(57)【要約】【課題】リグノセルロース原料から抽出されるセルロース固体画分の同時糖化発酵方法を提供する。【解決手段】セルロース固体画分の粘度を、液体炭水化物流れと混ぜることによって低下させる。適切な液体炭水化物流れは、リグノセルロース原料の処理中に固体画分からすでに分離された脱リグニン液体画分である。或はまた、固体画分の粘度を、一つ以上の単糖類を含む液体炭水化物流れと混ぜ合わせることによって低下させてもよい。次に、低粘度セルロース固体画分を、発酵微生物種菌とセルロースバイオマス分解酵素組成物と混ぜ合わせる。混ぜ合わせた混合物を、加圧反応容器においてセルロース固体の単糖類への酵素加水分解と単糖類の発酵を同時に可能にする高温下で維持して、エタノールビールを生成させる。エタノールビールは、燃料用エタノールと更に処理されてもよいアルコール蒸留廃液の回収に蒸留可能である。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース原料から抽出されるセルロース固体画分の同時糖化発酵方法であって、
抽出されたリグノセルロース供給原料をセルロース固体画分と液体画分に分離する工程、
前記液体画分を処理して、そこから抽出されたリグニンを除去し、それによって、無毒化された又は無毒化されていない液体画分の一つを生成させる工程、
前記セルロース固体画分と前記無毒化された又は無毒化されていない液体画分の一部とを混ぜることによって分離されたセルロース固体画分の粘度を低下させる工程、
低粘度セルロース固体画分と、(a)発酵微生物培養物の有効量と、(b)セルロースバイオマス分解酵素の有効量とを混ぜる工程、
前記微生物培養物、前記バイオマス分解酵素及び前記低粘度セルロース固体画分を混ぜ合わせて、エタノールを含む反応混合物を得る工程、及び
前記反応混合物からエタノールを分離する工程、
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記無毒化された又は無毒化されていない液体画分が、液体炭水化物流れと混ぜられる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記液体炭水化物流れが、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース又はこれらの混合物の一つを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
セルロース固体画分と混ぜる前に、前記無毒化された又は無毒化されていない液体画分を更に処理して、酢酸、フルフラール及び5-ヒドロキシメチル-2-フルフラールの少なくとも一つを除去する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記リグノセルロース原料が、被子植物バイオマス、裸子植物バイオマス、農作物バイオマス、植物及び/又は果物の果肉、木材及び木材処理スクラップ及び廃棄物、リサイクル可能な紙及びボール紙商品からなる群より選ばれる、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
発酵微生物培養物が、酵母種、真菌種、原生動物種及び細菌種からなる群より選ばれる菌株である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
発酵微生物培養物が、天然に存在する菌株及び遺伝子修正した菌株からなる群より選ばれる菌株である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
発酵微生物培養物が、サッカロミセス種からなる群より選ばれる菌株である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
発酵微生物培養物が、サッカロミセス・セレビシエ株Y-1528である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
発酵微生物培養物が、トリコデルマ種及びアスペルギルス種からなる群より選ばれる真菌株である、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
発酵微生物培養物が、ザイモモナス種、コリネバクテリム種、クロストリジウム種及びエシェリキア・コリからなる群より選ばれる細菌株である、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
セルロースバイオマス分解酵素が、セルラーゼ、β-グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ、β-キシロシダーゼ、及びこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、バッチ方法である、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
方法が、連続方法である、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
方法が、半連続方法又は流加培養方法である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
リグノセルロース原料から抽出且つ分離されるセルロース固体画分の同時糖化発酵方法であって、
前記セルロース固体画分と少なくとも一つの単糖炭水化物を含む液体流れとを混ぜることによって分離されたセルロース固体画分の粘度を低下させる工程、
低粘度セルロース固体画分と、(a)発酵微生物培養物の有効量と、(b)セルロースバイオマス分解酵素の有効量とを混ぜる工程、
前記微生物培養物、前記バイオマス分解酵素及び前記低粘度セルロース固体画分を混ぜ合わせて、エタノールを含む反応混合物を得る工程、 及び
前記反応混合物からエタノールを分離する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
液体流れが、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、及びこれらの混合物からなる群より選ばれる単糖を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記リグノセルロース原料が、被子植物バイオマス、裸子植物バイオマス、農作物バイオマス、植物及び/又は果物の果肉、木材及び木材処理スクラップ及び廃棄物、リサイクル可能な紙及びボール紙商品からなる群より選ばれる、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
発酵微生物培養物が、酵母種、真菌種、及び細菌種からなる群より選ばれる菌株である、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
発酵微生物培養物が、天然に存在する菌株及び遺伝子操作した菌株からなる群より選ばれる菌株である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
発酵微生物培養物が、サッカロミセス種からなる群より選ばれる菌株である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
発酵微生物培養物が、サッカロミセス・セレビシエ株Y-1528である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
発酵微生物培養物が、トリコデルマ種及びアスペルギルス種からなる群より選ばれる真菌株である、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
発酵微生物培養物が、ザイモモナス種、コリネバクテリム種、クロストリジウム種及びエシェリキア・コリからなる群より選ばれる細菌株である、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
セルロースバイオマス分解酵素が、セルラーゼ、β-グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ、β-キシロシダーゼ、グリカナーゼ、及びこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項16に記載の方法。
【請求項２６】
方法が、バッチ方法である、請求項16に記載の方法。
【請求項２７】
方法が、連続方法である、請求項16に記載の方法。
【請求項２８】
方法が、半連続方法である、請求項16に記載の方法。
【請求項２９】
リグノセルロース原料から抽出されるセルロース固体画分の同時糖化発酵のためのシステムであって、以下のように構成される複数の相互接続共働装置を備える、前記システム。
液体流れの供給と制御可能に連通し且つそれを通って受容し、
液体流れの供給と制御可能に連通しつつ、セルロース固体画分を受容し且つその中で処理し、
処理されたセルロース固体画分の供給をその中に制御可能に受容し、前記処理されたセルロース固体画分から反応生成物を得るように構成される同時糖化発酵方法をその中に含有し、更にそこから反応生成物を制御可能に流出させ、 更に
反応生成物を選択された成分に分離するとともに分離された前記成分の各々を制御可能に流出させる。
【請求項３０】
前記システムが、抽出されたセルロース固体画分のバッチを受容し且つその中で処理するように構成される、請求項29に記載のシステム。
【請求項３１】
前記システムが、そこから反応生成物を同時に流出させつつ、抽出されたセルロース固体画分を連続して受容し且つその中で処理するように構成される、請求項29に記載のシステム。
【請求項３２】
前記システムが、そこから液体成分を回収するように構成される、請求項29に記載のシステム。
【請求項３３】
回収された前記液体成分が、更に処理され、液体流れの供給として再循環するのに適する、請求項32に記載のシステム。
【請求項３４】
前記抽出されたセルロース固体画分が、再循環された前記液体流れの供給の一部と混ぜ合わせることによって前処理される、請求項33に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繊維性バイオマスを成分に分画するためのシステム及び方法に関する。より詳細には、本発明は、リグノセルロース物質から炭水化物の、単一容器における同時生産発酵に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物によって生産される天然に存在する繊維性バイオマスは、典型的には、エタノール生産酵母によってエタノールに容易に発酵させられるグルコース、ガラクトース、マンノースのような種々のヘキソース炭水化物を含有する。グルコースは、セルロースの唯一の成分であるが、特に針葉樹においては、ヘミセルロースの重要な成分でもある。ガラクトースとマンノースは、ヘミセルロースに存在するその他の主なヘキソース炭水化物である。エタノールの工業生産に典型的に用いられるサッカロミセス種(Saccharomyces spp.)、酵母がグルコースとガラクトースとマンノースの混合物を含む原料と存在するときには、最初に、グルコースを発酵させ、培地から排出させた後に、酵母細胞はマンノースを溶解し且つ発酵させるのに適合し、次に、マンノースが減少した後に、酵母が再びガラクトースを代謝させるように適合するが、これはヘミセルロースに由来する三つの主な炭水化物を発酵させるのに最も難しいものである。このタイプの適応代謝挙動は、ジオーキシー増殖又は代謝(二つの炭水化物について)、また、トリオーキシー増殖又は代謝(三つの炭水化物について)と呼ばれている。炭水化物使用の各相の間には、通常、発酵が起こらない数時間があり、必要な輸送タンパク質が酵母の細胞膜に誘導される。この誘導現象により、典型的には、ヘミセルロースに由来する発酵性炭水化物の混合物の完全な消費に必要とされる発酵時間が著しく長くなる。被子植物繊維、裸子植物繊維、農作物繊維のようなリグノセルロース物質から生じる混合ヘキソース炭水化物原料流れからエタノールの生産のために構成される工業方法又は方法において、ジオーキシー代謝とトリオーキシー代謝中の酵素調整によって引き起こされる発酵の遅れは、これらの方法に関連する設備投資と運転経費を著しく増加させる。従って、研究室規模のシステムにおいて液体ヘキソース流れをエタノールに変換する効率に基づき、工業発酵方法に潜在的に適した酵母菌株を同定し且つ選択する菌株選択戦略が一般に使われている。液体ヘキソース流れを発酵させるのに適した例示的な酵母菌株としては、グルコース-マンノース-ガラクトースを順次代謝するためのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) T1及びガラクトース-グルコース-マンノースを順次代謝するS. セレビシエ Y-1528が挙げられる(Keating et. al., 2004, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:235-244)。
【０００３】
リグノセルロース繊維物質の工業規模の処理の最初の段階は、一般に、繊維の物理化学的な破壊を含み、溶媒、希酸を用いた破壊された物質の化学抽出及び/又は生物学的変換が続く。溶媒抽出方法により、典型的には、繊維のオリゴ糖と多糖の成分からリグニンが分離され、リグニンと単糖類、オリゴ糖類及び多糖類の少なくとも一部が抽出溶媒に遊離する。溶媒を回収した後、使用済みの水性抽出液は、エタノール生産のための原料流れとして用いてもよい。しかしながら、使用済みの抽出液は、また、典型的には、有意量のリグノセルロース由来の有機化合物、例えば、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、微生物発酵代謝方法を著しく損なうか又は阻害するような他の化合物を含有する。このような阻害物質は、フルフラール、5-ヒドロキシメチルフルフラール、酢酸等によって例示される。その結果、商業的に有効な発酵微生物を同定する選択基準には、阻害物質にさらされる長時間の間の許容量と代謝性能の評価が含まれる。Keating et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 93: 1196-1206には、液体ヘキソース流れに含有するレベルの選択された阻害物質が増加するにつれてS.セレビシエ菌株T1とY-1528の発酵速度は落ちるが、研究室規模のバッチ発酵におけるエタノールの全体の収量は影響されなかったことが示されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の例示的な実施態様は、繊維性リグノセルロース原料の上流抽出の間に遊離される構造成分の同時下流糖化発酵のために構成される工業規模の方法、システム及び方法に関する。本明細書に提供され、記載され、予想される本発明の工業規模の同時糖化発酵方法、システム及び方法に適した例示的な繊維性リグノセルロース構造成分は、セルロース、ヘミセルロース、多糖類及びオリゴ糖類を含んでいる。
本発明の例示的な一実施態様によれば、繊維性リグノセルロース原料の有機溶媒抽出の間に遊離される構造成分の同時糖化発酵方法が提供される。例示的な方法は、一般的には、選択されたリグノセルロース原料を有機溶媒で処理して、混ぜ合わせた固体画分と液体画分を生成させる工程、固体画分を液体画分から分離する工程、分離した固体画分を選択された液体単糖及び/又はオリゴ糖又は混合単糖/オリゴ糖の流れと混ぜて、分離した固体画分の粘度を低下させ、その後、低粘度固体画分を、ペントース及び/又はヘキソース炭水化物の発酵に選ばれる適切な微生物培養物を含む種菌の有効量と混ぜ合わせる工程、更に、多糖類とオリゴ糖の糖化に適した酵素の有効量をそれに添加する工程、次に、微生物がオリゴ糖類を発酵させる能力を有する場合には固体画分の糖化と単糖類及び/又はオリゴ糖類の発酵に適した時間に適した反応条件を与える工程を含む。
適切な固体画分は、被子植物バイオマス、裸子植物バイオマス、農作物バイオマス、植物及び/又は果物の果実、木材及び木材処理スクラップ及び廃棄物、リサイクル可能な紙及びボール紙商品等によって例示される繊維性リグノセルロース原料から生成されてもよい。
抽出されたリグノセルロース原料から分離される固体画分の粘度を低下させるのに適した液体流れは、抽出されたリグノセルロース原料から分離される脱リグニン液体画分によって例示される。他の適切な液体流れは、水、短鎖アルコール、酸、塩基等を含む炭水化物含有溶液によって例示される。液体流れは、一つ以上の選ばれた単糖炭水化物、例えば、グルコース、ガラクトース及びマンノース等によって例示されるもので更に補足されてもよい。
【０００５】
ペントース及び/又はヘキソース炭水化物を発酵させるのに適した微生物種菌は、酵母種、真菌種、細菌種、原生動物、又は他の種より選ばれる一つ以上の適切な菌株を含む。適切な酵母は、サッカロミセス種やピチア種(Pichia spp.)によって例示される。適切なサッカロミセス種は、S.セレビシエ、例えば、菌株Y1528、Tembec-1等によって例示される。適切な真菌種は、アスペルギルス種(Aspergillus spp.)やトリコデルマ種(Trichoderma spp.)によって例示される。適切な細菌は、天然に存在し且つ遺伝子修飾されている、特に、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、ザイモモナス種(Zymomonas spp.)、クロストリジウム種(Clostridium spp.)、コリネバクテリウム種(Corynebacterium spp.)によって例示される。単一菌株を含む種菌、或いは、単一タイプの生物体から複数の菌株、或いは更に、複数の種と微生物タイプからの菌株(即ち、酵母、真菌、細菌)を含む菌株の混合物を提供することは、本発明の範囲内である。
適切な酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、β-グルコシダーゼ、β-キシロシダーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、及び他のグリカナーゼによって例示される。
本発明の一態様は、抽出された繊維性リグノセルロース原料の固体画分から分離される液体画分の回収及び再循環である。リグノセルロース原料の処理中に溶媒に抽出されるリグニンは、液体画分から分離される。無毒化された又は無毒化されていない液体画分、或いは部分的脱リグニン液体画分は、分離された固体画分の粘度を低下させるのに適した希釈剤である。固体画分の粘度を低下させるのに用いる前に一つ以上の単糖炭水化物で無毒化された又は無毒化されていない液体画分を改良することが適切である。適切な単糖炭水化物は、グルコース、マンノース、ガラクトース等によって例示される。
一態様によれば、方法は、バッチ方法である。
他の態様によれば、方法は、連続方法である。
更に他の態様によれば、方法は、半連続方法である。
【０００６】
本発明の他の実施例によれば、抽出された繊維性リグノセルロース原料から分離される固体画分の同時糖化発酵システムが提供される。システムは、一般的には、(a)固体画分と液体画分に分離可能な抽出された繊維性リグノセルロース原料の供給、(b)抽出されたリグノセルロース原料から分離される固体画分と液体画分をその中に別々に受容し且つ処理するように構成される複数の適切な装置及び作動システム、(c)固体画分の粘度を低下させるように発酵性炭水化物で強化される適切な液体流れの供給、(d)適切な微生物培養物の供給、(e)適切な選ばれた酵素、及び(f)固体画分、液体流れ、微生物培養物及び酵素をリグニンとエタノールによって例示される反応生成物を含む反応混合物に制御可能に混ぜ合わせるためのデバイス、装置、機器及びソフトウェアを備える。適切な液体流れは、抽出された繊維性リグノセルロース原料から回収され、次に無毒化されるか又は無毒化されず、更にその粘度を低下させるために固体画分と混ぜ合わせる前に完全に又は部分的にエタノール除去される液体画分によって例示される。反応混合物から分離されるエタノールは、燃料として又は燃料成分もしくは医薬品、食品及び飼料工業における用途のようなそれを更に精製した後の他の非燃料関連用途として使用できる。
一態様によれば、システムは、更に、懸濁した微粒子セルロース、ヘミセルロース、多糖類、及びオリゴ糖類を含む、抽出されたリグノセルロース繊維物質から分離される発酵性炭水化物で強化された液体画分をその中に受容し且つ無毒化されるように構成されてもよい。
他の態様によれば、システムは、反応生成物を同時に流出させつつ、抽出されたリグノセルロース原料から分離される固体画分のバッチを連続して受容し且つ処理するように構成されてもよい。
他の態様によれば、システムは、反応生成物を同時に流出させつつ、抽出されたリグノセルロース原料から分離される固体画分のバッチを連続して受容し、粘度を低下させ、更に処理するように構成されてもよい。
他の態様によれば、システムは、バッチシステムとして構成される。
更に他の態様によれば、システムは、使用済みの有機溶媒又は無機溶媒を回収し且つ調整し、前記調整された有機又は無機溶媒を再循環するように構成されてもよい。
【０００７】
更に態様によれば、システムは、使用済みの有機溶媒又は無機溶媒を回収し且つ再生するとともに、抽出されたリグノセルロース原料から分離される固体画分の粘度を低下させるための液体流れとしてその中に用いられる再生された有機溶媒又は無機溶媒を、前記固体画分の同時糖化発酵の前に再循環するように構成される。
本発明の更に他の例示的な実施態様によれば、抽出された繊維性リグノセルロース原料から分離される固体画分の同時糖化発酵のための方法であって、分離された固体画分をその中に炭水化物を含む適切な有機溶媒又は無機溶媒と、ペントース及び/又はヘキソースの炭水化物の発酵のために選ばれる適切な微生物培養物の有効量と、及び適切な酵素の有効量と混ぜ合わせることを含む、前記方法が提供される。その中に炭水化物を含む適切な有機溶媒又は無機溶媒は、抽出されたリグノセルロース原料から分離され、次に、固体画分と混ぜ合わせる前に無毒化されるか又は無毒化されない、液体画分によって例示される。ペントース及び/又はヘキソース炭水化物を発酵させるのに適した微生物培養物は、酵母種、真菌種及び細菌種より選ばれる一つ以上の適切な菌株を含む。適切な酵母は、サッカロミセス種やピチア種によって例示される。適切なサッカロミセス種は、S.セレビシエ、例えば、菌株Y1528、Tembec-1等によって例示される。適切な真菌種は、アスペルギルス種やトリコデルマ種によって例示される。適切な細菌は、天然に存在し且つ遺伝子操作された、特に、エシェリキア・コア、ザイモモナス種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種によって例示される。単一菌株、或いは単一タイプの生物体からの複数の菌株、或いは更に、複数の種と微生物タイプからの菌株(即ち、酵母、真菌、細菌)を含む菌株の混合物を含む種菌を提供することは本発明の範囲内である。適切な酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、β-グルコシダーゼ、β-キシロシダーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、及び他のこのようなグリカナーゼによって例示される。
本発明の更に他の例示的な実施態様によれば、抽出された繊維性リグノセルロース原料から分離される固体画分の同時糖化発酵のための方法であって、適切な液体流れを有する分離された固体画分をペントース炭水化物を発酵させ且つバイオマス分解酵素を分泌するように遺伝子操作されたサッカロミセス・セレビシエ株Y-1528の培養物の有効量と混ぜ合わせることを含む、前記方法が提供される。
本発明は、以下の図面を参照するとともに記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図1は、二つ又は三つの単糖類の混合物を含む溶液において培養されたときに、登録商標権を有するサッカロミセス・セレビシエ株(Ethanol Red(登録商標); Ethanol Redは、Lesaffre et Compagnie、パリ、フランスの登録商標である)のヘキソースからエタノールへの発酵効率を“Y-1528”として示される公有財産サッカロミセス・セレビシエ株と比較している図である。データ点は、三回の試料の平均である。データ点の上と下に伸びているバーは、信頼度95%の±標準偏差(SD)を表す。SDバーの無いデータ点は、これらのデータ点にSD範囲を包含している。
【図２】図2は、発酵基質として補足されたブリティッシュコロンビアアスペン(Populus tremula)の収集された全丸太から得られる広葉樹固体画分を用いて同時糖化発酵システムにおいて培養したときのS.セレビシエ株Y-1528によるエタノール生産率を示す図である。データ点は、三回の試料の平均である。データ点の上と下に伸びているバーは、信頼度95%の±標準偏差(SD)を表す。SDバーの無いデータ点は、これらのデータ点にSD範囲を包含している。
【図３】図3は、発酵基質としてガラクトースとマンノースで補足されたアスペンから得られる広葉樹固体画分を用いて同時糖化発酵システムにおいて培養したときのS.セレビシエ株Y-1528によるエタノール生産率を示す図である。データ点は、三回の試料の平均である。データ点の上と下に伸びているバーは、信頼度95%の±標準偏差(SD)を表す。SDバーの無いデータ点は、これらのデータ点にSD範囲を包含している。
【図４】図4は、発酵基質として補足されたアスペンから得られる広葉樹固体画分を用いて同時糖化発酵システムに取り込む前にガラクトース/マンノース基質において16時間培養したときのS.セレビシエ株Y-1528によるエタノール生産率を示す図である。データ点は、三回の試料の平均である。データ点の上と下に伸びているバーは、信頼度95%の±標準偏差(SD)を表す。SDバーの無いデータ点は、これらのデータ点にSD範囲を包含している。
【図５】図5は、図2-図4に示される三つのシステムにおけるS. セレビシエ株Y-1528によるエタノール生産率を比較している図である。データ点は、三回の試料の平均である。データ点の上と下に伸びているバーは、信頼度95%の±標準偏差(SD)を表す。SDバーの無いデータ点は、これらのデータ点にSD範囲を包含している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の例示的な実施態様は、固体画分と抽出された繊維性リグノセルロース物質と使用済みの抽出溶媒から分離される炭水化物で強化された必要により無毒化されていなくてもよい液体画分の同時糖化発酵(CSF)のために構成された発酵方法及びシステムに関する。このようなCSFシステムは、一般に、同時糖化発酵(SSF)方法とも呼ばれる。本発明の発酵方法は、バッチ方法として、或いは連続方法として、或いは更に半連続方法又は流加培養(fed-batch)方法として構成されてもよい。  
本発明の例示的な実施態様は、選択されたリグノセルロース原料を有機溶媒で処理して、通常はセルロース繊維(即ち、セルロース強化固体画分)を含む固体画分とリグノセルロース原料を含んだ種々の構造的有機成分と鉱物成分を可溶化された有機溶媒を含む液体画分を生成させることに関する。固体画分と液体画分に分離するのに適したリグノセルロース原料混合物は、植物材料からの繊維性バイオマス、例えば、被子植物、裸子植物、農作物、植物及び/又は果物の果肉、木材、木材処理スクラップ、リサイクル可能な紙、ボール紙商品等、又はこれらの混合物によって例示される。選択されたリグノセルロース原料は、オルガノソルブ方法に通常用いられる適切な溶媒と混ぜ合わせ、次に、セルロースパルプを含む固体成分と他の化合物の中でもリグニン、ヘミセルロース、多糖類、オリゴ糖類のような可溶性化成分を含有する有機溶媒を含む液体画分の分離を可能にするのに適した時間リグノセルロース原料を処理する。オルガノソルブ方法は、繊維性植物バイオマスからのリグニンを可溶化し且つ除去するために用いられるパルプ化溶媒のための有機薬品、例えば、短鎖脂肪族アルコール(例えば、メタノール、エタノール)、ギ酸、酢酸、酢酸エチル、フェノール及びクレゾールによって例示されるものを使う。繊維性リグノセルロース物質の溶媒脱リグニンの間に、植物ベースの繊維のヘミセルロース成分のほとんどが、部分的に加水分解され且つ溶媒に可溶化される。オルガノソルブ方法が完了に向かって進行するにつれて、単純な炭水化物とオリゴ糖類は、黒液に遊離される(黒液は、可溶化リグニン、炭水化物、炭水化物分解化合物、及び他の有機化合物及び無機化合物と水及び抽出に用いられる薬品との組み合わせである)。これらの炭水化物は、次に、沸騰温度で希釈された液体流れの蒸発を含む液処理工程に運ばれ、蒸発した液体を冷却し、発酵性条件にpH調整され、最終的には、SSF方法スキームにおける固体とすぐに混合できるか又はエタノールに別々に発酵できる蒸発器濃縮物として処理システムから出る。
本発明の他の例示的な実施態様は、リグニン成分又はリグニン分解、炭水化物分解、抽出成分分解生成物を除去するために蒸発器濃縮物を更に処理し、それによって、セルロース強化固体画分の粘度を希釈するのに適する無毒化炭水化物を多く含む有機溶媒を生成させて、同時糖化発酵工程を始める前に粘度を低下させることに関する。
【００１０】
本発明の他の例示的な実施態様は、無毒化炭水化物を多く含む有機溶媒を含有する低粘度セルロース強化固体画分を以下の割合及び効率を増強するのに選ばれた微生物種菌及び酵素と混ぜ合わせることに関する: (a)セルロース強化固体の主にグルコース、マンノース、ガラクトース及びより少ない程度のキシロースへの糖化及び(b)酵素加水分解によって生成されるこれらの単糖類の同時発酵。ペントース及び/又はヘキソース炭水化物を発酵させるのに適した微生物種菌は、酵母種、真菌種及び細菌種より選ばれる一つ以上の適切な菌株を含む。適切な酵母は、サッカロミセス種やピキア種によって例示される。適切なサッカロミセス種は、S.セレビシエ等によって例示される。適切な真菌種は、アスペルギルス種やトリコデルマ種によって例示される。適切な細菌は、天然に存在し且つ遺伝子操作された、特に、エシェリキア・コリ、ザイモモナス種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種によって例示される。単一菌株、或いは単一タイプの生物体からの複数の菌株、或いは更に、複数の種と微生物タイプからの菌株(即ち、酵母、真菌、細菌)を含む菌株の混合物を含む種菌を提供することは本発明の範囲内である。適切なサッカロミセス種培養物は、S.セレビシエ株Y1528、Tembec-1によって例示され、天然に存在する菌株及び/又は遺伝子操作された菌株であってもよい。木質バイオマスによって例示される繊維性バイオマスに見られる全三つの主なヘキソース炭水化物、即ち、グルコース、ガラクトース及びマンノースは、このようなS.セレビシエY-1528培養物によってエタノールに同時に発酵され、従って、一般的に用いられるサッカロミセス酵母種や菌株によって受ける長い遅延時間と関連するより多い運転コストが避けられる。これらの栄養要求性関連遅延時間の排除は、全体の発酵方法を加速する利点を有し、それによって、装置サイズの要求と関連の資本コストが低減する。更にまた、セルロースの糖化に通常使われるバイオマス分解酵素標品は、通常、成分単糖類への前処理工程の間にヘミセルロースから誘導されるヘミロース多糖類とオリゴ糖類のほとんどを加水分解するのに充分な第二活性を有する。それ故、ヘミセルロースから誘導されるオリゴ糖類が、必要により、本発明の方法の糖化段階に添加されてもよいことから、繊維性リグノセルロース原料の抽出によって得られる加水分解方法中に生成される種々のオリゴ糖成分の発酵を最大にするために追加のヘミセルロース分解酵素の有意量が必要とされる。セルラーゼ酵素源によっては、固体繊維性パルプに関連したままであるヘミセルロースを完全に加水分解するのに充分な第二活性があってもよい。そうでない場合には、追加のキシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、エステラーゼ、及び他のヘミセルロース分解酵素が、必要により、この望ましい目標を達成するように糖化混合物に添加されてもよい。
【００１１】
繊維性バイオマス固体画分と適切な液体流れと混ぜ合わせられる、S.セレビシエ株Y-1528によって例示される微生物培養物の有効量は、SSF工業方法に特に適切であり、分離された加水分解方法と発酵(SHF)工業方法にも適切である。更にまた、抽出されたリグノセルロース原料から分離される固体画分を前処理して、バイオマスをSSF方法に、或いはSHF方法に分配する前に繊維破壊と加水分解を開始することも本発明の範囲内である。
目的が燃料エタノールの生産である工業方法において、繊維性リグノセルロース原料に適したオルガノソルブ抽出法又は他の抽出法から得られるビールで生産されるエタノール濃度はその5.0-6.5% w/wより大きいことが経済的に望ましい。この目標を達成するために、糖化段階における典型的なオルガノソルブ前処理バイオマス試料には少なくとも16%(w/w)のリグノセルロース固形分コンシステンシーを有することが必要である。これらのビール濃度(約≧5.0%w/w)は、オルガノソルブ基質の場合には比較的低乾燥物質濃度で達成される。16%固形分を有する混ぜ合わせた固体画分懸濁液は、非常に濃く、粘稠で且つ混合するのが難しい。これは、最良に前処理されたオルガノソルブ基質の最高の状態のものである(水蒸気爆発木材又は希酸前処理農業廃棄物のような他の基質は、高含量の非発酵性成分、例えば、灰分(5-15%)、リグニン(20-40%)のためにこの目標を達成するように非常に大きいコンシステンシー(30-40%)を必要とする)。抽出されたリグノセルロース基質からオルガノソルブ処理固体画分は、最適に抽出された基質は、0.5%未満の灰分含量と5%未満のリグニン含量を有するのでこの問題を有しない。従って、本発明の他の実施態様は、菌株S.セレビシエY-1528をこの中に組み込み、ここで、炭水化物混合物を含む液体流れが固体のリグノセルロース物質と混ぜられ、それによって、より低いコンシステンシー、即ち、低粘度の固形物を得、次に、＞5.0-6.5%の過剰であるビールにおける最終エタノール濃度の達成を容易にする方法を提供する。混ぜている液体炭水化物流れを組み込むことの一態様は、例えば、キシロースの形の一部の単糖類が繊維性リグノセルロース物質の加水分解の初期段階で存在することである。キシロースの付随する存在は、通常、ほとんど未精製の繊維性バイオマス原料において加水分解の初期段階で存在しない、代謝と生存能力に必要な炭素源による酵母を与える。この実施態様の補助液体炭水化物流れの準備が、農業廃棄物を含む木質又は木質でないバイオマスから誘導される混合ヘキソース炭水化物のより完全な使用を容易にし、それによって、この種のリグノセルロース原料を処理するように構成されるリグノセルロースバイオリファイナリーのより少ない廃棄物とより安い廃棄物処理コストが得られる。これは、また、後の段階で、一般に、グルコースの存在下で阻止されるピキア・スチピチス(Pichia stipitis)のような天然に存在するペントース発酵微生物によってペントース炭水化物のエタノールへの発酵を容易にする。この実施態様は、また、ビールにおいて5.0-6.5%w/wの過剰で最終エタノール濃度の生産を容易にしつつSHF又はSSFシステムにおいて高度に粘稠な繊維性材料の必要な混合と関連するエネルギーコストを低減させることができる。更に、この実施態様は、より高い濃度のヘキソースとペントースの炭水化物が酵母代謝に利用可能であり且つセルロース固体加水分解と発酵の早期の段階の間、生存能力を維持するのに有効であるので、より少ない微生物負荷、即ち、効力に必要とされる酵母培養物の量を減少させることを可能にしてもよい。
【００１２】
この実施態様によれば、高コンシステンシー(＞40%)の固体のセルロース画分は、リグノセルロース原料の抽出に用いられる溶媒から誘導される単糖類とオリゴ糖類の混合物を含有する水性液体の流れでSSF又はSHF(〜20%)に適したコンシステンシーに希釈される。適切な処理前の方法は、オルガノソルブ、水蒸気爆発、希酸加水分解、アンモニア繊維爆発(AFEX)等によって例示される。更にまた、適切なセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、他のバイオマス分解酵素ブレンドが液体炭水化物流れに予備混合され、それによって、オリゴ糖と繊維性セルロースを多く含む固体画分の双方の完全な加水分解を更に容易にすることは本発明の範囲内である。SSF方法において、適切な微生物種菌の有効量が混合物に添加され、それによって、糖化方法と同時の発酵手段が得られる。適切な微生物種菌は、酵母種、真菌種及び細菌種より選ばれる少なくとも一つの菌株を含む。適切な酵母は、サッカロミセス種やピキア種によって例示される。適切なサッカロミセス種は、S.セレビシエ等によって例示される。適切な真菌種は、アスペルギルス種やトリコデルマ種によって例示される。適切な細菌は、天然に存在し且つ遺伝子操作された、特に、エシェリキア・コリ、ザイモモナス種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種によって例示される。単一菌株、或いは単一タイプの生物体からの複数の菌株、或いは更に、複数の種と微生物タイプからの菌株(即ち、酵母、真菌、細菌)を含む菌株の混合物を含む種菌を提供することは本発明の範囲内である。
SHF方法において、糖化に続いて、最初に発酵が進行する。完全な発酵後、得られたエタノールビールは、エタノールを回収するのに蒸留可能である。残存するアルコール蒸留廃液は、更に、(a)原料として或いはリグニンベースのプラスチック、接着剤、抗酸化剤、界面活性剤、コーティング材料等を生産するための原材料として適切な残留リグニン、(b)供給タンパク質への変換又はエタノール生産方法において再使用される再循環のための酵母細胞、(c)食品業界による原材料として用いられるか又は微生物によって又は化学方法によってエタノール又はキシリトールのような他の有効な化学へ発酵されるキシロース及び/又はアラビノースを回収するために処理されてもよく、(d)任意の残存する液体は、好気性又は嫌気性の廃棄物処理施設によって処理可能である。
繊維性リグノセルロース原料の上流の抽出と分画の間に遊離される構造成分の同時下流糖化発酵の本発明の方法、システム及び方法は、本発明の例示であることが意図され、限定するものでない以下の実施例において更に詳細に記載される。
【実施例１】
【００１３】
Red Ethanol(登録商標) S.セレビシエ株の乾燥培養物をPhibroChem(Ridgefield  Park, NJ, USA)から入手した。S.セレビシエ株Y-1528の培養物を、米国の農業研究サービス機関の系統保存(the United States Agricultural Research Service Culture Collection)、農業利用研究(Agricultural Utilization Research)(Peoria, IL, US)から入手した。寒天プレート上の酵母菌株を培養することによって酵母種菌を調製した。2Lのエルレンマイヤーフラスコに、BioShop Canada社(Burlington, ON, Canada)から供給される1%酵母エキスと1%ペプトンを含有する600mLの増殖培地と2%グルコース(Sigma, St. Louis, MO, USA)を各々供給した。pHを、10% v/v HClで5.5まで調整した。フラスコに寒天プレートから選び出した酵母コロニーを入れ、その後、入れた培地を250 rpmで撹拌しつつ微好気的条件で30o Cで一晩インキューベートした。
発酵実験を250mLのエルレンマイヤーフラスコにおいて実験し、各々が100mLの0.1Mクエン酸塩緩衝液(pH 5.5)を含有する。二組のフラスコを調製した。第一組のフラスコに以下を植菌した: (a) 47.5g/Lのマンノースと、(b) 47.5g/Lのガラクトース。第二組のフラスコに以下を植菌した: (a) 47.5g/Lのマンノース、(b) 47.5g/Lのガラクトース及び(c) 47.5g/Lのグルコース。各フラスコに0.5ppmの抗生物質のLactrol(登録商標)を植菌した(Lactrolは、Phibro Animal Health社、Fort Lee, NJ, USAの登録商標である)。これらの培地における各酵母菌株の発酵性能は、酵母エキス-ペプトン増殖培地から収集された3g/L odwの酵母細胞を選択されたフラスコに加え、次に、植菌したフラスコを36o Cでインキューベートすることによって二回の実験で試験した。各フラスコにおける上清の試料を、0、1、2、3、12、20、40、64時間で取り、以下を分析した: (a)ガスクロマトグラフィ(GC)によってエタノール含量、(b)HPLCによって炭水化物含量。
この実験の結果を図1に示す。Red Ethanol(登録商標) S.セレビシエ株は、工業エタノール業界のために開発された特別に選択された菌株である。この菌株は、エタノールに対する許容量が大きく、高温でアルコールを生産するために設計された。図1のデータは、高温(即ち、36o C)における公有財産S.セレビシエ株Y-1528の発酵性能がガラクトース-マンノース基質及びガラクトース-マンノース-グルコース基質の双方においてRed Ethanol(登録商標)菌株と同様であったことを示している。植菌後の12時間以内に、双方の酵母菌株は、約76%の全体のエタノール理論的収率に対応するエタノール濃度最大の約4.8%w/wエタノールに達した。12時間後、炭水化物はいずれも、上清における検出可能な濃度で存在せず、双方のS.セレビシエ株によって全消費が達成されたことを示した。
【実施例２】
【００１４】
SSFシステムにおけるS.セレビシエ株Y-1528のエタノール生産性能を、アスペン材チップ(Asp4として示される)から生産される広葉樹パルプを用いて評価した。ブリティッシュコロンビアアスペン(Populus tremula)丸太の代表的試料からAsp4パルプを調製し、収集し、皮をはぎ、分割し、細砕し、約20mm×20mm×3mmのチップサイズにした。これらの水分が約10%に達するまで、チップを通気したプラスチックバッグ内に周囲温度で保存した。次に、200グラム(o.d.w.)の風乾チップを、5:1の液体:木材比で触媒として0.55%硫酸を用いたエタノール水溶液(50%; w/w)を含有する特注バッチ高圧リアクタ内で195o Cで30分間オルガノソルブ前処理した(Parr Instrument社, Moline, IL, USA)。30分の蒸解時間の後、リアクタを、水冷却コイルを用いた周囲室温に冷却した。次に、固形物と液体をろ過によって分離した。固体画分を温かい70%エタノール溶液(v/v)を用いて英国の粉砕機においてホモジナイズし、次に、水洗した。洗浄した固体画分（即ち、パルプ）を水圧プレスで圧搾して、最終の水分を約50%(w/w)まで減少させた。最終のAsp4パルプを化学的に分析して組成を求めた: (a)アラビナン=0%、(b)ガラクタン=0%、(c)グルカン= 84.87%、(d)キシラン= 5.71%、(e)マンナン= 1.59%、及び(f)リグニン=2.94%。
この実験の反応混合物は、2.0Lのエルレンマイヤーフラスコ中で68.24mLの0.1Mクエン酸塩緩衝液で8%に希釈した16.0gのAsp4“湿式”パルプを含んだ。ASP4パルプの固形分は48.23%であり、グルカン含量は93%であった。反応混合物に、0.05g/LのLactrol(登録商標)、及び2gの酵母栄養混合物(Prod. No. YNB404; BioShop Canada社)、2.27g/Lの尿素(Prod. No. URE002; BioShop Canada社)、及び6.56g/Lのペプトン(Prod. No. PEP403; BioShop Canada社)を含む1.7g/Lの酵母ニトロゲンベースを増加した。トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesii)セルラーゼ酵素標品(Novozym 50013; Novozymes, Franklinton, NC, USA)を、20.0のFPU/gグルカン(FPU =ろ紙分解活性)を与えるように添加した。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)β-グルコシダーゼ酵素(Novozym 50010; Novozymes)を、40.0CBU/gグルカンを与えるように添加した(CBU = 毎分グルコースに変換されるセルビオースのモルとして表されるセロビアーゼ単位)。実施例1に記載されるように調製されたS.セレビシエ株Y-1528種菌を、5g/Lの濃度で反応混合物に添加した。フラスコを、三回の実験で調製した。10個のジルコニウム混合ボールを、各フラスコに添加し、その後、フラスコを150rpmで撹拌しながら微好気的条件下36o Cでインキューベートした。18時間、25時間、40時間でフラスコの試料を採取した。試料採取した反応混合物中のエタノール生産と単糖濃度を、それぞれGCとHPLCによって求めた。図2のデータは、この反応混合物における最大エタノール生産に関するSSF反応方法が25時間以内に実質的に完了したことを示している。
【実施例３】
【００１５】
実施例2に記載されるSSFシステムにおけるS.セレビシエ株Y-1528によるエタノール生産についてガラクトース及びマンノースでAsp4“湿式”パルプを補足する作用を、反応混合物のクエン酸緩衝液成分にガラクトース及びマンノース原溶液を添加して2.5g/Lのガラクトース及び2.5g/Lのマンノースの最終濃度を与えることによって評価した。その他の反応成分、即ち、Asp4パルプ、栄養素、酵素、酵母種菌は、実施例2に記載されるのと同じにした。フラスコは、三回の実験で調製した。10個のジルコニウム混合ボールを各フラスコに添加し、その後、フラスコを150rpmで撹拌しながら微好気的条件下36o Cでインキューベートした。4時間、18時間、25時間、40時間にフラスコの試料を採取した。試料採取した反応混合物におけるエタノール生産と単糖濃度をそれぞれGCとHPLCによって求めた。図3におけるデータは、酵素活性が、最初の25時間の間のグルコースレベルの減少に続いて次の試料採取で増加によって証明されるように40時間のSSF反応方法の間、維持されたが、マンノースレベルとガラクトースレベルは最初の25時間の間に減少し、その後一定になったことを示している。重要なエタノール生産は最初の25時間の間に生じ、エタノール生産率は実験の間に低下したが、エタノールの増加濃度を各試料採取で記録した。
【実施例４】
【００１６】
発酵活性を開始するサッカライド培地において酵母を16時間培養し、次に、活発に発酵している酵母を実施例に記載されたSSFシステムに移すことによってS.セレビシエ株Y-1528を順化する影響をこの実験で評価した。pH 5.5に調整した0.1Mクエン酸緩衝液を含む順化培養液を、2.5g/Lのガラクトースと2.5g/Lのマンノースで補足した。実施例1に示されるように調製した5g/Lの種菌を順化培養液に植菌した。順化培養液を250rpmで撹拌しながら微好気的条件下30o Cで16時間インキューベートした。次に、68.24mLの順化培養液を取り出し、8.51mLの新鮮な0.1Mクエン酸緩衝液で補足した。次に、緩衝液を補足した順化培養溶液を、実施例3に記載されるガラクトース及びマンノース補足反応混合物を調製するために用いた。フラスコを、三回の実験で調製した。10個のジルコニウム混合ボールを各フラスコに添加し、その後、フラスコを150rpmで撹拌しながら微好気的条件下36o Cでインキューベートした。フラスコを、18時間、25時間、40時間で試料採取した。試料採取した反応混合物におけるエタノール生産と単糖濃度をそれぞれGCとHPLCによって求めた。図4におけるデータは、順化酵母のガラクトースとマンノースを補足した反応混合物への添加によって、発酵が40時間のSSF期間の終わりまで進行することを可能にしたことを示している。
【実施例５】
【００１７】
実施例2-4に記載される3つのSSF条件におけるS.セレビシエ株Y-1528のエタノール生産性能を図5に示す。この菌株を発酵基質としてセルロースパルプを用いて36o CでSSF方法において用いたときに、エタノール収率は3.65%エタノール(w/w)であり、18時間で84%であると計算され、40時間で86%であり、いずれも理論的収率と比較した(図5; 実施例2)。2.5g/Lのガラクトース及び2.5g/Lのマンノースを発酵基質に添加すると、エタノール生産が4.68%(w/w)に増加し、18時間における潜在的な理論的収率が78%であり、40時間における理論的収率が85%であることが求められた(図5; 実施例3)。酵母菌株を、二つの単糖類を含有する培地において培養し、次に、ガラクトース-及びマンノース補足発酵培地に添加することによって前順化すると、同じ時間でSSFシステムにおけるエタノール生産が5.56%(w/w)まで更に増加し; この量は、18時間で理論的収率の93%、40時間で理論的収率の100%であると計算された(図5; 実施例4)。
本発明を例示的な実施態様に関して記載してきたが、当業者は、適切に選択された液体流れと混ぜることによって固体画分の粘度を低下させ、次に、その中に適切な微生物種菌の有効量と、適切な酵素を混ぜ合わせることによる、抽出されたリグノセルロース原料から分離される固体画分と液体画分の同時糖化発酵のための本明細書に開示される方法、システム、及び方法をどのように変更し適合するかを理解するであろう。当業者に明らかである多くの変更及び態様を考慮して、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるとみなされるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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