(57)【要約】  本発明は、神経疾患の分野、とりわけ、アルツハイマー病の分野に関する。具体的に、本発明は、テトラスパニンウェブファミリー及び関連タンパク質から選択されるアルツハイマー病に対する細胞外標的を提供する。さらに、アミロイド−β生成の阻害のための、標的に対するｓｉＲＮＡ及び抗体の使用のための、ゆえにアルツハイマー病の治療のための、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための薬剤の製造のための、ＰＴＧＦＲＮ（配列番号２）、ＣＤ８１（配列番号４）及びＳＬＣ３Ａ２（配列番号６）からなるリストから選択される、テトラスパニンウェブファミリーメンバーに結合する抗体の使用。
【請求項２】
アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための薬剤の製造のための、ＰＴＧＦＲＮ（配列番号１）、ＣＤ８１（配列番号３）及びＳＬＣ３Ａ２（配列番号５）からなるリストから選択されるテトラスパニンウェブファミリーメンバーをコードするＲＮＡ分子とハイブリッド形成する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用。
【請求項３】
センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ２本鎖を形成し、センスＲＮＡ鎖が、配列番号１又は３又は５の約１９から約２５の連続ヌクレオチドの標的配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含む単離ｓｉＲＮＡの有効量を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経性疾患の分野及び、とりわけアルツハイマー病の分野に関する。具体的に、本発明は、テトラスパニンウェブファミリー及び関連タンパク質から選択されるアルツハイマー病に対する細胞外標的を提供する。さらに、アミロイド−β産生の阻害のための、ゆえにアルツハイマー病の治療のための、標的に対するｓｉＲＮＡ及び抗体の使用のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
全ての細胞生物学的プロセスは、一時的又は安定的なタンパク質の物理学的相互作用に依存し、これらは、脂質、糖及びその他の生体分子と会合して、細胞において複合体及び機能的ネットワークを形成する。これらの相互作用は、タンパク質機能の極めて重要な局面である。「膜内切断プロテアーゼ（ｉＣＬｉＰｓ）」ファミリーのアスパルチルプロテアーゼであるγ−セクレターゼは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳における老人斑の主要成分であるβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の生成に関与する多タンパク質複合体である。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）以外に、γ−セクレターゼはまた、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎ−カドヘリン、ＥｒｂＢ−４及びシンデカン−３などの多岐にわたる生物学的プロセスに関与する多くの１型膜タンパク質も切断する１。細胞表面、エンドソーム区画及び再生区画は、γ−セクレターゼ活性の主要な場所として示唆されている２。
【０００３】
γ−セクレターゼのコアは、４つの高度疎水性タンパク質からなる（即ち、プレセニリン（ＰＳ）、ニカストリン（ＮＣＴ）、咽頭前部欠損（Ａａｎｔｅｒｉｏｒ  ｐｈａｒｙｎｘ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ−１（Ａｐｈ−１）及びプレセニリンエンハンサー−２（Ｐｅｎ−２）３。２つの異なるプレセニリン（ＰＳ１及びＰＳ２）は、元来、早期発症常染色体優性遺伝ＡＤに対する主要な遺伝子座の産物として同定された。ＰＳ１及びＰＳ２は、γ−セクレターゼ複合体に対する、２つの隣接する膜貫通ドメイン内のアスパラギン酸塩のペアからなる触媒部位を提供する４、５。ＮＣＴは、基質認識に関与し６、一方、Ａｐｈ−１及びＰｅｎ−２の機能的役割は完全には明らかになっていない。これらの４つのタンパク質は、活性複合体を形成するために必要とされる最小構成要素である。例えば、これらのタンパク質を発現しない酵母細胞において、４つの構成要素が一緒に発現された場合のみ、γ−セクレターゼ活性が再構成された７。哺乳動物及び昆虫細胞において、これらの４つの構成要素は不可欠であり、それらの同時過剰発現の結果、Ａβ分泌増加により測定されるように、γ−セクレターゼ活性が向上する８、９。しかし、活性の向上は、得られるタンパク質発現レベルから予測されるものよりも小さく、このことから、γ−セクレターゼ活性の制御にその他の因子が関与することが示唆される。実際に、γ−セクレターゼ活性を有する高分子量複合体の大きさは、使用される実験条件に依存して、〜２５０ｋＤａから〜２０００ｋＤａで変動し、このことから、コア構成要素と一時的又は安定して相互作用するγ−セクレターゼ複合体又は関連タンパク質のオリゴマー組み立ての何れかが示唆される１０−１４。
【０００４】
実際に、いくつかのタンパク質が、β−カテニン１５、Ｔｍｐ２１１６、ＣＤ１４７１７及びその他１などのＰＳ及び／又はγ−セクレターゼ複合体と相互作用することが示されている。しかし、γ−セクレターゼ活性と相互作用し制御する全てのタンパク質を同定するための包括的アプローチは現在まで公開されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐａｒｋｓ  Ａ．Ｌ．及びＤ．Ｃｕｒｔｉｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２３、２００７年、ｐ．１４０−１５０
【非特許文献２】Ｋａｅｔｈｅｒ  Ｃ．、Ｃ．Ｈａａｓｓ及びＨ．Ｓｔｅｉｎｅｒ、Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．Ｄｉｓ．、３、２００６年、ｐ．２７５−２８３
【非特許文献３】Ｄｅ  Ｓｔｒｏｏｐｅｒ  Ｂ．Ｎｅｕｒｏｎ  ３８、２００３年、ｐ．９−１２
【非特許文献４】Ｄｅ  Ｓｔｒｏｏｐｅｒ  Ｂ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１、１９９８年、ｐ．３８７−３９０
【非特許文献５】Ｗｏｌｆｅ  Ｍ．Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９８、１９９９年、ｐ．５１３−５１７
【非特許文献６】Ｓｈａｈ  Ｓ．他、Ｃｅｌｌ  １２２、２００５年、ｐ．４３５−４４７
【非特許文献７】Ｅｄｂａｕｅｒ  Ｄ．他、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５、２００３年、ｐ．４８６−４８８
【非特許文献８】Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  Ｗ．Ｔ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００、２００３年、ｐ．６３８２−６３８７
【非特許文献９】Ｔａｋａｓｕｇｉ、Ｎ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ４２２、２００３年、ｐ．４３８−４４１
【非特許文献１０】Ｃａｐｅｌｌ  Ａ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、１９９８年、ｐ．３２０５−３２１１
【非特許文献１１】Ｙｕ  Ｇ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、１９９８年、ｐ．１６４７０−１６４７５
【非特許文献１２】Ｌｉ  Ｙ．Ｍ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７、２０００年、ｐ．６１３８−６１４３
【非特許文献１３】Ｅｄｂａｕｅｒ  Ｄ．、Ｅ．Ｗｉｎｋｌｅｒ、Ｃ．Ｈａａｓｓ及びＨ．Ｓｔｅｉｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９、２００２年、ｐ．８６６６−８６７１
【非特許文献１４】Ｅｖｉｎ  Ｇ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４、２００５年、ｐ．４３３２−４３４１
【非特許文献１５】Ｚｈｏｕ  Ｊ．他、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８、１９９７年、ｐ．１４８９−１４９４
【非特許文献１６】Ｃｈｅｎ  Ｆ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ４４０、２００６年、ｐ．１２０８−１２１２
【非特許文献１７】Ｚｈｏｕ  Ｓ．、Ｈ．Ｚｈｏｕ、Ｐ．Ｊ．Ｗａｌｉａｎ及びＢ．Ｋ．Ｊａｐ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２、２００５年、ｐ．７４９９−７５０４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
γ−セクレターゼを制御するタンパク質の同定によってまた、ＡＤに対する薬剤の開発のための新しい分子標的も提供され得る。従って、発明者らは、ＰＳにおいてタンデムアフィニティータグ（ＴＡＰ−タグ）を使用し、そのインタラクトームをマッピングするためにタンデムアフィニティータグ精製（ＴＡＰ）を適用した。ＴＡＰは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１８、１９において主に使用されてきたが、最近、ＴＮＦ−α／ＮＦ−κＢ経路のインタラクトームもこの方法で哺乳動物細胞においてマッピングされた２０。ＴＡＰアプローチの主要な長所は、２つの高親和性結合段階及び２つの特異性が高い溶出段階の組み合わせであり、その結果、相互作用するタンパク質が効率的に濃縮される。
【０００７】
このストラテジーを用いることにより、発明者らは、細胞膜においてγ−セクレターゼが部分的にテトラスパニンウェブと会合することを初めて示すことができた。発明者らは、ＲＮＡｉ実験及び分別実験を用いてこのタンパク質を確認した。そのようにすることによって、テトラスパニンウェブファミリー由来の３つのタンパク質が、アルツハイマー病に対する細胞外標的であることが分かった。従って、標的において結合する分子は、ＡＤを治療するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ｄＴａｇ  ＰＳ及びｄＴａｇ  ＳＰＰＬ３の安定発現及びＴＡＰ−タグ精製。（ａ）ＰＳ  ｄＫＯ  ＭＥＦ細胞におけるｄＴａｇ  ＰＳの安定発現。γ−セクレターゼ構成要素及びＦＬＡＧ（Ｍ２）に対する抗体を用いてウエスタンブロットによってＭＥＦ細胞の細胞溶解液を分析した。ｄＴａｇ  ＰＳ１又はＰＳ２の発現により、ニカストリンの成熟及びＰｅｎ−２の安定化が回復した。ニカストリンの、ＰＳ１全長（ｆｌ）、Ｎ−末端断片（ＮＴＦ）、成熟（ｍ）及び未成熟（ｉ）形態を示す。（ｂ）ＰＳ  ｄＫＯ  ＭＥＦ細胞におけるｄＴａｇ  ＳＰＰＬ３の安定発現。ウエスタンブロット分析から、ｄＴａｇ  ＳＰＰＬ３によりγ−セクレターゼ成熟が回復できないことが示される。（ｃ）ＴＡＰ−タグ精製の略図。（ｄ）ｄＴａｇ  ＰＳ１のＴＡＰ−タグ精製。ウエスタンブロットにより各分画の当量を分析した。γ−セクレターゼ構成要素は精製分画において定量的に維持された（Ｍ２及びＣａＭ溶出液）。ＣＴＦ、Ｃ末端断片。（ｅ）精製分画のインビトロγ−セクレターゼアッセイ。各分画の当量を組み換え基質ＡＰＰ  Ｃ９９−３ｘＦＬＡＧと混合し、３７℃で温置し、抗Ａβ抗体（Ｗ０−２）を用いてウエスタンブロットにより分析した。Ａβのデノボ生成から、活性γ−セクレターゼの定量的回収が示される。（ｆ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＴＡＰ精製ｄＴａｇ  ＰＳ１分画（３段階）を分離し、クーマシーブルーで染色した。矢印はγ−セクレターゼ構成要素の予想位置を示す。左レーン、分子標準。
【図２】ｄＴａｇ  ＰＳ２、ＳＰＰＬ３及びＰＳ  ｄＫＯ  ＭＥＦ細胞のＴＡＰ−タグ精製。（ａ）ｄＴａｇ  ＰＳ２のＴＡＰ−タグ精製。ウエスタンブロットにより各分画を分析した。精製分画においてγ−セクレターゼ構成要素が保持された。（ｂ）ｄＴａｇ  ＳＰＰＬ３のＴＡＰ−タグ精製及び各分画のウエスタンブロット分析。γ−セクレターゼ構成要素はＭ２フロースルー中に残存した。（ｃ）ＰＳ  ｄＫＯ  ＭＥＦ細胞からの対照ＴＡＰ−タグ精製。
【図３】膜輸送及び膜構成に関与するＰＳ相互作用タンパク質。（ａ）膜輸送及び膜構成に関与するＰＳ相互作用タンパク質を説明とともに示す。（ｂ）パネルに列挙されたタンパク質は、ＥＲとゴルジとの間の順行性及び逆行性経路及び原形質膜から／原形質膜へのエンドサイトーシス／再循環経路に寄与する。ＰＭ、原形質膜；ＥＥ、初期エンドソーム；ＬＥ、後期エンドソーム；ＬＹ、ライソソーム；ＥＲＡＤ、ＥＲ関連分解。
【図４】ＰＳ相互作用タンパク質及びＡβ分泌におけるｓｉＲＮＡ介在ノックダウンの影響。（ａ）テトラスパニンウェブの略図。タンパク質間の矢印は、文献において実験的に示されている結合相互作用を指す３５、３６、５０。点線は、相互作用の様々なレベルに相当する。テトラスパニンウェブの形成に関与するか又はテトラスパニンウェブと側方に会合するＰＳ相互作用タンパク質が示される。（ｂ）ＨＥＫ２９３  ＡＰＰＳｗ細胞におけるＰＳ相互作用タンパク質のＲＮＡｉ介在ノックダウンの影響は、Ａβ分泌におけるテトラスパニンウェブに関与する。遺伝子移入から４８時間後に、分泌されたＡβ４０及びＡβ４２を特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｙ軸は、Ａβ対照レベルに対する％を表す（対照ｓｉＲＮＡプールを用いた遺伝子移入）。６回の試験の平均値及びＳＥＭとしてデータを表す。有意差は、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；及び＊＊＊Ｐ＜０．００１で設定した。（ｃ）ＨｅＬａ細胞におけるテトラスパニンウェブタンパク質のｓｉＲＮＡ介在ノックダウン。遺伝子移入から４８時間後、可溶化総細胞溶解液をウエスタンブロットにより分析した。結果は二つ組の試験で示される。（ｄ）ＨｅＬａ細胞におけるテトラスパニンウェブタンパク質のノックダウンにおけるγ−セクレターゼ活性。パネルｃのように、ＨｅＬａ細胞にｓｉＲＮＡを遺伝子移入し、続いて、ＡＰＰＳｗの発現を促進する組み換えアデノウイルスを感染させた。分泌されたＡβ４０及びＡβ４２をＥＬＩＳＡにより測定した。Ａβレベルは、対照ｓｉＲＮＡプールで処理された細胞におけるものと関連する。３回の独立した実験の平均値及びＳＥＭとしてデータを示す。有意差は＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１で設定した。
【図５Ａ】γ−セクレターゼ調節因子に対するＲＮＡｉスクリーニング。膜輸送及び、輸送体活性を有するタンパク質及び細胞接着分子などのその他のものに関与するＰＳ相互作用タンパク質のヒトオルソログを標的とするｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３  ＡＰＰＳｗ細胞に遺伝子移入した。遺伝子移入から４８時間後に特異的ＥＬＩＳＡによって、分泌されたＡβ４０及びＡβ４２を測定した。Ｙ軸は、対照細胞におけるＡβレベルに対するＲＮＡｉ処理細胞のＡβレベルを表す（対照ｓｉＲＮＡプールを用いた遺伝子移入）。４回の実験の平均値及びＳＥＭとしてデータを示す。有意差は、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；及び＊＊＊Ｐ＜０．００１で設定した。
【図５Ｂ】γ−セクレターゼ調節因子に対するＲＮＡｉスクリーニング。ＲＮＡｉにおける全長ＡＰＰ、ＡＰＰ  ＣＴＦ及びγ−セクレターゼ構成要素のレベルをウエスタンブロットにより分析した。ノックダウンによりＡβ４０、４２又はこの両方の何れかのレベルを有意に変化させたタンパク質を分析用に選択した。ＶＣＰのＲＮＡｉ、Ｍｙａｄｍ及び４Ｆ２ｌｃもまた、ＡＰＰ発現及びＡＰＰ−ＣＴＦのレベルに影響を与えたことに注意。このことから、これらのタンパク質が、γ−セクレターゼのレベルだけでなく、ＡＰＰ輸送のレベルでもＡＰＰプロセシングに影響を与えることが示唆される。
【図６】ｐ２４ファミリータンパク質のｓｉＲＮＡ介在ノックダウン。（ａ）Ｔｍｐ２１及びｐ２４ａ  ｓｉＲＮＡを遺伝子移入したＨＥＫ２９３  ＡＰＰＳｗ細胞のウエスタンブロット。この細胞にｓｉＲＮＡを２回遺伝子移入し、２回目の遺伝子移入から５６時間後に細胞を溶解させた。既に示されるように、Ｔｍｐ２１のノックダウンにより、ｐ２４ａのレベルが低下し、逆もまた同様であった。ｐ２４ａ  ＲＮＡｉはＡＰＰレベルに影響を与えた。（ｂ）分泌されるＡβをＥＬＩＳＡにより測定した。Ｔｍｐ２１のノックダウンによりＡβ４０が僅かに増加し、一方、ｐ２４ａによりＡβ４０及びＡβ４２の両方が減少した。３回の独立した実験の平均値及びＳＥＭとしてデータを示す。有意差は＊＊＊Ｐ＜０．００１で設定した。
【図７】テトラスパニン関連タンパク質の過剰発現。（ａ）ＦＰＲＰ、ＰＧＲＬ、ＣＤ９８ｈｃ（左パネル）、ＣＤ８１−Ｖ５、Ｕｐｋ１ｂ−Ｖ５（中央パネル）及びＣＤ９（右パネル）を一時的に発現したＨＥＫ２９３  ＡＰＰＳｗ細胞のウエスタンブロット分析。遺伝子移入から３６時間後にこの細胞を回収した。ＦＰＲＰ又はＰＧＲＬの発現によりＣＤ９８ｈｃのレベルが上昇した。（ｂ）分泌されるＡβをＥＬＩＳＡにより測定した。３回の独立した実験の平均値及びＳＥＭとしてデータを示す。有意差は、＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１で設定した。
【図８】γ−セクレターゼとテトラスパニンウェブ関連タンパク質との間の生理学的相互作用。（ａ）免疫共沈降による、γ−セクレターゼ複合体とテトラスパニンウェブタンパク質との間の相互作用の確認。抗Ａｐｈ−１ａ（Ｂ８０．３）又は免疫前血清（対照）により１％ＣＨＡＰＳＯ−可溶化ＨＥＫ２９３膜を沈殿させ、沈殿物をウエスタンブロットにより分析した。テトラスパニンＣＤ９（ＭＳ実験で同定されなかった。）もまたγ−セクレターゼ複合体と会合することが分かったことに注意。（ｂ）ＦＰＲＰ免疫共沈降γ−セクレターゼ構成要素。抗ＦＰＲＰ（１Ｆ１１）又はアイソタイプ対照抗体とともに１％ＣＨＡＰＳＯ−可溶化ＨＥＫ２９３膜を温置し、ウエスタンブロットにより分析した。ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＰＲＰ（ｃ）及びＰＧＲＬ（ｄ）の安定過剰発現。安定細胞からのＦＰＲＰ（１Ｆ１１）及びＰＧＲＬ（８Ａ１２）の免疫沈降から、ｗｔ細胞と比較して、γ−セクレターゼ構成要素との会合が増加することが示された。アスタリスクはＩｇバンドを示す。ＨＥＫ２９３細胞における内因性ＰＧＲＬの発現レベルは、検出レベル未満であり、ＰＧＲＬは、抗ＰＧＲＬ（ｄ）との沈降後のみ検出された。
【図９】ＣＤ８１及びＣＤ９欠損ＭＥＦにおけるγ−セクレターゼ基質のＣＴＦの蓄積。ＣＤ８１又はＣＤ９が欠損したＭＥＦ細胞における内因性γ−セクレターゼ基質のＣ末端断片（ＣＴＦ）のレベルをウエスタンブロットにより分析した（左パネル）。ＣＴＦの蓄積を示すために、１０μＭ  γ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴで処理したＷｔ  ＭＥＦ細胞を対照（ｗｔ＋阻害剤）として使用した。これらの細胞における個々のγ−セクレターゼ構成要素又は基質のレベルは不変である（右パネル）。
【図１０】ショ糖密度勾配におけるテトラスパニンウェブタンパク質及びγ−セクレターゼ構成要素の共分布。１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％ＤＤＭ、１％ＣＨＡＰＳＯ又は１％Ｂｒｉｊ９９でＨＥＫ２９３細胞を可溶化し、不連続ショ糖密度勾配で分離した。１３個の分画を最上部から回収し、ウエスタンブロットにより分析した。これらの実験において、膜／脂質ドメインは、それらが会合し続ける場合、最上部の分画に浮上する。相互作用を破壊する界面活性剤が使用される場合、タンパク質は最下層の分画に再分布する。テトラスパニンドメインは１％ＣＨＡＰＳＯ及び１％Ｂｒｉｊ９９中で維持され続け、γ−セクレターゼ構成要素はこの勾配においてこれらのドメインとともに一緒に分布する。ラフトに対するカベオリン−１マーカーもまた、予想されるようにこれらの実験において浮上することに注意。ＥＲマーカーカルネキシンは、より重い分画中に残る。ラフトを維持するＴＸ−１００又は０．５％ＤＤＭのような界面活性剤はテトラスパニンドメインを解離させており、γ−セクレターゼ複合体はもはや軽い分画で浮上しない。ラフトに対するカベオリンマーカーは軽い分画にとどまり、このことから、実際にラフトドメインがこれらの条件で保持され続けることが示される。
【図１１】テトラスパニンウェブと会合されるγ−セクレターゼは、より長いＡβ種を生成する。テトラスパニンウェブと会合されるγ−セクレターゼのタンパク質分解活性をインビトロアッセイにより測定した。（ａ）ＦＰＲＰを発現するｗｔＨＥＫ２９３細胞及びＨＥＫ２９３からの１％ＣＨＡＰＳＯ−可溶化ミクロソーム膜を抗ＦＰＲＰ、ＰＳ１、Ａｐｈ−１ａ又は対照抗体との免疫沈降に供した。組み換え基質Ｃ９９−３ｘＦＬＡＧと結合複合体を３７℃で３時間温置し、抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）を用いて、得られたＡＩＣＤをウエスタンブロットにより分析した（上パネル）。γ−セクレターゼ阻害剤Ｌ−６８５、４５８の存在下で温置した（インプット＋阻害剤）ｗｔ細胞の膜の反応によって、反応に対する特異性を確認した。抗Ａβ（８２Ｅ１）を用いて、尿素−ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、Ａβ種の生成を測定した（下パネル）。アスタリスクは、基質由来の非特異的バンドを示す。分子標準（Ａβ  ｓｔｄ）として合成Ａβペプチドを使用した。（ｂ）３回の独立実験の免疫ブロットからＡβ生成を定量した。Ａβバンドの強度を測定し、各個々の反応においてＡβの合計に対して正規化した。平均値及びＳＥＭとしてデータを示す。有意差は、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１で設定した。（ｃ）ＭＥＦ細胞の１％ＣＨＡＰＳＯ−可溶化ミクロソーム膜からの抗ＣＤ８１、ＣＤ９及びＰＳ１抗体との免疫沈降と、それに続くインビトロアッセイ。ウエスタンブロットによりＡＩＣＤ及びＡβ種を視覚化した。総Ａβあたりの長いＡβ種の相対比率を測定し、示した（下パネル）。（ｄ）４回の独立実験の免疫ブロットからＡβ生成を定量した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
γ−セクレターゼは、Ｉ型膜タンパク質を切断する、プレセニリン、ニカストリン、Ａｐｈ−１及びＰｅｎ−２を含有する高分子量複合体である。これらの４つの構成要素は、γ−セクレターゼ活性に必要であり十分であるが、さらなるタンパク質が相互作用し得る。従って、発明者らは、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）法を用いて、再構成プレセニリン−欠損繊維芽細胞から活性γ−セクレターゼ複合体を精製した。発明者らは、複合体成熟、膜輸送及びテトラスパニンウェブファミリーに関与するタンパク質を同定した。小さな、４つの膜貫通ドメインタンパク質（３５０アミノ酸以下）のテトラスパニンスーパーファミリーは、ヒト及びマウスにおいて３３のメンバーからなり、卵−精子融合、免疫学的反応及び組織分化と同じように多様な生理的プロセスに関与するタンパク質を含む。
【００１０】
トポロジー予測に従い、テトラスパニンは、２つの細胞外ドメイン（小細胞外ループ及び大細胞外ループ（ＬＥＬ）と呼ばれることが多い。）及び３つの比較的短い細胞質領域を有する。以前の実験からテトラスパニンが互いに相互作用し、ミクロドメインの新規クラスの組み立てに対する構造プラットフォームを形成することが証明された（テトラスパニンに富むミクロドメイン（ＴＥＲＭ、ＴＥＭ）又は「テトラスパニンウェブ」と呼ばれる。）。同型及び異型相互作用のネットワークを通じて、テトラスパニンは原形質膜において会合膜貫通受容体（例えば、インテグリン、受容体チロシンキナーゼ）の空間的並置を制御し、その結果、シグナル伝達経路が調整されることが提案されている。
【００１１】
テトラスパニンがそれらの会合パートナーの生合成成熟及び輸送を制御する新たな証拠もある。本発明において、発明者らは、γ−セクレターゼ複合体と生理学的に相互作用するだけでなく、アミロイドβの生成にも影響を与える３つのテトラスパニンウェブファミリーメンバーを同定した。従って、この３つのテトラスパニンウェブファミリーメンバー（ＣＤ８１、ＰＴＧＦＲＮ及びＳＬＣ３Ａ２）は、γ−セクレターゼ複合体の活性に影響を与える。この３つのテトラスパニンウェブファミリーメンバーのそれぞれの活性の下方制御により、アミロイドβの生成が減少する。従って、アルツハイマー病の治療のための薬剤を製造するために、ＣＤ８１、ＰＴＧＦＲＮ及び／又はＳＬＣ３Ａ２の発現を阻害する分子を使用することができる。
【００１２】
ＰＴＧＦＲＮ（又はプロスタグランジンＦ２−α受容体関連タンパク質又はプロスタグランジンＦ２−α受容体制御タンパク質又はプロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子の前駆体又はＣＤ３１５抗原又はＦＰＲＰ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１及び２で示す。
【００１３】
ＣＤ８１のヌクレオチド及びアミノ酸配列（又は増殖抑制抗体１又はテトラスパニン−２８又はＴＡＰＡＩの標的）はそれぞれ配列番号３及び４で示す。
【００１４】
ＳＬＣ３Ａ２（又はＣＤ９８抗原又はＭＤＵ１又はＮＡＣＡＥ又は４ｆ２細胞表面抗原重鎖）のヌクレオチド及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５及び６です。
【００１５】
特定の実施形態において、ＰＴＧＦＲＮ、ＣＤ８１又はＳＬＣ３Ａ２の発現を阻害する分子は低分子干渉ＲＮＡ分子である。
【００１６】
従って、本発明は、アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための薬剤の製造のための、ＰＴＧＦＲＮ（配列番号１）、ＣＤ８１（配列番号３）及びＳＬＣ３Ａ２（配列番号５）からなるリストから選択されるテトラスパニンウェブファミリーメンバーをコードするＲＮＡ分子とハイブリッド形成する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を提供する。ｓｉＲＮＡ配列は表２で示す。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖を含む単離ｓｉＲＮＡの有効量を含む医薬組成物を提供し、この場合、センス及びアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ２本鎖を形成し、センスＲＮＡ鎖は、配列番号１又は３又は５における約１９から約２５連続ヌクレオチドの標的配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。従って、特に、本発明は、配列番号１、３及び／又は５の標的ｍＲＮＡに標的化される、約１９から約２５ヌクレオチド長の短い２本鎖ＲＮＡを含む単離ｓｉＲＮＡを提供する。このｓｉＲＮＡは、標準的ワトソン−クリック塩基対形成相互作用によって（本明細書中で以後「塩基対形成される」と呼ぶ。）一緒にアニーリングされるセンスＲＮＡ鎖及び相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的ｍＲＮＡ内に含有される標的配列と同一である核酸配列を含む。本ｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、２つの相補的な１本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、又は、２つの相補的部分が塩基対形成され、１本鎖「ヘアピン」領域により共有結合される、単一分子を含み得る。「単離された」という用語は、人間の介入を通じて天然の状態から改変されるか又は除去されることを意味する。例えば、生きている動物において天然に存在するｓｉＲＮＡは「単離され」ていないが、合成ｓｉＲＮＡ又は、部分的又は完全にその天然状態の共に存在する物質から分離されるｓｉＲＮＡは、「単離され」ている。単離ｓｉＲＮＡは、実質的に純粋な形態で存在し得るか又は例えばｉＲＮＡが送達された細胞などの非天然環境に存在し得る。
【００１８】
本発明のｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ又は組み換え産生ＲＮＡならびに、１以上のヌクレオチドの、付加、欠失、置換及び／又は改変により天然のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含み得る。このような改変には、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性となるようにする修飾を含む、ｓｉＲＮＡの末端又はｓｉＲＮＡの１以上の内部ヌクレオチドになどに対する、非ヌクレオチド物質の付加が含まれ得る。
【００１９】
本発明のｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖はまた３’突出部も含み得る。「３’突出部」は、ＲＮＡ鎖の３’末端から伸びる少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。従って、ある実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、１から約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを含む。）長の、好ましくは１から約５ヌクレオチド長の、より好ましくは１から約４ヌクレオチド長の、及び特に好ましくは約１から約４ヌクレオチド長の、少なくとも１つの３’突出部を含む。
【００２０】
ｓｉＲＮＡ分子の両鎖が３’突出部を含む実施形態において、突出部の長さは、各鎖に対して同じ又は異なり得る。最も好ましい実施形態において、３’突出部は、ｓｉＲＮＡの両鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。本ｓｉＲＮＡの安定性を促進するために、３’突出部はまた分解に対しても安定化され得る。ある実施形態において、この突出部は、アデノシン又はグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むことにより、安定化される。
【００２１】
あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’−デオキシチミジンでの３’突出部におけるウリジンヌクレオチドの置換は、許容され、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を与えない。特に、２’−デオキシチミジンにおいて２’ヒドロキシルがないことにより、組織培養液中での３’突出部のヌクレアーゼ耐性が顕著に促進される。
【００２２】
何らかの標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）において、本発明のｓｉＲＮＡがおよそ１９−２５連続ヌクレオチドのなんらかのストレッチに標的化され得、この配列は配列番号１、３及び５で示される。ｓｉＲＮＡに対する標的配列を選択するための技術は当技術分野で周知である。従って、本ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡにおける約１９から約２５ヌクレオチドの何らかの連続ストレッチと同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明のｓｉＲＮＡは、当業者にとって公知の多くの技術を用いて得ることができる。例えば、当技術分野で公知の方法を用いて、ｓｉＲＮＡを化学合成するか又は組み換え産生することができる。好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホールアミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて、本発明のｓｉＲＮＡを化学合成する。２つの個別の相補的ＲＮＡ分子として、又は２つの相補領域を有する単一ＲＮＡ分子として、本ｓｉＲＮＡを合成することができる。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の市販業者としては、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ、ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡの一部）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．、ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、ＵＫ）が挙げられる。
【００２４】
あるいは、ｓｉＲＮＡはまた、何らかの適切なプロモーターを用いて、組み換え環状又は直鎖ＤＮＡプラスミドからも発現され得る。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現させるための適切なプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。その他の適切なプロモーターの選択は当技術分野の技術範囲内である。本発明の組み換えプラスミドはまた、特定の組織における又は特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導性又は制御性プロモーターも含み得る。組み換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、標準的技術により培養細胞発現系から単離され得るか又はニューロンにおいて細胞内で発現され得るかの何れかである。
【００２５】
本発明のｓｉＲＮＡはまた、ニューロンにおいて細胞内で組み換えウイルスベクターからも発現され得る。この組み換えウイルスベクターは、本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列及びｓｉＲＮＡ配列を発現させるための何らかの適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。その他の適切なプロモーターの選択は当技術分野の技術の範囲内である。本発明の組み換えウイルスベクターはまた、脳における（例えば海馬ニューロンにおける）ｓｉＲＮＡの発現のための誘導性又は制御性プロモーターも含み得る。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、ｓｉＲＮＡの「有効量」は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ介在分解を引き起こすのに十分な量又は対象において斑形成（又はアミロイド−β４０／４２形成）の進行を阻害するのに十分な量である。標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ介在分解は、上述のようにｍＲＮＡ又はタンパク質を単離及び定量するための標準的技術を用いて、対象の細胞において標的ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを測定することにより検出され得る。
【００２７】
当業者は、対象の大きさ及び体重；疾患侵入の程度；対象の年齢、健康及び性別；投与経路；及び投与が局所的であるか又は全身性であるかなどの因子を考慮することによって、ある一定の対象に投与されるべき本発明のｓｉＲＮＡの有効量を容易に決定することができる。一般に、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、約１ｎＭ（ｎＭ）から約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭから約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭから約１０ｎＭの細胞内濃度を含む。ｓｉＲＮＡのより多い又はより少ない量を投与し得ることが企図される。
【００２８】
本方法は、アルツハイマー病に罹患している患者の脳におけるアミロイド−βの斑形成を予防及び／又は治療するために使用することができる。アルツハイマー病を治療するために、本発明のｓｉＲＮＡとは異なる薬剤と組み合わせて、本発明のｓｉＲＮＡ（１、２又は３つの標的に向けられた１以上のｓｉＲＮＡ）を対象に投与することができる。あるいは、アルツハイマー病を治療するために設計された別の治療法と組み合わせて、対象に本発明のｓｉＲＮＡを投与することができる。
【００２９】
本方法において、裸のｓｉＲＮＡとして、送達試薬と組み合わせて、又はｓｉＲＮＡを発現する組み換えプラスミド又はウイルスベクターとしての何れかで、本ｓｉＲＮＡ（１又は２又は３つの標的に向けられたｓｉＲＮＡの少なくとも１つ又はその組み合わせ）を対象に投与することができる。特定の実施形態において、最初にポリアルギニンストレッチ（ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧＧＧＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）にカップリングされるＲａｂｉｅｓウイルス由来のペプチドにｓｉＲＮＡを結合させる（Ｐ．Ｋｕｍａｒら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４４８（７１４９）：３９−４３参照）（配列番号３５）。本ｓｉＲＮＡと組み合わせた投与のための適切な送達試薬には、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；又はポリカチオン（例えばポリリジン）又はリポソームが含まれる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【００３０】
リポソームは、ｓｉＲＮＡの血中半減期を延長させ得る。本発明での使用に適切であるリポソームは標準的小胞形成脂質から形成され、これには、一般に、中性又は負電荷リン脂質及びステロール（コレステロールなど）が含まれる。脂質の選択は一般に、所望のリポソームの大きさ及び血流中でのリポソームの半減期などの因子を考慮することにより導かれる。好ましくは、本ｓｉＲＮＡを封入するリポソームは、脳に対してリポソームを標的化することができるリガンド分子を含む。好ましいリガンドは、Ｒａｂｉｅｓ  Ｖｉｒｕｓ由来のペプチド（ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ）（配列番号３６）であるが、これは、このペプチドリガンドが脳血管関門を越えることができ、ニューロン膜を越えることもできるからである。
【００３１】
特に好ましくは、本ｓｉＲＮＡを封入するリポソームは、単核マクロファージ及び網内系によるクリアランスを回避するように、例えば、本構造の表面に結合するオプソニン化阻害部分を有することにより、修飾される。ある実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分及びリガンドの両方を含み得る。
【００３２】
本発明のリポソームの調製における使用のためのオプソニン化阻害部分は、通常、リポソーム膜に結合している大きな親水性ポリマーである。本明細書中で使用される場合、オプソニン化阻害部分は、例えば、膜そのものへの脂質溶解性アンカーの挿入によって又は膜脂質の活性基に直接結合させることによって、それが膜に化学的又は物理的に連結されている場合、リポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）及び網内系（「ＲＥＳ」）によりリポソームの取り込みを顕著に低下させる表面保護層を形成する。従って、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、非修飾リポソームよりもかなり長く循環中に残存する。このため、このようなリポソームは、「ステルス」リポソームと呼ばれることがある。好ましくは、オプソニン化阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ又はその誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、「ＰＥＧ付加リポソーム」と呼ばれることがある。
【００３３】
多くの周知の技術の何れか１つにより、オプソニン化阻害部分をリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーにＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを結合させ、次いで膜に結合させることができる。ｓｉＲＮＡはまた、遺伝子銃、エレクトロポレーションによって、又はその他の適切な非経口もしくは腸内投与経路によって、対象に投与することもできる。適切な腸内投与経路には、経口、直腸又は鼻内送達が含まれる。適切な非経口投与経路には、静脈内投与投与（例えば、静脈内ボーラス注入、静脈内点滴、動脈内ボーラス注入、動脈内点滴及び血管系へのカテーテル点滴）；組織周囲及び組織内注入（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注入、網膜内注入又は網膜下注入）；皮下点滴（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を含む皮下注入又はデポジション（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）（浸透圧ポンプによってなど）が含まれる。特定の実施形態において、脳への定位注入を通じて（例えば脳室内注入を通じて）ｓｉＲＮＡが送達される。単回投与で又は複数回投与で本発明のｓｉＲＮＡを投与することができる。本発明のｓｉＲＮＡの投与が点滴による場合、点滴は、単回の持続投与であり得るか又は複数回の点滴により送達され得る。
【００３４】
当業者はまた、ある対象に本発明のｓｉＲＮＡ（即ち少なくとも１つのｓｉＲＮＡ）を投与するための適切な投与計画を容易に決定し得る。例えば、ｓｉＲＮＡは、対象に一度、例えば単回注射又は脳へ直接、デポジション（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）として投与され得る。あるいは、ｓｉＲＮＡは、対象に１日１回又は２回、約３日から約２８日の期間にわたり、より好ましくは約７日から約１０日の期間にわたり、投与することができる。投与計画が複数回投与を含む場合、対象に投与されるｓｉＲＮＡの有効量は、投与計画全体にわたり投与されるｓｉＲＮＡの総量を含み得ることを理解されたい。
【００３５】
本発明のｓｉＲＮＡは、当技術分野で公知の技術に従い、好ましくは対象への投与前に医薬組成物として製剤化される。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり発熱物質不含であることを特徴とする。本明細書中で使用される場合、「医薬製剤」には、ヒト及び獣医学での用途のための製剤が含まれる。本発明の医薬組成物を調製するための方法は当技術分野の技術の範囲内であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．（１９８５）（その全体の開示を参照により本明細書中に組み込む。）に記載されるとおりである。
【００３６】
本医薬製剤は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合される、本発明のｓｉＲＮＡ（例えば、０．１から９０重量％）又は生理学的に許容可能なその塩を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。本発明の医薬組成物はまた、従来の医薬賦形剤及び／又は添加物も含み得る。適切な医薬賦形剤には、安定化剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤及びｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加物には、生理学的に生体適合性の緩衝剤（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（ｃｈｅｌａｎｔ）（例えば、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミドなど）又はカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）の添加又は場合によってはカルシウムもしくはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム）が含まれる。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装され得るか又は凍結乾燥され得る。固形組成物の場合、従来の非毒性固形担体を使用し得る；例えば、医薬グレードの、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどである。例えば、経口投与のための固形医薬組成物は、上記で列挙される担体及び賦形剤の何れか及び１以上の本発明のｓｉＲＮＡ  １０−９５％、好ましくは２５％−７５％を含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、上述のようにリポソームに封入された１以上の本発明のｓｉＲＮＡ  ０．０１−２０重量％、好ましくは１％−１０重量％を含み得る。必要に応じて担体もまた含まれ得る（例えば、鼻内送達のためのレシチン）。
【００３８】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための薬剤の製造のために、ＰＴＧＦＲＮ（配列番号２）、ＣＤ８１（配列番号４）及びＳＬＣ３Ａ２（配列番号６）からなるリストから選択されるテトラスパニンウェブファミリーメンバーに結合する抗体を使用する。
【００３９】
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ又はａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、配列番号２、４及び／又は６又はその何らかの機能的誘導体に特異的に向けられていることを特徴とする抗体に関し、この抗体は好ましくはモノクローナル抗体；その抗原結合断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）もしくは１本鎖Ｆｖ型のもの又はそれ由来の組み換え抗体の何れかのタイプである。配列番号２、４及び／又は６又はその何らかの機能的誘導体に対して調製される特異的ポリクローナル抗血清を含む本発明のこれらの抗体は、その他のタンパク質との交差反応性がない。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、配列番号２、４及び／又は６又はその何らかの機能的誘導体に対して免疫付与された動物の、特にマウス又はラットの脾臓細胞及び骨髄腫細胞株の細胞から古典的方法に従い形成され、配列番号２、４及び／又は６又はその何らかの機能的誘導体（これは、最初、動物の免疫付与のために使用された。）を認識するモノクローナル抗体を産生する能力により選択されるべき何らかのハイブリドーマにより産生され得る。本発明のこの実施形態に従うモノクローナル抗体は、Ｈ及びＬ鎖をコードするマウス及び／又はヒトゲノムＤＮＡ配列又はＨ及びＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンとは異なり、組み換えＤＮＡ技術により作製されたマウスモノクローナル抗体のヒト化型であり得る。
【００４１】
あるいは、本発明の実施形態に従うモノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であり得る。このようなヒトモノクローナル抗体は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３６０５に記載のような重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）再生により、又は米国特許第５，５４５，８０６号に記載のようなヒト抗体を産生できるトランスジェニック非ヒト動物を用いることによって、調製される。また、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２及びｓｃＦｖ（「１本鎖可変断片」）などのこれらのモノクローナル抗体由来の断片は、それらが元の結合特性を維持しているならば、本発明の一部となる。このような断片は、一般に、例えば、パパイン、ペプシン又はその他のプロテアーゼによる抗体の酵素消化により生成される。
【００４２】
モノクローナル抗体又はその断片が様々な使用に対して修飾され得ることは、当業者にとって周知である。本発明に関与する抗体は、酵素的、蛍光又は放射性型の適切な標識で標識され得る。特定の実施形態において、配列番号２、４及び／又は６又はその機能的断片に対する抗体は、ラクダ由来である。ラクダ抗体はＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９４／０４６７８及びＷＯ９７／４９８０５で詳述されている。
【００４３】
「治療するための薬剤」という用語は、アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための、上述のような分子及び医薬的に許容可能な担体又は賦形剤（この両用語は交換可能に使用され得る。）を含む組成物に関する。当業者にとって公知の適切な担体又は賦形剤は、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、固定油、オレイン酸エチル、食塩水中の５％デキストロース、等張性及び化学的安定性を促進する物質、緩衝剤及び保存料である。その他の適切な担体には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸及びアミノ酸コポリマーなど、組成物を投与される個体に有害な抗体の産生をそれ自身が誘導しない何らかの担体が含まれる。
【００４４】
「薬剤」は、当業者の知識の範囲内の何らかの適切な方法により投与され得る。投与の一経路は非経口経路である。非経口投与において、本発明の薬剤は、上記で定義されるような医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせて、溶液、縣濁液又はエマルジョンなどの単位投与注射形態で処方される。しかし、投与量及び投与形式は個々に依存する。一般に、本薬剤は、本発明の抗体が１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは１０μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの間、最も好ましくは０．１から２ｍｇ／ｋｇの間の用量で与えられるように、投与される。好ましくは、これは、ボーラス投与として与えられる。連続点滴も使用され得る。その場合、本薬剤は、５から２０μｇ／ｋｇ／分の間、より好ましくは７から１５μｇ／ｋｇ／分の間の用量で点滴され得る。
【００４５】
アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための薬剤の製造のための例えば配列番号２、４又は６に対する抗体を含む治療組成物の使用が、以下に限定されないが、非経口、皮下、腹腔内、肺内、脳室内及び鼻内投与を含む何らかの適切な手段により投与され得ることは、当業者にとって明らかである。非経口点滴には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。さらに、本治療組成物は、パルス点滴により、特に抗体の用量を減少させながら、適切に投与される。
【実施例】
【００４６】
１．ｄＴａｇ  ＰＳ及びＰＳＨ１のタンデムアフィニティー−タグ精製
発明者らは、ＰＳ１、ＰＳ２及びプレセニリンホモローグ１（ＰＳＨ１）のＮ末端に、３倍のＦＬＡＧ配列が続くカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）から構成される二重タグ（ｄＴａｇ）を付加した。ＳＰＰ−様プロテアーゼ３（ＳＰＰＬ３）とも呼ばれるＰＳＨ１は、プレセニリンホモローグファミリーのメンバーであるが、ＰＳに対して逆の膜トポロジーを有し、今回はこれを対照として使用する２１、２２。ｄＴａｇ  ＰＳ１又はｄＴａｇ  ＰＳ２を安定的に遺伝子移入することにより、ＰＳ１−／−ＰＳ２−／−（ｄＫＯ）ＭＥＦにおけるγ−セクレターゼ複合体成熟が回復したが、ｄＴａｇ  ＰＳＨ１によって回復しなかった（図１、パネルａ及びｂ）。ｄＴａｇ  ＰＳとのこれらの複合体は、ＡＰＰ、Ｎｏｔｃｈ、シンデカン−３及びＮ−カドヘリンの切断により示されるように（結果は示さず。）、酵素活性があった２３。
【００４７】
ＣＨＡＰＳＯ又はＣＨＡＰＳを用いてミクロソーム膜を可溶化し、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）及びカルモジュリン（ＣａＭ）結合ビーズを用いてＴＡＰを行った（図１、パネルｃで要約）。ウエスタンブロット分析から、ｄＴａｇ−タンパク質の定量的回収が示された（図１、パネルｄ）。その他の（内因性）γ−セクレターゼ構成要素、ＮＣＴ、Ａｐｈ−１ａ及びＰｅｎ−２を同時精製したが、これらのタンパク質の相当量がまた最初のフロースルー中にあると思われた。第二の結合段階において、全ての構成要素が安定して会合したままであるので、発明者らは、定常状態条件下でこれらのタンパク質のプールがＰＳと緩く結合しているか又は結合していないと推測する。γ−セクレターゼ複合体の活性は、最終試料において殆ど完全に回収された（図１、パネルｅ）。
【００４８】
発明者らは、溶出されたγ−セクレターゼが、固定化された過渡状態類似体阻害剤ＷＰＥ−ＩＩＩ−３１Ｃにどの程度まで結合し得るかを試験した（これは、活性γ−セクレターゼ複合体に対して濃縮するはずである。）２４。ＳＤＳを含有する緩衝液で結合タンパク質を溶出し、ゲル上で分離し、クーマシーブルー染色により視覚化するか（図１、パネルｆ）又は質量分析により同定した。発明者らは、ゲル染色及び質量分析を用いて、３段階（阻害剤ビーズによる）及び２段階精製により精製したタンパク質パターンを比較したが、有意差がないことが分かった。ある可能な解釈は、活性プロテアーゼのみがこの阻害剤カラムに結合するはずであるので、ＴＡＰ精製γ−セクレターゼ複合体が主に活性形態にあるということである２４。しかし、全長ＰＳ１の相当量はまた溶出液中にも存在し、このことから、この手順が活性複合体に対して完全に特異的ではないことが示唆される。
【００４９】
発明者らは、ｄＴａｇ  ＰＳ２を用いて精製を行い、同様の結果を得た（図２）。発明者らがｄＴａｇ  ＰＳＨ１を精製した際、全てのγ−セクレターゼ構成要素は、フロースルー分画中に留まっていた。最終的対照として、発明者らは、ＰＳ  ｄＫＯ膜を用いて「模擬」精製実験も行った。ここでまた、全てのγ−セクレターゼ構成要素がフロースルー分画に留まった。ｄＴａｇ  ＰＳ１の精製により、最大数のバンドが得られ、一方、ｄＴａｇ  ＰＳ２で検出されたバンドはより少なく、ｄＴａｇ  ＰＳＨ１及びＰＳ  ｄＫＯ  ＭＥＦ精製ではバンドが殆ど見られなかった。
【００５０】
２．ＰＳ／γ−セクレターゼ相互作用タンパク質のプロテオーム分析
クーマシーブルー染色したバンド（及びＰＳ  ｄＫＯ  ＭＥＦにより生成したゲルからの対応領域）を切り出し、ゲル中でトリプシン消化し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により分析した。全部で５個の独立したｄＴａｇ  ＰＳ１及び４個のｄＴａｇ  ＰＳ２精製を行い、分析した。ＰＳ及びＮＣＴが容易に同定されたが、Ａｐｈ−１ａ及びＰｅｎ−２ペプチドの数は非常に限定されていた。これらのタンパク質は極度に疎水性であり、同定された全てのペプチドは親水性ループ領域由来であった。従って、配列決定されたペプチドの存在量は必ずしも精製物質中のタンパク質の存在量又はＰＳとの相互作用の強度と相関しない。Ａｐｈ−１ｂ及びＡｐｈ−１ｃが同定されなかったが、これは、繊維芽細胞においてそれらの発現レベルが低いことを反映すると思われる。
【００５１】
発明者らが非特異的結合物とみなしたＰＳ  ｄＫＯ  ＭＥＦからの精製において同定されるタンパク質を排除した後、発明者らは、ＰＳ１及びＰＳ２の少なくとも２つの独立精製において５９種類のタンパク質を同定した。興味深いことに、この基準を用いて選択されたＰＳ２相互作用タンパク質はまたＰＳ１インタラクトームでも存在した。従って、ＰＳ２及びＰＳ１複合体は、細胞において同様のタンパク質と相互作用する。さらなる分析に対して、発明者らは、ｄＴａｇ  ＰＳＨ１で精製されたタンパク質、リボソーム及びミトコンドリアタンパク質も考慮に入れなかった。発明者らは現実の生理学的相互作用を一部反映する可能性を排除できないが、リボソーム及びミトコンドリアタンパク質のいくつかがＰＳ  ｄＫＯ及びＰＳＨ１対照精製において存在したという事実は、これらのタンパク質が容易にＴＡＰ精製に混入することを示唆するものである２５。
【００５２】
ＰＳ１相互作用タンパク質における文献は幾分広がっているが、興味深いことに、発明者らは、いくつかの既に公開された、即ち、Ｔｍｐ２１／ｐ２３、α−カテニン、β−カテニンγ−カテニン及びＲａｂ１１との会合を確認することができた１６、１７、２６、２７。発明者らはまた、δ−カテニン、Ｎ−カドヘリン、ＡｐｏＥＲ２及びＦＫＢＰ８も同定したが、１回の精製においてのみであった２８、３１。ＰＳとのその他の相互作用が公開されているかについては確認されなかった１。発明者らのアッセイの検出限界未満でこれらのタンパク質のいくつかが繊維芽細胞において発現された可能性がある。
【００５３】
３．ＰＳ１／γ−セクレターゼ相互作用タンパク質の機能
文献検索及び遺伝子オントロジーデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）に従い、ＰＳ相互作用タンパク質に様々な分子機能及び生物学的プロセスを割り当てた（表１）。小胞介在性膜輸送及び膜構成を含む機能的サブグループから、ＰＳ／γ−セクレターゼの正常機能に対する細胞内輸送の重要性が示される（図３、パネルａ）。Ｓｅｃ２２ｂは、ｃｉｓ−ゴルジ膜とのＥＲ由来ＣＯＰＩＩ被覆小胞のドッキングプロセスに関与するｖ−ＳＮＡＲＥである。ｐ２４ファミリータンパク質ｐ２４及びＴｍｐ２１のメンバーが、ＣＯＰＩコートタンパク質に対する積み荷受容体として働くことが提案された。ＥＲＧＩＣ−５３は、ＥＲ−ゴルジ−中間体−区画（ＥＲＧＩＣ）に主に局在するレクチンである。ＡＡＡ−ＡＴＰａｓｅ  ＶＣＰ／ｐ９７は、ＳＮＡＲＥ複合体を分解するために分子シャペロンとして働くが、ＥＲから細胞質への異常な折り畳みタンパク質のエクスポートとそれに続くプロテアソーム分解にも関与するとされている。ＶＡＭＰ８は、エンドソームソーティングのレベルで作用するｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質である。Ｒａｂ１１は、対照エンドソーム再生ならびにＴＧＮへの輸送に対して考えられるＲａｓ関連低分子量ＧＴＰａｓｅファミリータンパク質の１つである。さらに、アネキシン−２及びＥｒｌｉｎは、それぞれ原形質膜及びＥＲにおいて、脂質ラフト様膜構成に関与するとされている３２、３３。ＰＳは主にＥＲに存在し、一方、完全に組み立てられた複合体はＥＲを出て、分泌経路の後期区画及び原形質膜に到達する。
【００５４】
その活性の重要な一部分はエンドソーム区画で起こることも推測される３４。γ−セクレターゼ複合体の細胞内分布は、これらの膜輸送／構成関連タンパク質の局在に基づき推測され得る（図３、パネルｂ）。これらの相互作用の機能的重要性は、ＲＮＡｉ法及び内因性タンパク質の共沈を用いてさらに確認された（下記参照）。
【００５５】
上述のタンパク質に加えて、一連の同定タンパク質は主にＥＲに存在し、タンパク質合成、グリコシル化又はクオリティーコントロール（リボホリン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及び熱ショックタンパク質など）に関与する。これらのタイプのタンパク質はまた、ＰＳ２又はＰＳＨ１（ＳＰＰＬ３）の分析でも見出され、このことから、最初期膜分画（Ｅｅａｒｌｉｅｓｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）において共通の合成機構が示唆される。タンパク質複合体における天然の折り畳みのいくつかの変性を含む精製プロトコール中に、これらのシャペロンタンパク質のいくつかが結合する可能性もある。
【００５６】
さらに、文献検索に基づき、発明者らは、テトラスパニンウェブと呼ばれる特異的膜ミクロドメインを形成するタンパク質のサブセット及びこのドメインと会合し得るいくつかのタンパク質を同定した（表１、図４、パネルａ）。
【００５７】
４．機能的相互作用
発明者らは、生理的に適切なタンパク質−タンパク質相互作用が本複合体の機能特性に影響を与えるはずであると推論した。従って、発明者らは、さらなる検証のために２４種類のタンパク質を選択した。γ−セクレターゼ基質ＡＰＰＳｗを安定して過剰発現するヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞に、４８時間にわたり、個々の標的タンパク質に対するｓｉＲＮＡを遺伝子移入した。細胞培養液を回収し、ＥＬＩＳＡを用いてγ−セクレターゼで生成されたＡβ４０及びＡβ４２ペプチドを評価した（図４ｂ、図５）。対照（非標的）ｓｉＲＮＡの遺伝子移入と比較して、２４種類の候補から８及び９が、それぞれＡβ４０及びＡβ４２種の統計学的に有意な変化を示した。膜輸送タンパク質の中でも、ＶＣＰ／ｐ９７ノックダウンにより、Ａβ４０及びＡβ４２分泌両方が約５０％、有意に増加した。一方、Ｓｅｃ２２ｂ、Ｒａｂ１１及びＶＡＭＰ−８のノックダウンの結果、Ａβ生成が比較的軽度に低下した。有意な影響があるその他の候補は、Ｓｌｃ２ａ１（ＧＬＵＴ−１）（〜５０％増加）及びテトラスパニンウェブに関与するタンパク質であった（図５）。いくつかの候補のノックダウンは、ＡＰＰそのもののレベルに影響を及ぼすと思われる（図５ｂ、ＶＣＰ／ｐ９７、Ｍｙａｄｍ又は４Ｆ２ｌｃ）。注意すべきこととして、この最初の特性評価試験は単に、同定されるタンパク質がＡＰＰのγ−セクレターゼプロセシングに対する生理的関連性を有するということをさらに裏付けるだけであるが、それらの作用機構をさらに明らかにする必要がある。これらのデータの解釈に対して、発明者らはまた、特に代謝回転時間が長いタンパク質に関する問題であるＲＮＡｉ下方制御を発明者らが最適化しなかったことも考慮に入れなければならない。従って、発明者らの、Ａβ分泌に影響を与えるタンパク質の同定は保守的であり、将来の研究から、さらなる機能的相互作用が明らかにされ得る。
【００５８】
発明者らは、ｐ２４ファミリータンパク質のタンパク質ファミリーがγ−セクレターゼ制御に関与するとされているので、ｐ２４ファミリータンパク質Ｔｍｐ２１及びｐ２４ａのノックダウンを個別に調べた。Ｔｍｐ２１ノックダウンによりＡβ４０分泌が僅かに増加し、一方で、ｐ２４ａのノックダウンにより逆の影響が示された（図６）。
【００５９】
５．γ−セクレターゼ及びテトラスパニンウェブ分子
テトラスパニンは、４つの膜貫通ドメイン及び保存的アミノ酸残基を特徴とする内在性膜タンパク質である。これらは、その他のテトラスパニン及び多くのパートナー（例えば膜貫通）タンパク質との相互作用のネットワークを形成するための構造ブロックとして機能し、これらは、「テトラスパニンウェブ」又は「テトラスパニンに富むミクロドメイン」と呼ばれる３５、３６。最初の複合体は、テトラスパニン及び、ＥＷＩタンパク質及びインテグリンα３β１及びα６βなどの直接的パートナータンパク質からなり、これは、より高次の二次レベル複合体を形成するために同種親和性の側方相互作用を介して組み立てられる。これらには、相互作用の第三のレベルにおけるさらなる相互作用タンパク質が含まれる。テトラスパニンウェブは、細胞移動性、融合及び様々なシグナル伝達プロセスにおいて重要な役割を果たす２４、２５。テトラスパニンサブドメインは、細胞膜、エンドソーム（など）において低分子量のラフト様ミクロドメインを形成し、スクロース勾配でそれらを浮上させる特異的な脂質を組み込む。テトラスパニンウェブのコアタンパク質は、ＰＳ１精製中に存在する（表１、図４ａ）。とりわけ、ＣＤ８１、ＰＧＲＬ／ＥＷＩ−２（Ｉｇｓｆ８）、α３β１インテグリンが同様にＰＳ２インタラクトームで同定されたが、ＳＰＰＬ３による精製では同定されず、γ−セクレターゼとのこれらの相互作用の特異性が示唆される。
【００６０】
発明者らは、発明者らのさらなる実験において、テトラスパニンパートナータンパク質ＦＰＲＰ／ＣＤ９Ｐ−１／ＥＷＩ−Ｆ（Ｐｔｇｆｒｎ）、ＰＧＲＬのホモローグであり、ＰＳ１精製で一度同定された別のＥＷＩタンパク質も包含した。さらに、ＰＳ１及びＰＳ２精製の両方において、ＣＤ９８ｈｃ（ＳＬＣ３Ａ２）由来のペプチドを頻繁に配列決定した。ＣＤ９８ｈｃは、ＣＤ９８軽鎖に会合して、及びインテグリンシグナル伝達において、アミノ酸輸送複合体の制御に関与するとされており、このことから、三次相互作用のレベルでテトラスパニンウェブとの相互作用の可能性があることが示される５１。ＨＥＫ２９３細胞における一次ＲＮＡｉスクリーニングから、ＣＤ８１、ＦＰＲＰ及びＣＤ９８ｈｃのノックダウンによってＡβ分泌が減少し（図４ｎ）、一方、インテグリンＲＮＡｉによってＡβレベルが変化しなかったことが示された。このことから、元のテトラスパニンウェブ構成要素がγ−セクレターゼ活性制御に関与し、一方でインテグリンが、同じミクロドメインへのそれらの組み込みによってγ−セクレターゼとのみ会合すると思われることが示唆される。発明者らは、ＨｅＬａ細胞において機能的相互作用を確認した（図４ｃ及び４ｄ）。両アッセイにおいて、Ａβ分泌におけるテトラスパニンタンパク質のノックダウンの影響は中程度であるが（〜２０−４０％減少）有意であり、つまり、テトラスパニンネットワークとのγ−セクレターゼの会合が機能的に関連性があることが示される。一方、ＥＷＩタンパク質及びＣＤ９８ｈｃの過剰発現により、Ａβレベルが上昇した（図７）。興味深いことに、ＥＷＩタンパク質及びＣＤ９８ｈｃの発現レベルは、ノックダウン及び過剰発現実験の両方で互いに影響を及ぼした。これは、テトラスパニンウェブの維持に対する、それらの相互の相互依存関係を反映し得る。発明者らは、テトラスパニンウェブとのγ−セクレターゼの会合をさらに確認するために、ＨＥＫ２９３細胞において免疫共沈降実験を行った。ＣＤ８１及びＦＰＲＰを内因性ＰＳ１（データは示さず。）及びＡｐｈ−１ａ（図８、パネルａ）と共沈させた。興味深いことに、ＣＤ８１と同様の特性を共有するテトラスパニンタンパク質ＣＤ９も共沈した。相互に、ＦＰＲＰの免疫沈降から、内因性γ−セクレターゼ構成要素ならびに、テトラスパニンパートナーＣＤ８１、ＣＤ９及びまたＣＤ９８ｈｃの会合が明らかになった（図８、パネルｂ）。ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＰＲＰ又はＰＧＲＬの安定的な過剰発現により、γ−セクレターゼ複合体との相互作用が促進された（図８、パネルｃ及びｄ）。
【００６１】
発明者らは、独立に、ＣＤ８１又はＣＤ９欠損マウス由来の細胞を用いて、相互作用の機能的重要性を確認した。内因性γ−セクレターゼ基質ＡＰＰ、ＡＰＬＰ−２、ＡＤＡＭ１０、Ｎ−カドヘリン及びシンデカン−３のカルボキシ末端断片はそれらの細胞で蓄積し（図９）、一方で、個々のγ−セクレターゼ構成要素又は基質の発現レベルは不変であった。このことから、これらのテトラスパニンタンパク質非存在下でその基質とのγ−セクレターゼ相互作用が部分的に破壊されることが示される。
【００６２】
テトラスパニンタンパク質は、コレステロール及びガングリオシドと会合し、脂質ラフト様のテトラスパニンに富むミクロドメイン（ＴＥＭ）を形成し、穏やかな界面活性剤を用いたショ糖密度勾配で浮上する４２、４３。γ−セクレターゼはまた、界面活性剤耐性膜分画でも浮上する４４、４５。従って、発明者らは、この特性を利用してＴＥＭとのγ−セクレターゼ構成要素の会合を調べた。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＤＤＭ（ｎ−ドデシル−β−マルトシド）、ＣＨＡＰＳＯ又はＢｒｉｊ９９の何れかで可溶化したＨＥＫ２９３細胞溶解液を不連続スクロース勾配で分離した。図１０で示されるように、膜を穏やかな界面活性剤（ＣＨＡＰＳＯ及びＢｒｉｊ９９）で可溶化した場合、テトラスパニンウェブタンパク質ＣＤ８１、ＦＰＲＰ及びＣＤ９８ｈｃは、一部、低密度分画（分画２、３及び４）にγ−セクレターゼ構成要素と一緒に分布した（しかしＥＲマーカーカルネキシンと一緒には分布せず。）。コレステロールに富む軽い膜に対する標準的マーカーであるカベオリンは、同様に最上部の分画中で共に分布し、このことから、コレステロール及びスフィンゴ脂質に富む「ラフト」又は「カベオラ」がこの手順で維持されたことが示された。しかし、テトラスパニンウェブタンパク質ならびにγ−セクレターゼ複合体は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＤＤＭなどのより強い界面活性剤での可溶化の際、最下層の分画に留まり、一方、カベオリンは軽い膜分画中に留まった。従って、γ−セクレターゼ構成要素は、テトラスパニンウェブタンパク質を含有する分画とともに両条件下で共分布する。これらの結果からまた、浮上分画に分布する全部ではないとしても殆どのγ−セクレターゼがそれらと会合することが示唆される。
【００６３】
発明者らは、テトラスパニンドメインとのγ−セクレターゼの会合がその活性において直接的な機能的影響を有し得るか否かと考えた。従って、発明者らは内因性ＦＰＲＰ、ＣＤ８１又はＣＤ９と会合するγ−セクレターゼ活性を免疫沈降させ、その活性をインビトロアッセイにより細胞膜中に存在する総γ−セクレターゼ活性と比較した。ＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）のデノボ生成により示されるように、活性γ−セクレターゼは、テトラスパニンタンパク質と共沈した（図１１ａ及び１１ｃ）。ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＰＲＰの発現上昇によって共沈活性が上昇し、これは図８ｃで示される結果と合致し、一方で、非関連抗体又は阻害剤対照の中で反応の特異性を示すものはなかった。興味深いことに、テトラスパニンウェブ会合γ−セクレターゼにより生成される尿素−ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した場合のＡβ種のスペクトルは、抗ＰＳ又はＡｐｈ−１ａ抗体の何れかで破壊されるγ−セクレターゼの全体的活性とは異なった。テトラスパニン会合γ−セクレターゼ活性は、より長いＡβ種（＞Ａβ１−４２）の生成を増加させ、Ａβ１−３８及びＡβ１−４２は減少させることを示す（図１１ｂ及び６ｃの表）。より長いＡβ種を生成させるテトラスパニンウェブ会合γ−セクレターゼのこの特性は、インビトロ酵素反応から１６時間後でも保存されており、このことから、テトラスパニンウェブとの会合が、むしろ好ましくはγ−セクレターゼの連続的切断反応を単純に遅延させる長いＡβを生成させることが示される。これらのデータから、これらのミクロドメインの異なる膜又はタンパク質組成が実際に適切にγ−セクレターゼ複合体の活性に影響を及ぼすことが示唆される。
【００６４】
材料及び方法
抗体
ウサギポリクローナル抗Ａｐｈ−１ＡＬ（Ｂ８０．３）、抗Ｐｅｎ−２（Ｂ１２６．２）、抗ＡＰＰ（Ｂ６３．９）及びマウスモノクローナル抗ニカストリン（９Ｃ３）は他所に記載されている２５。その他の抗体は購入した：ＰＳ１に対する抗体（ＭＡＢ５２３２）はＣＨＥＭＩＣＯＮから；抗ＡβＮ末端（ＷＯ−２）はＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙから；抗ＦＬＡＧ  Ｍ２及び抗β−アクチンはＳｉｇｍａから；抗ＣＤ８１、抗ＣＤ９、抗ＣＤ９８ｈｃ及び抗カベオリン−１はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから；抗カルネキシンはＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂ．から、購入した。ＦＰＲＰ（１Ｆ１１）及びＰＧＲＬ（８Ａ１２）に対するモノクローナル抗体は、Ｅｒｉｃ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ博士（Ｉｎｓｅｒｍ、Ｆｒａｎｃｅ）の厚意により提供された。
【００６５】
安定細胞株の細胞培養及び作製
１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコの改変イーグル培地Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で不死化マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞を培養した。５％ＣＯ２を含有する湿潤大気中で３７℃にて培養物を維持した。ＰＳ１−／−ＰＳ２−／−マウス胚及びそれらの同腹子対照からＭＥＦ細胞を作製した２５。複製欠損レトロウイルス系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ｄＴａｇマウスＰＳ１、ＰＳ２又はヒトＰＳＨ１の何れかを発現するＰＳ  ｄＫＯ  ＭＥＦを作製した２５。５μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、安定的に遺伝子移入された細胞を選択した。
【００６６】
細胞溶解液の調製及びウエスタンブロット
１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及びコンプリートプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で総細胞抽出物を調製した。４℃にて１５，０００ｘｇで１５分間遠心することにより、不溶性分画を除去した。ブラッドフォード色素結合法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によりタンパク質濃度を測定した。４−１２％、１０％又は１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ＴＢＳ中の５％スキムミルクで膜をブロッキング処理し、抗体を用い、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とともに温置して調べた。Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ（ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でバンドを検出した。
【００６７】
γ−セクレターゼ複合体のタンデムアフィニティー精製
コンプリートプロテアーゼ阻害剤を添加したＳＴＥ緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＧＴＡ）中で、回収したＭＥＦ細胞を再懸濁した。ボールベアリング細胞クラッカーに１０回通過させることによりこの細胞を溶解し、次いで４℃にて８００ｘｇで１０分間遠心することによって核及び細胞残屑を除去した。４℃にて１００，０００ｘｇで６０分間、上清をさらに遠心した。コンプリートプロテアーゼ阻害剤を添加した可溶化緩衝液（ＨＥＰＥＳ緩衝液；１％３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）又は０．５％３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））入りの、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中でミクロソーム膜ペレットを再懸濁し、４℃で３時間可溶化した。４℃にて１００，０００ｘｇで６０分間遠心した後、上清を採取し、タンパク質濃度を測定した。可溶化膜を前もって平衡化した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）に添加した。可溶化緩衝液でこのゲルを洗浄し、ＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ）２０μｇ／ｍＬ入りの可溶化緩衝液で結合タンパク質を溶出した。溶出物に２ｍＭ  ＣａＣ２（最終）を添加し、カルモジュリン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に添加した。洗浄後、５ｍＭ  ＥＧＴＡで結合タンパク質を溶出した。ｄＴａｇ  ＰＳ１に対するさらなる精製のために、カルモジュリンビーズからの溶出物をγ−セクレターゼ阻害剤ビーズ上に添加した（これは、ヒドロキシエチル−尿素過渡状態類似体阻害剤、ＷＰＥ−ＩＩＩ−３１Ｃと結合したアガロースレジンａｆｆｉ−ｇｅｌ  １０２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）であった。）２６。可溶化緩衝液でビーズを洗浄した後、０．５％ＳＤＳを含有する緩衝液で、結合タンパク質を溶出した。
【００６８】
ＭＳ分析
精製物質を濃縮し、４−１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。製造者の説明書に従い、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）でこのゲルを染色した。タンパク質バンドを切り出し、トリプシンによりゲル中で消化し、次いで他所で記載のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った４９。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ又はＮＣＢＩ非冗長タンパク質データベースでタンパク質を同定した。
【００６９】
ＡＰＰプロセシングの分析
遺伝子移入の２４時間前に、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ）を有するＡＰＰを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに播種した。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ又はＤｕｐｌｅｘ（Ｐｔｇｆｒｎ、Ｉｇｓｆ８、Ｉｔｇｂ１、Ｉｔｇａ３、Ｓｌｃ３ａ２、ＣＤ８１、ＣＤ９及びＡＴＰ１Ａ１に対して）ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を細胞に遺伝子移入した。対照遺伝子移入に対しては、ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非標的プールｓｉＲＮＡを使用した。遺伝子移入から３２時間後、１％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭへと培地を交換し、１６時間後、培地を回収した。細胞を除去するために、４℃にて８００ｘｇで５分間培地を遠心した。Ａβ４０及びＡβ４２を検出するために、製造者の説明書に従い、特異的ＥＬＩＳＡにおいて上清を使用した（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。Ｈｅｌａ細胞での分析のために、細胞を２４ウェルプレートに播種し、細胞にｓｉＲＮＡを遺伝子移入した。２０時間後、５０の感染多重度を用いて、ヒトＡＰＰ−Ｓｗｅｄｉｓｈ−６９５（ＡＰＰ６９５Ｓｗ）アデノウイルスを細胞に感染させた。遺伝子移入から６時間後、ＤＰＢＳで細胞を一度すすぎ、１％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭへと培地を交換した。１６時間後、培地を回収し、ＥＬＩＳＡに供した。
【００７０】
溶解緩衝液（コンプリートプロテアーゼ阻害剤入りのＨＥＰＥＳ緩衝液中の１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）中で総細胞抽出物を調製し、４℃にて１５，０００ｘｇで１５分間遠心することにより、不溶性分画を除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の等量を分離し、ウエスタンブロットにより検出した。
【００７１】
インビトロγ−セクレターゼアッセイのために、Ｃ９９−ＦＬＡＧを発現するＥ．コリから精製した組み換え基質ＡＰＰ  Ｃ９９−ＦＬＡＧと試料を混合した。３７℃で温置した後、デノボ形成されたＡβペプチドを１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分離し、続いてウエスタンブロットを行った。
【００７２】
免疫共沈降
１％ＣＨＡＰＳＯで可溶化したミクロソーム膜を図面で示される抗体とともに４℃で一晩温置した。タンパク質Ｇアガロースビーズを添加し、３時間温置した。可溶化緩衝液でビーズを３回洗浄し、ＮｕＰＡＧＥ試料緩衝液中で免疫沈降物を溶出した。
【００７３】
ショ糖密度勾配
ＨＥＫ２９３細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、コンプリートプロテアーゼ阻害剤を添加した界面活性剤含有緩衝液：ＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％ｎ−ドデシル−β−マルトシド（ＤＤＭ）、１％ＣＨＡＰＳＯ又は１％Ｂｒｉｊ９９（Ｓｉｇｍａ）で可溶化した。１８ゲージの針に５回通し、２６ゲージの針に１０回通すことによって細胞を溶解した。４℃にて１５，０００ｘｇで１５分間遠心することにより不溶性物質を除去した後、スクロースの４５％最終濃度に溶解物を調整し（４．８ｍＬ）、遠心管に移した。３５％スクロース（４．８ｍＬ）及び５％（２．４ｍＬ）スクロースを重層することにより、不連続スクロース勾配を調製した。４℃にてＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ローター中で３８，０００ｒｐｍで１６時間、試験管を遠心し、９６０μＬの分画を勾配の最上部から回収した。
【００７４】
統計分析
平均値及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示すエラーバーとしてデータを示す。ダネットの事後多重ペアワイズ比較検定又は両側スチューデント検定を用いて、分散の片側分析（ＡＮＯＶＡ）により処置群を比較した。有意差は、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；及び＊＊＊Ｐ＜０．００１で設定した。統計計算は、ＰＲＩＳＭバージョン４統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。
【００７５】
考察
本願において、ＰＳ／γ−セクレターゼのインタラクトームがＴＡＰ法を用いて体系的に実証される。特許文献において、ヒト神経芽腫細胞でアフィニティータグ付加ＰＳと同時精製される一連のタンパク質が開示されている（ＷＯ０５０２３８５８）。これらには、この複合体の既知の構成要素が含まれ、また、カテニンファミリー及びカドヘリンファミリーのメンバーも含まれる。しかし、発明者らが今回同定したいくつかのタンパク質は新規であり、機能的分析又はテトラスパニンウェブとの会合はＷＯ０５／０２３８５８で開示されなかった。発明者らの実験における潜在的な問題は、穏やかな界面活性剤の使用である。これらは、γ−セクレターゼ複合体をインタクトで活性がある状態に保つために必要であるが、非特異的相互作用の数が増えると予想される。発明者らは、２種類の重要な陰性対照、即ち、非特異的にアフィニティーマトリクスに結合するタンパク質を同定するための非遺伝子移入細胞の模擬精製及び、ＰＳとして、同様の疎水性タンパク質に結合するタンパク質を同定するための、ｄＴａｇ  ＳＰＰＬ３を使用した。発明者らは、同定されたタンパク質のうち一部が、より大きなプロテオリピド構造の一部として複合体と間接的に相互作用すると推測する。しかし、発明者らがテトラスパニンウェブタンパク質を用いた実験で見たように、このような二次及び三次相互作用は、細胞生物学的な状況において重要である。発明者らのプロテオーム分析の信頼性は、１）４つのγ−セクレターゼ構成要素の存在、２）相互作用タンパク質の反復同定、３）ＰＳ１−及びＰＳ２−相互作用タンパク質の重複パターン及びＳＰＰＬ３−インタラクターとの違い及び４）いくつかの報告されているＰＳ−相互作用タンパク質の同定により、さらに確認される。発明者らは、（単回精製において）一度同定されたタンパク質をさらに分析しなかったが、これらのうち一部は、発明者らが複数回精製したものと生物学的機能を共有した。ＦＰＲＰを用いた実験から、１回のヒットで正真ＰＳ相互作用タンパク質が実際に同定され得ることが示される。発明者らは、ＮＣＴ又はＰｅｎ−２の何れかと結合することが想定されるＲｅｒ１ｐを同定しなかった３７、３８。しかし、これは、完全複合体が組み立てられるとＲｅｒ１ｐが解離するからであると予想される。
【００７６】
発明者らの研究によりγ−セクレターゼ活性の強力な制御因子は同定されなかったが、同定されたタンパク質のいくつかの発現の変化によりＡβ生成が上方又は下方制御され得ることが明らかである（図４）。注目すべきこととして、ＡＤの遺伝型を有する患者由来の細胞での多くの実験から、Ａβ分泌の同様の軽度の変化が示されている。発明者らは、今回発明者らが同定するインタラクトームが、散発性ＡＤでのＡβペプチドの蓄積を導き得、同定されたタンパク質がゲノムワイド会合実験において浮かび上がり得るリスク遺伝子である可能性があるという、複数の衝撃的な知見をもたらすことを示唆する。
【００７７】
最後に、発明者らは、今回の研究において、γ−セクレターゼの予想外で新規の局面、即ちテトラスパニンウェブの形成に関与するタンパク質のサブセットとのその会合、に焦点を当てた。テトラスパニンは、細胞膜におけるダイナミックなコレステロール含有微小環境を確立し、細胞移動性、融合及びシグナル伝達などの様々な生物学的プロセスを制御する様々なレベルの相互作用を介して多分子複合体を組織する３５、３６。γ−セクレターゼ構成要素はテトラスパニンウェブ分子と相互作用し、同時に浮上する。テトラスパニンウェブの発現レベルの変化から、様々な基質のγ−セクレターゼ依存性切断に対する顕著な影響が示された。以前の研究から、γ−セクレターゼ活性が浮遊性の界面活性剤耐性膜（ＤＲＭ）において存在することが示唆された４４、４５。テトラスパニンに富むミクロドメインは脂質ラフトと類似しているが異なり４２、４３、テトラスパニンは、原形質膜だけではなく、エンドサイトーシス小胞にも分布し、これは、活性γ−セクレターゼ複合体の全体的な空間的分布と一致する。さらに、増え続けるプロテオーム研究から、脂質ラフト及びＴＥＭが異なることが示されている４８。発明者らの研究から、ＤＲＭ会合γ−セクレターゼの大部分が実際にテトラスパニンミクロドメインにあることが示唆される（図１０）。
【００７８】
テトラスパニンは、質量分析から容易に漏れる小さな疎水性タンパク質である。これにより、おそらく、発明者らの研究において活性γ−セクレターゼと明確に相互作用するＣＤ９（図８ｂ及び１１ｃ）が発明者らのＴＡＰ分析においてなぜ直接同定されなかったかということが説明される。従って、発明者らは、その他のテトラスパニン分子がミクロドメインにおけるγ−セクレターゼの局在にも寄与すると推測する。
【００７９】
いくつかの証拠から、ＡＰＰのアミロイド形成的プロセシングにおける界面活性剤耐性ミクロドメインに対する役割が示唆された４４、４５。今回、発明者らは、テトラスパニンウェブにおけるγ−セクレターゼが酵素的に活性であり、Ａβ生成パターンの変化を示し、その結果、全体的にＡβがより長くなることを示す。このような長いＡβペプチドの生物学的及び病理学的意義は不明であるが、これらは、細胞と会合し続けると思われる。最近の研究から、これらの長いＡβ種が、γ−セクレターゼのε−及びγ−切断によるより短いＡβ種への連続的ＡＰＰ  ＣＴＦプロセシングの中間体であることが示唆され５２、従って、テトラスパニンウェブのミクロドメインがこれらのペプチドのさらなるプロセシングに影響を及ぼすと思われる。また、テトラスパニン欠損細胞における様々なγ−セクレターゼ基質の蓄積から、テトラスパニンウェブとのγ−セクレターゼ複合体会合が、その様々な基質での活性又はそれらとの相互作用の何れかに対する制御機構であることがさらに示唆される。その点で、最近の刊行物から、それが存在する膜の脂質組成に関してγ−セクレターゼ活性の強力な依存が明らかになった５３。ＴＥＭの詳細な脂質組成がまだ報告されていないが、一方で、テトラスパニンはエキソソームに豊富に存在することが知られており５４、エキソソームは、より多くのスフィンゴミエリン及びコレステロールを含有する５５。結論として、発明者の実験によりγ−セクレターゼ複合体のインタラクトームが提供され、テトラスパニンウェブが細胞内部位及び活性γ−セクレターゼの制御因子の１つであることが明らかになる。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
【表２】
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【００８２】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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