(57)【要約】  ソルビトールまたはマンニトールが培地に含まれる場合、キシロースを含む混合糖類を含有する培地において増殖させると、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、エタノール産生を改善することが分かった。より高い糖類濃度においてだけではなく、増殖停滞期間が生じない混合糖類の濃度においても、効果が認められた。
2010504757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）キシロースをエタノールに変換することが可能な組み換えザイモモナス細胞を提供すること；
（ｂ）（ｉ）キシロースおよび少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖組成物、ならびに（ｉｉ）ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、およびリビトールからなる群から選択される少なくとも１つの糖アルコールを含む適切な培地を提供すること；ならびに
（ｃ）（ａ）と（ｂ）とを接触させることによって、ザイモモナス細胞にエタノールを産生させること、
を含む、エタノール産生を改善するための方法。
【請求項２】
キシロースをエタノールに変換する組み換えザイモモナスの性能を、（ｂ）の糖アルコールの存在によって改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
より多い量のキシロースが混合糖組成物においてエタノールに変換される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１の（ｂ）に記載の糖アルコールの非存在下よりキシリトールの産生が少ない、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
請求項１（ｂ）の糖アルコールが、約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２ｍＭ〜約１００ｍＭ、および約５ｍＭ〜約２０ｍＭからなる群から選択される量で培地中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組み換えザイモモナス細胞が、以下の株、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５、Ｚ．モビリス８ｂ、ＺＷ６５８、ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−６、ＺＭ４（ｐＺＢ５）またはＺ．モビリスＣＰ４：ｐＺＢ５のいずれか１つ由来の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
キシロース資化性Ｚ．モビリス株ＺＷ６５８。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００６年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８４７９９７号明細書（すべての目的のために、その全体が本明細書の一部として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての陳述
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４およびＤＥ−ＦＣ３６−０３ＧＯ１３１４６に基づく米国政府の助成により行われた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子操作の分野に関する。より具体的には、キシロース含有混合糖類の発酵中のエタノール産生を改善する方法を開発した。
【背景技術】
【０００４】
再生可能な供給源から生成される燃料用エタノールは、世界的な化石燃料不足、エネルギーコストの高騰、および大気中二酸化炭素増加に関連する地球温暖化効果に対する長期的解決策の１つである。再生可能な供給源由来の燃料用エタノールは、糖類の発酵によって産生される。現在、米国では、トウモロコシ穀粒由来のグルコースは、エタノール産生のための最も豊富な糖供給源である。飼料および食物供給のためのトウモロコシ穀粒の需要のため、多様なタイプのセルロース系バイオマス（ヘミセルロースを含む）を発酵可能な糖類に変換する方法が開発されている。このバイオマス供給源由来の糖は、ヘキソース類およびペントース類、主に、グルコースおよびキシロースの混合物である。セルロース系バイオマスプロセシングの開発の結果として、これらの糖類は、高濃度で放出され、そしてエタノールを産生するために高濃度で発酵に使用され得、低減された水消費およびより高いスループットを伴う。従って、バイオマスからエタノールへの変換は、化石燃料用エタノール産生と比較して、環境への影響を改善するための大きな可能性を提示する。さらに、それは、化石燃料用エタノール産生に対する潜在的に経済的に実行可能な代替物を提供する。
【０００５】
バイオマスプロセシングにおける改善に加えて、エタノールを産生することが可能である微生物の改善を行うために、遺伝子操作が使用されている。セルロース系バイオマスからの糖類の資化を増強するために、４つの酵素：１）キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼの発現のために株を操作することによって、キシロースを資化することが可能なエタノロジェンのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）（即ち、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ））が作製されている（特許文献１、２、非特許文献１）。これらの株はキシロースを代謝するが、高キシロース濃度では、キシロースは十分には資化されず、そのため、理論的なエタノール収率は達成されない。キシロース代謝の副産物としてのキシリトールの合成によってもまた、エタノール収率は制限される（非特許文献２、３）。キシリトールは、リン酸化されて、細胞に蓄積し、増殖を阻害する化合物であるキシリトール５−リン酸になるため、細胞に対して毒性である。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のキシロース資化性組み換え株は、キシリトールをエタノールに変換することができないため、エタノールの収率は、キシリトールの合成によっても減少する。さらに、キシリトールは、操作されたキシロース代謝経路におけるキシロース資化の第１の工程を触媒するキシロースイソメラーゼの強力なインヒビターである。従って、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）によるキシロースを含む高度の糖培地における発酵は、最大のキシロース使用およびエタノール産生を達成しなかった。
【０００６】
キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）が、４％グルコースを伴う糖類混合物において８％キシロースを完全に使用するには、２〜３日間を所要する（非特許文献４）。６５ｇ／Ｌグルコースを伴う混合物において６５ｇ／Ｌキシロースを完全に使用するには、４８時間を必要とし（非特許文献５）、そしてより高濃度の糖類（７５ｇ／Ｌキシロースおよび７５ｇ／Ｌグルコース）を使用すると、不完全なキシロース資化が生じた。
【０００７】
高濃度のグルコースにおける操作されていないＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖を増強するための浸透圧保護剤として、ソルビトールが添加されている（非特許文献６）。ソルビトールは細胞内に蓄積した。さらに、高スクロース上で増殖する場合、ソルビトールが、細胞によって産生され、そして蓄積することが示された。キシロースを含む糖混合物の存在下で増殖させる場合、キシロースを資化するために操作されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によるエタノールの産生に対するソルビトールの効果については、以前には決定されていなかった。
【０００８】
キシロースを含む糖培地におけるエタノール産生を増強し、キシロース資化株が、最大キシロース資化を伴うそれらの最大エタノール産生能に短時間で到達することを可能にする発酵条件を開発することが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５５１４５８３号明細書
【特許文献２】米国特許第６５６６１０７号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３
【非特許文献２】Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：３５４−３６１
【非特許文献３】Ｋｉｍら（２０００）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６６：１８６−１９３
【非特許文献４】ＬａｗｆｏｒｄおよびＲｏｕｓｓｅａｕ（１９９９）Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７７−７９：２３５−２４９
【非特許文献５】ＪｏａｃｈｉｍｓｔｈａｌおよびＲｏｇｅｒｓ（２０００）Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ８４−８６：３４３−３５６
【非特許文献６】Ｌｏｏｓら（１９９４）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１７６：７６８８−７６９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、発酵によって行われるエタノールの産生を改善するための方法を提供する。本方法では、キシロース資化に関与する遺伝子を発現するために操作されているザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を、キシロースおよび少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖類を含有する培地で増殖させる。培地はまた、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、またはリビトール（アドニトールとも呼ばれる）を含み、キシロース資化の増加およびエタノール産生の増加を生じる。副産物キシリトールの産生もまた、減少する。本発明の１つの実施形態では、本方法は、
ａ）キシロースをエタノールに変換することが可能な組み換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を提供する工程と；
ｂ）（ｉ）キシロースおよび少なくとも１つのさらなる糖を含んでなる混合糖組成物、ならびに（ｉｉ）ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、およびリビトールからなる群から選択される少なくとも１つの糖アルコールを含んでなる適切な培地を提供する工程と；
ｃ）（ａ）と（ｂ）とを接触させる工程であって、それによって、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞はエタノールを産生する工程と
を含んでなる。
【００１２】
所定の実施形態では、上記の工程（ｃ）の接触は、少なくとも約２４時間行われる。上記の接触は、約２５℃〜約４０℃、または約３０℃〜約３７℃の温度で行ってもよい。上記の接触ことは、約４．５〜約７．５のｐＨ、または約５．０〜約６．０のｐＨで行ってもよい。
【００１３】
別の実施形態では、接触は、約０．０１％〜約２０％（ｖ／ｖ）の間、または約０．１％〜約２０％の間にある播種比を使用して、（ａ）の細胞を（ｂ）の培地に播種することによって行われる。
【００１４】
１つの実施形態では、キシロースおよび少なくとも１つのさらなる糖は、処置および／または糖化されているバイオマスから産生される。
【００１５】
別の実施形態では、混合糖組成物は、少なくとも約１０％キシロースを含んでなるか、または代替的実施形態では、混合糖組成物は、約４０％〜約６０％キシロースを含んでなる。
【００１６】
別の実施形態では、（ａ）および（ｂ）の接触は、気体の供給を伴わない発酵条件下で行われる。
【００１７】
本発明の別の態様は、本明細書においてＺＷ６５８（２００６年９月１２日に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５８）と称されるキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株である。
【００１８】
図面の簡単な説明、配列表の説明および生物学的寄託
本発明は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】トランスケトラーゼ（Ａ）、トランスアルドラーゼ（Ｂ）、キシロースイソメラーゼ（Ｃ）、およびキシルロキナーゼ（ｘｙｕｌｏｋｉｎａｓｅ）（Ｄ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図２】ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍのプラスミド地図を示す。
【図３】ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍのプラスミド地図を示す。
【図４】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）活性のグラフを示す。
【図５】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるトランスアルドラーゼ（ｔｒａｎｓａｌｄｏｌｓｅ）（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）活性のグラフを示す。
【図６】選択された適応キシロース資化株コロニーの理論的エタノール収率％およびキシロース資化％のグラフを示す。
【図７】５％グルコースを伴うＲＭ（リッチ培地）（ＲＭＧ）において５０代まで増殖する前および後の５％キシロースを伴うＲＭ（ＲＭＸ５％）上で７０時間目の適応キシロース資化株の増殖のグラフを示す。
【図８】ＲＭ＋１０％グルコース（ＲＭＧ１０％）（Ａ、Ｂ）およびＲＭ＋８％キシロース（ＲＭＸ８％）（Ｃ、Ｄ）における選択された株、ＺＷ６５８の増殖、グルコースまたはキシロース資化、ならびにエタノールおよびキシリトール産生を、コントロール、８ｂと比較したグラフを示す。
【図９】ＲＭ＋１０％グルコースおよび８％キシロースにおいて、酢酸塩を伴わない（Ａ、Ｂ）または０．６％酢酸塩を伴う（Ｃ、Ｄ）選択された株、ＺＷ６５８の増殖、グルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノールおよびキシリトール産生を、コントロール、８ｂと比較したグラフを示す。
【図１０】グルコース単独またはキシロース単独上で増殖させたキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における増殖（Ａ）およびエタノール産生（Ｂ）に対するソルビトールの効果のグラフを示す。
【図１１】ソルビトールの存在下でグルコースおよびキシロース混合糖上で増殖させたキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖、グルコース資化、キシロース資化、エタノール産生、酢酸産生およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図１２】ソルビトールの非存在下でグルコースおよびキシロース混合糖上で増殖させたキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖、グルコース資化、キシロース資化、エタノール産生、酢酸濃度およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図１３】酢酸塩およびソルビトールの存在下でグルコースおよびキシロース混合糖上で増殖させたキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖、グルコース資化、キシロース資化、エタノール産生、酢酸濃度およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図１４】酢酸塩の存在下およびソルビトールの非存在下でグルコースおよびキシロース混合糖上で増殖させたキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖、グルコース資化、キシロース資化、エタノール産生、酢酸濃度およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図１５】グルタミン酸塩の存在下でグルコースおよびキシロース混合糖上で増殖させたキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖、グルコース資化、キシロース資化、エタノール産生、酢酸濃度およびキシリトール産生のグラフを示す。
【図１６】０〜１０ｍＭの間の多様な量のソルビトールの存在下でグルコースおよびキシロース混合糖上で増殖させたキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖のグラフを示す。
【図１７】１０ｍＭ〜２００ｍＭの間の多様な量のソルビトールの存在下でグルコースおよびキシロース混合糖上で増殖させたキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖の（Ａ）およびエタノール産生（Ｂ）のグラフを示す。
【図１８】多様なポリオール類の存在下での増殖（Ａ）、キシロース資化（Ｂ）、およびエタノール産生（Ｃ）のグラフを示す。
【図１９】酢酸塩および多様なポリオール類の存在下での増殖（Ａ）、キシロース資化（Ｂ）、およびエタノール産生（Ｃ）のグラフを示す。
【図２０】多様な糖アルコール類の存在下での増殖（Ａ）およびグルコース資化（Ｂ）のグラフを示す。
【図２１】多様な糖アルコール類の存在下でのキシロース資化（Ａ）およびエタノール産生（Ｂ）のグラフを示す。
【図２２】多様な糖アルコール類の存在下での増殖（Ａ）およびグルコース資化（Ｂ）のグラフを示す。
【図２３】多様な糖アルコール類の存在下でのキシロース資化（Ａ）およびエタノール産生（Ｂ）のグラフを示す。
【００２０】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
【００２１】
配列表は、コンパクトディスクによって提供される。配列表を含むコンパクトディスクの内容は、米国特許法施行規則第１．５２条第（ｅ）項に応従して、参照により本明細書に援用される。コンパクトディスクは、２枚提出され、これらは相互に同一である。ディスクには、「Ｃｏｐｙ１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ」および「Ｃｏｐｙ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ」のラベルが付されている。ディスクは、次のファイル：「ＣＬ３４２５ｓｅｑ  ｌｉｓｔ．ＳＴ２５」を含有する。
【００２２】
配列番号１および２は、ｐＺＢ４由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号３および４は、ｐＺＢ４由来のｔａｌコーディング領域を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号５および６は、Ｐｇａｐおよびｔａｌフラグメント由来のＰｇａｐｔａｌを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号７および８は、ｐＺＢ１８６由来のｌｏｘＰ：：Ｃｍを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号９は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号１０および１１は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを収容する形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコーディング領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１２は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号１３および１４は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを伴うＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組込み体由来の１．６ｋｂのＰｇａｐｘｙｌＡ  ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号１５および１６は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを伴うＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組込み体由来の１．３ｋｂのｘｙｌＢ  ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３１】
本出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州２０１１０−２２０９において、以下の生物学的寄託を行った：
【００３２】
【表１】
2010504757.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本出願人らは、本開示において引用されるすべての参考文献のすべての内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメータが、範囲、好適な範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられる場合、これは、範囲が個別に開示されるかどうかにかかわらず、任意の上方の範囲限界または好適値および任意の下方の範囲限界または好適値の任意の対から形成されるすべての範囲を具体的に開示するものと理解されるべきである。数値の範囲が本明細書において引用される場合、特に記載しない限り、範囲は、その端点、ならびに範囲内のすべての整数および端数を含むことが意図される。本発明の範囲は、範囲を規定する場合に引用される特定の値に限定されないことが意図される。
【００３４】
本発明は、キシロースを含む混合糖類を含有する培地へのソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、またはリビトールの添加に関与する発酵を使用するエタノールの産生のための方法を提供する。ソルビトールを含む培地は、キシロース資化性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖を提供し、それ故、そのような株が混合糖類からエタノールを産生する能力を増加する。
【００３５】
本開示では、多くの用語を使用する。以下の定義を提供する：
【００３６】
ＲＭはリッチ培地である。
【００３７】
ＲＭＧ５％はＲＭ＋５％グルコースである。
【００３８】
ＲＭＧ５％はＲＭ＋１０％グルコースである。
【００３９】
ＲＭＸ８％はＲＭ＋８％キシロースである。
【００４０】
ＲＭＸ２％はＲＭ＋２％キシロースである。
【００４１】
ＲＭＸ５％はＲＭ＋５％キシロースである。
【００４２】
ＲＭＧＸ１０％８％は、ＲＭ＋１０％グルコースおよび８％キシロースである。
【００４３】
ＲＭＧＸ５％８％は、ＲＭ＋５％グルコースおよび８％キシロースである。
【００４４】
用語「発酵可能な糖」は、発酵プロセスにおいて、微生物により炭素源として使用することができるオリゴ糖および単糖類を指す。
【００４５】
本明細書において使用する「適切な培地」は、多様な条件下におけるＺ．モビルス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｓ）の増殖を支持する培地を指す。適切な培地は、キシロースおよび少なくとも１つのさらなる糖、ならびにソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、リビトールまたはそれらの混合物であってもよい１つ以上の糖アルコールを含む。さらに、十分な濃度の糖アルコールが培地に存在しない場合、培地は、増殖を支持する一方、至適なキシロース資化を提供しない培地である。
【００４６】
用語「リグノセルロース系」は、リグニンおよびセルロースの両方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系材料もまた、ヘミセルロースを含んでなり得る。
【００４７】
用語「セルロース系」は、セルロース、およびヘミセルロースを含むさらなる成分を含んでなる組成物を指す。
【００４８】
用語「糖化」は、多糖類からの発酵可能な糖類の生成を指す。
【００４９】
用語「前処置されたバイオマス」は、糖化前の前処置に供されているバイオマスを意味する。
【００５０】
「バイオマス」は、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料を指し、そしてセルロースを含んでなり、そして場合により、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料を含む。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質のようなさらなる成分を含んでなり得る。バイオマスは、単一の供給源から誘導されてもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源から誘導される混合物を含んでなり得る；例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびコーンストーバの混合物、または草および葉の混合物を含んでなり得る。バイオマスとして、バイオエネルギー作物、農業残渣、一般廃棄物、産業廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これらに限定されない。バイオマスの例として、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、穀物残渣、例えば、トウモロコシ皮、コーンストーバ、草、コムギ、コムギわら、オオムギ、オオムギわら、乾草、イネわら、スイッチグラス、廃紙、サトウキビバガス、モロコシ、ダイズ、穀粒、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木および潅木の粉砕から得られる成分、野菜、果物、花および動物性肥料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
「バイオマス加水分解物」は、バイオマスの糖化から生じる産物を指す。バイオマスはまた、糖化の前に前処置してもよい。
【００５２】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含んでなる、生来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかし、これは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。
【００５３】
用語「遺伝子構築物」は、１つ以上の特定のタンパク質の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然にはない外来性のものであってもよい。典型的に、遺伝子構築物は、「コード配列」を含んでなる。
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００５４】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に局在する。プロモーターは、そのままの形で生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見出される多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントからなるか、またはなお、合成ＤＮＡセグメントを含んでなり得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成性プロモーター」と呼ぶ。
【００５５】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。
【００５６】
本明細書において使用する「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体への伝達を指す。伝達された核酸は、宿主細胞において維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはある伝達された核酸を、宿主細胞のゲノムに組込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を、「トランスジェニック」または「組み換え」または「形質転換された」生物体と称する。
【００５７】
本明細書において使用する用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組み換えられている。
【００５８】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、コード配列に作動可能に連結される（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００５９】
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することが可能な抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００６０】
キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株
キシロース代謝に対し操作されているＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の任意の株を、発酵において使用し、本方法に従ってエタノールを産生させてもよい。典型的に、米国特許第５５１４５８３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のように、キシロース代謝に関与する４つの酵素の発現のために、４つの遺伝子がＺモビリス（Ｚ  ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入される。これらは、キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含む。さらに、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ、ペントースリン酸経路の２つの酵素は、キシルロース５−リン酸を、キシロースからエタノールへの代謝を可能にする解糖系のエントナー−ドウドレフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路にペントース代謝を結合する中間体に変換する。これらの酵素をコードする配列を有するＤＮＡフラグメントは、腸内細菌、ならびにいくつかの酵母および真菌のようなキシロースを代謝することが可能である多数の微生物のいずれかから入手してもよい。これらの遺伝子のコーディング領域は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼまたはＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼのプロモーターおよび他の調節エレメントのようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞において発現されるプロモーターに作動可能に連結される。これらのキメラ遺伝子は、典型的に、キシロース資化性株を操作するためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞に形質転換されるベクターにおいて構築される。キシロース資化のために操作されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の既知および新規の株であるキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、本方法において使用してもよい。キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株として、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４（ｐＺＢ５）（ヨアヒムスタール（Ｊｏａｃｈｉｍｓｔｈａｌ）およびロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）、上掲）、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＣＰ４：ｐＺＢ５（ローフォード（Ｌａｗｆｏｒｄ）ら、上掲）、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）８ｂ（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）、ＺＷ６５８（本明細書に記載されている；ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）、ならびにＺＷ８００、ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６（共有および同時係属中の米国仮特許出願第６０／８４７８１３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている）が挙げられる。株Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）８ｂ、ＺＷ６５８、ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６が特に有用である。
【００６１】
本明細書の実施例２に示すように、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ６５８は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）８ｂ株と比較して、個別の特性を有することが分かった。同じ発酵条件下において、ＺＷ６５８は、８ｂと比較して、キシリトール産生の低減、キシロース資化の増加、およびエタノール産生の増加を示す。これらの特性は、８ｂ株適応の場合におけるような変異誘発を含まない適応プロセス後も明白である。
【００６２】
キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ８００は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）をコードする遺伝子を不活化し、そしてキシリトール合成の低減を生じるさらなる遺伝子改変を有する。共有および同時係属中の米国仮特許出願第６０／８４７８１３号明細書（参照により本明細書に援用される）に詳述されているように、具体的には、ＺＷ８００は、コードされるタンパク質の発現を破壊する選択マーカーのＧＦＯＲコーディング領域への挿入を有する。ＧＦＯＲノックアウト変異体は、キシロース含有糖混合物上で増殖させる場合、ＧＦＯＲを発現する親株より、低減した量のキシリトールを産生し、ソルビトールの存在下、高度の糖混合物において増殖させる場合、より多くのキシロースを消費し、そしてより高い濃度および収率のエタノールを産生した。ＺＷ８００から誘導され、そしてＧＦＯＲコーディング領域を破壊するＧＦＯＲコーディング領域に欠失およびｌｏｘ部位フットプリント付加を生じるＣｒｅ／ｌｏｘ仲介切り出しによって選択マーカーが取り出されたＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６についてはまた、米国仮特許出願第６０／８４７８１３号明細書に記載されている。株ＺＷ８０１−４およびＺＷ８０１−６は、ＺＷ８００について上記と同じ特性を有する。
【００６３】
天然では使用しないキシロース以外の糖類を資化するためにさらに操作されるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、本方法に使用してもよい。例には、米国特許第５８４３７６０号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載のようなアラビノース資化のために操作されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株がある。
【００６４】
混合糖類
本方法において、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の細胞を、混合糖類を含有する培地において増殖させる。本明細書において言及する混合糖類は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞が資化するように操作されているキシロース、および少なくとも１つのさらなる糖を含む。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞の代謝のエネルギー源を提供し得る任意の糖、またはキシロースを含有する混合物に存在する任意の糖が含まれていてもよい。バイオマス糖化から生成される糖類上でキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を増殖させることが望ましい。典型的に、バイオマスは、例えば、国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレットならびに共有および同時係属中の米国特許出願第６０／６７０４３７号明細書に記載のように、前処置され、次いで、リンド，Ｌ．Ｒ．（Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．）ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２年）６６：５０６−５７７）によって概説されているように、糖化酵素で処置される。バイオマス糖化は、典型的に、キシロースとグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、および／またはアラビノースとの混合物を含み得る糖類を生成する。
【００６５】
混合糖類は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞の増殖のための培地において高濃度で使用してもよい。これは、バイオマス糖化糖類の直接使用、またはほとんど希釈を伴わない使用を可能にし、それによって、商業的規模のエタノール産生に所望される発酵容積が縮小される。より大きな濃度のエタノールが産生され得るように、高い糖類濃度が使用される。混合糖濃度は、典型的に、少なくとも約１２０ｇ／Ｌおよび約３００ｇ／Ｌまでである。この範囲の混合糖類濃度で、糖アルコールを増殖培地に添加して、有益な効果を提供することができる。約１５０ｇ／Ｌ〜約２３５ｇ／Ｌの間にある混合糖濃度が特に有用である。
【００６６】
多様な糖類の割合は、混合物において変動し得、キシロースでは、典型的に、糖類の全量の少なくとも約１０％である。好ましくは、キシロースは約４０％〜約６０％の間である。フルクトースは、サトウキビバガスのようないくつかのバイオマスの糖化によって生成される糖類に存在し、そしてキシロースが糖混合物の少なくとも約１０％を保持するように、キシロースまたはグルコースの一部をフルクトースに置き換えてもよい。さらに、アラビノースは、ヘミセルロースから誘導され、それ故、ヘミセルロースを含有する糖化バイオマスから誘導される混合糖類の典型的な成分である。
【００６７】
エタノール産生の改善
本方法では、ソルビトール（Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルビトールを含む）、マンニトール、ガラクチトール、およびそれらの混合物から選択される６炭素糖由来の糖アルコールを、キシロースを含む混合糖類を含有する培地に封入することによって、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）によるエタノールの産生が改善される。これらの有効な糖アルコール類に加えて、５炭素糖アルコールのリビトール（アドニトールとも呼ばれる）もまた有効であり、そして使用してもよい。本明細書の実施例３において実証されるように、糖としてキシロースのみを含有する培地にソルビトールを添加しても、エタノール産生に効果を及ぼさない一方、意外にも、キシロースを培地の混合糖組成に含めた場合、ソルビトールは、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）によるエタノール産生に有益な影響を及ぼしたことが分かった。出願人らは、ソルビトールの存在下で、キシロースを含む混合糖培地において、エタノール産生が有意に増加したことを見出した。１つの実施形態では、混合糖は、キシロースおよび１つ以上の他の糖類を含んでなる。１つの実施形態では、１つ以上の他の混合糖はグルコースである。
【００６８】
一般に、エタノールの産生は、培地の組成を含む使用する発酵条件に依存して変動する。増殖を支持する培地組成は、高い糖類濃度、インヒビター、または他の因子の存在のため、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における至適なキシロース資化を提供しないことがあるかもしれない。ソルビトール、または上記で列挙した他の糖アルコール類のいずれかをそのような培地に添加することにより、本方法において、それは適切な培地になる。例えば、培地は、糖化されたバイオマスに存在するような、エタノール産生レベルに影響を及ぼす酢酸塩のようなインヒビターを含んでもよい。キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）によってエタノール産生を改善するために、酢酸塩を含有する混合糖培地にソルビトールを添加することについて、本明細書において示した。ソルビトール、または他に示す糖アルコールの存在下で、エタノール産生は、少なくとも約５％増加し得るが、正確な量は、使用する適切な培地の組成に依存して変動する。最大のエタノール産生に到達する場合、発酵培養の定常期において比較を行う。
【００６９】
キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、増殖停滞を生じない濃度で混合糖類を含有する培地で増殖させる場合、ソルビトールまたは他に示す糖アルコールの存在下でエタノール産生の増加が生じ得る。停滞を伴わない増殖を支持する培地における混合糖類の濃度は、インヒビターのような培地における他の成分に依存して変動する。例えば、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、約１６５ｇ／Ｌ未満の濃度で混合糖類を含有する酢酸塩を伴わない培地において増殖させる場合、典型的に、明らかな停滞期間は生じない。浸透圧ストレスの典型的な特徴は増殖停滞であるため、増殖の停滞が生じていなければ、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞は、浸透圧ストレスを受けていないと特徴付けられる。それ故、ソルビトールまたは本明細書に記載の他の糖アルコールが、混合糖類による停滞が認められない条件下でエタノール産生を増加することは意外であり、このことは、高濃度のグルコースでロース（Ｌｏｏｓ）ら、（上掲）により観察された野生型Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の増殖に対するソルビトールの浸透圧効果とは区別される。典型的に増殖停滞が生じるさらに高濃度の混合糖類では、停滞が認められない条件について特徴付けられた、ソルビトールまたは本明細書に記載の他の糖アルコールのエタノール産生に対する同じ効果が、継続して生じる。
【００７０】
ソルビトールまたは本明細書に記載の他の糖アルコールが混合糖類を伴う培地に含まれ、適切な培地が形成される本方法では、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）はまた、キシロースの資化の増加を示した。上記のエタノール産生に関して、一般に、キシロース資化は、培地の組成を含む発酵条件に依存して変動する。例えば、培地は、糖化されたバイオマスに存在するような、キシロース資化に影響を及ぼす酢酸塩のようなインヒビターを含んでもよい。酢酸塩を含有する混合糖培地にソルビトールを添加すると、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）によるキシロース資化が改善される。ソルビトールまたは本明細書に記載の他の糖アルコールの存在下では、キシロース資化が、ソルビトールまたは本明細書に記載の他の糖アルコールを伴わない同じ条件下で資化されるキシロースのレベルより少なくとも約５％増加し得るが、正確な量は、使用する適切な培地の組成に依存して変動する。例えば、本明細書の実施例４および５では、培地中に酢酸塩の非存在下で、１００ｇ／Ｌグルコースを伴う糖類混合物において、８５ｇ／Ｌのキシロースが、ソルビトールの存在下で約３０時間以内に完全に資化された一方、培地中にソルビトールを伴わない場合、培養物が約６０時間で定常期に到達したとき、約２０％のキシロースが残留した。最大のキシロース資化に到達する場合、発酵培養の定常期において比較を行う。
【００７１】
さらに、今回の発見に従って、ソルビトールの存在を伴わずにキシリトールを産生させる条件下で混合糖類を含有する培地上でキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を増殖させる場合、ソルビトールが培地に含まれるときに産生されるキシリトールの量は減少する。キシリトール産生の減少はソルビトールの存在下で少なくとも約６％であるが、正確な量は、使用する適切な培地の組成に依存して変動する。例えば、本明細書の実施例４および５では、ソルビトールの添加により、キシリトールは約３倍減少した。
【００７２】
理論に制約されるものではないが、キシリトール産生の低減は、キシロース資化の増加を可能にすると思われる。キシロース資化の増加は、副産物キシリトールへの炭素フローの減少を伴って、共に、エタノール産生の増加を可能にする。従って、キシリトール産生の低減、キシロース資化の増加、およびエタノール産生の増加は、キシロース、およびソルビトールまたは上記のような他の糖アルコールを含む混合糖類を含有する本明細書に記載の適切な培地上で増殖するキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の改善された性能をすべて表している。
【００７３】
エリトリトール、マルチトール、およびラクチトールのような糖アルコール類、ならびに頻繁に使用される浸透圧保護剤グルタミン酸塩は、エタノール産生を増加せず、またそれらは、混合糖類を含有する適切な培地上で増殖するキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）によるキシロース資化を増加しない。グルタミン酸塩は、典型的な浸透圧保護剤として作用し、停滞が生じる条件下でキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を増殖させる場合、初期増殖の停滞期間をなくす。しかし、グルタミン酸塩の存在下では、キシリトール産生は減少せず、キシロース資化は増強されず、そしてエタノール産生は改善されない。それ故、浸透圧保護剤として作用する化合物は、ソルビトールおよびマンニトール、ガラクチトール、またはリビトールのようには、性能を改善しない。この見解は、これらの糖アルコールが、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の性能促進因子であることを示す。
【００７４】
ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、リビトールまたはそれらの混合物を、約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭの間の量で添加してもよい。さらに、これらの糖アルコールを、任意の比で、約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭの間の合計量で共に使用してもよい。約２ｍＭ〜約１００ｍＭの間の量が特に有用であり、５ｍＭ〜２０ｍＭが好適である。
【００７５】
エタノールの産生のために、組み換えキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、キシロース、およびソルビトール、他に示す糖アルコール、またはそれらの混合物のいずれかを含む混合糖を含有する適切な培地と接触させる。典型的には、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を適切な培地に播種する。約０．０１％〜約２０％（ｖ／ｖ）の間の播種比が、発酵培養を開始するために望ましい。典型的に、約０．１％〜約２０％（ｖ／ｖ）の間の播種比が使用される一方、より典型的には、比は、約１％〜約２０％（ｖ／ｖ）の間である。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が発生し、そしてエタノールが産生される培地で増殖する。発酵は、空気、酸素、または他の気体を供給することなく（嫌気性、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、または微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）発酵のような条件を含み得る）、少なくとも約２４時間行うが、３０時間以上行ってもよい。エタノール産生が最大に到達するタイミングは、発酵条件に依存してばらつきがある。典型的に、インヒビターが培地中に存在する場合、より長い発酵期間が必要である。接触、および連続発酵は、約２５℃〜約４０℃の間の温度、約４．５〜約７．５のｐＨにおいて行う。約３０℃〜約３７℃の間の温度における接触、および連続発酵がより適切である。約５．０〜６．０のｐＨにおける接触、および連続発酵がより好適である。
【００７６】
エタノール産生のための発酵
本方法では、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、キシロースを含む混合糖類を含有する好適な培地中、実験規模の発酵槽、および商業的量のエタノールが産生される大規模化された発酵において増殖させることができる。エタノールの商業的産生が所望される場合、さまざまな培養方法論を適用することができる。例えば、キシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からの大規模産生を、バッチおよび連続培養方法論の両方によって、産生させることができる。古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。それ故、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしば、ｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞は、静的な対数期を通過して高増殖対数期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期へと加減する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、いくつかの系の最終産物または中間体の大部分の産生を担う。定常期または指数期後の産生は他の系において得ることができる。
【００７７】
標準的なバッチ系の１つの変形例は流加培養系である。流加培養プロセスもまた、適切であり、培養の進行に伴って基質を増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を含んでなる。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することが所望される場合、流加培養系が有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は、困難であるため、これは、ｐＨ、およびＣＯ２のような排気体分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて、見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該技術分野において一般的かつ周知であり、その例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、クリューガー（Ｃｒｕｅｇｅｒ）、クリューガー（Ｃｒｕｅｇｅｒ）、およびブロック（Ｂｒｏｃｋ）、第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）、またはデスパンデ，ムクンドＶ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，２２７（１９９２年）（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【００７８】
エタノールの商業的産生はまた、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、ここで、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般的に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物および不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、当業者に公知である天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【００７９】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を調節することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源のような制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、そして他のすべてのパラメータを加減することが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、それ故、培地を抜き取ることによって起きる細胞の消失は、培養における細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスのための栄養物および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大限にするための技術については、産業微生物学の分野において周知であり、さまざまな方法がブロック（Ｂｒｏｃｋ）、上掲によって詳述されている。
【００８０】
以下の発酵レジメンがエタノール産生に特に適切である。所望されるキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、オービタルシェーカー中、約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃で振盪フラスコ中、半複合培地（ｓｅｍｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉｕｍ）において増殖させ、次いで、類似の培地を晩有する１〜１０Ｌ種発酵槽に移す。発酵パラメータがエタノール産生に最適化されている産生発酵槽に種培養物を移す場合、ＯＤ６００が３〜６の間になるまで、種培養物を、種発酵槽において嫌気的に増殖させる。種タンクから産生タンクに移される典型的な播種容積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物またはダイズを主材料とする製品（０〜１０ｇ／ｌ）のような複合窒素源のような最小培地成分を含有する。最終濃度で約５〜２０ｍＭのソルビトールまたは指定された糖アルコールが培地中に存在する。キシロース、およびグルコース（またはスクロース）のような少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖類は、炭素源を提供し、エタノールの率および力価を最大限にするために初期のバッチ処理された炭素源（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際して発酵容器に連続的に添加する。炭素源供給速度は、培養物が、酢酸のような毒性の副産物の形成をもたらし得るグルコースの過渡の蓄積を生じないことを確実にするために、動力学的に調整する。利用する基質から産生されるエタノールの収率を最大限にするために、最初にバッチ処理するか、または発酵過程中に供給されるリン酸塩の量によって、バイオマスの増殖を制限する。発酵は、（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、もしくは水酸化ナトリウムのような）苛性溶液および硫酸またはリン酸のいずれかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０で制御する。発酵槽の温度は、３０℃〜３７℃に制御する。発泡を最小限にするために、消泡剤（任意のクラス−シリコーンを主材料とするもの、有機物を主材料とするものなど）を、必要に応じて容器に添加する。汚染を最小限にするために、場合により、カナマイシンのような株において抗生物質耐性マーカーが存在する抗生物質を使用してもよい。
【実施例】
【００８１】
本発明を、以下の実施例においてさらに規定する。これらの実施例は、好適な実施形態を示す一方、あくまで例示として示されることが理解されるべきである。当業者であれば、上記の考察およびこれらの実施例から本発明の不可欠な特徴を確かめることが可能であり、また、その趣旨および範囲から逸脱することなく、それを多様な用途および条件に適合させるように本発明の多様な変更および改変をなすことが可能である。
【００８２】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、サンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；ならびにシルハビー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）；ならびにグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィリー−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）ニュージャージー州ホーボーケン（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）（１９８７年）から出版されたアウスベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙにより記載されている。
【００８３】
略語の意味は次のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍｒ」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍｓ」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐｒ」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐｓ」はスペクチノマイシン感受性を意味し、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼであり、「ＸＫ」はキシルロキナーゼであり、「ＴＡＬ」はトランスアルドラーゼであり、「ＴＫＴ」はトランスケトラーゼであり、「ＥＦＴ」は発酵経過時間を意味し、「ＲＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物＋２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有するリッチ培地を意味し、「ＭＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４および０．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する接合培地（ｍａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）を意味する。
【００８４】
光学密度（ＯＤ）の測定
約１ｍｌのウェル中に混合されたサンプルを、フラスコまたは発酵槽から得た。第１のサンプルの吸光度を、分光光度計（アマシャム・バイオサイエンス・ウルトロスペック３３００プロ，ＧＥヘルスケア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３３００ｐｒｏ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、米国）で直接測定した。読み取り値が０．６単位より低かった場合、希釈を必要としなかった。読み取り値が０．６単位より高かった場合、実際の読み取り値が０．１〜０．６単位の間になるまで、サンプルを培養培地で希釈した。本来のＯＤを希釈比および実際の読み取り値から算出した。
【００８５】
酵素アッセイ
酵素アッセイのためのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の無細胞抽出物の調製
細胞を、５０ｍｌのＲＭ＋２％グルコース中、３０℃で、１晩、１．０〜１．２のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を、４５００ｒｐｍで１０分間、４℃で、遠心分離により回収した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを、２５ｍｌ氷冷音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）で洗浄し、続いて、４５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。ペレットを、２．０〜２．５ｍｌ音波処理用緩衝液＋１ｍＭのＤＴＴに再懸濁した。５００μｌアリコートを、１分間、エッペンドルフ遠心管中、４℃で遠心分離した。上清のほとんどを廃棄し、約１０〜２０μｌを残して、ペレットの乾燥を防止した。細胞を凍結し、そしてアッセイを行うまで−８０℃で貯蔵した。アッセイの前に、細胞を融解し、そして５００μｌの音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールで再懸濁した。混合物を、ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）ソニファイアー４５０を使用して、４５秒間、６２％デューティサイクルおよび２の出力制御関数で、音波処理の間隔の間、サンプルを約３〜５分間冷やしながら、２回音波処理した。サンプルを、１４，０００ｒｐｍで６０分間、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）微量遠心機中、４℃で遠心分離した。上清を、新しいチューブに移し、そして４℃で保持した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡアッセイを、タンパク質濃度を決定するために使用した。
【００８６】
この酵素は他の酵素要素より不安定であるため、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）アッセイは、通常、最初に実施した。ＴＫＴアッセイの図を図１Ａに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３７ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．５、８．４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＴＰＰ（（チアミン塩化ピロリン酸）、０．６ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、４ｍＭのＢＨＰ（βヒドロキシピルビン酸）、４Ｕ／ｍｌのＰＧＩ（ホスホグルコースイソメラーゼ）、および４Ｕ／ｍｌのＧ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ３４０を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＴＫＴ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１μｍｏｌのＤ−フルクトース６−リン酸／分の形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【００８７】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）アッセイの基礎を図１Ｂに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３８ｍＭのＮＡＤＨ、８７ｍＭチエタノールアミン（ｔｈｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１７ｍＭのＥＤＴＡ、３３ｍＭのＦ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）、１．２ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、２．０Ｕ／ｍｌのＧＤＨ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、および２０Ｕ／ｍｌのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）。プレートを５分間、インキュベートし、次いで、Ａ３４０を３〜５分間、読み取った。ＴＡＬ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μｍｏｌのＤ−グリセルアルデヒドの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク
【００８８】
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）アッセイの基礎を図１Ｃに示す。
【００８９】
マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭチエタノールアミン（ｔｈｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、および１Ｕ／ｍｌのＳＤＨ（ソルビトールデヒドロゲナーゼ）。Ａ３４０を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨＰ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【００９０】
キシルロキナーゼ（ＸＫ）アッセイの基礎を図１Ｄに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μｌの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２．０ｍｍのＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、２．０ＭのＡＴＰ、０．２ＭのＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）、８．５ｍＭのＤ−キシルロース、５Ｕ／ｍｌのＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、および５Ｕ／ｍｌのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｎａｓｅ））。Ａ３４０を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロース−５−リン酸の形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ３４０／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたりの６２２０Ａ３４０である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μｌの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【００９１】
ＨＰＬＣ方法
糖類、酢酸塩、エタノール、および他の副産物の分析は、ＬＣ  ３ＤのＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアで行った。カラムは、ＢｉｏＲａｄ  Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（１２５−０１２９）を伴うＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（ＨＰＬＣ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｌｕｍｎ１２５−０１４０）であった。操作条件は以下のとおりであった：
流速：０．６ｍｌ／分
溶媒：０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４
停止時間：２５分
注入容積：５μｌ
オ−トサンプラ−：温度管理（１０℃または４℃）
カラム温度：５５℃
検出器：外部標準検量線を伴う屈折率（４０℃）
【００９２】
種培養
−８０℃で凍結された種菌のグリセロールストックを融解し、次いで、６０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４の混合物を含む滅菌培養管に播種した。初期のｐＨを４ＮのＫＯＨで５．５に調整した。この回復培養物を、１晩、３７℃で静置増殖させた。それを、７５ｇ／Ｌグルコース、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４を含む振盪フラスコに移した。初期のｐＨを４ＮのＫＯＨで５．５に調整した。ＯＤ６００を測定することによって、増殖をモニターした。ＯＤが約５に到達したら、所定の容積の種菌を、播種のために滅菌シリンジに抜き取った。
【００９３】
実施例１
ＺＷ６５８、キシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
ＺＷ６５８を、連続的な転位事象を介して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース資化遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ番号３１８２１）のゲノムに組込むことによって構築し、続いて、キシロースを含有する選択培地に適応した。以前に、米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書に記載の８ｂと呼ばれるキシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、相同組み換えおよびトランスポゾンアプローチの組み合わせを介して、選択抗生物質マーカーと共に２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡｘｙｌＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔをザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）５Ｃのゲノムに組込むことによって、構築し、続いて、適応およびＮＴＧ変異誘導を行った。このアプローチは利点として組込み部位の多数の選択肢および比較的高い挿入頻度を付与するため、ＺＷ６５８の調製では、部位特異的相同組み換えとは対照的に、転位（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）社製ＥＺ：：Ｔｎインビトロ転位システム）を使用した。キシロース資化酵素をコードする４つの遺伝子を配列し、そして組込みのための２つの個別のオペロン：ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔとしてクローニングした。２つのＰ１ファージＣｒｅリコンビナーゼ認識配列（ｌｏｘＰ）によってフランキングされる抗生物質耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）遺伝子を、組込み体の選択のための各オペロンに付着させた。２つのオペロンの組込みを、２段階の連続様式：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ続いて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢで達成した。Ｃｍ耐性選択は、プラスミド上のＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、続いて、各組込み後のプラスミドのキュアリングによって、取り出されるため、両方の組込みにおいて使用した。このプロセスにより、選択のために同じ抗生物質マーカーを複数回使用することが可能であった。さらに重要なことに、それは、オペロンの組込みの選択のために誘導される抗生物質マーカーの取り出しを可能にした。このプロセスにより、商業的用途のための発酵株に対する抗生物質耐性遺伝子の悪影響がなくされた。
【００９４】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの構築
米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書（その明細書の実施例９）に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）コーディング領域を含有する２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ消化によってｐＵＣｔａｌｔｋｔ（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書）から単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＭＯＤ（エピセンターバイオテクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））ベクターにクローニングし、ｐＭＯＤｔｋｔを得た。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ｇａｐ（Ｐｇａｐ；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーター領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスアルドラーゼのコーディング領域（ｔａｌ）に次のとおりに融合することによって、Ｐｇａｐｔａｌと命名されるＰＣＲフラグメントを作製した。配列番号１および２を伴うプライマーを使用して、Ｐｇａｐフラグメント（その構築については米国特許第５５１４５８３号明細書（実施例３）に記載されている）をｐＺＢ４から増幅した。ｐＺＢ４は、Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡ／ｘｙｌＢオペロンおよびＰＥＮＯ−ｔａｌ／ｔｋｔオペロンを含有する。配列番号３および４を伴うプライマーを使用して、ｔａｌコーディング領域フラグメントを、ｐＺＢ４から増幅した。テンプレートとしてＰｇａｐおよびｔａｌフラグメントを使用し、配列番号５および６を伴うプライマーを使用して、Ｐｇａｐｔａｌフラグメントを増幅した。このフラグメントをＸｂａＩで消化し、そしてプラスミドｐＭＯＤｔｋｔのｔｋｔコーディング領域の上流にクローニングした。Ｃｍｌｏｘ（Ｆ，ｓｆｉ）およびＣｍｌｏｘ（Ｒ，ｓｆｉ）プライマー（配列番号７および８）ならびにテンプレートとしてｐＺＢ１８６を使用するＰＣＲによって、ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを作製した。ｐＺＢ１８６は、生来のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）プラスミド、ならびに米国特許第５１４５８３号明細書（実施例３）およびチャン（Ｚｈａｎｇ）ら（（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）に記載のｐＡＣＹＣ１８４の組み合わせである。最後に、ｌｏｘＰ：：ＣｍＰＣＲフラグメントを、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔを含有するプラスミドのＳｆｉＩ部位に挿入し、組込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（図２）を形成させた。このプラスミドでは、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ  ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを、ｐＭＯＤベクターの２つのモザイク末端（ｍｏｓａｉｃ  ｅｎｄ）（トランスポナーゼ結合部位）の間に挿入した。ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号９として示す。
【００９５】
ＺＷ１におけるｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの転位および形質転換
プラスミドｐＭＯＤは、ｐＵＣに基づくベクターであり、従って、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における非複製ベクターである。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを、Ｍｇ２＋の存在下、室温で１時間、トランスポゼースで処置し、そして（２００オーム、２５μＦおよび１６ｋＶ／ｃｍに設定したバイオラッド・ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）を使用する）エレクトロポレーションによって、ＺＷ１細胞を形質転換するために使用した。エレクトロポレートした細胞を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１ｍＭのＭｇＳＯ４を補充した１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４）からなる接合培地（ｍａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＭ）中、６時間、３０℃でインキュベートした。形質転換混合物を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＭＭ中に１５ｇ／Ｌバクト（Ｂａｃｔｏ）寒天を含有する寒天プレート上でプレート化し、そして３０℃で嫌気的にインキュベートした。約２日間後、形質転換体が目視で認められた。形質転換／転位頻度は、約３×１０１／μｇのＤＮＡであった。
【００９６】
合計で３９個のＣｍｒ形質転換体コロニーを得た。２１個のコロニーを拾い出し、そしてＰＣＲおよび酵素活性アッセイによってさらに分析した。プライマー配列番号１０および１１を使用するＰＣＲにより、形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコーディング領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの存在を確認した。２１個の組み換え体コロニー由来のプラスミドＤＮＡによる戻し形質転換により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において戻し形質転換体が作製されなかったことから、ｔａｌおよびｔｋｔは、ＺＷ１のゲノムに組込まれたことが示唆された。マイクロプレート用に改変したプロトコル（一般的方法）を使用して、これらの組込み体を、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性について試験した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイを、タンパク質濃度の決定するために使用した。形質転換体を、１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を補充した２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有するＲＭ中、５０ｍｌ円錐遠心管において３０℃で増殖させた。酵素アッセイでは、コントロール株８ｂおよびＺＷ１も増殖させた（ＺＷ１ではＲＭ＋２％グルコースを使用した）。ＯＤ６００が１．０に到達した場合、細胞を回収した。細胞を１回洗浄し、そして音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６および１０ｍＭのＭｇＣｌ２）に再懸濁した。米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書に記載のように、酵素アッセイを行った。単位をμモル／分−ｍｇとして示す。１つを除いて、すべてのサンプルは、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性を有した。
【００９７】
ｔｋｔプローブを使用して、ＰｓｔＩで消化した選択された組込み体のゲノムおよびプラスミドＤＮＡに対し、サザンハイブリダイゼーションを実施した。ＺＷ１  ＤＮＡは、ｔｋｔプローブとはハイブリダイズしなかった。すべての組込み体ゲノムＤＮＡサンプルにおいて、共通の１．５ｋｂのバンドが認められたが、これは、ｔｋｔ中のＰｓｔＩ部位とｔａｌ中のＰｓｔＩ部位との間において予想されるＤＮＡフラグメントである。第２の認められる高分子量（６ｋｂ以上）のバンドは、各系統において個別のゲノム組込み部位を示す独立した系統Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５の間で独特であった。興味深いことに、プラスミドおよびＴ５のゲノムＤＮＡの両方ともｔｋｔプローブとハイブリダイズし、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔもまた、生来のプラスミド上のＴ５に組込まれた可能性があることを示した。Ｃｍｒマーカーを取り出すためのさらなるＣｒｅ処置について、これらの４つの株（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５）を選択した。
【００９８】
ｔａｌｔｋｔ組込み体からＣｍｒマーカーを取り出すためのＣｒｅ処置
Ｃｍｒマーカーを取り出すために、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５を、スペクチノマイシン耐性マーカーを伴うＣｒｅ発現カセットを担持するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＺＢ１８８［チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３；米国特許第５５１４５８３号明細書］の誘導体（ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦ）で形質転換した。２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を補充したＭＭ寒天プレート上で、形質転換体を選択した。Ｓｐｒ耐性コロニーを拾い出して、２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＲＭ寒天プレートおよび２％グルコースおよび１２０μｇ／ｍＬのＣｍを補充したＲＭ寒天プレート上に移した。拾い出したコロニーの１００％がＣｍｓであったことから、ＣｒｅによるＣｍｒの高い効率の切り出しが示された。ＳｐｒＣｍｓ形質転換体を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて、３７℃、２〜５回の連日継代で培養し、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦをキュアリングした。各継代時に、細胞を希釈し、そして拾い出して、２００μｇ／ｍＬのＳｐを伴うまたは伴わない同じ培地のさらなるプレートに移すために、ＲＭ＋２％グルコース寒天プレート上にプレート化した。ＰＣＲによってＳｐｓコロニーを分析して、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦの消失を確認した。組込み体のプラスミドがキュアリングされた子孫を、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃと命名した。これらの転位組込み体が安定であるかどうかを調べるために、これらの４つの株を、ＲＭ＋２％グルコースにおいて増殖させ、次いで、１０ｍｌの同じ培地に移し、そして３７℃で、２回反復測定の試験管において増殖させた。細胞を、１０日間連日、または約１００代まで継代した。１代および１０代継代後、コロニーを希釈し、そしてコロニー単離のためにＲＭＧプレート上にプレート化した。試験した各株の各継代由来の１２個のコロニーは、５’Ｐｇａｐおよび３’ｔｋｔプライマー（配列番号１および１１）を使用するコロニーＰＣＲによるＰｇａｐｔａｌｔｋｔの存在についてポジティブであった。トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性もまた、（一般的方法に記載のとおりに）１回目および１０回目の継代後の単離体について測定した。４つのすべての組込み体は、非選択的倍地上の１００代目後もＴＡＬおよびＴＫＴ活性の両方について類似のレベルを有したことから、これらの組込み体が遺伝的に安定であることが示唆された。
【００９９】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの構築
次の工程は、ＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ組込み体（Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ）にＰｇａｐｘｙｌＡＢ  ｌｏｘＰ：：Ｃｍオペロンをさらに組込むことであった。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（図２）に基づいて、組込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ（図３）を構築した。ＳａｃＩ／ＳｆｉＩ消化によってＰｇａｐｔａｌｔｋｔＤＮＡフラグメントを取り出した。ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｉＩ制限部位を含有するアダプターフラグメントを、連結によって導入した。次いで、ｐＺＢ４（米国特許第５５１４５８３号明細書）から単離したＰｇａｐｘｙｌＡＢのＮｏｔＩフラグメントを、アダプターのＮｏｔＩ部位にクローニングした。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）はｘｙｌＡによってコードされ、そしてキシルロキナーゼ（ＸＫ）はｘｙｌＢによってコードされる。ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号１２として示す。
【０１００】
Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５ＣにおけるｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの転位および形質転換
ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの組み込みと同様のアプローチを使用して、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃを、トランスポナーゼで処置した（上記の）ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍで形質転換／転位した。Ｃｍ選択後の２回の形質転換／転位実験で、６つの組込み体（Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ２）を得た。すべてについて、２つの組のプライマー：配列番号１３、および１４、ならびに配列番号１５および１６を使用するＰＣＲによって、ｘｙｌＡＢの存在か確認されたが、但し、Ｔ２ＣｃｍＸ１およびＴ２ＣｃｍＸ６については、プライマー配列番号１３および１４を使用すると、ＰＣＲフラグメントが検出されなかった。
【０１０１】
２つのＰＣＲネガティブ系統を含む組込み体を、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性についてアッセイした（一般的方法）。図４および５において示される結果は、６つのｘｙｌＡＢ組込み体Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、およびＴ５ＣＣｍＸ２はすべて、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性を有したことを示した。ネガティブな親コントロールと比較して、ＸＩおよびＸＫ活性が新たに獲得された（図４）。ＴＡＬおよびＴＫＴ活性は、親コントロールと同じように維持された。すべての結果は、タンパク質が作製され、そして機能的であることを示した。酵素活性レベルにはばらつきが認められたが、ＴＩおよびＸＫ活性は、同じプラスミドで形質転換／転位されたＺＷ１組込み体のＴＩおよびＸＫ活性と同様であった。ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴの活性のレベルは、株８ｂより低かった。
【０１０２】
ｘｙｌＡＢオペロンの組込みを、サザンハイブリダイゼーションによって確認した。６系統のゲノムおよびプラスミドＤＮＡの両方を、ＳｐｈＩで消化し、そしてジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｅｎｉｎ）標識ｘｙｌＢプローブにハイブリダイズさせた。ｘｙｌＢにおけるＳｐｈＩ部位およびｐＭＯＤベクターベクター上の隣接するクローニング部位におけるもう１つのＳｐｈＩ部位から作製される約３ｋｂの共通のバンドは、すべてのゲノムＤＮＡサンプルに存在し、さらに、ゲノムＤＮＡサンプル中に、より高い分子量のハイブリダイズバンドが認められたことから、染色体にＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのための４つの組込みの部位が存在することが示された。Ｔ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２は、同じ組込み部位を有するようであり、Ｔ３ＣＣｍＸ３およびＴ４ＣＣｍＸ１は、同じ組込み部位を有し得、そしてＴ５ＣＣｍＸ１およびＴ５ＣＣｍＸ２はそれぞれ、個別の組込み部位を有した。ＰｓｔＩによる同じＤＮＡの消化、それに続く、ｔｋｔプローブとのサザンハイブリダイゼーションにより、各組込み体は、そのそれぞれの親株と同じハイブリダイゼーションパターンを有したことが実証された。
【０１０３】
キシロース培地におけるＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ  ＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組込み体の適応
キシロース資化のための４つのすべての酵素活性が存在しているにもかかわらず、本発明者らの先の観察（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書）では、組込み体は、キシロース上で直ぐには増殖しないことが示された。キシロース上での増殖は、（試験管中またはプレート上のいずれかにおける）キシロース培地上での長期のインキュベーション、適応と呼ばれるプロセス後、生じ得る。
【０１０４】
株は、以下のとおりに適応させた。ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組込み株を、（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、２０ｇ／ｌまたは２％（ｗ／ｖ）キシロースならびにＲＭＧＸ（０．０２５％（ｗ／ｖ）グルコース、４％（ｗ／ｖ）キシロースを伴うＲＭを含有する）ＲＭＸを含有する試験管およびプレートに播種した。低レベルのグルコースを使用して、初期の増殖を支持し、適応中の変異の可能性を増加させた。培養およびプレートの両方におけるキシロースに対する適応についての少なくとも５つの試みのうちの１つが、成功であった。３０℃での１０日間の嫌気的インキュベーションの後、１７および１９個のコロニーが、それぞれＴ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２細胞をプレート化したＭＭＧＸ上で認められた。コロニーは小さく、そしてプレート上では健常でないように見えた（透明であった）。１２個のコロニー（Ｔ３ＣＣｍＸ１プレーティング由来の４個：Ｔ３ＣＣｍＸ１１、Ｔ３ＣＣｍＸ１２、Ｔ３ＣＣｍＸ１３およびＴ３ＣＣｍＸ１１０；Ｔ３ＣＣｍＸ２プレーティング由来の８個：Ｔ３ＣＣｍＸ２４、Ｔ３ＣＣｍＸ２５、Ｔ３ＣＣｍＸ２６、Ｔ３ＣＣｍＸ２７、Ｔ３ＣＣｍＸ２８、Ｔ３ＣＣｍＸ２９、Ｔ３ＣＣｍＸ２１１およびＴ３ＣＣｍＸ２１２）をＲＭＧＣｍ１２０に播種し、そしてさらなる適応のために３ｍｌのＲＭＸに移して、キシロース上でより
迅速に増殖することが可能な系統を得た。
【０１０５】
３ｍｌのＲＭＸを含有する試験管における組込み体の適応は、３０℃で行った。ＯＤ６００を、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計で定期的にモニターした。増殖が対数期の中間部に到達したら、培養をＲＭＸの新鮮な管に移した。このプロセスを、７継代、連続した。増殖速度および最終ＯＤ（非線形読み取り）が、継代の間に改善された。
【０１０６】
６回目の継代において、培養物をＲＭＸプレート上から画線して、単一のコロニーを単離した。３つの組込み体：Ｔ３ＣＣｍＸ１３、Ｔ３ＣＣｍＸ２６およびＴ３ＣＣｍＸ２７が、ＲＭＸ画線プレート上で他より迅速に増殖したが、これらを、以下の表および考察でＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７と称した。本発明者らは、最良のキシロース資化増殖体をスクリーニングするために、ＴＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７に対するそれぞれ４個の大きな（Ｌ１−４）および４個の小さな（Ｓ１−４）コロニーを選択し、そして増殖、糖資化、およびエタノール産生をモニターし得るように、ＲＭＸ試験管中でこれらを増殖させた。コロニーを、１晩、３０℃で増殖させ、続いて、２回反復測定の試験管中３ｍｌのＲＭＸにＯＤ６００＝０．０５を播種した。Ｘ２７は、ＲＭＧにおいて、他の培養物より遅く増殖し、そして６．５時間後に再度、播種した。６９時間（Ｘ２７では６２．５時間）後、サンプルを、ＨＰＬＣ分析（一般的方法）のために採取した。図６は、６９時間目（すべてのＸ２７培養物については６２．５時間）での培養の平均エタノール収率（理論的収率の％）およびキシロース資化（％）を示す図表である。大きなコロニーと小さなコロニーとの間で、有意差は認められなかった。Ｘ２７の性能は、キシロース上のＸ２６と比較して、より良好であったが、それは、グルコース上では、より遅い増殖を示した。従って、最上位の性能を示すもの、Ｘ１３（Ｘ１３Ｌ３）およびＸ２６（Ｘ２６Ｌ１）の大きなコロニーを、ｐＨ制御された発酵におけるさらなる評価のために選択した。発酵を、ＲＭＧ（６％グルコース）、ＲＭＸ（６％キシロース）およびＲＭＧＸ（８％：４％；グルコース：キシロース）中、３７℃で、株Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１、ならびにコントロール株８ｂについて行った。ＲＭＧ（６％）およびＲＭＧＸ（８％：４％）において増殖したＸ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１によるグルコースの発酵は、かなり迅速に進行した。ＲＭＧＸ（８％：４％）におけるキシロースの発酵は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１では、株８ｂと比較して緩徐であった。さらに、ＲＭＸ（６％）上、３７℃での増殖は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１の両方とも、長い停滞の後に生じた。いくらかの単離体、Ｘ１３ｂ、Ｘ１３ｃおよびＸ１３ＦＬを、ＲＭＸ（６％）発酵から回収した。これらの単離体を、本来の株Ｘ１３ａ（Ｘ１３Ｌ３の単離体）およびＸ２６と共に、本実施例において先に記載のようにＣｒｅ処置に供して、ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株からＣｍｒマーカーを取り出した。得られたＣｒｅ処置されたＣｍｒを含まない組込み体を：Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ１３ＦＬＣおよびＸ２６Ｃと命名した。
【０１０７】
ＲＭＸ（５％）中３７℃での連続継代によるキシロース培地における組込み体の適応
先に記載のように、ＲＭＸ上、３０℃での初期のＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株の適応により、これらの条件における株の増殖が顕著に改善された。しかし、適応された株は、ＲＭＸ（６％）における３７℃での増殖および発酵の間、長い停滞を蒙る。より高い糖濃度および温度を含む好適なプロセス条件でキシロース発酵のために組込み体をさらに改善するために、進化または適応プロセスを、ＲＭＸ（５％）中３７℃で継続させた。連続継代を行い、そして最も良好な資化増殖体を選択した。このプロセスで使用した組込み体は、Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ２６ＣおよびＸ１３ＦＬＣを含んだ。これらの５つの株を、ＲＭＸ中３０℃で６継代増殖させた後、さらに５〜１６代の継代のために、３７℃でＲＭＸ（５％）に移した。すべての継代中および後、培養物をＲＭＸプレート上に画線し、そして３７℃でインキュベートして、単一のコロニーを単離した。大きなコロニーについてさらに、ＲＭＸプレート上への画線および３７℃でのインキュベートを３〜４回行い、コロニーを精製した。最終的な大きなコロニーを、ＲＭＸ（５％）における３７℃での増殖試験のために選択した。
【０１０８】
ＲＭＸ（５％）培地における３７℃での適応由来の株の評価
連続継代による適応後に単離した１８個のコロニーを、はじめに、ＲＭＸ（５％）試験管中、３７℃で試験した。１２の株を、第２の試験管評価のために選択した。比較のために、株８ｂをすべての評価に含めた。１８個のコロニーを、ＲＭＧにおいて、３７℃で１晩増殖させ、遠心分離し、そして細胞を、第１の評価のために、試験管中４ｍｌのＲＭＸ（５％）に３７℃で、静置状態で播種した。増殖（ＯＤ６００、非線形的）およびエンドポイントのＨＰＬＣ結果（低い残留キシロースおよび高エタノール）に基づいて、１２の株を、第２の評価のために選択した。
【０１０９】
第２の評価の目的の１つは、キシロース上での改善された増殖の安定性および株のキシロース資化能を試験することであった。１２のすべての株を、安定性研究に供して、適応された株を非選択培地に暴露して、３７℃で５０代連続的に継代培養させた後に、それらが安定であるかどうかを調べた。ＲＭＧ（５％）継代培養の前および後の培養物を、ＲＭＸ（５％）試験管に播種し、そして評価のために３７℃で増殖させた。非線形的ＯＤを、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計において、試験管の直接読み取りによってモニターした。ＲＭＧにおける５０代の増殖の前および後のＲＭＸ（５％）における増殖の７０時間目のＯＤを、図７にプロットした。結果は、ほとんどの株が、ＲＭＧ、３７℃において５０代後も安定であったことを示した。（定常期における）エンドポイントの上清もまた、キシロースおよびエタノール濃度について一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。これらの培養物において低い残留キシロースおよび高いエタノール濃度が認められたことから、株が増殖し、そしてキシロースを良好に発酵したという事実が裏付けられた。
【０１１０】
上記の試験管評価（低い残留キシロース、高いエタノール濃度およびより高いＯＤ）、ならびに高度の糖類におけるおよび酢酸塩の存在下でより良好な資化増殖体を選択するための高濃度のグルコースおよび／またはキシロース（２０％まで）、および酢酸塩を伴うグルコースおよびキシロースの混合物による以後のマイクロタイタープレート増殖スクリーニングの結果に基づいて、全体的に最も良好な性能を示したＺＷ６５８と称される株番号２６に焦点を当てることに決定した。
【０１１１】
実施例２
最上位の改善されたキシロース資化株の３７℃における発酵の評価
以下の実施例は、バイオマス加水分解物において予想される糖濃度および酢酸レベルを模倣する発酵条件下の改善されたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株ＺＷ６５８の発酵性能を例示する。株ＺＷ６５８を、それぞれ、１０％グルコース（ＲＭＧ１０％）、８％キシロース（ＲＭＸ８％）、１０％グルコース＋８％キシロース（ＲＭＧＸ１０％８％）および１０％グルコース＋８％キシロース＋０．６％酢酸（ＲＭＧＸＡｃ１０％８％０．６％）を補充したＲＭ培地を含有する発酵槽に播種した。すべての発酵は、３００ｍｌ培地を伴うシックスフォース（Ｓｉｘｆｏｒｓ）中、１５０ｒｐｍ、ｐＨ５．５および３７℃で行った。窒素を、発酵槽中の培地に１晩パージし、そして播種直前に停止した。発酵中は、窒素をパージしなかった。ＲＭＧ５％においてワーキングストックから起こした後の振盪フラスコ（１５０ｒｐｍ）中３７℃でのＲＭＧＸ（１０％、４％）によって、発酵のための播種物を調製した。株８ｂを、同じ条件下のコントロールとして使用した。ＯＤ６００測定について、ならびにグルコース、キシロース、キシリトールおよびエタノールの（一般的方法に記載の）ＨＰＬＣ分析について、サンプルを、定期的に採取した。図８に示すように、ＺＷ６５８は、ＲＭＧ１０％上で８ｂと比較して、より緩徐に増殖し（ＡおよびＢ）、そしてＲＭＸ８％上では８ｂに類似の速度で増殖した（ＣおよびＤ）。より緩徐な増殖速度にもかかわらず、図８は、グルコース培地での発酵の終了時にＺＷ６５８のエタノール収率（９３％）が８ｂに類似したことを示す。ＲＭＸ８％培地では、エタノール収率は、８ｂ（０．４４ｇエタノール／ｇ糖）と比較するとＺＷ６５８（０．４６ｇエタノール／ｇ糖）の方が高かった。ＺＷ６５８は、ＲＭＸ８％において８ｂと比較して、約４ｇ／ｌ多いエタノールを産生した。興味深いことに、ＺＷ６５８は、何らキシリトールを産生しなかった一方、８ｂは、ＲＭＸ８％における発酵の終了時に低レベルのキシリトール（０．７ｇ／ｌ）を産生した。図９に示すデータは、酢酸塩を伴って（Ｃ、Ｄ）または伴わずに（Ａ、Ｂ）１０％グルコース＋８％キシロースを発酵する際に、ＺＷ６５８が、８ｂと比較してより良好に作動したことを示し、より多いグルコースおよびキシロース消費、より少ないキシリトール産生、およびより多いエタノール産生によって示される。３７℃およびｐＨ５．５でのＲＭＧ１０％Ｘ８％における両方の株の発酵の終了時に、グルコースのほとんどが使用され、そして実質的な残留キシロースが保持されたが、ＺＷ６５８は、８ｂより約８ｇ／ｌ多いキシロースを使用した。３７℃およびｐＨ５．５でのＲＭＧ１０％Ｘ８％中ＺＷ６５８における発酵の終了時のキシリトール産生（４．９ｇ／ｌ）は、８ｂのキシリトール産生（８．２ｇ／ｌ）より有意に低かった。酢酸塩（６ｇ／ｌ）の存在下において、両方の株の細胞増殖は、有意に減少し、グルコースおよびキシロースの両方の貧弱な発酵性能を生じたが、ＺＷ６５８は、より多いグルコースおよびキシロース産生、より少ないキシリトール産生およびより多いエタノール産生について、僅かにより良好な発酵性能を示した。ＲＭＸ８％とは異なり、酢酸塩を伴うまたは伴わないＲＭＧ１０％Ｘ８％では、両方の株とも副産物キシリトールを産生したが、８ｂと比較してＺＷ６５８ではキシリトールがより少なく産生された。２つの株の発酵性能を表１に要約する。全体として、ＺＷ６５８は、純粋な糖発酵において８ｂより良好に作動した。実施例１に記載のように、ＺＷ６５８は、抗生物質選択マーカーを含まず、これは、商業的用途において発酵生物体に貴重な特性である。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
実施例３
ソルビトールの存在および非存在下において高濃度グルコースまたはキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
４つの滅菌済み１２５ｍｌ三角培養フラスコ（カタログ番号３０１８０−０３６、ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）において、約５のＯＤ６００の１０ｍｌのＺＷ６５８株の種培養物を、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４ｇ／ＬのＫＨＣＯ３を含有する１００ｍｌの水溶液を含む各フラスコに播種した。播種の前に、２００ｇ／Ｌグルコースのみを伴う第２のフラスコと比較して、第１のフラスコはまた、２００ｇ／Ｌグルコースおよび２０ｍＭソルビトールも含有した。２００ｇ／Ｌキシロースのみを伴う第４のフラスコと比較して、第３のフラスコはまた、２００ｇ／Ｌキシロースおよび２０ｍＭソルビトールも含有した。播種後、糖濃度を約１８０ｇ／Ｌまで希釈した。初期のｐＨを４ＮのＨ３ＰＯ４溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は３３℃で行い、そしてｐＨは制御しなかった。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、エタノール、およびキシリトールを含む化合物について、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１０Ａは、０〜４８時間の間の時間ポイントにおけるＯＤ６００を示す。４８時間後、第１、第２、第３、および第４のフラスコについて、ＯＤ６００は、それぞれ、９．９４、６．４６、５．３７および５．４５であった。これらの結果は、ソルビトールが、高濃度グルコース培養物において有意に刺激された増殖を示すが、高濃度キシロース培養物においては増殖に対する効果をほとんど示さなかった。
【０１１４】
図１０Ｂにおける結果は、エタノール産生が、ソルビトールを伴うグルコースにおいては、より迅速であったが、ソルビトールを伴うおよび伴わない培養物中のエタノールは、約２０時間後に同じレベルに到達したことを示す。キシロースのみの培養物では、エタノール産生は、ソルビトールを伴ってもおよび伴わなくても同じ速度であったが、ソルビトールサンプルは、４８時間目において、ソルビトールを伴わないサンプルより少ないエタノールを産生した。これらのいずれの培養物においても、キシリトールは産生されなかった。
【０１１５】
実施例４
ソルビトールの存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
滅菌済み１リットル発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵシステム、ザルトリウスＢＢＩシステム社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）、ペンシルバニア州ベスレヘム（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、米国）において、約５の光学密度（６００ｎｍで測定した）の５０ｍｌのＺＷ６５８株種培養物を、糖類および培養物を含有する４５０ｍｌの水溶液に播種した。最終的な混合ブロスは、１００ｇ／Ｌグルコース、８５．１ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、および１０ｍＭソルビトールを含有した。ｐＨを４ＮのＫＯＨ溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は、３３℃およびｐＨ５．５で行った。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、エタノール、および酢酸塩を含む化合物について、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。また、サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１１は、存在するグルコース、キシロース、キシリトール、エタノールおよび酢酸の量、ならびに０〜６５時間の間の時間ポイントのＯＤ６００を示す。２９時間後、グルコースおよびキシロース濃度は、それぞれ０および２．０８ｇ／Ｌであり、そしてエタノール濃度は８３．９ｇ／Ｌに到達した。細胞は、１３のＯＤ６００まで増殖した。副産物キシリトール濃度は、２９時間で０．６７ｇ／Ｌであり、そして６４時間で０．９５ｇ／Ｌまで増加した。
【０１１６】
実施例５
ソルビトールの非存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
滅菌済み１リットル発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵシステム、ザルトリウスＢＢＩシステム社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）、ペンシルバニア州ベスレヘム（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、米国）において、約５の光学密度（６００ｎｍで測定した）の５０ｍｌのＺＷ６５８株種培養物を、糖類および培養物を含有する４５０ｍｌの水溶液に播種した。最終的な混合ブロスは、１０３ｇ／Ｌグルコース、８５．０ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有した。ｐＨを４ＮのＫＯＨ溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は、３３℃およびｐＨ５．５で行った。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、キシリトール、エタノール、および酢酸塩を含む化合物について、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。また、サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１２は、存在するグルコース、キシロース、エタノールおよび酢酸の量、ならびに０〜７０時間の間の時間ポイントのＯＤ６００を示す。実施例３の実験においてソルビトールが存在した場合のように、グルコース濃度は４０時間まで０に到達せず、そしてキシロース濃度は、一度も２ｇ／Ｌまで減少しなかった。稼動の終了時、６７時間後に、キシロースのみが１７．８ｇ／Ｌまで減少した。キシリトール産生は、２９時間で約０．２１ｇ／Ｌであり、６４時間後、３．０８ｇ／Ｌまで増加し、実施例１の実験におけるよりも３倍を超える高い量が産生された。６７時間後、エタノール濃度は７７．２ｇ／Ｌに到達し、そして細胞は、６．７のＯＤ６００まで増殖した。
【０１１７】
実施例３および４を比較して、結果は、ソルビトールの添加が、停滞時間を有意に減少し、そして糖資化（または取り込み）速度、最終エタノール濃度（即ち、収率）を改善し、そして増殖を倍加したことを示した。より少ないキシリトールが産生された。
【０１１８】
実施例６
ソルビトールおよび酢酸塩の存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
滅菌済み１リットル発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵシステム、ザルトリウスＢＢＩシステム社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）、ペンシルバニア州ベスレヘム（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、米国）において、約５のＯＤ６００の５０ｍｌのＺＷ６５８株種培養物を、糖類および培養物を含有する４５０ｍｌの水溶液に播種した。最終的な混合ブロスは、９９．０ｇ／Ｌグルコース、８２．７ｇ／Ｌキシロース、５．８ｇ／Ｌ酢酸塩（酢酸カリウムの形態）、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、および１０ｍＭソルビトールを含有した。ｐＨを４ＮのＫＯＨ溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は、３３℃およびｐＨ５．５で行った。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、エタノール、および酢酸塩を含む化合物について、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。また、サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１３は、存在するグルコース、キシロース、キシリトール、エタノールおよび酢酸の量、ならびに０〜６４時間の間の時間ポイントのＯＤ６００を示す。６３．７５時間後、グルコースおよびキシロース濃度は、それぞれ０および２９．６ｇ／Ｌであり、そしてエタノール濃度は７０．０ｇ／Ｌに到達した；細胞は６．４のＯＤ６００まで増殖した；副産物キシリトール濃度は３．５５ｇ／Ｌであった。
【０１１９】
実施例７
ソルビトールを伴わない酢酸塩の存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
滅菌済み１リットル発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵシステム、ザルトリウスＢＢＩシステム社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）、ペンシルバニア州ベスレヘム（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、米国）において、約５のＯＤ６００の８０ｍｌのＺＷ６５８株種培養物を、糖類および培養物を含有する７２０ｍｌの水溶液に播種した。最終的な混合ブロスは、９７．２ｇ／Ｌグルコース、８１．０ｇ／Ｌキシロース、５．７ｇ／Ｌ酢酸塩（酢酸カリウムの形態）、５ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４および１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有した。ｐＨを４ＮのＫＯＨ溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は、３３℃およびｐＨ５．５で行った。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、キシリトール、エタノール、および酢酸を含む化合物について、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。また、サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１４は、存在するグルコース、キシロース、エタノールおよび酢酸の量、ならびに０〜１４０時間の間の時間ポイントのＯＤ６００を示す。６３時間後、グルコースおよびキシロース濃度は、それぞれ０および５０ｇ／Ｌであり、そしてエタノール濃度は６１．８ｇ／Ｌに到達した。細胞は、３．３のＯＤ６００まで増殖した。１３５時間後、キシロース濃度は３８ｇ／Ｌまで減少し、そしてエタノール濃度は６４．４ｇ／Ｌに到達した。副産物キシリトール濃度は、６３時間で１．３ｇ／Ｌであり、そして１３５時間後、４．４ｇ／Ｌまで増加した。ソルビトールを伴わない発酵培養の定常期に産生された４．４ｇ／Ｌのキシリトールを、ソルビトールを伴う発酵培養の定常期に産生された３．５５ｇ／Ｌのキシリトール（実施例６）と比較した場合、結果は、ソルビトールの添加が、酢酸塩の存在下で産生されるキシリトールの量を減少したことを示した。
【０１２０】
実施例８
グルタミン酸塩の存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
滅菌済み１リットル発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）Ｂ−ＤＣＵシステム、ザルトリウスＢＢＩシステム社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）、ペンシルバニア州ベスレヘム（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、米国）において、約５のＯＤ６００の５０ｍｌのＺＷ６５８株種培養物を、糖類および培養物を含有する４５０ｍｌの水溶液に播種した。最終的な混合ブロスは、９８．０ｇ／Ｌグルコース、８１．２ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、および１０ｍＭグルタミン酸カリウムを含有した。ｐＨを４ＮのＫＯＨ溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は、３３℃およびｐＨ５．５で行った。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、キシリトール、エタノール、および酢酸を含む化合物について、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。また、サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１５は、存在するグルコース、キシロース、エタノールおよび酢酸の量、ならびに０〜６３．７５時間の間の時間ポイントのＯＤ６００を示す。グルタミン酸塩は停滞期間を減少し、そしてグルコース濃度は２４時間において０に到達した。しかし、キシロースはそれほど資化されず、細胞増殖およびエタノール産生は、ソルビトールの存在下（実施例４）と比較して減少し、そしてキシリトール産生は増加した。６３．７５時間後、グルコースおよびキシロース濃度は、それぞれ０および２１．２ｇ／Ｌであり、そしてエタノール濃度は７２．３ｇ／Ｌに到達した；細胞は６．９のＯＤ６００まで増殖した；副産物キシリトール濃度は４．３８ｇ／Ｌであった。結果は、グルタミン酸塩が停滞時間を減少し、そしてグルコース資化（または取り込み）速度を改善したが、キシロース使用、細胞増殖、およびキシリトール副産物の産生に対してソルビトールほど有益な効果を有さなかったことを示した。
【０１２１】
実施例９
多様な濃度におけるソルビトールの存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
５つの滅菌済み１２５ｍｌ三角培養フラスコ（カタログ番号３０１８０−０３６、ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）において、約５のＯＤ６００（６００ｎｍで測定した）の１０ｍｌのＺＷ６５８株の種培養物を、１００ｇ／Ｌグルコース、８０ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、１０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ならびに多様な濃度のソルビトール（０、０．５、１、２、および１０ｍＭ）を含有する１００ｍｌの水溶液を含む各フラスコに播種した。播種後、種培養物による希釈のため、全糖濃度は約１６０ｇ／Ｌであった。初期のｐＨを４ＮのＫＯＨ溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は３３℃で行い、そしてｐＨは制御しなかった。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１６は、０〜２８時間の間の時間ポイントにおけるＯＤ６００を示す。より高い濃度のソルビトールを伴う培養物は、この範囲で、より迅速かつより良好に増殖した。１４．２５時間後、ＯＤ６００は、０、０．５、１、２、および１０ｍＭのソルビトール濃度について、それぞれ４．１９、７．１０、８．０８、８．６２、および１０．１であった。
【０１２２】
実施例１０
２００ｍＭまでの多様な濃度におけるソルビトールの存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
５つの滅菌済み１２５ｍｌ三角培養フラスコ（カタログ番号３０１８０−０３６、ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）において、約５の光学密度（６００ｎｍで測定した；ＯＤ６００）の１０ｍｌのＺＷ６５８株の種培養物を、１１０ｇ／Ｌグルコース、９０ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４ｇ／ＬのＫＨＣＯ３、ならびに多様な濃度のソルビトール（１０、２０、５０、１００、および２００ｍＭ）を含有する１００ｍｌの水溶液を含む各フラスコに播種した。初期のｐＨを４ＮのＨ３ＰＯ４溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は３３℃で行い、そしてｐＨは制御しなかった。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、エタノールについて、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１７は、ＯＤ６００（Ａ）および０〜４８時間の間の時間ポイントで産生されたエタノール（Ｂ）を示す。２４時間後、ＯＤ６００は、１０、２０、５０、１００、および２００ｍＭのソルビトール濃度について、それぞれ７．７４、７．８６、８．０４、７．８２、および７．１２であった。４８時間後、ＯＤ６００は、１０、２０、５０、１００、および２００ｍＭのソルビトール濃度について、それぞれ８．３０、８．２６、８．８４、８．１２、および７．７２であった。同様に、これらの結果は、１０〜１００ｍＭソルビトールを伴う培養物が増殖した一方、２００ｍＭソルビトールを伴う培養物は若干緩徐に増殖したことを示した。エタノール産生は、１００または２００ｍＭソルビトールを伴う方が、１０、２０、または５０ｍＭソルビトールを伴うより若干緩徐であったが、全ての培養物は、およそ同じ最終エタノール産生量に到達した。いずれのサンプルにおいても、キシリトールは検出されなかった。それ故、１０ｍＭソルビトールは、これらの条件下で最大のエタノール産生を提供するのに適量である。
【０１２３】
実施例１１
多様なポリオール類の存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
５つの滅菌済み１２５ｍｌ三角培養フラスコ（カタログ番号３０１８０−０３６、ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）において、約５のＯＤ６００の１０ｍｌのＺＷ６５８株の種培養物を、１００ｇ／Ｌグルコース、８０ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および４ｇ／ＬのＫＨＣＯ３、ならびに１０ｍＭの次のポリオール類：エリトリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、またはラクチトールの１つを含有する１００ｍｌの水溶液を含む各フラスコに播種した。播種後、種培養物による希釈のため、全糖濃度は約１６０ｇ／Ｌであった。初期のｐＨを４ＮのＨ３ＰＯ４溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は３３℃で行い、そしてｐＨは制御しなかった。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、エタノール、キシリトール、および酢酸を含む化合物について、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１８は、ＯＤ６００（Ａ）、キシロース資化（Ｂ）、および０〜３２時間の間の時間ポイントで産生されたエタノール（Ｃ）を示す。ソルビトールまたはマンニトールを伴う培養物は、より迅速かつより良好に増殖した。３２時間後、ソルビトールまたはマンニトールを補充した培養物のＯＤ６００は、それぞれ１３．９４および１３．９２であった；一方では、エリトリトール、マルチトール、またはラクチトールを補充した培養物のＯＤ６００は、それぞれ９．４８、９．０２、および９．２４であった。培地中にソルビトールまたはマンニトールを伴う場合、より多くのキシロースが資化され、そしてエタノール産生もまたより良好であった。いずれの培養物においても、キシリトールは検出されなかった。ソルビトールまたはマンニトールの存在は、キシリトールの産生を伴わないより多くのキシロース資化を可能にした。
【０１２４】
本実施例は、マンニトールが、細胞増殖の改善、キシロース資化、キシリトールの減少、およびエタノール産生の増加に対し、高濃度糖類における同濃度のソルビトールと同程度に有効であることを示す。
【０１２５】
実施例１２
酢酸塩および多様なポリオール類の存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
５つの滅菌済み１２５ｍｌ三角培養フラスコ（カタログ番号３０１８０−０３６、ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）において、約５のＯＤ６００の１０ｍｌのＺＷ６５８株の種培養物を、１００ｇ／Ｌグルコース、８０ｇ／Ｌキシロース、３ｇ／Ｌ酢酸塩、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および４ｇ／ＬのＫＨＣＯ３、ならびに１０ｍＭの次のポリオール類：エリトリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、もしくはラクチトール；または５ｍＭソルビトール＋５ｍＭマルチトール、もしくは５ｍＭソルビトール＋５ｍＭラクチトールの１つを含有する１００ｍｌの水溶液を含む各フラスコに播種した。播種後、種培養物による希釈のため、全糖濃度は約１６０ｇ／Ｌであった。初期のｐＨを４ＮのＨ３ＰＯ４溶液で５．５に調整した。混合速度を１５０ｒｐｍに設定した。発酵は３３℃で行い、そしてｐＨは制御しなかった。サンプルを、定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、エタノール、および酢酸塩を含む化合物について、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。図１９は、ＯＤ６００（Ａ）、キシロース資化（Ｂ）、および０〜３２時間の間の時間ポイントで産生されたエタノール（Ｃ）を示す。ソルビトールまたはマンニトールを伴う培養物は、これらの成分のいずれも伴わない培養物より迅速かつ良好に増殖した。３２時間後、１０ｍＭソルビトール、１０ｍＭマンニトール、５ｍＭソルビトール＋５ｍＭマルチトール、および５ｍＭソルビトール＋５ｍＭラクチトールを補充した培養物のＯＤ６００は、それぞれ７．８８、７．４０、７．６２および７．７８であった；一方では、エリトリトール、マルチトール、またはラクチトールを補充した培養物のＯＤ６００は、それぞれ５．２０、５．２０、および５．３０であった。培地中にソルビトールまたはマンニトールを伴う場合、より多くのキシロースが資化され、そしてエタノール産生もまたより良好であった。いずれの培養物においても、キシリトールは検出されなかった。ソルビトールまたはマンニトールの存在は、キシリトールの産生を伴わないより多くのキシロース資化を可能にした。
【０１２６】
本実施例は、マンニトールが、細胞増殖の改善、キシロース資化、キシリトールの減少、およびエタノール産生の増加において、酢酸塩を伴う高濃度糖類における同濃度のソルビトールと同程度に有効であることを示す。ソルビトールとより高分子量のポリオール類（マルチトールまたはラクチトール）とを組み合わせても、発酵に対する相乗的改善は示さなかった。
【０１２７】
実施例１３
多様な糖アルコール類の存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
８つの滅菌済み５０ｍｌスクリューキャップ付き遠心管（カタログ番号２１００８−１７８、ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）において、約１０のＯＤ６００の２００μｌのＺＷ６５８株グリセロールストックを、９２ｇ／Ｌグルコース、８２ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および１０ｍＭのソルビトール、アラビトール、アドニトール（リビトールとも呼ばれる）、もしくはガラクチトールか；または５０ｍＭのアラビトール、アドニトール、もしくはガラクチトールのいずれか一方を含有する２５ｍｌの水溶液を含む各フラスコに播種した。コントロールには、糖アルコールを添加しなかった。初期のｐＨを４ＮのＨ３ＰＯ４溶液で５．５に調整した。発酵は３３℃で行い、そしてｐＨは制御しなかった。サンプルを、０〜４０時間の間で定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、キシリトール、およびエタノールについて、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。増殖およびグルコース資化の結果を、それぞれ図２０Ａおよび２０Ｂに示す。キシロース資化およびエタノール産生の結果を、それぞれ図２１Ａおよび２１Ｂに示す。ソルビトールまたはガラクチトールを伴う培養物は、コントロールよりかなり迅速かつ良好に増殖した。アドニトールを伴う培養物もまた、より良好に増殖した。４０時間後、ソルビトールまたはガラクチトールを補充した培養物のＯＤ６００は、７〜８であった；アドニトールを補充した培養物のＯＤ６００は約５であった；一方、他の培養物のＯＤ６００は１未満であった。培地中にソルビトールまたはガラクチトールまたはアドニトールを伴う場合、より多くのキシロースが資化され、そしてエタノール産生もまたより良好であった。いずれの培養物においても、キシリトールは検出されなかった。ソルビトール、ガラクチトール、またはアドニトールの存在は、キシリトールの産生を伴わないより多くのキシロース資化を可能にした。
【０１２８】
本実施例は、ガラクチトールが、細胞増殖の改善、キシロース資化、キシリトールの減少、およびエタノール産生の増加に対し、高濃度糖類における同濃度のソルビトールと同程度に有効であることを示す。アドニトールは、ソルビトールほど有効ではなかった。
【０１２９】
実施例１４
多様な糖アルコール類の存在下において高濃度グルコースおよびキシロース上で増殖させた株ＺＷ６５８によるエタノール産生
６つの滅菌済み５０ｍｌスクリューキャップ付き遠心管（カタログ番号２１００８−１７８、ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）において、約１０のＯＤ６００の２００μｌのＺＷ６５８株グリセロールストックを、９２ｇ／Ｌグルコース、８２ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物（ＹＥ）、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および１０ｍＭのＤ−ソルビトール、Ｌ−ソルビトール、Ｄ−スレイトール、ミオ−イノシトール、またはキシリトールを含有する２５ｍｌの水溶液を含む各フラスコに播種した。コントロールには、糖アルコールを添加しなかった。初期のｐＨを４ＮのＨ３ＰＯ４溶液で５．５に調整した。発酵は３３℃で行い、そしてｐＨは制御しなかった。サンプルを、０〜４８時間の間で定期的に採取した。サンプルを、０．２２ミクロンフィルターを介してろ過し、そしてろ過物を、グルコース、キシロース、キシリトール、およびエタノールについて、一般的方法に記載のようにＨＰＬＣによって分析した。サンプルを、（一般的方法に記載の）培地で希釈し、そしてＯＤ６００を測定して、細胞増殖をモニターした。増殖およびグルコース資化の結果を、それぞれ図２２Ａおよび２２Ｂに示す。キシロース資化およびエタノール産生の結果を、それぞれ図２３Ａおよび２３Ｂに示す。Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルビトールを伴う培養物は、コントロールより迅速かつ良好に増殖した。４８時間後、Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルビトールで補充した培養物のＯＤ６００はそれぞれ６．２および５．２であった；一方、他の培養物のＯＤ６００は１未満であった。培地中にＤ−ソルビトールまたはＬ−ソルビトールを伴う場合、より多くのキシロースが資化され、そしてエタノール産生もまたより良好であった。いずれの培養物においても、キシリトールは検出されなかった。Ｄ−ソルビトールまたはＬ−ソルビトールの存在は、キシリトールの産生を伴わないより多くのキシロース資化を可能にした。Ｄ−ソルビトールの方がＬ−ソルビトールより有効であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010504757.tif 000029
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