(57)【要約】  組み換えタンパク質の発現を顕著に高くするための哺乳類発現ベクターを構築する、または再構築するために、遺伝子発現エンハンサー要素または遺伝子発現「ホットスポット」配列として、ニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１または機能的等価物を使用する方法が開示される。非常に強い遺伝子発現ベクターのセットの組成物もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）哺乳類プロモーター配列、（ｂ）組み換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、（ｃ）ポリＡサイト、および（ｄ）前記ポリペプチドの発現を高めるＧＣ−リッチＤＮＡフラグメントを含む、哺乳類細胞におけるポリペプチドの組み換えの製造に用いるための発現ベクター。
【請求項２】
前記ＧＣ−リッチフラグメントが前記哺乳類プロモーター配列の５’隣接領域に融合されている、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記ＧＣ−リッチフラグメントが前記哺乳類プロモーター配列の３’隣接領域に融合されている、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記ＧＣ−リッチフラグメントが哺乳類発現ベクターのポリＡサイトの３’隣接領域に融合されている、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
（ａ）哺乳類プロモーター配列、（ｂ）組み換えポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、（ｃ）ポリＡサイト、および（ｄ）ポリペプチドの発現を高めるＧＣ−リッチＤＮＡフラグメントを含む発現ベクターの制御の下に、高密度細胞成長で哺乳類細胞においてポリペプチドを発現させることを含む、ポリペプチドの組み換えの製造方法。
【請求項６】
前記発現ベクターのＧＣ−リッチフラグメントが前記哺乳類プロモーター配列の５’隣接領域に融合されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現ベクターのＧＣ−リッチフラグメントが前記哺乳類プロモーター配列の３’隣接領域に融合されている、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＣ−リッチフラグメントが哺乳類発現ベクターのポリＡサイトの３’隣接領域に融合されている、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ベクター中にニワトリベータアクチンイントロン１またはその機能的等価物を有することを含む、遺伝子発現ベクターの有効性を向上させる方法。
【請求項１０】
前記ニワトリベータアクチンイントロン１の機能的等価物がＧＣ−リッチフラグメントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）哺乳類プロモーター配列の隣接領域に融合された、ニワトリベータアクチンイントロン１、またはその機能的等価物、（ｂ）組み換えポリペプチドをコードする遺伝子配列、（ｃ）ポリＡサイト、（ｄ）ニワトリベータアクチンイントロン１、またはその機能的等価物、および（ｅ）ｐＢＲ３２２ベクター骨格を含む、哺乳類細胞におけるポリペプチドの組み換えの製造に用いるための発現ベクター。
【請求項１２】
要素（ａ）および（ｄ）の機能的等価物が、ＧＣ−リッチＤＮＡフラグメントである、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
要素（ａ）のニワトリベータアクチンイントロン１、または機能的等価物が、哺乳類プロモーター配列の５’隣接領域に融合されている、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
要素（ａ）のニワトリベータアクチンイントロン１、または機能的等価物が、哺乳類プロモーター配列の３’隣接領域またはポリＡ配列の下流に融合されている、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
要素（ａ）のニワトリベータアクチンイントロン１、または機能的等価物が、哺乳類発現ベクターのポリＡサイトの３’隣接領域に融合されている、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
配列番号４の配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
配列番号５の配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
配列番号６の配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
配列番号７の配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
配列番号８の配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
配列番号９の配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
配列番号１０の配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号１１の配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
配列番号１２の配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
（ａ）哺乳類プロモーター配列の隣接領域に融合された、ニワトリベータアクチンイントロン１、またはその機能的等価物、（ｂ）組み換えポリペプチドをコードする遺伝子配列、（ｃ）ポリＡサイト、（ｄ）ニワトリベータアクチンイントロン１、またはその機能的等価物、および（ｅ）ｐＢＲ３２２ベクター骨格を含む発現ベクターの制御の下に、高密度細胞成長で哺乳類細胞においてポリペプチドを発現させることを含む、ポリペプチドの組み換えの製造方法。
【請求項２６】
要素（ａ）および（ｄ）の機能的等価物が、ＧＣ−リッチＤＮＡフラグメントである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
要素（ａ）のニワトリベータアクチンイントロン１、または機能的等価物が、前記発現ベクターの哺乳類プロモーター配列の５’隣接領域に融合されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
要素（ａ）のニワトリベータアクチンイントロン１、または機能的等価物が、前記発現ベクターの哺乳類プロモーター配列の３’隣接領域に融合されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
要素（ａ）のニワトリベータアクチンイントロン１、または機能的等価物が、哺乳類発現ベクターのポリＡサイトの３’隣接領域に融合されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記発現ベクターが配列番号４の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記発現ベクターが配列番号５の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記発現ベクターが配列番号６の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記発現ベクターが配列番号７の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記発現ベクターが配列番号８の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記発現ベクターが配列番号９の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記発現ベクターが配列番号１０の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記発現ベクターが配列番号１１の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記発現ベクターが配列番号１２の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
既存のプロモーターまたはポリＡサイトのどちらか一方の隣接領域で、ベクター中にニワトリベータアクチンイントロン１またはその機能的等価物を導入することを含む、哺乳類細胞におけるポリペプチドの組み換えの製造に用いるための既存の発現ベクターの性能を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本願は、２００７年１月２５日に出願された米国仮出願第６０／８９７，３９４号に対する優先権を主張するものであり、該出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、組み換えタンパク質の顕著に高レベルな発現と、組み換えタンパク質を非常に高いレベルで産生する哺乳類セルラインの製造とを目的として、新たな哺乳類発現ベクターを構築する、または既存の遺伝子発現ベクターを再構築するために、哺乳類遺伝子発現プロモーターの５’−または３’−隣接領域で、遺伝子発現エンハンサーまたは遺伝子発現「ホットスポット」としてニワトリベータアクチンイントロン−１を使用することに関連する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
組み換えタンパク質は、宿主細胞中に組み換えタンパク質をコードする発現ベクターを初めに導入し、次いで宿主細胞中で組み換えタンパク質を発現させることによって製造されうる。従来の宿主細胞として、無血清懸濁培地中で最適に強く成長するためには選択されない、オリジナルＣＨＯ、ＮＳＯおよび２９３細胞が挙げられる。従来の発現ベクターとしては、組み換えタンパク質の発現を制御する、ＳＶ４０またはＣＭＶ系プロモーターが使用できる。従来の発現システム中で用いられる宿主細胞は、倍増時間が約２４〜３６時間、最適な成長細胞濃度が３〜５×１０６細胞／ｍｌと比較的ゆっくりと成長する。
【０００４】
産生スピードを増加させ、組み換えタンパク質の高い産生率を維持するために、発明者は、より短い倍増時間およびより濃い細胞濃度を有する特定の強固な宿主細胞が好適に用いられうることを見出している。強固なセルラインは、迅速で高密度に成長するセルラインをスクリーニングすることによって通常選択され、または迅速で高密度に成長するセルラインのどんなタイプからも通常選択される。しかしながら、従来の発現ベクター中で使用されるプロモーターは、高い遺伝子発現レベルを目的とした、迅速で、高密度に成長するこれらのセルライン中で十分に強固ではない。また、それほど多くのベクターが多くのセルラインタイプに対して普遍的に用いることができるわけではない。
【０００５】
したがって、より短い倍増時間有し、高密度成長をする、強固で成長速度の速い宿主細胞中のほとんどで使用されるのに適した非常に強い普遍的な発現ベクターの探索が必要である。
【０００６】
植物遺伝子の５’調節領域はしばしば高いＧＣ−リッチ含量（ＣｐＧアイランド）を含むことが知られていた。植物遺伝子発現は、哺乳類発現よりもしばしば高いレベルで構成的（constitutive）である。おそらく、５’調節領域における強固なＤＮＡ構造を有する高いＧＣ−リッチ含量が、普遍的な機構としてあらゆる遺伝子発現に対して重要な役割を果たす。本分野における遺伝子ＤＮＡ配列研究およびこれまでのラボ実験により、ニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１の顕著に高いＧＣ−リッチ含量が同定された（１．００６ｋｂフラグメント、配列番号：１）。この１００６塩基対配列は、１３０塩基対断片の最も高いＧＣ含有率９０．８％を有し、平均で７４．８％のＧＣ含量を含む。我々の実験アプローチを通じて、この領域は非常に強固なＤＮＡ２次構造を有することを我々は見出し、これは、配列決定が非常に困難であり、全体のＰＣＲリーディングが不可能で、ライゲーションが困難であることにより証明された。したがって、我々は、強固なＤＮＡ構造を有する高いＧＣ−リッチの遺伝子ＤＮＡが、遺伝子転写を制御する、クロマチン凝縮およびヌクレオソーム形成を制御することにより、全ての哺乳類遺伝子発現の高い構成的レベルの秘密を握ると仮定をたてた。
【０００７】
本発明は、驚くべき発見、すなわち、新たな哺乳類発現ベクターを構築するための、または組み換えタンパク質の高発現を目的として既存のベクターを改変するための、５’−または／および３’−隣接遺伝子発現エンハンサーまたは遺伝子発現「ホットスポット」部位としての高いＧＣ−リッチニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１の使用に基づく。驚くべきことに、ニワトリアクチン遺伝子イントロン−１改変哺乳類発現ベクターが、成長速度の速いＣＨＯセルライン中で非常に高い発現レベルを産生した。
【０００８】
すなわち、ニワトリベータアクチンイントロン−１（１．００６ｋｂフラグメント、配列番号：１）がエンハンサー要素または発現「ホットスポット」配列として使用され、下記の説明のように、所定の哺乳類遺伝子プロモーターの周囲に構築された。
【０００９】
１）コントロール（アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）；
２）ｐＭＨ１（イントロン−１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）；
３）ｐＭＨ２（アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）；
４）ｐＭＨ３（イントロン−１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１；
５）ｐＭＨ４（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン１−ポリリンカー−ポリＡ）；
６）ｐＭＨ５（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）；
７）ｐＭＨ６（ｐイントロン−１−ＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）；
８）ｐＭＨ７（ｐイントロン−１−ＰＧＫプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）；
９）ｐＭＨ８（ｐＧＣリッチフラグメント−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）；
１０）ｐＭＨ９（ｐアクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−ＧＣリッチフラグメント）；
発明の簡単な要約
非常に強い哺乳類発現ベクターを構築するための、エンハンサー要素または発現「ホットスポット」配列としてのニワトリベータアクチンイントロン−１またはその機能的等価物を使用する方法が開示される。非常に強い遺伝子発現ベクターセットの組成物もまた開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｐアクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡのコントロールプラスミドは、ネイティブなニワトリベータアクチンプロモーター系発現ベクターである。これは、ポリＡサイトが続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩポリリンカーを有し、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＢＲ３２２ベクター骨格に挿入された、ニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーターの完全長の１．２７２ｋｂのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（配列番号：２）を用いることによって構築された。
【図２】ｐＭＨ１のイントロン−１改変プラスミド（イントロン−１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（配列番号：４）は、ＳａｌＩ／ＰｓｔＩアダプター改変イントロン−１の１．００６ｋｂをアクチンプロモーター配列の上流すぐのＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入することによって構築した。次いで、０．３３１ｋｂスペーサーフラグメント（ＣＭＶプロモーターなしのＣＭＶエンハンサー）をイントロン−１およびアクチンプロモーターの間のＰｓｔＩ部位にセンス方向に挿入した。
【図３】ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩアダプター改変１．００６ｋｂイントロン−１配列をポリＡシグナル配列の下流すぐのＰｓｔＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入することによって、ｐＭＨ２のイントロン−１改変プラスミド（アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（配列番号：５）を構築した。次いで、０．３３１ｋｂスペーサーフラグメント（ＣＭＶプロモーターなしのＣＭＶエンハンサー）をイントロン−１およびアクチンプロモーターの間のＰｓｔＩ部位にセンス方向に挿入した。
【図４】ｐＭＨ１（配列番号：５）のアクチンプロモーターを含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントおよびｐＭＨ２（配列番号：４）のｐＢＲ３２２骨格を含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントを結合することによって、ｐＭＨ３のイントロン−１改変プラスミド（イントロン１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１（配列番号：６）を構築した。
【図５】ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位を有する、ＰＣＲで増幅した０．８２ｋｂ  ＣＭＶプロモーター配列とＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩ改変イントロン−１フラグメントとを結合することによって、ｐＭＨ４のイントロン−１改変プラスミド（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン１−ポリリンカー−ポリＡ）（配列番号：７）を構築した。次いで、これをポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを有するＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＲ３２２ベクター骨格のＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。
【図６】ｐＭＨ４（配列番号：７）のアクチンプロモーターを含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントおよびｐＭＨ２（配列番号：５）のｐＢＲ３２２骨格を含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントを結合することによって、ｐＭＨ５のイントロン−１改変プラスミド（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（配列番号：８）を構築した。
【図７】ＳａｌＩ改変１．００６ｋｂイントロン−１配列をｐＭＨ５（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）のＣＭＶプロモーターの上流すぐのＳａｌＩ部位にセンス方向で挿入することによって、ｐＭＨ６のイントロン−１改変プラスミド（ｐイントロン−１−ＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（配列番号：９）を構築した。
【図８】ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する０．５７２ｋｂ  ＰＣＲで増幅したＰＧＫプロモーター配列をポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを有するＰｓｔＩ／ＨＩｎｄＩＩＩで切断したｐＢＲ３２２ベクター骨格に挿入することによって、ｐＭＨ７のイントロン−１改変プラスミド（ｐイントロン−１−ＰＧＫプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（配列番号：１０）を構築した。次いで、アダプター改変ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位を有するイントロン−１配列を、ＰＧＫプロモーターの上流すぐのＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入した。
【図９】ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位を有する合成１．３３７ｋｂ  ＧＣ−リッチフラグメント（配列番号：１３）を、ポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを有するｐＢＲ３２２ベクター骨格のアクチンプロモーター配列の上流すぐにあるＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入することによって、ｐＭＨ８のＧＣ−リッチＤＮＡフラグメント改変プラスミド（ｐＧＣリッチフラグメント−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（配列番号：１１）を構築した。
【図１０】ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩアダプター改変合成１．３３７ｋｂ  ＧＣ−リッチフラグメント（配列番号：１３）をポリＡシグナル配列の下流のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによって、ｐＭＨ９のＧＣ−リッチＤＮＡフラグメント改変プラスミド（ｐアクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−ＧＣ−リッチフラグメント）（配列番号：１２）を構築した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、組み換えタンパク質を顕著に高いレベルで発現させるための哺乳類発現ベクターを構築するために、ニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１がエンハンサー要素または発現「ホットスポット」配列として使用できるという発見に基づく。つまり、ニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１（１．００６ｋｂ  フラグメント  配列番号：１）はエンハンサー配列またはホットスポットとして用いられ、所定の哺乳類遺伝子プロモーターの周囲に構築され、下記のように説明された：
１）コントロール（アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）；
２）ｐＭＨ１（イントロン−１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）；
３）ｐＭＨ２（アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）；
４）ｐＭＨ３（イントロン−１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１；
５）ｐＭＨ４（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン１−ポリリンカー−ポリＡ）；
６）ｐＭＨ５（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）；
７）ｐＭＨ６（ｐイントロン−１−ＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）；
８）ｐＭＨ７（ｐイントロン−１−ＰＧＫプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）；
９）ｐＭＨ８（ｐＧＣリッチフラグメント−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）；
１０）ｐＭＨ９（ｐアクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−ＧＣリッチフラグメント）
ニワトリベータアクチン遺伝子５’−隣接調節要素の完全長は、Ｄｒ．Ｎ  Ｆｒｅｇｉｅｎから提供された（ＡＴＣＣ  ３７５０７）（Ｆｒｅｇｉｅｎ  Ｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｎ，１９８６）。その配列を決定し、制限酵素マッピングによって特徴付けをし、それは公表された配列（Ｋｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）と一致した。１．４９４ｋｂニワトリアクチン遺伝子プロモーターフラグメントは、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化（ダイジェッション）し、ＳＤＳゲルによって精製した。この１．４９４ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩプロモーターフラグメントをさらにＨｉｎｆＩによって消化して１．００６ｋｂイントロン−１を得、イントロン−１の５’−末端でＰｓｔＩを持ち、３’−末端でＨｉｎｄ  ＩＩＩを持たせるためにリン酸化ＰｓｔＩ／ＨｉｎｆＩアダプターを用いることによって改変した（配列番号１）。
【００１２】
コントロール（アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（配列番号：３）を形成するために、イントロン−１を含むニワトリベータアクチン遺伝子５’−隣接調節要素の完全長の１．２７２ｋｂ  Ｘｈｏ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメント（配列番号：２）を、ポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位を有するＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＢＲ３２２系ベクター骨格に挿入することによって、ネイティブニワトリベータアクチンプロモーター系発現ベクター（図１）（配列番号：３）を構築した。
【００１３】
ｐアクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡのコントロールプラスミド（図１）は、ネイティブなニワトリベータアクチンプロモーター系発現ベクターである。これは、ポリＡサイトが続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩポリリンカーを有し、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＢＲ３２２ベクター骨格に挿入された、ニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーターの完全長の１．２７２ｋｂのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（配列番号：２）を用いることによって構築された。
【００１４】
ｐＭＨ１のイントロン−１改変プラスミド（イントロン−１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（図２）（配列番号：４）は、ＳａｌＩ／ＰｓｔＩアダプター改変イントロン−１の１．００６ｋｂをアクチンプロモーター配列の上流すぐのＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入することによって構築した。次いで、０．３３１ｋｂスペーサーフラグメント（ＣＭＶプロモーターなしのＣＭＶエンハンサー）をイントロン−１およびアクチンプロモーターの間のＰｓｔＩ部位にセンス方向に挿入した。
【００１５】
ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩアダプター改変１．００６ｋｂイントロン−１配列をポリＡシグナル配列の下流すぐのＰｓｔＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入することによって、ｐＭＨ２のイントロン−１改変プラスミド（アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（図３）（配列番号：５）を構築した。次いで、０．３３１ｋｂスペーサーフラグメント（ＣＭＶプロモーターなしのＣＭＶエンハンサー）をイントロン−１およびアクチンプロモーターの間のＰｓｔＩ部位にセンス方向に挿入した。
【００１６】
ｐＭＨ１（配列番号：５）のアクチンプロモーターを含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントおよびｐＭＨ２（配列番号：４）のｐＢＲ３２２骨格を含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントを結合することによって、ｐＭＨ３のイントロン−１改変プラスミド（イントロン１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１（図４）（配列番号：６）を構築した。
【００１７】
ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位を有する、ＰＣＲで増幅した０．８２ｋｂ  ＣＭＶプロモーター配列とＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩ改変イントロン−１フラグメントとを結合することによって、ｐＭＨ４のイントロン−１改変プラスミド（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン１−ポリリンカー−ポリＡ）（図５）（配列番号：７）を構築した。次いで、これをポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを有するＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＲ３２２ベクター骨格のＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。
【００１８】
ｐＭＨ４（配列番号：７）のアクチンプロモーターを含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントおよびｐＭＨ２（配列番号：５）のｐＢＲ３２２骨格を含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントを結合することによって、ｐＭＨ５のイントロン−１改変プラスミド（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（図６）（配列番号：８）を構築した。
【００１９】
ＳａｌＩ改変１．００６ｋｂイントロン−１配列をｐＭＨ５（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）のＣＭＶプロモーターの上流すぐのＳａｌＩ部位にセンス方向で挿入することによって、ｐＭＨ６のイントロン−１改変プラスミド（ｐイントロン−１−ＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（図７）（配列番号：９）を構築した。
【００２０】
ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する０．５７２ｋｂ  ＰＣＲで増幅したＰＧＫプロモーター配列をポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを有するＰｓｔＩ／ＨＩｎｄＩＩＩで切断したｐＢＲ３２２ベクター骨格に挿入することによって、ｐＭＨ７のイントロン−１改変プラスミド（ｐイントロン−１−ＰＧＫプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（図８）（配列番号：１０）を構築した。次いで、アダプター改変ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位を有するイントロン−１配列を、ＰＧＫプロモーターの上流すぐのＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入した。
【００２１】
ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位を有する合成１．３３７ｋｂ  ＧＣ−リッチフラグメント（配列番号：１３）を、ポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを有するｐＢＲ３２２ベクター骨格のアクチンプロモーター配列の上流すぐにあるＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入することによって、ｐＭＨ８のＧＣ−リッチＤＮＡフラグメント（配列番号：１３）改変プラスミド（ｐＧＣリッチフラグメント−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（図９）（配列番号：１１）を構築した。
【００２２】
ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩアダプター改変合成１．３３７ｋｂ  ＧＣ−リッチフラグメント（配列番号：１３）をポリＡシグナル配列の下流のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによって、ｐＭＨ９のＧＣ−リッチＤＮＡフラグメント（配列番号１３）改変プラスミド（ｐアクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−ＧＣ−リッチフラグメント）（図１０）（配列番号：１２）を構築した。
【００２３】
ＥｃｏＲＩサイト−ＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ＮｏｔＩサイトをコードするｃＤＮＡ（配列番号１４）を、従前のプラスミドベクターから切断し（インハウス（ｉｎ  ｈｏｕｓｅ））、図１〜１０で表される上記で構築した哺乳類発現ベクター（配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入した。これらのプラスミドｃＤＮＡは、ＰｖｕＩにより線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）され、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社）を用いて成長速度が速いＣＨＯ親ホストラインに安定的に導入された。安定的なセルクローン選択のために、ＰＧＫ−ネオ耐性遺伝子−ｐＡカセットを共トランスフェクションするか、または各ベクターのＳａｌＩサイトに挿入することにより、ＰＧＫプロモーターで作動するネオマイシン耐性遺伝子を用いた。
【００２４】
安定的なセルクローンは、９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）中で選択された。トランスフェクションは繰り返し行われた。全ての遺伝子発現は、フレッシュで添加された０．１ｍｌ無血清培地中、３７℃、ＣＯ２インキュベーター中、９６−ウェルプレートで３時間行われた。
【００２５】
フレッシュ無血清培地中で３時間のＴＮＦＲ２−Ｆｃ発現は、ドットブロットまたはイライザ（Ｅｌｉｓａ）を用いることによって検出した。ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社）を結合した抗−ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント抗体を特定的結合に用いた。各構成物の発現タイターを比較するために、２×９６ウェルプレートの上記２つのトランスフェクションから最もよいクローンの発現タイターを用いた。
【００２６】
簡潔に、集められた条件培地は厳密に０、２、４、８、１６、および３２倍に希釈した。希釈条件培地は、ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社）を結合した抗ヒトＩｇ  Ｆｃ抗血清を用いてドットブロット半定量分析に供した。また、標準イライザ用に９６ウェルマイクロプレートを希釈条件培地０．１ｍｌを用いてコートし、次いでＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社）を結合した抗ヒトＩｇ  Ｆｃ抗血清でインキュベートし、洗い、発色現象およびマイクロプレートリーダーによる定量を行った。市販のＴＮＦＲ２−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）を我々の無血清培養培地に添加し、定量標準として用いた。
【００２７】
【表１】
2010516276.tif 000002
【００２８】
表１の結果より、この１．００６ｋｂニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１は、組み換えタンパク質の発現レベルを高くし、組み換えタンパク質を高いレベルで産生する哺乳類セルラインを製造するための、新しい哺乳類発現ベクターを構築する、または既存の遺伝子発現ベクターを再構築することを目的として、哺乳類遺伝子発現プロモーターの５’−または３’−隣接で共通の遺伝子発現エンハンサー要素または遺伝子発現「ホットスポット」配列として用いることができることが示された。イントロン−１は、発現ベクターのあらゆる異なる位置でよく作用するので、この結果により、また、イントロン−１がエンハンサー要素であるばかりでなく、「ホットスポット」配列でもあることが示された。また、合成ＧＣ−リッチフラグメントもまた、哺乳類遺伝子発現プロモーターの５’−または３’−隣接で共通遺伝子発現エンハンサー要素または遺伝子発現「ホットスポット」配列として用いることができることが示された。全ての発現タイターは、現在の工業レベル（１５−４５ｐｇ／細胞／日）の最高レベルに達している、または超えていて、これらの発現ベクターの多大なる商業的価値を示している。我々は、哺乳類遺伝子発現をこれで解決し、おそらくあらゆる遺伝子発現の共通の方法または機構、すなわち高い構成的哺乳類遺伝子発現用のエンハンサーまたは発現「ホットスポット」配列として強い２次構造を有する自然発生的な、または合成ＧＣ−リッチＤＮＡの使用を同定したことを確信した。
【００２９】
本発明の最初に論じたように、植物遺伝子５’調節領域はしばしばＣｐＧアイランドと呼ばれる高いＧＣ−リッチ含量を含む。植物遺伝子発現はしばしばより高いレベルで構造的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）である。表１の結果により、非常に高いＧＣ−リッチ含量を有し、ＤＮＡ構造が強い可能性がある、ニワトリベータアクチン遺伝子の自然発生的なイントロン−１がＣＨＯ細胞遺伝子発現にとって重要な役割を果たすことが示された。これは、真核性の遺伝子発現用の高いＧＣ含量イントロン、または発現エンハンサーあるいはインシュレーターを探索することは、効果的な遺伝子発現ベクターを構築する、または再構築するための普遍的なツールとなりうることを示した。他の選択肢は、この共通メカニズムに従うことによって、効果的な遺伝子発現ベクターを構築する、および再構築するための、人工的ＧＣ−リッチイントロン、「ホットスポット」、エンハンサー、プロモーターを合成することである。
【００３０】
表１の結果は、また高いＧＣ含量を有し、ＤＮＡ構造が強い可能性がある非特異的合成ＤＮＡフラグメントの融合により、ＣＨＯ細胞中での構成的遺伝子発現の高いレベルが支えられ、遺伝子発現ベクター構成物用の普遍的ツールとしての将来的な合成または改変遺伝子発現エンハンサーまたは「ホットスポット」配列を示唆する。我々は、高いＧＣ−リッチＤＮＡ配列が、遺伝子発現を高くするための共通の方法として遺伝子発現ベクターを再構築するための材料に用いられうると結論付けた。おそらく、強いＤＮＡ構造を有する高いＧＣ−含有ＤＮＡフラグメントは、高いレベルで遺伝子転写および発現を行うためのクロマチン凝縮およびヌクレオソーム形成を制御する普遍的機構である。
【００３１】
（他で特定されていない限り）本明細書を通じて使用されている「ＧＣリッチフラグメント」なる専門用語は、塩基数で約６８％以上がシトシン（Ｃ）および／またはグアニン（Ｇ）で構成され、最も好ましくは、塩基数で８０％以上がシトシン（Ｃ）および／またはグアニン（Ｇ）で構成される、自然発生的か、または合成されたＤＮＡ断片（長さが１００〜２０００ｂｐ）を意味する。
【００３２】
実施例１：ニワトリベータアクチン遺伝子の５’−隣接領域のシークエンシング
ニワトリベータアクチン遺伝子の５’−隣接領域は、Ｄｒ．Ｎ  Ｆｒｅｇｉｅｎ（ＡＴＣＣ  ３７５０７）（Ｆｒｅｇｉｅｎ  Ｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｎ，  １９８６）から提供され、商業的なサービスプロバイダーであるＬａｒａｇｅｎ社によって配列が決定された。完全な配列は、下記にリストされる：
【００３３】
【表２−１】
2010516276.tif 000003
【００３４】
【表２−２】
2010516276.tif 000004
【００３５】
【表２−３】
2010516276.tif 000005
【００３６】
【表２−４】
2010516276.tif 000006
【００３７】
実施例２：哺乳類発現ベクターの構築
ニワトリベータアクチン遺伝子５’−隣接調節要素の完全長は、Ｄｒ．Ｎ  Ｆｒｅｇｉｅｎから提供された（ＡＴＣＣ  ３７５０７）（Ｆｒｅｇｉｅｎ  Ｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｎ，１９８６）。その配列を決定し、制限酵素マッピングによって特徴付けをし、それは公表された配列（Ｋｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）と一致した。１．４９４ｋｂニワトリアクチン遺伝子プロモーターフラグメントは、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化（ダイジェッション）し、ＳＤＳゲルによって精製した。この１．４９４ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩプロモーターフラグメントをさらにＨｉｎｆＩによって消化して１．００６ｋｂイントロン−１を得、イントロン−１の５’−末端でＰｓｔＩを持ち、３’−末端でＨｉｎｄ  ＩＩＩを持たせるためにリン酸化ＰｓｔＩ／ＨｉｎｆＩアダプターを用いることによって改変した（配列番号１）。
【００３８】
コントロール（アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（配列番号：３）を形成するために、イントロン−１を含むニワトリベータアクチン遺伝子５’−隣接調節要素の完全長の１．２７２ｋｂ  Ｘｈｏ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメント（配列番号：２）を、ポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位を有するＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＢＲ３２２系ベクター骨格に挿入することによって、ネイティブニワトリベータアクチンプロモーター系発現ベクター（図１）（配列番号：３）を構築した。
【００３９】
ｐアクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡのコントロールプラスミド（図１）は、ネイティブなニワトリベータアクチンプロモーター系発現ベクターである。これは、ポリＡサイトが続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩポリリンカーを有し、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＢＲ３２２ベクター骨格に挿入された、ニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーターの完全長の１．２７２ｋｂのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（配列番号：２）を用いることによって構築された。
【００４０】
ｐＭＨ１のイントロン−１改変プラスミド（イントロン−１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（図２）（配列番号：４）は、ＳａｌＩ／ＰｓｔＩアダプター改変イントロン−１の１．００６ｋｂをアクチンプロモーター配列の上流すぐのＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入することによって構築した。次いで、０．３３１ｋｂスペーサーフラグメント（ＣＭＶプロモーターなしのＣＭＶエンハンサー）をイントロン−１およびアクチンプロモーターの間のＰｓｔＩ部位にセンス方向に挿入した。
【００４１】
ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩアダプター改変１．００６ｋｂイントロン−１配列をポリＡシグナル配列の下流すぐのＰｓｔＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入することによって、ｐＭＨ２のイントロン−１改変プラスミド（アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（図３）（配列番号：５）を構築した。次いで、０．３３１ｋｂスペーサーフラグメント（ＣＭＶプロモーターなしのＣＭＶエンハンサー）をイントロン−１およびアクチンプロモーターの間のＰｓｔＩ部位にセンス方向に挿入した。
【００４２】
ｐＭＨ１（配列番号：５）のアクチンプロモーターを含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントおよびｐＭＨ２（配列番号：４）のｐＢＲ３２２骨格を含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントを結合することによって、ｐＭＨ３のイントロン−１改変プラスミド（イントロン１−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（図４）（配列番号：６）を構築した。
【００４３】
ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位を有する、ＰＣＲで増幅した０．８２ｋｂ  ＣＭＶプロモーター配列とＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩ改変イントロン−１フラグメントとを結合することによって、ｐＭＨ４のイントロン−１改変プラスミド（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン１−ポリリンカー−ポリＡ）（図５）（配列番号：７）を構築した。次いで、これをポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを有するＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＲ３２２ベクター骨格のＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。
【００４４】
ｐＭＨ４（配列番号：７）のアクチンプロモーターを含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントおよびｐＭＨ２（配列番号：５）のｐＢＲ３２２骨格を含むＰｖｕＩ／ＮｏｔＩフラグメントを結合することによって、ｐＭＨ５のイントロン−１改変プラスミド（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（図６）（配列番号：８）を構築した。
【００４５】
ＳａｌＩ改変１．００６ｋｂイントロン−１配列をｐＭＨ５（ｐＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）のＣＭＶプロモーターの上流すぐのＳａｌＩ部位にセンス方向で挿入することによって、ｐＭＨ６のイントロン−１改変プラスミド（ｐイントロン−１−ＣＭＶプロモーター−イントロン−１−ポリリンカー−ポリＡ−イントロン−１）（図７）（配列番号：９）を構築した。
【００４６】
ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する０．５７２ｋｂ  ＰＣＲで増幅したＰＧＫプロモーター配列をポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを有するＰｓｔＩ／ＨＩｎｄＩＩＩで切断したｐＢＲ３２２ベクター骨格に挿入することによって、ｐＭＨ７のイントロン−１改変プラスミド（ｐイントロン−１−ＰＧＫプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（図８）（配列番号：１０）を構築した。次いで、アダプター改変ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位を有するイントロン−１配列を、ＰＧＫプロモーターの上流すぐのＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入した。
【００４７】
ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位を有する合成１．３３７ｋｂ  ＧＣ−リッチフラグメント（配列番号：１３）を、ポリＡ部位が続くＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを有するｐＢＲ３２２ベクター骨格のアクチンプロモーター配列の上流すぐにあるＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入することによって、ｐＭＨ８のＧＣ−リッチＤＮＡフラグメント（配列番号：１３）改変プラスミド（ｐＧＣリッチフラグメント−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（図９）（配列番号：１１）を構築した。
【００４８】
ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩアダプター改変合成１．３３７ｋｂ  ＧＣ−リッチフラグメント（配列番号：１３）をポリＡシグナル配列の下流のＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによって、ｐＭＨ９のＧＣ−リッチＤＮＡフラグメント（配列番号１３）改変プラスミド（ｐアクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−ＧＣ−リッチフラグメント）（図１０）（配列番号：１２）を構築した。
【００４９】
実施例３：ニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１のＧＣ含量分析
ニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１（配列番号：１）は下記のようにリストされる：
【００５０】
【表３−１】
2010516276.tif 000007
【００５１】
【表３−２】
2010516276.tif 000008
【００５２】
ニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１の高いＧＣ含量領域を分析し、下記表２に要約した。
【００５３】
【表４】
2010516276.tif 000009
【００５４】
９０．８％までの非常に高いＧＣ含有率が１００塩基対の最小ＤＮＡ長内のイントロン−１中で同定された。この顕著に高いＧＣ含量は、哺乳類ゲノム中ではまれである。ニワトリゲノム中で進化を通じてどのように起こったのかは不明である。実験的アプローチを通じて、我々は、この領域が非常に強いＤＮＡ２次構造を有することを見出し、これは、配列決定が非常に困難であること、全体のＰＣＲリーディングが不可能であること、そしてライゲーションが困難であることによって証明された。我々は、強固なＤＮＡ構造を有する高いＧＣ−リッチの遺伝子ＤＮＡが、遺伝子転写を制御する、クロマチン凝縮およびヌクレオソーム形成を制御することにより、全ての哺乳類遺伝子発現の高い構成レベルの秘密を握ると仮定をたてた。我々は次いで、下記非特異的ＧＣ含有が高い１３３７塩基対ＤＮＡフラグメント（配列番号：１３）をアイディアの証明用に合成した。このＧＣ−リッチＤＮＡフラグメントは同じＧＣ含量を含む（配列番号：１３）（表３）。したがって、哺乳類発現ベクター中に融合した際に、エンハンサーまたは「ホットスポット」活性を試験するために有用である。
【００５５】
合成された高いＧＣ含有ＤＮＡフラグメントは下記のようにリストされる（配列番号：１３）：
【００５６】
【表５】
2010516276.tif 000010
【００５７】
このＧＣ−リッチＤＮＡフラグメント（配列番号：１３）の高いＧＣ含有領域を分析し、下記表３にまとめた。
【００５８】
【表６】
2010516276.tif 000011
【００５９】
このＧＣ−リッチＤＮＡフラグメント（配列番号：１３）を用いることによって、我々はｐＭＨ８（ｐＧＣリッチフラグメント−アクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ）（図９）（配列番号：１１）およびｐＭＨ９（ｐアクチンプロモーター−ポリリンカー−ポリＡ−ＧＣリッチフラグメント）（図１０）（配列番号：１２）（実施例２参照）を構築した。発現結果を実施例４に示し、この強いエンハンサーまたは「ホットスポット」活性はニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１と同様であることが明確に示された。我々は、高いＧＣ−リッチＤＮＡ配列が、高い遺伝子発現用の共通の方法として遺伝子発現ベクターを再構築するための材料に用いられうると結論付けた。おそらく、これはあらゆる真核遺伝子発現を支配する普遍的な機構である。
【００６０】
（他で特定されていない限り）本明細書を通じて使用されている「ＧＣリッチフラグメント」なる専門用語は、塩基数で約６８％以上がシトシン（Ｃ）および／またはグアニン（Ｇ）で構成され、最も好ましくは、塩基数で８０％以上がシトシン（Ｃ）および／またはグアニン（Ｇ）で構成される、自然発生的か、または合成されたＤＮＡ断片（長さが１００〜２０００ｂｐ）を意味する。
【００６１】
実施例４：発現ベクターの強さを比較するためのＴＮＦＲ２−Ｆｃの発現
ＥｃｏＲＩサイト−ＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ＮｏｔＩサイトをコードするｃＤＮＡ（配列番号１４）を、従前のプラスミドベクターから切断し（インハウス（ｉｎ  ｈｏｕｓｅ））、図１〜１０で表される上記で構築した哺乳類発現ベクター（配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入した。これらのプラスミドｃＤＮＡは、ＰｖｕＩにより線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）され、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社）を用いて成長速度が速いＣＨＯ親ホストラインに安定的に導入された。安定的なセルクローン選択のために、ＰＧＫ−ネオ耐性遺伝子−ｐＡカセットを共トランスフェクションするか、または各ベクターのＳａｌＩサイトに挿入することにより、ＰＧＫプロモーターで作動するネオマイシン耐性遺伝子を用いた。
【００６２】
安定的なセルクローンは、９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）中で選択された。トランスフェクションは繰り返し行われた。全ての遺伝子発現は、フレッシュで添加された０．１ｍｌ無血清培地中、３７℃、ＣＯ２インキュベーター中、９６−ウェルプレートで３時間行われた。
【００６３】
フレッシュ無血清培地中で３時間のＴＮＦＲ２−Ｆｃ発現は、ドットブロットまたはイライザ（Ｅｌｉｓａ）を用いることによって検出した。ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社）を結合した抗−ＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント抗体を特定的結合に用いた。各構成物の発現タイターを比較するために、２×９６ウェルプレートの上記２つのトランスフェクションから最もよいクローンの発現タイターを用いた。
【００６４】
簡潔に、集められた条件培地は厳密に０、２、４、８、１６、および３２倍に希釈した。希釈条件培地は、ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社）を結合した抗ヒトＩｇ  Ｆｃ抗血清を用いてドットブロット半定量分析に供した。また、標準イライザ用に９６ウェルマイクロプレートを希釈条件培地０．１ｍｌを用いてコートし、次いでＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社）を結合した抗ヒトＩｇ  Ｆｃ抗血清でインキュベートし、洗い、発色現象およびマイクロプレートリーダーによる定量を行った。市販のＴＮＦＲ２−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）を我々の無血清培養培地に添加し、定量標準として用いた。
【００６５】
下記表１の結果より、この１．００６ｋｂニワトリベータアクチン遺伝子イントロン−１は、組み換えタンパク質の発現レベルを高くし、組み換えタンパク質を高いレベルで産生する哺乳類セルラインを製造するために、新しい哺乳類発現ベクターを構築する、または既存の遺伝子発現ベクターを再構築することを目的として、哺乳類遺伝子発現プロモーターの５’−または３’−隣接で遺伝子発現エンハンサー要素または遺伝子発現「ホットスポット」配列として用いることができることが示された。
【００６６】
発現ベクターのあらゆる異なる位置でよく作用するので、この結果により、また、イントロン−１がエンハンサー要素であるばかりでなく、「ホットスポット」配列でもあることが明確に示された。
【００６７】
また、合成ＧＣ−リッチフラグメントもまた、哺乳類遺伝子発現プロモーターの５’−または３’−隣接で遺伝子発現エンハンサー要素または遺伝子発現「ホットスポット」配列として用いることができることが示された。
【００６８】
全ての発現タイターは、現在の工業レベル（１５−４５ｐｇ／細胞／日）の最高レベルに達している、または超えていて、これらの発現ベクターの多大なる商業的価値を示している。我々は、哺乳類遺伝子発現をこれで解決し、おそらくあらゆる遺伝子発現の共通の機構、すなわち高い構成的哺乳類遺伝子発現用のエンハンサーまたは発現「ホットスポット」配列として強い２次構造を有する自然発生的な、または合成ＧＣ−リッチＤＮＡの使用を同定したことを確信した。
【００６９】
【表７】
2010516276.tif 000012
【００７０】
本発明の最初に論じたように、植物遺伝子５’調節領域はしばしばＣｐＧアイランドと呼ばれる高いＧＣ−リッチ含量を含む。植物遺伝子発現はしばしばより高いレベルで構造的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）である。表１の結果により、非常に高いＧＣ−リッチ含量を有し、ＤＮＡ構造が強い可能性がある、ニワトリベータアクチン遺伝子の自然発生的なイントロン−１がＣＨＯ細胞遺伝子発現にとって重要な役割を果たすことが示された。これは、哺乳類遺伝子発現用の高いＧＣ含量イントロン、または発現エンハンサーあるいはインシュレーターを探索することは、効果的な遺伝子発現ベクターを構築するための普遍的なツールとなりうることを示した。他の選択肢は、効果的な遺伝子発現ベクターを構築する、および再構築するための、人工的ＧＣ−リッチイントロン、「ホットスポット」、エンハンサー、プロモーターを合成することである。
【００７１】
表１の結果は、また非特異的合成ＧＣ−リッチＤＮＡフラグメントの融合が、ＣＨＯ細胞中での構成的遺伝子発現の高いレベルを支持し、遺伝子発現ベクター構成物用の普遍的ツールとしての合成遺伝子発現エンハンサーまたは「ホットスポット」配列のための将来的なＧＣ−リッチの使用を示唆する。おそらく、強いＤＮＡ構造を有する高いＧＣ−含有ＤＮＡフラグメントは、高いレベルで遺伝子転写および発現を行うためのクロマチン凝縮およびヌクレオソーム形成を制御する普遍的機構である。
【００７２】
実施例５：コントロールベクターおよびｐＭＨ４のプロモーター強度分析
ネイティブニワトリベータアクチンプロモーター系発現ベクター（図１）（配列番号：３）はイントロン−１（配列番号：１）を含むが、どういうわけか商業的目的に役立つほど十分に強度が高くない。よって、我々は、その下記プロモーター配列を分析した。
【００７３】
【表８】
2010516276.tif 000013
【００７４】
プロモーター配列は、ただ一つのＴＡＴＡボックスおよび２つの転写因子結合サイトＣＡＡＴボックスを含む。明らかに、このプロモーター配列は典型的な強いプロモーターではない。したがって、我々は、アクチンプロモーターを典型的なＣＭＶプロモーターで置換する（ｐＭＨ４）（図５）（配列番号：７）。分析用に用いたＣＭＶプロモーターの配列は下記のようにリストされる。
【００７５】
【表９】
2010516276.tif 000014
【００７６】
２つのＴＡＴＡボックスおよび１０のＣＡＡＴボックスが見出される。アクチンプロモーターに比べてＣＡＡＴボックスの数が増えているばかりではなく、これらのＣＡＡＴボックスおよびＧＣ−リッチイントロン−１領域間の距離が増加していた。増加した距離により、強固な構造が形成されたＧＣ−リッチイントロン−１を避けることによって転写因子結合がより効率的になるのであろう。
【００７７】
表１は、遺伝子発現が８倍に増加していることを示す。これは、これまでに知られている最も強いエンハンサー要素であるイントロン−１を含むけれども、進化の過程で現在の強さにまでニワトリベータアクチンプロモーターがどういうわけか変異したことを示した。ベータアクチン遺伝子プロモーターの完全長から単離したニワトリベータアクチンイントロン−１の使用は、組み換えタンパク質の製造用の哺乳類発現ベクターの構築および再構築に対する鍵である。
【００７８】
実施例６：ポリＡサイトの３’隣接領域での使用
ポリＡサイトの３’隣接領域でのイントロン−１の添加（ｐＭＨ３）（図４）は、コントロールと比較して顕著に遺伝子発現を増加させた（表１）。組み換えＴＮＦＲ２−Ｆｃコーディング遺伝子およびポリＡ配列が間に存在するので、このイントロン−１位置はアクチンプロモーター配列から遠く離れている。おそらく、イントロン−１がエンハンサー要素であるばかりでなく、「ホットスポット」配列でもある。核転写因子の接近性を増加させるために、遺伝子ＤＮＡ構造またはクロマチンを開裂させる、ＧＣリッチＤＮＡ構造を通じて、イントロン−１は遺伝子発現レベルを増加させる。
【図１】
2010516276.tif 000015
【図２】
2010516276.tif 000016
【図３】
2010516276.tif 000017
【図４】
2010516276.tif 000018
【図５】
2010516276.tif 000019
【図６】
2010516276.tif 000020
【図７】
2010516276.tif 000021
【図８】
2010516276.tif 000022
【図９】
2010516276.tif 000023
【図１０】
2010516276.tif 000024
【配列表】
2010516276000001.app
【国際調査報告】
2010516276.tif 000025