(57)【要約】本発明は、癌および慢性炎症の診断および予後診断、ならびに、さらに慢性炎症によって媒介される疾病の診断および予後診断における使用のための新規なバイオマーカーを提供する。当該バイオマーカーは糖タンパク質であり、発明者により、そのレベルは特定の病状に対応するように関連付けられた。本発明は、癌または慢性炎症性の症状の処置の治療への反応をモニターするための方法にまでさらにおよぶ。【選択図】図５
2010540953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症の診断方法であって、前記方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを前記試料において測定する工程と、
−  前記少なくとも１つのマーカーの前記測定されたレベルに基づく診断を与える工程と、を含み、
前記診断は前記被験者における敗血症の存在または不存在を確認する方法。
【請求項２】
前記敗血症は、グラム陽性菌によって引き起こされる請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、敗血症の診断における使用。
【請求項４】
被験者における敗血症の予後診断のための方法であって、前記方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを前記試料において測定する工程と、
−  前記少なくとも１つのマーカーの前記測定されたレベルに基づく予後診断を与える工程と、を含み、
前記予後診断は、前記被験者が敗血症を発症している可能性を確かめる方法。
【請求項５】
前記敗血症はグラム陽性菌である請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、敗血症の予後診断のための方法における使用。
【請求項７】
敗血症のための処置の治療への反応をモニターするための方法であって、
−  最初の時点で入手した、患者からの第１の試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを前記試料において測定する工程と、
−  前記第１の試料が入手された後の時点で前記被験者から得た少なくとも１つのさらなる試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを、前記試料中の前記少なくとも１つのさらなる試験試料において測定する工程と、
−  前記少なくとも１つのさらなる試料における前記少なくとも１つのマーカーのレベルと比較した場合の、前記第１の試料に存在する同様の少なくとも１つのマーカーの測定されたレベルの比較に基づく治療に対する反応の評価を与える工程と、を含む方法。
【請求項８】
膵炎を診断するための方法であって、前記方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを、前記試料において測定する工程と、
−  前記少なくとも１つのマーカーの前記測定されたレベルに基づく診断を与える工程と、を含み、
前記診断は、前記被験者における膵炎の存在または不存在を確かめる方法。
【請求項９】
Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、膵炎の診断における使用。
【請求項１０】
被験者における膵炎の予後診断のための方法であって、前記方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程と、
−  前記少なくとも１つのマーカーの前記測定されたレベルに基づく予後診断を与える工程と、を含み、
前記予後診断は、前記被験者が膵炎を発症している可能性を確かめる方法。
【請求項１１】
Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、膵炎の予後診断における使用。
【請求項１２】
膵炎のための処置の治療への反応をモニターする方法であって、
−  最初の時点で入手した、被験者からの第１の試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程と、
−  前記第１の試料が入手された後の時点で前記被験者から得た少なくとも１つのさらなる試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを、前記少なくとも１つのさらなる試験試料において測定する工程と、
−  前記少なくとも１つのさらなる試料における前記少なくとも１つのマーカーのレベルと比較した場合の、前記第１の試料に存在する同様の少なくとも１つのマーカーの測定されたレベルの比較に基づく治療に対する反応の評価を与える工程と、を含む方法。
【請求項１３】
膵臓癌の予後診断または診断のための方法であって、前記方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程と、
−  前記少なくとも１つのマーカーの前記測定されたレベルに基づく予後診断および／または診断を与える工程と、を含み、
前記診断は、前記被験者における膵臓癌の存在または不存在を確かめる方法。
【請求項１４】
Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、膵臓癌の予後診断または診断のための方法における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコシル化の分析に基づき、疾病を診断およびモニターする方法に関する。特に、本発明は、敗血症、膵炎および膵臓癌を診断ならびにモニターする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は、刺激（感染または組織損傷など）に対する反応において生じる一連の細胞および分子の事象を含む。しかし、急性期反応の間の免疫媒介物（サイトカイン、プロスタグランジンおよびロイコトリエンなど）の様式の相違は、炎症の性質および部位に応じて、異なる病態生理学的症状において生じる。疾病の発生および進行の間のグリカン構造の変化は、グリコシルトランスフェラーゼの発現の変化、その細胞内局在および安定性、活性化糖ヌクレオチドの有効性および輸送、ならびに糖タンパク質アクセプターの細胞内輸送を含む非常に複雑、かつ十分に理解されていない工程である。炎症の間のグリコシル化の変化は、動物モデルおよびいくつかの個々のヒト急性期タンパク質において示された。異なる炎症性疾患における、変化したオリゴ糖分枝およびα−１  酸性糖タンパク質の増加したシアリル化および免疫グロブリン  ＩｇＧの変化したガラクトシル化は、顕著な例である。
【０００３】
敗血症は、感染に対する全身性反応からもたらされる臨床症状である。敗血症の間の病態生理学的事象の大部分は、過剰反応または制御されない炎症反応からもたらされるため、これらの工程の理解に対するいずれかの寄与は、治療法の開発において価値を有するだろう。
【０００４】
膵炎は、膵臓内の酸素の活性化によって引き起こされる膵臓組織の炎症性疾患である。急性膵炎は、全身性炎症反応を含むが、しかし、バクテリア感染は、疾病の発症の初期段階の間には認められない。迅速な治療は、後の合併症のリスクを減少させることができるため、膵炎の早期診断は重要である。しかし、現在、この潜在的に重篤な疾病の発生および進行を予測するために使用することができる、信頼できる予後診断マーカーは明確に欠如している。
【０００５】
グリコシル化は、炎症の過程において重要であるという広く受け入れられた事実にも関わらず、敗血症におけるグリコシル化の変化の研究は十分ではなく、一方、膵炎におけるグリコシル化の変化については、現在までに取り組まれていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、敗血症または膵炎のいずれかに特異的なマーカー（当該マーカーは、これらの症状の予後診断および診断を可能にする）の同定について実質的なニーズがある。このようなマーカーは、疾病の進行のモニター、またさらに、これらの症状のそれぞれを治療するために使用される治療法に対する反応のモニターにおけるさらなる有用性を有する可能性がある。
【０００７】
詳細な実験の後、発明者らは、敗血症の診断または予後診断のための方法、またさらに、敗血症のための治療法を施されている被験者における治療に対する反応の評価のための方法における有用性を有する、グリコシル化におけるいくつかの定められた変化を同定した。グリコシル化におけるこれらの変化の同定および特徴づけは、（特に治療への反応における）これらの症状の診断、およびこれらの発症のモニターのために改善された方法の提供における特定の有用性を有する疾病特異的なマーカーを与える。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、敗血症の診断方法が与えられ、当該方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加された（ｔｒｉｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）Ｎ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加された（ｔｅｔｒａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）Ｎ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを当該試験試料において測定する工程と、
−  当該少なくとも１つのマーカーの当該測定されたレベルに基づく診断を与える工程と、を含み、
当該診断は当該被験者における敗血症の存在または不存在を確認する。
【０００９】
ある実施態様では、敗血症はグラム陽性菌によって引き起こされる。ある実施態様では、当該敗血症はグラム陰性敗血症である。
【００１０】
発明者らは、敗血症の診断における同定されたバイオマーカーの有用性をさらに認識した。
【００１１】
従って、本発明のさらなる態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、被験者の敗血症として定められる症状の診断における使用が与えられる。
【００１２】
ある実施態様では、敗血症はグラム陽性菌によって引き起こされる。ある実施態様では、当該敗血症はグラム陰性敗血症である。
【００１３】
発明者らは、敗血症の診断に加えて、本発明の第１の態様の方法およびマーカーは、被験者における敗血症の予後診断のための方法についてさらに有用性を有することをさらに同定した。
【００１４】
従って、本発明のさらなる態様は、被験者における敗血症の予後診断のための方法を与え、当該方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを当該試験試料において測定する工程と、
−  当該少なくとも１つのマーカーの当該測定されたレベルに基づく予後診断を与える工程と、を含み、
当該予後診断は、当該被験者が敗血症を発症している可能性を確かめる。
【００１５】
ある実施態様では、敗血症はグラム陽性菌によって引き起こされる。ある実施態様では、当該敗血症はグラム陰性敗血症である。
【００１６】
発明者らは、敗血症の予後診断における同定されたバイオマーカーの有用性をさらに認識した。
【００１７】
従って、本発明のさらなる態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの敗血症の予後診断における使用が与えられる。
【００１８】
ある実施態様では、敗血症はグラム陽性菌によって引き起こされる。ある実施態様では、当該敗血症はグラム陰性敗血症である。
【００１９】
さらに、本発明のマーカーおよび方法は、敗血症の治療またはこれに関連する少なくとも１つの症状の寛解のために被験者に施される、または施されている治療法に対する被験者による反応をモニターするための方法において有用性を有する。
【００２０】
従って、本発明のさらなる態様は、敗血症のための治療に対する反応をモニターするための方法であって、
−  最初の時点で入手した、被験者からの第１の試験試料を準備する工程と、
−  当該試料における少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程であって、当該マーカーは、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型  グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化、のうち少なくとも１つからなる群から選択される工程と、
−  当該第１の試料を入手した後の時点で当該被験者から得た少なくとも１つのさらなる試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを、当該少なくとも１つのさらなる試験試料において測定する工程と、
−  当該少なくとも１つのさらなる試料における当該少なくとも１つのマーカーのレベルと比較した場合の、当該第１の試料に存在する同様の少なくとも１つのマーカーの測定されたレベルとの比較に基づく治療に対する反応の評価を与える工程と、を含む方法を与える。
【００２１】
ある実施態様では、敗血症はグラム陽性菌によって引き起こされる。ある実施態様では、当該敗血症はグラム陰性敗血症である。
【００２２】
発明者らは、敗血症を治療するために被験者に提供される治療計画について、被験者による治療に対する反応の判定における当該同定されたバイオマーカーの有用性をさらに認識した。
【００２３】
従って、本発明のさらなる態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、敗血症を治療するために被験者に施された処置に対する当該被験者の反応を判定するための方法における使用が与えられる。
【００２４】
ある実施態様では、敗血症はグラム陽性菌によって引き起こされる。ある実施態様では、当該敗血症はグラム陰性敗血症である。
【００２５】
治療への反応の診断、予後診断、または評価が、敗血症に関連する少なくとも１つの本発明の方法によって与えられる、ある実施態様では、当該診断または予後診断は、被験者が敗血症を有するかどうか、被験者がグラム陽性敗血症を有するかどうか、被験者が敗血症を有しないかどうか、または被験者がグラム陰性敗血症を有するかどうかなどの要素を判定できる可能性がある。
【００２６】
発明者らは、膵炎の診断もしくは予後診断のための方法、または、さらに、膵炎のための治療法を施されている被験者の治療に対する反応を評価するための方法における有用性を有するグリコシル化に基づいたバイオマーカーをさらに同定した。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、膵炎を診断するための方法が提供され、当該方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを当該試料において測定する工程と、
−  当該少なくとも１つのマーカーの当該測定されたレベルに基づく診断を与える工程と、を含み、
当該診断は、当該被験者における膵炎の存在または不存在を確かめる。
【００２８】
発明者らは、膵炎の診断における当該同定されたバイオマーカーの有用性をさらに認識した。
【００２９】
従って、本発明のさらなる態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、膵炎の診断における使用が与えられる。
【００３０】
発明者らは、膵炎の診断に加えて、本発明の方法およびマーカーは、被験者における膵炎の予後診断のための方法におけるさらなる有用性を有することをさらに同定した。
【００３１】
従って、本発明のさらなる態様は、被験者における膵炎の予後診断のための方法を与え、当該方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを当該試料において測定する工程と、
−  当該少なくとも１つのマーカーの当該測定されたレベルに基づいて予後診断を与える工程と、を含み、
当該予後診断は、当該被験者が膵炎を発症している可能性を確かめる。
【００３２】
発明者らは、膵炎の予後診断における当該同定されたバイオマーカーの有用性をさらに認識した。
【００３３】
従って、本発明のさらなる態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、膵炎の予後診断における使用が与えられる。
【００３４】
さらに、本発明のマーカーおよび方法は、膵炎のための治療法に対する被験者による反応をモニターするための方法における有用性を有する。
【００３５】
従って、本発明のさらなる態様は、膵炎のための治療に対する反応をモニターするための方法であって、
−  最初の時点で入手した、被験者からの第１の試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程と、
−  当該第１の試料を入手した後の時点で当該被験者から得た少なくとも１つのさらなる試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを当該少なくとも１つのさらなる試験試料において測定する工程と、
−  当該少なくとも１つのさらなる試料における当該少なくとも１つのマーカーのレベルと比較した場合の、当該第１の試料に存在する同様の少なくとも１つのマーカーの測定されたレベルとの比較に基づいて治療に対する反応の評価を与える工程と、を含む方法を与える。
【００３６】
発明者らは、膵炎を治療するために被験者に提供される治療計画における、当該被験者による治療に対する反応の判定における当該同定されたバイオマーカーの有用性をさらに認識した。
【００３７】
従って、本発明のさらなる態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、膵炎を治療するために被験者に施される処置に対する当該被験者の反応を判定するための使用が与えられる。
【００３８】
治療に対する反応の診断、予後診断、または評価が、膵炎に関連する本発明の少なくとも１つの方法によって与えられる、ある実施態様では、当該診断または予後診断は、被験者が膵炎、または急性膵炎を有するかどうか、被験者が膵炎を有さないかどうか、などの要素を判定できる可能性があり、さらに、疾病の進行および／または重症度の段階の特徴づけの決定についての確定または補助における有用性を有する可能性がある。
【００３９】
発明者らは、膵臓癌の診断または予後診断のための方法、または、さらに、膵臓癌のための治療法を施されている被験者における治療に対する反応を評価するための方法における有用性を有するグリコシル化に基づいたバイオマーカーをさらに同定した。
【００４０】
本発明のさらなる態様によれば、膵臓癌の診断のための方法が与えられ、当該方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの当該試料中に存在するレベルを測定する工程と、
−  当該少なくとも１つのマーカーの当該測定されたレベルに基づく診断を与える工程と、を含み、
当該診断は、当該被験者における膵臓癌の存在または不存在を確かめる。
【００４１】
発明者らは、膵臓癌を診断するための方法における当該同定されたバイオマーカーの有用性をさらに認識した。
【００４２】
従って、本発明のさらなる態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、膵臓癌の診断における使用が与えられる。
【００４３】
発明者らは、膵臓癌の診断に加えて、本発明の方法およびマーカーは、被験者における膵臓癌の予後診断のための方法におけるさらなる有用性を有することをさらに同定した。
【００４４】
従って、本発明のさらなる態様は、被験者における膵臓癌の予後診断のための方法を与え、当該方法は、
−  被験者から試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程と、
−  当該少なくとも１つのマーカーの当該測定されたレベルに基づく予後診断を与える工程と、を含み、
当該予後診断は、被験者が膵臓癌を発症している可能性を確認する。
【００４５】
発明者らは、膵臓癌の予後診断における当該同定されたバイオマーカーの有用性をさらに認識した。
【００４６】
従って、本発明のさらなる態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、膵臓癌の予後診断における使用が与えられる。
【００４７】
さらに、本発明のマーカーおよび方法は、膵臓癌のための治療法に対する被験者による反応をモニターするための方法における有用性を有する。
【００４８】
従って、本発明のさらなる態様は、膵臓癌のための処置の治療に対する反応をモニターするための方法であって、
−  最初の時点で入手した、被験者からの第１の試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する工程と、
−  当該第１の試料を入手した後の時点で当該被験者から得た少なくとも１つのさらなる試験試料を準備する工程と、
−  Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームまたはＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを、当該少なくとも１つのさらなる試験試料において測定する工程と、
−  当該少なくとも１つのさらなる試料における当該少なくとも１つのマーカーのレベルと比較した場合の、当該第１の試料に存在する同様の少なくとも１つのマーカーの測定されたレベルとの比較に基づく治療に対する反応の評価を与える工程と、を含む方法を与える。
【００４９】
発明者らは、膵臓癌を治療するために被験者に提供された治療計画について、当該被験者による治療への反応の判定における、当該同定されたバイオマーカーの有用性をさらに認識した。
【００５０】
従って、本発明のさらなる態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン、Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造、Ｎ−結合型グリカンの分枝の程度、フコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、トリシアル酸付加された三分岐Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、Ｎ−結合型グリカン上のオリゴマンノース構造、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームおよびＮ−結合型グリカンのコアのフコシル化からなる群から選択される少なくとも１つのグリコシル化マーカーの、膵臓癌を治療するために被験者に施された処置に対する当該被験者の反応の判定における使用が与えられる。
【００５１】
治療に対する反応の診断、予後診断、または評価が、膵臓癌に関連する本発明の方法のうちの少なくとも１つによって与えられる、ある実施態様では、当該診断または予後診断は、被験者が膵臓癌または急性膵臓癌を有するかどうか、被験者が膵臓癌を有さないかどうか、などの要因を判定することができる可能性があり、さらに、疾病の進行および／または重症度の段階の特徴づけの決定における確定または補助における有用性を有する可能性がある。
【００５２】
ある実施態様では、被験者は哺乳類（典型的にヒト）である。
【００５３】
ある実施態様では、試験試料は、基本的に、当該技術分野で公知のいずれかの適した技術によって入手され、体液の試料、体組織、または糖タンパク質を含む他の試料を含むことができるが、これらに限定されない。さらなる例としては、全血清、血漿、血液、尿、痰、精液、精漿、胸水、腹水、乳頭吸引液、糞便または唾液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
膵炎もしくは膵臓癌の診断または予後診断に関連する本発明の実施態様では、典型的に、膵臓組織が使用される。あるいは、ある実施態様では、試料は、腫瘍細胞由来のものが与えられる可能性がある。
【００５５】
ある実施態様では、試験試料中の当該１つ以上のマーカーのレベルは、診断、予後診断および／または反応を決定するために、対照試料中の当該１つ以上のマーカーのレベルと比較される。
【００５６】
例えば、１つの実施態様では、Ｎ−結合型グリカン上の外腕からコアのフコシル化の比率、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、二分岐型グリカン；Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォーム、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型構造グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３およびＮ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１のうち１つ以上のレベルの増加；Ｎ−結合型グリカン上のマンノース構造およびＮ−結合型グリカンの分枝の程度のレベルのうち１つ以上の変化；ならびに／またはトリシアル酸付加された三分岐  Ｎ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３およびフコシル化Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）に対するトリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の比率のうち１つ以上のレベルの低下は、膵炎および／または敗血症の存在を示す。
【００５７】
当該１つ以上のマーカーの試験試料中におけるレベルの測定により、膵炎を敗血症と区別することがさらにできる。例えば、１つの実施態様では、シアリルルイスｘ  Ｎ−結合型グリカン構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３のレベルの連続的な増加および／またはオリゴマンノース構造のレベルの連続的な減少は、膵炎を示す。用語「連続的な増加」／「連続的な減少」は、本願明細書においては、レベルが一定の期間にわたって増加／減少し続けることを意味するように理解される。レベルを評価できる典型的な期間は、２日間、より好ましくは４日間、さらにより好ましくは８日間以上である。
【００５８】
当該１つ以上のマーカーの試験試料中におけるレベルの測定によって、さらに、膵炎および／または敗血症を、癌（例えば膵臓癌）と区別することができる可能性がある。１つの実施態様では、Ｎ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するＮ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態の比率の増加は、膵炎または敗血症のいずれか（しかし癌ではない）を示す。１つの実施態様では、Ｎ−結合型グリカンのコアのフコシル化の増加は、膵臓癌（しかし膵炎ではない）または敗血症を示す。
【００５９】
当該マーカーは、例えば、全試料から、試料からの糖タンパク質のプールから、または試料から精製された１つ以上のタンパク質で検出することができる。
【００６０】
従って、１つの実施態様では、Ｎ−結合型グリカンプールは、（例えば、グリコシダーゼの消化による糖タンパク質の精製を行っていない血清からの）試験試料中の総糖タンパク質から遊離され、当該グリカンプール中の１つ以上のマーカーのレベルが測定される。グリカンマーカーは、特定のタンパク質、例えば、１つ以上の急性期タンパク質（例えば、血清アミロイドＡ、ハプトグロビン、α１−酸性糖タンパク質、α１−アンチトリプシン、α１−抗キモトリプシン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、補体  Ｃ３、α２−マクログロブリン、プロトロンビン、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ヴィルブランド因子またはプラスミノーゲン）または興味ある他の血清タンパク質（単数または複数）上で任意に検出される。
【００６１】
特定のタンパク質上のマーカーは、試料からのタンパク質の精製の有無に関わらず検出できる。従って、１つの実施態様では、１つ以上のタンパク質（例えば、１つ以上の急性期タンパク質）は、当該タンパク質上の１つ以上のマーカーのレベルの測定の前に、試験試料から単離される。ＨＰＬＣによるグリカンマーカーのハイスループット解析の前に、急性期タンパク質を単離するための、急性期タンパク質のアフィニティー精製は、本願明細書の実施例に記載される。当該試料は、必要に応じて、マーカーの検出の前に処理することができ、例えば、細胞および／または組織は、細胞内糖タンパク質マーカーの検出のために、任意に溶解される。
【００６２】
当該１つ以上のマーカーの試験試料中のレベルは、基本的に、いずれかの簡便な技術または技術の組み合わせによって決定することができる。例えば、当該マーカーは、クロマトグラフィー（例えば、順相または弱陰イオン交換ＨＰＬＣ）、質量分析、ゲル電気泳動（例えば、１次元または２次元のゲル電気泳動）および／またはイムノアッセイ（例えば、イムノＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、レクチンＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、またはレクチン  イムノアッセイ）を、試料またはこれらの誘導体もしくは成分（例えば、血清、血清分画、細胞溶解液または組織溶解液、グリカンプール、単離されたタンパク質など）について行うことによって検出できる。例えば、本願明細書下記の実施例、および米国特許出願公開第２００６０２６９９７４号明細書（Ｄｗｅｋらによる、表題「Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ」）、米国特許出願公開第２００６０２７００４８号明細書（Ｄｗｅｋらによる、表題「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ（ｓ）」）、および米国特許出願公開第２００６０２６９９７９号明細書（Ｄｗｅｋらによる、表題「Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｌｙｃａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」）を参照。
【００６３】
本発明の前述の実施態様に記載されたように、本発明の様々な態様は、治療に対する被験者の反応のモニターにおける有用性を有する方法にまでおよぶ。従って、当該被験者が、膵炎、敗血症および膵臓癌からなる群から選択される症状について以前に診断されている実施態様の１つのクラスでは、当該方法は、当該症状について当該被験者を治療することと、当該治療の開始の前に当該被験者から得た第１の試験試料を準備することと、当該治療の開始後に当該被験者から得た第２の試験試料を準備することと、当該治療に対する当該被験者の反応をモニターするために当該第１の試験試料中の当該１つ以上のマーカーのレベルを、当該第２の試験試料のものと比較することと、を含む。
【００６４】
任意に、本願明細書に記載された２つ以上（例えば、３、４、５または６またはそれ以上）のマーカーの試験試料中のレベルが測定される。同様に、本願明細書に記載されたマーカーは、当該症状のための他のマーカー（例えば、グリコシル化マーカー、遺伝子マーカーおよび／またはタンパク質マーカーなど）と組み合わせて使用できる。従って、例えば、当該方法は、１つ以上のさらなるマーカーの試験試料、または被験者から得た別の臨床試料中のレベルを測定する工程、および１つ以上のマーカーのレベルおよび１つ以上のさらなるマーカーのレベルから診断、予後診断および／または反応を判定する工程を含むことができる。
【００６５】
当該方法は、当該１つ以上のマーカーのレベルに基づき、被験者の膵炎、敗血症もしくは膵臓癌の治療に対する反応を診断、予後診断および／またはモニターする工程を任意に含む。
【００６６】
組成物（例えば、本発明の方法の実行において有用な組成物、または本発明の方法を実行している間に形成される組成物）は、本発明の別の特徴である。例えば、本発明の組成物は、試料中のマーカーのレベルを測定するために他の試薬と任意に組み合わせて、本発明のマーカーのうちの１つに対する抗体を任意に含む。
【００６７】
従って、実施態様の１つの代表的な一般的クラスは、グリコフォームが、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、テトラシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン、トリシアル酸付加されたＮ−結合型グリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３、フコシル化  Ｎ−結合型グリカン  Ａ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスｘ）、Ｎ−結合型グリカン上のシアリルルイスｘの消化由来のＡ３ＦＧ１、分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォーム、Ｎ−結合型グリカンのα１，３  フコシル化形態、ならびにＮ−結合型グリカンのコアがフコシル化された形態および非フコシル化形態のうち１つ以上を含む、第１のタンパク質の第１のグリコフォームに対する第１の抗体を含む組成物を与える。
【００６８】
当該組成物は、第１のタンパク質（例えば、急性期タンパク質または他の血清タンパク質または興味のあるタンパク質）の第１のグリコフォーム、被験者から得た試料、レクチン、１次抗体に対する２次抗体、（共有結合または非共有結合の、かつ、マルチプレックスアッセイのため、組成物中の他の抗体上のいずれかの他のタグと任意に識別可能な）１次抗体と関連した核酸タグ、当該第１のタンパク質の第２のグリコフォームに対する２次抗体、および／または第２のタンパク質のグリコフォームに対する３次抗体を任意に含む。２次抗体またはレクチンは、（例えば、蛍光標識または酵素で）任意に標識され、または標識に結合するように形成される（例えば、ビオチン化される）。当該組成物は、核酸タグ（単数または複数）を増幅するための試薬（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチドなど）、レクチンまたは２次抗体を検出するための試薬（例えば、蛍光発生基質または比色分析基質）などを含むことができる。
【００６９】
当該組成物の１つ以上の要素を含むキットもまた、本発明の特徴である。例えば、キットは、上記の抗体、および任意にまた、レクチン、１次抗体に対する２次抗体、当該第１のタンパク質の第２のグリコフォームに対する２次抗体、第２のタンパク質のグリコフォームに対する３次抗体、核酸タグ（単数または複数）を増幅するための試薬、レクチンまたは２次抗体を検出するための試薬、および／または同様のものを、１つ以上の容器に詰められて含むことができる。典型的に、当該キットは、敗血症、膵炎もしくは膵臓癌を診断、予後診断またはモニターするために当該キットの要素を使用するための指示を含む。
【００７０】
上記関連を実行するためのシステムもまた、本発明の特徴である。典型的に、当該システムは、本発明の１つ以上のマーカーのレベルを、特定の診断、予後診断などと関連付けるシステムの命令を含むだろう。当該システムの命令は、マーカーのレベルについての検出された情報を、当該マーカーと、関連する表現型との間の相関を含むデータベースと比較することができる。当該システムは、例えば、自動化されたインターフェースまたはユーザー・インターフェースを通じた、マーカー検出情報に関する試料特異的な情報の出力、およびその情報とデータベースとの比較のための装置を含む。
【００７１】
当該システムは、１つ以上のマーカーのレベルを検出するための、１つ以上のデータ取得モジュールを含むことができる。これらは、例えば、試料の入手、試料の希釈または分注、マーカー物質（例えば、タンパク質）の精製、マーカーの検出などのために、試料ハンドラー（例えば、液体ハンドラー）、ロボティクス、マイクロ流体システム、タンパク質精製モジュール、検出器、クロマトグラフィー装置、質量分析計、サーモサイクラー、またはこれらの組み合わせを含むことができる。分析される試料、または上記で記載された組成物は、任意に当該システムの一部であり、または、それから分離するように考慮することができる。
【００７２】
ユーザーとインターフェースするためのシステムの構成要素が任意に提供される。例えば、当該システムは、コンピューターで実行されるシステムの命令の出力を見るためのユーザーが視認可能なディスプレイ、ユーザーのコマンドを入力し、当該システムを起動するための、ユーザー入力装置（例えば、キーボードまたはポインティング・デバイス（マウスなど））などを含むことができる。典型的に、興味のあるシステムは、コンピューターを含み、様々なコンピューターで実行されるシステムの命令がコンピューターソフトウェアで具体化され、例えば、コンピューター可読媒体上で保存される。
【００７３】
当業者は、対照からのレベルにおけるいずれかの統計的有意差は、診断、予後診断または反応の決定要因であり得ることを認識するだろう。顕著な変化または相違を示し、診断、予後診断または反応の決定要因となる可能性がある、被験者から得た試料中の１つ以上のマーカー（単数または複数）のレベルの、対照中のそのマーカー（単数または複数）のレベルとの相違の程度は、当業者の技量の範囲内で決定される。誤解を避けるため、かつ、明確さのため、顕著な変化は、マーカー（単数または複数）の測定されたレベルが、対照マーカー（単数または複数）のレベルに比べて、５、１０、１５または２０％超変化するものであることが好ましい。
【００７４】
（定義）
他に定義されていない限り、本願明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関与する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。下記の定義は、当該技術分野におけるものを補い、本願に向けられ、いずれかの関連する、または無関係のケース（例えば、いずれかの共有に係る特許または出願）に帰属するものではない。本願明細書に記載されたものの類似物または均等物のいずれかの方法および物質は、本発明の試験のための実行において使用できるが、好ましい物質および方法が本願明細書に記載される。従って、本願明細書で使用される用語法は、特定の実施態様の記載のためだけのものであり、制限することを意図したものではない。
【００７５】
本願明細書および添付の請求項で使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その、当該（ｔｈｅ）」は、構成上明確に指示されていない限り、複数の参照対象を含む。従って、例えば、「１つの（ａ）タンパク質」への言及は、複数のタンパク質を含み、「１つの（ａ）細胞」は、細胞の混合物などを含む。
【００７６】
「アミノ酸配列」は、文脈に応じて、アミノ酸残基のポリマー（例えば、タンパク質）またはアミノ酸ポリマーを示す文字列である。
【００７７】
「ポリペプチド」または「タンパク質」は、２つ以上のアミノ酸残基を含むポリマーである。当該ポリマーは、非アミノ酸の要素（例えば、標識、消光剤、保護基など）をさらに含むことができ、修飾（例えば、グリコシル化など）を任意に含むことができる。当該ポリペプチドのアミノ酸残基は、天然型または非天然型であってもよく、非置換型、非修飾型、置換型または修飾型であってもよい。
【００７８】
用語「糖タンパク質」は、アミノ酸配列、および当該アミノ酸配列と関連する１つ以上のオリゴ糖（グリカン）構造を指す。所定の糖タンパク質は、１つ以上の「グリコフォーム」を有することができる。特定の糖タンパク質の各グリコフォームは、同じアミノ酸配列を有する。しかし、異なるグリコフォームと関連するグリカン（単数または複数）は、少なくとも１つのグリカンが異なる。
【００７９】
用語「グリカン」は、多糖（２つ以上の単糖残基を含むポリマー）を指す。「グリカン」はまた、複合糖質の炭水化物部分（糖タンパク質または糖脂質など）を指すために使用できる。グリカンは、単糖残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーであってもよく、直鎖状または分枝状であってもよい。「Ｎ−結合型」グリカンは、タンパク質中のアスパラギン残基のＲ−基の窒素に結合することが見出され、一方「Ｏ−結合型」グリカンは、セリンまたはスレオニン残基のＲ−基の酸素に結合することが見出された。
【００８０】
グリカンの「ＧＵ値」（または「グルコース単位値（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｎｉｔ  ｖａｌｕｅ）」）は、そのおおよその大きさの程度を示す。ＧＵ値は、基本的に、クロマトグラフィーカラムからの特定のグリカンの溶出時間を表わす。実際の時間または量で表わされる溶出時間は、個々のカラム、その寿命などに依存して変化する可能性があるため、当該カラムは、グリコースオリゴマーの標準的な混合物で最初に較正される。
【００８１】
本願明細書全体における用語「Ａ３ＦＧ１」は、自然に存在するＡ３ＦＧ１、およびシアリダーゼ、ガラクトシダーゼおよび／またはα１，２  フコシダーゼでのグリカンの消化によって得られるＡ３ＦＧ１の両方を含む。従って、用語「ＳＬｅｘの消化由来のＡ３ＦＧ１」は、本願明細書において、自然に存在するＡ３ＦＧ１およびＳＬｅｘの消化由来のＡ３ＦＧ１を含むことが理解される。
【００８２】
「急性期タンパク質」は、炎症に対する反応において血漿濃度が増加（陽性急性期タンパク質）または減少（陰性急性期タンパク質）する（例えば、２５％以上）タンパク質である。
【００８３】
用語「被験者」は、動物（より好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒト）を指す。典型的に、当該被験者は、興味のある疾病、障害、または症状（例えば、癌または慢性炎症）を有する、またはこれらを有する疑いがあることが知られている。
【００８４】
用語「マーカー」は、被験者から入手した生物学的試料中で検出可能であり、当該被験者における興味のある疾病、障害、または症状（または、疾病、障害、もしくは症状に対する感受性）を示す分子を指す。本発明における特に興味のあるマーカーは、疾病、障害、または症状を有する個体から得た試料と、健康な対照から得た試料との間のグリコシル化の相違を示すグリカンおよび糖タンパク質を含む。
【００８５】
「対照試料」は、興味のある疾病、障害、または症状（例えば、癌または慢性炎症）に罹患していない単一の個体由来であってもよく、または２以上のこのような個体から貯えられた試料であってもよい。
【００８６】
本発明の構成では、用語「単離された」は、その自然に存在する環境において、通常付随または相互作用する成分を実質的に含まない生物学的物質（タンパク質など）を指す。当該単離された物質は、その自然の環境（例えば、細胞）において当該物質と共には見出されない物質を任意に含む。例えば、細胞または血清から単離されたタンパク質は、細胞または血清から、精製または部分的に精製できる。
【００８７】
「イムノアッセイ」は、抗原への抗体の特異的な結合を利用し、試料中の抗原を同定および／または定量化する。イムノアッセイは、（１つの抗原または複数の抗原に対する）１つの抗体または２つ以上の抗体を含む可能性がある。
【００８８】
様々なさらなる用語は、本願明細書において定義され、または別なふうに特徴付けられる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】（ａ）疾病の１、２、４および８日目における敗血症の患者から得た血清タンパク質、（ｂ）疾病の１、２、５および８日目における急性膵炎の患者から得た血清タンパク質、ならびに（ｃ）健康な対照から得た血清タンパク質、から遊離されたＮ−グリカンの順相クロマトグラムを示す。ピーク  １−２６において同定されたグリカン構造は、表１に示される。調査期間を通じて持続された変化は、矢印で印を付けた。試料  Ｓ１上の拡大した四角形は、この縮尺ではよく見えないが、全てのピークは明確に検出可能であることを示す。
【図２】敗血症（８日目）試料からの６つのＮ−グリカンの陰イオン  ナノ−ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ  スペクトルを示す。（ａ）主要な診断上の切断部位を示す構造を有するＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２。このオリゴマンノースグリカン、および他のオリゴマンノースグリカンにおける、３−アンテナおよび６−アンテナ上の分枝のパターンは、Ｄ、［Ｄ−１８］−およびＯ，３ＡＲ−２  イオンの質量によって示される。（ｂ）二分岐型グリカン  Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３（Ａ２Ｇ２）。Ｆ−型イオン（ｍ／ｚ  ４２４）は、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ  アンテナを示し、Ｃ１  イオン（ｍ／ｚ  １７９）は、ガラクトースを非還元末端に位置付ける。６−アンテナの組成物は、Ｄおよび［Ｄ−１８］−  イオン（それぞれ、ｍ／ｚ  ６８８および６７０）によって与えられる。（ｃ）フコシル化され二分された二分岐型グリカン。フコースの位置は、２，４ＡＲ、ＢＲおよび２，４ＡＲ−１  イオン（それぞれ、ｍ／ｚ  １６８１、１６２１および１４７８）の質量によって明らかにされた（フコースは失われた）。［Ｄ−２２１］−に対応するｍ／ｚ  ６７０でのイオンは、二分しているＧｌｃＮＡｃの存在についての診断となる。（ｄ）三分岐グリカン  Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３（Ａ３Ｇ３）。異性体の混合物。Ｅ−型のイオン（ｍ／ｚ  ８３１）およびＤ／［Ｄ−１８］−  イオン（ｍ／ｚ  ６８８／６７０）は、分枝３−アンテナを有する異性体についての診断となる。Ｄ、［Ｄ−１８］−および［Ｄ−３６］−イオン（それぞれ、ｍ／ｚ  １０５３、１０３５および１０１７）は、分枝６−アンテナを有する異性体の存在を示す。（ｅ）フコシル化された三分岐グリカン  Ｇａｌ３ＧｌｃＮＡｃ５Ｍａｎ３Ｆｕｃ１（Ａ３Ｇ３ＦおよびＦｃＡ３Ｇ３）。コア−フコシル化およびアンテナ−フコシル化の存在は、２，４ＡＲ、ＢＲおよび２，４ＡＲ−１  イオン（それぞれ、ｍ／ｚ  １９８９．７、１９２９．７および１７８６．６、ならびにｍ／ｚ  １８４３．７、１７８３．６および１６４０．６）の２つのセットによって示される。Ｆ−型イオン（ｍ／ｚ  ５７０）は、アンテナ−フコシル化を裏付け、Ｇａｌ−Ｆｕｃ  イオン（ｍ／ｚ  ３２５）の不存在は、ルイス  Ｘ  エピトープを形成しているＧｌｃＮＡｃ上のフコース置換を示す。Ｅ  イオン（ｍ／ｚ  ９７７）は、当該アンテナ−フコースが３−アンテナ上で置換されていることを示す。（ｆ）テトラ−アンテナ  グリカン  Ｇａｌ４ＧｌｃＮＡｃ６Ｍａｎ３（Ａ４Ｇ４）。分枝は、Ｅ（ｍ／ｚ  ８３１）およびＤ／［Ｄ−１８］−／［Ｄ−３６］−  イオン（それぞれ、ｍ／ｚ  １０５３、１０３５および１０１７）によって示される。
【図３】正常な患者（ａ）および８日目の敗血症の患者（ｂ）および膵炎の患者（ｃ）の血清からの脱シアル化グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量スペクトルを示す。スペクトルは平坦にされ（Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ  ２×２）、ピークを表２に記載されたピークの質量で表示した。
【図４Ａ】トリシアル酸付加されたＡ３Ｇ３Ｓ３およびＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆの構造における変化を示す。Ｎ−結合型グリカンは、血清タンパク質から遊離し、シアル酸の数に従って、ＷＡＸ−ＨＰＬＣによって分離される。トリシアル酸付加された分画は回収され、物質および方法の項で記載されるように、ＮＰ−ＨＰＬＣによって分析される。パネルＡ  −  １日目（Ｓ１）の敗血症および８日目（Ｓ８）の当該疾病の患者、疾病の１日目（Ｐ１）の膵炎および８日目（Ｐ８）の当該疾病の患者ならびに対照血清（Ｃ）のトリシアル酸付加された分画のＮＰ−ＨＰＬＣ  プロファイル。
【図４Ｂ】トリシアル酸付加されたＡ３Ｇ３Ｓ３およびＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆの構造における変化を示す。Ｎ−結合型グリカンは、血清タンパク質から遊離し、シアル酸の数に従って、ＷＡＸ−ＨＰＬＣによって分離される。トリシアル酸付加された分画は回収され、物質および方法の項で記載されるように、ＮＰ−ＨＰＬＣによって分析される。パネルＢ  −  敗血症および膵炎の最初の８日間のＡ３Ｇ３Ｓ３およびＡ３Ｇ３Ｓ３Ｆの構造の変化。
【図５】テトラシアル酸付加された構造における変化を示す。Ｎ−結合型グリカンは、血清タンパク質から遊離し、シアル酸の数に従って、ＷＡＸ−ＨＰＬＣによって分離される。テトラシアル酸付加された分画は回収され、物質および方法の項で記載されるように、ＮＰ−ＨＰＬＣによって分析される。１日目（Ｓ１）の敗血症および８日目（Ｓ８）の当該疾病の患者、１日目（Ｐ１）の膵炎および８日目（Ｐ８）の当該疾病の患者ならびに対照血清（Ｃ）のテトラシアル酸付加されたグリカン分画のプロファイルが示される。
【図６Ａ】オリゴマンノース構造における変化を示す。Ｎ−結合型グリカンは、血清タンパク質から遊離し、ＷＡＸ−ＨＰＬＣによって分離される。中性分画は回収され、物質および方法の項で記載されるように、ＮＰ−ＨＰＬＣによって分析される。パネルＡ  −  １日目（Ｓ１）の敗血症および８日目（Ｓ８）の当該疾病の患者、１日目（Ｐ１）の膵炎および８日目（Ｐ８）の当該疾病の患者および対照血清（Ｃ）の中性グリカン分画のプロファイルが示される。主要なオリゴマンノース構造（Ｍａｎ６、Ｍａｎ７およびＭａｎ８）を含むピークが示される。Ｍａｎ５を含むピークはまた、タチナタマメ  マンノシダーゼ消化に対して部分的に抵抗性であるため、ＦｃＡ２Ｂも含んでいた（データは示していない）。
【図６Ｂ】オリゴマンノース構造における変化を示す。Ｎ−結合型グリカンは、血清タンパク質から遊離し、ＷＡＸ−ＨＰＬＣによって分離される。中性分画は回収され、物質および方法の項で記載されるように、ＮＰ−ＨＰＬＣによって分析される。パネルＢ  −  敗血症の１日目（Ｓ１）および８日目（Ｓ８）、ならびに膵炎の１日目（Ｐ１）および８日目（Ｐ８）の間の、オリゴマンノースの構造における変化。マンノース構造は、中性グリカンの％として与えられる。
【図７Ａ】分枝の程度の変化。Ｎ−結合型グリカンは、血清タンパク質から遊離し、アルスロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）からのシアリダーゼ（ＡＢＳ）、肺炎球菌からのβ−ガラクトシダーゼ（ＳＰＧ）、およびウシ腎臓からのα−フコシダーゼ（ＢＫＦ）の組み合わせで処理され、これにより、グリカンが塩基性のモノアンテナ、ビアンテナ、トリアンテナおよびテトラアンテナの構造に還元される。パネルＡ  −  ＡＢＳ＋ＳＰＧ＋ＢＫＦ消化後のグリカンプールのＮＰ−ＨＰＬＣプロファイル。主要なコアグリカンの構造は、それらの対応するピークが上記に示される。
【図７Ｂ】分枝の程度の変化。Ｎ−結合型グリカンは、血清タンパク質から遊離し、アルスロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）からのシアリダーゼ（ＡＢＳ）、肺炎球菌からのβ−ガラクトシダーゼ（ＳＰＧ）、およびウシ腎臓からのα−フコシダーゼ（ＢＫＦ）の組み合わせで処理され、これにより、グリカンが塩基性のモノアンテナ、ビアンテナ、トリアンテナおよびテトラアンテナの構造に還元される。パネルＢ  −  敗血症の１日目（Ｓ１）および８日目（Ｓ８）、ならびに膵炎の１日目（Ｐ１）および８日目（Ｐ８）の間の分枝の程度の変化は、全コア構造のうちの割合として示される。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本願明細書で使用される「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子もしくは免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にまたは部分的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常部遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変部遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これは、次に、免疫グロブリンのクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）を定める。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーは、２つの同一の対のポリペプチド鎖からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変部を定める。用語、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼでの消化によって産生されたいくつかのよく特徴付けられた断片として存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド連鎖下の抗体を消化し、Ｆ（ａｂ）’２（それ自身がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合される軽鎖であるＦａｂのダイマー）を産生する。当該Ｆ（ａｂ）’２は、緩やかな条件下で還元されてもよく、ヒンジ領域中のジスルフィド連鎖を壊し、それによって（Ｆａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換する。当該Ｆａｂ’モノマーは、実質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、編集、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９９）を他の抗体断片のより詳細な説明のために参照）。様々な抗体断片は、インタクトな抗体の消化の面から定められる一方、当業者は、このようなＦａｂ’断片は、化学的に、または組み換えＤＮＡ法の使用によって新規に合成されてもよいことを認識するだろう。従って、本願明細書で使用される用語、抗体は、全抗体の修飾によって産生されるか、もしくは、組み換えＤＮＡ法を使用して新規に合成された抗体または断片を含む。抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに複鎖抗体または単鎖抗体、（（直接的に、またはペプチドリンカーを通じて）可変重鎖および可変軽鎖が共に結合され、連続的なポリペプチド、およびヒト化抗体またはキメラ抗体を形成する単鎖Ｆｖ（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）抗体を含む）が挙げられる。
【００９１】
抗体、例えば、本発明のグリカンマーカーを有するポリペプチドに特異的な抗体は、当該技術分野で周知の方法によって産生することができる。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生された断片を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９２】
ポリペプチドは、抗体産生のために生物学的活性を必要としない。しかし、当該ポリペプチドまたはオリゴペプチドは抗原性である。特異的な抗体を誘導するために使用されるペプチドは、典型的に、少なくとも約５のアミノ酸、しばしば少なくとも１０または２０のアミノ酸のアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの短いストレッチは、任意に、別のタンパク質（キーホールリンペットヘモシアニン、および融合タンパク質またはポリペプチドに対して産生された抗体など）と融合できる。
【００９３】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する多数の方法は、当業者に知られており、本発明のマーカーを有するポリペプチドに特異的な抗体を産生するように適合できる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ニューヨーク州；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州；Ｓｔｉｔｅｓら（編集）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州、ロスアルトス、およびこれに引用される参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、ニューヨーク；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、例えば、第４版（または後の版）、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ（編集）、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州（１９９８）；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７、を参照。抗体調製のための他の適した技術としては、ファージまたは同様のベクターの組み換え抗体のライブラリーの選択が挙げられる。Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照。抗体産生および工学技術についてのさらなる詳細は、米国特許第５，４８２，８５６号明細書、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編集）（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク州（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、英国、オックスフォード（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）、Ｐａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｗａｔａ、ニュージャージー州（Ｐａｕｌ）、Ｏｓｔｂｅｒｇら（１９８３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７、Ｏｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号明細書、およびＥｎｇｅｌｍａｎら  米国特許第４，６３４，６６６号明細書において見出すことができる。特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体および抗血清は、通常、少なくとも約０．１μＭ、好ましくは、少なくとも約０．０１μＭまたはそれ以上、最も典型的に、かつ好ましくは、０．００１μＭまたはそれ以上のＫＤで結合する。
【００９４】
（分子生物学的技術）
本発明の実行においては、分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術における多くの従来技術が任意に使用される。これらの技術は、周知であり、例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州、サンディエゴ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、第１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、２０００、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社と、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社との間のジョイントベンチャー（２００７年に補遣された）において説明されている。例えば、細胞単離および培養のための他の有用な参考文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク州、およびそれに引用される参考文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社  ニューヨーク州、ニューヨーク；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編集）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ベルリン  ハイデルベルグ  ニューヨーク）、ならびにＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編集）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州、ボーカラトーン、が挙げられる。核酸の作製方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増幅、細胞からの精製、または化学合成による）、核酸の操作方法（例えば、制限酵素消化、ライゲーションなどによる部位特異的な変異原性）、および核酸の操作および作製に有用な様々なベクター、細胞株などは、上記の参考文献に記載される。さらに、基本的にいずれのポリヌクレオチドも、いずれかの様々な市販の供給源から特別注文することができ、または標準的な注文をすることができる。
【００９５】
本願明細書に記載された他の参考文献に加えて、様々な精製方法／タンパク質精製方法が当該技術分野で周知であり、例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社  ニューヨーク州（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク州；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州；ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（オックスフォード）、英国、オックスフォード；ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（オックスフォード）、英国、オックスフォード；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  第３版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州；ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ニューヨーク州；ならびにＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州；ならびにこれらに引用された参考文献に記載されたものが挙げられる。
【実施例】
【００９６】
本願明細書に記載された実施例および実施態様は、説明目的のみのためのものであり、これらを考慮した様々な改変または変化は、当業者に示唆を与え、本願の趣旨および範囲、ならびに添付の請求項の範囲内に含まれることが理解されるだろう。従って、下記の実施例は、請求項記載の発明を説明するために提供され、これを制限するものではない。
【００９７】
（物質および方法）
（血清試料）
血清試料は、ザグレブ大学病院で集めた。敗血症の患者および急性膵炎の患者からの血清は、病院への報告時、次いで、入院の最初の８日の間にさらに３回採取した。患者に、気分が悪くなった最初の日に病院に報告するように要求し、そして、この日を疾病の最初の日であると仮定した。健康な個体からの血液（性別および年齢によってマッチさせた）は、１回のみ採取した。対照被験者におけるいずれかの炎症性の症状の可能性は、Ｃ−反応性タンパク質を測定することによってさらに除いた（ＣＲＰは０．５ｍｇ／ｄＬよりも低かった）。登録された患者は、敗血症または急性膵炎の臨床基準を満たし、かつ、参加するためにインフォームドコンセントに署名した個体である。この研究は１９７５年ヘルシンキ宣言の倫理指針に適合させ、ザグレブ大学病院センターならびにザグレブ大学  薬学および生化学部の機関審査委員会によって承認された。
【００９８】
（グリカン遊離および標識）
１０μＬの血清から得たＮ−グリカンを、以前に記載されたように（Ｒｏｙｌｅら、論文投稿中）分析した。手短に言うと、血清から得た当該タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのブロックに固定化し、Ｎ−グリカンを、組み換え  Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ロシュ・ダイアグノスティックス）による消化によって遊離させた。抽出後、グリカンを２−アミノベンズアミド（ＬｕｄｇｅｒＴａｇ  ２−ＡＢ  標識キット  Ｌｕｄｇｅｒ社、英国、アビンドン）で蛍光標識した。
【００９９】
（順相（ＮＰ）−ＨＰＬＣ）
次いで、遊離したグリカンを、３０℃で、５０ｍＭ  ギ酸（アンモニア溶液を用いてｐＨ４．４にまで調整した）を溶剤Ａとして、かつ、アセトニトリルを溶剤Ｂとして、ＴＳＫ  アミド−８０  ２５０×４．６ｍｍ  カラム（Ａｎａｃｈｅｍ、英国、ルートン）上の順相高速液体クロマトグラフィー（ＮＰ−ＨＰＬＣ）にかけた。２６９５  アライアンス  セパレーション  モジュール（ウォーターズ、マサチューセッツ州、ミルフォード）上で１８０および１２０分稼動させた。ＨＰＬＣには、ウォーターズ  温度制御モジュールおよびウォーターズ  ２４７５  蛍光検出器（励起波長および発光波長は、３３０および４２０ｎｍに設定した）を備えた。当該システムを、加水分解され、かつ、２−ＡＢ標識されたグルコースオリゴマーの外部標準を使用して較正し、個々のグリカンの保持時間をグルコース単位（ＧＵ）に変換した（Ｒｏｙｌｅ、Ｌ．、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ、Ｃ．Ｍ．ら  ２００６）。グリカンを、その溶出位置に基づいて分析し、グルコース単位で測定し、次いで、仮構造の帰属について、「Ｇｌｙｃｏｂａｓｅ」データベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｌｙｃｏｂａｓｅ．ｕｃｄ．ｉｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｌｙｃｏｂａｓｅ．ｃｇｉで利用できる）の基準値と比較した（Ｒｏｙｌｅらによる投稿）。
【０１００】
（弱陰イオン交換（ＷＡＸ）−ＨＰＬＣ）
グリカンは、弱陰イオン交換  ＨＰＬＣによって、シアル酸の数に従って分離した。分析をＶｙｄａｃ  ３０１ＶＨＰ５７５  ７．５×５０−ｍｍカラム（Ａｎａｃｈｅｍ社、英国、ベッドフォードシャー州、ルートン）を使用して行った（Ｒｏｙｌｅ、Ｌ．、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ、Ｃ．Ｍ．ら  ２００６）。化合物を、その電荷密度に従ってカラム上に保持し、より高電荷の化合物は最も長く保持された。分離された分画を回収し、ＮＰ−ＨＰＬＣにかけた。
【０１０１】
（エキソグリコシダーゼ消化）
グリカン（総グリカンプールおよびＷＡＸで分離された分画から得たものの両方）を、エキソグリコシダーゼ消化、次いでＮＰ−ＨＰＬＣによって配列決定した（Ｒｏｙｌｅ、Ｌ．、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ、Ｃ．Ｍ．ら  ２００６）。２−ＡＢ標識されたグリカンのエキソグリコシダーゼ消化は、プロザイム（米国、カリフォルニア州、サンリアンドロ）から入手した下記の酵素によって行った：α２−３，６，８  シアル酸特異的なＡＢＳ（アルスロバクター  ウレアファシエンス  シアリダーゼ（グリコ（Ｇｌｙｋｏ）シアリダーゼ  Ａ））；ＮＡＮ１（肺炎球菌ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ  Ｓ））はα２−３，８  結合型シアル酸を放出する）；ＢＴＧ（β１−３，４および６結合型  ガラクトース特異的なウシ精巣  β−ガラクトシダーゼ）；ＳＰＧ（β１−４−結合型  ガラクトース特異的な肺炎球菌  β−ガラクトシダーゼ）；ＢＫＦ（ウシ腎臓  α−フコシダーゼ）はα１−２，６−フコースを３，４−フコースをよりもはるかに多く消化する；ＧＵＨ（β−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ）はＮ−アセチルグルコサミンを消化する（しかし二分したものは消化しない）；ＪＢＭ（タチナタマメ  α−マンノシダーゼ）、ＡＭＦ（アーモンドミール  α−フコシダーゼ）はα１−３／４−フコースを除去する；ＸＭＦ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｕｓ  ｓｐ．α１−２−フコシダーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ（英国、ハーツ州、ヒッチン）。試料を、一晩、３７℃で、５０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ  ５．５中で（ただし、ＪＢＭ消化は１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｚｎ２＋、ｐＨ  ５．０中で）インキュベーションした。
【０１０２】
（質量分析）
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量分析）
遅延引き出し（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）でのリフレクトロンモードで操作されたウォーターズ−マイクロマス（英国、マンチェスター）ＴｏｆＳｐｅｃ  ２Ｅ  リフレクトロン−ＴＯＦ  質量分析上の、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）による分析（Ｈａｒｖｅｙ、Ｄ．Ｊ．１９９３）の前に、脱シアル化グリカン試料（１μＬの水溶液）を、ナフィオン  １１７  メンブレンで浄化した（Ｂｏｅｒｎｓｅｎ、Ｋ．Ｏ．、Ｍｏｈｒ、Ｍ．Ｄ．、Ｗｉｄｍｅｒ、Ｈ．Ｍ．１９９５）。
【０１０３】
（ナノエレクトロスプレー質量分析）
ナノエレクトロスプレー質量分析を、ウォーターズ−マイクロマス  四重極飛行時間型（Ｑ−Ｔｏｆ）ウルティマ  グローバル  インスツルメント（Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｌｏｂａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で行った。非２ＡＢ標識のグリカンの試料（０．５ｍＭ  リン酸アンモニウムを含む１：１（体積：体積）メタノール：水中）を、Ｐｒｏｘｅｏｎ（Ｐｒｏｘｅｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、デンマーク、オーデンセ）ナノスプレー  キャピラリーを通じて注入した（Ｈａｒｖｅｙ、Ｄ．Ｊ．、２００５において詳述される）。
【０１０４】
（結果）
敗血症または急性膵炎の患者の血清糖タンパク質からの主要なＮ−結合型グリカン構造を同定し、疾病の最初の８日間で定量化し、正常な血清糖タンパク質上に存在するグリカンと比較した。
【０１０５】
（全血清のグリカンプロファイル）
Ｎ−結合型グリカンは、敗血症の患者および急性膵炎の患者から経時的に採取された血清、ならびに健康な個体から得た血清から遊離した。疾病の最初の８日の間の患者のＮＰ−ＨＰＬＣ  プロファイル、および健康な個体からのグリカンプロファイルを、図１に示した。各ピーク中のグリカンの構造は、エキソグリコシダーゼ消化、クロマトグラフィー（ＮＰ−ＨＰＬＣおよびＷＡＸ−ＨＰＬＣ）および質量分析技術の組み合わせによって同定した。ＮＰ−ＨＰＬＣおよびＷＡＸ−ＨＰＬＣと、エキソグリコシダーゼ消化との組み合わせにより、インタクトな（シアル酸付加された）化合物（未消化のプロファイルに共溶出するものを含む）の同定および定量化が可能となった。クロマトグラフィーデータにおける構造の定量化は、全ての統合されたピークのうちの％として表現した。質量分析技術（脱シアル化された未標識のグリカン上で行った）は、クロマトグラフィーデータを補完し、三分岐グリカンの分枝様式などの詳細を与えた（詳細は、図２についての説明文を参照）。ＨＰＬＣ  プロファイルの主要なピーク中のグリカン（記載された全ての技術の組み合わせによって同定した）を、相対的な割合と共に表１に記載した。これらの構造は、健康な個体について既に報告されたもの（Ｒｏｙｌｅら、投稿中）と一致している。
【０１０６】
【表１】
2010540953.tif 000003
2010540953.tif 000004
2010540953.tif 000005
【０１０７】
血清から遊離された未処置のグリカンプール中に存在する主要なグリカン構造（ｆ＝発見されたが、しかし、非常に少量であるか、または他のピークと区別できない（正確な面積値））。
【０１０８】
表２は、ＭＳ技術によって同定されたグリカンの構造を記載し、図３は、対照患者と比較した脱シアル化グリカンのＭＡＬＤＩ  プロファイル（疾病の８日目に採取した）を示す。
【０１０９】
【表２】
2010540953.tif 000006
2010540953.tif 000007
2010540953.tif 000008
【０１１０】
測定された質量は、ＥＳＩ  スペクトルについて０．１質量単位以内、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦについて０．３質量単位以内だった。グリカン構造の記号表現は：ＧｌｃＮＡｃ、黒色の四角；ガラクトース、白色の菱形；フコース、内側に点がある菱形；シアル酸、黒色の星；β連鎖、実線；α連鎖、点線；１−６連鎖、＼；１−４連鎖、−；１−３連鎖、／；１−２連鎖、｜（ａ．平均質量；ｂ．α１−酸性糖タンパク質の公知の構造に基づく３−アンテナ上のフコースの位置）。
【０１１１】
急性膵炎および敗血症の患者からのグリカンプロファイルの分析により、健康なプロファイルからのいくつかの偏位、および疾病の経過の間に生じた変化が同定された。両方の症状の最初の８日間の、最も明白かつ持続性の変化は、ピーク番号  ２０〜２６（図１）における変化であり、シアリルルイスｘの有無に関わらず、トリシアル酸付加された構造、およびテトラシアル酸付加された構造であるものとして同定された。
【０１１２】
（シアリルルイスＸ  構造における変化）
グリカンプロファイル中のトリシアル酸付加された構造における変化は、調査期間中ずっと、両方の疾病において持続した。ＷＡＸ−ＨＰＬＣによって単離されたトリシアル酸付加されたグリカンのＮＰ−ＨＰＬＣ  分析（図４）は、トリシアル酸付加されたグリカン  Ａ３Ｇ３Ｓ３の量が、フコシル化されたＡ３ＦＧ３Ｓ３（シアリルルイスＸ）の量に対して、調査期間の間、特に敗血症において減少したことを示した。非フコシル化形態は、敗血症において、総グリカンプール中で５．４から３．４％に減少し、膵炎では、これは６．５から５．５％に減少し、一方、健康な対照では、この分画は総グリカンプールのうち８％を示した。フコシル化されたシアリルルイスＸ形態は、敗血症において、６．６から６．８％に増加し、一方、膵炎では、この増加は、総グリカンプール中６．０から９．７％となって、対照における６％と比較してより明白である（表１参照）。
【０１１３】
ＨＰＬＣおよびエキソグリコシダーゼ配列決定は、アーモンドミール  α−フコシダーゼ（ＡＭＦ）で消化されたＡ３ＦＧ３Ｓ３構造は、ＧｌｃＮＡｃに結合したフコース  α１−３またはα１−４を除去し、このＧｌｃＮＡｃ上のガラクトースはβ１−４  ガラクトシダーゼによって除去されることを示し、これは、ルイス  Ａ  構造というよりも、むしろルイス  Ｘ  構造であることを示している。外腕のフコシル化はまた、脱シアル化されたモノフコシル化三分岐グリカン上の陰イオン  ＭＳ／ＭＳ  分析によって（図２ｅ）見出された。非コアフコースの位置は、ＭＳ／ＭＳ  分析中のＧａｌ−Ｆｕｃに対応するＣ１イオンの不存在によって、ＧｌｃＮＡｃ残基上に示された。
【０１１４】
陰イオン  ＭＳ／ＭＳは、両方のコアおよび外腕がフコシル化された構造の存在を示した。アンテナ−モノ−フコシル化三分岐グリカンに対するコアの相対的な割合は、陰イオン  ＭＳ／ＭＳ  スペクトルにおける２，４ＡＲ  イオンの割合によって測定されたように、対照試料の３４％のアンテナおよび６６％のコアであり、一方、敗血症（１日目および８日目）の試料では、アンテナ−フコシル化グリカンの量は、その２つの日についてそれぞれ５２％および６３％に増加した。膵炎では、コアがフコシル化された三分岐グリカンに対するアンテナ−フコシル化三分岐グリカンの相対的な量は、２日目に７８％まで増加し、８日目に８５％まで増加した。これは、両方の疾病において、コアがフコシル化された構造に対して、ルイスＸ構造における明確な増加を示す。
【０１１５】
（テトラシアル酸付加された構造における変化）
図１に示されたＨＰＬＣ  プロファイルから、対照プロファイルと比較して、テトラシアル酸付加された構造が増加しており、総グリカンプールにおけるこれらの構造の量が両方の疾病の経過の間に変化したことが明らかである。認められた変化を、非フコシル化構造に対する外腕がフコシル化された構造の増加を明らかにしたＷＡＸ  ＨＰＬＣから得られたテトラシアル酸付加された分画のＮＰ−ＨＰＬＣ分析によってさらに分析した（図５）。
【０１１６】
脱シアル化モノフコシル化テトラ−アンテナの陰イオン  ＭＳ／ＭＳは、１日目の敗血症試料（７５％）および８日目（８６％）ならびに両方の膵炎試料（９２％）と比較して、対照試料においてフコースのうち５４％は外腕であることを示した。これはまた、疾病の経過の間の、テトラ−アンテナ構造上のルイスＸ構造への移行を示唆している。ジ−シアル酸付加されたビアンテナ構造上の外腕フコシル化の存在は、その低い存在量により、定量的に測定することが困難であった。しかし、ジシアル酸付加された試料の陰イオン  ＭＳ／ＭＳ（２，４ＡＲ  イオンの比率）分析により、対照および敗血症（１日目）の試料（約２％のフコシル化ビアンテナ構造）に存在する微量の外腕−フコシル化二分岐型グリカンを検出し、これは８日目の敗血症で約７％まで増加した。膵炎試料におけるアンテナ−フコシル化二分岐型グリカンの量は、いくらか高いように見え、２日目および８日目で約１０％に達した。断片化のパターンは、フコースが、６−アンテナにおいて主に置換されることを示した（Ｄおよび［Ｄ−１８］−イオン中の移動）。
【０１１７】
（総フコースにおける変化）
疾病の経過を通してのフコースレベルの変化はまた、発明者らが総グリカンプールのエキソグリコシダーゼ消化（ＡＢＳ＋ＳＰＧ）または（ＡＢＳ＋ＳＰＧ＋ＡＭＦ）後に全てのフコース含有グリカンを分析した際に見られた。両方の症状は、外腕フコシル化の増加（１日目と８日目との間で、敗血症では約５０％の相違、膵炎では約３０％の増加）を示したが、一方、コアのフコシル化は両方の症状で減少した（約１５％）。
【０１１８】
（オリゴマンノース構造における変化）
中性画分（ＷＡＸ  ＨＰＬＣによって調製した）のＮＰ−ＨＰＬＣ  プロファイルは、タチナタマメ  マンノシダーゼ（ＪＢＭ）の消化によって、オリゴマンノース構造（ピーク  Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８およびＭａｎ９）であるとして同定されたピークを示した。これらのマンノース構造の相対的な量は、疾病の１日目と８日目との間で変化し、対照血清との比較においても変化した（図６）。Ｍａｎ５と共溶出したピーク中のＦＡ２Ｂの量は、マンノースのピーク間の比較を計測（図６Ｂ）する前に引き算した。
【０１１９】
（分枝の程度の変化）
分枝の程度は、グリカンプールを、アルスロバクター  ウレアファシエンスから得たシアリダーゼ（ＡＢＳ）、肺炎球菌から得たβ−ガラクトシダーゼ（ＳＰＧ）、およびウシ腎臓から得たα−フコシダーゼ（ＢＫＦ）との組み合わせで処理した後に判定したところ、グリカンはコアアンテナ構造に還元されていた（ＧｌｃＮＡｃは、トリマンノシルキトビオースコア  モノアンテナ、ビアンテナ、トリアンテナおよびテトラアンテナ構造にのみに結合する）。図７Ａに示されるように、膵炎および敗血症の分枝の程度は、対照血清と異なり、また、疾病の経過の間に変化した。
【０１２０】
（他のグリカン）
対照試料および敗血症試料はまた、陰イオン  ＭＳ／ＭＳによって検出されるようにＮ−アセチル−ラクトサミン伸張を有する低いレベルのグリカンを含んでいた。そのスペクトルは、非常に大量のＦ型イオン（ｍ／ｚ  ７８９）を含んでおり、アンテナ構造をＨｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２として確認した。このイオンの高い相対的存在量は、６−アンテナの６−分枝上のＮ−アセチル−ラクトサミン置換と一致している（参考文献  Ｄａｖｉｄｓの論文）。１日目および８日目の敗血症の両方は、さらなるフコースと共に、さらなるＮ−アセチル−ラクトサミン−伸張  グリカンを有していた。１日目のスペクトルは弱かったが、８日目のものは、フコシル化された構造のうち８０％がアンテナのうちの１つにおける外腕−フコース置換を有することを示し、ｍ／ｚ  ９３５でのＦ  イオン（ｍ／ｚ  ７８９＋１４６）は、このフコースの少なくともいくつかが、Ｎ−アセチル−ラクトサミン−伸張  アンテナ上に位置していることを示した。この化合物は、早期の膵炎の試料中では検出されなかったが、８日目には存在した。
【０１２１】
（考察）
当該結果は、血清グリカンの変化が急性炎症の非常に早期に生じることを示している。異なるグリカンの割合は、毎日変化した。それらのうちいくつかは、連続的に同じ方向性であったが、一方、他は急性膵炎および敗血症の経過の間に変化した。疾病進行に一貫して伴う最も顕著な変化は、トリシアル酸付加された構造およびテトラシアル酸付加された構造ならびにオリゴマンノース構造について認められた。
【０１２２】
これらの構造はまた、膵炎および敗血症の両方の１日目で変化することが見出された（対照血清と比較した場合）。
【０１２３】
敗血症では、総グリカンプール中のトリシアル酸付加された三分岐  Ａ３Ｇ３Ｓ３の割合は、常に減少したが、一方、膵炎では、シアリルルイスＸ  構造  Ａ３ＦＧ３Ｓ３の割合は、常に増加した。急性期タンパク質  α１−酸性糖タンパク質は、急性期反応の早期に上昇し、このルイス抗原の主要な担体として認識されている（Ｂｒｉｎｋｍａｎ−ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ、Ｅ．Ｃ．、ｄｅ  Ｈａａｎ、Ｐ．Ｆ．ら  １９９８）。ハプトグロビンおよびα１−アンチキモトリプシンもまた、シアリルルイスＸの上昇に寄与することが見出されたが、より少ない程度だった。早期の研究はまた、α１−酸性糖タンパク質の濃度の増加に依存しない、炎症によって引き起こされた、α１−酸性糖タンパク質上のシアリルルイスＸの発現の上昇を報告した（Ｈｉｇａｉ、Ｋ．、Ａｏｋｉ、Ｙ．ら  ２００５）。悪性の疾病においても同様の観測がなされた（Ｃｒｏｃｅ、Ｍ．Ｖ．、Ｓａｌｉｃｅ、Ｖ．Ｃ．ら  ２００５）。この増加は、炎症の間に生じる可能性があり、致死的である可能性がある過剰反応から生物を保護することによる、有益な効果を有するかも知れないことが推定される（Ｂｏｎｅ、Ｒ．Ｃ．１９９６）。Ａ３Ｇ３Ｓ３へのフコースの付与に関与する酵素はα１−３  フコシル基転移酵素であるため、この酵素のレベルは重大である。α１−酸性糖タンパク質についての研究は、炎症性サイトカインが、肝臓組織におけるα１−３  フコシル化に関与するα１−３  フコシル基転移酵素  ＶＩの発現（Ｄｅ  Ｇｒａａｆ、Ｔ．Ｗ．、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｌｔ、Ｍ．Ｅ．ら  １９９３、Ｈｉｇａｉ、Ｋ．、Ａｏｋｉ、Ｙ．ら  ２００５）、およびシアリルルイスＸ形成に必要とされるα２−３  シアル酸転移酵素の発現を制御することを示唆していた（α２−３−結合型  Ｎｅｕ５Ａｃを含む構造のみがフコシル化され得るため）。敗血症性ショックにおけるα１−酸性糖タンパク質  グリコシル化の予後値についての研究（Ｂｒｉｎｋｍａｎ−ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ、Ｅ．Ｃ．、ｖａｎ  Ｏｍｍｅｎ、Ｅ．Ｃ．ら  １９９６）は、二分岐型グリカンの適度な上昇と、シアリルルイスＸの強力な増加との組み合わせは、徐々に増加しているシアリルルイスＸ発現を伴うビアンテナの高い一過性の増加よりも高い死亡率に関連することを示した。これは、グリカン構造の変化の様式は、疾病の重症度に関連する可能性があることを明確に示している。
【０１２４】
オリゴマンノース構造の量は、急性膵炎の進行と共に常に減少することが見出され、一方、敗血症では、これは日々を通してわずかに変化した。しかし、両方の疾病では、これらの構造は、１日目に顕著に増加し（対照と比較した場合）、次いで、８日目に減少した（Ｍａｎ６およびＭａｎ９は、対照レベル未満まで低下した）。グリカン構造のこれらの型は、補完物のＣ３因子上で見出すことができ（Ｈｉｒａｎｉ、Ｓ．、Ｌａｍｂｒｉｓ、Ｊ．Ｄ．、ら  １９８６）これはまた、陽性の急性期タンパク質の１つである。補完経路は、免疫系の生化学的カスケードを形成する多くの小さな血漿タンパク質から派生する。これは、感染性微生物および損傷した宿主物質を破壊するように作られている（Ｒｉｔｃｈｉｅ、Ｇ．Ｅ．、Ｍｏｆｆａｔｔ、Ｂ．Ｅ．ら  ２００２）。複雑なビアンテナ構造を有する、主に肝臓で合成される成分の大部分と対照的に、Ｃ３は、オリゴマンノース型のみ（Ｈａｓｅ、Ｓ．、Ｋｉｋｕｃｈｉ、Ｎ．ら  １９８５、Ｈｉｒａｎｉ、Ｓ．、Ｌａｍｂｒｉｓ、Ｊ．Ｄ．ら  １９８６）を、α鎖上の主にＭａｎ８およびＭａｎ９、ならびにβ鎖上のＭａｎ６と共に含む。
【０１２５】
二分岐型グリカンの増加は、急性および慢性の炎症性の症状を有する患者ならびに癌について報告されている（Ｈｉｇａｉ、Ｋ．、Ａｏｋｉ、Ｙ．ら  ２００５）。これらの化合物はまた、特に、急性反応の後期に上昇した。急性膵炎では、二分しているＧｌｃＮＡｃを有する二分岐型グリカンは、対照と比較して、顕著に上昇した。テトラアンテナ構造は、両方の疾病において上昇した（この上昇は膵炎においてより顕著であったが）。Ｎ−グリカン上のアンテナの合成に関与する酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ）である。ＧｎＴ  ＩＩＩは、二分しているβ１→４−ＧｌｃＮＡｃ構造を形成する、Ｎ−グリカンのコア中のマンノースの４−位置への、β−ＧｌｃＮＡｃの付加に関与する酵素である。ＧｎＴ  ＩＶは、トリ−マンノシル−キトビオースコアの３−アンテナへの、β１→４ＧｌｃＮＡｃの付加による三分岐構造の形成に関与し、一方、テトラアンテナグリカンは、この酵素、および６−アンテナのマンノースの６−位置にβ−ＧｌｃＮＡｃを付加するＧｎＴ  Ｖによる引き続く作用によって産生される（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ、Ｉ．、Ｈｕｌｌ、Ｅ．ら  １９８９）。これらの酵素の増加した活性は、多くのヒト悪性腫瘍において報告されている（Ｄｅｎｎｉｓ、Ｊ．Ｗ．およびＬａｆｅｒｔｅ、Ｓ．１９８９、Ｇｕｏ、Ｊ．Ｍ．、Ｚｈａｎｇ、Ｘ．Ｙ．ら  ２００１、Ｊｉｎ、Ｘ．Ｌ．、Ｌｉｕ、Ｈ．Ｂ．ら  ２００４、Ｔａｋａｍａｔｓｕ、Ｓ．、Ｏｇｕｒｉ、Ｓ．ら  １９９９、Ｙａｏ、Ｍ．、Ｚｈｏｕ、Ｄ．Ｐ．ら  １９９８）。当該結果は、急性期反応（特に膵炎）におけるこれらの酵素の活性の増加を示唆している。分枝６−アンテナを有する三分岐グリカンのアイソフォームは、敗血症および膵炎の両方で、かなりの割合の三分岐構造を示し、一方、正常な血清では、この構造の量はほとんど無視できる（表２）。
【０１２６】
トリ−アンテナ構造およびテトラ−アンテナ構造の比較は、コアがフコシル化された形態または非フコシル化形態に対するα１−３−フコシル化形態の比率は、膵炎および敗血症の両方で増加したことを明らかにした。コアのフコシル化のこの変化は、異なるヒトの癌における発見（Ｂｌｏｃｋ、Ｔ．Ｍ．、Ｃｏｍｕｎａｌｅ、Ｍ．Ａ．ら  ２００５、Ｉｔｏ、Ｙ．、Ｍｉｙａｕｃｈｉ、Ａ．ら  ２００３）、および膵臓癌における発見（Ｂａｒｒａｂｅｓ、Ｓ．、Ｐａｇｅｓ−Ｐｏｎｓ、Ｌ．ら  ２００７）とは異なり、コアのフコシル化の増加が認められ、新規な診断および予後診断のマーカーとして示唆さえもした。フコースレベルのこれらの変化は、これが免疫調節に関与することを示唆しているため、炎症の間の制御工程の一部である可能性がある（Ｂｏｎｅ、Ｒ．Ｃ．１９９６）（Ｌｉｓｔｉｎｓｋｙ、Ｊ．Ｊ．、Ｌｉｓｔｉｎｓｋｙ、Ｃ．Ｍ．ら  ２００１）。
【０１２７】
一般的に、当該結果は、血清グリカンの変化を急性炎症の非常に早期に認めることができ、異なる構造の割合は毎日変化することを示す。健康な血清のグリカンプロファイルは多かれ少なかれ一定であるため、これらの変化は、疾病を明白に反映する。敗血症と急性膵炎との間の認められた差は、恐らく、これらの２つの症状では、急性期反応は異なる刺激によって誘発され、従って、特定のサイトカインの生成の異なる様式に関連するという事実に起因する。この複雑性は、急性期反応がどれほど複雑かつ多様であり、多くの異なる工程においてグリカンがどれほど重要な役割を果たしているかを知れば、驚くことではない。
【０１２８】
本願明細書で言及された全ての記述は、参照により、本願明細書に組み込まれる。本発明の記載された実施態様についての様々な改変および変化は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載されているが、請求項記載の本発明は、このような特定の実施態様に過度に制限されるべきではないことが理解されるはずである。実際、当業者に明白な、本発明の実行について記載された方法の様々な改変は、本発明によって網羅されることが意図されている。
【０１２９】
（略称）
２−ＡＢ  −  ２−アミノベンズアミド；ＡＢＳ  −  アルスロバクター  ウレアファシエンスから得たシアリダーゼ；ＡＭＦ  −  アーモンドミール  α−フコシダーゼ；ＢＫＦ  −  ウシ腎臓から得たα−フコシダーゼ；ＢＴＧ  −  ウシ精巣から得たβ−ガラクトシダーゼ；ＣＲＰ  −  Ｃ−反応性タンパク質；ＤＨＢ  −  ジヒドロキシ安息香酸；ＥＳＩ  −  エレクトロスプレーイオン化；ＧｎＴ  −  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；ＧＵ  −  グルコース単位；ＧＵＨ  −  β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ；ＨＰＬＣ  −  高速液体クロマトグラフィー；ＪＢＭ  −  タチナタマメ  α−マンノシダーゼ；ＭＡＬＤＩ  −  マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法；ＭＳ  −  質量分析；ＮＡＮ１  −  肺炎球菌から得たノイラミニダーゼ；ＮＰ  −  順相；ＢＴＧ  −  ウシ精巣から得たβ−ガラクトシダーゼ；ＳＰＧ  −  肺炎球菌から得たβ−ガラクトシダーゼ；ＢＫＦ  −  ウシ腎臓から得たα−フコシダーゼ；ＧＵＨ  −  β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ；ＪＢＭ  −  タチナタマメ  α−マンノシダーゼ；ＡＭＦ  −  アーモンドミール  α−フコシダーゼ；ＰＮＧａｓｅ  Ｆ  −  Ｎ−グリコシダーゼ  Ｆ、ＱＴＯＦ−  四重極飛行時間；ＳＰＧ  −  肺炎球菌から得たβ−ガラクトシダーゼ；ＷＡＸ  −  弱陰イオン交換；ＸＭＦ  −  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｕｓ  ｓｐ．から得たα−フコシダーゼ。
【０１３０】
グリカン構造は、下記のように省略される：Ａｘ、トリマンノシルコア上のアンテナ（ＧｌｃＮＡｃ）の数；略称の開始におけるＦは、内部ＧｌｃＮＡｃに結合するコアフコース  α１−６を示す；Ｍｘ、コア  ＧｌｃＮＡｃ上のマンノースの数（ｘ）；Ｇｘ、アンテナ上のβ１−４結合型ガラクトースの数（ｘ）；Ｇ１［３］およびＧ１［６］は、ガラクトースが、α１−３またはα１−６  マンノースのアンテナ上にあることを示す；Ｆ（ｘ）、アンテナ  ＧｌｃＮＡｃにα１−３で結合したフコースの数（ｘ）；Ｌａｃ（ｘ）、ラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）伸張の数（ｘ）；Ｓｘ、ガラクトースに結合したシアル酸の数（ｘ）；Ｓの後の括弧内の３または６の数は、シアル酸がα２−３、α２−６連鎖にあるかどうかを示す。
【０１３１】
（参考文献）
Ｂａｒｒａｂｅｓ、Ｓ．ら（２００７）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１７、３８８−４００。
Ｂｌｏｃｋ、Ｔ．Ｍ．ら（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０２、７７９−７８４。
Ｂｏｎｄ、Ａ．ら（１９９７）Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ、１０、７７−８５。
Ｂｏｎｅ、Ｒ．Ｃ．（１９９６）Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、２４、１６３−１７２。
Ｂｏｅｒｎｓｅｎ、Ｋ．Ｏ．ら（１９９５）Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、９、１０３１−１０３４。
Ｂｒｉｎｋｍａｎ−ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎら（１９９８）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ、１５、１７７−１８２。
Ｂｒｉｎｋｍａｎ−ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ、Ｅ．Ｃ．ら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ、１３、２７−３１。
Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ、Ｉ．ら（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６４、１１２１１−１１２２１。
Ｃｒｏｃｅ、Ｍ．Ｖ．ら（２００５）Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ、２０、９１−９７。
Ｄｅ  Ｇｒａａｆ、Ｔ．Ｗ．ら（１９９３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１７７、６５７−６６６。
Ｄｅｎｎｉｓ、Ｊ．Ｗ．およびＬａｆｅｒｔｅ、Ｓ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４９、９４５−９５０。
Ｇａｂａｙ、Ｃ．およびＫｕｓｈｎｅｒ、Ｉ．（１９９９）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３４０、４４８−４５４。
Ｇｕｏ、Ｊ．Ｍ．ら（２００１）Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１２７、５１２−５１９。
Ｈａｒｖｅｙ、Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、７、６１４−６１９。
Ｈａｒｖｅｙ、Ｄ．Ｊ．（２００５）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１６、６２２−６３０（第１部）、６３１−６４６（第２部）および６４７−６５９（第３部）。
Ｈａｓｅ、Ｓ．ら（１９８５）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）、９８、８６３−８７４。
Ｈｉｇａｉ、Ｋ．ら（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１７２５、１２８−１３５。
Ｈｉｒａｎｉ、Ｓ．ら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、２３３、６１３−６１６。
Ｉｔｏ、Ｙ．ら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ、２００、１６７−１７２。
Ｊｉｎ、Ｘ．Ｌ．ら（２００４）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ、２０、３９９−４０６。
Ｌｉｓｔｉｎｓｋｙ、Ｊ．Ｊ．ら（２００１）Ａｄｖ  Ａｎａｔ  Ｐａｔｈｏｌ、８、３３０−３３７。
Ｌｏｗｅ、Ｊ．Ｂ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１５、５３１−５３８。
Ｐｉａｇｎｅｒｅｌｌｉ、Ｍ．ら（２００５）Ｓｈｏｃｋ、２４、４８−５２。
Ｒｉｔｃｈｉｅ、Ｇ．Ｅ．ら（２００２）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ、１０２、３０５−３２０−３１９。
Ｒｏｙｌｅ、Ｌ．ら（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３４７、１２５−１４３。
Ｔａｋａｍａｔｓｕ、Ｓ．ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５９、３９４９−３９５３。
Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ、Ｗ．ら（１９９８）Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、４３５、１４５−１５０。
ｖａｎ  Ｄｉｊｋ、Ｗ．ら（１９９５）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ、１２、２２７−２３３。
Ｙａｏ、Ｍ．ら（１９９８）Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１２４、２７−３０。
【図１】
2010540953.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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