(57)【要約】本発明は腫瘍の治療のための組成物及び方法を提供する。本発明の方法は、腫瘍を有していると診断されている対象の細胞において、通常はＭｙｃによって抑制されているミクロＲＮＡを発現させることを含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１又はそれらの断片よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡの配列に少なくとも８５％同一性を有する核酸塩基配列を含有してなり、腫瘍細胞における当該ミクロＲＮＡの発現が細胞の生存を減少させるか又は細胞分裂を減少させる、単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
当該オリゴヌクレオチドが、当該ミクロＲＮＡの核酸塩基配列を含有している、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
当該オリゴヌクレオチドが、実質的に当該ミクロＲＮＡの核酸塩基配列よりなる、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
当該ミクロＲＮＡ配列が成熟又はヘアピン形態である、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
当該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変結合を含んでいる、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
当該改変結合が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホロジチオエート、及びリン酸セレン酸結合よりなる群から選ばれる、請求項５に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
当該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変糖残基又は一つの改変核酸塩基を含有している、請求項５に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜４の何れかに記載のオリゴヌクレオチドをコードする単離された核酸分子であって、腫瘍細胞におけるオリゴヌクレオチドの発現が細胞の生存を減少させるか又は細胞分裂を減少させる、単離された核酸分子。
【請求項９】
当該核酸分子が、実質的にｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１又はそれらの断片よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡの成熟若しくはヘアピン形態をコードするヌクレオチド配列よりなる、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドをコードする発現ベクターであって、核酸分子が哺乳動物細胞において発現するように位置付けられている、発現ベクター。
【請求項１１】
ベクターが、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡをコードする、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
ベクターが、レトロウィルス、アデノウィルス、レンチウィルス及びアデノ関連ウィルスベクターよりなる群から選ばれるウィルスベクターである、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項８に記載の発現ベクター又は請求項１〜４の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含有してなる、宿主細胞。
【請求項１４】
組成物が、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡの配列と少なくとも８５％の同一性を有するオリゴヌクレオチドの有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなり、腫瘍細胞における当該ミクロＲＮＡの発現が細胞の生存を減少させるか又は細胞分裂を減少させる、腫瘍の治療のための医薬組成物。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが、当該ミクロＲＮＡと少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ミクロＲＮＡの量が、腫瘍細胞において細胞生存、細胞増殖、又はＭｙｃの発現を、未処理の対照細胞と比較して少なくとも約５％減少させるのに十分である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
組成物が、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、又はｍｉＲ１５ａ／１６−１の少なくとも１つを含有してなる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
組成物が、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡをコードする発現ベクターの有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなり、腫瘍細胞における当該ミクロＲＮＡの発現が細胞の生存を減少させるか又は細胞分裂を減少させる、腫瘍の治療のための医薬組成物。
【請求項１９】
ミクロＲＮＡの量が、腫瘍細胞においてＭｙｃの発現を、未処理の対照細胞と比較して少なくとも約５％減少させるのに十分である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
組成物が、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、又はｍｉＲ１５ａ／１６−１の少なくとも１つを含有してなる、請求項１４又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
組成物が、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれる、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのミクロＲＮＡを含有してなる、請求項１４又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが改変を含んでなる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
方法が、細胞を、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡと少なくとも８５％の同一性を有する核酸塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドと接触させ、それにより腫瘍細胞の生育、生存又は増殖を未処理の対照細胞と比較して減少させることを含有してなる、腫瘍細胞の生育、生存又は増殖を減少させる方法。
【請求項２４】
方法が、細胞を、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡをコードする発現ベクターと接触させ、それにより腫瘍細胞の生育、生存又は増殖を未処理の対照細胞と比較して減少させることを含有してなる、腫瘍細胞の生育、生存又は増殖を減少させる方法。
【請求項２５】
細胞が哺乳動物の細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
細胞がヒトの細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
細胞がリンパ腫細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
方法が腫瘍細胞にアポトーシスを誘発する、請求項２３〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
方法が、対象に、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡと少なくとも８５％の同一性を有する核酸塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドの有効量を投与し、それによって対象における腫瘍を治療することを含有してなる、対象における腫瘍を治療する方法。
【請求項３０】
方法が、対象に、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡをコードする発現ベクターの有効量を投与し、それによって対象における腫瘍を治療することを含有してなる、対象における腫瘍を治療する方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性を増強する改変を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
対象が、リンパ腫を有すると診断されている、請求項２２〜３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
方法が、対象の腫瘍細胞にアポトーシスを誘発する、請求項２２〜３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
有効量が、腫瘍細胞におけるＭｙｃの発現を、未処理の対照細胞と比較して少なくとも５％減少させるのに十分である、請求項２２〜３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
対象を、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ１５ａ／1６−１よりなる群から選ばれる、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのミクロＲＮＡと接触させる、請求項２２〜２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
方法が、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡの発現を試験することを含有してなる、腫瘍を特徴付ける方法。
【請求項３７】
方法が、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１よりなるミクロＲＮＡの組合わせの発現を試験することを含んでいる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
腫瘍がＭｙｃ調節不全を有していると特徴付けられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
方法が、
（ａ）腫瘍細胞を候補薬剤と接触させること；及び
（ｂ）ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡの発現を試験することを含有してなり、当該ミクロＲＮＡ発現の増大により、薬剤が腫瘍の治療に有用であることが同定される、腫瘍の治療用薬剤を同定する方法。
【請求項４０】
薬剤を機能試験でテストすることを更に含有している、請求３９に記載の方法。
【請求項４１】
機能試験が、細胞の生育、増殖、又は生存を分析する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドの少なくとも２つの対を含有してなり、その対のそれぞれが、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１又はそれらの断片よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡと結合する、プライマーセット。
【請求項４３】
それぞれが、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１又はそれらの断片よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡと結合する、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含有してなる、プローブセット。
【請求項４４】
ミクロＲＮＡ、又はｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１又はそれらの断片よりなる群から選ばれるミクロＲＮＡをコードする核酸分子を、含有してなるマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年１月１７日付け出願の米国仮特許出願第６０／８８０，９１９号の優先権を主張する。この全内容を参照して本明細書に組み入れる。
【０００２】
（連邦政府の援助でなされた発明に対する権利の主張）
本研究は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の以下の助成金で援助されている。助成金番号：Ｒ０１ＣＡ１２０１８５、Ｒ０１ＣＡ１２２３３４、及びＲ０１ＣＡ１０２７０９。政府は本発明においてある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
Ｍｙｃ発癌性転写因子の調節不全の発現又は機能は、ヒトの悪性腫瘍中にしばしば生じる。標的遺伝子の膨張性ネットワークの正及び負の制御を介して、Ｍｙｃは、増殖を促進するように、そしてある設定では細胞死をもたらすように、細胞を広く作り直す。Ｍｙｃは遺伝子発現を活性化及び抑制するために異なったメカニズムを用いる。転写を誘発するときＭｙｃは、その結合対Ｍａｘと２量体になって、標的遺伝子の直接上流にあるか又は第１イントロン内にあるゲノムＤＮＡと結合する。転写を抑制するときは、ＭｙｃはＤＮＡと直接接触しないようである。むしろ、Ｍｙｃは、タンパク−タンパク相互作用によってコアプロモータにされてそこで転写の正制御の活性に拮抗する。例えば、Ｍｙｃは転写因子Ｍｙｃ−相互作用亜鉛フィンガータンパク質１（Ｍｉｚ１）と結合してその活性を阻害することによって、Ｍｉｚ１のＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）及びＣＤＫＮ２Ｂ（ｐ１５ＩＮＫ４ｂ）細胞周期阻害遺伝子の活性化転写を防止する。その他のＭｙｃ標的の抑制は、同様に、Ｓｐ１、Ｓｍａｄ２、及びＮＦ−Ｙを含むさらなるタンパク質との相互作用及びその活性に拮抗するＭｙｃの能力を介している。
【０００４】
ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、Ｍｙｃ調節転写産物の新しい種類として最近現れてきた〜１８−２４ヌクレオチドＲＮＡ分子の種々のファミリーである。ｍｉＲＮＡは部分的相補標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性及び翻訳効率を調節する。ｍｉＲＮＡは、制限された、ポリアデニル化された、そしてしばしばスプライスされた長い一次転写産物（ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）としてＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）によって最初に転写される。成熟ミクロＲＮＡ配列は、折り畳んで〜６０−８０ヌクレオチドのヘアピン構造になる領域内のｐｒｉ−ｍｉｃｒｏ ＲＮＡのイントロン又はエクソンに位置している。大部分のｐｒｉ−ｍｉｃｒｏ ＲＮＡが非コード転写産物である間、ミクロＲＮＡのサブセットはタンパク質コード遺伝子のイントロン内に位置している。ミクロＲＮＡの成熟には、ミクロＲＮＡヘアピンがｐｒｉ−ｍｉＲＮＡから切り取られ、ヘアピンの末端ループが除去されて、得られる二本鎖のうちの一方の螺旋構造を選択的にＲＮＡ−誘発サイレンシングコンプレックス（ＲＩＳＣ）に取り込むという一連のエンドヌクレアーゼ反応を必要とする。このミクロＲＮＡプログラム化ＲＩＳＣが、標的ｍＲＮＡの調節を実施するエフェクターコンプレックスである。
【０００５】
多くの兆候が、癌細胞におけるｍｉＲＮＡ発現のほぼ随所に見られる調節不全を立証している。これらのｍｉＲＮＡの発現変化は癌の分類及び予後にとって非常に有益である。さらに、特異的なｍｉＲＮＡの変化した発現が腫瘍形成を促進することが明らかにされている。例えば、ｍｉｒ−１７クラスターとして知られている、同時に転写される６つのｍｉＲＮＡ群がリンパ腫及び固形腫瘍中で増幅される。これらのｍｉＲＮＡは腫瘍中でしばしば過剰発現し、細胞株において増殖を促進して、Ｍｙｃ誘発結腸腫瘍及びリンパ腫のマウスモデルにおける血管形成及び腫瘍形成を加速する。限定されたｍｉＲＮＡが癌細胞中で上方調節されるが、広範囲のｍｉＲＮＡの存在量が腫瘍中で一般に減少していると思われる。ｍｉＲＮＡの下方調節は、腫瘍形成能を有するタンパク質の増大した発現を可能にすることによって腫瘍性の形質変換に寄与していると思われる。最近の兆候は、ｍｉＲＮＡプロセッシングの第１段階の阻止が、癌細胞中の限定されたｍｉＲＮＡの存在量の減少に寄与することを示唆している。癌は米国における４人に１人の死亡原因となっていて、米国人の死因の第２位である。直接的転写抑制を含む、ｍｉＲＮＡ下方調節のさらなるメカニズムは未だ解明されていない。腫瘍を治療又は予防するための改善された組成物及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
下記のように、本発明はミクロＲＮＡを特徴とする組成物及びそれを用いる腫瘍を治療するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は概ね単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１、又は本明細書に詳細に説明されているその他の核酸分子又はそれらの断片の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡの配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の同一性を有する核酸塩基配列を含有していて、腫瘍細胞におけるミクロＲＮＡの発現が細胞の生存を減少させるか又は細胞分裂を減少させる。
【０００８】
別の態様では、本発明は本明細書に詳細に説明されているオリゴヌクレオチドをコードする単離された核酸分子を提供し、腫瘍細胞におけるそのオリゴヌクレオチドの発現が細胞の生存を減少させるか又は細胞分裂を減少させる。
【０００９】
別の態様では、本発明は本明細書に詳細に説明されている核酸分子をコードする発現ベクターを特徴としていて、その核酸分子は哺乳動物細胞（例えば、腫瘍細胞のような、ヒト細胞）中で発現するよう位置付けられている。一実施態様では、ベクターは、レトロウィルス、アデノウィルス、レンチウィルス及びアデノ関連ウィルスベクターよりなる群から選ばれるウィルスベクターである。
【００１０】
関連する態様では、本発明は、前記の態様の発現ベクター又は本明細書に詳細に説明されている核酸分子を含有している宿主細胞（例えば、腫瘍細胞のような、ヒト細胞）を特徴としている。
【００１１】
別の態様では、本発明は腫瘍（例えばリンパ腫）の治療のための医薬組成物を特徴としている。この組成物は、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の同一性を有するオリゴヌクレオチドの有効量及び薬学的に許容される賦形剤を含有していて、腫瘍細胞におけるそのミクロＲＮＡの発現が細胞の生存を減少させるか又は細胞分裂を減少させる。
一実施態様では、ミクロＲＮＡの量は、腫瘍細胞の生存又は増殖を、未処理の対照細胞と比べて、少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％減少させるのに十分な量である。
一実施態様では、組成物はｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、又はｍｉＲ−１５ａ／１６−１の少なくとも１つを含有している。
【００１２】
別の態様では、本発明は、腫瘍の治療のための医薬組成物を特徴としている。この組成物は、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡをコードする発現ベクターの有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有していて、腫瘍細胞におけるそのミクロＲＮＡの発現が細胞の生存を減少させるか又は細胞分裂を減少させる。
一実施態様では、ミクロＲＮＡの量は、腫瘍細胞におけるＭｙｃの発現を未処理の対照細胞と比べて、少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％減少させるのに十分な量である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞の生育、生存又は増殖を減少する方法を提供する。この方法は、細胞（例えば、腫瘍細胞のような、ヒト細胞）を、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡに少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の同一性を有する核酸塩基配列を含有している、オリゴヌクレオチドと接触させて、それによって、未処理の対照細胞と比べて、腫瘍細胞の生育、生存又は増殖を減少させることを含んでいる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞の生育、生存又は増殖を減少する方法を特徴としている。この方法は、細胞をｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡをコードする発現ベクターと接触させ、それによって、未処理の対照細胞と比べて、腫瘍細胞の生育、生存又は増殖を減少させることを含んでいる。
【００１５】
別の態様では、本発明は対象（例えば、家畜又はヒト患者）における腫瘍（例えば、リンパ腫）を治療する方法を特徴としている。この方法は、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡに少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の同一性を有する核酸塩基配列を含有している、オリゴヌクレオチドの有効量を対象に投与し、それによって対象における腫瘍を治療することを含んでいる。
【００１６】
別の態様では、本発明は対象（例えば、家畜又はヒト患者）における腫瘍（例えば、リンパ腫）を治療する方法を特徴としている。この方法は、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡをコードする発現ベクターの有効量を対象に投与し、それによって対象における腫瘍を治療することを含んでいる。
【００１７】
別の態様では、本発明は腫瘍を特徴付ける方法を特徴としている。この方法は、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡの発現を試験することを含んでいる。
【００１８】
一実施態様では、この方法は、ミクロＲＮＡの組合わせ、例えば、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１の２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の組合わせの発現を試験することを含んでいる。
【００１９】
一実施態様では、腫瘍がＭｙｃ調節不全を有している（例えば、対照細胞ではＭｙｃによって抑制されているミクロＲＮＡの発現が増大している）と特徴付けられる。
【００２０】
さらなる別の態様では、本発明は、腫瘍を治療する薬剤を同定する方法を特徴としている。この方法は、腫瘍細胞を候補の薬剤と接触させて、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡの発現を試験することを含んでいて、ミクロＲＮＡ発現の増大により、この薬剤が腫瘍の治療に有用であると同定される。
【００２１】
一実施態様では、この方法はさらに、機能試験（例えば、未処理の対照細胞と比較した、細胞の生育、増殖又は生存を測定する試験）でこの薬剤をテストする方法を含んでいる。
【００２２】
別の態様では、オリゴヌクレオチドの少なくとも２つの対を含有しているプライマーセットを特徴としていて、その対のそれぞれが、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上であるミクロＲＮＡ又はその断片と結合している。
【００２３】
別の態様では、本発明は、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れかであるミクロＲＮＡ又はその断片の少なくとも２つと結合している少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含有しているプローブセットを特徴としている。
【００２４】
別の態様では、本発明は、ミクロＲＮＡ、又はｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１であるミクロＲＮＡ又はその断片をコードする核酸分子を含有しているマイクロアレイを特徴としている。
【００２５】
上記態様の何れかの各種実施態様では、オリゴヌクレオチドはミクロＲＮＡの核酸塩基配列を含んでいる。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは本質的にミクロＲＮＡの核酸塩基配列よりなる。
【００２６】
上記態様の何れかの各種実施態様では、ミクロＲＮＡの配列は、ｐｒｉ−ミクロＲＮＡ、成熟又はへアピン形態である。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変糖残基又は１つの改変核酸残基を含む、少なくとも１つの改変結合（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホロジチオエート、及びリン酸セレン酸結合）を含有している。
【００２７】
本明細書に記載の方法又は組成物の各種実施態様では、核酸分子は本質的に、ミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１）又はその断片若しくは類縁体の成熟又はヘアピン形態をコードするヌクレオチド配列よりなる。
【００２８】
別の実施態様では、ミクロＲＮＡは、ｍｉＲ２２，ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１の何れか１つ又はそれ以上である。
【００２９】
上記態様の何れかのさらなる別の実施態様では、組成物は、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ２２，ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１）を含有している。
【００３０】
さらなる別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、改変（例えば、ヌクレアーゼ耐性を増強する改変のような、本明細書に記載の改変）を含んでいる。
【００３１】
本発明の各種実施態様では、細胞は哺乳動物の細胞（例えばヒト細胞、腫瘍細胞、又はリンパ腫細胞）である。
【００３２】
上記態様の各種実施態様では、組成物又は方法は、腫瘍細胞における細胞周期を崩壊するか又はアポトーシスを誘発する。上記態様の各種実施態様では、方法は、未処理の対照細胞と比べて、少なくとも約５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％、腫瘍細胞における細胞分裂、細胞生存率を減少するか、又はＭｙｃの発現を増大する。
【００３３】
各種実施態様では、対象を２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ２２，ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１）に接触させる。
【００３４】
本発明は、通常はＭｙｃによって抑制されているミクロＲＮＡを発現させることによって、腫瘍を治療する方法を提供する。本発明の別の特徴及び長所は、詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、ＭｙｃによるｍｉＲＮＡ発現の抑制を示す。  図１Ａは、Ｐ４９３−６細胞中で高いＭｙｃ又は低いＭｙｃの発現を伴うｍｉＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。Ｕ６ｓｎＲＮＡを、この実験及び以後の全ての実験でローディングコントロールとして用いた（代表的なブロットが示されている）。この図及び以後の図における「発現比」は、Ｍｙｃの低い状態と比較した、Ｍｙｃの高い状態におけるｍｉＲＮＡの発現レベルを示している。「ＮＤ」は検出されなかったことを示している。  図１Ｂは、ヒトｍｉＲ−３０クラスターの構成を示している。ｃで測定されているような、Ｍｙｃによって下方調節されたｍｉＲＮＡクラスターを、太字で示した。  図１Ｃは、ＭｙｃによるｍｉＲ−３０ファミリーのメンバーの抑制を明らかにしているノーザンブロットの結果を示す。配列中で各ｍｉＲ−３０ファミリーのメンバーと同一の合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド及びＰ４９３‐６細胞由来の全ＲＮＡを各ｍｉＲＮＡに特異的なプローブでハイブリダイズした。
【図１Ｄ】図１ＤはＭｙｃＥＲ腫瘍におけるｍｉＲＮＡの抑制を示す。図１Ｄは、ＭｙｃＥＲ腫瘍におけるｍｉＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。「発現比」はＭｙｃＯＦＦ状態と比較したＭｙｃＯＮ状態におけるｍｉＲＮＡの発現レベルを示している。図１Ｃ及び４Ｂに示されているように、特異的ハイブリダイズ条件をｍｉＲ−３０ｂ及びｌｅｔ−７ａに対して用いた。ｔＲＮＡＬｙｓをローディングコントロールとした（代表的なブロットが示されている）。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｃは、バーキットリンパ腫細胞中でＭｙｃがｍｉＲＮＡを抑制することを示す。  図２Ａは、既に刊行されているｍｉＲＮＡ発現プロファイルデータ（He et al., Nature, 2005）の分析を示す。これはＭｙｃで抑制された殆どのｍｉＲＮＡが、正常なＢ細胞と比べて、バーキットリンパ腫細胞中でより低レベルで発現することを明らかにしている。
【図２Ｂ−２Ｃ】図２Ｂは、ＥＷ３６バーキットリンパ腫細胞中で、レンチウィルスによって発現したｓｈＲＮＡによるＭｙｃノックダウンを示すウェスタンブロットの結果を提供している。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）に対するｓｈＲＮＡを陰性対照とした。  図２Ｃは、ＭｙｃノックダウンがＥＷ３６細胞中のｍｉＲＮＡの上方調節をもたらすことを示す。ｍｉＲ−２９ａはこれらの条件下ではＭｙｃｓｈＲＮＡによって上方調節されず、ｍｉＲ−３４ａ及びｍｉＲ−１５０はこの細胞株中で検出可能なレベルで発現されなかった（示していない）。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、Ｍｙｃが抑制されたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡプロモーターと結合していることを示す。  図３Ａは、既知構造の抑制されたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配置図を提供する。
【図３Ｂ−３Ｃ】図３Ｂは、ＣｈＩＰに対するリアルタイムＰＣＲアンプリコン（単位複製配列）が、転写開始部位のすぐ上流（アンプリコンＳ）、アンプリコンＳの５００ｂｐ上流（アンプリコンＵ）、又はアンプリコンＳの５００ｂｐ下流（アンプリコンＤ）内に設計されたことを示す。  図３Ｃは、Ｍｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析の結果を示すグラフである。このＣｈＩＰ実験及び以後のＣｈＩＰ実験のフォールドエンリッチメント（fold enrichment）は、関連のない抗体によって得られる信号と比較した、Ｍｙｃ免疫沈降によって得られる信号を示す。ＣＤＫＮＩＡ（ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）のプロモーター領域内の有効なＭｙｃ結合アンプリコンを陽性対照とした。陽性Ｍｙｃ結合に対する５０−フォールドエンリッチメント閾値を点線で示してある。エラーバーは３回の独立した測定から導かれた標準偏差を示す。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｃは、Ｍｙｃが抑制されたｍｉＲＮＡの保存領域の上流と結合していることを示す。  図４Ａは、ｍｉＲ−２９ｂ−２／２９ｃクラスターを含有している遺伝子間の領域の系統学的保存を説明している。ＶＩＳＴＡを、ヒト由来のゲノム配列（２００４年５月組み立て）と左に挙げた種のゲノム配列との間の対整合を作成するために用いた。このグラフは、所定の位置に中心がある１００塩基対のスライディングウィンドウに相同するヌクレオチドのプロットである。この遺伝子座から生成された注釈付きの転写物を図の上に示す。ｍｉＲ−２９ｂ−２／２９ｃの５’末端が右を向いていることに留意されたい。ＣｈＩＰ実験で用いたリアルタイムＰＣＲアンプリコンの位置をグラフの下に矢印で示してある。「Ｃ」は保存アンプリコンを示す。「Ｎ」は陰性対照のアンプリコンを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図３Ｃに記載のような、Ｍｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析の結果を示すグラフである。最大Ｍｙｃ結合を示した保存アンプリコン（Ｃ）及び代表的な陰性対照のアンプリコン（Ｎ）を各ｍｉＲＮＡについて示している。これらの及び、ｍｉＲ−２９ｂ−１／２９ａクラスター、ｍｉＲ−３０ｄ／３０ｂクラスター、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ１９５／４９７クラスター、及びｍｉＲ−１５０に対する更なるアンプリコンの位置が図５〜８に示されている。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡプロモーターに対応する保存Ｍｙｃ結合部位を示す。５’及び３’ＲＡＣＥで規定されるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物の構造を図示する。ある場合には、選択的スプライシングが、メジャー及びマイナーな転写産物アイソフォームを生じることが観察される。各転写物の下の、進化的保存を示しているプロットは、ＵＣＳＣゲノムブラウザー（ヒトゲノム、２００４年５月組み立て）からもたらされた。もっとも高いＭｙｃ結合信号を生じるＣｈＩＰアンプリコンの位置が矢印で示されている。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｂは、ＭｙｃがｍｉＲ２９ｂ−１／２９ａクラスターの保存領域の上流と結合していることを示す。  図５Ａは、図４Ａに記載のような、ｍｉＲ２９ｂ−１／２９ａクラスターを包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。  図４Ｂに示されるアンプリコンは太字で下線を付けてある。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図３Ｃに記載のような、Ｍｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図６Ａ】図６Ａ及び６Ｂは、ＭｙｃがｍｉＲ−３０ｄ／３０ｂクラスターの保存領域の上流と結合していることを示す。  図６Ａは、図４Ａに記載のような、ｍｉＲ−３０ｄ／３０ｂクラスターを包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。  図４Ｂに示されるアンプリコンは太字で下線を付けてある。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図３Ｃに記載のような、Ｍｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図７Ａ】図７Ａ及び７Ｂは、ＭｙｃがｍｉＲ−３４ａの保存領域の上流と結合していることを示す。  図７Ａは、図４Ａに記載のような、ｍｉＲ−３４ａを包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。  図４Ｂに示されるアンプリコンは太字で下線を付けてある。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図３Ｃに記載のような、Ｍｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図８Ａ】図８Ａ及び８Ｂは、ＭｙｃがｍｉＲ−１４６ａの保存領域の上流と結合していることを示す。  図８Ａは、図４Ａに記載のような、ｍｉＲ−１４６ａを包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。  図４Ｂに示されるアンプリコンは太字で下線を付けてある。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図３Ｃに記載のような、Ｍｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図９Ａ】図９Ａ及び９Ｂは、ＭｙｃがｍｉＲ−１９５／４９７クラスターの保存領域の上流と結合していることを示す。  図９Ａは、図４Ａに記載のような、ｍｉＲ−１９５／４９７クラスターを包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。  図４Ｂに示されるアンプリコンは太字で下線を付けてある。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図３Ｃに記載のような、Ｍｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び１０Ｂは、ＭｙｃがｍｉＲ−１５０の保存領域の上流と結合していないことを示す。  図１０Ａは、図３Ａに記載のような、ｍｉＲ−１５０を包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。  図４Ｂに示されるアンプリコンは太字で下線を付けてある。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図３Ｃに記載のような、Ｍｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ及び１１Ｂは、ＭｙｃがｍｉＲ−３０ａ／３０ｃ−２クラスターの保存領域の上流と結合していないことを示す。  図１１Ａは、図３Ａに記載のような、ｍｉＲ−３０ａ／３０ｃ−２クラスターを包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図３Ｃに記載のような、Ｍｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図１２Ａ−１２Ｄ】図１２Ａ−１２Ｄは、ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡがＭｙｃによって下方調節されることを示す。  図１２Ａは、ヒトｌｅｔ−７クラスターの構成を示す。図１２Ｂ−Ｄで測定されているような、Ｍｙｃによって下方調節されているｍｉＲＮＡクラスターを太字で示してある。合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド又はＰ４９３−６細胞からの全ＲＮＡのノーザンブロット分析を、ｌｅｔ−７ａファミリーの各メンバーに特異的なプローブを用いて実施した。  図１２Ｂ及び図１２Ｃは、ｍｉＲ９９／１００ファミリーに対する結果を示す。  図１２Ｄは、ｍｉＲ１２５ファミリーに対する結果を示す。「ＮＤ」は検出されなかったことを示す。
【図１３Ａ−１】図１３Ａ及び１３Ｂは、Ｍｙｃがｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡの保存領域の上流と結合していることを示す。  図１３Ａは、図４Ａに記載のようなｌｅｔ−７ａ−１／ｌｅｔ−７ｆ−１／ｌｅｔ−７ｄクラスター、ｌｅｔ−７ｇ、及びｍｉＲ−９９ａ／ｌｅｔ−７ｃ／ｍｉＲ−１２５ｂ−２クラスターを包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。
【図１３Ａ−２】図１３Ａは、図４Ａに記載のようなｌｅｔ−７ａ−１／ｌｅｔ−７ｆ−１／ｌｅｔ−７ｄクラスター、ｌｅｔ−７ｇ、及びｍｉＲ−９９ａ／ｌｅｔ−７ｃ／ｍｉＲ−１２５ｂ−２クラスターを包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。
【図１３Ａ−３】図１３Ａは、図４Ａに記載のようなｌｅｔ−７ａ−１／ｌｅｔ−７ｆ−１／ｌｅｔ−７ｄクラスター、ｌｅｔ−７ｇ、及びｍｉＲ−９９ａ／ｌｅｔ−７ｃ／ｍｉＲ−１２５ｂ−２クラスターを包含する系統的保存のＶＩＳＴＡ分析を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図３Ｃに記載のようなＭｙｃクロマチン免疫沈降のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ及び１４Ｂは、Ｍｙｃで抑制されたｍｉＲＮＡの発現がインビボにおいてリンパ腫細胞の生育に損害を与えることを示す。  図１４Ａは、ｍｉＲＮＡ及びＧＦＰを発現するレトロウィルスによるＭｙｃ３又は３８Ｂ９リンパ腫細胞の感染を示す略図である。少量のＧＦＰ陽性細胞が腫瘍形成の前後に測定された。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、厳選したｍｉＲＮＡを発現する細胞が腫瘍から消失することを示しているグラフである。３回の独立した試験の測定値の標準偏差を示してある。移植マウスに注入する前の全ての培養物は少なくとも３０％ＧＦＰ陽性であった。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ及び１５Ｂは、Ｍｙｃ３及び３８Ｂ９細胞におけるレトロウィルスのｍｉＲＮＡ発現レベルを示すウェスタンブロットである。ブロットの下の数字は、形質転換していないＢ細胞株ＹＳＢ１１と比較した各ｍｉＲＮＡの発現レベルを示している。全ての定量化をローディングコントロール（ｔＲＮＡＫｙｓ、示されていない）及びブロット全域のｍｉＲＮＡのレベルの直接比較ができるように各ゲル上に負荷したＰ４９３（低Ｍｙｃ）ＲＮＡに対して正規化した。図１５Ｂにおいて、レトロウィルスのｍｉＲ−１５０発現を、このｍｉＲＮＡがＹＳ−ＰＢ１１細胞中で発現されないので、ＭｙｃＯＦＦ腫瘍と比較した。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ及び１６Ｂは、Ｐ４９３−６細胞へのＭｙｃ導入に続くｍｉＲＮＡ抑制の動態を示す。  図１６Ａは、テトラサイクリン（ｔｅｔ）の除去に続くＭｙｃ導入を明らかにしているウェスタンブロットの結果を示す。左端のｔｅｔ（＋）又はｔｅｔ（−）レーンは、ｔｅｔと又はｔｅｔなしで７２時間生育した細胞を示す。  図１６Ｂは、ｔｅｔ放出に続くｍｉＲＮＡ抑制を明らかにしているノーザンブロットの結果を示す。ブロットの下の数字は、ローディングコントロール（ｔＲＮＡＫｙｓ、示されていない）に対して正規化された、ｔｅｔ（＋）レベルと比較した各ｍｉＲＮＡの発現レベルを表す。これらの条件下では、ｔｅｔ除去後４８時間までＰ４９３−６細胞は増殖を開始せず、そしてｔｅｔ除去後少なくとも７２時間まで最大生育に到達しない（我々の未刊行の観察及び O'Donnel et al., Mol Cell Bio, 2006）。
【図１７Ａ−１】図１７Ａ−１７Ｄは、本明細書に記載のミクロＲＮＡの配列を示す。  図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−２】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−３】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−４】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−５】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−６】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−７】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−８】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−９】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−１０】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−１１】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−１２】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−１３】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−１４】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−１５】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−１６】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−１７】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ａ−１８】図１７Ａは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１／２９ａ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−１及びミクロＲＮＡ２９ａ遺伝子（GenBank Accession No. EU154353）(配列番号２３０)に対応する。
【図１７Ｂ−１】図１７Ａ−１７Ｄは、本明細書に記載のミクロＲＮＡの配列を示す。  図１７Ｂは、ホモ・サピエンス・ミクロＲＮＡ２９ｂ−２／２９ｃ、前駆ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−２及びミクロＲＮＡ２９ｃ（GenBank Accession No. EU154351）(配列番号２３１)を示す。
【図１７Ｂ−２】図１７Ｂは、ホモ・サピエンス・ミクロＲＮＡ２９ｂ−２／２９ｃ、前駆ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−２及びミクロＲＮＡ２９ｃ（GenBank Accession No. EU154351）(配列番号２３１)を示す。
【図１７Ｂ−３】図１７Ｂは、ホモ・サピエンス・ミクロＲＮＡ２９ｂ−２／２９ｃ、前駆ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−２及びミクロＲＮＡ２９ｃ（GenBank Accession No. EU154351）(配列番号２３１)を示す。
【図１７Ｃ−１】図１７Ａ−１７Ｄは、本明細書に記載のミクロＲＮＡの配列を示す。  図１７Ｃは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−２／２９ｃ、前駆ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−２及びミクロＲＮＡ２９ｃ（GenBank Accession No. EU154352）(配列番号２３２)の配列を提供する。
【図１７Ｃ−２】図１７Ｃは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−２／２９ｃ、前駆ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−２及びミクロＲＮＡ２９ｃ（GenBank Accession No. EU154352）(配列番号２３２)の配列を提供する。
【図１７Ｃ−３】図１７Ｃは、ミクロＲＮＡ２９ｂ−２／２９ｃ、前駆ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ２９ｂ−２及びミクロＲＮＡ２９ｃ（GenBank Accession No. EU154352）(配列番号２３２)の配列を提供する。
【図１７Ｄ−１】図１７Ａ−１７Ｄは、本明細書に記載のミクロＲＮＡの配列を示す。  図１７Ｄは、ｍｉＲ−１４６ａ（GenBank Accession No. EU147785）(配列番号２３３)の配列を提供する。
【図１７Ｄ−２】図１７Ｄは、ｍｉＲ−１４６ａ（GenBank Accession No. EU147785）(配列番号２３３)の配列を提供する。
【図１７Ｄ−３】図１７Ｄは、ｍｉＲ−１４６ａ（GenBank Accession No. EU147785）(配列番号２３３)の配列を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（定義）
他に明示しない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は発明が属する分野の当業者に一般に理解されている意味を有している。次の参考資料は当業者に本発明で用いられている多くの用語の一般的な定義を提供している。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Gentics, 5th Ed., R. Rieger et al., (eds.), Springer Verlag (1991); 及び Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いられているような、以下の用語は、他に特定されない限り、以下のそれらに見なされている意味を有している。本明細書で参照するミクロＲＮＡの配列は当該技術分野で公知である。特に、ミクロＲＮＡの配列は、ミクロＲＮＡのデータを提供している、ｍｉＲＢａｓｅ（http://microrna.sanger.ac.uk/）から公式に入手可能である。ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース中のそれぞれの項目は、ｍｉＲＮＡ転写物の予測されるヘアピン部分を、成熟ｍｉＲＮＡ配列の位置及び配列情報と共に、示している。ヘアピン及び成熟配列の両方を、ＢＬＡＳＴ及びＳＳＥＡＲＣＨを用いる検索に利用でき、名称、キーワード、参考文献及び注釈により検索してエントリーもできる。
【００３７】
「ｍｉＲ−１５ａミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５ａ、Mir Base Reference No. MI0000069、MIMA T0000068、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−１５ａミクロＲＮＡ配列は次の通りである。
ＣＣＵＵＧＧＡＧＵＡＡＡＧＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＡＡＵＧＧＵＵＵＧＵＧＧＡＵＵＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＣＡＧＧＣＣＡＵＡＵＵＧＵＧＣＵＧＣＣＵＣＡＡＡＡＡＵＡＣＡＡＧＧ(配列番号１)（ヘアピン）及び
１４−ｕａｇｃａｇｃａｃａｕａａｕｇｇｕｕｕｇｕｇ−３５(配列番号２)（成熟）。
【００３８】
「ｍｉＲ−１５ａ遺伝子」とは、ｍｉＲ−１５ａミクロＲＮＡ又はその類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００３９】
「ｍｉｒ１６−１ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−１、Mir Base Reference No. MI0000079、MIMA T0000069、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉｒ１６−１ミクロＲＮＡ配列は次の通りである。
ＧＵＣＡＧＣＡＧＵＧＣＣＵＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧＵＵＡＡＧＡＵＵＣＵＡＡＡＡＵＵＡＵＣＵＣＣＡＧＵＡＵＵＡＡＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＧＡＡＧＵＡＡＧＧＵＵＧＡＣ(配列番号３)（ヘアピン）；又は
１４−ｕａｇｃａｇｃａｃｇｕａａａｕａｕｕｇｇｃｇ−３５(配列番号４)（成熟）。
ヒトｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−１５ａは１３ｑ１４で０．５ｋｂ以内でクラスターになる。この領域はＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）中で削除されることが示されている。第２の推定ｍｉｒ−１６ヘアピン前駆体は第３染色体に位置している（MI0000738）。
【００４０】
「ｍｉｒ１６−１遺伝子」とは、ｍｉｒ１６−１ミクロＲＮＡ又はその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００４１】
「ｍｉｒ−２２ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、NCBI Reference No. AJ421742、Mir Base Reference No. MI0000078若しくはMIMA T0000077、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉｒ−２２ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
５３−Ａａｇｃｕｇｃｃａｇｕｕｇａａｇａａｃｕｇｕ−７４(配列番号５)（成熟）；
ＧＧＣＵＧＡＧＣＣＧＣＡＧＵＡＧＵＵＣＵＵＣＡＧＵＧＧＣＡＡＧＣＵＵＵＡＵＧＵＣＣＵＧＡＣＣＣＡＧＣＵＡＡＡＧＣＵＧＣＣＡＧＵＵＧＡＡＧＡＡＣＵＧＵＵＧＣＣＣＵＣＵＧＣＣ(配列番号６)（ヘアピン）。
【００４２】
「ｍｉｒ−２２遺伝子」とは、ｍｉｒ−２２ミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを意味する。典型的なｍｉｒ−２２遺伝子の配列は、NCBI Reference No.AF480525 に提示されている。
【００４３】
「ｍｉＲ−２６ａ−１ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、Mir Base Accession No. MI0000083、MIMA T0000082、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｍｉｒ−２６ａ−１ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
１０−Ｕｕｃａａｇｕａａｕｃｃａｇｇａｕａｇｇｃｕ‐３１(配列番号７)（成熟）；及び
ＧＵＧＧＣＣＵＣＧＵＵＣＡＡＧＵＡＡＵＣＣＡＧＧＡＵＡＧＧＣＵＧＵＧＣＡＧＧＵＣＣＣＡＡＵＧＧＧＣＣＵＡＵＵＣＵＵＧＧＵＵＡＣＵＵＧＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＣ(配列番号８)（ヘアピン）。
【００４４】
「ｍｉＲ−２６ａ−１遺伝子」とは、ｍｉｒ−２６ａ−１ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００４５】
「ｍｉＲ−２６ａ−２ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、Mir Base Accession No. MI0000750、MIMA T0000082、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｍｉＲ−２６ａ−２ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
１４−ｕｕｃａａｇｕａａｕｃｃａｇｇａｕａｇｇｃｕ−３５(配列番号７)（成熟）；又は
ＧＧＣＵＧＵＧＧＣＵＧＧＡＵＵＣＡＡＧＵＡＡＵＣＣＡＧＧＡＵＡＧＧＣＵＧＵＵＵＣＣＡＵＣＵＧＵＧＡＧＧＣＣＵＡＵＵＣＵＵＧＡＵＵＡＣＵＵＧＵＵＵＣＵＧＧＡＧＧＣＡＧＣＵ(配列番号９)（ヘアピン）。
【００４６】
「ｍｉＲ−２６ａ−２遺伝子」とは、ｍｉＲ−２６ａ−２ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００４７】
「ｍｉＲ−２９ａミクロＲＮＡ」とは、ｈｓａ−ｍｉｒ−２９ａの配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉｒ−２９ａ配列は Mir Base Accession No. MI0000087 及び MIMA T0000086 に提示されている。２つの典型的なｍｉｒ−２９ａミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＡＵＧＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧＡＧＵＣＡＡＵＡＵＡＡＵＵＵＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡＵ(配列番号１０)（ヘアピン）；及び
ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ(配列番号１１)（成熟）。
【００４８】
「ｍｉｒ−２９ａ遺伝子」とは、ｍｉｒ−２９ａミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００４９】
「ｍｉＲ−２９ｂ−１ミクロＲＮＡ」とは、ｈｓａ−ｍｉｒ−２９ｂ−１の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉｒ−２９ｂ−１配列は Mir Base Accession No. MI0000105、ｈｓａ−ｍｉｒ−２９ｂ MIMA T0000100 又はその断片に提示されている。２つの典型的なｍｉＲ−２９ｂ−１ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵ(配列番号１２)（成熟）；及び
ＣＵＵＣＡＧＧＡＡＧＣＵＧＧＵＵＵＣＡＵＡＵＧＧＵＧＧＵＵＵＡＧＡＵＵＵＡＡＡＵＡＧＵＧＡＵＵＧＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵＣＵＵＧＧＧＧＧ(配列番号１３)（ヘアピン）。
【００５０】
「ｍｉＲ−２９ｂ−２ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−２９ｂ−２、Mir Base Accession No. MI0000107、MIMA T0000100、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｍｉＲ−２９ｂ−２ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
５２−ｕａｇｃａｃｃａｕｕｕｇａａａｕｃａｇｕｇｕｕ−７４(配列番号１２)（成熟）；又は
ＣＵＵＣＵＧＧＡＡＧＣＵＧＧＵＵＵＣＡＣＡＵＧＧＵＧＧＣＵＵＡＧＡＵＵＵＵＵＣＣＡＵＣＵＵＵＧＵＡＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＡＧＵＧＵＵＵＵＡＧＧＡＧ(配列番号１４)（ヘアピン）。
【００５１】
「ｍｉＲ−２９ｂ−２遺伝子」とは、ｍｉＲ−２９ｂ−２ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００５２】
「ｍｉＲ−２９ｃミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ、Mir Base Accession No. MI0000735、MIMA T0000681、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｍｉＲ−２９ｃミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
５４−ｕａｇｃａｃｃａｕｕｕｇａａａｕｃｇｇｕｕａ−７５(配列番号１５)（成熟）；又は
ＡＵＣＵＣＵＵＡＣＡＣＡＣＡＧＧＣＵＧＡＣＣＧＡＵＵＵＣＵＣＣＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧＡＧＵＣＵＧＵＵＵＵＵＧＵＣＵＡＧＣＡＣＣＡＵＵＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡＵＧＡＵＧＵＡＧＧＧＧＧＡ(配列番号１６)（ヘアピン）。
【００５３】
「ｍｉＲ−２９ｃ遺伝子」とは、ｍｉｒ−２９ｃミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００５４】
「ｍｉＲ−３０ｅミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｅ、Mir Base Accession No. MI0000749、MIMA T0000692、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｍｉＲ−３０ｅミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
１７−ｕｇｕａａａｃａｕｃｃｕｕｇａｃｕｇｇａａｇ−３８(配列番号１７)（成熟）；又は
ＧＧＧＣＡＧＵＣＵＵＵＧＣＵＡＣＵＧＵＡＡＡＣＡＵＣＣＵＵＧＡＣＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＡＡＧＧＵＧＵＵＣＡＧＡＧＧＡＧＣＵＵＵＣＡＧＵＣＧＧＡＵＧＵＵＵＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＣＵＧＣＣＡ(配列番号１８)（ヘアピン）。
【００５５】
「ｍｉＲ−３０ｅ遺伝子」とは、ｍｉＲ−３０ｅミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００５６】
「ｍｉＲ−３０ｃ−１ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−１、Mir Base Accession No. MI0000736、MIMA T0000244、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｍｉＲ−３０ｃ−１ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
１７−ｕｇｕａａａｃａｕｃｃｕａｃａｃｕｃｕｃａｇｃ−３９(配列番号１９)（成熟）；又は
ＡＣＣＡＵＧＣＵＧＵＡＧＵＧＵＧＵＧＡＡＡＣＡＵＣＣＵＡＣＡＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＵＧＡＧＣＵＣＡＡＧＧＵＧＧＣＵＧＧＧＡＧＡＧＧＧＵＵＧＵＵＵＡＣＵＣＣＵＵＣＵＧＣＣＡＵＧＧＡ(配列番号２０)（ヘアピン）。
【００５７】
「ｍｉＲ−３０ｃ−１遺伝子」とは、ｍｉＲ−３０ｃ−１ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００５８】
「ｍｉＲ−２６ｂミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、Mir Base Accession No. MI0000084、MIMA T0000083、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＣＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＵＵＣＡＡＧＵＡＡＵＵＣＡＧＧＡＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＣＵＧＵＣＣＡＧＣＣＵＧＵＵＣＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＧＧＣＵＣＧＧＧＧＡＣＣＧＧ(配列番号２１)（ヘアピン）；又は
１２−ｕｕｃａａｇｕａａｕｕｃａｇｇａｕａｇｇｕ−３２(配列番号２２)（成熟）。
【００５９】
「ｍｉＲ−２６ｂ遺伝子」とは、ｍｉＲ−２６ｂミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００６０】
「ｍｉＲ−３０ｃ−２ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−２、Mir Base Accession No. MI0000254、MIMA T0000244、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−３０ｃ−２ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＡＧＡＵＡＣＵＧＵＡＡＡＣＡＵＣＣＵＡＣＡＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＵＧＧＡＡＡＧＵＡＡＧＡＡＡＧＣＵＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＵＧＵＵＵＡＣＵＣＵＵＵＣＵ(配列番号２３)（ヘアピン）；
７−ｕｇｕａａａｃａｕｃｃｕａｃａｃｕｃｕｃａｇｃ−２９(配列番号１９）（成熟）；又は
４７−ｃｕｇｇｇａｇａａｇｇｃｕｇｕｕｕａｃｕｃｕ−６８(配列番号２４)（マイナー代替えプロセッシング）。
【００６１】
「ｍｉＲ−３０ｃ遺伝子」とは、ｍｉＲ−３０ｃミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００６２】
「ｍｉＲ−３４ａミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４ａ、Mir Base Accession No. MI0000268、MIMA T0000255、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−３４ａミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＧＧＣＣＡＧＣＵＧＵＧＡＧＵＧＵＵＵＣＵＵＵＧＧＣＡＧＵＧＵＣＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧＵＵＧＵＧＡＧＣＡＡＵＡＧＵＡＡＧＧＡＡＧＣＡＡＵＣＡＧＣＡＡＧＵＡＵＡＣＵＧＣＣＣＵＡＧＡＡＧＵＧＣＵＧＣＡＣＧＵＵＧＵＧＧＧＧＣＣＣ(配列番号２５)（ヘアピン）；又は
２２−ｕｇｇｃａｇｕｇｕｃｕｕａｇｃｕｇｇｕｕｇｕ−４３(配列番号２６)（成熟）。
【００６３】
「ｍｉＲ−３４ａ遺伝子」とは、ｍｉＲ−３４ａミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００６４】
「ｍｉＲ−１４６ａミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１４６ａ、Mir Base Accession No. MI0000477、MIMA T0000449、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｍｉＲ−１４６ａミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
２１−ｕｇａｇａａｃｕｇａａｕｕｃｃａｕｇｇｇｕｕ−４２(配列番号２７)（成熟）；又は
ＣＣＧＡＵＧＵＧＵＡＵＣＣＵＣＡＧＣＵＵＵＧＡＧＡＡＣＵＧＡＡＵＵＣＣＡＵＧＧＧＵＵＧＵＧＵＣＡＧＵＧＵＣＡＧＡＣＣＵＣＵＧＡＡＡＵＵＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＧＣＵＧＧＧＡＵＡＵＣＵＣＵＧＵＣＡＵＣＧＵ(配列番号２８)（ヘアピン）。
【００６５】
「ｍｉＲ−１４６ａ遺伝子」とは、ｍｉＲ−１４６ａミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００６６】
「ｍｉＲ−１５０ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５０、Mir Base Accession No. MI0000479、MIMA T0000451、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｍｉＲ−１５０ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
１６−ｕｃｕｃｃｃａａｃｃｃｕｕｇｕａｃｃａｇｕｇ−３７(配列番号２９)（成熟）；又は
ＣＵＣＣＣＣＡＵＧＧＣＣＣＵＧＵＣＵＣＣＣＡＡＣＣＣＵＵＧＵＡＣＣＡＧＵＧＣＵＧＧＧＣＵＣＡＧＡＣＣＣＵＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＵＧＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＣＵＧＧＧＧＡＣ(配列番号３０)（ヘアピン）。
【００６７】
「ｍｉＲ−１５０遺伝子」とは、ｍｉＲ−１５０ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００６８】
「ｍｉＲ−１９５ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９５、Mir Base Accession No. MI0000489、MIMA T0000461、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−１９５ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＡＧＣＵＵＣＣＣＵＧＧＣＵＣＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＧＣＧＡＧＵＣＵＧＣＣＡＡＵＡＵＵＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＧＧＧＵＧＧＵＧ(配列番号３１)（ヘアピン）；及び
１５−ｕａｇｃａｇｃａｃａｇａａｕａｕｕｇｇｃ−３５(配列番号３２)（成熟）。
【００６９】
「ｍｉＲ−１９５遺伝子」とは、ｍｉＲ−１９５ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００７０】
「ｍｉＲ−４９７ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−４９７、Mir Base Accession No. MI0003138、MIMA T0002820、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−４９７ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＣＣＡＣＣＣＣＧＧＵＣＣＵＧＣＵＣＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＵＧＵＧＧＵＵＵＧＵＡＣＧＧＣＡＣＵＧＵＧＧＣＣＡＣＧＵＣＣＡＡＡＣＣＡＣＡＣＵＧＵＧＧＵＧＵＵＡＧＡＧＣＧＡＧＧＧＵＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧ(配列番号３３)（ヘアピン）；及び
２４−ｃａｇｃａｇｃａｃａｃｕｇｕｇｇｕｕｕｇｕ−４４(配列番号３４)（成熟）。
【００７１】
「ｍｉＲ−４９７遺伝子」とは、ｍｉＲ−４９７ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００７２】
「ｌｅｔ−７ａ−１ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−１、Mir Base Accession No. MI0000060、MIMA T0000062、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｌｅｔ−７ａ−１ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
６−ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｇｕｕｇｕａｕａｇｕｕ−２７(配列番号３５)（成熟）；又は
ＵＧＧＧＡＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵＵＵＡＧＧＧＵＣＡＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＵＧＧＧＡＧＡＵＡＡＣＵＡＵＡＣＡＡＵＣＵＡＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣＵＡ(配列番号３６)（ヘアピン）。
【００７３】
「ｌｅｔ−７ａ−１遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ａ−１ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００７４】
「ｌｅｔ−７ｆ−１ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−１、Mir Base Accession No. MI0000067、MIMA T0000067、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｌｅｔ−７ｆ−１ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
７−ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇａｕｕｇｕａｕａｇｕｕ−２８(配列番号３７)（成熟）；又は
ＵＣＡＧＡＧＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵＧＵＧＧＧＧＵＡＧＵＧＡＵＵＵＵＡＣＣＣＵＧＵＵＣＡＧＧＡＧＡＵＡＡＣＵＡＵＡＣＡＡＵＣＵＡＵＵＧＣＣＵＵＣＣＣＵＧＡ(配列番号３８)（ヘアピン）。
【００７５】
「ｌｅｔ−７ｆ−１遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ｆ−１ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００７６】
「ｌｅｔ−７ｄミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、Mir Base Accession No. MI0000065、MIMA T0000065、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｌｅｔ−７ｄミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ(配列番号３９)（成熟）；又は
ＣＣＵＡＧＧＡＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵＵＵＡＧＧＧＣＡＧＧＧＡＵＵＵＵＧＣＣＣＡＣＡＡＧＧＡＧＧＵＡＡＣＵＡＵＡＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＣＣＵＵＵＣＵＵＡＧＧ(配列番号４０)（ヘアピン）。
【００７７】
「ｌｅｔ−７ｄ遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ｄミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００７８】
「ｍｉＲ−１００ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、Mir Base Accession No. MI0000102、MIMA T0000098、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｍｉＲ−１００ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
１３−ａａｃｃｃｇｕａｇａｕｃｃｇａａｃｕｕｇｕｇ−３４(配列番号４１)（成熟）；
ＣＣＵＧＵＵＧＣＣＡＣＡＡＡＣＣＣＧＵＡＧＡＵＣＣＧＡＡＣＵＵＧＵＧＧＵＡＵＵＡＧＵＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＵＵＧＵＡＵＣＵＡＵＡＧＧＵＡＵＧＵＧＵＣＵＧＵＵＡＧＧ(配列番号４２)（ヘアピン）。
【００７９】
「ｍｉＲ−１００遺伝子」とは、ｍｉＲ−１００ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００８０】
「ｌｅｔ−７ａ−２ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、Mir Base Accession No. MI0000061、MIMA T0000062、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｌｅｔ−７ａ−２ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＡＧＧＵＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵＵＡＧＡＡＵＵＡＣＡＵＣＡＡＧＧＧＡＧＡＵＡＡＣＵＧＵＡＣＡＧＣＣＵＣＣＵＡＧＣＵＵＵＣＣＵ(配列番号４３)（ヘアピン）；及び
５−ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｇｕｕｇｕａｕａｇｕｕ−２６(配列番号３５)（成熟）。
【００８１】
「ｌｅｔ−７ａ−２遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ａ−２ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００８２】
「ｍｉＲ−１２５ｂ−１ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２５ｂ−１、Mir Base Accession No. MI0000446、MIMA T0000423、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｈａｓ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
１５−ｕｃｃｃｕｇａｇａｃｃｃｕａａｃｕｕｇｕｇａ−３６(配列番号４４)（成熟）；又は
ＵＧＣＧＣＵＣＣＵＣＵＣＡＧＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡＵＧＵＵＵＡＣＣＧＵＵＵＡＡＡＵＣＣＡＣＧＧＧＵＵＡＧＧＣＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＵＧＣＧＡＧＵＣＧＵＧＣＵ(配列番号４５)（ヘアピン）。
【００８３】
「ｌｅｔ−７ａ−３ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３、Mir Base Accession No. MI0000062、MIMA T0000062、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｌｅｔ−７ａ−３ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＧＧＧＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵＵＧＧＧＧＣＵＣＵＧＣＣＣＵＧＣＵＡＵＧＧＧＡＵＡＡＣＵＡＵＡＣＡＡＵＣＵＡＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣＵ(配列番号４６)（ヘアピン）；又は
４−ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｇｕｕｇｕａｕａｇｕｕ−２５(配列番号３５)。
【００８４】
「ｌｅｔ−７ｂミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、Mir Base Accession No. MI0000063、MIMA T0000063、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。２つの典型的なｌｅｔ−７ｂミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
６−ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｇｕｕｇｕｇｕｇｇｕｕ−２７(配列番号４７)（成熟）；又は
ＣＧＧＧＧＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵＵＣＡＧＧＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＧＣＣＣＣＵＣＧＧＡＡＧＡＵＡＡＣＵＡＵＡＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＵＣＣＣＵＧ(配列番号４８)（ヘアピン）。
【００８５】
「ｌｅｔ−７ｂ遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ｂミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００８６】
「ｍｉＲ−９９ａミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−９９ａ、Mir Base Accession No. MI0000101、MIMA T0000097、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−９９ａミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＣＣＣＡＵＵＧＧＣＡＵＡＡＡＣＣＣＧＵＡＧＡＵＣＣＧＡＵＣＵＵＧＵＧＧＵＧＡＡＧＵＧＧＡＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＵＣＧＣＵＵＣＵＡＵＧＧＧＵＣＵＧＵＧＵＣＡＧＵＧＵＧ(配列番号４９)（ヘアピン）；又は
１３−ａａｃｃｃｇｕａｇａｕｃｃｇａｕｃｕｕｇｕｇ−３４(配列番号５０)（成熟）。
【００８７】
「ｍｉＲ−９９ａ遺伝子」とは、ｍｉＲ−９９ａミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００８８】
「ｌｅｔ−７ｃミクロＲＮＡ」とは、このものの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、Mir Base Accession No. MI0000064、MIMA T0000064、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｌｅｔ−７ｃミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＧＣＡＵＣＣＧＧＧＵＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵＵＡＧＡＧＵＵＡＣＡＣＣＣＵＧＧＧＡＧＵＵＡＡＣＵＧＵＡＣＡＡＣＣＵＵＣＵＡＧＣＵＵＵＣＣＵＵＧＧＡＧＣ(配列番号５１)（へピン）；又は
１１−ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｇｕｕｇｕａｕｇｇｕｕ−３２(配列番号５２)（成熟）。
【００８９】
「ｌｅｔ−７ｃ遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ｃミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００９０】
「ｍｉＲ−１２５ｂ−２ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２５ｂ−２、Mir Base Accession No. MI0000470、MIMA T0000423、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−１２５ｂ−２ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＡＣＣＡＧＡＣＵＵＵＵＣＣＵＡＧＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡＧＧＵＡＵＵＵＵＡＧＵＡＡＣＡＵＣＡＣＡＡＧＵＣＡＧＧＣＵＣＵＵＧＧＧＡＣＣＵＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＡ(配列番号５３)（ヘアピン）；又は
１７−ｕｃｃｃｕｇａｇａｃｃｃｕａａｃｕｕｇｕｇａ−３８(配列番号４４)（成熟）。
【００９１】
「ｍｉＲ−９９ｂミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−９９ｂ、Mir Base Accession No. MI0000746、MIMA T0000689、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−９９ｂミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＣＧＵＡＧＡＡＣＣＧＡＣＣＵＵＧＣＧＧＧＧＣＣＵＵＣＧＣＣＧＣＡＣＡＣＡＡＧＣＵＣＧＵＧＵＣＵＧＵＧＧＧＵＣＣＧＵＧＵＣ(配列番号５４)（ヘアピン）；又は
７−ｃａｃｃｃｇｕａｇａａｃｃｇａｃｃｕｕｇｃｇ−２８(配列番号５５)（成熟）。
【００９２】
「ｍｉＲ−９９ｂ遺伝子とは、ｍｉＲ−９９ｂミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを意味している。
【００９３】
「ｌｅｔ−７ｅミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、MI0000066、MIMA T0000066、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｌｅｔ−７ｅミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＣＣＣＧＧＧＣＵＧＡＧＧＵＡＧＧＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＣＵＡＵＡＣＧＧＣＣＵＣＣＵＡＧＣＵＵＵＣＣＣＣＡＧＧ(配列番号５６)（ヘアピン）；又は
８−Ｕｇａｇｇｕａｇｇａｇｇｕｕｇｕａｕａｇｕｕ−２９(配列番号５７)（成熟）。
【００９４】
「ｌｅｔ−７ｅ遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ｅミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００９５】
「ｍｉＲ−１２５ａミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２５ａ、Mir Base Accession No. MI0000469、MIMA T0000443、MIMA T0004602、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−１２５ａミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＵＧＣＣＡＧＵＣＵＣＵＡＧＧＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＵＵＡＡＣＣＵＧＵＧＡＧＧＡＣＡＵＣＣＡＧＧＧＵＣＡＣＡＧＧＵＧＡＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＣＵＧＧＣＧＵＣＵＧＧＣＣ(配列番号５８)（ヘアピン）；又は
１５−ｕｃｃｃｕｇａｇａｃｃｃｕｕｕａａｃｃｕｇｕｇａ−３８(配列番号５９)（成熟）又は
５３−ａｃａｇｇｕｇａｇｇｕｕｃｕｕｇｇｇａｇｃｃ−７４(配列番号６０)（成熟の代替えプロセッシング）。
【００９６】
「ｍｉＲ−１２５ａ遺伝子」とは、ｍｉＲ−１２５ａミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００９７】
「ｌｅｔ−７ｆ−２ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、Mir Base Accession No. MI0000068、MIMA T0000067、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｌｅｔ−７ｆ−２ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＵＧＵＧＧＧＡＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵＵＵＡＧＧＧＵＣＡＵＡＣＣＣＣＡＵＣＵＵＧＧＡＧＡＵＡＡＣＵＡＵＡＣＡＧＵＣＵＡＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣＣＡＣＧ(配列番号６１)（ヘアピン）；又は
８−ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇａｕｕｇｕａｕａｇｕｕ−２９(配列番号３７)（成熟）。
【００９８】
「ｌｅｔ−７ｆ−２遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ｆ−２ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００９９】
「ｍｉＲ−９８ミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｍｉｒ−ｍｉＲ−９８、Mir Base Accession No. MI0000100、MIMA T0000096、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｍｉＲ−９８ミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＡＧＧＡＵＵＣＵＧＣＵＣＡＵＧＣＣＡＧＧＧＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＡＧＵＵＧＵＡＵＵＧＵＵＧＵＧＧＧＧＵＡＧＧＧＡＵＡＵＵＡＧＧＣＣＣＣＡＡＵＵＡＧＡＡＧＡＵＡＡＣＵＡＵＡＣＡＡＣＵＵＡＣＵＡＣＵＵＵＣＣＣＵＧＧＵＧＵＧＵＧＧＣＡＵＡＵＵＣＡ(配列番号６２）（ヘアピン）；又は
２２−ｕｇａｇｇｕａｇｕａａｇｕｕｇｕａｕｕｇｕｕ−４３(配列番号６３)（成熟）。
【０１００】
「ｍｉＲ−９８遺伝子」とは、ｍｉＲ−９８ミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【０１０１】
「ｌｅｔ−７ｇミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、Mir Base Accession No. MI0000433、MIMA T0000414、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｌｅｔ−７ｇミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＡＧＧＣＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＵＵＵＧＵＡＣＡＧＵＵＵＧＡＧＧＧＵＣＵＡＵＧＡＵＡＣＣＡＣＣＣＧＧＵＡＣＡＧＧＡＧＡＵＡＡＣＵＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＣＵＧＣＣＵＵＧＣＣＡ(配列番号６４)（ヘアピン）；
５−ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｕｕｕｇｕａｃａｇｕｕ−２６(配列番号６５)（成熟）；又は
６２−ｃｕｇｕａｃａｇｇｃｃａｃｕｇｃｃｕｕｇｃ−８２(配列番号６６)（マイナー）。
【０１０２】
「ｌｅｔ−７ｇ遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ｇミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【０１０３】
「ｌｅｔ−７ｉミクロＲＮＡ」とは、これらの発現が腫瘍の生育を減少する、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、Mir Base Accession No. MI0000434、MIMA T0000415、又はそれらの断片の配列と実質的に同一である核酸塩基配列を含有している核酸分子を意味している。典型的なｌｅｔ−７ｉミクロＲＮＡの配列は次の通りである。
ＣＵＧＧＣＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＵＵＵＧＵＧＣＵＧＵＵＧＧＵＣＧＧＧＵＵＧＵＧＡＣＡＵＵＧＣＣＣＧＣＵＧＵＧＧＡＧＡＵＡＡＣＵＧＣＧＣＡＡＧＣＵＡＣＵＧＣＣＵＵＧＣＵＡ(配列番号６７)（ヘアピン）；又は
６−ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｕｕｕｇｕｇｃｕｇｕｕ−２７(配列番号６８)。
【０１０４】
「ｌｅｔ−７ｉ遺伝子」とは、ｌｅｔ−７ｉミクロＲＮＡ又はそれらの類縁体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【０１０５】
「薬剤」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はそれらの断片若しくは類縁体、小分子、又はその他の生物活性分子を意味している。
【０１０６】
「変化」とは、上記のような当該技術分野で公知の標準的な方法で検出されるような、遺伝子又はポリペプチドの発現レベルにおける変化（増大又は減少）を意味している。本明細書で用いる限りでは、変化は発現レベルにおける１０％の変化、好ましくは２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、そして最も好ましくは５０％又はそれ以上の発現レベルの変化を含んでいる。
【０１０７】
本開示において、「含む」、「含んでいる」、「含有している」及び「有している」などは、米国特許法においてそれらが見なされている意味を有することができ、そして「包含する」、「包含している」などを意味することができる。「本質的に〜より成っている」又は「本質的に〜より成る」などは、米国特許法において見なされている意味を有していて、この用語はオープンエンドであり、基本的若しくは新規な特徴がある限り、列挙されているもの以上の存在を許容するが、先行技術の態様は除外する。
【０１０８】
「対照」とは、標準的又は参照的な条件を意味している。
【０１０９】
「有効量」とは、治療していない患者と比較して疾患の症状を軽減するのに必要な薬剤の量を意味している。腫瘍の治療処置のために本発明を実施するのに用いられる活性薬剤の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重及び一般健康状態によって変わる。最終的には、主治医又は獣医が適切な量及び投薬計画を決定する。そのような量が「有効な」量として見なされる。
【０１１０】
「断片」とは、参照タンパク質又は核酸と実質的に同一であり、そして参照タンパク質又は核酸の生物活性を保持している、タンパク質又は核酸分子の部分（例えば、少なくとも１０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は５００個のアミノ酸又は核酸）を意味している。
【０１１１】
「宿主細胞」は、クローニングベクター又は発現ベクターのどちらかを含有している原核又は真核細胞の何れかである。この用語は、クローン化遺伝子を宿主細胞の染色体又はゲノムに含むように遺伝子操作されている原核又は真核細胞も包含している。
【０１１２】
「腫瘍を阻害する」とは、腫瘍に進展する細胞の性向の減少、又は腫瘍の生育又は増殖を遅延、減少、又は安定化を意味している。
【０１１３】
「単離された核酸分子」とは、本発明の核酸分子が由来する生命体の天然ゲノム中で遺伝子に隣接している、遺伝子が存在していない、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ又はこれらの類縁体）を意味している。従ってこの用語は、例えば、ベクターに；自動的に複製するプラスミド又はウィルスに；又は原核若しくは真核のゲノムＤＮＡに組み込まれている；又は他の配列から独立した別の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたｃＤＮＡ又はゲノム若しくはｃＤＮＡ断片）として存在している、組み換えＤＮＡを包含する。さらに、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されたミクロＲＮＡ又はその他のＲＮＡ分子、さらに付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡを包含する。
【０１１４】
「マーカー」とは、疾患又は障害に関連している発現レベル又は活性において変化があるタンパク質又はポリヌクレオチドの何れかを意味している。
【０１１５】
用語「マイクロアレイ」は、固体支持体（例えば、チップ、プレート、又はビーズ）上に配置されている１つ又はそれ以上の生命体からの核酸分子又はポリペプチドの回収を意味している。
【０１１６】
「改変」とは、天然の参照薬剤と比べて、ヌクレオチド、アミノ酸、又はその他の薬剤を生物学的に又はその他の合成的に変化させることの何れも意味する。
【０１１７】
「腫瘍」とは、不適正に高い細胞分裂のレベル、若しくは不適正に低いアポトーシスのレベル、又は両方によって引き起こされるか又はその結果である、何れかの疾患を意味している。例えば、癌は腫瘍である。癌の例は、限定することなく、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、重鎖病、及び肉腫並びに癌腫（例えば、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、ナイル腺管癌（nile duct carcinoma）、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞性肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管細胞芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）のような固形癌を包含する。リンパ増殖性疾患も増殖性疾患と見なされる。
【０１１８】
「成熟形態」とは、少なくとも部分的に、標的ｍＲＮＡの調節に関与できる生物学的活性形態に処理されているミクロＲＮＡを意味している。
【０１１９】
「ヘアピン形態」とは、二重螺旋部分を含んでいるミクロＲＮＡを意味している。
【０１２０】
「ミクロＲＮＡ」とは、ポリペプチドコード活性の何れとも無関係な生物活性を有している核酸塩基配列を意味している。ミクロＲＮＡは合成されても天然のものでもよく、そして本明細書に記載されている１つ又はそれ以上の改変を含んでいてもよい。ミクロＲＮＡは、ｐｒｉ−ミクロＲＮＡ、ヘアピンミクロＲＮＡ、及び成熟ミクロＲＮＡを包含する。
【０１２１】
「Ｍｙｃ調節異常」とは、通常はＭｙｃによって抑制されている１つ又はそれ以上のミクロＲＮＡの発現レベルにおける変化を意味している。
【０１２２】
「核酸」とは、リボ核酸又はデオキシリボ核酸、又はそれらの類縁体のオリゴマー又はポリマーを意味している。この用語は、天然の塩基、糖、及び糖間（骨格）結合からなるオリゴマー、更に、機能が同様な非天然部分を有するオリゴマーを包含する。このような改変又は置換オリゴヌクレオチドは多くの場合、例えば、ヌクレアーゼの存在下での増強された安定性のような特性のため、天然型よりも好ましい。
【０１２３】
「阻害性核酸分子を得ること」におけるような、「得ること」とは、阻害性核酸分子を合成すること、購入すること、又は別の手段で入手することを意味している。
【０１２４】
「オリゴヌクレオチド」とは、核酸塩基配列を含有する分子の何れもを意味している。オリゴヌクレオチドは、例えば、１つ又はそれ以上の改変された塩基、結合、糖残基、又はその他の改変を含むことができる。
【０１２５】
「操作可能に結合した」とは、第１ポリヌクレオチドが、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が第２ポリヌクレオチドに結合したときに、第１ポリヌクレオチドの転写を指示する第２ポリヌクレオチドに隣接して位置していることを意味している。
【０１２６】
「発現のために位置付けられている」とは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ分子）が、配列の転写及び翻訳を指示する（すなわち、例えば、本明細書に記載されている組み換えミクロＲＮＡの生産を促進する）ＤＮＡ配列に隣接して位置付けらていることを意味している。
【０１２７】
「プライマーセット」又は「プローブセット」は、オリゴヌクレオチドの組合わせを意味する。プライマーセットは、例えば、目的のポリヌクレオチドを増幅するために用いることができる。プローブセットは、例えば、目的のポリヌクレオチドとハイブリダイズするために用いることができる。プライマーセットは、少なくとも２、４，６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００又はそれ以上のプライマー又はプローブより成っている。
【０１２８】
「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の１部分を意味している。この部分は、参照する核酸分子又はポリペプチドの全長の、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を含有している。断片は５，６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５，１６、１７、１８、１９、２０、又は２１個のヌクレオチドを含有していてよい。
【０１２９】
「減少する」とは、負の変化を意味している。減少は、例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％又はもっと言えば１００％の減少を含んでいる。
【０１３０】
「生存が減少する」とは、参照と比較して、細胞または細胞集団における細胞死の可能性が増大することを意味している。例えば、生存における減少は、未処理の対照細胞と比較して、本発明のミクロＲＮＡで処理した細胞において測定される。細胞死は、アポトーシス又は壊死の細胞死を含む、何れの手段によるものでもよい。
【０１３１】
「細胞分裂が減少する」とは、参照と比較して、細胞周期を阻害する、又は細胞、組織若しくは器官の生育又は増殖を減少することを意味している。例えば、細胞分裂における減少は、未処理の対照細胞と比較して、本発明のミクロＲＮＡで処理した細胞において測定される。
【０１３２】
「参照」とは、標準的又は対照の条件を意味している。
【０１３３】
「レポーター遺伝子」とは、限定することなく、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）、及びベータ−ガラクトシダーゼを包含するポリペプチドのような；その発現を試験できるポリペプチドをコードする遺伝子を意味している。
【０１３４】
用語「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物を包含するように意図されている。哺乳動物は、これに限定されないが、ヒトを包含する。
【０１３５】
用語「薬学的に許容される賦形剤」は、ヒトへの投与に適している、１つ又はそれ以上の適合性のある固体又は液体の増量剤、希釈剤又は封入剤を意味するように本明細書で用いられる。
【０１３６】
「形質転換細胞」とは、その中に（又はその前駆細胞中に）、組み換えＤＮＡ技術の手段で、本発明のタンパク質を（本明細書で用いられているように）コードするポリヌクレオチド分子が導入されている、細胞を意味している。
【０１３７】
「ベクター」とは、核酸分子、例えば、宿主細胞中で複製可能な、プラスミド、コスミド、又はバクテリオファージ、を意味している。
一態様では、ベクターは、組み換え又は合成によって生成され、宿主細胞中で核酸分子の転写が可能な一連の特異的な核酸エレメントを担持している、核酸構築物である発現ベクターである。一般に、発現は、構成的又は誘導プロモータ、組織優先性調節エレメント、及びエンハンサーを包含する、ある特定の調節エレメントの制御下に置かれている。
【０１３８】
一態様では、本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする何れの核酸分子も包含する。
別の態様では、本発明の方法において有用な核酸分子は、ポリペプチド配列をもたらすこととは関連していない生物活性を有しているポリヌクレオチド（例えば、ミクロＲＮＡ）をコードする何れの核酸分子も包含する。このような核酸分子は内因性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、一般に実質的な同一性を示すであろう。
内因性の配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは一般的に、二重螺旋核酸分子の少なくとも１つの螺旋とハイブリダイズが可能である。
「ハイブリダイズ」とは、多種の厳密性条件下での、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）、又はその部分の間で二重螺旋分子を形成するための対を意味している。（例えば、Wahl, G.M. and S.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507 を参照されたい）。
【０１３９】
例えば、厳密な塩濃度は、通常約７５０ｍＭのＮａＣｌ及び７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、そしてより好ましくは約２５０ｍＭのＮａＣｌ及び２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満である。厳密性の低いハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができる一方、厳密性の高いハイブリダイゼーションは少なくとも約３５％のホルムアミド、そしてより好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。厳密な温度条件は、通常少なくとも３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、そして最も好ましくは少なくとも約４７℃の温度を包含するであろう。ハイブリダイゼーションの時間、洗浄剤、例えば、ドデシル硫酸（ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアＤＮＡの封入又は排除のような多くの更なるパラメータは当業者に周知である。多種の厳密性のレベルは、必要に応じて、これらの各種条件を組み合わせて達成される。
好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、３０℃で、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び１％のＳＤＳ中で起こるであろう。
より好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、３７℃で、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、及び１００μｇ／ｍｌの変性鮭精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中で起こるであろう。
最も好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、４２℃で、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中で起こるであろう。これらの条件の有用な変法を、当業者は容易に理解するであろう。
【０１４０】
殆どの適用に対して、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程も厳密性において変化するであろう。洗浄の厳密性条件は塩濃度によって、そして温度によって規定できる。上記のように、洗浄の厳密性は、塩濃度を下げることにより、又は温度を上げることにより増大することができる。例えば、洗浄工程に対する厳密な塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭのＮａＣｌ及び３ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、そして最も好ましくは約１５ｍＭのＮａＣｌ及び１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満であろう。洗浄工程に対する厳密な温度条件は通常少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４０℃、そして更により好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含むだろう。
好ましい態様では、洗浄工程は、２５℃の温度で、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳ中で起こるだろう。
より好ましい態様では、洗浄工程は、４２℃の温度で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳ中で起こるだろう。
より好ましい態様では、洗浄工程は、６８℃の温度で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳ中で起こるだろう。これらの条件の更なる変法を、当業者は容易に理解するであろう。
ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であって、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977);Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York に記載されている。 
【０１４１】
「実質的に同一」とは、参照のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列の何れか１つ）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列の何れか１つ）に少なくとも５０％の相同性を示すポリペプチド又は核酸分子を意味している。好ましくは、このような配列が、アミノ酸レベル又は核酸において、比較に用いられる配列に対して少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、そしてより好ましくは９０％、９５％又はもっと言えば９９％同一である。
【０１４２】
配列の同一性は通常、配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, or PILEUP/PRETTYBOX programs）を用いて測定される。このようなソフトウェアは、多種の置換、欠失、及び／又は改変に対する相同性の程度を決定して同一又は類似配列をマッチする。同類置換は一般に、次の郡内の置換を包含する；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する典型的なアプローチでは、密接に関連している配列を指し示すｅ−３とｅ−１００の間の確率スコアによる、ＢＬＡＳＴプログラムを用いることができる。
【０１４３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、腫瘍を治療又は予防するのに有用であるミクロＲＮＡを特徴とする組成物及び方法を提供する。Ｍｙｃはｍｉｒ−１７クラスターの転写を直接活性化する（O'Donnel et al., Nature 435, 839-43 (2005)）。Ｍｙｃで調節されたｍｉＲＮＡを同定するために、ヒト及びマウスモデルでＭｙｃが介在するリンパ腫起源の分析を行った。この分析は、一連の多くのＭｙｃで調節されたｍｉＲＮＡの発見をもたらした。顕著に、Ｍｙｃの導入が主として、ｍｉＲＮＡ発現の下方調節を広範にもたらした。Ｍｙｃがプロモーター又はそれが抑制するｍｉＲＮＡの保存領域の上流と直接結合することを、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）が明らかにした。本発明は、少なくとも一部は、Ｍｙｃで調節されたｍｉＲＮＡの発現がインビボでリンパ腫細胞の生育を劇的に阻害したという発見に基づいている。これらの知見は、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡの抑制が、Ｍｙｃ腫瘍形成プログラムの基本要素であることを示唆している。従って、本発明は、その発現が腫瘍を治療又は予防するのに有用なｍｉＲＮＡを特徴とする組成物及び方法を提供する。
【０１４４】
以下により詳細に報告するように、Ｍｙｃは以下のミクロＲＮＡの発現を少なくとも２倍抑制した；ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０。Ｍｙｃは、２つの腫瘍モデルにおいて、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２６ｂ、及びｍｉＲ−３０ｃの発現を少なくとも約１．５倍抑制した。従って、これらのＭｙｃで抑制されたミクロＲＮＡ又はそれらの断片の１つ又はそれ以上の発現は、腫瘍の治療又は予防のために有用であると期待されている。
【０１４５】
重大なことに、腫瘍内の腫瘍性細胞中に、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１が発現すると、これらのミクロＲＮＡを発現している細胞は、実質的に腫瘍から排除された。このことは、ｍｉＲＮＡがＭｙｃ及びｖ−Ａｂｌの両方が介在する形質転換において抗−腫瘍形成の特性を保持することを示唆している。ｍｉＲ−２６ａは、Ｍｙｃが介在する形質転換において腫瘍形成を抑制し、そしてｍｉＲ−２２はｖ−Ａｂｌが介在する形質転換において腫瘍形成を抑制した。これらの知見を考慮すると、腫瘍細胞内で本明細書に記載のミクロＲＮＡの発現を増大する薬剤は、多種の腫瘍の治療又は予防のために有用であると期待される。
【０１４６】
（ミクロＲＮＡ）
ミクロＲＮＡは、細胞内で特異的な遺伝子の転写後サイレンシングを、翻訳を阻害することによって又は標的ｍＲＮＡの分解を介して、引き起こすことができる小分子の非コードＲＮＡ分子である。ミクロＲＮＡは、標的の核酸と完全に相補的であるか、又はこれと非相補性領域を有して、結果として非−相補性領域に「バルジ」をもたらすことができる。ミクロＲＮＡは、ミクロＲＮＡが標的の核酸分子と完全には相補的でないときのように、翻訳を抑制することによって、又は標的ＲＮＡの分解を引き起こす（これはミクロＲＮＡが完全に相補的にその標的に結合するときのみに起こると考えられている）ことによって遺伝子の発現を阻害することができる。本発明はミクロＲＮＡの二重螺旋前駆体も包含することができる。
【０１４７】
ミクロＲＮＡ又はｐｒｅ−ミクロＲＮＡは長さが１８〜１００ヌクレオチド、より好ましくは長さが１８〜８０ヌクレオチドであってよい。成熟ｍｉＲＮＡは１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは２１〜２５ヌクレオチド、特に２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチドの長さを有することができる。ミクロＲＮＡ前駆体は通常、約７０〜１００ヌクレオチドの長さを有し、そしてヘアピン構造を有している。ミクロＲＮＡはインビボで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから酵素ダイサー及びドロシャ（これは長いｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを機能的なｍｉＲＮＡに特異的に処理する）よって生成される。本発明で特徴としているヘアピン又は成熟ミクロＲＮＡ、又はｐｒｅ−ミクロＲＮＡ薬剤は、インビボで細胞に基づいたシステムによって、又はインビトロで化学合成によって、合成することができる。
【０１４８】
本発明は単離されたミクロＲＮＡ及びそのような配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の組み換えミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉｒ−２６ｂ、ｍｉｒ−２９ｂ−１、ｍｉｒ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１）又はこのようなミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをそれらを必要とする対象に、腫瘍細胞の生育、生存、又は増殖を減少させるために投与することができる。１つの方法では、ミクロＲＮＡを裸のＲＮＡ分子として投与する。別の方法では、それを哺乳動物細胞における発現に適している発現ベクターで投与する。
【０１４９】
本発明によって提供される１つの典型的な方法は、組み換えミクロＲＮＡ分子、それらの変異体又は断片を潜在的な又は実在する罹患組織の部位へ直接あるいは全身への何れかによるような、組み換え薬治療的投与（例えば、従来の組み換え薬投与技術によって）を含んでいる。投与されるミクロＲＮＡの用量は、個々の患者の体格及び健康状態を含む、多くの因子によって決まる。ある特定の対象に対して、個々のニーズ及び投与又は組成物の投与を監視する者の専門的な判断に従って、特異的な投与計画を長期にわたって調整すべきである。
【０１５０】
例えば、本発明のミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１）を、約１〜１００ｍｇ／ｋｇの間（例えば、１、５、１０、２０、２５、５０、７５、及び１００ｍｇ／ｋｇ）の範囲の用量で投与することができる。
別の態様では、用量は約２５〜５００ｍｇ／ｍ２／日の範囲である。望ましくは、腫瘍を有するヒト患者は、約５０〜３００ｍｇ／ｍ２／日（例えば、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、２７５及び３００）の用量を投与される。
【０１５１】
望ましい特性を与える改変を含むようにミクロＲＮＡを合成することができる。例えば、この改変は、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織又は細胞型への狙い、又は細胞透過性を、例えばエンドサイトーシスによるメカニズム又はエンドサイトーシスによらないメカニズムによって、改善することができる。改変は、配列特異性を増大し、それによってオフサイト標的を減少させることもできる。合成及び化学的改変の方法は以下により詳細に記載されている。
【０１５２】
本発明は更に、１、２、３、４、５、６又はそれ以上のミクロＲＮＡを含むマイクロアレイ、ミクロＲＮＡのようなものを含むオリゴヌクレオチド、又はこのようなミクロＲＮＡをコードするか若しくはこれと結合する核酸配列を包含する、固体支持体を提供する。更に本発明は、本発明のミクロＲＮＡとハイブリダイズする、及び／又はこれをを増幅するために用いることのできるプローブを提供する。特定の態様では、本発明は、１、２、３、４、又はそれ以上のミクロＲＮＡを包含するプローブ又は本明細書に記載のプローブの収集物を提供する。
【０１５３】
（ミクロＲＮＡ類縁体）
所望により、ミクロＲＮＡ分子を、分解に対してミクロＲＮＡを安定化するために、半減期を増進するために、又は別の方法で効力を改善するために、改変することができる。望ましい改変は例えば、米国特許出願公開第２００７／０２１３２９２号公報、同第２００６／０２８７２６０号公報、同第２００６／００３５２５４号公報、同第２００６／０００８８２２号公報、及び２００５／０２８８２４４号公報に記載されていて、それぞれは参照としてその全てが本明細書に組み込まれている。
【０１５４】
ヌクレアーゼ耐性及び／又は標的に対する結合親和性を増大するために、本発明で特徴としている一重螺旋オリゴヌクレオチド薬剤は、２’−Ｏ−メチル、２’−フッ素、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−アミノ、及び／又はホスホロチオエート結合を含有することができる。ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、例えば２’−４’−エチレン−架橋化核酸、及びある特定の核酸塩基改変を含有させても標的に対する結合親和性を増大できる。オリゴヌクレオチド骨格にピラノース糖を含有させてもエンドヌクレアーゼの切断を減少できる。３’−カチオン基を含有させるか又はヌクレオシドを３’−末端で３’−３’−結合を用いて反転させることによって、アンタゴｍｉｒを改変することができる。別の選択肢では、３’−末端をアミノアルキル基でブロックすることができる。別の３’の共役は３’−５’−エクソヌクレアーゼ切断を阻害できる。理論に制約されていないが、３’はオリゴヌクレオチドの３’末端への結合からエクソヌクレアーゼを立体的にブロックしてエクソヌクレアーゼの切断を阻害できる。小さいアルキル鎖、アリール基又は複素環共役若しくは改変糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえも３’−５’−エクソヌクレアーゼをブロックできる。
【０１５５】
一態様では、ミクロＲＮＡはヌクレアーゼ耐性のためにホスホロチオエートに改変された幾つかの又は全てのヌクレオチド間結合を有する、オリゴヌクレオチドギャップを含有している２’−改変オリゴヌクレオチドを含んでいる。メチルホスホネート改変の存在はオリゴヌクレオチドのその標的ＲＮＡに対する親和性を増大して、ＩＣ５０を減少する。この改変も改変されたオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大する。本発明の方法及び薬剤が、阻害性核酸分子の安定性及び効力を増強するために開発され得る技術と共に用いることができるということは理解されるであろう。
【０１５６】
ミクロＲＮＡ分子は、改変された骨格又は非天然のヌクレオシド間結合を含有している核酸塩基オリゴマーを包含する。改変された骨格を有するオリゴマーは、骨格にリン原子を保持しているもの及び骨格にリン原子を有していないものを包含する。この明細書の目的ために、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有していない改変されたオリゴヌクレオチドも核酸塩基オリゴマーであると考えられている。改変されたオリゴヌクレオチド骨格を有している核酸塩基オリゴマーは、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキル−リン酸トリエステル、３’−アルキレンリン酸エステル及びキラルリン酸エステルを包含するメチル及びその他のアルキルリン酸エステル、ホスフィン酸エステル、ホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルリン酸エステル、チオノアルキルリン酸トリエステル、及びボラノリン酸エステルを包含する。多種の塩、混合塩及び遊離酸形態もまた含む。上記のリン含有結合の製造を教示する代表的な米国特許は、これに限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、及び同第５，６２５，０５０号を包含し、それぞれは参照として本明細書に組み込まれている。
【０１５７】
そこにリン原子を含んでいない改変オリゴヌクレオチド骨格を有している核酸塩基オリゴマーは、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルとの混合ヌクレオシド間結合、又は１つ又はそれ以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成されている）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分を有するその他のものを包含する。上記のオリゴヌクレオチドの製造を教示している代表的な米国特許は、これに限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、及び同第５，６７７，４３９号を包含し、それぞれは参照として本明細書に組み込まれている。
【０１５８】
核酸塩基オリゴマーは、１つ又はそれ以上の置換糖残基を含んでいてもよい。そのような改変は、２’−Ｏ−メチル及び２’−メトキシエトキシ改変を含んでいる。その他の好ましい改変は２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、２’−アミノプロポキシ及び２’−フルオロである。同様な改変をオリゴヌクレオチド又は別の核酸塩基オリゴマーの別の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置に行ってもよい。核酸塩基オリゴマーは、ペントフラノシル糖に代えてシクロブチル残基のような糖類似物を有していてもよい。このような改変糖構造の製造を教示している代表的な米国特許は、これに限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、及び同第５，７００，９２０号を包含し、それぞれはその全てが参照として本明細書に組み込まれている。
【０１５９】
別の核酸塩基オリゴマーでは、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が新規な基で置換されている。核酸塩基ユニットは、ｍｉＲ−１７−９２クラスターの核酸分子とのハイブリダイゼーションに対して保持される。これらの核酸塩基オリゴマーを作成及び使用する方法は、例えば、"Peptide Nucleic Acids (PNA): Protocols and Applications" Ed. P. E. Nielsen, Horizon Press, Norfolk, United Kingdom, 1999 に記載されている。ＰＮＡの製造を教示している代表的な米国特許は、これに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２を包含し、それぞれは参照として本明細書に組み込まれている。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500 に見出すことができる。
【０１６０】
別の態様では、一重螺旋改変核酸分子（例えば、ホスホロチオエート骨格及び２’−Ｏ−Ｍｅ糖改変を含んでいる核酸分子）がコレステロールと共役している。
【０１６１】
（核酸塩基オリゴマーの送達）
本発明のミクロＲＮＡ（これは成熟又はヘアピン形態であってよい）を、腫瘍細胞に浸入可能な裸のオリゴヌクレオチドとして提供することができる。ある場合は、ミクロＲＮＡ又はその他の核酸塩基オリゴマーの細胞への送達に役立つ製剤を用いることが望ましい（例えば、米国特許第５，６５６，６１１号、同第５，７５３，６１３号、同第５，７８５，９９２号、同第６，１２０，７９８号、同第６，２２１，９５９号、同第６，３４６，６１３号、及び同第６，３５３，０５０号を参照されたい、それぞれは参照として本明細書に組み込まれている）。
【０１６２】
いくつかの実施例では、ミクロＲＮＡ組成物は、少なくとも部分的に結晶、均一に結晶、そして／又は無水（例えば水分８０、５０、３０、２０、又は１０％未満）である。別の実施例では、ミクロＲＮＡ組成物は、水相の形態、例えば水を含有する溶液の形態である。水相又は結晶組成物を送達用賦形剤、例えば、リポソーム（特に液相に対し）、又は粒子（例えば、結晶組成物に適切であるような微粒子）に組み入れることができる。一般に、ミクロＲＮＡ組成物は、意図する投与方法に準じている態様に製剤化される。
【０１６３】
ミクロＲＮＡ組成物は、他の薬剤、例えば他の治療薬剤、又はオリゴヌクレオチド薬剤を安定化する薬剤（例えば、オリゴヌクレオチド薬剤と複合体を形成するタンパク質）と組み合わせて製剤化することができる。さらなる別の薬剤は、キレート剤、例えばＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋のような２価カチオンを除くために）、塩、及びＲＮＡ分解酵素阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎのような、広い特異性を持つＲＮＡ分解酵素阻害剤）を含んでいる。
【０１６４】
一態様では、ミクロＲＮＡ組成物が、別のミクロＲＮＡ、例えば第二ミクロＲＮＡ組成物（例えば、第１のものとは異なるミクロＲＮＡ）を含んでいる。更に別の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、又は１００又はそれ以上の異なったオリゴヌクレオチド種を含むことができる。
【０１６５】
（ポリヌクレオチド治療）
ミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを特徴とするポリヌクレオチド治療は、対象における腫瘍を阻害するための別の治療手段である。ミクロＲＮＡをコードする発現ベクターを腫瘍の治療又は予防のために対象の細胞に送達することができる。核酸分子は、細胞が取り込める形態で患者の細胞に送達されて、治療有効レベルが達成できるように有利に発現されなければならない。
【０１６６】
本発明によるポリヌクレオチドの細胞への送達方法は、リポソーム、ポリマー、ミクロスフェア、遺伝子治療ベクター、及び裸のＤＮＡベクターのような、送達システムの使用を包含する。
【０１６７】
形質導入ウィルス（例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、レンチウィルス、及びアデノ随伴ウィルス）ベクターを、特にこれらの感染の高効率、及び安定な組み込み並びに発現により、体細胞遺伝子治療に用いることができる（例えば、Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; 及び Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997 を参照されたい）。
例えば、ミクロＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを、レトロウィルスベクター中にクローン化して、その内因性プロモーターから、レトロウィルスの長い末端反復から、又は目的の標的細胞型に特異的なプロモーターから発現を推進することができる。
使用できるその他のウィルスベクターは、例えば、ワクシニアウィルス、ウシ・パピローマウィルス、又はエプステイン−バールウィルスのような、ヘルペスウィルスを包含する（例えば、Miller（Human Gene Therapy 15-14, 1990）、Friedman（Science 244:1275-1281, 1989）、Eglitis et al.（Bio Techniques 6:608-614, 1988）、Tolstoshev et al.（Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990）、Sharp（The Lancet 337:1277-1278, 1991）、Cornetta et al.（Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987）、Anderson, Science 226:401-409, 1984）、Moen（Blood Cells 17:407-416, 1991）、Miller et al.（Biotechnology 7:980-990, 1989）、Le Gal La Salle et al.（Science 259:988-990, 1993）及び Johnson（Chest 107:77S-83S, 1995）のベクターも参照されたい）。レトロウィルスは特によく開発されていて、臨床の場に用いられている（Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:370, 1990; Anderson et al., 米国特許第５，３９９，３４６号）。
【０１６８】
非ウィルス方法も、ミクロＲＮＡ治療薬を腫瘍があると診断された患者の細胞へ誘導するために用いることができる。例えば、リポフェクションの存在下で（Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymolgy 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド−ポリシン共役物の存在下で（Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）、又は手術条件下でのマイクロインジェクションによって（Wolff et al., Science 247:1465, 1990）、核酸を投与してミクロＲＮＡを細胞へ誘導することができる。ミクロＲＮＡ分子をリポソーム及びプロタミンと組み合わせて投与することが好ましい。
【０１６９】
遺伝子導入もインビトロでのトランスフェクションを含む非ウィルス方法を用いて実施することができる。このような方法は、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、及び原形質融合の使用を包含する。リポソームもＤＮＡを細胞に送達するために有用である可能性がある。
【０１７０】
ポリヌクレオチド治療方法で用いるためのミクロＲＮＡの発現を、適切なプロモータ（例えば、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、シミアウィルス４０（ＳＶ４０）、又はメタロチオネインプロモーター）から指令して、適切な哺乳動物調節要素によって調節することができる。例えば、所望により、特異的な細胞型において遺伝子の発現を選択的に指令することが知られているエンハンサーを、核酸の発現を指令するために用いることができる。用いられるエンハンサーは、これに限定されないが、組織又は細胞特異的なエンハンサーとして特徴付けられているものを包含する。
【０１７１】
ある特定の患者に対して、個々の必要性及び組成物を投与する又は組成物の投与を監督する者の専門的な判断に従って、特異的な投与計画が長期にわたって調整されなければならない。
【０１７２】
（医薬組成物）
本明細書で報告するように、Ｍｙｃによって調節される特異的なミクロＲＮＡの発現の減少は腫瘍又は腫瘍形成と結びついている。従って、本発明は、腫瘍の治療又は予防のための、本明細書に記載のミクロＲＮＡの発現を増大する治療組成物を提供する。
一態様では、本発明は、本発明のミクロＲＮＡ又は本発明のミクロＲＮＡをコードする核酸分子を含有する医薬組成物を提供する。所望により、核酸分子は、化学療法剤と組み合わせて投与される。
別の態様では、組み換えミクロＲＮＡ又はこのようなミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを、腫瘍細胞の生育、生存、又は増殖を減少させるために、又は腫瘍細胞のアポトーシスを増大するために投与する。本発明のポリヌクレオチドを医薬組成物の一部として投与することができる。
組成物は滅菌して、対象への投与に適している重量又は容量単位中にミクロＲＮＡ又はミクロＲＮＡをコードする核酸分子の治療有効量を含有していなければならない。
【０１７３】
本明細書に記載の組み換えミクロＲＮＡ又はミクロＲＮＡをコードする核酸分子を、単位用量形態中の、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤内で投与することができる。従来の製薬実務を、腫瘍を患っている患者にこの化合物を投与するための適切な製剤又は組成物を提供するために採用することができる。患者が症状を示す前に投与を始めることができる。適切な投与経路を何れも採用できる。例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼科的、脳室内、肝臓内、関節内、鞘内、嚢内、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、坐剤、又は経口投与でよい。例えば、治療製剤は液状溶液又は懸濁液の形態であってよく；経口投与のために、製剤は錠剤又はカプセルの形態であってよく；そして鼻腔内製剤のために、粉末、点鼻薬、又はエアゾールの形態でよい。
【０１７４】
製剤を作成する当該技術分野で周知の方法は、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy" Ed. A.R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000 に見出せる。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、又は食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール類、植物由来のオイル、又は水素化ナフタレン類を含有していてもよい。生体適合性、生物分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を、化合物の放出を制御するために用いることができる。阻害性核酸分子に対して有用であろう他の非経口送達システムは、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み式注入システム、及びリポソームを包含する。吸入用の製剤は、賦形剤、例えば、ラクトースを含んでいてよく、或いは例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート及びデオキシコレートを含有する水溶液であってよく、又は点眼液の形態で、又はゲルとして投与するための油性溶液であってもよい。
【０１７５】
この製剤を、腫瘍性の病気又は疾患の治療をもたらすために、ヒト患者に治療有効量（例えば、病状を予防する、取り除く、又は減少させる量）で、投与することができる。本発明の核酸塩基オリゴマーの好ましい用量は、疾患の型及び程度、特定患者の全般的な健康状態、化合物の製剤、賦形剤、及び投与の経路のような変数によって決まるだろう。
【０１７６】
腫瘍性の病気又は疾患を有する患者に対する、有効量は、腫瘍の増殖が安定化する、遅延する、又は減少するのに十分なものである。一般に、本発明の活性ポリヌクレオチド組成物の用量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１日当たり約１０００ｍｇ／ｋｇである。約５０〜約２０００ｍｇ／ｋｇの用量範囲が適切であろうと予想される。低用量は、静脈内投与のような、ある特定の投与形態からもたらされるだろう。初期用量の適用時に患者の応答が不十分な場合は、高用量（又は異なった、より局所の送達経路による効果的な高用量）を患者の耐性が許す範囲で採用することができる。１日当たりの複数回投与は、本発明のミクロＲＮＡ又はそのようなミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの適切な全身レベルをもたらすことを意図している。
【０１７７】
従って、本発明は、本明細書に記載のミクロＲＮＡを含有している組成物の治療有効量を対象（例えば、ヒトのような、哺乳動物）に投与することを含有してなる、病気及び／又は疾患又はそれらの症状を治療する方法を提供する。故に、一態様は腫瘍性の病気又は疾患若しくはそれらの症状を患っているかまたはそれに罹りやすい対象を治療する方法である。この方法は、哺乳動物に、病気又は疾患を治療する条件下で、本明細書のミクロＲＮＡ又はそのようなミクロＲＮＡをコードする核酸の、腫瘍性の病気若しくは疾患又はそれらの症状を治療するのに十分な、治療有効量を投与する工程を含んでいる。
【０１７８】
本明細書に記載の方法は、それを必要とする対象における腫瘍の生育若しくは生存を予防、治療、安定化、又は減少するために、対象（このような治療が必要であると同定された対象を含んでいる）に、本明細書に記載の化合物、又は本明細書に記載の組成物の有効量を投与することを含んでいる。このような治療が必要な対象の同定は、対象若しくは医療専門家の判断で行うことができ、そして主観的（例えば、見解）又は客観的（例えば、試験又は診断法によって測定可能である）に行うことができる。
【０１７９】
本明細書で用いられる用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、疾患及び／又はそれに付随する症状を減少させること又は軽減することを示している。当然のことながら、妨げられないことではあるが、病気又は疾患を治療することは、病気、疾患又はそれらに付随する症状を完全に除去することを必要としない。
【０１８０】
本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」などは、病気又は疾患を有していないが、病気又は疾患が進展する危険性があるか又はこれに罹りやすい対象における病気又は疾患を進展させる可能性を低減することを示す。
【０１８１】
本発明の治療方法（予防的治療を含む）は、一般に、ミクロＲＮＡ又は本明細書に記載のようなミクロＲＮＡをコードする核酸のような、本明細書に記載の薬剤の治療有効量を、それを必要とする、哺乳動物、特にヒトを包含する対象（例えば、動物、ヒト）へ投与することを含んでいる。このような治療は、病気、疾患、又はそれらの症状を患っている、有している、罹りやすい、又はその危険性がある対象、特にヒト、へ適切に投与することができる。「危険性のある」対象の確認は、対象又は医療提供者の診断試験又は見解（例えば、遺伝子試験、酵素またはタンパク質マーカー、Marker（例えば、増大したＭｙｃ発現又はＭｙｃ調節の変化に伴う腫瘍、又は本明細書で定義したようなもの）、家族歴、など）による客観的又は主観的な何れかの確認によって行われる。本明細書に記載の化合物は、Ｍｙｃの調節不全が影響している可能性がある他の疾患の何れの治療にも使用することができる。
【０１８２】
一態様では、本発明は治療経過をモニターする方法を提供する。この方法は、Ｍｙｃの調節不全に関連する疾患又はそれらの症状に罹っているか、又は罹りやすい対象で、疾患又はその症状を治療するのに十分な本明細書に記載の化合物の治療量を投与されている対象における、診断マーカー（Marker）（例えば、本明細書に記載の化合物によって調節される本明細書に説明されている標的の何れか、タンパク質又はそれらの指標物質など）のレベルの測定又は診断測定（例えば、スクリーニング、試験）の段階を含んでいる。この方法で測定されたMarkerのレベルを、健常な対照又は他の罹患者における公知のレベルと比較して対象の病状を明らかにすることができる。好ましい態様では、対象におけるMarkerの第２のレベルを、第１のレベルの測定より遅い時点で測定して、２つのレベルを比較して疾患の経過又は治療の効果を監視する。ある特定の好ましい態様では、対象における治療前のMarkerレベルを、本発明による治療開始の前に測定し、次いでこの治療前Markerレベルを、対象の治療開始後のMarkerレベルと比較して、治療の効果を確認する。
【０１８３】
（治療）
癌治療が行われるどこにおいても：家庭、医院、診療所、病院の外来、又は病院：治療を提供することができる。一般に治療は、医者が治療効果を綿密に観察して、必要によって何れの調節もできるように、病院で開始する。治療の期間は、治療する腫瘍の種類、患者の年齢及び状態、患者の疾患の段階及び型、及び患者の身体がこの治療に如何に応答しているかによって決められる。薬剤投与は異なった間隔（例えば、毎日、週に１回、月に１回）で行える。治療を、患者の身体が健康な新しい細胞を形成してその強度を取り戻す機会を得るために、休止期間を含む断続的な周期で行ってよい。
【０１８４】
癌のタイプ及びその進展の段階によって、治療を、癌の転移を遅延するために、癌の生育を遅延するために、原発腫瘍から身体の別の部位に転移し得る癌細胞を殺すか又は生育停止するために、癌によって引き起こされた症状を緩和するために、又は最初の位置で癌を阻止するために用いることができる。上記のように、必要により、ミクロＲＮＡ又はそのようなミクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドによる治療を、増殖性疾患の治療のための治療法（例えば放射線療法、手術、又は化学療法）と組み合わせることができる。上記の適用の何れの方法に対しても、本発明のミクロＲＮＡを静脈内投与することが好ましく、或いは腫瘍部位に適用される（例えば、注射で）。
【０１８５】
（診断）
以下に詳細に記載するように、本発明は、Ｍｙｃで調節された腫瘍に関係しているミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１）の発現の減少を確認した。これらのマーカーの１つ又はそれ以上の発現レベルの減少を、Ｍｙｃの異常調整に関連する腫瘍を有する患者を診断するために用いることができる。一態様では、方法は、以下のマーカーの一つ又はそれ以上のレベルの減少を試験して、本発明の方法を用いる治療に適している腫瘍を同定する；ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１。
【０１８６】
一態様では、対象が腫瘍を有していると又は腫瘍進展の性向を有していると診断され、その方法が、患者から得られる生体試料におけるマーカーを測定すること、及び１つ又はそれ以上のマーカー分子における参照分子の配列又は発現と比較した発現の変化を検出することを含んでいる。マーカーは典型的にミクロＲＮＡを包含する。
【０１８７】
本発明のミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１）の減少した発現は、本明細書に記載の組成物又は方法を用いる治療に適している腫瘍を同定するために用いられる。従って、本発明は患者におけるそのような腫瘍を同定するための組成物及び方法を提供する。遺伝子発現の変化は、当業者に公知であって本明細書に記載されている方法を用いて検出される。そのような情報を、腫瘍を診断するために、又は本発明の治療法に適しているような腫瘍を同定するために用いることができる。
【０１８８】
一方法では、本発明の診断方法が、参照（例えば、健常な組織のような、対応する対照組織中に存在するミクロＲＮＡのレベル）と比較した、生体試料中のミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１）の発現を試験するために用いられる。本発明のミクロＲＮＡと特異的に結合する典型的な核酸プローブは本明細書に記載されている。「核酸プローブ」とは、本発明のミクロＲＮＡと結合するか又はこれを増幅する核酸分子、又はその断片の何れもを意味している。このような核酸プローブは腫瘍の診断に有用である。
【０１８９】
一方法では、定量的ＰＣＲ方法が、本発明のミクロＲＮＡの発現における減少を同定するために用いられる。別の方法では、本発明のミクロＲＮＡとハイブリダイズするプローブが用いられる。プローブの特異性は、プローブが天然の配列、対立遺伝子多型、又は他の関連する配列とハイブリダイズするか否かを確認する。ハイブリダイゼーション技術を、腫瘍を示す変異を同定するために用いることができ、或いはこれらの遺伝子の発現レベルを監視するために（例えば、ノーザン分析によって）用いることができる（Ausubel et al., supra）。
【０１９０】
一般に、対象試料中の核酸分子又はタンパク質の測定値を、参照中に存在する診断量と比較する。腫瘍組織と対照組織の間では診断量が異なる。利用する特定の診断量は診断医の裁量によって、診断試験の感度又は特異性を上げるために調節できることを、当業者は理解されたい。一般に、参照と比較した、対象試料における試験核酸分子又はポリペプチドのレベルの何れの有意な増加又は減少も（例えば、少なくとも約１０％、１５％、３０％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％）、腫瘍の診断又は特徴付けに用いることができる。
試験分子は、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の１つ又はそれ以上の何れも包含する。
一態様では、参照は、腫瘍を有していない患者から得られる対照試料中に存在する試験ポリペプチド又は核酸分子のレベルである。
別の態様では、参照は、腫瘍治療の前に、最中に、又はその後に患者から得られる生体試料に存在する試験分子の基準レベルである。
更に別の態様では、参照は標準化曲線であってもよい。
【０１９１】
（生体試料のタイプ）
腫瘍を有しているか又はその進展の危険性がある患者由来の生体試料中のマーカーのレベルを測定でき、そして参照分子の配列又は発現と比較したマーカー分子の発現における変化を、異なったタイプの生体試料中で測定することができる。
試験マーカーは以下の１つ又は全ての何れも包含する；ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｍｉＲ−１５ａ／１６−１。
生体試料は一般に患者から、好ましくは体液（血液、脳脊髄液、痰、唾液、又は尿のような）又は組織試料（例えば、生検で得られる組織試料）から得られる。
【０１９２】
（キット）
本発明は、腫瘍の予防、治療、診断又は監視するためのキットを提供する。
一態様では、キットは、対象に投与するためのミクロＲＮＡ分子を提供する。
別の態様では、キットは、参照配列又は参照発現レベルと比較した、対象から得られるｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の配列又は発現の変化を検出する。
関連する態様では、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１核酸分子とハイブリダイズするプライマー又はプローブのような、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の発現を監視するための試薬を含んでいる。
【０１９３】
随意に、キットは対象から得られる生体試料中のMarkerの核酸分子を監視するための説明書を含んでいる。
他の態様では、キットは、プライマー、プローブ、抗体、又は他の検出試薬を含有している滅菌容器を含んでいて、このような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で公知の他の適切な容器であってよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は核酸を保持するのに適している他の材料で作られていてよい。
使用説明書は一般に、本明細書に記載のプライマー又はプローブの使用及びそれらの腫瘍を診断する際の使用に関する情報を含んでいる。好ましくは、キットは更に、本明細書に記載の診断試験に記載されている試薬の何れか１つ又はそれ以上を含んでいる。
他の態様では、使用説明書は以下のものの少なくとも１つを含んでいる；プライマー又はプローブの説明、腫瘍の診断のための同封してある物質の使用方法、注意、警告、指示、臨床又は調査研究、及び／又は参照。使用説明書は容器に直接印刷するか（容器がある場合）又は容器に貼付したラベルとして、又は容器中に又は一緒に供給される、別のシート、パンフレット、カード、又はフォルダーとしてもよい。
【０１９４】
（スクリーニング試験）
本発明の一態様は、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、又はｍｉＲ−１５ａ／１６−１の発現又は活性を増大する薬剤を同定する方法を包含している。従って、本発明のミクロＲＮＡ若しくは変異体、又はそれらの部分の発現若しくは活性を増大する化合物は、腫瘍の治療又は予防のための本発明の方法において有用である。本発明の方法は、本発明のミクロＲＮＡの１つ又はそれ以上の転写における増大を測定できる。そのような化合物を同定するスクリーニング試験を実施するために多くの方法を利用できる。一方法では、方法は本発明のミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１）を発現する細胞を薬剤と接触させて、薬剤と接触させた細胞における発現のレベルを対照細胞における発現レベルと比較することを含んでいて、本発明のミクロＲＮＡの発現を増大する薬剤が、腫瘍を阻害する。
【０１９５】
他の態様では、この薬剤は、実質的に本発明のミクロＲＮＡの機能を果たす、ミクロＲＮＡ模倣薬として作用する。候補模倣薬は、有機分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子を包含する。本発明の小分子化合物は、好ましくは２，０００ダルトン以下の、より好ましくは３００〜１，０００ダルトンの間の、更に好ましくは４００〜７００ダルトンの間の分子量を有している。これらの小分子化合物が有機分子であることが好ましい。本明細書に記載の何れかの方法で単離された化合物は、ヒト患者における腫瘍を治療する治療薬として用いることができる。
【０１９６】
更に、本発明のミクロＲＮＡの発現を増大する化合物は、本発明の方法においても有用である。ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、又はｍｉＲ−１５ａ／１６−１の発現を増大する新規な候補化合物を同定するスクリーニング試験を行うために多くの方法を利用するできる。本発明は、上記のスクリーニング試験によって同定される新規な化合物も包含する。随意に、このような化合物は、腫瘍の治療のための化合物の有効性を確認するために、１つ又はそれ以上の適切な動物モデルにおいて特徴付けられる。望ましく、動物モデルにおける特徴付けは、毒性、副作用、又はこのような化合物による治療の作用メカニズムを確認するためにも用いることができる。更に、上記のスクリーニング試験の何れかで同定された新規な化合物を、対象における腫瘍を治療するために用いることができる。このような化合物は単独で又は当該技術分野で公知の他の従来の治療方法と組み合わせて有用である。
【０１９７】
（試験化合物及び抽出物）
一般に、ミクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１）の発現又は生物活性を増大することによって腫瘍の生育又は増殖を阻害することができる化合物は、天然生成物又は合成（又は半合成）抽出物のどちらかの大きなライブラリー、又は化学ライブラリーから、当該技術分野で公知の方法に従って、同定される。これに限定されないが、糖、脂質、ペプチド、及び核酸由来の化合物を包含する、多数の化学化合物のランダム又は直接合成（例えば、半合成又は全合成）を行うために多数の方法を利用することができる。合成化合物ライブラリ−が Brandon Associates (Merrimack, N. H.) 及びAldrich Chemical (Milwaukee, Wis.) から市販されている。また、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、Biotics (Sussex, UK), Xenova (Slough, UK), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla) 及び PharmaMar, U.S.A. (Cambridge Mass.) を含む、多くの供給元から市販されている。
【０１９８】
一態様では、本発明の試験化合物は、当該技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリーの何れかに存在していて、このライブラリーは、生物ライブラリー；ペプチドライブラリー（ペプチドの機能性を有しているが、酵素分解に対して耐性でありそれでもなお生物活性を保持している新規で非ペプチド骨格を有している、分子のライブラリー；例えば、Zuckermann, R.N. et al., J. Med. Chem. 37:2678-85, 1994 を参照されたい）；空間的にアドレス可能な平行固相又は溶液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法；「一ビーズ一化合物（one-bead one compound）」ライブラリー方法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法を包含する。生物ライブラリー及びペプトイドライブラリー方法はペプチドライブラリーに限定されている一方、その他の４つの方法は、化合物のペプチド、非ペプチドのオリゴマー又は小分子ライブラリーに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des. 12:145, 1997）。
【０１９９】
分子ライブラリーの合成方法の例は当該技術分野、例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909, 1993; Erb et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994; Cho et al., Science 261:1303, 1993; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994; and Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233, 1994 中に見出すことができる。
【０２００】
化合物のライブラリーは溶液中（例えば、Houghtem, Biotechniques 13：412-421, 1992）、又はビーズ（Lam, Nature 354:82-84, 1991）、チップ（Fodor, Nature 364:555-556, 1993）、細菌（Lander, 米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ladner, 米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869, 1992）上、又はファージ上（Scott and Smith, Science 249:386-390, 1990; Devlin, Science 249:404-406, 1990; Cwirla et al.  Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991; Lander supra）に存在してもよい。
【０２０１】
更に、薬品の発見及び開発分野の当業者は、デレプリケーション（dereplication；分類学的デレプリケーション、生物学的デレプリケーション、及び化学的デレプリケーション、又はこれらの組合わせの何れか）又は抗腫瘍活性が既知の物質の複製物又は複写物の消去を可能なときに利用すべきである、ということを容易に理解できる。
【０２０２】
本発明の一態様では、異なった化学物質のｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、又はｍｉＲ−１５ａ／１６−１の活性を増強する能力についてスクリーニングするためにハイスループット手段を用いることができる。
【０２０３】
薬品の発見及び開発分野の当業者は、化合物又は試験抽出物の正確な起源は本発明のスクリーニング方法にとっては重大ではないということを理解できるであろう。従って、実質的に多数の化学抽出物又は化合物を本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングすることができる。このような抽出物又は化合物の例は、これに限定されないが、植物、カビ、原核生物、又は動物由来の抽出物、培養液、及び合成化合物を、更に既存化合物の改変体を包含する。                            
【０２０４】
粗抽出物が、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１００、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ａ−３、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−９９ｂ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−２、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１、変異体、又はそれらの断片の生物活性を増強することが見出されたときは、観察された効果に関与する化学成分を単離するために、陽性をもたらす抽出物の更なる分画が必要である。従って、抽出、分画、及び精製工程のゴールは、抗腫瘍活性を有する粗抽出物内にある化学物質の注意深い特徴付け及び同定である。このような異種抽出物の分画及び精製の方法は当該技術分野で公知である。所望により、腫瘍の治療のために有用であることが示された化合物を当該技術分野で公知の方法によって化学的に改変する。
【０２０５】
本発明の実施は、別に指示しない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学及び免疫学の従来の技術を利用し、これらは十分に当業者の知識の範囲内である。このような技術は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausbel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994), "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991) のような、文献中に十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの生成に適用でき、従って、それ自体が本発明を形成し実施するものと考えられる。特定の態様のために特に有用な技術は以下の項で説明されるだろう。
【０２０６】
以下の実施例は、本発明の試験、スクリーニング、及び治療の方法を如何に作成し使用するかを完全なる開示及び記述によって当業者に提供するために示されるもので、発明者がその発明と見なしているものの範囲を限定するようには意図されていない。
【実施例】
【０２０７】
実施例１：Ｍｙｃで抑制されたｍｉＲＮＡの同定
スポットしたオリゴヌクレオチドアレイを、Ｍｙｃの直接転写標的としてｍｉｒ−１７クラスターを同定するために用いた（O'Donnel et al., Nature 435, 839-43 (2005)）。ＭｙｃがさらなるｍｉＲＮＡを調節するか否かを確認するために、３１３個のヒトｍｉＲＮＡ及び２３３個のマウスｍｉＲＮＡの発現を試験できるプローブの拡張セットを用いて、カスタムマイクロアレイを作成した。Ｍｙｃが介在する腫瘍形成の２つのモデルを分析のために選択した。Ｍｙｃのテトラサイクリン（ｔｅｔ）抑制性対立遺伝子を包含している、エプスタインバールウィルス不死化ヒトＢ細胞である、Ｐ４９３‐６細胞（Pajic et al., Int J Cancer 87, 787-93 (2000)）を用いた。これらの細胞は免疫不全マウスにおいて発癌性であり、そしてヒトＢ細胞リンパ腫のモデルを示す（Gao et al., Cancer Cell 12, 230-8 （2007））。ｍｉＲＮＡの発現プロファイルを、高Ｍｙｃ（−ｔｅｔ）及び低Ｍｙｃ（＋ｔｅｔ）状態で試験した。Ｍｙｃ誘発Ｂ細胞リンパ腫のネズミモデルにおいてもｍｉＲＮＡ発現を試験した。この系において、ｐ５３−／−マウス由来の骨髄をＭｙｃ−エストロゲン受容体融合蛋白質（ＭｙｃＥＲ）を生産するレトロウィルスで感染させた。感染細胞は、ＭｙｃＥＲ融合蛋白質を活性化する、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）の存在下でポリクローナルＢ細胞リンパ腫を形成する（Yu et al., Cancer Research 65,5454-5461 (2005), Yu et al., Oncogene 21, 1922-7 (2002)）。高Ｍｙｃ活性（連続的に４−ＯＨＴで処置した動物）及び低Ｍｙｃ活性（腫瘍形成後に４−ＯＨＴを除去した動物）を有する皮下腫瘍由来のＲＮＡを分析した。両モデルについての完全発現プロファイリングデータを表１及び２（以下）に提示する。
【０２０８】
【表１−１】
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【０２０９】
【表１−２】
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【０２１０】
【表２−１】
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【０２１１】
【表２−２】
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【０２１２】
【表２−３】
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【０２１３】
【表２−４】
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【０２１４】
【表２−５】
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【０２１５】
【表２−６】
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【０２１６】
【表２−７】
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【０２１７】
【表２−８】
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【０２１８】
ヒト及びマウスの両モデルにおいて高Ｍｙｃ状態で２倍以上の上方調節又は下方調節を示した全てのｍｉＲＮＡを更なる分析のために選択した。両モデルで１．５倍以上の発現の変化を示したｍｉＲＮＡも、ａ）このｍｉＲＮＡ又は関連ファミリーメンバーが癌の中で消滅するか又は突然変異することが知られているか、又はｂ）関連ファミリーメンバーが両モデルにおいて２倍以上変化していれば選択した。
【０２１９】
明らかに、両モデル系におけるＭｙｃ誘発による顕著な影響は、ｍｉＲＮＡ発現の広範な抑制であった。本検討に含める基準を満たす上方調節されたｍｉＲＮＡは殆ど無かった。先の知見と一致して、ｍｉｒ−１７クラスター由来のｍｉＲＮＡは、両モデルにおけるＭｙｃによって２倍以上上方調節された。ｍｉＲ−７は、マイクロアレイ実験で同定された、唯一の更に連続して上方調節されたｍｉＲＮＡであった。しかしながら、このｍｉＲＮＡはノーザンブロッティングで検出されなかったので、更に検討しなかった。潜在的に２１の異なった転写ユニットを示す、少なくとも１３の下方調節されたｍｉＲＮＡが本検討に含めるための基準を満たしていた（表３）。
【０２２０】
【表３】
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【０２２１】
これらの下方調節されたｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ、 ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１９５、及びｌｅｔ−７は、癌の中で消滅することが知られているゲノム領域中で突然変異又は定住する（Calin et al., N Engl J Med 353, 1793-801 (2005), Calin et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101, 2999-3004 (2004)）。
【０２２２】
マイクロアレイ分析で検出された発現変化を裏付けるために、高Ｍｙｃ発現（−ｔｅｔ）及び低Ｍｙｃ発現（＋ｔｅｔ）のＰ４９３−６細胞中でのｍｉＲＮＡ発現を試験するためにノーザンブロッティングを用いた（図１Ａ−１Ｃ）。ｍｉＲＮＡファミリーの複数のメンバーが発現変化を示した（ｍｉＲ−２６ａ／ｂ、ｍｉＲ−２９ａ／ｃ、ｍｉＲ３０ｅ／ｃ、及びｌｅｔ−７ファミリーのメンバー）場合は、クロスハイブリダイゼーションがマイクロアレイの信号に分配された可能性を考慮した。僅か２つのヌクレオチドが異なるｍｉＲ−２９ファミリーのメンバーを特異的に試験できるノーザンブロッティング条件は既に確立されていた（Hwang, Science 315, 97-100 (2007)）。これらの条件を、ヌクレオチドが３つ異なるｍｉＲ−２６ａ及びｍｉＲ−２６ｂ、並びにより複雑なｍｉＲ−３０及びｌｅｔ−７ファミリーを除く全てのｍｉＲＮＡの発現を試験するために用いた（図１Ａ）。全ての場合において、ノーザンブロッティングで得られた結果はマイクロアレイで得られたものとよく一致していた。下方調節されたｍｉＲＮＡとクラスターになっている全ての追加ｍｉＲＮＡをノーザンブロッティング検討に加えた（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２９ｂ、及びｍｉＲ−４９７）。殆どの場合において、クラスターになっているｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９５とクラスターになって、マイクロアレイ及びノーザンで検出されなかったｍｉＲ−４９７を除いて、同様に挙動した（例えば、ｍｉＲ−２９ａ／ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ／ｃ、ｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６）。
【０２２３】
より大きいｍｉＲ−３０及びｌｅｔ−７ファミリーについて、各ファミリーメンバーについての特異的ハイブリダイゼーション条件を確立するために追加の実験を実施した。ｌｅｔ−７ファミリーはかなり複雑なので、ｍｉＲＮＡのこの群の分析はこの報告書の後に別に記載する。ｍｉＲ−３０ファミリーは、３つのクラスターにまとまっている５つの別々の成熟ｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＲ−３０ａ−ｅ）から成っている（図１Ｂ）。特異的ノーザンブロッティング条件を、それぞれのｍｉＲ−３０ファミリーメンバーと配列同一性を有する合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションプローブによって確立した（図１Ｃ）。内因性ｍｉＲ−３０ａは検出不能であって、ｍｉＲ−３０ａ／ｍｉＲ−３０ｃ−２クラスターはこの細胞株では発現されないことを示唆している。別の２つのｍｉＲ−３０クラスターは発現されて、高Ｍｙｃ状態で下方調節された。
【０２２４】
ＭｙｃＥＲ腫瘍において幾つかのｍｉＲＮＡの発現を更に試験して、期待した抑制も観察された（図１Ｄ）。次に、Ｍｙｃの過剰発現と関連するヒト腫瘍細胞が想定されるように抑制されたｍｉＲＮＡの低いレベルを示すか否かを確認した。既に刊行されているｍｉＲＮＡの発現プロファイリングのデータセット（He et al., Nature 435, 828-33 (2005)）の分析では、殆どのＭｙｃで抑制されたｍｉＲＮＡは、非形質転換Ｂ細胞においてよりも、バーキットリンパ腫細胞においてより低いレベルで発現されたことを明らかにした（図２Ａ）。更に、バーキットリンパ腫細胞株中で短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いるＭｙｃ発現の阻害が、大きくはないが一貫したこれらのｍｉＲＮＡの上方調節をもたらした（図２Ｂ、Ｃ）。
【０２２５】
実施例２：Ｍｙｃのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのプロモーターとの結合
Ｍｙｃは、それが抑制する遺伝子のコアプロモーターと結合するということが過去の研究で明らかにされている（Kleine-Kohlbrecher et al., Curr Top Microbiol Immunol 302,51-62 (2006)）。Ｐ４９３−６細胞中の下方調節されたｍｉＲＮＡのプロモーターにＭｙｃが存在するかを試験するためにクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を用いた。既に規定された転写開始部位を伴うｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ内に含まれているｍｉＲＮＡを最初に分析した。８ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１５ａ／１６−１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ３０ｅ／３０ｃ−１、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、及びｍｉＲ−２６ｂ）をコードする、６つのそのような転写物が、本明細書で報告された発現検討に基づくＭｙｃの推定陰性標的である（図３Ａ）。注目すべきことに、Ｍｙｃ結合部位のゲノムレベルの解析では、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１の１次転写物である、ＤＬＥＵ２のプロモータとのＭｙｃの結合を既に明らかにしている（Mao et al., Curr Biol 13, 882-6 (2003)）。ｍｉＲＮＡの発現は試験しなかったが、高Ｍｙｃ状態でＤＬＥＵ２の発現が減少することが見出された。Ｍｙｃ結合を試験するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アンプリコンを、これらのｍｉＲＮＡの転写開始部位の近くの３つの２５０塩基対（ｂｐ）ウィンドー内に、すなわち、転写開始部位のすぐ上流にアンプリコンＳを、アンプリコンＳの５００ｂｐ上流に位置してアンプリコンＵを、そしてアンプリコンＳの５００ｂｐ下流に位置してアンプリコンＤを設計した（図３Ｂ）。ｍｉＲ−２６ａ−１及びｍｉＲ−２６ａ−２に対するプロモーターのＧＣ含量が高いので、これらのｍｉＲＮＡについてはこれらのアンプリコンのサブセットのみが設計できた。陽性対照として、Ｍｙｃの有効な下方調節された標的である、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１ＷＡＦＩ／ＣＩＰＩ）のプロモーター領域内にアンプリコンを設計した（Seoane et al., Nature 419, 729-34 (2002)）。関連のない抗体で生じたＣｈＩＰ試料と比べると、ＭｙｃＣｈＩＰ試料中でＣＤＫＮ１Ａプロモーターアンプリコンの５０倍の富化（５０−フォールドエンリッチメント）が観察された（図３Ｃ）。従って、５０−フォールドエンリッチメントを以下の全ての検討での陽性Ｍｙｃ結合の閾値として設定した。この閾値以上の信号が、試験した６つのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのそれぞれの転写開始部位付近で得られ、Ｍｙｃがこれらのプロモーターと結合する強力な証拠をもたらした（図３Ｃ）。Ｍｙｃの発現がｔｅｔで処理して阻害されたときに、これらの信号は劇的に減少して、これらの知見の特異性を明らかにしている。
【０２２６】
実施例４：Ｍｙｃの、ｍｉＲＮＡの保存領域の上流との結合
ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡクラスターのサブセット（これは下に詳細に記述する）を除いて、残りの下方調節されたｍｉＲＮＡは転写開始部位がマッピングされていないので、関連するＭｙｃ結合部位の同定には、異なった戦略が必要である。図３Ａに示したｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが説明するように、ｍｉＲＮＡプロモーターは、ｍｉＲＮＡの数キロ塩基（ｋｂ）〜＞１００ｋｂ上流に位置できる。一般によく保存されているｍｉＲＮＡは、プロモーターも保存される傾向にあるだろうという仮定を導き出す。従って、ｍｉＲＮＡの保存候補領域の上流を、そこでＭｙｃ結合を評価するために、選択した。この戦略の最初の試験として、ｍｉＲ−２９ｂ−２／２９ｃクラスターを試験した。Vistaソフトウェアパッケージ (http://grnome. lbl. gov./vista/index.shtml) を用いて、これらｍｉＲＮＡの約２０ｋｂ上流にある保存の正確な領域を確認した（図４Ａ、アンプリコンＣ）。Ｐ４９３−６細胞におけるＣｈＩＰ分析は、)Ｍｙｃの特異的なこの保存領域との有意な結合を明らかにした（図４Ｂ）。Ｍｙｃは非保存領域の近くには結合せず（図４Ａ、アンプリコンＮ）、この知見の特異性を明らかにした。同様な戦略を、残りの下方調節されたｍｉＲＮＡの上流でのＭｙｃの結合を評価するために用いた。ｍｉＲ−２９ｂ−１／２９ａクラスター、ｍｉＲ−３０ｄ／３０ｂクラスター、ｍｉＲ−３４ａ及びｍｉＲ‐１４６ａの保存領域の上流とのＭｙｃ結合の証拠が得られた（図４Ｂ及び図５−８）。ｍｉＲ−１９５／４９７クラスターの上流で顕著なＭｙｃ結合も観察された。しかしながら、この結合部位がＢＣＬ６Ｂ転写の転写開始部位にも近いので、Ｍｙｃ結合がｍｉＲＮＡではなく、この転写の調節をもたらすという可能性を排除することはできない（図９Ａ及び９Ｂ）。いくつかのアンプリコンを試験したにもかかわらず、ＭｙｃがｍｉＲ−１５０の近辺で結合するという証拠は得られなかった（図１０Ａ及び１０Ｂ）。更なる陰性対照として、Ｐ４９３−６細胞中で発現されなかったｍｉＲ−３０ａ／３０ｃ−２クラスターの６つの保存部位の上流においてＭｙｃ結合を試験した（図１Ｃ）。予想通りに、これらのどのアンプリコンは陽性ＣｈＩＰ信号を生じなかった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。
【０２２７】
Ｍｙｃが、６つの試験した構造が公知のｍｉＲＮＡ転写ユニット（図３）のうちの６つの転写開始部位の近くで結合すると仮定すると、ｍｉＲ−２９ｂ−１／２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ−２／２９ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ／３０ｂ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１４６ａ、及び恐らくｍｉＲ−１９５／４９７の上流に確認された保存Ｍｙｃ結合部位はｍｉＲＮＡプロモーター内にあると思われる。これを直接試験するために、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）を行って、これらｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのサブセットを完全に特性化した。これら転写物のうちの３つについては、スプライスされた発現配列標識（ＥＳＴｓ）がＲＡＣＥの出発点として用いるために入手可能である。更なるｍｉＲＮＡである、ｍｉＲ−３４ａについて、１次転写物の完全構造が最近報告された（Chang et al., Mol Cell 26, 745-52 (2007)）。これらのケースのそれぞれで、実験的に同定されたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの５’末端は、最大Ｍｙｃ結合を示す保存部位と明確に一致した（図４Ｃ）。注目すべきことに、最近公表された別の研究が、ｍｉＲ−１４６ａに対する同一の転写開始部位を定義している（Taganov et al., Proc Natl Acad Sci USA 103,12481-6 (2006)）。要約すると、１３の構造が公知及び未知の両方の抑制されたｍｉＲＮＡ転写ユニットのうち、１２の上流のＭｙｃによる結合部位が確認された。これらのケースのうち１０において、Ｍｙｃ結合部位がｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ５’末端と明確に一致することが確認された。これらの知見は、高Ｍｙｃ状態において観察されるｍｉＲＮＡの抑制の大半が、ｍｉＲＮＡプロモーターへのＭｙｃ結合の直接の結果であろうことを示唆している。
【０２２８】
実施例５：ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡクラスターの調整制御の解析
高Ｍｙｃ状態で下方調節されたｍｉＲＮＡは、８つの異なった転写ユニットから産生した９つの高度に関連する成熟ｍｉＲＮＡ配列を含むｌｅｔ−７ファミリーのメンバーを含有していた（図１２Ａ）。ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡは、肺癌中で下方調節されることが知られていて、証拠によりこれらのｍｉＲＮＡが腫瘍抑制活性を保有していることが示唆されている（Johnson et al., Cell 120, 635-47 (2005), Takmizawa et al., Cancer Res 64, 3753-6, (2004), Yanaihara, et al., Cancer Cell 9, 189-98 (2006)）。ほぼ全てのヒトｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡに特異的なハイブリダイゼーション条件は、ノーザンプローブを、それぞれのｌｅｔ−７ファミリーメンバーと配列が同一の合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることによって確立された（図１２Ｂ）。特異的ハイブリダイゼーション条件は、ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡのサブセットとクラスターになっているｍｉＲ−９９／１００ファミリーのメンバーに対しても確認された（図１２Ｃ）。３つのｌｅｔ−７クラスターもｍｉＲ−１２５ファミリーのメンバーを包含し、これらは標準ノーザンブロット条件を用いて識別すると十分に異なっている（ｍｉＲ−１２５ａとｍｉｒ−１２５ｂの間で７つのヌクレオチドが異なっている）。Ｐ４９３−６細胞における、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−９９ａ、及びｍｉＲ−１２５ｂの発現を検出して、全てが高Ｍｙｃ状態で下方調節された（図１２Ｂ−１２Ｄ）。試験した残りのｍｉＲＮＡは検出されなかった。これらのデータはこの細胞株における、ｌｅｔ−７ａ−１／ｌｅｔ７−ｆ−１／ｌｅｔ７ｄクラスター、ｍｉＲ−９９ａ／ｌｅｔ−７ｃ／ｍｉＲ−１２５ｂ−２クラスター、及びｌｅｔ−７ｇの発現とのみよく一致している。
【０２２９】
これらのｍｉＲＮＡ転写ユニットのプロモーター又は保存部位の上流とのＭｙｃ結合を評価するためにＣｈＩＰを再び用いた。未だ特徴付けされていないｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ内に含まれているｌｅｔ−７ａ／ｌｅｔ−７ｆ‐１／ｌｅｔ−７ｄクラスターの保存部位上流、及びｌｅｔ−７ｇ ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの転写開始部位へのＭｙｃ結合の強力な証拠が得られた（図１３）。５０−フォールドエンリッチメント閾値以上の信号は、ｍｉＲ−９９ａ／ｌｅｔ−７ｃ／ｍｉＲ−１２５ｂ−２  ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに対する２つの代替的転写開始部位のどちらにおいても得られず、この転写が直接のＭｙｃ標的ではないことを示唆した。
【０２３０】
実施例６：Ｍｙｃで抑制されたｍｉＲＮＡの発現は、インビボでリンパ腫細胞の生育を阻害する。
特異的なｍｉＲＮＡの下方調節がＭｙｃが介在する腫瘍形成に寄与するか否かを確認するために、既に報告されているＢ細胞リンパ腫形成のインビボ選択モデルを用いた（Yu et al., Ann N Y Acad Sci 1059, 145-59 (2005)）。個々のヒトｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡクラスターをネズミ幹細胞ウィルス（ＭＳＣＶ−ＰＩＧ）の誘導体中でクローン化してレトロウィルス発現ベクターを最初に作成した。これは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）も発現する（図１４Ａ）（Hemann et al., Nat Genet 33, 396-400 (2003)）。１０個の異なったｍｉＲＮＡ発現構築物を作成した（ｍｉＲ−１５ａ／１６−１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−２９ｂ−１／２９ａ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１９５／４９７、及びｌｅｔ−７ａ−１／ｌｅｔ−７ｆ−１）。このセットは、高Ｍｙｃ状態で下方調節された全ての固有のｍｉＲＮＡ、及びそれぞれの下方修正されたｍｉＲＮＡファミリーの少なくとも１つのメンバーを含有していた。それぞれの成熟ｍｉＲＮＡ配列がヒト及びマウスの間で同一である。レトロウィルス構築物を、ｐ５３−／−マウス由来の骨髄中でＭｙｃを発現して作成したＢリンパ腫細胞株である、Ｍｙｃ３細胞を感染するために用いた（Yu et al., Blood 101, 1950-5 (2003)）。他の腫瘍遺伝子による形質転換の設定において、これらのｍｉＲＮＡ発現の影響を確認するために、ｖ−Ａｂｌ腫瘍遺伝子で形質変換されたｐｒｏ−Ｂ細胞である、３８Ｂ９細胞（Alt et al., Cell 27, 381-390 (1981)）を、並列実験で用いた。レトロウィルスの感染条件を、約５０％ＧＦＰ陽性の受容細胞が達成できるように調節して、これらの混合培養物をＳＣＩＤマウスに皮下注射した。約３週間後に、得られた腫瘍を除去して残存しているＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。腫瘍形成を阻害するｍｉＲＮＡの発現は、レトロウィルスに感染した細胞を選択的に阻害して、それによって腫瘍中のＧＦＰ陽性細胞の分画の減少をもたらすであろう。
【０２３１】
レトロウィルスの発現が生理的に的確なレベルの成熟ｍｉＲＮＡを産生するか否かを評価するために、レトロウィルスで感染したＭｙｃ３及び３８Ｂ９細胞 におけるｍｉＲＮＡの発現レベルを、非形質転換ｐｒｏ−Ｂ細胞株ＹＳ−ＰＢ１１における内因性発現レベルと比較した（Lu et al., J Immunol 161, 1284-91 (1998)）（図１５）。ＹＳ−ＰＢ１１においては発現しなかった、ｍｉＲ−１５０の発現レベルをＭｙｃＯＦＦ腫瘍と比較した。ほぼ全ての場合において、レトロウィルスのｍｉＲＮＡ発現のレベルは、生理的な環境で０．６〜６倍の範囲で観察された。高レベルの発現は、両細胞株においてｍｉＲ−２２で、及び３８Ｂ９細胞においてｍｉＲ−１９５で得られたので、これらの環境においてこれらのウィルスで観察された結果は、慎重に解釈すべきである。
【０２３２】
ｌｅｔ−７ａ−１／ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−２９ｂ−１／２９ａ、及びｍｉＲ−１４６ａによる安定に感染された細胞集団は確立することが不可能であった。これはこれらのウィルスの非効率的なパッケージングの結果である可能性もあるが、このことはインビトロでの細胞生育の間にこれらのｍｉＲＮＡが強力な陰性選択を強要したことを示唆しているかもしれない。残りのウィルスについては、ＧＦＰ−陽性によって評価すると、受容細胞の感染が３０〜７０％達成された。空の、ｍｉＲ−１８ａの又はｍｉＲ−３０ｂのウィルスで感染したＭｙｃ３及び３８Ｂ９細胞集団においてＧＦＰ−陽性細胞の分画が、腫瘍形成の前及び後に一定に残存した（図１４Ｂ）。その一方、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ１９５／４９７、及びｍｉＲ１５ａ／１６−１ウィルスで感染したＭｙｙｃ３又は３８Ｂ９細胞は腫瘍から殆ど除去され、Ｍｙｃ及びｖ−Ａｂｌの両方が介在する形質転換の環境において、これらのｍｉＲＮＡは抗腫瘍形成特性を有していることを示唆した。ｍｉＲ−２６ａはＭｙｃ形質転換細胞に特異的に腫瘍形成を阻害したのに対して、ｍｉＲ−２２の発現はｖ−Ａｂｌ形質転換細胞における腫瘍形成のみに作用した。重要なことに、ｍｉＲＮＡ発現の強さと観察された表現型との間の相関性は見られず、これらの結果がレトロウィルス過剰発現の産物を示す可能性が低いことを示唆している。例えば、両細胞株において腫瘍形成に対する最も強い陰性効果の１つを有していた、ｍｉＲ−１５ａ／１６−１は、最も低いレベルのレトロウィルス発現を示した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。これらのデータは、Ｍｙｃが抑制する幾つかのｍｉＲＮＡが、Ｍｙｃが介在する形質転換の環境、更には他の腫瘍遺伝子による形質転換の状況の両方において、腫瘍抑制活性を有していることを明らかにしている。
【０２３３】
抗腫瘍形成性ｍｉＲＮＡの下方調節が、Ｍｙｃ活性化後の増強された細胞増殖と相関があるか否かを確認するために、Ｐ４９３−６細胞におけるｍｉＲＮＡの動態を試験した（図１６）。これらの細胞はｔｅｔの除去後４８時間まで増殖を開始せず、そしてＭｙｃ導入後少なくとも７２時間まで最大生育率に達しない（O'Donnell et al., Mol Cell Biol 26, 2373-86 (2006)）。Ｍｙｃの導入による増殖に先行してそれらを抑制するための要件に一致して、これらの時点までｍｉＲＮＡの有意な下方調節が観察された。
【０２３４】
Ｍｙｃの病的に活性化された発現は、ヒトの癌における最も一般的な発癌事象の１つである。本検討において、Ｍｙｃ活性化の重要な影響は、腫瘍細胞のｍｉＲＮＡ発現パターンの広範な再プログラミングであった。ｐｒｏ−腫瘍形成性ｍｉｒ−１７クラスターはＭｙｃによって直接上方調節されることが既に示されているが（O'Donnell et al., Nature 435, 839-43 (2005)）、本明細書で報告される新しい知見は、ｍｉＲＮＡ発現に対するＭｙｃの顕著な影響は広範囲に及ぶ下方調節であるということを予想外に明らかにする。ＭｙｃによるｍｉＲＮＡ発現の抑制は、ｍｉＲＮＡのレベルが腫瘍において全体的に減少するという観察と一致している。ｍｉＲＮＡ生合成の阻害が、癌における特異的なｍｉＲＮＡの抑制に寄与することが明らかにされた。これらの新しい知見は、直接的な転写抑制もこの現象に寄与することを示唆している。
【０２３５】
ｍｉＲＮＡ抑制がＭＹｃが介在する腫瘍形成に有利に働くという結論を、幾つかの証拠が支持する。第１に、Ｍｙｃによって下方調節された幾つかのｍｉＲＮＡが、癌中で消失することが知られている領域内で、突然変異するか又はそこに位置して、これらが腫瘍抑制遺伝子として機能することを示唆している（Calin et al., N Engl J Med 353, 1793-801 (2005); Calin et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 2999-3004 (2004)）。ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１は慢性リンパ性白血病患者の３分の２以上において消失するか又は下方調節されて、抗−アポトーシス遺伝子ＢＣＬ２を標的にする。ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡファミリーのメンバーはＲＡＳ腫瘍遺伝子を標的にして、肺癌において高い頻度で下方調節される（Johnson et al., Cell 120, 635-47 (2007), Takamizawa et al., Cancer Res 64, 3753-6 (2004), Yanaihara et al., Cancer Cell 9, 189-98 (2006)）。最近の証拠は、ｍｉＲ−３４ａを、強力な抗増殖及びｐｒｏ−アポトーシス活性によるｐ５３腫瘍抑制ネットワークの重大な構成要素としてみなしている。ＭｙｃによるこれらのｍｉＲＮＡの抑制は、癌細胞においてそれらの減少した機能に寄与する重要なメカニズムである可能性が高い。さらに、本明細書で示されているように、Ｍｙｃに抑制された幾つかのｍｉＲＮＡはＢ細胞リンパ腫のマウスモデルにおいて劇的な抗腫瘍形成活性を有している。ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１５０、及びｍｉＲ−１９５／４９７については、これが、これらのｍｉＲＮＡが腫瘍抑制特性を有していることを示す最初に報告された実験データであることを示している。総合すれば、Ｍｙｃが介在する腫瘍形成におけるｍｉＲＮＡ発現を制御する重要な役割をこの入手可能なデータが支持している。更に、小さいｍｉＲＮＡの動物への全身送達における最近の成功を考慮すると、これらの結果は、Ｍｙｃに抑制されたｍｉＲＮＡの送達が新しい癌の治療戦略を示すという可能性を高めている。実際に、これらの知見は、たった１つの重要なｍｉＲＮＡの再発現で、腫瘍形成を阻害するのに十分であることを示唆している。
【０２３６】
本検討は、癌における関連ｍｉＲＮＡの調節制御、さらに別の生物学的過程の注意深い詳細な分析の重要性も強調している。ｍｉＲＮＡは所定の種のゲノムの至る所に分布している多数の高度に近縁又は同一の複写物に高い頻度で存在している。この構成は、ヒトにおける８つの個別転写ユニットから産生されたｌｅｔ−７ファミリーの９つの異なったｍｉＲＮＡに裏付けられている。先の研究が癌におけるｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡの下方調節を観察しているが（Johnson et al., Cell 120, 635-47 (2005), Takamizawa et al., Cancer Res 64, 3753-6 (2004), Yanaihara et al., Cancer Cell 9, 189-98 (2006)）、個々のｌｅｔ−７転写ユニットの発現、及びそれ故に所定の腫瘍におけるｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡの起源は殆ど試験されていない。本検討において、これらのｍｉＲＮＡの複雑な調節制御の詳細な分析の実現可能性が明らかにされた。関連するｍｉＲＮＡは同一の機能を常に有していない（Hwang Science 315, 97-100 (2007)）ので、所定の腫瘍型において調節不全の特異的なｍｉＲＮＡファミリーメンバーの特徴付けが、癌発病機序におけるそれらの役割を解明するために必要な要件である。
【０２３７】
最後に、これらのデータは、多数の癌のサブタイプで観察されているｍｉＲＮＡ発現のほぼ普遍的な調節不全の重大性の洞察をもたらす。我々の結果は、これらの異常なｍｉＲＮＡ発現パターンは、悪性形質転換を伴う細胞同一性の損失の間接的な影響としてのみでは説明できないことを示唆している。むしろ、発癌事象は、腫瘍形成に有利に働くｍｉＲＮＡトランスクリプトームを直接再プログラムすると思われる。
【０２３８】
本明細書で報告されている結果は、以下の材料及び方法を用いて得た。
細胞培養。Ｐ４９３−６細胞（Pajic et al., (2000). "Cell cycle activation by c-myc in a burkitt lymphoma model cell line", International Journal of Cancer 87(6):787-93を参照されたい）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンを補完したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
Ｍｙｃの発現を抑制するために、細胞を０．１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（Sigma）の存在下で７２時間生育した。高及び低Ｍｙｃ状態のネズミリンパ腫細胞を記載（Yu et al., Cancer Research 65, 5454-5461 (2005), Yu et al., Oncogene 21, 1922-7 (2002)）のようにして得た。
【０２３９】
ｍｉＲＮＡのマクロアレイ分析
３１３のヒトｍｉＲＮＡ又は２３３のマウスｍｉＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプローブを含有しているカスタムマイクロアレイは Combimatrix によって合成された。全ｍｉＲＮＡ用に２つのミスマッチを含有しているプローブが含まれていた。アレイハイブリダイゼーション及びデータ分析を記載（Chang et al., Mol Cell 26, 745-52 (2007)）のようにして実施した。バックグラウンドの２倍未満のシグナルをその後の分析から除外した（表１及び２においてゼロと表す）。ネズミＢ細胞リンパ腫のｍｉＲＮＡプロファイリングについては、高Ｍｙｃレベルの２つの腫瘍及び低Ｍｙｃレベルの２つの腫瘍を分析した。４分の３の腫瘍に存在していないか又はそれぞれの高Ｍｙｃ及び低Ｍｙｃ腫瘍のうちの１つに存在していないｍｉＲＮＡはその後の分析から除いた。フォールド変化値を高Ｍｙｃ及び低Ｍｙｃ腫瘍の間で全４対比較について計算して、平均値を求めて平均フォールド変化値を得た。
【０２４０】
ノーザンブロット分析
UltrahybOligo (Ambion) 及び成熟ｍｉＲＮＡ配列に完全に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−９９／１００、及びｌｅｔ−７ファミリーを除く、全てのｍｉＲＮＡについてノーザブロッティングを記載（Hwang Science 315, 97-100 (2007)）のようにして実施した。関連するｍｉＲＮＡのための特異的ハイブリダイゼーション条件を確立するために、１μｌのＲＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｎＭ）をポリアクリルアミドゲル上で分離して、上記のようにして探査した。ブロットを４２℃でて２ＸのＳＳＣ、０．５％のＳＤＳで１回洗浄して、そし２回目はより高い温度で洗浄して１０％未満のクロスハイブリダイゼーションを観察した。それぞれのプローブに対する特異的な洗浄温度を表４（以下）に挙げてある。
【０２４１】
【表４−１】
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【０２４２】
【表４−２】
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【０２４３】
【表４−３】
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【０２４４】
バーキットリンパ腫細胞におけるＭｙｃノックダウン
２９３Ｔパッケージング細胞を抗−Ｍｙｃ ｓｈＲＮＡ又は対照のｓｈＲＮＡ（Sigma）を発現するｐＬＫＯ．１−Ｐｕｒｏレンチウィルスでトランスフェクトした。ＥＷ３６細胞をレンチウィルスの上澄液で３回感染させた。最初の感染の４８時間後に、全ＲＮＡ及びタンパク質を採取する前に４８時間ピューロマイシン中で細胞を選択した。
【０２４５】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）及び定量的リアルタイムＰＣＲ
ＣｈＩＰを既述（O'Donnell et al., Nature 435, 839-43 (2005)）のようにして実施した。ABI 7900 Sequence Detection System を SYBR Green PCR core reagent kit (Applied Biosystems) と共に用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。ＣｈＩＰ試料を増幅するために用いたプライマーの配列を表５（以下）に示す。表５では、順方向プライマー配列を記載順にそれぞれ配列番号６９〜１２５として、及び逆方向プライマー配列を記載順にそれぞれ配列番号１２６〜１８２として開示する。
【０２４６】
【表５−１】
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【０２４７】
【表５−２】
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【０２４８】
ｍｉＲＮＡの１次転写物のＲＡＣＥマッピング
ｍｉＲ−２９ｂ−２／２９ｃ、ｍｉＲ−２９ｂ−１／２９ａ、及びｍｉＲ−１４６ａ一次転写物を特徴付けるために GeneRacer kit (Invitrogen）を用いた。これらの試験で用いる全ＲＮＡを単離する前に、ドローシャ（Drosha) の発現を、既述の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Hwang Science 315, 97-100 (2007)）をｔｅｔで処理したＰ４９３−６細胞中に電気穿孔して阻害した。電気穿孔は、記載（O'Donnell et al., Mol Cell Biol 26, 2373-86 (2006)）のようにして実施した。プライマー配列を以下の表６に示した。表６では、順方向プライマー配列を記載順にそれぞれ配列番号１８３〜１８６、１８３〜１８４、１９１〜１９２、１８３〜１８４、１９５〜１９６及び１９９〜２０８として、並びに逆方向プライマー配列を記載順にそれぞれ配列番号１８７〜１９０、１９３〜１９４、１８９〜１９０、１９７〜１９８、１８９〜１９０及び２０９〜２１８として開示する。
【０２４９】
【表６−１】
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【０２５０】
【表６−２】
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【０２５１】
【表６−３】
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【０２５２】
【表６−４】
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【０２５３】
腫瘍形成試験
ｍｉＲＮＡ及び少なくとも１００ｂｐのフランキング配列をゲノムＤＮＡから増幅してレトロウィルスベクターＭＳＣＶ−ＰＩＧ４１のＸｈｏＩ部位内にクローン化した。プライマー配列を表６に示してある。直接シーケンシングによって、正確なベクター構造を確認した。Ｍｙｃ３及び３８Ｂ９細胞のレトロウィルス感染、フローサイトメリー、及び腫瘍形成を記載（Yu et al., Ann NY Acad Sci 1059, 145-59 (2005)）のようにして実施した。挿入部分の配列は以下に示す。
【０２５４】
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【０２５５】
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【０２５６】
受入れ番号
ｍｉＲＮＡ１次転写物の配列は、以下の受入れ番号でGeneBank データベースに寄託してある：ｍｉＲ−２９ｂ−１／２９ａクラスター、ＥＵ１５４３５３；ｍｉＲ−２９ｂ−２／２９ｃ、ＥＵ１５４３５１、Ｅｕ１５４３５２；ｍｉＲ−１４６ａ、ＥＵ１４７７８５（それぞれ図１７Ａ−Ｅ）。マイクロアレイのデータは、受入れ番号ＧＳＥ９１２９でGene Expression Omnibus(GEO) データベースに寄託してある。
【０２５７】
その他の態様
上記の説明から、多種の用途及び条件に適用するために、本明細書に記載の発明に変更及び修正を行うことができるとういうことは明らかであろう。このような態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０２５８】
本明細書に記載の可変用語の定義の何れかにおける構成要素のリストの列挙は、単一の構成要素又は列挙されている構成要素の組合わせ（又はサブコンビネション）としての可変用語の定義を包含している。本明細書の態様の列挙は、何れかの単独の態様又は別の何れかの態様若しくはそれらの一部との組合わせとしての態様を包含している。
【０２５９】
本明細書で言及されている全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立した特許及び刊行物が参照によって組み込まれることが明確に個々に指摘されているのと同じような程度に参照として本明細書に組み込まれている。
【図１Ａ−１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｄ】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ａ−３】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１６Ａ−１６Ｂ】
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【図１７Ａ−１】
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【図１７Ａ−２】
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【図１７Ａ−３】
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【図１７Ａ−４】
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【図１７Ａ−５】
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【図１７Ａ−６】
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【図１７Ａ−７】
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【図１７Ａ−８】
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【図１７Ａ−９】
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【図１７Ａ−１０】
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【図１７Ａ−１１】
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【図１７Ａ−１２】
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【図１７Ａ−１３】
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【図１７Ａ−１４】
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【図１７Ａ−１５】
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【図１７Ａ−１６】
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【図１７Ａ−１７】
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【図１７Ａ−１８】
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【図１７Ｂ−１】
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【図１７Ｂ−２】
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【図１７Ｂ−３】
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【図１７Ｃ−１】
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【図１７Ｃ−２】
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【図１７Ｃ−３】
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【図１７Ｄ−１】
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【図１７Ｄ−２】
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【図１７Ｄ−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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