(57)【要約】  本発明は、細胞中の望ましい標的遺伝子からの遺伝子産物の発現を選択的に減少させるための、並びに、遺伝子の発現によって引き起こされる疾患の治療のための、組成物および方法を対象とする。より詳細には、本発明は、真核細胞において標的遺伝子の発現を減少させることができる、二本鎖RNA（“dsRNA”）を含む組成物、およびそれらを調製する方法を対象とする。dsRNAは、長さが25から約30ヌクレオチドの間の第一オリゴヌクレオチド配列、および、生物学的条件下で第一配列にアニーリングする第二オリゴヌクレオチド配列を有する。さらに、少なくとも長さ19ヌクレオチドの配列を有するdsRNAの配列の一方の領域は、標的遺伝子から産生されるRNAのヌクレオチド配列と十分に相補的であり、RNAi機構によって標的RNAの分解を誘導する。【選択図】なし
2010525813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さ25-30ヌクレオチドで、そして3'末端及び5'末端を有する、第一オリゴヌクレオチド鎖；および、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして
第二オリゴヌクレオチド鎖が長さ1-4ヌクレオチドの3'突出部をもち、前記第二ヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であって、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項２】
前記3'突出部の前記ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項３】
前記第一鎖および前記第二鎖のそれぞれが、少なくとも26、および多くとも30ヌクレオチドの長さを有する、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項４】
第一オリゴヌクレオチド鎖の前記3'末端の位置1が、デオキシリボヌクレオチドである、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項５】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖の前記3'末端の位置1および2がデオキシリボヌクレオチドである、請求項3の単離された二本鎖核酸。
【請求項６】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖の前記修飾ヌクレオチドが2'-O-メチルリボヌクレオチドである、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項７】
前記3'突出部の前記修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチルリボヌクレオチドである、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項８】
前記3'突出部のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項９】
第一オリゴヌクレオチド鎖および第二オリゴヌクレオチド鎖の一方または両方が5'リン酸を含む、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１０】
前記修飾ヌクレオチド残基が、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2 '-アリル、2'-O-[2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル]、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-（CH2）2-O-2'-架橋、2'-LNA、2'-アミノ、および2'-O-（N-メチルカルバメート）からなる群より選択される、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１１】
前記3'突出部が長さ1〜3ヌクレオチドである、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１２】
前記3'突出部が長さ1〜2ヌクレオチドである、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１３】
前記3'突出部が長さ2ヌクレオチドであり、そして、前記3'突出部の前記修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１４】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の位置20から5'末端までのすべての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１５】
前記第一鎖のヌクレオチド鎖および第二鎖のヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド残基の相対的長さが、第二鎖の長さが26〜29ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが25ヌクレオチド残基、第二鎖の長さが27〜30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが26ヌクレオチド残基、第二鎖の長さが28〜30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが27ヌクレオチド残基、第二鎖の長さが29〜30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが28ヌクレオチド残基、および第二鎖の長さが30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが29ヌクレオチド残基からなる群から選択される、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１６】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞においてダイサーによって内因的に切断される、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１７】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞において内因的に切断され、標的遺伝子発現を減少させる19〜23ヌクレオチドの範囲の長さの二本鎖核酸を産生する、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１８】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞において、in vitroで、少なくとも10％、少なくとも50％、および少なくとも80〜90％からなる群より選択される量（％によって表現される）によって、標的遺伝子の発現を減少させる、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項１９】
前記3'突出部が長さ2ヌクレオチドであり、かつ、前記3'突出部の前記修飾ヌクレオチドが2'-O-メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項２０】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞においてin vitroで、少なくとも10％、少なくとも50％、および少なくとも80〜90％からなる群より選択される量（％によって表現される）で導入される場合、前記二本鎖核酸が標的遺伝子の発現を減少させるのに効果的な量で存在し、そして、細胞の環境において、1ナノモルまたはそれ以下の効果的な濃度で、in vitroで哺乳類細胞でアッセイされた場合、標的遺伝子発現を減少させる点において、前記標的RNAの少なくとも19ヌクレオチドと同一なものを対象とする単離された21 mer siRNAよりも、高い有効性を前記二本鎖核酸が有する、請求項1の単離された二本鎖核酸を含む配合物。
【請求項２１】
前記細胞の環境において、前記効果的な量が、1ナノモルまたはそれ以下、200ピコモルまたはそれ以下、および、50ピコモルまたはそれ以下からなる群から選択される、請求項20の配合物。
【請求項２２】
前記二本鎖核酸が、少なくとも10％、少なくとも50％、および少なくとも80〜90％からなる群より選択される量（％によって表現される）で哺乳類の被験体の細胞に導入される場合、前記二本鎖核酸が標的遺伝子の発現を減少させるのに効果的な量で存在し、そして、細胞の環境において、1ナノモルまたはそれ以下の効果的な濃度で、in vitroで哺乳類細胞でアッセイされた場合、標的遺伝子発現を減少させる点において、前記標的RNAの少なくとも19ヌクレオチドと同一なものを対象とする単離された21 mer siRNAよりも、高い有効性を前記二本鎖核酸が有する、請求項1の単離された二本鎖核酸を含む配合物。
【請求項２３】
前記効果的な量が、1日あたり前記被験体のキログラムあたり1マイクログラム〜5ミリグラム、キログラムあたり100マイクログラム〜0.5ミリグラム、キログラムあたり0.001〜0.25ミリグラム、キログラムあたり0.01〜20マイクログラム、キログラムあたり0.01〜10マイクログラム、キログラムあたり0.10〜5マイクログラム、および、キログラムあたり0.1〜2.5マイクログラム、からなる群から選択される用量である、請求項22の配合物。
【請求項２４】
第一鎖および第二鎖が化学的リンカーによって結合された、請求項1の単離された二本鎖核酸。
【請求項２５】
前記第一鎖の前記3'末端および前記第二鎖の前記5'末端が、化学的リンカーによって結合された、請求項24の単離された二本鎖核酸。
【請求項２６】
請求項1の単離された二本鎖核酸を含む、哺乳類細胞。
【請求項２７】
請求項1の単離された二本鎖核酸および薬学的に許容可能な担体を含む、薬剤組成物。
【請求項２８】
請求項1の単離された二本鎖核酸を哺乳類細胞に、前記哺乳類細胞中の標的遺伝子の発現を減少させるために十分な量で導入することを含む、哺乳類細胞において、標的遺伝子の発現を減少させる方法。
【請求項２９】
細胞の環境において、1ナノモルまたはそれ以下の効果的な濃度で、in vitroで哺乳類細胞でアッセイされた場合、標的遺伝子発現を減少させる点において、前記標的RNAの少なくとも19ヌクレオチドと同一なものを対象とする単離された21 mer siRNAよりも、高い有効性を前記単離された二本鎖核酸が有する、請求項28の方法。
【請求項３０】
減衰させる標的遺伝子を同定すること；前記標的遺伝子に対する請求項1の単離された二本鎖核酸を合成すること；および、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、前記哺乳類細胞に前記二本鎖核酸を導入すること；を含む、前記哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項３１】
標的配列が少なくとも19ヌクレオチドを含む、標的遺伝子のRNAの標的配列を選択すること；および、請求項1または12の前記第一オリゴヌクレオド鎖および前記第二オリゴヌクレオド鎖を合成すること；を含む、1の単離された二本鎖核酸を調製する方法。
【請求項３２】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖が、前記3'末端の最後および最後から2番目のヌクレオチドとして2つのデオキシヌクレオチド残基を含む、31の方法。
【請求項３３】
3'末端及び5'末端を有する長さ25-30ヌクレオチドの第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ25-30ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖
を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二ヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項３４】
前記第一鎖および前記第二鎖のそれぞれが、少なくとも26かつ多くとも30ヌクレオチドの長さを有する、請求項33の単離された二本鎖核酸。
【請求項３５】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、位置1、3、5、7、9、11、13、15、および17のそれぞれが修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項33の単離された二本鎖核酸。
【請求項３６】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、さらに位置18から前記第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端までのすべての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項34の単離された二本鎖核酸。
【請求項３７】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19のそれぞれが修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項33の単離された二本鎖核酸。
【請求項３８】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、さらに位置20から前記第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端までのすべての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項37の単離された二本鎖核酸。
【請求項３９】
3'末端及び5'末端を有する長さ25-30ヌクレオチドの第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ25-30ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基（位置1）から始めて、位置1〜17は少なくとも6つの修飾ヌクレオチド残基を含み、かつ、位置18から前記第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端までのすべての位置は非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項４０】
3'末端及び5'末端を有する長さ25-30ヌクレオチドの第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ25-30ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基（位置1）から始めて、位置1〜19は少なくとも6つの修飾ヌクレオチド残基を含み、かつ、位置20から前記第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端までのすべての位置は非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項４１】
3'末端及び5'末端を有する長さ25-30ヌクレオチドの第一オリゴヌクレオチド鎖；および第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖の3'末端における第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17および19のそれぞれが修飾リボヌクレオチドを含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる、長さ27-30ヌクレオチドで、かつ、前記第一オリゴヌクレオチド鎖が前記第二オリゴヌクレオチド鎖とハイブリッドを形成する場合、前記3'末端に2〜4ヌクレオチドの突出部を含む；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項４２】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖の前記修飾リボヌクレオチドが、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-[2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル]、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-（CH2）2-O-2'-架橋、2'-LNA、2'-アミノ、および2'-O-（N-メチルカルバメート）からなる群より選択される、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項４３】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖の前記修飾リボヌクレオチドが、2'-O-メチルリボヌクレオチドを含む、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項４４】
第一オリゴヌクレオチド鎖および第二オリゴヌクレオチド鎖の一方または両方が5'リン酸を含む、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項４５】
前記第一鎖および第二鎖のそれぞれが、少なくとも26かつ多くとも30ヌクレオチドの長さを有する、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項４６】
第一オリゴヌクレオチド鎖の前記3'末端の位置1がデオキシリボヌクレオチドである、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項４７】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖の前記3'末端の位置1および2がデオキシリボヌクレオチドである、請求項46の単離された二本鎖核酸。
【請求項４８】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖の前記修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチルリボヌクレオチドである、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項４９】
前記3'突出部の前記修飾ヌクレオチドが2'-O-メチルリボヌクレオチドである、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５０】
前記3'突出部のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５１】
第一オリゴヌクレオチド鎖および第二オリゴヌクレオチド鎖の一方または両方が5'リン酸を含む、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５２】
前記修飾ヌクレオチド残基が、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-[2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル]、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-（CH2）2-O-2'-架橋、2'-LNA、2'-アミノ、および2'-O-（N-メチルカルバメート）からなる群より選択される、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５３】
前記3'突出部の長さが1〜3ヌクレオチドである、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５４】
前記3'突出部の長さが1〜2ヌクレオチドオである、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５５】
前記3'突出部の長さが2ヌクレオチドであり、そして、前記3'突出部の前記修飾ヌクレオチドが2'-O-メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５６】
前記第一鎖および第二鎖のヌクレオチド残基における相対的長さが、第二鎖の長さが26〜29ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが25ヌクレオチド残基、第二鎖の長さが27〜30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが26ヌクレオチド残基、第二鎖の長さが28〜30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが27ヌクレオチド残基、第二鎖の長さが29〜30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが28ヌクレオチド残基、および第二鎖の長さが30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが29ヌクレオチド残基からなる群から選択される、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５７】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞においてダイサーによって内因的に切断される、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５８】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞において内因的に切断され、標的遺伝子発現を減少させる19〜23ヌクレオチドの範囲の長さの二本鎖核酸を産生する、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項５９】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞において、in vitroで、少なくとも10％、少なくとも50％、および少なくとも80〜90％からなる群より選択される量（％によって表現される）によって、標的遺伝子の発現を減少させる、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項６０】
請求項41の単離された二本鎖核酸を哺乳類細胞に、前記哺乳類細胞中の標的遺伝子の発現を減少させるために十分な量で導入することを含む、哺乳類細胞において、標的遺伝子の発現を減少させる方法。
【請求項６１】
細胞の環境において、1ナノモルまたはそれ以下の効果的な濃度で、in vitroで哺乳類細胞でアッセイされた場合、標的遺伝子発現を減少させる点において、前記標的RNAの少なくとも19ヌクレオチドと同一なものを対象とする単離された21 mer siRNAよりも、高い有効性を前記単離された二本鎖核酸が有する、請求項60の方法。
【請求項６２】
減衰させる標的遺伝子を同定すること；前記標的遺伝子に対する請求項41の単離された二本鎖核酸を合成すること；および、哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、前記哺乳類細胞に前記二本鎖核酸を導入すること；を含む、前記哺乳類細胞において標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項６３】
標的配列が少なくとも19ヌクレオチドを含む、標的遺伝子のRNAの標的配列を選択すること；および、請求項1または請求項12の前記第一オリゴヌクレオド鎖および前記第二オリゴヌクレオド鎖を合成すること；を含む、請求項41の単離された二本鎖核酸を調製する方法。
【請求項６４】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖が、前記3'末端の最後および最後から2番目のヌクレオチドとして2つのデオキシヌクレオチド残基を含む、請求項77の方法。
【請求項６５】
請求項41の単離された二本鎖核酸を含む哺乳類細胞。
【請求項６６】
薬学的に許容可能な担体と合わせた、請求項41の単離された二本鎖核酸。
【請求項６７】
長さ25-30ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ25-30ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項６８】
前記第一鎖および前記第二鎖のそれぞれが、少なくとも26かつ多くとも30ヌクレオチドの長さを有する、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項６９】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な、前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、位置1、3、5、7、9、11、13、15、および17のそれぞれが修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項７０】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、さらに位置18から前記第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端までのすべての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項69の単離された二本鎖核酸。
【請求項７１】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19のそれぞれが修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項７２】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、前記第一オリゴヌクレオチド鎖の5'末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第二鎖のヌクレオチド残基から始めて、さらに位置20から前記第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端までのすべての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項71の単離された二本鎖核酸。
【請求項７３】
第一オリゴヌクレオチド鎖の前記3'末端の位置1がデオキシリボヌクレオチドである、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項７４】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖の前記3'末端の位置1および2がデオキシリボヌクレオチドである、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項７５】
前記第一オリゴヌクレオチド鎖の前記修飾ヌクレオチドが、2'-O-メチルリボヌクレオチドである、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項７６】
第一オリゴヌクレオチド鎖および第二オリゴヌクレオチド鎖の一方または両方が5'リン酸を含む、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項７７】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖の前記修飾ヌクレオチド残基が、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-[2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル]、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-（CH2）2-O-2'-架橋、2'-LNA、2'-アミノ、および2'-O-（N-メチルカルバメート）からなる群より選択される、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項７８】
前記第二オリゴヌクレオチド鎖が、長さ1〜4ヌクレオチドの3'突出部を有し、そして、前記3'突出部の前記ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項７９】
前記突出部の長さが1〜2ヌクレオチドである、請求項78の単離された二本鎖核酸。
【請求項８０】
前記突出部の長さが2ヌクレオチドであり、そして、前記修飾ヌクレオチド残基が2'-O-メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項78の単離された二本鎖核酸。
【請求項８１】
前記第一鎖および第二鎖のヌクレオチド残基における相対的長さが、第二鎖の長さが26〜29ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが25ヌクレオチド残基、第二鎖の長さが27〜30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが26ヌクレオチド残基、第二鎖の長さが28〜30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが27ヌクレオチド残基、第二鎖の長さが29〜30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが28ヌクレオチド残基、および第二鎖の長さが30ヌクレオチド残基かつ第一鎖の長さが29ヌクレオチド残基からなる群から選択される、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項８２】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞においてダイサーによって内因的に切断される、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項８３】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞において内因的に切断され、標的遺伝子発現を減少させる19〜23ヌクレオチドの範囲の長さの二本鎖核酸を産生する、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項８４】
前記二本鎖核酸が、哺乳類細胞において、in vitroで、少なくとも10％、少なくとも50％、および少なくとも80〜90％からなる群より選択される量（％によって表現される）によって、標的遺伝子の発現を減少させる、請求項67の単離された二本鎖核酸。
【請求項８５】
長さ25ヌクレオチドで、3'末端及び5'末端を有する、第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ27ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖が長さ2ヌクレオチドの3'突出部をもち、そして、第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17および19のそれぞれが修飾リボヌクレオチドを含む、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項８６】
第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26および27のそれぞれが、非修飾リボヌクレオチドを含む、請求項85の単離された二本鎖核酸。
【請求項８７】
長さ25ヌクレオチドで、3'末端及び5'末端を有する、第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ27ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖が長さ2ヌクレオチドの3'突出部をもち、そして、第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19および21のそれぞれが修飾リボヌクレオチドを含む、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項８８】
第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、23、24、25、26および27のそれぞれが、非修飾リボヌクレオチドを含む、請求項87の単離された二本鎖核酸。
【請求項８９】
長さ25ヌクレオチドで、3'末端及び5'末端を有する、第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ27ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖が長さ2ヌクレオチドの3'突出部をもち、そして、第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25および27のそれぞれが修飾リボヌクレオチドを含む、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項９０】
第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24および26のそれぞれが、非修飾リボヌクレオチドを含む、請求項89の単離された二本鎖核酸。
【請求項９１】
長さ25ヌクレオチドで、3'末端及び5'末端を有する、第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ27ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖が長さ2ヌクレオチドの3'突出部をもち、そして、第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、26および27のそれぞれが修飾リボヌクレオチドを含む、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項９２】
第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24および25のそれぞれが、非修飾リボヌクレオチドを含む、請求項91の単離された二本鎖核酸。
【請求項９３】
長さ25ヌクレオチドで、3'末端及び5'末端を有する、第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ27ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖が長さ2ヌクレオチドの3'突出部をもち、そして、第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17および26のそれぞれが修飾リボヌクレオチドを含む、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項９４】
第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置4、6、8、10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25および27のそれぞれが、非修飾リボヌクレオチドを含む、請求項93の単離された二本鎖核酸。
【請求項９５】
長さ25ヌクレオチドで、3'末端及び5'末端を有する、第一オリゴヌクレオチド鎖；および長さ27ヌクレオチドで、かつ、3'末端及び5'末端を有する、第二オリゴヌクレオチド鎖；を含む、単離された二本鎖核酸であって、
第一オリゴヌクレオチド鎖の3'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、および／または3がデオキシリボヌクレオチドであり；そして、
第二オリゴヌクレオチド鎖が長さ2ヌクレオチドの3'突出部をもち、そして、第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置4、6、7、12、13および16のそれぞれが修飾リボヌクレオチドを含む、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含み、そして、前記第二オリゴヌクレオチド鎖は、前記第二オリゴヌクレオチド鎖の長さの少なくとも19ヌクレオチドが標的RNAと十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を減少させる；
前記単離された二本鎖核酸。
【請求項９６】
第二オリゴヌクレオチド鎖の5'末端の第一ヌクレオチド（位置1）から始めて、位置1、2、3、5、8、9、10、11、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26および27のそれぞれが、非修飾リボヌクレオチドを含む、請求項95の単離された二本鎖核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
[0001]  本発明は、国立衛生研究所により供与される、助成金番号AI29392及びHL074704の下に、一部分は政府の支援によって行われた。政府は、本発明において特定の権利を有することができる。
【０００２】
[0002]  本発明の背景を明らかにするために本明細書中で用いられる文献およびその他の資料、および特に、実施に関する付加的な詳細を提供する事例は、参照として援用され、そして便宜上、以下の本文において著者および日付によって引用され、そして、添付の文献目録においては、著者のアルファベット順に列挙されている。
【０００３】
[0003]  本発明は二本鎖リボ核酸（dsRNA）エフェクター分子による遺伝子特異的な遺伝子発現の阻害のための組成物および方法に関連する。前記組成物および方法は、治療、診断、標的検証、およびゲノム創薬を含む様々な応用における、遺伝子発現の調節において有用である。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  二本鎖RNA（dsRNA）による遺伝子発現の抑制は、植物（転写後遺伝子抑制）（Napoliら、1990）、真菌（クエリング（quelling））（RomanoおよびMarcino、1992）、及び、線虫（RNA干渉）（Fireら、1998）を含む、様々な系において証明されてきた。二本鎖RNA（dsRNA）は、一本鎖RNA（ssRNA）よりも非常に安定性が高い。この違いは、細胞内環境において顕著である（Raemdonckら、2006）。しかしながら、非修飾siRNAは、ヌクレアーゼが極めて豊富な環境である血清中で、迅速に分解される。化学修飾によって、in vitroおよびin vivoの両方において、siRNAを著しく安定化させ、そして、有効性を改善することができる。アンチセンスおよびリボザイムの分野などの、合成核酸がin vivoでの実験または治療応用において使用されるところでの応用に向けて、過去20年以上広範囲の医薬品化学が行われ、そして、何百もの化合物が、ヌクレアーゼ安定性を改善し、結合親和性を上昇させ、そして時には合成核酸の薬力学的特性をも改善させる修飾を探求して試験がなされてきた（Matteucci、1997；Manoharan、2002；Kurreck、2003）。これらの修飾の多くは、既に試験がなされ、従来の21 mer siRNAにおける使用のための修飾因子として有用であることが見いだされてきた。いくつかの総説により、21 mer siRNA及び化学修飾に関する近年の経過の概要が提供されている（Zhangら、2006；Nawrot及びSipa、2006；Rana、2007）。ダイサー（Dicer）基質siRNA（DsiRNA）などの、より長いRNAにおける使用に向けた、修飾パターンの試験または最適化は、行われてきていない。
【０００５】
[0005]  哺乳類の系において、長いdsRNAを使用して遺伝子発現を抑制しようとした初期の試みは、より低次の生物においては存在しない、インターフェロン経路の活性化のために失敗した。dsRNAによって、インターフェロン応答が誘発される（Starkら、1998）。特に、プロテインキナーゼPKRが、30 bpより長いdsRNAによって活性化され（Mancheら、1992）、その結果、翻訳開始因子eIF2αのリン酸化が生じ、それによってタンパク質合成の阻害および2'5'-オリゴアデニレート合成酵素（2'5'-OAS）の活性化が引き起こされ、RNAの分解へと導かれる（Minksら、1979）。
【０００６】
[0006]  ショウジョウバエ細胞および細胞抽出物において、長さ150 bpまたはそれ以上のdsRNAが、RNA干渉を引き起こし、一方、より短いdsRNAは無効であることが観察された（Tuschlら、1999）。しかしながら、長い二本鎖RNAは、活性エフェクター分子ではなく；長いdsRNAはダイサー（Dicer）と呼ばれるRNase IIIに分類される酵素（Bernsterinら、2001）によって、2塩基の3'突出部を有する非常に短い21〜23  bpの二重鎖に分解される（Zamoreら、2000）。siRNAと呼ばれるこれらの短いRNA二重鎖は、in vivoにおいてRNAi応答へ導き、そして、本設計の短い化学合成siRNA二重鎖のトランスフェクションは、哺乳類細胞において、RNAi法の使用によって、望ましくないインターフェロン応答を誘発せずに、遺伝子発現を抑制することを可能にする（Elbashir ら、2001a）。siRNA二重鎖のアンチセンス鎖は、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）におけるエンドリボヌクレアーゼ機能の活性を導き、標的mRNAを分解する、配列特異的なガイドとして働く（Martinezら、2002）。
【０００７】
[0007]  in vitroでショウジョウバエ胚抽出物でのRNAiおけるサイズ限界の研究において、外部から供給された二本鎖RNAおよび、長さ36、30、29 bpの二重鎖を使用したRNA干渉の活性化では、38 bp付近の二本鎖RNAが低分子の方の閾値として確立された（Elbashirら、2001b）。短い30塩基RNAは、21-23塩基の活性siRNAへと切断されず、そのために、RNAiにおける使用では不活性であると考えられた（Elbashirら、2001b）。ショウジョウバエ胚抽出物系における研究は継続され、同一グループはのちに、RNAi経路においてsiRNAとして機能する、短い化学合成RNA二重鎖に必要とされる構造的な特徴を入念に示した。2塩基の3'突出部を有する長さ21 bpのRNA二重鎖が最も効果的であり、長さ20、22、および23 bpの二重鎖は、有効性が若干減少したがRNAiを介したmRNA分解を起こし、そして、24および25 bpの二重鎖は不活性であった（Elbashirら、2001c）。
【０００８】
[0008]  これらの初期の研究の結論のいくつかは、使用されたショウジョウバエの系に特異的である可能性もある。別の研究者は、より長いsiRNAがヒトの細胞において機能できることを証明した。しかしながら、21〜23 bpの範囲の二重鎖がより活性が高井ことが示されており、そして、一般的に認められる設計となった（Caplenら、2001）。基本的には、長い二重鎖RNAのダイサーによる分解によって得られる天然の産物を模倣して、化学的に合成された二重鎖RNAが、RNAiにおける使用に好ましい化合物として同定された。この問題に逆方向から取り組み、線虫におけるRNAiのサイズ限界を研究する研究者は、マイクロインジェクションした26 bpのRNA二重鎖は遺伝子発現を抑制するように機能できるが、81 bpの二重鎖と比較して、250倍高い濃度を必要とすることを見出した（Parrishら、2000）。
【０００９】
[0009]  近年のRNAi研究への注目にも関わらず、この分野は未だ発展の初期段階にある。すべてのsiRNA分子が細胞内でその相補的なRNAの分解を標的とすることができるわけではない。結果として、有効であろうRNAi分子を設計するために、複雑な規則の組み合わせが作り出されている。当業者は、機能的な組成物を見出すために多種のsiRNA分子を試験することを予期する（Jiら、2003）。一回の試験でサイレンシングを取得する機会増やすために、いくつかのsiRNA調製物を一緒にプールする技術者もいる（Jiら、2003）。siRNA分子は1 nMまたはそれ以下の濃度で働くことができるという事実にも関わらず（Holenら、2002）、前記プールは典型的に、20 nMまたはそれ以上のsiRNAオリゴヌクレオチド二重鎖混合物を含む（Jiら、2003）。この技術は、その他の細胞性RNAとsiRNA配列との相互作用により引き起こされるアーチファクトを導く可能性がある（“オフターゲット効果”）。（Schererら、2003）オフターゲット効果は、RNAiオリゴヌクレオチドが意図しない標的と相同性を有する場合、あるいは、RISC複合体が意図しない鎖をRNAi二重鎖から取り込む場合に起こる可能性がある。（Schererら、2003）一般的に、これらの効果は、より高濃度のRNAi二重鎖が使用される場合に、より顕著な傾向がある（Schererら、2003）。
【００１０】
[0010]  さらに、効果的なRNAi処理の有効期間は、約4日間に限られる（Holenら、2002）。つまり、研究者はsiRNA二重鎖のトランスフェクションから2〜3日以内にsiRNA実験を実施するか、あるいは、より長い期間のサイレンシングを得るためにプラスミドまたはウイルス発現ベクターを使用しなければならない。
【００１１】
[0011]  siRNAの効果を阻害する1つ主要な因子は、ヌクレアーゼによるsiRNAの分解である。3'-エキソヌクレアーゼが血清中に存在する主要なヌクレアーゼ活性であり、そのため、アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドの3'末端の修飾が分解を防ぐために重要である（Ederら、1991）。ERI-1と呼ばれる3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するRNase-Tファミリーヌクレアーゼが、siRNAの調節および分解に関与することが同定された（Kennedyら、2004；Hongら、2005）。この遺伝子は、マウスのThex1（NM_02067）、あるいは、ヒトのTHEXl（NM_153332）としても知られており、そして、ヒストンmRNAの分解に関与する；siRNAの3'突出部の分解も仲介するが、二重鎖RNAは分解しない（Yangら、2006）。そのため、siRNAの3'末端の安定性が、安定性を改善するであろうと推測することが妥当である。
【００１２】
[0012]  XRN1（NM_019001）は、P-bodyに存在する5'→3'エキソヌクレアーゼであり、そして、miRNAによって標的とされるmRNAの分解に関与しており（Rehwinkelら、2005）そして、siRNAによって行われるように、内部切断によって開始される分解の完了にも関与する可能性がある。XRN2（NM_012255）は、核RNAのプロセッシングに関与する別の5'→3'エキソヌクレアーゼである。siRNAおよびmiRNAの分解またはプロセッシングには、現在のところ関与しないが、これら両方はRNAを分解できることが既知のヌクレアーゼであり、そのため、考慮することも重要である可能性がある。
【００１３】
[0013]  RNaseAは哺乳類においてRNAを分解する主要なエンドヌクレアーゼである。ssRNAに特異的であり、そして、ピリミジン塩基の3'末端で切断する。RNase A切断に伴ってできるsiRNA分解産物は、血清中でインキュベーションした後、質量分析によって検出できる（Turnerら、2007）。3'突出部は、RNase分解へのsiRNAの感受性を亢進させる。血清からのRNase Aの除去はsiRNAの分解を減少させる；この分解はある程度の配列選択性を示し、そして、末端にポリA/U配列を有する配列において、より悪い（Haupenthalら、2006）。このことは、二重鎖のより安定性の低い領域は“呼吸breathe”する可能性があり、そして、RNase Aによる分解に使用可能である、一時的な一本鎖種を提供する可能性を示唆する。RNase A阻害剤を血清に加えて、それによってsiRNAの寿命および有効性を改善することができる（Haupenthalら、2007）。
【００１４】
[0014]  21 merでは、ホスホロチオエートまたはボラノリン酸修飾が、ヌクレオシド間リン酸結合を直接的に安定化する。ボラノリン酸修飾RNAは、ヌクレアーゼ耐性が高く、サイレンシング剤として有効であり、そして、比較的無毒である。ボラノリン酸修飾RNAは標準的な化学合成方法を使用して作成することはできず、そしてその代り、in vitro転写（IVT）によって作成される（Hallら、2004及び、Hallら、2006）。ホスホロチオエート（PS）修飾は、RNA二重鎖において、いかなる望ましい位置にも容易に付加することができ、そして、標準的な化学合成方法を使用して作成することができる。PS修飾は、用量依存的な毒性を示すため、ほとんどの研究者らはsiRNAへの制限された組み込みを推奨しており、ヌクレアーゼからの保護が最も重要な3'末端が好まれる（Harborthら、2003；ChiuおよびRana、2003；Braaschら、2003；Amarzguiouiら、2003）。より広範囲のPS修飾は強力なRNAi活性に対応することができる；しかしながら、（2'-O-メチルRNAなどの）糖修飾の使用が優れている可能性がある（Choungら、2006）。
【００１５】
[0015]  多様な置換基をリボースの2'位に付加することが可能であり、一般的に二重鎖の安定性（Tm）を高め、そして、ヌクレアーゼ耐性を顕著に改善することができる。2'-O-メチルRNAは、哺乳類のリボソームRNAおよびトランスファーRNAにおいて発見された、天然に生じる修飾である。siRNAにおける2'-O-メチル修飾は既知であるが、二重鎖内の修飾塩基の正しい位置が、効力の維持には重要であり、そして、RNAから2'-O-メチルRNAへの完全な置換は、siRNAを不活性化するであろう。例えば、交互に2'-O-メチル塩基を用いるパターンは、非修飾RNAと等しい効力を有することができ、かつ、血清中で非常に安定である（Choungら、2006；Czaudernaら、2003）。
【００１６】
[0016]  2'-フルオロ（2'-F）修飾もsiRNA機能に対応する；最も一般的には、（試薬の費用および入手し易さのため）ピリミジン部位に配置され、そして、プリン位置において2'-O-メチル修飾と組み合わされることができる；2'-Fプリンは入手可能であり、そしてまた使用することもできる。この種の大量に修飾された二重鎖は、in vitroにおいてRNAiを強力に誘発することができ（Allersonら、2005；Prakashら、2005；KraynackおよびBaker、2006）、そして、in vivoで使用される場合、性能を高め、そして、作用期間を延長することができる（Morrisseyら、2005a；Morrisseyら、2005b）。2'-Fおよび2'-O-メチル塩基を交互に含む、高性能で、ヌクレアーゼ安定の、平滑19 mer二重鎖は、Allersonにより教授される。本設計において、交互の2'-O-メチル残基はCzaudernaによって使用されるものと同一のパターンで配置されるが、残りのRNA残基が2'-F修飾塩基に変換される。Morrisseyにより使用される、高性能、ヌクレアーゼ耐性siRNAは、in vivoにおいて高性能、ヌクレアーゼ耐性siRNAを示した（employed）。2'-O-メチルRNAおよび2'-F RNAに加えて、本二重鎖は、DNA、RNA、反転した脱塩基残基（inverted abasic residues）、および3'末端のPSヌクレオシド間結合を含む。広範囲の修飾は一定の利点を有するが、より制限された二重鎖の修飾もまた、in vivoにおける性能を改善することができ、さらに、作成するのが、より単純で、かつ、より安価である。Soutschekら（2004）は、in vivoにおいて二重鎖を使用し、そして、ほとんどが2つの2'-O-メチルRNA塩基および限定された3'末端PSヌクレオシド間結合を有するRNAであった。
【００１７】
[0017]  locked核酸（LNA）は異なる分類の2'修飾であり、siRNAを安定化するために使用することができる。有効性を維持するLNA組み込みのパターンは、限定された修飾が好ましいため、2'-O-メチルまたは2'-F塩基よりも、より限られている（Braaschら、2003；Grunwellerら、2003；Elmenら、2005）。限定された組み込みであっても、LNA修飾の使用はsiRNA性能をin vivoにおいて改善することができ、さらに、オフターゲット効果プロファイルを変更または改善することも可能である（Mookら、2007）。
【００１８】
[0018]  細胞または生きた動物中に導入される合成核酸は、“異物（foreign）”として認識され、そして免疫応答を誘発する可能性がある。免疫刺激はオフターゲット効果の主要な分類を構成し、実験結果を大幅に変化させ、そして、細胞死さえ導く可能性がある。自然免疫系には、これらの応答を仲介するDNAおよびRNAと特異的に相互作用する、受容体分子の集積が含まれ、それらのいくつかは、細胞質に存在し、そして、いくつかはエンドソームに存在する（MarquesおよびWilliams、2005；Schleeら、2006）。カチオン性脂質またはリポソームによるsiRNAの運搬は、siRNAを細胞質およびエンドソームコンパートメントの両方に暴露し、1型インターフェロン（IFN）応答をin vitroおよびin vivoの両方において誘発するリスクを最大にする（Morrisseyら、2005b；SioudおよびSorensen、2003；Sioud、2005；Maら、2005）。細胞内で転写されるRNAは免疫原性がより低く（Robbinsら、2006）そして、脂質に基づく方法を使用して運搬される場合に免疫原性のある合成RNAは、機械的手法によって細胞に導入されるときは、in vivoにおいても、免疫刺激を避けることができる（Heidelら、2004）。しかしながら、脂質に基づく運搬方法は、簡便で、効果的で、かつ広く使用される。すべての細胞型が存在し、そして、免疫応答を生み出すリスクが最も高いin vivoにおける応用において特に、免疫応答を防ぐいくつかの一般的な戦略が必要とされる。化学修飾RNAの使用は、これらすべての問題のほとんどあるいはすべてをも解決する可能性がある。
【００１９】
[0019]  特定の配列モチーフはその他のものよりも明らかにより高い免疫原性を有するが、一般に自然免疫系の受容体は、原核生物RNAにおけるよりも哺乳類のRNAにおいて、より一般的に見出される、特定の塩基修飾の存在または非存在を識別すると考えられる。例えば、シュードウリジン、N6-メチル-A、および2'-O-メチル修飾塩基は、“自己（self）”として認識され、そのため、合成RNAにおいてこれらの残基を含有することは免疫検出から逃れることを助けることができる（Karikoら、2005）。非修飾RNAとしては強い免疫刺激性である配列の広範囲の2'-修飾は、マウスに静脈内投与する場合、免疫応答を遮断することができる（Morrisseyら、2005b）。しかしながら、広範囲の修飾は、免疫検出を逃れるためには必要ではなく、そして、siRNA二重鎖の1つの鎖の、2つ程度の少ない数の2'-O-メチル塩基への置換が、in vitroおよびin vivoの両方において、1型IFN応答を遮断するのに十分であることができ；修飾UおよびG塩基がもっとも効果的である（Judgeら、2006）。付加的な利点として、2'-O-メチル塩基の選択的な組み込みは、オフターゲット効果の大きさを減少させることができる（Jacksonら、2006）。そのため、2'-O-メチル塩基の使用は、in vivo応用を意図するすべてのsiRNAにおいて、免疫応答を遮断する手段として考えるべきであり、そして、ヌクレアーゼ安定性の改善およびオフターゲット効果の可能性の減少という、さらなる利点を有する。
【００２０】
[0020]  細胞死は免疫刺激の結果起こる可能性があるが、細胞生存率を調べることは、IFN応答の誘発をモニターするのに十分な方法ではない。IFN応答は細胞死なしでも存在する可能性があり、そして、細胞死は、IFNの引き金が存在しなくてもターゲットノックダウンによって引き起こされることができる（例えば、標的化遺伝子が細胞生存に不可欠である場合）。関連サイトカインは、培養培地中で直接的に計測することができ、そして、前記アッセイを日常的に行うことを可能にする、様々な市販キットが存在する。多数の異なる免疫エフェクター分子が計測可能であるが、通常、スクリーニング目的においては、IFN-α、TNF-α、およびIL-6のレベルをトランスフェクション後4時間および24時間において、試験することで十分である。“トランスフェクション試薬のみの対照”を含めることは、カチオン性脂質は特定の細胞では、核酸の積み荷がなくても、免疫応答を誘発する可能性があるので、重要である。IFN経路誘導に対する対照を含めることは、細胞培養作業として見なされるべきである。IFN応答を引き起こすリスクが最も高いin vivoにおいて、核酸を投与するときはいつでも、免疫刺激に対する試験をすることが不可欠である。
【００２１】
|0021]  従って、dsRNA、特にDsiRNAの効率を高める化学修飾パターンを提供する必要がある。修飾は、1）有効性を減少させるべきではない；2）ダイサープロセッシングを阻害すべきでない；3）生体液中における安定性を改善するべきである（ヌクレアーゼ感受性を減少する）；4）自然免疫系による認識を、遮断または回避するべきである；5）毒性があってはならない；そして6）作成の費用は増加させないか、あるいは、作成の容易さに影響を与えるべきである。
【００２２】
[0022]  本発明は、RNAiにおいて遺伝子発現を阻害するのに有用な組成物を提供し、そして、それらの使用のための方法を提供する。加えて、本発明は、有効性を最大にし、ダイサープロセッシングを亢進し、免疫系を回避する一方安定性を改善し、そして、毒性がないように設計されるRNAi組成物および方法を提供する。さらに、本発明の様々な態様は、研究の需要に合ったハイスループット、小規模の合成、並びに、治療的応用のための大規模製造にも適する。これらおよびその他の本発明の利点は、さらなる発明の特徴とともに、本明細書中で提供される発明の説明より明らかになるだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
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【発明の概要】
【００２４】
[0023]  本発明は、真核細胞において標的遺伝子の発現を減少させることができる、二本鎖RNA（“dsRNA”）を含む組成物、および、それらを調製する方法を対象とする。さらに特異的には、本発明は、機能的に改善される修飾を有する、ダイサー基質RNAを対象とする。
【００２５】
[0024]  従って、第一の観点において、本発明はRNA干渉（RNAi）用の新規組成物を提供する。組成物は前駆分子であるdsR NAを含み、すなわち、本発明のdsRNAは、in vivoでプロセッシングされて活性siRNAを産生する。dsRNAは、ダイサーによりプロセッシングされ、標的遺伝子のRNA干渉のためにRISC複合体に取り込まれる、活性siRNAとなる。前駆分子は、また、本明細書中で、前駆RNAi分子とも言われる。
【００２６】
[0025]  1つの態様において、dsRNA、すなわち前駆RNAi分子は、siRNAを産生するためダイサーによってプロセッシングされるために十分な長さを有する。本態様に従って、dsRNAは26から約30ヌクレオチドの間の長さの第一オリゴヌクレオチオ配列（センス鎖とも言われる）、および、細胞の細胞質中に見出される条件などの、生物学的条件下で、第一配列とアニーリングする第二オリゴヌクレオチド配列（アンチセンス鎖とも言われる）を含む。さらに、dsRNAの配列の一方、特にアンチセンス鎖中の1つの領域は、RNAi応答を引き起こす標的遺伝子から産生されるRNAのヌクレオチド配列と十分に相補的な21ヌクレオチドなどの、例えば約19から約23ヌクレオチドの、少なくとも長さが19ヌクレオチドの配列を有する。
【００２７】
[0026]  第二の態様において、dsRNA、すなわち前駆RNAi分子は、ダイサーによるそのプロセッシングを亢進させるいくつかの特性を有する。本態様に従って、dsRNAはダイサーによってプロセッシングされsiRNAを産生するために十分な長さ、および、以下の特性の少なくとも1つを有する：（i）dsRNAは非対称であり、例えば、アンチセンス鎖に3'突出物を有する。および、（ii）dsRNAは、ダイサーのdsRNAへの結合およびプロセッシングにより活性siRNAへと向かわせる、センス鎖の修飾3'末端を有する。本態様に従って、センス鎖は22〜28ヌクレオチドを含み、そして、アンチセンス鎖は、24〜30ヌクレオチドを含む。1つの態様において、dsRNAは、アンチセンス鎖の3'末端に突出部を有する。別の態様において、センス鎖は、センス鎖の3'末端に位置する適切な修飾因子によって、ダイサー結合およびプロセッシングのため、修飾される。適切な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、およびその類似物などのヌクレオチド、および、蛍光分子およびその類似物などの立体的に込み合った分子が含まれる。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、それらは、dsRNAの長さが変化しないように、dsRNA中のリボヌクレオチドと置換される。別の態様において、dsRNAはアンチセンス鎖の3'末端に突出部を有し、そして、センス鎖は、ダイサープロセッシングのために修飾される。別の態様において、センス鎖の5'末端はリン酸を有する。別の態様において、アンチセンス鎖の5'末端はリン酸を有する。別の態様において、アンチセンス鎖、またはセンス鎖、または両方の鎖は、1つまたはそれ以上の2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを有する。別の態様において、アンチセンス鎖は、2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを含む。別の態様において、アンチセンス鎖は、2'-O-メチル修飾ヌクレオチドが含まれる3'突出部を含む。アンチセンス鎖はまた、さらなる2'-O-メチル修飾ヌクレオチドも含むことができる。センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中に見出される条件などの、生物学的条件下で、アニーリングする。さらに、dsRNAの配列の一方、特にアンチセンス鎖中の1つの領域は、少なくとも長さ19ヌクレオチドの配列を有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3'末端と隣接する21ヌクレオチドの領域中にあり、標的遺伝子から産生されるRNAのヌクレオチド配列と十分に相補的である。さらに、本態様に従って、dsRNAすなわち前駆RNAi分子は、1つまたはそれ以上の、以下の付加的な特性をも有する可能性がある：（a）アンチセンス鎖は典型的な21 merから右方シフトを有する（すなわち、アンチセンス鎖は、典型的な21 merと比較して、分子の右側のヌクレオチドを含む）、（b）その鎖は完全には相補的でない可能性がある、すなわち、その鎖は単純なミスマッチの対を含む可能性がある、そして、（c）locked核酸などの塩基修飾が、センス鎖の5'末端に含まれる可能性がある。
【００２８】
[0027]  第三の態様において、センス鎖は25〜28ヌクレオチドを含み、センス鎖の3'末端の2ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。センス鎖は、5'末端にリン酸を含む。アンチセンス鎖は、26〜30ヌクレオチドを含み、そして、1〜4ヌクレオチドの3'突出部を含む。3'突出部を含むヌクレオチドは、2'-O-メチルRNAにより修飾される。アンチセンス鎖は、3'突出部に隣接するアンチセンス鎖の第一モノマーから始まり、そして、3'突出部に隣接する第一モノマーから15〜19ヌクレオチドまでに渡る、交互に2'-O-メチル修飾されたヌクレオチドを含む。例えば、27ヌクレオチドアンチセンス鎖で、アンチセンス鎖の5'末端の第一塩基をポジション番号1と数える場合、2'-O-メチル修飾は、塩基9、11、13、15、17、19、21、23、25、26および27に位置するだろう。1つの態様において、DsiRNAは、
【００２９】
【化１】
2010525813.tif 000003
【００３０】
を含み：式中“X”＝RNA、“P”＝リン酸基、
【００３１】
【化２】
2010525813.tif 000004
【００３２】
＝2'-O-メチルRNA、“Y”は随意で2'-O-メチルRNAモノマーである1〜4RNAモノマーを含む突出ドメイン、そして“D”＝DNAである。上の鎖がセンス鎖、そして、下の鎖がアンチセンス鎖である。
【００３３】
[0028]  第四の態様において、dsRNAすなわち前駆RNAi分子は、ダイサーによるそのプロセッシングを亢進するいくつかの特性を有する。本態様に従って、dsRNAは、ダイサーによってプロセッシングされsiRNAを産生するために十分な長さ、および、以下の特性の少なくとも1つを有する：（i）dsRNAは非対称であり、例えば、センス鎖に3'突出部を有する。および、（ii）dsRNAは、ダイサーのdsRNAへの結合およびプロセッシングにより活性siRNAへと向かわせる、アンチセンス鎖の修飾3'末端を有する。本態様に従って、センス鎖は24〜30ヌクレオチドを含み、そして、アンチセンス鎖は、22〜28ヌクレオチドを含む。1つの態様において、dsRNAは、センス鎖の3'末端に突出部を有する。別の態様において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の3'末端に位置する適切な修飾因子によって、ダイサー結合およびプロセッシングのため、修飾される。適切な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、およびその類似物などのヌクレオチド、および、蛍光分子およびその類似物などの立体的に込み合った分子が含まれる。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、それらは、dsRNAの長さが変化しないように、dsRNA中のリボヌクレオチドと置換される。別の態様において、dsRNAはセンス鎖の3'末端に突出部を有し、そして、アンチセンス鎖は、ダイサープロセッシングのために修飾される。1つの態様において、アンチセンス鎖は5'リン酸を有する。センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中に見出される条件などの、生物学的条件下で、アニーリングする。さらに、dsRNAの配列の一方、特にアンチセンス鎖中の1つの領域は、少なくとも長さ19ヌクレオチドの配列を有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3'末端と隣接し、そして標的遺伝子から産生されるRNAのヌクレオチド配列と十分に相補的である。さらに、本態様に従って、dsRNA、すなわち前駆RNAi分子は、1つまたはそれ以上の、以下の付加的な特性をも有する可能性がある：（a）アンチセンス鎖は典型的な21 merから左シフトを有する（すなわち、アンチセンス鎖は、典型的な21 merと比較して、分子の左側のヌクレオチドを含む）、そして（b）その鎖は完全には相補的でない可能性がある、すなわち、その鎖は単純なミスマッチの対を含む可能性がある。
【００３４】
[0029]  第二の観点において、本発明は、ダイサーによるプロセッシングを亢進させる、dsRNA、すなわち前駆RNAi分子を作成する方法を提供する。本方法に従って、少なくとも長さ19ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖siRNAは、与えられた標的遺伝子から、従来の技術およびアルゴリズムを使用して選択される。1つの態様において、アンチセンスsiRNAは、長さ24〜30ヌクレオチドになるように5'末端に5〜11リボヌクレオチドを含むように修飾される。アンチセンス鎖が長さ21ヌクレオチドを有するとき、次に3〜9ヌクレオチド、あるいは4〜7ヌクレオチドまたは6ヌクレオチドが、5'末端に付加される。付加されるリボヌクレオチドは標的遺伝子配列と相補的であることができるが、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は必要とされない。つまり、結果として得られるアンチセンスsiRNAは、標的配列と十分に相補的である。センス鎖は次に産生され、22〜28ヌクレオチドを有する。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖とアニーリングするために、アンチセンス鎖と十分に相補的である。1つの態様において、センス鎖は、アンチセンス鎖をダイサープロセッシングに導くために、修飾された3'末端を含むように合成される。別の態様において、dsRNAのアンチセンス鎖は3'突出部を有する。さらなる態様において、センス鎖は、ダイサー結合およびプロセッシングのため、修飾された3'末端を含むように合成され、そして、dsRNAのアンチセンス鎖は、3'突出部を有する。
【００３５】
[0030]  本方法の第二の態様において、アンチセンスs iRNAは、長さが22〜28ヌクレオチドになるように5'末端に1〜9リボヌクレオチドを含むように修飾される。アンチセンス鎖が、長さ21ヌクレオチドを有する場合、次に1〜7リボヌクレオチド、または2〜5リボヌクレオチドおよびまたは4リボヌクレオチドが、3'末端に付加される。付加されるリボヌクレオチドは、いかなる配列も有する可能性がある。付加されるリボヌクレオチドは、標的遺伝子配列と相補的であることができるが、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は必要とされない。つまり、結果として得られるアンチセンスsiRNAは、標的配列と十分に相補的である。センス鎖は次に産生され、24〜30ヌクレオチドを有する。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖とアニーリングするため、アンチセンス鎖と十分に相補的である。1つの態様において、アンチセンス鎖は、ダイサープロセッシングを導くために、修飾された3'末端を含むように合成される。別の態様において、dsRNAのセンス鎖は3'突出部を有する。さらなる態様において、アンチセンス鎖は、ダイサー結合およびプロセッシングのため、修飾された3'末端を含むように合成され、そして、dsRNAのセンス鎖は、3'突出部を有する。
【００３６】
[0031]  第三の観点において、本発明は、開示されるdsRNA組成物を含む薬剤組成物を提供する。
[0032]  第四の観点において、本発明は、細胞内で望ましい標的遺伝子からの遺伝子産物の発現を選択的に減少させ、さらに、その遺伝子の発現により引き起こされる疾患を治療する方法を提供する。1つの態様において、方法は、標的遺伝子の発現減少を引き起こすために十分量のdsRNAが細胞の細胞質に入ることができるように、本発明のdsRNAのある量を細胞環境に導入することに関与する。
【００３７】
[0033]  組成物および方法は、RNAi効果の予想外の有効性レベルを有する。本発明はその上で機能すると考えられる基本的な理論によって限定されることを意図しないが、この有効性レベルおよび作用の期間は、dsRNAが、標的遺伝子からのRNAの分解に直接的に関与するRISC複合体への、dsRNA由来の一つの配列の取り込みを促進すると思われる、ダイサーの基質として働くという事実によって引き起こされると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１−１】[0034]  図1A〜図1Fは、27 mer dsRNAが、21+2 siRNAよりも有効性の高いRNAiエフェクターであることを示す。固定量のEGFP発現プラスミドおよび様々な濃度のdsRNAを、HEK293細胞に共トランスフェクションした後、EGFP発現レベルを測定した。図1A〜図1C：トランスフェクションは、示されたdsRNAを（図1A）50 nM、（図1B）200 pM、および（図1C）50 pM、使用して行われた。
【図１−２】図1D：より長いdsRNAの用量反応試験。トランスフェクションは示された濃度のdsRNAを用いて行われた。
【図１−３】図1E：同じ、より長いRNAを使用して、in vitroにおけるダイサー反応を描写する。濃度および条件は、実施例に記述される通りだった。図1F：EGFPを安定発現させたNIH3T3細胞にトランスフェクションしたdsRNAの用量-反応曲線。各グラフの点は3回の独立した測定の平均（標準偏差と共に）を示す。
【図２−１】[0035]  図2A〜図2Eは、ダイサープロセッシングがRNAi活性と相関があることを示す。図2A：リコンビナントダイサーによるdsRNAの切断。各RNA二重鎖を、リコンビナントヒトダイサーの存在あるいは非存在下、24時間インキュベーションし、非変性PAGEを使用して分離し、そして可視化した（実施例参照）。図2B：本試験で使用されるRNA二重鎖。オリゴを、5'末端、3'末端または両方において、丸で示される通り、6FAMと共有結合した。上および下の線は、二重鎖形状におけるセンスおよびアンチセンス鎖を、センスは5'から3'の向き（左から右）、および、アンチセンスは3'から5'の向き（左から右）で示す。
【図２−２】図2C：6FAM末端修飾はin vitroでのダイサー活性に影響を及ぼす。RNA二重鎖は、0.5ユニットのリコンビナントヒトダイサーと8時間インキュベーションし、生成物を7.5％非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。RNAをエチジウムブロマイド染色によって可視化した。図2D：6FAM修飾は、RNAi活性に影響を及ぼす。200 pMのRNA二重鎖をEGFP発現プラスミドと共トランスフェクションし、そして、記載される通り、EGFP蛍光を24時間においてアッセイした。報告されるEGFP発現の値は、2回の独立した実験の平均を示す。蛍光の相対的なレベルはルシフェラーゼのものに対して標準化された。図2E：27 mer二重鎖RNAはin vivoにおいて21 merにプロセッシングされる。二重鎖3及び二重鎖5を10 nMでトランスフェクションした細胞から、全RNAを調製した。RNAを21 mer 32P標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションした試料を非変性PAGEによって分離し、そして、オートラジオグラフィーによって可視化した。サイズマーカーは32P末端標識した21 merおよび27 mer RNA二重鎖である。
【図３】[0036]  図3A〜図3Bは、様々な21＋2 siRNAのRNAi活性を示す。図3A：27 mer dsRNAのダイシングから予想される7つの可能性のある21＋2 siRNAを、個々に、あるいは、プールとして、HEK293細胞におけるEGFPレポーター構築物との共トランスフェクションアッセイによって試験した。各グラフは、二回の実験の平均を示す。図3B：in vitroでダイサー処理された27 mer dsRNA対完全な27 mer dsRNAのsiRNAにおける比較。図4Aにある通り、それぞれのRNAを示されたds RNA濃度で共トランスフェクションした。ダイサー処理産物において、1μM 27 mer dsRNAはダイサー反応バッファー中で、ダイサーなし（カラム3）またはダイサーあり（カラム4）で、37℃、12時間、インキュベーションした。混合物を水で希釈し、次に、EGFPレポーターとの共トランスフェクションにおいて直接使用した。希釈混合液中の残余ダイサーによる可能性のあるアーチファクトに関する対照として、カラム4の試料は、フェノール抽出およびエタノール沈殿をトランスフェクションより前に行った（カラム5）。
【図４Ａ】[0037]  図4Aおよび図4Bは、ダイサーとのインキュベーション前（図4A）および後（図4B）の27 mer二重鎖EGFPS1 27+0のESIマススペクトルを示す。二重鎖は一本鎖に分離し、そして、測定された各鎖の質量が示される。ダイサー消化は、高濃度の塩の存在下で行われ、そして、いくつかの“影（shadow）”ピークは、+1または+2 Na種を示す。
【図４Ｂ】[0037]  図4Aおよび図4Bは、ダイサーとのインキュベーション前（図4A）および後（図4B）の27 mer二重鎖EGFPS1 27+0のESIマススペクトルを示す。二重鎖は一本鎖に分離し、そして、測定された各鎖の質量が示される。ダイサー消化は、高濃度の塩の存在下で行われ、そして、いくつかの“影（shadow）”ピークは、+1または+2 Na種を示す。
【図５−１】[0038]  図5A〜図5Dは、RNAiにおける27 mer dsRNAの特徴を示す。図5A：27 mer dsRNAによるRNAi期間の延長。EGFPレベルは、EGFPを安定発現するNIH3T3細胞に、5 nM 21+2 siRNAまたは27 mer dsRNAをトランスフェクションした後、測定した。27 mer dsRNAと比較した、21+2 siRNAにより仲介されるEGFPサイレンシングのグラフによる表示。示された日に、二重の試料を採取し、そして、EGFP発現を蛍光光度計によって測定した。図5B：21 mer siRNAに不応性の部位を標的とする27 mer dsRNAは、RNAiを引き起すことができる。dsRNAをEGFPレポーター構築物と共にトランスフェクションし、そして、EGFP発現を測定した（方法）。カラム1、mock；カラム2、EGFPS2を標的とする21+2 siRNA；カラム3、EGFPS2を標的とする27 mer dsRNA；カラム4、EGFPS3を標的とする21+2 siRNA；カラム5、EGFPS3を標的とする27 mer dsRNA。
【図５−２】図5Cおよび図5D：内因性転写物の下方制御における21 mer siRNAと27 mer dsRNAとの比較。21+2 siRNAおよび27+0 dsRNA用のRNAは、hnRNP H mRNA（図5C）またはLa mRNA（図5D）中の部位を標的として設計された。hnRNP Hのノックダウンは、ウエスタンブロットによってアッセイし、そして、Laのノックダウンは、ノザンブロット分析によりアッセイした。dsRNAは、示された濃度で使用した。両方の実験において、β-アクチンを内部特異性およびローディング標準として使用した。
【図６】[0039]  図6はダイサー基質27 mer dsRNAの配列特異性を示す。HEK293細胞に、様々な27 mer dsRNAを、示された濃度で、EGFP発現プラスミドと共トランスフェクションし、そして、EGFP蛍光についてアッセイした。
【図７−１】[0040]  図7A〜図7Dは、siRNAおよびダイサー基質dsRNAが、インターフェロンを誘導したり、または、PKRを活性化したり、あるいは特異的な“オフターゲット効果”を生み出したりしないことを示す。図7Aおよび7B：インターフェロンアルファ（図7A）およびインターフェロンベータ（図7B）アッセイ：カラム1、IFN誘導に関する陽性対照（Kimら、2004）；カラム2、RNAなし；カラム3、化学的に合成された21+2 siRNA；カラム4、化学的に合成された27+0 dsRNA。
【図７−２】図7C：PKR活性化アッセイ。PKR活性化に用いられる長い（lond）dsRNA（Kimら、2004）、および、in vitro PKR活性化アッセイ（Mancheら、1992）は、以前に記述されている。二重鎖RNAを示される通りにトランスフェクションした。図7D：マイクロアレイ分析の要約。
【図８Ａ】[0041]  図8A〜図8Bは、27 mer二重鎖EGFPS1 27+0 Lの、ダイサーとのインキュベーション前（図8A）および後（図8B）のESIマススペクトルを示す。二重鎖は単一鎖に分離し、そして、各鎖の測定質量が示される。
【図８Ｂ】[0041]  図8A〜図8Bは、27 mer二重鎖EGFPS1 27+0 Lの、ダイサーとのインキュベーション前（図8A）および後（図8B）のESIマススペクトルを示す。二重鎖は単一鎖に分離し、そして、各鎖の測定質量が示される。
【図８Ｃ】[0042]  図8C〜図8Dは、27 mer二重鎖EGFPS1 27/25 Lの、ダイサーとのインキュベーション前（図8C）および後（図8D）のESIマススペクトルを示す。二重鎖は単一鎖に分離し、そして、各鎖の測定質量が示される。
【図８Ｄ】[0042]  図8C〜図8Dは、27 mer二重鎖EGFPS1 27/25 Lの、ダイサーとのインキュベーション前（図8C）および後（図8D）のESIマススペクトルを示す。二重鎖は単一鎖に分離し、そして、各鎖の測定質量が示される。
【図９Ａ】[0043]  図9A〜図9Bは、27 mer二重鎖EGFPS1 27+0 Rの、ダイサーとのインキュベーション前（図9A）および後（図9B）のESIマススペクトルを示す。二重鎖は単一鎖に分離し、そして、各鎖の測定質量が示される。
【図９Ｂ】[00 43]  図9A〜図9Bは、27 mer二重鎖EGFPS1 27+0 Rの、ダイサーとのインキュベーション前（図9A）および後（図9B）のESIマススペクトルを示す。二重鎖は単一鎖に分離し、そして、各鎖の測定質量が示される。
【図９Ｃ】[0044]図9C〜図9Dは、27 mer二重鎖EGFPS1 25/27 Rの、ダイサーとのインキュベーション前（図9C）および後（図9D）のESIマススペクトルを示す。二重鎖は単一鎖に分離し、そして、各鎖の測定質量が示される。
【図９Ｄ】[0044]図9C〜図9Dは、27 mer二重鎖EGFPS1 25/27 Rの、ダイサーとのインキュベーション前（図9C）および後（図9D）のESIマススペクトルを示す。二重鎖は単一鎖に分離し、そして、各鎖の測定質量が示される。
【図１０】[0045]  図10A〜図10Bは、ダイサープロセッシングを亢進するように設計された二重鎖が、RNAiの有効なエフェクターであることを示す。HEK293細胞に、固定量のEGFP発現プラスミドと、多様な濃度のdsRNAとを共トランスフェクションした後、EGFP発現レベルを測定した。図10A：二重鎖EGFPS2 -21+2、EGFPS2-27+0、EGFPS2-27/25 LおよびEGFPS2-25/27 Rの有効性の比較。図10B：二重鎖EGFPS1-27/25 LおよびEGFPS1-25/27 Rの有効性の比較。
【図１１】[0046]  図11は、標的配列に関する本発明の2つの態様、および、標的配列と各態様との間の関係を示す図である。
【図１２】[0047]  図12は、21 mer二重鎖に組み込まれた様々な修飾が有することができる、RNAiの誘因（trigger）としての二重鎖の有効性への効果を示す。図には、HeLa細胞に1 nM濃度でトランスフェクションした24時間後、qRT-PCRにより評価された、非修飾対照二重鎖と比較した％mRNAレベルが記載される。
【図１３】[0048]  図13は、25/27 mer dsRNA基質内の、ダイサープロセッシングが起こることが予想される、正確な切断部位を示す。図は、切断後の最終産物中に、予想される切断部位の右側の修飾は存在しないであろうことを示す。
【図１４】[0049]  図14は、25/27 mer DsiRNAに組み込まれた様々な修飾が有することができる、RNAiの誘因（trigger）としての二重鎖の有効性への効果を示す。図には、HeLa細胞に1 nM濃度でトランスフェクションした後、qRT-PCRにより評価された、センス鎖の3'末端の2 DNA塩基だけを修飾された対照二重鎖と比較した、％mRNAレベルが記載される。
【図１５】[0050]  図15は、EGFP遺伝子配列を標的とするDsiRNA上のいくつかの修飾パターンの相対的な効果を明示する。結果より、単一鎖修飾バリアントのすべてが、EGFP発現の減少において良く機能したことが示される。
【図１６】[0051]  図16は、ヒトHPRT遺伝子に対するいくつかのDsiRNA修飾パターンの、相対的な能力を示す。3つの用量（10 nM、1 nM、および0.1 nM）が試験された。図より、修飾されたDsiRNAが非修飾DsiRNAと同じ、またはほとんど同じ程度に機能するだけでなく、25/27 merは、ダイサー切断なしで、RISCに取り込まれる可能性があることをも明示する。
【図１７】[0052]  図17Aは、非修飾対ASm修飾DsiRNAをトランスフェクションする前及び後のT98G細胞における、様々な免疫経路遺伝子の発現レベルの相対的な変化を示す。2'-O-メチル修飾DsiRNAは、遺伝子発現レベルの最小限の変化という結果であったが、非修飾DsiRNAは、特定の遺伝子の発現が200倍以上上昇する結果となった。相対的mRNAレベルが、トランスフェクション後24時間において、qRT-PCRによって評価された。図17Bおよび図17Cは、対照遺伝子アッセイの結果のより細部の詳細な図を提供する。図17Bにおいて、非修飾HPRT-特異的DsiRNAは、HPRTmRNAレベルの減少だけでなく、対照の標的とされていない、1型IFN応答に特徴的なハウスキーピング遺伝子RPLP0の減少ももたらした。図17Cにおいて、ASm修飾HPRT-特異的DsiRNAは、対照RPLP0遺伝子の発現は変化させず、HPRTmRNAレベルの減少をもたらした。
【図１８】[0053]  図18は、組織培養においてT98G細胞に25/27 mer DsiRNAを導入する場合に分泌されるサイトカインレベルの変化を明示する。実施例20、図17において遺伝子発現レベルについて報告される、同じ培養細胞からの上清を、様々なサイトカインのレベルについてアッセイした。非修飾HPRT DsiRNAのトランスフェクションにより、免疫シグナル経路の強力な刺激を示す、IL-8およびIL-6サイトカインレベルの顕著な上昇がもたらされた。ASmパターンで2'-O-メチルRNAにより修飾された同配列では、いずれのサイトカインをも顕著な上昇が示されなかった。
【図１９】[0054]  図19は、非修飾DsiRNAおよび21 mer siRNA二重鎖と比較して、修飾27 mer DsiRNA設計では安定性が改善されることを証明する。RNA二重鎖を、50％ウシ胎仔血清中、37℃で、示された長さの時間インキュベーションし、抽出し、そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。非修飾27 mer DsiRNA二重鎖は、非修飾21 mer二重鎖と比較して安定性の改善を示し、そして、2'-O-メチルASm+5'P修飾パターンにおいて最も高い安定性が認められた。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
[0055]  本発明は、真核細胞において標的遺伝子の発現を減少させることができる、二本鎖RNA Dsi（“dsRNA”）を含む組成物、および、それらを調製する方を対象とする。dsRNAの一方の鎖は、標的遺伝子から転写されるRNAを分解へと向かわせることができる、約19から約30ヌクレオチドの範囲の長さを有するヌクレオチド配列の領域を含む。
【００４０】
[0056]  第一の観点において、本発明は、RNA干渉（RNAi）のための新規組成物を提供する。組成物は、前駆分子であるdsRNAを含む、すなわち、本発明のdsRNAはin vivoでプロセッシングされ、活性siRNAを産生する。dsRNAはダイサーによってプロセッシングされて、RISC複合体に取り込まれる、活性siRNAになる。前駆分子は、本明細書中で前駆RNAi分子とも言われる。本明細書中で使用される場合、活性siRNAという用語は、その各鎖が、RNA、RNA類似体、または、RNAおよびDNAを含む、二本鎖核酸をいう。siRNAは19から23ヌクレオチドの間を含むか、あるいは、21ヌクレオチドを含む。活性siRNAは、siRNAの二重鎖領域が17〜21ヌクレオチド、または19ヌクレオチドを含むように、各鎖の3'末端に2 bpの突出部を有する。典型的には、siRNAのアンチセンス鎖は、標的遺伝子の標的配列と十分に相補的である。
【００４１】
[0057]  “二重鎖領域”という語句は、相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチド鎖間の二重鎖を可能にする、ワトソン-クリック塩基対あるいはその他の様式によって、互いに塩基対を形成する、二つの相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチド内の領域をいう。例えば、21ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖が、21ヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対を作ることができるが、各鎖の19塩基のみが相補的または実質的に相補的である場合、“二重鎖領域”は19塩基対からなる。残りの塩基対は、たとえば、5'および3'突出部として存在することができる。さらに、二重鎖領域内で、100％の相補性は必要ではなく；二重鎖領域内で実質的な相補性が許容可能である。実質的な相補性とは、生物学的条件下でアニーリングすることができるような鎖間の相補性を言う。二つの鎖が生物学的条件下でアニーリングすることができるかどうかを実験的に決定する技術は、当技術分野においてよく知られている。あるいは、2つの鎖を合成し、そして、生物学的条件下で共に添加し、それらが互いにアニーリングするかを決定することができる。
【００４２】
[0058]  本明細書中で使用される場合、標的mRNA配列に対して“十分に相補的な”配列を有するsiRNAとは、RNAi機構（例えばRISC複合体）またはRNAiプロセスによって、標的mRNAの破壊を誘発するのに十分な配列をsiRNAが有することを意味する。siRNA分子を、アンチセンス鎖のそれぞれの残基が標的分子内の残基に相補的であるように設計することができる。あるいは、分子内に、安定性を増加させるため、および／または、前記分子の活性のプロセッシングを亢進させるために、置換を行うことができる。置換は、鎖内において行うことができ、または、鎖の末端の残基に行うこともできる。
【００４３】
[0059]  本発明の第一の観点の1つの態様において、dsRNAすなわち前駆RNAi分子は、ダイサーによってプロセッシングされてsiRNAが産生されるために十分な長さを有する。本態様に従って、適切なdsRNAは、長さが少なくとも25ヌクレオチドかつ約30ヌクレオチド未満の1つのオリゴヌクレオチド配列である、第一配列を含む。RNAの本配列は、約26から29ヌクレオチドの間の長さであることができる。本配列の長さは、約27または28ヌクレオチド、あるいは、27ヌクレオチドであることができる。dsRNAの第二配列は、真核細胞の細胞質内などの生物学的条件下で、第一配列とアニーリングする、いかなる配列であってもよい。一般に、第二オリゴヌクレオチド配列は、少なくとも19の、第一オリゴヌクレオチド配列と相補的な塩基対を有し、さらに典型的には、第二オリゴヌクレオチド配列は、約21またはそれ以上の、あるいは、約25またはそれ以上の、第一オリゴヌクレオチド配列と相補的な塩基対を有するだろう。1つの態様において、第二配列は第一配列と同じ長さであり、そして、dsRNAは平滑末端である。別の態様において、dsRNAの末端は突出部を有する。
【００４４】
[0060]  本第一の態様の特定の観点において、dsRNAの第一オリゴヌクレオチド配列および第二オリゴヌクレオチド配列は、化学的に合成することができ、そして典型的に化学的に合成される、別のオリゴヌクレオチド鎖上に存在する。いくつかの態様において、両鎖の長さは、26から30ヌクレオチドの間である。その他の態様において、両鎖の長さは、25から30ヌクレオチドの間である。1つの態様において、両鎖の長さは27ヌクレオチドであり、完全に相補的で、そして平滑末端を有する。dsRNAは、分子内アニーリングを行う1本のRNAオリゴヌクレオチド由来であることができ、あるいは、より典型的には、第一配列および第二配列は、別のRNAオリゴヌクレオチド上に存在する。1つの態様において、1つあるいは両方のオリゴヌクレオチド鎖は、ダイサーの基質として働くことができる。その他の態様において、遺伝子発現阻害における二本鎖RNA構造の効果を最大にする位置に（in an orientation）、ダイサーが二重鎖RNA構造に結合するのを促進する、少なくとも1つの修飾が存在する。dsRNAは、1つあるいはそれ以上のデオキシリボ核酸（DNA）塩基置換を含むことができる。
【００４５】
[0061]  2つの別のオリゴヌクレオチドを含む適切なdsRNA組成物を、化学的リンカーによって、そのアニーリング領域の外側で化学的に連結することができる。多数の適切な化学的リンカーが当技術分野において既知であり、そして、使用することができる。適切な基は、dsRNA上でのダイサー活性を阻害せず、そして、標的遺伝子から転写されたRNAの、誘導される分解を阻害しないであろう。あるいは、アニーリングする2つのオリゴヌクレオチド上にヘアピン構造を作成して、dsRNA組成物を形成するといったように、2つの別のオリゴヌクレオチドを第三のオリゴヌクレオチドによって連結することができる。ヘアピン構造はdsRNA上のダイサー活性を阻害せず、そして、標的遺伝子から転写されるRNAの、誘導される分解を阻害しないだろう。
【００４６】
[0062]  第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドは、完全に相補的である必要はない。実際に、1つの態様において、センス鎖の3'末端は、1つまたはそれ以上のミスマッチを含む。1つの観点において、約2つのミスマッチがセンス鎖の3'末端に組み込まれる。別の態様において、本発明のdsRNAは、長さがそれぞれ27ヌクレオチドの2つのRNAオリゴヌクレオチドを含む二本鎖RNA分子で、そして、互いにアニーリングすると平滑末端を有し、そして、センス鎖の3‘末端（アンチセンス鎖の5'末端）に2つのヌクレオチドミスマッチを有する。おそらくsiRNAのRISCへの進入に伴って生じる、いくつかの律速巻き戻し段階に作用することにより、アンチセンス鎖のRISCへの進入を促進するか、または有利にするため、ミスマッチ、または、熱力学的安定性の減少の使用（特に3'-センス/5'-アンチセンス位置において）が提唱されている（Schwarzら、2003；Khvorovaら、2003）。従って、末端の塩基組成は、活性21 mer siRNA二重鎖の選択における設計アルゴリズムに含まれている（Ui-Teiら、2004；Reynoldsら、2004）。本態様のdsRNAのダイサー切断によって、ミスマッチを含む小さな末端の配列は、アンチセンス鎖と対にならずに残される（3'突出部の一部になる）か、あるいは、最終の21 mer siRNAから完全に切り落とされるであろう。そのため、これらの“ミスマッチ”は、RISCの最終RNA組成物中にミスマッチとして存続しない。驚くべきことに、ダイサー基質のセンス鎖3'末端での塩基のミスマッチ、またはセグメント不安定化が、おそらく、ダイサーによるプロセッシングを促進することにより、RNAiにおける合成二重鎖の有効性を改善することが見出された。
【００４７】
[0063]  これらの25から約30ヌクレオチドのより長いdsRNA種が、有効性および作用期間に関して、予想外に効果的な結果を与えることが、実験的に見出された。本発明の基本的な理論に束縛されることは望ましくないが、より長いdsRNA種は細胞の細胞質において酵素ダイサーの基質として働くと考えられる。本発明のdsRNAをより短いセグメントに切断することに加えて、ダイサーは、切断されたdsRNA由来の一本鎖切断産物のRISC複合体への取り込みを促進して、標的遺伝子由来の細胞質RNAの分解に関与すると考えられる。本明細書中で記述される研究は、ダイサーによるdsRNA種の切断能が、dsRNA種の有効性および作用期間の増加と対応することを示している。
【００４８】
[0064]  本発明の第一の観点の第二の態様において、d sRNAすなわち前駆RNAi分子は、ダイサーによるそのプロセッシングを促進する、いくつかの特性を有する。本態様に従って、dsRNAは、ダイサーによってプロセッシングされ活性siRNAを産生するのに十分な長さ、および、以下の特性の少なくとも1つを有する：（i）dsRNAが非対称であり、例えば，アンチセンス鎖上に3'突出部を有し、そして（ii）dsRNAがセンス鎖に修飾された3'末端を有し、ダイサー結合および活性siRNAへのdsRNAのプロセッシングの配向を導く。本態様に従って、dsRNAの最も長い鎖は、24〜30ヌクレオチドを含む。1つの態様において、dsRNAは、センス鎖は22〜28ヌクレオチドを含み、そして、アンチセンス鎖は24〜30ヌクレオチドを含むといったように、非対称である。従って、結果として生じるdsRNAは、アンチセンス鎖の3'末端に突出部を有する。突出は1〜3ヌクレオチドであり、例えば、2ヌクレオチドである。センス鎖もまた、5'リン酸を有してよい。
【００４９】
[0065]  別の態様において、センス鎖はセンス鎖の3'末端に位置する適切な修飾因子によって、ダイサープロセッシングのために修飾される、すなわち、dsRNAはダイサー結合およびプロセッシングの配向を導くように設計される。適切な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、および類似体などのヌクレオチド、および、蛍光分子および類似体などの立体的に込み合った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、dNMP中に通常存在する2'-デオキシリボフラノシル糖が2-ヒドロキシエトキシメチル基に置換されている。その他のヌクレオチド修飾因子には、3'-デオキアデノシン（コルジセピンcordycepin）、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデオキシ-3'チアシチジン（3TC）、2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン（d4T）、並びに、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシ-3'チアシチジン（3TC）、および2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン（d4T）の一リン酸ヌクレオチドが含まれ得る。1つの態様において、デオキシヌクレオチドは、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、1-3ヌクレオチド修飾因子、または2ヌクレオチド修飾因子は、センス鎖の3'末端上のリボヌクレオチドと置換される。立体的に込み合った分子を使用する場合、それらをアンチセンス鎖の3'末端のリボヌクレオチドに結合させる。従って、修飾因子の組み込みによって鎖の長さは変化しない。別の態様において、本発明は、アンチセンス鎖のダイサープロセッシングの配向を導くためにdsRNA内に2つのDNA塩基を置換することを意図する。本発明のさらなる態様において、センス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端で二重鎖の平滑末端を形成するセンス鎖の3'末端の2つのリボヌクレオチドを、2つの末端DNA塩基で置換し、そして、アンチセンス鎖の3'末端に2ヌクレオチドのRNA突出部が位置する。これは、平滑末端にDNA、そして、突出末端にRNA塩基をもつ、非対称の組成物である。
【００５０】
[0066]  センス及びアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中に見出される条件などの、生物学的条件下において、アニーリングする。さらに、dsRNAの配列の一方、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも19ヌクレオチドの長さの配列を有し、これらのヌクレオチドはアンチセンス鎖の3'末端に隣接する21ヌクレオチド領域中にあり、そして標的遺伝子から産生されるRNAのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【００５１】
[0067]  さらに本態様に従って、dsRNA、すなわち前駆RNAi分子は、以下のさらなる特性の1つあるいはそれ以上をも有することができる：（a）アンチセンス鎖が典型的な21 merから右方シフトを有する、（b）鎖が完全に相補的でなくてよい、すなわち、鎖が単一のミスマッチ対を含んでよい、および、（c）locked核酸などの塩基修飾が、センス鎖の5'末端に含まれてよい。“典型的な”21 mer siRNAは、従来技術を使用して設計される。1つの技術において、一般的には様々な部位を、並行して試験するか、あるいは、同じ標的に特異的ないくつかの別のsiRNA二重鎖を含むプールにおいて、試薬のうちの1つが効果的であろうことを期待して試験する（Jiら、2003）。その他の技術は、活性RNAiエフェクター分子を得る可能性を増加させるために、設計規則およびアルゴリズムを使用する（Schwarzら、2003；Khvorovaら、2003；Ui-Teiら、2004；Reynoldsら、2004；Krolら、2004；Yuanら、2004；Boeseら、2005）。siRNAのハイスループット選択もまた、開発されてきている（本明細書中で参照として援用される、米国公開特許出願番号2005/0042641 A1）。可能性のある標的部位を、二次構造予測によって分析することもできる（Healeら、2005）。本21 merは次に21 merの5'末端の3〜9付加ヌクレオチドを含む右方シフトの設計に用いられる。これらの付加ヌクレオチドの配列はいかなる配列を有してもよい。1つの態様において、付加リボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。本態様においても、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は必要とされない。
【００５２】
[0068]  第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドは、完全に相補的である必要はない。それらは、生物学的条件下でアニーリングし、そして、標的配列に十分に相補的なsiRNAを産生する、ダイサーの基質を提供するために、実質的に相補的であることのみを必要とする。locked核酸、またはLNAは、当業者に良く知られている（Elmanら、2005；Kurreckら、2002；Crinelliら、2 002；BraaschおよびCorey、2001；Bondensgaardら、2000；Wahlestedtら、2000）。1つの態様において、LNAはセンス鎖の5'末端に組み込まれる。別の態様において、LNAは、アンチセンス鎖に3'突出部を含むように設計される二重鎖のセンス鎖の5'末端に組み込まれる。
【００５３】
[0069]  1つの態様において、dsRNAは、長さ25塩基対を有するセンス鎖、および2塩基の3'突出部をもつ長さ27塩基対を有するアンチセンス鎖をもつ、非対称な構造を有する。別の態様において、非対称構造を有する本dsRNAは、センス鎖の3'末端において2つのリボヌクレオチドの代わりに2つのデオキシヌクレオチドをさらに含む。
【００５４】
[0070]  2つの別のオリゴヌクレオチドを含む適切なdsRNA組成物を、第三の構造によって、化学的に連結することができる。第三の構造は、dsRNA上でのダイサー活性を阻害せず、そして、標的遺伝子から転写されるRNAの、誘導される分解を阻害しないであろう。1つの態様において、第三の構造は化学リンカーであってよい。多数の適切な化学リンカーが当技術分野において既知であり、そして、使用することができる。あるいは、第三の構造は、アニーリングする2つのオリゴヌクレオチド上にヘアピン構造を作成して、dsRNA組成物を形成するといった様式で、dsRNAの2つのオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドであってよい。ヘアピン構造はdsRNA上のダイサー活性を阻害せず、そして、標的遺伝子から転写されるRNAの、誘導される分解を阻害しないだろう。
【００５５】
[0071]  本発明の第一の観点の第三の態様において、dsRNAすなわち前駆RNAi分子は、ダイサーによるそのプロセッシングを促進する、いくつかの特性を有する。本態様に従って、dsRNAは、ダイサーによってプロセッシングされsiRNAを産生するのに十分な長さ、および、以下の特性の少なくとも1つを有する：（i）dsRNAが非対称であり、例えば、センス鎖上に3'突出部を有し、そして（ii）dsRNAがアンチセンス鎖に修飾された3'末端を有し、ダイサー結合および活性siRNAへのdsRNAのプロセッシングの配向を導く。本態様に従って、dsRNAの最も長い鎖は、24〜30ヌクレオチドを含む。1つの態様において、センス鎖は24〜30ヌクレオチドを含み、そして、アンチセンス鎖は22〜28ヌクレオチドを含む。従って、結果として生じるdsRNAは、センス鎖の3'末端に突出部を有する。突出は1〜3ヌクレオチドであり、例えば、2ヌクレオチドである。アンチセンス鎖もまた、5'リン酸を有してよい。
【００５６】
[0072]  別の態様において、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の3'末端に位置する適切な修飾因子によって、ダイサープロセッシングのために修飾される、すなわち、dsRNAはダイサー結合およびプロセッシングの配向を導くように設計される。適切な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、および類似体などのヌクレオチド、および、蛍光分子および類似体などの立体的に込み合った分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、dNMP中に通常存在する2'-デオキシリボフラノシル糖が2-ヒドロキシエトキシメチル基に置換されている。その他のヌクレオチド修飾因子には、3'-デオキアデノシン（コルジセピンcordycepin）、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデオキシ-3'チアシチジン（3TC）、2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン（d4T）、並びに、3'-アジド-3'-デオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシ-3'チアシチジン（3TC）、および2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン（d4T）の一リン酸ヌクレオチドが含まれ得る。1つの態様において、デオキシヌクレオチドは、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、1-3ヌクレオチド修飾因子、または2ヌクレオチド修飾因子は、アンチセンス鎖の3'末端上のリボヌクレオチドと置換される。立体的に込み合った分子を使用する場合、それらをアンチセンス鎖の3'末端のリボヌクレオチドに結合させる。従って、修飾因子の組み込みによって鎖の長さは変化しない。別の態様において、本発明は、ダイサープロセッシングの配向を導くためにdsRNA内に2つのDNA塩基を置換することを意図する。さらなる発明において、センス鎖の5'末端およびアンチセンス鎖の3'末端で二重鎖の平滑末端を形成する、2つのリボヌクレオチドの代わりに、2つの末端DNA塩基がアンチセンス鎖の3'末端に配置され、そして、センス鎖の3'末端に2ヌクレオチドのRNA突出部が配置される。これは、平滑末端にDNA、そして、突出末端にRNA塩基をもつ、非対称の組成物である。
【００５７】
[0073]  センス及びアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中に見出される条件などの、生物学的条件下において、アニーリングする。さらに、dsRNAの配列の一方、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも19ヌクレオチドの長さの配列を有し、これらのヌクレオチドはアンチセンス鎖の3'末端に隣接し、そして標的遺伝子から産生されるRNAのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【００５８】
[0074]  さらに本態様に従って、dsR NA、すなわち前駆RNAi分子は、以下のさらなる特性の1つあるいはそれ以上をも有することができる：（a）アンチセンス鎖が典型的な21 merから右方シフトを有し、そして、（b）鎖が完全に相補的でなくてよい、すなわち、鎖は単一のミスマッチ対を含んでよい。“典型的な”21 mer siRNAは、上述の通り、従来技術を使用して設計される。本21 merは次に21 merの5'末端の1〜7付加ヌクレオチドを含む右方シフトの設計に用いられる。これらの付加ヌクレオチドの配列はいかなる配列を有してもよい。付加されるリボヌクレオチドは標的遺伝子配列と相補的であってよいが、標的配列とアンチセンスsiRNAとの間の完全な相補性は必要とされない。つまり、結果として生じるアンチセンスsiRNAは、標的配列と十分に相補的である。第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドは、完全に相補的である必要はない。それらは、生物学的条件下でアニーリングし、そして、標的配列に十分に相補的なsiRNAを産生する、ダイサーの基質を提供するために、実質的に相補的であることのみを必要とする。
【００５９】
[0075]  1つの態様において、dsRNAは、長さ2 5塩基対を有するアンチセンス鎖、および1〜4塩基の3'突出部をもつ長さ27塩基対を有するセンス鎖をもつ、非対称な構造を有する。別の態様において、非対称構造を有する本dsRNAは、アンチセンス鎖の3'末端において2つのデオキシヌクレオチドをさらに含む。
【００６０】
[0076]  適切なdsRNA組成物は、第三の構造によって連結されることができる2つの別のオリゴヌクレオチドを含む。第三の構造は、dsRNA上でのダイサー活性を阻害せず、そして、標的遺伝子から転写されるRNAの、誘導される分解を阻害しないであろう。1つの態様において、第三の構造は化学リンカーであってよい。多数の適切な化学リンカーが当技術分野において既知であり、そして、使用することができる。あるいは、第三の構造は、アニーリングする2つのオリゴヌクレオチド上にヘアピン構造を作成して、dsRNA組成物を形成するといった様式で、dsRNAの2つオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドであってよい。ヘアピン構造はdsRNA上のダイサー活性を阻害せず、そして、標的遺伝子から転写されるRNAの、誘導される分解を阻害しないだろう。
【００６１】
[0077]  本発明のdsRNA組成物の1つの特徴は、それらがダイサーの基質として働くことができることである。典型的に、本発明のdsRNA組成物は、ダイサー、その他のRNase、またはそれらを含む抽出物によって処理されていないだろう。本発明において、このタイプの前処理は、ダイサーのアニーリングを阻害する可能性がある。dsRNA組成物がダイサー基質として働くかどうかを決定する、いくつかの方法が既知であり、そして、使用することができる。例えば、ダイサー活性は、リコンビナントダイサー酵素キット（GTS、San Diego、CA）を製造者の指示に従って使用して、in vitroで測定することができる。ダイサー活性は、dsRNAを細胞に処理し、次にそれらを回収する前にそれらを24時間維持し、そしてそのRNAを単離することにより、in vivoで測定することができる。RNAは、製造者の指示に従ってRNeasyTMキット（Qiagen）を用いるなどの標準的な方法を使用して、単離することができる。単離されたRNAは、10％PAGEゲルで分離することができ、それを使用して標準的なRNAブロットを調製し、Starfire（登録商標）オリゴ標識システム（Integrated DNA Technologies, Inc.、Coralville、IA）で標識したオリゴヌクレオチドなどの、適当な標識デオキシオリゴヌクレオチドでプローブする（probed）ことができる。
【００６２】
[0078]  dsRNAが有する細胞への影響は、細胞そのものに依存する可能性がある。いくつかの状況において、dsRNAは、ある細胞型においてアポトーシスまたは遺伝子サイレンシングを誘導することができ、そして別の細胞では誘導できない。従って、dsRNAがある細胞においては使用するのに適当であり、そして、別の細胞では適当でないという可能性がある。“適当である”と見なされるには、dsRNA組成物が、それが使用される可能性のあるすべての状況下で適当である必要はなく、むしろ、特定の組み合わせの状況下においてのみ適当である必要がある。
【００６３】
[0079]  本発明のdsRNAすなわち前駆RNAi分子は、その修飾によってdsRNA組成物がダイサーの基質として働くことを阻害されない限り、修飾を含むことができる。1つの態様において、dsRNAのダイサープロセッシングを促進する、1つあるいはそれ以上の修飾が行われる。第二の態様において、より効果的なRNAi産生をもたらす、1つまたはそれ以上の修飾が行われる。第三の態様において、より高いRNAi効果を支持する、1つまたはそれ以上の修飾が行われる。第四の態様において、細胞に運搬される各dsRNA分子あたりのより高い有効性をもたらす、1つまたはそれ以上の修飾が行われる。修飾は、3'末端領域、5'末端領域、3'末端および5'末端領域の両方、あるいは、いくつかの例においては配列中の様々な位置において、組み込まれることができる。上述の制限を考慮した上で、あらゆる数および組み合わせの修飾を、dsRNAに組み込むことができる。多数の修飾が存在する場合、それらは同じか、あるいは異なってもよい。塩基、糖部分、リン酸バックボーン、およびそれらの組み合わせへの修飾が意図される。5'末端のどちらかは、リン酸化することができる。
【００６４】
[0080]  リン酸バックボーンに意図される修飾の例には、メチルホスホネートを含むホスホネート、ホスホロチオエート、およびアルキルホスホトリエステルなどのホスホトリエステル修飾、および類似体が含まれる。糖部分に意図される修飾の例には、2'-O-メチルなどの2'-アルキルピリミジン、2'-フルオロ、アミノ、およびデオキシ修飾、および類似体が含まれる（例えばAmarzguiouiら、2003参照）。塩基部分に意図される修飾の例には、脱塩基糖、2-O-アルキル修飾ピリミジン、4-チオウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨードウラシル、および5-（3-アミノアリル）-ウラシル、および類似体が含まれる。locked核酸またはLNAもまた、組み込まれることができる。その他の多数の修飾が既知であり、そして、上記の基準が満たされる限り、使用することができる。修飾の例は、それぞれ本明細書中で参照として援用される、米国特許番号5,684,143、5,858,988および6,291,438、および、米国公開特許出願番号2004/0203145 A1にも開示される。その他の修飾は、Herdewijn（2000）、Eckstein（2000）、Rusckowskiら（2000）、Steinら（2001）；Vorobjevら（2001）に開示される。
【００６５】
[0081]  1つあるいはそれ以上の意図される修飾は、どちらかの鎖に組み込まれることができる。DsiRNAにおける修飾の配置は、より高い有効性および安定性を与えること、毒性を減少させること、ダイサープロセッシングを促進すること、および、免疫応答を最小限にすること、を含む、DsiRNAの特徴に大きく影響を与えることができる。1つの態様において、アンチセンス鎖あるいはセンス鎖あるいは両鎖は、1つまたはそれ以上の2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを有する。別の態様において、アンチセンス鎖は、2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを含む。別の態様において、アンチセンス鎖は、2'-O-メチル修飾ヌクレオチドが含まれる3'突出部を含む。アンチセンス鎖は、さらなる2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを含むこともできる。
【００６６】
[0082]  さらに、dsRNA構造は、ダイサー切断から生じたオリゴヌクレオチドセグメントが、遺伝子発現を阻害するのにもっとも効果的なオリゴヌクレオチドの部分であるだろうことを確認するために、最適化することができる。例えば、本発明の1つの態様において、dsRNA構造の27-bpオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を阻害すると予想される21から22-bpセグメントをアンチセンス鎖の3'-末端に配置して、合成される。アンチセンス鎖の5'末端に位置する残りの塩基は、ダイサーによって切断され、そして廃棄されるだろう。この切断される部分は、相同（すなわち、標的配列の配列に基づいている）あるいは非相同であってよく、そして、核酸鎖を伸長するために付加されることができる。
【００６７】
[0083]  1つの態様において、センス鎖は24〜26ヌクレオチドを含み、センス鎖の3'末端の2ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。センス鎖は、5'末端にリン酸を含む。アンチセンス鎖は、26〜29ヌクレオチドを含み、そして、1〜4ヌクレオチドの3'突出部を含む。3'突出部を含むヌクレオチドは2'-O-メチルで修飾される。アンチセンス鎖は、3'突出部に隣接するアンチセンス鎖の第一モノマーで始まり、そして、3'突出部に隣接する第一モノマーから15〜19ヌクレオチドに渡る、交互に2'-O-メチル修飾されたヌクレオチドを含み、それによって、ダイサー切断後の残りの21〜22塩基対のアンチセンス鎖は、修飾されたヌクレオチドを含むだろう。例えば、27ヌクレオチドアンチセンス鎖において、アンチセンス鎖の5'末端の一番目の塩基を位置番号1と数えると、2'-OMe修飾は、塩基9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、および27に位置するだろう。1つの態様において、DsiRNAは
【００６８】
【化３】
2010525813.tif 000005
【００６９】
を含み、式中、“X”＝RNA、“p”＝リン酸基、
【００７０】
【化４】
2010525813.tif 000006
【００７１】
＝2'-O-メチル修飾RNA、“Y”は随意に2'-O-メチルRNAモノマーである、1〜4 RNAモノマーからなる突出ドメイン、そして、“D”＝DNAである。上の鎖はセンス鎖、そして、下の鎖はアンチセンス鎖である。
【００７２】
[0084]  RNAは酵素的に、あるいは、部分的に／全て有機合成によって作成することができ、そして、修飾リボヌクレオチドはin vitroで酵素的または有機合成によって導入することができる。1つの態様において、各鎖は化学的に調製される。RNA分子を合成する方法、特に、VermaおよびEckstein（1998）に記述される、あるいは、本明細書中で記述される化学合成方法は、当技術分野において既知である。
【００７３】
[0085]  周知のように、RNAi方法は、幅広い種類の生物の幅広い種類の遺伝子に適用でき、そして、開示される組成物および方法は、これらの状況のそれぞれにおいて使用することができる。開示される組成物および方法によって標的とされることができる遺伝子の例には、細胞内に天然にある遺伝子である内因性遺伝子、または通常は細胞内に天然にはない遺伝子が含まれる。限定ではないが、これらの遺伝子には、癌遺伝子、サイトカイン遺伝子、イディオタイプ（Id）タンパク質遺伝子、プリオン遺伝子、血管新生を誘導する分子を発現する遺伝子、接着分子の遺伝子、細胞表面受容体、転移に関与するタンパク質、プロテアーゼ、アポトーシス遺伝子、細胞周期調節遺伝子、EGFおよびEGF受容体を発現する遺伝子、MDR1遺伝子などの多剤耐性遺伝子が含まれる。
【００７４】
[0086]  より特異的には、本発明の標的mRNAは、細胞質タンパク質（例えば、核、細胞質、膜貫通、または膜結合タンパク質）のアミノ酸配列を特定する。別の態様において、本発明の標的mRNAは、細胞外タンパク質（例えば、細胞外マトリックスタンパク質または分泌タンパク質）のアミノ酸配列を特定する。本明細書中で使用される場合、タンパク質の“アミノ酸配列を特定する”という語句は、遺伝子コードの規則に従ってmRNA配列がアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。以下のタンパク質の分類は、例示目的のために列挙される：発生タンパク質（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、翼状らせん（Winged helix）ファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインおよびそれらの受容体、増殖／分化因子およびそれらの受容体、神経伝達物質、およびそれらの受容体）；癌遺伝子コードタンパク質（例えば、ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETSI、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIM I、PML、RET、SRC、TALI、TCL3、およびYES）；腫瘍抑制タンパク質（例えば、APC、BRCAl、BRCA2、MADH4、MCC、NF I、NF2、RB I、TP53、およびWTI）；および酵素（例えば、ACCシンターゼおよびオキシターゼ、ACPデザチュラーゼ、およびヒドロキシラーゼ、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ（pyrophorylase）、ATPase、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコンシンターゼ、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合デンプン合成酵素、GTPase、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ（hernicellulase）、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調節因子シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、RUBISCO、トポイソメラーゼ、およびキシラナーゼ）。
【００７５】
[0087]  1つの観点において、本発明の標的mRNA分子は、病態に関連するタンパク質のアミノ酸配列を特定する。例えば、タンパク質は、病原体関連タンパク質（例えば、宿主の免疫抑制、病原体の複製、病原体の伝播、または感染の維持に関与するウイルスタンパク質）、または、宿主への病原体の侵入、病原体または宿主による薬物代謝、病原体のゲノムの複製または組み込み、宿主における感染の成立または伝播、あるいは、病原体の次世代の組み立てを促進する宿主タンパク質であってよい。病原体には、フラビウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、レンチウイルスを含むレトロウイルスなどのRNAウイルス、または、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルスなどのDNAウイルス、またはその他が含まれる。さらに病原体には、細菌、菌類、蠕虫、住血吸虫、およびトリパノソーマが含まれる。その他の種類の病原体は、哺乳類転移因子を含むことができる。あるいは、タンパク質は、腫瘍関連タンパク質または自己免疫疾患関連タンパク質であってよい。
【００７６】
[0088]  標的遺伝子は、あらゆる生物に由来し、あるいは、含まれてよい。生物は、植物、動物、原生動物、細菌、ウイルス、または菌類であってよい。例えば、本明細書中で参照として援用される、米国特許番号6,506,559参照。
【００７７】
[0089]  別の観点において、本発明は、本発明のdsRNAを含む薬剤組成物を提供する。dsRNA試料を適切に配合し、そして、十分な量の試料を細胞内に入れ、遺伝子サイレンシングをもし起こす場合には誘導することができる、あらゆる手段によって細胞環境に導入することができる。dsRNAの多数の配合法が当技術分野において既知であり、そして、dsRNAが機能できるように標的細胞に進入させることができる限り、使用することができる。例えば、それぞれ本明細書中で参照として援用される、米国公開特許出願番号2004/0203145 A1および2005/0054598 A1参照。例えば、dsRNAは、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造、および、カプシド中に配合されることができる。カチオン性脂質を用いるdsRNAの配合は、dsRNAの細胞へのトランスフェクションを促進するために使用されることができる。例えば、リポフェクチン（本明細書中で参照として援用される米国特許番号5,705,188）、カチオン性グリセロール誘導体などのカチオン性脂質、および、ポリリジン（本明細書中で参照として援用される公開PCT国際出願WO 97/30731）などのポリカチオン性分子を使用することができる。適切な脂質には、Oligofectamine、Lipofectamine（Life Technologies）、NC388（Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.、Boulder、CO）、またはFuGene 6（Roche）が含まれ、それらすべては、製造者の指示に従って使用することができる。
【００７８】
[0090]  細胞環境にdsRNAを導入する方法は、細胞の種類およびその環境の構成に依存するであろうことは理解されてよい。例えば、細胞が液体中に存在する場合、1つの好ましい配合はリポフェクタミンなどの脂質剤を用いるもので、そして、dsRNAを細胞の液体環境に直接添加することができる。脂質剤は、静脈注射、筋肉注射、または腹腔内注射によって、あるいは経口で、または、吸入によって、または当技術分野で既知のその他の方法などにより、動物にも投与することができる。製剤が哺乳類および、より特異的にはヒトなどの動物への投与に適当である場合、製剤は薬学的に許容可能でもある。オリゴヌクレオチドの投与のための薬学的に許容可能な製剤は、既知であり、そして、使用することができる。いくつかの例において、dsRNAを緩衝液または生理食塩水中に配合し、そして、配合されたdsRNAを細胞内へ、卵母細胞を用いる研究と同様に、直接注入することが好ましいだろう。dsRNA二重鎖の直接注入もまた、行われてよい。dsRNA導入の適当な方法については、本明細書中で参照として援用される、米国公開特許出願番号2004/0203145 A1を参照のこと。
【００７９】
[0091]  適当量のdsRNAが導入されなければならず、そして、これらの量は、標準的な方法を使用して実験的に決定することができる。典型的には、細胞の環境中における個々のdsRNA種の効果的な濃度は、約50ナノモルまたはそれ以下、10ナノモルまたはそれ以下であるだろう。あるいは、約1ナノモルまたはそれ以下の濃度において組成物を使用することができる。その他の態様において、約200ピコモルまたはそれ以下、および約50ピコモルまたはそれ以下の濃度をも使用する方法を、多くの状況において使用することができる。
【００８０】
[0092]  本方法は、dsRNA組成物が、その効果を発揮するために十分な量のdsRNAが細胞に入ることができるように配合されるという条件で、細胞がその中で生存可能であるあらゆる細胞外マトリックスへ、dsRNA組成物を添加することによって、本方法を実行することができる。例えば、本方法は、液体培地または細胞成育培地などの液体中、組織外植片中、または、哺乳類および特にヒトなどのを動物を含む生物個体中に存在する、細胞への使用に適している。
【００８１】
[0093]  標的遺伝子の発現は、当技術分野において現在既知の、あるいは、今後開発される、適当な方法によって決定することができる。標的遺伝子の発現を測定するために使用される方法は、標的遺伝子の特質に依存するだろうことは理解することができる。例えば、標的遺伝子が1つのタンパク質をコードする場合、“発現”という用語は、その遺伝子由来のタンパク質または転写物をいうことができる。前記の例において、標的遺伝子の発現は、標的遺伝子に対応するmRNAの量を測定することによって、あるいは、そのタンパク質の量を測定することによって、決定することができる。タンパク質は、染色または免疫ブロッティングによるなどのタンパク質アッセイ、または、タンパク質が測定可能な反応を触媒する場合は、反応速度を測定することによって、測定することができる。前記のすべての方法は、当技術分野において既知であり、そして、使用することができる。遺伝子産物がRNA種である場合、遺伝子産物に対応するRNAの量を決定することにより、発現を測定することができる。遺伝子発現を検出するいくつかの具体的な方法は、実施例1に記載される。測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物、またはその他のあらゆる適当な供給源物質で行われることができる。
【００８２】
[0094]  標的遺伝子の発現が減少したかどうかの決定は、遺伝子発現の変化を確実に検出できる適当な方法によって行われることができる。典型的には、細胞環境に未消化dsRNAを、少なくともそのdsRNAの一部分が細胞質に入るように導入し、そして次に、標的遺伝子の発現を測定することにより、前記決定は行われる。同じ測定を、同一の未処理細胞で行い、そして、それぞれの測定から得られる結果を比較する。
【００８３】
[0095]  dsRNAは薬理学的に有効な量のdsRNA、および、薬学的に許容可能な担体を含む薬剤組成物として、製剤化されることができる。薬理学的または治療的に有効な量とは、意図される薬理学的、治療的、または、予防的結果を生み出すのに有効なdsRNAの量をいう。“薬理学的に有効な量”および“治療的に有効な量”または単純に“有効な量”という語句は、意図される薬学的、治療的、または予防的結果を生み出すのに有効なRNAの量をいう。例えば、規定の臨床治療が、疾病または疾患に関連する測定可能なパラメーターの少なくとも20％の減少がある場合に有効であるとみなすならば、その疾病または疾患の治療における薬物の治療的に有効な量とは、そのパラメーターを少なくとも20％減少させる効果を示すのに必要な量である。
【００８４】
[0096]  “薬学的に許容可能な担体”という語句は、治療薬の投与における担体を言う。例となる担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。経口投与される薬物においては、薬学的に許容可能な担体には、限定するものではないが、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香料添加剤、着色剤、および保存料などの薬学的に許容可能な添加剤が含まれる。適当な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、および、ラクトースが含まれ、また、コーンスターチおよびアルギン酸は適当な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれてよく、また、滑沢剤は、存在するならば、一般的にはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石であろう。必要に応じて、錠剤は、消化管での吸収を遅らせるため、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの物質で覆うことが可能である。開示されるdsRNA組成物の薬学的に許容可能な担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマーナノカプセル、またはポリマーマイクロカプセルなどのミセル構造であってよい。
【００８５】
[0097]  ポリマーナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセルに包まれた、あるいは、結合したdsRNAの細胞への運搬および放出を促進する。それらは、特にポリブチルシアノアクリレートを含む、ポリマーおよびモノマー（monomelic）材料を含む。材料および製造方法の概要は公開されている（Kreuter、1991参照）。モノマーおよび／またはオリゴマー前駆体から、重合／ナノ粒子生成段階において形成されるポリマー材料は、それ自体が先行技術より既知であり、ナノ粒子を製造する分野の技術者が、通常の技術に従って適切に選択することができる、ポリマー材料の分子量および分子量分布も同様に既知である。
【００８６】
[0098]  適切に製剤化された本発明の薬剤組成物は、当技術分野において既知である、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、膣内、および局所（口腔および舌下を含む）投与を含む非経口経路によるなどの手段によって、投与されることができる。いくつかの態様において、薬剤組成物は、静脈内または腹腔内（intraparenteral）注入または注射によって、投与される。
【００８７】
[0100]  一般にdsRNAの適当な投与量単位は、1日当たりレシピエントのキログラム体重当たり0.001〜0.25ミリグラムの範囲内、または、1日当たりキログラム体重当たり0.01〜20マイクログラムの範囲内、または、1日当たりキログラム体重当たり0.01〜10マイクログラムの範囲内、または、1日当たりキログラム体重当たり0.10〜5マイクログラムの範囲内、または、1日当たりキログラム体重当たり0.1〜2.5マイクログラムの範囲内であろう。dsRNAを含む薬剤組成物は、毎日1回投与されることができる。しかしながら、治療薬はまた、1日を通して適当な間隔をあけて投与される、2、3、4、5、6またはそれ以上の回数の小用量を含む、用量単位で投与されることもできる。その場合、各小用量に含まれるds RNAは、1日の総用量単位に達するために、それに対応してより少なくなければならない。用量単位は、例えば、数日間に渡ってdsRNAの持続的かつ一定した放出を提供する、従来の徐放性製剤を使用して、数日間に1回の投与用に配合することもできる。徐放性製剤は、当技術分野においてよく知られる。本態様において、用量単位は、1日用量の対応する倍数量を含む。製剤にかかわらず、薬剤組成物は、投与される動物またはヒトにおいて、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量でdsRNAを含まなければならない。組成物は、dsRNAの多数回の単位の合計が十分な用量を含むような方法で、配合されることができる。
【００８８】
[0101]  細胞培養アッセイおよび動物研究よりデータを得て、ヒトに対して適当な用量の範囲を導き出すことができる。本発明の組成物の用量は、ほとんどあるいはまったく毒性のないED50（既知の方法により決定される）を含む、血中濃度の範囲内にある。用量は、用いられる投薬形態、および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化することができる。本発明の方法において使用されるすべての化合物において、治療的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイにより推測することができる。投与量は、細胞培養において決定されるIC50（すなわち、症状の半数の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の循環血漿濃度に達するように、動物モデルにおいて製剤化されることができる。前記の情報は、ヒトにおいて有用な投与量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のdsRNAレベルは、標準的な方法によって、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。
【００８９】
[0102]  さらなる観点において、本発明は、標的遺伝子の発現によって引き起こされる疾患または疾患を発症する危険性を有する、被験体を治療する方法に関連する。本態様において、dsRNAは、1つまたはそれ以上の、細胞増殖および／または分化疾患、骨代謝関連疾患、免疫疾患、造血障害、心疾患、肝疾患、ウイルス性疾患、または代謝異常を調節する、新規治療薬として機能することができる。方法は、標的遺伝子の発現がサイレンシングされるように、本発明の薬剤組成物を患者（例えばヒト）へ投与することを含む。それらの高い特異性によって、本発明のdsRNAは疾患細胞および組織の標的遺伝子のmRNAを、特異的に標的にする。
【００９０】
[01 03]  疾患の予防において、標的遺伝子は、疾患の開始または維持に必要とされるものであるか、あるいは、病気に罹患する、より高い危険性に関連することが見出されているものであってよい。疾患の治療において、dsRNAを、疾患を示している細胞または組織と接触させることができる。例えば、癌に関連する突然変異遺伝子または腫瘍細胞において高レベルで発現されるもの、例えばオーロラキナーゼの、すべてまたは一部と実質的に同一であるdsRNAを、癌性細胞または腫瘍遺伝子に接触させるか、または、導入することができる。
【００９１】
[0104]  細胞増殖および／または分化疾患の例には、癌、例えば上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、転移性疾患、または、造血新生物性疾患、例えば白血病が含まれる。転移性腫瘍は、限定するものではないが、前立腺、大腸、肺、乳房および肝臓由来のものを含む、多数の原発腫瘍型より生じる可能性がある。本明細書中で使用される場合、“癌”、“過剰増殖性”、および“新生物性”という用語は、自律的増殖能、すなわち、急速に増加する細胞増殖によって特徴づけられる状況の異常状態を有する細胞をいう。これらの用語は、病理組織学的分類または侵襲性の段階に関係なく、癌性増殖のすべての型または発癌過程、転移性組織、あるいは、悪性形質転換した細胞、組織または器官を含むことを意味する。増殖性疾患には、例えば、骨髄、リンパ、または赤血球系統、あるいはそれらの前駆細胞から生じる、造血系由来の過形成性／新生物性（neoplatic）細胞に関わる疾患を含む、造血新生物性疾患もまた、含まれる。
【００９２】
[0105]  本発明は、様々な免疫疾患、特に、遺伝子の過剰発現または変異遺伝子の発現に関連するものの治療にも使用することができる。造血障害または疾患の例には、限定するものではないが、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、ぜんそく、アレルギー性ぜんそく、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳脊髄炎、特発性両側性進行性感音難聴、無形成性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンスジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症を含む）、移植片対宿主病、移植の症例、およびアレルギーが含まれる。
【００９３】
[0106]  別の態様において、本発明は、限定するものではないが、ヒトパピローマウイルス、C型肝炎、B型肝炎、単純ヘルペスウイルス（HSV）、HIV-AIDS、ポリオウイルス、および天然痘ウイルスを含むウイルス疾患を治療する方法に関連する。本発明のdsRNAを、本明細書中に記載される通り、発現されるウイルスの配列を標的として調製し、こうしてウイルス活性および複製を改善する。分子は、動物および植物の両方において、ウイルス感染組織の治療および／または診断に使用することができる。また、前記分子は、肝細胞癌などのウイルス関連癌の治療に用いることもできる。
【００９４】
[0107]  本発明のdsRNAは、多剤耐性1遺伝子（“MDR1”）の発現を阻害するために使用することもできる。“多剤耐性”（MDR）とは、幅広く、関連のない化学構造および異なる作用機序をもつ、様々な化学療法薬に対する耐性の様式をいう。MDRの原因は多因子であるが、MDR薬物の運搬を仲介する膜タンパク質である、P-糖タンパク（Pgp）の過剰発現が、実験モデルにおいてMDRの基礎となる最もよくみられる変化である（ChildsおよびLing、1994）。さらに、Pgpの発現は、ヒト癌、特に、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、および軟部組織肉腫において、MDRの進展と関連している（Fanら）。近年の研究により、MDR-関連タンパク質（MRP）（Coleら、1992）、肺抵抗性タンパク質（LRP）（Schefferら、1995）、およびDNAトポイソメラーゼIIの突然変異体（Beck、1989）を発現する腫瘍細胞もまた、MDRになる可能性があることが示された。
【００９５】
[0108]  本発明の実施は、別に示されない限り、当技術分野の技術内である、化学、分子生物学、微生物学、組み換えDNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来技術を使用する。例えば、Maniatisら、1982、Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York）；Sambrookら、1989、Molecular Cloning第二版（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York）；SambrookおよびRussell、2001、Molecular Cloning第三版（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York）；Ausubelら、1992）、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons、定期的な更新版を含む）；Glover、1985、DNA Cloning（IRL Press、Oxford）；Anand、1992；GuthrieおよびFink、1991；HarlowおよびLane、1988、Antibodies、（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York）；JakobyおよびPastan、1979；Nucleic Acid Hybridization（B. D. Hames & S. J. Higgins編1984）；Transcription And Translation（B. D. Hames & S. J. Higgins編1984）；Culture Of Animal Cells（R. I. Freshney、Alan R. Liss, Inc.、1987）；Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press、1986）；B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）； the treatise、Methods In Enzymology（Academic Press, Inc.、N. Y.）；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（J. H. MillerおよびM. P. Calos編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory）；M ethods In Enzymology、第154巻および155巻（Wuら編）、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（MayerおよびWalker編、Academic Press、London、1987）；Handbook Of Experimental Immunology、第I〜IV巻（D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編、1986）；Riott、Essential Immunology、第六版、Blackwell Scientific Publications、Oxford、1988；Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo、（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986）；Westerfield, M.、The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish（Danio rerio）、（第四版、Univ. of Oregon Press、Eugene、2000）を参照のこと。
【実施例】
【００９６】
[0109]  本発明は、以下の実施例を参照することにより記述され、前記実施例は例示のために提供され、そして、本発明をいかなる様式においても限定することを意図しない。当技術分野においてよく知られる標準的な技術、または、下に具体的に記述される技術を使用した。
【００９７】
実施例1：二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの調製
[0110]  オリゴヌクレオチド合成および精製
[0111]  標準的な技術を使用して、RNAオリゴヌクレオチドを固相ホスホロアミダイト化学を使用て合成し、脱保護し、そしてNAP-5カラム（Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ）で脱塩した（DamhaおよびOlgivie、1993；Wincottら、1995）。Amersham Source 15Q column（1.0 cm×25 cm）（Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ）上、15分工程、線形勾配を用いるイオン交換高速液体クロマトグラフィー（IE-HPLC）を使用して、オリゴマーを精製した。勾配は、バッファーA：Bを90：10から52:48に変化させ、バッファーAは100 mM Tris pH 8.5、そしてバッファーBは100 mM Tris pH 8.5, 1 M NaClであった。260 nmで試料をモニターし、そして、全長オリゴヌクレオチド種に相当するピークを回収し、集積し、NAP-5カラムで脱塩し、そして凍結乾燥した。
【００９８】
[0112]  各オリゴマーの純度をBeckman PACE5000（Beckman Coulter, Inc.、Fullerton、CA）でのキャピラリー電気泳動（CE）によって決定した。CEキャピラリーは、100μmの内径を有し、ssDNA 100R Gel（Beckman-Coulter）を含有した。典型的には、約0.6ナノモルのオリゴヌクレオチドをキャピラリー中に注入し、444 V/cmの電場中で泳動し、そして、260 nmでのUV吸光度によって検出した。変性Tris-ホウ酸-7 M-尿素泳動バッファーは、Beckman-Coulterより購入した。以下に記述される実験において使用するため、CEによって調べた場合、オリゴリボヌクレオチドは少なくとも90％の純度であった。製造者推奨のプロトコールに従って、Voyager DETM Biospectometry Work Station（Applied Biosystems,、Foster City、CA）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析によって、化合物の同一性を検証した。すべてのオリゴマーの相対的分子量は、期待される分子量の0.2％以内であった。
【００９９】
[0113]  二重鎖の調製
[0114]  一本鎖RNA（ssRNA）オリゴマーを、100 mM酢酸カリウム、30 mM HEPES、pH 7.5からなる二重鎖バッファー中、100μMの濃度で再懸濁した。相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を、等モル量で、50μM二重鎖の最終溶液を得るように混合した。試料を95℃で5分間熱し、そして、使用前に室温まで冷却させた。二本鎖RNA（dsRNA）オリゴマーを-20℃で保存した。一本鎖RNAオリゴマーを凍結乾燥して保存するか、ヌクレアーゼを含まない水中、-80℃で保存した。
【０１００】
[0115]  命名法
[0116]  一貫性のため、本明細書および実施例を通して、以下の命名法をを使用する。二重鎖に与えられる名前は、オリゴマーの長さおよび突出部の存在または不在を示す。“21+2”二重鎖は、両方とも21ヌクレオチドの長さの二本のRNA鎖を含み、21 mer siRNA二重鎖とも言われ、そして、2塩基の3'突出部を有する。“21-2”設計は、2塩基の5'突出部をもつ21 mer siRNA二重鎖である。21-0設計は、突出部をもたない（平滑）21 mer siRNA二重鎖である。“21+2 UU”は、2塩基の3'突出部をもつ21 mer二重鎖で、かつ、3'端の末端2塩基が両方U残基である（標的配列とミスマッチをもたらす可能性がある）。“25/27”は、2塩基の3'突出部をもつ、25塩基センス鎖と27塩基アンチセンス鎖を有する非対称二重鎖である。“27/25”は、27塩基センス鎖と25塩基アンチセンス鎖をもつ、非対称二重鎖である。
【０１０１】
実施例2：25 merの有効性の上昇
[0117]  本実施例は、長さが25ヌクレオチドまたはそれより長い鎖を有するdsRNAが、驚くべきことに、哺乳類の系において、既知の21 merから23 mer siRNAよりも上昇した有効性を有することを証明する。
【０１０２】
[0118]  バクテリオファージT7を介するin vitro転写で行われたdsRNAの異なる5'および3'末端構造の効果の研究の間に（Kimら、2004）、いくつかは、同じ標的部位を対象とする合成21 mer siRNAよりも高い有効性を有するようであり、そして、この特性は長さに関連するようであることを我々は観察した。この現象をさらに調査するため、我々は、化学的に合成された異なる長さおよび設計の二重鎖RNAのサイレンシング特性を体系的に研究した。
【０１０３】
[0119]  細胞培養、トランスフェクション、およびEGFPアッセイ
[0120]  HEK293細胞をトランスフェクションの一日前に、DMEM培地中、24ウェルプレートに60％密集度で分割した。各RNAの一定分量を加えた後、レポーターベクターを含む50μlのOpti Mediaを加えた。次に、1.5μlのLipofectamine 2000（Invitrogen）を含む50μlのOpti Mediaを混合し、15分間インキュベーションした。次に、細胞に0.4 mlのDMEM培地を加えた。トランスフェクション効率に関して標準化するために、それぞれのアッセイには、標的および／または二重鎖RN Aと、蛍ルシフェラーゼか赤色蛍光タンパク質（RFP）かどちらかのレポータープラスミド（全てのその他のアッセイ）との共トランスフェクションが含まれた。ルシフェラーゼアッセイに関しては、Steady Gloルシフェラーゼアッセイキットを、製造者の指示に従って使用した（Promega）。RFP共トランスフェクションに関しては、示された量のEGFPレポータープラスミド（pLEGFP-C1ベクター、Clontech）を、20 ngのRFPレポータープラスミド（pDsRed2-C1、BD Sciences）とトランスフェクションした。24時間後、RFP発現を蛍光顕微鏡法によりモニターした。（REFP発現によって評価される）トランスフェクション効率が90％より高い実験のみを評価した。EGFP発現を24時間後に測定した。EGFP発現を、FACS（生細胞）によって決定されるEGFP蛍光細胞数の中央値か、または、蛍光光度計の測定値（細胞抽出物）によって、決定した。
【０１０４】
[0121]  EGFPを安定発現するNIH3T3細胞を使用するEGFPアッセイに関しては、励起フィルターD490および発光フィルターD520を使用する、VersaFluor Fluorometer（Bio-Rad）を使用して、測定結果を決定した。トランスフェクション前に、細胞を約30％の密集度で24ウェルプレートに播種した。day 0に、細胞を上述の通りトランスフェクションし、そしてトランスフェクション後day 1に培地を交換した。初回のEGFPアッセイはday 3に行った。抽出物の調製のため、1×105 細胞を採取し、そして、1×104細胞は、day 6でのEGFPアッセイのため、さらに増殖させた。day 6およびday 9に、同様の手順を繰り返した。
【０１０５】
[0122]  EGFPの抽出物での測定は、以下の通り得られた：1×105細胞を300μlのPBSに懸濁し、そして、10秒間超音波処理し、続いて2分間微量遠心分離を行った。上清を蛍光測定に使用した。EGFP発現パーセントを、未処理のNIH3T3細胞から調製した抽出物と比較して決定した。
【０１０６】
[0123]  核酸試薬
[0124]  レポーター系は、トランスフェクションプラスミドベクターpEGFP-C1（Clontech、Palo Alto、CA）として、または、NIH3T3細胞株の安定形質転換細胞としてのどちらかで、EGF Pを使用した。EGFPのコード配列は、Genbankアクセッション#U55763より、表1に示される。ATG開始コドンおよびTAA終止コドンは太字フォントで強調され、そして、本実施例およびその他の実施例においてsiRNA試薬により標的化される部位は下線が引かれている。
【０１０７】
【表１】
2010525813.tif 000007
【０１０８】
[0125]  本実施例で、EGFP中、siRNA標的に使用される部位-1は：
[0126]  部位-1：5' GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGC 3'（SEQ ID NO: 2）。
【０１０９】
[ 0127]  実施例1に記述される通り、RNA二重鎖を合成し、そして調製した。EGFP部位-1を標的とするRNA二重鎖は、表2に概説される。いくつかの配列は、センス鎖の3'末端に配置される二ヌクレオチド配列“UU”を有した（Elbashirら、2001c；Hohjoh、2002）。3'-末端“UU”含有によりもたらされたミスマッチ、または、ミスマッチが意図的に配置された場所は、太字で強調されかつ下線が引かれた。
【０１１０】
【表２−１】
2010525813.tif 000008
【０１１１】
【表２−２】
2010525813.tif 000009
【０１１２】
【表２−３】
2010525813.tif 000010
【０１１３】
[0128]  結果
[0129]  3'突出部、5'突出部、または平滑末端を含む、異なる長さの合成RNA二重鎖の幅広い組み合わせを、EGFPの“部位1”を標的とするモデル系において、それらの相対的有効性に関して試験した（Kimら、2003）。50 nMの様々なRNA二重鎖を使用して、最初のトランスフェクションを実行した（図1A）。より長い二重鎖の真の有効性は、トランスフェクションをナノモル未満の濃度で行った場合にのみ示された。200 pM（図1B）および50 pM（図1C）の濃度の二重鎖RNAを使用して、我々は長さに伴う有効性の上昇を認めた。平滑、5'突出、および3'突出末端は、同様の有効性であった。より長い二重鎖RNAの上昇した有効性は、EGFPを安定して発現するNIH3T3細胞においても認められた（図1F）。27 ntよりも長い二重鎖を合成し、そして、RNAi効率に関して試験した（図1D）。長さ27 bpの二重鎖において、最大阻害活性が見られた（図1D）。二重鎖が長くなるほど、機能的RNAi活性の漸進的減少がみとめられ、そして、40〜45 bpまでには、試験した濃度においては完全に不活性となり、それは、これらの二重鎖のダイサーによるin vitro切断が少ないこととも相関した（図1E）。
【０１１４】
実施例3：ダイサー基質
[0130]  本実施例は、dsRNAがダイサーの基質として働くかどうかを決定する方法を示す。
【０１１５】
[0131]  in vitroダイサー切断アッセイ
[0132]  RNA二重鎖（100 pmol）を、20μlの20 mM Tris pH 8.0、200 mM NaCl、2.5 mM MgCl2中、リコンビナントヒトダイサー（Stratagene）1ユニットと、24時間インキュベーションした。各反応の3μl（15 pmol RNA）分量を、15％非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、GelStar（Ambrex）で染色し、そして、UV励起を使用して可視化した。
【０１１６】
[0133]  結果
[0134]  リコンビナントヒトダイサーとの21 bpから27 bpRNA二重鎖のインキュベーションの結果、23 mer、25 merおよび27 mer二重鎖の切断が生じたが、21 mer二重鎖は切断されなかった（図2A）。本反応の反応速度が遅いため、ダイサー切断の相対的な効率の決定は、提供者によって推奨されるin vitro条件下では不可能であった。30 bpより長いdsRNAは、マイクロRNAプロセッシング酵素であるDroshaによって前もってプロセッシングされ、ダイサーの良い基質となる必要がある可能性を別にすると、我々は、なぜ、これらのより長いdsRNAがダイサーの基質として悪く、かつ、RNAiの誘発因子として悪いかの両方を説明できない。
【０１１７】
実施例4：末端修飾のダイサー活性への効果
[0135]  dsRNAの末端修飾の効果を、実施例3に記述したin vitroダイサー切断アッセイを使用して試験した。
【０１１８】
[0136]  27 mer二重鎖に関して、フルオレセイン末端修飾のダイサー活性およびRNAiサイレンシングを誘発する能力への効果を試験した。6-カルボキシフルオレセイン（6FAM）をセンス（S）鎖の5'末端、S-鎖の3'末端、アンチセンス（AS）鎖の5'末端、およびAS鎖の3'末端に結合した、EGFPS1部位に対するRNAオリゴヌクレオチドを合成した。対の組み合わせを使用して、二重鎖RNAを作成した（図2B）。二重鎖3は、非修飾野生型EGFPS1 27+0二重鎖であった。6FAM修飾二重鎖の構造は、表2に示した。RNA二重鎖をリコンビナントヒトダイサーと24時間インキュベーションし、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって分離し、染色し、そしてUV励起により可視化した（図2C）。RNA二重鎖が24時間のインキュベーション中に完全に切断された（図2A）、初期の実験とは異なり、修飾二重鎖のすべては、ダイサーによる切断にある程度の抵抗性を示した。非修飾野生型配列（二重鎖3）だけが、in vitroダイサー反応において完全に切断された。S鎖に3'-6FAMおよびAS鎖に3'-6FAMをもつ二重鎖（二重鎖5）は、これらの条件下で切断に対して完全に抵抗性を有した。これらの5つの二重鎖の機能的有効性を、200 pM RNA濃度を使用するEGFP共トランスフェクションアッセイ（図2D）において比較した。in vitroダイサー切断においてみられるパターンと平行して、6FAM修飾末端をもつすべての27 mer二重鎖は非修飾二重鎖よりもEGFP発現減少において有効性が低かった。リコンビナントダイサーによる部分的切断が示された、二重鎖1、2、および4は、3〜6倍のRNAi活性の減少を有した。リコンビナントダイサーによる切断を示さなかった二重鎖5は、最小のRNAi活性を有し、ダイサーによるin vitro切断と細胞培養におけるRNAiの相対的有効性の間に、直接的な相関が証明された。
【０１１９】
実施例5：ダイサーによるin vivoプロセッシング
[0137]  本実施例は、27 mer dsRNAがin vivoでダイサーによりプロセッシングされることを確認する。
【０１２０】
[0138]  27 mer RNAの細胞内プロセッシングに関するアッセイ
[0139]  上述の通り、RNA二重鎖を10 nMで6ウェルプレート中のHEK293細胞にトランスフェクションした。14時間後、以下に記述される通り、全RNAを調製した。まず、20μg全RNAを75℃で10分間加熱し、そして32P 5'末端標識オリゴヌクレオチドプローブ（5'- ACCCTGAAGTTCATCTGCACC-3'、SEQ ID NO: 73）と混合し、そして、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH. 7.4、1 mM EDTA）中、24℃でハイブリダイゼーションした。試料を7.5％非変性ポリアクリルアミドゲルにロードし、そして、200V、4℃で3時間分離し、そして、ゲルをX線フィルムに曝露した。32P末端標識した27 merおよび21 mer二本鎖RNAオリゴを、サイズ標準として使用した。
【０１２１】
[0140]  結果
[0141]  in vivoにおいてダイサーによって27 mer dsRNAがプロセッシングされることを確認するため、HEK293細胞に10 nMの二重鎖3（非修飾）または二重鎖5（両方の3'末端が6FAMにより修飾）をトランスフェクションした。14時間後、全RNAを単離し、そして、32P末端標識された21 merプローブオリゴ（S鎖）とハイブリダイゼーションした。RNAを非変性PAGEによって分離し、そして、オートラジオグラフィーによって可視化した（図2E）。in vitroダイサー切断において見られた結果と同様に、二重鎖3（非修飾27 mer）をトランスフェクションした細胞から調製したRNAにおいて、より小さい種が、ダイサー切断産物と一致する、21 mer二重鎖マーカーと共に移動することが観察された。この21 merの種は、二重鎖5（3'末端修飾27 mer）をトランスフェクションした細胞由来のRNAにおいては、検出されなかった。
【０１２２】
実施例6：dsRNAの有効性
[0142]  本実施例は、ダイサーによる27 merの可能性のある切断産物の有効性を調べる。
【０１２３】
[0143]  ダイサーによる27 merの切断は、切断が生じる場所に応じて、様々な別の21 merをもたらすことができ；これらの可能性のある21 merの1つまたは混合物は、比較のために標準として使用した特異的な21 merよりも、顕著に有効性が高いことは可能である。この可能性について試験するため、EGFPS1 27+0二重鎖より生じ得る7つの異なる21 merを、従来の21+2設計を使用し、アンチセンス鎖に沿って1塩基幅で移動させて、合成した。これらの7つの二重鎖を、HEK293細胞における共トランスフェクションアッセイにおいて、個別に、及び、プールとして、RNAi活性について試験した（図3A）。50または200 pM濃度において、個別の21 mer二重鎖も、プールされた7つの21 mer二重鎖の組み合わせも、27 mer二重鎖に相当する活性を示さなかった。トランスフェクション前の27 merのin vitroダイサー切断は、有効性を著しく亢進させなかった（図3B）。さらなる対照として、真ん中に配置された4つの連続したミスマッチ塩基を含む変異EGFP 27 mer二重鎖（表2）、EGFPS1-27+0/mut）をトランスフェクションした。ミスマッチは実質的には、いかなるRNAi活性をも排除した（図3B）。
【０１２４】
実施例7：ダイサー切断産物の分析
[0144]  本実施例は、質量分析によってin vitroダイサー切断産物を分析した。
[0145]  エレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析
[0146]  ダイサー処理前および後における二重鎖RNAのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ESI-LCMS）を、ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータプロセッシングソフトウェアおよびParadigm MS4 HPLC（Michrom BioResources）からなる、Oligo HTCSシステム（Novatia）を使用して行った。質量分析計（LC-MS）への注入前に使用される液体クロマトグラフィーの工程では、核酸と複合体を形成するカチオンのほとんどは除去され；ナトリウムイオンの一部分はRNAと結合したままでであることができ、そして、水素のナトリウムへの置換で見られる正味質量獲得を反映して、少数の+22、または+44種として可視化される。
【０１２５】
[0147]  結果
[0148]  in vitroでEGFPS1 27+0二重鎖とリコンビナントダイサーをインキュベーションすることにより実際に産生される種を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI MS）を使用して同定した（図4Aおよび図4B）。in vitroダイサー切断の結果であり得る、可能性のあるそれぞれの消化産物について計算された質量を、表3に示す。in vitro切断産物のESI MS分析は、本酵素の既知の活性と一致する。
【０１２６】
【表３】
2010525813.tif 000011
【０１２７】
実施例8：27 mer dsRNAの阻害特性のさらなる特徴付け
[0149]  EGFP標的を安定発現している細胞における、27 mer dsRNAの阻害特性をさらに特徴づけるために、安定的にトランスフェクションされたEGFPを発現するNIH3T3細胞に、21+2および27+0 dsRNA二重鎖（両方5 nM）をトンラスフェクションした。遺伝子抑制期間の定量的推計を得るために、トランスフェクション後day2、4、6、8、および10でEGFPの発現を観察する、時系列実験を行った。細胞抽出物を調製し、そして、蛍光光度計を使用してEG FP蛍光を測定した（図5A）。以前の観察結果（Persengievら、2004）と一致して、21+2 siRNAを使用するとEGFP抑制は約4日間続き、一方、27+0 dsRNAによって得られる阻害は、10日まで持続した。‘高機能の'21+2 siRNA群は、同様の、サイレンシング期間の延長を示すことが報告されているが（Reynoldsら、2004）、これらの配列は稀であり、そして、発見または予測することは難しい。27 mer dsRNA設計の使用は、より多様な標的部位において、より長期の、より有効なRNA iを達成することを可能にすることができる。
【０１２８】
実施例9：27 mer dsRNAの部位選択への効果
[0150]  遺伝子の発現を体系的に阻害する道具としてのRNAiの使用において頻発する問題は、すべての標的部位がsiRNAによる抑制を等しく受け易いわけではなく（ShererおよびRossi、2004）、効果的な部位を予測する複雑な設計アルゴリズムが必要とされることである（Reynoldsら、2004；Ui-Teiら、2004；AmarzguiouiおよびPrydz、2004）。そのため、我々は、27 mer dsRNAの上昇した有効性により、従来の21 mer siRNAを使用すると不活性である部位を効果的に標的とすることができるかどうかを、問うた。以前に両方とも標準siRNAを使用してRNAiの不応性を示した、EGFP内の2つの部位（‘EGFP-S2'および‘EGFP-S3'）に対する21+2および27+0設計を有する二重鎖RNAを作成した（KimeおよびRossi、2003）。
【０１２９】
[0151]  核酸試薬
[0152]  レポーター系は、上記SEQ ID NO: 1中にあるように、EGFPを使用した。EG FP中の部位-2（不良部位1とも言われる）および部位-3（不良部位2とも言われる）を標的とした。実施例1に記述の通り、RNA二重鎖を合成し、調製した。本実施例においてEGFP中のsiRNA標的に使用された部位2および部位-3は：
[0153]  部位2：5' UGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUG 3'（SEQ ID NO: 74）、及び
[0154]  部位3：5' UGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAU 3'（SEQ ID NO: 75）であった。
【０１３０】
[0155]  EGFP部位-2およびEGFP部位3を標的とするRNA二重鎖は、表4に概説される。
【０１３１】
【表４】
2010525813.tif 000012
【０１３２】
[0156]  結果
[0134]  二重鎖を、1 nMおよび10 nMで、共トランスフェクションアッセイ形式を使用して、HEK293細胞にトランスフェクションした（図5B）。これらの用量において、標準21+2 siRNAは両方の部位において無効であり、一方、27 mer dsRNAはEGFP発現を、EGFP-S2では80〜90％、および、EGFP-S3では50％（1 nM）および80％（10 nM）減少させた。ダイサー基質dsRNAの上昇した有効性にもかかわらず、標的部位の実験的試験が、RNAiにおける最も感受性の高い標的を見出すためには未だ有用である。この点において、いくつかの27 merからのダイサー産物が、機能性の低いsiRNAを生じたことは重要である。ダイサー基質選択性をより良く理解することによって、望ましい21 merを生じるであろう基質RNAを設計することが可能であるに違いない。我々は、27 merの一方の末端のみの2塩基の3'突出が、2塩基3'突出の上流21〜23 ntのダイサーによる切断を好ましく導くだろうことを見出した。
【０１３３】
[0135]  本実施例は、本発明のdsRNAが、以前の既知の方法によって以前に悪い標的とみなされていた、EGFP遺伝子内の部位を効果的に標的にできることを証明する。そのため、本発明の方法の使用は、RNAiのための部位選択および設計基準を単純化するだろう。本実施例はまた、センス鎖の3'末端への意図的なミスマッチの配置が、27 mer二重鎖の有効性を上昇させることも示す。
【０１３４】
実施例10：27 mer dsRNAのその他の遺伝子への効果
[0136]  27 mer dsRNAの上昇した有効性が、レポーター構築物を標的とするアーチファクトでないことを確認するため、2つの内因性転写物、ヒトhn RNP H mRNA（Markovtsovら、2000）およびLaタンパク質をコードするmRNA（WolinおよびCedervall、2002）を標的化した。
【０１３５】
[0137]  hnRNP HおよびLaに対するRNAiアッセイ
[0138]  HEK293細胞を6ウェルプレートに30％の密集度でプレーティングした。次の日、示された量のdsRNAを細胞にトンラスフェクションし、そして、翌日、培地を交換した。トランスフェクション72時間後、細胞を300μl PBS中に回収した。EGFPアッセイに関して上に記述した通り、抽出物を調製した。ウェスタンブロットのために、細胞抽出物の2μlを10％SDS-PAGEゲルにロードした。内因性hnRNP Hは、ウサギポリクローナル抗-hnRNP H抗体（Markovtsovら、2000）およびアルカリホスファターゼ結合抗ウサギ抗体（Sigma）を使用して検出した。β-アクチンは、マウス由来抗アクチン抗体（Sigma）およびアルカリホスファターゼ結合抗マウス抗体（Sigma）で検出した。ノザンブロット分析のために、回収した細胞をRNA STAT-60（Tel-TestB）と混合し、そして、全RNAを製造者のプロトコールに従って抽出した。RNAを6％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写し、そして、32P末端標識オリゴ（La、5'-CCAAAGGTACCCAGCCTTCATCCAGTT-3'（SEQ ID NO: 84）；β-アクチン、5'-GTGAGGATGCCTCTCTTGCTCTGGGCCTCG-3'（SEQ ID NO: 85））で探査した。10 mlのハイブリダイゼーション溶液（1 ml 50×デンハルト、3 ml 20×SSPE、0.5 ml 10％SDS）中、37℃、3時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、ブロットを37℃、2×SSPEで3回洗浄した。
【０１３６】
[0139]  核酸試薬
[0140]  ヒトヘテロ核リボヌクレオタンパク質H（hnRPH）mRNA（Genbankアクセッション番号NM_005520）のコード配列が表5に示される。ATG開始コドンおよびTAA終止コドンが太字フォントで強調され、そして、siRNA試薬により標的化される部位は下線が引かれている。
【０１３７】
【表５】
2010525813.tif 000013
【０１３８】
[0141]  Laタンパク質mRNAのコード配列（Genbankアクセッション番号NM_005520）が、表6に示される。ATG開始コドンおよびTAA終止コドンが太字フォントで強調され、そして、siRNA試薬により標的化される部位は下線が引かれている。
【０１３９】
【表６】
2010525813.tif 000014
【０１４０】
[0142]  実施例1に記述される通り、RNA二重鎖を合成し、そして調製した。HNRPH1を標的とするRNA二重鎖は、表7に概説される。
【０１４１】
【表７】
2010525813.tif 000015
【０１４２】
[0143]  結果
[0144]  ヒトhnRNP H mRNA（ウェスタンブロッティングによって分析される）およびLaタンパク質をコードするmRNA（ノザンブロットによって分析される）中の無作為に選ばれた部位を標的として、RNA二重鎖を合成した（図5Cおよび図5D）。両方の標的に関して、27 mer二重鎖は、これらのメッセージを標的とする21 mer siRNAよりも、有効性が高かった。
【０１４３】
実施例11：27 merの配列特異性
[0145]  27 mer dsRNAの配列特異性に関する試験として、1つ、2つまたは3つのミスマッチを有する、EGFP標的mRNAに対する一連の27+0 dsRNAを合成し、そして、共トランスフェクションアッセイにおいて、0 nM、1 nM、および200 pMの濃度で試験した（図6）。変異27+0 dsRNAの配列は、表2に示される。200 pMにおいて、各ミスマッチ配列は、野生型の27 mer dsRNAよりも有効性が低く；3ミスマッチ27 mer dsRNAは、試験したすべての濃度において、RNAiの誘発において完全に効果がなかった。EGFPの‘部位2'を標的とした27 mer dsRNAを使用して同様の結果が得られた。
【０１４４】
実施例12：インターフェロン応答の欠如
[0146]  本実施例は、本発明のdsRNA二重鎖がインターフェロン応答を活性化しないことを証明する。
【０１４５】
[0147]  インターフェロンおよびPKRアッセイ
[0148]  以前に記述された通り、20 nMの各RNAを293細胞にトランスフェクションした後、24時間後に培地を回収し、そして、以前に記述された通り、インターフェロンαおよびβのELISAアッセイに使用した（Kimら、2004）。PKR活性化アッセイを、以前に記述された通り、行った（GunneryおよびMathews、1998）。溶解物中のPKRを、まず示されたRNAとの共インキュベーションにより活性化し、次に、その自己キナーゼ反応により放射標識した。放射標識されたPKRを、次に、分析のため免疫沈降した。先行する活性化なしで、細胞溶解物中のPKR活性を決定するため、dsRNAを除外した。反応物を30℃、20分間インキュベーションした。反応物由来のPKRを、ポリクローナル抗体を使用して、免疫沈降した。ポリクローナル抗体を反応物に加え、次に氷上に1時間放置し、続いて、50μlのIPP500（10 mM Tris, pH 8、500 mM NaCl、0.1％ Nonidet P-40）中10％プロテインA-セファロースを添加した。この混合物を、4℃で30分間、振とうした。プロテインA-セファロースビーズを、1 ml IPP100バッファー（10 mM Tris, pH 8、100 mM NaCl、0.1％ Nonidet P-40）で、5回洗浄した。最後の洗浄の後、ビーズをタンパク質試料バッファー中で煮沸し、そして、SDS-ポリアクリルアミドゲル上にロードし、続いてオートラジオグラフィーを行った。
【０１４６】
[0149]  結果
[0150]  より長いdsRNAの使用における、可能性のある問題は、PKRの活性化、および、インターフェロンの誘導である（Mancheら、1992）。そのため、我々は、トランスフェクションした27 mer dsRNAが、インターフェロン-α（図7A）、または、インターフェロン-β（図7B）を活性化するかどうかを評価した。インターフェロン誘導の陽性対照として、三リン酸含有の単一鎖RNAをトランスフェクションし、それは、以前に報告された通り、インターフェロン-α、および-βを、強く活性化した（Kimら、2004）。21+2 siRNAまたは27+0 dsRNAのどちらを使用した場合も、どちらのサイトカインも検出されなかった。EGFP-S2およびEGFP-S3部位に特異的な、その他の2つの27 mer配列でもこの観察結果が見られた。細胞溶解物におけるPKR活性化もまた、以前に記述された通りに、アッセイを行った（GunneryおよびMathews、1998）。細胞溶解物を示されたRNAで処理し、続いて免疫沈降を行った。陽性対照の長いdsRNAはPKR活性を誘導したが、より短いRNAのいずれもPKRを活性化しなかった（図7C）。
【０１４７】
実施例13：非対称27 mer二重鎖設計および塩基修飾は、ダイシングパターンに影響を及ぼすことができ、そして、27 merの合理的な設計を可能にする
[0151]  本実施例は、多数の種が27 merへのダイサー活性によって産生されること、および、27 merの設計および／または塩基修飾の含有が、これらの分解パターンを誘導し、不均一性を制限し、そして、最終産物を予測することに用いることができることを証明する。
【０１４８】
[0152]  実施例6、図3Aおよび図3 Bにおいて、EGFPS1 27 mer二重鎖へのダイサー作用によって生産され得るそれぞれの21 merのすべてが、27 mer二重鎖よりもEGFPを抑制する能力が低いことが証明された。それにも関わらず、どの21 merが産生されるかが、最終的な有効性に影響することができる。エレクトロスプレー質量分析アッセイを使用して、どの21 merが、ダイサーによる27 mer基質RNAの酵素的消化より得られる実際の産物であるかを決定した。27 merのダイサー消化の結果、1つ以上の21 merを得ることができる。ダイシングパターンは調節されることができ、合理的な設計を可能にする。
【０１４９】
[0153]  in vitroダイシング反応のエレクトロスプレー質量分析アッセイ
[0154]  RNA二重鎖（100 pモル）を1ユニットのリコンビナントヒトダイサー（Stratagene、La Jolla、CA）を含む、20μlの20 mM Tris pH 8.0、200 mM NaCl、2.5 mM MgCl2中、12〜24時間インキュベーションした。ダイサー処理前および後における二重鎖RNAのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ESI-LCMS）を、ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータプロセッシングソフトウェアおよびParadigm MS4TM HPLC（Michrom BioResources、Auburn、CA）からなる、Oligo HTCSシステム（Novatia、Princeton、NJ）を使用して行った。質量分析計（LC-MS）への注入前に使用される液体クロマトグラフィーの工程では、核酸と複合体を形成するカチオンのほとんどは除去され；ナトリウムイオンの一部分はRNAと結合したままでであることができ、そして、水素のナトリウムへの置換で見られる正味質量獲得は、少数の+22、または+44種として可視化される。本アッセイの精度は、このサイズのオリゴヌクレオチドにおいて約+/-2ダルトンである。
【０１５０】
[0155]  結果
[0156]  EGFPS1-27+0二重鎖をダイサーで消化し、そして、マススペクトルを消化前（図8A）および消化後（図8B）に得た。一般に、ダイサーは、27 mer二重鎖を5'リン酸をもつ21 merの長さの断片に切断するだろう。通常、より少ない量の22 merも産生される。少量の20 merおよび23 merも、時々観察することができる。出発配列と観察される質量を比較することにより、2塩基の3'突出および5'リン酸を有する4つの二重鎖がこのダイシング反応によって産生されたと推測することができる。これらの種は2つの主要な切断産物を表し、それらの両方は21 merおよび22 merの二重鎖を結果としてもたらした。小文字の“p”は、リン酸基を示す。in vitroダイサー切断の結果として得ることのできる、可能性のある各消化産物の計算上の質量は、表8に示される。
【０１５１】
【表８】
2010525813.tif 000016
【０１５２】
[0157]  実施例2、図1A〜図1Cにおいて、平滑二重鎖または5'突出部を有する二重鎖が、3'突出部を有する二重鎖より、同じか、または高い有効性を示すことができることが証明された。これらの研究において、二重鎖は対称であった（すなわち、両端が平滑、両端が3'末端または両端が5'突出であった）。同様の研究において、片方の末端に2塩基のミスマッチを含む平滑27 mer二重鎖は、試験された、対称である平滑、3'突出、または5'突出種よりも、高い有効性を有することが見出された。2塩基のミスマッチを片方の末端に有する平滑二重鎖は、一方の末端は2塩基3'突出を有し、そして他方は平滑である非対称の二重鎖の作用と類似している。この種の非対称の27 mer二重鎖を試験して、高い有効性、および、より少ないダイシング産物（不均一性が少ない）を有することを見出し、そしてより予測可能なパターンをもたらした。
【０１５３】
[0158]  多くの酵素の二本鎖RNA結合ドメインは、しばしば特異的にRNAを認識し、そして、DNAまたはいくつかの修飾RNAは認識しない。平滑27 mer二重鎖の末端へのDNA残基の挿入が研究された。一方の鎖の3'末端にDNA残基をもつ非対称設計は、より少ないダイシング産物（より少ない不均一性）をもたらし、そして一般的に、非対称の3'突出設計とは反対である、予測可能なパターンを産生した。
【０１５４】
[0159]  EGFPS1-27+0二重鎖を、非対称の3'突出部を一方に有し、他方の3'末端に2 DNA塩基を有するように修飾した。ダイサープロセッシングを模倣するように、陥凹鎖の3突出部に5リン酸を配置した。本設計の最終二重鎖を、元の平滑27 merと並べて下に示す。小文字の“t”はDNAdT塩基を示し、そして、小文字の“p”は、リン酸基を示す。計算上の質量は表9に示される。
【０１５５】
【表９】
2010525813.tif 000017
【０１５６】
[0160]  マススペクトルを、消化前（図8C）および消化後（図8D）に得た。修飾非対称性二重鎖より得られるダイシング産物の分析は、対称性二重鎖に関するよりも、はるかに単純であった（図8Bと図8Dを比較せよ）。単一の切断産物が観察され、これはほとんど21 mer二重鎖であり、小量の22 merも検出できた。小文字の“t”はDNAdT塩基を示し、そして、小文字の“p”はリン酸基を示す。計算上の質量は表10に示される。
【０１５７】
【表１０】
2010525813.tif 000018
【０１５８】
[0161]  単一の2塩基3'突出部をもつ非対称性設計の使用、および、DNA残基の選択的組み込みは、ダイシング反応を単純化し、単一の主要切断産物を生じる。本設計は、さらに、ダイシングパターンの予測を可能にし、そして、特異的な、望ましい21 merがダイシングによって産生できるように、27 merを合理的に設計することを可能にする。証明として、EGFPS1-27-L配列と重複する第二の27 mer二重鎖、EGFPS1-27-Rを研究した。計算上の質量は、表11に示される。
【０１５９】
【表１１】
2010525813.tif 000019
【０１６０】
[0162]  マススペクトルを、消化前（図9A）および消化後（図9B）に得た。EGFPS1 -27+0 R二重鎖より得られるダイシング産物の分析は、EGFPS1 -27+0 L二重鎖において見られるのと同様の複雑なパターンを示した。2つの主要な切断産物が観察され、そして、21 merおよび22 mer種の両方が存在した。非常に少数の20 mer種も見られた。小文字の“p”はリン酸基を示す。in vitroダイサー切断の結果として得ることのできる、可能性のある各消化産物の計算上の質量は、表12に示される。
【０１６１】
【表１２】
2010525813.tif 000020
【０１６２】
[0163]  EGHPS1-27+0-R二重鎖を、下に示す通りDNA修飾、非対称25/27 mer二重鎖に変換し、そして、この二重鎖をin vitroダイシングアッセイで研究した。小文字の“cg”は、DNA dCdGを示し、そして、小文字の“p”は、リン酸基を示す。計算上の質量は、表13に示される。
【０１６３】
【表１３】
2010525813.tif 000021
【０１６４】
[0164]  マススペクトルを、消化前（図9C）、および消化後（図9D）に得た。DNA修飾非対称EGFPS1-25/25 R二重鎖は、表14に概説される通り、明確で、単一の、ダイシングされた21 mer種を示した。小文字の“p”は、リン酸基を示す。
【０１６５】
【表１４】
2010525813.tif 000022
【０１６６】
[0165]  図8Dおよび図9Dの結果を比較する場合、2つの異なる非対称性二重鎖EGFPS 1-27/25 LおよびEGFPS 1-25/27Rの消化は、同じ21 mer種、EGFPS 1-21（3）の形成をもたらすことを認めることができる。小文字の“t”または“cg”は、DNA塩基を示し、そして、小文字の“p”は、リン酸基を示す。計算上の質量は、表15に示される。
【０１６７】
【表１５】
2010525813.tif 000023
【０１６８】
[0166]  従って、本発明によって教授される、DNA修飾非対称性二重鎖の設計の使用は、27 mer RNA種におけるダイシング反応の複雑性を減少し、そして、RNAiにおいて、望ましい位置を特異的に標的とすることできるように使用するため、27 merの合理的な設計を可能にする。基質27 merのダイサーによる切断は、21 merの一方の末端が基質27 merの3'突出末端と一致する、固有の、予測可能な21 merをもたらす。
【０１６９】
実施例14：塩基修飾をもつ非対称性27 mer二重鎖の設計は、平滑27 merよりも有効性を改善することができる
[0167]  本実施例は、本発明によって教授される通り、一方に2塩基3'突出を、そして、他方に3塩基3'-DNA修飾をもつ平滑を有する、新規非対称性RNA二重鎖が、平滑27 mer二重鎖よりも有効性を改善できることを証明する。
【０１７０】
[0168]  実施例13、図8A〜図8D、および図9A〜図9Dにおいて、非修飾性二重鎖の使用が、ダイシングを導くことができ、そして、単一の主要な21 mer切断産物をもたらすことができることが証明された。さらに、27/25Lおよび25/27R非対称二重鎖の両方は、ダイシング後、同じ21 mer二重鎖をもたらす。同じ21 mer二重鎖が2つの非対称27 merのそれぞれから産生されるため、これらの化合物は機能的に同様の有効性を有するに違いないことが、当業者によって予測されるだろう。本実施例において、この場合はそうではなく、25/27 R設計は、27/25 L二重鎖および平滑27+0二重鎖の両方と比較して、予想外に有効性を上昇させたことが示される。
【０１７１】
[0169]  EGFPS2を標的とするRNA二重鎖を、EGFP発現プラスミドとHEK293細胞に共トランスフェクションし、そして、上述の方法に従って、24時間インキュベーションした後、EGFP活性についてアッセイした。トランスフェクションされた二重鎖は、表16に示される。小文字の“p”はリン酸基を示し、そして、小文字の塩基“cc”および“gt”はDNA塩基を示し、一方、大文字の塩基はRNAを示す。
【０１７２】
【表１６】
2010525813.tif 000024
【０１７３】
[0170]  EGFPS2-21+2およびEGFPS2-27+0 RNA二重鎖は、以前に実施例9において使用された。EGFPS2-27/25 LおよびEGFPS2-25/27 R二重鎖は、本発明に従って設計され、そして、同じ部位である、EGFPの部位IIを標的化する、新規非対称性dsRNAである。実施例13に記述される通り、in vitroダイシングエレクトロスプレー質量分析アッセイにおいて、EGFPS2-27/25 LおよびEGFPS2-25/27 R二重鎖の両方は、ダイサーによる消化の後、EGFPS2-21+2二重鎖と同様の、同じ21 mer産物を生じる。
【０１７４】
[0171]  トランスフェクションの結果は、図10Aに示される。以前に示された通り、EGFPS2- 21+2二重鎖がEGFP発現を抑制する最小の活性を有し、一方27+0二重鎖は、著しい阻害を示した。27/25 L二重鎖は、27+0二重鎖より有効性が少し低く、また、25/27 R二重鎖が最も有効性が高かった。非対称性二重鎖の両方が、ダイシング後、同じ21 mer種を産生するため、この発見は、先行技術の教授に基づくと予想外である。
【０１７５】
[0172]  同様のトランスフェクションを、EGFPS1二重鎖27/25 Lおよび25/27 Rを使用して行った。これらの二重鎖は、ダイシング後、同じ21 mer産物、EGFPS1-21（3）二重鎖を産生する（実施例13）。トランスフェクションされた二重鎖は、表17に示される。小文字の“p”は、リン酸基を示し、そして、小文字の塩基“tt”はDNA塩基を示し、一方、大文字の塩基はRNAを示す。
【０１７６】
【表１７】
2010525813.tif 000025
【０１７７】
[0173]  トランスフェクション後のEGFP発現は、図10Bに示される。以前と同様に、EGFP発現減少において、25/27 R二重鎖は27/25 L二重鎖よりも著しく有効性が高かった。平滑末端27 merを25/27 R二重鎖および27/25 L二重鎖と比較した、同様の実験において、dsRNAは以下の有効性を有することが見出された：
25/27 R二重鎖＞27/25 L二重鎖＞27 mer。
【０１７８】
[0174]  27 mer二重鎖RNAは、標的遺伝子発現の抑制において、21 mer二重鎖より著しく高い有効性を示すことができる。平滑27 merは、ダイシング後、様々な21 mer種をもたらす可能性があり、そのため、平滑27 mer二重鎖の正確な性能は、常に予測できるわけではない。二重鎖の片側が2塩基の3'突出部を有し、そして、もう一方の側は平滑であり、かつ、3'末端にDNAなどの塩基修飾を有する、本発明の新規非対称性二重鎖は、正確な21 merをもたらす、予測可能な方法において、ダイシングを起こさせる。非対称性二重鎖、すなわち、27/25 Lおよび25/27 Rのそれぞれもまた、21 merよりも有効性が高い。非対称性25/27 R設計は、本発明のもっとも有効性の高い態様である。
【０１７９】
[0175]  図11は、本発明の態様を比較する図である。標的遺伝子配列は、SEQ ID NO: 116によって示される。siRNA分子として使用される“典型的な”親21 merを標的遺伝子配列と並べて示す。センス鎖に3'突出部を、そして、アンチセンス鎖の3'末端に2つのDNA塩基を含む、L 27 mer v2.1は、標的遺伝子および親21 mer配列と並べられる。ダイシングされた切断産物もまた示される。この並列は、これらの前駆RNAi分子の設計における左方シフトを示す。アンチセンス鎖に3'突出部を、そして、センス鎖の3'末端に2つのDNA塩基を含む、R 27 mer v2.1もまた、標的遺伝子および親21 mer配列と並べられる。ダイシングされた切断産物もまた示される。この並列は、これらの前駆RNAi分子の設計における右方シフトを示す。
【０１８０】
実施例15：有効用量の決定
[0176]  本実施例は、本発明のdsRNAの哺乳類における有効用量を決定する方法を示す。dsRNAをコードする配列を含む組成物の治療的に有効な量（すなわち、有効用量）は、標的遺伝子産物の発現を少なくとも10％阻害する量である。より高いパーセンテージの阻害、例えば、20、50、90、95、99パーセントかそれ以上が、特定の状況においては、望ましい可能性もある。典型的な用量は、被験者または試料重量のキログラム当たり、分子のミリグラムまたはマイクログラム量を含む（例えば、キログラム当たり約1マイクログロム〜キログラム当たり約5ミリグラム、キログラム当たり約100マイクログロム〜キログラム当たり約0.5ミリグラム、または、キログラム当たり約1マイクログロム〜キログラム当たり約50マイクログラム）。主治医が必要と考える通り、約1〜10週間の間の期間、例えば、2〜8週間の間、または約3〜7週間の間、または、約4、5、または6週間、組成物を1週間あたり1回またはそれ以上投与することができる。被験者への治療的有効量の組成物の投与には、単回投与または一連の投与が含まれ得る。
【０１８１】
[0177]  特定のdsRNA組成物の適当な用量は、調節される発現または活性に関する、分子の有効性に依存する。これらの分子の1つまたはそれ以上は、動物、特に哺乳類、そして、特にヒトに、1つまたはそれ以上の標的遺伝子の発現または活性を調節するために、投与することができる。医師は、例えば、はじめは比較的低い用量を、続いて、適切な応答が得られるまで用量を増加して、処方してもよい。加えて、特定の被験者についての具体的な用量レベルは、疾患の重症度、以前の治療法、罹患している疾患、活性薬剤のオフターゲット効果、被験者の年齢、体重、総体的な健康状態、性別、および食餌、投与の時間、投与経路、排出率、薬物との組み合わせ、および調節される発現または活性の程度を含む、様々なその他の因子に依存するであろうことは、理解される。
【０１８２】
[0178]  治療の効果は、標的遺伝子mRNAの量（例えばリアルタイムPCRを使用する）、または、ウエスタンブロット分析によるなど標的遺伝子によってコードされる産物の量を測定することによってモニターできる。さらに、主治医は、患者が罹患している疾患または障害に関連する症状をモニターし、そして、治療開始前に記録した症状と比較することができる。
【０１８３】
[0179]  近年の研究より、RNAiの効果は、完全に特異的ではなく、そして、siRNAの濃度に依存した大きさでその望ましくない‘オフターゲット'効果が起こる可能性があることが、明らかである（Persengievら、2004）。新規ダイサー基質dsRNAアプローチは、従来の21 mer siRNAで必要とされるよりも、低濃度での二重鎖RNAの使用を促進することができる。21 mer siRNAを使用すると‘オフターゲット'効果が特定の細胞株で起こり得るということは、公開されたデータより明白であるが（Persengievら、2004；Jacksonら、2003）、これらはまた、ナノモル以下までの低い範囲において有効性をもつ試薬を使用することによって、最小限にすることができる（Persengievら、2004）。ダイサー基質dsRNAを使用して‘オフターゲット'効果の可能性を調べるために、EGFP部位1をそれぞれ標的化する、siRNA 21 merと27 merを比較する、マイクロアレイ分析を行った。EGFPを安定的に発現するNIH3T3細胞に、効果的な標的のノックダウンを与える濃度でsiRNAをトランスフェクションした（図2A、図7D）。トランスフェクション後24時間および48時間後に細胞の全RNAを細胞から調製し、そして、図7Dに記述される通り、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのハイブリダイゼーションによって分析した。分析した16,282のマウス遺伝子の中で、ごく一部だけが、対照の値の二倍以上、または以下に、上方制御または下方制御を示した（図7D）。27 merおよび21 merは、それらの効果的なRNAi濃度において、同等の結果をもたらした。より高い25 nMの濃度で27 merを使用した場合、上方制御された転写物の数が上昇したが、24時間対48時間、および、5 nM対25 nMで、影響された標的の比較は、重複を示さなかった。特異的な‘オフターゲット'効果よりむしろ、これらの変化は、調査した16,282遺伝子中の統計的散乱とより一致する。同じアッセイをEGFP-S2 27+0二重鎖RNAを使用して反復し、同様の結果を得た。
【０１８４】
[0180]  21+2 siRNAと比較して27 mer dsRNAは高い有効性を示したが、この見解が以前に報告されていないことは興味深い。その他の人は、哺乳類細胞におけるRNAi研究において、27 bpまでのdsRNAを使用したが（Bohulaら、2003；Caplenら、2001）、従来の21+2二重鎖との比較として、効果の違いは報告されなかった。以前の研究と我々独自のものとのこの不一致は、単純に、試験したdsRNAの濃度における違いによる可能性がある。21 mer siRNAにおける“良い”部位は、ナノモル範囲において有効性を有することができる（Reynoldsら、2004）。‘良い'部位が高濃度でトランスフェクションされたRNAで試験される場合、21 mer siRNAと27 mer dsRNAとの間の違いは、おそらく小さく、そして、簡単に見逃されるであろう。有効性における際立った違いは、低いナノモルまたはピコモル濃度における試験によって最もよく認められるが、その濃度は多くの研究室で通常行われるものではない。
【０１８５】
[0181]  ここまでは、調べたすべての部位で、21+2 siRNAと比較して27 mer dsRNA設計が、RNAi有効性の上昇を示した。しかしながら、それにもかかわらず、本明細書中で研究される27 merの組み合わせ内で、同じ遺伝子内の異なる標的部位間での有効性の範囲が見られる（図3B）。我々は、完全に最適化された設計規則がなくても、ダイサー基質dsRNAアプローチの使用は、従来の21+2 siRNAと比較してRNAi有効性を上昇させることができることを示した。さらに、27 mer dsRNAの使用は、従来の21 mer siRNAによる抑制には不応性である、特定の配列内のいくつかの部位の標的化を可能にする。RNAiを誘発するダイサー基質の使用は、21+2使用において必要とされるよりも低い濃度のRNAで、RNAiの有効性の亢進および持続期間の延長をもたらすはずである。ダイサー切断とRNAi有効性の亢進とを結びつける我々の結果と一致して、ダイサーの基質である、化学的に合成されたヘアピンRNAが、従来のsiRNAよりも、RNAiの効力の高い誘発剤であること、さらに、2塩基の3'突出部がダイサー切断を導くことが、最近示された（Siolasら、2005）。
【０１８６】
実施例16：修飾パターンの調査
[0182]  RNAiを介するSTAT1遺伝子の抑制に有効であると知られる部位が、21 mer siRNAおよび27 mer DsiRNAの両方において、相対的有効性および組織培養におけるあらゆる毒性効果について試験して、広範囲の修飾パターンを調査するために選択された。
【０１８７】
[0183]  試験された19〜21 mer RNAが表18に列挙される。
【０１８８】
【表１８−１】
2010525813.tif 000026
【０１８９】
【表１８−２】
2010525813.tif 000027
【０１９０】
[0184]  RNA二重鎖を、Oligofectamineを使用して、24ウェルプレート形式でHeLa細胞にトランスフェクションした。RNAを、10 nMおよび1 nMの濃度で、3回試行でトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後に、RNAを培養物から調製し、そして、cDNAを作成し；qRT-PCRアッセイを三回試行で行い、そして、陰性対照siRNAを100％として使用して、データをRPLP0（酸性リボソームタンパク質P0）mRNAレベルで標準化した。結果は図12に列挙される。
【０１９１】
[0185]  いくつかの修飾パターンは、良く作用し、一方、その他のものはしなかった。特に、交互2'-O-メチルRNAパターンに関連する、Czaudernaら（NAR 31：2703 2003）の結果および所見とは一致があった。この配列／部位について、完全に修飾された二重鎖は、不活性、または、少なくとも有効性の著しい損失を有した。10 nMでなされたトランスフェクションでは、高度に修飾された種に関する、有効性の感知できる改善は示されなかった。試験された24時間内では、どの種も細胞培養における明らかな毒性は示さなかった。
【０１９２】
[0186]  次に、修飾の調査を、非対称性25/27 mer DsiRNA二重鎖設計に拡張した。修飾オリゴヌクレオチドを合成し、そして、DsiRNA二重鎖を作成するようにアニーリングした。図13に示される図表に概説される通り、基質を望ましい21 mer最終産物に切断する、エンドヌクレアーゼダイサーの能力を遮断しないために、“ダイシングドメイン”は修飾されない。修飾された25〜27 mer RNAは、表1 9に列挙される。
【０１９３】
【表１９】
2010525813.tif 000028
【０１９４】
[0187]  19〜21 mer二重鎖と同様に、25〜27 mer RNA二重鎖を、Oligofectamineを使用して24ウェルプレート形式で、HeLa細胞にトランスフェクションした。RNAを、10 nMおよび1 nMの濃度で、3回試行でトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後に、RNAを培養物から調製し、そして、cDNAを作成し；qRT-PCRアッセイを三回試行で行い、そして、陰性対照siRNAを100％として使用して、データをRPLP0（酸性リボソームタンパク質P0）mRNAレベルで標準化した。結果は図14に列挙される。
【０１９５】
[0188]  結果。一般に、より重度に修飾された二重鎖、特に、2'-O-メチルおよび2'-F塩基の両方によって広範囲に修飾されたものは、有効性の減少を示した。不完全に修飾された二重鎖は、非修飾二重鎖と同様の有効性を示した。限定された規則的な2'-O-メチル修飾を使用するパターンが有益であった。
【０１９６】
[0189]  実施例16において概説される結果に基づいて、最初の高い有効性が証明されたパターンが、より詳細を研究するために選択された。以下の実施例において“ASm”といわれる、下のDsiRNAが、さらなる試験のため選択された：
【０１９７】
【化５】
2010525813.tif 000029
【０１９８】
DsiRNAは、配列ID番号：179および180によって形成される二重鎖と、アンチセンス鎖上の3'突出部を含む塩基が2'-O-メチルで修飾されていることを除いて、同一である。ASmパターンは、2'-O-メチル修飾突出塩基と2'-O-メチル修飾交互塩基とを含み、そして、任意で5'リン酸を含む、27モノマーからなるアンチセンス鎖、および、3'末端の2つのモノマーがDNAであり、そして5'リン酸を含む、25モノマーからなるセンス鎖を有する。
【０１９９】
実施例17：EGFPにおける2'-O-メチルRNA修飾パターンの研究
[0190]  次の一連の実験は、デュアル-Lucルシフェラーゼ／EGFP融合レポーターを使用して行われた。DsiRNAは、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）配列を標的として設計され、それはFLuc遺伝子の3'-UTRに組み込まれた。
【０２００】
[0191]  10 nMの各DsiRNAを、HCT116細胞に、標的（Renilla（ウミシイタケ））および標準化（Firefly（蛍））ルシフェラーゼコード領域の両方をコードする単一のプラスミドと一緒に、共トランスフェクションした。（RenillaにGFP配列を標的とする、ブロック化（blocked）27 merをもつpsiCheck-GFP。デュアルルシフェラーゼアッセイ（Promega）は、トランスフェクション24時間後行われ、Renilla活性（標的）をFireflyルシフェラーゼで標準化した。試験されたDsiRNAは、下の表20に列挙される。
【０２０１】
【表２０】
2010525813.tif 000030
【０２０２】
[0192]  図15に示される通り、すべての単一鎖修飾バリアントは良く作用し、二本鎖修飾バリアントは作用しなかった。ASmパターン（#3ブロック化）が良く機能した。
実施例18：ヒトHPRT1遺伝子における、ASm設計の性能
[0193]  ASmおよび関連する交互2'-O-メチル修飾パターンのDsiRNAを、ヒトHPRT遺伝子（NM_000194）を標的として、既知の可能な部位において、設計した。DsiRNAは、表21に列挙される。
【０２０３】
【表２１】
2010525813.tif 000031
【０２０４】
[0194]  Oligofectamineを使用して、二重鎖を、10 nM、1 nM、および0.1 nMの濃度で、HeLa細胞にトランスフェクションした。He La細胞を24ウェルプレートに35％の密集度で分割し、そして、翌日、Oligofectamine（Invitrogen、Carlsbad、CA）を65μLのOptiMEM Iあたり1μLを使用して示された濃度のRNA二重鎖とトランスフェクションした。すべてのトランスフェクションは、三回試行によって行った。RNAをトランスフェクション後24時間において、SV96全RNA単離キット（Promega、Madison、WI）を使用して回収した。RNAをBioanalyzer 2100（Agilent、Palo Alto、CA）を使用して質についてチェックし、そして、オリゴdTとランダムヘキサマープライミングの両方を使用し、500 ng全RNAと製造者の指示のもとSuperScript-II逆転写酵素（Invitrogen、Carlsbad、CA）とを使用して、cDNAを調製した。定量的qRT-PCRを、HPRT mRNAの相対的ノックダウンを調べるために行い、RPLP0遺伝子を内部参照標準として、そして、陰性対照DsiRNAを100％参照レベルとして使用した。
【０２０５】
[0195]  図16に示される通り、ASm修飾パターンは、同じ部位において、非修飾DsiRNA二重鎖と、有効性がもっとも類似していた。AS鎖全体に渡る交互の2'-O-メチル修飾を有する、“ASm Total”二重鎖もまた、低濃度（0.1 nM）においてWTまたはASmバージョンよりは低い有効性ではあるが、HPRTmRNAレベルの減少に効果的であった。in vitroダイシングアッセイからのデータは、“ASm Total”二重鎖に使用された2'-O-メチル修飾パターンが、ダイサーによる通常のプロセッシングを阻害することを示す（実施例20参照）。これらのデータの最も容易な解釈は、そのままのDsiRNA27 nt AS鎖は、ダイサーによる21 mer siRNAへの切断なしで、RISCに直接的にロードでき、そしてRNAiを誘発できるということである。
【０２０６】
[0196]  この仮説を試験するため、配列の末端4塩基（AS鎖の5'末端）が変異した、HPRT DsiRNAの“末端変異（end-mut）”変異体バージョンを設計した（表21配列表を参照）。これは、もし27merがそのままロードされた場合、“seed領域”のハイブリダイゼーションを阻害し、そして従って、RNAiを介してHPRT mRNAの抑制を誘発する、本二重鎖の活性は、遮断されるか、著しく減少するはずである。もし、ダイサー切断がRISCローディングの前に起こる場合、4塩基変異ドメインは、切り落とされ、そして、結果として生じる21 mer産物は、正常WT配列と同一であるだろう。
【０２０７】
[0197]  非修飾の末端変異配列は、WT HPRT DsiRNAと同様の有効性を示したが、それはダイサー切断が起こった場合に予測される結果である。しかしながら、“ASm-total”バージョンの末端変異配列は、有効性の際立った減少を示し、それは変異配列がダイサー切断なしでRISCへロードされた場合に予測される結果である。そのため、基質dsRNAが切断可能である（すなわち、切断部位にかかる、ヌクレアーゼ抵抗性の修飾をもたない）場合、ダイサープロセッシングが進行すると思われる。DsiRNAがダイシング部位内で修飾され、そして、ダイサーによってプロセッシングされることができない場合、dsRNAは、おそらくそのままの27 merとしてRISCローディングすることによって、まだRNAiの誘発因子として機能することができるが、低下した有効性で機能する。そのため、DsiRNAに使用される修飾パターンは、ダイサープロセッシングが予測される部位における切断可能な塩基、および、ヌクレオシド間結合を使用することは、望ましいが、必要とされない。
【０２０８】
実施例19：ASm修飾HPRT DsiRNAのダイサープロセッシング
[0198]  in vitroダイシングアッセイを非修飾および修飾二重鎖で行った。二重鎖を、リコンビナントヒトダイサーとインキュベーションし、そして、反応産物をESI-MS（エレクトロスプレー質量分析）にかけた。RNA二重鎖（100 pmol）を、リコンビナントヒトダイサー（Stratagene、La Jolla、CA）1ユニットと共に、または、なしで、20μlの20 mM Tris pH 8.0、200 mM NaCl、2.5 mM MgCl2と、37℃、24時間、インキュベーションした。試料をPerforma SR 96ウェルプレート（Edge Biosystems、Gaithersburg、MD）を使用して脱塩した。ダイサー処理前および処理後に、二重鎖RNAのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ESI-LCMS）を、ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータプロセッシングソフトウェアおよびParadigm MS4TM HPLC（Michrom BioResources、Auburn、CA）からなる、Oligo HTCSシステム（Novatia、Princeton、NJ）を使用して行った。質量分析計（LC-MS）への注入前に使用される液体クロマトグラフィーの工程では、核酸と複合体を形成するカチオンのほとんどは除去され；ナトリウムイオンの一部分はRNAと結合したままでであることができ、そして、水素のナトリウムへの置換で見られる正味質量獲得を反映して、少数の+22、または+44種として可視化される。すべてのダイシング実験は、少なくとも2回は行われた。質量データは、表22に概説される。
【０２０９】
【表２２】
2010525813.tif 000032
【０２１０】
[0199]  非修飾HPRT DsiRNAは、予測される21 mer種にダイシングされた。ASm修飾HPRT DsiRNAは、予測される位置で生じる切断による、21 merと22 merの等量の混合産物にダイシングされた。ASm全修飾HPRT DsiRNAは、通常のダイサープロセッシングを受けなかった。非修飾S鎖は、22 merに切断されたが、2'-O-メチル修飾AS鎖は、切断されないままだった。交互2'-O-メチルRNAパターンは、従って、ダイサーエンドヌクレアーゼ切断に抵抗性である。
【０２１１】
実施例20：qRT-PCRアッセイによるインターフェロン応答の測定
[0200]  自然免疫系による核酸の認識に関連する、ヒトおよびマウスの遺伝子に特異的である、qRT-PCRアッセイのパネルが開発された。これらの遺伝子の相対的レベルをモニターすることは、免疫経路の活性化を調べるための1つのアプローチである。免疫受容体、シグナル分子、インターフェロン応答遺伝子（IRG）、および試験された対照は、表23に列挙される。
【０２１２】
【表２３】
2010525813.tif 000033
【０２１３】
[0201]  これらの細胞が組織培養においてdsRNAに強く応答することが知られているため、T98G細胞を研究した。特に、前記細胞は、本発明の型のより長いRNAを認識できる、受容体／シグナル経路を所有することが示されてきた（Marquesら、2006）。抗HPRT DsiRNAの2つのバージョン、非修飾およびASm 2'-O-メチル修飾（実施例18の表21参照）を、siLentFectカチオン性脂質（Bio-Rad Laboratories）を使用して、高用量（100 nM）でトランスフェクションした。トランスフェクション後T=24時間において、ゼロ基準として脂質のみを使用し、IFN経路遺伝子を細胞培養においてアッセイした。抗HPRT DsiRNAの2つのバージョン、非修飾およびASm 2'-O-メチル修飾（実施例18の表21参照）を、siLentFectカチオン性脂質（Bio-Rad Laboratories）を使用して、高用量（100 nM）でトランスフェクションした。トランスフェクション後T=24時間において、脂質のみをゼロ基準として使用し、IFN経路遺伝子を細胞培養においてアッセイした。
【０２１４】
[0202]  リアルタイムPCR反応は、Immolase DNA Polymerase（Bioline、Randolph、MA）および200 nMプライマーおよびプローブを使用する、25μL反応液あたり推定33 ng cDNAを使用して、行った。使用したサイクリング条件は：50℃、2分、次に、95℃、10分、続いて、95℃、15秒および60℃、1分の2ステップPCRを40サイクルであった。PCRおよび蛍光測定は、ABI PrismTM 7000 Sequence DetectorまたはABI PrismTM 7900 Sequence Detector（Applied Biosystems Inc.、Foster City、CA）を使用して行った。全てのデータポイントは3回試行で行った。発現データを、別のウェルで並行して測定した、内部対照ヒト酸性リボソームリン酸タンパク質P0（RPLP0）（NM_001002）レベルで、標準化した。
【０２１５】
[0203]  結果は図17Aに示される。T98G細胞への非修飾DsiRNA処理により、自然免疫系内の多くのIFN応答遺伝子および受容体の強い誘導がもたらされた。ASm 2'-O-メチル修飾RNAの使用は、最小限の経路の活性化をもたらした。図17Bおよび17Cは、対照の配列をより明確に示す。RPLP0（対照）およびHPRT（標的）mRNAの両方は、非修飾DsiRNAで処理された細胞において非常に低いレベルに減少され、それは、mRNAの全体的な分解が起こったことの証拠であり（典型的なI型IFN応答）、一方、ASm処理細胞では、対照mRNA RPLP0レベルは正常である一方、標的HPRTレベルが減少する（RNAi抑制の成功を示す）。
【０２１６】
実施例21：サイトカインアッセイを使用するDsiRNAに対する免疫応答の測定
[0204]  dsRNA（21 mer siRNAを含む）は、in vivoで、投与された場合、特に、Toll様受容体（TLR）3、7、および8がある、エンドソーム区画への曝露を最大にする、脂質を基盤とする運搬試薬との複合体を形成して与えられた場合、自然免疫応答（古典的II型IFN応答）を誘発する危険性があることは、当技術分野において、よく知られている。21 merにおける2'-O-メチルRNAによる修飾は、一般にIFN活性化を防ぐことが示されている（Judgeら、Molecular Therapy 2006）。
【０２１７】
[0205]  Upstate（Millipore）由来の試薬を使用して、サイトカインアッセイを行った。これらは、抗体を基礎とするアッセイで、Luminex蛍光マイクロビーズ基盤を使用して多重的に実行する。絶対的定量を可能にするため、検量線を作成した。アッセイは、製造者の推奨に従って行われた。
【０２１８】
[0206]  T98G細胞に修飾および非修飾HPRT DsiRNAをトランスフェクション後、サイトカイン放出について、研究した。サイトカイン分泌および遺伝子発現を、同じ実験内で直接対比することができるように、実施例20で遺伝子発現について研究したものと同一の培養物由来の上清を使用した。RNAを高用量（100 nM）で、siLentFect（カチオン性脂質）を使用してトランスフェクションした。トランスフェクション後T=24時間における培養上清で、脂質のみをゼロ基準として使用して、サイトカインアッセイを行った。
【０２１９】
[0207]  図18は、非修飾RNAを使用した場合、炎症性サイトカインIL-8およびIL-6の高レベルの放出が観察されたことを示す。ASmパターンで2'-O-メチルRNA修飾した同じ配列をトランスフェクションした場合、サイトカインレベルの著しい上昇は観察されなかった。
【０２２０】
実施例22：DsiRNAの血清中での安定性
[0208]  以下の実施例は、修飾あり、または、なしのDsiRNAに付与される、ヌクレアーゼ分解からの保護の相対的なレベルを示す。
【０２２１】
[0209]  RNAを50％ウシ胎仔血清中、様々な長さの時間で（24時間まで）37℃でインキュベーションした。血清を抽出し、そして、核酸を20％非変性PAGEで分離し、そして、Gelstar染色で可視化した。マーカーは、示された長さの平滑二重鎖RNAである。研究された配列は表24に列挙される。
【０２２２】
【表２４】
2010525813.tif 000034
【０２２３】
[0210]  図19に示される通り、27 mer Dsi RNAは、化学的修飾なしでさえ、血清中での安定性の上昇を示した。ASmパターンでの2'-O-メチルRNAの添加は、このアッセイによっては、安定を上昇させないようであった。ASm +5'P修飾パターンは、安定性を改善した。21 mer siRNAは、おそらく平滑19 merを示す種への迅速な分解を示した（分解の第一段階は、ssRNA 3'-突出部の除去である）。二重鎖dsRNAドメインの分解はより遅い。
【０２２４】
[0211]  血清による分解を受けたRNAをHPLCによって分離し、そして、ピークを精製した；実際の分解産物を、Novatia ESI-MS platformを使用する、LC-MSによって同定した（in vitroダイシングアッセイについて前述された通りの方法）。興味深いことに、PAGE手法によって完全なままのものであるように見えるバンドは（図21）、実際は完全なものと部分的に分解されたRNAを含む、混合した集団である。質量分析により、5'リン酸により遮断される、5'エキソヌクレアーゼ活性の存在が明らかとなり、そのため、5'リン酸基を両方の鎖に有する二重鎖（ASm+5'P）は、非修飾またはASm修飾二重鎖よりも、完全なままであった。血清中24時間インキュベーション後に存在する、完全なままのDsiRNAの相対量は、ASm+5'P＞ASm＞非修飾WTであった。ダイサープロセッシングの結果である、天然に生じるmiRNAおよびsiRNA上に5'リン酸は存在する。合成RNA二重鎖の全ての鎖への5'リン酸の添加は、ある限定された程度のヌクレアーゼ安定性を与える、安価かつ生理学的方法である可能性がある。
【０２２５】
[0212]  本発明を記述する文脈において（特に、以下の請求項の文脈において）、“a”および“an”および“the”および同様の指示対象用語の使用は、本明細書中で別に示されるか、または、文脈によって明らかに否定されない限り、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。“含む（comprising）”、“有する（having）”、“含む（including）”、および“含む（containing）”という用語は、別に記述されない限り、制限のない用語（すなわち、“限定するものではないが、含む”を意味する）として、解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に別に示されない限り、単に、範囲内に入るそれぞれ別の値を個々に言及する簡便な方法として機能することが意図されており、そして、それぞれの別の値は、本明細書中でそれぞれに列挙されているかのように、本明細書中に取り入れられる。本明細書に記述されるすべての方法は、本明細書中で別に示されるか、または、文脈によって明らかに否定されない限り、あらゆる適当な順序において行われることができる。ありとあらゆる実施例、または本明細書中で提供される例示語（たとえば、“などの（such as）”）の使用は、本発明をよりよく理解することのみが意図されており、そして、別に請求されない限り、本発明の範囲の限定をもたらさない。本明細書中の用語は、本発明の実施に不可欠である、請求されないいかなる要素をも示すと解釈されてはなない。
【０２２６】
[0213]  本発明を実行するため、発明者に知られる最も良い様式を含み、本発明の態様は、本明細書中に記述される。それらの態様の変形は、前記の記述を読むことにより、当業者により明らかになってよい。発明者は、当業者が前記変形を適するように使用することを予測し、そして、発明者は、本明細書中に特に記述されるものとは違う形で、本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、適用される法律によって許可される場合、添付される請求項に記述される対象の、すべての修飾および同等物を含む。さらに、前記のすべての可能性のある変形における、上述の要素のいかなる組み合わせも、本明細書中で別に示されるか、または、文脈によって明らかに否定されない限り、本発明に含まれる。
【図１−１】
2010525813.tif 000035
【図１−２】
2010525813.tif 000036
【図１−３】
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【図８Ａ】
2010525813.tif 000038
【図８Ｂ】
2010525813.tif 000039
【図８Ｃ】
2010525813.tif 000040
【図８Ｄ】
2010525813.tif 000041
【図９Ａ】
2010525813.tif 000042
【図９Ｂ】
2010525813.tif 000043
【図９Ｃ】
2010525813.tif 000044
【図９Ｄ】
2010525813.tif 000045
【図１１】
2010525813.tif 000046
【図１２】
2010525813.tif 000047
【図１３】
2010525813.tif 000048
【図１４】
2010525813.tif 000049
【図１５】
2010525813.tif 000050
【図１６】
2010525813.tif 000051
【図１７】
2010525813.tif 000052
【図１８】
2010525813.tif 000053
【図１９】
2010525813.tif 000054
【図２−１】
2010525813.tif 000055
【図２−２】
2010525813.tif 000056
【図３】
2010525813.tif 000057
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2010525813.tif 000059
【図５−１】
2010525813.tif 000060
【図５−２】
2010525813.tif 000061
【図６】
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【図７−１】
2010525813.tif 000063
【図７−２】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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