(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣ２．６．１．１、ＥＣ２．６．１．４２、もしくはＥＣ２．６．１．５７によって定義されるホモセリンアミノ基転移酵素活性、ＥＣ１．１．１．３によって定義されるホモセリン脱水素酵素活性、または、ホモセリン酸化酵素活性を有する酵素により触媒され、ホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換して、２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸塩を得る第１のステップと、
ＥＣ１．１．１．２７、もしくはＥＣ１．１．１．２８によって定義される乳酸脱水素酵素活性、ＥＣ１．１．１．３７、ＥＣ１．１．１．８２、もしくはＥＣ１．１．１．２９９によって定義されるリンゴ酸脱水素酵素活性、または、ＥＣ１．１．１．２７２、もしくはＥＣ１．１．１．３４５によって定義される分岐鎖２−ヒドロキシ酸脱水素酵素活性であるＯＨＢ還元酵素活性を有する酵素により触媒され、得られた２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸塩（ＯＨＢ）を２，４−ジヒドロキシ酪酸塩または２，４−ジヒドロキシ酪酸に還元する第２のステップと、
の２ステップ経路を含むことを特徴とする、ホモセリンからの２，４−ジヒドロキシ酪酸塩または２，４−ジヒドロキシ酪酸の調製のための方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ホモセリンアミノ基転移酵素活性を有する酵素が、遺伝子ｉｌｖＥ、ｔｙｒＢ、ａｓｐＣ、ａｒａＴ、ｂｃａＴ、ＡＲＯ８によってコードされることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記ホモセリンアミノ基転移酵素活性を有する酵素が、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７もしくは配列番号６９または前記配列と少なくとも９０％の相同性を共有する任意の配列に表記されている配列によってコードされる、あるいは配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または前記配列と少なくとも９０％の相同性を共有する任意の配列に対応することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記ＯＨＢ還元酵素が、大腸菌由来の（Ｄ）−乳酸脱水素酵素、ラクトコッカス・ラクティス、カイウサギ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスもしくは枯草菌由来の（Ｌ）−乳酸脱水素酵素、大腸菌由来の（Ｌ）−リンゴ酸脱水素酵素、ラクトコッカス・ラクティス由来の分岐鎖（Ｄ）−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素またはこれらのホモログであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記ＯＨＢ還元酵素が、
位置Ｖ１７、Ｑ８５、Ｅ８９、Ｉ２２６またはＡ２２２に少なくとも１個の突然変異を含む乳酸脱水素酵素であって、前記位置が、ラクトコッカス・ラクティスＬｄｈＡ（配列番号６）を参照することにより定義される乳酸脱水素酵素、
位置Ｉ１２、Ｒ８１、Ｍ８５、Ｄ８６、Ｖ９３、Ｇ１７９、Ｔ２１１またはＭ２２７に少なくとも１個の突然変異を含むリンゴ酸脱水素酵素であって、前記位置が、大腸菌Ｍｄｈ（配列番号２）を参照することにより定義されるリンゴ酸脱水素酵素、
であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の方法であって、前記ＯＨＢ還元酵素が、
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２８８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６もしくは配列番号１１８または前記配列と少なくとも９０％の相同性を共有する任意の配列により表され、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２８７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５もしくは配列番号１１７または前記配列と少なくとも９０％の相同性を共有する任意の配列により表される核酸配列によってコードされることを特徴とする方法。
【請求項７】
ＥＣ２．６．１．１、ＥＣ２．６．１．４２、もしくはＥＣ２．６．１．５７によって定義されるホモセリンアミノ基転移酵素活性、ＥＣ１．１．１．３によって定義されるホモセリン脱水素酵素活性、または、ホモセリン酸化酵素活性を有する酵素により触媒され、ホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換して、２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸塩を得る第１のステップと、
ＥＣ１．１．１．２７、もしくはＥＣ１．１．１．２８によって定義される乳酸脱水素酵素活性、ＥＣ１．１．１．３７、ＥＣ１．１．１．８２、もしくはＥＣ１．１．１．２９９によって定義されるリンゴ酸脱水素酵素活性、または、ＥＣ１．１．１．２７２、もしくはＥＣ１．１．１．３４５によって定義される分岐鎖２−ヒドロキシ酸脱水素酵素活性であるＯＨＢ還元酵素活性を有する酵素により触媒され、得られた２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸塩を還元して、２，４−ジヒドロキシ酪酸塩を得る第２のステップと、
からなる、または、を含む２ステップ経路を含む、ホモセリンからの２，４−ＤＨＢの調製のための改変された微生物。
【請求項８】
請求項７に記載の微生物であって、細菌、酵母、または真菌であることを特徴とする微生物。
【請求項９】
請求項７または８に記載の微生物であって、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼおよびヘキソースシンポーターパーミアーゼの中から選ばれる酵素活性のうち少なくとも１種の発現が増加する、ならびに／または乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、酢酸キナーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ピルビン酸酸化酵素、イソクエン酸リアーゼ、フマラーゼ、２−オキソグルタル酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、リンゴ酸酵素、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、糖輸送ホスホトランスフェラーゼ、ケトヒドロキシグルタル酸アルドラーゼ、ホモセリン−Ｏ−サクシニルトランスフェラーゼ、ホモセリンキナーゼ、ホモセリン流出トランスポーター、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼおよび／もしくはメチルグリオキサールシンターゼの中から選ばれる酵素活性のうち少なくとも１種が減少することを特徴とする微生物。
【請求項１０】
請求項９に記載の微生物であって、全て大腸菌由来のｐｐｃ、ｐｃｋ、ａｃｅＡ、ｇａｌＰ、ａｓｄ、ｔｈｒＡ、ｍｅｔＬ、ｌｙｓＣ；ラクトコッカス・ラクティス由来のｐｙｃＡの中から選ばれる遺伝子のうち少なくとも１種を過剰発現する、および／またはｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ、ｓａｄ、ｇａｂＡＢＣ、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｐｃ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｍｇｓＡ、ｓｕｃＡＢ、ｐｔｓＩ、ｐｔｓＧ、ｐｇｉ、ｆｕｍＡＢＣ、ａｌｄＡ、ｌｌｄＤ、ｉｃｌＲ、ｍｅｔＡ、ｔｈｒＢ、ｌｙｓＡ、ｅｄａ、ｒｔｈＡ、ｒｔｈＢ、ｒｔｈＣの中から選ばれる遺伝子のうち少なくとも１種が欠失している大腸菌であることを特徴とする微生物。
【請求項１１】
適切な培養培地において請求項７〜１０のいずれか一項に記載の改変された微生物を培養するステップと、
前記培養培地から２，４−ＤＨＢを回収するステップと、
を含むことを特徴とする、２，４−ＤＨＢの産生方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、２，４−ＤＨＢがさらに精製されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
ホモセリンをＯＨＢに転換するための、ＥＣ２．６．１．１、ＥＣ２．６．１．４２、もしくはＥＣ２．６．１．５７によって定義されるホモセリンアミノ基転移酵素活性、ＥＣ１．１．１．３によって定義されるホモセリン脱水素酵素活性、または、ホモセリン酸化酵素活性を有することを特徴とする酵素のうちいずれか１種の使用。
【請求項１４】
ＯＨＢを２，４−ＤＨＢに転換するための、ＥＣ１．１．１．２７、もしくはＥＣ１．１．１．２８によって定義される（Ｌ）−乳酸脱水素酵素活性、ＥＣ１．１．１．３７、ＥＣ１．１．１．８２、もしくはＥＣ１．１．１．２９９によって定義される（Ｌ）−リンゴ酸脱水素酵素活性、または、ＥＣ１．１．１．２７２、もしくはＥＣ１．１．１．３４５によって定義される分岐鎖２−ヒドロキシ酸脱水素酵素活性を有することを特徴とする酵素のうちいずれか１種の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、
・ホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換して、２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸塩を得る第１のステップと、
・得られた２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸塩（ＯＨＢ）を還元して、２，４−ジヒドロキシ酪酸塩（２，４−ＤＨＢ）を得る第２のステップと、
の２ステップ経路を含む、ホモセリンからの２，４−ＤＨＢの調製のための新規方法に関する。
【０００２】
本願内に引用されているカルボン酸は、その塩（例えば、２，４−ジヒドロキシ酪酸塩（buryrate））または酸形態（例えば、２，４−ジヒドロキシ酪酸）の名称で均等に命名されている。
【背景技術】
【０００３】
２，４−ジヒドロキシ酪酸（均等に、２，４−ＤＨＢまたはＤＨＢ）は、相当な経済的利益を有する化合物である。ＤＨＢは、適切なｐＨ調整により、水性培地においてα−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンへと容易に変換され得る。α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、動物栄養において大きな市場を有するメチオニン代用物２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−酪酸塩（ＨＭＴＢ）の産生のための著名な前駆物質である（米国特許出願公開第２００９／３１８７１５号明細書）。現在のところ、α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、γ−ブチロラクトンのα位におけるハロゲン化と、その後のアルカリ性培地におけるヒドロキシル基によるハロゲン原子置換を示す多段階プロセスによりγ−ブチロラクトンから派生する（米国特許出願公開第２００９／３１８７１５号明細書）。
【０００４】
高騰する石油価格により、再生可能な資源からＤＨＢを産生する必要が生じている。微生物は、バイオマス由来の原材料、例えば、糖または有機酸を多種多様な異なる化学物質へと転換することができる（ワーピイ（Werpy）＆ピーターセン（Petersen）、２００４）。増えつつある生化学およびゲノム情報により、高い収量および生産性で天然起源の代謝中間体を過剰産生するように、微生物を改変することが可能である（ベイリー（Bailey）、１９９１）。産生微生物の最適化は、多くの場合、とりわけ対象とする代謝物の生合成に必要とされる酵素の過剰発現および産物フィードバック阻害の軽減を確実にする、代謝ネットワークの合理的操作を必要とする。別の可能性は、対象とする代謝物の産生を触媒する新規酵素系の実行である。
【０００５】
代謝操作アプローチおよび酵素触媒は、生化学および対象とする代謝物をもたらす代謝経路の調節の詳細な知識を必要とする。ＤＨＢ産生の場合、この情報は利用できない。ごく一部の研究が、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素欠乏症の患者におけるＤＨＢの出現を報告する（シンカ（Shinka）ら、２００２）が、ＤＨＢ産生に結びつけられる酵素反応は同定されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／３１８７１５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、発酵または酵素によるＤＨＢ産生は、（ｉ）利用できる前駆物質をＤＨＢに転換する熱力学的に実行可能な経路の同定、（ｉｉ）経路における個々の反応ステップを触媒することができる酵素の同定または構築および（ｉｉｉ）適切な産生生物における経路酵素の機能的発現を必要とする。本発明は、これらの必要を満たすという目的を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の一目的は、
・ホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換して、ＯＨＢを得る第１のステップと、
・得られたＯＨＢを２，４−ＤＨＢに還元する第２のステップと、
の２ステップ経路（図１を参照）を含む、ホモセリンからの２，４−ＤＨＢの調製方法である。本発明の方法の第１および／または第２のステップは、内在性または異種性遺伝子にコードされる酵素いずれかにより触媒され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換してＯＨＢを得る第１のステップと、得られたＯＨＢを２，４−ＤＨＢに還元する第２のステップを用いる２ステップ経路を含む、ホモセリンからの２，４−ＤＨＢの調製方法を示す図である。
【図２】位置Ｑ８５に変異導入された精製されたラクトコッカス・ラクティス乳酸脱水素酵素の比活性を示す図である。（Ａ）ＯＨＢにおける比活性、（Ｂ）ピルビン酸における比活性、（Ｃ）ＯＨＢおよびピルビン酸におけるＶｍａｘ値の比率として表現される基質特異性。グラフＣにおける１よりも高い値は、ＯＨＢの優先度を示す（０〜５０ｍＭの間のＯＨＢまたはピルビン酸では、変異導入された酵素に対しいずれかの基質における酵素活性の飽和が得られなかった）。２０ｍＭの基質濃度で活性を測定した。
【図３】位置Ｒ８１に変異導入された精製された大腸菌リンゴ酸脱水素酵素の比活性を示す図である。（Ａ）ＯＨＢにおける比活性、（Ｂ）オキサロ酢酸における比活性。２０ｍＭ  ＯＨＢまたは０．５ｍＭオキサロ酢酸の基質濃度で活性を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、酵素活性は、係る活性を有する酵素をコードする遺伝子を参照することによっても規定される。遺伝子の呼称単位の使用は、特定の生物に限定されず、他の生物における対応する遺伝子およびタンパク質を全て網羅する（例えば、酵素活性を保持するであれば、微生物、その機能アナログ、機能バリアントおよび機能断片）。
【００１１】
本発明のさらに別の態様内において、ホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換してＯＨＢを得る酵素は、ホモセリンアミノ基転移酵素、ホモセリン脱水素酵素またはホモセリン酸化酵素となり得る。
【００１２】
本発明のさらに別の態様内において、ホモセリンアミノ基転移酵素活性を有する酵素は、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＥＣ２．６．１．１）活性、分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素（ＥＣ２．６．１．４２）活性または芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素（ＥＣ２．６．１．５７）活性を有する酵素の中から同定することができる。
【００１３】
本発明のさらに別の態様内において、ホモセリンアミノ基転移酵素は、大腸菌（Escherichia coli）由来のＥｃ−ＩｌｖＥおよびラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）由来のＬｌ−ＢｃａＴである分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素、大腸菌（E. coli）由来のＥｃ−ＴｙｒＢ、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）由来のＬｌ−ＡｒａＴおよび出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＳｃ−Ａｒｏ８である芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素、または大腸菌由来のＥｃ−ＡｓｐＣであるアスパラギン酸アミノ基転移酵素となり得る。
【００１４】
本発明の方法の第２のステップは、ＯＨＢ還元酵素活性を有する酵素により触媒される。本発明のさらに別の態様内において、ＯＨＢ還元酵素活性を有する酵素は、２−ヒドロキシ酸脱水素酵素活性を有する酵素の中から、特に、乳酸脱水素酵素（Ｌｄｈ）（ＥＣ１．１．１．２７、ＥＣ１．１．１．２８）、リンゴ酸脱水素酵素（Ｍｄｈ）（ＥＣ１．１．１．３７、ＥＣ１．１．１．８２、ＥＣ１．１．１．２９９）活性または分岐鎖（Ｄ）−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．２７２、ＥＣ１．１．１．３４５）活性を有する酵素の中から同定することができる。より具体的には、ホモセリンアミノ基転移酵素活性を有する酵素は、遺伝子ｉｌｖＥ、ｔｙｒＢ、ａｓｐＣ、ａｒａＴ、ｂｃａＴまたはＡＲＯ８にコードされる。
【００１５】
さらにより具体的な態様において、ホモセリンアミノ基転移酵素活性を有する酵素は、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７もしくは配列番号６９または前記配列と少なくとも５０％の相同性を共有する任意の配列に表記されている配列にコードされる、あるいは配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０または前記配列と少なくとも５０％の相同性を共有する任意の配列に対応する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様内において、ＯＨＢ還元酵素は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌｌ−ＬｄｈＡ）由来、カイウサギ（Oryctalagus cuniculus）（Ｏｃ−ＬｌｄｈＡ）由来、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）（Ｇｓ−Ｌｌｄｈ）由来もしくは枯草菌（Bacillus subtilis）（Ｂｓ−Ｌｄｈ）由来の（Ｌ）−乳酸脱水素酵素、大腸菌（Ｅｃ−ＬｄｈＡ）由来の（Ｄ）−乳酸脱水素酵素、大腸菌（Ｅｃ−Ｍｄｈ）由来の（Ｌ）−リンゴ酸脱水素酵素、またはラクトコッカス・ラクティス（Ｌｌ−ＰａｎＥ）由来の分岐鎖（Ｄ）−２−ヒドロキシ酸脱水素酵素となり得る。
【００１７】
本発明のさらにより具体的な態様において、ＯＨＢ還元酵素は、アミノ酸配列、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２８８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６もしくは配列番号１１８または前記配列と少なくとも５０％の相同性を共有する任意の配列により表される、あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２８７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５もしくは配列番号１１７または前記配列と少なくとも５０％の相同性を共有する任意の配列により表される核酸配列にコードされる。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、上述の通り、ＯＨＢを２，４−ＤＨＢへと還元する酵素の使用も扱う。
【００１９】
機能バリアントまたは機能断片等、上述の酵素と実質的な相同性を共有するタンパク質も、本発明の別の態様である。
【００２０】
表現「実質的な相同性」は、構造および／またはアミノ酸構成成分および／または生物学的活性に関する相同性を網羅する。
【００２１】
より全般的には、本発明の意味内で、２種のタンパク質配列の間の相同性は、当業者に周知の方法により決定することができる。これは、参照配列と、対象とするタンパク質の配列との間の配列同一性のパーセンテージとして一般に定義される。
【００２２】
本明細書において、本明細書において同定されるアミノ酸またはヌクレオチド配列に関する「パーセント（％）配列同一性」は、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せず、最大パーセント配列同一性を達成した後の、酵素配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一の、候補配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。配列整列化を行い配列同一性を決定するための方法は、当業者に公知であり、必要以上の実験法を用いずに行うことができ、同一性計算値を確定的に得ることができる。例えば、オーズベル（Ausubel）ら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡＬＩＧＮプログラム（デイホフ（Dayhoff）（１９７８）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい。配列を整列し、配列同一性を決定するために多数のアルゴリズムを利用することができ、係るアルゴリズムは、例えば、ニードルマン（Needleman）ら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整列化アルゴリズム；スミス（Smith）ら（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズム；ピアソン（Pearson）ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性検索方法；スミス・ウォーターマン（Smith-Waterman）アルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３〜１８７（１９９７）；ならびにＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（アルチュール（Altschul）ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０を参照）を包含する。これらのアルゴリズムを用いたコンピュータ化プログラムを利用することもでき、そのようなものとして、ＡＬＩＧＮもしくはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアまたはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（アルチュールら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、２６６：４６０〜４８０（１９９６））；あるいはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ（アルチュールら）、上記参照、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、バージョン８、米国ウィスコンシン州マディソンにおいて利用できるＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ；ならびにＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州マウンテンビューによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬが挙げられるがこれらに限定されない。当業者であれば、比較されている配列の長さにわたる最大整列化の達成に必要とされるアルゴリズムを包含する、整列化を測定するための適切なパラメータを決定することができる。好ましくは、配列同一性は、プログラムにより決定されるデフォルトパラメータを用いて決定される。具体的には、配列同一性は、次の検索パラメータ：ギャップオープンペナルティ１２��ギャップ伸長ペナルティ１によるアフィンギャップ検索を用いてＭＳＰＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行される通り、スミス・ウォーターマン相同性検索アルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３〜１８７（１９９７））により決定することができる。好ましくは、一対アミノ酸比較は、ギャップウエイト（weight）１２および長さウエイト２によるｂｌｏｓｕｍ６２アミノ酸置換マトリクスを用いるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソンのＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて行うことができる。２種のアミノ酸配列の最適整列化に関して、バリアントアミノ酸配列の近接セグメントは、参照アミノ酸配列に対して追加的なアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有することができる。参照アミノ酸配列との比較に用いられる近接セグメントは、少なくとも２０個の近接アミノ酸残基を包含することができ、これは、３０、４０、５０個以上のアミノ酸残基となり得る。派生体のアミノ酸配列におけるギャップの包含に伴う配列同一性の増加の補正は、ギャップペナルティを割り当てることにより行うことができる。
【００２３】
同じ活性を有する本発明に係る酵素（ＯＨＢ還元酵素、あるいはホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換してＯＨＢを得る酵素）は、少なくとも約５０％、７０％または８５％アミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約８５％アミノ酸配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性、なおより好ましくは、９８％アミノ酸配列同一性を共有する。好ましくは、任意のアミノ酸置換は、あるアミノ酸が別の生物学的に類似のアミノ酸により置き換えられた、Ｌ−アミノ酸を用いた「保存的アミノ酸置換」である。保存的アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸の全般的な電荷、疎水性／親水性および／または立体容積を保存する置換である。保存的置換の例は、次の群の間の置換である：Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／ＴｈｒおよびＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒ。派生体は、例えば、６〜１０、僅か５、僅か４、３、２またはさらには１アミノ酸残基等、僅か１〜１０アミノ酸残基異なることができる。
【００２４】
用語、機能バリアントは、本願内に特に記載されている配列と比較して実質的な配列改変を提示し得るが、以前として本来の酵素活性を保持する酵素を網羅する。
【００２５】
これは、酵素の配列が、本来の配列よりも少ないアミノ酸を含み得るが、前記切断された酵素が、依然として本来の酵素活性を保持することも意味する。
【００２６】
本発明の態様において、本発明の方法の第１および／または第２のステップを触媒する酵素の活性は増強される。この増強は、実施例１または４に記載されている酵素アッセイにより測定することができる。
【００２７】
前記酵素の改善は、少なくとも１個の突然変異により得ることができ、前記突然変異は、（ｉ）それぞれホモセリンまたはＯＨＢに対する変異導入された酵素の活性および／または基質親和性を改善する、および／または（ｉｉ）その天然の基質に対する変異導入された酵素の活性および／または基質親和性を減少する。
【００２８】
本発明内で、表現「活性および／または基質親和性を改善する」は、突然変異前の酵素が、
・基質を用いることができなかった、および／または
・少なくとも３倍低い最大比速度で反応産物を合成した、および／または
・少なくとも３倍低いホモセリンもしくはＯＨＢに対する親和性を有した、および／または
・少なくとも３倍高い天然の基質における最大比活性を有した、および／または
・少なくとも３倍高い天然の基質に対する親和性を有した
のいずれかであったことを意味する。
【００２９】
さらにまた別の態様において、本発明は、本発明の方法の第１および第２のステップを触媒する酵素をコードするヌクレオチド配列を網羅する。
【００３０】
本発明のさらにより具体的な態様において、ＯＨＢ還元酵素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２８７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５もしくは配列番号１１７または前記配列と少なくとも５０％の相同性を共有する任意の配列により表される核酸配列にコードされる。
【００３１】
本発明に係るＯＨＢ還元酵素は、具体的な態様において、位置Ｖ１７、Ｑ８５、Ｅ８９、Ｉ２２６またはＡ２２２のうち少なくとも１種において、野生型酵素と比較して少なくとも１個の突然変異を含む（Ｌ）−乳酸脱水素酵素Ａに対応する。これらの位置は、乳酸脱水素酵素ファミリにおいて保存されており、本文章において、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌ）−乳酸脱水素酵素Ａ（配列番号６）を参照することにより定義される。続いて、当業者であれば、対応するアミノ酸配列の整列化により、他の乳酸脱水素酵素における対応するアミノ酸残基を容易に同定できるであろう。従って、本発明は、また、他の乳酸脱水素酵素におけるこれらのアミノ酸の変化を提供する。
【００３２】
本発明に係るＯＨＢ還元酵素は、具体的な態様において、位置Ｉ１２、Ｒ８１、Ｍ８５、Ｄ８６、Ｖ９３、Ｇ１７９、Ｔ２１１またはＭ２２７のうち少なくとも１種において、野生型酵素と比較して少なくとも１個の突然変異を含む（Ｌ）−リンゴ酸脱水素酵素に対応する。これらの位置は、リンゴ酸脱水素酵素ファミリにおいて保存されており、本文章において、大腸菌（Ｌ）−リンゴ酸脱水素酵素（配列番号２）の配列を参照することにより定義される。当業者であれば、対応するアミノ酸配列の整列化により、他のリンゴ酸脱水素酵素における対応するアミノ酸残基を容易に同定できるであろう。従って、本発明は、また、他のリンゴ酸脱水素酵素におけるこれらのアミノ酸の変化を提供する。
【００３３】
本発明に従って、「核酸配列」は、一本または二本鎖形態のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくは、ＤＮＡ分子を指す。「単離されたＤＮＡ」は、本明細書において、天然起源ではない、あるいはそれが本来存在していた天然の環境にもはや存在しないＤＮＡ、例えば、キメラ遺伝子における他の調節エレメントに関連する配列をコードするＤＮＡ、別の宿主細胞に移入されたＤＮＡ、または任意の天然起源のＤＮＡ配列と比較して異なるヌクレオチド配列を有する人工の合成により作製されたＤＮＡ配列を指す。
【００３４】
本発明は、また、互いに機能的に連結された、宿主生物において機能的な少なくとも１個のプロモータ、本発明において定義されている方法の第１および第２のステップを触媒する酵素のうちいずれかをコードするポリヌクレオチド、ならびに同じ宿主生物において機能的なターミネータエレメントを含むキメラ遺伝子に関する。キメラ遺伝子が含有し得る様々なエレメントは、第１に、プロモータ、シグナルペプチドもしくは輸送ペプチドをコードする配列またはポリアデニル化シグナルを構成するターミネータエレメント等、タンパク質の転写、翻訳および成熟化を調節するエレメントであり、第２に、タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。表現「互いに機能的に連結される」は、キメラ遺伝子の前記エレメントが、これらエレメントの一方の機能が、他方の機能により影響されるような仕方で互いに連結されていることを意味する。例として、プロモータは、前記コード配列の発現に影響を与えることができる場合、コード配列に機能的に連結されている。本発明に係るキメラ遺伝子の構築およびその様々なエレメントの組立は、当業者に周知の技法を用いて行うことができる。キメラ遺伝子を構成する調節エレメントの選択は、これらが機能するべき宿主生物に基本的に依存し、当業者であれば、所定の宿主生物において機能的な調節エレメントを選択することができる。用語「機能的」は、所定の宿主生物において機能することができることを意味するよう企図されている。
【００３５】
本発明に係るキメラ遺伝子が含有し得るプロモータは、構成的または誘導性のいずれかである。例として、細菌における発現に用いられるプロモータは、後述のプロモータから選ぶことができる。大腸菌における発現に関して、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ、ｐｒｏｕ、ｃｓｔ−ｌ、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、Ｐｓｙｎ、ｃｓｐＡ、ＰＬ、ＰＬ−９Ｇ−５０、ＰＲ−ＰＬ、Ｔ７、［ラムダ］ＰＬ−ＰＴ７、Ｔ３−ｌａｃ、Ｔ５−ｌａｃ、Ｔ４遺伝子３２、ｎｐｒＭ−ｌａｃ、ＶＨｂおよびプロテインＡプロモータ、あるいはＰｔｒｐプロモータ（国際公開第９９／６４６０７号パンフレット）について言及することができる。コリネバクテリウム属またはストレプトミセス属等、グラム陽性細菌における発現に関して、ＰｔｉｐＡまたはＰＳ１およびＰＳ２（ＦＲ９１／０９８７０号明細書）プロモータ、あるいは出願、欧州特許出願公開０６２９６９９（Ａ２）号明細書に記載されているプロモータについて言及することができる。酵母および真菌における発現に関して、クルイベロミセス・ラクティス（K. lactis）ＰＬＡＣ４プロモータまたはクルイベロミセス・ラクティスＰｐｇｋプロモータ（特許出願ＦＲ９１／０５２９４号明細書）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ｔｅｆ１またはｃｂｈ１プロモータ（国際公開第９４／０４６７３号パンフレット）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）ｈｉｓ、ｃｓｌまたはａｐｆプロモータ（国際公開第００／６８４０１号パンフレット）およびクロコウジカビ（Aspergillus niger）ｇｌａプロモータについて言及することができる。
【００３６】
本発明において、キメラ遺伝子は、転写アクチベータ（エンハンサ）等、プロモータとコード配列との間に配置された他の調節配列を含むこともできる。
【００３７】
そのようなものとして、本発明のキメラ遺伝子は、具体的な実施形態において、少なくとも、転写の方向において機能的に連結された、宿主生物において機能的なプロモータ調節配列、本発明において定義されている方法の第１および第２のステップを触媒する酵素のうちいずれかコードするポリヌクレオチドをコードする核酸配列、ならびに前記宿主生物において機能的なターミネータ調節配列を含む。
【００３８】
本発明は、また、本発明に係るキメラ遺伝子または本発明の核酸配列を含むクローニングおよび／または発現ベクタに関する。本発明に係るベクタは、宿主生物の形質転換ならびにこの生物における本発明の方法の第１および／または第２のステップを触媒する酵素のうちいずれかの発現に利用される。このベクタは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスとなり得る。優先的には、本発明に係る形質転換ベクタは、プラスミドである。一般的には、このベクタの主な品質は、特に、複製起点の存在に基づいて、宿主生物の細胞において自身を維持および自己複製し、その中で本発明の方法の第１および／または第２のステップを触媒する酵素のうちいずれかを発現することができる必要がある。宿主生物の安定的形質転換の目的のため、ベクタは、ゲノムに組み込むこともできる。係るベクタの選択と、また、このベクタへの本発明に係るキメラ遺伝子の挿入の技法は、当業者の一般知識の一部である。有利には、本発明において用いられるベクタは、本発明に係るキメラ遺伝子に加えて、選択可能マーカをコードするキメラ遺伝子も含有する。この選択可能マーカは、有効に形質転換された宿主生物、即ち、ベクタを組み入れた宿主生物の選択を可能にする。本発明の特定の実施形態において、形質転換しようとする宿主生物は、細菌、酵母、真菌である。用いることのできる選択可能マーカのうち、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子等、抗生物質に対する抵抗性の遺伝子を含有するマーカについて言及することができる。他のマーカは、ｐｙｒＡ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒ４、ａｒｇ４、ａｒｇＢおよびｔｒｐＣ遺伝子、モリブドプテリンシンターゼ遺伝子またはアセトアミダーゼ（acetamidase）の遺伝子等、栄養素要求性を補完する遺伝子となり得る。ＧＵＳ酵素等、容易に同定可能な酵素をコードする遺伝子、または色素もしくは形質転換細胞における色素の産生を調節する酵素をコードする遺伝子について言及することもできる。係る選択可能マーカ遺伝子は、特許出願、国際公開第９１／０２０７１号パンフレット、国際公開第９５／０６１２８号パンフレット、国際公開第９６／３８５６７号パンフレットおよび国際公開第９７／０４１０３号パンフレットに特に記載されている。
【００３９】
本発明は、また、改変された微生物に関する。より具体的には、本発明の改変された微生物は、
・ホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換して、２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸塩を得る第１のステップと、
・得られた２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸塩を還元して、２，４−ジヒドロキシ酪酸塩を得る第２のステップと、
を含む２ステップ経路により、ホモセリンからの２，４−ＤＨＢの調製を可能にする。
【００４０】
２ステップに関与する酵素は、上述の酵素である。
【００４１】
用語「微生物」は、２，４−ＤＨＢを産生するために本発明に係るキメラ遺伝子、核酸またはベクタを導入することのできる、任意の下等な単細胞生物を意味するよう企図されている。好ましくは、宿主生物は、微生物であり、特に、真菌、例えば、アオカビ属（Penicillium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、より具体的には、アスペルギルス・フラバス（Aspergillusflavus）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）またはトリコデルマ属（Trichoderma）の真菌、酵母、特に、サッカロミセス科（Saccharomycetaceae）、ピキア科（Pichiaceae）またはシゾサッカロミセス科（Schizosaccharomycetaceae）、最も優先的には、出芽酵母、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）またはピキア・ジャディニィ（Pichia jadinii）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）もしくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）の酵母、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、クロストリジウム科（Clostridiaceae）、バチルス科（Bacillaceae）、ストレプトミセス科（Streptomycetaceae）、連鎖球菌科（Streptococcaceae）、メチロバクテリウム科（Methylobacteriacae）およびコリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）、最も優先的には大腸菌、枯草菌、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）またはラクトコッカス・ラクティスの中から優先的に選択される細菌である。
【００４２】
本発明は、また、そのゲノムに組み込まれている、あるいは染色体外遺伝的エレメント、例えば、プラスミドにおいて保有されている本発明に係る少なくとも１種のキメラ遺伝子を含有する改変された微生物に関する。本発明のより具体的な態様において、形質転換された宿主生物は、ホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換してＯＨＢを得るポリペプチドをコードする本発明の核酸および／または２，４−ＤＨＢにおけるＯＨＢを還元するポリペプチドをコードする核酸、あるいはホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換してＯＨＢを得るポリペプチドおよび／またはＯＨＢ還元酵素をコードする核酸を含むキメラ遺伝子、あるいはホモセリンの一級アミノ基をカルボニル基に変換してＯＨＢを得るポリペプチドまたはＯＨＢ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクタを含む。
【００４３】
本発明のさらに別の態様内において、ホモセリンをＤＨＢに変換するための合成経路は、ホモセリンの産生が増強された微生物において発現される。微生物におけるホモセリンの産生の増強は、（ｉ）酵素、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびホモセリン脱水素酵素を過剰発現することにより、（ｉｉ）アスパラギン酸キナーゼ酵素を、リジン、メチオニンまたはスレオニンによってもたらされ得る産物阻害に対し非感受性にすることにより、ならびに（ｉｉｉ）ホモセリン生合成経路から分岐する代謝経路の欠失により達成することができる。アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびホモセリン脱水素酵素の過剰発現は、適切な構成的または誘導性プロモータの制御下においてマルチコピープラスミドから酵素を発現させることにより達成することができる。あるいは、前記酵素の過剰発現は、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびホモセリン脱水素酵素をコードする遺伝子の転写を制限する転写リプレッサの欠失により達成することができる。アスパラギン酸キナーゼは、そのアミノ酸配列に適切な突然変異を導入することにより、アスパラギン酸由来のアミノ酸による阻害に対し非感受性にすることができる。ホモセリン生合成経路から分岐する代謝経路への入り口は、Ｏ−サクシニルホモセリンもしくはＯ−アセチルホモセリンシンターゼ活性（メチオニン生合成へと進入）、ホモセリンキナーゼ活性（スレオニン生合成へと進入）またはジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性（リジン生合成へと進入）を有する酵素により触媒される。前記酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の欠失は、アスパラギン酸由来のアミノ酸の生成を回避し、従って、ホモセリン生成を助ける。
【００４４】
従って、大腸菌における遺伝子ｍｅｔＡ、ｔｈｒＢおよびｌｙｓＡの欠失は、ホモセリン生合成経路から分岐する経路を減弱化する。大腸菌におけるホモセリン経路の酵素活性の増加は、例えば、二機能性（bifunctional）アスパラギン酸キナーゼ−ホモセリン脱水素酵素変異体ｔｈｒＡ  Ｓ３４５Ｆ（スレオニン阻害に対し非感受性）およびａｓｄ（両方の遺伝子は大腸菌由来）の過剰発現により；あるいは単機能性アスパラギン酸キナーゼ変異体ｌｙｓＣ  Ｅ２５０Ｋ（リジンに対し非感受性）、ａｓｄ（両方の遺伝子は大腸菌由来）および出芽酵母（S cerevisiae）由来のホモセリン脱水素酵素遺伝子ＨＯＭ６の過剰発現により、達成することができる。
【００４５】
本発明の微生物は、ホモセリンを搬出する能力が減弱化されていてもよく、これは、このアミノ酸の細胞内利用能を増加させる。細胞からのホモセリン搬出の減少を達成するために、ホモセリンを搬出することのできるパーミアーゼを欠失させることができる。係るパーミアーゼは、微生物においてゲノムライブラリを過剰発現させ、阻害濃度のホモセリン、またはスレオニン、ロイシンもしくはアスパラギン酸等の構造的に類似のアミノ酸において前記微生物を培養することにより同定することができる（ザカテヴァ（Zakataeva）ら、１９９９／ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ／４５２／２２８〜２３２）。その過剰発現により、増加濃度の前記アミノ酸のいずれかにおける増殖が達成される遺伝子は、ホモセリン搬出に関与する可能性が高い。
【００４６】
さらに別の態様において、大腸菌である本発明の微生物は、ホモセリン流出トランスポーター、ｒｈｔＡ、ｒｈｔｂおよび／またはｒｈｔＣに欠失を保有する。
【００４７】
ＤＨＢ合成の補助因子供給の最適化に関して宿主生物の代謝ネットワークにおける炭素フラックス再区分を最適化し、ＤＨＢ以外の代謝副産物を生成させる競合経路を減弱化することにより、ＤＨＢの効率的な産生を確実にすることができる。株改善のための重要なツールは、制約に基づくフラックスバランス解析を提供する。この方法は、培養条件に依存する所定の代謝ネットワークの理論的収量の計算を可能にし、過剰発現または欠失のための代謝標的の同定を容易にする。代謝標的反応の過剰発現および欠失に用いられる実験技法が記載されている（実施例８）。
【００４８】
従って、本発明の微生物は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼおよびヘキソースシンポーターパーミアーゼの中から選ばれる、増加する酵素活性、および／または乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、酢酸キナーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ピルビン酸酸化酵素、イソクエン酸リアーゼ、フマラーゼ、２−オキソグルタル酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、リンゴ酸酵素、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、糖輸送ホスホトランスフェラーゼ、ケトヒドロキシグルタル酸アルドラーゼ、ホモセリン−Ｏ−サクシニルトランスフェラーゼ、ホモセリンキナーゼ、ホモセリン流出トランスポーター、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼおよび／またはメチルグリオキサールシンターゼの中から選ばれる、減少する酵素活性のうち少なくとも１種を提示することもできる。
【００４９】
さらに別の態様において、大腸菌である本発明の微生物は、全て大腸菌のｐｐｃ、ｐｃｋ、ａｃｅＡ、ｇａｌＰ、ａｓｄ、ｔｈｒＡ、ｍｅｔＬ、ｌｙｓＣ；ラクトコッカス・ラクティス由来のｐｙｃＡの中から選ばれる遺伝子のうち少なくとも１種を過剰発現する、および／またはｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ、ｓａｄ、ｇａｂＡＢＣ、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｐｃ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｍｇｓＡ、ｓｕｃＡＢ、ｐｔｓＩ、ｐｔｓＧ、ｐｇｉ、ｆｕｍＡＢＣ、ａｌｄＡ、ｌｌｄＤ、ｉｃｌＲ、ｍｅｔＡ、ｔｈｒＢ、ｌｙｓＡ、ｅｄａ、ｒｈｔＡ、ｒｈｔＢ、ｒｈｔＣの中から選ばれる遺伝子のうち少なくとも１種が欠失している。
【００５０】
本発明は、また、
・適切な培養培地において本発明の改変された微生物を培養するステップと、
・培養培地から２，４−ＤＨＢを回収するステップと、
を含む、２，４−ＤＨＢの産生方法を網羅する。前記２，４−ＤＨＢは、さらに精製することができる。
【００５１】
産物分離および精製は、プロセス全体の効率および産物コストに甚大に影響する非常に重要な要因である。産物回収のための方法は、一般に、細胞分離ならびに産物精製、濃縮および乾燥それぞれのステップを含む。
【００５２】
［細胞分離］
限外濾過および遠心分離を用いて、発酵培地から細胞を分離することができる。発酵培地からの細胞分離は、多くの場合、高い培地粘性により困難なものとなる。従って、本出願人らは、鉱酸もしくはアルカリ塩等、添加物を加えるまたは培養ブロスを加熱して、細胞分離を最適化することができる。
【００５３】
［産物回収］
バイオマス除去の前または後のいずれかにおけるＤＨＢの分離のために、種々のイオン交換クロマトグラフィ方法を適用することができる。これは、その等電点に従った産物の分離を容易にする一次陽イオン交換樹脂の使用を包含する。典型的には、樹脂に溶液を充填し、溶離液においてｐＨ増加（例えば、水酸化アンモニウムの添加による）後に保持された産物を別々に溶出する。別の可能性は、固定されたまたは疑似移動床式の樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィの使用である。適切な産物純度を達成するために、異なるクロマトグラフィステップを組み合わせる必要がある場合もある。このような精製方法は、高価な結晶化ステップと比較してより経済的であり、最終産物の形態に関して追加的な利点および柔軟性も提供する。
【００５４】
［産物濃縮および乾燥］
精製プロセスは、スプレ造粒機、スプレ乾燥機、ドラム乾燥機、回転乾燥機およびトンネル乾燥機等、任意の適した乾燥手段に関与し得る乾燥ステップを含むこともできる。濃縮されたＤＨＢ溶液は、多目的濃縮器または薄膜蒸発器を用いて、１３０℃の蒸気により減圧下で発酵ブロスを加熱することにより得ることができる。
【実施例】
【００５５】
次の非限定例は、本発明を図解する。
【００５６】
＜実施例１＞
［ＯＨＢ還元酵素活性の実証］
乳酸脱水素酵素またはリンゴ酸脱水素酵素をコードする野生型遺伝子を含有するプラスミドの構築：
大腸菌における（Ｌ）−リンゴ酸脱水素酵素、Ｅｃ−ｍｄｈ（配列番号１）、大腸菌における（Ｄ）−乳酸脱水素酵素、Ｅｃ−ｌｄｈＡ（配列番号３）、ラクトコッカス・ラクティスの（Ｌ）−乳酸脱水素酵素、Ｌｌ−ｌｄｈＡ（配列番号５）、枯草菌の（Ｌ）−乳酸脱水素酵素、Ｂｓ−ｌｄｈ（配列番号７）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの（Ｌ）−乳酸脱水素酵素、Ｇｓ−ｌｄｈ（配列番号９）、カイウサギの（Ｌ）−乳酸脱水素酵素の２種のアイソフォーム、Ｏｃ−ｌｄｈＡ（配列番号１１および配列番号１３）をコードする遺伝子を、高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および表１に収載されているプライマを用いたＰＣＲにより増幅した。大腸菌ＭＧ１６５５、ラクトコッカス・ラクティスＩＬ１４０３および枯草菌（B. subtilis）株１６８のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。遺伝子Ｏｃ−ｌｄｈＡおよびＧｓ−ｌｄｈを、大腸菌における発現のためにコドン最適化し、ＭＷＧ  Ｅｕｒｏｆｉｎｓにより合成した。プライマは、それぞれ開始コドンの上流および終止コドンの下流に制限部位（表１）を導入して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いたｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクタの対応する部位への消化されたＰＣＲ産物のライゲーションを容易にした。ライゲーション産物を大腸菌ＤＨ５α細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。その結果得られたｐＥＴ２８−Ｅｃ−ｍｄｈ、ｐＥＴ２８−Ｅｃ−ｌｄｈＡ、ｐＥＴ２８−Ｌｌ−ｌｄｈＡ、ｐＥＴ２８−Ｂｓ−ｌｄｈ、ｐＥＴ２８−Ｇｓ−ｌｄｈおよびｐＥＴ２８−Ｏｃ−ｌｄｈＡプラスミドを単離し、それぞれ大腸菌ｍｄｈ、大腸菌ｌｄｈＡ、ラクトコッカス・ラクティスｌｄｈＡ、枯草菌ｌｄｈ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）ｌｄｈおよびカイウサギ（O. cuniculus）ｌｄｈＡ遺伝子の正確な全長配列を含有していることをＤＮＡ配列決定により示した。対応するタンパク質配列は、それぞれ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４により表される。
【００５７】
【表１】
0006293746.tif 000002
【００５８】
酵素の発現：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）出発（star）細胞を、標準遺伝学プロトコール（サンブルック（Sambrook）、フリッチュ（Fritsch）＆マニアティス（Maniatis）、１９８９）を用いて適切なプラスミドにより形質転換した。ＯＤ６００が０．１の一晩培養物から播種して０．６のＯＤ６００となるよう増殖させ、その後、培養培地への１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりタンパク質発現を誘導した５０ｍＬのＬＢ培養物において、Ｎ末端ヘキサＨｉｓタグを有する酵素を発現させた。１５時間のタンパク質発現の後、４０００ｇ、４℃、１０分間の遠心分離により細胞を収集し、上清を廃棄した。さらに解析するまで細胞ペレットを−２０℃で貯蔵した。増殖およびタンパク質発現は、２５℃で行った。培養培地は、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有した。
【００５９】
酵素の精製：発現培養物の凍結した細胞ペレットを、０．５ｍＬの破損バッファ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７，５）に再懸濁し、４回の逐次ラウンドの超音波処理（超音波処理間隔：２０秒間、出力：３０％、超音波処理器：Ｂｉｏｂｌｏｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶｉｂｒａＣｅｌｌ（商標）７２４３７）により破損した。１５分間、４℃、４０００ｇで粗抽出物を遠心分離し、清澄な上清を保持することにより、細胞デブリを除去した。１５ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ）を添加し、１３０００ｇ、１０分間、４℃で試料を遠心分離し、上清を保持することにより、抽出物からＲＮＡおよびＤＮＡを除去した。１時間、４℃で、０．７５ｍＬ（総容積）のＴａｌｏｎ（商標）Ｃｏｂａｌｔ親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に、清澄なタンパク質抽出物をインキュベートした。卓上遠心分離機において７００ｇで懸濁液を遠心分離し、上清を除去した。０．５ｍＬの溶出バッファ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７，５）でタンパク質を溶出させる前に、１０総容積の洗浄バッファ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７，５）で樹脂を洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、溶出された酵素の純度を検証した。ブラッドフォード（Bradford）の方法（ブラッドフォード（１９７６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜５４）により、タンパク質濃度を推定した。乳酸脱水素酵素を安定化するために、ｐＨ７となるよう調整した１００ｍＭリン酸緩衝液で溶出バッファを系統的に交換した。タンパク質試料をＡｍｉｃｏｎ（商標）超遠心分離フィルター（カットオフ１０ｋＤａ）に移し、８分間、４０００ｇ、４℃で遠心分離してバッファを除去した。タンパク質をリン酸緩衝液に希釈し、手順を４回反復した。
【００６０】
酵素アッセイ：反応混合物は、６０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）、５０ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ（必要に応じて、５ｍＭフルクトース−１，６−ビスリン酸）（全製品はＳｉｇｍａ製）および適切な量の精製されたリンゴ酸もしくは乳酸脱水素酵素または細胞抽出物を含有した。適切な量の２−オキソ−４−ヒドロキシ酪酸塩（ＯＨＢ）、ピルビン酸またはオキサロ酢酸（ＯＡＡ）を添加することにより、反応を開始した。９６ウェル平底マイクロタイタープレートにおいて、２５０μＬの最終容量で、３７℃で酵素アッセイを行った。反応に続いて、マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＲａｄ  ６８０ＸＲ）において、３４０ｎｍ（εＮＡＤＨ＝６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１）におけるＮＡＤＨの特徴的吸収を測定した。
【００６１】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファ、ｐＨ７．８においてヘビ毒（Ｌ）−アミノ酸酸化酵素（１．２５Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）およびカタラーゼ（４４００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）と１２５ｍＭホモセリンを９０分間、３７℃でインキュベートすることにより、ＯＨＢを合成した。その後、カットオフ１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ（商標）超遠心分離フィルターにおいて反応混合物を精製して、酵素を排除した（ウェルナー（Wellner）＆リヒテンベルク（Lichtenberg）、１９７１から適応させた方法）。
【００６２】
１Ｍヒ酸ナトリウムおよび１Ｍホウ酸、ｐＨ６．５を含有する溶液１ｍＬと１００μＬの被験溶液を混合することにより、ＯＨＢを定量化した。混合物を室温で３０分間インキュベートし、３２５ｎｍにおける吸光度を用いてＯＨＢを定量化した。公知の濃度のピルビン酸溶液を用いて、吸光度およびケトンの濃度の間の関係を較正した（（ウェルナー＆リヒテンベルク、１９７１）から適応させた方法）。方法の典型的なＯＨＢ収率は、９０％であった。
【００６３】
結果：その天然の基質およびＯＨＢにおける被験酵素の動態パラメータを表２に収載する。有意なＯＨＢ還元酵素活性は、異なる生物学的起源のあらゆる乳酸脱水素酵素に見いだされる。大腸菌のリンゴ酸脱水素酵素、Ｍｄｈは、ＯＨＢにおいて非常に軽微な活性しか持たなかった。ラクトコッカス・ラクティス由来の分岐鎖２−オキソ−酸脱水素酵素、ＰａｎＥはまた、ＯＨＢにおいて有意な活性を有していた。
【００６４】
【表２】
0006293746.tif 000003
【００６５】
＜実施例２＞
［改善されたＯＨＢ還元酵素活性を有する乳酸脱水素酵素の構築］
ｐＥＴ２８−Ｌｌ−ｌｄｈＡプラスミドを鋳型として用いて、ラクトコッカス・ラクティスｌｄｈＡ遺伝子の部位特異的突然変異誘発を行った。表３に収載されているオリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  １Ｕ、ＨＦバッファ２０％（ｖ／ｖ）、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ダイレクト（direct）およびリバースプライマ各０．０４μＭ、鋳型プラスミド３０〜５０ｎｇ、水）により、アミノ酸配列を変化させるための点突然変異を導入した。ＰＣＲにより変異導入された遺伝子は、変異導入されたクローンの同定を容易にするために、機能的突然変異に加えて、表３に収載されている新しい制限部位（サイレント突然変異を用いて導入）を含有した。ＤｐｎＩにより３７℃で１時間ＰＣＲ産物を消化して鋳型ＤＮＡを除去し、コンピテント大腸菌ＤＨ５α（ＮＥＢ）細胞へと形質転換した。変異導入されたプラスミドを制限部位解析により同定し、ＤＮＡ配列決定により所望の突然変異を保有していることを検証した。
【００６６】
【表３】
0006293746.tif 000004
【００６７】
実施例１に記載されている通りに、変異体酵素を発現させ、精製し、ＯＨＢおよびピルビン酸還元酵素活性に関して検査した。両方の基質の活性測定値について、図２に概要を述べる。結果は、好ましくは、アラニン、システイン、アスパラギンまたはメチオニンによるＧｌｎ８５の置き換えが、ＯＨＢに対する酵素の特異性の増加および／または最大比ＯＨＢ還元酵素活性の増加を生じることを実証する。
【００６８】
Ｌｌ−Ｌｄｈにおける突然変異Ｑ８５Ｎを、突然変異Ｉ２２６Ｖと組み合わせた。この交換は、ＯＨＢに対する基質親和性に大きなプラスの影響を有したことが実証された。
【００６９】
【表４】
0006293746.tif 000005
【００７０】
＜実施例３＞
［改善されたＯＨＢ還元酵素活性を有するリンゴ酸脱水素酵素の構築］
表５に収載されているプライマを用いて、実施例２に記載されている通りに、大腸菌由来のｍｄｈ遺伝子の部位特異的突然変異誘発を行った。鋳型としてプラスミドｐＥＴ２８−Ｅｃ−ｍｄｈを用いた。
【００７１】
【表５】
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【００７２】
実施例１に記載されている通りに、変異体酵素を発現させ、精製し、ＯＨＢおよびオキサロ酢酸還元酵素活性に関して検査した。ＯＨＢおよびオキサロ酢酸における活性測定値について、図３に概要を述べる。結果は、アラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンまたはバリンによるＡｒｇ８１の置き換えが、顕著なＯＨＢ還元酵素活性と、随伴するオキサロ酢酸還元酵素活性減少をもたらすことを実証する。
【００７３】
Ｅｃ−Ｍｄｈにおける突然変異Ｒ８１Ａを、タンパク質配列の追加的な変化と組み合わせた。結果を表６に収載する。突然変異Ｍ８５Ｑ、Ｍ８５Ｅ、Ｉ１２Ｖ、Ｄ８６ＳまたはＧ１７９Ｄの導入が、ＯＨＢにおける活性の増加をもたらすことが実証された。
【００７４】
【表６】
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【００７５】
＜実施例４＞
［選択されたアミノ基転移酵素のホモセリンアミノ基転移酵素活性の実証］
高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）および表７に収載されているプライマを用いたＰＣＲにより、大腸菌、出芽酵母およびラクトコッカス・ラクティスにおける異なるアミノ基転移酵素をコードする遺伝子を増幅した。大腸菌ＭＧ１６５５、出芽酵母ＢＹ４７４１およびラクトコッカス・ラクティスＩＬ１４０３のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。プライマは、それぞれ開始コドンの上流および終止コドンの下流に制限部位（表７）を導入し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクタの対応する部位への消化されたＰＣＲ産物のライゲーションを容易にした。ライゲーション産物を大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。その結果得られたプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、対応する遺伝子の正確な全長配列を含有することを示した。対応するタンパク質配列の参照は、表７に収載されている。
【００７６】
【表７】
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【００７７】
実施例１に記載されている通りに酵素を発現させて精製し、後述する条件下でホモセリンアミノ基転移酵素活性に関して検査した。
【００７８】
酵素アッセイ：アミノ基アクセプタとして２−オキソグルタル酸を用いて、数種の候補アミノトランスフェラーゼのアミノ基転移酵素活性を定量化した。ホモセリンおよび酵素の好ましいアミノ酸を用いて、アミノ基転移酵素反応を行った。反応に続いて、共役脱水素酵素反応においてＮＡＤＨのアミノ酸依存性酸化を行った。
アミノ基転移酵素アッセイ（反応スキーム）
アミノ基転移酵素：アミノ酸＋２−オキソグルタル酸→２−オキソ−酸＋グルタミン酸塩
脱水素酵素：２−オキソ−酸＋ＮＡＤＨ→２−ヒドロキシ−酸＋ＮＡＤ＋
【００７９】
反応混合物は、６０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）、５０ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ２−オキソグルタル酸、０．１ｍＭピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＨ（必要に応じて、５ｍＭフルクトース−１，６−ビスリン酸）（全製品はＳｉｇｍａ製）、４ユニット／ｍＬの補助的２−ヒドロキシ酸脱水素酵素および適切な量の精製アミノトランスフェラーゼまたは細胞抽出物を含有した。補助的脱水素酵素は、アミノ酸フェニルアラニンおよびロイシンの場合はラクトコッカス・ラクティス由来の精製ＰａｎＥ（シャンベラン（Chambellon）、リイネン（Rijnen）、ロルケ（Lorquet）、ジットン（Gitton）、バン・ヒルカマブリーグ（van HylckamaVlieg）、ウーテルス（Wouters）＆イヴォン（Yvon）、２００９）、アスパラギン酸の場合はリンゴ酸脱水素酵素（Ｓｉｇｍａ）、ならびに出発基質としてホモセリンを用いる場合はウサギ筋肉（Ｌ）−乳酸脱水素酵素（Ｓｉｇｍａ）であった。５０ｍＭのアミノ酸を添加することにより反応を開始した。
【００８０】
９６ウェル平底マイクロタイタープレートにおいて最終容量２５０μＬで、３７℃で酵素アッセイを行った。反応に続いて、マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＲａｄ  ６８０ＸＲ）において、３４０ｎｍ（εＮＡＤＰＨ＝６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１）におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの特徴的吸収を測定した。
【００８１】
結果：異なるアミノトランスフェラーゼの動態パラメータは、表８に収載されている。顕著なホモセリンアミノ基転移酵素活性が、収載されているアミノ基転移酵素に見出される。
【００８２】
【表８】
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【００８３】
＜実施例５＞
［ホモセリン経路酵素の過剰発現のためのプラスミドの構築］
（プラスミドｐＴＡＣ−ｏｐ−ＨＭＳ１およびｐＡＣＴ３−ｏｐ−ＨＭＳ１の構築）
高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ開始コドンの上流および終止コドンの下流に導入するダイレクトおよびリバースプライマ５’ＣＡＣＧＡＧＧＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＧＴＣＴＣＣ３’（配列番号７１）および５’ＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＴＡＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣ３’（配列番号７２）を用いたＰＣＲによりｌｙｓＣ遺伝子を増幅することにより、プラスミドｐＥＴ２８−ＬＹＳＣｗｔを構築した。大腸菌ＭＧ１６５５由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによりＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクタの対応する部位にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。その結果得られたｐＥＴ２８−ＬＹＳＣｗｔプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列（配列番号７３）を有する全長ｌｙｓＣ遺伝子を含有することを示した。
【００８４】
ｐＥＴ２８−ＬＹＳＣｗｔプラスミドを鋳型として用いて、リジンによる阻害を軽減するためのｌｙｓＣの部位特異的突然変異誘発を行った。オリゴヌクレオチド５’ＧＣＧＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧＣＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＴＴＴＧ３’（配列番号７４）および５’ＣＡＡＡＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＡＡＣＧＣ３’（配列番号７５）を用いたＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  １Ｕ、ＨＦバッファ２０％（ｖ／ｖ）、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ダイレクトおよびリバースプライマ各０．０４μＭ、鋳型プラスミド５０ｎｇ、水）により、グルタミン酸からリジンへと位置２５０におけるアミノ酸配列を変化させるための点突然変異（Ｅ２５０Ｋ、配列番号３６）を導入した。３７℃で１時間、ＤｐｎＩによりＰＣＲ産物（配列番号３５）を消化して鋳型ＤＮＡを除去し、コンピテント大腸菌ＤＨ５α（ＮＥＢ）細胞に形質転換した。変異導入されたプラスミドｐＥＴ２８−ＬＹＳＣ＊を制限部位解析により同定し、ＤＮＡ配列決定により所望の突然変異を保有することを検証した。
【００８５】
高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびにＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ開始コドンの上流および終止コドンの下流に導入するダイレクトおよびリバースプライマ５’ＴＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＧＧ３’（配列番号７６）および５’ＴＡＴＡＡＴＧＧＡ−ＴＣＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＧＣ３’（配列番号７７）を用いたＰＣＲにより大腸菌のａｓｄ遺伝子を増幅することにより、プラスミドｐＥＴ２８−ＡＳＤｗｔを構築した。大腸菌ＤＨ５α由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩによりＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクタの対応する部位にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。その結果得られたｐＥＴ２８−ＡＳＤｗｔプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列（配列番号９８）を有する全長ａｓｄ遺伝子を含有することを示した。
【００８６】
高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ開始コドンの上流および終止コドンの下流に導入するダイレクトおよびリバースプライマ５’ＴＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＣＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＡＴＧ３’（配列番号７８）および５’ＴＡＴＡＡＴＧＧＡＴＣ−ＣＣＴＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴＣ３’（配列番号７９）を用いたＰＣＲにより出芽酵母のＨＯＭ６遺伝子を増幅することにより、プラスミドｐＥＴ２８−ＨＯＭ６ｗｔを構築した。出芽酵母ＢＹ４７４１由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによりＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４リガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクタの対応する部位にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。その結果得られたｐＥＴ２８−ＨＯＭ６ｗｔプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列（配列番号９７）を有する全長ＨＯＭ６遺伝子を含有することを示した。
【００８７】
プラスミドｐＥＴ２８−ＬＹＳＣ＊を、誘導性ｔａｃプロモータからのリジン非感受性アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびホモセリン脱水素酵素の発現を可能にするｐＴＡＣ−ｏｐ−ＨＭＳプラスミドの構築のための骨格として用いた。
【００８８】
ＰＣＲによりｐＥＴ２８−ａｓｄｗｔからａｓｄ遺伝子を得た。高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびにＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位をそれぞれｐＥＴ２８リボソーム結合部位（ｒｂｓ）の上流および終止コドンの下流に導入するダイレクトおよびリバースプライマ５’ＴＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧ３’（配列番号８０）および５’ＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＧ３’（配列番号８１）を用いたＰＣＲにより、全コード領域ならびにｐＥＴ２８リボソーム結合部位（ｒｂｓ）およびインフレームＮ末端Ｈｉｓタグを含む上流領域の部分を増幅した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによりＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＥＴ２８−ＬＹＳＣ＊の対応する部位にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。その結果得られたｐＥＴ２８−ＬＹＳＣ＊−ＡＳＤプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列を有することを示した。
【００８９】
ＰＣＲによりｐＥＴ２８−ＨＯＭ６ｗｔからＨＯＭ６遺伝子を得た。高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ＮｏｔＩおよびＰｓｐＸＩ制限部位をそれぞれｒｂｓの上流および終止コドンの下流に導入するダイレクトプライマ５’ＴＡＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴ３’（配列番号８２）およびリバースプライマ５’ＴＡＴＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＴＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴ３’（配列番号８３）を用いたＰＣＲにより、全コード領域ならびにｐＥＴ２８リボソーム結合部位およびインフレームＮ末端Ｈｉｓタグを含む上流領域の部分を増幅した。ＮｏｔＩおよびＰｓｐＸＩによりＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＥＴ２８−ＬＹＳＣ＊−ＡＳＤの対応する部位にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。その結果得られたｐＥＴ２８−ｏｐ−ＨＭＳ１プラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列を有することを示した。
【００９０】
ＳｐｈＩおよびＸｂａＩによりプラスミドを消化し、適した制限部位を有する別のプロモータ領域をクローニングすることにより、３種の遺伝子の発現を同時に調節する５’上流プロモータ領域（即ち、ｐＥＴ２８ａ＋におけるＴ７プロモータ）を、誘導性または構成的のその他のプロモータに置き換えることができる。
【００９１】
この非排他的な例において、ｐＥＴ２８ａ＋骨格のＴ７プロモータを、人工ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモータ（デ・ブール（de Boer）ら、１９８３）に置き換えた。ＳｐｈＩおよびＸｂａＩによりこのプラスミドを消化することにより、プラスミドｐＥＸＴ２０（ディクスホーン（Dykxhoorn）ら、１９９６）からｔａｃプロモータを得た。プロモータを含有するＤＮＡ断片を精製し、ＳｐｈＩおよびＸｂａＩで消化したｐＥＴ２８−ｏｐ−ＨＭＳ１にクローニングして、ｐＴＡＣ−ｏｐ−ＨＭＳ１を得た。その結果得られたｐＴＡＣ−ｏｐ−ＨＭＳプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列を有することを示した。
【００９２】
ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩ制限部位をＰＣＲ断片のそれぞれ５’および３’端に導入するプライマ５’−ＴＡＴＡＡＡＧＡＴＣＴＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡ−３’（配列番号８４）および５’−ＴＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＡＧＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴ−３’（配列番号８５）を用いて、ｌｙｓＣ＊、ａｓｄおよびＨＯＭ６のコード配列を含有するオペロンを、プラスミドｐＴＡＣ−ｏｐ−ＨＭＳ１からＰＣＲ増幅した。断片を精製し、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＡＣＴ３（ディクスホーンら、１９９６）の対応する部位にクローニングして、ベクタｐＡＣＴ３−ｏｐ−ＨＭＳ１を得た。その結果得られたｐＡＣＴ３−ｏｐ−ＨＭＳ１プラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列を有することを示した。
【００９３】
プラスミドｐＥＸＴ２０−ｏｐ−ＨＭＳ２およびｐＡＣＴ３−ｏｐ−ＨＭＳ２の構築
高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ開始コドンの上流および終止コドンの下流に導入するダイレクトおよびリバースプライマ５’−ＴＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＣＧＡＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＧ−３’（配列番号８６）および５’−ＴＡＴＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＡＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号８７）を用いたＰＣＲにより、二機能性酵素アスパラギン酸キナーゼ／ホモセリン脱水素酵素Ｉをコードする大腸菌ｔｈｒＡ遺伝子を増幅することにより、プラスミドｐＥＴ２８−ｔｈｒＡｗｔを構築した。大腸菌ＭＧ１６５５由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによりＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクタの対応する部位にライゲーションし、ＮＥＢ５−アルファコンピテント大腸菌細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。その結果得られたｐＥＴ２８−ｔｈｒＡｗｔプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列（配列番号８８）を有する全長ｔｈｒＡ遺伝子を含有することを示した。対応するタンパク質は、配列番号８９により表される。
【００９４】
位置３４５におけるセリンをフェニルアラニンに置き換える部位特異的突然変異誘発（Ｓ３４５Ｆ）により、スレオニンによる阻害に対し大幅に減少した感受性を有するアスパラギン酸キナーゼ／ホモセリン脱水素酵素を構築した。ダイレクトおよびリバースプライマ５’−ＴＧＴＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＴＡＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号９０）および５’−ＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧＡＡＡＡＴＡＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号９１）ならびに鋳型としてｐＥＴ２８−ｔｈｒＡｗｔプラスミドを用いて、部位特異的突然変異誘発を行った。ＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  １Ｕ、ＨＦバッファ２０％（ｖ／ｖ）、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ダイレクトおよびリバースプライマ各０．０４μＭ、鋳型プラスミド３０〜５０ｎｇ、水）により、アミノ酸配列を変化させる単一の点突然変異を導入した。ＰＣＲにより作製したプラスミドは、変異導入されたクローンの同定を容易にするために、機能的突然変異に加えて、サイレント突然変異により導入されたＸｈｏＩのための新しい制限部位（下線）を含有した。３７℃で１時間、ＤｐｎＩによりＰＣＲ産物を消化して鋳型ＤＮＡを除去し、ＤＨ５αコンピテント大腸菌細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。変異導入されたプラスミドｐＥＴ＿Ｅｃ＿ｔｈｒＡ＿Ｓ３４５Ｆを制限部位解析により同定し、所望の突然変異を保有することをＤＮＡ配列決定により検証した。
【００９５】
プラスミド  ｐＥＴ＿Ｅｃ＿ｔｈｒＡ＿Ｓ３４５Ｆを鋳型として用いたＰＣＲにより、二機能性大腸菌アスパラギン酸キナーゼ／ホモセリン脱水素酵素のｔｈｒＡＳ３４５Ｆコード領域を得た（配列番号９２）。高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびにＳａｃＩおよびＸｍａＩ制限部位（下線）をそれぞれ開始コドンの上流および終止コドンの下流に導入するダイレクトおよびリバースプライマ５’−ＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＧＡＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＧＧＣＧ−３’（配列番号９３）および５’−ＴＡＴＡＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＡＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号９４）を用いたＰＣＲにより、全コード領域を増幅した。ダイレクトプライマは、ｐＥＴ２８のリボソーム結合部位（ＧＡＡＧＧＡＧＡ）配列を包含する。ＳａｃＩおよびＸｍａＩによりＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＥＸＴ２０またはｐＡＣＴ３（ディクスホーン、サン・ピエール（St Pierre）＆リン（Linn）、１９９６）のいずれかの対応する部位にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。その結果得られたｐＥＸＴ２０−ｏｐ−ＨＭＳ２＿ｓｔｅｐ１およびｐＡＣＴ３−ｏｐ−ＨＭＳ２＿ｓｔｅｐ１プラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列を有することを示した。
【００９６】
高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびにＸｍａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ開始コドンの上流および終止コドンの下流に導入するダイレクトおよびリバースプライマ５’−ＴＡＴＡＡＴＣＣＣＧＧＧＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＧＧＣ−３’（配列番号９５）および５’−ＴＡＴＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＧ−３’（配列番号９６）を用いたＰＣＲにより、大腸菌アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素ａｓｄを増幅した（配列番号９８）。ダイレクトプライマは、ｐＥＴ２８のリボソーム結合部位配列を包含する。大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。ＸｍａＩおよびＢａｍＨＩによりＰＣＲ産物を消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＥＸＴ２０−ｏｐ−ＨＭＳ２＿ｓｔｅｐ１およびｐＡＣＴ３−ｏｐ−ＨＭＳ２＿ｓｔｅｐ１の対応する部位に大腸菌ｔｈｒＡ遺伝子の直接下流にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。その結果得られたｐＥＸＴ２０−ｏｐ−ＨＭＳ２およびｐＡＣＴ３−ｏｐ−ＨＭＳ２プラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定により、正確な配列を有することを示した。
【００９７】
＜実施例６＞
［ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、イソクエン酸リアーゼ酵素およびガラクトースシンポーターパーミアーゼの過剰発現のためのプラスミドの構築］
鋳型としての大腸菌ＭＧ１６５５由来のゲノムＤＮＡならびにフォワードおよびリバースプライマ、それぞれ５’ＴＡＴＡＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＣＧＣＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＣ３’（配列番号１１９）および５’ＴＡＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧ３’（配列番号１２０）を用いてｐｃｋコード配列を増幅することにより、大腸菌のｐｃｋ遺伝子をコードするＰＥＰカルボキシキナーゼを保持するプラスミドｐＡＣＴ３−ｐｃｋを構築した。ＸｍａＩおよびＸｂａＩによりＤＮＡ断片を消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＡＣＴ３発現ベクタ（ディクスホーンら、１９９６）の対応する部位にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地において、形質転換体を選択した。その結果得られたプラスミドを単離し、ｐｃｋ遺伝子の正確な挿入を配列決定により検証した。それぞれａｃｅＡ、ｐｐｃ、ｇａｌＰもしくはｐｃｋ（全て大腸菌）またはラクトコッカス・ラクティス由来のｐｙｃＡを保持するプラスミドｐＡＣＴ３−ａｃｅＡ、ｐＡＣＴ３−ｐｐｃ、ｐＡＣＴ３−ｇａｌＰ、ｐＡＣＴ３−ｐｃｋおよびｐＡＣＴ３−ｐｙｃＡを、表９に収載されているプライマを用いて類似的に構築した。
【００９８】
【表９】
0006293746.tif 000010
【００９９】
＜実施例７＞
［ホモセリンアミノ基転移酵素およびＯＨＢ還元酵素の過剰発現のためのプラスミドの構築］
それぞれフォワードおよびリバースプライマ５’−ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣ−３’（配列番号１３１）および５’−ＧＧＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＡＣＧＴＴＧＴＴＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＡＴＴＡＡＣＴＴＧ−３’（配列番号１３２）ならびに鋳型としてプラスミドｐＥＴ２８−Ｅｃ−ｉｌｖＥ（実施例４）を用いて、大腸菌由来の分岐鎖アミノトランスフェラーゼ、ＩｌｖＥのコード配列をＰＣＲ増幅した。それぞれフォワードおよびリバースプライマ５’−ＴＡＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＡＡＡＣＡＡＣＧＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＣ−３’（配列番号１３３）および５’−ＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＣＧＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＴＴＣ−３’（配列番号１３４）ならびに鋳型としてプラスミドｐＥＴ２８−Ｌｌ−ｌｄｈＡ（実施例１）を用いて、ラクトコッカス・ラクティス由来の乳酸脱水素酵素、ＬｄｈＡのコード配列をＰＣＲ増幅した。重複伸長ＰＣＲにおいて、１５０ｎｇの各断片を５０μＬの反応ミックスに添加して、プライマ５’−ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣ−３’（配列番号１３５）および５’−ＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＴＡＴＴＧＴＴＣＧＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＴＴＣ−３’（配列番号１３６）を用いてＰＣＲを行うことにより、増幅されたＰＣＲ断片を融合させた。その結果得られたＰＣＲ断片を精製し、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩにより消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いてｐＥＸＴ２０（ディクスホーン、サン・ピエール＆リン、１９９６）の対応する部位にライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。その結果得られたプラスミドｐＥＸＴ２０−ＤＨＢを単離し、ＤＮＡ配列決定により、Ｅｃ−ｉｌｖＥおよびＬｌ−ｌｄｈＡの正確な全長コード配列を含有することを示した。続いて、プラスミドを大腸菌ＭＧ１６５５由来の変異体株に形質転換し、ＤＨＢ産生に関して検査した。
【０１００】
＜実施例８＞
［ＤＨＢ産生に最適化された株の構築］
ＤＨＢ産生に対し炭素フラックス再区分および補助因子供給を最適化するために、大腸菌株ＭＧ１６５５における数種の遺伝子を破壊した。ファージ形質導入方法またはダツェンコ（Datsenko）ら（ダツェンコ＆ワーナー（Wanner）、２０００）に従ったラムダｒｅｄリコンビナーゼ方法を用いて遺伝子欠失を行った。
【０１０１】
（ファージ形質導入方法を用いた遺伝子欠失の導入のためのプロトコール）
Ｋｅｉｏコレクション（馬場（Baba）ら、２００６）から所望の単一欠失を保有する株を得た。５０μｇ／ｍＬカナマイシン、２ｇ／Ｌグルコースおよび５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する１０ｍＬのＬＢ培地に１００μＬの一晩前培養物を播種することにより、単一欠失変異体のファージライセートを調製した。１時間３７℃のインキュベーション後に、野生型ＭＧ１６５５株から調製した２００μＬのファージライセートを添加し、細胞溶解が完了するまで、培養物をさらに２〜３時間インキュベートした。２００μＬのクロロホルムの添加後、細胞調製物に先ず激しくボルテックスをかけ、次にそれを１０分間４５００×ｇで遠心分離した。清澄なライセートを回収し、４℃で貯蔵した。
【０１０２】
ＬＢ培地における３７℃の一晩培養により、ファージ形質導入のための受容体株を調製した。１．５ｍＬの容量の前培養物を１５００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４および５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する溶液６００μｌに細胞ペレットを再懸濁した。受容体株を含有する溶液１００μＬを１００μＬのライセートと混合し、この混合物を３０℃で３０分間インキュベートすることにより形質導入を行った。その後、１００μＬの１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を加え、続いて激しくボルテックスをかけた。１ｍＬのＬＢ培地の添加後に、３７℃で１時間、細胞懸濁液をインキュベートし、その後、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ寒天ディッシュ上に細胞を広げた。表１１に収載されているプライマを用いて、抗生物質の存在下で増殖することができるクローンが、所望の欠失を含有することをコロニーＰＣＲにより確認した。各遺伝子欠失の導入後に、（チェレパノフ（Cherepanov）＆ワッケルナーゲル（Wackernagel）、１９９５）の方法に従って上述の通りに抗生物質マーカを除去した。記載されている方法により、欠失ΔｌｄｈＡ、ΔａｄｈＥ、ΔｍｅｔＡ、ΔｔｈｒＢ、ΔｒｈｔＢおよびΔｌｌｄＤを逐次導入した。
【０１０３】
（ラムダ−ｒｅｄリコンビナーゼ方法を用いた遺伝子欠失の導入のためのプロトコール）
高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）および鋳型としてのプラスミドｐＫＤ４のＦＲＴ隣接カナマイシン抵抗性遺伝子（ｋａｎ）（ダツェンコ＆ワーナー、２０００）を用いたＰＣＲにより、欠失カセットを調製した。センスプライマは、各標的遺伝子の５’端に対応する配列（下線）と、続くｐＫＤ４のＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴカセットに対応する２０ｂｐを含有した。アンチセンスプライマは、各標的遺伝子の３’端領域に対応する配列（下線）と、続くカセットに対応する２０ｂｐを含有した。プライマは、表１０に記載されている。ＤｐｎＩによりＰＣＲ産物を消化し、形質転換前に精製した。
【０１０４】
ＬＢ液体培地において３７℃でＯＤ６００が０．６となるまで細胞を増殖させ、細胞を１００倍濃縮し、これを氷冷１０％グリセロールで２回洗浄することにより、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロコンピテントにした。エレクトロポレーション（２．５ｋＶ、２００Ω２５μＦ、２ｍｍギャップキュベット内）により、プラスミドｐＫＤ４６（ダツェンコ＆ワーナー、２０００）で細胞を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）ＬＢ固体培地において３０℃で形質転換体を選択した。
【０１０５】
ラムダＲｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドｐＫＤ４６を保持するエレクトロコンピテント大腸菌株において破壊カセットを形質転換した。アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する液体ＳＯＢ培地において３０℃で細胞を増殖させた。培養物のＯＤ６００が０．１に達したときに、１０ｍＭアラビノースを添加することによりラムダｒｅｄリコンビナーゼシステムを誘導した。ＯＤ６００が０．６になるまで細胞をさらに増殖させ、その後、遠心分離により収集し、氷冷１０％グリセロールで２回洗浄し、エレクトロポレーションにより破壊カセットで形質転換した。ＬＢ液体培地における３０℃の一晩の表現型発現後に、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する固体ＬＢ培地上に細胞を蒔いた。３０℃における培養後に形質転換体を選択した。
【０１０６】
Ｃｒｉｍｓｏｎ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いたコロニーＰＣＲにより、遺伝子置き換えを検証した。隣接する遺伝子座特異的プライマ（表１１を参照）を用いて第１の反応を行って、親断片の同時喪失および新しい変異体特異的断片の獲得を検証した。１種の遺伝子座特異的プライマを、ＦＲＴ−カナマイシン抵抗性カセット内で整列する（センス遺伝子座プライマ／ｋ１ｒｅｖおよびｋ２ｆｏｒ／リバース遺伝子座プライマ）対応するプライマｋ１ｒｅｖまたはｋ２ｆｏｒ（表１１を参照）のうち１種と共に用いることにより、２種の追加的な反応を行った。
【０１０７】
その後、ＦＬＰリコンビナーゼ保持プラスミドｐＣＰ２０（チェレパノフ＆ワッケルナーゲル、１９９５）を用いて染色体から抵抗性遺伝子（ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ）を切除し、１個のＦＲＴ部位を含有するｓｃａｒ領域を残した。ｐＣＰ２０は、温度感受性複製およびＦＬＰリコンビナーゼ合成の熱誘導を示すアンピシリンおよびＣｍＲプラスミドである。カナマイシン抵抗性変異体をｐＣＰ２０で形質転換し、３０℃でアンピシリン抵抗性形質転換体を選択した。次に、固体ＬＢ培地において３７℃で形質転換体を増殖させ、全抗生物質抵抗性の喪失に関して検査した。ｃｒｉｍｓｏｎ  ｔａｑポリメラーゼおよび隣接する遺伝子座特異的プライマ（表１１）を用いたコロニーＰＣＲにより、ＦＲＴ−カナマイシンカセットの切除を解析した。上述のステップを反復することにより、複数欠失を得た。
【０１０８】
【表１０】
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【０１０９】
【表１１】
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【０１１０】
【表１２】
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【０１１１】
【表１３】
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【０１１２】
【表１４】
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【０１１３】
アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびホモセリン脱水素酵素を同時発現するプラスミド（ｐＡＣＴ３−ｏｐ−ＨＭＳ１）を、ホモセリンアミノ基転移酵素およびＯＨＢ還元酵素を発現するプラスミド（ｐＥＸＴ２０−ＤＨＢ）と共に、最適化された宿主株において形質転換した。クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する固体ＬＢ培地において、形質転換体を選択した。構築された株の非排他的な例は、表１２に収載されている。
【０１１４】
【表１５】
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【０１１５】
宿主株におけるｌａｃＩのゲノム欠失と共に、上述のプラスミドの骨格からのｌａｃＩ遺伝子の除去が、上述のプラスミドからのタンパク質発現を構成的なものとし得ることが理解される。
【０１１６】
＜実施例９＞
［ホモセリン−ＯＨＢ経路を経たＤＨＢの発酵性産生の実証］
株および培養条件：表１２に収載されている株を用いて実験を行った。１７０ｒｐｍで回転するＩｎｆｏｒｓ回転式振盪機において、３７℃で全培養を行った。グリセロールストックから一晩培養物（試験管における３ｍＬ培地）に播種し、これを用いて、５００ｍＬ振盪フラスコ内で培養する１００ｍＬの増殖培養物における初期ＯＤ６００を０．０５に調整した。増殖培養物のＯＤ６００が０．８に達したら、１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるようＩＰＴＧを加えた。１リットル培養培地は、２０ｇグルコース、１８ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４＊１２Ｈ２Ｏ、３ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ＮａＣｌ、２ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０１５  ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、１００倍希釈した濃ＨＣｌにおいて調製した０．０６ｍｏｌ／Ｌ  ＦｅＣｌ３ストック溶液１ｍＬ、２ｍＬの１０ｍＭチアミンＨＣｌストック溶液、２０ｇ  ＭＯＰＳおよび１ｍＬの微量元素溶液（１リットル当たり：０．０４ｇ  Ｎａ２ＥＤＴＡ＊２Ｈ２Ｏ、０．１８ｇ  ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  Ｈ３ＢＯ３、０．１２ｇ  ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ  ＣｕＣｌ２＊Ｈ２Ｏを含有）を含有した。培地ｐＨを７に調整し、培地を濾過滅菌した。抗生物質カナマイシン硫酸塩、アンピシリンおよびクロラムフェニコールは、必要であれば、それぞれ５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌおよび２５ｍｇ／Ｌの濃度となるよう加えた。
【０１１７】
ＬＣ−ＭＳ解析によるＤＨＢ濃度の推定：自動溶離液（ＫＯＨ）発生システム（ＲＦＩＣ、Ｄｉｏｎｅｘ）および試料を４℃で保持するオートサンプラ（ＡＳ５０、Ｄｉｏｎｅｘ）を備えるＤｉｏｎｅｘ（米国サニーベール）製のＩＣＳ−３０００システムにおいて、液体陰イオン交換クロマトグラフィを行った。ＡＧ１１  ＨＣ（５０×２ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）プレカラムにより保護されたＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１１  ＨＣ（２５０×２ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）カラムにおいて分析物を分離した。カラム温度を２５℃に保持し、流速を０．２５ｍＬ／分に固定し、以前に記載された（グルーサック（Groussac）Ｅ、オルティス（Ortiz）Ｍ＆フランソワ（Francois）Ｊ（２０００）：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｏｎｉｃ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６、７１５〜７２３）ＫＯＨ勾配をアプライしつつ分析物を溶出した。注入された試料容量は、１５μＬであった。バックグラウンド低下のために、ＡＳＲＳウルトラＩＩ（２ｍｍ、外部水モード、７５ｍＡ）陰イオン抑制器を用いた。ＥＳＩモード（分割は１／３、窒素圧は９０ｐｓｉ、キャピラリー電圧は３．５ｋＶ、プローブ温度は４５０℃であった）の質量感受性検出器（ＭＳＱ  Ｐｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、分析物を定量化した。
【０１１８】
（結果）
２４時間の培養後に、ＬＣ−ＭＳ解析により異なる株の上清におけるＤＨＢ濃度を定量化した。株ＥＣＥ７３、ＥＣＥ７４、ＥＣＥ７５およびＥＣＥ７６は、それぞれ０ｍｇ／Ｌ、３．７ｍｇ／Ｌ、０．６７ｍｇ／Ｌおよび１１．９ｍｇ／ＬのＤＨＢを産生した。
【０１１９】
（参考文献）
シャンベラン、Ｅ．、リイネン、Ｌ．、ロルケ、Ｆ．、ジットン、Ｃ．、バン・ヒルカマブリーグ、Ｊ．Ｅ．Ｔ．、ウーテルス、Ｊ．Ａ．＆イヴォン、Ｍ．（２００９）．Ｔｈｅ  Ｄ−２−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎｃｏｒｒｅｃｔｌｙ  ａｎｎｏｔａｔｅｄ  ＰａｎＥ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｓｏｌｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ２−ｋｅｔｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９１、８７３〜８８１。
チェレパノフ、Ｐ．Ｐ．＆ワッケルナーゲル、Ｗ．（１９９５）．Ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ＴｃＲ  ａｎｄ  ＫｍＲ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｐ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ．Ｇｅｎｅ  １５８、９〜１４。
ダツェンコ、Ｋ．Ａ．＆ワーナー、Ｂ．Ｌ．（２０００）．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９７、６６４０〜６６４５。
ディクスホーン、Ｄ．Ｍ．、サン・ピエール、Ｒ．＆リン、Ｔ．（１９９６）．Ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ  １７７、１３３〜１３６。
ハーディケ（Hadicke）、Ｏ．＆クラムト（Klamt）、Ｓ．（２０１０）．ＣＡＳＯＰ：  ａ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｉｍｉｎｇ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４７、８８〜１０１。
クラムト、Ｓ．、サエズ−ロドリゲス（Saez-Rodriguez）、Ｊ．＆ギレス（Gilles）、Ｅ．Ｄ．（２００７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｗｉｔｈ  ＣｅｌｌＮｅｔＡｎａｌｙｚｅｒ．ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  １、２。
ロスマン（Rothman）、Ｓ．Ｃ．＆キルシュ（Kirsch）、Ｊ．Ｆ．（２００３）．Ｈｏｗ  ｄｏｅｓ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｍｐａｒｅ  ｔｏ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ？  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２７、５９３〜６０８。
サンブルック、Ｊ．、フリッチュ、Ｅ．Ｆ．＆マニアティス、Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。
シュスター（Schuster）、Ｓ．、ダンデカー（Dandekar）、Ｔ．＆フェル（Fell）、Ｄ．Ａ．（１９９９）．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｆｌｕｘ  ｍｏｄｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ：  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７、５３〜６０。
ウェルナー、Ｄ．＆リヒテンベルク、Ｌ．Ａ．（１９７１）．Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７、Ｐａｒｔ  Ｂ、５９３〜５９６。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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