(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合前の呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質の少なくとも１つの抗原エピトープを提示する熱安定な組換えポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質エクトドメインを含み、前記呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質エクトドメイン内の２つの多塩基性フューリン切断部位が、前記部位内の全アルギニン残基をリシン残基により置換することによって変異導入され、これにより前記フューリン切断部位が不完全になっている
熱安定な組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記組換えポリペプチドのエクトドメインに異種の三量体形成ドメインが続き、オリゴマーを形成する、請求項１に記載の熱安定な組換えポリペプチド。
【請求項３】
異種の前記三量体形成ドメインが、ＧＣＮ４ロイシンジッパー三量体形成モチーフである、請求項２に記載の熱安定な組換えポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含まない、請求項１−３のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチド。
【請求項５】
ＨＲＢ領域が、エクトドメインから機能的に欠失している、請求項１−４のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチド。
【請求項６】
ＨＲＢ領域の前記機能的欠失が配列番号１０の欠失を含む、請求項５に記載の熱安定な組換えポリペプチド。
【請求項７】
前記三量体形成ドメインのカルボキシ末端に連結したＬｙｓＭペプチドグリカン結合ドメインをさらに含む、請求項３−６のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチド。
【請求項８】
３×Ｓｔｒｅｐタグをさらに含む、請求項１−６のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチド。
【請求項９】
前記抗原エピトープが、融合前特異的モノクローナル抗体ＡＭ２２もしくはＤ２５、またはＡＭ２２およびＤ２５によって認識される、請求項１−８のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１−９のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含む、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記熱安定な組換えポリペプチドが、共有結合的または非共有結合的に担体粒子に結合している、請求項１０または１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記担体粒子が細菌様粒子である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
請求項１−９のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
対象において免疫応答をＲＳＶに対し誘導するための、請求項１−９のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチドまたは請求項１０−１３のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、請求項１−９のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチドまたは請求項１０−１３のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ＲＳＶ感染に対するワクチンにおける使用のための、請求項１−９のいずれかに記載の熱安定な組換えポリペプチドまたは請求項１０−１３のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医療分野に関し、詳細にはワクチン、より詳細には、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ：Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）に対し免疫するためのワクチンにおいて有用な組換えタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）は、急性の上気道および下気道感染を引き起こし、生後１年目の乳児が入院する主要な原因となっている。ＲＳＶによる再感染は頻繁に起き、確固たる殺菌免疫（ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）が達成されることは決してない。ＲＳＶはまた年配者において、インフルエンザに匹敵する著しい疾患負荷および死亡率の原因ともなる。
【０００３】
ｈＲＳＶは、パラミクソウイルス科（ｆａｍｉｌｙ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のニューモウイルス亜科（ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）に属する、エンベロープを持つマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。この亜科の他のメンバーには、ウシＲＳＶ（ｂＲＳＶ）およびヒト・メタニューモウイルス（ｈＭＰＶ：ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）がある。ｈＲＳＶ粒子は、中和抗体の重要な標的となる主要な２つの糖タンパク質を含有する：接着タンパク質Ｇ（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）および融合タンパク質Ｆである（Collins PL and JA Melero. 2011. Progress in understanding and controlling respiratory syncytial virus: still crazy after all these years. Virus Res 162:80-99によって総説されている）。Ｆタンパク質よりもＧタンパク質における差異の大きい、２つのＲＳＶ血清型（ＡおよびＢ）がある。Ｆタンパク質はＧに比べ、より効率の高い中和および防御抗原のようである。これは、Ｇタンパク質を免疫認識から遮蔽し得る炭水化物の含量が、Ｇタンパク質で高いことと関係する可能性がある。加えて、Ｇタンパク質は感染細胞から分泌もされ、この形態においては、抗原の囮として機能し得る。Ｆタンパク質は、ウイルス膜と宿主膜とを融合させるように機能するだけでなく、ウイルス−細胞接着において主要な役割も担う。Ｆを標的とする中和抗体はしたがって、ウイルス−細胞接着および／またはウイルス−細胞融合を妨げる可能性がある。
【０００４】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、三量体へとアセンブリーする不活性な前駆体タンパク質（「Ｆ０」と称する）として合成されるＩ型膜タンパク質である。組換え野生型ＲＳＶ  Ｆをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１として示し、一方、コードされる組換え可溶性野生型タンパク質の配列を配列番号２として示す。この前駆体タンパク質は、分泌経路により輸送される間に、フューリン様プロテアーゼによって切断され、「Ｆ２」、「ｐ２７」および「Ｆ１」と称する形態になる。ジスルフィド架橋を介して共有結合的に連結されたＦ２およびＦ１のホモ三量体は、準安定な融合前の活性構造を形成する。Ｆ１は、ヘプタッド反復ＡおよびＢ（ＨＲＡおよびＨＲＢと称する）、融合ペプチド（ＦＰ）および膜貫通（ＴＭ）ドメインを含み、最後の２つは、この分子の反対側に位置する。ウイルス−細胞接着が起きると、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のコンホメーションが変化して、疎水性の融合ペプチドが宿主細胞膜へと挿入されることになる。続いてこの融合中間体は、非常に安定な融合後構造へとリフォールディングする。この後者の構造のアセンブリーは、６ヘリックスバンドル（６ＨＢ）のアセンブリーにより規定される。この６ＨＢは、各単量体のＨＲＡおよびＨＲＢを逆平行のコンホメーションにおいて含む。その結果、ＨＲＢの下流に位置する膜貫通ドメインと、ＨＲＡの上流に位置する融合ペプチドとが隣接する位置に来るので、ウイルス膜および宿主膜の融合が達成される。融合後コンホメーションにあるＦタンパク質の構造が、研究により明らかにされている（McLellan JS et al. 2011. J Virol 85:7788-96；Swanson KA et al. 2011. Proc Natl Acad Sci USA 108:9619-24）。最近、融合前コンホメーションにあるＦタンパク質の構造も明らかにされた［McLellan et al. 2013 Science 340(6136):1113-7］。Ｆをその所望のコンホメーションのまま安定化するために、このタンパク質は、融合前特異的（ｐｒｅ−ｆｕｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）中和抗体Ｄ２５（ＵＳ２０１２／００７０４４６）と共に共発現された。この共結晶構造から、Ｄ２５は、抗原部位０と表す、三量体の頂端のある部位（図２）に結合することが明らかになった。Ｆの融合前形態にＤ２５が結合する領域は、配列番号２に示す野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質配列のアミノ酸６０〜７１（Ｆ２領域）およびアミノ酸１９７〜２１０（Ｆ１領域）の双方を包含する。これらの領域は、McLellan et al. April 2013. Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a prefusion-specific neutralizing antibody. Science 340:1113-7の図３に示されているアミノ酸６３〜７４および２００〜２１３にそれぞれ対応する。電子顕微鏡観察および競合結合により、ＡＭ２２（ＵＳ２０１２／００７０４４６）も同じ抗原部位に結合することが示された。
【０００５】
ｈＲＳＶワクチン開発は、１９６０年代に試験されたホルマリン不活化ウイルスワクチンによって得られた悲惨な結果に悩まされてきた。疾患重症度および入院率は、ワクチン接種を受けた子供達において増加した。この子供達は後に、ＲＳＶに自然感染し、幾人かは死亡した。ワクチンに誘導されたこの疾患増強の機構は、依然として不完全にしか理解されていないが、中和抗体の誘導が弱いこと、および好酸球が動員されることに関連するようである。この試みに続き、弱毒生ＲＳＶ株、サブユニットワクチンおよびウイルスベクターワクチンを含めた多数のＲＳＶワクチン戦略が探究されてきており、成果は様々であった（Groothuis JR et al. 2011. Prevention of serious respiratory syncytial virus-related illness. I: Disease pathogenesis and early attempts at prevention. Adv Ther 28:91-109；Hurwitz JL. 2011. Respiratory syncytial virus vaccine development. Expert Rev Vaccines 10:1415-33）。成功したＲＳＶワクチンは当然、免疫病理を誘導せずに、防御免疫を誘導するはずである。
【０００６】
報告されている諸開発
現在、ＲＳＶによって媒介される疾患を防止するために唯一利用できる選択肢は、市販のＲＳＶ中和モノクローナル抗体パリビズマブの受動投与である。この製品は、ＲＳＶ感染の予防として使用されており、Ｆタンパク質の高度に保存されたエピトープを認識する（Beeler JA and K van Wyke Coelingh. 1989. Neutralization epitopes of the F glycoprotein of respiratory syncytial virus: effect of mutation upon fusion function. J Virol 63:2941-50；Groothuis JR et al. 2011. Prevention of serious respiratory syncytial virus-related illness. II: Immunoprophylaxis. Adv Ther 28:110-25）。しかしパリビズマブの費用が高いためにその使用は、重度の呼吸器疾患を発症するリスクが高いと考えられる乳児に限定されている。
【０００７】
一般集団の防御のためのワクチンが必要とされていが、現在のところ、ＲＳＶに対し利用できる、承認を受けたワクチンはない。Ｆタンパク質である主要なＲＳＶの中和抗原に基づく多くのワクチン候補が、安定性、再現性および効力の問題によって失敗に終わった。
【０００８】
ＲＳＶ  Ｆの融合後形態は中和エピトープを含むことが示されているが［McLellan JS et al. 2011. Structure of respiratory syncytial virus fusion glycoprotein in the postfusion conformation reveals preservation of neutralizing epitopes. J Virol 85:7788-96；Swanson KA et al. 2011. Structural basis for immunization with postfusion respiratory syncytial virus fusion F glycoprotein (RSV F) to elicit high neutralizing antibody titers. Proc Natl Acad Sci USA 108:9619-24］、Ｍａｇｒｏおよび共同研究者達は、ヒト血清において見出される中和活性のほとんどが、Ｆの融合前形態に特異的な抗体によるものであることを示した（Magro M et al. 2012. Neutralizing antibodies against the preactive form of respiratory syncytial virus fusion protein offer unique possibilities for clinical intervention. Proc Natl Acad Sci USA 109:3089-94）。さらに、Ｆは認識するが、融合後コンホメーションにおそらくある、Ｆの組換え可溶性エクトドメインは認識しないＲＳＶ中和抗体が同定された（ＷＯ２００８／１４７１９６；ＵＳ２０１２／００７０４４６；McLellan JS et al. 2011. J Virol 85:7788-96；Swanson KA et al. 2011. Proc Natl Acad Sci USA 108:9619-24；Gonzalez-Reyes L et al. 2001. Cleavage of the human respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required for activation of membrane fusion. Proc Natl Acad Sci USA 98:9859-64；Ruiz-Arguello MB et al. 2002. Effect of proteolytic processing at two distinct sites on shape and aggregation of an anchorless fusion protein of human respiratory syncytial virus and fate of the intervening segment. Virology 298:317-26；Ruiz-Arguello MB et al. 2004. Thermostability of the human respiratory syncytial virus fusion protein before and after activation: implications for the membrane-fusion mechanism. J Gen Virol 85:3677-87）。図２を参照されたい。融合前Ｆ、または融合前Ｆと融合後Ｆとの間の中間体の形態（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｏｒｍ）をおそらく認識し、融合後Ｆは認識しないこれらの抗体は、Ｆタンパク質の全形態を認識するパリビズマブよりも効果的にＲＳＶを中和することが示された。
【０００９】
免疫組成物において使用するためにＲＳＶ  Ｆタンパク質を改変する試みが、報告されている（ＷＯ２０１０／１４９７４３；ＷＯ２０１２／１５８６１３）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、融合前の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質の少なくとも１つの抗原エピトープを提示する組換えポリペプチドの熱安定なオリゴマー複合体であって、前記ポリペプチドは、ＨＲＢ領域が機能的に欠失しており、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが欠失しかつ異種の三量体形成ドメインによって置換されている、ＲＳＶ  Ｆタンパク質エクトドメインを含み、前記エクトドメイン内の２つの多塩基性（ｍｕｌｔｉｂａｓｉｃ）フューリン切断部位が欠失しまたは変異導入され、これにより前記部位が不完全になっている、熱安定なオリゴマー複合体に関する。本発明はさらに、上述の熱安定なオリゴマー組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物、および、前記免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫応答をＲＳＶ  Ｆに対し誘導する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）由来の野生型融合（Ｆ）タンパク質の、遺伝子工学的に設計されたＲＳＶ  Ｆ抗原との比較を示す。矢頭はフューリン切断部位を指し示し、切断後にペプチドｐ２７が遊離する。フューリン切断の結果生じる、野生型配列のＦ１およびＦ２断片を示してある。図１Ｂは、パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ−５）融合前Ｆおよび遺伝子工学的に設計されたＲＳＶ融合後Ｆの諸結晶構造のデータに基づいた、遺伝子工学的に設計されたＲＳＶ融合前Ｆのモデルである。図１Ｃは、図１Ａの、遺伝子工学的に設計されたＲＳＶ融合後Ｆの構造を示す。ＣＴ＝細胞質尾部；ＳＰ＝シグナルペプチド（ＳＰのＤＮＡ配列は配列番号７に、アミノ酸配列は配列番号８に示す）；ＴＭ＝膜貫通領域である。図は全てNature Reviews Microbiology 10, 807-813; 2012からの転載である。
【図２】図２Ａ［McLellan JS et al. 2011. J Virol 85:7788-96からの転載（ｔａｋｅｎ  ｆｒｏｍ  ｔａｋｅｎ  ｆｒｏｍ）］は、ｈＲＳＶ  Ｆ三量体の、提唱されている融合前コンホメーションの三次元モデルであって、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬサーバー施設（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）、および鋳型としてＰＩＶ５  Ｆタンパク質の融合前構造の原子座標（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード、２Ｂ９Ｂ）を使用して構築した三次元モデルを示す。３つの単量体の主鎖構造を灰色にて示す。出版された原典のカラー図（McLellan JS et al. 2011. J Virol 85:7788-96）においては、１つの単量体の融合ペプチド配列はピンクに、ＨＲＡの配列は黒色にて示されている。Ｆタンパク質の異なる抗原部位にエピトープの位置するモノクローナル抗体によって選択されたウイルス分離株またはエスケープ変異体において変化している残基が、カラーの球としてその図中に示されている（抗原部位Ｉ、アミノ酸３８９；抗原部位ＩＩ、アミノ酸２６２、２６８、２７２および２７５；ならびに抗原部位ＩＶ、アミノ酸４２９、４３２、４３３、４３６および４４７）。抗原部位０は図２Ａに示してある［抗原部位の位置はMcLellan et al. 2013 Science 340(6136):1113-7より改変引用］。２つのタンパク質切断部位は、１つの単量体について、矢印によって指し示す。図２Ｂ（やはりMcLellan JS et al. 2011. J Virol 85:7788-96から転載）は、ＦＰを欠失したＲＳＶ  Ｆ上の中和エピトープを示す。モタビズマブおよびパリビズマブ（抗原部位ＩＩ）、１０１Ｆ（抗原部位ＩＶ）および１３１−２ａ（抗原部位Ｉ）に対するエピトープは溶媒に露出しており、抗体結合に適合したコンホメーションにある。残基２５４から２７７までは赤色に（抗原部位ＩＩ）、残基４２９から４３７までは青色に（抗原部位ＩＶ）、Ｐｒｏ３８９内の諸原子は球として（抗原部位Ｉ）示してある。残基の番号付けはMcLellan JS et al. 2011. J Virol 85:7788-96に従う。
【図３】図３は、マイクロ中和アッセイにおいて感染を５０％阻止するのに必要な、抗体の量を示す。この量が少ないほど、効果的な抗体である。Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）＝パリビズマブである。
【図４】図４は、本発明に使用した様々な発現コンストラクトの模式図を示す。ＴＭ＝膜貫通領域；ＣＴ＝細胞質尾部；ＣＤ５＝シグナルペプチド；ＨＲＡ＝ヘプタッド反復Ａ；ＨＲＢ＝ヘプタッド反復Ｂ；ＧＣＮ＝ＧＣＮ４三量体形成モチーフである。黒点は、システインからアラニンへの変異を表す。点線はフューリン切断部位の位置を示す。黒矢印は、シグナルペプチド（ＣＤ５）およびＰ２７が切り離される位置を指し示す。灰色矢印はトリプシン感受性切断部位を指し示す。
【図５】図５は、還元し、かつ加熱したか（左パネル）、還元せず、かつ加熱したか（中央パネル）、または還元せず、かつ加熱しなかったか（右パネル）のいずれかのＦｗｔ、Ｆｗｔ−ＧＣＮ、ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮタンパク質のウエスタンブロットを示す。右パネルの高次タンパク質は、これらのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動する前に、２−βメルカプトエタノール（還元性）により処理し、かつ加温するとほぼ完全に消失する、これらのタンパク質の融合後状態を示す。
【図６】図６は、加熱（上パネル）または加熱なし（下パネル）でトリプシン（Ｔ）による切断を増加させていった後に、Ｆｗｔ、Ｆｗｔ−ＧＣＮ、ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮタンパク質を分離したゲルのクマシーブルー染色を示す。
【図７】図７Ａは、様々な可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ、Ｆｗｔ−ＧＣＮ、ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮ）のＡＭ２２抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮについてトリプシンにより処理した場合はそう明記してある。図７Ｂは、様々な可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ、Ｆｗｔ−ＧＣＮ、ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮ）の１３１−２ａ抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮについてトリプシンにより処理した場合はそう明記してある。図７Ｃは、様々な可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ、Ｆｗｔ−ＧＣＮ、ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮ）のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮについてトリプシンにより処理した場合はそう明記してある。図７Ｄは、様々な可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ、Ｆｗｔ−ＧＣＮ、ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮ）の抗ｓｔｒｅｐ抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮについてトリプシンにより処理した場合はそう明記してある。
【図８】図８は、加熱したが還元しなかったか（左パネル）、または加熱し、かつ還元したか（右パネル）のいずれかのＦｗｔ−ＧＣＮ、Ｆｗｔ、Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｗｔ−ｃｙｓ、Ｆｌｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓタンパク質のウエスタンブロットを示す。実施例２に概要を述べたようにＨＲＢドメインにシステイン残基を導入すると、熱に耐性で、かつ還元に対しては部分的にしか感受性でない高次構造が生じる。
【図９】図９は、加熱後に（上パネル）または加熱せずに（下パネル）、かつトリプシンによる消化を増加させていった後に（Ｔ）、Ｆｗｔ−ｃｙｓ、Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮタンパク質を分離したゲルのクマシーブルー染色を示す。
【図１０】図１０Ａは、システインおよびアラニン変異をＨＲＢドメイン内に有する様々な可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ−ｃｙｓ、Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｗｔ−ａｌａ、Ｆｗｔ−ａｌａ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ａｌａ、Ｆｌｙｓ−ａｌａ−ＧＣＮ）の、ＡＭ２２コンホメーション認識抗体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。図１０Ｂは、システインおよびアラニン変異をＨＲＢドメイン内に有する様々な可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ−ｃｙｓ、Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｗｔ−ａｌａ、Ｆｗｔ−ａｌａ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ａｌａ、Ｆｌｙｓ−ａｌａ−ＧＣＮ）の、１３１−２ａコンホメーション認識抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。図１０Ｃは、システインおよびアラニン変異をＨＲＢドメイン内に有する様々な可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ−ｃｙｓ、Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｗｔ−ａｌａ、Ｆｗｔ−ａｌａ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ａｌａ、Ｆｌｙｓ−ａｌａ−ＧＣＮ）の、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）コンホメーション認識抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。図１０Ｄは、システインおよびアラニン変異をＨＲＢドメイン内に有する様々な可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ−ｃｙｓ、Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ、Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｗｔ−ａｌａ、Ｆｗｔ−ａｌａ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ａｌａ、Ｆｌｙｓ−ａｌａ−ＧＣＮ）の、抗ｓｔｒｅｐコンホメーション認識抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、還元せず、かつ加熱したか（左パネル）、または還元も加熱もしなかったか（右パネル）のいずれかのＦｗｔ−ａｌａ−ＧＣＮ、Ｆｗｔ−ａｌａ、Ｆｌｙｓ−ａｌａ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ａｌａタンパク質のウエスタンブロットを示す。
【図１２】図１２Ａは、Ｆタンパク質の融合前（左パネル）および融合後（右パネル）状態を、利用可能な、および利用可能でない様々な抗体のエピトープと共に示す。６ＨＢの存在しない融合前状態においては、ＡＭ２２に対するエピトープは利用可能だが（黒星印）、一方、１３１−２ａに対するエピトープは遮蔽されている（白抜きの記号）。６ＨＢの存在する、Ｆタンパク質の融合後状態においては、ＡＭ２２に対するエピトープは提示されていないが、一方、１３１−２ａに対するエピトープは利用可能である（白抜きにする代わりに塗りつぶした記号）。パリビズマブに対するエピトープ（三角形）は、融合前状態および融合後状態のいずれにおいても利用可能なままである。図１２Ｂは、Ｆタンパク質の融合前状態（６ＨＢなし）が、２つの中間体状態（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｔｅｓ）を遷移して、６ＨＢを呈する融合後状態に至るのを示し、種々の抗原部位の存在、出現および消失も示している。（諸記号をそれぞれの抗体と共に示す。ここで、１３１−２ａに対する白抜きの記号は、遮蔽されたエピトープを、１３１−２ａに対する塗りつぶした記号は、利用可能なエピトープを表す）。頭部ドメイン（縞状）のリフォールディングが原因となり、融合前状態から融合後状態にかけて、ＡＭ２２エピトープが消失していく。
【図１３】図１３は、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮタンパク質の発現を、還元条件（左パネル）および非還元条件（中央および右パネル）において示す。熱安定性も調べた（右パネルに対する中央パネル）。
【図１４】図１４は、非還元条件下における、加熱後の（左パネル）または加熱していない（右パネル）Ｆｌｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮについてのウエスタンブロットを示す。増加させていったトリプシン消化を示してある（Ｔ）。トリプシン処理なし、はマイナス（−）を用いて示してある。Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮは、切断に関係なく、かつ精製産物の加熱に関係なく高次構造を形成する。機能的ＨＲＢドメインがない以上、これらの高次構造は６ＨＢとは関連しない。
【図１５】図１５Ａは、異なる２つの可溶性Ｆタンパク質（Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ）のＡＭ２２コンホメーション認識抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。トリプシンの処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒｙｐｓｉｎ）は明記してある。図１５Ｂは、異なる２つの可溶性Ｆタンパク質（Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ）の１３１−２ａコンホメーション認識抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。トリプシンの処理は明記してある。図１５Ｃは、異なる２つの可溶性Ｆタンパク質（Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ）のＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）コンホメーション認識抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。トリプシンの処理は明記してある。図１５Ｄは、異なる２つの可溶性Ｆタンパク質（Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ）の抗ｓｔｒｅｐコンホメーション認識抗体との反応性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。トリプシンの処理は明記してある。
【図１６】図１６は、機能的ＨＲＢドメインを有するＲＳＶ  Ｆタンパク質（融合前Ｆ；左）およびＨＲＢステムのＧＣＮ４ステムによる置換を有するＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ；上パネル、中央）の模式図である。６ＨＢの存在しない融合前状態においては、ＡＭ２２に対するエピトープは利用可能だが（黒星印）、一方、１３１−２ａに対するエピトープは提示されていない（白抜きの記号）。トリプシン処理すると頭部ドメインがリフォールディングする。これによって、ＡＭ２２による認識は顕著に減少するが、一方、パリビズマブに対するエピトープ（三角形）は保持される。また、１３１−２ａに対するエピトープはまだ提示されない。ステムが存在しない場合（Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ；右パネル）、トリプシン処理するとやはり、頭部ドメインがリフォールディングする。ＡＭ２２に対するエピトープはもはや存在しないが、１３１−２ａに対するエピトープは利用可能である［黒塗りの記号］。
【図１７】図１７Ａは、比較用のＲＳＶ  Ｆタンパク質として使用したコンストラクト、Ｆｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢの模式図を示す。ここで、ＴＭ＝膜貫通領域；ＣＴ＝細胞質尾部；Ｐ２７＝フューリン切断後にＦから解離する２７アミノ酸ペプチド；ＣＤ５＝シグナルペプチド；ＦＰ＝融合ペプチド；ＨＲＡ＝ヘプタッド反復Ａ；ＨＲＢ＝ヘプタッド反復Ｂである。点線は、フューリン切断部位の位置を示す。矢印は、シグナルペプチド（ＣＤ５）およびＰ２７が切り離される位置を指し示す。図１７Ｂは、異なる可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ）の、異なるコンホメーション認識抗体（Ｄ２５および１３１−２ａ）との反応性についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ＭＡｂであるＤ２５および１３１−２ａとの組換えタンパク質の反応性は、２倍希釈したこれらの抗体を加えることによって決定した。抗体の結合は、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を使用して検出した。棒グラフは、一点希釈した抗体に対応する値を表す。各Ｆタンパク質調製物について、同一の抗体希釈を示してある。これは、これらの抗体との反応性が最も高いＦタンパク質調製物の曲線のうちの直線部分からとられた希釈である。
【図１８】図１８Ａは、本発明に使用したコンストラクト、Ｆａｌａ−ＧＣＮの模式図を示す。ここで、ＴＭ＝膜貫通領域；ＣＴ＝細胞質尾部；ＣＤ５＝シグナルペプチド；ＦＰ＝融合ペプチド；ＨＲＡ＝ヘプタッド反復Ａ；ＨＲＢ＝ヘプタッド反復である。黒矢印は、シグナルペプチド（ＣＤ５）が切り離される位置を指し示す。２つの多塩基性（ｍｕｌｔｉｂａｓｉｃ）フューリン切断部位（点線灰色矢印によって指し示す）内のアルギニンおよびリシン残基は、アラニン残基（ＲＡＲＲからＲＡＡＡへ、およびＲＫＲＲからＲＫＡＡへ）へと変異導入されている。この切断部位（ａｒｇ−＞ａｌａ）変異体コンストラクトを「Ｆａｌａ−ＧＣＮ」と称する（ヌクレオチド配列：配列番号２３；アミノ酸配列：配列番号２４）。図１８Ｂは、ポリエチレンイミンＩ（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションしたＲＳＶ  Ｆエクトドメインをコードする配列（Ｆｗｔ、Ｆｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢ、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ、Ｆａｌａ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮ）の一過性トランスフェクション後の、産生レベル（Ｆのｍｇ数／組織培養上清のＬ数）を示す。収率を、ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して決定した。
【図１９】図１９Ａ、ＢおよびＣは、純血種ニュージーランド白ウサギ（群あたりＮ＝２）が、様々な可溶性Ｆタンパク質（Ｆｗｔ、Ｆｗｔ−ΔＦＰ  ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ）を用いて筋肉内にワクチン接種された、ワクチン接種研究の結果を示す。最終血清をＥＬＩＳＡに供して、図１９Ａに示す融合前Ｆ（Ｔ４フォルドンにより三量体形成したＦｌｙｓ−ΔＨＲＢによってコーティングしたＥＬＩＳＡプレート）、または図１９Ｂに示す融合後Ｆ（Ｆｗｔによってコーティングしたプレート）に対する抗体力価を決定した。報告した力価（２ｌｏｇ）は、少なくとも０．２のＯＤ４５０に対応するサンプル希釈を算出し、逆数をとったものである。図１９Ｃは、融合前Ｆ特異的力価と融合後Ｆ特異的力価との比を示す。
【図２０】図２０は、図１９の説明に記述した血清を使用したＥＬＩＳＡ解析の結果を示す。ＥＬＩＳＡプレートは、抗原部位０の一部分を包含する合成ペプチドｈＡ−ｈｉｓによってコーティングした。報告した力価（２ｌｏｇ）は、少なくとも０．２のＯＤ４５０に対応するサンプル希釈を算出し、逆数をとったものである。図２０Ａは、ペプチドｈＡ−ｈｉｓに対し特異的なＥＬＩＳＡに供したモノクローナルＤ２５、Ｓｙｎａｇｉｓおよび１３１−２Ａの抗体力価を示す。図２０Ｂは、ペプチドｈＡ−ｈｉｓに対し特異的なＥＬＩＳＡに供した最終ウサギ血清の抗体力価を示す。
【図２１】図２１ＡおよびＢは、図１９Ａ、ＢおよびＣの説明に記述した血清のＲＳＶウイルス中和力価を示す。図２１Ａは、ＲＳＶ株ＡおよびＢに対する最終血清を用いて得られた融合前特異的ＥＬＩＳＡ力価の平均（２ｌｏｇ）を示す。図２１Ｂは、ＲＳＶ株ＡおよびＢに対する最終血清を用いて得られた融合後特異的（ｐｏｓｔ−ｆｕｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＥＬＩＳＡ力価の平均（２ｌｏｇ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ＲＳＶの組換え可溶性Ｆタンパク質の設計および評価にとっては、組換えＦタンパク質のコンホメーション状態を実証する手段のないことが、かなりの難点となってきた。入手可能な文献に基づいて本発明の発明者らは、Ｆの融合後形態は安定な６ＨＢを含むはずで、これは融合後特異的抗体によっては認識されるが、融合前特異的抗体によっては認識されないはずであると仮定した。対照的に、Ｆタンパク質の融合前形態は６ＨＢを持たないはずで、融合前特異的抗体によっては認識されるが、融合後特異的抗体によっては認識されない。この知見を踏まえ、このような融合前特異的抗体によって、安定で（例えば熱に対して耐性）、かつストレス性条件下においても依然として融合前コンホメーションにあるＲＳＶ  Ｆタンパク質変異体の同定が可能となるはずであると推論した。このような安定な融合前変異体（ｓｔａｂｌｅ  ｐｒｅ−ｆｕｓｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ）は次工程にて、ＲＳＶに対するワクチンにおいて使用し得る。安定なコンホメーションにあるこれらの変異体が免疫応答（インビボ）を引き起こし、融合前状態のＦタンパク質を持つウイルスを中和できるはずの中和抗体を生じさせることになるからである。本発明は、実際に本発明者らが、融合前コンホメーションのまま安定に保持され、したがってＲＳＶワクチンにおいて有用な組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質変異体を同定することができたことを開示する。
【００１３】
本発明は、以下の定義を参照することによって理解することができる。
【００１４】
「機能的に欠失」とは、欠失したドメインの機能が失われ、それによりそのタンパク質の特性が変更されるような、天然タンパク質配列からのアミノ酸の配列（「ドメイン」と称することもある）の欠失を意味する。
【００１５】
「熱安定」とは、ポリペプチドが水溶液中において、ある温度範囲に渡ってその３次元コンホメーションを維持し、そうすることによって、例えばこのようなポリペプチドの抗原特性を含めた、その特性を維持することを意味する。好ましい温度範囲は、約５℃から約６０℃である。より好ましい温度範囲は、約１０℃から約８０℃である。最も好ましい温度範囲は、約２０℃から約１００℃である。例示的コンホメーションは、融合前状態として特徴付けられるコンホメーションである。
【００１６】
「オリゴマー」または「オリゴマー複合体」とは、２つ、３つまたは４つのポリペプチド単量体からなるポリペプチド、例えば、実質的に同一のポリペプチド単量体による二量体、三量体または四量体の複合体などを意味する。本発明において最も好ましいオリゴマーポリペプチドは、三量体ポリペプチドである。
【００１７】
「融合後コンホメーション」または「融合後状態」とは、ポリペプチドまたはポリペプチドオリゴマーが最初に発現後またはオリゴマーアセンブリー後にとる形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）とは異なる三次元タンパク質形状であって、このようなポリペプチドまたはオリゴマーが、酵素作用がもとで、および／または他のタンパク質との、もしくは細胞膜などのタンパク質性アセンブリーとの物理的接触がもとで相互作用して生じる三次元タンパク質形状を意味する。融合後状態を形成するＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＨＲＡ−ＨＲＢ  ６ＨＢを含むＲＳＶ  Ｆタンパク質である。
【００１８】
「融合前コンホメーション」または「融合前状態」とは、ポリペプチドまたはポリペプチドオリゴマーが最初に発現後またはオリゴマーアセンブリー後にとる三次元タンパク質形状を意味する。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、細胞膜と融合する前には、融合前の形状を呈するＲＳＶ  Ｆタンパク質オリゴマーを形成する。融合前のＲＳＶ  Ｆタンパク質は以下の特徴を含む：ＨＲＡ領域は、ＲＳＶ  Ｆ頭部領域においてドメインＩＩＩに対しパッキングされ、ＨＲＢ領域は、６ヘリックスバンドル（６ＨＢ）の文脈においてＨＲＡ領域と会合するのではなく、むしろドメインＩおよびＩＩの近傍において三量体コイルドコイルストーク（ｔｒｉｍｅｒ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｓｔａｌｋ）を形成する。
【００１９】
「精製」タンパク質またはポリペプチドとは、組成物中に存在する、他の高分子成分に対する相対的なタンパク質の量が、粗調製物中に存在する量よりも相当高くなっているような、ポリペプチド産生系の他の成分から単離されたタンパク質またはポリペプチドを意味する。一般に精製タンパク質またはポリペプチドは、少なくとも約５０％均質、より好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または実質的に均質なはずである。
【００２０】
ＲＳＶ  Ｆエクトドメインのタンパク質配列は、配列番号１８のアミノ酸配列によって例示される。対応するヌクレオチド配列を配列番号１７に示す。ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸配列の番号付けおよび特定可能なドメインへの言及は、本明細書においては配列番号１８に対してなされる。しかし、同等な組換えポリペプチドを作製するために、他の株のＲＳＶを使用することもできる。
【００２１】
本発明は、融合前の呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質の少なくとも１つの抗原エピトープを提示する熱安定なオリゴマー組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、ＨＲＢ領域が機能的に欠失しており、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが欠失しかつ異種の三量体形成ドメインによって置換されている、呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質エクトドメインを含み、前記呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質エクトドメイン内の２つの多塩基性フューリン切断部位が欠失しまたは変異導入され、これにより前記フューリン切断部位が不完全になっている、熱安定なオリゴマー組換えポリペプチドに関する。好ましい一実施形態においては、前記フューリン切断部位が、前記部位内の全アルギニン残基をリシン残基により置換することによって変異導入されている。好ましい別の実施形態においては、異種の前記三量体形成ドメインが、ＧＣＮ４ロイシンジッパー三量体形成モチーフである。さらに別の好ましい実施形態においては、ＨＲＢ領域の前記機能的欠失が配列番号１０の欠失を含む。本発明の別の態様においては、本発明の熱安定なオリゴマー組換えポリペプチドは、前記三量体形成ドメインのカルボキシ末端に連結したＬｙｓＭペプチドグリカン結合ドメインをさらに含む。また、好ましいさらに別の実施形態においては、本発明の組換えポリペプチドは３×Ｓｔｒｅｐタグ（ｔｒｉｐｌｅ  Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）をさらに含む。好ましくは、エクトドメインが可溶性エクトドメインであり、また別の好ましい実施形態においては、抗原エピトープが、ＡＭ２２もしくはＤ２５などの融合前特異的モノクローナル抗体によって、またはＡＭ２２およびＤ２５の双方によって認識される。
【００２２】
本発明は、本発明のオリゴマー組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物にも関する。本発明の組成物がアジュバントをさらに含むのが好ましい。適切なアジュバントは当技術分野においてよく知られており、当業者ならば、どのようなアジュバントが本発明の免疫原性組成物において適切に使用できるのかをよく承知している。さらに別の好ましい実施形態においては、オリゴマー組換えポリペプチドが、共有結合的または非共有結合的に担体粒子に結合している。一方、別の好ましい態様においては、担体粒子が細菌様粒子である。
【００２３】
本発明は、本発明の熱安定なオリゴマーを形成するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターにも関する。ポリペプチドおよび発現ベクター、ならびにこのようなタンパク質またはベクターを含む組成物は、治療環境において適切に使用することができる。本発明はしたがって、対象において免疫応答をＲＳＶに対し誘導する方法であって、本発明の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む方法にも関する。
【００２４】
本発明は、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前状態を模する組換え可溶性タンパク質に関する。ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンホメーションおよび融合後コンホメーションを示す画像については、図１を参照されたい。本明細書に開示するように熱安定なことが見出された、改変ＲＳＶ  Ｆタンパク質の高次構造は、ポリペプチドのオリゴマーであり、改変ＲＳＶ  Ｆポリペプチドのポリペプチド三量体である可能性が最も高い。本明細書に開示する実験において検出されるサイズに基づいて、かつ改変ポリペプチドコンストラクトに三量体形成モチーフが存在することから、本ポリペプチドは三量体の構成（ｔｒｉｍｅｒ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）をとる可能性が高い。
【００２５】
好ましくは、本発明の熱安定なオリゴマーポリペプチドは、室温において安定である。より好ましくは、ポリペプチドは４０℃までの温度において安定であり、より一層好ましくは、ポリペプチドは６０℃までの温度において安定であり、また、さらにより一層好ましい実施形態においては、本発明の熱安定な組換えポリペプチドは、７０℃までの温度において安定である。最も好ましい一態様においては、本発明の熱安定な組換えポリペプチドは、約９６℃の温度においても依然として、少なくとも約５分から約１５分の間安定である。
【００２６】
本発明の熱安定な組換えポリペプチドは、ＨＲＢ領域の機能的欠失を含む。これは、本明細書に示すように例えば変異をＨＲＢ領域に導入（システインまたはアラニン）することによって（ＷＯ２０１２／１５８６１３）、当技術分野において行われてきたものとは異なっている。このような変異体は、内部において示されてきたのと同様に、６ＨＢ構造を形成することができないが、それでもコンホメーションは不安定なものとなる。このような不安定なコンホメーションは、本明細書に示すように、ＲＳＶ  Ｆタンパク質からＨＲＢ領域を除去することによって防ぐことができる。本発明のポリペプチドは、ＨＲＢ領域がもはやその本来の機能を果たすことできなくなるような、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＨＲＢ領域の機能的欠失を有する。例えば、このタンパク質が融合後コンホメーションを形成できないようにする、６ヘリックスバンドル（６ＨＢ）形成における機能的欠失などである。ＨＲＢ領域の欠失は、配列番号１０のアミノ酸を含むのが好ましい（欠失したヌクレオチドは、配列番号９に示す）。当業者ならば、このような欠失が、ＨＲＢ領域の両側において僅かにより小さい、および／もしくは僅かにより大きい、ならびに／または少数個のアミノ酸分だけずれていることがあることを理解するはずである。それでもやはり、このような欠失はＨＲＢ領域の機能的欠失をなし、フューリン切断部位の変異、および異種の三量体形成モチーフの追加との組合せにより、本明細書に示す熱安定なポリペプチドが得られることになる。
【００２７】
ＲＳＶタンパク質のフューリン切断部位には、例えば、アルギニン残基を他の任意の種類のアミノ酸により置換する、または重要な残基を欠失させるなどの、当技術分野において知られる様々な方法によって、変異導入することができる。好ましい一実施形態においては、フューリン切断部位の変異は、全アルギニン残基のリシン残基による置換を含む。
【００２８】
本発明の熱安定なオリゴマーポリペプチドは、以下からなる群より選択される、異種の三量体形成ドメインを含む：ＧＣＮ４ロイシンジッパー三量体形成モチーフ、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の三量体形成モチーフ、ＳＡＲＳスパイク、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＮａｄＡ、ＡＴＣａｓｅおよびフォルドン配列。好ましい一実施形態においては、異種の前記三量体形成ドメインがＧＣＮ４ロイシンジッパー三量体形成モチーフである。ＧＣＮ４などのロイシンジッパーモチーフおよび他の三量体形成モチーフは、３つのアルファヘリックスが集まってロープの撚り線のようにコイルになる、三量体コイルドコイルの形成を誘導する。このような三量体形成モチーフは、当技術分野においては、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に基づくＲＳＶワクチンを作製するために使用されてきた（ＷＯ２０１０／１４９７４３およびＷＯ２０１２／１５８６１３）。本発明に使用するＧＣＮ４三量体形成モチーフ配列を、配列番号１５（ヌクレオチド）および配列番号１６（アミノ酸）に示す。
【００２９】
本発明の熱安定なオリゴマーポリペプチドは、ＷＯ２００８／１４７１９６にその調製および特徴の両方が記述されている融合前特異的モノクローナル抗体、ＡＭ２２またはＤ２５によって認識されるのが好ましい。認識されたなら、融合前特異的抗原エピトープが利用可能なことが示される。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、ヒトＲＳＶ（血清型ＡおよびＢ）に起因する感染および疾患に対する防御となるワクチンの抗原成分（複数可）として適切である。ニューモウイルス亜科に属する他のウイルスのＦタンパク質に、Ｆタンパク質変異／欠失の本戦略を採用することによって、類似したこれらのウイルス、例えばウシＲＳＶまたはヒト・メタニューモウイルスなど、に起因する感染に対し防御性の免疫原性ポリペプチドを調製できる。
【００３１】
本発明はさらに、ＲＳＶ感染に対して免疫するために効果的なワクチンである免疫原性組成物に関する。好ましい一実施形態においては、前記免疫原性組成物は、免疫原性を増強するためにアジュバントを含む。さらに別の態様においては、本発明は、本発明の熱安定なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターに関する。
【００３２】
本発明の組換えタンパク質は、ＲＳＶ（またはその近縁のウイルス）のＦタンパク質の融合前形態を特異的に標的とする抗体応答を測定できる診断アッセイに使用することもできる。この応答は、疾患に関する予測において価値を有する可能性がある。さらに本発明の組換えタンパク質は、候補ワクチンによって誘導される抗体応答の質を試験するために使用してもよいし、候補ワクチンに存在するエピトープを研究するため、または（候補）ワクチンの抗原性を制御するための治療法として使用できる、コンホメーション特異的な抗体を作製するために使用してもよい。
【００３３】
別の好ましい実施形態においては、本発明は、タグとしてＬｙｓＭペプチドグリカン結合ドメインをさらに含む、本発明の組換えポリペプチドの熱安定なオリゴマー複合体に関する。本発明に使用するＬｙｓＭタグのヌクレオチド配列は配列番号１３に、一方、アミノ酸配列は配列番号１４に示す。組換えポリペプチドを容易に精製および検出するために、このポリペプチドに３×Ｓｔｒｅｐタグを含めるのが好ましい。本発明に使用する３×Ｓｔｒｅｐタグのヌクレオチド配列は配列番号１１に、一方、アミノ酸配列は配列番号１２に示す。さらに別の好ましい態様においては、ポリペプチド内のエクトドメインは可溶性エクトドメインである。
【００３４】
本発明の組換えポリペプチドの熱安定なオリゴマー複合体は、抗原性の融合前コンホメーションにあり、ＲＳＶ  Ｆタンパク質中の特定のエピトープを中和および認識する抗体を使用することによって確認できる。好ましい一態様においては、本発明の熱安定な組換えポリペプチドは、モノクローナル抗体ＡＭ２２によって認識される利用可能なエピトープを含む。ＡＭ２２がポリペプチドを認識するか否かは、当技術分野において使用され、本明細書に開示する一般的方法によって、容易に調べることができる。
【００３５】
本発明は医療分野において、詳細にはＲＳＶ感染に対するワクチンの分野において有用である。本発明の熱安定なポリペプチドは、第三世界など、保存および取扱い上の問題のある地域において、ＲＳＶに起因する疾患を発症するリスクのある（ヒト）対象を防御するために、ワクチン接種プログラムにて利用可能な免疫原性組成物において使用できる。
【００３６】
本発明のポリペプチドは安定にその融合前コンホメーションにあり、強力な中和抗体によって認識される融合前特異的エピトープであって、融合後コンホメーションにフォールディングしたポリペプチドには存在しない融合前特異的エピトープを提示するので、これらのポリペプチドは、ＲＳＶ感染に対する防御となる優れた融合前特異的中和抗体を誘導する能力がある。融合前特異的ＶＮ抗体のＲＳＶ自然感染ヒトにおける重要性は、Magro M et al. (2012. Neutralizing antibodies against the preactive form of respiratory syncytial virus fusion protein offer unique possibilities for clinical intervention. Proc Natl Acad Sci USA 109:3089-94)によって実証されている。したがって本発明は、本発明の熱安定な精製オリゴマーポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、ワクチン調製に一般に使用される賦形剤をさらに含んでいてもよい免疫原性組成物にも関する。
【００３７】
本発明の免疫原性組成物において使用する本ポリペプチドが、シグナルペプチドを含まないことを理解されたい。シグナルペプチドはこの熱安定なポリペプチドと共発現するが、産生細胞から離れる前に、ポリペプチドから切断される。好ましい一態様においては、厳密にそうする必要があるわけではないが、精製過程中またはその後に、追加の（ＲＳＶ  Ｆタンパク質のではない）タグ配列を酵素消化によって除去する。本発明の免疫原性組成物は、免疫応答をさらに増強するためにアジュバントをさらに含むのが好ましい。
【００３８】
本発明は、本発明の熱安定なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターにも関する。さらには、本発明は、対象において免疫応答をＲＳＶ  Ｆに対し誘導する方法であって、本発明の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む方法と、本明細書に開示する免疫原性組成物を利用することによって、ＲＳＶ感染に対するワクチンをヒト対象に接種する方法とに関する。本発明は、ＲＳＶ感染、またはＲＳＶ感染後の疾患を予防または処置するための医薬を製造するための、本発明の熱安定なポリペプチドの使用にも関する。本発明はさらに、ＲＳＶ感染に対するワクチンにおいて使用するための、本発明の熱安定な組換えポリペプチドおよび／または組換え発現ベクターに関する。
【００３９】
本発明の免疫原性組成物は、本明細書に参照によって組み込む公開ＰＣＴ出願ＷＯ２０１２／１２８６２８に開示されている技術を採用することによって調製し、免疫原性、有効性および安全性について試験することができる。ワクチン製剤は、チーズ製造のためなどに、食品業界において伝統的に使用される安全な細菌である、不活化ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）菌に由来する粒子（グラム陽性エンハンサーマトリックスまたは細菌様粒子と他に記述され、本明細書においては「ＢＬＰ」と称する）に基づくことがある。ＢＬＰは、Ｌ．ラクティス菌を酸性加熱処理することにより得られ、この処理により、主にペプチドグリカン表面からなる非生存球状粒子が生じる。ＢＬＰの調製はＷＯ０２／１０１０２６に開示されている。本発明の抗原性ポリペプチドをＢＬＰ上に付加してもよく、これには、タンパク質技術（Ｐｒｏｔａｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と称する、非共有結合による連結技術を採用し、このタンパク質技術は、本明細書に参照によって組み込むＵＳ７，３１２，３１１に開示されている。こうして生じる、抗原と会合したＢＬＰは、注射を必要とせずに、鼻部の粘膜層（例えば、滴剤または噴霧剤）または口（例えば、カプセル剤、錠剤または液剤）を経由してヒトにデリバリーすることのできる、最終的なワクチンを構成する。
【実施例１】
【００４０】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質調製
この実施例は、様々なＦタンパク質コンストラクトの作製、ならびにこれらコンストラクトの、抗体結合およびゲル電気泳動度に関するキャラクタリゼーションについて記述する。この解析から、これらの手段およびアッセイが、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のコンホメーション状態を実証するのに適していることが示される。さらに、ヒトＲＳＶ  Ｆの融合前状態を模する組換え可溶性タンパク質の産生を示す方法も開示する。
【００４１】
最初の工程において、ウイルス中和能の比較解析を、本明細書において使用したＭＡｂについて行った（図３）。以前の研究と一致して、パリビズマブまたはＡＭ２２と比べると、抗体１３１−２ａにはほとんど何らの中和能も認められなかった（McLellan JS et al. 2011. J Virol 85:7788-96）。対照的にＡＭ２２は、ＵＳ２０１２／００７０４４６に示されたのと一致して、ｈＲＳＶによる感染を効率よく中和し、パリビズマブよりも一層強力であった。パリビズマブは、ｈＲＳＶ  Ｆの融合後形態を認識することが示されたが、Ｆの融合前形態も認識する可能性が高い。パラインフルエンザウイルス５Ｆタンパク質について解かれたＸ線構造に基づけば（Yin HS et al. 2006. Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable, prefusion conformation. Nature 439:38-44）、パリビズマブのエピトープは、融合前形態にも存在するようだからである。抗体１３１−２ａは、Ｆの融合前形態において抗体が結合するためにアクセスすることはまずできないエピトープを認識する。１３１−２ａが、Ｆの融合前形態に結合できないと推測されることは、１３１−２ａが中和活性を欠くことと合致する。
【００４２】
本発明の発明者らおよび他の者達は以前に、人工的な三量体形成ドメインを加えることにより、組換え可溶性クラスＩ融合タンパク質をその融合前コンホメーションのまま保持できることを実証した（de Vries RP et al. 2010. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology 403:17-25；Wei CJ et al. 2008. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J Virol 82:6200-8；Yang X et al. 2000. Characterization of stable, soluble trimers containing complete ectodomains of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoproteins. J Virol 74:5716-25；Yin HS et al. 2006. Nature 439:38-44）。組換え可溶性生理活性インフルエンザＡウイルスＨＡタンパク質を発現させるために以前使用された類似コンストラクトを、可溶性Ｆタンパク質を発現させるために使用した（Cornelissen LA et al. 2010. A single immunization with soluble recombinant trimeric hemagglutinin protects chickens against highly pathogenic avian influenza virus H5N1. PLoS One 5:e10645；de Vries RP et al. 2011. Only two residues are responsible for the dramatic difference in receptor binding between swine and new pandemic H1 hemagglutinin. J Biol Chem 286:5868-75；de Vries RP et al. 2010. Virology 403:17-25）。
【００４３】
本発明に使用した発現コンストラクト（概要を図４に示す）においては、ヨーロッパ臨床分離株（Tan L et al. 2012. Genetic Variability among Complete Human Respiratory Syncytial Virus Subgroup A Genomes: Bridging Molecular Evolutionary Dynamics and Epidemiology. PLoS One 7:e51439）のＲＳＶ  Ｆエクトドメイン配列がヒト用にコドン最適化されたものが、その前にあるシグナルペプチドをコードする配列に続いていた。エクトドメイン配列の後ろには、適宜、ＧＣＮ４ロイシンジッパー三量体形成モチーフ（Harbury PB et al. 1993. A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science 262:1401-7）が続いていた。コドン最適化されたエクトドメイン配列（このタンパク質のこの部分の野生型バージョンをコードする）を有するタンパク質であって、その内部に野生型フューリン切断部位およびＨＲＢドメインが存在し、エクトドメインの後ろにはＧＣＮ４モチーフが続くこのタンパク質を、Ｆｗｔ−ＧＣＮと称した。比較のため、野生型Ｆタンパク質をコードする遺伝子も、三量体形成モチーフを欠くベクターにクローニングした（Ｆｗｔと称する）。タグは、精製を容易にするための３×Ｓｔｒｅｐタグからなるか、またはＬｙｓＭペプチドグリカン結合ドメイン、およびそれに続く３×Ｓｔｒｅｐタグからなるかのいずれかであった。これは、理由は未だ不明だが、ＧＣＮを含むＦコンストラクトは、ＬｙｓＭドメインも存在する場合に発現がより高レベルになることが分かったからである。野生型コンストラクト（ＦｗｔおよびＦｗｔ−ＧＣＮ）に加えて、フューリン切断部位を改変したＦタンパク質をコードする発現ベクターも構築した。これらの変異は、第１のフューリン切断部位（位置は８１、８３および８４）および第２のフューリン切断部位（位置は１０８、１１０および１１１）内のＲからＫへの変異として示し、配列番号２０のタンパク質配列中に明示してある。これらの変異体のヌクレオチド配列を、配列番号１９に示す。これらの切断部位（ａｒｇ−＞ｌｙｓ）変異コンストラクトを「Ｆｌｙｓ」と称する。フューリン切断がないと、融合後コンホメーションをＦタンパク質がとる妨げになることが、他の者達により示された（Ruiz-Arguello MB et al. 2002. Virology 298:317-26；Ruiz-Arguello MB et al. 2004. J Gen Virol 85:3677-87）。これは、膜融合の活性化にはＦの切断が必要とする考えに沿ったものである。
【００４４】
遺伝子の構築およびクローニングは以下のように行った：ＲＳＶ血清型Ａのヨーロッパ分離株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＸ０１５４９８．１）Ｆタンパク質の残基２６から５１５に対応するｃＤＮＡクローンの変異体を２つ、ヒトにおいて好まれるコドンを使用して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．により合成した。一方のｃＤＮＡクローンは野生型Ｆタンパク質エクトドメインをコードし、もう一方のクローンは、２つの多塩基性フューリン切断部位内のアルギニン残基がリシンへと変異導入されている（ＲＡＲＲからＫＡＫＫへ、およびＲＫＲＲからＫＫＫＫへ）Ｆタンパク質エクトドメインをコードしていた。それぞれのｃＤＮＡを、効率よく哺乳類細胞に発現させるために、ｐＣＤ５発現ベクターにクローニングした（de Vries RP et al. 2010. Virology 403:17-25）。このｐＣＤ５ベクターは改変して、Ｆタンパク質をコードする配列が、ＣＤ５シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流に、また指定のある場合には、異種のＧＣＮ４イソロイシンジッパー三量体形成モチーフおよび明示したタグをコードする配列の上流に、インフレームにクローニングされるようにしておいた。このタグは、３×ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＩＢＡ、ドイツ）、またはＬｙｓＭペプチドグリカン結合ドメイン（van Roosmalen ML et al. 2006. Mucosal vaccine delivery of antigens tightly bound to an adjuvant particle made from food-grade bacteria. Methods 38:144-9；ＷＯ２０１２／１２８６２８）およびそれに続く３×ＳｔｒｅｐタグＩＩのいずれかからなる。抗体ＡＭ２２（ＵＳ２０１２／００７０４４６Ａ１）の重鎖および軽鎖の可変部をコードする、コドン最適化された２つのＤＮＡ断片をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．によって合成し、それぞれを、ヒトＩｇＧ１重鎖および軽鎖の定常ドメインを含むｐＣＡＧＧＳ哺乳類発現ベクターにインフレームにクローニングした。
【００４５】
Ｆタンパク質エクトドメインの発現は、以下のように一過性トランスフェクションによって達成した：ＲＳＶ  Ｆエクトドメインをコードする配列を含むｐＣＤ５発現ベクターを、１：５のｗ／ｗ比（μｇ  ＤＮＡ：μｇ  ＰＥＩ）にてポリエチレンイミンＩ（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの６時間後、トランスフェクション混合物を、重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ）、グルコース（２．０ｇ／Ｌ）、Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ  ＲＬ−ＵＦ（３．０ｇ／Ｌ）、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ｇｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）および１，５％ジメチルスルホキシドの補充された２９３ＳＦＭＩＩ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって置換した。トランスフェクションの５日から６日後、組織培養上清を回収した。Ｆタンパク質はそのさらなる解析のため、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎセファロースビーズを使用し製造業者の指示（ＩＢＡ、ドイツ）に従って精製した。ＡＭ２２およびＤ２５発現ベクターを１：１の比にて、上記と同様にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした。細胞培養液を遠心分離によって清澄化し、ＡＭ２２およびＤ２５抗体は、標準的な条件を使用して、プロテインＡセファロースビーズを用いて精製した。精製タンパク質の濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００分光光度計（Ｉｓｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し製造業者の指示に従って決定した。
【００４６】
組換えタンパク質の発現および分泌は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ；１０％ＮｕＰＡＧＥ  ＢｉｓＴｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、それに続く、ウマダイコンペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲートされた抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（ＳｔｒｅｐＭＡＢ−ｃｌａｓｓｉｃ−ＨＲＰ、ＩＢＡ）、パリビズマブ［Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］、続いてＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ＩＴＫ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用するウェスタンブロッティングとによって確認した。この後者の抗体は、組換え抗体ＡＭ２２の発現を確認するためにも使用した。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の前に、５％の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を含有するか、または含有しないかのいずれかのＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＬＳＢ）に懸濁した。また指定のある場合には、９６℃で５〜１５分、サンプルを加熱した。
【００４７】
結果を図５に示す。パリビズマブによって認識されるエピトープは、Ｆタンパク質のＦ１部分内に位置する。結果は、非還元条件であればジスルフィドにより連結されていたはずのＦ１とＦ２とが分離することになる、還元条件下（すなわち、２−メルカプトエタノール存在下）のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供すると、諸Ｆエクトドメインは、ＧＣＮ−ＬｙｓＭ配列の有無に対応した別々の電気泳動度をもって泳動されることを示す。さらにＦタンパク質は、フューリン切断部位に変異導入されていた場合、ゲル内のより高い位置に泳動された（ＦｗｔをＦｌｙｓと、またＦｗｔ−ＧＣＮをＦｌｙｓ−ＧＣＮと比較されたい）。これは、これらのＦタンパク質が切断されていないことと一致する。同じＦタンパク質調製物を還元剤非存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した場合、切断されていないＦタンパク質の泳動度は、大きな影響を受けたようには見えなかった。
【００４８】
対照的に、ＦｗｔおよびＦｗｔ−ＧＣＮタンパク質は還元条件下において、ゲル内の、ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮよりもはっきりと低い位置に泳動されるものの、還元剤非存在下においては、泳動度の差ははるかに小さく見えた。これは、フューリンにより切断されたタンパク質においても依然として、Ｆ２部分がジスルフィド架橋を介してＦ１部分に繋がっていることと一致する。切断されたＦタンパク質と切断されていないＦタンパク質との間になおも認められた電気泳動度の小さな差は、切断されたタンパク質からの、グリコシル化されたｐ２７配列の解離によって説明される可能性が最も高い。興味深いことに、切断されたＦタンパク質の電気泳動度は非還元条件下において、電気泳動前にこの調製物を加熱しないと劇的に変化した。切断されていないタンパク質（ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮ。その電気泳動度は大きな影響は受けなかった）とは対照的に、ＦｗｔおよびＦｗｔ−ＧＣＮタンパク質の大半は、ゲル内のはるかに高い位置に泳動された。これら後者のタンパク質の泳動は、切断されたＦタンパク質が、タンパク質調製物を加熱しない限りＳＤＳに耐性の、極度に安定な６ＨＢの存在によって特徴付けられる安定な融合後コンホメーションをとっていることにより説明される。これらの結果から、可溶性の、切断されたＦエクトドメインの大部分は融合後コンホメーションをとることが示される。融合後コンホメーションは、エクトドメインが、人工的な三量体形成ドメインにより延長されていても妨げられない。しかしＦタンパク質が切断されないと、この安定な融合後コンホメーションは形成されない。
【００４９】
これらの観察を確認し、かつ発展させるために、精製Ｆタンパク質をタンパク質限定分解と、それに続く、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥとに供する、次の実験を行った。ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮのフューリン切断部位は、アルギニンをリシンにより置換することによって変異導入しておいたという事実にも関わらず、これらの位置は依然としてトリプシン消化に感受性である。したがって、ＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮタンパク質をトリプシンによって処理するとこれらのタンパク質が切断され、場合によっては、Ｆタンパク質の融合後コンホメーションに対応するＳＤＳ耐性高次構造が形成されることになるはずである。
【００５０】
精製Ｆタンパク質は、ウシ膵臓由来の、ＴＰＣＫ処理したトリプシン（Ｓｉｇｍａ）を様々な量用いて、２３℃で３０分（模擬）処理した。サンプルを次に氷上に置き、トリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ）を添加した後、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを解析した。Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する一般的な染色によってタンパク質のバンドを可視化した。結果を図６に示す。明らかに、トリプシンを用いた消化により、Ｆタンパク質の融合後コンホメーションに対応するＳＤＳ耐性高次構造が実際に出現することとなる。ＦｗｔおよびＦｗｔ−ＧＣＮタンパク質も対照として一緒に扱った。コロイドクマシーブルー染色を使用して精製タンパク質を検出した。電気泳動前にサンプルを加熱した場合（上パネル）、ＦｗｔおよびＦｗｔ−ＧＣＮはやはり、ゲル内の予想された位置に泳動された。サンプルを加熱しなかった場合、タンパク質はゲル内のはるかに高い位置に泳動された（下パネル）。予想通り、トリプシンを用いてこれらのサンプルを処理しても、高次構造の泳動度は大きな影響を受けなかった。しかしトリプシン処理すると、Ｆタンパク質タグがある程度除去されこととなった。これは、電気泳動前にサンプルを加熱した場合、より低い位置に泳動される（ｌｏｗｅｒ  ｍｉｇｒａｔｉｎｇ）Ｆタンパク質種が出現したことから実証される。切断されていないＦタンパク質を、トリプシンを用いて処理すると、ＦｗｔおよびＦｗｔ−ＧＣＮの対応物について観察されたのと同様に、非還元条件下においてゲル内のはるかに高い位置に泳動されるＦタンパク質が出現することとなった。ＳＤＳ耐性高次構造の形成は、Ｆｌｙｓ−ＧＣＮと比べると、Ｆｌｙｓでより明白であった。これは、融合後コンホメーションの形成が、ＧＣＮ三量体形成モチーフによりある程度妨げられることを示唆している。
【００５１】
ＲＳＶ  Ｆ特異的ＭＡｂであるパリビズマブ［Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）］、ＡＭ２２および１３１−２ａとのＦタンパク質調製物の反応性を、ＥＬＩＳＡ形式を使用して精査した。これには、９６ウェルＮｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、様々なＦタンパク質調製物（１ウェルあたり５０ｎｇ）によって一晩、４℃でコーティングした。ブロッキングし、十分に洗浄した後、プレートを、限界希釈したパリビズマブ［Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）。３ｍｇ／ｍｌストックの１／５００希釈から開始］、ＡＭ２２（０．７ｍｇ／ｍｌストックの２００倍希釈から開始）、１３１−２ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ。１ｍｇ／ｍｌストックの５００倍希釈から開始）または抗ｓｔｒｅｐ（ＩＢＡ製ＳｔｒｅｐＭＡｂ  ｃｌａｓｓｉｃ。ストックの５００倍希釈から開始）と共にインキュベートした。十分に洗浄した後、プレートを、１：５００希釈のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＩＴＫ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＨＲＰコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）と共に、室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ反応性の検出は、テトラメチルベンジジン基質（ＢｉｏＦＸ）およびＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ製ＥＬ−８０８）を使用して行った。結果を図７に示す。
【００５２】
Ｓｔｒｅｐタグに特異的なＭＡｂの結合によって実証されたように（抗Ｓｔｒｅｐのパネル）、Ｆタンパク質は全てほぼ同じ効率をもってコーティングされた。パリビズマブは全Ｆタンパク質調製物に対して濃度依存的結合を呈したがこれは、この抗体がＦタンパク質を、そのコンホメーション状態に関わりなく認識するという推測と一致する。対照的に、ＡＭ２２はＦｗｔに結合できなかったがこれは、この抗体が、融合後コンホメーションにあるタンパク質に結合できないという推測と一致する。しかし切断されたタンパク質が三量体形成モチーフにより延長されていた場合（Ｆｗｔ−ＧＣＮ）、または切断が妨げられていた場合（Ｆｌｙｓ）、中程度の結合が観察された。最も高い反応性は、これら２つの特色を組み合わせた場合（Ｆｌｙｓ−ＧＣＮ）に観察された。ウェルをコーティングする前にＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮをトリプシン処理すると、ＡＭ２２反応性が低減されることとなって、トリプシン処理後のＡＭ２２反応性は、ＦｗｔおよびＦｗｔ−ＧＣＮについて観察された反応性に匹敵した。パリビズマブのＦタンパク質との反応性は、トリプシン処理による影響を受けなかった。ＭＡｂである１３１−２ａは全Ｆタンパク質調製物と効率よく結合した。
【００５３】
これらの結果から、異なるＦタンパク質調製物間では中和抗体ＡＭ２２の結合が異なることが示される：融合後コンホメーションをとるＦｗｔはほとんど検出されず、一方、最も高い反応性はＦｌｙｓ−ＧＣＮについて検出された。これらの結果から、Ｆｗｔの大半が融合後コンホメーション（６ＨＢ＋、１３１−２ａ＋、ＡＭ２２−）にあると結論した。Ｆｗｔ−ＧＣＮは、ほぼ確実に諸コンホメーションの混合（６ＨＢ＋、１３１−２ａ＋、ＡＭ２２＋／−）として存在する。Ｆタンパク質は、切断のない場合は融合後コンホメーションをとらない（６ＨＢなし）。これらの切断されていないタンパク質は、１３１−２ａおよびＡＭ２２の双方と反応性があることから、何らかの形態の中間体状態にあることが示される。
【実施例２】
【００５４】
ＨＲＢ領域へのシステイン残基の導入
次に、４つのシステイン残基をＨＲＢドメインに導入したＦタンパク質（Ｆｗｔ−ｃｙｓ；Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮ；Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ；Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮと表す；図４）の特徴を吟味した。これらのｃｙｓ置換は、全長Ｆタンパク質（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む）に導入した場合、Ｆタンパク質をその融合前コンホメーションのまま安定化すると見られる分子間ジスルフィド架橋を生ずることが、以前に示された（Magro M et al. 2012. Proc Natl Acad Sci USA 109:3089-94）。精製タンパク質を、還元剤の存在下または非存在下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。図８に示すように、システイン残基をＨＲＢに導入すると、サンプルを加熱した場合ですら、非還元ゲルにおいて観察可能な高次構造が形成された。これらの高次構造は、ＧＣＮ４三量体形成モチーフを有するＦタンパク質（Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮ）について最もはっきりと認められるが、ＧＣＮ４モチーフを欠くＦタンパク質（Ｆｗｔ−ｃｙｓおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓ）についてもある程度認められる。これらの条件下において、野生型ＨＲＢを含むＦタンパク質についてはこれらの高次構造は観察されなかった。これは、図５および図６に示した結果と一致する。Ｆｗｔ−ｃｙｓおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓの高次構造は還元剤の存在に感受性だったが（図８；右パネル）、ＧＣＮ４モチーフをさらに含むタンパク質においては、この感受性ははるかに低かった。これらのデータから、ＨＲＢにシステイン残基を導入すると、ＧＣＮ４モチーフも存在する場合、高次構造が極度に安定になることが示される。
【００５５】
これらの観察を確認し、かつ発展させるために、精製Ｆタンパク質をタンパク質限定分解と、それに続く、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥとに供する、次の実験を行った。結果を図９に示す。コロイドクマシーブルー染色を使用して精製タンパク質を検出した。システイン残基を導入後に観察された高次構造はやはり、ゲル電気泳動前のサンプルの加熱に感受性でないことが示された。さらにこれらの結果から、トリプシン処理したＦｗｔ−ｃｙｓおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓ、これらはＧＣＮ４モチーフを欠き、また熱耐性高次構造にあるのは限られた量にすぎないのだが、はサンプルを電気泳動前に加熱しなかった場合、トリプシン処理したＦｗｔおよびＦｌｙｓ（図６）について観察されたようには高次構造を形成しないことが示される。これらの結果から、ＨＲＢにシステイン残基を導入後に観察される高次構造は、野生型ＨＲＢを有する切断されたＦタンパク質について観察される高次構造とは異なると結論した。後者とは対照的に前者は、熱に耐性であり、またＦタンパク質が切断されなくても形成されるからである。データからはさらに、ＨＲＢにシステイン残基を導入すると、熱感受性高次構造の形成が妨げられることが示される。これから、これらのタンパク質は、融合後コンホメーションには存在する６ＨＢをアセンブリーしないことが示される。
【００５６】
システイン変異体Ｆタンパク質調製物の反応性を、ＲＳＶ  Ｆ特異的ＭＡｂであるパリビズマブ、ＡＭ２２および１３１−２ａにより、上に概要を述べたようにＥＬＩＳＡ形式を使用して吟味した（図１０の番号１〜４）。Ｓｔｒｅｐタグに特異的なＭＡｂの結合によって実証されたように、システイン変異体Ｆタンパク質は全てほぼ同じ効率をもってコーティングされた。パリビズマブは全Ｆタンパク質調製物に対して濃度依存的結合を呈し、異なるＦ調製物間の結合の差は僅かに過ぎなかった。ＭＡｂである１３１−２ａおよびＡＭ２２は、異なるＦタンパク質に対して異なる結合を呈した。Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮには、１３１−２ａは結合しなかったが、明らかにＡＭ２２は結合した。これらの結果から、これら２つのタンパク質について観察される高次構造は、安定化された融合前Ｆタンパク質（６ＨＢ−、１３１−２ａ−、ＡＭ２２＋）に対応することが示される。結果からは、ＡＭ２２によって認識されるエピトープは、Ｆの切断による影響をある程度受けることも示される。Ｆｗｔ−ｃｙｓは１３１−２ａによって効率よく認識されたが（Ｆｌｙｓ−ｃｙｓの認識はそれより多少、効率が低かった）これは、これらのタンパク質のうち一部のみが、この抗体に反応性でない融合前高次構造を形成することと一致する。これと一致することには、これらの調製物はＡＭ２２とも反応した。観察されたこの、ＡＭ２２との反応性は、Ｆｗｔ−ｃｙｓおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓが何らかの形態の中間体状態（６ＨＢ−、１３１−２ａ＋、ＡＭ２２＋）にあることによっても、部分的には説明され得る。これは、Ｆｌｙｓの結果を考慮するとＦｌｙｓ−ｃｙｓについては予期され得るが、Ｆｗｔ−ｃｙｓの中間体的表現型（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）については代わりの説明が必要である。システインの導入は、ＨＲＢがＨＲＡに結合できないためにＡＭ２２の反応性を促進する可能性もある。６ＨＢを形成できないことは、ＡＭ２２エピトープが維持されることと直接関連している可能性があるからである。
【実施例３】
【００５７】
ＨＲＢ領域へのアラニン残基の導入
ＨＲＢドメイン内の変異の影響をより詳細に研究するために、実施例２に概要を述べたのと同じアミノ酸（Magro M et al. 2012. Proc Natl Acad Sci USA 109:3089-94も参照されたい）を、システインではなくむしろアラニンにより置換して（図４）、ジスルフィドにより安定化された融合前の三量体の形成が妨げられるようにした変異体Ｆタンパク質を作製した。またこれらのタンパク質を、高次構造の有無についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した。結果を図１１に示す。ＧＣＮ４のない場合にアラニン置換を導入すると（Ｆｗｔ−ａｌａと称するコンストラクト）、Ｆｗｔ−ｃｙｓについて観察されたのと同様に、非還元条件下において熱感受性高次構造（６ＨＢ）の形成が妨げられた（図１１と図５とを比較されたい）。ＧＣＮ４のある場合、電気泳動前のサンプルの加熱に感受性でない幾らかの高次構造が観察された。これらの僅かな高次構造は、融合前構造に対応する可能性がある。Ｆｗｔ−ａｌａおよびＦｌｙｓ−ａｌａは、いずれも６ＨＢをアセンブリーすることができないのだが、ＡＭ２２と反応することもまたない（図１０、右上パネル、折れ線５および６）。これから、６ＨＢの形成を妨げたからといって、ＡＭ２２に対するエピトープが維持されるわけではないことが示される。ほぼ確実にこれらのタンパク質は、融合前のタンパク質においてはＨＲＢによって形成されるステムが解離し、そのため１３１−２ａに対するエピトープがアクセス可能になる中間体状態にある。同時に、頭部ドメインはリフォールディングして、ＡＭ２２に対するエピトープは失われる。それでも、ＨＲＢのＨＲＡとの相互作用をまず間違いなく妨げる、ＨＲＢ中のアラニン変異の結果、６ＨＢは形成され得ない。これらのタンパク質にＧＣＮ４モチーフを導入（Ｆｗｔ−ａｌａ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ａｌａ−ＧＣＮ）するとほぼ確実に混合集団を生じ、一部の融合前のタンパク質はＡＭ２２については陽性だが、１３１−２ａについては陽性でない。結果としてこれらのタンパク質の、ＡＭ２２との反応性は増大し、一方１３１−２ａとの反応性は減少した。ＨＲＢにアラニン変異を有する全Ｆタンパク質が、その野生型ＨＲＢ対応物と比べ、ＡＭ２２との反応性の減少を呈する点は際立っている。明らかに、ＨＲＢの変異は融合前のエピトープを維持する補助となる可能性があるが（ＨＲＢにシステイン変異を有するＦタンパク質）、融合前特異的エピトープとの反応性を減少させる可能性もある（ＨＲＢにアラニン変異を有するＦタンパク質）。これらの変異はタンパク質中の同じ位置に導入され、いずれも同程度に６ＨＢ形成を妨げる点は際立っている。これから、このタンパク質が融合後構造をとる能力は、融合前構造のコンホメーション変化にとっての駆動力ではないことが示される。
【００５８】
本明細書に開示するデータは、一組のアッセイ、それを用いて組換え可溶性Ｆタンパク質のコンホメーションを決定することができる、が開発されたことを示す。これらのアッセイを用いて、図１２Ａおよび図１２Ｂに模式的に示す、Ｆタンパク質の４つのコンホメーション状態を識別することができる：
１）融合前Ｆ（６ＨＢ−、１３１−２ａ−、ＡＭ２２＋）。図１２Ａ（左パネル；タンパク質の模式バージョンを三次元描画と比較している）および図１２Ｂ（左上パネル）を参照されたい。安定な形態はＦｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮである；
２）中間体１（６ＨＢ−、１３１−２ａ＋、ＡＭ２２＋）。図１２Ｂ（左下パネル）を参照されたい。ＨＲＢによって形成されるステムは解離しているが、ＨＲＡを有する頭部ドメインはまだリフォールディングしていない。例はＦｌｙｓおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮである；
３）中間体２（６ＨＢ−、１３１−２ａ＋、ＡＭ２２−）。図１２Ｂ（右下パネル）を参照されたい。ＨＲＢによって形成されるステムは解離しており、ＡＭ２２によって認識されるエピトープをまず間違いなく含む頭部ドメインは、リフォールディングしている。この中間体２の形態においては、６ＨＢはまだアセンブリーされていない。例はＦｗｔ−ａｌａおよびＦｌｙｓ−ａｌａである；
４）融合後Ｆ（６ＨＢ＋、１３１−２ａ＋、ＡＭ２２−）。図１２Ａ（右パネル；タンパク質の模式バージョンを三次元描画と比較している）および図１２Ｂ（右上パネル）を参照されたい。最たる例はＦｗｔである。
【実施例４】
【００５９】
ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前状態を模する組換え可溶性タンパク質の合成
上記の実施例において、融合前コンホメーションにあるＦタンパク質は、他のコンホメーションを有するＦタンパク質とは抗原性が異なることが実証された。融合前以外に対し特異的な（ｎｏｎ−ｐｒｅ−ｆｕｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）エピトープに対応する抗体はウイルスを中和しないので（例えば、１３１−２ａ）、これらのエピトープの存在が、融合前Ｆエピトープを特異的に標的とする免疫応答にとっての妨げになっている可能性がある。Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮは融合前コンホメーションにあるにも関わらず、これらのタンパク質は、より大きなスケールにおいて融合前Ｆタンパク質を産生するのに適するとは考えられない。主な理由は、これらのタンパク質が非常に低レベルに発現するからである。これを解決するために本発明者らは、融合前特異的エピトープを含み、融合後特異的エピトープを欠く、高レベルの組換えＦタンパク質を発現させる代替戦略の考案を企てた。データから、ＧＣＮ４は組換えタンパク質を融合前状態にすることができるが、これが効率よく起きるのは、融合前状態にあるＨＲＢステムが安定化されている場合（例えば、Ｆｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮにおいて）のみであることが示される。この不安定性は、ＨＲＢ内の他の変異によってさらに増加し得る（本明細書に記述するアラニン変異など）。
【００６０】
本発明者らは、ＨＲＢが解離し、続いて、延長されたＨＲＡと相互作用するのを可能にする、何らかの形態のそれ固有の不安定性がＨＲＢにはあるのではないかと推測した。タンパク質発現レベルを著しく低減してしまう分子間ジスルフィド結合を導入することでＨＲＢを安定化しようとするのではなく、むしろＨＲＢ領域を（そして、それ固有の不安定性を）丸ごと除去することにした。しかしＨＲＢが完全になくなると、直接ＨＲＢの除去によるか（例えば、１３１−２ａのエピトープ）、または結果としてステムのなくなったタンパク質が三量体よりもむしろ単量体として振る舞い得ることによるかのいずれかにより、融合前状態においては通常は利用可能でないエピトープが、露出するようになると予想された。データからはさらに、切断のない場合はＡＭ２２エピトープが、そしておそらくは他の融合前特異的エピトープも、この組換えＦタンパク質においてよりよく保持されることが示されている（Ｆｌｙｓ−ｃｙｓ−ＧＣＮとＦｗｔ−ｃｙｓ−ＧＣＮとを比較されたい）。これらの考察を考慮に入れ、ＨＲＢを除去し、ＧＣＮ４三量体形成モチーフを加え、フューリン切断部位に変異導入した組換えタンパク質を作製した（図４）。欠失させたエクトドメインのＨＲＢ部分を配列番号１０に示す。発現させたポリペプチドＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮをコードする全長ヌクレオチド配列を配列番号５に示し、一方、アミノ酸配列を配列番号６に示す。対照として、ＧＣＮ４を欠く変異体を合成した（配列番号３および４）。本発明のコンストラクト内の欠失は、ＨＲＢが位置４８２〜５１０（配列番号２において）にわたると主張する文献（Swanson et al. 2011, Proc Natl Acad Sci USA 10.1073. PNAS.1106536108）においてＨＲＢ領域とされている領域よりは幾分大きい（すなわち、配列番号２の位置４７８〜５１２）。
【００６１】
これらの組換えタンパク質は、還元条件および非還元条件を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図１３）。いずれのタンパク質も、還元ゲル内の予想された位置に泳動された。しかし還元剤非存在下においては、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮの大半はゲル内のはるかに高い位置に泳動された。Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢの場合はこうはならなかった。サンプルを加熱しても、タンパク質の電気泳動度に大きな影響はなかった（図１３、中央パネル）この結果から、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮについて観察される高次構造は熱感受性６ＨＢに対応しないことが示される。これは、機能的ＨＲＢがないと６ＨＢが形成され得ないことから予期されるものである。
【００６２】
次に、これらの組換えタンパク質の切断をトリプシン処理により誘導して、タンパク質消化のタンパク質コンホメーションへの影響を研究した。対照としてＦｌｙｓ−ＧＣＮをとり、タンパク質を非還元ゲルにおいて泳動した。結果を図１４に示す。Ｆｌｙｓ−ＧＣＮをトリプシン処理すると、加熱なしの場合、切断されたＦｌｙｓ−ＧＣＮタンパク質は、６ＨＢ形成を示す（熱感受性）高次構造として泳動された。対照的にＦｌｙｓ−ΔＨＲＢの大半は、ゲル内のその予想された（算出された）位置に泳動され、トリプシンによる切断は高次構造の形成を誘導しなかった。これは、ＨＲＢがないと６ＨＢを形成し得ないことから予期されるものである。Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ４も大半はやはり、熱に耐性の高次構造として泳動された。この泳動は、トリプシン処理による顕著な影響を受けなかった。この結果から、ＨＲＢドメインをＧＣＮ４によって置換すると、明らかに６ＨＢに対応しない、極度に安定な高次構造が生じることが示される。
【００６３】
Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮタンパク質のモノクローナル抗体との反応性を、上に概要を述べたようにＥＬＩＳＡにて試験した（図１５）。Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢは、１３１−２ａおよびＡＭ２２の双方によって認識された。さらにＧＣＮ４も存在した場合（Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ）、１３１−２ａに対する反応性は失われ、一方、ＡＭ２２との反応性は上昇した。明らかに、ＧＣＮ４ドメインは１３１−２ａエピトープを遮蔽し（安定化されたＨＲＢと同様に）、ＡＭ２２のエピトープの存在を促す。サンプルをトリプシン処理しても１３１−２ａ反応性に影響はなかったが、ＡＭ２２反応性をはっきりと減少させた。パリビズマブ、またはｓｔｒｅｐタグに対するモノクローナルの反応性は、トリプシン処理による影響を受けなかった。これらの結果から、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンホメーションを表していると結論した。このタンパク質が６ＨＢを形成せず、ＡＭ２２と反応し、しかし１３１−２ａとは反応しないからである（この変異体の模式図、および種々のエピトープの利用可能性へのトリプシン処理の影響については、図１６を参照されたい）。
【００６４】
実施例１〜４において、１）ＨＲＢの除去；２）フューリン切断部位の不活性化；および３）異種の三量体形成モチーフの追加の組合せが、可溶性ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質を融合前状態のまま保持するのに必要なことが実証された。以下の比較例において、ＨＲＢおよび融合ペプチド（ＦＰ）領域の欠失しているＦタンパク質（Ｆｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢと表す；図１７を参照されたい）の特徴を吟味した。ＷＯ２０１２／１５８６１３には、可溶性ＲＳＶ  Ｆタンパク質（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を欠く）に導入した場合にこれらの欠失が、Ｆタンパク質をその融合前コンホメーションのまま（部分的に）安定化することが開示されている（ＷＯ２０１２／１５８６１３Ａ１；８７頁；節５の、融合ペプチドおよびＨＲＢ領域を欠くコンストラクトＲ０５７）。ここでコンホメーションは、電子顕微鏡を使用して、その多量体形成状態および外見によって決定している。
【実施例５】
【００６５】
ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合ペプチドおよびヘプタッド反復Ｂ領域を欠く組換え可溶性タンパク質の発現
ＷＯ２０１２／１５８６１３Ａ１に記述されているのと正確に同じＦＰおよびＨＲＢ領域を欠いたタンパク質を合成した（本明細書においてはＦｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢと称する；ヌクレオチド配列：配列番号２１；アミノ酸配列：配列番号２２）。このタンパク質の模式図を図１７Ａに示す。遺伝子の構築およびクローニングは以下のように行った：コードするｃＤＮＡクローンを、ヒトにおいて好まれるコドンを使用してＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．により合成した。このｃＤＮＡは、効率よく哺乳類細胞に発現させるためにｐＣＤ５発現ベクターにクローニングした（de Vries RP et al. 2010. Virology 403:17-25）。このｐＣＤ５ベクターは改変して、Ｆタンパク質をコードする配列が、ＣＤ５シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の下流に、かつ３×ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＩＢＡ、ドイツ）からなる明示したタグをコードする配列の上流に、インフレームにクローニングされるようにしておいた。Ｆｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢをコードする遺伝子を含むｐＣＤ５発現ベクターを、１：５のｗ／ｗ比（μｇ  ＤＮＡ：μｇ  ＰＥＩ）にてポリエチレンイミンＩ（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの６日から７日後、組織培養上清を回収した。Ｆタンパク質はそのさらなる解析のため、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎセファロースビーズを使用し製造業者の指示（ＩＢＡ、ドイツ）に従って精製した。組換えタンパク質の発現および分泌は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。
【００６６】
Ｆｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢのモノクローナル抗体との反応性を、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮとの比較において、図１５について上に概要を述べたようにＥＬＩＳＡにて試験した。図１７Ｂは、Ｆｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢが１３１−２ａおよびＤ２５の双方によって認識されたことを示す。対照的にＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮは、融合後特異的１３１−２ａとの反応性が明らかに減少していたが、融合前特異的Ｄ２５とはよく反応した。１３１−２ａおよびＤ２５の双方とのＦｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢの反応性から、ＨＲＢおよびＦＰの欠失の組合せは、Ｆタンパク質をその完全な融合前状態（Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮについて観察されたような）のまま保持するのに十分でなく、何らかの形態の中間体状態をもたらすことが示される。
【実施例６】
【００６７】
可溶性Ｆタンパク質の発現レベル
可溶性Ｆタンパク質は、ポリエチレンイミンＩ（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させた（発現の記述については実施例１を参照されたい）。発現レベルを、ＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。ＥＬＩＳＡには、９６ウェルプレートをＳｙｎａｇｉｓによって一晩、４℃でコーティングした。ブロッキングし、十分に洗浄した後、プレートを、３倍希釈の細胞培養液と共にインキュベートした。十分に洗浄した後、プレートを、１：１０００希釈のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ＲＳＶ抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）と共に、室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ反応性の検出は、テトラメチルベンジジン基質およびＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して行った（Ｆｗｔ、Ｆｌｙｓ−ＧＣＮ、Ｆａｌａ−ＧＣＮ）。Ｆａｌａ−ＧＣＮの模式図については、図１８Ａを参照されたい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる定量にはまず、Ｆタンパク質を細胞培養液から、Ｃ末端ｓｔｒｅｐタグを使用して精製した。精製タンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ウシ血清アルブミンを基準として使用し決定した（Ｆｗｔ、Ｆｌｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮおよびＦｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢ）。
【００６８】
フューリン切断部位（複数可）の不活性化は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をその融合前コンホメーションのまま保持するのに必須である。不活性化は、フューリン切断部位内に位置するアルギニンをリシン（Ｆｌｙｓ−ＧＣＮ、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ）またはアラニン（Ｆａｌａ−ＧＣＮ）により置換することによって達成した。アラニン置換またはリシン置換のいずれかによってフューリン切断部位を不活性化したＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現レベルをここで決定した。図１８Ｂは発現実験の結果を示す。Ｆａｌａ−ＧＣＮ（０．２ｍｇ／Ｌ）は、Ｆｌｙｓ−ＧＣＮ（１ｍｇ／Ｌ）およびＦｗｔ（２．５ｍｇ／Ｌ）と比べかなり低レベルに発現した。正に帯電したアミノ酸を中性アミノ酸（アラニン）により置換することによって２つのフューリン切断部位を不活性化すると、明らかに産生レベルが非常に低くなる。フューリン切断部位を、その正電荷を維持するようにアミノ酸置換すると、産生レベルは軽度の影響しか受けない：アルギニンをリシンに置換することによって、フューリン切断部位に変異導入しておいたＦタンパク質（Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮおよびＦｌｙｓ−ＧＣＮ）はいずれも、Ｆｗｔについて測定されたのにより近い発現レベルを示した。フューライン（ｆｕｒｉｎｅ）切断部位に細工すると明らかに容易に、Ｆタンパク質の発現が劇的に低減される（Ｆａｌａ−ＧＣＮを参照されたい）。しかし切断部位内の正に帯電したアミノ酸の１つ（Ｒ）を別の正に帯電したアミノ酸（Ｋ）に変化させても、Ｆｗｔと比べたその発現のレベルは保持されていた；タンパク質をワクチンに利用するための重要な特色である。
【００６９】
Ｆｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢ（０．５ｍｇ／Ｌ）は、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ（１．２ｍｇ／Ｌ）について観察されたレベルの、約５０％のレベルにおいて発現した。
【実施例７】
【００７０】
Ｆタンパク質を用いたウサギのワクチン接種
様々なコンホメーションにある諸Ｆタンパク質の、ワクチンとしての可能性を研究するために、変異体Ｆタンパク質（Ｆｗｔ、Ｆｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢおよびＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮ）の調製物を使用して、純血種ニュージーランド白ウサギに筋肉内経路にてワクチン接種した（１群あたりＮ＝２；１回のワクチン接種あたり４０μｇ）。これらの動物は、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）により、そのＳｐｅｅｄｙ  ２８−ｄａｙプログラム（第０．７日、１０日および２１日におけるワクチン接種）に従ってワクチン接種した。血清を第０日（免疫前）および２８日（最終採血）に採取した。
【００７１】
融合前または融合後のいずれかのコンホメーションにあるＦタンパク質と相互作用できる血清抗体の割合を、ＥＬＩＳＡ形式を使用して精査した。これには、９６ウェルＮｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、Ｆｗｔタンパク質（融合後の）またはＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−Ｔ４フォルドン・タンパク質（融合前の）（１ウェルあたり１００ｎｇ）によって一晩、４℃でコーティングした。いずれのタンパク質も、精製目的のＣ末端Ｆｌａｇタグを含む。ブロッキング（２．５％Ｐｒｏｖｉｔａｒ）し、十分に洗浄した後、プレートを、限界（３倍）希釈を１／５００希釈から開始したウサギ血清と共にインキュベートした。十分に洗浄した後、プレートを、１：５００希釈のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｒａｄ）と共に、室温において１時間インキュベートした。ＨＲＰ反応性の検出は、テトラメチルベンジジン基質（ＢｉｏＦＸ）およびＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ製ＥＬ−８０８）を使用して行った。結果を図１９Ａおよび図１９Ｂに示す。Ｆｗｔワクチン接種したウサギおよびＦｗｔ−ΔＦＰΔＨＲＢワクチン接種したウサギから採取した血清のそれぞれと比べて２５倍および８倍高いレベルの融合前特異的抗体が、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮワクチン接種した動物から採取した血清において測定された。融合後特異的抗体力価は群間でほぼ同じだった。免疫前血清は陰性だった。
【００７２】
次に、ペプチドｈＡ−ｈｉｓと相互作用できる血清抗体の割合を、ＥＬＩＳＡ形式を使用して決定した。ペプチドｈＡ−ｈｉｓは、配列番号２の残基１９１〜２１２を包含する。これらの残基は、抗原部位０のＦ１部分に相当する。ｈＡ−ｈｉｓペプチドを合成により作製した。
配列はＧＳＤＬＫＮＹＩＤＫＱＬＬＰＩＶＮＫＱＳＣＳＩＳＡＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号２５）である。
ここで、配列番号２の残基１９１〜２１２を太字にした。Ｎ末端のＧＳおよびＣ末端のＡＳはリンカー配列である。Ｃ末端に位置するＨＨＨＨＨＨは６ヒスチジンタグである。
【００７３】
相互作用実験には、９６ウェルＮｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、１００ｎｇ／ウェルのペプチドｈＡ−ｈｉｓによって一晩コーティングした。ブロッキングし、十分に洗浄した後、プレートを、限界希釈を１／５００希釈から開始したウサギ血清と共にインキュベートした。Ｄ２５（０．７ｍｇ／ｍｌストックの４０倍希釈から開始）、１３１−２ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ。１ｍｇ／ｍｌストックの６７０倍希釈から開始）もコーティング対照として一緒に扱った。ＨＲＰ反応性の検出は上記のように行った。Ｆの融合前形態にＤ２５が結合する領域は、配列番号２に示すＦタンパク質の残基６０〜７１（Ｆ２領域内の）および残基１９７〜２１０（Ｆ１領域内の）を包含する［McLellan et al. 2013 Science 340(6136):1113-7］。結果を図２０Ａに示す。明らかに、Ｄ２５が前記ペプチドに結合するには、Ｆ１部分の存在だけで十分である。予想通り、対照抗体１３１−２ＡおよびＳｙｎａｇｉｓはペプチドｈＡ−ｈｉｓに結合できない。次にウサギ血清サンプルを試験した。結果を図２０Ｂに示す。Ｆｗｔワクチン接種したウサギおよびＦｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢワクチン接種したウサギの血清力価のそれぞれと比べて１２倍および３．５倍高い、ペプチドｈＡ−ｈｉｓに特異的な抗体力価が、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮワクチン接種した動物から採取した血清において測定された。
【００７４】
次いで、ＲＳＶのＡ型またはＢ型に対するウイルス中和能の比較解析を、第０日（免疫前）および第２８日（最終血清）に採取したウサギ血清を用いて行った。予想通り、免疫前血清はウイルス中和能を示さなかった。Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮを用いてワクチン接種したウサギ由来の最終血清の中和能は、Ｆｗｔを用いてワクチン接種した動物、およびＦｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢを用いてワクチン接種した動物のそれぞれに由来する血清に比べ、４倍および２倍高かった。ウイルス中和のレベルは、融合前特異的ＥＬＩＳＡ力価と正の相関があるが（図２１Ａを参照されたい）、融合後特異的ＥＬＩＳＡ力価とは正の相関がない（図２１Ｂを参照されたい）ようである。
【００７５】
総合するとこれらの結果から、融合前コンホメーションのまま安定化されたＦｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮは、ワクチン接種すると、それぞれが融合後コンホメーションおよび中間体的融合コンホメーション（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にあるＦｗｔまたはＦｗｔ−ΔＦＰ−ΔＨＲＢと比べ、より高いレベルの融合前および抗原部位０特異的抗体を誘導できることが示される。さらに、Ｆｌｙｓ−ΔＨＲＢ−ＧＣＮによって誘導される高レベルの融合前および抗原部位０特異的抗体は、より高レベルのウイルス中和抗体と正の相関がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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