(57)【要約】本発明は、新規の化学化合物、これら化合物のトロンビン阻害剤としての利用、およびそれらを基にした医薬組成品に関し、トロンビン依存血栓塞栓症の治療および予防、並びに研究に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造式（Ｉ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩または溶媒和物であって、
Ａ−Ｂ−Ｃ  （Ｉ）
式中、Ｃは、次の構造を含む群から選ばれる、
【化１】
2010531352.tif 000064
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、互いに独立して、水素または、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｂは、−（ＣＨ２）ｎ−、ｎは１〜５の整数であり、Ａは、次の構造から選ばれる、
【化２】
2010531352.tif 000065
式中、Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、ＣＨ２ＮＲ１０Ｒ１１、およびＣＨ（ＣＨ３）ＮＲ１０Ｒ１１を含む群から選ばれ、
【化３】
2010531352.tif 000066
式中、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素または、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基またはハロゲンであり、
Ｒ８は、水素または、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基であり、
Ｒ９は、次からなる群から選ばれる、
【化４】
2010531352.tif 000067
式中、Ｒ１０およびＲ１２は、互いに独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、（ＣＨ２）ｍＣＯＯＲ１３、および（ＣＨ２）ｍＣＯＮ（Ｒ１３）２を含む群から選ばれ、
【化５】
2010531352.tif 000068
式中、ｍは、１から４の整数であり、
Ｒ１３は、水素またはＣ１〜Ｃ６のアルキル基
Ｒ１１は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、またはＡｒ
Ａｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ハロゲン，Ｎ（Ｒ１３）２、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＲ１３、ＣＯＮ（Ｒ１３）２およびＳＯ２Ｒ１３の群から選ばれた１から５つの置換基をもつ、フェニル、ピリジル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、フラニル、ピリミジニル、ピリダゾニル、ピラジニル、インドリル、ベンゾフラニル、またはベンゾチオフェニルであり、
次を、例外とする、
【化６】
2010531352.tif 000069
一般構造式（Ｉ）の化合物、およびその薬理学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項２】
具体的に
【化７】
2010531352.tif 000070
式中、Ｙは、水素、ハロゲン、ＣＯＯＲ１３、ＣＯＮ（Ｒ１３）２およびＳＯ２Ｒ１３からなる群から選ばれ、
ｒは、２から５の整数である、
請求項１に記載の化合物、およびその薬理学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項３】
トロンビンを阻害する能力のある、請求項１に記載の化合物、およびその薬理学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物、およびその薬理学的に許容される塩または溶媒和物の利用。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物、その薬理学的に許容される塩または溶媒和物の治療有効量、および薬理学的に許容される担体を含む、トロンビン依存血栓塞栓症の治療および予防に使用するための医薬組成品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の化学化合物、これら化合物のトロンビン阻害剤としての応用、およびそれらを基にした医薬組成品に関し、トロンビン依存血栓塞栓症（thromboembolic events）の治療および予防に使用することができ、また研究目的にも使用することができる。
【０００２】
トロンビンは、血液凝固系の主要な酵素であり、可溶性の血漿タンパク質、フィブリノゲンを、不溶性のフィブリン塊に転換する。フィブリン重合を引き起こす過程であるトロンビン形成とトロンビン阻害、すなわちトロンビン活性を抑制する過程の間には、不安定な平衡が存在する。過剰なトロンビン形成は、血栓症となる。
【０００３】
直接トロンビン阻害剤は、 活性酵素中心に直接強く結合し、天然基質であるフィブリノゲンをその活性中心から遮断するする阻害剤の名称である。この遮断によって、トロンビンが触媒するフィブリノゲンからフィブリンへの転換が阻止される。その結果、フィブリン凝固を防ぎ、血液凝固を遅らせるか、完全に予防する。よって、強力な抗トロンビン活性を有するには、直接トロンビン阻害剤は、最大限に可能な強度で活性トロンビン中心と結合しなければならない。このため、直接トロンビン阻害剤は、トロンビン分子の活性中心の構造のよって決定づけられる、いくつかの条件を満たさなければならない。
【０００４】
一般に、活性トロンビン中心は、アミド分解反応が起こる部位(point)の近傍の、フィブリノゲン基質の異なるアミノ酸を受ける数個のキャビティまたはポケットに、便宜上分けられる。ポケットＳ１は、疏水性アミノ酸残基によって形成される壁を有する深くて狭いキャビティであり、実際にそのキャビティの底部に、アミノ酸Ａｓｐ１８９のカルボキシル基の存在下で作られた負に帯電する源(source)である。ポケットＳ１は、フィブリノゲン中の主要アミノ酸残基（リシンまたはアルギニン）に、（リシンまたはアルギニンのＣ末端における）ペプチド結合の分離部分(breakup point)に直接結合する役割をもつ。主要アミノ酸の長い非分岐炭化水素残基は、ポケットＳ１の全長にわたって伸びている。一方で、炭化水素残基の末端で正に帯電した主要断片は、ポケットＳｌの底部で負に帯電したアスパラギン酸残基に塩架橋を形成している。従って、ポケットＳ１は、フィブリノゲンのポリペプチド鎖中の主要アミノ酸残基を識別するのに最も適している。
【０００５】
別のポケット、Ｓ２は、ポケットＳ１のすぐ傍に隣接する非極性アミノ酸残基によって形成され、（そのＮ末端において）ポケットＳ１に受けられた主要アミノ酸の後方で(behind)、フィブリノゲンのアミノ酸配列中の主要でない(minor)疏水性アミノ酸 (バリン、イソロイシンおよびロイシン)を認識する役割をもつ。ポケットＳ２は、ポケットＳｌより、やや小さい容積で、いかなる帯電したアミノ酸基をももたない。従って、ポケットＳ２は、非極性脂肪族アミノ酸の小さな炭化水素残基との結合に、理想的に適している。
【０００６】
さらに別のポケット、Ｓ３は、トロンビン表面上でポケットＳ２の隣に見られる。これも、疏水性ポケットであるが、むしろ大きい容積をもち、その大部分が、外に向かっており、直接溶媒にさらされているため、はっきりと特徴付けられていない。ポケッＳ３は、ペプチド鎖の分裂から２つまたは３つの結合離れた、フィブリノゲンの脂肪族および芳香族の疏水性アミノ酸断片を受ける役目をしている。
【０００７】
直接トロンビン阻害剤は、トロンビン分子の活性中心のこれら３つのポケットを、最適の様式で埋めなければならない。例えば、周知のトリペプチド阻害剤、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、活性トロンビン中心と次のように反応することが、Ｘ線構造解析により見出された。アルギニン残基が、ポケットＳ１を埋め、プロリン残基がポケットＳ２を塞ぎ、Ｄ−フェニルアラニンがポケットＳ３を占める。
【０００８】
血栓症をコントロールするために、現在、臨床で使用されている薬剤は、血液中で既に形成された過剰のトロンビンを阻害するのに必ずしも適しているわけではない。医師たちは、多量に未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン及びビタミンＫ拮抗剤（ワルファリン）などの間接トロンビン阻害剤を使用する傾向にある。これらの全ての薬剤が、それ自身で、系に蓄積する過剰のトロンビンを阻害することができるわけではない。種々のヘパリンは、血漿中に存在する天然のトロンビン阻害剤、アンチトロンビン  ＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の効果を阻害することを迅速に促すのみである。そのため、なんらかの理由で、患者の血漿中のＡＴＩＩＩ含有量が非常に低い場合、ヘパリンは弱い抗凝血効果しかもたない。ビタミンＫ拮抗剤は、肝臓での凝固因子の前駆体合成を抑制することによって、凝固速度を減じる。明らかに、ヘパリンは、血中に存在するトロンビンを早急に抑制する必要がある重篤な状況では有用であり得ない、比較的時間を要する選択肢である。
【０００９】
間接凝固剤療法には、制限があるので、製薬会社は、強力で選択的な直接トロンビン阻害剤の開発に努力してきた。現在まで、そのようなトロンビン阻害剤が数多く開発されてきた。しかし、その大部分は、薬剤に要求される性質をすべて示すわけではない。実効時間、低毒性、水溶性、経口での生体利用効率(bioavailability)など薬理学的性質を向上すべく、研究が続けられている。理想的なトロンビン阻害剤は、血塊に固定されたトロンビンに対しても効果がなければならない。理想的なトロンビン阻害剤は、線維素溶解に係るプロテアーゼを阻害することなく、トロンビンに選択的で、長時間血中に残存し、肝臓内の酵素やシトクロムＰ４５０の影響に耐性があり、水溶液媒体で保持され、血中タンパク質と混ざらず（または、ほんの僅かに混ざり）、無毒でなければならない。しかしながら、化合物の予備試験は、これら要件を満たす化合物の適性について結論に到達していない。多くの効果的な低分子量トロンビン阻害剤がすでに合成されてきたが、唯一、日本で合成されたアルガトロバン(Argatroban)（米国特許第５，２１４，０５２号１９９３）のみが、必要な臨床試験全てを通り、今日、使用されている。しかしながら、アルガトロバンは、溶液中での安定性が低く（その血漿中のＴ１／２は３６分）理想的な阻害剤でない。このことは、効果的で安全な新しい合成トロンビン阻害剤を開発する要求は、引き続き課題であることを意味する。
【００１０】
今日入手可能な公になっている特許および科学研究には、多数のトロンビン阻害剤が記述されている。これら公表文献の要約を下に示す。
【００１１】
米国特許出願第２００６／００１４６９９号（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ  ＡＢ）、２００６、および米国特許第５，７９５，８９６号（Ａｓｔｒａ  Ａｋｔｉｅｂｏｌａｇ）、１９９８、は、メラガトラン阻害剤を含む抗血栓症医薬化合物を記載している。
【００１２】
また、米国特許第５，５１０，３６９号（メルク社）、１９９６  に記載されているピロリジントロンビン阻害剤や、米国特許第５，７９２，７７９号（メルク社）、１９９８で記載されているものなどのピリジントロンビン阻害剤も公知である。
【発明の概要】
【００１３】
本出願人は、現存の阻害剤の構造や阻害剤とトロンビン分子間の反応の機序に関する情報を含む数多くの科学論文や記事を調査してきた。表１に示されているように、調査した文献は、トロンビン阻害剤として知られているほとんどすべての種類の化学化合物を網羅している。表１にある文献のリストは、完璧でないにしても、十分に足りるものである。我々が、独自のトロンビン阻害剤を開発するにあたって、これら文献にすでに記述されている構造を慎重に避けた。これらの我々が参照した文献には、発明として特許権を請求した新規化合物を特徴づける要素を有するトロンビン阻害剤に関する情報はなかった。
【００１４】
本発明の実際の目的(practical task)は、直接トロンビン阻害剤として働き得る新規の化合物を開発することである。これらの阻害剤は、様々な病変(pathologies)の影響で生物に発現する急性の血栓症(thrombotic conditions)の治療に用いることができる。生物における非常に多くの異なった病態(pathological conditions)が、止血系障害に関連している。心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症または肺動脈血栓塞栓症などの疾患の結果として起こる血栓塞栓性合併症は、世界中で、主な死因に入っている。よって、効果的で安全な臨床薬として働き得る薬剤の開発に長期にわたり鋭意努力が重ねられてきたことは、驚きに値しない。とりわけ、これら薬剤は、抗凝血性質を示す抗血栓症剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】様々な濃度の化合物ＨＣ−０１９ｓ−ＩＯＣ（表４を参照のこと）がある場合のトロンビンの効果のあるもとでの発色物質クロモザイム（Chromozim）ＴＨ（ＣＴＨ）に対する、特徴ある動態(kinetic)加水分解曲線の例を示す図である。
【図２】ＣＴＨ加水分解阻害の程度と、非常に効果的なトロンビン阻害剤である、新規に合成された他の化合物（ＨＣ−０１８ｓ−ＩＯＣ）の系内での濃度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
特に他に指示がない限り、次の定義が、本明細書において用いられる。
【００１７】
活性中心とは、生化学反応において鍵となる役割を果たすタンパク質高分子の領域である。
【００１８】
タンパク質とは、タンパク質高分子を意味する。
【００１９】
標的タンパク質とは、結合過程に係るタンパク質高分子を意味する。
【００２０】
リガンドとは、低分子量の化学構造物の集団(collections)を意味する。 
【００２１】
結合過程とは、リガンドと標的タンパク質の活性中心との間の、ファン・デル・ワールス力または共有結合による複合体の形成を意味する。
【００２２】
スクリーニングとは、タンパク質高分子の特定の領域に選択的に反応する化学的構造物の集団の中で、化合物の集まり(set)を同定することを意味する。
【００２３】
位置修正(correct positioning)とは、リガンド−タンパク質複合体の最小の自由エネルギーに対応する位置にリガンドを置くために位置調整をすることである。
【００２４】
選択的リガンドとは、特定の標的タンパク質に特異的方法で結合しているリガンドを意味する。
【００２５】
検証(validation)とは、施されている系の質、および所与の標的タンパク質に確実に結合しているリガンドの任意の集まり(random set)からリガンドを選択する効率を評価する一連の計算および比較のやり法を意味する。
【００２６】
参照タンパク質とは、実験データを踏まえて、または施されている系の検証の際に、モデル計算（スコア）のパラメータを調整するために、若しくは、特定の阻害剤の結合特異性を評価するために用いられるタンパク質を意味する。
【００２７】
特異的に結合するリガンドとは、特定のタンパク質にのみ結合し、他のタンパク質には結合しないリガンドを意味する。
【００２８】
阻害剤とは、特定の標的タンパク質の活性中心に結合し、生化学反応の通常の進行を妨げるリガンドを意味する。
【００２９】
ドッキングとは、タンパク質の活性中心において、リガンドの位置を調整することを意味する。
【００３０】
スコアリングとは、リガンドをタンパク質に結合するために要する自由エネルギーを評価するため算出することを意味する。
【００３１】
結合自由エネルギー(ΔG binding)とは、リガンドを標的タンパク質に結合するのに要する、結果として生じる(resulting)自由エネルギーの（ＳＯＬソフトウェアを用いて）計算された正の変化値(calculation gain)を意味する。
【００３２】
Ｃ１〜Ｃ６アルキル基とは、炭素数が１から６の非分岐または分岐炭化水素鎖を含むアルキル基を意味する。例えば、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ‐ブチルなどが挙げられる。
【００３３】
Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基とは、炭素数が１から６の非分岐または分岐の炭化水素鎖を含むアルコキシ基を意味する。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ‐プロポキシ、イソプロポキシなどが挙げられる。
【００３４】
ハロゲンとは、塩素、臭素、ヨウ素あるいはフッ素を意味する。
【００３５】
薬理学的に許容される塩とは、毒性を呈したり、活性化合物の吸収および薬効を阻害する場合を除き、構造式（Ｉ）の活性化合物により作られた任意の塩を意味する。このような塩は、構造式（Ｉ）の化合物、および、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、メチルアミン、エチルアミンなどの有機または無機塩基との間の反応によって作られる。
【００３６】
溶媒和物とは、構造式（Ｉ）の活性化合物の結晶形態であり、その結晶格子が、水の分子、または構造式（Ｉ）の活性化合物が結晶化する他の溶媒の分子を含む結晶形態を意味する。
【００３７】
薬理学的に許容される担体とは、組成物の他の成分と混合可能で、受け手に害を及ぼさない、すなわち、その使用量や使用濃度において細胞または哺乳類に対して無毒でなければならない担体を意味する。しばしば、薬理学的に許容される担体は、水性のｐＨバッファー溶液である。生理学的(physiologically)に許容される担体として、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸塩、アスコルビン酸、低分子量（１０残基未満）のポリペプチドを含む抗酸化剤、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの単糖類、二糖類および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、並びに、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコールを基にした溶液などのバッファーが挙げられる。
【００３８】
治療有効量とは、哺乳類生物において、所望の程度のトロンビン阻害を達成するために必要な量を意味する。
【００３９】
ここで用いられる意味において、哺乳類は、霊長類（例えば、人間、類人猿、非類人猿およびより下等な猿）、捕食動物（例えば、猫、犬および熊）、げっ歯動物（例えば、マウス、ラットおよびリス）、食虫類（例えば、トガリネズミとモグラ）などを含む。
【００４０】
出願人が定めた実際の目的(practical task)は、一般構造式（Ｉ）の化合物、（その薬理学的に許容される塩または溶媒和物を含む）を、開発することによって達成される。
Ａ−Ｂ−Ｃ  （Ｉ）
式中、Ｃは、次の構造を含む群から選ばれる、
【００４１】
【化１】
2010531352.tif 000002
【００４２】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、互いに独立して、水素または、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｂは、−（ＣＨ２）ｎ−、ｎは１〜５の整数であり、Ａは、次の構造を含む群から選ばれる、
【００４３】
【化２】
2010531352.tif 000003
【００４４】
式中、Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、ＣＨ２ＮＲ１０Ｒ１１、およびＣＨ（ＣＨ３）ＮＲ１０Ｒ１１を含む群から選ばれ、
【００４５】
【化３】
2010531352.tif 000004
【００４６】
式中、Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素または、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基またはハロゲンであり、
Ｒ８は、水素または、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基であり、
Ｒ９は、次からなる群から選ばれる、
【００４７】
【化４】
2010531352.tif 000005
【００４８】
式中、Ｒ１０およびＲ１２は、互いに独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、（ＣＨ２）ｍＣＯＯＲ１３、および（ＣＨ２）ｍＣＯＮ（Ｒ１３）２からなる群から選ばれ、
【００４９】
【化５】
2010531352.tif 000006
【００５０】
式中、ｍは、１から４の整数であり、
Ｒ１３は、水素またはＣ１〜Ｃ６のアルキル基
Ｒ１１は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、またはＡｒ
Ａｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ハロゲン，Ｎ（Ｒ１３）２、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＲ１３、ＣＯＮ（Ｒ１３）２およびＳＯ２Ｒ１３の群から選ばれた１から５つの置換基をもつ、フェニル、ピリジル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、フラニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、インドリル、ベンゾフラニル、またはベンゾチオフェニルである。
次は、例外とする。
【００５１】
【化６】
2010531352.tif 000007
【００５２】
この羅列(List)から除かれた化合物は、既に知られており、特に、４−アミノ−ｌ−［３−［（２−メチルフェニル）アミノ］−３−オキソプロピル］ピリジニウムクロライドは、Journal of Medicinal Chemistry, 17(7), 739-744, 1974, in "Carbocyclic Derivatives Related to Indoraminに記載されており、４−アミノ−ｌ−（２−フェノキシエチル）−ピリジニウムブロマイドは、Journal of Organic Chemistry, 26, 2740-7, 1961, in "Application of Sodium Borohydride Reduction to Synthesis of Substituted Aminopiperidines, Aminopiperazines, Aminopyridines And Hydrazinesに記載されている。しかし、これらの出典が、記載された化合物がトロンビン阻害剤として使用できるかどうかに触れていないことは、特筆に値する。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様は、次の請求項１の化合物、および薬理学的に許容される塩または溶媒和物を記載する。
【００５４】
【化７】
2010531352.tif 000008
【００５５】
式中、Ｙは、水素、ハロゲン、ＣＯＯＲ１３、ＣＯＮ（Ｒ１３）２およびＳＯ２Ｒ１３からなる群から選ばれ、
ｒは、２から５の整数である。
【００５６】
本出願人は、構造式Ａ−Ｂ−Ｃの化合物、およびその薬理学的に許容される塩または溶媒和物が、トロンビンを阻害することができることを見出した。
【００５７】
従って、新規化合物およびその薬理学的に許容される塩または溶媒和物を、トロンビン阻害剤として実際に用いることができる。
【００５８】
トロンビン阻害剤として、実際の利用に向けて興味深くあり得る化合物、すなわち、顕著な阻害効果を示し得る化合物を、次のように選択する。我々は、一般構造式（Ｉ）で表わされる構造を中心とする仮想ライブラリーから、分子の三次元モデルを構築した。次の工程において、得られた構造を、トロンビン阻害剤の活性中心にドッキングし、トロンビン阻害剤の可能性のある分子構造から受け取ったドッキング結果を、最も見込みのあるもの、すなわち、−５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌより悪くない（ドッキング過程において測定された）スコアリング関数値を示す分子を選択するのに用いた。そのような分子に対して、ドッキング過程によって提案された位置調整の方法を想定した(visualized)。もし、これらの位置調整の方法が、活性トロンビン中心に結合する阻害剤についての上記の仮説を満たす場合、そのような分子を、「バーチャルヒット(virtual hits)」とみなし、合成および阻害活性の実験測定に向けて見込みのある分子として受け入れた。合成を始めるか否かは、推定される合成の複雑さを評価することにより最終的に決定された。
【００５９】
本発明のトロンビン阻害剤は、トロンビンの活性中心との効果的な反応について上記の要件を最適に満足する。式（Ｉ）の阻害剤の正に帯電した化学基Ｃは、アミノ酸残基Ａｓｐ１８９に塩架橋を形成しているポケットＳｌの底部に位置している。化学基Ｂは、ポケットＳｌの残りの空間を占め、ポケットの壁と最適な疏水性反応を可能にしている。式（Ｉ）の化学基Ａは、ポケットＳ２に位置し、下記のＲ基は、疏水性の断片であり、分子の別の部分に結合し、溶媒にさらされたリンカーは、ポケットＳ３に位置する。活性トロンビン中心に結合するという観点からすれば、リンカーは、親水性および疏水性の分子グループどちらでもあり得るが、有益な薬物動態特性を阻害剤分子に付与するために、疏水性リンカーを選択することで、阻害剤分子全体として疏水性性質をある程度バランスすることが望ましい。この目的からも、ポケットＳ３に位置する疏水性断片は、溶媒にさらされた側面において、ポケットに位置する疏水性残基で改変し得る。ここで述べたトロンビン阻害剤は、完全に上記の要件をみたす。
【００６０】
この請求範囲は、下に述べられる手順に従って、本発明のトロンビン阻害剤の活性トロンビン中心への選択的な位置調整（ドッキング）によって、明示されている。ドッキングは、阻害剤分子の全エネルギーの大域的最小化によって、達成される。全阻害剤エネルギーは、活性トロンビン中心に結合している阻害剤から成る配座での活性トロンビン中心における阻害剤の内部テンションエネルギー(internal tension energy)およびトロンビン場(thrombin field)における阻害剤エネルギーを含む。続いて、トロンビン場は、阻害剤との、静電、ファンデルワールス反応、並びにトロンビン分子の各部やリガンドの溶媒和および脱溶媒和により起こる多くの反応を促す。これらの反応は、数多くの文献で記述され、当分野の研究者に良く知られている。大域的最小化は、遺伝的（genetic）アルゴリズムを用いて、数回繰り返される。最小化プログラムは、この酵素の活性中心におけるトロンビン阻害剤の幾何学的位置調整、およびここに述べられたトロンビン阻害剤とトロンビン分子との複合体を形成するのに用いられた自由エネルギーの推定値としての役割をもつスコアリング関数値に結果としてとなる。ここに述べられた阻害剤において、スコアリング関数は、常に−５ｋｃａｌ／ｍｏｌより小さく、これは、マイクロモル以下の範囲の阻害定数と合致する。スコアリング関数を用いた予測の信頼性は、当分野の専門家の知られている様々な方法で検討することができる。具体的に、スコアリング関数値に基づいた任意の分子中での公知の活性トロンビン阻害剤の選択性を示す、いわゆるトロンビン阻害剤増強係数(enhancement coefficient)は、０．８５であり、これは、十分に信頼できる予測である証拠である。ここで述べた、阻害剤の幾何学的位置は、前記のドッキング手順により達成され、トロンビン阻害剤の活性トロンビン中心への結合の最適条件を満足し、その位置で、トロンビンにより触媒されるフィブリノゲンアミド分解反応に関して、阻害剤生来の阻害活性が示される。
【００６１】
特許権が請求された化合物は、有機化学の専門家に公知の一般的な方法で得ることができる。
【００６２】
生物の様々な病態(pathological conditions)の多くは、止血系において進行する障害に関連している。血栓塞栓性心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、肺動脈血栓塞栓症といった疾病で起こる血栓塞栓性の合併症は、世界中で、主な死因になっている。
【００６３】
本発明は、トロンビンに依存する血栓塞栓症（thromboembolic events）の治療および予防(prophylactic prevention)のための医薬組成物も含む。それは、請求項1の化合物、若しくは、その薬理学的に許容される塩または溶媒和物、および薬理学的に許容される担体の治療有効量を含む。
【００６４】
本発明の化合物は、血中に生体蓄積がおこるように、任意の適切なやり方で投与される。投与は、静脈、筋肉、皮内、皮下、また腹腔内注射といった非経口投与の方法でなされる。適切な組成物を経口で服用することによる、消化管を通した吸収など、他の投与方法も用いられ得る。使用が簡単なため、経口服用が好ましい。或いは、この薬剤は、膣および肛門筋肉組織を通して投与し得る。さらに、本発明の化合物は、皮膚を通して（例えば、経皮的に）注入、または、吸入することによって投与し得る。好適な投与方法は、患者の病状、年齢、感受性によることは、当然である。
【００６５】
経口服用用に、医薬組成品を、結合剤（例えば、解膠トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリジノンまたはヒドロキシプロピル  メチルセルロース）、賦形剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、トーク酸化物(talk oxide)あるいは酸化シリコン、ジャガイモデンプンまたはでんぷん質のグリコール酸ナトリウム）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬理学的に許容される添加物とともに、例えば、錠剤またはカプセル剤に包み込むことができる。錠剤を、コートしてもよい。液体経口組成物は、溶液、シロップ、または懸濁液の形に、調製することができる。そのような液体組成物は、懸濁剤（例えば、セルロース誘導体）、乳化剤（例えば、レシチン）、希釈剤（精製植物油）および保存料（例えば、メチルまたはプロピル−ｎ−ヒドロキシベンゾエート、ソルビン酸）などの薬理学的に許容される添加物を用いる一般的な方法により得ることができる。組成物は、また、適当な緩衝塩、香料、色素および甘味料も含み得る。
【００６６】
これら組成物中の活性成分の含有量は、組成物重量の０．１％から９９．９％の間にわたり、好ましくは、５％から９０％である。
【００６７】
これらトロンビン阻害剤の毒性を、実験動物で、標準的な製薬学的手順を用い、ＬＤ５０（個体群の５０％に対する致死量）で測定した。本発明の好ましい化合物に対して、ＬＤ５０量は、３６７ｍｇ／ｋｇを超えており、これは、臨床試験を終えたアルガトロバン（ＬＤ５０＝４７５ｍｇ／ｋｇ）の致死量と矛盾がない(consistent)。
【００６８】
本発明の主題を、より理解可能にするように、次に、新規化合物およびその合成の中間生成物である材料の合成を説明するいくつかの例を、発明として請求された新規化合物の抗血栓症活性を検討するのに用いられた方法の説明とともに示す。
【００６９】
実施例は、例示であり、本発明の発想(idea)を下記の例の範囲に制限するものではない。
【００７０】
実施例１
中間生成物である３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェノールの合成
【００７１】
【化８】
2010531352.tif 000009
【００７２】
３．８ｇ（２７ｍｍｏｌ）のオルシン水和物、４．８ｇ（３０ｍｍｏｌ）の１−ブロモ−３−クロロプロパンおよび４．０ｇ（２９ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムの混合物を、３０ｍｌのアセトニトリル中で攪拌しながら３６時間、煮沸した。次に、この反応混合物を蒸発し、３０ｍｌのエーテルに溶解し、１５ｍｌの炭酸カリウムの飽和溶液で２回洗った。水層を捨て、エーテル層を、１５ｍｌの１０％水酸化ナトリウム溶液で、３回抽出した。エーテル層を捨て、水層を注意深く濃ＨＣｌで酸性にし、１５ｍｌのエステルで３回抽出した。エーテル抽出物を合わせ、少量の炭酸水素ナトリウムの飽和溶液で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥し，約３分の１体積部のヘキサンで希釈し、シリカゲルの層を通してろ過した。蒸発することにより、１．７ｇの黄色の油、約７０％のオルシン（Ｒｆ０．１０）および約３０％の３−（２−クロロプロポキシ）−５−メチルフェノール（Ｒｆ０．２６、収量  約１．２ｇ（純粋な基質あたり(per pure substance)２２％）の混合物を得た。
【００７３】
同様の方法を用いて、オルシン水和物およびｌ−ブロモ−２−クロロエタンから３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェノール（Ｒｆ０．２６、収量約１．１ｇ（純粋な基質あたり(per pure substance)２０％）を生成し、オルシン水和物およびｌ−ブロモ−４−クロロブタンから３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェノールを得た。
【００７４】
実施例２
中間生成物であるベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステルの合成
【００７５】
【化９】
2010531352.tif 000010
【００７６】
３ｇ（１７ｍｍｏｌ）のベンゼンスルホクロライドおよび２ｇ（２０ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを、３０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に１．６ｇの上の例の混合物の溶液に加えた。混合物を７時間攪拌し、トリエチルアミン塩酸塩の沈澱をろ過して除き、蒸発させた。得られた油を、２０ｍｌのエーテルに溶解し、１０ｍｌの１０−１２％アンモニア水溶液で数回洗い、過剰な未反応ベンゼンベンゼンスルホクロライドを分離し（薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってコントロール）、次に、１０ｍｌの約２０％の塩酸で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発することにより、（ＴＬＣに照らして）ほぼ同量のベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル（Ｒｆ０．３６）とオルシンのジベンゾイルスルホン酸エステル（Ｒｆ０．２５）を含む黄色の油を１．９４ｇ得た。
【００７７】
同様にして、３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェノール、３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェノール、および３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェノール並びに適当なアリルスルホクロリドから、次を得た。
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル（純粋な基質あたり(per pure substance)７７％）、
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル（８８％）、
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル（５６％）、
ベンゼンスルホン酸の３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（７２％）、
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（３５％）、
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（３４％）、
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（３７％）、
ベンゼンスルホン酸の３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェニルエステル（４５％）、
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェニルエステル（２７％）、
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェニルエステル（３２％）、
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェニルエステル（２１％）を、生成した。
【００７８】
実施例３
中間生成物である２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（３−ヨードプロポキシ）−５−メチルフェニルエステルの合成
【００７９】
【化１０】
2010531352.tif 000011
【００８０】
２ｇ（１３ｍｍｏｌ）のか焼(calcined)ヨウ化ナトリウムを、上記の例と同様に生成した２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステルを３０ｍｌの乾燥アセトン中に含む混合物２．６ｇに加え、４８時間煮沸した。次に、この反応混合物を、１０ｍｌのヘキサンに希釈し、蒸発した。その結果、ベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（Ｒｆ０．３５）および個別の(respective)オルシンのジベンゾイルスルホン酸エステル（Ｒｆ０．２５）を含む淡黄色の油を、２．４５ｇ得た。
【００８１】
同様の技法を用いて、適当な塩化物を、
ベンゼンスルホン酸の３−（３−ヨードプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（３−ヨードプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（３−ヨードプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル
ベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル
ベンゼンスルホン酸の３−（４−ヨードブトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（４−ヨードブトキシ）−５−メチルフェニル  エステル
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（４−ヨードブトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（４−ヨードブトキシ）−５−メチルフェニルエステル
に加工した。
【００８２】
実施例４
４−アミノ−ｌ−（３−（３−メチル−５−（２−クロロベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル）−ピリジニウムイオダイド（ＨＣ＿０２３ｓ＿ＩＯＣ）の合成
【００８３】
【化１１】
2010531352.tif 000012
【００８４】
１０ｍｌの乾燥ジオキサン中に、０．５５ｇの（前記の実施例からの）「未加工のヨウ化物(raw iodide)」（７０％の活性物質に対して計算）と０．０８ｇ（０．８５ｍｍｏｌ）の４−アミノピリジンを混ぜたものを、２０時間、煮沸した。混合物を冷却した後、溶液を蒸発し、得られた油を、固体になるまで、少量のエーテルで砕いた。固体沈澱をろ過し、ジオキサンとアセトニトリル（５：１）の混合物から、二度再結晶した。塩沈澱を、ろ過で取り、エステルで洗った。
真空乾燥することにより、０．３５ｇ（６５％）白い塩を得た。
【００８５】
【数１】
2010531352.tif 000013
【００８６】
同様の技法を用いて、適当なヨウ化物および複素環式化合物、チオ尿素およびチオ尿素誘導体を加工して、次を得た。
４−アミノ−１−（３−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル）−ピリジニウムイオダイド（ＨＣ＿０１６ｓ＿ＩＯＣ）
【００８７】
【化１２】
2010531352.tif 000014
【００８８】
【数２】
2010531352.tif 000015
【００８９】
２−アミノ−１−（３−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル）−チアゾリウムイオダイド（ＨＣ＿０１７ｓ＿ＩＯＣ）
【００９０】
【化１３】
2010531352.tif 000016
【００９１】
【数３】
2010531352.tif 000017
【００９２】
３−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル−イソチオウロニウムイオダイド（ＨＣ＿０１８ｓ＿ＩＯＣ）
【００９３】
【化１４】
2010531352.tif 000018
【００９４】
【数４】
2010531352.tif 000019
【００９５】
４−アミノ−１−（２−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）エチル）−ピリジニウムイオダイド（ＨＣ＿０１９ｓ＿ＩＯＣ）
【００９６】
【化１５】
2010531352.tif 000020
【００９７】
【数５】
2010531352.tif 000021
【００９８】
２−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）エチル−イソチオウロニウムイオダイド（ＨＣ＿０２０ｓ＿ＩＯＣ）
【００９９】
【化１６】
2010531352.tif 000022
【０１００】
【数６】
2010531352.tif 000023
【０１０１】
２−（３−メチル−５−（２−クロロベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）エチル−イソチオウロニウムイオダイド（ＨＣ＿０２４ｓ＿ＩＯＣ）
【０１０２】
【化１７】
2010531352.tif 000024
【０１０３】
【数７】
2010531352.tif 000025
【０１０４】
３−（３−メチル−５−（２−クロロベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル−イソチオウロニウムイオダイド（ＨＣ＿０２６ｓ＿ＩＯＣ）
【０１０５】
【化１８】
2010531352.tif 000026
【０１０６】
【数８】
2010531352.tif 000027
【０１０７】
４−アミノ−１−（２−（３−メチル−５−（２−クロロベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）エチル）−ピリジニウムイオダイド（ＨＣ＿０２５ｓ＿ＩＯＣ）
【０１０８】
【化１９】
2010531352.tif 000028
【０１０９】
【数９】
2010531352.tif 000029
【０１１０】
同様の方法で、実施例１〜４に記載の技法によって、様々なアリールスルホニル塩化物および複素環式スルホニル塩化物から、化合物を合成した。合成した化合物の化学式、質量分析パラメーター、および算出したスコアリング関数を表２に示す。それら化合物は、ヨウ化物、臭化物、塩化物、または他の塩の形で得られる可能性がある。
【０１１１】
実施例５
化合物の合成
【０１１２】
【化２０】
2010531352.tif 000030
【０１１３】
１．４−クロロ−３−ニトロベンゼン−１−スルホニルクロライド
ｏ−ニトロクロロアニリン（１５ｇ）を３０ｍｌのクロロスルホン酸に攪拌しながら加え、１００°Ｃで２時間加熱した。引き続き、１１０°Ｃで２時間、さらに、１２７°Ｃで５時間加熱した。反応混合物を、室温まで冷却し、砕いた氷（１４０ｇ）に注いだ。沈澱をろ過し、ろ過ケーキを氷水で洗い、風乾した。収穫物は、１５ｇの４  クロロ−３−ニトロベンゼン−１  スルホニルクロライドであった。
２．４−クロロ−Ｎ−メチル−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミド
【０１１４】
【化２１】
2010531352.tif 000031
【０１１５】
４−クロロ−３−ニトロベンゼン−ｌ−スルホニルクロライド（１０．６ｇ、０．０４１ｍｏｌ）を、トルエン（５０ｍｌ）に溶解し、次いで、トリエチルアミン（４．１４ｇ、０．０４１ｍｏｌ）を加えた。得られた溶液に、Ｎ−メチルアニリン（４．４ｇ、０．０４１ｍｏｌ）を攪拌しながら加えた。反応混合物を７０〜８０°Ｃで１時間、インキュベートした後、冷却した。冷した溶液を、３０ｍｌの水で２回洗い、真空下で濃縮した。残留物を、エタノールから再結晶化した。４−クロロ−Ｎ−メチル−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゼン  スルホンアミドの収量は、９．４ｇ（６１％）であった。
３．Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミド
【０１１６】
【化２２】
2010531352.tif 000032
【０１１７】
４−クロロ−Ｎ−メチル−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゾイルスルホンアミド（９．４ｇ、０．０２９ｍｏｌ）のエタノール溶液（５０ｍｌ）を、２５ｍｌの４０％メチルアミン水溶液と混ぜた。反応混合物を、７０°Ｃに熱し、この温度で１時間攪拌した。冷却、ろ過した後、ろ過ケーキをエタノールで洗い、６０°Ｃで乾燥した。Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゾイルスルホンアミドの収量は、９．０ｇ（９７％）であった。
４．３−アミノ−Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミド
【０１１８】
【化２３】
2010531352.tif 000033
【０１１９】
Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゾイルスルホンアミド（９ｇ、０．０２８ｍｏｌ）をイソプロパノール（９０ｍｌ）に溶解した。この溶液に、ヒドラジン水和物（１１ｍｌ）、活性炭（２ｇ）およびＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ（１０ｍｌのエタノール中に、０．５  ｇ）を加えた。反応混合物を、８時間煮沸した。炭(charcoal)を、ろ過して除いた。ろ液を、蒸発乾固した。３−アミノ−Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミドの収量は、８．１ｇ（９９％）であった。
５．３−クロロ−Ｎ−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニル）プロパンアミド
【０１２０】
【化２４】
2010531352.tif 000034
【０１２１】
氷上で冷やした（〜５°Ｃ）、３−アミノ−Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミド（５．４ｇ、０．０１８ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．８１ｇ、０．０１８ｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１６ｍｌ）溶液に、クロロプロピオニルクロライド（２．３２ｇ、０．０１８ｍｏｌ）を加えた。室温で、５時間、攪拌しながら反応した。その後すぐに、水（１４ｍｌ）とアセトニトリル（５ｍｌ）を、５時間加えた。生じた沈澱をろ過した。３−クロロ−Ｎ−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニル）プロパンアミドの収量は、３．１ｇ（４５％）であった。
６．４−アミノ−１−（３−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）ピリジニウムクロライド
【０１２２】
【化２５】
2010531352.tif 000035
【０１２３】
３−クロロ−Ｎ−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニル）プロパンアミド（１ｇ、０．００２６ｍｏｌ）および４−アミノピリジニウム（０．７３ｇ、０．００７８ｍｏｌ）を、無水アセトン（５０ｍｌ）中で５０時間、煮沸した。残留物をろ過し、アセトニトリルとエタノールを１０：１で混合したものから、結晶化した。
４−アミノ−１−（３−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）ピリジニウムクロライドの収量は、０，５４ｇ（４３％）であった。
７．４−アミノ−１−（２−（１−メチル−５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）エチル）ピリジニウムクロライド
【０１２４】
【化２６】
2010531352.tif 000036
【０１２５】
アセトニトリル（８ｍｌ）に４−アミノ−ｌ−（３−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）ピリジニウムクロライド（０．２ｇ、０．０００４２ｍｏｌ）を入れた懸濁液に、塩化チオニル（０．２ｍｌ）を加えた。反応混合物を１０分間煮沸した後、室温で２４時間放置し、ジエチルエーテル（８ｍｌ）で希釈した。生じた沈澱を、ろ過して回収し、アセトニトリルと無水エタノールを１０：１で混合したものから、結晶化した。４−アミノ−ｌ−（２−（ｌ−メチル−５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−ｌＨ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）エチル）ピリジニウムクロライドの収量は、０，０５５ｇ（２６％）であった。
【０１２６】
同様にして、実施例５に記載の技法によって、様々な化合物を合成した。それらの化学式、質量分析のパラメーター、および算出したスコアリング関数を表３に示す。化合物は、ヨウ化物、臭化物、塩化物、その他の塩の形で得られる可能性がある。
【０１２７】
実施例６
試験化合物のトロンビン活性に対する効果の検討
合成物質のトロンビン活性への効果を、これら化合物が存在する水性バッファー溶液および存在しない水性バッファー溶液中で、トロンビンの特異的低分子量物質の加水分解速度を測定することにより、検討した。そのような物質のひとつは、発色物質クロモザイム(Chromozim)ＴＨ（ＣＴＨ）：Ｎ−（ｐ−Ｔｏｓｙｌ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ[Sonder SA, Fenton JW 2nd. Thrombin Specificity with Tripeptide Chromogenic Substrates: Comparison of Human and Bovine Thrombins with and without Fibrinogen Clotting Activities. Clin. Chem., 1986, 32(6):934-937]であった。多くの実験で用いられた他の基質は、蛍光物質ＢＯＣ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｓ）（式中、ＢＯＣは、ブトキシカルボニル残基を、ＡＭＣは、７−アミノ−４−アリールメチルクマリルを表す）[Kawabata S, Miura T, Morita T, Kato H, Fujikawa K, Ivanaga S, Takada K, Kimura T, Sakakibara S. Highly Sensitive peptide-4-methylcoumaryl-7-amide Substrates for Blood-Clotting Proteases and Trypsin. Eur. J. Biochem., 1988, 172(1): 17- 25] であった。
【０１２８】
１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．１％ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝６，０００）を含むｐＨ８．０のバッファーを、一般的な９６穴ボード（ｂｏａｒｄ）の穴部に入れた。基質（穴部における最終濃度１００ｍｃＭ）、トロンビン（最終濃度１９０ｐＭ）、および異なる濃度（０．００２ｍＭ〜３．３ｍＭ）の試験化合物（提案されたトロンビン阻害剤）を加えた。発色物質を用いた場合、有色の反応産物（パラニトロアニリン）の蓄積を、分光光度Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  プレートリーダー(board reader)（サーモマックス(Thermomax)、米国）で観察し、波長４０５ｎｍでの光学濃度の増加を測定した。蛍光物質の場合、トロンビンは、加水分解中に、  遊離した形で著しく蛍光を発するアミノメチルクマリルを切り離す（励起波長３８０ｎｍおよび放出波長４４０ｎｍ）。反応動態は、蛍光分析Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎプレートリーダー(board reader)（ＬａｂＳｙｓｔｅｍ，  フィンランド）で記録される。
【０１２９】
初期反応速度は、直線区間（記録開始から１０分〜１５分）の反応速度曲線傾斜角度の正接として測定する。阻害剤が無い場合の反応速度を１００％とした。２つの独立した測定の平均算術値を、最終結果として使用した。
【０１３０】
図１は、様々な濃度の化合物ＨＣ−０１９ｓ−ＩＯＣ（表４を参照のこと）がある場合のトロンビンの効果のあるもとでの発色物質クロモザイム（Chromozim）ＴＨ（ＣＴＨ）に対する、特徴ある動態(kinetic)加水分解曲線の例を示す。阻害剤がない場合の速度論的加水分解曲を、コントロールとして用いた。
【０１３１】
図２は、ＣＴＨ加水分解阻害の程度と、非常に効果的なトロンビン阻害剤である、新規に合成された他の化合物（ＨＣ−０１８ｓ−ＩＯＣ）の系内での濃度との関係を示す（表４を参照のこと）。
多数の新規に合成された化合物のトロンビン活性への阻害効果の程度に関するデータを、表４に示す。
従って、上記にように得られた結果は、新規に合成した化合物のすべてが、直接トロンビン阻害剤であることを示す。阻害の程度は、個々の化合物によって異なるが、新規化合物の大部分は、非常に効果的なトロンビン阻害剤であり、トロンビンに依存する血栓塞栓性症状を制御するのに用いる医薬組成品の基材として使用するにも、研究用に使用するにも適している。
【０１３２】
【表１−１】
2010531352.tif 000037
【０１３３】
【表１−２】
2010531352.tif 000038
【０１３４】
【表１−３】
2010531352.tif 000039
【０１３５】
【表１−４】
2010531352.tif 000040
【０１３６】
【表１−５】
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【０１３７】
【表１−６】
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【０１３８】
【表１−７】
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【０１３９】
【表１−８】
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【０１４０】
【表１−９】
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【０１４１】
【表１−１０】
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【０１４２】
【表１−１１】
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【０１４３】
【表１−１２】
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【０１４４】
【表１−１３】
2010531352.tif 000049
【０１４５】
【表１−１４】
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【０１４６】
【表１−１５】
2010531352.tif 000051
【０１４７】
【表２−１】
2010531352.tif 000052
【０１４８】
【表２−２】
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【０１４９】
【表２−３】
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【０１５０】
【表２−４】
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【０１５１】
【表２−５】
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【０１５２】
【表３−１】
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【０１５３】
【表３−２】
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【０１５４】
【表４−１】
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【０１５５】
【表４−２】
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【０１５６】
【表４−３】
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【０１５７】
【表４−４】
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【０１５８】
【表４−５】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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