(57)【要約】  本発明は、ｉ）細胞をｓｉＲＮＡ分子、担体および光感作薬と接触させることと、ｉｉ）細胞に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射することを含み、前記担体が非リポソーム剤形中のリポポリアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、βシクロデキストリンアミンポリマー、アミン基含有デンドリマー、および陽イオン性ペプチドなどの陽イオン性ポリアミンを含む、ｓｉＲＮＡ分子を細胞のサイトゾル内に導入する方法に関する。本方法によって得ることができる細胞または細胞集団、ｓｉＲＮＡ分子および担体分子を含む組成物、キットおよび上記の物の治療上の使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉＲＮＡ分子を細胞のサイトゾル内に導入する方法であって、
ｉ）前記細胞をｓｉＲＮＡ分子、担体および光感作薬と接触させることと、
ｉｉ）細胞に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射することを含む方法であって、
前記担体が、
（ａ）非リポソーム剤形中のリポポリアミン、
（ｂ）ＧＰＣによるＭｎ値が５００〜２００００であるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、
（ｃ）以下の式のβシクロデキストリンアミンポリマー
【化１】
2010504080.tif 000015
［式中、Ｘは１〜１００の整数（端値を含む）であり、ｎは４〜１０の整数（端値を含む）である］、
（ｄ）アミン基含有デンドリマー、および
（ｅ）陽イオン性ペプチド
から選択された陽イオン性ポリアミンである方法。
【請求項２】
リポポリアミンが第一級もしくは第二級アミン基、またはその混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リポポリアミンのポリアミン領域が少なくとも２個の窒素原子および生理的ｐＨで少なくとも＋１の電荷を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記担体の少なくとも１個の窒素含有基が生理的ｐＨで帯電していない、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
リポポリアミンの末端（last）アミンがプロトン化されるｐＫａが５．５以下である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
リポポリアミンのポリアミン領域が式（Ｉ）を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法：
【化２】
2010504080.tif 000016
［式中、
ｍは２以上の整数であり、ｎは１以上の整数であり、ｍは前記式中に現れる際に同一または異なっていてよく、それぞれの位置においてＲ1は水素またはリポポリアミンのリポ部分との連結基、またはリポ部分自体であり、それぞれの炭素原子で同一または異なっていてよく、
Ｒ２は、水素またはリポポリアミンのリポ部分との連結基またはリポ部分自体であり、
Ｒ１およびＲ２の一方のみがリポポリアミンのリポ部分との連結基、またはリポ部分自体であり、Ｒ１またはＲ２が前記リポ部分に結合した連結基またはリポ部分自体である場合、式（Ｉ）は前記リポポリアミンである］。
【請求項７】
ｍが２〜６の間（端値を含む）であり、ｎが１〜５の間である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｎが３である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ２がＨである、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリアミン領域が以下の式によって表される、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法：
【化３】
2010504080.tif 000017
［式中、Ｒ1a〜Ｒ1jは、請求項７で定義したＲ1のとおりである］。
【請求項１１】
Ｒ1aがリンカーであり、残りのＲ1基が水素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ1またはＲ2が水素原子または一般式ＩＩの基を表す、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法：
【化４】
2010504080.tif 000018
［式中、
Ｒ3およびＲ4は、同一または異なっていてよく、それぞれが飽和脂肪族基ＣpＨ2p+2、不飽和脂肪族基ＣpＨ2pまたはＣpＨ2p-2を表し、ｐは１２〜２２の整数（端値を含む）であり、
Ｒ5は、水素原子または、１〜４個の炭素原子を含む、任意にフェニル基で置換されたアルキル基を表す（ただし、Ｒ1およびＲ2の一方のみが一般式（ＩＩ）の基を表すことができる）］。
【請求項１３】
Ｒ1およびＲ2がそれぞれ水素原子または一般式ＩＩＩの基を表す、請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法：
【化５】
2010504080.tif 000019
［式中、
Ｘは、メチレン基（−ＣＨ2−）またはカルボニル基（−ＣＯ−）を表し、Ｒ6およびＲ7は、同一または異なっていてよく、それぞれが飽和脂肪族基Ｃp’Ｈ2p’+2、不飽和脂肪族基Ｃp’Ｈ2p’またはＣp’Ｈ2p’-2を表し、ｐ’は１１〜２１の整数（端値を含む）である（ただし、Ｒ1およびＲ2の一方のみが一般式（ＩＩＩ）の基を表すことができる）］。
【請求項１４】
ｎが２〜５の整数（端値を含む）であり、異なる断片
【化６】
2010504080.tif 000020
中のｍの値が同一である、請求項６から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ｎが２〜５の間（端値を含む）であり、異なる断片
【化７】
2010504080.tif 000021
中のｍの値が異なる、請求項６から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ｎが３に等しく、断片
【化８】
2010504080.tif 000022
中のｍの値が同一または異なり、３または４を表し、
Ｒ1またはＲ2のどちらかが、
（ｉ）一般式（ＩＩ）の基［式中、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ１２〜２２個の炭素原子を含むアルキル基を表し、Ｒ5は水素原子を表す］、または
（ｉｉ）一般式（ＩＩＩ）の基［式中、Ｒ6−Ｘ−およびＲ7−Ｘ−は、それぞれ１２〜２２個の炭素原子を含むアルカノイル基を表す］
を表す、請求項６から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リポポリアミンの親油性領域が、任意の飽和または不飽和の炭化水素鎖、コレステロールまたは他のステロイド、ラメラ相または六方相を形成することができる天然脂質もしくは合成脂質である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
炭化水素鎖の長さが１０〜３０個の炭素の長さである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
リポポリアミンが、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）、２，３−ジオレイル−オキシ−Ｎ［２−スペルミンカルボキシイル（carboxyyl）−アミド］エチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミン）（ＤＯＳＰＥＲ）およびＲＰＲ−１２０５３５から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
リポポリアミンが、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
担体がＪｅｔＳＩ（商標）もしくはＪｅｔＳＩ−ＥＮＤＯ（商標）、またはＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記担体分子が分枝ＰＥＩ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＥＩの分子量が５０ｋＤａ未満、好ましくは２５ｋＤａ未満である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記担体分子がＰＡＭＡＭデンドリマー分子、好ましくは世代２〜６のＰＡＭＡＭデンドリマー分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記担体分子が、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−ヒスチジン、ヒスチジル化ポリ−リシンおよびポリ−オルニチン、あるいはＬもしくはＤリシン、ＬもしくはＤアルギニン、ＬもしくはＤヒスチジンおよび／またはオルニチン残基と１つ以上の他のアミノ酸とのコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ｓｉＲＮＡ分子が長さ１２〜２８ヌクレオチドである、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
光感作薬が、ポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、リソソーム向性（lysomotropic）弱塩基、ナフタロシアニン、陽イオン性色素、テトラサイクリン、５−アミノレブリン酸および／もしくはそのエステル、または前記光感作薬のいずれかの誘導体、好ましくはＴＰＰＳ4、ＴＰＰＳ2a、ＡｌＰｃＳ2a、ＴＰＣＳ2a、５−アミノレブリン酸もしくは５−アミノレブリン酸のエステル、または製薬上許容されるその塩から選択される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｓｉＲＮＡを前記担体と接触させる追加のステップをさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ｓｉＲＮＡ分子および担体分子を、細胞と接触させる前に２０〜４０分間、互いに接触させる、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
１０ｎＭ〜２００ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入に用いる、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ポリカチオン、ポリエチレンイミン、デンドリマー、陽イオン性脂質およびペプチドから選択された光感作薬担体がさらに存在する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ｓｉＲＮＡを担体と混合して複合体を形成させ、次いでそれを細胞に光感作薬と同時にまたは逐次的に投与する、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞を光感作薬と接触させ、前記細胞を、導入する担体およびｓｉＲＮＡ分子と接触させ、前記細胞に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射することによって前記方法を行い、前記照射は、前記ｓｉＲＮＡ分子および前記担体の、前記光感作薬を含む細胞内区画内への細胞取り込みの前に、好ましくは前記分子および前記担体の、任意の細胞内区画内への細胞取り込みの前に行う、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法によって、ｓｉＲＮＡ分子を標的遺伝子を含む細胞内に導入することによって前記標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記ｓｉＲＮＡ分子が、前記標的遺伝子の発現を特異的に阻害する方法。
【請求項３６】
細胞のサイトゾル内に内部移行されているｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる細胞または細胞集団。
【請求項３７】
請求項１から２５のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子および担体分子を含み、任意に別個に請求項１から２５または２８のいずれか一項に記載の光感作薬も含む組成物。
【請求項３８】
光感作薬を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
請求項３６に記載の細胞または細胞集団を含む組成物。
【請求項４０】
治療で使用するための、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１から２５または２８のいずれか一項に記載の、ｓｉＲＮＡ分子、担体分子および任意に光感作薬を含むキット。
【請求項４２】
前記患者において１つ以上の標的遺伝子の発現を変更させることによって、疾患、障害または感染症を治療または予防するための医薬品の調製における、請求項１から２５または２８のいずれか一項に記載の、ｓｉＲＮＡ分子および担体ならびに任意に光感作薬の使用。
【請求項４３】
前記患者において１つ以上の標的遺伝子の発現を変更させることによって、疾患、障害または感染症を治療または予防するための医薬品の調製における、請求項３６に記載の細胞または細胞集団の使用。
【請求項４４】
前記医薬品が、異常な遺伝子発現によって代表される、または１つ以上の遺伝子の抑制から利益を受ける疾患または障害、好ましくは癌を治療するためのものである、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
患者において疾患、障害または感染症を治療または予防する方法であって、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法に従ってｓｉＲＮＡ分子および担体を１つ以上の細胞内にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで導入すること、および必要な場合には前記細胞を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項４６】
患者において疾患、障害または感染症を治療または予防する方法であって、請求項３６に記載の細胞または細胞集団を前記患者に導入することを含む方法。
【請求項４７】
異常な遺伝子発現によって代表される、または１つ以上の遺伝子の抑制から利益を受ける疾患、好ましくは癌を治療するために使用する、請求項４５または４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光感作薬および担体分子と光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光での細胞の照射とを用いて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞内、好ましくは細胞のサイトゾル内に導入する方法、ならびに遺伝子活性、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子サイレンシングを変更するための本方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉のプロセスは多くの生物中で起こり、このプロセスでは、二本鎖の非コードＲＮＡが、配列特異的な転写後の様式で、遺伝子発現のサイレンシングを行う。自然において、この現象は、生物のゲノムをトランスポゾン、導入遺伝子およびウイルス遺伝子などの外来の侵入核酸から保護する。
【０００３】
細胞内への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入がこのＲＮＡサイレンシングのプロセスを始動し、導入したｄｓＲＮＡに配列が対応する細胞内のすべてのｍＲＮＡが分解される。ＲＮＡサイレンシング経路は、ｄｓＲＮＡを、リボヌクレアーゼを相同的ｍＲＮＡ標的へと導く低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと変換することを含む。酵素ダイサーは、ｄｓＲＮＡを、一般に長さが２０〜２５個のヌクレオチドであるｓｉＲＮＡへと処理する。その後、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体へと会合し、これは相補的ＲＮＡ分子へと導かれ、ここでこれらは標的ｍＲＮＡを切断および破壊する。ＲＮＡサイレンシングの成分が増幅することにより、少量のｄｓＲＮＡが大量の標的ｍＲＮＡのサイレンシングを行うことができる（ＨａｎｎｏｎおよびＲｏｓｓｉ（２００４）、Ｎａｔｕｒｅ、４３１、３７１〜３７８に掲載）。
【０００４】
ｓｉＲＮＡ分子がこの経路の主要な構成要素であるという知識により、標的のＲＮＡまたはＤＮＡ配列に対応する、化学合成した長さが約２０〜２２塩基対のｓｉＲＮＡ分子の試験がもたらされた。これらの分子は、哺乳動物細胞中で標的配列の発現を乱すように作用することが示された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．Ｍ．他、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ、４１１、４９４〜４９８）。２０個のヌクレオチドのｓｉＲＮＡが、通常、遺伝子特異的なサイレンシングを誘発させるために十分長いが、宿主応答を回避するために十分短い長さである。標的遺伝子産物の発現の低下は大規模である可能性があり、数分子のｓｉＲＮＡによって９０％のサイレンシングが誘発される。
【０００５】
したがって、ｓｉＲＮＡ技術が配列特異的遺伝子サイレンシングの一般的技術として開発された。遺伝子サイレンシングには、研究ツールおよび治療的戦略のどちらとしても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのどちらにおいても多くの用途が存在する。ｓｉＲＮＡ技術を使用した際に見られる高い効力および特異性が、この技術を特に魅力的にしている。
【０００６】
遺伝子サイレンシングが起こるためには、ｓｉＲＮＡ分子が、有用となるために十分な濃度で細胞に入ることが必要であるので、すべての場合において、ｓｉＲＮＡ分子を細胞へ送達することは大きな課題となっている。サイレンシング応答の強度およびその持続期間は細胞に送達されるｓｉＲＮＡの量によって影響を受け、ｓｉＲＮＡを十分に高い濃度で供給することによって、比較的弱いｓｉＲＮＡ分子もその標的をサイレンシングできることが示されている。しかし、このことを、大量のｓｉＲＮＡを細胞内に投与することは、「的外れ」効果（すなわち、タンパク質発現レベルの所望しない変化）または自然免疫経路の活性化などの望ましくない効果をもたらす可能性があることが知られているという事実に対してバランスを取るべきである。
【０００７】
一般に、ｓｉＲＮＡは、リポソーム、陽イオン性脂質、陰イオン性脂質、および微量注入を用いることなどの、核酸の標準の形質移入プロトコルを用いることによって細胞に適用している。ｓｉＲＮＡは二本鎖分子であり、したがって、分子の送達および細胞取り込みは、細胞に取り込ませる血清タンパク質と結合するアンチセンスよりも困難である。様々な異なる戦略が用いられており、市販のキットがこの目的のために存在する。上述のように、遺伝子サイレンシングの効力は細胞中のｓｉＲＮＡの濃度に少なくとも部分的に依存するので、効率的な形質移入が極めて望ましいが、高濃度で細胞に投与することは、望ましくない副作用も引き起こし得る。
【０００８】
また、高レベルでの投与は、多くの場合、高濃度の形質移入試薬も必要とし、これは、細胞生存度の低下および様々な他の副作用を含めて、細胞に対して表現型および非表現型のどちらの有害作用も与える場合がある。さらに、高濃度の試薬を用いた場合、特異的送達が達成されない。
【０００９】
また、ｓｉＲＮＡなどの核酸分子の標的送達は、一般に、十分に信頼性のあるものではない。この目的のためにウイルスを使用することができるが、この手法には安全性に対する懸念があり、全身性ウイルス送達は達成が困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ｓｉＲＮＡは細胞のサイトゾル中で作用し、分子が作用するためには、それがサイトゾルに達する必要がある。上記検討事項に鑑みて、ｓｉＲＮＡを細胞のサイトゾルに送達する改善された方法を開発することが望ましいであろう。そのような改善された方法の望ましい特性には、ｉ）ｓｉＲＮＡ分子をその作用部位へと時間および部位に特異的な送達を行う能力、ｉｉ）高濃度の形質移入試薬および／もしくはｓｉＲＮＡの使用の回避、ならびに／またはｉｉｉ）細胞系におけるｓｉＲＮＡサイレンシングの増強が含まれる。具体的には、そのような方法により、特定のレベルの遺伝子サイレンシングを達成するために必要なｓｉＲＮＡ：脂質の複合体の全体数が低下するか、またはそれが改善される。そのような方法では、特定の量の遺伝子サイレンシングを維持するか、またはそれを改善させながら、ｓｉＲＮＡ：形質移入試薬の比を変更し得る。ｓｉＲＮＡ：脂質の比を増加することは、高濃度の形質移入試薬を使用した場合に観察される阻害剤の効果を最小限にするので、有用である。
【００１１】
あるいは、改善された方法の全体的な目的は、ｓｉＲＮＡを有効かつ調節可能にサイトゾルへ送達する必要性と、たとえば特定の細胞種における、高濃度の形質移入試薬または非特異的な効果のどちらかによって引き起こされる有害な副作用の軽減とのバランスを取る要望として述べることができる。上述のように、ｓｉＲＮＡ：脂質の複合体の全体数の低下および／またはｓｉＲＮＡ：脂質の比の増加がこの目的に寄与するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
これらの目的を達成するために、本発明者らは、担体（形質移入試薬）の使用を光化学的内部移行（ＰＣＩ）の技術と組み合わせた。選択した特定の担体は、ｓｉＲＮＡ分子を細胞の細胞内区画、たとえば細胞のエンドソームおよび／またはリソソームなどのエンドサイトーシス小胞へと送達する。ｓｉＲＮＡ：脂質の複合体を取り込ませ得る別の細胞内区画には、ゴルジ体および小胞体が含まれる。
【００１３】
細胞内小胞からのｓｉＲＮＡ分子の放出がＰＣＩ技術の結果として起こる。これは、細胞を光感作化合物に曝露させ、続いて照射を行うことに依存し、ｓｉＲＮＡ分子の放出は細胞の照射後にのみ起こることが認められ、したがって、その効果が媒介されるサイトゾル内へのこの放出は、空間的または時間的な様式で調節することができる。ｉ）その細胞内小胞内にｓｉＲＮＡを含み、ｉｉ）光化学的内部移行剤に曝露され、ｉｉｉ）照射に曝露された細胞のみが、ｓｉＲＮＡ分子を細胞のサイトゾル内に放出して、それがその細胞内のｍＲＮＡに作用する。
【００１４】
一般に、サイトゾルへのｓｉＲＮＡの送達を最適化するために、形質移入試薬を高濃度で使用する必要がある。本発明者らは、驚くべきことに、低濃度の形質移入試薬（および光化学的内部移行剤）を用いることによって、形質移入ステップを使用してｓｉＲＮＡをエンドソームなどの細胞内小胞へと導くことができることを観察し、その放出が照射の適用によって始動されるまで、ｓｉＲＮＡはそれに含まれる。したがって、本方法は、高濃度の形質移入試薬またはｓｉＲＮＡを使用することを必要とせずに、ｓｉＲＮＡがその作用部位に到達することを可能にする。さらに、ＰＣＩ技術を用いることによってエンドソームなどの細胞内小胞からのｓｉＲＮＡ分子の放出のタイミングおよび位置を調節することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
したがって、第１の態様では、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子を細胞のサイトゾル内に導入する方法であって、前記細胞をｓｉＲＮＡ分子、担体および光感作薬と接触させるステップと、細胞に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射するステップを含む方法を提供する。活性化された後、前記光感作薬を含む前記細胞内の細胞内区画が、これらの区画に含まれるｓｉＲＮＡをサイトゾル内へと放出する。
【００１６】
ＰＣＩとは、光感作薬を、その光感作薬を活性化させるための照射ステップと組み合わせて用い、細胞と共に細胞のサイトゾル内へと同時投与した分子の放出を達成する技術である。この技術により、細胞によってエンドソームなどのオルガネラ内へと取り込まれる分子が、照射後に、これらのオルガネラからサイトゾル内へと放出されることを可能にする。
【００１７】
光化学的内部移行（ＰＣＩ）の基本的な方法は、本明細書中に参考として組み込まれている国際公開第９６／０７４３２号パンフレットおよび国際公開第００／５４８０２号パンフレットに記載されている。上述のように、内部移行させる分子を（本発明に従った使用ではｓｉＲＮＡ分子である）、この場合では担体分子および光感作薬と共に、細胞と接触させる。光感作薬、担体分子および内部移行させる分子が、細胞内の、細胞膜に結合した小区画内に取り込まれる。細胞を適切な波長の光に露光させた際、光感作薬が活性化され、これにより、細胞内区画膜を破壊する反応性種が直接または間接的に生じる。これにより、内部移行した分子がサイトゾル内へと放出されることが可能となる。
【００１８】
これらの方法では、過剰の毒性種の産生を回避するために、たとえば照射時間または光感作薬の用量を減少することによって方法を適切に調整した場合に、広範囲の細胞破壊または細胞死をもたらさない様式で、光化学効果を、そうでなければ膜不透過性（または透過不良）の分子を細胞のサイトゾル内に導入する機構として用いる。
【００１９】
本方法は、有効な遺伝子阻害を達成する一方で、慣用のｓｉＲＮＡ形質移入で必要なよりも低い濃度で担体もしくは形質移入試薬および／またはｓｉＲＮＡを使用することが可能となるので、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入することに特に有利である。さらに、必要な効果を達成するために望ましい時間および位置でのみ放出されるように、ｓｉＲＮＡ分子を放出させる照射のタイミングおよび位置を調節し得る。したがって、細胞のｓｉＲＮＡおよび担体への曝露が最小限となり、望ましくない副作用が最小限となる。これは、ｓｉＲＮＡの放出のタイミングおよび位置を調節することが不可能であり、高濃度の形質移入試薬が必要なｓｉＲＮＡを細胞内に導入するための標準技術と対照的である。担体の量を、使用が提唱される量と比較して減らす（ｓｉＲＮＡ：担体の比を変更する）ことによって、または細胞に適用するｓｉＲＮＡ：担体の複合体の全体数を減らすことによって、ＰＣＩ照射の前にｓｉＲＮＡが細胞内区画から漏れることを最小限にすることも可能であり得る。
【００２０】
ｓｉＲＮＡを送達するために本明細書中に定義した担体をＰＣＩと共に使用することによって、やはり細胞毒性を引き起こさずに強力な遺伝子サイレンシング効果を達成できることが、さらに示されている。たとえば、ＰＥＩ（分子量２５０００）を１μｇ／ｍｌで、１００ｎＭのｓｉＲＮＡと共に、４０秒間までの光用量で用いることで、細胞毒性効果は観察されなかった（図１１Ｂ参照）。これらの条件下では、強力な遺伝子サイレンシング効果が観察された（図１０参照）。
【００２１】
ＲＮＡとは、それぞれがリン酸基および窒素塩基と会合した糖リボースを含むリボヌクレオチドのポリマーである（典型的には、アデニン、グアニン、シトシン、またはウラシル）。ＤＮＡの場合と同様、ＲＮＡは相補的水素結合を形成することができ、ＲＮＡは、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）または一本鎖オーバーハングを有する二本鎖であり得る。「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）とは、ｍＲＮＡ分子と結合することによってタンパク質の発現を特異的に干渉する、約１０〜約３０個のヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ分子をいう。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、１２〜２８個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは１５〜２５個のヌクレオチドの長さ、さらにより好ましくは１９〜２３個のヌクレオチドの長さ、最も好ましくは２１〜２３個のヌクレオチドの長さである。したがって、好ましいｓｉＲＮＡ分子の長さは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９個のヌクレオチドである。
【００２２】
１本の鎖の長さによりｓｉＲＮＡ分子の長さが指定される。たとえば、２１個のリボヌクレオチドの長さ（２１量体）と記載されたｓｉＲＮＡは、１９個の連続的な塩基対にわたって一緒にアニーリングするＲＮＡの２本の互いに逆の鎖を含むことができる。それぞれの鎖上の残りの２個のリボヌクレオチドはオーバーハングを形成する。ｓｉＲＮＡが異なる長さの２本の鎖を含む場合、鎖のうちの長い方によりｓｉＲＮＡの長さが指定される。たとえば、２１個のヌクレオチドの長さの１本の鎖および２０個のヌクレオチドの長さの第２の鎖を含むｄｓＲＮＡは、２１量体を構成する。
【００２３】
オーバーハングを含むｓｉＲＮＡが望ましい。オーバーハングは鎖の５’または３’末端に存在し得る。好ましくは、これはＲＮＡ鎖の３’末端に存在する。オーバーハングの長さは異なり得るが、好ましくは約１〜約５個のヌクレオチドであり、より好ましくは約２個のヌクレオチドの長さである。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは約２〜４個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。より好ましくは、３’オーバーハングは２個のリボヌクレオチドの長さである。さらにより好ましくは、３’オーバーハングを含む２個のリボヌクレオチドは、ウラシル（Ｕ）塩基を保有する。
【００２４】
ｓｉＲＮＡは標的リボヌクレオチド配列と相互作用するように設計されており、言い換えれば、これらは、標的配列と結合するように標的配列と相補的である、すなわち、ｓｉＲＮＡのうちの１本が標的配列の領域と相補的である。
【００２５】
その半減期を増加させるために修飾された主鎖を有するｓｉＲＮＡ分子も作製されている（たとえば、Ｃｈｉｕ他、（２００３）、ＲＮＡ．、９（９）、１０３４〜４８およびＣｚａｕｄｅｒｎａ他、（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１、２７０５〜２７１６に記載のように）。したがって、用語「ｓｉＲＮＡ」には、そのような修飾された分子も含まれる。したがって、ｓｉＲＮＡへの言及は、同じ機能、すなわち標的ｍＲＮＡ配列との相互作用を示すｓｉＲＮＡの誘導体または変異体を包含する。好ましい変異体には、修飾された主鎖が使用されている（上記）または１つもしくは複数の天然に存在しない塩基が使用されているものが含まれる。
【００２６】
本方法は、複数種のｓｉＲＮＡ分子を細胞内に導入するために使用し得る。言い換えれば、異なる配列を有するｓｉＲＮＡ分子を細胞内に同時に導入することができる。複数のｓｉＲＮＡ分子を導入する場合は、これは、複数のｓｉＲＮＡ分子を担体と同時に会合させることによって達成することができる。あるいは、それぞれのｓｉＲＮＡ分子の種類を別々に担体と会合させることができる。
【００２７】
化学合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクター、およびＰＣＲ発現カセットなど、ｓｉＲＮＡを調製する方法がいくつか存在する。そのような技術は当該分野で周知である。たとえば、Ｐｏｎ他、（２００５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．、２４（５〜７）：７７７〜８１、Ｄｕ他、（２００６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３４５（１）：９９〜１０５およびＫａｔｏｈ他、（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｕｐｐｌ．（３）：２４９〜５０を参照されたい。
【００２８】
同様に、所望の結果を達成するためにｓｉＲＮＡ分子を設計する方法も十分に文書化されている。最初にｓｉＲＮＡ標的部位を選択しなければならない。これは、様々な技術を用いて実施することができる（たとえば、Ｊａｇｌａ他、（２００５）、ＲＮＡ．、１１（６）：８６４〜７２およびＴａｋａｓａｋｉ他、（２００６）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３０（３）：１６９〜７８参照）。
【００２９】
本発明の方法では、サイトゾル内へのｓｉＲＮＡ分子の転位置を達成する。しかし、細胞と接触するそれぞれかつすべての分子の取り込みは達成不可能であることを理解されたい。しかし、ＰＣＩまたは担体を使用しないバックグラウンドレベルと比較して顕著かつ改善した取り込みが達成可能である。
【００３０】
好ましくは、本発明の方法は、その効果がそれらの細胞の発現産物で明白なほど十分なレベルでのｓｉＲＮＡ分子の取り込みを可能にする。この目的を達成するため、たとえば、細胞と共にたとえば２４、４８、７２または９６時間（たとえば２４〜４８時間）インキュベートした後に、少なくとも１０％の標的遺伝子の発現の減少、たとえば少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％の減少（たとえば標的遺伝子によってコードされている１つまたは複数のタンパク質の発現の減少）を達成するために、細胞と接触させるｓｉＲＮＡの適切な濃度を調整し得る。同様に、上述の減少を達成するために、担体の種類および／または濃度、光感作薬の種類および／または濃度ならびに照射時間を調整することができる。
【００３１】
これは、ウエスタンブロッティングなどの当該分野で知られている標準技術を用いて細胞中のタンパク質レベルを決定することによって測定することができる。タンパク質減少レベルはタンパク質の半減期に依存する、すなわち、既存のタンパク質がその半減期に従って除去される。したがって、半減期が考慮されるようにｓｉＲＮＡを用いない、同じ時点での発現に対して、発現の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％の減少が達成される。
【００３２】
あるいは、これは、細胞中に存在するｍＲＮＡの量に対するｓｉＲＮＡ分子の効果の観点から測定することができ、たとえば、ｓｉＲＮＡを用いない同じ時点での標的配列のｍＲＮＡレベルに対して、細胞と共にたとえば２４、４８、７２または９６時間、たとえば２４〜４８時間）インキュベートした後に、ｍＲＮＡレベルの少なくとも１０％の減少、たとえば少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％の減少を達するために、この方法を実施することができる。これは、ハイブリダイゼーションまたはブロッティング技術およびＲＴ−ＰＣＲなどの当該分野で知られている標準技術を用いて測定することもできる。
【００３３】
本方法は、ｓｉＲＮＡ分子を形質移入する標準方法よりも有意に少ない担体または形質移入剤（および／あるいは、複合体の全体数を減少させるのか、またはｓｉＲＮＡ：担体もしくは形質移入剤の比を変更するのか、または両方なのかに応じて、より少ないｓｉＲＮＡ）しか使用を必要としないので、タンパク質の発現またはｍＲＮＡレベルの特定の減少量を達成するために必要な担体または形質移入剤の量に関して、本発明の方法を用いて形質移入の改善を表すことも可能である。たとえば、本発明の方法は、好ましくは、たとえば、ＰＣＩを用いずに、標的タンパク質の発現またはｍＲＮＡレベルの同レベルの減少を達成するために必要な担体の量よりも少なくとも１０、２０、３０、４０、５０または６０％低い担体濃度および／またはｓｉＲＮＡ濃度を用いて、標的タンパク質の発現またはｍＲＮＡレベルの特定の減少（たとえば上述のように少なくとも１０％、たとえば少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％）を可能とする。
【００３４】
また、ＰＣＩを存在させる場合および存在させない場合の、特定のｓｉＲＮＡおよび担体の濃度で見られる、タンパク質の発現またはｍＲＮＡレベルの減少のレベル間で比較を行うこともできる。たとえば、本発明の方法は、好ましくは、ＰＣＩ技術の照射ステップを存在させずに本方法を実施することによって達成されるタンパク質の発現またはｍＲＮＡレベルと比較して、上述のように少なくとも１０％、たとえば少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％の標的タンパク質の発現またはｍＲＮＡレベルの減少を可能とする。
【００３５】
本明細書中で使用する用語「細胞」には、すべての真核細胞（昆虫細胞および真菌細胞を含む）が含まれる。したがって、代表的な「細胞」には、あらゆる種類の哺乳動物および非哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞ならびに原虫が含まれる。しかし、好ましくは、細胞は哺乳動物、たとえばネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットからの細胞であり、最も好ましくはヒトからの細胞である。
【００３６】
本明細書中で使用する「接触させる」とは、細胞内への内部移行に適した条件下、たとえば、好ましくは３７℃、適切な栄養培地中、たとえば２５〜３９℃で、細胞と光感作薬および／またはｓｉＲＮＡならびに担体とを互いに物理接触させることをいう。
【００３７】
光感作薬とは、適切な波長および強度での照射で活性化されて活性種を生じる薬剤である。好都合には、そのような薬剤は、特にエンドソームまたはリソソームなどの細胞内区画に局在化するものであり得る。様々なそのような光感作薬が当該分野で知られており、本明細書中に参考として組み込まれている国際公開第９６／０７４３２号パンフレットを含めた文献に記載されている。培養中の細胞のエンドソームおよびリソソームの位置を見つけることが示されているジ−およびテトラスルホン化アルミニウムフタロシアニン（たとえばＡｌＰｃＳ2a）、スルホン化テトラフェニルポルフィン（ＴＰＰＳn）、ナイルブルー、クロリンｅ6誘導体、ウロポルフィリンＩ、フィロエリスリン、ヘマトポルフィリンおよびメチレンブルーに関して言及されている可能性がある。これは、ほとんどの場合、光感作薬のエンドサイトーシスの取り込みによるものである。したがって、光感作薬とは、好ましくは、細胞の内部区画、たとえばリソソームおよび／またはエンドソーム内に取り込まれる薬剤である。本発明で使用するためのさらなる適切な光感作薬は、やはり本明細書中に参考として組み込まれている国際公開第０３／０２０３０９号パンフレットに記載されており、具体的には、スルホン化メソ−テトラフェニルクロリン、好ましくはＴＰＣＳ2aである。
【００３８】
しかし、他の細胞内区画、たとえば小胞体またはゴルジ体の位置を見つける他の光感作薬も用い得る。また、光化学的処理の効果が細胞の他の構成要素（すなわち、膜に限定された、すなわち膜に取り囲まれる区画以外の構成要素）に対するものである機構も作用していることが考えられる。したがって、たとえば、１つの可能性は、光化学的処理が細胞内輸送または小胞融合に重要な分子を破壊することであり得る。そのような分子は、必ずしも膜に限定された区画に位置していない可能性があり、それでも、そのような分子の光化学的損傷は、たとえば、そのような分子に対する光化学的効果により内部移行させる分子（すなわちｓｉＲＮＡ分子）の、リソソームなどの分解性小胞への輸送の減少がもたらされる機構によって、担体：ｓｉＲＮＡの複合体の光化学的内部移行をもたらし得る。これにより、内部移行させる分子は分解される前にサイトゾルへと逃げることができる。
【００３９】
必ずしも膜に限定された区画に位置しない分子の例は、ダイニンおよびダイナクチンの構成要素などの微小管輸送系のいくつかの分子；ならびにたとえばｒａｂ５、ｒａｂ７、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（ＮＳＦ）、可溶性ＮＳＦ付着タンパク質（ＳＮＡＰ）等である。
【００４０】
したがって、言及し得る適切な光感作薬のクラスには、ポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、クロリン（特に以下に記載のプロフィリンのクロリン誘導体）、ベンゾポルフィリン、リソソーム向性（ｌｙｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ）弱塩基、ナフタロシアニン、陽イオン性色素およびテトラサイクリンまたはその誘導体が含まれる（Ｂｅｒｇ他、（１９９７）、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、６５、４０３〜４０９）。他の適切な光感作薬には、テキサフィリン、フェオホルビド、ポルフィセン、バクテリオクロリン、ケトクロリン、ヘマトポルフィリン誘導体、およびその誘導体、５−アミノレブリン酸によって誘発される内在性光感作薬およびその誘導体、光感作薬間の二量体または他のコンジュゲートが含まれる。
【００４１】
好ましい光感作薬には、ＴＰＰＳ4、ＴＰＰＳ2a、ＡｌＰｃＳ2a、ＴＰＣＳ2aおよび他の両親媒性光感作薬が含まれる。他の適切な光感作薬には、化合物５−アミノレブリン酸もしくは５−アミノレブリン酸のエステルまたは製薬上許容されるその塩が含まれる。
【００４２】
光感作薬を活性化させるための細胞の「照射」とは、本明細書中以下に記載するように、光を直接または間接的に施すことをいう。したがって、細胞に光源を、たとえば、直接（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏで単一細胞に）、または間接的に、たとえば細胞が皮膚の表面下にある場合、もしくはすべてが直接照射されない、すなわち他の細胞によって覆われていない細胞層の形態である場合はｉｎ  ｖｉｖｏで、照射し得る。
【００４３】
本方法では、細胞内に導入するｓｉＲＮＡ分子は、光感作薬またはｓｉＲＮＡ分子の細胞内への取り込みを促進または増加させるように作用する、１つまたは複数の担体分子または形質移入剤に付着、会合、またはコンジュゲートしている。この付着、会合またはコンジュゲートは、ｓｉＲＮＡ分子およびその担体を細胞と接触させる前に、または前記接触時に、これらの分子を接触させることによって行い得る。
【００４４】
用語担体および形質移入剤は、本明細書中で互換性があるように使用する。
担体分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡおよび光感作薬の両方と会合、結合、またはコンジュゲートしていてよい。したがって、たとえばｓｉＲＮＡは、電荷：電荷の相互作用によって担体に付着していてよい。上述のように、複数の担体を同時に用いてよく、担体は、複数のｓｉＲＮＡ分子または複数種のｓｉＲＮＡ分子と会合、結合またはコンジュゲートしていてよい。
【００４５】
好ましくは、担体は、２つ以上のアミン基（すなわちポリアミンである）を含み、陽イオン性であり、好ましくは様々なｐＨ値でプロトン化可能な（すなわち、適切な反応条件下１つまたは複数の追加の水素原子を保有するようにプロトン化し得る）化合物を、好ましくは非リポソーム配合物中で含む。様々なｐＨ値には、単一分子内および／または様々な分子内のプロトン化可能な原子の様々な値が当てはまる。
【００４６】
本明細書中で使用する用語「プロトン化可能」とは、その基が水素原子を受容できることを意味し、すなわちプロトン化可能な基は水素受容基である。基が水素を受容する能力は、基の性質だけでなく、基が曝されるｐＨにも依存することが明らかである。好ましくは、前記プロトン化可能な基は窒素原子を含み、この原子が水素原子を受容する。
【００４７】
本明細書中で言及する「陽イオン性」とは、分子の全体的な、すなわち実効電荷が＋１以上であることを示す。これは、好ましくは生理的ｐＨ、すなわちｐＨ７．２で測定する。分子は、より高い電荷、たとえば＋２以上、＋３以上、＋４以上、＋５以上、＋６以上、＋７以上、＋８以上、＋９以上、＋１０以上、＋１１以上、＋１２以上、＋１３以上、＋１４以上、＋１５以上、＋２０以上、＋２５以上、＋５０以上、＋７５以上、＋１００以上、＋１５０以上、＋２００以上、＋２５０以上、＋３００以上、＋４００以上、＋５００以上、＋７５０以上または＋１０００以上を有し得る。
【００４８】
本発明の方法に従って使用する陽イオン性ポリアミンは本明細書中以下で定義するとおりであり、以下が含まれる。
（ａ）非リポソーム配合物中のリポポリアミン、
（ｂ）ＧＰＣによって５００〜２００００のＭｎ値を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、
（ｃ）以下の式のβシクロデキストリンアミンポリマー
【００４９】
【化１】
2010504080.tif 000002
【００５０】
［式中、Ｘは１〜１００の整数（端値を含む）であり、ｎは４〜１０の整数（端値を含む）である］、
（ｄ）アミン基含有デンドリマー、および
（ｅ）陽イオン性ペプチド。
【００５１】
好ましくは、本明細書中で言及するポリアミンは、第一級もしくは第二級アミン基、またはその混合物（たとえば少なくとも２つの第一級アミン基）を含む。好ましくは、ポリアミン領域は、少なくとも２、３、４、５または６個の窒素原子、および生理的ｐＨで少なくとも＋１、＋２、＋３、＋４、もしくは＋５（または少なくとも＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋２０、＋２５、＋５０、＋７５、＋１００、＋１５０、＋２００、＋２５０、＋３００、＋４００、＋５００、＋７５０もしくは＋１０００）の電荷を有し、たとえばアミン基の一部またはすべてが帯電している。好ましくは、少なくとも１個（たとえば少なくとも２、３または４個）の窒素含有基、たとえばＮＨは、生理的ｐＨで帯電していない。ポリアミン、たとえばリポポリアミンの最後のアミンがプロトン化されるｐＫａは、好ましくは約５．５である、すなわち、ｐＨを低下していく際、または酸性化合物を加えていく際、プロトン化される最後のアミンは、ｐＨ５．５以下でプロトン化される。
【００５２】
一実施形態では、担体は非リポソーム配合物中のリポポリアミンを含む。リポポリアミンとは、少なくとも１つの親水性ポリアミン領域（すなわち２つ以上のアミン基を含む）および１つの親油性領域を含む両親媒性分子を意味する。親油性領域は、１つまたは複数の親油性の鎖を含み得る。
【００５３】
リポポリアミンのポリアミン領域は、好ましくは式（Ｉ）を有し、
【００５４】
【化２】
2010504080.tif 000003
【００５５】
式中、ｍは２以上の整数であり、ｎは１以上の整数であり、ｍは２つのアミン間に含まれる様々な炭素基間で異なることが可能である、すなわち、それぞれの（ＣＨ）m−ＮＨ基が異なるｍの値を有してよく、ｍは前記式中に現れる際に同一または異なっていてよい。それぞれの位置Ｒ１には、本明細書中以下に記載するように水素またはリポポリアミンの脂肪部分との連結基または脂肪部分自体があり、それぞれの炭素原子で同一または異なっていてよい。Ｒ２は、本明細書中以下に記載のように水素またはリポポリアミンの脂肪部分との連結基または脂肪部分自体である。優先的には、ｍは２〜６（端値を含む）であり、より好ましくは３または４であり、ｎは１〜５（端値を含む）であり、より好ましくは３である。
【００５６】
好ましくは、Ｒ1およびＲ2の一方のみが、リンカー、ポリアミンの脂肪部分に付着したリンカー、またはポリアミンの脂肪部分である。好ましくは、１つのＲ1基のみが、リンカー、ポリアミンの脂肪部分に付着したリンカーまたはポリアミンの脂肪部分である。Ｒ2は好ましくはＨである。
【００５７】
Ｒ１またはＲ２が脂肪部分自体である場合、またはポリアミンの脂肪部分に付着したリンカーである場合、式（Ｉ）はリポポリアミンである。したがって、Ｒ1またはＲ2が脂肪部分または脂肪部分が付着した連結基でない場合にのみ、式（Ｉ）はポリアミン領域である。
【００５８】
さらにより優先的には、ポリアミン領域は以下の式によって表される
【００５９】
【化３】
2010504080.tif 000004
【００６０】
［式中、Ｒ2およびＲ1a〜Ｒ1jは、上記でＲ1を定義したとおりであり、好ましくは、Ｒ1aはリンカーであり、残りのＲ1基およびＲ2は水素である］。
連結基は、通常条件下で安定な結合からなる。
【００６１】
好ましくは、Ｒ1またはＲ2は水素原子または一般式ＩＩのラジカルを表す：
【００６２】
【化４】
2010504080.tif 000005
【００６３】
［式中、Ｒ3およびＲ4は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが飽和脂肪族ラジカルＣpＨ2p+2または不飽和脂肪族ラジカルＣpＨ2pもしくはＣpＨ2p-2を表し、ｐは１２〜２２の整数（端値を含む）であり、Ｒ5は、水素原子、または１〜４個の炭素原子を含む、任意選択でフェニルラジカルで置換されたアルキルラジカルを表す］。
【００６４】
あるいは、Ｒ1またはＲ2は、それぞれ一般式ＩＩＩのラジカルであり得る：
【００６５】
【化５】
2010504080.tif 000006
【００６６】
［式中、Ｘは、メチレン基（−ＣＨ2−）またはカルボニル基（−ＣＯ−）を表し、Ｒ6およびＲ7は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが飽和脂肪族ラジカルＣp’Ｈ2p’+2または不飽和脂肪族ラジカルＣp’Ｈ2p’もしくはＣp’Ｈ2p’-2を表し、ｐ’は１１〜２１の整数（端値を含む）である］。
【００６７】
Ｍおよびｎの値にかかわらず、記号Ｒ1およびＲ2の一方のみが一般式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のラジカルを表すことができる。
ｎが２〜５である場合、異なる断片
【００６８】
【化６】
2010504080.tif 000007
【００６９】
中のｍの値は、同じであっても異なっていてもよい。
式（Ｉ）の好ましい実施形態では、ｎは３に等しく、断片
【００７０】
【化７】
2010504080.tif 000008
【００７１】
中のｍの値は同一または異なっており、３または４を表し、Ｒ1もしくはＲ2のどちらかが、一般式（ＩＩ）のラジカル［式中、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ１２〜２２個の炭素原子を含むアルキルラジカルを表し、Ｒ5は水素原子を表す］を表すか、またはＲ1もしくはＲ2のどちらかが、一般式（ＩＩＩ）のラジカル［式中、Ｒ6−Ｘ−およびＲ7−Ｘ−は、それぞれ１２〜２２個の炭素原子を含むアルカノイルラジカルを表す］を表す。
【００７２】
５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）が特に好ましい。
【００７３】
上記リポポリアミンの合成は米国特許第５，４７６，９６２号に記載されている。
本発明に従って使用するリポポリアミンのさらなる例には、２，３−ジオレイル−オキシ−Ｎ［２−スペルミンカルボキシイル−アミド］エチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオル酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミン）（ＤＯＳＰＥＲ）およびＲＰＲ−１２０５３５が含まれる（Ａｈｍｅｄ他（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２（６）、９７２〜９８０）。好ましいリポポリアミンの構造を図７に示す。
【００７４】
ＤＯＳＰＡでは、連結基は
【００７５】
【化８】
2010504080.tif 000009
【００７６】
である。
ＤＯＳＰＥＲでは、連結基は
【００７７】
【化９】
2010504080.tif 000010
【００７８】
である。
したがって、上記構造は連結基のさらなる適切な例を表す。
親油性領域は、上記Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5またはＲ6に定義したとおりであるか、または任意の飽和もしくは不飽和の炭化水素鎖、コレステロールもしくは他のステロイド、ラメラ相もしくは六方相を形成することができる天然脂質もしくは合成脂質であることができる。炭化水素鎖の長さは、１０〜３０個の炭素の長さ、たとえば１２〜２８、１４〜２６、１６〜２４、１８〜２２個の炭素の長さであり得る。
【００７９】
担体は、好ましくはＪｅｔＳＩ（商標）またはＪｅｔＳＩ−ＥＮＤＯ（商標）であり、これらはどちらもＰｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎから入手可能である。あるいは、担体はＰｒｏｍｅｇａから入手可能なＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）であり得る。
【００８０】
リポソーム形成とは、陽イオン性の帯電した両親媒性物質（すなわちリポポリアミン）をＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）などの中性ヘルパー脂質と合わせてリポソームを形成することを意味する。したがって、リポポリアミンの非リポソーム配合物とは、リポポリアミンリポソームの形態で存在しない、リポポリアミン含有配合物である。言い換えれば、そのような配合物は、リポポリアミンに加えては、どの中性ヘルパー脂質も含まない。ヘルパー脂質の例は、中性リン脂質、コレステロール、グリセロホスホエタノールアミンおよびジアシルグリセロールである。好ましくは、リポポリアミン配合物は本明細書中に記載のリポポリアミンのみを含む。
【００８１】
一般に、形質移入剤をＤＯＰＥなどのヘルパー脂質と組み合わせることで形質移入効率が増加することが知られており、したがって、本発明の方法で使用した場合にこれらの化合物を配合物から除外することによって改善された、より選択的な度合の阻害を達成できることは、驚くべきことである。
【００８２】
担体は、好ましくは、リポフェクタミン２０００、リポフェクチン、ｊｅｔＰＥＩ、またはこれら市販の形質移入試薬の組成を有する担体ではない。リポフェクタミン２０００の組成は、３：１（ｗ／ｗ）の、ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）（ケミカルアブストラクト登録名：Ｎ−［２−（２，５−ビス［（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オクスペンチル−アミノ）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸）のリポソーム配合物、および中性脂肪ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【００８３】
リポフェクチンの組成は、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロマイド）およびＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）の１：１混合物である。
【００８４】
また、担体は、ｓｉＰＯＲＴまたはこの市販の形質移入試薬の組成を有する担体でもない。
代替実施形態では、担体は、生理的ｐＨで陽イオン性（かつ好ましくはプロトン化可能）であるポリアミン化合物、たとえばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩは、多くの様々な構造変異体として存在するが、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によって６００以上のＭｎ値（数平均分子量）を有する変異体が最も興味深い。たとえば、ＰＥＩは、５００〜７００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１００〜１２５０、１０００〜１２５０、１２５０〜１５００、１０００〜２００００、１１００〜１５０００、１２００〜１２５００、１２５０〜１００００、１５００〜７５００、１７５０〜５０００、２０００〜４０００または２５００〜３５００のＭｎ値を有し得る。
【００８５】
数平均分子量は、ポリマーの分子量を決定する一方法である。ポリマー分子は、同じ種類のものでも様々な大きさ（直鎖状ポリマーでは鎖の長さ）で存在するので、平均分子量は平均する方法に依存する。数平均分子量は、個々のポリマーの分子量の一般的な平均である。ｎ個のポリマー分子の分子量を測定し、重量を合計し、ｎで割り算することによって決定する。
【００８６】
【数１】
2010504080.tif 000011
【００８７】
ＰＥＩの直鎖形または非直鎖状、たとえば分枝鎖状のＰＥＩ（これはたとえば、本明細書中に記載の分子量値の低分子量であることができる）を使用し得る。
分枝鎖状ＰＥＩとは、第三級アミン基、ならびに第一級および第二級アミン基を含むＰＥＩを意味する。第一級および／または第二級アミン基に対する第三級アミン基の数は、ポリマー中の分枝の量または度合の指標である。一般に、分枝鎖状ＰＥＩは、０．５〜１．５：１．５〜２．５：０．５〜１．５の比、たとえば１：２：１で第一級、第二級および第三級アミン基を含むが（すなわち第二級および第三級アミン基の比は２：１）、第三級アミン基をより多くまたは少なく含む分枝構造を有する分枝鎖状ＰＥＩも存在し、本発明で使用することができる。別の比の例は、１：１〜３：１（第二級：第三級アミン基）、たとえば１．２：１〜２．８：１、１．４：１〜２．６：１、１．６：１〜２．４：１、１．８：１〜２．２：１である。
【００８８】
ＰＥＩの分子量は、好ましくは３０ｋＤａまたは２５ｋＤａより低い、たとえば１５、１０、５または２ｋＤａより低い。
適切なＰＥＩの例はＳｉｇｍａから入手可能である（４０８７１９ポリエチレンイミン（平均ＭｗはＬＳで約８００Ｄａまで、平均ＭｎはＧＰＣで約６００まで、低分子量、非含水）。他の市販のＰＥＩ系試薬には、Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ  ＰＥＩ（分枝鎖状、Ｍｗ１０，０００）、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｘｇｅｎ５００、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｊｅｔＰＥＩ（商標）、Ｓｉｇｍａ  ＥＳＣＯＲＴ（商標）Ｖ形質移入試薬、およびＭｉｎｉｓ  ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）が含まれる。
【００８９】
上述のように、好ましい実施形態では、１つまたは複数のβシクロデキストリンアミンポリマーを担体分子として用いることができる、すなわちポリアミン化合物はβシクロデキストリンアミンポリマーである。適切なβシクロデキストリンアミンポリマーおよびそのような分子の合成方法は、Ｈｗａｎｇ他、（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ、１２、２８０〜９０に記載されている。
【００９０】
適切なβシクロデキストリンアミンポリマーおよび適切な単量体からのその合成を示す模式図を、以下に示す：
【００９１】
【化１０】
2010504080.tif 000012
【００９２】
上述のように、ｎは、４〜１０（端値を含む）、好ましくは５〜８（端値を含む）、または６〜７（端値を含む）の整数であることができる。ｎは、最も好ましくは４、６または８である。Ｘは任意の整数であることができる。Ｘは、好ましくは１〜１００、１０〜５０、１５〜２５、１〜２０、たとえば２〜１５、３〜１２、４〜１０、５〜８または６〜７（端値を含む）である。Ｘは、最も好ましくは４または５である。
【００９３】
さらに好ましい実施形態では、１つまたは複数のアミン基含有デンドリマー（たとえばポリアミドアミド（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー）を担体分子として用いることができる、すなわちポリアミン化合物はアミン基含有デンドリマーである。デンドリマーは「デンススター（ｄｅｎｓｅ  ｓｔａｒ）」ポリマーと呼ばれる巨大分子構造のクラスを表す。
【００９４】
伝統的なポリマーとは異なり、デンドリマーは高い度合の分子均一性、狭い分子量分布、具体的な大きさおよび形状特徴、ならびに高度に官能化された末端表面を有する。したがって、デンドリマーは、分枝鎖状単位または単量体から構築されて単分散の樹状または世代構造を構成する人工的に製造または合成した分子である。単分散ポリマーの合成には高いレベルの合成の調節を必要とし、デンドリマーを一度に一単量体層、すなわち一「世代」ずつ構築する段階的な反応によって達成する。それぞれのデンドリマーは、それぞれの官能部位に樹状ウェッジが付着した多官能性の核分子からなる。核分子は「世代０」と呼ばれる。すべての分枝に沿ったそれぞれの連続的な反復単位が次の世代、「世代１」、「世代２」などを、最終世代まで形成する。
【００９５】
したがって、製造プロセスは、中心の開始核から開始する一連の反復ステップである。続くそれぞれの成長ステップは、前の世代より大きな分子直径、２倍の数の反応性表面部位、および約２倍の分子量を有するポリマーの新しい「世代」を表す。たとえば、ＰＡＭＡＭデンドリマーの作製は、Ｅｓｆａｎｄ他、（２００１）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、６（８）、４２７〜３６およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ他、（１９９６）、９３（１０）、４８９７〜９０２に記載されている。
【００９６】
適切なデンドリマーには、アミン基を含むすべてのデンドリマー、たとえば、トリエタノールアミン、ＮＨ３、またはアミン含有単量体が付着したエチレンジアム核を有するデンドリマーが含まれる。ＰＡＭＡＭデンドリマーが特にも好ましい。好ましくは、デンドリマーはポリアミン単量体、たとえば一般式Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）m−ＮＨ−（ＣＯ）n−（ＣＨ2）ｏ［式中、ｍおよびｏは１〜１０の整数、好ましくは１または２であり、ｎは０または１である］を有するものから構成される。
【００９７】
ＰＡＭＡＭデンドリマーを図１４に示す。やはり図中に示すように、それぞれの「世代」は、前の世代のそれぞれの末端アミノ基への２つの新しいＨ2Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−基の付加を表す。
【００９８】
以下の表は、アミン表面官能性ＰＡＭＡＭデンドリマーの計算した特性を世代別に示す。
【００９９】
【表１】
2010504080.tif 000013
【０１００】
好ましくは、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、分子量が１０００〜２３５０００または３０００〜１１７０００、たとえば６０００〜６００００または１４０００〜３００００Ｄａのものである。
【０１０１】
デンドリマーは、その世代に関して定義することもでき、したがって、デンドリマー（たとえばＰＡＭＡＭデンドリマー）は、好ましくは世代０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のもの、特に世代２〜６のものである。
【０１０２】
上述のように、さらなる代替実施形態では、１つまたは複数の陽イオン性ポリペプチドを担体分子として用いることができる、すなわちポリアミン化合物は陽イオン性ポリペプチドである。様々な陽イオン性ペプチドが当該分野で知られている。
【０１０３】
本明細書中で定義する「ペプチド」には、任意の数のアミノ酸、すなわち１つまたは複数のアミノ酸を含む任意の分子が含まれる。しかし、好ましくは、ペプチドは連続的なアミノ酸のポリマーである。
【０１０４】
ペプチドは、任意の好都合な手段、たとえば、直接化学合成または適切な配列の核酸分子を細胞中で発現させることによる組換え手段によって調製し得る。
ペプチドに関して本明細書中で言及する「陽イオン性」とは、生理的ｐＨ、すなわちｐＨ７．２でペプチドの全体的な、すなわち実効電荷が＋１以上であることを示す。アミノ酸は、ペプチドの配列構成中で存在する場合に、生理的ｐＨでの優勢種が陽性に帯電している場合に＋１とみなされる。ペプチド中のそのようなアミノ酸のそれぞれがさらなる正電荷に寄与して、ペプチドの最終電荷が計算される。ペプチドの実効電荷（それぞれのアミノ酸に起因する電荷を合計することによって計算する）が陽性である限りは、ペプチドは１つまたは複数の陰性に帯電したアミノ酸残基、および中性残基を含み得る。
【０１０５】
したがって、ペプチドの電荷はそのアミノ酸組成に依存する。特定のアミノ酸は通常の生理的ｐＨで帯電している。陽性に帯電したアミノ酸はリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）であり、上述のスケールで＋１とみなされる。アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）はほとんどの生理的ｐＨで負電荷を保有し、上記スケールで−１とみなされる。他の天然に存在するアミノ酸は電荷を保有しないとみなされる。ペプチドの全体的な電荷が＋１以上である限りは、任意の数の陽性または陰性に帯電したアミノ酸が存在し得る。
【０１０６】
本発明で使用するペプチドで用いられるアミノ酸は、必ずしも天然に存在するアミノ酸である必要はない。ペプチド中のアミノ酸のうちの１つまたは複数を、天然に存在しない、たとえば誘導体化したアミノ酸で置換し得る。そのようなアミノ酸は、ペプチドの電荷へのその寄与に基づいて同様に評価する。したがって、天然に存在するアミノ酸の場合と同様、優性種が生理的ｐＨで陽性である場合、全体的な電荷が＋１以上である限りは、その電荷が誘導体化した部分（たとえば導入したアミン基）に由来するのか、または天然のアミノ酸中にも存在する部分に由来するのかどうかは重要でない。
【０１０７】
ペプチドの電荷は、＞１、好ましくは＋１〜＋１０００、＋１〜＋５００、＋１〜２５０または＋１〜＋１００、たとえば＋２〜＋８０、たとえば＋３〜＋６０または＋４〜＋５０、＋５〜＋３０、＋６〜＋２０、たとえば＋１０または＋１５である。
【０１０８】
好ましくは、陽イオン性ペプチドは、ＬもしくはＤリシン、ＬもしくはＤアルギニン、ＬもしくはＤヒスチジンおよび／またはオルニチン残基を含む。さらにより好ましくは、ペプチドはこれらの残基のうちの１つまたは複数に富む、たとえば１０〜１００％、２０〜８０％、３０〜７０％、４０〜６０％または５０％の陽性に帯電した残基を含む。そのようなペプチドの例には、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−ヒスチジン、ヒスチジル化ポリ−リシンおよびポリ−オルニチン、あるいはＬもしくはＤリシン、ＬもしくはＤアルギニン、ＬもしくはＤヒスチジンおよび／またはオルニチン残基と他のアミノ酸、たとえばアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンのうちの１つまたは複数とのコポリマーが含まれる。
【０１０９】
前記陽イオン性ポリペプチドは、その分子量に関して定義することができる。したがって、これらの重量は、好ましくは少なくとも１０００Ｄａ、１５００Ｄａ、２０００Ｄａ、２５００Ｄａ、５０００Ｄａ、７５００Ｄａ、１００００Ｄａ、１５０００Ｄａ、２００００Ｄａ、２５０００Ｄａ、３００００Ｄａ、４００００Ｄａ、５００００Ｄａ、６００００Ｄａ、７００００Ｄａ、８００００Ｄａ、９００００Ｄａまたは１０００００Ｄａである。
【０１１０】
あるいは、陽イオン性ポリペプチドは、その長さに関して定義することができる。好ましい陽イオン性ポリペプチドの長さは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個のアミノ酸である。
【０１１１】
極めて好ましい陽イオン性ペプチドは、ポリアルギニン、特にＭｗが少なくとも１５０００ｋＤａのポリアルギニンである。
理論に拘泥するものではないが、担体とｓｉＲＮＡ分子との会合は、陽性に帯電した担体と陰性に帯電したｓｉＲＮＡ分子との相互作用に基づいており、ｓｉＲＮＡ−担体の複合体の形成がもたらされると考えられている。ｓｉＲＮＡ−担体の複合体は細胞表面の陰イオン性プロテオグリカンと相互作用し、エンドサイトーシスによって取り込まれる。
【０１１２】
一般に、担体とｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡおよび光感作薬の両方との会合、結合またはコンジュゲートは、単純に２つの構成要素を適切な条件下および濃度で混合し、構成要素を相互作用させることによって達成される。したがって、好ましい実施形態では、本方法は、前記ｓｉＲＮＡを前記担体と接触させる追加のステップを含む。この接触ステップを実施する条件、ならびに担体およびｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの適切な濃度は、ルーチン試験を行うことによって当業者によって容易に決定することができる。適切な条件の例を実施例に記載する。たとえば、ｓｉＲＮＡ分子および担体分子を、たとえば渦撹拌によって混合し、たとえば室温で静置し得る。その後、ｓｉＲＮＡ分子および担体分子を約１０〜２０、１０〜３０または２０〜４０分間放置した後に、細胞と接触させ得る。
【０１１３】
好ましくは、１０ｎＭ〜２００ｎＭ、たとえば１５〜１５０ｎＭ、２０〜１００ｎＭ、２０〜１００ｎＭ、３０〜９０ｎＭ、４０〜８０ｎＭ、または５０〜７０ｎＭのｓｉＲＮＡを、たとえば標準の６ウェルプレートのウェル中で、形質移入に用いるが、異なる濃度を試験し得る。本方法で使用するｓｉＲＮＡの最適濃度の決定はルーチンの問題である。
【０１１４】
ｓｉＲＮＡおよび担体を適用する細胞は、標準の細胞培養技術を用いて調製する。細胞が接着細胞である場合、これらは好ましくは５０〜７０％または２５〜５０％コンフルエントである。
【０１１５】
担体およびｓｉＲＮＡ分子は、標準プロトコルに基づいて様々な比で混合し得る。たとえば、実施例１〜６に示すように、６ウェルプレートに適用するために、水溶液として作製した８．４μｌの２ｍＭの担体を２ｍｌの培地中の２．８μｇのｓｉＲＮＡと混合することができる。同様に、６ウェルプレートに適用するために、水溶液として作製した４．２μｌの２ｍＭの担体を１ｍｌの培地中の１．４μｇのｓｉＲＮＡと混合することができる。担体は必ず２ｍＭである必要はなく、適切な範囲には０．５〜５ｍＭ、１〜３ｍＭ、１．５〜２．５ｍＭが含まれる（たとえば水溶液として作製）。１ｎｇのｓｉＲＮＡに対して、光感作薬と一緒の溶液中に合計約６ナノモルに等価な量の担体（たとえば１〜１０、２〜８）を用いることができる。
【０１１６】
ＰＥＩでは、６ウェルプレートで適用するための好ましい濃度は、たとえば１ｍｌの培地中で１００ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ（たとえば０．５〜２０または１〜１５μｇ／ｍｌ）である。これは、実施例９に示すように、１２００〜２５０００ダルトン（たとえば１３００〜２０００ダルトン）の分子量を有するＰＥＩに特に有効であることが示されている。使用するＰＥＩの濃度は、実施例９に示す条件を用いて達成される電荷比および／またはＮ／Ｐ比を達成するために変更することができる。
【０１１７】
βシクロデキストリンアミンポリマーでは、６ウェルプレートで適用するための適切な濃度は、たとえば１ｍｌの培地中で５０ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて、１００μｇ／ｍｌ（たとえば１０〜１０００、２０〜８００、３０〜６００、４０〜４００、５０〜２００μｇ／ｍｌ）である。これは、実施例１１に記載のポリマーの使用に基づく。ｎおよびＸの値は分子の電荷に影響を与え、したがって、様々な濃度が適切であり得る。使用するβシクロデキストリンアミンポリマーの濃度は、実施例１１に示す条件を用いて達成される電荷比および／またはＮ／Ｐ比を達成するために変更することができる。
【０１１８】
アミン基含有デンドリマーでは、６ウェルプレートで適用するための適切な濃度は、たとえば１ｍｌの培地中で１００ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて、１００μｇ／ｍｌ（たとえば１０〜１０００、２０〜８００、３０〜６００、４０〜４００、５０〜２００μｇ／ｍｌ）である。使用するアミン基含有デンドリマーの濃度は、実施例１２に示す条件を用いて達成される電荷比および／またはＮ／Ｐ比を達成するために変更することができる。
【０１１９】
陽イオン性ペプチドでは、６ウェルプレートで適用するための適切な濃度は、たとえば１ｍｌの培地中で１００ｎＭのｓｉＲＮＡを用いて、０．３５μｇ／ｍｌまたは０．７μｇ／ｍｌ（たとえば０．１〜２０、０．２〜１５、０．３〜１０μｇ／ｍｌ）である。実施例１３に示すように、これらの濃度は、分子量１５０００〜７００００および＞７００００のポリアルギニン担体を用いた使用で成功した。ペプチドの分子量およびアミノ酸組成は分子の電荷に影響を与え、したがって、様々な濃度が適切であり得る。使用する陽イオン性ペプチドの濃度は、実施例１３に示す条件を用いて達成されるような電荷比および／またはＮ／Ｐ比を達成するために変更することができる。
【０１２０】
２つの構成要素の比は電荷の比として表現してもよく、このことも考慮に入れる必要がある。好ましくは、担体およびｓｉＲＮＡの間の電荷比は、少なくとも１＋／−（すなわち１つの負電荷あたり１つの正電荷）、５＋／−、１０＋／、２０＋／−、３０＋／−、４０＋／−、５０＋／−、６０＋／−、７０＋／−、８０＋／−、９０＋／−、１００＋／−、２００＋／−、３００＋／−、４００＋／−または５００＋／−である。
【０１２１】
電荷比は、それぞれの構成要素（すなわちｓｉＲＮＡおよび担体）の電荷ならびに存在するそれぞれの構成要素の量に依存する。
あるいは、２つの構成要素の比は、Ｎ／Ｐ比、すなわち窒素残基対オリゴヌクレオチドリン酸の比として表現し得る。担体のすべての窒素原子が必ず陽イオンであるわけではないので、Ｎ／Ｐ比は電荷比と同じではない。Ｎ／Ｐ比は、それぞれの化合物の化学組成および存在するそれぞれの化合物の量に依存する。Ｎ／Ｐ比の適切な値には、１〜５００、たとえば２〜４５０、３〜４００、４〜３５０、５〜３００、６〜２５０、７〜２００、８〜１５０、９〜１００、１０〜８０、１５〜６０、２０〜５０、３０〜４０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５が含まれる。
【０１２２】
好ましくは、担体は、使用に選択した濃度では、ＰＣＩの照射ステップなしでは細胞内区画からの放出が起こらず、ＰＣＩの照射ステップ後に細胞内区画からの放出が見られるような濃度である。ｓｉＲＮＡおよび担体の適切な濃度および比は上述した。
【０１２３】
担体は、一般に水溶液（たとえば水）中での形質移入目的のために形成されている。その後、ストック溶液（たとえばエタノール中に２０ｍＭ）を使用に適した濃度に（たとえば水で）希釈することができる。米国特許第５，４７６，９６２号は、リポポリアミンの形成を記載している。
【０１２４】
上述のように、ｓｉＲＮＡ担体も光感作薬の担体として使用し得る。しかし、その代わりに、光感作薬は、担体なしで、またはｓｉＲＮＡのために本発明に従って使用しない別の担体と共に使用し得る。そのような別の担体は本明細書中で光感作薬担体と呼び、ポリリシン（たとえばポリ−Ｌ−リシンもしくはポリ−Ｄ−リシン）、ポリエチレンイミンまたはデンドリマー（たとえばＳｕｐｅｒＦｅｃｔ７などの陽イオン性デンドリマー）などのポリカチオン；ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質またはリポフェクチンおよびペプチドが含まれる。
【０１２５】
特異的な細胞（たとえば癌細胞）または組織をｓｉＲＮＡ分子および／または光感作薬の標的とするために、ｓｉＲＮＡ分子および／または光感作薬および／または担体を、所望の細胞または組織内へのｓｉＲＮＡ分子の特異的な細胞取り込みを促進する特異的標的化分子と会合またはコンジュゲートさせ得る。
【０１２６】
たとえばＣｕｒｉｅｌ（１９９９）、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８６、１５８〜１７１；Ｂｉｌｂａｏ他、（１９９８）、癌の遺伝子治療（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）（Ｗａｌｄｅｎ他編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）；ＰｅｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ（１９９９）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０、４５４〜４５７；Ｗｉｃｋｈａｍ（２０００）、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７、１１０〜１１４に記載のように、多くの異なる標的化分子を用いることができる。
【０１２７】
標的化分子を、ｓｉＲＮＡ分子、担体、光感作薬あるいはそれらの部分の２つ（たとえば、ｓｉＲＮＡおよび担体もしくはｓｉＲＮＡおよび光感作薬もしくは担体および光感作薬）または３つすべてと会合、結合またはコンジュゲートさせてよく、同一または異なる標的化分子を使用し得る。上述のように、複数の標的化分子を同時に使用し得る。
【０１２８】
本発明の方法は以下に記載するように実施し得る。本発明の方法では、ｓｉＲＮＡ分子を、その担体および光感作化合物と一緒に（任意選択で同じ担体もしくは光感作薬担体と共に）、同時にまたは次々と細胞に適用し、ここで、光感作化合物、担体およびｓｉＲＮＡ分子が、エンドソーム、リソソームまたは他の細胞内の膜に限定された区画内に、エンドサイトーシスまたは他の様式で転位される。
【０１２９】
ｓｉＲＮＡ、担体および光感作化合物は、一緒にまたは逐次的に細胞に適用し得る。一般に、上述のようにｓｉＲＮＡを担体と混合して複合体を形成させ、次いで、それを細胞に光感作化合物と同時に投与する。あるいは、ｓｉＲＮＡ：担体の複合体および光感作化合物を逐次的に投与することができる。ｓｉＲＮＡ−担体の複合体および光感作化合物を、細胞によって同一または異なる細胞内区画内に取り込ませ得る（たとえば、これらは同時転位し得る）。
【０１３０】
次いで、光感作化合物を活性化させるために細胞を適切な波長の光に露光させ、それにより細胞内区画膜の破壊、および続いて光感作薬と同じ区画内に位置し得るｓｉＲＮＡのサイトゾルへの放出をもたらすことによって、ｓｉＲＮＡが放出される。したがって、これらの方法では、細胞を光に露光する最終ステップが、ｓｉＲＮＡが光感作薬と同じ細胞内区画から放出されてサイトゾル中に存在することもたらす。
【０１３１】
国際公開第０２／４４３９６号パンフレット（本明細書中に参考として組み込まれている）は、たとえば、内部移行させる分子（および担体）を細胞と接触させる前に、光感作薬を細胞と接触させて照射によって活性化させるように、ステップの順序を変更できる方法を記載している。この適応方法は、照射時に内部移行させる分子が光感作薬と同じ細胞小区画中に存在している必要がないことを利用している。
【０１３２】
したがって、好ましい実施形態では、前記光感作薬、前記担体および前記ｓｉＲＮＡ分子（たとえば担体：ｓｉＲＮＡの複合体として）を細胞に一緒に適用するか、または、前記光感作薬を前記担体および前記ｓｉＲＮＡ分子とは別々に適用する。その結果、これらが細胞によって同じ細胞内区画内に取り込まれる場合があり、その後、前記照射を行い得る。光感作薬、担体およびｓｉＲＮＡ分子は別々であるか、またはこれらをデンドリマー分子として配合することができる（たとえばＮｉｓｈｉｙａｍａ  Ｎ他、（２００５）Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．、４（１２）：９３４〜４１参照）。
【０１３３】
代替実施形態では、前記方法は、前記細胞を光感作薬と接触させるステップと、前記細胞を、導入する担体およびｓｉＲＮＡ分子と接触させるステップと、前記細胞に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射するステップとによって行うことができ、前記照射は、前記ｓｉＲＮＡ分子および前記担体の、前記光感作薬を含む細胞内区画内への細胞取り込みの前に、好ましくは前記分子および前記担体の、任意の細胞内区画内への細胞取り込みの前に行う。
【０１３４】
前記照射は、前記ｓｉＲＮＡ分子および光感作薬が露光時に同じ細胞内区画内に局在しているかどうかにかかわらず、分子および担体分子の、細胞内区画内への細胞取り込みの後に行うことができる。しかし、好ましい一実施形態では、照射は、内部移行させる分子の細胞取り込みの前に行う。
【０１３５】
本明細書中で使用する「内部移行」とは、分子のサイトゾル送達をいう。したがって、この事例では、「内部移行」には、分子を細胞内／膜結合区画から細胞のサイトゾルへと放出させるステップが含まれる。
【０１３６】
本明細書中で使用する「細胞取り込み」または「転位置」とは、細胞膜外部にある分子が、外の細胞膜の内部に見つかるように細胞内に取り込まれる、たとえばエンドサイトーシスまたは他の適切な取り込み機構によって、たとえば細胞内の膜に限定された区画内、たとえば小胞体、ゴルジ体、リソソーム、エンドソームなど内に取り込まれるまたはそれと会合する、内部移行のステップの１つをいう。
【０１３７】
細胞を光感作薬とならびにｓｉＲＮＡ分子および担体と接触させるステップは、任意の好都合または所望される方法によって実施し得る。したがって、接触ステップをｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する場合、細胞を好都合にたとえば適切な細胞培地などの水性培地中に維持してよく、適切な時点で、光感作薬ならびに／またはｓｉＲＮＡ分子および担体を、適切な条件下で、たとえば適切な濃度および適切な時間、単純に培地に加えることができる。たとえば、細胞を無血清培地の存在下でｓｉＲＮＡ分子および担体と接触させ得る。
【０１３８】
光感作薬を適切な濃度で適切な時間、細胞と接触させ、これらはルーチン技術を用いて当業者が容易に決定することができ、使用する具体的な光感作薬ならびに標的細胞の種類および位置などの要素に依存する。光感作薬の濃度は、細胞内に取り込まれた後、たとえばその細胞内区画の１つまたは複数内に取り込まれるまたはそれと会合し、照射によって活性化させた後、１つまたは複数の細胞構造が破壊される、たとえば１つまたは複数の細胞内区画が溶解または破壊されるような濃度でなければならない。たとえば、本明細書中に記載の光感作薬は、たとえば１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で使用し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの使用では、はるかに広範な範囲、たとえば０．０５〜５００μｇ／ｍｌのであることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト治療では、光感作薬は、全身投与した場合は０．０５〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ、または局所適用する溶媒中で０．１〜２０％の範囲で使用し得る。より小さな動物では濃度範囲は異なる場合があり、それに応じて調整することができる。
【０１３９】
細胞の光感作薬とのインキュベーション時間（すなわち「接触」時間）は数分間から数時間まで変動することができ、たとえば４８時間以上までも、たとえば１２〜２０または２４時間であることができる。インキュベーション時間は、光感作薬が適切な細胞によって、たとえば前記細胞の細胞内区画内に取り込まれるようなものであるべきである。
【０１４０】
細胞の光感作薬とのインキュベーションには、任意選択で、細胞を光に露光させるまたはｓｉＲＮＡ分子および担体を加える前に、たとえば１０分間〜８時間、特に１〜４時間、光感作薬を含まない培地を用いたインキュベーション時間が続いてもよい。
【０１４１】
ｓｉＲＮＡ分子および担体（たとえば事前に形成させたｓｉＲＮＡ：担体の複合体として）は、適切な濃度で、適切な時間、細胞と接触させる。
本発明の方法で使用するｓｉＲＮＡ分子の適切な用量の決定は、当業者にはルーチン的な実施である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの用途ではｓｉＲＮＡ分子の例示的な用量は約１〜１００ｎＭのｓｉＲＮＡであり、ｉｎ  ｖｉｖｏの用途ではヒトに注射する１回あたり約１０-6〜１ｇのｓｉＲＮＡである。たとえば、ｓｉＲＮＡ分子は、５００ｎＭ未満、たとえば３００ｎＭ未満、特に好ましくは１００ｎＭもしくは５０ｎＭ未満、たとえば１〜１００ｎＭ、または５〜５０ｎＭのレベルで投与してよく、示した濃度は、細胞と接触するレベルを反映している。
【０１４２】
上述のように、光感作薬を加え、照射を行った数時間後にさえ接触を開始し得ることが見出された。
適切な濃度は、懸案のｓｉＲＮＡ分子の懸案の細胞内への取り込み効率、および細胞中で達成することを所望する最終濃度に応じて決定することができる。したがって、「形質移入時間」または「細胞取り込み時間」、すなわち分子が細胞と接触している時間は、数分間または数時間までであることができ、たとえば、１０分間〜２４時間、たとえば３０分間〜１０時間、またはたとえば３０分間〜２時間もしくは６時間の形質移入時間を使用することができる。より長いインキュベーション時間、たとえば２４〜９６時間以上、たとえば５〜１０日間も使用し得る。
【０１４３】
形質移入時間の増加は、通常、懸案の分子の取り込みの増加をもたらす。しかし、より短いインキュベーション時間、たとえば３０分間〜１時間も、分子の取り込みの改善された特異性をもたらすことができる。したがって、任意の方法の形質移入時間を選択する際、分子の十分な取り込みを得つつＰＣＩ処理の十分な特異性を維持する、適切なバランスを取らなければならない。
【０１４４】
ｓｉＲＮＡ分子、担体および光感作薬を標的細胞と接触させる、ｉｎ  ｖｉｖｏの適切な方法およびインキュベーション時間は、投与様式ならびにｓｉＲＮＡ分子、担体および光感作薬の種類などの要素に依存する。たとえば、ｓｉＲＮＡ分子および担体を治療する腫瘍、組織または器官内に注射した場合、注射点付近の細胞は、後の時点およびより低い濃度でｓｉＲＮＡ分子と接触する可能性の高い注射点からより離れた位置の細胞よりも迅速にｓｉＲＮＡ分子と接触してそれを取り込む傾向がある。
【０１４５】
さらに、静脈内注射によって投与したｓｉＲＮＡ分子は、標的細胞に到達するまでにある程度の時間がかかる場合があり、したがって、十分または最適な量のｓｉＲＮＡ分子が標的細胞または組織内に蓄積されるまでにより長い投与後時間、たとえば数時間かかり得る。もちろん、同じ考慮が、光感作薬が細胞内に取り込まれるために必要な投与時間にも適用される。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで個々の細胞に必要な投与時間は、これらおよび他のパラメータに応じて変動する可能性がある。
【０１４６】
いずれにせよ、ｉｎ  ｖｉｖｏの状況はｉｎ  ｖｉｔｒｏよりも複雑であるが、本発明の基底の概念は依然として変わらない、すなわち、分子を標的細胞と接触させる時間は、照射が起こる前に適切な量の光感作薬が標的細胞によって取り込まれており、（ｉ）照射前またはその間、ｓｉＲＮＡ分子は、同一もしくは異なる細胞内区画内に取り込まれている、または標的細胞との十分な接触後にそれに取り込まれる、あるいは、（ｉｉ）照射後、ｓｉＲＮＡ分子を、細胞内へのその取り込みを可能にするために十分な時間、細胞と接触させるような時間でなければならない。ｓｉＲＮＡ分子を光感作薬の活性化によって影響を受ける細胞内区画（たとえば光感作薬が存在する区画）内に取り込ませる限りは、ｓｉＲＮＡ分子は照射の前または後に取り込ませことができる。
【０１４７】
光感作薬を活性化させるための光照射ステップは、当該分野で周知の技術および手順に従って行い得る。たとえば、光の波長および強度は、使用する光感作薬に応じて選択し得る。適切な光源が当該分野で周知である。
【０１４８】
本発明の方法において細胞を光に露光させる時間は変動し得る。細胞損傷、ひいては細胞死が増加する最大値を超える光への露光の増加に伴って、サイトゾル内へのｓｉＲＮＡ分子の内部移行効率が増加する。
【０１４９】
照射ステップの好ましい時間の長さは、標的、光感作薬、標的細胞または組織中に蓄積された光感作薬の量および光感作薬の吸収スペクトルと光源の発光スペクトルとの重なりなどの要素に依存する。一般に、照射ステップの時間の長さは、分間から数時間の桁、たとえば好ましくは６０分間まで、たとえば０．５または１〜３０分間、たとえば０．５〜３分間、または１〜５分間もしくは１〜１０分間、たとえば３〜７分間、好ましくは約３分間、たとえば２．５〜３．５分間である。より短い照射時間、たとえば１〜６０秒間、たとえば１０〜５０、２０〜４０または２５〜３５秒間も用い得る。
【０１５０】
適切な光用量を当業者によって選択することができ、これは、ここでも、光感作薬および標的細胞または組織中に蓄積された光感作薬の量に依存する。たとえば、光感作薬フォトフリンおよびプロトポルフィリン前駆体５−アミノレブリン酸を用いた癌の光力学治療で通常用いる光用量は、高体温を回避するために、２００ｍＷ／ｃｍ2未満のフルエンス範囲で５０〜１５０Ｊ／ｃｍ２の範囲である。可視スペクトルの赤色領域の消光係数がより高い光感作薬を用いた場合、光用量は通常より低い。しかし、より少ない光感作薬が蓄積された非癌性組織の治療では、必要な光の総量は、癌の治療よりも実質的に高い場合がある。さらに、細胞生存度を維持する場合は、過剰レベルの毒性種の発生を回避すべきであり、それに応じて関連パラメータを調整し得る。
【０１５１】
本発明の方法は、光化学的処理が原因で、すなわち光感作薬が活性化される際に毒性種が発生することによって、ある程度の細胞死滅を必然的に生じ得る。提案された使用に応じて、この細胞死は重要でない場合があり、一部の用途（たとえば癌治療）には実際に有利な場合がある。しかし、好ましくは、細胞死を回避し、本明細書中の他の箇所に記載したように、細胞毒性を存在させずに発現の強力な阻害（すなわち強力なｓｉＲＮＡ効果）を引き起こすように、本発明を実施することができる。全般的な細胞毒性または細胞生存度に対する効果なしに強力な発現の阻害を達成することが極めて有利である。本発明の方法は、生存細胞の分率または割合が光用量を光感作薬の濃度に関係して選択することによって調節されるように変更し得る。ここでも、そのような技術は当分野で知られている。
【０１５２】
生細胞が望ましい用途では、実質的にすべての細胞、または顕著に大多数（たとえば細胞の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０、７０、８０または９０％）が死滅しない。ＰＣＩ処理後の細胞生存度は、ＭＴＳ試験などの当該分野で知られている標準技術によって測定することができる（実施例参照）。
【０１５３】
光感作薬の活性化によって誘発された細胞死の量にかかわらず、ｓｉＲＮＡが細胞に対して効果を有するためには、ＰＣＩ効果が現れる個々の細胞の一部は光化学的処理単独で死滅しないように光用量を調節することが重要である（ただし、細胞内に導入する分子が細胞毒性効果を有する場合はその後死滅し得る）。
【０１５４】
細胞毒性効果は、たとえば遺伝子を下方制御するために、たとえばｓｉＲＮＡ分子を本発明の方法によって腫瘍細胞内に内部移行させる遺伝子治療を用いて達成し得る。
本発明の方法は、たとえば遺伝子治療方法およびスクリーニングアッセイの作製における特定の遺伝子産物の発現の阻害を含めた様々な目的のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、たとえばｉｎ  ｓｉｔｕ治療またはｅｘ  ｖｉｖｏ治療のために使用し、次いで処理細胞を身体に投与し得る。
【０１５５】
したがって、本発明は、本明細書中に既に記載した方法によって、ｓｉＲＮＡ分子を前記標的遺伝子を含む細胞内に導入することによって標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、前記ｓｉＲＮＡ分子は、前記標的遺伝子の発現を特異的に阻害する。
【０１５６】
「特異的阻害」とは、標的遺伝子の配列依存的阻害をいう。核酸レベルで使用するｓｉＲＮＡ分子と十分な同一性を有する配列を含む遺伝子の発現が、ｓｉＲＮＡ分子によって影響を受ける。上述のように、発現の配列特異的阻害を引き起こす適切な配列のｓｉＲＮＡ分子を当業者が設計することを可能にする、標準的な技術が開発されている。
【０１５７】
「標的遺伝子」とは、その発現を下方制御させる、かつ調査または操作の標的となる遺伝子をいう。
これらの方法は、細胞の発現プロフィールを変更させて、たとえば細胞経路を調査するため、もしくは特定の遺伝子の発現の影響を測定するために、あるいは治療目的に使用し得る。
【０１５８】
本発明の方法は、１つ以上の遺伝子の下方制御、修復または変異から利益を受ける任意の疾患の治療にも用い得る。たとえば、癌において過剰発現される遺伝子は、適切なｓｉＲＮＡ分子を投与することによって下方制御し得る（Ｌａｇｅ（２００５）Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ、１（１）：１０３〜１３）。治療し得る別の疾患には、ハンチントン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患ならびに肝炎（たとえばＢ、Ｃ）およびＨＩＶなどのウイルス感染症が含まれる。
【０１５９】
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書中に記載の、ｓｉＲＮＡ分子、担体分子（好ましくは前記ｓｉＲＮＡ分子との複合体として）および任意に別個に光感作薬も含む組成物を提供する。さらなる態様では、本発明は、治療で使用する前記組成物を提供する。
【０１６０】
あるいは、本発明は、本明細書中に記載の、ｓｉＲＮＡ分子、担体分子および任意に光感作薬も含むキットを提供する。好ましくは、前記キット（または製品）は、医療における同時、個別または逐次的な使用のためのものである。
【０１６１】
別の記載をすると、本発明は、前記患者において１つ以上の標的遺伝子の発現を変更させることによって疾患、障害または感染症を治療または予防するための医薬品の調製における、本明細書中に記載のｓｉＲＮＡ分子および担体の使用を提供する。任意選択で、前記医薬品は前記ｓｉＲＮＡ分子または担体の一方のみを含む場合があり、その医薬品は、前記医薬品中に存在しない前記ｓｉＲＮＡ分子または担体が前記疾患、障害または感染症を治療または予防する際に前記患者に投与するためのものである方法で使用し得る。任意選択で、前記医薬品は光感作薬を含み得る。好ましくは、前記医薬品は遺伝子治療用である、すなわち、異常な遺伝子発現によって代表される、または１つ以上の遺伝子の抑制から利益を受ける疾患または障害を治療するためのものである。前記変更には、前記発現の下方制御が含まれる。
【０１６２】
上述の様々な実施形態によれば、前記光感作薬ならびに前記ｓｉＲＮＡ分子および担体を患者の細胞または組織と同時にまたは逐次的に接触させ、前記細胞を、光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光で照射し、その照射は、前記ｓｉＲＮＡ分子および担体の前記光感作薬を含む細胞内区画内への細胞取り込みの前、その間または後に、好ましくは前記移行分子の任意の細胞内区画内への細胞取り込みの前に行う。
【０１６３】
したがって、別の態様では、本発明は、患者において疾患、障害または感染症を治療または予防する方法であって、本明細書中で既に記載した方法に従ってｓｉＲＮＡ分子および担体を１つ以上の細胞内にｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで導入すること、および必要な場合（すなわち形質移入をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施する場合）には前記細胞を前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１６４】
本明細書中で定義する「治療」とは、治療前の症状と比較して、治療中の疾患、障害または感染症の１つ以上の症状を軽減、緩和または排除することをいう。「予防」とは、疾患、障害または感染症の症状の発症を遅延または予防することをいう。
【０１６５】
本発明の組成物は、本発明の方法によって細胞のサイトゾル内に内部移行されているｓｉＲＮＡ分子を含む細胞も含み得る。本発明は、治療、特に癌または遺伝子治療において使用するそのような組成物にさらに拡張する。
【０１６６】
したがって、本発明のさらなる態様は、細胞のサイトゾル内に内部移行されているｓｉＲＮＡ分子を含む、本発明の方法によって得ることができる、細胞または細胞集団を提供する。
【０１６７】
本発明のさらなる態様は、本明細書中で既に記載した治療、好ましくは癌または遺伝子治療において使用する組成物または医薬品を調製するための、そのような細胞または細胞集団の使用を提供する。
【０１６８】
本発明は、患者に本発明の細胞または組成物を投与することを含む前記患者の治療方法、すなわち、本明細書中で既に記載したようにｓｉＲＮＡ分子を細胞内に導入するステップと、そのように調製した前記細胞を前記患者に投与するステップとを含む方法をさらに提供する。好ましくは、前記方法を癌の治療または遺伝子治療で用いる。
【０１６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、当分野で一般的または標準の任意の投与様式、たとえば注射、点滴、体表面の内および外などへの局所投与を用い得る。ｉｎ  ｖｉｖｏの使用では、本発明は、体液部位を含めた光感作薬およびｓｉＲＮＡ分子が局在する細胞を含む任意の組織、ならびに固形組織に関して使用することができる。光感作薬が標的細胞によって取り込まれ、光を適切に送達することができる限りは、すべての組織を治療することができる。
【０１７０】
したがって、本発明の組成物は、製薬分野で知られている技術および手順に従った任意の好都合な様式で、たとえば１つ以上の製薬上許容される担体または賦形剤を用いて製剤にし得る。本明細書中で言及する「製薬上許容される」とは、組成物の他の成分と適合性があり、かつ受容者に生理的に許容される成分をいう。組成物および担体の性質または賦形剤物質、用量などは、好み（choice）および所望の投与経路、治療目的などに応じてルーチン様式で選択し得る。同様に、用量もルーチン様式で決定してよく、用量は分子の性質、治療目的、患者の年齢、投与様式などに依存し得る。光感作薬に関連して、照射時に膜を破壊する効力／能力も考慮に入れるべきである。
【０１７１】
あるいは、上述の方法を、ハイスループットスクリーニング方法のスクリーニングツールを作製するため、特に特定の遺伝子をサイレンシングする効果を分析するために用い得る。上述のように、１つ以上の特異的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを作製して本発明の方法で使用し得る。したがって、ｓｉＲＮＡを、細胞集団中の遺伝子の発現を減少させるために用い得る。その後、得られる細胞集団を、標準技術によって遺伝子サイレンシングの下流効果を同定するためのスクリーニングツールとして用い得る。
【０１７２】
正常および化学修飾したアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を減少させる以前の試みは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解、非特異的効果の発生および／または不十分な標的親和性の問題によって制限されてきた。ｓｉＲＮＡを投与するために本発明の方法を用いることによって、これらの問題に打ち勝ち得る。
【０１７３】
したがって、さらなる態様では、本発明は、遺伝子の発現を阻害または減少させることができるｓｉＲＮＡ分子、担体および光感作薬を細胞（たとえば細胞集団）と接触させること、細胞（たとえば細胞集団）に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射することを含む、細胞（たとえば細胞集団）の遺伝子発現パターンを改変して、スクリーニングツール（たとえば高スループットスクリーニング用）として使用するための細胞（または細胞集団）を調製する方法を提供する。本発明は、そのような細胞ならびに、そのような細胞の特異的特性、たとえばそのような細胞のｍＲＮＡ発現レベルを、たとえばマイクロアレイで検査する、そのような細胞をスクリーニングする方法にさらに拡張する。「改変された遺伝子発現パターン」とは、前記ｓｉＲＮＡ分子が細胞核中に存在する結果、遺伝子の、それが方向付けられているものへの転写または翻訳に影響が与えられることを意味する。
【０１７４】
遺伝子の発現のこの変化の結果、他の遺伝子の発現が影響を受け得る。したがって、調査中の遺伝子の正常発現に影響を与えることによって、他の遺伝子の発現パターンの変化を決定することが可能である。そのような遺伝子の同定、および調査中の遺伝子の発現がそれらに与える影響の同定により、調査者が遺伝子の機能、たとえばその下流機能について結論づけることが可能となる。調査中の遺伝子の正常発現の変化によって影響を受ける遺伝子は上方制御または下方制御され得るが、発現パターンの全体的な変化により、正常細胞機能における遺伝子の役割およびその誤制御による結果の指標が与えられる。
【０１７５】
当分野で周知の標準技術を用いて、懸案の遺伝子の発現の下方制御または排除の効果を研究することが可能である。これは、たとえば細胞接着の変化、タンパク質分泌の変化または形態学的変化などの、細胞（または胞集団）の機能的変化を探すことによって行い得る。あるいは、ここでも当分野で周知の標準技術を用いて、ｍＲＮＡパターンおよび／またはタンパク質発現を分析することによって、遺伝子発現プロファイルを直接研究することができる。
【０１７６】
遺伝子の発現を阻害または減少させることとは、本方法に供していない細胞、すなわち野生型または正常な細胞と比較した場合に、懸案の遺伝子の発現が減少することと理解される。遺伝子発現レベルの変化は当分野で知られている標準技術によって決定し得る。
【０１７７】
遺伝子の検出可能な発現が存在しない、すなわちｍＲＮＡもしくはタンパク質が検出不可能であるような発現の完全な阻害があり得、または遺伝子発現の量が野生型もしくは正常な細胞よりも低い、発現の部分的な阻害、すなわち減少があり得る。これは、特定の配列を有するｓｉＲＮＡの効果を、組み換えた配列、すなわち同じ組成のヌクレオチドであるが異なる配列順序を有するｓｉＲＮＡの効果と比較することによって、評価および調節することができる。好ましくは、この技術が有用となるためには、発現の減少は、対照レベル未満またはその８０％、たとえば対照レベルの＜５０％、好ましくは＜２０、１０または５％である。使用する細胞（または複数の細胞）は、好ましくは細胞集団であり、その個々の細胞は遺伝的に同一である。細胞は、上述のように任意の細胞であり得る。
【０１７８】
本発明の方法に従って作製した細胞または細胞集団を用いて、本発明のさらなる態様を形成するライブラリを作製し得る。
以下、本発明を、以下の図面を参照しながら、以下の非限定的な実施例でさらに詳述する。
【実施例】
【０１７９】
材料および方法
細胞系および培養条件。
ＨＣＴ−１１６（結腸直腸腺癌）およびＳＷ６２０（結腸直腸腺癌）を米国タイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得た。ＯＨＳ（骨肉腫（osteocarcinoma））およびＲＭＳ細胞系はノルウェーラジウム病院（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｒａｄｉｕｍ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で確立されたものである。すべての細胞系は、抗生物質を含まないが１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オーストリアＬｉｎｚ）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、ベルギーＶｅｒｖｉｅｒｓ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、ベルギーＶｅｒｖｉｅｒｓまたはＧｉｂｃｏＢＲＬ、英国Ｐａｉｓｌｅｙ）を用いて培養した。５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で細胞を増殖およびインキュベートした。すべての細胞系を試験し、実験前にマイコプラズマ感染に関して陰性であることが見出された。
【０１８０】
光源および光感作薬。
Ｌｕｍｉｓｏｕｒｃｅ（登録商標）（ＰＣＩ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳ、ノルウェーＯｓｌｏ）を光源として用いた。Ｌｕｍｉｓｏｕｒｃｅ（登録商標）とは、処理領域の均一な照射を提供し、主にピークが４２０ｎｍの青色光を発光するように設計された４本の蛍光チューブのバンク（bank）である。光感作薬、ジスルホン化テトラフェニルポルフィン（ＴＰＰＳ2a）はＰｏｒｐｈｙｒｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国ユタ州Ｌｏｇａｎ）から購入した。最初にＴＰＰＳ2aを０．１ＭのＮａＯＨに溶かし、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．５で５ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、０．００２ＭのＮａＯＨの最終濃度まで希釈した。光感作薬は光から保護し、使用時まで−２０℃で保管した。
【０１８１】
ＰＣＩを用いないｓｉＲＮＡ形質移入。
ｓｉＲＮＡ送達用の様々な形質移入試薬は、以下を用いて評価した：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．のリポフェクチン（商標）試薬（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのリポフェクタミン（商標）２０００（米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、Ｒｏｃｈｅ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＦｕＧｅｎｅ６（ドイツＭａｎｎｈｅｉｍ）、ＡｍｂｉｏｎのｓｉＰＯＲＴ（商標）Ｌｉｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｔ（米国テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎのｊｅｔＳＩ（商標）およびｊｅｔＳＩ（商標）−ＥＮＤＯ（フランスＩｌｌｋｉｒｃｈ）。すべての形質移入試薬は、製造者の仕様書に従って取り扱った。すべての細胞系を「細胞系および培養条件」に記載のように培養し、６ウェルプレート中で２４時間、５０〜７０％のコンフルエンスまで培養した後、２４、４８または９６時間形質移入した。形質移入試薬を用いた組み換えｓｉＲＮＡに加えて、未処理の対照として形質移入試薬を単独で細胞に適用した。
【０１８２】
ｊｅｔＳＩ／ｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯで用いたプロトコルは、標準の６ウェルプレートにおいて以下のとおりであった：
・ステップ１：それぞれのウェルについて、４．２（８．４）μｌのｊｅｔＳＩ／ｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯ溶液を１００μｌの培地に希釈する。激しく渦攪拌し（重要：混合にピペットを用いない）、１０分間待つ（重要：３０分間を超えない）。
・ステップ２：それぞれのウェルについて、１．４μｇ（１００ｎＭ）のｓｉＲＮＡ二重鎖を１００μｌの培地中に希釈する。穏やかに渦攪拌する。
・１００μｌのｊｅｔＳＩ培地溶液を１００μｌのｓｉＲＮＡ溶液に加え、溶液を直ちに混合する（重要：溶液を逆の順序で混合しない）
・直ちに溶液を１０秒間渦攪拌混合する。
・３０分間、室温でインキュベーションを行って複合体を形成させる（重要：１時間を超えない）。
・複合体の形成中、増殖培地をプレートから除去し、事前に３７℃に温めた０．８ｍｌの新鮮な血清含有培地（および使用する場合は光感作薬）を加える。
・２００μｌのｊｅｔＳＩ／ｓｉＲＮＡ溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートを穏やかに回すことによって混合物を均一にする。
・プレートを必要な細胞培養条件下で１８時間インキュベートし、その後、プレートを新鮮な培地で３回洗浄し、２〜４ｍｌの培地で再度インキュベートする。
【０１８３】
ＰＣＩを用いたｓｉＲＮＡ形質移入。
数点の変更以外は、細胞を「ＰＣＩを用いないｓｉＲＮＡ形質移入」と同様に培養および形質移入した。光感作薬ＴＰＰＳ2a（０，５μｇ／ｍｌ）を形質移入時に培地に加えた。１８時間のインキュベーション後、細胞を新鮮な培地で３回洗浄し、光処理の前に４時間インキュベートした。４時間後、細胞を、細胞系に応じて青色光（７ｍＷ／ｃｍ２）に様々な時間（６０〜９０秒間）露光させ、２４、４８および９６時間再度インキュベートした後に回収した。ＰＣＩ効果を測定するために、エフェクターｓｉＲＮＡ、組み換えｓｉＲＮＡおよび形質移入試薬単独を、同じプレート中の異なるウェルに、光感作薬を用いてまたは用いずに適用し、同じ処理を与えた。細胞はこれらの実験中アルミニウム箔によって光から保護した。
【０１８４】
Ｓ１００Ａ４のリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ。
ＧｅｎＥｌｕｔｅ哺乳動物全ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツＳｔｅｉｎｈｅｉｍ）を用いて全細胞ＲＮＡを単離し、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を逆転写に用いた。どちらのキットも、製造者のマニュアルに従って使用した。すべてのＰＣＲを並行して実行し、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  Ｉを用いることによってリアルタイム検出が得られた。それぞれのＰＣＲについて、１０μｌのｃＤＮＡ、３０μｌのｉＱ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）、３００ｎＭのそれぞれのプライマーおよびヌクレアーゼを含まない水を加えて最終容積６０μｌとした。その後、それぞれ２５μｌの試料をＰＣＲプレートに適用した。本方法では、並行が真の並行であり、すべての複製（replicate）について十分なＰＣＲミックスが存在することを保証する。プライマーの設計は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）を用いて達成した。使用したプライマー組（フォワードプライマー５’−ＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＡＧＴＣＡＧＡＡＣ−３’およびリバースプライマー５’−ＣＡＴＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＣＣＣＣＡＡＧＡ−３’）によって、Ｓ１００Ａ４配列のエクソン２および３中の７９−塩基対のセグメントが増幅される。
【０１８５】
リアルタイム反応は、以下の増幅プロトコルにしたがい、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で実行した：９５℃で３分間の最初の変性、５０サイクルの９５℃で１０秒間の変性、６０℃で３５秒間のアニーリング／伸長、９５℃で２０秒間の１回の保持、続いて５５℃で１分間の保持、最後に、最終温度９５℃まで、１０秒ごとに０．５℃の上昇の８０ステップ融解曲線分析（finally a melt curve analysis of 80 steps each for 10s, with 0.5℃ increase until a final temperature of 95℃）。ＲＮＡ試料の品質は、２つのハウスキーピング遺伝子、ＴＢＰ（フォワードプライマー５’−ＧＣＣＣＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＴＡＴ−３およびリバースプライマー５’−ＣＧＴＧＧＣＴＣＴＣＴＴＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡ−３’）ならびにＲＰＬＰＯ（フォワードプライマー５’−ＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＴＣＡＡＣ−３’およびリバースプライマー５’−ＴＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣ−３’）の増幅によって確認した。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｃｒｏ、バージョン１．１（Ｂｉｏｒａｄ）を定量的計算に用いた。このプログラムは、同じ試料組に対して様々なプライマー組を用いて得られるサイクル閾値の比較を可能にするΔΔＣＴ方法に基づいて計算を行う。
【０１８６】
顕微鏡観察研究。
記載（ＰＣＩを用いたおよび用いないｓｉＲＮＡ形質移入）のように細胞をｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯの複合体と共にインキュベートし、４８時間後に、ＰＣＩ処理を用いておよび用いずに、ＦＩＴＣ（４５０〜４９０ｎｍのＢＰ励起フィルター、５１０ｎｍのＦＴビームスプリッター、および５１５〜５６５ｎｍのＬＰ発光フィルター）、ならびにローダミン（５４６／１２ｎｍのＢＰ励起フィルター、５８０ｎｍのＦＴビームスプリッター、および５９０ｎｍのＬＰ発光フィルター）用のフィルターを備えたＺｅｉｓｓ倒立顕微鏡、Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００で分析した。画像（Pictures）は、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲ、バージョン５．０５．１０およびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ３．１．２．１ソフトウェアを用いることによって構成した。画像(Images)はＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ７．０（Ａｄｏｂｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）およびＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（バージョン３）を用いて形成した。
【０１８７】
ウエスタン免疫ブロット。
タンパク質溶解物は、１５０ｍＭのＮａＣｌならびに２ｇ／ｍｌのペプスタチン、アプロチニン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、モンタナ州Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）およびロイペプチン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツＭａｎｎｈｅｉｍ）を含む０．１％のＮＰ−４０を含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で調製した。それぞれの試料からの全タンパク質溶解物（３０μｇ）を１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、製造者のマニュアルに従ってＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）上に移した。ローディング対照および移動対照として、膜を０．１％のアミドブラックで染色した。続いて、膜を、０．５ＭのＮａＣｌおよび１０％の乾燥乳（ブロッキング溶液）を含む０．２５％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含む２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でインキュベートした後、５％の乾燥乳を含むＴＢＳＴ中のウサギポリクローナル抗Ｓ１００Ａ４（１：３００に希釈、ＤＡＫＯ、デンマークＧｌｏｓｔｒｕｐ）およびマウスモノクローナル抗α−チューブリン（１：２５０に希釈、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、英国Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ）と共にインキュベートした。洗浄後、二次抗体（１：５０００に希釈、ＤＡＫＯ、デンマークＧｌｏｓｔｒｕｐ）に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼおよび増強した化学発光系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ）を用いて免疫反応性タンパク質を可視化した。Ｓ１００Ａ４タンパク質レベルは対照試料の割合として報告し、α−チューブリンをローディング対照として用いた。
【０１８８】
［実施例１］ＯＨＳ細胞系における遺伝子サイレンシング
ＯＨＳ細胞を、様々な形質移入系を用いてＳ１００Ａ４タンパク質の発現を標的とするように設計して、形質移入した。それぞれの実験において、標準の形質移入プロトコルを製造者の指示に従って用いた。光感作薬を用いた場合は、それはＴＰＰＳ2aであった（１ｍｌの形質移入容積中に０．５μｇ、これとは別にｊｅｔＳＩは２ｍｌの形質移入容積を用いた）。それぞれの実験における照射時間は６０秒間であった。
【０１８９】
２０μＭのｓｉＲＮＡストック溶液をそれぞれの異なる形質移入試薬と混合し、６ウェルプレート中で最終容積１ｍｌになるように形質移入した（ただし、ｊｅｔＳＩおよびｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯの場合は、最終容積は２ｍｌであった）。
ｓｉＰＯＲＴ脂質＝１０００μｌ中に１．４μｇのｓｉＲＮＡと組み合わせて２および４μｌを試験した
ＦｕＧｅｎｅ６＝１０００μｌ中に１．４μｇのｓｉＲＮＡと組み合わせて４．２μｌおよび８．４μｌを試験した
リポフェクタミン２０００＝１０００μｌ中に１．４μｇのｓｉＲＮＡと組み合わせて４．２および７μｌを試験した
リポフェクチン＝１０００μｌ中に１．４μｇのｓｉＲＮＡと組み合わせて４．２および７μｌを試験した
ｊｅｔＳＩ＝２０００μｌ中に２．８μｇのｓｉＲＮＡと組み合わせて８．４μｌ
ｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯ＝２０００μｌ中に１．４μｇのｓｉＲＮＡと組み合わせて４．２μｌ。
【０１９０】
使用したｓｉＲＮＡ分子はＳ１００Ａ４のｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２９６１）に対するものであった。配列
５’−ＵＧＡＧＣＡＡＧＵＵＣＡＡＵＡＡＡＧＡ−３’
３’−ＡＣＵＣＧＵＵＣＡＡＧＵＵＡＵＵＵＣＵ−５’
を有する特異的ｓｉＲＮＡを、Ｅｌｂａｓｈｉｒ他（（２００１）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５、１８８〜２００）に従って設計した。選択した標的遺伝子に対して設計されたｓｉＲＮＡに加えて、組み換えｓｉＲＮＡ（５’−ＣＧＣＡＵＡＡＧＵＧＡＡＡＵＡＧＡＡＵ−３’、３’−ＧＣＧＵＡＵＵＣＡＣＵＵＵＡＵＣＵＵＡ−５’）を作製することによって対照ｓｉＲＮＡを設計し、偽ハイブリダイゼーションを排除するためにＢＬＡＳＴ検索を行った。二重鎖のＧＣ含有率は３０〜７０％の範囲内に保ち、ｓｉＲＮＡ二重鎖の最適な安定性のために、すべてのｓｉＲＮＡ分子はその３’末端にｄＴｄＴ突出を有するように合成した。ｓｉＲＮＡ分子はＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギーＳｅｒａｉｎｇ）から注文した。
【０１９１】
乾燥ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをＤＥＰＣ処理した水で１００μＭまで再懸濁させ、−２０℃で保管した。それぞれのＲＮＡオリゴヌクレオチドを別々のアリコートとし、５０μＭの濃度まで希釈することによって、アニーリングを行った。その後、３０μｌのそれぞれのＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液および１５μｌの５×アニーリング緩衝液を合わせて、ＤＥＰＣ処理した水中に５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌの最終濃度とした。その後、溶液を３分間、水浴中、９５℃でインキュベートし、次いで作業台上で４５分間徐々に冷却した。アニーリングの成功は４％のＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル電気泳動によって確認した（データ示さず）。
【０１９２】
図１から、ＰＣＩ依存性の遺伝子サイレンシングは、形質移入剤ｊｅｔＳＩおよびｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯを用いることで達成できることがわかる。ＰＣＩを存在させずにこれらの２つの形質移入剤を用いた場合（すなわち、照射するが光感作薬が存在しない）、遺伝子発現は、ウエスタンブロットを用いたタンパク質レベルの測定に基づいて対照の約７５％であるが、追加でＰＣＩを用いた場合、遺伝子発現は対照の約１５％まで減少する。
【０１９３】
対照的に、形質移入剤としてＳＩＰＯＲＴ脂質またはＦｕＧｅｎｅ６を使用することでは、遺伝子発現有意な減少が何ら達成されず、リポフェクタミン２０００およびリポフェクチンを使用した場合は、ＰＣＩも用いたかどうかにかかわらず遺伝子発現の阻害が達成された。
【０１９４】
［実施例２］様々な細胞系における遺伝子サイレンシング
４つの異なる細胞系、ＨＣＴ１１６、ＳＷ６２０、ＯＨＳおよびＲＭＳ細胞を、標準のｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯプロトコルを用いて、光感作薬（０．５μｇ／ｍｌのＴＰＰＳ2a）を存在させておよび存在させずに、Ｓ１００Ａ４の発現をサイレンシングするように設計された（実施例１参照）５０ｎＭのｓｉＲＮＡ（ｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯ＝４．２μｌ、１．４μｇのｓｉＲＮＡと組み合わせた）を用いて形質移入した。細胞を照射に供し、照射の９６時間後にウエスタンブロットを行うことによってＳ１００Ａ４タンパク質レベルを決定した（照射条件は、ＯＨＳ＝６０秒間、ＳＷ６２０＝８０秒間、ＨＣＴ１１６＝９０秒間、ＲＭＳ＝７０秒間であった）。
【０１９５】
結果の例を図２Ｂに示し、結果を図２Ａにグラフで表す。それぞれの細胞種において、形質移入した細胞をＰＣＩ処理に曝露することにより高レベルの遺伝子サイレンシングが引き起こされ、一方で、Ｓ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡを形質移入したがＰＣＩ処理に供さなかった細胞では、有意により低い遺伝子サイレンシングが示された。組換えｓｉＲＮＡは、ＰＣＩが存在する場合でも存在しない場合でも、遺伝子発現に対して効果を示さなかったので、この効果は特異的であることが示された。試験した様々な細胞系間で遺伝子サイレンシング効果の有意な差異はなかった。
【０１９６】
［実施例３］ｓｉＲＮＡ濃度および時間の効果
Ｓ１００Ａ４タンパク質の発現をサイレンシングするように設計されたｓｉＲＮＡ分子を、４．２μｌのｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯを用いて１〜５ｎＭの濃度でＯＨＳ細胞内に形質移入し、上述のようにＰＣＩ処理に供した。
【０１９７】
ウエスタンブロットを用いて細胞溶解液中のタンパク質レベルを測定し、これを図３Ａに未処理の対照細胞のタンパク質レベルの割合として示した。
遺伝子サイレンシング効果は、細胞を曝露したｓｉＲＮＡの濃度に伴って増加したが、４ｎＭおよび５ｎＭのｓｉＲＮＡで見られたサイレンシング効果には僅かな差異しか存在しなかった。
【０１９８】
組換えｓｉＲＮＡ分子もすべての実験で使用し、遺伝子発現に影響を与えないことが示された。したがって、遺伝子阻害効果は特異的である。
図２Ｂは、細胞の照射と分析するための細胞溶解液の回収との間の時間を変更することによる、遺伝子サイレンシングに対する時間の効果を示す。照射後かつ回収前に細胞を長く放置すればするほど、遺伝子発現のより大きな阻害が観察されることがわかる。
【０１９９】
［実施例４］ｓｉＲＮＡ  ＰＣＩ処理後のＯＨＳ細胞における遺伝子サイレンシング
ＯＨＳ細胞に上述のように１００ｎＭのｓｉＲＮＡまたは組換えｓｉＲＮＡを形質移入し、タンパク質およびｍＲＮＡのレベルに対するＰＣＩ処理の効果を、照射の９６時間後にウエスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲによって決定し、未処理の対照におけるタンパク質およびｍＲＮＡのレベルと比較した。
【０２００】
図４に示す結果は、タンパク質およびｍＲＮＡのレベルのどちらに関しても、Ｓ１００Ａ４遺伝子の大量の遺伝子サイレンシングが、この遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡをｊｅｔＳＩ  ＥＮＤＯを用いて形質移入し、細胞をＰＣＩ処理に供した場合に観察されることを示している（図３ＡおよびＢのレーン５）。タンパク質およびＲＮＡのレベルの少量の減少がＰＣＩ処理を用いずに見られるが（図３ＡおよびＢのレーン２）、これはＰＣＩ処理によって著しく増強される。
【０２０１】
［実施例５］標識したｓｉＲＮＡのサイトゾル送達
ＯＨＳ細胞に、ｊｅｔＳＩ  ＥＮＤＯ（（ｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯ＝８，４μｌ、１０００μｌの形質移入容積中で２，８μｇのｓｉＲＮＡと組み合わせた結果、２００ｎＭのｓｉＲＮＡ溶液である）を用いて、光感作薬を用いておよび用いずに、２００ｎＭのＦＩＴＣで標識したｓｉＲＮＡを形質移入した。その後、形質移入した細胞を照射に供した。
【０２０２】
位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて細胞を検査した。画像を比較することによって、ＰＣＩ処理が存在しない場合、ｓｉＲＮＡは点状の分布に留まることが見られ、これは細胞内小胞中の分布に代表的である（図５ａおよびｃ）。また、ある程度の漏れも見られる（図５ｃの右側のボックス）。対照的に、ＰＣＩ処理後、標識したｓｉＲＮＡは細胞質全体にわたっておよび核中に分布していることが見られる（図５ｂ参照）。
【０２０３】
これにより、ｓｉＲＮＡが細胞の必要な区画に送達されるためにはＰＣＩ処理が必要であること、また、送達がＰＣＩ処理に依存することが実証される。
【０２０４】
［実施例６］ｓｉＲＮＡ−ＰＣＩを用いた遺伝子サイレンシングは標準の形質移入よりも少ない担体の使用を必要とする。
【０２０５】
ＯＨＳ細胞に、ｊｅｔＳＩを用いて１００ｎＭのｓｉＲＮＡを形質移入した。上述の実験とは対照的に、ｊｅｔＳＩをより低い濃度、すなわち標準プロトコルで推奨された濃度の５０％で使用した。６ウェルプレートでの標準プロトコルは、２０００μｌの培地中に２．８μｇのｓｉＲＮＡ＋８．４μｌのｊｅｔＳＩであり、それぞれのウェルについて１００ｎＭのｓｉＲＮＡということになる。
【０２０６】
対照的に、６ウェルプレートで、１．４μｇのｓｉＲＮＡを１０００μｌの培地中に４．２μｌのｊｅｔＳＩと混合すると、それぞれのウェルについて１００ｎＭのｓｉＲＮＡということになる。したがって、複合体の全体量が５０％減少した。
【０２０７】
形質移入後、細胞をＰＣＩ処理に供したか（この実験での光用量は、０，５μｇ／ｍｌのＴＰＰＳ2aを用いて３０秒間であった）、または未処理のままとし、ＲＴ−ＰＣＲを用いて遺伝子サイレンシングを測定した。エフェクターｓｉＲＮＡはＳ１００Ａ４遺伝子の発現を未処理の対照の２０％未満まで減少させることができたが、ＰＣＩを用いない場合および組換えｓｉＲＮＡ（ＰＣＩ処理を用いるかまたは用いない）を用いた場合では僅かな減少しか見られなかった。
【０２０８】
これにより、担体およびＰＣＩを組み合わせた使用は選択的なｓｉＲＮＡ分子の放出の利点を提供するだけでなく、ＰＣＩと組み合わせた場合には、より低い濃度の形質移入剤の使用で高レベルの遺伝子サイレンシングが達成できることが実証される。図６のレーン５および図１のレーン５を比較することにより、実施例１で使用した形質移入剤の５０％しか使用しない場合でも、ＰＣＩも使用した場合は、遺伝子阻害の度合がはるかに大きいことがわかる。
【０２０９】
［実施例７］ＰＥＩを担体として用いた形質移入
ｓｉＲＮＡ標的をＳ１００Ａ４のｍＲＮＡ配列（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２９６１）に対して選択した。ｓｉＲＮＡの４８１〜４９９をエフェクターとして用いた（配列は実施例１を参照）。
【０２１０】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、ＰＣＩに誘発される送達について評価した。細胞系を形質移入前に、６ウェルプレート中で５０〜８０％のコンフルエンスまで培養した（１０％のＦＢＳ、１０ｍｌのＬ−グルタミン酸、１０ｍｌのＨｅｐｅｓを添加したＲＰＭＩ−１６４０）。１００ｎＭのｓｉＲＮＡを標準濃度として用いた。
【０２１１】
使用したＰＥＩはＳｉｇｍａのものであり、滅菌水で希釈し、１０００μｌのＰＥＩおよび９０００μｌの滅菌水を含むストック溶液を作製した。ストック溶液から１および１０μｌを用いて、細胞に１．４μｇのｓｉＲＮＡを形質移入した（各ウェル１００ｎＭ）。
【０２１２】
ＳｉｇｍａのＰＥＩを使用した（４０８７１９ポリエチレンイミン（ＬＳによる平均Ｍｗ約８００まで、ＧＰＣによる平均Ｍｎ約６００まで、分枝状、低分子量、非含水））。
形質移入には、２つの溶液を作製した。溶液Ａは、ｓｉＲＮＡを１００μｌの無血清（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ）培地に希釈した。溶液Ｂは、ＰＥＩを１００μｌの無血清培地に希釈した。穏やかに混合することによって溶液ＡおよびＢを混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、混合溶液を細胞に加えた（１ｍｌの１００ｎＭ ｓｉＲＮＡ）。
【０２１３】
ｊｅｔＳＩについて上述したようにＰＣＩ処理を行った。ＰＥＩ実験の光用量は４０秒間であった。照射の９６時間後にウエスタンブロットによってタンパク質レベルを測定した。
【０２１４】
図８から、レーン５および６に示す試料、すなわちＰＥＩでの形質移入およびＰＣＩ処理に供した試料においてＳ１００Ａ４タンパク質の発現が減少したことが認められる。
【０２１５】
［実施例８］２５ｋＤａのＰＥＩ担体を用いたｓｉＲＮＡの活性に対するＰＣＩの効果
ｓｉＲＮＡ形質移入。すべての細胞系を「細胞系および培養条件」に記載のように培養し、形質移入前に２５〜５０％のコンフルエンスで６ウェルプレートにまいた（plated）。ｓｉＲＮＡおよび担体を穏やかな混合によって複合体形成させ、細胞に加える前に３０分間インキュベートした。細胞を、ｓｉＲＮＡ、担体、および光感作薬（ＴＰＰＳ2a＝０，５μｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずに形質移入し、１８時間インキュベートし、その後、新鮮な培地で３回洗浄し、光処理の前に４時間、再度インキュベートした。４時間後、細胞を青色光（７ｍＷ／ｃｍ２）に、実験に応じて様々な時間（０〜６０秒間）露光させ、９６時間再度インキュベートした後に回収した。遺伝子サイレンシングの際のＰＣＩの効果を測定するために、特異的ｓｉＲＮＡ、組み換えｓｉＲＮＡ、および形質移入試薬単独を同じプレート中の異なるウェルに、光感作薬を用いてまたは用いずに適用し、全く同じ処理を与えた。細胞は実験中アルミニウム箔によって光から保護した。
【０２１６】
分枝状の２５ｋＤａのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（１μｇ／ｍｌ）およびＳ１００Ａ４の遺伝子を標的とする１００ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡを使用して、ＰＣＩ処理を用いておよび用いずに、ｓｉＲＮＡに媒介されるＳ１００Ａ４遺伝子サイレンシングをタンパク質レベルで測定した。光用量は３０秒間とし、血清含有培地中での複合体形成および形質移入をどちらも伴って、上述のプロトコルに従った。図９Ａは、ＰＣＩの使用により、Ｓ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡは、Ｓ１００Ａ４レベルを典型的には未処理の対照（ｓｉＲＮＡを用いずにＰＥＩで処理）のレベルの５〜１５％まで減少させたことを示す。対照的に、ＰＣＩを用いないＳ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡは、Ｓ１００Ａ４レベルを対照の１００〜８０％までしか減少させることができなかった。未処理の対照レベルは、組み換えｓｉＲＮＡをＳ１００Ａ４特異的ｓｉＲＮＡの代わりに使用した対照と同等であった（データ示さず）。図９Ｂでは、実験をウエスタンブロットによって表す。図中に示すように、上部バンドはローディング対照（αチューブリン）を表し、下部バンドはＳ１００Ａ４レベルを表す。ブロットから見ることができるように、有意な遺伝子サイレンシングを検出できなかった、ＰＣＩで処理しなかったＳ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡを受容する細胞の状況と比較して、Ｓ１００Ａ４は、ＰＣＩを使用した場合にはｓｉＲＮＡで有意にサイレンシングされる。
【０２１７】
［実施例９］様々な濃度で使用した様々なＰＥＩ担体を用いた、ｓｉＲＮＡの活性に対するＰＣＩの効果
Ｓ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡの活性に対するＰＣＩ効果を、様々な分枝状ＰＥＩ製剤（formulation）を様々な濃度（０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ、ウェル１つあたり１ｍｌの培地を使用した）で用いて調査した。試験したＰＥＩ種（すべて分枝鎖状）は以下のとおりである：
ＰＥＩ  分子量（Ｄａ）
１      ８００
２      １２００
３      １３００
４      １８００
５      ２０００
６      ２５０００
光用量は３０秒間とし、血清含有培地中での複合体形成および形質移入をどちらも伴って、材料および方法に記載したプロトコルに従った。ｓｉＲＮＡは１００ｎＭの濃度で用いた。図１０から見ることができるように、ＰＣＩの使用は、様々なＰＥＩ担体を用いたＳ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効果を有意に増強させることができる。この効果は、１０μｇ／ｍｌのＰＥＩ４（分子量１８００）を除いてはＰＣＩを用いない場合の効果が非常に低いが、より少量のＰＥＩ（１および１０μｇ／ｍｌ）で特に顕著である。これら２つのＰＥＩの濃度では、ＰＣＩにより、ＰＥＩ１（分子量８００）以外の試験したすべてのＰＥＩ種の遺伝子サイレンシング効果が顕著に増強された。
【０２１８】
ＰＣＩを用いない場合、ＰＥＩ濃度の増加に伴って遺伝子サイレンシングの度合が増加し、ＰＣＩを用いた場合、この効果はそれほど明白ではない、ただし、０．１μｇ／ｍｌのＰＥＩでは、（ＰＣＩを用いても用いなくても）遺伝子サイレンシングを観察することができない。これの１つの可能な説明は、このＰＥＩの量は、すべてのｓｉＲＮＡを複合体にするために十分に高くはなく、その結果、細胞によって取り込まれない陰性に帯電した複合体が生じていることである。ＰＣＩを用いない場合では、ＰＥＩ担体の分子量の増加に伴って遺伝子サイレンシングが増加する傾向にあると考えられ、ＰＣＩを用いた場合、この効果はそれほど顕著ではなく、ここでもＰＥＩ１（分子量８００）は例外である。より高い分子量およびより多い量での、ＰＣＩを用いない場合のＰＥＩの効果は、恐らく、ＰＥＩが高濃度の場合にのみ作用する、ＰＥＩについて報告されているエンドソーム溶解特性によるものである。
【０２１９】
これは、ＰＣＩでこの効果を置き換え、低い量および低い分子量のポリエチレンイミンを使用することが可能となることを示しており、これはＰＥＩ担体の毒性および他の問題を回避するために非常に有利な特性である。
【０２２０】
［実施例１０］毒性研究
様々なＰＥＩ製剤（formulation）（分子量８００〜２５．０００）単独（ＰＣＩ処理を用いない）の毒性を最初に評価した。このアッセイでは、ＯＨＳ細胞を９６ウェルプレートにまき（plated）、血清含有培地中で一晩接着させた。その後、培地を廃棄し、細胞を培地および様々なＰＥＩ製剤（formulation）と共に、様々な濃度下で２０時間インキュベートした。その後、ＰＥＩ含有培地を廃棄し、ＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）をそれぞれのウェルに加え（１：６に希釈、１００μｌ／ウェル）、プレートをさらに４時間、再度インキュベートした。４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０２２１】
図１１Ａから観察できるように、ＰＥＩ製剤（formulation）の分子量の増加（たとえば２５０００のＰＥＩ対８００のＰＥＩ）およびＰＥＩの量の増加に伴って毒性が増加した。重要なことに、１μｇ／ｍｌ（示さず）および１０μｇ／ｍｌのＰＥＩ製剤（formulation）は有意な毒性を示さなかった。これらの試料では、ＰＣＩを用いてｓｉＲＮＡの有意な生物学的効果を達成することができ、一方で、ＰＣＩを用いない効果は非常に低かった（実施例９参照）。
【０２２２】
ｓｉＲＮＡ／ＰＣＩ処理を用いたＰＥＩの毒性も評価した。ＯＨＳ細胞を６ウェルプレートにまき（plated）、血清含有培地中で一晩接着させた。その後、培地を廃棄し、６ウェルプレート中の細胞をＰＥＩ単独、組み換えｓｉＲＮＡおよび特異的ｓｉＲＮＡを用いて、光感作薬を用いてまたは用いずに形質移入した。その後、細胞を一晩インキュベートし、続いて洗浄し、「ｓｉＲＮＡ形質移入」に記載のように青色光で処理した（ＰＣＩ）。４４時間再度インキュベートした後、１６６．６μｌのＭＴＳ溶液）をそれぞれのウェルに加え、プレートをさらに４時間、再度インキュベートした。４９０ｎｍでの吸光度を測定した。図１１Ｂは、１μｇ／ｍｌのＰＥＩ（分子量２５０００）、１００ｎＭのｓｉＲＮＡおよびＰＣＩを用いた様々な光用量における組合せ処理の毒性を示す。グラフからわかるように、ＰＣＩ処理は、すべてのＰＥＩ遺伝子サイレンシング実験において、強い遺伝子サイレンシング効果がＰＣＩによって誘発された光用量である（図１０参照）使用光用量（３０秒間）で、有意な毒性を誘発しなかった。４０秒間のより高い光用量でもＰＣＩ処理の細胞毒性は観察されず、ＰＣＩが細胞毒性効果を与えずに完全に増強されたｓｉＲＮＡ送達を誘発できることが示された。
【０２２３】
［実施例１１］β−シクロデキストリンアミンを担体として用いたｓｉＲＮＡ分子のＰＣＩに誘発される送達。
β−シクロデキストリンアミンに媒介されるｓｉＲＮＡ送達に対するＰＣＩの効果を調査した。６０秒間の光用量をこれらの実験で用い、材料および方法に記載のプロトコルに従った。ｎ＝６およびＸ＝４である上述のβ−シクロデキストリンアミンを滅菌水で希釈し、無血清培地中で複合体形成および形質移入を行った。ウエスタンブロット（図１２）から見ることができるように、５０ｎＭ（０．７μｇ）のｓｉＲＮＡと複合体形成した１００μｇ／ｍｌのβ−シクロデキストリンアミン（各ウェルに１ｍｌを使用）が、ＰＣＩに誘発されるｓｉＲＮＡ送達に有効であり（レーン３）、一方で、これらの条件下では、ＰＣＩを用いない送達は無効であった（レーン６）。本研究で用いたβ−シクロデキストリンアミンは、ｓｉＲＮＡとの結合に関与するアミン橋によって複合化したβ−シクロデキストリン分子からなり、Ｈｗａｎｇ  Ｓ．Ｊ．他（２００１、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１２、２８０〜２９０）に記載されている。
【０２２４】
［実施例１２］エチレンジアミン核を有するポリアミドアミド（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（世代２〜７）を用いたｓｉＲＮＡ分子のＰＣＩに誘発される送達
ポリアミドアミド（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを、ＰＣＩに誘発されるｓｉＲＮＡ送達について評価した。ＰＡＭＡＭを滅菌水で希釈し、血清含有培地中で形質移入を行った。１００μｇ／ｍｌの様々な種類のＰＡＭＡＭデンドリマー（世代２〜７）（各ウェルに１ｍｌを使用）を１００ｎＭ（１．４μｇ）のｓｉＲＮＡと複合体形成させ、上述の手順に従って形質移入を実施した。３０秒間の光用量をこれらの実験で用いた。ウエスタンブロット（図１３Ａ）からわかるように、ｓｉＲＮＡ／ＰＡＭＡＭが単独では遺伝子サイレンシングに無効であった条件下で（レーン４および５）、ＰＣＩはｓｉＲＮＡの活性を強力に増強することができた（レーン１および２）。図１３Ｂからわかるように、この効果はいくつかの他の種類のＰＡＭＡＭデンドリマーでもみられ、これは、ＰＣＩがポリアミン系のデンドリマーによってｓｉＲＮＡ送達を全般的に増強することができることを示している。
【０２２５】
本研究で用いた、異なる量の表面アミン基を含む様々な種類のＰＡＭＡＭは、以下のとおりである：
G2 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=2); デンドリPAMAM(NH2)16
G3 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=3); デンドリPAMAM(NH2)32
G4 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=4); デンドリPAMAM(NH2)64
G5 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=5); デンドリPAMAM(NH2)128
G6 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=6); デンドリPAMAM(NH2)256
G7 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=7); デンドリPAMAM(NH2)512
【０２２６】
【表２】
2010504080.tif 000014
【０２２７】
［実施例１３］塩酸ポリ−Ｌ−アルギニンを担体として用いたｓｉＲＮＡのＰＣＩに誘発される送達
ポリアルギニンを滅菌水で希釈し、無血清培地中で形質移入を行った。２種類のポリアルギニン担体（分子量１５０００〜７００００および＞７００００）を試験した。０．３５または０．７μｇ／ｍｌのポリアルギニン（各ウェルに１ｍｌを使用）を１００ｎＭ（１．４μｇ）のｓｉＲＮＡと複合体形成させ、上述のプロトコルに従って、３０秒間の光用量を与えた後にＳ１００４Ａの発現をウエスタンブロットによって評価した。図１５からわかるように、ＰＣＩで処理したおよび処理していない試料間で遺伝子サイレンシングの有効性に有意な差異が存在する。このように、ＰＣＩで処理したすべての試料（図１５のＲ＋試料）は有意な遺伝子サイレンシングを示す一方で、ＰＣＩで処理しない対応する試料（図１５のＲ−試料）ではサイレンシング効果が観察されない。したがって、ＰＣＩは、試験した異なるポリアルギニン担体のどちらでも、また使用したどちらの濃度でも、遺伝子サイレンシングの誘発に有効であり、これは、ＰＣＩが陽イオン性ペプチド系の担体によってｓｉＲＮＡ送達を有意に増強することができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】様々な形質移入試薬を用いてＯＨＳ細胞系を使用した遺伝子サイレンシング実験の結果を示す図であり、ｓｉＲＮＡ９を用いたＰＣＩ処理あり（黒いバー）およびなし（白いバー）を示す。グラフは、左から右に、１）ｓｉＰＯＲＴ脂質、２）ＦｕＧｅｎｅ６、３）リポフェクタミン２０００、４）リポフェクチン、５）ｊｅｔＳＩおよび６）ｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯのＳ１００Ａ４タンパク質レベルを示す。結果は未処理の対照細胞の％として表す。バーは３回の個別実験の平均である。誤差バーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図２】様々な種類の細胞を、ＰＣＩ処理を用いておよび用いずに、ｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯを使用してｓｉＲＮＡを形質移入した遺伝子サイレンシング実験の結果を示す図である。（Ａ）の結果は、ｓｉＲＮＡで処理した際の４つの細胞系におけるＳ１００Ａ４タンパク質レベルを示す。灰色のバーはＰＣＩを用いた組み換え対照ｓｉＲＮＡを示し、黒いバーはＰＣＩを用いないエフェクターｓｉＲＮＡを示し、白いバーはＰＣＩを用いたエフェクターｓｉＲＮＡを示す。細胞系は、左から右に、ＨＣＴ−１１６、ＳＷ６２０、ＯＨＳおよびＲＭＳである。バーは３回の個別実験の平均である。誤差バーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。（Ｂ）の結果は、上から下に様々な細胞系、すなわちＨＣＴ−１１６、ＳＷ６２０、ＯＨＳおよびＲＭＳを示すウエスタンブロットを示す。上部パネルはα−チューブリンのローディング対照を示し、下部パネルはＳ１００Ａ４レベルを示す。下部パネルのそれぞれにおいて、レーン１〜３は、ＰＣＩ処理を用いない、未処理の対照（Ｃ）、組み換え対照（ｓｉＲＮＡ１１）、およびエフェクター（ｓｉＲＮＡ９）のタンパク質レベルを示す。レーン４〜６は、ＰＣＩ処理を用いた、未処理の対照（Ｃ）、スクランブル対照（ｓｉＲＮＡ１１）、およびエフェクター（ｓｉＲＮＡ９）のタンパク質レベルを示す。
【図３】ＯＨＳ細胞における遺伝子サイレンシング実験の結果を示す図であり、ａ）照射の９６時間後の用量依存性サイレンシング（１〜５ｎＭのｓｉＲＮＡ）、ｂ）ｓｉＲＮＡ９を用いた時間依存性サイレンシング（２４、４８および９６時間）を示す。結果は未処理の対照細胞の％として表した。バーは３回の個別実験の平均である。誤差バーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図４】ＰＣＩ処理を用いておよび用いずにｊｅｔＳＩで形質移入したｓｉＲＮＡを用いた遺伝子サイレンシングの、照射の９６時間後の結果を示す図である。結果は、ＯＨＳ細胞系を１００ｎＭのｓｉＲＮＡで以下に示すように処理した後のＳ１００Ａ４タンパク質レベル（Ａ）およびＲＮＡレベル（Ｂ）を示す。黒いバーはＰＣＩを用いない試料を表し、白いバーはＰＣＩに供した試料を表す。ＰＣＩ処理を用いない未処理の対照を、すべての試料の対照として用いた（示さず）。試料１および４）組み換え対照（ｓｉＲＮＡ１１）、２および５）エフェクター（ｓｉＲＮＡ９）、３）未処理の対照。バーは３回の個別実験の平均を表す。誤差バーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図５】ＰＣＩ処理を用いておよび用いずに、ｊｅｔＳＩ−ＥＮＤＯを用いた形質移入（２００ｎＭ）後の、ＯＨＳにおける蛍光標識したｓｉＲＮＡの分布を示す図であり、ａ）ＰＣＩ処理を用いないｓｉＲＮＡの送達であり、左から右に位相差、蛍光および対応するマージ（merge）を示す。ｂ）ＰＣＩ処理を用いたｓｉＲＮＡの送達であり、左から右に位相差、蛍光および対応するマージ（merge）を示す。ｃ）ＰＣＩ処理を用いない蛍光写真であり、左から右に、蛍光封入したエンドソーム（左側のボックス）、エンドソームからの蛍光漏れ（右側のボックス）、左側のボックス内の画像の拡大、および右側のボックスの画像の拡大を示す。
【図６】ＯＨＳを１００ｎＭのｓｉＲＮＡおよび標準プロトコルと比較して推奨レベルの５０％のｊｅｔＳＩで処理した後の、ｊｅｔＳＩを用いた遺伝子サイレンシングの結果を示す図である。バーは、１）ＰＣＩを用いない組み換え対照ｓｉＲＮＡ、２）ＰＣＩを用いないエフェクターｓｉＲＮＡ、３）ＰＣＩを用いた未処理の対照、４）ＰＣＩを用いた組み換え対照ｓｉＲＮＡ、５）ＰＣＩを用いたエフェクター対照ｓｉＲＮＡを表す。バーは３回の個別実験の平均を表す。
【図７】好ましいリポポリアミンの構造を示す図である（Ａｈｍｅｄ他、上記およびＢｅｈｒ他（１９８９）ＰＮＡＳ、８６、６９８２〜６も参照）。
【図８】ＰＥＩを担体として用いた遺伝子サイレンシングの結果を示す図である。ウエスタンブロットは、上部パネルにローディング対照（α−チューブリン）を示し、下部パネルにＳ１００Ａ４タンパク質レベルを示す。レーン１＝未処理の対照（ＰＥＩなし）、２＝１μｌのＰＥＩ＋エフェクターｓｉＲＮＡ、３＝１０μｌのＰＥＩ＋エフェクターｓｉＲＮＡ、４＝未処理の対照（ＰＥＩなし）、５＝１μｌのＰＥＩ＋エフェクターｓｉＲＮＡ、６＝１０μｌのＰＥＩ＋エフェクターｓｉＲＮＡ。レーン１〜３はＰＣＩを用いず、レーン４〜６はＰＣＩを用いたものである。
【図９】２５ｋＤａのＰＥＩを担体として用いた遺伝子サイレンシングの結果を示す図である。使用した試料は図中に示した。Ａ．Ｓ１００Ａ４タンパク質レベルはウエスタンブロットの走査によって定量した（ＰＣＩを用いてまたは用いない、Ｓ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡを使用、３回の個別実験の平均、誤差バーはＳＥＭを表す）。Ｂ．ウエスタンブロットの例を示す。
【図１０】様々なＰＥＩ担体を様々な濃度で使用した際の、ｓｉＲＮＡの活性に対するＰＣＩの効果を示す図である。Ｓ１００Ａ４タンパク質レベルはウエスタンブロットの走査によって定量した。黒いバーはＰＣＩを用いない形質移入を表し、白いバーはＰＣＩを用いた形質移入を表す。結果は３回の個別実験の平均である。
【図１１】ＰＥＩ単独、ならびにＰＣＩおよびｓｉＲＮＡと組み合わせた場合のＰＥＩの毒性を決定するための実験の結果を示す図である。ＰＥＩの量およびＰＣＩ実験で使用した光用量を示した。Ａ．ＰＣＩを用いないＰＥＩの毒性。試験した様々な（分枝）ＰＥＩ担体の分子量を示した（５回の個別実験の平均）。Ｂ．様々な光用量におけるＰＣＩ、ＰＥＩ（１μｇ）およびｓｉＲＮＡの組合せの毒性。試験した試料および使用した光用量を示す。対照−＝未処理の対照（ＰＥＩを用いるがＰＣＩを用いない）、組み換え−＝組換えｓｉＲＮＡ対照（ＰＥＩを用いるがＰＣＩを用いない）、ｓｉＲＮＡ−＝Ｓ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡ（ＰＥＩを用いるがＰＣＩを用いない）。対照＋、組み換え＋、およびｓｉＲＮＡ＋は、対照−、組み換え−、およびｓｉＲＮＡ−と同じであるが、ＰＣＩを用いる（５回の個別実験の平均）。
【図１２】β−シクロデキストリンアミンを担体として用いた、ｓｉＲＮＡ分子のＰＣＩに誘発される送達を示す図である。レーン１および４＝ｓｉＲＮＡなしの対照、レーン２および５＝対照組換えｓｉＲＮＡ、レーン３および６＝Ｓ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡ。チューブリン対照のバンドおよびＳ１００Ａ４のバンドは示したとおりである。
【図１３】エチレンジアミン核を有するポリアミドアミド（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（世代２〜７）を用いた、ｓｉＲＮＡ分子のＰＣＩに誘発される送達を示す図である。（Ａ）上部バンドがローディング対照（αチューブリン）を表し、下部バンドがＳ１００Ａ４レベルを表すウエスタンブロットである。異なるレーン中の試料は、１．ＰＣＩを用いたＰＡＭＡＭ世代６。２．ＰＣＩを用いたＰＡＭＡＭ世代７。３．ＰＣＩを用いた対照。４．ＰＣＩを用いないＰＡＭＡＭ世代６。５．ＰＣＩを用いないＰＡＭＡＭ世代７。６．ＰＣＩを用いない対照である。（Ｂ）．ウエスタンブロットの走査によって定量したＳ１００Ａ４タンパク質レベル。黒いバーはＰＣＩを用いない形質移入を表し、白いバーはＰＣＩを用いた形質移入を表す。結果は３回の個別実験の平均である。使用したＰＡＭＡＭの様々な形態を図中に示す。
【図１４】世代０、世代１および世代２のＰＡＭＡＭデンドリマーの構造式を示す図である。
【図１５】ポリアルギニンに媒介されるｓｉＲＮＡ送達に対するＰＣＩの効果を示す図である。Ｓ１００Ａ４タンパク質のレベルはウエスタンブロットによって分析した。上部レーンはローディング対照（αチューブリン）を表し、下部レーンはＳ１００Ａ４レベルを表す。ゲル上の試料は以下のとおりである：Ｃ＋＝ＰＣＩを用いた対照、Ｓ＋＝ＰＣＩを用いた対照組換えｓｉＲＮＡ、Ｒ＋＝ＰＣＩを用いたＳ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡ、Ｃ＝ＰＣＩを用いない対照、Ｓ＝ＰＣＩを用いない対照組換えｓｉＲＮＡ、Ｒ＝ＰＣＩを用いないＳ１００Ａ４  ｓｉＲＮＡ。１＝ポリアルギニン、分子量１５，０００〜７０，０００、０．３５μｇ、２＝ポリアルギニン、分子量１５，０００〜７０，０００、０．７μｇ、３＝ポリアルギニン、分子量＞７０．０００、０．３５μｇ、４＝ポリアルギニン、分子量＞７０，０００、０．７μｇ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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