(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖からなり、前記第１及び第２のポリペプチド鎖が互いに共有結合したダイアボディ分子であって、
(Ｉ)  第１のポリペプチド鎖は、アミノ（Ｎ）末端及びカルボキシ（Ｃ）末端を有し、Ｎ末端からＣ末端に向けて、
(1) 第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含むドメインＡ、および
(2) 第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含むドメインＢ、
を含んでなり、前記ドメインＡと前記ドメインＢが共有結合で連結されているが、前記ドメインＡと前記ドメインＢはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
前記第１のポリペプチド鎖は、さらに、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むドメインＣと、前記ドメインＣと前記ドメインＡのＮ末端又は前記ドメインＢのＣ末端とを共有結合で連結するシステイン残基（Cys1）を含むリンカードメインとを含んでおり、
(ＩＩ)  第２のポリペプチド鎖は、アミノ（Ｎ）末端及びカルボキシ（Ｃ）末端を有し、Ｎ末端からＣ末端に向けて、
(1) 前記第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2)を含むドメインＤ、および
(2) 前記第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1)を含むドメインＥ、
を含んでなり、前記ドメインＤと前記ドメインＥが共有結合で連結されているが、前記ドメインＤと前記ドメインＥはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
前記第２のポリペプチド鎖は、さらに、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むドメインＦと、前記ドメインＣが前記ドメインＡのＮ末端と連結していた場合には前記ドメインＦと前記ドメインＤのＮ末端とを共有結合で連結し、又は前記ドメインＣが前記ドメインＢのＣ末端と連結していた場合には前記ドメインＥのＣ末端とを共有結合で連結するシステイン残基（Cys2）を含むリンカードメインとを含んでおり、
(Ａ)  前記ドメインＡと前記ドメインＥが互いに会合して、前記第１のエピトープと結合する第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており；
(Ｂ) 前記ドメインＢと前記ドメインＤが互いに会合して、前記第２のエピトープと結合する第２の結合部位(VL2)(VH2)を形成しており；
(Ｃ) 前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとは異なり；
(Ｄ) 前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖が、前記システイン残基（Cys1）と、前記システイン残基（Cys2）の間のジスルフィド結合を介して互いに共有結合されており；
(Ｅ) 前記ドメインＣ及び前記ドメインＦの前記ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインが会合してＦｃドメインを形成している；
ことを特徴とするダイアボディ分子。
【請求項２】
前記ドメインＣは、さらに、前記ＣＨ２ドメインのＮ末端にヒンジドメインを含んでいることを特徴とする請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項３】
前記システイン残基（Cys1）を含むリンカードメインは、前記ドメインＣと前記ドメインＡのＮ末端とを共有結合で連結し、前記システイン残基（Cys2）を含むリンカードメインは、前記ドメインＦと前記ドメインＤのＮ末端とを共有結合で連結することを特徴とする請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項４】
前記システイン残基（Cys1）を含むリンカードメインは、前記ドメインＣと前記ドメインＢのＣ末端とを共有結合で連結し、前記システイン残基（Cys2）を含むリンカードメインは、前記ドメインＦと前記ドメインＥのＣ末端とを共有結合で連結することを特徴とする請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項５】
前記第１の免疫グロブリンまたは前記第２の免疫グロブリンがヒト又はヒト化免疫グロブリンであり、該ヒト又はヒト化免疫グロブリンがIgA、IgE、IgD、IgGまたはIgMである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のダイアボディ分子。
【請求項６】
前記ヒト又はヒト化免疫グロブリンがIgGであり、該IgGがIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択される、請求項５に記載のダイアボディ分子。
【請求項７】
Ｆｃドメインがヒト又はヒト化Ｆｃドメインである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のダイアボディ分子。
【請求項８】
少なくとも１つのエピトープ結合部位がFcγRI、FcγRIIまたはFcγRIII受容体に対して特異的である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のダイアボディ分子。
【請求項９】
Fcγ受容体がFcγRIII受容体であり、該FcγRIII受容体がFcγRIIIA(CD16A)受容体またはFcγRIIIB(CD16B)受容体である、請求項８に記載のダイアボディ分子。
【請求項１０】
FcγRIII受容体がFcγRIIIA(CD16A)受容体である、請求項９に記載のダイアボディ分子。
【請求項１１】
Fcγ受容体がFcγRII受容体であり、該FcγRII受容体がFcγRIIA(CD32A)受容体またはFcγRIIB(CD32B)受容体である、請求項８に記載のダイアボディ分子。
【請求項１２】
FcγRII受容体がFcγRIIB(CD32B)受容体である、請求項１１に記載のダイアボディ分子。
【請求項１３】
少なくとも一つのエピトープ結合部位が病原性抗原に対して特異的である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイアボディ分子。
【請求項１４】
少なくとも一つのエピトープ結合部位が癌抗原に対して特異的である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイアボディ分子。
【請求項１５】
少なくとも一つのエピトープ結合部位が毒素または薬物に対して特異的である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイアボディ分子。
【請求項１６】
前記ダイアボディがCD32Bに特異的なエピトープ結合部位とCD16Aに特異的なエピトープ結合部位を有する、請求項８に記載のダイアボディ分子。
【請求項１７】
前記ドメインＣは、変異型ＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、前記変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のダイアボディ分子。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のダイアボディ分子の第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項２１】
前記病原性抗原により特徴づけられる疾患または障害の治療に使用するための医薬の製造における、請求項１３に記載のダイアボディ分子の使用。
【請求項２２】
前記疾患または障害が感染性疾患である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記癌抗原により特徴づけられる癌の治療に使用するための医薬の製造における、請求項１４に記載のダイアボディ分子の使用。
【請求項２４】
前記癌抗原がＨｅｒ２である、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2005年4月15日付の米国仮出願第60/671,657号の恩恵を主張するものであり、
その全内容を参照として本明細書に組み入れる。
【０００２】
1. 発明の分野
本発明は、ダイアボディ分子と、免疫疾患や癌を含む様々な疾患および障害の治療におけ
るその使用に関する。本発明のダイアボディ分子は、少なくとも２つのエピトープ結合部
位（同一のまたは異なるエピトープを認識しうる）を形成するように結合している少なく
とも２つのポリペプチド鎖を含むものである。さらに、エピトープは同一のまたは異なる
分子に由来しても、同一のまたは異なる細胞上に位置してもよい。ダイアボディ分子の個
々のポリペプチド鎖は、非ペプチド結合型共有結合を介して共有結合されており、例えば
、各ポリペプチド鎖内に存在するシステイン残基のジスルフィド結合により共有結合され
るが、これに限定されない。特定の実施形態において、本発明のダイアボディ分子は、該
分子に抗体様機能性をもたせるFc領域をさらに含む。
【背景技術】
【０００３】
2. 発明の背景
共有結合型ダイアボディ（covalent diabody）の設計は一本鎖Fv構築物（scFv）に基づい
ている(Holligerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; その全内容を参
照することにより本明細書に組み入れる)。完全な非修飾型のIgGでは、VLおよびVHドメイ
ンが別々のポリペプチド鎖、すなわち、それぞれ軽鎖と重鎖に位置している。抗体軽鎖と
抗体重鎖の相互作用、特にVLドメインとVHドメインの相互作用により、該抗体のエピトー
プ結合部位の１つが形成される。これに対して、scFv構築物では、抗体のVLおよびVHドメ
インが１本のポリペプチド鎖に含まれているが、これらのドメインは、機能性のエピトー
プ結合部位へとこれら２つのドメインが自己集合することを可能にする、十分な長さの柔
軟性リンカーによって分離されている。リンカーの長さが不十分なため（約12アミノ酸残
基より短いため）、これらのドメインが自己集合できない場合には、２つのscFv構築物が
相互作用して二価の分子を形成する（一方の鎖のVLが他方の鎖のVHと結合する）（Marvin
ら, 2005, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658）。さらに、該構築物のＣ末端にシステイ
ン残基を付加させると、ポリペプチド鎖同士のジスルフィド結合が可能となり、生じる二
量体はその二価分子の結合特性の妨害なしに安定化することが分かっている (例えば、Ol
afsenら, 2004, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27参照)。さらに、特異性が異なっている
VLおよびVHドメインを選択する場合には、二価であるだけでなく、二重特異性を示す分子
を構築することができる。
【０００４】
二価のダイアボディは、治療や免疫診断を含めて、広範囲の用途を有する。二価にすると
、様々な用途でのダイアボディの設計および工学的操作が非常にフレキシブルとなり、多
量体抗原に対する結合活性の向上、異なっている抗原の架橋、両標的抗原の存在に依存す
る特定の細胞型への直接的なターゲッティングが可能となる。それらの増大した結合価、
低い解離速度、および（約50kDa以下の、小サイズのダイアボディの場合は）循環系から
の速やかなクリアランスのため、当技術分野で知られたダイアボディ分子は腫瘍イメージ
ングの分野においても特別に使用されている (Fitzgeraldら, 1997, Protein Eng. 10:12
21)。異なっている細胞の架橋、例えば細胞傷害性Ｔ細胞の腫瘍細胞への架橋は特に重要
である (Staerzら, 1985, Nature 314:628-631、およびHolligerら, 1996, Protein Eng.
9:299-305)。ダイアボディのエピトープ結合ドメインはまた、Ｔリンパ球、ナチュラル
キラー(NK)細胞または他の単核細胞上に発現されるCD3、CD16、CD32もしくはCD64のよう
な免疫エフェクター細胞の表面決定基にも向けられる。多くの研究において、エフェクタ
ー細胞の決定基、例えばFcγ受容体(FcγR)へのダイアボディ結合はまた、エフェクター
細胞を活性化することが見出された (Holligerら, 1996, Protein Eng. 9:299-305; Holl
igerら, 1999, Cancer Res. 59:2909-2916)。通常、エフェクター細胞の活性化は、抗原
と結合した抗体がFc-FcγR相互作用を介してエフェクター細胞に結合することによって開
始される。したがって、これに関連して、本発明のダイアボディ分子は、それらがFcドメ
インを含むかどうかに係りなく、（例えば、当技術分野で知られたまたは本明細書に例示
されたエフェクター機能アッセイ（例えば、ADCCアッセイ）でアッセイするとき）Ig様機
能を示すことができる。腫瘍細胞とエフェクター細胞を架橋させることによって、ダイア
ボディは腫瘍細胞のすぐ近くにエフェクター細胞を引き寄せるだけでなく、腫瘍の効果的
な死滅をもたらす (例えば、Cao and Lam, 2003, Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197を
参照；その全内容を参照することにより本明細書に組み入れる)。
【０００５】
2.1 エフェクター細胞受容体および免疫系におけるその役割
伝統的な免疫機能では、抗体-抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、広範囲の応答
をもたらし、その範囲はエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害作用、肥満細胞
脱顆粒、および食作用）から免疫調節シグナル（例えば、リンパ球増殖および抗体分泌の
調節）にまで及ぶ。これらの相互作用はすべて、抗体または免疫複合体のFcドメインが造
血細胞上の特殊な細胞表面受容体と結合することにより開始される。抗体と免疫複合体に
より開始される細胞応答の多様性は、Fc受容体の構造上の不均一性からもたらされる。Fc
受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介すると思われる構造的に関連した抗原結合ドメイン
を共有する。
【０００６】
タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであるFcγ受容体は、
免疫グロブリン分子のFcγ部分と結合することができる表面糖タンパク質である。このフ
ァミリーの各メンバーは、Fcγ受容体のα鎖上の認識ドメインを介して１以上のアイソタ
イプの免疫グロブリンを認識する。Fcγ受容体は免疫グロブリンサブタイプに対するその
特異性によって定義される。IgGに対するFcγ受容体はFcγRと、IgEに対するものはFcεR
と、そしてIgAに対するものはFcαRと呼ばれる。さまざまなアクセサリー細胞が異なるア
イソタイプの抗体に対するFcγ受容体を持ち、抗体のアイソタイプが所与の応答にどのア
クセサリー細胞が関わるかを決定する（Ravetch J.V.ら 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:4
57-92；Gerber J.S.ら 2001 Microbes and Infection, 3:131-139；Billadeau D.D.ら 20
02, The Journal of Clinical Investigation, 2(109):161-1681；Ravetch J.V.ら 2000,
Science, 290:84-89；Ravetch J.V.ら, 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90；Ravetch
J.V. 1994, Cell, 78(4):553-60に論評される）。種々のFcγ受容体、それを発現する細
胞、およびそのアイソタイプ特異性を表１にまとめてある（「免疫生物学：健康と病気に
おける免疫系（Immunobiology: The Immune System in Health and Disease）」, 第4版.
1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New Yorkから引用）。
【０００７】
Fcγ受容体
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関連ドメインのC2セットに関係する細胞
外ドメイン、１回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインを持つ内在性膜糖タン
パク質である。３種の公知のFcγRがあり、それぞれFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、
およびFcγRIII（CD16）と呼ばれる。３種の受容体は異なる遺伝子によりコードされる；
しかし３種のファミリーメンバー間の広範な相同性は、これらが共通の祖先から、恐らく
は遺伝子複製により生じたことを示唆する。
【０００８】
FcγRII（CD32）
FcγRIIタンパク質は40KDaの内在性膜糖タンパク質であり、モノマーIgに対して低親和性
（106M-1）であるため複合体化したIgGとだけ結合する。この受容体は、単球、マクロフ
ァージ、B細胞、NK細胞、好中球、肥満細胞、および血小板を含めて、全ての造血細胞上
に存在する最も広く発現されているFcγRである。FcγRIIは、その免疫グロブリン結合鎖
中に免疫グロブリン様領域を２つだけ有し、従って、IgGに対してFcγRIより遥かに低い
親和性を有する。３種のヒトFcγRII遺伝子（FcγRII-A、FcγRII-BおよびFcγRII-C）が
存在し、それらは全て凝集体または免疫複合体のIgGと結合する。
【０００９】
FcγRII-AとFcγRII-Bの細胞質内ドメイン内には明確な相違があるので、受容体ライゲー
ションに対して２つの機能的に異種の応答を創出する。基本的な相違は、Aアイソフォー
ムが細胞活性化（例えば、食作用および呼吸バースト）に至る細胞内シグナル伝達を開始
するのに対して、Bアイソフォームは抑制的シグナルを開始し、例えばB細胞活性化を抑制
する、ことにある。
【００１０】
FcγRIII (CD16)
このクラスの不均一性のため、FcγRIIIのサイズはマウスおよびヒトで40〜80kDaの範囲
に及ぶ。２つのヒト遺伝子が２種の転写産物をコードしており、すなわち、内在性膜糖タ
ンパク質のFcγRIIIAと、グリコシルホスファチジル-イノシトール(GPI)結合型のFcγRII
IBとをコードする。１つのマウス遺伝子は膜貫通ヒトFcγRIIIAに相同性のFcγRIIIをコ
ードしている。FcγRIIIは他の２つのFcγRのそれぞれと構造上の特徴を共有する。FcγR
IIと同様に、FcγRIIIは低い親和性でIgGと結合し、対応する２つの細胞外Ig様ドメイン
を含む。FcγRIIIAはマクロファージ、肥満細胞で発現され、NK細胞では唯一のFcγRであ
る。GPI結合型のFcγRIIIBは、目下、ヒト好中球でのみ発現されることが知られている。
【００１１】
FcγRを介するシグナル伝達
活性化と抑制の両方のシグナルは、ライゲーション後にFcγRを介して伝達される。これ
らの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造上の相違からもたらされる。
受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の２つの異なるドメイン、すなわち、免疫受容
体チロシン系活性化モチーフ（ITAM）または免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ITIM）
が、この異なる応答の原因となる。これらの構造体への異なる細胞質酵素の動員が、Fcγ
R媒介細胞応答の結果を規定する。ITAM含有FcγR複合体にはFcγRI、FcγRIIA、FcγRIII
Aが含まれるが、ITIM含有複合体にはFcγRIIBだけが含まれる。
【００１２】
ヒト好中球はFcγRIIA遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的抗体架橋を介するFcγ
RIIAクラスター形成は、ITAMを、ITAMリン酸化を容易にする受容体関連キナーゼとともに
凝集させるように作用する。ITAMリン酸化はSykキナーゼに対するドッキング部位として
役立ち、Sykキナーゼの活性化は下流の基質（例えば、PI3K）の活性化をもたらす。細胞
活性化により前炎症性メディエーターが放出される。
【００１３】
FcγRIIB遺伝子はBリンパ球上に発現され、その細胞外ドメインはFcγRIIAと96％同一で
あって、識別できない様式でIgG複合体と結合する。FcγRIIBの細胞質ドメイン中のITIM
の存在が、FcγRの抑制サブクラスを規定する。最近、この抑制の分子的基礎が確立され
た。活性化FcγRとともに結合されると、FcγRIIB中のITIMはリン酸化されて、イノシト
ールポリリン酸5'-ホスファターゼ（SHIP）のSH2ドメインを引き付け、これがホスホイノ
シトールメッセンジャー（ITAM含有FcγR介在チロシンキナーゼ活性化の結果として放出
される）を加水分解し、その結果、細胞内Ca++の流入を抑制する。従って、FcγRIIBの架
橋は、FcγRライゲーションに対する活性化応答を消失させ、細胞応答性を抑制する。こ
のようにしてB細胞活性化、B細胞増殖および抗体分泌が停止する。
【表１】
0006285481.tif 000002
【発明の開示】
【００１４】
3. 発明の概要
本発明は、共有結合型ダイアボディおよび/または共有結合型ダイアボディ分子、ならび
に癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患、および細菌、真菌もしくはウイルスが原因の感染
症を含む各種の疾患および障害の治療におけるその使用に関する。好ましくは、本発明の
ダイアボディは２つの異なる細胞上の２つの異なるエピトープに結合することができ、こ
こにおいて、第１のエピトープは第２のエピトープとは異なる細胞型に発現されるもので
あり、その結果該ダイアボディはこれら２つの細胞を寄せ集めることができる。
[１]
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖
可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１のドメイン、(ii) 第２のエピトープに特異的な
第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第２のドメイン、およ
び(iii) Fcドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含んでなり、第１のドメイン
と第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１のドメインと第２のドメインはエ
ピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2
)を含む第４のドメイン、(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1
)を含む第５のドメイン、および(iii) Fcドメインを含む第６のドメインを含んでなり、
第４のドメインと第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４のドメインと第５
のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合す
る第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており；さらに、第２のドメインと第４のドメイン
が会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位(VL2)(VH2)を形成している；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
[２]
第３のドメインがヒンジドメインをさらに含む、[１]に記載のダイアボディ分子。
[３]
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖
可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１のドメイン、(ii) 第２のエピトープに特異的な
第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第２のドメイン、およ
び(iii) ヒンジドメインとFcドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含んでなり
、第１のドメインと第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１のドメインと第
２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2
)を含む第４のドメイン、(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1
)を含む第５のドメイン、および(iii) ヒト軽鎖定常ドメインのＣ末端の少なくとも２〜
８アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む第６のドメインを含んでなり、第４のドメインと第
５のドメインが共有結合で連結されているが、第４のドメインと第５のドメインはエピト
ープ結合部位を形成するように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合す
る第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており；
第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部
位(VL2)(VH2)を形成している；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
[４]
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖
可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１のドメイン、(ii) 第２のエピトープに特異的な
第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第２のドメイン、およ
び(iii) ヒンジドメインを含む第３のドメインを含んでなり、第１のドメインと第２のド
メインが共有結合で連結されているが、第１のドメインと第２のドメインはエピトープ結
合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2
)を含む第４のドメイン、(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1
)を含む第５のドメイン、および(iii) ヒト軽鎖定常ドメインのＣ末端の少なくとも２〜
８アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む第６のドメインを含んでなり、第４のドメインと第
５のドメインが共有結合で連結されているが、第４のドメインと第５のドメインはエピト
ープ結合部位を形成するように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合す
る第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており；
第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部
位(VL2)(VH2)を形成している；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
[５]
ヒト軽鎖がヒトκ軽鎖である、[３]または[４]に記載のダイアボディ分子。
[６]
ヒト軽鎖がλ軽鎖である、[３]または[４]に記載のダイアボディ分子。
[７]
第６のドメインがＣ末端の６アミノ酸のアミノ酸配列を含み、該配列がPheAsnArgGlyGluC
ys（配列番号23）である、[５]に記載のダイアボディ分子。
[８]
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が、第１のポリペプチド鎖上の第１ドメイ
ンと第２ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基と、第２のポリペプチド鎖上
の第４ドメインと第５ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基の間の少なくと
も１個のジスルフィド結合を介して共有結合で連結されている、[１]、[２]、[３]または
[４]に記載のダイアボディ分子。
[９]
第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基が第３のドメインにあり、第２のポリペプチド
鎖上のシステイン残基が第６のドメインにある、[８]に記載のダイアボディ分子。
[１０]
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖
可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１のドメイン、(ii) 第２のエピトープに特異的な
第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第２のドメイン、およ
び(iii) Fcドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含んでなり、第１のドメイン
と第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１のドメインと第２のドメインはエ
ピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2
)を含む第４のドメイン、および(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領
域(VH1)を含む第５のドメインを含んでなり、第４のドメインと第５のドメインが共有結
合で連結されているが、第４のドメインと第５のドメインはエピトープ結合部位を形成す
るように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合す
る第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており；
第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部
位(VL2)(VH2)を形成しており；そして
第３のドメインが第１のドメインと第２のドメインの両方のＮ末端側にある；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
[１１]
第３のドメインがヒンジ領域をさらに含む、[１０]に記載のダイアボディ分子。
[１２]
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が、第１のポリペプチド鎖上の第１ドメイ
ンと第２ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基と、第２のポリペプチド鎖上
の第４ドメインと第５ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基の間の少なくと
も１個のジスルフィド結合を介して共有結合で連結されている、[１０]または[１１]に記
載のダイアボディ分子。
[１３]
第１のポリペプチド鎖上の前記少なくとも１個のシステイン残基が第１ドメイン、第２ド
メインおよび第３ドメインのＣ末端側にあり、第２のポリペプチド鎖上の前記少なくとも
１個のシステイン残基が第４ドメインおよび第５ドメインのＣ末端側にある、[１２]に記
載のダイアボディ分子。
[１４]
前記分子が野生型第１ドメインに対して第１ドメインの少なくとも１個のアミノ酸改変と
、野生型第５ドメインに対して第５ドメインの少なくとも１個のアミノ酸改変を含み、第
１ドメインと第５ドメインのそれぞれにおける該少なくとも１個のアミノ酸改変がシステ
インによる置換を含んでなり、その結果第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が
、第１ドメイン中の置換システイン残基と第５ドメイン中の置換システイン残基の間のジ
スルフィド結合を介して共有結合で連結される、[１]、[３]または[１０]に記載のダイア
ボディ分子。
[１５]
Fcドメインが野生型Fcドメインに対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がアラニン
による215位の置換を含んでなる、[１]、[３]または[１０]に記載のダイアボディ分子。
[１６]
前記分子が２つの単量体からなり、各単量体が第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチ
ド鎖を含んでなり、該単量体同士が各単量体の第１のポリペプチド鎖の第３ドメイン中の
少なくとも１個のシステイン残基間の少なくとも１個のジスルフィド結合を介して共有結
合で連結される、[３]、[１０]または[１１]に記載のダイアボディ分子。
[１７]
第１ドメインと第４ドメインがそれぞれ第２ドメインおよび第５ドメインのＮ末端側に位
置する、[１]、[３]または[１０]に記載のダイアボディ分子。
[１８]
第１ドメインと第４ドメインがそれぞれ第２ドメインおよび第５ドメインのＣ末端側に位
置する、[１]、[３]または[１０]に記載のダイアボディ分子。
[１９]
第６ドメインが第４ドメインおよび第５ドメインのＣ末端側にある、[１]または[２]に記
載のダイアボディ分子。
[２０]
第１および第２ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、[１]、[３]、[４]または[
１０]に記載のダイアボディ分子。
[２１]
第４および第５ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、[１]、[３]、[４]または[
１０]に記載のダイアボディ分子。
[２２]
第１および第２ドメインが０、１、２、３、４、５、６、７、８または９アミノ酸残基に
より分離されている、[２０]に記載のダイアボディ分子。
[２３]
第４および第５ドメインが０、１、２、３、４、５、６、７、８または９アミノ酸残基に
より分離されている、[２１]に記載のダイアボディ分子。
[２４]
第１および第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖
可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１のドメイン、および(ii) 第２のエピトープに特
異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第２のドメイン
を含んでなり、第１のドメインと第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１の
ドメインと第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2
)を含む第３のドメイン、および(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領
域(VH1)を含む第４のドメインを含んでなり、第３のドメインと第４のドメインが共有結
合で連結されているが、第３のドメインと第４のドメインはエピトープ結合部位を形成す
るように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第３のドメインが会合して、第１のエピトープと結合す
る第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており、該エピトープ結合部位はCD32Bに対して特
異的であり；
第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部
位(VL2)(VH2)を形成しており、該エピトープ結合部位はCD16に対して特異的であり；そし
て
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が、第１のポリペプチド鎖上の第１ドメイ
ンと第２ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基と、第２のポリペプチド鎖上
の第３ドメインと第４ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基の間のジスルフ
ィド結合を介して共有結合で連結されており、第１のポリペプチド鎖上の該システイン残
基は第１のポリペプチド鎖のＣ末端にはなく、また第２のポリペプチド鎖上の該システイ
ン残基は第２のポリペプチド鎖のＣ末端にはない；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
[２５]
第１および第２ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、[２４]に記載のダイアボデ
ィ分子。
[２６]
第３および第４ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、[２４]に記載のダイアボデ
ィ分子。
[２７]
ジスルフィド結合が第１のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基と第２の
ポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基の間にある、[２４]に記載のダイア
ボディ分子。
[２８]
第１のエピトープと第２のエピトープが異なるものである、[１]、[３]、[４]、[１０]ま
たは[２４]に記載のダイアボディ分子。
[２９]
第１のエピトープと第２のエピトープが同一分子に由来するエピトープである、[２８]に
記載のダイアボディ分子。
[３０]
第１のエピトープと第２のエピトープが異なる分子に由来するエピトープである、[２８]
に記載のダイアボディ分子。
[３１]
第１の免疫グロブリンまたは第２の免疫グロブリンがヒトまたはヒト化免疫グロブリンで
ある、[１]、[３]、[４]、[１０]または[２４]に記載のダイアボディ分子。
[３２]
第１の免疫グロブリンまたは第２の免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンであり、該ヒト
免疫グロブリンがIgA、IgE、IgD、IgGまたはIgMである、[３１]に記載のダイアボディ分
子。
[３３]
ヒト免疫グロブリンがIgGであり、該IgGがIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選
択される、[３２]に記載のダイアボディ分子。
[３４]
FcドメインがヒトFcドメインである、[１]、[３]または[１０]に記載のダイアボディ分子
。
[３５]
FcドメインがIgA、IgE、IgD、IgGまたはIgMのFcドメインである、[３４]に記載のダイア
ボディ分子。
[３６]
FcドメインがIgGのFcドメインであり、該IgGがIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群よ
り選択される、[３５]に記載のダイアボディ分子。
[３７]
少なくとも１つのエピトープ結合部位がＢ細胞、Ｔ細胞、食細胞、ナチュラルキラー(NK)
細胞、または樹状細胞に対して特異的である、[１]、[３]、[４]または[１０]に記載のダ
イアボディ分子。
[３８]
少なくとも１つのエピトープ結合部位が細胞表面マーカーに対して特異的である、[１]、
[３]、[４]または[１０]に記載のダイアボディ分子。
[３９]
細胞表面マーカーがFc受容体である、[３８]に記載のダイアボディ分子。
[４０]
Fc受容体が活性化性Fc受容体である、[３９]に記載のダイアボディ分子。
[４１]
Fc受容体が抑制性Fc受容体である、[３９]に記載のダイアボディ分子。
[４２]
Fc受容体がFcγ受容体である、[３９]に記載のダイアボディ分子。
[４３]
Fcγ受容体がFcγRI、FcγRIIまたはFcγRIII受容体である、[４２]に記載のダイアボデ
ィ分子。
[４４]
Fcγ受容体がFcγRIII受容体であり、該FcγRIII受容体がFcγRIIIA(CD16A)受容体または
FcγRIIIB(CD16B)受容体である、[４３]に記載のダイアボディ分子。
[４５]
FcγRIII受容体がFcγRIIIA(CD16A)受容体である、[４４]に記載のダイアボディ分子。
[４６]
第１のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第１の免疫グロブリンに由来し
、該免疫グロブリンが抗体3G8である、[４２]に記載のダイアボディ分子。
[４７]
第２のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第２の免疫グロブリンに由来し
、該免疫グロブリンが抗体3G8である、[２４]に記載のダイアボディ分子。
[４８]
抗体3G8がヒト化されている、[４６]に記載のダイアボディ分子。
[４９]
抗体3G8がヒト化されている、[４７]に記載のダイアボディ分子。
[５０]
VL1領域が配列番号73のアミノ酸配列を含み、VH1領域が配列番号71のアミノ酸配列を含む
、[４８]に記載のダイアボディ分子。
[５１]
VL1領域が配列番号73のアミノ酸配列を含み、VH1領域が配列番号71のアミノ酸配列を含む
、[４９]に記載のダイアボディ分子。
[５２]
Fcγ受容体がFcγRII受容体であり、該FcγRII受容体がFcγRIIA(CD32A)受容体またはFc
γRIIB(CD32B)受容体である、[４３]に記載のダイアボディ分子。
[５３]
FcγRII受容体がFcγRIIA(CD32A)受容体である、[５２]に記載のダイアボディ分子。
[５４]
第１のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第１の免疫グロブリンに由来し
、該免疫グロブリンが抗体IV.3である、[５３]に記載のダイアボディ分子。
[５５]
抗体IV.3がヒト化されている、[５４]に記載のダイアボディ分子。
[５６]
FcγRII受容体がFcγRIIB(CD32B)受容体である、[５３]に記載のダイアボディ分子。
[５７]
第１のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第１の免疫グロブリンに由来し
、該免疫グロブリンが抗体2B6である、[５６]に記載のダイアボディ分子。
[５８]
第１のエピトープ結合部位を構成するVL1領域とVH1領域が第１の免疫グロブリンに由来し
、該免疫グロブリンが抗体2B6である、[２４]に記載のダイアボディ分子。
[５９]
抗体2B6がヒト化されている、[５７]に記載のダイアボディ分子。
[６０]
抗体2B6がヒト化されている、[５８]に記載のダイアボディ分子。
[６１]
VL1領域が配列番号41、配列番号42、配列番号43のアミノ酸配列を含み、VH1領域が配列番
号40のアミノ酸配列を含む、[５９]に記載のダイアボディ分子。
[６２]
VL1領域が配列番号41、配列番号42、配列番号43のアミノ酸配列を含み、VH1領域が配列番
号40のアミノ酸配列を含む、[６０]に記載のダイアボディ分子。
[６３]
VL1領域が野生型2B6 VL1領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステイン
による105位の置換からなり、かつVH1領域が野生型2B6 VH1領域に対してアミノ酸改変を
含み、該アミノ酸改変がシステインによる44位の置換からなる、[５９]に記載のダイアボ
ディ分子。
[６４]
VL1領域が野生型2B6 VL1領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステイン
による105位の置換からなり、かつVH1領域が野生型2B6 VH1領域に対してアミノ酸改変を
含み、該アミノ酸改変がシステインによる44位の置換からなる、[６０]に記載のダイアボ
ディ分子。
[６５]
第２のエピトープ結合部位が病原性抗原に対して特異的である、[４２]に記載のダイアボ
ディ分子。
[６６]
病原性抗原が腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または自己免疫抗原である、[６５]に記
載のダイアボディ分子。
[６７]
病原性抗原が細菌抗原である、[６６]に記載のダイアボディ分子。
[６８]
細菌抗原がリポ多糖である、[６７]に記載のダイアボディ分子。
[６９]
病原性抗原がウイルス抗原である、[６６]に記載のダイアボディ分子。
[７０]
ウイルス抗原がヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルスおよび肝炎ウイルスに由来する抗
原からなる群より選択される、[６９]に記載のダイアボディ分子。
[７１]
病原性抗原が自己免疫抗原である、[６６]に記載のダイアボディ分子。
[７２]
自己免疫抗原がDNA、RNAおよびコラーゲンからなる群より選択される、[７１]に記載のダ
イアボディ分子。
[７３]
第２のエピトープ結合部位が毒素に対して特異的である、[３８]に記載のダイアボディ分
子。
[７４]
第２のエピトープ結合部位が薬物に対して特異的である、[３８]に記載のダイアボディ分
子。
[７５]
第２のエピトープ結合部位が毒素に対して特異的である、[３９]に記載のダイアボディ分
子。
[７６]
第２のエピトープ結合部位が薬物に対して特異的である、[３９]に記載のダイアボディ分
子。
[７７]
第１のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的で、第２のエピトープ結合部位がCD16Aに特異
的である、[１]に記載のダイアボディ分子。
[７８]
第１のエピトープ結合部位がCD16Aに特異的で、第２のエピトープ結合部位がCD32Bに特異
的である、[３]に記載のダイアボディ分子。
[７９]
第１のエピトープ結合部位がCD16Aに特異的で、第２のエピトープ結合部位がCD32Bに特異
的である、[４]に記載のダイアボディ分子。
[８０]
第１のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的で、第２のエピトープ結合部位がCD16Aに特異
的である、[１０]に記載のダイアボディ分子。
[８１]
第１のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的で、第２のエピトープ結合部位がCD16Aに特異
的である、[１１]に記載のダイアボディ分子。
[８２]
第１のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的で、第２のエピトープ結合部位がCD16Aに特異
的である、[２４]に記載のダイアボディ分子。
[８３]
第１のポリペプチド鎖が配列番号14のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列
番号15のアミノ酸配列を含む、[７７]に記載のダイアボディ分子。
[８４]
第１のポリペプチド鎖が配列番号18のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列
番号16のアミノ酸配列を含む、[７８]に記載のダイアボディ分子。
[８５]
第１のポリペプチド鎖が配列番号19のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列
番号９のアミノ酸配列を含む、[８１]に記載のダイアボディ分子。
[８６]
第１のポリペプチド鎖が配列番号20のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列
番号９のアミノ酸配列を含む、[８０]に記載のダイアボディ分子。
[８７]
第１のポリペプチド鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列
番号11のアミノ酸配列を含む、[８２]に記載のダイアボディ分子。
[８８]
第１のポリペプチド鎖が配列番号11のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列
番号９のアミノ酸配列を含む、[８２]に記載のダイアボディ分子。
[８９]
第３のドメインが変異型Fc領域を含み、該変異型Fc領域が野生型Fc領域に対して少なくと
も１つのアミノ酸改変を含んでなる、[１]、[３]、[４]または[１０]に記載のダイアボデ
ィ分子。
[９０]
前記改変がFc領域とFc受容体間の結合親和性を改変させる、[８９]に記載のダイアボディ
分子。
[９１]
前記改変がFc領域とFc受容体間の結合をゼロにする、[９０]に記載のダイアボディ分子。
[９２]
[１]、[３]、[４]、[１０]または[２４]に記載のダイアボディ分子の第１のポリペプチド
鎖または第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
[９３]
[１]、[３]、[４]、[１０]または[２４]に記載のダイアボディ分子の第１のポリペプチド
鎖と第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
[９４]
[９２]に記載の核酸を含有するベクター。
[９５]
[９３]に記載の核酸を含有するベクター。
[９６]
発現ベクターである、[９４]に記載のベクター。
[９７]
発現ベクターである、[９５]に記載のベクター。
[９８]
[９４]に記載の核酸を含有する宿主細胞。
[９９]
[９５]に記載の核酸を含有する宿主細胞。
[１００]
ダイアボディ分子の組換え生産方法であって、
a. [９８]に記載の宿主細胞を、ダイアボディ分子の発現に好適な条件下に培地中で培養
し、
b. 該培地からダイアボディ分子を回収する、
ことを含んでなる上記方法。
[１０１]
ダイアボディ分子の組換え生産方法であって、
a. [９８]に記載の宿主細胞を、ダイアボディ分子の発現に好適な条件下に培地中で培養
し、
b. 該培地からダイアボディ分子を回収する、
ことを含んでなる上記方法。
[１０２]
病原性抗原により特徴づけられる疾患または障害の治療方法であって、それを必要とする
患者に有効量の[６６]に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなり、該ダイア
ボディ分子が該病原性抗原と結合するものである、上記方法。
[１０３]
前記疾患または障害が癌である、[１０２]に記載の方法。
[１０４]
前記疾患または障害が感染性疾患である、[１０２]に記載の方法。
[１０５]
病原性抗原に対する免疫寛容の誘発方法であって、それを必要とする患者に有効量の[６
６]に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなる上記方法。
[１０６]
解毒方法であって、それを必要とする患者に有効量の[７３]に記載のダイアボディ分子を
投与することを含んでなる上記方法。
[１０７]
解毒方法であって、それを必要とする患者に有効量の[７４]に記載のダイアボディ分子を
投与することを含んでなる上記方法。
[１０８]
第１のエピトープと第２のエピトープが異なる細胞に由来するものである、[２８]に記載
のダイアボディ分子。
[１０９]
Fcドメイン部分がCH2欠失部分からなる、[１]、[３]または[１０]に記載のダイアボディ
分子。
[１１０]
Fcドメイン部分がCH3欠失部分からなる、[１]、[３]または[１０]に記載のダイアボディ
分子。
[１１１]
前記分子が二量体であり、該二量体が
(a) 前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖の対からなる第１の単量体、
および
(b) 前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖の対からなる第２の単量体、
からなり、第１および第２の単量体が各単量体の第１のポリペプチド鎖の第３ドメイン中
の少なくとも１個のシステイン残基間の少なくとも１つのジスルフィド結合を介して共有
結合で連結されている、[３]、[１０]または[１１]に記載のダイアボディ分子。
[１１２]
第１の単量体と第２の単量体が同一のものである、[１１１]に記載のダイアボディ分子。
[１１３]
第１の単量体と第２の単量体が異なるものである、[１１２]に記載のダイアボディ分子。
【００１５】
一実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボデ
ィは第１および第２のポリペプチド鎖を含んでなり、ここで、第１のポリペプチド鎖は、
(i) 第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(V
L1)を含む第１のドメイン、(ii) 第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重
鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第２のドメイン、および、場合により(iii) 少な
くとも１個のシステイン残基を含む第３のドメインを含んでなり、第１および第２のドメ
インが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を
形成するように会合することはなく；ここで、第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫
グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2)を含む第４のドメイン、(ii) 第１の免疫
グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1)を含む第５のドメイン、および、場合に
より(iii) 少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含んでなり、第４お
よび第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピト
ープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリ
ペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際
、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合
部位(VL1)(VH1)を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエ
ピトープと結合する第２の結合部位(VL2)(VH2)を形成している。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボ
ディは第１および第２のポリペプチド鎖を含んでなり、ここで、第１のポリペプチド鎖は
、(i) 第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域
(VL1)を含む第１のドメイン、(ii) 第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの
重鎖可変ドメインの結合領域(VH2)を含む第２のドメイン、および(iii) Fcドメインまた
はその一部を含む第３のドメインを含んでなり、第１および第２のドメインが共有結合で
連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会
合することはなく；ここで、第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖
可変ドメインの結合領域(VL2)を含む第４のドメイン、(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖
可変ドメインの結合領域(VH1)を含む第５のドメインを含んでなり、第４および第５のド
メインが共有結合で連結されているが、第３および第４のドメインはエピトープ結合部位
を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は
共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメ
インと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位(VL1)(VH
1)を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結
合する第２の結合部位(VL2)(VH2)を形成している。
【００１７】
特定の態様において、本発明はダイアボディ分子に関し、該分子は第１および第２のポリ
ペプチド鎖を含んでなり、ここで、第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピトープに特
異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１のドメイン
、(ii) 第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領
域(VH2)を含む第２のドメイン、および(iii) Fcドメインまたはその一部を含む第３のド
メインを含んでなり、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１お
よび第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；ここで
、第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(V
L2)を含む第４のドメイン、(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(V
H1)を含む第５のドメイン、および(iii) 少なくとも１個のシステイン残基を含む第６の
ドメインを含んでなり、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４
および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１
のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合は
ペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエ
ピトープと結合する第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており；第２のドメインと第４の
ドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位(VL2)(VH2)を形成して
いる。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイア
ボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１および第２のポリ
ペプチド鎖を含んでなり、ここで、第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピトープに特
異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１のドメイン
、(ii) 第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領
域(VH2)を含む第２のドメイン、および(iii) Fcドメインまたはその一部を含む第３のド
メインを含んでなり、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１お
よび第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；ここで
、第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(V
L2)を含む第４のドメイン、(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(V
H1)を含む第５のドメイン、および(iii) 少なくとも１個のシステイン残基を含む第６の
ドメインを含んでなり、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４
および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；各ダ
イアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されて
いるが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、各ダイアボディ分子の第１のドメ
インと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位(VL1)(VH
1)を形成しており；各ダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインが会合して、
第２のエピトープと結合する第２の結合部位(VL2)(VH2)を形成している。
【００１９】
さらに他の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディに関し、該ダ
イアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１および第
２のポリペプチド鎖を含んでなり、ここで、第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピト
ープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１の
ドメイン、(ii) 第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン
の結合領域(VH2)を含む第２のドメイン、および(iii) Fcドメインまたはその一部を含む
第３のドメインを含んでなり、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが
、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく
；ここで、第２のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結
合領域(VL2)を含む第４のドメイン、(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結
合領域(VH1)を含む第５のドメイン、および(iii) 少なくとも１個のシステイン残基を含
む第６のドメインを含んでなり、第４および第５のドメインが共有結合で連結されている
が、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはな
く；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共
有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、
第１のエピトープと結合する第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており；第２のドメイン
と第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位(VL2)(VH2)を
形成しており；そして第２のダイアボディ分子は第１および第２のポリペプチド鎖を含ん
でなり、ここで、第１のポリペプチド鎖は、(i) 第３のエピトープに特異的な第３の免疫
グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL3)を含む第１のドメイン、(ii) 第４のエピ
トープに特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH4)を含む第２
のドメイン、および(iii) Fcドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含んでなり
、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメイン
はエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；ここで、第２のポリペプチ
ド鎖は、(i) 第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL4)を含む第４のド
メイン、(ii) 第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH3)を含む第５のド
メイン、および(iii) 少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含んでな
り、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメイ
ンはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と
第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではな
く；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第３のエピトープと結合する
第１の結合部位(VL3)(VH3)を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して
、第４のエピトープと結合する第２の結合部位(VL4)(VH4)を形成している。
【００２０】
本発明の特定の態様において、第１のエピトープ、第２のエピトープ、適宜に、第３のエ
ピトープ、および第４のエピトープは同一でありうる。他の態様では、第１のエピトープ
、第２のエピトープ、適宜に、第３のエピトープ、および第４のエピトープが他とそれぞ
れ異なっていてもよい。第３のエピトープの結合ドメインを含む本発明の特定の態様では
、第１のエピトープと第３のエピトープが同一でありうる。第４のエピトープの結合ドメ
インを含む本発明の特定の態様では、第１のエピトープと第４のエピトープが同一であり
うる。第３のエピトープの結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第２のエピトー
プと第３のエピトープが同一でありうる。第４のエピトープの結合ドメインを含む本発明
の特定の態様では、第２のエピトープと第４のエピトープが同一でありうる。本発明の好
ましい態様では、第１のエピトープと第２のエピトープは異なっている。第３のエピトー
プの結合ドメインと第４のエピトープの結合ドメインを含む本発明のさらに他の態様では
、第３のエピトープと第４のエピトープは異なっていてよい。前述の任意の組合せは本発
明に包含されることを理解すべきである。
【００２１】
本発明の特定の態様においては、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第１のドメイン
と第５のドメインを同一の免疫グロブリンから誘導することができる。別の態様では、ダ
イアボディまたはダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインを同一の免疫グロ
ブリンから誘導することができる。さらに別の態様では、ダイアボディまたはダイアボデ
ィ分子の第１のドメインと第５のドメインを異なる免疫グロブリンから誘導することがで
きる。さらに別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第２のドメインと第
４のドメインを異なる免疫グロブリンから誘導することができる。前述の任意の組合せは
本発明に包含されることを理解すべきである。
【００２２】
本発明の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第１のポリペプチ
ド鎖と第２のポリペプチド鎖間の共有結合は、第１のポリペプチド鎖上の少なくとも１個
のシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも１個のシステイン残基間のジス
ルフィド結合を介するものでありうる。ジスルフィド結合に関与する第１または第２のポ
リペプチド鎖上のシステイン残基は、第１、第２、第３、第４、第５または第６のドメイ
ン内を含めて、ポリペプチド鎖上のどこに存在してもよい。特定の実施形態では、第１の
ポリペプチド鎖上のシステイン残基は第１ドメインに、そして第２のポリペプチド鎖上の
システイン残基は第５ドメインに存在する。第１、第２、第４および第５のドメインは結
合に関与する可変領域に相当する。好ましい実施形態では、第１および第２のポリペプチ
ド鎖間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基は、それぞれ第３および第６のドメ
イン内に位置づけられる。この実施形態の特定の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３
ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列によりコードされるヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミ
ノ酸、FNRGEC (配列番号23)を含む。この実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド
鎖の第６ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列によりコードされるヒトκ軽鎖のＣ末端
の６アミノ酸、FNRGEC (配列番号23)を含む。この実施形態のさらに別の態様では、第１
のポリペプチド鎖の第３ドメインは、配列番号80のヌクレオチド配列によりコードされる
ヒトIgGのヒンジドメインから誘導されるアミノ酸配列VEPKSC (配列番号79)を含む。この
実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、配列番号80のヌクレ
オチド配列によりコードされるヒトIgGのヒンジドメインから誘導されるアミノ酸配列VEP
KSC (配列番号79)を含む。この実施形態の特定の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３
ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸FNRGEC (配列番号23)を含み、そして第２
のポリペプチド鎖の第６ドメインはアミノ酸配列VEPKSC (配列番号79)を含む。この実施
形態の他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６
アミノ酸FNRGEC (配列番号23)を含み、そして第１のポリペプチド鎖の第３ドメインはア
ミノ酸配列VEPKSC (配列番号79)を含む。この実施形態のさらに他の態様では、第１のポ
リペプチド鎖の第３ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸FNRGEC (配列番号23)
を含み、そして第２のポリペプチド鎖の第６ドメインはヒンジドメインを含む。この実施
形態の他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６
アミノ酸FNRGEC (配列番号23)を含み、そして第１のポリペプチド鎖の第３ドメインはヒ
ンジドメインを含む。この実施形態のさらに他の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３
ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸FNRGEC (配列番号23)を含み、そして第２
のポリペプチド鎖の第６ドメインはFcドメインまたはその一部を含む。この実施形態のさ
らに他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６ア
ミノ酸FNRGEC (配列番号23)を含み、そして第１のポリペプチド鎖の第３ドメインはFcド
メインまたはその一部を含む。
【００２３】
他の実施形態において、ジスルフィド結合に関与する第１または第２のポリペプチド鎖上
のシステイン残基は、第１のポリペプチド鎖の第１、第２または第３ドメインの外側に、
そして第２のポリペプチド鎖の第４、第５または第６ドメインの外側に位置していてよい
。特に、第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第１ドメインのＮ末端、または第１
ドメインのＣ末端に存在しうる。第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第２ドメイ
ンのＮ末端、または第２ドメインのＣ末端に存在してもよい。第１のポリペプチド鎖上の
システイン残基は第３ドメインのＮ末端、または第３ドメインのＣ末端に存在してもよい
。さらに、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第４ドメインのＮ末端、または第
４ドメインのＣ末端に存在しうる。第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第５ドメ
インのＮ末端、または第５ドメインのＣ末端に存在してもよい。これに応じて、第２のポ
リペプチド鎖上のシステイン残基は第６ドメインのＣ末端、または第６ドメインのＮ末端
に存在してもよい。特定の態様では、ジスルフィド結合は第１のポリペプチド鎖上の少な
くとも２個のシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残
基間にある。第３ドメインと第６ドメインがFcドメインまたはその一部を含まない特定の
態様では、システイン残基が第１のポリペプチド鎖のＣ末端にあり、かつ第２のポリペプ
チド鎖のＣ末端にある。前述の任意の組合せは本発明に包含されることを理解すべきであ
る。
【００２４】
上に記載した本発明の特定の実施形態においては、本発明の共有結合型ダイアボディはダ
イアボディ分子の二量体（各ダイアボディ分子が第１および第２のポリペプチド鎖を含む
）を包含する。この実施形態のある態様では、ダイアボディ分子同士が共有結合で連結さ
れて二量体を形成しているが、該共有結合はペプチド結合ではない。この実施形態の好ま
しい態様では、共有結合が二量体の各ダイアボディ分子の第１ポリペプチド鎖上にある少
なくとも１個のシステイン残基間のジスルフィド結合である。本発明のさらに好ましい態
様では、共有結合が二量体を形成している各ダイアボディ分子の第１ポリペプチド鎖上に
ある少なくとも１個のシステイン残基間のジスルフィド結合であるが、該少なくとも１個
のシステイン残基が各第１ポリペプチド鎖の第３ドメインに存在する。
【００２５】
本発明のある態様においては、第１のポリペプチド鎖上の第１ドメインが第２ドメインの
Ｎ末端にあっても、第２ドメインのＣ末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第
１ドメインは第３ドメインのＮ末端にあっても、第３ドメインのＣ末端にあってもよい。
第１のポリペプチド鎖上の第２ドメインは第１ドメインのＮ末端にあっても、第１ドメイ
ンのＣ末端にあってもよい。さらに、第１のポリペプチド鎖上の第２ドメインは第３ドメ
インのＮ末端にあっても、第３ドメインのＣ末端にあってもよい。これに応じて、第１の
ポリペプチド鎖上の第３ドメインは第１ドメインのＮ末端にあっても、第１ドメインのＣ
末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第３ドメインは第２ドメインのＮ末端に
あっても、第２ドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖に関しては、第
４ドメインが第５ドメインのＮ末端にあっても、第５ドメインのＣ末端にあってもよい。
第４ドメインは第６ドメインのＮ末端にあっても、第６ドメインのＣ末端にあってもよい
。第２のポリペプチド鎖上の第５ドメインは第４ドメインのＮ末端にあっても、第４ドメ
インのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第５ドメインは第６ドメインの
Ｎ末端にあっても、第６ドメインのＣ末端にあってもよい。これに応じて、第２のポリペ
プチド鎖上の第６ドメインは第４ドメインのＮ末端にあっても、第４ドメインのＣ末端に
あってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第６ドメインは第５ドメインのＮ末端にあって
も、第５ドメインのＣ末端にあってもよい。前述の任意の組合せは本発明に包含されるこ
とを理解すべきである。
【００２６】
特定の実施形態において、第１ドメインと第２ドメインは第１のポリペプチド鎖上の第３
ドメインのＣ末端に存在してもよいし、あるいは、第１ドメインと第２ドメインは第１の
ポリペプチド鎖上の第３ドメインのＮ末端に存在してもよい。第２のポリペプチド鎖に関
して、第４ドメインと第５ドメインは第６ドメインのＣ末端に存在してもよいし、あるい
は、第４ドメインと第５ドメインは第６ドメインのＮ末端に存在してもよい。この実施形
態の特定の態様では、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボデ
ィはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１および第２のポリペプ
チド鎖を含んでなり、ここで、第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピトープに特異的
な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１のドメイン、(ii
) 第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH2
)を含む第２のドメイン、および(iii) Fcドメインまたはその一部を含む第３のドメイン
を含んでなり、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第
２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく、第３のドメイ
ンは第１ドメインと第２ドメインの両方のＮ末端側にあり；ここで、第２のポリペプチド
鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2)を含む第４のドメ
イン、(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1)を含む第５のドメ
イン、および(iii) 少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含んでなり
、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメイン
はエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；各ダイアボディ分子の第１
のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合は
ペプチド結合ではなく；その際、各ダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメイン
が会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており；各
ダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結
合する第２の結合部位(VL2)(VH2)を形成している。
【００２７】
さらに別の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディに関し、該ダ
イアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１および第
２のポリペプチド鎖を含んでなり、ここで、第１のポリペプチド鎖は、(i) 第１のエピト
ープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL1)を含む第１の
ドメイン、(ii) 第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン
の結合領域(VH2)を含む第２のドメイン、および(iii) Fcドメインまたはその一部を含む
第３のドメインを含んでなり、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが
、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく
、第３のドメインは第１ドメインと第２ドメインの両方のＮ末端側にあり；ここで、第２
のポリペプチド鎖は、(i) 第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL2)を
含む第４のドメイン、(ii) 第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH1)を
含む第５のドメイン、および(iii) 少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメイ
ンを含んでなり、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および
第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリ
ペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチ
ド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトー
プと結合する第１の結合部位(VL1)(VH1)を形成しており；第２のドメインと第４のドメイ
ンが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位(VL2)(VH2)を形成しており；
そして第２のダイアボディ分子は第１および第２のポリペプチド鎖を含んでなり、ここで
、第１のポリペプチド鎖は、(i) 第３のエピトープに特異的な第３の免疫グロブリンの軽
鎖可変ドメインの結合領域(VL3)を含む第１のドメイン、(ii) 第４のエピトープに特異的
な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH4)を含む第２のドメイン、お
よび(iii) Fcドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含んでなり、第１および第
２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結
合部位を形成するように会合することはなく、第３のドメインは第１ドメインと第２ドメ
インの両方のＮ末端側にあり；ここで、第２のポリペプチド鎖は、(i) 第４の免疫グロブ
リンの軽鎖可変ドメインの結合領域(VL4)を含む第４のドメイン、(ii) 第３の免疫グロブ
リンの重鎖可変ドメインの結合領域(VH3)を含む第５のドメイン、および(iii) 少なくと
も１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含んでなり、第４および第５のドメイン
が共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成
するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結
合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと
第５のドメインが会合して、第３のエピトープと結合する第１の結合部位(VL3)(VH3)を形
成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第４のエピトープと結合する
第２の結合部位(VL4)(VH4)を形成している。
【００２８】
上述したように、個々のポリペプチド鎖上のドメインは共有結合で連結されている。特定
の態様では、第１と第２のドメイン間、第１と第３のドメイン間、第２と第３のドメイン
間、第４と第５のドメイン間、第４と第６のドメイン間、および/または第５と第６のド
メイン間の共有結合はペプチド結合でありうる。特に、第１と第２、および第４と第５の
ドメインが結合部位を形成するようには結合しないかぎり、第１と第２のドメイン、およ
び第４と第５のドメインは、それぞれ第３のドメインおよび第６のドメインにより、また
は追加のアミノ酸残基により分離されていてもよい。アミノ酸残基の数は0、1、2、3、4
、5、6、7、8または9個のアミノ酸残基であってよい。ある好ましい態様では、ドメイン
間のアミノ酸残基の数が8個である。
【００２９】
本発明の特定の態様では、Fcドメインを含む第１および第２のポリペプチド鎖のドメイン
（すなわち、場合により、それぞれ第３および第６のドメイン）は、該ドメインがヒンジ
-Fc領域を含むようにヒンジドメインをさらに含むことができる。これとは別の実施形態
では、第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖が、Fcドメインを含むことなく
ヒンジドメインを含むことができる。本発明で用いる重鎖、軽鎖、ヒンジ領域、Fcドメイ
ン、および/またはヒンジ-Fcドメインは、IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMを含めて、どの
免疫グロブリン型に由来するものであってもよい。好ましい態様では、免疫グロブリン型
はIgGまたはそのいずれかのサブタイプ、すなわちIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4である
。他の態様では、軽鎖および重鎖の由来となる免疫グロブリンはヒト化またはキメラ化さ
れたものである。
【００３０】
さらに、ダイアボディまたはダイアボディ分子が結合する第１エピトープと第２エピトー
プ、適宜に、第３エピトープと第４エピトープは、同一の抗原に由来する異なるエピトー
プであっても、異なる抗原に由来する異なるエピトープであってもよい。抗原は、抗体を
生成することができるどのような分子であってもよく、例えば、タンパク質、核酸、細菌
毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬物などである。特
定の態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Ｂ細胞、Ｔ細胞
、食細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、樹状細胞といった特定の細胞上の抗原に対して特
異的である。
【００３１】
本実施形態の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の少なくとも１
つのエピトープ結合部位はFc受容体に特異的であり、該Fc受容体は活性化性Fc受容体また
は抑制性Fc受容体でありうる。特定の態様では、Fc受容体がFcγ受容体であり、Fcγ受容
体はFcγRI、FcγRIIまたはFcγRIII受容体である。より好ましい態様では、FcγRIII受
容体がFcγRIIIA (CD16A)受容体またはFcγRIIIB (CD16B)受容体であり、さらに好ましく
は、FcγRIII受容体がFcγRIIIA (CD16A)受容体である。別の好ましい態様では、FcγRII
受容体がFcγRIIA (CD32A)受容体またはFcγRIIB (CD32B)受容体であり、さらに好ましく
は、FcγRIIB (CD32B)受容体である。特に好ましい態様では、ダイアボディの１つの結合
部位がCD32Bに特異的で、他の結合部位がCD16Aに特異的である。本発明の特定の実施形態
では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位が活
性化性Fc受容体に特異的で、少なくとも１つの他の部位が抑制性Fc受容体に特異的である
。この実施形態のある態様では、活性化性Fc受容体がCD32Aで、抑制性Fc受容体がCD32Bで
ある。この実施形態の他の態様では、活性化性Fc受容体がBCRで、抑制性Fc受容体がCD32B
である。この実施形態のさらに他の態様では、活性化性Fc受容体がIgERIで、抑制性Fc受
容体がCD32Bである。
【００３２】
１つのエピトープ結合部位がCD16Aに特異的である場合には、VLおよびVHドメインがマウ
ス抗体3G8（この配列はクローン化されており、本明細書に示される）のVLおよびVHドメ
インと同一であっても、類似していてもよい。１つのエピトープ結合部位がCD32Aに特異
的である他の場合には、VLおよびVHドメインがマウス抗体IV.3のVLおよびVHドメインと同
一であっても、類似していてもよい。１つのエピトープ結合部位がCD32Bに特異的である
さらに他の場合には、VLおよびVHドメインがマウス抗体2B6（この配列はクローン化され
ており、本明細書に示される）のVLおよびVHドメインと同一であっても、類似していても
よい。3G8、2B6およびIV.3抗体のVLまたはVHドメインのいずれもが任意の組合せで使用で
きることを理解すべきである。本発明はまた、第１のエピトープがCD32Bに特異的で、第
２のエピトープがCD16Aに特異的である二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子
に関する。
【００３３】
他の態様においては、エピトープ結合部位が病原性抗原に特異的であってよい。本明細書
で用いる病原性抗原とは、癌、感染症、自己免疫疾患をはじめとする特定の病原性疾患に
関わる抗原のことである。こうして、病原性抗原は腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、
または自己免疫抗原でありうる。病原性抗原の例としては、限定するものではないが、リ
ポ多糖、ウイルス抗原（ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス
、西ナイルウイルス（例えば、E16および/またはE53抗原）、および肝炎ウイルスに由来
するウイルス抗原からなる群より選択される）、核酸（DNAおよびRNA）、およびコラーゲ
ンが挙げられる。好ましくは、病原性抗原は中和抗原である。好ましい態様において、一
方のエピトープ結合部位がCD16AまたはCD32Aに特異的である場合、他方のエピトープ結合
部位は自己免疫抗原を除く病原性抗原に特異的である。さらに別の好ましい態様において
、一方のエピトープ結合部位がCD32Bに特異的である場合、他方のエピトープ結合部位は
いずれかの病原性抗原に特異的である。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子
は同一細胞上の２つの異なる抗原に結合し、例えば、一方の抗原結合部位は活性化性Fc受
容体に特異的であるが、他方は抑制性Fc受容体に特異的である。他の実施形態では、ダイ
アボディ分子は２つの異なるウイルス中和エピトープ（例えば、西ナイルウイルスのE16
およびE53であるが、これに限定されない）に結合する。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態においては、本発明のダイアボディを用いて様々な疾患や障
害を治療することができる。したがって、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイア
ボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる疾
患または障害の治療方法に関し、該ダイアボディまたはダイアボディ分子は、少なくとも
１つの結合部位が癌細胞の表面または細菌やウイルス粒子の表面に発現される抗原のよう
な病原性抗原に特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位がFc受容体（例えば
、CD16A）に特異的である。
【００３５】
さらに別の実施形態においては、本発明は、有効量の本発明のダイアボディまたはダイア
ボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる疾患または障害の治療
方法に関し、該ダイアボディまたはダイアボディ分子は、少なくとも１つの結合部位がCD
32Bに特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位がCD16Aに特異的である。
【００３６】
さらに別の実施形態においては、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディま
たはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、病原性抗
原に対する免疫寛容の誘発方法に関し、該ダイアボディまたはダイアボディ分子は、少な
くとも１つの結合部位がCD32Bに特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位が
該病原性抗原に特異的である。この実施形態のいくつかの態様では、病原性抗原はアレル
ゲンまたは免疫寛容が望まれる別の分子（例えば、移植した組織に発現されるタンパク質
）でありうる。
【００３７】
さらに別の実施形態においては、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディま
たはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる解毒方法に
関し、該ダイアボディまたはダイアボディ分子は、少なくとも１つの結合部位が細胞表面
マーカーに特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位が毒素に特異的である。
特定の態様では、投与される本発明のダイアボディは、１つの結合部位がFcのような細胞
表面マーカーに特異的で、他の結合部位が細菌毒素または薬物に特異的であるものである
。ある態様では、細胞表面マーカーは赤血球上に存在しないものである。
【００３８】
3.1 定義
特に断らないかぎり、本明細書で用いる全ての技術用語、表記法、その他の科学用語また
は専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解する意味を有するものとする
。いくつかの場合には、通常理解される意味の用語であっても、明確さのためにおよび/
または参考までに本明細書中で定義されるが、そうした定義を本明細書に含めても、当技
術分野で一般的に理解されている意味に対する大きな相違を表すと必ずしも解釈されるべ
きでない。本発明の実施には、特にほかで示さないかぎり、当業者が容易に想到しうる分
子生物学（組換え法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学
の分野の慣用技術を利用するものとする。そうした技術は文献に詳しく説明されており、
例えば、Current Protocols in Immunology (J. E. Coliganら編, 1999, 2001年の増刊を
含む); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubelら編, 1987, 2001年の
増刊を含む); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版 (Sambrook and Russel,
2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullisら編, 1994); The Immunoassay 
Handbook (D. Wild編, Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. 
Hermanson編, Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Massey
eff, W. H. Albert, およびN. A. Staines編, Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH
, 1993), Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; ならびにBeaucageら編, Curren
t Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000)を
参照されたい。
【００３９】
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、モノクローナル、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒ
ト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、Fab
フラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合二重特異性Fv（sdFv）、細胞内発
現抗体（intrabody）、および抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば、本発明の抗体に
対する抗Idおよび抗-抗Id抗体を含む）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラ
グメントを意味する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免
疫活性フラグメント、すなわち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子
はいずれのタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えば、Ig
G1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはサブクラスであってもよい。
【００４０】
本明細書中で用いる「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に
結合する」、「特異的に認識する」および同様の用語は、抗原（例えば、エピトープまた
は免疫複合体）と特異的に結合するが、他の分子とは特異的に結合しない分子をさす。抗
原と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、BIAcore、または当技術分野で知
られた他のアッセイで測定して、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドと結
合してもよい。好ましくは、抗原と特異的に結合する分子は他のタンパク質と交差反応し
ない。抗原と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、BIAcore、または当業
者に知られた他の技法により同定することができる。
【００４１】
本明細書中で用いる「免疫複合体」とは、少なくとも１つの標的分子と少なくとも１つの
異種Fcγ領域含有ポリペプチドが互いと結合して、より大きな分子量の複合体を形成する
ときに生じる構造体をさす。免疫複合体の例は抗原-抗体複合体であり、これは可溶性で
あっても粒状（例えば、細胞表面上の抗原/抗体複合体）であってもよい。
【００４２】
本明細書中で用いる「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」、「フレームワーク領域」、「定
常ドメイン」などの語は、免疫学分野でのそれらの通常の意味を有し、天然の免疫グロブ
リン中のドメインおよび合成（例えば、組換え）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、
一本鎖抗体、キメラ抗体など）の対応するドメインをさす。天然の免疫グロブリン（例え
ば、IgG）の基本的な構造単位は、２本の軽鎖と２本の重鎖をもつ四量体であり、通常は
約150,000 Daの糖タンパク質として発現される。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、主
に抗原認識に関与する約100〜110またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各
鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を規定しており、軽鎖が１つの定常ドメイ
ンを有し、重鎖が通常３つの定常ドメインとヒンジ領域を有する。したがって、IgG分子
の軽鎖の構造はn-VL-CL-cであり、IgG重鎖の構造はn-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (ここでHはヒ
ンジ領域)である。IgG分子の可変領域は、抗原と接触する残基を含む相補性決定領域(CDR
)と、フレームワークセグメントと呼ばれる非CDRセグメントから成り、該セグメントは一
般に構造を維持し、CDRループの位置を決定する（しかし、特定のフレームワーク残基が
抗原と接触してもよい）。したがって、VLおよびVHドメインは構造n-FR1, CDR1, FR2, CD
R2, FR3, CDR3, FR4-cを有する。
【００４３】
結合タンパク質または抗体（本明細書では広範に定義される）について述べるとき、各ド
メインへのアミノ酸の帰属はKabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest
(National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)の定義に従う。免疫
グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域由来のアミノ酸は、その鎖中のアミノ酸の位
置によって指定される。Kabatは多数の抗体のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに
つき共通のアミノ酸配列を同定し、そして各アミノ酸に残基番号を割り当てた。Kabatの
ナンバリング方式は、問題の抗体を、保存アミノ酸を基準にしたKabatの共通配列の１つ
とアライメントすることにより、彼の一覧表には含まれない抗体にまで拡張することがで
きる。残基番号を割り当てるこの方法は、当該分野で標準的になってきており、様々な抗
体（キメラやヒト化変異体を含む）において同等の位置のアミノ酸を容易に同定する。例
えば、ヒト抗体軽鎖の50位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の50位のアミノ酸と等しい位置
を占めている。
【００４４】
本明細書中で用いる「重鎖」なる用語は、IgG抗体の重鎖を特定するために使用される。
完全な天然IgGでは、重鎖は免疫グロブリンドメインVH、CH1、ヒンジ、CH2およびCH3を含
む。本明細書全体を通して、IgG重鎖中の残基の番号付けは、Kabatら, Sequences of Pro
teins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, NH1, MD (1991)（
参照として本明細書に組み入れる）におけるようなEUインデックスのそれである。「Kaba
tにおけるようなEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の番号付けをさす。ヒトIgG1の
ヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含むアミノ酸配列の例を、以下に記載する図1Aおよび1B
に示す。図1Aおよび1Bには、IgG2、IgG3およびIgG4の重鎖のヒンジ、CH2およびCH3ドメイ
ンのアミノ酸配列も示される。IgG2、IgG3およびIgG4アイソタイプのアミノ酸配列は、そ
れぞれのヒンジ領域の最初と最後のシステイン残基（重鎖間S-S結合を形成する）を同じ
位置に配置することによって、IgG1配列とアライメントされる。IgG2とIgG3のヒンジ領域
については、全ての残基がEUインデックスにより番号付けされるとは限らない。
【００４５】
「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、一般的に、ヒトIgG1のGlu216からPro230ま
での広がりとして定義される。ヒトIgG1のヒンジ領域のアミノ酸配列の例を図1Aに示す（
図1Aでのアミノ酸残基はKabatシステムに従って番号付けされる）。他のIgGアイソタイプ
のヒンジ領域は、図1Aに示すように重鎖間S-S結合を形成する最初と最後のシステイン残
基を同じ位置に配置することにより、IgG1配列とアライメントさせることができる。
【００４６】
本明細書中で用いる「Fc領域」、「Fcドメイン」または同様の語は、IgG重鎖のＣ末端領
域を規定するために用いられる。ヒトIgG1を含むアミノ酸配列の例を図1Bに示す。Kabat
システムに従って番号付けしたとき、境界はわずかに変化しうるが、Fcドメインはアミノ
酸231から447まで延びている（図1Bでのアミノ酸残基はKabatシステムに従って番号付け
される）。図1Bには、IgGアイソタイプIgG2、IgG3およびIgG4のFc領域のアミノ酸配列の
例も示される。
【００４７】
IgGのFc領域は、2つの定常ドメイン、CH2およびCH3を含む。ヒトIgG Fc領域のCH2ドメイ
ンは、通常、Kabatのナンバリングシステムに従ってアミノ酸231からアミノ酸341まで延
びている（図1B）。ヒトIgG Fc領域のCH3ドメインは、通常、Kabatのナンバリングシステ
ムに従ってアミノ酸342からアミノ酸447まで延びている（図1B）。ヒトIgG Fc領域のCH2
ドメイン（「Cγ2」ドメインとも呼ばれる）は、それがもう一つのドメインと密接に対合
していないという点でユニークである。それどころか、完全な天然IgGの2つのCH2ドメイ
ン間には、2つのN-結合分岐糖鎖が介在している。
【００４８】
本明細書中で用いる「FcγR結合タンパク質」、「FcγR抗体」および「抗FcγR抗体」と
いう用語は互換的に用いられ、さまざまな免疫グロブリン様タンパク質または免疫グロブ
リン由来タンパク質をさす。「FcγR結合タンパク質」はVLおよび/またはVHドメインとの
相互作用を介してFcγRと結合する（Fcγ介在結合とは区別される）。FcγR結合タンパク
質の例としては、完全にヒトの抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗
体（例えば、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む）、そのフラグメント（例えば、Fab、Fab’
、F(ab’)2、Fvフラグメント）、二官能性もしくは多官能性抗体（例えば、Lanzavecchia
ら, 1987, Eur. J. Immunol. 17:105参照）、一本鎖抗体（例えば、Birdら, 1988, Scien
ce 242:423-26参照）、融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイ融合タンパク質
）、「ミニボディ」（例えば、米国特許第5,837,821号参照）、ならびにVLおよび/または
VHドメインまたはそのフラグメントを含む他の抗原結合タンパク質が挙げられる。ある態
様において、FcγRIIIA結合タンパク質は「四量体抗体」であり、すなわち、一般的に天
然のIgGの構造を有し、かつ可変ドメインと定常ドメインを含む（すなわち、VLドメイン
と軽鎖定常ドメインを有する軽鎖２本およびVHドメインと重鎖ヒンジおよび定常ドメイン
を有する重鎖２本を含む）。
【００４９】
本明細書中で用いる「FcγRアンタゴニスト」および類似の用語は、FcγRの少なくとも１
つの生物学的活性をアンタゴナイズする（例えば、シグナル伝達を遮断する）タンパク質
および非タンパク質性物質（小分子を含む）をさす。例えば、本発明の分子はIgGのFcγR
への結合をブロックすることによってシグナル伝達を遮断する。
【００５０】
本明細書中で用いる、ポリペプチドまたはタンパク質に関する「誘導体」なる語は、アミ
ノ酸残基の置換、欠失または付加の導入により改変されているアミノ酸配列を含むポリペ
プチドまたはタンパク質を指す。本明細書中で用いる「誘導体」はまた、改変されている
、すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質への任意のタイプの分子の共有結合により改
変されているポリペプチドまたはタンパク質を意味する。例えば、限定するものではない
が、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の
保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパ
ク質との結合などにより改変することができる。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質は
、限定するものでないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン
の代謝的合成などを含めて、当業者に公知の技術を用いる化学的修飾により製造すること
ができる。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが誘導される元
のポリペプチドまたはタンパク質と同様のまたは同一の機能を保持する。
【００５１】
本明細書中で用いる、非タンパク質誘導体に関しての「誘導体」なる語は、第１の有機ま
たは無機分子の構造に基づいて形成された第２の有機または無機分子を意味する。有機分
子の誘導体は、限定するものではないが、例えば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カル
ボキシルまたはアミン基の付加または欠失により、改変された分子を含む。有機分子はま
た、エステル化、アルキル化および/またはリン酸化されてもよい。
【００５２】
本明細書中で用いる「ダイアボディ分子」とは、２本またはそれ以上のポリペプチド鎖ま
たはタンパク質の複合体であって、それぞれが少なくとも１つのVLおよびVHドメインまた
はその断片を含み、両ドメインが単一のポリペプチド鎖内に含まれている該複合体をさす
。いくつかの実施形態において、「ダイアボディ分子」にはFcまたはヒンジ-Fcドメイン
を含む分子が含まれる。かかる複合体のポリペプチド鎖は同一でも異なっていてもよく、
すなわち、ダイアボディ分子はホモ多量体またはヘテロ多量体でありうる。特定の態様で
は、「ダイアボディ分子」には二量体または四量体が含まれ、つまり前記ポリペプチド鎖
が両方ともVLおよびVHドメインを含む。多量体タンパク質を構成する個々のポリペプチド
鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって多量体の少なくとも１つの他のペプチドと共有結合
で連結されていてもよい。
【００５３】
本明細書中で用いる「障害」および「疾患」は、互換的に使用され、被験者の症状を意味
する。特に、用語「自己免疫疾患」は「自己免疫障害」と互換的に使用され、被験者自身
の細胞、組織および/または器官に対する被験者の免疫反応に起因する細胞、組織および/
または器官の損傷により特徴づけられる被験者の症状を意味する。用語「炎症性疾患」は
用語「炎症性障害」と互換的に使用され、炎症、好ましくは慢性炎症により特徴づけられ
る被験者の症状を意味する。自己免疫障害は炎症を伴っても伴わなくてもよい。さらに、
炎症は自己免疫障害に起因してもしなくてもよい。従って、ある特定の障害は自己免疫障
害と炎症性障害の両方により特徴づけられてもよい。
【００５４】
本明細書中で用いる「同一のポリペプチド鎖」とは、ほぼ同一のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド鎖を意味し、例えば、１個以上のアミノ酸の相違を有するポリペプチド鎖、好
ましくは２つのポリペプチド鎖の活性が有意に異ならないような保存的アミノ酸置換を有
するポリペプチド鎖が含まれる。
【００５５】
本明細書中で用いる「癌」なる語は、異常な無制御の細胞増殖から生じる新生物または腫
瘍を意味する。本明細書中で用いる癌は、明確に白血病およびリンパ腫を含む。いくつか
の実施形態において、癌は局在化したままで存在する良性腫瘍を意味する。他の実施形態
において、癌は、近隣の身体構造に侵入して破壊し、離れた部位に広がる悪性腫瘍を意味
する。いくつかの実施形態では、癌は特定の癌抗原を随伴する。
【００５６】
本明細書中で用いる「免疫調節剤」およびその変形は、宿主の免疫系をモジュレートする
薬剤を意味する。ある特定の実施形態においては、免疫調節剤は免疫抑制剤である。ある
特定の実施形態においては、免疫調節剤は免疫賦活剤である。免疫調節剤としては、限定
するものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分
子、ミメチック、および有機分子を含む。
【００５７】
本明細書中で用いる「エピトープ」なる語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましく
はヒトにおいて抗原性または免疫原性を有するポリペプチドもしくはタンパク質または非
タンパク質分子の断片を意味する。免疫原性を有するエピトープは、動物において抗体応
答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原性を有するエピトープは
、当業者に周知の方法、例えばイムノアッセイにより確認されるような、抗体が免疫特異
的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原性エピトープは必ずしも
免疫原性である必要はない。
【００５８】
本明細書中で用いる「断片」または「フラグメント」とは、別のポリペプチドのアミノ酸
配列の少なくとも5個連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少
なくとも15個連続したアミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも
25個連続したアミノ酸残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続
したアミノ酸残基、少なくとも60個連続したアミノ酸残基、少なくとも70個連続したアミ
ノ酸残基、少なくとも80個連続したアミノ酸残基、少なくとも90個連続したアミノ酸残基
、少なくとも100個連続したアミノ酸残基、少なくとも125個連続したアミノ酸残基、少な
くとも150個連続したアミノ酸残基、少なくとも175個連続したアミノ酸残基、少なくとも
200個連続したアミノ酸残基、または少なくとも250個連続したアミノ酸残基のアミノ酸配
列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。特定の実施形態においては、ポリペプ
チドの断片は、そのポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持する。
【００５９】
本明細書中で用いる「核酸」および「ヌクレオチド配列」なる語は、DNA分子（例えば、c
DNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（例えば、mRNA）、DNAおよびRNA分子の組合せまたはハ
イブリッドDNA/RNA分子、ならびにDNAまたはRNA分子の類似体を含む。このような類似体
は、例えば、限定するものではないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含むヌクレオチ
ド類似体を用いて作製することができる。このような類似体はまた、分子に有益な属性を
与える（例えば、ヌクレアーゼ耐性を付与したり、細胞膜を通過する能力を高める）改変
された骨格を有するDNAまたはRNA分子を含んでもよい。核酸またはヌクレオチド配列は一
本鎖、または二本鎖であってもよいし、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含んでもよく、
また、三本鎖部分を含んでもよい。しかし、好ましくは二本鎖DNAである。
【００６０】
本明細書中で用いる「治療上有効な量」、「治療に有効な量」または「治療有効量」とは
、疾患または障害を治療または管理するのに十分な治療剤の量を意味する。治療上有効な
量は、疾患の発症を遅延させるかまたは最小限にする（例えば、癌の拡大を遅延させるか
または最小限にする）のに十分な治療剤の量を指すこともある。治療上有効な量は、疾患
の治療または管理において治療上の利益を与える治療剤の量を意味してもよい。さらに、
本発明の治療剤についての治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利
益を与える、単独でのまたは他の治療剤と組み合わせた治療剤の量を意味する。
【００６１】
本明細書中で用いる「予防剤」なる語は、障害の予防に、または障害の再発または拡大の
予防に使用される薬剤を意味する。予防上有効な量は、過増殖性疾患（特に癌）の再発ま
たは拡大、または患者（限定するものではないが、過増殖性疾患の素因がある患者、例え
ば、遺伝的に癌の素因があるかまたは以前に発癌物質に曝された患者を含む）におけるそ
れらの発生を予防するのに十分な予防剤の量を意味しうる。予防上有効な量はまた、疾患
の予防において予防上の利益を与える予防剤の量を意味してもよい。さらに、本発明の予
防剤についての予防上有効な量は、疾患の予防において予防上の利益を与える、単独での
または他の薬剤と組み合わせた予防剤の量を意味する。
【００６２】
本明細書中で用いる「予防」とは、予防剤または治療剤の投与から得られる、被験者にお
ける障害の１以上の症状の再発または発症の予防を意味する。
【００６３】
本明細書中で用いる「組み合わせて」は、２種以上の予防剤および/または治療剤の使用
を意味する。用語「組み合わせて」は、予防剤および/または治療剤を、障害のある被験
者に投与する順序を制限するものではない。第１の予防剤または治療剤は、障害のある被
験者に第２の予防剤または治療剤を投与する前（例えば5分、15分、30分、45分、1時間、
2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週
、5週、6週、8週、または12週前）に、または第２の予防剤または治療剤を投与すると同
時に、または第２の予防剤または治療剤を投与した後（例えば5分、15分、30分、45分、1
時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週
、4週、5週、6週、8週、または12週後）に、投与することができる。
【００６４】
本明細書において用いられる「エフェクター機能」は、抗体のFc領域と、Fc受容体または
抗原との相互作用によりもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能の例と
しては、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）、抗体依存性食作用(ADCP)、および補体依存性
細胞傷害作用があるが、これに限定されるものではない。エフェクター機能には、抗原結
合後に作用するエフェクター機能と、抗原結合とは無関係に作用するエフェクター機能の
両方が含まれる。
【００６５】
本明細書において用いられる「エフェクター細胞」は、1つ以上のFc受容体を発現し、1つ
以上のエフェクター機能を媒介する、免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞の例と
しては、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞
、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞があるが、これら
に限定されるものではなく、またエフェクター細胞は任意の生物、例えば、ヒト、マウス
、ラット、ウサギおよびサルに由来し得るが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
本明細書中で用いる「免疫複合体と特異的に結合する」および類似の用語は、ある免疫複
合体と特異的に結合するが、別の分子とは特異的に結合しない分子を意味する。免疫複合
体と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、BIAcore、または当技術分野で公
知の他のアッセイで測定して、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドと結合
してもよい。好ましくは、免疫複合体と特異的に結合する分子は他のタンパク質と交差反
応しないものである。免疫複合体と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、BI
Acore、または当技術分野で公知の他の技法により、確認することができる。
【００６７】
本明細書中で用いる「安定な融合タンパク質」とは、当業者に知られた通常の生化学的お
よび機能性アッセイを用いて評価したとき、製造および/または保存中に最小限ないし検
出不能レベルの分解を受ける融合タンパク質を意味し、生物学的活性（例えば、FcγRと
の結合）の低下なく、長期間保存することができる。
【００６８】
4. 図面の説明
（本明細書の最後に記載する。）
【００６９】
5. 好適な実施形態の説明
ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は、VLドメインおよびVHドメインを含む。それらは
、ドメインの自己集合が起こらないように共有結合によって連結されている。２つのポリ
ペプチド鎖の相互作用により２つのVL-VH対合が生じ、２つのエピトープ結合部位、すな
わち二価の分子を形成する。VHまたはVLドメインは、ポリペプチド鎖内のどの位置にも拘
束されず、つまり、アミノ（N）末端またはカルボキシ（C）末端に制限されることはない
。また前記ドメインは、互いの相対的位置に制限されることもなく、つまり、VLドメイン
がVHドメインに対してN末端側にあってもよいし、その逆であってもよい。唯一の制限は
、機能的なダイアボディを形成するために、相補的なポリペプチド鎖が利用可能であると
いうことである。VLおよびVHドメインが同一抗体に由来する場合、二本の相補的ポリペプ
チド鎖は、同一であってもよい。例えば、結合ドメインがエピトープAに特異的な抗体に
由来する場合（すなわち、結合ドメインがVLA-VHA相互作用から形成される場合）、各ポ
リペプチドはVHAおよびVLAを含むことができる。抗体の２つのポリペプチド鎖のホモ二量
体化は、２つのVLA-VHA結合部位の形成をもたらし、結果的に二価の単一特異性抗体が生
じる。VLおよびVHドメインが異なる抗原に対して特異的な抗体に由来する場合、機能的な
二重特異性ダイアボディの形成には、異なる二本のポリペプチド鎖の相互作用、すなわち
ヘテロ二量体の形成が必要となる。例えば、二重特異性ダイアボディの場合、１本のポリ
ペプチド鎖はVLAおよびVLBから構成される。前記鎖のホモ二量体化は、結果的に、結合な
しのまたは予測できない結合の、２つのVLA-VHB結合部位の形成をもたらし得る。これに
対して、２つの異なるポリペプチド鎖が、例えば組換え発現系において自由に相互作用で
きる場合、一方はVLAおよびVHBから、他方はVLBおよびVHAからなり、二つの異なる結合部
位、すなわちVLA-VHAおよびVLB-VHBを形成することができる。全てのダイアボディポリペ
プチド鎖の対に関して、２つの鎖のアライメントミスまたは結合ミス、すなわちVL-VLま
たはVH-VHドメインの相互作用の可能性があり得る。しかし、機能的なダイアボディの精
製は、適切に二量体化した結合部位の免疫特異性に基づいて、当該分野で公知のまたは本
明細書で例示した、例えばアフィニティークロマトグラフィーといった親和性を基礎とす
る方法を用いることで、容易に行うことができる。
【００７０】
他の実施形態では、ダイアボディの１以上のポリペプチド鎖がFcドメインを含んでいる。
ダイアボディ分子のポリペプチド鎖におけるFcドメインは、優先的に二量体を形成し、結
果的に免疫グロブリン様の性質（例えばFc-FcγR相互作用）を示すダイアボディ分子の形
成をもたらす。Fcを含むダイアボディは、例えば、２本のポリペプチド鎖からなり、それ
ぞれがVHドメイン、VLドメインおよびFcドメインを含む二量体であってもよい。前記ポリ
ペプチド鎖の二量体化により、非改変型二価抗体の構造とは明確に区別される構造である
にもかかわらず、Fcドメインを含む二価のダイアボディが生じる（図１１）。このような
ダイアボディ分子は、野生型免疫グロブリンと比較すると、例えば、血中半減期や結合特
性等の変化といった表現型の変化を示し得る。他の実施形態において、Fcドメインを含む
ダイアボディ分子は四量体であってもよい。前記四量体は、２本の「重い」ポリペプチド
鎖、すなわちVL、VHおよびFcドメインからなるポリペプチド鎖と、２つの「軽い」ポリペ
プチド鎖、すなわちVLおよびVHからなるポリペプチド鎖を含む。前記軽い鎖および重い鎖
は相互作用によって単量体を形成し、そしてこれらの単量体は、不対合状態のFcドメイン
を介して相互に作用してIgG様分子を形成する。このようなIg様ダイアボディは四価であ
り、単一特異性、二重特異性、または四重特異性であり得る。
【００７１】
ダイアボディ分子の少なくとも２つの結合部位は、同一または異なるエピトープを認識で
きる。異なるエピトープは、同一抗原由来、または異なる抗原由来とすることができる。
一の実施形態において、エピトープは異なる細胞由来である。他の実施形態において、エ
ピトープは、同一細胞またはウイルス上の細胞表面抗原である。エピトープ結合部位は、
抗体の作製が可能ないかなる抗原をも認識できる。例えば、タンパク質、核酸、細菌毒素
、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬剤等が挙げられる。具
体的な態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、特定の細胞、
例えばB細胞、T細胞、貪食細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞または樹状細胞上の抗原に
対して特異的である。
【００７２】
ダイアボディのポリペプチド鎖の各ドメイン、すなわちVL、VHおよびFCドメインを、ペプ
チドリンカーによって隔てることができる。ペプチドリンカーは、０、１、２、３、４、
５、６、７、８または９個のアミノ酸とすることができる。いくつかの実施形態で、アミ
ノ酸リンカー配列は、配列番号76の核酸配列によりコードされたGGGSGGGG（配列番号10）
である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖が、少なくとも１個のシ
ステイン残基を含むように作製される。このシステイン残基は、本発明の２本目のポリペ
プチド鎖上の少なくとも１個のシステイン残基と相互作用して、鎖間ジスルフィド結合を
形成することができる。鎖間ジスルフィド結合は、ダイアボディ分子の安定化に貢献し、
組換え系における発現および回収を改善することで、結果的に安定かつ一貫性のある調製
物をもたらすのみならず、分離・精製された産物のin vivoでの安定性を改善する。前記
少なくとも１個のシステイン残基は、単一のアミノ酸として、または比較的長いアミノ酸
配列（例えばヒンジドメイン）の一部として、ポリペプチド鎖の任意の位置に導入するこ
とができる。具体的な実施形態では、前記少なくとも１個のシステイン残基を遺伝子操作
によってポリペプチド鎖のC末端に存在するように設計する。いくつかの実施形態で、前
記少なくとも１個のシステイン残基は、アミノ酸配列LGGCの内部に入れて、ポリペプチド
鎖に導入される。具体的な実施形態では、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプ
チド鎖のC末端は、アミノ酸配列LGGCを含む。他の実施形態で、前記少なくとも１個のシ
ステイン残基は、例えば配列番号１または配列番号４の、ヒンジドメインを構成するアミ
ノ酸配列内部に入れて、ポリペプチド鎖に導入される。具体的な実施形態で、本発明のダ
イアボディ分子のポリペプチド鎖のC末端は、例えば配列番号１のようなIgGヒンジドメイ
ンのアミノ酸配列を含む。他の実施形態で、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖
のC末端は、ヌクレオチド配列（配列番号80）でコードされ得るアミノ酸配列VEPKSC（配
列番号79）を含む。他の実施形態で、前記少なくとも１個のシステイン残基は、ヌクレオ
チド配列（配列番号78）によってコードされ得るアミノ酸配列LGGCFNRGEC（配列番号17）
内部に入れて、ポリペプチド鎖に導入される。具体的な実施形態で、本発明のダイアボデ
ィ分子を構成するポリペプチド鎖のC末端は、ヌクレオチド配列（配列番号78）によって
コードされ得るアミノ酸配列LGGCFNRGEC（配列番号17）を含む。さらなる他の実施形態で
、前記少なくとも１個のシステイン残基は、ヌクレオチド配列（配列番号77）によってコ
ードされ得るアミノ酸配列FNRGEC（配列番号23）の内部に入れて、ポリペプチド鎖に導入
される。具体的な実施形態で、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のC
末端は、ヌクレオチド配列（配列番号77）によってコードされ得るアミノ酸配列FNRGEC（
配列番号23）を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態で、ダイアボディ分子は少なくとも2本のポリペプチド鎖を含む。前
記各ポリペプチド鎖はアミノ酸配列LGGCを含み、かつ前記LGGC配列中のシステイン残基間
のジスルフィド結合によって共有結合している。他の具体的な実施形態で、ダイアボディ
分子は少なくとも２本のポリペプチド鎖を含む。うち一方は、配列FNRGEC（配列番号23）
を含むが、他方はヒンジドメイン（少なくとも1個のシステイン残基を含む）を含む。こ
こで、前記少なくとも2本のポリペプチド鎖は、FNRGEC（配列番号23）中のシステイン残
基とヒンジドメイン中のシステイン残基の間でジスルフィド結合によって共有結合してい
る。具体的な態様で、ヒンジドメイン中に存在して、ジスルフィド結合に関与するシステ
イン残基は、Cys-128（Kabat EUによる番号付け；改変されていない完全なIgG重鎖のヒン
ジドメインの中に位置する）である。そして、その相手方（カウンターパート）は、配列
番号23中のシステイン残基Cys-214（Kabat EUによる番号付け；改変されていない完全なI
gG軽鎖のC末端に位置する）である（Elkabetzら, 2005, J. Biol. Chem. 280:14402-1441
2：参照としてその全てを本明細書中に組み入れる）。さらなる他の実施形態では、少な
くとも１個のシステイン残基を、遺伝子操作によりアミノ酸鎖のN末端に存在させる。さ
らに他の実施形態では、少なくとも１個のシステイン残基を、遺伝子操作によりダイアボ
ディ分子のポリペプチド鎖のリンカー部分に存在させる。さらなる実施形態で、VHまたは
VLドメインは、親（操作前）のVHまたはVLドメインと比較して少なくとも１個のアミノ酸
の改変を含むように遺伝子操作する。そのようなアミノ酸改変は、親のアミノ酸をシステ
インで置換することを含む。
【００７５】
本発明は、Fcドメインまたはその一部（例えば、CH2ドメインまたはCH3ドメイン）を含む
ダイアボディ分子を包含する。Fcドメインまたはその一部は、IgA、IgD、IgG、IgEおよび
IgMを含むがこれらに限定はされない、あらゆる免疫グロブリンのアイソタイプまたはア
ロタイプに由来するものであってもよい。Fcドメイン（またはその一部）は、IgGに由来
するのが好ましい実施形態である。IgGアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4
、またはそれらのアロタイプであることが特に好ましい実施形態である。ある実施形態で
、ダイアボディ分子はFcドメインを含む。このFcドメインは、あらゆる免疫グロブリンア
イソタイプから独立に選択されたCH2ドメインおよびCH3ドメインを含む（すなわち、Fcド
メインはIgGに由来するCH2ドメインとIgEに由来するCH3ドメイン、またはIgG1に由来する
CH2ドメインとIgG2に由来するCH3ドメイン等を含んでなる）。前記Fcドメインを、本発明
のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖の中に、前記ポリペプチド鎖の他のドメイ
ンまたは部分に対してどんな位置であっても、遺伝子操作で導入することができる（例え
ば、Fcドメインもしくはその一部が、ポリペプチド鎖のVLおよびVH両ドメインのC末端に
あってもよく、VLおよびVH両ドメインのN末端にあってもよく、または一方のドメインのN
末端と他方のドメインのC末端に（すなわち、ポリペプチド鎖の2つのドメインの間に）あ
ってもよい）。
【００７６】
本発明はまた、ヒンジドメインを含む分子を包含する。ヒンジドメインは、IgA、IgD、Ig
G、IgEおよびIgMを含むどんな免疫グロブリンのアイソタイプまたはアロタイプに由来す
るものであってもよい。好ましい実施形態では、ヒンジドメインはIgGに由来し、そのIgG
アイソタイプはIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4、またはそれらのアロタイプである。前記
ヒンジドメインは、ダイアボディ分子がヒンジ−Fcドメインを含むように、ダイアボディ
分子を構成するポリペプチド鎖の中にFcドメインと共に、遺伝子操作で導入することがで
きる。いくつかの実施形態で、ヒンジおよびFcドメインは、当該分野で公知のまたは本明
細書で例示したどの免疫グロブリンアイソタイプとも無関係に選択される。他の実施形態
で、ヒンジおよびFcドメインは、ポリペプチド鎖の少なくとも１つの他のドメイン、例え
ば、VLドメインによって隔てられている。ヒンジドメインを、または任意でヒンジ−Fcド
メインを、本発明のポリペプチドの中に、前記ポリペプチド鎖の他のドメインまたは一部
に対してどんな位置であっても、遺伝子操作で導入することができる。いくつかの実施形
態で、本発明のポリペプチド鎖はヒンジドメインを含むが、このヒンジドメインは、Fcド
メインを含まないポリペプチド鎖のC末端に存在する。さらなる他の実施形態で、本発明
のポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖のC末端に存在するヒンジ−Fcドメインを含む。さ
らなる実施形態で、本発明のポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖のN末端に存在するヒン
ジ−Fcドメインを含む。
【００７７】
上述したように、本発明は、それぞれのポリペプチド鎖がVHおよびVLドメインを含むポリ
ペプチド鎖の多量体を包含する。いくつかの態様において、前記多量体のポリペプチド鎖
は、さらにFcドメインを含む。Fcドメインの二量体形成は、免疫グロブリン様の機能性、
すなわちFcを介した機能（例えば、Fc-FcγR相互作用、補体結合等）を示すダイアボディ
分子の形成をもらたす。いくつかの実施形態で、各ポリペプチド鎖を構成するVLおよびVH
ドメインは、同一の特異性を有し、前記ダイアボディ分子は、二価であって、かつ単一特
異的である。他の実施形態で、各ポリペプチド鎖を構成するVLおよびVHドメインは、異な
る特異性を有し、ダイアボディは二価で、かつ二重特異的である。
【００７８】
さらに、他の実施形態で本発明のダイアボディ分子は、各ポリペプチド鎖がVHおよびVLド
メインを含むポリペプチド鎖の四量体を包含する。いくつかの実施形態で、四量体の２つ
のポリペプチド鎖は、さらにFcドメインを含む。したがって、四量体は、それぞれがVL、
VHおよびFcドメインから成る２本の「重い」ポリペプチド鎖と、VLおよびVHドメインから
成る２本の「軽い」ポリペプチド鎖を含む。二価単量体への「重い」鎖と「軽い」鎖の相
互作用と結びついた、「重い」鎖のFcドメインを介した二価単量体の二量体形成は、四価
の免疫グロブリン様分子の形成をもたらし得る（実施例6.2および6.3に例示）。いくつか
の態様で、単量体は同一であり、四価のダイアボディ分子は、単一特異性または二重特異
性である。他の態様では、単量体は異なっており、四価の分子は、二重特異性または四重
特異性である。
【００７９】
上記四重特異性ダイアボディ分子の形成は、４本の異なるポリペプチド鎖の相互作用を必
要とする。そのような相互作用を単細胞組換え生産系で効率的に行わせることは、鎖の潜
在的なミスペアリングによる多数の変異体の存在により困難である。ミスペアリングの可
能性が増加することに対する１つの解決策は、所望のポリペプチド鎖対の中に「knobs-in
to-holes」型変異を導入することである。このような変異は、ホモ二量体形成よりもヘテ
ロ二量体形成が好ましい。例えば、Fc-Fc相互作用に関して、アミノ酸置換（「knob」を
形成する嵩高な側鎖を含むアミノ酸、例えばトリプトファンと置換することが好ましい）
をCH2またはCH3ドメインに導入して、立体障害が同様に変異させたドメインとの相互作用
を妨げるようにし、かつ立体障害がその変異型ドメインを、相補的なまたは適合する変異
（すなわち「the hole」、例えばグリシンで置換する）を遺伝子操作で導入したドメイン
と、強制的に対合させるようにする。このような変異のセットは、ダイアボディ分子を構
成するどのポリペプチド対にも遺伝子操作で導入することができ、さらに、そのような対
のポリペプチド鎖のどの部分にも遺伝子操作で導入することができる。ホモ二量体形成よ
りもヘテロ二量体形成に有利なタンパク質操作の方法、特に免疫グロブリン様分子の操作
については、当該分野でよく知られており、それらは本明細書中に包含される（Ridgway
ら., 1996, Protein Engr. 9:617-621、Atwellら, 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35、お
よびXiら、2005, J. Immunol. Methods 296:95-101を参照されたい；いずれの文献も参照
としてその全てを本明細書中に組み入れる）。
【００８０】
本発明はまた、変異型Fcもしくは変異型ヒンジ−Fcドメイン（またはその一部）を含むダ
イアボディ分子を包含する。この変異型Fcドメインは、比較可能な野生型Fcドメインもし
くは野生型ヒンジ−Fcドメイン（またはその一部）と比べて、少なくとも１つのアミノ酸
改変（例えば、置換、挿入、または欠失）を含んでいる。変異型Fcドメインもしくは変異
型ヒンジ−Fcドメイン（またはその一部）を含む分子（例えば、抗体）は、野生型Fcドメ
インもしくは野生型ヒンジ−Fcドメイン（またはその一部）を含む分子と比べて、通常は
表現型が変化している。変異型の表現型は、NK依存性またはマクロファージ依存性アッセ
イでアッセイしたときに、血中半減期の変化、安定性の変化、細胞性酵素に対する感受性
の変化、またはエフェクター機能の変化として現れることがある。エフェクター機能を変
えると確認された変異型Fcドメインは、国際公開WO 04/063351号、米国特許出願公開2005
/0037000号および2005/0064514号、米国仮出願第60/626,510号（2004年11月10日出願）、
第60/636,663号（2004年12月15日出願）、および第60/781,564号（2006年3月10日出願）
、本発明者の同時出願である米国特許出願第11/271,140号（2005年11月10日出願）および
第11/305,787号（2005年12月15日出願）に開示されている。各特許文献は参照としてその
全てが本明細書に組み込まれる。
【００８１】
本発明の二重特異性ダイアボディは、２つの分離した、異なるエピトープに同時に結合で
きる。いくつかの実施形態では、エピトープは同一抗原由来である。他の実施形態では、
エピトープは異なる抗原由来である。少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Tリンパ
球、ナチュラルキラー（NK）細胞、または他の単核細胞で発現され、免疫エフェクター細
胞上に提示される決定因子（例えば、CD3、CD16、CD32、CD64等）に特異的であることが
実施形態として好ましい。一の実施形態において、ダイアボディ分子は、エフェクター細
胞の決定因子に結合し、また前記エフェクター細胞をも活性化する。これに関連して、本
発明のダイアボディ分子は、それらがさらにFcドメインを含んでいるかどうかとは無関係
に、Ig様の機能性を示すことができる（例えば、当該分野で公知の、または本明細書で例
示した、いずれかのエフェクター機能アッセイ（例えばADCCアッセイ）でアッセイしたと
き）。いくつかの実施形態で、本発明の二重特異性ダイアボディは、腫瘍細胞上の癌抗原
とエファクター細胞の決定因子の両方に結合すると同時にエフェクター細胞を活性化する
。他に取り得る実施形態で、本発明の二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子は
、上記（背景技術の項を参照されたい）のように、同一細胞上の活性化受容体と抑制受容
体に同時に結合し（例えば、CD32AとCD32B、BCRとCD32B、またはIgERIとCD32Bに結合する
）、それらを連結することによって、標的（例えばエフェクター）細胞の活性化を阻害す
ることができる。本実施形態のさらなる態様において、二重特異性ダイアボディは、ウイ
ルス上の２つの中和エピトープ（例えば、RSVエピトープ；E16およびE53のようなWNVエピ
トープ）に同時に結合することによって、抗ウイルス性を示すことができる
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディ分子は、特定の細胞型を標的
とするための無比の機会を提供する。例えば、二重特異性ダイアボディまたはダイアボデ
ィ分子を、遺伝子操作して標的細胞型または標的組織型に特異な抗原のセットを認識する
エピトープ結合部位の組合せを含むようにすることができる。さらに、個々の抗原の一方
または両方が、他の組織および／または細胞型において別個にかなり一般的なものである
場合、低親和性結合ドメインを用いて、ダイアボディまたはダイアボディ分子を構築する
ことができる。このような低親和性結合ドメインは、治療目的のために十分な結合力でも
って個々のエピトープまたは抗原に結合できないであろう。しかし、エピトープまたは抗
原の両方が、単一標的細胞または組織上に存在する場合、その細胞もしくは組織に対する
ダイアボディまたはダイアボディ分子の結合力は、抗原１つだけを発現している細胞もし
くは組織のそれと比べれば増加するであろう。このように前記細胞もしくは組織は、本発
明によって効率的に標的化されるであろう。前記二重特異性分子は、たった１つの抗原に
対する特異性を持つ単一特異性ダイアボディまたは抗体と比べると、前記両方の抗原を発
現している細胞上の一方のまたは双方の標的抗原に対して強化された結合性を示し得る。
【００８２】
本発明のダイアボディの結合特性は、結合活性および／または１以上のFcγRを介したエ
フェクター細胞機能（Fc-FcγR相互作用を通して、またはFcγRに対するダイアボディ分
子の免疫特異的結合によって仲介される）を測定するためのin vitro機能アッセイにより
特徴付けされることが好ましい（セクション5.4.2および5.4.3を参照)。FcγRに対する本
発明の分子（例えばダイアボディ）の親和性および結合特性を、結合ドメイン−抗原また
はFc-FcγR相互作用（すなわち、それぞれ、結合ドメインへの抗原の特異的結合、または
FcγRへのFc領域の特異的結合）を測定するための当該分野で知られるin vitroアッセイ
法（生化学的なまたは免疫学をベースとするアッセイ法）を用いて測定することができる
。前記in vitroアッセイ法には、ELISAアッセイ法、表面プラズモン共鳴アッセイ法、免
疫沈降アッセイ法（セクション5.4.2参照）が含まれるが、これらに限定されない。本発
明の分子が（本明細書に記載され、開示されたような）in vivoモデルにおいて、in vitr
oベースのアッセイにおけるそれと同様の結合特性を有する実施形態が、最も好ましい。
しかしながら、本発明は、in vitroベースのアッセイでは所望の表現型を示さないが、in
vivoでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。
【００８３】
ある実施形態では、本発明の分子を操作して、鋳型分子の匹敵する部分と比べて変化した
グリコシル化パターンまたは変化したグリコフォームを含むようにすることができる。操
作されたグリコフォームは、エフェクター機能を増強することを含むがそれに限定されな
い、様々な目的に有用であり得る。操作されたグリコフォームは、当業者に知られたどの
方法ででも作ることができる。例えば、遺伝子操作されたもしくは変異型の発現株を用い
る方法、１以上の酵素、例えばDI N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼIII (GnTI
II)との共発現による方法、各種生物もしくは各種生物由来の細胞株で本発明のダイアボ
ディを発現させることによる方法、またはダイアボディを発現させて精製した後に糖鎖を
修飾することによる方法が挙げられる。遺伝子操作されたグリコフォームを作製する方法
は、当該分野では公知である。かかる方法は、Umanaら、1999, Nat. Biotechnol 17:176-
180；Daviesら、2001 Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shieldsら、2002, J Biol Chem 2
77:26733-26740；Shinkawaら、2003, J Biol Chem 278:3466-3473)、米国特許第6,602,68
4号；米国特許出願第10/277,370号；米国特許出願第10/113,929号；国際公開WO 00/61739
A1号；国際公開WO 01/292246A1号；国際公開WO 02/311140A1号；国際公開WO 02/30954A1
号；PotillegentTMtechnology (Biowa, Inc. Princeton, NJ)；GlycoMAbTMglycosylation
engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)を含むが
、これらに限定はされない。また、上記各方法は、参照としてその全てを本明細書に組み
入れる。例えば、国際公開WO 00061739号；EA第01229125号；US第20030115614号；Okazak
iら、2004, JMB, 336: 1239-49 を参照されたい。これらのいずれも参照としてその全て
を本明細書に組み入れる。
【００８４】
さらに本発明は、本発明のダイアボディを作製するために非天然アミノ酸を組み込むこと
を包含する。そのような方法は当業者には公知である。例えば、天然の生合成機構を用い
てタンパク質内への非天然アミノ酸の組み込みを可能にする方法等がある。例えば、Wang
ら、2002, Chem. Comm. 1: 1-11；Wangら、2001, Science, 292: 498-500； van Hestら
、2001, Chem. Comm. 19: 1897-1904を参照されたい。これらはいずれも参照としてその
全てを本明細書に組み入れる。もう一つの方法として、アミノアシルtRNAの生合成に関与
する酵素に焦点を当てたものがある。例えば、Tangら、2001, J. Am. Chem. 123(44): 11
089-11090；Kiickら、2001, FEBS Lett. 505(3): 465を参照されたい。これらはいずれも
、参照としてその全てを本明細書に組み入れる。
【００８５】
いくつかの実施形態で、本発明は、グリコシル化部位を付加または欠失することによって
、本発明の分子のVL、VHまたはFcドメインを改変する方法を包含する。タンパク質の糖鎖
を改変する方法は、当該分野では周知であり、本発明中に包含される。例えば米国特許第
6,218,149号；欧州特許第0,359,096B1号；米国特許公開第2002/0028486号；国際公開WO 0
3/035835号；米国特許公開第2003/0115614号；米国特許第6,218,149号；米国特許第6,472
,511号を参照されたい。これらは全て参照としてその全内容が本明細書に組み込まれる。
【００８６】
5.1. ダイアボディ結合ドメイン
本発明のダイアボディは、一般に免疫グロブリンまたは抗体に由来する抗原結合ドメイン
を含む。本発明の方法に使用する結合ドメインが由来する抗体は、鳥および動物（例えば
、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ
、ウマ、またはニワトリ）を含むいずれの動物起源からのものであってもよい。抗体は、
ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書で用いる場合、「
ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫
グロブリンライブラリーもしくは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーから
、またはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから、単離された抗体を含む。
【００８７】
本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染症の治療および／または予防用に
当該分野で知られるあらゆる抗体を、本発明のダイアボディの結合ドメインのソースとし
て使用することを意図している。既知の癌抗体の非限定的な例をセクション5.7.1に示す
だけでなく、列挙した標的抗原に特異的な他の抗体、およびセクション5.6.1で列挙した
癌抗原に対する抗体を示す。自己免疫疾患および炎症性疾患の治療および／または予防用
の既知の抗体の非限定的な例をセクション5.7.2に示すだけでなく、列挙した標的抗原に
対する抗体およびセクション5.6.1で列挙した抗原に対する抗体も示す。他の実施形態で
は、セクション5.6.3に列挙した感染症に関連するエピトープに対する抗体を使用するこ
とができる。いくつかの実施形態で、前記抗体は１以上のアミノ酸改変を有する変異型Fc
領域を含む。当該抗体は、本発明の方法によって同定され、付与されたエフェクター機能
、並びに／または野生型Fc領域を含む匹敵する分子と比べてFcγRIIBに対する親和性の増
強およびFcγRIIIAに対する親和性の低減を有することがわかっている。本発明により操
作され得る炎症性疾患の治療または予防に使用される抗体の非限定的例を表９に示す。ま
た、自己免疫疾患の治療または予防に使用される抗体の非限定的例を表１０に示す。
【００８８】
ヒトにおける抗体のin vivoでの使用およびin vitro検出アッセイを含むいくつかの使用
に関しては、ヒト、キメラまたはヒト化抗体由来の可変ドメインを有するダイアボディを
使用することが好ましい。完全なヒト抗体由来の可変領域は、被験者の治療のために特に
望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上
記のファージディスプレイ法を含む、当該分野で知られる様々な方法によって作成するこ
とができる。また、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；並びに国際公開WO 98/
46645号、WO 98/50433号、WO 98/24893号、WO 98/16654号、WO 96/34096号、WO 96/33735
号およびWO 91/10741号も参照されたい。これらは、それぞれを参照としてその全てが本
明細書に組み込まれる。
【００８９】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合でき、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的
に有するフレームワーク領域とヒト以外の免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有す
るCDRを含む、抗体、その変異体もしくはフラグメントをいう。ヒト化抗体は、少なくと
も１つの、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むことができる。当該可変
ドメインでは、CDR領域の全部もしくは実質的に全部がヒト以外の免疫グロブリン（すな
わち、ドナー抗体）のCDR領域と一致し、また全部もしくは実質的に全部のフレームワー
ク領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のフレームワーク領域となっている。
【００９０】
ヒト化抗体のフレームワーク領域およびCDR領域は、親配列と正確に一致する必要はない
。例えば、ドナーCDRまたはコンセンサスフレームワークは、少なくとも１個の残基の置
換、挿入もしくは欠失により変異誘発させて、変異誘発させた部位のCDRまたはフレーム
ワーク残基がコンセンサスまたはドナー抗体に一致しないようにすることができる。しか
しながら、そのような変異を広範囲に行うことは好ましくない。一般的には、ヒト化抗体
残基の少なくとも75％、大抵は90％以上、最も好ましくは95％を超える残基が、親のフレ
ームワーク領域（FR）およびCDR配列のそれと一致する。ヒト化抗体は当該分野で知られ
る様々な技術を用いて作ることができる。限定はしないが、そのような技術には、CDRグ
ラフト法（欧州特許第239,400号、国際公開WO 91/09967号、並びに米国特許第5,225,539
号、第5,530,101号および第5,585,089号）、ベニアリング（veneering）法またはリサー
フェイシング（resurfacing）法（欧州特許第592,106号および第519,596号；Padlan, 199
1, Molecular Immunology 28(4/5):489 498；Studnickaら、1994, Protein Engineering 
7(6):805 814；および Roguskaら、1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969 973）、チェ
ーンシャッフリング（chain shuffling）法（米国特許第5,565,332号）、並びに、例えば
米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、第5,585,089号、国際公開WO 9317105号、Tanら
,2002, J. Immunol. 169:1119 25、Caldasら,2000, Protein Eng. 13:353 60、Moreaら,2
000, Methods 20:267 79、Bacaら,1997, J. Biol. Chem. 272:10678 84、Roguskaら,1996
, Protein Eng. 9:895 904、Coutoら, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s 5977s、C
outoら,1995, Cancer Res. 55:1717 22、Sandhu, 1994, Gene 150:409 10、Pedersenら,1
994, J. Mol. Biol. 235:959 73、Jonesら, 1986, Nature 321:522-525、 Riechmannら,1
988, Nature 332:323、およびPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596で開示
された技術等が含まれる。しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残基を、CD
Rドナー抗体由来の対応する残基で置換して、抗原結合性を変える、好ましくは改善する
ことができる。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法で同定される。例
えば、CDRとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合性に重要なフレー
ムワーク残基を同定する方法、および配列比較により特定の位置の普通でないフレームワ
ーク残基を同定する方法が挙げられる（例えば、Queenらによる米国特許第5,585,089号；
米国特許公開第2004/0049014号および第2003/0229208号；米国特許第6,350,861号；第6,1
80,370号；第5,693,762号；第5,693,761号；第5,585,089号；および第5,530,101号、並び
にRiechmannら, 1988, Nature 332:323を参照されたい。これらの全ては、参照としてそ
の内容の全てを本明細書に援用する）。
【００９１】
最も好ましい実施形態で、ヒト化結合ドメインは、ドナーであるマウス抗体と同一のエピ
トープに特異的に結合する。当業者には、本発明が一般に、抗体のCDRグラフト法を包含
することが理解できるであろう。したがって、たとえ同一抗体クラスまたは同一抗体サブ
クラスであっても、ドナー抗体およびアクセプター抗体を同一種の動物由来にすることが
できる。しかし、より一般的には、ドナー側およびアクセプター側の抗体は、異なる種類
の動物に由来する。典型的には、ドナー抗体はゲッ歯類のMAb等のヒト以外の抗体であり
、アクセプター抗体はヒト抗体である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ドナー抗体に由来する少なくとも１つのCDRがヒト抗体にグラ
フト化される。他の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変領域のそれぞれの、少な
くとも2つ、好ましくは３つ全てのCDRがヒト抗体にグラフト化される。CDRは、カバット(
Kabat)CDR、ループCDR、またはそれらの組合せを含むことができる。いくつかの実施形態
で、本発明は、少なくとも1つのCDRグラフト化重鎖と少なくとも１つのCDRグラフト化軽
鎖を含むヒト化FcγRIIB抗体を包含する。
【００９３】
本発明の方法で用いられるダイアボディには、修飾された誘導体、すなわち、ダイアボデ
ィへのあらゆるタイプの分子の共有結合により修飾された誘導体が含まれる。例えば、限
定するつもりはないが、前記ダイアボディ誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化
、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解
切断、細胞性リガンドもしくは他のタンパク質との結合等によって改変されたダイアボデ
ィを含む。多数の化学修飾のいずれをも既知の技術によって実行することができる。当該
技術は、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含む
が、これらに限定はされない。さらに、誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含むことが
できる。
【００９４】
キメラ抗体は、例えば非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域を
有する抗体のように、キメラ抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分
子のことである。キメラ抗体を作る方法は、当該分野では公知である。例えば、Morrison
, 1985, Science 229:1202；Oiら, 1986, BioTechniques 4:214； Gilliesら, 1989, J. 
Immunol. Methods 125:191-202；並びに米国特許第6,311,415号、第5,807,715号、第4,81
6,567号および第4,816,397号を参照されたい。これらは参照としてその全てが本明細書に
組み込まれる。 
しばしば、フレームワーク領域内のフレームワーク残基を、CDRドナー抗体由来の対応す
る残基と置換して、抗原結合性を変える、好ましくは改善することができる。これらのフ
レームワーク置換は、当該分野において周知の方法によって同定することができる。例え
ば、CDRとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合性に重要なフレーム
ワーク残基を同定する方法や、配列を比較して特定位置におけるフレームワークの普通で
ない残基を同定する方法が挙げられる（例えば、米国特許第5,585,089号；およびRiechma
nnら、1988, Nature 332:323を参照されたい。これらは、参照としてその全てを本明細書
に組み入れる）。
【００９５】
本発明のダイアボディの結合ドメインの由来となるモノクローナル抗体は、当該分野で知
られる様々な技術を用いて調製することができる。前記技術には、ハイブリドーマ、組換
え体およびファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組合せが含まれる。例えば
、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。前記ハイ
ブリドーマ技術には、当該分野では公知の技術の他、例えば、Harlowらの Antibodies: A
Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerl
ingらの in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, 
N.Y., 1981) (いずれも参照として本明細書にその全てを組み入れる)で教示される技術が
含まれる。本明細書で使用する場合「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介
して作製された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、あらゆる真
核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含む単一クローンに由来す
る抗体を意味するのであって、それを生産する方法を意味するものではない。
【００９６】
ハイブリドーマ技術を用いた特定の抗体を作製するためのおよびスクリーニングするため
の方法はルーチンなことであり、当該分野においては周知である。非限定的例では、マウ
スを対象の抗原またはそのような抗原を発現する細胞で免疫化することができる。例えば
、抗原特異的抗体がマウス血清から検出されるように、ひとたび免疫応答が検出されると
マウス脾臓が摘出され、脾細胞が単離される。その後、その脾細胞を周知技術によって任
意の適当なミエローマ細胞と融合させる。ハイブリドーマを限界希釈法により選択し、ク
ローン化する。そのハイブリドーマクローンを、その後当該分野で既知の方法によって前
記抗原に結合できる抗体を分泌する細胞に関してアッセイする。通常、高レベルの抗体を
含むとされる腹水を、マウスの腹腔内に陽性ハイブリドーマクローンを接種することによ
って得ることができる。対象の抗原は、セクション5.8.1に記載した癌に関連する抗原、
セクション5.8.2に記載した自己免疫疾患および炎症性疾患に関連する抗原、セクション5
.8.3に記載した感染症に関連する抗原、並びにセクション5.8.4に記載した毒素を含む。
ただし、これらに限定はされない。
【００９７】
抗体はまた、当該分野で知られる様々なファージディスプレイ法を用いて作製することが
できる。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、それをコードしたポリヌ
クレオチド配列を担持するファージ粒子表面上に提示される。具体的な実施形態では、前
記ファージを利用して、レパートリーもしくはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例え
ばヒトまたはマウス）から発現された抗原結合ドメイン（例えばFabやFv、またはジスル
フィド結合安定化Fv）を提示することができる。対象の抗原に結合する抗原結合ドメイン
を発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識した抗原、または固体表面もしくは
ビーズに結合または捕捉させた抗原を用いて）選択し、または同定することができる。こ
れらの方法で用いられるファージは、一般にはfdやM13を含む繊維状ファージである。抗
原結合ドメインは、ファージ遺伝子IIIまたはVIIIタンパク質のどちらかに組換えで融合
させたタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメントの
作製に用いることのできるファージディスプレイ法の例は、以下の文献中に開示されてい
る方法を含む。すなわち、BrinkmanらによるJ. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995；Am
esらによるJ. Immunol. Methods, 184:177-186, 1995；Kettleboroughらによる Eur. J. 
Immunol., 24:952-958, 1994；PersicらによるGene, 187:9-18, 1997；BurtonらによるAd
vances in Immunology, 57:191-280, 1994；国際出願PCT/GB91/01134号；国際公開WO 90/
02809号；国際公開WO 91/10737号；国際公開WO 92/01047号；国際公開WO 92/18619号；国
際公開WO 93/11236号；国際公開WO 95/15982号；国際公開WO 95/20401号；並びに米国特
許第5,698,426号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5
,750,753号；第5,821,047号；第5,571,698号；第5,427,908号；第5,516,637号；第5,780,
225号；第5,658,727号；第5,733,743号および第5,969,108号である。これらの文献は、い
ずれも参照としてその全てを本明細書中に援用する。
【００９８】
ファージディスプレイ技術を使用して、抗原に対する抗体の親和性を増大させることがで
きる。この技術は、高親和性抗体を得るのに有用である。親和性成熟と呼ばれるこの技術
は、突然変異誘発、または同種抗原を用いたCDRウォーキングおよび再選択を使用して、
初期抗体もしくは親抗体と比較した場合に抗原に対して、より高い親和力で結合する抗体
を同定する（例えば、Glaserらの1992, J. Immunology 149:3903を参照されたい）。単一
ヌクレオチドに対してというよりもコドン全体に対しての突然変異誘発は、結果的にアミ
ノ酸変異の半ランダム化レパートリーをもたらす。変異型クローンのプールからなるライ
ブラリーを構築することができ、前記変異型クローンは、それぞれが１つのCDR中の単一
アミノ酸の改変によって異なっており、かつ各CDR残基に関して可能なアミノ酸置換をそ
れぞれ提示する変異体を含んでいる。抗原に対する結合親和性が増加した変異体は、固定
した変異体と標識した抗原との接触によってスクリーニングすることができる。当該分野
で知られるどんなスクリーニング方法であっても、抗原に対する結合活性が増加した変異
型抗体を同定するのに使用することができる（例えば、ELISA法）（Wuらの1998, Proc Na
tl. Acad Sci. USA 95:6037； Yeltonらの1995, J. Immunology 155:1994を参照されたい
）。軽鎖をランダム変異させるCDRウォーキングも使用できる（Schierらの1996, J. Mol.
Bio. 263:551を参照されたい）。
【００９９】
本発明はまた、フレームワークもしくはCDR領域に変異（例えば、１以上のアミノ酸置換
）を持った、本明細書に記載したもしくは当該分野で知られるいずれかの結合ドメインの
アミノ酸配列からなる結合ドメインの使用を包含する。これらの結合ドメインにおける変
異は、結合ドメインのFcγRIIB（これに結合ドメインが免疫特異的に結合する）に対する
結合力および／または親和力を維持または増強することが好ましい。当業者に知られる標
準的な技術（例えばイムノアッセイ）を使用して、特定の抗原に対する抗体の親和性をア
ッセイすることができる。
【０１００】
当業者に既知の標準的な技術を使用して、抗体もしくはそのフラグメントをコードするヌ
クレオチド配列中に変異を導入することができる。そのような技術には、例えば結果的に
アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびPCRを介した突然変異誘発等が挙
げられる。誘導体は、元となった抗体もしくはそのフラグメントと比較して、15アミノ酸
未満の置換、10アミノ酸未満の置換、5アミノ酸未満の置換、4アミノ酸未満の置換、3ア
ミノ酸未満の置換、または2アミノ酸未満の置換を含むことが好ましい。好ましい実施形
態において、誘導体は、１以上の予測される非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換
を有する。
【０１０１】
5.1.1. FcγRIIBと免疫特異的に結合するエピトープ結合部位を含むダイアボディ
具体的な実施形態において、本発明のダイアボディの少なくとも１つの結合ドメインは、
FcγRIIBの少なくとも１つの活性にアゴナイズする。本発明の一の実施形態で、前記活性
は、B細胞受容体を介したシグナル伝達を阻害することである。他の実施形態において、
結合ドメインはB細胞の活性化、B細胞の増殖、抗体産生、B細胞の細胞内カルシウム流入
、細胞周期の進行、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における１以上の下流のシグナル伝
達分子の活性を阻害する。さらなる他の実施形態で、結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸
化またはSHIPの動員を増強する。本発明のさらなる実施形態で、結合ドメインはB細胞受
容体を介したシグナル伝達経路でのMAPキナーゼ活性またはAkt動員を阻害する。他の実施
形態において、結合ドメインは、FcεRIシグナル伝達のFcγRIIBを介した阻害にアゴナイ
ズする。具体的な実施形態では、前記結合ドメインは、FcεRI誘導されたマスト細胞活性
化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を阻害する。他
の実施形態で、本発明の結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化を刺激し、SHIPの動員を刺
激し、SHIPのリン酸化およびSHIPとShcとの結合を刺激し、またはMAPキナーゼファミリー
メンバー（例えばErk1、Erk2、JNK、p38等）の活性化を阻害する。さらなる他の実施形態
で、本発明の結合ドメインは、p62dokのチロシンリン酸化、並びにそれとSHIPおよびrasG
APとの結合を増強する。他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、単球またはマクロフ
ァージでのFcγRを介した食作用を阻害する。
【０１０２】
他の実施形態では、結合ドメインは、FcγRIIBの少なくとも１つの活性にアンタゴナイズ
する。一の実施形態で、前記活性とは、B細胞受容体を介したシグナル伝達の活性化であ
る。具体的な実施形態で、結合ドメインは、B細胞活性、B細胞の増殖、抗体産生、B細胞
の細胞内カルシウム流入、またはFcγRIIBシグナル伝達経路における１以上の下流のシグ
ナル伝達分子の活性を増強する。さらなる他の実施形態で、結合ドメインは、FcγRIIBの
リン酸化またはSHIPの動員を減少させる。本発明のさらなる実施形態で、結合ドメインは
、B細胞受容体を介したシグナル伝達経路でのMAPキナーゼ活性またはAkt動員を増強する
。他の実施形態において、結合ドメインは、FcεRIシグナル伝達のFcγRIIBを介した阻害
にアンタゴナイズする。具体的な実施形態では、前記結合ドメインは、FcεRI誘導された
マスト細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出
を増強する。他の実施形態で、結合ドメインは、FcγRIIBのリン酸化を阻害し、SHIPの動
員を阻害し、SHIPのリン酸化およびそれとShcとの結合を阻害し、またはMAPキナーゼファ
ミリーメンバー（例えばErk1、Erk2、JNK、p38等）の活性化を増強する。さらなる他の実
施形態で、本発明の結合ドメインは、p62dokのチロシンリン酸化、並びにそれとSHIPおよ
びrasGAPとの結合を阻害する。他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、単球またはマ
クロファージでのFcγRを介した食作用を増強する。他の実施形態において、結合ドメイ
ンは、脾臓マクロファージによるオプソニン化粒子の食作用、クリアランスを妨げる。
【０１０３】
その他の実施形態において、少なくとも１つの結合ドメインを使用して、FcγRIIBを発現
する細胞を本発明のダイアボディの標的とすることができる。
【０１０４】
一の具体的な実施形態で、結合ドメインの１つは、クローン2B6または3H7より産生される
マウスモノクローナル抗体に由来する。前記クローンは、それぞれATCC受託番号PTA-4591
およびPTA-4592を有する。2B6および3H7抗体を産生するハイブリドーマは、American Typ
e Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209)に2002年8
月13日に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づ
いて寄託され、それぞれ受託番号PTA-4591（2B6を産生するハイブリドーマ用）およびPTA
-4592（3H7を産生するハイブリドーマ用）が付与された。これらは、参照により本明細書
中に組み込まれる。結合ドメインはヒト由来であるか、またはヒト化されたものであるこ
とが実施形態として好ましい。3H7または2B6クローンから産生される抗体のヒト化バージ
ョンに由来する結合ドメインが好ましい。
【０１０５】
本発明はまた、他の抗体由来の結合ドメインを有するダイアボディを包含する。他の抗体
とは、特にFcγRIIB、好ましくはヒトFcγRIIB、より好ましくは天然のヒトFcγRIIBに結
合し、かつ1D5、2E1、2H9、2D11および1F2（それぞれATCC受託番号PTA-5958、PTA-5961、
PTA-5962、PTA-5960およびPTA-5959を有する）を含むがそれらに限定されないクローンに
由来する。上記のクローンを産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定の下に、
American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-22
09)に2004年5月7日に寄託されている。それらのハイブリドーマは、参照によって本明細
書中に組み込まれる。上記抗体由来の結合ドメインは、ヒト化されたものが実施形態とし
ては好ましい。
【０１０６】
具体的な実施形態で、本発明のダイアボディに使用される結合ドメインは、抗体またはそ
の抗原結合フラグメント（例えば、2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クローンに
より産生される抗体の１以上の相補性決定領域（CDR）、好ましくは６つのCDR全てを含む
）由来である。他の実施形態で、結合ドメインは、2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11また
は1F2クローンのそれぞれで産生されるマウスモノクローナル抗体と同一のエピトープに
結合し、および／または、例えばELISAアッセイもしくは他の適当な競合イムノアッセイ
で測定したとき、2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クローンにより産生されたマ
ウスモノクローナル抗体と競合し、かつまた、その結合ドメインがFcγRIIAと結合するよ
りも強い親和性でFcγRIIBと結合する。
【０１０７】
本発明はまた、2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クローンで産生されるマウスモ
ノクローナル抗体の重鎖可変部および／または軽鎖可変部のアミノ酸配列と少なくとも45
％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70
％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95
％、または少なくとも99％同一である重鎖可変部および／または軽鎖可変部のアミノ酸配
列を含む結合ドメインを有するダイアボディを包含する。本発明はさらに、FcγRIIAに結
合するよりも高い親和性でFcγRIIBに特異的に結合し、また2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2
D11または1F2クローンで産生されるマウスモノクローナル抗体の１以上のCDRのアミノ酸
配列と少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも
65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも
90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である１以上のCDRのアミノ酸配列を
含む、結合ドメインを持ったダイアボディを包含する。2つのアミノ酸配列の同一性パー
セントの決定は、BLASTタンパク質検索を含む当業者に公知のいずれの方法によっても決
定することができる。
【０１０８】
本発明はまた、結合ドメインがFcγRIIAと結合するよりも強い親和性でFcγRIIBと特異的
に結合する結合ドメインを含むダイアボディの使用を包含する。この結合ドメインは、2B
6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クローンで産生されるマウスモノクローナル抗体
のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
によってコードされている。好ましい実施形態で、結合ドメインは、FcγRIIAよりも強い
親和性でFcγRIIBと特異的に結合し、かつ2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クロ
ーンで産生されるマウスモノクローナル抗体の軽鎖可変部および／または重鎖可変部のヌ
クレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によ
ってコードされる軽鎖可変部および／または重鎖可変部を含む。他の好ましい実施形態で
、結合ドメインは、FcγRIIAよりも強い親和性でFcγRIIBと特異的に結合し、かつ2B6、3
H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クローンで産生されるマウスモノクローナル抗体の１
以上のCDRのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレ
オチド配列によってコードされる１以上のCDRを含む。ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件は、限定はしないが、フィルターに結合したDNAを約45℃の温度下で6×塩
化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）溶液中にて処理した後、約50〜65℃下で0.2×
SSC／0.1% SDS溶液にて1回以上洗浄するハイブリダイゼーションを含む。より高度のスト
リンジェントな条件は、例えばフィルターに結合したDNAを約45℃の温度下で6×SSC溶液
中で処理した後、約60℃下で0.1×SSC／0.2% SDS溶液にて1回以上洗浄するハイブリダイ
ゼーションを含む。あるいは、当業者に公知の他のストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件（例えば、Ausubel, F.M.ら編、1989 Current Protocols in Molecular Biolo
gy, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley and Sons, Inc., NY
6.3.1〜6.3.6ページおよび2.10.3ページを参照されたい；参照として本明細書に組み入
れる)を含む。
【０１０９】
本発明はまた、フレームワークまたはCDR領域に変異（例えば、１以上のアミノ酸置換）
を有する上記いずれかの結合ドメインのアミノ酸配列を含む結合ドメインの使用を包含す
る。これらの結合ドメインにおける変異は、結合ドメインが免疫特異的に結合するFcγRI
IBに対する結合ドメインの結合力および／または親和性を維持または強化するものが好ま
しい。当業者に公知の標準的な技術（例えば、イムノアッセイ）を用いて、特定の抗原に
対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
【０１１０】
当業者に公知の標準的な技術を用いて抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列中に変異を導入することができる。そのような技術には、例えば、アミノ酸置換
をもたらす部位特異的突然変異誘発およびPCRを介した突然変異誘発が含まれる。誘導体
は、元となった抗体もしくはそのフラグメントに対して15アミノ酸未満の置換、10アミノ
酸未満の置換、5アミノ酸未満の置換、4アミノ酸未満の置換、3アミノ酸未満の置換、ま
たは2アミノ酸未満の置換を含むことが好ましい。誘導体が１以上の予測される非必須ア
ミノ酸残基に保存的アミノ酸置換を有することが実施形態として好ましい。
【０１１１】
好ましい実施形態では、結合ドメインはヒト化抗体に由来する。ヒト化FcγRIIB特異的抗
体は、少なくとも１つ、通常は2つの可変ドメインの実質的に全てを含んでいてもよい。
この可変ドメインでは、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（例
えば、ドナー抗体）のCDR領域と一致し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全て
がヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域のコンセンサス配列となっている。
【０１１２】
本発明のダイアボディは、FcγRIIBに特異的なヒト化可変ドメインを含む。この可変ドメ
インでは、ヒト抗体（レシピエント抗体）の重鎖および／または軽鎖可変領域の１以上の
CDRの１以上の領域が、FcγRIIAよりも強い親和性でFcγRIIBと特異的に結合するドナー
のモノクローナル抗体の1以上のCDRの類似部分で置換されている。そのようなモノクロー
ナル抗体として、例えば、2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クローンで産生され
るモノクローナル抗体が挙げられる。他の実施形態では、ヒト化抗体は、それぞれ2B6、3
H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2と同一のエピトープに結合する。
【０１１３】
好ましい実施形態で、ヒト化FcγRIIB結合ドメインのCDR領域は、FcγRIIBに特異的なマ
ウス抗体に由来する。いくつかの実施形態で、本明細書に記載したヒト化抗体は、限定は
しないが、アクセプター抗体のアミノ酸欠失、挿入、修飾を包含する改変を含む。ここで
言うアクセプター抗体とは、すなわち、ヒト抗体であり、さらにドナーモノクローナル抗
体の結合特異性を保持する上で必要な重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのフレーム
ワーク領域を意味する。いくつかの実施形態で、本明細書に記載したヒト化抗体のフレー
ムワーク領域は、必ずしも天然のヒト抗体可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列
と正確に同じである必要はなく、ヒト化抗体の性質を変えるアミノ酸欠失、挿入、修飾を
含む（ただし、これらに限定はされない）様々な改変を包含する。ここで、ヒト化抗体の
性質を変えるとは、例えば、マウスのFcγRIIB特異的抗体と同一の標的に対して特異的で
あるヒト化抗体領域の結合特性を改善すること等が該当する。最も好ましい実施形態では
、非ヒトフレームワーク残基を広範に導入することを避け、かつヒトにおいてヒト化抗体
の最小限の免疫原性を確保するために、フレームワーク領域に対して最少数の改変を行う
。ドナーのモノクローナル抗体は、2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クローンに
より産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【０１１４】
具体的な実施形態で、結合ドメインは、FcγRIIAと結合するよりも強い親和力でFcγRIIB
と特異的に結合するCDRグラフト化抗体の可変ドメインを包含する。ここで、CDRグラフト
化抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、ドナーモノクローナル抗体由来の
残基からなる重鎖可変領域ドメインを含む。ドナーモノクローナル抗体は、例えば、2B6
、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クローンより産生されるモノクローナル抗体のよ
うに、FcγRIIAと結合するよりも強い親和力でFcγRIIBと特異的に結合する抗体である。
他の具体的な実施形態で、本発明のダイアボディは、CDRグラフト化抗体がFcγRIIAと結
合するよりも強い親和力でFcγRIIBと特異的に結合する該CDRグラフト化抗体由来の可変
ドメインを含む。ここで、CDRグラフト化抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残
基と、ドナーモノクローナル抗体由来の残基からなる軽鎖可変領域ドメインを含む。ドナ
ーモノクローナル抗体は、例えば、2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2クローンよ
り産生されるモノクローナル抗体のように、FcγRIIAと結合するよりも強い親和力でFcγ
RIIBと特異的に結合する抗体である。
【０１１５】
本発明で用いられるヒト化抗FcγRIIBの可変ドメインは、CDR1(配列番号24もしくは配列
番号25)および／またはCDR2(配列番号26もしくは配列番号27)および／またはCDR3(配列番
号28もしくは配列番号29)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに／或いはCDR1 (配
列番号32もしくは配列番号33)および／またはCDR2 (配列番号34、配列番号35、配列番号3
6もしくは配列番号37)および／またはCDR3(配列番号38もしくは配列番号39)のアミノ酸配
列を含む軽鎖可変領域を有していてもよい。
【０１１６】
具体的な実施形態で、ダイアボディはヒト化2B6抗体に由来する可変ドメインを含む。こ
のダイアボディでは、VH領域がヒト生殖系列のVHセグメントであるVH1-18（Matsudaら、1
998, J. Exp. Med. 188:2151062）およびJH6（Ravetchら1981, Cell 27(3 Pt. 2): 583-9
1）に由来するFRセグメントと、配列番号24、配列番号26または配列番号28のアミノ酸配
列を有する2B6 VHの１以上のCDR領域とから成る。一の実施形態で、2B6 VHは配列番号40
のアミノ酸配列を有する。他の実施形態で、2B6 VHドメインは、配列番号87のHu2B6VHの
アミノ酸配列を有し、配列番号88のヌクレオチド配列によりコードされ得る。他の具体的
な実施形態で、ダイアボディはVL領域をさらに含み、このVL領域はヒト生殖系列VLセグメ
ントであるVK-A26（Lautner-Rieskeら、1992, Eur. J. Immunol. 22:1023-1029）およびJ
K4（Hieterら、1982, J. Biol. Chem. 257:1516-22）のFRセグメントと、配列番号32、配
列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号38のアミノ酸配列を有する、2B6 VLの
１以上のCDR領域とから成る。一の実施形態で、2B6 VLは、配列番号41、配列番号42、ま
たは配列番号43のアミノ酸配列を有する。具体的な実施形態において、2B6 VLは、配列番
号89のHu2B6VLのアミノ酸配列を有し、配列番号90のヌクレオチド配列によりコードされ
得る。
【０１１７】
他の具体的な実施形態で、ダイアボディは、ヒト化3H7抗体に由来する可変ドメインを有
する。このダイアボディでは、VH領域がヒト生殖系列VHセグメントに由来するFRセグメン
トと、配列番号37のアミノ酸配列を有する3H7 VHのCDR領域とから成る。他の具体的な実
施形態において、ヒト化3H7抗体はさらにVL領域を含み、このVL領域はヒト生殖系列VLセ
グメントのFRセグメントと、配列番号44のアミノ酸配列を有する3H7VLのCDR領域とから成
る。
【０１１８】
具体的には、結合ドメインは、天然のヒトFcγRIIBの細胞外ドメインと免疫特異的に結合
し、また以下の組合せのいずれかにおいて2B6、3H7、1D5、2E1、2H9、2D11または1F2のCD
R配列を含む（あるいは、から成る）。前記組合せとは、VH CDR1およびVL CDR1；VH CDR1
およびVL CDR2；VH CDR1およびVL CDR3；VH CDR2およびVL CDR1；VH CDR2およびVL CDR2
；VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR3 and a VH CDR1；VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR3およ
びVL CDR3；VH1 CDR1、VH CDR2およびVL CDR1；VH CDR1およびVH CDR2およびVL CDR2；VH
CDR1、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1、VH CDR2、VH CDR3およ
びVL CDR2；VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3；VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1
、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR2、VL CDR1およびVL 
CDR3；VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH 
CDR2、VH CDR3およびVL CDR1；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2；VH CDR1、VH 
CDR2、VH CDR3およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH 
CDR2、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH 
CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR2、VH 
CDR3、VL CDR1およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3；VH CDR1、VH 
CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2；VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL 
CDR3；VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3；VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL
CDR2、 およびVL CDR3；VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3；または
本明細書で開示したVH CDRおよびVL CDRのいずれかの組合せをいう。
【０１１９】
本発明のダイアボディに含まれる結合ドメインの由来となる抗体は、FcγRIIAと比べてFc
γRIIBに最も強い特異性をもった抗体を選択できるように、エピトープマッピングによっ
てさらに特徴付けることができる。抗体のエピトープマッピング法は当該分野では周知で
あり、本発明の方法に包含される。いくつかの実施形態では、FcγRIIBの１以上の領域を
含む融合タンパク質を、本発明の抗体のエピトープをマッピングするのに使用することが
できる。具体的な実施形態で、融合タンパク質は、ヒトIgG2のFc部分と融合したFcγRIIB
の領域のアミノ酸配列を含んでいる。各融合タンパク質は、下記の表２に示すようなアミ
ノ酸置換および／または相同受容体（例えばFcγRIIA）の対応領域による該受容体の特定
領域の交換をさらに含むことができる。pMGX125およびpMGX132は、FcγRIIB受容体のIgG
結合部位を含み（前者はFcγRIIBのC末端を有し、そして後者はFcγRIIAのC末端を有する
）、C末端結合性を区別するために使用することができる。その他は、IgG結合部位におけ
るFcγRIIA置換、およびFcγRIIAまたはFcγRIIBのいずれかのN末端を有する。これらの
分子は、抗体が結合する受容体分子の部分を決定するのに役に立つ。
【表２】
0006285481.tif 000003
【０１２０】
融合タンパク質は、本発明の抗FcγRIIB抗体への結合を測定するためのいずれかの生化学
的アッセイ法、例えばELISA法で使用することができる。他の実施形態においては、特定
の残基をFcγRIIA配列由来の残基と置き換えたペプチドを用いて、エピトープ特異性のさ
らなる確認を行うことができる。
【０１２１】
抗体は、本発明の抗体の機能、特にFcγRIIBシグナル伝達を調節する活性、を同定するた
めのアッセイ法を用いて性状解析することができる。例えば、本発明の性状解析は、Fcγ
RIIBのITIMモチーフ中のチロシン残基のリン酸化を測定したり、あるいは、B細胞受容体
によって生じるカルシウム動員の阻害を測定することもできる。本発明の性状解析は、細
胞ベースのアッセイ法または無細胞系アッセイ法とすることができる。
【０１２２】
マスト細胞においては、高親和性IgE受容体であるFcεRIとFcγRIIBとの共凝集が、抗原
誘導性脱顆粒、カルシウム動員、およびサイトカイン産生の阻害をもたらすことは当該分
野では十分に立証されている（Metcalfe D.D.ら 1997, Physiol. Rev. 77:1033；Long E.
O. 1999 Annu Rev. Immunol 17: 875）。このシグナル伝達経路の分子的詳細については
、最近明らかとなった（Ott V.L., 2002, J. Immunol. 162(9):4430-9)。ひとたびFcεRI
と共凝集すると、FcγRIIBは、そのITIMモチーフ中のチロシン上で直ちにリン酸化され、
その後Srcホモロジー2含有イノシトール-5-ホスファターゼ（Src Homology-2 containing
inositol-5-phosphatase：SHIP)を動員する。この酵素は、SH2ドメイン含有イノシトー
ルポリホスフェート5-ホスファターゼであって、順次リン酸化されて、Shcおよびp62dok
と会合する。p62dokは、アダプター分子ファミリーのプロトタイプであり、ここでいうア
ダプター分子ファミリーは、例えば、アミノ末端のプレクストリン相同ドメイン（PHドメ
イン）のようなシグナル伝達ドメイン、PTBドメイン、およびPXXPモチーフと多数のリン
酸化部位を含むカルボキシ末端領域を含む（Carpinoら、1997 Cell, 88: 197； Yamanshi
ら、1997, Cell, 88:205））。
【０１２３】
本発明で使用する抗FcγRIIB抗体は、同様に、１以上のIgE介在応答を調節する能力につ
いて性状解析することができる。IgEに対して高親和性の受容体およびFcγRIIBに対して
低親和性の受容体を共発現する細胞株を、IgE介在応答の調節における抗FcγRIIB抗体の
性状解析に用いることが好ましい。具体的な実施形態において、全長のヒトFcγRIIBでト
ランスフェクトしたラット好塩基球性白血病細胞株（RBL-H23； Barsumian E.L.ら1981 E
ur. J. Immunol.11:317；参照として本明細書にその全てを組み入れる）由来の細胞を用
いることができる。RBL-2H3は、十分に特徴付けられたラット細胞株であり、IgEを介した
細胞活性化後のシグナル伝達機構を研究するのに広く使用されている。RBL-2H3細胞で発
現され、そしてFcεRIと共凝集すると、FcγRIIBは、FcεRI誘導カルシウム動員、脱顆粒
およびサイトカイン産生を阻害する（Malbecら、1998, J. Immunol. 160:1647；Daeronら
、1995 J. Clin. Invest. 95:577；Ottら、2002 J. of Immunol. 168:4430-4439）。
【０１２４】
本発明で使用する抗体は、FcεRI誘導型マスト細胞活性化の阻害について性状解析するこ
ともできる。例えば、FcγRIIBでトランスフェクトされたラット好塩基球性白血病細胞株
（RBL-H23； Barsumian E.L.ら1981 Eur. J. Immunol.11:317）由来の細胞を、IgEで感作
し、そしてFcεRIだけを凝集するウサギ抗マウスIgGのF(ab’)2フラグメントで刺激する
か、またはFcγRIIBとFcεRIを共凝集する完全なウサギ抗マウスIgGで刺激する。この系
では、下流シグナル伝達分子の間接的な調節を、感作および刺激した細胞に本発明の抗体
を添加したときにアッセイできる。例えば、FcγRIIBのチロシンリン酸化およびSHIPの動
員とリン酸化、Erk1、Erk2、JNKまたはp38を含むがそれらに限定されないMAPキナーゼフ
ァミリーメンバーの活性化、並びにp62dokのチロシンリン酸化およびそれとSHIPおよびRa
sGAPとの会合をアッセイする。
【０１２５】
本発明の抗体によりFcεRI誘導型マスト細胞活性化の阻害を測定する１つの典型的なアッ
セイは、以下を含み得る。すなわち、ヒトFcγRIIBでRBL-H23細胞をトランスフェクトす
ること、IgEでRBL−H23細胞を感作すること、そしてウサギ抗マウスIgGのF(ab’)2（Fcε
RIのみを凝集し、FcεRI介在シグナル伝達を引き起こす；対照として用いる）でRBL−H23
細胞を刺激するか、または完全なウサギ抗マウスIgG（FcγRIIBとFcεRIを共凝集し、結
果的にFcεRI介在シグナル伝達を阻害する）でRBL−H23細胞を刺激することを含み得る。
完全なウサギ抗マウスIgG抗体で刺激した細胞を、さらに、本発明の抗体とプレインキュ
ベートすることができる。本発明の抗体とプレインキュベートした細胞、および本発明の
抗体とプレインキュベートしていない細胞のFcεRI依存性活性を測定し、これらの細胞に
おけるFcεRI依存性活性のレベルを比較することで、本発明の抗体によるFcεRI依存性活
性の調節を示すことができる。
【０１２６】
上記の典型的なアッセイを使用して、例えば、FcγRIIB受容体へのリガンド（IgG）結合
をブロックし、かつおよびFcεRIとFcγRIIBの共凝集を妨げることによってFcεRIシグナ
ル伝達のFcγRIIB介在阻害にアンタゴナイズする抗体を同定することができる。同様にこ
のアッセイは、FcγRIIBとFcεRIの共凝集を増強し、かつFcγRIIBとFcεRIの共凝集を促
進することでFcεRIシグナル伝達のFcγRIIB介在阻害にアゴナイズする抗体を同定する。
【０１２７】
いくつかの実施形態で、本明細書で同定され記載されたまたは当該分野で知られた、本発
明の抗FcγRIIB抗体のエピトープ結合ドメインを含む抗FcγRIIBダイアボディは、好まし
くは細胞ベースのアッセイ法において、マスト細胞もしくは好塩基球の脱顆粒をモニター
しおよび／または測定することにより、IgE介在応答を調節するその能力について性状解
析される。このようなアッセイで用いるマスト細胞または好塩基球は、当業者に公知の標
準的な組換え法を用いて、ヒトFcγRIIBを含むように遺伝子操作されていることが好まし
い。具体的な実施形態で、本発明の抗FcγRIIB抗体は、細胞ベースのβヘキソサミニダー
ゼ（顆粒中に含まれる酵素）放出アッセイでIgE介在応答を調節するその能力について性
状解析される。マスト細胞および好塩基球からのβヘキソサミニダーゼ放出は、急性アレ
ルギー状態および急性炎症状態の最初の事象である（Aketaniら、2001 Immunol. Lett. 7
5: 185-9；Aketaniら、2000 Anal. Chem. 72: 2653-8）。セロトニンやヒスタミンを含む
がこれらに限定されない他の炎症性メディエータの放出を本発明の方法に従ってアッセイ
し、IgE介在応答を測定してもよい。特定の作用機序に縛られるつもりはないが、マスト
細胞および好塩基球からのβヘキソサミニダーゼ含有顆粒のような顆粒の放出は、FcγRI
と多価抗原との架橋により開始される細胞内カルシウム濃度依存性のプロセスである。
【０１２８】
ヒトマスト細胞の研究の可能性は、適当な長期のヒトマスト細胞培養物がないことで制限
されている。最近になって、LAD1およびLAD2と呼ばれる２種の新規幹細胞因子依存性のヒ
トマスト細胞株が、マスト細胞肉腫／白血病患者由来の骨髄液から樹立された(Kirshenba
umら、2003, Leukemia research, 27:677-82；参照としてその全てを本明細書に組み入れ
る)。両細胞株は、FcεRIおよびいくつかのヒトマスト細胞マーカーを発現することが記
載されている。LAD 1細胞およびLAD2細胞は、IgE介在応答に本発明の抗体が及ぼす効果を
評価するのに使用することができる。具体的な実施形態で、上記のような細胞ベースのβ
ヘキソサミニダーゼ放出アッセイをLAD細胞で使用して、本発明の抗FcγRIIB抗体によるI
gE介在応答のあらゆる調節を測定することができる。典型的なアッセイでは、例えば、LA
D 1等のヒトマスト細胞を、ヒトキメラIgE抗ニトロフェノール(NP)で刺激し、多価抗原で
あるBSA-NPでチャレンジする。そして細胞の脱顆粒を、上清中に放出されるβヘキソサミ
ニダーゼを測定することによりモニターする (Kirshenbaumら、2003, Leukemia research
, 27:677-682；参照としてその全てを本明細書に組み入れる)。
【０１２９】
いくつかの実施形態で、当該分野で公知の標準的な方法、例えばFACS染色等を使用して測
定したとき、ヒトマスト細胞の内在性FcγRIIBの発現が低い場合、本発明の抗FcγRIIBダ
イアボディにより媒介される阻害経路の活性化の差異をモニターおよび／または検出する
ことは困難かもしれない。それ故、本発明は、サイトカインおよび特定の増殖条件を用い
てFcγRIIB発現を上方制御することのできる別の方法を包含する。FcγRIIBは、THP1やU9
37等のヒト単球系細胞株（Tridandapaniら、2002, J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089
）、およびヒト初代単球（Pricopら、2001, J. of Immunol., 166: 531-537）では、IL-4
により高度に上方制御されることが記載されている。ジブチリル環状AMPによるU937の分
化は、FcγRIIの発現を増加することが記載されている（Cameronら、2002 Immunology Le
tters 83, 171-179）。したがって、検出感度を増強するために、本発明の方法で使用す
るヒトマスト細胞での内在性FcγRIIBの発現は、例えばIL-4、IL-13のようなサイトカイ
ンを用いて上方制御することができる。
【０１３０】
抗FcγRIIBダイアボディは、B細胞受容体（BCR）を介したシグナル伝達の阻害についてア
ッセイすることもできる。BCRを介したシグナル伝達は、少なくとも１つ以上の下流の生
物学的応答、例えばB細胞の活性化および増殖、抗体産生等を含み得る。FcγRIIBとBCRと
の共凝集は、細胞周期の進行および細胞の生存の阻害をもたらす。さらに、FcγRIIBとBC
Rとの共凝集は、BCR介在シグナル伝達の阻害をもたらす。
【０１３１】
特に、BCRを介するシグナル伝達は、以下の少なくとも１つ以上を含む。すなわち、下流
シグナル伝達分子の調節、例えば、FcγRIIBのリン酸化状態、SHIPの動員、Btkおよび／
またはPLCγの局在、MAPキナーゼ活性、Akt（抗アポトーシスシグナル）の動員、カルシ
ウム動員、細胞周期の進行、および細胞増殖が挙げられる。
【０１３２】
BCRシグナル伝達のFcγRIIB介在阻害におけるエフェクター機能の多くはSHIPを介してい
るが、最近、SHIP欠損マウス由来のリポ多糖（LPS）活性化B細胞が、カルシウム動員、In
s(1,4,5)P3産生、並びにErkおよびAktのリン酸化の顕著なFcγRIIB介在阻害を示すことが
立証された（Brauweiler A.ら、2001, Journal of Immunology, 167(1): 204-211）。し
たがって、SHIP欠損マウス由来のex vivo B細胞を用いて、本発明の抗体を特徴付けるこ
とができる。本発明の抗体によるBCRシグナル伝達のFcγRIIB介在阻害を測定するための
典型的なアッセイは、以下のステップを含み得る。すなわち、SHIP欠損マウスから脾臓B
細胞を分離するステップ、前記細胞をリポ多糖で活性化するステップ、および前記細胞を
F(ab’)2抗IgMで刺激してBCRを凝集させるか、または抗IgMで刺激してBCRをFcγRIIBと共
凝集させるステップである。完全な抗IgMで刺激し、BCRをFcγRIIBと共凝集させた細胞を
、さらに本発明の抗体とプレインキュベートすることができる。細胞のFcγRIIB依存性活
性は、当該分野で知られる標準的な技術によって測定することができる。抗体とプレイン
キュベートした細胞およびプレインキュベートしていない細胞のFcγRIIB依存性活性のレ
ベルを比較することにより、その抗体によるFcγRIIB依存性活性の調節を表すことができ
る。
【０１３３】
FcγRIIB依存性活性の測定は、例えば、フローサイトメトリーで細胞内カルシウム動員を
測定すること、Aktおよび／もしくはErkのリン酸化を測定すること、PI(3,4,5)P3のBCR介
在蓄積を測定すること、またはB細胞のFcγRIIB介在増殖を測定することを含み得る。
【０１３４】
前記アッセイを用いて、例えば、本発明で使用する以下のようなダイアボディまたは抗Fc
γRIIB抗体を同定することができる。すなわち、FcγRIIB受容体のリガンド（IgG）結合
部位をブロックし、かつFcγRIIBとBCRの共凝集を妨げることによりBCRシグナル伝達のFc
γRIIB介在阻害にアンタゴナイズすることで、BCRシグナル伝達のFcγRIIB介在阻害を調
節するダイアボディまたは抗FcγRIIB抗体である。また、前記アッセイを用いて、FcγRI
IBとBCRの共凝集を増強しかつBCRシグナル伝達のFcγRIIB介在阻害にアゴナイズする抗体
を同定することもできる。
【０１３５】
抗FcγRIIB抗体は、ヒト単球／マクロファージにおいてFcγRIIを介したシグナル伝達に
ついてアッセイすることもできる。FcγRIIBと免疫受容体チロシン活性化モチーフ（immu
noreceptor tyrosine-based activation motif：ITAM）を有する受容体との共凝集は、SH
IPをエフェクターとして用いるFcγR介在食作用を下方制御するように作用する（Tridand
apaniら、2002, J. Biol. Chem. 277(7):5082-9）。FcγRIIAとFcγRIIBの共凝集は、Fc
γRIIBのITIMモチーフ上のチロシン残基の迅速なリン酸化をもたらし、これはSHIPのリン
酸化の増強、SHIPとShcとの結合、および120kDaおよび60〜65kDaの分子量を有するタンパ
ク質のリン酸化を引き起こす。さらに、FcγRIIAとFcγRIIBの共凝集は、Aktのリン酸化
の下方制御をもたらす。Aktは、セリン・トレオニンキナーゼであり、細胞制御に関与し
、またアポトーシスを抑制する働きをもつ。
【０１３６】
抗FcγRIIBダイアボディは、ヒト単球／マクロファージにおいてFcγRを介した食作用の
阻害についてアッセイすることができる。例えば、ヒト単球系細胞株THP-1由来の細胞を
、FcγRIIに対するマウスモノクローナル抗体IV.3のFabフラグメントおよびヤギ抗マウス
抗体（FcγRIIAのみを共凝集させる）で刺激するか、完全なIV.3マウスモノクローナル抗
体およびヤギ抗マウス抗体（FcγRIIAとFcγRIIBを共凝集させる）で刺激することができ
る。この系では、下流のシグナル伝達分子の調節、例えばFcγRIIBのチロシンリン酸化、
SHIPのリン酸化、SHIPとShcの結合、Aktのリン酸化、および120kDaおよび60〜65kDaの分
子量を有するタンパク質のリン酸化等を、刺激した細胞に本発明の分子を加えることでア
ッセイすることができる。さらに、単球系細胞株のFcγRIIB依存性食作用効率を、本発明
の抗体の存在下および非存在下で直接、測定することができる。
【０１３７】
本発明の抗体によるヒト単球／マクロファージにおけるFcγR介在食作用の阻害を測定す
るための他の典型的なアッセイは、以下を含み得る。すなわち、THP-1細胞を、IV.3マウ
ス抗FcγRII抗体のFabおよびヤギ抗マウス抗体で刺激する（FcγRIIAのみを凝集させ、Fc
γRIIA介在シグナル伝達を誘導する）か、マウス抗FcγRII抗体およびヤギ抗マウス抗体
で刺激する（FcγRIIAとFcγRIIBを共凝集させ、FcγRIIA介在シグナル伝達を阻害する）
ことを含む。マウス抗FcγRII抗体およびヤギ抗マウス抗体で刺激した細胞を、さらに本
発明の分子とプレインキュベートすることができる。本発明の分子とプレインキュベート
した刺激済み細胞および本発明の分子とプレインキュベートしなかった細胞のFcγRIIA依
存性活性を測定すること、並びにこれらの細胞におけるFcγRIIA依存性活性のレベルを比
較することで本発明の抗体によるFcγRIIA依存性活性の調節を示すことができる。
【０１３８】
記載された典型的なアッセイを使用して、例えば、以下のような結合ドメインを同定する
ことができる。すなわち、FcγRIIB受容体のリガンド結合をブロックし、かつFcγRIIBと
FcγRIIAの共凝集を妨げることによってFcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB介在阻害にアン
タゴナイズする結合ドメインである。同様に、このアッセイで、FcγRIIBとFcγRIIAの共
凝集を増強し、かつFcγRIIAシグナル伝達のFcγRIIB介在阻害にアゴナイズする結合ドメ
インを同定することができる。
【０１３９】
対象となるFcγRIIB結合ドメインは、以前に報告された方法（Tridandapaniら、2000, J.
Biol. Chem. 275: 20480-7）により、フルオレセイン化IgGオプソニン化ヒツジ赤血球（
SRBC）を貪食するTHP-1細胞の能力を測定することでアッセイできる。例えば、食作用を
測定するための典型的なアッセイは、THP-1細胞を本発明の抗体でまたはFcγRIIに結合し
ない対照抗体で処理するステップ、前記細胞の活性レベルを比較するステップから構成さ
れる。その際、細胞の活性（例えば、ロゼット形成活性（IgG被覆SRBCと結合するTHP-1細
胞の数）、付着活性（THP-1細胞に結合したSRBCの総数）、および食作用率）の差異が、
本発明の抗体によるFcγRIIA依存性活性の調節を示すことができる。このアッセイを用い
て、例えば、FcγRIIB受容体のリガンド結合をブロックし、かつ食作用のFcγRIIB介在阻
害にアンタゴナイズする抗体を同定することができる。このアッセイは、FcγRIIAシグナ
ル伝達のFcγRIIB介在阻害を増強する抗体を同定することもできる。
【０１４０】
好ましい実施形態で、結合ドメインは、ヒト単球／マクロファージにおけるFcγRIIB依存
性活性を、以下の少なくとも１以上の方法で調節する。すなわち、下流シグナル伝達分子
の調節（例えば、FcγRIIBのリン酸化状態の調節、SHIPリン酸化の調節、SHIPとShcの結
合の調節、Aktのリン酸化の調節、約120kDaおよび60〜65kDaの更なるタンパク質のリン酸
化の調節）および食作用の調節である。
【０１４１】
5.1.2 CD16A結合ドメイン
以下のセクションでは、CD16A結合タンパク質について論ずる。このタンパク質は、共有
結合型ダイアボディの作製のための軽鎖および重鎖の可変領域のソースとして使用するこ
とができる。本発明では、CD16A結合タンパク質は、抗CD16A抗体のVLおよびVHドメインか
らなる分子を含む。このVLおよびVHドメインを、本発明のダイアボディの作製に使用する
。
【０１４２】
様々なCD16A結合タンパク質を、本発明に関連して用いることができる。適当なCD16A結合
タンパク質は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、並びにCD16A結合抗体フラグメン
ト（例えば、scFvまたは1本鎖抗体、Fabフラグメント、ミニボディ）、および軽鎖可変領
域ドメイン、重鎖可変領域ドメイン、またはその両方との相互作用を介してCD16Aに結合
する他の抗体様タンパク質を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態で、本発明に従って使用するためのCD16A結合タンパク質は、非ヒト
抗CD16A抗体（例えばマウス抗CD16A抗体）に由来する配列をもつ１以上のCDRと、１以上
のヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列に由来する１以上のフレームワーク領域とを
有する、VLおよび／またはVHドメインを含む。CDRおよび他の配列を得ることのできる多
数の非ヒト抗CD16Aモノクローナル抗体が知られている（例えば、TammとSchmidt, 1996, 
J. Imm. 157:1576-81；Fleitら、1989,p.159；LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND
HEMATOPOIETIC CELLS, Reinherzら編、New York: Springer-Verlag,1986；LEUCOCYTE TY
PING III: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, McMichael A J,編、Oxford: Oxford 
University Press,1986；LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS,
Kapp ら編、Oxford Univ. Press, Oxford；LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENT
IATION ANTIGENS, Schlossman ら編、Oxford Univ. Press, Oxford；LEUKOCYTE TYPING V
I: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kishimoto編、Taylor & Francisを参照され
たい）。さらに、実施例で説明するように、細胞上に提示されるヒトCD16Aを認識する新
たなCD16A結合タンパク質は、モノクローナル抗体または関連する結合タンパク質の作製
および選択のための周知の方法（例えば、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ法
等）を用いて得ることができる。例えば、O'Connelらの2002, J. Mol. Biol. 321:49-56
；HoogenboomとChamesの2000, Imm. Today 21:371078；Krebsらの2001, J. Imm. Methods
254:67-84；および本明細書で引用した他の文献を参照されたい。ヒト以外の種由来のモ
ノクローナル抗体を、当該分野において知られている抗体のヒト化技術を用いてキメラ化
またはヒト化することができる。
【０１４４】
あるいはまた、CD16Aに対する完全なヒト抗体は、ヒト免疫系の成分を有するトランスジ
ェニック動物を用いて（例えば、米国特許第5,569,825号および第5,545,806号）、ヒト末
梢血細胞を用いて(Casaliら、1986, Science 234:476)、ヒトB細胞由来のDNAライブラリ
ーをHuseら、1989, Science 246:1275で概説された通常のプロトコルに従ってスクリーニ
ングすることにより、および他の方法により作製することができる。
【０１４５】
結合ドナーは、例えば、米国特許出願第2004/0010124号（参照としてその全てを本明細書
に組み入れる）に開示されているような、3G8抗体またはそのヒト化型由来であることが
実施形態として好ましい。いくつかの目的には、3G8が結合するエピトープと同一のエピ
トープで、または3G8による結合をブロックするために当該エピトープに少なくとも十分
に近接するエピトープで、CD16A受容体に結合するCD16A結合タンパク質を使用することが
有利であると考えられる。所望の結合特性をもつ結合タンパク質を同定するためのエピト
ープマッピング法および競合的結合実験は、実験免疫学の当業者には周知である。例えば
、上記で引用したHarlowとLaneの論文；Stahlらの1983, Methods in Enzymology 9:242-5
3；Kirklandらの1986, J. Immunol. 137:3614-19；Morelらの1988, Molec. Immunol. 25:
7-15；Cheungらの1990, Virology 176:546-52；およびMoldenhauerらの1990, Scand. J. 
Immunol. 32:77-82を参照されたい。例えば、２つの抗体が同一部位に結合するかどうか
は、一方の抗体を用いてELISAプレート上で抗原を捕捉し、その後捕捉された抗原に結合
する第２の抗体の能力を測定することによって、確認することが可能である。また、エピ
トープの比較は、第１の抗体を直接的にもしくは間接的に酵素、放射性核種または蛍光団
で標識し、細胞上の、溶液中のまたは固相上の抗原への第１の抗体の結合を阻害する未標
識の第２の抗体の能力を測定することによって達成することもできる。
【０１４６】
CD16A受容体とELISAプレート上に形成された免疫複合体との結合をブロックする抗体の能
力を測定することも可能である。前記免疫複合体は、まずフルオレセイン等の抗原でプレ
ートを被覆し、次に特異的な抗フルオレセイン抗体をプレートにアプライすることによっ
て形成される。この免疫複合体は、その後、sFcRIIIaのような可溶性Fc受容体のリガンド
として働く。あるいはまた、可溶性の免疫複合体を形成させて、酵素、放射性核種または
蛍光団で直接的にもしくは間接的に標識してもよい。その後、これらの標識された免疫複
合体と、細胞上の、溶液中のまたは固相上のFc受容体との結合を阻害する抗体の能力を測
定することができる。
【０１４７】
本発明のCD16A結合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンFc領域を含んでいてもよいし、含
まなくともよい。Fc領域は、例えば、scFv結合タンパク質中には存在しない。Fc領域は、
例えば、ヒトもしくはヒト化四量体モノクローナルIgG抗体には存在する。上記のように
、本発明のいくつかの実施形態では、CD16A結合タンパク質は、エフェクター機能が改変
されているFc領域を含む。改変されたエフェクター機能として、例えば、未改変Fc領域（
例えば天然のIgG1タンパク質のFc等）と比較した場合のFc受容体または補体のC1成分のよ
うなエフェクターリガンドに対する親和性の低下が挙げられる。一の実施形態で、Fc領域
は、297位に相当するFc領域のアミノ酸がグリコシル化されていない。このような抗体はF
cエフェクター機能を欠いている。
【０１４８】
したがって、CD16A結合タンパク質は、結合タンパク質中にFcドメインを欠くことから、F
c受容体または補体のC1成分のようなエフェクターリガンドへのFc介在結合を示さないこ
とがあるが、他のケースでは、結合やエフェクター機能の欠如は抗体の定常領域の変化に
起因している。
【０１４９】
5.1.2.1 mAb 3G8 CDR配列に類似するCDR配列を含むCD16A結合タンパク質
本発明の実施に際して使用することができるCD16A結合タンパク質は、マウスモノクロー
ナル抗体3G8のCDRに由来する（すなわち同一もしくは類似の配列を有している）CDR配列
を含むタンパク質を包含する。マウス3G8モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領
域をコードする相補的cDNA（CDRをコードする配列を含む）を、記載したようにクローン
化して配列決定した。3G8の核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。マウス可変領
域およびCDR配列を用いて、3G8のCDRに由来する相補性決定領域を含む数多くのキメラお
よびヒト化モノクローナル抗体を作製し、それらの特性を解析した。CD16Aに高親和性で
結合し、さらに他の所望の性質を有するヒト化抗体を同定するために、3G8由来のCDRを有
するVH領域を含む抗体重鎖を作製し、3G8由来のCDRを有するVL領域を含む抗体軽鎖と（共
発現により）結合させて、解析用の四量体抗体を作製した。得られた四量体抗体の性質を
以下に記載のように測定した。以下で説明するように、3G8のCDRを含むCD16A結合タンパ
ク質、例えば、本明細書に記載したヒト化抗体タンパク質を本発明に従って使用すること
ができる。
【０１５０】
5.1.2.1.1 VH領域
一態様において、本発明のCD16A結合タンパク質は、少なくとも１つのCDR（通常は３つの
CDR）がマウスモノクローナル抗体3G8重鎖の１つのCDR（一般的には３つ全てのCDR）の配
列を有し、該結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒトの配列を有する（ヒト抗体の重
鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する）、重鎖可変ドメインを含むことができる
。
【０１５１】
一態様において、本発明は、実質的にヒトのフレームワーク中に3G8抗体由来のCDRを含む
ヒト化3G8抗体または抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメインの少なくとも１つのC
DRが対応するマウス抗体3G8重鎖CDRと配列の点で異なる、上記抗体を提供する。例えば、
一の実施形態で、CDRは、当該分野で公知のまたは表３および表4A〜Hで開示したような、
CD16Aへの3G8の結合に影響することが当該分野で知られている１以上のCDR置換を少なく
とも有することで、3G8のCDR配列とは異なる。適当なCD16結合タンパク質は、これらの置
換を0、1つ、2つ、3つまたは4つ、あるいはそれ以上含み（多くの場合、１〜４つの置換
を有する）、任意で、追加の置換をも有することができる。
【表３】
0006285481.tif 000004
【表４Ａ】
0006285481.tif 000005
0006285481.tif 000006
【表４Ｂ】
0006285481.tif 000007
【表４Ｃ】
0006285481.tif 000008
【表４Ｄ】
0006285481.tif 000009
【表４Ｅ】
0006285481.tif 000010
【表４Ｆ】
0006285481.tif 000011
【表４Ｇ】
0006285481.tif 000012
【表４Ｈ】
0006285481.tif 000013
【０１５２】
一の実施形態で、CD16A結合タンパク質は、Hu3G8VH-1構築物（配列番号70に示す）のVHド
メインと同一のまたは類似する重鎖可変ドメインの配列を含むことができる。例えば、本
発明は、（1）表１に記載した、０、１またはそれ以上のCDR置換によりHu3G8VH-1（配列
番号70）のVHドメインとは異なり、（2）表１に記載した、０、１またはそれ以上のフレ
ームワーク置換によりHu3G8VH-1のVHドメインとは異なり、（3）残りの位置でHu3G8VH-1
のVH配列と少なくとも約80％同一である、多くの場合少なくとも約90％、時には少なくと
も約95％同一である、または少なくとも約98％も同一である、配列を有するVHドメインを
含むCD16A結合タンパク質を提供する。
【０１５３】
本発明のCD16A結合タンパク質の典型的なVHドメインは、3G8VH、Hu3G8VH-5およびHu3G8VH
-22の配列（それぞれ、配列番号81、配列番号71および配列番号72)を有する。3G8VHおよ
びHu3G8VH-5の配列（それぞれ、配列番号81および配列番号71）をコードする典型的なヌ
クレオチド配列を、それぞれ配列番号82および配列番号83に示す。
【０１５４】
VHドメインは、表3で示した置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、
少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つによってHu3G8VH-1（配列番号70
）の配列と異なる配列を有することができる。これらの置換は、CD16Aに対する親和性の
増加をもたらし、および／またはヒトに投与した場合にCD16A結合タンパク質の免疫原性
を減じると考えられている。いくつかの実施形態で、残りの位置のHu3G8VH-1のVHドメイ
ンとの配列同一性の程度は、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、
または少なくとも約98％である。
【０１５５】
限定ではなく例示として、多数のCD16A結合タンパク質のVHドメインの配列を表４に示す
。ヒトCγ1定常領域と融合させた、これらの配列を含む重鎖を、hu3G8VL-1軽鎖（以下に
記載）と共に共発現させて、四量体の抗体を形成させた。また、CD16Aに対する該抗体の
結合性を測定して、アミノ酸置換の効果をhu3G8VH-1のVHドメインと比較して評価した。V
Hドメインがhu3G8VH-1、2、3、4、5、8、12、14、16、17、18、19、20、22、23、24、25
、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、42、43、44および45の配列を有す
る構築物は高親和結合性を示し、hu3G8VH-6および-40のVHドメインは中間の結合性を示し
た。hu3G8VH-5およびhu3G8VH-22（それぞれ、配列番号71および配列番号72）のVHドメイ
ンを含むCD16A結合タンパク質は、特に好ましい結合性質を有すると考えられる。
【０１５６】
5.1.2.2 VL領域
好ましい結合特性を有する軽鎖可変ドメイン配列を同定するために同様の研究を行った。
一の態様において、本発明は、以下のような軽鎖可変ドメインを含むCD16A結合タンパク
質を提供する。このドメインでは、少なくとも１つのCDR（通常は３つのCDR）が、マウス
モノクローナル抗体3G8軽鎖の１つのCDR（通常は３つ全てのCDR）の配列を有し、該結合
タンパク質の残りの部分は実質的にヒトの配列を有する（ヒト抗体の軽鎖可変領域に由来
し、実質的にそれに類似する）。
【０１５７】
一の態様において、本発明は、実質的にヒトのフレームワーク中に3G8抗体由来のCDRを含
むヒト化3G8抗体のフラグメントであって、軽鎖可変ドメインの少なくとも１つのCDRがマ
ウスモノクローナル抗体3G8の軽鎖CDRと配列において異なる、上記抗体フラグメントを提
供する。一の実施形態で、CDRは１以上のアミノ酸置換、例えば表２で示した１以上の置
換（例えば、CDR1の24位のアルギニン；CDR1の25位のセリン；CDR1の32位のチロシン；CD
R1の33位のロイシン；CDR2の50位のアスパラギン酸、トリプトファンもしくはセリン；CD
R2の53位のセリン； CDR2の55位のアラニンもしくはグルタミン；CDR2の56位のスレオニ
ン；CDR3の93位におけるセリン；および／またはCDR3の94位のスレオニン）をCDR中に少
なくとも有することで、3G8配列とは異なっている。様々な実施形態で、可変ドメインは
、このような置換を０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上有し（多くの場合
、１〜４つの前記置換）、任意で更なる置換をも有することができる。
【０１５８】
実施形態の一つにおいて、適当なCD16A結合タンパク質は、Hu3G8VL-1（配列番号73）構築
物のVLドメインと同一のまたは類似する軽鎖可変ドメイン配列を含むことができる。この
配列を表６に示す。例えば、本発明は、（1）表５に記載した、０、１またはそれ以上のC
DR置換によりHu3G8VL-1（配列番号73）のVLドメインとは異なり、（2）表５に記載した、
０、１またはそれ以上のフレームワーク置換によりHu3G8VL-1のVLドメインとは異なり、
（3）残りの位置でHu3G8VL-1のVL配列（配列番号73）と少なくとも約80％同一である、多
くの場合少なくとも約90％、時には少なくとも約95％同一である、または少なくとも約98
％も同一である、配列を有するVLドメインを含むCD16A結合タンパク質を提供する。
【表５】
0006285481.tif 000014
【表６Ａ】
0006285481.tif 000015
0006285481.tif 000016
【表６Ｂ】
0006285481.tif 000017
【表６Ｃ】
0006285481.tif 000018
【表６Ｄ】
0006285481.tif 000019
【表６Ｅ】
0006285481.tif 000020
【表６Ｆ】
0006285481.tif 000021
【表６Ｇ】
0006285481.tif 000022
【表６Ｈ】
0006285481.tif 000023
【０１５９】
本発明のCD16結合タンパク質の典型的なVLドメインは、表５および６で示すように、3G8V
L、Hu3G8VL-1またはHu3G8VL-43の配列（それぞれ、配列番号84、配列番号73および配列番
号74）を有する。3G8VL（配列番号84）およびHu3G8VL-1（配列番号73）をコードする典型
的なヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号85および配列番号86に示す。
【０１６０】
VLドメインは、表２で示した置換の０、１、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくと
も４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたは少な
くとも９つによってHu3G8VL-1の配列（配列番号73）とは異なる配列をもつことができる
。これらの置換は、CD16Aに対する親和性の増加をもたらし、および／またはヒトに投与
した場合にCD16A結合タンパク質の免疫原性を減じると考えられる。いくつかの実施形態
で、残りの位置の配列同一性の程度は、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくと
も約95％、または少なくとも約98％である。
【０１６１】
限定ではなく例示として、多数のCD16A結合タンパク質のVLドメイン配列を表６に示す。
ヒトCκ定常ドメインと融合させたこれらの配列を含む軽鎖を、Hu3G8VH重鎖（上記）と共
発現させ、四量体の抗体を形成させた。また、CD16Aに対する該抗体の結合性を測定して
、アミノ酸置換の効果をHu3G8VL-1のVLドメイン（配列番号73）と比較して評価した。VL
ドメインがhu3G8VL-1、2、3、4、5、10、16、18、19、21、22、24、27、28、32、33、34
、35、36、37、および42の配列を有する構築物は高親和結合性を示した。また、hu3G8VL-
15、17、20、23、25、26、29、30、31、38、39、40および41は中間の結合性を示した。hu
3G8VL-1、hu3G8VL-22およびhu3G8VL-43（それぞれ、配列番号73、配列番号75および配列
番号74）のVLドメインを含むCD16A結合タンパク質は、特に好ましい結合性質を有すると
考えられている。
【０１６２】
5.1.2.2.1 VLおよび／またはVHドメインの組合せ
当該分野では公知であり、また本明細書の他の箇所でも記載したように、免疫グロブリン
の軽鎖および重鎖は、それらの鎖が結合してダイアボディを産生する条件下で、組換え技
術によって発現させることができ、またin vitroでそのように組み合わせることができる
。したがって、本明細書で記載した3G8由来のVLドメインを本明細書に記載した3G8由来の
VHドメインと組み合わせて、CD16A結合性ダイアボディを作製することができ、そのよう
な組合せの全てが意図されていることがわかるであろう。
【０１６３】
限定ではなく例示として、有用なCD16Aダイアボディの例は、少なくとも１つのVHドメイ
ンと少なくとも１つのVLドメインを含むダイアボディであり、そのVHドメインがhu3G8VH-
1、hu3G8VH-22またはhu3G8VH-5（それぞれ、配列番号70、配列番号72および配列番号71）
に由来し、またVLドメインがhu3G8VL-1、hu3G8VL-22またはhu3G8VL-43（それぞれ、配列
番号73、配列番号75および配列番号43）に由来する。特に、hu3G8VH-22（配列番号22）と
hu3G8VL-1、hu3G8VL-22またはhu3G8VL-43（それぞれ、配列番号73、配列番号72および配
列番号73）、またはhu3G8VH-5（配列番号71）とhu3G8VL-1（配列番号73）を含むヒト化抗
体は、好ましい性質を有する。
【０１６４】
本明細書に記載したVLおよびVHドメインの配列を、当該分野で公知の方法、例えば親和性
成熟等（Schierら、1996, J. Mol. Biol. 263:551-67；Daughertyら、1998, Protein Eng
. 11:825-32；Boderら、1997, Nat. Biotechnol. 15:553-57； Boderら、2000, Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A 97:10701-705；HudsonとSouriau, 2003, Nature Medicine 9:129-
39を参照されたい）によって、さらに改変することができることは、当業者であれば十分
理解できるであろう。例えば、CD16A結合タンパク質を、親和性成熟技術を用いて改変し
、CD16Aに対する親和性の増加したおよび／またはCD16Bに対する親和性の低下したタンパ
ク質を同定することができる。
【０１６５】
典型的なCD16結合タンパク質の一つは、マウス3G8抗体である。ヒト化3G8のVHおよびVLド
メインを含むアミノ酸配列を図２、９、１４に記載し、配列番号9、配列番号11、配列番
号12、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配
列番号21、配列番号22、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73および配列番
号74で示す。
【０１６６】
5.2 Fc領域またはその一部を含むダイアボディ
本発明は、Fcドメインまたはその一部（例えば、CH2もしくはCH3ドメイン）を含むダイア
ボディ分子を包含する。いくつかの実施形態で、Fcドメインまたはその一部は、IgG2、Ig
G3またはIgG4のFc領域（例えばCH2もしくはCH3）の１以上の定常ドメインを含む。他の実
施形態で、本発明は、Fcドメインまたはその一部を含む分子を包含し、ここで、前記Fcド
メインまたはその一部は、匹敵する野生型Fcドメインまたはその一部に対して少なくとも
１つのアミノ酸改変（例えば、置換）を含んでいる。変異型Fcドメインは当該分野ではよ
く知られており、前記変異型Fcドメインを含む抗体の表現型（当該分野で周知の結合活性
解析法またはエフェクター機能解析法のいずれか、例えばELISA、SPR解析もしくはADCC等
でアッセイされる）を変えるのに主として用いられる。このような変異型Fcドメインまた
はその一部は、Fcドメイン（またはその一部）を含む本発明のダイアボディ分子によって
示されるエフェクター機能（例えばNK依存的もしくはマクロファージ依存的アッセイ等で
機能的にアッセイされる）を付与するまたは改変することにより、本発明において使用さ
れる。エフェクター機能を改変すると同定されたFcドメイン変異体は、国際公開WO 04/06
3351号、米国特許出願公開第2005/0037000号および同第2005/0064514号、2004年11月10日
に出願された米国仮出願第60/626,510号、2004年12月15日に出願された同第60/636,663号
および2006年3月10日に出願された同第60/781,564号、並びに本発明者の同時出願である2
005年11月10日に出願された米国特許出願第11/271,140号および2005年12月15日に出願さ
れた同第11/305,787号中に開示されている。これらはいずれも参照としてその全てを本明
細書中に組み入れる。
【０１６７】
他の実施形態で、本発明は、当該分野で知られるあらゆるFc変異体の使用も包含する。例
えば、Duncanら、1988, Nature 332:563-564；Lundら、1991, J. Immunol 147:2657-2662
；Lundら、1992, Mol Immunol 29:53-59；Alegreら、1994, Transplantation 57:1537-15
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, Immunol Lett. 44:111-117；Lundら、1995, Faseb J 9:115-119；Jefferisら、1996, I
mmunol Lett 54:101-104；Lundら、1996, J Immunol 157:49634969；Armourら、1999, Eu
r J Immunol 29:2613-2624；Idusogieら、2000, J Immunol 164:41784184；Reddyら、200
0, J Immunol 164:1925-1933；Xuら、2000, Cell Immunol 200:16-26；Idusogieら、2001
, J Immunol 166:2571-2575；Shieldsら、2001, J Biol Chem 276:6591-6604；Jefferis
ら、2002, Immunol Lett 82:57-65；Prestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490；
米国特許第5,624,821号；米国特許第5,885,573号；米国特許第6,194,551号；国際公開WO 
00/42072号；国際公開WO 99/58572号（いずれも参照としてその全てを本明細書中に組み
入れる）で開示されたFc変異体等が挙げられる。
【０１６８】
いくつかの実施形態で、Fc領域のアミノ酸に対する前記１以上の改変は、Fc領域の、した
がって本発明のダイアボディ分子の、１以上のFcγR受容体に対する親和性および結合力
を減じる。特定の実施形態で、本発明は、変異型Fc領域もしくはその一部を含むダイアボ
ディを包含し、ここで、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比較して少なくとも１つの
アミノ酸改変を含み、変異型Fcドメインのみが１つのFcγRと結合し、該FcγRがFcγRIII
Aである。他の特定の実施形態で、本発明は、変異型Fc領域もしくはその一部を含むダイ
アボディを包含し、ここで、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比較して少なくとも１
つのアミノ酸改変を含み、変異型Fc領域のみが１つのFcγRと結合し、該FcγRがFcγRIIA
である。他の特定の実施形態で、本発明は、変異型Fc領域もしくはその一部を含むダイア
ボディを包含し、ここで、前記変異型Fc領域は、野生型Fc領域と比較して少なくとも１つ
のアミノ酸改変を含み、変異型Fc領域のみが１つのFcγRと結合し、該FcγRがFcγRIIBで
ある。いくつかの実施形態で、本発明は、変異型Fcドメインを含む分子を包含し、ここで
、前記変異体は、当業者に公知であり、また本明細書に記載された方法を用いて測定した
ときに、Fcドメインを含まない分子もしくは野生型Fcドメインを含む分子と比較して、AD
CC活性の増加および／またはFcγRIIA(CD32A)に対する結合増加を付与するか、または仲
介する。別の実施形態で、本発明は変異型Fcドメインを含む分子を包含し、ここで、前記
変異体は、当業者に公知で、かつ本明細書に記載された方法を用いて測定したときに、Fc
ドメインを含まないもしくは野生型Fcドメインを含む分子と比較して、ADCC活性（もしく
は他のエフェクター機能）の低下および／またはFcγRIIB (CD32B)への結合増大を付与す
るか、または仲介する。
【０１６９】
本発明はまた、２以上のIgGアイソタイプに由来するドメインまたは領域を含むFcドメイ
ンの使用を包含する。当該分野で知られているように、Fc領域のアミノ酸改変は、Fcを介
するエフェクター機能および／または結合活性に大きな影響を及ぼし得る。しかし、機能
特性のこうした改変は、選択したIgGアイソタイプという背景で行う場合、さらに洗練さ
れ、かつ／または操作され得る。同様に、Fcアイソタイプの天然の特性は、１以上のアミ
ノ酸改変により操作することができる。複数のIgGアイソタイプ(すなわち、IgG1、IgG2、
IgG3およびIgG4)は、ヒンジおよび／またはFcドメインのアミノ酸配列の違いゆえに、異
なった物理学的および機能的性質、例えば血中半減期、補体結合、FcγR結合親和性、お
よびエフェクター機能活性（例えばADCC、CDC）を示す。いくつかの実施形態で、所望の
特徴をもつダイアボディを設計するために、アミノ酸改変およびIgG Fc領域は、それらの
それぞれの個別の結合性および／またはエフェクター機能活性に基づいて、独立に選択さ
れる。たいていの実施形態では、前記アミノ酸改変およびIgGヒンジ／Fc領域は、IgG1と
いう状況において本明細書に記載されまたは当該分野で公知であるような結合性および／
またはエフェクター機能活性に関して別々にアッセイされている。いくつかの実施形態で
、前記アミノ酸改変およびIgGヒンジ／Fc領域は、ダイアボディ分子または他のFc含有分
子（例えば免疫グロブリン）という状況においてFcγR結合性またはエフェクター機能に
ついて別々にアッセイしたとき、類似の機能性、例えばFcγRIIAに対する親和性の増加等
を示す。前記アミノ酸改変と選択したIgG Fc領域の組み合わせは、その後、相加的にまた
はより好ましくは相乗的に作用して、野生型Fc領域を含む本発明のダイアボディ分子と比
較して、本発明のダイアボディ分子の前記機能性を改変する。他の実施形態において、前
記アミノ酸改変およびIgGのFc領域は、本明細書に記載したまたは当該分野で公知の野生
型Fc領域を含むダイアボディ分子もしくは他のFc含有分子（例えば、免疫グロブリン）と
いう状況においてFcγR結合性および／またはエフェクター機能について別個にアッセイ
したとき、相反する機能性、例えばFcγRIIAに対する親和性のそれぞれ増加および低下を
示す。前記「相反する」アミノ酸改変および選択したIgG領域の組合せは、Fc領域を含ま
ないまたは同一アイソタイプの野生型Fc領域を含む本発明のダイアボディと比較すると、
本発明のダイアボディの特異的機能性を選択的に弱めるまたは減少させるように作用する
。あるいはまた、本発明は、新規の性質を示す、当該分野で公知のアミノ酸改変と選択し
たIgG領域との組合せを含む変異型Fc領域を包含する。かかる性質は、前記改変および／
または領域を本明細書で記載したように独立にアッセイした場合には検出不能である。
【０１７０】
複数のIgGアイソタイプ、およびそのドメインの機能特性は、当該分野では周知である。I
gG1、IgG2、IgG3およびIgG4のアミノ酸配列を、図1A〜1Bに示す。本発明の方法に用いる
特定のIgGアイソタイプに由来する２以上のドメインの選択および／または組合せは、Fc
γRに対する親和性を含めて、親アイソタイプのいずれかの既知パラメータを基にするこ
とができる（表７；FleschとNeppert、1999, J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156；Chappel
ら、1993, J. Biol. Chem. 33:25124-25131；Chappelら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:9036-9040；いずれも参照としてその全てを本明細書中に援用する）。例を挙げ
ると、FcγRIIBへの限定された結合を示すか、またはFcγRIIBへの結合を示さないIgGア
イソタイプ（例えばIgG2またはIgG4）に由来する領域もしくはドメインの使用は、活性化
受容体への結合を最大にし、抑制性受容体への結合を最小にするようにダイアボディを操
作することが望れる場合に、特に有用である。同様に、C1qまたはFcγRIIIAと優先的に結
合することが知られる、例えばIgG3（Brueggemannら、1987, J. Exp. Med 166:1351-1361
）等のIgGアイソタイプに由来するFc領域もしくはドメインの使用は、ADCCを増強するこ
とが当該分野で知られるFcアミノ酸改変と組み合わせて、エフェクター機能活性（例えば
、補体活性化またはADCC）が最大となるようにダイアボディ分子を操作することができる
。
【表７】
0006285481.tif 000024
【０１７１】
5.3 分子結合体
本発明のダイアボディ分子を、異種ポリペプチド（すなわち、関連性のないポリペプチド
、またはその一部、好ましくはそのポリペプチドの少なくとも10アミノ酸、少なくとも20
アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも40アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少な
くとも60アミノ酸、少なくとも70アミノ酸、少なくとも80アミノ酸、少なくとも90アミノ
酸もしくは少なくとも100アミノ酸）と、組換えによって融合させて、または化学的に結
合（共有結合、非共有結合の両方を含む）させて、融合タンパク質を作製することができ
る。融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０１７２】
さらに、本発明のダイアボディ分子（すなわち、ポリペプチド）は、治療薬または所与の
生物学的応答を改変する薬剤成分と結合することができる。直接的な結合に代わるものと
して、本発明の多価（例えば四価）のダイアボディ分子上の複数のエピトープ結合部位に
より、ダイアボディの少なくとも１つの結合領域は、ダイアボディの結合に影響すること
なく、治療薬または所望の薬剤成分と結合するようにデザインすることができる。
【０１７３】
治療薬または薬剤成分は、古典的な化学治療薬であるとは限らない。例えば、薬剤成分は
、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このよう
なタンパク質としては以下が含まれる：アブリン、リシンA、緑膿菌外毒素（すなわち、P
E-40）またはジフテリア毒素等の毒素、リシン、ゲロニンおよびポークウィード（pokewe
ed）抗ウイルスタンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、αインターフェロン(IFN-α)および
βインターフェロン(IFN-β)を含むがこれらに限定はしないインターフェロン、神経成長
因子(NGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、アポト
ーシス剤（例えば、TNF-α、TNF-β、国際公開WO 97/33899号に記載のAIM I)、AIM II（
国際公開WO 97/34911号参照）、Fasリガンド（Takahashiら、J. Immunol., 6:1567-1574,
1994）、およびVEGI（国際公開WO 99/23105号）等のタンパク質、血栓剤もしくは血管新
生阻害剤（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）、または例えばリンホカ
イン（例えば、インターロイキン１（IL-1）、インターロイキン２（IL-2）、インターロ
イキン６（IL-６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および顆粒球
コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF））、または成長
因子（例えば、成長ホルモン（GH））のような生物学的応答改変物質、プロテアーゼ、あ
るいはリボヌクレアーゼ。
【０１７４】
本発明のダイアボディ分子（すなわち、ポリペプチド）を、例えば精製を容易にするペプ
チド等のマーカー配列と融合させることができる。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチドであり、例えば、市販品の数ある中でも特にpQ
Eベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)中にて提供される
タグが挙げられる。Gentzらが1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824で記載し
ているように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精
製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質のエピトー
プに相当するヘマグルチニン「HA」タグ（Wilson ら、Cell, 37:767 1984）、および「Fl
ag」タグ（Knappikら、Biotechniques, 17(4):754-761, 1994）が含まれるが、これらに
限られない。
【０１７５】
更なる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシ
ャッフリングおよび／またはコドンシャッフリング（正確には「DNAシャッフリング」と
呼ばれる）の技術を介して作製することができる。DNAシャッフリングを使用して、本発
明の分子の活性（例えば、より高い親和性とより低い解離速度を持ったエピトープ結合部
位）を変えることができる。一般には、米国特許第5,605,793号；第5,811,238号；第5,83
0,721号；第5,834,252号；および第5,837,458号、並びにPattenら、1997, Curr. Opinion
Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76；Hanssonら、1999
, J. Mol. Biol. 287:265；LorenzoとBlasco, 1998, BioTechniques 24:308（いずれも参
照としてその全てを本明細書中に組み入れる）を参照されたい。本発明のダイアボディ分
子、または本発明の分子をコードする核酸は、さらにエラープローン（error-prone）PCR
法、ランダムヌクレオチド挿入法または他の方法を用いたランダム変異誘発により、組換
え前に改変することができる。本発明の分子をコードするポリヌクレオチドの１以上の部
分を、１以上の異種分子の１以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片
等と組み換えることができる。
【０１７６】
また、本発明は、診断薬もしくは治療薬、または他のいずれかの分子（血中半減期の増加
／減少が望まれる分子および／または細胞の特定の小集団を標的とする分子）と結合した
、またはそれらを免疫特異的に認識する本発明のダイアボディ分子も包含する。本発明の
分子を診断に使用して、例えば、疾患、障害、または感染の発生もしくは進行を臨床試験
の一環としてモニターして、例えば所与の治療計画の効果を測定することができる。本発
明の分子を検出可能な物質と結合させることにより、または検出可能な物質を免疫特異的
に認識する分子により、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、各種
酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、
および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、本発明の分子と直接的
に、もしくは媒介物質（例えば、当該分野で公知のリンカー）を介して間接的に、当該分
野で公知の方法を用いて連結または結合することができる。あるいは、当該分子が検出可
能な物質を免疫特異的に認識する（すなわち、前記物質と免疫特異的に結合する）ことが
できる。例えば、本発明の診断薬として用いるための抗体と結合させることができる金属
イオンについては、米国特許第4,741,900号を参照されたい。前記診断および検出は、検
出可能な物質を免疫特異的に認識するように該分子をデザインするか、または本発明の分
子を検出可能な物質と連結することにより、達成することができる。ここで検出可能な物
質は、限定はしないが、各種酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ（ただし、これら
に限定はしない）；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン等の補欠分
子族複合体（ただし、これらに限定はしない）；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フ
ルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン フルオレ
セイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリン等の蛍光物質（ただし、これらに限定し
ない）、ルミノール等の発光物質（ただし、これに限定しない）、ルシフェラーゼ、ルシ
フェリンおよびエクオリン等の生物発光物質（ただし、これらに限定しない）、ビスマス
(213Bi)、炭素(14C)、クロム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153G
d、159Gd)、ガリウム(68Ga、67Ga)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウ
ム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、ランタン(140La)
、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、亜リン
酸(32P)、プラセオジム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジ
ウム(105Rh)、ルテニウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレン(75S
e)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム (99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(
113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン (133Xe)、イッテルビウム (169Yb、175Yb)、
イットリウム(90Y)、亜鉛(65Zn)等の放射性物質（ただし、これらに限定しない）、様々
な陽電子放射断層撮影で用いられる陽電子放出金属、並びに非放射性常磁性金属イオンを
含む。
【０１７７】
本発明のダイアボディ分子は、細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制剤もしくは殺細胞剤）、
治療剤、または放射性元素（例えば、α放射体、γ放射体等）のような治療成分を免疫特
異的に認識するか、またはそれと結合することができる。細胞毒素または細胞毒性剤は細
胞に有害などんな薬剤をも包含する。例として、パクリタキセル、サイトカラシンB、グ
ラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポ
シド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン
、ジヒドロキシアンスラシンジオン（dihydroxy anthracin dione）、ミトキサントロン
、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-ジハイドロテストステロン、糖コルチコイド
、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシンまたは
それらの類似体または同族体を含む。治療剤は、限定はしないが、代謝拮抗物質（例えば
、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウ
ラシル、ダカルバジン)、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラム
ブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミ
ド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよ
びシス ジクロロジアミン白金(II) (DDP)シスプラチン）、アントラサイクリン類（例え
ば、ダウノルビシン（かつてのダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗体（例えば
、ダクチノマイシン（かつてのアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、
およびアンスラマイシン(AMC)、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよび
ビンブラスチン）を含む。
【０１７８】
さらに、本発明のダイアボディ分子は、治療成分、例えば放射性物質または放射性金属イ
オンと結合させるのに有用な大環状キレート剤と結合させるか、またはそれを免疫特異的
に認識するようにデザインすることができる（放射性物質の上記例を参照されたい）。い
くつかの実施形態で、大環状キレート剤は、リンカー分子を介してポリペプチドに結合す
ることのできる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N’,N’’,N’’’-四酢酸(DOTA)
である。前記リンカー分子は、当該分野で普通に知られており、Denardoら、1998, Clin 
Cancer Res. 4:2483-90；Petersonら、1999, Bioconjug. Chem. 10:553；およびZimmerma
nら、1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50にも記載されている。これらはいずれも参照と
してその全てを本明細書中に援用する。
【０１７９】
前記治療成分を、例えばFcドメインを含めて、ポリヌクレオチドと結合させる方法は周知
である。例えば、Arnonら“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In C
ancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら（編）、
1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.；Hellstromら“Antibodies For Drug Delivery
”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinsonら（編）、1987, pp. 623-53, M
arcel Dekker, Inc.；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Th
erapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applic
ations, Pincheraら（編）、1985, pp. 475-506；“Analysis, Results, And Future Pro
spective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in
Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら（編）、1985, 
pp. 303-16, Academic Press；and Thorpeら、Immunol. Rev., 62:119-58, 1982を参照さ
れたい。
【０１８０】
本発明のダイアボディ分子は、当該分子と結合した治療成分と共にもしくは治療成分なし
で投与してもよいし、単独で投与してもよいし、または治療処置用の細胞毒性因子および
／またはサイトカインと組み合わせて投与してもよい。単独で投与する場合、多価の、例
えば四価のダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープは、治療薬（例えば、細胞毒
性因子および／またはサイトカイン）を免疫特異的に認識するように設計できる。この治
療薬は、本発明の分子と同時に、またはそれに続いて投与することができる。このように
、ダイアボディ分子は、直接的な結合と類似した方法で治療薬を特異的に標的とすること
ができる。あるいはまた、本発明の分子を抗体に結合させて、Segalが米国特許第4,676,9
80号に記載しているように抗体ヘテロ結合体を形成させることができる。この文献は、参
照としてその全てを本明細書中に組み入れる。本発明のダイアボディ分子は、固相支持体
に結合することもできる。これは、特に標的抗原のイムノアッセイまたは精製に有用であ
る。このような固相支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポ
リスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定はされない。
【０１８１】
5.4 ダイアボディ分子の結合の性状解析
本発明のダイアボディ分子は、各種方法で性状解析することができる。特に、本発明の分
子は、例えばFcRIIIAもしくはFcRIIB等の抗原と免疫特異的に結合する能力について、ま
たは当該分子がFcドメイン（もしくはその一部）を含む場合には、Fc-FcγR相互作用（す
なわち、Fcドメイン（もしくはその一部）のFcγRへの特異的結合）を示す能力について
、アッセイすることができる。前記アッセイは、溶液中で（例えば、Houghten, Bio/Tech
niques, 13:412 421, 1992）、ビーズ上で（Lam, Nature, 354:82 84, 1991）、チップ上
で（Fodor, Nature, 364:555 556, 1993）、細菌上で（米国特許第5,223,409号）、胞子
上で（米国特許第5,571,698号、第5,403,484号および第5,223,409号)、プラスミド上で（
Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865 1869, 1992）、またはファージ上で（Sc
ottとSmith, Science, 249:386 390, 1990；Devlin, Science, 249:404 406, 1990；Cwir
laら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378 6382, 1990；およびFelici, J. Mol. Biol
., 222:301 310, 1991)（これらの文献は、参照としてその全てを本明細書中に組み入れ
る）実施することができる。抗原に免疫特異的に結合することが同定されている分子、例
えばFcγRIIIAは、その後、抗原に対する特異性および親和性についてアッセイすること
ができる。
【０１８２】
複数のエピトープ結合ドメインを含むように作製した本発明の分子は、１以上の抗原（例
えば、癌抗原）に対する免疫特異的な結合性および他の抗原（FcγR）との交差反応性に
ついて、またはその分子がFcドメイン（もしくはその一部）を含む場合にはFc-FcγR相互
作用について、当該分野で公知のいずれかの方法によってアッセイすることができる。免
疫特異的結合、交差反応性、およびFc-FcγR相互作用を解析するために用いることができ
るイムノアッセイ法には、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ法、ELISA法（
酵素結合免疫吸着解析法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ法、免疫沈降アッセイ法、
沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、凝集アッセイ法、補体結合アッセイ
法、イムノラジオメトリック法、蛍光イムノアッセイ法、プロテインAイムノアッセイ法
等と、ほんの数例ではあるが、これらの技術を用いた競合および非競合アッセイ系が含ま
れる。ただし、これらの技術に限定はしない。前記アッセイ法は、当該分野では日常的に
行われており、周知である（例えば、Ausubelら編、1994, Current Protocols in Molecu
lar Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい。これらは参
照によりその全てを本明細書中に援用する)。
【０１８３】
抗原−結合ドメインの相互作用、またはFc-FcγR相互作用の結合親和性および解離速度を
競合結合アッセイ法によって測定することができる。競合結合アッセイ法の一例に、ラジ
オイムノアッセイ法がある。この方法は、標識された抗原、例えば四量体FcγR（例えば
、3Hまたは125I、セクション5.4.1を参照）と対象の分子（例えば、複数のエピトープ結
合ドメインを含む本発明の分子）とを、四量体FcγR（セクション5.4.1を参照）のような
未標識エピトープの量を増加していきながら、インキュベーションし、標識抗原に結合し
た該分子を検出することを含む。抗原に対する本発明の分子の親和性および結合解離速度
は、Scatchard解析法による飽和率から測定することができる。
【０１８４】
抗原またはFcγRに対する本発明の分子の親和性および結合特性は、初めに抗原-結合ドメ
インまたはFc-FcγR相互作用について当該分野では公知のin vitroアッセイ法（生化学ま
たは免疫学に基づくアッセイ法）を用いて測定することができる。ここで、in vitroアッ
セイ法は、ELISA法、表面プラズモン共鳴解析法、免疫沈降アッセイ法を含むが、これら
に限定はされない。また、本発明の分子の結合特性を、セクション5.4.2に記載したよう
な１以上のFcγR介在エフェクター細胞機能を測定するためのin vitro機能アッセイ法に
よって特徴付けすることが好ましい。最も好ましい実施形態において、本発明の分子は、
in vitroベースのアッセイにおける結合特性と同様の結合特性をin vivoモデル（例えば
、本明細書で記載し、かつ開示したもの）でも有する。しかし、本発明は、in vitroベー
スのアッセイでは所望の表現型を示さないが、in vivoでは所望の表現型を示す本発明の
分子を排除するものではない。
【０１８５】
いくつかの実施形態で、複数のエピトープ結合ドメイン、および任意でFcドメイン（もし
くはその一部）を含む分子のスクリーニングおよび同定は、機能に基づくアッセイ法、好
ましくは高速処理能力を持つ方法で行われる。機能に基づくアッセイ法は、例えば、本明
細書中のセクション5.4.2および5.4.3に記載されているような、１以上のFcγR介在エフ
ェクター細胞機能を特徴付けるための当該分野で公知のいずれかアッセイ法とすることが
できる。本発明の方法で使用できるエフェクター細胞機能の非限定的な例として、抗体依
存性細胞障害（ADCC）、抗体依存性食作用、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、
細胞結合性、ロゼット形成、C1q結合、および補体依存性細胞を介した細胞毒性を含む。
ただし、これらに限らない。
【０１８６】
BIAcore動態解析を使用して、抗原またはFcγRに対する本発明の分子の結合速度および解
離速度を測定する実施形態が好ましい。BIAcore動態解析は、抗原またはFcγRの結合と解
離を、固定した分子（例えば、それぞれエピトープ結合ドメインまたはFcドメイン（もし
くはその一部）を含む分子）をその表面に担持したチップ上で解析することを含む。BIAc
ore解析は、セクション5.4.3で説明する。
【０１８７】
当業者に公知のいずれかの方法を用いた蛍光活性化セルソーティング装置（FACS）を、免
疫学または機能に基づくアッセイ法に用いて、本発明の分子を性状解析することが好まし
い。フローソーターは、本発明の分子によって結合された（例えばそれによってオプソニ
ン化された）多数の細胞を個別に、かつ迅速に調べることができる（例えば１時間あたり
1000万〜１憶個の細胞）（Shapiroら、Practical Flow Cytometry, 1995）。さらに、ダ
イアボディの挙動を最適化するのに使用される特定のパラメータには、限定はしないが、
抗原濃度 (すなわち、FcγR四量体複合体、セクション5.4.1を参照)、動態競合時間、ま
たはFACSストリンジェンシーが含まれる。これらをそれぞれ変化させて、特異的な結合特
性（例えば複数のエピトープへの同時結合）を示す本発明の分子を包含するダイアボディ
分子を選択することができる。生体細胞を分取して調べるフローサイトメーターは、当該
分野では周知である。公知のフローサイトメーターは、例えば、米国特許第4,347,935号
；第5,464,581号；第5,483,469号；第5,602,039号；第5,643,796号；および第6,211,477
号に記載されている。これらの文献の内容の全ては、参照として本明細書中に組み込まれ
る。他の公知のフローサイトメーターには、Becton Dickinson and Companyより市販され
ているFACS VantageTMシステム、およびUnion Biometricaより市販されているCOPASTMシ
ステムがある。
【０１８８】
標的抗原結合親和性またはFc-FcγR結合親和性の性状解析、および細胞表面上の標的抗原
密度またはFcγR密度の評価は、当該分野で周知の方法、例えばScatchard解析法等により
、またはメーカー使用説明書に従ったキット、例えばQuantumTM Simply Cellular（Simpl
y Cellularは登録商標）（Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN）の使用により、行
うことができる。１以上の機能アッセイは、当業者に公知のまたは本明細書中に記載した
ような１以上のFcγR介在エフェクター細胞機能を特徴付けるための当該分野で公知のい
ずれのアッセイでもよい。特定の実施形態で、複数のエピトープ結合ドメイン、および任
意でFcドメイン（もしくはその一部）を含む本発明の分子は、１以上の標的抗原または１
以上のFcγR（例えば、FcγRIIIA、FcγRIIA、FcγRIIA）への結合についてELISAアッセ
イ法でアッセイされ、続いて１以上のADCCアッセイでアッセイされる。いくつかの実施形
態で、本発明の分子は、さらに表面プラズモン共鳴に基づいたアッセイ、例えばBIAcore
を用いてアッセイされる。表面プラズモン共鳴に基づいたアッセイは、当該分野では周知
であるが、セクション5.4.3でさらに説明し、本明細書中でも例えば実施例6.1において例
証される。
【０１８９】
最も好ましい実施形態で、複数のエピトープ結合ドメイン、および任意でFcドメイン（も
しくはその一部）を含む本発明の分子は、さらに標的抗原（例えばFcγR）との相互作用
またはFc-FcγR相互作用について動物モデルで特徴付けされる。Fc-FcγR相互作用をアッ
セイする場合、本発明の方法で使用する上で好ましい動物モデルは、例えば、ヒトFcγR
を発現するトランスジェニックマウス、例えば米国特許第5,877,397号および第6,676,927
号に記載されているいずれかのマウスモデルである。これらの文献は、参照としてその全
てを本明細書中に組み入れる。さらに、前記方法で使用するトランスジェニックマウスは
、限定はしないが、ヒトFcγRIIIAを担持しているFcγRIIIAノックアウトヌードマウス；
ヒトFcγRIIAを担持しているFcγRIIIAノックアウトヌードマウス；ヒトFcγRIIBおよび
ヒトFcγRIIIAを担持しているFcγRIIIAノックアウトヌードマウス；ヒトFcγRIIBおよび
ヒトFcγRIIAを担持しているFcγRIIIAノックアウトヌードマウス；ヒトFcγRIIIAおよび
FcγRIIAを担持しているFcγRIIIAおよびFcγRIIAノックアウトヌードマウス、並びにヒ
トFcγRIIIA、FcγRIIAおよびFcγRIIBを担持しているFcγRIIIA、FcγRIIAおよびFcγRI
IBノックアウトヌードマウスを含む。
【０１９０】
5.4.1 FcγRを含む結合アッセイ
Fcドメイン（もしくはその一部）を含む、および／またはFcγRに特異的なエピトープ結
合ドメインを含む分子によるFcγRへの結合の特徴付けは、限定はしないがFcγRの多型変
異体を含めて、いずれのFcγRを使用しても行うことができる。いくつかの実施形態では
、158位にフェニルアラニンを含むFcγRIIIAの多型変異体が使用される。他の実施形態で
は、158位にバリンを含むFcγRIIIAの多型変異体を用いて特徴付けが行われる。FcγRIII
A 158Vは、IgG1に対して158Fよりも高い親和性、およびADCC活性の増加を示す（例えば、
Koeneら、1997, Blood, 90:1109-14；Wuら、1997, J. Clin. Invest. 100: 1059-70；い
ずれも参照としてその全てを本明細書中に組み入れる）。この残基は、実際IgG1の下部ヒ
ンジ領域と直接相互作用するが、このことはIgG1-FcγRIIIAの共結晶化研究によって最近
明らかにされた（例えば、Sondermanら、2000, Nature, 100: 1059-70を参照されたい。
この文献は参照としてその全てが本明細書中に援用される）。研究により、いくつかのケ
ースにおいて、治療用抗体はFcγRIIIA-158Vホモ接合患者で向上した効果を有することが
明らかとなった。例えば、ヒト化抗CD20モノクローナル抗体リツキシマブ（Rituximab）
は、FcγRIIIA-158Fホモ接合患者と比べてFcγRIIIA-158Vホモ接合患者で、より治療効果
があった（例えば、Cartronら、2002 Blood, 99(3): 754-8を参照されたい）。他の実施
形態で、この領域を含む治療用分子はまた、FcγRIIIA-158VおよびFcγRIIIA-158Fに関し
てヘテロ接合の患者において、並びにFcγRIIIA-131Hをもつ患者でも、効果的であり得る
。特定の作用機序に縛られるつもりはないが、別のアロタイプを用いた本発明の分子の選
択は、ひとたび治療用ダイアボディに作製されたら、そのようなアロタイプについてホモ
接合性の患者に対して臨床的により効果があると思われる変異体を提供することができる
。
【０１９１】
FcγR結合アッセイが、本発明の分子とFcγRとの結合を測定するために、特に、Fcドメイ
ンとFcγRとの結合を測定するために開発された。このアッセイにより、リガンドに対す
る受容体の親和性が本質的に弱くても、例えばFcγRIIBとFcγRIIIAについてマイクロモ
ルの範囲であっても、Fc-FcγR相互作用の検出および定量が可能となった。前記方法は、
国際公開WO 04/063351号および米国特許出願公開第2005/0037000号および第2005/0064514
号にその詳細が記載されている。いずれも参照としてその全てを本明細書に援用する。簡
単に言えば、この方法は、当該分野で知られるいずれかの標準的なイムノアッセイ法、例
えばFACS、ELISA、表面プラズモン共鳴等で追跡することができるFcγR複合体の形成を含
む。さらに、FcγR複合体は、複合体形成していないFcγRと比べると、Fc領域に対して改
善された結合活性を有している。本発明によれば、好ましい分子複合体は四量体の免疫複
合体であり、この免疫複合体は、(a) FcγRの可溶性領域（例えば、FcγRIIIA、FcγRIIA
またはFcγRIIBの可溶性領域）；(b) FcγRの可溶性領域（例えば、FcγRIIIA、FcγRIIA
またはFcγRIIBの可溶性領域）のC末端に機能し得るように連結されたビオチン化15アミ
ノ酸AVITAG配列（AVITAG）；および(c)ストレプトアビジン-フィコエリトリン(SA-PE)を
、四量体FcγR複合体を形成するモル比で（好ましくは5：1のモル比で）含んでなる。こ
の融合タンパク質は、例えば15アミノ酸AVITAG配列中のリジン残基を特異的にビオチン化
する大腸菌ビオチンリガーゼBirA酵素を用いて、酵素的にビオチン化されている。ビオチ
ン化された可溶性FcγRタンパク質を、その後、四量体FcγR複合体を形成させるためにSA
-PEと、1×SA-PE：5×ビオチン化可溶性FcγRのモル比で混合する。
【０１９２】
Fc領域を含むポリペプチドは、単量体の非複合FcγRよりも少なくとも８倍高い親和性で
四量体FcγR複合体と結合することがわかった。Fc領域を含むポリペプチドの四量体FcγR
複合体への結合性は、当業者には公知の標準的な技術、例えば蛍光活性化セルソーティン
グ法（FACS）、ラジオイムノアッセイ法、ELISA法等を用いて測定することができる。
【０１９３】
本発明は、細胞ベースのまたは無細胞系のアッセイでFc領域を含む分子の機能性を測定す
るための、上記方法により形成される本発明の分子を含む免疫複合体の使用を包含する。
【０１９４】
便宜上、試薬は、アッセイキットで、すなわちFcγR四量体複合体と結合するFc領域を含
んだ分子の能力をアッセイするためにパッケージされた試薬の組合せで提供され得る。Fc
-FcγR相互作用を測定するのに使用する分子複合体の他の形態は、本発明の方法での使用
も考慮されている。例えば、2003年1月13日出願の米国仮出願第60/439,709号（参照とし
てその全てを本明細書に組み入れる）に記載されているように形成された融合タンパク質
が挙げられる。
【０１９５】
5.4.2 変異型重鎖をもつ分子の機能性アッセイ
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインと、場合によりFcドメイン（またはその一部）
とを含む本発明の分子を、該分子のエフェクター細胞機能を同定するための当業者に知ら
れたアッセイを使用して、特徴づけることを包含する。特に、本発明は、本発明の分子を
、FcγR介在エフェクター細胞機能について特徴づけることを包含する。さらに、本発明
のダイアボディ分子の標的抗原の少なくとも１つがFcγRである場合、ダイアボディ分子
によるFcγRの結合は、FcγR-Fc結合により活性化される経路と類似したFcγR介在経路を
活性化するのに役立ちうる。こうして、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ
結合ドメインがFcγRを認識する場合には、ダイアボディ分子は、Fcドメイン（またはそ
の一部）を含むことなく、または付随するFc- FcγR結合なしに、FcγR介在エフェクター
細胞機能を誘発することができる。本発明に従ってアッセイすることができるエフェクタ
ー細胞機能の例として、限定するわけではないが、以下が含まれる：抗体依存性細胞傷害
、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、Clq結合、および補体依存性細胞傷害。
エフェクター細胞機能活性を判定するために、当業者に知られた細胞ベースのアッセイま
たは無細胞アッセイはいずれも使用することができる(エフェクター細胞アッセイについ
ては、以下を参照：Perussiaら、2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92；Baggioliniら
、1998 Experientia, 44(10): 841-8；Lehmannら、2000 J. Immunol. Methods, 243(1-2)
: 229-42；Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-64；Munnら、1990 J. Exp. M
ed., 172: 231-237, Abdul-Majidら、2002 Scand. J. Immunol. 55: 70-81；Dingら、199
8, Immunity 8:403-411(それぞれの全内容を参照として本明細書中に組み入れる))。
【０１９６】
ある実施形態では、本発明の分子をヒト単球でFcγR介在食作用についてアッセイするこ
とができる。あるいはまた、本発明の分子のFcγR介在食作用をその他の食細胞、例えば
、好中球(多形核白血球；PMN)；ヒト末梢血単球、単球由来マクロファージでアッセイす
ることもできる。これらは当業者に知られた標準的手順を使用して取得することができる
(例えば、Brown EJ. 1994, Methods Cell Biol., 45: 147-164参照)。一実施形態では、
本発明の分子の機能を、既述された方法(Tridandapaniら、2000, J. Biol. Chem. 275: 2
0480-7)により、フルオレセイン化IgG-オプソニン化ヒツジ赤血球細胞(SRBC)を貪食するT
HP-1細胞の能力を測定することによって、特徴付ける。
【０１９７】
本発明の分子の食作用を判定するための別の例示的なアッセイは、抗体依存性オプソニン
食作用アッセイ(ADCP)であり、これは以下のステップを含むことができる：大腸菌(Esche
richia coli)-標識FITC(Molecular Probes)または黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureu
s)-FITCなどの標的生体粒子を、(i)フルオレセインに対する抗体である野生型4-4-20抗体
(FcγR依存性ADCPについての対照抗体として)(全内容を参照として本明細書に組み入れる
Bedzykら、1989, J. Biol. Chem, 264(3): 1565-1569参照)、または(ii)FcγRIIIへの結
合をノックアウトするD265A突然変異を保有する4-4-20抗体(FcγR依存性ADCPについての
バックグラウンド対照として)、(iii)4-4-20のエピトープ結合ドメインおよびFcドメイン
および/またはFcγRIIIに特異的なエピトープ結合ドメインを含むダイアボディ、でコー
トすること；そしてオプソニン化した粒子を形成させること；記載したオプソニン化粒子
(i〜iii)のいずれかをTHP-1エフェクター細胞(単球細胞系、ATCCより入手可能)に1：1、1
0：1、30：1、60：1、75：1、または100：1の比で添加して、FcγR介在食作用を発生させ
ること；好ましくは該細胞と大腸菌-FITC/抗体を37℃で1.5時間インキュベートすること
；インキュベーション後、細胞にトリパンブルーを添加して(好ましくは室温で2〜3分)、
内部に取り込まれないで細胞表面の外側に付着した細菌の蛍光を消失させること；細胞を
FACSバッファー(例えば、PBS中の0.1%BSA、0.1%アジ化ナトリウム)中に移し、FACS(例え
ば、BD FACS Calibur)を用いてTHP1細胞の蛍光を分析すること。好ましくは、このアッセ
イに用いられるTHP-1細胞を、FACSにより細胞表面上のFcγRの発現について分析する。TH
P-1細胞はCD32AとCD64の両方を発現する。CD64は、本発明の方法に従ってADCPアッセイを
実行する際にブロックされる、高親和性FcγRである。THP-1細胞を、好ましくは100μg/m
Lの可溶性IgG1または10%ヒト血清でブロックする。ADCPの程度を分析するため、ゲートを
好ましくはTHP-1細胞に設定し、蛍光強度の中央値を測定する。個々の突然変異体につい
てのADCP活性を算出し、得られた野生型chMab 4-4-20に対して標準化した数値として記録
する。オプソニン化した粒子をTHP-1細胞に添加して、Tオプソニン化粒子とTHP-1細胞の
比が30：1または60：1になるようにする。最も好ましい実施形態では、ADCPアッセイを以
下のような対照を用いて実施する：培地中の大腸菌-FITC、大腸菌-FITCおよびTHP-1細胞(
FcγR非依存性ADCP活性として役立つ)、大腸菌-FITC、THP-1細胞および野生型4-4-20抗体
(FcγR依存性ADCP活性として役立つ)、大腸菌-FITC、THP-1細胞、4-4-20 D265A(FcγR依
存性ADCP活性についてのバックグラウンド対照として役立つ)。
【０１９８】
別の実施形態では、本発明の分子を、当業者に知られた標準的な方法のいずれかを使用し
て、エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞で、FcγR介在ADCC活性についてア
ッセイすることができる(例えば、Perussiaら、2000, Methods Mol. Biol. 121: 179-92
；Wengら、2003, J. Clin. Oncol. 21:3940-3947; Dingら、Immunity, 1998, 8:403-11)
参照)。本発明の分子のADCC活性を判定するための例示的なアッセイは、以下のステップ
を含む5lCr放出アッセイに基づくものである：標的細胞を[51Cr]Na2CrO4で標識すること(
この細胞膜透過性分子が標識用に一般的に使用される。なぜならば、これは細胞質タンパ
ク質と結合し、細胞から速度論的に緩慢に自発放出されるが、標的細胞の壊死後、大量に
放出されるからである)；変異型重鎖を含む本発明の分子で標的細胞をオプソニン化する
こと；オプソニン化した放射性標識標的細胞とエフェクター細胞とを、標的細胞とエフェ
クター細胞の適切な比で、マイクロタイタープレートにて混合すること；細胞の混合物を
16〜18時間、37℃でインキュベートすること；上清を回収すること；および放射活性を分
析すること。その後、本発明の分子の細胞傷害性を、例えば以下の式を使用して算出する
ことができる: 溶解％＝(実験cpm−標的漏出cpm)/(界面活性剤溶解cpm−標的漏出cpm)ｘ1
00％、あるいは、溶解％＝(ADCC-AICC)/(最大放出−自発放出)。比溶解は以下の式を使用
して算出することができる：比溶解＝本発明の分子の存在下での溶解％−本発明の分子の
不在下での溶解％。標的：エフェクター細胞の比または抗体濃度のいずれかを変更するこ
とによって、グラフを作成することができる。
【０１９９】
好ましくは、本発明のADCCアッセイで使用するエフェクター細胞は末梢血単核細胞(PBMC)
である。これは好ましくは、当業者に知られた標準的方法、例えばFicoll-Paque密度勾配
遠心分離を使用して、正常ヒト血液から精製される。本発明の方法で使用するのに好まし
いエフェクター細胞は、異なるFcγR活性化受容体を発現する。本発明は、重鎖抗体突然
変異体が野生型IgGl抗体に比較して増加したADCC活性および食作用を示すかどうかを判定
するために、エフェクター細胞、FcγRI、FcγRIIAおよびFcγRIIBを発現するTHP-1、な
らびにFcγRIIIAとFcγRIIBの両方を発現する、ヒト全血に由来する単球由来の一次マク
ロファージを包含する。
【０２００】
ヒト単球細胞系であるTHP-1は、高親和性受容体FcγRIおよび低親和性受容体FcγRIIAの
発現を介して食作用を活性化する(Fleitら、1991, J. Leuk. Biol. 49: 556)。THP-1細胞
は、FcγRIIAまたはFcγRIIBを構成的に発現しない。サイトカインを用いてこれらの細胞
を刺激すると、FcR発現パターンが影響される(Pricopら、2000 J. Immunol. 166: 531-7)
。サイトカインIL4の存在下でのTHP-1細胞の生育はFcγRIIB発現を誘発し、FcγRIIAおよ
びFcγRI発現の減退をもたらす。また、FcγRIIB発現も細胞密度の増加によって増大され
る(Tridandapaniら、2002, J. Biol Chem. 277: 5082-9)。対照的に、IFNγはFcγRIIIA
の発現を導くことができると報告されている(Pearseら、1993 PNAS USA 90: 4314-8)。細
胞表面上の受容体の存在または不在は、当業者に知られた一般的方法を使用して、FACSに
よって確認することができる。サイトカインにより誘発される細胞表面上でのFcγRの発
現は、FcγRIIBの存在下で活性化および抑制の両方を試験する系を提供する。THP-1細胞
がFcγRIIBを発現することができない場合は、本発明は別のヒト単球細胞系であるU937を
さらに包含する。これらの細胞は、IFNγおよびTNFの存在下で、最終的にマクロファージ
に分化することが分かっている(Korenら、1979, Nature 279: 328-331)。
【０２０１】
FcγR依存性腫瘍細胞死滅は、マウス腫瘍モデルではマクロファージとNK細胞によって仲
介される(Clynesら、1998, PNAS USA 95 : 652-656)。本発明は、食作用およびADCCアッ
セイの両方で、標的細胞の細胞傷害を誘発するFc突然変異体の効力を分析するため、エフ
ェクター細胞としての、ドナー由来のエルトリエートした（elutriated）単球の使用を包
含する。FcγRI、FcγRIIIA、およびFcγRIIBの発現パターンは、異なる増殖条件によっ
て影響を受ける。エルトリエートして凍結させた単球、新鮮なエルトリエートした単球、
10％ FBS中に維持した単球、FBS＋GM-CSF中および/またはヒト血清中で培養した単球から
のFcγR発現は、当業者に知られた一般的方法を使用して測定することができる。例えば
、細胞をFcγR特異的抗体で染色し、FACSによって分析してFcγRプロファイルを決定する
ことができる。その後、マクロファージのin vivo FcγR発現を最もよく模倣する条件を
本発明の方法で使用する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本発明は、特に適合するFcγRプロファイルを持つヒト細胞を
取得することができない場合には、マウス細胞の使用を包含する。いくつかの実施形態で
は、本発明は、ヒトFcγRIIIAでトランスフェクトすることができるマウスマクロファー
ジ細胞系RAW264.7(ATCC)、および当技術分野で知られた方法を使用して単離された安定な
トランスフェクタントを包含する(例えば、Ralphら、J. Immunol. 119: 950-4参照)。ト
ランスフェクタントは、通常の実験操作を用いたFACS分析によって、FcγRIIIA発現につ
いて定量し、高発現体を本発明のADCCアッセイに使用することができる。別の実施形態で
は、本発明は、本明細書で開示したものなどのノックアウトトランスジェニックマウスか
らの、ヒトFcγRを発現する脾臓腹腔マクロファージの単離を包含する。
【０２０３】
リンパ球は、Ficoll-Paque勾配(Pharmacia)を使用して、ドナーの末梢血(PBM)から回収す
ることができる。単離された細胞の単核集団内では、ほとんでADCC活性が、その表面にFc
γRIIIAを含むがFcγRIIBは含まないナチュラルキラー細胞(NK)を介して生じる。これら
の細胞を用いた結果は、NK細胞ADCCの誘発に対する突然変異体の効力を示し、エルトリエ
ートした単球を用いて試験するための試薬を確立する。
【０２０４】
本発明のADCCアッセイで使用する標的細胞として、限定するわけではないが、以下が含ま
れる：乳癌細胞系、例えばSK-BR-3(ATCC受託番号 HTB-30)(例えば、Trempら、1976, Canc
er Res. 33-41参照)；Bリンパ球；バーキットリンパ腫由来の細胞、例えばRaji細胞(ATCC
受託番号CCL-86)(例えば、Epsteinら、1965, J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240参照)
、およびDaudi細胞(ATCC受託番号CCL-213)(例えば、Kleinら、1968, Cancer Res. 28: 13
00-10参照)。標的細胞はアッセイすべきダイアボディ分子の抗原結合部位によって認識さ
れるものでなければならない。
【０２０５】
ADCCアッセイは、アポトーシス経路によって細胞死を仲介するNK細胞の能力に基づいてい
る。NK細胞は、一部には細胞表面の抗原に結合したIgG FcドメインのFcγRIIIA認識によ
って、細胞死を仲介する。本発明の方法に従って使用するADCCアッセイは、放射性ベース
のアッセイまたは蛍光ベースのアッセイでもよい。変異型Fc領域を含む本発明の分子を特
徴付けるるために使用するADCCアッセイは以下のステップを含む：標的細胞、例えばSK-B
R-3、MCF-7、OVCAR3、Raji、Daudi細胞を標識すること；標的細胞を、抗原結合部位を介
して標的細胞上の細胞表面受容体を認識する抗体でオプソニン化すること；標識したオプ
ソニン化標的細胞とエフェクター細胞とを適切な比(これは通常の実験操作によって決定
することができる)で混合すること；細胞を回収すること；使用した標識に基づく適切な
検出スキームを使用して、溶解した標的細胞の上清中の標識を検出すること。標的細胞は
当技術分野で知られた標準的方法を使用して、放射性標識または蛍光標識で標識すること
ができる。例えば、標識として、限定するわけではないが、以下が含まれる：[51Cr]Na2C
r04；および蛍光増給リガンドである2,2':6',2''-ターピリジン-6-6''-ジカルボン酸(TDA
)のアセトキシメチルエステル。
【０２０６】
特定の好ましい実施形態では、蛍光増強リガンドである2,2':6',2''-ターピリジン-6-6''
-ジカルボン酸(TDA)のアセトキシメチルエステルで標識した標的細胞に対するADCC活性を
測定するために、時間分解蛍光測定アッセイを使用する。こうした蛍光測定アッセイは、
当技術分野で知られている。例えば、Blombergら、1996, Journal of Immunological Met
hods, 193: 199-206(その全内容を参照として本明細書に組み入れる)を参照されたい。簡
単に述べると、標的細胞を膜透過性TDAのアセトキシメチルジエステルである（ビス(アセ
トキシメチル)2,2':6',2''-ターピリジン-6-6''-ジカルボン酸(BATDA))で標識する。これ
は生細胞の細胞膜を通過して迅速に拡散する。細胞内エステラーゼがエステル基を開裂さ
せ、再生された膜非透過性TDA分子は細胞内に捕捉される。エフェクター細胞および標的
細胞を例えば少なくとも2時間、長くとも3.5時間、37℃、5％ CO2下でインキュベートし
た後、溶解標的細胞から放出されたTDAをEu3+でキレート化し、生成したユーロピウム-TD
Aキレートの蛍光を時間分解蛍光光度計(例えば、Victor 1420, PerkinElmer/Wallace)で
定量する。
【０２０７】
別の特定の実施形態では、複数のエピトープ結合部位、および場合によりFcドメイン（ま
たはその一部）を含む本発明の分子を特徴付けるために使用するADCCアッセイは以下のス
テップを含む： 好ましくは4〜5x106個の標的細胞(例えば、SK-BR-3、MCF-7、OVCAR3、Ra
ji細胞)をビス(アセトキシメチル)2,2':6',2''-ターピリジン-t-6''-ジカルボン酸(DELFI
A BATDA試薬, Perkin Elmer/Wallac)で標識する。最適な標識効率のため、ADCCアッセイ
で使用する標的細胞の数は、好ましくは5x106個を超えないようにすべきである。この細
胞にBATDA試薬を添加し、混合物を37℃、好ましくは5％CO2下で、少なくとも30分間イン
キュベートする。次に細胞を生理学的バッファー（例えば、0.125mMスルフィンピラゾー
ルを含むPBS）、および0.125mMスルフィンピラゾールを含有する培地で洗浄する。次に標
識した標的細胞を、EcγRIIAに特異的なエピトープ結合ドメイン、および場合によりFcド
メイン（またはその一部）を含む本発明の分子でオプソニン化(コート)する。好ましい実
施形態では、ADCCアッセイで使用する分子はまた、細胞表面受容体、腫瘍抗原、または癌
抗原に特異的である。本発明のダイアボディ分子は、セクション5.6.1に列挙するものな
どの癌または腫瘍抗原と特異的に結合することができる。ADCCアッセイで使用する標的細
胞は、本発明のダイアボディが標的細胞の細胞表面受容体と特異的に結合するように、該
ダイアボディに導入されたエピトープ結合部位に従って選択される。
【０２０８】
標的細胞をエフェクター細胞、例えばPBMCに、エフェクター：標的の比が約1：1、10：1
、30：1、50：1、75：1、または100：1になるように添加する。エフェクターおよび標的
細胞を少なくとも2時間、長くとも3.5時間、37℃、5％CO2下でインキュベートする。細胞
上清を回収し、酸性ユーロピウム溶液(例えば、DELFIAユーロピウム溶液, Perkin Elmer/
Wallac)に添加する。生成したユーロピウム-TDAキレートの蛍光を、時間分解蛍光光度計(
例えば、Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac)で定量する。最大放出(MR)および自発放出(
SR)は、標的細胞を、それぞれ1％ TX-100および培地のみとインキュベートすることによ
って測定する。抗体非依存性細胞傷害(AICC)を、試験分子（例えば本発明のダイアボディ
）の不在下で標的およびエフェクター細胞をインキュベーションすることによって測定す
る。各アッセイは、好ましくは3回反復して実施する。比溶解の平均パーセントを以下に
よって算出する：実験放出値(ADCC)-AICC)/(MR-SR)ｘ100。
【０２０９】
本発明は、Fcドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子によるC1qの結合および補
体依存性細胞傷害（CDC）の仲介を特徴づけるための、当技術分野で公知でありかつ本明
細書に例示されるアッセイを包含する。C1q結合性を測定するために、C1q結合ELISAを実
施することができる。例示的なアッセイは、以下のステップを含み得る：アッセイプレー
トを、コーティングバッファー中で本発明の分子または出発ポリペプチド（対照）により
、4℃で一晩コーティングする。次いでこのプレートを洗浄し、ブロックする。洗浄後、
ヒトC1qのアリコートを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートする。さらに洗浄
した後、100μLのヒツジ抗補体C1qペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を各ウェルに添
加し、室温で1時間インキュベートする。プレートを再度洗浄バッファーで洗浄し、OPD（
O-フェニレンジアミン二塩酸塩（Sigma））を含む100μlの基質バッファーを各ウェルに
添加する。黄色の出現によって観察される酸化反応を30分間進行させて、100μlの4.5 NH
2SO4の添加によって該反応を停止させる。次いで吸光度を(492〜405)nmで読み取る。
【０２１０】
補体活性化を評価するために、補体依存性細胞傷害（CDC）アッセイを、例えば参照とし
てその全体を本明細書に組み入れるGazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202:163 (
1996)に記載されるように、実施することができる。簡潔に言うと、(変異型)Fcドメイン
（またはその一部）を含む分子およびヒト補体を様々な濃度にバッファーで希釈する。ダ
イアボディ分子が結合する抗原を発現する細胞は、1ml当たり約1x106細胞の密度に希釈す
る。(変異型)Fcドメイン（またはその一部）を含むダイアボディ分子、希釈したヒト補体
および抗原を発現する細胞の混合物を、平底組織培養96ウェルプレートに添加して、37℃
、5％CO2下で2時間インキュベートさせて、補体介在細胞溶解を促進させる。次いで、50
μLのアラマーブルー（Accumed International）を各ウェルに添加して、37℃で一晩イン
キュベートする。吸光度は530nmの励起および590nmの発光を有する96ウェル蛍光光度計を
用いて測定する。結果は相対蛍光単位（RFU）で表すことができる。サンプル濃度を標準
曲線から求めて、非変異型分子（すなわち、Fcドメインを含まないかまたは非変異型Fcド
メインを含む分子）と比較した活性％を対象の変異体について記録する。
【０２１１】
5.4.3 その他のアッセイ
複数のエピトープ結合ドメイン、および場合によりFcドメイン、を含む本発明の分子は、
抗原結合ドメインまたはFc-FcγR結合の速度論的パラメーターを特徴付けるための、当技
術分野で知られた表面プラズモン共鳴(SPR)に基づくアッセイのいずれかを使用してアッ
セイすることができる。限定するわけではないが以下を含む市販のSPR装置のいずれかを
本発明で使用することができる：Biacore AB製のBIAcore装置(Uppsala, Sweden)；Affini
ty Sensors製のIAsys装置(Franklin, MA.)；Windsor Scientific Limited製のIBISシステ
ム(Berks, UK)；日本レーザ電子製のSPR-CELLIAシステム(北海道、日本)；およびTexas I
nstruments社製のSPR Detector Spreeta(Dallas, TX)。SPRに基づく技法の概説について
は、以下を参照されたい：Mulletら、2000, Methods 22: 77-91；Dongら、2002, Review 
in Mol. Biotech., 82: 303-23；Fivashら、1998, Current Opinion in Biotechnology 9
:97-101；Richら、2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61(その全体を参照
として本明細書中に組み入れる)。さらに、米国特許第6,373,577号；第6,289,286号；第5
,322,798号；第5,341,215号；第6,268,125号(その全体を参照として本明細書中に組み入
れる)に記載されたタンパク質-タンパク質相互作用を測定するためのSPR装置およびSPRに
基づく方法のいずれをも、本発明の方法に含むものとする。
【０２１２】
簡単に述べると、SPRベースのアッセイは、結合ペアの一方を表面に固定化すること、お
よび溶液中の結合ペアの他方との相互作用をリアルタイムでモニタリングすることを含む
。SPRは、複合体の形成または解離時に生じる表面付近での溶媒の屈折率の変化を測定す
ることに基づくものである。固定化を行う表面はセンサーチップであって、これがSPR技
法の心臓部となるものである。これは金の薄層でコートされたガラス表面からなり、分子
の表面への結合性を最適化するように設計された特殊な表面領域の基礎を形成する。様々
なセンサーチップが特に上記の会社から市販されており、これらのすべてを本発明の方法
で使用することができる。センサーチップの例としては、BIAcore AB, Inc.から市販され
ているもの、例えばSensor Chip CM5、SA、NTA、およびHPAが挙げられる。本発明の分子
は、限定するわけではないが、以下を含む、当技術分野で知られた固定化方法および化学
作用を使用して、センサーチップの表面に固定化することができる：アミン基を介した直
接共有結合、スルフヒドリル基を介した直接共有結合、アビジンコート表面へのビオチン
結合、炭水化物基へのアルデヒド結合、およびヒスチジンタグを介したNTAチップとの結
合。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、複数のエピトープ結合部位および場合によりFcドメインを含む
本発明の分子と、抗原またはFcγRとの結合の速度論的パラメーターは、BIAcore装置(例
えば、BIAcore装置1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ)を使用して測定することができ
る。上で述べたように（セクション5.4.1参照）、ダイアボディ分子の少なくとも１つの
エピトープ結合部位がFcγRを免疫特異的に認識する場合、および/またはダイアボディ分
子がFcドメイン（またはその一部）を含む場合、任意のFcγRを使用して本発明の分子の
結合を評価することができる。特定の実施形態では、FcγRはFcγRIIIA、好ましくは可溶
性の単量体FcγRIIIAである。例えば、一実施形態では、可溶性単量体FcγRIIIAは、リン
カー-AVITAG配列に結合されたFcγRIIIAの細胞外領域である(米国仮出願番号60/439,498
号、2003年1月9日出願(代理人整理番号11183-004-888)および米国仮出願番号60/456,041
号、2003年3月19日出願を参照されたい(これらの全体を参照として本明細書中に組み入れ
る))。別の特定の実施形態では、FcγRはFcγRIIB、好ましくは可溶性の二量体FcγRIIB
である。例えば、一実施形態では、可溶性二量体FcγRIIBタンパク質を以下に記載された
方法に従って調製する：米国仮出願番号60/439,709号、2003年1月13日出願(その全体を参
照として本明細書に組み入れる)。
【０２１４】
全ての免疫学的アッセイにおいて、本発明の分子によるFcγRの認識/結合は複数のドメイ
ンによって影響される。ある特定の実施形態では、本発明の分子は複数のエピトープ結合
ドメインのうちの１つを介してFcγRを免疫特異的に認識する。本発明の分子がFcドメイ
ン（またはその一部）を含む、さらに他の実施形態では、ダイアボディ分子はFc-FcγR相
互作用を介してFcγRを免疫特異的に認識することができる。本発明の分子がFcドメイン
（またはその一部）と、FcγRを免疫特異的に認識するエピトープ結合部位の両方を含む
、さらに他の実施形態では、ダイアボディ分子はエピトープ結合ドメインとFcドメイン（
またはその一部）の一方または両方を介してFcγRを認識することができる。複数のエピ
トープ結合部位および場合によりFcドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子の、
抗原および/またはFcγRに対する速度論的パラメーターを、BIAcore装置を用いて測定す
るための例示的なアッセイは、以下を含む：第１の抗原をセンサーチップ表面の4つのフ
ローセルの1つに、好ましくはアミンカップリング化学を介して固定化し、それにより約5
000反応単位(RU)の第１の抗原が表面に固定化されるようにする。好適な表面が調製され
た時点で、第１の抗原を免疫特異的に認識する本発明の分子を、好ましくは20μg/mL溶液
の流速5μL/mLでの1分間の注入によって、該表面を通過させる。この段階で該表面に結合
した本発明の分子のレベルは、一般的に400〜700RUの範囲である。次に、HBS-Pバッファ
ー(20mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, pH 7.5)中の第2の抗原（例えば、FcγR）または
FcγR受容体の一連の希釈系列を表面上に100μL/分で注入する。異なる第2の抗原または
受容体希釈物間での分子の再生は、好ましくは100mM NaHCO3 pH 9.4；3M NaClの1回の5秒
間注入によって行われる。当技術分野で知られたいずれの再生技術も本発明の方法で想定
されている。
【０２１５】
全てのデータセットが収集された時点で、得られる結合曲線を、SPR装置製造元、例えばB
IAcore社(Piscataway, NJ)から供給されているコンピュータアルゴリズムを使用して、包
括的に適合させる。これらのアルゴリズムでは、KonおよびKoffの両方を算出し、これら
から見かけの平衡結合定数Kdを、2つの速度定数の比(すなわち、Koff/Kon)として演繹す
る。個々の速度定数をどのようにして誘導するかについてのさらに詳細な処理法は、BIAe
valuaion Software Handbook(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)から得られる。作成した
データの解析は、当技術分野で知られたどの方法を使用しても実施することができる。作
成した速度論的データを解釈する各種方法の概説については、以下を参照されたい：Mysz
ka, 1997, Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7；Fisherら、1994, Current Opin
ion in Biotechnology 5: 389-95；O'Shannessy, 1994, Current Opinion in Biotechnol
ogy, 5:65-71；Chaikenら、1992, Analytical Biochemistry, 201: 197-210；Mortonら、
1995, Analytical Biochemistry 227: 176-85；O'Shannessyら、1996, Analytical Bioch
emistry 236: 275-83(これらの全体を参照として本明細書中に組み入れる)。
【０２１６】
好ましい実施形態では、SPR分析、例えばBIAcoreを使用して測定した速度論的パラメータ
ーは、本発明の分子が機能的アッセイ、例えばADCC中で、どのように機能するかを予測す
るための指標として使用することができる。SPR分析から取得した速度論的パラメーター
に基づいて本発明の分子の効力を予測するための例示的な方法は、以下を含む：本発明の
分子の（エピトープ結合ドメインおよび/またはFcドメイン（もしくはその一部）を介し
た）FcγRIIIAおよびFcγRIIBとの結合についてのKoff値を測定すること；ADCCデータに
対して、(1) FcγRIIIAについてのKoff(wt)/Koff(mut)；(2) FcγRIIBについてのKoff(mu
t)/Koff(wt)をプロットすること。1よりも高い数値が、野生型と比較して、FcγRIIIAに
ついての減少した解離速度、およびFcγRIIBについての増加した解離速度を示し、増大し
たADCC機能を有することを示す。
【０２１７】
5.5 本発明のダイアボディ分子の製造方法
本発明のダイアボディ分子は、当技術分野で周知の各種方法により製造することができ、
de novoタンパク質合成、結合タンパク質をコードする核酸の組換え発現といった方法が
ある。所望の核酸配列は組換え法（例えば、所望のポリヌクレオチドの以前に作製された
変異体のPCR突然変異誘発）により、または固相DNA合成により得ることができる。通常は
組換え発現が用いられる。ある態様において、本発明はCD16A VHおよび/またはVLをコー
ドする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本発明はCD32B VHおよび
/またはVLをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝子コードの縮重の
ため、それぞれの免疫グロブリンアミノ酸配列を種々の核酸配列がコードしており、本発
明はここに記載する結合タンパク質をコードするあらゆる核酸を包含する。
【０２１８】
5.5.1 本発明の分子をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の分子（ポリペプチドおよび抗体を含む）をコードするポリヌクレオチ
ドをも含む。当技術分野で知られたいずれかの方法により、本発明の分子をコードするポ
リヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することがで
きる。
【０２１９】
本発明の方法によって同定される分子のヌクレオチド配列が決定されたら、そのヌクレオ
チド配列を当技術分野で周知の方法、例えば組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、P
CR等を使用して操作し(例えば以下に記載された技術を参照されたい：Sambrookら、2001,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, C
old Spring Harbor, NY；およびAusubelら編集、1998, Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, NY(これらの両方の全体を参照として本明細書に組み入れ
る))、例えばアミノ酸の置換、欠失、および/または挿入を生じさせることによって、例
えば異なるアミノ酸配列をもつ抗体を作製することができる。
【０２２０】
一実施形態では、ヒトライブラリーまたは当技術分野で利用し得るその他のライブラリー
を当技術分野で知られた標準的技術によってスクリーニングして、本発明の分子をコード
する核酸をクローニングすることができる。
【０２２１】
5.5.2 本発明の分子の組換え発現
本発明の分子（すなわち、抗体）をコードする核酸配列が得られた時点で、該分子を産生
するためのベクターを、組換えDNA技術により当技術分野で周知の技術を用いて作製する
ことができる。当業者に周知の方法を利用して、本発明の分子のコード配列および適当な
転写・翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法
としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝的組換えが挙
げられる（例えば、Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2
版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubelら編, 19
98, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載される技
術を参照されたい）。
【０２２２】
本発明の方法により同定された分子のヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、従来技術
（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カ
ルシウム沈降）により宿主細胞に導入し、次いでトランスフェクトした細胞を従来技術に
より培養して、本発明の分子を産生させることができる。特定の実施形態においては、本
発明の分子の発現を構成的、誘導性、または組織特異的なプロモーターにより制御する。
【０２２３】
本発明の方法により同定された分子を発現させるために利用する宿主細胞は、細菌細胞、
例えば大腸菌（Escherichia coli）であるか、または好ましくは、特に完全な組換え免疫
グロブリン分子を発現させるためには、真核細胞でありうる。特に、哺乳動物細胞、例え
ばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中
間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターとの併用において、免疫グロブリン
のための有効な発現系である（Foeckingら, 1998, Gene 45:101；Cockettら, 1990, Bio/
Technology 8:2）。
【０２２４】
様々な宿主-発現ベクター系を利用して、本発明の方法により同定された分子を発現させ
ることができる。このような宿主-発現系は、本発明の分子のコード配列を産生し、続い
て精製することができるビヒクルに相当するが、適当なヌクレオチドコード配列により形
質転換またはトランスフェクトされると本発明の分子をin situで発現することができる
細胞にも相当する。これらとしては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる
：例えば、本発明の方法により同定された分子のコード配列を含有する組換えバクテリオ
ファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換された細菌
（例えば大腸菌（E.coli）や枯草菌（B. subtilis）等）の微生物；本発明の方法により
同定された分子をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵
母（例えば、サッカロミセス属、ピキア属）；本発明の方法により同定された分子をコー
ドする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染
させた昆虫細胞系；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換
えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）およびタバコ
モザイクウイルス（TMV））を感染させたまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えば
、Tiプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプ
ロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプ
ロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモ
ーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、COS、CHO、BH
K、293、293T、3T3細胞、リンパ球（米国特許第5,807,715号を参照）、Per C.6細胞（Cru
cellにより開発されたヒト網膜細胞））。
【０２２５】
細菌系においては、発現される分子に対して意図される用途に応じて、多くの発現ベクタ
ーを有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を調製するために大量のタ
ンパク質を産生させる必要がある場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レ
ベルの発現を指令するベクターが望ましい。このようなベクターとしては、限定するもの
ではないが、抗体コード配列をベクター中にlacZコード領域と共にインフレームで個々に
連結して融合タンパク質が産生されるようにする大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら, 
1983, EMBO J. 2: 1791）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 
13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙
げられる。また、pGEXベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフ
ェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般的に、このよ
うな融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン-ア
ガロースビーズへの吸着および結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出により容
易に精製することができる。pGEXベクターはトロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計されており、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物をGST成
分から切り離すことが可能である。
【０２２６】
昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Autographa c
alifornica nuclear polyhedrosis virus）（ACNPV）が外来遺伝子を発現させるためのベ
クターとして利用される。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera fru
giperda）細胞中で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘ
ドリン遺伝子）中に個々にクローニングして、AcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリ
ンプロモーター）の制御下に配置させることができる。
【０２２７】
哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。
アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、目的の抗体コード配列を、アデノ
ウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３分節（tripartite）リ
ーダー配列と連結することができる。このキメラ遺伝子を次いでアデノウイルスゲノムに
in vitroまたはin vivo組換えにより挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば
、E1またはE3領域）への挿入により、感染した宿主内で生存可能でありかつ免疫グロブリ
ン分子を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、Logan & Shenk, 198
4, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359を参照されたい）。特定の開始シグナルも、
挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要でありうる。これらのシグナルは、
ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全インサートの翻訳を確
実にするために、目的のコード配列のリーディングフレームと同じフェーズになければな
らない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のものであっ
てよく、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転
写ターミネーターなどを含めることにより増強することができる（Bittnerら, 1987, Met
hods in Enzymol. 153:51-544を参照されたい）。
【０２２８】
さらに、挿入した配列の発現をモジュレートしたり、遺伝子産物を所望の特定の様式で改
変またはプロセシングしたりする宿主細胞株を選択することができる。このようなタンパ
ク質産物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）はタンパク質
の機能にとって重要でありうる。例えば、特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分
子を含むポリペプチドは単一の遺伝子産物として（例えば単一のポリペプチド鎖として、
すなわちポリタンパク質前駆体として）発現させることができるが、かかる単一の遺伝子
産物は本発明のダイアボディ分子の別個のポリペプチドを形成するために天然のまたは組
換えの細胞機構によるタンパク質分解切断を必要とする。したがって、本発明は、本発明
のポリペプチドを含むポリタンパク質前駆体分子をコードする核酸配列（該ポリタンパク
質前駆体の翻訳後切断を指令することができるコード配列を含む）を遺伝子工学的に作製
することを包含する。ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断は本発明のポリペプチドをもた
らす。本発明のポリペプチドを含む前駆体分子の翻訳後切断はin vivo（すなわち、天然
のまたは組換えの細胞系/機構、例えば適切な部位でのフューリン切断、により宿主細胞
内）で起こってもよいし、in vitro（例えば、既知の活性のプロテアーゼもしくはペプチ
ダーゼを含む組成物および/または所望のタンパク質分解作用を促すことが知られている
条件もしくは試薬を含む組成物中での該ポリペプチド鎖のインキュベーション）で起こっ
てもよい。組換えタンパク質の精製および修飾は当技術分野でよく知られており、ポリタ
ンパク質前駆体の設計には当業者が容易に理解しうるいくつかの実施形態が含まれる。上
記の前駆体分子の修飾のためには当技術分野で知られたプロテアーゼまたはペプチダーゼ
を使用することができ、例えば、トロンビン（アミノ酸配列LVPRGS (配列番号91)を認識
する)、またはXa因子（アミノ酸配列I(E/D)GR (配列番号92)を認識する(Naganiら, 1985,
PNAS USA 82:7252-7255、およびJennyら, 2003, Protein Expr. Purif. 31:1-11；その
全内容を参照として本明細書に組み入れる))、エンテロキナーゼ（アミノ酸配列DDDDK (
配列番号93)を認識する(Collins-Racieら, 1995, Biotechnol. 13:982-987；その全内容
を参照として本明細書に組み入れる))、フューリン（アミノ酸配列RXXR^を認識し、RX(K/
R)Rを優先的に認識する（それぞれ配列番号94および配列番号95）（P6位の追加のRは切断
を促進するようである))、およびAcTEV（アミノ酸配列ENLYFQ^G (配列番号96)を認識する
(Parksら, 1994, Anal. Biochem. 216:413；その全内容を参照として本明細書に組み入
れる))、ならびに口蹄疫ウイルスプロテアーゼC3が使用される。例えば、セクション6.4
を参照されたい。
【０２２９】
それぞれの宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に
対する特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系を選ぶことにより、
発現される外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを確実にすることができる。この
ために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化の
ための細胞機構をもつ真核宿主細胞を用いることができる。このような哺乳動物宿主細胞
としては、限定するものではないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T
3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47D、CRL7030およびHs578Bstが挙げられる
。
【０２３０】
組換えタンパク質を長期間、高収率で産生させるためには、安定した発現が好ましい。例
えば、本発明の抗体を安定に発現する細胞株を遺伝子工学的に作製することができる。ウ
イルスの複製起点を含有する発現ベクターを使うよりもむしろ、選択マーカーおよび適当
な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター
、ポリアデニル化部位など）により制御されるDNAで宿主細胞を形質転換する。外来DNAを
導入した後に、遺伝子操作した細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地
に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与するので、
細胞が安定してプラスミドをその染色体中に組み込み、増殖して巣を形成し、続いてクロ
ーニングして細胞株に増やすことが可能である。この方法は、本発明の抗体を発現する細
胞株を遺伝子工学的に作製するために有利に使用することができる。このような遺伝子工
学的に作製された細胞株は、本発明の分子と直接的または間接的に相互作用する化合物を
スクリーニングして評価する上で特に有用である。
【０２３１】
多くの選択系を利用することができ、それらには、限定するものではないが、以下のもの
が含まれる：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）
、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski,
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）遺伝子はそれぞれtk-、hgprt-またはaprt-細
胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性は以下の遺伝子を選択するた
めの基礎として用いることができる：メトトレキセート耐性を与えるdhfr（Wiglerら, 19
80, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O'Hareら, 1981, Proc. NATL. Acad. Sci. US
A 78: 1527）；ミコフェノール酸耐性を与えるgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc. NATL
. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo（Clinical Phar
macy 12:488-505；WuおよびWu, 1991, 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmaco
l. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；MorganおよびAnderso
n, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215)；なら
びにヒグロマイシン耐性を与えるhygro（Santerreら, 1984, Gene 30:147）。組換えDNA
技術の分野で一般的に知られる利用可能な方法は、Ausubelら編, 1993, Current Protoco
ls in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, Gene Transfer an
d Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；ならびに第12および13章, D
racopoliら(編), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY
；Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。
【０２３２】
本発明の分子の発現レベルはベクター増幅により増加させることができる（概要について
は、BebbingtonおよびHentschel, 「DNAクローニングにおける哺乳動物細胞でのクローン
化遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの利用（The use of vectors based
on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in 
DNA cloning）」, Vol.3, Academic Press、New York、1987を参照されたい）。抗体を発
現するベクター系中のマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在する阻
害剤のレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数が増加するだろう。増幅された
領域はダイアボディ分子のポリペプチドのヌクレオチド配列と結びついているので、該ポ
リペプチドの産生も増加するだろう（Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０２３３】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、すなわち、ダイアボディ分子の第１のポリペ
プチドをコードする第１のベクターおよびダイアボディ分子の第２のポリペプチドをコー
ドする第２のベクターで同時トランスフェクトすることができる。これら２つのベクター
は、両方のポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい
。あるいは、両方のポリペプチドをコードする単一のベクターを用いてもよい。本発明の
分子のポリペプチドをコードする配列は、cDNAまたはゲノムDNAでありうる。
【０２３４】
本発明の分子（すなわち、ダイアボディ）が組換えにより発現された時点で、これを、当
技術分野で公知の、ポリペプチド、ポリタンパク質またはダイアボディを精製するための
当技術分野で公知の方法（抗原選択性に基づく抗体精製スキームに類似）のいずれかで精
製することができる。かかる精製法として、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオ
ン交換、アフィニティー、特に（任意で、ダイアボディ分子がFcドメインまたはその一部
を含む場合はプロテインＡによる選択の後に）特異的抗原に対する親和性によるもの、お
よびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはポリペプチ
ド、ポリタンパク質もしくはダイアボディを精製するための他の標準的な技法がある。
【０２３５】
5.6 予防および治療方法
本発明の分子は、FcγRにより仲介されるエフェクター細胞機能（例えば、ADCC）が望ま
れる疾患、障害または感染（例えば、癌、感染性疾患）を治療および/または予防するの
に特に有用である。以下で述べるように、本発明のダイアボディは、Fcドメインを含まな
いにもかかわらず、エフェクター機能を引き出すのに抗体に似た機能性を示しうる。Fcγ
Rを免疫特異的に認識する少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含むことにより、
ダイアボディ分子はFc-FcγR相互作用に類似したFcγR結合および活性を示すことができ
る。例えば、本発明の分子は免疫エフェクター細胞（例えば、NK細胞）上の細胞表面抗原
とFcγR（例えば、FcγRIIIA）と結合して、該細胞に対してエフェクター機能（例えば、
ADCC、CDC、食作用、オプソニン化など）を刺激する。
【０２３６】
他の実施形態において、本発明のダイアボディ分子はFcドメイン（またはその一部）を含
むものである。かかる実施形態では、Fcドメインは野生型Fcドメイン（またはその一部）
に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含み、かつ/または１以上のIgGアイソタ
イプ（例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4）由来のドメインを含むことができる。変異
型Fcドメインを含む本発明の分子は、野生型Fcドメインを含む分子と比べて、賦与された
または改変された表現型、例えば改変されたまたは賦与されたエフェクター機能活性（例
えば、NK依存性またはマクロファージ依存性アッセイでアッセイされる）を示しうる。こ
の実施形態において、エフェクター機能活性が賦与または改変されている本発明の分子は
、エフェクター機能活性の増大した効力が望まれる疾患、障害または感染の治療および/
または予防に有用である。ある特定の実施形態では、Fcドメイン（またはその一部）を含
む本発明のダイアボディ分子が補体依存性カスケードを仲介する。エフェクター機能を改
変するものとして確認されたFcドメイン変異体は、国際出願WO04/063351、米国特許出願
公開2005/0037000および2005/0064514、米国仮出願60/626,510（2004年11月10日出願）、
60/636,663（2004年12月15日出願）、および60/781,564（2006年3月10日出願）、ならび
に米国特許出願11/271,140（2005年11月10日出願）、および11/305,787（2005年12月15日
出願）（本発明者らの同時出願）に開示されており、それぞれの全内容を参照として本明
細書に組み入れる。
【０２３７】
本発明は、被験者に、治療に有効な量の１種以上の分子を投与することを含んでなる、被
験者の癌を治療、予防または管理するための方法ならびに組成物を包含し、前記分子は１
つ以上のエピトープ結合部位および場合により本発明に従って遺伝子操作されたFcドメイ
ン（またはその一部）を含み、かつ該分子は癌抗原とさらに結合する。本発明の分子は原
発性腫瘍、癌細胞の転移、および感染性疾患の予防、阻止、増殖抑制または退行に特に有
用である。特定の作用機構によって束縛されるものではないが、本発明の分子はエフェク
ター機能を仲介して腫瘍の消失、腫瘍の抑制、またはその両方をもたらす。別の実施形態
では、本発明のダイアボディは、細胞表面抗原および/または受容体の架橋およびアポト
ーシスまたは負の増殖調節のシグナル伝達の増加により治療活性を仲介する。
【０２３８】
特定の作用機構によって束縛されるものではないが、本発明のダイアボディ分子は当技術
分野で知られた治療用抗体と比べて増大した治療効力を示すが、これは一部には、例えば
ダイアボディ-エピトープ相互作用の向上した結合力ゆえに標的細胞上により長く留まっ
ているダイアボディの能力によって、ダイアボディが特定の抗原（例えば、FcγR）を低
レベルで発現する標的細胞と免疫特異的に結合できるためである。
【０２３９】
抗原（例えば、FcγR）に対する親和性および結合力が増大している本発明のダイアボデ
ィは、標的細胞集団ではFcγRが低レベルで発現される被験者において、癌または別の疾
患もしくは障害を治療、予防または管理するのに特に有用である。本明細書中で用いる場
合、細胞でのFcγR発現は、細胞あたりの該分子の密度によって定義され、これは当業者
に公知の通常の方法を用いて測定される。複数のエピトープ結合部位、および場合により
FcγR（またはその一部）を含む本発明の分子はまた、好ましくは、標的抗原（例えば、
癌抗原）を30,000〜20,000分子/細胞の密度で、20,000〜10,000分子/細胞の密度で、10,0
00分子/細胞もしくはそれ以下の密度で、5000分子/細胞もしくはそれ以下の密度で、また
は1000分子/細胞もしくはそれ以下の密度で発現する細胞において、結合力および親和性
および/またはエフェクター機能が賦与されているか、または増大されている。本発明の
分子は、標的細胞集団では標的抗原が低レベルで発現される亜集団において、癌のような
疾患または障害を治療、予防または管理するのに特に利用される。
【０２４０】
本発明の分子はまた、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患のような疾患を
治療または予防するための当技術分野で公知の他の治療薬と組み合わせて、有利に使用す
ることもできる。特定の実施形態では、本発明の分子を、例えば該分子と相互作用して免
疫応答を高めるエフェクター細胞の数または活性を増加させるのに役立つ、造血性増殖因
子（例えば、IL-2、IL-3およびIL-7など）、リンホカイン、またはモノクローナルもしく
はキメラ抗体と併用してもよい。本発明の分子はまた、疾患、障害、または感染を治療す
るために用いる1種以上の薬物、例えば抗癌剤、抗炎症剤または抗ウイルス剤と組み合わ
せて有利に利用することもでき、これらは、例えば、以下のセクション5.7に詳述される
。
【０２４１】
5.6.1 癌
本発明は、被験者に治療上有効な量の、複数のエピトープ結合ドメインを含む1種以上の
分子を投与することを含む、被験者の癌を治療または予防するための方法および組成物を
包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、FcγR多型を有する被験者（例えば
、FcγRIIIA-158VまたはFcγRIIIA-158F対立遺伝子についてホモ接合性の被験者）の癌を
治療または予防するための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態において、
本発明は、FcγRIIIA(158F)と免疫特異的に結合する、ダイアボディ分子の少なくとも１
つのエピトープ結合ドメインを工学的に操作することを包含する。他の実施形態では、本
発明は、FcγRIIIA(158V)と免疫特異的に結合する、ダイアボディ分子の少なくとも１つ
のエピトープ結合ドメインを工学的に操作することを包含する。
【０２４２】
標準的なモノクローナル抗体療法の効力は、被験者のFcγR多型に依存する(Cartonら、20
02 Blood, 99: 754-8；Wengら、2003 J Clin Oncol. 21(21): 3940-7；この両者の全体を
参照として本明細書に組み入れる)。これらの受容体はエフェクター細胞の表面上に発現
され、ADCCを仲介する。低親和性の活性化受容体の高親和性対立遺伝子は、ADCCを仲介す
るエフェクター細胞の能力を改善する。Fc-FcγR相互作用に頼ってエフェクター機能を果
たすのとは対照的に、本発明の方法は、低親和性の活性化受容体を免疫特異的に認識する
ように分子を操作して、該分子を特定の多型用に設計することを包含する。これとは別に
、またはこれに加えて、本発明の分子はエフェクター細胞上のFcγRに対して（野生型Fc
ドメインと比べて）増大した親和性を示す変異型Fcドメインを含むように操作してもよい
。本発明の操作された分子は、患者についてそのFcγR多型にかかわらず、よりよい免疫
療法試薬を提供する。
【０２４３】
本発明に従って作製されたダイアボディ分子は、培養細胞系または患者由来のPMBC細胞を
用いたADCCによって試験して、ADCCを増大させるFc変異体の能力を判定する。本明細書に
開示した方法を使用して、標準的ADCCを実施する。Ficoll-Paque勾配(Pharmacia)を使用
して、リンパ球を末梢血から回収する。標的細胞（すなわち、培養細胞系または患者由来
の細胞）にユーロピウム(PerkinElmer)を負荷し、エフェクターとともに37℃で4時間イン
キュベートする。蛍光プレートリーダー(Wallac)を使用して、放出されたユーロピウムを
検出する。得られたADCCデータは、NK細胞介在細胞傷害を誘発する本発明の分子の効力を
示し、どの分子が患者サンプルおよびエルトリエートした（elutriated）単球の両方を用
いて試験できるかを立証する。その後、ADCC活性を誘発させるのに最大の能力を示すダイ
アボディ分子を、患者由来のPBMCを用いたADCCアッセイで試験する。健康なドナー由来の
PBMCがエフェクター細胞として用られる。
【０２４４】
したがって本発明は、癌抗原を免疫特異的に認識するダイアボディ分子を作製することに
よって、癌抗原により特徴付けられる癌を予防または治療する方法を提供するが、該ダイ
アボディ分子はそれ自体が細胞傷害性（アポトーシスまたは増殖性シグナルのダウンレギ
ュレーションを増大させる細胞表面受容体の架橋による）であり、かつ/または本発明に
従ってFcドメインを含み、かつ/または１以上のエフェクター機能（例えば、ADCC、食作
用）を仲介するように作製される。本発明に従って作製されたダイアボディは、細胞傷害
活性(例えば、増大した腫瘍細胞殺傷および/または増大したADCC活性もしくはCDC活性)を
もつので、癌の予防または治療に有用である。
【０２４５】
癌抗原を伴う癌は、癌抗原に結合しかつ細胞傷害性であり、かつ/または本発明の方法に
従って操作したことにより増大したエフェクター機能を示すダイアボディの投与によって
治療または予防することができる。例えば、限定するわけではないが、以下の癌抗原を伴
う癌を本発明の方法および組成物によって治療または予防することができる：KS 1/4 汎
癌腫抗原(Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667；Bumal, 1988, Hybrid
oma 7(4): 407-415)、卵巣癌抗原(CA125)(Yuら、1991, Cancer Res. 51(2): 468-475)、
前立腺酸性ホスフェート(Tailorら、1990, Nucl. Acids Res. 18(16): 4928)、前立腺特
異的抗原(Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910；Is
raeliら、1993, Cancer Res. 53 :227-230)、黒色腫関連抗原p97(Estinら、1989, J. Nat
l. Cancer Instit. 81(6): 445-446)、黒色腫抗原gp75(Vijayasardahlら、1990, J. Exp.
Med. 171(4): 1375-1380)、高分子量黒色腫抗原(HMW-MAA)(Nataliら、1987, Cancer 59:
55-63；Mittelmanら、1990, J. Clin. Invest. 86: 2136-2144)、前立腺特異的膜抗原、
癌胎児性抗原(CEA)(Foonら、1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294)、多形性上皮
ムチン抗原、ヒト乳脂肪小球抗原、結直腸腫瘍関連抗原（例えばCEA、TAG-72(Yokataら、
1992, Cancer Res. 52: 3402-3408)、C017-lA(Ragnhammarら、1993, Int. J.Cancer 53: 
751-758)；GICA 19-9(Herlynら、1982, J. Clin. Immunol. 2: 135)、CTA-1およびLEA）
、バーキットリンパ腫抗原-38.13,CD19(Ghetieら、1994, Blood 83: 1329-1336)、ヒトB-
リンパ腫抗原-CD20(Reffら、1994, Blood 83: 435-445)、CD33 (Sgourosら、1993, J. Nu
cl. Med. 34: 422-430)、黒色腫特異的抗原（例えばガングリオシドGD2(Salehら、1993, 
J. Immunol., 151,3390-3398)、ガングリオシドGD3(Shitaraら、1993, Cancer Immunol. 
Immunother. 36: 373-380)、ガングリオシドGM2(Livingstonら、1994, J. Clin. Oncol. 
12: 1036-1044)、ガングリオシドGM3(Hoonら、1993, Cancer Res. 53: 5244-5250)）、腫
瘍特異的移植型細胞表面抗原(TSTA)（例えばDNA腫瘍ウイルスのT抗原およびRNA腫瘍ウイ
ルスのエンベロープ抗原を始めとするウイルス誘発腫瘍抗原など）、腫瘍胎児抗原-アル
ファフェトプロテイン（例えば結腸のCEA）、膀胱腫瘍胎児抗原(Hellstromら、1985, Can
cer. Res. 45: 2210-2188)、分化抗原（例えばヒト肺癌抗原L6、L20(Hellstromら、1986,
Cancer Res. 46: 3917- 3923)）、線維肉腫の抗原、ヒト白血病T細胞抗原-Gp37(Bhattac
harya-Chatterjeeら、1988, J of Immun. 141: 1398-1403)、新生糖タンパク質、スフィ
ンゴリピド、乳癌抗原（例えばEGFR(上皮成長因子受容体)）、HER2抗原(pl85HER2)、多形
上皮ムチン(PEM)(Hilkensら、1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17: 359)、悪性ヒトリ
ンパ球抗原-APO-1 (Bernhardら、1989, Science 245: 301-304)、分化抗原(Feizi, 1985,
Nature 314: 53-57)（例えば胎児赤血球および初期内胚葉中のI抗原）、胃腺癌中のI(Ma
)、乳房上皮中のM18およびM39、骨髄細胞中のSSEA-1、結直腸癌中のVEP8、VEP9、Myl、VI
M-D5およびD156-22、TRA-1-85(血液型H)、結腸腺癌中のC14、肺腺癌中のF3、胃癌中のAH6
、胚性癌細胞中のYハプテンであるLeY、TL5(血液型A)、A431細胞中のEGF受容体、膵癌中
のElシリーズ(血液型B)、胚性癌細胞中のFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中のCO-514 (血液型L
ea)、腺癌中のNS-10、CO-43(血液型Leb)、G49、EGF受容体、結腸腺癌中のMH2(血液型ALeb
/Ley)、結腸癌、胃癌ムチン中の19.9、骨髄細胞中のT5A7、黒色腫中のR24、胚性癌細胞中
の4.2、GD3、Dl.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、およびMl:22:25:8、ならびに4〜8細胞胚中
のSSEA-3およびSSEA-4。別の実施形態では、抗原は皮膚T細胞リンパ腫からのT細胞受容体
由来ペプチドである(Edelson, 1998, The Cancer Journal 4: 62参照)。
【０２４６】
本発明の方法および組成物によって治療または予防することができる癌およびこれに関連
する疾患には、限定するわけではないが、以下が含まれる：白血病（限定するものではな
いが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、
骨髄単球性、単球性、赤白血球性白血病、および脊髄形成異常症候群など）、慢性白血病
（限定するわけではないが、慢性骨髄性(顆粒球)白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞
白血病など））；真性赤血球増加症；リンパ腫（限定するわけではないが、ホジキン病、
非ホジキン病など）;多発骨髄腫（限定するわけではないが、非定型的多発骨髄腫、非分
泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞
腫など）；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；特徴未確定の単クローングロブ
リン血症；良性単クローングロブリン血症；重鎖病；骨および結合組織肉腫（限定するわ
けではないが、骨部肉腫, 骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維
肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管腫 (血管肉腫)、線維肉腫、カポジ肉腫、平
滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫など）；脳腫瘍（
限定するわけではないが、グリオーマ、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣細胞腫、希突
起グリオーマ、非グリア腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果
体芽腫、初発脳リンパ腫など）；乳癌（限定するわけではないが、腺癌、小葉(小細胞)癌
、管内癌、髄様乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、乳頭癌、ページェット病、および炎症性乳癌
など）；副腎癌、（限定するわけではないが、クロム親和性細胞腫および副腎皮質癌など
）；甲状腺癌（限定するわけではないが、乳頭性もしくは小胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌
および未分化甲状腺癌など）；膵癌、（限定するわけではないが、膵島細胞腫、ガトリノ
ーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドもしく
は膵島細胞腫瘍など）；下垂体癌（限定するわけではないが、クッシング病、プロラクチ
ン分泌腫瘍、末端肥大症、および尿崩症など）；眼の癌（限定するわけではないが、虹彩
黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫などの眼部黒色腫、および網膜芽腫など）；
膣癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫など）；外陰部癌（限
定するわけではないが、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびページェ
ット病など）；子宮頚部癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌、および腺癌など）；
子宮癌（限定するわけではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫など）；卵巣癌（限定する
わけではないが、卵巣上皮癌、境界性腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質腫瘍など）；食道癌
（限定するわけではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌
、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、および燕麦細胞(小細胞)癌など）；胃癌（限定す
るわけではないが、腺癌、菌状(ポリープ状)、潰瘍性、表在性、拡散性、悪性リンパ腫、
脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫など）；結腸癌；直腸癌；肝癌（限定するわけではな
いが、肝細胞癌および肝芽腫など）；胆嚢癌（限定するわけではないが、腺癌など）；胆
管癌（限定するわけではないが、乳頭様、結節性、および拡散性など）；肺癌（限定する
わけではないが、非小細胞肺癌、扁平上皮癌(表皮癌)、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌
など）；精巣癌（限定するわけではないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化性、古典的(典型
的)、精子細胞、非精上皮腫、胎児性癌、奇形腫、絨毛癌(卵黄のう腫瘍)など）；前立腺
癌（限定するわけではないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫など）；陰茎癌；口
腔癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌など）；基底癌；唾液腺癌（限定するわけで
はないが、腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌など）；咽頭癌（限定するわけではない
が、扁平上皮癌、および疣状癌など）；皮膚癌（限定するわけではないが、基底細胞癌、
扁平上皮癌および黒色腫、表在性黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性
黒色腫など）；腎癌（限定するわけではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移
行性細胞癌(腎骨盤および/または子宮)）；ウィルムス腫瘍；膀胱癌（限定するわけでは
ないが、移行性細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫など）。さらに、癌は以下を含む：粘
液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌
、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌(こうした疾患の総
説については、以下を参照されたい：Fislunanら、1985, Medicine, 第2版, J. B. Lippi
ncott Co., Philadelphia およびMurphyら、1997, Informed Decisions: The Complete B
ook of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books 
U.S.A.,Inc., United States of America)。
【０２４７】
したがって、本発明の方法および組成物は、限定するわけではないが、以下を含む多様な
癌またはその他の異常増殖性疾患の治療または予防においても有用である：癌（膀胱、乳
房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、前立腺、子宮頚部、甲状腺および皮膚の癌
を含む）；扁平上皮癌など；リンパ造血系腫瘍、例えば白血病、急性リンパ性白血病、急
性リンパ芽球白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫など；骨髄造
血系腫瘍、例えば急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病など；間葉起源の
腫瘍、例えば線維肉腫および横紋筋肉腫など；その他の腫瘍、例えば黒色腫、精上皮腫、
奇形癌、神経芽腫およびグリオーマなど；中枢および末梢神経系の腫瘍、例えば星状細胞
腫、神経芽腫、グリオーマ、および神経鞘腫など；間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫、横
紋筋肉腫、および骨肉腫など；ならびにその他の腫瘍、例えば黒色腫、色素性乾皮症(、
角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺小胞癌および奇形癌等。アポトーシスの異常に起因する
癌も、本発明の方法および組成物によって治療しうると想定される。こうした癌として、
限定するわけではないが以下が含まれる：小胞腫、p53突然変異を伴う癌、乳房、前立腺
および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに家族性腺腫様ポリープ症および脊髄形成異常
症候群などの前癌性病変。特定の実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵
臓または子宮において、悪性疾患もしくは増殖異常変化(異形成および形成不全等)、また
は過剰増殖性疾患を、本発明の方法および組成物によって治療または予防する。別の特定
の実施形態では、肉腫、黒色腫、または白血病を、本発明の方法および組成物によって治
療または予防する。
【０２４８】
特定の実施形態では、本発明の分子(例えば、複数のエピトープ結合ドメイン、および任
意にFcドメインまたはその一部を含むダイアボディ)は、癌細胞の増殖を、本発明の該分
子の不在下での癌細胞の増殖と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも
90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも
60％、少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも
35％、少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％、または少なくとも10％、抑制
するかまたは減少させる。
【０２４９】
特定の実施形態では、本発明の分子(例えば、複数のエピトープ結合ドメイン、および任
意にFcドメインまたはその一部を含むダイアボディ)は、親分子よりも、少なくとも5％、
少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、
少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、
少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、
または少なくとも100％多く、細胞を殺傷するか、癌細胞の増殖を抑制または軽減する。
【０２５０】
5.6.2 自己免疫疾患および炎症性疾患
いくつかの実施形態において、本発明の分子は、本発明の方法に従って操作された、Fcγ
RIIBに特異的なエピトープ結合ドメインおよび/または変異型Fcドメイン（またはその一
部）を含み、該Fcドメインが野生型Fcドメインと比べてより大きなFcγRIIBに対する親和
性、および低下したFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を示す。そのような
結合特性を有する本発明の分子は、免疫応答の調節、例えば自己免疫疾患または炎症性疾
患に関連する免疫応答の抑制、において有用である。いずれの作用機構にも拘束されるこ
とを意図しないが、FcγRIIBに対する親和性を有する、および/または増大したFcγRIIB
に対する親和性と低下したFcγRIIIAおよび/またはFcγRIIAに対する親和性を有するFcド
メインを含む、本発明の分子は、FcγRに対する活性化応答を弱め、かつ細胞応答性の抑
制をもたらし、したがって自己免疫疾患の治療および/または予防において治療効力を有
すると考えられる。
【０２５１】
本発明はまた、被験者における、炎症性障害に関連する1以上の症状を予防し、治療し、
または管理する方法を提供し、該方法は、1以上の抗炎症薬の、治療上または予防上有効
な量を被験者に投与することをさらに含む。本発明はまた、自己免疫疾患に関連する1以
上の症状を予防し、治療し、または管理する方法を提供し、該方法は、1以上の免疫調節
薬の、治療上または予防上有効な量を被験者に投与することをさらに含む。セクション5.
7は、抗炎症薬および免疫調節薬の非限定的な例を掲げる。
【０２５２】
本発明の分子を投与することにより治療できる自己免疫障害の例は、限定されるものでな
いが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己
免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および睾丸炎、自己免疫
血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎（
celiac sprue-dermatitis）、慢性疲労免疫機能障害症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性
多発性神経障害、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集
素病、クローン病、円板状狼蒼、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎
、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギヤン-バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性
血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニ
エール病、混合結合組織病、多発性硬化症、I型または免疫を介する糖尿病、重症筋無力
症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマ
チ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆
汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サル
コイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトー
デス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブ
ドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎のような血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症を含
む。炎症性障害の例は、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞
性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未
分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的なウイルスまたは細菌感染から生じる
慢性炎症を含む。本明細書のセクション2.2.2に記載の通り、いくつかの自己免疫障害は
炎症性障害と関連している。このように、自己免疫障害と考えられる障害と炎症性障害と
考えられる障害との間には重複がある。従って、いくつかの自己免疫障害は炎症性障害と
しても特徴付けることができる。本発明の方法に従って予防、治療または管理することが
できる炎症性障害の例としては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、
慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関
節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的なウイルスまたは細菌感染か
ら生じる慢性炎症が挙げられる。
【０２５３】
FcγRIIBに特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインおよび/または増大したFc
γRIIB親和性および低下したFcγRIIIA親和性を有する変異型Fcドメインを含む本発明の
分子はさらに、炎症性障害のある動物（特に哺乳動物）が被る炎症を軽減するために使用
することもできる。特定の実施形態では、本発明の分子は動物の炎症を、前記分子を投与
されてない動物の炎症と比較して、少なくとも99％、少なくとも95％、少なくとも90％、
少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、
少なくとも50％、少なくとも45％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも35％、
少なくとも30％、少なくとも25％、少なくとも20％,または少なくとも10％軽減する。
【０２５４】
FcγRIIBに特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインおよび/または増大したFc
γRIIB親和性および低下したFcγRIIIA親和性を有する変異型Fcドメインを含む本発明の
分子はさらに、移植の拒絶反応を防止するために用いることもできる。
【０２５５】
5.6.3 感染性疾患
本発明はまた、被験者における感染症の治療または予防の方法を包含し、該方法は、感染
症と関連した感染性病原体に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む、
1種以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実
施形態において、本発明の分子は感染性病原体に対して毒性であり、該分子の不在下での
免疫応答と比べて、該病原体に対する免疫応答を増強するか、または該病原体に対するエ
フェクター機能を増強する。本発明の分子によって治療または予防し得る感染症は、限定
するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原虫、およびウイルスを含む感染性病原体
により引き起こされる。
【０２５６】
本発明の方法との関連で、本発明の分子を用いて治療または予防し得るウイルス性疾患は
、限定するものでないが、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、イン
フルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、I型単純ヘルペスウイルス（HSV-I
）、II型単純ヘルペスウイルス（HSV-II）、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイ
ルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サ
イトメガロウイルス、エキノウイルス（echinovirus）、アルボウイルス、ハンタウイル
ス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポ
リオウイルス、天然痘ウイルス、エプスタイン-バーウイルス、I型ヒト免疫不全ウイルス
（HIV-I）、II型ヒト免疫不全ウイルス（HIV-II）、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、デ
ング熱または天然痘のようなウイルス性疾患の病原体により引き起こされるものを含む。
【０２５７】
本発明の方法との関連で、本発明の分子を用いて治療または予防し得る細菌性疾患は、限
定するものでないが、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、肺
炎球菌（S. pneumonia）、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）（ライム病）、炭
疽菌（炭疽病）、破傷風菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバクテリ
ウム、破傷風菌、百日咳菌、コレラ菌、ペスト菌、ジフテリア菌、クラミジア、黄色ブド
ウ球菌（S. aureus）およびレジオネラ菌を含む細菌により引き起こされるものを含む。
【０２５８】
本発明の方法との関連で、本発明の分子を用いて治療または予防し得る原虫性疾患は、限
定するものでないが、リーシュマニア、コクシジウム（kokzidioa）、トリパノソーマま
たはマラリア原虫を含む原虫により引き起こされる。
【０２５９】
本発明の方法との関連で、本発明の分子を用いて治療または予防し得る寄生虫性疾患は、
限定するものでないが、クラミジアおよびリケッチアを含む寄生虫により引き起こされる
。
【０２６０】
本発明の1つの態様によれば、感染性病原体に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合
ドメインを含む本発明の分子は、該病原体（例えば病原性タンパク質）に対する抗体エフ
ェクター機能を示す。感染性病原体の例として、限定するものではないが、細菌(例えば
、大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌
（Staphylococcus aureus）、腸球菌（Enterococcus faecials）、カンジダ・アルビカン
ス（Candida albicans）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、スタフィロコ
ッカス・ビリダンス（Staphylococcus viridans）およびシュードモナス・アエルギノー
サ(Pseudomonas aeruginosa))、病原体(例えば、Bリンパ球向性パポバウイルス(LPV)；ボ
ルダテラ・ペルツッシス（Bordatella pertussis）；ボルナ病ウイルス(BDV)；ウシコロ
ナウイルス；脈絡髄膜炎ウイルス；デング熱ウイルス；ウイルス、大腸菌；エボラ；エコ
ーウイルス1；エコーウイルス11(EV)；エンドトキシン(LPS)；腸内細菌；腸内オーファン
ウイルス；腸内ウイルス；ネコ白血病ウイルス；手足口病ウイルス；テナガザル白血病ウ
イルス(GALV)；グラム陰性細菌；ヘリコバクター・ピロリ(Heliocacter pylori)；B型肝
炎ウイルス(HBV)；単純ヘルペスウイルス；HIV-1；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトコロ
ナウイルス；インフルエンザA、BおよびC；レジオネラ菌；リーシュマニア・メキシカー
ナ(Leishmania mexicana)；リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）
；はしかウイルス；髄膜炎菌；麻疹ウイルス；マウス肝炎ウイルス；マウス白血病ウイル
ス;マウスガンマヘルペスウイルス；マウスレトロウイルス;マウスコロナウイルス；マウ
ス肝炎ウイルス；ミコバクテリウム・アビウムM（Mycobacterium avium-M）;リン菌(Neis
seria gonorrhoeae);ニューキャッスル病ウイルス;パーボウイルスB19；熱帯熱マラリア
原虫；ポックスウイルス；シュードモナス；ロタウイルス；サルモネラ・チフィムリウム
（Samonella typhiurium）；赤痢菌；連鎖球菌；T-細胞リンパ球ウイルス1；ワクシニア
ウイルス)が挙げられる。
【０２６１】
5.6.4 解毒
本発明はまた、毒素（例えば、毒性の薬物分子）にさらされた被験者の解毒方法を包含し
、該方法は、毒性の薬物分子に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む
１種以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実
施形態において、本発明の分子の毒素への結合は該毒素の有害な生理学的作用を軽減また
は排除する。さらに他の実施形態では、本発明のダイアボディの毒素への結合は、該ダイ
アボディの不在下での毒素の除去、分解もしくは中和と比べて、毒素の除去、分解もしく
は中和を増大または増強する。本発明の方法に従う免疫毒素療法は、ジゴキシン、PCP、
コカイン、コルヒチン、三環式抗うつ薬を含むがこれらに限らない薬物の過剰投与または
該薬物への曝露を治療するために使用することができる。
【０２６２】
5.7 併用療法
本発明はさらに、限定するわけではないが、現行の標準的および実験的化学療法、ホルモ
ン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法または外科手術を含む、癌、自己免疫疾患
、感染症、または中毒の治療または予防について当業者に知られたその他の療法と併用し
て、本発明の分子を投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子を
、治療上または予防上有効な量の1種以上の薬剤、治療用抗体、または癌、自己免疫疾患
、感染症、もしくは中毒の治療および/または予防について当業者に知られた他の薬剤と
併用して、投与することができる。
【０２６３】
特定の実施形態では、1種以上の本発明の分子を、癌の治療に有用なその他の1種以上の治
療薬と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。「同時に」なる用語は、予防薬ま
たは治療薬の正確な同時投与に限定するものではなく、むしろ本発明の分子とその他の薬
剤を哺乳動物に連続的かつ一定の時間間隔以内に投与して、本発明の分子がその他の薬剤
と共に作用して、これらを別々に投与した場合よりも増大した利益を提供するようにした
ものを意味する。例えば、予防または治療用(例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン
療法または生物学的療法)薬のそれぞれを、同時に、または任意の順序で連続的に、異な
る時点で投与することができる。しかし、同時に投与しない場合は、所望の治療または予
防効果が提供されるように、時間的に十分近接させて投与すべきである。各治療薬は、任
意の適切な形態で、かつ任意の好適な経路で、別々に投与することができる。種々の実施
形態では、予防薬または治療薬を以下のように投与する：1時間未満の間隔、約1時間間隔
、約1時間〜約2時間間隔、約2時間〜約3時間間隔、約3時間〜約4時間間隔、約4時間〜約5
時間間隔、約5時間〜約6時間間隔、約6時間〜約7時間間隔、約7時間〜約8時間間隔、約8
時間〜約9時間間隔、約9時間〜約10時間間隔、約10時間〜約11時間間隔、約11時間〜約12
時間間隔、24時間間隔以下または48時間間隔以下。好ましい実施形態では、2種以上の成
分を患者の同一来診時に投与する。
【０２６４】
別の実施形態では、予防薬または治療薬を、約2〜4日間隔、約4〜6日間隔、約1週間間隔
、約1〜2週間間隔、2週間以上の間隔で、投与する。好ましい実施形態では、予防薬また
は治療薬を、両方の薬剤が依然活性である時間枠内に、投与する。当業者ならば、投与す
る薬剤の半減期を測定することによって、こうした時間を決定することができるだろう。
【０２６５】
特定の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、被験者に周期的に投与する。周期
的治療には、第1薬剤をある期間投与した後、第2薬剤および/または第3薬剤をある期間投
与し、この連続投与を反復することを含む。周期的治療は、1種以上の療法に対する耐性
の進行を減少させ、療法の1つの副作用を回避するかまたは減少させ、かつ/または治療の
効力を向上させることができる。
【０２６６】
ある実施形態では、予防薬または治療薬を、約3週間未満の周期で、約2週間毎に1回、約1
0日毎に1回、または約1週間毎に1回、投与する。1周期には、周期毎に約90分間、周期毎
に約1時間、周期毎に約45分間かけて注入することによる、治療薬または予防薬の投与が
含まれる。各周期は少なくとも1週間の休止、少なくとも2週間の休止、少なくとも3週間
の休止期を含む。投与する周期の回数は約1〜約12周期、より典型的には約2〜約10周期、
より典型的には約2〜約8周期である。
【０２６７】
さらに別の実施形態では、本発明の治療および予防薬を、メトロノーム的投薬方式で、長
期の休止期間を置かない連続注入または頻繁投与のいずれかによって投与する。こうした
メトロノーム的投与には、休止期間のない、一定の間隔での投薬が含まれうる。典型的に
は、治療薬、特に細胞傷害薬を低用量で使用する。こうした投薬方式には、長期間の比較
的低用量の連日投与が含まれる。好ましい実施形態では、低用量の使用は、毒性副作用を
最少にし、休止期間を排除することができる。特定の実施形態では、治療および予防薬は
、以下の範囲で、連日低用量投与または連続注入によって送達される：約24時間から約2
日まで、約1週間まで、約2週間まで、約3週間まで、約1ヶ月まで、約2ヶ月まで、約3ヶ月
まで、約4ヶ月まで、約5ヶ月まで、約6ヶ月まで。こうした投薬方式のスケジュールは腫
瘍専門家が最適化することができる。
【０２６８】
別の実施形態では、複数の治療コースを哺乳動物に同時に投与する。すなわち、個別の用
量の治療薬を別々に投与するけれども、本発明の分子が別の薬剤と協同して作用できるよ
うな時間間隔内に投与する。例えば、ある成分を1週間に1回投与し、それと組み合わせて
、別の成分を2週間毎に1回、または3週間毎に1回投与してもよい。言い換えれば、治療薬
の投薬レジメンは、治療薬が同時にまたは患者の同一来診時に投与されないときでさえ、
同時に実施される。
【０２６９】
他の予防および/または治療薬と併用する場合、本発明の分子と他の予防および/または治
療薬は相加的に、より好ましくは相乗的に、作用することができる。1つの実施形態では
、本発明の分子を1以上の治療薬とともに同一の医薬組成物中で同時に投与する。別の実
施形態では、本発明の分子を1以上の治療薬とともに別々の医薬組成物として同時に投与
する。さらに別の実施形態では、本発明の分子を、他の予防または治療薬の投与前、また
はその後に投与する。本発明は、同一または異なる投与経路、例えば経口および非経口で
、本発明の分子を他の予防または治療薬と併用して投与することを想定している。特定の
実施形態では、本発明の分子を、限定するわけではないが、毒性などの有害副作用をもた
らす可能性がある他の予防または治療薬と同時に投与する場合、その予防または治療薬は
、有害副作用が誘発される閾値より低い用量で投与することが有利である。
【０２７０】
本明細書で提供する投薬量および投与頻度は、治療上有効なおよび予防上有効なという用
語により包含されている。投薬量および頻度はさらに、典型的には各患者に特有な要因に
従って、投与する特定の治療または予防薬、癌の重篤度およびタイプ、投与経路、ならび
に患者の年齢、体重、応答性、および過去の病歴に応じて、変更されよう。好適な治療計
画は、こうした要因を考慮し、例えば文献に報告され、また以下で推奨されている投薬量
に従うことによって、当業者が選択し得るものである：Physician's Desk Reference (第
56版, 2002)。
【０２７１】
5.7.1 抗癌剤
特定の実施形態では、本発明の方法は、1以上の本発明の分子を、癌の治療および/または
予防のために使用される1以上の治療薬とともに投与することを包含する。1つの実施形態
では、血管新生阻害薬を本発明の分子と併用して投与することができる。本発明の方法お
よび組成物中で使用することができる血管新生阻害薬としては、限定するわけではないが
以下が含まれる：アンギオスタチン(Angiostatin)(プラスミノーゲン断片)；抗血管新生
抗トロンビンIII；アンギオザイム(Angiozyme)；ABT-627；Bay 12-9566；ベネフィン(Ben
efin)；ベバシズマブ(Bevacizumab)；BMS- 275291；軟骨由来阻害薬(CDI)；CAI；CD59 補
体断片；CEP-7055；Col 3；コンブレタスタチン(Combretastatin)A-4；エンドスタチン(
コラーゲンXVIII断片)；フィブロネクチン断片；Gro-β；ハロフギノン(Halofuginone)；
ヘパリナーゼ類；ヘパリンヘキササッカライド断片；HMV833；ヒト絨毛性ゴナドトロピン
(hCG)；IM-862；インターフェロンα/β/γ；インターフェロン誘導性タンパク質 (IP-10
)；インターロイキン-12；クリングル(Kringle)5(プラスミノーゲン断片)；マリマスタッ
ト(Marimastat)；メタロプロテイナーゼ阻害薬(TIMPs)；2-メトキシエストラジオール；M
MI 270(CGS 27023A)；MoAb IMC-1C11；ネオバスタット(Neovastat)；NM-3；パンゼム(Pan
zem)；PI-88；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；血小
板因子-4(PF4)；プリノマスタット(Prinomastat)；プロラクチン16kDa断片；プロリフェ
リン(Proliferin)関連タンパク質(PRP)；PTK787/ZK 222594；レチノイド；ソリマスタッ
ト(Solimastat)；スクアラミン(Squalamine)；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；テ
トラヒドロコルチゾール-S；テトラチオモリブダート；サリドマイド；トロンボスポンジ
ン-1(TSP-1)；TNP-470；トランスフォーミング増殖因子β(TGF-b)；バスキュロスタチン(
Vasculostatin)；バソスタチン(Vasostatin)(カルレチキュリン断片)；ZD6126；ZD 6474
；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬(FTI)；およびビスホスホナート類。
【０２７２】
本発明の医薬組成物および剤形ならびにキットを含む、本発明の各種の実施形態において
本発明の分子と併用して使用することができる抗癌薬としては、限定するわけではないが
以下が含まれる：アシビシン(acivicin)；アクラルビシン(aclarubicin)；塩酸アコダゾ
ール(acodazole)；アクロニン(acronine)；アドゼレシン(adozelesin)；アルデスロイキ
ン(aldesleukin)；アルトレタミン(altretamine)；アンボマイシン(ambomycin)；酢酸ア
メタントロン(ametantrone)；アミノグルテチミド(aminoglutethimide)；アンサクリン(a
msacrine)；アナストロゾール(anastrozole)；アントラマイシン(anthramycin)；アスパ
ラギナーゼ；アスペルリン(asperlin)；アザシチジン(azacitidine)；アゼテパ(azetepa)
；アゾトマイシン(azotomycin)；バチマスタット(batimastat)；ベンゾデパ(benzodepa)
；ビカルタミド(bicalutamide)；塩酸ビサントレン(bisantrene)；ジメシル酸ビスナフィ
ド(bisnafide)；ビゼレシン(bizelesin)；硫酸ブレオマイシン(bleomycin)；ナトリウム
ブレキナル(brequinar)；ブロピリミン(bropirimine)；ブスルファン(busulfan)；カクチ
ノマイシン(cactinomycin)；カルステロン(calusterone)；カラセミド(caracemide)；カ
ルベチメル(carbetimer)；カルボプラチン(carboplatin);カルムスチン(carmustine) ；
塩酸カルビシン(carubicin)；カルゼレシン(carzelesin)；セデフィンゴル(cedefingol)
；クロランブシル(chlorambucil)；シロレマイシン(cirolemycin)；シスプラチン(cispla
tin)；クラドリビン(cladribine)；メシル酸クリスナトル(crisnatol)；シクロホスファ
ミド；シタラビン(cytarabine)；ダカルバジン(dacarbazine)；ダクチノマイシン(dactin
omycin)；塩酸ダウノルビシン(daunorubicin)；デシタビン(decitabine)；デキソルマプ
ラチン(dexormaplatin)；デザグアニン(dezaguanine)；メシル酸デザグアニン(dezaguani
ne)；ジアジクオン(diaziquone)；ドセタキセル(docetaxel)；ドキソルビシン(doxorubic
in)；塩酸ドキソルビシン(doxorubicin)；ドロロキシフェン(droloxifene)；クエン酸ド
ロロキシフェン(droloxifene)；プロピオン酸ドロモスタノロン(dromostanolone)；ジュ
アゾマイシン(duazomycin)；エダトレキサート(edatrexate)；塩酸エフロルニチン(eflor
nithine)；エルサミトルシン(elsamitrucin)；エンドプラチン(enloplatin)；エンプロマ
ート(enpromate)；エピプロピジン(epipropidine)；塩酸エピルビシン(epirubicin)；エ
ルブロゾール(erbulozole)；塩酸エソルビシン(esorubicin)；エストラムスチン(estramu
stine)；リン酸エストラムスチン(estramustine)ナトリウム；エタニダゾール(etanidazo
le)；エトポシド(etoposide)；リン酸エトポシド(etoposide)；エトプリン(etoprine)；
塩酸ファドロゾール(fadrozole)；ファザラビン(fazarabine)；フェンレチニド(fenretin
ide)；フロキシウリジン(floxuridine)；リン酸フルダラビン(fludarabine)；フルオロウ
ラシル；フルロシタビン(flurocitabine)；フォスキドン(fosquidone)；ナトリウムフォ
ストリエシン(fostriecin)；ゲムシタビン(gemcitabine)；塩酸ゲムシタビン(gemcitabin
e)；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン(idarubicin)；イフォスファミド(ifosfamide)
；イルモフォシン(ilmofosine)；インターロイキンII(組換えインターロイキンII、また
はrIL2を含む)、インターフェロンα-2a；インターフェロンα-2b；インターフェロンα-
nl；インターフェロンα-n3；インターフェロンβ-Ia；インターフェロンγ-Ib；イプロ
プラチン(iproplatin)；塩酸イリノテカン(irinotecan)；酢酸ランレオチド(lanreotide)
；レトロゾール(letrozole)；酢酸ロイプロリド(leuprolide)；塩酸リアロゾール(liaroz
ole)；ロメトレキソル(lometrexol)ナトリウム；ロムスチン(lomustine)；塩酸ロソキサ
ントロン(losoxantrone)；マソプロコル(masoprocol)；メイタンシン(maytansine)；塩酸
メクロレタミン(mechlorethamine)；酢酸メゲストロル(megestrol)；酢酸メレンゲストロ
ル(melengestrol)；メルファラン(melphalan)；メノガリル(menogaril)；メルカプトプリ
ン ；メトトレキサート；ナトリウムメトトレキサート；メトプリン(metoprine)；メツレ
デパ(meturedepa)；ミチンドミド(mitindomide)；ミトカルシン(mitocarcin)；ミトクロ
ミン(mitocromin)；ミトギリン(mitogillin)；ミトマルシン(mitomalcin)；マイトマイシ
ン；ミトスペル(mitosper)；ミトタン(mitotane)；塩酸ミトキサントロン(mitoxantrone)
；ミコフェノール酸(mycophenolic acid)；ノコダゾール(nocodazole)；ノガラマイシン(
nogalamycin)；オルマプラチン(ormaplatin)；オキシスラン(oxisuran)；パクリタキセル
(paclitaxel)；ペガスパルガーゼ(pegaspargase)；ペリオマイシン(peliomycin)；ペンタ
ムスチン(pentamustine)；硫酸ペプロマイシン(peplomycin)；ペルホスファミド(perfosf
amide)；ピポブロマン(pipobroman)；ピポスルファン(piposulfan)；塩酸ピロキサントロ
ン(piroxantrone)；プリカマイシン(plicamycin)；プロメスタン(plomestane)；ポルフィ
マー(porfimer)ナトリウム；ポルフィロマイシン(porfiromycin)；プレドニムスチン(pre
dnimustine)；塩酸プロカルバジン(procarbazine)；ピューロマイシン(puromycin)；塩酸
ピューロマイシン(puromycin)；ピラゾフリン(pyrazofurin)；リボプリン(riboprine)；
ログレチミド(rogletimide)；サフィンゴル(safingol)；塩酸サフィンゴル(safingol)；
セムスチン(semustine)；シントラゼン(simtrazene)；ナトリウムスパルフォサート(spar
fosate)；スパルソマイシン(sparsomycin)；塩酸スピロゲルマニウム(spirogermanium)；
スピロムスチン(spiromustine)；スピロプラチン(spiroplatin)；ストレプトニグリン(st
reptonigrin)；ストレプトゾシン(streptozocin)；スロフェヌル(sulofenur)；タリソマ
イシン(talisomycin);テコガラン(tecogalan)ナトリウム；テガフル(tegafur)；塩酸テロ
キサントロン(teloxantrone)；テモポルフィン(temoporfin)；テニポシド(teniposide)；
テロキシロン(teroxirone)；テストラクトン(testolactone)；チアミプリン(thiamiprine
)；チオグアニン(thioguanine)；チオテパ(thiotepa)；チアゾフリン(tiazofurin)；チラ
パザミン(tirapazamine)；クエン酸トレミフェン(toremifene)；酢酸トレストロン(trest
olone)；リン酸トリシリビン(triciribine)；トリメトレキサート(trimetrexate)；グル
クロン酸トリメトレキサート(trimetrexate)；トリプトレリン(triptorelin)；塩酸ツブ
ロゾール(tubulozole)；ウラシルマスタード(uracil mustard)；ウレデパ(uredepa)；バ
プレオチド(vapreotide)；ベルテポルフィン(verteporfin)；硫酸ビンブラスチン(vinbla
stine)；硫酸ビンクリスチン(vincristine)；ビンデシン(vindesine)；硫酸ビンデシン(v
indesine)；硫酸ビンエピジン(vinepidine)；硫酸ビングリシナート(vinglycinate)；硫
酸ビンレウロシン(vinleurosine)；酒石酸ビノレルビン(vinorelbine)；硫酸ビンロシジ
ン(vinrosidine)；硫酸ビンゾリジン(vinzolidine)；ボロゾール(vorozole)；ゼニプラチ
ン(zeniplatin)；ジノスタチン(zinostatin)；塩酸ゾルビシン(zorubicin)。その他の抗
癌薬として、限定するわけではないが、以下が含まれる:20-エピ-1,25ジヒドロキシビタ
ミンD3 ；5-エチニルウラシル；アビラテロン(abiraterone)；アクラルビシン(aclarubic
in)；アシルフルベン(acylfulvene)；アデシペノル(adecypenol)；アドゼレシン(adozele
sin)；アルデスロイキン(aldesleukin)；ALL-TK拮抗薬；アルトレタミン；アンバムスチ
ン(ambamustine)；アミドックス(amidox)；アミフォスチン(amifostine)；アミノレブリ
ン酸；アンルビシン(amrubicin)；アンサクリン(amsacrine)；アナグレリド(anagrelide)
；アナストロゾール(anastrozole)；アンドログラホリド(andrographolide)；血管形成阻
害薬；拮抗薬D；拮抗薬G；アンタレリクス(antarelix)；抗背方化形態発生タンパク質-1 
；抗アンドロゲン前立腺癌；抗エストロゲン；抗ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌ
クレオチド；グリシン酸アフィジコリン(aphidicolin)；アポトーシス遺伝子モジュレー
ター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；アラ-CDP-DL-PTBA；アルギニンデアミ
ナーゼ；アシュラクリン(asulacrine)；アタメスタン(atamestane)；アトリムスチン(atr
imustine)；アキシナスタチン(axinastatin)1；アキシナスタチン2 ；アキシナスタチン3
；アザセトロン(azasetron)；アザトキシン(azatoxin)；アザチロシン(azatyrosine)；
バッカチンIII誘導体；バラノル(balanol)；バチマスタット(batimastat)；BCR/ABL拮抗
薬；ベンゾクロリン類；ベンゾイルスタウロスポリン(benzoylstaurosporine)；βラクタ
ム誘導体；βアレチン(beta-alethine)；βクラマイシン(betaclamycin)B；ベチュリン酸
；bFGF阻害薬；ビカルタミド(bicalutamide)；ビサントレン(bisantrene)；ビサジリジニ
ルスペルミン(bisaziridinylspermine)；ビスナフィド(bisnafide)；ビストラテン(bistr
atene)A；ビゼレシン(bizelesin)；ブレフラート(breflate)；ブロピリミン(bropirimine
)；ブドチタン(budotitane)；ブチオニンスルホキシイミン(buthionine sulfoximine)；
カルシポトリオル(calcipotriol)；カルホスチン(calphostin)C；カンプトテシン(campto
thecin)誘導体；カナリポクス(canarypox)IL-2；カペシタビン(capecitabine)；カルボキ
サミド-アミノ-トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；CaRest M3；CARN 700；
軟骨由来阻害薬；カルゼレシン(carzelesin)；カゼインキナーゼ阻害薬(ICOS)；カスタノ
スペルミン(castanospermine)；セクロピン(cecropin)B；セトロレリクス(cetrorelix)；
クロルン(chlorlns)；クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト(cicaprost)；ci
sポルフィリン；クラドリビン(cladribine)；クロミフェン(clomifene)類似体；クロトリ
マゾール(clotrimazole)；コリスマイシン(collismycin)A；コリスマイシンB；コンブレ
タスタチン(combretastatin)A4；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン(conagenin)；
クランベシジン(crambescidin)816；クリスナトル(crisnatol)；クリプトフィシン(crypt
ophycin)8；クリプトフィシンA誘導体；キュラシン(curacin)A；シクロペンタアントラキ
ノン類；シクロプラタム(cycloplatam)；シペマイシン(cypemycin)；シタラビンオクホス
ファート(cytarabineocfosfate)；細胞溶解因子；シトスタチン(cytostatin)；ダクリキ
シマブ(dacliximab)；デシタビン(decitabine)；デヒドロジデムニン(dehydrodidemnin)B
；デスロレリン(deslorelin)；デキサメタゾン(dexamethasone)；デキシホスファミド(de
xifosfamide)；デクスラゾキサン(dexrazoxane)；デクスベラパミル(dexverapamil)；ジ
アジクオン(diaziquone)；ジデミン(didemnin)B ；ジドクス(didox)；ジエチルノルスペ
ニン(diethylnorspennine)；ジヒドロ-5-アザシチジン；ジヒドロタキソール,9- ；ジオ
キサマイシン(dioxamycin)；ジフェニルスピロムスチン(diphenyl spiromustine)；ドセ
タキセル(docetaxel)；ドコサノル(docosanol)；ドラセトロン(dolasetron)；ドキシフル
リジン(doxifluridine)；ドロロキシフェン(droloxifene)；ドロナビノル(dronabinol)；
ジュオカルマイシン(duocarmycin)SA；エブセレン(ebselen)；エコムスチン(ecomustine)
；エデルフォシン(edelfosine)；エドレコロマブ(edrecolomab)；エフロルニチン(eflorn
ithine)；エレメン(elemene)；エミテフル(emitefur)；エピルビシン(epirubicin)；エプ
リステリド(epristeride)；エストラムスチン(estramustine)類似体；エストロゲン作動
薬；エストロゲン拮抗薬；エタニダゾール(etanidazole)；リン酸エトポシド(etoposide)
；エキセメスタン(exemestane)；ファドロゾール(fadrozole);ファザラビン(fazarabine)
；フェンレチニド(fenretinide)；フィルグラスチム(filgrastim)；フィナステリド(fina
steride)；フラボピリドル(flavopiridol)；フレゼラスチン(flezelastine)；フルアステ
ロン(fluasterone)；フルダラビン(fludarabine) ；塩酸フルロダウノルニシン(fluoroda
unorunicin)；ホルフェニメクス(forfenimex)；ホルメスタン(formestane)；ホストリエ
シン(fostriecin)；ホテムスチン(fotemustine)；テキサフィリンガドリニウム(gadolini
um texaphyrin)；硝酸ガリウム；ガロシタビン(ga
locitabine)；ガニレリクス(ganirelix)；ゲラチナーゼ阻害薬；ゲムシタビン(gemcitabi
ne)；グルタチオン阻害薬；ヘプスルファム(hepsulfam)；ヘレグリン(heregulin)；ヘキ
サメチレンビスアセトアミド；ハイペリシン(hypericin)；イバンドロン酸；イダルビシ
ン(idarubicin)；イドキシフェン(idoxifene)；イドラマントン(idramantone)；イルモフ
ォシン(ilmofosine)；イロマスタット(ilomastat)；イミダゾアクリドン類；イミキモド(
imiquimod)；免疫刺激ペプチド類；インスリン様成長因子-1受容体阻害薬；インターフェ
ロン作動薬；インターフェロン類；インターロイキン類；イオベングアン(iobenguane)；
ヨードドキソルビシン(iododoxorubicin)；イポメアノル(ipomeanol),4-；イロプラクト(
iroplact)；イルソグラジン(irsogladine)；イソベンガゾール(isobengazole)；イソホモ
ハリコンドリン(isohomohalicondrin)B；イタセトロン(itasetron)；ジャスプラキノリド
(jasplakinolide)；カハラリド(kahalalide)F；3酢酸ラメラリン(lamellarin)-N；ランレ
オチド(lanreotide)；レイナマイシン(leinamycin)；レノグラスチム(lenograstim)；硫
酸レンチナン(lentinan)；レプトルスタチン(leptolstatin)；レトロゾール(letrozole)
；白血病抑制因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド+エストロゲン+プロゲステ
ロン；ロイプロレリン(leuprorelin)；レバミソール(levamisole)；リアロゾール(liaroz
ole)；線状ポリアミン類似体；親油性ジサッカライドペプチド；親油性白金化合物；リソ
クリナミド(lissoclinamide)7；ロバプラチン(lobaplatin)；ロンブリシン(lombricine)
；ロメトレキソル(lometrexol)；ロニダミン(lonidamine)；ロソキサントロン(losoxantr
one)；ロバスタチン(lovastatin)；ロキソリビン(loxoribine)；ルルトテカン(lurtoteca
n);テキサフィリンルテチウム(lutetium texaphyrin)；リソフィリン(lysofylline) ；溶
解性ペプチド類；マイタンシン(maitansine)；マンノスタチン(mannostatin)A；マリマス
タット(marimastat)；マソプロコル(masoprocol)；マスピン(maspin)；マトリリシン(mat
rilysin)阻害薬；マトリックス金属プロテイナーゼ阻害薬；メノガリル(menogaril)；メ
ルバロン(merbarone)；メテレリン(meterelin)；メチオニナーゼ；メトクロプラミド(met
oclopramide)；MIF阻害薬；ミフェプリストン(mifepristone)；ミルテホシン(miltefosin
e)；ミリモスチム(mirimostim)；ミスマッチ二本鎖RNA；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミ
トラクトル(mitolactol)；マイトマイシン類似体；ミトナフィド(mitonafide)；マイトト
キシン線維芽成長因子-サポリン(saporin)；ミトキサントロン(mitoxantrone)；モファロ
テン(mofarotene)；モルグラモスチム(molgramostim)；モノクローナル抗体、ヒト絨毛ゴ
ナドトロフィン；モノホスホリルリピドA+ミオバクテリウム細胞壁sk；モピダモル(mopid
amol)；多重薬剤耐性遺伝子阻害薬；多発性腫瘍抑制因子1ベースの治療；マスタード抗癌
薬；マイカペルオキシドB；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン(myriaporone)
；N-アセチルジナリン(acetyldinaline)；N-置換ベンズアミド類；ナファレリン(nafarel
in)；ナグレスチップ(nagrestip)；ナロキソン(naloxone)+ペンタゾシン(pentazocine)；
ナパビン(napavin)；ナフテルピン(naphterpin)；ナルトグラスチム(nartograstim)；ネ
ダプラチン(nedaplatin)；ネモルビシン(nemorubicin)；ネリドロン酸；中性エンドペプ
チダーゼ；ニルタミド(nilutamide)；ニサマイシン(nisamycin)；一酸化窒素モジュレー
ター；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン(nitrullyn)；06-ベンジルグアニン；オクトレ
オチド(octreotide)；オキセノン(okicenone)；オリゴヌクレオチド類；オナプリストン(
onapristone)；オンダンセトロン(ondansetron)；オンダンセトロン(ondansetron)；オラ
シン(oracin)；経口サイトカイン誘導薬；オルマプラチン(ormaplatin)；オサテロン(osa
terone)；オキサリプラチン(oxaliplatin)；オキサウノマイシン(oxaunomycin)；パクリ
タキセル(paclitaxel)；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体類 ；パラウアミ
ン(palauamine)；パルミトイルリゾキシン(palmitoylrhizoxin)；パミドロン酸；パナキ
シトリオール；パノミフェン(panomifene)；パラバクチン(parabactin)；パゼリプチン(p
azelliptine)；ぺグアスパルガーゼ(pegaspargase)；ペルデシン(peldesine)；ポリ硫酸
ペントサンナトリウム；ペントスタチン(pentostatin)；ペントロゾール(pentrozole)；
パーフルブロン(perflubron)；パーホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイ
シン(phenazinomycin)；酢酸フェニル；リン酸塩阻害薬；ピシバニル(picibanil)；塩酸
ピロカルピン(pilocarpine)；ピラルビシン(pirarubicin)；ピリトレキシム(piritrexim)
；プラセチン(placetin)A；プラセチンB；プラスミノーゲン活性化因子阻害薬；白金複合
体；白金化合物；白金-トリアミン複合体；ポルフィマー(porfimer)ナトリウム；ポルフ
ィロマイシン(porfiromycin)；プレドニゾン(prednisone)；プロピルbis-アクリドン；プ
ロスタグランジンJ2；プロテアソーム阻害薬；タンパク質Aベースの免疫モジュレーター
；タンパク質キナーゼC阻害薬；タンパク質キナーゼC阻害薬類、ミクロアルガル(microal
gal)；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻
害薬；プルプリン類；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチ
レンコンジュゲート；raf拮抗薬；ラルチトレキセド(raltitrexed)；ラモセトロン(ramos
etron)；rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬；ras阻害薬；ras-GAP阻
害薬；脱メチル化レテリプチン(retelliptine)；レニウムRe186エチドロナート；リゾキ
シン(rhizoxin)；リボザイム類；RIIレチナミド(retinamide)；ログレチミド(rogletimid
e)；ロヒツキン(rohitukine)；ロムルチド(romurtide)；ロキニメクス(roquinimex)；ル
ビギノン(rubiginone)Bl；ルボキシル(ruboxyl)；サフィンゴル(safingol)；サイントピ
ン(saintopin)；SarCNU；サルコフィトル(sarcophytol)A；サルグラモスチン(sargramost
im)；Sdi 1模倣体；セムスチン(semustine)；セネセンス誘導阻害薬1；センスオリゴヌク
レオチド類；シグナル導入阻害薬；シグナル導入モジュレーター；一本鎖抗原結合性タン
パク質；シゾフィラン(sizofiran)；ソブゾキサン(sobuzoxane)；ボロカプト酸ナトリウ
ム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロル(solverol)；ソマトメジン結合性タンパク質；
ソネルミン(sonermin)；スパルホジン酸(sparfosic acid)；スピカマイシンD；スピロム
スチン(spiromustine)；スプレノペンチン(splenopentin)；スポンギスタチン(spongista
tin)1；スクアラミン；幹細胞阻害薬；幹細胞分裂阻害薬；スチピアミド(stipiamide)；
ストロメリシン(stromelysin)阻害薬；スルフィノシン(sulfinosine)；高作用性血管作用
性腸内ペプチド拮抗薬；スラジスタ(suradista)；スラミン(suramin)；スウェインソニン
(swainsonine)；合成グリコサミンオグリカン；タリムスチン(tallimustine)；タモキシ
フェンメチオジド(tamoxifen methiodide)；タウロムスチン(tauromustine)；タザロテン
(tazarotene);テコガラン(tecogalan)ナトリウム；テガフル(tegafur)；テルラピリリウ
ム(tellurapyrylium)；テロメラーゼ阻害薬;テモポルフィン(temoporfin)；テモゾロミド
(temozolomide)；テニポシド(teniposide)；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン(t
etrazomine)；タリブラスチン(thaliblastine)；チオコラリン(thiocoraline)；トロンボ
ポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン(thymalfasin)；チモポエチン(thym
opoietin)受容体作動薬；チモトリナン(thymotrinan) ；甲状腺刺激ホルモン；チエニル
エチオプルプリン；チラパザミン(tirapazamine)；2塩化チタノセン；トプセンチン(tops
entin)；トレミフェン(toremifene)；全能性幹細胞因子；翻訳阻害薬；トレチノイン(tre
tinoin)；トリアセチルウリジン；トリシリビン(triciribine)；トリメトレキサート；ト
リプトレリン(triptorelin)；トロピセトロン(tropisetron)；ツロステリド(turosteride
)；チロシンキナーゼ阻害薬；チルホスチン類；UBC阻害薬；ウベニメクス(ubenimex)；尿
生殖洞由来成長抑制因子；ウロキナーゼ受容体拮抗薬；バプレオチド(vapreotide)；バリ
オリン(variolin)B；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療；ベラレソル(velaresol)；ベ
ラミン(veramine)；ベルジン類；ベルテポルフィン(verteporfin)；ビノレルビン(vinore
lbine)；ビンキサルチン(vinxaltine)；ビタキシン(vitaxin)；ボロゾール(vorozole)；
ザノテロン(zanoterone)；ゼニプラチン(zeniplatin)；ジラスコルブ(zilascorb)；およ
びジノスタチンスチマラマー(zinostatin stimalamer)。好ましいその他の抗癌薬は5-フ
ルオロウラシルおよびロイコボリン(leucovorin)である。
【０２７３】
本発明の方法で使用することができる治療用抗体の例としては、限定するわけではないが
、以下が含まれる：ZENAPAXS(登録商標)(daclizumab)(Roche Pharmaceuticals, Switzerl
and)(急性腎同種移植片拒絶反応の予防用の、免疫抑制性ヒト化抗CD25モノクローナル抗
体)；PANOREXTM(マウス抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体)(Glaxo Wellcome/Centocor)；BEC
2(マウス抗イディオタイプ(GD3エピトープ)IgG抗体)(ImClone System)；IMC-C225(キメラ
抗EGFR IgG抗体)(Clone System)；VITAXINTM(ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体)(Applied
Molecular Evolution/MedImmune)；Smart M195(ヒト化抗CD33 IgG抗体)(Protein Design
Lab/Kanebo)；LYMPHOCIDETM(ヒト化抗CD22IgG抗体)(Immunomedics)；ICM3(ヒト化抗ICAM
3抗体(ICOS Phann)；IDEC-114(霊長類化抗CD80抗体)(IDECPharm/Mitsubishi)；IDEC-131(
ヒト化抗CD40L抗体)(IDEC/Eisai)；IDEC-151(霊長類化抗CD4抗体)(IDEC);IDEC-152(霊長
類化抗CD23抗体)(IDEC/Seikagaku)；SMART抗CD3(ヒト化抗CD3 IgG)(Protein Design Lab)
；5G1.1(ヒト化抗補体因子5(C5)抗体)(Alexion Pharm)；D2E7(ヒト化抗TNF-α抗体)(CAT/
BASF)；CDP870(ヒト化抗TNF-αFab断片)(Celltech)；IDEC-151(霊長類化抗CD4 IgGl抗体)
(IDECPharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4(ヒト抗CD4 IgG抗体)(Medarex/Eisai/Genmab)
；CDP571(ヒト化抗TNF-αIgG4抗体)(Celltech)；LDP-02(ヒト化抗α4β7抗体)(LeukoSite
/Genentech)；OrthoClone OKT4A(ヒト化抗CD4 IgG抗体)(Ortho Biotech)；ANTOVATM(ヒト
化抗CD40L IgG抗体)(Biogen)；ANTEGRENTM(ヒト化抗 VLA-4 IgG抗体)(Elan)；およびCAT-
152(ヒト抗TGF-β2抗体)(Cambridge Ab Tech)。本発明に従って使用することができる治
療用抗体のその他の例を表8に示す。
【表８】
0006285481.tif 000025
0006285481.tif 000026
0006285481.tif 000027
0006285481.tif 000028
0006285481.tif 000029
【０２７４】
5.7.2 免疫調節薬および抗炎症薬
本発明は、本発明の分子を他の治療薬とともに投与することを含む、自己免疫疾患および
炎症性疾患の治療方法を提供する。免疫調節薬の例としては、限定するものではないが、
メトトレキセート、エンブレル（ENBREL）、レミケード（REMICADETM）、レフルノミド、
シクロホスファミド、シクロスポリンA、およびマクロライド抗生物質（例えば、FK506（
タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（MP）、コルチコステロイド、ステロイド、ミ
コフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペル
グアリン（deoxyspergualin）、ブレキナル（brequinar）、マロノニトリルアミド（例え
ば、レフルナミド）、T細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレ
ーターを含む。
【０２７５】
抗炎症薬は、炎症性疾患および自己免疫疾患の治療において成功をおさめており、現在、
このような疾患のための共通かつ標準の治療薬となっている。当業者に知られたいずれの
抗炎症薬も本発明の方法に使用することができる。抗炎症薬の非限定的な例は、非ステロ
イド系抗炎症薬（NSAID）、ステロイド系抗炎症薬、β作動薬、抗コリン作動薬、および
メチルキサンチンを含む。NSAIDの例は、限定するものではないが、アスピリン、イブプ
ロフェン、セレコキシブ（CELEBREXTM）、ジクロフェナク（VOLTARENTM）、エトドラク（
LODINETM）、フェノプロフェン（NALFONTM）、インドメタシン（INDOCINTM）、ケトロラ
ク（TORADOLTM）、オキサプロジン（DAYPROTM）、ナブメトン（RELAFENTM）、スリンダク
（CLINORILTM）、トルメチン（TOLECTINTM）、ロフェコキシブ（VIOXXTM）、ナプロキセ
ン（ALEVETM、NAPROSYNTM）、ケトプロフェン（ACTRONTM）およびナブメトン（RELAFENTM
）を含む。このようなNSAIDはシクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、COX-1および/またはC
OX-2）を阻害することにより機能する。ステロイド系抗炎症薬の例は、限定するものでは
ないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン（DECADRONTM）、コルチゾン、ヒドロコル
チゾン、プレドニゾン（DELTASONETM）、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフ
ィジン、およびエイコサノイド、例えばプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロ
イコトリエンを含む。
【０２７６】
炎症性疾患の治療または予防のために本発明の分子と併用して使用することができる抗体
の非限定的な例を表9に示し、また、自己免疫疾患の治療または予防のために使用するこ
とができる抗体の非限定的な例を表10に示す。
【表９】
0006285481.tif 000030
0006285481.tif 000031
0006285481.tif 000032
【表１０】
0006285481.tif 000033
0006285481.tif 000034
【０２７７】
5.7.3 感染症治療用の薬剤
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、感染症の治療および/または予防のために、
当業者に公知の1種以上のさらなる治療薬の治療上または予防上有効な量と組み合わせて
投与することができる。本発明は、感染症の治療および/または予防のための当業者に公
知の抗生物質と組み合わせた、本発明の分子の使用を想定している。本発明の分子と組み
合わせて用いることができる抗生物質としては、限定するものではないが、マクロライド
（例えばトブラマイシン（Tobi（登録商標））、セファロスポリン（例えばセファレキシ
ン（Keflex（登録商標））、セフラジン（Velocef（登録商標））、セフロキシム（Cefti
n(登録商標)）、セフプロジル（Cefzil(登録商標)）、セファクロール（Ceclor(登録商標
)）、セフィキシム（Suprax(登録商標)）またはセファドロキシル（Duricef(登録商標)）
）、クラリスロマイシン（例えばクラリスロマイシン（Biaxin(登録商標)）、エリスロマ
イシン（例えばエリスロマイシン（EMycin(登録商標)）、ペニシリン（例えば、ペニシリ
ンV（V-Cillin K(登録商標)またはPen Vee K(登録商標)））またはキノロン（例えばオフ
ロキサシン（Floxin(登録商標)）、シプロフロキサシン（Cipro(登録商標)）またはノル
フロキサシン（Noroxin(登録商標)））、アミノ配糖体系抗生物質（例えばアプラマイシ
ン、アルベカシン、バンバーマイシン（bambermycin）、ブチロシン、ジベカシン、ネオ
マイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボス
タマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン）、アンフェニコール（amphenic
ol）系抗生物質（例えばアジダムフェニコール（azidamphenicol）、クロラムフェニコー
ル、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール）、アンサマイシン系抗生物質（例
えばリファマイド（riphamide）およびリファンピン）、カルバセフェム系（例えばロラ
カルベフ）、カルバペネム系（例えばビアペネムおよびイミペネム）、セファロスポリン
系（例えばセファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セ
ファゼドン（cefazedone）、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、およびセ
フピロム）、セファマイシン系（例えばセフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミ
ノクス）、モノバクタム系（例えばアズトレオナム、カルモナム、およびチゲモナム（ti
gemonam））、オキサセフェム系（例えばフロモキセフ、およびモキサラクタム）、ペニ
シリン系（例えばアムジノシリン（amdinocillin）、アムジノシリンピボキシル（amdino
cillin pivoxil）、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジル
ペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナムシリン
、ペネタメートヒドリオダイド（penethamate hydriodide）、ペニシリンo-ベネタミン、
ペニシリンO、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシリンVヒドラバミン（penici
llin V hydrabamine）、ペニメピシクリン（penimepicycline）、およびフェンシヒシリ
ン（phencihicillin）カリウム）、リンコサミド系（例えばクリンダマイシン、およびリ
ンコマイシン）、アンフォマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エ
ンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン系（例えばアピサイクリン（apic
ycline）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、およびデメクロサイクリン）、
2,4-ジアミノピリミジン系（例えばブロジモプリム（brodimoprim））ニトロフラン系（
例えばフラルタドン、および塩化フラゾリウム（furazolium chloride））、キノロンお
よびその類似体（例えばシノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、およびグレパ
グロキサシン（grepagloxacin））、スルホンアミド系（例えばアセチルスルファメトキ
シピラジン、ベンジルスルフアミド、ノプリルスルフアミド、フタリルスルフアセトアミ
ド、スルフアクリソイジン（sulfachrysoidine）、およびスルファシチン（sulfacytine
））、スルホン系（例えばジアチモスルホン（diathymosulfone）、グルコスルホンナト
リウム、およびソラスルホン（solasulfone））、シクロセリン、ムピロシンおよびチュ
ベリン（tuberin）を含む。
【０２７８】
特定の実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の1種以上の抗真菌
剤と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いることができ
る抗真菌剤には、限定するものではないが、アンフォテリシンB、イトラコナゾール、ケ
トコナゾール、フルコナゾール、イントラセカル（intrathecal）、フルシトシン、ミコ
ナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、ニスタチン、テルコナゾール、チオコナ
ゾール、シクロピロクス、エコナゾール、ハロプログリン（haloprogrin）、ナフチフィ
ン、テルビナフィン、ウンデシレネート、およびグリセオフルビンが含まれる。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の1種以上の抗
ウイルス薬と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いるこ
とができる有効な抗ウイルス薬には、限定するものではないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌ
クレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびヌクレオシド類似
体が含まれる。抗ウイルス薬の例としては、限定するものではないが、ジドブジン、アシ
クロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびリ
バビリン、並びにホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナ
ビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、αインターフェロン；アデフォビル、
クレバジン（clevadine）、エンテカビル、プレコナリルが挙げられる。
【０２８０】
5.8 ワクチン療法
本発明は、本発明の組成物を用いて、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答を誘発
することをさらに包含し、該物質としては、限定するものではないが、癌抗原および感染
症抗原（これらの例は後述する）が含まれる。本発明のワクチン組成物は、1以上の抗原
性または免疫原性物質（それに対する免疫応答が望まれる）を含み、該1以上の抗原性ま
たは免疫原性物質は、FcγRIIIAに対する増大した親和性を有する本発明の変異型抗体に
よりコートされる。本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質に対する免疫
応答、好ましくは防御性免疫応答を引き起こすのに特に有効である。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物中の抗原性または免疫原性物質は、ウ
イルス（それに対する免疫応答が望まれる）を含む。ウイルスは組換え体またはキメラで
もよく、好ましくは弱毒化されている。組換え体、キメラ、および弱毒化ウイルスの産生
は、当業者に公知の標準的な手法を用いて行うことができる。本発明は、本発明に従って
製剤化される生組換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンを包含する
。生ワクチンが好ましく、なぜなら宿主内での複製が、自然な感染において起こるのと同
種かつ同程度の持続的な刺激をもたらし、従って十分な、長期的な免疫を付与するためで
ある。そのような生組換えウイルスワクチン製剤の生産は、細胞培養物またはニワトリ胚
尿膜中でのウイルス増殖と、それに続く精製を含む従来の方法を用いて達成し得る。
【０２８２】
具体的な実施形態では、組換えウイルスは、それが投与される被験者に対して非病原性の
ものである。これに関して、ワクチン用に遺伝子操作ウイルスを使用するには、これらの
ウイルス株が弱毒化特性をもつ必要がある。トランスフェクションに用いる鋳型に適当な
突然変異（例えば欠失）を導入すると、弱毒化特性を有する新規ウイルスが得られる。例
えば、温度感受性または寒冷適応に関連する特定のミスセンス突然変異を、欠失突然変異
中に導入することができる。これらの突然変異は、寒冷または温度感受性変異体に関連す
る点突然変異よりも安定であるはずであり、復帰突然変異の頻度が極めて低いはずである
。組換えウイルスを作製するための組換えDNA技術は、当技術分野で公知であり、本発明
に包含される。例えば、負鎖RNAウイルスの改変のための技術が当技術分野において公知
であり、例えば、米国特許第5,166,057号を参照されたい（その全文を参照として本明細
書に組み入れる）。
【０２８３】
あるいはまた、「自殺」特性を有するキメラウイルスが、本発明の皮内ワクチン製剤での
使用のために構築され得る。そのようなウイルスは、宿主内でわずかに1〜数回の複製し
か行うことがない。ワクチンとして用いたときには、組換えウイルスは限られた複製サイ
クルを行い、十分なレベルの免疫応答を誘発するが、ヒト宿主中でさらに複製サイクルを
行って、病気を引き起こすことはない。あるいはまた、不活化（死滅）ウイルスを本発明
に従って製剤化することができる。不活化ワクチン製剤は、キメラウイルスを「死滅させ
る」ための、従来の方法を用いて調製することが可能である。不活化ワクチンは、その感
染性が破壊されているという意味で「死んでいる」。理想的には、ウイルスの感染性がそ
の免疫原性を損なうことなく破壊される。不活化ワクチンを調製するためには、キメラウ
イルスを細胞培養物もしくはニワトリ胚尿膜中で増殖させ、ゾーン超遠心により精製し、
ホルムアルデヒドもしくはβ-プロピオラクトンにより不活化してプールする。
【０２８４】
特定の実施形態では、完全に外来性のエピトープ（他のウイルス性または非ウイルス性病
原体に由来する抗原を含む）が本発明の皮内ワクチン製剤に使用するためのウイルスへと
遺伝子工学的に操作される。例えば、例えばHIV（gp160、gp120、gp41）のような非関連
ウイルスの抗原、寄生虫抗原（例えばマラリア）、細菌もしくは真菌抗原または腫瘍抗原
を操作して、弱毒化株にすることができる。
【０２８５】
事実上あらゆる異種遺伝子配列が、皮内ワクチン製剤で使用するための本発明のキメラウ
イルスへと構築され得る。好ましくは、異種遺伝子配列は、生物学的応答の改変因子とし
て作用する部分またはペプチドである。好ましくは、様々な病原体のいずれかに対して防
御性免疫応答を引き起こすエピトープ、または中和抗体に結合する抗原が、キメラウイル
スによって、またはその一部として発現される。例えば、本発明のキメラウイルスに構築
され得る異種遺伝子配列は、限定するものではないが、インフルエンザおよびパラインフ
ルエンザの血球凝集素、ノイラミニダーゼおよび融合糖タンパク質（例えばヒトPIV3のHN
およびF遺伝子）を含む。また別の実施形態では、キメラウイルスへと操作し得る異種遺
伝子配列には、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。免疫調節
タンパク質の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、I型インターフェロ
ン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-1
2、およびこれらの物質のアンタゴニストが含まれる。
【０２８６】
また別の実施形態では、本発明は、変異型抗体を表面に発現する病原性細胞またはウイル
ス、好ましくは弱毒化ウイルスを包含する。
【０２８７】
代替的な実施形態では、本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質がFcγRI
IIAに対する増大した親和性を有する本発明の変異型抗体と機能的に連結されている、融
合ポリペプチドを含む。本発明のワクチン組成物に使用するための融合ポリペプチドの操
作は、慣例的な組換えDNA技術の方法を用いて行われ、通常の技能の範囲内である。
【０２８８】
本発明は、本発明の組成物を投与することにより、被験者において免疫寛容を誘発する方
法をさらに包含する。好ましくは、被験者において免疫寛容を誘発するのに適した組成物
は、本発明の変異型抗体によってコートされた抗原性または免疫原性物質を含み、その際
、該変異型抗体はFcγRIIBに対してより高い親和性を有するものである。特定の作用機構
に拘束されることを意図しないが、そのような組成物はFcγRIIBを介した阻害経路を活性
化することにより免疫寛容を誘発するのに有効である。
【０２８９】
5.9 組成物および投与方法
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインおよび任意にFcドメイン（またはその一部）を
含む本発明の分子（すなわちダイアボディ）を含んでなる方法および医薬組成物を提供す
る。本発明はまた、疾患、障害または感染に関連する1以上の症状を治療、予防、および
改善する方法であって、被験者に有効な量の、本発明の融合タンパク質もしくはコンジュ
ゲート分子、または本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子を含む医薬組成
物を投与することによる上記方法をさらに提供する。好ましい態様では、抗体、融合タン
パク質、またはコンジュゲート分子は、実質的に精製されている(すなわち、その効果を
限定するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。具体的な実施
形態では、被験者は動物、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、
ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザルおよ
びヒト）である。好ましい実施形態では、被験者はヒトである。また別の好ましい実施形
態では、本発明の抗体は被験者と同じ生物種に由来するものである。
【０２９０】
様々な送達系が知られていて、本発明の分子を含む組成物を投与するために利用すること
ができるが、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への封入、抗体または融合
タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば
、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）、レトロウイルスまたは他
のベクターの一部としての核酸の構築などがある。本発明の分子を投与する方法には、限
定するものではないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下
）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内および口腔経路）が含まれる。具体的な実施形
態では、本発明の分子を筋肉内、静脈内、または皮下に投与する。組成物を任意の都合の
よい経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例
えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を介する吸収により投与してもよく、他の生
物学的活性薬剤と一緒に投与してもよい。投与は全身的でも局所的でもよい。さらに、例
えば、吸入器または噴霧器の使用により、およびエアロゾル化剤を用いる製剤化により肺
投与を採用することもできる。例えば、米国特許第6,019,968；5,985,320；5,985,309；5
,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；および4,880,078号；ならびにPCT公開WO 
92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；およびWO 99/66903を参照されたい
（これらのそれぞれの全体を参照として本明細書に組み入れる）。
【０２９１】
本発明はまた、本発明の分子を密閉容器（例えばアンプルまたは小袋）中にパッケージし
て、抗体の量を表示することを提供する。一実施形態では、本発明の分子を、乾燥した無
菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として密閉容器に入れて供給し、そして例えば水または
生理食塩水を用いて被験者に投与するための適当な濃度に再調製する。好ましくは、本発
明の分子を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として密閉容器に入れて、少な
くとも5mg、さらに好ましくは少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少な
くとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、または少なくとも75mgの単位用量にて供
給する。凍結乾燥した本発明の分子はその元の容器内で2〜8℃の間で貯蔵しなければなら
ず、また、該分子は、再調製した後12時間以内、好ましくは6時間以内、5時間以内、3時
間以内、または1時間以内に投与しなければならない。代替的な実施形態では、本発明の
分子を、液剤として密閉容器に入れて、該分子、融合タンパク質、またはコンジュゲート
分子の量および濃度を表示して供給する。好ましくは、本発明の分子の液剤を、密閉容器
に入れて、少なくとも1mg/ml、さらに好ましくは少なくとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml
、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/kg、少なくとも25mg/ml、少
なくとも50mg/ml、少なくとも100mg/ml、少なくとも150mg/ml、少なくとも200mg/mlの該
分子にて供給する。
【０２９２】
疾患に関連する1以上の症状を治療、予防または改善するために有効でありうる本発明の
組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。製剤中で用いる正確な用
量はまた、投与経路や病状の重篤度にも左右され、医師の判断および各患者の状況によっ
て決定されねばならない。有効な用量をin vitroまたは動物モデル試験系から誘導した用
量-応答曲線から推定することができる。
【０２９３】
本発明により包含されるダイアボディの場合、患者に投与される投与量は、典型的には、
0.0001mg/kg〜100mg/kg（患者の体重）である。好ましくは、患者に投与される用量は、0
.0001mg/kg〜20mg/kg、0.0001mg/kg〜10mg/kg、0.0001mg/kg〜5mg/kg、0.0001〜2mg/kg、
0.0001〜1mg/kg、0.0001mg/kg〜0.75mg/kg、0.0001mg/kg〜0.5mg/kg、0.0001mg/kg〜0.25
mg/kg、0.0001〜0.15mg/kg、0.0001〜0.10mg/kg、0.001〜0.5mg/kg、0.01〜0.25mg/kgま
たは0.01〜0.10mg/kgである。本発明のダイアボディの投与量と頻度は、例えば、リピド
化などの修飾によりダイアボディの取込みおよび組織浸透を増強することによって、低減
または変更することができる。
【０２９４】
一実施形態では、患者に投与される本発明の分子の投与量は、単剤療法として用いるとき
、0.01mg〜1000mg/日である。他の実施形態では、本発明の分子を他の治療用組成物と一
緒に用いて、患者に投与される投与量を、上記分子を単剤療法として用いるときより低く
する。
【０２９５】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療の必要な部位に局所投与することが望
ましい。これは、例えば、限定するものではないが、局所注入により、注射により、また
はシアラスチック（sialastic）メンブランなどのメンブランまたは繊維を含む多孔質、
非多孔質、またはゼラチン状の材料からなる移植片を用いて達成することができる。好ま
しくは、本発明の分子を投与するとき、該分子が吸収されない材料を使うように注意しな
ければならない。
【０２９６】
他の実施形態では、組成物を小胞、特にリポソームに入れて送達することができる（Lang
er, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatら「感染症と癌の治療法におけるリポソーム
（Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer）」, Lopez-Berestein
and Fidler (編), Liss, New York, pp.353-365 (1989)；Lopez-Berestein, 前掲, pp.3
17-327 を参照されたい；一般的には前掲を参照）。
【０２９７】
さらに他の実施形態では、組成物を制御放出または持続放出システムで送達することがで
きる。本発明の1種以上の分子を含む持続放出製剤を作るために、当業者に公知のいずれ
の技術を用いてもよい。例えば、米国特許第4,526,938号；PCT公開WO 91/05548；PCT公開
WO 96/20698；Ningら, 1996,「持続放出ゲルを用いたヒト大腸癌異種移植片の腫瘍内放射
線免疫療法（Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft U
sing a Sustained-Release Gel）」 Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Songら, 199
5, 「長循環エマルジョンの抗体を介する肺ターゲティング（Antibody Mediated Lung Ta
rgeting of Long-Circulating Emulsions）」 PDA Journal of Pharmaceutical Science 
& Technology 50:372-397；Cleekら, 1997, 「心血管適用のためのbFGF抗体に対する生物
分解性ポリマー担体（Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Car
diovascular Application）」 Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:85
3-854；およびLamら, 1997, 「局所送達のための組換えヒト化モノクローナル抗体のマイ
クロカプセル化（Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody 
for Local Delivery）」 Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760
を参照されたい（それぞれの全体を参照として本明細書に組み入れる）。一実施形態では
、ポンプを制御放出システムで用いることができる（Langer, 前掲；Sefton, 1987, CRC 
Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwaldら, 1980, Surgery 88:507；およびSaudekら,
1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。他の実施形態では、ポリマー材料を用いて
抗体の制御放出を達成することができる（例えば「制御放出の医療上の応用例（Medical 
Applications of Controlled Release）」, LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca R
aton, Florida (1974)；「制御放出薬物バイオアベイラビリティー、医薬品設計と性能（
Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance）」, Smolen
およびBall (編), Wiley, New York (1984)；RangerおよびPeppas, 1983, J., Macromol
. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61；（またLevyら, 1985, Science 228:190；Duringら
, 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howardら, 1989, J. Neurosurg. 7 1:105も参照）；米国
特許第5,679,377号；米国特許第5,916,597号；米国特許第5,912,015号；米国特許第5,989
,463号；米国特許第5,128,326号；PCT公開WO 99/15154；およびPCT公開WO 99/20253を参
照）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例としては、限定するものではないが、ポリ
(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)
、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド（PLG）、ポリ
酸無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、
ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド（PLA）、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)（PLG
A）、およびポリオルトエステルが挙げられる。さらに他の実施形態では、制御放出シス
テムを治療標的（例えば、肺）の近位に配置することで、全身用量の一部しか必要としな
いようにすることができる（例えば、Goodson, 「制御放出の医療上の応用（Medical App
lications of Controlled Release）」, 前掲, vol. 2, pp.115-138 (1984)を参照）。他
の実施形態では、制御放出移植片として有用なポリマー組成物が、Dunnら（米国特許第5,
945,155号を参照）に従い用いられる。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性物
質のin situ制御放出の治療効果に基づく。移植は一般的に、治療処置を必要とする患者
体内のいずれの場所で行ってもよい。他の実施形態では非ポリマー系の持続送達システム
が使用されるが、この場合には、被験者体内の非ポリマー移植片が薬物送達システムとし
て使用される。体内に移植すると、移植片の有機溶媒が、該組成物から周囲組織液中に散
逸、分散または浸出して、非ポリマー材料が徐々に凝集または沈降し、固体の微孔質マト
リックスを形成する（米国特許第5,888,533号を参照）。
【０２９８】
制御放出システムは、Langerによる文献（1990, Science 249:1527-1533）に述べられて
いる。本発明の1種以上の治療薬を含む持続放出製剤を作るために、当業者に公知のいず
れの技術を用いてもよい。例えば、米国特許第4,526,938号；国際公開WO 91/05548および
WO 96/20698；Ningら, 1996, RadioTherapy & Oncology 39:179-189；Songら, 1995, PDA
Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleekら, 1997, Pro. 
Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；およびLamら, 1997, Proc. I
nt'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい（それぞれの全
体を参照として本明細書に組み入れる）。
【０２９９】
具体的な実施形態では、本発明の組成物が本発明のダイアボディをコードする核酸である
場合、これを適当な核酸発現ベクターの一部として構成し、それが細胞内に取り込まれる
ようにこれを投与することによって、そのコード化されたダイアボディの発現を促進する
ために該核酸をin vivoで投与することができる。細胞内への取り込みは、例えば、レト
ロウイルスベクターを使用することによって（米国特許第4,980,286号を参照）、または
直接注射によって、または微粒子衝突（例えば遺伝子銃；Biolistic, Dupont）によって
、または脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクト試薬でコーティングすることに
よって、または核に侵入することが知られるホメオボックス様ペプチドと連結して投与す
る（例えば、Joliotら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照）こと
等によって行う。あるいはまた、核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによって発現の
ために宿主細胞DNA内に組み込むことができる。
【０３００】
治療上または予防上有効な量の本発明の分子を用いる被験者の治療は、単回治療であって
もよいが、好ましくは、一連の治療を含む。好ましい例においては、約0.1〜30mg/kg(体
重)の本発明の分子を用いて、週1回、約1〜10週間にわたって、好ましくは約2〜8週間に
わたって、さらに好ましくは約3〜7週間にわたって、より一層好ましくは約4、5、または
6週間にわたって、被験者を治療する。他の実施形態では、本発明の医薬組成物を1日1回
、1日2回、または1日3回投与する。他の実施形態では、医薬組成物を週1回、週2回、2週
毎に1回、月1回、6週毎に1回、2ヶ月毎に1回、年2回または年1回投与する。治療に使用す
る分子の有効投与量が、特定の治療期間を通して増加したり減少したりすることもまた理
解されよう。
【０３０１】
5.9.1 医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用であるバルク薬組成物（例えば、不純なまた
は非滅菌の組成物）および単位投与剤形の調製に利用できる医薬組成物（すなわち、被験
者または患者に投与するのに適した組成物）を含む。そのような組成物は、予防上または
治療上有効な量の本明細書中に開示した予防薬および/または治療薬またはそれらの薬剤
の組合せと、製薬上許容し得る担体とを含む。好ましくは本発明の組成物は、予防上また
は治療上有効な量の1種以上の本発明の分子および製薬上許容される担体を含む。
【０３０２】
本発明はまた、本発明のダイアボディ分子と、特定の癌抗原に特異的な治療用抗体（例え
ば腫瘍特異的モノクローナル抗体）と、製薬上許容される担体とを含む医薬組成物を包含
する。
【０３０３】
特定の実施形態において、「製薬上許容し得る」との用語は、動物、特にヒトでの使用に
ついて、連邦政府または州政府の規制当局により認可された、または米国薬局方もしくは
他の一般的に認められた薬局方に掲げられたことを意味する。「担体」との用語は、治療
薬がそれらとともに投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバン
ト（完全および不完全））、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような製薬上の担
体は、水や油などの無菌液体であってもよく、石油、動物、植物または合成起源のもの、
例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む。医薬組成物を静脈内投与する
とき、水は好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロー
ル水溶液は、特に注射液用の、液状担体として利用することができる。好適な製薬上の賦
形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦
粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、
タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノ
ールなどを含む。所望であれば、組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH
緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カプ
セル剤、粉剤、持続放出製剤などの剤形をとり得る。
【０３０４】
一般的に、本発明の組成物の成分は、別々にまたは一緒に混合して単位投与剤形で、例え
ば、乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、密閉容器、例えばアンプルまたは小
袋に入れ、活性薬剤の量を表示して供給される。組成物を注入により投与する場合は、薬
品級の滅菌水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて調剤してもよい。組成物を
注射により投与する場合は、無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを提供して、諸
成分が投与前に混合されるようにすることができる。
【０３０５】
本発明の組成物を、中性または塩形態として製剤化してもよい。製薬上許容し得る塩とし
ては、限定するものではないが、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などか
ら誘導されるアニオンにより形成された塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノ
エタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたカチオンにより形成された塩が
含まれる。
【０３０６】
5.9.2 遺伝子治療
特定の実施形態では、本発明の分子をコードする配列を含む核酸を投与することにより、
遺伝子治療を用いて疾患、障害、または感染に関連する1以上の症状を治療、予防、また
は改善する。遺伝子治療は、発現されるまたは発現可能な核酸を被験者に投与することに
より行われる治療を意味する。本発明のこの実施形態では、核酸が、治療または予防効果
を媒介するそのコード化抗体または融合タンパク質を産生する。
【０３０７】
当技術分野で利用しうるいずれの遺伝子治療法も本発明に従って使用することができる。
代表的な方法を以下に記載する。
【０３０８】
遺伝子治療法の一般的総括については、Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-
505；WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol
. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, Science 260:926-932 (1993)；およびMorgan and An
derson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIBTECH 11 (5) :155-215
を参照されたい。利用することができる組換えDNA技術の技術分野で公知の方法は、Ausub
elら(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；
およびKriegler, Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual, Stockton Pres
s, NY (1990)に記載されている。
【０３０９】
好ましい態様では、本発明の組成物は本発明のダイアボディをコードする核酸を含み、該
核酸は好適な宿主内で抗体を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸
は、抗体コード領域と機能的に連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを
有し、上記プロモーターは誘導性、構成的、場合によっては組織特異的なものでありうる
。他の特定の実施形態では、抗体コード配列および他の所望の配列が、ゲノム内の所望の
部位での相同的組換えを促進する領域によって挟まれており、その結果として、抗体をコ
ードする核酸の染色体内発現をもたらすような核酸分子が使用される（KollerおよびSmit
hies, 1989, Proc. Natl. ACAD. Sci. USA 86:8932-8935；ならびにZijlstraら, 1989, N
ature 342:435-438）。
【０３１０】
他の好ましい態様では、本発明の組成物は融合タンパク質をコードする核酸を含み、上記
核酸は好適な宿主において融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部分である。特に
、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域と機能的に連結されたプロモーター、
好ましくは異種プロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性、構成的、場合によって
は組織特異的なものでありうる。他の特定の実施形態では、融合タンパク質のコード配列
および他の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域によっ
て挟まれており、その結果として、融合タンパク質をコードする核酸の染色体内発現をも
たらすような核酸分子が使用される。
【０３１１】
核酸の被験者への送達は、直接的（この場合には被験者を核酸または核酸担持ベクターに
直接曝す）または間接的（この場合には細胞を最初に核酸でin vitroにて形質転換し、次
いで被験者に移植する）のいずれであってもよい。これらの2つの手法は、それぞれ、in 
vivoまたはex vivo遺伝子治療として知られている。
【０３１２】
特定の実施形態では、核酸配列を直接in vivoで（そこで発現されて、コードされた産物
をもたらす）投与する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより、例え
ばそれを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを細胞内に取込まれるように
投与することにより、実施することができる。このような取込みは、例えば、欠損もしく
は弱毒化レトロウイルスまたは他のベクターを使った感染により（米国特許第4,980,286
号を参照）、または裸のDNAの直接注入により、または微粒子ボンバードメント（例えば
、遺伝子銃；Biolistic、Dupont）により、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは
トランスフェクション試薬のコーティングにより、またはリポソーム、微粒子、もしくは
マイクロカプセル内への封入により、あるいは核に侵入することが知られるペプチドとそ
れらを連結して投与することにより、受容体介在エンドサイトーシスを受ける抗原と連結
して投与することにより（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を
参照）（この方法は受容体を特異的に発現する細胞型を標的とするために用いられる）、
実施することができる。別の実施形態では、核酸-抗原複合体（この抗原はエンドソーム
を破壊する融合性ウイルスペプチドを含む）を形成させて、核酸のリソソーム分解を回避
させることができる。さらに別の実施形態では、核酸は、特異的受容体を標的とすること
により、in vivoで細胞特異的な取込みおよび発現へと目標を定めることができる（例え
ば、PCT公開WO 92/06180；WO 92/22635；W092/20316；W093/14188；WO 93/20221を参照）
。あるいはまた、核酸は、細胞内に導入して、相同的組換えによって、発現のために宿主
細胞DNA内に組込むことができる（Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:8932-8935 ；およびZijlstraら, 1989, Nature 342:435-438）。
【０３１３】
特定の実施形態では、本発明の分子（例えばダイアボディまたは融合タンパク質）をコー
ドする核酸配列を含有するウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベク
ターを利用することができる（Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599を参照）。
これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主
細胞DNA中への組込みのために必要な成分を含有する。遺伝子治療に利用する抗体または
融合タンパク質をコードする核酸配列は1以上のベクター中にクローニングされ、これに
よりヌクレオチド配列の被験者への送達が容易になる。レトロウイルスベクターについて
のさらなる詳細はBoesenら（1994, Biotherapy 6:291-302）に見出すことができ、これは
、化学療法により耐性のある造血幹細胞を作る目的でmdr 1遺伝子を幹細胞へ送達するた
めのレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベク
ターの使用を説明する他の参考文献には以下のものがある：Clowesら, 1994, J. Clin. I
nvest. 93:644-651；Kleinら, 1994, Blood 83:1467-1473；SalmonsおよびGunzberg, 199
3, Human Gene Therapy 4:129-141；ならびにGrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin.
in Genetics and Devel. 3:110-114。
【０３１４】
アデノウイルスは、遺伝子治療に利用しうる他のウイルスベクターである。アデノウイル
スは、遺伝子を呼吸器上皮に送達する運搬体として特に興味をそそる。アデノウイルスは
元来、呼吸器上皮に感染して軽度の疾患を引き起す。アデノウイルスに基づく送達系の他
の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは分裂しな
い細胞に感染することができるので有利である。KozarskyおよびWilson（Current Opinio
n in Genetics and Development 3:499-503, 1993）はアデノウイルスに基づく遺伝子治
療法の総説を報じている。Boutら（Human Gene Therapy, 5:3-10,1994）は、遺伝子をア
カゲザルの呼吸器上皮へ導入するためのアデノウイルスベクターの利用を実証した。遺伝
子治療におけるアデノウイルスの利用の他の例は、Rosenfeldら, 1991, Science 252:431
-434；Rosenfeldら, 1992, Cell 68 :143-155；Mastrangeliら, 1993, J. Clin. Invest.
91:225-234；PCT公開W0 94/12649；ならびにWangら, 1995, Gene Therapy 2:775-783に
見出すことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが用いられる。
【０３１５】
アデノ随伴ウイルス（AAV）も遺伝子治療における利用が提案されている（例えば、Walsh
ら, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300および米国特許第5,436,146号を参
照）。
【０３１６】
遺伝子治療に対する他のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リ
ン酸カルシウムを介したトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により、
組織培養物中の細胞に遺伝子を導入することを含む。通常、導入の方法は、選択マーカー
の細胞への導入を含む。次いで細胞を選択に供し、回収し、かつ導入した遺伝子を発現す
る細胞を単離する。次いでそれらの細胞を被験者に送達する。
【０３１７】
この実施形態では、核酸を細胞中に導入した後に、得られる組換え細胞をin vivo投与す
る。このような導入は、当技術分野で公知のいずれかの方法、例えば、限定するものでは
ないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、
核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合
、染色体を介した遺伝子導入、微小細胞を介した遺伝子導入（microcell mediated gene 
transfer）、スフェロプラスト融合などにより実施することができる。外来遺伝子を細胞
中に導入するための多数の技術は当技術分野で公知であり（例えば、Loeffler and Behr,
1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohenら, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；お
よびClin. Pharma. Ther. 29:69-92,1985を参照）、受容細胞の必要な発生的および生理
学的機能が破壊されないことを条件として本発明に従って利用することができる。その技
術は核酸の細胞への安定な導入を提供して、それにより核酸が細胞により発現可能になり
、そして好ましくはその細胞子孫に遺伝してかつ発現されうるものでなければならない。
【０３１８】
得られる組換え細胞は、当技術分野で公知の様々な方法により被験者に送達することがで
きる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に
投与される。使用のために想定される細胞量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、
当業者が決定することが可能である。
【０３１９】
遺伝子治療の目的で核酸が導入される細胞は、あらゆる所望の入手可能な細胞型を包含し
、限定するものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞
、肝細胞；血液細胞、例えばTリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好
酸球、巨核球、顆粒球；様々な幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞、
例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるものを含む。
【０３２０】
好ましい実施形態では、遺伝子治療に使用される細胞は被験者自身に由来するものである
。
【０３２１】
組換え細胞を遺伝子治療に使用する実施形態では、抗体または融合タンパク質をコードす
る核酸配列を細胞中に導入して、それらが該細胞またはその子孫により発現されるように
し、次いでその組換え細胞を治療効果のためにin vivoで投与する。具体的な実施形態で
は、幹細胞または前駆細胞を用いる。分離可能でin vitroで維持できる幹細胞および/ま
たは前駆細胞はどれも本発明のこの実施形態に従って利用できる可能性がある（例えば、
PCT公開WO 94/08598；StempleおよびAnderson, 1992, Cell 7 1:973-985；Rheinwald, 19
80, Meth. Cell Bio. 21A :229；ならびにPittelkowおよびScott, 1986, Mayo Clinic Pr
oc. 61:771を参照されたい）。
【０３２２】
特定の実施形態では、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域と機能的に連結
された誘導性プロモーターを含み、それにより適当な転写誘導物質の存在または不在を制
御することにより核酸の発現が制御可能となる。
【０３２３】
5.9.3 キット
本発明は、本発明の分子を充填した1以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供す
る。さらに、疾患の治療に有用な1以上の他の予防または治療薬を、医薬パックまたはキ
ット中に含んでもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の1以上の成分を充填した1以
上の容器を含む医薬パックまたはキットも含む。場合によっては、このような容器に、医
薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局が指示した形式で、ヒ
ト投与のための製造、使用または販売の行政当局による認可を反映する注意書きを添付し
てもよい。
【０３２４】
本発明は、上記の方法で使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キッ
トは1以上の本発明の分子を含む。他の実施形態では、キットはさらに、1以上の容器中に
、癌の治療に有用な1以上の他の予防または治療薬を含む。別の実施形態では、キットは
さらに、癌に関連する1以上の癌抗原と結合する1以上の細胞傷害性抗体を含む。ある実施
形態では、他の予防または治療薬は化学療法剤である。他の実施形態では、予防または治
療薬は生物学的またはホルモン治療薬である。
【０３２５】
5.10 治療上の有用性の特徴付けおよび検証
ヒトに使用する前に、本発明の医薬組成物、予防または治療薬のいくつかの態様は、好ま
しくは、in vitroで、細胞培養系で、および動物モデル生物で、例えばげっ歯類動物モデ
ル系で、所望の治療活性について試験される。例えば、特定の医薬組成物の投与が適切な
ものかを確認するのに用いることができるアッセイは、細胞培養アッセイを含み、該アッ
セイにおいては、患者組織サンプルを培養で増殖させ、本発明の医薬組成物に曝すかまた
は別の方法で接触させ、そして組織サンプルに対する該組成物の効果を観察する。組織サ
ンプルは患者から生検により得ることができる。この試験により、個々の患者に対して治
療上最も有効な予防または治療分子を同定することができる。様々な具体的実施形態では
、in vitroアッセイを、自己免疫疾患または炎症性疾患に関係する細胞型の代表的細胞（
例えば、T細胞）を用いて実施し、本発明の医薬組成物がそのような細胞型に対して所望
の効果を奏するかを確認することができる。
【０３２６】
予防薬および/または治療薬の組合せは、ヒトで使用する前に、適当な動物モデル系で試
験することができる。このような動物モデル系としては、限定するものではないが、ラッ
ト、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野
で周知のいずれの動物系を使用してもよい。本発明の具体的な実施形態では、予防および
/または治療薬の組合せはマウスモデル系で試験する。このようなモデル系は広く使用さ
れていて、当業者に周知である。予防および/または治療薬は反復して投与することがで
きる。手順のいくつかの様相は様々でありうる。かかる様相には、予防および/または治
療薬の投与の時間的管理、およびこのような薬剤を別々に投与するのか混合物として投与
するのかが含まれる。
【０３２７】
本発明の方法に使用する好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上にFc
γRを発現するトランスジェニックマウスであり、例えば、米国特許第5,877,396号（その
全体を参照として本明細書に組み入れる）に記載されたいずれかのマウスモデルを本発明
に用いることができる。本発明の方法に使用するトランスジェニックマウスとしては、限
定するものではないが、ヒトFcγRIIIAを保有するマウス；ヒトFcγRIIAを保有するマウ
ス；ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγRIIIAを保有するマウス；ヒトFcγRIIBおよびヒトFcγR
IIAを保有するマウスが挙げられる。好ましくは、上記の機能的アッセイにおいて最高レ
ベルの活性を示した変異を、ヒトでの使用に先立って動物モデル研究での使用について試
験する。十分量の抗体は、上記の方法を用いて、動物モデルでの使用のために調製するこ
とが可能であり、例えば本明細書に開示され例示される哺乳類発現系および精製法を用い
て調製することができる。
【０３２８】
マウス異種移植モデルを用いて、腫瘍特異的標的に対して作製されたマウス抗体の効力を
、本発明のダイアボディ分子のエピトープ結合ドメインの親和性と特異性、および免疫応
答を引き出すダイアボディの能力に基づいて試験することができる（Wuら, 2001, Trends
Cell Biol. 11: S2-9）。マウスエフェクター細胞上にヒトFcγRを発現するトランスジ
ェニックマウスはユニークであり、ヒトFc-FcγR相互作用の効力を試験するためのテーラ
ーメイド動物モデルである。Jeffrey Ravetch博士の研究室で作製されたFcγRIIIA、Fcγ
RIIBおよびFcγRIIAトランスジェニックマウス系統のペアが利用可能であり（Rockefelle
r大学とSloan Kettering癌センターとのライセンス契約を介して）、以下の表11に挙げら
れているようなものである。
【表１１】
0006285481.tif 000035
【０３２９】
本発明の併用療法の抗炎症活性は、当技術分野で公知の、かつCrofford L. J.およびWild
er R. L.「動物の関節炎と自己免疫（Arthritis and Autoimmunity in Animals）」、Art
hritis and Allied Conditions:A Textbook of Rheumatology, McCartyら (編), 第30章(
Lee and Febiger, 1993)に記載の様々な炎症性関節炎の実験動物モデルを利用して確認す
ることができる。炎症性関節炎および自己免疫リウマチ疾患の実験的および自然発生的動
物モデルはまた、本発明の併用療法の抗炎症活性を評価するために利用することもできる
。以下は例として掲げたいくつかのアッセイであり、限定するものではない。
【０３３０】
当技術分野で公知の、かつ広く利用される関節炎または炎症性疾患の主な動物モデルは、
以下のものを含む：アジュバント誘導関節炎ラットモデル、コラーゲン誘導関節炎ラット
およびマウスモデル、ならびに、抗原誘導関節炎ラット、ウサギおよびハムスターモデル
。これらは全て、Crofford L. J.およびWilder R. L.「動物の関節炎と自己免疫（Arthri
tis and Autoimmunity in Animals）」、Arthritis and Allied Conditions:A Textbook 
of Rheumatology, McCartyら (編), 第30章(Lee and Febiger), 1993に記載されている（
その全体を参照として本明細書に組み入れる）。
【０３３１】
本発明の併用療法の抗炎症活性は、カラゲナン誘導関節炎ラットモデルを用いて評価する
ことができる。カラゲナンが誘導する関節炎はまた、慢性関節炎または炎症の研究におい
て、ウサギ、イヌおよびブタでも利用されている。定量的な組織形態計測的評価が治療効
力の決定に用いられる。このようなカラゲナン誘導関節炎モデルを利用する方法は、Hans
ra P.ら,「ラットにおけるカラゲナン誘導関節炎（Carrageenan-induced Arthritis in t
he Rat）」, Inflammation, 24(2):141-155, (2000)に記載されている。また、ザイモサ
ン誘導炎症動物モデルも一般的に利用されており、当技術分野で公知である。
【０３３２】
本発明の併用療法の抗炎症活性はまた、カラゲナンが誘導するラットの足浮腫（paw edem
a）の抑制を、Winter C. A.ら,「抗炎症薬アッセイとしての、カラゲナンが誘導するラッ
ト後足浮腫（Carrageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Ant
i-inflammatory Drugs）」Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547, (1962)に記載され
る方法の改変法を用いて測定することにより、評価することもできる。このアッセイはほ
とんどのNSAIDの抗炎症活性に対する一次in vivoスクリーニングとして用いられており、
ヒトでの効力を予測すると考えられている。試験予防薬または治療薬の抗炎症活性は、ビ
ヒクルを投与した対照群に対する試験群の後足重量増加の抑制パーセントとして表される
。
【０３３３】
さらに、炎症性腸疾患の動物モデルを、本発明の併用療法の効力を評価するのに用いるこ
ともできる（Kimら, 1992, Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537；Strober, 1985, Dig.
Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S）。潰瘍性大腸炎およびクローン病は、動物で誘導しう
るヒト炎症性腸疾患である。硫酸化された多糖類（限定するものではないが、アミロペク
チン、カラゲナン、硫酸アミロペクチンおよび硫酸デキストランを含む）または化学刺激
剤（限定するものではないが、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）および酢酸を含む
）を動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘導することができる。
【０３３４】
自己免疫疾患の動物モデルもまた、本発明の併用療法の効力を評価するのに用いることが
できる。自己免疫疾患、例えばI型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマトーデス、
および糸球体腎炎の動物モデルが開発されている（Flandersら, 1999, Autoimmunity 29:
235-246；Kroghら, 1999, Biochimie 81:511-515；Foster, 1999, Semin. Nephrol. 19:1
2-24）。
【０３３５】
さらに、当業者に公知のアッセイはどれも、自己免疫および/または炎症性疾患に対する
本明細書に開示した併用療法の予防上および/または治療上の有用性を評価するのに用い
ることができる。
【０３３６】
本発明の予防および/または治療プロトコルの毒性および効力は、細胞培養または実験動
物における標準的な薬学的手法により確認することができ、例えば、LD50（集団の50％に
対する致死量）およびED50（集団の50％における治療有効量）を決定する手法により確認
することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として
表現される。大きな治療指数を示す予防および/または治療薬が好ましい。毒性副作用を
示す予防および/または治療薬を使用することはできるが、このような薬物を罹患組織の
部位にターゲッティングする送達システムを設計して、非罹患細胞の起こりうる損傷を最
小限に抑え、それにより副作用を軽減するよう注意を払うべきである。
【０３３７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用する予防および/ま
たは治療薬の投与量の範囲を決定するのに利用することができる。このような薬物の投与
量は、好ましくは、毒性が低いか全くなく、ED50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量
は、採用する投与剤形および利用する投与経路に依存して変わりうる。本発明の方法で使
用するいずれの薬物に対しても、治療上有効な用量はまず細胞培養アッセイから推定する
ことができる。用量は、細胞培養で決定したIC50（すなわち、症状の最大の２分の１の抑
制（half-maximal inhibition）を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲
を達成するように、動物モデルにおいて決定してもよい。このような情報は、ヒトに有用
な投与量をさらに正確に決定するのに用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、
高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０３３８】
本発明に従って使用される治療法の抗癌活性はまた、癌研究用の様々な実験動物モデル、
例えばSCIDマウスモデルまたはトランスジェニックマウスまたはヒト異種移植片をもつヌ
ードマウス、動物モデル、例えば、ハムスター、ウサギなどを用いることにより決定する
こともでき、これらは当技術分野で公知であり、かつRelevance of Tumor Models for An
ticancer Development (1999, FiebigおよびBurger編)；Contributions to Oncology (19
99, Karger)；The Nude Mouse in Oncology Research (1991, Boven and Winograd編)；
およびAnticancer Drug Development Guide (1997 編Teicher）（これらの全体を参照と
して本明細書に組み入れる）に記載されている。
【０３３９】
本発明の分子の治療効力を決定するのに好ましい動物モデルは、マウス異種移植モデルで
ある。異種移植腫瘍の供給源として用いることができる腫瘍細胞株は、限定するものでは
ないが、SKBR3およびMCF7細胞を含み、それらは乳腺癌の患者に由来する。これらの細胞
は、erbB2とプロラクチン受容体の両者を有する。SKBR3細胞は、ADCCおよび異種移植腫瘍
モデルとして、当技術分野において通常用いられている。これとは別に、ヒト卵巣腺癌に
由来するOVCAR3細胞を異種移植腫瘍の供給源として用いることができる。
【０３４０】
本発明のプロトコルと組成物は、ヒトで使用する前に、好ましくは、in vitroで、次いで
in vivoで、所望の治療または予防活性について試験される。治療薬および治療法は、腫
瘍または悪性培養細胞株の細胞を用いてスクリーニングすることができる。当技術分野に
おいて標準的な多くのアッセイを、このような生存および/または増殖を評価するのに用
いることができる；例えば、細胞増殖は3H-チミジン取込みを測定することにより、直接
細胞計数より、プロトオンコジーン（例えば、fos、myc）または細胞周期マーカーなどの
公知の遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができる；細胞生存率
はトリパンブルー染色により評価することができ、分化は形態の変化、軟寒天中での増殖
および/またはコロニー形成の減少または三次元基底膜または細胞外マトリックス調製物
中の管状ネットワーク形成などに基づいて視覚的に評価することができる。
【０３４１】
治療に用いる化合物は、ヒトで試験する前に好適な動物モデル系で試験することができ、
動物としては、限定するものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサ
ギ、ハムスターなどがあり、例えば、上記の動物モデルで試験することができる。化合物
はその後、適当な臨床試験で使用される。
【０３４２】
さらに、当業者に公知のアッセイはどれも、癌、炎症性疾患、または自己免疫疾患の治療
または予防について本明細書に開示した併用療法の予防上および/または治療上の有効性
を評価するのに用いることができる。
【実施例】
【０３４３】
6.1 共有結合型二重特異性ダイアボディの設計と特徴付け
単一特異性共有結合型ダイアボディおよび二重特異性共有結合型ダイアボディを構築し、
それぞれの組換え体の作製、精製および結合特性を評価した。本明細書に記載した組換え
発現系によって作製され、アフィニティー精製されたダイアボディ分子は、SDS−PAGEお
よびSEC解析により単一の二量体種から成ることが判明した。ELISAおよびSPR解析により
、共有結合型二重特異性ダイアボディは双方の標的抗原に親和性を示すこと、および双方
の抗原と同時に結合できることがさらに明らかになった。
【０３４４】
＜材料と方法＞
ポリペプチド分子の構築および設計
核酸発現ベクターを設計し、図２で模式図により示した４つのポリペプチド構築物を作製
した。構築物１(配列番号9)は、FcγRIIBを認識するヒト化2B6抗体のVLドメイン、および
FcγRIIIAを認識するヒト化3G8抗体のVHドメインを含む。構築物２(配列番号11)は、Hu3G
8のVLドメイン、およびHu2B6のVHドメインを含む。構築物３(配列番号12)は、Hu3G8のVL
ドメイン、およびHu3G8のVHドメインを含む。構築物４(配列番号13)は、Hu2B6のVLドメイ
ン、およびHu2B6のVHドメインを含む。
【０３４５】
PCRおよび発現ベクターの構築
VLおよびVHドメインのコード配列を、第１PCR産物が重複配列を含むように設計したフォ
ワードおよびリバースプライマーを用いて鋳型DNAから増幅した。これにより、重複PCRで
所望のポリペプチド構築物のコード配列を作製することが可能となる。
【０３４６】
鋳型DNAの第１PCR増幅
約35ngの鋳型DNA（例えば、目的の抗体の軽鎖および重鎖）、1μlの10μMフォワードプラ
イマーおよびリバースプライマー、2.5μlの10×pfuUltraバッファ(Stratagene, Inc.)、
1μlの10mM dNTP、1μlの2.5ユニット/μlのpfuUltra DNAポリメラーゼ(Stratagene, Inc
.)、および総量25μlになるように加えた蒸留水を、微量遠心チューブ内で静かに混合し
、微量遠心機で短時間スピンして反応混合物をチューブの底に集めた。PCR反応を、GeneA
mp PCR System 9700 (PE Applied Biosystem)を用いて行った。反応は、94℃で2分間；続
いて94℃で15秒間、58℃で30秒間および72℃で1分間を25サイクルに設定した。
【０３４７】
Hu2B6のVLは、Hu2B6の軽鎖からフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号
57および58）を用いて増幅した。Hu2B6のVHは、Hu2B6の重鎖からフォワードおよびリバー
スプライマー（それぞれ配列番号59および60）を用いて増幅した。Hu3G8のVLは、Hu3G8の
軽鎖からフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号57および61）を用いて
増幅した。Hu3G8のVHは、Hu3G8の重鎖からフォワードおよびリバースプライマー（それぞ
れ配列番号62および63）を用いて増幅した。
【０３４８】
１％アガロースゲルにてPCR産物を120ボルトで30分間、電気泳動した。PCR産物をゲルか
ら切り出した後、MinEluteゲル抽出キット(Qiagen, Inc.)を用いて精製した。
【０３４９】
重複PCR
第１PCR産物を下記のように結合させて、鋳型DNAの最初の増幅で説明したPCR条件と同一
の条件を用いて増幅した。重複PCRの産物も、上記のように精製した。
【０３５０】
構築物１をコードする核酸配列（配列番号９）（図２に模式図で示す）をHu2B6のVLおよ
びHu3G8のVHのPCR増幅産物、並びにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列
番号57および63）を混合して増幅した。構築物２をコードする核酸配列（配列番号11）（
図２に模式図で示す）をHu3G8のVLおよびHu2B6のVHのPCR増幅産物、並びにフォワードお
よびリバースプライマー（それぞれ配列番号57および60）を混合して増幅した。構築物３
をコードする核酸配列（配列番号12）（図２に模式図で示す）をHu3G8のVLおよびHu3G8の
VHのPCR増幅産物、並びにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号57お
よび63）を混合して増幅した。構築物４をコードする核酸配列（配列番号13）（図２に模
式図で示す）をHu2B6のVLおよびHu2B6のVHのPCR増幅産物、並びにフォワードおよびリバ
ースプライマー（それぞれ配列番号57および60）を混合して増幅した。
【０３５１】
VLドメインのフォワードプライマー（すなわち、配列番号57）およびVHドメインのリバー
スプライマー（すなわち、配列番号60および配列番号63）は、発現ベクター内への最終産
物のクローニングを可能にするユニークな制限部位を含んでいる。精製された重複PCR産
物を制限エンドヌクレアーゼNheIおよびEcoRIで切断し、哺乳動物発現ベクターpCIneo(Pr
omega, Inc.)内に導入してクローン化した。構築物をコードするプラスミドを表12に示す
ように命名した。
【表１２】
0006285481.tif 000036
【０３５２】
ポリペプチド／ダイアボディの発現
構築物１をコードするpMGX0669を、構築物２をコードするpMGX0667と共に、リポフェクト
アミン2000（Invitrogen）を用いて、使用説明書に従ってHEK-293細胞にコトランスフェ
クションした。これら２つのプラスミドのコトランスフェクションは、FcγRIIBおよびFc
γRIIIAの双方に対して免疫特異的な共有結合型二重特異性ダイアボディ(CBD) (h2B6-h3G
8ダイアボディ)が発現するように設計されている。構築物３および４をそれぞれコードす
るpMGX0666およびpMGX0668を、それぞれFcγRIIIAに対して免疫特異的な共有結合型単一
特異性ダイアボディ(CMD)（h3G8ダイアボディ）およびFcγRIIBに対して免疫特異的な共
有結合型単一特異性ダイアボディ(CMD)（h2B6ダイアボディ）の発現のために、HEK-293細
胞に別々にトランスフェクトした。培養３日後、分泌された産物を条件培地から精製した
。
【０３５３】
精製
ダイアボディを条件培地から、CNBr活性型セファロース4Bと結合させた関連する抗原を用
いて回収した。ローディング前にアフィニティーセファロース樹脂を20mM Tris/HCl(pH 8
.0)で平衡化した。ローディング後、溶出前に、樹脂を平衡バッファーで洗浄した。ダイ
アボディを、50mMグリシン(pH 3.0)を用いて洗浄済み樹脂から溶出した。溶出したダイア
ボディを、1M Tris/HCl(pH 8.0)で直ちに中和し、遠心分離型濃縮器を用いて濃縮した。
濃縮したダイアボディを、さらにPBSで平衡化したSuperdex 200カラムを用いてサイズ排
除クロマトグラフィー（SEC）によって精製した。
【０３５４】
SEC
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、カラムから溶出されたダイアボディのおおよそ
のサイズと異質性を分析した。SEC解析は、PBSで平衡化したGEヘルスケア社のSuperdex 2
00HR 10/30カラムで行われた。全長IgG(約150 kDa)、Fabフラグメント(約50 kDa)および
一本鎖Fv(約30 kDa)の溶出プロファイルとの比較を対照として用いた。
【０３５５】
ELISA
溶出および精製されたダイアボディの結合性を、ELISAアッセイによってセクション5.4.2
で説明したように、性状解析した。1ウェルあたり50μlの2μg/mlのsCD32B-Ig溶液を、炭
酸バッファーの入った96ウェルMaxisorpプレート上に４℃で一晩コーティングした。プレ
ートをPBS-T(PBS＋0.1% Tween20)で３回洗浄し、PBS-T中の0.5% BSAで３０分間、室温に
てブロッキングした。続いて、h2B6-h3G8 CBD、h2B6 CMDまたはh3G8 CMDを、ブロッキン
グバッファーを用いて２倍希釈で連続希釈し、0.5μg/mlから0.001μg/mlまでの範囲のダ
イアボディ濃度を作製した。その後、プレートを室温で１時間インキュベーションした。
PBS-Tで３回洗浄した後、0.2μg/mlのsCD16A-ビオチンを1ウェルあたり50μlで、各ウェ
ルに加えた。プレートを再び室温で１時間インキュベーションした。PBS-Tで３回洗浄し
た後、1：5000希釈したHRP結合ストレプトアビジン（Amersham Pharmacia Biotech）を検
出のために１ウェルあたり50μl用いた。HRP-ストレプトアビジンを４５分間、室温でイ
ンキュベーションした。プレートをPBS-Tで３回洗浄し、TMB基質を１ウェルあたり80μl
用いて発色させた。10分間のインキュベーション後、1% H2SO4を１ウェルあたり40μl加
えることによって、HRP-TMB反応を停止させた。OD450を96ウェルプレートリーダーとSOFT
maxソフトウェアを用いて読み込み、結果をGraphPadPrism 3.03ソフトウェアを用いてプ
ロットした。
【０３５６】
BIAcore解析
溶出および精製されたダイアボディの動態パラメータを、セクション5.4.3で説明したよ
うにBIAcoreアッセイ(BIAcore instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, N.J.)およ
び付属のソフトウェアを用いて解析した。
【０３５７】
sCD16A、sCD32B、またはsCD32A（陰性対照）を、センサーチップ表面の４つのフローセル
のうちの１つ（フローセル２）に、いずれの受容体も約1000の応答ユニット（response u
nits：RU）が表面上に固定されるように、（NHS/EDCの混合物によるカルボキシメチル基
の修飾によって）アミン結合化学を介して固定した。これに続いて、未反応の活性エステ
ルを、1M Et-NH2を加えて「キャップオフ(capped off）」した。適当な表面が調製された
ら、共有結合型二重特異性ダイアボディ(h2B6-h3G8 CBD)または共有結合型単一特異性ダ
イアボディ(h2B6 CMDもしくはh3G8 CMB)を表面に、6.25〜200nMの溶液を70mL/minの流速
で180秒間導入することにより、流した。h3G8 scFVも比較用にテストした。
【０３５８】
全データセットを回収した時点で、得られた結合曲線を、製造業者であるBIAcore, Inc.
社 (Piscataway, NJ)より提供されるコンピュータアルゴリズムを用いて、全体的にフィ
ット（近似）させた。これらのアルゴリズムにより、KonおよびKoffの双方が算出された
。これから、見かけの平衡結合定数KDが２つの速度定数の比（すなわちKoff／Kon）とし
て推定される。個々の速度定数をどうやって導き出したかについてのより詳細な処理につ
いては、BIAevaluaionソフトウェアハンドブック(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)で知
ることができる。
【０３５９】
結合期および解離期は別々にフィットさせた。解離速度定数を、180秒の解離期において3
2〜34秒間隔で得られた。結合期フィットを1:1 Langmuirモデルで得た。基底フィットを
二重特異性ダイアボディとscFvに関するRmaxおよびカイ二乗法に基づいて選択した。二価
分析物フィットはCMD結合に使用された。
【０３６０】
＜結果＞
非還元条件下でのSDS-PAGE解析により、h3G8 CMD、h2B6 CMDおよびh2B6-h3G8 CBD発現系
の精製産物は、それぞれ単一種であり、約50kDa（図３のそれぞれレーン４、５および６
）の推定分子量をもつことが明らかとなった。還元条件下では、CMDの各発現系から精製
された産物は、単一バンド（レーン1および２）として移動したが、h2B6-h3G8 CBD系から
精製された産物は、2つに分離するタンパク質（図３、レーン３）であることが明らかと
なった。発現系から精製され、還元条件下でSDS-PAGEによって視覚化された全ポリペプチ
ドは、約28kDaの位置に移動した。
【０３６１】
各発現系産物のSEC解析でも、それらが単一分子種であり（図４B）、それぞれIgGのFabフ
ラグメント(約50kDa)とほぼ同じ時間で溶出されること（図４A）が明らかとなった。これ
らの結果は、アフィニティー精製した産物がCMD発現系の場合は同種の共有結合型ホモ二
量体であり、またh2B6-h3G8 CBDの場合は同種の共有結合型へテロ二量体であることを示
している。
【０３６２】
ELISAサンドイッチアッセイを使用して、CD32Bおよび／またはCD16Aのいずれか一方また
は両方に対するh2B6-h3G8 CBDの結合特異性を試験した（図５）。CD32Bを標的抗原として
使用し、またCD16Aを第２プローブとして使用した。ELISAの陽性シグナルにより、ヘテロ
ニ量体であるh2B6-h3G8 CBDは両抗原に対して特異性を有することが明らかとなった。h3G
8 CMD (CD32Bに結合しないはずである)での同様の試験では、シグナルが見られなかった
。
【０３６３】
SPR解析は、h3G8 CMDがsCD16を免疫特異的に認識するがsCD32Bは認識できないこと、h2B6
CMDがsCD32Bを免疫特異的に認識するがsCD16は認識できないこと、そしてh2B6-h3G8 CBD
がsCD16とsCD32Bの両方を免疫特異的に認識できることを示した（図６A〜B）。試験した
ダイアボディはいずれも、対照受容体sCD32Aには結合しなかった（図６C）。
【０３６４】
また、SPR解析を使用して、sCD16および／またはsCD32Bに対する２つのCMDおよびh2B6-h3
G8 CBDの速度定数および平衡定数を推定した。結果をh3G8 scFVについて算出された上記
定数と比較した。図７A〜Eは、SPR解析の結果をグラフで示したものである。図７で描か
れた結果から計算された、onおよびoff速度、並びに平衡定数を表13に示す。
【表１３】
0006285481.tif 000037
【０３６５】
ELISA解析の結果と合わせると、h2B6-h3G8共有結合型へテロニ量体はCD32BおよびCD16の
双方に対して特異性を保持していること、および両抗原に同時に結合することができるこ
とが実験から裏付けられた。本分子を図８に模式図で示してある。
【０３６６】
6.2 Fcドメインを含む共有結合型二重特異性ダイアボディの設計と性状解析
IgG様分子、つまりFcドメインを含む分子を作るために、実施例6.1で示したヘテロ二量体
CBD分子を含むポリペプチドの１つを、Fcドメインをさらに含む（抗体の重鎖および軽鎖
に類似する「重い」鎖および「軽い」鎖を作り出す）ように改変した。したがって、ヘテ
ロ二量体の二重特異性分子が同種分子と二量体化するFcドメインを含むことで、四価の四
量体IgG様分子（すなわち、ヘテロ二量体の二重特異性分子のFcドメインを介して二量体
化することで形成される分子）が形成されるだろう。興味深いことに、このような四量体
分子は、例えば標的抗原に対する免疫特異的結合性について条件培地を試験するといった
機能アッセイを用いて、組換え発現系の条件培地中には検出されなかった。その代わりに
、VL、VHおよびFcドメインからなる単量体を含む二量体分子のみが、前記機能アッセイで
検出された。理論上の四量体構造が安定性の面で問題となるかどうかを試験するために、
Fcドメインを含むポリペプチドがヒンジ領域をさらに含むように遺伝子操作し、一方「軽
い」鎖を含むポリペプチドはヒトκ型軽鎖の定常ドメインの6個のC末端アミノ酸を含むよ
うに遺伝子操作した。このように遺伝子操作した「重い」および「軽い」鎖を組換え発現
系で共発現させたとき、機能アッセイによって、標的抗原と抗Fc抗体の双方に免疫特異的
に結合できるダイアボディ分子が検出された。
【０３６７】
＜材料と方法＞
ポリペプチド分子の構築および設計
実施例6.1で示した構築物１および２の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設
計した。構築物５(配列番号14)および６(配列番号15)は、さらにFcドメインを含むように
、それぞれ構築物１および２を遺伝子操作することにより作製された。構築物７(配列番
号16)は、構築物１を遺伝子操作して、さらにそのC末端に配列FNRGEC(配列番号23)を含む
ように作製された。構築物８(配列番号18)は、構築物２を遺伝子操作して、さらにヒンジ
領域とFcドメイン（V215A変異を含む）を含むように作製された。構築物５〜８の模式図
を図９に示す。
【０３６８】
PCRおよび発現ベクターの構築
PCRおよびPCR産物の精製プロトコルは全て、実施例6.1で説明した通りである。プラスミ
ドpMGX0669およびpMGX0667を、それぞれ構築物1および２のコード配列用の鋳型として用
いた。HuIgGのFcドメイン用のおよび／またはヒンジドメイン用のコード配列は、それぞ
れ配列番号５または配列番号１および配列番号５とした。鋳型DNAのコード配列はフォワ
ードおよびリバースプライマーを用いて増幅したが、PCR産物が重複配列を含み、重複PCR
が所望の産物のコード配列を生成させるようなプライマーを用いた。
【０３６９】
構築物１のコード配列は、pMGX0669からフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ
配列番号57および配列番号64）を用いて増幅された。構築物２のコード配列は、pMGX0667
から、フォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号57および配列番号65）を
用いて増幅された。HuIgGヒンジ-Fcは、フォワードおよびリバースプライマー（それぞれ
配列番号67および配列番号68）を用いて増幅した。構築物７(配列番号16)のコード配列は
、pMGX0669から、フォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号57および配列
番号69）を用いて増幅された。
【０３７０】
重複PCR
第１PCR産物を以下に記載したように組み合わせ、実施例6.1で説明したように増幅および
精製した。
【０３７１】
構築物５(配列番号14)（図９に模式図で示す）をコードする核酸配列は、構築物1およびH
uIgG FcのPCR増幅産物、並びにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号
57および配列番号66）を組み合わせて増幅した。構築物６(配列番号15)（図９に模式図で
示す）をコードする核酸配列は、構築物２およびHuIgG FcのPCR増幅産物、並びにフォワ
ードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号57および配列番号66）を組み合わせて
増幅した。構築物８(配列番号18)（図９に模式図で示す）をコードする核酸配列は、構築
物２およびHuIgGヒンジ−FcのPCR増幅産物、並びにフォワードおよびリバースプライマー
（それぞれ配列番号57および配列番号68）を組み合わせて増幅した。
【０３７２】
最終産物を、前述のように哺乳動物発現ベクターpCIneo(Promega, Inc.)内にクローン化
した。構築物をコードするプラスミドは表14に示したように命名した。
【表１４】
0006285481.tif 000038
【０３７３】
ポリペプチド／ダイアボディの発現
セクション6.1で記載したように、リポフェクトアミン2000（Invitrogen）を用いてHEK-2
93細胞内に別個に４つのコトランスフェクションを行った。前記コトランスフェクション
は、すなわち、構築物1および６をそれぞれコードするpMGX0669およびpMGX0674、構築物
２および５をそれぞれコードするpMGX0667およびpMGX0676、並びに構築物７および８をそ
れぞれコードするpMGX0677およびpMGX0678である。
【０３７４】
これらのプラスミドのコトランスフェクションは、FcγRIIBおよびFcγRIIIAの双方に免
疫特異的なIgG様構造を有する、四価の二重特異性ダイアボディ(CBD)を発現するように設
計された。構築物６および５をそれぞれコードするpMGX0674およびpMGX0676の追加的なコ
トランスフェクションも行った。培養３日後、条件培地を回収した。条件培地中の分泌産
物の量を、精製されたFcを基準に用いて、抗IgG Fc ELISAによって定量化した。その後、
サンプル中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化し、この正規化したサンプルを以降の
アッセイに使用した。
【０３７５】
ELISA
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を、上記サンドイッチELISAでアッセイし
た。特に示した場合を除き、CD32Bをプレートコーティング用に、つまり標的タンパク質
として用いた。また、HRP結合CD16をプローブとして使用した。
【０３７６】
＜結果＞
ELISAアッセイを用いて、構築物１および６（pMGX669−pMGX674）、構築物２および５（p
MGX667−pNGX676）、並びに構築物５および6（pMGX674−pMGX676）を含む組換え発現系由
来の正規化したサンプルを、CD32BおよびCD16Aと同時に結合可能なダイアボディ分子の発
現について試験した（図１０）。ELISAデータは、構築物１および６を用いたコトランス
フェクション、または構築物２および５を用いたコトランスフェクションでは、一方また
は両方の抗原に結合できる産物は生じなかった（図１０、それぞれ□および▲）。しかし
ながら、構築物５および６のコトランスフェクションは、CD32BおよびCD16Aの両抗原に結
合できる産物の分泌をもたらした。後者の産物は、構築物５および６の二量体であり、図
１１に模式図で示した構造を有し、それぞれの抗原に対する１つの結合部位を含んでいる
。
【０３７７】
IgG様へテロ四量体構造の形成を導くため、付加的な６アミノ酸のコード配列を構築物１
のC末端に付加して、構築物７（配列番号16；図９に模式図で示す）を作製した。付加的
な６アミノ酸FNRGEC (配列番号23)は、κ型軽鎖のC末端に由来し、通常IgG分子内で重鎖
の上部ヒンジドメインと相互に作用する。また、ヒンジドメインを構築物６の内部に遺伝
子操作で導入し、構築物８（配列番号18、および図９）を作製した。構築物８は、さらに
、上部ヒンジ領域中にアミノ酸変異A215Vを含んでいた。構築物７および構築物８をコー
ドする発現プラスミドである、それぞれpMGX677およびpMGX678を、その後HEK-293細胞に
コトランスフェクションし、上記のように発現させた。
【０３７８】
構築物７および８（pMGX0677 + pMGX0678）を含む組換え発現系から産生されたダイアボ
ディ分子は、ELISAアッセイでCD32BおよびCD16Aとの結合に関して、構築物１および６（p
MGX669+pMGX674）、構築物２および８（pMGX669+pMGX678）、並びに構築物６および７（p
MGX67+pMGX674）（図１２）を含む発現系から産生されたダイアボディ分子と比較した。
【０３７９】
既に述べたように、構築物１および６（pMGX669 + pMGX674）を含む発現系によって産生
された分子は、CD32AおよびCD16Aのいずれにも結合できないことがわかった（図１０およ
び図１２）。これに対して、構築物７および６（pMGX0677 + pMGX0674）の共発現、また
は構築物７および８（pMGX0677-pMGX0678）の共発現から得られる産物は、CD32AおよびCD
16Aの両方と結合できた（図１２）。構築物７がC末端配列FNRGEC （配列番号23）を含む
ことを除けば構築物１に類似していること、並びに構築物８がヒンジドメインおよびA215
V変異を含むことを除けば構築物６に類似していることが注目される。このデータは、C-
κ型軽鎖のC末端に由来する余分な６アミノ酸（FNRGEC；配列番号23）を、Fcを持たない
「軽い」鎖に付加することが、対応する重い鎖がヒンジドメインを含むか否かにかかわら
ず(すなわちpMGX0677 + pMGX0674およびpMGX0677-pMGX0678、図１２)、四量体IgG様ダイ
アボディ分子の形成を安定化するのに役立つ、ことを示している。Fcを有する「重い」ポ
リペプチドにヒンジドメインを付加することは、対応する「軽い」鎖へのC末端配列FNRGE
C（配列番号23）の付加なしでは、明らかに同様の安定化を達成することができなかった
（つまり、構築物２および８（pMGX669 + pMGX67）のコトランスフェクションの産物によ
る結合が欠如している）。四量体ダイアボディ分子の構造を図１３に模式図で示す。
【０３８０】
6.3 四量体IgG様ダイアボディの形成におけるドメインの順番および追加的なジスルフィ
ド結合の効果
四量体IgG様ダイアボディ分子の「軽い」および「重い」ポリペプチド鎖間の追加的な安
定化の効果を、ポリペプチド鎖上の選択された残基のシステインによる置換によって調べ
た。付加的なシステイン残基は、「重い」および「軽い」鎖間に付加的なジスルフィド結
合を付与する。さらに、Fcドメインまたはヒンジ−Fcドメインをポリペプチド鎖のC末端
からN末端に移すことで、結合活性おけるドメインの順番を調べた。付加的なジスルフィ
ド結合を含む分子の結合活性は、そのような結合をもつ先に構築されたダイアボディ分子
と比べて変わらなかったが、Fcもしくはヒンジ−Fcドメインを、ダイアボディを構成する
「重い」ポリペプチド鎖のN末端に移すと、その標的抗原の一方もしくは双方に対する二
重特異性分子の結合親和性および／または結合力が驚くほど改善された。
【０３８１】
＜材料と方法＞
ポリペプチド分子の構築および設計
実施例6.2で示した構築物５、６および８の改変型を作製するために、核酸発現ベクター
を設計した。構築物９（配列番号19）および構築物１０（配列番号20）（いずれも図１３
に模式図で示す）は、それぞれFcドメインまたはヒンジ−FcドメインがポリペプチドのC
末端からN末端にシフトしていることを除けば、構築物８および６と類似する。さらに、
使用したFcドメインは全て、野生型IgG1のFcドメインである。構築物１１（配列番号21）
（図１４に模式図で示す）は、C末端が配列FNRGEC（配列番号23）をさらに含むように設
計されていることを除けば、実施例6.1からの構築物２に類似する。構築物１２（配列番
号２２）（図１４に模式図で示す）は、Fcドメインがさらにヒンジ領域を含むことを除け
ば、実施例6.2からの構築物５に類似する。また、構築物１１および１２に関しては、2B6
のVLドメインおよび2B6のVHドメインは、各ドメイン中のグリシンをシステインに置換す
るための単一アミノ酸変異（それぞれG105CおよびG44C）を含んでいる。
【０３８２】
PCRおよび発現ベクターの構築
PCRおよびPCR産物の精製プロトコルは全て、実施例6.1および6.2で説明した通りである。
【０３８３】
重複PCR
実施例6.1および6.2に記載の方法を用いて、最終産物を構築し、増幅し、精製した。
【０３８４】
最終産物を、前記のように哺乳動物発現ベクターpCIneo(Promega, Inc.)内にクローン化
した。構築物をコードするプラスミドは表１５に示すように命名した。
【表１５】
0006285481.tif 000039
【０３８５】
ポリペプチド／ダイアボディの発現
セクション6.1で記載したようにリポフェクトアミン2000を用いてHEK-293細胞内に別個に
３つのコトランスフェクションを行った。前記コトランスフェクションは、すなわち構築
物1および９をそれぞれコードするpMGX0669およびpMGX0719、構築物１および１０をそれ
ぞれコードするpMGX0669およびpMGX0718、並びに構築物１１および１２をそれぞれコード
するpMGX0617およびpMGX0717である。これらのプラスミドのコトランスフェクションは、
FcγRIIBおよびFcγRIIIAの双方に免疫特異的なIgG様構造をもった四価の二重特異性ダイ
アボディ(CBD)を発現するように設計されている。培養３日後、条件培地を回収した。条
件培地中の分泌産物の量を、抗IgG Fc ELISAによって、精製したFcを基準として用いて定
量化した。その後、サンプル中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化し、この正規化し
たサンプルを以降のアッセイに使用した。
【０３８６】
ELISA
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を、上記サンドイッチELISAによってアッ
セイした。特に示した場合を除き、CD32Bをプレートコーティング用に、つまり標的タン
パク質として用いた。また、HRP結合CD16をプローブとして使用した。
【０３８７】
ウェスタンブロット
上記３つのコトランスフェクションからの条件培地約15mlをSDS-PAGEによって非還元条件
下で解析した。一枚のゲルをSimply Blue Safestain (Invitrogen)で染色し、続いて、同
一ゲルを一般的な転写方法を用いてPVDFメンブレン(Invitrogen)に転写した。転写後、メ
ンブレンを１×PBS中の５％脱脂粉乳でブロッキングした。その後、メンブレンを、２％
脱脂粉乳１×PBS/0.1% Tween 20中の1：8000希釈したHRP結合ヤギ抗ヒトIgG1 H+L抗体10m
l中で室温にて１時間静かに撹拌しながらインキュベーションした。１×PBS/0.3% Tween 
20で、それぞれ５分間ずつ２回洗浄した後、ECLウェスタンブロッティング検出システム(
Amersham Biosciences)を用いて、使用説明書に従って室温で２０分間、メンブレンを露
光した。フィルムをX線処理装置で現像した。
【０３８８】
＜結果＞
構築物１および９、構築物１および１０、並びに構築物１１および１２を含む組換え発現
系由来の条件培地を、SDS-PAGE（非還元条件下）解析およびウェスタンブロッティング（
抗IgGをプローブとして使用）によって解析した。ウェスタンブロットにより、構築物１
１および１２を含む系または構築物９および１を含む系由来の産物は、主に約150kDaの単
一分子種（それぞれ図１５のレーン３および２）を形成することが明らかとなった。これ
らの産物はいずれも、内部ジスルフィド結合がダイアボディを構成する「軽い」および「
重い」鎖の間に設計されている。一方、「軽い」および「重い」鎖の間に内部ジスルフィ
ド結合を設計されていない構築物１０および１から形成された分子は、分子量約75 kDaお
よび約100 kDa（図１５のレーン１）の少なくとも２つの分子種を形成した。
【０３８９】
ウェスタンブロットの結果にもかかわらず、３つの産物のそれぞれがCD32AおよびCD16の
両方と結合できることがわかった（図１６)。驚いたことに、C末端にヒンジ−Fcドメイン
を含む産物（構築物１１および１２から形成された）と比べて、Fc（またはFc−ヒンジ）
ドメインが、Fc含有ポリペプチド鎖（すなわち「重い」鎖）のアミノ末端にある両方の発
現系由来の産物（構築物９＋１および構築物１０＋１）では、その標的ペプチド（すなわ
ちCD32Bおよび／またはCD16）の一方または両方に対する親和性および／または結合力が
増強されることが実証された。
【０３９０】
6.4 ポリプロテイン前駆体のプロセシングにおける内部／外部切断部位の効果、および共
有結合型二重特異性ダイアボディの発現；ヒトIgGラムダ鎖およびヒンジドメインの一部
を含む二重特異性ダイアボディの設計および性状解析
本明細書で説明したように、本発明のダイアボディの個々のポリペプチド鎖またはダイア
ボディ分子を、単一のポリプロテイン前駆体分子として発現させることができる。実施例
6.1〜6.3で説明した組換え系の、前記ポリプロテイン前駆体から機能的なCBDを適切にプ
ロセシングして発現する能力は、内部切断部位（特にフューリン切断部位）によって分離
されるCBDの第１および第２ポリペプチド鎖の両方をコードする核酸を作製することによ
って試験した。機能的なCBDは、ポリプロテイン前駆体分子を含む組換え系から単離した
。
【０３９１】
実施例6.3で既に述べたように、ヒトκ軽鎖由来のC末端の６アミノ酸FNRGEC （配列番号2
3）の付加は、ダイアボディ形成を安定化することがわかった。おそらく、これは、配列
番号23を含むドメインと、Fcドメインもしくはヒンジ−Fcドメインを含むドメインとの間
で鎖間相互作用が増強されるためと思われる。このラムダ鎖／Fc様相互作用の安定効果を
、どちらのポリペプチド鎖もFcドメインを含まないCBDで試験した。ダイアボディの一方
のポリペプチド鎖を遺伝子操作して、そのC末端に配列番号23を導入した。その相手方と
なるポリペプチド鎖は、IgGのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列VEPKSC（配列番号7
9）を含むように遺伝子操作した。このCBDと構築物１および２を含むCBD（実施例6.1由来
）との比較により、ヒンジドメインおよびラムダ鎖に由来するドメインを含むCBDは、そ
の標的エピトープの一方または両方に対して僅かに大きい親和性を示すことが明らかとな
った。
【０３９２】
＜材料と方法＞ 
ポリペプチド分子の構築および設計
（ポリプロテイン前駆体）
２つのポリプロテイン前駆体分子を作製するために核酸発現ベクターを設計した。両分子
とも図１７に模式図で示してある。構築物１３（配列番号97）は、ポリペプチド鎖のN末
端側から順に、3G8のVLドメイン、2.4G2のVHドメイン（mCD32Bに結合する）、フューリン
切断部位、2.4G2のVLドメイン、および3G8のVHドメインを含んでいる。構築物１３をコー
ドするヌクレオチド配列を配列番号98に示す。構築物14（配列番号99）（図１７）は、ポ
リペプチド鎖のN末端側から順に、3G8のVLドメイン、2.4G2のVHドメイン（mCD32Bに結合
する）、フューリン切断部位、FMD（口蹄疫ウイルスプロテアーゼC3）部位、2.4G2のVLド
メイン、および3G8のVHドメインを含んでいる。構築物１４をコードするヌクレオチド配
列を配列番号100に示す。
【０３９３】
核酸発現ベクターを、実施例6.1で示した構築物１および２の改変型を作製するために設
計した。構築物１５（配列番号101）（図１７）は、構築物１５のC末端がアミノ酸配列FN
RGEC（配列番号23）を含むことを除けば、実施例6.1で示した構築物１（配列番号9）に類
似している。構築物１５をコードする核酸配列を配列番号102に示す。構築物１６（配列
番号103）（図１７）は、構築物１６のC末端がアミノ酸配列VEPSK（配列番号79）を含む
ことを除けば、実施例6.1で示した構築物２に類似している。構築物１６コードする核酸
配列を配列番号104に示す。
【０３９４】
PCRおよび発現ベクターの構築
PCRおよびPCR産物の精製プロトコルは全て、実施例6.1および6.2で説明した通りである。
【０３９５】
重複PCR
実施例6.1および6.2に記載の方法を用いて、適当なプライマーを使って、最終産物を構築
し、増幅し、精製した。
【０３９６】
最終産物を、前述のように哺乳動物発現ベクターpCIneo(Promega, Inc.)内にクローン化
した。構築物をコードするプラスミドは表１６に示すように命名した。
【表１６】
0006285481.tif 000040
【０３９７】
ポリペプチド／ダイアボディの発現
セクション6.1で記載したようにリポフェクトアミン2000を用いてHEK-293細胞内に１回の
トランスフェクションおよび１回のコトランスフェクションを行った。単独のトランスフ
ェクションでは、構築物１３をコードするpMGX0750を、また、コトランスフェクションで
は構築物１５および１６をそれぞれコードするpMGX0752およびpMGX0753を用いた。培養３
日後、条件培地を回収し、分泌された産物を上記のようにアフィニティー精製した。
【０３９８】
ELISA
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を上記サンドイッチELISAによってアッセ
イした。マウスCD32Bを標的タンパク質として用いてプレートをコーティングした。また
、HRP結合CD16を、構築物１５および１６のコトランスフェクションの産物用プローブと
して使用した。mCD32Bを標的タンパク質として使用し、またビオチン結合CD16Aを構築物
１３を含む組換え系用のプローブとして使用した。
【０３９９】
＜結果＞ 
構築物１３を含む組換え発現系から得られた条件培地を、サンドイッチELISAで解析した
。ELISAアッセイは、mCD32Bおよび／またはCD16の一方または両方への特異性についてCBD
の結合性を試験した（図１８）。CD32Bを標的抗原として利用し、またCD16Aを二次プロー
ブとして用いた。ELISAにおける陽性シグナルにより、ポリプロテイン前駆体から生成さ
れるヘテロ二量体h2.4G2-h3G8 CBDは両抗原に対して特異性を有することが明らかとなっ
た。
【０４００】
同様に、構築物１５および１６をコードするベクターのコトランスフェクションによって
生じた精製産物をELISAアッセイで試験し、構築物１および２からなる産物（実施例6.1）
と比較した。CD32Bを標的抗原として利用し、またCD16Aを二次プローブとして用いた。構
築物１および２からなる産物と同様、構築物１５および１６の産物は、同時にCD32Bおよ
びCD16Aと結合できることがわかった。むしろ、構築物１５および１６の産物が、標的抗
原、すなわちCD32BまたはCD16Aの一方または両方に対して僅かに増強された親和性を有す
ることがわかった。これは、おそらく構築物１および２からなる産物にはない、ラムダ鎖
領域FNRGEC（配列番号23）とヒンジ領域VEPKSC（配列番号79）の相互作用によって与えら
れる鎖間結合の安定性および／または忠実度の増加（野生型のVH-VLドメインの相互作用
と比較したとき）によるものと思われる。
【０４０１】
本発明においては、当業者にとって明らかであるように、本発明の精神と範囲から逸脱す
ることなく、多数の改変および変異を含むことができる。本明細書に記載した具体的な実
施形態は、単に例示の目的で提示したものである。本発明は、添付の特許請求の範囲およ
びその権利が付与される均等の範囲によってのみ限定されるべきである。このような修飾
は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。
【０４０２】
本明細書で引用した全ての文献、特許および非特許文献は、個々の刊行物、特許または特
許出願の全内容を参照として組み込むことが明確かつ個別に示される程度に、あらゆる目
的のためにその全内容を参照として本明細書に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０４０３】
【図１Ａ】図1Aは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のヒンジドメインのアミノ酸配列を示す (IgG1ヒンジドメイン(配列番号１)；IgG2ヒンジドメイン(配列番号2)；IgG3ヒンジドメイン(配列番号3)；IgG4ヒンジドメイン(配列番号4))。図1Aで示されたアミノ酸残基は、Kabat EUのナンバリングシステムにしたがって番号を付している。アイソタイプ配列については、重鎖間のS-S結合を形成する各ヒンジ領域の最初と最後のシステイン残基を同一位置に配置することによって、IgG1配列とのアライメントを行っている。
【図１Ｂ】図1Bは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のFcドメインのアミノ酸配列を示す(IgG1 Fcドメイン(配列番号5)；IgG2 Fcドメイン(配列番号6)；IgG3 Fcドメイン(配列番号7)；IgG4 Fcドメイン(配列番号8))。図1Bで示されたアミノ酸残基は、Kabat EUのナンバリングシステムにしたがって番号を付している。図１Bでは、CH2ドメイン中の残基を＋で示し、CH3ドメイン中の残基を〜で示している。
【図２】共有結合型二機能性ダイアボディのポリペプチド鎖の模式図を示す。共有結合型二機能性ダイアボディのポリペプチドは、短いペプチドリンカーで分離された抗体VLドメインおよび抗体VHドメインから成る。8アミノ酸残基のリンカーは、一本鎖ポリペプチドのscFv構築物への自己集合を妨げており、その代わりに、異なるポリペプチド鎖のVLドメインおよびVHドメイン間の相互作用が優先する。4つの構築物を作製した（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端「n」から図の右側のカルボキシ末端「c」まで記載されている）：構築物（１）(配列番号９)は、n−Hu2B6のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu3G8のVHドメイン−およびC末端配列(LGGC)−cを含み、構築物（２）(配列番号11)は、n−Hu3G8のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu2B6のVHドメイン−およびC末端配列(LGGC)−cを含み、構築物（３）(配列番号12)は、n−Hu3G8のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu3G8のVHドメイン−およびC末端配列(LGGC)−cを含み、構築物（４）(配列番号13)は、n−Hu2B6のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu2B6のVHドメイン−およびC末端配列(LGGC)−cを含む。
【図３】アフィニティー精製されたダイアボディのSDS-PAGE分析を示す図である。アフィニティー精製されたダイアボディを還元（レーン１〜３）または非還元（レーン４〜６）条件下でSDS-PAGE分析にかけた。標準品のおおよその分子量を（レーン３および４の間に)示している。レーン１および４はh3G8 CMDを、レーン２および５はh2B6 CMDを、レーン３および６はh2B6-h3G8 CBDを示す。
【図４Ａ】アフィニティー精製されたダイアボディのSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）分析を示す図である。アフィニティー精製されたダイアボディをSEC分析にかけた。既知標準品、すなわち、全長IgG (〜150 kDa)、IgGのFabフラグメント(〜50kDa)、およびscFv(〜30kDa) の溶出プロファイル。
【図４Ｂ】アフィニティー精製されたダイアボディのSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）分析を示す図である。アフィニティー精製されたダイアボディをSEC分析にかけた。既知標準品、すなわち、h2b6 CMD、h3G8 CMDおよびh2B6-h3G8 CBDの溶出プロファイル。
【図５】h2B6-h3G8 CBDのsCD32BおよびsCD16Aとの結合を示す図である。h2B6-h3G8 CBDとsCD32BおよびsCD16Aとの結合を、サンドイッチELISAで分析した。sCD32Bを標的タンパク質として使用した。二次プローブは、HRPコンジュゲートsCD16Aとした。CD16Aに結合するh3G8 CMDを対照として使用した。
【図６Ａ−Ｃ】sCD16A、sCD32BおよびsCD32Aとのダイアボディの結合のBIAcore解析を示す図である。2B6-h3G8 CBD、h2B6 CMDおよびh3G8 CMDとsCD16A、sCD32BおよびsCD32A (陰性対照)との結合をSPR解析によって分析した。h3G8 scFvも対照として試験した。(A) sCD16との結合、(B) sCD32Bとの結合、および(C)sCD32Aとの結合。ダイアボディを100nMの濃度で、scFvを200nMの濃度で、流速50ml/分にて60秒間、受容体表面に投入した。
【図７Ａ−Ｃ】sCD16Aとのダイアボディの結合のBIAcore解析を示す図である。h3G8 CMDおよびh2B6-h3G8 CBDとsCD16Aとの結合をSPR解析によって分析した。h3G8 scFvも対照として試験した。(A) h3G8 CMD sCD16Aとの結合；(B) h2B6-h3G8 CBDとsCD16Aとの結合；(C) h3G8 scFvとsCD16Aとの結合。ダイアボディを6.25〜200nMの濃度で、流速70ml/分にて180秒間、受容体表面に投入した。
【図７Ｄ−Ｅ】sCD32Bとのダイアボディの結合のBIAcore解析を示す図である。h2B6 CMDおよびh2B6-h3G8 CBDとsCD32Bとの結合をSPR解析によって分析した。(D) h2B6 CMDとsCD32Bとの結合、および(E) h2B6-h3G8 CBDとsCD32Bとの結合。ダイアボディを6.25〜200nMの濃度で、流速70ml/分にて180秒間、受容体表面に投入した。
【図８】共有結合型二重特異性ダイアボディ分子を形成するためのVLおよびVHドメインを含んだポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図である。NH2およびCOOHは、それぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシ末端を表す。Sは、各ポリペプチド鎖のC末端システイン残基を表す。VLおよびVHは、それぞれL鎖可変ドメインおよびH鎖可変ドメインを示す。点線および破線は、２つのポリペプチド鎖同士を区別するためのものであり、特に前記鎖のリンカー部分を表している。h2B6 Fvおよびh3G8 Fvは、それぞれCD32BおよびCD16に特異的なエピトープ結合部位を示す。
【図９】共有結合型二重特異性ダイアボディのFcドメインを含むポリペプチド鎖の模式図を示す。本発明のダイアボディ分子のポリペプチド構築物の模式図（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端「n」から図の右側のカルボキシ末端「c」まで記載されている）。構築物（５）(配列番号14)は、n−Hu2B6のVLドメイン−第１リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu3G8のVHドメイン−第２リンカー(LGGC)−およびヒトIgG1のC末端Fcドメイン−cを含み、構築物（６）(配列番号15)は、n−Hu3G8のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu2B6のVHドメイン−および第２リンカー(LGGC)−およびヒトIgG1のC末端Fcドメイン−cを含み、構築物（７）(配列番号16)は、n−Hu2B6のVLドメイン−第１リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu3G8のVHドメイン−およびC末端配列(LGGCFNRGEC) (配列番号17)−cを含み、構築物（８）(配列番号18)は、n−Hu3G8のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu2B6のVHドメイン−および第２リンカー(LGGC)−およびヒトIgG1のC末端ヒンジ／Fcドメイン（A215Vのアミノ酸置換を有する）−cを含む。
【図１０】Fcドメインを含むダイアボディ分子とsCD32BおよびsCD16Aとの結合を示す図である。Fcドメインを含むダイアボディ分子とsCD32BおよびsCD16Aとの結合をサンドイッチELISAで分析した。分析したダイアボディは、次の３つの組換え発現系により産生された：構築物１および６をそれぞれ発現するpMGX669およびpMGX674のコトランスフェクション、構築物２および５をそれぞれ発現するpMGX667およびpMGX676のコトランスフェクション、構築物５および６をそれぞれ発現するpMGX676およびpMGX674のコトランスフェクション。sCD32Bを標的タンパク質として用いた。第２プローブはHRPコンジュゲートsCD16Aとした。
【図１１】二価の共有結合型ダイアボディ分子を形成するために、それぞれ１つのFcドメインを含む、２つのポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図である。NH2およびCOOHは、各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ表す。Sは、各ポリペプチド鎖の第２リンカー配列中のシステイン残基間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。VLおよびVHは、それぞれL鎖可変領域およびH鎖可変領域を示す。点線および破線は、２つのポリペプチド鎖同士を区別するためのものであり、特に前記鎖の第１リンカー部分を表す。CH2およびCH3は、FcドメインのCH2およびCH3定常ドメインを示す。h2B6 Fvおよびh3G8 Fvは、それぞれCD32BおよびCD16に特異的なエピトープ結合部位を示す。
【図１２】ヒンジ／Fcドメインを含むダイアボディ分子のsCD32BおよびsCD16Aに対する結合性を示す図である。Fcドメインを含むダイアボディ分子とsCD32BおよびsCD16Aとの結合については、サンドイッチELISAで分析した。分析したダイアボディは、次の４つの組換え発現系により産生された：構築物１および６をそれぞれ発現するpMGX669+pMGX674のコトランスフェクション、構築物２および８をそれぞれ発現するpMGX669+pMGX678のコトランスフェクション、構築物７および６をそれぞれ発現するpMGX677+pMGX674のコトランスフェクション、構築物７および８をそれぞれ発現するpMGX677+pMGX678のコトランスフェクション。sCD32Bを標的タンパク質として使用した。第２プローブは、HRPコンジュゲートsCD16Aとした。
【図１３】四量体ダイアボディ分子を形成するためのポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図である。NH2およびCOOHは、各ポリペプチド鎖のそれぞれアミノ末端およびカルボキシ末端を表す。Sは、Fcを持つ「重い」ポリペプチド鎖の第２リンカー配列中のシステイン残基と、Fcを持たない「軽い」ポリペプチド鎖のC末端配列中のシステイン残基間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。VLおよびVHは、それぞれL鎖可変ドメインおよびH鎖可変ドメインを示す。点線および破線は、２つのポリペプチド鎖同士を区別するためのものであり、特に前記重い鎖の第１リンカー部分または前記軽い鎖のリンカーを表す。CH2およびCH3は、FcドメインのCH2およびCH3定常ドメインを示す。h2B6 Fvおよびh3G8 Fvは、それぞれCD32BおよびCD16に特異的なエピトープ結合部位を示す。
【図１４】共有結合型二重特異性ダイアボディを形成するFcドメインを含むポリペプチド鎖の模式図である。本発明のダイアボディ分子を形成するポリペプチド構築物の模式図（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端「n」から図の右側のカルボキシ末端「c」まで記載されている）。構築物（９）(配列番号19)は、n−ヒトIgG1のヒンジ/Fcドメイン−Hu3G8のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG(配列番号10))−Hu2B6のVHドメイン−リンカー(GGGSGGGG(配列番号10))−およびC末端LGGC配列−cを含み、構築物（１０）(配列番号20)は、n−ヒトIgG1のFcドメイン−Hu3G8のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG(配列番号10))−Hu2B6のVHドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−およびC末端LGGC配列−cを含み、構築物（１１）(配列番号21)は、n−Hu2B6のVLドメイン(G105C)−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu3G8のVHドメイン−およびA215Vのアミノ酸置換を有するヒトIgG1のC末端ヒンジ/Fcドメイン−cを含み、構築物（１２）(配列番号22)は、n−Hu3G8のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu2B6のVHドメイン(G44C)−およびC末端FNRGEC(配列番号23)配列−cを含む。
【図１５】アフィニティー四量体ダイアボディのSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を示す図である。構築物１０および１、構築物９および１、構築物１１および１２を発現するベクターでコトランスフェクションされた組換え発現系によって産生されたダイアボディを、非還元的条件のSDS-PAGE分析（A）、およびヤギ抗ヒトIgG1 H+Lをプローブとして用いたウェスタンブロット分析（B）にかけた。SDS-PAGEゲル中のタンパク質をシンプリー ブルー セーフステイン（Simply Blue Safestain；Invitrogen社）で視覚化した。AおよびBの両パネルにおいて、構築物１０および１、構築物９および１、構築物１１および１２Aを含むダイアボディ分子は、それぞれレーン１、２、３に相当する。
【図１６】Fcドメインおよび遺伝子操作によって作られた鎖間ジスルフィド結合を含むダイアボディ分子のsCD32BおよびsCD16Aに対する結合性を示す図である。Fcドメイン、および「軽い」ポリペプチド鎖と「重い」ポリペプチド鎖の間の遺伝子操作によって作られたジスルフィド結合を含むダイアボディ分子と、sCD32BおよびsCD16Aとの結合をサンドイッチELISAでアッセイした。アッセイしたダイアボディは、次の３つの組換え発現系により産生された：それぞれ構築物１および１０を発現する系、構築物１および９を発現する系、並びに構築物１１および１２を発現する系。sCD32Bを標的タンパク質として使用した。第２プローブはHRPコンジュゲートsCD16Aとした。h3G8の結合を対照として用いた。
【図１７】ダイアボディ分子のポリタンパク質前駆体の模式図、およびラムダ軽鎖および／またはヒンジドメインを含むポリペプチド鎖の模式図である。本発明のダイアボディ分子を形成するポリペプチド構築物の模式図（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端「n」から図の右側のカルボキシ末端「c」まで記載されている）。構築物（１３）(配列番号97)は、n−3G8のVLドメイン−第１リンカー(GGGSGGGG(配列番号10))−2.4G2VHのVHドメイン−第２リンカー(LGGC)−フューリン認識部位(RAKR(配列番号95))−2.4G2のVLドメイン−第３リンカー(GGGSGGG (SEQ ID NO:10)−3G8のVHドメイン−およびC末端LGGCドメインを含み（配列番号97をコードするヌクレオチド配列は配列番号98に示す）、構築物（１４）(配列番号99)は、n−3G8のVLドメイン−第１リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−2.4G2VHのVHドメイン−第２リンカー(LGGC)−フューリン認識部位(RAKR(配列番号95))−FMD（口蹄疫ウイルスプロテアーゼC3）部位−2.4G2のVLドメイン−第３リンカー(GGGSGGG(配列番号10)−3G8のVHドメイン−およびC末端LGGCドメインを含む（配列番号99をコードするヌクレオチド配列は配列番号100に示す）。構築物（１５）(配列番号101)は、n−Hu2B6のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu3G8のVHドメイン−およびC末端FNRGEC (配列番号23)ドメインを含む（配列番号101をコードするヌクレオチド配列は配列番号102に示す)。構築物（１６）(配列番号103)は、n−Hu3G8のVLドメイン−リンカー(GGGSGGGG (配列番号10))−Hu2B6のVHドメイン−C末端VEPKSC(配列番号79)ドメインを含む（配列番号103をコードするヌクレオチド配列は配列番号104に示す）。
【図１８】ポリタンパク質前駆体分子に由来するダイアボディ分子のmCD32BおよびsCD16Aに対する結合性を示す図である。ポリタンパク質前駆体分子構築物１３(配列番号97)に由来するダイアボディ分子とマウスCD32B(mCD32B)および可溶性CD16A(sCD16A)との結合をサンドイッチELISAで解析した。mCD32Bを標的タンパク質として用いた。第２プローブはビオチンコンジュゲートsCD16Aとした。
【図１９】ラムダ鎖および／またはヒンジドメインを含むダイアボディのsCD32BおよびsCD16Aに対する結合性を示す図である。ヒトラムダ軽鎖のC末端に由来するドメインおよび／またはIgGのヒンジドメインを含むダイアボディと、sCD32BおよびsCD16Aとの結合をサンドイッチELISAでアッセイし、構築物１および２（図５）からなるダイアボディと比較した。アッセイしたダイアボディは、構築物１５および１６（それぞれ配列番号101および配列番号103）を発現する組換え発現系により産生された。sCD32Bを標的タンパク質として使用した。第２プローブはHRPコンジュゲートsCD16Aとした。小点状模様のバーは構築物15/16の組合せ物を表し、また市松模様のバーは構築物1/2の組合せ物を表す。
【図１Ａ】
0006285481.tif 000041
【図１Ｂ】
0006285481.tif 000042
【図２】
0006285481.tif 000043
【図３】
0006285481.tif 000044
【図４Ａ】
0006285481.tif 000045
【図４Ｂ】
0006285481.tif 000046
【図５】
0006285481.tif 000047
【図６Ａ−Ｃ】
0006285481.tif 000048
【図７Ａ−Ｃ】
0006285481.tif 000049
【図７Ｄ−Ｅ】
0006285481.tif 000050
【図８】
0006285481.tif 000051
【図９】
0006285481.tif 000052
【図１０】
0006285481.tif 000053
【図１１】
0006285481.tif 000054
【図１２】
0006285481.tif 000055
【図１３】
0006285481.tif 000056
【図１４】
0006285481.tif 000057
【図１５】
0006285481.tif 000058
【図１６】
0006285481.tif 000059
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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