(57)【要約】  本発明は、測定装置に接続された電気化学セルを伴う、化学分析物を分析するための方法、組成物、及びキットを含む。前記電気化学セルは、１又は複数のナノ粒子を有する溶液、１又は複数の化学分析物、及びインジケータを含む。さらに、電気化学セルは、溶液と連通した１又は複数の電極を含む。１又は複数の電極触媒特性は、１又は複数のナノ粒子と液体試料の相互作用によって生成され、前記１又は複数の電極において測定される。
2010531975.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の分析方法であって、
個々に約１μｍ〜約２ｍｍの直径を有する少なくとも２つの電極を含む試料チャンバー内で、液体試料に１又は複数の金属ナノ粒子を添加するステップと、
前記少なくとも２つの電極のうちの少なくとも１つにおいて、前記１又は複数のナノ粒子と前記液体試料との間の酸化又は還元反応を検出するステップであって、検出器が、電流、電位、電荷、インピーダンス、光、及び色のうちの少なくとも１つを測定することによって、前記電極に接触している個々のナノ粒子を検出することができるステップと、
前記酸化又は還元反応によって生成される、１又は複数の電極触媒特性を観察するステップと
を含む方法。
【請求項２】
酸化又は還元反応が、１又は複数のナノ粒子によって触媒される還元反応又は酸化反応からの電極触媒増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１又は複数の電極触媒特性が、電流、抵抗、インピーダンス、キャパシタンス、インダクタンス、又はこれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１又は複数のナノ粒子が、白金ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子、ルテニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、酸化スズナノ粒子、炭素ナノ粒子、又はこれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１又は複数のナノ粒子の直径が０．５ｎｍ〜１００ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
電極が約２０μｍ２〜約３ｍｍ２の面積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ナノ粒子が、金、白金、パラジウム、ロジウム、銅、銀、ルテニウム、鉄、アルミニウム、ニッケル、及びスズから選択される元素の原子を少なくとも５０個含み、電極が、微量以下の前記元素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出器のアレイを形成するように、少なくとも１つの追加の検出器をさらに含み、前記検出器のアレイが、複数の電極における個々のナノ粒子を検出することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ナノ粒子の表面積に対して正規化したナノ粒子に起因する反応の速度が、電極の表面積に対して正規化した電極に起因するレドックス反応物の反応速度の少なくとも２００倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ナノ粒子の表面積に対して正規化したナノ粒子に起因する反応の速度が、電極の表面積に対して正規化した電極に起因するレドックス反応物の反応速度の少なくとも１００００倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのナノ粒子を有する試料を分析するための電気化学セルであって、
試料チャンバー内に入れた試料とコミュニケーションするように配置された、１又は複数の電極と、
前記試料チャンバー内に置かれた１又は複数のナノ粒子であって、前記試料と相互作用することによって１又は複数の電極触媒特性を生成する１又は複数のナノ粒子と、
前記１又は複数の電極触媒特性を検出するための、前記１又は複数の電極と連絡した検出器であって、電流、電位、電荷、インピーダンス、光、及び色のうちの少なくとも１つを測定することによって、前記電極と接触している個々のナノ粒子を検出することができる検出器と
を含む電気化学セル。
【請求項１２】
１又は複数の電極が、１又は複数の超微小電極を含む、請求項１１に記載の電気化学セル。
【請求項１３】
１又は複数の電極触媒特性が、電流、抵抗、インピーダンス、キャパシタンス、インダクタンス、又はこれらの組合せを含む、請求項１１に記載の電気化学セル。
【請求項１４】
１又は複数の電極触媒特性が、１又は複数のナノ粒子によって触媒される還元反応又は酸化反応からの電極触媒増幅である、請求項１１に記載の電気化学セル。
【請求項１５】
１又は金属ナノ粒子が、白金ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子、ルテニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、酸化スズナノ粒子、炭素ナノ粒子、又はこれらの組合せを含む、請求項１１に記載の電気化学セル。
【請求項１６】
１又は複数のナノ粒子の直径が０．５ｎｍ〜１００ｎｍである、請求項１１に記載の電気化学セル。
【請求項１７】
化学分析物を分析するための、少なくとも１つのナノ粒子を有するデバイスであって、
測定装置に接続された電気化学セルであって、容器及び少なくとも１つの電極を含む電気化学セルと、
前記容器内に１又は複数の化学分析物を含み、インジケータとコミュニケーションしている溶液と、
前記溶液中の１又は複数の金属ナノ粒子であって、１又は複数の電極触媒特性が、前記少なくとも１つの電極において、前記１又は複数の金属ナノ粒子によって生成され、個々のナノ粒子の接触を測定することができる金属ナノ粒子と
を含むデバイス。
【請求項１８】
１又は複数の電極触媒特性が、１又は複数のナノ粒子によって触媒される還元反応又は酸化反応からの電極触媒増幅である、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
測定装置が電流を検出し、１又は複数の金属ナノ粒子が、金、白金、パラジウム、ロジウム、炭素、及び銅から選択される元素の原子を少なくとも１００個含み、少なくとも１つの電極が、約２０μｍ２〜１ｍｍ２の範囲の面積を有し、前記ナノ粒子の直径が１ｎｍ〜１０ｎｍの範囲である、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２０】
１又は複数のナノ粒子が、白金ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子、ルテニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子、酸化スズナノ粒子、炭素ナノ粒子、又はこれらの組合せを含む、請求項１７に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ナノ粒子の分野に関し、特に、本発明は、金属ナノ粒子を使用する触媒反応からのシグナルを増幅するための機器、方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、その背景をナノ粒子に関連して説明する。ナノ粒子の物理的性質（例えば、高い表面対体積比、表面エネルギーの上昇、圧力荷重後の延性の増大、より高い硬度、より大きな比熱など）により、材料指向産業及び材料科学において用途が増大した。例えば、様々な金属ナノ粒子が、多数の反応を触媒するのに使用されている。
【０００３】
ナノ粒子のサイズは０．５〜１００ｎｍの範囲であり、電子エネルギーバンド構成はサイズ依存性であり、これはさらには、物理的及び化学的性質に影響する。ナノ粒子とそのバルク材料の間の基本的な区別は、表面原子の割合及び表面の曲率半径が、格子定数と同等であることである。結果として、ナノ構造触媒は、バルク材料に基づくその類似体と比較した場合、高い触媒活性を有する。ナノ粒子を形成する方法は、当業者に知られており、原子（又はより複雑なラジカル及び分子）の混合、並びにバルク材料の分散、例えば、熱蒸発、イオンスパッタリング、溶液の還元、マイクロエマルジョンの還元、及び凝縮による形成を含む。
【０００４】
例えば、「Colloidal particles used in sensing arrays」という表題の米国特許第６，５３７，４９８号明細書には、流体中で分析物を検出するための、導電性ナノ粒子材料の複数の交互になった非導電性領域及び導電性領域を有する化学センサーが開示されている。センサーごとの化学的な感受性の可変性は、導電性及び／又は非導電性領域の組成を定性的又は定量的に変更することによって提供される。
【０００５】
別の例には、名称が「Methods to increase nucleotide signals by Raman scattering」である米国特許第６，９７２，１７３号明細書が含まれ、銀又は金ナノ粒子に共有結合的に連結したヌクレオチドを使用する、増強ラマン分光法による核酸配列決定に関する方法及び装置が教示されている。分析目的のためのナノ粒子における電極触媒作用は、当技術分野で記載されているが、そのような記述では、電極表面上で単層又はほぼ単層の膜として、少なくとも数十万の多数のナノ粒子が関与する（Polsky, R; Gill, R; Kaganovsky, L; Willner, I, Analytical Chemistry, 2006, 78, 2268-2271）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，５３７，４９８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，９７２，１７３号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Polsky, R; Gill, R; Kaganovsky, L; Willner, I, Analytical Chemistry, 2006, 78, 2268-2271
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、特に、ｎｍスケールで、及びこれらの電極反応に関連する、非常に小さな電流又は電荷を測定することにおいて、１個のナノ粒子を電気化学的に生成し、位置づけ、特徴づけることが困難であることを認識した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、電極における１個のナノ粒子（ＮＰ）の衝突を電気化学的に観察するための方法及び装置を提供する。本発明は、１個のナノ粒子における電極触媒作用、並びに高感度電気分析法の基盤を提供する。金属、炭素、及び半導体ナノ粒子は、電子工学、光学及び触媒学において広範囲の用途を有する。
【００１０】
本発明は、試料チャンバー内で試料を分析する方法及びデバイスに関する。本発明の方法は、試料チャンバーで液体試料に１又は複数のナノ粒子を添加するステップと、１又は複数の電極を使用して、ナノ粒子と液体試料の相互作用によって生成される、１又は複数の電極触媒特性を観察するステップとを含む。一般に、電極触媒特性は、金属ナノ粒子によって触媒される反応の増幅であるが、電極触媒特性は、それだけに限らないが、電流、抵抗、インピーダンス、キャパシタンス、インダクタンス若しくはこれらの任意の組合せ、又は電極で電子移動事象を認識する任意の他の手段も含むことができる。
【００１１】
さらに、本発明は、生体分子を検出及び分析するためのナノ粒子の使用を含む。例えば、目的の分子（例えば、抗体、ポリヌクレオチド、単鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、電極表面と相互作用するか又はかかる表面に接着するナノ粒子で連結又は標識することによって、ナノ粒子を電極の近傍に運ぶことができ、ここでその電極触媒特性を用いて検出及び分析を行う。
【００１２】
本発明のデバイスは、測定装置に接続された電気化学セルを含む。電気化学セルは一般に、１又は複数の電極、試料チャンバー内に置かれた１又は複数のナノ粒子、及び電極とコミュニケーションした検出器を有する。置かれたナノ粒子は、試料と相互作用し、検出器によって捕らえることができる１又は複数の電極触媒特性を生成する。必要に応じてデバイスは、溶液中にインジケータ（indicator）を含んでいてもよい。さらに、前記電気化学セルは、超微小電極を有するナノメートルレベルの大きさであってよい。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つのナノ粒子、少なくとも１つの化学指示薬、少なくとも１つの電極、並びにナノ粒子（複数も）、電極（複数も）及び化学分析物（複数も）の間の相互作用によって生成される１又は複数の電極触媒特性を読み取る測定装置を有する、１又は複数の化学分析物（複数も）を分析するためのキットを含む。
【００１４】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、添付の図面とともに発明の詳細な説明をこれから参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】白金ナノ粒子の衝突事象の概略図である。
【図２】Ｐｔナノ粒子を伴った、及び伴わない炭素繊維電極における、プロトンの電気化学的還元のグラフである。
【図３Ａ】炭素繊維電極における、白金コロイド溶液を注入する前後の電流遷移のグラフである。
【図３Ｂ】１個の粒子の固着を示すグラフである。
【図３Ｃ】粒子凝集体の固着を示すグラフである。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、白金粒子を注入する前後の、溶液中の炭素電極における電流トランジェント（current transient）のグラフである。図４Ｃは、衝突数対そのピーク電流の統計のプロットである。
【図５】異なる印加電位での炭素電極における電流トランジェントを例示するグラフである。
【図６】衝突の頻度を粒子濃度と関連づけるための、個々の粒子濃度での炭素繊維電極における電流トランジェントのグラフである。
【図７】様々なサイズの粒子から生じる電流振幅のグラフである。
【図８】様々なサイズの粒子から生じる電流振幅のグラフである。
【図９Ａ】クエン酸白金ナノ粒子の存在下での、超微小電極における電流トランジェントのグラフである。
【図９Ｂ】クエン酸白金ナノ粒子の存在下での、超微小電極における電流トランジェントのグラフである。
【図９Ｃ】炭素超微小電極曲線２２及び白金超微小電極のサイクリックボルタモグラムである。
【図１０Ａ】Ｂ及びＣタイプの衝突を例示するための、大きな白金ナノ粒子の存在下での電流トランジェントのグラフである。
【図１０Ｂ】配合物中のより小さい白金粒子によって生じるプロトン還元において観察されるＣタイプの衝突において示された変動を例示するグラフである。
【図１１】白金ナノ粒子の衝突事象の別の実施形態の概略図である。
【図１２】代表的な電流−時間曲線を示すグラフである。
【図１３】１ｍｓの時間分解能で記録した、２つの一般的な電流トランジェントを示すグラフである。
【図１４Ａ】電流対時間特性のグラフである。
【図１４Ｂ】統計的なピーク電流対ピーク頻度のプロットである。
【図１４Ｃ】試料のＴＥＭ像である。
【図１４Ｄ】対応するＰｔナノ粒子のサイズ分布のプロットである。
【図１５Ａ】ヒドラジン濃度でのピーク電流分布シフトのプロットである。
【図１５Ｂ】ヒドラジン濃度でのピーク電流分布シフトのプロットである。
【図１５Ｃ】ヒドラジン濃度でのピーク電流分布シフトのプロットである。
【図１５Ｄ】主要ピーク電流対ヒドラジン濃度のプロットである。
【図１６Ａ】個々のＰｔ粒子濃度で記録した電流トランジェントのプロットである。
【図１６Ｂ】対応する一次微分係数のプロットである。
【図１７Ａ】５０及び１００ｍＭのクエン酸二水素ナトリウム電解液並びに１０ｍＭの過塩素酸電解液中の、Ｐｔ  ＵＭＥ及びＣ  ＵＭＥにおけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１７Ｂ】Ｃ及びＰｔナノ粒子溶液を注入する前後に記録した電流トランジェントのグラフである。
【図１７Ｃ】個々の電流特性の拡大図である。
【図１７Ｄ】個々の電流特性の拡大図である。
【図１８】様々な溶液中の電流トランジェント及びサイクリックボルタモグラムのイメージである。
【図１９】異なる粒径の個々のＰｔナノ粒子について記録した電流トランジェントのグラフである。
【図２０Ａ】サイクリックボルタモグラムのイメージである。
【図２０Ｂ】電流トランジェントのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用を以下に詳細に論じるが、本発明は、多種多様な特定の状況において具体化することができる、多くの適用可能な発明概念を提供することが理解されるべきである。本明細書で論じる特定の実施形態は、本発明を作製及び使用するための特定の方法の単に例示的なものであり、本発明の範囲を定めない。
【００１７】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書で定義される用語は、本発明に関連した分野における当業者によって一般に理解される意味を有する。単数で示した用語は、単数形の実体のみを指すことが意図されているのではなく、そのクラス全体を含むことができ、かかるクラス中の特定の例を説明のために用いた。本明細書の専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明するのに使用されるが、その使用は、特許請求の範囲で略述されている場合を除いて、本発明の範囲を定めない。
【００１８】
本明細書で使用する場合、用語「連結された」又は「連結している」は、２つの部分間の会合を指す。会合は、共有結合とすることができる。会合は、それだけに限らないが、イオン相互作用、水素結合、及びファンデルワールス力を含めた非共有結合とすることができる。例示的な非共有結合には、相補性のオリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーション、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用、並びに抗体／抗原相互作用が含まれる。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「ナノ粒子」は、本明細書で使用する場合、別段の指定のない限り、個々のナノ粒子を指す。本明細書で開示する場合、ナノ粒子は、約０．５ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲である、ナノスケールの大きさを有する物質である。本開示によれば、ナノ粒子は、金属並びに非金属を含むことができ、コーティングされていても、キャップされていてもよい。本発明による、用語「ナノ粒子」は、生物学的化合物を包含しない。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「電極」は、電気化学セルの電気的に伝導性の測定部分を指す。本明細書で開示する場合、電極は、レドックス反応物にとって低電極触媒特性であり、接触しているナノ粒子への電荷移動を可能にするのに十分な導電性を有する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「接触」は、互いにトンネリング距離内にある２つの物体を指す。この距離内で、電荷移動が起こり得る。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「レドックス反応物」は、本明細書で使用する場合、還元又は酸化反応を起こすことができる、ナノ粒子及び電極と異なる、電気化学セル内の物質を指す。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「連結された」又は「連結している」は、２つの部分間の会合を指す。会合は、共有結合とすることができる。会合は、それだけに限らないが、イオン相互作用、水素結合、及びファンデルワールス力を含めた非共有結合とすることができる。例示的な非共有結合には、相補性のオリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーション、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用、並びに抗体／抗原相互作用が含まれる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「電極触媒」は、レドックス反応物の電気化学的な酸化又は還元の速度を増幅することができる物質を指す。少なくとも１つの実施形態では、ナノ粒子と電極の間の接触により、ナノ粒子と電極の間の電荷移動が可能になり、ナノ粒子が、レドックス反応物に対する電極触媒になることが可能になる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「微量」は、物質が、仮にあったとしても、かかる物質の電極触媒反応に対する寄与が測定可能でない量で存在することを意味する。
【００２６】
本発明は、１個の粒子衝突事象における、化学種の急速な電極触媒反応に関与する、大きな電流増幅定数に基づく方法を提供する。ナノ粒子における、溶液中の相対的に高濃度の化学種の反応は、導電性であるが触媒的ではない測定超微小電極（ＵＭＥ）では起こらない。当業者は、測定微小電極表面は、処理することによって、例えば、酸化膜を形成し、又はある特定の化合物を吸着させることによって、特定の電極反応に関する活性を低下させることができることを認識するであろう。電極はまた、処理することによって、触媒粒子の吸着又は固着を促進することができ、これにより、様々な分析スキームの基盤を提供することができる。
【００２７】
図１は、１個の白金ナノ粒子の衝突事象の概略図である。粒子は、電極に拡散し、そこで滞留時間の間にこれは衝突し、還元（この概略図ではプロトンの）を触媒する。超微小電極１２における１個の白金ナノ粒子１０の衝突は、粒子触媒反応１４についての、その特徴的な電流−時間過渡現象によって、電気化学的に観察された。１個の事象は、溶液中に存在する指標種１６（例えば、プロトン、過酸化水素）の電極触媒反応（electrocatalyzed reaction）によって生成される電流によって特徴づけられる。指標反応１４は、選択された超微小電極１２で起こらず、ナノ粒子１０よりはるかに大きな拡散係数を有する、高濃度の指標種１６を伴うことができるので、電流の大きな増幅（例えば、１０桁以上）が起こる。衝突ごとに独特の電流−時間特性が生成され、これは、粒径、粒子の滞留時間、及び超微小電極１２の表面とのナノ粒子１０の相互作用の性質に相関し得る。本発明により、１個のナノ粒子１０における不均一反応速度の研究、粒径分布の判定、及び非常に高感度な電気分析法の適用も可能になる。本明細書で説明するこの例は還元反応であるが、当業者は、例えば、適切な電位のＵＭＥにおけるメタノールの白金粒子との触媒酸化反応について、同じ原理が当てはまることを認識するであろう。
【００２８】
図２は、空気飽和した、５０ｍＭのクエン酸二水素ナトリウム溶液中のガラス電極中のディスク状炭素繊維におけるプロトンの電気化学的還元のグラフであり、下の曲線１８では、表面上に白金ナノ粒子を伴わず、上の曲線２０では白金粒子を伴う（繊維直径：８μｍ、掃引速度：１００ｍＶ／ｓ）。電極は、軟質ガラス中に直径８μｍの炭素繊維を密封し、次いで底部を研磨して炭素のディスクのみが溶液に曝されるようにすることによって作製される。例として、酸性水溶液中の白金ナノ粒子の分散系中に浸漬した炭素繊維の超微小電極を考慮されたい。定常状態の、超微小電極表面への粒子の拡散に制御されたフラックスＪｐ，ｓは、
【００２９】
【数１】
2010531975.tif 000003
【００３０】
によって与えられ、式中、Ｄｐは、粒子の拡散係数であり、Ｃｐは、粒子の濃度であり、ａは、炭素の超微小電極ディスク電極の半径である（Bard, A. J.; Faulkner, L. R. Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications, 2nd ed.; John Wiley & Sons: New York, 2001）。通常、単純なナノ粒子の帯電過程では、１個又は数個の電子のみが、ナノ粒子と超微小電極の間を移動し（ｎｐ）、電流、ｉｐ，ｓ＝ｎｐＦπａ２Ｊｐ，ｓを生じ、これは、はるかに小さすぎてノイズ及びバックグラウンドレベルの上で観察することができない（Ｆはファラデーである）。しかし、ナノ粒子は、超微小電極に接触すると、指標種（例えば、プロトン、過酸化水素）の別の反応、及び化学種ＯのＲへの還元を電極触媒することができ（例えば、白金粒子での水素発生）、はるかに大きな電流、ｉＯが流れることができる。即ち、ナノ粒子が電極表面に衝突するとき、これは、ＯのＲへの反応を、この反応が超微小電極において起こらない電位で可能にする。例えば、粒子が、衝突後に超微小電極表面に固着する場合、粒子における定常状態の拡散に制御された電流は、
【００３１】
【数２】
2010531975.tif 000004
【００３２】
で与えられ、式中、ＪＯ，ｐは、Ｏの粒子へのフラックスであり、ＤＯは、溶液中のＯの拡散係数であり、ＣＯは、Ｏの濃度であり、ｒ０は、粒子の半径である。係数の、Ａｐ、即ち粒子の面積、及びＢは、粒子形状、及び、粒子が超微小電極上にどのように位置しているかに依存する。無限の面上の球を考えることができる場合、Ａｐ＝４πｒ０２及びＢ＝４πｌｎ２＝８．７１である。ＣＯ及びＤＯは、Ｃｐ及びＤｐよりもはるかに大きくなり得るので、ａとｒ０の差があっても、Ｏの１個の粒子への拡散のフラックスは、粒子の超微小電極へのフラックスより１０桁以上大きくなることができる。
【００３３】
衝突についての電流は、Ｏの還元のための粒子帯電、及び約ｒ０２／ＤＯの時間で定常状態に達する、変化中のファラデー電流を含む過渡現象である。様々な種類の衝突が起こり得るので、それぞれの衝突事象についての電流−時間（ｉ−ｔ）過渡現象は、電極での粒子の滞留時間、τ、即ち、電極が粒子に電子を送ることができる時間によって決定されることになる。粒子が、定常状態電流に達するのに十分な時間電極に固着し、反応物Ｏは、粒子においてのみ還元される場合、粒子及びＯの相対的な定常状態のフラックスによって与えられる増幅定数は、約（Ｂ／１６）（ＤＯＣＯａ）／（ＤｐＣｐｒ０）である。これにより、相対的な定常状態電流である、約Ｂ（ＤＯＣＯｒ０）／４（ＤｐＣｐａ）が導かれる（ｎｐ＝ｎＯと仮定して）。１ｐＭの粒子の溶液及び１０ｍＭのインジケータＯについて、反応物Ｏの拡散係数と粒子の拡散係数が約１桁異なると仮定すると、１ｎｍの半径の粒子についての推定増幅定数は、９〜１０桁となり得る。
【００３４】
２つの電気化学的反応、即ち、プロトンの還元及び過酸化水素の還元をこの効果を例示するのに選択した。当業者は、触媒還元又は触媒酸化を起こす他の物質を使用することができることを認識するであろう。これらの反応の両方は、炭素の超微小電極において緩慢であるが、白金においてより急速である。図２に示すように、５０ｍＭのクエン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２Ｃｉｔｒ）中の炭素電極において、ＳＨＥに対して−０．５Ｖの正の電位で、プロトン還元は起こらず、０〜−０．５Ｖの電流の小さな増加は、溶液中の酸素の一部の還元によるものである。Ｐｔ粒子で覆われた炭素電極、又は純粋な白金電極については、−０．３Ｖより負の電位で、プロトン還元により定常状態電流が生じる（Bobbert, P. A.; Wind, M. M.; Vlieger, J. Physica 1987 141A, 58-72）。これらの電位で、酸素還元も著しく促進される。白金粒子における定常状態電流は、反応しない面と接触している球への定常状態電流から推定することができ、但し、粒子は、超微小電極とのオーム接触を維持し、印加される電位は、拡散制御下でＯをＲに変化させるのに十分である。説明した条件下でのプロトン還元についてのこの電流は、直径が２ｎｍの球状粒子について約３０ｐＡであるはずである。粒子当たりのより高い電流は、プロトン濃度を増加させることによって、例えば、より高い濃度のクエン酸二水素ナトリウム、又は数十ミリモルの濃度の過塩素酸（水素気泡の形成を防止するために６０ｍＭ未満でなければならない）を使用して実現することができるが、図３に見られるように、これらの条件下では、粒子は凝集し、沈殿する。
【００３５】
図３Ａは、２０ｍＭのＨＣｌＯ４及び０．１ＭのＮａＣｌＯ４中の炭素繊維電極において、白金コロイド粒子の溶液を注入する前後の電流遷移のグラフである。図３Ｂは、１個の粒子の固着を示すグラフであり、図３Ｃは、粒子凝集体を示すグラフである。
【００３６】
図４は、白金粒子を注入する前後の、溶液中の炭素電極における電流トランジェントを示す。図４Ａは、下の曲線２２に見られる、クエン酸白金ナノ粒子の非存在下、上の曲線２４に見られる、クエン酸白金ナノ粒子の存在下での、５０ｍＭのクエン酸二水素ナトリウム溶液中の炭素繊維電極における電流トランジェントのグラフである。粒子濃度は約５０ｐＭである。図４Ｂは、図４Ａの拡大部分のグラフであり、それぞれＡ、Ｂ、及びＣの、電流、振幅、及び頻度によって区別される３種類の衝突を示している。図４Ｃは、衝突数対そのピーク電流の統計のプロットである。一般に頻度（Ｃ）のタイプであった、１５ｐＡ未満のピーク電流を有する衝突は含まれておらず、４０ｐＡを超えるピーク電流を有する衝突は、ほとんど粒子の固着によるものである。挿入図は、代表的な白金ナノ粒子のＴＥＭ像である。
【００３７】
炭素の超微小電極の電位は−０．４Ｖであった。白金コロイド溶液は、クエン酸ナトリウムの存在下で、Ｈ２ＰｔＣｌ６を水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって得た（Zhou, J. F.; Zu, Y. B.; Bard, A. J. J. Electroanal. Chem. 2000, 491, 22-29）。粒径の範囲は約２〜６ｎｍであり、主な分布は、直径４±０．８ｎｍであった。一般に、約２、５、及び１０μＬのコロイド溶液（ナノ粒子を形成するための還元前の、初発濃度はＨ２ＰｔＣｌ６中０．５ｍＭ）を、窒素をバブリングさせながら、約５０ｍＬの電気化学セル中に順次注入し、ナノ粒子のｐＭ溶液を得、次いで窒素雰囲気下でｉ−ｔ応答を記録した。粒子溶液を注入する前は、電流トランジェントは、小さい一定のノイズレベルを有する滑らかな曲線であったが、注入後に、大きな電流トランジェントが出現した。これらの変動は、粒子の補助電極との衝突によるものである。不可逆の衝突についての、即ち、粒子が表面に固着し、したがって電流レベルを増大させる場合の、定常状態電流の振幅は、約４０〜８０ｐＡであり、これは、注入された粒子のサイズと一致している。
【００３８】
図５は、異なる印加電位での炭素電極における電流トランジェントを例示するグラフである。電極電位が正にシフトするとともに、電流スパイクの振幅は減少し、これは、白金超微小電極において記録された定常状態電流と一致している。プロトン濃度は、電流スパイクの、観察される特性周波数及び振幅に大きな影響を有し、これは図３に示す。図６に見られるように、衝突の頻度は、粒子濃度にほぼ比例した。
【００３９】
図６は、白金ナノ粒子の５つの個々の注入に対応する、５０ｍＭのクエン酸二水素ナトリウム溶液中の炭素繊維電極における電流トランジェントのグラフである。平均頻度は、使用した炭素超微小電極において、１秒当たり、粒子濃度１ｐＭ当たり約０．０２であり、これは、８μｍの炭素電極について、式１によって推定された平均頻度の、１秒当たり、粒子濃度１ｐＭ当たり０．０３に非常に近い。本発明者らは、粒子の拡散係数は、１×１０−８ｃｍ２／ｓであり、粒子濃度は、合成において使用したＨ２ＰｔＣｌ６の濃度の約１０００〜２０００分の１未満であり、即ち、１個の粒子は、約１０００〜２０００個のＰｔ原子を有すると仮定した。電流振幅は、注入した粒子のサイズとともに変化し、約８ｎｍ超の粒子及び約２ｎｍ未満の粒子についてそれぞれ図７及び８に示すように、粒子が大きいほどスパイクが大きい。
【００４０】
電極との粒子の衝突は、一般に、図４Ｂに示すように、３つのタイプのｉ−ｔ応答を生じさせる。それぞれのｉ−ｔ特性は、個々の１個の粒子衝突に関連する。個々のｉ−ｔ特性の特徴は、粒径、粒子の滞留時間、及び粒子と電極表面の間の相互作用によって影響される。多くの場合では、粒子は、その衝突後に電極を離れ、したがって電流は増加するが、次いでバックグラウンドに戻る。これは、負に帯電した粒子と負に帯電した表面の間の反発的な相互作用に帰することができ、この効果は、さらにより負の値で電位を設定することによって試験し、本発明者らは、より少ない衝突を観察した。図４ＢにおいてＡ、Ｂ、及びＣを示した特徴を有する過渡現象によって例示したように、それぞれの個々の衝突事象において生成される電流が変化する理由は、衝突の性質（例えば、粒子が、電子トンネリングが可能な距離内に、電極表面にどのように密接に接近することができるか）、滞留時間、及びまた粒径効果のためである。時間とともに触媒的な効率を失うことを意味する粒子の非活性化も要因である。
【００４１】
図９Ａ及び９Ｂは、超微小電極における電流トランジェントのグラフである。図９Ａ及び９Ｂは、代表的なスパイクの一般的な形状を示す。個々のスパイクの電流最大値は変化し、主として粒径、基板表面と粒子表面の間の伝達特性に関係する、個々の１個の粒子の非常に高感度な検出を知らせる。図９Ａは、クエン酸白金ナノ粒子の存在下で、１０ｍＭの過塩素酸及び２０ｍＭの過塩素酸ナトリウム中の炭素の超微小電極における電流トランジェントのグラフである。粒子濃度は、約２５ｐＭである。図９Ｂは、図９Ａの拡大図である。図９Ｃは、炭素の超微小電極の曲線２２、並びに５０ｍＭのクエン酸二水素ナトリウムの曲線２４、及び１０ｍＭの過塩素酸と２０ｍＭの過塩素酸ナトリウムの曲線２６中の白金超微小電極のサイクリックボルタモグラムである。
【００４２】
強酸を使用することの利点は、図９Ｃに示すように、弱酸の脱プロトン化の動力学的プロセスを無視することができることである。しかし、過塩素酸などの強酸を使用してプロトン濃度を１０ｍＭに増加させる場合、粒子を負に安定化させる、シトレートのカルボン酸基のプロトン化のために、白金ナノ粒子は安定ではない。粒子の安定性は、クエン酸白金粒子の存在下で電流トランジェントを記録することによっても立証することができる。一般に、図３Ａに示すように、粒子を注入した直後に、約６００秒未満の期間内に、非常に急激なスパイクが出現する。興味深いことに、この場合、それぞれのスパイクの後に、電流の有意な増加はまったくなく、これは、粒子は、表面に十分に固着しないが、比較的短時間の間のみ触媒電流を生じさせることを明確に示す。
【００４３】
大きな白金ナノ粒子、典型的には直径８ｎｍ超の白金ナノ粒子の存在下での電流トランジェントも測定した。この粒子は、オキサレートによって安定化される。同じ時間及び同じ白金濃度内で、わずか数個の電流スパイクを捕らえることができる。より大きな粒径のために、粒子濃度及び粒子の拡散係数の両方が小さくなるので、この結果は妥当である。しかし、図７の電流トランジェントのグラフに示すように、上述したＢ及びＣのタイプの衝突は、明確に観察されない。
【００４４】
１個のナノ粒子の衝突事象は、プロトンの代わりにインジケータとして過酸化水素を使用して試験されており、当業者は、他の化合物並びにインジケータ、例えば、還元反応に対して酸素、並びに酸化に対して水素、メタノール及びヒドラジンを使用することができることが分かるであろう。バックグラウンド電流を低減し、粒子の電極表面への結合を促進するために、金の超微小電極（これは、Ｈ２Ｏ２還元にとって触媒的ではない）を、溶液の化学種への電子トンネリングができる安定な単層を形成する、ベンゼンジメタンチオールの表面組織化単分子層（surface assembled monolayer）でコーティングした（Yang, J.; Lee, J. Y.; Too, H. P. Anal. Chim. Acta 2006, 571, 206-210）。末端のチオール基は、白金粒子に強く結合することができる。粒子を注入すると、固定化された白金粒子の近接のために、電流の即時の増加が観察される。粘着性の衝突の特徴である、ｉ−ｔ応答における不連続なステップに加えて、本発明者らは、より小さい振幅であるが、より高い頻度を有する、より小さい電流変動も観察した。これらの頻度は、不連続な電流ステップの頻度よりも約２桁高い。図１０Ｂに示した変動は、図４Ｂに示したプロトン還元において観察されたＣタイプの衝突に類似しており、配合物中のより小さい白金粒子によって生じた可能性がある。超微小電極又は電極は、金、炭素繊維の微小電極及びＩＴＯのような他の材料を含むことができる。さらに、指標種は、プロトン、過酸化水素、酸素又は当業者に既知の他の物質とすることができる。
【００４５】
本発明は、超微小電極を用いて１個の粒子の衝突事象を観察する、新規の方法を提供する。１つの事象は、溶液中に存在するインジケータの粒子触媒反応を通じて生成される電流によって特徴づけられる。インジケータは、高濃度及び高拡散係数を有するように選択することができるので、大きな増幅が起こる。衝突ごとに独特のｉ−ｔ特性が生成され、これは、粒径、粒子の滞留時間、及び電極表面との粒子の相互作用に関連する場合がある。粒子濃度、粒径（例えば、クエン酸白金ナノ粒子対白金デンドリマーナノ粒子）、印加基板電位、及び前記インジケータの濃度を変更することによって、ｉ−ｔ特性を使用して、１個の粒子におけるインジケータ反応についての情報を得ることが可能であるはずである。ナノ粒子を使用して、光学的シグナル、伝導率シグナル、及び質量シグナルを増幅することと比較して（Xiao, X. Y.; Xu, B. Q.; Tao N. J. Nano Lett. 2004, 4, 267-271、Sonnichsen, C.; Reinhard, B. M.; Liphardt, J.; et al. Nature Biotech. 2005, 23, 741-745）、本発明の触媒電流増幅は、１個の粒子の衝突事象の観察、及びｉ−ｔ曲線を通じて、１個の粒子レベルでの電気化学的速度の研究を可能にする。さらに、これは、粒径分布を求めることにおいて、及びおそらく１つの結合事象レベルに対する、非常に高感度な電気分析法として有用となり得る。
【００４６】
白金ナノ粒子溶液は、６０ｍＬの２ｍＭのＨ２ＰｔＣｌ６水溶液を、３ｍＬの５０ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液と混合することによって調製し、次いで、勢いよく撹拌しながら、７ｍＬの１２０ｍＭのＮａＢＨ４水溶液を液滴で添加した。この溶液をさらに３０分間撹拌し続けた。
【００４７】
サブナノメートルから数ナノメートルの範囲の様々なサイズの金属ナノ粒子（ＭＮＰ）を所望するが、これは、その大きな表面対体積比、サイズに依存した光学的性質、及び高密度の表面欠陥のためであり、これらの粒子は、独特の物理的及び化学的性質を示す。当業者は、他のナノ粒子溶液、例えば、白金、パラジウム、銅、銀、ルテニウム、鉄、アルミニウム、ニッケル、スズ及び金、並びに炭素及び酸化スズのような非金属を同様に調製することができることを認識するであろう。粒子物質の選択は、触媒される電極反応に依存する。例えば、ナノ粒子は、元素の少なくとも５０、１００、３００、１０００、又は３０００個の原子を含むことができる。例えば、ナノ粒子は、元素の少なくとも１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、又は１，０００，０００個の原子を含むことができる。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、元素の炭素、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、及びフラーレンのうちの少なくとも１つを含む。例えば、ナノ粒子は、金、白金、パラジウム、ロジウム、炭素、及び銅から選択される元素の原子を少なくとも１００個含むことができる。ナノ粒子は、純粋に元素（例えば、純粋な白金）である必要はなく、合金、酸化物、及び化合物、並びにコアシェル型構造を含むことができる。様々な実施形態では、ナノ粒子は、均質でなくてもよい。いくつかの実施形態では、異なる組成を有するナノ粒子を同時に使用することができる。
【００４８】
電気化学的研究では、ＭＮＰは、通常、不活性な支持材料において固定化されることによって電極を形成し、プロトン還元又は酸素還元などの電極触媒反応おけるその効果がプローブされる。ＭＮＰの電極触媒効果を特徴づけることにおいて、支持材料に対して表面被覆率が果たすように、ＭＮＰのサイズ及び形状の均質性は、複雑な役割を果たす。通常、平均効果が見られ、活性をＭＮＰの性質と関連づけることは、表面被覆率及び総面積の効果、並びに粒子の支持材料との相互作用によって複雑になっている。したがって、電極触媒の挙動に対する粒径の効果について意見の相違がある。一般に、１個のナノ粒子レベルでの電極特徴づけは、当技術分野において限られており、多数の課題を有し、実験的な研究が比較的少ない。
【００４９】
ナノ電極又はＭＮＰ電極は、１個の分子検出から細胞エキソサイトーシスのリアルタイム画像法に及ぶ用途を見出すことも提唱されている。これらの電極のサイズは、生体分子、及び生体膜中のイオンチャネルのサイズに匹敵する。しかし、当業者は、ナノメートルスケールで電極を作製することは、依然として技術的に困難であることを認識している。さらに、ｎｍサイズでは、そのような電極において生成される電流は、通常、ｐＡレベルであり、良好な信号対雑音レベルを伴った測定を困難にしている。ＭＮＰのサイズ及びサイズ分布を求めるために、様々な分析手段、例えば、電子顕微鏡法、走査プローブ顕微鏡法、ＵＶ−可視分光法、表面プラズマ共鳴、質量分析法、動的光散乱、並びにＸ線吸収分光法（ＸＲＤ及びＥＸＡＦＳ）が開発されている。例えば、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）は、直径が数ｎｍのＭＮＰのサイズを、炭素グリッド支持体上にキャストすることによって、正確に求めるために、一般に且つ広く使用されている。本発明は、液体溶液中でＭＮＰのサイズをスクリーニングすることができる電気化学的方法を提供し、１個のＭＮＰにおける電極触媒作用の速度を研究するためのプラットフォームも提供する。
【００５０】
簡単に言えば、所与の検出器の電極材料、例えば、Ｃにおいて不活発に起こるが、ＭＮＰが電極で衝突し、固着するとＭＮＰにおいて起こる、異種の電子移動反応が選択される。ＭＮＰが検出器の電極と接触すると、電子は、ＭＮＰ中に、又はＭＮＰから流れ、ＭＮＰ表面における触媒反応を維持する。図１１Ａは、Ａｕ  ＵＭＥ表面における１個のナノ粒子の衝突についての、白金ナノ粒子の衝突事象の概略図であり、反応は、粒子が検出電極と接触するとき開始される。平面の電極と接触した１個の球状のＭＮＰにおいて生成される限界電流は、
【００５１】
【数３】
2010531975.tif 000005
【００５２】
によって与えられ、式中、Ｄは、濃度Ｃでの反応物の拡散係数であり、ｒは、１個のＭＮＰの半径である。この式は、球状のＵＭＥについての式と、ｌｎ２の項によって異なり、これは、支持平面による、ＭＮＰに対する拡散経路のブロッキングを説明する。
【００５３】
明らかに、粒径、又は半径は、反応物の所与の濃度で記録される触媒電流に比例し、但し、Ｄは、大抵１００ｍＭ未満である、反応物及び支持電解液のある特定の濃度範囲において一定に維持されると仮定する。
【００５４】
１個のＭＮＰ衝突を観察するための第１のステップは、触媒反応を選択することによって電流を増幅することである。ＭＮＰにおける反応速度は、第１に、ある特定の電位範囲内で、基板における反応速度より著しく速いべきであり、例えば、Ｐｔ対Ｃにおけるプロトン還元である。第２に、触媒反応は、無視できる動力学的な影響とともに、質量輸送制御された条件下で起こるべきであり、その場合電流は、１個のＭＮＰのサイズに比例しており、即ち、式（３）が適用される。ＭＮＰにおける電極触媒作用の不均一反応速度は、その形状及びキャッピング剤の関数となる場合があるので、ＭＮＰにおける拡散限界電流が常に維持される電位で、電極にバイアスをかけることによって、これらの効果を最小限にすることが有用である。最後に、反応物は、検出限界より十分上の、即ち、数十ｐＡ以上の十分に大きな電流が得られるように、高い濃度であり、大きな拡散係数を有するべきである。
【００５５】
プロトン還元に加えて、Ｐｔ、Ａｕ、及びＣの微小電極における、酸素還元、メタノール及びギ酸酸化、過酸化水素の酸化又は還元、並びにヒドラジン酸化などの反応は、これらの電極におけるその電極触媒応答において電位差を示す。しかし、酸素還元についての電流は、水中でのその低い溶解度によって制限され、メタノール及びギ酸などの小さい有機分子の酸化は、ＣＯのような中間体の吸着によって表面の毒作用を招き、これは、酸化電流を制限し、酸化電流の不安定性を引き起こす。Ｈ２Ｏ２の使用は、過酸化水素の異種の触媒的分解によって乱され、Ｐｔ  ＭＮＰが、過酸化水素試験溶液中に注入されると、気泡が生成される。ヒドラジン酸化及びプロトン還元は、Ｐｔ、Ａｕ及びＣ電極の間で区別可能な触媒的挙動を示し、ある特定のｐＨ領域において再現可能な応答を生じる。
【００５６】
図１１Ｂは、Ａｕ  ＵＭＥとＰｔ  ＵＭＥとの間で、ヒドラジン酸化速度を合わせる電流増幅のグラフであり、ここで走査速度は、５０ｍＶ／ｓであり、電解液は、１０ｍＭのヒドラジン及び５０ｍＭのＰＢＳ緩衝液であり、ｐＨは約７．５である。図１１Ｂは、例として、ヒドラジン酸化は、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液中、０．４Ｖを超える電位で、Ａｕ  ＵＭＥにおいて定常状態の限界電流を生じさせ、一方、ＰｔのＵＭＥにおいて、酸化のための電位は、約−０．５Ｖシフトすることを示す。そのような電位シフトは、Ｐｔにおける反応速度が、Ａｕにおける反応速度より著しく大きくなるように調整するのに十分大きい電位ウインドウを導く。定常状態の限界電流は、半径５μｍを有するＵＭＥにおいて、ｐＨ７．５で、１０ｍＭのヒドラジンについて約５０ｎＡであり、１５ｍＭのヒドラジンについて７５ｎＡである。
【００５７】
図１１Ｃは、１個のナノ粒子の衝突事象において観察される、代表的な電流特性のグラフである。図１１Ｃの個々の段階的な電流特性は、以下に説明するように、粒径を求めるのに使用することができる。そのような電流特性は、粒子表面において電極触媒ヒドラジン酸化を開始する前後の、検出器の電極におけるＭＮＰの衝突及び接着の１つの事象を表す。電流特性は、ＵＭＥにおいて記録されたものと類似しており、このＭＮＰにおける定常状態の電流が実現されたことを示す。粒径を求めるために、ピーク高さを、同じ試験電解液について、ＰｔのＵＭＥにおいて得た限界電流と直接関連づける。粒径分布を評価するために、本発明者らは、ヒドラジン及びＰＢＳ緩衝電解液を含む試験溶液中に、非常に希薄なＰｔコロイド溶液を注入することによって、粒子衝突頻度を制御した。十分に分離した電流特性は、個々の１個のＭＮＰの衝突事象を示した。
【００５８】
Ｐｔナノ粒子（Ｐｔ  ＮＰ）溶液は、クエン酸ナトリウムの存在下で、Ｐｔ前駆体である、Ｈ２ＰｔＣｌ６又はＫ２ＰｔＣｌ４を、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）により還元することによって調製した。簡単に言えば、４０ｍＬの２ｍＭのＨ２ＰｔＣｌ６（９９．９％、Alfa Alsar）を、２８ｍｇのクエン酸ナトリウム（９９＋％、Aldrich）と混合し、その後、勢いよく磁気撹拌しながら、新鮮な水素化ホウ素ナトリウム溶液（９９％、Aldrich）を液滴で添加した。水素化ホウ素ナトリウムの濃度を５６〜５００ｍＭに変化させることによって粒径を制御し、溶液をさらに３０分間撹拌した。Ｈ２ＰｔＣｌ６を用いて調製したナノ粒子溶液は、ＴＥＭによって求めた場合、注入したＮａＢＨ４の濃度に応じて、３．２〜５．３ｎｍの直径付近で比較的狭いサイズ分布を有していた。３．６ｎｍ付近に分布した粒径を有するＰｔ  ＮＰ溶液を、説明される粒子衝突において主に使用した。これらのコロイド溶液は、合成溶液中で数カ月間安定であった。ＮａＢＨ４によるＫ２ＰｔＣｌ４の還元では、１．３ｎｍの直径付近の非常に小さいＮＰ、又は粒子凝集体に至った。粒子凝集体は、星形であり、サイズは、１３〜２５ｎｍの範囲であった。これらのコロイド溶液はともに安定ではなかった。Ｐｔ粒子溶液は、シュウ酸カリウムの存在下で、Ｋ２ＰｔＣｌ４を水素還元することによっても調製した。この調製において、Ｐｔ粒子は、より良好な結晶子を有するが、粒径は、５〜１６ｎｍで広く分布している。当業者は、これらの合成経路を修正又は微調整することによって、様々な結果を生じさせることができることを認識するであろう。
【００５９】
ＮＰ濃度は、通常、それぞれの粒子が含むＰｔ原子の平均数で除したＰｔ前駆体の濃度から計算した。例えば、３．６ｎｍのＰｔ粒子は、約１４００のＰｔ原子を含むと仮定され、したがって、Ｐｔ粒子の濃度は、Ｐｔ前駆体の濃度の１４００分の１未満である。ＩＣＰ−ＭＳによって確認されるように、調製されたばかりのコロイド溶液については、Ｐｔ損失は無視でき、例えば、５％未満のＰｔ濃度の減少は、おそらくＰｔ粒子が、磁気撹拌子及びガラス壁に接着するためである。
【００６０】
粒径は、ＴＥＭによって求めた。Ｐｔ粒子を、ＴＥＭグリッドにおいて、遠く離して間隔をおいて配置するために、ＴＥＭグリッドを、水で約２０倍希釈したＰｔコロイド合成溶液中に一晩浸漬し、次いでこれをコロイド溶液から垂直に取り出し、水で徹底的にすすいだ。炭素膜は、依然として十分に疎水性であるため、このすすぎの後で通常乾燥していた。この手順を使用することによって、グリッド表面上でのＭＮＰの凝集を最小限にし、粒子の凝集体であるかどうかの判定を可能にした。液滴をキャストすることによって調製したＴＥＭ試料を、比較のために使用した。ＴＥＭ像は、JEOL 2010F透過電子顕微鏡（JEOL社製）から得た。点像に対するＴＥＭ分解能は、０．１９４ｎｍであった。ＴＥＭグリッドは、２００メッシュの銅上に支持された炭素膜であった（Electron Microscope Sciences）。
【００６１】
１０μｍ及び２５μｍのＡｕ、Ｐｔ  ＵＭＥは、金属ワイヤを溶かして軟質ガラス中に入れることによって調製した。金属ワイヤを、銀エポキシを用いてＮｉ−Ｃｒリードと接続した後、電極を、鏡面が得られるまで、０．３μｍのアルミナで研磨した。予定した表面積と品質のＵＭＥは、水溶液中のフェロセンメタノール酸化のボルタンメトリーから得た。それぞれを使用する前に、電極を、０．３μｍ及び０．０５μｍのＡｌ２Ｏ３粉末で研磨した。
【００６２】
１−ヘキサデカンチオール（Ｃ１６ＳＨ）及び１６−メルカプトヘキサデカン酸（ＨＳＣ１５ＣＯＯＨ）の自己組織化単分子層（ＳＡＭ）は、以下に論じるように、清潔なＡｕ電極を、約１ｍＭのＣ１６ＳＨ又はＨＳＣ１５ＣＯＯＨを含むエタノール溶液中に異なる時間浸漬することによって調製した。次いで電極を、エタノール、アセトン及び水で徹底的にすすいだ。
【００６３】
サイクリックボルタンメトリー及びクロノアンペロメトリーは、約５０ｍＬの電解液を含む３つの電極セル（CH Instruments、Austin、TX、モデル６６０）を用いて実施した。炭素棒を対電極として使用し、ポリピロールでコーティングしたステンレス鋼ワイヤを参照電極として使用した。電極の電位は、標準Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極によって較正し、リスケールすることによって電位対標準水素電極（ＳＨＥ）を得た。電気化学セルは、ファラデー箱内に維持し、電流トランジェントは、通常、約１０ｍｓの分解能で記録した。Ｐｔコロイド溶液を注入する前に、電極を数回の電位サイクルにかけることによって表面を浄化し、次いでバックグラウンド電流が３００ｐＡ未満である電位で保持した。ＭＮＰ注入のためにファラデー箱を開けるといつも、ノイズが出現した。箱を閉じた後、セルをＡｒ雰囲気中で維持した。ＭＮＰの衝突によって生成される電流は、ファラデー箱のドアが閉じているとき、使用した増幅レベルでバックグラウンドノイズから容易に区別することができた。
【００６４】
電流は、Ｐｔコロイド溶液を注入する前後で、時間に対して記録した。コロイド溶液をＡｒで約１０秒間バブリングする間に、この溶液を試験電解液中に注入した。この手順により、試験電解液全体に、Ｐｔ  ＮＰが均一に素早く分布したが、この期間により高いノイズレベルが生じた。一般に、Ｐｔ  ＮＰにおける電流増幅のためのインジケータ反応として、ヒドラジン酸化及びプロトン還元を使用した。
【００６５】
図１２は、機械的研磨及び電気化学的クリーニング後に、０．１Ｖの電位で維持し、Ａｕ  ＵＭＥにおいて記録した、代表的な電流−時間曲線を示すグラフである。バックグラウンド電流は、約２２０ｐＡであり、本質的に一定であり、時間とともに非常に徐々に減衰した（図１２Ａ、青色の曲線）。５〜１５秒で観察された大きいノイズは、ファラデー箱の開閉によって生じ、その間にＰｔ粒子溶液を注入した。その期間の後に、電流はわずかにずれ、これは、この期間の１個又は数個の粒子の衝突のためである可能性がある。この期間の後に、溶液を可能な限り無振動に維持し、電流をモニターした。示したように、電流は、段階的な様式で陽極的に（anodically）に増加した。
【００６６】
図１２Ｂに示した、初期の時間の間に電流振幅で２０ｐＡ未満の数個の電流ステップが出現した。これらの小さい電流ステップは、その後にも頻繁に観察されたことに注意されたい。この期間の後のほとんどの電流ステップは、４０〜６５ｐＡの範囲であった。それぞれの電流ステップにおいて、電流は、非常に急速に増加し、次いで、定常状態値に維持された。数個の電流ステップは、より長い過渡現象時間を示したが（図１２、青色の矢印）、これは、基板との粒子衝突の性質についての微視的な詳細を示す可能性がある（図１２Ｃ）。例えば、低濃度では起こりそうもないが、粒子は、表面上に既にある別の粒子と相互作用する場合がある。２つの別々の粒子が再配列又は融合して１つの単位になることによっても、実用的な表面積が減少し、したがって電極触媒電流が減少する。ＭＮＰは、溶液中の外来性の不純物によって不活性化される場合がある。本発明者らは、一般に後の記録時間での電流の減衰を述べた。衝突ステップの詳細な形状において明らかに微妙なことが存在し、これはさらに研究される必要があるが、制御することは困難である。
【００６７】
図１３は、１ｍｓの時間分解能で記録した２つの一般的な電流トランジェントを示す。図１３は、１個のＰｔナノ粒子の衝突についての、高分解能電流トランジェントである。電流は、１ｍｓに設定した、本発明者らのポテンシオスタットの限界分解能で切り替えた。粒径は、約３．６ｎｍ及び１０μｍのＡｕ  ＵＭＥであり、１５ｍＭのヒドラジン及び５０ｍＭのＰＢＳ緩衝液のｐＨは約７．５である。図１３Ａ及び１３Ｂは、１ｍｓの時間分解能で記録した、２つの一般的な電流トランジェントを示す。立ち上がり時間は、１ｍｓ以内である。ポテンシオスタットに直接接続した、より高い時間分解能のオシロスコープ（Tektronix 2440）を使用して、本発明者らは、電流ステップの立ち上がり時間は、約４０〜１００μｓであることを見出した。この立ち上がり時間は、おそらくポテンシオスタットの機器限界も表す。
【００６８】
図１４Ａは、電流対時間特性についての電流ステップグラフのグラフである。図１４Ｂは、２００ｓ以内に分析した統計的なピーク電流対ピーク頻度のプロットである。図１４ＣはＴＥＭ像であり、図１４Ｄは、対応するＰｔナノ粒子のサイズ分布のプロットである。図１４Ａは、ほぼ等しい高さ（約６０ｐＡ）のいくつかのステップを含む、一般的な電流対時間特性を示す。これにより、式（３）を介して粒子半径が導かれる。より多数のステップについて、所与のピーク電流の出現の数をプロットすることができ、これは、４０〜６５ｐＡの主な分布を示し、１００及び１６０ｐＡ付近のより少数のより大きなピーク電流を伴っている（図１４Ｂ）。それぞれの電流特性は、１個の粒子の衝突事象を伝えるので、ピーク電流の分布は、ＮＰのサイズの分布を反映するはずである。実際にこれは、ＴＥＭ像の図１４Ｃ及び分布の図１４Ｄによって求めた粒径分布とよく一致する。これらのＰｔ  ＮＰは、炭素表面において開路電位に付着しているが、粒子のランダムな衝突を通じてＴＥＭグリッドの表面にも付着していることに注意されたい。ＭＮＰのサイズ分布は、上述した衝突実験において、電極表面に付着した粒子を表すはずである。より大きなピーク電流は、おそらく、ＭＮＰ凝集体の衝突によって起こる。
【００６９】
図１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃは、ヒドラジン濃度に伴うピーク電流分布のシフトのプロットであり、図１５Ｄは、主要ピーク電流対ヒドラジン濃度のプロットである。分布の形状がわずかに変化しているが、これは、統計的分析についての時間スケールが異なるためであり、通常、時間がより長いと、大きなピークのカウントがより多いことに注意されたい。
【００７０】
個々の電流特性は、異なる条件、例えば、ヒドラジン濃度、粒子濃度、検出電極（Ｃ及びＡｕ  ＵＭＥ）の性質及び面積、並びに粒径の下で研究を実施することによる１個のＭＮＰの衝突によるものであることが示された。ヒドラジン濃度を変化させたとき、注入した同じコロイドＰｔ溶液について、電流ステップの振幅は、比例して変化した。したがって、所与の濃度のヒドラジンに対して、ピーク電流の分布によって粒径分布を直接評価することができる。
【００７１】
図１６Ａは、個々のＰｔ粒子濃度で記録した電流トランジェントのプロットであり、図１６Ｂは、対応する一次微分係数のプロットである。図１６Ｂ中の青銅色の曲線は、ＭＮＰの非存在下で記録した電流トランジェントに由来する。トレースは、明確にするためにゼロからずらした。青色の矢印は、２０ｐＡを超える電流ステップを生じさせるスパイクを示し、赤色の矢印は、２０ｐＡ未満の電流ステップを示す。粒径は、約３．６ｎｍであり、１０μｍのＡｕ  ＵＭＥであり、約７．５のｐＨを有する、１５ｍＭのヒドラジン及び５０ｍＭのＰＢＳ緩衝液の溶液を用いる。漸増濃度のＰｔ  ＮＰで、図１６に見られるように、ピークの頻度は増加したが、ピーク電流の振幅は変化しないままであった。１０μｍのＡｕ  ＵＭＥの代わりに２５μｍの直径のＡｕ  ＵＭＥを使用したとき、衝突頻度は約２倍増加した。
【００７２】
図１６Ｂに示すように、ステップをカウントし、出現の頻度を得るために、電流の一次の時間微分係数を使用した。ここでは、それぞれのスパイクは、電流ステップ、したがって粒子衝突の１つの事象を表す。個々のスパイク間の分離は、数秒から数ミリ秒の範囲である。時間とともに頻度が変動してスパイクが観察されることは、バルクの電解液からのＭＮＰの電極との衝突が、ランダムプロセスであることを示す。この衝突プロセスは、粒子の吸着に至らない、検出器の電極におけるＭＮＰのいくつかの衝突も含む場合があり、即ち、電極における粒子の滞留時間は、粒子によって変化する場合がある。
【００７３】
図１６Ｂ中の青銅色の曲線は、ＭＮＰの非存在下で記録した信号対雑音レベルを示す。変動の振幅は、上向き及び下向きの両方向にほとんど等しく分布している。青色の矢印によって示されたものより大きい振幅を有するスパイクは、２０ｐＡより大きい電流ステップに対応する。これらのスパイクは、衝突後に基板に固着するＭＮＰによるものである。これらのスパイクの頻度は、約０．０１２〜０．０２ｐＭ−１ｓ−１である（即ち、２５ｐＭの粒子濃度について、頻度は、約０．４ｓ−１、又は約２秒という衝突間の平均時間である（図１６Ｂ、赤色曲線を参照されたい））。赤色の矢印によって示されたスパイクはまた、ＭＮＰの衝突によるものである場合がある。これらの衝突は、電流ステップよりむしろ電流スパイクを導くので、これらはおそらく、検出電極における非常に短い滞留時間のＭＮＰの衝突と関連づけられる。
【００７４】
衝突頻度は、拡散限界の定常状態条件で、すべてのＭＮＰが検出器の電極において衝突し、次いで固着すると仮定することによって求めることができ、
【００７５】
【数４】
2010531975.tif 000006
【００７６】
（式中、Ｄｐ及びＣｐは、Ｐｔ粒子の拡散係数及び濃度であり、ａは、ＵＭＥの半径である）によって与えられるフラックスＪを生じる。既知の粒子濃度及びＡｕ  ＵＭＥの半径で、観察される衝突頻度は、約１×１０−８ｃｍ２／ｓのＮＰの拡散係数に対応する。しかし、３〜４ｎｍの範囲のＰｔ  ＮＰの拡散係数は、ＮＰの拡散及び他のデータに関するストークス−アインシュタインの関係に基づくと約１×１０−７ｃｍ２／ｓであると推定される。
【００７７】
電流ステップが観察されるために、粒子は、観察可能な電流を生成するのに十分長いある特定の時間、電極表面に接触して留まらなければならない。したがって、本発明者らが観察したのは、衝突頻度の代わりに固着頻度である。したがって粒子が固着する確率は、この実験では、衝突の約１〜１０％である。
【００７８】
試験電解液が粒子を安定に維持するかどうかということは、非常に重要な役割を果たす。粒子濃度当たりの電流ステップの数は、５０ｍＭのＰＢＳの代わりに支持電解液として１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを使用したとき、劇的に減少した。これは、Ｐｔ粒子は、クエン酸塩溶液中で比較的安定であるためである。粒子は液相中に有利に残存し、固着確率が低くなる。一方、ＰＢＳ溶液中では、粒子は安定ではなく、凝集及び沈殿する傾向があり、これは、粒子が衝突後に表面に固着するのをより容易にする。これはまた、本発明者らが、電流ステップの出現を時間とともに次第に少なく観察した理由を説明するものである。検出電極の表面修飾は、粒子の固着確率に影響する場合があるが、これまでのところ大きな差は見られておらず、大部分は同じ桁内である。本発明者らは、検出電極の電位を次第により正に設定したとき、電流ステップのわずかな増大を観察し、Ａｕ表面を、負に帯電した３−メルカプトプロピオン酸で修飾したとき、わずかな減少を観察した。
【００７９】
ＴＥＭグリットからカウントされた粒子数は、式４を通じて計算した数よりはるかに小さいことは述べるに値する。２５ｐＭのＰｔコロイド溶液中に一晩浸漬したＴＥＭ試料グリッドについて、１×１０−７ｃｍ２／ｓの拡散係数を使用して式２によって推定される、１μｍ２当たり１０００個を超える粒子を有することが予期される。代わりに、様々な表面領域は、１μｍ２当たり２０個未満の粒子を有する。
【００８０】
図１７Ａは、５０ｍＭ及び１００ｍＭのクエン酸二水素ナトリウム電解液（緑色及び青色）、並びに１０ｍＭの過塩素酸電解液（赤色）中のＰｔ並びにＣ  ＵＭＥにおけるサイクリックボルタモグラムである。１００ｍＶ／ｓ。図１７Ｂは、Ｃ（赤色）及びＰｔ（青色）ナノ粒子溶液の注入の前（黒色）及び後に記録した電流トランジェントのグラフである。図１７Ｃ及び１７Ｄは、個々の電流特性の拡大図である。試料は、５０ｍＭのクエン酸二水素ナトリウムを含み、−０．５Ｖの電極電位、約３．６ｎｍのＰｔナノ粒子サイズ、約２５ｎｍのＣナノ粒子サイズを有し、直径１０μｍの検出Ｃ  ＵＭＥ電極を使用する。
【００８１】
図１７Ａに見られるように、強酸及び弱酸電解液中のＰｔ及びＣ  ＵＭＥでのサイクリックボルタモグラムで実証したように、炭素電極におけるプロトン還元は、不活発に起こり、高い過電圧を必要とするが、この反応は、Ｐｔにおいては急速である。定常状態の拡散限界電流は、ＨＣｌＯ４及びクエン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２Ｃｉｔ）の両方において観察された。５０ｍＭのＮａＨ２Ｃｉｔがプロトン供給源として使用されるが、これは、Ｐｔ  ＮＰは、この環境中で比較的安定であるが、これらは５ｍＭのＨＣｌＯ４中で凝集する傾向があるためである。定常状態の限界電流は、１０μｍのＰｔ  ＵＭＥにおいて約７０ｎＡである。１００ｍＭのＮａＨ２Ｃｉｔ又は純粋なＨＣｌＯ４にＰｔコロイド溶液を注入すると凝集する。図１７Ｂは、炭素繊維の微小電極において記録した、３つの電流−時間曲線を示す。バックグラウンドにおいて、又はＣ  ＮＰの溶液（Ｐｔ  ＮＰの代わりに）を試験電解液中に注入したときにおいて、明白な電流スパイクは全く観察されなかった。Ｐｔ  ＮＰを注入したとき、全体的な電流は増加し、電流スパイクと重なった。これらの電流スパイクは、ヒドラジン酸化の場合に観察されたものと類似している。しかし、電流は、ヒドラジン酸化で観察されたように、より長い時間一定の定常状態レベルを維持しなかった。電流が最大値に維持されたのは１秒未満であり、次いでほとんどバックグラウンドレベルまで徐々に減衰した（例えば、図１７Ｃ及び１７Ｄを参照されたい）。ほとんど全ての電流特性は、そのような電流の減衰を示したことに注意されたい。ピーク電流は、３０〜８０ｐＡの範囲であり、これは、約４ｎｍの範囲の粒径に相関する。
【００８２】
図１８Ａ、１８Ｂ及び１８Ｃは、Ｐｔ  ＵＭＥにおける電流トランジェント及びサイクリックボルタモグラムのイメージであり、図１８Ａでは、３ｍＭのＦｃ−メタノール＋０．１Ｍの過塩素酸ナトリウム、図１８Ｂでは、１２ｍＭのヒドラジン＋５０ｍＭのＰＢＳ緩衝液、及び図１８Ｃでは、２ｍＭ過塩素酸＋２０ｍＭ過塩素酸ナトリウムである。黒色の矢印は、パルス電位を示す。直径１０μｍのＰｔ、図１８Ｃは、直径２５μｍのＰｔ（黒色）、及び直径８μｍの、炭素繊維において堆積したＰｔ（青色）を有する。
【００８３】
衝突後の電流の減衰は、ヒドラジン酸化よりもプロトン還元でより顕著である。プロトン還元及びヒドラジン酸化についてのＰｔ  ＵＭＥにおける電流トランジェントを、フェロセン−メタノール酸化と比較した。Ｆｃ−メタノール酸化についての電流トランジェントは、２０ｍｓ以内に定常状態電流に到達した後、無視できる電流減衰を示す（図１８Ａに見られるように）。ヒドラジン酸化は、フェロセン−メタノールの挙動と類似した挙動を示すが（図１８Ｂに見られるように）、プロトン還元は、特にＰｔ  ＮＰで修飾した炭素電極において、少し長い過渡現象時間を示す（図１８Ｃに見られるように）。０．５〜１０ｓで、電流は、フェロセン−メタノールについて約６％、ヒドラジンについて３％、及びプロトンについて３２％（図１８Ｃ、青色に見られるように）減衰した。１０〜２０秒で、電流の減衰は、フェロセン酸化及びヒドラジン酸化の両方について約１％、並びにプロトン還元について５％であった。長い分極時間での小さな差は、電流の減衰が主に、漸進的な表面汚染のためであることを示す。漸進的な表面汚染はまた、連続的な電位パルスにおいて電流を減少させ得る。ヒドラジン酸化の場合では、本発明者らは、電流の減衰は、Ａｕ  ＵＭＥよりＰｔ  ＵＭＥにおいてより厳しいことを見出した。ＭＮＰにおける表面汚染は、その高い相対的な表面積のために、マクロ電極より悪い場合がある。これは、水素原子のＰｔ上への吸着に依存する水素発生反応にとって特に重要になるであろう。電流の減衰を引き起こすことができる別の様式は、Ｐｔ  ＭＮＰの格子中への水素原子の吸収である。
【００８４】
リン酸の濃度を２００ｍＭに増大させたとき、Ｐｔ  ＵＭＥにおける類似の電流減少が見られ、電流の減衰は、ＭＮＰの安定性に有利である、低濃度の支持電解液によるものではなかったことを示す。しかし、電流の減衰は、Ａｕ  ＵＭＥにおいてかなり減速し、これは、電流の減衰が、Ｐｔ表面の触媒的な性質にほとんど相関することを示す。
【００８５】
図１９Ａ、１９Ｂ及び１９Ｃは、異なる粒径の個々のＰｔナノ粒子について記録した電流トランジェントのグラフである。対応するＰｔナノ粒子のＴＥＭ像は、それぞれ下に示されている。Ｐｔ原子に基づく濃度は、図１９Ａにおいて約５０ｎＭ、図１９Ｂにおいて５００ｎＭ、及び図１９Ｃにおいて２５０ｎＭである。約７．５のｐＨで、１２ｍＭのヒドラジン及び５０ｍＭのＰＢＳ緩衝液中で、１０μｍのＡｕ  ＵＭＥを用いた。
【００８６】
図１９は、異なる粒径を有するいくつかのＰｔコロイド溶液について記録した、いくつかの代表的な電流トランジェントを示す。Ｐｔ  ＮＰは、類似のキャッピング分子、シトレート又はオキサレートによって安定化されるので、これらは、類似の触媒的な性質を有する。これらのＮＰ溶液を、ヒドラジン試験電解液中に注入する場合、記録される電流トランジェントは、非常に異なる電流振幅の、不連続な電流ステップを示す。約３．６ｎｍであるＰｔ  ＮＰについて、電流ステップは、ほとんど均一な振幅を有し、これは、４５ｐＡ付近に主に分布していた（図１９Ａに見られるように）。星状のＰｔ  ＮＰの場合では（図１９Ｂに見られるように）、ピーク電流は、約２０ｎｍの粒径に対応する、２４０ｐＡ付近に主に分布していた。電流ピークのうちのわずかな部分は、おそらく、小さい粒子及び２〜３単位の凝集体の存在による、約１２０ｐＡ未満又は約３００ｐＡ超のピーク電流を有する。図１９Ｃは、多分散系のＰｔ  ＮＰについて記録した電流トランジェントを示す。ピーク電流は、５〜１６ｎｍの範囲の粒径に対応する、６０〜２００ｐＡの広い範囲にわたって分布していた。研究したケースについてのピーク電流の振幅は、粒径分布とよく相関するように思われる。
【００８７】
ＭＮＰ衝突の別の可能な用途は、絶縁膜の多孔性の評価である。アルカンチオールの表面自己組織化単分子層膜を有するＡｕ  ＵＭＥを使用して、むき出しの電極における衝突数と比較した衝突数、及びＭＮＰサイズの効果を示すことができる。ＳＡＭの頂部での粒子衝突を、ＳＡＭ内の孔を通じた粒子衝突と区別するために、Ａｕ検出器の電極を、単層を通じた電子移動を阻害するのに十分長いＣ１６ＳＨ単層で修飾した。Ａｕ上のＣ１６ＳＨ  ＳＡＭの多孔性は、アセンブル時間を３０分から一晩に変更することによって変化させた。本発明者らは、Ａｕ表面上に残存する水層は、疎水性分子の吸着を減速するので、Ａｕ基板の乾燥の程度は、膜の品質に重要な役割を果たすことも見出した。
【００８８】
図２０Ａは、サイクリックボルタモグラムのイメージであり、図２０Ｂは、電流トランジェントのグラフであり、無垢（黒色）及びＣ１６ＳＨ又はＨＳＣ１５ＣＯＯＨでアセンブルしたＡｕ  ＵＭＥにおいて記録し、ＰｔにおけるＣＶを比較のためにプロットし、走査速度は１００ｍＶ／ｓである。さらに、図２０Ｂ中のトレースは、明確にするためにわずかにずらした。挿入図は、代表的な電流特性、及び非常に速い電流変動を示す。３６ｐＭの粒子濃度、及び約３．６ｎｍのＰｔ粒子、及び５０ｍＭのＰＢＳ緩衝液中の１５ｍＭのヒドラジンを含み、約７．５のｐＨの溶液を用いて示した、クロノアンペロメトリーにおける基板電位。
【００８９】
ＳＡＭの品質は、ヒドラジン酸化の抑制から直接推定することができた（図２０Ａに見られるように）。多孔性のより小さい膜は、ヒドラジン酸化のより大きい抑制、したがってより小さい電流をもたらす。図２０Ａは、酸化電位は正にシフトしただけでなく、０．５Ｖの負の電位での無垢のＡｕ電極と比較した場合、酸化電流も減少したことを示す。これらの修飾電極でのヒドラジン酸化の抑制の程度から、サイクリックボルタモグラムは、ＨＳＣ１５ＣＯＯＨ膜は、Ｃ１６ＳＨ膜より多孔性であることを示す。
【００９０】
しかし、ヒドラジンは小分子であるので、これは、おそらくすべての種類の孔を貫通することができ、したがって、ヒドラジン酸化の阻害は、孔のサイズ分布を示さない。孔のサイズ分布は、サイズの定められたＭＮＰを使用して求められる可能性がある。例として、本発明者らは、約３．６ｎｍのＰｔ  ＮＰ溶液を同じ試験電解液中に注入し、これらの修飾電極における電流トランジェントを記録した。衝突頻度又は衝突数は、明らかに減少した。Ｃ１６ＳＨ膜及びＨＳＣ１５ＣＯＯＨ膜の両方について、多孔性のより小さい膜は、より少ない衝突を示した。これは、サイクリックボルタモグラムで示したヒドラジン酸化の抑制と一致している。表面をＨＳＣ１５ＣＯＯＨ及びＣ１６ＳＨで一晩アセンブルした場合、明白な衝突はまったく観察されないか、非常にわずかな衝突しか観察されなかった。
【００９１】
これらの修飾電極において、ほとんどの電流トランジェントは、非常に長い過渡現象時間を示し、これは、Ｐｔ  ＮＰは、周囲のアルカンチオールによって不活性化されることを示している可能性がある。２つの一般的な過渡現象を挿入曲線で示す（図２０Ｂ中に示され、黒色の矢印によって示されている）。アルカンのマトリックスは、Ａｕ表面からＰｔ表面に再配置し、したがって、電気化学的なヒドラジン酸化を妨げることができる。第２に、電流は多くの場合、ほぼ同じ電流振幅で、前後に急速に変動し（図２０Ｂ中に示され、赤色の矢印によって示されている）、同じ粒子が、Ａｕ表面に付着し、Ａｕ表面から脱離することができることを示した。そのような変動は、周囲のマトリックスのために、粒子が電極表面とより弱く相互作用することを示す。
【００９２】
Ｃ１６ＳＨ膜のＨＳＣ１５ＣＯＯＨ膜との比較により、衝突がより少ないこと示されたが、より高いヒドラジン酸化のピーク電流が、ＨＳＣ１５ＣＯＯＨ膜で覆われた電極において観察された。これは、膜内の微視的な孔は、容易な触媒的なヒドラジン酸化を依然として可能にするが、ＭＮＰを通過させることはできないことを示す。孔のサイズに加えて、露出した末端カルボン酸基も、孔を介したＭＮＰの貫通を妨げる役割を果たすことができる。これらの効果を確認し、どれが重要な役割を果たすかを理解するために、異なる粒径を用いたより多くの実験を実施する必要がある。
【００９３】
電極触媒増幅は、１個のＭＮＰの衝突の観察を可能にし、これは、Ｐｔ  ＮＰが検出器の電極において衝突し、固着するとき生成される、個々の電流ステップによって特徴づけられる。電流は、ＭＮＰがその表面において、検出器の電極が、無視できるほど小さい電気化学的な活性を示す電位で、電極触媒反応を開始するとき生じる。それぞれの衝突の間の、観察された電流特性は、ＵＭＥにおいて記録された電流トランジェントに類似しており、ＮＰの半径の関数である。電極触媒反応の速度（kinetics）は、観察された電流減衰において重要な役割を果たし、これは、ナノメートルスケールでの電極との粒子の相互作用及び電極触媒作用のカイネティクスに関係するより微視的な詳細の調査を必要とする。
【００９４】
質量輸送で制御された条件で、それぞれの電流ステップの振幅は、粒径に相関するので、電流振幅対ピーク出現の頻度のプロットは、ＴＥＭで見出されるような粒径分布とよく相関し、したがって、ＮＰ分散系の迅速なスクリーニングに対する電気化学的手法を提供する。衝突頻度は、検出器の電極の有効表面積にも相関するので、この技法は、電極表面上の絶縁膜の多孔性を評価することにおいて有用となり得る。
【００９５】
本発明は、微小電極及び超微小電極の使用を企図し、半導体製造方法及びシルクスクリーニングを含めた当技術分野で既知の方法によって作製することができる。電極は、様々なサイズ並びに形状（例えば、ディスク、円形、正方形、長方形、及び楕円形）、並びに結果として様々な面積（例えば、電極は、約５μｍ２〜約３ｍｍ２の面積を有することができる）を有することができる。電極表面は、粗くても滑らかであってもよい。いくつかの実施形態では、電極表面は、滑らかであることによって、ナノ粒子の非存在下でのレドックス反応物に対する電極触媒速度を低減することができる。
【００９６】
類似の又は異なる対／補助／参照電極を使用することによって、電気回路を完成することができる。いくつかの実施形態では、直径１ｃｍのグラファイト棒を対電極として使用することができ、参照電極は、飽和した白金−水素又はポリピロールステンレス鋼とすることができる。他の一般的な参照電極には、Ａｇ／ＡｇＣｌが含まれる。これらの標準的な電気化学的技法に対する詳細については、Bard, A. J.; Faulkner, L. R. Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications, 2nd ed.; John Wiley & Sons: New York, 2001を参照されたい。対電極、任意選択の参照電極、及び電極は、電気化学セル内に一緒に配置することができる。このセルは、レドックス反応物を含む溶液も保持することができる。
【００９７】
本明細書で使用する場合、用語「レドックス反応物」は、還元又は酸化反応を起こすことができる、ナノ粒子及び電極と異なる、電気化学セル内の物質を指す。さらに、電極と接触するナノ粒子は、溶液中のレドックス反応物に対する電極触媒となることができる。レドックス反応物は、電荷担体、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、ＰＯ３２−、ＮＨ４＋などを含む溶液中に見出すことができる。溶液は、ｐＨ緩衝液を含むことができる。溶液は、他の化合物、例えば、界面活性剤、糖、脂肪、タンパク質などを含むことができる。本明細書で使用する場合、用語「電極触媒」は、レドックス反応物の電気化学的な酸化又は還元の速度を増幅することができる物質を指す。少なくとも１つの実施形態では、ナノ粒子と電極の間の接触により、ナノ粒子と電極の間の電荷移動が可能になり、ナノ粒子が、レドックス反応物に対する電極触媒になることが可能になる。特定の実施形態について、レドックス反応物は、ナノ粒子及び電極を考慮して選択することができ、その結果ナノ粒子は、レドックス反応物に対する電極触媒として作用するが、電極は、レドックス反応物に対して皆無かそれに近い電極触媒能を有する。例示的なレドックス反応物には、白金含有ナノ粒子、及び炭素含有電極を伴った、メタノール、過酸化水素、及びプロトンが含まれる。他の例示的なレドックス反応物には、白金含有ナノ粒子、及び金含有電極を伴った、過酸化水素、プロトン、ヒドラジン、及び酸素が含まれる。他の例示的なレドックス反応物には、炭素含有ナノ粒子、及びニッケル含有電極を伴った、トリプロピルアミンが含まれる。
【００９８】
検出器又は検出器のアレイを使用することによって、レドックス反応物に対するナノ粒子の電極触媒能からのシグナル増幅を介して、電極とのナノ粒子の衝突を検出することができ、例えば、検出器は衝突数をカウントすることができ、検出器は、電流変化をモニターすることによって、ナノ粒子の衝突を測定することができ、又は検出器は、衝突を１又は複数のタイプに分類することができる（例えば、電流増加の規模を使用することによって、ナノ粒子を分類することができる）。様々な実施形態では、検出器は、電位変化をモニターすることによってナノ粒子の衝突を測定することができる。例えば、電極は、一定の電流を用いて駆動することができる。ナノ粒子の非存在下で、電流を通すのに必要な電極の電圧は、大きくなり得る。ナノ粒子が衝突すると、必要とされる電圧は、実質的に降下することができ、したがって、速く、大きな電圧降下は、ナノ粒子の衝突として解釈することができる。電圧降下の規模は、例えば、ナノ粒子のサイズによってナノ粒子を分類するのに使用することができる。時間応答も、例えば、異なる滞留時間にナノ粒子を分類するのに使用することができる。
【００９９】
本発明は、測定装置に接続された電気化学セルを有する、化学分析物を分析するための方法、組成物、及びキットを含む。電気化学セルは、１又は複数の金属ナノ粒子を有する溶液、１又は複数の化学分析物、インジケータを含む。さらに、電気化学セルは、溶液とコミュニケーションした１又は複数の電極を含む。１又は複数の電極触媒特性は、１又は複数の金属ナノ粒子と液体試料の相互作用によって生成され、１又は複数の電極において測定される。
【０１００】
本発明は、電気化学セル内の溶液中の１又は複数のナノ粒子を含む。ナノ粒子は、完全に、又は部分的に金属物質又は炭素質物質又は半導体物質とすることができる。例えば、１又は複数の金属ナノ粒子は、白金ナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子、ルテニウムナノ粒子、パラジウムナノ粒子又はその混合物及び組合せとすることができる。ナノ粒子は、ナノ粒子の外側の物質と異なる物質のコアも有することができる。ナノ粒子は、約０．５ｎｍ〜約１００ｎｍのサイズの直径のものとすることができるが、一実施形態についての一般的なサイズの範囲は、直径が約１ｎｍ〜７ｎｍであり、平均の直径が４ｎｍである。さらに、ナノ粒子の直径のサイズ分布は、一般に均一であっても、分散性であっても、又は変動していてもよい。ナノ粒子は、群内で一般に同じ直径であるが、溶液中の他の群と比べて異なる直径を有する、異なる群の粒子を有することができる。
【０１０１】
電気化学的反応は、電極の電位を制御することによって推進することができる。電極の電位は、酸化又は還元が電極で起きることができるように選択することができる。電位は、ナノ粒子の非存在下でのレドックス反応物及び他の電気化学的反応から生じる電流を最小限にするように設定することができる。電位は、対電極に対して、又は参照電極に対して設定することができる。これらの標準的な電気化学的技法に対する詳細については、Bard, A. J.; Faulkner, L. R. Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications, 2nd ed.; John Wiley & Sons: New York, 2001を参照されたい。例えば、電位は、標準水素電極（ＳＨＥ）に対して、ゼロから１Ｖ以内とすることができる。例えば、電位は、対電極に対してゼロから１Ｖ以内とすることができる。より小さい電圧規模（例えば、０．５Ｖ、０．３Ｖ、０．２５Ｖ、又は０．１Ｖ）も有用となり得る。電位は、時間とともに変化し、又は一定であることができる。ある特定の実施形態では、一定の電位を使用することによって、電極の二重層荷電による容量性の過渡現象を排除することができる。いくつかの実施形態では、電流は、電極を通して流すことができ、電位をモニターすることができる。ナノ粒子が接触すると、インピーダンス及び電圧が大いに低減する。ナノ粒子の存在をモニターするのに必要な電気化学的反応を進めるための他のスキームは、当業者に明白となるであろう。
【０１０２】
電極上にナノ粒子が接触すると、レドックス反応物についての反応速度は、大いに増大する。例えば、ナノ粒子の表面積に対して正規化したナノ粒子に起因するレドックス反応物の反応速度は、電極の表面積に対して正規化した電極に起因するレドックス反応物の反応速度より、少なくとも２００倍大きくなることができる。電流を測定する場合、上述したことは、（ｉＮＰ−ｉｅ）／ＡＮＰ＞２００ｉｅ／Ａｅとして数学的に表すことができ、式中、ｉＮＰは、ナノ粒子の存在下で測定される電流であり、ｉｅは、ナノ粒子の非存在下で測定される電流であり、ＡＮＰ及びＡｅは、それぞれ、ナノ粒子及び電極の表面積である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、増大の係数は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、又は１０９超である。約１００ｐＡのナノ粒子に起因する電流、約７０ｐＡの電極に起因する電流、並びに、それぞれ電極及びナノ粒子についての、５０μｍ２及び５×１０−５μｍ２の面積を用いて計算した場合、係数は約１０６であった。一定の電位で生成される電流は、大きくなることができるが、これは、レドックス反応物が高濃度であることができ、速い拡散体となることができるためである。例として、レドックス反応物を含む溶液中のナノ粒子の分散系中に浸漬したディスク電極を考えられたい。電極表面に対する、ナノ粒子（ＮＰ）の定常状態の拡散制御フラックス、ＪＮＰ，ｅは、
【０１０４】
【数５】
2010531975.tif 000007
【０１０５】
によって与えられ、式中、ＤＮＰは、ナノ粒子の拡散係数であり、ＣＮＰは、ナノ粒子の濃度であり、ａは、電極の半径である（Bard, A. J.; Faulkner, L. R. Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications, 2nd ed.; John Wiley & Sons: New York, 2001）。通常、単純なナノ粒子の帯電過程では、わずか１個又は数個の電子がナノ粒子と電極（ｎＮＰ）の間を移動し、電流、ｉＮＰ，ｅ＝ｎＮＰＦπａ２ＪＮＰ，ｅ＝４ｎＮＰＦａＤＮＰＣＮＰを生じ、これは、はるかに小さくすぎてノイズ及びバックグラウンドレベルの上で観察することができない（Ｆはファラデーである）。しかし、ナノ粒子は、電極と接触すると、レドックス反応物（ＲＲ）を電極触媒し、例えば、化学種ＲＲを還元又は酸化して生成物Ｐにすることができ、その結果、はるかに大きい電流、ｉＲＲが流れることができる。即ち、ナノ粒子が電極表面と衝突すると、これは、ＲＲのＰへの反応を、ナノ粒子がない電極では、いかなる大きな程度にもこの反応が起こらない電位で可能にする。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、電極と接触しているナノ粒子を検出することができる。ナノ粒子における定常状態の拡散制御電流は、
【０１０７】
【数６】
2010531975.tif 000008
【０１０８】
で与えられ、式中、ＪＲＲ，ＮＰは、レドックス反応物ＲＲのナノ粒子へのフラックスであり、ＤＲＲは、ＲＲの拡散係数であり、ＣＲＲはＲＲの濃度であり、ｒＮＰはナノ粒子の半径であり、ｎＲＲは、ＲＲが生成物Ｐに変換されるための、レドックス反応当たりに必要な電子数である。係数の、ＡＮＰ、即ちナノ粒子の表面積、及びＢは、ナノ粒子の形状、及び、この粒子が電極上にどのように位置しているかに依存する。無限の面上の球を考えることができる場合、ＡＮＰ＝４πｒＮＰ２及びＢ＝４πｌｎ２≒８．７１（Bobbert, P. A.; Wind, M. M.; Vlieger, J. Physica 1987 141A, 58-72）。ＣＲＲ及びＤＲＲは、ＣＮＰ及びＤＮＰよりはるかに大きくなることができるので、ａとｒＮＰの差であっても、１個のナノ粒子においてレドックス反応物の電極触媒作用から生じる電流は、電極において同じナノ粒子を容量性に荷電することから生じる電流よりも１０桁以上大きくなることができる。
【０１０９】
様々な実施形態では、電極電流の時間応答を測定することができる。電流トランジェントは、粒子帯電、及び時間約ｒＮＰ２／ＤＲＲで定常状態に達する、レドックス反応物の電極触媒作用のための、変化中のファラデー電流を含む。異なるタイプの衝突が起こり得るので、それぞれの衝突事象についての電流−時間（ｉ−ｔ）過渡現象は、ナノ粒子の電極における滞留時間、即ち、電極がナノ粒子に電子を送ることができる時間によって求められることになる。ナノ粒子が、定常状態電流を達成するのに十分な時間電極に固着し、レドックス反応物は、粒子においてのみ生成物に変換される場合、充電電流に対する電気化学的電流の増幅定数は、粒子及びＲＲの相対的な定常状態のフラックスによって与えられ、これは、約（Ｂ／１６）（ＤＲＲＣＲＲａ）／（ＤＮＰＣＮＰｒＮＰ）である。これにより、ｎＲＲ＝ｎＮＰを仮定して、約（ＢＤＲＲＣＲＲｒＮＰ）／（４ＤＮＰＣＮＰａ）の相対的な定常状態電流が導かれる。１ｐＭのナノ粒子及び１０ｍＭのレドックス反応物の分散系について、レドックス反応物の拡散定数が、ナノ粒子の拡散定数より約１桁大きいと仮定すると、半径１ｎｍの粒子についての推定増幅定数は、９〜１０桁となり得る。言い換えると、レドックス反応物の生成物への電気化学的変換によって生じる電流は、ナノ粒子の容量性の充電電流より９〜１０桁大きくなることができる。
【０１１０】
さらに、本発明は、ナノ粒子の濃縮溶液を使用する、試料の分析を提供する。当業者は、特定のパラメータに応じて、広範囲のナノ粒子濃度（例えば、１個のナノ粒子溶液からモル溶液まで）を本発明によって使用することができることを認識するであろう。さらに、異なるサイズ、異なる粒子組成、及び異なる粒子を有する粒子の混合物を、本発明とともに使用することができる。事象は、溶液中に存在するインジケータの粒子触媒反応を通じて生成される電流によって特徴づけられる。インジケータは、高濃度及び高拡散係数を有するように選択することができるので、大きな増幅が起こる。
【０１１１】
１又は複数の電極触媒特性は、装置によって測定することができる任意の性質とすることができるが、最も一般的な性質は、金属ナノ粒子によって触媒される還元又は酸化反応からの電極触媒増幅である。しかし、他の性質は、電流、抵抗、インピーダンス、キャパシタンス、インダクタンス若しくはこれらの組合せ、又は電極における電子移動反応を示す別の技法とすることができる。
【０１１２】
ナノ粒子を安定化させるための例示的なコーティング又はキャッピング化合物として、アルカンチオール、メルカプトアルコール、メルカプトカルボン酸、チオフェノール、チオール官能化オリゴヌクレオチド、ベンゼンジメタンチオール、オキサレート、及びシトレートが挙げられる。そのような安定性改善化合物は、十分に小さく、その結果、電子トンネリングは依然として起きることによって、電極からナノ粒子への電荷移動を可能にすることができる。
【０１１３】
本明細書で論じた任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬、又は組成物に対して実施することができ、逆の場合も同様であることが企図されている。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を実現するために使用することができる。
【０１１４】
本明細書に記載した特定の実施形態は、例として示されており、本発明の制限として示されていないことが理解されよう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく様々な実施形態において使用することができる。当業者は、日常程度の実験を使用して、本明細書に記載した特定の手順に対する多数の均等物を認識することなり、又は確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内であるとみなされ、特許請求の範囲によって包含されている。
【０１１５】
本明細書で述べたすべての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する当業者のスキルのレベルを示す。すべての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が、具体的に且つ個々に参照により組み込まれていると示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１１６】
特許請求の範囲及び／又は本明細書において、用語「含む」とともに使用されるとき、単数の使用は、「１つ」を意味することができるが、「１又は複数の」、「少なくとも１つの」及び「１又は１を超える」の意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを指すか、代替物が相互に排他的であることが明確に示されていない限り、「及び／又は」を意味するのに使用されるが、本開示は、代替物のみ並びに「及び／又は」を指す定義を支持する。本願全体にわたって、用語「約」は、値は、その値を求めるために使用されるデバイス、方法に対する誤差の固有の変動、又は研究対象の中に存在する変動を含むことを示すのに使用される。
【０１１７】
本明細書及び請求項（複数も）で使用する場合、単語「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」などの有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」などの含む（including）の任意の形態）、又は「含む（containing）」（並びに「含む（contains）」及び「含む（contain）」などの含む（containing）の任意の形態）は、包括的又は無制限であり、追加の、列挙していない要素又は方法ステップを除外しない。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、用語「又はこれらの組合せ」は、本明細書で使用する場合、この用語に先行して列挙される項目のすべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はこれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、及び特定の状況において順序が重要である場合、また、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢのうちの少なくとも１つを含むことが意図されている。この例に続いて、１又は複数の項目又は用語の繰り返し、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどを含む組合せは特に含まれる。当業者は、状況から明らかでない限り、任意の組合せにおける項目又は用語の数に制限は一般にないことを理解するであろう。
【０１１９】
本明細書で開示及び主張した組成物及び／又は方法のすべては、本開示を考慮すると、過度の実験を伴うことなく、作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を、好適な実施形態に関して説明してきたが、組成物及び／又は方法に対して、並びに本明細書に記載した方法のステップ又はステップの順序において、本発明の概念、精神並びに範囲から逸脱することなく、変形を適用することができることは当業者に明らかとなるであろう。当業者に明らかなすべてのそのような類似の代替及び改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の精神、範囲及び概念の中にあるとみなされる。
【０１２０】
（参考文献）
1. Polsky, R; Gill, R; Kaganovsky, L; Willner, I, Analytical Chemistry, 2006, 78, 2268-2271
2. Bard, A. J.; Faulkner, L. R. Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications, 2nd ed.; John Wiley & Sons: New York, 2001
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7. Sonnichsen, C.; Reinhard, B. M.; Liphardt, J.; et al. Nature Biotech. 2005, 23, 741-745
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【国際調査報告】
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