(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）：
【化１】
0006285931.tif 000005
（式中、
−Ｘ１およびＸ２は互いに独立して、１Ｈ（Ｈ）または２Ｈ（Ｄ）であり、
−Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は互いに独立して、１２Ｃ（Ｃ）または１３Ｃであり、
−Ｒ１は、メチル基（ここで、炭素原子は１２Ｃ（Ｃ）または１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、１Ｈ（Ｈ）または２Ｈ（Ｄ）である）であり、
−Ｒ２は、メチル基（ここで、炭素原子は１２Ｃ（Ｃ）または１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、１Ｈ（Ｈ）または２Ｈ（Ｄ）である）であるか、または
−Ｒ２は、エチル基（ここで、炭素原子は互いに独立して、１２Ｃ（Ｃ）または１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、１Ｈ（Ｈ）または２Ｈ（Ｄ）である）である）
の化合物であるが、但し、式（Ｉ）の化合物において、同時に、少なくとも１つの水素原子が２Ｈ（Ｄ）であり、少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃである化合物。
【請求項２】
−Ｒ１が、ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＨ２Ｄおよび１３ＣＨＤ２からなる群から選択され、
−Ｒ２が、１３ＣＤ３からなる群から選択されるメチル基であるか、または
−Ｒ２が、ＣＤ３−ＣＤ２、１３ＣＨ３−ＣＤ２、ＣＨ３−１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２−ＣＤ２、１３ＣＨＤ２−１３ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ−ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ−１３ＣＤ２および１３ＣＨ３−１３ＣＤ２からなる群から選択されるエチル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝１３Ｃである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
・（Ｓ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨ３−ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−２Ｈ，２’−１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨ２Ｄ−ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−２Ｈ２，２’−１３Ｃ，）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨＤ２−ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（１３Ｃ）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝１３ＣＨ３；Ｒ２＝１３ＣＤ３｝、
・（Ｓ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝１３ＣＨ３；Ｒ２＝ＣＤ３−ＣＤ２｝
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
・（Ｓ）−１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−２Ｈ２，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝１３Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨ３−１３ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−２Ｈ，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝１３Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨ２Ｄ−１３ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−２Ｈ２，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝１３Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨＤ２−１３ＣＤ２｝
からなる群から選択される、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を調製するための方法であって、式（ＩＩ）
【化２】
0006285931.tif 000006
のアルファ−ケト酸を、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳ  ＩＩ）、補酵素チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、酸化還元補因子フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、マグネシウム塩および緩衝液の存在下で式（ＩＩＩ）
【化３】
0006285931.tif 000007
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｒ１およびＲ２は、請求項１〜６のいずれか一項において式（Ｉ）に関して定義される意味を有する）
のアルファ−ケト酸と反応させること
を含む方法。
【請求項８】
反応のｐＨが、５から９（端値を含む）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
緩衝液が、リン酸塩；マレイン酸水素ナトリウム、イミダゾール；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；トリエタノールアミン（ＴＥＡ）；３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）；およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）からなる群において選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
反応混合物中の緩衝液の濃度が、０．０１Ｍから０．２５Ｍ（端値を含む）の間である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
反応混合物中のアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳ  ＩＩ）の濃度が、２００から７００μｇ／ｍｌの間（端値を含む）である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
反応混合物中の式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸および式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸のそれぞれの濃度が、２ｍＭから１００ｍＭの間（端値を含む）である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
反応が、１５〜４０℃の温度で実施される、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を使用した、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸の同位体標識のための方法。
【請求項１５】
タンパク質および生体分子集合体をＮＭＲ分光法により分析するための方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物による、分析されるタンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の同位体標識のステップを含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の１つまたは複数の化合物を含む、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の同位体標識のためのキット。
【請求項１７】
反応のｐＨが、６から７．８（端値を含む）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
リン酸塩がリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
反応混合物中のアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳ  ＩＩ）の濃度が、３００から５００μｇ／ｍｌの間（端値を含む）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
反応混合物中の式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸および式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸のそれぞれの濃度が、５ｍＭから５０ｍＭの間（端値を含む）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
反応が、２０〜３０℃の温度で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を使用した、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンメチル基の特異的な標識のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識されたキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体、前記誘導体を調製するための方法、ならびにタンパク質および生体分子集合体におけるアミノ酸の同位体標識のための、詳細にはアミノ酸のメチル基の同位体標識のための、より詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンメチル基の特異的な同位体標識のためのその使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、タンパク質および生体分子集合体をＮＭＲ分光法により分析するための方法であって、本発明のキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体により分析される、タンパク質および生体分子集合体におけるアミノ酸、詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンの同位体標識のステップを含む方法に関する。
【０００３】
本発明はさらに、本発明の１つまたは複数のキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体を含む、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の同位体標識のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
巨大タンパク質（>１００ｋＤａ）および超分子系の動態、相互作用ならびに機能の分析に溶液ＮＭＲ分光法を使用することが次第に実現可能になってきている。この進歩の秘訣は、生体分子を標識する新たな強力な手法の開発であり、それらはＮＭＲ方法論における多くの進歩を促すため決定的なものとなってきた。
【０００５】
メチル基は、巨大タンパク質の溶液ＮＭＲ分光法研究のための理想的な分子プローブであることが判明している。
【０００６】
初期のメチル標識手順では、アルファ−ケト酸が、メチルプロトン化イソロイシン（Ｉｌｅ）の産生における前駆体として使用された。より最近の戦略は、大腸菌（E. coli）におけるイソロイシンの生合成前駆体である標識された２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキサブタン酸塩を使用することに基づいている（Ａｙａｌａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍ．、２０１１、ｗｗｗ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｃｈｅｍｃｏｍｍ、ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ１ＣＣ１２９３２Ｅ）。この方法では、前駆体が化学的に合成されることから、前駆体がラセミ混合物として得られこと、また得られる混合物の半分のみが細菌により変換され得ることを意味している。
【０００７】
バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）は、それらのメチル基が、タンパク質において利用可能なすべてのメチルプローブの５０％超を占めるため、大変興味が持たれる３つのアミノ酸である。
【０００８】
過重水素化（perdeuterated）タンパク質におけるロイシンおよびバリンメチル基のプロトン化は一般的に、これらのアミノ酸の生合成における中間体であるメチルプロトン化された２−オキソ−３−メチルブタン酸（アルファ−ケトイソ吉草酸としても公知である）を使用して達成され、ここでは両方のメチル基が、１Ｈ、１３Ｃ標識される。このタイプのアルファ−ケトイソ吉草酸を使用することにより、非常に多くのＮＭＲ可視メチルプローブに起因して過密した［１Ｈ，１３Ｃ］−関連スペクトルがもたらされるため、高分子量タンパク質では効率的ではないことが判明した。
【０００９】
国際公開第２０１１／０８３３５６号は、化学合成により得られるアセト乳酸塩誘導体のラセミ混合物を使用した、タンパク質集合体におけるバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）の特異的な同位体標識のための方法について記載している。従来法により前記ラセミ混合物をそれらの立体化学的に純粋なアセト乳酸塩誘導体へ分割することは、効率的ではないことが判明した。
【００１０】
Ｒｕｓｃｈａｋ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ、２０１０、４８（３）、ｐ.１２９〜３５およびＡｙａｌａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０１２年、４８、ｐ．１４３４〜１４３６は、イソロイシンガンマ−２メチル基の特異的な標識のための２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソブタン酸および２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩のエステル誘導体を調製するための合成経路について記載している。これらの参照文献では、化合物は、アセト酢酸メチル（またはエチル）から化学合成により調製され、したがってラセミ混合物の形態で得られる。その結果として、Ｓ立体化学を有する得られた化合物の半分のみが、細菌により取り込まれ得る。さらに、２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソブタン酸および２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の誘導体は、エステルの形態で存在し、使用前に塩基性媒質で化合物を脱保護させるのにさらなるステップが必要とされることを意味する。あまり制御されていない反応条件下では、これが、化合物の著しい分解をもたらし得る。
【００１１】
Ｇｏｄｏｙ−Ｒｕｉｚ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２（５１）、ｐ.１８３４０〜５０は、アルファ−ケトイソ吉草酸（Ａｌａ、ＬｅｕおよびＶａｌ部位を標識するため）およびアルファ−ケト酪酸（Ｉｌｅ位の標識のため）を使用したアラニン、ロイシン、バリンおよびイソロイシンメチル位の同時選択的同位体標識、ならびに距離制限（distance restraints）や可動性のデータを得るためのそれらの使用について記載している。この参照文献に記載される標識方法は、イソロイシンのガンマ−２位における同位体リーク（isotopic leaks）を導き、構造的な制約を抽出する際に人為的結果をもたらす。この現象は、標識された３−１３Ｃ−アラニンの幾つかの脱アミノ化に起因し、標識されたピルビン酸塩のｉｎ  ｖｉｖｏ合成を導く。このようにして得られる標識されたピルビン酸塩と内因性２−オキソブタン酸塩とのアセト乳酸シンターゼの存在下での縮合により、２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソ−４−１３Ｃ−ブタン酸塩が生じる。
【００１２】
Ｅｎｇｅｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８８、ｐ.８２５〜８３は、芳香族アルファ−ヒドロキシケトンの立体選択的合成における大腸菌（Escherichia Coli）由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼＩ（ＡＨＡＳ  Ｉ）の使用を報告している。
【００１３】
米国特許第２００６／０１４８０４２号は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）またはタルトロン酸セミアルデヒドシンターゼ（ＴＳＡＳ）を使用したキラル芳香族アルファ−ヒドロキシケトンの調製に関する生体内変換方法に関する。この文書は、キラルアセトヒドロキシ酸の非芳香族合成の合成、特異的にまたは全体的に重水素化され、および／または炭素１３（１３Ｃ）が富化されたキラルアセトヒドロキシ酸の合成、およびアミノ酸の同位体標識のためのそれらの使用に関しては、全く触れていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０８３３５６号
【特許文献２】米国特許第２００６／０１４８０４２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｙａｌａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１１、ｗｗｗ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｃｈｅｍｃｏｍｍ、ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ１ＣＣ１２９３２Ｅ
【非特許文献２】Ｒｕｓｃｈａｋ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ、２０１０、４８（３）、ｐ.１２９〜３５
【非特許文献３】Ａｙａｌａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０１２、４８、ｐ．１４３４〜１４３６
【非特許文献４】Ｇｏｄｏｙ−Ｒｕｉｚ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２（５１）、ｐ.１８３４０〜５０
【非特許文献５】Ｅｎｇｅｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８８、ｐ.８２５〜８３
【非特許文献６】Ｂａｒ−Ｉｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０（２００１）  １１９４６〜５４）
【非特許文献７】Ａｙａｌａ  ｅｔ  ａｌ、２０１２、Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ、４８（１０）：１４３４〜６
【非特許文献８】Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９７）
【非特許文献９】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００４  ８８（７）：８２５〜３１
【非特許文献１０】Ｐ．Ｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１０、４９、１９５８〜１９６２）
【非特許文献１１】Ｇｏｄｏｙ−Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２、１８３４０〜１８３５０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、アミノ酸、詳細にはロイシン、バリンおよびイソロイシンから選択されるアミノ酸のメチル基を効率的かつ特異的に標識することが可能である標識された立体特異的なアルファ−ヒドロキシケト酸が依然として必要されている。
【００１７】
詳細には、高収率でかつ穏やかな条件下で位置選択的および立体選択的な方法により製造される上述の標識された立体特異なアルファ−ヒドロキシケト酸が依然として必要とされている。
【００１８】
より詳細には、アミノ酸が標識される部位、即ち、アミノ酸ロイシン、バリンおよびイソロイシンのメチル基で、同位体リークを引き起こさずにアミノ酸を標識することが可能な上述の標識された立体特異的なアルファーヒドロキシケト酸が依然として必要とされている。
【００１９】
さらにより詳細には、検出可能なスクランブリングを伴わずに細菌により標的タンパク質に取り込まれ得る上述の標識された立体特異的なアルファ−ヒドロキシケト酸が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）：
【００２１】
【化１】
0006285931.tif 000002
【００２２】
（式中、
−Ｘ１およびＸ２は互いに独立して、１Ｈ（Ｈ）または２Ｈ（Ｄ）であり、
−Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は互いに独立して、１２Ｃ（Ｃ）または１３Ｃであり、
−Ｒ１は、メチル基（ここで、炭素原子は１２Ｃ（Ｃ）または１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、１Ｈ（Ｈ）または２Ｈ（Ｄ）である）であり、
−Ｒ２は、メチル基（ここで、炭素原子は１２Ｃ（Ｃ）または１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、１Ｈ（Ｈ）または２Ｈ（Ｄ）である）であるか、または
−Ｒ２は、エチル基（ここで、炭素原子は互いに独立して、１２Ｃ（Ｃ）または１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、１Ｈ（Ｈ）または２Ｈ（Ｄ）である）である）
の化合物であるが、但し、式（Ｉ）を有する化合物において、同時に、少なくとも１つの水素原子が２Ｈ（Ｄ）であり、少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃである化合物を提供することにより、当該技術分野におけるこれらの必要性および他の必要性に対処する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物はまた、２−（Ｓ）−アルファ−アセト乳酸誘導体または２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−アルキル−３−オキソブタン酸誘導体としても知られている。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物はキラルである。１２Ｃ（Ｃ）または１３Ｃのいずれかである本発明の化合物における不斉／キラル中心は、（Ｓ）立体配置を有する。その結果として、タンパク質においてアミノ酸を同位体標識するのに必要とされる式（Ｉ）の化合物の量は、同じ操作に必要な当該技術分野のラセミ混合物の量と比較して半分に低減される。
【００２５】
本発明の化合物の別の利点は、当該技術分野のエステル化合物とは異なり、式（Ｉ）の化合物が酸の形態で存在し、したがって実験的に困難であり得るエステル官能基のさらなる脱保護ステップが回避されることである。
【００２６】
本発明の化合物のさらなる利点は、式（Ｉ）の化合物を用いて、アミノ酸の高レベルの同位体標識が、他の位置に対していかなる漏出も伴わずに得られることである。
【００２７】
本発明の状況では、下記用語は、下記の意味を有する：
−Ｖａｌは、アミノ酸バリンを指す；
−Ｌｅｕは、アミノ酸ロイシンを指す；
−Ｉｌｅは、アミノ酸イソロイシンを指す；
−１３Ｃは、炭素１３同位体を指す；
−１２Ｃ（またはＣ）は、炭素−１２同位体を指す；
−２Ｈ（またはＤ）は、重水素として知られる水素の同位体を指す；
−１Ｈ（またはＨ）は、水素の一般的な同位体を指す；
−キラル分子は、上に重ねられない鏡像（miror image）、即ち、通過する平面偏光単色光の偏光面を回転させる特性を有する分子である。本発明では、キラル／不斉中心は、４つの異なる置換基を保有する式（Ｉ）の化合物における炭素原子（１３Ｃまたは１２Ｃ）、即ち２位にある炭素である；
−立体配置は、キラル分子における不斉／キラル中心に直接結合された原子の空間的配置を指す。この配置は、文字（Ｒ）または（Ｓ）を用いて化学式中に割り当てられる。本件では、式（Ｉ）の化合物は、（Ｓ）立体配置を有する；
−生体分子集合体は、タンパク質、およびＤＮＡループ（二重鎖ＤＮＡ分子の２本鎖が、ＤＮＡの第３の鎖によって一定のストレッチで分離させられ、離れて保持される構造）、脂質、各種リガンド等のような他の群を含有する分子を指す；
−立体特異性は、基質または反応物の幾つかの立体異性体のうちの１つに関する顕著な特異性を指し、通常は酵素または有機反応について言われる；
−位置特異性は、すべての他の考え得る方向よりも優先的に作製または切断する一方向の結合を指す；
−ｐｒｏＲ、ｐｒｏＳ：標識されていないＬｅｕのガンマ炭素上のメチル基（デルタ１およびデルタ２）は異ならず、その結果として標識されていないＬｅｕアミノ酸の前記ガンマ炭素はキラルでない。標識されていないＶａｌのベータ炭素上のメチル基（ガンマ１およびガンマ２）は異ならず、その結果として標識されていないＶａｌアミノ酸の前記ベータ炭素はキラルでない。
【００２８】
しかしながら、基Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）の化合物では同じ様式で標識されず、それぞれＬｅｕおよびＶａｌのガンマおよびベータ炭素原子上の得られたメチル基は、異なって標識される。この差異に起因して、それぞれＬｅｕおよびＶａｌのガンマおよびベータ炭素原子はキラルとなる。これらのメチル基は、標識が（Ｒ）立体配置を生じる場合にはｐｒｏＲと称され、標識が（Ｓ）立体配置を生じる場合にはｐｒｏＳと称される。
【００２９】
好ましい実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物では、
−Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、すでに定義される通りであり、
−Ｒ１は、ＣＤ３、１３ＣＨ３、１３ＣＨ２Ｄおよび１３ＣＨＤ２からなる群から選択され、
−Ｒ２は、１３ＣＤ３からなる群から選択されるメチル基であるか、または
−Ｒ２は、ＣＤ３−ＣＤ２、１３ＣＨ３−ＣＤ２、ＣＨ３−１３ＣＤ２、１３ＣＨＤ２−ＣＤ２、１３ＣＨＤ２−１３ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ−ＣＤ２、１３ＣＨ２Ｄ−１３ＣＤ２および１３ＣＨ３−１３ＣＤ２からなる群から選択されるエチル基である。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物では、
−Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１およびＲ２は、様々な実施形態ですでに定義される通りであり、
−Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃである。
【００３１】
さらに別の好ましい実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物では、
−Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１およびＲ２は、様々な実施形態ですでに定義される通りであり、
−Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝１３Ｃである。
【００３２】
本発明のある実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物は、
・（Ｓ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨ３−ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−２Ｈ，２’−１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨ２Ｄ−ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−２Ｈ２，２’−１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨＤ２−ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−（２Ｈ３，１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（１３Ｃ）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝１３ＣＨ３；Ｒ２＝１３ＣＤ３｝、
・（Ｓ）−２−（２Ｈ５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（１３Ｃ）メチルブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝Ｃ；Ｒ１＝１３ＣＨ３；Ｒ２＝ＣＤ３−ＣＤ２｝
からなる群から選択される。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物は、
・（Ｓ）−１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−２Ｈ２，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝１３Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨ３−１３ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−２Ｈ，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝１３Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨ２Ｄ−１３ＣＤ２｝、
・（Ｓ）−１，２，３−（１３Ｃ）−２−（１’−２Ｈ２，２’−２Ｈ２，１３Ｃ２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（２Ｈ３）ブタン酸｛Ｘ１＝Ｘ２＝Ｈ；Ｙ１＝Ｙ２＝Ｙ３＝１３Ｃ；Ｒ１＝ＣＤ３；Ｒ２＝１３ＣＨＤ２−１３ＣＤ２｝
からなる群から選択される。
【００３４】
本発明の別の目的は、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を調製するための方法であって、式（ＩＩ）
【００３５】
【化２】
0006285931.tif 000003
【００３６】
のアルファ−ケト酸を、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳ  ＩＩ）、補酵素チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、酸化還元補因子フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、マグネシウム塩および緩衝液の存在下で式（ＩＩＩ）
【００３７】
【化３】
0006285931.tif 000004
【００３８】
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｒ１およびＲ２は、様々な実施形態で式（Ｉ）に関して定義される意味を有する）
のアルファ−ケト酸と反応させること
を含む方法を提供することである。
【００３９】
この方法は酵素的であり、それは、
−位置選択的であり（酵素は好ましくは、式（ＩＩ）および／または（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸のある特定の部位と反応する）、また立体特異的であり（２−（Ｓ）−アルファ−ヒドロキシケト酸が単独で入手される）；
−エナンチオマーを分離するステップを必要とせず；
−高収率（少なくとも５０％）で（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を生じ、
−副生成物の形成を低減し、場合によっては排除し；および／または
−穏やかな反応条件下で高い反応速度を提供する。
【００４０】
式（Ｉ）の化合物を調製するこの酵素的方法の別の利点は、当該技術分野で記載される化学合成により容易に入手可能でない標識された化合物の産生に帰する。
【００４１】
この方法は、植物、細菌、酵母または真菌ＡＨＡＳ  ＩＩを使用してもよく、それらは、野生型であってもよく、組換えでもよく、遺伝子操作および突然変異されてもよい。
【００４２】
本発明のある実施形態では、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳ  ＩＩ）は好適には、Ｂａｒ−Ｉｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０（２００１）  １１９４６〜５４）で調製される大腸菌（ＷＴ）由来の野生型ＡＨＡＳアイソザイムＩＩである。本発明の別の実施形態では、ＡＨＡＳ  ＩＩは好適には、Ｎ末端位内にタグを有する組換えＡＨＡＳアイソザイムＩＩである。
【００４３】
この方法では、反応のｐＨが、５から９、好ましくは６から７．８（端値を含む）であり得る。
【００４４】
式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）アルファ−ケト酸間の反応は、緩衝液の存在下で実施される。緩衝液が好適には、リン酸塩、詳細にはリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム；マレイン酸水素ナトリウム、イミダゾール；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；トリエタノールアミン（ＴＥＡ）；３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）；およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）からなる群において選択される。
【００４５】
この方法では、反応混合物中の緩衝液の濃度が、０．０１Ｍ〜０．２５Ｍ（端値を含む）であり得る。
【００４６】
反応混合物中のアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳ  ＩＩ）の濃度は、２００から７００μｇ／ｍｌの間、好ましくは３００から５００μｇ／ｍｌの間（端値を含む）であり得る。
【００４７】
この方法では、式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸および式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸のそれぞれの濃度が、２ｍＭから１００ｍＭの間、好ましくは５ｍＭから５０ｍＭの間（端値を含む）である。
【００４８】
好ましい実施形態では、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸が、化学量論量で存在する。
【００４９】
式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸と式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸との間の反応が、１５から４０℃の間、好ましくは２０から３０℃の間（端値を含む）の温度で実施され得る。
【００５０】
本発明による方法では、式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸と式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸との間の反応は、０から５０％ｖ／ｖの濃度の２−プロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびアセトアミドから選択される水混和性有機溶媒の存在下で実施され得る。
【００５１】
式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸と式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸との間の反応は、総濃度０から１５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような酵素安定性を改善するための還元剤、１つまたは複数の緩衝塩の存在下で任意に実施され得る。
【００５２】
マグネシウムイオンは、カルシウム、バリウム、マンガン、亜鉛、コバルトおよびニッケルのような酵素を活性化することが可能である他の二価金属陽イオンで置き換えられてもよい。
【００５３】
続いて、過重水素化された発現培養液に添加されると、式（Ｉ）の化合物は、検出可能なスクランブリングを伴わずに細菌により標的タンパク質へ取り込まれる。
【００５４】
本発明はまた、本発明による（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を使用した、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸の同位体標識のための、より詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンメチル基の特異的な標識のための方法に関する。
【００５５】
この方法は、検出可能なスクランブリングを伴わずに、タンパク質または所望のタンパク質を過剰発現する細菌を含有する培養培地における本発明による（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物の添加による、タンパク質および生体分子集合体におけるイソロイシン、ロイシンおよびバリンアミノ酸におけるメチル基の効率的かつ立体特異的な標識を可能にする。細菌は、大腸菌であり得るが、これに限定されない。使用されるプロトコルは、例えば国際公開第２００１／０８３３５６号に記載されるものであってもよい。
【００５６】
本発明はまた、タンパク質および生体分子集合体をＮＭＲ分光法により分析するための方法であって、本発明による（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物による、分析されるタンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびアミノ酸の同位体標識のステップを含む方法に関する。
【００５７】
したがって、式（Ｉ）の化合物は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸を含有するタンパク質の構造的研究を実施することを可能にする。式（Ｉ）の化合物による標識は、３０ｋＤａ未満のタンパク質において０．０５Ｈｚ程度と低い弱い双極子およびスカラー相互作用を検出することを可能にする。
【００５８】
本発明はさらに、本発明による（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の１つまたは複数の化合物を含む、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の同位体標識のための、詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンメチル基の同位体標識のためのキットに関する。
【００５９】
本発明の他の利点および特徴は、説明目的で付与される下記実施例および添付の図面と関連してより良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】大腸菌のアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＳＡＨ  ＩＩ）による２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−エチル，３−オキソブタン酸イオンおよび２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−メチル，３−オキソブタン酸イオン（前駆体とも称される）の酵素合成を表す。ピルビン酸イオン分子の１つに由来する最終化合物の炭素原子を太字で示す。
【図２】２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−エチル，３−オキソブタン酸塩（前駆体とも称される）の酵素合成を表す。左：時間の関数としてのＡＳＡＨ  ＩＩの存在下でのオキソブタン酸塩／ピルビン酸塩の１：１混合物の一次元ＮＭＲスペクトルが表される。右：オキソブタン酸塩のメチル基および前駆体のデルタ−１位におけるメチル基の共鳴強度の時間の関数としての漸進的変化が表される。
【図３】２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−１３Ｃ−１’−Ｄ２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ３−ブタン酸イオン（Ｉ）の合成を表す。上部パネル：（Ｕ−Ｄ）ピルビン酸イオンおよび４−１３Ｃ−３−Ｄ２−２−オキソブタン酸イオンの等モル混合物（左）およびＡＨＡＳ  ＩＩの添加後の２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−１３Ｃ−１’−Ｄ２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ３−ブタン酸イオン（前駆体デルタ−１とも称される）（右）のＮＭＲスペクトルが表される。幾らかのアセト乳酸塩（１０％未満）が反応中に形成されるが、それらは重水素化されると観察不可能である。下部パネル：２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−１３Ｃ−１’−Ｄ２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ３−ブタン酸イオンの合成スキームが表される。１３Ｃ標識された炭素原子を太字で表す。
【図４】２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ５）エチル，３−オキソ，４−１３Ｃ−オキソブタン酸イオンの合成を表す。上部パネル：（Ｕ−Ｄ）−２−オキソブタン酸イオンおよび３−１３Ｃ−ピルビン酸イオンの等モル混合物（左）およびＡＨＡＳ  ＩＩの添加後の最終生成物（２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ５）エチル，３−オキソ，４−１３Ｃ−ブタン酸イオン）（右）のＮＭＲスペクトルが表される。１．３５および１．５７ｐｐｍのピークは、ピルビン酸イオンの水和形態に相当し（左）、１．３２および１．５５ｐｐｍのピークは、反応中に形成されるアセト乳酸塩に相当する（右）。下部パネル：２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ５）エチル，３−オキソ，４−１３Ｃ−ブタン酸イオン（前駆体ガンマ−２とも称される）の合成スキームが表される。１３Ｃ標識された炭素位置を太字で表す。
【図５】２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−１３Ｃ−ブタン酸イオンの合成を表す。上部パネル：３−１３Ｃ−ピルビン酸イオン（左）およびＡＨＡＳ  ＩＩの添加後の最終生成物（２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−１３Ｃ−ブタン酸イオン）（右）のＮＭＲスペクトルが表される。１．３５および１．５７ｐｐｍのピークは、ピルビン酸イオンの水和形態に相当に相当する。下部パネル：２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−１３Ｃ−ブタン酸イオン（アセト乳酸イオンとも称される）の合成スキームが表される。１３Ｃ標識された炭素位置を太字で表す。
【図５ａ】２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ２−１’−Ｄ２）−エチル−３−オキソ−１，２，３−１３Ｃ−４−Ｄ３−ブタン酸イオンの合成を表す。上部パネル：（Ｕ−１３Ｃ）−３−Ｄ２−２−オキソブタン酸イオンおよび（Ｕ−Ｄ）−２−１３Ｃ−ピルビン酸イオンの等モル混合物（左）およびＡＨＡＳ  ＩＩの添加後の最終生成物（右）のＮＭＲスペクトルが表される。１．３５および１．５７ｐｐｍのピークは、ピルビン酸イオンの水和形態に相当し（左）、１．３２および１．５５ｐｐｍのピークは、反応中に形成されるアセト乳酸イオンに相当する（右）。下部パネル：２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ２−１’−Ｄ２）−エチル−３−オキソ−１，２，３−１３Ｃ−４−Ｄ３−ブタン酸イオンの合成の合成スキームが表される。１３Ｃ標識された炭素位置を太字で表す。
【図６】添加される外因性前駆体の量の関数としての過剰発現されるタンパク質における（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の取込みのレベルを表す。ユビキチンは、２ｇ／ＬのＵ−［２Ｈ］−グルコースを有するＭ９／Ｄ２Ｏ培養培地中の大腸菌で発現された。（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の取込みのレベル（四角）を、化学合成（Ａｙａｌａ  ｅｔ  ａｌ、２０１２、Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ、４８（１０）：１４３４〜６）により得られるラセミ２−ヒドロキシ−２−［２Ｈ５］エチル−［１，２，３，４−１３Ｃ４］−３−オキソブタン酸塩の取込みのレベル（黒丸）と比較する。定量化は、イソロイシンガンマ−２メチル基に相当するシグナルの強度を、メチオニンのイプシロンメチル基のシグナルに関して比較することにより実施した。９５％のＩｌｅ側鎖における取込みのレベルは、化学合成した前駆体に関して１リットル当たり１００ｍｇ以上と比較して、Ｍ９／Ｄ２Ｏ培養培地１リットル当たり（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩約５０ｍｇを添加することにより得られる。
【図７】標識されたアラニンおよび２−オキソブタン酸塩の存在下（上部パネル）、または標識されたアラニンおよび上述のプロトコルを使用して合成される前駆体の存在下（下部パネル）のいずれかで大腸菌で産生されるユビキチンの１３Ｃ−ＨＳＱＣスペクトルを表す。スペクトルは、点線領域内（ここでは、スペクトルは１％でプロットされる）を除いてイソロイシンアミノ酸の共鳴の最大強度の１０％でプロットされる。Ｇｏｄｏｙ−Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２（５１）、ｐ．１８３４０〜５０）のプロトコルを使用することにより、１．５〜２％のイソロイシンのガンマ−２メチル基の人為的な標識が導かれ（上部パネル）、その標識は、培養液に関して本発明者らの前駆体を使用する場合には、総合的に抑制される（下部パネル）。
【図８】実施例で記載するような本発明者の標識プロトコルに習って産生されたユビキチンの１３Ｃ−ＨＳＱＣスペクトル（メチル領域）を表す。ロイシンおよびバリンのｐｒｏＳメチル基ならびにイソロイシンアミノ酸のデルタ−１メチル基のみが標識されていることが観察され得る。他のメチル位への漏出は観察されない。
【実施例】
【００６１】
材料および手順
使用する化合物は市販されている：（Ｄ５）−２−オキソブタン酸塩に関しては、ＣＤＮ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｉｎｃ．、４−（１３Ｃ）−２−オキソブタン酸塩、３−１３Ｃ−ピルビン酸塩、２−１３Ｃ−ピルビン酸塩、ピルビン酸塩に関しては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＵ−（１３Ｃ）−２−オキソブタン酸塩に関しては、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。ＡＨＡＳ  ＩＩの２つのサブユニットをコードする配列を保有するプラスミドは、Ｄａｖｉｄ  Ｃｈｉｐｍａｎ博士（ネゲブのベングリオン大学）によりご厚意により提供された。
【００６２】
１Ｈおよび１３Ｃ一次元ＮＭＲスペクトルはすべて、極低温三重共鳴パルス磁場勾配プローブヘッドを装備したプロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＶａｒｉａｎ  ＤｉｒｅｃｔＤｒｉｖｅ分光計で記録した。
【００６３】
標識されたタンパク質の二次元１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣは、直接的な次元における１２８８個（／７８０）の複素数データ点（最大値ｔ２＝９９ｍｓ）（／６０ｍｓ））および炭素次元における５１２個（／３８０）の点（最大値ｔ１＝１２８ｍｓ）（／４７ｍｓ））で記録された。
【実施例１】
【００６４】
１’アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳ  ＩＩ）の調製
ＡＨＡＳ  ＩＩの過剰発現および精製は、Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９７）の方法に従って行われた。過剰発現されたＡＨＡＳ  ＩＩのプラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で３７℃で成長させた。
【００６５】
６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）または吸光度が０．５〜０．７に達した際に、最終濃度０．４ｍＭになるようにイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することより、ＡＨＡＳ  ＩＩ発現を誘発させた。発現は、２０℃で１２時間実施した。４℃で１５分間、５０００ｇでの遠心分離により、細菌を収集して、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ  ０．１Ｍ  ｐＨ  ７．５  １０ｍｌ中に再懸濁させて、４℃で１５分間、４０００ｇで遠心分離した。細菌を緩衝液（緩衝液Ａ：ＴＲＩＳ  ５０ｍＭ  ｐＨ８、ＫＣｌ  ０．５Ｍ、イミダゾール１０ｍＭおよびＦＡＤ  ２０μＭ）１０ｍｌ中に再懸濁させた。２分間の超音波処理により、細胞を崩壊させて、４℃で４５分間、４５，０００ｇで超遠心分離により、不溶性物質を除去した。
【００６６】
次に、緩衝液Ａで平衡化したＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎから入手）上に上清を置いた（deposed）。５倍容量の緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：ＴＲＩＳ  ５０ｍＭ  ｐＨ８、ＫＣｌ  ０．５Ｍ、イミダゾール４００ｍＭおよびＦＡＤ  ２０μＭ）を使用して、ＡＨＡＳ  ＩＩを溶出させた。ＡＨＡＳ  ＩＩを含有する分画をプールして、濃縮して、脱イオン水に対して透析して、凍結乾燥させた。ＡＨＡＳ  ＩＩの活性は、３３３ｎｍでピルビン酸塩の吸光度の減少を測定することにより決定した。
【実施例２】
【００６７】
１３Ｃおよび２Ｈ（Ｄ）標識された２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−エチル，３−オキソ，４−ブタン酸塩および２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−メチル，３−オキソ，４−ブタン酸塩の合成
本発明による２つの化合物であるＤおよび１３Ｃで標識された２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−エチル，３−オキソ，４−ブタン酸塩および２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−メチル，３−オキソ，４−ブタン酸塩の合成は、芳香族アルファ−ヒドロキシケトンのキラル合成に関するＤ．Ｃｈｉｐｍａｎ氏により記載されるプロトコル（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００４  ８８（７）：８２５〜３１および米国特許第２００６／０１４８０４２号）に従って実施した。
【００６８】
１３Ｃおよび２Ｈ標識された化合物の合成は、１３Ｃおよび２Ｈ（Ｄ）標識されたピルビン酸塩および２−オキソブタン酸塩の等モル混合物中で、上述のように精製したＡＨＡＳ  ＩＩの分割量を添加することにより行った。反応は、１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（一次元）によりモニタリングして、ピルビン酸塩と２−オキソブタン酸塩との縮合は、図２で示されるように２時間で完了した。１３Ｃおよび２Ｈにより異なって標識された試薬を使用して、多数の式（Ｉ）の化合物を酵素的に合成できた。
【００６９】
Ａ．２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−１３Ｃ−１’−Ｄ２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ３−ブタン酸塩（前駆体デルタ−１）の合成。
【００７０】
３３ｍＭの（Ｕ−Ｄ）ピルビン酸塩（ｐＨ１０．７で７２時間、Ｄ２Ｏ中での標識されていないピルビン酸塩の処理により過重水素化した）を、Ｄ２Ｏ緩衝液（リン酸カリウム５０ｍＭ  ｐＨ７．８、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、チアミン二リン酸１ｍＭ、ＦＡＤ  ２０ｍＭ）３ｍｌ中で３３ｍＭの４−１３Ｃ，３−Ｄ２−２−オキソブタン酸塩と混合させた。
【００７１】
反応は、６ｍＭ（４２０ｍｇ／ｍｌ）のＡＨＡＳ  ＩＩの添加により開始して、続いて１Ｈ  ＮＭＲ（一次元）を行った。初期および最終化合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図３に表す。
【００７２】
Ｂ．２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ５）エチル，３−オキソ，４−１３Ｃ−ブタン酸塩（前駆体ガンマ−２）の合成
３３ｍＭの３−１３Ｃ−ピルビン酸塩を、Ｄ２Ｏ緩衝液（リン酸カリウム５０ｍＭ  ｐＨ７．８、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、チアミン二リン酸１ｍＭ、ＦＡＤ  ２０ｍＭ）３ｍｌ中で同濃度のＤ５−２−オキソブタン酸塩と混合させた。
【００７３】
反応は、６ｍＭ（４２０ｍｇ／ｍｌ）のＡＨＡＳ  ＩＩの添加により開始して、続いて１Ｈ  ＮＭＲ（一次元）を行った。初期および最終化合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図４に表す。
【００７４】
Ｃ．２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−（１３ＣＤ３）−ブタン酸塩（アセト乳酸塩）の合成
６６ｍＭの３−１３Ｃ−ピルビン酸塩を、Ｄ２Ｏ緩衝液（リン酸カリウム５０ｍＭ  ｐＨ７．８、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、チアミン二リン酸１ｍＭ、ＦＡＤ  ２０ｍＭ）３ｍｌ中に溶解させた。
【００７５】
反応は、６ｍＭ（４２０ｍｇ／ｍｌ）のＡＨＡＳ  ＩＩの添加により開始して、続いて１Ｈ  ＮＭＲ（一次元）を行った。ピルビン酸イオンおよび最終化合物（２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−（１３ＣＤ３）−ブタン酸イオン）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図５に示す。４位での重水素化は、Ｐ．Ｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１０、４９、１９５８〜１９６２）により記載されるように、１Ｈ／２Ｈ（Ｄ）交換により遂行される。
【００７６】
Ｄ．２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ２−１’−Ｄ２）−エチル−３−オキソ−１，２，３−１３Ｃ−４−Ｄ３−ブタン酸塩の合成
３３ｍＭのＵ−Ｄ，２−１３Ｃ−ピルビン酸塩を、Ｄ２Ｏ緩衝液（リン酸カリウム５０ｍＭ  ｐＨ７．８、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、チアミン二リン酸１ｍＭ、ＦＡＤ  ２０ｍＭ）３ｍｌ中で同濃度でのＵ−１３Ｃ，３−Ｄ２−２−オキソブタン酸塩と混合させた。
【００７７】
反応は、６ｍＭ（４２０ｍｇ／ｍｌ）のＡＨＡＳ  ＩＩの添加により開始して、続いて１Ｈ  ＮＭＲ（一次元）を行った。初期および最終化合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図５ａに示す。
【実施例３】
【００７８】
過剰発現されたタンパク質における（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の取込みの最適化。
【００７９】
過剰発現されたタンパク質への（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩取込みのレベルを決定するための初期実験は、モデル系としてユビキチンを使用して実施した。
【００８０】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、Ｈｉｓでタグ付したヒトのユビキチン遺伝子を保有するｐＥＴ４１ｃプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎから入手）（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）で形質転換して、形質転換体を、１ｇ／Ｌの１５ＮＤ４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＵ−［２Ｈ］−グルコースを含有するＭ９／Ｄ２Ｏ培地中で成長させた。
【００８１】
６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、標識された２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩を含有する溶液を添加した。さらに１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。誘発は、３７℃で３時間実施した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）クロマトグラフィーカラムにより精製した。
【００８２】
過剰発現されたタンパク質におけるほぼ完全な取込みを達成するのに必要とされる２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の最適な量は、２００ｍｇ／ｍＬのＵ−［１３Ｃ］−メチオニンと一緒に１５、３０、６０、８０および１００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように、種々の量の標識された前駆体が誘発の１時間前に添加された一連の培養物（それぞれ１００ｍＬ）中で評価した。精製タンパク質への取込みのレベルは、１３Ｃ−ＨＳＱＣ  ＮＭＲによりモニタリングした。定量化は、Ｍｅｔのイプシロンメチル基のシグナルに関して、Ｉｌｅメチル基に相当するシグナルの積算を比較することにより実施した。
【００８３】
Ｍ９／Ｄ２Ｏ培養培地１リットル当たり約５０ｍｇの純粋な（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の添加により、Ｉｌｅ側鎖における９５％の取込みレベルが達成される（図６）。
【実施例４】
【００８４】
Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１５Ｎ］，Ｉｌｅ−ｄ１−［１３Ｃ１Ｈ３］タンパク質の産生。
【００８５】
Ｈｉｓでタグ付したヒトのユビキチン遺伝子を保有するｐＥＴ４１ｃプラスミド（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１ｇ／Ｌの１５ＮＤ４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ７（Ｉｓｏｔｅｃから入手）を含有するＭ９／Ｄ２Ｏ培地に、三段階で２４時間かけて徐々に適合させた。最終的な培養では、細菌を、９９．８５％のＤ２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐから入手）を用いて調製したＭ９培地中で３７℃で成長させた。
【００８６】
６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−［２’−１３Ｃ，１’−Ｄ２］エチル，［４−Ｄ３］−３−オキソ−ブタン酸塩（実施例２−Ａに記載するプロトコルに従って調製）および２−オキソイソ吉草酸−ｄ７を含有する溶液を、それぞれ６５ｍｇ／Ｌおよび２００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように培養培地に添加した。１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。発現を３７℃で３時間実施した後、収集した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）カラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００８７】
１３Ｃスペクトルを、プロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＮＭＲ分光計でＤ２Ｏ中で３７℃で記録した。デルタ−１イソロイシンメチル炭素に関する唯一のシグナルが、１３Ｃスペクトルで観察され、（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−［２−１３Ｃ，１−Ｄ２］エチル，［４−Ｄ３］−３−オキソ−ブタン酸塩の１３Ｃ１Ｈ３基が、他のアミノ酸の代謝経路に取り込まれないことを示した。イソロイシンアミノ酸のデルタ−１位における１３ＣＨ３基の取込みレベルは、標識されたタンパク質の二次元１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣで観察されるＮＭＲシグナルの積算に基づいて９５％よりも高いと推定された。
【実施例５】
【００８８】
Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１５Ｎ］，Ｉｌｅ−ｇ２−［１３Ｃ１Ｈ３］タンパク質の産生。
【００８９】
Ｈｉｓでタグ付したヒトのユビキチン遺伝子を保有するｐＥＴ４１ｃプラスミド（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１ｇ／Ｌの１５ＮＤ４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ７（Ｉｓｏｔｅｃから入手）を含有するＭ９／Ｄ２Ｏ培地に、三段階で２４時間かけて徐々に適合させた。最終的な培養では、細菌を、９９．８５％のＤ２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐから入手）を用いて調製したＭ９培地中で３７℃で成長させた。
【００９０】
６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ５）エチル，３−オキソ，４−１３Ｃ−ブタン酸塩（実施例２−Ｂに記載するプロトコルに従って調製）および２−オキソイソ吉草酸−ｄ７を含有する溶液を、それぞれ６５ｍｇ／Ｌおよび２００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように培養培地に添加した。１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。発現を３７℃で３時間実施した後、収集した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）カラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００９１】
１３Ｃスペクトルを、プロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＮＭＲ分光計でＤ２Ｏ中で３７℃で記録した。イソロイシンのガンマ−２メチル炭素に関する唯一のシグナルが、１３Ｃスペクトルで観察され、２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ５）エチル，３−オキソ，４−１３Ｃ−ブタン酸塩の１３Ｃ１Ｈ３基が、他のアミノ酸の代謝経路に取り込まれないことを示した。イソロイシンのガンマ−２位における１３ＣＨ３基の取込みレベルは、標識されたタンパク質の二次元１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣで観察されるＮＭＲシグナルの積算に基づいて９５％よりも高いと推定された。
【実施例６】
【００９２】
Ｇｏｄｏｙ−Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２、１８３４０〜１８３５０頁）のプロトコルを使用したＵ−［２Ｈ］，Ｕ−［１５Ｎ］，Ａｌａ−ベータ［１３Ｃ１Ｈ３］，Ｉｌｅ−デルタ−１−［１３Ｃ１Ｈ３］タンパク質の産生
Ｈｉｓでタグ付したヒトのユビキチン遺伝子を保有するｐＥＴ４１ｃプラスミド（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１ｇ／Ｌの１５ＮＤ４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ７（Ｉｓｏｔｅｃから入手）を含有するＭ９／Ｄ２Ｏ培地に、三段階で２４時間かけて徐々に適合させた。最終的な培養では、細菌を、９９．８５％のＤ２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐから入手）、２．５ｇ／Ｌのコハク酸塩−ｄ５（Ｉｓｏｔｅｃから入手）を用いて調製したＭ９培地中で３７℃で成長させた。
【００９３】
６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、１３ＣＨ３−アラニン，４−１３Ｃ−２−ケト酪酸および２−ケトイソ吉草酸−ｄ７を含有する溶液を、それぞれ８００、７５および２００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように培養培地に添加した。スペクトルを簡素化して、重複を回避するために、元のプロトコルからの４−１３Ｃ，３−メチル（２Ｈ３）−２−ケトイソ吉草酸を、前駆体の過重水素化形態で置換したことに留意されたい。１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。発現を３７℃で３時間実施した後、収集した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）カラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００９４】
１３Ｃスペクトルを、プロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＮＭＲ分光計でＤ２Ｏ中で３７℃で記録した。アラニン、およびイソロイシンのデルタ−１メチル炭素に関するシグナルが、１３Ｃスペクトルで観察されたが、イソロイシンの共鳴ガンマ−２メチル炭素に相当する疑似ピークも観察された。イソロイシンのガンマ−２メチル炭素における同位体スクランブリングのレベルは、図７に示されるように１．５〜２％であると推定された。イソロイシンのデルタ−１位およびアラニンのベータ位における１３ＣＨ３基の取込みレベルは、標識されたタンパク質の二次元１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣで観察されるＮＭＲシグナルの積算に基づいて９５％よりも高いと推定された。
【実施例７】
【００９５】
Ｕ−［２Ｈ］，Ｕ−［１５Ｎ］，Ａｌａ−ベータ［１３Ｃ１Ｈ３］，Ｉｌｅ−デルタ−１−［１３Ｃ１Ｈ３］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［１３Ｃ１Ｈ３］ｐｒｏＳタンパク質の産生
Ｈｉｓでタグ付したヒトのユビキチン遺伝子を保有するｐＥＴ４１ｃプラスミド（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１ｇ／Ｌの１５ＮＤ４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ７（Ｉｓｏｔｅｃから入手）を含有するＭ９／Ｄ２Ｏ培地に、三段階で２４時間かけて徐々に適合させた。最終的な培養では、細菌を、９９．８５％のＤ２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐから入手）を用いて調製したＭ９培地中で３７℃で成長させた。
【００９６】
６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、１３ＣＨ３−アラニン，２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−１３Ｃ−１’−Ｄ２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ３−ブタン酸塩および２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−（１３ＣＤ３）−ブタン酸塩前駆体を含有する溶液を、それぞれ８００ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように培養培地に添加した。
【００９７】
２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−（１３ＣＤ３）−ブタン酸塩前駆体（実施例２−Ｃに記載するように酵素的に調製）を使用する場合、最終化合物の量は、４００ｍｇ／Ｌに代わって２００ｍｇ／Ｌに低減させることができる。１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。発現を３７℃で３時間実施した後、収集した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）カラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００９８】
１３Ｃスペクトルを、プロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＮＭＲ分光計でＤ２Ｏ中で３７℃で記録した。イソロイシンメチル炭素のガンマ−２の共鳴に相当する検出可能な疑似ピークを伴わずに、Ａｌａ、Ｉｌｅ−デルタ−１、Ｌｅｕ／Ｖａｌ−ｐｒｏＳメチル炭素に関するシグナルが、１３Ｃスペクトルで観察された。イソロイシンのガンマ−２位、Ｌｅｕ／Ｖａｌ−ｐｒｏＳおよびＡｌａのベータ位における１３ＣＨ３基の取込みレベルは、標識されたタンパク質の二次元１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣで観察されるＮＭＲシグナルの積算に基づいて９５％よりも高いと推定された。
【００９９】
したがって、図７に示すように、上述のプロトコルを使用することにより、標識の人為的結果、即ち構造決定（ＮＯＥ）に関して必要とされるデータを収集することを妨げるイソロイシンのガンマ−２メチル基の残留標識が抑制されることは明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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