(57)【要約】  本発明は、脊椎動物のＩＬ−１β及びＴＮＦ−α自己分子に対してその脊椎動物において免疫反応を誘発するように、ＩＬ−１β及び場合によってはＴＮＦ−αサイトカイン又はそれらの誘導体と、該ＩＬ−１β及び任意のＴＮＦ−αサイトカイン又はそれらの誘導体と組み合わせて、その脊椎動物に関して非自己である部分と、を含む、脊椎動物における変形性関節症の治療のためのワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物においてその脊椎動物のＩＬ−１β及び場合によってはＴＮＦ−α自己分子に対してワクチンが免疫反応を誘発するように、ＩＬ−１β及び場合によってはＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体と、ＩＬ−１β及び任意のＴＮＦ−α又はその誘導体と会合している、該脊椎動物に対して非自己である部分と、を含む、脊椎動物における変形性関節症の治療のためのワクチン。
【請求項２】
ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体が、治療される脊椎動物に対して同種である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
脊椎動物に対して非自己である部分が、微生物由来の抗原決定基を含む、請求項１又は請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
脊椎動物に対して非自己である部分がアジュバントを含む、請求項１から請求項３の何れかに記載のワクチン。
【請求項５】
ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体が、脊椎動物の自己ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカインと比較した場合、低い生物学的活性を有することを特徴とする、請求項１から請求項４の何れかに記載のワクチン。
【請求項６】
脊椎動物における変形性関節症の治療のためのワクチンを作製するための、ＩＬ−１β及び場合によってはＴＮＦ−αサイトカインの使用。
【請求項７】
ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体が、治療される脊椎動物に対して同種である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ワクチンを作製するために、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体が微生物由来の抗原決定基と会合させられる、請求項６及び請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ワクチンを作製するために、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体がアジュバントと会合させられる、請求項６から請求項８の何れかに記載の使用。
【請求項１０】
ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体が、脊椎動物の自己ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカインと比較した場合、低い生物学的活性を有することを特徴とする、請求項６から請求項８の何れかに記載の使用。
【請求項１１】
請求項１から請求項５の何れかに記載のワクチンを投与することによる、脊椎動物における変形性関節症の治療。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊椎動物における変形性関節症の治療のためのワクチン、このようなワクチンを作製するためのＩＬ−１β及び場合によってはＴＮＦ−αサイトカインの使用及びこのワクチンを投与することによる脊椎動物における変形性関節症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症（ＯＡ）は、老齢のヒト及び動物において主に起こる非炎症性の変形性関節疾患であり、関節軟骨の変性、縁部の骨の過形成及び滑膜の変化を特徴とする。この疾患は複数の原因から生じ得るが、機械的及び生化学的な力の両方がその発症及び進行の主因であることが一般に認識されている。この疾患には、特に長時間の活動後の、疼痛及び硬直が伴う。これは、ヒト及び動物、特にイヌ及びウマに広く見られる疾患であり、ヒトならびに動物の健康上の重大な問題である。
【０００３】
軽度ＯＡの患者は、アセトアミノフェンなどの鎮痛剤でのみ治療され得る。しかし、多くの患者は、非ステロイド性の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を与えられる。これらのＮＳＡＩＤは、疼痛を鎮めるだけであり、胃潰瘍、日光曝露に対する過敏性、腎障害、神経過敏及び鬱を含む危険な副作用が起こる可能性がある。一部の患者は、ＯＡの発現を遅延させるために、関節へのコルチコステロイドの直接注射により治療される。しかし、これは、コルチコステロイドの危険な副作用の可能性を考えると、好ましくない。文献では、ＯＡ軟骨損傷を特徴とする基質分解増加を媒介することに関与すると考えられるサイトカインに対するアンタゴニストを用いて、インシトゥでの治療により、即ちＯＡ関節で、ＯＡを治療することも示唆されている。これは、例えば、インターロイキン受容体アンタゴニスト（ＩＬ−Ｒａ）遺伝子の関節内注射に基づく遺伝子療法治療を記載する、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、Ｖｏｌ．４０、Ｎｏ．６、１９９７年６月、ｐ．１０１２−１０１９）及びＦｅｒｎａｎｄｅｓ（Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ  ３９、２００２、２３７−２４６）から知られており、この治療により、実験的に誘導された損傷の進行が抑えられ得る。しかし、好ましい効果は非常に短く、治療としての適用性はまだ証明されていない。また、サイトカインそのもの、特にインターロイキン６に対するモノクローナル抗体のインシトゥ投与はＥＰ１  ７１５  ８９１（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００６年公開）から知られている。この治療の短所は、高用量が必要なことから治療が本質的に高価になってしまうこと、局所的（侵襲的）投与及び効果が短時間であることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１  ７１５  ８９１号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、Ｖｏｌ．４０、Ｎｏ．６、１９９７年、ｐ．１０１２−１０１９
【非特許文献２】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ、Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ  ３９、２００２年、ｐ．２３７−２４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＯＡに対する既知の治療の短所がないか又は少なくとも短所が改善された変形性関節症に対する治療を提供することである。この意味における治療には、ＯＡを予防する、臨床兆候を緩和する、疾患を軽減するかもしくは治療する又は発現開始後にその進行を抑制するための治療が含まれ得る。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
このために、脊椎動物のＩＬ−１β及びＴＮＦ−α自己分子に対して脊椎動物においてワクチンが免疫反応を誘発するように、ＩＬ−１β及び場合によってはＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体と、該ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α又はその誘導体とともに該脊椎動物に対して非自己である部分と、を含む、プリアンブルに従うワクチンを開発した。場合によっては、本ワクチンは、非自己部分と会合させられたＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体を保持するための媒体を含む。
【０００８】
この点におけるワクチンは、脊椎動物、即ち、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳類（ヒトを含む。）などの関節を有する何らかの生きている動物への適用のための適切な構成物である（この後、「動物」という用語は、何らかの脊椎動物を示すために使用される。）。一般に、ワクチンは、弱毒化もしくは死滅微生物及びそのサブユニットなどの１以上の抗原又は生物の代謝産物などの何らかのその他の物質を含む。動物に対するワクチンの投与の際、抗原に対する免疫反応が誘発されるが、この反応は、疾病又は疾患を予防、改善又は治療するのに役立つ。一般に、抗原は、「医薬的に許容可能な担体」と呼ばれることが多い、抗原を保持するための媒体と組み合わせられる。このような担体は、脊椎動物に生理学的に適合する、何らかの、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などであり得る。このような保持媒体のある例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、細菌培養液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせである。これらは、意図する投与様式に依存して、液体、半固体及び固体剤形を提供し得る。一般に知られているように、保持媒体の存在はワクチンの有効性に必須ではないが、これにより、抗原の調剤及び投与を顕著に容易になり得る。
【０００９】
ワクチンは、さらに、アジュバントと呼ばれることが多い、非特異的免疫刺激剤を含み得る。原則的に、究極的には免疫反応をより良好にする、免疫学的事象のカスケードにおける特定のプロセス（即ち、抗原に対する総合的な身体反応、特にリンパ球が介在し、一般に特異的抗体又は既に感作されたリンパ球による抗原認識を含むもの）を促進するか又は増幅することができる各物質は、アジュバントとして定義され得る。アジュバントは、一般に、この特定プロセスを引き起こすために必要ではないが、このプロセスを促進又は増幅することに注意されたい。
【００１０】
本発明のワクチンは、ＩＬ−１β（インターロイキン１β）及びＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）サイトカインの使用に基づく。サイトカインは、一般に、抗原に接触した際に細胞集団により放出される非抗体タンパク質であり、免疫反応の生成において細胞間メディエーターとして作用する。インターロイキン−１βは、主にマクロファージ及びＴリンパ球により分泌され、リンパ球及び造血幹細胞の増殖及び分化を誘発するタンパク質のクラスである、インターロイキンのクラスのサブグループである。これは、Ｂ及びＴ細胞の活性化を含む多岐にわたる免疫及び炎症反応を媒介する強力な免疫調節因子である。ＴＮＦ−αは、エンドトキシン存在下でとりわけマクロファージにより産生され、とりわけ癌性腫瘍を攻撃し破壊することができることが実験的に示されているタンパク質を代表するファミリーである、「腫瘍壊死因子」ファミリーの最もよく知られているメンバーである。本ケースにおいて、ワクチンは、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α又はその誘導体と、それらとともにその脊椎動物に対して非自己である部分と、を含む。この意味において非自己とは、それが治療される動物において免疫原性であること、即ち、それが免疫反応を誘発することができることを意味する。一般に知られているように、別の分子と会合させて非自己部分を使用することにより、この他の分子がその動物に対して自己のものであっても、この他の分子に対して免疫反応がもたらされ得る。サイトカインと会合させられる非自己部分は、単純に、その動物に対して異種であるＩＬ−１β及びＴＮＦ−αを選択することによって提供され得る。この点において異種とは、同じ種由来ではないことを意味する（同種と反対）。この場合、サイトカインは、本質的に、それらの分子構造において、治療される動物に対して非自己である部分を含む。別の可能性は、例えば、治療される動物と同種であるが突然変異体であるか、又は組み換え技術により外来タンパク質部分とともに提供される、サイトカインを選択することである。サイトカイン又はその誘導体と会合させられた非自己部分を提供するその他の方法は、例えば、１以上の非自己分子、非自己構造、化合物又は単に何らかの非自己構成物をそのサイトカインに物理学的又は化学的に連結させることである。何らかの事象において、コンストラクトが自己サイトカイン（ｉ．ｃ．ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α）に対する免疫反応を誘発することができるように、有効な連結がサイトカイン又はその誘導体と非自己部分との間に存在する免疫学的コンストラクトが提供される。
【００１１】
本明細書中、上記で示されるように、例えば大きな外来及び免疫原性担体タンパク質への自己タンパク質の化学カップリング（ＵＳ４，１６１，５１９）による又は自己タンパク質と外来担体タンパク質との間の融合コンストラクトの調製による（ＷＯ８６／０７３８３）又はさらに自己タンパク質におけるただ１つの外来Ｔヘルパーエピトープを置換することによる（ＷＯ９５／０５８４９）、自己タンパク質に対してワクチンを開発するための（「ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓタンパク質（自己タンパク）としても知られる。）技術は、１９８０年代半ばから一般に知られている。これらの場合、免疫原性コンストラクトの非自己部分は、可能性のある自己寛容性（ａｕｔｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を突破するＴ−ヘルパーリンパ球に対するエピトープの提供に関与する。本発明に関するＩＬ−１β及び／又はＴＮＦ−αの誘導体は、出発サイトカインよりも小さいか又は大きいが、この出発サイトカインと相同である１以上の部分を依然として含む分子を意味し、この部分がこれらのサイトカインの抗原決定基を構成することに注意されたい。このような部分は、わずか１個という小さなエピトープであり得る。わずか１個のエピトープを使用することは、実際に非常に特異的なモノクローナル抗体が、自己ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに対して誘発され得るという長所を有する。これにより、その他のサイトカインとの交差反応のリスクが低下するか又は完全に阻止される。この原理は、一般に知られ、例えば、サイトカインの免疫原性ペプチド（即ち免疫反応を誘導することができるペプチド）を明白に開示する、ＷＯ２００５／０８４１９８、ＷＯ０３／０８４９７９及びＥＰ２１８５３１に記載されている。ワクチンにおいて、両サイトカインに対して同時に誘導体が使用され得るだけでなく、サイトカインの一方がその天然型で使用され、他方がその天然型の誘導体であることに注意されたい。
【００１２】
出願者らは、驚くべきことに、本発明によるワクチンを投与することにより、変形性関節症が首尾よく治療され得ることを見出した。特に、動物がＯＡを発現する前にワクチン接種される場合、動物が実際にＯＡを発症するとき、臨床兆候がより少ないことが分かった。疾患の臨床兆候は、何ら重篤な慢性的副作用なく抑制される。これらの肯定的結果を考えると、予想とは逆に、誘発されるＩＬ−１βの的確な量及び適用できるＴＮＦ−α抗体がＯＡ関節に到達することには疑いの余地はない。ＯＡ関節に存在する場合、サイトカインアンタゴニストがＯＡ進行を抑制することが知られているので（本明細書中上記で述べられる、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ及びＷａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ参照）、本発明によるワクチンで治療される動物は、ＯＡが進行しにくい。ＯＡは進行性の変性疾患なので、動物がＯＡを発症し始めた後に本発明によるワクチンでその動物を治療する場合、対応する結果が得られることを理解されたい。理論に縛られないが、予想外に重篤な慢性的副作用がなかったことは、本発明によるワクチンでのワクチン接種によって、その動物における自己サイトカインＩＬ−１β及びＴＮＦ−αが完全に機能的に遮断されないが、とりわけ関節において、正常レベルまで、これらのサイトカインの濃度が低下すると推測することにより説明され得る。
【００１３】
Ｇｏｌｄｒｉｎｇ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ及びＲｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏ．４２７Ｓ、ｐ．Ｓ２７−Ｓ３６）が、ＩＬ−１及びＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインが軟骨基質の進行性破壊及び関節機能の喪失を導くコンドライト（ｃｈｏｎｄｒｙｔｅ）機能の異常調節に関与することが示唆されると述べていることに注意されたい。しかし、Ｇｏｌｄｒｉｎｇはまた、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍｔｉｓｍ、Ｖｏｌ．４８、Ｎｏ．１２、ｐ．３４５２−３４６３、２００３）による最近の研究から、ＩＬ−１β又はＩＬ−１β変換酵素の遺伝子欠失が膝変形性関節症の発現を加速することが示されたとも述べている。従って、先行技術では、ＯＡでのこれらのサイトカインの役割については不明瞭である。それらが明らかにＯＡを刺激するか又は抑制するかということも分かっていない。これは、例えば、ＯＡの発現におけるサイトカインの役割を評価するための研究プログラムを記載する最新の論文により認められている（Ｂａｇｇｉｏ、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ及びＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １０７（２００５）２７−３９）。この論文は、明確に、ＩＬ−１及びＴＮＦの両方がＯＡを進行させることが報告されたが、これらのサイトカインの破棄がＯＡを治療するために適切であるか否かは依然として決着していないと述べている。Ｗｉｌｄｂａｕｍ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｖｏｌ．１９、６７９−６８８、２００３年１１月）はまた、中和ＴＮＦ−αが炎症性疾患関節リウマチを緩和するが変形性関節症を緩和しないことを報告している。従って、当業者らは、ＯＡに対する治療について探索した場合、明確に、ＩＬ−１β及び任意のＴＮＦ−α抑制に到達しない。さらに、サイトカインアンタゴニストでのインシトゥ治療がＯＡに役立ち得る場合、全身的アプローチが奏功しないことが先行技術からはっきりと分かっている（ＥＰ１  ７１５  ８９１；実施例３参照）。これは、関節が血液−関節関門のために到達が非常に困難であるという一般的理解と一致する（Ｂａｓら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、１９９６；３５（６）：５４８−５５２及びＫｕｓｈｎｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、１９７１；１４（５）：５６０−５７０）。
【００１４】
急性炎症性疾患の治療に関する多くの参考文献が知られており、自己ＩＬ−１及び／又はＴＮＦ−αに対して免疫反応を誘導するためにＩＬ−１及び／又はＴＮＦ−αを含むワクチンを用いることによってその疾患が治療され得ることが示されていることにも注意されたい。このような参考文献の典型例は、Ｃｙｔｏｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄに譲渡されたＷＯ２００７／０３９５５２である。炎症においては、ＯＡなどの疾患とは逆に、サイトカインの役割は非常に明確であり、下方制御により放出が起こり、従って治療に効果的である。前記の参考文献で、変形性関節症にＩＬ−１β及びＴＮＦ−αが関与し得ることが知られているので、例の形態で証拠を開示せずに、同じ治療がまた変形性関節症でも有効であることが示唆されるか又はそのように言われることが多い。しかし、本明細書中上記で説明されるように、ＯＡは非炎症性疾患であり、従って、炎症性疾患とは完全に異なる。ＩＬ−１β及び／又はＴＮＦ−αなどのサイトカインの役割は明確ではなく、明瞭ではないと思われる。従って、変形性関節症の分野の熟練者にとって、このような参考文献からは、免疫原性ＩＬ−１β及び／又はＴＮＦ−αでのＯＡの治療による適正な成功確率を予想するためにさえも正当な根拠が得られず、唯一期待されるのは、全身的に与えられる免疫原性ＩＬ１β及び場合によっては免疫原性ＴＮＦ−αがＯＡの的確な治療をもたらすことのみである。
【００１５】
まとめると、当業者が、変形性関節症に関する利用可能な知識に基づき、ＯＡを治療するためにＩＬ−１β及び場合によってはＴＮＦ−αに対してワクチンを開発しないことには２つの重要な理由がある：第一に、先行技術が、ＯＡにおけるサイトカイン、特にＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの役割が何であるかを明確に教示していないこと、及び第二に、同じアンタゴニストに基づくインシトゥ治療が奏功することが明らかであった場合でも、関節そのものでのサイトカインの役割を調節するためのサイトカインアンタゴニストを用いた全身的アプローチが奏功しないことが分かっていること、である。従って、当業者は、今日利用可能である知識に基づき、ＯＡを治療するために自己サイトカインＩＬ−１β及び／又はＴＮＦ−αに対するワクチンを開発しないが、これは、非常に大きな欠点となり得るこれらのサイトカインに対する全身的攻撃があることを意味するので、なおさらその開発が控えられる。インターロイキン−１は、例えば、微生物感染に対する免疫反応に関与し、骨髄細胞数を増加させ、（口腔）創傷治癒において重要な役割を果たし、抗糖尿病効果を有し、さらに妊娠後期の細胞的事象を調節することが知られている。従って、このサイトカインの阻害は一般に望ましくないとみなされている。
【００１６】
ある実施形態において、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体は、治療される脊椎動物に対して同種である。この意味における「同種」とは、本明細書中上記で定義されるような異種とは逆に、同じ種由来であることを意味する。予想外に、同種由来の抗原サイトカインにより、治療される脊椎動物においてより高い抗体力価が誘導されることが分かった。
【００１７】
別の実施形態において、脊椎動物に対して非自己である部分は、微生物由来の抗原決定基を含む。この意味において微生物とは、特に、細菌、酵母、カビ、原生動物、藻類、リケッチア、病原菌又はウイルスに属する、顕微鏡的又は超微視的サイズの生物を意味する。このような抗原決定基、即ち、リンパ球において抗原特異的膜受容体に又は分泌される抗体に結合する免疫学的活性領域をもたらすエピトープを含むことによって、脊椎動物の自己サイトカインに対して抗体力価が高くなり得ると思われる。
【００１８】
さらに別の実施形態において、脊椎動物に対して非自己である部分はアジュバントを含む。本明細書中上記で述べられるように、アジュバントは、原則的には、何らかの非特異的免疫刺激物質であり得る。アジュバント部分は、何らかの化学的もしくは物理学的結合によるか又は、アジュバント部分がＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体と操作可能に連結される限り、即ち、アジュバント部分がこれらＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体に対して、及び従って脊椎動物の自己ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの対応する抗原決定基に対しても免疫反応を刺激することができる限り、何らかのその他の方法で、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体と会合させられ得る。アジュバントは、一般に、それらが誘導する免疫学的事象に従い分類され得る。とりわけＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、サポニン（又はＱｕｉｌ  Ａなどのその画分及び誘導体）、水酸化アルミニウム、リポソーム、コクレエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、ポリ乳酸／グリコール酸を含む第一のクラスは、抗原取り込み、輸送及びＡＰＣ（抗原提示細胞）による提示を促進する。とりわけ油性エマルジョン、ジェル、ポリマー性ミクロスフェア、非イオン性ブロックコポリマー及びほぼ確実に水酸化アルミニウムをも含む第二のクラスは、デポー効果（ｄｅｐｏｔ  ｅｆｆｅｃｔ）をもたらす。とりわけＣｐＧリッチモチーフ、モノホスホリル脂質Ａ、ミコバクテリア（ムラミルジペプチド）、酵母抽出物、コレラ毒素を含む第三のクラスは、シグナル０として定義される、保存的微生物構造（いわゆる病原性関連微生物パターン（ＰＡＭＰ））の認識に基づく。とりわけ油性エマルジョン界面活性剤、水酸化アルミニウム、ハイポキシア（ｈｙｐｏｘｉａ）を含む第四のクラスは、免疫系の能力を危険なものと無害なもの（自己及び非自己と同じである必要はない。）とに区別することを促進することに基づく。とりわけサイトカインを含む第五のクラスは、ＡＰＣにおける共刺激分子、シグナル２の上方制御に基づく。アジュバントは、的確な免疫反応をもたらすのに役立つ。従って、サイトカイン又はその誘導体の非自己部分が自己寛容性を突破することができることは既にさほど重要ではない。従って、アジュバントによって抗原選択がより自由になる。特に、例えばサポニン、その画分及び水中油エマルジョン（例えばリポソーム）で代表されるクラス１からのアジュバントにより、良好な結果が得られた。
【００１９】
さらに別の実施形態において、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカイン又はその誘導体は、脊椎動物の自己ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αサイトカインと比較した場合に生物学的活性が低い。低生物学的活性、即ち、生きている動物又はその組織においてその物質の効果が低いことにより、ワクチンの投与の際、急性の副作用のリスクが低下する。サイトカインの生物学的活性が低下しない場合、嘔吐、ショック、疝痛などの急性の副作用が起こり得る。トキソイドへの細菌毒素の変換のために使用されるものと同様の化学的ホルムアルデヒド処理などの様々なサイトカイン不活性化手順により、生物学的活性を低下させ得る。このような方法は、ワクチン技術の分野で周知である。代替的アプローチにおいて、生物学的活性が低下した突然変異サイトカインを作製することができる。これも当技術分野で周知である。生物学的活性が低下したサイトカインは、生物学的不活性とも呼ばれる（しかし実質的生物学的活性は残存し得る。）ことに注意されたい。
【００２０】
本発明はまた、脊椎動物における変形性関節症の治療及び治療それ自身のためのワクチンを作製するための、ＩＬ−１β及び場合によってはＴＮＦ−αサイトカインの使用にも関する。本ワクチンは、ワクチン技術の分野で使用される何らかの従来の経路により、特に筋肉内経路、皮下、皮内又は粘膜下経路により、又は例えば注射用縣濁液の形態での静脈内経路により、投与され得る。単回投与として又はある一定の間隔後の１回以上の反復投与として、投与が行われ得る。適切な用量は、とりわけ治療される個体の重量の関数として変動し得る。
【００２１】
本発明は、続く実施例を参照することによりより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ＣａＩＬ−１βに対して測定された抗体力価；ワクチン接種後いくつかの時点で測定されたＩＬ−β及びＴＮＦ−α特異的抗体反応を示す。イヌは、免疫付与しないか（食塩水対照）又はＱｕｉｌＡ、Ｍａｔｒｉｘ  ＣもしくはＭｉｃｒｏｓｏｌ中で処方された［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］タンパク質（Ｃａと省略）で免疫付与したか又はＱｕｉｌＡ（最初のみ）／食塩水（追加免疫）中で処方された［ＥｑＩＬ−１β＋ＥｑＴＮＦ−α］タンパク質（Ｅｑと省略）で免疫付与した。初回ワクチン接種から４、８、２０及び２４週後、イヌに追加免疫ワクチン接種した。タンパク質がＣＤＶ−タグなしで使用された抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いて抗体を測定した。
【図１Ｂ】ＥｑＩＬ−１βに対して測定された抗体力価；ワクチン接種後いくつかの時点で測定されたＩＬ−β及びＴＮＦ−α特異的抗体反応を示す。イヌは、免疫付与しないか（食塩水対照）又はＱｕｉｌＡ、Ｍａｔｒｉｘ  ＣもしくはＭｉｃｒｏｓｏｌ中で処方された［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］タンパク質（Ｃａと省略）で免疫付与したか又はＱｕｉｌＡ（最初のみ）／食塩水（追加免疫）中で処方された［ＥｑＩＬ−１β＋ＥｑＴＮＦ−α］タンパク質（Ｅｑと省略）で免疫付与した。初回ワクチン接種から４、８、２０及び２４週後、イヌに追加免疫ワクチン接種した。タンパク質がＣＤＶ−タグなしで使用された抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いて抗体を測定した。
【図１Ｃ】ＣａＴＮＦ−αに対して測定された抗体力価；ワクチン接種後いくつかの時点で測定されたＩＬ−β及びＴＮＦ−α特異的抗体反応を示す。イヌは、免疫付与しないか（食塩水対照）又はＱｕｉｌＡ、Ｍａｔｒｉｘ  ＣもしくはＭｉｃｒｏｓｏｌ中で処方された［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］タンパク質（Ｃａと省略）で免疫付与したか又はＱｕｉｌＡ（最初のみ）／食塩水（追加免疫）中で処方された［ＥｑＩＬ−１β＋ＥｑＴＮＦ−α］タンパク質（Ｅｑと省略）で免疫付与した。初回ワクチン接種から４、８、２０及び２４週後、イヌに追加免疫ワクチン接種した。タンパク質がＣＤＶ−タグなしで使用された抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いて抗体を測定した。
【図１Ｄ】ＥｑＴＮＦ−αに対して測定された抗体力価；ワクチン接種後いくつかの時点で測定されたＩＬ−β及びＴＮＦ−α特異的抗体反応を示す。イヌは、免疫付与しないか（食塩水対照）又はＱｕｉｌＡ、Ｍａｔｒｉｘ  ＣもしくはＭｉｃｒｏｓｏｌ中で処方された［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］タンパク質（Ｃａと省略）で免疫付与したか又はＱｕｉｌＡ（最初のみ）／食塩水（追加免疫）中で処方された［ＥｑＩＬ−１β＋ＥｑＴＮＦ−α］タンパク質（Ｅｑと省略）で免疫付与した。初回ワクチン接種から４、８、２０及び２４週後、イヌに追加免疫ワクチン接種した。タンパク質がＣＤＶ−タグなしで使用された抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いて抗体を測定した。
【図２】ＣＤＶ−タグ付加及び非タグ付加ＣａＩＬ−β、ＣａＴＮＦ−α及びＥｑＩＬ−１β及びＥｑＴＮＦ−αタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。初回ワクチン接種から９週間後に各ワクチン接種群からの1匹のイヌ由来の血清を用いて４−１２％Ｎｕ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより、タンパク質、１μｇ／レーンを分析した。［Ａ］．クーマシー染色ゲル；［Ｂ］．対照血清と温置したウエスタンブロット；［Ｃ］．ＱｕｉｌＡアジュバント中で処方された［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］でワクチン接種されたイヌ由来の血清とともに温置したウエスタンブロット；［Ｄ］．Ｍａｔｒｉｘ  Ｃアジュバント中で処方された［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］でワクチン接種されたイヌ由来の血清とともに温置したウエスタンブロット；［Ｅ］．Ｍｉｃｒｏｓｏｌアジュバント中で処方された［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］でワクチン接種されたイヌ由来の血清とともに温置したウエスタンブロット；［Ｆ］．ＱｕｉｌＡ（最初のみ）／食塩水（追加免疫）アジュバント中で処方された［ＥｑＩＬ−１β＋ＥｑＴＮＦ−α］でワクチン接種されたイヌ由来の血清とともに温置したウエスタンブロット。
【図３Ａ】ワクチン接種されたイヌ由来の血清によるＩＬ−１β−又はＴＮＦ−α−誘導性ＮＦκＢ活性の阻害を示す。［Ａ］ＣａＩＬ−１β、［Ｂ］ＥｑＩＬ−１β、［Ｃ］ＣａＴＮＦ−α又は［Ｄ］ＥｑＴＮＦ−αの１０ｎｇ／ｍＬを［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］でワクチン接種したイヌ由来の抗体血清の希釈液と混合し、ＮＩＨ−３Ｔ３レポーター細胞とともに温置した。相対光単位（ＲＬＵ）において抗体によるＩＬ−１β又はＴＮＦ−α活性の阻害を定量した。Ｔ＝６週：これは、初回ワクチン接種後６週で採取された群２＋３＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。Ｔ＝９＋１２週：これは、初回ワクチン接種後９及び１２週で採取された群２＋３＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。Ｔ＝２４週：これは、初回ワクチン接種後２４週で採取された群２＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。
【図３Ｂ】ワクチン接種されたイヌ由来の血清によるＩＬ−１β−又はＴＮＦ−α−誘導性ＮＦκＢ活性の阻害を示す。［Ａ］ＣａＩＬ−１β、［Ｂ］ＥｑＩＬ−１β、［Ｃ］ＣａＴＮＦ−α又は［Ｄ］ＥｑＴＮＦ−αの１０ｎｇ／ｍＬを［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］でワクチン接種したイヌ由来の抗体血清の希釈液と混合し、ＮＩＨ−３Ｔ３レポーター細胞とともに温置した。相対光単位（ＲＬＵ）において抗体によるＩＬ−１β又はＴＮＦ−α活性の阻害を定量した。Ｔ＝６週：これは、初回ワクチン接種後６週で採取された群２＋３＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。Ｔ＝９＋１２週：これは、初回ワクチン接種後９及び１２週で採取された群２＋３＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。Ｔ＝２４週：これは、初回ワクチン接種後２４週で採取された群２＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。
【図３Ｃ】ワクチン接種されたイヌ由来の血清によるＩＬ−１β−又はＴＮＦ−α−誘導性ＮＦκＢ活性の阻害を示す。［Ａ］ＣａＩＬ−１β、［Ｂ］ＥｑＩＬ−１β、［Ｃ］ＣａＴＮＦ−α又は［Ｄ］ＥｑＴＮＦ−αの１０ｎｇ／ｍＬを［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］でワクチン接種したイヌ由来の抗体血清の希釈液と混合し、ＮＩＨ−３Ｔ３レポーター細胞とともに温置した。相対光単位（ＲＬＵ）において抗体によるＩＬ−１β又はＴＮＦ−α活性の阻害を定量した。Ｔ＝６週：これは、初回ワクチン接種後６週で採取された群２＋３＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。Ｔ＝９＋１２週：これは、初回ワクチン接種後９及び１２週で採取された群２＋３＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。Ｔ＝２４週：これは、初回ワクチン接種後２４週で採取された群２＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。
【図３Ｄ】ワクチン接種されたイヌ由来の血清によるＩＬ−１β−又はＴＮＦ−α−誘導性ＮＦκＢ活性の阻害を示す。［Ａ］ＣａＩＬ−１β、［Ｂ］ＥｑＩＬ−１β、［Ｃ］ＣａＴＮＦ−α又は［Ｄ］ＥｑＴＮＦ−αの１０ｎｇ／ｍＬを［ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］でワクチン接種したイヌ由来の抗体血清の希釈液と混合し、ＮＩＨ−３Ｔ３レポーター細胞とともに温置した。相対光単位（ＲＬＵ）において抗体によるＩＬ−１β又はＴＮＦ−α活性の阻害を定量した。Ｔ＝６週：これは、初回ワクチン接種後６週で採取された群２＋３＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。Ｔ＝９＋１２週：これは、初回ワクチン接種後９及び１２週で採取された群２＋３＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。Ｔ＝２４週：これは、初回ワクチン接種後２４週で採取された群２＋４（表１参照）のイヌ由来のプール血清である。
【図４Ａ】ビーグル犬に対する立位［Ａ］及び歩行［Ｂ］での平均スコア及び平均総跛行スコア［Ｃ］（立位＋歩行）を示す。データは、幾何平均±ＳＥＭとして表す。
【図４Ｂ】ビーグル犬に対する立位［Ａ］及び歩行［Ｂ］での平均スコア及び平均総跛行スコア［Ｃ］（立位＋歩行）を示す。データは、幾何平均±ＳＥＭとして表す。
【図４Ｃ】ビーグル犬に対する立位［Ａ］及び歩行［Ｂ］での平均スコア及び平均総跛行スコア［Ｃ］（立位＋歩行）を示す。データは、幾何平均±ＳＥＭとして表す。
【図５Ａ】ビーグル犬に対する、触診時の疼痛［Ａ］の平均スコア及び膝関節滲出［Ｂ］の平均スコアを示す。データは、幾何平均±ＳＥＭとして表す。
【図５Ｂ】ビーグル犬に対する、触診時の疼痛［Ａ］の平均スコア及び膝関節滲出［Ｂ］の平均スコアを示す。データは、幾何平均±ＳＥＭとして表す。
【図６Ａ】シェトランドポニーに対する、立位［Ａ］及び歩行［Ｂ］での平均スコア及び平行総跛行スコア［Ｃ］（立位＋歩行）を示す。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。左縦軸の矢印は、示されるパラメータに対する最大スコアを示す。
【図６Ｂ】シェトランドポニーに対する、立位［Ａ］及び歩行［Ｂ］での平均スコア及び平行総跛行スコア［Ｃ］（立位＋歩行）を示す。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。左縦軸の矢印は、示されるパラメータに対する最大スコアを示す。
【図６Ｃ】シェトランドポニーに対する、立位［Ａ］及び歩行［Ｂ］での平均スコア及び平行総跛行スコア［Ｃ］（立位＋歩行）を示す。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。左縦軸の矢印は、示されるパラメータに対する最大スコアを示す。
【図７Ａ】触診時の疼痛［Ａ］に対する平均スコア及び膝関節滲出［Ｂ］に対する平均スコアを示す。図７［Ｃ］は、シェトランドポニーに対する総臨床スコア（立位＋歩行＋疼痛＋腫脹）を示す。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。左縦軸の矢印は、示されるパラメータに対する最大スコアを示す。
【図７Ｂ】触診時の疼痛［Ａ］に対する平均スコア及び膝関節滲出［Ｂ］に対する平均スコアを示す。図７［Ｃ］は、シェトランドポニーに対する総臨床スコア（立位＋歩行＋疼痛＋腫脹）を示す。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。左縦軸の矢印は、示されるパラメータに対する最大スコアを示す。
【図７Ｃ】触診時の疼痛［Ａ］に対する平均スコア及び膝関節滲出［Ｂ］に対する平均スコアを示す。図７［Ｃ］は、シェトランドポニーに対する総臨床スコア（立位＋歩行＋疼痛＋腫脹）を示す。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。左縦軸の矢印は、示されるパラメータに対する最大スコアを示す。
【図８Ａ】［Ａ］ＣａＩＬ−１βに対して測定した抗体力価；初回ワクチン接種後のいくつかの時間点で測定されたＩＬ−β及びＴＮＦ−α特異的抗体反応を示す。イヌは、ワクチン接種されていないか（食塩水対照）又はＱｕｉｌＡもしくはＭｉｃｒｏｓｏｌ中で処方される［ＣＤＶ−タグ付加ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］タンパク質（Ｃａと略称）で初回ワクチン接種した後にＴ＝４８及びＴ＝５４で再ワクチン接種したか又はＱｕｉｌＡ（初回のみ）もしくは食塩水（追加）中で処方された［ＥｑＩＬ−１β＋ＥｑＴＮＦ−α］タンパク質（Ｅｑと略称）で再ワクチン接種されたかの何れかであった。抗原特異的ＥＬＩＳＡ（タンパク質をＣＤＶ−タグなしで使用）を用いて、初回ワクチン接種後Ｔ＝４８、Ｔ＝５４及びＴ＝５８週で、抗体を測定した。★＝食塩水群に対して有意差あり（Ｐ＜０．０５）；▼−▼＝指示される群間で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。Ｔ＝初回ワクチン接種後の週数。
【図８Ｂ】［Ｂ］ＥｑＩＬ−１βに対して測定した抗体力価；初回ワクチン接種後のいくつかの時間点で測定されたＩＬ−β及びＴＮＦ−α特異的抗体反応を示す。イヌは、ワクチン接種されていないか（食塩水対照）又はＱｕｉｌＡもしくはＭｉｃｒｏｓｏｌ中で処方される［ＣＤＶ−タグ付加ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］タンパク質（Ｃａと略称）で初回ワクチン接種した後にＴ＝４８及びＴ＝５４で再ワクチン接種したか又はＱｕｉｌＡ（初回のみ）もしくは食塩水（追加）中で処方された［ＥｑＩＬ−１β＋ＥｑＴＮＦ−α］タンパク質（Ｅｑと略称）で再ワクチン接種されたかの何れかであった。抗原特異的ＥＬＩＳＡ（タンパク質をＣＤＶ−タグなしで使用）を用いて、初回ワクチン接種後Ｔ＝４８、Ｔ＝５４及びＴ＝５８週で、抗体を測定した。★＝食塩水群に対して有意差あり（Ｐ＜０．０５）；▼−▼＝指示される群間で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。Ｔ＝初回ワクチン接種後の週数。
【図８Ｃ】［Ｃ］ＣａＴＮＦ−αに対して測定した抗体力価；初回ワクチン接種後のいくつかの時間点で測定されたＩＬ−β及びＴＮＦ−α特異的抗体反応を示す。イヌは、ワクチン接種されていないか（食塩水対照）又はＱｕｉｌＡもしくはＭｉｃｒｏｓｏｌ中で処方される［ＣＤＶ−タグ付加ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］タンパク質（Ｃａと略称）で初回ワクチン接種した後にＴ＝４８及びＴ＝５４で再ワクチン接種したか又はＱｕｉｌＡ（初回のみ）もしくは食塩水（追加）中で処方された［ＥｑＩＬ−１β＋ＥｑＴＮＦ−α］タンパク質（Ｅｑと略称）で再ワクチン接種されたかの何れかであった。抗原特異的ＥＬＩＳＡ（タンパク質をＣＤＶ−タグなしで使用）を用いて、初回ワクチン接種後Ｔ＝４８、Ｔ＝５４及びＴ＝５８週で、抗体を測定した。★＝食塩水群に対して有意差あり（Ｐ＜０．０５）；▼−▼＝指示される群間で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。Ｔ＝初回ワクチン接種後の週数。
【図８Ｄ】［Ｄ］ＥｑＴＮＦ−αに対して測定した抗体力価；初回ワクチン接種後のいくつかの時間点で測定されたＩＬ−β及びＴＮＦ−α特異的抗体反応を示す。イヌは、ワクチン接種されていないか（食塩水対照）又はＱｕｉｌＡもしくはＭｉｃｒｏｓｏｌ中で処方される［ＣＤＶ−タグ付加ＣａＩＬ−１β＋ＣａＴＮＦ−α］タンパク質（Ｃａと略称）で初回ワクチン接種した後にＴ＝４８及びＴ＝５４で再ワクチン接種したか又はＱｕｉｌＡ（初回のみ）もしくは食塩水（追加）中で処方された［ＥｑＩＬ−１β＋ＥｑＴＮＦ−α］タンパク質（Ｅｑと略称）で再ワクチン接種されたかの何れかであった。抗原特異的ＥＬＩＳＡ（タンパク質をＣＤＶ−タグなしで使用）を用いて、初回ワクチン接種後Ｔ＝４８、Ｔ＝５４及びＴ＝５８週で、抗体を測定した。★＝食塩水群に対して有意差あり（Ｐ＜０．０５）；▼−▼＝指示される群間で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。Ｔ＝初回ワクチン接種後の週数。
【図９Ａ】ビーグル犬に対する平均総臨床スコアを示す。図９［Ａ］は、総臨床スコアを与える（立位＋歩行＋触診時の疼痛＋膝関節腫脹）。図９［Ｂ］は、歩行時の平均スコアを与える。歩行は［Ｃ］で示され、触診時の疼痛は［Ｄ］で示され、膝関節滲出（腫脹）は［Ｅ］で示される。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。★＝示される時間点で尿酸結晶対照群に対して有意差あり（Ｐ＜０．０５）、▼−▼＝示される群間で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。
【図９Ｂ】ビーグル犬に対する平均総臨床スコアを示す。図９［Ａ］は、総臨床スコアを与える（立位＋歩行＋触診時の疼痛＋膝関節腫脹）。図９［Ｂ］は、歩行時の平均スコアを与える。歩行は［Ｃ］で示され、触診時の疼痛は［Ｄ］で示され、膝関節滲出（腫脹）は［Ｅ］で示される。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。★＝示される時間点で尿酸結晶対照群に対して有意差あり（Ｐ＜０．０５）、▼−▼＝示される群間で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。
【図９Ｃ】ビーグル犬に対する平均総臨床スコアを示す。図９［Ａ］は、総臨床スコアを与える（立位＋歩行＋触診時の疼痛＋膝関節腫脹）。図９［Ｂ］は、歩行時の平均スコアを与える。歩行は［Ｃ］で示され、触診時の疼痛は［Ｄ］で示され、膝関節滲出（腫脹）は［Ｅ］で示される。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。★＝示される時間点で尿酸結晶対照群に対して有意差あり（Ｐ＜０．０５）、▼−▼＝示される群間で有意差あり（Ｐ＜０．０５）。
【図１０】ビーグル犬に対する平均臨床スコアを示す。［Ａ］。立位時の平均臨床スコア；［Ｂ］。歩行時の平均臨床スコア。データは幾何平均±ＳＥＭとして表す。★＝指示される時間点において尿酸結晶対照群に対して有意差あり（Ｐ＜０．０５）。
【実施例】
【００２３】
１．材料及び方法
Ａ．イヌにおける自己ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに対する抗体の誘導
組み換えイヌ（Ｃａ）及びウマ（Ｅｑ）タンパク質。イヌ又はウマ血液からそれぞれ抽出された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からの単離ＲＮＡを使用して標準的分子生物学的技術を用いてＣａＩＬ−１β、ＣａＴＮＦ−α、ＥｑＩＬ−１β及びＥｑＴＮＦ−αをクローニングした。イヌジステンパーウイルス融合タンパク質（ＣＤＶ−Ｆ）由来の最小（１７ａａ）Ｔ細胞エピトープにＣａ分子の３’末端を遺伝子融合させた（Ｇｈｏｓｈら（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０４ｐｐ．５８−６６）。５’末端がＨｉｓ−タグ付き（精製目的）でインフレームになるように、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αをコードするｃＤＮＡ断片を最終的にｐＥＴベクターに連結した。ウマＩＬ−１β及びＴＮＦ−αには、ＣＤＶ−タグ付加を行わなかった。タンパク質は全て、Ｅ．コリにより発現させ、Ｈｉｓタグ精製し、ＬＰＳ含量について調べた。抗原として使用されるタンパク質は全て、ＬＰＳ含量が＜２０Ｕ／ｍＬであった。配列番号１は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加ＣａＩＬ−１βに対するＤＮＡを表す。ヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３２−５８５はＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当する。配列番号２は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｃａ  ＩＬ−１βタンパク質それ自身に相当する。配列番号３は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｃａ  ＴＮＦαに対するＤＮＡに相当する。ヌクレオチド１−６３はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３５−５８８はＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当する。配列番号４は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｃａ  ＴＮＦαタンパク質それ自身に相当する。配列番号５は、ウマＩＬ−１βに対するＤＮＡに相当する。ヌクレオチド１−６３はＨｉｓタグに相当する。配列番号６は、ウマＩＬ−１βタンパク質それ自身に相当する。配列番号７はウマＴＮＦαに対するＤＮＡに相当する。ヌクレオチド１−６３はＨｉｓタグに相当する。配列番号８はウマＴＮＦαタンパク質それ自身に相当する。
【００２４】
上記段落で述べられたこれらの野生型分子の次に、全身的な有害反応の可能性を回避するために、部位特異的突然変異誘発を用いて一連の生物学的不活性突然変異（ｍｔ）分子を作製した（注意：この記述において、生物学的活性のある野生型分子は、「ｗｔ」と呼ばれるか又は示され；生物学的不活性又は生物学的に「低」活性の突然変異分子は、「ｍｔ」と呼ばれるか又は示され；言及又は指示がない限り、野生型形態が意図されることに注意）。これらの突然変異は、イヌジステンパーウイルス融合タンパク質（ＣＤＶ−Ｆ）からの最小（１７ａａ）又は最大（３２ａａ）Ｔ細胞エピトープに３’末端で（Ｇｈｏｓｈら（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０４ｐｐ．５８−６６）及びイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）からの最大（３５ａａ）Ｔ細胞エピトープに５’末端で（Ｈｉｓタグの後）（Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１ｐｐ．２３２１−２３２９）遺伝子融合されている。突然変異部位は、ヒトＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに関する利用可能な科学的文献に基づき選択した：ＩＬ−１β点突然変異に対して、Ｓｉｍｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８ｐｐ．９７７１−９７７９及びＥｖａｎｓら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０ｐｐ．１１４７７−１１４８３及びＴＮＦ−α点突然変異に対してＺｈａｎｇら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７ｐｐ．２４０６９−２４０７５。あるＴＮＦ−α突然変異（突然変異番号１２、下記参照）は、自然突然変異と組み合わせた特異的点突然変異の誘導体である。タンパク質は全てＥ．コリにより発現させ、Ｈｉｓタグ精製し、ＬＰＳ含量について調べた。抗原として使用される被験タンパク質は全て、ＬＰＳ含量が＜２０Ｕ／ｍＬであった。１８種類の生物学的不活性突然変異体を作製した。これらの突然変異をコードするＤＮＡを下記で挙げる。
【００２５】
突然変異番号１は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｈ３０Ｇ  ＣａＩＬ−１β突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。このＤＮＡのヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３２−５８５は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）相当し、ヌクレオチド１６３Ｃ＞Ｇ及び１６４Ａ＞ＧはＨ３０Ｇ突然変異に相当する。
【００２６】
突然変異番号２は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｋ９２Ｇ  ＣａＩＬ−１β突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７２はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５２９−５８２は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド３４６Ａ＞Ｇ及び３４７Ａ＞ＧはＫ９２Ｇ突然変異に相当する。
【００２７】
突然変異番号３は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｈ３０Ｇ＋Ｋ９２Ｇ  ＣａＩＬ−１β二重突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３２−５８５は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド１６３Ｃ＞Ｇ及び１６４Ａ＞ＧはＨ３０Ｇ突然変異に相当し、ヌクレオチド３４９Ａ＞Ｇ及び３５０Ａ＞ＧはＫ９２Ｇ突然変異に相当する。
【００２８】
突然変異番号４は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｃ７Ｓ  ＣａＩＬ−１β突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３２−５８５は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド９８Ｇ＞ＣはＣ７Ｓ突然変異に相当する。
【００２９】
突然変異番号５は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｋ８Ｅ  ＣａＩＬ−１β突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３２−５８５は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド１００Ａ＞Ｇ及び１０２Ｇ＞ＡはＫ８Ｅ突然変異を表す。
【００３０】
突然変異番号６は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｌ９Ｓ  ＣａＩＬ−１β突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３２−５８５は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド１０４Ｔ＞ＣはＬ９Ｓ突然変異に相当する。
【００３１】
突然変異番号７は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｃ７Ｓ＋Ｋ８Ｅ＋Ｌ９Ｓ  ＣａＩＬ−１β三重突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３２−５８５は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド９８Ｇ＞ＣはＣ７Ｓ突然変異に相当し、ヌクレオチド１００Ａ＞Ｇ及び１０２Ｇ＞ＡはＫ８Ｅ突然変異に相当し、ヌクレオチド１０４Ｔ＞ＣはＬ９Ｓ突然変異に相当する。
【００３２】
突然変異番号８は、最大ＣＰＶ及びＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｃ７Ｓ  ＣａＩＬ−１β突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド７６−１７１は最大ＣＰＶエピトープ（３２アミノ酸）に相当し、ヌクレオチド６２８−７２６は最大ＣＤＶ−Ｆエピトープ（３２アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド１９４Ｇ＞ＣはＣ７Ｓ突然変異に相当する。
【００３３】
突然変異番号９は、最大ＣＰＶ及びＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｋ８Ｅ  ＣａＩＬ−１β突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド７６−１７１は最大ＣＰＶエピトープ（３２アミノ酸）に相当し、ヌクレオチド６２８−７２６は最大ＣＤＶ−Ｆエピトープ（３２アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド１９６Ａ＞Ｇ及び１９８Ｇ＞ＡはＫ８Ｅ突然変異に相当する。
【００３４】
突然変異番号１０は、最大ＣＰＶ及びＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｌ９Ｓ  ＣａＩＬ−１β突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７５はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド７６−１７１は最大ＣＰＶエピトープ（３２アミノ酸）に相当し、ヌクレオチド６２８−７２６は最大ＣＤＶ−Ｆエピトープ（３２アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド２００Ｔ＞ＣはＬ９Ｓ突然変異に相当する。
【００３５】
突然変異番号１１は、最大ＣＰＶ及びＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｃ７Ｓ＋Ｋ８Ｅ＋Ｌ９Ｓ  ＣａＩＬ−１β三重突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７６はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド７６−１７１は最大ＣＰＶエピトープ（３２アミノ酸）に相当し、ヌクレオチド６２８−７２６は最大ＣＤＶ−Ｆエピトープ（３２アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド１９４Ｇ＞ＣはＣ７Ｓ突然変異に相当し、ヌクレオチド１９６Ａ＞Ｇ及び１９８Ｇ＞ＡはＫ８Ｅ突然変異に相当し、ヌクレオチド２００Ｔ＞ＣはＬ９Ｓ突然変異に相当する。
【００３６】
突然変異番号１２は、最大ＣＰＶ及びＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｋ８Ｄ＋Ｌ９Ｓ＋Ｑ１０ｄｅｌ  ＣａＩＬ−１β三重突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−７６はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド７６−１７１は最大ＣＰＶエピトープ（３２アミノ酸）に相当し、ヌクレオチド６２５−７２３は最大ＣＤＶ−Ｆエピトープ（３２アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド１９６Ａ＞Ｇ及び１９８Ｇ＞ＴはＫ８Ｄ突然変異に相当し、ヌクレオチド２００Ｔ＞ＣはＬ９Ｓ突然変異に相当し、野生型配列と比較してアミノ酸１０が欠失していた（Ｑ１０ｄｅｌ）。
【００３７】
突然変異番号１３は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｙ８７Ｓ  ＣａＴＮＦ−α突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−６３はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３５−５８８は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド３２３Ａ＞ＣはＹ８７Ｓ突然変異に相当する。
【００３８】
突然変異番号１４は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｙ１１９Ｎ  ＣａＴＮＦ−α突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−６３はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３５−５８８は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド４１８Ｔ＞ＡはＹ１１９Ｎ突然変異に相当する。
【００３９】
突然変異番号１５は、最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｙ８７Ｓ＋Ｙ１１９Ｎ  Ｃａ  ＴＮＦ−α二重突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−６３はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド５３５−５８８は最小ＣＤＶ−Ｆエピトープ（１７アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド３２３Ａ＞ＣはＹ８７Ｓ突然変異に相当し、ヌクレオチド４１８Ｔ＞ＡはＹ１１９Ｎ突然変異に相当する。
【００４０】
突然変異番号１６は、最大ＣＰＶ及びＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｙ８７Ｓ  ＣａＴＮＦ−α突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−６３はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド６４−１５９は最大ＣＰＶエピトープ（３２アミノ酸）に相当し、ヌクレオチド６３１−７２９は最大ＣＤＶ−Ｆエピトープ（３２アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド４１９Ａ＞ＣはＹ８７Ｓ突然変異に相当する。
【００４１】
突然変異番号１７は、最大ＣＰＶ及びＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｙ１１９Ｎ  ＣａＴＮＦ−α突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−６３はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド６４−１５９は最大ＣＰＶエピトープ（３２アミノ酸）に相当し、ヌクレオチド６３１−７２６は最大ＣＤＶ−Ｆエピトープ（３２アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド５１４Ｔ＞ＡはＹ１１９Ｎ突然変異に相当する。
【００４２】
突然変異番号１８は、最大ＣＰＶ及びＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｙ８７Ｓ＋Ｙ１１９Ｎ  ＣａＴＮＦ−α二重突然変異に対するＤＮＡによりコードされる。ヌクレオチド１−６３はＨｉｓタグに相当し、ヌクレオチド６４−１５９は最大ＣＰＶエピトープ（３２アミノ酸）に相当し、ヌクレオチド６３１−７２６は最大ＣＤＶ−Ｆエピトープ（３２アミノ酸＋停止コドン）に相当し、ヌクレオチド４１９Ａ＞ＣはＹ８７Ｓ突然変異に相当し、ヌクレオチド５１４Ｔ＞ＡはＹ１１９Ｎ突然変異に相当する。
【００４３】
ワクチンアジュバント。使用されるアジュバントは、ＱｕｉｌＡ（０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳと略称、「食塩水」とも呼ばれる。）中の２５０μｇ／ｍＬ）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｃ（０．０１Ｍ  ＰＢＳ中の１２５μｇ／ｍＬ）及びＭｉｃｒｏｓｏｌ（２５％水中油エマルジョン）である。ＱｕｉｌＡは、南アメリカの樹木キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）（バラ科）の樹皮から単離される周知のサポニンアジュバントである。これは、Ｂｉｏｌａｎｇ、ＫａｌｖｅＨａｖｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ又はＲｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙから得ることができる。Ｍａｔｒｉｘ  Ｃ（免疫刺激複合体又はＩＳＣＯＭ）は、サポニン、コレステロール及びリン脂質（ホスファチジルコリン）を含有するワクチンアジュバントであり、これは、通常直径４０ｎｍのケージ様構造を形成する。これは、ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ又はＩｓｃｏｎｏｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから得ることができる。Ｍｉｃｒｏｓｏｌは、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓから入手可能な、１％Ｔｗｅｅｎ８０界面活性剤（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンオレイン酸）を用いることにより安定化された、水中の小さな（通常１μｍ以下）鉱油滴（ＥｘｘｏｎＭｏｂｉｌのＭａｒｃｏｌ  ５２）から構成される水中油エマルジョンである。
【００４４】
実験計画
生物学的活性（ｗｔ）サイトカイン「単独」実験に対して、計画は次のとおりである。表１で示されるように、５つの群のおよそ４ヶ月齢の標準的ビーグル犬の右胴部に、処方物１．０ｍＬをｓ．ｃ．でワクチン接種した。
【００４５】
【表１】
2010540487.tif 000002
【００４６】
初回ワクチン接種から４、８、２０及び２４週間後に、イヌに１．０ｍＬの追加ワクチン接種を行った（右胴部にｓ．ｃ．）。初回ワクチン接種後Ｔ＝０、３、６、９、１２、１６、２０、２４、２８、３２及び３６週に血液試料を採取した。血清を使用して、（１）抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いてＣａＩＬ−１β及びＣａＴＮＦ−αに対する抗体レベルを調べ；（２）ウエスタンブロット分析について調べ；（３）中和抗体について調べた。
【００４７】
混合生物学的活性（ｗｔ）／ビオチン活性（ｍｔ）サイトカイン実験に対して、計画は次のとおりである。表１Ａで示されるように、１５−１８週齢の標準的ビーグル犬の６つの群に対して、右胴部に処方物１．０ｍＬをｓ．ｃ．でワクチン接種した。この実験において、１突然変異  ＣａＩＬ−１βタンパク質（突然変異番号４：最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｃ７Ｓ  ＣａＩＬ−１β突然変異）及び１突然変異  ＣａＴＮＦ−αタンパク質（突然変異番号１３：最小ＣＤＶ−Ｆタグ付加Ｙ８７Ｓ  Ｃａ  ＴＮＦ−α突然変異）を単一のタンパク質−抗原で又は組み合わせて試験した。
【００４８】
【表２】
2010540487.tif 000003
【００４９】
初回ワクチン接種から４、８、１１、１４及び１６週間後に、イヌに１．０ｍＬを追加免疫した（右胴部にｓ．ｃ．）。初回ワクチン接種後Ｔ＝０、４、８、１１、１４、１６及び１７週に血液試料を採取した。抗原特異的ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ捕捉法）を用いてＣａＩＬ−１β及びＣａＴＮＦ−αに対する抗体レベルを調べるために、血清を使用した。
【００５０】
ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット分析。標準的手順を用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。このために、捕捉ポリクローナルヤギ−抗イヌＩＬ−１β及び捕捉モノクローナルマウス−抗イヌＴＮＦ−α抗体を使用して、９６ウェルマイクロタイタープレートを被覆した。次に、Ｃ末端へのＨｉｓ（Ｃ−Ｈｉｓ）−タグ付加ＣａＩＬ−１β又はＣ−Ｈｉｓタグ付加ＣａＴＮＦ−αをプレートに添加し、続いて、イヌ血清の希釈系列を連続的に添加した。ポリクローナルウサギ−抗イヌＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ−標識抗体を用いて、抗ＩＬ−１β又は抗ＴＮＦ−α特異的抗体の結合を検出した。
【００５１】
ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αバイオアッセイの阻害。阻害を測定するために、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α反応性ＮＩＨ−３Ｔ３  ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター細胞株を使用した。Ｃａ及びＥｑ  ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αタンパク質１０ｎｇ／ｍＬとともに、いくつかの時点からのイヌプール血清を予温置し、中和活性について、即ち受容体結合の阻害活性について試験した。抗体によるＩＬ−１β又はＴＮＦ−α活性の阻害は、相対光単位（ＲＬＵ）で定量した。
【００５２】
Ｂ．ビーグル犬における尿酸結晶誘発性ＯＡモデルの設定
実験計画。発明者らは、尿酸結晶誘発性変形性関節症モデルを使用した（とりわけＢｏｎｎｅａｕら；Ｒｅｖｕｅ  Ｍｅｄ．Ｖｅｔ．、２００５、１５６、４、１７９−１８１）。４匹の標準的ビーグル犬の２つの群（およそ５ヶ月齢）に対して、１カ所の膝関節（後肢）に、１．０ｍＬ  ０．９％ＮａＣｌ（対照群）又は０．９％ＮａＣｌ中の１０ｍｇ／ｍＬ尿酸結晶１．０ｍＬ（ＯＡモデル群）の何れかを関節内注入した。全身麻酔下で１．０ｍＬ溶液の関節内注入を行った。注入後Ｔ＝０、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、３０ｈ、４８ｈ、７２ｈ及び９６ｈに、一般行動、跛行（立位及び歩行時に点数化）、触診時の疼痛及び膝関節滲出（腫脹）を各イヌに対して点数化した。実験終了時に、イヌを安楽死させ、病理医の立会いのもと、肉眼で膝を観察した。
【００５３】
尿酸結晶。関節内注入のために、０．９％ＮａＣｌ溶液中の１０ｍｇ／ｍＬ尿酸結晶（Ｓｉｇｍａ  ｉｔｅｍｎｒ．Ｕ２８７５；バッチ番号１２０Ｋ５３０５）を使用した。このために、５０ｍｇ／ｇの濃度の０．９％ＮａＣｌ中の尿酸結晶溶液２２ｇを調製した。粒子≦５０μｍ（顕微鏡による試験）の縣濁液が得られるまでこの溶液を超音波処理した。顕微鏡画像により粒子のサイズが≦５０μであることを確認した後、０．９％ＮａＣｌで２０ｇ縣濁液を１００ｇに希釈した（最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）。ｐＨ７．０にｐＨを調整し、縣濁液をオートクレーブ処理した。オートクレーブ処理の直前及び直後に結晶サイズ（≦５０μｍとなるはず）についても顕微鏡画像を調べた。調製後、縣濁液をさらなる使用まで２−８℃で保存した。
【００５４】
同定。個々のイヌの耳に番号を付けた（刺青）。
【００５５】
飼育。イヌを１匹ずつ、自然な無制限環境下で通常の犬小屋に収容し、屋外運動を可能にし、自由に水を飲めるようにした。制限付きでパンくずを摂取できるようにした。
【００５６】
【表３】
2010540487.tif 000004
【００５７】
０．９％ＮａＣｌの注入。群１（対照群）からの４匹の動物に対して、１カ所の膝関節（剃毛した左後肢）に、全身麻酔下で１．０ｍＬ  ０．９％ＮａＣｌを関節内注入した。
【００５８】
尿酸結晶の注入。群２からの４匹の動物（ＯＡモデル群）の１カ所の膝関節（剃毛した左後肢）に、全身麻酔下で０．９％ＮａＣｌ中の１．０ｍＬ  １０ｍｇ／ｍＬ尿酸結晶を関節内注入した。
【００５９】
実験手順及びパラメータ
観察。注入後Ｔ＝０、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、３０ｈ、４８ｈ、７２ｈ及び９６ｈに、一般行動、跛行（立位及び歩行時に点数化）、触診時の疼痛及び膝関節滲出（腫脹）を各イヌについて点数化した。イヌを最初にそれらのケージ中で観察して点数化し、続いて歩行中及び最後に観察テーブル上で立位時に、観察し、点数化した。
【００６０】
跛行の点数化：
立位スコア
０：全体重負荷で正常に立位。
１：一部体重負荷で異常姿勢。
２：体重をかけずに異常姿勢（３本肢のイヌ）。
３：起き上がるのを嫌がる。
【００６１】
歩行スコア
０：全体重負荷で正常に歩行。
１：一部体重負荷でわずかに跛行。
２：断続的体重負荷で明らかに跛行。
３：体重をかけない（３本肢のイヌ）。
４：歩行を嫌がる。
【００６２】
速歩スコア
０：全体重負荷で正常に速歩。
１：一部体重負荷でわずかに跛行。
２：断続的体重負荷で明らかに跛行。
３：体重をかけない（３本肢のイヌ）。
４：速歩を嫌がる。
【００６３】
触診時疼痛スコア：
０：疼痛の兆候なし。
１：軽度から中程度の疼痛（触診には応じるが首を回すか又は引っ込め、発声、鬱状態）。
２：重度疼痛（実験者に関節を触診させない。）。
【００６４】
非注入関節スコアと比較した膝関節滲出（腫脹）：
０：関節滲出なし（触診可能な明らかな膝蓋靱帯）。
１：軽度滲出（靱帯が明確である最小滑液充満）。
２：中程度の滲出（靭帯が不明瞭な明らかな滑液充満）。
３：重度滲出（靭帯触診不可能）。
【００６５】
Ｃ．シェトランドポニーでの尿酸結晶誘発性ＯＡモデルの設定
実験設計。発明者らは、ポニーにおいて同じ変形性関節症モデルを使用した。２頭の標準的なシェトランドポニーの２つの群（およそ１２ヶ月齢）に対して、１カ所の膝関節（右後肢）に５．０ｍＬ  ０．９％ＮａＣｌ（対照群）又は０．９％ＮａＣｌ中の５．０ｍＬ  １０ｍｇ／ｍＬ尿酸結晶（ＯＡモデル群）の何れかを関節内注入した。軽度鎮静下で５．０ｍＬ溶液の関節内注入を行った。注入後、Ｔ＝０、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、３０ｈ、４８ｈ、７２ｈ及び９６ｈに、一般行動、跛行（立位及び歩行時に点数化）、触診時の疼痛及び膝関節滲出（腫脹）を各個々のポニーについて点数化した。実験終了時に、ポニーを安楽死させ、病理医の立会いのもと、肉眼で観察した。
【００６６】
尿酸結晶。セクションＢ参照。
【００６７】
識別。シェトランドポニーを移植チップ及び番号付きの首輪により識別した。
【００６８】
飼育。自然な無制限環境下で通常の馬小屋に１匹ずつ収容したポニーに自由に干草及び水を摂取させ、制限付きでパンくずを摂取可能にした。
【００６９】
【表４】
2010540487.tif 000005
【００７０】
０．９％ＮａＣｌの注入。群１（対照群）からの２匹の動物に対して、１カ所の膝関節（剃毛した右後肢）に軽度鎮静下で５．０ｍＬ  ０．９％ＮａＣｌを関節内注入した。
【００７１】
尿酸結晶の注入。群２からの２匹の動物（ＯＡモデル群）に対して、１カ所の膝関節（剃毛した右後肢）に軽度鎮静下で０．９％ＮａＣｌ中の５．０ｍＬ  １０ｍｇ／ｍＬ尿酸結晶を関節内注入した。
【００７２】
実験手順及びパラメーター
観察。注入後Ｔ＝０、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、３０ｈ、４８ｈ、７２ｈ及び９６ｈに、一般行動、跛行（立位及び歩行時に点数化）、触診時の疼痛及び膝関節滲出（腫脹）を各ポニーに対して点数化した。
【００７３】
ポニーの馬小屋中で、続いて廊下での歩行中に、ポニーを観察し、点数化した。
【００７４】
跛行点数化：
立位スコア
０：全体重負荷で正常に立位。
１：一部体重負荷で異常姿勢。
２：体重をかけずに異常姿勢（３本肢のポニー）。
３：起き上がるのを嫌がる。
【００７５】
歩行スコア
０：全体重負荷で正常に歩行。
１：一部体重負荷でわずかに跛行。
２：断続的体重負荷で明らかに跛行。
３：体重をかけない（３本肢のポニー）。
４：歩行を嫌がる。
【００７６】
触診時疼痛スコア：
０：疼痛の兆候なし。
１：軽度から中程度の疼痛（触診には応じるが首を回すか又は引っ込め、発声、鬱状態）。
２：重度疼痛（実験者に関節を触診させない。）
【００７７】
非注入関節スコアと比較した膝関節滲出（腫脹）：
０：関節滲出なし（触診可能な明らかな膝蓋靱帯）。
１：軽度滲出（靱帯が明確である最小滑液充満）。
２：中程度の滲出（靭帯が不明瞭な明らかな滑液充満）。
３：重度滲出（靭帯触診不可能）。
【００７８】
Ｄ．ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに対して予防的にワクチン接種されたビーグル犬でのＯＡ症候の予防
実験的ワクチン接種計画。実験Ａにおいて、「ｗｔ単独」実験に対して、ワクチン接種後Ｔ＝０、Ｔ＝４、Ｔ＝８、Ｔ＝２０及びＴ＝２４週に、群あたりいくつかの異なる免疫増強物質とともに処方したＩＬ−１β及びＴＮＦ−αを、被験犬にワクチン接種した（表１参照）。本実験の場合、これらのイヌに対して、表４で示されるような１．０ｍＬ（右胴部でｓ．ｃ．）ワクチン処方物で、最後のワクチン接種から２４週間後に再び２回ワクチン接種した（即ち、初回ワクチン接種後Ｔ＝４８及びＴ＝５４週）。初回ワクチン接種後Ｔ＝４８、Ｔ＝５４及びＴ＝５８に、血清学試験のために血液試料を採取した。抗原特異的ＥＬＩＳＡ及び標準的手順を用いてＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに対する抗体レベルを調べるために、血清を使用した。
【００７９】
【表５】
2010540487.tif 000006
【００８０】
混合ｗｔ／ｍｔ実験の場合、表１Ａで示されるような実験的ワクチン接種を使用した。
【００８１】
ＯＡの誘発。ｗｔ単独実験の場合、最後の血液試料採取から１週間後（Ｔ＝５９週）、群１からのイヌ（ＰＢＳ対照群）を２つの新しい群（Ｎ＝２及びＮ＝４）に分けた。この時点でおよそ１８ヶ月齢の５つの群からの全てのイヌに対して、１カ所の膝関節（後肢）に、１．０ｍＬ  ０．９％ＮａＣｌ（対照群）又は０．９％ＮａＣｌ中の１０ｍｇ／ｍＬ尿酸結晶１．０ｍＬ（ＯＡモデル群２−５）の何れかを関節内注入した。全身麻酔下で１．０ｍＬ溶液の関節内注入を行った。注入後、Ｔ＝０、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、３２ｈ、４８ｈ、７２ｈ及び９６ｈに、一般行動、跛行（立位及び歩行時に点数化）、触診時の疼痛及び膝関節滲出（腫脹）を各イヌに対して点数化した。実験終了時に、イヌを安楽死させ、病理医の立会いのもと、肉眼で膝を観察した。
【００８２】
【表６】
2010540487.tif 000007
【００８３】
混合ｗｔ／ｍｔ実験の場合、表１Ａで示されるようにＯＡの誘発を設定した。
【００８４】
跛行点数化：セクションＢ参照。
【００８５】
統計学的分析。多重比較検定として最小有意差（Ｌ．Ｓ．Ｄ．）による分散分析を用いて（ＡＮＯＶＡ）平均スコア値の比較を行った。ＳＡＳ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｇｕｉｄｅ  ２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）ソフトウェアを使用して全結果を生成させた。９５％（Ｐ＜０．０５）の信頼水準で、差が有意であるとみなした。
【００８６】
２．結果
Ａ．イヌにおける自己ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに対する抗体の誘導
ワクチン接種による副作用（ｗｔ単独実験）。初回ワクチン接種（ｐｒｉｍｏ）後、ＱｕｉｌＡ中のＥｑタンパク質を与えられたイヌに局所（皮膚）反応が見られた。従って、続く追加ワクチン接種において、発明者らは、このワクチン接種群でＱｕｉｌＡの代わりにＰＢＳを使用した（表１も参照）。初回追加ワクチン接種の直後、群２（ＱｕｉｌＡ中のＣａタンパク質）、３（Ｍａｔｒｉｘ−Ｃ中のＣａタンパク質）及び４（Ｍｉｃｒｏｓｏｌ中のＣａタンパク質）からの殆どのイヌが体調を崩したが、これは、おそらく、ワクチン製剤中に（遊離）生物学的活性ＴＮＦ−αの高濃度が存在するためであると思われる。これらの急性の全身性副作用は、続く追加ワクチン接種において、５０μｇ／投与／イヌから５μｇ／投与／イヌに、ＴＮＦ−α、Ｃａ及びＥｑタンパク質の両方の量を減量することにより対処した。
【００８７】
ワクチン接種による副作用（混合ｗｔ／ｍｔ実験）。初回ワクチン接種（ｐｒｉｍｏ）後、Ｍｉｃｒｏｓｏｌアジュバント（群３−６）を投与されたイヌの殆どにおいて局所（皮膚）反応が見られた。初回及び続く（追加）ワクチン接種後、局所反応はさほど明確ではなかった。使用されたＣａＩＬ−１β及びＣａＴＮＦ−αタンパク質濃度で急性の全身性副作用は観察されなかった。
【００８８】
ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α（ｗｔ単独実験）に対する抗体力価。図１Ａ−Ｄで示されるように、自己分子ＣａＩＬ−１β及びＣａＴＮＦ−αに対して顕著なＥＬＩＳＡ抗体力価が生じ得る。抗体が交差反応性であること、即ち、Ｃａタンパク質に対して生じる抗体がＥｑタンパク質を認識すること又はその逆は、これらの図面から明らかである。ＣａＴＮＦ−αに対して生じた抗体が、特に早い時間点で、ＣａＴＮＦ−αタンパク質よりも高い力価（おそらく親和性／特異性による）でＥｑＴＮＦ−αを認識することは注目すべきものである（図１Ｃ及び１Ｄ）。一般に、対応するＥｑ型と比較した場合にＣａタンパク質でワクチン接種されたイヌにおいて全体的抗体力価がより高い。初回ワクチン接種から１２週間後、飼育の限界のために、群１及び３を実験から除外した。まとめると、遺伝子改変イヌ自己分子又は異種ウマタンパク質を使用することによって、自己に対する免疫寛容性を打破し、高い抗体力価を誘導することができると結論付けることができる。突然変異サイトカインを用いて同等の結果が得られたことに注意されたい。
【００８９】
ウエスタンブロット分析。抗ＩＬ−１β及び抗ＴＮＦ−α抗体の特異性を確認するために、ＣＤＶ−タグ付加及び非タグ付加タンパク質を用いてウエスタンブロット分析を行った。初回ワクチン接種後Ｔ＝９週からの血清とともにウエスタンブロットを温置した。図２で示されるように、全ての抗体がＣａ及びＥｑ  ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αタンパク質と交差反応する。非関連Ｈｉｓタグ精製Ｅ．コリ発現タンパク質、ニワトリＩＬ−１８（Ｃｈ  ＩＬ−１８）を対照として使用し、これは本抗体により認識されなかった。
【００９０】
抗ＩＬ−１β及び抗ＴＮＦ−α抗体の中和能。ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに対してイヌにおいて高抗体力価が誘導されたが、これらの抗体が対応するタンパク質の生物学的活性を中和することができるか否かは明らかではなかった。このために、発明者らは、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α反応性ＮＩＨ−３Ｔ３  ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター細胞株を使用した。いくつかの時間点からのプール血清とともにＣａ及びＥｑ  ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αを予温置し、中和活性、即ち受容体結合の阻害活性について試験した。図３Ａ及び３Ｂで示される結果から、初回ワクチン接種から２４週後からのプール血清が最良の抗ＣａＩＬ−１β及び抗ＥｑＩＬ−１β中和抗体を含有すると、結論付けることができる。相対光単位（ＲＬＵ）で測定されたＣａＩＬ−１β及びＥｑＩＬ−１βの生物学的活性は、その他の血清と比較した場合、劇的に低かった。目立たないものの、これは、ＣａＴＮＦ−α及びＥｑＴＮＦ−α（図３Ｃ及び３Ｄ）の生物学的活性の阻害に対しても同じである。初回ワクチン接種後６週及び９＋１２週からのプール血清には、中和ＩＬ−１β抗体はあまり含有されないが、顕著な中和ＴＮＦ−α抗体が含有される。
【００９１】
結論
結論として、発明者らは、最小ＣＤＶ−タグ付加野生型及び突然変異ＣａＩＬ−１β及びＣａＴＮＦ−α自己分子に対する能動免疫付与により、発明者らが抗体を生成させることができる明確な証拠を提供した。
【００９２】
Ｂ．ビーグル犬における尿酸結晶誘発性ＯＡモデルの設定
膝関節への液体注入。一般に、重篤な副作用なく、１．０ｍＬ  ０．９％ＮａＣｌ又は０．９％ＮａＣｌ中の１．０ｍＬ  １０ｍｇ／ｍＬ尿酸結晶の膝関節への注入を行った。
【００９３】
臨床評価：跛行の点数化。尿酸結晶を注入された動物は、注入後２時間以内に、歩行及び立位時の両方で明らかな跛行を示した（図４参照）。２匹のイヌは２４時間以内に完全に回復したが、一方でその他の２匹のイヌは実験終了まで尿酸結晶による障害があった。安楽死させたイヌの膝関節の肉眼での観察の結果から、これらの２匹のイヌが膝蓋骨脱臼していたことが明らかになった（解剖学的関節異常）。尿酸結晶溶液注入と相まって、この膝蓋骨脱臼の結果、おそらく、上述のように不快症状期間が長くなったと思われる。０．９％ＮａＣｌ溶液のみを注入されたイヌの群では、１匹のみが注入により短時間、不快症状を示した（Ｔ＝８時間で見ることができる。）。このイヌの膝関節を肉眼で観察したところ、この動物も膝蓋骨脱臼していたことが明らかになった。
【００９４】
臨床評価：触診時の疼痛及び膝関節滲出（腫脹）。触診時の疼痛及び膝関節滲出も監視した。図５で見られ得るように、ＳＥＭ（標準誤差）が大きく、このことから、個々のイヌの間でかなりの変動があることが示される。尿酸結晶注入から２から８時間後、触診時の疼痛が測定可能であり、４から６時間の間に最大となる。膝関節滲出は、触診時の疼痛と比較して若干遅く、注入後４時間から始まり、８時間で最大となる。
【００９５】
臨床評価：膝の病理。実験終了時に、全てのイヌを安楽死させ、肉眼で膝を観察した。全てのイヌで、注入溶液の痕跡は見られなかった。１匹のイヌでのみ、注入部位が依然として明らかであった。３匹のイヌの膝において、大量の液体が見られた。これらの３匹のイヌは膝蓋骨脱臼していたことが分かった。
【００９６】
結論
１カ所の膝関節（後肢）への尿酸結晶を含有する溶液の関節内注入によるイヌにおける応用関節炎モデルは、急性であり（２時間以内に影響が見られる。）、持続時間が短く（１−２日間の時間）、可逆的である。プロセスを監視するための関連パラメータには、歩行及び立位時の跛行、触診時の疼痛及び関節滲出の点数化が含まれる。体温及び膝温度はこのモデルにおいて非関連パラメータである。
【００９７】
Ｃ．シェトランドポニーにおける尿酸結晶誘発性ＯＡモデルの設定
膝関節への液体注入。一般に、重篤な副作用なく、５．０ｍＬ  ０．９％ＮａＣｌ又は０．９％ＮａＣｌ中の５．０ｍＬ  １０ｍｇ／ｍＬ尿酸結晶の膝関節への注入を行った。
【００９８】
臨床評価：跛行の点数化。尿酸結晶を注入されたポニーは、注入後２時間以内に、歩行及び立位時の両方で明らかな跛行を示した（図６参照）。最大不快症状は、注入後６から８時間の間に点数化した。２頭の対照ポニーは跛行の兆候を示さなかった。
【００９９】
臨床評価：触診時の疼痛及び膝関節滲出（腫脹）。触診時の疼痛及び膝関節滲出も監視した。図７Ａで見られ得るように、注入後２時間以内に疼痛を点数化し、一方、膝関節滲出（図７Ｂ）はより後の段階（＞４８時間）で検出可能であった。膝関節滲出は７２から９６時間の間、増加しないので、このことから、腫脹が９６時間で最大となることが示され得る。
【０１００】
臨床評価：膝の病理。実験終了時に、全てのポニーを安楽死させ、肉眼で膝を観察した。全てのポニーで、注入溶液の痕跡は見られ得なかった。尿酸を注入されたポニーの膝関節の肉眼的観察から、黄色の滑液量増加、浮腫及び出血を伴う滑膜の肥厚が示された。対照では病理的なものは見られなかった。
【０１０１】
結論。１カ所の膝関節（右後肢）への尿酸結晶含有溶液の関節内注入によるポニーにおける応用関節炎モデルは、発明者らがイヌでも示したように、跛行及び疼痛を点数化する場合、急性であり（２時間以内に影響が見られる。）、持続時間が短く（１−２日間の時間）、可逆的である。膝関節滲出（腫脹）は明瞭であり、注入から４８時間後に始まり、７２時間から９６時間の間に最大に到達すると思われる。
【０１０２】
Ｄ．ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに対して予防的にワクチン接種されたビーグル犬におけるＯＡ症候の予防
再ワクチン接種後のＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに対する抗体力価。図８Ａ−Ｄで示されるように（ｗｔ単独実験）、ワクチン接種後Ｔ＝４８週、即ち、最後の追加ワクチン接種後２４週での全体的抗体力価は、幾分高レベルで維持された。イヌの再ワクチン接種の結果、全ての被験抗原及び全ての群を通じて、抗体力価が中等度に上昇した。
【０１０３】
臨床評価：不快症状スコア。図９において（ｗｔ単独実験）、「立位」（図９Ｂ）、「歩行」（図９Ｃ）、「触診時の疼痛」（図９Ｄ）、「膝関節滲出（腫脹）」（図９Ｅ）及び「総臨床スコア」（測定した全ての不快症状スコアの平均である。）に対する不快症状スコア（図９Ａ）を示す。全ての図から、非ワクチン接種のイヌが、注入後２時間以内に明らかな不快症状を示したことは明らかである。いくつかの場合で顕著に、示されたワクチン接種されたイヌの不快症状は軽度なものへと軽減されるか又は緩和された。これらの図で見られ得るように、ワクチン接種したイヌに対する不快症状スコアは、非ワクチン接種のイヌと比較した場合、顕著に低下し、遅延を示した。
【０１０４】
臨床評価：膝の病理。実験終了時に、全てのイヌを安楽死させ、病理学者が肉眼で膝を観察した。一般に、ＮａＣｌ対照イヌを除き、全てのイヌにおいて、滑膜が肥厚し、赤味を帯びているように見えた。全ての膝において、この次に、少量の粘液性の液体が検出された。
【０１０５】
臨床評価：不快症状スコア。図１０において（混合ｗｔ／ｍｔ実験）、「立位」（図１０Ａ）及び「歩行」（図１０Ｂ）に対する不快症状スコアは、関節内尿酸注入後６時間及び８時間の時間点で示される。両図から、非ワクチン接種のイヌ（尿酸対照群）が注入後６時間及び８時間で明白な不快症状を示したことが明らかである。示されたワクチン接種したイヌは、いくつかの場合で顕著に、不快症状が軽度へと軽減又は緩和された。図１０で見られ得るように、ワクチン接種されたイヌに対する不快症状スコアは、非ワクチン接種のイヌ（尿酸対照群）と比較した場合、顕著に低かった。特に、注入後８時間で、野生型ＣａＩＬ−１β単独又は突然変異ＣａＩＬ−１β単独でのワクチン接種によって、非ワクチン接種尿酸対照のイヌと比較した場合、不快症状が軽減したことも明らかである。
【０１０６】
結論
この実験から得られた結果から、発明者らは、野生型又は突然変異サイトカインの何れかの使用に基づき、自己分子ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに対する抗体を誘導することができ、ＩＬ−β単独に対するか又はＴＮＦ−αにも対するかの何れかのこれらの抗体が関節炎の症状を抑制することができると結論付けることができる。最良の結果は、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの両方に対するワクチンで得られると思われると結論付けることもできる。
【０１０７】
Ｅ．変形物（ｖａｒｉｏｕｓ）
生物学的活性ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αを用いて、発明者らが急性の副作用を見たことに注意されたい。これらの副作用は、例えば米国特許第６，０９３，４０５号から知られるように、これらのサイトカインの生物学的不活性型を用いることにより対処することができる。免疫原性と生物学的活性とのバランスを取るために、ある程度不活性なサイトカインを選択し得る。発明者らは、ＯＡを誘発するために尿酸結晶モデルを使用した。例えば前十字靭帯離断モデル（ＡＣＬＴ、Ｆｌｅｍｉｎｇら；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ．２００５年１０月；１６（５）：３５４−３６２に記載）又はグルーブモデル（Ｇｒｏｏｖｅ  ｍｏｄｅｌ）（Ｍａｓｔｂｅｒｇｅｎら；Ｒｈｅｕｍａｔｈｏｌｏｇｙ、２００６；４５（４）：４０５−４１３に記載）など、ＯＡに対するその他のモデルが、先行技術から知られていることに注意されたい。本願で記載される実験の肯定的な結果を考えると、天然の原因によるＯＡに罹患しているか又はこれを発症しているこれらのモデル又は患者に適用する場合、対応する結果が得られると考えられる。発明者らは、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α又はその誘導体の組み合わせでワクチン接種される場合、ＯＡ患者に対する苦痛軽減において顕著な効果を示した。これは、ビーグル犬において示された。この脊椎動物における結果及び、脊椎動物の群、イヌ、ウマ及びヒトなどの特に哺乳脊椎動物の関節に関する生理学的プロセスの類似性を考えると、本発明は、あらゆる脊椎動物、特に哺乳脊椎動物で使用することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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