(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液流体サンプル内の第１細胞種の量を測定するための方法であって、前記サンプルは第２細胞種を含み、前記方法は、
第１の体積の前記サンプル内の前記第２細胞種の個体数を、前記第１の体積を血液細胞計数器に流すことにより決定することと、
厚さ及び前記厚さよりも大きな幅を有するサンプルストリームをもたらすために、フローセル内の流れるシース液内に、第２の体積の前記サンプルを注入することにより、第１の数の前記第１細胞種、及び第２の数の前記第２細胞種の画像を得ることであって、前記得られた画像は、前記サンプルストリームの前記厚さを横断する画像経路に沿って得られる、ことと、
前記得られた画像を使用して、前記第１の数の前記第１細胞種の、前記第２の数の前記第２細胞種に対する比を決定することと、
前記比及び前記第２細胞種の前記個体数を使用して、前記サンプル内の前記第１細胞種の細胞量値を計算することと、
を含み、
前記血液細胞計数器は、前記第１細胞種の計数に関連付けられる第１の精度、及び前記第２細胞種を計数することに関連付けられる第２の精度を有し、前記第２の精度は前記第１の精度よりも優れている、方法。
【請求項２】
前記細胞量値は、前記血液流体サンプル内の前記第１細胞種の細胞濃度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞量値は、前記血液流体サンプル内の前記第１細胞種の細胞計数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記血液細胞計数器は所望の精度範囲を有し、前記所望の精度範囲は、前記第１の体積内の細胞の最小個体数から前記第１の体積内の細胞の最大個体数にわたり、前記体積内の前記第２細胞種の前記決定される個体数は前記所望の精度範囲内にあり、前記サンプルの前記第１細胞種の前記計算された細胞量値は前記所望の精度範囲外にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血液細胞計数器に前記第１の体積を流した結果として、前記第１の体積の前記サンプル内の前記第１細胞種の個体数を決定することを更に含み、前記第１の体積内の前記第１細胞種の前記決定される個体数は、前記第１細胞種の所望の精度範囲を上回るか、又は下回り、前記第１細胞種の前記計算された細胞量値とは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１細胞種の前記決定された個体数はゼロである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１細胞種の前記決定された個体数はゼロより大きい、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記血液細胞計数器は、第２の種類の細胞が前記細胞計数器を通って流れることに応じた電気インピーダンスの変化を検出するセンサ機構を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血液細胞計数器は、第２の種類の細胞が前記細胞計数器を通って流れることに応じた光経路の遮断を検出するセンサ機構を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液細胞計数器は、前記第１細胞種のための検出可能濃度下限及び検出可能濃度上限、並びに前記第２細胞種のための検出可能濃度下限及び検出可能濃度上限を有し、
前記第２細胞種の前記決定された個体数は、前記第２細胞種のための前記下限よりも高く、かつ前記上限よりも低い、前記第２細胞種について検出された濃度パラメータに基づき、
前記第１細胞種は、前記第１細胞種のための前記下限よりも低いか、又は前記上限よりも高い濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液細胞計数器は、前記第１細胞種のための検出可能体積下限及び検出可能体積上限、並びに前記第２細胞種のための検出可能体積下限及び検出可能体積上限を有し、
前記第２細胞種の前記決定された個体数は、前記第２細胞種のための前記下限よりも高く、かつ前記上限よりも低い、前記第２細胞種について検出された体積パラメータに基づき、
前記第１細胞種は、前記第１細胞種のための前記下限よりも低いか、又は前記上限よりも高い体積パラメータで存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液細胞計数器は、前記第１細胞種のための検出可能サイズ下限及び検出可能サイズ上限、並びに前記第２細胞種のための検出可能サイズ下限及び最大検出可能体積サイズを有し、
前記第２細胞種の前記決定された個体数は、前記第２細胞種のための前記下限よりも高く、かつ前記上限よりも低い、前記第２細胞種について検出されたサイズパラメータに基づき、
前記第１細胞種は、前記第１細胞種のための前記下限よりも低いか、又は前記上限よりも高いサイズパラメータで存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の体積の前記サンプル内の前記第２細胞種の前記個体数の前記決定は、前記第１細胞種の細胞、及び前記第２細胞種の細胞を共にグループ化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記比及び前記第２細胞種の前記個体数を用いて前記サンプル内の前記第２細胞種の細胞量値を計算することを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の体積の前記サンプル内の前記第２細胞種の前記個体数の前記決定は、前記第１細胞種の細胞、及び前記第２細胞種の細胞を共にグループ化することを含み、前記方法は更に、前記血液細胞計数器に前記第１の体積を流した結果として、前記サンプルの前記第１の体積内における前記第１細胞種の個体数を決定することを含み、前記サンプル内の前記第１細胞種の前記細胞量値の前記計算は、前記比、前記第２細胞種の前記個体数、及び前記第１細胞種の前記個体数を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記血液細胞計数器は、撮像装置を備えておらず、かつ、前記第１の体積の前記サンプルを撮像しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
血液流体サンプル内の第１細胞種の量を測定するためのシステムであって、前記サンプルは第２細胞種を含み、前記システムは、
チャネル及び出力を有する血液細胞計数器であって、前記出力は、前記チャネルを通じて流れる第１の体積の前記サンプル内の、前記第２細胞種の個体数を示す信号を生成するために、前記チャネルに動作可能に結合される、血液細胞計数器と、
サンプルストリームのフローを促進するように構成されたフローセルであって、前記サンプルストリームは、第２の体積の前記サンプル、及びシース液を含み、厚さ及び前記厚さよりも大きな幅を有する、フローセルと、
第１の数の前記第１細胞種、及び第２の数の前記第２細胞種の画像を得るように構成された撮像装置であって、前記得られた画像は、前記サンプルストリームの前記厚さを横断する画像経路に沿って得られる、撮像装置と、
前記得られた画像を使用して、前記第１の数の前記第１細胞種の、前記第２の数の前記第２細胞種に対する比を決定するプロセッサであって、前記プロセッサは、前記比及び前記第２細胞種の個体数を示す前記信号を使用して、前記サンプル内の前記第１細胞種の細胞量値を計算する、プロセッサと、
を備え、
前記血液細胞計数器は、前記第１細胞種の計数に関連付けられる第１の精度、及び前記第２細胞種を計数することに関連付けられる第２の精度を有し、前記第２の精度は前記第１の精度よりも優れている、システム。
【請求項１８】
前記プロセッサは、前記第２細胞種の前記個体数を示す信号を受信するために、前記血液細胞計数器に結合される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記プロセッサは、前記得られた画像を受信するために前記撮像装置と結合される、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２０】
前記フローセル及び前記撮像装置は、前記血液流体サンプル中の細胞を撮像するために、粘度及び形状の組み合わせによるハイドロフォーカシングを行う、血液分析器の構成要素である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２１】
前記シース液と前記血液流体サンプルとの間の粘度差は、前記フローセルの流路サイズの縮小と相まって、前記フローセルの画像キャプチャサイトにおいて、前記サンプルストリームをハイドロフォーカスするために有効である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２２】
前記血液細胞計数器は、前記撮像装置を備えていない、請求項１７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は非仮出願であり、２０１３年３月１５日に出願された、米国特許仮出願番号第６１／７９９，１５２号（その内容は本明細書において参照により組み込まれている）に対する優先権の利益を請求するものである。本出願はまた、全て２０１４年３月１７日に出願された、米国特許出願番号第１４／２１５，８３４号、同第１４／２１６，５３３号、同第１４／２１６，３３９号、同第１４／２１６，８１１号、及び同第１４／２１７，０３４号、並びに国際特許出願番号第（ａｕｔｏｆｏｃｕｓ，ｆｌｏｗｃｅｌｌ，ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｕｉｄ，ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ，ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）にも関する。これらの出願のそれぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、サンプル内の血球などの粒子を区別及び計量化するために、完全に、又は一部自動化した装置を使用し、流体サンプル内の粒子の撮像を含む、粒子分析のための、装置、システム、組成物、及び方法の分野に関する。本開示はまた、被験体からのサンプル内の粒子を分析するために有用な、粒子及び／又は細胞内小器官整位液（ＰＩＯＡＬ）、この液体を生成するための方法、及びこの液体を使用して粒子を検出及び分析する方法に関する。画像に基づく生物学的な流体サンプルの分析のために有用な、組成物、システム、装置、及び方法もまた開示される。本開示の組成物、システム、装置、及び方法はまた、赤血球、網状赤血球、有核赤血球、血小板などの、生物学的流体内の粒子を検出し、数え、かつ特徴付けるため、並びに、画像及び形態学に基づく白血球弁別計数、分類、細分類、特徴付け、及び／又は分析のためにも有用である。
【背景技術】
【０００３】
血球分析は、患者の健康状態の概況を把握するための、最も一般的に行われる医療検査の１つである。血液のサンプルが患者の身体から抜かれ、凝固しないように抗凝固物質を含む試験管に保存されることがある。全血サンプルは通常、赤血球（エリスロサイト）、白血球（リューコサイト）、及び血小板（スロンボサイト）を含む、３つの主要な血球のクラスを含む。各クラスは、要素のサブクラスへと更に細分類することができる。例えば、白血球（ＷＢＣ）の５つの主な種類、又はサブクラスは、異なる形状及び機能を有する。白血球は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球を含み得る。赤血球の種類のサブクラスも存在する。サンプル内の粒子の外観は、病理学的状態、細胞成熟度、及び他の要因によって異なる場合がある。赤血球のサブクラスは、網状赤血球、及び有核赤血球を含み得る。
【０００４】
ＲＢＣ、ＷＢＣ、又は血小板の濃度を推定する血球計数は、手動により、又は自動分析器を使用して行うことができる。血球計数が手動で行われる場合、顕微鏡スライドに薄く塗末することにより、血液の液滴が適用される。典型的に、５種類の白血球の数又は相対量を決定するために、顕微鏡スライド上の、乾燥させ、染色した血液塗抹標本が使用されてきた。細胞又は細胞構造を染色するために、組織染料、及び染色剤が使用されてきた。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ染色剤は組織染色剤であり、光学顕微鏡で検査するため、血液塗抹標本を染色するのに使用されてきた。完全血球計数（ＣＢＣ）は、自動分析器を使用して求めることができ、ある種類のものは、粒子又は細胞が小さな管に沿った感知領域を通過する際の、インピーダンス又は動的光散乱に基づいて、血液サンプル内の異なる粒子又は細胞の数を計数する。自動ＣＢＣは、別個に計数することができる、ＲＢＣ、ＷＢＣ、及び血小板（ＰＬＴ）を含む、異なる種類細胞を識別するための、器具又は方法を利用し得る。例えば、大きな細胞のみを計数するために、最小粒径又は体積を必要とする計数技術が使用され得る。血液中の異常細胞など、ある種の細胞は、正確に計数又は識別されないことがある。互いに接着する小さな細胞が大きい細胞として誤って計数される場合がある。計数の誤りが疑われる場合、細胞を確認及び識別するために、器具の結果を手動で点検することが必要とされることがある。
【０００５】
自動血球計数技術は、フローサイトメトリーを伴う場合がある。フローサイトメトリーは、狭い流路をもたらすこと、並びに個別の血球の通過を感知及び計数することを含む。フローサイトメトリー法は、血液サンプル内の細胞など、流体内に懸濁した粒子を検出し、かつ粒子の種類、寸法、及び体積分布を分析して、血液サンプル内の各粒子種類の濃度、又は粒子体積を推定するために使用されてきた。流体内に懸濁された粒子を分析する好適な方法の例としては、沈殿、微視的特徴付け、インピーダンスに基づく計数、及び動的光散乱などが挙げられる。これらのツールは、試験誤差を生じ得る。一方で、粒子の種類及び濃度の正確な特徴付けは、医療診断などの用途において重要であり得る。
【０００６】
撮像に基づく計数技術において、観察領域を通過し得る調製されたサンプルのピクセルデータ画像が、デジタルカメラに接続された顕微鏡対物レンズを使用してキャプチャされる。ピクセル画像データが、データ処理技術を使用して分析され、またモニターに表示され得る。
【０００７】
フローセルを備える、自動診断システムの態様が、米国特許番号第６，８２５，９２６号（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、及び米国特許番号第６，１８４，９７８号、同第６，４２４，４１５、及び同第６，５９０，６４６号（全てＫａｓｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．）に開示され、これらは本明細書において完全に説明されたものとして参照により組み込まれている。
【０００８】
完全血球計数（ＣＢＣ）、合計白血球数（ＷＢＣ）、赤血球の合計細胞体積（ＲＢＣ分布）、ヘモグロビンＨＧＢ（血液中のヘモグロビンの量）、平均細胞体積（ＭＣＶ）（赤血球の平均体積）、ＭＰＶ（平均ＰＬＴ体積）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、ＭＣＨ（ＨＧＢ／ＲＢＣ）（赤血球当たりのヘモグロビンの平均量）、及びＭＣＨＣ（ＨＧＢ／ＨＣＴ）（細胞中のヘモグロビンの平均濃度）を求めるために、動的光散乱又はインピーダンスを使用した自動システムが使用されてきた。白血球５部弁別計数、及び血液サンプル分析を促進するために、自動、又は一部自動プロセスが使用されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，８２５，９２６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８４，９７８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４２４，４１５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５９０，６４６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような、現在既知の粒子分析システム及び方法、並びに関連する医療診断技術は、医師、臨床医、及び患者に利益をもたらし得るが、更なる改善が望ましい。本発明の実施形態は、これらの際立った要求の少なくとも一部に対する解決法をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態は、例示的な動的又は検出範囲拡張技術を使用して、血液流体サンプル内に存在する、細胞又は粒子を数量化するためのシステム及び方法を包含する。
【００１２】
例えば、例示的な実施形態は、粒子体積などのパラメータに基づく、少なくとも１つの検出範囲と関連する、不正確な粒子計数を補正するための技術を包含する。本開示において記載される装置を操作することにより、濃度及び／又は体積における検出範囲外の粒子を正確に検出及び測定することができる。
【００１３】
本明細書において使用するとき、本開示において作製される粒子計数器と関連する用語「検出限界」又は「検出範囲外」は、その内部においては粒子計数がより正確であり、及び／又はその外部においては粒子計数がより正確でないか、若しくは更に計数不可能であるような、範囲を包含するものと理解される。検出範囲は、検出の上限及び／又は下限を含むことがあり、典型的には最大濃度又は最小濃度と表現されるが、また場合によっては粒子が所与の正確性公差の範囲内で計数される最大又は最小頻度として表現される。したがって、本発明の実施形態は、低密度の、及び／又は多量の化学種の計数を定量化するための、並列なフローセル及びインピーダンス分析のための、システム及び方法を包含する。
【００１４】
検出範囲は、密度に基づく場合があり、これは局所的な濃度、及び／又は他の特定の基準を含み得る。例えば、通常のＰＬＴよりも小さい血球又は断片などの粒子（すなわち、２μｍよりも小さい直径を有する）は、粒子計数器において正確に検出及び計数するのが困難な場合がある。一般的な白血球よりも大きな異常細胞（すなわち、１５μｍより大きな直径を有する）は、粒子計数器において正確に検出及び計数するのが困難であり得る。加えて、高濃度のＲＢＣ及びＰＬＴは、正確に計数するのが困難であり得る。希釈後であっても、ＲＢＣ及びＰＬＴは凝集して集塊を形成し、粒子計数器を使用して誤った粒子計数の読み取り値が得られる場合がある。更に、低濃度でサンプルに存在する一定の未熟な、又は異常な血球の正確な計数をもたらすのは困難である。
【００１５】
例として、いくつかの実施形態において、本明細書において記載される装置を使用することにより、測定値の検出範囲、ＷＢＣの検出上限は、単位体積当たり、最大３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、又は１，０００，０００まで拡張することができる。いくつかの実施形態において、ＰＬＴの検出下限は、μｌ当たり、２０，０００、１９，０００、１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、１０，０００、９，５００、９，０００、８，５００、８，０００、７，５００、７，０００、６，５００、６，０００、５，５００、５，０００、４，５００、４，０００、３，５００、３，０００、２，５００、２，０００、１，５００、若しくは１，０００、又は５００未満まで拡張することができる。
【００１６】
これに関連して、例示的な実施形態は、１つのチャネル内で検出される、異なるクラス（各クラスの要素も含む）の粒子を区別することにより、粒子計数器において得られる不正確な結果を補正するための技術を包含する。本明細書において開示されるように、一部の粒子は、同様の体積又は形態を有し、１つのチャネルで検出され得る。例えば、「巨大」ＰＬＴ、ＰＬＴ凝集体、又は集塊、及び有核ＲＢＣは、ＷＢＣを検出するように設計された１つのチャネル内で「ＷＢＣ」として計数され得る。加えて、非溶解細胞、クリオグロブリン、ハインツ体、及びマラリア原虫が、「ＷＢＣ」として計数されて、実際にサンプル内に存在するものよりも高いＷＢＣ計数値を生じることがある。同様に、高濃度のＷＢＣ及び巨大ＰＬＴは、「ＲＢＣ」として計数されて、実際の値よりも高いＲＢＣ計数数を生じることがある。小赤血球細胞、赤血球内容物、白血球断片、塵埃粒子、溶血／破砕赤血球、及び更には電子／電気ノイズが、実際よりも高いＰＬＴ計数値を生じ得る。他方で、同じクラスの細胞の凝固及び破損、又はあるクラスの細胞と別のクラスとの混同が、粒子計数器の対応するクラスの不正確かつより低い計数値を生じることがある。
【００１７】
本開示の方法のいくつかの態様において、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子が、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子に適用可能な検出範囲を上回る濃度で、サンプル内に存在し、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子は、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子に適用可能な検出範囲内でサンプル内に存在する。本発明の方法の他の態様において、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子に適用可能な検出範囲を下回る濃度で、サンプル内に存在し、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子は、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子に適用可能な検出範囲内でサンプル内に存在する。他の態様において、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子は、少なくとも一種類以上の異常な血球、未熟な血球、集塊化した血球、１５マイクロメートル超の直径を有する血球、及び２マイクロメートル未満の直径を有する血球を含み、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子は白血球を含む。
【００１８】
本開示に記載されるように装置を操作することにより、粒子計数器の１つのチャネル内で、別の種類の粒子と間違えて数えられた粒子を、別個に、かつ正確に測定することができる。例示的な方法はまた、粒子計数器において正確に検出されなかった、粒子数又は粒子濃度を決定するために使用することができる。これらの粒子は、通常の体積の範囲外の粒子、及び／又は粒子計数器において検出可能な濃度の上限若しくは下限付近、又はこれを超える濃度で存在する粒子が挙げられるがこれらに限定されない。これに関連して、特に粒子計数器及び画像分析器を含む、記載されるシステム装置を、本開示において記載される、例示的な粒子造影剤組成物及びＰＩＯＡＬと相まって操作することにより、粒子計数器の１つのチャネル内において別の種類の粒子と数え間違えられることのある一部の粒子を、別個にかつ正確に測定することができる。本発明の方法はまた、いくつかの例において、粒子計数器において正確に検出することができない、粒子数又は粒子濃度を決定するために使用することができる。これらの粒子は、検出範囲外の粒子、及び／又は粒子計数器において検出可能な濃度の上限又は下限付近、又はこれを超える濃度で存在する粒子が挙げられるがこれらに限定されない。これは画像分析器から得られる情報を適用することによって得られる。
【００１９】
全体的に、例示的な粒子造影剤組成物、及びＰＩＯＡＬシース液を使用して、本明細書において開示される装置を操作することにより、血球又は他の断片などの粒子を含むサンプルの分析を、粒子計数器の通常の検出範囲外である、検出範囲において行うことができる。これに関連して、本明細書において開示されるシステム及び組成物を使用して、濃度又は粒子体積などのパラメータに基づく、拡張した検出範囲において、血液流体サンプルの分析を行うことができる。拡張した検出範囲は、粒子計数器の検出範囲外であり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、システム又は装置は粒子計数器を含み得る。他の実施形態において、この粒子計数器は、少なくとも１つの検出範囲を有する。いくつかの態様において、分析器及びプロセッサは、粒子計数器に関連付けられる試験エラーを補正するために追加的な情報をもたらし、更にサンプル内の異なるカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子の正確な粒子数又は濃度を決定するように構成することができる。粒子計数器及び分析器から、粒子のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの少なくとも２つの計数値、１つ以上の比、及び分布に関する情報が得られ場合、粒子計数器による計数値、分類、及び／又は細分類のエラーが補正され得、粒子計数器により最初に報告されなかった、計数値、カテゴリ、及び／又はサブカテゴリが得られる。
【００２１】
本発明の実施形態は、例示的な動的又は検出範囲拡張技術を使用して、血液流体サンプル内に存在する、細胞又は粒子を数量化するためのシステム及び方法を包含する。
【００２２】
例えば、例示的な実施形態は、粒子体積などのパラメータに基づく、少なくとも１つの検出範囲と関連する、不正確な粒子計数を補正するための技術を包含する。本開示において記載される装置を操作することにより、濃度及び／又は体積における検出範囲外の粒子を正確に検出及び測定することができる。
【００２３】
本明細書において使用するとき、本開示において作製される粒子計数器と関連する用語「検出限界」又は「検出範囲外」は、その内部においては粒子計数がより正確であり、及び／又はその外部においては粒子計数がより正確でないか、若しくは更に計数不可能であるような、範囲を包含するものと理解される。検出範囲は、検出の上限及び／又は下限を含むことがあり、典型的には最大濃度又は最小濃度と表現されるが、また場合によっては粒子が所与の正確性公差の範囲内で計数される最大又は最小頻度として表現される。したがって、本発明の実施形態は、低密度の、及び／又は多量の化学種の計数を定量化するための、並列なフローセル及びインピーダンス分析のための、システム及び方法を包含する。
【００２４】
検出範囲は、密度に基づく場合があり、これは局所的な濃度、及び／又は他の特定の基準を含み得る。例えば、通常のＰＬＴよりも小さい血球又は断片などの粒子（すなわち、２μｍよりも小さい直径を有する）は、粒子計数器において正確に検出及び計数するのが困難な場合がある。一般的な白血球よりも大きな異常細胞（すなわち、１５μｍより大きな直径を有する）は、粒子計数器において正確に検出及び計数するのが困難であり得る。加えて、高濃度のＲＢＣ及びＰＬＴは、正確に計数するのが困難であり得る。希釈後であっても、ＲＢＣ及びＰＬＴは凝集して集塊を形成し、粒子計数器を使用して誤った粒子計数の読み取り値が得られる場合がある。更に、低濃度でサンプルに存在する一定の未熟な、又は異常な血球の正確な計数をもたらすのは困難である。
【００２５】
例として、いくつかの実施形態において、本明細書において記載される装置を使用することにより、測定値の検出範囲、ＷＢＣの検出上限は、単位体積当たり、最大３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、又は１，０００，０００まで拡張することができる。いくつかの実施形態において、ＰＬＴの検出下限は、μｌ当たり、２０，０００、１９，０００、１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、１０，０００、９，５００、９，０００、８，５００、８，０００、７，５００、７，０００、６，５００、６，０００、５，５００、５，０００、４，５００、４，０００、３，５００、３，０００、２，５００、２，０００、１，５００、若しくは１，０００、又は５００未満まで拡張することができる。
【００２６】
これに関連して、例示的な実施形態は、１つのチャネル内で検出される、異なるクラス（各クラスの要素も含む）の粒子を区別することにより、粒子計数器において得られる不正確な結果を補正するための技術を包含する。本明細書において開示されるように、一部の粒子は、同様の体積又は形態を有し、１つのチャネルで検出され得る。例えば、「巨大」ＰＬＴ、ＰＬＴ凝集体、又は集塊、及び有核ＲＢＣは、ＷＢＣを検出するように設計された１つのチャネル内で「ＷＢＣ」として計数され得る。加えて、非溶解細胞、クリオグロブリン、ハインツ体、及びマラリア原虫が、「ＷＢＣ」として計数されて、実際にサンプル内に存在するものよりも高いＷＢＣ計数値を生じることがある。同様に、高濃度のＷＢＣ及び巨大ＰＬＴは、「ＲＢＣ」として計数されて、実際の値よりも高いＲＢＣ計数数を生じることがある。小赤血球細胞、赤血球内容物、白血球断片、塵埃粒子、溶血／破砕赤血球、及び更には電子／電気ノイズが、実際よりも高いＰＬＴ計数値を生じ得る。他方で、同じクラスの細胞の凝固及び破損、又はあるクラスの細胞と別のクラスとの混同が、粒子計数器の対応するクラスの不正確かつより低い計数値を生じることがある。
【００２７】
本開示の方法のいくつかの態様において、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子が、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子に適用可能な検出範囲を上回る濃度で、サンプル内に存在し、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子は、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子に適用可能な検出範囲内でサンプル内に存在する。本発明の方法の他の態様において、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子に適用可能な検出範囲を下回る濃度で、サンプル内に存在し、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子は、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子に適用可能な検出範囲内でサンプル内に存在する。他の態様において、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子は、少なくとも一種類以上の異常な血球、未熟な血球、集塊化した血球、１５マイクロメートル超の直径を有する血球、及び２マイクロメートル未満の直径を有する血球を含み、第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子は白血球を含む。
【００２８】
本開示に記載されるように装置を操作することにより、粒子計数器の１つのチャネル内で、別の種類の粒子と間違えて数えられた粒子を、別個に、かつ正確に測定することができる。例示的な方法はまた、粒子計数器において正確に検出されなかった、粒子数又は粒子濃度を決定するために使用することができる。これらの粒子は、通常の体積の範囲外の粒子、及び／又は粒子計数器において検出可能な濃度の上限若しくは下限付近、又はこれを超える濃度で存在する粒子が挙げられるがこれらに限定されない。これに関連して、特に粒子計数器及び画像分析器を含む、記載されるシステム装置を、本開示において記載される、例示的な粒子造影剤組成物及びＰＩＯＡＬと相まって操作することにより、粒子計数器の１つのチャネル内において別の種類の粒子と数え間違えられることのある一部の粒子を、別個にかつ正確に測定することができる。本発明の方法はまた、いくつかの例において、粒子計数器において正確に検出することができない、粒子数又は粒子濃度を決定するために使用することができる。これらの粒子は、検出範囲外の粒子、及び／又は粒子計数器において検出可能な濃度の上限又は下限付近、又はこれを超える濃度で存在する粒子が挙げられるがこれらに限定されない。これは画像分析器から得られる情報を適用することによって得られる。
【００２９】
全体的に、例示的な粒子造影剤組成物、及びＰＩＯＡＬシース液を使用して、本明細書において開示される装置を操作することにより、血球又は他の断片などの粒子を含むサンプルの分析を、粒子計数器の通常の検出範囲外である、検出範囲において行うことができる。これに関連して、本明細書において開示されるシステム及び組成物を使用して、濃度又は粒子体積などのパラメータに基づく、拡張した検出範囲において、血液流体サンプルの分析を行うことができる。拡張した検出範囲は、粒子計数器の検出範囲外であり得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、システム又は装置は粒子計数器を含み得る。他の実施形態において、この粒子計数器は、少なくとも１つの検出範囲を有する。いくつかの態様において、分析器及びプロセッサは、粒子計数器に関連付けられる試験エラーを補正するために追加的な情報をもたらし、更にサンプル内の異なるカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子の正確な粒子数又は濃度を決定するように構成することができる。粒子計数器及び分析器から、粒子のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの少なくとも２つの計数値、１つ以上の比、及び分布に関する情報が得られ場合、粒子計数器による計数値、分類、及び／又は細分類のエラーが補正され得、粒子計数器により最初に報告されなかった、計数値、カテゴリ、及び／又はサブカテゴリが得られる。
【００３１】
一態様において、本発明の実施形態は、血液流体サンプル内における、第１細胞種の量を測定するための方法を包含する。サンプルは第２細胞種を含み得る。例示的な方法は、第１体積のサンプル内の第２細胞種の個体数を、この第１体積を血液細胞計数器に流すことにより決定するステップと、厚さ及び厚さより大きな幅を有するサンプルストリームをもたらすために、フローセル内に流れるシース液に第２体積のサンプルを注入することにより、第１の数の第１細胞種、及び第２の数の第２細胞種の画像を得るステップであって、得られた画像は、サンプルストリームの厚さを横断する画像経路に沿って得られる、ステップと、得られた画像を使用して、第１の数の第１細胞種の、第２の数の第２細胞種に対する比を決定するステップと、この比及び第２細胞種の個体数を使用して、サンプル内の第１細胞種の細胞量値を計算するステップとを含む。いくつかの場合において、細胞量値は、血液流体サンプル内の第１細胞種の細胞濃度を含む。いくつかの場合において、細胞量値は、血液流体サンプル内の第１細胞種の細胞計数を含む。場合によっては、細胞計数器は、第１細胞種の計数に関連付けられる第１の精度、及び第２細胞種を計数することに関連付けられる第２の精度を有する。ここで、第２の精度は第１の精度よりも優れている。場合によっては、血液細胞計数器は所望の精度範囲を有し、所望の精度範囲は、第１の体積内の細胞の最小個体数から第１の体積内の細胞の最大個体数にわたる。ここで、体積内の第２細胞種の決定される個体数は所望の精度範囲内にあり、サンプルの第１細胞種の計算された細胞量値は所望の精度範囲外にある。いくつかの場合において、血液細胞計数器に第１の体積を流した結果として、第１体積のサンプル内の第１細胞種の個体数を決定するステップを含み、第１体積内の第１細胞種の決定される個体数は、第１細胞種の所望の精度範囲を上回るか、又は下回り、第１細胞種の計算された細胞量値とは異なる。いくつかの場合において、第１細胞種の決定される個体数はゼロである。場合によっては、第１細胞種の決定された個体数はゼロよりも大きい。いくつかの場合において、血液細胞計数器は、第２の種類の細胞が細胞計数器を通って流れることに応じた電気インピーダンスの変化を検出するセンサ機構を含む。いくつかの場合において、血液細胞計数器は、第２の種類の細胞が細胞計数器を通って流れるのに応じた光路の遮断を検出するセンサ機構を含む。いくつかの場合において、血液細胞計数器は、第１細胞種に関して検出可能濃度下限、及び検出可能濃度上限を、第２細胞種に関して検出可能濃度下限、及び検出可能濃度上限を有し、第２細胞種の決定される個体数は、第２細胞種の下限を上回り、かつ上限を下回る第２細胞種の検出される濃度パラメータに基づいており、第１細胞種は第１細胞種の下限を下回るか、又は上限を上回る濃度で存在する。いくつかの場合において、血液細胞計数器は、第１細胞種に関して検出可能体積下限、及び検出可能体積上限を、第２細胞種に関して検出可能体積下限、及び検出可能体積上限を有し、第２細胞種の決定される個体数は、第２細胞種の下限を上回り、かつ上限を下回る第２細胞種の検出される濃度パラメータに基づいており、第１細胞種は第１細胞種の下限を下回るか、又は上限を上回る体積パラメータで存在する。いくつかの場合において、血液細胞計数器は、第１細胞種に関して検出可能体積下限、及び検出可能体積上限を、かつ第２細胞種に関して検出可能サイズ下限、及び検出可能体積サイズ上限を有し、第２細胞種の決定される個体数は、第２細胞種の下限を上回り、かつ上限を下回る第２細胞種の検出されるサイズパラメータに基づいており、第１細胞種は第１細胞種の下限を下回るか、又は上限を上回るサイズパラメータで存在する。いくつかの場合において、第１体積のサンプル内の第２細胞種の個体数の決定は、第１細胞種の細胞、及び第２細胞種の細胞を共にグループ化することを含む。場合によっては、方法は、比及び第２細胞種の個体数を用いてサンプル内の第２細胞種の細胞量値を算出することを含む。いくつかの場合において、第１体積のサンプル内の第２細胞種の個体数の決定は、第１細胞種の細胞、及び第２細胞種の細胞をグループ化することを含み、方法は更に、血液細胞計数器に第１体積を流した結果として、サンプルの第１体積内における第１細胞種の個体数を決定することを更に含み、サンプル内の第１細胞種の細胞量値の計算は、比、第２細胞種の個体数、及び第１細胞種の個体数を使用する。
【００３２】
別の態様において、本発明の実施形態は、血液流体サンプル内における、第１細胞種の量を測定するためのシステムを包含する。サンプルは第２細胞種を含み得る。例示的なシステムは、チャネル及び放出部を有する血液細胞計数器であって、放出部はチャネルを流れる第１体積のサンプル内に存在する第２細胞種の個体数を示す信号を生成するために、チャネルと動作可能に結合されている、血液細胞計数器と、サンプルストリームの流れを促進するように構成されたフローセルであって、サンプルストリームは第２体積のサンプル、及びシース液を有し、厚さ及び厚さよりも大きな幅を有する、フローセルと、第１の数の第１の種類の細胞、及び第２の数の第２の種類の細胞の画像を得るように構成された撮像装置であって、得られた画像はサンプルストリームの厚さを横断する画像経路に沿って得られる、撮像装置と、プロセッサと、得られた画像を使用して、第１の数の第１細胞種と第２の数の第２細胞種の比を決定するために、プロセッサ上で実行される、機械可読個コードを組み込む有形媒体を有する画像分析モジュールと、比及び第２細胞種の個体数を示す信号を使用して、サンプル内の第１細胞種の細胞量値を計算するために、プロセッサで実行される、機械可読コードを組み込む有形媒体を含む細胞量モジュールとを含む。いくつかの場合において、プロセッサが、第２細胞種の個体数を示す信号を受信するために、血液細胞計数器に結合される。いくつかの場合において、プロセッサは、得られた画像を受信するために、撮像装置に結合される。いくつかの場合において、フローセル及び撮像装置は、血液流体サンプル中の細胞を撮像するために、粘度及び形状の組み合わせによるハイドロフォーカシングを行う、血液分析器の構成要素である。いくつかの場合において、シース液と血液流体サンプルとの間の粘度差と、フローセルの流路サイズの縮小と相まって、フローセルの画像キャプチャサイトにおいて、サンプルストリームをハイドロフォーカスするために有効である。
本明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
血液流体サンプル内の第１細胞種の量を測定するための方法であって、前記サンプルは第２細胞種を含み、前記方法は、
第１の体積の前記サンプル内の前記第２細胞種の個体数を、前記第１の体積を血液細胞計数器に流すことにより決定することと、
厚さ及び前記厚さよりも大きな幅を有するサンプルストリームをもたらすために、フローセル内の流れるシース液内に、第２の体積の前記サンプルを注入することにより、第１の数の前記第１細胞種、及び第２の数の前記第２細胞種の画像を得ることであって、前記得られた画像は、前記サンプルストリームの前記厚さを横断する画像経路に沿って得られる、ことと、
前記得られた画像を使用して、前記第１の数の第１細胞種の、前記第２の数の前記第２細胞種に対する比を決定することと、
前記比及び前記第２細胞種の前記個体数を使用して、前記サンプル内の前記第１細胞種の細胞量値を計算することと、
を含む、方法。
（項目２）
前記細胞量値は、前記血液流体サンプル内の前記第１細胞種の細胞濃度を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞量値は、前記血液流体サンプル内の前記第１細胞種の細胞計数を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記細胞計数器は、前記第１細胞種の計数に関連付けられる第１の精度、及び前記第２細胞種を計数することに関連付けられる第２の精度を有し、前記第２の精度は前記第１の精度よりも優れている、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記血液細胞計数器は所望の精度範囲を有し、前記所望の精度範囲は、前記第１の体積内の細胞の最小個体数から前記第１の体積内の細胞の最大個体数にわたり、前記体積内の前記第２細胞種の前記決定される個体数は前記所望の精度範囲内にあり、前記サンプルの前記第１細胞種の前記計算された細胞量値は前記所望の精度範囲外にある、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記血液細胞計数器に前記第１の体積を流した結果として、前記第１の体積の前記サンプル内の前記第１細胞種の個体数を決定することを更に含み、前記第１の体積内の前記第１細胞種の前記決定される個体数は、前記第１細胞種の所望の精度範囲を上回るか、又は下回り、前記第１細胞種の前記計算された細胞量値とは異なる、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記第１細胞種の前記決定された個体数はゼロである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記第１細胞種の前記決定された個体数はゼロより大きい、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記血液細胞計数器は、第２の種類の細胞が前記細胞計数器を通って流れることに応じた電気インピーダンスの変化を検出するセンサ機構を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記血液細胞計数器は、第２の種類の細胞が前記細胞計数器を通って流れることに応じた光経路の遮断を検出するセンサ機構を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記血液細胞計数器は、前記第１細胞種のための検出可能濃度下限及び検出可能濃度上限、並びに前記第２細胞種のための検出可能濃度下限及び検出可能濃度上限を有し、
前記第２細胞種の前記決定された個体数は、前記第２細胞種のための前記下限よりも高く、かつ前記上限よりも低い、前記第２細胞種について検出された濃度パラメータに基づき、
前記第１細胞種は、前記第１細胞種のための前記下限よりも低いか、又は前記上限よりも高い濃度で存在する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記血液細胞計数器は、前記第１細胞種のための検出可能体積下限及び検出可能体積上限、並びに前記第２細胞種のための検出可能体積下限及び検出可能体積上限を有し、
前記第２細胞種の前記決定された個体数は、前記第２細胞種のための前記下限よりも高く、かつ前記上限よりも低い、前記第２細胞種について検出された体積パラメータに基づき、
前記第１細胞種は、前記第１細胞種のための前記下限よりも低いか、又は前記上限よりも高い体積パラメータで存在する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記血液細胞計数器は、前記第１細胞種のための検出可能サイズ下限及び検出可能サイズ上限、並びに前記第２細胞種のための検出可能サイズ下限及び最大検出可能体積サイズを有し、
前記第２細胞種の前記決定された個体数は、前記第２細胞種のための前記下限よりも高く、かつ前記上限よりも低い、前記第２細胞種について検出されたサイズパラメータに基づき、
前記第１細胞種は、前記第１細胞種のための前記下限よりも低いか、又は前記上限よりも高いサイズパラメータで存在する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記第１の体積の前記サンプル内の前記第２細胞種の前記個体数の前記決定は、前記第１細胞種の細胞、及び前記第２細胞種の細胞を共にグループ化することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記比及び前記第２細胞種の前記個体数を用いて前記サンプル内の前記第２細胞種の細胞量値を計算することを更に含む、項目６に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の体積の前記サンプル内の前記第２細胞種の前記個体数の前記決定は、前記第１細胞種の細胞、及び前記第２細胞種の細胞をグループ化することを含み、前記方法は更に、血液細胞計数器に前記第１の体積を流した結果として、前記サンプルの前記第１の体積内における第１細胞種の個体数を決定することを更に含み、前記サンプル内の第１細胞種の前記細胞量値の前記計算は、前記比率、前記第２細胞種の前記個体数、及び前記第１細胞種の前記個体数を使用する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
血液流体サンプル内の第１細胞種の量を測定するためのシステムであって、前記サンプルは第２細胞種を含み、前記システムは、
チャネル及び出力を有する血液細胞計数器であって、前記出力は、前記チャネルを通じて流れる第１の体積の前記サンプル内の、前記第２細胞種の個体数を示す信号を生成するために、前記チャネルに動作可能に結合される、血液細胞計数器と、
サンプルストリームのフローを促進するように構成されたフローセルであって、前記サンプルストリームは、第２の体積の前記サンプル、及びシース液を含み、厚さ及び前記厚さよりも大きな幅を有する、フローセルと、
第１の数の前記第１細胞種、及び第２の数の前記第２細胞種の画像を得るように構成された撮像装置であって、前記得られた画像は、前記サンプルストリームの前記厚さを横断する画像経路に沿って得られる、撮像装置と、
前記得られた画像を使用して、前記第１の数の前記第１細胞種の、前記第２の数の前記第２細胞種に対する比を決定するプロセッサであって、前記プロセッサは、前記比及び前記第２細胞種の個体数を示す前記信号を使用して、前記サンプル内の前記第１細胞種の細胞量値を計算する、プロセッサと、
を備える、システム。
（項目１８）
前記プロセッサは、前記第２細胞種の前記個体数を示す信号を受信するために、前記血液細胞計数器に結合される、項目１７に記載のシステム。
（項目１９）
前記プロセッサは、前記得られた画像を受信するために前記撮像装置と結合される、項目１７に記載のシステム。
（項目２０）
前記フローセル及び前記撮像装置は、前記血液流体サンプル中の細胞を撮像するために、粘度及び形状の組み合わせによるハイドロフォーカシングを行う、血液分析器の構成要素である、項目１７に記載のシステム。
（項目２１）
前記シース液と前記血液流体サンプルとの間の粘度差は、前記フローセルの流路サイズの縮小と相まって、前記フローセルの画像キャプチャサイトにおいて、前記サンプルストリームをハイドロフォーカスするために有効である、項目１７に記載のシステム。
【００３３】
上記したもの及び本発明の実施形態の多くの他の特徴及び付随する利点は、下記の実施形態への参照により、付随の図と共に考慮されると、明らかとなりより理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】デジタル画像処理を使用したサンプル画像分析のための、例示的なフローセル、自動オートフォーカスシステム、及び高光学解像度撮像デバイスの、動作態様を示す、一部断面図であり、縮尺通りではない、概略図である。
【図３Ａ】本発明の実施形態に係る、フローセルの追加的な断面図をもたらす。
【図３Ｂ】本発明の実施形態に係る、フローセルの追加的な断面図をもたらす。
【図２】例示的な実施形態に係る、フローセルの斜視図である。
【図３】図２に示されるフローセルの直線３−３に沿った、長手方向中央断面図である。
【図３Ａ】本発明の実施形態に係る、フローセルの追加的な断面図をもたらす。
【図３Ｂ】本発明の実施形態に係る、フローセルの追加的な断面図をもたらす。
【図４】本発明の実施形態に係る、撮像システムの態様を例示する。
【図４Ａ】本発明の実施形態に係る、フローセルの態様を示す。
【図４Ｂ】本発明の実施形態に係る、フローセルの態様を示す。
【図４Ａ−１】本発明の実施形態に係る、それぞれカニューレ出口ポート、及び画像キャプチャサイトにおける、フローセル内のシース液（例えば、ＰＩＯＡＬ）外被、及びサンプル流体流寸法の断面図を示す。
【図４Ａ−２】本発明の実施形態に係る、それぞれカニューレ出口ポート、及び画像キャプチャサイトにおける、フローセル内のシース液（例えば、ＰＩＯＡＬ）外被、及びサンプル流体流寸法の断面図を示す。
【図４Ｋ】本発明の実施形態に係る、フローセルの画像キャプチャサイトを流れるサンプルストリームを示す。
【図４Ｌ】本発明の実施形態に係る、フローセルの画像キャプチャサイトを流れるサンプルストリームを示す。
【図４Ｍ】葉などの内部小器官を有する例示的な好中球（白血球の一種）を示す。
【図４Ｎ】葉などの内部小器官を有する例示的な好中球（白血球の一種）を示す。
【図４Ｏ】本発明の実施形態に係る、ＰＩＯＡＬシース液を使用して得られる画像と、非ＰＩＯＡＬを使用して得られる画像の比較を示す。
【図４Ｐ】本発明の実施形態に係る、標準的なシース液及び例示的なＰＩＯＡＬ液を使用して得られる画像の比較を示す。
【図４Ｑ】本発明の実施形態に係る、標準的なシース液及び例示的なＰＩＯＡＬ液を使用して得られる画像の比較を示す。
【図５】本発明の実施形態に係る、血液サンプル内の粒子分析のための動的又は検出範囲拡大を達成するためのシステム及び方法の追加の態様を示すブロック図である。
【図６】本発明の実施形態に係る、サンプルを分析するための例示的な装置を示す。
【図６Ａ】本発明の実施形態に係る、例示的な計数器又は計数モジュールの態様を示す。
【図６Ｂ】本発明の実施形態に係る、モジュールシステムの態様を示す。
【図７】本発明の実施形態に係る、血液流体サンプル中の第１細胞種の量を測定するためのシステム及び方法の態様を示す。
【図８】本発明の実施形態に係る、粒子を含むサンプルを分析するための方法を示す。
【図９】本発明の実施形態に係る、粒子の２つのサブカテゴリの濃度を決定する例示的な方法を例示する。
【図１０Ａ】本発明の実施形態に係る、粒子のカテゴリの検出を示す。
【図１０Ｂ】本発明の実施形態に係る、粒子のカテゴリの検出を示す。
【図１０Ｃ】本発明の実施形態に係る、粒子のカテゴリの検出を示す。
【図１０Ｄ】本発明の実施形態に係る、粒子のカテゴリの検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本開示は、粒子を包含するサンプルを分析するための装置、システム、組成物、及び方法に関する。一実施形態において、本発明は、例えば、視覚的分析器であってもよい、分析器を備える自動粒子撮像システムに関する。いくつかの実施形態では、視覚的分析器は、画像の自動分析を促進するためのプロセッサを更に備えてもよい。
【００３６】
本開示によれば、液体内に懸濁された粒子を含むサンプルの画像を得るための、視覚的分析器を備えるシステムが提供される。本システムは、例えば、白血球弁別計数、分類及び細分類並びに分析を含む、赤血球、網赤血球、有核赤血球、血小板、及び白血球の検出及び定量化など、生体液内の粒子の特徴付けのために有用となり得る。他の流体からの血球を特徴付けることなど、他の同様の用途もまた想到される。
【００３７】
血液サンプル内の血球の区別は、主題が特によく適している例示的な用途である。サンプルは、自動化された手法によって調製され、薄いリボン状サンプルストリームとして高光学解像度撮像デバイスに提示され、リボン状サンプルストリームが視野を横切って流れる間に定期的に撮像される。粒子（血球など）の画像は、細胞又は粒子を同定及び計数するために、ピクセル画像データのプログラムされた処理手法を用いて、もっぱら自動的に、又は人間の補助をわずかに用いて、互いに識別され、分類、細分類、及び計数されることができる。記憶して粒子の異常又は重要な特徴の場合に利用することができる細胞画像に加えて、出力データは、記録されたサンプル画像内で識別された細胞又は粒子のそれぞれの特定のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの出現の計数を含む。
【００３８】
それぞれの画像内で見つかった異なる粒子の計数は更に処理することができ、例えば、サンプル全体内における識別されたカテゴリ及び／又はサブカテゴリのそれぞれの細胞の正確で統計的に有意な比を累算するために用いられる。視覚的区別のために用いられるサンプルは希釈することができるが、それぞれのカテゴリ及び／又はサブカテゴリ内の細胞の割合は、特に、多数の画像が処理された後には、希釈されたサンプル内に表される。
【００３９】
本明細書に開示されている装置、及び方法は、サンプル内の細胞を視覚的相違に基づいて区別し、定量化するために有用である。サンプルは、生体サンプル、例えば、制限なく、血液、血清、骨髄、洗浄液、体腔液、滲出液、脳脊髄液、胸水、腹水、及び羊水を含む、白血球を含む体液サンプルであることができる。いくつかの実施形態では、サンプルは、固形組織サンプル、例えば、細胞懸濁液を作成するために処理された生検サンプルであることができる。サンプルは、糞便サンプルを処理することから得られる懸濁液であってもよい。サンプルは、細胞培養サンプルなどの、粒子を含む試験室サンプル又は生産ラインサンプルであってもよい。用語、サンプルは、患者若しくは試験室から得られるサンプル又はそのいくらかの割合、部分若しくは一定分量に言及するために用いられてもよい。サンプルは、いくつかのプロセスにおいて希釈するか、部分に分割するか、又は染色することができる。
【００４０】
一態様において、本開示のシステム、組成物及び方法はフロー内の細胞の驚異的に高品質の画像を提供する。一態様において、視覚的分析器を本開示の方法で用いて、自動化された画像ベースのＷＢＣ弁別計数を提供することができる。特定の実施形態では、本開示の方法は、被検者は健康であるのか、それとも病気、疾患、異常及び／若しくは感染症を有しているのか、並びに／又は治療に反応があるのか、それとも反応がないのかの判定、診断、予知、予測、及び／又はその診断の支援のための形態学的特徴及び／又は異常を含む、視覚的相違の自動識別に関する。いくつかの実施形態では、システムは粒子計数器を更に含んでもよい。用途は、血液サンプルなどの、流体サンプル内の細胞の分類及び／若しくは細分類、並びに計数を含む。追加の種類の粒子及び／又は他の流体サンプル内の粒子を計数するための他の同様の使用法も想到される。本発明のシステム、組成物、及び方法は、任意の好適な自動粒子認識アルゴリズムを用いた画像のリアルタイムの分類及び細分類並びに観察のために用いることができる。それぞれのサンプルについてのキャプチャ画像は、後日に観察するために記憶することができる。
【００４１】
別の態様では、本発明の装置、組成物、及び方法は、驚異的により正確な画像ベースの細胞分類及び細分類並びに標識を提供し、これにより、現在の自動分析器を用いた場合の手作業の見直しの割合に比較して手作業の見直しの割合は低下する。システム、組成物、及び方法は手作業の見直しの割合を低下させ、手作業の見直しを機器上で実行することを可能にする。加えて、本開示のシステム、組成物、及び方法はまた、自動分析中に、手作業の見直しを必要とするものとして標識されるサンプルの割合も低下させる。
【００４２】
本開示は更に、ＣＢＣ並びに画像ベースの拡張された白血球百分率及び画像ベースの拡張された血小板計数を獲得し、それにより、血小板を計数するための有効検出範囲を拡げるために、完全血球計数（ＣＢＣ）計数器を視覚的分析器などの分析器と組み合わせるためのシステム、方法及び組成物に関する。
【００４３】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、粒子、例えば、血球を包含するサンプルを分析するための装置及び方法を提供する。本開示によれば、液体内に懸濁された粒子を含むサンプルの画像を得るための視覚的分析器が提供される。いくつかの実施形態では、視覚的分析器はフローセル及びオートフォーカス構成要素を備える。目的の粒子を包含する液体サンプルを、ビューポートを有するフローセル内に流し、対物レンズに結合されたカメラがビューポートを通して粒子のデジタル画像をキャプチャする。フローセルは、本明細書に記載されているように、希釈され、及び／若しくは処理された血液サンプル若しくはその他の体液サンプルなどの、サンプル液の供給源、並びに透き通ったシース液、若しくは粒子及び／若しくは細胞内小器官整位液（ＰＩＯＡＬ）の供給源に結合される。
【００４４】
一実施形態において、装置はまた、少なくとも１つの検出範囲を有する粒子計数器、並びに分析器、及びプロセッサも備える。分析器及びプロセッサは、粒子計数器に関連付けられる計数、分類、及び細分類の誤りを補正し、サンプル内の粒子の異なるカテゴリ及び／又はサブカテゴリの正確な粒子計数又は濃度を更に決定するための追加の情報を提供するように構成される。
【００４５】
本開示は、画像ベースのサンプル分析を行う際の粒子及び／又は細胞内小器官の整位のために有用な方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、完全血球計数（ＣＢＣ）と、例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、網赤血球、有核ＲＢＣ、芽球、前骨髄球、骨髄球、若しくは後骨髄球を含む、ＷＢＣ、ＲＢＣ、及び／若しくは血小板などの細胞種を同定して計数すること、並びにＷＢＣ計数及び形態、赤血球（ＲＢＣ）計数及び形態並びに血小板（ＰＬＴ）計数及び形態のための画像ベースの情報を提供することができる、画像ベースの拡張された白血球（ＷＢＣ）弁別と、を実行する能力を有する、計数及び撮像を組み合わせたシステムのための方法及び組成物に関する。
【００４６】
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている通りの粒子の画像ベースの分析に用いることができるＰＩＯＡＬに関する。本開示においては、血液サンプル内の細胞カテゴリ計数及び／又はサブカテゴリ計数が、分析することができるサンプルの種類の非限定例として用いられている。いくつかの実施形態では、サンプル内に存在する細胞はまた、細菌若しくは真菌細胞、並びに白血球、赤血球及び／若しくは血小板を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組織又は吸引液から得られた粒子懸濁液が分析されてもよい。
【００４７】
血液サンプル内の血球の区別は、主題が特によく適している例示的な用途である。サンプルは、自動化された手法によって調製され、リボン状サンプルストリームとして高光学解像度撮像デバイスに提示され、サンプルが視野を横切って流れる間に定期的に撮像される。粒子（血球など）の画像は、細胞又は粒子を同定及び計数するために、ピクセル画像データのプログラムされた処理手法を用いて、もっぱら自動的に、又は人間の補助をわずかに用いて、互いに識別され、分類、細分類、及び／又は計数されることができる。記憶して異常又は重要な特徴の場合に利用することができる細胞画像に加えて、出力データは、記録されたサンプル画像内で識別された細胞又は粒子のそれぞれの特定のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの出現の計数を含む。それぞれの画像内で見つかった異なる粒子の計数は更に処理することができ、例えば、サンプル全体内における識別されたカテゴリ及び／又はサブカテゴリのそれぞれの細胞の正確で統計的に有意な比率又はその関数を累算するために用いられる。視覚的区別のために用いられるサンプルは高度に希釈することもできるが、それぞれのカテゴリ及び／又はサブカテゴリ内の細胞の割合は、特に、多数の画像が処理された後には、希釈されたサンプルについての分布内に表される。
【００４８】
いくつかの態様では、サンプルは、自動化された仕方で提示され、撮像され、分析される。血液サンプルの場合には、サンプルは水又は食塩溶液を用いて大幅に希釈されてもよく、それにより、希釈していないか又は希釈度がより低いサンプル内であればいくつかの細胞の姿が他の細胞によって隠れ得る程度が低減される。細胞は、一部の細胞の外観のコントラストを高める薬剤によって、例えば、細胞膜を透過性にする透過化処理剤、並びに顆粒及び核などの特徴内に付着し、それらを明らかにするための組織染色剤を用いて、処理することができる。いくつかの実施形態では、網赤血球、有核赤血球、及び血小板を含む粒子を計数し、特徴付けるため、並びに白血球の弁別、特徴付け及び分析のために、サンプルの一定分量を染色することが望ましい場合がある。他の実施形態では、赤血球を包含するサンプルはフローセルへの導入及び撮像の前に希釈されてもよい。
【００４９】
サンプルの希釈、透過化及び組織染色のためのサンプル調製装置及び方法の詳細は、一般的に、１つ以上のプログラム可能コントローラによって作動させる精密ポンプ及び弁を用いて達成され、本開示の中心をなすものではない。プログラム可能制御装置に関する、米国特許第７，３１９，９０７号などの、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｍｏｔｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された特許に実施例を見いだすことができる。同様に、特定の細胞カテゴリ及び／又はサブカテゴリを相対サイズ及び色などのそれらの特質によって識別するための手法を、白血球に関連する米国特許第５，４３６，９７８号に見いだすことができる。これらの特許の開示は本明細書において参照により組み込まれている。
【００５０】
細胞などの粒子が分類及び／又は細分類される能力、スピード及び効率を促進するためには、データ処理システムによる自動分析のための血球の鮮明な高品質画像を提供することが有利となる。本開示によれば、調製されたサンプルストリームが、フローセルの対壁間の安定した位置を有する薄いリボン状に整えられる。サンプルストリームの位置付け、及び薄いリボン形状へのその扁平化は、サンプル液と粘度が異なり、フローチャネルの対称的な区域を通って流す、フローセル内に導入されるＰＩＯＡＬの層間の流動によって達成されてもよい。
【００５１】
ＰＩＯＡＬは好適な粘度及び密度を有し、サンプルのフローセルへの導入の地点における流量は、サンプル液が薄いリボン状に扁平化するような流量とされる。リボン状サンプルストリームはＰＩＯＡＬと共に運搬され、リボン状サンプルストリームの観察を可能にするために対物レンズ及び光源が配置された観察ポートの前を通過する。サンプル液は、ＰＩＯＡＬの流路が対称的に狭窄化する地点において導入される、例えば、注入される。その結果、サンプル液ストリームは扁平化し、薄いリボン状に引き伸ばされる。本開示のＰＩＯＡＬはシース液として本開示のいずれかの視覚的分析器と共に用いられてよい。一実施形態において、ＰＩＯＡＬは、サンプル液を排出部に向かって押し流すために、フローセルの端部内に導入することができる。
【００５２】
観察区域内のリボン状サンプルストリームの寸法はＰＩＯＡＬ流路の幾何学的薄化、並びにサンプル液及びＰＩＯＡＬの線速度差によって影響を受け、その結果、リボン状サンプルストリームの薄化及び引き伸ばしが生じる。サンプルの、ＰＩＯＡＬに対する初期線速度差は０．５：１〜５：１に及んでもよい。ＰＩＯＡＬ流路断面は、約１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１０５：１、１１０：１、１１５：１、１２５：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、又は２００：１の率で奥行きを縮小することによって、薄化されてもよい。一実施形態において、幾何学的薄化は４０：１である。一実施形態において、幾何学的薄化は３０：１である。考慮される因子は、フローセル内の通過時間、サンプル処理量の所望速度、粒子サイズに相当するリボン状サンプルストリーム厚さの達成、粒子及び小器官の整位の達成、粒子の含有物の合焦の達成、動作限界値以内での圧力、流量、及び粘度のバランス、リボン状サンプルストリーム厚さの最適化、所望の線速度の達成、製造可能性の考慮事項、並びに必要とされるサンプル及びＰＩＯＡＬの体積である。
【００５３】
カニューレの長さ及び容積並びに断面の扁平化は、サンプルフロー不安定の期間を短縮するように選択されてもよく、それにより、処理量を高める。いくつかの実施形態では、フロー不安定の期間は、約３、２．７５、２．５、２．２５、２、１．７５、１．５  １．２５秒未満、又は約１秒未満であってもよい。カニューレ容積が小さくなると、サンプルを流す合間にカニューレを洗浄するために必要な時間及び希釈剤の体積も減少してよい。いくつかの実施形態では、フローセル内の通過時間は、１、２、３、若しくは４秒、又はそれらの時間のうちの任意の２つの間の任意の範囲である。いくつかの実施形態では、通過時間は４、３又は２秒未満であってもよい。
【００５４】
サンプル液及びＰＩＯＡＬの粘度及び流量並びにフローセルの輪郭は、ＰＩＯＡＬフローがサンプルフローを扁平化して引き伸ばし、信頼できるロケーションにおいて観察区域を常に通過する平坦なリボン状にするように構成される。サンプル液ストリームの流体フロー厚さはおおよそ２〜３μｍに圧縮されてもよい。いくつかの血球種は、ストリーム厚さよりも大きい直径を有する。フローの方向に平行な方向の剪断力によって、高光学解像度撮像デバイスの焦平面内の撮像条件下における粒子の画像投影の増進がもたらされ、並びに／又は粒子内構造、例えば、細胞内構造、小器官若しくは葉の、フローの方向に実質的に平行になる位置付け、再位置付け、及び／若しくはより良好な位置付けが行われる。高光学解像度撮像装置の被写界深度は最大７μｍ、例えば、１〜４μｍである。
【００５５】
リボン状サンプルストリームが一緒に運搬されるＰＩＯＡＬのフロー断面は、観察ポートであって、それを通して対物レンズが方向づけられる、観察ポートの前の観察区域を通じて一定である。対物レンズは高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスの対物部品であってもよい。リボン状サンプルストリームは、フローセル内の既知かつ再現性のある位置において、例えば、フローセルの２つの壁から既知かつ再現性のある距離の所で観察区域を横切る経路をたどり、下流に排出される。
【００５６】
リボン状サンプルストリームが観察ポートの前の観察区域を通って運搬される際に、サンプル内の粒子からの光学情報が分析器内の検出部によって検出され、それにより、サンプル内に包含されている粒子／細胞からのデータを生成する。この分析器の使用は、サンプル内に包含されている細胞並びに／又は粒子のキャプチャ、処理、分類及び細分類並びに計数を可能にする。ＰＩＯＡＬ液体は、粘度調節剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、抗菌剤、イオン強度調節剤、界面活性剤、及び／又はキレート剤の添加によって調製することができる。本開示における分析器の例示的な機能構成要素及び／又は機能は、例えば、画像分析からのデータを得、及び／又は処理する能力、サンプル染色処理、画像処理、及び／若しくは粒子画像同定、計数、並びに／又は分類及び細分類を含むことができる。
【００５７】
一実施形態において、本開示は、ＰＩＯＡＬ内への適当な量の粘性剤の添加によって、フローセル内の粒子／細胞の整位は著しく向上し、合焦した細胞、若しくは細胞成分の割合の増大、並びに流動内の細胞及び／若しくは粒子の画像の高品質化がもたらされるという驚くべき予想外の発見に基づいていた。粘性剤の添加はＲＢＣのような細胞に対する剪断力を増大させ、これにより、フロー方向に実質的に平行な平面内の細胞の整位が改善し、その結果、画像の最適化がもたらされる。これはまた、フローの方向に実質的に平行な、細胞内構造、小器官又は葉などの粒子内構造の位置付け、再位置付け、及び／又はより良好な位置付けも生じさせ、その結果、画像の最適化がもたらされる。粘性剤は、細胞の整位不良、一般的に、限定するものではないが、フローストリームよりも直径が小さい細胞の整位不良も低減する。
【００５８】
フローストリームよりも直径が小さい細胞、例えば、赤血球の整位は、例えば、ＰＩＯＡＬの粘度を増大させることによって、又は流動スピード比を増大させることによって得られてもよい。これは結果的に流れの方向と平行なＲＢＣの整位を生じる。いくつかの実施形態では、ＰＩＯＡＬの粘度を増大させることによってＲＢＣ整位不良の低減及び／又はＲＢＣ整位の増大が達成される。
【００５９】
リボン状サンプルストリームの厚さは、サンプル液及びＰＩＯＡＬの相対粘度及び流量によって影響を受け得る。例えば、精密容積式ポンプを備える、サンプルの供給源及び／又はＰＩＯＡＬの供給源は、リボン状サンプルストリームの寸法を最適化するために、すなわち、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスの視野と少なくとも同じ幅の薄いリボンとして最適化するために制御可能な流量でサンプル及び／又はＰＩＯＡＬを提供するように構成することができる。
【００６０】
リボン状サンプルストリームが一緒に運搬されるＰＩＯＡＬのフロー断面は、観察ポートであって、それを通して高光学解像度撮像デバイスが方向づけられる、観察ポートの前の観察区域を通じて一定である。リボン状サンプルストリームは、フローセルの前壁及び後壁のうちのいずれかから既知かつ再現性のある距離の所で観察区域を横切る経路をたどり、その下流に排出される。
【００６１】
用語、高光学解像度撮像デバイスは、形態学的特徴及び／又は変化を弁別するために十分な視覚的相違を有する粒子画像を得る能力を有するデバイスを含むことができる。例示的な高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．４６μｍなどの、例えば、０．４〜０．５μｍを含む、１μｍ以下の光学解像度を有するデバイスを含むことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び／又は方法のうちのいずれかで得られる画像はデジタル化画像であってもよい。いくつかの実施形態では、得られる画像は顕微鏡画像である。特定の実施形態では、画像は手動で得られてもよい。他の実施形態では、画像を得るための手順の少なくとも一部は自動化されている。いくつかの実施形態では、画像は、フローセルと、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスとを備え、任意選択的にオートフォーカス機能を有する視覚的分析器を用いて得られてもよい。
【００６３】
一実施形態において、画像は、細胞の細胞基質、細胞核及び／又は核成分に関する情報を提供する。一実施形態において、画像は、細胞の粒状成分及び／又はその他の形態学的特徴に関する情報を提供する。一実施形態において、画像は、細胞の細胞基質、核成分及び／又は粒状成分に関する情報を提供する。粒状及び／又は核の画像及び／又は特徴は、単独か又は互いに組み合わせるかの両方で、細胞の分類及び細分類のための判定力を持つ。
【００６４】
本発明の方法の一態様において、粒子造影剤組成物と接触させ、及び／又は撮像する細胞は、有核赤血球である。更に別の態様では、本発明の方法は、ａ）赤血球の一部の撮像、及びｂ）撮像された赤血球の形態の判定を含む、画像ベースの赤血球分類及び細分類を実行するための方法に関する。本明細書で使用するとき、赤血球（ＲＢＣ）は、例えば、正常若しくは異常赤血球、網赤血球、有核赤血球、並びに／又はマラリア感染細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、撮像は、粒子計数器、視覚的分析器及びプロセッサを備える装置などの本開示の装置を用いて実行される。
【００６５】
本明細書で使用するとき、例示的な完全血球計数（ＣＢＣ）は、患者の血液サンプル内の粒子及び／又は細胞に関する情報を提供する医師又はその他の医療専門家によって通例要求される検査パネルを含むことができる。血流内を循環する例示的な細胞は概ね、限定するものではないが、例えば、白血球（white  blood  cell）（例えば、白血球（leukocyte））、赤血球（red  blood  cell）（例えば、赤血球（erythrocyte））、及び血小板（platelet）（例えば、血小板（thrombocyte））を含む、３つの種類に類別することができる。
【００６６】
本明細書で使用するとき、異常に高いか又は低い計数は、病気、障害、及び／又は疾患の存在を指示している場合がある。それゆえ、ＣＢＣは、患者の全身の健康状態の概要を提供することができるため、医療において一般的に行われている血液試験の１つである。その結果、ＣＢＣは年に１度の健康診断の際に日常的に行われている。
【００６７】
本明細書で使用するとき、通例、瀉血専門医が被検者から血液サンプルを採取する。一般的に、血液は、その凝固を阻止するために抗凝血剤（例えば、ＥＤＴＡ、ときによってクエン酸塩）を通例包含する試験管内に吸入される。次に、サンプルは試験室へ輸送される。ときにより、サンプルは、自動計数器による即時処理のために指の刺し傷からパスツールピペットを用いて吸入される。一実施形態において、粒子画像は、粒子がシース液又はＰＩＯＡＬ内に包囲されている間に得られる。特定の実施形態では、血液サンプルは、患者の血液のサンプルを用いて調製したスライド上で顕微鏡下で観察されてもよい（血液塗抹標本、又は末梢血液塗抹標本）。特定の実施形態では、完全血球計数は自動分析器によって実行される。
【００６８】
本明細書で使用するとき、一般的に、血液分析器は細管を通じてごく少量の検体を吸引することができる。センサは、管を通過する細胞の計数及び／又は数を検出することができ、細胞の種類を同定することができる。例示的なセンサは、光（例えば、可視光、ＵＶ光又はＩＲ光）及び／又は電気インピーダンスの検出器を含んでもよい。例示的な検出パラメータは、サイズ、体積、及び／又は細胞特徴を含んでもよい。特定の実施形態では、センサは、約２００ｎｍ〜約１００００ｎｍに及ぶ波長スペクトル内の可視光及び非可視光を検出することができる。特定の実施形態では、センサは約３８０ｎｍ〜約７６０ｎｍの波長を検出することができる。
【００６９】
本明細書において使用するとき、血球計数は、例えば、合計赤血球、ヘモグロビン−血液中におけるヘモグロビンの量、又は血球容積（ＰＣＶ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）−赤血球の平均容積（貧血は、この値が予想される通常範囲を上回るか、又は下回るかによって小赤血球性、又は大赤血球性に分類される。ＭＣＶに影響し得る他の疾患には、サラセミア、網赤血球増加性、及びアルコール中毒が挙げられる）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）−赤血球当たりのヘモグロビンの平均量（ピコグラム）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）−細胞中におけるヘモグロビンの平均濃度（ＭＣＨＣ）−細胞中のヘモグロビンの平均濃度、赤血球分布幅（ＲＤＷ）−ＲＢＣ集団の細胞体積のばらつき、好中球顆粒細胞（急性ウイルス感染において典型的に増加する、細菌感染を示し得る）が挙げられる。核のセグメント化した外観のために、好中球は「ｓｅｇｓ」と称されることがある。あまり成熟していない好中球はセグメント化しておらず、帯状又は細長い形状を有する。あまり成熟していない好中球−最近骨髄から血流内へ放出されたもの−は「ｂａｎｄ」として知られる。血球数についてのその他のデータ／パラメータは、例えば、リンパ球（例えば、腺熱などの一部のウイルス感染と共に、及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ：chronic  lymphocytic  leukemia）ときに増加するか、又はＨＩＶ感染によって減少する）、単球（細菌感染、結核、マラリア、ロッキー山脈紅斑熱、単球性白血病、慢性潰瘍性大腸炎及び限局性腸炎時に増加する場合がある、好酸性顆粒球（例えば、寄生虫感染、喘息、又はアレルギー反応時に増加する）、好塩基性顆粒球（例えば、白血病又はリンパ腫などの骨髄関係の疾患時に増加するを含むこともできる。
【００７０】
本明細書で使用するとき、血球数のデータ／パラメータはまた、例えば、血小板数、血液中のそれらのサイズ並びにサイズの範囲に関する情報、平均血小板体積（ＭＰＶ：mean  platelet  volume）−血小板の平均サイズの測定値を含む、血小板に関連付けられるデータを含むこともできる。
【００７１】
本発明の方法の別の態様では、粒子造影剤組成物と接触させ、及び／又は撮像される細胞は、マラリア感染細胞、異型リンパ球などの、異常細胞である。本発明のいくつかの態様では、細胞は、疾患、病気、感染及び／又は症候群の同定、予測、診断、予知、又は診断の支援に用いることができる異常細胞である。
【００７２】
本発明の方法の別の態様では、細胞は血小板である。
【００７３】
別に明示的に指示されないかぎり、本開示における「粒子（particle）」又は「粒子群（particles）」への言及は、流体内に分散したあらゆる個別又は有形の物体を包含すると理解されることになる。本明細書で使用するとき、「粒子」は、生体液内の全ての（例えば、画像及び／又はその他の測定可能パラメータによって）測定可能な成分及び検出可能な成分を含むことができる。粒子は任意の物質、任意の形状及び任意のサイズのものである。特定の実施形態では、粒子は細胞を含むことができる。粒子の例は、限定するものではないが、血球、芽細胞、上皮、幹細胞、腫瘍細胞を含む、細胞、若しくは細菌、寄生生物、又は上述のもののうちのいずれかの断片若しくは生体液内のその他の断片を含む。血球は、生体液内に潜在的に存在する任意の正常細胞若しくは異常細胞、成熟細胞若しくは未熟細胞を含む、任意の血球、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）及びその他の細胞であってよい。要素はまた未熟細胞又は異常細胞も含む。未熟ＷＢＣは、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球及び芽球を含んでもよい。成熟ＲＢＣに加えて、ＲＢＣの要素は有核ＲＢＣ（ＮＲＢＣ）及び網赤血球を含んでもよい。ＰＬＴは「巨大」ＰＬＴ及びＰＬＴ凝集塊を含んでもよい。血球及び有形成分については本開示の他の箇所において更に説明されている。
【００７４】
例示的な粒子は、例えば、球状粒子及び非球状粒子を含む、生体液サンプル内の有形成分を含むことができる。特定の実施形態では、粒子は非球状成分を含むことができる。非球状成分の画像投影は高光学解像度撮像デバイスの焦平面内で最大化させることができる。特定の実施形態では、非球状粒子は高光学解像度撮像デバイスの焦平面内に整位される（フローの方向に実質的に平行な平面内に整位される）。いくつかの実施形態では、血小板、網赤血球、有核ＲＢＣ、並びに好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、及び芽球、前骨髄球、骨髄球、若しくは後骨髄球を含む未熟ＷＢＣを含む、ＷＢＣが粒子として計数され、分析される。
【００７５】
本明細書で使用するとき、検出可能及び測定可能な粒子パラメータは、例えば、サイズ、形状、対称性、輪郭及び／又はその他の特徴の視覚的指数及び／又は非画像ベースの指数を含むことができる。
【００７６】
サンプルは、例えば、体液サンプル、血液、血清、脳脊髄液、胸水、腹水、唾液、精液、涙、汗、乳汁、羊水、洗浄液、骨髄アシレート、体腔液、滲出液を含む、分離され、及び／又は調製された生体サンプル、あるいは被検者から得られたその他のサンプル（例えば、細胞懸濁液を作成するために処理された生検サンプル、又は粒子を含む試験室サンプル若しくは生産ラインサンプル）であることができる。いくつかの実施形態では、サンプルは、固形組織サンプル、例えば、細胞懸濁液を作成するために処理された生検サンプルであることができる。サンプルは、糞便サンプルを処理することから得られる懸濁液であってもよい。サンプルは、細胞培養サンプルなどの、粒子を含む、試験室サンプル、化学サンプル、工業サンプル又は生産ラインサンプルであってもよい。用語、サンプルは、患者若しくは試験室から得られるサンプル又はそのいくらかの割合、部分若しくは一定分量に言及するために用いられてもよい。サンプルは、いくつかのプロセスにおいて、希釈するか、部分に分割するか、又は造影剤を用いて処理することができる。
【００７７】
本明細書に開示されている方法は、哺乳類、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、ウマ、ウシ若しくはその他の家畜、イヌ、ネコ若しくはペットとして飼われるその他の哺乳類、ラット、マウス、若しくはその他の実験動物；鳥類、例えば、ニワトリ；爬虫類、例えば、ワニ；魚類、例えば、サケ及びその他の養殖種；並びに両生類を含む、広範囲の生物からのサンプルに適用可能である。
【００７８】
サンプルは任意の通常の方法、例えば、排泄、摘出、採取、吸引、又は生検、によって得ることができる。サンプルは、健康であると考えられる被検者からのもの、例えば、定期健康診断の一部として収集されるサンプルであることができる。サンプルはまた、障害を有する被検者、障害のリスクがある被検者、又は障害を有する疑いがある被検者からのものであることもできる。障害は、病気、遺伝的異常、感染、けが又は未知の原因の結果であり得る。代替的に、又は追加的に、方法は、障害の治療の最中の被検者の監視に有用であり得る。治療及び／又は療法に対する非反応性の兆候が生じた場合には、臨床医は代替薬又は補助剤を選ぶことができる。被検者の状態及び、特定の障害がある場合にはそれに依存して、サンプルは、毎日、毎週、毎月、又は毎年１回（若しくは２回、３回、等）収集することができる。
【００７９】
粒子はサンプルによって異なり得る。粒子は、生体細胞、例えば、血球、芽細胞、幹細胞、腫瘍細胞又はそれらの断片であることができる。いくつかの実施形態では、粒子は感染病原体、例えば、ウイルス又は細菌、であることができる。
【００８０】
本開示においてなされる「血球」への言及は、生体液内に潜在的に存在する任意の正常細胞又は異常細胞、成熟細胞又は未熟細胞、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）及びその他の細胞、を包含すると理解されることになる。一般的に、正常なＲＢＣ、ＰＬＴ、及びＷＢＣはそれぞれ、６〜８μｍ、２〜３μｍ、及び８〜１５μｍの範囲内の粒子直径を有する。正常なＲＢＣ、ＰＬＴ及びＷＢＣはそれぞれ、正常な患者からの全血サンプル内に、３．９〜５．７×１０１２細胞／Ｌ、１．４〜４．５×１０１１細胞／Ｌ、３．５〜１１×１０９細胞／Ｌのおおよその濃度範囲内で存在する。Ｂａｒｂａｒａ  Ｊ．Ｂａｉｎ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００７，３４−３６を参照されたい。
【００８１】
「有形成分」への言及は、生体液サンプル内に存在する非流体成分を包含すると理解されることになる。有形成分は、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）及び血小板（ＰＬＴ）を含む科学的類別又は生理機能に基づく血球の種別、ＷＢＣ凝集塊、成熟リンパ球、及び単球、好中球、好酸球、好塩基球などの未熟白血球を含む、白血球のサブクラスを含む。本明細書において使用するための「有形成分」はまた、微生物、細菌、真菌、寄生生物、若しくはそれらの断片又はその他の細胞片などの粒子も含むことになる。ＷＢＣの主要要素は、限定するものではないが、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球を含む。要素はまた未熟細胞又は異常細胞も含む。例えば、未熟ＷＢＣは、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球を含んでもよい。成熟ＲＢＣに加えて、ＲＢＣの要素は有核ＲＢＣ（ＮＲＢＣ）及び網赤血球を含んでもよい。ＰＬＴは、普通のＰＬＴ、及びサイズが普通のＷＢＣのものに近い「巨大」ＰＬＴを含んでもよい。本開示においてなされる粒子のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの「要素（member）」又は「要素群（members）」への言及は、粒子のカテゴリ又はサブカテゴリ内の個々の粒子を包含するとが理解される。
【００８２】
別に明示的に指示されないかぎり、本開示においてなされる粒子の「カテゴリ」への言及は、サイズ、形状、きめ、又は色などの測定、検出又は導出される少なくとも１つの検出基準を用いて検出された粒子のグループを包含すると理解されることになる。いくつかの実施形態では、本開示の装置によって計数される粒子の少なくとも１つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリの要素は、同じ種類の有形成分であることになる。
【００８３】
このような粒子が「チャネル」内に検出されることがある。本開示においてなされる「チャネル」への言及は、信号源に結合され、少なくとも１つのチャネル検出基準を満たす粒子の検出の多少によって変化する出力を提供する検出器を備える粒子計数器の一部分を包含すると理解されることになる。例えば、チャネル検出基準は粒子のサイズ又は体積に基づくことができる。いくつかの実施形態では、粒子計数器内のチャネルの数は１本である。いくつかの他の実施形態では、粒子計数器内のチャネルの数は２本以上である。
【００８４】
粒子計数器の１本のチャネル内で検出される粒子の１つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の異なる種別及びサブクラス、並びに２つ以上のサブクラス内の粒子のグループ化した要素を含む場合がある。本開示においてなされる粒子の「カテゴリ」への言及は、サイズ、形状、きめ、又は色などの測定、検出又は導出される基準に対応する粒子のグループ化を包含すると理解されることになる。いくつかの実施形態では、本開示の装置によって計数される粒子の少なくとも１つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリの要素は、同じ種類の有形成分であることになる。
【００８５】
本明細書において使用するとき、用語、高光学解像度撮像デバイスは、形態学的特徴及び／又は変化を弁別するために十分な視覚的相違を有する粒子画像を得る能力を有するデバイスを含むことができる。例示的な高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．４６μｍなどの、例えば、０．４〜０．５μｍを含む、１μｍ以下の光学解像度を有するデバイスを含むことができる。
【００８６】
本明細書で使用するとき、粒子造影剤組成物は、被検者からのサンプル内の粒子を分析するための視覚的分析器内の粒子及び／又は細胞内小器官整位液（ＰＩＯＡＬ）と相まって、使用するように適合させることができる。例示的なＰＩＯＡＬは、一例として、被検者からのサンプル内の異なる種類の粒子の自動認識のための方法において有用である。
【００８７】
別の態様では、細胞は、画像を得る際に、ＰＩＯＡＬ内に包囲されていてもよい。好適な例示的な細胞内小器官整位液が本明細書に記載されている。
【００８８】
本明細書で使用するとき、「整位（alignment）」は部分的に、球状粒子及び／又は非球状粒子の整位によって特徴付けることができる。例えば、非球状粒子などの粒子は、フローの方向に実質的に平行な平面内に整位されてもよい。特定の実施形態では、非球状粒子の整位は、粒子の配向によって特徴付けられる高光学解像度撮像デバイスの焦平面内の撮像条件下での非球状粒子の画像投影を増大させる。球状粒子などの粒子は、粒子及び細胞の合焦した粒子内含有物の量が増加してもよく、これは、粒子の分類及び細分類のための視覚的相違を生み出すために有効となる。球状粒子などの粒子の粒子内構造は、フローの方向に実質的に平行になるように位置付けられ、再位置付けされ、及び／又はより良好に位置付けられてもよい。例えば、細胞内構造、小器官又は葉も、フローの方向に実質的に平行になるように位置付けられ、再位置付けされ、及び／又はより良好に位置付けられてよい。
【００８９】
本開示においてなされる粒子の「種別（class）」への言及は、科学的類別に基づく粒子のグループを包含すると理解されることになる。例えば、全血サンプル内には、ＲＢＣ、ＷＢＣ及びＰＬＴを含む、血球の３つの主要種別が存在する。
【００９０】
本開示においてなされる粒子の「要素（member）」又は「要素群（members）」への言及は、粒子の１つのカテゴリ又はサブカテゴリ内の粒子を包含すると理解されることになる。例えば、血球のそれぞれのカテゴリはサブカテゴリ又は要素に更に分けることができる。ＷＢＣの主要要素は、限定するものではないが、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球を含む。要素はまた未熟細胞又は異常細胞も含む。例えば、未熟ＷＢＣは、後骨髄球、骨髄球、及び前骨髄球を含んでもよい。成熟ＲＢＣに加えて、ＲＢＣの要素は有核ＲＢＣ（ＮＲＢＣ）及び網赤血球を含んでもよい。ＰＬＴは、普通のＰＬＴ、及びサイズが普通のＷＢＣのものに近い「巨大」ＰＬＴを含んでもよい。
【００９１】
「未熟細胞」への言及は、特定の発達段階、例えば、骨髄の内部における段階、又は骨髄からの放出直後であるが、成熟細胞への完全な発達前の段階、における細胞を包含すると理解されることになる。
【００９２】
「異常細胞」への言及は、不正規の形態学的特徴を有する細胞、又は特定の病気若しくは疾患に関連付けられる細胞、あるいは場合によっては特定の病気又は疾患に関連付けられることがある、関連する不正規性を包含すると理解されることになる。特定の病気の例としては、限定するものではないが、赤血球増加症、多血症、貧血症、赤芽球減少症、白血球増加症、白血球減少症、リンパ球増加症、リンパ球減少症、顆粒球増加症、顆粒球減少症若しくは無顆粒球症、好中球増加症、好中球減少症、好酸球増加症、好酸球減少症、好塩基球増加症、好塩基球減少症、血小板増加症、血小板減少症、並びに汎血球減少症が挙げられる。細胞の種別は血流内で増加又は減少する場合がある。条件によっては、正規の白血球よりもはるかに大きい異常細胞が血液サンプル内に少濃度で存在する。サイズ、形状、色、及び／又は細胞内構造のばらつきは特定の病気又は疾患に関連付けられる場合がある。
【００９３】
本開示においてなされる粒子の「計数」又は「粒子計数」への言及は、粒子計数器の１本のチャネルから得られる粒子の数を包含すると理解されることになる。本開示においてなされる粒子の種別又は要素の「濃度」への言及は、単位体積当たり（例えば、１リットル当たり）、又は既知の体積のサンプル当たりの粒子の数を意味すると理解されることになる。例えば、粒子計数器は、粒子のカテゴリについての計数又は濃度若しくはその他の計数に基づく関数を提供してもよく、それに対して、視覚的分析器は、粒子のそれぞれのカテゴリ又はサブカテゴリについての計数、濃度、比若しくはその他の濃度に基づくパラメータを提供してもよい。
【００９４】
本開示においてなされる「比」への言及は、粒子の２つのカテゴリ／サブカテゴリ、種別又は要素の任意の量比及び／又は比率を包含すると理解されることになる。このような比の例としては、限定するものではないが、粒子の濃度、重さによる比、及び／又は数による比が挙げられる。通例、比は、１つのカテゴリ、種別又は要素の計数の、別のこのようなカテゴリ、種別又は要素の計数に対する数値的割合に関係する。いくつかの実施形態では、重みを付けた計数、又は重みを付け、及び／若しくは比例した比を用いる判定が行われてもよい。
【００９５】
血液検査−粒子分析システム
次に図面を参照すると、図１は、デジタル画像処理を用いてサンプルフローストリーム３２内の微視的粒子を撮像するための構成の高光学解像度撮像デバイス２４の観察区域２３を通ってサンプル液を運搬するための例示的なフローセル２２を概略的に示す。フローセル２２は、粒子造影剤組成物との接触、及び加熱などの処理を受けていてもよいサンプル液の供給源２５に結合される。フローセル２２はまた、サンプル液の粘度よりも大きい粘度を有する透き通ったグリセロール溶液などの、粒子及び／又は細胞内小器官整位液（ＰＩＯＡＬ）の１つ以上の供給源２７にも結合される。
【００９６】
サンプル液は、サンプル供給管２９の遠位端２８における扁平な開口部を通じて、リボン状サンプルストリームの上方及び下方に（又はその両側に）ＰＩＯＡＬの安定した対称的な層流を生じさせるＰＩＯＡＬフローが実質的に確立された地点において、フローセル２２の内部に注入される。サンプルストリーム及びＰＩＯＡＬストリームは精密定量ポンプによって供給されてもよく、ポンプはＰＩＯＡＬを、注入されたサンプル液と共に、大幅に狭窄化する流路に沿って移動させる。ＰＩＯＡＬはサンプル液を包囲し、流路が狭窄化する区域２１内で圧縮する。それゆえ、区域２１における流路厚さの減少部はサンプルストリーム３２の幾何学的集束に寄与することができる。サンプル液リボン３２は包囲されてＰＩＯＡＬと一緒に狭窄化区域２１の下流へ運搬され、例えば、ＣＣＤ  ４８を用いて画像が収集される高光学解像度撮像デバイス２４の前を通過するか、又はさもなくばその観察区域２３を通過する。プロセッサ１８は、入力として、ＣＣＤ  ４８からピクセルデータを受け取ることができる。サンプル液リボンはＰＩＯＡＬと一緒に排出部３３へ流れる。
【００９７】
本明細書において使用するとき、狭窄化区域２１は、近位厚さＰＴを有する近位流路部分２１ａと、遠位厚さＤＴを有する遠位流路部分２１ｂを有することがあり、遠位厚さＤＴは近位厚さＰＴよりも小さい。したがってサンプル流体は、近位部分２１ａの遠位方向、かつ遠位部分２１ｂの近位方向にある位置で、サンプルチューブ２９の遠位端２８を通じて注入され得る。それゆえ、サンプル液は、ＰＩＯＡＬストリームが区域２１によって圧縮されるときにＰＩＯＡＬ外被に入ることができる。サンプル液注入管は、サンプル液が流動シース液内に注入される遠位出口ポートを有し、遠位出口ポートはフローセルの流路サイズの減少部によって囲まれる。
【００９８】
対物レンズ４６を有するデジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン状サンプルストリーム３２と交差する光軸に沿って方向づけられる。対物レンズ４６とフローセル３３との間の相対距離は、光センサアレイ上の合焦したデジタル化画像を解像して収集するために、モータ駆動装置５４の作動によって可変である。
【００９９】
フローセル
図２及び図３に、フローセル２２の実用的実施形態が更に示される。ここに示されるように、フローセル２２は、サンプル供給源２５と結合され、同様にＰＩＯＡＬ材料の供給源２７にも結合されることができる。サンプル液はカニューレ２９を介して、例えば、カニューレ２９の遠位出口ポート３１を通じて、フローセル２２内に注入される。通例、ＰＩＯＡＬシース液は、それがフローセル内の曲線状チャネル区間４１を通って供給源２７から観察区域２３に向かって移動する際には、層流状態ではない。しかし、フローセル２２は、ＰＩＯＡＬシース液が、サンプル液が流動シース液内に導入される遠位出口ポート３１を越えて流れる際には、ＰＩＯＡＬシース液は層流であるか若しくは層流になるように、又は平坦な速度分布を呈するように、構成することができる。サンプル液及びＰＩＯＡＬは、フローセル２２に沿って、矢印Ａによって大まかに指示される方向に流れ、その後、排出部３３を経てフローセル２２から出ることができる。フローセル２２は、（例えば遷移区域２１において）フロー方向Ａに対称的に狭窄化する内部流路２０を画定する。流路の対称性は、サンプルストリームの頑強な中心配置されたフローに寄与する。フローセル２２は、ＰＩＯＡＬによって包囲されたサンプルのフロー３２を、フローセル内の観察区域２３、すなわち、観察ポート５７の後ろの観察区域２３を通るように誘導するように構成される。ビューポート５７に関連付けられているのはオートフォーカスパターン４４である。フローセル２２はまた、顕微鏡対物レンズ（図示せず）を受け入れる、又は受容するように構成される丸い又はへこんだ座部５８も有する。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、オートフォーカスパターン４４は、フローセル２２に対して固定し、リボン状サンプルストリーム３２の平面から変位距離に配置される位置を有することができる。ここに示される実施形態では、オートフォーカスパターン（目標４４）は、高光学解像度撮像デバイス（図示せず）によってビューポート５７を通して収集された画像内で可視のロケーションにおいてフローセル２２に直接取り付けられている。フローセル２２は、第１若しくは上部部分若しくは層２２ａと、第２若しくは下部部分若しくは層２２ｂとで構築することができる。ここに示されるように、ガラス又は透明窓ガラス６０が第１の部分２２ａに取り付けられているか又はそれと一体になっている。窓ガラス６０はフローセル内のサンプル流路の少なくとも一部分を画定することができる。光源４２からの光は、フローストリーム３２内を流れるサンプル粒子を照明するために、オートフォーカスパターン４４の開口部又は通路を通って進むことができる。
【０１０１】
場合によっては、窓ガラス６０の厚さは約１５０μｍ〜約１７０μｍの範囲内の値を有することができる。上述したように、窓ガラス６０は流路又はシース（例えばＰＩＯＡＬ）チャネルの一部を規定又は形成することができる。薄い窓ガラス６０を用いることによって、顕微鏡対物レンズをサンプル液リボンの非常に近くに配置し、それゆえ、流路に沿って流れる粒子の高度に拡大された画像を得ることが可能である。
【０１０２】
図３Ａは、撮像軸３５５と遠位遷移区域部分３１６との間の距離が約８．２４ｍｍである、フローセルの実施形態の態様を示す。遠位遷移区域部分３１６とカニューレ出口ポート３３１との間の距離は約１２．５４ｍｍである。カニューレ出口ポート３３１とシース液入口３０１との間の距離は約１２．７ｍｍである。カニューレ出口ポート３３１と近位遷移区域部分３１８との間の距離は約０．７３ｍｍである。図３Ｂは、カニューレ出口ポートが、図３Ａの実施形態に比べて、遷移区域に対してより遠位のロケーションへ移動された、フローセルの実施形態の態様示す。ここに示されるように、カニューレ遠位端はフローセルの狭窄化遷移区域内へ前進させられ、撮像軸３５５と遠位遷移区域部分３１６との間の距離は約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内にある。場合によっては、撮像軸３５５と遠位遷移区域部分３１６との間の距離は約２１ｍｍである。
【０１０３】
図１の参照に戻ると、（例えば遷移区域２１における）フローセル内部輪郭並びにＰＩＯＡＬ流量及びサンプル流量は、サンプルがリボン状ストリーム３２に形成されるように調整することができる。ストリームは、リボン状サンプルストリーム内に包囲される粒子とおおよそ同じ薄さとするか、又はそれらよりも更に薄くすることができる。白血球は、例えば、１０μｍ前後の直径を有してもよい。１０μｍ未満の厚さを有するリボン状サンプルストリームを提供することによって、リボン状サンプルストリームがシース液、すなわちＰＩＯＡＬによって引き伸ばされたときに、細胞を配向させることができる。驚くべきことに、より高い粘度などの、リボン状サンプルストリームと異なる粘度のＰＩＯＡＬ層内で狭窄化流路に沿ってリボン状サンプルストリームを引き伸ばすことは、非球状粒子をフロー方向に実質的に平行な平面に整位させ、細胞に力を加え、細胞の細胞内構造の含有物の合焦を改善する有利な傾向を有する。高光学解像度撮像デバイス２４の光軸はリボン状サンプルストリームの平面に実質的に垂直（直角）である。撮像地点におけるリボン状サンプルストリームの線速度は、例えば、２０〜２００ｍｍ／秒であってもよい。いくつかの実施形態では、リボン状サンプルストリームの線速度は、例えば、５０〜１５０ｍｍ／秒であってもよい。
【０１０４】
リボン状サンプルストリームの厚さは、サンプル液及びＰＩＯＡＬの相対粘度及び流量によって影響を受け得る。例えば精密容積式ポンプを備える、サンプルの供給源２５及び／又はＰＩＯＡＬの供給源２７は、リボン状サンプルストリーム３２の寸法を最適化するために、すなわち、高光学解像度撮像デバイス２４の視野と少なくとも同じ幅の薄いリボンとして最適化するために制御可能な流量でサンプル及び／又はＰＩＯＡＬを提供するように構成することができる。
【０１０５】
一実施形態において、ＰＩＯＡＬの供給源２７は、ＰＩＯＡＬを所定の粘度で提供するように構成される。その粘度はサンプルの粘度と異なってもよく、サンプルの粘度よりも高くすることができる。ＰＩＯＡＬの粘度及び密度、サンプル材料の粘度、ＰＩＯＡＬの流量及びサンプル材料の流量は、リボン状サンプルストリームを、オートフォーカスパターンから変位距離に維持し、有利なリボン状サンプルストリームの厚さなどの、所定の寸法特性を有する状態に維持するように調整される。
【０１０６】
実用的実施形態では、ＰＩＯＡＬは、サンプルよりも高い線速度及びサンプルよりも高い粘度を有し、それにより、サンプルを平坦なリボン状に引き伸ばす。ＰＩＯＡＬ粘度は最大１０センチポアズに達し得る。
【０１０７】
図２及び図３も参照すると、フローセルの内部流路は、ＰＩＯＡＬ内へのリボン状サンプルストリームの注入の地点の下流で狭窄化し、例えば最大７μｍのリボン状サンプルストリーム厚さを作り出し、及び／又は内部流路は５００〜３，０００μｍのリボン状サンプルストリーム幅を作り出す。例示的な実施形態では、図１に示されるように、フローセルの内部流路は、ＰＩＯＡＬ内へのサンプルストリームの注入の地点の上流で狭窄化遷移区域が開始している。
【０１０８】
別の実施形態では、内部流路は、厚さ２〜４μｍのリボン状サンプルストリーム厚さを作り出すように狭窄化し、及び／又は内部流路は幅２０００μｍのリボン状サンプルストリームを生じさせる。これらの寸法は血液検査のために特に有用である。この場合のストリームの厚さは、弛緩状態の赤血球などの、いくつかの粒子の直径よりも小さい。その結果、それらの粒子は、識別特徴を明らかにするのに役立つ、自分のより広い寸法を撮像軸に向けるように再配向することができる。
【０１０９】
リボン状サンプルストリームの線速度は、光センサアレイの画像露光時間におけるデジタル化画像の動きぶれを阻止するために、十分に制限することができる。光源は、任意選択的に、短時間に高い入射振幅を加えるために一瞬光らせるストロボ光とすることができる。オートフォーカスパターン４４及び画像は同じ視野内にあるので、光源は、リボン状サンプルストリーム及びオートフォーカスパターンを同時に照明するように構成される。しかし、他の実施形態では、撮像のための視野とオートフォーカスのための視野は異なり、例えば、別々に照明し、及び／又は撮像することができる。
【０１１０】
主題の開発技術は方法の態様及び装置の態様を有する。視覚的分析器を合焦させる方法は、デジタル高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスであってもよい高光学解像度撮像デバイス２４を、フローセル２２に対して固定したオートフォーカスパターン４４に合焦させること含む。ここで、オートフォーカスパターン４４はリボン状サンプルストリーム３２から変位距離５２に配置される。デジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン状サンプルストリーム３２と交差する光軸を有する対物レンズを有する。対物レンズとフローセル２２との間の相対距離はモータ駆動装置５４の作動によって変化させるが、一方で、高光学解像度撮像デバイスと最適焦点の地点との間の光軸に沿った距離は既知である。デジタル高光学解像度撮像デバイスは、光センサアレイ上のデジタル化画像を解像して収集するように構成される。オートフォーカスプロセスでは、モータ駆動装置を作動させ、オートフォーカスパターンに合焦する。次に、モータ駆動装置を変位距離にわたって作動させ、それにより、高光学解像度撮像デバイスをリボン状サンプルストリームに合焦させる。
【０１１１】
本方法は更に、リボン状サンプルストリームをリボン形状に形成することを更に含むことができる。リボン形状は、高光学解像度撮像デバイスの光軸がリボン状サンプルストリームに対して実質的に直角になるように、すなわちリボン状ストリームの平面に垂直になるように示される。
【０１１２】
図４は、血液流体サンプル内の粒子を撮像するためのシステム４００の態様を示す。ここに示されるように、システム４００は、サンプル液注入システム４１０、フローセル４２０、及び画像キャプチャデバイス４３０、及びプロセッサ４４０を含む。フローセル４２０は、シース液の流れを、任意選択的にサンプル液と相まって、送出する流路４２２を提供する。いくつかの実施形態によれば、サンプル液注入システム４１０はカニューレ若しくは管４１２を含むか、又はそれと結合させることができる。サンプル液注入システム４１０は、流路４２２と流体連通していることができ、サンプル液ストリーム４２８を提供するために、サンプル液４２４をカニューレ４１２の遠位出口ポート４１３を通じてフローセル４２０内の流動シース液４２６内に注入するように動作することができる。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、サンプル液注入システム４１０に、サンプル液４２４を流動シース液４２６内に注入させるように構成されるコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を含むか、又はそれと共同して動作してもよい。ここに示されるように、シース液４２６はシース液注入システム４５０によってフローセル４２０内に導入することができる。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、シース液注入システム４５０に、シース液４２６をフローセル４２０内に注入させるように構成されるコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を含むか、又はそれと共同して動作してもよい。
【０１１３】
サンプル液ストリーム４２８は、注入管４１２に隣接して第１の厚さＴ１を有する。フローセルの流路４２２は流路サイズの減少部を有し、それにより、サンプル液ストリーム４２８の厚さは初期の厚さＴ１から画像キャプチャサイト４３２に隣接して第２の厚さＴ２へ減少する。画像キャプチャデバイス４３０は、フローセル４２０の画像キャプチャサイト４３２において第１のサンプル液からの第１の複数の粒子を撮像するために、画像キャプチャサイト４３２と位置合わせされる。
【０１１４】
プロセッサ４４０は、サンプル液注入器システム４１０、画像キャプチャデバイス４３０、及び任意選択的にシース液注入システム４５０と結合される。プロセッサ４４０は、流動シース液４２６内への第１のサンプル液の注入を終了し、流動シース液４２６内への第２のサンプル液の注入を始め、それにより、サンプル液過渡状態が開始されるように構成される。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、サンプル液注入システム４１０に、第２のサンプル液を流動シース液４２６内に注入させ、それにより、サンプル液過渡状態が開始されるようにするように構成されるコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を含むか、又はそれと共同して動作してもよい。
【０１１５】
更に、プロセッサ４４０は、サンプル液過渡状態の後、及び第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に、フローセル４２０の画像キャプチャサイト４３２における第２のサンプル液から第２の複数の粒子の画像のキャプチャを開始するように構成される。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、画像キャプチャデバイス４３０に、サンプル液過渡状態の後、及び第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に、フローセル４２０の画像キャプチャサイト４３２における第２のサンプル液から第２の複数の粒子の画像のキャプチャを開始させるように構成されるコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を含むか、又はそれと共同して動作してもよい。
【０１１６】
図４Ａに示されるフローセルの実施形態において示されるように、（例えば遷移区域４１９ａにおける）流路サイズの減少部は、流路４２２ａの対向壁４２１ａ、４２３ａによって規定され得る。対向壁４２１ａ、４２３ａは、流路４２２ａに沿って半径方向内側へ、サンプル液ストリーム４２８ａを二等分する横断面４５１ａを中心として概ね対称に角度付けることができる。平面４５１ａは、サンプルストリーム４２８ａがカニューレ又はサンプル注入管４１２ａの遠位部４２７ａを出るロケーションにおける、サンプルストリームが第１の厚さＴ１を有する場所で、サンプルストリーム４２８ａを二等分することができる。同様に、平面４５１ａは、サンプルストリーム４２８ａが画像キャプチャサイト４３２ａを通るロケーションにおける、サンプルストリームが第２の厚さＴ２を有する場所でサンプルストリーム４２８ａを二等分することができる。いくつかの実施形態によれば、第１の厚さＴ１は約１５０μｍの値を有し、第２の厚さＴ２は約２μｍの値を有する。このような場合には、サンプルリボンストリームの圧縮比は７５：１になる。いくつかの実施形態によれば、第１の厚さＴ１は約５０μｍ〜約２５０μｍの範囲内の値を有し、第２の厚さＴ２は約２μｍ〜約１０μｍの範囲内の値を有する。サンプルストリーム流体がフローセルを通って流れるにつれて、リボンは、加速して引き伸ばされながら、薄化する。フローセルの２つの特徴がサンプル液リボンの薄化に寄与することができる。第１に、シース液外被とサンプル液リボンとの速度差が、リボンの厚さを縮小するように機能することができる。第２に、遷移区域の先細状の幾何形状が、リボンの厚さを縮小するように機能することができる。
【０１１７】
通例、第１の厚さＴ１はサンプル粒子のサイズよりもはるかに大きく、それゆえ、粒子はサンプルリボンストリーム内に完全に包含される。しかし、第２の厚さＴ２は一部のサンプル粒子のサイズよりも小さくてもよく、それゆえ、それらの粒子はサンプル液から周囲のシース液内へ延出してもよい。図４Ａに示されるように、サンプルリボンストリームは、それがカニューレを出て画像キャプチャサイトに向かって移動する際に、概ね、同じ平面に沿って流れることができる。
【０１１８】
フローセルは、遠位カニューレ部４２７ａと画像キャプチャサイト４３２ａとの間の離隔距離４３０ａを提供することもできる。いくつかの実施形態によれば、サンプル液注入管４１２ａの遠位部４２７ａは、画像キャプチャサイト４３２ａから軸方向離隔距離４３０ａに位置付けることができる。ここでは、軸方向離隔距離４３２ａは約２１ｍｍの値を有する。場合によっては、軸方向離隔距離４３０ａは約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内の値を有する。
【０１１９】
カニューレ出口ポートと画像キャプチャサイトとの間の軸方向離隔距離４３０ａは、液が出口ポートから画像キャプチャサイトへ移動する際のサンプル液のための通過時間に影響を与えることができる。例えば、比較的より短い軸方向離隔距離４３０ａはより短い通過時間に寄与することができ、比較的より長い軸方向離隔距離４３０ａはより長い通過時間に寄与することができる。
【０１２０】
流路遷移区域４１９ａに対する、又は流路遷移区域４１９ａの近位部４１５ａに対するカニューレ遠位部４２７ａにおける出口ポートの位置もまた、液が出口ポートから画像キャプチャサイトへ移動する際のサンプル液のための通過時間を推論することができる。例えば、シース液は、近位部４１５ａにおいては比較的より遅いスピードを有し、近位部４１５ａと遠位部４１６ａとの間のロケーションにおいては比較的より速いスピードを有してもよい。それゆえ、遠位部４２７ａにおけるカニューレ出口ポートが近位部４１５ａに位置付けられる場合には、サンプル液が画像キャプチャサイトに到達するために要する時間量はより長くなることになる。これは、移動距離がより長いためだけでなく、カニューレ遠位ポートを出た後のサンプル液の初期スピードが（より遅いシース液スピードのために）より遅いためでもある。言い換えれば、サンプル液がフローセルの（例えば近位部４１５ａ付近の）より厚い部分内に長く存在するほど、サンプルが画像キャプチャサイトに到達するのに要する時間は長くなる。逆に、遠位部４２７ａにおけるカニューレ出口ポートが近位部４１５ａに対して遠位に（例えば、図４Ａに示されるように、近位部４１５ａと遠位部４１６ａとの間の中心ロケーションに）位置付けられる場合には、サンプル液が画像キャプチャサイトに到達するために要する時間量はより短くなることになる。これは、移動距離がより短いためだけでなく、カニューレ遠位ポートを出た後のサンプル液の初期スピードが（より速いシース液スピードのために）より速いためでもある。本明細書の他の箇所で説明されているように、シース液は、遷移区域４１９ａを通って流れる際に、区域４１９ａの断面積の狭窄化のために、加速される。
【０１２１】
いくつかの実施形態によれば、より短い通過時間を用いることで、より多くの時間を画像キャプチャサイトにおける画像収集のために利用可能である。例えば、カニューレ遠位端から撮像領域までの通過時間の期間が短くなるほど、特定の量の時間内にサンプルをより多く処理することが可能になり、関連して、特定の量の時間内の画像（例えば１分ごとの画像）をより多く得ることが可能になる。
【０１２２】
カニューレ遠位部４２７ａの出口ポートを画像キャプチャサイト４３２ａにより近接して位置付けることに関連付けられる利点があるとはいえ、ポートとキャプチャサイトとの間にはいくらかの距離を維持することも望ましい。例えば、図３に示されるように、撮像デバイスの光学対物レンズ又は前方レンズはフローセル２２の座部５８内に位置付けることができる。カニューレの出口ポート３１が座部５８に近すぎる場合には、このとき、サンプル液は、シース液内に注入された後に、画像キャプチャサイトにおける所望の撮像特性を提供するために十分に安定化されない場合がある。同様に、先細状の領域が、画像キャプチャデバイス対物レンズを受容する座部５８の位置付けに支障を来さないように、先細状遷移領域２１を観察区域２３から一定の距離離して維持することが望ましい場合がある。
【０１２３】
図４Ａを引き続き参照すると、サンプル液注入管４１２ａの下流端部４２７ａは流路遷移区域４１９ａの近位部４１５ａに対して遠位に位置付けることができる。関連して、サンプル液注入管４１２ａの下流端部４２７ａは流路遷移区域４１９ａの遠位部４１６ａに対して近位に位置付けることができる。それゆえ、いくつかの実施形態によれば、サンプル液は遷移区域４１９ａ内のロケーションにおいて注入カニューレ４１２ａからフローセル内へ注入することができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態によれば、（例えば流路遷移区域４１９ａにおける）流路サイズの減少部の対称性は、血液流体サンプル内の粒子整位不良を抑制するように機能する。例えば、このような対称性は、血液流体サンプル内の赤血球撮像配向整位不良を約２０％未満に抑制するために有効となり得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されている方法は、血球数分析の間の標識率をサンプルの３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％又は５％未満にするように可能である。
【０１２６】
いくつかの実施形態によれば、画像キャプチャサイト４３２ａは約１５０μｍ×１５０μｍ〜４００μｍ×４００μｍの視野４３３ａを有する。場合によっては、画像キャプチャサイト４３２ａは約２７５μｍ×２７５μｍの視野４３３ａを有する。場合によっては、視野は、長さ掛ける幅を用いて定義することができる。表面積として表す場合には、２７５μｍ×２７５μｍの視野は７５，６２５μｍ２の面積を有する。いくつかの実施形態によれば、視野は撮像デバイス対物レンズ及びその倍率によって判定することができる。場合によっては、視野は、収集光学素子（例えば対物レンズ、チューブレンズ、及びカメラ）によって撮像される場（エリア）の範囲に対応することができる。場合によっては、視野は画像キャプチャサイトにおける透明なエリアの観察ポートよりもはるかに小さい。
【０１２７】
図４Ａ−１及び図４Ａ−２は、サンプルストリームがカニューレ出口ポートから画像キャプチャサイトへ移動する際のサンプルストリームに対するハイドロフォーカシングの効果を示す。図４Ａ−１に示されるように、サンプルストリームは約１５０μｍの高さＨ（Ｓ）及び約１３５０μｍの幅Ｗ（Ｓ）を有することができる。更に、ＰＩＯＡＬシースストリームは約６０００μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）を有することができる。ハイドロフォーカシングの後では、図４Ａ−２に示されるように、サンプルストリームは約２μｍの高さＨ（Ｓ）及び約１３５０μｍの幅Ｗ（Ｓ）を有することができる。更に、ＰＩＯＡＬシースストリームは約１５０μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）を有することができる。一実施形態において、カニューレ出口におけるＰＩＯＡＬシースストリームの断面積は画像キャプチャサイト付近の断面積よりも４０倍大きい。
【０１２８】
いくつかの実施形態によれば、画像キャプチャサイトにおけるフローセルチャネルの断面を判定することが有用となり得る。これは、図４Ａ−２に示されるように、約１５０μｍのＰＩＯＡＬシースストリーム高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）に対応することができる。また、画像キャプチャサイトにおけるフローセルを通って流れる一体化したサンプル液及びシース液の体積流量を決定することも有用となり得る。断面積及び流量が分かれば、画像キャプチャサイトにおける一体化したサンプル液及びシース液の速度を決定することが可能である。
【０１２９】
いくつかの実施形態によれば、フローセルを通るサンプル液及びシース液のフローは平行板プロファイルモデルを用いて近似することができる。関連して、（例えば図４Ａ−２に示される通りの）サンプル液ストリームの中心における流量は、一体化したサンプル及びシース液ストリームの平均流量の約１．５倍になり得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、カニューレ出口におけるサンプルフローの断面積（例えば図４Ａ−１におけるＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））は、撮像サイトにおけるサンプルフローの断面積（例えば図４Ａ−２におけるＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））よりも４０倍大きい。撮像領域におけるシース液の体積流量は約４５μＬ／秒になり得る。撮像領域におけるサンプル液の体積流量は約０．２３２μＬ／秒になり得る。場合によっては、撮像サイトにおける一体化したシースストリーム及びサンプルストリームの断面積は６００，０００μｍ２になる。場合によっては、撮像サイトにおける平均フローストリーム速度は７５ｍｍ／秒になる。
【０１３１】
流量又は流速は、鮮明な合焦した細胞画像を生じさせる速度として決定することができる。例示的な流量及び流速は、撮像サイトにおいて一定のサンプルフローストリームリボン形状又は特性を達成することが観察された２つのサンプルの流量に基づいて発見された。例えば、約７５ｍｍ／秒（又は２０〜２００ｍｍ／秒の範囲内）の流量では、細胞は、連続した画像内に細胞の重複が存在するほどにゆっくり流れすぎることもなく、細胞は、ゴースト効果（ぼけた画像）が生じるほどに速く流れすぎることもない。関連して、過度に高い流量を回避することによって、より多くの試薬及びサンプルを節約することが可能になる。いくつかの実施形態によれば、体積流量（ポンプ速度）又はカニューレの形状のどちらかを変化させることによって、最適又は所望の線速度を達成することができる。
【０１３２】
画像キャプチャ区域を通るサンプルストリームの流速は、フローセル機能に対する画像キャプチャデバイスの性能にも関連し得る。例えば、サンプルストリームがもし急速に流れすぎる場合には、サンプル内に包含された粒子の鮮明な画像を得ることが困難になる場合がある（例えば、画像キャプチャデバイスのシャッタースピードが遅すぎるために、ぼけた画像を生成してしまう場合がある）。同様に、サンプルストリームがゆっくり流れすぎる場合には、画像キャプチャデバイスは同じ粒子の連続画像を得てしまう場合がある（例えば、２度の画像キャプチャの際に同じ粒子がキャプチャコマ内に残ってしまう）。いくつかの実施形態では、サンプルリボンの速度は画像キャプチャ速度に対して（例えば、様々なフローセル動作パラメータのうちのいずれかを調整することによって）調節することができ、そのため、コマキャプチャの合間のフローは最小限に抑えられ、それゆえ、サンプルのうちの高い割合が撮像される。
【０１３３】
いくつかの実施形態によれば、粒子分析システム及び関連構成要素は、シース液及び流体サンプルがフローセルを流れる際に、シース液は４５μＬ／ｓのシース液体積流量で流れることができ、流体サンプルは０．２３２μＬ／ｓ（又は０．２〜０．３５μＬ／ｓの範囲内）の流体サンプル体積流量で流れることができるように構成することができる。場合によっては、シース液流量の、サンプル液流量に対する比は約２００である。場合によっては、シース液流量の、サンプル液流量に対する比は約７０〜２００の範囲内の値を有する。場合によっては、シース液流量の、サンプル液流量に対する比は約１９３である。場合によっては、シース液流量の、サンプル液流量に対する比は約７０である。場合によっては、シース液体積の、フローセル内を流れる流体サンプル体積に対する比は２５：１〜２５０：１の範囲内にあることができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態によれば、システム及び関連構成要素は、シース液及び流体サンプルがフローセル４２０を流れる際に、シース液は撮像領域の前で７５ｍｍ／秒のシース液速度で流れることができ、流体サンプルは撮像領域の前で１３０ｍｍ／秒の流体サンプル速度で流れることができるように構成することができる。場合によっては、シース液体積の、フローセル内を流れる流体サンプル体積に対する比は１００：１〜２００：１の範囲内にあることができる。
【０１３５】
場合によっては、フローセルは約５０：１の最小圧縮比及び約１２５：１の最大圧縮比を有することができる。場合によっては、最小圧縮比は約３０：１又は２０：１であることができる。この圧縮比は、図４Ａ−１を図４Ａ−２と比較した場合のフローストリーム厚さの比Ｈ（Ｓ）：Ｈ（Ｓ）を指す。この圧縮比は、幾何学的圧縮（例えば、図４Ａ−１を図４Ａ−２と比較した場合のシース液厚さの比Ｈ（Ｐ）：Ｈ（Ｐ）であり、また、図４Ａに示されるフローセル狭窄化先細状遷移区域４１９ａの寸法にも概ね対応し得る）と、流体力学的圧縮（例えば、同様に速度の差にも対応する）との組み合わせによって影響を受け得る。いくつかの実施形態によれば、幾何学的圧縮比は約４０：１である。
【０１３６】
遷移区域に対応する流路サイズの減少部は、近位厚さ若しくは高さを有する近位流路部、並びに近位厚さ若しくは高さよりも小さい遠位厚さ若しくは高さを有する遠位流路部によって画定することができる。例えば、図４Ｂの部分図に示されるように、流路の遷移区域４１９ｂは近位部４１５ｂと遠位部４１６ｂとの間の長さＬを有することができる。ここで、近位部４１５ｂは近位高さ４１７ｂを有し、遠位部４１６ｂは遠位高さ４１８ｂを有する。本明細書の他の箇所において述べられているように、遷移区域の形状又は輪郭は曲線状又は滑らかにすることができ、例えば、Ｓ字曲線、シグモイド曲線、又は正接曲線の形状で提供することができる。いくつかの実施形態によれば、近位高さ４１７ｂは約６０００μｍの値を有する。場合によっては、近位高さ４１７ｂは約３０００μｍ〜約８０００μｍの範囲内の値を有する。いくつかの実施形態によれば、遠位高さ４１８ｂは約１５０μｍの値を有する。場合によっては、遠位高さ４１８ｂは約５０μｍ〜約４００μｍの範囲内の値を有する。
【０１３７】
遷移区域４１９ａの幾何形状は、第１の流路境界４０３ｂと二等分横断面４５１ｂとの間の第１の角度α１、及び第２の流路境界４０４ｂと二等分横断面４５１ｂとの間の第２の角度α２を与えることができる。場合によっては、角度α１は約４５度であり、角度α２は約４５度である。場合によっては、角度α１は約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。場合によっては、角度α２は約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。いくつかの実施形態によれば、角度α１及びα２は同じ値を有する。角度α１及びα２は、層流を維持するか、又はサンプル液が近位部４１５ｂから遠位部４１６ｂへ移動する際のサンプル液の乱流を最小限に抑えるように選択することができる。これは結果として、横断面４５１ｂに沿ったサンプル内の粒子の整位を向上させることができる。図４Ａを参照して上述したように、遠位境界及び近位境界、あるいは遷移区域の部分は、折れ曲がる代わりに、曲線状又は滑らかであってもよい。
【０１３８】
図４Ｋに示されるように、フローセル４２０ｋの画像キャプチャサイト４３２ｋを通って流れるサンプルストリームリボンＲは約２μｍの厚さＴを有することができる。場合によっては、サンプルストリームリボンの厚さＴは最大約３μｍであることができる。通例、リボン内には、サンプルストリーム厚さよりも小さい細胞又は粒子が包含されることになる。典型的な赤血球（ＲＢＣ）は両凹の円板として存在することができ、約６．２μｍ〜約８．２μｍの直径Ｄを有することができる。更に、典型的な赤血球は、約２μｍ〜約２．５μｍの最大厚さＴ１、及び約０．８μｍ〜約１μｍの最小厚さＴ２を有することができる。場合によっては、赤血球は最大約３μｍの厚さを有することができる。典型的なヒト血小板はサイズにばらつきがあり得、約２μｍの厚さ又は直径も有し得る。ここでは原寸に比例して示されていないが、フローセルは、画像キャプチャサイトにおいて、約１５０μｍの値を有する流路厚さＨを画定することができる。場合によっては、流路厚さＦは５０μｍ〜４００μｍの値を有する。この流路厚さＦはまた、図４Ｂに示される遠位部４６１ｂの遠位高さ４１８ｂにも対応することができる。
【０１３９】
図４Ｋに示されるように、サンプル液ストリームの厚さＴの、粒子（赤血球）の厚さに対する比は約１：１である。いくつかの実施形態によれば、画像キャプチャサイトにおけるサンプル液ストリームの厚さＴの、粒子のうちの１つのサイズに対する比は０．２５〜２５の範囲内にある。場合によっては、厚さＴは０．５μｍ〜５μｍの範囲内の値を有することができる。シース液とサンプル液との粘度差は、フローセル内におけるリボンサンプルストリームの所望の位置付けを達成するように選択することができる。
【０１４０】
本明細書の他の箇所、並びに同時継続中の米国特許出願番号第＿＿＿＿号において述べられているように、サンプルリボンＲの流体とシース液との粘度差は、サンプルストリーム内の粒子、例えば赤血球、をフローの方向に沿って整位又は配向させるように機能することができる。そのように整位されると、図４Ｋに示されるように、血球の主表面はカメラの方に向いているので、撮像デバイス又はカメラは、赤血球が丸く見えるように赤血球の画像を得ることができる。このように、赤血球は、フローに対して低い抵抗を示す整位の姿勢をとる。それゆえ、シース液及びサンプル液の相対的な粘度特性は、赤血球のうちの高い割合又は多数がカメラの方を向くことに寄与することができ、かくして、粒子分析システムの評価能力を高める。
【０１４１】
いくつかの実施形態によれば、シース液の粘度特性は血液流体サンプル内の粒子整位不良を抑制するように機能する。例えば、粘度差は、血液流体サンプル内の赤血球撮像配向整位不良を約１０％未満に抑制するために有効となり得る。すなわち、サンプル内の１００個の赤血球のうち９０個以上の赤血球を、それらの主表面が撮像デバイスの方を向くように整位させることができる。対称的な狭窄化遷移区域は２０％の値を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、シース液は水の屈折率（すなわちｎ＝１．３３３０）と同様の屈折率を有する。場合によっては、シース液は約８９％の含水量を有する。粘度差の結果として観察される整位効果に加えて、左右相称の先細状遷移区域の結果としての整位効果も観察される。場合によっては、左右相称の（すなわち対称的な）先細状遷移区域は、非対称的な先細状遷移区域設計に比較して、粒子の整位に２倍有効であることが観察される。
【０１４２】
赤血球の効率のよい整位は診断の改善に寄与することができる。場合によっては、撮像された赤血球の形状を用いて、サンプルを得た患者は特定の生理的状態又は病気を有しているかどうかを判定することができる。例えば、鎌状赤血球症の患者は、異常な（すなわち鎌の形状の）形状を有する血球を示す。それゆえ、整位した赤血球の高品質画像を得ることによって、正確な診断を確実にすることが可能になる。赤血球のその他の形状変化、例えば、薄い周辺領域及び大きな平らな中心領域を有し、それによって赤血球は自転車のタイヤの外形を有するように見える赤血球も、本整位手法を用いて効果的に撮像することができる。同様に、小さな中心部、及び厚い周辺領域を有し、それにより赤血球はトラックのタイヤの外形を有するように見える赤血球も、診断目的のために撮像することができる。本明細書に開示されている改善された撮像手法はまた、ヘモグロビン含有量、鉄含有量、及び同様のものなどの、他の赤血球特性の評価にも有用である。
【０１４３】
いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、シース液の粘度とサンプル液の粘度との粘度差は修正放物線分布を作り出すと考えられている。この分布は概ね放物線状であり、加速が増大するフローの中心領域に対応する中心隆起を有し、中心隆起はサンプル粒子又は粒子内小器官の整位に寄与する。いくつかの実施形態によれば、シースとサンプルリボンとの速度差、及び粘度差は剪断力を発生し、小器官又は細胞内粒子の整位を増進する。シース液放物線分布の例示的な態様が、同時係属中の米国特許出願第＿＿＿＿＿＿＿号に説明されている。同出願の内容は本明細書において参照により組み込まれている。
【０１４４】
白血球は通例、赤血球及び血小板よりも大きい。例えば、例示的な好中球及び好酸球は約１０μｍ〜約１２μｍの直径を有することができる。例示的な好塩基球は約１２μｍ〜約１５μｍの直径を有することができる。例示的なリンパ球（小）は約７μｍ〜約８μｍの直径を有することができ、例示的なリンパ球（大）は約１２μｍ〜約１５μｍの直径を有することができる。例示的な単球は約１２μｍ〜約２０μｍの直径を有することができる。フローセルを通過する際のシース液と流体サンプルリボンとの間の相互作用を含む粒子分析システムの構成は、図４Ｌに指示されるように、白血球が画像キャプチャサイト４３２ｌを通って移動する際に白血球を圧縮するように機能することができる。それゆえ、例えば、白血球（ＷＢＣ）の中心部はサンプル液リボンＲ内に位置付けられることができ、白血球の周辺部はシース液内に位置付けられることができる。それゆえ、白血球がリボンによってフローセルを通って輸送されるにつれて、白血球の両側はシース液内へ延出することができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態によれば、シース液とサンプル液との粘度差は、白血球などの細胞内に存在する小器官又はその他の細胞内の特徴を整位させるように機能することができる。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、シース液とサンプル液との粘度差に関連付けられる剪断力が、細胞内の特徴を整位させるように白血球に作用し得ると考えられている。場合によっては、シース液とサンプル液との速度差に関連付けられる剪断力がこのような整位に寄与し得る。これらの整位効果は、粒子とサンプル液リボンとのサイズの差によっても影響を受ける場合がある。例えば、粒子の部分がサンプル液リボンから周囲のシース液内へ延出する場合には、粘度の差に関連付けられる剪断力が細胞内の特徴の整位に顕著な効果を及ぼし得る。
【０１４６】
図４Ｌに示されるように、白血球などの細胞の部分はシース液内へ延出することができる。本発明の実施形態は、シース液組成物であって、細胞がそのシース液に曝されたときに、細胞を溶解又は寸断しないか、又はさもなくば外側の細胞膜の完全性を損なわない、シース液組成物を包含する。細胞膜又は細胞壁がサンプル液リボンとシース液外被との間の界面を横切るか、あるいはさもなくばサンプル液ストリームから流動シース液内へ延出したときに、細胞の構造（例えば形状）及び含有物（例えば核）を無傷のまま残すために、シース液内の粘性剤はサンプル液ストリーム内の細胞の生存力を保持するように機能することができる。
【０１４７】
多くの場合、細胞又は粒子がフローセルに沿ってサンプル液リボン内を流れるにつれて細胞又は粒子に作用する圧縮力が存在する。それゆえ、細胞は、狭窄化遷移区域の結果として細胞が圧縮状態にあるか、又はさもなくば圧縮力を受ける間に、シース液と接触する場合がある。シース液の粘性剤は、圧縮された細胞を、それらが薄いサンプル液リボンから現れ、粘性シース液に曝されたときに、少なくとも、細胞が画像キャプチャサイトに到達するまでは、寸断又は破壊されないように保護するように機能することができる。それゆえ、シース液の粘性剤組成物は細胞保護剤として機能することができ、同時に、粒子又は粒子内含有物の整位も向上させる。
【０１４８】
図４Ｋ及び図４Ｌを参照すると、場合によっては、細胞又は粒子の部分は薄いサンプル液リボンＲから周囲のシース液内へ延出することがある。同時係属中の米国特許出願第＿＿＿＿号に説明されているように、シース液は、シース液が細胞又は粒子を分断するか又は溶解させるのを抑止又は阻止する細胞保護剤を含有してもよい。例えば、シース液は、細胞がシース液の化学的環境に曝されたときに、細胞壁の構造的完全性を保存する細胞保護剤を含有してもよい。同様に、細胞保護剤はまた、細胞が、フローセル幾何形状、並びにサンプル液とシース液との速度及び／若しくは粘度の差によって引き起こされる何らかの剪断力を経験したときに、細胞壁の構造的完全性を保存するように機能してもよい。関連して、保護剤は、サンプル液とシース液との速度の差から生じる力から細胞又は粒子を保護することができる。このように、細胞は、それらが画像キャプチャサイトに到達するときに、それらの生存力を保持する。
【０１４９】
剪断力はサンプル液リボンとシース液外被との間の界面において大きくなり得る。いくつかの実施形態によれば、フローセル流路内のフローは放物線状のフロー分布によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態によれば、サイズが十分に大きい粒子は、このような粒子が単一の流体相内（すなわちシース液外被内、又は代替的にサンプル液リボン内のいずれか）に完全に包含されている場合でさえ、いくらかの量の剪断力を受けることになる。
【０１５０】
場合によっては、シース液の速度はサンプル液の速度と異なってもよい。例えば、シース液は８０ｍｍ／秒で移動してもよく、サンプル液は６０ｍｍ／秒で移動してもよい。それゆえ、場合によっては、サンプル液は、周囲の外被のシース液スピードよりも遅いサンプル液スピードで遠位カニューレポートを出る。それゆえ、シース液は、カニューレの流路に沿ってサンプル液を引っ張るように機能することができ、かくして、サンプル液を加速し、サンプル液リボンの厚さを縮小する。サンプル液リボンは全体の体積及び質量を維持する。そのため、その移動が速くなるにつれて、それは薄くなっていく。いくつかの実施形態によれば、シース液及びサンプル液はどちらも画像キャプチャサイトにおいて約２０〜２００ｍｍ／秒の速度を有する。
【０１５１】
通例、サンプル液がカニューレ出口ポートから画像キャプチャサイトへ移動するにつれて、サンプル液の速度は増加する。場合によっては、画像キャプチャサイトにおけるサンプル液の速度は、カニューレ遠位部におけるカニューレポートを出る際のサンプル液の速度の４０倍になる。いくつかの実施形態によれば、サンプルリボンの断面積の減少は速度の増加に対して線形である。いくつかの実施形態によれば、カニューレ出口におけるシース速度がサンプルリボン速度よりも高い場合には、これもまた撮像領域における最終的なサンプルリボン速度を増加させることになる。
【０１５２】
シース液は、サンプル液リボンに対して、及びサンプル液リボン内の粒子に対して大きな剪断力を加えるように機能することができる。いくらかの力はフローの方向に平行であり、粒子は、フローの方向に直角である力に遭遇する場合もある。多くの場合、シース液及びサンプル液が画像キャプチャサイト又は区域に接近するにつれて、シース液及びサンプル液は同じ速度又はその付近の速度で移動していく。それゆえ、画像キャプチャサイトを通過する際のシース液とサンプル液との間の境界又は界面は、遠位カニューレ出口ポートにおける、又は先細状遷移区域における境界又は界面に比較して、より低い剪断力を呈してもよい。例えば、先細状遷移区域においては、シース液外被とサンプル液リボンとの間の境界又は界面は過渡期にあることができ、そのため、最初はより遅く、より厚いサンプルリボンは、より速く、より薄くなっていき、サンプル液内の粒子はより整位していく。言い換えれば、剪断力は先細状遷移区域において顕著であってよく、画像キャプチャサイトに向かって消失することができる。画像キャプチャサイトにおける剪断力は放物線分布によって表現することができ、先細状遷移区域における剪断力よりもはるかに低くなり得る。それゆえ、細胞又は粒子は、それらが遷移区域を通過する際にはより高い剪断力を経験し、それらが画像キャプチャサイトを通過する際にはより低い剪断力を経験することができる。いくつかの実施形態によれば、シース液とサンプル液との粘度差は赤血球を整位させ、その結果、合焦させることができる。いくつかの実施形態によれば、シース液とサンプル液との粘度差は白血球小器官を整位させ、その結果、合焦させることができる。関連して、ストリームの幾何学的狭窄化及びシース液とサンプル液との速度差の結果として、整位して合焦した細胞成分及び小器官成分の向上した撮像結果を得ることができる。
【０１５３】
本明細書の他の箇所において述べられているように、並びに図４Ｋ及び図４Ｌを参照すると、シース液及びサンプル液Ｒがフローセルの流路サイズの縮小部又は遷移区域を通って撮像サイト４３２ｋ又は４３２ｌに向かって流れるにつれて、シース液粘度とサンプル液粘度との粘度差に関連付けられるシース液とサンプル液Ｒとの間の相互作用によって引き起こされる粘性ハイドロフォーカシング効果が、流路サイズの縮小部又は遷移区域に関連付けられるシース液とサンプル液Ｒとの間の相互作用によって引き起こされる幾何学的ハイドロフォーカシング効果と相まって、撮像サイト４３２ｋ又は４３２ｌにおける複数の粒子の少なくとも一部における目標撮像状態を提供する。
【０１５４】
場合によっては、本発明の実施形態は、シース液又は粒子及び細胞内小器官整位液（ＰＩＯＡＬ）などの、本明細書に記載されている通りの血液検査システムと共に使用するための組成物を含む。このようなシース液又はＰＩＯＡＬは、粘度及び形状の組み合わせによるハイドロフォーカシングを行う視覚的分析器における使用に適している。ＰＩＯＡＬは、視覚的分析器の狭窄化フローセル遷移区域を通る所与の粘度の血液サンプル液のフローを誘導するか又は容易にするように機能することができる。ＰＩＯＡＬは、サンプルの粘度よりも高い粘度を有する流体を含むことができる。粘度差に関連付けられるＰＩＯＡＬ液とサンプル液との間の相互作用によって引き起こされる粘性ハイドロフォーカシング効果は、狭窄化フローセル遷移区域に関連付けられるＰＩＯＡＬ液とサンプル液との間の相互作用によって引き起こされる幾何学的ハイドロフォーカシング効果と相まって、血液サンプル液内の細胞の生存力を保持しつつ視覚的分析器の撮像サイトにおける複数の粒子のうちの少なくとも一部における目標撮像状態を提供するために有効となり得る。
【０１５５】
図４Ｍは、葉４１０ｍなどの内部小器官を有する例示的な好中球４００ｍ（白血球の一種）を示す。サンプル液とシース液との粘度差の結果として、内部小器官は、図４Ｎにおいて指示されるように、細胞内で整位させることができる。それゆえ、細胞内小器官は、画像キャプチャデバイス４３０ｍを用いて、小器官が互いに重なり合うことなく、効果的に撮像することができる。すなわち、図４Ｍに示されるように葉が互いに積み重なる代わりに、画像キャプチャデバイスの撮像軸又は光軸から見ると、図４Ｎに示されるように、葉は整位し、隣り合って並んでいる。それゆえ、葉は、キャプチャされた撮像されたものの内でより効果的に視覚化することができる。内部小器官の整位は、サンプル液とシース液との粘度差の驚くべき予想外の結果である。したがって、粘度差、流体力学的流動、及び幾何学的圧縮の特徴を用いて、細胞の整位及び合焦に対応する改善された撮像結果が達成される。
【０１５６】
本明細書の他の箇所において述べられているように、並びに図４Ｍ及び図４Ｎを参照すると、シース液及びサンプル液Ｒがフローセルの流路サイズの縮小部又は遷移区域を通って画像キャプチャデバイス４３０ｍ又は４３０ｎの撮像サイトに向かって流れるにつれて、シース液粘度とサンプル液粘度との粘度差に関連付けられるシース液とサンプル液Ｒとの間の相互作用によって引き起こされる粘性ハイドロフォーカシング効果が、流路サイズの縮小部又は遷移区域に関連付けられるシース液とサンプル液Ｒとの間の相互作用によって引き起こされる幾何学的ハイドロフォーカシング効果と相まって、撮像サイトにおける複数の粒子の少なくとも一部における目標撮像状態を提供する。いくつかの実施形態によれば、目標撮像状態は撮像状態の分布に対応してもよい。
【０１５７】
場合によっては、目標撮像状態は、撮像サイトにおける焦平面に対する目標粒子内構造配向（例えば整位及び／又は位置）を含むことができる。例えば、図４Ｎに示されるように、内部構造４１０ｍ（例えば細胞内構造、小器官、葉、又は同様のもの）を焦平面Ｆに対して配向させることができる。場合によっては、目標整位は、図４Ｋ−３に示される粒子整位関係と同様の、撮像サイトにおける焦平面Ｆに対する目標粒子内構造整位を含む。場合によっては、目標位置は、図４Ｋ−１に示される粒子位置関係と同様の、撮像サイトにおける焦平面に対する目標粒子内構造位置を含む。場合によっては、粒子内構造の目標配向は、焦平面に対する目標整位、及び同様に焦平面に対する目標位置の両方を含むことができる。場合によっては、目標撮像状態は撮像サイトにおける目標変形を含むことができる。例えば、図４Ｎに示されるように、粒子４００ｍは、図４Ｍに示される粒子形状に比較して、圧縮された形状を有する。それゆえ、フローセルの作用は粒子形状に対する側面圧縮効果を生み出すことができることが分かる。関連して、粒子内の特徴は、粒子自身の形状が圧縮されるのに従い、位置的又は方向的に配向されることができる（例えば焦平面Ｆ及び／又はリボン流平面に対して整位されることができる）。いくつかの実施形態によれば、シース液とサンプル液との速度差はフローストリーム内の摩擦を生み出すことができ、シース液とサンプル液との粘度差はその流体力学的摩擦を増幅することができる。
【０１５８】
様々な血液検査又は血液粒子分析手法はいずれも、フローセルを通って流れるサンプル液の画像を用いて実行することができる。多くの場合、画像分析は、特定の細胞若しくは粒子パラメータを決定すること、あるいは特定の細胞若しくは粒子の特徴を測定、検出、又は評価することを含むことができる。例えば、画像分析は、細胞若しくは粒子サイズ、細胞核の特徴、細胞質の特徴、細胞内小器官の特徴、並びに同様のものを評価することを含むことができる。関連して、分析手法は、白血球（ＷＢＣ）分類を含む、特定の計数若しくは類別方法又は診断試験を包含することができる。場合によっては、フローセルを用いて得られた画像はＷＢＣ  ５分類試験を支援することができる。場合によっては、フローセルを用いて得られた画像はＷＢＣ  ９分類試験を支援することができる。関連して、図４を参照すると、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、システム４００に、画像キャプチャデバイスから得られた画像に基づいて異なる種類の細胞を弁別させるように構成されるコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を含むか、又はそれと共同して動作することができる。同様に、図６Ｂを参照すると、プロセッサ６０４Ｂは、プロセッサによって実行されると、システム６００ｂ又はシステム６４２ｂに、画像キャプチャデバイスから得られた画像に基づいて異なる種類の細胞を弁別させるように構成されたコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を含むか、又はそれと共同して動作することができる。例えば、種々の細胞（例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球、及び芽球）を弁別するための診断又は試験手法を用いることができる。
【０１５９】
図４Ｏは、ＰＩＯＡＬを用いて得た画像対非ＰＩＯＡＬシース液を用いて得た画像の比較を示す。ＰＩＯＡＬの使用は、葉、細胞質、及び／又は顆粒などのより合焦した細胞含有物を生じさせた。本例では、粘性剤（約３０％グリセロール）を含むＰＩＯＡＬを用いてサンプルを処理した。ｐＨは約６．８〜７．２のｐＨに調整し、サンプル混合物は（０．９％塩化ナトリウム）によって等張性にした。ここに示される結果は、細胞及び細胞内小器官を整位させるために画像分析器上で用いた例示的なＰＩＯＡＬの有効性を実証している。
【０１６０】
図４Ｐ及び図４Ｑは、標準的なシース液を用いて得た画像（図Ｐの上及び下のパネル）対例示的なＰＩＯＡＬ液を用いて得た画像（図４Ｑの上及び下のパネル）の比較を示す。ここに示されるように、ＰＩＯＡＬの使用は、改善されたＲＢＣ整位を生じさせた（図１に示される通りの例示的な目標４４への）機器合焦プロトコルを用いてサンプルを分析し、視覚的分析器によって目標を合焦させた。次に、合焦システムを変位距離５２だけずらし、その結果、リボン状サンプルストリーム内の粒子が合焦した。血液サンプルは、サンプル希釈剤を用いて前もって希釈した。サンプルはカニューレを通り、フローセルの流路に沿って流れ、それにより、ＰＩＯＡＬ又は（対照における）標準的なシースの２つの層に挟まれたリボン状サンプルストリーム（例えば厚さ２ミクロン）を作り出した。次に、視覚的分析器は、分析に用いるためのリボン状サンプルストリーム内の粒子の合焦画像を（例えば、約６０コマ毎秒で）生成する。血液サンプルは被検者から得られ、血液分析器による分析のために処理される。標準的なシース液又はＰＩＯＡＬを用いてサンプルが処理される間に、フローセル内のＲＢＣの画像をキャプチャする。撮像データ（例えば４Ｐ及び４Ｑ）に基づき、相対的割合は、整位されたＲＢＣの数の大幅な改善を実証している。この結果は、ＰＩＯＡＬは、本明細書に説明されている集束機器／プロトコルを用いたリボン状サンプルストリーム内を流れる間のＲＢＣ整位の割合の増大に効果があることを実証した。
【０１６１】
ＰＩＯＡＬの実装は、対称的なフローセル及び非対称的なフローセル内において、使用するグリセロール（ｇｌｙ）のレベルの増加に基づき整位の改善をもたらすことも観察された。
【０１６２】
これらの結果は、特定のＰＩＯＡＬ組成物は、画像ベースの粒子／細胞分析を実行するために用いると、細胞を整位させ、細胞内構造を再位置付けする予想外の特性を有するという、驚くべき予想外の発見の証拠を提供する。
【０１６３】
動的範囲拡張
図５は、本発明の実施形態に係る、血液サンプル内の粒子分析のための動的又は検出範囲拡大を達成するためのシステム及び方法の追加の態様を示すブロック図である。ここに示されるように、モータ駆動装置５４を作動させ、目標オートフォーカスパターン４４に対する異なる焦点位置において収集された光センサアレイからのデジタル化画像を分析するために、少なくとも１つのデジタルプロセッサ１８が結合される。プロセッサ１８は、オートフォーカスパターン４４の焦点位置を決定するように、すなわち、目標オートフォーカスパターン４４にオートフォーカスし、かくして、高光学解像度撮像デバイス２４とオートフォーカスパターン４４との間の最適距離を確立するように構成される。これは、画像全体に適用するか、又は少なくともオートフォーカスパターン４４の縁部において適用することができる、第１の距離における画像内のコントラストのレベルを評価するためのアルゴリズムを適用することなどの、画像処理ステップによって達成することができる。プロセッサはモータ５４を別の位置へ移動させ、その位置又は縁部におけるコントラストを評価し、２回以上の反復後、オートフォーカスパターン４４への合焦の精度が最大になる最適距離（又はその位置へ移動させれば合焦の精度が最適化されるであろう最適距離）を決定する。プロセッサは、オートフォーカス目標オートフォーカスパターン４４とリボン状サンプルストリームとの間の固定した間隔を信頼し、次に、プロセッサ１８はモータ５４を作動させ、高光学解像度撮像デバイス２４を、リボン状サンプルストリーム３２に合焦するための正しい距離へ移動させる。より具体的には、プロセッサはモータを作動させ、高光学解像度撮像デバイスとリボン状サンプルストリーム３２との間の距離を、リボン状サンプルストリームが目標オートフォーカスパターン４４から変位している変位距離５２（図１参照）だけ変位させる。こうして、高光学解像度撮像デバイスはリボン状サンプルストリームに合焦される。
【０１６４】
いくつかの実施形態によれば、視覚的分析器１７は図１の例示的な分析器１７である。視覚的分析器１７は、少なくとも１つのフローセル２２と、デジタルカメラなどの撮像センサを有する高光学解像度撮像デバイスなどの少なくとも１つの撮像デバイス２４と、を備えることができる。視覚的分析器１７はまたサンプル注入器２９を備えることもできる。サンプル注入器２９は、サンプル１２を少なくとも１つのフローセル２２内に提供するように構成される。フローセル２２は、例えば、フロー方向に対称的に狭窄化する内部ＰＩＯＡＬ流路を画定する。フローセル２２は、サンプルのフロー３２を誘導し、フローセル２２内の観察区域を通過させるように構成される。
【０１６５】
図５は、説明されている通りのデジタル撮像のオートフォーカス及びその他の態様を示す。このような手法は、撮像を基盤としないか、又はことによると説明されている実施形態ほど画像に関連しない、フローサイトメータとしても知られるコールター血球計数器などの血球装置と併用することができる。このような計数器は、流体内の血球及び粒子を検出し、計数することで知られているが、普通は撮像によるものではない。その種の計数器内には、流体内に包囲された粒子のフローを運搬するためのフローセルが配置される。フローセルは狭窄化し、流路内の粒子を強制的に１列縦隊にする。流路にまたがる１対の電極又はその他の検出器が、電気インピーダンスのパルス状の変化、又は細胞が通過する際の光源と光検出器との間の光路の遮断の検出によって、計数を生成する。
【０１６６】
フローサイトメータは、視覚的計数器内で実際に撮像することができる細胞の数よりもはるかに多い、多数の細胞又はその他の粒子を計数することができるため、有利である。しかし、フローサイトメータは、細胞同士を種類によって識別すること、又は正常細胞と異常細胞の識別を可能にすること、又は血小板凝集塊などの集団化した細胞をばらばらの血球と識別することについては、同じほど有効ではない。分析器、例えば、説明されている通りの視覚的分析器、を動作させることによって、リボン状サンプルストリームの統計的に有意な数の画像コマを通じて、血球種類の分布又は比を測定することができる。視覚的分析器から決定された比率又はその関数は血球計数に適用され、細胞種に関する区別はあまりないか又は全く区別はないものではあるが、サイトメータによって計数されたより大きな血球数に適用され、両方の種類の分析器の固有の利点を利用した正確な総血球数が提供される。
【０１６７】
いくつかの実施形態によれば、粒子計数は、アルゴリズム、例えば、粒子計数の比に基づくアルゴリズム、を適用することによって推論することができる。図５は、血液分析に適合された例示的な装置を示す。いくつかの実施形態では、粒子計数器１５及び視覚的分析器１７は、並列以外に、直列に接続されてもよい。粒子計数器１５は、例えば、流体内の血球及び粒子を検出して計数する、コールター血球計数器であってもよい。その種の計数器内には、流体内に包囲された粒子のフローを運搬するための流路（図示せず）が配置される。流路は狭窄化し、流路内の粒子を強制的に１列縦隊にする。流路にまたがる１対の電極又はその他の検出器が、電気インピーダンスのパルス状の変化、又は細胞が通過する際の光源と光検出器との間の光路の遮断の検出によって、計数を生成する。粒子計数器１５は、多数の細胞又はその他の粒子を計数するように構成される。しかし、粒子計数器１５は、細胞のサブカテゴリ内の要素同士を識別すること、及び／又は正常細胞と異常細胞を識別すること、又は血小板凝集塊などの集団化した細胞をばらばらの血球と識別することができない場合があり得る。
【０１６８】
視覚的分析器１７はまた、希釈剤、透過化処理剤、粒子分類及び／又は細分類のための視覚的相違を生み出すために有効な造影剤のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つの化学物質を提供するように構成される少なくとも１つの接触チャンバ２５を備えることもできる。例えば、図１及び図５を参照して示されるように、接触させたサンプルをサンプル注入器２９を通じてフローセル内に導入し、シース又は細胞内小器官整位試薬を注入器２７から導入する。希釈剤は、サンプルを好適な濃度に希釈するために用いることができる。造影剤及び／又は透過化処理剤は、粒子を分類及び／又は細分類するための視覚的相違を生み出すために用いられる。ＰＩＯＡＬは、特定の種類の細胞又は細胞構造を、撮像をより良好にするための方向に整位させるために用いられる。いくつかの実施形態では、まず、少なくとも１つの化学物質を、サンプルに接触するために加えることができ、その後、処理したサンプルを視覚的分析器１７上に提供する。少なくとも１つの化学物質の少なくとも添加によるサンプルの処理は室温で実行することができる。いくつかの実施形態では、このような処理は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、３６、３７、３８、３８、３９、４０、４５、４６、４７、４８、４９又は５０℃などの温度で実行することができる。選択された温度における処理は、視覚的分析器１７とは別個のインキュベータ内、又は温度制御された視覚的分析器１７上で遂行することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、視覚的分析器は、サンプルを造影剤並びに／又は透過化処理剤若しくは界面活性剤と接触させるための造影剤注入器を有してもよい。他の実施形態では、サンプルを、視覚的分析器内への注入前に造影剤、透過化処理剤と接触させてもよい。他の実施形態では、サンプルを、造影剤及び／又は透過化処理剤と接触している間に、制御された温度で制御された時間、加熱するための加熱要素を包含する視覚的分析器。視覚的分析器はまた、加熱ステップの後にサンプル混合物を冷却するための冷却要素を有してもよい。血液流体サンプルを処理するために用いることができる例示的な造影剤組成物及び方法が、同時係属中の米国特許出願第＿＿＿＿＿＿＿＿号に開示されている。同出願の内容は本明細書において参照により組み込まれている。
【０１７０】
説明されている通りの視覚的分析器１７を動作させることによって、リボン状サンプルストリームの統計的に有意な数の画像コマを通じて、細胞カテゴリ及び／又はサブカテゴリ内の細胞の比率をプロセッサ１８によって決定することができる。視覚的分析器１７から決定された比率は血球計数に適用され、細胞カテゴリ及び／若しくはサブカテゴリ内の要素に関する区別はあまりないか又は全く区別はないものではあるが、粒子計数器１５によって計数されたより大きな血球数に適用され、粒子計数器１５及び視覚的分析器１７の両方の固有の利点を利用した正確な総血球数が提供される。
【０１７１】
正確な結果を提供することに加えて、粒子計数器１５及び視覚的分析器１７を備える装置は分析のスピードの改善に大きな利点をもたらす。図５では、異なる血球の計数の正確な結果を、ディスプレイ６３を通じて出力することができる。分析プロセスの最中に、操作者は端末６５を通じてプロセッサ１８と対話してもよい。以前には、造影剤を含むスライドを作り、それを操作者が顕微鏡下で調べることによって、最大で結果の約２５％〜３０％を手作業で見直していた。それに比べて、いくつかの実施形態によれば、本発明の装置を用いる例示的な方法は、粒子計数器上におけるＣＢＣ、並びに血球の分類及び／若しくは細分類を含む。本開示に説明されている通りの装置を動作させることによって、画像は視覚的分析器上で見直すことができ、サンプルは手作業の見直しをあまり頻繁に必要としなくなる。
【０１７２】
モータ５４は、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスによって撮像される識別する特徴、特に、血球の外観よりもいくらか小さい精密度を有する歯車付きステッピングモータを備えることができる。高光学解像度撮像デバイス２４のロケーションを、光学対物レンズの位置をリボン状サンプルストリームの幅内に配置するように調整すれば、リボン状サンプルストリーム内の細胞／粒子の視像が合焦する。オートフォーカスパターンは高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスの視野の縁部に配置することができ、その理由のために、観察の邪魔にならない。
【０１７３】
更に、高光学解像度撮像デバイスが変位距離をわたって移動され、オートフォーカスパターンが合焦しなくなると、合焦して見える特徴は、オートフォーカスパターンではなく、血球になる。いくつかの実施形態によれば、オートフォーカスパターンは視野内の図形によって画定することができる。図形は、有限のサイズの比較的薄い離散した形であり、したがって、変位距離だけ移動した後には、リボン状サンプルストリームに合焦されたときのデジタル化画像内に形はほぼ見えなくなる。典型的な変位距離は、例えば、血液（血球）撮像用途のために寸法が決められたフローセル内では、５０〜１００μｍであってもよい。いくつかの実施形態では、オートフォーカス機能は高光学解像度撮像デバイスを最適焦点距離の１μｍ以内に維持する。
【０１７４】
フローセルの内部輪郭並びにＰＩＯＡＬ流量及びサンプル流量は、サンプルがリボン状ストリームに形成されるように調整することができる。ストリームは、リボン状サンプルストリーム内に包囲される粒子とおおよそ同じ薄さとするか、又はそれらよりも更に薄くすることができる。白血球は、例えば、１０μｍ前後の直径を有してもよい。１０μｍ未満の厚さを有するリボン状サンプルストリームを提供することによって、リボン状サンプルストリームがシース液、すなわちＰＩＯＡＬによって引き伸ばされたときに、細胞を配向させることができる。驚くべきことに、より高い粘度などの、リボン状サンプルストリームと異なる粘度のＰＩＯＡＬ層内で狭窄化流路に沿ってリボン状サンプルストリームを引き伸ばすことは、非球状粒子をフロー方向に実質的に平行な平面に整位させ、細胞に力を加え、細胞の細胞内構造の含有物の合焦を改善する有利な傾向を有する。高光学解像度撮像デバイス２４の光軸はリボン状サンプルストリームの平面に実質的に垂直（直角）である。撮像地点におけるリボン状サンプルストリームの線速度は、例えば、２０〜２００ｍｍ／秒であってもよい。いくつかの実施形態では、リボン状サンプルストリームの線速度は、例えば、５０〜１５０ｍｍ／秒であってもよい。
【０１７５】
リボン状サンプルストリームの厚さは、サンプル液及びＰＩＯＡＬの相対粘度及び流量によって影響を受け得る。例えば精密容積式ポンプを備える、サンプルの供給源２５及び／又はＰＩＯＡＬの供給源２７は、リボン状サンプルストリーム３２の寸法を最適化するために、すなわち、高光学解像度撮像デバイス２４の視野と少なくとも同じ幅の薄いリボンとして最適化するために制御可能な流量でサンプル及び／又はＰＩＯＡＬを提供するように構成することができる。
【０１７６】
一実施形態において、ＰＩＯＡＬの供給源２７は、ＰＩＯＡＬを所定の粘度で提供するように構成される。その粘度はサンプルの粘度と異なってもよく、サンプルの粘度よりも高くすることができる。ＰＩＯＡＬの粘度及び密度、サンプル材料の粘度、ＰＩＯＡＬの流量及びサンプル材料の流量は、リボン状サンプルストリームを、オートフォーカスパターンから変位距離に維持し、有利なリボン状サンプルストリームの厚さなどの、所定の寸法特性を有する状態に維持するように調整される。
【０１７７】
実用的実施形態では、ＰＩＯＡＬは、サンプルよりも高い線速度及びサンプルよりも高い粘度を有し、それにより、サンプルを平坦なリボン状に引き伸ばす。ＰＩＯＡＬ粘度は最大１０センチポアズに達し得る。
【０１７８】
図５に示される実施形態では、光センサアレイから得られたピクセルデジタル画像の分析に用いる同じデジタルプロセッサ１８を、オートフォーカス用モータ５４の制御にも用いる。しかし、画像をキャプチャするたびに高光学解像度撮像デバイス２４をオートフォーカスさせるわけではない。オートフォーカスプロセスは、定期的に遂行するか、又は例えば、温度若しくはその他のプロセスの変化が、対応するセンサによって検出されたときに遂行するか、又は画像分析が再合焦の潜在的必要性を検出したときに遂行することができる。他の実施形態では、血液画像分析は１つのプロセッサによって遂行させ、自らの光センサアレイに任意選択的に関連付けられ、固定した目標４４に対するオートフォーカスのステップを処理するように構成された別個のプロセッサを有することも可能である。
【０１７９】
図５では、少なくとも１つの前記デジタルプロセッサ１８は、プログラムされた時間に、又はプログラムされた条件で、又はユーザの要求に応じてオートフォーカスするように構成され、また、画像に基づく粒子の分類及び細分類も実行するように構成される。例示的な粒子としては、細胞、白血球、赤血球及び同様のものが挙げられる。
【０１８０】
一実施形態において、少なくとも１つの前記デジタルプロセッサ１８は、オートフォーカス再開始信号を検出するように構成される。オートフォーカス再開始信号は、検出された温度変化、ピクセル画像日付のパラメータによって認識される通りの合焦の質の低下、時間の経過、又はユーザ入力によってトリガすることができる。有利には、変位距離５２を再校正のために測定するという意味で再校正を行う必要はない。任意選択的に、オートフォーカスは、品質管理のため、及び又は合焦を維持するために、特定の頻度／間隔で作業の合間に再校正を行うようにプログラムすることができる。
【０１８１】
変位距離５２はフローセルごとに少しずつ異なるが、所与のフローセルについては一定のままである。画像分析器をフローセルに取り付ける際のセットアッププロセスとして、まず、変位距離を推定し、次に、オートフォーカス及び撮像の態様を実行する校正ステップの間に、フローセルのための正確な変位距離を決定し、定数としてプロセッサ１８のプログラミングに入力する。
【０１８２】
図６を参照すると、粒子を包含するサンプル１２を分析するための例示的な装置１０は、いくつかの実施形態に係る、少なくとも１つの検出範囲を有する粒子計数器１５、分析器１７、及びプロセッサ１８を含む。図６のブロック図は例示の目的のためのものである。粒子計数器１５、分析器１７、及びプロセッサ１８は互いに接続されてもよく、又は接続されなくてもよい。いくつかの実施形態では、プロセッサは分析器及び／又は粒子計数器に結合されてもよい。他の実施形態では、プロセッサは分析器及び／又は粒子計数器の構成要素であってもよい。
【０１８３】
粒子計数器１５は少なくとも１本のチャネルを備え、粒子の少なくとも１つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリのための粒子計数を提供するように構成される。いくつかの実施形態では、粒子計数器１５は、粒子の異なるカテゴリ及び／又はサブカテゴリのための少なくとも２本のチャネルを備える。いくつかの実施形態では、粒子は、サンプルの電気インピーダンス又は光散乱を検知することを通じて計数される。好適な粒子計数器１５の例としては、限定するものではないが、フローサイトメータが挙げられる。いくつかの実施形態では、検出は、異なる物理特性に応じて、複数のチャネルのそれぞれにおいて、同時か又は順次かのいずれかで行われてもよい。
【０１８４】
分析器１７は、粒子の異なるカテゴリ及び／若しくはサブカテゴリ並びにそれぞれのカテゴリ及び／若しくはサブカテゴリの対応する要素を弁別するように構成される。好適な分析器１７の例としては、限定するものではないが、ピクセルデータをキャプチャすることができ、ピクセルファイル内に表された特質を区別するようにプログラムされる、視覚的分析器、デジタルカメラ、又は任意のその他のピクセルデータ分析器が挙げられる。プロセッサ１８及び分析器１７は、粒子の２つのカテゴリ又は２つの対応するサブカテゴリの計数の比率の決定などのアルゴリズムを適用し、このような比率を、粒子計数器１５の少なくとも１本のチャネルにおいて得られた粒子の少なくとも１つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子計数に適用するように構成される。データ分析の後に、プロセッサ１８は、出力２０において、サンプル１２内の粒子のそれぞれのカテゴリ及びそれぞれの対応するサブカテゴリの濃度の正確な大きさを提供する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、サンプル１２内において、少なくとも粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な検出範囲外の濃度で存在することができ、それに対して、少なくとも粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な検出範囲内の濃度で存在する。粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの濃度は粒子計数器１５上で決定される。第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに対する比率は分析器１７上で決定される。第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリ内の粒子の濃度は、少なくとも部分的には、プロセッサ１８上で、このような比率を粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの濃度に適用することによって、算出される。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、粒子計数器１５の少なくとも１本のチャネルにおいて検出された粒子のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは粒子の少なくとも２つの種別を含むことができる。更に、粒子のそれぞれの種別は複数のサブクラスを含んでもよい。粒子計数器１５は、例えば、所定のサイズ範囲に基づく、１つ以上の選択基準を満たす複数の粒子を検出し、その粒子計数を提供するように構成される。選択基準は粒子の少なくとも２つの種別の要素を包含する。分析器１７及びプロセッサ１８は、粒子の少なくとも２つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリの要素を識別するようにプログラムされる。少なくとも２つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリにわたるそれぞれのその要素の分布がプロセッサ１８上で決定される。プロセッサ１８はこのような分布を用いて、粒子計数器１５上で得られた少なくとも２つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリのうちの少なくとも１つの要素についての粒子計数を補正する。
【０１８７】
より具体的には、装置１０は、サンプル内の、ＲＢＣ、ＷＢＣ、ＰＬＴ、及びその他の血球を含む各種の血球、芽細胞、若しくは細菌細胞、ウイルス粒子、寄生生物、寄生虫性嚢胞を含む、嚢胞、結晶、又はそれらの断片若しくはその他の細胞片を同定し、定量化するために用いることができる。
【０１８８】
図６Ａは、本発明の実施形態に係る、例示的な計数器又は計数モジュール６００ａの態様を示す。このような計数器は、ＷＢＣ、ＲＢＣ、及びＰＬＴ細胞計数、並びにヘモグロビン測定のための、様々な機械的機能、並びに電子測定機能及び光度測定機能を制御するか、又は実行するように動作することができる。代表的な計数器を用いて、ＣＢＣ分析用にサンプルを調製し、開口槽アセンブリ（例えばＷＢＣ槽６１０ａ及びＲＢＣ槽６２０ａ）を介して、ＣＢＣパラメータ測定値を生成することができる。いくつかの実施形態によれば、図６の計数器１５は図６Ａの計数器６００ａによって代表させることができる。同様に、いくつかの実施形態によれば、図５の計数器１５は図６Ａの計数器６００ａによって代表させることができる。いくつかの実施形態によれば、図７の計数器７２２は図６Ａの計数器６００ａによって代表させることができる。
【０１８９】
血液の細胞成分（例えば赤血球、白血球、及び血小板）は、電気インピーダンス法を用いて数えることができる。例えば、吸引された全血サンプルを２つの一定分量に分け、等張性希釈剤と混合できる。第１希釈液をＲＢＣ開口槽６２０ａに送達してよく、第２希釈液をＷＢＣ開口槽６１０ａに送達してよい。ＲＢＣチャンバでは、ＲＢＣ及び血小板の両方を数え、細胞が検出開口部を通過する際の電気インピーダンスによって区別できる。例えば、２〜２０ｆＬの粒子は血小板として計数され、３６ｆＬを超えるものはＲＢＣとして計数することができる。ＷＢＣチャンバ処理において、ＲＢＣ溶解試薬をＷＢＣ希釈一定分量に加え、ＲＢＣを溶解してヘモグロビンを遊離でき、その後、ＷＢＣ槽の検出開口部のインピーダンスによってＷＢＣを計数できる。ある場合には、槽は複数の開口部を備えてよい。したがって、例えば、血球算出法で使用される血球数は、ＲＢＣ  ３口開口槽を用いて得ることができる。
【０１９０】
例示的なＣＢＣサンプル調製法は、サンプル取得及びサンプル送達の２つのプロセスを含んでよい。サンプル取得は、１６５μＬの患者サンプルを吸引し、血液サンプリング弁（ＢＳＶ）に誘導するときに起こり得る。ＢＳＶは、患者サンプルの一定量を処理試薬と共に２つの三口開口槽への送達のために誘導するように動作することができる。患者サンプル及び処理試薬は、円形のデザインと相まって、気泡を混入せずにサンプル及び試薬を十分に混合することを可能にする角度で開口槽の底部に送達することができる。続いて、サンプルを測定及び分析用に調製できる。いくつかの実施形態によると、ＷＢＣ槽では、６．０ｍＬ（±１．０％）の希釈剤及び２８μＬのサンプルを、１．０８ｍＬ（±１．０％）のＤ×Ｈ細胞溶解液と合わせ、最終希釈率を１：２５１としてよい。いくつかの実施形態によると、ＲＢＣ槽では、１０ｍＬ（±１．０％）の希釈剤及び１．６μＬのサンプルを合わせ、最終希釈率を１：６２５０としてよい。患者サンプル及び試薬を混合した後、細胞数及び細胞体積の測定のため、開口部に真空及び開口部電流を印加してよい。ＲＢＣ及びＰＬＴの計数には、開口部付近の細胞の再循環を防ぐため、スイープフローの適用を含んでもよい。特定の実施形態では、ＲＢＣ及びＰＬＴのデータ取得は、最大２０秒まで、ＷＢＣについては最大１０秒までであってよい。特定の実施形態では、開口部アセンブリによって生成される全アナログパルスは、プリアンプカードによって増幅され、その後Ａ−Ｄ変換とパラメータ抽出のため、ＣＢＣ信号調整分析器カードに送られてよい。いくつかの実施形態によると、システムを用いて、各細胞イベントについて複数のパラメータを測定でき、デジタルパラメータ抽出プロセスを用いて、時間、体積（振幅及びパルス幅を含むパルス属性）、計数及び計数率、並びに待ち時間などのデジタル測定値を提供できる。このような測定値は、パルス編集、同時通過補正、計数決定、ＷＢＣ、ＲＢＣ及びＰＬＴについてのヒストグラムの生成、ヒストグラム決定、パターン分析、及び干渉補正、並びに同様のもののために使用することができる。
【０１９１】
図６Ｂは、モジュールシステム６００ｂの個々のシステム要素が分離した又はより統合された様式でどのように実装され得るかを、大まかに例示する、例示的なモジュールシステムの簡略ブロック図である。モジュールシステム６００ｂは、本発明の実施形態に係る、血液サンプル液内の粒子を撮像するための粒子分析システムの一部であるか、又はそれと接続していてもよい。本明細書の他の箇所で説明されるように、モジュールシステム６００ｂは、動的範囲拡張技術に関するデータ又は器具を生成し、動的範囲拡張技術に関連する入力を受信し、及び／又は動的範囲拡張技術に関する情報又はデータを処理するために好適である。いくつかの例において、モジュールシステム６００ｂは、バスサブシステム６０２ｂを介して電気的に結合する、１つ以上のプロセッサ６０４ｂ、ユーザインタフェース入力装置などの１つ以上の入力装置６０６ｂ、及び／又はユーザインタフェース出力装置のような１つ以上の出力装置６０８ｂを含む、ハードウェア要素を含む。場合によっては、システム６００ｂは、ネットワークインタフェース６１０ｂ、並びに／又は分析器／計数システム６４２ｂから信号を受信し、及び／若しくはこれに信号を伝送することができる分析器／計数システムインタフェース６４０ｂを含む。場合により、分析器／計数システム６４２ｂは、図６に示されるような、分析器１７及び／又は粒子計数器１５を含み得る。いくつかの例において、システム６００ｂは、例えば、ここでは、メモリ６１４ｅの作業メモリ６１２ｂ内に配置されるものとして示される、本明細書に開示する技術の１つ以上の態様を実装するように構成されるプログラムなどの、オペレーティングシステム６１６ｂ、及び／又は他のコード６１８ｂのような、ソフトウェア要素を含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、モジュールシステム６００ｂは、本明細書に開示される様々な技術の機能性を提供する、基礎プログラミング及びデータ構造体を記憶できる記憶サブシステム６２０ｂを含んでもよい。例えば、本明細書に開示される方法態様の機能性を実装するソフトウェアモジュールは、記憶サブシステム６２０ｂにおいて記憶されてもよい。これらのソフトウェアモジュールは、１つ以上のプロセッサ６０４ｂによって実行されてもよい。分散環境において、ソフトウェアモジュールは、複数のコンピュータシステム上に記憶され、複数のコンピュータシステムのプロセッサによって実行されてもよい。記憶サブシステム６２０ｂは、メモリサブシステム６２２ｂ及びファイル記憶サブシステム６２８ｂを含み得る。メモリサブシステム６２２ｂは、プログラム実行中の命令及びデータの記憶のためのメインのランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）６２６ｂ、並びに固定命令を記憶する読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）６２４ｂを含む、多数のメモリを含んでもよい。ファイル記憶サブシステム６２８ｂはプログラム及びデータファイルのための永続的（不揮発性）記憶装置を提供することができ、任意に、サンプル、患者、治療、評価、又はその他データを組み入れることができる有形記憶媒体を含んでもよい。ファイル記憶サブシステム６２８ｂは、ハードディスクドライブ、関連する取り外し可能媒体を伴うフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、コンパクトデジタル読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）ドライブ、光学ドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ  ＲＷ、固体取り外し可能メモリ、他の取り外し可能メディアカートリッジ又はディスクなどを含んでもよい。当該ドライブの１つ以上は、遠隔位置でモジュールシステム６００ｂに結合する他のサイトの他の接続コンピュータ上に配置されてもよい。いくつかの例において、システムは、１つ以上のプロセッサによって実行されると、１つ以上のプロセッサに、本明細書に開示する技術又は方法の任意の態様を実施させることができる、１つ以上の一連の命令を記憶する、コンピュータ読取り可能記憶媒体又は他の有形記憶媒体を含んでもよい。本明細書に開示する技術の機能性を実装する１つ以上のモジュールはファイル記憶サブシステム６２８ｂによって記憶されてもよい。いくつかの実施形態において、ソフトウェア又はコードは、モジュールシステム６００ｂが通信ネットワーク６３０ｂと通信することを可能にするプロトコルを提供し得る。任意で、かかる通信は、ダイヤルアップ又はインターネット接続通信を含んでもよい。
【０１９３】
システム６００ｂは、本発明の方法の様々な態様を実行するように構成され得るということが理解される。例えば、プロセッサ構成要素又はモジュール６０４ｂは、センサ入力装置若しくはモジュール６３２ｂから、ユーザインタフェース入力装置若しくはモジュール６０６ｂから、並びに／又は分析器／計器システム６４２ｂから、任意選択的に、分析器／計器システムインタフェース６４０ｂ、及び／又はネットワークインタフェース６１０ｂ、並びに通信ネットワーク６３０ｂを介して、信号又はデータを受信するように構成されたマイクロプロセッサ制御モジュールであり得る。場合によっては、センサ入力装置（単数又は複数）は、血液流体サンプルの画像を得るために備えられる粒子分析システムを含むか又はその一部であってもよい。場合によっては、ユーザインタフェース入力装置（単数又は複数）６０６ｂ及び／又はネットワークインタフェース６１０ｂは、画像パラメータを得るために備えられる粒子分析システムによって生成された画像パラメータ信号を受信するように構成されてもよい。場合によっては、分析器／計器システム６４２ｂは、血液流体サンプルに関連する画像パラメータ及び／又は計数パラメータを得るために備えられる粒子分析システムを含むか又はその一部であってもよい。
【０１９４】
また、プロセッサ要素、つまりモジュール６０４ｂは、粒子分析パラメータ信号又は画像パラメータ信号を、本明細書に開示される任意の手法によって任意に処理して、センサ出力装置、つまりモジュール６３６ｂに、ユーザインタフェース出力装置、つまりモジュール６０８ｂに、ネットワークインタフェース装置、つまりモジュール６１０ｂに、分析器／計器システムインタフェース６４０ｂに、又はこれらの任意の組み合わせに伝送するように構成することもできる。本発明の実施形態に従う装置又はモジュールのそれぞれは、プロセッサによって処理されるコンピュータ読取り可能媒体上の１つ以上のソフトウェアモジュール、若しくはハードウェアモジュール又はそれらの組み合わせを含み得る。様々な一般的に使用されるプラットフォーム、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＭａｃＩｎｔｏｓｈ、及びＵｎｉｘ（登録商標）のいずれかが、一般的に使用されるプログラミング言語のいずれかと共に、本発明の実施形態を実装するために使用され得る。
【０１９５】
ユーザインタフェース入力装置６０６ｂは、例えば、タッチパッド、キーボード、マウスのようなポインティング装置、トラックボール、グラフィックスタブレット、スキャナ、ジョイスティック、画面に組み込まれたタッチスクリーン、音声認識システムのようなオーディオ入力装置、マイク、及び他の型の入力装置を含んでもよい。ユーザ入力デバイス６０６ｂはまた、有形記憶媒体から又は通信ネットワーク６３０ｂから、本明細書に開示する方法又はその態様のいずれかを具体化するコンピュータ実行可能コードをダウンロードしてもよい。端末ソフトウェアは時々更新され端末に適切にダウンロードされ得るということが理解されるだろう。概して、用語「入力装置」の使用は、情報をモジュールシステム６００ｂに入力するための、様々な通常の及び固有の装置及び手段を含むことを意図する。
【０１９６】
ユーザインタフェース出力装置６０６ｂは、例えば、表示サブシステム、プリンタ、ファックス機、又はオーディオ出力装置のような非視覚表示を含んでもよい。当該表示サブシステムは、陰極線管（ＣＲＴ）、液晶画面（ＬＣＤ）のような平板装置、投影装置等であってもよい。表示サブシステムは、オーディオ出力装置を介してのような非視覚表示もまた提供してもよい。概して、用語「出力装置」の使用は、モジュールシステム６００ｂからユーザに情報を出力するための、様々な通常の及び固有の装置及び方法を含むことを意図する。
【０１９７】
バスサブシステム６０２ｂは、モジュールシステム６００ｂの様々な構成要素及びサブシステムを意図又は所望に応じて互いに通信させるためのメカニズムを提供する。モジュールシステム６００ｂの様々なサブシステム及び構成要素は、同じ物理的位置にある必要はないが、分散ネットワーク内の様々な位置に分散されてもよい。バスサブシステム６０２ｂは単一バスとして模式的に示されるが、バスサブシステムの代替の実施形態は複数のバスを活用してもよい。
【０１９８】
ネットワークインタフェース６１０ｂは、外部ネットワーク６３０ｂ又は他の装置へのインタフェースを提供し得る。外部通信ネットワーク６３０ｂは、相手方との通信を必要又は所望に応じて生じさせるように構成され得る。したがってそれは電子パケットをモジュールシステム６００ｂから受信し、必要又は所望に応じて任意の情報をモジュールシステム６００ｂに返送することができる。ここに図示されるように、通信ネットワーク６３０ｂ及び／又は分析器／計器システムインタフェース６４２ｂは、血液流体サンプルに対応する画像パラメータ及び／又は計数パラメータを得るために備えられる分析器／計器システム６４２ｂへ情報を伝送するか、又はそこから情報を受信してもよい。
【０１９９】
システムの内部にかかる基板通信リンクを提供することに加え、通信ネットワークシステム６３０ｂはインターネットのような他のネットワークへの接続もまた提供してもよく、有線、無線、モデム、及び／又は他の型のインタフェース接続を備え得る。
【０２００】
具体的な要求に従い、相当な変形が使用されてもよいということが当業者には明らかであるだろう。例えば、カスタマイズされたハードウェアもまた使用され得る、及び／又は特定の要素がハードウェア、ソフトウェア（アプレットのような高移植性ソフトウェア）、若しくは両方に実装され得る。更に、ネットワーク入力／出力装置のような他のコンピュータ装置への接続が用いられてもよい。モジュール端末システム６００ｂ自体は、コンピュータ端末、パーソナルコンピュータ、携帯型コンピュータ、ワークステーション、ネットワークコンピュータ、又は任意の他のデータ処理システムを含む様々な型であり得る。コンピュータ及びネットワークの変化し続ける性質により、図６Ｂに描写するモジュールシステムの記載は６００ｂ、本発明の１つ以上の実施形態を例示する目的のためのほんの具体的例を意図するものである。図６Ｂに描写したモジュールシステムより多い又は少ない構成要素を有し、モジュールシステム６００ｂの多数の他の構成が可能である。モジュールシステム６００ｂの任意のモジュール若しくは構成要素、又はかかるモジュール若しくは構成要素の任意の組み合わせは、本明細書に開示する粒子分析及び／又は撮像システムの実施形態の任意のものと結合するか、その内部に統合するか、又は別の方法で接続するように構成することができる。関連して、上記のハードウェア及びソフトウェア構成要素のうちの任意のものが、他の位置で使用される他の医学評価又は治療システムと、統合し得る又はそれらとのインタフェースとなるように構成され得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、モジュールシステム６００ｂは、入力モジュールにおいて血液流体サンプルの１つ以上の画像パラメータを受信するように構成することができる。画像パラメータデータは評価モジュールへ伝送することができ、そこで、画像データの分析に基づいて診断結果又はその他の結果を予測又は判定することができる。画像又は診断データは、出力モジュールを介して、システムのユーザに対して出力することができる。場合によっては、モジュールシステム６００ｂは例えば、診断モジュールを用いることによって、血液流体サンプルについての診断結果を判定することができる。診断情報は、出力モジュールを介して、システムのユーザに対して出力できる。任意選択的に、診断の特定の態様は出力装置によって判定され、診断システム、又は診断システムのサブデバイスへ伝送されることができる。血液流体サンプル、又は年齢、体重、性別、治療歴、病歴、及び同様のものを含む、サンプルが得られた患者に関する様々なデータのうちのいずれかをモジュールシステム内に入力することができる。治療レジメン又は診断評価のパラメータは、かかるデータに基づいて決定され得る。
【０２０２】
関連して、場合によっては、システムは、画像データを入力として受信するように構成されるプロセッサを含む。任意選択的に、プロセッサ、記憶媒体、又はその両方が血液又は粒子分析機械内に組み込まれてもよい。場合によっては、血液機械は、画像データ又は他の情報をプロセッサへの入力のために生成してもよい。いくつかの例において、プロセッサ、記憶媒体、又は両方がコンピュータ内に組み込まれ得、当該コンピュータは血液機械と通信し得る。いくつかの例において、プロセッサ、記憶媒体、又は両方がコンピュータ内に組み込まれ得、当該コンピュータはネットワークを経由して血液機械と遠隔通信し得る。
【０２０３】
図７は、本発明の実施形態に係る、血液流体サンプル内の第１細胞種の量を測定するためのシステム及び方法であって、サンプルは第２細胞種も含む、システム及び方法の態様を示す。ここに示されるように、方法７００は、血液流体サンプル７１０からサンプルの第１の体積７２０及びサンプルの第２の体積７３０を得ることを含むことができる。ステップ７２４において指示されるように、本方法は、第１の体積を血液細胞計数器７２２内に流すことによって、サンプルの第１の体積７２０内の第２細胞種の個体数を決定することを含んでもよい。多くの場合、細胞計数器７２２は、サンプル内に十分な量の電気的に識別可能な種類の細胞が存在するときには、細胞の正確な計数に適し、細胞種の量が一定の限度又は閾値を超えるときには、適さない。細胞計数器は、血液サンプル内の赤血球、又はその他の成分（例えば大型成分）の総数を短時間で計数するために用いられてもよい。場合によっては、細胞計数器は、血液内の白血球とその他の成分（例えば大型成分）とを区別するとき、又はいくつかの異なる種が存在し得るが、それぞれの数は比較的少ないときに、課題に直面する場合がある。
【０２０４】
更に、方法７００は、ステップ７３２において指示されるように、厚さ、及び厚さよりも大きい幅を有するサンプルストリームを提供するために、サンプルの第２の体積７３０を、フローセル内を流れるシース液内に注入することによって、第１の種類の細胞の第１の数及び第２細胞種の第２の数の画像を得ることを含んでもよい。得られる画像は、サンプルストリームの厚さを横断する画像経路に沿って得られる。場合によっては、画像取得７３２は、図５及び／又は図６に示される通りの分析器１７を用いて実行することができる。場合によっては、分析器は、血液流体サンプル内の白血球、巨大血小板、及びその他の大型成分を効率的に区別することができる。しかし、このような分析器を、サンプル内の完全な粒子計数を得るために用いるときには、課題がある場合がある。更に、場合によっては、分析器を、特定の計数（例えば全赤血球の計数）を得るために用いることは望ましくない場合がある。これは、このような計数手順は、計数を得ることに加えて、粒子の特徴付けを実行することも同様に含む場合があるためである。いくつかの実施形態によれば、分析器は、分析器を通って処理されるサンプルのうちのほんの何割か又は一部のための画像を得るために用いられる。
【０２０５】
図７に示されるように、方法７００は、ステップ７３８において指示されるように、得られた画像を用いて、第１細胞種の第１の数７３４の、第２細胞種の第２の数７３６に対する比を決定することを含んでもよい。方法はまた、ステップ７４０において指示されるように、比７３８及び第２細胞種７２４の個体数を用いてサンプル内の第１細胞種の細胞量値を算出することも含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態によれば、ステップ７４０において算出される細胞量値は、血液流体サンプル７１０内の第１細胞種についての細胞濃度である。場合によっては、ステップ７４０において算出される細胞量値は、血液流体サンプル７１０内の第１細胞種についての細胞計数である。場合によっては、細胞計数器７２２は、第１細胞種の計数に関連付けられる第１の精度、及び第２細胞種を計数することに関連付けられる第２の精度を有する。ここで、第２の精度は第１の精度よりも優れているか、又はそれよりも高い。場合によっては、（例えば図１０Ａ及び１０Ｂ参照）血液細胞計数器７２２は所望の精度範囲を有し、所望の精度範囲は、第１の体積７２０内の細胞の最小個体数から第１の体積７２０内の細胞の最大個体数の間にわたる。ここで、ステップ７２４において決定される体積内の第２細胞種の個体数は所望の精度範囲内にあり、ステップ７４０において算出されるサンプルの第１細胞種の細胞量値は所望の精度範囲外にある。
【０２０７】
図７に更に示されるように、（及び図１０Ａ及び図１０Ｂを引き続き参照すると）方法は任意選択的に、第１の体積を血液細胞計数器７２２内に流す結果として、サンプルの第１の体積内の第１細胞種の個体数を決定すること７２６を含んでもよい。第１の体積内の第１細胞種の決定された個体数７２６は第１細胞種のための所望の精度範囲よりも高いか又は低い場合があり、また、ステップ７４０において算出される通りの第１細胞種の細胞量値と異なる場合もある。いくつかの場合において（例えば、図１０Ａ）、第１細胞種の決定された個体数７２６はゼロである。いくつかの場合において（例えば、図１０Ｂ）、第１細胞種の決定された個体数７２６は０個よりも大きい。
【０２０８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、血液細胞計数器７２２は、第２の種類の細胞が細胞計数器を通って流れるのに応じた電気インピーダンスの変化を検出するセンサ機構を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、血液細胞計数器７２２は、第２の種類の細胞が細胞計数器を通って流れるのに応じた光路の遮断を検出するセンサ機構を含む。
【０２０９】
場合によっては、血液細胞計数器７２２は、第１細胞種のための検出可能濃度下限及び検出可能濃度上限、並びに第２細胞種のための検出可能濃度下限及び検出可能濃度上限を有する。第２細胞種の決定された個体数７２４は、第２細胞種のための下限よりも高く、かつ上限よりも低い、第２細胞種について検出された濃度パラメータに基づき得る。第１細胞種は、第１細胞種のための下限よりも低いか、又は上限よりも高いかのいずれかの濃度で存在し得る。
【０２１０】
場合によっては、血液細胞計数器７２２は、第１細胞種のための検出可能体積下限及び検出可能体積上限、並びに第２細胞種のための検出可能体積下限及び検出可能体積上限を有する。第２細胞種の決定された個体数７２４は、第２細胞種のための下限よりも高く、かつ上限よりも低い、第２細胞種について検出された体積パラメータに基づき得る。第１細胞種は、第１細胞種のための下限よりも低いか、又は上限よりも高いかのいずれかの体積パラメータで存在し得る。
【０２１１】
場合によっては、血液細胞計数器７２２は、第１細胞種のための検出可能サイズ下限及び検出可能サイズ上限、並びに第２細胞種のための検出可能サイズ下限及び最大検出可能体積サイズを有する。第２細胞種の決定された個体数７２４は、第２細胞種のための下限よりも高く、かつ上限よりも低い、第２細胞種について検出されたサイズパラメータに基づき得る。第１細胞種は、第１細胞種のための下限よりも低いか、又は上限よりも高いかのいずれかのサイズパラメータで存在し得る。
【０２１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（図１３ｂ、ｃ参照）、サンプルの第１の体積内の第２細胞種の個体数７２４の決定は、第１細胞種の細胞及び第２細胞種の細胞を一緒にグループ化することを含む。場合によっては、方法はまた、比及び第２細胞種の個体数を用いてサンプル内の第２細胞種の細胞量値を算出することを含んでもよい。場合によっては（例えば、図１０Ｄに示されるように）、サンプルの第１の体積内の第２細胞種の個体数の決定７２４は、第１細胞種の細胞及び第２細胞種の細胞を一緒にグループ化することと、血液細胞計数器７２２内に第１の体積を流す結果としてサンプルの第１の体積内の第１細胞種の個体数を決定すること７２６と、を含む。ステップ７４０において算出される通りのサンプル内の第１細胞種の細胞量値は、比７３８、第２細胞種の個体数７２４、及び第１細胞種の個体数７２６を用いることができる。
【０２１３】
他の態様では、例えば、図８並びに／又は図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるように、粒子を包含するサンプルを分析するための方法が提供される。このような方法では、図８の方法７０内のステップ７２において指示されるように、サンプルを、検出限界を有する粒子計数器上に提供する。少なくとも粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な検出範囲外の濃度でサンプル内に存在することができ、少なくとも粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な検出範囲内でサンプル内に存在する。ステップ７４において指示されるように、サンプル内の粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの濃度を粒子計数器上で決定する。ステップ７６において指示されるように、サンプルを分析器上にも提供し、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリ対粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの比率を決定する。ステップ７８において指示されるように、次に、少なくとも部分的には、比率を粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの濃度に適用することによって、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリ内の粒子の濃度を算出することができる。図１０Ａは、検出範囲を下回るサンプル内の粒子の検出を示し、図１０Ｂは、検出範囲を上回ってサンプル内に存在する粒子の検出を示す。
【０２１４】
したがって、図８は、いくつかの実施形態に係る、粒子計数器上の検出範囲外の濃度でサンプル内に存在する、粒子の第１のカテゴリの濃度を決定する例示的な方法７０を示す。ステップ７２において、図６及び図８も参照すると、サンプル１２を、少なくとも１つの検出範囲を有する粒子計数器１５上に提供する。サンプル１２は、流体内に分散していてもよい粒子を含む。いくつかの実施形態では、粒子の第１のカテゴリは、粒子の第１のカテゴリに適用可能な検出範囲の上限を上回る濃度でサンプル内に存在する。粒子の第２のカテゴリは、粒子の第２のカテゴリに適用可能な検出範囲内でサンプル内に存在する。例えば、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリはＷＢＣを含むことができる。粒子の第２のカテゴリは血小板を含むことができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、粒子の第１のカテゴリは、粒子の第１のカテゴリに適用可能な検出可能範囲の下限を下回る濃度でサンプル内に存在する。粒子の第２のカテゴリは、粒子の第２のカテゴリに適用可能な検出範囲内でサンプル内に存在する。例えば、粒子の第１のカテゴリは血小板を含む。粒子の第２のカテゴリは白血球を含む。
【０２１６】
図８のステップ７４において、サンプル１２内の粒子の第２のカテゴリの濃度を粒子計数器１５上で決定する。粒子計数器は少なくとも１本のチャネルを備えることができる。いくつかの実施形態では、粒子の第２のカテゴリはチャネルのうちの１本において測定される。いくつかの実施形態では、粒子計数器は少なくとも２本のチャネルを備えることができる。粒子の第１のカテゴリは、濃度が、粒子の第１のカテゴリに適用可能な検出範囲内にある場合には、もう一方のチャネルにおいて計数することができる。
【０２１７】
図８のステップ７６において、サンプル１２を（例えば、図５又は図６に示される通りの）視覚的分析器１７などの分析器上に提供し、粒子の第１のカテゴリの、粒子の第２のカテゴリに対する比率を決定する。いくつかの実施形態では、視覚的分析器１７は、上述した通りの撮像デバイスに接続されるフローセル２２を備える。粒子の第１のカテゴリの、粒子の第２のカテゴリに対する比率は，本明細書に記載されている方法に従って決定することができる。例えば、希釈剤、透過化処理剤、及び造影剤のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つの化学物質をサンプルに導入してもよい。血液流体サンプルの処理に用いることができる例示的な化学物質、組成物、造影剤、及び関連組成物が、同時係属中の米国特許出願第＿＿＿＿号に説明されている。同出願の内容は本明細書において参照により組み込まれている。造影剤は、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリと第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリとを弁別する視覚的相違を生み出すために有効となり得る。いくつかの実施形態では、図５に示される調製されたサンプル１２Ｂを少なくとも１つのフローセル２２に加えることができる。調製されたサンプル１２Ｂの粒子の画像をキャプチャする。視覚的分析器１７であることができる分析器及び／又はプロセッサ１８によって画像分析を実行する。次に、リボン状サンプルストリームの複数の画像を分析することによって、粒子の第１のカテゴリの、粒子の第２のカテゴリに対する比率を決定する。
【０２１８】
図８のステップ７８において、次に、（例えば、図６に示される通りの）プロセッサ１８によって、少なくとも部分的には、比率を粒子の第２のカテゴリの濃度に適用することによって、第１のカテゴリ内の粒子の濃度を算出することができる。
【０２１９】
本開示はまた、粒子を包含するサンプルを分析するための方法も提供する。図９は、いくつかの実施形態に係る、粒子計数器によって識別することができない粒子の２つのサブカテゴリの濃度を決定する例示的な方法８０を示す。ステップ８２において、サンプル（例えば、図６のサンプル１２）を粒子計数器（例えば、図６の粒子計数器１５）上に提供する。粒子計数器は、識別したいと望む粒子の少なくとも２つのカテゴリ又はサブカテゴリによって満たされる検出基準を有する。粒子計数器からの結果はこれらのカテゴリ又はサブカテゴリを図９のステップ８４における単独の計数内に包含する。
【０２２０】
ステップ８６において、サンプルを分析器（視覚的分析器など）上に提供し、粒子の第１のカテゴリ又はサブカテゴリの、粒子の第２のカテゴリ又はサブカテゴリに対する比率を決定する。いくつかの実施形態では、例えば、図５及び／又は図６に示されるように、視覚的分析器１７は、撮像デバイスに接続されるフローセル２２を含む。
【０２２１】
粒子の第１のカテゴリ又はサブカテゴリの、粒子の第２のカテゴリ又はサブカテゴリに対する比率は、本明細書に記載されている方法に従って決定することができる。希釈剤、透過化処理剤、及び造影剤のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つの化学物質をサンプルに導入する。造影剤は、第１のカテゴリ又はサブカテゴリを粒子の第２のカテゴリ又はサブカテゴリと弁別する粒子分類及び細分類のための視覚的相違を生み出すために有効である。図５に示されるように、いくつかの実施形態では、調製されたサンプル１２Ｂを少なくとも１つのフローセル２２に加えることができる。調製されたサンプル１２Ｂの粒子の画像をキャプチャする。視覚的分析器及び／又はプロセッサ１８によって画像分析を実行する。次に、複数の画像を分析することによって、粒子の少なくとも第１のサブカテゴリの、粒子の第２のサブカテゴリに対する比率を決定する。
【０２２２】
図９のステップ８８において、次に、図５又は図６に示されるように、プロセッサ１８によって、少なくとも部分的には、比率を、粒子計数器から得られた単独の計数（例えば、図９のステップ８４）に適用することによって、第１のカテゴリ又はサブカテゴリ内の粒子の濃度を算出することができる。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な検出範囲の上限を上回る濃度でサンプル内に存在する。粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な検出範囲内でサンプル内に存在する。例えば、粒子の第１のカテゴリは白血球を含む。粒子の第２のカテゴリは血小板を含む。図１０Ｂに示されているように、本開示の分析器からの粒子計数は、粒子濃度、体積及び／又はサイズなどの、粒子計数器によって用いられる少なくとも１つの検出範囲に関連付けられる不正確な粒子計数を補正するために用いることができる。本開示に説明されているように装置を運用することによって、検出範囲の上限を上回る量で存在する粒子を正確に検出し、測定することができる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、図１０Ａに示されるように、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な何らかのパラメータ、例えば濃度、の検出可能範囲の下限未満でサンプル内に存在する。粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な検出範囲内でサンプル内に存在する。図１０Ａに示されているように、本開示の分析器からの２つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリ内の粒子計数の比率は、少なくとも１つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリについての粒子計数器からの不正確な計数を補正するために用いることができる。本開示に説明されているように装置を運用することによって、粒子計数器によって検出されない、検出範囲限界未満で存在する粒子を正確に測定することができる。
【０２２５】
図１０Ａに示されるように、粒子計数器はカテゴリ２についての粒子計数を提供する。分析器はカテゴリ１及び２についての粒子計数の比率を提供する。比率掛けるカテゴリ２についての粒子計数を乗算することによって、プロセスはカテゴリ１についての粒子計数に到達する。粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、例えば、血小板を含んでもよい。粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは白血球を含む。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されている動的又は検出範囲拡大システム及び方法は、サンプル内に包含される血小板の数が少ないときに、正確な血小板計数を得るために用いることができる。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、分析器は、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに対する比率を決定するために、撮像デバイスと、撮像デバイスに接続されるフローセルと、を含む。希釈剤、透過化処理剤、造影剤のうちの少なくとも１つをサンプルに導入する。少なくとも１つの化学物質は、粒子の第１及び第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリを弁別する視覚的相違を生み出すために有効である。このような比率を決定するステップにおいて、サンプルを、いくつかの実施形態において存在する少なくとも１つのフローセルに加える。計数又は比率の統計的に有意な推定を提供するために、サンプルの粒子の複数の画像をキャプチャする。次に、粒子の第１及び第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリのそれぞれの内の粒子を計数することによって、粒子の少なくとも第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに対する比率を決定する。
【０２２７】
別の態様では、図９及び／又は図１０Ｄに示されるように、粒子計数器上で得られた粒子計数を補正するために、粒子を包含するサンプルを分析するための方法８０が提供される。例えば、本開示の分析器からの結果、例えば、相対計数は、粒子計数器によって用いられる検出基準又は基準群のみによって弁別することができない粒子のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの正確な粒子計数を得るために用いることができる。
【０２２８】
図１０Ｃに示される別の実施形態では、計数器は複数の粒子についての実質的に正確な計数を提供してもよい。複数の粒子は少なくとも２つのサブカテゴリの要素を包含するが、計数はサブカテゴリ同士を識別しない。少なくとも２つのサブカテゴリの要素のそれぞれの分布は分析器上で決定することができる。サブカテゴリの分布は各々のサブカテゴリの計数の、全体に対する比率である。プロセッサは、少なくとも２つのサブカテゴリの要素を識別するようにプログラムされる。分析器からの分布及び粒子計数器からの総粒子計数を用いることによって、例えば、図１０Ｃに示されるように、次に、プロセッサによって、要素のそれぞれの分布を用いることによって、少なくとも２つのサブカテゴリのうちの少なくとも１つの要素についての粒子計数を決定することができる。
【０２２９】
いくつかの実施形態によれば、図１０Ｄに示されるように、サンプルには粒子の２つのカテゴリが存在してもよい。この状況では、カテゴリは、複数のカテゴリ及び／又は複数のサブカテゴリの可能性を含むと解釈されてもよい。本開示に説明されているように装置を運用することによって、粒子の少なくとも１つの追加のカテゴリからの少なくとも一部の要素が粒子計数器によって粒子の第１のカテゴリの要素として不正確に分類又は細分類された粒子の計数に対して、補正を行うことができる。このような方法では、複数の粒子についての計数は、粒子計数器上で、その粒子計数を提供するための所定の範囲、例えば、サイズ及び／又は体積範囲、を用いて決定することができる。所定の範囲は、粒子の第１のカテゴリの要素、及び粒子の少なくとも第２のカテゴリの少なくとも一部の要素を粒子計数内で一緒にグループ化する。装置の１本のチャネルにおいて粒子の別のカテゴリとして不正確に計数された１つ以上のカテゴリ又はサブカテゴリ内のそれらの粒子は、サンプル内の粒子の第１のカテゴリ及び粒子の少なくとも第２のカテゴリにわたる粒子の分布を識別するように構成された分析器を用いて、別々に正確に測定することができる。カテゴリ及び／又はサブカテゴリの分布は、各々のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの計数の、全体に対する比率である。次に、プロセッサは分布を用いて、粒子の第１のカテゴリ並びに少なくとも第２のカテゴリ及び／若しくはサブカテゴリの要素についての粒子計数を算出する。この実施形態では、図１０Ｄに示されているように、本開示の装置及び方法並びにそれぞれのカテゴリ及び／若しくはサブカテゴリ内の粒子の計数を補正することができる。
【０２３０】
図１０Ｄに示されるように、粒子計数器は、２つのカテゴリを含む実質的に正確な総計数を提供してもよい。この計数は、カテゴリ１及び２についての推定的な計数を含んでもよい。しかし、粒子計数器はカテゴリ２の少なくとも１つの要素を誤ってカテゴリ１と類別している点で、推定的な計数は不正確である。分析器は、粒子計数器で用いるよりも小さなサンプルに基づいてカテゴリ１及び２についての粒子計数の分布を提供するが、分析器は正確な分布を生成する。プロセッサはこの情報を用いて、両カテゴリについての正確な計数に到達する。この同じプロセスは、粒子の２つを超えるカテゴリ及び／又はサブカテゴリを包含するサンプルのために用いることができる。
【０２３１】
例えば、同様のサイズ又は形態を有する異なる粒子カテゴリ又はサブカテゴリの要素は、粒子計数器によって正確に分類又は細分類されない場合がある。例えば、「巨大」ＰＬＴ、ＰＬＴ凝集体、凝集塊、複数の血小板及び有核ＲＢＣはＷＢＣとして誤って計数される場合があり、その結果、サンプル内に実際に存在するよりも高いＷＢＣ計数を生じさせる。別の例として、小球性赤血球、細胞片、アーチファクト、及び更には電子的ノイズが血小板として誤って計数される場合があり、その結果、ＰＬＴの不正確に高い計数を生じさせる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、分析器は、撮像デバイス及びフローセルを備える視覚的分析器である。一例として、希釈剤、透過化処理剤、造影剤のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つの化学物質をサンプルに導入する。少なくとも１つの化学物質は、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリと第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリとを弁別する視覚的相違を生み出すために有効である。このような分布を決定するステップにおいて、サンプルを、いくつかの実施形態において存在する少なくとも１つのフローセルに加える。
【０２３３】
粒子の少なくとも２つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリの要素のそれぞれの分布を決定するステップにおいて、サンプルの少なくとも一部を少なくとも１つのフローセル内に加える。少なくとも１つの化学物質は、粒子のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの要素を弁別する視覚的相違を生み出すために有効である。サンプルの粒子の複数の撮像をキャプチャする。計数又は比率の統計的に有意な推定を提供するために、サンプルの粒子の複数の画像をキャプチャする。次に、粒子の第１及び第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリのそれぞれの内の粒子を計数することによって、粒子の少なくとも第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに対する比率を決定する。
【０２３４】
サンプルの粒子の複数の画像に基づいて、粒子のカテゴリ及び／若しくはサブカテゴリ内の粒子の２つ以上のサブカテゴリのそれぞれの要素の比率、並びに／又は粒子の第１のカテゴリ及び／若しくはサブカテゴリの要素の、粒子の少なくとも１つの他のカテゴリ及び／若しくはサブカテゴリの要素に対する比率を決定することができる。次に、粒子のそれぞれのカテゴリ及び／又はサブカテゴリについての計数又は濃度値を算出、推定、推論及び／又は導出することができる。一例として、分析器からの粒子のそれぞれのサブカテゴリの比率、及び粒子計数器からのカテゴリ内の粒子の総数の計数に基づいて粒子のサブカテゴリの濃度を決定することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのサブカテゴリの要素は、白血球、血小板、及び赤血球のサブカテゴリからなる群から選択される少なくとも１種類の粒子を含む。
【０２３５】
したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、分析器及び／又はプロセッサからのサンプルの粒子の複数の画像に基づいて、粒子計数器の粒子の１つのカテゴリに適用可能な検出範囲外の濃度で存在する粒子の１つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリ内の粒子の計数の、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な検出範囲内にある粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリ内の粒子の計数に対する比率を決定することを更に含む。次に、比率を、粒子計数器上で得られた粒子計数に適用することによって、粒子計数器の検出範囲外の粒子のカテゴリ及び／又はサブカテゴリのサンプル内の濃度を決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な検出範囲限界の上限を上回る濃度でサンプル内に存在する。粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに適用可能な粒子計数器の検出範囲内で（検出範囲の上限以下かつ下限以上で）サンプル内に存在する。粒子計数器によって用いられる検出基準又は基準群が、第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子を少なくとも第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの粒子と共にグループ分けすることによって粒子を誤って分類する別の例として、第１及び第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリについての粒子計数を、視覚的分析器及び／又はプロセッサからのサンプルの粒子の複数の画像から決定された粒子の比率から補正することができる。
【０２３６】
測定の検出範囲は、図６における粒子計数器１５上のみでは限られている場合がある。例えば、粒子計数器１５上では、ＷＢＣのための検出上限は１００，０００〜２００，０００毎μＬよりも低い場合があり得る。血小板の検出下限は、１０，０００毎μＬよりも低い場合がある。本明細書に記載されている装置を用いることによって、測定の有効検出範囲を拡大させることができ、例えば、いくつかの実施形態では、ＷＢＣのための検出上限を、約３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４１０，０００、４２０，０００、４３０，０００、４４０，０００、４５０，０００、４６０，０００、４７０，０００、４８０，０００、４９０，０００、５００，０００、５１０，０００、５２０，０００、５３０，０００、５４０，０００、５５０，０００、５６０，０００、５７０，０００、５８０，０００、５９０，０００、６００，０００、６１０，０００、６２０，０００、６３０，０００、６４０，０００、６５０，０００、６６０，０００、６７０，０００、６８０，０００、６９０，０００、７００，０００、７１０，０００、７２０，０００、７３０，０００、７４０，０００、７５０，０００、７６０，０００、７７０，０００、７８０，０００、７９０，０００、８００，０００、８１０，０００、８２０，０００、８３０，０００、８４０，０００、８５０，０００、８６０，０００、８７０，０００、８８０，０００、８９０，０００、９００，０００、９１０，０００、９２０，０００、９３０，０００、９４０，０００、９５０，０００、９６０，０００、９７０，０００、９８０，０００、９９０，０００、若しくは１，０００，０００、１，０００，０００、１，０１０，０００、１，０２０，０００、１，０３０，０００、１，０４０，０００、１，０５０，０００、１，０６０，０００、１，０７０，０００、１，０８０，０００、１，０９０，０００、１，１００，０００、１，１１０，０００、１，１２０，０００、１，１３０，０００、１，１４０，０００、１，１５０，０００、１，１６０，０００、１，１７０，０００、１，１８０，０００、若しくは約１，１９０，０００細胞毎μＬ、又はそれらの値のうちの２つの間の任意の範囲まで上方へ拡大させることができる。いくつかの実施形態では、ＰＬＴのための検出下限を、１０，０００、９，５００、９，０００、８，５００、８，０００、７，５００、７，０００、６，５００、６，０００、５，５００、５，０００、４，５００、４，０００、３，５００、３，０００、２，５００、２，０００、１，５００若しくは１，０００、又は５００、４００、３００、２００、若しくは１００細胞毎μＬまで下方へ拡大させることができる。
【０２３７】
分析器は好ましくは、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの、粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリに対する比率を決定するように動作可能な視覚的分析器１７を含む。この実施形態では、上述した通りの比率は、視覚的分析器１７上で撮影されたサンプル内の粒子の複数の画像を分析することによって決定することができる。
【０２３８】
視覚的分析器１７は、粒子分類及び細分類のための視覚的相違を生み出すために、サンプルに、希釈剤、透過化処理剤、及び／又は造影剤のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つの化学物質を導入するように構成することができる。このような視覚的相違は少なくとも２つのカテゴリの要素を弁別する。サンプルの粒子の画像をキャプチャする。視覚的分析器１７及びプロセッサ１８は、サンプルの粒子の画像間の区別を行うことによって、粒子のそれぞれのカテゴリ又はサブカテゴリの比率を決定するように構成される。次に、粒子のそれぞれのカテゴリ又はサブカテゴリの濃度を算出する。例えば、ＷＢＣ、巨大ＰＬＴ及びＮＲＢＣの正確な結果を決定することができる。粒子計数器上では、同様のサイズ又は形態のために、巨大ＰＬＴ及びＮＲＢｃはＷＢＣとして計数される。上述のように装置を運用することによって、巨大ＰＬＴ及びｎＲＢＣの粒子計数又は濃度を正確に報告することができる。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、サンプルは、サイズが粒子計数器１５の検出サイズ範囲外にある粒子を含み得る。視覚的分析器１７及びプロセッサ１８は、サンプルの粒子の画像に基づいて、粒子を検出し、検出サイズ範囲外の粒子の、粒子計数器１５の検出サイズ範囲内の粒子に対する比率を決定するように構成される。次に、粒子計数器１５の検出サイズ範囲外の粒子のカテゴリ及びサブカテゴリの濃度を算出することができる。
【０２４０】
一般的に、粒子を包含するサンプルを分析するための方法は、粒子計数器上で得られた粒子計数を補正するために提供される。例示的な方法は、例えば、図５及び図６に示されるように、粒子計数器１５上では粒子の同じカテゴリ及び／又はサブカテゴリに入る、対応するサブカテゴリを含む、粒子の異なるカテゴリを弁別するために用いることができる。本方法は、粒子計数器１５において得られた粒子計数を補正するために用いることができる。いくつかの実施形態では、例えば、粒子の第１のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは、１つ以上の種類の異常血球、未熟血球、凝集塊化した血球、又は異常サイズの血球を含む。粒子の第２のカテゴリ及び／又はサブカテゴリは白血球を含む。本明細書に記載されているように装置を運用することによって、サブカテゴリ内の粒子を分析器によって識別することができ、粒子計数器から得られた粒子のカテゴリ及び／又はサブカテゴリの計数を補正することができる。
【０２４１】
サンプル又はその一部を粒子計数器１５上に提供して粒子を検出し、粒子の少なくとも２つのカテゴリのサブカテゴリを包含する可能性がある１つ以上の選択基準に基づく粒子計数を提供する。例えば、粒子計数器からのＷＢＣカテゴリと称されるものは少量の巨大ＰＬＴ及びＮＲＢＣも含む可能性がある。粒子計数器からのそのカテゴリは、粒子計数器によって識別することができない白血球のサブカテゴリを更に含み得る。これらの誤分類を解決し、及び／又は識別されていないＷＢＣサブカテゴリを細分類するために、以下において説明されるように、サンプルの別の部分も視覚的分析器上で分析されてよい。
【０２４２】
図５に示される通りの分析器１７上では、少なくとも２つのサブカテゴリ又はカテゴリのそれぞれの分布を決定することができる。このような分布は相対計数の数値比、比率及び／又はその他の関数の形で提示することができる。いくつかの実施形態では、このような分布は、本明細書に開示されている方法に従って、フローセル２２及び撮像デバイス２４を備える視覚的分析器１７上で決定することができる。説明されているように、サンプルの一部であってもよいサンプル１２Ａを少なくとも１つのフローセル２２に加える。希釈剤、透過化処理剤、造影剤のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つの化学物質をサンプル１２Ａに導入する。希釈剤、透過化処理剤、及び／又は造影剤のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つの化学物質は、粒子の少なくとも２つのカテゴリを弁別し、粒子の少なくとも１つのカテゴリの少なくとも２つのサブカテゴリを弁別する視覚的相違を生み出すために有効である。サンプル１２Ｂの粒子の複数の画像をキャプチャする。視覚的分析器１７及び／又はプロセッサ１８上で画像分析を実行する。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、プロセッサ１８は、少なくとも２つのカテゴリ及び／又はサブカテゴリの要素を識別するようにプログラムされる。サンプルの粒子の複数の画像に基づいて、粒子の少なくとも２つのサブカテゴリ又はカテゴリのそれぞれの内の粒子の計数の比率を決定することができる。次に、サブカテゴリのそれぞれの分布を用いることによって、粒子計数器１５から得られた少なくとも２つのカテゴリの少なくとも１つのサブカテゴリについての粒子計数をプロセッサ１８上で補正することができる。粒子のそれぞれのサブカテゴリの比率、及び粒子計数器から得られた粒子のカテゴリの粒子計数に基づいて、粒子のそれぞれのサブカテゴリの濃度をプロセッサ１８上で算出することができる。
【０２４４】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されている方法はまた、粒子計数器１５上の検出範囲外の１つ以上の種類の粒子を弁別するために用いることもできる。例えば、これらの粒子は、大きすぎるか又は小さすぎるために粒子計数器１５上では検出することができない血球又はその他の断片であり得る。視覚的分析器１７上では、サンプルの粒子の複数の画像に基づいて、粒子計数器上では検出範囲外の１つの種類の粒子の計数の、粒子計数器の検出範囲内の別の種類の粒子に対する比率を決定することができる。次に、少なくとも部分的に、比率を、粒子計数器１５上で得られた粒子計数に適用することによって、サンプル内の検出範囲外の種類の粒子の濃度を決定することができる。
【０２４５】
それゆえ、本発明の実施形態は、例えば、電気的識別が難しい可能性があり得る細胞を分析するために、又は細胞の正確な電子的計数を得ることを難しくする量で存在する細胞を分析するために、例えば、電子的細胞計数及び写真による細胞撮像手法を組み合わせた、ハイブリッドシステム及び方法を包含する。
【０２４６】
本明細書に記載される計算、つまり演算はそれぞれ、ハードウェア、ソフトウェア、及び／又はファームウェアを有するコンピュータ又はその他プロセッサを用いて実行されてよい。様々な方法ステップはモジュールによって実行されてよく、モジュールは、本明細書に記載される方法ステップを実行するために配置される、任意の広範なデジタル及び／又はアナログデータ処理ハードウェア及び／又はソフトウェアを備えてよい。データ処理ハードウェアを任意に備えるモジュールは、これらに伴って適当な機械プログラミングコードを有することによって、これらのステップのうち１つ以上を実行するのに適しており、２つ以上のステップ（又は２つ以上のステップの部分）に対するモジュールは、任意の広範な統合処理及び／又は分散処理アーキテクチャにおいて、単一のプロセッサボードに組み込まれている、又は、異なるプロセッサボードに分かれている。これらの方法及びシステムは、多くの場合、上記方法ステップを実行するための命令を伴う、コンピュータ可読なコードを組み込む有形媒体を利用するだろう。好適な有形媒体は、メモリ（揮発性メモリ及び／又は不揮発性メモリを含む）、記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、テープなどへの磁気記録、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ／Ｗ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤなどといった光学式メモリ、又は任意のその他デジタル若しくはアナログ記憶媒体）などを含んでよい。
【０２４７】
本開示で論じた全ての特許、特許公開、特許出願、雑誌論文、書籍、技術文献などは、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４８】
図に描写する又は上述する構成要素の異なる配置が、示していない又は記載していない構成要素及びステップと同様に可能である。同様に、いくつかの特徴及び部分的組み合わせが有益であり、他の特徴及び部分的組み合わせへの参照なしに用いられてもよい。本発明の実施形態は制限的でなく例示的な目的のために記載されており、代替の実施形態が本特許の読者に明らかになるだろう。特定の場合では、方法ステップ又は操作が異なる順序で実施、つまり実行されてよく、あるいは、操作を追加、削除、又は変更してもよい。本発明の特定の態様では、ある要素若しくは構造を提供するため、又は、ある機能を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素と置き換えてよく、複数の構成要素を単一の構成要素と置き換えてよいことが理解され得る。かかる置換が本発明の特定の実施形態の実行に有効でない場合を除き、かかる置換は本発明の範囲内であるとみなされる。したがって、本発明は上記又は図に描写の実施形態に制限されず、下記の請求項の範囲から逸脱することなく様々な実施形態及び修正が生じ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図４Ｏ】
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【図４Ｐ】
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【図４Ｑ】
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【図５】
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【図６】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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