(57)【要約】  新規ヒトパルボウイルスB19変異株ゲノムの配列に由来する核酸分子を提供する。また、これらの核酸分子を含んでなるアッセイおよびキットを提供する。【選択図】  図１
2010516231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1、配列番号128、配列番号129に記載のヌクレオチド配列、もしくはそれらの相補体を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項２】
少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列を含んでなる、単離された核酸分子であって、この連続したヌクレオチドが、
5’-GATAACTGGTGGTGCTCT-3’                                        (配列番号 2)、
5’-ACTTCTGACTGGGA-3’                                            (配列番号 3)、
5’-GAATGTAACAAATTTGA-3’                                         (配列番号 4)、
5’-TTATTTAATAATGT-3’                                            (配列番号 5)、
5’-CTTGTAACTGAAA-3’                                             (配列番号 6)、
5’-TTTAGAGATGGAGA-3’                                            (配列番号 7)、
5’-TTAATGAAAAAAAT-3’                                            (配列番号 8)、
5’-CCTTTAAATGTTGT-3’                                            (配列番号 9)、
5’-CAGACTTTGAGCAGG-3’                                          (配列番号 10)、
5’-TGGAATAATGAAAA-3’                                           (配列番号 11)、
5’-TTTCCATTTAATGATGTAGC-3’                                     (配列番号 12)、
5’-TTGGTGGTCTGGGATGA-3’                                        (配列番号 13)、
5’-GAAGCTGCAAAAGCCATTTTAGG-3’                                  (配列番号 14)、
5’-ACCAGGGTAGATCA-3’                                           (配列番号 15)、
5’-ATAACCAGCAATGGTGACATTAC-3’                                  (配列番号 16)、
5’-CATGCTAAAGCCTTAAA-3’                                        (配列番号 17)、
5’-AGCCCTGACATGGG-3’                                           (配列番号 18)、
5’-TGGTGTAATGCACAAAGCTGG-3’                                    (配列番号 19)、
5’-CCACTATGAAAACTGGGCAATAAACTACAC-3’                           (配列番号 20)、
5’-TTTGATTTCCCTGGAAT-3’                                        (配列番号 21)、
5’-AATGCAGATGCCCTCCACCCAGA-3’                                  (配列番号 22)、
5’-CTCCAAACCACCCC-3’                                           (配列番号 23)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAGAACTC-3’                      (配列番号 24)、
5’-CCAGGCGCCTGGAACA-3’                                         (配列番号 25)、
5’- TGAAACCCCGCGCTCTAGTACGCC -3’                               (配列番号 26)、
5’-TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATCATTTGTCGGAAGC-3’                   (配列番号 27)、
5’-CAGTTTCGTGAACTGTTAGT-3’                                     (配列番号 28)、
5’-GCTTGGTATAATGGATGGAA-3’                                     (配列番号 29)、
5’-AAATGTGCTTACCT-3’                                           (配列番号 30)、
5’-TTTGTAGATTATGAGTAAA-3’                                      (配列番号 31)、
5’-ATTTCTTTAGATAATCC-3’                                        (配列番号 32)、
5’-TATATAGTCATCATTTTCA-3’                                      (配列番号 33)、
5’- CATGGACAGTTATCTGACCACCCCCATGCCTTATCATCCAGTA -3’            (配列番号 34)、
5’-CAGAACCTAGAGGAGAAAATGCAGTATTATCTA-3’                        (配列番号 35)、
5’-TGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGC-3’                          (配列番号 36)、
5’- TACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAG -3’                    (配列番号 37)、
5’-TACAAGCTGGGCC-3’                                            (配列番号 38)、
5’-GACAGTGCTGCAAGGATTCATGACTTTAGGTATAGCCAA-3’                  (配列番号 39)、
5’-TTAAAAAATATAAAAAATGAAAC-3’                                  (配列番号 40)、
5’-TACTTTACTTTAAAAGGTGCAGCTGCCCCTGTGGCCCATTTTCAAGGAAGTTT-3’    (配列番号 41)、
5’- TACAACGCCTCAGAAAAATACCC -3’                                (配列番号 42)、
5’-AGCATGACTTCAGTTAA-3’                                        (配列番号 43)、
5’-TCTGCAGAAGCCAGCACTGGTGCAGG-3’                               (配列番号 44)、
5’-AAAAGCATGTGGAGTGA-3’                                        (配列番号 45)、
5’-AGTAGCTGCCACAATGC-3’                                        (配列番号 46)、
5’-TTAGATTTTAATGCTTT-3’                                        (配列番号 47)、
5’-GATGCTTTAACTGT-3’                                           (配列番号 48)、
5’-TATGCTTACTTAACAGTAGG-3’                                     (配列番号 49)、
5’-AGTGAAGAATCAGC-3’                                           (配列番号 50)、
5’-TTTTATGAAATGTACAA-3’                                        (配列番号 51)、
5’-GCTGAAGACAAAGAGTATCA-3’                                     (配列番号 52)、
5’-AATGAAAAAGAACA-3’                                           (配列番号 53)、
5’-TGGAACAGAAGAGC-3’                                           (配列番号 54)、
5’-CTTCACTATGAAAG-3’                                           (配列番号 55)、
5’-CCTCAAATATTTTTAAAAATA-3’                                    (配列番号 56)、
5’-CCTCAAATATTTTTAAAAATA-3’                                    (配列番号 57)、
5’-CATTTACCATATGTACT-3’                                        (配列番号 58)、
5’- TATGACCCCACAGCTACAGATGCAAA -3’                             (配列番号 59)、
5’-GGATATGAAAAGCCTGAAGAATTGTGGAC-3’                            (配列番号 60)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAGAACTCAGTGAAAGCAGCTTT-3’      （配列番号134)、
および
5’-CTTAAAAACTCTCCAGAC-3’                                      （配列番号135)、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらの相補体である、前記単離された核酸分子。
【請求項３】
少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列を含んでなる、単離された核酸分子であって、この連続したヌクレオチドが、
5’-TTGGTGGTCTGGGATGA-3’                                        (配列番号 13)、
5’-GAAGCTGCAAAAGCCATTTTAGG-3’                                  (配列番号 14)、
5’-ACCAGGGTAGATCA-3’                                           (配列番号 15)、
5’-ATAACCAGCAATGGTGACATTAC-3’                                  (配列番号 16)、
5’-CATGCTAAAGCCTTAAA-3’                                        (配列番号 17)、
5’-AGCCCTGACATGGG-3’                                           (配列番号 18)、
5’-TGGTGTAATGCACAAAGCTGG-3’                                    (配列番号 19)、
5’-CCACTATGAAAACTGGGCAATAAACTACAC-3’                           (配列番号 20)、
5’-TTTGATTTCCCTGGAAT-3’                                        (配列番号 21)、
5’-AATGCAGATGCCCTCCACCCAGA-3’                                  (配列番号 22)、
5’-CTCCAAACCACCCC-3’                                           (配列番号 23)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAGAACTC-3’                      (配列番号 24)、
5’-CCAGGCGCCTGGAACA-3’                                         (配列番号 25)、
5’- TGAAACCCCGCGCTCTAGTACGCC -3’                               (配列番号 26)、
5’-TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATCATTTGTCGGAAGC-3’                   (配列番号 27)、
5’-CAGTTTCGTGAACTGTTAGT-3’                                     (配列番号 28)、
5’-GCTTGGTATAATGGATGGAA-3’                                     (配列番号 29)、
5’-AAATGTGCTTACCT-3’                                           (配列番号 30)、
5’-TTTGTAGATTATGAGTAAA-3’                                      (配列番号 31)、
5’-ATTTCTTTAGATAATCC-3’                                        (配列番号 32)、
5’-TATATAGTCATCATTTTCA-3’                                      (配列番号 33)、
5’- CATGGACAGTTATCTGACCACCCCCATGCCTTATCATCCAGTA -3’            (配列番号 34)、
5’-CAGAACCTAGAGGAGAAAATGCAGTATTATCTA-3’                        (配列番号 35)、
5’-TGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGC-3’                          (配列番号 36)、
5’- TACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAG -3’                    (配列番号 37)、
5’-TACAAGCTGGGCC-3’                                            (配列番号 38)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAGAACTCAGTGAAAGCAGCTTT-3’      （配列番号134)、
および
5’-CTTAAAAACTCTCCAGAC-3’                                      （配列番号135)、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらの相補体である、前記単離された核酸分子。
【請求項４】
少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列を含んでなる、単離された核酸分子であって、この連続したヌクレオチドが、
5’-TTGGTGGTCTGGGATGA-3’                                        (配列番号 13)、
5’-CATGCTAAAGCCTTAAA-3’                                        (配列番号 17)、
5’-AGCCCTGACATGGG-3’                                           (配列番号 18)、
5’-TGGTGTAATGCACAAAGCTGG-3’                                    (配列番号 19)、
5’-AATGCAGATGCCCTCCACCCAGA-3’                                  (配列番号 22)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAGAACTC-3’                      (配列番号 24)、
5’-CCAGGCGCCTGGAACA-3’                                         (配列番号 25)、
5’-TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATCATTTGTCGGAAGC-3’                   (配列番号 27)、
5’-TTTGTAGATTATGAGTAAA-3’                                      (配列番号 31)、
5’-CAGAACCTAGAGGAGAAAATGCAGTATTATCTA-3’                        (配列番号 35)、
5’-TGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGC-3’                          (配列番号 36)、
および
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAGAACTCAGTGAAAGCAGCTTT-3’      （配列番号134)、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれらの相補体である、前記単離された核酸分子。
【請求項５】
ヌクレオチド配列もしくはその相補体のうちの、少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子であって、この連続したヌクレオチドが、
5’-CACTTCTGACTGGGAACCATTAACTCATTCTAACAGACT-3’          (配列番号 61)、
5’-ATGTAAAGCTTAAATTTTTACCAGGAATGACTACAAAAG-3’          (配列番号 62)、
5’-AATATTTTAGAGATGGAGAACAATTTATAGAAAATTATT-3’          (配列番号 63)、
5’-ATTTTAGAGATGGAGAACAATTTATAGAAAATTATTTAA-3’          (配列番号 64)、
5’-TAACCAATATTGATGGGTACATAGATACCTGCATTTCTG-3’          (配列番号 65)、
5’-ATGGGTACATAGATACCTGCATTTCTGCTTCTTTTAGAC-3’          (配列番号 66)、
5’-TTAGACGGGGAGCCTTTCAGGCTAAAAAACCCCGCATTA-3’          (配列番号 67)、
5’-GAACCAGGGGAATCTAGCGCTACAGGGGGAGATGTTGTG-3’          (配列番号 68)、
5’-TGCCATTTGCTGGGAAGGGGACTAAAGCTGGAATAAAAT-3’          (配列番号 69)、
5’-GGACTAAAGCTGGAATAAAATTTCAAACTATGGTAAATT-3’          (配列番号 70)、
5’-TAAATTGGTTGTGTGAAAATAGGGTTTTTACAGAGGATA-3’          (配列番号 71)、
5’-ATTGGTTGTGTGAAAATAGGGTTTTTACAGAGGATAAGT-3’          (配列番号 72)、
5’-TTAACCAGTACACTTTACTTAGCAGTAGTCACAGTGGGA-3’          (配列番号 73)、
5’-TAAAACTAGCTATTTATAAGGCTACCAATTTAGTGCCTA-3’          (配列番号 74)、
5’-TAGCTATTTATAAGGCTACCAATTTAGTGCCTACAAGTA-3’          (配列番号 75)、
5’-CTACCAATTTAGTGCCTACAAGTACATTTTTGTTACACA-3’          (配列番号 76)、
5’-CAAGTACATTTTTGTTACACACAGACTTTGAGCAGGCTA-3’          (配列番号 77)、
5’-CACACAGACTTTGAGCAGGCTAACTGTATTAAAGAAAAT-3’          (配列番号 78)、
5’-GTGTCAAAATTATGACCCCTTGTTGGTGGGACAGCATGT-3’          (配列番号 79)、
5’-GGATTGATAAAAAATGTGGCAAAAAAAATACACTGTGGT-3’          (配列番号 80)、
5’-ATACACTGTGGTTTTATGGCCCACCAAGTACAGGAAAAA-3’          (配列番号 81)、
5’-GTACAGGAAAAACAAATTTAGCAATGGCTATTGCTAAAA-3’          (配列番号 82)、
5’-GCTTGGTGGTCTGGGATGAGGGTATTATTAAGTCTACTA-3’          (配列番号 83)、
5’-GCTTACTTACAGAGGCTGACGTGCAGCAATGGCTTACAT-3’          (配列番号 84)、
5’-CCCCGCGCTCTAGTACGCCAGTCCCCGGGACCAGTTCAG-3’          (配列番号 85)、
5’-AGAATCATTTGTCGGAAGCTCAATTTCCTCCGAAGCTGT-3’          (配列番号 86)、
5’-ATCATTTGTCGGAAGCTCAATTTCCTCCGAAGCTGTAGC-3’          (配列番号 87)、
5’-AGCTCAATTTCCTCCGAAGCTGTAGCTGCATCGTGGGAA-3’          (配列番号 88)、
5’-TGACTATGTATGGGATGGTATAAGGGGTTTACCTGTTTG-3’          (配列番号 89)、
5’-TTAATAACAGTGGGGGAGGCTTGGGATTTTGTCCCCATT-3’          (配列番号 90)、
5’-CAGTGGGGGAGGCTTGGGATTTTGTCCCCATTGCATTAA-3’          (配列番号 91)、
5’-GCAAAAAATGTGCTTACCTATCTGGCTTGCAAAGTTTTG-3’          (配列番号 92)、
5’-AATGTGCTTACCTATCTGGCTTGCAAAGTTTTGTAGATT-3’          (配列番号 93)、
5’-TTTGTAGATTATGAGTAAAGAAATTGGTAAATGGTGGGA-3’          (配列番号 94)、
5’-TTATGAGTAAAGAAATTGGTAAATGGTGGGAAAGTGATG-3’          (配列番号 95)、
5’-CTTCTTTGTTTGACTTAGTGGCTCGTATTAAAAGTAACC-3’          (配列番号 96)、
5’-ATGAAACTGGGTTTCAAGCTCAAGTAGTAAAAGACTACT-3’          (配列番号 97)、
5’-TCCTGATGCTTTAACTGTTGCCATATCAGAAATTGCCAT-3’          (配列番号 98)、
5’-TTGCCATATCAGAAATTGCCATTAAAGATGTTACAGACA-3’          (配列番号 99)、
5’-TGCCATATCAGAAATTGCCATTAAAGATGTTACAGACAA-3’          (配列番号 100)、
5’-AATACAAGTACCCATATGTATTAGGTCAAGGACAAGATA-3’          (配列番号 101)、
5’-AAGATACCTTAGCCCCAGAGCTTCCAATTTGGGTGTACT-3’          (配列番号 102)、
5’-CAGTAGGAGATGTAAACACGCAGGGAATTTCTGGGGACA-3’          (配列番号 103)、
5’-AGAATCAGCGTTTTATGTCCTGGAACACAGCTCTTTTGA-3’          (配列番号 104)、
5’-CTACTATGTCTTATAAGTTCCCTCCAGTGCCCCCAGAGA-3’          (配列番号 105)、
5’-TCCCTCCAGTGCCCCCAGAGAATTTAGAAGGCTGTAGTC-3’          (配列番号 106)、
5’-CCCGTTTAGGAGTCCCTGATACATTAGGAGGGGACCCCA-3’          (配列番号 107)、
5’-AACACATGAAGACCACGCAGTTCAGCCACAAAATTTTAT-3’          (配列番号 108)、
5’-ACGCAGTTCAGCCACAAAATTTTATGCCAGGGCCACTGG-3’          (配列番号 109)、
5’-GGCCACTGGTAAACTCAGTTTCCACAAAGGAGGGAGACA-3’          (配列番号 110)、
5’-AGGAGGGAGACAGTTCTAACACAGGAGCGGGAAAAGCCC-3’          (配列番号 111)、
5’-GTCAAAGTACTAGAATATCATTACGCCCTGGTCCAGTGT-3’          (配列番号 112)、
5’-GCCCTGGTCCAGTGTCTCAACCATATCACCACTGGGACA-3’          (配列番号 113)、
5’-GTCCAGTGTCTCAACCATATCACCACTGGGACACAGATA-3’          (配列番号 114)、
5’-CAGATAAATATGTAACAGGGATAAATGCCATTTCTCATG-3’          (配列番号 115)、
5’-CTGAAGACAAAGAGTATCAACAGGGCGTGGGTAGGTTTC-3’          (配列番号 116)、
5’-AAGACAAAGAGTATCAACAGGGCGTGGGTAGGTTTCCCA-3’          (配列番号 117)、
5’-AGGGCGTGGGTAGGTTTCCCAATGAAAAAGAACAACTAA-3’          (配列番号 118)、
5’-AACAGTTACAGGGTTTAAATATACACACATATTTTCCCA-3’          (配列番号 119)、
5’-GTTTAAATATACACACATATTTTCCCAATAAAGGTACCC-3’          (配列番号 120)、
5’-TACCAAATTTAGATGACAGCTTTAAAACTCAGTTTGCAG-3’          (配列番号 121)、
5’-AGCTTTAGGAGGTTGGGGACTACATCAGCCACCCCCTCA-3’          (配列番号 122)、
5’-GGCCAATTGGGGGTATTAAGTCAATGGGAATAACAACAT-3’          (配列番号 123)、
5’-TTAAGTCAATGGGAATAACAACATTAGTTCAATATGCTG-3’          (配列番号 124)、
5’-TAGTTCAATATGCTGTGGGTATTATGACAGTAACTATGA-3’          (配列番号 125)、
5’-TAACTATGACATTTAAATTAGGGCCTCGCAAAGCTACAG-3’          (配列番号 126)、 および
5’-ACCCTCCTCACGCAGCAGGCCATTTACCATATGTACTAT-3’          (配列番号 127)、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列、もしくはその相補体に含まれる、前記単離された核酸分子。
【請求項６】
ヌクレオチド配列もしくはその相補体からなる、単離された核酸分子であって、このヌクレオチド配列が、
5’-TGAAACCCCGCGCTCTA-3’                                (配列番号136)、
5’-AACTAACAGTTCACGAAACTG-3’                            (配列番号137)、
5’-TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAA-3’                          (配列番号138)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGT-3’                                (配列番号139)、
5’-TAGAGCGCGGGGTTTCA-3’                                (配列番号140)、
5’-TGAAAGCTCTGAAGAACTCAGTGAAAGCAGCTTT-3’               (配列番号141)、
5’-AATGCAGATGCCCTCCAC-3’                               (配列番号142)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAA-3’                    (配列番号143)、
5’-TGTTCCAGGCGCCTG-3’                                  (配列番号144)、
5’-CACAGCTACAGATGCAAA-3’                               (配列番号145)、
5’-GGTGCACACGGCTTTT-3’                                 (配列番号146)、
5’-TGTCCACAATTCTTCAGGCTTTTCATATCC-3’                   (配列番号147)、
5’-TGGATATGAAAAGCCTGAAGTATTGTGGAC-3’                   (配列番号148)、
5’-GGTCATTTACCATATGTACT-3’                             (配列番号149)、
5’-AGCTACAGATGCAAANCAACACCACAGACA-3’                   (配列番号150)、
5’-GAAAACTTTCCATTTAATGATGT-3’                          (配列番号151)、
5’-ATTTTTTGATCTACCCTGGT-3’                             (配列番号152)、
5’-TTGGTGGTCTGGGATGAAGG-3’                             (配列番号153)、
5’- GTTTTATGGGCCGCCAAGTA-3’                            (配列番号154)、
5’- TTCATCCCAGACCACCAAGG-3’                            (配列番号155)、
5’- ATGGCTATTGCTAAAACTGTTCCAGTGTA-3’                   (配列番号156)、
5’- TGGAATAATGAAAACTTTCCATTTAATGATGTAG-3’              (配列番号157)、および
5’- CAATGGCCATTGCTAAAAGTGTTCCA-3’                      (配列番号158)、
からなる群から選択される、前記単離された核酸分子。
【請求項７】
ストリンジェントな条件下で、配列番号1、配列番号128、配列番号129に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補体を含んでなるポリヌクレオチドとアニーリングするが、試験サンプル中に存在する可能性のある非パルボウイルスB19 DNAもしくはRNA分子とは、ストリンジェントな条件下でアニーリングしない、単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号1、配列番号128、配列番号129に示されるヌクレオチド配列、もしくはその相補体と、ストリンジェントな条件下でアニーリングする、単離された核酸分子であって、この単離された核酸分子が、パルボウイルスB19 Au、A6、V9、またはD91.1のDNAもしくはRNAとも、ストリンジェントな条件下でアニーリングする、前記単離された核酸配列。
【請求項９】
ストリンジェントな条件下でヌクレオチド配列もしくはその相補体とアニーリングする、単離された核酸分子であって、このヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、および配列番号133に示されるとおりである、前記単離された核酸配列。
【請求項１０】
配列番号1、配列番号128、配列番号129に示されるヌクレオチド配列、もしくはその相補体と、ストリンジェントな条件下でアニーリングする、単離された核酸分子であって、この単離された核酸分子が、パルボウイルスB19 Au、A6、V9、またはD91.1のDNAもしくはRNAとは、ストリンジェントな条件下でアニーリングしない、前記単離された核酸分子。
【請求項１１】
オープンリーディングフレーム、または部分オープンリーディングフレームを含んでなる、単離された核酸分子であって、このオープンリーディングフレームが、配列番号1、配列番号128、配列番号129、またはその相補体に含まれる、前記単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号1、配列番号128、もしくは配列番号129に示されるヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、単離されたヒトエリスロウイルス。
【請求項１３】
少なくとも１つのプライマーおよび少なくとも１つのプローブを含んでなるキットであって、この少なくとも１つのプライマーが、(配列番号 136)、(配列番号 137)、(配列番号 139)、(配列番号 140)、(配列番号 142)、(配列番号 144)、(配列番号 145)、(配列番号 146)、(配列番号 149)、(配列番号 151)、(配列番号 152)、(配列番号 154)、または(配列番号 155)に示されるプライマー核酸配列を含んでなるものであり、前記の少なくとも１つのプローブが、(配列番号 138)、(配列番号 141)、(配列番号 143)、(配列番号 147)、(配列番号 148)、(配列番号 150)、(配列番号 153)、(配列番号 156)、(配列番号 157)、(配列番号 158)、またはそれらの相補配列に示されるプローブ核酸配列を含んでなる、前記キット。
【請求項１４】
フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを含んでなるキットであって、このフォワードプライマーが、(配列番号 136)、(配列番号 139)、(配列番号 142)、(配列番号 145)、(配列番号 149)、(配列番号 151)、または(配列番号 154)に示されるフォワードプライマー核酸配列を含んでなり、前記リバースプライマーは、(配列番号 137)、(配列番号 140)、(配列番号 144)、(配列番号 146)、(配列番号 152)、または(配列番号 155)に示されるリバースプライマー核酸配列を含んでなるものであって、前記プローブが、(配列番号 136)、(配列番号 137)、(配列番号 138)、(配列番号 139)、(配列番号 140)、(配列番号 141)、(配列番号 142)、(配列番号 143)、(配列番号 144)、(配列番号 145)、(配列番号 146)、(配列番号 147)、(配列番号 148)、(配列番号 149)、(配列番号 150)、(配列番号 151)、(配列番号 152)、(配列番号 153)、(配列番号 154)、(配列番号 155)、(配列番号 156)、(配列番号 157)、(配列番号 158)、またはそれらの相補配列に示されるプローブ核酸配列を含んでなる、前記キット。
【請求項１５】
サンプル中のパルボウイルスB19を検出するための方法であって、その方法が、
a)フォワードプライマー核酸配列を有するフォワードプライマー、およびリバースプライマー核酸配列を有するリバースプライマーを用いて、サンプルの少なくとも一部でPCRを実施すること、ここで、このフォワードプライマー核酸配列は、(配列番号 136)、(配列番号 139)、(配列番号 142)、(配列番号 145)、(配列番号 149)、(配列番号 151)、または(配列番号 154)に示すとおりであり、リバースプライマー核酸配列は、(配列番号 137)、(配列番号 140)、(配列番号 144)、(配列番号 146)、(配列番号 152)、または(配列番号 155)に示すとおりである、ならびに
b)アンプリコンの有無を判定すること、ここで、アンプリコンの存在は、サンプル中にパルボウイルスB19が存在することを示しており、この判定には、オリゴヌクレオチドとアンプリコンとのアニーリングが含まれる、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが、（配列番号138）、（配列番号141）、（配列番号143）、（配列番号147）、（配列番号148）、（配列番号150）、（配列番号153）、（配列番号156）、（配列番号157）、（配列番号158）、またはその相補配列に示される配列を含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のパルボウイルスB19を測定する方法であって、
a)少なくとも１つの核酸分子を用いて、サンプル中のパルボウイルスB19核酸を増幅すること、ここで、該核酸分子は、
i) 少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列、またはその相補体であって、この連続したヌクレオチドは、(配列番号 2)、(配列番号 3)、(配列番号 4)、(配列番号 5)、(配列番号 6)、(配列番号 7)、(配列番号 8)、(配列番号 9)、(配列番号 10)、(配列番号 11)、(配列番号 12)、(配列番号 13)、(配列番号 14)、(配列番号 15)、(配列番号 16)、(配列番号 17)、(配列番号 18)、(配列番号 19)、(配列番号 20)、(配列番号 21)、(配列番号 22)、(配列番号 23)、(配列番号 24)、(配列番号 25)、(配列番号 26)、(配列番号 27)、(配列番号 28)、(配列番号 29)、(配列番号 30)、(配列番号 31)、(配列番号 32)、(配列番号 33)、(配列番号 34)、(配列番号 35)、(配列番号 36)、(配列番号 37)、(配列番号 38)、(配列番号 39)、(配列番号 40)、(配列番号 41)、(配列番号 42)、(配列番号 43)、(配列番号 44)、(配列番号 45)、(配列番号 46)、(配列番号 47)、(配列番号 48)、(配列番号 49)、(配列番号 50)、(配列番号 51)、(配列番号 52)、(配列番号 53)、(配列番号 54)、(配列番号 55)、(配列番号 56)、(配列番号 57)、(配列番号 58)、(配列番号 59)、および(配列番号 60)からなる群から選択されるヌクレオチド配列に含まれる、または
ii) ヌクレオチド配列またはその相補体のうちの、少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドであって、このヌクレオチド配列は、(配列番号 61)、(配列番号 62)、(配列番号 63)、(配列番号 64)、(配列番号 65)、(配列番号 66)、(配列番号 67)、(配列番号 68)、(配列番号 69)、(配列番号 70)、(配列番号 71)、(配列番号 72)、(配列番号 73)、(配列番号 74)、(配列番号 75)、(配列番号 76)、(配列番号 77)、(配列番号 78)、(配列番号 79)、(配列番号 80)、(配列番号 81)、(配列番号 82)、(配列番号 83)、(配列番号 84)、(配列番号 85)、(配列番号 86)、(配列番号 87)、(配列番号 88)、(配列番号 89)、(配列番号 90)、(配列番号 91)、(配列番号 92)、(配列番号 93)、(配列番号 94)、(配列番号 95)、(配列番号 96)、(配列番号 97)、(配列番号 98)、(配列番号 99)、(配列番号 100)、(配列番号 101)、(配列番号 102)、(配列番号 103)、(配列番号 104)、(配列番号 105)、(配列番号 106)、(配列番号 107)、(配列番号 108)、(配列番号 109)、(配列番号 110)、(配列番号 111)、(配列番号 112)、(配列番号 113)、(配列番号 114)、(配列番号 115)、(配列番号 116)、(配列番号 117)、(配列番号 118)、(配列番号 119)、(配列番号 120)、(配列番号 121)、(配列番号 122)、(配列番号 123)、(配列番号 124)、(配列番号 125)、(配列番号 126)、および(配列番号 127)からなる群から選択される、
ならびに
b)ステップ(a)で生成したアンプリコンを検出することであって、アンプリコンが検出されることは、サンプル中に変異株が存在することを示し、検出は、場合により、ステップ(a)(ii)の少なくとも１つの核酸配列とアンプリコンとのアニーリングを含むまたは含まない、
前記検出、
を含んでなる前記方法。
【請求項１８】
サンプル中のパルボウイルスB19を測定する方法であって、
a) 少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列、またはそれらの相補体を含んでなる、少なくとも１つの核酸分子を用いて、サンプル中のパルボウイルスB19核酸を増幅すること、ここで該連続したヌクレオチドは、(配列番号 2)、(配列番号 3)、(配列番号 4)、(配列番号 5)、(配列番号 6)、(配列番号 7)、(配列番号 8)、(配列番号 9)、(配列番号 10)、(配列番号 11)、(配列番号 12)、(配列番号 13)、(配列番号 14)、(配列番号 15)、(配列番号 16)、(配列番号 17)、(配列番号 18)、(配列番号 19)、(配列番号 20)、(配列番号 21)、(配列番号 22)、(配列番号 23)、(配列番号 24)、(配列番号 25)、(配列番号 26)、(配列番号 27)、(配列番号 28)、(配列番号 29)、(配列番号 30)、(配列番号 31)、(配列番号 32)、(配列番号 33)、(配列番号 34)、(配列番号 35)、(配列番号 36)、(配列番号 37)、(配列番号 38)、(配列番号 39)、(配列番号 40)、(配列番号 41)、(配列番号 42)、(配列番号 43)、(配列番号 44)、(配列番号 45)、(配列番号 46)、(配列番号 47)、(配列番号 48)、(配列番号 49)、(配列番号 50)、(配列番号 51)、(配列番号 52)、(配列番号 53)、(配列番号 54)、(配列番号 55)、(配列番号 56)、(配列番号 57)、(配列番号 58)、(配列番号 59)、および(配列番号 60)からなる群から選択されるヌクレオチド配列に含まれる、ならびに
b)ステップ(a)で生成したアンプリコンを検出すること、ここで該アンプリコンが検出されることは、サンプル中にパルボウイルスB19が存在することを意味し、検出は、場合により少なくとも１つの核酸配列とアンプリコンとのアニーリングステップを含むまたは含まない、
前記検出、
を含んでなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトエリスロウイルスに関するものであり、新規変異株を検出するのに有用な方法および組成物も本発明に含めるものとする。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルス科（Parvoviridae）を構成するウイルスは、動物および昆虫のありふれた病原体であるが、これは、少なくとも脊椎動物細胞に感染する能力に基づいて、さらにパルボウイルス亜科に分類される。エリスロウイルス属（Erythrovirus）に属するパルボウイルス類はヒトに感染することが知られており、たとえばAu (遺伝子型1)と呼ばれるプロトタイプのパルボウイルスB19、ならびにA6 (遺伝子型2)やV9およびD91.1 (遺伝子型3)などの変異株がある。これらは、一本鎖、直鎖DNAゲノムを有する非エンベロープ型のウイルスである。たとえば、パルボウイルスB19-Auとして知られるプロトタイプのヒトエリスロウイルス（たとえば、GenBank登録番号：M13178を参照されたい）は、長さ約5.6キロベースの直鎖DNAゲノムを有する。
【０００３】
パルボウイルスB19は1975年に発見され、その後、鎌状赤血球病患者において、骨髄無形成クリーゼに結びつけられた。それ以来、このウイルスが、伝染性紅斑（EI）（小児のりんご病）、自然流産、およびある種の急性関節炎などの、さまざまな病的状態および疾病の原因となること、またはそれらに関与することが明らかになった。
【０００４】
エリスロウイルスは至る所に存在し、感染性である。パルボウイルスB19の場合、成人のおよそ60%が血清反応陽性である。小児は、定期的にいっしょに遊び、学校に通学し始める年齢で特に感染しやすく、感染がピークの時期は春から初夏にかけてである。
【０００５】
空気感染および濃厚接触による伝染に加えて、ヒトエリスロウイルスは、妊娠した女性から胎児へ垂直感染することもある。たとえば、活動性の病状を有する妊婦のうちで、約30%の胎児がパルボウイルスB19に感染することになる。加えて、受胎後６週間以内に感染が起こると、パルボウイルスB19は自然流産を引き起こす可能性のあることが、現在十分に立証されている。こうした初期段階における感染は、生命と相容れない重大な異常を引き起こす。
【０００６】
ヒトエリスロウイルスの伝染は、さまざまな種類の血液製剤もしくは血漿製剤を介しても起こりうる。たとえば、パルボウイルスB19含有血漿プールから調製された血液製剤に起因する症候性疾患の症例が報告されている。パルボウイルスB19のDNAは、1回の献血中、血漿プール中、およびさまざまな製法で製造された血漿製剤（たとえば、凝固因子、アルブミン、アンチトロンビンIII、および免疫グロブリン）中から検出された。パルボウイルスB19伝染は、凝固因子による治療を受けた患者にも認められ、治療を受けた血友病患者では血清陽性率がより高いこと、パルボウイルスB19のDNAが存在すること、ならびに抗体陽転が起こっていることが明らかとなっている。残念なことに、血液／血漿製剤によるヒトエリスロウイルス伝染のリスクは、熱および溶媒-界面活性剤処理などの効果的な不活化法に対するウイルスの抵抗性によって、増大している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ヒトエリスロウイルスへの曝露から来る健康上のリスクは依然として存在し、エリスロウイルス属の変異株の同定および性質検討は、感染の正しい診断と管理に向けての重要なステップを構成することとなる。免疫診断法は、ヒトエリスロウイルスで汚染されている可能性のある血液、血清もしくは血漿を検査するために用いられてきた。しかし、こうした免疫診断法は、たとえば、最近の、もしくは直近の感染を効果的に検出できないこと、および／または異なる遺伝子型のエリスロウイルスを区別できないことを含め、限界がある。したがって、ヒトエリスロウイルスの変異株を同定および性質検討すること、ならびにそれらを検出および／または識別するための高感度で有効なアッセイを開発することは、いまなお必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
配列番号1、配列番号128、配列番号129に示すヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含んでなる、単離された核酸分子を提供する。
【０００９】
ある態様において、本発明は、配列番号1の核酸配列（すなわち、本明細書に開示のD11と名付けられた新規変異株の、部分的なゲノム配列）、ならびに既知のパルボウイルスB19 Au遺伝子型1、A6遺伝子型2、V9遺伝子型3、およびD91.1遺伝子型3の核酸配列で表される、パルボウイルス科の検出に単独で有用な核酸分子を提供する。したがって、本発明は、少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列、またはそれらの相補体を含んでなる、単離された核酸分子を包含するものであって、この連続したヌクレオチドは、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列中に含まれる、
5’-GATAACTGGTGGTGCTCT-3’                                        (配列番号 2)、
5’-ACTTCTGACTGGGA-3’                                            (配列番号 3)、
5’-GAATGTAACAAATTTGA-3’                                         (配列番号 4)、
5’-TTATTTAATAATGT-3’                                            (配列番号 5)、
5’-CTTGTAACTGAAA-3’                                             (配列番号 6)、
5’-TTTAGAGATGGAGA-3’                                            (配列番号 7)、
5’-TTAATGAAAAAAAT-3’                                            (配列番号 8)、
5’-CCTTTAAATGTTGT-3’                                            (配列番号 9)、
5’-CAGACTTTGAGCAGG-3’                                          (配列番号 10)、
5’-TGGAATAATGAAAA-3’                                           (配列番号 11)、
5’-TTTCCATTTAATGATGTAGC-3’                                     (配列番号 12)、
5’-TTGGTGGTCTGGGATGA-3’                                        (配列番号 13)、
5’-GAAGCTGCAAAAGCCATTTTAGG-3’                                  (配列番号 14)、
5’-ACCAGGGTAGATCA-3’                                           (配列番号 15)、
5’-ATAACCAGCAATGGTGACATTAC-3’                                  (配列番号 16)、
5’-CATGCTAAAGCCTTAAA-3’                                        (配列番号 17)、
5’-AGCCCTGACATGGG-3’                                           (配列番号 18)、
5’-TGGTGTAATGCACAAAGCTGG-3’                                    (配列番号 19)、
5’-CCACTATGAAAACTGGGCAATAAACTACAC-3’                           (配列番号 20)、
5’-TTTGATTTCCCTGGAAT-3’                                        (配列番号 21)、
5’-AATGCAGATGCCCTCCACCCAGA-3’                                  (配列番号 22)、
5’-CTCCAAACCACCCC-3’                                           (配列番号 23)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAGAACTC-3’                      (配列番号 24)、
5’-CCAGGCGCCTGGAACA-3’                                         (配列番号 25)、
5’- TGAAACCCCGCGCTCTAGTACGCC -3’                               (配列番号 26)、
5’-TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATCATTTGTCGGAAGC-3’                   (配列番号 27)、
5’-CAGTTTCGTGAACTGTTAGT-3’                                     (配列番号 28)、
5’-GCTTGGTATAATGGATGGAA-3’                                     (配列番号 29)、
5’-AAATGTGCTTACCT-3’                                           (配列番号 30)、
5’-TTTGTAGATTATGAGTAAA-3’                                      (配列番号 31)、
5’-ATTTCTTTAGATAATCC-3’                                        (配列番号 32)、
5’-TATATAGTCATCATTTTCA-3’                                      (配列番号 33)、
5’- CATGGACAGTTATCTGACCACCCCCATGCCTTATCATCCAGTA -3’            (配列番号 34)、
5’-CAGAACCTAGAGGAGAAAATGCAGTATTATCTA-3’                        (配列番号 35)、
5’-TGAAGACTTACACAAGCCTGGGCAAGTTAGC-3’                          (配列番号 36)、
5’- TACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAG -3’                    (配列番号 37)、
5’-TACAAGCTGGGCC-3’                                            (配列番号 38)、
5’-GACAGTGCTGCAAGGATTCATGACTTTAGGTATAGCCAA-3’                  (配列番号 39)、
5’-TTAAAAAATATAAAAAATGAAAC-3’                                  (配列番号 40)、
5’-TACTTTACTTTAAAAGGTGCAGCTGCCCCTGTGGCCCATTTTCAAGGAAGTTT-3’    (配列番号 41)、
5’- TACAACGCCTCAGAAAAATACCC -3’                                (配列番号 42)、
5’-AGCATGACTTCAGTTAA-3’                                        (配列番号 43)、
5’-TCTGCAGAAGCCAGCACTGGTGCAGG-3’                               (配列番号 44)、
5’-AAAAGCATGTGGAGTGA-3’                                        (配列番号 45)、
5’-AGTAGCTGCCACAATGC-3’                                        (配列番号 46)、
5’-TTAGATTTTAATGCTTT-3’                                        (配列番号 47)、
5’-GATGCTTTAACTGT-3’                                           (配列番号 48)、
5’-TATGCTTACTTAACAGTAGG-3’                                     (配列番号 49)、
5’-AGTGAAGAATCAGC-3’                                           (配列番号 50)、
5’-TTTTATGAAATGTACAA-3’                                        (配列番号 51)、
5’-GCTGAAGACAAAGAGTATCA-3’                                     (配列番号 52)、
5’-AATGAAAAAGAACA-3’                                           (配列番号 53)、
5’-TGGAACAGAAGAGC-3’                                           (配列番号 54)、
5’-CTTCACTATGAAAG-3’                                           (配列番号 55)、
5’-CCTCAAATATTTTTAAAAATA-3’                                    (配列番号 56)、
5’-CCTCAAATATTTTTAAAAATA-3’                                    (配列番号 57)、
5’-CATTTACCATATGTACT-3’                                        (配列番号 58)、
5’- TATGACCCCACAGCTACAGATGCAAA -3’                             (配列番号 59)、
および
5’-GGATATGAAAAGCCTGAAGAATTGTGGAC-3’                            (配列番号 60)。
【００１０】
別の態様において、本発明は、配列番号1の核酸配列によって表される、パルボウイルス科を特異的に検出するのにそれぞれ有用である核酸分子を提供する。したがって、本発明は、ヌクレオチド配列もしくはその相補体のうちの、少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子を包含するものである。このヌクレオチド配列は、下記からなる群から選択される、
5’-CACTTCTGACTGGGAACCATTAACTCATTCTAACAGACT-3’          (配列番号 61)、
5’-ATGTAAAGCTTAAATTTTTACCAGGAATGACTACAAAAG-3’          (配列番号 62)、
5’-AATATTTTAGAGATGGAGAACAATTTATAGAAAATTATT-3’          (配列番号 63)、
5’-ATTTTAGAGATGGAGAACAATTTATAGAAAATTATTTAA-3’          (配列番号 64)、
5’-TAACCAATATTGATGGGTACATAGATACCTGCATTTCTG-3’          (配列番号 65)、
5’-ATGGGTACATAGATACCTGCATTTCTGCTTCTTTTAGAC-3’          (配列番号 66)、
5’-TTAGACGGGGAGCCTTTCAGGCTAAAAAACCCCGCATTA-3’          (配列番号 67)、
5’-GAACCAGGGGAATCTAGCGCTACAGGGGGAGATGTTGTG-3’          (配列番号 68)、
5’-TGCCATTTGCTGGGAAGGGGACTAAAGCTGGAATAAAAT-3’          (配列番号 69)、
5’-GGACTAAAGCTGGAATAAAATTTCAAACTATGGTAAATT-3’          (配列番号 70)、
5’-TAAATTGGTTGTGTGAAAATAGGGTTTTTACAGAGGATA-3’          (配列番号 71)、
5’-ATTGGTTGTGTGAAAATAGGGTTTTTACAGAGGATAAGT-3’          (配列番号 72)、
5’-TTAACCAGTACACTTTACTTAGCAGTAGTCACAGTGGGA-3’          (配列番号 73)、
5’-TAAAACTAGCTATTTATAAGGCTACCAATTTAGTGCCTA-3’          (配列番号 74)、
5’-TAGCTATTTATAAGGCTACCAATTTAGTGCCTACAAGTA-3’          (配列番号 75)、
5’-CTACCAATTTAGTGCCTACAAGTACATTTTTGTTACACA-3’          (配列番号 76)、
5’-CAAGTACATTTTTGTTACACACAGACTTTGAGCAGGCTA-3’          (配列番号 77)、
5’-CACACAGACTTTGAGCAGGCTAACTGTATTAAAGAAAAT-3’          (配列番号 78)、
5’-GTGTCAAAATTATGACCCCTTGTTGGTGGGACAGCATGT-3’          (配列番号 79)、
5’-GGATTGATAAAAAATGTGGCAAAAAAAATACACTGTGGT-3’          (配列番号 80)、
5’-ATACACTGTGGTTTTATGGCCCACCAAGTACAGGAAAAA-3’          (配列番号 81)、
5’-GTACAGGAAAAACAAATTTAGCAATGGCTATTGCTAAAA-3’          (配列番号 82)、
5’-GCTTGGTGGTCTGGGATGAGGGTATTATTAAGTCTACTA-3’          (配列番号 83)、
5’-GCTTACTTACAGAGGCTGACGTGCAGCAATGGCTTACAT-3’          (配列番号 84)、
5’-CCCCGCGCTCTAGTACGCCAGTCCCCGGGACCAGTTCAG-3’          (配列番号 85)、
5’-AGAATCATTTGTCGGAAGCTCAATTTCCTCCGAAGCTGT-3’          (配列番号 86)、
5’-ATCATTTGTCGGAAGCTCAATTTCCTCCGAAGCTGTAGC-3’          (配列番号 87)、
5’-AGCTCAATTTCCTCCGAAGCTGTAGCTGCATCGTGGGAA-3’          (配列番号 88)、
5’-TGACTATGTATGGGATGGTATAAGGGGTTTACCTGTTTG-3’          (配列番号 89)、
5’-TTAATAACAGTGGGGGAGGCTTGGGATTTTGTCCCCATT-3’          (配列番号 90)、
5’-CAGTGGGGGAGGCTTGGGATTTTGTCCCCATTGCATTAA-3’          (配列番号 91)、
5’-GCAAAAAATGTGCTTACCTATCTGGCTTGCAAAGTTTTG-3’          (配列番号 92)、
5’-AATGTGCTTACCTATCTGGCTTGCAAAGTTTTGTAGATT-3’          (配列番号 93)、
5’-TTTGTAGATTATGAGTAAAGAAATTGGTAAATGGTGGGA-3’          (配列番号 94)、
5’-TTATGAGTAAAGAAATTGGTAAATGGTGGGAAAGTGATG-3’          (配列番号 95)、
5’-CTTCTTTGTTTGACTTAGTGGCTCGTATTAAAAGTAACC-3’          (配列番号 96)、
5’-ATGAAACTGGGTTTCAAGCTCAAGTAGTAAAAGACTACT-3’          (配列番号 97)、
5’-TCCTGATGCTTTAACTGTTGCCATATCAGAAATTGCCAT-3’          (配列番号 98)、
5’-TTGCCATATCAGAAATTGCCATTAAAGATGTTACAGACA-3’          (配列番号 99)、
5’-TGCCATATCAGAAATTGCCATTAAAGATGTTACAGACAA-3’          (配列番号 100)、
5’-AATACAAGTACCCATATGTATTAGGTCAAGGACAAGATA-3’          (配列番号 101)、
5’-AAGATACCTTAGCCCCAGAGCTTCCAATTTGGGTGTACT-3’          (配列番号 102)、
5’-CAGTAGGAGATGTAAACACGCAGGGAATTTCTGGGGACA-3’          (配列番号 103)、
5’-AGAATCAGCGTTTTATGTCCTGGAACACAGCTCTTTTGA-3’          (配列番号 104)、
5’-CTACTATGTCTTATAAGTTCCCTCCAGTGCCCCCAGAGA-3’          (配列番号 105)、
5’-TCCCTCCAGTGCCCCCAGAGAATTTAGAAGGCTGTAGTC-3’          (配列番号 106)、
5’-CCCGTTTAGGAGTCCCTGATACATTAGGAGGGGACCCCA-3’          (配列番号 107)、
5’-AACACATGAAGACCACGCAGTTCAGCCACAAAATTTTAT-3’          (配列番号 108)、
5’-ACGCAGTTCAGCCACAAAATTTTATGCCAGGGCCACTGG-3’          (配列番号 109)、
5’-GGCCACTGGTAAACTCAGTTTCCACAAAGGAGGGAGACA-3’          (配列番号 110)、
5’-AGGAGGGAGACAGTTCTAACACAGGAGCGGGAAAAGCCC-3’          (配列番号 111)、
5’-GTCAAAGTACTAGAATATCATTACGCCCTGGTCCAGTGT-3’          (配列番号 112)、
5’-GCCCTGGTCCAGTGTCTCAACCATATCACCACTGGGACA-3’          (配列番号 113)、
5’-GTCCAGTGTCTCAACCATATCACCACTGGGACACAGATA-3’          (配列番号 114)、
5’-CAGATAAATATGTAACAGGGATAAATGCCATTTCTCATG-3’          (配列番号 115)、
5’-CTGAAGACAAAGAGTATCAACAGGGCGTGGGTAGGTTTC-3’          (配列番号 116)、
5’-AAGACAAAGAGTATCAACAGGGCGTGGGTAGGTTTCCCA-3’          (配列番号 117)、
5’-AGGGCGTGGGTAGGTTTCCCAATGAAAAAGAACAACTAA-3’          (配列番号 118)、
5’-AACAGTTACAGGGTTTAAATATACACACATATTTTCCCA-3’          (配列番号 119)、
5’-GTTTAAATATACACACATATTTTCCCAATAAAGGTACCC-3’          (配列番号 120)、
5’-TACCAAATTTAGATGACAGCTTTAAAACTCAGTTTGCAG-3’          (配列番号 121)、
5’-AGCTTTAGGAGGTTGGGGACTACATCAGCCACCCCCTCA-3’          (配列番号 122)、
5’-GGCCAATTGGGGGTATTAAGTCAATGGGAATAACAACAT-3’          (配列番号 123)、
5’-TTAAGTCAATGGGAATAACAACATTAGTTCAATATGCTG-3’          (配列番号 124)、
5’-TAGTTCAATATGCTGTGGGTATTATGACAGTAACTATGA-3’          (配列番号 125)、
5’-TAACTATGACATTTAAATTAGGGCCTCGCAAAGCTACAG-3’          (配列番号 126)、 および
5’-ACCCTCCTCACGCAGCAGGCCATTTACCATATGTACTAT-3’          (配列番号 127)。
【００１１】
他の態様において、本発明は、ヌクレオチド配列もしくはその相補体からなる、単離された核酸分子を提供するが、このヌクレオチド配列は下記の群から選択される、
5’-TGAAACCCCGCGCTCTA-3’                                (配列番号136)、
5’-AACTAACAGTTCACGAAACTG-3’                            (配列番号137)、
5’-TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAA-3’                          (配列番号138)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGT-3’                                (配列番号139)、
5’-TAGAGCGCGGGGTTTCA-3’                                (配列番号140)、
5’-TGAAAGCTCTGAAGAACTCAGTGAAAGCAGCTTT-3’               (配列番号141)、
5’-AATGCAGATGCCCTCCAC-3’                               (配列番号142)、
5’-TCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAA-3’                    (配列番号143)、
5’-TGTTCCAGGCGCCTG-3’                                  (配列番号144)、
5’-CACAGCTACAGATGCAAA-3’                               (配列番号145)、
5’-GGTGCACACGGCTTTT-3’                                 (配列番号146)、
5’-TGTCCACAATTCTTCAGGCTTTTCATATCC-3’                   (配列番号147)、
5’-TGGATATGAAAAGCCTGAAGTATTGTGGAC-3’                   (配列番号148)、
5’-GGTCATTTACCATATGTACT-3’                             (配列番号149)、
5’-AGCTACAGATGCAAANCAACACCACAGACA-3’                   (配列番号150)、
5’-GAAAACTTTCCATTTAATGATGT-3’                          (配列番号151)、
5’-ATTTTTTGATCTACCCTGGT-3’                             (配列番号152)、
5’-TTGGTGGTCTGGGATGAAGG-3’                             (配列番号153)、
5’- GTTTTATGGGCCGCCAAGTA-3’                            (配列番号154)、
5’- TTCATCCCAGACCACCAAGG-3’                            (配列番号155)、
5’- ATGGCTATTGCTAAAACTGTTCCAGTGTA-3’                   (配列番号156)、
5’- TGGAATAATGAAAACTTTCCATTTAATGATGTAG-3’              (配列番号157)、 および
5’- CAATGGCCATTGCTAAAAGTGTTCCA-3’                      (配列番号158)。
【００１２】
一部の態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号1、配列番号128、配列番号129に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補体を含んでなるポリヌクレオチドとアニーリングするが、試験サンプル中に存在する可能性のある非パルボウイルスDNAもしくはRNA分子とは、ストリンジェントな条件下でアニーリングしない（すなわちパルボウイルスB19核酸に特異的に結合する）、単離された核酸分子を提供する。
【００１３】
ある態様において、本発明は、配列番号1、配列番号128、配列番号129に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補体と、ストリンジェントな条件下でアニーリングする、単離された核酸分子を提供するが、この単離された核酸分子は、パルボウイルスB19 Au、A6、V9、またはD91.1のDNAもしくはRNAとも、ストリンジェントな条件下でアニーリングする。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下でヌクレオチド配列もしくはその相補体とアニーリングする、単離された核酸分子を提供するが、このヌクレオチド配列は、配列番号1、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、および配列番号133に示されるとおりである。
【００１５】
他の態様において、本発明は、配列番号1、配列番号128、配列番号129に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補体と、ストリンジェントな条件下でアニーリングする、単離された核酸分子を提供するが、この単離された核酸分子は、パルボウイルスB19 Au、A6、V9、またはD91.1のDNAもしくはRNAとは、ストリンジェントな条件下でアニーリングしない。
【００１６】
他のさまざまな態様において、本発明は、オープンリーディングフレーム、部分オープンリーディングフレーム、もしくはそれらの相補体を含んでなる、単離された核酸分子を提供するが、このオープンリーディングフレームは、配列番号1、配列番号128、配列番号129、またはその相補体に含まれる。
【００１７】
他の態様において、本発明は、配列番号1、配列番号128、もしくは配列番号129に示されるヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、単離されたヒトエリスロウイルスを提供する。
【００１８】
ある態様において、本発明は、少なくとも１つのプライマーおよび少なくとも１つのプローブを含んでなるキットを提供するが、この少なくとも１つのプライマーは、(配列番号 136)、(配列番号 137)、(配列番号 139)、(配列番号 140)、(配列番号 142)、(配列番号 144)、(配列番号 145)、(配列番号 146)、(配列番号 149)、(配列番号 151)、(配列番号 152)、(配列番号 154)、または(配列番号 155)に示されるプライマー核酸配列を含んでなるものであり、前記の少なくとも１つのプローブは、(配列番号 138)、(配列番号 141)、(配列番号 143)、(配列番号 147)、(配列番号 148)、(配列番号 150)、(配列番号 153)、(配列番号 156)、(配列番号 157)、(配列番号 158)、またはそれらの相補配列として示されるプローブ核酸配列を含んでなるものである。
【００１９】
別の態様において、キットは、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを含んでなるが、このフォワードプライマーは、(配列番号 136)、(配列番号 139)、(配列番号 142)、(配列番号 145)、(配列番号 149)、(配列番号 151)、または(配列番号 154)に示されるフォワードプライマー核酸配列を含んでなり、前記リバースプライマーは、(配列番号 137)、(配列番号 140)、(配列番号 144)、(配列番号 146)、(配列番号 152)、または(配列番号 155)に示されるリバースプライマー核酸配列を含んでなるものであって、前記プローブは、(配列番号 136)、(配列番号 137)、(配列番号 138)、(配列番号 139)、(配列番号 140)、(配列番号 141)、(配列番号 142)、(配列番号 143)、(配列番号 144)、(配列番号 145)、(配列番号 146)、(配列番号 147)、(配列番号 148)、(配列番号 149)、(配列番号 150)、(配列番号 151)、(配列番号 152)、(配列番号 153)、(配列番号 154)、(配列番号 155)、(配列番号 156)、(配列番号 157)、(配列番号 158)、またはそれらの相補配列に示されるプローブ核酸配列を含んでなる。
【００２０】
一部の態様において、本発明は、サンプル中のパルボウイルスB19を検出するための方法を提供する。その方法は下記を含んでなる、
a)フォワードプライマー核酸配列を有するフォワードプライマー、およびリバースプライマー核酸配列を有するリバースプライマーを用いて、サンプルの少なくとも一部分でPCRを実施するが、このフォワードプライマー核酸配列は、(配列番号 136)、(配列番号 139)、(配列番号 142)、(配列番号 145)、(配列番号 149)、(配列番号 151)、または(配列番号 154)に示すとおりであり、リバースプライマー核酸配列は、(配列番号 137)、(配列番号 140)、(配列番号 144)、(配列番号 146)、(配列番号 152)、または(配列番号 155)に示すとおりである、ならびに
b)アンプリコンの有無を判定するが、アンプリコンの存在は、サンプル中にパルボウイルスB19が存在することを示しており、この判定には、オリゴヌクレオチドとアンプリコンとのアニーリングが含まれる。
【００２１】
他の態様において、本発明は、サンプル中のパルボウイルスB19を測定する方法を提供する。その方法は以下を含んでなる、
a)少なくとも１つの核酸分子を用いて、サンプル中のパルボウイルスB19核酸を増幅するが、この核酸分子は下記を含んでなる、
i) 少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列、またはその相補体であって、この連続したヌクレオチドが、(配列番号 2)、(配列番号 3)、(配列番号 4)、(配列番号 5)、(配列番号 6)、(配列番号 7)、(配列番号 8)、(配列番号 9)、(配列番号 10)、(配列番号 11)、(配列番号 12)、(配列番号 13)、(配列番号 14)、(配列番号 15)、(配列番号 16)、(配列番号 17)、(配列番号 18)、(配列番号 19)、(配列番号 20)、(配列番号 21)、(配列番号 22)、(配列番号 23)、(配列番号 24)、(配列番号 25)、(配列番号 26)、(配列番号 27)、(配列番号 28)、(配列番号 29)、(配列番号 30)、(配列番号 31)、(配列番号 32)、(配列番号 33)、(配列番号 34)、(配列番号 35)、(配列番号 36)、(配列番号 37)、(配列番号 38)、(配列番号 39)、(配列番号 40)、(配列番号 41)、(配列番号 42)、(配列番号 43)、(配列番号 44)、(配列番号 45)、(配列番号 46)、(配列番号 47)、(配列番号 48)、(配列番号 49)、(配列番号 50)、(配列番号 51)、(配列番号 52)、(配列番号 53)、(配列番号 54)、(配列番号 55)、(配列番号 56)、(配列番号 57)、(配列番号 58)、(配列番号 59)、および(配列番号 60)からなる群から選択されるヌクレオチド配列内に含まれる、または
ii) ヌクレオチド配列、またはその相補体の、少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドであって、このヌクレオチド配列が、(配列番号 61)、(配列番号 62)、(配列番号 63)、(配列番号 64)、(配列番号 65)、(配列番号 66)、(配列番号 67)、(配列番号 68)、(配列番号 69)、(配列番号 70)、(配列番号 71)、(配列番号 72)、(配列番号 73)、(配列番号 74)、(配列番号 75)、(配列番号 76)、(配列番号 77)、(配列番号 78)、(配列番号 79)、(配列番号 80)、(配列番号 81)、(配列番号 82)、(配列番号 83)、(配列番号 84)、(配列番号 85)、(配列番号 86)、(配列番号 87)、(配列番号 88)、(配列番号 89)、(配列番号 90)、(配列番号 91)、(配列番号 92)、(配列番号 93)、(配列番号 94)、(配列番号 95)、(配列番号 96)、(配列番号 97)、(配列番号 98)、(配列番号 99)、(配列番号 100)、(配列番号 101)、(配列番号 102)、(配列番号 103)、(配列番号 104)、(配列番号 105)、(配列番号 106)、(配列番号 107)、(配列番号 108)、(配列番号 109)、(配列番号 110)、(配列番号 111)、(配列番号 112)、(配列番号 113)、(配列番号 114)、(配列番号 115)、(配列番号 116)、(配列番号 117)、(配列番号 118)、(配列番号 119)、(配列番号 120)、(配列番号 121)、(配列番号 122)、(配列番号 123)、(配列番号 124)、(配列番号 125)、(配列番号 126)、および(配列番号 127)からなる群から選択される、ならびに
b)ステップ(a)で生成したアンプリコンを検出するが、アンプリコンが検出されることは、サンプル中に変異株が存在することを示しており、この検出は、場合により、ステップ(a)(ii)の少なくとも１つの核酸分子とアンプリコンとのアニーリングを含むまたは含まない。
【００２２】
一部の態様では、本発明は、サンプル中のパルボウイルスB19を測定する方法を提供する。その方法は下記を含んでなる、
a) 少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列、またはそれらの相補体を含んでなる、少なくとも１つの核酸分子を用いて、サンプル中のパルボウイルスB19核酸を増幅するが、この連続したヌクレオチドは、(配列番号 2)、(配列番号 3)、(配列番号 4)、(配列番号 5)、(配列番号 6)、(配列番号 7)、(配列番号 8)、(配列番号 9)、(配列番号 10)、(配列番号 11)、(配列番号 12)、(配列番号 13)、(配列番号 14)、(配列番号 15)、(配列番号 16)、(配列番号 17)、(配列番号 18)、(配列番号 19)、(配列番号 20)、(配列番号 21)、(配列番号 22)、(配列番号 23)、(配列番号 24)、(配列番号 25)、(配列番号 26)、(配列番号 27)、(配列番号 28)、(配列番号 29)、(配列番号 30)、(配列番号 31)、(配列番号 32)、(配列番号 33)、(配列番号 34)、(配列番号 35)、(配列番号 36)、(配列番号 37)、(配列番号 38)、(配列番号 39)、(配列番号 40)、(配列番号 41)、(配列番号 42)、(配列番号 43)、(配列番号 44)、(配列番号 45)、(配列番号 46)、(配列番号 47)、(配列番号 48)、(配列番号 49)、(配列番号 50)、(配列番号 51)、(配列番号 52)、(配列番号 53)、(配列番号 54)、(配列番号 55)、(配列番号 56)、(配列番号 57)、(配列番号 58)、(配列番号 59)、および(配列番号 60)からなる群から選択されるヌクレオチド配列中に含まれる、ならびに
b)ステップ(a)で生成したアンプリコンを検出するが、このアンプリコンが検出されることは、サンプル中にパルボウイルスB19が存在することを意味し、この検出は、場合により、少なくとも１つの核酸分子とアンプリコンとをアニーリングさせるステップを含むまたは含まない。
【００２３】
本発明の効果および利点は、本明細書を読むことで当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本明細書に開示の新規パルボウイルスB19変異株に対応するゲノムDNAの部分配列を示す（すなわち、D11変異株に対する配列番号1）。VP1およびVP2タンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）は、それぞれ2105位および2786位のヌクレオチドから開始されるのに対して、NS1タンパク質の部分ORFは、1から2109位までのヌクレオチドとして示され、その中でヌクレオチド2107〜2109位、すなわちGAGはグルタミン酸をコードする。
【図２Ａ】図２は、E3として本明細書に開示および記載の新規パルボウイルスB19変異株に対応するゲノムDNAの部分配列を示す（すなわち、配列番号128）。VP1タンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）は、ヌクレオチド2141位から開始されるが、ヌクレオチド1位から2145位まではNS1タンパク質の部分ORFとなっている。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図３Ａ】図３は、P1として本明細書に開示および記載の新規パルボウイルスB19変異株に対応するゲノムDNAの部分配列を示す（すなわち、配列番号129）。VP1タンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）は、ヌクレオチド2263位から開始されるが、ヌクレオチド1位から2167位まではNS1タンパク質の部分ORFとなっている。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図４Ａ】図４は、本発明の新規ヒトパルボウイルスB19変異株の部分DNA配列（すなわち、D11変異株に対する配列番号1；E3変異株に対する配列番号128、P1変異株に対する配列番号129）；AuヒトパルボウイルスB19 DNA、遺伝子型1（すなわち、登録番号M13178に対する配列番号130）、A6ヒトパルボウイルスB19 DNA、遺伝子型2、（すなわち、登録番号AY064476に対する配列番号131）；V9 ヒトパルボウイルスB19 DNA、遺伝子型3（すなわち、登録番号NC 004295に対する配列番号132）；およびD91.1 ヒトパルボウイルスB19 DNA、遺伝子型3（すなわち、登録番号AY083234に対する配列番号133）の配列比較を示す。この配列比較において、配列番号1、配列番号128、および配列番号129の1位に示されるヌクレオチドは、それぞれ図１における154位、図２における991位、および図３における1122位に相当する。
【図４Ｂ】図４Ａの続きである。
【図４Ｃ】図４Ｂの続きである。
【図４Ｄ】図４Ｃの続きである。
【図４Ｅ】図４Ｄの続きである。
【図４Ｆ】図４Ｅの続きである。
【図４Ｇ】図４Ｆの続きである。
【図４Ｈ】図４Ｇの続きである。
【図４Ｉ】図４Ｈの続きである。
【図４Ｊ】図４Ｉの続きである。
【図４Ｋ】図４Ｊの続きである。
【図４Ｌ】図４Ｋの続きである。
【図４Ｍ】図４Ｌの続きである。
【図４Ｎ】図４Ｍの続きである。
【図４Ｏ】図４Ｎの続きである。
【図４Ｐ】図４Ｏの続きである。
【図４Ｑ】図４Ｐの続きである。
【図４Ｒ】図４Ｑの続きである。
【図４Ｓ】図４Ｒの続きである。
【図４Ｔ】図４Ｓの続きである。
【図４Ｕ】図４Ｔの続きである。
【図５Ａ】図５は、97%コンセンサス配列の、パルボウイルスB19遺伝子型１プロトタイプAu株（すなわち、PVBAUA、配列番号130）に対する配列比較を示す。
【図５Ｂ】図５Ａの続きである。
【図５Ｃ】図５Ｂの続きである。
【図５Ｄ】図５Ｃの続きである。
【図５Ｅ】図５Ｄの続きである。
【図６】図６は、パルボウイルスB19遺伝子型１プロトタイプAu株（すなわち、PVBAUA、配列番号130）と、ヌクレオチド1351から2426までの高度に保存された領域を示す97%コンセンサス配列との配列比較を示す。
【図７】図７は、パルボウイルスB19遺伝子型１プロトタイプAu株（すなわち、PVBAUA、配列番号130）と、ヌクレオチド3704から4804までの高度に保存された領域を示す97%コンセンサス配列との配列比較を示す。
【図８】図８は、パルボウイルスB19ゲノム、ならびに保存配列および標的領域を示す転写マップの図解を示す。ITRは逆方向末端反復、NS1は非構造タンパク質1、VP1はウイルスタンパク質1、ならびにVP2はウイルスタンパク質2である。
【図９】図９は、標的領域5のプライマーおよびプローブの、パルボウイルスB19遺伝子型１のAu分離株、遺伝子型2のA6分離株、ならびに遺伝子型3の分離株V9およびD91.1の配列比較を示す。
【図１０】図１０は、パルボウイルスB19ゲノムの高度に保存された領域に由来する、標的領域およびオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１１】図１１は、標的領域1から4までの、P1（すなわち配列番号129）およびE3（すなわち配列番号128）の平均CT値を示す。増幅および検出が認められない試験サンプル希釈物は、CT =40としてプロットする。
【図１２】図１２は、プライマー／プローブセット2d、60℃：P1（すなわち配列番号129）およびE3（すなわち配列番号128）の増幅プロットを示す。
【図１３】図１３は、プライマー／プローブセット3b、55℃：P1（すなわち配列番号129）およびE3（すなわち配列番号128）の増幅プロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
これまでに報告されていないウイルスDNA配列のバリエーションを有する新規ヒトエリスロウイルス変異株（本明細書では、D11、P1、もしくはE3変異株と命名した）が、本発明によって見出された。本明細書に記載の新規変異株は、ヒトエリスロウイルス類の他の既知の変異株と、ある程度の核酸相同性を共有しているが、ウイルスゲノムのいくつかの領域は相違を示す。この相違は、現行の検出法を逃れた3種の未知のヒトエリスロウイルス変異株を示しており、こうした変異株を知ることは、ウイルスのスクリーニングおよび検出のための新たな方法を提供する。
【００２６】
本明細書の「ヒトエリスロウイルス」という用語は、エリスロウイルス属を構成するウイルスのメンバーを指す。
【００２７】
本明細書の「パルボウイルスB19」または「B19」という用語は、遺伝子型１、遺伝子型2、および遺伝子型3を含めた、パルボウイルス科のパルボウイルスB19を指す。たとえば、「パルボウイルスB19」には、少なくとも、パルボウイルスB19遺伝子型１（例、GenBank 登録番号：M13178）、ならびに関連する変異株、たとえば、A6パルボウイルスB19遺伝子型2（例、GenBank 登録番号：AY064476）、V9ヒトパルボウイルスB19遺伝子型3（例、GenBank 登録番号：NC 004295)、D91.1パルボウイルスB19遺伝子型3（例、GenBank 登録番号：AY083234）、および本発明のパルボウイルスB19変異株（すなわち、D11、E3、およびP1）が含まれる。Fryerら（Emerg. Infect. Diseases 2006 12:151-154）は、エリスロウイルス属のウイルスを含めたパルボウイルス亜科を構成するウイルスの系統発生解析を開示する。
【００２８】
本明細書の「ユニバーサル塩基」という用語は、任意の塩基と置き換えられる基を指す。「ユニバーサル塩基」は、ハイブリダイゼーションに寄与する必要はないが、ハイブリダイゼーションを有意に低下させるべきではない。ユニバーサル塩基の例には、5-ニトロインドールおよび4-ニトロベンゾイミダゾールがあるが、限定されない。
【００２９】
ある実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号128、配列番号129に示すヌクレオチド配列、またはその相補配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。一部の実施形態において、この単離された核酸分子は、一本鎖もしくは二本鎖の核酸からなる。他の実施形態において、単離された核酸分子はリボ核酸（RNA）、デオキシリボ核酸（DNA）、もしくはそれらの組合せからなる。
【００３０】
本明細書の「核酸」もしくは「核酸分子」という用語は、広く、RNA、DNA、修飾されたRNAもしくはDNA、スプライシングされたメッセンジャーRNA、RNAもしくはDNAミメティック、またはそれらの組合せ（たとえば、RNA/DNAハイブリッド）を含んでなる、任意の長さのポリマーを指す。したがって、この用語は、天然のヌクレオチド塩基、糖、およびヌクレオシド間の共有結合（骨格）からなるポリマー、ならびに同様に機能する非天然部分を有する核酸分子を包含する。さらに、「核酸分子」はまた、二本鎖、一本鎖もしくはそれらを組合せたポリマーも包含する。
【００３１】
本発明のもう一つの態様において、本発明の新規パルボウイルスB19変異株（すなわちD11）のDNAもしくはRNAとアニーリングすることができ、また、たとえばAu、A6、V9、またはD91.1パルボウイルスの配列といった、１つもしくは複数の他のパルボウイルス配列ともアニーリングすることができる、単離された核酸分子が提供され、これによって、1回のテストで複数のウイルス型を検出するのに役立つプローブおよびプライマーが提供される。したがって、上記態様によれば、本発明は、パルボウイルスB19の検出に有用な核酸分子に関するものであるが、このB19には配列番号1の核酸配列により特徴付けられる新規変異株、ならびにAu、A6、V9、およびD91.1として知られる１つもしくは複数の変異株が含まれる（図４を参照されたい）。したがって、本発明は、少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列、またはそれらの相補体を含んでなる、単離された核酸分子を包含するものであって、この連続したヌクレオチドは、(配列番号 2)、(配列番号 3)、(配列番号 4)、(配列番号 5)、(配列番号 6)、(配列番号 7)、(配列番号 8)、(配列番号 9)、(配列番号 10)、(配列番号 11)、(配列番号 12)、(配列番号 13)、(配列番号 14)、(配列番号 15)、(配列番号 16)、(配列番号 17)、(配列番号 18)、(配列番号 19)、(配列番号 20)、(配列番号 21)、(配列番号 22)、(配列番号 23)、(配列番号 24)、(配列番号 25)、(配列番号 26)、(配列番号 27)、(配列番号 28)、(配列番号 29)、(配列番号 30)、(配列番号 31)、(配列番号 32)、(配列番号 33)、(配列番号 34)、(配列番号 35)、(配列番号 36)、(配列番号 37)、(配列番号 38)、(配列番号 39)、(配列番号 40)、(配列番号 41)、(配列番号 42)、(配列番号 43)、(配列番号 44)、(配列番号 45)、(配列番号 46)、(配列番号 47)、(配列番号 48)、(配列番号 49)、(配列番号 50)、(配列番号 51)、(配列番号 52)、(配列番号 53)、(配列番号 54)、(配列番号 55)、(配列番号 56)、(配列番号 57)、(配列番号 58)、(配列番号 59)、(配列番号 60)、(配列番号 134)、および(配列番号 135)からなる群から選択されるヌクレオチド配列中に含まれる。
【００３２】
本発明の別の態様において、本発明の新規パルボウイルスB19変異株（すなわちD11、E3、およびP1）のDNAもしくはRNAとアニーリングすることができ、また、たとえばAu、A6、V9、またはD91.1パルボウイルスの配列といった、１つもしくは複数の他のパルボウイルス配列ともアニーリングすることができる、単離された核酸分子が提供され、それによって、1回のテストで複数のウイルス型を検出するのに役立つプローブおよびプライマーが提供される。したがって、上記態様によれば、本発明は、パルボウイルスB19の検出に有用な核酸分子に関するものであるが、このB19には配列番号1、配列番号128、および配列番号129の核酸配列により特徴付けられる新規変異株、ならびにAu、A6、V9、およびD91.1として知られる１つもしくは複数の変異株が含まれる。したがって、本発明は、配列番号1、配列番号128、および配列番号129に示されるヌクレオチド配列を含むエリスロウイルスゲノム中に存在する、配列もしくはその相補配列を含んでなる、単離された核酸分子を包含するが、この配列は、他の少なくとも１つのパルボウイルスゲノム中に含まれる。ある実施形態において、他の少なくとも１つのパルボウイルスゲノムは、パルボウイルスB19 Au、A6、V9、およびD91.1である。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドからなる配列、またはそれらの相補体を含んでなる、単離された核酸分子を包含するものであって、この連続したヌクレオチドは、(配列番号 13)、(配列番号 14)、(配列番号 15)、(配列番号 16)、(配列番号 17)、(配列番号 18)、(配列番号 19)、(配列番号 20)、(配列番号 21)、(配列番号 22)、(配列番号 23)、 (配列番号 25)、(配列番号 26)、(配列番号 27)、(配列番号 28)、(配列番号 29)、(配列番号 30)、(配列番号 31)、(配列番号 32)、(配列番号 33)、(配列番号 34)、(配列番号 35)、(配列番号 36)、(配列番号 37)、(配列番号 38)、(配列番号 134)、および(配列番号 135)からなる群から選択されるヌクレオチド配列中に含まれる。
【００３４】
他の実施形態において、本発明は、ヌクレオチド配列もしくはその相補体からなる単離された核酸分子を提供するが、このヌクレオチド配列は、（配列番号136）、（配列番号137）、（配列番号138）、（配列番号139）、（配列番号140）、（配列番号141）、（配列番号142）、（配列番号143）、（配列番号144）、（配列番号145）、（配列番号146）、（配列番号147）、（配列番号148）、（配列番号149）、（配列番号150）、（配列番号151）、（配列番号152）、（配列番号153）、（配列番号154）、（配列番号155）、（配列番号156）、（配列番号157）、および（配列番号158）からなる群から選択される。
【００３５】
他の態様において、単離された核酸分子は、新たに見出された本発明のD11変異株と、他の既知のパルボウイルスB19、たとえばAu、A6、V9、およびD91.1との区別を可能にする。したがって、本発明は、ヌクレオチド配列もしくはそれらの相補体の、少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子を提供する。このヌクレオチド配列は、新たに見出された本発明のD11変異株に含まれる領域に基づくものである。少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドは、サンプル中で、特異的かつ／または高感度のヒトエリスロウイルスの検出をもたらす。したがって、本発明は、ヌクレオチド配列もしくはそれらの相補体の、少なくとも12、少なくとも15、もしくは少なくとも20連続したヌクレオチドを含んでなる、単離された核酸分子を包含するが、このヌクレオチド配列は、（配列番号61）、（配列番号62）、（配列番号63）、（配列番号64）、（配列番号65）、（配列番号66）、（配列番号67）、（配列番号68）、（配列番号69）、（配列番号70）、（配列番号71）、（配列番号72）、（配列番号73）、（配列番号74）、（配列番号75）、（配列番号76）、（配列番号77）、（配列番号78）、（配列番号79）、（配列番号80）、（配列番号81）、（配列番号82）、（配列番号83）、（配列番号84）、（配列番号85）、（配列番号86）、（配列番号87）、（配列番号88）、（配列番号89）、（配列番号90）、（配列番号91）、（配列番号92）、（配列番号93）、（配列番号94）、（配列番号95）、（配列番号96）、（配列番号97）、（配列番号98）、（配列番号99）、（配列番号100）、（配列番号101）、（配列番号102）、（配列番号103）、（配列番号104）、（配列番号105）、（配列番号106）、（配列番号107）、（配列番号108）、（配列番号109）、（配列番号110）、（配列番号111）、（配列番号112）、（配列番号113）、（配列番号114）、（配列番号115）、（配列番号116）、（配列番号117）、（配列番号118）、（配列番号119）、（配列番号120）、（配列番号121）、（配列番号122）、（配列番号123）、
（配列番号124）、（配列番号125）、（配列番号126）、および（配列番号127）からなる群から選択される。
【００３６】
ある実施形態において、ヌクレオチド配列は、（配列番号61）、（配列番号64）、（配列番号65）、（配列番号66）、（配列番号68）、（配列番号70）、（配列番号81）、（配列番号84）、（配列番号86）、（配列番号87）、（配列番号88）、（配列番号89）、（配列番号97）、（配列番号102）、（配列番号109）、（配列番号114）、（配列番号119）、（配列番号120）、（配列番号121）、および（配列番号127）からなる群から選択される。
【００３７】
他の態様において、単離された核酸分子は、新たに見出された本発明の変異株（すなわちD11、E3、およびP1）と、他の少なくとも１つの既知のパルボウイルスB19、たとえばAu、A6、V9、およびD91.1との区別を可能にする。したがって、本発明は、エリスロウイルスゲノム中に存在する配列もしくはその相補体を含んでなる、単離された核酸分子を提供するが、このゲノムは、配列番号1、配列番号128、もしくは配列番号129に記載のヌクレオチド配列を含んでなり、その配列は、他の少なくとも１つのパルボウイルスゲノム中には存在しない。ヌクレオチド配列は、新たに見出された本発明のD11、E3および／またはP1変異株のゲノムの領域に基づくものである。この連続したヌクレオチドは、サンプル中でヒトエリスロウイルスの特異的かつ／または高感度の検出を提供する。
【００３８】
他の態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号1に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補体を含んでなるポリヌクレオチドとアニーリングするが、ストリンジェントな条件下で、試験サンプル中に存在する可能性のある他のDNAもしくはRNA分子とはアニーリングしない（すなわち、パルボウイルスB19核酸と特異的に結合する）、単離された核酸分子を提供する。ある実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号128に記載の通りであるか、またはその相補体である。ある実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号129に記載の通りであるか、またはその相補体である。本明細書で使用されるストリンジェントな条件とは、高度にストリンジェントな条件、または中程度にストリンジェントな条件である。
【００３９】
ストリンジェンシー条件は、当業者に明らかであり、たとえば、Current Protocols in Molecular Biology (1999. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, 編 John Wiley & Sons, Inc.)、またはSambrook ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989)に見出すことができる。ストリンジェンシー条件は、二本鎖領域を有する核酸ハイブリッドが、形成および／または維持される一連の条件に関する。2つの相補的な一本鎖核酸（DNAもしくはRNA）が、互いにアニーリングしてハイブリッドと呼ばれる複合体が形成されることは、当技術分野でよく知られている。ハイブリッドの形成または形成されたハイブリッドのその後の安定性は、ハイブリダイゼーション（すなわちアニーリング）が生じる条件、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件、もしくはその両方の影響を受けると考えられる。したがって、１つもしくは複数の核酸ハイブリダイゼーションステップによって（それに続いて１つもしくは複数の洗浄ステップを行うことができる）、相互にある程度の相補的同一性を有する２つの核酸は、互いにアニーリングして、二本鎖核酸の１つもしくは複数の連続する領域を含んでなるハイブリッドを形成することができる。さらに、ハイブリッド形成は、さまざまな環境で行うことができるが、たとえば、溶液中で、一方の成分をナイロン膜、ニトロセルロール紙、ポリスチレンなどの固相支持体上に固定化して、またはin situで（たとえば、適切に準備された細胞、または組織切片で）行うことができる。
【００４０】
たとえば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件の温度、持続時間、回数、または塩もしくは界面活性剤濃度といったいくつかの要因が、ハイブリッド形成および／または安定性に影響を提供することが、当技術分野でよく知られている。したがって、たとえば、ある条件のストリンジェンシーは、特に使用されるハイブリダイゼーション条件が、安定なハイブリッドとともに、安定性の低いハイブリッドも形成される条件であるならば、主に洗浄条件に起因しうる（たとえば、ストリンジェンシーの高い洗浄条件は、安定性の低いハイブリッドを除去することができる）。一般に、配列が長いほど、正しいアニーリングのために高い温度が必要となり、配列が短いほど低い温度が必要とされる。ハイブリダイゼーションは概して、相補鎖が融点以下の温度で好ましい環境中に存在するとき、変性した核酸がリアニーリングする能力に依存する。２つの配列間で求められるホモロジーの度合いが高いほど、用いることのできる相対温度は高くなる。結果として、相対温度が高ければ高いほど、反応条件はますますストリンジェントとなる傾向があり、温度が低いほどストリンジェントでなくなることになる。
【００４１】
一般に、ストリンジェンシーは、たとえば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄中の温度および塩濃度を操作することによって、変更またはコントロールすることができる。たとえば、高い温度と低い塩濃度の組合せは、ストリンジェンシーを高める。当業者は、ポリヌクレオチドの長さなどといった要因に対応するようストリンジェント条件の、温度、イオン強度などを、必要に応じて調整する方法を承知している。
【００４２】
本明細書に定義する「高ストリンジェント条件」とは、42℃で、50%ホルムアミド、5X SSC（0.75 M NaCl、0.075 Mクエン酸ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）、0.1% ピロリン酸ナトリウム、5X デンハート溶液、超音波処理サケ精液DNA（50μg/ml）、0.1% SDS、および10% デキストラン硫酸、ならびに42℃にて0.2X SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）で洗浄および55℃の50%ホルムアミドで洗浄、その後55℃にて0.1X SSCの洗浄を含む条件と規定することができる。
【００４３】
本明細書に定義する「中程度のストリンジェント条件」とは、上記の高ストリンジェント条件よりも低ストリンジェントの洗浄および／またはハイブリダイゼーション条件であると規定することができる。中程度のストリンジェント条件の例は、20%ホルムアミド、5X SSC（150 mM NaCl、15 mMクエン酸三ナトリウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）5X デンハート溶液、10% デキストラン硫酸、および20 mg/ml変性サケ精液DNAを含む溶液中、37℃にて一晩のインキュベーションと、それに続く約35〜50℃、1X SSCでの洗浄である。
【００４４】
核酸の二本鎖もしくはハイブリッドの安定性は、融解温度すなわちTmで表されることがあり、それは核酸二本鎖から一方の核酸の50%が解離する温度である。したがって、この融点は、必要なストリンジェンシー条件を定義するために用いることができる。複数の配列が、同一ではなく、互いに関連していて、大部分が同一である場合、最初に、特定の塩（たとえば、SSCもしくはSSPE）濃度で相同アニーリングのみが起こる、もっとも低い温度を確立することが有用であり得る。その後、1%のミスマッチが1℃のTmの低下をもたらすと推定し、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を、それに応じて低下させる（たとえば、互いに＞95%同一性を有する配列を望む場合、最終の洗浄温度を5℃下げる）。実際には、Tmの変化は、1%のミスマッチあたり0.5℃から1.5℃の間であり得る。
【００４５】
他の態様において、本発明は、高ストリンジェント条件下で、配列番号1に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補配列を含んでなるポリヌクレオチドとアニーリングする、単離された核酸分子を提供するが、この単離された核酸分子は、パルボウイルスB19 Au、A6、V9、またはD91.1変異株のDNAもしくはRNAとは高ストリンジェント条件下でアニーリングしない。ある実施形態において、該ポリヌクレオチドは配列番号128に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補配列を含んでなる。別の実施形態では、該ポリヌクレオチドは配列番号129に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補配列を含んでなる。ストリンジェンシー条件は上記の通りである。
【００４６】
ハイブリダイズする核酸分子のアニーリング部分の長さはさまざまに異なると考えられるが、典型的には少なくとも約6、例としては、少なくとも約10、12、15、20、25、30、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、または1000ヌクレオチドの長さである。しかしながら、マイナーグルーブ結合核酸のような結合エンハンサーは、普通の長さの核酸と比べて、より短い核酸ターゲットと、高い配列特異性をもってアニーリングすることを可能にする（Kutyavin IV, ら, Nucleic Acid Research 2000 28:655-661）。アニーリングした核酸のアニーリング部分は、本明細書に明記された核酸配列またはその相補配列の、一部もしくはすべての配列と、少なくとも60%、たとえば、少なくとも70%、80%、95%、または少なくとも98%同一である。本明細書に記載される型のアニーリング核酸は、たとえば、クローニングプローブ、プライマー（たとえばPCRプライマー）、または診断プローブとして使用することができる。
【００４７】
上記のように、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、本明細書に開示の核酸配列から導くことができる。さまざまな実施形態において、プライマーおよびプローブは、相互に組合せて使用される。本発明は、研究用、医療用、および診断用などのさまざまに異なる用途に用いることができるが、用途はこれに限定されない。
【００４８】
一部の実施形態では、プライマーおよびプローブは、配列番号1、配列番号128、または配列番号129の領域からデザインすることができるが、このプライマーおよびプローブは、それぞれ、パルボウイルスB19 Au、A6、V9、およびD91.1といった別のヒトエリスロウイルスゲノムの対応する領域にも存在する、１つもしくは複数の保存されたヌクレオチドを含んでなる。たとえば、少なくとも2つのパルボウイルス配列について、たとえばコンピューターアルゴリズムを用いてヌクレオチド配列比較を行って、少なくとも２つのパルボウイルスに共通する同一の連続したヌクレオチド配列を決定することができる。したがって、該プライマーおよびプローブは、たとえばパルボウイルスの検出アッセイもしくはキットに用いる試薬を提供し、それによって、該アッセイもしくはキットにより検出することができるパルボウイルス変異株のレパートリーを増やすことができる。
【００４９】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのプライマーおよび少なくとも１つのプローブを含んでなるキットを提供するが、この少なくとも１つのプライマーは、(配列番号 136)、(配列番号 137)、(配列番号 139)、(配列番号 140)、(配列番号 142)、(配列番号 144)、(配列番号 145)、(配列番号 146)、(配列番号 149)、(配列番号 151)、(配列番号 152)、(配列番号 154)、または(配列番号 155)に記載のプライマー核酸配列を含んでなり、少なくとも１つのプローブは、(配列番号 138)、(配列番号 141)、(配列番号 143)、(配列番号 147)、(配列番号 148)、(配列番号 150)、(配列番号 153)、(配列番号 156)、(配列番号 157)、(配列番号 158)もしくはそれらの相補配列からなるプローブ配列を含んでなる。
【００５０】
もう一つの実施形態において、キットは、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを含んでなるが、このフォワードプライマーは、(配列番号 136)、(配列番号 139)、(配列番号 142)、(配列番号 145)、(配列番号 149)、(配列番号 151)、または(配列番号 154)に示されるフォワードプライマー核酸配列を含んでなり、前記リバースプライマーは、(配列番号 137)、(配列番号 140)、(配列番号 144)、(配列番号 146)、(配列番号 152)、または(配列番号 155)に示されるリバースプライマー核酸配列を含んでなるものであって、前記プローブは、(配列番号 136)、 (配列番号 137)、(配列番号 138)、(配列番号 139)、(配列番号 140)、(配列番号 141)、(配列番号 142)、(配列番号 143)、(配列番号 144)、(配列番号 145)、(配列番号 146)、(配列番号 147)、(配列番号 148)、(配列番号 149)、(配列番号 150)、(配列番号 151)、(配列番号 152)、(配列番号 153)、(配列番号 154)、(配列番号 155)、(配列番号 156)、(配列番号 157)、(配列番号 158)、またはそれらの相補配列に示されるプローブ核酸配列を含んでなる。一部の実施形態では、プローブ核酸配列は、(配列番号 138)、(配列番号 141)、(配列番号 143)、(配列番号 147)、(配列番号 148)、(配列番号 150)、(配列番号 153)、(配列番号 156)、(配列番号 157)、(配列番号 158)、またはそれらの相補配列に示すとおりである。
【００５１】
一部の態様において、本発明は、サンプル中のパルボウイルスB19を検出するための方法を提供する。その方法は下記を含んでなる：
a)サンプルの少なくとも一部を用いて、フォワードプライマー核酸配列を有するフォワードプライマー、およびリバース核酸配列を有するリバースプライマーを使用してPCRを実施するが、このフォワードプライマー核酸配列は、(配列番号 136)、(配列番号 139)、(配列番号 142)、(配列番号 145)、(配列番号 149)、(配列番号 151)、または(配列番号 154)に記載の通りであり、リバースプライマー核酸配列は、(配列番号 137)、(配列番号 140)、(配列番号 144)、(配列番号 146)、(配列番号 152)、または(配列番号 155)に記載の通りである、ならびに
b)アンプリコンの有無を測定するが、アプリコンの存在は、サンプル中にパルボウイルスB19が存在することを示す。ある実施形態において、測定は、オリゴヌクレオチドをアプリコンとアニーリングすることを含んでなり、このオリゴヌクレオチドは(配列番号 138)、(配列番号 141)、(配列番号 143)、(配列番号 147)、(配列番号 148)、(配列番号 150)、(配列番号 153)、(配列番号 156)、(配列番号 157)、(配列番号 158)、またはそれらの相補配列に示される配列を含んでなる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識をさらに含む。別の態様では、PCRはリアルタイムPCRである。
【００５２】
一部の実施形態において、プライマーおよびプローブは、配列番号1、配列番号128、もしくは配列番号129の領域からデザインすることができるが、このプライマーおよびプローブはパルボウイルスB19 Au、A6、V9、およびD91.1といった他のヒトエリスロウイルスゲノムの対応する領域と比べて独特な１つもしくは複数のヌクレオチドを含んでなるものである。したがってこのプライマーおよびプローブは、パルボウイルスB19の検出を容易にするアッセイを提供することができるが、同時に、本明細書に記載の１つもしくは複数の新規変異株、または他の既知のヒトエリスロウイルス、たとえばパルボウイルスB19 Au、A6、V9、およびD91.1を区別するアッセイも与えることができる。したがって、このプライマーおよびプローブは、パルボウイルス変異株の中からある株を識別することができる、より特異的なパルボウイルス検出アッセイをもたらすことができる。
【００５３】
ハイブリダイゼーションアッセイプローブのもう一つの例は、「モレキュラービーコン」と呼ばれる構造であって、これはたとえば、米国特許第5,925,517号に記載されている。モレキュラービーコンは、対になった標識を含有し、ステム・アンド・ループ構造を形成する、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。ループの成分は、標的配列に相補的なプローブ配列を含んでなる。ステムは、標的核酸配列が存在しない場合にプローブを閉じたコンホメーションに保持する、親和性のある塩基対（すなわち核酸アーム）を含んでなる。ステムは、プローブ配列の両側にそれぞれ位置する相補的なアーム配列のアニーリングによって形成される。標的核酸配列と標的相補配列とのハイブリダイゼーションが、親和性塩基対を分離させ、それによってプローブは開いたコンホメーションに変わる。開いたコンホメーションへの転換は、対になった標識の相互作用が低下することによって検出でき、この標識ペアは、たとえばフルオロフォアおよびクエンチャー（例、DABCYLおよびEDANS）とすることができる。
【００５４】
ドナーとアクセプターのエネルギー移動を利用して2つ以上のプローブを同時に使用することが、当技術分野で知られている。したがって、色の異なるフルオロフォアを有するモレキュラービーコンを合成して、同じ反応で異なる標的を同時に検出するアッセイが行えるようにすることができる。たとえば、多重アッセイは、いくつかの異なるプライマーセットを含有することができ、それぞれのセットは、異なる病原体由来の特有の配列を増幅することを可能にし、対応する数のモレキュラービーコンが存在してもよく、そのそれぞれがアンプリコンのうち１つに特異的なプローブ配列を有し、異なる色のフルオロフォアでそれぞれ標識される。結果として生じる蛍光の色は、もしいくらかでもあれば、サンプル中の病原体を同定し、また、検出可能な蛍光を生じるのに必要な増幅回数は、存在する標的生物の数の定量的な指標を提供する。2種類以上の病原体がサンプル中に存在する場合、発生する蛍光の色は、いずれの病原体が存在するかを特定する。その上、遺伝子増幅アッセイに本来備わっているデザインにより、モレキュラービーコンの使用は、はるかに多量の病原体が存在する中で、微量の病原体の存在量を測定することを可能にする。
【００５５】
一般に、プライマーは、標的核酸の特異的な増幅を（たとえばPCRによって）もたらし、増幅産物（「アンプリコン」とも呼ばれる）を生成することができる。ある実施形態において、標的核酸は、本明細書に記載の新規ヒトエリスロウイルスのDNAもしくはRNAである。一部の実施形態では、標的核酸は、配列番号1に示すヌクレオチド配列を含有するゲノムを含んでなる。他の態様では、標的核酸は、配列番号1に示すヌクレオチド配列を含有するゲノムから転写されたRNA分子を含んでなる。ある実施形態において、ゲノムは、配列番号128、または配列番号129に示すヌクレオチド配列を含有する。
【００５６】
一部の実施形態において、プライマー配列は、少なくともヌクレオチド10個の長さとすることができるが、例として約10から約100個まで、約12から約75個まで、約14から約65個まで、約16から約60個まで、約20から約55個まで、約25から約50個まで、または約30から約45個まで、などとすることができる。ある実施形態では、プライマー配列は、ヌクレオチドが約15から約20個までの長さである。
【００５７】
プローブは一般に、標的領域配列内の１つもしくは複数の変異株ヌクレオチドに相補的な核酸配列を有するようにデザインされる。増幅に基づく検出法に使用するのに適したプローブは、2つの選択されたプライマーを用いて生成する増幅産物の配列内にある任意の配列からデザインすることができる。
【００５８】
さまざまな実施形態において、プローブ配列は、少なくともヌクレオチド約10個の長さとすることができるが、例として約10から約100個まで、約12から約75個まで、約14から約65個まで、約16から約60個まで、約20から約55個まで、約25から約50個まで、または約30から約45個まで、などとすることができる。ある実施形態では、プローブ配列は、ヌクレオチドが約15から約20個までの長さである。
【００５９】
ヌクレオチド残基の数に応じて、核酸分子は、「オリゴヌクレオチド」もしくは「オリゴマー」とも呼ぶことができる。「オリゴヌクレオチド」もしくは「オリゴマー」という用語は、典型的には、比較的短いヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。たとえば、オリゴヌクレオチドは、約5から約500個のヌクレオチド残基の長さとすることができる。オリゴヌクレオチドは、二本鎖もしくは一本鎖であると考えられるが、これらはその相補体に容易に結合することができるので、相補的DNAもしくはRNAを検出するための一本鎖プローブとして使用することができる。オリゴヌクレオチドを使用する方法の、限定的でない例としては、核酸検査（NAT）、DNAマイクロアレイ、増幅断片長多型（AFLP）解析、断片解析、サザンブロット、および蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）がある。DNAで構成されるオリゴヌクレオチドが、当業者によく知られている方法であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に使用されることが多い。これに関連して、オリゴヌクレオチドは、「プライマー」と呼ばれることもあり、これは相補的な標的配列に結合する、短いDNA片である。これは、ポリメラーゼが結合してヌクレオチドの付加によりプライマーを伸長させるための場所をもたらし、標的配列の相補的コピーが作製される。オリゴヌクレオチドはまた、「プローブ」と呼ばれることもあるが、これは、相補的な配列を保有する特定のDNAまたはRNA分子を検出および同定するために使用することができる、短いDNAもしくはRNA片である。プローブの検出は、蛍光、比色分析、放射能、抗原結合、または酵素活性によって行われる。
【００６０】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも5ヌクレオチド残基の長さのオリゴヌクレオチドであるが、例としては、約5から約500まで、約8から約400まで、約10から約300まで、約12から約200まで、約14から約100まで、約16から約90まで、約18から約80まで、約20から約70まで、約25から約60まで、または約30から約50残基までのオリゴヌクレオチドである。
【００６１】
本発明の単離された核酸分子は、Current Protocols in Molecular Biology (1999. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, 編 John Wiley & Sons, Inc.)に記載のPCRなどの標準的な分子生物学の手法によって、または化学合成によって、もしくは核酸アナログによって得ることができる、と当業者に理解されるであろう。
【００６２】
化学合成を伴う方法は、自動化および商業化されており、たとえば、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、もしくはホスホルアミダイト法が含まれ得る。米国特許第4,458,066号；第4,415,732号；ならびに Meth. Enzymol. 1979 68:90および109は、参照により本明細書に含めるものとするが、これらは化学合成法の実例を開示している。核酸の化学合成は、核酸分子内に、非天然塩基または修飾塩基を組み入れること、ならびに、さまざまな標識部分を組み入れることも可能にする。さらに、たとえば、ペプチド連結、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホトリエステル、2'-O-メチルRNA、2'-O-メチルRNA、P-エトキシDNA、およびP-エトキシ2'-O-メチルRNAといった、修飾された骨格化学構造も容易に利用可能であって、当技術分野で公知である。さらに、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて標的配列に架橋するために架橋性プローブを用いることは、当技術分野で公知である。たとえば、付加物形成によって核酸分子に付け加えられた、フロクマリンまたはプソラレンを基本とする化合物が、米国特許第4,826,967号および米国特許第5,082,934号（これら２つの特許は参照により本明細書に含めるものとする）に記載されており、介在する塩基部分のない状態で、リボースもしくはデオキシリボース糖部分の1位に、フェニル環を介して結合したクマリン部分を有する光活性化可能なヌクレオシドアナログが記載されている。
【００６３】
核酸アナログおよび擬似体は、天然の核酸分子と類似した化学構造を有するが、特有の修飾を伴う。核酸アナログ、たとえば、ロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、およびモルフォリノは、標準的な核酸化学に伴う限界を超えて、従来の核酸分子の可能性を向上させる（Karkare S and Bhatnagar D. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006 71:575-586）。こうした核酸アナログは、関連核酸配列を検出および同定する能力を大きく伸ばし改善する。
【００６４】
一部の態様において、本発明の単離された核酸分子は、さらに、１つもしくは複数の異種ヌクレオチドを含んでなる。「異種ヌクレオチド」という用語は、ここでは、単離された核酸分子に本来あるものではないが、単離された核酸分子に自然に、または人工的に結合された１つもしくは複数のヌクレオチドを指す。異種核酸配列の例には、ベクター配列、精製プローブの塩基配列に相補的な配列、たとえばエンハンサーもしくはプロモーター配列のような制御配列（すなわち、その配列に結合して転写を開始させ、RNA転写産物を生じる、RNAポリメラーゼによって認識される配列）、および１つもしくは複数の制限酵素部位を含む配列があるが、それらに限定されない。
【００６５】
「制御配列」という用語は、本明細書では、特定の宿主生物において機能的に連結されたコード配列の発現に必要な配列を指す。原核生物に適した制御配列には、たとえば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、およびリボゾーム結合部位がある。真核細胞は、プロモーター、メッセンジャーRNAスプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００６６】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置されるとき、「機能的に連結され」ている。たとえば、プレ配列もしくは分泌リーダーのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、そのポリペプチドをコードするDNAに機能的に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を提供するならば、そのコード配列に機能的に連結されている；あるいは、リボゾーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されているならば、コード配列に機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結される」とは、連結されているDNA配列が隣接していること、そして分泌リーダーの場合には隣接していて、しかも読み枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接する必要はない。連結は、利用しやすい制限酵素部位でのライゲーションによって行われる。そうした部位が存在しない場合には、従来法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくはリンカーを使用する。
【００６７】
ある実施形態において、１つもしくは複数の異種ヌクレオチドは、精製プローブの塩基配列に相補的な配列を有する。精製プローブは、溶解状態で遊離している粒子またはマトリックスのような固相支持体に連結することができる。固相支持体の非限定的な例としては、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および磁気誘因性粒子がある。たとえば、精製プローブは、DNAもしくはRNA配列からなることができ、クロスリンカーを介してアミンもしくはビオチンタグで標識することができる。次いで、このビオチンもしくはアミン標識された精製プローブは、in vitro核酸：核酸、もしくはタンパク質：核酸の相互作用をさせる、固定化法および検出法に供することができる。したがって、単離された核酸分子の異種セグメントを精製プローブの相補的塩基配列とアニーリングすることは、単離された核酸分子のウイルス特異的配列セグメントとアニーリングする分子のサンプル精製を促進することができる。米国特許第6,534,273号は、サンプル中の標的核酸分子を固相支持体上に捕捉する方法を記載しており、参考として本明細書に含めるものとする。
【００６８】
ある実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、上記のような固相支持体に結合している。
【００６９】
一部の実施形態において、１つもしくは複数の異種ヌクレオチドは、１つもしくは複数の繰り返し塩基配列を含有するが、それはたとえば、精製プローブの１つもしくは複数の繰り返し塩基配列に相補的な、１つもしくは複数の繰り返し塩基配列である。繰り返し塩基配列は、たとえば、ポリアデニン(An)、ポリチミン(Tn)、ポリシトシン(Cn)、ポリグアニン(Gn)、およびポリウリジン(Un)によって形成される配列のように、規則的に反復する塩基配列とすることができる。繰り返し配列は、AT反復（[AT]n）などのような混合ポリマーも含めることができる。
【００７０】
単離された核酸分子の１つもしくは複数の異種ヌクレオチドの繰り返し塩基配列の数は、精製プローブの繰り返し塩基配列の塩基数と等しい、それより多い、またはそれより少なくてよい。相補的な繰り返し配列の長さは、異種セグメント：精製プローブ複合体の融解温度（Tm）を決定しうる。ある実施形態において、異種セグメントの繰り返し塩基配列は、精製プローブの相補的繰り返し塩基配列より長い。別の実施形態において、異種セグメントまたは精製プローブの繰り返し塩基配列は、少なくとも約5塩基の長さとすることができるが、例を挙げると、約5から約40まで、約10から約30まで、または約15から約20まで、などとすることができる。
【００７１】
その他の実施形態において、１つもしくは複数の異種ヌクレオチドは、機能的に連結された制御配列を含有する。ある実施形態において、制御配列は、その配列に結合して転写を開始しRNA転写産物を生成するRNAポリメラーゼによって、特異的に認識されるエンハンサーもしくはプロモーター配列である。RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターの、限定的でない例としては、T3、T7、またはSP6といったプロモーターがある。したがって、単離された核酸分子は、たとえば、Nature 350:91-92 (1991)；および米国特許第5,399,491号に記載の転写仲介増幅（TMA）アッセイのような、RNAポリメラーゼを用いて複数のRNA転写産物を生成させるアッセイを含めて、核酸をベースとするさまざまなアッセイに使用することができ、上記2文献は参照により本明細書に含めるものとする。
【００７２】
場合により、本発明の単離された核酸分子を検出可能な標識に結合することができる。標識は、単離された核酸分子に直接、または間接的に結合することができる。核酸の標識化は、検出可能な原子団（標識）をたとえば内部もしくは末端のいずれかの位置に共有結合させることによって行うことができる。標識の付加を可能にする、反応性官能基を用いた、オリゴヌクレオチドを誘導体化するさまざまな方法があることは、当業者に明らかである。核酸分子に直接、標識を結合するために、そして、放射能、蛍光、化学発光、酵素、もしくは電子密度標識をアビジンを介して結合することができるようプローブをビオチン化するために、いくつかのアプローチを利用することができる。核酸を標識化するための標識および方法を記載する参考文献の限定的でない例として、米国特許第4,605,735号；米国特許第4,757,141号；米国特許第6,965,020号；Nucl. Acids Res. 5:363 (1978); Nucl. Acids Res. 13:1529 (1985); Nucl. Acids Res. 15:3131 (1987); Nucl. Acids Res. 15:6455 (1987); Nucl. Acids Res. 13:4485 (1985); Nucl. Acids Res. 15:4837 (1987); およびAnal. Biochem. 169:1-25 (1988)が挙げられるが、これらは核酸の標識化に関する記述を目的として参照により本明細書に含めるものとする。
【００７３】
本発明の単離された核酸分子を、クローニング（DNAの増幅）用もしくは発現用の複製可能なベクターに挿入することができる。さまざまなベクターが公的に入手可能である。ベクターは、たとえば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形をとることができる。適当な核酸配列をさまざまな手順でベクター内に挿入することができる。一般に、DNAは、当技術分野で公知の方法によって、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクターの構成要素には、一般に、シグナル配列、複製起点、１つもしくは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうち１つもしくは複数が含まれるが、これに限定されない。１つもしくは複数の上記成分を含有する適当なベクターの構築には、当業者に公知の標準的なライゲーション技術が用いられる。
【００７４】
さらに、オープンリーディングフレームを含む単離された核酸分子（このオープンリーディングフレームは配列番号1、配列番号128、または配列番号129に含まれる）、またはその相補体によりコードされるウイルスタンパク質は、組換えによって、直接作製することができるのみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして作製することも可能であって、この異種ポリペプチドは、シグナル配列であっても、またはその成熟タンパク質もしくはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する、他のポリペプチドであってもよい。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であってもよいが、ベクター内に挿入される、タンパク質をコードするDNAの一部であってもよい。シグナル配列は、たとえば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または耐熱性エンテロトキシンIIリーダーからなる群から選択される原核生物シグナル配列とすることができる。酵母での分泌のために、シグナル配列は、たとえば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロマイセス(Saccharomyces)およびクルイベロマイセス(Kluyveromyces)α因子リーダーなど、後者は米国特許第5,010,182号に記載）、または酸ホスファターゼリーダー、C. albicans グルコアミラーゼリーダー（EP 362,179）、またはWO 90/13646に記載のシグナルとすることができる。哺乳動物細胞での発現の場合、哺乳類のシグナル配列を用いてタンパク質の分泌を指示することができるが、これはたとえば同一種もしくは近縁種の分泌ポリペプチドに由来するシグナル配列であり、同様にウイルス性分泌リーダーも使用できる。
【００７５】
発現ベクターもクローニングベクターもいずれも、１つもしくは複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する。こうした配列は、さまざまな細菌、酵母、およびウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適合し、2μプラスミドの開始点は酵母に適しており、さまざまなウイルスの開始点（SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV、またはBPV）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【００７６】
発現およびクローニングベクターは、典型的には、選択遺伝子を含有するものであり、これは選択マーカーとも呼ばれる。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素、たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を提供するタンパク質、(b)栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または(c)複合培地から利用することができない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、たとえば、桿菌に対してのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【００７７】
哺乳動物細胞に適した選択マーカーは、たとえば、ウイルスタンパク質をコードした核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするマーカー、たとえばDHFRもしくはチミジンキナーゼである。野生型DHFRを使用する場合、適当な宿主細胞は、DHFR活性を欠失したCHO細胞株であるが、これは、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)に記載のように調製し、増殖させる。酵母での使用に適した選択遺伝子は、Nature 282:39 (1979); Gene 7:141 (1979); およびGene 10:157 (1980)に記載のように、酵母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である。trp1遺伝子は、Genetics 85:12 (1977)に記載のように、トリプトファンで増殖する能力を欠いた酵母の変異株、たとえば、ATCC No. 44076もしくはPEP4-1に対して選択マーカーとなる。
【００７８】
発現およびクローニングベクターは通常、ウイルスタンパク質をコードする核酸配列に機能的に結合したプロモーターを含有し、mRNA合成を指示する。宿主となりうるさまざまな細胞によって認識されるプロモーターがよく知られている。原核生物宿主に使用するのに適したプロモーターには、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系[Nature 275:615 (1978)およびNature 281:544 (1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系[Nucl. Acids Res. 8:4057 (1980)およびEP 36,776]、ならびにハイブリッドプロモーター、たとえばtacプロモーター[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21 25 (1983)]がある。細菌系で用いるプロモーターは、ウイルスタンパク質をコードするDNAに機能的に結合したシャイン・ダルガルノ（S.D.）配列を含有することもある。
【００７９】
酵母宿主とともに使用するのに適したプロモーター配列の例には、J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)に記載の3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、またはJ. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968)およびBiochemistry 17:4900 (1978)に記載の他の解糖酵素、たとえば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターがある。
【００８０】
他の酵母プロモーターは、転写が増殖条件によって制御されるという追加的な利点を有する誘導プロモーターであって、これは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝関連分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素の、プロモーター領域である。酵母での発現に使用するのに適したベクターおよびプロモーターは、EP 73,657にさらに記載されている。
【００８１】
哺乳動物細胞におけるベクターからのウイルスタンパク質の転写は、たとえば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス(GB 2,211,504)、アデノウイルス（たとえばアデノウイルス2）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、およびサルウイルス40 (SV40)といったウイルスのゲノムから得られるプロモーター、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターなどの異種哺乳類プロモーターから得られるプロモーター、ならびに熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、ただしこうしたプロモーターが宿主細胞系に適合していることが条件である。
【００８２】
ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって、高等真核生物による、ウイルスタンパク質をコードするDNAの転写を増大させることができる。エンハンサーは、DNAのシス作用エレメントであって、通常約10から約300 bpまでであり、プロモーターに作用してその転写を増加させる。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、およびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側にあるSV40エンハンサー（bp 100-270）、CMV初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。エンハンサーは、ウイルスタンパク質コード配列に対して5'または3'の位置で、ベクター内に挿入することができるが、好ましくはプロモーターから5'側に位置する。
【００８３】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞）に使用される発現ベクターは、転写終結のため、ならびにmRNAの安定化のために必要な配列も含有する。こうした配列は通例、真核生物もしくはウイルスのDNAまたはcDNAの非翻訳領域内のポリアデニル化部位の上流にある。この領域は、ウイルスタンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分において、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
【００８４】
組換え脊椎動物細胞の培養において、ウイルスタンパク質を合成するのに適した、他の方法、ベクター、および宿主細胞が、Nature 293:620 625 (1981); Nature 281:4046 (1979); EP 117,060; およびEP 117,058に記載されている。
【００８５】
宿主細胞は、本発明の単離された核酸分子で（または、それらを含んでなる発現ベクターもしくはクローニングベクターで）トランスフェクトまたは形質転換することができるが、さらに、ウイルス産生を誘導し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適切に改変された、従来の栄養培地で培養することができる。ある実施形態において、宿主細胞は赤血球細胞である。別の実施形態では、この赤血球細胞はヒト赤血球細胞である。
【００８６】
培地、温度、pHなどといった培養条件は、過度の実験をすることなく、当業者が選択することができる。細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、および実践的技術は、M. Butler, Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, IRL Press (1991) およびSambrookら、上記、に見出すことができる。
【００８７】
真核細胞をトランスフェクトする方法、および原核細胞を形質転換する方法は当業者に公知であり、たとえば、CaCl2、CaPO4、リポソームによる方法、およびエレクトロポレーションである。使用する宿主細胞に応じて、形質転換は、そうした細胞にふさわしい標準的な手法を用いて実施される。一般に原核生物には、Sambrookら(上記)に記載の塩化カルシウムを用いるカルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用される。Agrobacterium tumefaciensによる感染は、ある種の植物細胞の形質転換に使用されるが、これはGene 23:315 (1983)およびWO 89/05859に記載される。上記のような細胞壁を持たない哺乳動物細胞には、Virology 52:456 457 (1978)に記載のリン酸カルシウム沈殿法を用いることができる。哺乳動物細胞宿主系のトランスフェクションに関する一般的態様は、米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母の形質転換は、典型的には、J. Bact. 130:946 (1977) およびProc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829 (1979)に記載の方法にしたがって行われる。しかしながら、細胞内へDNAを導入する他の方法、たとえば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン（例、ポリブレン、ポリオルニチン）も使用することができる。哺乳動物細胞を形質転換するためのさまざまな技法については、たとえば、Methods in Enzymology 185:527 (1990) およびNature 336:348 (1988)を参照されたい。
【００８８】
他のさまざまな態様において、本発明は、オープンリーディングフレーム、もしくはその相補体を含んでなる、単離された核酸分子を提供するが、このオープンリーディングフレームは配列番号1に含まれる。ある実施形態において、このオープンリーディングフレームは配列番号128に含まれる。別の実施形態において、このオープンリーディングフレームは配列番号129に含まれる。
【００８９】
一部の態様において、本発明は、配列番号1に示すヌクレオチド配列を含んでなるゲノムを有する、単離されたヒトエリスロウイルスを提供する。ある実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号128または配列番号129に示すとおりである。
【００９０】
他の態様において、本発明は、キットを提供する。キットは、本明細書に記載の核酸配列を用いて開発することができる。こうした配列は、核酸増幅反応のプライマーとして、および／または核酸ハイブリダイゼーション法のプローブとして使用することができる。キットは、サンプル中のパルボウイルス核酸配列の存在を測定するのに有用である。キットの構成要素は、購入することも、当技術分野で周知の方法により作製することもできる。加えて、キットの構成要素は、必要に応じて、溶解状態、または凍結乾燥状態とすることができる。ある実施形態において、構成要素は同一区画に入っているが、別の実施形態では、構成要素は別々の区画に入っている。好ましい実施形態において、キットはさらに、使用説明書を含む。
【００９１】
（実施例)
以下の実施例を例示のみを目的として記載する。
【実施例１】
【００９２】
PCRによるパルボウイルスB19 D11変異株の検出
D11変異株を、生物学的起源、例えば血漿、血液、骨髄または臓器スクリーニング用の組織サンプルから検出する。
【００９３】
約1 mLの血漿または他の生物学的起源のサンプルを、パルボウイルスB19ビリオンの沈殿を促進するために設計された試薬を含有する約200μLのバッファー溶液に加える。キャプシドの破壊とペレット化を促進するために、バッファー溶液はカオトロピック物質 (例えばグアニジンイソチオシアナート)および／または界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS))を含有する。サンプルをボルテックス混合するかまたは反転させることにより十分に混合し、次いで遠心分離する。上清を破棄して、カオトロピック物質、(例えばグアニジンチオシアナート)を含有する約600μLのバッファー溶液をペレットに加え、ウイルスキャプシドを完全に破壊する。次いで、例えば約700μLのイソプロパノールを用いてパルボウイルスB19 DNAを沈殿させる。サンプルをボルテックス混合するかまたは反転させることにより十分に混合し、次いでDNAの大部分が回収されるような条件で遠心分離する。場合によりペレットを約1 mLの70%エタノールで洗浄する。遠心分離後に、パルボウイルスB19変異株DNAを回収し、次いでペレットをその後DNA増幅できるような容量(例えば200μL)のバッファー溶液に再懸濁する。
【００９４】
D11変異株核酸は、当技術分野で周知の技術を用いてPCRにより増幅する。例えば、i) バッファー溶液、ii) D 11変異体特異的オリゴヌクレオチド（そのうちの１つは5’末端がビオチン化されている）、iii) ジデオキシトリヌクレオチド、およびiv) DNAポリメラーゼを含む約35〜45μLの作業用マスター混合物を、増幅のためにPCRチューブまたはプレートに加える。５〜15μLの再懸濁サンプルを、作業用マスター混合物が入ったPCRチューブまたはプレートに加える。BioRad iCycler (Bio-Rad Laboratories社)などの標準PCRサーマルサイクラーを用いて、サンプルおよび全ての関係する対照をPCR増幅にかける。PCR増幅条件は、例えば、i)変性ステップ(例えば94℃で60秒)、ii)熱変性(例えば、94℃で15秒)およびポリメラーゼ伸長(例えば65℃で30秒)を含む約４０サイクル、ならびにiii)ポリメラーゼ伸長(例えば60℃で7分)の最終ステップを含む。
【００９５】
増幅の後に、生じる増幅産物を、当技術分野で周知の種々の方法を用いて検出する。例えば増幅産物は、生じた増幅生成物を最初に変性させ、変性された核酸配列を相補的なRNAプローブとアニーリングさせることによりRNA：DNA複合体を形成させて検出する。RNAプローブはパルボウイルスB19変異株配列から設計する。この複合体はストレプトアビジンコーティングされたプレート上で捕捉され、例えばELISAフォーマットでは前記複合体に対する抗体を用いて検出するかつ／または定量する。
【００９６】
当技術分野では種々のELISAフォーマットが知られている。例えば、50μLのサンプル希釈剤(例えば、Multiprep Specimen Diluent (MP DIL) (Roche Molecular Systems社, Branchburg, NJ))を96ウェルプレートに加え、25μLの変性試薬(1.25N NaOH)を添加する。次いでサンプル希釈剤および変性溶液を含有する各ウェルに、5〜10μLの増幅物質を加える。すべてのサンプルを移した後に、ELISAプレートを覆い、プレートを約30〜60秒間ロータリーシェーカーに載せてサンプルを混合する。プレートを室温で10〜20分インキュベートし、その後、各ウェルに約25μLのRNAプローブ(中和化用バッファー中に500 pmole/L)を加える。全サンプルを移した後、プレートを覆い、プレートを約30〜60秒ロータリーシェーカーに載せることでサンプルを混合し、次いで65℃で25〜35分インキュベートする。
【００９７】
インキュベート後に、各ウェルの内容物を、予めストレプトアビジンでコーティングした別の96ウェルプレートに移す。全てのサンプルを移した後に、プレートを覆い、該プレートをロータリーシェーカーに25〜35分載せることでサンプルを混合する。この後半のステップにより、組込まれたビオチン標識を含むRNA：DNA複合体がストレプトアビジンコーティングされたプレートに結合することができる。インキュベーションおよびウェルの内容物の除去の後に、100μLの適切に希釈された、RNA：DNA複合体を認識するよう標的化されている、アルカリホスファターゼにカップリングされた抗体を各ウェルに加え、ロータリーシェーカーで室温にて約25〜35分インキュベートする。
【００９８】
インキュベーションの後に、各ウェルを緩衝化された洗浄溶液(例えば、80mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、0.05% Tween 20)で約4〜5回洗浄し、非結合試薬を除去した。プレートに結合したRNA：DNA：抗体複合体は、アルカリホスファターゼ基質、例えばリン酸p-ニトロフェニル(pNPP)を用いて検出する。反応速度またはシグナル強度は、標準ELISAプレートリーダーを用いて405ナノメートルにて測定する。色の量は、ウェル中に存在するRNA：DNA：抗体複合体の相対量に対応する。D11変異株の量は、測定するサンプルと同じように処理された種々の濃度のD11変異株または好適な対照標準(例えば、校正されたプラスミド、増幅産物など)から作製された標準曲線への内挿により決定する。
【実施例２】
【００９９】
リアルタイムPCRによるパルボウイルスB19 D11変異株の検出
D11変異株はまた、当技術分野で周知のリアルタイムPCRを用いて検出し、かつ／または定量する。
【０１００】
ウイルス核酸を含むサンプルを上記のように調製する。増幅は、適切な量のPCR作業用マスター混合物を用いてPCRチューブまたはプレートにて行う。作業用マスター混合物は、i) D11変異株特異的オリゴヌクレオチド（そのうちの１つはその５’末端に蛍光色素を有しかつその３’末端にまたは３’末端付近にクエンチャー（蛍光抑制物質）を有する）、ii)デオキシリボヌクレオチド、およびiii)５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する好熱性DNAポリメラーゼを含有するバッファー溶液を含む。5〜15μLの再懸濁サンプルを、増幅のための作業用マスター混合物を含むPCRチューブまたはプレートに加える。リアルタイムPCR、例えばAB7300リアルタイムPCR System (Applied Biosystems社)を用いて、サンプルおよび全ての関連する対照を増幅する。
【０１０１】
リアルタイムPCR増幅条件は、例えばi)変性のステップ(例えば94℃にて60秒)、ii)熱変性(例えば94℃にて15秒)およびポリメラーゼ伸長(例えば65℃にて30秒)を含む約４０サイクル、ならびにiii)ポリメラーゼ伸長(例えば60℃にて7分)の最終ステップを含む。
【０１０２】
増幅の最中に、オリゴヌクレオチドから切断された蛍光色素を励起するための適当なエネルギー源、および放射された蛍光を捕捉するためのフィルターを用いて、生じる増幅産物を検出する。この検出は、標的の相対蛍光を測定し、それをサンプルと装置のバックグラウンド蛍光と比較することで、各増幅サイクルの最中に行う。この相対蛍光を、特徴付けされた分子標準の既知量を用いて導出した標準曲線に対してプロットし、該標準曲線を作製するために用いた対照の既知量に基づき、サンプルに量を割り当てる。
【実施例３】
【０１０３】
パルボウイルスB19 D11変異株感染性アッセイ
D11変異株の感染性を測定するために、プライマー(１種または複数種)およびプローブを用いて、D11変異株mRNAから増幅産物を増幅し検出する。増幅産物は、Virology 301:374-380 (2002)に記載のように、ウイルス複製の指標物質としての役割を果たす。
【０１０４】
パルボウイルスB19感染または複製に感受性の培養細胞に、D11変異株を感染させるかまたはウイルスDNAをトランスフェクトさせる。ウイルス遺伝子の発現後に、細胞を、適当なバッファー、例えば上記のグアニジンに基づくバッファーにより溶解させる。アルコールに基づく沈殿またはカラム中のマトリクスへの結合(例えば、Promega SV Total RNA Isolation System)または粒子フォーマット、例えば磁気ビーズ(例えば、Ambion’s MagMAX Viral RNA Isolation Kits)により、該溶解物から核酸を回収する。回収した核酸を洗浄して細胞残渣を除き、水またはTEバッファーのような適当な溶液に再懸濁する。回収された核酸の一部をDNaseで処理してDNAを分解する。これにより２種類のサンプルが調製され、１つは完全な感染細胞核酸を含むサンプルであり、もう片方は感染細胞RNAが富化された核酸を含むサンプルである。
【０１０５】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびD11変異株に固有のDNA配列を含む介在型プローブを用いて、サンプル中のD11変異株RNAを増幅し検出する。ウイルスRNAを、当技術分野で周知の標準的技術を用いてcDNAに逆転写する。例えば、SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen)などの試薬を使用し、特定のプライマーまたはランダムなオリゴマーを用いて逆転写ステップを開始する。
【０１０６】
ウイルスRNAのcDNAへの逆転写後に、標準的な増幅技術、例えばPCR、転写仲介増幅 (TMA)、またはリガーゼ連鎖反応を用いてD11変異株核酸を増幅する。パルボウイルスB19変異株の増幅された産物は、標識、例えば放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識を有する標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションの後に検出する。標識、したがって変異体は、例えば、TaqMan反応での増幅の最中の蛍光の放射のような標識の直接検出により、あるいは酵素のビオチンへの結合、または標識化抗体のプローブへの結合のような間接的検出により検出する。あるいは、スプライスされたmRNAをもたらす領域を標的とすることができる。短い増幅されたmRNA標的は、長さに基づいて核酸を区別する方法を用いることにより、ネイティブなDNAテンプレートから容易に区別することができる。
【実施例４】
【０１０７】
先行する増幅なしでのパルボウイルスB19 D11変異株の検出
D11変異株は、当技術分野で周知の非増幅型の技術を用いて検出しかつ／または定量する。こうした方法は、単一分子の検出により、高いシグナル対ノイズ比で極少量の核酸配列の検出を可能にする。
【０１０８】
例えばAnal. Chem. 76:4169 (2004)に記載のように、ポリメラーゼ伸長反応を用いて、上記のように調製したサンプル中のパルボウイルスB19変異株を検出する。高度に蛍光性の核酸レポーター分子はテンプレートとしてのパルボウイルスB19変異株標的核酸に固有の配列に基づいて作製する。例えば、レポーター分子は、D11変異株に固有のオリゴヌクレオチドプライマーを標的にアニーリングさせることにより形成される。次いでプライマーは、DNAポリメラーゼおよび遊離オリゴヌクレオチドにより伸長される。こうした遊離のオリゴヌクレオチドの１つがフルオロフォアで標識化されている。蛍光の検出はサンプル中にD11変異株が存在することを示す。
【０１０９】
D11変異株はまた、Analyst 130:483 (2005)に記載のような、蛍光分子ビーコン(MB)の共焦点型単一分子検出(SMD)を用いて、サンプル中から検出する。この技術は、本明細書に記載のパルボウイルスB19 D11変異株に固有の配列を有するオリゴヌクレオチドを利用する。分子ビーコンはそのネイティブなコンホメーションでは、ヘアピン構造を形成し、このときクエンチャー（蛍光抑制物質）とフルオロフォアが近接することにより蛍光が抑制される。標的パルボウイルスB19変異株オリゴヌクレオチドへのアニーリングのときにヘアピン構造は解かれて、そのことによりフルオロフォアはクエンチャーから解放されて蛍光が生じる。この蛍光の増大を共焦点顕微鏡法により検出する。
【０１１０】
D11変異株はまた、Analyst 131:484 (2006)に記載の方法を用いてサンプル中から検出する。この技術は２色量子ドット(QD)および単分子同時検出を用いてパルボウイルスB19変異株核酸の迅速で高感度の検出を可能にする。量子ドット(QD)は広範な励起スペクトルと狭い発光帯域を有し、比較的量子収率が高く、特別に光化学的に安定である。この方法によれば、D11変異株に固有の２つのビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを用いて、サンドイッチハイブリダイゼーション反応により特異的で相補的な標的DNAを認識し検出する。DNAハイブリッドは、最初に、特異的ストレプトアビジン−ビオチン結合により１種のQDの表面に捕捉される。異なる発光スペクトルを有する別の種類のQDがDNAハイブリッドの他方の末端に結合してQD/DNAハイブリッド/QD複合体が形成される。このハイブリッドは、両種のQDの結合に起因して同時型のスペクトルを示すが、該スペクトルは標的D11変異株DNAが存在しないときには見られない。
【実施例５】
【０１１１】
パルボウイルスB19 D11変異株特異的配列の差次的検出
本明細書に記載のD11変異株はまた、他のパルボウイルスB19、例えばAu、A6、V9、およびD91.1の中から、差次的に検出される。サンプルは上記のように調製し、D11変異株核酸は、該変異体配列を特異的に標的とするが他の遺伝子型を標的としない核酸オリゴヌクレオチドを用いて検出する。種々のパルボウイルスB19 遺伝子型のうちの配列特異的なバリエーションは、当技術分野で既知の種々のアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを用いて決定する。該アライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムとしてはFASTA、BLAST、またはENTREZ (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD.より入手可能)が挙げられるがこれに限らない。FASTAとBLASTはGCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, WI.)の一部として入手可能である。
【０１１２】
標的核酸は、完全なビリオン由来のゲノムDNAまたは細胞内で複製しているパルボウイルス由来のウイルスmRNAとすることができる。ウイルスDNAまたはmRNAは上記のように調製し、場合により特定の配列を選択するためのハイブリッド捕捉手法を縦列に追加することにより、標的化された核酸の富化を促進することができる。D11変異株に特異的な核酸配列は、当該変異体核酸の特異的増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーとして、検出のために(例えばフルオロフォア、色素、または検出用の他の分子の組込みにより)標識化されたオリゴヌクレオチドプローブとして、あるいは非特異的核酸配列を除去しつつ標的変異体を富化するための選択的な捕捉と保持のための部分として使用する。
【０１１３】
核酸の増幅および検出は上記のように行う。例えば変異体核酸は、標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ(例えば、TaqManまたは分子ビーコン)を用いて増幅反応の一部として検出する。あるいは、変異体核酸は、本明細書に記載のD11変異株に特異的なプライマーを用いて差次的に増幅し、種々の方法（限定するものではないが、ゲル電気泳動、増幅核酸の検出のためのマイクロウェルプレートシステム、ならびにJ. Virol Methods 136:210 (2006)およびJ. Clin. Microbiol. 44:2212 (2006)に記載のシグナルを生成するための種々の蛍光発生的手法などが挙げられる）により視覚化する。
【実施例６】
【０１１４】
パルボウイルスB19 DNAゲノムの保存領域の同定
B19検出アッセイの特異性を拡張して、パルボウイルスB19遺伝子型1、2、3、および変異体ならびに各遺伝子型に含まれる亜型の検出を包含するための、パルボウイルスB19ゲノムの新規な標的領域を同定するために、in silico解析を行い、遺伝子型1、2および3の部分的および完全コード配列（本発明の新規なD11、E3、およびP1変異体を含む）を比較して、パルボウイルスB19ゲノムの高度に保存された領域を決定した。
【０１１５】
合計で７つの検索をGenBank(リリース159)に対して行い、データベースに存在するパルボウイルスB19変異株ならびに遺伝子型1、2、および3のプロトタイプ株のDNA配列を同定した。これらの検索は次の用語、すなわち「パルボウイルスB19」、「ヒトパルボウイルスB19」、「ヒトパルボウイルスA6」、「ヒトパルボウイルスV9」、「ヒトパルボウイルスD91.1」、「パルボウイルスB19遺伝子型」、および「パルボウイルスB19変異株」を用いて行った。同定されたDNA配列をローカルのVector NTIデータベースに取込み、100塩基未満および5600塩基より長い配列、ヒトB19受容体および免疫グロブリン遺伝子、環状ベクター、パルボウイルス4、ならびにサルやイヌのような他種のパルボウイルスの配列を除外するようにフィルタリングした。100塩基未満の配列を除外したのは、隣接領域がほとんどの場合、プライマー由来であり必ずしも実際のネイティブなパルボウイルス配列ではないためである。5600塩基よりも長い配列を除外したのは、パルボウイルスB19ゲノムが5600塩基しかなく、これよりも長い配列は、コンセンサス配列を変更するベクターの隣接領域を含むからである。他の除外した配列はネイティブなパルボウイルスB19配列に典型的な配列ではなく、したがって全体としてのコンセンサス計算に含まれるべきではない。本発明の新規なD11、E3、およびP1変異体を含む残されたDNA配列は、表１のアライメント設定に従いVector NTI、バージョン7.1中のAlignXプログラムを用いてアライメントさせた。これはVector NTI、バージョン7.1の初期設定である。２つの個別の配列の互いに対するアライメントは対ごと(pairwise)のアライメント設定により決定され、個々の対ごとのアライメントが他の全ての対ごとのアライメントとどのように整列されるかは複数アライメント設定により決定される。
【表１】
2010516231.tif 000003
【０１１６】
コンセンサス配列は、Vector NTIを用いて以下のアライメント表示設定に従い100%、99%、98%、97%、および95%について計算した。コンセンサス計算では同一の残基のみを考慮し、コンセンサス計算ではギャップは無視し、コンセンサスのための残余部分(residue fraction for consensus)は、それぞれ1.0、0.99、0.98、0.97、および0.95に設定した。ある特定の配列をコンセンサスとして使用する機能はチェックを入れないままとした。表２にコンセンサス計算に使用した類似性の一覧表を示す。コンセンサス計算では、強い類似性のみを考慮した。
【表２】
2010516231.tif 000004
【０１１７】
97%にて計算したコンセンサス配列が最も高い配列相同性と、フィルタリングしたパルボウイルス配列同士の最も少ないヌクレオチドギャップをもたらした。これを、パルボウイルスB19のリアルタイムPCR検出における評価のためのオリゴヌクレオチドプライマーとプローブのセットを設計するためのコンセンサス配列とした。
【０１１８】
プライマーとプローブのセットの最初の同定は、標的領域が存在するか保存領域を目視で観察することにより行った。標的領域とは、プライマーおよび検出プローブを設計することのできる領域と定義する。100〜200ヌクレオチドであり、20ヌクレオチドより長い内部連続配列(プローブ結合領域)を有し、かつ15〜25連続ヌクレオチドの２つのフランキング配列(プライマー結合領域)を有する標的領域を同定した。また、内部配列はいずれかのフランキング配列と近接(20ヌクレオチド以内)していなければならない。同定されたプライマー配列は、プライマーダイマー形成、二次構造の存在、および融解温度についてさらに評価した。同定された検出プローブを評価して、二次構造が存在しないこと、プライマー／プローブダイマーが存在しないこと、５’グアニン残基が存在しないこと、ならびに融解温度が隣接するプライマーのペアよりも7〜10℃高いことを確認した。
【０１１９】
GenBankでの検索用語の組合せにより、881のDNA配列を同定し、これらをローカルのVector NTIデータベースに取込んだ。取込んだ881の配列は上記の基準にしたがってフィルタリングし、残った565のDNA配列をVector NTI、バージョン7.1中のAlignXプログラムを用いてアライメントした。
【０１２０】
表１および表２に示すVector NTIのアライメント表示設定を用いて、565のパルボウイルスB19 DNA配列のアライメントからDNAコンセンサス配列を生成した。「コンセンサスのための残余部分(residue fraction for consensus)」の値を変更しつつ他の全ての設定を保って、100%、99%、98%、97%、および95%相同性について種々のDNAコンセンサス配列を生成した。97%コンセンサス配列を、参照配列としてのB19のAu単離株(登録番号: M13178)とアラインメントし(図５)、保存領域の位置および97%レベルの配列相同性のどの位置にヌクレオチドが存在しないかを示す。
【０１２１】
97%DNA配列相同性コンセンサスの再精査から、パルボウイルスB19ゲノムの２つの領域が565のアライメントされたパルボウイルスB19配列全てにわたり高度に保存されていることが明らかになった。パルボウイルスB19遺伝子型1プロトタイプ株Auと比較すると、この２つの領域は、ヌクレオチド1351〜2426(図６)およびヌクレオチド3704〜4804(図７)を包含する。
【０１２２】
ヌクレオチド1351〜2426にわたる高度に保存された配列をさらに解析して、標的領域として利用可能なDNA領域が特定できるか調べた。４つ(4)の標的領域を同定し、これを領域1、2、4および5と命名した(図８および表３)。
【表３】
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【０１２３】
ヌクレオチド3704〜4804にわたる高度に保存された配列もまた、何かしら標的領域となる可能性のある領域が特定できるかさらに解析した。１つ(1)の標的領域が同定され、これを領域3と命名した(図８および表３)。
【０１２４】
領域1、2、4および5は、非構造型タンパク質1 (NS1)をコードするパルボウイルスB19遺伝子内に位置しており、領域3はウイルスタンパク質1および2 (VP1、VP2)をコードする重複型遺伝子内に位置する(図８)。図９は、例えば標的領域5のプライマー／プローブ配列とパルボウイルスB19遺伝子型1のプロトタイプ株Au(すなわち配列番号130)とのアライメントを示す。
【０１２５】
その結果、565のパルボウイルスB19変異株と遺伝子型1、2、および3のDNA配列とのアライメントから、パルボウイルスB19ゲノムの５つの高度に保存された標的領域が、97% DNA配列相同性にて同定された。97%DNA配列相同性において、5つの異なる領域に対する13のオリゴヌクレオチドプライマーを、コンセンサス配列と100％相同性で設計した。同じレベルで、10のオリゴヌクレオチド検出プローブを設計した。この10のプローブのうち、6が100％相同性を有する。少なくとも１つのプローブ(すなわちB19_4703-FAM)は97%コンセンサス配列と97%相同性を有する。このプローブ、B19_4703-FAMは、コンセンサス配列では空白である５’末端からヌクレオチド16において１つの塩基を有する。プローブとB19ウイルスDNA配列のハイブリダイゼーションを促進するために、この位置に普遍的塩基(5-ニトロインドール)を挿入した。例となる普遍的塩基アナログとしては、限定するものではないが、5-ニトロインドール、イノシン、および4-ニトロベンゾイミダゾールが挙げられる。
【実施例７】
【０１２６】
パルボウイルスB19検出についての新規な標的化戦略の評価
GenBank中に存在するヒトパルボウイルスB19遺伝子型1、2、および3の完全および部分的ゲノム配列のアライメントから得られるコンセンサス配列を利用して、パルボウイルスB19ゲノムの高度保存領域を同定し、各保存領域内のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを設計した(表３および図１０を参照のこと)。パルボウイルスB19に対する標的領域となる可能性があると同定された保存DNA配列領域がパルボウイルスB19変異株および遺伝子型の検出の特異性を実際に強化するか否かを実験的に評価するために、同定された保存領域の増幅と検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを設計した。合計で16のプライマー／プローブの組合せを評価した(表４)。
【表４】
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【０１２７】
全てのオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies社 (IDT) (Coralville, IA)より、プライマーについては100ナノモル合成スケールおよびプローブについては250ナノモルスケールにて購入した。各オリゴヌクレオチドはRNase、DNaseフリーの水に懸濁した。オリゴヌクレオチドセットを用いてB19マスター混合物を調製した(表４)。抽出パネルのために用いる血漿サンプルは、NAT-056 (遺伝子型1)、E3 (すなわち配列番号128) (遺伝子型1)、およびP1(すなわち配列番号129) (遺伝子型3)である。評価のためのパルボウイルスB19遺伝子型2を含有する血漿は現在、入手することができない。将来、評価のために、全長遺伝子型2の増幅産物を取得することができる。ストック物質を正常ヒト血漿中で１０倍連続希釈することで最終的に10-9希釈とすることにより、最初の抽出のためのP1(すなわち配列番号129)およびE3(すなわち配列番号128)の希釈パネルを作製した。表４に示すプライマーおよびプローブの組合せを用いて、10-4、10-7、および10-9試験サンプル希釈物を評価した。各抽出セットは表５に列記する試験サンプルと対照を含む。
【表５】
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【０１２８】
増幅と検出は、AB7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて実施した。全ての抽出サンプルは二重反復的に増幅した。増幅対照は各オリゴヌクレオチドセットについての５つのB19定量標準を含む。アッセイ対照は、B19陰性対照、B19低陽性対照、およびB19高陽性対照からなる。抽出サンプルを増幅するために用いた試験マスター混合物は、表４に列記した種々のプライマーおよびプローブの組合せを用いて調整した。それぞれのプライマーおよびプローブの組合せは、一部のプライマーやプローブの低い融解温度(Tm)に対応するために、２つのアニーリング温度／伸長温度、すなわち60℃と55℃で増幅した(表４)。
【０１２９】
各サンプル濃度についての、それぞれのプライマーおよびプローブの組合わせの55℃および60℃におけるパルボウイルスB19検出の結果を表６に示す。
【表６】
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【０１３０】
全5つの保存領域に対応する16のうちの13のプライマー／プローブセットからP1 (すなわち配列番号129)および／またはE3 (すなわち配列番号128)の検出が示された。プライマー／プローブセット2bでは増幅も検出も見られなかった。さらなるオリゴヌクレオチドおよびB19ゲノム領域配列解析から、増幅と検出をもたらそうにも、プローブとフォワードプライマーが互いに近接し過ぎていた(プローブがプライマーの３’末端と重複している)ことが明らかにされた。プライマー／プローブセット2cについても増幅と検出が見られず、これはおそらくリバースプライマーの設計の不備または低性能のためであろう。プライマー／プローブセット2fは、プライマー／プローブセット2cとリバースプライマーが共通することから、分析しなかった。12のプライマー／プローブセットのうちの10セットについて、アニーリング温度／伸長温度の両方における、P1 (すなわち配列番号129)およびE3 (すなわち配列番号128)の増幅と検出からの平均CT値を図１１に示す。プライマー／プローブセットの2dおよび3bについての増幅プロットの例を図１２および１３に示す。
【０１３１】
パルボウイルスB19ゲノムの保存領域として同定された5つの標的領域は全て、P1およびE3変異体の両方の検出を示し、これらの標的領域が少なくともパルボウイルスB19遺伝子型1および3について保存されていることが確認された。5つの標的領域を検出するために設計したプライマー／プローブセットは、確実で性能の良い増幅と検出を提供した。
【図１】
2010516231.tif 000011
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2010516231.tif 000013
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2010516231.tif 000017
【図４Ｃ】
2010516231.tif 000018
【図４Ｄ】
2010516231.tif 000019
【図４Ｅ】
2010516231.tif 000020
【図４Ｆ】
2010516231.tif 000021
【図４Ｇ】
2010516231.tif 000022
【図４Ｈ】
2010516231.tif 000023
【図４Ｉ】
2010516231.tif 000024
【図４Ｊ】
2010516231.tif 000025
【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
2010516231.tif 000029
【図４Ｏ】
2010516231.tif 000030
【図４Ｐ】
2010516231.tif 000031
【図４Ｑ】
2010516231.tif 000032
【図４Ｒ】
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【図４Ｓ】
2010516231.tif 000034
【図４Ｔ】
2010516231.tif 000035
【図４Ｕ】
2010516231.tif 000036
【図５Ａ】
2010516231.tif 000037
【図５Ｂ】
2010516231.tif 000038
【図５Ｃ】
2010516231.tif 000039
【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
2010516231.tif 000041
【図６】
2010516231.tif 000042
【図７】
2010516231.tif 000043
【図８】
2010516231.tif 000044
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010516231.tif 000051
2010516231.tif 000052
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