(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、遺伝子構築物：
ＤＮＡ要素；
ＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能である、前記適合末端要素；
バーコード要素；
バーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能であるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記適合末端要素；および
第４適合末端要素と第１適合末端要素の間に位置する分離部位であって、ここで、ＤＮＡ要素、第１適合末端要素、および第２適合末端要素は分離部位の一方の側にあり、バーコード要素、第３適合末端要素、および第４適合末端要素は分離部位の反対側にある、前記分離部位。
【請求項２】
以下を含む、遺伝子構築物：
複数のＤＮＡ要素；
複数のＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能である、前記適合末端要素；
複数のバーコード要素；
複数のバーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能であるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記適合末端要素；および
第４適合末端要素と第１適合末端要素の間に位置する、分離部位であって、ここで、複数のＤＮＡ要素、第１適合末端要素、および第２適合末端要素は分離部位の一方の側にあり、複数のバーコード要素、第３適合末端部位、および第４適合末端要素は分離部位の反対側にある、前記分離部位。
【請求項３】
コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための方法であって：
請求項１または２に記載の第１遺伝子構築物を含有するベクターを提供すること；
第１遺伝子構築物内の分離部位においてベクターを切断し、第１遺伝子構築物を、第１および第２セグメントに分離すること；
請求項１または２に記載の第２遺伝子構築物を提供すること；および
第２遺伝子構築物を、切断されたベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、互いにアニーリングすることが可能な、第１および第２遺伝子構築物内の適合末端要素において生じ、およびここでアニーリングの後に、第２遺伝子構築物を、第１遺伝子構築物の第１および第２セグメントの間に組み込んで、コンビナトリアル遺伝子構築物を作成すること、
を含む、前記方法。
【請求項４】
方法が反復的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素の同定のための方法であって：
請求項１または２に記載の遺伝子構築物を提供すること；
アッセイを行って、遺伝子構築物内のバーコードもしくは複数バーコードのＤＮＡ配列および／または遺伝子構築物内のＤＮＡ要素もしくは複数ＤＮＡ要素のＤＮＡ配列を決定すること；および
ＤＮＡ要素または複数ＤＮＡ要素を同定すること；
を含む、前記方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載の２または３以上の遺伝子構築物を含む、ライブラリ。
【請求項７】
コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための、以下を含む方法：
以下を含むベクターを提供すること：
第１ＤＮＡ要素、
第１バーコード要素、および
第１ＤＮＡ要素と第１バーコード要素の間に位置する、２つの部位特異的組換え要素；
以下を含む第１インサートを提供すること：
第２ＤＮＡ要素、
第２バーコード要素、および
第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素のそれぞれに隣接する、部位特異的組換え要素であって、ここで第１インサート内の第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素はベクター内の部位特異的組換え要素とライゲートもアニールもすることができず、第１インサート内の第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する２つの部位特異的組換え要素は、ベクター内の部位特異的組換え要素とライゲートまたはアニールすることができる、前記部位特異的組換え要素；
ベクターと第１インサートの間で部位特異的組換えを行うこと、ここで部位特異的組換えは、第１ＤＮＡ要素と第１バーコード要素の間に位置する、ベクター内の部位特異的組換え要素と、第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する、第１インサート内の適合する部位特異的組換え要素との間で生じ、およびここで、部位特異的組換えに続いて、第１インサートはベクター内に位置し、およびベクターは、複数のＤＮＡ要素および複数のバーコード要素と、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素を含有し；
以下を含む第２インサートを提供すること：
第３ＤＮＡ要素、
第３バーコード要素、および
第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素のそれぞれに隣接する、部位特異的組換え要素であって、ここで第２インサート内の第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素は、ベクターの複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素とライゲートもアニールもすることができず、および第２インサート内の第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素の外側に位置する２つの部位特異的組換え要素は、ベクターの複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素とライゲートまたはアニールすることができる、前記部位特異的組換え要素；
ベクターと第２インサートの間で部位特異的組換えを行うこと、ここで部位特異的組換えは、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する、ベクター内の部位特異的組換え要素と、第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素の外側に位置する、第２インサート内の適合する部位特異的組換え要素との間で生じ、およびここで、部位特異的組換えに続いて、第２インサートはベクター内に位置し、およびベクターは、複数のＤＮＡ要素および複数のバーコード要素と、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素を含有し；および、
ベクターと第１インサートの間の部位特異的組換えと、ベクターと第２インサートの間の部位特異的組換えを交互に行って部位特異的組換えをｎ回繰り返し、コンビナトリアル遺伝子構築物を作成すること。
【請求項８】
請求項７の方法により生成された、コンビナトリアル遺伝子構築物。
【請求項９】
１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素を同定するための方法であって、
請求項８に記載のコンビナトリアル遺伝子構築物を提供すること；
アッセイを行って、コンビナトリアル遺伝子構築物内の１もしくは２以上のバーコード要素のＤＮＡ配列および／またはコンビナトリアル遺伝子構築物内の１もしくは２以上のＤＮＡ要素のＤＮＡ配列を決定すること；および
ＤＮＡ要素または複数ＤＮＡ要素を同定すること；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための、以下を含む方法：
以下を含むベクターを提供すること：
第１ＤＮＡ要素、
第１バーコード要素、および
第１ＤＮＡ要素と第１バーコード要素の間に位置する第１制限酵素に対する、認識部位；
以下を含むインサートを提供すること：
第２ＤＮＡ要素、
第２バーコード要素、
第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の間に位置する第１制限酵素に対する、認識部位、および
第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する第１制限酵素とは異なる１または２以上の制限酵素に対する、２つの認識部位、ここで、ベクター内の認識部位と、インサート内の第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する２つの認識部位とにおける制限消化が、適合末端を生成するようになっており；
ベクターおよびインサートを、第１制限酵素および第１制限酵素とは異なる１または２以上の制限酵素で消化すること；および
インサートをベクターにアニーリングすること、これにより、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素とを含有するコンビナトリアル遺伝子構築物を生成すること、ここで第１ＤＮＡ要素、適合末端、第２ＤＮＡ要素、第１制限酵素認識部位、第２バーコード要素、適合末端および第１バーコード末端が、この順序にある。
【請求項１１】
前記方法をｎ回繰り返すことを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１の方法により生成された、コンビナトリアル遺伝子構築物。
【請求項１３】
１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素を同定するための方法であって、
請求項１２に記載のコンビナトリアル遺伝子構築物を提供すること；
アッセイを行って、コンビナトリアル遺伝子構築物内の１もしくは２以上のバーコード要素のＤＮＡ配列および／またはコンビナトリアル遺伝子構築物内の１もしくは２以上のＤＮＡ要素のＤＮＡ配列を決定すること；および
ＤＮＡ要素または複数ＤＮＡ要素を同定すること；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号DP2 OD008435のもとで政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、遺伝要素の高次の組合せを迅速に生成するため、および遺伝要素の容易な同定のための、方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生物学は長年、複雑な細胞摂動を生成できないことにより制限されてきた。これまでの研究では、単一遺伝子の過剰発現研究を用いて、所望の表現型についてスクリーニングを行い（Kitagawa et al. (2005) DNA Research 12:291-9；Soo et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108:1484-9）、また単一遺伝子のノックアウト研究ならびに、限定的なダブルノックアウト研究も行われている（Butland et al. (2008) Nature Methods 5:789-95；Pan et al. (2004) Molecular Cell 16:487-96；Tong et al. (2004) Science 303:808-13）。しかしながらこれらの方法は、摂動の高次の組合せを生成し、ネットワークのより強力かつ複雑な質問（interrogation）を防止するように拡張することはできない。さらに、これらの方法は、数千以上の組合せを生成するように容易に拡張はできない。このことは、何百万もの組合せをハイスループットのプールされた形でスクリーニングおよび試験することを妨げ、代わりにウェルまたはコロニーベースのスクリーニングに依存させる。最終的にこれらの方法は、特定の組合せの迅速な特徴付けを可能にするために設計されてはいない。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に記載されるのは、遺伝要素の高次の組合せの迅速な生成を可能にし、単一の細胞内またはプールされた集団内でコードされた遺伝要素の特定の組合せの迅速な特徴付けのためのバーコードの基礎を提供する、方法および組成物である。これらの新規なアプローチは、複数の分野で広範な意味を有し、遺伝要素の組合せの生成が有益で生産的であるところの非常に広い調査を可能にする。この技術は、以前には研究へのアクセスが不可能であった複雑な表現型および新生のネットワーク特性に対して、新たな洞察をもたらすことができる。
【０００５】
本発明の側面は、以下を含む、遺伝子構築物に関する：
ＤＮＡ要素；
ＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能である、前記適合末端要素；
バーコード要素；
バーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能であるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記適合末端要素；
第４適合末端要素と第１適合末端要素の間に位置する分離部位であって、ここで、ＤＮＡ要素、第１適合末端要素、および第２適合末端要素は分離部位の一方の側にあり、バーコード要素、第３適合末端要素、および第４適合末端要素は分離部位の反対側にある、前記分離部位。
【０００６】
本発明のさらなる側面は、以下を含む、遺伝子構築物に関する：
複数のＤＮＡ要素；
複数のＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能である、前記適合末端要素；
複数のバーコード要素；
複数のバーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能であるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記適合末端要素；および
複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する、分離部位。
【０００７】
本発明のさらなる側面は、以下を含む、コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための方法に関する：
本発明に関連する第１遺伝子構築物を含有するベクターを提供すること；
第１遺伝子構築物内の分離部位においてベクターを切断し、第１遺伝子構築物を、第１および第２セグメントに分離すること；
本発明に関連する第２遺伝子構築物を提供すること；および
第２遺伝子構築物を、切断されたベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、互いにアニーリングすることが可能な第１および第２遺伝子構築物内の適合末端要素において生じ、およびここでアニーリングの後に、第２遺伝子構築物を、第１遺伝子構築物の第１および第２セグメントの間に組み込んで、コンビナトリアル遺伝子構築物を作成すること。いくつかの態様において、方法は反復的である。
【０００８】
本発明のさらなる側面は、以下を含む、１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素の同定のための方法に関する：
本発明に関連する遺伝子構築物を提供すること；
アッセイを行って、遺伝子構築物内のバーコードもしくは複数バーコードのＤＮＡ配列および／または遺伝子構築物内のＤＮＡ要素もしくは複数ＤＮＡ要素のＤＮＡ配列を決定すること；および
ＤＮＡ要素または複数ＤＮＡ要素を同定すること。
本発明のさらなる側面は、本発明に関連する２または３以上の遺伝子構築物を含む、ライブラリに関する。
【０００９】
本発明のさらなる側面は、以下を含む、コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための方法に関する：
以下を含むベクターを提供すること：
第１ＤＮＡ要素、
第１バーコード要素、および
第１ＤＮＡ要素と第１バーコード要素の間に位置する、２つの部位特異的組換え要素；
以下を含む第１インサートを提供すること：
第２ＤＮＡ要素、
第２バーコード要素、および
第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素のそれぞれに隣接する、部位特異的組換え要素であって、ここで２つの部位特異的組換え要素は、ベクター内の部位特異的組換え要素と適合しない第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の間に位置し、２つの部位特異的組換え要素は、ベクター内の部位特異的組換え要素と適合しない第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する、前記部位特異的組換え要素；
ベクターと第１インサートの間で部位特異的組換えを行うこと、ここで部位特異的組換えは、第１ＤＮＡ要素と第１バーコード要素の間に位置するベクター内の部位特異的組換え要素と、第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する第１インサート内の適合する部位特異的組換え要素との間で生じ、およびここで、部位特異的組換えに続いて、第１インサートはベクター内に位置し、およびベクターは、複数のＤＮＡ要素および複数のバーコード要素と、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素を含有し；
以下を含む第２インサートを提供すること：
第３ＤＮＡ要素、
第３バーコード要素、および
第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素のそれぞれに隣接する、部位特異的組換え要素であって、ここで２つの部位特異的組換え要素は、ベクターの複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素と適合しない第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素の間に位置し、および２つの部位特異的組換え要素は、ベクターの複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素と適合する第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素の外側に位置する、前記部位特異的組換え要素；
ベクターと第２インサートの間で部位特異的組換えを行うこと、ここで部位特異的組換えは、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置するベクター内の部位特異的組換え要素と、第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素の外側に位置する第２インサート内の適合する部位特異的組換え要素との間で生じ、およびここで、部位特異的組換えに続いて、第２インサートはベクター内に位置し、およびベクターは複数のＤＮＡ要素および複数のバーコード要素と、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素を含有し；および、
部位特異的組換えをｎ回繰り返すこと、ベクターと第１インサートの間の部位特異的組換えと、ベクターと第２インサートの間の部位特異的組換えを交互に行うこと、これにより、コンビナトリアル遺伝子構築物を作成すること。
【００１０】
本発明のさらなる側面は、かかる方法により生成された、コンビナトリアル遺伝子構築物に関する。本発明のさらなる側面は、かかるコンビナトリアル遺伝子構築物内の１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素を同定するための、以下を含む方法に関する：
コンビナトリアル遺伝子構築物を提供すること；
アッセイを行って、コンビナトリアル遺伝子構築物内の１もしくは２以上のバーコード要素のＤＮＡ配列および／またはコンビナトリアル遺伝子構築物内の１もしくは２以上のＤＮＡ要素のＤＮＡ配列を決定すること；および
ＤＮＡ要素または複数ＤＮＡ要素を同定すること。
本発明のさらなる側面は、コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための、以下を含む方法に関する：
以下を含むベクターを提供すること：
第１ＤＮＡ要素、
第１バーコード要素、および
第１ＤＮＡ要素と第１バーコード要素の間に位置する第１制限酵素に対する、認識部位；
以下を含むインサートを提供すること：
第２ＤＮＡ要素、
第２バーコード要素、
第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の間に位置する第１制限酵素に対する、認識部位、および
第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する第１制限酵素とは異なる１または２以上の制限酵素に対する、２つの認識部位、ここで、ベクター内の認識部位と、インサート内の第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する２つの認識部位とにおける制限消化が、適合末端を生成するようになっており；
ベクターおよびインサートを、制限酵素で消化すること；
インサートをベクターにアニーリングすること、これにより、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素とを含有するコンビナトリアル遺伝子構築物を生成すること；および
任意に該方法をｎ回繰り返すこと。
【００１１】
本発明のさらなる側面は、かかる方法により生成された、コンビナトリアル遺伝子構築物に関する。本発明のさらなる側面は、かかるコンビナトリアル遺伝子構築物内の１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素を同定するための、以下を含む方法に関する：
コンビナトリアル遺伝子構築物を提供すること；
アッセイを行って、コンビナトリアル遺伝子構築物内の１もしくは２以上のバーコード要素のＤＮＡ配列および／またはコンビナトリアル遺伝子構築物内の１もしくは２以上のＤＮＡ要素のＤＮＡ配列を決定すること；および
ＤＮＡ要素または複数ＤＮＡ要素を同定すること。
【００１２】
本発明のこれらおよび他の側面、ならびにその様々な態様は、本発明の図面および詳細な説明を参照することでより明らかになるであろう。
本発明の限定の各々は、本発明の種々の態様を包含することができる。したがって、任意の１つの要素または要素の組合せを含む本発明の限定の各々は、本発明の各側面に含まれ得ることが想定される。本発明は、その用途において、以下の説明に示されるかまたは図面に描かれている、構成の詳細および構成要素の配置には限定されない。本発明は別の態様が可能であり、様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
添付の図面は、縮尺通りに描かれることを意図していない。図面において、様々な図に示される同一またはほぼ同一の構成要素の各々は、同様な参照番号で表されている。明確にするために、必ずしも全ての構成要素が、全ての図面でラベル付けされてはいない。図面においては、以下が示されている。
【図１】図１は、本発明の非限定的な態様を示す概略図である。図１Ａは、各ユニークなＤＮＡ要素に対するユニークなバーコード構築物の作成を示す。図１Ｂは、本発明の側面に関連する遺伝子構築物が、べクター（例えば、制限酵素切断を介して）および、相同インサート（例えば、ＰＣＲを介して）を生じ得ることを示す。適合末端はアニールして、ライゲートすることができる。図１Ｃは、本発明の側面に関連するコンビナトリアル構築物が、ユニークなバーコードのシーケンシングを介したＤＮＡ要素の迅速な同定と（矢印）、さらなる挿入を可能にする分離部位の保持を可能にすることを示す。
【図２】図２は、単一のユニークな要素の、それ自体との組合せを実証する図である。図２Ａは、未切断プラスミドのゲル電気泳動を描き、挿入の長さに対応して、各付加により約〜１ｋｂの増加を示す。図２Ｂは、構築物領域に隣接する２つの部位での制限消化を描き、長さの増加を示す。
【００１４】
【図３】図３は、mCherryとＧＦＰ構築物の組合せおよび機能的発現を示す図である。蛍光画像は、mCherry（図３Ａ）、ＧＦＰ（図３Ｂ）およびオーバーレイ（図３Ｃ）用のフィルタを用いて示されている。
【図４】図４は、コンビナトリアル反応からの４つのクローンのシーケンシング結果とアラインメントを示す図である。配列の注釈は下部に表示されている。濃い影付きの配列は、バーコードのユニークな部分を表す。２つのバーコード構築物の４つ全ての可能な順列が、右側のXbaI分離部位を保全しつつ、回収された。
【図５】図５は、本発明の側面に関連する制限部位概念技術を示す図である。制限酵素BamHIおよびBglIIは、ライゲートされた場合にどちらの酵素によっても認識されない瘢痕（scar）を形成する、適合オーバーハングを生成する。分離部位は、BglIIおよびEcoRI制限部位から構成される。ベクターおよびインサートを異なる制限酵素で消化すると、さらなる組合せのための分離部位を保持しつつ、インサートの挿入が可能である。
【００１５】
【図６】図６は、高次の組合せの容易な生成を示す図である。図６Ａは、個々のコロニーからの２個一組、３個および４個の組合せについて検証された配列を示す。SpeIおよびAvrII制限部位は、バーコード領域に隣接する。図６Ｂは、バーコード遺伝子のみ（１個）、および２個〜４個の組合せについての、プラスミド分離物（isolate）の制限消化を示す。各プラスミドを消化して、ベクターの一定の残りの部分から、可変のコンビナトリアル領域（点で示される）を分離した。
【図７】図７は、制限部位アセンブリを介したＧＦＰとmCherryの組合せの定量的評価を示す図である。試料＃１〜２４は、コンビナトリアルライブラリから大腸菌DH5α細胞への形質転換から分離したコロニーである。ＧＦＰ−ＧＦＰの組合せは、試料＃１、８、１４、１５、１６、１８、２１、２２、および２４により；mCherry-mCherryの組合せは、＃７、１０、１１、１７、２０により；ＧＦＰとmCherryの組合せは、＃２〜６、８、１２、１３、１９、２３により表される。
【図８】図８は、バーコードステッチング（barcode stitching）を示す図である。バーコードはＤＮＡ要素のいずれかの末端に配置され、一緒に融合される。この戦略は２個一組の組合せに限定され、各ピースごとに個別のライブラリが必要である。この図は、Merryman (2012) Metabolic Engineering 14:196-204から採用した。
【００１６】
【図９】図９は、ＤＮＡを切断することなしにＤＮＡの転送を可能とする、Gateway（登録商標）のクローニング技術を示す図である（http://wolfson.huji.ac.il/expression/gatewayman.pdfより）。
【図１０】図１０は、1つの遺伝子構築物内に複数のインサートをアセンブルするためのMultisite Gateway（登録商標）Proのクローニング技術の非限定的な例を示す（ウェブサイト：pfgrc.jcvi.org/index.php/gateway_clones/about_knockoutclones.htmlより）。
【図１１】図１１は、ユニークな組換え配列を有する２つのベクターライブラリが、ＰＣＲを介して、各インサート内にＤＮＡ要素およびバーコード要素に隣接する組換え配列を有する２つのインサートライブラリを生成可能であるという、非限定的な態様を示す図である。ａｔｔ組換え配列は、Ｂ、Ｐ、ＬまたはＲにより表される。ＢＣ＝バーコード、ＤＮＡ＝ＤＮＡ要素。
【００１７】
【図１２】図１２は、１つのベクターライブラリと２つのインサートライブラリを用いる、組換え介在性コンビナトリアル遺伝学を介した、より高次の組合せの反復生成を示す図である。反復プロセスは、２つのインサートライブラリ間で交互に行う。バーコードは互いにすぐ近くに存在し、バーコードの決定、したがって下流のＤＮＡ要素の同定を可能にする。
【図１３】図１３は、遺伝子構築物の中央の２つの組換え配列が、自己組換えを回避するために常に端部に直交している、非限定的な態様を示す図である。
【図１４】図１４は、反応性末端（Ｂ１＋Ｂ２、Ｌ３＋Ｌ４）がＰＣＲによって付加される、本発明の非限定的な態様を示す図である。この態様は、ベクターが、最終的にそれ自身と反応することを回避する。
【００１８】
【図１５】図１５は、単一の酵素分離部位を用いた、超並列コンビナトリアル遺伝学の非限定的な態様を示す図である。この態様では、単一の酵素である酵素１はベクターの分離部位において開裂し、３塩基の３’オーバーハングを生成する。インサート内のバーコード要素およびＤＮＡ要素は、異なる酵素である酵素２に対する制限部位に隣接し、酵素２は酵素１と適合性のオーバーハングを生成する。ベクターとインサートの消化およびライゲーションは、ベクター内に酵素１に対する制限部位を維持した、インサートを含有するベクターを生成する。
【００１９】
【図１６】図１６Ａは、超並列コンビナトリアル遺伝学アセンブリ戦略の非限定的な態様を示す図である。転写因子（ＴＦ）発現構築物は、バーコード化され（ＢＣ）、４つの制限部位（１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ）が図中に示すように配置されている。ペア：１Ａ／１Ｂと２Ａ／２Ｂは、１ペア内に適合オーバーハングを生成するが、他のペアと適合性のない、ユニークな制限部位である。バーコードベクターをプールし、酵素１Ｂ＋２Ａで消化する。インサートは、ベクターからＰＣＲにより生成され、１Ａ＋２Ｂで消化される。図１６Ｂは、２個一組のライブラリの組合せからのハイスループットシーケンシングリード（read）の分布を示す。図１６Ｃは、超並列コンビナトリアル遺伝学構築物の発現を示す。ＧＦＰとmCherryの構築物の４つ全ての２個一組の組合せと、単一のＧＦＰおよびmCherryの構築物は、２５０ｎｇ／ｍＬのａＴｃで誘導し、フローサイトメトリーによって評価した。
【図１７】図１７は、バーコード化され超並列コンビナトリアル遺伝学ライブラリのアセンブリのために制限部位に隣接した、単一遺伝子発現構築物（ＧＦＰ）を表す、プラスミドマップを示す図である。
【００２０】
【図１８】図１８Ａは、超並列コンビナトリアル遺伝学の方法の非限定的な態様を示す図である。超並列コンビナトリアル遺伝学ライブラリを含む大腸菌NDM-1細胞を、ａＴｃ有りまたは無しの培養物に希釈し、中期対数期まで増殖させる。次に各培養物を、抗生物質有りまたは無しおよびａＴｃ有りまたは無しの培養物中にさらに希釈する。各条件からのＤＮＡは、初期および後期対数増殖段階で採取し、ハイスループットシーケンシング用に処理する。異なる条件における組合せの存在量の比較は、所望の表現型につながる遺伝子型を明らかにする。図１８Ｂは、「ヒット」の概要ヒートマップを示す図である。実験全体の組合せＳスコアの階層的クラスタリングは、異なる表現型のプロフィールを示す。「相乗作用」と記された領域は、セフトリアキソンとａＴｃ両方の添加時に脱落する組合せを示す。反対側の「増殖」は、セフトリアキソンとａＴｃ両方の添加時に比較的過剰表現される組合せを示す。
【図１９】図１９は、遺伝子の組合せおよび相反体（reciprocals）の階層的クラスタリングを示す図である。番号１〜８は、図１８Ｂの番号に対応する遺伝子ペアを表す。Ｒは、遺伝子ペアの逆配列を表す。同一の表現型を与える遺伝子ペアとその相反体が一緒にクラスタ化する。
【００２１】
【図２０】図２０Ａは、NDM-1の抗生物質感受性表現型についての相乗作用を示すグラフである。NDM-1抗生物質感受性表現型。図２０Ｂは、NDM-1の抗生物質感受性表現型に対する対照を示すグラフである。組合せは、セフトリアキソンのマイナーな増強作用を示している。eCFP＋norRの作用の発現はadiY＋marAに比べて遅れている。図２０Ｃは、NDM-1の抗生物質感受性表現型について増殖の利点を示すグラフである。組合せは、実験の過程を通し、誘導の際に最小限の効果を示す。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、個々の遺伝子の抗生物質感受性を示すグラフである。
【図２２】図２２は、抗生物質のセフトリアキソン、イミペネム、ピペラシリン−タゾバクタムおよびゲンタマイシンにわたる階層的クラスタリングを示す図である。β−ラクタムの高処置は、ゲンタマイシンとは別に、一緒にクラスタ化する。
【００２２】
【図２３】図２３Ａは、組合せが、誘導されると抗生物質致死性を４〜６桁増強し、１０時間以上にわたって増殖を抑制することを示すグラフである。図２３Ｂは、cadC＋allRなどのランダムな致死性組合せが、時間にわたって、顕著に弱いセフトリアキソンの増幅と、より持続の短い増殖抑制を示したことを示すグラフである。図２３Ｃは、torRおよびmetRが個々に、torR＋metRの組合せに比べて、顕著に弱いセフトリアキソンの増幅を示したことを示すグラフである。図２３Ｄは、NDM1細胞に感染するtorR＋metRおよびnhaR＋melRを含むファージミドが、セフトリアキソンおよび誘導によって培養物に対して増強した死滅効果を示したことを示すグラフである。
【図２４】図２４は、蛍光誘導曲線のグラフである。
【図２５】図２５は、全ての抗生物質−ａＴｃ条件にわたる、トップヒットの階層的クラスタリングを示す図である。６３１１組の遺伝子ペアは、２．４より上または−２．４より下において少なくとも１つのＳスコアを示し、ここで２．４は、Ｓスコアの集団分布の標準偏差の３倍の値である。平均リンケージとのユークリッド相関を、クラスタリング解析に用いた。ａＴｃの存在下で、β−ラクタムのイミペネム、セフトリアキソン、およびピペラシリン−タゾバクタムは、ゲンタマイシンとは別に、一緒にクラスタ化する（赤色の括弧）。
【００２３】
【図２６】図２６は、１８９×１８７×１８の遺伝子を組み合わせた、低複雑性３個一組のコンビナトリアルライブラリを示すグラフである。６３６，１７４の可能な組合せのうち、５８２，４３３のユニークな組合せ（全ての可能な組合せの９２％）を、約３０００万のシーケンシングのリードから回収した。
【図２７】図２７は、１８９×１８７×１８７の遺伝子を組み合わせた、高複雑性３個一組のコンビナトリアルライブラリを示すグラフである。６，６０９，１４１の可能な遺伝子の組合せのうち、４，０４２，３１６の組合せ（６１％）を約２０００万のシーケンシングのリードから回収した。
【図２８】図２８は、αＳｙｎの複数の直列型コピーをガラクトース（Ｇａｌ）誘導性プロモーターと統合することによって生成された、遺伝子スクリーニング株を示す図である。コンビナトリアルライブラリの発現は、Tet-ON誘導系により制御した。実験は、Ｇａｌおよびドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処置による細胞の生存に貢献する遺伝子組合せを回収するよう、設計された。
【００２４】
【図２９】図２９は、ユニークなバーコード（ＢＣ）と４つの制限部位の、単一の発現構築物を示す図である。バーコードベクターをプールし、酵素AvrII＋NotIで消化する。インサートを、SpeI＋PspOMIでの消化によって生成する。ワンポットライゲーション反応は、２個一組のコンビナトリアルライブラリを生成する。
【図３０】図３０は、超並列コンビナトリアル遺伝学およびＰ２Ａ戦略によって構築された、ｅＧＦＰとmCherryの２個一組の組合せの遺伝子発現の定量分析を示すグラフである。
【図３１】図３１は、ＲＮＡ誘導転写プログラミングによる超並列コンビナトリアル遺伝子スクリーンを示す図である。
【図３２】図３２は、遺伝子ノックダウンの超並列コンビナトリアル遺伝子スクリーンを示す図である。
【００２５】
【図３３】図３３は、レンチウイルスベクターの設計を示す図である。前駆体ｍｉＲをＣＭＶｐ駆動のＧＦＰ遺伝子と共に発現する直列型転写単位、および／またはＵｂｃｐ駆動のＲＦＰ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲセンサー配列（例えば、該ｍｉＲの相補的な標的配列の４つの反復）は、レンチウイルスベクター骨格に構築された。Ｕｂｃｐ＝ヒトユビキチンＣプロモーター;ＣＭＶｐ＝ヒトサイトメガロウイルスプロモーター；ＲＦＰ＝赤色蛍光タンパク質；ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質。
【図３４】図３４は、HEK293T細胞における、前駆体ｍｉＲ発現を示すグラフである。３つの異なる前駆体ｍｉＲ（すなわち、miR-124、miR-128およびmiR-132）をＣＭＶｐ駆動のＧＦＰ遺伝子と共に発現する直列型転写単位、および／またはＵｂｃｐ駆動のＲＦＰ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲセンサー配列を含むレンチウイルスを用いて、HEK293T細胞を感染させた。ＧＦＰ＋細胞に対するＲＦＰ＋細胞のパーセンテージを、前方および側方散乱でゲーティングした後にフローサイトメーターにより決定した。HEK293T；感染後４日。
【００２６】
【図３５】図３５は、一次ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）における、前駆体ｍｉＲ発現を示すグラフである。２つの異なる前駆体ｍｉＲ（すなわち、miR-128およびmiR-132）（配列番号１）をＣＭＶプロモーター（ＣＭＶｐ）駆動のＧＦＰ遺伝子と共に発現する直列型転写単位、および／またはＵｂｃｐ駆動のＲＦＰ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲセンサー配列を含むレンチウイルスを用いて、ＨＤＦ細胞を感染させた。ＧＦＰ＋細胞に対するＲＦＰ＋細胞のパーセンテージを、前方および側方散乱でゲーティングした後にフローサイトメーターにより決定した。HEK293T；感染後７日。
【図３６】図３６は、HEK293T細胞における、コンビナトリアル前駆体ｍｉＲ発現を示すグラフである。個々のまたはコンビナトリアル前駆体ｍｉＲ（すなわち、miR-128、miR-132、またはmiR-128-132）をＣＭＶｐ駆動のＧＦＰ遺伝子と共に発現する直列型転写単位、および／またはＵｂｃｐ駆動のＲＦＰ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲセンサー配列を含むレンチウイルスを用いて、HEK293T細胞を感染させた。ＧＦＰ＋細胞に対するＲＦＰ＋細胞のパーセンテージを、前方および側方散乱でゲーティングした後にフローサイトメーターにより決定した。HEK293T；感染後４日。
【００２７】
【図３７】図３７は、一次ＨＤＦ細胞における、コンビナトリアル前駆体ｍｉＲ発現を示すグラフである。個々のまたはコンビナトリアル前駆体ｍｉＲ（すなわち、miR-128、miR-132、またはmiR-128-132）をＣＭＶｐ駆動のＧＦＰ遺伝子と共に発現する直列型転写単位、および／またはＵｂｃｐ駆動のＲＦＰ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲセンサー配列を含むレンチウイルスを用いて、ＨＤＦ細胞を感染させた。ＧＦＰ＋細胞に対するＲＦＰ＋細胞のパーセンテージを、前方および側方散乱でゲーティングした後にフローサイトメーターにより決定した。HEK293T；感染後７日。
【図３８】図３８は、miR-128およびmiR-132を直列に含有するベクターのマップを示す図である。
【００２８】
詳細な説明
本明細書に記載されるのは、超並列コンビナトリアル遺伝学と呼ばれる新規な技術であり、これは、遺伝学やシステム生物学などの分野を制限していた障害を克服するものである。本発明は少なくとも部分的に、遺伝要素の高次の組合せの迅速な生成および、所望の表現型をもたらす組合せの迅速な同定を可能にする方法および組成物についての、驚くべき発見に基づいている。この技術は新しい研究手法を可能にし、広く適用可能である。本明細書に記載のアプローチは、以前の方法よりも、許容される遺伝学的摂動の柔軟性、使いやすさ、および高次の組合せへの迅速な拡張性を含む、有意な利点を提供する。
過去には、大規模な体系的な摂動研究は、低複雑度の摂動に限られていた。例えば、ASKAライブラリは、大腸菌ゲノム内の全〜４０００のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）についての単一遺伝子の過剰発現モデルのライブラリである。ＯＲＦはプラスミドに基づき、多数のプレート上に配列されている。研究では、この単一の過剰発現ライブラリを、抗生物質耐性などの所望の表現型についてスクリーニングし、個々のシーケンシングを通じてクローンが同定された（Soo et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108:1484-9）。２個一組のコンビナトリアル戦略は理論的には、異なる選択マーカーを有するプラスミド上に別のＯＲＦライブラリを生成し、ASKAライブラリの1メンバーと新しいライブラリの1メンバーを用いて株を同時形質転換することにより、このアプローチに由来し得る。しかし、全〜１６００万の２個一組のＯＲＦの組合せを生成する試みは、規模の制限によって直ちに妨害されることになる。これは、高次の組合せを生成する場合にはさらに明らかである；例えば、複数ベクターの同時形質転換の効率が低いこと、およびユニークな選択マーカーの数が少ないことは、高次の組合せを妨害する。
【００２９】
同様の障害は、コンビナトリアルノックアウトへの従来のアプローチに影響を与える。単一遺伝子ノックアウトライブラリは、大腸菌（例えば、KEIOライブラリ）およびS. cerevisiaeについて生成されている。バーコードライブラリは、ハイスループットシーケンシングと組合せた場合に、プールされたスクリーニングを可能にする。しかし、二重遺伝子ノックアウトライブラリを生成する効率的な方法は存在しなかった。合成遺伝子アレイ（Tong et al. (2004) Science 303:808-13）は酵母交配（mating）を使用して、プレートベースのフォーマットでダブルノックアウトを生成する；同様の方法が、大腸菌でも報告されている（Butland et al. (2008) Nature Methods 5:789-95）。しかし、２つのユニークな株をプレート上に同時スポットした場所で交配が生じるため、数千の組合せを超えるスケーリングは非現実的である。さらに、後続する各実験では、細胞を再度プレートするという骨の折れるプロセスが必要となる。
【００３０】
遺伝要素の組合せは、幹細胞の分化における転写因子などのいくつかの特定の用途で有用であった。過去における典型的な方法は、細胞型を多くの個々の転写因子で同時トランスフェクトし、分化を観察することであった；次にこのプールの各メンバーを、分化を誘導する最小限のセットが同定されるまで、1つずつ取り除く（Son et al. (2011) Cell Stem Cell 9:205-18）。この方法は、それぞれのユニークな組合せが別の実験を必要とするために面倒であり、多くの個々の要素との同時トランスフェクションを必要とするので、効率が低い。これらの問題は、分化表現型が多くの場合、トランスフェクションの数週間後に観察されるという事実によって、悪化している。
最近の研究では、バックツーバック（back-to-back）バーコード「ステッチング」の概念が解説されており（Merryman (2012) Metabolic Engineering 14:196-204；Roth et al.（米国特許公報第US 2009/0098555号)）、ここでは、それぞれ３’末端および５’末端にバーコードを有する２つのＤＮＡ要素を一緒に融合して、２つのバーコードを近接して配置する（図８）。これの達成に使用される方法は、ＰＣＲオーバーラップおよびギブソン・アセンブリを含む。近接により、組合せはシーケンシングを介して追跡することができる。しかし、このアプローチの戦略は、２個一組の組合せを超えて拡張することはできない。さらに、各バーコード部分は、同じインサートライブラリを反復的に利用する代わりに、別のライブラリの構築を必要とする。
【００３１】
明細書に記載の超並列コンビナトリアル遺伝学のアプローチは、従来の方法に比べて多くの利点を提供する。これは、転写因子などの種々の遺伝要素のコンビナトリアルセットを、迅速に生成することできる。さらにこの技術は、複数組合せのオーダーのプールされたスクリーニングを可能にし（例えば、２個一組、３個一組、およびｎ個一組の組合せをプールして、同時に一緒にスクリーニングすることができる）、所与の用途のために必要な最小限の組合せを同定する。
過去の方法に対する本明細書に記載された技術のさらなる利点は、ＤＮＡ摂動の種類におけるその柔軟性である。合成遺伝子アレイ法などの過去の方法は、例えば、ノックアウトの生成などの１つの技術に関しては適しているが、摂動の他のタイプには適していない。対照的に、本明細書に記載された技術は、遺伝子の過剰発現とノックダウンの前例のない組合せを可能にする。過去の方法に比べてさらなる利点は、本明細書に記載のアプローチが、２個一組の組合せを越えて拡張可能であることである。
【００３２】
超並列コンビナトリアル遺伝学アプローチの側面は、１または２以上のＤＮＡ要素および１または２以上のバーコード要素を含む遺伝子構築物に関し、ここで各特定のＤＮＡ要素は、ユニークなバーコード要素に関連付けられている。本明細書で使用される場合、特定のＤＮＡ要素とユニークなバーコード要素の関連とは、特定のＤＮＡ要素とユニークなバーコード要素が常に、同一の遺伝子構築物内に含まれることを意味する。したがって、遺伝子構築物内のユニークなバーコード要素の存在は、関連する特定のＤＮＡ要素もまた、同じ遺伝子構築物内に存在することを示している。
ＤＮＡ要素は、ＤＮＡの任意の部分を含むことができ、任意の機能または配列を有することができることが、理解されるべきである。いくつかの態様において、ＤＮＡ要素は、タンパク質をコードしてもしなくてもよい遺伝子または遺伝子断片を含む。ＤＮＡ要素は、コード領域および非コード領域の両方を含むことができる。例えば、いくつかの態様において、ＤＮＡ要素は、オープンリーディングフレームまたはその断片、リボソーム結合部位、プロモーターおよび／またはターミネーターを含むことができる。いくつかの態様において、ＤＮＡ要素は、非コードＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡの前駆体、例えば長い非コードＲＮＡの前駆体（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）／低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡを含む。いくつかの態様において、ＤＮＡ要素は、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）に関与する遺伝子、またはゲノムワイドＯＲＦコレクションからのＤＮＡ要素である。ＤＮＡ要素はまた、メタゲノム試料、または合成生物学回路の1または２以上の構成成分も、含むことができる。
【００３３】
いくつかの態様において、ＤＮＡ要素（単数または複数）は、以下をコードする：転写因子（内因性および人工転写因子を含む）、ヒストン修飾酵素、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、キナーゼまたはホスファターゼ、代謝酵素、エピジェネティック酵素、ＦＤＡ承認薬の標的、癌遺伝子、モノクローナル抗体、および／または変異型タンパク質。
図１は、本発明に関連する遺伝子構築物の非限定的な例の、いくつかの概略図を示す。図１Ａにおいて、ＤＮＡ−１と表されたＤＮＡ要素は、互いにアニーリングすることが可能な、第１適合末端要素Ｇ２Ａと第２適合末端要素Ｇ２Ｂに隣接している。遺伝子構築物はまた、ＢＣ−１と表されたバーコード要素も含有し、ＢＣ−１は、相互にアニーリングすることが可能であるがＧ２ＡまたはＧ２Ｂにアニーリングすることはできない、第３適合末端要素Ｇ１Ａと第４適合末端要素Ｇ１Ｂに隣接している。遺伝子構築物は分離部位も含み、これにより、バーコード要素は分離部位の片側にあり、一方ＤＮＡ要素は分離部位の反対側にある。図1では、バーコード要素は、ＤＮＡ要素に対して上流または５’末端にあるように描かれているが、逆の配置も可能である。
【００３４】
適合末端要素は、当業者によく知られた様々な方法で作成することができ、種々の異なる配列から構成され得る。本明細書で使用する場合、適合末端要素とは、互いにライゲートまたはアニールすることができるＤＮＡの領域を指す。いくつかの非限定的な態様において、適合末端要素は、制限部位および適合するオーバーハング、ギブソン・アセンブリ配列、または、リコンビナーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクター／ジンクフィンガーヌクレアーゼ、トランス切断リボザイム／ＤＮＡザイムもしくはインテグラーゼを含む、任意の他のＤＮＡアセンブリ方法の機能的要素から、構成することができる。
いくつかの態様において、ギブソン・アセンブリを用いて、適合オーバーハングを生成することができる。ギブソン・アセンブリは、複数のＤＮＡ断片を単一の反応で結合することができる、等温ＤＮＡ末端結合技術を指す。この方法は、Gibson et al. (2009) Nature Methods 6:343-5にさらに記載されており、これは参照によって組み込まれる。
【００３５】
別の態様において、図５に示すように、制限部位消化を用いて適合末端を生成することができる。この方法を使用すると、２つのユニークな制限酵素が、適合オーバーハングを生成する。これらのオーバーハングがライゲートされると瘢痕が作成されるが、瘢痕はいずれの酵素によっても認識されない。適合オーバーハングを生成する任意の制限酵素が使用できることを、理解すべきである。いくつかの非限定的な態様において、BioBricks（登録商標）（The BioBricks Foundation）またはBglBricks（Anderson et al. (2010) Journal of Biological Engineering 4:1）などの標準生物学的パーツ、およびかかる標準生物学的パーツに関連する酵素が使用される。BioBricks（登録商標）またはBglBricksなどの標準生物学的パーツの使用は、当業者にルーチンであると考えられる。古典的な制限酵素を使用することができるが（例えば、タイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩ制限酵素など）、他のＤＮＡ切断分子も使用可能であることを理解すべきである。例えば、標的化リボザイムは、特定の標的部位の切断に使用することができる。メガヌクレアーゼはまた、挿入されたＤＮＡ要素との干渉の可能性を最小限にするために利用することができる。ＴＡＬＥまたはＺＦヌクレアーゼもまた、長いＤＮＡ部位を標的として、挿入されたＤＮＡ要素の内部切断の可能性を最小限にすることができる。さらに、TOPO（登録商標）クローニングを用いて、制限消化およびライゲーションを達成することができる。
【００３６】
遺伝子構築物内の分離部位は、構築物の直線化を可能にする領域を表す。分離部位は、ＤＮＡを切断する任意の手段に対応可能であることを理解すべきである。いくつかの態様において、分離部位は、制限酵素認識部位である。
本発明のさらなる側面は、コンビナトリアル構築物、およびコンビナトリアル構築物を生成するための方法に関する。本明細書で用いる場合、「コンビナトリアル構築物」は、複数のＤＮＡ要素を含んでいる遺伝子構築物を指す。本明細書で使用する場合、複数のＤＮＡ要素とは、１より多くのＤＮＡ要素を意味する。図１Ｂに示すように、コンビナトリアル構築物の生成には、本発明に関連する第１の遺伝子構築物を含むベクターの、ベクターを遺伝子構築物内の分離部位において切断することによる、直線化が関与する。本発明に関連する第２の遺伝子構築物は、図1Ｂにインサートとして示されている。本明細書で使用する場合、「インサート」とは、切断されたベクターに挿入することが意図される遺伝子構築物を指す。いくつかの態様において、インサートは、例えばＰＣＲまたは制限消化などにより、ベクターから精製される。インサートは切断されたベクターに、インサート内の終端適合末端要素と、直線化ベクター内のそれらの適合要素とのアニーリングを介して、ライゲートされ得る。
【００３７】
図１Ｃは、複数のＤＮＡ要素と複数の対応するバーコード要素を含む、組合せ後のコンビナトリアル構築物を示す。図１Ｃに示す非限定的な例において、遺伝子構築物は、ＤＮＡ−１およびＤＮＡ−２と称する２つの異なるＤＮＡ要素と、ＢＣ−１およびＢＣ−２と称する２つの対応するバーコード要素を含む。コンビナトリアル構築物はさらに、複数のバーコード要素と複数のＤＮＡ要素の間に位置する、分離部位を含む。
分離部位は、単一の制限酵素認識部位であり得る。図１５は、BglII部位などの単一の制限酵素部位によって分離された、ＤＮＡ要素とバーコード要素を含むベクターの非限定的な態様を示す。図１５に示す対応するインサートの非限定的な例は、ＤＮＡ要素およびバーコード要素を含む。いくつかの態様において、BglII部位などの制限部位は、インサートのＤＮＡ要素とバーコード要素の間に位置し、一方、AlwNI部位などの２つの制限部位は、ＤＮＡ要素とバーコード要素の外側に位置する。BglIIおよびAlwNIは、これらがＤＮＡを切断すると、適合末端を生成する。したがって、BglIIによるベクターの消化およびAlwNIによるインサートの消化は、インサートのベクターへのライゲーションを可能とし、BglII部位などの制限部位により分離された２つのＤＮＡ要素と２つのバーコード要素を含むベクターを生成する。
【００３８】
ＤＮＡを切断する際に適合末端を生成する様々な異なる酵素の組合せを、本発明のこの側面に関連して使用できることを理解すべきである。いくつかの態様において、インサート内で、ＤＮＡ要素とバーコード要素の外側に位置する２つの制限部位が同じ制限酵素によって認識され、該制限酵素は、ベクターを消化する制限部位に対する適合末端を生成する。別の態様において、インサート内で、ＤＮＡ要素とバーコード要素の外側に位置する２つの制限部位が、２つの異なる制限酵素によって認識され、該制限酵素のそれぞれは、ベクターを消化する制限部位に対する適合末端を生成する。
本発明のさらなる側面は、コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための部位特異的組換えの使用に関する。かかる態様において、本発明に関連する遺伝子構築物は、分離部位を必要とせず、制限酵素による切断を必要としない。組換えに基づくクローニング法の非限定的な例は、Gateway（登録商標）クローニング技術（Life Technologies, Carlsbad, CA）であり、これについては当業者が精通しているであろう。
【００３９】
図９は、Gateway（登録商標）クローニング方法論の例を示す。ＤＮＡ要素は、Clonase（商標）酵素反応混合物の存在下での組換えを可能にする、部位特異的組換え要素に隣接している。Gatewayシステム内では、部位特異的組換え要素は、付着部位または「att部位」と呼ばれ、以下を含む：attB1、attB2, attP1、attP2、attL1、attL2、attR1およびattR2。attB1はattP1と反応し、attB2はattP2と反応し、attL1はattR1と反応し、attL2はattR2と反応する。任意の組換えに基づくクローニング法が、本発明の側面と適合することが理解されるべきである。
図１０は、複数のインサートを1つの遺伝子構築物内に組み入れるための、Multisite Gateway（登録商標）Proクローニング技術の非限定的な例を示す（http://pfgrc.jcvi.org/index.php/gateway_clones/about_knockoutclones.htmlから）。
図１１は、組換えに基づくコンビナトリアル遺伝学的アプローチの非限定的な態様を示す。この例では、２つのベクターライブラリを用いて、２つのインサートライブラリを生成する。各ベクターは、ＤＮＡ要素、バーコード要素、および２つの部位特異的組換え要素を含む。様々な方法を用いて、インサートライブラリを生成できることが理解されるべきである。いくつかの態様において、例えば図１１に示すインサートライブラリ１またはインサートライブラリ２などのインサートライブラリが、図１１に示すベクターライブラリ１およびベクターライブラリ２などのベクターライブラリから、例えばＰＣＲにより、生成される。いくつかの態様において、ＰＣＲを用いて、インサートライブラリに直交する組換え配列の隣接ペアが付加される。
【００４０】
図１２は、組換えに基づくコンビナトリアル遺伝学を用いてコンビナトリアル遺伝子構築物を生成する、非限定的な態様を示す。この例では、ベクターライブラリ1からのベクターが、ＤＮＡ要素、バーコード要素、およびＤＮＡ要素とバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素を含んで示されている。ベクターは、ＤＮＡ要素とバーコード要素を含みかつこれらの各々が部位特異的組換え要素に隣接している、ライブラリ２からのインサートと組換えされる。ライブラリ２からのインサート内において、２つの部位特異的組換え要素は、ＤＮＡ要素とバーコード要素の間に位置しており、２つの部位特異的組換え配列は、ＤＮＡ要素とバーコード要素の外側に位置している。ＤＮＡ要素とバーコード要素の外側に位置する部位特異的組換え要素は、ベクター内のＤＮＡ要素とバーコード要素の間に位置するベクター内の２つの部位特異的組換え要素と、適合性である。
【００４１】
適合部位での組換えに続いて、インサートライブラリ２からのインサートはベクター内に含まれ、これによって、２つのＤＮＡ要素と２つのバーコード要素、およびＤＮＡ要素とバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え部位を含むベクターが生成される。
図1２に示すように、ベクターは次に、ＤＮＡ要素とバーコード要素を含みかつこれらの各々が部位特異的組換え部位に隣接している、インサートライブラリ１からのインサートと組換えることができる。ライブラリ１からのインサート内において、２つの部位特異的組換え要素は、ＤＮＡ要素とバーコード要素の間に位置しており、２つの部位特異的組換え配列は、ＤＮＡ要素とバーコード要素の外側に位置している。ＤＮＡ要素とバーコード要素の外側に位置する部位特異的組換え要素は、ベクター内のＤＮＡ要素とバーコード要素の間に位置するベクター内の２つの部位特異的組換え要素と、適合性である。
組換えに続いて、インサートライブラリ１からのインサートはベクター内に含まれ、これによって、３つのＤＮＡ要素と３つのバーコード要素、およびＤＮＡ要素とバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え部位を含むベクターが生成される。
【００４２】
図１３および図１４は、ベクター−ベクターの組換えを回避しつつ、いかにしてベクターとインサートを互いに組換えるように設計できるかを示す。いくつかの態様において、部位特異的組換え要素を、ＰＣＲによって遺伝子構築物に付加する。
コンビナトリアル構築物を生成するための本明細書に記載の方法は、反復することができる。例えば、図1Ｃに示す、組合せイベントにより生成されたコンビナトリアル構築物は、分離部位で再び切断することができ、１または２以上のさらなるインサートをコンビナトリアル構築物にライゲートしつつ、一方でさらなる挿入のために分離部位を維持することができる。同様に、図１２のベクターをライブラリ1のインサートおよびライブラリ２のインサートと交互に組換えて、コンビナトリアル遺伝子構築物を生成することができる。重要なことには、反復プロセスを通じて、遺伝子構築物内のＤＮＡ要素の数が増加し続けるにつれて、各ＤＮＡ要素に関連付けられたユニークなバーコードは、関連するＤＮＡ要素と同一の遺伝子構築物内に維持される。いくつかの態様において、組合せプロセスは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回または２０回より多く、反復される。いくつかの態様において、プロセスはｎ回反復され、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、または２０回より多い。
【００４３】
コンビナトリアル構築物は、任意数のＤＮＡ要素および関連するバーコード要素を含むことができることが、理解されるべきである。いくつかの態様において、コンビナトリアル構築物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１００より多くのＤＮＡ要素および関連するバーコード要素を含む。
本発明のさらなる側面は、遺伝子構築物内の1つまたは２以上のＤＮＡ要素を同定するための方法に関する。組合せイベントの後、特定のＤＮＡ要素に関連するユニークなバーコードは、特定のＤＮＡ要素と同一の遺伝子構築物内に留まる。したがって、１つのバーコード要素または複数のバーコード要素の同定は、同じ遺伝子構築物内の関連する１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素の同定を可能にする。いくつかの態様において、バーコード要素および／またはＤＮＡ要素の配列を、シーケンシングによって、またはマイクロアレイ分析によって決定する。ＤＮＡ配列を決定する任意の手段は、1または２以上のバーコード要素および対応するＤＮＡ要素の同定に適合性であることを、理解すべきである。重要なことは、図１Ｃに示されたものなどのコンビナトリアル構築物において、複数のバーコード要素は互いに近接しており、複数のバーコード要素の、したがって複数のＤＮＡ要素の同定を、ＤＮＡシーケンシングなどの方法を介して同時に可能とする。
【００４４】
本発明のさらなる側面は、超並列コンビナトリアル遺伝学のための方法と適合性の、本明細書に記載の２または３以上の遺伝子構築物を含むライブラリに関する。本明細書で使用される場合、遺伝子構築物のライブラリは、２または３以上の遺伝子構築物の集合を指す。いくつかの態様おいて、遺伝子構築物のライブラリは、各ユニークなＤＮＡ要素がプラスミド上にあるように生成される。このプラスミドライブラリをプールして、ベクターライブラリを形成することができる。インサートライブラリは、例えばベクターライブラリにＰＣＲを行うことにより、生成することができる。第１の組合せイベントにおいて、全てのベクターが全てのインサートと対となって、２個一組の組合せの完全なコンビナトリアルセットを生成することができる。この２個一組のライブラリとインサートライブラリの間のさらなる反応は、単一ベクターのライブラリから生じる３個一組、４個一組、または４個一組より大のライブラリをもたらす。図６は、バーコード要素の２個一組、３個一組、および４個一組の組合せの効果的な統合を実証する。
本発明のいくつかの側面は、コンビナトリアル構築物のライブラリを使用してスクリーンを実施することに関する。例えば、コンビナトリアルライブラリを含む細胞のプールを、化学療法などのストレス要因に対する耐性について試験することができる。ＤＮＡ要素のどの組合せが、化学療法に対する耐性などの特定の表現型を付与するのに最も効果的であるかを決定するために、化学療法を生き残る細胞を単離し、１または複数のバーコードの配列を決定することができ、所望の表現型を付与するのに効果的である１または複数のＤＮＡ要素の迅速な同定が可能となる。
【００４５】
コンビナトリアルのステップがin vitroで行われるため、この技術は、ＤＮＡを受領できる任意の生物に拡張可能であることを理解すべきである。いくつかの態様において、生物は細菌であり、構築物はプラスミドまたはファージ上に担持されている。別の態様において、生物は酵母であり、構築物はプラスミドまたはシャトルベクター上に担持されている。別の態様において、例えばげっ歯類または哺乳動物細胞において、本明細書に記載の遺伝子構築物は、プラスミド上に担持することができ、またはレンチウイルスもしくはアデノウイルスなどのウイルスによって送達することができる。
本明細書に記載の方法および組成物は、遺伝要素のコンビナトリアルセットの生成から利益を得ることができる、任意の研究に広く適用可能である。例えば、このアプローチは、疾患につながるよりかすかな酵素経路を規定し得るネットワークの摂動によって解明される、新規な薬物標的の同定に、または疾患を処置するための、新規な化学的または生物学的メディエーター（化学的および／または生物学的メディエーターの組合せを含む）の創薬を可能にする可能性がある。さらに、本明細書に記載の技術は、疾患の処置および／または予防のための既存の薬物標的の組合せの発見に適用することができ、ＦＤＡ承認の治療薬を用いた新たな併用療法につながる可能性がある。
【００４６】
本発明の側面により遺伝子発現を摂動することができる方法の、いくつかの非限定的な例としては、以下を含む：強い過剰発現、調整可能な過剰発現（調整可能な誘導性プロモーターを介して）、強力なノックダウン（短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または他のアンチセンスＲＮＡ構築物を介して）、および調整可能なノックダウン（ｓｈＲＮＡまたは他のアンチセンスＲＮＡ構築物および調整可能な誘導性プロモーターを介して）。
本発明の側面によりスクリーニングまたは選択することができる、関心のある表現型のいくつかの非限定的な例としては、以下を含む：細菌および真菌（例えば酵母）において：抗生物質耐性または感受性、持続性、毒性および代謝工学；哺乳動物細胞において：疾患状態の低減、疾患状態の生成、複雑な多因子疾患、老化および加齢関連疾患、神経変性、化学療法耐性、経路調節（例えば、ストレス反応）、感染に対する耐性、幹細胞の分化、細胞型分化転換およびＦＤＡ承認薬の増強。
【００４７】
過剰発現またはノックダウンを、調整可能な誘導性プロモーターを介して調整する能力は、摂動のセットに、従来可能であったよりもはるかにニュアンスを含ませることができる。例えば、ネットワークダイナミクスが発現レベルの最適化により最良に摂動され得る場合に、多くのタンパク質についての過剰発現の複数のレベルを組合せて、最適な表現型についてスクリーニングすることができる。さらに、異なるＤＮＡ要素に対して独立して誘導可能なプロモーターを使用することにより、複数の同時実験を行って、発現空間または時間的空間を探索することができる。
この技術は、直接的な生物医学用途のホストを可能とする。遺伝子治療ベクターの活用により、in vitroおよびin vivoにおいて、ノックダウンおよび過剰発現構築物のコンビナトリアルセットの送達がもたらされ得る。この技術の非限定的な生物医学的用途としては、多因子疾患の処置を、細胞を修飾し次いでヒトに移植するという、複雑な表現型と組織工学的応用によって行うことを含む。本明細書に記載のアプローチは、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体の組合せを含むコンビナトリアル抗体療法に適用することができる。同様に、コンビナトリアルワクチンは、複数のエピトープのコンビナトリアル選択によって最適化することができる。
【００４８】
さらに、この技術は幅広い可能性を有する基本的な発見を可能にする。一例は、in vitroでのタンパク質相互作用のグローバルマッピングである。遺伝子の過剰発現とノックダウンの２個一組またはより高次の組合せの、増殖速度および他の表現型に対する効果を測ることによって、タンパク質相互作用の総合的なマッピングを得ることができる。このデータから、相互作用する経路とネットワークハブを明らかにすることができ、細胞内タンパク質ネットワークのより微妙な概念と、所望の表現型のための新規なネットワーク摂動の発見がもたらされる。
本明細書に記載の方法、構築物およびライブラリの別の基本的な用途は、多因子疾患の決定因子の発見にある。疾患状態における細胞の遺伝子発現プロフィールおよび疾患に関連する遺伝子が報告されているが、例えば糖尿病、肥満、老化などの複雑な状態の特定の遺伝的決定因子は、未だ不明である。超並列コンビナトリアル遺伝学は、疾患状態を有する細胞を生成することができ、新たな疾患モデルを生成し、新規な治療標的を同定することができる。
【００４９】
従来のアプローチに対するこの技術の大きな利点は、事実上あらゆる表現型の調査のために、構築したライブラリを再度利用する能力である。例えば、ヒトゲノムにおける全ての既知のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のプールされたコンビナトリアルレンチウイルスライブラリは、幹細胞の分化から癌転移の阻害に至るまでの表現型をスクリーニングするために使用することができる。これは、さらなる疑問を調査するために必要な限界労力を、劇的に軽減する。
本発明は、原核細胞および真核細胞を含む、ＤＮＡを導入することができる任意の細胞型を包含する。いくつかの態様において、細胞は細菌細胞であり、例えば以下である：Escherichia spp.、Streptomyces spp.、Zymonas spp.、Acetobacter spp.、Citrobacter spp.、Synechocystis spp.、Rhizobium spp.、Clostridium spp.、Corynebacterium spp.、Streptococcus spp.、Xanthomonas spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcus spp.、Bacillus spp.、Alcaligenes spp.、Pseudomonas spp.、Aeromonas spp.、Azotobacter spp.、Comamonas spp.、Mycobacterium spp.、Rhodococcus spp.、Gluconobacter spp.、Ralstonia spp.、Acidithiobacillus spp.、Microlunatus spp.、Geobacter spp.、Geobacillus spp.、Arthrobacter spp.、Flavobacterium spp.、Serratia spp.、Saccharopolyspora spp.、Thermus spp.、Stenotrophomonas spp.、Chromobacterium spp.、Sinorhizobium spp.、Saccharopolyspora spp.、Agrobacterium spp.およびPantoea spp。細菌細胞は、Escherichia coli（大腸菌）細胞などのグラム陰性菌、またはBacillus種などのグラム陽性菌であることができる。
【００５０】
別の態様において、細胞は、酵母細胞などの真菌細胞であり、例えば、Saccharomyces spp.、Schizosaccharomyces spp.、Pichia spp.、Paffia spp.、Kluyveromyces spp.、Candida spp.、Talaromyces spp.、Brettanomyces spp.、Pachysolen spp.、Debaryomyces spp.、Yarrowia spp.、および産業倍数体酵母株である。好ましくは、酵母株はS. cerevisiae株である。真菌の他の例としては、Aspergillus spp.、Pennicilium spp.、Fusarium spp.、Rhizopus spp.、Acremonium spp.、Neurospora spp.、Sordaria spp.、Magnaporthe spp.、Allomyces spp.、Ustilago spp.、Botrytis spp.、およびTrichoderma spp.が挙げられる。
別の態様において、細胞は藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、げっ歯類細胞または哺乳動物細胞であり、ヒト細胞（例えば、ヒト胎児腎臓細胞（例えばHEK293T細胞）、ヒト皮膚線維芽細胞）を含む。
いくつかの態様において、本発明に関連する１または２以上の遺伝子は、組換え発現ベクター中で発現される。本明細書で使用する「ベクター」は、所望の１または複数の配列が、異なる遺伝子環境間での輸送のため、または宿主細胞における発現のために、制限およびライゲーションによってまたは組換えによって挿入され得るところの、多数の核酸のいずれであってもよい。ベクターは、通常ＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターには、限定はされないが、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体が含まれる。
【００５１】
クローニングベクターは、宿主細胞のゲノム中で自律的に複製しまたはこれに組み込まれることができ、かつ、以下によってさらに特徴付けられるものである：ベクターが決定可能な様式で切断されることができて、所望のＤＮＡ配列をライゲートできるところの、１または２以上のエンドヌクレアーゼ制限部位、または、適合末端を有するインサートが、新しい組換えベクターが宿主細胞中で複製する能力を保持するような様式で、組み込まれることができる組換え部位。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主細菌などの宿主細胞内でプラスミドのコピー数が増加するにつれて、多数回起こるか、または宿主が有糸分裂により再生する前に、宿主あたり一回のみ起こり得る。ファージの場合、複製は、溶解相の間に活動的に、または溶原相の間に受動的に、発生し得る。
【００５２】
発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が、制限およびライゲーションまたは組換えによってこれに挿入されることができ、こうして該配列が調節配列に作動可能に連結され、ＲＮＡ転写物として発現され得るようになるものである。ベクターはさらに、ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされていてもいなくてもよい細胞の同定に使用するのに適した、1または２以上のマーカー配列を含んでいてもよい。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当該技術分野で周知の標準的なアッセイにより検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および、形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に目に見える影響を与える遺伝子が挙げられる（例えば、緑色蛍光タンパク質）。好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の、自律複製および発現が可能なベクターである。
【００５３】
本明細書で使用する場合、コード配列および調節配列は、それらが、コード配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くような様式で共有結合により結合されている場合に、「動作可能」に連結されていると言う。コード配列が機能タンパク質に翻訳されることが所望される場合、２つのＤＮＡ配列は以下の場合に、作動可能に連結されたと言う：５’調節配列でのプロモーターの誘導が、コード配列の転写をもたらし、かつ２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさず、（２）プロモーター領域のコード配列の転写を指示する能力を妨害せず、または（３）対応するＲＮＡ転写物のタンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合。したがってプロモーター領域は、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写に、得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドへ翻訳可能なように影響を及ぼすことができる場合に、コード配列に作動可能に連結されたと言う。
【００５４】
核酸分子が細胞内で発現される場合、種々の転写制御配列（例えば、プロモーター／エンハンサー配列）を用いて、その発現を指示することができる。プロモーターは天然のプロモーター、すなわち、遺伝子の発現の正常な調節を提供する、その内因性の文脈における遺伝子のプロモーターであり得る。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的であることができ、すなわち、プロモーターは調節されないで、その関連遺伝子の継続的な転写を可能にする。また、種々の条件付プロモーターも使用でき、例えば、分子の存在または不在によって制御されるプロモーターを用いることができる。いくつかの態様において、プロモーターは、ヒトユビキチンＣプロモーター（Ｕｂｃｐ）である。いくつかの態様において、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶｐ）である。
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種または細胞型の間で変化し得るが、一般には、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などが挙げられる。特に、かかる５’非転写調節配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。必要に応じて、調節配列はまた、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に５’リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
【００５５】
発現に必要な全ての要素を含有する発現ベクターが市販されており、当業者に知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012を参照。細胞は、異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の細胞内に導入することにより、遺伝子操作される。異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）を転写要素の動作可能な制御下に置いて、宿主細胞において異種ＤＮＡの発現を可能にする。
本発明に関連する核酸分子は、当該技術分野で標準的な方法および技術を用いて、１または複数の細胞に導入することができる。例えば、核酸分子は、化学変換およびエレクトロポレーション、トランスダクション、微粒子銃を含む形質転換などの標準的なプロトコルにより、導入することができる。核酸分子の発現はまた、核酸分子をゲノム中に組み込むことによって達成してもよい。
【００５６】
いくつかの態様において、本発明に関連する1または２以上の遺伝子は、細菌細胞中で組換え発現される。本発明による細菌細胞は、任意の種類（リッチまたは最小）および任意の組成の培地で培養することができる。当業者によって理解されるように、様々な種類の培地が本発明の側面と適合性であり得る。選択された培地には、様々な追加の成分を補充することができる。補足的な成分のいくつかの非限定的な例としては、グルコース、抗生物質、遺伝子誘導用のイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ＡＴＣＣ微量ミネラルサプリメントおよびグリコレートを含む。同様に、本発明の細胞の培地および増殖条件の他の側面は、日常的な実験により最適化することができる。例えば、ｐＨおよび温度は、最適化が可能な因子の非限定的な例である。いくつかの態様において、補足成分の濃度および量を最適化することができる。
本発明のいくつかの側面は、抗生物質耐性表現型における多様な摂動を同定するための、薬剤耐性（例えば、多剤耐性）の細菌またはウイルス株、例えばニューデリーメタロβラクタマーゼ1（NDM-1）大腸菌株を使用した、超並列コンビナトリアル遺伝学の使用に関する。特に、本明細書中の方法および構築物は、例えば、既存の抗生物質を処置のために強化することができる、転写因子の組合せを同定するために使用され得る。したがって、いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、転写因子（ＴＦ）の、２個一組、３個一組、およびｎ個一組（例えば４、５、６、７、８、９、または１０個一組）の組合せのライブラリであって、例えば次世代シーケンシングを介して解析可能なものである。
【００５７】
いくつかの態様において、コンビナトリアル転写因子のライブラリは、単一抗生物質または一定範囲の抗生物質（例えば、１より多くの抗生物質、または２、３、４または５以上の抗生物質）に対する抗生物質耐性表現型に関して、相乗効果を発揮するＴＦの組合せ（例えば２または３以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）を同定するために使用され得る。いくつかの態様において、mt1RとuidR、またはqseBとbo1Aを発現する構築物が提供される。いくつかの態様において、mt1RとuidR、またはqseBとbo1Aを発現する構築物を含有する細胞（例えば、細菌細胞）が提供される。
いくつかの態様において、rstAとrob、rstAとmirA、rcsBとmirA、またはfeaRとhcaRを発現する構築物が提供される。いくつかの態様において、rstAとrob、rstAとmirA、rcsBとmirA、またはfeaRとhcaRを発現する構築物を含有する細胞（例えば、細菌細胞）が提供される。
いくつかの態様において、コンビナトリアル転写因子のライブラリを用いて、抗生物質の殺菌活性を増幅する致死効果を発揮するＴＦの組合せを同定することができる。いくつかの態様において、torRとmetR、nhaRとme1R、a11RとmetJ、ma1LとyfeT、cadCとa11R、torR、metR、またはtorRを発現する構築物が提供される。いくつかの態様において、torRとmetR、nhaRとme1R、a11RとmetJ、ma1LとyfeT、cadCとa11R、torRまたはmetRを発現する構築物を含有する細胞（例えば、細菌細胞）が提供される。
【００５８】
本発明に従って使用される抗生物質としては、限定はされないが、以下が挙げられる：アミノグリコシド、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、スペクチノマイシン、アンサマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、リファキシミン、ストレプトマイシン、カルバセフェム、ロラカルベフ、カルバペネム、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファロスポリン（第1世代）、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン（Cefalotin）またはセファロチン（Cefalothin）、セファレキシン、セファロスポリン（第２世代）、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セファロスポリン（第３世代）、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セファロスポリン（第４世代）、セフェピム、セファロスポリン（第５世代）、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール、グリコペプチド、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、リンコサミド、クリンダマイシン、リンコマイシン、リポペプチド、ダプトマイシン、マクロライド、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、モノバクタム、アズトレオナム、ニトロフラン、フラゾリドン、ニトロフラントイン、オキサゾリドノン、リネゾリド、ポシゾリド（Posizolid）、ラデゾリド（Radezolid）、トレゾリド、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ペニシリンＧ、テモシリン、チカルシリン、ペニシリンの組合せ、アモキシシリン／クラブラネート、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラネート、ポリペプチド、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、キノロン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、スルホンアミド、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド（Sulfanilimide）（archaic）、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（TMP-SMX）、スルホンアミドクリソイジン（Sulfonamidochrysoidine）（archaic）、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン（米国におけるリ��ァンピン）、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン、チニダゾールおよびトリメトプリム。
【００５９】
本明細書で企図される他の抗生物質耐性病原体としては、限定はされないが、Staphylococcus aureus、StreptococcusおよびEnterococcus、Pseudomonas aeruginosa、Clostridium difficile、Salmonella、Escherichia coli、Acinetobacter baumanniiおよびMycobacterium tuberculosisが挙げられる。
本発明の様々な側面は、複雑なヒト疾患の根底にある病理学的メカニズムを解明するための、超並列コンビナトリアル遺伝学の使用に関する。例えば、本発明の方法は、酵母モデルにおいて寿命の調節および神経変性疾患を調べるために使用することができる。高次の遺伝的相互作用の探査により、超並列コンビナトリアル遺伝学は、加齢関連疾患における新たな治療戦略および創薬への洞察を提供することができる。酵母モデルは、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集を特徴とするいくつかのヒト神経変性疾患を研究するために、広く使用されている（表1に要約）。
【００６０】
【表１】
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利用可能な酵母モデルの中で、それぞれアルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）の発現を駆動すると広く考えられている増加したアミロイドβ（Ａβ）およびαシヌクレイン（αＳｙｎ）は、濃度依存的に顕著に細胞死を誘導する。最も重要なのは、いくつかの遺伝的要因が、酵母におけるＡβまたはαＳｙｎ毒性を抑制するだけでなく、ＡＤおよびＰＤのより高度なモデル生物で、鍵となる病理学的特徴を救済することである。したがって、これら２つのモデルを用いて、臨床治療に有益となり得るコンビナトリアル遺伝因子を探索することができる。
【００６１】
本発明のいくつかの態様において、遺伝子スクリーニングのための酵母株は、例えばαシヌクレインまたはアミロイドβのなどの目的の遺伝子と誘導性プロモーター（例えば、ガラクトース（Ｇａｌ）誘導性プロモーター）の、複数の直列型コピーを組み込むことによって生成される。いくつかの態様において、酵母株を操作して、Tet-ON発現系の一部である逆テトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）を含むようにする。この性質は、操作された酵母株を使用して生成されたコンビナトリアルライブラリの発現を、Tet-ON発現系により制御可能にする（例えば、抗生物質テトラサイクリンまたはその誘導体の一つ（例えば、ドキシサイクリン）の存在下で、転写が可逆的に開始される）。いくつかの態様において、操作された酵母株を超並列コンビナトリアル遺伝学と組合せて用いて、Ｇａｌおよびドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処置による細胞の生存に寄与する遺伝子の組合せを回収する。
【００６２】
発明の側面はまた、例えば転写因子およびヒストン修飾酵素などの、転写制御因子の過剰発現ライブラリ（例えば、コンビナトリアルライブラリ）を提供する。いくつかの態様において、ライブラリはまた、ユビキチン／プロテアソーム、オートファジー（autophage）、およびシャペロン経路に関与する酵母遺伝子を含有してもよい。ライブラリ内の各遺伝子には、例えば、ライブラリアセンブリを体系的にスケールアップし、超並列コンビナトリアル遺伝学を用いた遺伝子組合せのためのハイスループットシーケンシングを実行するための、ユニバーサル制限酵素切断部位が隣接してもよい。
いくつかの態様において、本発明の発現構築物は、図２９に示すように配置された１つのユニークなバーコード（ＢＣ）と４つの制限部位を含む。バーコードベクターをプールし、酵素（例えば、AvrIIおよびNotI）で消化する。インサートは、異なる酵素（例えば、SpeIおよびPspOMI）での消化によって生成することができる。いくつかの態様において、「ワンポット」または単一のライゲーション反応は、２個一組のコンビナトリアルライブラリを生成するために使用され得る。
【００６３】
本発明の別の側面において、超並列コンビナトリアル遺伝学を用いて、マイクロＲＮＡのコンビナトリアルライブラリを生成することができる。したがって、いくつかの態様において、本発明のＤＮＡ要素は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）をコードすることができる。本明細書において、マイクロＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に存在する標準的な配列との塩基対形成を介して遺伝子発現を調節する、非コードＲＮＡを意味する（Berezikov, E. et al. Nat Rev Genet 12, 846-860 (2011)）。ｍｉＲは、自分自身を折り畳んでヘアピン構造を形成し、Droshaおよびダイサー／ＲＩＳＣ複合体で処理されてその成熟形態を生成する前駆体ｍｉＲとして、初めに転写される。ヒト成熟ｍｉＲは、典型的には、そのｍＲＮＡ標的に部分的な相補性を示す。ｍｉＲの５’領域における６〜８のヌクレオチド長の配列は、標的特異性の重要な決定因子であると考えられている。したがって、単一のｍｉＲは複数のｍＲＮＡ標的を有することができ、単一のｍＲＮＡは複数のｍｉＲによって標的化することできる。標的とされたｍＲＮＡは分解されるか、またはその翻訳が防止される。上記のメカニズムによって、ｍｉＲは、数千の遺伝子の発現を調節し、ほとんどの生物学的プロセスに関与している（Ambros, V. Nature 431:350-355 (2004)；Gangarajiu, V.K. et al. Nat Rev Mol Cell Bio 10:116-125 (2009)；Inui, M. et al. Nat Rev Mol Cell Bio 11:222-263 (2010)）。また、ｍｉＲの異常な発現は、多くの疾患状態で報告されている（Esteller M., et al., Nat Rev Genet 12:861-874 (2011)；Eacker, S.M. et al. Nat Rev Neurosci 10:837-841 (2009)；Kong, Y.W. et al. Lancet Oncol 13:e249-258 (2012)）。様々なｍｉＲの発現の回復は、特定の疾患状態に有益な効果を持っており、治療薬として開発され得る（Esteller M., et al. (2011)；Kong, Y.W. et al. (2012)）。
【００６４】
本発明の別の側面において、超並列コンビナトリアル遺伝学を用いて、前駆体ｍｉＲを、任意にマーカー／レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰ）と共に発現する直列型転写単位を含むベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター）を生成することができる。本明細書において転写単位は、ｍｉＲをコードするヌクレオチド配列を指す。ベクターは、２または３以上の同一の転写単位を含んでよく（例えば、miR-124などの同一のｍｉＲをコードする各単位）、および／または、ベクターは、２または３以上の異なる転写単位を含んでよい（例えば、miR-124をコードする１または２以上の単位、miR-128をコードする１または２以上の単位、および／または、miR-132をコードする１または２以上の単位）。したがって、直列型転写単位は、miR-124、miR-128、miR-132またはそれらの任意の組合せをコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含んでもよい。いくつかの態様において、ベクターは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０（およびこれらの間の整数）または５１以上の、同一および／または異なる転写単位を含有することができる。
いくつかの態様において、本発明の前駆体ｍｉＲは、配列番号６、配列番号７、または配列番号８で示される配列を、含む／である。いくつかの態様において、本発明のｍｉＲセンサーは、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１で示される配列を、含む／である。いくつかの態様において、ベクターは、配列番号１で示される配列を含む／である直列型前駆体ｍｉＲを含む。
【００６５】
いくつかの態様において、本発明は、以下を含む遺伝子構築物を提供する：
マイクロＲＮＡをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列（例えば、1つのヌクレオチド配列または複数のヌクレオチド配列）；ＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素が互いにアニーリングすることが可能である、前記第１および第２適合末端要素；バーコード要素；バーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は互いにアニーリングすることが可能であるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記第３および第４適合末端要素；および、第４適合末端要素と第１適合末端要素の間に位置する分離部位であって、ここで、ＤＮＡ要素、第１適合末端要素および第２適合末端要素は分離部位の一方の側にあり、バーコード要素、第３適合末端要素および第４適合末端要素は分離部位の反対側にある、前記分離部位。
【００６６】
さらに本明細書で提供されるのは、前駆体ｍｉＲを発現する直列型転写単位を含むベクターの、効率および／または有効性を試験するためのアッセイおよび構築物である。例えば、いくつかの態様において、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター）は、前駆体ｍｉＲを任意に第１マーカー／レポーター遺伝子（例えばＧＦＰまたはＲＦＰ）と共に発現する直列型転写単位、および、第１とは異なる第２のマーカー／レポーターの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲセンサー配列を含んでもよい。本明細書においてｍｉＲセンサー配列とは、ｍｉＲと相補的であるヌクレオチド配列を指す（すなわち、ｍｉＲの相補的標的配列）。ｍｉＲセンサー配列は、少なくとも一つの相補的な標的配列を含み、いくつかの例では、相補的標的配列の反復を含むことができる。例えば、いくつかの態様において、ｍｉＲセンサー配列は、ｍｉＲのヌクレオチド配列に相補的な、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１以上の反復配列を含むことができる。
【００６７】
本発明は、その用途において、以下の説明に示され図面に描かれた構成要素の構成および配置の詳細に、限定されない。本発明は別の態様でも可能であり、様々な方法で実施または実行されることができる。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明目的のためであり、限定とみなされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する」、「含有する」、「伴う」、およびそれらのバリエーションの使用は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
本発明は、以下の実施例によりさらに例示されるが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用された参考文献（参考文献、発行済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）は、特に本明細書に引用された教示について、ここに参照によって明示的に組み込まれる。
【実施例】
【００６８】
例１．バーコード遺伝子構築物の開発
バーコード遺伝子構築物を開発し、要素のバーコード組合せを生成するために操作した。遺伝子構築物の非限定的な例の一般的な概略図を図１Ａに示す。ＤＮＡ要素（例えば、ＤＮＡ−１）は、ユニークなバーコード（例えば、ＢＣ−１）に関連付けられている。ＤＮＡ要素に隣接するのは、適合末端、この場合はＧ２ＡおよびＧ２Ｂであり、これらは、図１ＡにＢＣ−１に隣接して示されているＧ１ＡおよびＧ１Ｂと同様に、互いにアニーリングすることができる。しかし、Ｇ１ＡとＧ２Ｂは適合性ではない。Ｇ１ＢとＧ２Ａの間には、制限酵素部位またはＤＮＡを切断する他の方法などの、構築物の直線化を可能にする分離部位がある。この配置の鏡像、すなわちＤＮＡ要素の３’にバーコードおよび適合末端を有するものもまた機能的である。
【００６９】
図１Ｂは、ユニークなベクターとユニークなインサートの間に発生する組合せイベントを示す。ベクターは、その分離部位で切断される。インサートはそのベクターから、例えばＰＣＲまたは制限消化を介して、調製することができる。インサートの末端は、直線化ベクターにおいてそれらの適合性のパートナーへアニールし、ライゲートされる。
図１Ｃは組合せ後の構築物を示し、これらは当業者に周知の方法によって細胞に形質転換することができる。バーコードＢＣ−１とＢＣ−２は現在近接しており、シーケンシングによって容易に読み取ることができ、ＤＮＡ要素の身元を明らかにする。さらに、分離部位は保持されて、高次の組合せの容易な構築を可能にする。
試料生成スキームの非限定的例において、図１Ａに示すような構築物のライブラリを、ハイスループットロボットを介して、各ユニークなＤＮＡ要素についてプラスミド上に調製する。このプラスミドライブラリをプールし（ベクターライブラリの生成）、プールに対してＰＣＲを実施する（インサートライブラリの生成）。ワンポット反応では、全てのベクターは全てのインサートと対合され、２個一組の組合せの完全なコンビナトリアルセットが生成される。この２個一組のライブラリを次に、同じインサートライブラリとさらに反応させて、３個一組のライブラリ、４個一組のライブラリ等々を、単一のベクターライブラリから生成する。
【００７０】
コンビナトリアルライブラリにおけるユニークなバーコードの近接は、シーケンシング、マイクロアレイ、またはＤＮＡ配列を決定する他の方法を介して、単一のコンビナトリアル構築物中に存在するＤＮＡ要素の迅速な同定を可能にする。一例では、コンビナトリアルライブラリを含む細胞のプールは、特定の表現型（例えば、化学療法耐性）についての選択を受ける；生存細胞のその後の単離およびシーケンシングは、どのＤＮＡ要素の組合せが所望の表現型を生じさせたかを解明する。別の例では、プールされた細胞は、ハイスループット次世代シーケンシングを受け、プール内の特定のＤＮＡの組合せの普及をもたらす；このデータはその後、タンパク質相互作用ネットワークを生成するために使用することができる。
【００７１】
例２．ギブソン・アセンブリの概念
本発明のいくつかの非限定的な態様において、ギブソン・アセンブリ法を用いて、適合末端要素を生成する。ギブソン反応はＴ５エキソヌクレアーゼを用いて５’鎖を消化し、相補配列をアニールし、ギャップにＤＮＡポリメラーゼを充填し、構築物をＴａｑリガーゼでライゲートすることを可能とする（Gibson et al. (2009) Nature Methods 6:343-5）。図１に示すように、Ｇ１ＡおよびＧ１Ｂは同一配列であり；Ｇ２ＡおよびＧ２Ｂも同様に同一である。分離部位は、制限酵素認識部位である。
いくつかの態様において、単一の制限部位を用いて、反応のための直線化ベクターを生成し、こうしてＤＮＡ要素との干渉を回避する。このように、この方法論は、ＯＲＦおよび非コードＤＮＡなどのゲノムワイドでの要素の組合せの探索に、特に有用である。
【００７２】
例３：大腸菌における超並列コンビナトリアル遺伝学の実証
超並列コンビナトリアル遺伝学のための方法を、大腸菌において２種の蛍光タンパク質、ＧＦＰとmCherryに成功して適用した。それぞれの全ＤＮＡ要素は、誘導性プロモーター、タンパク質ＯＲＦ、およびターミネーターから成る。これらの要素は、それぞれＢＣ１−ＧＦＰおよびＢＣ２−mCherryとしてバーコード化された。
最初の実証において、ＢＣ１−ＧＦＰを２回続けてそれ自体に挿入して、ＢＣ１−ＢＣ１−ＧＦＰ−ＧＦＰおよびＢＣ１−ＢＣ１−ＢＣ１−ＧＦＰ−ＧＦＰ−ＧＦＰを生成した。図２Ａは、未切断プラスミド自体に連続したバーコードＧＦＰ単位を組み込んで、プラスミドにさらに〜１ｋｂを追加する、ゲル電気泳動を示す。プラスミドはまた、プラスミド上の静的領域から、変化するコンビナトリアル領域を分離する、プラスミド上の点で制限消化した。図２Ｂには、消化されたインサートを囲むボックスが示され、連続挿入あたり〜１ｋｂの増加を示し、一方印のない静的な領域は、同じサイズのままである。
【００７３】
次に、コンビナトリアルセットを、ＧＦＰとmCherry両方のための構築物を用いて作成した。蛍光顕微鏡法は、ＤＮＡ要素と機能的タンパク質の発現の成功した組合せを示した（図３）。図３は、mCherryとＧＦＰ構築物の組合せおよび機能的発現を示す。蛍光画像は、mCherry用フィルタ（図３Ａ）、ＧＦＰ用フィルタ（図３Ｂ）を用いて、および重ねて示す（図３Ｃ）。ＧＦＰ発現のみまたはmCherry発現のみを示すクローンも同定した。
シーケンシングにより、無傷のバーコードおよび分離部位の４つの組合せの完全なコンビナトリアルスペースが確認され、この方法の堅牢性を示す（図４）。このようにして、本明細書で開発された方法の次の能力が実証される：ｉ）ユニークなバーコードＤＮＡ要素の組合せのセットを生成する、ｉｉ）バーコード領域のシーケンシングを介して組合せの同定を可能にする、およびｉｉｉ）各組合せステップについて同じバーコード構築物を用いて、より高次の組合せを生成する。
【００７４】
例４：制限部位の概念
本技術のいくつかの非限定的な態様において、制限部位の方法論を適用して適合末端要素を生成することができる（図５）。BioBrick（登録商標）標準と同様に、２つのユニークな制限酵素は、一緒にライゲートした場合にどちらかの制限酵素によっても認識されず、かつ切断することもできない瘢痕を形成する、適合オーバーハングを生成する（Anderson et al. (2010) Journal of Biological Engineering 4:1）。ギブソン・アセンブリ法と比較して、このアプローチに関連する短い瘢痕は、標準の次世代シーケンシングリード内で読み取られるバーコード要素のより大きな数を可能にし、したがって、より高次の組合せを可能にする。追加的な制限酵素の使用は、挿入されたＤＮＡ要素との干渉の可能性を高める一方で、使用される特定の制限酵素をＤＮＡ要素の任意のセットに対して改変して、この方法に必要な制限酵素が最小数の要素に干渉するようにすることができる。さらに、突然変異誘発をＤＮＡ要素に実施して、その配列から制限部位を除去することができる。
【００７５】
制限部位アセンブリ戦略を用いて、より高次の組合せ生成の容易さを試験した。５つのバーコードＤＮＡ要素のライブラリを使用して、組合せ配列を３回繰り返し、２個一組、３個一組、および４個一組の組合せを生成した。個々のコロニーのシーケンシングは、読みやすい様式でのバーコードおよび瘢痕の保持を示した（図６Ａ）。次にコロニーから単離したプラスミドを消化して、バーコードおよびそれぞれのＤＮＡ要素で構成された可変コンビナトリアル領域を、ベクターの定常の残部から分離した（図６Ｂ）。
【００７６】
例５：ライブラリの生成
次に、遺伝子発現を試験するために、ＧＦＰとmCherryのバーコードベクターライブラリを、ａＴＣ誘導性pLtetOプロモーターと各ＯＲＦの下流のT1＋T7融合ターミネーターの制御下で構築した。各ベクターは、構成的プロモーターの制御下で高コピーColE1起点、tetRを含んでおり、ｃａｔはクロラムフェニコール耐性を付与する。
インサートライブラリをＰＣＲを介して生成し、図５に示すように２個一組の組合せのセットを作成し、これはその後、DH5a細胞に形質転換した。２４のコロニーを単離し、陽性および陰性対照と共にａＴＣの増加濃度中で増殖させた（図７）。重要なことは、データはいくつかの特徴を示す：ｉ）カイ二乗検定で有意性を示さない３つの可能な組合せの均一な分布（全２４試料；９個のＧＦＰ−ＧＦＰ；５個のmCherry−mCherry；１０個のＧＦＰ−mCherry）；ｉｉ）各個別のプロモーター−ＯＲＦの組合せの、独立に近い発現、これは、N95-2などのＧＦＰ−mCherryの組合せ、およびN95-3などのmCherry−ＧＦＰの組合せにより決定した；およびｉｉｉ）高レベルの抑圧および誘導の制御、これは１５０〜３００倍のオン／オフ比をもたらす。
【００７７】
例６：大腸菌での抗菌耐性の調査
抗菌耐性および耐性に打ち勝つ方法を、大腸菌で調べた。大腸菌における１７３の記録された転写因子をバーコード化することにより、２個一組および３個一組の組合せを生成し、最も効果的に抗生物質耐性を減少または増加させる組合せを決定した。シーケンシングリードの統計的分析により、相乗作用と拮抗作用などの非線形上位性の遺伝的相互作用を同定した。これらの結果を次に、抗生物質感受性試験で検証した。この技術のフルパワーを実証するために、最も成功した２個一組の組合せを次に用いて、３個一組の組合せを生成し、感受性を再度評価した。耐性の複数のメカニズムを本明細書で提供される方法を用いて調べることができ、これには、抗生物質の範囲に応じて、拡張スペクトルβ−ラクタマーゼ、排出ポンプ変異体、およびメタロ−βラクタマーゼを含む。
【００７８】
超並列コンビナトリアル遺伝学は、バーコードＤＮＡ要素のライブラリから開始される、反復的クローニング戦略を使用する（図１６Ａ）。プールしたベクターおよびインサートライブラリの制限消化と、続いてワンポットライゲーション反応は、バーコードが互いに近接している、２個一組の組合せのライブラリを作成する。その結果、特定の構築物中の成分の同一性は、順番にバーコードを読み取る短い配列によって決定することができる。ハイスループットシーケンシングにより、プールされた集団内のライブラリメンバーの分布を調査することができ、異なる実験条件下での集団の変化を同定する。代替的に、サンガーシーケンシングを、プレーティングアッセイまたは細胞選別を介して選択された、分離したコロニーに対して行ってもよい。注目すべきことには、本明細書に提供される方法は、新たに生成されたコンビナトリアルライブラリと同じインサートプールを使用して、対数線形時間でより高次の組合せを生成することができる、反復的方法である。
図１６Ａは、アセンブリ法の概略を示す。転写因子（ＴＦ）発現構築物はバーコード化され、４つの制限部位（１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ）は図示のように配置されている。ペアである１Ａ／１Ｂと２Ａ／２Ｂは、ペア内で適合オーバーハングを生成するが、他のペアと適合性のない、ユニークな制限部位である。バーコードベクターをプールし、酵素１Ｂ＋２Ａで消化する。インサートは、ＰＣＲによりベクターから生成し、１Ａ＋２Ｂで消化する。ワンポットライゲーション反応は２個一組のコンビナトリアルライブラリを生成し、これはさらに消化され、同一のインサートプールでライゲートされて、より高次の組合せを生成することができる。
【００７９】
この研究において、１７３の大腸菌転写因子（ＴＦ）および１８の蛍光タンパク質を、ａＴｃ誘導性pLtetOプロモーターの制御下に置いた（図１７）。これらの発現構築物は、ユニークにバーコード化され、組み合わされて、全ての可能な３５，３４３の２個一組の組合せを生成した（いくつかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、制限酵素による切断に起因するベクターまたはインサートとして拒否された）。この２個一組のコンビナトリアルライブラリを大腸菌MG1655株に形質転換し、Illumina HiSeq（商標）プラットフォーム上でシーケンシングし、集団にわたる、組合せの均一な分布と３４，５５４の組合せの回収、または全ての可能な組合せの９８％の回収を示した（図１６Ｂ）。構築物の発現レベルおよび発現レベルに対する順序の影響を評価するために、ＧＦＰとmCherryの４つ全ての２個一組の組合せ、並びに単一のＧＦＰとmCherryの蛍光を測定した（図２４）。ＧＦＰとmCherryの４つ全ての２個一組の組合せ、並びに単一のＧＦＰとmCherryは、ａＴｃが２５０ｎｇ／ｍＬにおいて誘導され、これをフローサイトメトリーによって評価した。ＧＦＰ−mCherryとmCherry−ＧＦＰは同等の蛍光レベルを示し、発現レベルに対する配列の低い影響を示した。ＧＦＰ−ＧＦＰとmCherry−mCherryは、異種の組合せおよび単一の構築物と比較して、それぞれＧＦＰとmCherryの約２倍の発現レベルを示した（図１６Ｃ）。
【００８０】
コンビナトリアルライブラリで転写因子（ＴＦ）の組合せが発見され、ニューデリーメタロβラクタマーゼ1（NDM-1）大腸菌株についての生存能力表現型がもたらされた。最近発見されたNDM-1酵素は、カルバペネムを含む広範囲のβ−ラクタム抗生物質を加水分解する（Mochon, A. B. et al. (2011) Journal of clinical microbiology 49:1667-1670）。一般的に処置で使用される抗生物質に対するこの耐性は、一握りの最後の手段の薬でのみ処置が可能な、手に負えない感染症を引き起こす。この研究はしたがって、処置のための既存の抗生物質を強化することができる転写因子の組合せを同定するために、主として求められる。
コンビナトリアルライブラリを、大腸菌MG1655株とKlebsiella pneumoniaeNDM-1の臨床分離株のコンジュゲーションにより生成された、大腸菌NDM-1株に形質転換した。大腸菌NDM-1株の広範囲の耐性を、抗生物質の一定範囲で確認したところ、その耐性プロフィールは、元のKlebsiella pneumoniae単離物に類似していることが判明した（表２）。抗生物質の死滅を増強した組合せを同定するために、形質転換されたNDM-1株を、ａＴｃ誘導有りまたは無しの条件でセフトリアキソン処置に供した（図１８Ａ）。セフトリアキソンは、広範囲の活性を有する第３世代セファロスポリンであり、肺炎、細菌性髄膜炎および淋病を処置するために臨床的に使用される。各条件での集団を、指定された増殖段階で採取し、経時的に集団の分布のシフトを観察した。これらの試料は、Illumina HiSeqプラットフォーム上でハイスループットシーケンシングのために多重化した。
【００８１】
【表２】
0006401700.tif 000003
各組合せのNDM-1生存率に対する影響を判断するために、特定の実験条件における各組合せの存在量を、別の実験におけるその存在量と比較した。例えば、ａＴｃ単独またはセフトリアキソン単独に比べて、ａＴｃとセフトリアキソン両方の存在下で特に過剰表現された組合せは、組合せが細胞に対して相対的な増殖優位性を付与したことを示唆した。同様に、ａＴｃとセフトリアキソン両方の存在下で特に過少表現された組合せは、セフトリアキソンとの殺菌相乗作用を付与した。相乗的死滅、中性増殖、および有利な増殖の表現型をもたらす組合せを選択した。組合せの階層的クラスタリングおよび各実験でのそれらのスコアは、表現型クラスによるクラスタリングを示した（図１８Ｂ）。発現構築物中の遺伝子の順序の影響を評価するために、階層的クラスタリングを、これらの組合せおよびそれらの相互構成（reciprocal configuration）について実施した。同じ表現型の組合せが、順序と無関係に一緒にクラスタ化した（図１９）。
【００８２】
各遺伝子ペアをクローンニングし、その活性を、抗生物質感受性アッセイで検証した。相乗的として同定された組合せは、抗生物質単独またはａＴｃ単独と比べて、３〜４桁の顕著な死滅の増幅を示し（図２０Ａ）、また、対照よりも顕著に大きい増幅を示した（図２０Ｂ）。対照的に、有利と同定された組合せは、抗生物質単独による死滅の最小限の増幅を示した（図２０Ｃ）。有利な組合せは、抗生物質単独を超える追加の生存を与えなかったが、遺伝子ペアの無害な発現は、相乗的および対照の組合せに比べて、ライブラリの実験における高い存在量につながった。
コンビナトリアルライブラリのハイスループットスクリーニングを可能にすることにより、超並列コンビナトリアル遺伝学は、一見無関係のタンパク質間の予想外の相乗作用の発見を可能にする。相乗的組合せmtlRとuidRはそれぞれ、マンニトールおよびβグルコシド代謝を調節する。各遺伝子は個別に抗生物質耐性を媒介しないことが報告され、抗生物質感受性アッセイにおいて最小の効果を示した（図２１Ａ）。同様に、qseBとbolAはそれぞれ、病原性およびストレス応答に関連した経路に関与するとされ、個々の遺伝子は、２個一組の組合せと比較して、顕著に低い活性を示した（図２１Ｂ）。
【００８３】
超並列コンビナトリアル遺伝学が、抗生物質のある範囲にわたって組合せを同定できるかどうかを検討するために、コンビナトリアルライブラリを、β−ラクタム抗生物質のイミペネムおよびピペラシリン・タゾバクタムに、およびアミノグリコシド抗生物質のゲンタマイシンに暴露した。各抗生物質はセフトリアキソンと共に臨床シナリオで広く使用され、NDM-1株によって分解される。興味深いことに、β−ラクタム抗生物質は、おそらくはそれらの特徴的な作用メカニズムのために、ゲンタマイシンとは別に一緒にクラスタ化した（図２２、２５）。超並列コンビナトリアル遺伝学は、したがって、実験的処置のニュアンスを区別することができる。
超並列コンビナトリアル遺伝学が、抗生物質の殺菌活性を増幅する致死的組合せを同定できるかどうかを判断するため、ａＴｃおよびａＴｃ＋セフトリアキソンの存在下で、存在量が減少する組合せを選択した。セフトリアキソン単独と比べて、５桁を超える細菌集団の死滅の程度を示す組合せが発見された（図２３Ａ）。多くの遺伝子は有毒であるため、毒性遺伝子のランダムな組合せを構築し、超並列コンビナトリアル遺伝学が特に致死的な組合せを同定できるかどうかを評価した。同定された組合せは、最も低い細胞密度の時点で、平均して一桁大きい死滅の程度を示した（図２３Ｂ）。さらに、組合せは１０時間を超える期間にわたり、長く持続的に死滅を示した。
【００８４】
この研究はまた、大規模な死滅効果が、２つの構成成分である遺伝子間の相乗効果によるものかどうかを評価した。torRとmetRは個別に発現された場合には有毒であるが、それらの活性の総和は組合せの活性を完全には再現せず、それらの効果の相乗作用を示唆する（図２３Ｃ）。したがって超並列コンビナトリアル遺伝学は、コンビナトリアル摂動を分離でき、組合せの個々の構成成分からは事前には明らかでない、強力な表現型がもたらされる。
毒性遺伝子の組合せは、例えばファージにより送達された場合、抗生物質処置のための効果的なアジュバントとなり得る。組合せ構築物をファージミドにパッケージ化して、Klebsiella pneumoniaeNDM-1の臨床分離株とコンジュゲートした大腸菌ＥＭＧ２株を感染させた。セフトリアキソンとコンジュゲーションされた遺伝子の誘導は、セフトリアキソン単独と比較して、１〜２桁高い死滅をもたらし、一方対照ファージミドでは、改善は見られなかった（図２３Ｄ）。
【００８５】
超並列コンビナトリアル遺伝学の方法の、高次の組合せへの容易な拡張性を実証するために、３個一組の組合せライブラリを、２個一組のＴＦライブラリから構築した。複雑性の低いライブラリは、１８９×１８７×１８個の遺伝子を組み合わせることによって生成した（図２６）。６３６，１７４の可能な組合せのうち、約１７００万のシーケンシングのリードから５１６，７９８のユニークな組合せ（全ての可能な組合せの８１％）を回収した。高い複雑性のライブラリも、１８９×１８７×１８７個の遺伝子を組み合わせることによって生成した（図２７）。６，６０９，１４１の可能な組合せのうち、約２０００万のシーケンシングのリードから４，０４２，３１６のユニークな組合せ（６１％）を回収した。ライブラリのより大きな適用範囲は、追加のエレクトロポレーションと、試料についてのより多くのリードを行うことにより、達成可能であろう。
【００８６】
超並列コンビナトリアル遺伝学を介して、抗生物質耐性の強い表現型を付与する遺伝子の組合せが、確実に同定された。ライブラリアセンブリ戦略に適用されたハイスループットシーケンシングは、プールされたコンビナトリアル集団のかつてないスケールでの全数調査を可能にした。本明細書において提供される方法は柔軟性があり、遺伝子発現およびノックダウン構築物、合成回路構成要素、およびゲノム配列を含む、選択した任意のＤＮＡ要素の高次の組合せを構築することができる。超並列コンビナトリアル遺伝学を用いて、複雑なインタラクトームデータセットを生成し、分化などの所望の表現型のコンビナトリアル誘導物質についてスクリーニングし、これまでにない規模と効率で合成回路を特徴付けることができた。制限酵素を用いた超並列コンビナトリアル遺伝学はまた、ライブラリが制限部位と適合性がない状況において、ギブソン等温アセンブリまたはリコンビナーゼに適合させることができる。複雑な表現型と創発ネットワーク特性をプロービングすることは、生体系の理解およびその用途に大きく貢献するであろう。
【００８７】
方法
細菌株および培養条件。クローニングに用いる大腸菌DH5α細胞は、New England Biolabsから入手した。ライブラリのエレクトロポレーションに用いる大腸菌ElectroTen-Blue細胞は、Agilentから入手した。K. pneumonia産生NDM-1臨床分離株にコンジュゲートした大腸菌MG1655細胞を、抗生物質感受性と永続性アッセイに使用した。特に断りのない限り、培養物は、Luria-Bertoni（ＬＢ）ブロス中で次の化学物質濃度で増殖させた：ａＴｃは１００ｎｇ／μＬ、カルベニシリン（Ｃａｒｂ）は５０μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール（Ｃｍ）は３０μｇ／ｍｌ、セフトリアキソンは１９２μｇ／ｍＬ。
化学物質。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、および制限酵素はNew England Biolabsから入手した。ポリメラーゼ連鎖反応は、Kapa BiosystemsのHiFi（商標）HotStartを用いて行った。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologiesから購入した。抗生物質はSigmaおよびEnzo Life Sciencesから購入した。他の全ての化学物質は、Sigma-Aldrichから購入した。
【００８８】
ライブラリの構築。バーコード化された単一の転写因子（ＴＦ）のライブラリを構築するため、ギブソン等温アセンブリを用いて、ユニークな６塩基対のバーコードを、PLtetOプロモーター、ＴＦオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、およびベクター骨格にライゲートした。各バーコードの長さは６塩基対であり、少なくとも２塩基の遺伝的距離によって、他の全てのバーコードから分離された。転写因子ＯＲＦ配列は、ＮＩＧのNBRP−大腸菌からのASKA Clone(-)ライブラリから得た。全てのＴＦ発現構築物には、Registry of Standard Biological PartsからのターミネーターBBa_B1006が続いた。この構成における、各バーコードＴＦ含有制限部位：SpeI−バーコード−AvrII−PspOMI−ＴＦ発現構築物−NotI。インサートは各ベクターから、２つの一般的なプライマーを用いたＰＣＲによって生成した。
２個一組のコンビナトリアルライブラリを構築するために、全てのベクターおよびインサートは、NanoDrop 2000（Thermo Scientific）で濃度を測定し、等モル量でプールして、ベクターのプールとインサートプールを形成した。ベクタープールをAvrIIおよびPspOMiで消化し、インサートプールをSpeIおよびNotIで消化した。次に両方の消化物をフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。消化物プールはT4 DNAリガーゼでライゲートし、フェノール／クロロホルムおよびエタノール沈殿で精製し、製造業者のプロトコルにより、ElectroTen-Blue細胞にエレクトロポレーションした。全部で３，０００，０００の形質転換体を取得し、１００ｍＬのＬＢ＋３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール中で、中期対数期まで増殖させた。プラスミドは、Midi Prep (Qiagen)を介して分離し、大腸菌NDM-1にエレクトロポレーションした。
【００８９】
抗生物質処置。抗生物質のアッセイは、３７℃にて９６ウェル透明底プレート中、VersaMax（商標）マイクロプレートリーダーおよびシェーカー（Molecular Devices）上で行った。全ての培養ウェルは、２００μＬを保持した。NDM-1の凍結ストックとライブラリを、１００ｎｇ／μＬのａＴｃ有りまたは無しでＬＢに希釈した。これらの培養物がＯＤ６００＝０．６に達したとき、これを、抗生物質有りまたは無しおよび１００ｎｇ／μＬのａＴｃ有りまたは無しのウェル中に希釈した。使用した抗生物質濃度は以下であった：低セフトリアキソン：６４μｇ／ｍＬ；高セフトリアキソン：２５６μｇ／ｍＬ；低イミペネム：３２μｇ／ｍＬ；高イミペネム：９６μｇ／ｍＬ；低ピペラシリン・タゾバクタム：６４μｇ／ｍＬのピペラシリン、８μｇ／ｍＬのタゾバクタム；高ピペラシリン・タゾバクタム：２５６μｇ／ｍＬのピペラシリン、３２μｇ／ｍＬのタゾバクタム；低ゲンタマイシン：３２μｇ／ｍＬ；高ゲンタマイシン：２５６μｇ／ｍＬ。これらのウェルは、ＯＤ＝０．３または０．９まで増殖させた。全ＤＮＡをウェルから、アルカリ溶解およびエタノール沈殿により回収した。各ミニプレップ試料は、SYBR（登録商標）Fast qPCRキット（Kapa Biosystems）を使用して濃度についてアッセイした。
【００９０】
ハイスループットシーケンシング。各試料は、Illumina HiSeq（商標）シーケンシングにより、インデックスバーとイルミナアンカー配列を加えることによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して調製した。集団分布を歪め得るＰＣＲバイアスを防止するために、ＰＣＲ反応は、指数増殖期中に終了させた。ＰＣＲ産物は、AMPure XPビーズ（Agencourt（登録商標））で精製し、ｑＰＣＲによって濃度を定量し、等モル量でプールした。多重化された試料を次に、以下に示すプライマーを用いてシーケンシングした。
【００９１】
シーケンシングのためにCombiGEM集団を増幅するためのプライマー。
フォワードプライマー：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGCTGGCAAGTGTAGC（配列番号２）
バーコードリバースプライマー：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGGGAGGGCCCGTTG（配列番号３）
イルミナシーケンシングプライマー：
CCACGAGGATTCGAAAAGGTGAACCGACCCGGTCGATGCACTAGT（配列番号４）
イルミナインデックスプライマー：
CCTAGGAGCAAGTACGAACAACGGGCCCTCCC（配列番号５）
【００９２】
集団分析。各実験における各遺伝子ペアの生のリードは、シーケンシングデータから処理した。下流の有効な対数変換を保証するために、各遺伝子ペア実験の組合せに、1つの擬似リードを追加した。組合せ毎のリードを、各実験における全リードに対して、および、各実験においてフルオロフォア対照（ｅＣＦＰ（シアン蛍光強化タンパク質）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、およびmCherryのみからなる２個一組の組合せ）に対して、正規化した。乗法モデルを使用したａＴｃのバッチ効果について補正するために、各遺伝子ペア実験についての正規化されたリードを、ａＴｃがオンまたはオフでの全実験からのその遺伝子ペアのリード中央値で割算した。最後に、正規化およびバッチ補正されたリードを対数変換し、薬物と遺伝子ペアの各組合せに同等な存在量を生成した。２つの実験における遺伝子ペアの存在量の差は、その正規化されバッチ補正されたリードの対数比に対応する。相互作用スコアの計算は、特定の薬物条件下における遺伝子ペアについての同等の存在量と、全ての薬物スクリーンで構成される参照セットの存在量の平均値との間の、加法モデルに基づく。
【００９３】
相乗的な相互作用のＳスコアの式は、
【数１】
0006401700.tif 000004
として定義され、式中、ｉ，ｊは、遺伝子ｉとｊの組合せであり、ｋは、実験のセットにわたり、
【数２】
0006401700.tif 000005
は、ｎｉｊ回の実験からの存在量αｋｉｊの平均であり、σｋｉｊは、体系的な分散を構成する最小境界を有する、全体の標準偏差である。
クラスタリング分析。階層的クラスタリングは、遺伝子ペアのサブセットにわたり、ピアソン相関と平均リンケージを用いた実験により行った。
抗生物質感受性アッセイ。分析を通じて同定された特定の組合せを、ベクター骨格上に構築し、サンガーシーケンシングによって検証し、NDM-1に形質転換した。凍結ストックは、ＬＢ＋Ｃａｒｂ＋Ｃｍ中で一晩増殖させ、その後２ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ中に１：１００に希釈し、３７℃で1時間増殖させた。ａＴｃおよびセフトリアキソンを必要に応じて添加し、培養物を３７℃に戻した。示された時点でコロニー形成単位（ｃｆｕ）数を得るために、１００μＬの関連培養物を集め、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、１００μＬのＰＢＳに再懸濁した。連続希釈をＰＢＳで行い、１０μＬの各希釈液をＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。ＬＢ寒天プレートは、計測の前に３７℃で一晩インキュベートした。
【００９４】
フローサイトメトリー。最小および最大蛍光レベルを含む培養物を用いて、BD LSRFortessaハイスループットサンプラー上の、フルオレセインイソチオシアネートとPE-TexasRed（登録商標）のフィルタ電圧を較正し、それぞれ、ＧＦＰおよびmCherryの発現レベルを測定した。ＧＦＰは４８８ｎｍのレーザーで励起し、mCherryは５６１ｎｍのレーザーで励起した。フルオレセインイソチオシアネートとPE-TexasRed用の電圧補正は、どの実験でも不要であった。
【００９５】
例７Ａ：酵母細胞における超並列コンビナトリアル遺伝学の実証
ＧＦＰとmCherryをそれぞれバーコード化し、ＧＡＬ応答性プロモーターの制御下に置き、制限部位法のための制限部位を隣接させる。これらは、大腸菌pMB1起点、アンピシリン耐性カセット、酵母セントロメアCEN6起点、および栄養要求性選択のためのURA3遺伝子を含有するｐＲＳシャトルベクター内に配置されている。インサートは、ＰＣＲによりベクターから生成される。プールされたコンビナトリアルライブラリを作成し、大腸菌に形質転換し、これからプラスミドを単離して酵母細胞内に導入する。レポーターの全ての組合せを含むプールされた集団は、ガラクトースの存在下で増殖させ、フローサイトメトリーにより緑と赤の上で分析して、ＧＦＰとmCherryの３つのユニークな２個一組の組合せを表す３つの集団が示された。
【００９６】
例７Ｂ：酵母細胞における超並列コンビナトリアル遺伝学の実証
超並列コンビナトリアル遺伝学を、複雑なヒト疾患の根底にある病理学的メカニズムを解明するために使用することができる。例えば、本明細書で提供される方法を用いて、酵母モデルにおける寿命および神経変性疾患の調節を調べることができる。高次の遺伝的相互作用の調査を通して、本発明の方法は、加齢関連疾患における新たな治療戦略および創薬への洞察を提供するために、使用され得る。
２つの酵母モデル、１つはアルツハイマー病（アミロイドβ、Ａβの産生の増加）、もう１つはパーキンソン病（α−シヌクレイン、αＳｙｎの増加）のモデルを、臨床治療に有益となり得るコンビナトリアル遺伝因子を探索するために使用した。
反復的なＡβまたはαＳｙｎ発現アレイを酵母ゲノム（W303バックグラウンド）に組み込み、ガラクトース誘導によって制御した。図２８は、αＳｙｎとガラクトース（Ｇａｌ）誘導性プロモーターの複数の直列型コピーを統合することにより生成された酵母株を示す。ライブラリ構築用のプラスミド骨格のサイズを最小にするため、Tet-ON発現系の一部であるリバーステトラサイクリントランスアクチベータ（ｒｔＴＡ）を、両方の酵母株に組み込んだ（Gossen, M. et al., Science 268(51218):1766-9 (1995)）。Tet-ONの誘導を、異なる蛍光タンパク質（例えば、ｅＧＦＰとmCherry）を使用して試験し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処置により、堅牢な遺伝子活性化（約５０倍の増加）が一貫して検出された。さらに、組み込まれたrtTAもＤｏｘ処置のいずれも、細胞増殖または誘導性アミロイド毒性に影響を与えない。同様に、長寿研究のために、rtTAを野生型株（BY4741バックグラウンド）に成功して組込んだ。
【００９７】
バーコードコンビナトリアルライブラリの構築と２個一組の組合せのトライアル
１９６の転写因子と２９のヒストン修飾酵素を含む、転写調節因子の過剰発現ライブラリを構築した。アミロイド毒性は一般にタンパク質の品質管理の障害によるため、ユビキチン／プロテアソーム、オートファジー、およびシャペロン経路（別の２２４の遺伝子）に関与する酵母遺伝子も収集した。Ａβ（またはαＳｙｎ）サプレッサーおよび酵母寿命モジュレーターとして知られている５４の遺伝子を用いて、全ての遺伝子配列を一緒にプールし、BioBrick（登録商標）アセンブリのための適合性のある２ペアの制限酵素を同定した。図２９に示すように、ライブラリの各遺伝子およびそのユニークなバーコードは、普遍的制限酵素切断部位に隣接され、したがって、ライブラリアセンブリを体系的に拡張して、超並列コンビナトリアル遺伝学の特徴である、遺伝子組合せについてのハイスループットシーケンシングを行うことができる。
酵母において超並列コンビナトリアル遺伝学の戦略を検証するために、３つの蛍光遺伝子（ＥＧＦＰ、mCherry、およびEBFP2）を用いてトライアルを設定した。各遺伝子は、ギブソン等温方法により割り当てられたバーコードを有する、ライブラリ骨格プラスミドにクローニングした。２個一組の組合せを構築するために、個々のバーコードプラスミドを均等に一緒にプールし、その後、アセンブリベクターとしてAvrIIおよびNotIで消化した（図２９）。SpeIおよびPspOMIを用いて、同じＤＮＡプールからのインサートを作成した。ＤＮＡライゲーションを介して、全９つの可能な２個一組の組合せが、ランダムコロニーからバーコードのシーケンシングにより回収された。
【００９８】
次にＥＧＦＰとmCherryの２個一組の組合せを選択して、プラスミド上の異なる順序での遺伝子発現を調べた。各ケースにおいて、両方の蛍光遺伝子は類似の発現レベルを示し、これは単一の遺伝子構築物に匹敵する（〜５０倍の誘導）（図３０）。超並列コンビナトリアル遺伝学を、２つの蛍光遺伝子を同じプラスミド上に同時に発現させるポリシストロニック発現について、Ｐ２Ａの方法と比較した（Fang et al., Nature Biotechnology 23:584-590 (2005)）。超並列コンビナトリアル遺伝学クローンの発現プロフィールとは異なり、Ｐ２Ａクローンの発現プロフィールは、遺伝子の順序を交換することにより予測可能ではない。このように、超並列コンビナトリアル遺伝学の戦略は、高次のコンビナトリアルライブラリを構築するために、強力で信頼性が高い。
【００９９】
CRISPRに基づく複数遺伝子標的化
超並列コンビナトリアル遺伝学に加えて、CRISPR（クラスター化され等間隔にスペーサーが入っている短い回文型のリピート）戦略を用いて、酵母モデルにおいてコンビナトリアル遺伝子発現をプログラムした。一般に、CRISPRは４つの連続ステップで標的ＤＮＡ二本鎖切断を行う。第１に、２つの非コードＲＮＡ、pre-crRNAアレイおよびtracrRNAを、CRISPR遺伝子座から転写する。第２に、tracrRNAがpre-crRNAの反復領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含む成熟crRNAs中へのpre-crRNAのプロセシングを媒介する。第３に、成熟crRNA：tracrRNA複合体は、crRNA上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成を介して、Cas9を、標的ＤＮＡに指向させる（これは、標的認識の追加の要件である）。最後に、Cas9は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作成する。
【０１００】
ここで、設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を有する合成Cas9エンドヌクレアーゼ複合体を用いて、部位特異的消化を決定する。ＤＮＡ結合能力を保持するCas9ヌクレアーゼ変異型（dCas9）を使用することにより、dCas9を、Tet-ON誘導系によって調節される、転写アクチベーターまたはリプレッサーとして機能するように操作し（dCas9-VP16）、αＳｙｎ株に組み込む（図３１）。ｇＲＮＡの配列結合特異性にはその１６ヌクレオチドのみが寄与しており、単一のｇＲＮＡが複数の遺伝子標的化を媒介できることを示唆する。並行して、加齢および加齢関連アッセイのためのコンビナトリアルｇＲＮＡライブラリも構築した。ｇＲＮＡはわずか２０個のヌクレオチドのみが異なっており、したがってこれらは、直接シーケンシングにより遺伝子の組合せを回復するためのユニークなバーコードとして、使用することができる。
野生型Cas9も酵母モデル株に組み込んだ。特定のｇＲＮＡのコレクションを用いて、初期の終止コドンを、ｇＲＮＡ媒介ゲノム編集によって導入する。こうして、遺伝子ノックダウンの高次のコンビナトリアルスクリーニングが行われる（図３２）。
【０１０１】
例８Ａ：哺乳動物細胞における超並列コンビナトリアル遺伝学の実証
ＧＦＰ−mCherryの組合せも、哺乳動物細胞で実証する。ＧＦＰとmCherryをそれぞれバーコード化し、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）の制御下に置き、制限部位法のために、制限部位を隣接させる。これらを、ｐＵＣ起点およびネオマイシン耐性カセットから成るベクター内に置く。インサートは、ＰＣＲによりベクターから生成する。プールされたコンビナトリアルライブラリが作成され、大腸菌に形質転換され、これからプラスミドを単離して、rtTAを生成するHeLa細胞に導入する。レポーターの全ての組合せを含むプールされた集団は、ドキシサイクリンの存在下で増殖させ、フローサイトメトリーにより緑と赤の上で分析して、ＧＦＰとmCherryの３つのユニークな２個一組の組合せを表す３つの集団が示された。
【０１０２】
実施例８Ｂ：マイクロＲＮＡを用いた、哺乳動物細胞における超並列コンビナトリアル遺伝学の実証
前駆体ｍｉＲ（マイクロＲＮＡ）を発現し、その活性をヒト細胞において測定するために、前駆体ｍｉＲとＧＦＰ遺伝子を共に発現する直列型転写単位と、ＲＦP遺伝子の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲセンサー配列（例えば、ｍｉＲの相補的な標的配列の４反復）とから成るレンチウイルスベクターを構築した（図３３）。前駆体ｍｉＲまたはｍｉＲセンサー配列のいずれかを含まない対照発現ベクターもまた、比較のために構築した（図３３）。各ベクターについて生成されたレンチウイルスを用いて、ヒト胎児腎臓細胞（HEK293T）および一次ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）を感染させた。フローサイトメトリーを実施して、ＧＦＰおよびＲＦＰ蛍光陽性の細胞集団を測定し、ＧＦＰ＋細胞に対するＲＦＰ＋細胞の割合を決定した。結果は以下を明らかにした：ＧＦＰ−前駆体ｍｉＲ発現細胞の大部分は、センサー配列が含まれた場合に、ＲＦＰ蛍光を示さず（図３４および図３５）、これは個々の前駆体ｍｉＲを、ヒト細胞において我々のレンチウイルスベクターを用いて発現させることができることを示す。コンビナトリアルｍｉＲ発現を可能とするように設計された単一のベクターは、全ての標的細胞において、その一貫した発現比率を保証するであろう。レンチウイルスベクターは次に、２つの直列に配置された前駆体ｍｉＲ（例えば、miR-12-132）をＧＦＰ遺伝子と共に発現するように構築することができる。本明細書の他の箇所に記載されるように、レンチウイルスベクターはまた、バーコード要素と共に構成されてもよい。発現されたコンビナトリアル前駆体ｍｉＲは、独立して発現されたために、同等の活性を示した（図３６および図３７）。これらの結果は、レンチウイルスベクターを用いて、ヒト細胞において、コンビナトリアルｍｉＲ発現を効率的に駆動できることを実証する。この研究で使用されたレンチウイルスベクターを、図３８および３９に示す。
【０１０３】
方法
レンチウイルスベクター構築。前駆体ｍｉＲ（表３）およびｍｉＲセンサー配列（表４）は、合成した遺伝子断片からＰＣＲ増幅し、レンチウイルスベクター骨格にクローニングした。
【表３】
0006401700.tif 000006
【表４】
0006401700.tif 000007
【０１０４】
例９：リコンビナーゼを使用した超並列コンビナトリアル遺伝学
超並列コンビナトリアル遺伝学は、リコンビナーゼを用いて実現することもできる。図９に示すように、組換えは、Gateway（登録商標）クローニングなどの技術の背後にある基礎を形成する。簡単に説明すると、適合性のある組換え配列に挟まれたＤＮＡ断片は、規定のClonase（商標）酵素反応ミックスを使用して交換することができる。たとえば、Gateway（登録商標）クローニングにおいて、attB組換え配列はattP配列と適合性であり、組換え反応後にattL部位とattR部位を形成する。次にattL部位とattR部位は適合性であり、attB部位とattP部位を生成する。Gateway（登録商標）技術では、attB、attP、attLおよびattR配列の4つの直交セットが存在する。
組換え介在性コンビナトリアル遺伝学技術の非限定的な例を図１１に示す。この態様は、２つの組換え配列がＤＮＡ要素とそのバーコード要素との間に配置されている、２つのベクターライブラリを使用する。インサートはＰＣＲによって生成することができ、直交の組換え配列の隣接ペアを含むことができる。att組換え配列は、Ｂ、Ｐ、ＬまたはＲで表される。ＢＣ＝バーコード、ＤＮＡ＝ＤＮＡ要素。
【０１０５】
図１２に示すように、組合せを反復的に生成するために、どちらかのライブラリからのベクターを用いることができる。反復反応は、２つのインサートライブラリ間で交互に進行し、最初の組換えステップのために使用されなかったベクターライブラリから生成されたインサートで開始される。
使用される特定の組換え配列は、適合性のための最小要件が満たされて望ましくない組換えが防止される限り、変化させることができる。attB、attP、attL、およびattR配列のおよその長さは、それぞれ、３０、２４０、１００、および１６０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、attBおよびattL部位のバーコードの間への挿入は、配列の長さを、シーケンシングまたは他の方法で読み取られるように最適化することができる。
【０１０６】
実施例１０：単一酵素分離部位を使用した超並列コンビナトリアル遺伝学
超並列コンビナトリアル遺伝学を、遺伝子構築物内のＤＮＡ要素とバーコード要素との間に位置する単一の制限部位を用いて行うことができる。図１５は、バーコード要素とＤＮＡ要素が、制限酵素BglIIのための制限部位によって分離されたベクターを示す。また、図示されているのはＤＮＡ要素とバーコード要素を含むインサートである。インサートは、ＤＮＡ要素とバーコード要素の間に位置する制限酵素BglIIのための制限部位、および、ＤＮＡ要素とバーコード要素の外側に位置する制限酵素AlwNIのための制限部位を含む。制限酵素BglIIおよびAlwNIは、ベクターがBglIIにより切断されインサートがAlwNIによって切断された場合にベクターとインサートが互いにアニールされるような様式で、適合末端を生成し、こうして、酵素BglIIのための単一の制限部位によって分離された２つのＤＮＡ要素と２つのバーコード要素を含むベクターが生成される。
【０１０７】
本発明を、以下に番号付けされた段落によりさらに説明する：
１．以下を含む、遺伝子構築物：
ＤＮＡ要素；
ＤＮＡ要素に隣接する第１適合末端要素および第２適合末端要素であって、ここで第１および第２適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能である、前記適合末端要素；
バーコード要素；
バーコード要素に隣接する第３適合末端要素および第４適合末端要素であって、ここで第３および第４適合末端要素は、互いにアニーリングすることが可能であるが、しかし第１または第２適合末端要素にアニーリングすることはできない、前記適合末端要素；および
第４適合末端要素と第１適合末端要素の間に位置する分離部位であって、ここで、ＤＮＡ要素、第１適合末端要素および第２適合末端要素は分離部位の一方の側にあり、バーコード要素、第３適合末端要素および第４適合末端要素は分離部位の反対側にある、前記分離部位。
【０１０８】
２．ＤＮＡ要素が、少なくとも２つのヌクレオチド配列を直列に含み、各ヌクレオチド配列が目的の遺伝子をコードする、段落１に記載の遺伝子構築物。
３．遺伝子構築物が、少なくとも２つのバーコード要素を直列に含む、段落２に記載の遺伝子構築物。
４．各ヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、段落１〜３のいずれか１つに記載の遺伝子構築物。
５．目的の遺伝子が、転写因子および／またはヒストン修飾酵素である、段落２〜４のいずれか１つに記載の遺伝子構築物。
【０１０９】
６．段落２〜５のいずれか１つに記載の遺伝子構築物であって、ここで：
（ａ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはmtlRをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはuidRをコードする；
（ｂ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはqseBをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはbolAをコードする；
（ｃ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはrstAをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはrobをコードする；
（ｄ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはrstAをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはmirAをコードする；
（ｅ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはrcsBをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはmirAをコードする；
（ｆ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはfeaRをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはhcaRをコードする；
（ｇ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはfeaRをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはhcaRをコードする；
【０１１０】
（ｈ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはtorRをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはmetRをコードする；
（ｉ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはnhaRをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはmelRをコードする；
（ｊ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはallRをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはmetJをコードする；
（ｋ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはmalLをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはyfeTをコードする；
（ｌ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはcadCをコードし、かつヌクレオチド配列の少なくとも1つはallRをコードする；
（ｍ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはtorRをコードする；または
（ｎ）ヌクレオチド配列の少なくとも1つはmetRをコードする。
【０１１１】
７．直列にある少なくとも２つのヌクレオチド配列が、細菌細胞内での抗生物質の致死性を増強する、段落２〜６のいずれか１つに記載の遺伝子構築物。
８．細菌細胞が、少なくとも１つの抗生物質に耐性である、段落７に記載の遺伝子構築物。
９．細菌細胞が、ニューデリーメタロβラクタマーゼ1（NDM-1）大腸菌細胞である、段落７または８に記載の遺伝子構築物。
１０．抗生物質が、セフトリアキソン、イミペネム、ピペラシリン、タゾバクタム、ゲンタマイシン、または前述の任意の２もしくは３種以上の組合せである、段落８または９に記載の遺伝子構築物。
【０１１２】
１１．ＤＮＡ要素が、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）配列、または少なくとも２つの直列のｍｉＲ配列を含む、段落１に記載の遺伝子構築物。
１２．遺伝子構築物が、少なくとも２つのバーコード要素を直列に含む、段落１１に記載の遺伝子構築物。
１３．ｍｉＲが、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、段落１１または１２に記載の遺伝子構築物。
１４．ｍｉＲが、miR-124、miR-128、およびmiR-138から選択される、段落１１〜１３のいずれか１つに記載の遺伝子構築物。
１５．少なくとも２つの直列のｍｉＲが、miR-124、miR-128、およびmiR-138から選択された組合せである、段落１１〜１３のいずれか１つに記載の遺伝子構築物。
【０１１３】
１６．段落１〜１５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの遺伝子構築物を含む、ファージミド。
１７．段落１６に記載のファージミドを含む、組換えバクテリオファージ。
１８．組換えバクテリオファージが、Myoviridae、Siphoviridae、Podoviridae、Tectiviridae、Corticoviridae、Lipothrixviridae、Plasmaviridae、Rudiviridae、Fuselloviridae、Inoviridae、Microviridae、LeviviridaeおよびCystoviridaeから選択されるファミリーのものである、段落１７に記載の組換えバクテリオファージ。
１９．組換えInoviridaeバクテリオファージが、Ｍ１３またはＭ１３様のバクテリオファージである、段落１８に記載の組換えバクテリオファージ。
【０１１４】
２０．抗生物質の致死性を増強する遺伝子をスクリーニングする方法であって：
抗生物質耐性の細菌細胞を、段落１〜１５のいずれか１つに記載の２または３以上の遺伝子構築物を含むライブラリを用いて、形質転換すること；
形質転換した細菌細胞を、同族誘導物質による、抗生物質による、および同族誘導物質と抗生物質処置の組合せによる処置に付すこと；
各処置条件における、細胞の表現型を比較すること；および
相乗的死滅、中性増殖の表現型を選択し、各処置について細胞表現型を評価すること、
を含む、前記方法。
２１．選択した表現型を有する細菌細胞からの遺伝子構築物をシーケンシングすることをさらに含む、段落２０に記載の方法。
【０１１５】
２２．コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための方法であって：
段落１〜１５のいずれか１つに記載の第１遺伝子構築物を含有するベクターを提供すること；
第１遺伝子構築物内の分離部位においてベクターを切断し、第１遺伝子構築物を、第１および第２セグメントに分離すること；
段落Ａ１〜Ａ１５のいずれか１つに記載の第２遺伝子構築物を提供すること；および
第２遺伝子構築物を、切断されたベクターにアニーリングすること、ここでアニーリングは、互いにアニーリングすることが可能な第１および第２遺伝子構築物内の適合末端要素において生じ、およびここでアニーリングの後に、第２遺伝子構築物を、第１遺伝子構築物の第１および第２セグメントの間に組み込んで、コンビナトリアル遺伝子構築物を生成すること、
を含む、前記方法。
２３．方法が反復的である、段落２２に記載の方法。
【０１１６】
２４．１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素の同定のための方法であって：
段落１〜１５のいずれか１つに記載の遺伝子構築物を提供すること；
アッセイを行って、遺伝子構築物内のバーコードもしくは複数バーコードのＤＮＡ配列、および／または遺伝子構築物内のＤＮＡ要素もしくは複数ＤＮＡ要素のＤＮＡ配列を決定すること；および
ＤＮＡ要素または複数ＤＮＡ要素を同定すること；
を含む、前記方法。
２５．段落１〜１５のいずれか１つに記載の２または３以上の遺伝子構築物、を含む、ライブラリ。
【０１１７】
２６．コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための、以下を含む方法：
以下を含むベクターを提供すること：
第１ＤＮＡ要素、
第１バーコード要素、および
第１ＤＮＡ要素と第１バーコード要素の間に位置する、２つの部位特異的組換え要素；
以下を含む第１インサートを提供すること：
第２ＤＮＡ要素、
第２バーコード要素、および
第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素のそれぞれに隣接する、部位特異的組換え要素であって、ここで２つの部位特異的組換え要素は、ベクター内の部位特異的組換え要素と適合しない第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の間に位置し、２つの部位特異的組換え要素は、ベクター内の部位特異的組換え要素と適合しない第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する、前記部位特異的組換え要素；
【０１１８】
ベクターと第１インサートの間で部位特異的組換えを行うこと、ここで部位特異的組換えは、第１ＤＮＡ要素と第１バーコード要素の間に位置する、ベクター内の部位特異的組換え要素と、第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する、第１インサート内の適合する部位特異的組換え要素との間で生じ、およびここで、部位特異的組換えに続いて、第１インサートはベクター内に位置し、およびベクターは、複数のＤＮＡ要素および複数のバーコード要素と、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素を含有し；
以下を含む第２インサートを提供すること：
第３ＤＮＡ要素、
第３バーコード要素、および
第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素のそれぞれに隣接する、部位特異的組換え要素であって、ここで２つの部位特異的組換え要素は、ベクターの複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素と適合しない第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素の間に位置し、および２つの部位特異的組換え要素は、ベクターの複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素と適合する第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素の外側に位置する、前記部位特異的組換え要素；
【０１１９】
ベクターと第２インサートの間で部位特異的組換えを行うこと、ここで部位特異的組換えは、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する、ベクター内の部位特異的組換え要素と、第３ＤＮＡ要素と第３バーコード要素の外側に位置する、第２インサート内の適合する部位特異的組換え要素との間で生じ、およびここで、部位特異的組換えに続いて、第２インサートはベクター内に位置し、およびベクターは、複数のＤＮＡ要素および複数のバーコード要素と、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素の間に位置する２つの部位特異的組換え要素を含有し；および、
部位特異的組換えをｎ回繰り返すこと、ベクターと第１インサートの間の部位特異的組換えと、ベクターと第２インサートの間の部位特異的組換えを交互に行うこと、これにより、コンビナトリアル遺伝子構築物を作成すること。
【０１２０】
２７．各ＤＮＡ要素が、異なる、またはユニークな、転写因子および／またはヒストン修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、段落２６に記載の方法。
２８．各ＤＮＡ要素が、異なる、またはユニークな、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む、段落２６に記載の方法。
２９．段落２６〜２８のいずれか１つに記載の方法により生成される、コンビナトリアル遺伝子構築物。
【０１２１】
３０．１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素の同定のための方法であって：
段落２９に記載のコンビナトリアル遺伝子構築物を提供すること；
アッセイを行って、コンビナトリアル遺伝子構築物内の１または２以上のバーコード要素のＤＮＡ配列、および／またはコンビナトリアル遺伝子構築物内の１または２以上のＤＮＡ要素のＤＮＡ配列を決定すること；および
１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素を同定すること；
を含む、前記方法。
【０１２２】
３１．コンビナトリアル遺伝子構築物を生成するための、以下を含む方法：
以下を含むベクターを提供すること：
第１ＤＮＡ要素、
第１バーコード要素、および
第１ＤＮＡ要素と第１バーコード要素の間に位置する、第１制限酵素に対する認識部位；
以下を含むインサートを提供すること：
第２ＤＮＡ要素、
第２バーコード要素、
第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の間に位置する、第１制限酵素に対する認識部位、および
第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の間に位置する、第１制限酵素とは異なる１または２以上の制限酵素に対する、２つの認識部位、ここで、ベクター内の認識部位と、インサート内の第２ＤＮＡ要素と第２バーコード要素の外側に位置する２つの認識部位とにおける制限消化が、適合末端を生成するようになっており；
ベクターおよびインサートを、制限酵素で消化すること；
インサートをベクターにアニーリングすること、これにより、複数のＤＮＡ要素と複数のバーコード要素とを含有するコンビナトリアル遺伝子構築物を生成すること；および
任意に該方法をｎ回繰り返すこと。
【０１２３】
３２．各ＤＮＡ要素が、異なる、またはユニークな、転写因子および／またはヒストン修飾酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、段落３１に記載の方法。
３３．各ＤＮＡ要素が、異なる、またはユニークな、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む、段落３１に記載の方法。
３４．段落３１〜３３のいずれか１つに記載の方法により生成される、コンビナトリアル遺伝子構築物。
３５．１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素の同定のための方法であって：
段落３４に記載のコンビナトリアル遺伝子構築物を提供すること；
アッセイを行って、コンビナトリアル遺伝子構築物内の１または２以上のバーコード要素のＤＮＡ配列、および／またはコンビナトリアル遺伝子構築物内の１または２以上のＤＮＡ要素のＤＮＡ配列を決定すること；および
前記１つのＤＮＡ要素または複数のＤＮＡ要素を同定すること；
を含む、前記方法。
【０１２４】
配列
配列番号１−直列型前駆体ｍｉＲ発現
【数３】
0006401700.tif 000008
【０１２５】
【数４】
0006401700.tif 000009
【０１２６】
【数５】
0006401700.tif 000010
【０１２７】
【数６】
0006401700.tif 000011
【０１２８】
【数７】
0006401700.tif 000012
【０１２９】
【表５】
0006401700.tif 000013
【０１３０】
【数８】
0006401700.tif 000014
【０１３１】
【数９】
0006401700.tif 000015
【０１３２】
参考文献
【表６】
0006401700.tif 000016
【０１３３】
【表７】
0006401700.tif 000017
【０１３４】
本発明の少なくとも一態様のいくつかの側面を説明したが、様々な変更、修正、および改良が当業者には容易に想起されることを、理解すべきである。かかる変更、修正および改良は本開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明および図面は、ほんの一例に過ぎない。
【０１３５】
均等物
本発明のいくつかの態様を本明細書に記述し説明したが、当業者は容易に、本明細書に記載された機能を実施するため、および／または結果および／もしくは１もしくは２以上の利点を得るための、種々の別の手段および／または構造を想定するであろうし、かかる変形および／または修正の各々は、本明細書に記載された本発明の態様の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者には容易に、本明細書に記載された全てのパラメータ、寸法、材料、および構成は例示的であることが意図され、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成は、本発明の教示が用いられている１または２以上の特定の用途に依存することを理解する。当業者は、日常的な実験以上のものを用いることなく、本明細書に記載された特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認できるであろう。したがって、前述の態様は例示としてのみ提示されており、また添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内において、本発明の態様は、具体的に記載し特許請求された以外によっても実施できることが、理解されるべきである。本開示の発明の態様は、本明細書に記載の各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に向けられている。さらに、２または３以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組合せは、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しない場合には、本開示の発明の範囲内に包含される。
【０１３６】
本明細書において定義され使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献における定義、および／または定義された用語の通常の意味を、支配すると理解すべきである。
明細書および特許請求の範囲においてここで使用される、不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される語句「および／または」は、これにより結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解すべきであり、すなわち、要素はいくつかの場合においては結合的に存在し、別の場合には選択的に存在する。「および／または」を用いてリストされた複数の要素は、同様の様式で解釈すべきであり、すなわち、これにより結合された要素の「１または２以上」を意味する。「および／または」節によって特定して識別された要素以外の他の要素も、具体的に識別された要素に関連するかまたは関連しないかに関わらず、任意に存在してよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」は、「含む」などのオープンエンドの言葉と組合せて使用する場合、一態様においては、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意に含む）を指し；別の態様においては、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意に含む）を指し；さらに別の態様においては、ＡとＢの両方（別の要素を任意に含む）を指す、などである。
【０１３７】
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「または」は、上記に定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は包括的であると解釈されるべきであり、すなわち、多数のもしくはリストされた要素の、少なくとも１つを含むこと、およびこれの１より多くを含むこと、および任意に、リストにない追加の項目を含むこと、となる。明確に逆を指示する要素、例えば「１つのみ」または「正確に１つ」、または、特許請求の範囲で使用される場合の「〜からなる」は、多数のまたはリストされた要素からの正確に１つの要素の包含を指す。一般的に、本明細書で使用される用語の「または」は、「いずれか」、「１つ」、「１つのみ」または「正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合に、排他的代替物を示す（すなわち、「一方または他方のどちらかであるが両方ではない」）と解釈される。特許請求の範囲で使用される場合、「本質的に〜からなる」は、特許法の分野で用いられるその通常の意味を有するものとする。
【０１３８】
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される場合、１または２以上の要素のリストを参照しての「少なくとも１つ」の語句は、要素のリストの任意の１または２以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、しかし必ずしも、要素のリスト中に具体的に挙げられた各および全ての要素の少なくとも１つを含む必要はなく、および、要素のリスト中の要素の任意の組合せも除外しない。この定義はまた、語句「少なくとも1つ」が参照する要素のリスト内に具体的に特定された要素以外にも、具体的に特定された要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、任意に要素が存在することを可能とする。したがって、非限定的例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または、同等に、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）とは、以下を指すことができる：一態様において、少なくとも１つのＡを、任意に１つより多くのＡを含み、Ｂは不在である（および任意に、Ｂ以外の要素を含む）；別の態様において、少なくとも１つのＢを、任意に１つより多くのＢを含み、Ａは不在である（および任意に、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の態様において、少なくとも１つのＡを、任意に１つより多くのＡを含み、および、少なくとも１つのＢを、任意に１つより多くのＢを含む（任意に、別の要素を含む）；など。
【０１３９】
また、明確に別の指示がない限り、１より多くのステップまたは行為を含む本明細書に記載の任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、本方法のステップまたは行為が引用されている順序には必ずしも限定されないことが、理解されるべきである。
本明細書で開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合においては、文書全体を包含することもできる。
特許請求の範囲において、および上記明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「担持する（carrying）」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成する」などの移行句は、オープンエンドであること、すなわち、それを含むが限定はされないことを意味すると理解すべきである。「〜からなる」および「本質的に〜からなる」のみは、米国特許審査便覧のセクション2111.03に記載されているように、クローズまたは半クローズの移行句とすべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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