(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質結合性ポリペプチドと脂質とを含むディスク状粒子の製造方法であって、
前記方法は、以下の工程：
（ａ）液性環境中で脂質結合性ポリペプチドを洗浄剤で可溶化された脂質に接触させる工程と、
（ｂ）ｐＨ６．０〜１０．０で前記粒子を自己集合させる工程と
を含み、
前記脂質結合性ポリペプチドが、
（ａ）脂質と相互作用するタンパク質のＳＡＰＬＩＰファミリーに属するサポシン様タンパク質（ＳＡＰＬＩＰ）、又は
（ｂ）その誘導体の形態
であり、前記誘導体は、
（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、若しくは６で表される全長配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質；
（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、若しくは６で表される全長配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するタンパク質、ここで、前記タンパク質は両親媒性であり、少なくとも１つのαへリックスを形成し、そして前記工程（ｂ）において、可溶化された脂質とともにリポタンパク質粒子中に自己集合することができるものとする；又は
（ｉｉｉ）アミノ酸１〜４０個が欠失、付加、挿入及び／又は置換された配列番号１、２、３、４、５、若しくは６で表される配列を含むタンパク質
であり、そして、
前記粒子は、親水性又は水性のコアを含まない、前記方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）が、工程（ａ）において得られた混合物を、前記工程（ａ）において得られた混合物よりも少ない量の洗浄剤を含有する液体で希釈する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、工程（ｂ）において又は後続工程（ｃ）として遊離脂質及び／又は遊離脂質結合性ポリペプチドの少なくとも部分的な除去による前記粒子の精製を含み、場合により、前記精製が、クロマトグラフィー、特にサイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分離、透析、洗浄剤結合性バイオビーズへの接触、濃縮器の使用、アフィニティークロマトグラフィー、磁気ビーズ、及び／又は結合していない／組み込まれていない脂質及び／又は疎水性化合物を除去するための膜／フィルターにより実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
脂質結合性ポリペプチドと、
脂質と、
疎水性剤と
を含む、ディスク状粒子であって、
前記粒子は、親水性又は水性のコアを含まず、
前記疎水性剤は、脂質又は洗浄剤ではなく、そして
前記脂質結合性ポリペプチドは、
（ａ）脂質と相互作用するタンパク質のＳＡＰＬＩＰファミリーに属するサポシン様タンパク質（ＳＡＰＬＩＰ）、又は
（ｂ）その誘導体の形態
であり、前記誘導体は、
（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、若しくは６で表される全長配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質；
（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、若しくは６で表される全長配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するタンパク質、ここで、前記タンパク質は両親媒性であり、少なくとも１つのαへリックスを形成し、そして、請求項１に記載の方法において使用される場合には、可溶化された脂質とともにリポタンパク質粒子中に自己集合することができるものとする；又は
（ｉｉｉ）アミノ酸１〜４０個が欠失、付加、挿入及び／又は置換された配列番号１、２、３、４、５、若しくは６で表される配列を含むタンパク質
である、前記ディスク状粒子。
【請求項５】
前記粒子が、最大直径２ｎｍ〜２００ｎｍ、特に３ｎｍ〜１５０ｎｍ、好ましくは３ｎｍ〜１００ｎｍを有する、請求項４に記載の粒子。
【請求項６】
前記疎水性剤が、疎水性有機化合物及び疎水性生体分子からなる群から選択される、請求項４又は５に記載の粒子。
【請求項７】
前記疎水性有機化合物及び疎水性生体分子が、生物学的活性剤、薬剤、薬剤の活性成分、化粧料生成物の活性成分、植物保護生成物の活性成分、栄養及び／又は栄養補助食品、診断用プローブ、造影剤、標識、及びインジケータからなる群から選択される、請求項６に記載の粒子。
【請求項８】
前記疎水性生体分子が、疎水性部分を含むタンパク質であり、特に膜タンパク質、内在性膜貫通タンパク質、内在性モノトピック膜タンパク質、周辺膜タンパク質、脂質に結合した状態のアンフィトロピックタンパク質、脂質アンカー型タンパク質、並びに融合された疎水性及び／又は膜貫通ドメインを有するキメラタンパク質からなる群から選択されるタンパク質である、請求項６又は７に記載の粒子。
【請求項９】
前記脂質が、脂質二重層形成性脂質、及び／又は生体適合性脂質である、請求項４〜８のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１０】
前記脂質が、真核生物の脂質、リン脂質、及び／又は脳の白質及び灰白質中に存在する脂質からなる群から選択され、特に、脂質が、リン脂質、スフィンゴ糖脂質、ステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、２−オレオイル−１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、２−オレオイル−１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＰＯＰＧ）、２−オレオイル−１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジアシルグリセロール、コレステロール、スフィンゴミエリン、ガラクトシルセラミド、ガングリオシド、ホスファチジルイノシトール、及びスルホガラクトセラミド、又はそれらの組み合わせから選択され、そして特に好ましくは、脂質が、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む、請求項４〜９のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１１】
前記脂質結合性ポリペプチドが、機能的部分、例えば標的部分又は生物活性部分、をさらに含むキメラポリペプチドである、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１２】
前記脂質結合性ポリペプチドが、サポシンＡ又はその誘導体若しくはトランケーティッド体、特に、配列番号１との配列同一性の少なくとも６０％を有するアミノ酸配列を含むサポシンＡの誘導体である、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１３】
前記粒子が、請求項６において定義される通りであり、前記脂質が、請求項９又は１０において定義される通りであり、及び／又は前記脂質結合性ポリペプチドが、請求項１１又は１２において定義される通りである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の粒子の製造用の請求項１〜３及び１３のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ａ）において、前記脂質結合性ポリペプチドを、前記粒子内に組み込まれるべき疎水性剤を含む液性環境中で脂質に接触させるものとし、そして場合により、前記疎水性剤が、請求項６〜８のいずれか一項において定義される通りである、前記方法。
【請求項１５】
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の粒子を含み、疎水性剤が活性成分であり、及び／又は前記疎水性剤に加えて活性成分が存在する、必要とする個体に疎水性剤を送達するための医薬組成物。
【請求項１６】
医薬分野における使用のための、特に、疾患の重篤度の予防、治療、若しくは軽減における使用のための、又は診断方法若しくは化粧法における使用のための、又はワクチン製剤としての、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１７】
疎水性剤送達粒子としての、薬剤開発用、薬剤スクリーニング用、又は膜タンパク質研究用ツールとしての、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の技術分野】
【０００１】
本発明は、リポタンパク質粒子、疎水性剤（hydrophobic agents）例えば疎水性薬剤（hydrophobic drugs）又は膜タンパク質用の送達又は運搬システムとしてのそれらの使用、及び前記ディスク状リポタンパク質（disk-like lipoproteins）の製造方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
膜タンパク質及び疎水性化合物は、医薬品又はライフサイエンス研究及び用途のための主要な課題の２つ：（ｉ）不溶性疎水性化合物又は膜タンパク質を水溶液中で可溶性にすること、並びに（ｉｉ）前記物質の治療剤及び診断薬としての投与、に対処しそして代表するには悪名高いほどに困難である。
【０００３】
膜タンパク質は、全ＯＲＦの約３０％によりコードされており（Wallin and von Heijne, Protein Science 1998 Apr; 7 (4):1029-38）、そして薬剤の大部分すなわち６０％以上が、実際はこのクラスのタンパク質を標的としていることから（Overington et al., Nature Reviews Drug Discovery 5, 993-996 (December 2006)）、薬剤標的の重要なクラスを代表している。膜タンパク質は、多くの生物学的プロセス、例えばシグナル伝達、分子及びエネルギーの輸送、認識、並びに細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしている。しかし、膜タンパク質は、天然の脂質二重層環境から抽出されたときに凝集するそれらの傾向及びそれらの不溶性のために、研究することが困難である。膜タンパク質の完全性を維持するためには、人工的な疎水性環境が必要である。ここで、最も一般的に使用される洗浄剤ミセルは、しかしながら、生体適合性にマイナスの影響を与える可能性があり、膜タンパク質の活性に有害な影響を与える可能性があり、そしてアッセイのための実験条件を妨害する可能性がある。
【０００４】
別の主要な薬理学的な課題は、疎水性タンパク質及び／又は疎水性化合物の、治療剤又は診断薬としての投与及び送達により代表される。疎水性薬剤の溶解性が制限されているためにこれらは凝集する傾向があり、このことにより、高い毒性、望ましくない免疫応答が導かれ、薬剤の不活性が引き起こされる可能性がある（Allen and Cullis, SCIENCE, 303 (5665): 1818-1822, MAR 19, 2004）。
【０００５】
したがって、可溶性粒子に疎水性剤例えば膜タンパク質、薬剤、又は診断化合物を組み込む用途が、非常に望まれている。これらの課題２つに対処する現在の方法は、とりわけ、リポソーム及び再構成された（reconstituted）高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）粒子である（Chan and Boxer, Current Opinion in chemical Biology 11:1-7, 2007）。
【０００６】
ＥＰ１５９６８２８Ｂ１は、脂質二重層をダブルベルト状の様式で（in a double belt-like fashion）しっかりと取り囲んでいるアポリポタンパク質を含むディスク状の生物活性剤送達粒子を記載している。前記粒子の内部は、脂質二重層の疎水性領域によって形成されている。これは、水性の内部を含む閉じた球状の二重層の外郭構造（closed spherical bilayer shells）であるリポソームと対照的である。ＥＰ１５９６８２８Ｂ１に記載されたディスク状の生物活性因子送達粒子は、ストークス直径約１０ｎｍ（Stokes diameter）を有し、そして疎水性医薬品例えばアンホテリシンＢ又はカンプトテシンの送達ビヒクル用の使用が提案されている。
【０００７】
ＥＰ１３４５９５９Ｂ１は、直径約１０ｎｍ及び高さ約５．５ｎｍの同様のタイプのナノスケール粒子を記載している。粒子は、ディスク状でありそして（ｉ）人工膜骨格タンパク質、（ｉｉ）リン脂質二重層、及び（ｉｉｉ）疎水性又は部分的に疎水性の膜タンパク質の少なくとも１つ、から構成される。前記膜骨格タンパク質は、ダブルベルト状の様式で脂質二重層を再び取り囲み、そしてヒトのアポリポタンパク質Ａ−１の誘導体又はトランケーティッド体（truncated form）であり、ヒトのアポリポタンパク質Ａ−１のＮ末端球状ドメインを欠いており、両親媒性でありそしてα−ヘリックスの少なくとも１つを形成し、そして水性環境において、リン脂質又はリン脂質混合物によりこのディスク状のナノスケールの粒子に自己集合する。改変された前記の膜骨格タンパク質（ＭＳＰ）は、ナノスケールのディスク状のリポタンパク質粒子に対して安定性、サイズの均一性、及び有用な機能を提供するであろう。
【０００８】
しかし、この現在利用可能なナノディスク技術にはいくつかの欠点があり、例えば、洗浄剤の除去が粒子の集合の間に必要とされる点である。また、アポリポタンパク質由来のＭＳＰのしっかりとしたダブルベルト状フィットによる大きさの均一性が、固定された最小粒子の大きさ及び先行技術の方法により得られる最大径に関する制限を犠牲にしていると考えられる。
【０００９】
サポシンファミリーは、小型の（〜８０アミノ酸）タンパク質の４種、サポシンＡ〜Ｄを含み、これらは、脂質と結合及び／又は相互作用し、そしてスフィンゴ脂質異化におけるリソソーム酵素の複数のための必須の補因子として機能する（Bruhn, Biochem J. (2005) 389, 249-257及びこの中で引用されている文献を参照）。サポシンは、負に帯電した脂質及び低ｐＨを好むことが記載されており、このことにより、リソソーム内のｐＨである４．７５が最適ｐＨであることとともに、酸性ｐＨにおける顕著に増加した活性が示される。サポシンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、単一の大きな前駆体タンパク質であるプロサポシンからタンパク質分解的に加水分解される。サポシンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤのための完全なアミノ酸配列は、プロサポシンのゲノム構成及びｃＤＮＡ配列と同様に報告されている（O'Brien et al. (1988) Science 241, 1098- 1101; Furst et al (1992) Biochim Biophys Acta 1126: 1-16）。
【００１０】
サポシンＣは酸性環境下でリン脂質含有小胞の膜融合を誘導することができ（Archives of Biochemistry and Biophysics 2003 Jul 1; 415(1): 43-53）、これは、他のサポシンによって示されていない機能である。Qi et al. (2009) Clin Cancer Res 15(18):5840-5851は、水性の内部を含み平均直径約１９０ｎｍを有しそしてインビボにおいて腫瘍標的活性を示すサポシンＣ結合ジオレオイルホスファチジルセリンナノベシクル（saposin C-coupled dioleoylphosphatidylserine nanovesicles）（ＳａｐＣ−ＤＯＰＳ）を報告している。ＳａｐＣ−ＤＯＰＳにおいて、サポシンＣ又はそれに由来するペプチドは、それらが結合されるリポソームのためのホーミングペプチド（homing peptide）として機能する。その後、サポシンＣは、細胞膜の外葉上でホスファチジルセリンを露出させているがん細胞に対するリポソームを標的とする。著者らは、リソソーム酵素の細胞外漏出に起因するがん細胞の周囲の独特の酸性微小環境が、腫瘍組織をサポシンＣの最適な標的にすると考えている。Ｑｉらによると、ＳａｐＣ−ＤＯＰＳリポソームは、Ｎ２（ｇ）下で溶媒溶解リン脂質を乾燥させ、精製サポシンＣを含有する酸性バッファ（ｐＨ５）中で乾燥リン脂質を分散させ、生理的水溶液において前記混合物を５０倍に希釈し、そしてその後の超音波処理でナノベシクルの集合を促進することにより調製される。
【００１１】
Popovic et al., PNAS, Vol. 109, No.8 (2012) 2908-2912は、サポシンＡ洗浄剤ディスク（saposin A detergent discs）の構造を報告している。サポシンＡは、可溶性でかつ脂質／洗浄剤に結合した状態で存在する。脂質の非存在下では、サポシンＡは、閉じた単量体のａｐｏ構造（apo conformation）を採用している。対照的に、Ｐｏｐｏｖｉｃらによって報告されたサポシンＡ洗浄剤ディスク構造は、高秩序の二重層様疎水性コアに組織された、内部で結合された洗浄剤分子４０個をカプセル化する開構造のサポシンＡの鎖の２つを明らかにしている。
【００１２】
サポシンＡ洗浄剤ディスクの結晶化に加えて、Ｐｏｐｏｖｉｃらはまた、複数工程を必要とする方法によるｐＨ４．７５での可溶性脂質サポシンＡ複合体の調製を記載している。まず、大型単層リポソーム小胞の均一画分をクロロホルムに溶解した脂質をＮ２（ｇ）下で乾燥させることにより調製し、酸性バッファ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中でボルテックス混合することにより乾燥脂質を分散させ、懸濁液を凍結融解１０サイクルに供し、ボルテックスミキサーで５分間ブレンドし、そして２００ｎｍフィルターを通して混合物を押し出す。酸性バッファ中においてこのようにして調製した大型単層リポソーム小胞と精製されたサポシンＡとを混合すると、可溶性脂質サポシンＡ粒子が得られた。前記粒子は、平均流体力学（ストークス）半径である３．２ｎｍ周辺の狭いサイズ分布を示し、サポシンＡ鎖あたり約５：１の脂質分子を含有していた。粒子の正確な大きさは、脂質及びタンパク質のモル比及びリポソーム組成によってのみ穏やかに影響を受けた。著者らは、陰イオン性リン脂質、コレステロール、又はスフィンゴ糖脂質（glycosphingolipids）がリポソーム混合物に存在したか否かに関わらず、同様の３．２ｎｍ粒子を観察した。全ての場合において、単一のピークが、ストークス半径３．２ｎｍの大きさの範囲で観察され、このことは、種の比較的狭い分布を示している。従って、この刊行物の技術は、ｐＨ値４．７５に、前記の粒子の大きさに制限され、かつ面倒な上流のリポソーム調製工程を含んでいる。
【００１３】
この背景に対して、膜タンパク質及び他の疎水性化合物の可溶化用のリポタンパク質粒子組成物の、信頼性が高く実施が容易で安定しており明確な生成方法の必要性が存在する。これは、ディスク状リポタンパク質粒子調製用の先行技術において開示されている複雑な複数工程の方法を考慮すると、特に当てはまる。
【００１４】
多種多様な疎水性剤は、先行技術に記載されたアポリポタンパク質又はサポシンＡ由来のナノディスク技術から潜在的に利益を得ることができる。しかしながら、サポシンＡ由来の粒子の３．２ｎｍの大きさ制限のために、たとえあったとしても、小分子のみが、それらに開示されている酸性ｐＨで前記粒子内に取り込まれる可能性があると考えられる。大きな（bulky）疎水性化合物及び大型の生体分子例えば（オリゴマー）膜タンパク質が、先行技術のアポリポタンパク質Ａ由来のナノディスク中に取り込まれることができる一方で、可能な最大径は、これらの粒子のダブルベルト状アポリポタンパク質の周囲によって未だ制限されている。さらに、また、１０ｎｍのアポリポタンパク質Ａ由来のナノディスクは、特定の用途には大きすぎる可能性がある。
【００１５】
したがって、リポタンパク質粒子内に組み込まれるべき疎水性剤のそれぞれの大きさに適応するための能力を特徴とする、高度なナノディスク技術と柔軟かつ制御可能な大きさの範囲を有する優れたリポタンパク質の必要性が存在する。前記の粒子は、例えば、薬学的又は生物学的に活性な化合物又は診断用化合物であることができる、膜タンパク質及び他の疎水性成分の単純な統合を可能にするであろう。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の根底にある問題は、その大きさを制御することができ、及び／又はその大きさを組み込まれた分子の特性に対して調節することができ、生産してそして長い期間にかけて、均一な大きさ、品質、及び組成を維持することが容易であるナノスケールのリポタンパク質粒子の条件において見られる。
【００１７】
この問題は、脂質結合性ポリペプチド、少なくとも１つの種類の脂質、及び疎水性剤を含む粒子であって、前記疎水性剤が、前記少なくとも１つの種類の脂質と異なるものとし、そして前記脂質結合性ポリペプチドは、サポシン様タンパク質又はその誘導体若しくはトランケーティッド体であるものとする、前記粒子により解決される。
【００１８】
本発明はまた、本発明の粒子を含む、医薬又は診断組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、脂質結合性ポリペプチド及び脂質を含む粒子の製造方法であって、前記脂質結合性ポリペプチドは、サポシン様タンパク質又はその誘導体若しくはトランケーティッド体であるものとし、前記方法が、前記脂質結合性ポリペプチドを可溶性脂質に液性環境中で接触させる工程、及びｐＨ５．０〜１０で粒子を自己集合させる工程を含むものとする前記方法を、さらに提供する。
【００２０】
最後に、本発明の粒子は、疎水性剤の送達ビヒクルとして、薬剤開発、薬剤スクリーニング、膜タンパク質研究のためのツールとして、そしてワクチン製剤として使用することができる。
【００２１】
この理論に縛られることなく、疎水性剤と脂質及びサポシン様タンパク質又はその誘導体若しくはトランケーティッド体との結合は、強固な構造を提供し、この構造は、広いｐＨ範囲にわたり特に生理学的ｐＨで水溶液中において安定でありそして３．２ｎｍより大きな先行技術のサポシンＡ由来リポタンパク質粒子を可能にする。前記粒子は、ｐＨ５．０〜１０で操作する本発明の方法により得ることができ、したがって、このことにより、本発明の粒子の自己集合が可能となる。
【００２２】
本発明の方法により得られるサポシン様タンパク質−リポタンパク粒子（以下、「Ｓａｌｉｐｒｏ粒子（Salipro particle）」と称する）は、複数の特徴、例えばそれらの固有の大きさの柔軟性及び前記リポタンパク質粒子に組み込まれるべき疎水剤のそれぞれの大きさに適応する能力において先行技術の粒子とは異なっている。
【００２３】
サポシン−リポタンパク質の粒子がサポシンの天然の最適ｐＨの４．７５又はその近辺で最高の状態で組み立てられるであろうという予想に反して、前記粒子の調製の間により中性の又は塩基性のｐＨが維持される場合に、改善された特性及び拡張された応用範囲を有するサポシン−リポタンパク質粒子が得られることが発見された。驚くべきことに、ｐＨ５．０〜１０の範囲でありそして可溶化された脂質の存在下で、精製されたサポシン様タンパク質又はその誘導体若しくはトランケーティッド体が、面倒な上流のリポソーム調製工程なしで安定的なリポタンパク質粒子中に自己集合することを発見した。この単純で信頼性の高い調製方法は、サポシンの天然の最適ｐＨ４．７５又は脂質の非存在下で粒子の集合を試みた場合では、満足する結果を得ることができなかった。
【００２４】
本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子は、生理学的ｐＨで、様々な脂質、膜タンパク質、及び疎水性化合物の組み込みが可能であり、これにより、水性環境中で可溶性かつ安定であるナノ複合体を生じさせることが証明されている。
【００２５】
本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子は、標準的な遠心フィルターユニットを用いた濃縮、凍結融解を通して強固である。また、実証実験により、本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子は熱安定性をある程度示すことが示された。また、任意の主要な品質劣化なしで、本発明の粒子を凍結乾燥すること、保存すること、そして再水和することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【００２６】
脂質結合性ポリペプチドは、サポシン様タンパク質（ＳＡＰＬＩＰ）又はその誘導体若しくはトランケーティッド体である。本明細書で使用される用語「サポシン様タンパク質」（ＳＡＰＬＩＰ）は、当該技術分野で認識されており、そして脂質と相互作用するタンパク質のサポシン様タンパク質（ＳＡＰＬＩＰ）ファミリーの群の全てを含む。ＳＡＰＬＩＰファミリーは、サポシン折り畳み（saposin-fold）、高度に保存された分子内ジスルフィド結合によって安定化され保存されたα−ヘリックス立体構造により特徴付けられる（Munford et al. (1995), Journal of Lipid Research, vol. 36, no. 8, 1653-1663 and Bruhn (2005), Biochem J 389 (15): 249-257）。本発明によるサポシン様タンパク質（ＳＡＰＬＩＰ）の群の例は、Munford et al. (1995), Journal of Lipid Research, vol. 36, no. 8, 1653-1663及びBruhn (2005), Biochem J 389 (15): 249-257において記載されており、これらの両方の開示はその全体が参照により本明細書に組みこまれる。
【００２７】
リガンドフリー（すなわち、洗浄剤を含まない／脂質を含まない）、「閉じた」状態では、ＳＡＰＬＩＰは、単量体のコンパクト４ヘリックスバンドル型構造（a monomeric compact four-helix bundle-type structure）、サポシン折り畳みを採用している。この折り畳みは、ヒトサポシンＡ（Protein Data Bank (PDB) ID code: 2DOB, Ahn et al. (2006) Protein Sci. 15: 1849-1857）の閉じたアポ型の構造により、又はサポシンＣ（PDB ID code: 1M12; de Alba et al. (2003) Biochemistry 42, 14729-14740）、ＮＫ−リジン（PDB ID code: 1NKL; Liepinsh et al. (1997) Nat. Struct. Biol. 4, 793-795）、アメーバポアＡ（PDB ID code: 1OF9）、及びグラニュライシン（PDB ID code: 1L9L; Anderson et al. (2003) J. Mol. Biol. 325, 355-365）の構造により例示されており、これらの全てはほぼ同一であり、容易に重ねられることができる（easily super-imposable）。
【００２８】
ＳＡＰＬＩＰは、リガンド例えば脂質又は洗浄剤分子に結合する際に構造変化を起こす。リガンド結合の「開いた」構造では、ＳＡＰＬＩＰは、結合した脂質と接触する露出した疎水性表面を有するＶ字型又はブーメラン型の構造（V-shaped or boomerang-shaped conformation）を採用する。開いた構造は、先行技術のサポシンＡ洗浄剤ディスク構造（PDB ID code: 4DDJ; Popovic et al., PNAS, Vol. 109, No.8 (2012) 2908-2912）及びＳＤＳ洗浄剤ミセルに結合するサポシンＣ（PDB ID code: 1SN6; Hawkins et al. (2005) J.Mol.Biol. 346: 1381-1392）の構造により例示されている。
【００２９】
本発明の粒子においては、脂質結合性ポリペプチドは、好ましくは、その構造の一部分が多かれ少なかれ親水性でありかつ水性溶媒に直面しそして他方の部分が多かれ少なかれ疎水性でありかつ脂質を含む粒子の疎水性中心に直面する、両親媒性である。脂質結合性ポリペプチドは、好ましくは、ヘリックスの表面の１つの主により疎水性の残基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ、又はＹ）そしてヘリックスの他の表面に極性のある又は荷電した残基（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｋ、又はＲ）を有する両親媒性ヘリックスによって特徴付けられる。
【００３０】
本明細書で使用されるアミノ酸残基の略語は、以下の通りである：Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｖ、Ｖａｌ、バリン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｉ、ｌｉｅ、イソロイシン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｗ、Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、スレオニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｙ、Ｔｙｒ、チロシン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｋ、Ｌｙｓ、リジン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；及びＨ、Ｈｉｓ、ヒスチジン。
【００３１】
先行技術のアポリポタンパク質由来ナノディスクとは対照的に、本発明の脂質結合性ポリペプチドは、ダブルベルト状の様式で脂質を封入していないが（図１参照）、むしろ、本発明の粒子は、本発明の得られた粒子内での個々の脂質結合性ポリペプチド間のタンパク質−タンパク質の直接接触を有しない頭尾配向（head-to-tail orientation）において配列された、おおよそＶ字型又はブーメラン型の脂質結合性ポリペプチドの２つ又はそれ以上に囲まれている脂質を含むコアにより結合している（図２〜７参照）。この理論に拘束されることを望むことなく、本発明の粒子内の脂質結合性ポリペプチド及び脂質のこの配列は、大きな疎水性剤又は増加された量の脂質が本発明の粒子内に組み込まれた場合に観察される大きさの柔軟性を提供する。
【００３２】
前記両親媒特性及び三次元構造と同様に脂質と相互作用する能力がＳＡＰＬＩＰ間で高度に保存されている一方で、それらはアミノ酸配列のレベルでは、相同性を定義するための通常の同一性の２５〜３０％の閾値帯下の（below the usual threshold zone）配列同一性を有し、非常に異なっている（sequence comparison in Figure 4 A and 4 B of Bruhn (2005), Biochem J 389 (15): 249-257参照、これらの図は参照により本明細書に特別に組み込まれる）。
【００３３】
本発明のリポタンパク質粒子において、脂質結合性ポリペプチドは、まず第一に、本発明のリポタンパク質粒子のディスク状構造の骨格を提供する構造タンパク質としての役目を果たす。この理由から、構造的特徴、特にＳＡＰＬＩＰの特徴であるサポシン折り畳みが、単なる配列のデターミナント（determinants）と比較して本発明の脂質結合性ポリペプチドを定義するためにより重要になる。
【００３４】
本発明によるＳＡＰＬＩＰの例は、サポシンＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤ（例えば、ヒト（Homo sapiens）［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１〜４参照］、ウマ（Equus caballus）、ウシ（Bos taurus）、ハツカネズミ（Mus musculus）、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、又はアフリカツメガエル（Xenopus laevis）から）；サーファクタントタンパク質Ｂ（例えば、ヒト、イヌ（Canis familiaris）、ハツカネズミ、アナウサギ、ヒツジ（Ovis aries）、又はドブネズミから）；グラニュライシン（例えば、ヒトから；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５参照）；ＮＫ−リジン（例えば、ウマ又はヒツジから）；アメーバポア（例えば、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）から）；アメーバポアオルソログ（例えば、赤痢アメーバ（Entamoeba dispar）又は赤痢アメーバ（Entamoeba invadens）から）；アメーバポア様タンパク質（例えば、肝蛭（Fasciola hepatica）から）；Ｎａｅｇｌｅｒｉａｐｏｒｅｓ（例えば、ネグレリア−フォーレリ（Naegleria fowleri）から）；Ｃｌｏｒｎｏｒｉｎ（例えば肝ジストマ（Clonorchis sinensis）から）；プロサポシン（例えば、ヒト、ウマ、ヒツジ、ハツカネズミ、アナウサギ、ドブネズミ、又はアフリカツメガエルから）、及びＭＳＡＰ（例えばヒトから）である。
【００３５】
本発明により使用される特定のＳＡＰＬＩＰの配列は、Bruhn (2005), Biochem J 389 (15): 249-257の図４Ａ及び図４Ｂに示されており、これらの特定の図及び配列は、参照により本明細書に特別に取り込まれる。本発明に従って使用される特定のＳＡＰＬＩＰの配列は、配列表に以下のように記載される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１ サポシンＡ［ヒト］、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.２ サポシンＢ［ヒト］、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.３ サポシンＣ［ヒト］、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.４ サポシンＤ［ヒト］、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５ グラニュライシン［ヒト］、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.６ ＮＫ−リジン［イノシシ（Sus scrofa）］。
【００３６】
本発明により使用されるＳＡＰＬＩＰはまた、多ドメインタンパク質の一部としてサポシン折り畳みを含むポリペプチドであることができる。この例は、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ヒト、シノラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）、カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）、ハマダラカ（Anopheles）、ショウジョウバエ（Drosophila）、ハツカネズミ、又はドブネズミから）；ＧＤＳＬ（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ）リパーゼ、例えばアシロキシ酸（ヒト又はドブネズミから）；Ｃｏｕｎｔｉｎ（キイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）から）；Ｊ３−クリスタリン（ミツデリッポウクラゲ（Tripedalia cystophora））、及びアスパラギン酸プロテアーゼ（緑色植物亜界（Viridiplantae）から）である。本発明により使用されるさらなるＳＡＰＬＩＰは、バクテリオシンＡＳ−４８（bacteriocin AS-48）であることができる。バクテリオシンＡＳ−４８は抗菌活性を示し、また、脂質に結合し、残りのＳＡＰＬＩＰファミリーの群のように同じ折り畳みを有するが、任意のジスルフィド架橋を欠いている。
【００３７】
これに対し、本発明は、脂質結合性ポリペプチドとしてのサポシンＡ又はその誘導体若しくはトランケーティッド体のさらなる詳細を以下で記載しており、そして脂質結合性ポリペプチドとしてのサポシンＡ又はその誘導体若しくはトランケーティッド体は、好適な実施態様であり、本発明はそれらにより限定されないものとする。むしろ、本発明は、本発明の脂質結合性ポリペプチドとしてのサポシン様タンパク質（ＳＡＰＬＩＰ）のファミリー全体に明示的に及ぶ。ＳＡＰＬＩＰ間の構造的及び機能的保存が高度であることにより、脂質結合性ポリペプチドとしてのサポシンＡを有する本発明の特定の実施態様の特徴及び利点が、本発明の脂質結合性ポリペプチドとしての他のＳＡＰＬＩＰ又はその誘導体若しくはトランケーティッド体を用いた他の実施態様にもまた適応することが期待される。
【００３８】
好適な実施態様によると、ＳＡＰＬＩＰはサポシンＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤ、特にサポシンは、（ヒト、ウマ、ヒツジ、ハツカネズミ、アナウサギ、ドブネズミ、又はアフリカツメガエル）サポシンＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤから選択されるサポシンである。１つの実施態様では、ＳＡＰＬＩＰは、（ヒト、ウマ、ヒツジ、ハツカネズミ、アナウサギ、ドブネズミ、又はアフリカツメガエル）サポシンＡ、サポシンＢ、又はサポシンＤである。
【００３９】
サポシンＣは、膜融合を誘導することができるという点でサポシンの中では特別であり、この特性は他のサポシンでは示されない。膜融合活性が、常に望ましいわけではない。本発明の特定の実施態様によれば、ＳＡＰＬＩＰがサポシンＣではないことを条件にあるいはＳＡＰＬＩＰがサポシンＣ又はその誘導体若しくはトランケーティッド体ではないことを条件に、脂質結合性ポリペプチドはサポシン様タンパク質（ＳＡＰＬＩＰ）又はその誘導体若しくはトランケーティッド体である。
【００４０】
１つの実施態様では、ＳＡＰＬＩＰはヒト由来（すなわち、ヒトＳＡＰＬＩＰ）である。
【００４１】
好ましい実施態様では、ＳＡＰＬＩＰは、サポシンＡ、好ましくは（ヒト、ウマ、ヒツジ、ハツカネズミ、アナウサギ、ドブネズミ、又はアフリカツメガエル）サポシンＡであり、そして特に好ましくはヒトサポシンＡであり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ. １で示される。サポシンＡは公知のタンパク質である。ＬＤＡＯ−洗浄剤複合体としてのその発現、精製、及び結晶化は、例えば、PNAS, Vol. 109, No.8 (2012) 2908-2912 (Popovic et al.)に記載されている。
【００４２】
本発明の１つの実施態様によると、脂質結合性ポリペプチドは、ＳＡＰＬＩＰの全長配列を含む。その他の実施態様では、脂質結合性ポリペプチドは、ＳＡＰＬＩＰの誘導体であり、特にそれぞれのＳＡＰＬＩＰの全長配列と少なくとも２０、３０、４０、５０、又は６０％、好ましくは少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。脂質結合性ポリペプチドは、ＳＡＰＬＩＰの全長配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性を有する配列を含むことができる。
【００４３】
本明細書で使用する用語「配列同一性（Sequence identity）」は、スコアリングマトリックス例えばHenikoff S. and Henikoff JG., P. N. A. S. USA 1992, 89: 10915-10919に記載されているＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを使用した配列の最適アライメント（optimal alignment）によって計算することができる、タンパク質間の同一性の程度を意味する。Needleman及びWunsch（J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453）のＢｌｏｓｕｍ６２類似性マトリックス及びアルゴリズムを用いた二配列の同一性の割合及び最適アライメントの計算は、プログラムのデフォルトパラメータを使用したＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＧＡＰプログラムを用いて実施されることができる。
【００４４】
アミノ酸アライメント比較としてのＥＭＢＬオンラインツール「EMBOSS Stretcher」（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher/）が使用されており、これは、プログラムデフォルトセッティング（programs default settings）を使用している。
【００４５】
別の実施態様では、ＳＡＰＬＩＰの誘導体は、それぞれのＳＡＰＬＩＰのアミノ酸配列において、アミノ酸欠失、付加、挿入、及び／又は置換の１つ又はそれ以上を有する配列を含むポリペプチドである。例えば、ＳＡＰＬＩＰ誘導体は、その中のアミノ酸１〜４０、好ましくは１〜３０、そして特に１〜２０又は１〜１５が欠失、付加、挿入及び／又は置換された、特定のＳＡＰＬＩＰの配列を含むポリぺプチドであることができる。
【００４６】
本明細書で使用される用語「欠失」は、それぞれの初めの配列からのアミノ酸残基の、１、２、３、４、５、又はそれ以上の除去を意味する。
【００４７】
本明細書において用いられる用語「挿入」又は「付加」は、それぞれの初めの配列からのアミノ酸残基の、１、２、３、４、５、又はそれ以上の挿入又は付加を意味する。
【００４８】
本明細書でおいて用いられる用語「置換」とは、特定の位置にある任意のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基との交換を意味する。
【００４９】
本発明の別の実施態様によれば、脂質結合性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の断片の１つ以上を含むサポシンＡの誘導体である。好ましい断片は、サポシンＡのヘリックスα１、α２、α３、及びα４に該当し、ここで、ヘリックスα１は、以下の連続的なアミノ酸のストレッチ：「ＳＬＰＣＤＩＣＫＤＶＶＴＡＡＧＤＭＬＫ」により形成され；ヘリックスα２は、以下の連続的なアミノ酸のストレッチ：「ＡＴＥＥＥＩＬＶＹＬＥＫＴＣＤＷＬ」により形成され；ヘリックスα３は、以下の連続的なアミノ酸のストレッチ：「ＰＮＭＳＡＳＣＫＥＩＶＤＳＹＬＰＶＩＬＤＩＩＫＧＥＭＳ」により形成され；そしてヘリックスα４は、以下の連続的なアミノ酸のストレッチ：「ＰＧＥＶＣＳＡＬ」により形成される。本発明の特定の実施態様によれば、サポシンＡの誘導体は、サポシンＡのヘリックスα１、α２、α３、α４及びそれらの組み合わせから選択される配列を含むポリペプチド、特に、サポシンＡのヘリックスα１、α２、及びα３の配列を含むポリペプチドである。サポシンＡの断片例えばヘリックスα１、α２、α３、α４は、アミノ酸配列中にアミノ酸の１又はそれ以上の欠失、付加、挿入、及び／又は置換を有することができる。
【００５０】
サポシンＡの誘導体又はトランケーティッド体が本発明による脂質結合性ポリペプチドとして使用された場合は、前記サポシンＡの誘導体又はトランケーティッド体は、両親媒性であり、αへリックスの少なくとも１つを形成し、そして以下に詳細に記載されている本発明による調製工程において使用される場合は、可溶化された脂質とともにリポタンパク質粒子中に自己集合できるであろう。本明細書で使用する場合、「両親媒性」という用語は、親水性及び疎水性の両方の領域を有するポリペプチド又は分子を意味する。
【００５１】
好ましくは、ＳＡＰＬＩＰの誘導体が使用される場合には、ＳＡＰＬＩＰ創始メンバーサポシンＡ（SAPLIP founding member saposin A）におけるシステイン６個に相当するシステイン残基６個が存在するであろう。この点に関しては、Bruhn (2005), Biochem J 389 (15): 249-257の図４Ａ及び図４Ｂに言及されており、これらの図は参照により本明細書に特別に組み込まれる。
【００５２】
本発明による脂質結合性ポリペプチドはまた、非天然アミノ酸；アミノ酸アナログ、又はペプチド模倣構造（peptidomimetic structure）の１つ以上を含むことができ、これらのペプチド結合は、代謝分解に対してより耐性を有する構造に置換される。
【００５３】
本発明の別の実施態様によれば、脂質結合性ポリペプチドは、タグ例えばＨｉｓ６タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ａｖｉタグ、Ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグ、ＪＳタグ、システインタグ、ＦＬＡＧタグ、又は当該技術分野で公知の他のタグをＮ末端又はＣ末端にさらに含む。
【００５４】
本発明の脂質結合性ポリペプチドはまた、キメラポリペプチドであることができる。本明細書で使用する場合、「キメラ」は、別々に存在することが可能でありそしてその構成分子の所望する全ての機能を有する単一の分子を形成するために一緒に結合された分子の２つ以上を指す。キメラ分子の構成分子は、化学的結合により合成的に接合されることができ、又は、構成分子が全てポリペプチド又はその類似体それ自体である場合は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、単一の連続ポリペプチドが発現されるように組み換え技術により（recombinantly）一緒に融合することもできる。前記のキメラ分子は、「融合タンパク質」として知られている。キメラポリペプチドの種々の成分は、互いに直接に結合することができるか、又はリンカー１つ若しくはそれ以上を介して結合することができる。
【００５５】
１つの実施態様では、脂質結合性ポリペプチドは、機能的部分例えば標的部分又は生物活性部分をさらに含むキメラポリペプチドである。
【００５６】
本発明の粒子が薬剤送達ビヒクルとして使用される場合、前記の標的部分は、例えば、特定の細胞若しくは組織型、又は感染因子それ自体に対して本発明の粒子を標的とする機能を果たすことができる。いくつかの実施態様において、粒子は、脂質結合性ポリペプチド又は脂質成分に結合した標的部分を含んでいる。いくつかの実施態様では、粒子に組み込まれている疎水性剤は、標的能力を有する。例えば、標的部分は受容体認識特性を有し、これにより粒子は特定の細胞表面受容体を標的とすることができる。例えば、本発明の粒子は、特定種の感染性因子を有する公知の特定細胞種を標的にすることができ、例えば、粒子の脂質結合性ポリぺプチド成分を修飾することにより、標的とされている前記細胞種の表面上の受容体と相互作用することが可能となる状態にする。１つの実施態様では、標的部分は、天然若しくは合成のリガンド、抗体及び抗体フラグメント、又は標的の目的用に適した他の生体分子から成る群から選択される。
【００５７】
脂質結合性ポリペプチドが生物活性部分を含む場合、これは、例えば、薬剤、細胞傷害剤、酵素、標識、フルオロフォア、造影剤、及び放射性標識から選択されることができる。
【００５８】
本発明の目的に適した脂質は、天然に存在する脂質、合成脂質、修飾脂質、脂肪、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質（saccharolipids）、ポリケチド、ステロール脂質、及びプレノール脂質又はそれらの組み合わせから選択することができる。
【００５９】
本明細書で使用される用語「脂質」は、当該技術分野で認識されており、そして有機溶媒に可溶性若しくは部分的に可溶性であるか、又は水相中に存在する場合には疎水性の環境に分割している（partitions into）、生物学的又は合成的起源の物質を意味する。
【００６０】
本明細書で使用される用語「脂質」は、本発明の粒子中の脂質単分子として意図されていない。実際には、同一の脂質分子の複数又はその中に存在する少なくとも２種の異なる脂質分子の複数のように意味される。
【００６１】
好ましい実施態様によれば、脂質は、脂質二重層形成性脂質、及び／又は生体適合性脂質である。
【００６２】
本明細書において使用される用語「生体適合性」は、生体組織中で、毒、傷害、又は免疫応答を生成しないことによって、生物学的に適合性であることを意味する。
【００６３】
本明細書で使用される用語「二重層形成性脂質」は、疎水性の内部と親水性の外部とにより脂質二重層を形成することができる脂質を指す。ディスク状構造内に集合するＳＡＰＬＩＰ又はその誘導体若しくはトランケーティッド体と結合することができる任意の二重層形成性脂質は、本発明に従って使用することができる。二重層形成性脂質には、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、アルキルリン脂質、エーテル脂質、及びプラズマローゲンが含まれるが、これらに限定されない。二重層形成性脂質の１つの種類は、２つ又はそれ以上の種類の混合物を使用されることができる。
【００６４】
粒子は、脂質二重層を形成していない脂質を含むことができる。前記の脂質としては、コレステロール、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールアミン（この脂質は特定の状況下で二重層を形成することができる）、オキシステロール、植物ステロール、エルゴステロール、シトステロール、カチオン性脂質、セレブロシド、スフィンゴシン、セラミド、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、ガングリオシド、エーテル脂質、アルキルリン脂質、プラズマローゲン、プロスタグランジン、及びリゾリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
好ましい実施態様によれば、脂質は、真核生物の脂質（eukaryotic lipids）及び／又は脳の白及び灰白質中に存在する脂質である。好ましい脂質は、例えば、リン脂質、スフィンゴ糖脂質、ステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、２−オレオイル−１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、２−オレオイル−１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール（ＰＯＰＧ）、２−オレオイル−１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジアシルグリセロール、コレステロール、スフィンゴミエリン、ガラクトシルセラミド、ガングリオシド、ホスファチジルイノシトール、及びスルホガラクトセラミド、又はそれらの組み合わせである。好ましい脂質は、真核生物の脂質である。ホスファチジルセリン（ＰＳ）が特に好ましい脂質である。
【００６６】
１つの実施態様では、脂質は、リン脂質を含むか又はリン脂質から成る。適切なリン脂質の例としては、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＰＯＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、カルジオリピン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、卵黄ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、及びカチオン性リン脂質を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
いくつかの実施態様では、本発明の粒子に含まれる脂質は、結合した機能性部分、例えば前記の標的部分又は生物活性部分の１つ又はそれ以上を含む、修飾された脂質であることができる。
【００６８】
本明細書で使用される用語「洗浄剤」は、当該技術分野において認識されており、本明細書で使用される「脂質」の定義に含まれていない。
【００６９】
多くの脂質は、洗浄剤と比較すると、同様の両親媒性の一般構造、すなわち、極性の親水性の頭部基と非極性の疎水性の尾部を有するが、脂質は、モノマーの形態において、溶液中で形成される凝集物の種類において、そして凝集に必要とされる濃度範囲において洗浄剤とは異なる。脂質は、一般的に、実質的に円筒形である；疎水性尾部が占める体積は、極性頭部基が占める体積と同じである。洗浄剤モノマーは、一般的に円錐形である。疎水性尾部が占める体積は、極性頭部基が占める体積よりも小さい。洗浄剤は、脂質の非存在下で二重層構造を形成することなく、水溶性である球形の又は楕円体のミセルに凝集する傾向がある（Ａｎａｔｒａｃｅ（www.anatrace.com）からのハンドブック「膜タンパク質科学における洗浄剤及びそれらの使用（Detergents and their uses in membrane protein science）」を参照）。
【００７０】
本明細書で使用される用語「洗浄剤」に含まれる化合物の例としては、アニオン性洗浄剤例えばアルキルベンゼンスルホン酸塩又は胆汁酸、カチオン性洗浄剤、並びに非イオン性又は両性イオン性洗浄剤例えばラウリルジメチルアミン酸化物（ＬＤＡＯ）、フォス・コリン、ＣＨＡＰＳ／ＣＨＡＰＳＯ、アルキルグリコシド例えば短、中、若しくは長鎖アルキルマルトシド及びグルコシドが含まれる。
【００７１】
本発明の粒子は、さらに、脂質とは異なるそうでなければ粒子中に含まれる疎水性剤を含む。これは、疎水性剤自体が脂質又は修飾された脂質である場合に、粒子中に含まれる脂質の大部分（すなわち、粒子中に存在する脂質の総量に基づくと５０モル％より多く）は、疎水性剤を形成する脂質とは異なるものでなければならないことを意味する。本発明の１つの実施態様では、疎水性剤は脂質ではない；本発明の別の実施態様では、疎水性剤は、脂質でも洗浄剤でもない。
【００７２】
本発明の粒子に組み込まれることができる疎水性剤は、疎水性有機化合物及び／又は疎水性生体分子であることができる。これは、治療的に若しくは生物学的に活性である疎水性剤、又は本発明の粒子のディスク形状を単に安定化する疎水性剤であることができる。疎水性剤は、水相中に存在する場合に、水中で完全に浸透しないか若しくは可溶性を維持し、及び／又は凝集する傾向があり、及び／又は疎水性環境に分割する、薬剤、すなわち、化合物及び／又は生体分子である。本発明の粒子に含まれていることにより、疎水性剤は、粒子の疎水性内部において効果的に可溶化されることができる。それによって、それは、天然の機能性、例えば触媒活性又はリガンド結合を維持することができる。
【００７３】
本発明の粒子に含まれる疎水性剤は、一般的に、脂質二重層の疎水性部分に結合することができる又は組み込むことができる疎水性（例えば親油性）領域の少なくとも１つを含む。疎水性剤それ自体はキメラ分子であることができ、脂質二重層の疎水性部分に結合することができる又は組み込むことができる疎水性（例えば親油性）部分、モジュール、又は化合物は、他方の分子に結合されていることができる。例えば、脂質又は脂肪酸結合化合物、特に脂質又は脂肪酸結合薬剤は、本発明による疎水性剤として使用されることができる。これらのケースにおいては、前記化合物又は薬剤それ自体は、必ずしも疎水性である必要はない。いくつかの実施態様では、疎水性剤の少なくとも一部分は、粒子内部における脂質分子の疎水性部分（例えば、脂肪酸アシル鎖）内に挿入されるか又は浸透することができる。
【００７４】
疎水性剤は、例えば、生物学的活性剤、薬剤、薬剤の活性成分、化粧料生成物の活性成分、植物保護生成物の活性成分、栄養及び／又は栄養補助食品（dietary and/or nutritional supplement）、診断用プローブ、造影剤、標識、及び／又はインジケータであることができる。
【００７５】
本発明の粒子に含まれることができそしてそれを必要とする患者に投与されることができる疎水性薬剤は、水性環境中における低溶解度を有する任意の薬剤であることができる。水性環境への溶解度の低さは、特定の条件下例えば、特定のｐＨ若しくは温度範囲でのみ又は疎水性剤の濃度が一定の閾値を超える場合にのみ明らかである。
【００７６】
例えば、本発明の粒子に含まれることができそしてそれを必要とする患者に投与されることができる薬剤は、がん治療、炎症性若しくは感染状態、心血管疾患、神経疾患、及びとりわけリウマチ用のものである。疎水性剤は、抗酸化剤、ビタミン、抗増殖剤、ホルモン、ステロイド、又は酵素であることができる。これは、除草性又は殺菌性化合物であることができる。
【００７７】
本発明の粒子中に組み込むことができる疎水性薬剤のいくつかの具体的な例としては、クルクミン、スルホンアミド、例えばスルホンアミド、スルファメトキサゾール、及びスルファセタミド；トリメトプリム、特にスルファメトキサゾールとの組み合わせ；キノリン、例えば、ノルフロキサシン及びシプロフロキサシン；ペニシリンを含むβ−ラクタム化合物、例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、アンピシリン、アモキシシリン、及びピペラシリン、セファロスポリン、例えばセファロスポリンＣ、セファロチン、セフォキシチン、及びセフタジジム、他のβ−ラクタム抗生物質、例えばイミペネム、及びアズトレオナム；ベータラクタマーゼ阻害剤、例えば、クラブラン酸；アミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、及びネチルマイシン；テトラサイクリン、例えばクロルテトラサイクリン及びドキシサイクリン；クロラムフェニコール；マクロライド例えばエリスロマイシン；混合型真菌剤（miscellaneous antibiotics）、例えばクリンダマイシン、ポリミキシン、及び抗菌用バシトラシン、場合によっては、抗真菌感染症として、ポリエン抗生物質、例えばアンホテリシンＢ、ナイスタチン、及びハマイシン；フルシトシン；イミダゾール又はトリアゾール、例えばケトコナゾール、ミコナゾール、イトラコナゾール、及びフルコナゾール；抗真菌性疾患用、例えばアスペルギルス症、カンジダ症、又はヒストプラズマ用のグリセオフルビン；抗ウイルス性疾患用のジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、インターフェロン（例えば、インターフェロンα−２ａ又はインターフェロンα−２ｂ）、及びリバビリン；アスピリン、フェニルブタゾン、フェナセチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、インドメタシン、スリンダク、ピロキシカム、ジクロフェナク；炎症性疾患用、例えば関節炎用の金（gold）及びステロイド系抗炎症剤；ＡＣＥ阻害剤、例えばカプトプリル、エナラプリル、リシノプリル；有機硝酸塩、例えば亜硝酸アミル、ニトログリセリン、及び硝酸イソソルビド；カルシウムチャネル遮断薬、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、及びベラパミル；βアドレナリン性アンタゴニスト例えば心血管疾患用のプロプラノロール；利尿薬例えばチアジド；例えば、ベンゾチアジアジン又はループ利尿薬例えばフロセミド；交感神経遮断薬、例えばメチルドパ、クロニジン、グアナベンズ、グアネチジン、及びレセルピン；血管拡張剤っ例えばヒドララジン及びミノキシジル；カルシウムチャネル遮断薬例えばベラパミル；高ＡＣＥ阻害剤例えば血圧治療用のカプトプリル；心臓不整脈治療用のキニジン、プロカインアミド、リドカイン、エンカイニド、プロプラノロール、エスモロール、ブレチリウム、及びジルチアゼム；高リポタンパク質血症治療用のロバスタチン、リピトール、クロフィブラート、コレスチラミン、プロブコール、及びニコチン酸；アントラサイクリン例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、及びイダムビシン；共有結合ＤＮＡ結合化合物（covalent DNA binding compound）、共有結合ＤＮＡ結合化合物及び白金化合物例えばシスプラチン及びカルボプラチン；葉酸アンタゴ���スト例えばメトトレキサート及びトリメトトレキサート；代謝拮抗剤及びピリミジン拮抗薬、例えばフルオロウラシル、５−フルオロウラシル、及びフルオロデオキシウリジン；代謝拮抗剤及びプリン拮抗薬例えば、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、及びチオグアニン；代謝拮抗剤及び糖修飾アナログ、例えばシタラビン及びフルダラビン；代謝拮抗剤及びリボヌクレオチド還元酵素阻害剤例えばヒドロキシ尿素；共有結合ＤＮＡ結合化合物及びナイトロジェンマスタード化合物、例えばシクロホスファミド及びイホスファミド；アルカンスルホン酸及びアルカンスルホン酸塩、例えばブスルファン；ニトロソウレア例えばカルムスチン；共有結合ＤＮＡ結合化合物及びメチル化剤、例えばプロカルバジン；共有結合ＤＮＡ結合化合物及びアジリジン、例えばマイトマイシン；非共有結合ＤＮＡ結合化合物；非共有結合ＤＮＡ結合化合物、例えばミトキサントロン及びブレオマイシン；クロマチン機能阻害剤及びトポイソメラーゼ阻害剤、例えばエトポシド、テニポシド、カンプトテシン、及びトポテカン；クロマチン機能阻害剤及び微小管阻害剤、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びパクリタキセルを含むビンカアルカロイド、タキソテール、又は他のタキサン；内分泌機能に影響を与える化合物、例えばプレドニゾン、プレドニゾロン、タモキシフェン、ロイプロリド、エチニルエストラジオール、抗体例えばハーセプチン；遺伝子、例えばｐ−５３遺伝子、ｐ１６遺伝子、ＭＩＴ遺伝子、及びＥ−カドヘリン；サイトカイン、例えばインターロイキン、特にＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、及びＩＬ−１２、腫瘍壊死因子例えば腫瘍壊死因子−α及び腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子、例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−β１、インターフェロン−β２、及びインターフェロン−γ；がん治療用のオールトランスレチノイン酸又は別のレチノイド；免疫抑制剤、例えば：シクロスポリン、免疫グロブリン、及びスルファサラジン、メトキサレン、及びサリドマイド；糖尿病用のインスリンとグルカゴン；骨粗しょう症治療用、高カルシウム血症、及びパジェット病治療用のカルシトニン及びナトリウムアレンドロネート；モルヒネ及び関連オピオイド；中枢作用性の鎮咳薬、例えばデキストロメトルファン；疼痛管理用のテトラヒドロカンナビノール又はマリノール、リドカイン、及びブピバカイン；クロルプロマジン、プロクロルペラジン；カンナビノイド例えばテトラヒドロカンナビノール、ブチロフェノン例えばドロペリドール；吐き気及び嘔吐治療用のベンズアミド例えばメトクロプラミド；抗凝固剤、抗血栓、又は抗血小板薬としての、ヘパリン、クマリン、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；炎症性腸疾患治療用の、ヘパリン、スルファサラジン、ニコチン、及びステロイド、及び腫瘍壊死因子−α；喫煙中毒治療用のニコチン；ホルモン療法用の、成長ホルモン、黄体形成ホルモン、コルチコトロピン、及びソマトト��ピン、そして一般的なアナフィラキシー用のアドレナリン、を含む。
【００７８】
特定の化合物が、以下の実施例例えば実施例９において記載されている方法による本発明の粒子内によく組み込まれている場合に、当業者は、実験的に容易に決定することができる。分光法によって検出されない化合物については、当業者は、例えば、ＬＣ−ＭＳ又は薄層クロマトグラフィーを信用して特定の化合物が本発明の粒子内に組み込まれているかどうかを決定することができる。
【００７９】
本発明の粒子内に疎水性剤を含ませることの利点は、前記粒子の安定的な構造内で効果的に可溶性になることであり、それにより、前記粒子は、水性環境中で疎水性剤用の送達沈着物（deposit）及び／又はビヒクルとして機能し、例えば、体液や組織の大部分に存在する。洗浄剤又は有機溶媒を介して可溶化させる古典的な手段と比較して、本発明の粒子は、外部から親水性であるという利点を提供する一方で、粒子の疎水性の内部において疎水性剤が効果的に可溶化され、これにより、疎水性剤が天然の機能性、例えば酵素活性又はリガンド結合を維持可能であることが意味される。さらに、ほとんどの洗浄剤及び有機溶媒とは対照的に、本発明の粒子は、生体適合性であると考えられる。
【００８０】
疎水性有機化合物の他に、本発明のリポタンパク質粒子もまた、疎水性の生体分子例えば疎水性部分を含むタンパク質を安定的に組み込み可能であることが証明されている。本発明によれば、疎水性部分を含むタンパク質は、例えば、膜タンパク質、内在性膜貫通タンパク質、内在性モノトピック膜タンパク質（integral monotopic membrane protein）、周辺膜タンパク質、脂質に結合した状態のアンフィトロピックタンパク質（amphitropic protein）、脂質アンカー型タンパク質、並びに融合された疎水性及び／又は膜貫通ドメインを有するキメラタンパク質から選択されることができる。
【００８１】
内在性膜タンパク質は、不変的に、脂質二重層に結合し、そして通常は膜変位の形になるために洗浄剤又は非極性溶媒を必要としている膜タンパク質である。膜貫通タンパク質は、少なくとも一度は膜にまたがる（span across）内在性膜タンパク質である。本発明の粒子に組み込むことができる膜貫通タンパク質の例としては、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、輸送体例えばユニポーター（uniporters）、共輸送体、若しくは交換輸送体、チャネル例えばイオンチャネル、又は酵素である。
【００８２】
内在性モノトピック膜タンパク質は、不変的に、片側のみから膜に結合しておりそして膜をまたがることはない。このクラスは、αヘリックス膜貫通アンカーを介して膜に繋留された（tethered）膜タンパク質を含んでいる。例としては、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ及びグリコホリンＡを含む。
【００８３】
周辺膜タンパク質は、一時的に又は間接的にのみ脂質二重層又はこれに組み込まれた脂質二重層と結合している。周辺膜タンパク質は、通常、高ｐＨ又は高塩濃度の極性試薬で処理した後の膜から解離する。周辺膜タンパク質の例には、ホスホリパーゼＡ２又はＣ、リポキシゲナーゼ、及びシトクロムＣが含まれる。
【００８４】
脂質アンカー型タンパク質は、脂質化、特にプレニル化又はＧＰＩアンカー型アミノ酸残基を介して脂質二重層に結合している。例としては、細菌リポタンパク質、Ｇタンパク質、及び特定のキナーゼを含む。
【００８５】
アンフィトロピックタンパク質は、少なくとも２つの立体配座状態で、脂質を含まず、水溶性の状態で、そして脂質に結合した状態で存在するタンパク質である。脂質との結合の際に、アンフィトロピックタンパク質には、それらが可逆的又は不可逆的膜結合になることを可能にする構造変化が生じる。アンフィトロピックタンパク質の例は、孔形成毒素及び抗菌性ペプチドである。
【００８６】
本発明の粒子は、２ｎｍ〜２００ｎｍ、特に３ｎｍ〜１５０ｎｍ、好ましくは３ｎｍ〜１００ｎｍの範囲のストークス半径（流体力学半径）Ｒｓを有するディスク状であると一般に考えられる。当業者は、ストークス半径を決定する方法について理解している。これは、好ましくは、既知のストークス半径の基準と比較して、分析用ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー）によって行われる。特に、粒子をゲル濾過ステップ例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０ ３０ゲル濾過カラムに供することができ、そしてｐＨ７．５において適切なバッファで０．５ｍＬ／分で室温で溶出することができる。吸光度をタンパク質について２８０ｎｍで測定する。カラムは、次のような既知のストークス半径のタンパク質標準の混合物、例えばサイログロブリン６６９ｋＤａ（ＲＳ＝８．５ｎｍ）、フェリチン４４０ｋＤａ（ＲＳ＝６．１ｎｍ）、カタラーゼ２３２ｋＤａ（ＲＳ＝４．６ｎｍ）、乳酸脱水素酵素１４０ｋＤａ（ＲＳ＝４．１ｎｍ）、ウシ血清アルブミン６６ｋＤａ（ＲＳ＝３．５５ｎｍ）、及びウマ心臓シトクロムｃ１２．４ｋＤａ（ＲＳ＝１．８ｎｍ）を用いて較正する。標準タンパク質のＲＳ値は、関心のある粒子のＲＳ値より上及びより下に及ぶべきである。検量線は、標準的なタンパク質についてＲＳ対溶出位置をプロットすることによって生成される。これにより、一般的にほぼ線形のプロットが与えられるが、それ以外の場合は、点間の線を描きそしてこの標準曲線上のその溶出位置から関心のあるタンパク質のＲＳを読み取ることで十分である。
【００８７】
いくつかの実施態様では、例えば大きな疎水性剤又は脂質のより多い量が粒子中に存在する場合には、ストークス半径は、３．２ｎｍ、特に、少なくとも３．５ｎｍ、少なくとも５．０ｎｍ、又は少なくとも１０．０ｎｍより大きくなる。
【００８８】
本発明の粒子及び具体的にはその実質的なディスク形状は、透過電子顕微鏡法を介して検査することができ、又はもし前記粒子が十分な大きさであれば、以下の実施例１２に記載のようなネガティブ染色電子顕微鏡及び単一粒子分析を介して検査することができる。
【００８９】
構造解析により、本発明の粒子において、脂質は、粒子内部の離散的大きさ（discrete size）のディスク状二重層様構造中に集合することが示されている。脂質結合性ポリペプチド成分は、一般的にディスク状二重層の境界を定義し、そして粒子に構造及び安定性を提供する。ほとんどの実施態様では、粒子の内部は、疎水性領域を含む（例えば、脂質の脂肪酸アシル鎖が含まれる）。リポソームと対照的に、本発明の粒子は、典型的には、親水性又は水性のコアを含まない。粒子は、一般的にディスク状であり、水平で、ディスク状で、ほぼ円形の、脂質結合性ポリペプチドの２つ又はそれ以上により提供される両親媒性αヘリックスにより囲まれる脂質二重曹を有し、これは、ディスク周辺の二重曹の疎水性表面に結合している。本発明のディスク状粒子の具体例が、模式的に図２〜７に示されている。
【００９０】
本発明の粒子のディスク形状は、少なくとも１．０：１．１、特に１．０：１．５又は１．０：２．０の最大径（直径の長さ）に対する最大高さの比を有する円筒に近い。ディスク状粒子の最大高さは、透過電子顕微鏡法により又はもし前記粒子が十分な大きさであればネガティブ染色電子顕微鏡及び単一粒子分析により決定されるように、一般的には、少なくとも３．５ｎｍ、特に少なくとも５．０ｎｍである。本発明の粒子は、頂部、底部、及び外周側面（circumferential side surface）を有し、頂部及び底部表面の最大径（直径の長さ）は、外周側面の高さより大きい。本発明の粒子のいくつかの実施態様では、脂質結合性ポリペプチドは、少なくとも部分的に粒子の外周側面を囲むように配置されている。
【００９１】
本発明のいくつかの実施態様では、透過電子顕微鏡法により又はもし前記粒子が十分な大きさであればネガティブ染色電子顕微鏡及び単一粒子分析により決定されるようなディスク状粒子の最大径（直径長さ）は、２ｎｍ〜２００ｎｍ、特に３ｎｍ〜１５０ｎｍ、好ましくは３ｎｍ〜１００ｎｍである。別の実施態様では、ディスク状粒子の最大径（直径長さ）は、３ｎｍ〜８０ｎｍ、具体的には３ｎｍ〜６０ｎｍである。実証実験により、最大径（長径）３ｎｍ〜２０ｎｍを有する粒子が本発明の方法を用いて特に容易に得られることが示されている。
【００９２】
本発明の好適な実施態様では、例えばＨｉＬｏａｄ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ １６／６０ ＧＬカラム上のゲル濾過溶出プロファイル（gel filtration elution profile）により評価されるように、粒子は、ディスク構造の実質的に単分散集団（monodisperse population）によって定義される。
【００９３】
一般的に、粒子中の脂質結合性ポリペプチドと脂質二重層との主な相互作用は、生物活性剤送達粒子の周囲の二重層の端での、脂質結合性ポリペプチド分子の両親媒性αヘリックスの疎水性表面上の残基と脂質の疎水性表面例えばリン脂質の脂肪アシル鎖との間の疎水性相互作用を介している。脂質結合性ポリペプチド分子の両親媒性αヘリックスは、粒子の周囲の脂質二重層の疎水性表面と接触している疎水性表面と、粒子の外面に直面しておりそして前記粒子が水性媒体中に懸濁されたときに水性環境と接触する親水性表面との両方を含む。
【００９４】
いくつかの実施態様において、粒子は、水溶液中で安定であり、長期保存のために凍結乾燥することができ、続いて水溶液中で再構成することができる。本明細書で使用される「安定性」又は「安定」は、粒子の断片化（particle fragmentation）が低レベルから検出できないレベル、粒子の凝集又は調製、輸送、及び貯蔵中の品質劣化が低レベルから検出できないレベルであることを意味する。
【００９５】
好ましい実施態様では、本発明の粒子は、例えば目視検査（透明でありそして沈殿のない溶液）又は分析用ゲル濾過（粒子の断片化が５０％未満、特に１〜４０％）により決定されるように、ｐＨ５．０〜８．０及び温度−２１０℃〜４℃の水溶液中で、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも７日、少なくとも２週間、少なくとも１月、少なくとも６月、又は少なくとも１２月の間安定している。実証実験により、本発明の粒子はまた、例えば目視検査（透明でありそして沈殿のない溶液）又は分析用ゲル濾過（粒子の断片化が５０％未満、特に１〜４０％）により決定されるように、ｐＨ５．０〜８．０及び温度４℃〜４０℃の水溶液中で、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも７日、少なくとも２週間、少なくとも１月、又は少なくとも３月の間安定していることが示される。
本発明の粒子は、例えば目視検査（透明でありそして沈殿のない溶液）又は分析用ゲル濾過（粒子の断片化が５０％未満、特に１〜４０％）により決定されるように、ｐＨ５．０〜８．０及び温度４０℃〜７５℃の水溶液中で、少なくとも１０分の間安定していることが証明されている。いくつかの実施態様では、粒子は長期間貯蔵用に凍結乾燥され、続いて水溶液中で再構成されることができる。いくつかの実施態様では、本発明の粒子は、例えばｐＨ７．５の適切なバッファ中での再構成後の分析用ゲル濾過（粒子の断片化が５０％未満、特に１〜４０％）によって決定されるように、凍結乾燥形態において、−２１０℃〜４０℃、具体的には−２１０℃〜２５℃で、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも７日、少なくとも２週間、少なくとも１月、少なくとも６月、又は少なくとも１２月の間安定している。本明細書で用いられる「断片化」とは、ゲル濾過の溶出プロファイルにおいて、本発明の粒子に相当するピーク（すなわち、ピーク高さ）の大きさが、新たに調製した本発明の粒子のピークの大きさと比較して、遊離非脂質結合ＳＡＰＬＩＰ及び／又は遊離脂質及び／又は凝集物のピークの大きさを犠牲にして減少したことを意味する。したがって、４０％の断片化は、例えば、ピークの大きさ（すなわち、ゲル濾過の溶出プロフィールのピーク高さ）が、貯蔵前のピークの大きさ（１００％）と比較して４０％減少したことを意味する。
【００９６】
実証実験により、本発明の粒子が、洗浄剤を実質的に含まない水溶液中でも特に安定していることが示されている。洗浄剤を実質的に含まないとは、水溶液が、水溶液の全体積に基づいて０．００１％未満（ｗ／ｖ）の洗浄剤を含むことを意味する。
【００９７】
さらなる観点において、本発明は、脂質結合性ポリペプチド及び脂質を含む粒子の製造方法を提供し、ここで脂質結合性ポリペプチドは、ＳＡＰＬＩＰ又はその誘導体若しくはそのトランケーティッド体であるものとする。前記方法は、
（ａ）液性環境中で脂質結合性ポリペプチドを可溶化された脂質に接触させる工程；及び
（ｂ）ｐＨ５．０〜１０．０又は５．０〜８．５；特に６．０〜８．０、そして最も好ましくは７．０〜８．０で粒子を自己集合させる工程
の工程を含む。
【００９８】
方法のいくつかの実施態様において、脂質結合性ポリペプチド及び脂質は前記の通りである。
【００９９】
本発明の方法の１つの実施態様において、脂質結合性ポリペプチドは、工程（ａ）において水性液体中で可溶化された脂質と接触する。特定の実施態様において、水性液体は、ｐＨ５．０〜１０．０又は５．０〜８．５；特に６．０〜８．０、そして最も好ましくは７．０〜８．０のバッファ溶液である。
【０１００】
本発明の方法の特定の実施態様では、脂質は、有機溶媒又は洗浄剤によって可溶化されている。好ましくは、工程（ａ）で使用される脂質は、洗浄剤で可溶化された状態である。実証実験により、多種多様な洗浄剤が、本発明の方法における使用のために、脂質を可溶化するために使用可能であることが示された。例えば、本発明の方法は、アルキルグルコシド例えば短又は長鎖アルキルマルトシド及びグルコシドの０．０１〜５．０％、特に０．１〜１．０％を含む溶液において可溶化された脂質とともに非常によく機能する。しかし、使用される脂質の種類に応じて、他の適切な洗浄剤を同様に用いることができる。脂質又は脂質混合物を可溶化するための任意の洗浄剤の能力は、凝集物、沈殿、又は相分離を有しない透明な溶液を形成することによって視覚的に容易に検査することができる。
【０１０１】
従来技術の方法とは対照的に、本発明の方法において、脂質は、上流のリポソーム調製工程を必要とせずに直接用いられることができる。これは、ＳＡＰＬＩＰリポタンパク質粒子の製造工程を簡略化するので、有利である。本発明用の方法の工程（ａ）用の出発物質として使用される脂質の特性である可溶性を考慮して、前記脂質は実質的にリポソームの形態でないと考えられている。
【０１０２】
実証実験により、本発明の脂質結合性ポリペプチドは、精製、貯蔵、又はハンドリング中に、洗浄剤又は他の溶媒を一般的に必要としないことが示された。しかしながら、必要に応じて、また、工程（ａ）で使用される脂質結合性ポリペプチドは、洗浄剤で可溶化された状態にすることができる。
【０１０３】
本発明の方法の１つの実施態様では、工程（ａ）における脂質に対する脂質結合性ポリペプチドモル比は、少なくとも１：１、特に少なくとも１：３、好ましくは少なくとも１：５又は１：１０である。
【０１０４】
本発明の方法の工程（ｂ）において、５.０〜１０．０好ましくは５．０〜８．５のｐＨにより、成分が、ステップ（ａ）において相互に接触し本発明の粒子内に自己集合することが可能となる。ＳＡＰＬＩＰリポタンパク質粒子が、最高の状態で集合する又はサポシンの天然の最適ｐＨ４．７５に近くする必要がある従来技術に基づく予想に反して、ＳＡＰＬＩＰリポタンパク質の粒子が、前記粒子の調製中により中性又は塩基性ｐＨに維持された場合に、簡単かつ信頼性の高い方法によって得ることができることが見出された。驚くべきことに、ｐＨ５．０〜１０でそして可溶化された脂質の存在下において、精製されたサポシン様タンパク質又はその誘導体若しくはトランケーティッド体が、上流のリポソーム調製工程を必要とせずに、安定的なリポタンパク質粒子内に自己集合することが見出された。この単純で信頼性の高い調製方法は、サポシンの天然の最適ｐＨ４．７５又は脂質の非存在下で粒子の集合を試みた場合、満足する結果を得ることができなかった。
【０１０５】
本発明の方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）において得られた混合物を前記工程（ａ）において得られた混合物よりも少ない量の洗浄剤を含有する液体で希釈する工程を含むことができる。実証実験により、前記希釈工程は、本発明の粒子の自己集合をさらに誘導及び促進することが示される。この理論に縛られることを望まないが、前記希釈工程が、溶媒又は洗浄剤分子を脂質結合性ポリペプチド及び脂質の疎水性表面から効果的に除去し、それによる成分の疎水性相互作用の強化を介して、本発明の粒子の自己集合工程をトリガーしたと考えられる。
【０１０６】
粒子の自己集合工程（ｂ）は、（ａ）で調製されたように、正確に同じ組成物中で行うことができる一方で、実証実験により、工程（ｂ）は、好適には、有機溶媒／洗浄剤の除去又は希釈工程を含むことが示されている。工程（ｂ）は、例えば、ゲル濾過工程であることができる。特定の実施態様では、工程（ａ）で得られた混合物をゲル濾過工程に供し、それによって、ゲル濾過バッファ又は他の溶液は、工程（ａ）で得られた混合物よりも少ない量の洗浄剤を含む液体となる。
【０１０７】
本発明の工程（ａ）及び／又は（ｂ）は、１℃〜９５℃、特に１５℃〜８０℃、特に好適には３０℃〜４０℃、及び／又は使用される脂質のゲルから液晶への相転移温度に近い温度で好適に実施される。使用する脂質の相転移温度は、文献中に容易に見付けることができる又は熱量測定により決定することができる。
【０１０８】
本発明の方法の１つの実施態様によると、工程（ｂ）において又は任意の後続工程（ｃ）において、少なくとも遊離脂質及び／又は遊離脂質結合性ポリペプチドの部分的除去による本発明の粒子の精製が実施される。適切な精製方法は、クロマトグラフィー法、特にサイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分離、透析、洗浄剤結合性バイオビーズへの接触、濃縮器の使用、アフィニティークロマトグラフィー、磁気ビーズ、及び／又は結合していない／組み込まれていない脂質及び／又は疎水性化合物を除去するための膜／フィルターである。
【０１０９】
本発明の方法の生成物は、脂質結合性ポリペプチドと脂質成分とを含む粒子である。本発明のこれらの粒子は、本発明のさらなる記載においてＳａｌｉｐｒｏ粒子と呼ばれ、そして特定の実施態様において、脂質結合性ポリペプチド、脂質、及び疎水性剤を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子についての前記の任意の又は全ての特徴を有することができる。
【０１１０】
本発明の方法はまた、Ｓａｌｉｐｒｏ粒子内に疎水性剤を組み込むために使用されることができ、それによって、脂質結合性ポリペプチド、脂質、及び疎水性剤を含む生成物粒子が得られる。疎水性剤は、本発明の粒子に含まれることができる種々の疎水性分子のための前記の任意の又は全ての特徴を有することができる。
【０１１１】
もし、組み込まれた疎水性剤を有するＳａｌｉｐｒｏ粒子を調製する必要があれば、本発明の方法は、脂質結合性ポリペプチドが、前記粒子に組み込まれるべき疎水性剤を含む液性環境中で、脂質に接触されるという点で修正される。実証実験により、本発明の方法は、疎水性有機化合物例えばクルクミンと単量体又はオリゴマーの膜タンパク質との両方を本発明の粒子に安定的に組み込むことを可能にする。
【０１１２】
特定の実施態様によれば、工程（ａ）及び／又は（ｂ）は、好ましくは、２０℃〜８０℃、特に２０℃〜７０℃、特に好適には３０℃〜７０℃、の温度で実施される。工程（ａ）及び／又は（ｂ）において３０℃〜７０℃の温度はほとんどの化合物のために十分である一方で、実証実験により、特定の疎水性剤については、工程（ａ）及び／又は（ｂ）における温度を高い温度例えば５０℃〜７０℃の温度範囲に上昇させることにより、本発明の粒子内に組み込まれている疎水性剤の負荷が増加される。本明細書で教示される方法により、当業者は、化合物、脂質、及び使用されるタンパク質の温度安定性、並びに意図された用途のための所望の疎水性剤の負荷に関して最適なインキュベーション温度を決定することができる。
【０１１３】
１つの実施態様では、疎水性剤は、前工程（ａ）で使用される前に、適した有機溶媒（例えばＤＭＳＯ、メタノール、及び／又はクロロホルム）又は洗浄剤によって可溶化されている。好ましくは、工程（ａ）で使用される疎水性剤は、洗浄剤で可溶化された状態である。洗浄剤は、脂質を可溶化するために使用される洗浄剤と同じであることもでき又は異なることもできる。
【０１１４】
本発明の１つの実施態様では、脂質を可溶化するための洗浄剤、及び／又は工程（ａ）において使用される疎水性剤は、本発明の最終の粒子に実質的な量で引き継がれていない（carried over）。特に、本発明の方法により得られる粒子中の洗浄剤の量を、検出不可能となるまで低くすることができる。１つの実施態様では、本発明の粒子は、粒子の重量に基づいて、洗浄剤の任意の実質的な量、特に０．１重量％未満、好ましくは０．０１重量％未満、特に好ましくは０．００１重量％未満を含まない。粒子中に存在する洗浄剤の量は、例えば質量分析によって決定することができる。
【０１１５】
もし工程（ａ）で使用される疎水性剤が、洗浄剤により可溶化状態にあるならば、実証実験により、短〜中鎖疎水性尾部を用いた疎水性剤の精製及び／又は可溶化用の洗浄剤を使用することが有利であることが示されている。膜タンパク質が、疎水性剤として組み込まれている場合、これは特に当てはまる。本明細書で用いられる「短鎖疎水性尾部」は、Ｃ２〜９、例えばｎ−ノニル−β−マルトシド（ＮＭ）を意味し；本明細書で用いられる「中鎖疎水性尾部」は、Ｃ１０〜１５、例えばｎ−デシル−β−マルトシド（ＤＭ）又はｎ−ドデシル−β−マルトシド（ＤＤＭ）を意味する。１つの実施態様では、疎水性剤の精製及び／又は可溶化用に使用される洗浄剤は、その疎水性尾部に炭素原子２〜１２個、好ましくは２〜１０個、そして最も好ましくは２〜９個を有する。
【０１１６】
いくつかの実施態様では、工程（ａ）における疎水性剤に対する脂質結合性ポリペプチドのモル比は、少なくとも１：０．５、好ましくは少なくとも１：２、又は少なくとも１：５、特に好ましくは１：１０である。別の実施態様では、工程（ａ）における疎水性剤に対する脂質結合性ポリペプチドのモル比は、１：０．５〜１：１００００、特に１：０．５〜１：１０００又は１：０．５〜１：５００である。実証実験により、成分中の化学量論と得られる粒子のサイズとが、出発成分の比率を調整することにより適宜に制御可能であることが示されている。
【０１１７】
本発明の粒子に組み込まれるべきほとんどの疎水性剤について、工程（ａ）における疎水性剤に対する脂質のモル比が、１００００：１〜１：１０００、特に１０：１〜０．５：１の場合に、最適の結果が達成される。
【０１１８】
本発明はまた、すなわち、粒子の調製に実際に使用された方法とは関係なく、前記の本発明の方法により得られる粒子にも関する。本発明の方法により得られる粒子は、複数の特徴において、例えば、それらの固有の大きさの柔軟性及びリポタンパク質粒子に組み込まれるべき疎水性剤のそれぞれの大きさに対して適応する能力に関して従来技術の粒子とは異なる。
【０１１９】
本発明はまた、必要とする個体に疎水性剤を送達するための医薬組成物を提供し、前記組成物は本発明の粒子を含み、そして前記疎水性剤は活性成分であり、及び／又は前記疎水性剤に加えて活性成分が存在する。
【０１２０】
本発明の粒子に加えて、医薬組成物は、任意で薬学的に許容されるビヒクル、担体、又はアジュバントを（さらに）含むことができる。
【０１２１】
本発明の粒子が医薬組成物中で使用するためのものである場合に、粒子及び医薬組成物の個々の成分は、薬学的に許容可能であるべきである。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなしでヒトと及び下等動物の組織との接触における使用に適しておりそして合理的な利益／リスク比と釣り合っている成分、化合物又は薬剤を指す。
【０１２２】
さらに別の観点において、本発明は、上記の医薬組成物の治療的有効量によりそれを必要とする個体を治療する方法を提供する。本明細書中で使用される、医薬組成物の「治療的有効量」は、治療される疾患又は状態の重篤度を治療又は軽減するために有効な量である。本明細書で用いられる「個体」という用語は、動物、例えば哺乳動物、そしてより具体的にはヒトを意味する。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、治療されるべき疾患又は状態の重症度に応じて、経口で、直腸で、非経口で、大槽内で（intracisternally）、膣内で、腹腔内で、局所で（粉末、軟膏、又はドロップによる）、又は頬側で、エアロゾルとして、経口又は経鼻スプレーなどによりヒト及び他の動物に投与することができる。特に、医薬組成物は、経腸、非経口及び／又は局所投与用に製剤化されることができる。それは、カプセル剤、点滴若しくは注射、ブラシ可能な（brushable）若しくは飲料の組成物として、又はエアロゾルとして投与されることができる。本発明の医薬組成物のいくつかの実施態様において、本発明の粒子は、固体の形態で、分散物として、又は溶液中に存在する。
【０１２４】
本発明の粒子はまた、診断及び／又は化粧品用途に有用である。例えば、前記標識、マーカー、又はインジケータとして検出可能な物質を含む粒子は、診断薬として使用することができ、診断目的のために適用されることができる。ラベル、マーカー、又はインジケータはそれら自体が、疎水性剤の中に含まれるか又は疎水性剤に含まれることができるが、それらは粒子の脂質結合性ポリペプチド又は脂質成分にも結合することができる。本発明の診断及び生命科学研究ツールとしては、例えば、標識され組み込まれた疎水性タンパク質の粒子、標識された脂質結合性ポリペプチド、標識された脂質、組み込まれたフルオロフォア又は造影剤（例えばＭＲイメージング用）を含む。標識は、例えば、蛍光標識されることができる。
【０１２５】
さらに、本発明の粒子は、薬剤開発、薬物スクリーニング、及び／又は膜タンパク質研究用のツールとして有用である。
【０１２６】
例えば、膜タンパク質薬物標的、例えば細胞表面受容体又はイオンチャネルは、本発明の粒子に組み込まれ、それによって可溶化されることができる。前記粒子は、次に、そのネイティブな脂質二重層環境における薬剤標的膜タンパク質の活性を研究するためにアッセイに使用されることができるか、又は新しい薬剤を同定するための薬剤スクリーニングにおいて使用されることができる。
【０１２７】
さらに、本発明の粒子はまた、用途例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又はバイオセンサー用途のために有用にするために、固体支持体に固定されることができる。
【０１２８】
本発明の粒子は、ネイティブ様二重層微小環境において不溶性の膜タンパク質を別の方法で水溶液に可溶性にするために一般に有用である。したがって、本発明は、膜タンパク質の研究に多種多様な新たな用途を提供する。例えば、本発明の粒子は、方法例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）、Ｘ線結晶学、電子顕微鏡（ＥＭ）、質量分析法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、差動光散乱、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）等による、本発明の粒子に組み込まれた膜タンパク質の研究を可能にする。
【０１２９】
別の観点では、本発明の粒子は、ワクチン製剤として、その担体として、又はその薬剤送達ビヒクルとして有用である。ワクチン接種において特に強力であることができる多くの病原体抗原が、病原体の表面に露出している及び／又は細胞外膜に含まれる、すなわち病原体の脂質、他の疎水性生体分子、又は膜タンパク質に由来する。例えば、インフルエンザウイルスの主要な抗原は、内在性膜タンパク質のヘマグルチニンに存在している。前記の病原性の疎水性生体分子は、本発明の粒子とともに、その後ワクチン製剤において抗原提示送達ビヒクルとして使用可能な粒子に効果的に組み込まれることができる。これらの線に沿って、本発明の粒子はまた、適切な宿主動物例えばウサギ、ヤギ又はラマにおいて疎水性剤又は生体分子に対する抗体を生成するための抗原提示送達ビヒクルとしての機能を果たすために有用である。
【０１３０】
また、本発明の粒子は、化粧品に使用されることができ、特に、本発明の粒子は、皮膚栄養（skin nourishing）及び／又は育成剤（nurturing agents）例えばビタミン及び／又は酸化防止剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
本発明のさらなる特徴及び利点は、添付の図面における非限定的な例により示される、以下のその実施態様のいくつかの詳細な説明から明らかになるであろう：
【図１】先行技術（例えば前記のＥＰ１５９６８２８Ｂ１）のナノディスク粒子を含有するアポリポタンパク質の形状及び分子組織の概略図である。
【図２】疎水性有機化合物を含む本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子とそれらの調製の概略図である；側面図としてａ）がそして上面図としてｂ）が描写される。
【図３】膜タンパク質を含む本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子とそれらの調製の概略図である；側面図としてａ）がそして上面図としてｂ）が描写される。
【図４】疎水性有機化合物及び膜タンパク質を含む本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子とそれらの調製の概略図である；側面図としてａ）がそして上面図としてｂ）が描写される。
【図５】オリゴマー膜タンパク質を含む本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子の概略図である；側面図としてａ）がそして上面図としてｂ）が描写される。
【図６】標的成分例えば抗体と疎水性有機化合物とを含む本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子とそれらの調製の概略図である。
【図７】本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子及びそれらの調製の概略図である；側面図としてａ）がそして上面図としてｂ）が描写される。
【図８】実施例２に記載の本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン＋脂質  ｐＨ７．５（Saposin+Lipids pH 7.5）」）のゲル濾過溶出プロファイル及び比較実験（「サポシン＋脂質  ｐＨ４．７５（Saposin+Lipids pH 4.75）」；「サポシン  ｐＨ７．５（Saposin pH 7.5）」）である。
【図９】実施例３に記載の本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン＋ＬＤＡＯ＋脂質  ｐＨ７．５」（Saposin+LDAO+Lipids pH 7.5））のゲル濾過溶出プロファイル及び比較実験（「サポシン＋ＬＤＡＯ  ｐＨ７．５（Saposin+LDAO pH 7.5）」；「サポシン＋ＬＤＡＯ  ｐＨ４．７５（Saposin+LDAO pH 4.75）」；「サポシン＋ＬＤＡＯ＋脂質  ｐＨ４．７５（Saposin+LDAO+Lipids pH 4.75）」）である。
【図１０】実施例４に記載の様々な異なる脂質を使用した本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子のゲル濾過溶出プロファイルである。
【図１１】実施例５に記載の膜タンパク質ＹｂｇＨを含む本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ７．５（Saposin+Detergent+Lipids+MemProt YbgH pH 7.5）」）のゲル濾過溶出プロファイル及び比較実験（「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ４．７５（Saposin+Detergent+Lipids+MemProt YbgH pH 4.75）」；「サポシン＋洗浄剤＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ７．５（Saposin+Detergent+MemProt YbgH pH 7.5）」；「サポシン＋洗浄剤＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ４．７５（Saposin+Detergent+MemProt YbgH pH 4.75）」）である。
【図１２】実施例６に記載の本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン＋洗浄剤＋脂質（Saposin+Detergent+Lipids）」）及び膜タンパク質ＭＡＴＥを含むＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＭＡＴＥ（Saposin+Detergent+Lipids+MemProt MATE）」）のゲル濾過溶出プロファイル及び比較実験（「サポシン（Saposin）」；「サポシン＋洗浄剤＋膜タンパク質ＭＡＴＥ（Saposin+Detergent+MemProt MATE）」）である。
【図１３】実施例７に記載の本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン＋脂質（Saposin+Lipids）」）又はホモ四量体膜タンパク質ＰＯＴ１を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン＋脂質＋膜タンパク質ＰＯＴ１（Saposin+Lipids+MemProt POT1）」）のゲル濾過溶出プロファイルである。
【図１４】実施例８に記載の本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン＋脂質（Saposin+Lipids）」）又はヒト膜タンパク質シナプトフィジン（Synaptophysin）を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン＋脂質＋膜タンパク質ＳＹＰ（Saposin+Lipids+MemProt SYP）」）のゲル濾過溶出プロファイルである。
【図１５】実施例９に記載の本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子（「脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ（lipid-only Salipro）」）又は親油性薬剤クルクミンを含むＳａｌｉｐｒｏ粒子（「Ｓａｌｉｐｒｏ−クルクミン（Salipro-Curcumin）」）のゲル濾過溶出プロファイルである。
【図１６】実施例１０に記載の様々な量の脂質を用いて調製された本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子（「脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ（lipid-only Salipro）」）のゲル濾過溶出プロファイルである。
【図１７】実施例１１に記載の本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子（「脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ（lipid-only Salipro）」）及びＰＯＴ１又はシナプトフィジンを含むＳａｌｉｐｒｏ粒子（「サポシン−ＰＯＴ１（Saposin-POT1）」；「サポシン−ＳＹＰ（Saposin-SYP）」）のゲル濾過溶出プロファイルである。
【図１８】実施例１２に記載のネガティブ染色電子顕微鏡を用いたＳａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１粒子の単一粒子解析を示し、ａ）は電子顕微鏡写真、そしてｂ）はＳａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１粒子のクラス平均である。差し込み図ｃ）及びｄ）は、それぞれ上面図及び側面図におけるＳａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１粒子の３Ｄ再構成で表現された表面を示す。
【図１９】実施例１３に記載の様々な熱処理に供された本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子のゲル濾過溶出プロファイルである。
【０１３２】
図１は、先行技術（例えば前記のＥＰ１５９６８２８Ｂ１）のナノディスク粒子１０を含有するアポリポタンパク質Ａ−１の形状及び分子組織を、概略的に示している。先行技術の粒子１０は、脂質３により形成された脂質二重層をダブルベルト状の様式で強固に取り囲むアポリポタンパク質骨格タンパク質１１を含むディスクの形状である。前記粒子の内部は、前記脂質二重層中の脂質３の疎水性領域により形成されている。粒子１０のストークス直径は、１０ｎｍの範囲内である。
【０１３３】
図２は、ａ）側面図及びｂ）上面図で示された、疎水性有機化合物４を含む本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子１の調製並びに形状及び分子組織を概略的に示している。
【０１３４】
本発明の粒子１は、精製された脂質結合性ポリペプチド２と脂質３及び組み込まれるべき疎水性有機化合物４とを混合することにより調製され、そしてｐＨ約５．０〜約１０．０で粒子１の自己集合が可能となる。脂質結合性ポリペプチド２は、サポシン様タンパク質（ＳＡＰＬＩＰ）でありそして円柱状で示される両親媒性ヘリックス４個を含む。脂質３は、親水性頭部基（円で示される）と疎水性尾部例えば脂肪アシル鎖（ジグザグの線として示されている）とを含む両親媒性である。以下の図３〜６にもあるように、粒子１及びその脂質３とＳＡＰＬＩＰ２構成要素との一般的構造の特徴の詳細な説明は、図７に示される、以下の基本的な脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子の記載中に見出すことができる。
【０１３５】
粒子１では、疎水性有機化合物４は脂質３により形成される脂質二重層の疎水性部分に埋め込まれている。疎水性有機化合物４は、例えば、生物学的活性剤、薬剤、薬剤の活性成分、化粧料生成物の活性成分、植物保護生成物活性成分、栄養及び／又は栄養補助食品、診断用プローブ、造影剤、標識、及び／又はインジケータであることができる。
【０１３６】
図３は、ａ）側面図及びｂ）上面図で示された、内在性単量体膜タンパク質５を含む、本発明によるＳａｌｉｐｒｏ粒子１の調製並びに形状及び分子組織を概略的に示している。図３及び４に示されているように、膜タンパク質５は、単量体の形態の膜貫通タンパク質であることができる。しかしながら、それはまた、図５に示されるようにオリゴマーの状態であるか、又は末梢膜タンパク質、脂質結合状態のアンフィトロピックタンパク質、脂質アンカータンパク質、又は融合された疎水性及び／又は膜貫通ドメインを有するキメラタンパク質であることができ、これらの全ては単量体又はオリゴマーの状態であることができる。
【０１３７】
本発明の粒子１は、精製されたＳＡＰＬＩＰ２と脂質３及び組み込まれるべき膜タンパク質５とを混合することにより調製され、そしてｐＨ約５．０〜約１０．０で粒子１の自己集合が可能となる。膜タンパク質５は、洗浄剤分子６及び／又は脂質１２に結合することができる。洗浄剤分子６は、膜タンパク質５の精製及び／又は可溶化からもたらされることができる。膜タンパク質５に結合された脂質１２は、精製前の膜タンパク質ネイティブの脂質環境からの持ち越し（carry-over）であることができる。粒子１においては、膜タンパク質５が脂質二重層の疎水性部分に埋め込まれ、そしてその天然の膜結合状態と同様の構造を採用している。粒子１は、場合により、脂質１２及び／又は精製された膜タンパク質５由来の洗浄剤分子６を含むことができる。特定の実施態様では、粒子１は、洗浄剤分子６の実質的な量、特に、前記粒子の重量に基づいた０．１重量％より少ない洗浄剤分子を含まない。
【０１３８】
本発明の粒子１の大きさは柔軟である。略図２〜７は、縮尺通りで描かれていない。粒子１に組み込まれた膜タンパク質５の大きさに応じて、図３に示される粒子は、図７に示される脂質のみの粒子よりも、又は図２に示すような低分子量有機疎水性化合物４を含む粒子よりも実質的に大きくなることができる。一般的に、粒子の大きさの増加は、２より多くすることができる粒子当たりのＳＡＰＬＩＰ分子２の数によっても反映される。本発明の粒子は、例えば、ＳＡＰＬＩＰ分子２を２〜２０個、特に２〜１０個含むことができる。粒子１の大きさはまた、その調製の工程（ａ）において添加される脂質３の量により影響されることができる。
【０１３９】
図４は、ａ）側面図及びｂ）上面図で示された、内在性単量体膜タンパク質５及び疎水性有機化合物４を含む、本発明によるＳａｌｉｐｒｏ粒子１の調製並びに形状及び分子組織を概略的に示している。本発明の粒子１は、精製されたＳＡＰＬＩＰ２と脂質３並びに組み込まれるべき膜タンパク質５及び疎水性化合物４とを混合することにより調製され、そしてｐＨ約５．０〜約１０．０で粒子１の自己集合が可能となる。
【０１４０】
図５は、ａ）側面図として及びｂ）上面図として示された、オリゴマー膜タンパク質７を含む、本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子１の概略図である。前記粒子１の大きさは柔軟であり、そしてその中に組み込まれた疎水性剤７の大きさに適応する。図５に示す実施態様では、粒子１は、頭尾の様式で配列された（arranged in a head-to-tail fashion）、粒子当たり３個のＳＡＰＬＩＰ分子２を含む。ＳＡＰＬＩＰ分子の３個を含む粒子の流体力学半径は、組み込まれる疎水性剤に応じて５〜２０ｎｍの範囲である。
【０１４１】
図６は、標的成分例えば抗体８及び疎水性有機化合物４を含む、Ｓａｌｉｐｒｏ粒子１の調製並びに形状及び分子組織を概略的に示している。前記の標的成分８は、図６に示されるような脂質アンカータンパク質の形態であるか又は疎水性若しくは膜貫通ドメインが融合されたキメラタンパク質の形態であることができる。標的成分は、脂質結合性ポリペプチド２、脂質３の１つ、及び／又は疎水性化合物４のいずれかに結合される又は含まれることができる。
【０１４２】
図７は、本発明によるＳａｌｉｐｒｏ粒子の調製並びに形状及び分子組織を概略的に示している。本発明の粒子１は、精製されたＳＡＰＬＩＰ２と脂質３とを混合することにより調製され、そしてｐＨ約５．０〜約１０．０で粒子１の自己集合が可能となる。脂質３は、親水性頭部基（円で示される）と疎水性尾部例えば脂肪アシル鎖（ジグザグの線として示されている）を含む両親媒性である。「閉じた」アポ状態においては（図７ａ左側参照）、ＳＡＰＬＩＰ２の構造は、本発明の粒子１中のその脂質結合の「開いた」構造（図７ａ右側参照）と比較して異なる。閉じた状態では、ＳＡＰＬＩＰ２は、４ヘリックスバンドルの内側に面しているその両親媒性ヘリックスの疎水性部分を有する４ヘリックスバンドル型構造を採用している。粒子１の「開いた」脂質結合構造においては、ＳＡＰＬＩＰ２は、脂質二重層中で脂質３の疎水性領域に接触する両親媒性ヘリックスの疎水性部分を有するＶ字型の又はブーメラン型の構造（図７ｂ及び図７ａ右側参照）を採用する。
【０１４３】
図７ａは側面図としての粒子１とその調製を示し、図７ｂは上面図である。本発明の粒子１はおおよそディスク状であり、ＳＡＰＬＩＰ分子２の２つの両親媒性αヘリックスにより取り囲まれた方形の脂質二重層に対して平坦で、ディスク状で略円形（roughly circular）である。脂質３は、粒子１の内部で、個々の大きさのディスク状脂質二重層構造内に集合する。ＳＡＰＬＩＰ２は粒子１内でディスク状二重層の境界を定義し、その内部は疎水性であり、すなわち脂質の脂肪アシル鎖に含まれそして親水性又は水性コアを欠いている。粒子１は、粒子１の二重層コア内の脂質３の疎水性相互作用と脂質３及び粒子の内部に向いているＳＡＰＬＩＰ２の両親媒性ヘリックスの疎水性部分の相互作用とにより、主に結合している。ＳＡＰＬＩＰ２は頭尾の様式で配列しており、そして粒子１内におけるＳＡＰＬＩＰ２間の分子内でのタンパク質−タンパク質の接触は実質的には存在しない。その最小の形態において、粒子１は、ＳＡＰＬＩＰ２の２分子と周囲の脂質分子３の少なくとも１０分子とを含有すると考えられる。しかしながら、本発明の粒子１は、大きさが柔軟である。その調製に使用される成分の大きさ及びモル比に応じて、それは、ＳＡＰＬＩＰ分子２の複数すなわち２分子以上とより多くの脂質３と場合により更なる成分とを収容することができる。例えば、粒子は、ＳＡＰＬＩＰ分子２の２〜２０、特に２〜１０分子を含有することができる。
【０１４４】
その脂質のみの形式でのＳａｌｉｐｒｏ粒子１の最大の高さは、脂質二重層の高さに対応しており、約５ｎｍである。粒子１は、上面（図７ｂにおいて見られる）、底面、及び周側面（circumferential side surface）を有しており、上面及び底面の直径（長径）は、周側面の高さよりも大きい。
【実施例】
【０１４５】
以下の実施例は、特定の実施態様及び図面を参照して、本発明をより詳細に、具体的に説明するのに有用であるが、本開示を限定することを意図しない。
【０１４６】
Ｉ  略語
以下の略語が使用される：
ＰＯＴ１：原核生物膜タンパク質、ペプチド輸送体
ＰＯＴ２：原核生物膜タンパク質、ペプチド輸送体
ＰＯＴ３：原核生物膜タンパク質、ＭＡＴＥ輸送体
ＳＹＰ：ヒト膜タンパク質
ＹｂＧＨ：原核生物膜タンパク質（大腸菌由来）、ペプチド輸送体（ＤｔｐＤとしても公知である）
ＤＤＭ：ドデシル−β−Ｄ−マルトシド
ＬＤＡＯ：Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシド；
ＰＳ：ホスファチジルセリン
ＰＯＰＣ：２−オレオイル−１−パルイトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＰＯＰＧ：２−オレオイル−１−パルイトイル−ｓｎ−グリセロ−３−グリセロール
ＴＥＶ：タバコエッチ病ウイルス
ＴＣＥＰ：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン
ＲＴ：室温
サポシンＡ（Ｓａｐｏｓｉｎ Ａ）：サポシンＡ（ヒト）１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（Hepes）（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ
脳脂質溶液（Brain-lipid-solution）：脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ
脳脂質：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ウシ脳由来脳抽出物、Ｉ型、Ｆｏｌｃｈ画分Ｉ（Folch Fraction I）；Ｂ−１５０２
ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）：５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ
ＧＦ−バッファ（ｐＨ４．７５）：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ
【０１４７】
ＩＩ  サポシンＡの精製
《実施例１》
精製サポシンＡは以下のように調製された。サポシンＡタンパク質発現をｐＮＩＣ−Ｂｓａ４プラスミド内に挿入されたヒトサポシンＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）コード領域を有するベクターを使用して実行し、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ−２ （ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）系統で形質転換しそして発現させた。細胞をテトラサイクリン、クロラフェニコル、及びカナマイシンを添加したＴＢ培地中で３７℃で増殖させ、０．７ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。誘導の３時間後に、細胞を１２０００Ｘｇで１５分間の遠心分離により収集した。上澄を廃棄し、細胞ペレットを溶解バッファ（２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、２０ｍＭイミダゾール）を用いて再懸濁し、超音波を用いて崩壊させた。溶解物を２６０００Ｘｇで３０分間の遠心分離に供し、上澄を８５℃１０分間加熱し、続いて２６０００Ｘｇで３０分間の追加の遠心分離工程を行った。準備としての（Preparative）ＩＭＡＣ精製を、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ培地の転倒型回転（end-over-end rotation）６０分間による上清のバッチ吸着によって行った。サポシンＡのＩＭＡＣ樹脂への結合の後に、クロマトグラフィー培地を１０ｍｍ（ｉ．ｄ．）オープン重力流カラム（open gravity flow column）に充填し、未結合タンパク質を溶解バッファ１５ベッドボリュームで洗浄することにより除去した。樹脂を洗浄バッファＷＢ２（２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、４０ｍＭイミダゾール）の１５ベッドボリュームで洗浄した。サポシンＡを、溶出バッファＥＢ（２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、４００ｍＭイミダゾール）の１５ベッドボリュームを添加することにより溶出した。溶出液を組換えＴＥＶプロテアーゼを添加したゲル濾過バッファＧＦ（ｐＨ７．５）（２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）に対して一晩透析した。非開裂Ｈｉｓタグ（un-cleavable His-tag）を含むＴＥＶプロテアーゼをＩＭＡＣ樹脂２ｍＬに通過させることによって溶出液から除去した。切断された標的タンパク質を、遠心濾過ユニットを用いて、体積５ｍＬまで濃縮し、そしてＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒＴＭ１０クロマトグラフィーシステムを使用したＨｉＬｏａｄ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １６／６０ ＧＬカラムにロードした（両方ともＧｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。ピーク画分をプールし、１．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質に濃縮した。タンパク質サンプルを液体窒素中で急速冷凍し−８０℃で保存した。
【０１４８】
ＩＩＩ  Ｓａｌｉｐｒｏ粒子の生成
《実施例２》
Ｓａｌｉｐｒｏ粒子（図８において「サポシン＋脂質  ｐＨ７．５」と示されている）の再構成のために、精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）１０μＬを１％（ｗ／ｖ）ＬＤＡＯ−洗浄剤溶液１．６μＬ及び脳脂質溶液（脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ）４μＬと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）４９．４μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物をＡｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５を備えたＡＫＴＡｍｉｃｒｏＴＭクロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ ５／１５０ ＧＬ分析濾過カラム上でゲル濾過工程に供し（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、前記Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５は、サンプルを含有しているタンパク質２５μＬを自動的に注入する。分析ゲル濾過をＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）中において流速０．２ｍＬ／分で４℃で行った。
【０１４９】
《比較例２》
ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）の代わりにＧＦ−バッファ（ｐＨ４．７５）（図８において「サポシン＋脂質  ｐＨ４．７５」と示されている）を使用した以外は実施例２を繰り返して実施した。
【０１５０】
ネガティブコントロール（図８において「サポシン  ｐＨ７．５」と示されている）として、精製サポシンＡ１０μＬを３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦバッファ（ｐＨ７．５）５５μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物を前記のゲル濾過工程に供した。
【０１５１】
実施例２におけるようなｐＨ７．５での脳脂質とのサポシンＡのインキュベーションは、より高い分子量の安定した脂質−タンパク質粒子（図８の「サポシン＋脂質  ｐＨ７．５」参照）に関するピークシフトをもたらした。対照的に、比較例２（図８の「サポシン＋脂質  ｐＨ４．７５」参照）におけるようなｐＨ４．７５での脳脂質とのインキュベーション後には、安定した脂質−タンパク質粒子は観察されなかった。
【０１５２】
《実施例３》
この実験の目的は、本発明による方法のための脂質の存在の重要性を評価することである。
【０１５３】
精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）１０μＬを１％（ｗ／ｖ）ＬＤＡＯ−洗浄剤溶液１．６μＬ及び脳脂質溶液（脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ）４μＬと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）４９．４μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物をＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）を用いて上記のゲル濾過工程に供した（図９における「サポシン＋ＬＤＡＯ＋脂質  ｐＨ７．５」参照）。
【０１５４】
《比較例３》
精製サポシンＡ１０μＬをＬＤＡＯ−洗浄剤溶液（１％）１．６μＬ及び脳脂質溶液４μＬと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦ−バッファ（ｐＨ４．７５）４９．４μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物をＧＦ−バッファ（４．７５）を用いて上記のゲル濾過工程に供した（図９における「サポシン＋ＬＤＡＯ＋脂質  ｐＨ４．７５」参照）。
【０１５５】
本発明の方法（図９の「サポシン＋ＬＤＡＯ  ｐＨ７．５」を用いて安定的なサポシンＡ−洗浄剤を生成するために、精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）１５μＬを１％（ｗ／ｖ）ＬＤＡＯ−洗浄剤溶液１．６μＬと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）４８．４μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物をＡｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５を備えたＡＫＴＡｍｉｃｒｏＴＭクロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ ５／１５０ ＧＬ分析濾過カラム上でゲル濾過工程に供し（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、前記Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５は、サンプルを含有しているタンパク質２５μＬを自動的に注入する。分析ゲル濾過をＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）中において流速０．２ｍＬ／分で４℃で行った。
【０１５６】
ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）の代わりにＧＦ−バッファ（ｐＨ４．７５）（図９において「サポシン＋ＬＤＡＯ  ｐＨ４．７５」と示されている）を使用した以外は、再度実施例２に記載されたように実験を実施した。
【０１５７】
図９に示される結果により、本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子の調製方法が脂質の存在を必要とすること（実施例３及び図９の「サポシン＋ＬＤＡＯ＋脂質  ｐＨ７．５」、並びに比較例３及び図９の「サポシン＋ＬＤＡＯ  ｐＨ７．５」参照）、そして比較例３にあるように（図９の「サポシン＋ＬＤＡＯ＋脂質  ｐＨ７．５」及び「サポシン＋ＬＤＡＯ＋脂質  ｐＨ４．７５」参照）、リソソームのｐＨが４．７５では安定的な粒子を得ることができないことが実証された。洗浄剤の存在は、安定的なＳａｌｉｐｒｏ粒子の形成を妨害しない一方で、洗浄剤単独の存在下においては、本発明の粒子を得ることは不可能であった（実施例３及び図９の「サポシン＋ＬＤＡＯ＋脂質  ｐＨ７．５、並びに比較例３及び「サポシン＋ＬＤＡＯ  ｐＨ７．５」参照）。
【０１５８】
《実施例４》
ＰＯＰＧ、ＰＯＰＣ、脳脂質、及びＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから。全て粉末の形態）を１％（ｗ／ｖ）ＤＤＭを添加したＧＦバッファ（ｐＨ７．５）に２０ｍｇ／ｍＬで溶解し、中程度のボルテックス撹拌をしながら３７℃で一時間インキュベートしそして−８０℃で貯蔵した。使用のために、脂質溶液を０．０３％（ｗ／ｖ）ＤＤＭを添加したＧＦバッファ（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍＬに希釈し、５ｍｇ／ｍＬ脂質、５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭの最終組成物が得られた。
【０１５９】
精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）１０μＬを各々の脂質溶液（ＰＧ、ＰＣ、脳脂質、ＰＳ）５μＬと混合し、そして３７℃で１０分間インキュベートした。次に、０．０３％（ｗ／ｖ）ＤＤＭを添加したＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）４５μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物をＡｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５を備えたＡＫＴＡｍｉｃｒｏＴＭクロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ ５／１５０ ＧＬ分析濾過カラム上でゲル濾過工程に供し（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、前記Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５は、サンプルを含有しているタンパク質２５μＬを自動的に注入する。分析ゲル濾過をＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）中において流速０．２ｍＬ／分で４℃で行った（図１０の「サポシン＋ＰＧ」、「サポシン＋ＰＣ」、「サポシン＋脳脂質」、及び「サポシン＋ＰＳ」参照）。
【０１６０】
ネガティブコントロールとして、精製サポシンＡ１０μＬを３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦバッファ（ｐＨ７．５）５５μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物を前記のゲル濾過工程に供した（図１０の「サポシン」参照）。
【０１６１】
図１０に示される結果により、本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子の調製方法が様々な異なる脂質とともに機能することが実証された。注目すべきは、Ｓａｌｉｐｒｏの粒子の大きさは可変であり、例えば、粒子の調製に使用される脂質により影響される可能性があることである（図１０参照）。
【０１６２】
ＩＶ  タンパク質性疎水性剤を含有するＳａｌｉｐｒｏ粒子
疎水性生体分子用担体としてのＳａｌｉｐｒｏ粒子の能力を実証するために、膜タンパク質を上記のアプローチを用いて、すなわち生理学的ｐＨにおいて生成サポシンＡと脂質及び組み込まれるべき膜タンパク質とに混合して続いてゲル濾過することにより、本発明のＳａｌｉｐｒｏナノ粒子中に組み込んだ。
【０１６３】
《実施例５》
細菌の膜タンパク質ＹｂｇＨを含むＳａｌｉｐｒｏ粒子（Ｓａｌｉｐｒｏ−ＹｂｇＨ、図１１において「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ７．５」と示されている）の再構成のために、精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）１０μＬを１％（ｗ／ｖ）ＬＤＡＯ−洗浄剤溶液１．６μＬ及び脳脂質溶液（脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ）４μＬと精製膜タンパク質ＹｂｇＨ（１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、５％グリセロール、０．０３％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）２．６μＬとに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）４６．８μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物をＡｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５を備えたＡＫＴＡｍｉｃｒｏＴＭクロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ ５／１５０ ＧＬ分析濾過カラム上でゲル濾過工程に供し（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、前記Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５は、サンプルを含有しているタンパク質２５μＬを自動的に注入する。分析ゲル濾過をＧＦ−バッファ（７．５）中において流速０．２ｍＬ／分で４℃で行った。
【０１６４】
《比較例５》
ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）の代わりにＧＦ−バッファ（ｐＨ４．７５）（図１１における「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ４．７５」参照）を使用した以外は実施例５を繰り返して実施した。
【０１６５】
加えて、精製サポシンＡ１０μＬを１％（ｗ／ｖ）ＬＤＡＯ−洗浄剤溶液１．６μＬ及び精製膜タンパク質ＹｂｇＨ（１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、５％グリセロール、０．０３％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）２．６μＬと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）５０．８μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物を上記のゲル濾過工程に供した（図１１における「サポシン＋洗浄剤＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ７．５」参照）。
【０１６６】
最終的に、精製サポシンＡ１０μＬを１％（ｗ／ｖ）ＬＤＡＯ−洗浄剤溶液１．６μＬ及び精製膜タンパク質ＹｂｇＨ（１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、５％グリセロール、０．０３％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）２．６μＬと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次にＧＦ−バッファ、（ｐＨ４．７５）５０．８μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物をＧＦ−バッファ（ｐＨ４．７５）を用いて上記のゲル濾過工程に供した（図１１における「サポシン＋洗浄剤＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ４．７５」参照）。
【０１６７】
図１１に示される結果により、本発明によるＳａｌｉｐｒｏ粒子の調製方法が前記粒子内への膜タンパク質のさらなる組み込みを可能にすることが実証された（図５参照）。Ｓａｌｉｐｒｏ−ＹｂｇＨの溶出プロファイル（図１１における「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ７．５」参照）は、２つの主要なピークを示しており、溶出体積１．５ｍＬの第一ピークはＳａｌｉｐｒｏ粒子に組み込まれた膜タンパク質に該当し、以前に観察されているものと同じ体積に溶出している溶出体積１．８ｍＬの第二ピークは脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子に該当する（図１０における「脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子」参照）。
【０１６８】
さらに、疎水性剤を含む本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子の調製方法が脂質の存在を必要とすること（実施例５及び図１１の「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ７．５」、並びに比較例５及び図１１の「サポシン＋洗浄剤＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ７．５」参照）、そしてリソソームのｐＨ（４．７５）では安定的な粒子を得ることができないこともまた実証された（比較例５及び図１１の「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ４．７５」参照）。脂質の非存在下においては（比較例５及び図１１の「サポシン＋洗浄剤＋膜タンパク質ＹｂｇＨ  ｐＨ７．５」参照）、精製サポシンＡに該当する溶出プロファイルは上昇的ショルダー（ascending shoulder）を示し、後者はおそらくＹｂｇＨ単独により形成された。
【０１６９】
《実施例６》
異なる原核生物膜タンパク質、ＭＡＴＥ輸送体を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子を調製した（Ｓａｌｉｐｒｏ−ＭＡＴＥ、図１２の「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＭＡＴＥ」参照）。
【０１７０】
精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）１０μＬを１％（ｗ／ｖ）ＬＤＡＯ−洗浄剤溶液２μＬ、脳脂質溶液（脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ）５μＬ、及び精製膜タンパク質ＭＡＴＥ（９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、５％グリセロール、０．０１％（ｗ／ｖ）ＤＭＮＧ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）７μＬとに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）４１μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物をＡｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５を備えたＡＫＴＡｍｉｃｒｏＴＭクロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ ５／１５０ ＧＬ分析濾過カラム上でゲル濾過工程に供し（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、前記Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５は、サンプルを含有しているタンパク質２５μＬを自動的に注入する。分析ゲル濾過をＧＦ−バッファ（７．５）中において流速０．２ｍＬ／分で４℃で行った（図１２の「サポシン＋洗浄剤＋膜タンパク質ＭＡＴＥ」参照）。
【０１７１】
《比較例６》
精製サポシンＡ１０μＬを１％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ−洗浄剤溶液２μＬ及び精製膜タンパク質ＭＡＴＥ（９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、５％グリセロール、０．０１％ＤＭＮＧ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）７μＬと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）４６μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物を上記のゲル濾過工程に供した（図１２における「サポシン＋洗浄剤＋膜タンパク質ＭＡＴＥ」参照）。
【０１７２】
脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子のコントロールのように、精製サポシンＡ１０μＬを１％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ２μＬ及び脳脂質溶液５μＬと混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）４８μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物を上記のゲル濾過工程に供した（図１２における「サポシン＋洗浄剤＋脂質」参照）。
【０１７３】
ネガティブコントロールとして、精製サポシンＡ１０μＬを３７℃で１０分間インキュベートした。次に、ＧＦバッファ（ｐＨ７．５）５５μＬを混合物に添加し、そして体積６５μＬの最終生成物を得た。室温での１０分間のインキュベーション後、混合物を前記のゲル濾過工程に供した（図１２の「サポシン」参照）。
【０１７４】
図１２に示される結果により、原核生物膜輸送体ＭＡＴＥは、以下の本発明による方法により容易にＳａｌｉｐｒｏ粒子内へ組み込まれることが実証された。Ｓａｌｉｐｒｏ−ＭＡＴＥの溶出プロファイル（（実施例６及び図１２の「サポシン＋洗浄剤＋脂質＋膜タンパク質ＭＡＴＥ」参照））は、溶出体積１．５ｍＬに主要なピークの１つを示しており、これはＳａｌｉｐｒｏ粒子に組み込まれた膜タンパク質に該当し、そして以前に観察されているものと同じ体積に溶出している、分子量がより小さくより低い溶出体積１．８ｍＬのピークは脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子に該当する（脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子コントロール「サポシン＋洗浄剤＋脂質」参照、そして図１０参照）。
【０１７５】
《実施例７》
異なる原核生物膜タンパク質、Ｓ. ｏｅｎｉｄｅｎｓｉｓペプチドＰＯＴ１を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子を調製した（Ｓａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１、図１３の「サポシン＋脂質＋膜タンパク質ＰＯＴ１」参照）。
【０１７６】
脳脂質溶液（脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ）２３０μＬを３７℃で１０分間インキュベートし、精製膜タンパク質ＰＯＴ１（１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、５％グリセロール、０．３％ＮＭ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）２５０μＬを添加して３７℃で３０秒間インキュベートした。次に精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）４６０μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）６３０μＬを添加した。室温での１分間のインキュベーション後、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）２ｍＬを添加しそしてサンプルを１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄をＧＦ−バッファ（７．５）を用いてＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒＴＭ１０クロマトグラフィーシステムを使用したＨｉＬｏａｄ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ １６／６０ ＧＬカラム上で（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ゲル濾過工程に供した（図１３の「サポシン＋脂質＋膜タンパク質ＰＯＴ１」参照）。
【０１７７】
ＰＯＴ１を添加しなかった以外は、前段落を繰り返して実施した（図１３における「サポシン＋脂質」参照）。
【０１７８】
Ｓａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１の溶出プロファイルは、Ｓａｌｉｐｒｏ粒子に組み込まれた膜タンパク質に該当するピークの１つを示し、分子量がより小さくより低いピークは脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子に該当する。したがって、サポシンＡ、脂質及び膜タンパク質は組み込まれた膜タンパク質を有する可溶性粒子を形成するように結合した。
【０１７９】
《実施例８》
原核生物膜タンパク質、精製ヒト膜タンパク質シナプトフィジン（ＳＹＰ）を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子を調製した（Ｓａｌｉｐｒｏ−ＳＹＰ、図１４の「サポシン＋脂質＋膜タンパク質ＳＹＰ」参照）。
【０１８０】
脳脂質溶液（脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ）５００μＬを３７℃で１０分間インキュベートし、精製膜タンパク質ＳＹＰ（４．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、５％グリセロール、０．０３％ＤＤＭ）８００μＬを添加して３７℃で３０秒間インキュベートした。次に精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）９００μＬを添加し、３７℃で１分間インキュベートし、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）６３０μＬを添加した。室温での１０分間のインキュベーション後、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）１．９ｍＬを添加しそしてサンプルを１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄をＧＦ−バッファ（７．５）を用いてＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒＴＭ１０クロマトグラフィーシステムを使用したＨｉＬｏａｄ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ １６／６０ ＧＬカラム上で（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ゲル濾過工程に供した（図１４の「サポシン＋脂質＋膜タンパク質ＳＹＰ」参照）。
【０１８１】
脳脂質溶液（脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ）２３０μＬを３７℃で１０分間インキュベートした。次に精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）４６０μＬを添加し、混合物を３７℃で１分間インキュベートし、次にＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）６３０μＬで希釈した。室温での１０分間のインキュベーション後、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）２ｍＬを添加しそしてサンプルを１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄をＧＦ−バッファ（７．５）を用いてＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒＴＭ１０クロマトグラフィーシステムを使用したＨｉＬｏａｄ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ １６／６０ ＧＬカラム上で（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ゲル濾過工程に供した（図１４の「サポシン＋脂質」参照）。
【０１８２】
Ｓａｌｉｐｒｏ−ＳＹＰは、その位置に脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子が存在することを示す小規模な下降的ショルダーの単一のピークを示す（図１４の「サポシン＋脂質＋膜タンパク質ＳＹＰ」及び「サポシン＋脂質」参照）。
【０１８３】
Ｖ  疎水性有機化合物を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子
疎水性化合物用の担体、例えば親油性薬剤としてのＳａｌｉｐｒｏ粒子の能力を評価するために、上記と同じ組み込みのための方法を用いて、本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子にこのような化合物を組み込むこと、すなわち精製サポシンＡと脂質及び組み込まれるべき化合物とを後続のゲル濾過工程を用いて生理的ｐＨで混合することが可能であるかどうか評価した。
【０１８４】
《実施例９》
クルクミンを、本発明の方法を用いたＳａｌｉｐｒｏ粒子への組み込みを試験するための疎水性のモデル薬剤として使用した。クルクミンは、主に脂質環境におけるその様々な薬理学的影響（例えば、抗癌、抗炎症、抗酸化剤、及び抗増殖活性）と蛍光とにより選択された。脂質環境でのＵＶ吸光度及び蛍光特性（励起波長４２０ｎｍ、発光５００ｎｍ）を用いて、Ｓａｌｉｐｒｏ粒子へのクルクミンの組み込みを容易に追跡することができる。
【０１８５】
クルクミン（１０ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ中）１μＬを脳脂質溶液（脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ）６０μＬと混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。次に精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）１００μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）８９μＬを添加し、続いて混合物を室温で１０分間インキュベートした。次にＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）２５０μＬを添加しそしてサンプルをＧＦ−バッファ（７．５）を用いてＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒＴＭ１０クロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １０／３００ ＧＬカラム上で（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ゲル濾過工程に供した。ＵＶ吸光度を２８０ｎｍ（タンパク質）及び４２０ｎｍ（クルクミン）で測定した。図１５の「Ｓａｌｉｐｒｏ−クルクミン」参照。
【０１８６】
クルクミンを添加しなかった以外は、前段落を繰り返して実施した（図１５における「脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ」参照）。
【０１８７】
図１５に示される結果により、脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子が小さな蛍光ピーク（図１５の「脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ」参照）のみを示す一方で、２８０ｎｍと特徴的なＳａｌｉｐｒｏタンパク質吸光ピークが存在する正確な位置の両方に蛍光ピークが存在することにより、クルクミンは、本発明によるＳａｌｉｐｒｏ粒子により組み込まれることが実証された。クルクミンの放出が５００ｎｍで記録された場合にも同様の結果が得られた。２８０ｎｍでは、精製Ｓａｌｉｐｒｏ−クルクミン粒子は、脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子とほとんど同一の単分散ピークを示す（図１５の「Ｓａｌｉｐｒｏ−クルクミン」及び「脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子」参照）。
【０１８８】
さらなる実験により、サポシンＡの非存在下では、脂質とクルクミンとを含む混合物は、可溶性の脂質クルクミン複合体中に自己集合することができないということが実証された。本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子は、Ｓａｌｉｐｒｏナノスケール粒子の脂質環境への組み込みにより、不溶性親油性化合物を別の方法で可溶性の状態にすることが可能である。
【０１８９】
ＶＩ  Ｓａｌｉｐｒｏ粒子は組み込んだ粒子の大きさ／特性を調節する
《実施例１０》
前記の実施例４の結果により、本発明の方法によって得られるＳａｌｉｐｒｏ粒子の大きさが本質的に柔軟であることが示された（図１０中の粒子の調製に使用される様々な脂質の影響を参照）。これは、本発明の方法によるＳａｌｉｐｒｏ粒子の調製において、脂質の量を増加させて使用するその後の実験で確認することができた。
【０１９０】
脳脂質溶液（脳脂質５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、０．２８％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ）の様々な量（「脂質５」：１μＬ、「脂質１２．５」：２．５μＬ、「脂質２５」：５μＬ、「脂質５０」：１０μＬ、「脂質１００」：２０μＬ）を３７℃で１０分間インキュベートした。精製サポシンＡ１０μＬを添加し、３７℃で１分間インキュベートし、そしてＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）を添加しそして最終体積を４１μＬとした。室温での１０分間のインキュベーション後、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）２４μＬを添加しそしてサンプルをＡｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５を備えたＡＫＴＡｍｉｃｒｏＴＭクロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ ５／１５０ ＧＬ分析濾過カラム上でゲル濾過工程に供し（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、前記Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５は、サンプルを含有しているタンパク質２５μＬを自動的に注入する。分析ゲル濾過をのＧＦ−バッファ（７．５）中において流速０．２ｍＬ／分で４℃で行った（図１６の「サポシン＋脂質５」、「サポシン＋脂質１２．５」、「サポシン＋脂質２５」、「サポシン＋脂質５０」、「サポシン＋脂質１００」参照）。
【０１９１】
ネガティブコントロールとして、精製サポシンＡ（１．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭヘぺス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣＬ）１０μＬを３７℃で１分間インキュベートし、そしてＧＦバッファ（ｐＨ７．５）３１μＬを添加した。室温での１０分間のインキュベーション後、ＧＦ−バッファ（ｐＨ７．５）２４μＬを添加しそしてサンプルをＡｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５を備えたＡＫＴＡｍｉｃｒｏＴＭクロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ ５／１５０ ＧＬ分析濾過カラム上でゲル濾過工程に供し（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、前記Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５は、サンプルを含有しているタンパク質２５μＬを自動的に注入する。分析ゲル濾過をＧＦ−バッファ（７．５）中において流速０．２ｍＬ／分で４℃で行った（図１６の「サポシン」参照）。
【０１９２】
図１６に示される結果により、本発明の方法により得られたＳａｌｉｐｒｏ粒子は大きさが柔軟であり、それによって例えば粒子の調製中に添加される脂質の量により、大きさを制御することができる。
【０１９３】
《実施例１１》
Ｓａｌｉｐｒｏ粒子の大きさの固有の柔軟性はまた、異なる大きさの膜タンパク質が本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子に組み込まれた実験から明らかになる。
【０１９４】
小さな（２７ｋＤａ）ヒトシナプトフィジン（サポシン−ＳＹＰ）を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子、四量体（４×５６ｋＤａ）大腸菌ペプチド輸送体ＰＯＴ１を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子（サポシン−ＰＯＴ１）、及び脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子を実施例７及び８に記載したように調製した。サンプルをＧＦバッファ（７．５）を用いてＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒＴＭ１０クロマトグラフィーシステムを使用したＨｉＬｏａｄ ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １６／６０ ＧＬカラム上でゲル濾過工程に供した（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
【０１９５】
図１７における溶出プロファイルの比較から明らかであるように、本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子の大きさは柔軟であり、その中に組み込まれた疎水性剤の大きさに対して調節していると考えられる。「空（ｅｍｐｔｙ）」すなわち、脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子が約３ｎｍの平均流体力学的半径を有する一方で、オリゴマーＰＯＴ１輸送体を含むＳａｌｉｐｒｏ粒子は、約１０ｎｍの平均流体力学的半径を示すまで拡大する。
【０１９６】
ＶＩＩ  Ｓａｌｉｐｒｏ粒子の視覚化
細菌のペプチド輸送体が取り込まれたＳａｌｉｐｒｏ粒子（Ｓａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１）を実施例７に記載したように調製し、そしてネガティブ染色電子顕微鏡で分析した。
【０１９７】
《実施例１２》
Ｓａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１サンプルを炭素薄膜でコーティングされたグロー放電銅グリッド（glow-discharged copper grids）に塗布しそしてギ酸ウラニルで染色した。イメージングを、加速電圧２００ｋＶでＪＥＯＬ ＪＥＭ２１００Ｆ電子顕微鏡を用いて実施した。顕微鏡写真は、４ＫのＣＣＤカメラで記録した。精製Ｓａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１の典型的な電子顕微鏡写真を図１８ａ）に示す。Ｓａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴは、グリッド上の様々な、すなわち粒子の側面又は上面／底面図を見ることができる配向を採用する正方形状の粒子に一般的に似ており、これにより３Ｄ単一粒子再構成が可能となる。
【０１９８】
単一のＳａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１粒子を顕微鏡写真から採取し、そしてＥＭＡＮ２スイート（EMAN2 suite）を使用して処理した。３Ｄ再構成のために、対称性（symmetry）は使用しなかった。図１８ｂ）は粒子のクラス平均を示し、そして図１８ｃ）及びｄ）の表面は、上面図及び側面図のそれぞれにおいてＳａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１の３Ｄ再構成を提供する。
【０１９９】
正方形の形状のＳａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１ディスクの外観と寸法は、その天然の細菌膜環境中の細菌ペプチド輸送体ＰＯＴ１によって形成されたホモ四量体膜タンパク質複合体（homo-tetrameric membrane protein complex）とよく一致している。ディスクの厚さは約５ｎｍであり、これは、脂質二重層の寸法を連想させ、そして主に膜貫通ヘリックスから成り大きな細胞質ゾルドメインを欠いているＰＯＴ１の公知の構造と一致している。直径及び最大直径（長径）は１２ｎｍ〜２ｎｍの範囲内である。Ｓａｌｉｐｒｏ−ＰＯＴ１粒子の見かけの化学量論と大きさとを考えると、各々の粒子は、ＰＯＴ１タンパク質４個及びサポシンＡ分子４個で構成されていると考えられる。これは、組み込まれた疎水性剤の大きさに適合させることにより、均一にかつ安定的にリポタンパク質複合体内に集合するサポシンＡの特定の柔軟性を示している。
【０２００】
Ｓａｌｉｐｒｏ粒子は、したがって、ホモ四量体ＰＯＴ１の例の場合のように（図５及び１８参照）、大きな疎水性脂質／タンパク質アセンブリの周囲のサポシンＡ分子の複数、並びに空の、脂質のみの状態の又は低分子量及び／又はモノマー疎水性剤（図２〜４及び６〜７参照）と共にロードされた場合の、脂質／洗浄剤コアに取り囲まれたサポシンＡ分子の２つから構成されている。
【０２０１】
ＶＩＩＩ  Ｓａｌｉｐｒｏ粒子の安定性
前記の例によって示されるように、Ｓａｌｉｐｒｏ粒子は、生理学的ｐＨで様々な脂質、膜タンパク質、及び疎水性化合物を組み込み、それによって水性環境下で可溶性であるナノスケールの複合体を生じさせることが可能である。本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子の実用性を確認するために、時間、温度、及び様々な処理条件にわたって、それぞれの安定性を試験した。
【０２０２】
《実施例１３》
熱安定性を評価するために、実施例７で記載されているように調製された脂質のみのＳａｌｉｐｒｏ粒子サンプル（各々６５μＬ）を急速冷凍し、−８０℃で保存し、解凍して、０℃、３７℃、５０℃、７３℃、又は９５℃で１０分間解凍した。続く分析は、Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５を備えたＡＫＴＡｍｉｃｒｏＴＭクロマトグラフィーシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ ５／１５０ ＧＬ分析濾過カラム上でのゲル濾過工程を介して実施し（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、前記Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ Ａ−９０５は、サンプルを含有しているタンパク質２５μＬを自動的に注入する。分析ゲル濾過をＧＦ−バッファ（７．５）中において流速０．２ｍＬ／分で４℃で行った。
【０２０３】
図１９に示される結果により、本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子が特定の熱安定性を示すことを実証する。
【０２０４】
さらなる実験は、本発明のＳａｌｉｐｒｏ粒子はまた、標準的な遠心フィルターユニットを用いた濃縮、凍結、及び解凍にわたり強固（robust）であることが明らかになった。さらに、Ｓａｌｉｐｒｏ粒子は、有意な品質劣化なしで凍結乾燥、貯蔵、及び再水和することが可能である。
【図１】
0006293779.tif 000002
【図２ａ】
0006293779.tif 000003
【図２ｂ】
0006293779.tif 000004
【図３ａ】
0006293779.tif 000005
【図３ｂ】
0006293779.tif 000006
【図４ａ】
0006293779.tif 000007
【図４ｂ】
0006293779.tif 000008
【図５ａ】
0006293779.tif 000009
【図５ｂ】
0006293779.tif 000010
【図６】
0006293779.tif 000011
【図７ａ】
0006293779.tif 000012
【図７ｂ】
0006293779.tif 000013
【図８】
0006293779.tif 000014
【図９】
0006293779.tif 000015
【図１０】
0006293779.tif 000016
【図１１】
0006293779.tif 000017
【図１２】
0006293779.tif 000018
【図１３】
0006293779.tif 000019
【図１４】
0006293779.tif 000020
【図１５】
0006293779.tif 000021
【図１６】
0006293779.tif 000022
【図１７】
0006293779.tif 000023
【図１８ａ】
0006293779.tif 000024
【図１８ｂ】
0006293779.tif 000025
【図１８ｃ】
0006293779.tif 000026
【図１８ｄ】
0006293779.tif 000027
【図１９】
0006293779.tif 000028
【配列表】
0006293779000001.app