(57)【要約】本発明は、化合物の感作性を測定する方法であって、(a)  特異的細胞型の適切な細胞培養物を提供し、その試験サンプルおよび対照サンプルを提供する工程（ここに、該試験サンプルおよび該対照サンプルは同一である）、(b)  該試験サンプルを溶媒中にて化合物に曝露し、該対照サンプルを該溶媒に一定時間曝露する工程、(c)  配列番号1〜153に対応する遺伝子群から選択されるi=1〜nの遺伝子のサブセットについて試験サンプルおよび対照サンプルの遺伝子発現xiを測定する工程、(d)  このサブセットのn遺伝子について１セットの対照および試験サンプルについての遺伝子発現xiをデータベースにて検索し、該試験サンプルを感作物質および非感作物質の両方を含む１セットの化学的感作モデル化合物に一定時間曝露する工程、(e)  該データベースに基づき、n遺伝子の該サブセットについて遺伝子発現xiを用いて感作物質または非感作物質のいずれかとして化合物を分類するために訓練し最適化される統計分類モデルへのインプットとして工程(c)の該試験サンプルおよび該対照サンプルの遺伝子発現を用いる工程、および(f)  該モデルにより試験化合物が感作物質のクラスまたは非感作物質のクラスに属するか否かを予測する工程を含む、方法に関する。2010504744.tif 000092
2010504744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の感作性を測定する方法であって、
(a)  特異的細胞型の適切な細胞培養物を提供し、その試験サンプルおよび対照サンプルを提供する工程（ここに、該試験サンプルおよび該対照サンプルは同一である）、
(b)  該試験サンプルを溶媒中にて化合物に曝露し、該対照サンプルを該溶媒に一定時間曝露する工程、
(c)  配列番号1〜153に対応する遺伝子群、最も好ましくは配列番号1〜45に対応する遺伝子群から選択されるi=1〜nの遺伝子のサブセットについて試験サンプルおよび対照サンプルの遺伝子発現xiを測定する工程、
(d)  このサブセットのn遺伝子について１セットの対照および試験サンプルについての遺伝子発現xiをデータベースにて検索し、該試験サンプルを感作物質および非感作物質の両方を含む１セットの化学的感作モデル化合物に一定時間曝露する工程、
(e)  該データベースに基づき、n遺伝子の該サブセットについて遺伝子発現xiを用いて感作物質または非感作物質のいずれかとして化合物を分類するために訓練し最適化される統計分類モデルへのインプットとして工程(c)の該試験サンプルおよび該対照サンプルの遺伝子発現を用いる工程、および
(f)  該モデルにより試験化合物が感作物質のクラスまたは非感作物質のクラスに属するか否かを予測する工程を含む、方法。
【請求項２】
化合物の感作性を測定する方法であって、
(a)  特異的細胞型の適切な細胞培養物を提供し、その試験サンプルおよび対照サンプルを提供する工程（ここに、該試験サンプルおよび該対照サンプルは同一である）、
(b)  該試験サンプルを溶媒中にて化合物に曝露し、該対照サンプルを該溶媒に一定時間曝露する工程、
(c)  配列番号1〜153に対応する遺伝子群、最も好ましくは配列番号1〜29および配列番号31〜45に対応する遺伝子群から選択されるi=1〜nの遺伝子のサブセットについて試験サンプルおよび対照サンプルの遺伝子発現xiを測定する工程、
(d)  このサブセットのn遺伝子について１セットの対照および試験サンプルについての遺伝子発現xiをデータベースにて検索し、該試験サンプルを感作物質および非感作物質の両方を含む１セットの化学的感作モデル化合物に一定時間曝露する工程、
(e)  該データベースに基づき、n遺伝子の該サブセットについて遺伝子発現xiを用いて感作物質または非感作物質のいずれかとして化合物を分類するために訓練し最適化される統計分類モデルへのインプットとして工程(c)の該試験サンプルおよび該対照サンプルの遺伝子発現を用いる工程、および
(f)  該モデルにより試験化合物が感作物質のクラスまたは非感作物質のクラスに属するか否かを予測する工程を含む、方法。
【請求項３】
化合物の感作性を測定する方法であって、
(a)  特異的細胞型の適切な細胞培養物を提供し、その試験サンプルおよび対照サンプルを提供する工程（ここに、該試験サンプルおよび該対照サンプルは同一である）、
(b)  該試験サンプルを溶媒中にて化合物に曝露し、該対照サンプルを該溶媒に一定時間曝露する工程、
(c)  配列番号1〜125および配列番号127〜153、最も好ましくは配列番号1〜45に対応する遺伝子群から選択されるi=1〜nの遺伝子のサブセットについて試験サンプルおよび対照サンプルの遺伝子発現xiを測定する工程、
(d)  このサブセットのn遺伝子について１セットの対照および試験サンプルについての遺伝子発現xiをデータベースにて検索し、該試験サンプルを感作物質および非感作物質の両方を含む１セットの化学的感作モデル化合物に一定時間曝露する工程、
(e)  該データベースに基づき、n遺伝子の該サブセットについて遺伝子発現xiを用いて感作物質または非感作物質のいずれかとして化合物を分類するために訓練し最適化される統計分類モデルへのインプットとして工程(c)の該試験サンプルおよび該対照サンプルの遺伝子発現を用いる工程、および
(f)  該モデルにより試験化合物が感作物質のクラスまたは非感作物質のクラスに属するか否かを予測する工程を含む、方法。
【請求項４】
化合物の感作性を測定する方法であって、
(g)  特異的細胞型の適切な細胞培養物を提供し、その試験サンプルおよび対照サンプルを提供する工程（ここに、該試験サンプルおよび該対照サンプルは同一である）、
(h)  該試験サンプルを溶媒中にて化合物に曝露し、該対照サンプルを該溶媒に一定時間曝露する工程、
(i)  配列番号1〜125および配列番号127〜153、最も好ましくは配列番号1〜29および配列番号31〜45に対応する遺伝子群から選択されるi=1〜nの遺伝子のサブセットについて試験サンプルおよび対照サンプルの遺伝子発現xiを測定する工程、
(j)  このサブセットのn遺伝子について１セットの対照および試験サンプルについての遺伝子発現xiをデータベースにて検索し、該試験サンプルを感作物質および非感作物質の両方を含む１セットの化学的感作モデル化合物に一定時間曝露する工程、
(k)  該データベースに基づき、n遺伝子の該サブセットについて遺伝子発現xiを用いて感作物質または非感作物質のいずれかとして化合物を分類するために訓練し最適化される統計分類モデルへのインプットとして工程(c)の該試験サンプルおよび該対照サンプルの遺伝子発現を用いる工程、および
(l)  該モデルにより試験化合物が感作物質のクラスまたは非感作物質のクラスに属するか否かを予測する工程を含む、方法。
【請求項５】
データベースが配列番号1〜153に対応する全遺伝子についての遺伝子発現xiを含む、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項６】
モデルが事実上判別的であるか、または事実上確率的である、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項７】
モデルが一次または二次の判別モデル、ロジスティック判別モデル、ツリーモデル、最近接モデル、ニューラルネットワークおよびサポートベクターマシンからなる群から選択される、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項８】
データベースが時間における動的存在である、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項９】
上記サブセット中のn遺伝子が化学的感作物質および非感作物質を区別する可能性に基づき選択される、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
モデルの最適化がモデルをよく調節し、n遺伝子の最終サブセットを選択するために用いられる反復工程である、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
nが少なくとも1、好ましくは少なくとも2、好ましくは少なくとも3、好ましくは少なくとも4およびより好ましくは少なくとも5、有利には少なくとも10である、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
曝露時間が15分〜48時間、好ましくは3〜24時間である、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
試験化合物および／または化学的感作モデル化合物についての遺伝子発現が時間窓内の1〜3の曝露時間について測定される、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
データベースが1〜3の濃度の化学的感作モデル化合物について遺伝子発現xiを含む、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
濃度が化合物に曝露される細胞中の約0%〜約40%の細胞死、好ましくは約20%の細胞死を引き起こす濃度に対応する、請求項１６記載の方法。
【請求項１６】
濃度がその溶媒における化合物の最大可溶用量およびその1、2または3倍希釈に対応する、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
データベースが1〜5の非関連繰り返し実験について遺伝子発現xiを含む、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
非感作物質が刺激物質である、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
試験および対照サンプルの遺伝子発現が対数倍数変化の形態にて発現する、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
適切な細胞培養がCD34-DC細胞培養またはDC様代替細胞モデルまたは他の任意の抗原提示細胞モデルである、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
適切な細胞培養がCD34-DC細胞培養、CD14+単球由来DC、MUTZ-3細胞系、MUTZ-3由来DC、THP-1細胞系またはU937細胞系などのDC様代替細胞モデルである、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子発現を測定する工程がcDNAまたはmRNAマイクロアレイ、マルチプレックスリアルタイムRT-PCR、マルチプルシングルプレックスリアルタイムRT-PCR、競合RT-PCR、RNase保護アッセイ、ノーザンブロッティングおよびタンパク質専用（マイクロ）アレイ、例えばLuminex系、Elisa、FACS、レポーターアッセイおよびウェスタンブロッティングによるマルチプレックスタンパク質分析からなる群から選択される方法からなる工程を含む、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項２３】
アレルギー性接触皮膚炎についての化合物の感作性を予測する、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
呼吸アレルギー、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎および食物アレルギーからなる群から選択されるアレルギー反応についての化合物の感作性を予測する、先の請求項のいずれか記載の方法。
【請求項２５】
生物系としての化合物に一定時間曝露される配列番号1〜153の適切な細胞培養物（に対応するもの）からなる群から選択される遺伝子のサブセット、好ましくは少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150または153遺伝子の発現を測定するために配置された手段および媒体を含む、試験キットまたはアッセイ。
【請求項２６】
先の請求項のいずれか記載の方法を用いて化合物の感作性を試験するために配置された手段および媒体を含む、試験キットまたはアッセイ。
【請求項２７】
コンピュータプログラムを含む、請求項２５または２６記載の試験キット。
【請求項２８】
cDNAまたはmRNAマイクロアレイ、マルチプレックスリアルタイムRT-PCR、マルチプルシングルプレックスリアルタイムRT-PCR、競合RT-PCR、RNアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロッティングおよびタンパク質専用（マイクロ）アレイ、例えばLuminex系、Elisa、FACSおよびウェスタンブロッティングによるマルチプレックスタンパク質分析からなる群から選択される発現検出系を含む、請求項２５〜２７のいずれか記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物のアレルギー性または感作性（アレルギー誘発性とも称される）、より詳細にはアレルギー性接触皮膚炎に関する化合物のアレルギー誘発性を測定する方法に関する。該方法は、IV型の他のタイプのT細胞媒介過敏性症候群（例えば呼吸および食物アレルギー）に拡張することができる。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患は、先進国の人口の20%までに影響を与える。職場にて、刺激物質性およびアレルギー性接触皮膚炎は職業病の約40%を占める。これらは欠席の最も一般的な原因、仕事の常習的な欠勤の実質的な原因であり、成人の生活の質を妨げる。接触皮膚炎の経済的負担は、ヘルスケアコストおよび生産性に対する二重の影響のために甚大である。アレルギー性接触皮膚炎（ACD）の最も一般的な原因は芳香または化粧品成分（クマリン、石けん、クリーム）およびニッケル、コバルトおよびクロムなどの重金属への肌曝露である。
【０００３】
一方における市販の化学薬品および医薬品における着実な増加および他方における動物実験の減少要求が、新規物質の感作性の予測のための非動物モデルの開発についての強い動機となっている。さらに、EU白書（http://europe.eu.int/comm/environment/chemicals/whitepaper.htm）によれば、30000の化学薬品を2012年までに毒性試験すべきであり、現時点で入手可能なインビトロ代替物が不十分であるとのことである。
【０００４】
これらの試験を開発するための究極の挑戦は、アレルギー障害の機序の理解を代替の試験方法に適用することである。これらの代替のほとんどはアレルギーの感作段階に関与する細胞を使用し、ランゲルハンス細胞（LC）および樹状細胞（DC）またはLC/DC様細胞のインビトロ培養が最も見込みがある。
【０００５】
LCは、表皮にて見られうる抗原提示樹状細胞である。それらはいわゆるDCのサブタイプであり、ほとんどの末梢組織、特に環境との接触部位（肌および粘膜）にて見られうる。LCおよびDCはアレルゲンを吸収し、処理することができる。この処理の間、LC/DCは活性化され、成長し始める。それらはリンパ節に移動し、そこで処理されたアレルゲンをT細胞に提示する。アレルゲン特異的T細胞は、抗原を認識し、活性化され、クローン性増殖を受け、それにより適応できる免疫応答を開始することができる。
【０００６】
LC/DCはそれらが存在する組織のすべての細胞の小フラクション（1〜3%）を構成し、それゆえ十分な数にて単離することは困難である。特異的サイトカインの存在下における臍帯血（または骨髄）からのCD34+造血前駆細胞（CD34-DC）から樹状細胞（DC）を生成する培養技術の発展によりLC/DC様抗原提示細胞の源が提供され、これはLC/DCの抗原処理および提示可能性を有し、リンパ節における未処理T細胞を刺激することができる。あるいは、末梢血からのCD14+単球から生成されるDCは細胞モデルとして用いることができるが、収量は通常、CD34+由来DCと比較して低い。
【０００７】
ACDおよび他のIV型過敏性症候群に必要な免疫生物学的機序は複雑であり、高組織的分子性および細胞性相互作用に依存する。近年のゲノミクス技術の発展によりアレルギーの処置における重要な生化学的事象の調査および解釈のためのツールが提供されている。DNAチップまたはマイクロアレイは、異なる生物学的サンプル、例えば対照細胞および毒性処置細胞間における何千もの個々の遺伝子の発現レベルの定量的比較を可能とする。
【０００８】
従って、アレルギーを起こす可能性のある既知および新規の化合物を素早く確実に同定することができる迅速かつ安価な（ハイスループット）スクリーニング系が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、アレルギー潜在性化合物を測定するための迅速かつ安価な（ハイスループット）インビトロ試験を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、化合物（「試験化合物」とも称される）の感作性を測定する方法であって、
(a)  特異的細胞型の適切な細胞培養物を提供し、その試験サンプルおよび対照サンプルを提供する工程（ここに、該試験サンプルおよび該対照サンプルは同一である）、
(b)  該試験サンプルを溶媒中にて化合物に曝露し、該対照サンプルを該溶媒に一定時間曝露する工程、
(c)  配列番号1〜153に対応する遺伝子群から選択されるi=1〜nの遺伝子（「候補遺伝子」とも称される）のサブセットについて試験サンプルおよび対照サンプルの遺伝子発現xiを測定する工程、
(d)  このサブセットのn遺伝子について１セットの対照および試験サンプルについての遺伝子発現xiをデータベースにて検索し（調べ）、該試験サンプルを感作物質および非感作物質の両方を含む１セットの化学的感作モデル化合物に一定時間曝露する工程、
(e)  該データベースに基づき、n遺伝子の該サブセットについて遺伝子発現xiを用いて感作物質または非感作物質のいずれかとして化合物を分類するために訓練し最適化される統計分類モデルへのインプットとして工程(c)の該試験サンプルおよび該対照サンプルの遺伝子発現を用いる工程、および
(f)  該モデルにより試験化合物が感作物質のクラスまたは非感作物質のクラスに属するか否かを予測する工程を含む、方法に関する。
【００１１】
データベースは少なくとも対照および試験サンプルのセットについての遺伝子発現xiを含む。好ましくは、本発明によれば、データベースは配列番号1〜153に対応するすべての遺伝子についての遺伝子発現xiを含む。当業者はそれぞれのデータベースを構築（建設）することができるか、または先に構築されたデータベースにて遺伝子発現を調べることができる。
【００１２】
本発明はまた、配列番号1〜153に対応する遺伝子の対立遺伝子変異および突然変異体も含む。
【００１３】
言い換えると、データベースはまた、配列番号1〜153に対応するすべての遺伝子およびその対立遺伝子変異および突然変異体についての遺伝子発現xiも含むことができる。
【００１４】
遺伝子の「対立遺伝子変異」は、遺伝子のDNAベース配列における変形に由来し、遺伝子の異なるmRNAイソフォームおよびスプライス変異、および可能なら異なる遺伝子産物を生じる。
【００１５】
「対立遺伝子変異」は、その参照配列と本質的に同じ遺伝子座にて起こる配列を意味するものであるが、例えば変異または組換えにより引き起こされる天然変形体により類似するが同一でない配列を有する。対立遺伝子変異は当業者によく知られており、遺伝子間配列内に発見されることが期待されよう。
【００１６】
用語「突然変異」は、変異体の一例から生ずるかまたはもたらされる任意の新規な遺伝特性を意味し、野生型に見られない新規な特性または特徴の創製をもたらす有機体の遺伝子または染色体のDNA内の突然の構造変化である。
【００１７】
本発明にて、変異は遺伝子のDNA配列における永久的変化である。遺伝子のDNA配列における変異は遺伝子によりコード化されたタンパク質のアミノ酸配列を変形しうる。用語としては、点変異、欠失変異（欠失による変異）および挿入変異（挿入による変異）が挙げられる。
【００１８】
本発明はまた、化合物の感作性を測定する方法であって、
(a)  特異的細胞型の適切な細胞培養物を提供し、その試験サンプルおよび対照サンプルを提供する工程（ここに、該試験サンプルおよび該対照サンプルは同一である）、
(b)  該試験サンプルを溶媒中にて化合物に曝露し、該対照サンプルを該溶媒に一定時間曝露する工程、
(c)  配列番号1〜153に対応する遺伝子群、最も好ましくは配列番号1〜29および配列番号31〜45に対応する遺伝子群から選択されるi=1〜nの遺伝子のサブセットについて試験サンプルおよび対照サンプルの遺伝子発現xiを測定する工程、
(d)  このサブセットのn遺伝子について１セットの対照および試験サンプルについての遺伝子発現xiをデータベースにて検索し、該試験サンプルを感作物質および非感作物質の両方を含む１セットの化学的感作モデル化合物に一定時間曝露する工程、
(e)  該データベースに基づき、n遺伝子の該サブセットについて遺伝子発現xiを用いて感作物質または非感作物質のいずれかとして化合物を分類するために訓練し最適化される統計分類モデルへのインプットとして工程(c)の該試験サンプルおよび該対照サンプルの遺伝子発現を用いる工程、および
(f)  該モデルにより試験化合物が感作物質のクラスまたは非感作物質のクラスに属するか否かを予測する工程を含む、方法にも関する。
【００１９】
統計分類モデル（「予測モデル」とも称される）は事実上判別的であるか、または事実上確率的であることができる。これは一次または二次判別モデル、ロジスティック判別モデル、ツリーモデル、最近傍モデル、ニューラルネットワークおよびサポートベクターマシンの一つから選択することができる。分類モデルの選択はデータ駆動型であり、時間変動であることができる。
【００２０】
有利には、本発明にてデータベースは時間における動的存在である。
【００２１】
好ましくは、上述の工程(d)におけるサブセットにおけるn遺伝子は、化学的感作物質および非感作物質を判別する可能性に基づき選択される。候補遺伝子（バイオマーカー）は第1表に示される（Genbank信託番号、名称およびUnigene名について第2表を参照のこと）。最も有望なものは、群1および／または2（配列番号1-14および／または15-45）内、次いで群3（配列番号46-153）のもので見られる。
【００２２】
特に、最も有望なものは群1および／または2（配列番号1-14および／または15-29および／または31-45）内、次いで群3（配列番号46-153）のもので見られる。
【００２３】
より特に、最も有望な遺伝子は群1および／または2（配列番号1-14および／または15-29および31-45）内、次いで群3（配列番号46-125および127-153）のもので見られる。
【００２４】
最も好ましくは、工程(d)におけるn遺伝子を群1のものから選択し、該群にて十分な数の判別遺伝子が見られなければ、群2または群3からの遺伝子を加える。
【００２５】
本発明の好ましい具体的態様によれば、統計分類モデルの最適化は、モデルを微調整し、n遺伝子の最終サブセットを選択するために用いられる反復工程である。有利には、この微調整はまた、曝露時間および曝露濃度の選択にも役立つ。
【００２６】
好ましくは、本発明の方法において、nは少なくとも1、2、3、4、好ましくは少なくとも5、有利には少なくとも10である。
【００２７】
好ましくは、本発明の方法において、nは少なくとも1、2、3、4、好ましくは少なくとも5、有利には少なくとも10、最も好ましくは5〜10である。
【００２８】
原則として、nは1〜153の任意の数であることができ、さらに好ましくは遺伝子の数（n）は過調整を回避することができないほど高すぎるものではない。
【００２９】
有利には、（一定の）曝露時間は15分〜48時間であり、好ましくは3〜24時間である。
【００３０】
有利には、（一定の）曝露時間は15分〜48時間であり、好ましくは6〜24時間である。
【００３１】
さらに、本発明の方法において、試験化合物および／または化学的感作モデル化合物についての遺伝子発現は、異なる曝露時間、例えば時間窓内の少なくとも1、より好ましくは少なくとも2または3の異なる曝露時間について測定される。
【００３２】
実際には、試験化合物および／または化学的感作モデル化合物についての遺伝子発現は、より好ましくは時間窓内の1〜3、最大で5の曝露時間にて測定される。
【００３３】
好ましくは、本発明の方法において、データベースは化学的感作モデル化合物の異なる濃度、好ましくは1〜3、5までの濃度についての遺伝子発現xiを含む。
【００３４】
好ましくは、データベースは、MTTアッセイ（Mosmann, 1983）、Alamar Blueアッセイ（Ahmed et al., 1994）、乳酸脱水素酵素（LDH）活性放出アッセイ（Korzeniewski and Callewaert, 1983）またはヨウ化プロピジウム取り込み（Zarcone et al., 1986）などの細胞毒性評価（Balls and Fentem, 1992; Vander Plaetse and Schoeters, 1995）についての従来法により測定されるように、化合物（細胞培養物）に曝露された細胞の約0%〜約40%の細胞死、好ましくは約20%の細胞死をもたらす濃度に対応する化合物の濃度についての遺伝子発現xiを含む。
【００３５】
好ましくは、試験化合物が細胞毒性をもたらさない場合に、データベースは、その溶媒中の化合物およびその1、2、3または4の希釈物の最高可溶用量に対応する化合物の濃度についての遺伝子発現xiを含む。
【００３６】
より正確には、有利なことに、各実験にて、溶媒が細胞培養媒体でない場合に、細胞培養物中の溶媒の最大最終濃度は0.5%である。その溶媒中の化合物の希釈は、細胞培養媒体中にてなされ、細胞培養中の溶媒の0.5%の最大最終濃度を考慮し、好ましくは1:1 (v/v)、1:4 (v/v)、1:9 (v/v)であることができる。
【００３７】
好ましくは、データベースは少なくとも1、好ましくは少なくとも2、より好ましくは少なくとも3の非関連（反復）実験についての遺伝子発現xiを含む。
【００３８】
有利には、データベースは1〜5の非関連（反復）実験についての遺伝子発現xiを含む。
【００３９】
好ましくは、本発明の方法において、試験化合物についても発現xiを少なくとも1、好ましくは少なくとも2または3の非関連（反復）実験について測定する。
【００４０】
有利には、試験化合物についても発現xiを1〜5の非関連実験について測定する。
【００４１】
有利には、本発明の方法において、試験化合物および化学的感作モデル化合物（すなわちデータベース）についての遺伝子発現を異なる化合物濃度および異なる（反復）実験について異なる曝露時間（時間窓内）について測定する。
【００４２】
好ましくは、試験化合物について、1〜3の曝露時間、1〜3の濃度および1〜5の非関連（反復）実験を用いる。
【００４３】
好ましくは、データベースのモデル化合物について、同じ時点および同じ濃度を用い、同一またはそれ以上の数の非関連（反復）実験を用いる。
【００４４】
用語「非関連（反復）実験」は、同一の方法および材料を用いて同様に行われる実験を意味する。そのような実験の唯一の違いは、非関連供与個体からの細胞を一次細胞型について用い、同じ起源であるが異なる継代培養相からの細胞を細胞株について用いることである。
【００４５】
本発明による方法を行うために用いられる細胞培養物がCD34-DC細胞である場合に（以下参照）、「非関連実験についての遺伝子発現xi」は非関連個体についての遺伝子発現xiを意味する。
【００４６】
方法がCD34-DC細胞培養物を用いて行われる場合に（以下参照）、好ましいデータベースは少なくとも1、好ましくは少なくとも2、より好ましくは少なくとも3の非関連個体についての遺伝子発現xiを含む。
【００４７】
方法をCD34-DC細胞培養物を用いて行う場合に（以下参照）、有利なことにデータベースは1〜5の非関連個体についての遺伝子発現xiを含む。
【００４８】
方法をCD34-DC細胞培養物を用いて行う場合に（以下参照）、好ましい本発明の方法において、発現xiは試験化合物についても少なくとも1、好ましくは少なくとも2または3の非関連個体について測定する。
【００４９】
方法をCD34-DC細胞培養物を用いて行う場合に（以下参照）、有利なことに発現xiは試験化合物についても1〜5の非関連個体について測定する。
【００５０】
有利には、本発明の方法において、試験化合物および化学的感作モデル化合物についての遺伝子発現（すなわちデータベース）は異なる曝露時間（時間窓内）、異なる化合物濃度および異なる供与個体について測定する。
【００５１】
好ましくは、試験化合物について、1〜3の曝露時間、1〜3の濃度および1〜5の非関連供与個体を用いる。
【００５２】
好ましくは、データベースのモデル化合物について、同じ時点および同じ濃度を用い、同一またはそれ以上の数の非関連供与個体を用いる。
【００５３】
好ましくは、本発明の方法において、非感作物質は刺激物質である。
【００５４】
有利には、試験および対照サンプルの遺伝子発現は倍数変化の対数（LFC, 定義を参照のこと）の形態にて発現するが、他のパラメータもまた用いることができる。
【００５５】
有利には、本発明において、適切な細胞培養は、CD34-DC細胞培養またはDC様代替細胞モデルもしくは他の抗原提示細胞モデル（単球およびマクロファージ）である。
【００５６】
有利には、本発明において、適切な細胞培養はCD34-DC細胞培養である。しかし、CD14+単球由来DC、MUTZ-3細胞株、MUTZ-3由来DC、THP-1細胞株またはU937細胞株などのDC様代替細胞モデルであることもできる。
【００５７】
好ましくは、遺伝子発現を測定する工程は、cDNAまたはmRNAマイクロアレイ、マルチプレックスリアルタイムRT-PCR、マルチプルシングルプレックスリアルタイムRT-PCR、競合RT-PCR、RNアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロッティングおよびタンパク専用（マイクロ）アレイ、例えばLuminex系、Elisa、FACS、レポーターアッセイおよびウェスタンブロッティングによる多重タンパク質分析からなる群から選択される方法からなる工程を含む。PCR法が好ましい。
【００５８】
本発明の方法により、（化学的）接触アレルゲンの感作可能性を予測（測定）することができる。
【００５９】
特に有利な方法にて、化合物のアレルギー性接触皮膚炎についての感作可能性は本発明による方法で予測される。
【００６０】
しかし、該方法はまた、食物、花粉などの他のアレルゲンについても作用しうる。
【００６１】
他のタイプのアレルギー性反応についての化合物の感作可能性もまた、本発明の方法により予測できる。
【００６２】
そのような他のタイプのアレルギー性反応の非包括的な例は、呼吸アレルギー、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎および食物アレルギーである。
【００６３】
本発明の別の態様は、生物系として化合物に一定時間曝露される配列番号1〜153の適切な細胞培養からなる（に対応する）群から選択されるサブセットの遺伝子、例えば少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150または153遺伝子の発現を測定するために配置された手段および媒体を含む試験キットまたはアッセイに関する。
【００６４】
試験キットは、本明細書にさらに詳細に記載される分類モデルの実施であるコンピュータプログラムを含むことができる。該試験キットは、cDNAまたはmRNAマイクロアレイ、マルチプレックスリアルタイムRT-PCR、マルチプルシングルプレックスリアルタイムRT-PCR、競合RT-PCR、RNアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロッティングおよびタンパク専用（マイクロ）アレイ、例えばLuminex系、Elisa、FACSおよびウェスタンブロッティングによる多重タンパク質分析からなる群から選択される発現検出系を含むことができる。
【００６５】
定義：
用語「遺伝子発現」は、本明細書においてその最も広い内容にて用いられ、(m)RNA発現またはタンパク質発現のいずれかを意味することができる。
【００６６】
FC = 倍数変化 = 試験サンプル対対照サンプルの遺伝子発現の比
【００６７】
LFC = FCの対数；非ゼロLFCを有する遺伝子は、対照サンプルよりも試験サンプルについての異なる遺伝子発現を有する。
【００６８】
用語「感作物質」は、個体における感作反応を誘発することができる合成または天然起源の任意の化合物を意味する。
【００６９】
反対に、この感作反応を引き起こさない任意の化合物は、本発明にて非感作物質と称される。
【００７０】
特定のタイプの非感作物質は「刺激物質」を意味する。感作物質に対して、刺激物質は免疫反応を誘発しない。これらは非特異的方法にて反応する。刺激物質は、感作物質と区別することが困難であるため、試験の発展における非感作物質として有用である。
【００７１】
本発明が特定の（単一の）化合物の感作可能性を測定する方法に関することは理解されるべきである。
【００７２】
本発明はまた、特定の化合物の感作可能性を測定する方法であって、化合物が単一の特定の化合物または特定の化合物の混合物に対応する、方法にも関する。
【００７３】
言い換えると、用語「特定の化合物」は、単一の特定の化合物および／または特定の化合物の混合物を意味することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】Figure 1は、曝露時間12時間後の対数倍数変化を示し（LFC 12）、各記号は供与個体に対応する。
【００７５】
【図２】Figure 2は、この場合には（in casu）ニッケルおよびBC、試験化合物についてのLFC 12を示し、各記号は供与個体に対応する。
【００７６】
【図３】Figure 3は、9化合物への曝露後に測定したPBEF1のLFC値／個体を示し、化合物はその感作特性によりグループ分けする。
【００７７】
【図４】Figure 4は、各遺伝子についての特徴値および識別力についてのp値を与え；化合物はその感作特性によりグループ分けする。
【００７８】
【図５】Figure 5は、遺伝子NINJ、PBEF1、CCR7、CREMのldaに基づくデータの二次元表示を示す。各点は一の化合物に曝露された一の個体に対応する。
【００７９】
【図６】Figures 6 A-Iは、一の化合物（試験化合物）を除外することによる分類モデルの相互検証の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
発明の詳しい説明
試験アレイについての候補遺伝子の同定
CD34-DCを本発明によるインビトロ試験アッセイ／方法の開発のための細胞モデルとして用いた。
【００８１】
CD34-DCはインフォームド・コンセントを得た後の参加母体からの臍帯血中に存在するCD34+前駆細胞に由来した。
【００８２】
CD34-DCを感作物質および非感作物質（感作物質から区別することが最も困難であるような特定の場合における刺激物質）を含む化学的感作モデル化合物の一団（一セット）に曝露した。ここで、CD34-DCを4のモデル化学的アレルゲン（「参照アレルゲン」または「参照感作物質」とも称される）および2の刺激物質（「参照刺激物質」とも称される）に曝露した。モデル化合物および濃度の選択は文献情報に基づいた。他の（または別の）参照アレルゲンおよび刺激物質を選択することができる。用語「参照」および「モデル」は、これらの化合物のうち感作物質であるか否かが先験的に知られているという事実を意味する。
【００８３】
各CD34-DCサンプルを時系列実験における曝露について用いた（0.5、1、3、6、12および24時間曝露）。各時点にて、同じ供与体からの非曝露対照サンプルもまた得た。各化合物について、3の非関連個体からのCD34-DCを用いた。
【００８４】
次いで、マイクロアレイ分析を各化合物について選択された時点について行った。用いたマイクロアレイはバンダービルトマイクロアレイ共有資源センター（USA）から得た。約11.000のヒト遺伝子の情報を含むcDNAマイクロアレイを用いた。従って、それらを用いて、1実験以内に11.000のヒト遺伝子の遺伝子発現レベルを測定することができる。
【００８５】
各化合物について、少なくとも3の時点をマイクロアレイ分析のために選択した。マイクロアレイを各化合物について全3供与体について行った。
【００８６】
二の異なるアプローチを行い、適当な候補遺伝子（感作物質および非感作物質についての可能性を判別するもの）を同定した：相補的である統計的アプローチおよび発見的アプローチ。適用される選択基準についての以下のさらなるいくつかの情報を提供する。
【００８７】
第一アプローチにて、LFC（定義を参照のこと）を用い、候補物質（バイオマーカー）についての同定手順は以下の基準に基づいた：
【００８８】
第一アプローチにて、LFC（定義を参照のこと）を用い、候補物質（バイオマーカー）についての同定手順は以下の基準に基づいた：
【００８９】
第一基準は、感作物質のための発現の変化であった。t-試験を用いて感作物質への曝露後に有意にノンゼロLFCを示した遺伝子を選択した。この結果は359遺伝子のリストに示す。
【００９０】
第二基準は感作物質および非感作物質の判別であった。残りの359遺伝子を感作物質および刺激物質を判別する可能性についてスコアし（t-試験による）、後者は非感作化合物を示した。遺伝子をp-値の増加により順序づけし、トップ48を選択した。
【００９１】
従って、t-試験およびFDR法に対応して、残りの48遺伝子のそれぞれは感作物質についてのノンゼロ平均LFCおよび刺激物質についての異なる平均LFCをともに高い程度の確実性まで有する。
【００９２】
これらの48遺伝子を補完して、第二セットの10の候補遺伝子を主にこれらの遺伝子の既知の生物学的機能性に基づいて加えた。
【００９３】
用いた第二のアプローチにて、倍数変化の程度を統計的有意性の代わりに用いた。より正確には、候補遺伝子を以下の基準により選択することを決定することができる：
・  少なくとも三分の二の供与体にて遺伝子は＞1.5または＜0.667の対照サンプルと比較して発現の変化を有しなければならない。
・  同じ遺伝子（上記基準により選択される）が刺激物質ではなく3または4の化学的感作物質について発見された場合、候補遺伝子のリストに含まれる。
【００９４】
これらの2のアプローチにより選択された153の候補遺伝子のセットに対応するmRNA配列を第1表に示す。第一群の遺伝子（配列番号: 1〜14）は現在RT-PCRにより試験されている最も有望な遺伝子からなる。第二群（配列番号: 15〜45）は群1を試験した後さらなる遺伝子が必要であれば試験を開始した遺伝子である。群3（配列番号: 46〜153）は、群1および2ほどではないが未だ興味深い遺伝子を含む。従って、最も有望な候補遺伝子は特に群1の中のリストのトップに見られる。第2表は、第1表の各配列についてGenbank信託番号、名称および公式UniGene名を与える。
【００９５】
候補遺伝子（バイオマーカー）の選択に用いられるモデルまたは参照化合物
6の化合物を試験し、このうちの4は異なる強度の既知の感作物質である。また、二の刺激物質を本研究に含んだ。これらの6の化合物は遺伝子発現xiが測定される「化学的感作モデル化合物」の例である。用いたモデル化合物についてのいくつかのさらなる情報を以下に示す。
【００９６】
A. アレルゲン
A.1. 塩化ニッケルまたは硫酸ニッケル：
ニッケルはニッケル含有産物の高い消費のために環境にかなり豊富にある重金属である。ニッケルは中程度の感作物質として分類される。
【００９７】
A.2. オキサゾロン（4-エトキシメチレン-オキサゾール-5-オン）：
オキサゾロンの適用について文献にはほとんど情報を見ることができない。しかし、これは強い感作物質として分類される。
【００９８】
A.3. DNCB（1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン）：
DNCBは強い感作物質であると考えられる有機化合物である。
【００９９】
A.4. オイゲノール（2-メトキシ-4-(2-プロペニル)フェノール）：
オイゲノールは特に丁子油およびシナモンからの特定のエッセンシャルオイルから抽出される透明から薄黄色油状液体である。オイゲノールは弱い感作可能性のみ有する。
【０１００】
B. 刺激物質
B.1. SDS（ラウリル硫酸ナトリウムとしても知られるドデシル硫酸ナトリウム）：
SDSは、その肥大効果およびその泡を作る能力のために、歯磨き粉、シャンプー、髭剃りクリームおよび気泡剤などの家庭用品に用いられるイオン性洗剤である。これは典型的な刺激性化合物である。
【０１０１】
B.2. BC（塩化ベンザルコニウム）：
BCは防腐剤および殺精子剤として用いられる有機化合物である。これは目薬、手洗い用液体および洗顔料、うがい薬、殺精子クリームならびに種々の他の洗浄剤、殺菌剤および消毒剤に用いられる。
【０１０２】
（モデル）化学的アレルゲンおよび刺激物質に曝露されるCD34+前駆体由来樹状細胞における遺伝子発現特性
3の独立した個体からのCD34+前駆体由来DCを上記リストの全化合物または溶媒（蒸留水またはDMSO、陰性対照）に0.5、1、3、6、12および24時間曝露した。曝露した培養物とこれと等価な時点の対照とを比較したマイクロアレイを全曝露時間についての3の個体および全化合物について分析した。
【０１０３】
細胞源
臍帯血サンプルは、送達直後に正常な満期出産乳児の胎盤の臍帯血管から集めた。血液の採集は、胎盤を上昇させ、200 U/mlの最終濃度にて10%ウシ胎仔血清（FBS, Hyclone, Bornem, Belgium）およびヘパリンナトリウム（Sigma, Bornem, Belgium）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM, Invitrogen, Merelbeke, Belgium）を含むヘパリン化チューブに血液を流出させることにより行った。臍帯血サンプルを室温にて貯蔵し、採集後24時間以内に取り扱った。臍帯血サンプルの採集はアントワープ大学の倫理委員会および地方の産科により承認され（Moederhuis O.L. Vrouw, Geel, and Heilig Hartziekenhuis, Mol, Belgium）、インフォームド・コンセントの署名はこの研究に参加する母親から得た。
【０１０４】
細胞分離および培養
単核細胞（MNC）を密度勾配遠心分離により希釈臍帯血（リン酸緩衝食塩水（PBS, Invitrogen）中1:2）から分離した（Ficoll Paque Plus, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）。次の磁気細胞分離における赤血球による干渉を回避するためにこの手順を２回行った。製造業者により記載される手順に従い、Midi-MACSを用いた陽性免疫磁性選択（positive immunomagnetic selection）によりCD34+前駆細胞をMNCから精製した（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）。85%より高純度が得られた。
【０１０５】
単離CD34+前駆細胞をLardonらにより記載された方法に従い培養した（Lardon et al. GM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）を用いた骨髄前駆細胞からの樹状細胞の生成、TNF-アルファおよびさらなるサイトカイン：IL-4およびIFN-ガンマの拮抗作用およびTNF-アルファレセプター-1の選択的関与。Immunology (1997) 91(4):553-559）。簡潔には、CD34+前駆細胞を、1 x 105細胞/mlの細胞濃度にて10% FBS、2%ペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen）および1%ウシ血清アルブミン（BSA, Sigma）を含むIMDM中、37℃、5% CO2および95%湿度にて液体アッセイ中にて培養した。開始後最初の5日間に、ヒト組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、GM-CSF（500 ng/ml; Novartis Pharma, AG, Basel, Switzerland）、幹細胞因子、SCF（幹細胞因子）（50 ng/ml; Biosource, Nivelles, Belgium; 特異的活性（SA）＞105 U/mg）および腫瘍壊死因子-α、TNF-α（2,5 ng/ml; Boehringer Mannheim GmbH, Vilvoorde, Belgium; SA＞108 U/mg）を培養物に加えた。次の8日間に、細胞培養物に1000 U/ml IL-4（1000 U/ml; R＆D, Halle-Zoersel, Belgium; SA: 2.9 x 104 U/μg）を補充した。12日の全培養期間後に、未熟DC表現型を検証し、DCを化合物または溶媒に曝露した。
【０１０６】
細胞の化学的曝露
12日の培養期間の終わりに、3個体からのDC（4x106細胞/4 ml）を（モデル）化合物または溶媒に0.5、1、3、6、12および24時間曝露した。
以下の濃度および溶媒を用いた：
【表１】
2010504744.tif 000003
【０１０７】
フローサイトメトリーによる表現型分析
培養の12日後に、フローサイトメトリーを用いて表面マーカーの発現を分析した。百万の細胞を培養物から採取し、カウントし、50μl PBS + 10% FBS中の105細胞のアリコートを調製した。30分間4℃にてフルオレセインイソチオシアネート（FITC）またはフィコエリトリン（PE）にコンジュゲートした+/-0.5μgのモノクローナル抗体（mAb）で細胞をインキュベートした。次いでmAbを用いた：アンチ-HLA-DR-PEおよびアンチ-CD14-PE（Becton-Dickinson, Erembodegem, Belgium）；アンチ-CD1a-FITC、アンチ-CD83-PEおよびアンチ-CD86-PE（BD Pharmingen, Erembodegem, Belgium）。同形対照はマウスIgG1-PE、IgG1-FITCおよびIgG2a-PE（Becton-Dickinson）であった。フローサイトメトリーをFACStar Plusにて行い、Cell Questソフトウェア（Becton Dickinson）を用いてデータを分析した。DCを光散乱により定義し、死亡細胞を除外し、蛍光ヒストグラムを評価した。表現型分析の結果をDC培養の質の基準として用いた。未曝露未熟DCを常に40-50% CD1a+、50-60% HLA-DR+、6-8% CD86+、2-3% CD83+および＜5% CD14+とした。
【０１０８】
全RNAの抽出
適当な曝露時間の後、残存細胞を遠心分離し（400g, 10分）、上清を除去した。細胞をRLT溶解緩衝液に溶解した（Qiagen, Hilden, Germany）。全RNAを製造業者の明細に従い、RNeasy Mini RNA単離キットを用いて単離した（QiaGen）。RNAをRNaseフリー水（Qiagen）に-80℃にて貯蔵した。RNA濃度をUV分光分析により測定し、質をアガロースゲル上にて非崩壊のために視覚的に調査した。
【０１０９】
RNA増幅およびcDNA標識
インビトロ転写の改変プロトコールを用いてアンチセンスRNA増幅を行った（Puskas et al. わずかな偏倚率の再現可能なマイクロアレイデータにおけるRNA増幅結果。Biotechnology (2002) 32(6):1330-1334, 1336, 1338, 1340）。第一ストランドcDNA合成について、全RNA 5μgをHPLC精製結合オリゴ-dT + T7プロモータ（5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-T24(ACG)-3'）（配列番号: 154）（Invitrogen）2μgと全容積22.0μl中にて混合し、65℃まで5分間加熱した。この混合物に、8μl 5x第一ストランド緩衝液、4μl 0.1 M DTT、3μl 10 mM dNTP mixおよび2.5μl（500単位）SuperScript II（すべてInvitrogenより）を加えた。サンプルをPerkin-Elmerサーモサイクラー中42℃にて終夜インキュベーションした。第一ストランド反応混合物に、Rnaseフリー水83.8μl、5x第二ストランド合成緩衝液33.4μl、10 mM dNTP mix 3.4μl、1μlの10 U/μl E.coli DNAリガーゼ、4μl 10 U/μl E.coli DNAポリメラーゼIおよび1μl 2 U/μl E.coli RnaseH（すべてInvitrogenより）を加え、16℃にて少なくとも3時間インキュベーションした。合成二重ストランドcDNAをQiaquick（Qiagen）で精製し、SpeedVacにて乾燥した。
【０１１０】
アンチセンスRNA合成は、製造業者の指示に従い、全容積20μl中AmpliScribe T7高収率転写キット（Epicentre Technologies, Madison, USA）を用いて行った。RNAを塩析出により精製し、Rnaseフリー水50μlに再懸濁した。
【０１１１】
ランダムヘキサマー6μg（Invitrogen, Belgium）を容積22.0μl中の増幅RNA5μgに加え、65℃にて10分間インキュベートした。この混合物に5x第一ストランド緩衝液8μl、0.1 M DTT 4μl、10 mM アミノ-アリル-dUTP（Sigma）1.4μl、20 mM dATP 1μl、dGTP、dCTP mix、5 mM dTTP 1.3μlおよびSuperScript II 2.5μl（500 Units）（すべてInvitrogenより）を加えた。混合物を42℃にて終夜インキュベートした。
【０１１２】
RNAを1 M NaOH 10μlおよび0.5 M EDTA 10μlを加え、65℃にて30分間インキュベーションすることにより加水分解した。1 M HCl 10μlを加えて溶液を中和し、QiaQuick精製カラムを用いて過剰aa-dUTPを除去した。サンプルをSpeedVac中にて乾燥し、0.1 M Na2CO3（pH 9.0）4.5μlにて再懸濁した。Cy染料エステル4.5μl（Amersham Pharmacia PA25001およびPA23001, 1のCy染料バイアルの内容物をDMSO 73μL（Lab-scan, Dublin, Ireland）に溶解し、曝露サンプルについてCy5を用い、対照サンプルについてCy3）を加え、暗室室温にて1.5時間インキュベートした。QiaQuickカラムを用いたサンプルの精製により非取り込みCy染料を除去した。
【０１１３】
染料の収率および取り込みはUV分光分析により推定した。サンプルを集め、Cot DNA 5μl（1μg/μl）、tRNA 5μl（10μg/μl）およびポリ-A (Sigma) DNA 1μl（20μg/μl）を加えた。次いでサンプルをSpeedVac中にて乾燥した。
【０１１４】
マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションおよび洗浄
マイクロアレイスライドをバンダービルトマイクロアレイ共有資源センター, Nashville, TN, USAから得た。およそ11,000のヒト遺伝子に対応するcDNAクローンを含むヒト11kアレイを用いた。スライドを55℃にて45分間5x SSC、1% BSAおよび1% SDSにあらかじめ混成させた。スライドを水で5回、次いでイソプロパノールにて洗浄することによりきれいにした。スライドを空気乾燥した。
【０１１５】
乾燥サンプルをハイブリダイゼーション溶液60μl（50% ホルムアミド, 5x SSC, 0.1% SDS）中にて再懸濁し、2分間沸騰水中にて加熱した。サンプルをマイクロアレイスライドに適用し、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションチャンバーに移し、40℃暗室にて終夜インキュベートした。
【０１１６】
カバースリップを55℃にて2xSSC+0.1% SDSに穏やかにスライドを差し込むことにより除去した。ハイブリダイゼーション後の洗浄を55℃にて1xSSC、0.1% SDSで5分間、0.5xSSC（室温）で3分間、室温にて0.1xSSCで3分間を２回行い、0.1xSSCで２回すすいで残存するSDSを除去した。
【０１１７】
マイクロアレイデータ分析
スライドをTecan LS200スキャナー（Tecan, Grodig/Salzburg, Austria）を用いて532 nmおよび635 nmにてスキャンした。イメージ分析をArrayProアナライザーソフトウェア（MediaCybernetics, Silver Spring, MD, USA）で行った。スポット強度を、各スポットの局所バックグラウンドの平均強度から差し引いたスポットの平均強度として測定した。特定のスポットにおける遺伝子の発現は、シグナルがバックグラウンドに5xバックグラウンドの標準偏差を足したものよりも大きい場合に関連するものと考えられた。Lowess手順を用いてデータを標準化し、Cy5/Cy3比を測定した。
【０１１８】
感作化学物質へのCD34-DCの曝露により有意に影響される遺伝子を同定するために、上記方法を用いた。
【０１１９】
以前に述べたとおり、153の候補配列のリスト（配列番号1〜153を参照のこと）を同定した。リストは配列表（第1表）に詳述した。
【０１２０】
統計分類モデル：
統計分類モデルの目的は、二のクラス：C1 = 感作またはC2 = 非感作のうちの一に任意に与えられる化合物を分類することである。各化合物について、多くの変形を測定し：これらの変形は：xi =「遺伝子iの発現」, nを決定して（以下に詳述する）i=1,...,nとして示す。対数倍数変化（LFC）はインプット（xi）として統計分類モデルに用いることができ、「予測モデル」とも称される。
【０１２１】
予測モデルの設計（任意）は、C1またはC2に属するか否かが先験的に知られている化合物のセット（好ましくは大量）にて該変形xiを測定することにより開始する。この測定の収集（さらにトレーニングセットとも称される）は参照セットの例として供されよう。次に、数学的分類モデルを選択し、次いでこれをこれらの参考例のために最適化（訓練）する。
【０１２２】
より正確には、例えば5〜10までの遺伝子のサブセットについての遺伝子発現xiの収集を参考セット例として用いることができる。
【０１２３】
その後、数学的分類モデルを選択する。以下に多くの可能性がある。モデル間の主な差異は、数学的関係の仮定および複雑性である。いくつかのモデルは、事実上判別的であり：クラスの出力モデルとして生成する。いくつかのモデルは確率的であり：クラスメンバーについての確率を生成する。いくつかのモデルは分析的に最適化することができ、他のより複雑なモデルは最適条件の（非）グローバルな性質について内在的不確実性を伴う多くの最適化を必要とする。一般に、より複雑なモデルはより複雑な（非線形）関係を発見しうるが、より訓練される例を必要とする。より直接的なモデルは必要なデータが少なく、より堅調であり、不安定性により敏感である。
【０１２４】
分類モデルの選択は、データ駆動型であり、当業者に知られているように、成長するトレーニングセットの性質により時間変動であることができる。
【０１２５】
いくつかの可能なモデルは：
・線形または二次判別モデル
・ロジスティック判別モデル
・ツリーモデル
・最近傍モデル
・ニューラル・ネットワーク（多層パーセプトロン, 放射基底）
・サポートベクターマシン
【０１２６】
次いで、分類モデルはこれらの参考例について最適化（訓練）される。トレーニングセットの化合物について対応するインプットxiがモデルに提示された場合に、モデルができるかぎり誤判別がないようにC1またはC2を選択することができるべきであることを意味する。この最適化工程はクラスメンバー（提示化合物の感作可能性）が先験的であることが知られているため、「管理された学習」とも称されることがある。
【０１２７】
n遺伝子の最終セットを選択するために、当業者は好ましくは最も有望な遺伝子（群1または場合により群2）で開始する。遺伝子は、識別力を示す限り、（トレーニングセットにて）保持され、そうでなければ拒絶される。従って、トレーニングセット（およびデータベース）は時間における動的存在である。この手順は、一セット、好ましくは5〜10の（判別）遺伝子が保持されるまで繰り返す。
【０１２８】
次に、これらのn遺伝子のxiからなるトレーニングセットを用いて分類モデルを訓練し、評価する。この点、遺伝子の数が少ないため、遺伝子の異なる組合せを試験することができる。分類モデルの挙動は遺伝子を保持または拒絶するために用いられる（曝露時間および曝露濃度を選択するためにも用いられる）最終基準である。すなわち、この目的にて、さらなるインプットの選択が生じる。残された遺伝子の数が良い分類モデルを作製するには少ない結果になった場合、新たな遺伝子（もし必要ならば群1、2または3から）を含むことができる。
【０１２９】
従って、分類モデルの構築は、都合良く、データベース（トレーニングセット）が成長するにつれて続くであろう反復工程であり、すなわち、新規化合物が含まれるか、または第1表のリストからの他の遺伝子が参照化合物について測定される。
【０１３０】
モデルがトレーニングセットにてよく実行され、このセットが他の化合物の代表である場合、一般化により見られる数学的関係を用いて予測をたてることができると仮定しうる。モデルが感作可能性が（先験的に）未知である新規化合物を分類することができることを意味する。
【０１３１】
従って、モデル能力を推定して一般化することは可能であり、これは相互検証によりなしうる：オリジナルトレーニングセットをトレーニングセットおよび試験セットに分け；訓練後に一般化を試験セットにおけるモデル挙動により測定することができる。
【０１３２】
以下のいくつかの実施例は本発明をさらに説明するために提示する。実施例は限定されるものではない。
【実施例】
【０１３３】
実施例1：特定の化合物のACDポテンシャルの測定：
候補遺伝子（バイオマーカー）を測定するための先に記載の方法は、ここで上記のように構築された参照データベースを用いて化合物のACD感作可能性を測定するための改変された形態にて用いることができる。
【０１３４】
臍帯血に由来するCD34-DCをアレルギー誘発性について試験すべき化合物に曝露する。各CD34-DCサンプルを一定時間または一連の時間の曝露について用いる。それぞれの時点にて、同じ供与体からの非曝露対照サンプルもまた得られる。各化合物について、3の非関連個体からのCD34-DCを用いる。
【０１３５】
次いで、マイクロアレイ分析を選択された時点について行い、該マイクロアレイは配列番号1〜153として示されるRNA配列に対応する例えば5または10のcDNAフラグメントのサブセットを含む。
【０１３６】
該マイクロアレイ分析から得られる10のcDNAフラグメントについての発現を分類試験（またはモデル）（上記のとおり）についてのインプットとして用い、該化合物のACDポテンシャルを測定する。
【０１３７】
実施例2：マイクロアレイ分析により得られる結果の相互検証
現在のマイクロアレイデータベースは、平均3の個体からの試験および対照サンプルについての11,000の遺伝子発現を含み、以下のものに一連の時間曝露する：
【表２】
2010504744.tif 000004
【０１３８】
明確な例についての試験ケースとして、データベースを現在、12時間の曝露時間に限定するだろう。さらに、NiおよびBCはデータベースから除かれ、ACDポテンシャルを測定しなければならない化合物として用いられよう。
【０１３９】
次に、配列番号1〜153は遺伝子1（配列番号1に対応）のみを考慮する。この遺伝子について、発現はデータベースに調べられ、対数倍数変化（LFC）を測定する。結果はFigure 1に示す。
【０１４０】
これらの化合物についてのこの遺伝子の発現データに基づき、非常に単純な分類モデルは「いくつかの個体の平均LFC 12がゼロより大きい場合に、化合物はACD感作可能性を有する」として定義することができる。
【０１４１】
最終的に、NiおよびBCはそれらの感作可能性について試験することができる。それらのLFC 12はFigure 2に提示される。
【０１４２】
これらのデータが上記分類に与えられる場合、当業者はNiがACD感作可能性を有し、BCが有さないという的確な結論に達する。
【０１４３】
この実施例におけるアプローチはより多くの遺伝子が含まれるべき堅調な試験について単純すぎ、より高次元のベクタースペースにおける分類方法が要求される。ここに可能な方法は線形判別分析であるか、または非線形方法が必要であれば、ニューラル・ネットワークおよびサポートベクターマシンが可能な候補である。
【０１４４】
特定の化合物の存在下にて測定される遺伝子発現を用いて、続けて参照データベースの質を再評価することに留意すべきである。
【０１４５】
言い換えると、参照データベースは時間における動的存在である。トレーニングセットは動的存在であり、いつ（非）感作であると知られている化合物のxiが測定されるかにかかわらず、時間的に成長するであろう。新規データが入手可能となるときに、上記のモデル最適化は繰り返されなければならない。この反復工程はモデルを連続的に微調整し、最終遺伝子（すなわちxi）を選択する際の案内を供して使用するだろう。
【０１４６】
限られた数の遺伝子により、十分な確実性をもって化学的アレルゲンを同定するのに十分であることができる。遺伝子の数およびタイプに基づき、発現レベルを測定するための多くの異なる戦略を例えば最も一般的に用いられる手順のいくつかに適用することができる：
mRNAレベルにて：
・ガラス、プラスチックまたはナイロン膜の専用マイクロアレイ
・マルチプレックスリアルタイムRT-PCRまたはマルチプルシングルプレックスリアルタイムRT-PCR法
・競合RT-PCR法
・RNase保護アッセイ
・ノーザンブロッティング
・蛍光分子の候補遺伝子のプロモータ配列の遺伝子構築物の構築および関連細胞系への変換、次いで光生成の測定
タンパク質レベルにて
・ガラス、プラスチック、膜の専用タンパク（マイクロ）アレイにて
・例えばLuminex系による多重タンパク質分析
・Elisa
・FACS分析
・ウェスタンブロッティング
【０１４７】
実施例3：4の遺伝子および9の参照化合物によるトレーニングセットに基づく予測モデルを用いたさらなる実施例
本実施例に用いられるRT-PCRデータ
遺伝子発現xiを以下の遺伝子についてRT-PCRにより測定した：PBEF1 (AA281932)、CREM (AA464861)、CXCR4 (T62636)、MAX (H86558)、ENC (H72122)、NINJ (AA625806)、CCR2 (H58254)、PTGS2 (R80217|AA644211)、CD36 (N39161)、CLTB (N39161)、CLTB (N20335)およびCCR7 (NM 001838)。
【０１４８】
次の9の化学的感作モデル化合物を用いた：
【表３】
2010504744.tif 000005
最初の6は感作物質であることが知られており、最後の3は非感作物質であることが知られている。それらの（非）感作可能性は先験的（インビボ試験より）であることが知られている。
【０１４９】
あらゆる遺伝子の発現を9の異なる化合物のそれぞれ（対照＝溶媒）への曝露後に測定した。平均3における各化合物について、異なる非関連個体を曝露に用いた。3からの平均サンプルについて、異なる個体を化合物ごとに用いた。3の曝露時間（6、12および24時間）からなる各曝露および三の異なる濃度を各曝露実験について用いた。結果として、各遺伝子についての平均で一つは9*3*3*3 = 243 LFC値（対数倍数変化）。
【０１５０】
試験された三の濃度から最も高いもののみ（EC20に大雑把に対応）が明らかに非ゼロLFC値を誘発したので、実施例はさらに一の濃度に制限される。他の二の濃度のLFCは省略する：従って各遺伝子について81のLFC測定を用いた。
【０１５１】
個別の各遺伝子の識別力
遺伝子の識別力を分析するために、どうやって感作物質からのLFCが非感作物質のLFCから区別することができるかを定量化しなければならない。各遺伝子のデータは三次元空間（3時点）における27点（平均3の個体にて9化合物）として示すことができる：PBEF1データについてfigure 3を参照のこと。
【０１５２】
二の群の分離を定量化するために、例えば線形判別分析（lda）を用いることができる。この方法により、群間の判別が最大である空間（本ケースにおいて3D空間における一方向）にて方向を測定する。この方向のすべてのデータを推定することにより、一次元へのデータを軽減する（figure 4を参照のこと）。数学的に、この推定は6、12および24時間におけるLFCの線形結合であり；LFCのこの線形結合は特徴値と称されよう。この遺伝子ごとの特徴データについて、F試験を行い、分離の有意性（p値）を分析することができる（F試験は群内の分散を群間の分散と比較する）。p値により順番付けられた各遺伝子についての結果をfigure 4に示す。
【０１５３】
閾値を設定し、それ以下のp値でそれらの遺伝子を保持することができる。本実施例についてp = 0.0001の閾値を選択し、従ってNINJ、PBEF1、CCR7、CREMおよびMAXを保持する。遺伝子MAXについて技術的な問題によりニッケルでの実験が不成功であったため、この遺伝子はさらに省略する。
【０１５４】
NINJ、PBEF1、CCR7、CREMに基づく分類モデルの構築
化合物に曝露される各個体について、考えられる遺伝子のそれぞれについての一つは4の特徴値を有する。従って、これらのデータは感作物質の雲および非感作物質の雲として四次元空間に示すことができる。
【０１５５】
まず、次元をさらに軽減した：データは二次元空間上にて推定した。これは実施例を視覚的によりあり得るものとするが、より重要なことに、次元の減少により過剰適合（overfitting）の危険性を軽減し、トレーニングデータの量が限定された場合に分類モデルの一般化を改善することができる。
【０１５６】
この目的を達成するために、ldaを再度用いて二群間の分離が最適である二次元空間を発見した。結果をfigure 5に示す。この空間の二軸の変動は四の遺伝子の四の特徴値の線形結合である。我々はx-およびy-変動をそれぞれ特徴値1および2と称する。これらの特徴値はデータによりトレーニングされることに留意する。例えばいくつかの化合物がデータセットから除外され、手順を繰り返す場合、得られた特徴値、従ってデータの二次元表示が異なるだろう。
【０１５７】
figure 5から、感作物質および非感作物質が二のよく分離された群に含まれることは明らかである。このデータに基づく分類モデルを構築するために、我々は二次判別分析を用いた。この二次モデルについて、二群を分離する決定境界が円錐曲線、この場合楕円である。
【０１５８】
figure 5から、二群を正確に分離しうる分類モデルを作製することは困難ではないことが明らかである。しかし、データの量が限定されているので、そのようなモデルが正確にモデルの最適化に用いられない新規化合物を分類するか否かは明らかではない。モデルの一般化可能性の一次分析は相互検証である。
【０１５９】
分類モデルの相互検証
まず、9化合物の一つを選択し、データセットから対応する測定を除外する。次に、lda最適化および先の工程に記載の二次判別モデルの構築を繰り返す。
【０１６０】
次に、除外された化合物のデータを分類モデルに送って用い、化合物が属するクラスを推定する。
【０１６１】
9化合物のそれぞれについての実行の結果をfigure 6に示す。
【０１６２】
figure 6から、モデルが非感作物質としてTBT、トリトンおよびDMSO、および感作物質として他の化合物を分類することが分かる。これは正しい。さらに、すべての化合物について、個体（平均3）間で完全に一致し：すべての試験点は同じクラスに含まれる。
【０１６３】
従って、検討中の化合物について、6、12および24 hについての曝露後（EC20の濃度）に測定した遺伝子NINJ、PBEF1、CCR7およびCREMのLFCの組み合わせは、良い分類モデルを作成するのに十分である。結果的に、新規化合物の感作可能性を予測するための一次試験が構築され得、インプットデータとして、この新規化合物の上記濃度における上記曝露後の上記LFC測定が必要となろう。
【０１６４】
モデルの正確性および信頼性を増大するために、先験的に感作可能性が知られているより多くの化合物を試験（好ましくはより多くの個体）すべきである。いつそのような過剰データが入手可能となろうと、この実施例に類似する手順を行い、分類モデルをアップデートし、試験を改良できる。これにより、他のまたは異なる数の遺伝子の使用をもたらしてもよい。しかし、第1表に記載のものから選択的に選択される5〜10の遺伝子が良いモデルを構築するのに十分であるべきであることが予期される。
【０１６５】
第1表:配列表。第一列: 配列番号。第二列: 対応mRNA配列。3の異なる群について、本明細書の説明を参照のこと。
【表４】
2010504744.tif 000006
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
2010504744.tif 000085
【０１６６】
第2表: 第1表の候補配列のマイクロアレイにおけるGenbank信託番号、名称およびUnigene名。いくつかの名称は入手できなかった。EST: 発現配列タグ。第一列に対応配列番号。
【表８４】
2010504744.tif 000086
【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
2010504744.tif 000089
【表８８】
2010504744.tif 000090
【０１６７】
参考文献
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【図１】
2010504744.tif 000093
【図２】
2010504744.tif 000094
【図３】
2010504744.tif 000095
【図４】
2010504744.tif 000096
【図５】
2010504744.tif 000097
【図６Ａ】
2010504744.tif 000098
【図６Ｂ】
2010504744.tif 000099
【図６Ｃ】
2010504744.tif 000100
【図６Ｄ】
2010504744.tif 000101
【図６Ｅ】
2010504744.tif 000102
【図６Ｆ】
2010504744.tif 000103
【図６Ｇ】
2010504744.tif 000104
【図６Ｈ】
2010504744.tif 000105
【図６Ｉ】
2010504744.tif 000106
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月27日(2009.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010504744000001.app
【国際調査報告】
2010504744.tif 000107
2010504744.tif 000108
2010504744.tif 000109