(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高麗人参抽出物から分離されたジンセノサイドＦ２を含むアルコール性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記肝疾患が、肝炎、肝硬変、脂肪肝、肝不全及び肝臓癌からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項３】
前記ジンセノサイドＦ２が、肝臓における脂肪の蓄積を抑制するものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項４】
前記ジンセノサイドＦ２が、制御性Ｔ細胞（Treg）の分布を増加させて肝臓の炎症を抑制するものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項５】
前記ジンセノサイドＦ２が、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現を増加させるものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項６】
前記ジンセノサイドＦ２が、ナイーブＴ細胞（Naive T cell）のＴｈ１７細胞への分化を抑制するものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項７】
前記ジンセノサイドＦ２が、ＬＸＲα（liver X receptor alpha）の活性を抑制するものである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項８】
高麗人参抽出物から分離されたジンセノサイドＦ２を含むアルコール性肝疾患予防又は改善用機能性食品。
【請求項９】
高麗人参抽出物から分離されたジンセノサイドＦ２を含むアルコール性肝疾患予防又は改善用飼料組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかの組成物をヒトを除く肝疾患の疑いのある個体に投与するステップを含む、アルコール性肝疾患予防又は治療方法。
【請求項１１】
アルコール性肝疾患を予防又は治療するための医薬の製造における、高麗人参抽出物から分離されたジンセノサイドＦ２の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンセノサイドＦ２の肝疾患予防、改善又は治療用薬学組成物、機能性食品、及び飼料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコール性肝疾患は、臨床症状によってアルコール性脂肪肝、アルコール性肝炎、アルコール性肝硬変に大きく分けられ、個人の遺伝的な特徴、性別によって差があるが、１日８０ｇ以上のアルコールを摂取すると、肝疾患を発症する可能性が高くなることが知られている。
【０００３】
特に、アルコール性脂肪肝とは、アルコール代謝の結果として脂肪酸が過剰生成されて脂肪が肝臓に蓄積されることにより発症するものであり、肝臓に蓄積された脂質の占める重量比重が５％以上の場合脂肪肝と定義される。蓄積される脂質の種類はほとんどが中性脂肪（triglyceride）である。
【０００４】
アルコール性脂肪肝の原因は多様であることが知られている。第一に、アルコールが代謝される過程で発生する過剰量の水素（ＮＡＤＨ）が原因となる肝臓内での脂肪酸酸化の減少、脂肪酸濃度の増加などにより中性脂肪が蓄積されて発症し得る。また、アルコール代謝中に生成される有害な中間生成物質であるアセトアルデヒドが細胞内のタンパク質と結合してタンパク質の肝臓外への排出通路を遮断し、さらに脂質過酸化を引き起こして細胞膜を損傷させ、リポタンパク質の肝臓外への排出を遮断することにより肝臓内の中性脂肪が蓄積される。アルコール摂取による肝臓内の脂肪蓄積は、肝疾患（肝炎，肝硬化，肝臓癌）への移行における非常に重要な初期症状として認められている。
【０００５】
アルコール性脂肪肝を抑制できる物質としては、グルタチオン（glutathione）、２−メルカプトプロピオニルグリシン（2-mercaptopropionylglycine）、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（3-amino-1,2,4-triazole）、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−ｐ−フェニレンジアミン（N,N'-diphenyl-p-phenylenediamine）などの抗酸化活性のある物質、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（S-adenosyl-L-Methionine）、ベタイン（betaine）などのリン脂質及びグルタチオン合成促進物質、Ｌ−グリシン（L-glycine）、Ｌ−システイン（L-cysteine）などのアルコール代謝促進物質などが知られている（特許文献１）。しかし、副作用がなく効果に優れたアルコール性肝疾患治療剤が依然として求められている。
【０００６】
一方、ジンセノサイドＦ２は、乳癌幹細胞（ＣＳＣｓ）においてオートファジー（autophagy）と共にアポトーシスを誘導して乳癌における抗癌効果を示し（非特許文献１）、ＳＤラットのゼノグラフトモデルにおいてジンセノサイドＦ２がグリオブラストーマに対して抗癌効果を示すことが報告されている（非特許文献２）。また、ジンセノサイドＦ２をシワ改善、皮膚美白又はニキビ改善用化粧料組成物として使用できることが知られている（特許文献２）。しかし、ジンセノサイドＦ２の肝疾患治療効果については明らかにされていない。
【０００７】
こうした背景の下、本発明者らは、肝疾患を治療する方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、高麗人参から抽出できるジンセノサイドＦ２がアルコール媒介性肝損傷から保護するだけでなく、肝臓内における中性脂肪の形成、蓄積及び炎症を抑制し、様々なアルコール性又は非アルコール性肝疾患の予防又は治療用途に使用できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国公開特許第２０１２−０１３８３９２号公報
【特許文献２】韓国公開特許第２０１４−００１３７９５号公報
【特許文献３】韓国公開特許第２０１３−０１３４９３０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Mai TT et al. 2012; 28;321(2): 144-53
【非特許文献２】Shin JY et al. 2012; 36(1):86-92
【非特許文献３】McClain CJ他, Semin Liver Dis 1999;19:205-219
【非特許文献４】Neuman MG他, Exp Mol Pathol 95: 376-384
【非特許文献５】Reuben A. 2008. Curr Opin Gastroenterol 24: 328-338
【非特許文献６】Kim DK et al., Gut. 2013 Jul;62(7):1044-54
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ジンセノサイドＦ２を含む肝疾患予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、ジンセノサイドＦ２を含むアルコール性肝疾患予防又は改善用機能性食品を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、ジンセノサイドＦ２を含む肝疾患予防又は改善用飼料組成物を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、前記薬学組成物を個体に投与するステップを含む肝疾患の治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明の一態様は、ジンセノサイドＦ２を含む肝疾患予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【００１５】
ジンセノサイドＦ２とは、下記化学式１で表される四環系ＰＰＤ（protopanaxadiol）サポニンであり、メジャーサポニンに比べて相対的に吸収及び薬効に優れたマイナーサポニンの一種である。
【００１６】
【化１】
0006293099.tif 000002
【００１７】
本発明におけるジンセノサイドＦ２は、商業的に販売されているものを購入するか、自然栽培もしくは採取した高麗人参から分離するか、又は分離したジンセノサイドから変換したものを用いることができる。あるいは、合成方法で合成されたジンセノサイドＦ２を用いることができるが、本発明の肝疾患予防又は治療効果を示すジンセノサイドＦ２であれば制限なく用いることができる。
【００１８】
前記肝疾患の一例として、肝炎、肝硬変、脂肪肝、肝不全及び肝臓癌からなる群から選択されるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
肝炎とは、肝細胞及び肝組織の炎症を意味し、慢性肝炎により長期間にわたって肝細胞の破壊と再生の過程が繰り返されると、肝臓の線維組織と再生結節が増加して肝硬変が進むことがある。肝硬変が一定レベル以上に進むと、肝性脳症（Hepatic encephalopathy）、食道静脈瘤（Esophageal varix）などの合併症を引き起こすことがある。
【００２０】
脂肪肝（fatty liver）とは、正常な肝臓において脂肪が占める割合（５％）より多量の脂肪が肝臓に蓄積されたことを意味する。前記脂肪肝は、アルコール性脂肪肝であってもよく、肥満、糖尿病、脂質異常症、薬物などによる非アルコール性脂肪肝であってもよい。
【００２１】
肝不全とは、肝臓の合成及び解毒機能が低下した状態であり、肝炎と肝硬変が混在して現れる。
【００２２】
前記肝疾患は、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、ＧＧＴ又はビリルビン（Bilirubin）により診断される疾患であってもよい。
【００２３】
本発明者らは、ジンセノサイドＦ２が脂肪生成を刺激するタンパク質であるＬＸＲ（liver X receptor）のアゴニスト（agonist）ＴＯ９０１３１７によって増加した脂肪合成遺伝子ＲＥＢＰ１ｃとＦＡＳの発現を肝細胞株において抑制することを確認した（実施例２，図５ｅ，図５ｆ，図５ｇ）。よって、ジンセノサイドＦ２が肝細胞、肝星細胞において脂肪合成を抑制する効果に優れ、具体的には、ジンセノサイドＦ２がアルコール媒介性エンドカンナビノイドの産生を抑制し、隣接する肝細胞内のＣＢ１Ｒシグナル伝達を低下させることにより、肝臓における脂肪形成を抑制することを確認した。よって、本発明のジンセノサイドＦ２を含む薬学組成物は、肝脂肪形成による非アルコール性及びアルコール性肝疾患を効果的に予防、治療することができる。
【００２４】
前記肝疾患の他の例としては、アルコール性肝疾患であってもよい。前記アルコール性肝疾患とは、過剰な飲酒により発症する肝疾患を意味する。
【００２５】
アルコール性肝炎においては、過剰なアルコール摂取により酸化性ストレス及び各種炎症媒介物質（ＴＮＦ，proinflammatory cytokine，ＩＬ−１β，ＩＬ−６，ＩＬ−８）が増加し、それに伴う反応性代謝産物と酸素種（oxygen species）が生成されて肝細胞の防御機序に影響を与える。それにより、正常な肝再生機序が損傷して肝毒性が生じることが報告されている（非特許文献３）。
【００２６】
アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）とは、過剰飲酒により中性脂肪が肝組織に蓄積される疾患であり、アルコールは糖代謝と脂肪代謝に影響を及ぼし、肝細胞のＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比と脂肪合成に必要な前駆体の増加を誘導することにより、中性脂肪の合成を増加させると共に分解を減少させ（非特許文献４）、過剰生成されたアセトアルデヒドは肝細胞の主要タンパク質と脂質の機能を低下させ、タンパク質合成の減少と中性脂質の蓄積を誘導することにより、肝細胞損傷を起こすことが知られている（非特許文献５）。継続してアルコールにさらされると、脂肪肝は肝炎、肝硬変症、肝臓癌に進行することがある。
【００２７】
本発明者らは、ジンセノサイドＦ２がアルコールにより増加した血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ値を減少させることを血清分析により確認し（実施例１，図２）、エタノール投与により発症した炎症及び細胞損傷を減少させることを肝組織染色により確認した（図３ａ，図３ｂ）。
【００２８】
また、ジンセノサイドＦ２が、アルコール媒介性肝炎においてマクロファージや好中球などの炎症細胞の活性を抑制する制御性Ｔ細胞（Treg）の分布を増加させて、肝炎から保護することを確認し（図６ａ及び図６ｂ）、アルコールにより増加した炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１７の発現を抑制し、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の発現は増加させることを確認した（図６ｄ及び図６ｅ）。さらに、ナイーブＴ細胞においてＩＬ−１７を発現する炎症誘発細胞であるＴｈ１７細胞への分化を抑制することを確認した（実施例４，図７ａ〜図７ｃ）。
【００２９】
よって、ジンセノサイドＦ２は、アルコールにより誘発された肝炎症及びそれによる肝損傷を緩和させることができる。
【００３０】
さらに、本発明者らは、ジンセノサイドＦ２が、アルコールにより増加した血清中の中性脂質（ＴＧ）、総コレステロール含有量を減少させることを血清分析により確認し（実施例１，図２）、エタノール投与により増加した肝組織における中性脂質の蓄積を減少させることを肝組織染色により確認した（図３ａ，図３ｃ）。
【００３１】
また、肝細胞及び肝星細砲において脂肪を蓄積する経路を調節する転写因子であるＳＲＥＢＰ１ｃとＦＡＳ、肝細胞内での脂肪合成に重要であることが知られているＣＢ１Ｒ、脂肪の合成を誘導するエンドカンナビノイド合成酵素ＤＡＧＬ−α、βの発現増加を抑制し、脂肪酸加水分解酵素ＦＡＡＨ、脂肪の酸化を誘発するｐＡＭＰＫの発現減少を阻害することにより（図４ａ〜図４ｃ，図５ｂ〜５ｄ）、ジンセノサイドＦ２が肝臓における脂肪形成及び蓄積を予防又は抑制し、肝疾患を効果的に予防又は治療できることを確認した。
【００３２】
よって、一例として、前記ジンセノサイドＦ２は、肝臓における脂肪の蓄積を抑制するものであってもよく、制御性Ｔ細胞（Treg）の分布を増加させて肝臓の炎症を抑制するものであってもよい。他の例として、前記ジンセノサイドＦ２は、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現を増加させるものであってもよい。また、前記ジンセノサイドＦ２は、ナイーブＴ細胞（Naive T cell）のＴｈ１７細胞への分化を抑制するものであってもよい。さらに、前記ジンセノサイドＦ２は、ＬＸＲ（liver X receptor）の活性を抑制するものであってもよい。
【００３３】
本発明における「予防」とは、本発明によるジンセノサイドＦ２を個体に投与することにより、肝疾患の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。
【００３４】
本発明における「治療」とは、本発明の前記組成物を肝疾患発症の疑いのある個体に投与することにより、肝疾患の症状を好転させたり、好適に変更させるあらゆる行為を意味する。
【００３５】
本発明の薬学組成物は、単一製剤として用いてもよく、公認された肝疾患治療効果を有することが知られている薬物をさらに含む複合製剤として製造して用いてもよく、薬学的に許容される担体又は賦形剤を用いて製剤化することにより単位用量形態に製造されてもよく、多用量容器内に収納して製造されてもよい。
【００３６】
本発明における「薬学的に許容される担体」とは、生物体を刺激することなく、注入される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。本発明に使用される前記担体の種類は特に限定されるものではなく、当該技術分野において通常用いられて薬学的に許容される担体であれば、いかなるものでも用いることができる。前記担体の例としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、グルコース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノールなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び／又は静菌剤などの他の通常の添加剤を添加して用いてもよく、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などをさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤などに製剤化して用いてもよい。
【００３７】
また、本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量のジンセノサイドＦ２を含むことができる。本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、一般に０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量を１日１回又は数回に分けて投与する。しかし、発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否かをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と併用又は同時投与される薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野で周知の類似因子に応じて異なる量を適用することが好ましい。
【００３８】
本発明の薬学的組成物は、単独の治療剤として投与することもでき、他の治療剤と併用して投与することもでき、従来の治療剤と順次又は同時に投与することができる。また、単一又は多重投与することができる。上記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大限の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定される。
【００３９】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、標的組織に送達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路で投与することができる。
【００４０】
本発明による薬学組成物の投与方法は特に限定されるものではなく、当該技術分野において通常用いる方法を採用することができる。前記投与方法の例として、組成物を経口投与又は非経口投与方法で投与することができるが、これらに限定されるものではない。本発明による薬学組成物は、目的とする投与方法に応じて様々な剤形に製造することができる。
【００４１】
本発明の組成物の投与頻度は、特にこれらに限定されるものではないが、１日１回投与してもよく、用量を数回に分けて投与してもよい。
【００４２】
本発明の他の態様は、前記組成物を肝疾患の疑いのある個体に投与するステップを含む、肝疾患予防又は治療方法を提供する。例えば、前記組成物をヒトを除く肝疾患の疑いのある個体に投与するステップを含む、肝疾患予防又は治療方法を提供する。
【００４３】
ジンセノサイドＦ２及び肝疾患は前述した通りである。
【００４４】
本発明における「個体」とは、肝疾患が発症しているか、或いは発症する可能性のあるヒトを含むあらゆる動物を意味する。前記動物は、ヒトだけでなく、それに類似する症状の治療を必要とするウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、カモシカ、イヌ、ネコなどの哺乳動物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本発明の前記予防又は治療方法は、具体的には、肝疾患が発症しているか、或いは発症する可能性のある個体に前記組成物を薬学的に有効な量で投与するステップを含んでもよい。
【００４６】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、標的組織に送達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路を介して投与することができる。
【００４７】
本発明のさらに他の態様は、ジンセノサイドＦ２を含む肝疾患予防又は改善用機能性食品を提供する。
【００４８】
ジンセノサイドＦ２及び肝疾患は前述した通りである。
【００４９】
前記ジンセノサイドＦ２は、高麗人参、白参、山参などから抽出可能な天然物質であり、長期間の使用により安全性が立証されているので、常食できて肝疾患の予防又は改善を図ることのできる食品の形態に製造して摂取することができる。
【００５０】
機能性食品（functional food）とは、特定保健用食品（food for special health use, FoSHU）と同義であり、栄養供給以外に生体調節機能を効率的に示すように加工された医学、医療的効果の高い食品を意味し、前記食品は肝疾患の予防又は改善に有用な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸剤などの様々な形態に製造することができる。
【００５１】
本発明の食品組成物は、食品学的に許容される担体をさらに含むものであってもよい。
【００５２】
本発明のジンセノサイドＦ２を含む組成物を添加できる食品の種類には特に制限がなく、例えば各種飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などが挙げられる。前記食品組成物には肝疾患予防又は改善効果の妨げとならない他の成分を追加することができ、その種類は特に限定されるものではない。例えば、通常の食品と同様に様々な生薬抽出物、食品学的に許容される食品補助添加剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。
【００５３】
前記食品補助添加剤は、各剤形の機能性食品を製造する際に添加されるものであり、当業者が適宜選択して用いることができる。例えば、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤や天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド、増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などが含まれるが、前記例にその種類が限定されるものではない。
【００５４】
ここで、前記食品に含まれる抽出物の含有量は、特にこれらに限定されるものではないが、食品組成物の総重量に対して０．０１〜１００重量％、より好ましくは１〜８０重量％の量で含まれる。
【００５５】
食品が飲料の場合は、１００ｍｌに対して１〜３０ｇ、好ましくは３〜２０ｇの割合で含まれる。また、前記組成物は、食品組成物に常用されて香り、味、味覚などを向上させることのできる追加成分を含んでもよい。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（niacin）、ビオチン（biotin）、葉酸（folate）、パントテン酸（panthotenic acid）などを含んでもよい。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）などのミネラルを含んでもよい。また、リシン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含んでもよい。また、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（サラシ粉と高度サラシ粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチルヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）など）、甘味料（ズルチン、チクロ、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ−酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、被膜剤、ガムベース、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（food additives）を添加することができる。前記添加物は、食品の種類によって選別されて適切な量で用いられる。
【００５６】
本発明の機能性食品は、当業界で通常用いられる方法で製造することができ、前記製造の際に当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、一般の薬品とは異なり、食品を原料とするので、薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがないという利点があり、携帯性に優れる。
【００５７】
本発明のさらに他の態様は、ジンセノサイドＦ２を含む肝疾患予防又は改善用飼料組成物を提供する。
【００５８】
ジンセノサイドＦ２及び肝疾患は前述した通りである。
【００５９】
前記飼料組成物は、飼料添加剤を含んでもよい。本発明の飼料添加剤は、飼料管理法上の補助詞料に該当する。
【００６０】
本発明における「飼料」とは、動物が食べて摂取し、消化させるための、又はそれに適した任意の天然又は人工の規定食、一食など、又は前記一食の成分を意味する。
【００６１】
前記飼料の種類は特に限定されるものではなく、当該技術分野において通常用いられる飼料を用いることができる。前記飼料の例としては、穀物類、堅果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、デンプン類、ウリ科の植物類（ミール類）、穀物副産物類などの植物性飼料と、タンパク質類、無機物類、油脂類、ミネラル類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類、飲食物などの動物性飼料とが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【発明の効果】
【００６２】
本発明によるジンセノサイドＦ２を含む薬学組成物は、肝臓における脂肪形成及び蓄積を抑制し、炎症細胞の活性を抑制する制御性Ｔ細胞の分布を増加させ、制御性Ｔ細胞において抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の発現を増加させ、ナイーブＴ細胞において炎症誘発細胞であるＴｈ１７細胞への分化を抑制し、効果的に肝疾患を予防又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ジンセノサイドＦ２が肝疾患予防又は治療効果を発揮する機序を示す図である。統計値は平均±ＳＥＭで表し、対応する対照群と比較した有意性を＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１で示す（以下同様）。
【図２】ジンセノサイドＦ２処理による血清分析（ＡＬＴ，ＡＳＴ，ＴＧ，総コレステロール含有量）結果を示す図である。
【図３ａ】ジンセノサイドＦ２処理による肝組織の組織学的変化を示す図である。
【図３ｂ】ジンセノサイドＦ２処理による肝組織の組織学的変化を示す図である。
【図３ｃ】ジンセノサイドＦ２処理による肝組織の組織学的変化を示す図である。
【図４ａ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞及び肝星細胞の脂肪合成指標（ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＦＡＳ、ＣＢ１Ｒ、ＤＡＧＬ−α、β、ＦＡＡＨ、ｐＡＭＰＫなど）の変化を示す図である。
【図４ｂ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞及び肝星細胞の脂肪合成指標（ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＦＡＳ、ＣＢ１Ｒ、ＤＡＧＬ−α、β、ＦＡＡＨ、ｐＡＭＰＫなど）の変化を示す図である。
【図４ｃ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞及び肝星細胞の脂肪合成指標（ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＦＡＳ、ＣＢ１Ｒ、ＤＡＧＬ−α、β、ＦＡＡＨ、ｐＡＭＰＫなど）の変化を示す図である。
【図５ａ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞、肝星細砲における脂肪合成抑制効果及びその脂肪合成抑制機序を確認して示す図である。
【図５ｂ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞、肝星細砲における脂肪合成抑制効果及びその脂肪合成抑制機序を確認して示す図である。
【図５ｃ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞、肝星細砲における脂肪合成抑制効果及びその脂肪合成抑制機序を確認して示す図である。
【図５ｄ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞、肝星細砲における脂肪合成抑制効果及びその脂肪合成抑制機序を確認して示す図である。
【図５ｅ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞、肝星細砲における脂肪合成抑制効果及びその脂肪合成抑制機序を確認して示す図である。
【図５ｆ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞、肝星細砲における脂肪合成抑制効果及びその脂肪合成抑制機序を確認して示す図である。
【図５ｇ】ジンセノサイドＦ２処理による肝細胞、肝星細砲における脂肪合成抑制効果及びその脂肪合成抑制機序を確認して示す図である。
【図６ａ】ジンセノサイドＦ２の制御性Ｔ細胞増加の誘導による肝臓の炎症性変化抑制効果を示す図である。
【図６ｂ】ジンセノサイドＦ２の制御性Ｔ細胞増加の誘導による肝臓の炎症性変化抑制効果を示す図である。
【図６ｃ】ジンセノサイドＦ２の制御性Ｔ細胞増加の誘導による肝臓の炎症性変化抑制効果を示す図である。
【図６ｄ】ジンセノサイドＦ２の制御性Ｔ細胞増加の誘導による肝臓の炎症性変化抑制効果を示す図である。
【図６ｅ】ジンセノサイドＦ２の制御性Ｔ細胞増加の誘導による肝臓の炎症性変化抑制効果を示す図である。
【図７ａ】ジンセノサイドＦ２処理によるナイーブＴ細胞におけるＩＬ−１７を産生するＴｈ１７細胞への分化抑制効果を示す図である。
【図７ｂ】ジンセノサイドＦ２処理によるナイーブＴ細胞におけるＩＬ−１７を産生するＴｈ１７細胞への分化抑制効果を示す図である。
【図７ｃ】ジンセノサイドＦ２処理によるナイーブＴ細胞におけるＩＬ−１７を産生するＴｈ１７細胞への分化抑制効果を示す図である。
【図８ａ】ＩＬ−１０欠乏マウスにおいてジンセノサイドＦ２の肝臓保護効果が消滅することを示す図である。
【図８ｂ】ＩＬ−１０欠乏マウスにおいてジンセノサイドＦ２の肝臓保護効果が消滅することを示す図である。
【図８ｃ】ＩＬ−１０欠乏マウスにおいてジンセノサイドＦ２の肝臓保護効果が消滅することを示す図である。
【図８ｄ】ＩＬ−１０欠乏マウスにおいてジンセノサイドＦ２の肝臓保護効果が消滅することを示す図である。
【図８ｅ】ＩＬ−１０欠乏マウスにおいてジンセノサイドＦ２の肝臓保護効果が消滅することを示す図である。
【図８ｆ】ＩＬ−１０欠乏マウスにおいてジンセノサイドＦ２の肝臓保護効果が消滅することを示す図である。
【図８ｇ】ＩＬ−１０欠乏マウスにおいてジンセノサイドＦ２の肝臓保護効果が消滅することを示す図である。
【図８ｈ】ＩＬ−１０欠乏マウスにおいてジンセノサイドＦ２の肝臓保護効果が消滅することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下、本発明を下記例により詳細に説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのものにすぎず、下記例に本発明の範囲が限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
実施例１：アルコールによる肝損傷緩和及び脂肪肝形成抑制効果
８週齢の雄マウス（体重２５〜２８ｇ）に、２週間正常食餌と共に３ｇ／ｋｇのエタノールに５０ｍｇ／ｋｇのジンセノサイドＦ２（図面にはＧＦ２で表示）を溶解して毎日午後３〜４時頃に経口で投与し、２週間後に犠牲にして下記実験を行った。
【００６６】
ジンセノサイドＦ２の製造方法は次の通りである。朝鮮人参、花旗参、竹節参などを含むその他の高麗人参の葉及び根に２０倍の体積の８０％エタノールを加えて２回以上抽出し、乾燥させて粗サポニンを得る。前記粗サポニンを水に再び溶解させてＨＰ−２０樹脂に吸着させ、その後１００％水で洗浄して糖を除去し、次いで４０％エタノールで一次洗浄してプロトパナキサトリオール（protopanaxatriol）系のジンセノサイドＲｅ、Ｒｇ１を優先的に除去する。その後、８０％エタノールで洗浄するとプロトパナキサジオール（protopanaxadiol）系のジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄが溶出して出てくるので、これを乾燥させて得る。前記プロトパナキサジオールジンセノサイド混合物を基質として用いて、特許文献３に記載の方法で反応させることにより、７０％以上のジンセノサイドＦ２を得た。次いで、試料用に用いるジンセノサイドＦ２は、ＯＤＳ樹脂を用いて吸着させ、その後適正濃度のエタノールを濃度勾配により連続して流出させると９５％以上の高純度のジンセノサイドＦ２分画を得ることができ、これを乾燥させて用いた。
【００６７】
（１）血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ、総コレステロール含有量の測定
前記マウスの腹部大動脈から採血して遠心分離機にて３，３００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清のみ分離し、血清中のＡＬＴ（alanine aminotransferase）、ＡＳＴ（alanine aminotransferase）含有量を、アイデックスラボラトリーズ（IDEXX Laboratories, 米国）社のキットを用いて、製造会社が提供する実験方法に従ってベットテスト（VetTEST, IDEXX, 米国）で測定した。また、中性脂肪（triglyceride, TG）及び総コレステロール含有量は、肝組織５０ｍｇを摘出して粉砕し、その後クロロホルム−メタノール（２：１）溶液を添加して遠心分離し、肝組織中に含まれる脂質成分を抽出して作製した抽出液を、アイデックスラボラトリーズのキットを用いて、製造会社が提供する実験方法に従ってベットテストで測定した。
【００６８】
その結果、図２の（ａ）に示すように、肝損傷の指標であるＡＬＴはアルコールと担体（EtOH+Vehicle）を投与すると２倍以上増加するが、アルコールと共にジンセノサイド（EtOH+GF2）を投与した場合はＡＬＴの増加率が高くないことが確認された。また、図２の（ｂ）に示すように、ジンセノサイド投与によりＡＳＴ値も減少した。
【００６９】
また、図２の（ｃ）に示すように、脂肪肝炎の指標の１つであるＴＧも、アルコールと共にジンセノサイド（EtOH+GF2）を投与すると正常値までＴＧレベルが低くなり、ＡＬＴと同様の傾向を示す。
【００７０】
（２）肝組織の分析
肝組織の組織学的変化を観察するためのＨ＆Ｅ（Hematoxylin and eosin）染色、及びアポトーシスの確認のためのＴＵＮＥＬ（Terminal deoxyribonucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling）染色を行った。前記ＴＵＮＥＬ染色は、アポトーシス染色（TAKARA BIO INC, Shiga, Japan）を用いて、製造会社が提供する実験方法に従って行った。また、オイルレッドＯ（Oil-red O）染色により肝細胞の中性脂質を染色した。その結果を図３ａに２００倍又は４００倍の倍率で示す。
【００７１】
その結果、図３ａに示すように、エタノール投与により発症した炎症がジンセノサイドＦ２を投与すると減少し（Ｈ＆Ｅ染色）、細胞損傷もジンセノサイドＦ２により減少することが確認された（ＴＵＮＥＬ染色）。中性脂質の蓄積もジンセノサイドＦ２投与により減少することが確認された（オイルレッドＯ染色）。
【００７２】
図３ｂは図３ａでＴＵＮＥＬ陽性を示す細胞を数値化して統計分析したものであり、ジンセノサイドＦ２を投与した結果、アルコール投与によりＴＵＮＥＬ陽性を示す死滅細胞が著しく減少することが確認された。図３ｃは図３ａの中性脂質を数値化して統計分析したものであり、ジンセノサイドＦ２を投与した場合に肝組織中の中性脂肪が減少することが確認された。
【００７３】
（３）肝細胞及び肝星細胞の脂肪合成関連指標の分析
過度にアルコールを摂取すると、肝臓ではエンドカンナビノイド（endocannabinoid）の一種である２−アラキドノイルグリセロール（2-arachidonoylglycerol, 2-AG）が増加し、これは肝細胞の２−アラキドノイルグリセロールの受容体であるエンドカンナビノイド受容体（ＣＢ１Ｒ）を活性化することにより、核ホルモン受容体ＥＲＲγの発現を増加させる。また、増加したＥＲＲγはＣＹＰ２Ｅ１の転写調節部位に直接結合することによりＣＹＰ２Ｅ１の発現を増加させ、これは活性酸素の増加をもたらし、結果として肝損傷を誘発する（非特許文献６）。
【００７４】
図４ａに示すように、マウスの肝臓から分離した肝細胞に対してアルコールと担体（EtOH+Vehicle）を投与すると、肝損傷に関連する因子であるＣＹＰ２ｅ１、ＡＤＨ１、ＣＢ１Ｒ、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＦＡＳの発現が増加したが、ジンセノサイド（EtOH+GF2）を投与すると、前記因子の発現が有意に減少した。特に、肝臓に脂肪を蓄積する経路を調節する転写因子であるＳＲＥＢＰ１ｃとＦＡＳの発現がジンセノサイドＦ２を投与した場合に減少し、肝細胞における脂肪合成に重要であることが知られているＣＢ１Ｒの発現も減少することが確認された。
【００７５】
また、図４ｂに示すように、マウスの肝臓から分離した肝星細砲に対してアルコールと担体（EtOH+Vehicle）を投与すると、肝損傷に関連する因子であるＮＡＰＥ−ＰＬＤ、ＤＡＧＬ−α、β、ＭＧＬの発現が増加し、ＦＡＡＨの発現が減少したが、ジンセノサイド（EtOH+GF2）を投与すると、特に脂肪の合成を誘導するエンドカンナビノイド合成酵素であるＤＡＧＬ−α、βの発現が有意に減少し、脂肪酸加水分解（Fatty Acid Amide Hydrolase, FAAH）酵素も有意に増加した。
【００７６】
図４ｃは肝組織からタンパク質を抽出してウェスタンブロットを行った結果を示す図である。ジンセノサイドＦ２を投与すると、脂肪の酸化を誘発するｐＡＭＰＫの発現は増加し、脂肪合成に関連するＳＲＥＢＰ１ｃ、ＦＡＳの発現は減少することが観察された。
【００７７】
よって、本発明のジンセノサイドＦ２は、肝臓内の脂肪の代謝を調節することにより、脂肪肝の形成を抑制し、肝損傷を緩和する効果があることが確認された。
【００７８】
実施例２：共同培養された肝細胞及び肝星細砲における実験
（１）肝細胞、肝星細砲における脂肪合成の抑制
マウスから肝細胞と肝星細砲を分離し、その後、図５ａに示す模式図のように、下方の底に肝星細砲（ＨＳＣ）を配置し、上方に肝細胞（hepatocyte）を配置した状態で共同培養を行った。培養時に１００ｍＭのエタノールで１２時間処理し、その後３０μＭのジンセノサイドＦ２で６時間又は１２時間処理した。
【００７９】
図５ｂは共同培養した肝細胞を回収してウェスタンブロットを行った結果を示す図である。エタノールでのみ処理した肝細胞とは異なり、ジンセノサイドＦ２を共に用いて処理した場合、脂肪を減少させるｐＡＭＰＫの発現は増加し、逆に脂肪を合成するＳＲＥＢＰ１ｃ、ＦＡＳの発現は減少した。
【００８０】
図５ｃは共同培養した肝細胞のリアルタイム（real-time）ＰＣＲ結果であり、ジンセノサイドＦ２で処理すると、脂肪合成に重要な役割を果たすＣＢ１Ｒ、ＳＲＥＢＰ１ｃ及びＦＡＳの発現が減少した。共同培養した肝星細胞においては、ジンセノサイドＦ２で処理すると、脂肪合成を誘導するエンドカンナビノイド合成酵素であるＤＡＧＬ−α、βの発現が減少した（図５ｄ）。
【００８１】
（２）ＬＸＲ媒介脂肪合成及びエンドカンナビノイド産生の抑制
ジンセノサイドＦ２の脂肪合成抑制機序を確認するために、ヒト肝細胞株であるＨｅｐＧ２Ａを３０μＭのジンセノサイドＦ２で処理し、３０分後に脂肪生成を刺激するタンパク質であるＬＸＲのアゴニスト（agonist）として、脂肪の合成を誘導する物質である１０μＭのＴＯ９０１３１７でさらに処理し、その後９時間培養した。その後、肝細胞に対してリアルタイムＰＣＲを行った結果、ジンセノサイドＦ２はＴＯ９０１３１７により増加した脂肪合成遺伝子であるＳＲＥＢＰ１ｃとＦＡＳの発現を抑制することが確認された（図５ｅ）。
【００８２】
また、ＨｅｐＧ２Ａを０〜１００μＭの各濃度のジンセノサイドＦ２で処理して１２時間培養した結果、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＦＡＳの発現が減少し、特に４０μＭ以上で発現抑制効果が優れていた（図５ｆ）。
【００８３】
肝星細砲を３０μＭのジンセノサイドＦ２で処理し、３０分後に１０μＭのＴＯ９０１３１７でさらに処理し、その後１２時間培養した。図５ｆと図５ｇは培養された肝星細砲に対してリアルタイムＰＣＲを行い、ウェスタンブロットを行った結果を示す図である。その結果、脂肪の合成を誘導する物質であるＴＯ９０１３１７で処理した場合はグルタメート受容体であるｍＧｌｕＲ１又は５はほとんど発現しなかったが、ジンセノサイドＦ２で処理した場合は発現が有意に増加することが確認された。
【００８４】
よって、本発明のジンセノサイドＦ２は肝細胞、肝星細胞において脂肪合成を抑制する効果に優れ、これはジンセノサイドＦ２がアルコール媒介性エンドカンナビノイドの産生を抑制し、隣接する肝細胞内のＣＢ１Ｒシグナル伝達を低下させることにより、肝臓における脂肪形成を抑制する機序によるものであることが確認された。
【００８５】
実施例３：制御性Ｔ細胞増加による肝臓の炎症性変化の抑制
マウスに毎日正常食餌と共にエタノールを各個体に３ｇ／ｋｇずつ２週間与えた。ここで、１グループ（E+Veh）には担体を、２グループ（E+GF2）にはジンセノサイドＦ２を与えた。
【００８６】
その後、肝臓から単核球細胞を分離してマクロファージのマーカーであるＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０で染色して流細胞分析を行った結果、ジンセノサイドＦ２で処理するとマクロファージの割合が減少し（図６ａ）、好中球のマーカーであるＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１で染色して流細胞分析を行った結果、ジンセノサイドＦ２で処理すると好中球の割合が減少することが確認された（図６ｂ）。マクロファージと好中球は、炎症反応と密接な関連があることが知られている細胞であり、ジンセノサイドＦ２が肝細胞において炎症反応を緩和する可能性があることを示唆するものである。
【００８７】
また、肝臓内の炎症細胞を制御性Ｔ細胞（Treg）のマーカーであるＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３で染色した結果、ジンセノサイドＦ２で処理すると制御性Ｔ細胞が増加し、炎症を促進する細胞の１つであるＴｈ１７細胞（ＩＬ−１７及びＣＤ４陽性）はジンセノサイドＦ２により減少した。しかし、図６ｃに示すように、ＣＤ４、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞などの割合にはジンセノサイドＦ２が有意な影響を及ぼさないことが確認された。
【００８８】
また、前記分離した単核球を対象にリアルタイムＰＣＲを行った結果、アルコールにより増加した炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１７の発現をジンセノサイドＦ２が抑制し、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の発現は増加させることが確認された（図６ｄ）。これらの効果はマウスの血清に対してＥＬＩＳＡを行った結果においても同様であった（図６ｅ）。
【００８９】
よって、本発明のジンセノサイドＦ２は、アルコール媒介性肝炎においてマクロファージや好中球などの炎症細胞の活性を抑制する制御性Ｔ細胞の分布を増加させ、制御性Ｔ細胞において抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の発現を増加させることにより、肝炎症を緩和することが確認された。よって、ジンセノサイドＦ２は、肝疾患に対する予防又は治療用途に用いることができる。
【００９０】
実施例４：ナイーブＴ細胞のＩＬ−１７を産生するＴｈ１７細胞への分化の抑制
マウスからナイーブＴ細胞（naive T cell）を分離して５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６で処理し、ＣＤ３／２８抗体がコーティングされたＤＣで３．５日間培養して炎症誘発細胞であるＴｈ１７細胞（T helper 17 cell）に分化させた。ここで、様々な濃度（０〜３０μＭ）のジンセノサイドＦ２で共に処理し、Ｔｈ１７細胞のマーカーを観察した結果を図７ａ〜図７ｃに示す。ＮはＴＧＦ−β１、ＩＬ−６、ジンセノサイドＦ２のいずれでも処理していないナイーブＴ細胞を示す。
【００９１】
図７ａ及び図７ｂは分化させたナイーブＴ細胞をＦＡＣＳ分析した図であり、ジンセノサイドＦ２の濃度依存的にＩＬ−１７を発現するＴｈ１７細胞が減少するのに対して、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０はジンセノサイドＦ２の濃度依存的に増加する傾向を示す。
【００９２】
また、前記分化させた細胞に対してリアルタイムＰＣＲ分析を行った結果、図７ｃに示すように、中性脂肪は増加させずＨＤＬコレステロールのみ選択的に減少させるタンパク質であるＡｂｃａ１の発現がジンセノサイドＦ２の濃度依存的に減少し、Ｔｈ１７細胞の転写因子であるＲＯＲγｔ（ROR gamma t）、ＳＴＡＴ３もジンセノサイドＦ２処理により減少した。
【００９３】
よって、本発明のジンセノサイドＦ２は、ナイーブＴ細胞が炎症誘発細胞であるＴｈ１７細胞に分化することを抑制することにより、アルコール以外の原因による肝臓の炎症を緩和し、肝疾患治療用途に使用できることが確認された。
【００９４】
実施例５：ＩＬ−１０欠乏マウスにおけるＧＦ２の肝臓保護効果の消滅
８週齢のＩＬ−１０欠乏雄マウス（重量２５〜２８ｇ）を対象に、２週間正常食餌と共に３ｇ／ｋｇのエタノールと５０ｍｇ／ｋｇのジンセノサイドＦ２を毎日経口で投与した（E+GF2）。対照群にはジンセノサイドＦ２の代わりに同量のエタノールと担体を与えた（E+Veh）。２週間後にマウスを解剖検査して血清、肝組織、肝単核球を得た。その後、実施例１の（１）に記載の方法と同様に、血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ、コレステロールを測定し、肝組織では壊死巣（necrotic foci）を観察し、２つに分離した肝臓から壊死巣の数を計数した。肝単核球ではＦ４／８０又はＧｒ１抗原マーカーを用いてマクロファージ及び好中球の発現の程度を流細胞分析した。
【００９５】
その結果、ＩＬ−１０欠乏マウスにジンセノサイドＦ２を投与してもＡＬＴ、ＴＧ、コレステロール量などには有意な影響を与えず（図８ａ）、肝組織の壊死巣（necrotic foci）にも大きな変化はなかった（図８ｂ及び図８ｃ）。また、マクロファージと好中球の発現（図８ｄ及び図８ｅ）及び他の免疫細胞（図８ｆ）においてジンセノサイドＦ２は有意な影響を与えなかった。
【００９６】
しかし、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋を示す制御性Ｔ細胞はジンセノサイドＦ２を投与したグループで増加する様相を示し（図８ｇ）、単核球を用いてリアルタイムＰＣＲを行った結果、図８ｈに示すように、ジンセノサイドＦ２を投与したグループでＩＬ−６、ＩＬ−１７などの炎症性サイトカインの発現だけでなく、Ｆｏｘｐ３の発現も共に増加した。
【００９７】
よって、ＩＬ−１０欠乏マウスにおいてはジンセノサイドＦ２の肝臓保護効果がほとんど現れないことが確認されたので、ジンセノサイドＦ２が制御性Ｔ細胞（Treg）と抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の生産を増加させる過程で肝臓保護効果を示すことが類推される。
【００９８】
なお、上記実施例における統計は平均±ＳＥＭで表し、対応する対照群と比較した有意性を＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１で示す。
【００９９】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
0006293099.tif 000003
【図２】
0006293099.tif 000004
【図３ａ】
0006293099.tif 000005
【図３ｂ】
0006293099.tif 000006
【図３ｃ】
0006293099.tif 000007
【図４ａ】
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【図４ｂ】
0006293099.tif 000009
【図４ｃ】
0006293099.tif 000010
【図５ａ】
0006293099.tif 000011
【図５ｂ】
0006293099.tif 000012
【図５ｃ】
0006293099.tif 000013
【図５ｄ】
0006293099.tif 000014
【図５ｅ】
0006293099.tif 000015
【図５ｆ】
0006293099.tif 000016
【図５ｇ】
0006293099.tif 000017
【図６ａ】
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【図６ｂ】
0006293099.tif 000019
【図６ｃ】
0006293099.tif 000020
【図６ｄ】
0006293099.tif 000021
【図６ｅ】
0006293099.tif 000022
【図７ａ】
0006293099.tif 000023
【図７ｂ】
0006293099.tif 000024
【図７ｃ】
0006293099.tif 000025
【図８ａ】
0006293099.tif 000026
【図８ｂ】
0006293099.tif 000027
【図８ｃ】
0006293099.tif 000028
【図８ｄ】
0006293099.tif 000029
【図８ｅ】
0006293099.tif 000030
【図８ｆ】
0006293099.tif 000031
【図８ｇ】
0006293099.tif 000032
【図８ｈ】
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