(57)【要約】本発明はシアノバクテリアからバイオマテリアルを生産するための試薬および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマテリアルを生産する方法であって、
（ａ）Ｓｌｒ１１２５発現が欠損しているシアノバクテリア宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）前記シアノバクテリア宿主細胞を採取する工程、および
（ｃ）採取されたシアノバクテリア宿主細胞からバイオマテリアルを調製する工程
からなる方法。
【請求項２】
シアノバクテリア宿主細胞はＳｌｒ１１２５の発現を低減または除去するように遺伝子操作されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオマテリアルは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）およびシアノフィシンからなる群から選択されたバイオマテリアルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
シアノバクテリア宿主細胞は、シネコシスティス（Synechocystis ）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、シネココッカス（Synechococcus ）、トリコデスミウム（Trichodesmium ）、およびクロコスファエラ（Crocosphaera）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
シアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティスのＰＣＣ６８０３細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
シアノバクテリア宿主細胞はｓｌｒ１１２５遺伝子を欠失させるように遺伝子組換え操作されている、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
シアノバクテリア宿主細胞はｓｌｒ１１２５遺伝子の発現を誘導式にダウンレギュレーションするように遺伝子組換え操作されている、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
シアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティスのＰＣＣ６８０３のｓｌｒ１１２５遺伝子を欠失させるように遺伝子組換え操作されている、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
シアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティスのＰＣＣ６８０３のＳｌｒ１１２５の発現を誘導式にダウンレギュレーションするように遺伝子組換え操作されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
シアノバクテリア宿主細胞はＮＡＤ合成酵素およびＮＡＤ＋リン酸化酵素のうち少なくともいずれか一方を過剰発現するように遺伝子操作されており、培養は、ＮＡＤ合成酵素およびＮＡＤ＋リン酸化酵素のうち少なくともいずれか一方を過剰発現するのに適した条件下で組換えシアノバクテリア宿主細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法はＰＨＡを調製する工程を含み、前記シアノバクテリア宿主細胞はシアノフィシン産生が欠損している、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
シアノフィシン発現の欠損は、シアノバクテリア宿主細胞におけるシアノフィシン合成酵素の発現を低減または除去するようにシアノバクテリア宿主細胞を遺伝子組換え操作することに起因する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法はシアノフィシンを調製する工程を含み、前記シアノバクテリア宿主細胞はＰＨＡ産生が欠損している、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＨＡ発現の欠損は、シアノバクテリア宿主細胞におけるＳｌｒ１９９３の発現を低減または除去するようにシアノバクテリア宿主細胞を遺伝子組換え操作することに起因する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
シアノバクテリア宿主細胞はシアノフィシナーゼ発現が欠損している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法はＰＨＡを調製する工程を含み、前記シアノバクテリア宿主細胞はポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の産生が欠損している、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＨＢの産生の欠損は、Ｓｌｒ１９９４、Ｓｌｒ１８２９、およびＳｌｒ１８３０のうち１つ以上の発現を低減または除去するように遺伝子組換え操作することに起因する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
シアノバクテリア宿主細胞はＳｌｒ１９９４の発現を低減または除去するように遺伝子操作されており、かつ前記方法はアセトアセチルＣｏＡを生産する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
シアノバクテリア宿主細胞は、Ｓｌｒ１８２９およびＳｌｒ１８３０のうち一方または両方の発現を低減または除去するように遺伝子操作されており、かつ前記方法はポリ（３‐ヒドロキシブチリルＣｏＡ）を生産する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
単離された組換え核酸であって、
（ａ）誘導型のシアノバクテリアプロモータを含む第１の核酸と、
（ｂ）第１の核酸に作動可能なように連結された第２の核酸とを含み、第２の核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択されたポリペプチドのアミノ酸配列をコードする標的核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項２１】
抑制性の核酸はアンチセンス核酸を含む、請求項２０に記載の単離核酸。
【請求項２２】
標的核酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択される、請求項２０に記載の単離核酸。
【請求項２３】
誘導型のシアノバクテリアプロモータは配列番号９を含む、請求項２０に記載の単離核酸。
【請求項２４】
配列番号１０、１１、および１２からなる群から選択されたＮＡＤ合成酵素タンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む、請求項２０に記載の単離核酸。
【請求項２５】
第３の核酸は、配列番号１３、１４、または１５の、ＮＡＤ合成酵素をコードする配列で構成される、請求項２４に記載の単離核酸。
【請求項２６】
請求項２０に記載の単離された組換え核酸を含む発現ベクター。
【請求項２７】
請求項１に記載の単離された組換え核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項２８】
宿主細胞はシアノバクテリア宿主細胞である、請求項２７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２９】
シアノバクテリアは、シネコシスティス（Synechocystis ）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、シネココッカス（Synechococcus ）、トリコデスミウム（Trichodesmium ）、およびクロコスファエラ（Crocosphaera）からなる群から選択される、請求項２８に記載の組換えシアノバクテリア宿主細胞。
【請求項３０】
組換えシアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティスのＰＣＣ６８０３細胞である、請求項２８に記載の組換えシアノバクテリア宿主細胞。
【請求項３１】
組換え宿主細胞は、
（ａ）シアノフィシン産生、および
（ｂ）ポリ‐β‐ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生
のうち一方が欠損している、請求項２８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３２】
組換え宿主細胞はシアノフィシン発現が欠損しており、シアノフィシン発現の欠損は、シアノバクテリアにおけるシアノフィシン合成酵素遺伝子（配列番号２２）の欠失に起因する、請求項２８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３３】
組換え宿主細胞はシアノフィシン発現が欠損しており、かつ組換え宿主はシアノフィシン合成酵素のアミノ酸配列（配列番号２３）をコードする標的核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードする核酸に作動可能なように連結されたプロモータ配列を含む核酸構築物を有する発現ベクターをさらに含む、請求項２８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３５】
組換え宿主細胞はＰＨＡ発現が欠損しており、ＰＨＡ発現の欠損は、シアノバクテリアにおけるｓｌｒ１９９３遺伝子（配列番号２４）の欠失に起因する、請求項２８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３６】
組換え宿主細胞はシアノフィシン発現が欠損しており、かつ組換え宿主は配列番号２５のアミノ酸配列をコードする標的核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードする核酸に作動可能なように連結されたプロモータ配列を含む核酸構築物を有する発現ベクターをさらに含む、請求項２８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３７】
発現が誘導型プロモータの制御下にある第２の抑制性の核酸をさらに含み、第２の抑制性の核酸は配列番号２６（シアノフィシナーゼ）のアミノ酸配列をコードする標的核酸に相補的である、請求項３５または３６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３８】
第２の抑制性の核酸は、配列番号２７のうち少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３９】
本発明の組換えシアノバクテリアはさらに、
Ｓｌｒ１９９４（配列番号２８）、
Ｓｌｒ１８２９（配列番号２９）、および
Ｓｌｒ１８３０（配列番号３０）
のうち１つ以上の発現が欠損するようになされる、請求項２８に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４０】
組換えシアノバクテリア宿主細胞であって、
（ａ）Ｓｌｒ１１２５発現の欠損と；
（ｂ）遺伝子組換えにより生じた以下の表現型、すなわち
（ｉ）シアノフィシン産生の欠損；
（ｉｉ）ポリ‐β‐ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生の欠損；
（ｉｉｉ）ＮＡＤ合成酵素の過剰発現；
（ｉｖ）ＮＡＤ＋リン酸化酵素の過剰発現；
（ｖ）シアノフィシン合成酵素発現の欠損；
（ｖｉ）Ｓｌｒ１９９３発現の欠損；
（ｖｉｉ）シアノフィシナーゼ発現の欠損；
（ｖｉｉｉ）ＰＨＢ産生の欠損；
（ｉｘ）Ｓｌｒ１９９４発現の欠損；
（ｘ）Ｓｌｒ１８２９発現の欠損；および
（ｘｉ）Ｓｌｒ１８３０発現の欠損
のうち１つ以上とを有する組換え宿主細胞。
【請求項４１】
前記組換えシアノバクテリア宿主細胞は、Ｓｌｒ１１２５発現を低減または除去するように遺伝子操作されている、請求項４０に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４２】
シアノバクテリアは、シネコシスティス、アルスロスピラ・マキシマ、シネココッカス、トリコデスミウム、およびクロコスファエラからなる群から選択される、請求項４０に記載の組換えシアノバクテリア宿主細胞。
【請求項４３】
前記組換えシアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティスのＰＣＣ６８０３細胞である、請求項４０に記載の組換えシアノバクテリア宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアノバクテリアによるバイオプラスチックおよびバイオマテリアルの生産のための試薬および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
相互参照
本願は、２００７年６月２７日に出願された米国特許出願シリアル番号第６０／９３７，４００号の優先権を主張するものであり、前記出願は参照により全体が本願に組み込まれる。
【０００３】
今後数十年の間に、再生可能エネルギーは、ポリマーなどの石油化学製品を基にした工業製品に徐々に取って代わると予想される。生体高分子からのプラスチックの生産は、石油由来の再生不能物質が再生可能資源に置き換わり、その結果として確実な（国内）供給、農村共同体での雇用、持続可能な生産、温室効果ガス産出量の低下、および価格競争力がもたらされる可能性を提示している。
【０００４】
地球環境問題意識の高まりに応じて、ＰＨＡ（ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ））は、非生物分解性のポリマーの潜在的代替品として多大な関心を集めている。現在の石油および天然ガスの価格上昇はプラスチック市場に反映されており、再生可能なバイオプラスチックの競争力を高めている。しかしながら、細菌発酵に基づいたバイオプラスチック生産の原料価格はさらに上昇している。
【０００５】
いくつかの報告によれば、細菌発酵によるバイオプラスチックの生産原価は、特に、肥料、殺虫剤、輸送、および工程エネルギーの生成のために消費されるエネルギーおよび材料を考慮に入れると、原料および化石燃料エネルギーを必要とせず環境からＣＯ２を利用する光合成で生産されるプラスチックの生産原価よりも高い。したがって、独自の固定炭素供給源を生成する独立栄養性のシアノバクテリアから作られる生体高分子は、発酵による生体高分子の生産よりも絶えず大きい利点を有すると思われる。
【０００６】
１つの態様では、本発明はバイオマテリアルを生産する方法を提供し、前記方法は、
（ａ）Ｓｌｒ１１２５発現が欠損しているシアノバクテリア宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）前記シアノバクテリア宿主細胞を採取する工程、および
（ｃ）採取されたシアノバクテリア宿主細胞からバイオマテリアルを調製する工程
からなる。
【０００７】
本発明の方法は、例えば、既知のシアノバクテリア宿主細胞を使用しても従来は不可能であった大量のバイオマテリアルを生産するために使用することができる。１つの実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞はＳｌｒ１１２５の発現を低減または除去するように遺伝子操作されている。別の実施形態では、バイオマテリアルは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）およびシアノフィシンからなる群から選択されたバイオマテリアルを含む。さらなる実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞は、シネコシスティス（Synechocystis ）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、シネココッカス（Synechococcus ）、トリコデスミウム（Trichodesmium ）、およびクロコスファエラ（Crocosphaera）からなる群から選択される。別の実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティス属細菌ＰＣＣ６８０３細胞である。様々なさらなる実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞はｓｌｒ１１２５遺伝子を欠失させるように遺伝子組換え操作されており、シアノバクテリア宿主細胞はＮＡＤ合成酵素またはＮＡＤ＋リン酸化酵素のうち少なくともいずれか一方を過剰発現するように遺伝子操作されており；シアノバクテリア宿主細胞はシアノフィシン産生が欠損しており；シアノバクテリア宿主はＳｌｒ１９９３発現が欠損しており；シアノバクテリア宿主細胞はシアノフィシナーゼ（cyanophycinase）発現が欠損しており、かつ、シアノバクテリア宿主細胞はＳｌｒ１９９４、Ｓｌｒ１８２９およびＳｌｒ１８３０のうち１つ以上の発現を低減または除去するように遺伝子組換えされる。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、単離された組換え核酸であって、
（ａ）誘導型のシアノバクテリアプロモータを含む第１の核酸と、
（ｂ）第１の核酸に作動可能なように連結された第２の核酸とを含み、第２の核酸は配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されたポリペプチドのアミノ酸配列をコードする標的核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードすることを特徴とする、核酸を含む。本発明の単離核酸は、例えば本発明の方法によってバイオマテリアルを生産する際に有用な、例えばシアノバクテリア細胞におけるＳｌｒ１１２５発現のダウンレギュレーションのために、使用することができる。１つの実施形態では、抑制性の核酸はアンチセンス核酸を含む。別の実施形態では、標的核酸配列は配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される。さらなる実施形態では、誘導型のシアノバクテリアプロモータは配列番号９を含む。さらなる実施形態では、単離核酸は、配列番号１０、１１および１２からなる群から選択されたＮＡＤ合成酵素タンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む。別の実施形態では、第３の核酸は、配列番号１３、１４、または１５の、ＮＡＤ合成酵素をコードする配列で構成される。別の実施形態では、本発明の単離核酸は、複製および発現のためのベクター中に含まれて提供される。
【０００９】
別の態様では、本発明は、本発明による単離核酸または発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、例えば、本発明の単離核酸を大量に生産するために、本発明の方法を実行するために、使用することができる。１つの実施形態では、宿主細胞はシアノバクテリア宿主細胞であり、別の実施形態では、組換え宿主細胞は細菌宿主細胞である。さらなる実施形態では、組換えシアノバクテリア宿主細胞は、シネコシスティス（Synechocystis ）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、シネココッカス（Synechococcus ）、トリコデスミウム（Trichodesmium ）、およびクロコスファエラ（Crocosphaera）からなる群から選択される。別の実施形態では、組換えシアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティスのＰＣＣ６８０３細胞である。さらなる実施形態では、組換え核酸はシアノバクテリアゲノムの染色体に組み込まれる。様々なさらなる実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞はｓｌｒ１１２５遺伝子を欠失させるように遺伝子組換え操作されており；シアノバクテリア宿主細胞はＮＡＤ合成酵素またはＮＡＤ＋リン酸化酵素のうち少なくともいずれか一方を過剰発現するように遺伝子操作されており；シアノバクテリア宿主細胞はシアノフィシン産生が欠損しており；シアノバクテリア宿主はＳｌｒ１９９３の発現が欠損しており；シアノバクテリア宿主細胞はシアノフィシナーゼ発現が欠損しており、かつ、シアノバクテリア宿主細胞はＳｌｒ１９９４、Ｓｌｒ１８２９およびＳｌｒ１８３０のうち１つ以上の発現を低減または除去するように遺伝子組換え操作される。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、組換えシアノバクテリア宿主細胞であって、
（ａ）Ｓｌｒ１１２５発現の欠損と；
（ｂ）遺伝子組換えにより生じた以下の表現型、すなわち
（ｉ）シアノフィシン産生の欠損；
（ｉｉ）ポリ‐β‐ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生の欠損；
（ｉｉｉ）ＮＡＤ合成酵素の過剰発現；
（ｉｖ）ＮＡＤ＋リン酸化酵素の過剰発現；
（ｖ）シアノフィシン合成酵素発現の欠損；
（ｖｉ）Ｓｌｒ１９９３発現の欠損；
（ｖｉｉ）シアノフィシナーゼ発現の欠損；
（ｖｉｉｉ）ＰＨＢ産生の欠損；
（ｉｘ）Ｓｌｒ１９９４発現の欠損；
（ｘ）Ｓｌｒ１８２９発現の欠損；および
（ｘｉ）Ｓｌｒ１８３０発現の欠損
のうち１つ以上とを有する宿主細胞を提供する。
【００１１】
そのような宿主細胞は、例えば、本発明の方法を実行するために使用することができる。１つの実施形態では、組換えシアノバクテリア宿主細胞はＳｌｒ１１２５の発現を低減または除去するように遺伝子操作されている。別の実施形態では、シアノバクテリアは、シネコシスティス（Synechocystis ）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、シネココッカス（Synechococcus ）、トリコデスミウム（Trichodesmium ）、およびクロコスファエラ（Crocosphaera）からなる群から選択される。さらなる実施形態では、組換えシアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティス属細菌のＰＣＣ６８０３細胞である。
【００１２】
本発明のこれらの態様および実施形態について以下により詳細に述べるが、各々の態様および実施形態は、本明細書の文脈がそうでないことを明白に示している場合を除き、組み合わせることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】シネコシスティスにおけるＰＨＢ生合成の流れ図。
【図２】例えばＰＨＡ生産用の安定にトランスフェクションされたシアノバクテリア菌株を作出するために使用可能な、例示の組換え核酸構築物を示す概略図。
【図３】安定なシアノフィシン産生シアノバクテリア菌株の作出に有効な組換え核酸の概略図。
【図４】３‐ヒドロキシブチレートの生産に適した組換え核酸の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本願においては、別途記載のない限り、利用される技法は、いくつかの良く知られた参照文献すなわち「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（Sambrookら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press））、「Gene Expression Technology」（D. Goeddel編、Methods in Enzymology第１８５巻、１９９１年、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のアカデミックプレス（Academic Press））、Methods in Enzymologyの「Guide to Protein Purification」（M.P. Deutshcer編、（１９９０）アカデミックプレス社（Academic Press, Inc.））；「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」（Innisら、１９９０年、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のアカデミックプレス）、「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」第２版（R.I. Freshney、１９８７年、ニューヨーク州ニューヨーク所在のリス・インコーポレイテッド（Liss, Inc.））、および「Gene Transfer and Expression Protocols」、ｐ．１０９〜１２８、E.J. Murray編、米国ニュージャージー州クリフトン所在のヒューマナ出版社（The Humana Press Inc.））のうちいずれかにおいて見出すことができる。
【００１５】
１つの態様では、本発明は組換え核酸を提供し、前記組換え核酸は、
（ａ）誘導型のシアノバクテリアプロモータを含む第１の核酸と、
（ｂ）第１の核酸に作動可能なように連結された第２の核酸とを含み、第２の核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択された１以上のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする標的核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードすることを特徴とする。
【００１６】
本発明のこの第１の態様の組換え核酸を、例えば、Ｓｌｒ１１２５（またはそのオーソログ）の産生を制御するために組換えシアノバクテリアを生産するための構築物として使用することができる。Ｓｌｒ１１２５タンパク質は、ミクソキサントフィルの生合成に関与するカロチノイドグリコシルトランスフェラーゼであり、本発明の組換え核酸は、例えば、少なくとも部分的には、Ｓｌｒ１１２５のダウンレギュレーションによる、カロチノイド生合成／分解経路の中断に起因する、顆粒形成および生体高分子産生への細胞の変換の誘導に基づいて、シアノバクテリア中で従来可能であったよりも大量のバイオプラスチック（例えば以下に議論されるようなＰＨＢを含むポリヒドロキシアルカノエート（「ＰＨＡ」）など）およびシアノフィシンを生産するために使用することができる。
【００１７】
配列番号２はシネコシスティス属細菌ＰＣＣ６８０３のＳｌｒ１１２５のアミノ酸配列である。繊維状シアノバクテリアであるトリコデスミウム・エリトラウム（Trichodesmium erythraeum）ＩＭＳ１０１は、アミノ酸レベルで同一性５５％のＳｌｒ１１２５オーソログ（配列番号４）を有し、クロコスファエラ・ワストニイ（Crocosphaera watsonii）ＷＨ８５０１（かつてはシネコシスティス属細菌ＷＨ８５０１として知られていた）のＳｌｒ１１２５は、２つのオープンリーディングフレーム（ＺＰ＿００１７７８３１（配列番号６）およびＺＰ＿００１７４１０２（配列番号８））に分割されているようである。
【００１８】
したがって、１つ以上のＳｌｒ１１２５オーソログをコードする核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードする第２の核酸を組み入れた組換え核酸も、シアノバクテリア中で、従来可能であったよりも大量のバイオプラスチックを生産するために使用することができる。
【００１９】
本明細書で使用されるように、「組換え核酸」とは、ゲノム配列中またはｃＤＮＡ配列中において正常時にその周囲にある核酸配列から取り出されているものである。そのような組換え核酸配列は、抑制性の核酸の発現を促進するのに有用な追加の配列、またはその他任意の有用なシグナルを含むことができる。
【００２０】
用語「作動可能なように連結された」とは、単一の組換え核酸における第１および第２の核酸のつながりであって、第２の核酸の発現が第１の核酸によって活性化されるようなつながりを指す。したがって、第１の核酸が第２の核酸の発現に影響を及ぼすことができる場合に、第１の核酸は第２の核酸に作動可能なように連結されている。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、用語「発現」とは、本発明の核酸フラグメントに由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写を指す。発現とはまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指す場合もある。
【００２２】
用語「抑制性の核酸」とは、前記核酸の標的核酸配列の発現（転写または翻訳）、または発現産物（ＲＮＡまたはタンパク質）の蓄積を阻害することができる任意の種類の核酸を意味する。そのような抑制性の核酸には、限定するものではないが、アンチセンス核酸、低分子干渉核酸、リボザイム、および標的核酸に結合するアプタマーが挙げられる。
【００２３】
「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的の一次転写産物またはｍＲＮＡの全体または一部に相補的なＲＮＡ転写物、および標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列に対するものであってよい。「機能的なＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されないが細胞プロセスに対して影響を有する他のＲＮＡを指す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、したがって細胞により翻訳されてタンパク質を生じることができるＲＮＡ転写物を指す。
【００２４】
「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「共抑制」とは、同一またはほぼ同様の外来または内因性の遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００２５】
用語「相補的」とは、互いにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。抑制性の核酸は、標的核酸の発現産物の発現または蓄積を阻害するのに十分な大きさの領域にわたって、標的核酸に相補的である。１つの実施形態では、抑制性の核酸は、標的核酸のうち少なくとも２０個の連続したヌクレオチドに相補的であり、様々なさらなる実施形態では、抑制性の核酸は、標的核酸のうち少なくとも３０個、５０個、１００個、２５０個、もしくは５００個の連続したヌクレオチドに相補的であるか、または標的核酸の全核酸配列に相補的である。
【００２６】
「プロモータ」とは、第２の核酸の発現を制御することができるＤＮＡ塩基配列を指す。一般に、第２の核酸は誘導型プロモータの３’側に配置されるが、第１および第２の核酸の作動可能な連結を可能にする任意の配置構成を使用することができる。「誘導型」とは、そのプロモータが第２の核酸の発現を構成的には活性化しないが調節された発現を可能にすることを意味する。誘導型プロモータはその全体が天然の遺伝子に由来するものでもよいし、自然界で見つかった異なるプロモータに由来する異なる要素で構成されてもよいし、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含むものでもよい。当然ながら、ほとんどの場合は調節配列の正確な境界は完全には定義されていないので、様々な長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモータ活性を有する場合がある。
【００２７】
用語「シアノバクテリアプロモータ」とは、前記プロモータがシアノバクテリア（例えばシネコシスティス、トリコデスミウム、およびクロコスファエラ）の中で第２の核酸の発現を導くことができることを意味し、シアノバクテリアに由来するプロモータに限定されない。
【００２８】
この第１の態様の１つの実施形態では、標的核酸配列は、それぞれ配列番号２、４、６および８をコードするＤＮＡである配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７から選択された核酸を含むかまたは前記核酸で構成されている。
【００２９】
当業者には当然のことであるが、抑制性の核酸は、標的核酸配列との十分な同一性を有する限りは様々なシアノバクテリア細菌種において使用することができる。好ましい実施形態では、抑制性の核酸の由来となった菌株が使用される。原核生物では、遺伝子はその転写の間に翻訳されるので、ＲＮＡは通常、一方では転写酵素と結合し、他方では翻訳のためにリボソームが結合している。したがって、さらなる実施形態では、完全長のアンチセンスＲＮＡ分子が使用されて、遊離状態のＲＮＡ分子への完全な結合だけでなく、転写‐翻訳過程においてＲＮＡ分子が少しでも露出した部分に結合することができるようになっている。これらの実施形態は、最大限の抑制特異性をも確実にする。
【００３０】
第１の核酸は誘導型シアノバクテリアプロモータを含むかまたは前記プロモータで構成されている。本明細書中で使用されるように、「誘導型」とは、プロモータからの抑制性の核酸の発現が調節可能であること、したがって前記発現は、前記プロモータが機能する場である細胞に適切な刺激を加えることによって、所望の通りに増大または減少させることができることを意味する。シアノバクテリアにおいて複製可能な任意の誘導型プロモータを使用することができるが、シネコシスティス、アルスロスピラ・マキシマ、トリコデスミウムおよびクロコスファエラからなる群から選択されたシアノバクテリアにおいて誘導可能なものが好ましい。１つの実施形態では、誘導型シアノバクテリアプロモータは、配列番号９のプラストシアニンプロモータ（銅によって誘導可能）、またはその機能的な等価物を含む。他の実施形態では、誘導型シアノバクテリアプロモータはＵＳ２００４０１５７３３１またはＵＳ２００２０１６４７０６に開示されているような誘導型プロモータを含むかまたは前記プロモータで構成される。
【００３１】
本発明のこの態様の組換え核酸は、所与の適用に応じて所望されるさらなる機能的構成成分を含むことができる。例えば、構築物は、対象とする発現産物をコードする１つ以上の追加の核酸を含むことが可能であり、そのような追加の核酸は、誘導型プロモータに作動可能なように連結されてもよいし、組換え核酸の中に存在する１以上の別のプロモータに作動可能なように連結されてもよい。１つのそのような実施形態では、組換え核酸は、配列番号１０（シネコシスティス）、１１（クロコスファエラ・ワストニイ  ＷＨ８５０１）、または１２（トリコデスミウム・エリトラウム  ＩＭＳ１０１）のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列で構成されるＮＡＤ＋合成酵素タンパク質（Ｓｌｒ１６９１）をコードする第３の核酸をさらに含む。本発明のこの第１の態様のさらなる実施形態では、第３の核酸は、配列番号１３（シネコシスティス）、１４（クロコスファエラ・ワストニイ  ＷＨ８５０１）、または１５（トリコデスミウム・エリトラウム  ＩＭＳ１０１）のＮＡＤ合成酵素コード配列を含むかまたは前記配列で構成される。
【００３２】
本発明のこの第１の態様の別の実施形態では、組換え核酸は、ｓｌｒ１６９１とともに、配列番号１６（シネコシスティス属細菌ＰＣＣ６８０３）、１８（クロコスファエラ・ワストニイ  ＷＨ８５０１）、または２０（トリコデスミウム・エリトラウム  ＩＭＳ１０１）のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列で構成される推定上のＮＡＤ＋リン酸化酵素Ｓｌｌ１４１５をコードする第４の核酸をさらに含む。さらなる実施形態では、第４の核酸は、配列番号１７（シネコシスティス属細菌ＰＣＣ６８０３）、１９（クロコスファエラ・ワストニイ  ＷＨ８５０１）、または２１（トリコデスミウム・エリトラウム  ＩＭＳ１０１）のＮＡＤ＋リン酸化酵素コード配列を含むかまたは前記配列で構成される。
【００３３】
ＰＨＡ生合成は補因子としてＮＡＤＰＨを必要とし、したがってＮＡＤ生合成の増加がＰＨＡ産生を増強することも考えられる。したがって、本発明は、ＮＡＤ合成酵素またはＮＡＤ＋リン酸化酵素のうち少なくともいずれか一方をＰＨＡ生合成の誘導と協調して過剰発現させることにより、ＰＨＡ生合成に必要な補因子の利用可能性を増大させるために、ＮＡＤ合成酵素またはＮＡＤ＋リン酸化酵素のうち少なくともいずれか一方のコピーを誘導型プロモータ（例えば銅制御型プロモータ）の前に導入することが可能なシアノバクテリア組換え体を提供する。
【００３４】
本発明の第１の態様の核酸は、シアノバクテリアゲノムにおける二重の相同組換えを促進するために「組換え用配列（recombination sequence）」をさらに含むことができる。本明細書中で使用されるように、「二重の相同組換え」とは、２つのＤＮＡ分子の間のヌクレオチド配列が同一の２つの部位におけるＤＮＡフラグメントの交換を意味する。したがって、「組換え用配列」は、ゲノム内への組換えを行うべき領域に隣接する２つの核酸を含み、前記組換え用配列は、本発明の組換え核酸を挿入するための標的とされるシアノバクテリアゲノム中の配列と同一である。例えば、Mes and Stal, Gene. 2005 Feb 14;346:163-71；およびMes and Doeleman,. J Bacteriol. 2006 Oct;188(20):7176-85を参照されたい。１つの実施形態では、挿入のためのシアノバクテリアゲノム標的の領域は、非タンパク質コード領域であってよいが、他の実施形態では、シアノバクテリアゲノムの標的領域を、分断すべきタンパク質コード遺伝子とすることにより、その分断されるタンパク質コード遺伝子を発現できないが本発明の組換え核酸を発現する突然変異シアノバクテリアを生成させる能力が提供される。これらの実施形態のさらなる実施例を以下に提供する。
【００３５】
この第１の態様の任意の実施形態の組換え配列は、選択された生物における複製を促進するための配列をさらに含むことができる。そのような配列は当分野において良く知られている。例えば、そのような複製能力を備えた市販のベクター（プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を使用することが可能であり、本発明の組換え核酸を前記ベクター内にクローニングすることができる。そのような複製能力を有するベクターは、例えば、大量の本発明の組換え核酸を生産するのに有用である。選択される生物は、組換え核酸の複製に有用であろう任意の生物であってよく、例えば大腸菌が挙げられるがこれに限定されない。
【００３６】
本発明の第１の態様の組換え核酸、および本発明の第１の態様の組換え核酸を含むベクターは、例えばベクターを発現している宿主細胞の選択を容易にするために、選択可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む場合もある。前記組換え核酸およびベクターは、以下により詳細に議論するような他のプロモータ配列および他のコード核酸またはポリペプチド、ならびに適切な制御シグナル（すなわちリーダーシグナル、転写シグナルおよび翻訳停止シグナル）、および組換え核酸の特定領域に、ライゲーションを容易にする特定の制限部位を導入するためのポリリンカーを包含することができる。
【００３７】
本発明の第１の態様のこれらの実施形態は、本明細書の文脈からそうでないことが明白に示される場合を除き、組み合わせることが可能である。
第２の態様では、本発明は、（ａ）本発明の第１の態様の組換え核酸が染色体に組み込まれているか、（ｂ）本発明の第１の態様の組換え核酸を含む複製能力を有するベクターでトランスフェクションされているか、のうち少なくともいずれか一方である組換え宿主細胞を提供する。そのような組換え宿主細胞は原核生物でも真核生物でもよいが、原核生物の宿主細胞が好ましい。例として、例えば大腸菌での発現を可能にするために構築された組換え発現ベクターでトランスフェクションされた組換え宿主細胞を、本発明の組換え発現ベクターおよび組換え核酸の大量生産に使用することができる。二重の相同組換えについては上記に議論されている。組換えシアノバクテリア宿主細胞、例えば、限定するものではないが、クロロコックム目（例えばシネコシスティスおよびシネココッカス（Synechococcus ）、好ましくはシネコシスティス属細菌ＰＣＣ６８０３およびシネココッカスＭＡ１９）、トリコデスミウム、およびクロコスファエラからなる群から選択されるシアノバクテリア、ならびに以下の実施例において開示する特定の菌株を、例えば、以下により詳細に議論するようにして大量のバイオプラスチックを生産するために使用することができる。原核細胞および真核細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、当分野で既知の任意の技術、例えば、限定するものではないが、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在型、ＤＥＡＥデキストラン介在型、ポリカチオン介在型、もしくはウイルス介在型のトランスフェクションによって行うことができる（例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（Sambrookら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press））；「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」第２版（R.I. Freshney、１９８７年、ニューヨーク州ニューヨーク所在のリス・インコーポレイテッド（Liss, Inc.））を参照されたい）。組換えシアノバクテリア宿主細胞を生産するための二重の相同組換えについては上記に議論されているが、Koksharova and Wolk, Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Feb;58(2): 123-37、およびGolden, Methods Enzymol. 1988;167:714-27も参照されたい。
【００３８】
本発明の第２の態様の組換えシアノバクテリアは大量のＰＨＡおよびシアノフィシンを産生する。場合によっては、例えば対象とする産物の単離を容易にするために、上記産物のうち一方のみを大量に生産することが望ましいかもしれない。これは、本発明の第２の態様の組換えシアノバクテリアを、上記２つの主要産物のうち一方のみを産生するようにさらに改変することにより、成し遂げることができる。したがって、上記実施形態のうちいずれかについての様々なさらなる実施形態では、本発明の第２の態様の組換えシアノバクテリア細胞はさらに、
（ａ）シアノフィシン発現、および
（ｂ）ポリ‐β‐ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）発現
のうちの一方が欠損していてもよい。
【００３９】
したがって、本発明の第２の態様の、一組のさらなる実施形態においては、本発明による組換えシアノバクテリア宿主細胞はさらにシアノフィシンの発現が欠損している。本発明の第２の態様の、別の一組のさらなる実施形態においては、いずれの組換え宿主細胞もさらにＰＨＡ発現が欠損している。本明細書中で使用されるように、「ＰＨＡ」（本明細書中では「バイオプラスチック」とも呼ばれ、生体起源のポリマーである）には、操作されているシアノバクテリア中の任意のＰＨＡ（例えば３‐ヒドロキシブチリルＣｏＡおよびポリ（３‐ハイドロキシブチレート）（「ＰＨＢ」）が挙げられるがこれらに限定されない）が含まれる。
【００４０】
列挙した欠損を作出するための任意のメカニズム、例えば、限定するものではないが、二重の相同組換えを使用する遺伝子ノックアウト、およびシアノフィシン発現に関与する遺伝子（例えば、限定するものではないがシアノフィシン合成酵素）またはＰＨＡ発現に関与する遺伝子（例えば、限定するものではないがＰＨＡ合成酵素）（典型的な遺伝子は以下に議論されている）の発現産物に相補的な抑制性の核酸に作動可能なように連結されたプロモータを備えた組換え核酸の構築物を使用することが可能である。抑制性の核酸が使用される場合、作動可能なように連結されるプロモータは構成的プロモータでも誘導型プロモータでもよく、いずれの場合も、組換え核酸は本発明の第１の態様の組換え核酸とともに単一の構築物として連結されてもよいし、本発明の第１の態様の組換え核酸とは分離した組換え核酸として構築されてもよい。
【００４１】
１つの実施形態では、本発明の第２の態様の組換え宿主細胞はシアノフィシン発現が欠損しており、この菌株はＰＨＡの生産に特に有用である。別の実施形態では、シアノフィシン発現の欠損は、前記シアノバクテリアにおけるシネコシスティス由来のシアノフィシン合成酵素遺伝子（配列番号２２）の欠損に起因する。これらの実施形態の実施例は以下に提供される。
【００４２】
別例として、本発明の第２の態様の組換え宿主細胞は、シネコシスティスのシアノフィシン合成酵素（配列番号２３）（Ｓｌｒ２００２）のアミノ酸配列をコードする標的核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードする核酸に作動可能なように連結されたプロモータ配列を含む核酸構築物を有する発現ベクターをさらに含む。さらなる実施形態では、抑制性の核酸は、配列番号２２（ｓｌｒ２００２）の核酸配列のうち少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス転写物である。様々なさらなる実施形態では、アンチセンス転写物は、配列番号２２のうち少なくとも連続した３０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、または全核酸配列を含む。好ましい実施形態では、アンチセンス転写物をコードする核酸は、シアノバクテリアの誘導型プロモータに作動可能なように連結される。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の第２の態様の組換えシアノバクテリア細胞はＰＨＡ発現が欠損しており、ＰＨＡ発現の欠損は、ｓｌｒ１９９３遺伝子（配列番号２４；シネコシスティス由来）の欠失に起因する。この実施形態は、シアノフィシンの生産に特に有用である。この実施形態の実施例は以下に提供される。別例として、組換え宿主細胞は、配列番号２５（Ｓｌｒ１９９３）のアミノ酸配列をコードする標的核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードする核酸に作動可能なように連結されたプロモータ配列を含む核酸構築物を有する発現ベクターをさらに含む。さらなる実施形態では、抑制性の核酸は、配列番号２４の核酸配列のうち少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス転写物である。様々なさらなる実施形態では、アンチセンス転写物は、配列番号２４のうち少なくとも連続した３０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、または全核酸配列を含む。好ましい実施形態では、前記アンチセンス転写物をコードする核酸は、上記に議論されたプラストシアニンプロモータのようなシアノバクテリアの誘導型プロモータに作動可能なように連結される。
【００４４】
ｓｌｒ１１２５突然変異およびＰＨＡ欠損突然変異が組み合わさっている宿主細胞は、ＰＨＡが十分に発現されないので、例えばシアノフィシンの生産／単離に使用することができる。さらなる実施形態では、これらの宿主細胞は、第２の抑制性の核酸であってその発現が誘導型プロモータの制御下にあり、シアノフィシン顆粒（cyanophycin granule）を分解するシアノフィシナーゼ（Ｓｌｒ２００１；シネコシスティス由来の配列番号２６を参照）をコードする標的核酸に相補的である第２の抑制性の核酸をさらに含んでもよい。この実施形態では、シアノフィシナーゼを標的とする第２の抑制性の核酸、およびｓｌｒ１１２５を標的とする抑制性の核酸が、いずれも同じ誘導型プロモータの制御下にあることが好ましい。第２の抑制性の核酸は、配列番号２７の核酸配列のうち少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス転写物であってもよい。様々なさらなる実施形態では、アンチセンス転写物は、配列番号２７のうち少なくとも連続した３０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、または全核酸配列を含む。別例の実施形態では、シアノフィシナーゼの欠損は、ｓｌｒ２００１遺伝子（配列番号２７）またはそのオーソログの欠失に起因する。
【００４５】
シネコシスティスにおけるＰＨＢ経路
ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）は、シアノバクテリアを含む多くの細菌によって産生される細胞内貯蔵物質である。シネコシスティスでは、アセチルＣｏＡからＰＨＢへの変換には３つの酵素すなわち：β‐ケトチオラーゼ（Ｓｌｒ１９９３）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（Ｓｌｒ１９９４）およびＰＨＢポリメラーゼ（Ｓｌｒ１８２９およびＳｌｒ１８３０；これらの２つのＯＲＦはＰＨＢヘテロダイマーを形成する２つのポリペプチドをコードし、ＰＨＢポリメラーゼ活性を完全に除去するには一方または両方の欠如で十分である）が関与する。２つのアセチルＣｏＡ基がβ‐ケトチオラーゼによって縮合されてアセトアセチルＣｏＡを形成する。その後、アセトアセチルＣｏＡはＮＡＤＰ特異的レダクターゼによって還元されて、ＰＨＢポリメラーゼの基質であるＤ（−）‐β‐ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成する。
【００４６】
さらなる実施形態では、本発明の第２の態様の組換えシアノバクテリアを、他のＰＨＡ（ＰＨＢなど）生合成経路の遺伝子の発現が欠損して、その結果所望のＰＨＡ経路最終生成物が生じる状態にすることができる。これらの実施形態を、好ましくはシアノフィシン発現が阻害される実施形態と組み合わせて、その結果所望のＰＨＡを産生する組換えシアノバクテリアを得ることができる。シネコシスティスにおけるＰＨＢ生合成の流れ図は図１に提示されている。
【００４７】
このように、様々なさらなる実施形態では、本発明の第２の態様の組換えシアノバクテリアはさらに、
Ｓｌｒ１９９４（配列番号２８）、
Ｓｌｒ１８２９（配列番号２９）、および
Ｓｌｒ１８３０（配列番号３０）
のうち１つ以上の発現が欠損するようになされる。（Taroncher-Oldenburg et al, Appl Environ Microbiol. 2000 Oct;66(10):4440-8; Hein et al., Arch Microbiol. 1998 Sep;170(3):162-70）
ｓｌｒ１９９４発現が欠損するようになされた細胞は、例えば、一例においては他の細菌が他の所望の化学物質を産生するための供給原料として有用なアセトアセチルＣｏＡを生産するために使用することが可能であり、ｓｌｒ１８２９およびｓｌｒ１８３０のうち一方または両方が欠損するようになされたものは、例えば、他の細菌のための供給原料として、または生物燃料として直接使用するために有益な３‐ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは３‐ヒドロキシブチリルモノマーのうち少なくともいずれか一方を生産するために使用可能なポリ（３‐ヒドロキシブチリルＣｏＡ）を生産するために使用することができる。
【００４８】
１つの実施形態では、発現の欠損は、シアノバクテリアにおける関連遺伝子（配列番号３１、３２、および／または３３）の欠失に起因する。この実施形態の実施例は以下に提供される。別例として、本発明の第２の態様の組換えシアノバクテリアは、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３０のうち１つ以上のアミノ酸配列をコードする標的核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードする核酸に作動可能なように連結されたプロモータ配列を含む核酸構築物を有する発現ベクターをさらに含む。さらなる実施形態では、抑制性の核酸は、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３のうち１つ以上の核酸配列のうち少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス転写物である。様々なさらなる実施形態では、アンチセンス転写物は、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３３のうち少なくとも連続した３０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、または全核酸配列を含む。好ましい実施形態では、アンチセンス転写物をコードする核酸は、上記に議論されたプラストシアニンプロモータのようなシアノバクテリアの誘導型プロモータに作動可能なように連結される。
【００４９】
別例の実施形態では、本発明の第２の態様の組換えシアノバクテリア細胞は、ｓｌｒ１９９３遺伝子（配列番号２４）またはそのオーソログの欠失に起因するＰＨＡ発現の欠損を有している。この実施形態の一実施例が以下に提供される。別例として、組換え宿主細胞は、配列番号２５のアミノ酸配列をコードする標的核酸配列に相補的な抑制性の核酸をコードする核酸に作動可能なように連結されたプロモータ配列を含む核酸構築物を有する発現ベクターをさらに含む。さらなる実施形態では、抑制性の核酸は、配列番号２４の核酸配列のうち少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス転写物である。様々なさらなる実施形態では、アンチセンス転写物は、配列番号２４のうち少なくとも連続した３０個、５０個、１００個、２５０個、５００個、または全核酸配列を含む。好ましい実施形態では、アンチセンス転写物をコードする核酸は、上記に議論されたプラストシアニンプロモータのようなシアノバクテリアの誘導型プロモータに作動可能なように連結される。
【００５０】
下記は、本発明の範囲内にある組換え核酸構築物の具体例と、そのような構築物の具体的な用法である。
図２は、例えばＰＨＡ生産用の安定にトランスフェクションされたシアノバクテリア菌株を作出するために使用することができる、例示の構築物の概略図を提供している。前記構築物は、例えば大腸菌において増殖させるための任意の標準的なベクターにクローニング可能である。本発明の宿主細胞とともに使用するのに適した、任意の抗生物質耐性マーカー、例えば、限定するものではないがクロラムフェニコール耐性マーカーを使用することができる。
【００５１】
ボックスはそれぞれＤＮＡセグメントを表す。ｓｌｒ２００２の「Ｎ末端」および「Ｃ末端」は、ゲノムのｓｌｒ２００２遺伝子との二重の相同組換えのための上流部位および下流部位の略称である。Ｓｌｒ２００２は上記に議論されたシアノフィシン合成酵素遺伝子（配列番号２２）である。当業者には当然のことであるが、６００ｂｐの、ｓｌｒ２００２の５’配列（配列番号３４）またはｓｌｒ２００２の３’配列（配列番号３５）を使用することは、例示である。様々な実施形態では、２００ヌクレオチドまたはそれ以上を使用することが可能であり、ヌクレオチド数の大きいほうが好ましい。
【００５２】
銅制御型のｐｅｔＥプロモータに作動可能なように連結されたアンチセンスｓｌｒ１１２５をコードする核酸を含む核酸構築物を、ｓｌｒ２００２相同組換え用配列の内側に挿入し、前記構築物を用いてシアノバクテリアを二重の相同組換えによりトランスフェクションすることにより、結果として、銅の存在下で大量のＰＨＡを産生するがシアノフィシン顆粒を合成することはできず、従ってシアノフィシンの妨害を伴わずに宿主細胞からＰＨＡのみを生産かつ精製することが容易な組換えシアノバクテリアが得られる。
【００５３】
図３は、純粋なシアノフィシン生産のための安定なシアノフィシン産生株の作出に役立つ、本発明による組換え核酸の概略図を提供している。この場合、組換え用配列はｓｌｒ１９９３（ＰＨＡ特異的β‐ケトチオラーゼ遺伝子）（配列番号２４）に由来し、したがって二重の相同組換えによりこの構築物でトランスフェクションされた組換えシアノバクテリアはこの遺伝子が欠失しており、ＰＨＡを合成しない。前記構築物は、それぞれが銅制御型のｐｅｔＥプロモータに作動可能なように連結された、アンチセンスｓｌｒ１１２５とさらにアンチセンスｓｌｒ２００１とをコードする核酸をさらに含み、ｓｌｒ２００１はシアノフィシン顆粒を分解するシアノフィシナーゼの遺伝子である（上記参照）。
【００５４】
したがって、細胞を銅に曝露すると前記構築物からシアノフィシナーゼをダウンレギュレーションするアンチセンスの発現が生じることになり、同時にアンチセンスｓｌｒ１１２５は、ＰＨＢ生合成およびシアノフィシン分解の不在下でシアノフィシン顆粒の形成を引き起こすことになる。
【００５５】
図４は、３‐ヒドロキシブチレートの生産に適した本発明の組換え核酸の概略図を示す。この場合、組換え用配列はｓｌｒ１８２９（ポリ（３‐ヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子）（配列番号３２））に由来し、したがって、二重の相同組換えによりこの構築物でトランスフェクションされた組換えシアノバクテリアはこの遺伝子が欠失しており、ＰＨＢを合成しない。
【００５６】
前記構築物は、それぞれが銅制御型のｐｅｔＥプロモータに作動可能なように連結された、アンチセンスｓｌｒ１１２５と、さらにアンチセンスｓｌｒ２００２とをコードする核酸をさらに含み、ｓｌｒ２００２はシアノフィシン合成酵素の遺伝子（配列番号２２）である。したがって、細胞を銅に曝露すると前記構築物からシアノフィシン発現をダウンレギュレーションするアンチセンスの発現が生じることになり、同時にアンチセンスｓｌｒ１１２５は、機能的なｓｌｒ１８２９遺伝子の欠如により重合しないモノマーとして３‐ヒドロキシブチリル酸の蓄積を引き起こすことになる。
【００５７】
本明細書の文脈がそうでないことを明白に示している場合を除き、本発明の第２の態様のこれらの実施形態を望み通りに組み合わせることも、本発明の第１の態様の様々な実施形態と組み合わせることも可能である。
【００５８】
第３の態様では、本発明は、バイオマテリアルを生産する方法であって、
（ａ）Ｓｌｒ１１２５発現が欠損しているシアノバクテリア宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）前記シアノバクテリア宿主細胞を採取する工程、および
（ｃ）採取されたシアノバクテリア宿主細胞からバイオマテリアルを調製する工程
からなる方法を提供する。本発明の方法は、例えば、既知のシアノバクテリア宿主細胞を使用しても従来は不可能であった量のバイオマテリアルを生産するために使用することができる。シアノバクテリア宿主細胞は、Ｓｌｒ１１２５発現が元々欠損していてもよいし、Ｓｌｒ１１２５発現を低減または除去するように遺伝子操作されてもよい。１つの実施形態では、そのような遺伝子操作はｓｌｒ１１２５遺伝子を欠失させることを含む。別の実施形態では、そのような遺伝子操作は、Ｓｌｒ１１２５の発現を所望の通りに制御することができるように、ｓｌｒ１１２５が誘導型プロモータの制御下にある上記に開示されるような宿主細胞の使用を含む。例えば、アンチセンス技術は、上記に議論されるような、後方にアンチセンス方向のｓｌｒ１１２５を備えた天然の銅制御型プラストシアニンプロモータを使用して、培地にμＭ量の銅を加えることでＳｌｒ１１２５発現のダウンレギュレーションを可能にすることにより、達成することができる。このプロトコールは、ｓｌｒ１１２５遺伝子発現を制御する直接的かつ安価な方法を提供する。
【００５９】
本発明者らは、Ｓｌｒ１１２５発現が欠損しているシアノバクテリアが大量の顆粒を産生し、かつＰＨＡおよびシアノフィシンの混合物が主な生成物である顆粒内容物を放出することができるため、当分野において可能であった量よりも非常に大量のこれら生成物の生産が容易になることを発見した。
【００６０】
本発明の第１および第２の態様の組換え核酸および組換え宿主細胞のすべての実施形態は、本発明のこの第３の態様における使用に等しく適用可能である。上記に開示されるように、様々な実施形態はすべて誘導可能なｓｌｒ１１２５インヒビター構築物との組み合わせを基にしており、この第３の態様では、上記の様々な実施形態はすべて、ｓｌｒ１１２５欠失変異株とともに使用するにあたり、単独でも組み合わせでも等しく両立性を有する。
【００６１】
したがって、１つの典型的な実施形態では、生産されるバイオマテリアルは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）およびシアノフィシンからなる群から選択されたバイオマテリアルを含む。別の実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞は、シネコシスティス、アルスロスピラ・マキシマ、シネココッカス、トリコデスミウムおよびクロコスファエラからなる群から選択される。さらなる実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティスのＰＣＣ６８０３細胞である。別の実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞はＮＡＤ合成酵素またはＮＡＤ＋リン酸化酵素のうち少なくともいずれか一方を過剰発現するように遺伝子操作されており、培養は、ＮＡＤ合成酵素またはＮＡＤ＋リン酸化酵素のうち少なくともいずれか一方を過剰発現するのに適した条件下で組換えシアノバクテリア宿主細胞を培養することを含む。
【００６２】
さらなる実施形態では、前記方法はＰＨＡを調製する工程を含み、シアノバクテリア宿主細胞は、例えばシアノバクテリア宿主細胞におけるシアノフィシン合成酵素の発現を低減または除去するようにシアノバクテリア宿主細胞を遺伝子組換え操作することにより、シアノフィシン産生が欠損している。別の実施形態では、前記方法はシアノフィシンを調製する工程を含み、シアノバクテリア宿主細胞は、例えばシアノバクテリア宿主細胞におけるＳｌｒ１９９３の発現を低減または除去するようにシアノバクテリア宿主細胞を遺伝子組換え操作することにより、ＰＨＡ産生が欠損している。別の実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞はシアノフィシナーゼ発現が欠損している。
【００６３】
別の実施形態では、前記方法はＰＨＡを調製する工程を含み、シアノバクテリア宿主細胞は、例えばＳｌｒ１９９４、Ｓｌｒ１８２９、およびＳｌｒ１８３０のうち１つ以上の発現を低減または除去するようにシアノバクテリア宿主細胞を遺伝子組換え操作することにより、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の産生が欠損している。１つの実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞はＳｌｒ１９９４の発現を低減または除去するように遺伝子操作されており、かつ前記方法はアセトアセチルＣｏＡの生産を含む。別の実施形態では、シアノバクテリア宿主細胞は、Ｓｌｒ１８２９およびＳｌｒ１８３０のうち一方または両方の発現を低減または除去するように遺伝子操作されており、かつ前記方法はポリ（３‐ヒドロキシブチリル‐ＣｏＡ）の生産を含む。
【００６４】
これらの様々な実施形態による核酸構築物および組換えシアノバクテリア宿主細胞の調製については、上記に詳細に説明されている。
使用される培養条件は対象とするバイオマテリアルの生産に適した任意の条件でよい。ｓｌｒ１１２５欠失変異株のための典型的な培養条件は、以下の実施例に提供されている。シアノバクテリアをバイオプラスチック生産に使用する主な利点は、投入エネルギーを太陽エネルギーが提供するということである。一実施例において、シアノバクテリアは２５℃〜３４℃で（例えばシネコシスティス属細菌のＰＣＣ６８０３は至適温度（３０℃）を含めた２５℃〜３４℃で増殖する）、緩衝化したＢＧ‐１１培地（４０）のような培地中で、適切な光条件、例えば光子量５０〜２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１（５０は低光量、２００は高光量である）の存在下で振とうしながら増殖させることが可能である。当業者には当然のことであるが、大規模生産の細胞は、立地およびバイオリアクタの仕様により異なる光条件、例えば細胞の自己遮蔽効果を考慮に入れることにより、明るい日当たりのよい日とほぼ同等な光子量６００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１まで適応させることができる。光条件は所与の目的に適するように変動可能であり、また連続的であっても周期的であってもよく、大規模かつ屋外の培養については、コストを最小限にし、かつ人工照明の追加費用を回避するために光／暗サイクルが好ましい。そのような条件下では、大規模なシアノバクテリア増殖により高密度培養物を得ることができる。
【００６５】
１つの実施形態では、増殖培地中の窒素源として硝酸塩の代わりにアンモニアを用いることにより、細胞増殖中に顆粒形成が誘導される。シアノバクテリアは窒素を固定せず、したがって増殖培地中には窒素源が必要であるが、窒素源としてアンモニアを使用するとシアノバクテリアが硝酸塩をアンモニアに変換する必要がなくなり、ＮＡＤＰＨ還元力の消費が制限されて、誘導期における顆粒形成およびバイオマテリアル生合成のためのＮＡＤＰＨ備蓄量が細胞内で増大するのを可能にする。１つの実施形態では、アンモニアの量は、標準的な増殖培地中の硝酸塩の量とほぼ等モルである。別の実施形態では、アンモニアの量は０．７５ｇ／Ｌ〜１．５ｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態では、０．７５ｇ／Ｌ〜１．２５ｇ／Ｌの範囲にある。別の実施形態では、０．７５ｇ／Ｌ〜１．０ｇ／Ｌの範囲にある。これらの顆粒形成の実施形態のうちのいずれかのさらなる実施形態では、細胞を最大密度まで増殖させて、そして顆粒形成を誘導してＰＨＢ、シアノフィシンおよび３‐ヒドロキシブチレートなどの対象とするバイオマテリアルの産生を最大限にすることができる。さらなる実施形態では、シアノバクテリア細胞は、上記に開示されるように、銅誘導型プロモータを含めることなどによってＳｌｒ１１２５遺伝子の発現を誘導式にダウンレギュレーションするように遺伝子組換え操作されている。さらなる実施形態では、ｓｌｒ１１２５のダウンレギュレーションまたは欠失と併せてＮＡＤ合成酵素またはＮＡＤリン酸化酵素のうち少なくともいずれか一方が過剰発現されてもよい。１つの非限定的な実施例では、シネコシスティス属細菌のＰＣＣ６８０３は８〜１０時間の倍加時間を有する。したがって、４〜５ＯＤ７３０／リットルのバイオマスを二等分し、一方を細胞バイオマスの連続供給を可能にするためにさらに増殖させ、他の半分を上記に議論したような顆粒の産生を促すために使用することができる。さらなる実施形態では、顆粒形成は、増殖培地にリコピンシクラーゼの阻害剤を含めることにより誘導することが可能であり、そのような阻害剤の例には、限定するものではないが、ニコチン酸（５〜５０μＭ）、クロロフェノキシトリエチルアミン（ＣＯＰＴＡ）、２‐（４‐クロロフェニルチオ）‐トリエチルアミン（ＣＡＰＴ）、２‐（３，４‐ジクロロフェン‐オキシ）‐トリエチルアミン（ＤＣＰＴＡ）、２‐（３，５‐ジメチルフェノキシ）‐トリエチルアミン（ＤＭＰＴＡ）、２‐（４‐メチル‐フェノキシ）‐トリエチルアミン（ＭＰＴＡ）、アミノトリアゾール、アザスクアレン（azasqualene ）、ドデシルトリメチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ‐ジメチルドデシルアミン、イミダゾール、ピペロニルブトキシド、ピペリジン、トリエチルアミンおよびピリジンが挙げられる。そのような阻害剤の使用は顆粒の形成を増強し、細胞培養物がその最大密度に達した後の顆粒形成時間を短縮する。１つの実施形態では、培養培地は窒素源として硝酸塩を含み、別の実施形態では、アンモニアが窒素源として提供される。ｓｌｒ１１２５構築物のうち任意のものを、カロチノイド生合成阻害剤（例えばデサチュラーゼおよびシクラーゼ）を使用する実施形態に好適な欠失変異株と共に使用することができ���。
【００６６】
カロチノイドは、いずれもＣ５炭化水素分子であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）とその異性体ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＰＰ）との重合から、フィトエン（Ｃ４０分子）を形成するまでの逐次工程を経て合成される一群のＣ４０炭化水素である。この分子フィトエンは、シアノバクテリアであるシネコシスティス属細菌ＰＣＣ６８０３のカロチノイド生合成経路の中で合成される最初の関連カロチノイド分子である。２つのカロチンデサチュラーゼ酵素（フィトエンデサチュラーゼおよびζ‐カロチンデサチュラーゼ）の作用による、フィトエン分子への４つの二重結合の導入は、不飽和Ｃ４０リコピンを生じる。リコピンはリコピンシクラーゼによってさらに環化されて、単環式カロチン（γ‐カロチン）または二環式カロチン（β‐カロチン）を生じる。ミクソキサントフィルの場合には、単環式カロチノイド分子をさらに修飾してグリコシル化分子を生じるために追加の酵素が必要であり（ｓｌｌ０２５４、ｓｌｒ１２９３およびｓｌｒ１１２５）、これらの遺伝子の産物は、ミクソキサントフィル・カロチノイド配糖体の最終形成に必要な主要酵素である。最終的な主要カロチノイドはさらに処理されてより小さなカロチノイド生成物（例えばレチナール群）になる。以下に列挙した阻害剤は、カロチノイド生合成／分解の酵素のうち１つ以上を阻害し、ミクソキサントフィルの生合成を阻止する。したがって、１つ以上のこれらの阻害剤を本発明の宿主細胞の組み合わせとともに使用することにより、バイオマテリアル（ＰＨＢおよびシアノフィシンなど）の産生および増大がさらに制御され、細胞が全面的に顆粒に移行するために必要な顆粒形成時間が短縮される。１つの実施形態では、最終生成物の量および質の両方をさらに改善し、かつコストを最小限にするために、シアノバクテリアからのＰＨＢおよびシアノフィシンの大規模生産のために１つ以上の阻害剤が使用される。表１は、阻害剤についての培地中における好ましい濃度域を提示している。
【００６７】
【表１】
2010531669.tif 000002
【００６８】
上記に開示された様々な条件によって引き起こされる電子の利用可能性の劇的な変化、ＮＡＤＰＨの蓄積、および自己遮蔽効果による光の変化は、本発明のシアノバクテリア宿主細胞における顆粒の形成を著しく増大させる。
【００６９】
適切な誘導条件が適切な時に使用されることを除いて同様の培養条件を、発現するとｓｌｒ１１２５（またはそのオーソログ）のオープンリーディングフレームの発現をダウンレギュレーションする抑制性の核酸に連結された誘導型プロモータを担持する組換えシアノバクテリアに使用することができる。ｓｌｒ１１２５発現を低減するための適切な条件は、使用される誘導型プロモータ、ならびにその他の要因、例えば、限定されるものではないが使用される特定のシアノバクテリア、シアノバクテリアの濃度、培地、ｐＨ、温度、露光量などによって変わることになる。しかしながら、当業者であれば、本明細書中の教示に照らして使用すべき特定の条件を決定することができる。１つの典型的な実施形態では、誘導型プロモータはｐｅｔＥプロモータ（配列番号９）を含み、抑制性の核酸の発現は、培地にμＭ量の銅を添加することによって誘導される（例えば（Briggs, et al., 1990）を参照されたい）。当業者であれば銅の最適濃度を決定することができるが、実験室条件下では２〜１０μＭの範囲が使用された。１つの実施形態では、アンチセンスｓｌｒ１１２５構築物はｐｅｔＥプロモータの下流かつ制御下にある。したがって、培地にμＭ量の銅を加えることにより、ｓｌｒ１１２５発現がダウンレギュレーションされ、顆粒が産生され、かつ細胞を採取して前記細胞からＰＨＡおよびシアノフィシンを調製することができるようになる。
【００７０】
シアノバクテリア細胞の採取は、当業者には既知の任意の技術、例えば、限定するものではないが遠心分離および濾過によって遂行することができる。
同様に、採取された組換えシアノバクテリアからバイオマテリアルを調製する方法は、以下の実施例に記載されるもののような当分野で既知の任意の手段によって実行することができる。１つの非限定的な実施形態では、ＰＨＡポリエステルは、非ＰＨＡ細胞塊の酸性溶解、ｐＨ調整（ｐＨ１０）、および漂白液中での最終脱色で構成される手順で回収および精製することができる。本発明の組換えシアノバクテリアによって産生される主要生成物は、ＰＨＡおよびシアノフィシンの混合物である。上記に述べたように、様々な実施形態において、これら２つのポリマーの生合成を選別するために別個のシアノバクテリア菌株（シアノフィシン欠損およびＰＨＡ合成酵素欠損）が作られる。
【００７１】
Ｌ‐アスパラギン酸およびＬ‐アルギニンのコポリマーであるシアノフィシンは、シアノフィシン合成酵素によって非リボソーム型ポリペプチド生合成によって生産される。さらなる実施形態では、単離されるバイオマテリアルはシアノフィシンを含み、シアノフィシンは次に、任意の適切な方法、例えば、限定するものではないが高ｐＨ値での煮沸を使用して、部分加水分解されてポリアスパルテートを生じるが、ポリアスパルテートは化学合成ポリカルボキシレートの生物分解性の代替物である。後者ポリカルボキシレートは陰イオン性高分子電解質であり、極めて有効な色素分散剤として水性の工業用の保護コーティング材、光沢分散塗料ならびに印刷インキにおける使用に用いることができる。さらに、塗料、革製品の仕上げ、織物、プラスチック、インクなどの着色に使用される色素濃縮物においても使用される。種々様々の接着剤、例えば物理的に乾燥するアクリル酸分散液、空気乾燥するアルキド樹脂乳剤、ポリエステルメラミン、２液エポキシ剤、アクリラートなどと共に使用される。したがって、本発明のこの実施形態は、毒性のポリカルボキシレートに代わるシアノフィシン（ポリアスパルテート）生産用の非常にコスト効率の良い方法であって、エネルギーおよび水の節約法としても使用することができる（すなわち、水の蒸発を防ぐために湖沼および溜池の水面で薄膜を形成する）方法を提供する。
【００７２】
よって、上述の様々な実施形態において、本発明の第３の態様で使用される組換えシアノバクテリアは、上記に開示されるように、シアノフィシン発現またはＰＨＡ発現がさらに欠損していてもよい。非ＰＨＡ細胞塊からのＰＨＡポリマーの分離および精製は、ＰＨＡ顆粒および非ＰＨＡ細胞塊がいずれも固相であることから技術的障害を呈する。純度、収量および分子の大きさがＰＨＡ回収における３つの主な要素である。ＰＨＡポリエステル（ＰＨＢなど）は、非ＰＨＡ細胞塊の酸性溶解、ｐＨ調整（ｐＨ１０）、および漂白液中での最終脱色で構成される手順で回収および精製することができる。したがって、シアノフィシン発現が欠損している細胞の使用は、本発明の組換えシアノバクテリアによって産生されたＰＨＡの分離および精製を容易にする。同様に、ＰＨＡ合成酵素の発現が欠損している細胞の使用は、本発明の組換えシアノバクテリアによって産生されたシアノフィシンの分離および精製を容易にする。ＰＨＡ生合成は補助因子としてＮＡＤＰＨを必要とし、したがってＮＡＤ生合成を増大させると、ＰＨＡ産生を増強し、顆粒に全面的に変換するための時間を短縮することができると考えられる。したがって、上記に議論されるように、本発明は、銅制御型プロモータの前にＮＡＤ（＋）合成酵素のコピーを導入してＰＨＡ生合成の誘導と協調して過剰発現させることによって、ＰＨＡ生合成に必要な補助因子の利用可能性を増大させることができるシアノバクテリア組換え体を提供する。
【００７３】
１つの非限定的な実施例では、シネコシスティス属細菌のＰＣＣ６８０３は８〜１０時間の倍加時間を有する。したがって、４ＯＤ７３０／リットルのバイオマスを二等分して：一方を細胞バイオマスの連続供給を可能にするためにさらに増殖させ、他の半分を、顆粒の産生段階に使用することができる。細胞が４〜５ＯＤ７３０／リットルのバイオマスの連続供給は、太陽光を使用して毎日達成することができる。例えば：２０ｃｍ×１００ｃｍ×２５０ｃｍ（幅×長さ×高さ）のプラスチックバッグは５００Ｌを供給し、この５００Ｌはおよそ１．５ｋｇ／バッグ／日のバイオマスを産出し、このバイオマスは０．７５〜１．０ｋｇ／バッグ／日のＰＨＡ（５０％、乾燥バイオマス重量比）に変換される。本発明の方法は、１．２〜１．３５ｋｇ／バッグ／日のＰＨＡを供給する乾燥バイオマス重量比でおよそ８０〜９０％の非常に高収量かつ高純度を達成し、これは生物学的に光合成独立栄養である生物由来のこれらのバイオマテリアルについて現在まで先例のない収率に相当する。
【００７４】
第４の態様では、本発明は、組換えシアノバクテリア宿主細胞であって、
（ａ）Ｓｌｒ１１２５発現の欠損と；
（ｂ）遺伝子組換えにより生じた以下の表現型、すなわち
（ｉ）シアノフィシン産生の欠損；
（ｉｉ）ポリ‐β‐ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生の欠損；
（ｉｉｉ）ＮＡＤ合成酵素の過剰発現；
（ｉｖ）ＮＡＤ＋リン酸化酵素の過剰発現；
（ｖ）シアノフィシン合成酵素発現の欠損；
（ｖｉ）Ｓｌｒ１９９３発現の欠損；
（ｖｉｉ）シアノフィシナーゼ発現の欠損；
（ｖｉｉｉ）ＰＨＢ産生の欠損；
（ｉｘ）Ｓｌｒ１９９４発現の欠損；
（ｘ）Ｓｌｒ１８２９発現の欠損；および
（ｘｉ）Ｓｌｒ１８３０発現の欠損
のうち１つ以上とを有する宿主細胞を提供する。
【００７５】
本発明のこの態様の宿主細胞は、例えば、上記に開示された本発明の方法によって大量のバイオマテリアルを調製するために使用することができる。
列挙された発現の欠損または過剰発現のうちいずれかを備えた組換えシアノバクテリア宿主細胞を得るための実施形態は、上記に開示されており、本発明のこの第４の態様で使用するために等しく適用可能である。この態様では、組換えシアノバクテリア宿主細胞は、Ｓｌｒ１１２５発現の欠損と、列挙された一覧から少なくとも１つのさらに改変された表現型であって組換え体がＰＨＡおよびシアノフィシンのようなバイオマテリアルを産生する能力を増大させる表現型とを有する。１つの実施形態では、Ｓｌｒ１１２５発現の欠損は天然に存在する欠損に基づくものであってよい。別の実施形態では、宿主細胞は例えばｓｌｒ１１２５遺伝子の欠失によって欠損を引き起こすように遺伝子操作される。別の実施形態では、そのような遺伝子操作は、上記に開示されるような宿主細胞であって、ｓｌｒ１１２５が誘導型プロモータの制御下にあるため、Ｓｌｒ１１２５の発現を所望の通りに、かつ上記に詳細に開示されるように制御することができる宿主細胞の使用を含む。
【００７６】
シアノバクテリア宿主における発現の、少なくとも１つのさらなる遺伝子組換えによる改変は、列挙された改変のうち１つ以上を含み、各々について上記に詳細に開示されている。様々なさらなる実施形態において、シアノバクテリアは、シネコシスティス、アルスロスピラ・マキシマ、シネココッカス、トリコデスミウムおよびクロコスファエラからなる群から選択され、さらなる実施形態では、組換えシアノバクテリア宿主細胞はシネコシスティスのＰＣＣ６８０３細胞である。
【実施例】
【００７７】
ｓｌｒ１１２５のクローニングおよびｐΔｓｌｒ１１２５Ｓプラスミドの構築
シネコシスティス属細菌ＰＣＣ６８０３のｓｌｒ１１２５遺伝子およびそのフランキング領域を、利用可能なシネコシスティスのゲノム配列（ＣｙａｎｏＢａｓｅ；ウェブサイト：kazusa.or.jp/cyano/cyano.html）（Kanekoら）に基づいたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。順方向プライマーは、人為的にＥｃｏＲＩ部位（下線部）が組み込まれ、ＣｙａｎｏＢａｓｅの塩基番号８５７２１‐８５７４５に対応する
【００７８】
【化１】
2010531669.tif 000003
【００７９】
（配列番号３９）とし、逆方向プライマーは、人為的にＳｐｈＩ制限部位（下線部）が組み込まれ、ＣｙａｎｏＢａｓｅの塩基８７８４５‐８７８６７に対応する配列を備えた
【００８０】
【化２】
2010531669.tif 000004
【００８１】
（配列番号４０）とした（制限部位を導入するための塩基変更は太字で表されている）。ＰＣＲで増幅された配列は、ＯＲＦの両側におよそ４３０‐４５０ｂｐのフランキング配列を備えたｓｌｒ１１２５に相当する。期待される大きさ（２．１４７ｋｂ）のＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用いて（プライマーに導入された制限部位を使用して）制限酵素切断し、ｐＵＣ１９にクローニングしてｐｓｌｒ１１２５構築物を作出した。ｓｌｒ１１２５遺伝子を、ｓｌｒ１１２５オープンリーディングフレームの始点および終点の付近にある内部ＳｔｙＩ部位で制限酵素切断によって削除し、このＳｔｙＩフラグメント（１．２ｋｂ）を１．５ｋｂのストレプトマイシン耐性カセットに交換した。その結果ｐΔｓｌｒ１１２５Ｓ構築物が作出され、前記構築物を、Vermaas et al. 1987に従って実行したシネコシスティス属細菌ＰＣＣ６８０３の形質転換に使用した。５ｍＭグルコースを補足し、かつ最大３００μｇ／ｍｌまで濃度を漸増させたストレプトマイシン（滅菌水に溶解）を添加したＢＧ‐１１／寒天プレートで形質転換体を増殖させた。形質転換体の分離状態を、ｓｌｒ１１２５コード領域の上流および下流の配列を認識するプライマーを使用した形質転換体ＤＮＡのＰＣＲによって観察した。変異体のＰＣＲ分析に使用したシネコシスティス属細菌ＰＣＣ６８０３のゲノムＤＮＡは、He et al.に記載されているようにして調製した。上流および下流にフランキング領域を備えてクローニングされたｓｌｒ１１２５ＯＲＦの配列を検証した（配列番号４１）。
【００８２】
増殖条件
シネコシスティス属細菌株ＰＣＣ６８０３を、５ｍＭのＮ‐トリス（ヒドロキシメチル）メチル‐２‐アミノエタンスルホン酸‐ＮａＯＨ（ｐＨ８．２）で緩衝化したＢＧ‐１１培地（４０）の中で３０℃にて回転振盪機で培養した。プレート上での増殖については、１．５％（重量／体積）のＤｉｆｃｏＴＭ（ディフコ、登録商標）寒天および０．３％（重量／体積）のチオ硫酸ナトリウムを添加した。冷白色（cool-white）の蛍光灯からの光子量束密度４０および１００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１を、液体培地中での連続光下での増殖に使用した。Rippka et al. 1979に記載の通常のＢＧ１１培地は、シネコシスティス菌株増殖用の窒素源として硝酸塩を含有し、この培地組成により細胞増殖はその最大限度（３〜５ＯＤ７３０）に至る。
【００８３】
顆粒形成条件
顆粒誘導期を開始するために、細胞を、硝酸塩の代わりに窒素源として等モル量のアンモニア（１ｇ／Ｌ）を含有するＢＧ１１培地で０．７５ＯＤ７３０に希釈したが、この方策は、顆粒生合成の増大を促進するＮＡＤＰＨの還元力のおよそ４０％を節約する。細胞を、上記に述べた同じ培養条件下でさらに４８時間培養した。この培養条件下では、前記増殖条件が大規模な顆粒産生に有利に働くためさらなる細胞増殖はほとんどなかった。
【００８４】
ＰＨＢの抽出
本発明の利点のうちの１つは、顆粒形成が誘導されてしまえば、ＰＨＢ顆粒は培地表面に浮かび、前記表面から直接大規模に回収することができるということである。０．７５ＯＤ７３０の細胞の１リットル培養物を遠心分離によって回収して培地中のあらゆるものを回収し、かつＰＨＢの量を正確に分析した。回収された顆粒および細胞物質を、色素の除去のためにメタノール中に懸濁させた（４℃、一晩）。遠心分離後に得られたペレットを６０℃で乾燥させて、ＰＨＢを温クロロホルムで抽出し、続いて冷ジエチルエーテルで沈殿させた。沈殿物を、１１０００ｇで２０分間遠心分離処理し、アセトンで洗浄し、温クロロホルムに再び溶解させた。
【００８５】
ＰＨＢの分光光度測定
Law and Slepecky (1961)の通りに分光光度アッセイを実施した。クロロホルム中にポリマーを含有する試料を清浄な試験管に移した。クロロホルムを蒸発させ、１０ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４を添加した。この溶液を水浴中で２０分間加熱した。冷却して完全に混合した後、前記溶液の吸光度をＨ２ＳＯ４ブランクに対して２３５ｎｍで計測した。ＰＨＢの存在をさらに確認するために、試料および標準品（ｄｌ‐β‐ヒドロキシブチリル酸、米国所在のシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））の吸収スペクトル（２００〜１０００ｎｍ）を、酸消化に続く分光光測定によって比較した。これらのスペクトルをさらに、ＰＨＢの酸加水分解の副産物であるクロトン酸のスペクトル、および標準品のＰＨＢまたは細胞由来のＰＨＢの場合には２３５ｎｍで吸収を示す化合物のスペクトルと比較した。ｓｌｒ１１２５欠失菌株の０．７５ＯＤ７３０の培養フラスコから合計２００ｍｇが回収された。抽出された顆粒の２３５ｎｍにおける吸収を、米国所在のシグマケミカル社のβ‐ヒドロキシブチリル酸によって生成された標準曲線と比較した。２００ｍｇの細胞物質から１０５ｍｇのＰＨＢが測定され、概算で回収された物質の乾燥重量あたり５２％のＰＨＢが得られた。
【００８６】
【表２】
2010531669.tif 000005
【００８７】
2010531669.tif 000006
【図１】
2010531669.tif 000007
【図２】
2010531669.tif 000008
【図３】
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【図４】
2010531669.tif 000010
【配列表】
2010531669000001.app
【国際調査報告】
2010531669.tif 000011
2010531669.tif 000012
2010531669.tif 000013
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