｂ）は、ＶＩ１６７４２樹脂に結合するプロテインキナーゼのＳＢ２０３５８０による濃度依存的阻害を表す。ＳＢ２０３５８０の細胞内標的について、競合試験で決定したＩＣ５０値、及び、得られたＫｉ値を示す。
【図６−１】図６は、再現分析用の定量的目標結合データの相関を表す図である。（ａ）は、実験概要を示す。通常のアルギニン、リジン（Ａｒｇ０／Ｌｙｓ０）又は安定同位体で置換された変異体（Ａｒｇ６／Ｌｙｓ４、Ａｒｇ１０／Ｌｙｓ８）を用いて細胞溶解前にＨｅＬａ  Ｓ３細胞をＳＩＬＡＣエンコードした。通常の標識構想において、Ａｒｇ０／Ｌｙｓ０でエンコードされたタンパク抽出物を阻害剤ビーズ（Ｉ）を用いて１つのインキュベーションステップに供し、その一方で、Ａｒｇ１０／Ｌｙｓ８で標識した溶解物について２回の連続的インビトロ会合を行った。Ａｒｇ０／Ｌｙｓ０及びＡｒｇ１０／Ｌｙｓ８でエンコードされた溶解物を逆の標識構想を用いたクロスオーバー試験に切り替えた。クロスオーバー試験により、特定の標的結合の再現性が確認され、偽陽性の標的同定を排除する有効な手段が提供された。後者は、細胞に由来しない、したがって、Ａｒｇ０及び／又はＬｙｓ０で標識されたペプチド種を通じてしか同定されない少量の汚染タンパク種の存在のせいであり得る。非常に高い親和性の特異的な標的が「通常の」標識計画において同様のＳＩＬＡＣパターンを生じさせる結果となるので、このことは重要である。非特異的なバックグラウンド結合を説明するためにコントロール樹脂（Ｃ）を用いてＡｒｇ６／Ｌｙｓ４で標識した細胞溶解物をインキュベートした。インビトロ会合ステップ後に、樹脂結合タンパクを溶出させ、定量ＬＣ−ＭＳによって分析した。
【図６−２】図６は、再現分析用の定量的目標結合データの相関を表す図である。（ｂ）は、通常の標識構想において、ペプチドイオン強度が、どのように、キナーゼ阻害剤樹脂を用いた親和性精製によって保持される標的タンパクのパーセンテージを特定するかを示す図である。例えば、固定化された阻害剤によって９０％が保持され、上澄み画分で１０％が結合しないままであり、その後、第２インビトロ会合ステップにおいて上澄みが同量の阻害剤に供されたとき、第１目標集団の９％（９０％の１０％）が親和性樹脂に結合する。得られる標的比ｒ＝０．１は、ＳＩＬＡＣによって可能になる標的由来ペプチドの相対存在量の定量化により決定され、標的のいずれの画分が親和性樹脂により保持されていないかを示す。従って、１−ｒ＝０．９は、阻害剤ビーズに結合する標的画分のための単位を表わす。（ｃ、ｄ）は、逆標識構想（ｘ軸）及び通常標識構想（ｙ軸）に従って行ったＳＩＬＡＣ試験について、固定化されたＡＸ１４５９６（ａ）又はＶＩ１６７４２（ｂ）ビーズへの第１次の結合で保持される標的タンパク量と、第２次の結合で保持される標的タンパク量との比を比較した図である。点線は、反復試験間の最大の相関関係を示す。
【図７】図７は、時間経過に伴う標的タンパク結合の分析を示す図である。（ａ）は、この研究の全体を通じて行ったインキュベーションの２．５時間以内に標的結合反応が平衡に達していたことを確認するために、異なるようにＳＩＬＡＣエンコードされた溶解物を固定化された阻害剤を含むビーズの存在下で５時間又は２．５時間のインビトロ会合に供したことを表す。溶離画分を組み合わせて定量ＬＣ−ＭＳによって分析した。（ｂ、ｃ）は、樹脂結合標的の５時間後と２．５時間後との比を決定し、その比を、固定化されたＡＸ１４５９６（ｂ）又はＶＩ１６７４２（ｃ）についての標的解離定数のｌｏｇ１０変換値に対してプロットした図である。大部分のプロットされた値は、比が１となるようにｘ軸と交差する垂線に接近しており、ＡＸ１４５９６（ｂ）又はＶＩ１６７４２（ｃ）樹脂についての平衡結合に近い条件を示している。
【図８】図８は、固定化された阻害剤の濃度が細胞内標的タンパクに対してモル過剰であるか否かを決定するコントロール試験を表す図である。（ａ）は、３ｍｇ又は１ｍｇの細胞内タンパクを同じインキュベーション体積で阻害剤親和性樹脂に供するＳＩＬＡＣ試験を行なったことを示す。２つの並行的インキュベーション反応に由来する溶出液を溜め、定量ＬＣ−ＭＳによって分析した。（ｂ、ｃ）は、１ｍｇの細胞抽出液から樹脂に結合した標的タンパクに対する３ｍｇの細胞抽出液から樹脂に結合した標的タンパクの比を決定し、固定化されたＡＸ１４５９６（ｂ）又はＶＩ１６７４２（ｃ）について標的解離定数のｌｏｇ１０変換値に対照させてプロットした図である。タンパク比が３に近かったことは、固定化されたキナーゼ阻害剤の有効濃度が結合分析における限定要因でないことを示した。
【図９】図９は、競合試験の反復分析における標的結合データの相関を表す図である。（ａ）は、阻害剤ビーズ及び様々な濃度の「遊離」キナーゼ阻害剤を含む競合アッセイを反復分析で行ったものである。この分析においては、阻害剤親和性ビーズの添加の３０分前（試験１）又は３０分後（試験２）に遊離した阻害剤を添加した。標的タンパク溶出及び定量ＬＣ−ＭＳの２．５時間前に第２インキュベーションステップを行った。（ｂ、ｃ）は、試験１及び試験２の競合データに別々に基づいて、遊離した阻害剤標的成分についてＩＣ５０値を決定したことを示す。これらのＩＣ５０値の比をｌｏｇ２で変換し、ゲフィチニブ（ｂ，ＡＸ１４５９６樹脂に対して試験した）又はＳＢ２０３５８０（ｃ，ＶＩ１６７４２樹脂に対して試験した）について算出した標的親和性（Ｋｉ値）のｌｏｇ１０変換比に対してプロットした。ｌｏｇ２変換されたＩＣ５０比が０に近かったことから、試験１及び試験２の定常段階と可溶段階とにおいて標的成分分散が同様であることが明らかであった。従って、競合アッセイの再現性を証明することに加えて、標的成分の可逆性、すなわち、化合物（阻害剤）相互作用が確認され、競合アッセイにおいて結合平衡に達したことが示された。
【図１０】図１０は、ＶＩ１６７４２の化学構造及び樹脂結合タンパクの遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を表す図である。（ａ）は、ＶＩ１６７４２の共有結合的固定化のための官能基を円で示した図である。（ｂ）は、ＶＩ１６７４２親和性ビーズによって保持されたすべての定量されたタンパクについての著しく過剰出現したＧＯ分子機能用語（Ｐ＜０．００１）、及び、特異的阻害剤標的成分で特徴付けられるタンパクの部分集合を示す図である。プロテインキナーゼ及び脂質キナーゼ活性等のＧＯ用語の過剰出現は、すべての阻害剤樹脂結合タンパクと比較して特定の標的画分において顕著であった。
【図１１】図１１は、細胞内ゲフィチニブ及びＳＢ２０３５８０標的について化学プロテオミクス（Ｋｉ，ｃｐ）により決定されたＫｉ値をｌｏｇ１０変換し、組み換えタンパクキナーゼ（Ｋｉ，ｋａ）（表６）を用いたインビトロ阻害分析からのゲフィチニブ（暗灰色の点）及びＳＢ２０３５８０（明灰色の点）についてのｌｏｇ１０変換されたＩＣ５０値に対してプロットした図である。。マイクロモル以下のＡＴＰ濃度を用いたことにより、酵素分析によるＩＣ５０値は、実際のＫｉ値の近い値を示した。これらの結果は、以前に公表された化学プロテオミクス手法（データ示されず）（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５，  １０３５−１０４４  （２００７））について報告されたデータと比較して、化学プロテオミクス分析と酵素活性分析とのさらに良い相関関係を示している。
【図１２】図１２は、ダサチニブ及び対応する固定化ダサチニブ親和性樹脂の構造を示す図である。
【図１３】図１３は、溶液中の遊離ダサチニブについての標的親和性を示す図である。溶液中の遊離ダサチニブについての標的親和性を決定した。通常及び２つの異なる形態の安定同位体で標識されたアミノ酸（ＳＩＬＡＣ）の存在下でＫ５６２細胞をインキュベーションした。異なる標識をした細胞溶解物を、共有結合で固定化された様々な濃度のダサチニブを有するダサチニブ親和性ビーズを用いて（左側）、また、高濃度遊離ダサチニブの存在下で最高リガンド濃度のダサチニブ親和性ビーズを用いて（右側）インキュベーションした。固定化されたダサチニブに結合したタンパクを溶出させ、定量ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。様々なサンプルについて決定した相対的なタンパク比からチェン−プルソフ方程式を用いて遊離ダサチニブ（Ｋｄ、ｆｒｅｅ  ｄａｓａｔｉｎｉｂ）についてＫｄ値の計算を行うことができた。ＢＣ５０は、標的タンパク結合の５０％を許容する固定化されたダサチニブ濃度を示す。ＣＣ５０は、固定化されたダサチニブに結合する標的タンパクの５０％を阻害する遊離ダサチニブ濃度を示す。「Ｃｉｍｍｏｂ。  ｄａｓａｔｉｎｉｂ」という言葉は、競合試験においてＣＣ５０を決定するために用いた固定化されたダサチニブ濃度を表す。
【図１４】図１４は、ダサチニブ標的タンパクの表はＫ５６２細胞抽出液及びそれらの対応するＫｄ値から決定したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
「被検体」という用語は、ここで用いられているように、プロテオーム、異なるプロテオームの混合物、細胞溶出物若しくは細胞抽出物、組織溶出物若しくは組織抽出物、細胞インキュベーション上澄み、組織インキュベーション上澄み、又は、乳汁、分泌液又はリンパ液等の体液であってもよい。
【００３１】
「プロテオーム」という用語は、ここで用いられているように、細胞、組織又は器官の特定のタンパク組成物を指す。含まれている個々の細胞に依存して、細胞又は組織のインキュベーション液は、理論上、そこに含まれている細胞があるのと同じくらい多数のプロテオームを含みうる。便宜上、１つの細胞インキュベーション又は１つの組織のプロテオームを１つのプロテオームを表すものとみなす。１種の器官のプロテオームは、細胞の状態及び遺伝的背景に依存して異なる場合がある。
【００３２】
本発明の目的のために被検体として様々なプロテオームを用いることができる。そのようなプロテオームは、単一細胞に由来するか又は細胞の均質集団から若しくは細胞の混合物から作られる細胞インキュベーション液に由来してもよい。また、それらは、組織、器官又は生命体に由来してもよい。さらに、前記単一細胞、細胞のインキュベーション液若しくは混合物、組織、器官又は生命体を、熱、ストレス、飢餓、薬剤、放射能、化学薬品、毒素、ウイルス感染、抗生物質、及び、老化等の条件に供してもよい。これらの条件は、本発明の方法において被検体としても用いることができ、また、そこに含まれる標的成分の規定の対象化合物に対する結合に関して互いに比較することができるプロテオームの様々「セット」をもたらす。従って、これらのプロテオームは、インビボの状況に似ている状況を可能な限り近く反映する。
【００３３】
本発明において被検体として用いるプロテオームは、細菌細胞、病原性微生物、真菌細胞、酵母菌、植物細胞、哺乳動物細胞、魚細胞、線虫細胞、昆虫細胞等の原核生物又は真核細胞、また、特に、胚幹細胞又は成体幹細胞（例えば、非ヒト胚幹細胞又は成体幹細胞）等の幹細胞に由来してもよい。さらに、本発明の方法を、結合組織、内皮組織、脳、硬骨、肝臓、心臓、骨格筋、前立腺、結腸、腎臓、分泌腺、リンパ節、膵臓、根、葉及び花等の組織又は器官に存在するか又は由来する様々なプロテオームに適用することができる。最後に、適切なプロテオームは、非ヒト生命体に存在するものであるか、又は、大腸菌、キイロショウジョウバエ、線虫、ゼブラフィッシュ、ラット、ハムスター、マウス、ヤギ、ヒツジ、サル、ヒト及びクラゲ等の生命体、若しくは、コウベイ、ポテト、シロイヌナズナ、コムギ、オートムギ及びタバコ等の植物生命体に由来するものであってもよい。
【００３４】
ここで用いられているように、「標的成分」は、相互作用（例えば対象化合物への結合）の能力がある被検体内の任意の構成要素であってもよい。従って、標的成分は、例えば、オリゴ糖若しくは多糖、核酸、プロテオグリカン、ペプチド又はタンパク（糖タンパクを含む）であってもよい。好ましい実施形態において、本発明における被検体の標的成分はタンパクである。上記タンパクは、好ましくはキナーゼであり、さらに好ましくはプロテインキナーゼである。同程度に好ましい実施形態において、標的成分は脂質キナーゼである。
【００３５】
本発明において、固体支持体の表面に固定化される化合物又は競合化合物は、酵素、ポリペプチド、ペプチド、抗体及び断片、オリゴ糖若しくは多糖、プロテオグリカン類、化学物質、小分子、薬剤、代謝産物又はプロドラッグから選択される任意の対象化合物であってもよい。前記化合物又は前記競合化合物は、被検体中の標的成分の阻害剤であることが好ましい。
【００３６】
そのような化合物又は競合化合物の好適な例は、合成化合物及び／又は天然に存在する化合物、小分子、ペプチド、タンパク、抗体などである。
【００３７】
本発明に従って化合物と競合化合物とが同一であってもよく、又は、互いに異なっていてもよいことが理解できるだろう。
【００３８】
用語「小分子」との用語は、ここに用いられているように、５０００Ｄａ未満の分子量（好ましくは２０００Ｄａ未満、さらに好ましくは１０００Ｄａ未満、最も好ましくは５００Ｄａ未満）を示す分子を指す。そのような化合物はさらなる最適化に適する「リード」になりえる。
【００３９】
例えば、薬剤、代謝産物、プロドラッグ、潜在的薬剤、潜在的代謝産物、潜在的プロドラッグ等の合成の及び／又は天然に存在する「小分子」化合物である化合物又は競合化合物は、本明細書及び特許請求の範囲に記載されている方法において好適に使用される。前記化合物又は前記競合化合物は、合成化合物又は天然に存在する化合物と有機合成薬剤とからなる群より選択されることが好ましく、小分子、有機薬剤、又は、天然小分子化合物であることがより好ましい。
【００４０】
本発明の方法の好ましい実施形態において、標的成分はキナーゼ及び固定化された対象化合物であり、また、競合化合物はキナーゼ阻害剤である。
【００４１】
しかしながら、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はＰＮＡ（タンパク核酸）等の核酸である化合物又は競合化合物の使用も本発明に包含されている。そのような核酸は、特定のヌクレオチド配列及び／又は繰り返し単位（ｍｏｔｉｆ）を含む核酸を含む、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの形態で存在し得る。様々な形態の核酸の混合物を用いてもよい。
【００４２】
「固体支持体」との用語は、ここに用いられているように、その表面で対象化合物の上記薬効範囲を固定化することができる任意の非溶解支持体に関する。固体支持体として用いることができる材料は、数多く、限定されないが、溶融石英、合成石英、シリコン、プラスチック、ガラス、金、金属、透明電極（例えば、インジウム錫オキサイド又は関連材料）、セラミック（例えば酸化金属）、紙、伝導性炭素、導電性高分子材料、フィルタ、ガラススライド、シリコン表面、ビーズ及びカスタマイズされた化学的マイクロアレイを含む。他の形態を使用してもよいが、そのような適切な材料は、小ビーズ、小球、ディスク、チップ、皿、マルチウェルプレート、ウエハース等の形態を有していてもよい。
【００４３】
本発明の方法の任意の好ましい実施形態においては、セファロース（例えばＮＨＳ活性化セファロース）又はアガロースビーズ等のビーズに化合物を結合させる。特に好ましい実施形態において、前記ビーズは、任意にエポキシ活性化された若しくはＮＨＳ活性化されたセファロース、又は、アガロースビーズである。例えば、３つの異なる濃度でエポキシ活性化されたセファロースビーズに阻害剤化合物（Ｖ１６７４２、図２ａ等）を結合させることができ、個別の樹脂に共有結合で固定化された阻害剤の相対的濃度（ここでは最低濃度の１倍、５倍及び２５倍）を吸光度測定法により決定する。
【００４４】
適切な固体支持体材料は、フェロ磁性又はフェリ磁性粒子の特性に関係している限り、例えば、参照によりここに組込まれているＷＯ０１／７１７３２で知られているフェロ磁性又はフェリ磁性粒子を含むか又はそれからなっていてもよい。フェロ磁性又はフェリ磁性粒子は、ガラス又はプラスチックを含んでいてもよい。本発明において用いることができるフェロ磁性又はフェリ磁性粒子は、多孔性であってもよい。フェロ磁性又はフェリ磁性ガラス粒子は、約３０〜５０重量％のＦｅ３Ｏ４及び約５０〜７０重量％のＳｉＯ２を含んでいてもよい。有用なフェロ磁性又はフェリ磁性粒子の平均直径は、約５〜２５μｍであることが好ましく、約６〜１５μｍであることがより好ましく、約７〜１０μｍであることが特に好ましい。フェロ磁性又はフェリ磁性粒子の総表面積は、１９０ｇ／ｍ以上、例えば、（Ｂｒｕｎａｕｒ  Ｅｍｍｅｔ  Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）法に従って決定されて）約１９０〜２７０ｇ／ｍの範囲内であってもよい。
【００４５】
これらの磁気微粒子により、精製、分離、及び／又は、プロテインキナーゼのような生体分子の分析が容易になる。対象分子に結合する磁気粒子（又はビーズ）は、該粒子含んでいる容器に外部磁界を適用することによって、集められるか又は回収されうる。
【００４６】
固体支持体材料の表面への化合物の固定化は、吸着、吸収、イオン結合、共有結合、アミノ基やカルボキシル基や水酸基、（ストレプト）アビジン−ビオチン若しくはチオール−金相互作用、及び、制御可能な密度又は濃度で材料を付着させることができる他の方法によって達成することができる。
【００４７】
固定化された化合物は、固体支持体の表面に定められた濃度で存在することが好ましい。この点についての好ましい濃度又は濃度範囲は、約３０ｎＭから約１０ｍＭの濃度であり、好ましくは、約１００ｎＭから約１０ｍＭ、又は、約１μＭから約５ｍＭである。
【００４８】
本発明の方法の任意の好ましい実施形態において、化合物は共有結合で固体支持体に結合している。結合させる前に、固体支持体材料又はマトリックスは、化合物との結合反応を可能にするために、ＮＨＳ、カルボジイミド等の活性基を含んでいてもよい。例えば、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、及び、ケトン基等の官能基を用いる直接結合、及び、例えば、ビオチン、化合物に共有結合で付着しているビオチン、及び、固体支持体に直接結合しているストレプトアビジンに対するビオチンの非共有結合等の非直接結合によって固体支持体に化合物を結合させることができる。
【００４９】
ビオチン−アビジンの親和性ペアは、生物学的用途に最も利用されている単一の親和性封鎖及び分離技術である。この系は、アビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを固体支持体の表面に固定化することに基づいている。ビオチン化されたおとり分子を細胞溶解物に混合させる。その後、この混合物をアビジンベース親和性カラムに投入して洗浄して非特異的結合タンパクを溶出させる。その後、いくつかの入手可能な試薬で洗浄することによって所望のタンパクを放出することができる。多くの作業により、単量体ニュートラアビジンを用いて一般的タンパクとの非特異的相互作用を最小化することができることが示されている。更に、特異的官能基を有する小分子をビオチン化することができる多くの化学的な試薬が容易に入手可能である。
【００５０】
本発明の方法の任意の好ましい実施形態において、アミノ基、水酸基又はカルボキシル基を通じて固体支持体材料（特にビーズ）の表面に化合物を固定化する。
【００５１】
義務的でないが、リンカー又はスペーサーによって固体支持体材料の表面に化合物を固定化することは有用である可能性がある。いくつかの拘束系を用いて化合物を固体支持体に付着させることができる。例えば、化合物と固体支持体との間に共有結合性リンカーを使用することができる。タンパク結合のために最適なリンカーの種類、剛性及び長さ等の要因を最適化し、さらに、望まれない非特異的相互作用を最小化するために、組み合わせ技術を用いてもよい。それらを最適化するために適切なシステム及び技術は、当業者に知られている。
【００５２】
本発明の文脈において、「接触」との用語は、被検体と固体支持体との間の相互作用を許容する手段又はステップをすべて含む。被検体内の標的成分が相互に作用することができるか又は固定化された化合物に結合することができる方法で接触を行う。標的成分と化合物との間の結合は、例えば、塩橋、水素結合、疎水性相互作用又はこれらの組み合わせ等を介した結合ような非共有性の可逆的結合であることが好ましい。
【００５３】
本発明の方法は、細胞又は組織の溶解物又は抽出物等の被検体中の標的成分と対象化合物との相互作用を質的及び／又は定量的に評価し又は決定することを可能にする。
【００５４】
本明細書でＩＶＡ１（インビトロアソシエイション、設定１）による方法とも称される本発明の第１態様において、対象化合物に対する標的成分の親和性を決定することができる上述の接触ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）等の様々な並列的又は連続的親和性精製ステップを異なる濃度で組み合わせて固体支持体の表面に該化合物を固定化する。
【００５５】
本発明のこの態様の条件において、固体支持体の表面に対象化合物を固定化する様々な濃度比が適切である。上述のステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）における好ましい濃度比は、約１：５：２５又は約１：１０：１００から選択される。しかしながら、例えば、約１：３：９、約１：４：１６、１：６：３６、約１：７：４９、約１：８：６４、又は、約１：９：８１等の他の比率は同様に適切である。
【００５６】
ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において固体支持体に結合した標的成分量を決定し、これらのステップにおいて固体支持体に結合した標的成分量を比較することによって、上記方法は、質的に、また、ある程度まで定量的に、対象化合物に対する被検体内の標的成分の結合親和性を決定することができる。
【００５７】
ＩＶＡ１による方法において、固体支持体に対して標的成分量は、例えば、ステップ（ｄ）において例えばＭＳによって測定されて決定された信号強度によって反映される。信号強度の増大を反映するように、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において化合物に結合する標的成分量が増加することは、標的成分が、固体支持体に結合した化合物についての結合親和性が低いか又は中程度でしかないものであるかもしれないことを示している。ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において化合物に結合した標的成分量がわずかに増えることは、相当程度同じ信号強度で反映され、固体支持体に結合した化合物に対する標的成分の高い結合親和性を示す。ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において化合物に結合した標的成分の量が同じである場合、それは、等しい信号強度によって視覚化され、このことは、固体支持体に結合している化合物に対する非常に強い結合又は固形材料に対する非特異的結合のいずれかを示しているかもしれない。
【００５８】
ＩＶＡ１による方法で正確にＫｄ値を決定するために、固定化された阻害剤の濃度が好ましくは被検体中の対応する標的成分の濃度のモル過剰で存在すべきであり、少なくとも２倍モル過剰で存在することが好ましい。しかしながら、固定化されたリガンドの濃度が制限している状態下でさえ、分析により、固定化されたリガンドに対する親和性に従って標的成分が異なって順位付けられるであろう。したがって、リガンドがモル過剰であることが好ましく、任意の要件であるが、必須ではない。
【００５９】
図１ａ（ＩＶＡ１、インビトロアソシエイション、設定１）における本発明の上記態様を例示的に説明する。同じ細胞の３つのインキュベーション液に由来するが、異なる同位体標識を用いて代謝的に標識された点で異なる細胞溶解物を用いてこの態様による方法を行なうことが好ましい。上記方法において同じ被検体の独立した分割量として、これらの異なって標識した溶解物を処理する。具体的には、それらを固体支持体の表面に固定化されている対象阻害剤化合物（図ではＶ１６７４２を用いた）と、異なる濃度で（図では１：５：２５の比で）接触させる。リガンドを用いたインビトロ会合の後に、固体支持体に結合した各分割量のタンパクを混合してＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析する。続いて、３つの並列的インキュベーション（図１ａ）に由来する安定同位体標識されたペプチドイオンの強度比を決定することによって相互作用するタンパクの相対存在量を定量してもよい。
【００６０】
本発明の上記態様に従って対象化合物に対する標的成分の親和性について特定の質的決定だけでなく量的な決定を行ってもよいことが理解されるであろう。
【００６１】
Ｖ１６７４２に対する低いか又は中程度の親和性で保持される代表的な標的成分について図に概略的に示されているように、その強度は、固定化された阻害剤化合物の低濃度から高濃度まで標的成分の結合が増加するのを反映する（図１ａ−ｉｉ）。
【００６２】
しかしながら、この試験から、固定化された阻害剤化合物の濃度が最も高いときに何パーセントの細胞内標的成分が保持されるかを確実に導き出すことができないので、阻害剤と標的成分との相互作用（図１ａ−ｉｉ）についてＫｄ値（解離定数）を決定するのは難しいかもしれない。
【００６３】
阻害剤の濃度が中程度であり、被検体から高い親和性を有する標的成分がすでに消費された場合には、強度は、親和性ビーズの表面に存在するより多くの阻害剤に伴ってさらに増加しない（図１ａ−ｉｉｉ）。しかしながら、信号強度（標的成分の相対量を表す）が３つのインビトロ会合すべてで等しい場合、これは、非常に高い親和性で結合する標的成分によるものであるかもしれないし、又は、固体支持体材料との非特異的な弱い相互作用によって保持される標的成分の「バックグラウンド」結合を示しているかもしれない（図１ａ−ｉｖ）。
【００６４】
ここにおいてＩＶＡ２（インビトロアソシエイション、設定２）による方法とも称される本発明の別の態様において、これらの起こりうる２つの状況を区別することができる方法を提供する。この方法は、高濃度（例えば、本発明の第１態様による方法において使用したか又は決定した最高濃度）で固体支持体の表面に固定化された化合物を用いて被検体内の標的成分の２回の連続的インビトロ会合ステップを行うステップ、及び、これらのステップの第２回において結合した標的成分量と、１回のみの会合ステップを有する並行的インビトロ会合（図１ｂ−ｉ）において結合した標的成分量とを比較するステップを具える。
【００６５】
しかしながら、この方法によれば、また、同じ細胞の３つのインキュベーション液に由来するが、代謝的同位体標識の点で異なる細胞溶解物が用いられ、該細胞溶解物は、同じ被検体の独立した分割量として再び処理される。第１分割量を高濃度で固定化された対象化合物（ここではＶ１６７４２）を有する固体支持体に接触させる。インビトロ会合をさせた後に、固体支持体から上澄みを分離し、高濃度で固定化された化合物を有する上述した種類の固体支持体材料と再接触させる。上記方法は、また、異なって標識された第２分割量を、高濃度で固定化された化合物を有する上述の種類の固体支持体材料に接触させるステップを具える。さらに異なるように標識して固体支持体に接触させた第３分割量を用いたネガティブコントロールであって、該固体支持体に上記化合物が固定化されていないネガティブコントロールを並行的に実施した。固体支持体に結合した第１及び第３分割量に由来するタンパクと、再接触ステップにおいて固体支持体に結合した第２分割量のタンパクとを混合してＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、３つの並列インキュベーションに由来する同位体標識されたペプチドイオンの強度比を決定することによって相互に作用するタンパクの相対存在量を定量する（図１ｂ）。
【００６６】
被検体中の相互作用が弱い標的成分とは対照的に、固定化された化合物（例えば、阻害剤化合物）に対してより高い親和性を有する標的成分の大部分は、第２分割量を供する第１接触ステップにおいて消費される。
【００６７】
表面に固定化された化合物を有する同じ固体支持体（例えば阻害剤ビーズ）を用いた親和性精製の２回目の上澄みから保持した異なるように標識された標的成分との量的比較によって、現在は、最高濃度の阻害剤化合物における標的成分結合のパーセンテージを算出することができる（それぞれ、図１ｂ−ｉｉ及び図１ｂ−ｉｉｉにおいて与えられる結合の１０％及び７５％の実施例）。Ｖ１６７４２親和性樹脂に特異的に結合する各標的の濃縮係数は、式Ｅｎ＝（１−ｒｎ）×１００によって算出することができる。ここで、ｒｎは、ｎ番目の標的について、Ｖ１６７４２親和性樹脂を用いたＩＶＡ２設定の第２回及び第１回において観察された結合の比を表し、また、Ｅｎは、ｎ番目の標的についてのパーセント濃縮係数である。
【００６８】
さらに、固定化された化合物と特異的に相互に作用しない被検体の標的成分を同定する手段は、結合した化合物を有しない固体支持体の使用、すなわち、コントロールによって提供される（図１ｂ−ｉｖ）。
【００６９】
ＩＶＡ２による本発明の方法によって結合親和性を決定することができるように、固体支持体の表面に固定化された化合物は、接触ステップの時に標的成分と比較してモル過剰で存在するべきである。
【００７０】
ＩＶＡ２による方法において、固体支持体に結合した標的成分量は、ステップ（ｄ）において例えばＭＳによって測定して決定された信号強度において反映される。ステップ（ａ）及び（ｃ）において化合物結合した標的成分量の減少は、信号強度の減少において反映される。減少の程度は、固体支持体に結合した化合物に対する標的成分の結合親和性を表す。ステップ（ａ）と（ｃ）とにおいて、結合した量がわずかだけ異なっていた（減少した）場合、このことは、低い親和性結合を示す。その一方で、大幅な差異（減少）は、固体支持体に結合した化合物に対して中程度又は高い親和性で標的成分が結合することを示す。ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）において化合物に結合した標的成分量が等しい場合、このことは、バックグラウンド結合又は非特異的結合を示す。
【００７１】
Ｋｄ値を相当正確に決定するために、固定化された阻害剤の濃度は、被検体中の標的成分濃度に対して少なくとも２倍モル過剰であることが好ましい。しかしながら、固定化されたリガンドの濃度が制限されている状態下でさえ、分析により、固定化されたリガンドに対する親和性に従って標的成分が異なって順位付けられるであろう。したがって、リガンドのモル過剰は好ましく、任意の要件であるが、必須ではない。
【００７２】
それを確認するためにさらなる対照実験を行なうことができる、固定化された化合物は、本発明のＩＶＡ方法において限定されない。図１ｃ−ｉに示されているように、異なるように標識され（例えばＳＩＬＡＣエンコードされ）、好ましくは同じ容積を有し、異なる量の細胞タンパクを含む細胞溶解物（例えばＨｅＬａ細胞由来）をＩＶＡ１又はＩＶＡ２で用いられる種類のビーズ（例えば固定化されたリガンドの最低の濃度を含むビーズ）と共にインキュベーションすることができる。リガンドと相互に作用する標的タンパクに由来する信号強度比が当初のタンパク濃度比に対応している場合、結合分析において、固定化されたリガンド濃度がその標的タンパクに対してモル過剰で存在していたと結論付けることができる。
【００７３】
本明細書においてＩＶＡ（インビトロアソシエイション）競合方法と称される本発明の第３態様において、固定化された化合物（例えば固定化された阻害剤）の結合親和性（例えばＫｄ値単位）を決定してもよく、前記被検体中の任意の標的成分について対象競合化合物の結合親和性は、濃度依存的競合によって決定されたか又は決定される。例えばＩＶＡ１及び／又はＩＶＡ２に従った本発明の任意の方法によって、固定化された化合物の結合親和性を決定してもよい。この方法の長所は、この方法において競合化合物を固定化する必要がないことである。
【００７４】
本発明の任意の方法（すなわち、ＩＶＡ１若しくはＩＶＡ２による方法又はＩＶＡ競合方法のいずれか）による接触ステップにおけるインキュベーション時間は、標的と阻害剤との相互作用について結合平衡に達するように充分に長いことが好ましい。本発明者らは、これが一般的にインキュベーション後２．５時間であることを実験的に確認した。しかしながら、より短いインキュベーション時間内に結合平衡に達する可能性もある。原則として、緩衝剤、塩、並びに、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ等のキレート剤又は追加的補助因子等の他の構成成分の濃度を広い濃度範囲で変化させてもよい。さらに、異なる温度で接触ステップを行ってもよい。好適な温度は、約４℃、約１５℃、室温、約２５℃、約３７℃、及び、約４２℃から選択される。約４℃、室温、及び、約３７℃が特に好ましい。
【００７５】
本発明の任意の方法による接触ステップは、生理的な条件下又は基本的に生理的な条件下で行われることが好ましい。これによってインビボ状況に可能な限り近い状況を再現することが可能になる。容易に偽陽性の結果となる最先端技術による他の方法とは対照的に、生理的な条件下又は基本的に生理的な条件下で機能する可能性が本発明の方法の長所の１つである。接触ステップは、好ましくは、適切な緩衝剤、及び、任意に、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、ｃＧＭＰ、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ｃＡＭＰ等の補助因子を用いて行われる。補助因子は、複合体及びプロテオームの形成、及び、プロテオーム及び／又は複合体と潜在的相互作化合物との相互作用を同時に著しく改善する場合がある。ここで用いられているように、「生理学的条件」との用語は、温度、ｐＨ、イオン強度、粘度、並びに、生存可能な生命体に適合し、及び／又は、酵母細胞等の生存可能なインキュベーション細胞又は哺乳動物細胞等の高等真核細胞において細胞内に一般的に存在する同様の生化学的パラメーターを指す。
【００７６】
例えば、一般的実験インキュベーション条件下でインキュベーションされた酵母細胞における細胞内の条件は、生理的条件である。インビトロの転写混合物に適切なインビトロの反応条件は、一般的な生理的条件である。一般に、インビトロの生理的条件には、５０〜２００ｍＭのＮａＣＩ又はＫＣＩ（ｐＨ６．５〜８．５、２０〜４５℃）、及び、０．００１〜１０ｍＭの二価陽イオン（例えばＭｇ＋＋、Ｃａ＋＋）が含まれる。好ましくは約１５０ｍＭのＮａＣＩ又はＫＣＩ（ｐＨ７．２〜７．６、５ｍＭの二価陽イオンであり、また、多くの場合に０．０１〜１．０％の非特異的タンパク（例えばＢＳＡ）が含まれる。多くの場合、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）が存在してもよく、通常約０．００１〜２体積％で、一般的には０．０５〜０．２体積％（ｖ／ｖ）で存在し得る。当業者は特に適切な条件を従来の方式に従って容易に選択することができる。一般的なガイダンス用として、以下の緩衝化された水溶液：１０〜１２００ｍＭのＮａＣＩ、５〜５０ｍＭのトリス／ＨＣＩ、ｐＨ５〜８を用いてもよく、二価陽イオン、及び／又は、金属キレート剤、及び／又は、非イオン性界面活性剤、及び／又は、膜画分、及び／又は、抗発泡剤、及び／又は、発光剤を任意に追加してもよい。
【００７７】
「基本的に生理的な条件」は、例えば、ｐＨ６．５〜７．５（好ましくはｐＨ７．０〜７．５）、及び／又は、１０〜５０ｍＭの緩衝剤濃度（好ましくは２５〜５０ｍＭ）、及び／又は、単価の塩（例えばＮａ又はＫ）の濃度が１２０〜１７０ｍＭであること（好ましくは１５０ｍＭ）を指すように意図する。二価の塩（例えば、Ｍｇ又はＣａ）は、１〜５ｍＭの濃度で存在してもよく、好ましくは１〜２ｍＭで存在してもよく、緩衝剤は、より好ましくはトリスＨＣＩ又はＨＥＰＥＳからなる群より選択される。
【００７８】
しかしながら、本発明の任意の方法による接触ステップを好ましくはより高い濃度（例えば１．２Ｍまで）の塩の存在下で行なって、バックグラウンドタンパクの非特異的結合を減少させるか又はより低い温度（例えば４℃）においてタンパク安定性を確保してタンパク凝集を防止してもよい。
【００７９】
上述したように、本発明の方法は、化合物が結合しているか又はしていない固体支持体から被検体を溶出させるステップを具えていてもよい。検出ステップを行うのに基づいてサンプル中に混合する前に固体支持体から本発明の標的成分を溶出させることが好ましい。
【００８０】
適切な溶出方法は当業界で周知であり、相互作用の性質に依存する。イオン強度を変化、ｐＨ値、温度又は洗剤を用いたインキュベーションは、大抵、固定化された化合物又は固体支持体（非特異的相互作用の場合）から被検体を標的成分を溶出させるために好適である。溶出緩衝剤を用いて極端なｐＨ値（高いか又は低いｐＨ；例えば０．１Ｍのシトラート（ｐＨ２〜３）によってｐＨを低下させること）、イオン強度の変化（例えばＮａＩ、ＫＩ、ＭｇＣＩ２又はＫＣＩを用いた高塩濃度）、疎水的相互作用を混す極性低下剤（例えばジオキサン又はエチレングリコール）、又は、変性剤（カオトロピック塩若しくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の洗剤)（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ａ．，２００２，ｌｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１），４１−４７を検討用に参照されたい。）によって結合相手を分離することができる。
【００８１】
これらのかなり非特異的な方法を用いて、被検体の結合している標的成分の大部分又はすべてを放出させて、次に、例えば、質量分析法（又は、代替的に他の任意の適切な検出方法（下記参照））によって分析してもよい。
【００８２】
支持体材料がカラム内に含まれている場合には、カラム通流物として放出された材料を回収することができる。支持体を被検体（いわゆるバッチ処理）と混合する場合、穏やかな遠心分離等のさらなる分離ステップが有用又は必要である可能性があり、放出された材料を上澄みとして回収する。あるいは、磁気装置を用いてサンプルからビーズを除去することができるように固体支持体として磁性ビーズを用いることができる。
【００８３】
当業者は、本発明の方法の各ステップ間に洗浄ステップが必要であるかもしれないことを理解できるであろう。そのような洗浄は、当業者の知識の一部である。その洗浄は、固体支持体から被検体の非結合成分を取り除くように機能する。低級洗剤を加えることにより、又は、洗浄緩衝剤中の塩濃度を穏やかに調整することにより、非特異的（例えば、単なるイオン性の）結合相互作用を最小化することができる。
【００８４】
溶出させた標的成分の同定及び定量化は、空間的に決定された信号位置及び信号強度に基づく。信号強度又は信号出現の速度を空間的に決定することができる多くの様々な装置技術を結合標的成分の検出に用いることができる。
【００８５】
これらの方法は、本発明の方法の任意において使用されてもよく、限定されないが、標識された標的成分からの螢光の検出、蛍光性の挿入剤、蛍光性の溝結合剤、分子信号、放射性同位元素、表面電位、有色生成物、酵素標識された標的、抗体標識された標的、及び、金粒子標識された標的を含む。
【００８６】
放射能検査法、蛍光検出方法、ルミネセンス検査法、染料検査法、酵素検査法及び質量分析法を用いて溶出させた標的成分を検出することが好ましい。
【００８７】
好ましい実施形態において、溶出させた標的成分を質量分析法によって検出する、すなわち、質量分析法によって特性を明らかにして定量する。
【００８８】
質量分光分析（質量分析法）を用いたタンパクの同定は、当業界で知られており（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８：  ８５０−８５８；  Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０，  ４３７−４７３）、これについては実施例の章でさらに説明する。
【００８９】
検出可能な標識で被検体中の標的成分を標識することが好ましい。上述したように、本発明の方法の好ましい実施形態において、検出可能な標識は被検体の各分割量において異なる。
【００９０】
この点に関して、質量分析法による定量タンパク分析用に確立された手順であるＳＩＬＡＣ（細胞インキュベーション液中のアミノ酸を用いた安定同位体標識）を用いてもよい。例えば、細胞の３つの群は、同位体標識されたアルギニン及びリジン（Ａｒｇ０／Ｌｙｓ０、Ａｒｇ６／Ｌｙｓ４、Ａｒｇ１０／Ｌｙｓ８）の３つの別個の組み合わせを用いてエンコードされたＳＩＬＡＣであってもよい。しかし、本発明の方法又はステップを質量分析法によるタンパク定量化のための他の方法と組み合わせることもできる。
【００９１】
しかし、本発明の方法において他の検出可能な標識を使用してもよい。適切な検出可能標識は、例えば、１３Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２９Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎなど等の放射性標識、染料標識、抗体で検知可能な標識、酵素標識、及び、検出可能な質量を有する標識からなる群より選択される。プロテオーム分析において質量分光法を使用する実験例は、Ｈｏ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．（標識なし）（”Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”  Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，Ｊａｎ．１０；４１５（６８６８）：１８０−３．）、Ｇｕ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（”Ｐｒｅｃｉｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｌｙｓｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｓｓ  ｔａｇｇｉｎｇ”．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００３，Ｊａｎ；１４（１）：１−７）  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｃ  ａｎｄ  Ａｄｄｏｎａ  ＴＡ  （”Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＰＲ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０００  Ｆｅｂ；１８（２）：４５−８）に記載されている。
【００９２】
標的成分の標識は、リン光性マーカー、蛍光性マーカー、化学発光性マーカー、ホスファターゼ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、タップ法マーカー及びペルオキシダーゼから選択されてもよい。ＴＡＧに加えて、他のマーカーは、Ａｒｇ標識、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合領域、ＤｓｂＡ、Ｃ−ｍｙｃ標識、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ標識、ＨＡＴ標識、Ｈｉｓ標識、マルトース結合タンパク、ＮｕｓＡ、Ｓ標識、ＳＢＰ標識、Ｓｔｒｅｐ標識、及び、チオレドキシンである。これらの標識の使用は、文献（例えば、Ｔｅｒｐｅ  Ｋ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００３  Ｊａｎ；６０（５）：５２３−３３）に広く記載されている。
【００９３】
本明細書中において早期に示したように本発明の方法の全部又は少なくとも一部を高生産性方式で行なってもよい。
【００９４】
本発明の方法は、固定化された化合物の様々な化合物濃度（密度）でカバーされる濃度範囲内のすべての同定された標的成分についてＫｄ値を決定することができる。非常に高い親和性を有する標的成分については、Ｋｄ値が、固定化された化合物の最低濃度に対応する値よりも低いと推測することができる。一方で、最も高い化合物濃度において結合が５０％未満の標的であって、かなり弱く相互作用する標的については、Ｋｄ値が特定の閾値よりも高いと結論付けることができる。固定化された化合物に対する標的タンパク感受性についての量的情報を取り出すことに加えて、特異的に保持されているタンパク標的から容易にバックグラウンド結合剤を同定することができる。
【００９５】
本発明は、固定化された阻害剤親和性精製に基づいて、従来の化学的プロテオーム処理の主な欠点を解消する。ＨｅＬａ細胞抽出物を用いて、固定化されたＶ１６７４２の記載されている定量化学分析により、質量分析法によって同定及び定量された９６個のプロテインキナーゼを含む１３１個の細胞内標的についてＫｄが決定された（図２ｂ及び表１）。同定されたキナーゼ標的のカイノーム系図における分散は、Ｖ１６７４２がかなり非選択的な阻害剤であることを示唆している（図２ｄ）。非キナーゼ標的も本発明の方法によって同定され得る。本発明の方法は、固体支持体の表面に固定化され得る任意の種類の親和性リガンドに適用することができる。
【００９６】
ＨｅＬａ細胞に由来する溶解物すべてをコントロールビーズ又はＶ１６７４２ビーズのいずれかを用いたＩＶＡ１及びＩＶＡ２に供して質量分析法の結果を確認した。高くから非常に低くまでに及ぶ親和性を有すると質量分析法によって同定／予想される標的であるＪＮＫ２、ＲＩＰＫ２、ＥＲＫ２及びＲＯＣＫ２に対して特異的な抗体を用いてビーズ表面に保持されたタンパクを免疫ブロットした。キナーゼは、質量分析法（表１）によって得られる定量データと同様に、実験計画（図１）によって予想されたものと一致するパターンでＶ１６７４２マトリックス（図２ｃ）と特異的に相互作用した。
【００９７】
固定化された阻害剤についての標的Ｋｄ値の情報は、さらに、固定化された阻害剤によって保持される標的に対する遊離試験化合物の選択性を迅速に分析するための定量化学的プロテオームの土台を構成することができる。このスクリーニング手法を確立するために、異なるようにＳＩＬＡＣエンコードされた細胞溶解物及び最高密度（図３ａ）で固定化された相当程度に非選択的な阻害剤Ｖ１６７４２を用いたインビトロ会合に、濃度を増やしたキナーゼ阻害剤ＳＢ２０３５８０を添加した。パネル全体のキナーゼ／非キナーゼ標的と固定化されたＶ１６７４２との相互作用と競合する能力について、様々な濃度（１００ｎｍ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）のＳＢ２０３５８０を試験した。
【００９８】
固定化された阻害剤に対するＳＢ２０３５８０標的タンパクの結合の量依存的な阻害は、定量的ＭＳによって測定され、ＳＢ２０３５８０についての標的に特異的なＩＣ５０濃度を決定するために用いることができた。ＩＣ５０濃度は、その遊離化合物が固定化されたＶ１６７４２に対する結合を５０％阻害する濃度である。固定化されたＶ１６７４２との相互作用に対してＳＢ２０３５８０によって最も強く競合した標的であるＲＩＰＫ２についての代表的なスペクトルを図３ｂに示す。続いて、ＳＢ２０３５８０に対するＩＣ５０値及び固定化されたＶ１６７４２について予め決定されたＫｄ値を用いて、Ｖ１６７４２親和性樹脂（表２）で示されるＳＢ２０３５８０標的についてのＫｄ値を古典的チェン−プルソフ方程式を用いて決定することができた。
【００９９】
質量分析法の結果を免疫ブロット法によって再び確認した。質量分析法によって同定／予想されるＳＢ２０３５８０標的であるＲＩＰＫ２、ＧＡＫ、ＣＫ１α、ＧＳＫ３β及びＪＮＫ２のための特異的抗体を用いて上昇させた濃度のＳＢ２０３５８０の存在下でＩＶＡ反応を調べた。キナーゼと固定化されたＶ１６７４２との間の相互作用は、定量的質量分析法の結果（表２）を有効にし、それによってコンセプトの証明を加える量依存的様式（図３ｃ）でＳＢ２０３５８０によって特異的に競合された。
【０１００】
したがって、非選択的キナーゼ阻害剤（又はその組み合わせ）に結合する標的タンパクについてのＫｄ値が、生物抽出物中のタンパクについて上述した化学的プロテオーム戦略によって決定されると、この情報は、対象化合物（これ自身は固定化される必要がない）に対する感受性について保持されたタンパクをすべて迅速に試験することができる選択性パネルを構成するために用いられ得る。
【０１０１】
医療用キナーゼ阻害剤ゲフィチニブ及び固定化されたその誘導体ＡＸ１４５９６を用いて、プロテオーム全域に渡る偏りのない標的同定と、品質が制御された標的親和性測定とを統合する、本発明の化学的プロテオミクス概念をさらに考案した。固定化されたＡＸ１４５９６又はリガンドを有しないコントロール樹脂を示す阻害剤ビーズとともに、異なってＳＩＬＡＣエンコードされた細胞溶解物をインキュベーションした。並行的に、第１の結合ステップからの上澄みをＡＸ１４５９６樹脂を用いた第２のインキュベーションに供した（図４）。得られた３つの溶出画分を混合し、ゲル電気泳動によって分離し、タンパク分解的に消化し、保持されたタンパクの相対存在量を定量した。コントロール樹脂に相当な結合を示すタンパクを非特定の相互作用とみなし、従って、さらに考慮しなかった。第２回で保持されたタンパクと、ＡＸ１４５９６ビーズへの結合の第１回との相対量を表す比ｒは、固定化された阻害剤によって分離しなかった画分に相当する。一方で、１−ｒは、親和性樹脂に実際に結合した標的の割合を示している（図４ａ、図６ａ及び６ｂ）。これらの標的に特異的な比率は、「標識スイッチ」試験（図６ａ及び６ｃ）において類似していた。その細胞内標的に対して固定化された化合物が超過している（この超過はモル過剰であることが好ましい）だけでなく、並行的なコントロールＳＩＬＡＣ試験においても結合平衡を確定した（図７及び図８）。
【０１０２】
分光測光法で決定した固定化された化合物（例えばＡＸ１４５９６）の濃度を用いると、解離定数（Ｋｉ値）を算出して固定化された化合物についてそれぞれの標的親和性の定量的測定を提供することができる（図４、表３〜５）。
【０１０３】
競合試験（例えば、好ましくはＳＩＬＡＣに基づいた競合試験）において、修飾された及び／又は固定化された化合物への標的結合に対する化合物濃度上昇による影響（例えばＡＸ１４５９６ビーズに結合する標的に対するゲフィチニブ濃度上昇による影響；図４を参照されたい。）をモニターして、親化合物の修飾及び／又は固定化によって標的親和性が潜在的に変化しているかをチェックすることができる。図４に表されている試験の実施例において、競合剤の添加前に、「遊離」ゲフィチニブ又はＡＸ１４５９６ビーズのいずれかと共に溶解物を予備インキュベーションすることによって同様の結果が得られたことは、分析条件下での平衡結合を示している（図９）。固定化された誘導体についての標的Ｋｉ値、及び、予め決定された固定化された誘導体濃度と共に、ＡＸ１４５９６ビーズに対する標的結合の半分を阻害するのに必要とされるゲフィチニブ濃度ＩＣ５０（Ｇｅｆ．）を用いて、チェン−プルソフ方程式に従って、「遊離」ゲフィチニブについての標的に特異的な解離定数Ｋｉ（Ｇｅｆ．）を算出した（図４及び表４）。これらの解離定数は、組み換え酵素を用いたインビトロキナーゼ分析で決定されたＫｉ値との相関関係が良好であった（表３）。これらの結果から、本発明の定量化学的プロテオミクス戦略が様々な被検体（例えば生物抽出物）に対する化合物（例えば小分子キナーゼ阻害剤）の直接的定量プロファイリングを可能にする適切な方法であることが確認される。
【０１０４】
さらに、潜在的細胞内ゲフィチニブ標的としてのＮＡＤＨジホスファターゼＮＵＤＴ１２及びブレオマイシンヒドロラーゼの同定は、定量化がプロテインキナーゼに限定されないことを示す（Ａｂｄｅｌｒａｈｅｉｍ，Ｓ．Ｒ．，Ｓｐｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．＆  ＭｃＬｅｎｎａｎ，Ａ．Ｇ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＮＡＤＨ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｄｉｘ ｆａｍｉｌｙ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ＮＵＤＴ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７４，３２９−３３５（２００３）；Ｒａｍｏｔａｒ，  Ｄ．  ＆  Ｗａｎｇ，  Ｈ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４３，２１３−２２４（２００３））。
【０１０５】
本発明の化学的プロテオミクス手法の代替的に実施においては、広く選択的なピリド［２，３−ｄ］ピリミジンをベースとするキナーゼ阻害剤ＶＩ１６７４２を親和性捕捉に用いてきた（図１０ａ）。上記と同じ定量的戦略を用いて約１３０個のプロテインキナーゼ及び約２５個の他のヌクレオチド結合酵素に対する固定化されたＶＩ１６７４２についてのＫｉ値を決定することができた（図５ａ及び表７〜８）。遺伝子オントロジー分析で示されるように、対応する分子機能は、阻害剤樹脂によって特異的に保持されるタンパクにおいて非常に過剰に示された（図１０ｂ）。
【０１０６】
ＶＩ１６７４２と相互作用するタンパクは、それらの天然の細胞環境に由来する多くのヌクレオチド結合タンパクに対する定量的阻害剤特性のためのスクリーニングパネルを構成した。１つのみの固定化された捕獲分子を有するＶｌ１６７４２樹脂により、以前に記載された７つの個別のリガンドの樹脂混合物（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，１０３５−１０４４（２００７））とほぼ同数の細胞抽出物中プロテインキナーゼを定量的に評価することができる。
【０１０７】
被検体中の標的成分結合に対する対象化合物の（例えばキナーゼ阻害剤ＳＢ２０３５８０の）競合を例えば濃度依存的方法のＳＩＬＡＣ試験で定量的に評価してもよい（図５ｂ）。ＲＩＰＫ２、ＧＡＫ、ＧＳＫ３β及び他のキナーゼ標的について示されているように、固定化されたＶＩ１６７４２の定量的データと得られたＩＣ５０値とを併せることにより、ＳＢ２０３５８０についての解離定数を決定することができた（図５ｂ、表８）。ＳＢ２０３５８０及びゲフィチニブについて本発明のプロテオミクス手法によって決定されたＫｉ値は、組み換えキナーゼ分析のデータとかなり一致しており、細胞内標的の親和性測定の正確さが顕著に向上したことを示している（表６及び図１１）。
【０１０８】
本発明の方法はキナーゼ阻害剤分析に概念的に限定されないが、例えば他の種類の小分子に適用してもよい。
【０１０９】
本発明の方法従った化学的プロテオミクス技術を用いると、主要な分子、それらの分子の標的、作用機構、選択性及び効能を同時に評価することができ、従って、創薬プロセスを劇的に改善し、臨床開発情報ルートにおける化合物の減少率を低下させる。
【０１１０】
細胞溶解物又は組織サンプルから直接的にタンパクの結合を同定及び定量するために、親和性プローブとして固体支持体の表面に固定化された薬剤様化合物を使用することには、本質的に薬剤化可能なタンパクを同定するという長所がある。従って、標的群の新しい構成要素を探すためにこの技術を応用することにより、新しい標的構成要素を同定できるだけでなく、その標的に対して非常に選択的な高親和性の化合物を同定することもできる。
【０１１１】
本発明の別の態様は、一般的な創薬ツールとしてここに開示されている方法の使用を含む。この化学的プロテオミクス手法は、機能的タンパク標的の理解を容易にし、複雑な細胞内プロセスを分析するためのツールを提供する。
【０１１２】
本発明の別の態様は、既存の承認された医薬品についての新たな指標の同定のための本明細書に記載されている又は特許請求の範囲に記載されている方法の使用である。例示の目的のためにキナーゼ阻害剤である薬を考慮する。多くのキナーゼが存在すると予想されていることを考慮すると、この化合物がより広い影響力の病理学に包含される他の日和見的キナーゼ標的を阻害することは、大いにあり得る。したがって、この化合物の市場潜在力が非常に増大し得ると予想することは合理的である。
【０１１３】
本発明の別の態様は、初期の薬剤候補の作用機構を明らかにする、本明細書及び特許請求の範囲に記載されている方法の使用である。薬剤候補が興味深い生物学的作用を示すが、それについての一般的な分子メカニズムがわかっていない場合に、この技術を用いて活性の合理的な最適化を行うことができる。例えば、企業が既定の疾病モデルにおいて興味深い生物学的作用及び効能を示す小分子候補又は分子種を有してるが、正確な作用機構を理解していない場合、作用に関連した標的の同定は、それらを医薬品にするのを容易にするように機能するだろう。構造と活性との関係データが入手可能な場合、生物活性を損なわずに修飾することができる分子の部位を同定することができる。この薬剤候補を固定化することによって、プロテオミクス分析による化合物の標的の同定を可能にする。対象標的が構造に基づく薬剤設計に適している場合に特に、この種の情報は最適化プロセスにおいて非常に価値がある。
【０１１４】
本発明の別の態様は、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘプロファイリングのための本明細書に記載されている方法及び特許請求の範囲に記載されている方法の使用である。病院に導入する前に、本明細書に開示されている技術を用いて、薬剤候補の毒性プロフィールを生成し、また、薬剤候補のＡＤＭＥ特性を評価することができる。ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ関連プロテオーム（すなわち、例えば薬剤候補の生物学的利用可能性を評価するために用いられる漿液結合タンパク）のバッテリー／パネルに化合物又は化合物種を晒すことによって薬剤候補の薬物動態学的特性を評価することができ、それによって候補優先順位及び候補最適化段階において有用な重要情報が提供される。いくつかのあり得る候補類を候補最適化に供すると仮定すると、各類の特性の迅速な評価は、どの種に注目するかについての化学者による選択を助ける。優れたＡＤＭＥ特性を有していると最も考えられる種は、薬剤開発のための望ましい特性を有する薬剤候補を生成する可能性が最も高いと考えられる。同様に、そのような化合物に対する第２及び第３の標的の知識は、潜在的に有毒な副作用の発生を減少させ、それによって臨床開発における成功率を上昇させるだろう。一般に、どの化合物をより正確でより高価な薬物動態的及び毒性研究に供するかについて優先順位を付けるフィルタとしてこの技術を用いることができる。
【０１１５】
従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載されている細胞内標的タンパクに結合する小分子のプロテオーム全域に渡る定量化のための方法を、根本的問題を解決して医薬品工業にサービスを提供することに適用することができる。
【０１１６】
すべての参考文献はここで引用されているようにその全体を参照することによりここに組み込まれている。
【０１１７】
以下の図面及び実施例によって本発明をさらに説明する。これらの図面及び実施例は、本出願の特許請求の範囲によって与えられる保護範囲を限定するものではない。
【０１１８】
実施例１：化合物合成及び共有結合
記載されている合成ルート（Ｍｏｌｏｎｅｙ，  Ｇ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ２，５−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ５ＨＴ１Ｂ／１Ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４０，  ２３４７−６２  （１９９７）．  Ｂａｒｖｉａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｙｒｉｄｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−７−ｏｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅｓ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４３，  ４６０６−１６  （２０００））に基づいてキナーゼ阻害剤Ｖ１６７４２を合成した。以前に記載されている（Ｂｒｅｈｍｅｒ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５，３７９−３８２（２００５））ようにＡＸ１４５９６及びゲフィチニブを合成した。３つの異なる濃度でエポキシ活性化したセファロースビーズにＶ１６７４２を結合させ、さらに、別々の樹脂剤の表面に共有結合で固定化された阻害剤の相対濃度を吸光度測定によって決定した（ここにでは最低濃度の１倍、５及び２５倍）。以前に記載されている（Ｗｉｓｓｉｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｌａｓｓ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ６，５３７−５４７（２００７））ように、２．５ｍＭの濃度のＡＸ１４５９６の２容量をエポキシ活性化されたセファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１容量に結合させた。共役反応時に可溶性相中の阻害剤濃度の還元を分光測光法を用いて測定することにより、共有結合で固定化された阻害剤の濃度を決定した。
【０１１９】
実施例２：細胞インキュベーション及びインビトロ会合試験
細胞インキュベーション液中のアミノ酸を用いた安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）のために、１０％の透析ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びに、４２ｍｇｌ−１の標識されていないＬアルギニン（Ａｒｇ０）及び７１ｍｇｌ−１のＬリジン（Ｌｙｓ０）、又は、等モル量の同位体変種Ｌアルギニン−Ｕ−１３Ｃ６（Ａｒｇ６）及びＬリジン２Ｈ４（Ｌｙｓ４）、又は、Ｌアルギニン−Ｕ−１３Ｃ６−１４Ｎ４（Ａｒｇ１０）及びＬリジン１３Ｃ６−１５Ｎ２（Ｌｙｓ８）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むダルベッコ修飾されたイーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＨｅＬａ  Ｓ３細胞をインキュベーションした。
【０１２０】
ＳＩＬＡＣ標識された細胞の３つの群及び３つの異なるの阻害剤樹脂剤を用いて、ＩＶＡ１（インビトロアソシエイション：設定１）及びＩＶＡ２（インビトロアソシエイション：設定２）と称されている２つの並行的試験を行った。阻害剤親和性ビーズを用いたインビトロ会合のために、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ及び添加剤を含む緩衝液中において、異なって標識したＨｅＬａ細胞を溶解させた。遠心分離後に、３ｍｇの高塩溶解物と排水したＶ１６７４２マトリックス又はコントロールマトリックスのいずれか３０μｌとのインビトロ会合を図１に示されている構成のように４℃で２．５時間行う前に溶解物を１ＭのＮａＣＩに調整した。ＩＶＡ１において、異なって標識されたＨｅＬａ細胞の細胞溶解物と共に、３つ異なる濃度（反応において最終濃度が５２μＭ、８．７４μＭ及び１．８７μＭである）で固定化された阻害剤を有する樹脂をインキュベートした。ＩＶＡ２において、ＳＩＬＡＣエンコードされたＨｅＬａ細胞溶解物を、最も高いリガンド密度の２回の並行する連続的親和性精製に供した。該精製においては、最初のＩＶＡの後に残された上澄みを２回目のＩＶＡに用いた。固定化された阻害剤を有しないコントロールビーズを用いてＨｅｌａ細胞溶解物をさらにインキュベートしてバックグラウンド結合剤を区別した。溶解緩衝剤を用いた３つの洗浄ステップ（１ＭのＮａＣＩを含む溶解緩衝剤による２回、及び、溶解緩衝剤による１回）の後に、３０μｌの１．５×ＬＤサンプル緩衝剤を用いて７０℃で１０分間ビーズを溶出させ、樹脂に結合した材料を放出させた。
【０１２１】
実施例３：競合ＳＢ２０３５８０の存在下におけるＩＶＡ試験
異なってＳＩＬＡＣ標識した細胞に由来する溶解物を、４℃の暗室において、上昇させた濃度（０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）のキナーゼ阻害剤ＳＢ２０３５８０と共に３０分間予備インキュベートした。その後、これらの溶解物を高密度阻害剤（Ｖ１６７４２）ビーズによるインビトロ会合に、４℃、２．５時間に渡って供した。その後、上記のようにサンプルを処理した。
【０１２２】
実施例３ａ：競合ゲフィチニブの存在下で固定化されたゲフィチニブ（＝ＡＸ１４５９６）又は競合ＳＢ２０３５８０の存在下で固定化されたＶＩ１６７４２を用いるＩＶＡ試験
競合試験のために、ＡＸ１４５９６又はＶＩ１６７４２ビーズを添加する前に、異なる濃度のゲフィチニブ（０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ）又は異なる濃度のＳＢ２０３５８０（０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）を用いてＳＩＬＡＣ標識した細胞溶解産物をそれぞれ３０分間処理した。代替的に、遊離阻害剤の添加前に阻害剤ビーズを用いて溶解物を３０分間インキュベートした。続いて、インビトロ会合を４℃で２．５時間行なった。すべてのインビトロ会合試験において、樹脂結合材料を３０μｌの１．５×ＬＤサンプル緩衝剤を用いて７０℃で１０分間溶出させる前に、３つの洗浄ステップ（１ＭのＮａＣＩを含む溶解緩衝剤による２回及び溶解緩衝剤による１回）を行なった。
【０１２３】
実施例３ｂ：競合ダサチニブの存在下で固定化されたダサチニブを用いたＩＶＡ試験
エポキシ活性化されたセファロースにキナーゼ阻害剤ダサチニブを結合させ、また、実施例１及び２に記載されているように、Ｋ５６２細胞をＳＩＬＡＣ標識した。実施例２及び３において記載されているように、異なる濃度（ここでは最低濃度の１倍、２倍、４倍、８倍及び１６倍）で共有結合により固定化された阻害剤を有する５つのダサチニブ親和性樹脂剤を、上昇させた濃度の遊離ダサチニブ（０ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ）の存在下でＩＶＡ試験に供した。実施例４、６、７及び８において記載されているように質量分光分析を行なった。実施例９に記載されているように、遊離ダサチニブ（ＣＣ５０）についてのＩＣ５０値及び固定化されたダサチニブについてのＫｄ値を用いて、遊離ダサチニブについてのＫｄ値を決定した。
【０１２４】
実施例４：質量分析法のためのサンプル調製
親和性クロマトグラフィー溶出液を混合し、既製品のゲル（ＮｕＰａｇｅ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において電気泳動によって分離し、コロイド状クマシー染色（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．１，２８５６−６０（２００６））によって視覚化した。ゲルを３つの薄片にカットし、その後に、トリプシンを用いたゲル内消化、及び、ステージチップス（ＳｔａｇｅＴｉｐｓ、Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２，１８９６−９０６（２００７）；Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２７，６３５−４８（２００６))を用いたペプチド抽出を行った。
【０１２５】
実施例５：免疫ブロット分析
ＩＶＡ１又はＩＶＡ２設定のいずれかに由来する親和性クロマトグラフィー溶出液の免疫ブロットを以下の抗体：ウサギ抗カゼインキナーゼＩα、ウサギ抗ＪＮＫ２、ウサギ抗ＲＯＣＫ−ＩＩ（すべてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＧＳＫ３β、抗ＲＩＰＫ２、抗ＧＡＫ、抗ＥＲＫ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて行なった。
【０１２６】
上昇させた濃度（０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）のＳＢ２０３５８０の存在下でＨｅｌａ細胞溶解物と固定化されたＶ１６７４２ビーズとのＩＶＡ反応を行なった。ＳＢ２０３５８０標的（すなわち、ＪＮＫ２、ＲＩＰＫ２、ＥＲＫ２、及び、ＲＯＣＫ２）に対する特異的抗体を用いてマトリックスから溶出した結合タンパク質を免疫ブロットし、質量分析法の結果を検証した。
【０１２７】
実施例６：質量分光分析
基本的に（Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２７，６３５−４８（２００６））に記載されているように、ナノエレクトロスプレーイオン源（Ｐｒｏｘｅｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、オーデンセ、デンマーク）を具えたハイブリッドＬＴＱオービトラップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ブレーメン、ドイツ）質量分析計に接続されたナノフローＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １１００、ヴァルトブロン、ドイツ）を用いてすべての質量分光分析（ＭＳ）を行った。簡潔に、０．５％の酢酸中において５％から４０％のアセトニトリルの２時間の濃度勾配を有し、３μｍＣ１８ビーズ（Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−ＡＱ  Ｐｕｒ，Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ）が詰められた１５ｃｍの分析用カラム（内径７５μｍ）にトリプシンペプチド及びリンペプチド混合物を分注した。ＨＰＬＣからの流出液を質量分析計に直接的に電気スプレーした。フルスキャンＭＳとＭＳ／ＭＳアクイジションとを自動的に切り替えるためにデータ依存モードでＭＳ装置を操作した。解像度Ｒ＝６０，０００を有するオービトラップを用いて、ｍ／ｚ４００（直線イオントラップにおいて「目標値」が１，０００，０００まで蓄積された後）で概観フルＭＳスペクトル（ｍ／ｚ３００〜２０００）を得た。２以上の帯電状態を有する５つの最も強度が強いペプチドイオンを目標値が５，０００の標的値になるまで連続的に分離し、複数段階活性化（ＭＳＡ  ｏｒ  ｐｓｅｕｄｏ  ＭＳ３）（Ｏｌｓｅｎ，  Ｊ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １２７，６３５−４８（２００６）；  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６，３５９０−８（２００４））による直線イオントラップにおいて断片化した。装置のＬＴＱ部にすべての断片イオンスペクトルを記録した。オービトラップ検出器を用いたすべての測定のために、（Ｏｌｓｅｎ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４，２０１０−２１（２００５））に記載されていように、周囲空気（ｍ／ｚ４２９．０８８７５）からの基準物質イオンを内部校正に用いた。一般的な質量分光条件は、スプレー電圧２．４ｋＶ、シース及び補助ガスフローがないこと、熱された毛細管温度（１５０℃）、ＬＴＱにおけるＭＳＡ用標準化衝突エネルギー３５％であった。イオン選択限界値は、ＭＳ２について５００カウントであった。活性化ｑ＝０．２５及び３０ミリセカンドの活性化時間を用いた。
【０１２８】
実施例７：ペプチド同定及び計量
ＭＳ／ＭＳピークリストを、未加工のＭＳファイルから抽出し、ＩＰＩヒトデータベースバージョン３．１９の前方方向及び逆方向のバージョンとからなる、連結された標的／デコイデータベース（Ｅｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，６６７−７５（２００５））に対するマスコットによって検索した。ＭＳモードにおける初期質量許容範囲を２５ｐｐｍにセットし、また、ＭＳ／ＭＳ質量許容範囲は０．５Ｄａであった。
【０１２９】
システインカルバミドメチル化を固定修飾として検索したが、Ｎ−アセチルタンパク、Ｎ−ピログルタミン、酸化メチオニン、セリン、トレオニン及びチロシンのリン酸化反応、アルギニン及びリジンへのＳＩＬＡＣ標識を可変修飾として検索した。得られたマスコットｈｔｍｌ出力ファイルを未加工のＭＳのファイルにリンクし、ＭＳＱｕａｎｔソフトウェア（http://msquant.sourceforge.net）に読み込ませた。偽発見率（ＦＤＲ）を最小化するために、すべてのペプチド同定を質量誤差及びマスコットスコアの閾値によってフィルタリングした。推定１％未満（ｐ＜０．０１）のＦＤＲを与える（Ｅｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，６６７−７５（２００５））逆にしたデータベース一致（正しくないペプチド配列）の数より、前方向一致の数がデータベースにおいて少なくとも２００倍多いペプチドを承認した。最終フィルタリング基準（ｐ＜０．０１）は、質量誤差＜５ｐｐｍ（全試験）、マスコットスコア≧１６（ＩＶＡ１及びＩＶＡ２、試験１）、マスコットスコア≧１８（ＩＶＡ１、試験２）、マスコットスコア≧１７（ＩＶＡ１、試験２）、又は、マスコットスコア≧１２（競合試験１及び２）であった。ペプチド溶出時間についての比率平均をＭＳＱｕａｎｔによって算出し、定量に用いた割当を視覚化して確認した。特に、許可基準は、正確なＳＩＬＡＣ形態（重い、中程度、又は、軽い）でペプチドを同定するべきであること、及び、ＳＩＬＡＣパートナー間のフルスキャンにおいてみられる質量差によって特定されるリジン残基及びアルギニン残基の正確な数を含むべきであることを含む。
【０１３０】
実施例８：データ解析
第１試験におけるＩＶＡ２設定のためのマスコットｈｔｍｌ出力ファイルに基づいたペプチドに共通ＩＰＩ同定テンプレートを割り当てた。質量誤差及びマスコットスコアについて、ユニークなペプチドに基づいて同定された適合タンパクをフィルターした。最後に、第１及び第２のＩＶＡ２試験の両方において同定された的中をＭＳＱｕａｎｔによって第１試験のＩＶＡ２設定について定量した。その後、高密度リガンドビーズにおいて観察された結合と比較して２５％を超えるコントロールビーズへの結合を示したバックグラウンドバインダーを除去した。第１回ＩＶＡと比較して第２回ＩＶＡにおける濃縮が５０％未満の的中タンパクを除去するために次の選抜を行った。これは、５０％未満の濃縮では、対応する標的についてＫｄ値を推定するときに著しい誤差が存在し得るからである。その後、試験１のＩＶＡ２において特に濃縮された標的についてリガンド（Ｖ１６７４２）濃度（ＩＶＡ１設定）を変化させたときの標的タンパクの結合を表す比をＭＳＱｕａｎｔによって得た。独立した第２試験のＩＶＡ２及びＩＶＡ１設定において標的の同一のセットを定量した。
【０１３１】
ＳＢ２０３５８０を用いた競合試験について、データ解析は基本的にＩＶＡ試験と同様であった。また、共通ＩＰＩ同定テンプレートに従ってＭＳＱｕａｎｔによって得られた比は示した。その後、ＳＢ２０３５８０の非存在下において高密度リガンドビーズを用いたコントロールＩＶＡ反応と比較して、１００μＭの最高競合濃度において結合が少なくとも５０％少ない標的タンパクを選択した。これらの選択された標的について、１μＭ及び０．１μＭのＳＢ２０３５８０における競合を示す比もＭＳＱｕａｎｔによって得た。
【０１３２】
ピークリスト生成、ＳＩＬＡＣに基づいた定量、偽発見率（ＦＤＲ）決定、ペプチドからタンパクグループへの組立及びデータフィルタリングを行なうＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（バージョン１．０．１２．０）を用いて、文献（Ｇｒａｕｍａｎｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ＳＩＬＡＣ−ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａ  ｄｅｐｔｈ  ｏｆ  ５１１１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  （２００７）；  Ｃｏｘ，  Ｊ．  ＆  Ｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｉｓ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ？  Ｃｅｌｌ  １３０，３９５−３９８（２００７））に記載されているように、阻害剤樹脂（例えばＡＸ１４５９６）を用いたすべての試験で得られた生データファイルをまとめて分析した。マスコット（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、  バージョン２．１．０４）を用いて頻繁に検出された汚染物質が補われたヒトＩＰＩデータベース（バージョン３．３７）の前方方向及び逆方向のバージョンを結合したものを用いてデータ検索を行った。システインカルバミドメチル化を固定修飾として設定し、Ｎ−アセチルタンパク及び酸化メチオニンを可変修飾とした。ＭａｘＱｕａｎｔによるＳＩＬＡＣパートナーの予備検索検出において標識された重いペプチドから得られたことが判明したスペクトルを、固定修飾Ｌｙｓ４、Ｌｙｓ８、Ａｒｇ６及びＡｒｇ１０を用いて検索し、その一方で、データベース探索前にＳＩＬＡＣ状態を割り当てることができなかったＭＳ／ＭＳスペクトルについては、可変修飾としてＬｙｓ４、Ｌｙｓ８、Ａｒｇ６及びＡｒｇ１０を用いて検索した。モノアイソトピック前駆イオンに対して質量許容範囲を５ｐｐｍに設定し、また、ＭＳ／ＭＳピークに対して０．５Ｄａに設定した。最小のペプチド長を６つのアミノ酸に設定し、また、ペプチド当たり３個までの残存断片及び３個の同位体標識されたアミノ酸を許容した。タンパク及びペプチドについて１％の偽発見率（ＦＤＲ）を容認した。ペプチドの後部エラー率（ＰＥＰ、ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）についての切り捨てを１０％に設定した。前方一致及び後方一致の両方についてマスコットスコア及びペプチド長依存ヒストグラムを生成し、次に、ベイズの定理を用いて規定のトップスコアペプチドについての偽同定の確率を得ることによって、ペプチドＰＥＰを決定した。その後、同じタンパクに属するペプチドのＰＥＰを増幅させた。同じ同位体パターンの複数回のシークエンシング、又は、異なるＳＩＬＡＣ状況、帯電状況及び修飾状況を有するペプチド種のシークエンシングの場合に決定される最低ＰＥＰを用いて、各ペプチド配列を一度だけ考慮した。その後、タンパクをペプチドＰＥＰの産物に従って分類し、タンパクリストに含まれる逆タンパクの画分に従ってＦＤＲが１％に到達するまで組み込んだ。タンパク同定に適用したＦＤＲ閾値に加えて、タンパクを、少なくとも２つのペプチド（それらの１つタンパクがユニークであることが必要である）と同一であるときに組み込み、少なくとも１つの定量可能なＳＩＬＡＣペアがそれらに関連づけられ��場合に定量した。すべてのペプチド比率の平均値ではなく中央値としてタンパク比率を算出したので、異常値を除去しなかった。異なる同定タンパクにおいて共有されるペプチドについては、多くのユニークなペプチドと同一視されるタンパクの比率のみに関してＳＩＬＡＣ比率を考慮した。異なるインビトロ会合試験についてのタンパク比率を、貯蔵したＳＩＬＡＣエンコード細胞抽出物中のタンパク比率の中央値から決定した初期ＳＩＬＡＣ貯蔵比に対して補正した。
【０１３３】
まず、阻害剤ビーズに結合したタンパクに対する阻害剤を有しないコントロールビーズに結合したタンパクの平均比率に従って、定量されたタンパクを分類した。０．２未満のバックグラウンド比を有するタンパクのみを更に検討した。続いて、阻害剤ビーズとのインキュベーションの第１回における結合に対する第２回における結合の比率を重複して入手可能なタンパクをさらなるデータ評価（このケースにおいて、平均値は１未満であった。）に供した。反復試験において逆の比率を示した汚染物質と考えられるものをさらなる分析から除外した。インビトロ会合の第１回の標的タンパク結合に対する第２回の標的タンパク結合の比率ｒを用い、下記方程式に従って、固定化された阻害剤のそれぞれの解離定数Ｋｉ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｍｍｏ）を算出した。
Ｋｉ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｍｍｏ）＝［Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｍｍｏ］×ｒ／（１−ｒ）
［Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｍｍｏ］は、結合分析の最終体積中の固定化された阻害剤の濃度であった。さらに、樹脂に結合した標的の５時間後と２．５時間後との比率、及び、３ｍｇの開始抽出物と比較した１ｍｇの開始抽出物の結合を決定し、インビトロ会合試験において平衡結合をどの程度満たしたかを評価した。
【０１３４】
並行して、阻害剤樹脂（例えばＡＸ１４５９６）及び異なる遊離阻害剤濃度（例えばゲフィチニブ濃度）を用いて、競合試験で得た誤差訂正した貯留比から、固定化されたリガンドに対するＫｄ値が利用可能な標的への結合の最大阻害の半分を表すＩＣ５０値を決定した。重複試験からの対立比率を平均した。
【０１３５】
阻害剤の非存在下における最大結合を１００％と設定された１つの部位の飽和に関する方程式を使用し、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（バージョン１０．０、Ｓｙｓｔａｔソフトウェア社）のリガンド結合モジュールを用いて標的特異的ＩＣ５０値を決定した。コントロールインキュベーションと比較した遊離阻害剤の最高濃度が０．６以下の比率の標的タンパクのみを検討した。続いて、遊離阻害剤に対する標的Ｋｉ値を下記チェン−プルソフ方程式従って算出した。
Ｋｉ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｆｒｅｅ）＝Ｋｉ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｍｍｏ）／（［Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｍｍｏ］＋Ｋｉ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｍｍｏ））×ＩＣ５０（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｆｒｅｅ）
【０１３６】
実施例９：結合定数の決定
ＩＶＡ１及びＩＶＡ２試験から得た比を異なるリガンド密度におけるパーセント結合に変換した。最大結合が１００％に設定された１つの部位の飽和に関する方程式を用いるＳＩＧＭＡプロットソフトウェアのリガンド結合モジュールを用いることによってＫｄ値を決定した。２つの独立した試験から算出したそれぞれの標的に対するＫｄ値は、一般に２倍以内であった。
【０１３７】
定量的ＭＳによって測定される固定化された阻害剤に対するＳＢ２０３５８０標的タンパクの結合の量依存的阻害を量反応曲線として表わすことができた。ＳＩＧＭＡプロットを用いてデータを一部位競合方程式に適合させ、ＳＢ２０３５８０についての標的特異的ＩＣ５０を決定した。続いて、下記式に従って、ＳＢ２０３５８０に対するＩＣ５０値、及び、固定化されたＶ１６７４３について予め決定したＫｄ値を用いて、Ｖ１６７４２親和性樹脂において示されるＳＢ２０３５８０標的に対するＫｄ値を決定することができた。
Ｋｄ（ＳＢ２０３５８０）＝（Ｋｄ（Ｖ１６７４２）/（Ｋｄ（Ｖ１６７４２）+［Ｖ１６７４２］）×ＩＣ５０（ＳＢ２０３５８０）
【０１３８】
実施例１０：キナーゼ分析
６０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＭｎＣｌ２、３μＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１．２ｍＭのジチオトレイトールを含むキナーゼ緩衝剤中において、レセプタ相互作用プロテインキナーゼ２（ＲＩＰＫ２）、ｃ−ｊｕｎＮＨ２末端キナーゼ２α２（ＪＮＫ２α２）、カゼインキナーゼ１δ（ＣＫ１δ）、エフリンレセプタＢ４（ＥｐｈＢ４）（すべてＵｐｓｔａｔｅ製）、カゼインキナーゼ１ε（ＣＫ１ε）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グリコゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）、胸腫瘍キナーゼ（ＢＲＫ）、ＳｒｃファミリーキナーゼＬｙｎ及びＹｅｓ、肝細胞増殖因子レセプタ（Ｍｅｔ）（すべてＰｒｏＱｉｎａｓｅ製）、及び、サイクリンＧ関連キナーゼ（ＧＡＫ）（Ｇｏｄｌ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，１５４３４−１５４３９（２００３））の生体外のキナーゼ分析を行なった。ＲＩＰＫ２及びＢＲＫについては０．３３ｍｇ／ｍｌのミエリン塩基性タンパク（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＫ１δ及びＣＫ１εについては２００μｍｏｌ／ｌのＣＫ１ｔｉｄｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ）、ＧＡＫについては０．２ｍｇ／ｍｌのヒストン混合物（Ｒｏｃｈｅ）、ＥｐｈＢ４、Ｌｙｎ、Ｙｅｓ及びＭｅｔについては０．２ｍｇ／ｍｌのポリＧｌｕ４Ｔｙｒ(Ｓｉｇｍａ）、ＪＮＫ２α２については８０μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ｃ−ｊｕｎ（Ｈｉｂｉ，  Ｍ．，  Ｌｉｎ，  Ａ．，  Ｓｍｅａｌ，  Ｔ．，  Ｍｉｎｄｅｎ，  Ａ．  ＆  Ｋａｒｉｎ，  Ｍ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−  ａｎｄ  ＵＶ− ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｃ−Ｊｕｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ７，２１３５−２１４８（１９９３））、ＧＳＫ３βについては５０μＭのＧＳＫ３β基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を基質として供給した。０．１μＭのＡＴＰ、０．５μＣｉ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ、及び、異なる濃度のＳＢ２０３５８０又はゲフィチニブの存在下で２５μｌの総体積内においてすべてのキナーゼを分析した。氷上の３０分間の予備インキュベーションステップにおいてキナーゼ反応をＡＴＰ添加によって開始させ、３０℃で７分間行なった。キナーゼ反応はインキュベーション時間を通じて直線的である。ＧＡＫ及びＲＩＰＫ２の場合には、３×ＳＤＳサンプル緩衝剤の添加によって反応を終了させた。ゲル電気泳動後にホスホイメージングによってリン酸化基質タンパク量を定量した。他のすべてのキナーゼについては、６μｌの３％リン酸を添加することによって反応を終了させ、また、Ｐ３０ガラス繊維フィルタ（Ｗａｌｌａｃ、ツルク、フィンランド）にリン酸化基質を結合させて３３Ｐの取り込みを測定した。ＥＧＦＲインビトロキナーゼ分析については、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ中においてＨｅＬａ  Ｓ３細胞をインキュベートして１５ｃｍの皿の表面に密着させた。７５０μｌの溶解緩衝剤を用いて溶解物を調製し、遠心分離によって予備除去した（Ｂｌｅｎｃｋｅ，  Ｓ．，  Ｕｌｌｒｉｃｈ，  Ａ．  ＆  Ｄａｕｂ，  Ｈ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ７６６  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｈｏｔｓｐｏｔ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，１５４３５−１５４４０（２００３））。ｍＡｂ１０８．１抗体及びプロテインＧセファロースビーズを用いて溶解物の３５０μｌの分割量を４℃で３時間に渡って免疫沈降させた（Ｂｌｅｎｃｋｅ，  Ｓ．，  Ｕｌｌｒｉｃｈ，  Ａ．  ＆  Ｄａｕｂ，  Ｈ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ７６６  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｈｏｔｓｐｏｔ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，１５４３５−１５４４０（２００３））。ビーズを添加剤を含まない３００ｍｌの溶解緩衝剤を用いて２回洗浄し、さらに、２００μｌのキナーゼ緩衝剤を用いて２回洗浄した。その後、氷上において、０．２ｍｇ／ｍｌのポリ（Ｇｌｕ４Ｔｙｒ）及び異なるの濃度のゲフィチニブを添加したキナーゼ緩衝剤中で、沈降ＥＧＦＲを３０分間予備インキュベートした。キナーゼ反応は、０．１μＭのＡＴＰ及び１μのＣｉ［γ―３３Ｐ］ＡＴＰを添加することによって開始され、１２μｌの３％リン酸添加及びフィルタに結合した基質への３３Ｐの取り込みの測定の前に５０μｌの総体積中で３０℃で１０分間で行われた。その後、すべてのキナーゼについて、Ｓｉｇｍａプロット（バージョン１０．０、Ｓｙｓｔａｔソフトウェア社）を用いてＩＣ５０値を決定した。すべての分析において用いたＡＴＰ濃度（０．１μＭ）がＡＴＰについてのＫＭ値よりも相当低かった（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｚ．Ａ．＆Ｓｈｏｋａｔ，Ｋ．Ｍ．Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １２，６２１−６３７（２００５））ように、キナーゼ分析ついてはＩＣ５０≒Ｋｉであった。
【０１３９】
当業者は、ここに広く記載されている本発明の実施において、不必要な実験をしなくても、ここに詳細に記載されている以外の方法、手順、装置、機械使用、材料及び試薬を容易に使用することができることを理解するだろう。本発明の実施に容易に応用できるすべての方法、手順、装置、機械使用、材料及び試薬、又は、ここに開示されている当業界において機能的に等価であると認められる特定の方法、手順、装置、機械使用、材料及び試薬が本発明に包含されるように意図されている。ここに引用されているすべての参考文献は、それらが本明細書と矛盾しない程度において引用により組み込まれている。
【０１４０】
【表１】
2010540947.tif 000003
【０１４１】
2010540947.tif 000004
【０１４２】
2010540947.tif 000005
【０１４３】
2010540947.tif 000006
【０１４４】
【表２】
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【０１４５】
【表３】
2010540947.tif 000008
【０１４６】
【表４】
2010540947.tif 000009
【０１４７】
【表５】
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【０１４８】
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【０１４９】
【表６】
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【０１５０】
【表７】
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【０１５１】
【表８】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
2010540947.tif 000023
【図１ａ】
2010540947.tif 000024
【図１ｂ】
2010540947.tif 000025
【図１ｃ】
2010540947.tif 000026
【図２ａ】
2010540947.tif 000027
【図２ｂ】
2010540947.tif 000028
【図２ｃ】
2010540947.tif 000029
【図２ｄ】
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【図３ａ】
2010540947.tif 000031
【図３ｂ】
2010540947.tif 000032
【図３ｃ】
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【図４】
2010540947.tif 000034
【図５ａ】
2010540947.tif 000035
【図５ｂ】
2010540947.tif 000036
【図６−１】
2010540947.tif 000037
【図６−２】
2010540947.tif 000038
【図７】
2010540947.tif 000039
【図８】
2010540947.tif 000040
【図９】
2010540947.tif 000041
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2010540947.tif 000046
【国際調査報告】
2010540947.tif 000047
2010540947.tif 000048
2010540947.tif 000049