(57)【要約】  本発明は、ペプチド又はポリペプチドであって、（ａ）（ｉ）グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、Ｃ末端のカルボキシレートで、（ｉｉ）グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、存在する場合、１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシレートで、（ｉｉｉ）アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、存在する場合、１つ又は複数のＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基又はＴｙｒ残基のヒドロキシル基で、（ｉｖ）アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、存在する場合、１つ又は複数のＣｙｓ残基のスルフヒドリル基で、及び／又は（ｖ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸で予めアミド化したＮ末端で、エステル化又はチオエステル化し、エステルは、当該α−ヒドロキシ酸又は当該β−ヒドロキシ酸のヒドロキシ基と、当該アルカン酸グアニジニウム又は当該グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのカルボキシル基との間で形成される、及び／又は（ｂ）１つ又は複数のジスルフィドを含有し、当該ジスルフィドは、存在する場合、Ｃｙｓ残基のスルフヒドリル基と、グアニジニウムアルカンチオールとの間、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧとの間で形成される、ペプチド又はポリペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）
（ｉ）グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、Ｃ末端のカルボキシレートでエステル化又はチオエステル化されるか、
（ｉｉ）１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基が存在する場合、グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシレートで、エステル化又はチオエステル化されるか、
（ｉｉｉ）１つ又は複数のＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基又はＴｙｒ残基が存在する場合、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基又はＴｙｒ残基のヒドロキシル基で、エステル化又はチオエステル化されるか、
（ｉｖ）１つ又は複数のＣｙｓ残基が存在する場合、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＣｙｓ残基のスルフヒドリル基で、エステル化又はチオエステル化される
及び／又は
（ｖ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸で予めアミド化したＮ末端でエステル化され、エステルはα−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸のヒドロキシ基と、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのカルボキシル基との間で形成される、
並びに／又は
（ｂ）Ｃｙｓ残基が存在する場合、Ｃｙｓ残基のスルフヒドリル基と、グアニジニウムアルカンチオールとの間、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧとの間で形成される１つ又は複数のジスルフィドを含有する、
ペプチド又はポリペプチド。
【請求項２】
前記グアニジニウムアルカノール又はグアニジニウムアルカンチオールが、以下の構造を有する、請求項１に記載のペプチド又はポリペプチド。
ＨＸ−（ＣＲ1Ｒ2）n−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式Ｉ）
式中、Ｘは、Ｏ又はＳであり、
Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ2、炭素数が１〜５のアルキル、アリール、及びヘテロアリールから選択され、
ｎは、２〜１５の整数であり、
Ｒ3は、Ｈ又は炭素数が１〜５のアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は独立して、Ｈ、炭素数が１〜５のアルキル、アリール、及びヘテロアリールから選択され、Ｒ4基又はＲ5基を受けるＮは、ヘテロアリール環の環原子であってもよく、及び／又はＲ4及びＲ5は共に、ヘテロアリール環を与えるように選択されてもよい。
【請求項３】
前記グアニジニウムアルカノール又はグアニジニウムアルカンチオールが、以下の構造を有する、請求項１又は２に記載のペプチド又はポリペプチド。
ＨＸ−（ＣＨ2）n−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2（式ＩＩ）
式中、Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、２〜１０の整数であり、
Ｒは、Ｈ又は炭素数が１〜５のアルキルである。
【請求項４】
前記アルカン酸グアニジニウムが、以下の構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
ＨＯＯＣ−（ＣＲ1Ｒ2）n−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式ＩＩＩ）
式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ2、炭素数が１〜５のアルキル、アリール、及びヘテロアリールから選択され、
ｎは、２〜１５の整数であり、
Ｒ3は、Ｈ又は炭素数が１〜５のアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は独立して、Ｈ、炭素数が１〜５のアルキル、アリール、及びヘテロアリールから選択され、Ｒ4基又はＲ5基を受けるＮは、ヘテロアリール環の環原子であってもよく、及び／又はＲ4及びＲ5は共に、ヘテロアリール環を与えるように選択されてもよい。
【請求項５】
前記アルカン酸グアニジニウムが、以下の構造を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
ＨＯＯＣ−ＣＨＲ1−（ＣＨ2）n-1−Ｎ（Ｒ2）−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2（式ＩＶ）
式中、Ｒ1は、Ｈ又はＮＨ2であり、
ｎは、２〜１０の整数であり、
Ｒ2は、Ｈ又は炭素数が１〜５のアルキルである。
【請求項６】
ｎが４〜９、好ましくは４〜６である、請求項２〜５のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項７】
前記グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又は前記グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧがそれぞれ、以下の構造を有する、請求項２〜６のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
ＨＸ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）k−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式Ｖ）
式中、ｋは、１〜１２の整数であり、Ｘ、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、請求項２で規定される通りである。
【請求項８】
前記グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧが、以下の構造を有する、請求項２〜７のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
ＨＯＯＣ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）k−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式ＶＩ）
式中、ｋは、１〜１２の整数であり、Ｘ、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、請求項４で規定される通りである。
【請求項９】
ｋが１〜３である、請求項２〜８のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１０】
−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5が、ピリミジン−２−イル、キナゾリン−２−イル、イミジダゾール−２−イル又はベンズイミダゾール−２−イルである、請求項２又は４〜９のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１１】
（ａ）前記Ｃ末端のカルボキシレートが、前記のようにエステル化又はチオエステル化しない場合、脂肪族アルコールによってエステル化し、及び／又は
（ｂ）前記Ｎ末端のアミノ基が、α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸によってアミド化されない場合、脂肪酸でアミド化する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１２】
前記脂肪族アルコール及び／又は前記脂肪酸は、炭素数が５〜１５、好ましくは炭素数が９である、請求項１１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１３】
存在する場合、任意のＡｒｇ残基を含むグアニジニウム基の数が、４〜２０、より好ましくは７〜１５、及び最も好ましくは９であり、少なくとも１つのグアニジニウム基が、請求項１〜１０のいずれか一項に規定される通りの、グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、アルカン酸グアニジニウム、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧに含まれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチド又はポリペプチドが、ペプチド−ＰＮＡキメラの一部である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項１５】
核酸であって、
（ａ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、以下の位置の１つ又は複数：
（ｉ）５’末端の５’ヒドロキシル基、
（ｉｉ）３’末端の３’ヒドロキシル基、
（ｉｉｉ）５’末端又は３’末端の２’ヒドロキシル基、及び
（ｉｖ）内部の２’ヒドロキシル基
でエステル化され、
（ｂ）グアニジニウムアルカノール、又はグアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧによって、１つ、複数又は全てのホスフェートでエステル化され、及び／又は
（ｃ）グアニジニウムアルカノール、又はグアニジニウム基で置換されたＰＥＧによって、２’ヒドロキシル基がアセタールに変換される、核酸。
【請求項１６】
グアニジニウムアルカノールによってエステル化されない場合、１つ又は複数の末端ホスフェートは、脂肪族アルコールによってエステル化される、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである、請求項１５又は１６に記載の核酸。
【請求項１８】
生理的条件下で切断可能な官能基によって、リポソーム又はミセルと連結された、１つ又は複数のグアニジニウム基を有するリポソーム又はミセル。
【請求項１９】
前記官能基がエステル基である、請求項１８に記載のリポソーム又はミセル。
【請求項２０】
（ａ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のヒドロキシル基で、及び／又は
（ｂ）グアニジニウムアルコール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、ホスフェート及びカルボキシレート等の１つ又は複数の酸性基でエステル化された、請求項１８又は１９に記載のリポソーム又はミセル。
【請求項２１】
前記リポソーム又はミセルの第１級アミノ基が、グアニジニウム基に変換された、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のリポソーム又はミセル。
【請求項２２】
前記ヒドロキシル基が、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、モノ−アシルグリセロール、及びジ−アシルグリセロールから選択される、前記リポソーム又はミセルに含まれる脂質のヒドロキシル基、又は該リポソーム又はミセルに含まれる
ＰＥＧ部分の末端ヒドロキシル基である、請求項２０又は２１に記載のリポソーム又はミセル。
【請求項２３】
前記第１級アミノ基が、ホスファチジルエタノールアミン又はＰＥＧ部分の第１級アミノ基であり、該ＰＥＧ部分の末端ヒドロキシル部分が、第１級アミノ基に置換された、請求項２１又は２２に記載のリポソーム又はミセル。
【請求項２４】
前記グアニジニウムアルカノール又はグアニジニウムアルカンチオールが、請求項２、３、６又は１０のいずれか一項に規定される通りのグアニジニウムアルカノール又はグアニジニウムアルカンチオールである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸或いは請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のリポソーム又はミセル。
【請求項２５】
前記アルカン酸グアニジニウムが、請求項４〜７のいずれか一項に規定される通りのアルカン酸グアニジニウムである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸或いは請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のリポソーム又はミセル。
【請求項２６】
前記グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又は前記グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧが、請求項７又は９に規定される通りのものである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸或いは請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のリポソーム又はミセル。
【請求項２７】
前記グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧが、請求項８又は９に規定される通りのものである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸或いは請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のリポソーム又はミセル。
【請求項２８】
請求項１〜１３又は１８のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチド、及び／又は請求項１４〜１７又は２４〜２７のいずれか一項に記載の核酸、及び／又は請求項１８〜２７のいずれか一項に記載のリポソーム又はミセルを含む薬学的組成物。
【請求項２９】
１つ又は複数のカルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及び／又はホスフェート基を有する、ポリマー、リポソーム又は、ミセルの生物学的障壁通過能を高める方法であって、これらの該基の少なくとも１つを修飾して式ＶＩＩの化合物を生成する工程を含む方法。
【化１】
2010504929.tif 000019
式ＶＩＩ
式中、それぞれの式ＶＩＩに関して独立して、
（ａ）Ｘは、−（Ｃ＝Ｏ）であり、Ｙは、Ｏ又はＳであり、
（ｂ）Ｘは、−Ｏ又は−Ｓであり、Ｙは、（Ｃ＝Ｏ）又は（ＣＨＲa）−Ｏであり、
（ｃ）Ｘ−Ｙは、−Ｓ−Ｓであり、又は
（ｄ）Ｘは、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）ＯＲPであり、Ｙは、Ｏ又はＳであり、且つ
Ｊはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ2、炭素数が１〜１５のアルキル、及び［ＣＨＲ］o−ＮＲ’−ＣＨ（ＮＨＲ’’）−ＮＨ−Ｒ’’’から選択され、
Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、Ｒa及びＲpはそれぞれ独立して、Ｈ、炭素数が１〜１５のアルキル、及び置換又は非置換のアリールから選択され、Ｒ及びＲ’、Ｒ’及びＲ’’、及び／又はＲ’’及びＲ’’’は共に、環状構造を形成するように選択されてもよく、
アルキルは置換されてもよく、
ｍは、０〜１０の整数であり、Ｊが［ＣＨＲ］o−ＮＲ’−ＣＨ（ＮＨＲ’’）−ＮＨ−Ｒ’’’の場合は、ｍは１であり、
ｏは、１〜１５の整数であり、且つ
ｐは、０又は１であり、ｐが０の場合は、Ｒ’を受けるＮの自由原子価は、Ｈで満たされる。
【請求項３０】
前記ポリマーが、ペプチド、ポリペプチド又は核酸である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）
（ｉ）グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、Ｃ末端のカルボキシレートで、エステル又はチオエステルを形成する工程
（ｉｉ）１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基が存在する場合、グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシレートで、エステル又はチオエステルを形成する工程
（ｉｉｉ）１つ又は複数のＳｅｒ残基が存在する場合、アルカン酸グアニジニウムによって、１つ又は複数のＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基又はＴｙｒ残基のヒドロキシル基で、エステル又はチオエステルを形成する工程
（ｉｖ）１つ又は複数のＣｙｓ残基が存在する場合、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＣｙｓ残基のスルフヒドリル基で、エステル又はチオエステルを形成する工程
及び／又は
（ｖ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸で予めアミド化したＮ末端で、該α−ヒドロキシ酸又は該β−ヒドロキシ酸のヒドロキシ基と、該アルカン酸グアニジニウム又は該グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのカルボキシル基との間でエステル又はチオエステルを形成する工程、並びに／又は
（ｂ）１つ又は複数のジスルフィドを形成する工程であって、該ジスルフィドが、存在する場合、Ｃｙｓ残基のスルフヒドリル基と、グアニジニウムアルカンチオールとの間、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧとの間で形成される
工程を含む、ペプチド又はポリペプチドの生物学的障壁通過能を高める方法。
【請求項３２】
前記生物学的障壁が、細胞膜、粘膜及び血液脳関門から選択される、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）前記Ｃ末端が、請求項３１に規定される通りにエステル化しない場合、脂肪族アルコールによって、該Ｃ末端のカルボキシレートでエステル又はチオエステルを形成する工程、及び／又は
（ｂ）脂肪酸によって、前記Ｎ末端のアミノ基をアミド化する工程をさらに含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記脂肪族アルコール及び／又は前記脂肪酸は、炭素数が５〜１５、好ましくは炭素数が９である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
存在する場合、任意のＡｒｇ残基の数を含む、エステル、チオエステル、アセテート、ジスルフィド及び／又はホスフェートエステルの形成時のグアニジニウム基の数が、５〜２０、より好ましくは７〜１５、及び最も好ましくは９である、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
核酸の生物学的障壁通過能を高める方法であって、
（ａ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、以下の位置の１つ又は複数：
（ｉ）５’末端の５’ヒドロキシル基、
（ｉｉ）３’末端の３’ヒドロキシル基、
（ｉｉｉ）５’末端又は３’末端の２’ヒドロキシル基、及び
（ｉｖ）内部の２’ヒドロキシル基
でエステルを形成する工程、
（ｂ）グアニジニウムアルカノール、又はグアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧによって、１つ又は複数のホスフェートでエステルを形成する工程、及び／又は
（ｃ）２’ヒドロキシル基と、グアニジニウムアルカノールとの間、又はグアニジニウム基で置換されたＰＥＧとの間でアセタールを形成する工程を含む、核酸の生物学的障壁通過能を高める方法。
【請求項３７】
脂肪族アルコールによって、１つ又は複数の末端ホスフェートをエステル化することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
リポソーム又はミセルの生物学的障壁通過能を高める方法であって、
（ａ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、該リポソーム又はミセルの１つ又は複数のヒドロキシル基でエステルを形成する工程、及び／又は
（ｂ）グアニジニウムアルコール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、ホスフェート又はカルボキシレート等の１つ又は複数の酸性基でエステルを形成する工程、及び／又は
（ｃ）前記リポソーム又はミセルの第１級アミノ基をグアニジニウム基に変換する工程を含む、リポソーム又はミセルの生物学的障壁通過能を高める方法。
【請求項３９】
前記グアニジニウムアルカノール又はグアニジニウムアルカンチオールが、請求項２、３、６又は７のいずれか一項に規定される通りのグアニジニウムアルカノール又はグアニジニウムアルカンチオールである、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記アルカン酸グアニジニウムが、請求項４〜７のいずれか一項に規定される通りのアルカン酸グアニジニウムである、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又は前記グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧが、請求項７又は９に規定される通りのものである、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧが、請求項８又は９に規定される通りのものである、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド又はポリペプチドであって、
（ａ）（ｉ）グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、Ｃ末端のカルボキシレートで、エステル化又はチオエステル化されるか、（ｉｉ）１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基が存在する場合、グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシレートがエステル化又はチオエステル化されるか、（ｉｉｉ）１つ又は複数のＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基又はＴｙｒ残基が存在する場合、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基又はＴｙｒ残基のヒドロキシル基がエステル化又はチオエステル化されるか、（ｉｖ）１つ又は複数のＣｙｓ残基が存在する場合、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＣｙｓ残基のスルフヒドリル基がエステル化又はチオエステル化されるか、及び／又は（ｖ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸で予めアミド化したＮ末端でエステル化され、該エステルは、α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸のヒドロキシ基と、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのカルボキシル基との間で形成される、並びに／又は（ｂ）Ｃｙｓ残基が存在する場合、１つ又は複数のジスルフィドを含有し、当該ジスルフィドが該Ｃｙｓ残基のスルフヒドリル基と、グアニジニウムアルカンチオールの間、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧとの間で形成される、ペプチド又はポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において、特許出願及び製造業者のマニュアルを含む多くの文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性には関係がないと考えられ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
ペプチド若しくはタンパク質の性質を有するか、又は核酸を含む薬学的活性物質の数が増えている。多くの場合、このような薬剤の投与は侵襲的な方法でしか達成することができない。侵襲的な投与は、医療スタッフしか行うことができないことが多く、また、少なくとも患者にとっては負担になることが多い。さらに、静脈投与は、肝臓における薬剤の著しい分解を伴うことが多い。しかし、残念ながら、上述の薬剤は帯電しているので、その大部分は、非侵襲的な投与に利用することができない。一般的に、特に負の電荷に帯電しているため、このような薬学的活性物質にとって細胞膜は通過することができない障壁となる。
【０００４】
アンテナペディアペプチドを含む、膜貫通ペプチドとも呼ばれるペプチド群が存在する（例えば、非特許文献１を参照されたい）。これらの膜貫通ペプチドは、単独で、又はタンパク質「カーゴ（cargo）」と連結して、効率的に細胞の原形質膜を横断することができる。膜貫通ペプチドは一般的に両親媒性であり、生理的ｐＨで多くの正の電荷を保有する。実際、最も効率的な細胞貫通ペプチドの１つは、単純なポリ−アルギニンである。これまでのところ、Ｄ−ペプチドとＬ−ペプチドとの間に違いは報告されていないので、細胞移入機構は、荷電状態の結果であると考えられる。
【０００５】
非特許文献２は、血管脳関門透過性が高い磁気共鳴造影剤の設計及び化学合成を説明している。この造影剤は、誘導体化アミロイド−βペプチドである。誘導体化は、アスパラギル／グルタミル−４−アミノブタン残基によるＡｓｐ残基及びＧｌｕ残基の置換を含む。言い換えれば、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩のカルボキシレートは、１，４−ジアミノ−ブタンとアミド結合を形成する。これらの修飾によって、誘導体化ペプチドが血管脳関門を通過することが可能になると考えられる。
【０００６】
非特許文献３は、ミセル及びリポソームの構成物質としてグアニジニウム−コレステロール陽イオン性脂質を記載しており、ここでは、トランスフェクトされるポリヌクレオチドがミセル又はリポソームの内腔に存在する。グアニジニウム基は、一対の水素結合を確立することができるポリヌクレオチドのホスフェート残基との相互作用に特に十分適していると考えられることが報告されている。結果として、ＤＮＡ／脂質の集合体の自然形成が容易又は可能になる。
【０００７】
非特許文献４は、脂溶性ジヒドロピリジンのイオン性で脂質不溶性のピリジニウム塩への酸化還元変換に基づく化学送達系を記載している。血液及び脳の酸化還元電位がそれぞれ、酸化が脳では起こるが、血液では起こらないようなものであるので、酸化型は中枢神経系で捕捉されることになる。結果として、血管脳関門を通って、このような化学送達系と操作可能に連結する薬剤の効果的な移動が見られる。
【０００８】
しかし従来技術は、ヒト又は動物の体内におけるタンパク質、核酸、リポソーム又はミセルの膜状障壁通過能を高める単純で可逆的且つ非免疫原性の手段を提供することはできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Zorco and Langel, Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 529-545 （2005）
【非特許文献２】Poduslo et al. （Biochemistry 43, 6064-6075 （2004））
【非特許文献３】Vigneron et al. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9682-9686 （1996））
【非特許文献４】Prokai et al. （Med. Res. Rev. 20, 367-416 （2000））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ゆえにこれらの制限を考慮すると、本発明の根底にある技術的課題は、薬学的活性物質の薬理学的特性を変える、改良又は代替の手段及び方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって本発明は、ペプチド又はポリペプチドに関するものであって、（ａ）（ｉ）グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、或いはグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、Ｃ末端のカルボキシレートでエステル化又はチオエステル化されるか、（ｉｉ）１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシレートが存在する場合、グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシレートでエステル化又はチオエステル化されるか（ｉｉｉ）１つ又は複数のＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基又はＴｙｒ残基のヒドロキシル基が存
在する場合、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基又はＴｙｒ残基のヒドロキシル基でエステル化又はチオエステル化されるか、（ｉｖ）１つ又は複数のＣｙｓ残基のスルフヒドリル基が存在する場合、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のＣｙｓ残基のスルフヒドリル基でエステル化又はチオエステル化しされるか、及び／又は（ｖ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのＮ末端でエステル化又はチオエステル化したペプチド又はポリペプチドであって、前記Ｎ末端はα−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸で予めアミド化され、前記エステルは、α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸のヒドロキシ基と、アルカン酸グアニジニウム又は該グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのカルボキシル基との間で形成される、並びに／又は（ｂ）Ｃｙｓ残基が存在する場合、１つ又は複数のジスルフィドを含有するペプチド又はポリペプチドであって、該ジスルフィドは、Ｃｙｓ残基のスルフヒドリル基と、グアニジニウムアルカンチオールとの間、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧとの間で形成されるペプチド又はポリペプチドに関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】天然Ａｒｇ残基（右側）に対して、本発明に従って修飾した例示的なＧｌｕ残基（左側、中央）を示す図である。示されるように、Ｇｌｕ残基はペプチド含有物中に包含され、主鎖の窒素及びカルボニル炭素における自由原子価が側にある。
【図２】Ａｓｐ残基又はＧｌｕ残基と同様に、天然Ｌｙｓ残基及び天然Ａｒｇ残基、を含むペプチド（左側）の概略図である。本発明に従ってＡｓｐ残基及びＧｌｕ残基は修飾される（右側）。
【図３】ペプチド主鎖及び側鎖の修飾を示す例示的な概略図である。
【図４】アルギニン−エステル修飾ペプチドが、ＳＣＦ−レポータ構築物の小胞体への送出（export）を遮断することを示すグラフ図である。Ｙ軸：レポータ構築物のゴルジ染色（青色）を示す細胞の％：２時間の前処理及び１時間のＥＲへのゴルジ輸送。Ａｒｇ正常ペプチドは、非処理細胞のＥＲへのゴルジ輸送に相当する。
【図５】アルギニン−エステルペプチドの送達及び細胞表面へのＳＣＦ輸送の阻害（１６時間）を示す図である。左側：ペプチドなし、正常なＳＣＦ膜染色。右側：アルギニン−エステルペプチド（１００μＭ）、細胞内ＳＣＦ染色への移行。
【図６】本発明の核酸の例を示す図である。示した核酸は、遊離５’ヒドロキシル基及び遊離３’ヒドロキシル基でホスホ−ジエステル結合を形成することによって、核酸部分がより長くなり得る。
【図７】最初のジスルフィド還元、その後の分子内切断によるｉｎ  ｖｉｖｏホスフェートエステル切断機構を示す図である。
【図８】実施例１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図９】実施例１のペプチドの質量スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、最大３０個のアミノ酸から成るアミノ酸の縮合ポリマーを表す。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、３０個を超えるアミノ酸の縮合ポリマーを表す。用語「ポリペプチド」はタンパク質を含むことが理解される。好ましいポリペプチドはタンパク質である。さらに、用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」の両方は、タンパク質断片及び合成分子を含む。また、その大きさに応じて、抗体、並びにその断片及び誘導体は、この用語のいずれかに含まれる。好ましくは、本発明のペプチド又はポリペプチドは、対応する天然ペプチド若しくはポリペプチド、又は（ａ）に従ってエステル化及び／又はチオエステル化するか、及び／又は（ｂ）に従って１つ又は複数のジスルフィドを含有するという点でしかその薬理学的特性が改良されていないペプチド若しくはポリペプチドとは異なる。
【００１４】
用語「エステル化（された）」及び「チオエステル化（された）」は、１つ又は複数のエステル官能基−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−又はチオエステル官能基−Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−の存在を表し、エステル又はチオエステルの酸構成部分、アルコール構成部分又はチオール構成部分は、エステル化又はチオエステル化前の形態のペプチド又はポリペプチドによって与えられる。同じことが、ジスルフィドの硫黄原子の１つが上記ペプチド又はポリペプチドのＣｙｓ残基のスルフヒドリル基によって与えられるという点で（ｂ）のジスルフィドに適用される。言い換えれば、用語「エステル化された」、「チオエステル化された」及び「ジスルフィド形成された」は、その構成部分に関する本発明のペプチド又はポリペプチド、即ち（ａ）に従ってエステル化又はチオエステル化されず、且つ（ｂ）に従って１つ又は複数のジスルフィドを含有していないペプチド又はポリペプチドの構造的特徴を与え、好ましくは一方に天然ペプチド又はポリペプチド、及びもう一方に上記グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール又はアルカン酸グアニジニウムを与える。
【００１５】
本発明のペプチド及びポリペプチドは、構成部分に関して規定され、即ち一方でその薬理学的特性が改良されたペプチド又はポリペプチド、もう一方で本明細書に規定のグアニジニウム基含有化合物（グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、アルカン酸グアニジニウム等）が自然に存在するペプチド又はポリペプチドである。これらの構成部分は、エステル結合、チオエステル結合及び／又はジスルフィド結合によって、本発明のペプチド及びポリペプチドにおいて互いに共有結合する。例示的なペプチド／ポリペプチドは、本明細書に包含される実施例及び図面に示す。
【００１６】
本発明のグアニジニウムアルカノールは、グアニジニウム基−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2及びヒドロキシル基を保有するアルカンである。好ましい一実施の形態では、さらなる官能基は存在しない。ω−グアニジニウムアルカン−１−オールも好ましい。同じことが、本発明のグアニジニウムアルカンチオール及びアルカン酸グアニジニウムに準用される。したがって、アルカン酸グアニジニウムは、カルボキシル基及びグアニジニウム基を保有するアルカンである。ω−グアニジニウムアルカン−１−オイック酸が好ましい。
【００１７】
上記のように、ＰＥＧ鎖−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）k−は、１つ又は複数の上記グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール及び／又はアルカン酸グアニジニウムの存在下で上記のアルカンの代わりをすることができ、これによって上記グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、上記グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧ、上記グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧが生じる。アルカン部分をＰＥＧで置き換えることは、本発明のペプチド又はポリペプチドによる治療の副作用を低減する手段である。
【００１８】
実施の形態（ｖ）は、オプション（ｉ）〜オプション（ｉｖ）がいずれも利用することができないか、又はこれらのオプションを既に使い果たしている場合、グアニジニウム基又はさらなるグアニジニウム基を導入する経路を開放する。好ましいα−ヒドロキシ酸は、グリコール酸（２−ヒドロキシエタン酸）及び乳酸（２−ヒドロキシプロパン酸）である。好ましいβ−ヒドロキシ酸は、３−ヒドロキシプロパン酸である。
【００１９】
例示的な実施形態は、図１及び図２に示す。
【００２０】
ペプチド又はポリペプチドにおける１つ又は複数のグアニジニウム基の導入によって、当該ペプチド又はポリペプチドの生体膜通過能が有意に高まる（本明細書に添付の実施例を参照されたい）。グアニジニウム基の導入と同時に、このような膜通過の重大な障害としてカルボキシレートの負電荷が消失するので、実施の形態（ｉ）及び実施の形態（ｉｉ）は特に都合が良い。言い換えれば、単一の評価基準によって、２つの異なる機構によっ
て、ペプチド又はポリペプチドの例えば細胞膜のような生物学的障壁の通過能が高まる。
【００２１】
本発明のペプチド又はポリペプチドに存在するエステル、チオエステル及びジスルフィドの共通の特徴は、生理的条件下でのその可逆性である。膜等の生物学的障壁を通過する際、当該ジスルフィドは、その還元型と平衡状態であり、当該エステル又はチオエステルは容易に加水分解又は切断する。正味の効果は、一時的にしかエステル化又はチオエステル化しない、及び／又は一時的にしか１つ又は複数のジスルフィドを含有しないペプチド又はポリペプチドである。エステル化／チオエステル化／ジスルフィド形態では、ペプチド又はポリペプチドが生物学的障壁を通過する送達の増大を示す一方で、当該障壁を通過する際、本発明のエステル、チオエステル又はジスルフィドがないか、又は実質的にない形態のペプチド又はポリペプチドが回収され、それ自体が活性物質送達を目的としたペプチド又はポリペプチドを構成する。用語「送達」は、作用物質の生物、組織又は細胞内の部位への輸送を表す。結果として、誘導体形態のペプチド又はポリペプチド、即ち本発明のペプチド又はポリペプチドは、免疫系の有害反応を防ぐのに十分短い半減期を有する。
【００２２】
生物学的障壁を通過した後のエステル基又はチオエステル基の切断、及びジスルフィドの還元のさらなる結果として、平衡が移動形態へと移る。結果として、エステル若しくはチオエステルの切断、又はジスルフィドの還元の際、ペプチド又はポリペプチドが生物学的障壁内に効果的に捕捉される。
【００２３】
これと一致して、移動ペプチドは、本明細書に添付の実施例に記載されるように、完全な生体活性を示す。この原理の説明に関しては、図３を参照されたい。
【００２４】
エステラーゼは、腫瘍、脳及び細胞内部で特に活性があることが知られているので、エステル化及びチオエステル化が特に都合がいい。したがって、本発明のペプチド又はポリペプチドによる腫瘍及び癌の治療は、血液脳関門を通るペプチド又はポリペプチド活性物質の送達の場合を特に想定している。
【００２５】
全てのオプション（ａ）の（ｉ）〜（ｖ）及び（ｂ）が利用可能である場合、所望のグアニジニウム基が導入されるだけでなく、生物学的障壁の通過を妨げるカルボキシレートの負荷電が取り除かれるので、オプション（ｉ）及びオプション（ｉｉ）を利用することが好ましい。
【００２６】
本発明のグアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルケンチオール、又はアルカン酸グアニジニウムにおけるアルキル鎖の長さに関しては、炭素数が４個のアルキル鎖等のより長いアルキル鎖が優先される。
【００２７】
本発明のペプチド又はポリペプチドにおけるグアニジニウム基の空間分布に関して（ここで、用語「グアニジニウム基」はアルギニン残基に含まれるグアニジニウム基を含む）、当該グアニジニウム基が、当該ペプチド又はポリペプチドの配列にわたって可能な限り均一に分布することが好ましい。言い換えれば、可能であれば、ペプチド又はポリペプチドの１つの領域にグアニジニウム基が凝集するのは避けるが、残りの当該本発明のペプチド又はポリペプチドが、グアニジニウム残基を含まないか又は本質的に含まないのが好ましい。凝集しつつも、生物学的障壁を通る本発明のペプチド又はポリペプチドの取り込みをなくすことによって、より均一な分布と比べて、或る程度取り込みを低減することができる（Rothbard et al., J. Med. Chem. 45, 3612-3618 （2002）を参照されたい）。均一な分布、即ち凝集の回避は、以下の手段のいずれか１つによって達成することができる。ペプチドの場合、特に２０個以下の残基を有するペプチドの場合、本発明のペプチドは、アミノ酸構成要素から合成によって得ることができ、エステル化アミノ酸が所望の位置で使用されている。即ち、例えばＡｓｐ又はＧｌｕの代わりに、上記で規定のように側鎖
カルボキシレートでエステル化したＡｓｐ又はＧｌｕを使用する。より長いペプチド及びポリペプチドの場合、この合成アプローチはあまり好ましくない。したがって、一方で天然のペプチド又はポリペプチド、又は薬理学的特性が改善されるペプチド又はポリペプチドと、もう一方で上記で規定のグアニジニウム基含有化合物（グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、アルカン酸グアニジニウム、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧ、並びにグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧ）とのモル比を制御することによって、均一な分布を得ることができる。必要であれば、変性条件を使用して、確実にエステル化される全ての官能基を等しく接近可能にすることができる。
【００２８】
ペプチド又はポリペプチド活性物質の送達等の薬理学的特性を高める手段として従来技術の細胞貫通ペプチドを使用するのを避けることによって、このようなペプチド又はポリペプチド活性物質の作製が顕著により経済的になる。さらに、当該細胞貫通ペプチドの起こり得る長期的なアレルギー作用又は免疫原性作用が避けられる。
【００２９】
（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つに従ってエステル化又はチオエステル化せず、且つ（ｖ）に従ってアミド化及びエステル化又はチオエステル化せず、且つ（ｂ）に従ってジスルフィドを含有しないペプチド又はポリペプチドに対して、本発明のポリペプチド又はペプチドが薬学的活性がないか、又はより低い程度しか薬学的活性がない場合では、本発明のペプチド又はポリペプチドはプロドラッグ形態である。その後、送達の際のエステル及び／又はチオエステルの切断、及び／又はジスルフィドの還元によって、遅延及び／又は送達依存的に薬学的に活性のあるペプチド又はポリペプチドが生じる。送達には、生物学的障壁の通過が含まれる。
【００３０】
本発明のペプチド又はポリペプチドの好ましい実施の形態において、グアニジニウムアルカノール又はグアニジニウムアルカンチオールが、以下の構造：
ＨＸ−（ＣＲ1Ｒ2）n−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式Ｉ）
（式中、Ｘは、Ｏ又はＳであり、
Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ2、炭素数が１〜５のアルキル、アリール、及びヘテロアリールから選択され、
ｎは、２〜１５の整数であり、
Ｒ3は、Ｈ又は炭素数が１〜５のアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は独立して、Ｈ、炭素数が１〜５のアルキル、アリール、及びヘテロアリールから選択され、Ｒ4基又はＲ5基を受けるＮは、ヘテロアリール環の環原子であり、及び／又はＲ4及びＲ5は共に、ヘテロアリール環を与えるように選択され得る）を有する。
【００３１】
代替的な実施の形態において、上記で規定のものよりも大きいｎの値が意図的に想定されている。このようなより大きい値には、ｎ＝２０、２５又は３０が含まれる。
【００３２】
より好ましい実施の形態において、グアニジニウムアルカノール又はグアニジニウムアルカンチオールが、以下の構造：
ＨＸ−（ＣＨ2）n−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2（式ＩＩ）
（式中、Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、２〜１０の整数であり、
Ｒは、Ｈ又は炭素数が１〜５のアルキルである）を有する。
【００３３】
さらに好ましい実施の形態において、アルカン酸グアニジニウムが、以下の構造：
ＨＯＯＣ−（ＣＲ1Ｒ2）n−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式ＩＩＩ）
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ2、炭素数が１〜５のアル
キル、アリール、及びヘテロアリールから選択され、
ｎは、２〜１５の整数であり、
Ｒ3は、Ｈ又は炭素数が１〜５のアルキルであり、
Ｒ4及びＲ5は独立して、Ｈ、炭素数が１〜５のアルキル、アリール、及びヘテロアリールから選択され、Ｒ4基又はＲ5基を受けるＮは、ヘテロアリール環の環原子である可能性があり、及び／又はＲ4及びＲ5は共に、ヘテロアリール環を与えるように選択され得る）を有する。
【００３４】
代替的な実施の形態において、上記で規定のものよりも大きいｎの値が意図的に想定されている。このようなより大きい値には、ｎ＝２０、２５又は３０が含まれる。
【００３５】
好ましくは、上記アルカン酸グアニジニウムはクレアチン又はグアニジニノ（guandinino）酢酸であり、その式を以下に示す：
ＨＯＯＣ−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2（クレアチン）
ＨＯＯＣ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2（グアニジニノ酢酸）
【００３６】
より好ましい実施の形態において、アルカン酸グアニジニウムが、以下の構造：
ＨＯＯＣ−ＣＨＲ1−（ＣＨ2）n-1−Ｎ（Ｒ2）−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ2（式ＩＶ）
（式中、Ｒ1は、Ｈ又はＮＨ2であり、
ｎは、２〜１０の整数であり、
Ｒ2は、Ｈ又は炭素数が１〜５のアルキルである）を有する。
【００３７】
好ましい一実施の形態において、上記アルカン酸グアニジニウムはアルギニン、即ちＲ1がＮＨ2であり、Ｒ2がＨであり、ｎが４である。
【００３８】
概して、好ましいｎの値は、４〜９、より好ましくは４〜６である。
【００３９】
好ましい実施の形態において、上記炭素数が１〜５のアルキルはメチルである。
【００４０】
本発明のペプチド又はポリペプチドのさらに好ましい実施の形態において、上記グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又は上記グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧがそれぞれ、以下の構造：
ＨＸ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）k−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式Ｖ）
（式中、ｋは、１〜１２の整数であり、Ｘ、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、上記で規定されるようなものである）を有する。
【００４１】
本発明のペプチド又はポリペプチドのさらに好ましい実施の形態において、上記グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧは、以下の構造：
ＨＯＯＣ−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）k−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式ＶＩ）
（式中、ｋは、１〜１２の整数であり、Ｘ、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、上記で規定されるようなものである）を有する。代替的に、当該グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧは、以下の式：
ＨＯＯＣ−ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）k−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5
を有する。
【００４２】
このような化合物は、例えば他端でα−ハロ（α−ブロモ又はα−ヨード）酢酸ｔ−ブチルエステルを、保護グアニジニウム基（例えばＮ，Ｎ’ビス−Ｚ、又はＮ−トシル保護基）を保有するＰＥＧ分子の遊離末端ヒドロキシ基と反応させることによって利用可能である。酸性条件下でのｔ−ブチルエステル保護基の最終的な除去によって、上記で規定の
ようにヒドロキシル基によってエステル化できる状態にある所望の（例えばペプチド又はポリペプチドの）化合物が生成される。
【００４３】
好ましくは、ｋは１〜３である。
【００４４】
本発明のペプチド又はポリペプチドの好ましい実施の形態において、−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5は、ピリミジン−２−イル、キナゾリン−２−イル、イミダゾール−２−イル又はベンズイミダゾール−２−イルである。言い換えれば、また上記の好ましい実施の形態で述べられるように、本発明のグアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、アルカン酸グアニジニウム、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのグアニジニウム基は、上述のヘテロアリール環等の環に含まれ得る。
【００４５】
さらに好ましい実施の形態において、上記アルカン酸グアニジニウム又は上記グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧは、それぞれＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基、Ｔｙｒ残基又はＣｙｓ残基のヒドロキシル基又はスルフヒドリル基によって、直接エステル化又はチオエステル化しないが、ポリマーリンカー又はオリゴマーリンカーの代わりに、同様にペプチド又はポリペプチドによるエステル化に利用可能な官能基を含む。好ましくは、またさらなる説明のために、当該ポリマーリンカー又はオリゴマーリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はアルキルジオール、好ましくはアルキル−１，ω−ジオール、又はグリセロール等のポリオールである。したがって、好ましいリンカーは、一般式ＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）iＨ又はＨＯ（ＣＨ2）jＯＨ又はＨＯ−ＣＨ2−［（ＣＨ（ＯＨ）］(j-2)−ＣＨ2−ＯＨを有する。好ましいｉの値は、１〜１０、より好ましくは２、３、４又は５の整数である。好ましいｊの値は、１〜２０の整数、好ましくは２〜１０の値である。本発明のアルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧがこのようなリンカーと連結する場合、一方でアルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのカルボキシル基と、もう一方でリンカーの末端ヒドロキシル基との間でエステル結合を形成する。結果として、エステル化に利用可能な末端ヒドロキシル基を有するグアニジニウム基含有部分が得られ、この末端ヒドロキシル基は、リンカーと、本発明のアルカン酸グアニジニウムとの間又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧとの間のエステル結合に関与しないリンカーの末端ヒドロキシル基である。得られた分子は、ペプチド又はポリペプチドのカルボキシレートによってエステル化することができる遊離ヒドロキシル基を有する。したがって得られた分子は、ペプチド又はポリペプチドのＣ末端のカルボキシレート、或いは存在する場合、１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシレートによってエステル化することができる。言い換えれば、当該分子は、主要な実施の形態で言及されるように、グアニジニウムアルカノールの代わりになり得る。リンカーによってエステル化する、好ましいアルカン酸グアニジニウムは、以下の式ＶＩ及び式ＶＩＩ（式中、好ましいｉ及びｊの値は上記で規定されるようなものであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、式ＩＩＩ及び式ＩＶと共に記載されるように規定される）で示す。
ＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）iＣ（＝Ｏ）−（ＣＲ1Ｒ2）n−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式ＶＩＩＩ）
ＨＯ（ＣＨ2）jＯＣ（＝Ｏ）−（ＣＲ1Ｒ2）n−Ｎ（Ｒ3）−Ｃ（＝ＮＲ4）−ＮＨＲ5（式ＩＸ）
【００４６】
同じことが、グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧに準用される。
【００４７】
本発明のペプチド又はポリペプチドのさらに好ましい実施の形態において、（ａ）上記で規定されるようにエステル化又はチオエステル化しない場合、Ｃ末端のカルボキシレー
トは、脂肪族アルコールによってエステル化し、及び／又は（ｂ）α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸によってアミド化しない場合、Ｎ末端のアミノ基は、脂肪酸によってアミド化する。用語「アミド化された」又は「アミド化」は、カルボキシレートとアミノ基との間のアミド結合−ＣＯ−ＮＨ−の形成を表す。
【００４８】
本発明のペプチド又はポリペプチドにおける脂肪族アルコール及び／又は脂肪酸の存在によって、当該ペプチド又はポリペプチドの疎水性が高まり、それによって送達中に通過する膜の脂質二重層の脂溶性環境に対する親和性が増大する。このように、この好ましい実施の形態のペプチド又はポリペプチドは、膜付着及び膜内在化を容易にする２つの異なる種類の部分、即ち上記脂肪族アルコール及び／又は上記脂肪酸によって与えられる疎水基、及び１つ又は複数のグアニジニウム基を含む。
【００４９】
本発明の脂肪酸は、長い脂肪族末端を有するカルボン酸である。この末端は、飽和又は不飽和であり、非分岐であるのが好ましい。本発明の脂肪酸は、炭素数が少なくとも４である。好ましくは、当該脂肪酸の炭素数は３０以下である。
【００５０】
本発明の脂肪族アルコールは、炭素数が少なくとも４の第１級又は第２級アルコールである。本発明の脂肪族アルコールは、飽和であっても、又は不飽和であってもよい。好ましくは、当該脂肪族アルコールの炭素数は３０以下である。
【００５１】
好ましい実施の形態において、上記脂肪族アルコール及び／又は上記脂肪酸は、炭素数が５〜１５、好ましくは炭素数が９である。
【００５２】
したがって、好ましい脂肪族アルコールとしては、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、１−ヘプタノール、１−オクタノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、１−トリデカノール、１−テトラデカノール及び１−ペンタデカノールが挙げられる。同様に、好ましい本発明の脂肪酸としては、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸及びペンタデカン酸が挙げられる。それぞれより好ましくは、１−ノナノール及びノナン酸である。
【００５３】
本発明のペプチド又はポリペプチドのさらに好ましい実施の形態において、存在する場合、任意のＡｒｇ残基（複数可）を含むグアニジニウム基の数が、４〜２０、より好ましくは７〜１５、及び最も好ましくは９であり、少なくとも１つのグアニジニウム基が、上記に規定されるように、グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、アルカン酸グアニジニウム、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧに含まれる。本発明のペプチド又はポリペプチドは、正味の負電荷がないことも好ましい。したがって、Ｃ末端カルボキシレートを含む、全てのＡｓｐ残基及びＧｌｕ残基のカルボキシレートの総数が２０個未満である場合、本発明のペプチド又はポリペプチドは、全ての当該カルボキシレートでエステル化することが好ましい。
【００５４】
本発明のペプチド又はポリペプチドの好ましい実施の形態において、当該ペプチド又はポリペプチドは、ペプチド−ＰＮＡキメラの一部である。用語「ＰＮＡ」は、「ペプチド核酸」を表し、以下でさらに考察される。
【００５５】
本発明は、核酸であって、（ａ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、以下の位置の１つ又は複数：（ｉ）５’末端の５’ヒドロキシル基、（ｉｉ）３’末端の３’ヒドロキシル基、（ｉｉｉ）５’末
端又は３’末端の２’ヒドロキシル基、及び（ｉｖ）内部の２’ヒドロキシル基でエステル化する、（ｂ）グアニジニウムアルカノール、又はグアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧによって、１つ、複数又は全てのホスフェートでエステル化する、及び／又は（ｃ）グアニジニウムアルカノール、又はグアニジニウム基で置換されたＰＥＧによって、２’ヒドロキシル基をアセタールに変換する、核酸にも関する。
【００５６】
好ましい実施の形態において、オプション（ｂ）のみを使用する。
【００５７】
好ましくは、上記アセタールはホルムアルデヒドアセタールである。代替的に、当該アセタールのアルデヒド成分は、ホルムアルデヒド以外のアルデヒドである可能性があり、一般式Ｒa−ＣＨＯ（Ｒaは本明細書で以下に規定される）を有する。上記２’ヒドロキシル基をアセタールに変換する手段及び方法は、当該技術分野で記載され、さらに以下に表す。
【００５８】
２’ヒドロキシル基に言及する限りにおいて、本発明の核酸はＲＮＡであるか、又はこれを含むことが理解される。オリゴリボヌクレオチドの２’ヒドロキシル位置を誘導体化する方法は、当該技術分野で既知であり、例えばRastogi and Usher（Nucleic Acids Research 23, 4872-4877（1995））に記載される。はっきりと想定されるさらなる種類の核酸（即ちＲＮＡの他に）は以下でさらに考察される。
【００５９】
核酸の例を図６に示す。図６に示すホスフェートは、３つのエステル結合に関与し、その内の２つは、リボースの第２級ヒドロキシル基を有し、３番目のエステル結合は上記で規定のグアニジニウムアルカノールを有する。（ｉ）グアニジニウムアルカノールのヒドロキシル基が第１級ヒドロキシ基であり、（ｉｉ）対応するホスフェートエステルが、本発明の核酸の外部の接近可能な表面に位置するので、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、グアニジニウムアルカノールを有するエステルは、エステラーゼによって加水分解又は切断する。このことは、糖−ホスフェート骨格の一部である、したがってより安定性があるエステル結合には適用されない。
【００６０】
さらに好ましい実施の形態において、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、グアニジニウムアルカノールを有するエステル、又は脂肪族アルコールを有するエステルは、２段階機構によって本発明の核酸の１つ、複数又は全てのホスフェートで切断することができる。例えば、Parang et al.（Current Medicinal Chemistry, 2000, 7, 995-1039）によって記載されるように、分子内転位しやすい官能基を遊離させる第１の切断で誘発される分子内脱離によって、ホスフェートを切断することができる。例を図７に挙げる。図７では、スルフィドの切断によって、２−メルカプトエステルを形成し、この２−メルカプトエステルは次にチイランの形成によって、分子内切断を受ける。同様に、「セーフティキャッチ」ストラテジーも想定され、アルコールに対してβ位にケトン等の電子求引基を有する構築物を、（電子求引性ではない）アセタールとして一時的に保護することができる。アセタールの合成後の除去又はｉｎ  ｖｉｖｏ切断によって、電子求引性のケトン基が放出され、これによりβ−脱離によるホスフェート切断が促進される。
【００６１】
さらに好ましい実施の形態において、グアニジニウムアルカノールによってエステル化しない場合、１つ又は複数の末端ホスフェートは、脂肪族アルコールによってエステル化する。
【００６２】
リン酸が三塩基酸であるので、末端ホスフェートは、１当量又は２当量のアルコールによってエステル化することができる。したがって、末端ホスフェートは、１当量のグアニジニウムアルカノールと、１当量の脂肪族アルコールとでエステル化することができる。
また、末端ホスフェートのエステル化には、２当量の脂肪族アルコールも想定される。また、グアニジニウムアルカノール又は脂肪族アルコールのいずれかである１当量だけのアルコールを末端ホスフェートと連結させることができる。
【００６３】
本明細書で使用される用語「核酸」は、一本鎖核酸及び二本鎖核酸の両方を包含する。
【００６４】
好ましい本発明の二本鎖核酸は、１つの末端ホスフェート（第１の鎖の５’末端ホスフェート）で１当量の脂肪族アルコール、もう１つの末端ホスフェート（第２の鎖の５’末端ホスフェート）で１当量のグアニジニウムアルカノールによってエステル化する。任意で、好ましい本発明の二本鎖核酸では、上記で規定の（ａ）の（ｉ）〜（ｉｖ）、及び／又は（ｂ）の位置の１つ又は複数を上記で規定のようにエステル化することができる。この場合、（ｂ）のホスフェートは内部ホスフェートであることが理解される。
【００６５】
好ましい本発明の一本鎖核酸は、５’末端ホスフェートで１当量の脂肪族アルコール、及び上記で規定の位置（ｂ）の１つ又は複数で少なくとも１当量のグアニジニウムアルカノールによってエステル化する。この場合、（ｂ）のホスフェートは内部ホスフェートであることが理解される。代替的に、又は１つ又は複数の内部ホスフェートでグアニジニウムアルカノールによってエステル化するのに加えて、上記の好ましい本発明の一本鎖核酸は、上記で規定の（ａ）の（ｉ）〜（ｉｖ）の位置の１つ又は複数で１つ又は複数のアルカン酸グアニジニウムによってエステル化する。
【００６６】
本発明のペプチド又はポリペプチドにおけるカルボキシレートのエステル化に類似して、本発明の核酸におけるホスフェートのエステル化は、二重の目的を果たす：（ｉ）グアニジニウム基の導入、及び（ｉｉ）負の電荷の除去。グアニジニウムアルカノールによるエステル化という単一の評価基準によって、両方の目的が達成される。
【００６７】
さらに好ましい実施の形態において、上記アルカン酸グアニジニウム又は上記グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧは、（ａ）の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つに規定の核酸のヒドロキシル基によって直接エステル化しないが、ポリマーリンカー又はオリゴマーリンカーの代わりに、同様に核酸によるエステル化に利用可能な官能基を含む。好ましくは、またさらなる説明のために、当該ポリマーリンカー又はオリゴマーリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はアルキルジオール、好ましくはアルキル−１，ω−ジオール、又はグリセロール等のポリオールである。したがって、好ましいリンカーは、一般式ＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）iＨ又はＨＯ（ＣＨ2）jＯＨ又はＨＯ−ＣＨ2−［（ＣＨ（ＯＨ）］(j-2)−ＣＨ2−ＯＨを有する。好ましいｉの値は、１〜１０、より好ましくは２、３、４又は５の整数である。好ましいｊの値は、１〜２０の整数、好ましくは２〜１０の値である。本発明のアルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧがこのようなリンカーと連結する場合、一方でアルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのカルボキシル基と、もう一方でリンカーの末端ヒドロキシル基との間でエステル結合を形成する。結果として、エステル化に利用可能な末端ヒドロキシル基を有するグアニジニウム含有部分が得られ、この末端ヒドロキシル基は、リンカーと、本発明のアルカン酸グアニジニウムとの間又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧとの間のエステル結合に関与しないリンカーの末端ヒドロキシル基である。言い換えれば、得られた分子は、核酸のホスフェートによってエステル化することができる遊離ヒドロキシル基を有する。したがって得られた分子は、上記の（ｂ）に規定の核酸のホスフェートによってエステル化することができる。即ち、当該分子は、本発明の核酸に関する実施の形態の項目（ｂ）で言及するグアニジニウムアルカノールの代わりになり得る。リンカーによってエステル化する、好ましいアルカン酸グアニジニウムを本明細書の上記で示す。式ＶＩ及び式ＶＩＩを参照されたい。同じことが、グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換
されたＰＥＧに準用される。
【００６８】
さらに好ましい実施の形態において、上記の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである。本発明による核酸分子としては、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ、及びＲＮＡが挙げられる。本明細書で使用される用語「ＲＮＡ」には、全ての形態のＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ（非コード化ＲＮＡ）、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡを含む）が含まれることが理解される。用語「非コード化ＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｒａｓｉＲＮＡ（反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（repeat
associated RNA））、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）及びｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）を含む。好ましくは、「ＲＮＡ」に言及する実施の形態は、ｍＲＮＡに関する。同時に、上記で言及される特定の形態を含む、他の形態のＲＮＡが、各実施の形態で意図的に想定される。さらにＲＮＡウイルスのＲＮＡの場合等では、ゲノムＲＮＡが含まれる。
【００６９】
さらに、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成又は半合成の誘導体及び混合ポリマー、センス鎖及びアンチセンス鎖のような、当該技術分野で既知の分子を模した核酸が含まれる。これらは、当業者が容易に分かるような、付加的な非天然ヌクレオチド塩基又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有し得る。このような本発明の核酸を模した分子又は核酸誘導体としては、ホスホロチオエート核酸、ホスホルアミデート核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えばBraasch and Corey, Chemistry & Biology 8, 1-7（2001）を参照されたい）。ＬＮＡは、２’酸素と４’炭素との間のメチレン結合によってリボース環が拘束されるＲＮＡ誘導体である。
【００７０】
本発明のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤＮＡ類似体である。アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの対応する誘導体の単量体単位は市販されている（例えばPerceptive Biosystems製）。ＰＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡの糖−ホスフェート骨格の代わりにアミド骨格を有する合成ＤＮＡ模倣体である。結果として、ＤＮＡの或る特定の成分（例えばリン、酸化リン、又はデオキシリボース誘導体）はＰＮＡには存在しない。Nielsen et al., Science 254:1497 （1991）、及びEgholm et al., Nature 365:666 （1993）で開示されるように、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖と特異的に強く結合し、ヌクレアーゼで分解されない。さらに、これらは酸性条件下で安定であり、プロテアーゼにも耐性がある（Demidov et al. （1994）, Biochem. Pharmacol., 48, 1310-1313）。この静電的に中性の骨格によって、対応するＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の安定性に比べて、相補的なＤＮＡとの結合力が強くなる（Wittung et al. （1994）, Nature 368, 561-563、Ray and Norden （2000）, Faseb J., 14, 1041-1060）。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体がＤＮＡと結合するよりもＤＮＡと強く結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電反発力がなく、またポリアミド骨格がより可塑性であるためである。このため、ＰＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖より広い範囲のストリンジェント条件下で結合し、多重ハイブリダイゼーションを行うのを容易にする。強い結合のために、ＤＮＡよりも小さいプローブを使用することができる。さらに、ＰＮＡ／ＤＮＡ  １５−ｍｅｒの単一塩基ミスマッチが、ＤＮＡ／ＤＮＡ  １５−ｍｅｒ二本鎖での４℃〜１６℃に対して、８℃〜２０℃、融点（Ｔm）を下げるので、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用する方が、単一塩基ミスマッチを決定することができる可能性が高くなる。これによって、完全なマッチとミスマッチとの識別が改善される。その不変的な性質のため、２つの負に荷電したＤＮＡ鎖間の鎖間反発力を無効にする必要がないため、ＰＮＡはまた、低塩条件又は無塩条件下でのＤＮＡサンプルのハイブリダイゼーションを可能にする。結果として、標的ＤＮＡは、ハイブリダイゼーション条件下でより少ない二次構造しか有さず、プローブ分子により接近しやすい。
【００７１】
さらに、上記の本発明の核酸はＰＮＡであることが想定される。ＰＮＡは、グアニジニウム基を受ける部分の導入によって、ポリアミド骨格のα−炭素で誘導体化し、それによってＰＮＡである本発明の核酸を得ることができる。
【００７２】
本発明のＰＮＡキメラは、１つ又は複数のＰＮＡ部を含む分子である。残りのキメラ分子は、１つ又は複数のＤＮＡ部（ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ）、或いは１つ又は複数の（ポリ）ペプチド部（（ポリ）ペプチド−ＰＮＡキメラ）を含み得る。本発明の（ポリ）ペプチド−ＤＮＡキメラは、１つ又は複数の（ポリ）ペプチド部と、１つ又は複数のＤＮＡ部とを含む分子である。また、ＰＮＡ部、ペプチド部及びＤＮＡ部を含む分子が想定される。キメラ分子部の長さは、１個〜Ｎ−１個の塩基、その同等物又はアミノ酸の範囲である可能性があり、「Ｎ」は全分子の塩基、その同等物及びアミノ酸の総数である。
【００７３】
上記のＰＮＡ、（ポリ）ペプチド、ＰＮＡキメラ及びペプチド−ＤＮＡキメラに付随する用語「誘導体」は、ＰＮＡ、（ポリ）ペプチド及びＤＮＡとは異なる１つ又は複数のさらなる基又は置換基を含む分子に関する。当該技術分野で既知であり、且つこれらの分子の合成に使用される基又は置換基（例えば、保護基）及び／又はこれらの分子を伴う用途のための基又は置換基（例えば、ラベル及び（切断可能な）リンカー）が全て想定されている。
【００７４】
さらに本発明は、１つ又は複数のグアニジニウム基を受けるリポソーム又はミセルであって、当該１つ又は複数のグアニジニウム基が、生理的条件下で切断可能な官能基によって、リポソーム又はミセルと連結する、１つ又は複数のグアニジニウム基を受けるリポソーム又はミセルに関する。
【００７５】
本発明のリポソームは、リン脂質と、任意でコレステロールとを含む膜二重層を有する小胞、好ましくは球状小胞である。リポソームは、（卵ホスファチジルエタノールアミンのような）混合脂質鎖を有する、又はＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のような純粋な界面活性剤成分を有する天然由来のリン脂質を含み得る。通常、しかし定義によるものではないが、リポソームは水溶液のコアを含有する。リポソームは、その特有の性質のために薬剤送達に使用される。本発明のために、生体系への送達が望まれているリポソーム（例えばその内部に１つ又は複数の薬学的活性物質を含有するリポソーム）が想定される。リポソームは、疎水性膜内に水溶液領域を封入し得る。溶解された親水性溶質は、脂質を容易に通り抜けることはできない。疎水性化学物質は膜に溶解することができ、このようにしてリポソームは、疎水性分子と親水性分子との両方を保有することができる。分子を作用部位に送達するために、リポソームの脂質二重層を細胞膜等の他の二重層と融合し、このようにしてリポソーム含有物を送達することができる。（通常、膜を通って拡散することができない）ＤＮＡ又は薬剤等の作用物質の溶液中にリポソームを作製することによって、当該作用物質は、脂質二重膜を通って（自由に）送達することができる。ＤＮＡの宿主細胞への形質転換又はトランスフェクションのためのリポソームの使用は、リポフェクションとして知られている。リポソーム研究のさらなる進歩によって、リポソームを体内の免疫系、具体的には網内系（ＲＥＳ）の細胞による検出から回避させることが可能となっている。これらのリポソームは「ステルスリポソーム」として知られており、膜の外側に埋め込まれたＰＥＧ（ポリエチレングリコール）で構築される。本体内で不活性のＰＥＧコーティングによって、薬物送達機構に対する循環寿命が長くなる。
【００７６】
本発明のミセルは通常、脂質に分散される界面活性剤分子の集合体である。水溶液中の典型的なミセルは、周囲溶媒に接触した親水性「頭部」領域を有する集合体を形成し、ミセル中心で疎水性尾部領域を捕捉する。代替的に、ミセルは二重層構造を有し得る。ミセル中心は、例えば生体系への送達が望まれる薬学的活性物質のような物質をさらに含み得
る。一般的に、ミセルは略球状である。ミセルの形状及び大きさは、その界面活性剤分子の分子幾何構造と、界面活性剤濃度、温度、ｐＨ及びイオン強度等の溶液条件とに応じたものである。
【００７７】
一般的にミセルは、コレステロールを含まない。本発明のリポソーム及びミセルの両方がコレステロールを含まないか、又はコレステロールが存在する場合、当該コレステロールが非変性の天然コレステロールであるのが好ましい。
【００７８】
本発明のために、上記グアニジニウム基の全て又はそのかなりの画分が、上記リポソーム又はミセルの外表面に位置していることが重要である。
【００７９】
好ましい実施の形態において、上記官能基はエステル基である。生理的条件下で切断可能なさらなる本発明の官能基は、アセタール、ジスルフィド、チオエステル、及びホスフェートエステルである。
【００８０】
さらに好ましい実施の形態において、上記のリポソーム又はミセルは、（ａ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、１つ又は複数のヒドロキシル基で、及び／又は（ｂ）グアニジニウムアルコール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、ホスフェート及びカルボキシレート等の１つ又は複数の酸性基でエステル化する。
【００８１】
好ましくは、上記ヒドロキシル基は、第１級ヒドロキシル基、即ち−ＣＨ2Ｒ断片と結合したヒドロキシル基である。エステル化の際に第１級ヒドロキシル基は、第２級又は第３級ヒドロキシル基に比べて、より迅速に及び／又はより大きく切断されるエステルを生じる。より迅速な切断及び／又はより大きい切断は、上記グアニジニウム基を含まないか又は実質的に含まないリポソーム又はミセルのより迅速な形成及び／又はより大きい形成を伴うために好ましく、それらの接触は、生体膜等の生物学的障壁の通過能を一時的に高めるのに有用である。
【００８２】
本発明のリポソーム又はミセルのさらに好ましい実施の形態において、上記リポソーム又はミセルの第１級アミノ基は、グアニジニウム基に変換される。第１級アミノ基は、市販又は既知の「グアニジル化（guanidylation）試薬」を使用することによってグアニジニウム構造に変換することができる。第１級アミンのグアニジニル化（guanidinylation）に好適な手段及び方法は、例えばFeichtinger et al.（J. Org. Chem. 63, 8432-8439 （1998））又はBrand and Brand（Organic Syntheses 3, 440 （1955））に記載されている。Feichtinger et al.によれば、グアニジル化試薬の両方の窒素が保護され、有機溶媒において高収率で反応が起こる。それから反応完了の際、主に酸切断によって保護基を取り除かなければいけない。Brand and Brandによれば、グアニジル化剤は、非反応形態で塩として維持される（窒素は共有結合的に保護されない）。その後、塩基性ｐＨで水／水溶液混合物中に第１級アミンを添加すると、所望の生成物が得られる。後者の手法であれば、最終的に保護基を取り除く必要はない。
【００８３】
さらに好ましい実施の形態において、ヒドロキシル基はホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、モノ−アシルグリセロール、及びジ−アシルグリセロールから選択される脂質のヒドロキシル基（当該脂質はリポソーム若しくはミセルに含まれる）、又はリポソーム若しくはミセルに含まれるＰＥＧ部分の末端ヒドロキシル基である。リポソーム及びミセルの構成物質の極性頭部基としてのＰＥＧ部分の使用は、当該技術分野で既知である。
【００８４】
好ましくは、上記の第１級アミノ基は、ホスファチジルエタノールアミン又はＰＥＧ部分の第１級アミノ基であり、ここでは、ＰＥＧ部分の末端ヒドロキシル部分が第１級アミノ基に置き換わる。
【００８５】
好ましくは、本発明の核酸、リポソーム又はミセルに含まれるグアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、アルカン酸グアニジニウム、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧ、並びにグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧは、本発明のペプチド及びポリペプチドと共に本明細書中の上記に規定されるようなものである。これらの化合物に関するさらなる説明及びさらに好ましい実施の形態は、本発明の核酸、リポソーム及びミセルに準用される。
【００８６】
本発明は、本発明のペプチド又はポリペプチド、及び／又は本発明の核酸、及び／又は本発明のリポソーム又はミセルを含む薬学的組成物にも関する。
【００８７】
薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤をさらに含み得る。好適な薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤の例は、当該技術分野で既知であり、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルション（例えば油／水エマルション）、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液等が含まれる。このような担体を含む組成物は、既知の従来方法によって調製することができる。これらの薬学的組成物は、好適な用量で被験者に投与することができる。好適な組成物の投与は様々な方法（例えば静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、皮内投与、鼻内投与又は気管支内投与）によって達成することができる。この組成物はまた標的部位に直接、例えば微粒子銃（biolistic）送達（「遺伝子銃」とも呼ばれる）によって外部若しくは内部の標的部位に投与してもよい。担当医及び臨床学的因子によって、投与計画を決定する。医学分野で既知のように、いずれか１人の患者に対する投薬量は、多くの因子（患者の大きさ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身の健康状態、及び同時投与する他の薬剤を含む）によって変わる。タンパク質の薬学的活性物質が、１用量当たり１ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で存在し得るが、特に上述の因子を考慮して、この例示的範囲前後の用量が想定される。また計画が連続注入である場合、１分当たり体重１ｋｇ当たり１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲であるものとする。
【００８８】
本発明はさらに、ポリマー、リポソーム又はミセルの生物学的障壁通過能を高める方法であって、当該ポリマー、リポソーム又はミセルは、１つ又は複数のカルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及び／又はホスフェート基を有し、これらの基の少なくとも１つを修飾する工程であって、
【００８９】
【化１】
2010504929.tif 000002
【００９０】
（式中、それぞれの式ＶＩＩに関して独立して、
（ａ）Ｘは、−（Ｃ＝Ｏ）であり、Ｙは、Ｏ又はＳであり、
（ｂ）Ｘは、−Ｏ又は−Ｓであり、Ｙは、（Ｃ＝Ｏ）又は（ＣＨＲa）−Ｏであり、
（ｃ）Ｘ−Ｙは、−Ｓ−Ｓであり、又は
（ｄ）Ｘは、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）ＯＲPであり、Ｙは、Ｏ又はＳであり、且つ
Ｊはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ2、炭素数が１〜１５のアルキル、及び［ＣＨＲ］o−ＮＲ’−ＣＨ（ＮＨＲ’’）−ＮＨ−Ｒ’’’から選択され、
Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、Ｒa及びＲpはそれぞれ独立して、Ｈ、炭素数が１〜１５のアルキル、及び置換又は非置換のアリールから選択され、Ｒ及びＲ’、Ｒ’及びＲ’’、及び／又はＲ’’及びＲ’’’は共に、環状構造を形成するように選択されてもよく、
アルキルは置換されてもよく、
ｍは、０〜１０の整数であり、Ｊが［ＣＨＲ］o−ＮＲ’−ＣＨ（ＮＨＲ’’）−ＮＨ−Ｒ’’’の場合は、ｍは１であり、
ｏは、１〜１５の整数であり、且つ
ｐは、０又は１であり、ｐが０の場合は、Ｒ’を受けるＮの自由原子価は、Ｈで満たされる）を与える、修飾する工程を含む、ポリマー、リポソーム又はミセルの生物学的障壁通過能を高める方法を提供する。
【００９１】
式ＶＩＩには、本発明の方法で想定される、上記カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はホスフェート基の修飾が含まれる。したがって、Ｘ−Ｙ部分は（ａ）の場合、エステル基又はチオエステル基であり、（ｂ）の場合、エステル基、チオエステル基又はアセタール基であり、（ｃ）の場合、ジスルフィドであり、（ｄ）の場合、ホスフェート又はチオホスフェートである。Ｘは、（ａ）〜（ｄ）で示されるように自由原子価を含有し、これは、修飾されるカルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はホスフェート基を、上記ポリマーリポソーム又はミセルと連結させる結合である。
【００９２】
Ｊは、［ＣＨＲ］o−ＮＲ’−ＣＨ（ＮＨＲ’’）−ＮＨ−Ｒ’’’であってもよいので、本発明の方法は、上記カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はホスフェート基のいずれか１つでビス−グアニジニウム置換基を導入することができる。
【００９３】
好ましくは、ｍとｏとの合計は、４、５又は６である。アルキルがメチルであるのも好ましい。
【００９４】
本発明の方法の好ましい実施の形態において、上記ポリマーは、ペプチド、ポリペプチド又は核酸である。
【００９５】
したがって、上記の本発明のペプチド、ポリペプチド又は核酸は、本発明の方法によって入手可能である。
【００９６】
本発明は、ペプチド又はポリペプチドの生物学的障壁通過能を高める方法であって、（ａ）１つ又は複数のエステル又はチオエステルを（ｉ）グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、Ｃ末端のカルボキシレートで、（ｉｉ）グアニジニウムアルカノール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、存在する場合、１つ又は複数のＡｓｐ残基又はＧｌｕ残基の側鎖カルボキシレートで、（ｉｉｉ）アルカン酸グアニジニウムによって、存在する場合、１つ又は複数のＳｅｒ残基、
Ｔｈｒ残基又はＴｙｒ残基のヒドロキシル基で、（ｉｖ）アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、存在する場合、１つ又は複数のＣｙｓ残基のスルフヒドリル基で、及び／又は（ｖ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸で予めアミド化したＮ末端で形成する工程であって、エステルが、当該α−ヒドロキシ酸又はβ−ヒドロキシ酸のヒドロキシ基と、当該アルカン酸グアニジニウム又は当該グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧのカルボキシル基との間で形成される、形成する工程、及び／又は（ｂ）１つ又は複数のジスルフィドを形成する工程であって、当該ジスルフィドが、存在する場合、Ｃｙｓ残基のスルフヒドリル基と、グアニジニウムアルカンチオールとの間、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧとの間で形成される、形成する工程を含む、ペプチド又はポリペプチドの生物学的障壁通過能を高める方法も提供する。
【００９７】
本明細書に上記された本発明の主な実施の形態の定義、利点及び好ましい実施の形態は、上記された本発明のペプチド又はポリペプチドの生物学的障壁通過能を高める方法にも準用される。
【００９８】
本発明の方法の好ましい実施の形態において、生物学的障壁が、細胞膜、粘膜及び血液脳関門から選択される。
【００９９】
さらに好ましい実施の形態において、上記された本発明のペプチド又はポリペプチドの生物学的障壁通過能を高める方法が、（ａ）Ｃ末端が、上記に規定のようにエステル化しない場合、脂肪族アルコールによって、Ｃ末端のカルボキシレートでエステル又はチオエステルを形成する工程、及び／又は（ｂ）脂肪酸によって、Ｎ末端のアミノ基をアミド化する工程をさらに含む。
【０１００】
より好ましい実施の形態において、上記脂肪族アルコール及び／又は上記脂肪酸は、炭素数が５〜１５、好ましくは炭素数が９である。
【０１０１】
それぞれ、上記脂肪酸又は上記脂肪族アルコールに関し、本発明のペプチド又はポリペプチドと共に本明細書に上記された定義、利点及び好ましい実施の形態は、本発明の方法にも準用される。
【０１０２】
さらに好ましい実施の形態において、存在する場合、任意のＡｒｇ残基（複数可）のものを含む、エステル、チオエステル、アセテート、ジスルフィド及び／又はホスフェートエステルの形成時のグアニジニウム基の数が、５〜２０、より好ましくは７〜１５、及び最も好ましくは９である。
【０１０３】
さらに本発明は、核酸の生物学的障壁通過能を高める方法であって、（ａ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、以下の位置の１つ又は複数：（ｉ）５’末端の５’ヒドロキシル基、（ｉｉ）３’末端の３’ヒドロキシル基、（ｉｉｉ）５’末端又は３’末端の２’ヒドロキシル基、及び（ｉｖ）内部の２’ヒドロキシル基でエステルを形成する工程、（ｂ）グアニジニウムアルカノール、又はグアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧによって、１つ又は複数のホスフェートでエステルを形成する工程、及び／又は２’ヒドロキシル基と、グアニジニウムアルカノールとの間、又はグアニジニウム基で置換されたＰＥＧとの間でアセタールを形成する工程を含む、核酸の生物学的障壁通過能を高める方法を提供する。
【０１０４】
好ましくは、上記アセタールはホルムアルデヒドアセタールである。代替的に、当該ア
セタールのアルデヒド成分は、ホルムアルデヒド以外のアルデヒドである可能性があり、一般式Ｒa−ＣＨＯ（Ｒaは本明細書で以下に規定される）を有する。
【０１０５】
グアニジニウムアルカノール又はグアニジニウム基で置換されたＰＥＧによってホスフェート基でエステル化する核酸は、改良した標準的なプロトコル（Vinayak et al., Nucleic Acids Research, 20, 1265-1269 （1992）、Ogilvie et al., P.N.A.S. 85, 5764-5768 （1988））によって調製することができる。固定支持体からバイオポリマーを切断するのに利用される塩基性条件下で取り除かれる標準的なシアノエチル保護基の代わりに、塩基に不安定な基（Ｆｍｏｃ）又は還元に不安定な部分（ニトロ、ベンジル、トリクロロエチル）で保護される、グアニジニウムアルカノール又はグアニジニウム基で置換されたＰＥＧを利用することができる。塩基に不安定なグアニジニウム保護基の場合、合成オリゴヌクレオチドを切り離す最終的な塩基処理と共に、グアニジニウム保護基が取り除かれる。還元条件下で切断可能なグアニジニウム保護基の場合、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、最終的にグアニジニウム保護基を取り除いた後に、還元条件下でのさらなる工程が必要である。
【０１０６】
アセタール基を介して、グアニジニウムアルカノール又はグアニジニウム基で置換されたＰＥＧによって、２’位で誘導体化される核酸は、改良された標準的なプロトコル（例えばRastogi et. al., Nucleic Acids Research 23, 4872-4873 （1995））によって調製することができる。グアニジニウムアルカノール又は一端をグアニジニウム基で置換したＰＥＧは、２’位にヒドロキシル基を有するアセタールを形成するのに使用することができる。アセタールは、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断している間は安定である。
【０１０７】
さらに好ましい実施の形態において、上記方法は、脂肪族アルコールによって、１つ又は複数の末端ホスフェートをエステル化することをさらに含む。
【０１０８】
本発明の核酸と共に記載される定義、利点及び好ましい実施の形態は、本発明の核酸の生物学的障壁通過能を高める方法に準用される。
【０１０９】
さらに本発明は、リポソーム又はミセルの生物学的障壁通過能を高める方法であって、（ａ）アルカン酸グアニジニウム、又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧによって、該リポソーム又はミセルの１つ又は複数のヒドロキシル基でエステルを形成する工程、及び／又は（ｂ）グアニジニウムアルコール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによって、ホスフェート又はカルボキシレート等の１つ又は複数の酸性基でエステルを形成する工程、及び／又は（ｃ）上記リポソーム又はミセルの第１級アミノ基をグアニジニウム基に変換する工程を含む、リポソーム又はミセルの生物学的障壁通過能を高める方法を提供する。
【０１１０】
本発明のリポソーム又はミセルの調製は、アルカン酸グアニジニウム又はグアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧを使用して、当該リポソーム又はミセルの１つ又は複数のヒドロキシル基でエステルを形成することによって達成することができる。当該リポソーム又はミセルのヒドロキシル基は、ホスファチジルグリセロール等の構成両親媒性脂質によって与えられ得る。例えば、ホスファチジルグリセロール又はホスファチジルジオール（アルキルによってエステル化したか、又は２つの遊離端がそれぞれヒドロキシル基を受けるＰＥＧ鎖を有するリン脂質）は、カルボン酸グアニジニウムによって、遊離末端のヒドロキシル基又はスルフヒドリル基でエステル化する。例えば、ＤＣＣ−ＨＯＢＴ−ＤＭＡＰカップリングを介してＤＭＦ／ＤＣＭ混合物中で、市販のＮ，Ｎ’−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグアニジニウム酢酸をホスファチジルグリセロールと
カップリングさせることができる。精製後、ＴＦＡ処理によってビス−Ｂｏｃ基を取り除き、所望の化合物を生成する。
【０１１１】
本発明のリポソーム又はミセルの調製は、例えばホスファチジル−セリン（ホスファチジル−セリンは、当該リポソーム又はミセルの構成物質である）によってエステル化する、グアニジニウムアルコール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧを使用することによっても達成することができる。この場合、アミノ酸部分（セリン）の遊離カルボキシレートは、当該グアニジニウムアルコール、グアニジニウムアルカンチオール、グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、又はグアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧによってエステル化する。
【０１１２】
上記リポソーム又はミセルの第１級アミノ基をグアニジニウム基に変換することは、例えばホスファチジルエタノールアミンのような第１級アミノ基を有する陽イオン性界面活性剤（当該陽イオン性界面活性剤は、当該リポソーム又はミセルの構成物質である）を、過剰な第１級アミンをグアニジニウム基に変換可能な試薬（例えば１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−メチルイソチオ尿素）で処理することによって容易に達成することができる。例えば、非求核塩基（例えばＴＥＡ又はＤＩＥＡ）の存在下、室温で２４時間〜４８時間、ＤＣＭ（ジクロロメタン）中で２当量〜３当量の１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−メチルイソチオ尿素とホスファチジルエタノールアミンを反応させることができる。ＵＶ−ニンヒドリンモニタリングによって、反応をモニタリングすることができる。溶媒の蒸発及び反応材料の単離の際に、Ｂｏｃ基を切断するのに必要なＴＦＡによる最終処理によって、遊離グアニジニウム基を有する所望の生成物が生成される。
【０１１３】
第１級アミノ基をグアニジニウム基に変換する方法は、本明細書に上記される。
【０１１４】
本発明のリポソーム及びミセルと共に記載される、定義、利点及び好ましい実施の形態は、本発明のリポソーム又はミセルの生物学的障壁通過能を高める方法に準用される。特に、上記グアニジニウムアルカノール、上記グアニジニウムアルカンチオール、上記アルカン酸グアニジニウム、上記グアニジニウム基で置換されると共に遊離ヒドロキシル基を有するＰＥＧ、上記グアニジニウム基及びスルフヒドリル基で置換されたＰＥＧ、又は上記グアニジニウム基及びカルボキシル基で置換されたＰＥＧは、本明細書の上記で規定されるようなものであるのが好ましい。
【実施例】
【０１１５】
以下の実施例は、本発明を説明するが、限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１６】
実施例１
融合（即ち細胞貫通）ペプチドを使用しない、ＳＣＦ（幹細胞因子）の２０−ｍｅｒペプチド阻害剤の送達
標的ペプチド（ＳＣＦのＥＲ送出に必要）：
【化２】
2010504929.tif 000003
対応するアルギニン−エステル−ペプチド（即ちこのペプチドは、グアニジニウムアルカノールでグルタミン酸塩のカルボキシレートをエステル化することによって本発明に従って修飾する）：
【化３】
2010504929.tif 000004
【０１１７】
アスパラギン酸側鎖をメチルエステルで保護した：Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＯＨ
【０１１８】
Ｉ．シュードアルギニン由来のＳＦＣ誘導体：
グアニジニウム基をエステル結合を介してグルタミン酸側鎖に化学的に組み込み、４つの炭素のアルキル鎖（ブチル）によってカルボン酸から分離した。グアニジニウム保護基はビス−Ｚ（Ｎ，Ｎ’ビスベンジルオキシカルボニル）である。
【０１１９】
ストラテジー：Ｂｏｃ／Ｆｍｏｃストラテジー。
使用前駆体：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯブチルグアニジニウムビスＺ）−ＯＨ。
樹脂：Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐａｍ樹脂ＲＡＰＰポリマー。０．５９ｍｍｏｌ／ｇ。０．２ｍｍｏｌ規模の合成。
カップリング剤：前駆体にはＢＯＰ、及び残余はＨＣＴＵ。
【０１２０】
手動カップリングを使用して、固相ペプチド合成を達成した。ＴＦＡ切断は、短時間（１×１分）であり、ビスＺ切断が避けられる。標準的な２０％ピペリジンサイクルを使用して、Ｆｍｏｃ基を取り除いた。最終的に、ＨＦ切断を行った。ＨＰＬＣ（図８を参照されたい）及びＭＳ−Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ（期待値Ｍ＋Ｈ＝３３４６、実測値３３４７、図９を参照されたい）によって、生成物の純度及び同一性を確認した。
【０１２１】
ＩＩ．前駆体の合成：
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯビスＺグアニジニウムブチル）−ＯＨ
出発材料：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ
【０１２２】
【化４】
2010504929.tif 000005
【０１２３】
実験プロトコル
ＤＭＥＭ含有１０％血清においてカバーガラス上でＣｏｓ−７細胞を一晩平板培養した。分析のために、本発明者らは、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で１ｍＭのペプチドを懸濁し、完全培地中で最終濃度に希釈した。本発明者らは、１５分後又は３０分後、ＰＢＳで１回細胞を洗浄し、１０分間パラホルムアルデヒド（４％）で固定し、ＰＢＳ中で画像を撮影した。
【０１２４】
ストラテジーを改良するために、（ｉ）より長い炭素スペーサを使用して、起こり得る
副反応（ラクタム形成）を避け、（ｉｉ）全てのＢｏｃ化学反応を利用して、鎖集合を単純化した。この場合、６−アミノ−１−ヘキサノールから始まり、Ｂｏｃ固相ペプチド合成できる状態にあるアミノ酸が得られる：
【０１２５】
【化５】
2010504929.tif 000006
【０１２６】
実施例２
【０１２７】
【化６】
2010504929.tif 000007
【０１２８】
１−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンの合成
４９．９ｍｇ（１ｍｍｏｌ、１当量）のＮａＨを、乾燥ＴＨＦ  １０ｍＬ中、窒素下で懸濁した。２９８．３ｍｇ（１ｍｍｏｌ、１当量）の１−（６−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンの乾燥ＴＨＦ溶液１０ｍＬを１０分滴下した。溶液を室温で１時間撹拌し、０．１２ｍＬ（１ｍｍｏｌ、１当量）の臭化ベンジルを滴下した。反応物を室温で２時間３０分撹拌し、ＴＬＣで確認した。４４．９ｍｇ（１ｍｍｏｌ、１当量）のＮａＨを添加した。５時間３０分（総反応時間）後では、ＴＬＣは、ほとんど前進が見られず、反応物を一晩撹拌させた。水を幾らか添加し、有機溶媒を真空下で取り除いた。水相をエーテルで３回抽出した。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、蒸発させ、４３０．０ｍｇの無色油を得た。シリカ上のフラッシュクロマトグラフィ（溶離液  ＡｃＯ
Ｅｔ：ペンタン  １：９、Ｒf＝０．２６）でこの油を精製し、無色油として３１５．５ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）の１−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンを得た（収率＝８０％）。
【０１２９】
実施例３
【０１３０】
【化７】
2010504929.tif 000008
【０１３１】
２−グアニジノエチルベンゾエートトリフラート塩の合成
４ｍＬ（５２ｍｍｏｌ、６５当量）のＴＦＡを、３１５．５ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ、１当量）の１−（２−（ベンジルオキシ）エチル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンに添加し、室温で３時間撹拌した。溶液を蒸発させ、淡橙色油として３３６．９ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）の２−グアニジノエチルベンゾエートトリフラート塩を得た（収率＝１１０％）。
【０１３２】
実施例４
【０１３３】
【化８】
2010504929.tif 000009
【０１３４】
Ｎ−（Ｎ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドの合成
１６４．５ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、１当量）の２−グアニジノエチルベンゾエートトリフラート塩を幾らかのアセトン中に溶解した。４ＭのＮａＯＨ溶液４ｍＬを添加した。８６．１ｍｇ（０．４４ｍｍｏｌ、１．１当量）のトルエン−４−スルホニル−クロリドをアセトン中に溶解し、反応混合物に添加した。反応物を室温で２時間撹拌し、この反応物を６ＭのＨＣｌ溶液で中性にした。アセトンを真空下で取り除いた。水相をＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、蒸発させ、１７４．８ｍｇの無色油を得た。白色結晶が週末にわたって（over week end）形成された。これらの結晶をＡｃＯＥｔで洗浄し、周囲の油を取り除いた。８３．８ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）のＮ−（Ｎ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドを白色結晶として回収した（収率＝６０％）。
【０１３５】
実施例５
【０１３６】
【化９】
2010504929.tif 000010
【０１３７】
Ｎ−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドの合成
８３．８ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）のＮ−（Ｎ−（２−（ベンジルオキシ）エチル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドをＭｅＯＨ中、窒素下で溶解した。活性炭上の１０％パラジウムを数ｍｇ添加した。３回真空水素通気を行った後、反応物をＨ2雰囲気下で激しく撹拌した。２時間後では、ＴＬＣ（溶離液  ＡｃＯＥｔ：ペンタン
９：１）による変化が見られず、活性炭上のパラジウムを出発量の約５倍添加した。反応物を一晩撹拌した。反応が完了まで余程遠くなければ、ＴＬＣによって、より極性のある生成物の形成が示された。１ｍＬの酢酸を添加した。１時間後に反応が完了した。反応物をセライトで濾過し、溶媒を蒸発させ、白色固体として６２．８ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）のＮ−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドを得た（収率＝１００％）。
【０１３８】
実施例６
【０１３９】
【化１０】
2010504929.tif 000011
【０１４０】
ベンゾイン１−イミノ−１３，１３−ジメチル−１−（４−メチルフェニルスルホンアミド）−６，１１−ジオキソ−５，１２−ジオキサ−２，１０−ジアザテトラデカン−９−カルボン酸無水物の合成
６２．８ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ、１当量）のＮ−（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミド及び８２．７ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ、１当量）のＢｏｃ−Ｌ−グルタミン酸１−ベンジルエステルを乾燥ジクロロメタン中、窒素下で溶解した。７．４５ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ、０．２当量）のＤＭＡＰ及び５５．３ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＣを添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。白色析出物が現れ、それを濾過で取り除いた。溶媒を真空下で蒸発させ、１８４．１ｍｇの白色固体を得た。この白色固体をジクロロメタン中に溶解し、分取ＴＬＣ（溶離液  純ＡｃＯＥｔ、Ｒf＝０．６５）で精製した。８３．２ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）のベンゾイン１−イミノ−１３，１３−ジメチル−１−（４−メチルフェニルスルホンアミド）−６，１１−ジオキソ−５，１２−ジオキサ−２，１０−ジアザテトラデカン−９−カルボン酸無水物を無色油として回収した（収率＝６０％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝１．１２（ｍ，１Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ），１．８６（ｍ
，１Ｈ），２．１８（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｍ，５Ｈ），３．４１（ｍ，１Ｈ），３．６１（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｍ，１Ｈ），５．１７（ｑ，Ｊ＝１１．９８Ｈｚ，２Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝８．８３Ｈｚ，１Ｈ），６．４９（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝８．２０Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｍ，５Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．１９Ｈｚ，２Ｈ）．
【０１４１】
実施例７
【０１４２】
【化１１】
2010504929.tif 000012
【０１４３】
１−（６−ヒドロキシへキシル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンの合成
７．２５５ｇ（２４．９９ｍｍｏｌ、１当量）の１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−メチルイソチオ尿素、４．１０１ｇ（３４．９８ｍｍｏｌ、１．４当量）の６−アミノ−１−ヘキサノール及び６１４．５ｍｇ（５ｍｍｏｌ、０．２当量）のＤＭＡＰを１４０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。反応物を室温で撹拌した後、ＴＬＣ（溶離液  ＡｃＯＥｔ：ペンタン  ３：７）を行った。約６０時間後、反応が完了した。溶媒を真空下で蒸発させた（フードの下でＮａＯＣｌ溶液中で気体発生、ＭｅＳＨの蒸発）。得られた油をジクロロメタン中に溶解し（白色フレークは依然として存在する）、１ＭのＫＨＳＯ4溶液で３回、及びブラインで１回洗浄した。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を真空下で蒸発させ、１０．４３ｇの無色油を得た。シリカ上のフラッシュクロマトグラフィ（溶離液  ＡｃＯＥｔ：ペンタン  １：１、Ｒf＝０．４３）でこの油を精製し、無色油（一晩で白色固体になった）として８．４４７ｇ（２３．５０ｍｍｏｌ）の１−（６−ヒドロキシへキシル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンを得た（収率＝９４％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝１．４２（ｍ，５Ｈ），１．５２（ｓ，１０Ｈ），１．５３（ｓ，１０Ｈ），１．５８（ｔ，Ｊ＝６．９４Ｈｚ，２Ｈ），１．６４（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｍ，２Ｈ），３．６５（ｔ，Ｊ＝６．６４Ｈｚ，２Ｈ）．
【０１４４】
実施例８
【０１４５】
【化１２】
2010504929.tif 000013
【０１４６】
１−（２−（ベンジルオキシ）ヘキシル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンの合成
１．３００ｇ（３２．４９ｍｍｏｌ、１．３当量）の水素化ナトリウムを、１７０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中、窒素下で懸濁した。乾燥ＴＨＦ中に溶解した８．９８３ｇ（２４．９９
ｍｍｏｌ、１当量）の１−（６−ヒドロキシへキシル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンを懸濁液に滴下した。反応物を室温で４５分間撹拌した。３．６ｍＬ（２９．９９ｍｍｏｌ、１．２当量）の臭化ベンジルを１０分滴下した。反応物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣで反応物を確認したら、反応は完了していなかった。０．８３３ｇ（２０．８２ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウムを添加した。１時間後、ＴＬＣが変わらなかったので、０．８１０ｇ（２０．２４ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウムを添加した。３時間後、ＴＬＣに進展が見られなかったので、１．３９６ｇ（３４．８９ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウム及び１．６ｍＬ（１３．３３ｍｍｏｌ）の臭化ベンジルを添加した。反応物を一晩撹拌したが、ＴＬＣは依然として変わらなかった。溶液が透明になるまで水を添加することで反応を停止させた。ＴＨＦを真空下で取り除いた。水相をエーテルで３回抽出した。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、蒸発させ、１５．４４ｇの淡黄色油を得た。シリカ上のフラッシュクロマトグラフィ（溶離液  ＡｃＯＥｔ：ペンタン  １：９、Ｒf＝０．４３）でこの油を精製し、無色油として３．７８ｇの１−（２−（ベンジルオキシ）ヘキシル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンを得た（収率＝３４％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝１．３９（ｍ，５Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ），１．６１（ｍ，５Ｈ），３．４５（ｍ，４Ｈ），４．５０（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｍ，１Ｈ），７．３４（ｍ，４Ｈ）．
【０１４７】
実施例９
【０１４８】
【化１３】
2010504929.tif 000014
【０１４９】
２−グアニジノへキシルベンゾエートトリフラート塩の合成
４．６１（１０．３ｍｍｏｌ、１当量）の１−（２−（ベンジルオキシ）ヘキシル）−Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｂｏｃ−グアニジンを４９ｍＬ（６６９ｍｍｏｌ、６５当量）のＴＦＡ中に溶解した。反応物を室温で３時間撹拌した。ＴＦＡを真空下で取り除き、６．０６ｇの茶色油を得た（収率＝１６２％）。
【０１５０】
実施例１０
【０１５１】
【化１４】
2010504929.tif 000015
【０１５２】
Ｎ−（Ｎ−（６−（ベンジルオキシ）ヘキシル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドの合成
６．０６ｇ（１０．３ｍｍｏｌ、１当量）の粗２−グアニジノへキシルベンゾエートトリフラート塩をアセトン中に溶解し、５０ｍＬの４Ｍ  ＮａＯＨ溶液を添加した。２．３７７ｇ（１２．４ｍｍｏｌ、１．２当量）のトルエン−４−スルホニル−クロリドをアセトン中に溶解し、反応混合物に添加した。溶液全体に茶色油が現れたら、分解が完了するまでアセトンを添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。３７％ＨＣｌ溶液を添加することによって、反応物を中性にした（リトマスでｐＨ＝６）。アセトンを真空下で取り除き、水相をＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、溶媒を蒸発させ、５．２３ｇの淡黄色油を得た。シリカ上のフラッシュクロマトグラフィ（溶離液  ＡｃＯＥｔ：ペンタン  ６：４、Ｒf＝０．５２）でこの油を精製し、無色油として３．２０ｇ（７．９ｍｍｏｌ）のＮ−（Ｎ−（６−（ベンジルオキシ）ヘキシル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドを得た（収率＝７７％）。1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝１．２７（ｍ，５Ｈ），１．４４（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｓ，２Ｈ），３．４４（ｔ，Ｊ＝６．６２Ｈｚ，３Ｈ），４．４８（ｓ，２Ｈ），６．３０（ｓ，３Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝８．２０，２Ｈ），７．２８（ｍ，１Ｈ），７．３３（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝８．１９Ｈｚ，２Ｈ）．
【０１５３】
実施例１１
【０１５４】
【化１５】
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【０１５５】
Ｎ−（Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドの合成
３．２０ｇ（７．９ｍｍｏｌ）のＮ−（Ｎ−（６−（ベンジルオキシ）ヘキシル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドをＭｅＯＨ中、窒素下で溶解した。数ｍｇの活性炭上の１０％パラジウムを添加した。１ｍＬの酢酸を添加した。３回真空水素通気を行った後、反応物をＨ2雰囲気下で激しく撹拌した。反応物を室温で３時間激しく撹拌して、ＴＬＣで確認した。変化が見られなかったので、２ｍＬの酢酸を添加した。１時間後、ＴＬＣで変化が見られなかったので、より多くの活性炭上の１０％パラジウムを添加した。３日後、ＴＬＣで完全な変化が見られ、溶液をセライトで濾過し、溶媒を乾燥させ、淡黄色油として２．４８０ｇのＮ−（Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミドを得た（収率＝１００％）。
【０１５６】
実施例１２
【０１５７】
【化１６】
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【０１５８】
１−ベンジル５−（６−（３−トシルグアニジノ）ヘキシル）２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ペンタンジオエートの合成
２．４８ｇ（７．９ｍｍｏｌ、１当量）のＮ−（Ｎ−（６−ヒドロキシへキシル）カルバミミドイル）−４−メチルベンゼンスルホンアミド及び２．６７ｇ（７．９ｍｍｏｌ、１当量）のＢｏｃ−Ｌ−グルタミン酸１−ベンジルエステルを乾燥ジクロロメタン中、窒素下で溶解した。１９８．９ｍｇ（１．５８ｍｍｏｌ、０．２当量）のＤＭＡＰ及び１．８１０ｇ（８．７ｍｍｏｌ、１．１当量）のＤＣＣを室温で添加した。反応物を一晩撹拌したら、白色析出物が現れた。濾過によって析出物を取り除き、溶媒を蒸発させ、５．９９ｇの混合黄色油／固体化合物を得た。シリカ上のフラッシュクロマトグラフィ（溶離液
純ＡｃＯＥｔ、Ｒf＝０．７１）でこの化合物を精製し、４．８３ｇの淡黄色油を得た（収率＝９７％）。
【０１５９】
実施例１３
【０１６０】
【化１７】
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【０１６１】
１−イミノ−１７，１７−ジメチル−１−（４−メチルフェニルスルホンアミド）−１０，１５−ジオキソ−９，１６−ジオキサ−２，１４−ジアザオクタデカン−１３−カルボン酸の合成
１０３．６ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）の１−ベンジル５−（６−（３−トシルグアニジノ）ヘキシル）２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ペンタンジオエートをＭｅＯＨ中、窒素下で溶解した。活性炭上の１０％パラジウムを数ｍｇ添加した。３回真空水素通気を行った後、反応物をＨ2雰囲気下で２日間激しく撹拌した。反応物をセライトで濾過し、溶媒を蒸発させ、７４．４ｍｇの無色油を得た（収率＝８６％）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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