(57)【要約】  本発明は、海産食品又は魚中のヒスタミン濃度を測定するための簡単で迅速な電流測定バイオセンサーを提供する。このバイオセンサーは、スクリーン印刷の技術をバイオ受容体としての固定化ジアミンオキシダーゼと組み合わせている。本発明の一実施形態では、バイオセンサーは、メディエータとしてヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムを組み込む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用電極と、対電極と、参照電極とを備え、前記作用電極がスクリーン印刷電極であるヒスタミン測定用の電流測定バイオセンサーであって、ジアミンオキシダーゼがスクリーン印刷作用電極の表面上に固定化されることを特徴とする電流測定バイオセンサー。
【請求項２】
スクリーン印刷作用電極がカーボンペースト系である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
対電極が白金棒である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
参照電極が銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
ジアミンオキシダーゼが、
ａ）ジアミンオキシダーゼ溶液をポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合するステップと、
ｂ）スクリーン印刷作用電極の表面上にこの混合物を滴下コーティングするステップと、
ｃ）電極を光硬化させるステップと
によって固定化される、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
ジアミンオキシダーゼが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合する前にリン酸緩衝液に溶解される、請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
ジアミンオキシダーゼ溶液が、比１：４に従ってポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合される、請求項５又は請求項６に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
電極が、窒素ガス流下、ＵＶ曝露ユニット内で３００秒間光硬化する、請求項５から７までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
ａ）ヒスタミンを含む疑いのある試料を請求項１から４までのいずれか一項に記載のバイオセンサーにかけるステップと、
ｂ）電流を測定することによってヒスタミンの存在を示す出力信号を提供するステップと
を含むヒスタミンの測定方法。
【請求項１０】
ヒスタミン測定用の電圧範囲が、０．３０ボルト〜０．５０ボルトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ヒスタミン測定用の電圧が、好ましくは０．３５ボルトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒスタミン測定用のｐＨ範囲が、６．４〜８．４である、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒスタミン測定用のｐＨが、好ましくは７．４である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒスタミンを測定するための反応時間が２０秒以上である、請求項９から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒスタミンを測定するための反応時間が、好ましくは５０秒である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
作用電極と、対電極と、参照電極とを備え、電極すべてが基板上にスクリーン印刷されるヒスタミン測定用の電流測定バイオセンサーであって、ジアミンオキシダーゼ及びヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムが、スクリーン印刷作用電極の表面上に固定化され、電着されることを特徴とする電流測定バイオセンサー。
【請求項１７】
スクリーン印刷作用電極及び対電極がカーボンペースト系である、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
スクリーン印刷参照電極が、塩化銀（ＡｇＣｌ）ペースト系のスクリーン印刷電極である、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
電極が、ポリエステル基板上にスクリーン印刷される、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
バイオセンサーが、基底トラック層として印刷された銀層をさらに備える、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
ジアミンオキシダーゼが、
ａ）ジアミンオキシダーゼ溶液をポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合するステップと、
ｂ）スクリーン印刷作用電極の表面上にこの混合物を滴下コーティングするステップと、
ｃ）電極を光硬化させるステップと
によって固定化される、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項２２】
ジアミンオキシダーゼが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合する前にリン酸緩衝液に溶解される、請求項２１に記載のバイオセンサー。
【請求項２３】
ジアミンオキシダーゼ溶液が、比１：４に従ってポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合される、請求項２１又は請求項２２に記載のバイオセンサー。
【請求項２４】
電極が、窒素ガス流下、ＵＶ曝露ユニット内で３００秒間光硬化する、請求項２１から２３までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２５】
ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムが、撹拌しながらヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム溶液中でスクリーン印刷作用電極をサイクルさせるステップを含むサイクリックボルタンメトリ法によって電着される、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項２６】
電極が、０．１Ｍヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムの脱イオン水溶液中で撹拌しながら０．２ｖｓ−１で少なくとも１５回サイクルされる、請求項２５に記載のバイオセンサー。
【請求項２７】
ａ）ヒスタミンを含む疑いのある試料を請求項１６から２０までのいずれか一項に記載のバイオセンサーにかけるステップと、
ｂ）電流を測定することによってヒスタミンの存在を示す出力信号を提供するステップと
を含むヒスタミンの測定方法。
【請求項２８】
ヒスタミン測定用の電圧範囲が、０．３０ボルト〜０．５０ボルトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ヒスタミン測定用の電圧が、好ましくは０．３５ボルトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ヒスタミン測定用のｐＨ範囲が、６．４〜８．４である、請求項２７から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ヒスタミン測定用のｐＨが、好ましくは７．４である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ヒスタミンを測定するための反応時間が２０秒以上である、請求項２７から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ヒスタミンを測定するための反応時間が、好ましくは５０秒である、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒスタミン、特に海産食品及び魚組織中のヒスタミンを測定するための電流測定バイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
海産食品及び魚製品は、それらの栄養価のために、また世界の多数の国にとって国際貿易及び外国との取引による収入のための物品として重要である。その他の動物製品とは異なり、海産食品及び魚製品の品質は、種、性別、年齢、生息環境、及びそれらの自己消化酵素の作用が変動するので、制御するのがより困難である（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ、２００２）。ヒスタミンの濃度は、海産食品及び魚製品の腐敗の迅速な指標であることが示唆されている（Ｍａｌｅら、１９９６；Ｔｏｍｂｅｌｌｉ及びＭａｓｃｉｎｉ、１９９８；Ｐａｔａｎｇｅら、２００５）。バクテリアによる腐敗が、製品の貯蔵中に開始されると、ヒスタミンは、海産食品及び魚組織に蓄積することが知見され（Ｍａｌｅら、１９９６）、その際、海産食品及び魚の正常な外観及び臭気には変化がなかった（Ｌｅｈａｎｅ及びＯｌｌｅｙ、２０００）。したがって、製品の新鮮度を評価するために、海産食品及び魚製品中のヒスタミン濃度を測定するための簡単で迅速な技法が、食品業界によって強く要望されている。
【０００３】
ヒスタミンは、呼吸器系、心臓血管系、胃腸系及び血液免疫系並びにアレルギー性皮膚の細胞膜上の受容体に結合することによってその効果を発揮し、低血圧症、紅潮、下痢、嘔吐及び頭痛などの反応を引き起こす（Ｌｅｈａｎｅ及びＯｌｌｅｙ、２０００）。症状は、汚染した海産食品及び魚製品中のヒスタミンの同じ用量に曝露された個体間で変動する場合がある（Ｂｒｅｍｅｒら、２００３）。米国ＦＤＡの国際食品安全基準では、ヒスタミンの有害濃度は５００ｐｐｍであると見積もられている（ＦＤＡ、２００１）。しかし、ヒスタミンは、一般に、腐敗した魚中に均一に分布してはいない（Ｌｅｈａｎｅ及びＯｌｌｅｙ、２０００；ＦＤＡ、２００１）。したがって、５０ｐｐｍという指標濃度が、海産食品及び魚の腐敗に対する化学的指標として設定されている。５０ｐｐｍのヒスタミンが、海産食品又は魚組織の１つの断面中に見出された場合、その他の断面では５００ｐｐｍを超える恐れがあるという可能性が存在する（Ｌｅｈａｎｅ及びＯｌｌｅｙ、２０００；ＦＤＡ、２００１）。上記の濃度を超えるヒスタミンを含む海産食品及び魚製品は、ヒトの消費のために販売することが禁止されている（Ｇｉｇｉｒｅｙら、１９９８）。
【０００４】
ヒスタミン検出に関してクロマトグラフィーによる日常の分析など数種の方法が提案されており、このクロマトグラフィーとして、ガスクロマトグラフィー、薄層液体クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、プレカラム、ポストカラム又はオンカラム誘導体化技法を備えた液体クロマトグラフィー、及び高速液体クロマトグラフィーが挙げられる（Ｃｈｅｍｎｉｔｉｕｓ及びＢｉｌｉｔｅｗｓｋｉ、１９９６；Ｍａｌｅら、１９９６；Ｓｃｏｔｔ、１９９８；Ｔｏｍｂｅｌｌｉ及びＭａｓｃｉｎｉ、１９９８）。しかし、こうした方法には、複雑で高価な器具、毒性試薬、長い時間が必要であり、試料の処理が複雑であるためにｉｎ  ｓｉｔｕ分析として実際的ではなく、こうした試験を実施するための訓練を受けた人員が必要である。
【０００５】
スクリーン印刷電極に基づく電流測定系によって、海産食品及び魚製品の新鮮度及び腐敗を迅速に測定するための簡単で、安価で携帯可能な装置を製造することが可能になる。電流測定バイオセンサーによって、電気活性な種の酸化又は還元による電子流が測定される。定常状態の電流は、電気活性な種の濃度に比例する。酵素電極の分野では、最も広く使用される酵素は、電気活性な過酸化水素を生成するオキシダーゼであり、この電気活性な過酸化水素は、電流信号（Ｗｉｌｌｎｅｒら、２０００）又は基質と酵素との直接の電気化学的なやりとりによって測定することができる。電流測定バイオセンサーは、その他の型のバイオセンサーでの欠点の大部分を克服することが分かった。電流測定バイオセンサーは、濁りのある媒体中で作動することができ、装置の感度が同程度であり、小型化により適している（Ｃｈａｕｂｅｙ及びＭａｌｈｏｔｒａ、２００２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主たる目的は、海産食品及び魚組織のヒスタミン濃度を測定することによって海産食品及び魚製品の新鮮度及び腐敗を求めることができる簡単で迅速な電流測定バイオセンサーを提供することである。
【０００７】
本発明の目的は、低動作電圧下で海産食品及び魚組織のヒスタミン濃度を測定できる小型化された感度のよい電流測定バイオセンサーを提供することでもある。
【０００８】
本発明の別の目的は、非実験室的な設定で実施できる、海産食品及び魚組織のヒスタミン濃度を測定するための簡便で安全な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のこれらの目的及びその他の目的は、以下の方法によって実現される。
【００１０】
作用電極と、対電極と、参照電極とを備え、前記作用電極がスクリーン印刷電極であるヒスタミン測定用の電流測定バイオセンサーであって、ジアミンオキシダーゼがスクリーン印刷作用電極の表面上に固定化されることを特徴とする電流測定バイオセンサー。
【００１１】
作用電極と、対電極と、参照電極とを備え、電極すべてが、基板上にスクリーン印刷されるヒスタミン測定用の電流測定バイオセンサーであって、ジアミンオキシダーゼ及びヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムが、スクリーン印刷作用電極の表面上に固定化され、電着されることを特徴とする電流測定バイオセンサー。
【００１２】
ヒスタミンを含む疑いのある試料を上記のバイオセンサーのいずれか１つにかけるステップと、電流を測定することによってヒスタミンの存在を示す出力信号を提供するステップとを含むヒスタミンの測定方法。
【００１３】
本発明のその他の態様及びそれらの利点は、添付の図面と合わせて詳細な説明を検討することによって理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態の電流測定バイオセンサーの直線応答範囲を示すグラフである。
【図２】図２は、同じバイオセンサーを用いて連続測定を実施した後に得られた電流の読み取り値を示すグラフである。
【図３】図３は、ｐＨが本開発のバイオセンサーの応答に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明を実施するバイオセンサーによって測定されたヒスタミン濃度と、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）よって測定されたヒスタミン濃度との相関関係を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の別の実施形態の電流測定バイオセンサーの直線応答範囲を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、試料中のヒスタミン濃度を測定するための電流測定バイオセンサーであって、固定化ジアミンオキシダーゼがバイオ受容体として使用される電流測定バイオセンサーを提供する。本発明の第１番目の実施形態では、バイオセンサーは、スクリーン印刷作用電極と、対電極と、参照電極とを備える。好ましくは、バイオセンサーは、カーボンペースト系スクリーン印刷作用電極と、白金棒対電極と、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）参照電極とを備える。
【００１６】
ジアミンオキシダーゼは、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）によってスクリーン印刷作用電極の表面上に固定化される。固定化をする前に、酵素を、ｐＨが６．４〜８．４の範囲であり、最適ｐＨが７．４である０．１Ｍリン酸緩衝液中に溶解する。光ＨＥＭＡは、Ｌｏｗ及び共同研究者によって報告（２００５）された通りに調製される。２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）は、光開始剤２’ジメトキシフェニルアセトフェノン（ＤＭＰＰ）と混合される。すべてのＤＭＰＰが溶解するまで、この混合物は振とうされる。ホモジナイズ感光性混合物は、アルミホイルで覆われ、ＵＶ光による分解を防止するために使用するまで４℃で貯蔵される。バイオ受容体を調製するために、適切な体積の光ＨＥＭＡがジアミンオキシダーゼ溶液と混合される。本発明に従って、ジアミンオキシダーゼ溶液は、１部のジアミンオキシダーゼと４部の光ＨＥＭＡの比（１：４）により光ＨＥＭＡと混合される。ジアミンオキシダーゼ溶液と光ＨＥＭＡの比が１：１、１：２及び１：３である場合、光ＨＥＭＡ濃厚混合物中の光ＨＥＭＡがより少ないと、電流変化に一貫性がなく、酵素が不十分（比１：５）であると電流変化が低下した。次いで、ホモジナイズ混合物は、作用電極の表面上に滴下被覆され、電極は、窒素ガス流下ＵＶ曝露ユニット中で約３００秒間光硬化する。電極の硬化が３００秒未満である場合、電極の乾燥は不完全であることになり、酵素を浸出させる恐れがある。ＵＶ下で電極を３００秒超曝露させると、酵素活性が低減する恐れがある。
【００１７】
本発明のバイオセンサーは、以下に示すようにイミダゾールアセトアルデヒド、次いでイミダゾール酢酸を形成するヒスタミンの酸化脱アミノ化過程によって、試料中のヒスタミンを検出する。
【化１】
2010522323.tif 000002
【００１８】
上記反応におけるジアミンオキシダーゼとヒスタミンの間の活性によって、基質と酵素の間の直接的な電気化学的やりとりが引き起こされる。電子移動の機構は、非常に不安定であり、イミダゾール酢酸まで酸化される形成生成物すなわちイミダゾールアセトアルデヒドの電解酸化を介して生じる。
【００１９】
バイオセンサーは、最高３００ｐｐｍまでのヒスタミン応答範囲を有する。図１に示す直線応答範囲によれば、バイオセンサーの分析範囲は、最高６０ｐｐｍまでのヒスタミンであることが分かる。これは、米国ＦＤＡが見積もったヒスタミン５０ｐｐｍという海産食品及び魚製品の腐食指標濃度をカバーする。バイオセンサーの直線応答範囲は、フローインジェクション法又はＣｌａｒｋ酸素電極を使用したＴａｋａｇｉ及びＳｈｉｋａｔａ（２００４）；Ｆｒｅｂｏｒｔら（２０００）；Ｃａｒｓｏｌ及びＭａｓｃｉｎｉ（１９９９）；Ｄｒａｉｓｉら（１９９８）並びにＣｈｅｍｎｉｔｉｕｓ及びＢｉｌｉｔｅｗｓｋｉ（１９９６）による報告に比較してより広い。バイオセンサーの感度は、５．５６ｎＡ  ｐｐｍ−１であり、検出限界はヒスタミン０．６５ｐｐｍという低さであり、これは、検体のゼロ応答における標準偏差の３倍として計算される。バイオセンサーの安定性が、最適であることも証明された。というのは、図２に示すように、数個の分析が、電流の読み取り値の有意な低減なしで同じ電極で実施することができるからである。
【００２０】
試料中のヒスタミン濃度は、試料をバイオセンサーにかけ、出力電流信号を測定することによって求められる。ヒスタミンの測定は、０．３０ボルト〜０．５０ボルトの電位範囲で実施される。固定化酵素を使用するヒスタミン測定に対する最適電位は、０．３５ボルトである。０．３５ボルトにおける電子移動の機構は、形成生成物、すなわち、イミダゾールアセトアルデヒドの電解酸化を介して生じ、Ｋａｐｅｌｌｅｒ  Ａｄｌｅｒ及びＦｌｅｔｃｈｅｒ（１９５９）が提案するように、イミダゾールアセトアルデヒドは、非常に不安定であり、存在するのが疑わしいので、ジアミンオキシダーゼによっても酸化することができる（Ｌｅｈａｎｅ及びＯｌｌｅｙ、２０００）。本開発のバイオセンサーの出力電流は、ｐＨ依存性であり、６．４〜８．４のｐＨ範囲で検出することができる。しかし、最適の活性は、図３に示すように、ｐＨ７．４で見られる。出力電流はまた、２０秒から始まって、反応時間につれて増加し、５０秒が、ヒスタミン測定に対する最適反応時間である。本発明のバイオセンサーを使用するヒスタミン測定の精度は、９５％信頼性レベルで従来の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法に匹敵する。バイオセンサー及び確立されているＨＰＬＣ法によって求められたヒスタミン濃度の相関関係は、図４に示されている。
【００２１】
本発明の第２の実施形態では、バイオセンサーの３電極系は、スクリーン印刷技術によって小型化される。小型化バイオセンサーは、バイオセンサーの製作に少量の酵素のみしか必要としないこと、かかる小型化バイオセンサーの大量生産が可能であること、及びしたがって、使い捨て型のバイオセンサーを実現することができることなどの数種の利点を提供する。本発明の小型化バイオセンサーは、作用電極と、対電極と、参照電極とを備え、電極のすべてが基板上にスクリーン印刷される。好ましくは、バイオセンサーは、カーボンペースト系のスクリーン印刷作用電極及び対電極、並びに塩化銀（ＡｇＣｌ）ペースト系スクリーン印刷参照電極を備える。３つの電極はすべてポリエステル基板上にスクリーン印刷される。
【００２２】
前記の実施形態に記載されたように、ジアミンオキシダーゼは、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）によってスクリーン印刷作用電極の表面に固定化される。本発明のバイオセンサーは、バイオセンサーの感度を増加させるためにメディエータとしてヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムを使用することによって、前記したバイオセンサーから改変される。ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムは、サイクリックボルタンメトリ法によって、スクリーン印刷作用電極の表面に電着される。０．１Ｍヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムの脱イオン水溶液中で、電極は、撹拌しながら０．２ｖｓ−１で少なくとも１５回サイクルされる。次いで、改変電極は、大容積の脱イオン水を用いて洗浄され、すすがれ、使用するまで室温で乾燥状態で貯蔵される。
【００２３】
本発明のバイオセンサーは、以下に示すように、メディエータの電子流によって試料中のヒスタミンを検出する。
【化２】
2010522323.tif 000003
【００２４】
ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムは、そのバイオ電気化学的な特性が優れているので、バイオセンサー用のメディエータとして用いられる。［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−は、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−に容易に還元される。この特性によって、酸化された［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−と還元された［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−の双方がスクリーン印刷作用電極の表面に堆積することが可能になる。以下の式１に示すように固定化ジアミンオキシダーゼがヒスタミンと反応すると、電極の表面に過酸化水素が生成する。
【化３】
2010522323.tif 000004
Ｈ２Ｏ２＋２Ｆｅ（ＣＮ）６４−＋２Ｈ＋→２Ｈ２Ｏ＋２Ｆｅ（ＣＮ）６３−        （２）
Ｆｅ（ＣＮ）６３−＋ｅ→Ｆｅ（ＣＮ）６４−                                 （３）
【００２５】
以下の過程（式２）が起こるのは、電子受容体などのメディエータが酸素を過酸化水素に還元する触媒能を有するからである。次いで、再利用するために、式３で示すように［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−が［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−に還元される。
【００２６】
本発明のバイオセンサーは、ヒスタミン最高２００ｐｐｍまでの応答範囲を有する。図５に示す直線応答範囲によって、このバイオセンサーが前記実施形態に比較して最高８０ｐｐｍという、より広い範囲のヒスタミンを検出することが分かる。バイオセンサーの感度は、５．３１ｎＡ  ｐｐｍ−１である。バイオセンサーの動作条件は、前記実施形態で記載した通りであり、電位範囲は、０．３０ボルト〜０．５０ボルト、好ましくは０．３５ボルトであり、ｐＨ範囲は、６．４〜８．４、好ましくはｐＨ７．４であり、反応時間は、２０秒が最小であり、ヒスタミン測定の最適反応時間は５０秒である。
【００２７】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するのみのためのものであり、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではない。
【００２８】
実際試料の分析
車エビ（Ｐｅｎａｅｕｓ  ｍｏｎｏｄｏｎ）を３０℃±２℃で０〜５時間曝露し、毎時間試料を採集した。車エビの殻、頭部、及び尾を取り除き、車エビの胴体領域約１０ｇを０．１Ｍ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液１００ｍｌとブレンドした。次いで、いかなる予備処理又は抽出ステップもなしで、本開発のバイオセンサーを使用して試料を分析した。０．３５ボルトで操作されたＧＰＥＳソフトウエアを備えたＡｕｔｏｌａｂ  ＰＧＳＴＡＴ  １２  Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔを使用して測定を実施した。０．１Ｍ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を含むビーカー内で試料を試験した。
【００２９】
その一方で、Ｍｏｐｐｅｒ及びＳｃｉａｃｃｈｉｔａｎｏ（１９９４）によって記載されているように、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法では、試料からヒスタミンを抽出することが必要であった。試料をメタノールとブレンドし、抽出物１と脱イオン水１０の比（１：１０）に従って希釈した。次いで、ヒスタミンの精製を、Ｖａｌｅ及びＧｌｏｒｉａ（１９９７）によって報告されている通りに実施した。最後に、２５４ｎｍでのベンゾイル化環の検出を増進するために抽出試料を誘導体化した（Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ、１９９３）。Ｗａｔｅｒｓ  １５００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ  Ｐｕｍｐ及び粒径５μｍの４．６ｍｍ×２５０ｍｍＩ．Ｄ．Ｃ１８カラムを使用する定組成逆相ＨＰＬＣによって、ベンゾイル化ヒスタミンの分離を実施し、Ｗａｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ２４８７  Ｄｕａｌ  λ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて、２５４ｎｍにおける分光光度法でヒスタミンを検出した。
【００３０】
小型化バイオセンサーの製作
小型化バイオセンサーの構築では厚膜技術を適用した。というのは、この技術によって、固体状態の機械的に強固な平面センサーを構築することが可能になるからである。これは、スクリーン印刷プロセスによって基板上に厚膜を順次堆積させて実施される。バイオセンサーの構造は、絶縁性担体又は基板上に順次堆積したペースト層を備える。本発明の小型化バイオセンサーを、半自動化ＤＥＫ−Ｊ２０２ＲＳ厚膜プリンタを使用する多段スクリーン印刷法によって製造した。モノフィラメントポリエステル（ＳＥＦＡＲ（登録商標）ＰＥＴ  １０００）ステンシル（規格９０−４８Ｗ）の高弾性率メッシュを、スクリーンメッシュに固定された正方形パッドに平行なストレートで短く広い導電体として設計した。これによって、円形パッドを有する曲がった狭い導電体の設計に比較してより良好な導電率がもたらされる。印刷ペーストに対するエマルジョン厚さが１２μｍ±２μｍで、ステンレス鋼スクリーンメッシュ（地金厚７８μｍ）を４５°でプリントストロークに載せた。３つの電極をポリエステル基板上にスクリーン印刷した（５０×６０ｍｍ）。印刷プロセスの前に、ポリエステルシートをオーブンで１３０℃５時間焼くことによって、次の加熱ステップ中にホイルが収縮するのを防止した。各印刷サイクルによって、単一片のポリエステル基板上に、カーボンペースト（Ｓｃｒｅｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢＢＩ  ４４０）作用電極及び対電極、並びに塩化銀（ＡｇＣｌ）ペースト（Ｄｕｐｏｎｔ、Ｂ１６６）参照電極を備える３つの小型化スクリーン印刷電極が製造された。銀層（Ｄｕｐｏｎｔ、Ｂ１１１）を基底トラック層として印刷することによって基板状のペーストの導電率及び接着性を増進させた。各層を印刷した後、ペーストをオーブンで１１０℃１０分間乾燥することによって溶媒を揮発させた。
【００３１】
本発明の特定の実施形態を説明したが、本発明の範囲を逸脱することなく本発明に対する多様な変更及び改変を実施できることは当業者には明らかであろう。本発明の範囲内にあるかかる改変形態のすべては添付の特許請求の範囲においてカバーされるものである。
【図１】
2010522323.tif 000005
【図２】
2010522323.tif 000006
【図３】
2010522323.tif 000007
【図４】
2010522323.tif 000008
【図５】
2010522323.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月15日(2008.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用電極と、対電極と、参照電極とを備え、前記作用電極がスクリーン印刷電極であるヒスタミン測定用の電流測定バイオセンサーであって、ジアミンオキシダーゼが滴下コーティングを介してスクリーン印刷作用電極の表面上にポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）とともに固定化されることを特徴とする電流測定バイオセンサー。
【請求項２】
スクリーン印刷作用電極がカーボンペースト系である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
対電極が白金棒である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
参照電極が銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
滴下コーティングを介して、スクリーン印刷作用電極の表面上にジアミンオキシダーゼをポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）とともに固定化する方法であって、
ａ）ジアミンオキシダーゼ溶液をポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合するステップと、
ｂ）スクリーン印刷作用電極の表面上にこの混合物を滴下コーティングするステップと、
ｃ）電極を光硬化させるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
ジアミンオキシダーゼが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合する前にリン酸緩衝液に溶解される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ジアミンオキシダーゼ溶液が、比１：４に従ってポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合される、請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項８】
電極が、窒素ガス流下、ＵＶ曝露ユニット内で３００秒間光硬化する、請求項５から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）ヒスタミンを含む疑いのある試料を請求項１から４までのいずれか一項に記載のバイオセンサーにかけるステップと、
ｂ）電流を測定することによってヒスタミンの存在を示す出力信号を提供するステップと
を含むヒスタミンの測定方法。
【請求項１０】
ヒスタミン測定用の電圧範囲が、０．３０ボルト〜０．５０ボルトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ヒスタミン測定用の電圧が、好ましくは０．３５ボルトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒスタミン測定用のｐＨ範囲が、６．４〜８．４である、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒスタミン測定用のｐＨが、好ましくは７．４である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒスタミンを測定するための反応時間が２０秒以上である、請求項９から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒスタミンを測定するための反応時間が、好ましくは５０秒である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
作用電極と、対電極と、参照電極とを備え、電極すべてが基板上にスクリーン印刷されるヒスタミン測定用の電流測定バイオセンサーであって、ジアミンオキシダーゼが滴下コーティングを介してポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）とともに固定化され、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムが、スクリーン印刷作用電極の表面上に電着されることを特徴とする電流測定バイオセンサー。
【請求項１７】
スクリーン印刷作用電極及び対電極がカーボンペースト系である、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
スクリーン印刷参照電極が、塩化銀（ＡｇＣｌ）ペースト系のスクリーン印刷電極である、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
電極が、ポリエステル基板上にスクリーン印刷される、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
バイオセンサーが、基底トラック層として印刷された銀層をさらに備える、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
ジアミンオキシダーゼが、
ａ）ジアミンオキシダーゼ溶液をポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合するステップと、
ｂ）スクリーン印刷作用電極の表面上にこの混合物を滴下コーティングするステップと、
ｃ）電極を光硬化させるステップと
によって、滴下コーティングを介してポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）とともに固定化される、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項２２】
ジアミンオキシダーゼが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合する前にリン酸緩衝液に溶解される、請求項２１に記載のバイオセンサー。
【請求項２３】
ジアミンオキシダーゼ溶液が、比１：４に従ってポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（光ＨＥＭＡ）と混合される、請求項２１又は請求項２２に記載のバイオセンサー。
【請求項２４】
電極が、窒素ガス流下、ＵＶ曝露ユニット内で３００秒間光硬化する、請求項２１から２３までのいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２５】
ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムが、撹拌しながらヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム溶液中でスクリーン印刷作用電極をサイクルさせるステップを含むサイクリックボルタンメトリ法によって電着される、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項２６】
電極が、０．１Ｍヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウムの脱イオン水溶液中で撹拌しながら０．２ｖｓ−１で少なくとも１５回サイクルされる、請求項２５に記載のバイオセンサー。
【請求項２７】
ａ）ヒスタミンを含む疑いのある試料を請求項１６から２０までのいずれか一項に記載のバイオセンサーにかけるステップと、
ｂ）電流を測定することによってヒスタミンの存在を示す出力信号を提供するステップと
を含むヒスタミンの測定方法。
【請求項２８】
ヒスタミン測定用の電圧範囲が、０．３０ボルト〜０．５０ボルトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ヒスタミン測定用の電圧が、好ましくは０．３５ボルトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ヒスタミン測定用のｐＨ範囲が、６．４〜８．４である、請求項２７から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ヒスタミン測定用のｐＨが、好ましくは７．４である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ヒスタミンを測定するための反応時間が２０秒以上である、請求項２７から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ヒスタミンを測定するための反応時間が、好ましくは５０秒である、請求項３２に記載の方法。
【国際調査報告】
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