(57)【要約】  ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、養豚産業における世界的に大きな問題である。ワクチンにマーカーを含有させておくと、予防接種を受けた動物と、野生型ウイルスに自然感染した動物とを診断的に区別することが可能になるだろう。北アメリカ１型ＰＲＲＳＶのｃＤＮＡ伝染性クローンを使用して、ｎｓｐ２領域の免疫原性エピトープ、ＥＳ４の欠失を含有する組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識ＰＲＲＳＶを作製した。ＧＦＰ及びＥＳ４エピトープに基づくＥＬＩＳＡは、マーカー同定を補完する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え北アメリカ１型ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）であって、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａに１つ又は複数の突然変異を含み、前記突然変異は、前記組換えＰＲＲＳＶがＯＲＦ１ａに対応する少なくとも１つの機能的ポリペプチドを産生できない突然変異である、組換えＰＲＲＳＶ。
【請求項２】
前記突然変異が欠失を含む、請求項１に記載の組換えＰＲＲＳＶ。
【請求項３】
前記欠失が前記ｎｓｐ２領域にある、請求項２に記載の組換えＰＲＲＳＶ。
【請求項４】
前記欠失がエピトープＥＳ４を含む、請求項３に記載の組換えＰＲＲＳＶ。
【請求項５】
前記欠失がＯＲＦ１ａのアミノ酸７３６〜７９０を含む、請求項４に記載の組換えＰＲＲＳＶ。
【請求項６】
前記突然変異が異種性ＤＮＡ配列の挿入を含む、請求項３に記載の組換えＰＲＲＳＶ。
【請求項７】
前記挿入が、ＯＲＦ１ａのアミノ酸７３３と７３４との間にある、請求項６に記載の組換えＰＲＲＳＶ。
【請求項８】
前記挿入が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項６に記載の組換えＰＲＲＳＶ。
【請求項９】
北アメリカＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子によってコードされる北アメリカＰＲＲＳウイルスであって、前記ＤＮＡ配列が配列番号４３であるＤＮＡ配列を含む、組換え北アメリカＰＲＲＳウイルス。
【請求項１０】
北アメリカ１型ＰＲＲＳＶワクチンであって、ＯＲＦ１ａに突然変異を有する組換えＰＲＲＳＶであり、前記突然変異がＯＲＦ１ａにおける欠失、挿入、又は両方を含む組換えＰＲＲＳＶと、薬学的に許容される担体とを含むワクチン。
【請求項１１】
前記突然変異が前記ｎｓｐ２領域における欠失を含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記欠失が前記ｎｓｐ２領域のアミノ酸７３６〜７９０である、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記突然変異が異種性ＤＮＡ配列の挿入を更に含む、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記挿入が、前記ｎｓｐ２領域のアミノ酸７３３と７３４との間にある、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
ＯＲＦ１ａに突然変異を有するＰＲＲＳＶ変異体であり、前記突然変異は、前記ＰＲＲＳＶ変異体が機能的ＯＲＦ１ａポリペプチドを産生できない突然変異であり、前記突然変異が異種性ＤＮＡ配列の挿入を含むＰＲＲＳＶ変異体、及び薬学的に許容される担体を含むワクチンと；
前記異種性ＤＮＡ配列によりコードされる１つ又は複数の第１のポリペプチドと；
前記機能的ＯＲＦ１ａによりコードされる１つ又は複数の第２ポリペプチドとを含むキット。
【請求項１６】
前記ＰＲＲＳＶワクチンの前記突然変異が、前記ｎｓｐ２領域における欠失を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記欠失がＥＳ４エピトープであり、前記１つ又は複数の第１のポリペプチドがＧＦＰを含み、前記１つ又は複数の第２のポリペプチドがＥＳ４エピトープを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ＰＲＲＳＶマーカーワクチンで予防接種を受けた動物と、ＰＲＲＳＶに自然感染した動物とを区別するための方法であり、前記ＰＲＲＳＶマーカーワクチンが挿入突然変異及び欠失突然変異を含む方法であって：
前記挿入突然変異を含んでいる第１の組換えＰＲＲＳＶタンパク質を準備するステップと；
前記欠失突然変異を含んでいる第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質を準備するステップと；
前記動物由来の血清試料を、前記第１及び第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質と共に定温放置するステップと；
前記試料中の抗体と、前記第１及び第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質との結合を検出するステップとを含み；
前記試料中の抗体と前記第１の組換えＰＲＲＳＶタンパク質との結合が、予防接種を受けた動物を示し、前記試料中の抗体と前記第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質との結合が、自然感染した動物を示す方法。
【請求項１９】
前記第１の組換えＰＲＲＳＶタンパク質がＧＦＰ挿入を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質がＥＳ４欠失を含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年６月２５日に出願された米国仮出願第６０／９４６，０８０号の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、分子ウイルス学の分野に関し、より詳しくはブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）をコードする組換え核酸の構築に関する。
【背景技術】
【０００３】
ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は、経済的に最も重要な、ブタの世界的疾患である。この症候群は、雌ブタの後期生殖障害及び新生仔ブタの重症肺炎により特徴付けられる。ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）には、ヨーロッパ遺伝子型（１型）及び北アメリカ遺伝子型（２型）の２つの主要な遺伝子型があり、以前は各々が異なる大陸に見出されていた。より最近では、１型ＰＲＲＳＶ分離株（北アメリカ１型）が、米国の養豚場で同定された。この群のウイルスは、典型的な北アメリカ型及びヨーロッパ型ＰＲＲＳＶとは異なる固有の抗原性特徴及び遺伝子的特徴を有している。固有の５１ｂｐ欠失が、Ｎｓｐ２免疫優勢領域において同定されている。ＰＲＲＳの病原体は、プラス一本鎖ＲＮＡゲノムを含有する小型エンベロープウイルスである。ＰＲＲＳＶは、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸脱水素酵素ウイルス（ＬＤＶ）、及びサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）を含む、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）に属する（Ｓｎｉｊｄｅｒ  ＆  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，１９９８）。ヌクレオチド配列を比較すると、ＰＲＲＳＶは、特徴的なヨーロッパ遺伝子型（１型）及び北アメリカ遺伝子型（２型）に分類できることが判明した（Ａｌｌｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９９；Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。
【０００４】
ＰＲＲＳＶゲノムは、長さが約１５ｋｂであり、９つのオープンリーディングフレームを含有している。ゲノムの３’末端は、４つの膜結合糖タンパク質（ＧＰ２ａ、ＧＰ３、ＧＰ４、及びＧＰ５；ｓｇ  ｍＲＮＡ２〜５によりコードされている）、２つの非グリコシル化膜タンパク質（Ｅ及びＭ；ｓｇ  ｍＲＮＡ２及び６によりコードされている）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ；ｓｇ  ｍＲＮＡ７によりコードされている）をコードしている（Ｂａｕｔｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９９６；Ｍａｒｄａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ＆  ｄｅｎ  Ｂｅｓｔｅｎ，１９９６；Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｍｏｕｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，２００５）。ゲノムの５’末端に位置するレプリカーゼ関連遺伝子、ＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ｂは、ウイルスゲノムのほぼ７５％に相当する。ＯＲＦ１ａｂにコードされたポリタンパク質ｐｐ１ａｂは、１２か所の部位で切断されて、１３個の産物：ｎｓｐｌα、ｎｓｐｌβ、及びｎｓｐ２からｎｓｐ１２を形成することが予測される（Ａｌｌｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；ｄｅｎ  Ｂｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｎｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｎｉｊｄｅｒ  ＆  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，１９９８）。
【０００５】
ＰＲＲＳＶに対する修飾された弱毒化生ワクチンは、ＰＲＲＳＶ関連の臨床疾患を低減するために、現在入手可能である（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．社製）。しかしながら、それらは、自然感染から回復したブタと、予防接種を受けたブタとを血清学的に識別することができない。遺伝子的に標識されたワクチンであれば、予防接種を受けたブタと、自然感染したブタとの区別が可能になり、それはＰＲＲＳＶ抑制及び根絶プログラムに必要なことである。
【発明の概要】
【０００６】
組換えブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａに１つ又は複数の突然変異を含み、この突然変異は、ＯＲＦ１ａに対応する少なくとも１つの機能的ポリペプチドを組換えＰＲＲＳＶが産生できないような突然変異である。突然変異は欠失であってもよい。欠失は、ｎｓｐ２領域にあってもよく、エピトープＥＳ４を含んでいてもよい。１つの実施形態では、欠失は、ＯＲＦ１ａのアミノ酸７３６〜７９０を含む。突然変異は、異種性ＤＮＡ配列の挿入を含んでいてもよい。挿入は、ＯＲＦ１ａのアミノ酸７３３と７３４との間であってもよい。挿入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含んでいてもよい。
【０００７】
組換え北アメリカＰＲＲＳウイルスは、北アメリカＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子によってコードされ、ＤＮＡ配列は配列番号４３又はそれに相同的な配列である。
【０００８】
ワクチンは、ＯＲＦ１ａに突然変異を有するＰＲＲＳＶ変異体を含み、突然変異は、機能的ＯＲＦ１ａポリペプチドを前記ＰＲＲＳＶ変異体が産生できないような突然変異であり、ワクチンは、薬学的に許容される担体を含んでいる。突然変異は、ｎｓｐ２領域におけるアミノ酸７３６〜７９０の欠失などの、ｎｓｐ２領域における欠失を含んでいてもよい。突然変異は、異種性ＤＮＡ配列の挿入を含んでいてもよい。挿入は、ｎｓｐ２のアミノ酸７３３と７３４との間であってもよい。
【０００９】
キットは、ＯＲＦ１ａに突然変異を有するＰＲＲＳＶ変異体であり、この突然変異が、機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ＯＲＦ１ａポリペプチドを前記ＰＲＲＳＶ変異体が産生できないような突然変異であり、この突然変異が異種性ＤＮＡ配列の挿入を含んでいるＰＲＲＳＶ変異体と、薬学的に許容される担体とを含むワクチンを含む。このキットは、異種性ＤＮＡ配列によりコードされた１つ又は複数の第１のポリペプチド、及び機能的ＯＲＦ１ａによりコードされた１つ又は複数の第２のポリペプチドを更に含む。ＰＲＲＳＶワクチンの突然変異は、ＥＳ４エピトープにおける等のｎｓｐ２領域における欠失であってもよく、１つ又は複数の第１のポリペプチドはＧＦＰを含み、１つ又は複数の第２のポリペプチドはＥＳ４エピトープを含む。
【００１０】
ＰＲＲＳＶマーカーワクチンで予防接種を受けた動物と、ＰＲＲＳＶに自然感染した動物とを区別するための方法であって、ＰＲＲＳＶマーカーワクチンが挿入突然変異及び欠失突然変異を含む方法が提供される。この方法は、挿入突然変異を含んでいる第１の組換えＰＲＲＳＶタンパク質を準備するステップと、欠失突然変異を含んでいる第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質を準備するステップと、動物由来の血清試料を、第１及び第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質と共に定温放置（インキュベート）するステップと、試料中の抗体と、第１及び第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質との結合を検出するステップとを含む。試料中の抗体と第１の組換えＰＲＲＳＶタンパク質との結合は、予防接種を受けた動物を示し、試料中の抗体と第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質との結合は、自然感染動物を示す。第１の組換えＰＲＲＳＶタンパク質は、ＧＦＰ挿入を含んでいてもよく、第２の組換えＰＲＲＳＶタンパク質は、ＥＳ４欠失を含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＰＲＲＳＶゲノム及びクローニング戦略の略図である。
【００１２】
【図２】図２Ａ〜Ｆは、伝染性クローンｐＳＤ０１−０８の感染性を調査するために実施された免疫蛍光アッセイの結果を表す図である。
【００１３】
【図３】図３は、クローンウイルス、親ウイルス、及びＧＦＰ発現ウイルスの増殖速度論を示すグラフである。
【００１４】
【図４】図４は、クローンウイルス及び親ウイルスＳＤ０１−０８のＲＴ−ＰＣＲ産物の制限酵素断片パターンを表す図である。
【００１５】
【図５Ａ】図５Ａは、クローンウイルスのｉｎ  ｖｉｖｏ特徴付けを示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、クローンウイルスのｉｎ  ｖｉｖｏ特徴付けを示すグラフである。
【００１６】
【図６】図６Ａ〜Ｃは、ＧＦＰ発現ＰＲＲＳＶを調査するために実施された免疫蛍光アッセイの結果を表す図である。
【００１７】
【図７】図７は、ｐＳＤ０１−０８−ＧＦＰ構築体の略図である。
【００１８】
【図８】図８は、ｐＳＤ０１−０８−ＧＦＰ／ΔＥＳ４構築体の略図である。
【００１９】
【図９】図９は、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスの増殖速度論を示すグラフである。
【００２０】
【図１０】図１０は、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルス及び親ウイルスのプラーク形態を表す図である。
【００２１】
【図１１】図１１は、ＧＦＰ発現の安定性を表す図である。
【００２２】
【図１２】図１２は、野生型ＧＦＰ遺伝子と、Ａｒｇ９７変異ＧＦＰ遺伝子との比較を表す図である。
【００２３】
【図１３】図１３は、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスのｉｎ  ｖｉｖｏ特徴を表すグラフである。
【００２４】
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスのウイルス学的及び免疫学的特性を表すグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスのウイルス学的及び免疫学的特性を表すグラフである。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスのウイルス学的及び免疫学的特性を表すグラフである。
【００２５】
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＧＦＰ及びＥＳ４エピトープに基づくＥＬＩＳＡの結果を表す図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＧＦＰ及びＥＳ４エピトープに基づくＥＬＩＳＡの結果を表す図である。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＧＦＰ及びＥＳ４エピトープに基づくＥＬＩＳＡの結果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
北アメリカ１型ＰＲＲＳＶ分離株の全長ｃＤＮＡクローン、ＳＤ０１−０８を開発した。レリスタッドウイルス（Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ）と比較すると、ＳＤ０１−０８は、ヌクレオチドレベルで９４．１％の同一性を共有する（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ４８９３１１）。ＳＤ０１−０８とＬＶとの重要な相違は、ＰＡＭ及びサル腎細胞中での増殖特性である。Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら（１５）により報告された結果は、野生型ＬＶウイルス及びクローンＬＶウイルスはＰＡＭ中でよく増殖するが、ＭＡ−１０４派生細胞系（ＣＬ２６２１）では低レベルにしか増殖しなかったことを示した。親ＳＤ０１−０８及びクローンＳＤ０１−０８は、ＰＡＭ、及び別のＭＡ−１０４派生細胞系であるＭＡＲＣ−１４５細胞で、同様によく増殖した。ＳＤ０１−０８クローンウイルスの力価は、４８ｈｐｉでピークに達し、一方、ＬＶクローンウイルスは、より低力価に増殖し、９６ｈｐｉにおいてでさえピークに達しなかった。従って、ＳＤ０１−０８伝染性クローンは、連続継代細胞系でよく複製する。ＬＶとＳＤ０１−０８との間の別の相異は、毒性のレベルである。ＰＡＭでは、ＬＶクローンウイルスは、１０７．１から１０７．９ＴＣＩＤ５０／ｍｌの高力価に達し、約３２ｈｐｉでピークに達した。ＳＤ０１−０８クローンウイルスは、ＰＡＭ中でその親ウイルスと同じ力価に達したが、それらの力価は両方ともＬＶの力価より低く、わずかに約１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌに達しただけであり、より後期の約７２ｈｐｉでピークに達した。この結果は、ＳＤ０１−０８クローンウイルスが、ＬＶクローンウイルスより毒性が低いことを示唆する。この結論は、野外観察及び実験動物負荷研究により支持されている。ＳＤ０１−０８は、実験的に感染させたブタでは、著しい臨床的徴候を引き起こさず、軽度の病理学的病変が観察されただけだった。対照的に、ＬＶは、ブタに著しい呼吸器障害を引き起こし、雌ブタに流産を引き起こすことが報告された（３４）。
【００２７】
伝染性クローンの主な応用の１つは、遺伝子操作されたワクチンを構築するためのウイルス骨格として、それを使用することである。米国において現在使われているＰＲＲＳＶワクチンは、主として北アメリカ２型分離株を標的とする。北アメリカ１型ＰＲＲＳＶの出現により、両遺伝子型のＰＲＲＳＶに有効なワクチンが必要とされている。あらゆる生ウイルスワクチンの必須条件は、その毒性が低く、疾患症状を全く誘発しないか、又は酷くともごく軽い疾患症状しか誘発しないということである。親ウイルス、ＳＤ０１−０８は、臨床的徴候を示さないブタの群から単離された。病原論的研究により、ＳＤ０１−０８は、疾患の急性期において低毒性の特性を有することが確認されており、ｐＳＤ０１−０８伝染性クローンが、有望な低毒性株であり、ワクチン構築に好適であることを示唆した。
【００２８】
ワクチン開発の重要なステップの１つは、予防接種を受けた動物と、野生型ウイルスに自然感染した動物とを診断的に区別するためのマーカーを含有させることである。マーカーワクチンは、食用動物並びにコンパニオンアニマルにおけるウイルス感染の抑制又は根絶を目指したプログラムにおいて重要である（Ｂａｂｉｕｋ，１９９９；Ｂａｂｉｕｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，２００；ｖａｎ  Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，２００１）。ヘルペスウイルスマーカーワクチンは、中でも最初に現場で有効であることが証明され（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；ｖａｎ  Ｏｉｒｓｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、その後、古典的なブタコレラウイルス（Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；ｖａｎ  Ｇｅｎｎｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）及び牛疫ウイルス（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）等の、種々の遺伝子修飾ＲＮＡウイルスが続いた。ＥＡＶ根絶プログラムでは、ウマが活発に国際貿易及び交通に関与しているため、マーカーワクチンは、幾つかの法律当局によってに必要とされている。予防接種と感染との識別は、支配的な問題になりつつある（Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｏｌｉｖａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。同様に、ＰＲＲＳＶ根絶プログラムでは、ブタ及び豚肉の国際貿易は、将来的にマーカーワクチンを必要とする可能性が高くなるだろう。更に、世界がＰＲＲＳＶの根絶に向かって進んでいく際に、血清調査は、疾患状態を確認するのに不可欠なツールである。現在入手可能な従来型ワクチンでは、野生型感染と予防接種との区別を可能にすることができない。従って、予防接種が進行中である間、又は予防接種の中止後の数か月間は、血清調査が不可能である。明らかに、マーカーワクチンは大きな有益性をもたらすであろう。
【００２９】
北アメリカ１型ＰＲＲＳＶの伝染性クローン、ｐＳＤ０１−０８を使用して、組換えＰＲＲＳＶを生成した。ヨーロッパ型レリスタッドウイルス（ＬＶ）伝染性クローンと比較して、ｐＳＤ０１−０８は、（１）ｐＳＤ０１−０８伝染性クローンは、北アメリカ１型ＰＲＲＳＶである、２００１年に米国で単離された親株に由来する；（２）親株ＳＤ０１−０８は、臨床的徴候を示さない８週齢のブタの群から単離された；および（３）ＳＤ０１−０８は、Ｎｓｐ２の免疫優勢領域において固有の５１ｂｐ欠失を有するという幾つかの特徴的な生物学的特性を有する（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００３０】
ｎｓｐ２はウイルス複製に役割を果たす。ｎｓｐ２は、Ｎ末端にあるシステインプロテアーゼドメインを含有している。このドメインは、ｎｓｐ２／３切断を誘導し、ｎｓｐ４セリンプロテアーゼのコファクターとしても機能して、他の切断産物をプロセシングする（Ｓｎｉｊｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，１９９５；Ｗａｓｓｅｎａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＥＡＶ及びＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ２のシステインプロテアーゼは、ウイルス複製におけるその機能に加えて、卵巣腫瘍（ＯＴＵ）プロテアーゼスーパーファミリーに属することが示されている。ＯＴＵプロテアーゼは、ユビキチン及び細胞タンパク質に由来するＩＳＧ１５の両方を脱コンジュゲートすることが可能であり、Ｕｂ依存性及びＩＳＧ１５依存性の先天性免疫応答を阻害する（Ｆｒｉａｓ−Ｓｔａｈｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００３１】
マーカーワクチンの開発は、外来性抗原をそこに挿入することができるか（陽性マーカー）、又は免疫原性エピトープをそこから欠失させることができる（陰性マーカー）ｃＤＮＡ伝染性クローンの操作に基づく。外来性抗原又はウイルスエピトープに対する抗体応答を使用すると、予防接種を受けた動物と自然感染した動物とを区別することができる。ＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ２は、マーカー修飾の優れた候補部位である。マーカー操作に関するｎｓｐ２の最も重要な特性は、ｎｓｐ２が大きな欠失及び挿入を許容できるということである。このタンパク質の中央領域内におけるヌクレオチド配列の挿入／欠失は報告されている（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。マーカー操作に関する別の特性は、この領域に幾つかの免疫優勢エピトープが存在することである。デンマーク１型ウイルスのｎｓｐ２領域において、６つの直鎖Ｂ細胞エピトープ部位（ＥＳ）（ＥＳ２からＥＳ７）が同定されている（Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。２型ウイルスでは、構造タンパク質と比較して、ｎｓｐ２は、免疫優勢エピトープを最も高い頻度で含有することが見出されている（ｄｅ  Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００３２】
米国１型ＰＲＲＳＶ伝染性クローンのｎｓｐ２領域におけるマーカー修飾を調製した。陽性マーカー、ＧＦＰをｎｓｐ２領域に挿入したが、ＧＦＰ遺伝子は安定しなかった。次に、ｎｓｐ２領域に位置している高度に免疫原性のエピトープ、ＥＳ４（ＯＲＦ１ａのアミノ酸７３６から７９０）を欠失させ、逆遺伝学を使用してＧＦＰ遺伝子と置換し（ＯＲＦ１ａのアミノ酸７３３／７３４で）、陰性マーカーを生成した。その結果生じた組替えウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製特徴、及びｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的特性を特徴付けて、ＰＲＲＳＶ感染に対するマーカーワクチンとしてのその潜在的有用性を決定した。ＧＦＰ抗原及びＥＳ４ペプチド抗原に基づくＥＬＩＳＡを試験して、マーカー検出及び区別用の携帯診断アッセイとしての、それらの感受性及び特異性を決定した。
【００３３】
Ｉ．陽性マーカーＧＦＰ
細胞及びウイルス。北アメリカ１型ＰＲＲＳＶ分離株、ＳＤ０１−０８は、米国において８週齢のブタの群から２００１年に初めて単離されたものであり、ＰＲＲＳの臨床的徴候を示していなかった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡからウイルスを復元するために、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１Ｃ１３：アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を初期形質移入に使用した。ＭＡＲＣ−１４５細胞を、ウイルス救出及びその後の実験に使用した（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。特異的病原体未感染のＰＲＲＳＶ未感染子ブタの肺洗浄によって、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞を取得した。
【００３４】
ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、及び配列決定：ＭＡＲＣ−１４５細胞を、およそ０．１ＭＯＩでプラーク精製ウイルスに感染させた。３日後に、培養液上清を０．５Ｍスクロースクッション上に重ねて、１００，０００×ｇで１４時間、ＳＷ４１ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で遠心分離した。ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、ペレットからＲＮＡを抽出した。親ウイルス、ＳＤ０１−０８の全長ゲノム配列を取得するために、一連のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した（Ｒｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。各ＲＴ−ＰＣＲ産物を、両方向から少なくとも２回直接的に配列決定して、コンセンサス配列を取得した。伝染性クローンを構築するために、固有の制限酵素部位により隣接された全長ウイルスゲノムをカバーする９つのオーバーラップ断片（図ｌ）を、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅用の順方向及び逆方向オリゴヌクレオチドを、最初はＬＶ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ９６２６２；１８）に基づいて設計し、その後修飾してＳＤ０１−０８配列と一致させた（表１）。ＲＴ−ＰＣＲを実施した（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらのＲＴ−ＰＣＲ増幅断片をゲル精製し、ＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。各断片の３つのクローンを配列決定し、コンセンサス配列を含有するクローンを使用して伝染性クローン組み立てた。
【００３５】
表１．ＲＴ−ＰＣＲ増幅用に使用されたプライマー
【表１】
2010531143.tif 000002
2010531143.tif 000003
＊Ｓｃａ１制限酵素部位を生成ために突然変異されたヌクレオチドは、太字及びイタリック体である。
【００３６】
製造業者の説明書に従ってＧｅｎｅＲＡＣＥＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用し、ゲノム配列の５’及び３’末端を決定した。ウイルスゲノムの５’末端を表す断片は、真正５’末端ヌクレオチド及びＡｓｃ１制限酵素部位の直前にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ部位を組み込んだプライマー、Ｅ１ＧＦ及びＥ２９６８Ｒ（表１）を用いたＲＴ−ＰＣＲを使用して調製した。３’末端配列を含有する断片を、４１個のポリＡ残基及びＸｂａｌ部位を隣接しているプライマー０１８ポリＡを用いたＲＮＡの逆転写により構築した。逆転写反応後に、プライマーＥ１４０５９Ｆ及び０１８  ３’Ｒ（表１）を用いてＰＣＲを行った。
【００３７】
北アメリカ１型ＰＲＲＳＶの全長ｃＤＮＡクローンの構築及びその感染性の決定
北アメリカ１型ＰＲＲＳＶの全長ゲノムｃＤＮＡクローン、ｐＳＤ０１−０８を、図１に示される戦略を使用して構築した。ＢａｍＨ１及びＢｇｌ１部位間の断片を、図１に示されるような制限酵素部位を含有する合成遺伝子として調整したスタッファー断片に置換することにより、低コピー数プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０６４０２）を修飾した。ＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏから制限酵素を使用して、ウイルス断片の各々を切り出し、同じ制限酵素で消化したｐＡＣＹＣ１７７プラスミドにライゲーションした。各ライゲーションステップ後で、ｐＡＣＹＣ１７７構築体を大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換し、カナマイシンの存在下で終夜３７℃で増殖させた。完全に組み立てられた全長ｃＤＮＡクローンを配列決定し、全長ゲノム配列を受入番号ＤＱ４８９３１１でＧｅｎＢａｎｋに寄託した。
【００３８】
Ｓｃａ１制限酵素部位を生成するために、ＯＲＦ７のヌクレオチド４２（ＳＤ０１−０８ゲノムのヌクレオチド１４５８８）でのサイレント突然変異（ＧからＴへの突然変異）を、指定部位突然変異誘発を使用して生成した。指定部位突然変異誘発は、プライマー対Ｅ１４０５９Ｆ／Ｓｃａ１Ｒ及びＳｃａ１Ｆ／ＹＦｐ５０３Ｒを使用して、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技術（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）により達成した。ＤＮＡ配列決定分析により、突然変異産物を確認した。
【００３９】
この構築体は、ウイルスゲノムの５’末端にあるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ７プロモーターとウイルスゲノムの最初のヌクレオチドとの間に導入された１個の追加的グアノシン残基、ＳＤ０１−０８の１５０４７ヌクレオチド全長ゲノム、及びゲノムの３’末端に組み込まれた４１残基のポリ（Ａ）尾部を含有している。親ウイルスのゲノム配列と比較して、ｐＳＤ０１−０８のＤＮＡ配列は、６つのヌクレオチドの違いを含有していた（表２）。
【００４０】
表２．親ＳＤ０１−０８分離株と全長ｃＤＮＡクローンとのヌクレオチドの違い
【表２】
2010531143.tif 000004
【００４１】
これらの違いのうち４つは、サイレント突然変異であった。クローンウイルスと親ウイルスとを区別するために、ヌクレオチド１４５８８の突然変異をＯＲＦ７に導入して、固有のＳｅａ１制限酵素部位を生成した。ヌクレオチド突然変異のうちの２つはアミノ酸変化に帰着し、それらには、Ｎｓｐ１０に位置するヌクレオチド９４９２におけるＣからＴへの置換（アミノ酸ＰからＬ）、及びＮｓｐ１１に位置するヌクレオチド１１２６１におけるＴからＣへの置換（アミノ酸ＹからＨ）が含まれていた。
【００４２】
プラスミドｐＳＤ０１−０８を制限酵素Ｘｂａｌで線形化し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用して、キャッピングされたＲＮＡを合成した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のキャッピングされたＲＮＡを、ＢＨＫ−２１細胞に形質移入した。形質移入４８時間後に、ｍＡｂ  ＳＤＯＷ１７を用いた蛍光抗体染色により、細胞を、Ｎタンパク質の発現について検査した（図２Ａ）。図２Ａの結果は、形質移入された細胞の約５％がＮタンパク質を発現したことを示した。形質移入された細胞由来の上清を、ＭＡＲＣ−１４５細胞で継代した。７２時間後、ＭＡＲＣ−１４５細胞を、ＳＤ０１−０８特異的抗Ｎｓｐ２ｍＡｂ、ＥＳ３−４  ５８−４６（図２Ｂ）及び抗Ｎ  ｍＡｂ  ＳＤＯＷ１７（図２Ｃ）を使用して染色した。北アメリカ２型ＰＲＲＳＶ特異的抗Ｎ  ｍＡｂ  ＭＲ３９（図２Ｄ）を、陰性対照として組み入れた。その結果は、Ｎｓｐ２及びＮタンパク質の両方が、ｐＳＤ０１−０８で形質移入されたＢＨＫ−２１細胞に由来する上清で接種されたＭＡＲＣ−１４５細胞において検出されたことを示した。上清を新しいＭＡＲＣ−１４５細胞で更に継代すると（ＭＡＲＣ−１４５細胞での継代２）、細胞変性効果（ＣＰＥ）が、４８から７２感染後時間（ｈｐｉ）以内に観察された。ＭＡＲＣ−１４５細胞での継代２に由来するウイルス滴定は、３．６×１０７ＦＦＵ／ｍｌの平均力価を示した。これらの結果は、生存可能な伝染性北アメリカ１型ＰＲＲＳＶが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のＲＮＡで形質移入した細胞から救出されたことを示す。
【００４３】
ＧＦＰ挿入：プラスミドｐＳＤ０１−０８中のウイルスゲノムのＮｓｐ２領域（ヌクレオチド２４２０／２４２１）に、ＧＦＰ遺伝子配列（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を挿入することにより、ｐＳＤ０１−０８−ＧＦＰクローンを構築した。ＧＦＰ遺伝子を、順方向プライマーｇｆｐＦ及び逆方向プライマーｇｆｐＲを用いて、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から増幅した。Ｎｓｐ２Ｆ１／Ｎｓｐ２Ｒ１及びＮｓｐ２Ｆ２／Ｎｓｐ２Ｒ２のプライマー対を使用して、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技術（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ；  １９８９、Ｊｅｓｐｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）により、ＧＦＰを挿入した。ＰＣＲ産物をＲｓｒｌ１及びＡｃｌ１制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したｐＳＤ０１−０８プラスミドにライゲーションした。
【００４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及びＰＲＲＳＶの救出：プラスミド、ｐＳＤ０１−０８又はｐＳＤ０１−０８−ＧＦＰを、制限酵素Ｘｂａ１で線形化した。ｍＭｅｓｓａｇｅ  Ｍａｃｈｉｎｅキット（Ａｍｂｉｏｎ社製）を使用して、キャッピングされたＲＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼで転写し、製造業者の説明書に従ってＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用し、ＢＨＫ−２１細胞に形質移入した。ウイルスを救出するために、形質移入４８時間後に得られた細胞培養上清を、ＭＡＲＣ−１４５細胞で連続継代した。伝染性ウイルスの救出は、間接免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）（Ｒｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）によって確認した。ＳＤ０１−０８のＮｓｐ２を特異的に認識するＭＡｂ  ＥＳ３−４  ５８−４６を含むモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を、ＩＦＡ検査で使用するために開発した（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｆ．Ｒｅｓ．Ｗｏｒｋ．Ａｎｉｍ，Ｄｉｓ．，ａｂｓｔｒ．７８，２００４）。ＭＡｂ  ＭＲ３９は、北アメリカ２型ＰＲＲＳＶのＮタンパク質を特異的に認識し、ＭＡｂ  ＳＤＯＷ１７は、両遺伝子型のＰＲＲＳＶのＮタンパク質を認識する（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｒｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ，２００４）。ＧＦＰウイルスの救出については、更にＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で直接的に視覚化した。
【００４５】
ＭＡＲＣ−１４５細胞を０．１ＭＯＩのクローンウイルス及び親ウイルスに感染させることにより、増殖速度論を検討した。０、６、１２、２４、３６、４８、６０、及び７２感染後時間に感染細胞を収集し、ウイルス力価をＭＡＲＣ−１４５細胞でのＩＦＡにより決定し、１ｍｌ当たりの蛍光焦点単位（ＦＦＵ／ｍｌ）として定量化した。クローンウイルス及び親ウイルス間のプラーク形態を、ＭＡＲＣ−１４５細胞でのプラークアッセイにより比較した。コンフルエント細胞単層を、０．１ＭＯＩのウイルスに感染させた。２時間後、細胞培養上清を取り除き、寒天重層をアプライした。３７℃で５日後にプラークを検出し、０．１％クリスタルバイオレットを使用して染色した。
【００４６】
クローンウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付け
親ウイルス及びクローンウイルス（ＭＡＲＣ−１４５細胞上での継代２）を、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）に滴定した。抗Ｎ  ｍＡｂを使用した免疫蛍光染色は、両ウイルスがＰＡＭで複製したことを示し（図２Ｅ及び２Ｆ）、７２ｈｐｉで同様のウイルス収量（２．１〜２．８×１０４ＦＦＵ／ｍｌ）をもたらした。
【００４７】
クローンウイルス及び親ウイルスの増殖特性を更に比較するために、ＭＡＲＣ−１４５細胞を０．１ＭＯＩの各ウイルスに感染させ、６、１２、２４、３６、４８、６０、及び７２ｈｐｉで回収した。その結果、増殖曲線は、クローンウイルスが、親ウイルスの増殖速度論と同様の増殖速度論を有していたことを示した（図３）。力価は、両ウイルスとも４８ｈｐｉでピークに達した。クローンウイルスのピーク力価は、親ウイルスの２．３４×１０７ＦＦＵ／ｍｌに対して、１．３９×１０７ＦＦＵ／ｍｌであった。これらのウイルスのプラーク形態も決定し、クローンウイルスによりもたらされたプラークサイズは、親ウイルスのプラークサイズに類似していた（データ非表示）。これらの結果は、クローンウイルスが、親野生型ウイルスと同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性を有することを示す。
【００４８】
クローンウイルスと親ウイルスとを区別するために、本発明者らは、ＯＲＦ７のヌクレオチド４２にＳｅａ１制限酵素部位を設計した。図４に示されているように、ヌクレオチド１３８７５から１４９２８の増幅に由来する１０５４ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ断片は、クローンウイルスのＳｅａ１によって切断された。対照的に、親ウイルスに由来するＲＴ−ＰＣＲ断片は、Ｓｅａ１によって切断されなかった。
【００４９】
ブタモデルのｐＳＤ０１−０８に由来するクローンウイルスの病原性特性及び免疫学的特性
育仔場ブタモデルを使用して、伝染性クローンに由来するウイルスの複製特性に関するｉｎ  ｖｉｖｏ研究を実施した。２１頭の４週齢ＰＲＲＳＶ未感染ブタを認定ＰＲＲＳＶ陰性群から取得し、４群に無作為分割し、別々に隔離施設に収容した。４日間の順応期間後、各群のブタを（クローンウイルス感染群の場合は、ｎ＝６；残りの群の場合は、ｎ＝５）、１０５ＴＣＩＤ５０のクローンウイルス（群１）又は親ウイルス（群２）を１ｍｌ用いて鼻腔内接種した。動物の第３群を、現行の修飾生ウイルス（ＭＬＶ）Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳＶワクチンで接種した。陰性対照群（群４）の動物を、ＭＡＲＣ−１４５細胞培養上清で偽負荷した。
【００５０】
感染後の最初の７日間は、毎日、ブタの臨床的徴候を観察し、体温を測定した。０、７、１４、２１、２８、３５、及び４２日目に、全てのブタから血液試料を取得した。血清試料を、更なる検査のために−８０℃で保管した。急性感染の死後分析のために、各群から２頭のブタを接種後２１日目（ｄｐｉ）に安楽死させた。各群の残りの３頭のブタを、４２ｄｐｉに安楽死させた。研究動物の肺病変を、各葉が全肺に寄与する近似容積に基づく以前に開発した方式を使用して評価した：左及び右頂葉、左及び右心臓葉、及び各中葉は、各々全肺容積の１０％に寄与し、左及び右尾部側葉は各々２５％に寄与する。その後、これらのスコアを使用して、各葉の相対的寄与に基づく合計肺病変スコアを算出した（Ｈａｌｂｕｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）。
【００５１】
ウィルスＲＮＡの検出及びウイルス負荷の決定ついては、０、７、１４、２１、２８、３５、及び４２ｄｐｉでの血清試料を、Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＤＳＵ−ＡＤＲＤＬ）で日常的に実施されているリアルタイム定量ＰＣＲ（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ  ＶｅｔＡｌｅｒｔ  ＰＲＲＳ；Ｗａｓｉｌｋ  ｅｔ  ａｌ，２００４）を使用して検査した。血清試料は全て、ＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋ（登録商標）ＰＲＲＳ  ２ＸＲ  ＥＬＩＳＡ及びウイルス中和反応アッセイ（ＶＮ）を使用して、抗ＰＲＲＳＶ抗体について評価した。これらの検査も、厳密な品質保証ガイドラインに従ってＳＤＳＵ−ＡＤＲＤＬにおいて日常的に実施されている。
【００５２】
ウイルスを受容したブタは全て感染し、感染は、血清中のウイルスＲＮＡの有無に関するＲＴ−ＰＣＲの結果が陽性であること、及び血清学的検査により判明した。血清中のウイルスは、約１４感染後日数（ｄｐｉ）時にピークに達した（図５Ａ；表３）。１４ｄｐｉで、クローンウイルス群の６頭中５頭のブタ、親ウイルス群の５頭中４頭のブタ、及びワクチン群の５頭のブタ全てが、血清転換した（図５Ｂ；表３）。クローンウイルス負荷群の６頭中４頭のブタは、２１ｄｐｉに検出可能な中和抗体力価を示し、親負荷群の５頭中１頭のブタは、２１ｄｐｉまでに中和抗体を誘発した。ＭＬＶワクチン負荷群のブタのうち２頭は、４２ｄｐｉに検出可能な中和抗体力価を生じさせた（表３）。
【００５３】
表３．異なる感染後日数（ｄｐｉ）で接種されたブタの血清の血清学的結果及びＰＣＲ結果の要約
【表３】
2010531143.tif 000005
ａＰＣＲ：リアルタイムＰＣＲにより決定された各群のブタのＰＣＲ陽性を示すブタの頭数／各群のブタの総頭数；ｂＥＬＩＳＡ：ＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋ（登録商標）ＰＲＲＳ  ２ＸＲ  ＥＬＩＳＡによって決定された各群のブタの血清反応陽性ブタの頭数／各群のブタの総頭数；ｃＶＮ：蛍光焦点中和アッセイによって決定された、ブタの中和抗体応答を誘発したブタの頭数／ブタの総頭数。結果は、ウイルス感染の９０％低減と解釈された。
＊２頭のブタは、急性感染を分析するために２１日目に安楽死させた。
【００５４】
偽感染ブタは全て、研究期間中にわたって陰性のＲＴ−ＰＣＲ及びＰＲＲＳＶ抗体のままだった。著しい臨床的徴候は、感染ブタのいずれにも観察されなかった。軽症間質性肺炎等の、ＰＲＲＳＶに特徴的な軽度の病理学的肺病変のみが、クローンウイルス群の６頭中３頭のブタで、親ウイルス群の５頭中５頭のブタで、及びワクチン群の５頭中２頭のブタで観察された。残りのブタは、肉眼的な肺病変を示さなかった（表４）。興味深いことには、異なる群のブタで病理学的病変を比較すると、病変スコアは、親ウイルスに感染したブタにおいてわずかにより高いと考えられる。
【００５５】
表４．感染ブタの肉眼的肺炎病変を有する肺のパーセンテージ
【表４】
2010531143.tif 000006
＊肉眼的肺病理は、肺の各肺葉を％肺炎について評価した肉眼的ブタ肺病変スコア方式を使用することにより評価し、各肺葉の％肺炎は、肺全体について加算されている（１０）。
【００５６】
伝染性クローンのＮｓｐ２領域への緑色蛍光タンパク質の導入
本発明者らは、この伝染性クローンを外来遺伝子発現に使用する可能性を検討した。以前の研究により、Ｎｓｐ２は、外来遺伝子挿入のための優れた候補部位であることが示された。１型及び２型は両方とも、Ｎｓｐ２のＣ末端領域にアミノ酸挿入及び欠失を含む超可変ドメインを含有している（７、８、２７）。ＳＤ０１−０８と、ヨーロッパ１型ウイルスの原型メンバーであるＬＶとの間の主要な違いの１つは、Ｎｓｐ２における１７個のアミノ酸欠失の存在であり、その欠失は、ＬＶのＯＲＦ１のアミノ酸７３４から７５０の間に位置している。本発明者らは、Ｎｓｐ２のこの固有欠失部位に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を挿入した（ＳＤ０１−０８  ＯＲＦ１ａのアミノ酸７３３／７３４において、図７）。構築体、ｐＳＤ０１−０８−ＧＦＰを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写し、ＢＨＫ−２１細胞に形質移入した。生菌細胞を、形質移入４８時間後に蛍光顕微鏡で直接的に検査した。形質移入されたＢＨＫ細胞からの細胞培養上清を、ＭＡＲＣ−１４５細胞で継代し、その結果ＧＦＰ発現細胞が出現し、それは早くも感染６時間後には明白に視覚化することができた（図６Ａ）。感染４８時間後に、ＧＦＰ−Ｎｓｐ２融合タンパク質の発現を確認するために、細胞を固定し、Ｎｓｐ２特異的ｍＡｂ  ＥＳ３−４  ５８−４６で染色した。ＥＳ３−４  ５８−４６は、ＧＦＰ挿入部位の直ぐ上流に配置されているＥＳ３エピトープ配列（図７）から作られた合成ペプチドでマウスを免疫することにより作製された。赤色蛍光性Ｃｙ３をコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧを、二次抗体として使用した。共焦点顕微鏡法により、ＧＦＰ及びＮｓｐ２の両方が核周囲に局在化し、親ウイルスのＮｓｐ２局在化に類似していたことが示された（図６Ｂ及び６Ｃ）。ＧＦＰ発現がウイルス複製に影響を与えるかどうかを決定するために、ＧＦＰウイルスの増殖特徴を、親野生型ウイルス及びクローンウイルスと比較した。ｐＳＤ０１−０８−ＧＦＰウイルスの複製サイクルは、４８ｈｐｉでウイルス力価がピークに達することを含み、他のウイルスに類似していたが、ＧＦＰウイルス感染のピーク力価は、およそ１０分の１に低減した（図３）。
【００５７】
複数回のウイルス複製にわたるＧＦＰ発現の安定性を調査するため、ＧＦＰウイルスをＭＡＲＣ−１４５細胞で８回連続継代した。７代目の継代までに、非ＧＦＰ発現ウイルスの亜集団が出現し、全ウイルス集団の１５％と計数された。更にＧＦＰ喪失をＲＴ−ＰＣＲで分析した。全細胞ＲＮＡを、ＧＦＰウイルスの７代目継代に感染した細胞から単離し、ＲＮＡを、ＧＦＰ挿入領域を増幅したプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、クローニングし、配列決定した。その結果は、ＧＦＰのＮ末端アミノ酸１〜１５９が欠失していたことを明らかにした（図７）。より興味深いことには、アミノ酸１〜１５９が欠失していた一方で、２個のアミノ酸、メチオニン（Ｍ）及びグルタミン酸（Ｅ）が、ウイルスによってＧＦＰアミノ酸１６０の前に挿入されていた（図７）。従って、ＧＦＰ遺伝子の欠失をコードするウイルスゲノムの選択が、ＧＦＰを発現する感染細胞の割合を低下させたことが説明された。まとめると、これらの結果は、Ｎｓｐ２領域が外来遺伝子の導入を許容できることを示す。しかしながら、外来遺伝子の挿入は、ウイルス複製のレベルを低減する。このように、陽性マーカー、ＧＦＰ遺伝子は、安定していなかった。
【００５８】
ＩＩ．陰性マーカーウイルスＧＦＰ／ΔＥＳ４
ＧＦＰ／ΔＥＳ４陰性マーカーワクチンの構築
有望な陰性マーカーワクチンウイルスを取得するために、ＧＦＰの下流に（ＳＤ０１−０８ウイルスゲノムのヌクレオチド２４２７から２５９１に）位置するＢ細胞エピトープ、ＥＳ４を、プライマー対ΔＥＳ４Ｆ／Ｅ３４４８Ｒ及びＥ１８９５Ｆ／ΔＥＳ４Ｒを使用して、オーバーラップ伸長ＰＣＲ技術（Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）で欠失させた（表５）。ＰＣＲ産物をＲｓｒｌ１及びＥｃｏＲＶ制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したｐＳＤ０１−０８−ＧＦＰプラスミドにライゲーションした。その結果生じたプラスミド構築体を、ｐＳＤ０１−０８−ＧＦＰ／ΔＥＳ４と命名する（図８）。
【００５９】
表５．ＥＳ４エピトープ欠失及びＥＬＩＳＡ抗原発現に使用したプライマー
【表５】
2010531143.tif 000007
＊ＧＦＰのヌクレオチドは太字、制限酵素部位は下線のイタリック体；
＠付番は、ＳＤ０１−０８ゲノム内のヌクレオチド位置に対応する。
【００６０】
図８は、ｐＳＤ０１−０８−ＧＦＰ／ΔＥＳ４構築体の略図である。ＧＦＰは、ＯＲＦ１ａのアミノ酸７３３と７３４との間に挿入され、ＧＦＰの下流に（アミノ酸７３６から７９０に）位置していた免疫原性Ｂ細胞エピトープ、ＥＳ４を、ＳＤ０１−０８ウイルスから欠失させた。このプラスミドＤＮＡをＢＨＫ−２１細胞に直接形質移入すると、ウイルス複製の完全なサイクルが開始される。感染４８時間後に得られたＢＨＫ−２１細胞からの細胞培養上清を、ＭＡＲＣ−１４５細胞で継代して、伝染性子孫ウイルスを回収し、その結果生じたウイルスを、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスと命名した。親ウイルス、ＳＤ０１−０８を、ｐＳＤ０ｌ−０８ｃＤＮＡクローンと並行して作製した。ＭＡＲＣ−１４５細胞に由来するウイルスの継代２を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ特徴付けに使用した。
【００６１】
増殖速度論研究により、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスは、わずかに遅い速度論で複製し、親ウイルス、ＳＤ０１−０８より数時間後に最大力価に達したことが示された。マーカーウイルスのピークウイルス力価（３．３４×１０４ＦＦＵ／ｍｌ）は、親ウイルス（２．５６×１０６ＦＦＵ／ｍｌ）より、およそ２ｌｏｇ分だけ低力価だった（図９）。図９は、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスの増殖速度論を表す。並行して、ＭＡＲＣ−１４５細胞を、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルス及び親ウイルスの継代３に０．１ＭＯＩで感染させた。０、６、１２、２４、３６、４８、６０、及び７２感染後時間で細胞を回収し、ウイルス力価をＭＡＲＣ−１４５細胞でのＩＦＡにより決定した。その結果は３回反復実験の平均値であり、ウイルス力価は、１ミリリットル当たりの蛍光焦点単位（ＦＦＵ／ｍｌ）として表した。マーカーウイルス及び親ウイルス間のプラーク形態を、ＭＡＲＣ−１４５細胞でのプラークアッセイにより比較した。ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスによって形成されたウイルスプラークのサイズは劇的に低減し、ほとんどのプラークは針先サイズであり（図１０）、ＧＦＰ挿入／ＥＳ４欠失が、感染中の細胞間伝播速度に負の効果を与えたことを示唆する。図１０は、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルス（１０−１）及び親ウイルス（１０−２）のプラーク形態を示す。コンフルエント細胞単層を、０．１ＭＯＩのウイルスに感染させた。２時間後、細胞培養上清を取り除き、寒天重層をアプライした。３７℃で５日後にプラークを検出し、０．１％クリスタルバイオレットを使用して染色した。
【００６２】
組替えウイルスにおけるＧＦＰ挿入又はＥＳ４欠失のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を、ＭＡＲＣ−１４５細胞で１０代の連続継代（各継代は、７２時間のインキュベーション）をしている間、追跡した。継代１０のウイルスのＧＦＰ／ΔＥＳ４領域を配列決定した。意外にも、Ｎ末端１５９アミノ酸の欠失を経験した以前のＳＤ０１−０８−ＧＦＰウイルスとは異なり、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスのＧＦＰは、全長遺伝子として完全なままであり、ＥＳ４欠失は依然として存在していた。この結果は、ＥＳ４エピトープ領域の欠失が、挿入された外来遺伝子、ＧＦＰの安定性を向上させたことを示す。小集団の感染細胞がＧＦＰ関連蛍光を失ったことが識別された（図１１）。ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスの継代１０に感染させたＭＡＲＣ−１４５細胞のＧＦＰ発現が、１１−１に示されている。ＡｌｅｘｉＦｌｕｏｒ標識抗ヌクレオカプシドモノクローナル抗体、ＳＤＯＷ１７（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）で染色された同一ウイルス焦点が、１１−２に示されている。ＧＦＰ蛍光を失ったウイルスの集団が、円内に示されている。
【００６３】
ＧＦＰ／ΔＥＳ４領域の場合、本発明者らは、３回独立反復のＰＣＲ及び配列決定（順方向及び逆方向の両方）を実施した。従って、合計６つの配列を取得した。それらの配列の１つでは、ヌクレオチドＣ−２８９からＴ−２８９への突然変異が同定され、それは、ＧＦＰの９７位にアルギニンからシステインへのアミノ酸突然変異を引き起こし、ＧＦＰ関連蛍光を失った小集団の感染細胞に対応している可能性がある（図１２）。他の５つの配列では、突然変異は検出されなかった。図１２は、Ａｒｇ−９７変異ＧＦＰ遺伝子と比較した野生型ＧＦＰ遺伝子の電気泳動図を表す図である。ＧＦＰ挿入領域を、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスの細胞培養継代１０から配列決定した。アミノ酸は一文字コードで示されており、太字はＣＧＣ（Ａｒｇ）からＴＧＣ（Ｃｙｓ）への変異アミノ酸を示す。
【００６４】
ＥＳ４及びＧＦＰ抗原発現
ＥＳ４抗原は、以前に記述されている修飾方法（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を使用して、タンデムリピートＥＳ４エピトープとして発現させた。手短かに言えば、ＥＳ４エピトープ（ＳＤ０１−０８のＯＲＦ１ａのアミノ酸７３６〜７９０）の３つのコピーを、タンパク質発現ベクター、ｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に構築した。可動性ペプチドリンカー、ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣを、エピトープ間に付加して、エピトープ提示を支援した。２つの順方向プライマーがあった。順方向プライマー１、ｐＥＴ−ＥＳ４Ｆ１は、ＢｇｌＩＩ制限部位を含有していたが、リンカー配列は含有せず、一方、順方向プライマー２、ｐＥＴ−ＥＳ４Ｆ２は、ＢｇｌＩＩ制限部位だけでなくリンカー配列も含有していた。まず、ＥＳ４遺伝子断片を、順方向プライマー１及び逆方向プライマー、ｐＥＴ−ＥＳ４Ｒで増幅した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ−２８ａにクローニングした。このクローンを、ｐＥＴ−２８ａ−ＥＳ４（＋１）と命名した。ＥＳ４の第２のコピーを、順方向プライマー２及び逆方向プライマー、ｐＥＴ−ＥＳ４ＲでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴ−２８ａ−ＥＳ４（＋１）にクローニングした。ＥＳ４の第３のコピーを、第２のコピーと同じ戦略を使用して挿入した。最終構築体を、ｐＥＴ−２８ａ−ＥＳ４（＋３）と命名した。ＧＦＰ遺伝子を、プライマー対ｐＥＴ−ＥＧＦＰ−Ｆ／ｐＥＴ−ＥＧＦＰ−Ｒを用いて、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化したｐＥＴ−２８ａベクターにライゲーションした。組換えタンパク質を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、Ｎ末端に６個のヒスチジン残基を有する融合タンパク質を産生した。このタンパク質を、本発明者らの以前の論文（Ｆｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）に記述されるように、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００６５】
ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスのｉｎ  ｖｉｖｏ特徴付け
ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスのｉｎ  ｖｉｖｏ特徴を、育仔場ブタ疾患モデルで研究した。１８頭の４週齢ブタを、ＰＲＲＳＶ未感染群れから購入した。動物を、無作為に３群に分割（ｎ＝６／群）し、実験的接種開始前の順応期間を７日間としたＢＬ２隔離条件下で収容した。群１のブタをＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスに感染させ、群２のブタを陽性対照として親ＳＤ０１−０８ウイルスに感染させ、群３のブタを細胞培養培地で偽感染させた。群１及び群２のブタに、１×１０６５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）のウイルスを、鼻腔内及び筋肉内部位の両方を介して接種した（各部位について、１ｍｌ）。４２感染後日数（ｄｐｉ）時に、群１及び群２のブタを、異種性１型株、ＳＤ０３−１５ウイルスで負荷した。
【００６６】
ＳＤ０３−１５は、別の米国１型株であり、２００３年に本発明者らの診断実験室に提出された臨床試料から単離された。現地報告では、ＳＤ０３−１５に感染したブタは、３週間で８０〜９０％の離乳前死亡率を経験した。全身状態の低下は、終末期まで継続した。成体雌ブタの集団では、以前の米国ＰＲＲＳＶ流行と比較して軽度の流産急性発症があった。本発明者らの以前の実験動物研究は、このウイルスの病原性の性質も実証した（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｃｏｎｆ．Ｒｅｓ．Ｗｏｒｋ．Ａｎｉｍ．Ｄｉｓ．，ａｂｓｔｒ．９９，２００５）。
【００６７】
群３の３頭のブタをＳＤ０３−１５ウイルスで負荷し、他の３頭のブタを偽感染対照として残した。感染後の最初の７日間及び負荷後の最初の７日間、ブタの臨床的徴候及び体温を毎日観察した。異なる負荷群間の平均体温応答を比較した。直腸温を、負荷の１日前及び負荷７日後に測定した。初期感染後、温度上昇はいずれのブタでも検出されず、臨床的徴候は観察されなかった。負荷後、群３（初期偽感染）のこれら３頭の負荷したブタの直腸温が、負荷１日及び２日後に上昇した（図１３）。臨床的徴候（咳嗽及び鼻汁）も、これら３頭のブタで観察された。残りのブタは無症候性のままだった。血液試料を、全てのブタから週１回取得した。ブタを、負荷２１日後に安楽死させた。研究動物の肉眼的肺病変を、各葉が全肺に寄与する近似容積に基づく以前に開発した方式を使用して評価した：左及び右頂葉、左及び右心臓葉、及び各中葉は、各々全肺容積の１０％を寄与し、左及び右尾部側葉は各々２５％を寄与する。その後、これらのスコアを使用して、各葉の相対的寄与に基づく合計肺病変スコアを算出した（Ｈａｌｂｕｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）。剖検では、肉眼的な病理学的病変は、群１、群２、及び３頭の厳格な陰性対照ブタには観察されなかった。対照的に、ＰＲＲＳＶに特徴的な軽度の肉眼的な病理学的肺病変が、最初に偽感染させその後ＳＤ０３−１５で負荷した、群３のそれら３頭のブタに観察された。
【００６８】
ウイルス学的及び免疫学的特性
ｉｎ  ｖｉｖｏでのマーカーウイルスのウイルス学的及び免疫学的特性を決定した。図１４Ａ〜１４Ｃにおいて垂直の点線として示されているように、ブタを４２ｄｐｉで負荷した。ウイルス血症の期間及び高さをリアルタイムＰＣＲで決定し、その結果を、１ｍｌ当たりのＲＮＡコピー数として解釈した。感染後は毎日、異なる頭文字（Ａ、Ｂ、又はＣ）で示す平均ウイルス負荷は、有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。親ウイルスに感染した群２のブタと比較すると（ピーク平均ウイルス力価＝５．９×１０７コピー／ｍｌ）、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスに感染したブタは、より低いピークウイルス負荷を示した（ピーク平均ウイルス力価＝２．０８×１０５コピー／ｍｌ、図１４Ａ）。負荷後７日目では、ウイルス負荷は、最初に偽感染させその後ＳＤ０３−１５ウイルスで負荷したそれらのブタより、２から３ｌｏｇだけ低かった。負荷後２１日目までに、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスに感染した群のブタは、親群と比較して１０倍低いウイルス負荷を示し、３／５頭のブタは、血清中のウイルスを撲滅した（図１４Ａ；表６）。
【００６９】
表６．遺伝子的に異なる株、ＳＤ０３−１５での負荷後２１日目に定量ＰＣＲで測定した血清中のウイルス負荷
【表６】
2010531143.tif 000008
＊４２ｄｐｉに異種性株、ＳＤ０３−１５で負荷された陰性群のブタのうちの３頭。
【００７０】
１４ｄｐｉまでに、感染群のブタは全て血清転換した。ＰＲＲＳＶ特異的血清抗体を、ＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｋ（登録商標）ＰＲＲＳＶ  ＥＬＩＳＡ  ２ＸＲキットで測定した。０．４を超えるＳ／Ｐ比が、陽性とみなされる。抗体反応は、２１ｄｐｉ後、同じようなレベルに達した（図１４Ｂ）。
【００７１】
ウイルス中和抗体応答を、蛍光焦点中和アッセイによって決定した（図１４Ｃ）。結果をウイルス感染の９０％低減として解釈し、中和抗体力価を、ｌｏｇ２目盛りでの平均値（ｎ＝６）として表した。親ＳＤ０１−０８ウイルスを、ウイルス中和アッセイに使用した。感染後は毎日、異なる頭文字（Ａ、Ｂ、又はＣ）で示す平均は、有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。血清中和（ＳＮ）抗体レベルを更に測定すると、親ウイルスに感染したブタでは、感染後２１日目までに６頭中１頭のブタからＳＮ抗体が検出され、感染後３５日目までには、３／６頭のブタが、平均幾何平均力価（ＧＭＴ）が２に達した検出可能なＳＮ力価を示したことが示された。対照的に、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスで感染させたブタでは、より速くより高い中和抗体応答が発生した。感染後１４日目までに、６頭中１頭のブタからＳＮ抗体が検出され、ＳＮ力価は、この群にブタの全てから検出され、感染後３５日目までに平均ＧＭＴが９．２に達した。ＳＤ０３−１５で負荷した後、効果の増加が観察され、４９ｄｐｉ（負荷１週間後）では、親ウイルス感染群のＧＭＴが５．７であるのに対して、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルス感染群のＧＭＴは１８．４であった。両群は、６２ｄｐｉ（負荷３週間後）で同じようなＳＮ力価に達した（図１４Ｃ）。これらのデータは、初期感染においては、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスに感染したブタが、親ウイルスに感染したブタより高い中和抗体力価を発生させたことを示唆する。
【００７２】
ウイルス単離及び配列決定
７、１４、２１、及び２８ｄｐｉの血清試料を、以前の記述のようにウイルス単離に使用した（Ｗａｓｉｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ウイルスの存在を、ＰＲＲＳＶ特異抗体、ＳＤＯＷ１７を用いたＩＦＡで確認した（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＧＦＰ挿入及びＥＳ４エピトープ欠失の安定性を決定するために、ウイルスＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用し、血清単離ウイルスから抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを、以前に記述されている方法を使用して実施した（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＲＴ−ＰＣＲ増幅断片をゲル精製し、配列は、アイオワ大学配列決定所（Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）（エイムズ、米国アイオワ州）において決定された。プライマー対ｎｓｐ２−２１４４Ｆ／ｎｓｐ２−２６９４Ｒ（表５）をＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定に使用し、ＧＦＰ挿入及びＥＳ４欠失を含有するヌクレオチド領域（ＳＤ０１−０８ゲノムの２１４４から２６９４）を増幅した。ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスの全長配列は、配列番号４３に示されている（表７）。
【００７３】
ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性
ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーの安定性を決定するために、７から２８ｄｐｉまでの血清試料を、ＭＡＲＣ−１４５細胞でのウイルス単離に使用した。７、１４、及び２１ｄｐｉに収集した血清試料からウイルスを回収し、ウイルスは、２８ｄｐｉから収集した血清試料からは単離されなかった。細胞培養物中で、本発明者らは、７及び１４ｄｐｉから単離したウイルスを有する感染細胞の小集団が、弱いＧＦＰ蛍光を示すことのみを観察し、ＧＦＰ蛍光は、２１ｄｐｉから単離したウイルスを有する感染細胞では観察されなかった。しかしながら、ヌクレオカプシドタンパク質特異的モノクローナル抗体、ＳＤＯＷ１７を使用した免疫蛍光染色により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究で観察されたのと同様に、大集団のウイルスの存在が確認された（図１１）。ＧＦＰ挿入／ΔＥＳ４欠失の安定性を、対応する領域を配列決定することにより決定した。その結果により、ＥＳ４欠失が存在し、ＧＦＰは全長遺伝子として完全なままだったことが確認された。しかしながら、配列決定の結果により、ＧＦＰのヌクレオチド１４４（ＣからＴ）及びヌクレオチド２８９（ＣからＴ）に位置した２つの点突然変異が明らかになった。ヌクレオチド１４４突然変異はサイレントであったが、ヌクレオチド２８９突然変異は、ＧＦＰの９７位においてアルギニン（Ｒ）からシステイン（Ｃ）へのアミノ酸突然変異を引き起こし、それは本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ配列決定分析と一致する（図１２）。興味深いことには、７及び１４ｄｐｉから単離したウイルスには、非突然変異ＧＦＰ遺伝子の小集団が依然として検出された。各ｄｐｉについて、本発明者らは、３頭のブタから単離したウイルスを配列決定し、配列決定は順方向及び逆方向プライマーの両方を使用して実施し、その結果、各ｄｐｉにつき合計６つの配列がもたらされた。７ｄｐｉから単離したウイルスの場合、１／６の配列は、９７位に突然変異を有していないことが見出され、他の５つの配列は、ＲからＣへの突然変異を含有することが決定された。１４ｄｐｉから単離したウイルスの場合、２／６の配列で突然変異が同定されず、これらの２つの配列は２頭の異なるブタに由来していた。他の４つの配列でも、ＲからＣへの突然変異が含有されていると同定された。２１ｄｐｉのウイルスからもたらされた配列は全て、ＲからＣへの突然変異を含有していた。このデータは、ＧＦＰ蛍光が失われるのはＲからＣへの突然変異のためであるという以前の報告（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）と一致していた。小集団の非突然変異ＧＦＰが存在することは、弱い蛍光を発する細胞が細胞培養物中で観察されたことを説明するだろう。これらの結果は、選択が徐々に起こって、ウイルス複製の向上に好ましい突然変異が生じた可能性を示唆する。
【００７４】
ＧＦＰ及びＥＳ４エピトープに基づくＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ＨＢ９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製、フランクリン、米国マサチューセッツ州）を使用して実施した。組換えタンパク質を、コーティング緩衝液（１５ｍＭ炭酸ナトリウム−３５ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で希釈し、プレートのコラム１、３、５、７、９、及び１１を、１００μｌの希釈抗原でコーティングした。コラム２、４、６、８、１０、及び１２を、バックグラウンド対照として１００μｌのコーティング緩衝液で処理した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、その後、過剰のタンパク結合部位を、ＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有する１×ＰＢＳ）中の１０％ミルクで、終夜４℃でブロッキングした。試験血清を、５％ミルクを有するＰＢＳＴ緩衝液中に１：５希釈で添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗ブタＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、ゲーサーズバーグ、米国メリーランド州）を、プレート上の抗原に結合している任意のＰＲＲＳＶ血清抗体に結合させるために添加した。プレートを３７℃で更に１時間インキュベートし、洗浄し、ペルオキシダーゼ基質ＡＢＴ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、ゲーサーズバーグ、米国メリーランド州）を、発色のために添加した。発色は、ＸＣｈｅｋソフトウェア（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）によって制御されたＥＬ８００マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．社製、ウィヌースキー、米国バーモント州）を用いて、４０５ｎｍで読み込むことにより定量化した。
【００７５】
携帯鑑別診断アッセイを、マーカーワクチンで予防接種を受けた動物と、野外ウイルスに自然感染した動物とを区別するために開発した。２つのマーカー、ＧＦＰ挿入（陽性マーカー）及びＥＳ４欠失（陰性マーカー）を使用したため、本発明者らは、ＧＦＰ及びＥＳ４エピトープ両方に基づくＥＬＩＳＡアッセイをマーカー検出のために開発した。ＧＦＰ及びＥＳ４エピトープの両方は、可溶性組換えタンパク質として発現された。本発明者らは、特異的抗体検出用のこれら２つのＥＬＩＳＡ検査を評価した。図１５Ａは、ＥＳ４エピトープに基づくＥＬＩＳＡからの結果を示し、図１５Ｂは、ＧＦＰ抗原に基づくＥＬＩＳＡからの結果を示す。図１５Ａにおいて垂直の点線として示されているように、ブタを感染後４２日目に負荷した。予想した通り、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスでの群１ブタの感染は、欠失ＥＳ４エピトープに対する検出可能な抗体応答を誘導しなかったが（図１５Ａ）、ＧＦＰ抗原に対する強い抗体応答を誘導し、それは１４ｄｐｉから始まり、６２ｄｐｉまでの研究期間中継続した（図１５Ｂ）。対照的に、親ウイルスに感染した群２ブタでは、ＥＳ４組換えタンパク質に特異的な抗体を２１ｄｐｉで検出することができ、これも６２ｄｐｉまで続いたが（図１５Ａ）、ＧＦＰ抗原に対する特異的抗体応答は検出されなかった（図１５Ｂ）。０３−１５ウイルスはＥＳ４エピトープを含有しているため、０３−１５で負荷された後、群１ブタは、ＥＳ４エピトープに対する検出可能な抗体反応を負荷１週間後に示した（図１５Ａ）。３頭の厳格な陰性対照ブタに由来する血清試料についての特異的抗体応答は、ＧＦＰ及びＥＳ４エピトープの両方に基づくＥＬＩＳＡでは、検出されなかった（図１５Ａ及び１５Ｂ）。
【００７６】
他の１型及び２型ＰＲＲＳＶ罹患動物に由来する血清試料
陰性マーカーの基本的な必要条件は、抗原性領域が、多岐にわたる野外ウイルスと反応可能であるべきだということである。ＥＳ４エピトープが種々のウイルス株において反応性であり得ることを保証するために、本発明者らは、米国１型ウイルス、ＳＤ０１−０７、ＳＤ０１−０８、ＳＤ０２−１１、及びＳＤ０３−１５の４つの代表的な株の各々で感染させたブタに由来する血清試料を使用した（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｃｏｎｆ．Ｒｅｓ．Ｗｏｒｋ．Ａｎｉｍ．Ｄｉｓ．，ａｂｓｔｒ．９９，２００５）。ＳＤ０１−０７及びＳＤ０１−０８分離株を、臨床的疾患を示していない群れから取得し、ＳＤ０２−１１及びＳＤ０３−１５を、若いブタで相当の罹患率及び死亡率を示す群れから取得した。これらの４つの分離株も、米国起源の１型ＰＲＲＳＶ分離株用に作成された系統樹の異なる分岐に分類される（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。２型ウイルス、ＶＲ２３３２に感染した実験ブタに由来する血清試料を、ＰＲＲＳＶ共同農業プロジェクト（ＰＲＲＳＶ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ＣＡＰ）の共有試薬資産から取得した。図１５Ｃに示されるように、ＥＳ４エピトープは、これら４つのウイルス株に感染したブタに由来する抗血清と全て反応した。結果は、平均値（ｎ＝６）として示されている。抗体反応は、１４ｄｐｉまでに検出され、６２ｄｐｉを越えて続いた。しかしながら、２型原型株、ＶＲ２３３２に感染した実験ブタの群に由来する血清試料を更に検査すると、ＥＬＩＳＡではＥＳ４エピトープと反応しないことが示された（データ非表示）。従って、１型ウイルスに感染した動物と、２型ウイルスに感染したそれらの動物とを区別するためには、別の血清学的検査が必要とされるだろう。
【００７７】
ＩＩＩ．考察
ＰＲＲＳウイルスのｎｓｐ２領域の２つの遺伝子マーカーを構築した。陽性マーカー（ＧＦＰ挿入）は、予防接種を受けた動物の検出を可能にし、陰性マーカー（ＥＳ４エピトープ欠失）は、動物における野生型ウイルスの存在を検出可能にする。従来の多重細胞培養継代技術によって調製されたＭＬＶと比較すると、このタイプの厳密に定義された弱毒化欠失／挿入を使用して構築したワクチン、及び逆遺伝学技術の使用は、有毒な野生型ウイルスへの復帰変異の潜在的リスクを低減する。
【００７８】
マーカーワクチンは、予防接種レベルをモニターし、感染の空間的経過を追跡するための好適な検査（携帯診断検査）が利用可能な場合にのみ、有用である。ＧＦＰ抗原に基づくＥＬＩＳＡは、マーカーウイルスに感染したブタの群に高レベルの抗ＧＦＰ応答を検出した。ＥＳ４エピトープに基づくＥＬＩＳＡも、親ウイルスに感染したブタの群に高レベルの抗体応答を検出したが、抗ＧＦＰ応答のＥＬＩＳＡより遅延して発色すると考えられる。マーカーウイルスに感染したブタにおける高レベルの堅牢な抗ＧＦＰ応答は、１４ｄｐｉまでに検出することができるが、野生型ウイルスに感染したブタにおける抗ＥＳ４抗体応答は、２１ｄｐｉまでに検出され、２８ｄｐｉまでにより高いレベルに達した。ＥＳ４エピトープは、１型ウイルスのｎｓｐ２に同定された（Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）６つのＢ細胞エピトープ中最も高い親水性値（Ｈｏｐｐ  ＆  Ｗｏｏｄｓ，１９８１）を有する。現在入手可能な１型ＰＲＲＳＶのｎｓｐ２アミノ酸配列（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００７）を分析することにより、この領域は、１型遺伝子型内で６３．６％から１００％のアミノ酸配列同一性を有することが示された。タンパク質配列分析により、ＥＳ４エピトープ領域、ＡＡ７３６〜ＡＡ７９０は、実際に７つの小さなＢ細胞エピトープを含有していることが示された（Ｐｅｐ  Ｔｏｏｌ、Ｂｉｏ  Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．社製、エドモントン、アルバータ州、カナダ）。エピトープＡＡ７４５〜ＡＡ７５４及びＡＡ７６８〜ＡＡ７８０は、１型遺伝子型内によく保存されている。本発明者らのＥＳ４  ＥＬＩＳＡデータは、タンパク質配列分析と一致し、ＥＳ４エピトープが、１型ＰＲＲＳＶの４つの代表的な野外株に感染した動物に由来する血清試料と反応することができることを示した。しかしながら、ＥＳ４エピトープは、２型分離株に感染した動物に由来する血清試料とは反応しない。ｎｓｐ２領域で同定されたＢ細胞エピトープを比較すると、ｎｓｐ２領域で同定されたエピトープはいずれも、１型及び２型分離株間で保存されなかった。従って、ＥＳ４エピトープ欠損変異株で予防接種されたブタと、２型野外株に感染したブタとを区別するためには、別の診断アッセイが必要である。
【００７９】
ｎｓｐ２領域のＥＳ４エピトープは、ＰＲＲＳＶ複製に必須ではないと考えられるが、ウイルス弱毒化及び病原性にｉｎ  ｖｉｖｏで重要な役割を果たしている可能性がある。しかしながら、ＧＦＰの下流にあるＥＳ４エピトープが欠失し、ウイルス力価が、親ウイルスの力価と比較して少なくとも２ｌｏｇだけ低減した場合、ＧＦＰ挿入だけでは、ウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖特性を実質的に低減しなかった。プラーク形態は、マーカーがウイルス増殖に負の効果を与えることも実証した。ｉｎ  ｖｉｖｏ特徴付けにより、ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルスは、野生型ウイルスより低いレベルのウイルス血症及び高いレベルの中和抗体応答で弱毒化されたことが更に実証された。タンパク質配列分析は、ＥＳ４エピトープ領域が、ｎｓｐ２で最も高い親水性値を有することを示した（Ｈｏｐｐ  ＆  Ｗｏｏｄｓ，１９８１）。
【００８０】
意外にも、ＥＳ４エピトープ欠失は、ｎｓｐ２におけるＧＦＰ挿入の安定性を向上させた。別の興味深い知見は、ＧＦＰ遺伝子は完全なままだったにもかかわらず、ＧＦＰ蛍光がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで失われたことである。配列分析により、Ａｒｇ−９７からＣｙｓへの突然変異がＧＦＰで同定された。Ａｒｇ−９７からＣｙｓへの突然変異は、２型ウイルスのｎｓｐ２領域に挿入されたＧＦＰに同定されたアミノ酸突然変異とまさに同一である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７によって示されているように、そのＡｒｇ−９７はＧＦＰの発色団形成に重要な役割を果たし、発色団形成がｎｓｐ２の機能に影響を与える可能性を示唆する。更に、Ｃｙｓは、通常、タンパク質のジスルフィド結合の形成に関与するアミノ酸であるため、ｎｓｐ２が機能するための正しい立体配座を維持するのに、追加的なジスルフィド結合が必要とされている可能性がある。それでもやはり、ＧＦＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでその免疫原性を保持しており、予防接種を受けた動物と、野生型ウイルスに感染した動物とを区別するための優れた陽性マーカーとして機能する。
【００８１】
この明細書中の出版物及び特許出願は全て、本発明が関する当業者レベルを示す。出版物及び特許出願は全て、あたかも個々の出版物又は特許出願が参照により具体的に及びに個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００８２】
本発明は、種々の実施形態及び技術に関して記述されている。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲内にありながらも、多数の変更及び改変がなされ得ることは理解されるべきである。
【００８３】
表７  ＧＦＰ／ΔＥＳ４マーカーウイルス全長配列（配列番号４３）
【表７】
2010531143.tif 000009
2010531143.tif 000010
2010531143.tif 000011
2010531143.tif 000012
2010531143.tif 000013
【００８４】
参考文献
１．  Ａｌｌｅｎｄｅ，  Ｒ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｔ．  Ｌ．，  Ｌｕ，  Ｚ．，  Ｒｏｃｋ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｋｕｔｉｓｈ，  Ｇ．  Ｆ．，  ＡＩｉ，  Ａ．，  Ｄｏｓｔｅｒ，  Ａ．  Ｒ．  ＆  Ｏｓｏｒｉｏ，  Ｆ．  Ａ．  （１９９９）．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｄｉｆｆｅｒ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０，  ３０７−３１５．
２  Ｂａｂｉｕｋ，  Ｌ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｊ．，  Ｓｕｒａｄｈａｔ，  Ｓ．，  Ｂａｃａ−Ｅｓｔｒａｄａ，  Ｍ．，  Ｆｏｌｄｖａｒｉ，  Ｍ．  ＆  Ｂａｂｉｕｋ，  Ｓ．  （１９９９）．  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７３，  １３１−１４０．
３．  Ｂａｂｉｕｋ，  Ｌ．  Ａ．  （１９９９）．  Ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １７，  １５８７−１５９５．
４．  Ｂａｂｉｕｋ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｂａｂｉｕｋ，  Ｓ．  Ｌ．  ＆  Ｂａｃａ−Ｅｓｔｒａｄａ，  Ｍ．  Ｅ．  （２００２）．  Ｎｏｖｅｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．  Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ５８，  ２９−８０．
５．  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｔ．，  Ｐａｒｉｄａ，  Ｓ．，  Ｍｏｈａｐａｔｒａ，  Ｍ．，  Ｗａｌｓｈ，  Ｐ．，  Ｄａｓ，  Ｓ．  ＆  Ｂａｒｏｎ，  Ｍ．  Ｄ．  （２００３）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １１４，  ８９−９７．
６．  Ｂａｕｔｉｓｔａ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｓ．  Ｍ．  Ｇｏｙａｌ，  Ｉ．  Ｊ．  Ｓｏｏｎ，  Ｈ．  Ｓ．  Ｊｏｏ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ．  １９９６．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  （ＶＲ−２３３２）  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  １４１  ：１３５７−１３６５．
７．  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｅ．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｌ．  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｇｏｙａｌ，  Ｄ．  Ｒｏｂｉｓｏｎ，  Ｗ．  Ｔ．  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，  Ｒ．  Ｂ．  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｄ．  Ｇｏｒｃｙｃａ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｃｈｌａｄｅｋ．  １９９２．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｉｎｅ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＳＩＲＳ）  ｖｉｒｕｓ  （ｉｓｏｌａｔｅ  ＡＴＣＣ  ＶＲ−２３３２）．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ４：１２７−１３３．
８．  Ｂｏｓｃｈ，  Ｊ．  Ｃ，  Ｋａａｓｈｏｅｋ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｋｒｏｅｓｅ，  Ａ．  Ｈ．  ＆  Ｖａｎ  Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，  Ｊ．  Ｔ．  （１９９６）．  Ａｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｍａｒｋｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｈａｎ  ｔｗｏ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５２，  ２２３−２３４．
９．  Ｃａｌｖｅｒｔ，  Ｊ．  Ｇ．，  Ｍ．  Ｇ．  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｋ．  Ｗ．  Ｗｅｌｃｈ．  ２００３．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＰＲＲＳ）  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ．  米国特許出願第２００３０１５７６８９号。
１０．  Ｃａｌｖｅｒｔ，  Ｊ．  Ｇ．，  Ｍ．  Ｇ．  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｋ．  Ｗ．  Ｗｅｌｃｈ．  ２００２．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＰＲＲＳ）  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ．  米国特許第６，５００，６６２号。
１１．  Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｏｌｉｖａｒｅｓ，  Ｊ．，  Ｗｉｅｒｉｎｇａ，  Ｒ．  Ｔ．，  Ｂａｋｏｎｙｉ，  Ａ．  Ａ．  Ｆ．，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，  Ｎ．  Ｊ．，  Ｐｏｙｎｅｒ，  Ｄ．  ＆  Ｒｏｔｔｉｅｒ，  Ｐ．  Ｊ．  Ｍ．  （２００３）．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｌｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｅｑｕｉｎｅ  ａｒｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，  ８４７０−８４８０．
１２．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｄ．  Ａ．  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ，  Ｗ．  Ｔ．  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，  Ｌ．  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｄ．  Ｐ．  Ｓｈａｗ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｇｏｙａｌ，  Ｄ．  Ｇｏｒｃｙｃａ，  Ｄ．  Ｃｈｌａｄｅｋ，  Ｓ．  ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ，  Ｒ．  Ｂ．  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓ．  Ｊｏｏ．  １９９２．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｉｎｅ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  （Ｉｓｏｌａｔｅ  ＡＴＣＣ  ＶＲ−２３３２）  ｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ  ｐｉｇｓ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ４：１１７−１２６．
１３．  ｄｅｎ  Ｂｏｏｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｋ．  Ｓ．  Ｆａａｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｍ．  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，  Ａ．  Ｌ．  Ｍ．  Ｗａｓｓｅｎａａｒ，  Ｐ．  Ｇ．  Ｗ．  Ｐｌａｇｅｍａｎｎ，  Ａ．  Ｅ．  Ｇｏｒｂｅｌｅｎｙａ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｊ．  Ｓｎｉｊｄｅｒ．  １９９５．  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ＯＲＦＩａ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐａｐａｉｎｌｉｋｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６９：４５００−４５０５．
１４．  ｄｅ  Ｌｉｍａ，  Ｍ．，  Ｐａｔｔｎａｉｋ，  Ａ．  Ｋ．，  Ｆｌｏｒｅｓ，  Ｅ．  Ｆ．  ＆  Ｏｓｏｒｉｏ，  Ｆ．  Ａ．  （２００６）．  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｂ−  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  Ｎｓｐ２  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３，  ４１０−４２１．
１５．  Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  Ｄ．  −Ｙ．  Ｋｉｍ，  Ｓ．  Ｒｏｐｐ，  Ｐ．  Ｓｔｅｅｎ，  Ｊ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｅ．Ａ．  Ｎｅｌｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｒ．  Ｒ．  Ｒｏｗｌａｎｄ．  ２００４．  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  Ｎｓｐ２  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  １００：２２９−２３５．
１６．  Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  Ｒｏｗｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｒ．  Ｒ．，  Ｒｏｏｆ，  Ｍ．，  Ｌｕｎｎｅｙ，  Ｊ．  Ｋ．，  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｊ．  ＆  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｅ．  Ａ．  （２００６）．  Ａ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  １  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ：  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｓｐ２  ｒｅｇｉｏｎ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０，  １１４４７−１１４５５．
１７．  Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｐ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．  Ｐ．，  Ｆａａｂｅｒｇ，  Ｋ．，  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｅ．  Ａ．  ＆  Ｒｏｗｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｒ．  Ｒ．  （２００７）．  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗｌｙ  ｅｍｅｒｇｅｄ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  １  ｐｏｒｃｉｎｅ  ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ．  Ａ  ｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５２，  １００９−１０１７．
１８．  Ｆｅｒｒｉｎ，  Ｎ．  Ｈ．，  Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｃ．  Ｒ．，  Ｍｕｒｔａｕｇｈ，  Ｍ．  Ｐ．，  Ｐｏｉｓｏｎ，  Ｄ．  Ｄ．，  Ｔｏｒｒｅｍｏｒｅｌｌ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  ＣＨｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍ  １１，  ５０３−５１４．
１９．  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｂｒａｎｓｏｎ，  Ｅ．  Ｄ．  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｎ．  （１９９６）．  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １２，  ９９．
２０．  Ｆｌｏｅｇｅｌ−Ｎｉｅｓｍａｎｎ，  Ｇ．  （２００３）．  Ｍａｒｋｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １１４，  １８５−１９１．
２１．  Ｆｒｉａｓ−Ｓｔａｈｅｌｉ，  Ｎ．，  Ｇｌａｎｎａｋｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｎ．  Ｖ．，  Ｋｌｋｋｅｒｔ，  Ｍ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｂｒｉｄｇｅｎ，  Ａ．，  Ｐａｒａｇａｓ，  Ｊ．，  Ｒｉｃｈｔ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｒｏｗｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｒ．  Ｒ．，  Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｓｎｉｊｄｅｒ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，  Ａ．  ＆  Ｖｉｒｇｉｎ，  Ｈ．  Ｗ．  （２００７）．  Ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｄｏｍａｉｎ−  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｅｖａｄｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−  ａｎｄ  ＩＳＧ１５−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ２，  ４０４−４１６．
２２．  Ｇａｏ，  Ｚ．  Ｑ．，  Ｘ．  Ｇｕｏ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｃ．  Ｙａｎｇ．  ２００４．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  １４９：１３４１−１３５１．
２３．  Ｇａｒｒｉｔｙ，  Ｒ．  Ｒ．，  Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ，  Ｇ．，  Ｍｉｎａｓｓｉａｎ，  Ａ．，  Ｔｓａｉ，  Ｗ．  Ｐ．，  Ｌｉｎ，  Ｇ．，  ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  Ｊ．，  Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，  Ｊ．  ＆  Ｎａｒａ，  Ｐ．  （１９９７）．  Ｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄａｍｐｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５９，  ２７９−２８９．
２４．  Ｈａｌｌ，  Ｂ．  Ｆ．  ＆  Ｊｏｉｎｅｒ，  Ｋ．  Ａ．  （１９９１）．  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｏｆ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｖａｄｉｎｇ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １２，  Ａ２２．
２５．  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｎ．，  Ｗｅｌｓｃｈｏｆ，  Ｍ．，  Ｚｅｗｅ，  Ｍ．，  Ｂｒａｕｎａｇｅｌ，  Ｍ．，  Ｄｕｂｅｌ，  Ｓ．，  Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，  Ｆ．  ＆  Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｍ．  （１９９４）．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＤＲ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７，  ３１０，  ３１２，  ３１４−３１５．
２６．  Ｈａｌｂｕｒ，  Ｐ．  Ｇ．，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｕｌ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｆｒｅｙ，  Ｊ．  Ｌａｎｄｇｒａｆ，  Ｋ．  Ｅｅｒｎｉｓｓｅ，  Ｘ．−Ｊ．  Ｍｅｎｇ，  Ｍ．  Ａ．  Ｌｕｍ，  Ｊ．  Ｊ．  Ａｎｄｒｅｗｓ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ａ．  Ｒａｔｈｊｅ．  １９９５．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｕ．Ｓ．  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｅｔ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３２：６４８−６６０．
２７．  Ｈａｎ，  Ｊ．，  Ｌｉｕ，  Ｇ．，  Ｗａｎｇ，  Ｙ．  ＆  Ｆａａｂｅｒｇ，  Ｋ．  Ｓ．  （２００７）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｓｐ２  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＶＲ−２３３２  ｆｏｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１，  ９８７８−  ９８９０．
２８．  Ｈｏ，  Ｓ．  Ｎ．，  Ｈ．  Ｄ．  Ｈｕｎｔ，  Ｒ．  Ｍ．  Ｈｏｒｔｏｎ，  Ｊ．  Ｋ．  Ｐｕｌｌｅｎ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｒ．  Ｐｅａｓｅ．  １９８９．  Ｓｉｔｅ−  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅ．  ７７：５１−５９．
２９．  Ｈｏｐｐ，  Ｔ．  Ｐ．  ＆  Ｗｏｏｄｓ，  Ｋ．  Ｒ．  （１９８１）．  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７８，  ３８２４−３８２８．
３０．  Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ，  Ｔ．，  Ｄ．  Ｍｏｇｅｎｓ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｓ．  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ．  １９９７．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｏｎ−ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ’ｅｎｄ  ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ．’  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：４８−５２．
３１．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｃ．  Ｒ．，  Ｙｕ，  Ｗ．  ＆  Ｍｕｒｔａｕｇｈ，  Ｍ．  （２００７）．  Ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｎｓｐｌ  ａｎｄ  ｎｓｐ２  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８８，１１８４−１１９５．
３２．  Ｋｅｆｆａｂｅｒ，  Ｋ．  Ｋ．  １９８９．  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  ｕｎｋｎｏｗｎ  ｅｔｉｏｌｏｇｙ．  Ａｍ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｓｗｉｎｅ  Ｐｒａｃｔ．  Ｎｅｗｓｌ．  １  ：１−９．
３３．  Ｋｉｍ，  Ｄ．  Ｙ．，  Ｃａｌｖｅｒｔ，  Ｊ．  Ｇ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｋ．  Ｏ．，  Ｈｏｒｌｅｎ，  Ｋ．，  Ｋｅｒｒｉｇａｎ，  Ｍ．，  Ｒｏｗｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｒ．  Ｒ．  （２００７）．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｔａｇｓ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｎｓｐ２  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  （ＰＲＲＳＶ）．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２８，  １０６−  １１４．
３４．  Ｋｉｎｇ，  Ｎ．  Ｊ．  ＆  Ｋｅｓｓｏｎ，  Ａ．  Ｍ．  （２００３）．  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｈｏｓｔ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８１，  ２０７−  ２１６．
３５．  Ｋｏｎｉｇ，  Ｐ．，  Ｂｅｅｒ，  Ｍ．，  Ｍａｋｏｓｃｈｅｙ，  Ｂ．，  Ｔｅｉｆｋｅ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｐｏｌｓｔｅｒ，  Ｕ．，  Ｇｉｅｓｏｗ，  Ｋ．  ＆  Ｋｅｉｌ，  Ｇ．  Ｍ．  （２００３）．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｍａｒｋｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２，  ２０２−２１２．
３６．  Ｍａｒｄａｓｓｉ，  Ｈ．，  Ｂ．  Ｍａｓｓｉｖｅ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｄｅａ．  １９９６．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＯＲＦｓ  ５  ｔｏ  ７  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２１  ：９８−ｌ  １２．
３７．  Ｍａｒｒａｃｋ，  Ｐ．  ＆  Ｋａｐｐｌｅｒ，  Ｊ．  （１９９４）．  Ｓｕｂｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．  Ｃｅｌｌ  ７６，  ３２３．
３８．  Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ，  Ｔ．，  Ｋｏｏｌｅｎ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｍ．，  ｄｅ  Ｖａａｎ，  Ｌ．  Ｔ．  Ｃ，  ｄｅ  Ｈａａｓ，  Ｎ．，  Ｂｒａｂｅｒ，  Ｍ．，  Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ，  Ａ．，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ，  Ｐ．  ＆  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａｒｅｌ，  Ｐ．  （２００２）．  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｍａｒｋｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ：  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ＮＤＶ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｒ  ｒｅｐｌａｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６，  １０１３８−  １０１４６．
３９．  Ｍｅｎｇ，  Ｘ．  Ｊ．，  Ｐ．  Ｓ．  Ｐａｕｌ，  Ｉ．  Ｍｏｒｏｚｏｖ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｇ．  Ｈａｌｂｕｒ．  １９９６．  Ａ  ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｏｒ  ｓｅｖｅｎ  ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  ｍＲＮＡｓ  ｉｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：１２６５−  １２７０．
４０．  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｊ．  Ｎ．  Ｂｏｓ−ｄｅ  Ｒｕｉｊｔｅｒ，  Ｒ．  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｇｒａａｆ，  Ｇ．  Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｍｏｏｒｍａｎｎ．  １９９８．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：３８０−３８７．
４１．  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ−ｄｅｎ  Ｂｅｓｔｅｎ．  １９９６．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｘｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ：  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＧＰ２  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＯＲＦ２  ｉｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２５：４４−５１．
４２．  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｍ．，  Ａ．  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ−ｄｅｎ  Ｂｅｓｔｅｎ，  Ｅ．  Ｐ．  ｄｅ  Ｋｌｕｙｖｅｒ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｍ．  Ｍｏｏｒｍａｎｎ，  Ｗ．  Ｍ．  Ｍ．  Ｓｃｈａａｐｅｒ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ．  １９９５．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＯＲＦｓ  ２  ｔｏ  ７  ｏｆ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０６：１５５−１６３．
４３．  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｍ．  Ｍ．  Ｈｕｌｓｔ，  Ｅ．  Ｊ．  ｄｅ  Ｍｅｉｊｅｒ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｍｏｏｎｅｎ，  Ａ．  ｄｅｎ  Ｂｅｓｔｅｎ，  Ｅ．  Ｐ．  ｄｅ  Ｋｌｕｙｖｅｒ，  Ｇ．  Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｊ．  Ｍｏｏｒｍａｎｎ．  １９９３．  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ，  ｔｈｅ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ａｂｏｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＰＥＡＲＳ），  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ＬＤＶ  ａｎｄ  ＥＡＶ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９２：６２−７２．
４４．  Ｍｏｒａｄｐｏｕｒ，  Ｄ．，  Ｍ．  Ｊ．  Ｅｖａｎｓ，  Ｒ．  Ｇｏｓｅｒｔ，  Ｚ．  Ｙｕａｎ，  Ｈ．  Ｅ．  Ｂｌｕｍ，  Ｓ．  Ｐ．  Ｇｏｆｆ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｍ．  Ｒｉｃｅ．  ２００４．  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｏ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５  Ａ  ａｌｌｏｗｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：７４００−７４０９．
４５．  Ｍｏｕｎｉｒ，  Ｓ．，  Ｈ．  Ｍａｒｄａｓｓｉ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｄｅａ．  １９９５．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓ  ＯＲＦｓ  ７，  ５  ａｎｄ  ４  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ８０：３１７−３２０．
４６．  Ｎａｒａ，  Ｐ．  Ｌ．，  Ｓｍｉｔ，  Ｌ．，  Ｄｕｎｌｏｐ，  Ｎ．，  Ｎａｔｃｈ，  Ｗ．，  Ｍｅｒｇｅｓ，  Ｍ．，  Ｗａｔｅｒｓ，  Ｄ．，  Ｋｅｌｌｉｈｅｒ，  Ｊ．，  Ｇａｌｌｏ，  Ｒ．  Ｃ，  Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ，  Ｐ．  Ｊ．  ＆  Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，  Ｊ．  （１９９０）．  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｖ３  −ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ＩＩＩＢ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６４，  ３７７９−  ３７９１．
４７．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｅ．  Ａ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｔ．  Ｄｒｅｗ，  Ｇ．  Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，  Ｊ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ａ．  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ．  １９９３．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３１  ：３１８４−３１８９．
４８．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｅ．  Ａ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ａ．  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ．  １９９５．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  （ＰＲＲＳＶ）．  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ３８０：３２１−３２３．
４９．  Ｎｅｌｓｅｎ，  Ｃ．  Ｊ．，  Ｍｕｒｔａｕｇｈ，  Ｍ．  Ｐ．  ＆  Ｆａａｂｅｒｇ，  Ｋ．  Ｓ．  （１９９９）．  Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ：  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｗｏ  ｃｏｎｔｉｎｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３，  ２７０−２８０．
５０．  Ｎｅｕｍａｎｎ，  Ｅ．  ２００５．  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｎ  ｓｗｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．  ＪＡＶＭＡ，  ２２７：３８５−３９２．
５１．  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｈ．  Ｓ．，  Ｇ．−Ｐ．  Ｌｉｕ，  Ｊ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｍ．  Ｂ．  Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ，  Ａ．  Ｂｏｔｎｅｒ，  Ｔ．  Ｓｔｏｒｇａａｒｄ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｓ．  Ｆａａｂｅｒｇ．  ２００３．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  ＶＲ−２３３２，  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ−ｔｙｐｅ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：３７０２−３７１１．
５２．  Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ，  Ｍ．Ｂ．，  Ａ．  Ｂｏｔｎｅｒ，  Ｐ．  Ｔｏｆｔ，  Ｐ．  Ｎｏｒｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｓｔｏｒｇａａｒｄ．  ２００１．  Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：  ｔｈｅ  ｎｓｐ２  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：３２７７−３２９０．
５３．  Ｒｏｐｐ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｃ．  Ｅ．  Ｍａｈｌｕｍ  Ｗｅｅｓ，  Ｙ．  Ｆａｎｇ，  Ｅ．  Ａ．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｋ．  Ｄ．  Ｒｏｓｓｏｗ，  Ｍ．  Ｂｉｅｎ，  Ｂ．  Ａｒｎｄｔ，  Ｓ．  Ｐｒｅｓｚｌｅｒ，  Ｐ．  Ｓｔｅｅｎ，  Ｊ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｄ．  Ａ．  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｓ．  Ｆａａｂｅｒｇ．  ２００４．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ−ｌｉｋｅ  ＰＲＲＳＶ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：３６８４−３７０３．
５４．  Ｓｈｅｎ，  Ｓ．，  Ｊ．  Ｋｗａｎｇ，  Ｗ．  Ｌｉｕ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｘ．  Ｌｕｉ．  ２０００．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｓｐ２  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  １４５：８７１−８８３．
５５．  Ｓｎｉｊｄｅｒ，  Ｅ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊ．  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ．  １９９８．  Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：９６１−９７９．
５６．  Ｓｎｉｊｄｅｒ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ａ．  Ｌ．  Ｍ．  Ｗａｓｓｅｎａａｒ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｐａａｎ．  １９９４．  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ＯＲＦＩａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｅｑｕｉｎｅ  ａｒｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６８：５７５５−５７６４．
５７．  Ｓｎｉｊｄｅｒ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｗａｓｓｅｎａａｒ，  Ａ．  Ｌ．  Ｍ．，  Ｓｐａａｎ，  Ｗ．  Ｊ．  ＆  Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ，  Ａ．  Ｅ．  （１９９５）．  Ｔｈｅ  ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ  Ｎｓｐ２  ｐｒｏｔｅａｓｅ．  Ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｔｏ  ｂｏｔｈ  ｐａｐａｉｎ−  ｌｉｋｅ  ａｎｄ  ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０，  １６６７１−１６６７６．
５８．  Ｓｕｎ，  Ｔ．，  Ｌｕ，  Ｐ．  ＆  Ｗａｎｇ，  Ｘ．  （２００４）．  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ＡＢＣ  ｏｆ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１９，  ７９−８６．
５９．  Ｔｉａｎ，  Ｋ．，  Ｙｕ，  Ｘ．，  Ｚｈａｏ，  Ｔ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｙ．，  Ｃａｏ，  Ｚ．，  Ｗａｎｇ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆａｔａｌ  ＰＲＲＳＶ  ｖａｒｉａｎｔｓ：  ｕｎｐａｒａｌｌｅｌｅｄ  ｏｕｔｂｒｅａｋｓ  ｏｆ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ＰＲＲＳ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｉｑｕｅ  ｈａｌｌｍａｒｋ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２，  ５２６．
６０．  Ｔｒｕｏｎｇ  Ｈ．  Ｍ．，  Ｚ．  Ｌｕ，  Ｇ．  Ｋｕｔｉｓｈ，  Ｊ．  Ｇａｌｅｏｔａ，  Ｆ．  Ａ．  Ｏｓｏｒｉｏ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｋ．  Ｐａｔｔｎａｉｋ．  ２００４．  Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｒｅｔａｉｎｓ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒｅｎｔａｌ  ｓｔｒａｉｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ３２５：３０８−３１９．
６１．  ｖａｎ  Ｄｉｎｔｅｎ，  Ｌ．  Ｃ，  Ａ．  Ｌ．  Ｗａｓｓｅｎａａｒ，  Ａ．  Ｅ．  Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ，  Ｗ．  Ｊ．  Ｓｐａａｎ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｊ．  Ｓｎｉｊｄｅｒ．  １９９６．  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｑｕｉｎｅ  ａｒｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ＯＲＦ１ｂ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｖｉｒａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：６６２５−６６３３．
６２．  ｖａｎ  Ｇｅｎｎｉｐ，  Ｈ．  Ｇ．，  Ｂｏｕｍａ，  Ａ．，  ｖａｎ  Ｒｉｊｎ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏ  Ｍ．  Ｎ．  ＆  Ｍｏｏｒｍａｎｎ，  Ｒ．  Ｊ．  （２００２）．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  （ＣＳＦ）  ｂｙ  ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ（ｒｎｓ）  ｏｒ  Ｅ２  ｏｆ  ＣＳＦＶ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０，  １５４４−１５５６．
６３．  ｖａｎ  Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，  Ｊ．  Ｔ．  （２００１）．  Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｖｅｔ．  Ｑｕａｒｔ  ２３，  １００−１０８．
６４．  ｖａｎ  Ｏｉｒｓｃｈｏｔ，  Ｊ．  Ｔ．，  Ｋａａｓｈｏｅｋ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｒｉｊｓｅｗｉｊｋ，  Ｆ．  Ａ．  ＆  Ｓｔｅｇｅｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．  （１９９６）．  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍａｒｋｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ＡＡ，  ７５−  ８１．
６５．  Ｖｉｊａｙａｋｒｉｓｈａｎａｎ，  Ｌ．，  Ｋｕｍａｒ，  Ｖ．，  Ａｇｒｅｗａｌａ，  Ｊ．  Ｎ．，  Ｍｉｓｈｒａ，  Ｇ．  Ｃ．  ＆  Ｒａｏ，  Ｋ．  Ｖ．  （１９９４）．  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３，  １６１３−１６２５．
６６．  Ｗａｌｓｈ，  Ｅ．  Ｐ．，  Ｂａｒｏｎ，  Ｍ．  Ｄ．，  Ｒｅｎｎｉｅ，  Ｌ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  ＆  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｔ．  （２０００）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍａｒｋｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８１，  ７０９−７１８．
６７．  Ｗａｓｉｌｋ，  Ａ．，  Ｊ．  Ｃａｌｌａｈａｎ，  Ｊ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｂ．  Ｔ．  Ｇａｙ，  Ｙ．  Ｆａｎｇ，  Ｍ．  Ｄａｍｍｅｎ，  Ｍ．  Ｔｏｒｒｅｍｏｒｅｌｌ，  Ｄ．  Ｐｏｉｓｏｎ，  Ｍ．  Ｍｅｌｌｅｎｃａｍｐ，  Ｅ．Ａ．  Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｎｅｌｓｏｎ．  ２００４．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ／Ｅｕｒｏｐｅａｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｏａｒ  ｓｅｍｅｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏ．  ４２：４４５３−４４６１．
６８．  Ｗａｓｓｅｎａａｒ，  Ａ．  Ｌ．，  Ｗ．  Ｊ．  Ｓｐａａｎ，  Ａ．  Ｅ．  Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ｊ．  Ｓｎｉｊｄｅｒ．  １９９７．  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ＯＲＦ１ａ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  Ｎｓｐ２  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｓｐ４  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１  ：９３１３−９３２２．
６９．  Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，  Ｇ．，  Ｃ．  Ｔｅｒｐｓｔｒａ，  Ｊ．  Ｍ．  ＰｏＬ，  Ｅ．  Ａ．  ｔｅｒ  Ｌａａｋ，  Ｍ．  Ｂｌｏｅｍｒａｄ，  Ｅ．  Ｐ．  ｄｅＫｌｕｙｅｒ，  Ｃ．  Ｋｒａｇｔｅｎ，  Ｌ．  ｖａｎ  Ｂｕｉｔｅｎ，  Ａ．  ｄｅｎ  Ｂｅｓｔｅｎ，  Ｆ．  Ｗａｇｅｎａａｒ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｊ．  Ｍ．  Ｍｏｏｎｅｎ，  Ｔ．  Ｚｅｔｓｔｒａ，  Ｅ．  Ａ．  ｄｅ  Ｂｏｅｒ，  Ｈ．  Ｊ．  Ｔｉｂｂｅｎ，  Ｍ．  Ｆ．  ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  Ｐ．  ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｌｄ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｒ．  Ｇｒｏｅｎｌａｎｄ，  Ｊ．  Ａ．  ｖａｎ  Ｇｅｎｎｅｐ，  Ｍ．  Ｔ．  Ｈ．  Ｖｏｅｔｓ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｍ．  Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｂｒａａｍｓｋａｍｐ．  １９９１．  Ｍｙｓｔｅｒｙ  ｓｗｉｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｅｔ．  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  １３：１２１−１３０．
７０．  Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏ，  Ｍ．  Ｎ．，  ｖａｎ  Ｇｅｎｎｉｐ，  Ｈ．  Ｇ．，  Ｂｏｕｍａ，  Ａ．，  ｖａｎ  Ｒｉｊｎ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｍｏｏｒｍａｎｎ，  Ｒ．  Ｊ．  （２０００）．  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ  Ｅ（ｒｎｓ）  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ：  ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ａｓ  ｎｏｎ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ，  ｍｏｄｉｆｉｅｄ，  ｌｉｖｅ−  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４，  ２９７３−２９８０．
７１．  Ｗｕ，  Ｗ．  Ｈ．，  Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  Ｒｏｗｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｒ．  Ｒ．，  Ｌａｗｓｏｎ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｊ．，  Ｙｏｏｎ，  Ｋ．  Ｊ．  ＆  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｅ．  Ａ．  （２００５）．  Ｔｈｅ  ２ｂ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｍｉｎｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ＰＲＲＳ  Ｖ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １１４，  １７７−１８１．
７２．  Ｗｕ，  Ｗ．  Ｈ．，  Ｙ．  Ｆａｎｇ，  Ｒ．  Ｆａｒｗｅｌｌ，  Ｍ．  Ｓｔｅｆｆｅｎ−Ｂｉｅｎ，  Ｒ．  Ｒ．  Ｒｏｗｌａｎｄ，  Ｊ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−  Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ａ．  Ｎｅｌｓｏｎ．  ２００１．  Ａ  １０−ｋＤａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ＯＲＦ  ２ｂ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８７：１８３−１９１．
７３．  Ｚｅｍａｎ，  Ｄ．，  Ｒ．  Ｎｅｉｇｅｒ，  Ｍ．  Ｙａｅｇｅｒ，  Ｅ．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ，  Ｐ．  Ｌｅｓｌｉｅ−Ｓｔｅｅｎ，  Ｊ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｄ．  Ｍｉｓｋｉｍｉｎｓ，  Ｒ．  Ｄａｌｙ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｍｉｎｅｈａｒｔ．  １９９３．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＲＲＳ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ｓｗｉｎｅ  ｈｅｒｄｓ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ５：５２２−５２８．
７４．  Ｙ．  Ｆａｎｇ，  Ｂ．  Ｎｅｉｇｅｒ，  Ｔ．  Ｈａｗｋｉｎｓ，  Ｊ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，  Ｒ．  Ｒｏｗｌａｎｄ，  Ｅ．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｃｏｎｆ．  Ｒｅｓ．  Ｗｏｒｋ．  Ａｎｉｍ．  Ｄｉｓ．，  ａｂｓｔｒ．  ７８，  ２００４
【図２】
2010531143.tif 000014
【図３】
2010531143.tif 000015
【図４】
2010531143.tif 000016
【図５Ａ】
2010531143.tif 000017
【図５Ｂ】
2010531143.tif 000018
【図６】
2010531143.tif 000019
【図９】
2010531143.tif 000020
【図１０】
2010531143.tif 000021
【図１１】
2010531143.tif 000022
【図１３】
2010531143.tif 000023
【図１４Ａ】
2010531143.tif 000024
【図１４Ｂ】
2010531143.tif 000025
【図１４Ｃ】
2010531143.tif 000026
【図１５Ａ】
2010531143.tif 000027
【図１５Ｂ】
2010531143.tif 000028
【図１５Ｃ】
2010531143.tif 000029
【図１】
2010531143.tif 000030
【図７】
2010531143.tif 000031
【図８】
2010531143.tif 000032
【図１２】
2010531143.tif 000033
【配列表】
2010531143000001.xml
【国際調査報告】
2010531143.tif 000051
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