(57)【要約】  本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）と結合する能力を有する、ＩＬ−１０発現、特に、高度ＩＬ−１０発現に関する臨床症状または病理学的障害、例えば、感染性疾患、腫瘍、癌、および深刻な機能障害の状態の治療において使用することができるペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６から選択されるペプチド、
ｂ）ａ）において定義されたペプチドの変異体、および
ｃ）５〜１５個の連続するアミノ酸を含んでなる、ａ）において定義されたペプチドのフラグメントまたはｂ）において定義された変異体のフラグメント
から選択される、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチド、およびその薬学上許容される塩。
【請求項２】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３として同定されたペプチド、およびそれらの薬学上許容される塩からなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
in vitroおよび／またはin vivoにおいてＩＬ−１０の生物活性を阻害する能力を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、および配列番号２５として同定されたペプチド、その変異体またはフラグメント、ならびにそれらの薬学上許容される塩からなる群から選択される、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドをコードする、核酸配列。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸配列を含んでなる、遺伝子構築物。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸配列または請求項６に記載の遺伝子構築物を含んでなる、ベクター。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸配列、請求項６に記載の遺伝子構築物、または請求項７に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項９】
治療上有効な量の請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドを、少なくとも一つの薬学上許容される賦形剤、または請求項５に記載の核酸配列、または請求項６に記載の遺伝子構築物、または請求項７に記載のベクター、または請求項８に記載の宿主細胞、および薬学上許容される担体とともに含んでなる、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも一つのペプチドを、任意の一以上の代替ＩＬ−１０阻害化合物とともに含んでなる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＩＬ−１０発現を提示する臨床症状または病理学的障害の治療のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５に記載の核酸配列、請求項６に記載の遺伝子構築物、請求項７に記載のベクター、および請求項８に記載の宿主細胞から選択される、生産物。
【請求項１２】
Ｔｈ１細胞応答が阻害される臨床症状または病理学的障害を含むＩＬ−１０発現を提示する臨床症状または病理学的障害の治療のための、請求項１１に記載の生産物。
【請求項１３】
感染性疾患、腫瘍、癌および急性損傷状態から選択されるＩＬ−１０発現を提示する臨床症状または病理学的障害の治療のための、請求項１１に記載の生産物。
【請求項１４】
らい菌、結核菌、ペスト菌、ヘリコバクター・ピロリ、カンジダ・アルビカンス、紅色白癬菌、アスペルギルス属種に起因するか、もしくは熱帯熱マラリア原虫、リーシュマニア症、トキソプラスマ症に起因する感染症の治療のための、またはホジキンリンパ腫、頭頸部癌、黒色腫、もしくはＵＶにより突然変異したケラチノサイトから発生した基底細胞癌および扁平上皮癌の治療のための、または火傷および関連する敗血症の治療のための、請求項１３に記載の生産物。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法であって、請求項８に記載の宿主細胞を、前記ペプチドの製造および、必要に応じて、前記ペプチドの回収を可能にする条件下で増殖させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）と結合する能力を有するペプチドおよびそれらの利用に関する。本発明は、特に、ＩＬ−１０と直接結合することによってＩＬ−１０の生物活性を阻害するペプチド、およびＩＬ−１０発現、特に高度のＩＬ−１０発現に関連する臨床症状または病理学的障害の治療におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
背景技術
免疫応答には、細胞応答と体液性応答がある。細胞応答は、主としてＴ細胞によって媒介され、一方、体液性応答は、Ｂ細胞によって媒介される。リンパ球は、免疫応答において重要な役割を果たし、ウイルスに感染した細胞の細胞死誘導や、サイトカインおよび抗体の産生などがある。リンパ球はまた、急性および慢性炎症性疾患にも関与する。
【０００３】
サイトカインは、細胞間の反応を媒介し、細胞増殖および分化に影響を及ぼす可溶性タンパク質である。サイトカインは、特異的受容体との結合を通じて効果を発揮し、その結合によって該サイトカインに対して特異的な形質導入シグナルの活性化をもたらす。
【０００４】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、マクロファージ、単球、Ｔｈ２型および調節性Ｔ細胞ならびにＢ細胞などのいくつかの細胞種によって産生される多機能サイトカインである。ＩＬ−１０は、免疫抑制特性および抗炎症特性を有するサイトカインであり、ＩＬ−１０は、数多くの細胞骨髄およびリンパ球活性を調節し、Ｔ細胞およびＮＫ（ナチュラルキラー）細胞によるいくつかの炎症性サイトカインの産生を直接阻害する。
【０００５】
ＩＬ−１０は、最初に、Ｔｈ１細胞による、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１−α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１−β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカイン(proinflammatory cytokines)の産生を阻害する、Ｔｈ２細胞によって産生されるサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）として記載された。炎症性サイトカイン(proinflammatory cytokines)の産生阻害に加えて、ＩＬ−１０は、抗原特異的Ｔｈ１細胞増殖を阻害することができ、これらの細胞における主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ発現の脱調節を通じて抗原提示単球の能力を低下させることも分かってきた。
【０００６】
ＩＬ−１０が、Ｔｈ１細胞活性化に対して、そして炎症性サイトカイン(proinflammatory cytokines)の産生に対して強い阻害効果を有しているという新たな知見は、ＩＬ−１０が細胞性免疫応答の強力な免疫抑制薬であるという仮説をもたらした。他の著者らは、急性および慢性炎症過程の治療においての、さらに自己免疫疾患においての、このサイトカインの使用を提案した。これらの理由によって、このサイトカインは、いくつかの自己免疫疾患、例えば乾癬、関節リウマチ、およびクローン病に用いられてきた。しかしながら、他の疾患において、例えば感染過程や癌においては、このサイトカインは、治癒に有利に働くと思われるＴｈ１応答の誘導を妨げるため、負の影響を与える。これらの過程の例としては、らい病、結核、リーシュマニア症、ならびにウイルス感染症が挙げられる。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による慢性感染症においてＩＬ−１０が多量に発現されることが記載されている。このサイトカインは、ＨＣＶ抗原刺激の結果としてＴｈ２細胞によって産生され得る。また、このサイトカインは、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８）によっても産生され得、Ｔｈ１型抗ウイルス性エフェクター細胞の発生を阻害する。最後に、ＨＣＶタンパク質と接触した状態の感染樹状細胞（ＤＣ）または単球は、感染していない細胞よりも多量のＩＬ−１０を産生し、そしてそれがＴｈ２応答の発生に有利に働き、ウイルス除去を妨げる。
【０００７】
上述のように、ＩＬ−１０が重要な役割を果たす別の場は、抗腫瘍応答である。例えば、腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞は、いくつかある分子の中で特に、ＤＣの機能に損傷を与えるＩＬ−１０を産生することができる。腫瘍における正常なＤＣ機能の阻害は、抗腫瘍応答が起こらない理由の一つと思われる。in vitroおよびin vivoでのＩＬ−１０の阻害により、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生の増加と、付随して、Ｔｈ１応答の増加が生じるならば、該ＩＬ−１０阻害は、ある特定の抗ウイルス療法、例えば慢性ＨＣＶ感染、においても抗腫瘍療法においても極めて有用であり、そこで強力なＴｈ１型応答が誘導されると思われる。例えば、ＩＬ−１０とその受容体との相互作用を妨げる、非メチル化オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）と抗ＩＬ−１０受容体抗体の組合せは、ＣｐＧだけを用いた場合に達成される抗腫瘍応答よりも大きく、より効果的な抗腫瘍応答を誘導することが可能であることが記載されている。(Vicari A. P. et al. Reversal of tumor-induced dendritic cell paralysis by CpG immuno-stimulatory oligonucleotide and anti-interleukin 10 receptor antibody. J Exp Med. 2002 Aug 19 196(4) :541-9)。ＩＬ−１０の生物活性を阻害するために通常用いられる他の戦略には、特異的な中和抗体の使用またはその発現をブロックするＩＬ−１０コード遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）の使用がある。抗体の使用では、このサイトカイン（ＩＬ−１０）の全遮断および特異的遮断が可能となるが、血液中の外因性免疫グロブリンの存在に起因して、さらにＩＬ−１０の全身遮断によってもたらされる作用に起因しても、ある特定の副作用が高まる。さらに、免疫グロブリンの経時的安定性から、このサイトカインの活性遮断の短時間制御は認められない。アンチセンスオリゴは、ＩＬ−１０産生を遺伝子発現レベルで阻害し、そしてそれはこのサイトカインが関与する総ての過程において重要な脱調節をもたらし得る。
【０００８】
したがって、特異的であり、効力がより大きく、ヒト療法において潜在的に有用な新規ＩＬ−１０阻害剤を同定する必要がある
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、概していえば、ＩＬ−１０の生物活性を阻害することができる新規化合物を探求する問題に向けられたものである。
【００１０】
本発明により提供される解決法は、本発明者らが、ＩＬ−１０と結合することができるだけでなく、ＩＬ−１０自体と直接結合することによってＩＬ−１０の生物活性を阻害することもできるペプチドを同定した事実に基づくものである。これらのペプチドは、ファージライブラリーに関連する技術を用いることによって同定され、この技術では、概していえば、ＩＬ−１０と高親和性結合する６〜１５個のアミノ酸を含んでなるサイズのペプチドを決定し、続いてin vitroアッセイによって、異なるペプチドのＩＬ−１０生物活性阻害能力を定量することを可能にする。
【００１１】
ＩＬ−１０と結合することができるペプチド、特にＩＬ−１０と直接結合することによってＩＬ−１０の生物活性を阻害することができるペプチドは、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する臨床症状および病理学的障害の治療に潜在的に有用である。同様に、ＩＬ−１０と結合することができるペプチドは、ＩＬ−１０の生物学的役割を研究するためのツールを提供する。
【００１２】
よって、本発明の一つの態様は、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチドに関する。特定の好ましい実施形態においては、前記ペプチドは、さらにＩＬ−１０の生物活性を阻害する能力を有する。
【００１３】
別の態様においては、本発明は、前記ペプチドの少なくとも一つを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１４】
別の態様においては、本発明は、ＩＬ−１０発現、特に高度のＩＬ−１０発現に関連する臨床症状および病理学的障害の治療のための前記ペプチドに関する。
【００１５】
別の態様においては、本発明は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する臨床症状および病理学的障害の治療のための医薬品の調製における前記ペプチドの使用に関する。
【００１６】
別の態様においては、本発明は、前記ペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。
【００１７】
別の態様においては、本発明は、本発明により提供されるペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構築物に関する。
【００１８】
別の態様においては、本発明は、前記ＤＮＡ配列または前記ＤＮＡ構築物を含んでなるベクターに関する。
【００１９】
別の態様においては、本発明は、前記ＤＮＡ配列またはＤＮＡ構築物あるいは前記ベクターを含んでなる宿主細胞、例えば形質転換宿主細胞に関する。
【００２０】
別の態様においては、本発明は、本発明により提供されるペプチドの製造方法であって、前記宿主細胞を、該ペプチドの発現および、必要に応じて、得られたペプチドの回収を可能にする条件下で培養することを含む方法に関する。
【００２１】
別の態様においては、本発明は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する臨床症状および病理学的障害の治療のための前記ＤＮＡ配列およびＤＮＡ構築物に関する。
【００２２】
別の態様においては、本発明は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する臨床症状または病理学的障害の治療のためのベクターおよび細胞の調製における前記ＤＮＡ配列およびＤＮＡ構築物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】は、繊維状バクテリオファージＭ１３の表面上の、タンパク質ｐＩＩＩと遺伝子融合している、１５個のアミノ酸を有するペプチド（Ｐ１５ａａ）の位置を概略的に示す図である。
【図２】は、バイオパニング技術によるペプチドの選択を概略的に示す図である。ビオチン化したＩＬ−１０を、ストレプトアビジンを入れたプレート中で（ビオチン−ストレプトアビジン結合により）固定化する。ＩＬ−１０と、ファージにより提示されたペプチドとの相互作用に基づいて、ファージライブラリーをスクリーニングする。ＩＬ−１０に対して低親和性を有するファージを、洗浄によって除去する。プレート中に残るファージを、ｐＨを下げることによって溶出する。ＩＬ−１０に対して高親和性を有するファージの濃縮３サイクル後、ファージを単離し、配列決定する（実施例１参照）。
【図３】は、異なる濃度のヒトＩＬ−１０および異なる濃度のマウスインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下でのＭＣ／９細胞増殖を示すグラフである。
【図４】は、１５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、および５０μｇ／ｍＬ（左から右へ）の濃度において各ペプチドに関して得たヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）およびネズミＩＬ−１０（ｍＩＬ−１０）の阻害率（図４Ａ）、ならびに毒性率［顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）によるＭＣ／９細胞増殖の阻害率（図４Ｂ）を示す棒グラフ群である。各棒は２回または３回の独立した試験の平均値に相当する。
【図５】は、ＩＬ−１０と結合する能力を有するいくつかのペプチドの、Ｋａｒｐａｓ（ＩＬ−１０産生）細胞株の免疫抑制活性に対する効果を示す棒グラフである。これらの細胞を用いて「混合リンパ球反応」（ＭＬＲ）アッセイを行い、これらの細胞における産生ＩＦＮ−γレベルを免疫応答測定値として測定した。著しいＩＬ−１０阻害能力を有し、ＭＬＲのＩＦＮ−γレベルを回復させることができるペプチドをストライプの棒で示す。凡例：ＰＢＬ：末梢血リンパ球、ＰＢＬ１およびＰＢＬ２：２人の異なる健康なドナーの末梢血リンパ球（定義によれば、これらの細胞の混合物は、ＭＨＣとＴＬＲとの反応を通じて同種異系認識により増殖活性化を誘導する）、ＭＬＲ：混合リンパ球反応、ＭＬＲ＋Ｋ：混合リンパ球反応＋Ｋａｒｐａｓ  ２９９細胞株、Ｋ：Ｋａｒｐａｓ  ２９９細胞株）。
【図６】は、異なるＴヘルパー決定基ペプチド（Ｔｈ０）によるリンパ球の再刺激におけるペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）のin vitro効果を示す棒グラフであり、この効果はＩＦＮ−γ産生として定量した。この系におけるＩＬ−１０の阻害は、Ｔｈ１サイトカインプロファイル、それゆえ、ＩＦＮ−γの増加に有利に働くと思われる。ペプチド  ＦＩＳＥＡ  Ｇ（配列番号３８）は、最高のＩＦＮ−γレベルとともに、上清において検出可能なＩＬ−１０レベルをもたらした唯一のペプチドであった。このケースでのみ、ペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）はＩＦＮ−γ産生を増加させる。
【図７】は、５×１０５腫瘍細胞（ＣＴ２６）を皮下接種した異なるＢＡＬＢ／ｃマウス群における平均腫瘍増殖を示す略図である。これらの異なる群は、未処置での平均腫瘍増殖（対照群）、ポリＩ：Ｃおよび抗ＣＤ４０抗体（アジュバント）で処置した平均腫瘍増殖、（腫瘍内に）ペプチドＰ９（配列番号６）および（腹膜内に）Ｐ１３（配列番号８）（ＩＬ−１０阻害剤）で処置した平均腫瘍増殖またはアジュバントとＩＬ−１０阻害剤の組合せ（アジュバント＋ＩＬ−１０阻害剤）で処置した平均腫瘍増殖を示す。
【図８】は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって得た、ＩＬ−１０とペプチドＰ９（配列番号６）との間で起こる生体分子相互作用プロファイルを、対照ペプチド［Ｐ３０１（配列番号５４）］に関して得たプロファイルとともに示すグラフである。
【図９】は、ＳＰＲ分析によって測定した、ＩＬ−１０と、ペプチドＰ９（配列番号６）、Ｐ１３（配列番号８）ならびにそれらの末端切断型および／または修飾型：Ｐ９（２−１５）（配列番号４５）、Ｐ９（１−１４）（配列番号４６）、Ｐ９（１−１３）（配列番号４７）、Ｐ９（２−１４）（配列番号４８）、Ｐ９（２−１３）（配列番号４９）、Ｐ９（３−１４）（配列番号５０）、Ｐ９（１５  Ａｌａ）（配列番号５１）、Ｐ９（１４  Ａｌａ）（配列番号５２）、Ｐ９（１−１３、１  Ｓｅｒ）（配列番号５３）との間で起こる生体分子相互作用から得た結果を示す棒グラフである。
【図１０】は、ＩＬ−１０によって誘導されるＳＴＡＴ３リン酸化に対するペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）の阻害効果を示す図である。リン酸化ＳＴＡＴ３の発現をウエスタンブロット技術により解析した（図１０Ａ）。棒グラフ（図１０Ｂ）は、各サンプルについて、濃度測定によって定量した、リン酸化ＳＴＡＴ３バンドの含量と、アクチン対照で得た含量との比率を示す。
【図１１】は、ペプチドＰ９（配列番号６）、Ｐ１３（配列番号８）、Ｐ１５（配列番号１０）、Ｐ１６（配列番号１１）、Ｐ３１（配列番号２２）、およびＰ３４（配列番号２５）によってもたらされた細胞増殖阻害率と、対照ペプチドＰ３０１（配列番号５４）によってもたらされた細胞増殖阻害率を棒グラフで示す図である。それらの総てを２００μｇ／ｍｌの濃度で試験した。示した結果は、三連で行った二種類のアッセイの平均と偏差である。
【図１２】は、ＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ）により、Ｃ型肝炎ウイルスヌクレオキャプシド（ＨＣＶコア）タンパク質の存在下で刺激した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養物におけるＩＦＮ−α産生に対するペプチドＰ１３（配列番号８）の効果を示す棒グラフである。簡潔には、健康なドナーのＰＢＭＣを、ＨＣＶコア（２．５μｇ／ｍｌ）を含めたまたは含めないＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ、５μｇ／ｍｌ）で、ペプチドＰ１３（配列番号８）の存在下または非存在下で刺激した。１μｇ／ｍｌの濃度の抗ＩＬ−１０抗体(eBioscience, 16-7108-81)を陽性対照として用いた。３７℃および５％ＣＯ２での４８時間インキュベーション後に、培養物上清でのＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡによって測定した。示した結果は、同様の結果が生じた４試験の代表的なものである。
【発明の具体的説明】
【００２４】
本発明は、概していえば、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチドおよびそれらの適用に関する。
【００２５】
よって、一つの態様においては、本発明は、
ａ）アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６から選択されるペプチド、
ｂ）ａ）において定義されたペプチドの変異体、および
ｃ）５〜１５個の連続するアミノ酸を含んでなるフラグメント、ａ）において定義されたペプチドのフラグメント、またはｂ）において定義された変異体のフラグメント
から選択される、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチド（以下、本発明のペプチド）ならびにその薬学上許容される塩に関する。
【００２６】
本明細書において、「ペプチド」とは、その修飾体または誘導体、例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、アミド化などを含む。
【００２７】
本記載において、「変異体」とは、項ａ）においてすでに定義しているペプチドに由来するペプチドに関し、そのペプチドのアミノ酸は、例えば置換によって、修飾を受けているか、またはそのペプチドは１個以上のアミノ酸の挿入または欠失を有しているが、そのペプチドは起源ペプチドの少なくとも一つの機能、有利にはＩＬ−１０との結合に関連する少なくとも一つの機能を保存する状態である。前記変異体は、通常、保存的置換を含み、その場合、最終ペプチドの機能は変更されない。ペプチドＰ９（配列番号６）の変異体の限定されない例示例としては、とりわけ、Ｐ９（配列番号６）の１５位のアミノ酸（Ｐｈｅ）がＡｌａに置換されているペプチドＰ９（１５  Ａｌａ）（配列番号５１）、Ｐ９（配列番号６）の１４位のアミノ酸（Ｖａｌ）がＡｌａに置換されているペプチドＰ９（１４  Ａｌａ）（配列番号５２）が挙げられる。
【００２８】
本記載において、「フラグメント」とは、項ａ）またはｂ）においてすでに定義しているペプチドに由来するペプチドに関し、そのペプチドのアミノ酸は、アミノ末端からもしくはカルボキシル末端からまたは両方の末端からの除去を受けているが、そのペプチドは起源ペプチドの一以上の機能、好ましくは、ＩＬ−１０との結合に関連する機能を維持している。ペプチドＰ９（配列番号６）のフラグメントの限定されない例示的な例としては、とりわけ、ペプチドＰ９（２−１５）（配列番号４５）、Ｐ９（１−１４）（配列番号４６）、Ｐ９（１−１３）（配列番号４７）、Ｐ９（２−１４）（配列番号４８）、Ｐ９（２−１３）（配列番号４９）、Ｐ９（３−１４）（配列番号５０）、Ｐ９（１−１３、１  Ｓｅｒ）（配列番号５３）が挙げられる。
【００２９】
本発明のペプチドの薬学上許容される塩は、本発明の範囲内である。本明細書において、「薬学上許容される塩」としては、金属塩または酸付加塩を形成するために通常用いられる塩が含まれる。前記塩が薬学上許容されるならば、前記塩の性質は重要ではない。本発明のペプチドの薬学上許容される塩は、有機酸もしくは無機酸または有機塩基もしくは無機塩基から得ることができる。前記塩は、当業者には周知の従来の方法により得ることができる。
【００３０】
本発明のペプチドは、ＩＬ−１０と結合する能力を有する。前記ペプチドのいくつかは、さらに、in vitroおよび／またはin vivoでＩＬ−１０の生物活性を阻害する能力も有する。
【００３１】
本発明のペプチドの、ＩＬ−１０と結合する能力は、２分子間の結合を決定することができる任意の好適な方法によって、例えば、ＩＬ−１０とアッセイするペプチドを、該ペプチドとＩＬ−１０の結合を可能にする条件下において、接触して置くこと、および該ペプチドとＩＬ−１０との結合を評価することを含む、親和性アッセイによって、決定することができる。特定の実施形態においては、前記親和性アッセイは、例えば放射性標識したＩＬ−１０を用いて行うことができる。また、標識することができる化合物は、アッセイするペプチドである。この種の親和性アッセイは、概していえば、例えばストレプトアビジンでブロックしたプレート中に固定化されたＩＬ−１０を、ＩＬ−１０結合能力を識別するペプチドと接触して置くことおよび好適な時間インキュベートした後に、そのペプチドとＩＬ−１０の結合を解析することを含み、本記載に添付する実施例１に示すように、ＩＬ−１０に対して低親和性を有するペプチドは洗浄によって除去され、一方、より高い親和性を有するペプチドは、ＩＬ−１０と結合したまま残り、両分子の分子間相互作用を破壊することによって放出させることができ、そしてそれは、例えばｐＨを下げることによって行うことができる。ペプチドを異なる濃度のＩＬ−１０に対してアッセイすることによりあるいはその逆により、問題のペプチドの、ＩＬ−１０に対する親和性に関しての概念を得ることができる。
【００３２】
本発明の総てのペプチドは、ＩＬ−１０と結合する能力を有するが、特定の実施形態においては、ＩＬ−１０と結合する能力を有する本発明のペプチドは、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３として同定されたペプチド、その変異体またはフラグメント、ならびにそれらの薬学上許容される塩からなる群から選択される。
【００３３】
本発明のペプチドの、in vitroでＩＬ−１０の生物活性を阻害する能力は、ＩＬ−１０によって増殖が誘導されるラット肝臓由来肥満細胞株である、ＭＣ／９細胞株(CRL-8306, American Type Cell Culture (ATCC), Virginia, United States)の増殖の阻害についてのアッセイによって評価し、必要に応じて、定量することができる（実施例３参照）。
【００３４】
別の特定の実施形態においては、本発明のペプチドは、ＩＬ−１０の生物活性を阻害する能力を有するペプチドであり、配列番号１（Ｐ１）、配列番号６（Ｐ９）、配列番号８（Ｐ１３）、配列番号１０（Ｐ１５）、配列番号１３（Ｐ１９）、配列番号１４（Ｐ２０）、配列番号１６（Ｐ２２）、配列番号１９（Ｐ２５）、および配列番号２５（Ｐ３４）として同定されたペプチド、その変異体またはフラグメント、ならびにそれらの薬学上許容される塩から選択される。前記ペプチドは、ＩＬ−１０と結合し、ＩＬ−１０の生物活性を阻害する能力を有することに加えて、共通の構造特性を有する。従って、前記ペプチドは、（ｉ）それらのアミノ酸配列中に、予想される割合（約４５％）よりもはるかに高い、６０％〜９０％の割合の疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、およびＰｒｏ）および塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、ＨｉｓおよびＬｙｓ）を有し、かつ（ｉｉ）Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒから選択される少なくとも１個（一般的には２個または３個）の芳香族アミノ酸、好ましくは、Ｐｈｅを有する。同様に、観察できるように、配列番号８（Ｐ１３）として同定されたペプチドを参照ペプチドとしたアミノ酸配列アライメント解析では、２〜５位に塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）を、そして１０〜１４位に疎水性アミノ酸を有するというある特定の傾向が存在し、配列番号１（Ｐ１）、配列番号６（Ｐ９）、配列番号８（Ｐ１３）、配列番号１３（Ｐ１９）、および配列番号２５（Ｐ３４）として同定されたペプチドでは、このパターンが維持されており、配列番号１０（Ｐ１５）、および配列番号１６（Ｐ２２）として同定されたペプチドの場合にはこの位置が逆であり、配列番号１４（Ｐ２０）および配列番号１９（Ｐ２５）として同定されたペプチドにはこのような位置が存在しないことが示される。
【００３５】
特定の実施形態においては、ヒトＩＬ−１０と、ペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）、ならびにその一部の誘導体（末端切断型および／または修飾型）との生体分子相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によってアッセイし、ＩＬ１０と結合する能力を確認した（実施例７）。同様に、ペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）によってもたらされる阻害もＳＴＡＴ３リン酸化に対する効果によって確認した（このＳＴＡＴ３分子は、ＩＬ−１０とその細胞受容体との結合後のシグナル伝達に関与する）（実施例８）。本発明により提供されるＩＬ−１０阻害ペプチドの効果は、in vitro Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞増殖アッセイにおいても認められた（実施例９）。さらに、ＩＬ−１０はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染症の慢性化を決定し得たマイナス要因の一つであるため、ペプチドＰ１３（配列番号８）の効力をin vitroモデルにおいて試験した。このモデルではＨＣＶコアタンパク質は（ＩＬ−１０を誘導するその能力を通じて）低ＩＦＮ−α産生に関与しており、そしてこれを検出する（実施例１０）、図１２において観察できるように、ペプチドＰ１３（配列番号８）はＩＦＮ−α産生を救済することができる。
【００３６】
ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチドの最初の同定においては、本発明者らは、ファージライブラリーに関連する技術を用い、この技術では、ＩＬ−１０と高親和性結合するペプチドを決定し、続いてin vitroアッセイによって、異なるペプチドのＩＬ−１０生物活性阻害能力を定量することが可能である。ＩＬ−１０と結合し、in vitroでＩＬ−１０の生物活性を阻害するペプチドの配列は、数サイクル、一般的には３サイクルのバイオパニング後に対応するＤＮＡ配列から推定することができる。ある特定の産物の阻害剤を同定するためのファージライブラリーの使用は、例えば、Chirinos-Rojas C. L. et al., in Immunology, 1999, Jan. 96(1): 109-113、 McConnell S. J., et al., in Gene 1994, Dec. 30, 151(1-2): 115-118によって、またはSmith G. P., Science, 1985, Jun. 14, 228(4705):1315-1317において記載されている。
【００３７】
よって、本発明は、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチドの同定方法であって、
（ｉ）複数の繊維状ファージを含んでなるファージライブラリーを用い（該ファージの各々のゲノムが、ファージコートタンパク質の遺伝子に連結された、異なるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、それによって各々のファージが、ファージコートタンパク質と遺伝子融合された異なるペプチドを含む）、
（ｉｉ）親和性アッセイによって、ＩＬ−１０とより高い親和性で結合するペプチドを含むファージを選択し、そして
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において選択されたファージに挿入されている、ＩＬ−１０と結合するペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に基づいて、ＩＬ−１０と結合するペプチドの配列を決定すること
を含む方法を提供する。
【００３８】
特定の実施形態においては、ＩＬ−１０と高親和性で結合することができ、該サイトカインの生物活性に対する阻害活性を有する可能性がある、１５個のアミノ酸長を有するペプチドを得る目的で、ファージライブラリーを用いた。このファージライブラリーは、複数の繊維状バクテリオファージ（Ｍ１３）により作製され、該ファージの各々が、ファージコートタンパク質と遺伝子融合された（この場合、コートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端に結合された）、１５個のアミノ酸を有する異なるペプチドを含む。そのため、このファージは、その表面上に、表面タンパク質５分子に各々、１５個のアミノ酸を有するペプチドを有し、一方、その内部は、該ペプチド配列をコードするＤＮＡを含む。ファージライブラリーでは、前記ペプチドコード配列は、２０個の天然アミノ酸に関して１５の位置の各々において縮重した配列から来る配列であり、そして、それは異なるファージにおいて１５個のアミノ酸の１．１×１０１２の考えられる配列を表示することを可能にする。バクテリオファージ中の前記ペプチド配列と、それをコードするＤＮＡとの物理的割合、１対１は、多数の変異体から、ＩＬ−１０と特異的に結合する配列を選択することを可能にする。この工程は親和性アッセイによって行われる。
【００３９】
特定の実施形態においては、前記親和性アッセイは、バイオパニングと呼ばれるin vitro選択プロトコールからなる。簡潔には、前記技術は、実際には、（この場合）１５個のアミノ酸を有するペプチドの総ての変異体を表すファージ群を、ストレプトアビジンでブロックし、それにビオチン化したＩＬ−１０を加えたプレート中で、インキュベートすることからなる。このビオチン化ＩＬ−１０は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を通じてプレートに固定され、それによって、ビオチン化ＩＬ−１０は、ファージが担持するペプチドとの相互作用について正確に表示される。インキュベーション後に、結合していないファージを洗浄によって除去し、続いて、特異的に結合したファージを、ＩＬ−１０とファージによって表示されたペプチドとの分子間相互作用を破壊するｐＨ低下によって溶出する。次いで、溶出されたファージを細菌株感染によって増幅する。この工程を合計３ラウンド繰り返して、特異的に結合し、ＩＬ−１０に対して高親和性を有するファージの含量を高める。プレートをブロックするために用いるビオチン化ＩＬ−１０の濃度は、各ラウンドごとに徐々に、例えば２．５μｇ／ｍＬから０．０２μｇ／ｍＬ、最後には、０．００２μｇ／ｍＬまで下げる。こうして各ラウンドにおいて選択したファージは、ＩＬ−１０に対してより高い親和性の程度を示す。この工程の終了時に、ＩＬ−１０に対する親和性について選択したファージを、プライマーを用いて配列決定する。これにより、ファージにおいて表示されたペプチドの配列を得ることが可能になる。
【００４０】
本記載に添付する実施例１においては、ファージライブラリーによるＩＬ−１０と結合するペプチドの選択、バイオパニング技術による選択およびＩＬ−１０と高親和性結合するペプチドの配列決定を示す。この技術によって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号２６として同定されたペプチドを得た。
【００４１】
別の特定の場合、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチドの最初の同定においては、本発明者らは、（ＩＬ−１０）−（ＩＬ−１０受容体）複合体の構造を考慮した(Josephson K, Logsdon NJ, Walter MR. Crystal structure of the IL-10/IL-10R1 complex reveals a shared receptor binding site. Immunity, 2001 Jul、 15(1):35-46)。このアプローチ（実施例２参照）によって、本発明者らは、前記構造において、αヘリックスコンホメーションを有し、ＩＬ−１０とその受容体との相互作用に関連すると考えられるように配向された、ＩＬ−１０中の領域が存在することを観察した。こうして、本発明者らは、逆平行に配向された、ＩＬ−１０中の二つのαヘリックス領域、具体的には、ＩＬ−１０アミノ酸配列の１９−３５アミノ酸配列を含んでなる第１の領域と、ＩＬ−１０アミノ酸配列の８６−１１０アミノ酸配列を含んでなるもう一つの第２の領域との存在を見いだしたため、それらの領域はＩＬ−１０とその受容体との相互作用に関連している可能性があると考えられる。こうして、上述したように、ＩＬ−１０阻害能力を有するペプチドの合成に用いることができるＩＬ−１０アミノ酸配列領域を同定し、続いて、in vitroアッセイによって異なるペプチドの、ＩＬ−１０の生物活性を阻害する能力を定量することができる。
【００４２】
上記アプローチを用いることによって同定した、潜在的にＩＬ−１０阻害能力を有するペプチドの限定されない例示例を表２に示し（実施例２）、それらには、配列番号３０（Ｆ２４）、配列番号３１（Ｆ２５）、配列番号３２（Ｆ２６）、配列番号３３（Ｆ２７）、配列番号３４（Ｆ２８）、配列番号３５（Ｆ２９）、および配列番号３６（Ｆ３０）として同定されたペプチドが含まれる。前記表２に見られるように、配列番号３０（Ｆ２４）として同定されたペプチドは、天然ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）アミノ酸配列の８６−９７アミノ酸配列を含んでなるペプチドであり、ペプチド配列番号３１（Ｆ２５）として同定されたペプチドは、天然逆ｈＩＬ−１０アミノ酸配列の２３−３４アミノ酸配列を含んでなるペプチドであり、配列番号３２（Ｆ２６）として同定されたペプチドは、天然ｈＩＬ−１０アミノ酸配列の２３−３４アミノ酸配列を含んでなるペプチドであり、配列番号３３（Ｆ２７）として同定されたペプチドは、相補的天然ｈＩＬ−１０アミノ酸配列の２３−３４アミノ酸配列を含んでなるペプチドであり、ＩＬ−１０と結合する能力を有し、配列番号３４（Ｆ２８）として同定されたペプチドは、相補的逆天然ｈＩＬ−１０アミノ酸配列のアミノ酸配列２３−３４を含んでなるペプチドであり、ＩＬ−１０と結合する能力を有し、配列番号３５（Ｆ２９）として同定されたペプチドは、相補的天然ｈＩＬ−１０アミノ酸配列の９９−１０７アミノ酸配列を含んでなるペプチドであり、ＩＬ−１０と結合する能力を有し、そして配列番号３６（Ｆ３０）として同定されたペプチドは、相補的逆天然ｈＩＬ−１０アミノ酸配列のアミノ酸配列９９−１０７を含んでなるペプチドであり、ＩＬ−１０と結合する能力を有する。
【００４３】
本明細書において、「逆」とは、アミノ酸配列が、逆に読んだ天然タンパク質のタンパク質またはフラグメントのアミノ酸配列に相当することを意味する。本明細書において、「相補的」とは、天然タンパク質のアミノ酸配列の他の相補的残基と「確実に相互作用する」ことができる残基を含んでなるアミノ酸配列に関する。本明細書において、「確実に相互作用する」とは、２個のアミノ酸間の相互作用が静電気力、疎水性相互作用、水素結合などによって引力を生む状況に関する。
【００４４】
数多くの生物学的過程におけるＩＬ−１０の役割から、本発明のペプチドのＩＬ−１０阻害活性の結果は、かかるペプチドが損傷をもたらす過剰の前記サイトカインをブロックすることができることから、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する臨床症状および病理学的障害の治療に有用な新規薬物ファミリーの潜在的開発と結び付く。よって、本発明のペプチドは、被験体または患者の臨床症状の悪化にＩＬ−１０の増加が関係しているいかなる臨床症状または病理学的障害においても適用できる可能性があると思われる。
【００４５】
本明細書において、「被験体」とは、哺乳類動物種の任意のメンバーに関し、それには、限定されるものではないが、愛玩動物、霊長類、およびヒトが含まれる。被験体は、好ましくは、任意の年齢または人種の男性または女性ヒトである。
【００４６】
従って、本発明のペプチドは、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する臨床症状または病理学的障害の治療において用いることができる。本発明のペプチドを用いて治療することができる、ＩＬ−１０が免疫抑制の役割を有する前記臨床症状または病理学的障害の例示例としては、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、腫瘍、癌または急性損傷状態が挙げられる。
【００４７】
これらのような感染過程、腫瘍、癌または急性損傷状態においては、ＩＬ−１０は、治癒に有利に働くと思われるＴｈ１応答の誘導を妨げるため、マイナスの影響を与える。本発明のペプチドを用いて治療することができるウイルス感染症の限定されない例示例としては、ウイルス起源の事実上総ての感染症、例えば、ヘルペスウイルス、例えば、ヒトヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、カポジヘルペスウイルス(Kaposi's herpesvirus)（ＨＨＶ−８）など）に起因し、場合によって、日光にさらされると皮膚再燃を起こす感染症、肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に起因する感染症などが挙げられる。本発明のペプチドを用いて治療することができる細菌感染症の限定されない例示例としては、限定されるものではないが、らい菌(Mycobacterium leprae)に起因する感染症、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)に起因する感染症、ペスト菌(Yersinia pestis)に起因する感染症、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）に起因する胃感染症などが挙げられる。本発明のペプチドを用いて治療することができる真菌に起因する感染症の限定されない例示例としては、限定されるものではないが、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、紅色白癬菌(Trichophyton rubrum)に起因する感染症に起因する感染症、アスペルギルス属種(Aspergillus sp.)に起因する感染症などが挙げられる。本発明のペプチドを用いて治療することができる寄生虫感染症の限定されない例示例としては、限定されるものではないが、リーシュマニア症、例えば、内臓リーシュマニア症、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)に起因する感染症、トキソプラスマ症などが挙げられる。本発明のペプチドを用いて治療することができる腫瘍および癌の例示例としては、限定されないが、ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、黒色腫、紫外線放射により突然変異したケラチノサイトから発生した基底細胞癌および扁平上皮癌などが挙げられる。本発明のペプチドを用いて治療することができる急性損傷状態の例示例としては、限定されないが、火傷および関連する敗血症などが挙げられる。一般的には、ＩＬ−１０の活性が被験体の臨床症状の悪化または慢性化において重要な免疫抑制の役割を果たす腫瘍成長、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または寄生虫感染症のあらゆる過程を本発明のペプチドを用いて治療することができる。
【００４８】
よって、別の態様においては、本発明は、治療上有効な量の本発明のペプチドを、少なくとも一つの薬学上許容される賦形剤とともに含んでなる医薬組成物に関する。本発明により提供される医薬組成物は、本発明の一以上のペプチドを、任意の一以上の代替ＩＬ−１０阻害化合物とともに含むことができる。
【００４９】
前記医薬組成物は、ヒトまたは動物の体における、好ましくはヒトの体におけるその投与および／または適用に有用である。必要に応じて、本発明の医薬組成物中に、本発明のペプチド以外の事実上総てのＩＬ−１０阻害化合物を存在させることができる。本発明のペプチドとともに用いることができる、本発明のペプチド以外の代替ＩＬ−１０阻害化合物の例示例としては、限定されないが、ＩＦＮ−γ、ＡＳ１０１  アンモニウムトリクロロ（ジオキソエチレン−Ｏ，Ｏ’）テルレート）、中和抗体、１５ｄ−ＰＧＪ２（１５−デオキシ−Δ−１２，１４−プロスタグランジン  Ｊ２）、キメラネズミ抗ヒトＣＤ２０抗体(Ritubimax)などが挙げられる。
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは抗体を用いる代わりに、本発明のペプチドなどのペプチドを使用することには、それらのペプチドが小分子であり、より強力な拡散能力とより短い半減期を有することから、数多くの利点がある。これらのようなペプチドはＩＬ−１０に対して高親和性を有し得るが、抗体よりも速く分解され、用量によって副作用を制御することができる。また、器官または組織を標的にするためにペプチドを運搬することは、他の種類の化合物と比較して容易でもある。
【００５１】
本発明のペプチドは、ヒトまたは動物の体において本発明のペプチドをその作用部位と接触させる任意の手段によってＩＬ−１０発現、特に高度（過剰）ＩＬ−１０発現に関する臨床症状または病理学的障害を治療するために投与することができる。本発明により提供される医薬組成物中に存在し得るペプチド、誘導体またはその薬学上許容される塩の量は、広い範囲内で変化し得る。
【００５２】
本発明のペプチドおよび／または医薬組成物を用いて、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する病理学的障害または疾患を治療するための用量は、患者の年齢、状態、病理学的障害、または疾患の重篤度、投与の経路および頻度を含む多数の因子、ならびに投与する本発明のペプチドによって決定される。
【００５３】
本発明のペプチドを含む医薬組成物は、いかなる投与形態（例えば固体または液体）でも与えることができ、いかなる好適な方法によっても、例えば経口的に、非経口的に、経直腸的に、または局所的に投与することができ、そのために所望の投与形態、例えば軟膏（リポゲル、ヒドロゲルなど）点眼薬、スプレー、注射液、浸透圧ポンプなどの処方物に必要な薬学上許容される賦形剤を含んでもよい。異なる医薬品投与形態およびそれらを得るために必要な賦形剤の総説は、例えば、"Tratado de Farmacia Galenica", C. Fauli i Trillo, 1993, Luzan 5, S. A. Ediciones, Madridに見いだすことができる。
【００５４】
よって、別の態様においては、本発明は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関する臨床症状または病理学的障害の治療のための本発明のペプチドに関する。特定の実施形態においては、前記臨床症状または病理学的障害は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現を提示する臨床症状または病理学的障害である。特定の実施形態においては、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現を提示する前記臨床症状または病理学的障害は、Ｔｈ１細胞応答が阻害される臨床症状を含む。治療することができる前記臨床症状または病理学的障害の例示例としては、既に述べた、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、腫瘍、癌、または急性損傷状態が挙げられる。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、前記医薬組成物の調製における本発明のペプチドの使用である。よって、別の態様においては、本発明は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する臨床症状または病理学的障害の治療のための医薬品の調製における本発明のペプチドの使用に関する。特定の実施形態においては、前記臨床症状または病理学的障害は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現を提示する臨床症状または病理学的障害である。特定の実施形態においては、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現を提示する前記臨床症状または病理学的障害は、Ｔｈ１細胞応答が阻害される臨床症状を含む。治療することができる前記臨床症状または病理学的障害の例示例としては、既に述べた、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、腫瘍、癌、または急性損傷状態が挙げられる。
【００５６】
サンプル中のＩＬ−１０発現レベルを測定するための方法は、当業者には周知である。よって、限定されない例示として、前記方法には、例えば、血清、痰、または精液サンプル中のＩＬ−１０レベルまたは濃度の、例えばＥＬＩＳＡ技術による測定がある。前記技術では、サンプル中のＩＬ−１０レベルを、正常レベルと比較して、すなわち健康な個体サンプル中のＩＬ−１０レベルと比較して定量することが可能である。
【００５７】
本発明のペプチドは、従来の方法によって、例えば固相化学合成技術によって得ることができ、従来の方法によって、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、精製することができ、そして、必要に応じて、それを、従来の技術によって、例えば、配列決定および質量分析、アミノ酸分析、核磁気共鳴などによって解析することができる。限定されない例示として、本発明のペプチドは、従来の方法に従って(Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963 85:2149-2154)、Atherton Ｆｍｏｃ変異体(Atherton, E., Logan, J. C. and Sheppard, R. C. 1989. Peptide synthesis II. Procedures for solid phase synthesis using N-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids on polyamide supports. Synthesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:538)を用いて、ペプチド合成によって得ることができる。得られるペプチドの純度は、例えば逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーおよび／または質量分析によって、決定することができる。
【００５８】
一方、本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術によっても得ることができる。よって、別の態様においては、本発明は、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供する。前記ＤＮＡ配列は、本発明のペプチドのアミノ酸配列から容易に推定することができる。
【００５９】
前記ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ構築物中に含めることができる。よって、別の態様においては、本発明は、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構築物を提供する。前記ＤＮＡ構築物は、機能しうる形で結合された、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現調節配列を組み込むことができる。前記制御配列は、本発明のペプチドの転写および、必要に応じて、翻訳を制御し、調節する配列であり、それらとしては、前記ＤＮＡ構築物または配列を含んでなる形質転換宿主細胞において機能的な、プロモーター、終結配列などが挙げられる。特定の実施形態においては、前記発現制御配列は細菌において機能する。有利には、前記ＤＮＡ構築物は、前記ＤＮＡ構築物で形質転換された宿主細胞を選択することが可能なモチーフまたは表現型をコードするマーカーまたは遺伝子をさらに含んでなる。本発明により提供されるＤＮＡ構築物は、技術の現状において広く知られている技術を用いることによって得ることができる[Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol. 1-3]。
【００６０】
本発明により提供されるＤＮＡ配列またはＤＮＡ構築物は、好適なベクターに挿入することができる。よって、別の態様においては、本発明は、ベクター、例えば前記ＤＮＡ構築物または配列を含んでなる発現ベクターに関する。ベクターの選択は、後にベクターを導入する宿主細胞によって決定する。例として、前記ＤＮＡ配列を導入するベクターは、宿主細胞に導入した場合に、前記細胞のゲノム中に組み込まれるまたは組み込まれないプラスミドまたはベクターであり得る。前記ベクターは、当業者には公知の従来の方法によって得ることができる[Sambrok et al., 1989, 上述]。
【００６１】
別の態様においては、本発明は、本発明により提供されるＤＮＡ配列またはＤＮＡ構築物あるいはすでに述べたベクターを含んでなる宿主細胞、例えば形質転換宿主細胞に関する。前記細胞は、原核または真核細胞であり得る。
【００６２】
別の態様においては、本発明は、本発明により提供されるＤＮＡ配列、本発明により提供されるＤＮＡ構築物、本発明により提供されるベクター、または本発明により提供される宿主細胞、および薬学上許容される担体を含んでなる医薬組成物に関する。特定の実施形態においては、前記医薬組成物は、遺伝子導入ベクター、例えばウイルスまたは非ウイルスベクターに入った、本発明により提供されるＤＮＡ配列または本発明により提供されるＤＮＡ構築物を含んでなる。本発明のこの実施形態を実行するのに好適なウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、コロナウイルス由来ベクターなどが挙げられる。本発明のこの実施形態を実行するのに好適な非ウイルス型ベクターとしては、限定されるものではないが、裸のＤＮＡ、リポソーム、ポリアミン、デンドリマー、カチオン性糖ポリマー、リポソーム−ポリカチオン複合体、タンパク質、受容体媒介遺伝子導入系などが挙げられる。
【００６３】
よって、別の態様においては、本発明は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する臨床症状または病理学的障害の治療のための、本発明により提供されるＤＮＡ配列、または本発明により提供されるＤＮＡ構築物、または本発明により提供されるベクター、または本発明により提供される宿主細胞に関する。特定の実施形態においては、前記臨床症状または病理学的障害は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現を提示する臨床症状または病理学的障害である。特定の実施形態においては、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現を提示する前記臨床症状または病理学的障害は、Ｔｈ１細胞応答が阻害される臨床症状を含む。治療することができる前記臨床症状または病理学的障害の例示例としては、すでに述べた、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、腫瘍、癌、または急性損傷状態が挙げられる。
【００６４】
別の態様においては、本発明は、ＩＬ−１０発現、特に高度ＩＬ−１０発現に関連する臨床症状および病理学的障害の治療のためのベクターおよび細胞の調製における前記ＤＮＡ配列およびＤＮＡ構築物の使用に関する。本発明のこの態様によれば、前記ＤＮＡ構築物または配列は、遺伝子導入ベクター、例えばウイルスまたは非ウイルスベクターと接触される。本発明のこの実施形態を実行するのに好適なウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、コロナウイルス由来ベクターなどが挙げられる。本発明のこの実施形態を実行するのに好適な非ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、裸のＤＮＡ、リポソーム、ポリアミン、デンドリマー、カチオン性糖ポリマー、リポソーム−ポリカチオン複合体、タンパク質、受容体媒介遺伝子導入系などが挙げられる。
【００６５】
別の態様においては、本発明は、本発明のペプチドの製造方法であって、本発明により提供されるＤＮＡ構築物、配列またはベクターを含んでなる宿主細胞を、本発明のペプチドの製造および、必要に応じて、本発明のペプチドの回収を可能にする条件下で増殖させることを含む方法に関する。前記宿主細胞の培養を最適化するための条件は、用いる宿主細胞によって決まる。必要に応じて、本発明のペプチドの製造方法は、該ペプチドの単離および精製をさらに含む。
【００６６】
次の実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６７】
実施例１
ファージライブラリーによる、ＩＬ−１０と結合するペプチドの選択
ＩＬ−１０と高親和性で結合することができ、このサイトカインの生物活性に対する阻害活性を有する可能性がある、１５個のアミノ酸を有するペプチドを得るために、ファージライブラリーから発生した技術に基づくin vitro選択技術を用いた。これらのライブラリーは、ウイルスコートタンパク質と、遺伝子融合された（この場合、コートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端に結合された）ペプチドを含む繊維状バクテリオファージ（Ｍ１３）とからなる（図１）。そのため、このファージは、その表面上に、該ファージの表面上にあるこのタンパク質５分子に各々、１５個のアミノ酸を有するペプチドを有し、一方、その内部は、該ペプチド配列をコードするＤＮＡを含む。ファージライブラリーでは、前記ペプチドコード配列は、２０個の天然アミノ酸に関して１５の位置の各々において縮重した配列からくる配列である。これは、異なるファージにおいて１５個のアミノ酸の１．１×１０１２の考えられる配列を表示することを可能にする。バクテリオファージ中の前記ペプチド配列とそれをコードするＤＮＡとの物理的割合、１対１は、多数の変異体から、ＩＬ−１０と特異的に結合する配列を選択することを可能にする。この工程は、「バイオパニング」と呼ばれるin vitro選択プロトコールによって行われる。
【００６８】
この実施例を実施するために用いるファージライブラリーは、２×１０８異なるクローンを含み、George P. Smithの研究室 (University of Missouri, USA) から提供された。この技術についてのさらなる情報は、次のウェブページ上において見つけることができる：
http://www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsitelndex.html
【００６９】
選択技術（バイオパニング）
まず、バイオパニングの前に、１０μｌのファージライブラリーを、宿主株として（G. P. Smith, Division of Biological Sciences Tucker Hall. University of Missouriによって供給された）大腸菌(Escherichia coli)Ｋ９１Ｋａｎ株を用いて増幅し、その後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌでの２回の沈殿およびＣｓＣｌ勾配遠心分離によって精製した。
【００７０】
分光分析によって算出したファージ懸濁液の力価は、３．８２×１０１４ビリオン／ｍｌであり、感染粒子の数は１．３×１０１３ＴＵ／ｍｌであった。選択アッセイ開始前に、増幅がクローンの多様性に影響を及ぼさないことを確認するために、このファージ懸濁液の一部を配列決定した。
【００７１】
バイオパニング技術は、（実際には）１５個のアミノ酸を有する総ての変異体を表すファージ群を、ストレプトアビジンでブロックし（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中１０μｇ／ｍｌ、室温で２時間）それにビオチン化したＩＬ−１０を加えたプレート中で、インキュベートすることからなる。このビオチン化ＩＬ−１０は、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を通じてプレートに固定され、それによって、ビオチン化ＩＬ−１０は、ファージが担持するペプチドとの相互作用について正確に表示される。ＩＬ−１０を、３×１０４ウイルス／ｍｌの濃度においてファージが担持するペプチドと接触させ、およそ１２時間インキュベートさせる。インキュベーション後に、結合していないファージを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水／ソルビタン脂肪酸エステルのポリオキシアルキレン誘導体）での５回の洗浄によって除去し、続いて、特異的に結合したファージを、ＩＬ−１０とファージによって表示されたペプチドとの分子間相互作用を破壊するｐＨ低下（溶出バッファー）によって溶出する。次いで、溶出されたファージを細菌株（大腸菌Ｋ９１Ｋａｎ）感染によって増幅する。この工程を合計３ラウンド繰り返して、特異的に結合し、ＩＬ−１０に対して高親和性を有するファージの含量を高める（図３）。プレートをブロックするために用いるビオチン化ＩＬ−１０の濃度は、各ラウンドごとに徐々に、２．５μｇ／ｍＬから０．０２μｇ／ｍＬ、最後には、０．００２μｇ／ｍＬまで下げる。こうして各ラウンドにおいて選択したファージは、ＩＬ−１０に対して次第に高くなる親和性の程度を示す。この工程の終了時に、ＩＬ−１０に対する親和性について選択したファージは、大腸菌細胞に感染させた後に遺伝子改変ファージによって提供されるテトラサイクリン耐性による単離後、プライマーを用いて配列決定する。これにより、単離コロニーの得られた数のクローンのファージにおいて表示されたペプチドの配列を得ることが可能になる。全配列決定クローンの、各クローンが担持する、１５個のアミノ酸を有するペプチドに対応する配列の繰り返し回数は、１５個のアミノ酸を有するペプチドがＩＬ−１０に対して有する親和性の相対的程度に関しての概念を与える。
【００７２】
ペプチド配列
バイオパニングによって得られる、ファージクローンを得るために、抗生物質の存在下でこれらのファージに感染した細菌コロニーの選択を行い、その耐性は、該ファージのゲノム中に存在するテトラサイクリン耐性遺伝子によって与えられる。この方法では、バクテリオファージに感染したコロニーだけが増殖する。よって、各コロニーは、その表面上に表示される単一ペプチドの配列が対応する単一ファージのゲノムを含む。
【００７３】
バイオパニングによる選択最終ラウンドによって得られる、ファージに感染した細菌コロニーから、そのＤＮＡを抽出し、ファージのタンパク質ｐＩＩＩにおいて表示されたペプチドに対応する領域を含んでなるゲノム部分を、配列番号２７で識別されるこの領域近くでハイブリダイズする特異的なプライマーを用いて配列決定した。こうして、表１に示す配列を得、表１では前記配列に担持されたコロニー（クローン）の数をさらに示す。
【００７４】
【表１】
2010522551.tif 000002
【００７５】
各配列のクローン（コロニー）数は、ペプチドとＩＬ−１０との親和性の程度に関しての相対的な概念を与える。すなわち、クローン数が大きいほど、結合親和性が高くなる。しかしながら、最も活性があるペプチドのいくつかのもの、例えば、配列番号６（Ｐ９）および配列番号１７（Ｐ２３）として同定されたペプチドは、各々、三つおよび一つのクローンを与え、一方、２９クローンを与える、配列番号２として同定されたペプチドは、阻害アッセイにおいてかなり活性が低い（実施例３）ことから、親和性の程度は、ＩＬ−１０の活性をブロックする能力に対応していない。学説に関係なく、この点については、最も活性があるペプチドが恐らくＩＬ−１０とその受容体との結合をブロックするであろうということに基づいて説明することができた。
【００７６】
ペプチド配列比較
得られた配列を、インターネット上で入手できる、アミノ酸配列を推定することが可能な「トランスレートツール」プログラム(http://www.expasy.org/tools/dna.html)を用いて解析し、これらのアミノ酸配列をその後取り扱った。合計１４３クローンを配列決定し、そしてそれは３５個の異なるペプチド（Ｐ１−Ｐ３５）を同定することを可能にした。そのうち９個の前記ペプチド（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１７、Ｐ２７、Ｐ２８、およびＰ３０）は、他のタンパク質に関する他のバイオパニングアッセイでも見いだされたため、それらのペプチドはＩＬ−１０との結合に特異的ではないとみなし、その結果として、それらのペプチドを廃棄することができた。これらの非特異的結合は、選択工程中に存在する成分のいくつか（プラスチック、ビオチン、ストレプトアビジンなど）との相互作用および／またはファージ表面タンパク質に起因する可能性がある。
【００７７】
実施例２
ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）とその受容体との複合体の構造に基づいたペプチド設計
この場合には、（ｈＩＬ−１０）−（ｈＩＬ−１０受容体）複合体の構造を考慮して、ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）阻害剤を開発した。前記構造においては、逆平行に配向された、ｈＩＬ−１０一次構造中の二つのαヘリックス領域（アミノ酸１９−３５およびアミノ酸８６−１１０）が存在し、それらの領域はｈＩＬ−１０とその受容体との相互作用に関連している可能性がある。これらのペプチドの配列を下記に示す：
（配列番号２８）  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ（ｈＩＬ−１０のアミノ酸１９−３５）
（配列番号２９）  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ（ｈＩＬ−１０のアミノ酸８６−１１０）
【００７８】
これらの配列に基づき、本発明者らは、表２に下記に示す、Ｃ末端に修飾を有する（該末端がアミド化されている）ペプチドがｈＩＬ−１０の領域と（またはｈＩＬ−１０受容体の領域と）結合し、ｈＩＬ−１０とその受容体との相互作用を妨げることができると推測した。こうして、表２に示す配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２として同定されたペプチドはｈＩＬ−１０受容体と結合し、一方、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６として同定されたペプチドはｈＩＬ−１０と結合すると予測した。
【００７９】
【表２】
2010522551.tif 000003
【００８０】
従って、例えば、「ｃｏｍｐ  ９９−１０７」（配列番号３５）と定義したペプチドでは、該ペプチド９９−１０７（下記にボールド文字で示す）中に存在するアミノ酸ＬｙｓおよびＡｒｇが、予測ペプチドのアミノ酸Ａｓｐ（これについてもボールド文字で示す）と相互作用し得ることから、該ペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸９９〜アミノ酸１０７の間に含まれるｈＩＬ−１０フラグメントのアミノ酸配列（ペプチド９９−１０７）と相補的であり、そして該ペプチドは、「ｃｏｍｐ  ９９−１０７」として設計された：
【数１】
2010522551.tif 000004
【００８１】
実施例３
ＭＣ／９細胞を用いた増殖アッセイにおけるペプチドによるＩＬ−１０in vitro生物活性の阻害
ＭＣ／９細胞株(CRL-8306, American Type Cell Culture (ATCC), Virginia, United States)は、マウス肝臓由来肥満細胞であり、ＭＣ／９細胞株は懸濁液中で増殖し、それらの増殖は、培養培地に外から加えたＩＬ−１０の存在によって誘導される。このため、前記サイトカインを阻害する合成ペプチドにより外因性ＩＬ−１０の効果を阻害することによってＭＣ／９細胞の増殖を抑制し、そしてそれが前記ペプチドのＩＬ−１０阻害活性をin vitroにおいて測定することを可能にする。このアッセイでは、増殖を、ＤＮＡ合成中のトリチウム化チミジンの組込みとして間接的に測定する。
【００８２】
ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）と、マウスＩＬ−１０（ｍＩＬ−１０）との両方の阻害を評価する場合に、このアッセイを行うのに最も好適な条件は以下である。ＭＣ／９細胞を９６−ウェルプレートに、完全培地:５％ＲＡＴ−ＳＴＩＭ(354115 Becton Dickinson)とともに０．５ｎｇ／ｍＬマウスＩＬ−４(Preprotech EC, London, United Kingdom)および必要に応じて１．２５ｎｇ／ｍＬ  ｈＩＬ−１０(e-Bioscience)またはｍＩＬ−１０(e-Bioscience)を補給した、１０％ＦＢＳ(10270-106 Gibco)、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび５０Ｕ／ｍＬペニシリン(15140-122 Gibco)、２ｍＭグルタミン(BE17-605E BioWhittaker)ならびに２−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ(BE-12-604F BioWhittaker)中、初期密度２０，０００細胞／ウェルにおいて加え、それらを３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。その後、１ウェル当たり１μＣｉのメチル−３Ｈ−チミジン(Amersham Life Science, Buckinghamshire, United Kingdom)を加え、そのプレートをさらに１２時間同じ条件でインキュベートする。最後に、細胞を回収し、トリチウム化チミジンはＤＮＡ合成において組み込まれており、プレートに移し(UniFilter-96 GF/C, Perkin Elmer)、シンチレーション液を加えた後、シンチレーションカウンター(Top Count, Microplate Scintillation Counter, Packard)で放射能を定量し、各ウェルのカウント毎分（ｃｐｍ）の放射を測定してそれを定量する。
【００８３】
ペプチドの阻害能力は、アッセイする各ペプチドを異なる濃度（１５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ）で用いて決定する。ペプチド溶液を、必要に応じて１．２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１０またはｍＩＬ−１０とともに、２時間インキュベートし、その後、ＭＣ／９細胞をマウスＩＬ−４とともに加え、ＩＬ−４の終濃度は０．５ｎｇ／ｍｌとなるようにする。陰性増殖対照は、マウスＩＬ−４とともにインキュベートした細胞からなり、一方、陽性増殖対照は、マウスＩＬ−４およびＩＬ−１０とともにインキュベートした細胞からなる。必要に応じて、抗ヒトＩＬ−１０抗体(e-Bioscience)または抗マウスＩＬ−１０抗体(e-Bioscience)（３ｎｇ／ｍｌ）を阻害対照として用いる。各ペプチドを三連で解析した。結果は、次式によって算出した阻害率として表している：
％阻害＝（ｃｐｍ  ｍａｘ−ｃｐｍ  ｅｘｐ）／（ｃｐｍ  ｍａｘ−ｃｐｍ  ｍｉｎ）×１００
式中：
「ｃｐｍ  ｍａｘ」は、放射能（カウント毎分）の最大値であり、
「ｃｐｍ  ｅｘｐ」は、ペプチドに関する放射能（カウント毎分）の実験値であり、および
「ｃｐｍ  ｍｉｎ」は、放射能（カウント毎分）の基礎値である。
【００８４】
アッセイするペプチド（図４）は、従来の方法に従って(Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963 85:2149-2154)、Atherton Ｆｍｏｃ変異体(Atherton, E., Logan, J. C. and Sheppard, R. C. 1989. Peptide synthesis II. Procedures for solid phase synthesis using N-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids on polyamide supports. Synthesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:538)を用いて、ペプチド合成によって得た。
【００８５】
ペプチドの純度は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／または質量分析によって決定した。８０％以上の純度を有するペプチドだけを、ＩＬ−１０の活性を阻害する能力に関して試験した。
【００８６】
ＩＬ−１０を阻害するペプチドの能力を測定するためには、それらのペプチドが、ＭＣ／９細胞を用いた増殖アッセイを行う培養培地中に溶解している必要がある。そのために、まず、ペプチドを完全培地中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させるよう試みた。これらの条件では、表１の２６個のペプチドのうち、１０個のペプチドだけが溶解し、２個のペプチドは部分的に溶解した（表３）という事実から、異なる割合のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または尿素を加えることによって残りのペプチドの溶解度を向上させる必要があった。他の可溶化剤、例えば塩酸グアニジン、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、アセトニトリル、アンモニア、および酢酸も試験したが、これらの可溶化剤は、ＭＣ／９細胞に対してあまり効果がなかったか、または毒性があったという事実から、それらの使用は排除した。ＤＭＳＯまたは尿素の毒性を可能な限り制限するために、培養培地中の両方の薬剤の濃度を、in vitroアッセイとの適合が可能な限り低く維持した。こうして、ＭＣ／９細胞のin vitro増殖アッセイの実施を可能にする、加える可溶化剤の最大濃度をまず決定した。上記に示したように、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、および０．００１％酢酸、アンモニア、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、アセトン、アセトニトリル、イソプロパノール、メタノール、およびエタノールならびに２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、０．２５０Ｍ、０．１２５Ｍ、０．０６２Ｍ、および０．０３１Ｍ尿素および塩酸グアニジンを試験した。
【００８７】
塩酸グアニジンは、試験した総ての濃度において高い毒性があった。酢酸、ＤＭＳＯおよびＤＭＦについての、アッセイに適合する最終的な最大濃度は、０．０１％または０．００５％であり、これらの濃度ではペプチドは可溶化しない。尿素の場合、限界濃度は１２５ｍＭであり、アンモニアでは、０．２％（試験した最大濃度）であった。アルコールに関しては、１％（最大）まで適合し、アセトンおよびアセトニトリルは、ＭＣ／９細胞増殖を誘導するように思われた。
【００８８】
ＤＭＳＯ：
配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５および配列番号１６として同定されたペプチドをＤＭＳＯ（最終量の２％の１ｍｇ／ｍＬストック）で再懸濁し、清澄化した培地を試験した。それらを音波処理に供した後、配列番号１６として同定されたペプチドを除くそれらの総てはまだ濁っていた。
【００８９】
メタノール／エタノール
これらのアルコールを用いてペプチドを溶解するためには、アルコールを１００％で用いる必要があるが、この濃度ではアルコールはＭＣ／９細胞に対して毒性がある。アルコールは７０％でも毒性がある。
【００９０】
尿素
配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２０として同定されたペプチドを、８Ｍ尿素（１ｍｇ／ｍＬ中終濃度０．８Ｍ）を含む完全培地中に溶解した。尿素は比較的毒性がある（尿素を含まない場合のｃｐｍ  １．１２８、１２０ｍＭ尿素を含む場合１０９、８０ｍＭを含む場合３０８、２０ｍＭを含む場合８００、ウインドウは維持する）。
【００９１】
ペプチドを可溶化するために用いる条件を表３に要約する。示した合計３９個のペプチドのうち、１１個のペプチド（ボールド文字で）は示した条件で可溶化させることができなかったため、それらのペプチドはin vitroアッセイにおいて試験することはできなかった。
【００９２】
【表３】
2010522551.tif 000005
【００９３】
試験条件で可溶化することができなかったペプチドをボールド文字で示す、ｐａｒｔ  Ｓ：部分的に溶解する、Ｓ：溶解する、Ｉ：溶解しない
【００９４】
外因性ＩＬ−１０を加えたＭＣ／９細胞培養物に、ＩＬ−１０活性を阻害する能力を有するペプチドを加えることには、ＩＬ−１０がこれらの細胞の増殖を促進するという事実から、これらの細胞の増殖を阻害する効果がある。しかしながら、培養物に、ＭＣ／９細胞に対して毒性があった（ペプチド溶解度を向上させるために用いる）ペプチドまたは任意の成分を加えることにも細胞増殖を阻害する効果があると思われる。このため、ペプチドが実際にＩＬ−１０を阻害し、これらの細胞に対する毒性からの増殖でないことを確かめるために、培養物に加えるペプチドまたは他の薬剤がこれらの細胞に対して毒性がないことを示す必要がある。このために、ペプチドと並行して、ＩＬ−１０の代わりにマウス顆粒球−単球コロニー刺激因子（ｍＧＭ−ＣＳＦ）（これもＭＣ／９細胞増殖を促進する）を用いたアッセイを行った。用いたｍＧＭ−ＣＳＦの濃度は０．０１ｎｇ／ｍＬであった。この場合、ＩＬ−４を共刺激として用いなかった。毒性は、ｍＧＭ−ＣＳＦによって誘導される増殖の阻害率として表した。
【００９５】
尿素に溶解したペプチドの場合、ＩＬ−１０阻害および毒性の両方を解析する際には、陰性対照、陽性対照、および抗体を含むペプチドサンプル中に尿素の濃度（１２０ｍＭ、８０ｍＭ、および２０ｍＭ）が存在する対照ならびに尿素を含まない対照を含めた。
【００９６】
ペプチドの各濃度における阻害率は、サンプルのｃｐｍ値を同じ濃度の尿素を含む対照のｃｐｍ値と比較して算出した。
【００９７】
図４に示すペプチド［Ｐ１（配列番号１）、Ｐ２（配列番号２）、Ｐ７（配列番号４）、Ｐ９（配列番号６）、Ｐ１０（配列番号７）、Ｐ１３（配列番号８）、Ｐ１５（配列番号１０）、Ｐ１６（配列番号１１）、Ｐ１９（配列番号１３）、Ｐ２０（配列番号１４）、Ｐ２２（配列番号１６）、Ｐ２３（配列番号１７）、Ｐ２３−３（配列番号４３）、Ｐ２３−４（配列番号４４）、Ｐ２４（配列番号１８）、Ｐ２５（配列番号１９）、Ｐ２６（配列番号２０）、Ｐ３１（配列番号２２）、Ｐ３２（配列番号２３）、Ｐ３３（配列番号２４）、Ｐ３４（配列番号２５）、Ｐ３５（配列番号２６）、Ｆ２４（配列番号３０）、Ｆ２５（配列番号３１）、Ｆ２７（配列番号３３）、Ｆ２８（配列番号３４）、Ｆ２９（配列番号３５）、およびＦ３０（配列番号３６）］によるＩＬ−１０の阻害率を、それらの毒性とともに考慮すると、
−完全培地に溶解したまたは部分的に溶解した、表３の１２個のペプチドのうち、Ｐ７（配列番号４）、Ｐ１０（配列番号７）、およびＰ２０（配列番号１４）として同定されたペプチド（図４）には、ｈＩＬ−１０またはｍＩＬ−１０に対して大きな阻害活性はなく（阻害についてはおよそ１０％〜２０％の値）、残りのペプチドには、３０％〜５０％含まれるＩＬ−１０阻害活性があり、Ｐ１５（配列番号１０）、ＰＩ９（配列番号１３）、Ｐ２５（配列番号１９）、およびＰ３４（配列番号２５）として同定されたペプチドに最も活性があったということ、
−尿素を用いて溶解したペプチド［Ｐ９（配列番号６）、Ｐ２２（配列番号１６）、Ｐ２３（配列番号１７）、Ｐ２３−３（配列番号４３）、Ｐ２３−４（配列番号４４）、Ｐ２４（配列番号１８）、およびＰ２６（配列番号２０）として同定されたペプチド］に関しては、Ｐ９（配列番号６）およびＰ２２（配列番号１６）として同定されたペプチドに非常に活性があり、およそ６０％のＩＬ−１０阻害活性を有し、この群の残りのペプチドには活性はなく、Ｐ２４（配列番号１８）およびＰ２６（配列番号２０）として同定されたペプチドには、ＭＣ／９細胞に対して部分的に毒性があったということ、そして
−ＩＬ−１０配列領域との「相補性」の考察（実施例２）に基づいて予測したペプチド［Ｆ２４（配列番号３０）、Ｆ２５（配列番号３１）、Ｆ２７（配列番号３３）、Ｆ２８（配列番号３４）、Ｆ２９（配列番号３５）、およびＦ３０（配列番号３６）として同定されたペプチド］の群では、Ｆ２８（配列番号３４）、Ｆ２９（配列番号３５）、およびＦ３０（配列番号３６）として同定されたペプチドも若干のＩＬ−１０阻害活性を示すということ
が認められる。
【００９８】
実施例４
混合リンパ球応答（ＭＬＲ）を阻害するためのアッセイにおける、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチドによる、Ｋａｒｐａｓ調節性Ｔ細胞の生物活性のin vitro阻害
ＩＬ−１０産生調節性Ｔ細胞プロファイルを有する、ヒトリンパ腫由来のＫａｒｐａｓ  ２９９細胞株（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ３１）の存在については、文献において最近記載された。これらの細胞を用いて、「混合リンパ球反応」またはＭＬＲを行った。この技術は、互いに異物として認識するであろう、異なる組織適合性を有する、異なる起源のリンパ球の共培養によるＩＦＮ−γ産生に基づく。この反応によりリンパ球が増殖することとなり、ＩＦＮ−γなどのサイトカインを分泌する。このアッセイにおいては、１００，０００個の各ドナー（ＭＬＲ陽性対照）細胞を単独でまたは漸増量のＫａｒｐａｓ  ２９９細胞（０〜１００，０００個のＫａｒｐａｓ  ２９９）とともに９６−ウェルプレートで培養した。ペプチドの活性を測定するために、１ウェル当たり１００μｇ／ｍＬの各ペプチドを加えた。４８時間後に、上清のアリコートを取り出して、ＩＦＮ−γを測定した。この場合、Ｋａｒｐａｓ  ２９９細胞株の存在がＭＬＲ増殖において起こり得る効果をマスクするという事実から、細胞増殖を測定することはできなかった。ＩＦＮ−γ測定の結果を図５に示す。
【００９９】
このアッセイでは、ペプチドＰ１（配列番号１）、Ｐ１３（配列番号８）、Ｐ１５（配列番号１０）、Ｐ１９（配列番号１３）、Ｐ２０（配列番号１４）、Ｆ２４（配列番号３０）、Ｆ２５（配列番号３１）、Ｆ２８（配列番号３４）、およびＦ２９（配列番号３５）がＩＬ−１０活性の阻害剤として際立っていた。
【０１００】
実施例５
in vitroリンパ球再刺激後に上清で産生されるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を定量することによる、Ｔｈ０決定基による免疫処置後のin vitro Ｔｈ１応答誘導に対する、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチド［Ｐ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）］の効果
ペプチド（抗原）による免疫系の応答誘導により、配列の特徴に応じて特異的なサイトカインプロファイルがもたらされる。ヘルパー決定基ペプチドは、Ｔｈ１プロファイル（細胞傷害応答）またはＴｈ２（体液性応答）からもたらされるＴｈ０応答を誘導し、各々、その特異的なサイトカインプロファイルを特徴とする。最適なＴｈ２プロファイル（ＩＬ−４の存在によって定義される）は、Ｔｈ１プロファイルを阻害し、Ｔｈ２プロファイルに対する免疫応答を導くＩＬ−１０の存在によって支持されている。これに関連して、Ｔｈ０型応答誘導中のＩＬ−１０阻害剤での処置には、Ｔｈ１プロファイルサイトカイン誘導効果（ＩＦＮ−γ）があると思われる。
【０１０１】
この研究においては、Ｔｈ０決定基として、６個の最適化ペプチド、３個のオボアルブミン（ＯＶＡ）由来ペプチドと、３個のマッコウクジラのミオグロビン（ＭＩＯ）（ＦＩＳＥＡ）由来ペプチド（表４）とを選択した。
【０１０２】
【表４】
2010522551.tif 000006
【０１０３】
このアッセイを行うために用いるＩＬ−１０阻害ペプチドは、ペプチドＰ９（配列番号６）、不溶性、およびＰ１３（配列番号８）、可溶性であった。簡潔には、４〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２００μＬのフロイント不完全アジュバントと５０ナノモルの対応するＴｈ０決定基ペプチドを含有する水溶液の１：１エマルジョンにより皮下に免疫処置した。免疫処置の１０日後、これらの動物を犠牲にし、鼠径リンパ節、大動脈周囲リンパ節、および膝窩リンパ節、ならびに脾臓を摘出した。摘出したリンパ球を９６−ウェルＵ底プレートにおいて、最終量２００μｌの完全培地（ＭＣ、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５×ｌ０５Ｍ  ２β−メルカプトエタノール、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、および０．５％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム）中、免疫処置に用いるペプチドの３０ｍｇ／ｍｌの濃度での存在または非存在下、そしてＩＬ−１０阻害ペプチド［Ｐ９（５０ｍｇ／ｍｌ）およびＰ１３（１００ｍｇ／ｍｌ）］の存在または非存在下で４８時間培養した。３７℃で５％ＣＯ２での培養の４８時間後に、１ウェル当たり１００μＬの上清（ＩＦＮ−γ定量用の５０μＬ＋ＩＬ−１０定量用の５０μＬ）を採取した。ＥＬＩＳＡ技術によってサイトカインを測定するまで上清を−２０℃の温度で凍結させた。
【０１０４】
このアッセイにおいては、ペプチドＦＩＳＥＡ  Ｇ（配列番号３８）により免疫処置した動物のリンパ球は、このペプチドによるin vitroでの再刺激後、試験した残りのペプチドに対して最高のＩＦＮ−γレベルに達することが見出された（図６）。さらに、これらのＩＦＮ−γレベルは、ＩＬ−１０の阻害に適合する機構によって、ペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）の存在を明らかに増加させた（図６）。実際に、このペプチド［ＦＩＳＥＡ  Ｇ（配列番号３８）］は、上清において検出可能なＩＬ−１０レベル（７０ｐｇ／ｍＬ）を誘導した唯一のものであった。
【０１０５】
実施例６
ＣＴ２６細胞の皮下接種後の抗腫瘍応答誘導に対する、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチド［Ｐ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）］の効果
ＩＬ−１０は、腫瘍増殖に関して強力な免疫抑制効果を有するサイトカインである。ゆえに、ＩＬ−１０は、効果的な免疫応答を妨げる機構として多くの腫瘍により生成されるサイトカインである。
【０１０６】
この実施例では、ＣＴ２６細胞［マウス結腸腺癌細胞株(Fearon, E. R., Vogelstein, B. 1990. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61:759)］の皮下接種後の腫瘍増殖モデルにおいて、ペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）の効果を、樹状細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化、およびその後の抗腫瘍細胞傷害応答誘導のためのアジュバント：ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）および抗ＣＤ４０作動性抗体での腫瘍内免疫療法の存在または非存在下で試験した。
【０１０７】
このアッセイでは、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、５×１０５  ＣＴ２６腫瘍細胞を、２００μＬのＰＢＳとともに皮下接種することにより抗原投与し、４群に分けた：
（１）対照群：ＣＴ２６細胞を接種したマウス。
（２）アジュバント群：第０日目、第７日目、および第１４日目に１００μＬのＰＢＳにより腫瘍内経路によって５０μｇのｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃおよび５０μｇ  抗ＣＤ４０で処置したマウス。
（３）阻害剤群：ＩＬ−１０阻害剤だけ（ＰＢＳにより週に３回、３週間、各マウスに腫瘍内経路によって５０μｇのＰ９（配列番号６）、および腹膜内経路によって５０μｇのＰ１３（配列番号８））で処置したマウス。
（４）完全群：アジュバントと、ＩＬ−１０阻害剤とで処置したマウス。
腫瘍が５〜６ｍｍ径に達した時点を第「０」日とみなした。
【０１０８】
ＩＬ−１０阻害ペプチドでの処置により、動物の６．６％を防御することができ、腫瘍増殖のかなりの遅れをもたらすことができた（図７）。アジュバントは動物の５３％を防御し、平均腫瘍増殖を大幅に減少させた（図７）。アジュバントとＩＬ−１０阻害剤の組合せでは、アジュバント単独で処置した群に対して、平均腫瘍増殖が少し遅延し（図７）、腫瘍に対する防御率が７６．６％まで高まった。
【０１０９】
この実施例は、腫瘍成長においてこの因子が媒介する免疫抑制との関連でＩＬ−１０阻害ペプチドの適用性をはっきりと示す。
【０１１０】
実施例７
表面プラズモン共鳴分析によって決定する、ヒトＩＬ−１０と、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチド［Ｐ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）］ならびにその誘導体との生体分子間相互作用
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって、ヒトＩＬ−１０と、ペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）、ならびにＰ９の次の末端切断型および／または修飾型との生体分子相互作用を測定した：
【０１１１】
【表５】
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【０１１２】
表５に見られるように：
配列番号４５［Ｐ９（２−１５）］は、ペプチドＰ９（配列番号６）のアミノ酸配列２−１５を含んでなるペプチドであり、
配列番号４６［Ｐ９（１−１４）］は、ペプチドＰ９（配列番号６）のアミノ酸配列１−１４を含んでなるペプチドであり、
配列番号４７［Ｐ９（１−１３）］は、ペプチドＰ９（配列番号６）のアミノ酸配列１−１３を含んでなるペプチドであり、
配列番号４８［Ｐ９（２−１４）］は、ペプチドＰ９（配列番号６）のアミノ酸配列２−１４を含んでなるペプチドであり、
配列番号４９［Ｐ９（２−１３）］は、ペプチドＰ９（配列番号６）のアミノ酸配列２−１３を含んでなるペプチドであり、
配列番号５０［Ｐ９（３−１４）］は、ペプチドＰ９（配列番号６）のアミノ酸配列３−１４を含んでなるペプチドであり、
配列番号５１［Ｐ９（１５  Ａｌａ）］は、ペプチドＰ９（配列番号６）のアミノ酸配列を含んでなり、１５位に存在するアミノ酸（Ｐｈｅ）がＡｌａに置換されているペプチドであり、
配列番号５２［Ｐ９（１４  Ａｌａ）］は、ペプチドＰ９（配列番号６）のアミノ酸配列を含んでなり、１４位に存在するアミノ酸（Ｖａｌ）がＡｌａに置換されているペプチドであり、および
配列番号５３［（１−１３、１  Ｓｅｒ）］は、ペプチドＰ９（配列番号６）のアミノ酸配列１−１３を含んでなり、１３位に存在するアミノ酸（Ａｌａ）がＳｅｒに置換されているペプチドである。
【０１１３】
このアッセイを行うために、Biosensor BIAcore X (BIAcore, AB, Uppsala, Sweden)を用いた。簡潔には、De Crescenzo et al. 2001 (JBC, Vol 276 29632-29643)に記載のとおり、ヒト組換えタンパク質ＩＬ−１０(R & D Systems, カタログ番号217-IL/CF)を、ＣＭ５チップ(BIAcore)のフローセル２（ＦＣ２）の表面に共有結合で固定化した。参照フローセルとして、表面にＩＬ−１０が固定化されていないフローセル１（ＦＣ１）を用いた。ペプチド溶液（１０μＭ）を、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）により３０μｌ／分の流量で少なくとも２回注射した。ＦＣ２において得られた応答からＦＣ１における応答を差し引くことによって結合曲線を加工した。試験ペプチドと同じ長さの無関係の対照ペプチドとで平衡状態での応答を比較した。用いた対照ペプチドは、ペプチドＰ３０１（配列番号５４）（ＨＩＶ−１外膜由来、ｇｐ１２０（３０１−３１５）：ＮＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲ）であった。各応答に質量補正係数を乗じた：ＭＷ（ＰＸ）／ＭＷ（Ｐ）（式中、ＭＷ（ＰＸ）は試験ペプチドＰの分子量であり、ＭＷ（Ｐ）は対照ペプチド（Ｐ３０１）の分子量である）。試験した異なるペプチドが陽性シグナルを示すことが認められた。これはそれらのペプチドのＩＬ−１０と特異的に結合する能力をはっきりと示す。
【０１１４】
図８は、ＳＰＲ分析によって得た、ＩＬ−１０とペプチドＰ９（配列番号６）との間で起こる生体分子相互作用プロファイルの例を、対照ペプチド［Ｐ３０１（配列番号５４）］に関して得たプロファイルとともに示す。
【０１１５】
図９は、ＳＰＲ分析によって測定した、ＩＬ−１０と、ペプチドＰ９（配列番号６）、Ｐ１３（配列番号８）ならびにそれらの末端切断型および／または修飾型：Ｐ９（２−１５）（配列番号４５）、Ｐ９（１−１４）（配列番号４６）、Ｐ９（１−１３）（配列番号４７）、Ｐ９（２−１４）（配列番号４８）、Ｐ９（２−１３）（配列番号４９）、Ｐ９（３−１４）（配列番号５０）、Ｐ９（１５  Ａｌａ）（配列番号５１）、Ｐ９（１４  Ａｌａ）（配列番号５２）、Ｐ９（１−１３、１  Ｓｅｒ）（配列番号５３）との間で起こる生体分子相互作用から得た結果を示す。
【０１１６】
概して、ＩＬ−１０とアッセイしたペプチドとの間には良好な相互作用が見られた。Ｐ９（配列番号６）由来のペプチドの分析では、カルボキシル末端におけるアミノ酸の修飾は、ＩＬ−１０と結合するそれらの能力に影響しないが、アミノ末端またはカルボキシル末端において末端切断されたペプチドの場合には、ＩＬ−１０と結合する該ペプチドの能力の改善が見られるということが認められた。
【０１１７】
実施例８
ＩＬ−１０とその膜受容体との結合によって誘導される転写因子ＳＴＡＴ３リン酸化に対する、ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）の阻害効果
ＩＬ−１０の活性は、特異的な膜受容体、ＩＬ−１０Ｒとの結合によって媒介され、このＩＬ−１０Ｒは多様な免疫細胞において発現される。ＩＬ−１０／ＩＬ−１０Ｒ相互作用は、転写因子ＳＴＡＴ３(Signal Tranducer and Activator of Transcription 3)をリン酸化し、活性化する二つのキナーゼ（Ｊａｋ１およびＴｙｋ２）を誘引し、捕捉する。転写因子ＳＴＡＴ３は、細胞質において不活性型で見られ、ＩＬ−１０についての公知の機能総てに不可欠である(Donnelly et al., Journal of Interferon & Cytokine, Research. June 1, 1999, 19(6): 563-573)。
【０１１８】
ＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）の、ＩＬ−１０によって誘導されるＳＴＡＴ３リン酸化を阻害する能力を試験した。このアッセイは、ヒトＩＬ−１０およびネズミＩＬ−１０の両方に対応するＭＣ／９細胞(CRL-8306, American Type Cell Culture(ATCC), Virginia, United States)を用いて行った。９６−ウェルＵ底プレート(TPP, 92097)において、ＭＣ／９細胞と接触させる前に、ペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）を、１００μｌ量の完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５×１０５Ｍ  β−メルカプトエタノール、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、および０．５％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム）中、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、０．１５ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１０とともに３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。
【０１１９】
次いで、２×１０５細胞／ウェルを加え、最終量２００μｌ／ウェルにおいて、３７℃および５％ＣＯ２でさらに２時間インキュベートした。細胞を１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した後、そのペレットを１５０ｍｌの電気泳動用ローディングバッファー（１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール、２％ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ６２．５ｍＭ［ｐＨ６．８］、０．００６％ブロモフェノールブルー）に再懸濁し、サンプルを−８０℃で凍結させた。アッセイした異なる条件（陰性対照（細胞のみ）および陽性対照（細胞＋ＩＬ−１０）を含む）でのリン酸化ＳＴＡＴ−３量を測定するために、これらのサンプルからウエスタンブロットを行った。解析対照として、各サンプル中のアクチン量も測定した。ウエスタンブロットで得たバンドをデンシトメーターにより分析して、それらの各々の含量を定量した。各サンプルについて得たデンシトメーター測定値を対応するアクチン対照により補正した。
【０１２０】
図１０は、ＩＬ−１０によって誘導されるＳＴＡＴ３リン酸化に対するペプチドＰ９（配列番号６）およびＰ１３（配列番号８）の阻害効果を示す。リン酸化ＳＴＡＴ３の発現をウエスタンブロットにより解析した（図１０Ａ）。図１０Ｂは、各サンプルについて、濃度測定によって定量した、リン酸化ＳＴＡＴ３バンドの含量と、アクチン対照で得た含量との比率を示す。
【０１２１】
実施例９
Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を用いた増殖アッセイにおけるＩＬ−１０阻害ペプチドの効果
ＩＬ−１０免疫抑制効果は腫瘍増殖に関連しており、かかるＩＬ−１０は、効果的な免疫応答を回避するために多くの腫瘍により生成されるサイトカインであった。実際に、ある特定の腫瘍細胞は、悪性細胞増殖に不可欠であるＩＬ−１０を構成的に分泌し、腫瘍細胞の中和により腫瘍細胞の増殖が減少することは証明されている。これは、Ｂ１６−Ｆ１０（Ｂ１６）ネズミ黒色腫腫瘍株の例であり、この腫瘍株はかなりの量のＩＬ−１０を分泌し、その増殖はＩＬ−１０中和抗体の存在下で阻害される。
【０１２２】
このアッセイでは、このサイトカインを増殖に必要とするＢ１６細胞の増殖におけるＩＬ−１０阻害ペプチドの活性を試験した。このアッセイを行うために、２％ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ培地中、１ウェル当たり５，０００細胞を、９６−ウェルプレート（組織培養プレート、９６ウェル、平底、蓋付、滅菌、CELLSTAR N°655180）において、ペプチド：Ｐ９（配列番号６）、Ｐ１３（配列番号８）、Ｐ１５（配列番号１０）、Ｐ１６（配列番号１１）、Ｐ３１（配列番号２２）およびＰ３４（配列番号２５）の存在または非存在下で培養し、ペプチドＰ３０１（配列番号５４）を陰性対照として用いた。アッセイしたペプチド濃度は２００μｇ／ｍｌであった。こうして細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。この時間の経過後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、その染料を、１０％酢酸で洗浄することによって定量し、ＥＬＩＳＡリーダーにより５７０ｎｍで測定した。総てのペプチドを２００μｇ／ｍｌの濃度で試験した。得られた結果は、図１１に示しており、三連で行ったアッセイの平均と偏差である。
【０１２３】
実施例１０
末梢血単核細胞培養物におけるＩＦＮ−α産生における、Ｃ型肝炎ウイルスヌクレオキャプシド（ＨＣＶコア）タンパク質の阻害活性に対するペプチドＰ１３（配列番号８）の効果
形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）によるＩＦＮ−α産生は、抗ウイルス免疫応答において極めて重要である。慢性化傾向が高いＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の場合、この応答を回避するための機構の一つは、受容体ＴＬＲ２（Ｔｏｌｌ様受容体２）を通じてのＨＣＶコアタンパク質との単球の結合後に単球の活性化によって媒介され、そしてそれはＩＬ−１０などのサイトカインの産生を刺激し、それが次にはｐＤＣによるＩＦＮ−α産生を阻害する(Dolganiuc et al., The Journal of Immunology, 2006, 177:6758-6768)。ＴＬＲ９リガンドによる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激が、ｐＤＣによるＩＦＮ−α産生を誘導し、ＨＣＶコアの存在がＩＦＮ−α産生を阻害する。この阻害は、単球によるＩＬ−１０産生によって少なくとも部分的に媒介されるため、この系における、本発明により提供されるＩＬ−１０と結合する能力を有するペプチドの効果を試験することを決めた。そのために、異なる健康なドナーから血液サンプルを得、それらのサンプルからフィコール勾配によってＰＢＭＣを単離した(GE Healthcare, 17-1440-03)。９６−ウェルＵ底プレート(TPP, 92097)において、１ウェル当たり２×１０５細胞を加え、細胞を、１０％ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ培地で、５μｇ／ｍｌの濃度のＴＬＲ９リガンドＣｐＧ(Genosys, ODN2216)、２．５μｇ／ｍｌの濃度の組換えＨＣＶコア(BioDesign, R8A115)およびペプチドＰ１３（配列番号８）とともにインキュベートした。１μｇ／ｍｌの濃度の抗ＩＬ−１０抗体(eBioscience, 16-7108-81)を陽性対照として用いた。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。この時間の経過後、各ウェルから上清を採取し、ＥＬＩＳＡ技術によって、市販のキット(MabTech, 3424-1H-6)を用いてＩＦＮ−α産生を測定した。
【０１２４】
図１２は、すでに述べたように、ウイルスＣｐＧにより、ＨＣＶコアの存在下で刺激したＰＢＭＣ培養物におけるＩＦＮ−α産生に対するペプチドＰ１３（配列番号８）の効果を棒グラフで示している。示した結果は、同様の結果が生じた４試験の代表的なものである。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２】
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【図４Ａ】
2010522551.tif 000016
【図４Ｂ】
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【図６】
2010522551.tif 000018
【図８】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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