(57)【要約】  本発明は、免疫調節剤のスクリーニング方法に関するものである。具体的には、ＡＩＭＰ１の５４−１９２部位が、配列番号１８で表されるｇｐ９６の６９９−７９９部位に結合することを利用して、ｇｐ９６の細胞表面における発現水準を調節する、免疫調節剤のスクリーニング方法、抗癌剤のスクリーニング方法及び自己免疫疾患治療剤のスクリーニング方法に関するものである。さらに、前記結合を利用して自己免疫疾患を診断する方法に関する。
2010525362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと試験製剤を接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が前記分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階を含む免疫調節剤スクリーニング方法。
【請求項２】
前記（ｂ）段階でテストした候補物質を配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと接触させる段階；
前記試験製剤が配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階をさらに含む請求項１記載の免疫調節剤スクリーニング方法。
【請求項３】
（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチド及び配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドを発現する細胞又は組織と試験製剤を接触させる段階；及び
（ｂ）前記試験製剤が接触された細胞又は組織におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準の、試験製剤が接触されていない細胞におけるｇｐ９６細胞表面発現水準に対する変化（ｃｈａｎｇｅ）を測定（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）する段階を含む免疫調節剤スクリーニング方法。
【請求項４】
前記細胞又は組織に配列番号４で表示されるアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を含む分離されたポリヌクレオチド及び配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を含む分離されたポリヌクレオチドを同時にトランスフェクトさせる請求項３記載の免疫調節剤スクリーニング方法。
【請求項５】
前記配列番号４で表示されるアミノ酸配列を暗号化する核酸配列が配列番号５で表示される請求項４記載の免疫調節剤スクリーニング方法。
【請求項６】
前記配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を暗号化する核酸配列が配列番号１９で表示される請求項４記載の免疫調節剤スクリーニング方法。
【請求項７】
（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと試験製剤を接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が前記分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を癌細胞又は癌動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された癌細胞又は癌動物モデルにおいて癌進行の変化を測定する段階を含む抗癌剤スクリーニング方法。
【請求項８】
（ａ）試験製剤を配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞又は組織と接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が前記接触された細胞又は組織におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準が試験製剤が接触されていない細胞におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準と比較して増加されたか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を癌細胞又は癌動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された癌細胞又は癌動物モデルにおいて癌の進行の変化を測定する段階を含む抗癌剤スクリーニング方法。
【請求項９】
（ａ）配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと試験製剤を接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルにおいて免疫抑制程度を測定する段階を含む自己免疫疾患治療剤スクリーニング方法。
【請求項１０】
（ａ）試験製剤を配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドを発現する細胞又は組織と接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が前記接触された細胞又は組織におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準が試験製剤が接触されていない細胞におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準と比較して減少されたか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された癌細胞又は自己免疫疾患動物モデルにおいて免疫抑制程度を測定する段階を含む自己免疫疾患治療剤スクリーニング方法。
【請求項１１】
ＡＩＭＰ１蛋白質に特異的な抗体を含む自己免疫疾患診断用組成物。
【請求項１２】
（ａ）ＡＩＭＰ１蛋白質に特異的な抗体を検出試料と接触させる段階；
（ｂ）抗原−抗体複合体を形成する段階；及び
（ｃ）前記抗原−抗体複合体の形成量を対照区と比較する段階を含む自己免疫疾患診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫調節剤スクリーニング方法に関する。具体的には、ＡＩＭＰ１の５４−１９２部位が、配列番号１８で示されるｇｐ９６の６９９−７９９部位の結合を利用してｇｐ９６の細胞表面発現水準を調節する免疫調節剤スクリーニング方法、抗癌剤スクリーニング方法及び自己免疫疾患治療剤スクリーニング方法に関する。さらに、前記結合を利用して自己免疫疾患を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｇｐ９６は小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）に存在するＨＳＰ９０蛋白質（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ９０）ファミリーに属する蛋白質である。ｇｐ９６蛋白質のＣ末端には小胞体残留シグナルであるＫＤＥＬ配列が存在する。前記ＫＤＥＬ配列が存在するにも拘らず、ｇｐ９６の細胞表面発現が正常の拝繊維芽細胞では観察されないものの、ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔｈ−Ａ  ｓａｒｃｏｍａ細胞で観察された（（非特許文献１）Ａｌｔｍｅｙｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，６９：３４０−３４９，１９９６）。さらに、ｇｐ９６を含むＨＳＰ蛋白質種類等が二十日鼠の胸腺細胞表面でも発現されることが報告（（非特許文献２）Ｗｉｅｓｔ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９４：１８８４−１８８９，１９９７）され、ｇｐ９６の細胞表面発現が癌細胞のみに限定されるのではないとして思われている。ｇｐ９６が先天性免疫と適応性免疫に関与することから、ｇｐ９６の細胞表面発現は免疫と関連性があるものと思われている。さらに、ｇｐ９６は樹状細胞（ＤＣｓ）活性と、成熟に関与するものとして知られている。最近、細胞表面にｇｐ９６を発現する形質転換マウスにおいて、ＤＣが過度に活性化され、ループスのような自己免疫疾患が誘導されることが報告された（（非特許文献３）Ｌｉｕ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１００：１５８２４−１５８２９，２００３）。前記結果等は、小胞体でｅｘｐｏｒｔされてきたｇｐ９６が、免疫を調節するに重要な役割をし、ｇｐ９６の細胞表面は不要な免疫反応を回避する為に厳格に調節されるべきであることを示す。
【０００３】
前記の通り、ｇｐ９６蛋白質は癌ワクチン効果を有するｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎにして、初めて発見され（（非特許文献４）Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ．Ｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８３，３４０７−３４１１，１９８５）現在ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａに対して、臨床３相が進行中である蛋白質医薬として開発されつつある（（非特許文献５）Ｐｉｌｌａ  Ｌ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ａｕｇ：５５（８）：９５８−６８，２００６）。ｇｐ９６蛋白質が前記のような抗原効果を有することは、免疫細胞を活性化させ得る能力（（非特許文献６）Ａｒｎｏｌｄ−Ｓｃｈｉｌｄ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１：１６２（７）：３７５７−６０，１９９９）と、一種のｃｈａｐｅｒｏｎｅとして作用し、ｐｅｐｔｉｄｅと結合し得る能力に起因したものにして（（非特許文献７）Ｌｉｎｄｅｒｏｔｈ  ＮＡ，  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２５；２７５（８）：５４７２−７，２０００：（非特許文献８）Ｓｉｎｇｈ−Ｊａｓｕｊａ  Ｈ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．５；１９１（１１）：１９６５−７４，２０００）、癌細胞でｇｐ９６は、癌細胞特異的抗原と結合することにより、癌ワクチンに応用するようになった（（非特許文献９）Ｈｅｉｋｅｍａ  Ａ，ｅｔ．  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．１；５７（１−３）：６９−７４，１９９７）。しかしながら、正常細胞では、若し、細胞表面に過多露出された時、自己免疫疾患が誘導されるものとして動物実験結果から明らかになった（（非特許文献１０）Ｌｉｕ  Ｂ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，２３；１００（２６）：１５８２４，２００３）。従って、ｇｐ９６の細胞表面発現水準の調節は、癌細胞ばかりでなく正常細胞でも重要であり、これを調節する物質は抗癌剤又は自己免疫治療剤に開発でき得る。
【０００４】
一方、ＡＩＭＰ１（ＡＲＳ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）は、従来ｐ４３蛋白質として知られたものにして、本発明者等により再命名されたものである（（非特許文献１１）Ｓａｎｇ  Ｇｙｕ  Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３０：５６９−５７４，２００５）。前記ＡＩＭＰ１は、３１２個のアミノ酸でなされた蛋白質にして、多重ｔＲＮＡ合成酵素複合体（ｍｕｌｔ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合して（（非特許文献１２）Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２９，５７７−５８３，１９７４；（非特許文献１３）Ｄａｎｇ  Ｃ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂ  ｉｏｃｈｅｍ．１４，５３９−５４３，１９８２；（非特許文献１４）Ｍｉｒａｎｄｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１，７３３−７３６，１９８２；（非特許文献１５）Ｙａｎｇ  Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ  Ｃｅｌｌ．Ｒｅｇｕｌ．２６，３２５−３３５，１９８５）前記多重ｔＲＮＡ合成酵素の触媒的活性（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を増進させる蛋白質である（（非特許文献１６）Ｐａｒｋ  Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１６６７３−１６６７６，１９９９）。ＡＩＭＰ１は前立腺癌、免疫及び形質転換細胞を含む多様な形態の細胞から分泌され、この分泌はＴＮＦ及びショックのような多様な刺戟により誘導される（（非特許文献１７）Ｐａｒｋ  Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６６，３８７−３９８，２００５；（非特許文献１８）Ｂａｒｎｅｔｔ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，２８５０−２８５７，２０００）。分泌されたＡＩＭＰ１は単核球／マクロファージ、内皮細胞及び線維芽細胞のような多様な標的細胞に作用するものとして知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｌｔｍｅｙｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，６９：３４０−３４９，１９９６
【非特許文献２】Ｗｉｅｓｔ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９４：１８８４−１８８９，１９９７
【非特許文献３】Ｌｉｕ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１００：１５８２４−１５８２９，２００３
【非特許文献４】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ．Ｋ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８３，３４０７−３４１１，１９８５
【非特許文献５】Ｐｉｌｌａ  Ｌ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ａｕｇ：５５（８）：９５８−６８，２００６
【非特許文献６】Ａｒｎｏｌｄ−Ｓｃｈｉｌｄ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１：１６２（７）：３７５７−６０，１９９９
【非特許文献７】Ｌｉｎｄｅｒｏｔｈ  ＮＡ，  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２５；２７５（８）：５４７２−７，２０００
【非特許文献８】Ｓｉｎｇｈ−Ｊａｓｕｊａ  Ｈ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．５；１９１（１１）：１９６５−７４，２０００
【非特許文献９】Ｈｅｉｋｅｍａ  Ａ，ｅｔ．  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．１；５７（１−３）：６９−７４，１９９７
【非特許文献１０】Ｌｉｕ  Ｂ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，２３；１００（２６）：１５８２４，２００３
【非特許文献１１】Ｓａｎｇ  Ｇｙｕ  Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３０：５６９−５７４，２００５
【非特許文献１２】Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２９，５７７−５８３，１９７４
【非特許文献１３】Ｄａｎｇ  Ｃ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂ  ｉｏｃｈｅｍ．１４，５３９−５４３，１９８２
【非特許文献１４】Ｍｉｒａｎｄｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１，７３３−７３６，１９８２
【非特許文献１５】Ｙａｎｇ  Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ  Ｃｅｌｌ．Ｒｅｇｕｌ．２６，３２５−３３５，１９８５
【非特許文献１６】Ｐａｒｋ  Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１６６７３−１６６７６，１９９９
【非特許文献１７】Ｐａｒｋ  Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６６，３８７−３９８，２００５
【非特許文献１８】Ｂａｒｎｅｔｔ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，２８５０−２８５７，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者等は配列番号４で示されるＡＩＭＰ１の５４−１９２部位が、配列番号１８で示されるｇｐ９６の６９９−７９９部位と直接的に結合してｇｐ９６の細胞表面発現水準を調節し、前記結合が壊れると自己免疫疾患が誘発され、自己免疫疾患患者の血液サンプルにおいて、免疫細胞表面のｇｐ９６水準と血清内ＡＩＭＰ１の水準が正常人より高いことを確認することにより本発明を完成した。
【０００７】
本発明の目的はｇｐ９６の細胞表面の発現水準を調節する免疫調節剤を探索する方法及び自己免疫疾患診断方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記のような目的を達成する為に、本発明は、
（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと試験製剤を接触させる段階；
（ｂ）試験製剤が前記分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階を含む免疫調節剤スクリーニング方法を提供する。さらに、本発明は前記（ｂ）段階でテストした候補物質を配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと接触させる段階；
前記試験製剤が配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階を追加して含むことを特徴とする免疫調節剤スクリーニング方法を提供する。
【０００９】
本発明の他の目的を達成する為に、本発明は、
（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチド及び配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドを発現する細胞又は組織と試験製剤を接触させる段階；及び
（ｂ）前記試験製剤が接触された細胞又は組織におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準の、試験製剤が接触されていない細胞におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準に対する変化（ｃｈａｎｇｅ）を測定（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）する段階を含むことを特徴とする免疫調節剤スクリーニング方法を提供する。
【００１０】
本発明のさらに、他の目的を達成する為に、本発明は、
（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチド試験製剤を接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が前記分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を癌細胞又は癌動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された癌細胞又は癌動物モデルにおいて、癌の進行の変化を測定する段階を含む抗癌剤スクリーニング方法を提供する。
【００１１】
従って、本発明の他の目的を達成する為に、
（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞又は組織と接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が接触された細胞又は組織におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準が試験製剤と接触されない細胞におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準と比較して増加されたか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を癌細胞又は癌動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された癌細胞又は癌動物モデルにおいて、癌の進行の変化を測定する段階を含む抗癌剤スクリーニング方法を提供する。
【００１２】
さらには、本発明のさらに、他の目的を達成する為に、
（ａ）配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと試験製剤を接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルにおいて、免疫抑制程度を測定する段階を含む自己免疫疾患治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００１３】
さらには、本発明の他の目的を達成する為に、本発明は、
（ａ）配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドを発現する細胞又は組織と接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が接触された細胞又は組織におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準が試験製剤と接触されていない細胞におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準と比較して減少されたか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルにおいて、免疫抑制程度を測定する段階を含む自己免疫疾患治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明のさらに、他の目的を達成する為に、本発明は配列番号１のＡＩＭＰ１蛋白質に特異的な抗体を含む、自己免疫疾患診断用組成物及び（ａ）ＡＩＭＰ１蛋白質に特異的な抗体を検出試料と接触させる段階；（ｂ）抗原−抗体複合体を形成する段階；及び（ｃ）前記抗原−抗体複合体の形成量を対照群と比較する段階を含む自己免疫疾患診断方法を提供する。
【００１５】
定義
他の定義がない限り、本明細書に使用された全ての技術的及び科学的用語は当業者等により通常的に理解される同一な意味を有する。下記の参考文献は本発明の明細書に使用された多くの用語等の一般的な定義を有する技術（ｓｋｉｌｌ）の一つを提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９９８）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ。さらに、次の定義は本発明の実施の為の読者（ｒｅａｄｅｒ）の為に提供される。
【００１６】
本発明で“発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）”とは、細胞において蛋白質又は核酸の生成を意味する。
【００１７】
本発明で“宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）”とは、任意の手段（例：電気衝撃法、カルシウムホスファターゼ沈澱法、微細注入法、形質転換法、ウイルス感染等）により細胞内に導入された異種性ＤＮＡを含む原核又は真核細胞を言う。
【００１８】
本発明で“分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）”とは、それの起源環境（例：自然的に生成されるものであれば自然環境）から除去された物質を意味する。例えば、自然的に生成される核酸、ポリペプチド、又は生きている動物に存在する細胞は分離されたものではないものの、同一なポリヌクレオチド、ポリペプチド又は共同存在する物質の一部又は全部から分離された（ｓｅｐａｒａｔｅｄ）細胞は以降、それが自然システムに再導入されるとしても分離されたものである。前記核酸はベクターの一部でも有り／あるか、前記核酸又はポリペプチドは組成物の一部でも有り得て、前記ベクターや組成物は自然環境の一部でない、分離されたものである。
【００１９】
本発明で“免疫調節剤”とは、ｇｐ９６の細胞表面発現水準を増加又は減少させ、免疫を増加又は抑制させる製剤を言う。
【００２０】
本発明で“ｇｐ９６の細胞表面発現水準を調節”とは、ｇｐ９６の細胞表面発現水準を上向調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（つまり、活性化又は促進）又は下向調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（つまり、阻害又は抑制）でもあり得る。例えば、下向調節はＡＩＭＰ１がｇｐ９６蛋白質と結合していて、ｇｐ９６細胞表面に移動を抑制して免疫反応を阻害し、上向調節はＡＩＭＰ１が除去されるとｇｐ９６蛋白質の細胞表面への移動が増加して免疫反応の増加を誘導するようになる。
【００２１】
本発明で“ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）”とは、“ポリペプチド等（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）”又は蛋白質（等）”と互換性をもって使用され、例えば、自然状態の蛋白質において、一般的に、発見されるようにアミノ酸残基の重合体を言う。
【００２２】
本発明で分離されたポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを言う。前記配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドはＡＩＭＰ１蛋白質の一部アミノ酸配列（配列番号１の５４−１９２部位）を有するペプチドであって、前記配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドはｇｐ９６蛋白質のＣ−末端アミノ酸配列の一部（配列番号１３の６９９−７９９部位）を有するポリペプチドを言う。
【００２３】
さらに、本発明のポリペプチドの範囲には、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的同等物及びそれらの塩又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的同等物及びそれらの塩を含む。
【００２４】
本明細書で配列相同性及び同質性は、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号１８のアミノ酸配列と候補配列を整列して、ギャップ（ｇａｐｓ）を導入した後、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号１８のアミノ酸配列に対する候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義する。必要な場合、最大百分率配列同質性を収得する為に、配列同質性の部分として保存的置換は考慮しなかった。配列番号４又は配列番号１８のアミノ酸配列のＮ−末端、Ｃ−末端又は内部伸長、欠損又は挿入は配列同質性又は相同性に影響を与える配列として解析されない。さらに、前記配列同質性は二つのポリペプチドのアミノ酸配列の類似した部分を、比較する為に使用される一般的な標準方法により決定できる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡのようなプログラムは、二つのポリペプチドをそれぞれのアミノ酸が最適にマッチング（ｍａｔｃｈｉｎｇ）されるように整列する（一つ又は二つの配列の全長配列によって、又は一つ又は二つの配列の予測された部分によって）。前記プログラムはデフォルトオープニングペナルティ（ｄｅｆａｕｌｔ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）及びデフォルトギャップペナルティ（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐｓ  ｐｅｎａｌｔｙ）を提供し、コンピュータプログラムと共に連係されて使用でき得るＰＡＭ２５０（標準スコーリングマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ５，ｓｕｐｐ．３．１９７８）と同じスコーリングマトリックスを提供する。例えば、百分率同質性は下記の通り計算することができる：一致する配列（ｉｎｄｅｎｔｉｃａｌ  ｍａｔｃｈｅｓ）の総数に１００を掛けた後、対応されるスパン（ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｐａｎ）内のより長い配列の長さと二つの配列を整列する為に、より長い配列内に導入されたギャップ（ｇａｐｓ）の数の和で分ける。
【００２５】
本発明に伴うポリペプチドは天然で抽出するか又は遺伝工学的方法により作製することができる。例えば、通常的な方法により前記配列番号４又はこれの機能的同等物を暗号化する核酸（例：配列番号５）を作製する。さらに、前記配列番号１８又はこれの機能的同等物を暗号化する核酸（例：配列番号１９）を作製する。前記核酸は、適切なプライマー（例：配列番号２６／２７）を使用してＰＣＲ増幅することにより作製し得る。他の方法で当業界に公知の標準方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成器（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ又はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅａｍｓ）社で販売するもの）を使用してＤＮＡ配列を合成することもできる。作製された核酸はこれに作動可能に連結され（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）核酸の発現を調節する一つ以上の発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（例：プロモータ、エンハンサ等）を含むベクターに挿入させ、これより形成された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させる。生成された形質転換体を前記核酸が発現するに適切な培地及び条件下で培養し、培養物から前記核酸により発現された実質的に純粋なポリペプチドを回収する。前記回収は当業界に公知の方法（例えば、クロマトグラフィー）を利用して行われる。前記にて“実質的に純粋なポリペプチド（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）”とは、本発明に伴うポリペプチドが宿主細胞から由来した如何なる他の蛋白質も実質的に含まないことを意味する。本発明のポリペプチド合成の為の遺伝工学的方法は、下記の文献を参考できる：Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｓｕｐｒａ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ,Ｇｕｔｈｒｉｅ  &  Ｆｉｎｋ(ｅｄｓ.),Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ,Ｓａｎ  Ｄｉａｇｏ,Ｃａｌｉｆ.１９９１：ａｎｄ  Ｈｉｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,２５５,１２０７３-１２０８０,１９９０。
【００２６】
さらに、本発明のポリペプチドは当業界に公知の化学的合成（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｏｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ，１９８３）により容易に製造し得る。代表的な方法としてこれらに限定はされないものの、液体又は固体状合成、断片凝縮、Ｆ−ＭＯＣ又はＴ−ＢＯＣ化学法が含まれる（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ,Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ.ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ,Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌｏｒｉｄａ,１９９７：Ａ  Ｐｒａｃｔｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ,Ａｔｈｅｒｔｏｎ  &  Ｓｈｅｐｐａｒｄ,Ｅｄｓ.,ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ,Ｏｘｆｏｒｄ,Ｅｎｇｌａｎｄ,１９８９）。
【００２７】
本発明で“核酸”、“ＤＮＡ配列”又は“ポリヌクレオチド”は単一又は二重鎖の形態でなるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを言う。他の制限がない限り、自然的に生成されるヌクレオチドと類似した方法で核酸に混成化される自然的ヌクレオチドの公知されたアナログも含まれる。
【００２８】
本発明で核酸配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ配列を全て含む。つまり、前記ポリヌクレオチドは配列番号４のアミノ酸配列を暗号化する塩基配列を有するか、又は塩基配列に相補的な塩基配列を有することができる。好ましくは、配列番号５又は配列番号１９で表示される塩基配列を有する。前記核酸は天然で分離されたか若しくは、上述した通り、遺伝工学的な方法により製造し得る。
【００２９】
本発明で“アナログ（ａｎａｌｏｇ）”とは、標準物質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と構造的に類似するものの、標準物質の特異的置換基が置換により、代替されることにより、標的や調節方法が変更された物質を言う。標準物質と比較するに、アナログは当業者により予想し得るように、同一又は類似するか、又は向上された有用性（ｕｔｉｌｉｔｙ）を有する。向上された性質（例：標的物質に対するさらに高い結合親和力）を有する公知の化合物変異体を糾明する為の、アナログの合成及びスクリーニングは薬理化学的分野に公知の方法である。
【００３０】
本発明で“相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）”とは、蛋白質及び／又は蛋白質配列に言及する場合には、共通の祖先蛋白質（ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）又は蛋白質配列で自然的に又は人為的に由来したことを示す。類似して核酸及び／又は核酸配列はそれらの共通の祖先核酸又は核酸配列から自然的に又は人為的に由来した時に相同する。
【００３１】
本発明で“接触（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）”とは、これの一般的な意味（ｎｏｒｍａｌ  ｍｅａｎｉｎｇ）であり、２個以上の製剤（例：２個のポリペプチド）を結合（ｃｏｍｂｉｎｅ）させるか、又は製剤と細胞（例：蛋白質と細胞）を結合させることを言う。接触は試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で起こり得る。例えば、試験管（ｔｅｓｔ  ｔｕｂｅ）又はコンテナー（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）で２個以上の製剤を結合させるか、又は試験製剤の細胞又は細胞溶解物と試験製剤を結合させることである。さらに、接触は細胞又はインサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）でも起こり得る。例えば、２個のポリペプチドを暗号化する組換えポリヌクレオチドを細胞内で共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｉｏｎ）させることにより、細胞又は細胞溶解物において２個のポリペプチドを接触させることである。
【００３２】
本発明で“製剤（ａｇｅｎｔ）”又は“試験製剤（ｔｅｓｔ  ａｇｅｎｔ）”とは、任意の物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、分子（ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、元素（ｅｌｅｍｅｎｔ）、化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、実在物（ｅｎｔｉｔｙ）又はこれらの組合せを含む。例えば、これに限定はされないものの、蛋白質、ポリペプチド、小有機分子（ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ポリヌクレオチド等を含む。さらに、自然産物（ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、合成化合物又は化学化合物又は２個以上の物質の組合せでもあり得る。別に指定されない限り、製剤、物質及び化合物は互換性あるように（ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｌｙ）使用し得る。
【００３３】
より具体的には、本発明のスクリーニング方法でスクリーニングできる試験製剤は、ポリペプチド、ベータターンミメチック（ｂｅｔａ−ｔｕｒｎ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロサイクリック化合物、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）、オリゴメリックＮ−置換グリシン（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  Ｎ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｄｅ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、オリゴカルバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅｓ）、糖類（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、脂肪酸、プリン、ピリミジン又はこれらの誘導体、構造的アナログ又は組合せを含む。ある試験製剤は合成物質でもあり得、他の試験製剤は天然物質でもあり得る。前記試験製剤は合成又は自然化合物のライブラリーを含む広範囲で多様な出処から得られる。組合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）ライブラリーはステップ−バイ−ステップ方式で合成し得る多様な種類の化合物に生産し得る。多数の組合せライブラリーの化合物等はＥＳＬ（ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）方法（ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９３／０６１２１、ＷＯ９４／０８０５１、ＷＯ９５／３９５５０３及びＷＯ９５／３０６４２）により製造できる。ペプチドライブラリーはファージディスプレー方法（ＷＯ９１／１８９８０）により製造し得る。バクテリア、黴、植物及び動物抽出物形態の自然化合物のライブラリーは、商業的出処から得られるか、若しくはフィールド（ｆｉｅｌｄ）で収集できる。公知の薬理学的（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ）製剤が構造的アナログを製造する為に、アシル化、アルキル化、エステル化反応（ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、アミド化反応（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような指定された（ｄｉｒｅｃｔ）又は無作為の化学的修飾に適用でき得る。
【００３４】
前記試験製剤は自然的に生成される蛋白質又はその断片でもあり得る。このような試験製剤は自然出処（ｎａｔｕｒａｌ  ｓｏｕｒｃｅ）、例えば、細胞又は組織溶解物から収得できる。ポリペプチド製剤のライブラリーは、例えば、通常的な方法により生成されたり、又は商業的に入手することもできるｃＤＮＡライブラリーから収得し得る。前記試験製剤はペプチド、例えば、約５〜３０個、好ましくは、約５〜２０個、さらに、好ましくは、約７〜１５個のアミノ酸を有するペプチドでもあり得る。前記ペプチドは自然的に生成される蛋白質、ランダムペプチド又は“バイアス（ｂｉａｓｅｄ）”ランダムペプチドの分解物でもあり得る。
【００３５】
さらに、前記試験製剤は、“核酸”でもあり得る。試験製剤は自然的に生成される核酸、ランダム核酸、又は“バイアス（ｂｉａｓｅｄ）”ランダム核酸でもあり得る。例えば、原核又は真核ゲノムの分解物を上記にて記載したのと同様にして使用できる。
【００３６】
さらに、前記試験製剤は小分子（例：約１，０００以下の分子量を有する分子）でもあり得る。小分子の調節製剤をスクリーニングする為の方法には、好ましくは、高速分析アッセイ（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｓｓａｙ）が適用できる。上記にて記載した通り、小分子試験製剤の組合せライブラリーがｐ５３の小分子調節因子をスクリーニングすることに容易に適用できる。多くのアッセイが前記スクリーニングに有用である（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．，８：２４０９−２４１４，１９９８；Ｗｅｌｌｅｒ，Ｍｏｌ．Ｄｒｉｖｅｒｓ．，３：６１−７０，１９９７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５９７−６０３，１９９８；ａｎｄ  Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．ＢＩＯＬ．，１：３８４−９１，１９９７）。
【００３７】
本発明の方法によりスクリーニングされる試験製剤のライブラリーは、ＡＩＭＰ１又はこれの断片や、アナログに対する構造研究及びｇｐ９６又はこれの断片やアナログに対する構造研究を基に製造し得る。このような構造研究はＡＩＭＰ１又はｇｐ９６に結合する可能性がある試験製剤の糾明を可能にする。ＡＩＭＰ１又はｇｐ９６の３次元的構造は多様な方法、例えば、結晶学構造及び分子モデリング（ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）で研究し得る。Ｘ線結晶学（Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）を利用する蛋白質構造研究方法が文献において良く知られている：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏ-Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,Ｖａｎ  Ｈｏｌｄｅ,Ｋ.Ｅ.(Ｐｒｅｎｔｉｃｅ-Ｈａｌｌ,Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ,１９７１),ｐｐ.２２１-２３９,Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｗｉｔｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ,Ｄ.Ｅｉｓｅｎｇｅｒｇ  &  Ｄ.Ｃ.Ｃｒｏｔｈｅｒｅｓ(Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ,Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ１９７９）。
【００３８】
ＡＩＭＰ１構造に対するコンピユータモデリングは、ｇｐ９６の細胞表面発現水準を調節する免疫調節剤をスクリーニングする為に、試験製剤のデザインの為の手段を提供する。分子的モデリング方法は文献に開示されている：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６１２，８９４ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５８３，９７３．さらに、蛋白質構造は中性子回折（ｎｅｕｔｒｏｎ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）及びＮＭＲ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）により決定できる。：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,４ｔｈ  Ｅｄ.Ｍｏｏｒｅ,Ｗ.Ｊ.(Ｐｒｅｎｔｉｃｅ-Ｈａｌｌ,Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ,１９７２),ＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ,Ｋ.Ｗｕｔｈｒｉｃｈ,Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１９８６）。
【００３９】
本発明で“抗体”とは、抗原性部位に対して指示される特異的な蛋白質分子を意味する。本発明の目的上、抗体はＡＩＭＰ１を特異的に認知する抗体を意味する。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を全て含む。ＡＩＭＰ１を利用して特異的な抗体を生成することは、当業界に広く知られた技術を利用して容易に製造できる。前記本発明に使用されるＡＩＭＰ１は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有することができる。
【００４０】
ポリクローナル抗体は前記のＡＩＭＰ１蛋白質抗原を動物に注射し、動物から採血して抗体を含む血清を収得する当業界に広く公知の方法により生産できる。このようなポリクローナル抗体は山羊、兎、羊、猿、馬、豚、牛、犬等の任意の動物種宿主から製造可能である。
【００４１】
モノクローナル抗体は当業界に広く知られた融合方法（ｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６：５１１−５１９参照）、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）又はファージ抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８，１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１−５９７，１９９１）技術を利用して製造し得る。
【００４２】
本発明のＡＩＭＰ１蛋白質検出に使用される抗体は、２個の全体の長さの軽鎖及び２個の全体の長さの重鎖を有する完全な形態ばかりでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）２及びＦｖ等がある。
【００４３】
本発明で“検出試料”とは、自己免疫疾患発生により、マーカー蛋白質の発現量の差が検出でき得る組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液又は尿のような生物学的試料を意味し、当業界で広く公知の方法で処理して準備される。
【００４４】
本発明で“抗原−抗体複合体”とは、生物学的試料中のＡＩＭＰ１蛋白質と、これを特異的に認知する抗体の結合物を意味する。
【００４５】
抗原−抗体複合体形成を調べてみる実験方法には、組織免疫染色、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、免疫拡散分析法（Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ、蛋白質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ）等があり、こりに制限されない。
【発明の効果】
【００４６】
以上の通り、本発明者等は配列番号４で示されるＡＩＭＰ１の５４−１９２部位は、配列番号１８で示されるｇｐ９６の６９９−７９９部位と直接結合してｇｐ９６の小胞体（ＥＲ）残留を手助けて細胞表面に移動を抑制して細胞表面に存在するｇｐ９６の量と、それに伴う免疫反応を調節することを初めて糾明した。従って、ＡＩＭＰ１の５４−１９２部位と配列番号１８で示されるｇｐ９６の６９９−７９９部位の結合を利用して免疫調節剤、抗癌剤及び自己免疫疾患治療剤をスクリーニングし得る。さらに、結合が壊れると免疫調節がなされず、自己免疫疾患を誘発することにより、ＡＩＭＰ１蛋白質の水準測定に利用されるＡＩＭＰ１蛋白質に特異的な抗体は、自己免疫疾患を診断する新たなマーカーとして使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１はマウスの膵臓から分離した蛋白質をビオチンが付着されたＡＩＭＰ１で分離精製してシルバー染色した結果である（矢印はＡＩＭＰ１結合蛋白質を示す）。
【図２】図２はマウスの膵臓から分離した蛋白質をビオチンが付着されたＡＩＭＰ１で分離精製してウェスタンブロットした結果である。
【図３】図３はＡＩＭＰ１欠損マウス（−／−）と、野生型マウス（＋／＋）膵臓から分離した蛋白質をＧＳＴ−ＡＩＭＰ１で分離精製してウェスタンブロットした結果である。
【図４】図４はＨｅＬａ細胞から分離された蛋白質を抗ｇｐ９６抗体で共同免疫沈澱させた結果である。
【図５】図５はＡＩＭＰ１欠損マウス（−／−）と、野生型マウス（＋／＋）由来ＭＥＦｓでｇｐ９６の細胞内位置を調査した免疫蛍光染色結果である（ＥＲ：ゴルジ体、ＰＭ：原形質膜）。
【図６】図６はＡＩＭＰ１欠損（−／−）由来ＭＥＦｓからｍｙｃ−ＡＩＭＰ１を形質転換した後、ｇｐ９６の細胞内位置を調査した免疫蛍光染色結果である。
【図７】図７は野生型マウス（＋／＋）及びＡＩＭＰ１欠乏マウス（−／−）由来ＭＥＦで細胞表面ｇｐ９６を染色してＦＡＣＳで分析した結果である。
【図８】図８は野生型マウス（＋／＋）及びＡＩＭＰ１欠乏マウス（−／−）由来の脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）において、細胞表面ｇｐ９６を染色してＦＡＣＳで分析した結果である。
【図９】図９は野生型マウス（＋／＋）及びＡＩＭＰ１欠乏マウス（−／−）由来の、脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）で抗ｇｐ９６抗体（緑色）又は、抗Ｆａｓ抗体（緑色）で免疫蛍光染色した結果である（核はＰＩ（赤色）で染色）。
【図１０】図１０はＨｅＬａ細胞で対照区又はＡＩＭＰ１ｓｉＲＮＡ処理に伴うｇｐ９６の細胞表面発現水準をＦＡＣＡ分析した結果（左側）及びウェスタンブロットした結果（右側）である。
【図１１】図１１は２９３細胞でｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ＥＶ）又は、ＡＩＭＰ１ベクターでトランスフェクトさせた後、ｇｐ９６の細胞表面発現水準をＦＡＣＡ分析した結果（左側）及びウェスタンブロットした結果（右側）である。
【図１２】図１２は野生型マウス（＋／＋）及びＡＩＭＰ１欠乏マウス（−／−）の肝臓から分離した核蛋白質を自己血清でウェスタンブロットした結果である。
【図１３】図１３は野生型マウス（＋／＋）及びＡＩＭＰ１欠乏マウス（−／−）の血清に、自己核抗体（ＡＮＡ）の存在可否を調査した免疫蛍光染色結果であり（上部分）、腎臓の糸球体にｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘが沈着されることを観察した結果（下部分）である。
【図１４】図１４は野生型マウス（＋／＋）、ヘテロマウス（＋／−）及び、ＡＩＭＰ１欠乏マウス（−／−）の血清Ｉｇ水準を示した結果である。
【図１５】図１５は精製されたＧＳＴ−ＡＩＭＰ１断片等とｇｐ９６結合程度を分析したウェスタンブロット結果である。
【図１６】図１６は精製されたＧＳＴ−ｇｐ９６断片等とＡＩＭＰ１の結合程度を分析したウェスタンブロット結果である。
【図１７】図１７はｇｐ９６変異体（Ｅ７９１）がＡＩＭＰ１と結合するか、否かを分析したウェスタンブロット結果である。
【図１８】図１８はＡＩＭＰ１とｇｐ９６のそれぞれの機能的ドメインを示した模式図である。
【図１９】図１９は正常人とＳＬＥ患者から分離された血清でのＡＩＭＰ１の水準を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明者等はｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｉｎｉｔｙ実験を介してＡＩＭＰ１又はｇｐ９６が結合することを確認し（図１参照）、ウェスタンブロットと共同免疫沈殿法により、再び確認した結果、ｇｐ９６とＡＩＭＰ１が直接結合することが再び確認された（図２乃至図４参照）。ＡＩＭＰ１と結合することにより、ｇｐ９６細胞内位置がどんなになるかを調査する為に、ＡＩＭＰ１野生型マウス（ＡＩＭＰ１+/+）-と欠損マウス（ＡＩＭＰ１-／-）でＭＥＦ細胞をそれぞれ分離し、ｇｐ９６細胞内位置を調査した結果、ＡＩＭＰ１野生型マウスにおいて、ｇｐ９６は核周辺のＥＲに主に存在するものの、ＡＩＭＰ１欠損マウスでは、原形質膜に存在するものとして表れた（図５参照）。ＡＩＭＰ１欠損マウスにＡＩＭＰ１を過発現させると、ｇｐ９６が再びＥＲに存在するものとして表れた（図６参照）。前記結果からｇｐ９６の細胞内位置はＡＩＭＰ１により調節されることが分った。
【００４９】
さらに、ＡＩＭＰ１によるｇｐ９６によるｇｐ９６の細胞表面発現水準をＦＡＣＳで分析した結果、欠損マウス（ＡＩＭＰ１-/-）のＭＥＦ細胞と、脾臓細胞でｇｐ９６の細胞表面発現水準が野生型マウス（ＡＩＭＰ１+/+）のＭＥＦ細胞と、脾臓細胞でｇｐ９６の細胞表面発現水準と比較して増加された（図７乃至図９参照）。ＨｅＬａ細胞にＡＩＭＰ１ｓｉＲＮＡを処理して内在的にＡＩＭＰ１を抑制させた時、ｇｐ９６細胞表面発現水準は増加され（図１０参照）、２９３細胞にＡＩＭＰ１を過発現させるとｇｐ９６の細胞表面発現水準が減少されたことを確認できた（図１１参照）。これより細胞表面発現水準はＡＩＭＰ１により調節されることが分った。これはＡＩＭＰ１欠損マウスにおいて、自己免疫疾患表現型が表れたものからも再度確認することができた。（図１２乃至図１４参照）。つまり、ＡＩＭＰ１によりｇｐ９６の細胞表面発現水準が調節されるものの、ＡＩＭＰ１が欠損されると、ｇｐ９６が細胞表面発現水準が増加して免疫反応が強く起こり自己免疫疾患が起こることが分った。
【００５０】
前記にて記載した通り、ＡＩＭＰ１とｇｐ９６が結合し、ｇｐ９６の細胞表面発現水準がＡＩＭＰ１により、調節されることを確認した。本発明者等はＡＩＭＰ１とｇｐ９６の結合する部位を同定した。その結果、配列番号１の５４−１９２部位（配列番号４３）が配列番号１３のｇｐ９６の６９９−７９９部位（配列番号１８）と結合するものとして表れた（図１８参照）。
【００５１】
要約すれば、配列番号４で表されるＡＩＭＰ１の５４−１９２部位は、配列番号１８で表されるｇｐ９６の６９９−７９９部位と直接結合して、ｇｐ９６の小胞体（ＥＲ）残留を手助けて細胞表面に移動を抑制する。反面、ＡＩＭＰ１を除去するとｇｐ９６細胞表面への移動が増加して免疫反応の増加を誘導するようになる。従って、前記断片等間の結合を弱化又は強化させ得る物質は、免疫抗癌ワクチン又は免疫抑制物質に開発可能である。配列番号４で表されるＡＩＭＰ１の５４−１９２部位と、配列番号１８で表されるｇｐ９６の６９９−７９９部位の結合を利用した免疫調節剤スクリーニングシステムは、本発明で最初に開示されるものである。
【００５２】
前記の通り、ＡＩＭＰ１とｇｐ９６と結合してｇｐ９６の細胞内位置を調節し、その結果、細胞表面に存在するｇｐ９６の量とそれに伴う免疫反応が調節される。動物実験結果、細胞表面でｇｐ９６が過多露出される時、自己免疫疾患が誘導されるものとして知られているものの、（Ｌｉｕ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１００：１５８２４−１５８２９，２００３）、自己免疫疾患患者の場合、細胞内でｇｐ９６とＡＩＭＰ１の結合が分離されてｇｐ９６は細胞表面に多く発現され、ｇｐ９６は細胞の外に分泌され、血液内に多く存在することを確認した（図１９参照）。つまり、ＳＬＥ患者の血清からＡＩＭＰ１の水準が正常人の血清でＡＩＭＰ１水準より高く示されたことを確認することができた。（図１９参照）。従って、ＡＩＭＰ１の血液内水準は、測定しうるＡＩＭＰ１の抗体が自己免疫疾患を診断し得る新たなマーカーとして使用し得ることが分った。
【００５３】
従って、本発明は（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと試験製剤を接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が前記分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階を含む免疫調節剤スクリーニング方法を提供する。
【００５４】
さらに、前記（ｂ）段階でテストした候補物質を配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと接触させる段階；
前記候補物質が配列番号１８で表示するアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階を追加して含むことを特徴とする免疫調節剤スクリーニング方法を提供する。
【００５５】
当業界に公知の多様な生化学的及び分子生物学的技術が前記方法を実施するのに利用できる。前記技術は下記の文献に開示されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ:Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ,Ｎ.Ｙ.,Ｓｅｃｏｎｄ(１９９８)ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ(２０００)Ｅｄｉｔｉｏｎｓ;ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ.,Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７−１９９９）。
【００５６】
先ず、本発明の免疫調節剤をスクリーニングする為に、ＡＩＭＰ１の一部断片（配列番号１の５４−１９２）の配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離された、ポリペプチドと試験製剤を接触させ、前記分離されたポリペプチドと試験製剤が結合するか、否かを測定できる。前記分離されたポリペプチドに対する試験製剤の結合は、例えば、表示された試験管内蛋白質−蛋白質結合アッセイ、ＥＭＳＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙｓ）、蛋白質結合を検出する為の免疫アッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイ等）のような多様な方法でアッセイされることができる（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ.Ｎｏｓ.４,３６６,２４１:４,３７６,１１０:４,５１７,２８８:４,８３７,１６８;Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｈｃｌｏｇｙ,１３:１１５-１２２,１９９５;Ｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ/ｔｅｈｃｌｏｇｙ,１３:３５１-３６０,１９９５;ａｎｄ  Ｈｏｄｇｓｏｎ,Ｂｉｏ/ｔｅｈｃｌｏｇｙ,１０:９７３-９８０,１９９２）。試験製剤は配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドとの直接的な結合を検出することにより確認できる。例えば、配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む、ＡＩＭＰ１蛋白質に抗体によるＡＩＭＰ１ポリペプチドとの共同沈澱（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を検出することにより確認できる。さらに、試験製剤は前記本発明の分離されたポリペプチド、又はＡＩＭＰ１と試験製剤の結合を表し得るシグナル、例えば、蛍光ケンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）を検出することにより確認できる。
【００５７】
競争アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）は本発明の分離されたポリペプチド又はＡＩＭＰ１特異的に結合する試験製剤を糾明するにおいて、適当なフォーマット（ｆｏｒｍａｔ）を提供する。前記フォーマットで、試験製剤はＡＩＭＰ１と結合するものと既に知られた化合物との競争を介してスクリーニングされる。知られた結合化合物は合成化合物でもあり得る。さらに、それは、本発明の分離されたポリペプチド、又はＡＩＭＰ１を特異的に認識する抗体、例えば、ＡＩＭＰ１に対する単一クローン抗体でもあり得る。若し、試験製剤が公知の本発明の分離されたポリペプチド、又はＡＩＭＰ１と公知の化合物の結合を阻害すれば、前記試験製剤は本発明の分離されたポリペプチド又はＡＩＭＰ１にも結合する。
【００５８】
多様な種類の競争アッセイ等が当業界に知られている。例えば、固体状直接又は間接的酵素放射免疫測定法（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｏｒ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＲＩＡ）、固体状直接又は間接的酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競争アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９：２４２−２４５３，１９８３）；固体状直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３７：３６１４−３６１９，１９８６）；固体状直接標識化されたアッセイ、固体状直接標識化されたサンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓ  ｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）；１２５Ｉを利用した固体状直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．，２５（１）：７−１５，１９８８）；固体状直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７６：５４６−５５２，１９９０）；及び直接標識化されたＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｃｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：７７−８２，１９９０）。一般的に、前記アッセイ等は非標識化された試験製剤及び標識化された対照化合物を含有している細胞、又は個体表面に結合されている精製されたポリペプチドの利用を含む。競争的阻害は試験製剤の存在下で個体表面又は細胞に結合された標識の量を決定することにより測定できる。競争アッセイにより糾明された調節製剤は対照化合物と同一なエピトープに結合する製剤及び立体阻害（ｓｔｅｒｉｃ  ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）が起こるようにする為に、対照化合物により結合されたエピトープに十分に近接した隣接エピトープと結合する製剤を含む。通常的に競争阻害が過度に存在するとき、一般的な標的ポリペプチドに対する対照化合物の特異的な結合が少なくとも５０又は７５％阻害されるであろう。
【００５９】
前記スクリーニングアッセイは、不溶性又は溶解性フォーマットでもあり得る。不溶性アッセイの一例には、本発明の分離されたポリペプチド又はＡＩＭＰ１を固体状マトリックスで固定化することである。以降、製剤が結合するに十分な時間の間、固体状マトリックスを試験製剤と接触させておく。以降、固体状マトリックスから結合されていない物質を洗滌して除去した後、固定状に結合された製剤の存在を確認した。前記方法は固体状マトリックスから結合された製剤を溶離して製剤を分離する段階をさらに、含め得る。両者択一的に、本発明の分離されたポリペプチド又はＡＩＭＰ１を固定化させる他の方法は、試験製剤を固体状マトリックスに結合させ、本発明の分離されたポリペプチド又はＡＩＭＰ１を添加することである。
【００６０】
溶解性アッセイは、上述された幾つかの結合ライブラリースクリーニング方法を含む。溶解性アッセイがフォーマット下で、試験製剤や本発明の分離されたポリペプチド又はＡＩＭＰ１は全て固体支持台に結合しない。試験製剤に対する本発明の分離されたポリペプチド、又はＡＩＭＰ１結合は、例えば、本発明の分離されたポリペプチド又はＡＩＭＰ１及び／又は試験製剤の蛍光により測定できる。蛍光は内在的であるか、若しくは、（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）蛍光物質（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）を有する成分の標識により与えられ得る。
【００６１】
複数の結合アッセイにおいて、本発明の分離されたポリペプチド又はＡＩＭＰ１、試験製剤又は第３の物質（例：ＡＩＭＰ１に結合する抗体）は、与えられた条件で前記ポリペプチドの確認、検出及び定量を容易にする為に、標識された状態で提供でき得る。つまり、共有的に結合又は検出可能な標識やグループ、又は架橋可能なグループにリンクされ、提供され得る。これら検出可能なグループ等は検出可能なポリペプチドグループ、例えば、アッセイ可能な（ａｓｓａｙａｂｌｅ）酵素又は抗体エピトープとを含む。両者択一的に、前記検出可能なグループは放射性同位元素（例：１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ）又は化学発光性又は蛍光性グループのような、他の検出可能なグループ又はラベルより選択できる。類似するように前記検出可能なグループは基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ），補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ），阻害剤又は親和リガンドでもあり得る。
【００６２】
前記分離されたポリペプチドとｇｐ９６が結合してｇｐ９６の細胞表面発現水準が調節されるので、前記のような方法により配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと、結合する試験製剤はｇｐ９６の細胞表面発現水準を増加させ、免疫を増強できる免疫調節剤となり得る。
【００６３】
試験製剤が前記配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合しないとすれば、前記試験製剤を配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと接触させ、前記試験製剤が前記配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストし得る。前記試験製剤が結合すれば、配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含むｇｐ９６蛋白質の細胞表面発現水準を減少させ、免疫を抑制できる免疫調節剤となり得る。
【００６４】
前記分離されたポリペプチドに対する試験製剤の結合可否に対する方法は前記に記載されている方法と同一である。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法は、（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチド及び配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドを発現する細胞又は組織と試験製剤を接触させる段階；及び
（ｂ）前記試験製剤が接触された細胞又は組織におけるｇｐ９６の細胞表面発現水準を試験製剤が接触されない細胞でのｇｐ９６の細胞表面発現水準と比べての変化（ｃｈａｎｇｅ）を測定（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）する段階を含め得る。
【００６６】
前記細胞は前記ポリペプチド等が内在的に発現される細胞でもあり得て、配列番号４で表示されるアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を含む、分離されたポリヌクレオチド及び配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を含む分離されたポリヌクレオチドを同時に形質感染させ収得された組換え細胞でもあり得る。
【００６７】
ｇｐ９６細胞表面発現水準は、公知の方法により測定できる。例えば、ｇｐ９６抗体に免疫蛍光物質のような標識物質を結合させ、顕微鏡で観察するか又はＦＡＣＳ分析してｇｐ９６の細胞発現水準を測定することができる。
【００６８】
ＡＩＭＰ１の５４−１９２部位とｇｐ９６の６９９−７９９部位が直接結合してｇｐ９６の小胞体残留を手助けて細胞表面への移動を抑制し、その結果、免疫反応が阻害される。従って、前記配列番号４のアミノ酸配列（ＡＩＭＰ１の５４−１９２部位）を含む分離されたポリペプチドと前記配列番号１８のアミノ酸配列（ｇｐ９６の６９９−７９９部位）を含む分離されたポリペプチドの相互作用を調節する試験製剤は、ｇｐ９６細胞表面発現水準を調節する免疫調節剤になるであろう。前記製剤はペプチド等間の相互作用を促進又は強化して免疫を抑制する免疫調節剤ともなり得、逆に前記相互作用を抑制又は弱化させ免疫を増加させる免疫調節剤となり得る。
【００６９】
前記スクリーニング方法は前記にて言及した通り、標識された試験管内蛋白質−蛋白質結合アッセイ（試験管内プル−ダウンアッセイ）、ＥＭＳＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙｓ）蛋白質結合の為の免疫アッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイ等）、酵母−２ハイブリッドアッセイ、非免疫沈澱アッセイ、免疫沈澱ウェスタンブロットアッセイ、免疫−共局在アッセイ（ｉｍｍｕｎｏ−ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）等、当業界に公知の多様な方法により行え得る。
【００７０】
例えば、バクテリアリプレッサーＬｅｘＡ又は酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン及び酵母ＧＡＬ４蛋白質のトランスアクチベーション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメインにそれぞれ融合された、配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む、ＡＩＭＰ１の一部断片ポリペプチド及び／又はＡＩＭＰ１と配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む、ｇｐ９６の一部断片ポリペプチド及び／又はｇｐ９６、又はこれを蛋白質の一部又は相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）を発現する酵母を利用して酵母−２ハイブリッドアッセイを行い得る。（ＫＩＭ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｔ．，３４：３３０−３３６，２００３）。配列番号４のアミノ酸配列を含むＡＩＭＰ１一部断片及び／又は、ＡＩＭＰ１と配列番号１８のアミノ酸配列を含むｇｐ９６一部断片及び／又はｇｐ９６の相互作用は、ＬｅｘＡ蛋白質又はＧＡＬ４のＤＮＡ−結合ドメインに結合された調節配列を有しているプロモータの統制下で、レポーター遺伝子の発現を誘導するトランスアクチベータを再構成するようにする。
【００７１】
前記レポーター遺伝子では前記に記載された通り、当業界に公知の任意の検出可能なポリペプチドを暗号化する遺伝子（例：ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ルシファラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシターゼ、アルカリホスファターゼ及びＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等を使用できる。若し、ＡＩＭＰ１とｇｐ９６、又はこれら蛋白質の一部又は相同体の相互作用は、試験製剤により促進されるか又は強化される場合、前記リポータ遺伝子の発現は正常条件に比べて、さらに、増加される。逆に、前記相互作用が試験製剤により、阻害されたり又は弱化される場合、前記レポーター遺伝子は発現されなかったり、又は正常条件に比べて少なく発現される。
【００７２】
さらに、レポーター遺伝子には、酵母の成長を可能にする蛋白質（つまり、前記レポーター遺伝子が発現されない時、酵母の成長が抑制される）を暗号化することにより選択でき得る。例えば、アミノ酸又は窒素塩基の為の生合成過程に関係のある酵素を暗号化する栄養要求性（ａｕｘｏｔｒｏｐｉｃ）遺伝子（例：ＡＤＥ３、ＨＩＳ３等の酵母遺伝子又は他の種由来の同等遺伝子）でもあり得る。このシステムで発現されたＡＩＭＰ１とｇｐ９６、又はこれら蛋白質の一部又は相同体の相互作用は試験製剤により、抑制、又は弱化される場合、レポーター遺伝子は発現されなかったり、又は少なめに発現される。従って、前記条件下で酵母の成長は、停止されるか、又は遅くなる。このようなレポーター遺伝子の発現による効果は肉眼や装置（例：顕微鏡）を介して観察できる。
【００７３】
本発明は（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと試験製剤を接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が前記分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を癌細胞又は癌動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された癌細胞又は癌動物モデルで癌の進行の変化を測定する段階を含む抗癌剤スクリーニング方法を提供する。
【００７４】
さらに、（ａ）試験製剤を配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞又は組織と接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が接触された細胞又は組織でのｇｐ９６の細胞表面発現水準が試験製剤が接触されていない細胞でのｇｐ９６の細胞表面発現水準と比較して増加されたか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を癌細胞又は癌動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された癌細胞又は癌動物モデルで癌の進行の変化を測定する段階を含む抗癌剤スクリーニング方法を提供する。
【００７５】
前記の通り、試験製剤が配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合、又は前記ポリペプチドを発現する細胞のｇｐ９６の細胞表面発現水準を増加させるとすれば、ｇｐ９６が細胞表面に移動され免疫反応の増加を誘導するようにする免疫調節剤として、公知の癌細胞又は癌動物モデルに前記試験製剤を投与して癌の進行を抑制することを確認すれば、新たな抗癌剤として使用できる。現在臨床３相が進行中のｇｐ９６癌ワクチンは癌患者から得なければならない問題があって、量的な面と共に、費用が問題とはなるものの、本発明の方法によりスクリーニングされた抗癌剤は、前記ｇｐ９６癌ワクチンを代替し得る抗癌剤に開発可能である。前記癌細胞又は癌動物モデルは寄託機関に寄託されたもの、又は商業的に購入して使用することもでき、公知の方法により製作して使用し得る。
【００７６】
前記癌の種類には、例えば、これに限定はされないもの、黒色腫、乳癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部癌、皮膚又は眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門付近癌、結腸癌、ラッパ管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌、腟癌、陰門癌腫、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、ＣＮＳ腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、悩間神経膠腫、脳下垂体腺腫のような癌又はこれら癌の一つ以上の組合せでもあり得る、好ましくは黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）である。
【００７７】
本発明はさらに、（ａ）配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと試験製剤を接触させる段階；
（ｄ）前記試験製剤が配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合するか、否かをテストする段階；
（ｅ）前記試験製剤を免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルに投与する段階；及び
（ｆ）前記試験製剤が投与された免疫細胞又は、自己免疫疾患動物モデルにおいて免疫抑制程度を測定する段階を含む自己免疫疾患治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００７８】
さらに、本発明は（ａ）試験製剤を配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドを発現する細胞又は組織と接触させる段階；
（ｂ）前記試験製剤が接触された細胞又は組織でのｇｐ９６の細胞表面発現水準が試験製剤が接触されていない細胞でのｇｐ９６の細胞表面発現水準と比較して減少されたか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記試験製剤を免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルに投与する段階；及び
（ｄ）前記試験製剤が投与された免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルから免疫抑制程度を測定する段階を含む自己免疫疾患治療剤スクリーニング方法を提供する。
【００７９】
さらに、本発明は、（ａ）配列番号４で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現する細胞又は組織と候補物質を接触させる段階；
（ｂ）前記候補物質が前記分離されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現する細胞又は組織と結合するか、否かをテストする段階；
（ｃ）前記（ｂ）段階でテストした候補物質を、配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現する細胞又は組織と接触させる段階；
（ｄ）前記候補物質が配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現する細胞又は組織と結合するか、否かをテストする段階；
（ｅ）前記候補物質を免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルに投与する段階；及び
（ｆ）前記候補物質が投与された免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルで免疫抑制程度を測定する段階を含む自己免疫疾患治療剤スクリーニングする方法を提供する。
【００８０】
前記の通り、試験製剤が配列番号１８で表示されるアミノ酸配列を含む分離されたポリペプチドと結合するか、又は前記ポリペプチドを発現する細胞のｇｐ９６の細胞表面発現水準を減少させれば、ｇｐ９６が細胞表面に移動することを抑制して、免疫反応を抑制させる免疫調節剤として、公知の免疫細胞又は自己免疫疾患動物モデルに前記試験製剤を投与して、免疫抑制程度を確認すれば新たな自己免疫疾患治療剤として使用でき得る。
【００８１】
前記免疫細胞又は自己免疫疾患モデルは、寄託機関に寄託されたものか、又は商業的に購入して使用することができ、公知の方法により製作して使用し得る。前記免疫細胞は、例えば、これに限定はされないものの、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、大食細胞等であり、前記自己免疫疾患動物モデルはこれに限定はされないものの、ＡＩＭＰ１欠損マウス（Ｃｅｃｃｏｎｉ，Ｆ．＆Ｍｅｙｅｒ，Ｂ．Ｉ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４８０：６３−７１，２０００）又は細胞表面にｇｐ９６を発現する形質転換マウス（Ｌｉｕ  Ｂ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１５８２４−１５８２９，２００３）でもあり得る。前記自己免疫疾患は全身性紅斑性ループス、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、糖尿病、橋本甲状腺炎、乾癬、強皮症、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）又は重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）でもあり得る。
【００８２】
さらに、本発明はＡＩＭＰ１蛋白質水準を測定できるＡＩＭＰ１に特異的な抗体を含む自己免疫疾患診断用組成物を提供する。
【００８３】
本発明の自己免疫疾患診断用組成物には、ＡＩＭＰ１蛋白質を選択的に認知する抗体ばかりでなく、免疫学的分析に使用される当分野で一般的に使用される道具、試薬等が含まれる。このような道具／試薬には適合した担体、検出可能な信号を生成し得る標識物質、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤が含まれるものの、これに限定はされない。標識物質が酵素の場合には、酵素活性を測定できる基質及び反応停止剤を含め得る。適合した担体には、これに限定はされないものの、可溶性担体、例えば、当分野に公知の生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、弗素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他の紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せでもあり得る。
【００８４】
本発明の自己免疫疾患診断用組成物は、これに限定はされないものの、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティックデバイス、免疫クロマトグラフィー試験ストリップ及び放射分割免疫検定デバイス、及びフロースロー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）デバイス等の形態を有し得る。
【００８５】
さらに、本発明はＡＩＭＰ１に特異的な抗体を検出試料と接触させ、抗原−抗体複合体を形成し、抗原−抗体複合体の形成量を対照区と比較することにより、自己免疫疾患診断方法を提供する。
【００８６】
抗原−抗体複合体の形成を定性又は定量的に測定可能にするラベルには、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス分子及び放射線同位元素等があり、必ずしもこれに限定されるものではない。検出ラベルに利用可能な酵素には、β−グルクロニターゼ、β−Ｄ−グルコシターゼ、β−Ｄ−ガラクトシターゼ、ウレア剤、ペルオキシターゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシターゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシターゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルデートアミノトランフェラーゼ、ホスホエノールピルベートデカボキシラーゼ、β−ラクタマーゼ等があり、これに限定されない。蛍光物には、フルオレッセン、イソチオシアネート、ローダミン、ピコエリトリン、ピコシアニン、アロピコシアニン、ｏ−フタレート、フルオレスカミン等があり、これに限定はされない。リガンドにはビオチン誘導体等があり、これに限定されない。発光物質にはアクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ等があり、これに限定されない。微小粒子には、コロイド金、着色されたラテックス等があり、これに限定されない。レドックス分子にはフェロセン、ルテニウム錯化合物、バイオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジアミド、１，４−ベンゾキノン、ヒドロキノン、Ｋ４Ｗ（ＣＮ）８、［Ｏｓ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＲＵ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＭＯ（ＣＮ）８］４−等があり、これに限定されない。放射性同位元素には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ等があり、これに限定されない。
【００８７】
対照区と検出試料中の抗原−抗体複合体形成量間に有意的な差があるか、否かを絶対的（例：μｇ／ｍｌ）又は相対的（例：シグナルの相対強度）差で見ることにより、自己免疫疾患を診断できる。
【実施例】
【００８８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００８９】
実施例１：ＡＩＭＰ１結合蛋白質としてｇｐ９６同定
＜１−１＞ａｆｆｉｎｉｔｙによるＡＩＭＰ１結合蛋白質の精製
ＡＩＭＰ１と結合する蛋白質を分離する為に、ＡＩＭＰ１  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎを実施してＡＩＭＰ１とｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄされた蛋白質は、ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙに同定した結果、ｇｐ９６とＡＩＭＰ１蛋白質が結合するものとして示された。具体的に組換えＡＩＭＰ１蛋白質とＢＳＡは製造社（Ｐｉｅｒｃｅ）方法により、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン試薬を利用してビオチンを付着させた。マウス膵臓は１％トリトンＸ−１００を含有する均質化バッファ（２５ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．４，１０ｍＭＮａＣｌ，０．５ｍＭＥＤＴＡ，０．５ｍＭｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，１μｇ／ｍｌｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ，ａｎｄ  ５μｇ／ｍｌａｐｒｏｔｉｎｉｎ）で均質化させた。ビオチンが付着されたＡＩＭＰ１とＢＳＡを予めストレプトアビジンビーズに固定化させ、前記ビーズを１０ｍｇの蛋白質抽出物と共に、４℃で１２時間培養した後、洗滌して共同沈澱された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥして主要バンドを切断し、３７℃で６時間トリプシン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）処理した。さらに、トリプシン処理されたペプチド断片をボイジャーＤＥタイム−オブ−フライトマススペクトロメータ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ｔｉｍｅ−ｏｆ-ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｇｈａｍ，ＭＡ）を利用して分析した結果を図１に示した。
【００９０】
図１に示した通り、ｇｐ９６、ＡＩＭＰ１とｃｏｐｍｌｅｘを形成するものとして知られたｔＲＮＡ合成酵素等（ＥＰＲＳ、ＬＲＳ、ＱＲＳ）及びＣＯＰＩ  ｃｏｐｍｌｅｘ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ等がＡＩＭＰ１と結合する蛋白質として示された。
【００９１】
＜１−２＞ウェスタンブロッティング
ＡＩＭＰ１とｇｐ９６又はβ−ＣＯＰとの結合を再度確認する為に、マウスの膵臓から抽出した蛋白質を、前記＜１−１＞方法により分離されたビオチンが付着されたＡＩＭＰ１とＢＳＡで精製した。さらに、兎抗ｇｐ９６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）とβ−ＣＯＰ抗体を利用してウェスタンブロットしてその結果を図２に示した。さらに、マウスの膵臓から抽出した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分離されたＧＳＴ又はＧＳＴ−ＡＩＭＰ１で精製し、兎抗ｇｐ９６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）とマウス抗ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）を利用してウェスタンブロットしてその結果を図３に示した。
【００９２】
図２及び図３に示したことにより、ＡＩＭＰ１とｇｐ９６が直接結合することを確認することができた。
【００９３】
＜１−３＞共同免疫沈澱（Ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）
ＡＩＭＰ１を暗号化するプラスミド（Ｋｏ  ＹＧ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２２；２７６（２５）：２３０２８−３３，２００１）でトランスフェクトさせたＨＬ−６０細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を細胞溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１０ｍＭＮａＣｌ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭＤＴＴ，１ｍＭＰＭＳＦ  ａｎｄ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）で細胞を溶解させた。超音波破砕機で５秒間細胞を破砕し、遠心分離器を利用して１４，０００ｒｐｍで１５分間回転させ、上層液を採り蛋白質抽出液に使用した。抽出された蛋白質を蛋白質Ａアガロースと予め結合させた兎抗ｇｐ９６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）と混合した後、沈澱された蛋白質を兎抗ｇｐ９６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）と抗ＡＩＭＰ１（Ｐａｒｋ  Ｓ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１６６７３−１６６７６，１９９９）と免疫沈澱させた結果、ＡＩＭＰ１とｇｐ９６が共同免疫沈澱されたことを確認することができた（図４）。
【００９４】
前記結果からｇｐ９６はＡＩＭＰ１と結合することが分った。
【００９５】
実施例２：ＡＩＭＰ１と結合可否に伴うｇｐ９６細胞内位置調査
＜２−１＞ＡＩＭＰ１によるｇｐ９６の細胞内位置
本発明者等はＡＩＭＰ１＋／＋及びＡＩＭＰ１−／−ＭＥＦｓで、ｇｐ９６の細胞内位置を調査した。前記ＡＩＭＰ１−／−マウスはジントラップ方法（Ｃｅｃｃｏｎｉ，Ｆ．＆Ｍｅｙｅｒ，Ｂ．Ｉ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４８０：６３−７１，２０００）を利用して製造した。先ず、ジントラップベクターＶＩＣＴＲ２０（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＵＳＡ）を使用してＳｖＥｖＢｒｄマウス（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＵＳＡ）のゲノムＤＮＡを突然変異させた。前記突然変異されたゲノムＤＮＡを１２９／ＳｖＥｖＢｒｄマウス（Ｏｍｎｉｂａｎｋ）から由来した背幹細胞に導入し、突然変異体ライブラリを製作した。前記ライブラリジントラップベクターの導入により、破壊されたＡＩＭＰ１遺伝子を含有しているクローンをスクリーニングし、前記クロンを“ＯＳＴ５８５０７”と命名した。以降、前記クローンを利用して製造社（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のプロトコルにより、異形接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Ｓａｍｔａｋｏ）を製造した。前記異形接合性マウスを交配して野生型マウス（ＡＩＭＰ１＋／＋）１４５匹、異形接合性突然変異マウス（ＡＩＭＰ１＋／−）３２３匹及び同形接合性突然変異マウス（ＡＩＭＰ１−／−）５９匹を収得した。
【００９６】
ＡＩＭＰ１＋／＋及びＡＩＭＰ１−／−ＭＥＦｓは、１２．５日経った胚から文献（Ｐａｒｋ  ＳＧ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．，１６６（２）：３  ８７−９８，２００５）に記載された方法により得られた。１ｘＰＢＳ溶液でＭＥＦｓ細胞を洗滌し、１００％メタノール溶液で５分間固定した。さらに、１ｘＰＢＳ溶液で洗滌し、抗ｇｐ９６抗体を１５ＣＡＳ−１を含むＰＢＳ溶液に１／１００に希釈して細胞と反応させた。１ｘＰＢＳ溶液で再度洗滌し、今度はＦＩＴＣ（緑色）−コンジュゲート２次抗体を反応させ、ＡＩＭＰ１＋／＋及びＡＩＭＰ１−／−ＭＥＦｓでｇｐ９６の細胞内位置を調査してその結果を図２ａに示した。野生型マウスのＭＥＦでｇｐ９６は核周辺のＥＲに主に存在するものとして発見され、ＡＩＭＰ１欠損マウスのＭＥＦでは原形質膜に存在するものとして示された（図５参照）。
【００９７】
さらに、ＡＩＭＰ１欠損マウスのＭＥＦにｍｙｃタグ化されているＡＩＭＰ１を含むベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトさせ、兎抗ｇｐ９６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）又は抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）と反応させ、ＦＩＴＣ（緑色）−とＴＲＩＲＣ（赤色）−コンジュゲート２次抗体と反応させ、その結果を図６に示した。
【００９８】
ＡＩＭＰ１欠損マウスＭＥＦにＡＩＭＰ１を過発現させると、ｇｐ９６が再びＥＲに存在するものとして表れた（図６）。前記結果からｇｐ９６の細胞内位置はＡＩＭＰ１により調節されることが分った。
【００９９】
＜２−２＞ＡＩＭＰ１によるｇｐ９６の細胞表面発現水準調査
ｇｐ９６は一般的に、ＥＲに存在するＨＳＰ９０ファミリメンバーである（ＬｉＺ，ＤａｉＪ，ｅｔ．ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ，７：ｄ７３１−７５１，２００２）。しかしながら、死滅又は感染条件ではｇｐ９６細胞表面で発現するものとして知られている（Ｂａｓｕ，Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１５３９−１５４６，２０００；Ｈｉｌｆ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９９：３６７６−３６８２，２００２；Ｂａｎｅｒｊｅｃ，ｑＰ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：３５０７−３５１８，２００２）。
【０１００】
本発明者等は前記実施例＜２−１＞でｇｐ９６の細胞内位置がＡＩＭＰ１により調節されるものとして確認された為、ｇｐ９６細胞表面発現水準もＡＩＭＰ１により調節されるか、否かを調査した。
【０１０１】
ａ．ＭＥＦ細胞でｇｐ９６の細胞表面発現水準分析
前記実施例＜２−１＞に記載された方法と同一にＭＥＦ細胞を分離して１ｘＰＢＳで洗滌した後、ＦＡＣＳバッファ溶液（１ｘＰＢＳ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ２％ＦＢＳ，１％ＢＳＡ，ａｎｄ０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ）に懸濁させた。さらに、一般的なヤギ抗体で予備処理した。ＭＥＦ細胞を１ｘＰＢＳ溶液で洗滌し、ＦＡＣＳバッファ溶液に３０分間反応して抗体の非特異的結合を防止した後、抗ｇｐ９６抗体を１／１００にＦＡＣＳバッファ溶液に希釈して３０分間細胞と結合させた。その後、１ｘＰＢＳ溶液で洗滌し、さらに、ＦＡＣＳバッファ溶液に２次抗体を１／２００に希釈した溶液を反応させ、ＦＡＣＳで分析した。
【０１０２】
その結果、ＡＩＭＰ１欠損マウスのＭＥＦでｇｐ９６の細胞表面発現水準が野生型マウスのＭＥＦの細胞表面発現水準と比較して増加されたことが分った（図７参照）。
【０１０３】
ｂ．脾臓細胞からｇｐ９６の細胞表面発現水準分析
前記実施例＜２−１＞に記載された方法と同一に製造された１２週令のマウスから脾臓（ｓｐｌｅｅｎｓ）を分離し、細胞を細胞分離器（ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を利用して１ｘＰＢＳで懸濁させ、洗滌した後、１ｘＰＢＳで再懸濁させた。
【０１０４】
ＡＩＭＰ１＋／＋及びＡＩＭＰ１−／−で分離された脾臓細胞の細胞表面水準をＦＡＣＳで分析した結果は図８に示した。
【０１０５】
さらに、脾臓細胞の細胞表面に発現されるｇｐ９６の水準は、ポリクローナル抗体ｇｐ９６又は抗Ｆａｓ抗体を利用して免疫蛍光染色をし、核はＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ、赤色）で染色して免疫蛍光顕微鏡で観察した結果を図９に示した。Ｆａｓは細胞表面マーカーに使用された。
【０１０６】
前記結果からＡＩＭＰ１−／−脾臓細胞は、ＡＩＭＰ１＋／＋脾臓細胞よりｇｐ９６の細胞表面発現水準が高い反面、Ｆａｓの細胞表面発現水準は差がなかった（図８及び図９参照）。
【０１０７】
ｃ．ＨｅＬａ細胞で内在的ＡＩＭＰ１抑制時ｇｐ９６の細胞表面発現水準分析
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を６個ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに敷いて５０％が融合された時、製造社の指針に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏ  ｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を利用して配列番号１５のＡＩＭＰ１  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を最終濃度が５０ｎＭになるように、トランスフェクトさせた。細胞生存度に影響なくトランスフェクトさせた後、４８時間に内在的なＡＩＭＰ１が最も多く減少された。ＡＩＭＰ１のｓｉＲＮＡを処理しないＨｅＬａ細胞を対照群に使用した。
【０１０８】
ｇｐ９６細胞表面発現水準を前記実施例＜２−２＞ｂ．に記載された方法と同一にＦＡＣＳ分析をして、その結果を図１０の左側側面に表し、前記実施例１に記載された方法と同一にウェスタンブロットした結果は、図１０の右側側面に表した。
【０１０９】
前記結果からＨｅＬａ細胞でｓｉＲＮＡを利用して内在的なＡＩＭＰ１が抑制されたとき、ｇｐ９６細胞表面発現水準は増加されたことが分った。
【０１１０】
ｄ．２９３細胞でＡＩＭＰ１を過発現時ｇｐ９６の細胞表面発現水準分析
２９３細胞（ＡＴＣＣ）にＡＩＭＰ１を含有するベクター又は空ベクターをトランスフェクトさせた後、ｇｐ９６の細胞表面発現水準を前記実施例＜２−２＞ｂ．に記載された方  法と同一に、ＦＡＣＳ分析をしてその結果を図１１の左側に表した。
【０１１１】
さらに、Ｍｙｃ抗体とｇｐ９６の抗体を利用して前記実施例１に記載された方法と同一にウェスタンブロットをした結果を図１１の右側に表した。
【０１１２】
前記結果からＡＩＭＰ１を過発現させると、ｇｐ９６の細胞表面発現水準が減少されたことが分った。
【０１１３】
つまり、ＡＩＭＰ１を内在的に抑制すると、ｇｐ９６の細胞表面発現水準は増加し、ＡＩＭＰ１の細胞内で過発現されるとｇｐ９６の細胞表面発現水準が減少するので、ｇｐ９６の細胞表面発現水準はＡＩＭＰ１により調節されることが分った。
【０１１４】
実施例３：ＡＩＭＰ１欠損マウスの自己免疫疾患表現型調査
細胞表面にｇｐ９６を発現する形質転換マウスが製造され、前記マウスの樹状細胞（ｄｅｎｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ）が過渡に活性化されており、前記マウスに自己免疫疾患が発生することが報告された（Ｌｉｕ  Ｂ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１５８２４−１５８２９，２００３）。
【０１１５】
前記実施例２でｇｐ９６の細胞表面発現水準がＡＩＭＰ１により調節されることを確認した為、本発明者等はＡＩＭＰ１の欠損マウスが前記ｇｐ９６形質転換マウスのように自己免疫疾患が発生するか、否かを調査した。
【０１１６】
＜３−１＞ＡＩＭＰ１の欠損マウス自己抗体生成可否
前記実施例＜２−１＞に記載された方法により製造されたＡＩＭＰ１＋／＋及びＡＩＭＰ１−/−マウスの血液において凝固促進剤（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を利用して血清を分離した。さらに、前記５週齢、９週齢、１０週齢、１２週齢、１５週齢マウスの肝臓から核を分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、核蛋白質を分離した。さらに、前記自己血清を利用してウェスタンブロットした結果を図１２に表した。
【０１１７】
図１２に示した通り、ＡＩＭＰ１−/−マウスの核蛋白質は９週齢以降、マウスの自己血清と反応する。従って、ＡＩＭＰ１−/−マウスの場合、野生型とは異なり自己免疫疾患が発生するものとして表れた。
【０１１８】
＜３−２＞ＡＩＭＰ１の欠損マウス自己核抗体生成可否と糸球体にｉｍｍｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ沈着可否
前記実施例＜３−１＞に記載された方法で分離された血清において、自己核抗体（Ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＮＡ））の検出可否をＨＥＰ−２コーディングされたスライド（ＩＮＯＶＡ  Ｄｉａｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を利用して間接免疫蛍光方法により調査した。前記スライドは先ず、ＰＢＳを利用して１：４０稀釈されたマウス血清と共に３０分間培養した。ＰＢＳで洗滌した後、ＦＩＴＣ−標識された羊抗マウスＩｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を添加して３０分間追加培養した。全ての実験はＲＴにある湿った暗室で行った。その後、スライドを洗滌してマウンティング培地（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を利用して装着した。さらに、蛍光顕微鏡を利用して観察した
【０１１９】
さらに、前記マウスから腎臓を冷却器（ｃｒｙｏｓｔａｔ）を利用して取り出し、これら低温断片等は羊血清にブロッキングした後、ＦＩＴＣ標識された羊抗マウスＩｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で染色して免疫蛍光顕微鏡で分析した。
【０１２０】
前記結果からＡＩＭＰ１−/−マウスの血清には、自己核抗体（ＡＮＡ）が存在し（図１３の上部分）、腎臓の糸球体にはｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘが沈着されることを観察（図１３の下部分）することができた。
【０１２１】
＜３−３＞ＡＩＭＰ１の欠損マウスで高ガンマグロブリン血症生成可否
前記実施例＜３−１＞に記載された方法で分離された血清（野生型５匹、ＡＩＭＰ１−/−マウス５匹、ＡＩＭＰ１＋/−のマウス４匹のマウスそれぞれにおいて分離された血清）でＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＭ水準をサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を利用して測定した。さらに、ＩｇＥ水準はＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を利用して測定した。
【０１２２】
その結果、図１４に示した通り、ＡＩＭＰ１欠損マウスの血清にＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭ及びＩｇＥが増加されたものとして表れ、前記マウスに高ガンマグロブリン血症が生成されたものとして表れた。
【０１２３】
前記結果から、ＡＩＭＰ１欠損されるとループス（ｌｕｐｕｓ）のような自己免疫疾患が発生するものとして表れた。つまり、ＡＩＭＰ１がｇｐ９６と結合してｇｐ９６の細胞表面発現水準を調節するものの、ＡＩＭＰ１が欠損されるとｇｐ９６が細胞表面発現水準が増加して免疫反応が強く起こり、自己免疫疾患が起ることが分った。
【０１２４】
実施例４：ＡＩＭＰ１とｇｐ９６の結合領域の同定
＜４−１＞ＡＩＭＰ１又はその断片とｇｐ９６の結合
前記に記載された通り、ＡＩＭＰ１とｇｐ９６が結合し、ｇｐ９６の細胞表面発現水準がＡＩＭＰ１により調節されることを確認した。本発明者等はＡＩＭＰ１とｇｐ９６の結合する部位を同定した。
【０１２５】
３１２個のアミノ酸からなるＡＩＭＰ１蛋白質（配列番号１）は当業界に公知の朴等の方法（Ｐａｒｋ  Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：４５２４３−４５２４８）により製造した。
【０１２６】
ＡＩＭＰ１の断片等、つまり、ＡＩＭＰ１−（１−５３；配列番号３）、ＡＩＭＰ１−（５４−１９２；配列番号４）及びＡＩＭＰ１−（１９３−３１２；配列番号６）断片をそれぞれ製造した。
【０１２７】
前記各断片はＡＩＭＰ１のｃＤＮＡを鋳型として各断片に対する特異的なプライマーセット（表１）を利用してＰＣＲ増幅で合成した。ＰＣＲ反応条件は下記の通りである：９５℃で２分間加熱し、鋳型ＤＮＡを全変性させた後、９５℃で３０秒；５６℃で３０秒；及び７２℃で１分を１サイクルにして２５サイクルを行い、７２℃で５分間最終反応させた。
【０１２８】
前記ＰＣＲ産物等及び前記ＡＩＭＰ１蛋白質をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断して同一な酵素に切断したｐＧＥＸ４Ｔ３べクター（アマシャムバイオサイエンス社）にライゲートした。前記べクターでＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１を形質転換し、これを培養してペプチド等の発現を誘導した。ＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質に発現される各ペプチドをＧＳＨアガロスで精製した。リポポリサッカリドを除去する為に、蛋白質溶液をパイロジェン無添加緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム）で透析した。透析後、蛋白質を同一な緩衝液で平衡させたポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にローディングして２０分間培養した後、溶出させ各ＡＩＭＰ１の断片等を製造した。
【０１２９】
【表１】
2010525362.tif 000003
【０１３０】
精製されたＧＳＴ−ＡＩＭＰ１の断片等をＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）細胞溶解物と共に培養して、兎抗ｇｐ９６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）を使用してウェスタンブロットをした。Ａｒｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ合成酵素（ＲＲＳ）抗体（Ｊｅｏｎｇｗｏｏ  Ｋａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：３１６８２−３２  ６８８，２００）を対照群として実験した。１２０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＫＣｌ  ａｎｄ  ０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー溶液でｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを行った。
【０１３１】
実験結果、図１５に示した通り、ＡＩＭＰ１はｇｐ９６と結合する部位と対照群に使用されたＲＲＳと別の部位で結合する。つまり、ＡＩＭＰ１の５４−１９２部位がｇｐ９６と結合するものとして表れた。
【０１３２】
＜４−２＞ｇｐ９６断片とＡＩＭＰ１の結合
ｇｐ９６は３個の機能的ドメインで分けられる。つまり、配列番号１１のｇｐ９６の２２乃至２８７部位は、ヌクレオチド／ゲルダナマイシン結合と関連がある部位であり、２８８乃至３６８部位は酸性ドメインとして知られている（Ｌｉ  Ｚ.Ｄａｉ  Ｊ,Ｚｈｅｎｇ  Ｈ,Ｌｉｕ  Ｂ,Ｃａｕｄｉｌｌ  Ｍ:Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｐ９６−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ.Ｆｒｏｎｔ.Ｂｉｏｓｃｉ２００２,７:ｄ７３１-７５１）
【０１３３】
さらに、６９９−７９９部位はｇｐ９６の重合化と自己アセンブリーに関係するドメインで知られている。（Ｌｉ  Ｚ.Ｄａｉ  Ｊ,Ｚｈｅｎｇ  Ｈ,Ｌｉｕ  Ｂ,Ｃａｕｄｉｌｌ  Ｍ:Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｐ９６−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ.Ｆｒｏｎｔ.Ｂｉｏｓｃｉ２００２,７:ｄ７３１-７５１）
【０１３４】
従って、前記ｇｐ９６の機能的ドメインが、ｇｐ９６とＡＩＭＰ１との結合にどんな影響を及ぼすかを調べる為に、ｇｐ９６−（２２−２８７；配列番号１５）、ｇｐ９６−（２８８−３６８；配列番号１６）、ｇｐ９６−（３６９−６９８；配列番号１７）及びｇｐ９６−（６９９−７９９；配列番号１８）断片をそれぞれ製造した。
【０１３５】
前記各断片はｇｐ９６のｃＤＮＡを鋳型として断片に対する特異的なプライマーセット（表２）を利用してＰＣＲ増幅で合成した。ＰＣＲ反応条件は下記の通りである：９５℃で２分間加熱し、鋳型ＤＮＡを全変性させた後、９５℃で３０秒；５６℃で３０秒；及び７２℃で１分を１サイクルにして総３０サイクルを行った。７２℃で５分間最終反応させた。前記ＰＣＲ産物等をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断し、同一な酵素で切断したｐＧＥＸ４Ｔ３べクター（アマシャムバイオサイエンス社）にライゲートした。前記べクターでＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１を形質転換してこれを培養し、ペプチドの発現を誘導した。ＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質に発現される各ペプチドをＧＳＨアガロスで精製した。リポポリサッカライドを除去する為に、蛋白質溶液をパイロジェン無添加緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム）で透析した。透析後、蛋白質を緩衝液で平衡させたポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にローディングして２０分間培養した後、溶出させ各ｇｐ９６断片等を製造した。
【０１３６】
【表２】
2010525362.tif 000004
【０１３７】
精製されたＧＳＴ−ｇｐ９６断片等をＡＩＭＰ１と培養し、抗ＡＩＭＰ１抗体を利用してウェスタンブロットした結果を図１６に表した。
【０１３８】
その結果、ｇｐ９６のオリゴメリゼーションに関与するドメインであるｇｐ９６−（６９９−７９９；配列番号１８）がＡＩＭＰ１と結合するものとして表れた。
【０１３９】
前記結果等から、配列番号４のＡＩＭＰ１の５４乃至１９２部位が配列番号１８のｇｐ９６の６９９−７９９部位と結合することが分った。
【０１４０】
＜４−３＞ｇｐ９６変異体とＡＩＭＰ１の結合程度調査
本発明者等は前記実施例＜２−２＞で配列番号１のＡＩＭＰ１の５４乃至１９２部位が配列番号１３のｇｐ９６の６９９−７９９部位と結合することを確認した。これをさらに確認する為に、ｇｐ９６のＳＮＰでＧｅｎｂａｎｋに掲載されているものの中で、ｇｐ９６がＡＩＭＰ１と結合する部位である６９９−７９９部位の中で、一つに変異があるＳＮＰであるＥ７９１（Ｅ７９１△）変異体がＡＩＭＰ１と結合するか、否かを調査した。Ｅ７９１（Ｅ７９１△）変異体がＡＩＭＰ１と結合するか、否かを調査する為に、野生型のｇｐ９６−（２８８−７９９）断片と変異体ｇｐ９６−（２８８−７９９，Ｅ７９１△）断片をそれぞれ製造した。
【０１４１】
前記各断片はｇｐ９６のｃＤＮＡを鋳型として各断片に対する特異的なプライマーセット（表３）利用してＰＣＲ増幅で合成した。ＰＣＲ反応条件は次の通りである：９５℃で２分間加熱し、鋳型ＤＮＡを全変性した後、９５℃で３０秒；５６℃で３０秒；及び７２℃で２分を１サイクルにして、総３０サイクルを行い、７２℃で５分間最終反応させた。前記ＰＣＲ産物等をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断して同一な酵素で切断したｐＥＴ２８ｃベクター（ノバジェンＮｏｖａｇｅｎ）にライゲートした。前記ベクターでＥｃｏｌｉ  ＢＬ２１を形質転換し、これを培養してペプチドの発現を誘導した。Ｈｉｓ−ｔａｇ融合蛋白質で発現される各ペプチドをニッケルカラムで精製した。リポポリサッカライドを除去する為に、蛋白質溶液をパイロジェン無添加緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム）で透析した。透析後、蛋白質を同一な緩衝液で平衡させたポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にローデイングして２０分間培養した後、溶出させ、各ｇｐ９６蛋白質の断片等を製造した。
【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
精製されたｇｐ９６蛋白質等をＧＳＴ又はＧＳＴ−ＡＩＭＰ１と培養した後、兎抗ｇｐ９６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）と共同免疫沈澱させた結果を図１７に示した。図１７に示した通り、Ｅ７９１（Ｅ７９１△）変異体は野生型のｇｐ９６と比較してＡＩＭＰ１との親和度が著しく低下された。従って、ｇｐ９６とＡＩＭＰ１との結合にｇｐ９６の６９９−７９９部位が重要であることが分った。
【０１４４】
実施例５：自己免疫疾患患者の血液からＡＩＭＰ１水準測定
本発明者等は前記実施例３でＡＩＭＰ１欠損マウスが自己免疫疾患が発生することを確認したため、自己免疫疾患患者の血液サンプルからＡＩＭＰ１の水準がどんなになるかを調査した。
【０１４５】
１５８名のＳＬＥ（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｓｕｓ）患者と９９名の正常人の血液を採取して、ＡＩＭＰ１蛋白質の水準をＥＬＩＳＡ方法で測定した。ＡＩＭＰ１のＮ末端を認識するＡＩＭＰ１のモノクローナル抗体と、Ｃ末端を認識するＡＩＭＰ１のモノクローナル抗体を下記の方法により製造した。ＡＩＭＰ１蛋白質抗原１００μｇをマウスの腹腔に注入した。Ｂ細胞クロンを拡大する為に、略１ヶ月間隔で３〜４回免疫を実施し、最後に免疫を施行した３日後にマウスを犠牲させ、脾臓を摘出した。脾臓細胞と骨髄腫細胞を混合した後、これに５０％ＰＥＧ１０００（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、分子量１０００）を混合することにより、細胞融合を起こしてハイブリッドマを作った。細胞融合後ＰＥＧを培養液で洗滌した後、細胞等をＨＡＴ培養液に浮遊させた懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）にまんべんなく分配した。ここで陽性クロン（ＡＩＭＰ１のＮ末端とＣ末端を特異的に認識するクロン）を選び培養した後、培養細胞をマウス腹腔に注入して培養した。約１０日後にマウスから腹水（略５〜６ｍｌ）を採取してＡＩＭＰ１のＮ末端を認識するＡＩＭＰ１のモノクローナル抗体とＣ末端を認識するＡＩＭＰ１のモノクローナル抗体をそれぞれ精製した。
【０１４６】
前記のように製造されたＡＩＭＰ１のＮ末端を認識するモノクローナル抗体をＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）に溶解して２００ｎｇ／ｗｅｌｌで９６−ｗｅｌｌプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ．，Ｆ９６；Ｎｕｎｃ）をコーテイングした。洗滌後ブロッキングバッファ（１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を含有するＰＢＳバッファ）で１時間反応させた。前記にて採取した各血液サンプルから血清を分離して各血清を各ウェルに入れ、１％ＢＳＡを含有する１ｘＰＢＳを入れ、１００μｌに合わせた。２時間培養液後にプレートを洗滌し、ＡＩＭＰ１のＣ−末端を認識するＨＲＰが結合されたＡＩＭＰ１モノクローナル抗体と共に培養した。前記プレートを洗滌して基質反応溶液を各ウェルに添加し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。さらに、精製されたＡＩＭＰ１蛋白質を０、０．３１、０．６３、１．２５、２．５、５、１０、２０ｎｇ／ｍｌ濃度にして同時にＥＬＩＳＡ方法を遂行して測定された吸光度値を標準として血清内にＡＩＭＰ１蛋白質水準を図１９に示した。
【０１４７】
前記の通り、ＡＩＭＰ１はｇｐ９６と結合してｇｐ９６の細胞内位置を調節し、その結果細胞表面に存在するｇｐ９６の量とそれに伴う免疫反応が調節される。動物実験結果、細胞表面にｇｐ９６が過多露出された時、自己免疫疾患が誘導されるものとして知られているものの、自己免疫疾患患者の場合、細胞内でｇｐ９６とＡＩＭＰ１の結合が壊れてｇｐ９６は細胞表面に多く発現され、ＡＩＭＰ１は細胞外に分泌され、血液内に多く存在するものと予想されている前記図１９に示した結果によっても確認された。つまり、ＳＬＥ患者の血清からＡＩＭＰ１の水準が正常人の血清でＡＩＭＰ１の水準より高く表れたことを確認できた（図１９参照）。前記結果からＡＩＭＰ１の血液内水準は、自己免疫疾患を診断し得る新たなマーカーとして使用し得ることが分った。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
以上察した通り、本発明者等は配列番号４で表されるＡＩＭＰ１の５４−１９２部位は、配列番号１８で表されるｇｐ９６の６９９−７９９部位と直接結合してｇｐ９６の小胞体（ＥＲ）残留を手助けて細胞表面に移動を抑制し、細胞表面に存在するｇｐ９６の量とそれに伴う免疫反応を調節することを初めて糾明した。従って、ＡＩＭＰ１の５４−１９２部位と配列番号１８で表されるｇｐ９６の６９９−７９９部位の結合を利用して免疫調節剤、抗癌剤及び自己免疫疾患治療剤をスクリーニングすることができる。さらに、前記結合が分離されると免疫調節ができない為、自己免疫疾患を誘発するので、ＡＩＭＰ１蛋白質の水準測定に利用されるＡＩＭＰ１蛋白質に特異的な抗体は自己免疫疾患を診断する新たなマーカーとして使用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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