(57)【要約】  本発明は、有効成分として絡石藤（Trachelospermi caulis）とイチヤクソウ(Pyrola japonica)の生薬混合抽出物を含有する炎症性疾患の予防及び治療用医薬組成物に関する。更に詳しくは、本発明の医薬組成物は、所定比で混合された絡石藤とイチヤクソウの生薬混合抽出物を含有することで、１種の生薬から製剤されたものに比べて、鎮痛効果、急性炎症抑制効果、炎症を含む因子と係る酵素分泌の抑制効果、及びＮＯ、ｉＮＯＳなどの生成抑制効果が優れており、それ故、関節炎などの炎症性疾患の予防及び治療に有用である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絡石藤とイチヤクソウの混合抽出物を含有する炎症性疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記絡石藤とイチヤクソウの抽出物の混合比は、１：１〜１：１５の質量比である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記炎症疾患は関節炎及び浮腫である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
（ａ）絡石藤とイチヤクソウを 混合して、水、アルコール及びアルコール水溶液から選択される溶媒を使用して抽出し、混合抽出液をろ過する段階と、
（ｂ）前記ろ液から 水層分離する段階と、
（ｃ）前記水層を濃縮して 可溶性固形物を得る段階と、
を含む絡石藤とイチヤクソウの混合抽出物の製造方法。
【請求項５】
前記抽出は、混合抽出物の質量の５〜８倍量の溶媒を使用して行う、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記濃縮は減圧下で行う、請求項４記載の方法。
【請求項７】
（ａ）アルコールを使用して濃縮を懸濁して前記懸濁液を遠心分離し、ろ過する段階と、
（ｂ）前記ろ液を再度減圧濃縮する段階と、
（ｃ）前記濃縮物を乾燥、粉砕及び滅菌する段階と、
を更に含む、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分として絡石藤（Ｔｒａｃｈｅｌｏｓｐｅｒｍｉ ｃａｕｌｉｓ）とイチヤクソウ（一薬草、Ｐｙｒｏｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の生薬混合抽出物を含有する炎症性疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物に関する。更に詳しくは、本発明の医薬組成物は、所定比で混合された絡石藤とイチヤクソウの生薬混合抽出物を含有することで、１種の生薬から製剤されたものに比べて、鎮痛効果、急性炎症抑制効果、炎症を含む因子と係る酵素分泌の抑制効果、及びＮＯ、ｉＮＯＳなどの生成抑制効果が優れており、それ故、関節炎などの炎症性疾患の予防及び治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
関節炎は、細菌感染や外傷により関節内で生じた炎症性変化に関連する疾病の総称である。このような関節炎は大きく急性関節炎と慢性関節炎の２つに分類される。
【０００３】
急性関節炎は次のようにさらに分類することができる。（１）漿液性関節炎：通常外傷により生じるが、原因不明なものもあり、一般的に１つの関節だけに起きる。（２）漿液線維素性関節炎：急性関節リウマチ関節炎と同時に起き、関節腔内に混濁した滲出液が溜まる。これは偽膜の生成により炎症が治まっても運動障害を引き起こし得る。（３）化膿性関節炎：関節の開放創、または淋疾、腸チフス、しょう紅熱及び敗血症のような伝染病で多発性関節炎が起きる。生後１〜２ヶ月の乳児は、治療不能の骨の損傷により脱臼に発展し得る。成人はしばしば、化膿部がつぶれて膿が関節に入り骨膜骨髄炎に発展するが、これを２次化膿関節炎と言う。
【０００４】
慢性関節炎は次のようにさらに分類することができる。
（１）特殊型炎症：通常、結核性関節炎または梅毒性関節炎、もしくは中年男性に多く発生する尿酸の代謝障害により起こる通風性関節炎と関連する。
（２）多発性関節炎：慢性関節リウマチが大部分である。これは、急性漿液性関節炎から移行したり、肺炎、梅毒及び淋疾の過程で多発性関節炎として起こったり、または敗血症の１種であることもある。その他に、スティル病もこの範疇に属する。
（３）変形性関節炎：通常退行性の老化過程または外傷により起きる。
（４）血友病性関節炎：血友病患者のうち関節内の出血により発生する。
【０００５】
また、変性性関節炎は「骨関節炎」とも呼ばれる。変性による関節軟骨の変化により生じる局部的関節炎であり、主に中年または高齢者に発生する。局部的関節炎の主要因は老化であり、５５〜６５歳の年齢層の約８５％に発生する。男性より女性に多く表れ、更に深刻である。更に、肥満の人に正常な健康の人より２倍ほど多く発生し、特に、体重がかかる脚の軟骨に表れ、例えば、股関節、膝関節、足首関節などに表れる。関節痛は一般的に、関節を激しく動かした後、または夕方に発生し、休息すると症状は改善する。
朝に感じる初期硬直は、約５〜１０分間体を動かすと、簡単になくなる。症状が深刻であったり、進行した場合、動くたびに関節からポキッという音がし、更に深刻な場合、関節の動きが限定される。時折、体重に耐える関節、特に膝関節は、一時的に全く使えなくなった後、特別な治療なく自発的に症状が改善されることがよくある。一般的に、６０歳以上の女性の約３５％及び男性の約１５％で、変性関節炎と関連する症状が観察される。症状を改善させるための最適な治療法は、規則的な運動または水泳をすることであり、各自に適した程度行い、運動を助けるための補助器具を使用することができる。症状の治療薬の例としては、抗消炎鎮痛剤、副腎皮質ホルモン剤、軟骨保護剤、関節内への潤滑剤投与手術などがある。前述した関節炎に代表される各種炎症性疾患の治療のために、多くの薬剤が開発されている。
【０００６】
本発明は、生薬抽出物を含有する医薬組成物に関し、合成薬品による副作用の恐れを排除することができる。実際、本発明の生薬組成物を含有する生薬の単回投与毒性実験によりその安全性が確認された。
【０００７】
本発明の生薬組成物は、絡石藤及びイチヤクソウの抽出物を含有する。絡石藤は、キョウチクトウ(夾竹桃)科(Apocynaceae)に属するテイカカズラ(定家葛)、及びツキヌキニンドウ(突抜忍冬)とも呼ばれ、５メートルの高さまで育つ。花びらは５つに深く分岐し、５〜６月に風車の形をした白い花が咲き、とても良い香りを持つ。果実は９〜１１月頃に実り、２つの長い果実は漢字の人という字を想像させ、しばしば腕輪のように丸い円形を作る。実際、絡石藤は韓国の南部地方の海岸、山麓、または荒地に育ち、特に、岩石、壁、またはその他の木や植物に巻きつきながら育つ。絡石藤が多い所では、その他の種類の草が育つことができず、四方が絡石藤で覆われている所もある。北朝鮮で発行された「東医学辞典」によると、絡石藤はテイカカズラの茎と葉を乾かしたものである。味は苦く、東洋医学の観点からその性質は冷たい。心経絡、肝経絡、及び腎経絡に作用する。病原因子と混ざり合った風湿を排除し、経絡をスムーズに通すようにする。一方、麻痺症候群、四肢痙攣、腰痛、関節痛、扁桃炎、及び発疹を治療するのに有用である。
【０００８】
絡石藤の有効成分は、アクチイン(arctiin)、アクチゲニン(arctigenin)、トラケロサイド（tracheloside）、マテレシノサイド（matairesinoside）、シマロース(cymarose)などである。これらは血管拡張作用及び降圧作用を有することが知られている［非特許文献１］。
【０００９】
イチヤクソウは、イチヤクソウ(Pyrola japonica Klenze ex Alefeld)科に属する常緑多年草である。黄白色または白色の花が総状花序に６〜７月に花茎の先に咲き、果実はさく果で８月に熟す。葉と茎は止血剤及び解毒剤として使用される。有効成分として、アルブチン(arbutin)とメチルアルブチン(methylarbutine)が約１％含有しており、ホモアルブチン、ケツセチン、ウルソル酸、オレアノール酸などを含む。一般的に、高血圧及び関節痛の治療に有用されることが知られている［非特許文献２］。
【００１０】
しかし、生薬混合抽出物を含有する薬剤の効能についての研究は未だない。また、東医宝鑑、郷薬集成方、広済秘笈などの薬草書や関連文献は、東洋医学の観点からの生薬の効能及び煎じ薬を製剤する方法を簡潔に言及しているのみである。更に、生薬混合剤の煎じ薬の処方法に関する報告はない。実際に、前記方法を使用して抽出された有効成分の効能についての報告はない。また、動物モデルを使用した前臨床試験または抗炎症効果及び鎮痛効果のような薬学効果に関する知見はない。
【００１１】
本発明の背景技術に開示された情報は、発明の背景技術の理解を高めるだけのものであり、この情報が先行技術をなす提案または認識として受け入れられてはならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Herb Medicinal Pharmacology, J.P. Lim, p155-156(2003)
【非特許文献２】The Encyclopedia of Chinese Crude Drug, J.H. Park, p139-140(2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
より科学的で客観的なデータを提供することで前述した問題を解決し、抽出効能を最適化するために集中的に努力した結果、本発明の発明者らは、適合質量比で混合し、疼痛と急性炎症の治療に優れた絡石藤とイチヤクソウの２種の生薬抽出物を含有する医薬組成物を発見した。
【００１４】
従って、本発明の目的は、有効成分として絡石藤とイチヤクソウ(一薬草)の生薬混合抽出物を含有する炎症疾患の予防及び治療用医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は絡石藤とイチヤクソウとの生薬混合抽出物を含有する炎症疾患の予防及び治療用医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明を更に詳しく説明すると下記の通りである。
【００１７】
本発明は、所定範囲で混合された絡石藤とイチヤクソウの生薬混合抽出物を含有し、１種の生薬から製剤されたものに比べて、鎮痛効果、急性炎症抑制効果、炎症を含む因子と係る酵素分泌の抑制効果、及びＮＯ、ｉＮＯＳなどの生成抑制効果が優れており、それ故、関節炎などの炎症性疾患の予防及び治療に有用である医薬組成物に関する。
【００１８】
絡石藤とイチヤクソウの抽出物を含有する混合生薬組成物は、水またはアルコール水溶液を使用して次の方法を利用して抽出された。
【００１９】
絡石藤とイチヤクソウの生薬を細かく刻み、１：１〜１：１５の質量比、好ましくは１：１〜１：５の質量比で混合し、混合生薬の総質量に対して１０〜１５倍の水、アルコールまたはアルコール水溶液を添加した後、抽出する。前記抽出により得られたろ液を層分離して、得られたアルコール層を６０〜８０℃で減圧濃縮する。濃縮段階の間、得られた抽出物を共沸濃縮して、凍結乾燥し、最終的に粉末抽出物の形体で製造される。
【００２０】
本発明の抽出方法を更に詳しく説明すると下記の通りである。
【００２１】
絡石藤とイチヤクソウの元生薬は、１：１〜１：１５の質量比、好ましくは１：１〜１：５の質量比で混合され、水、アルコールまたはアルコール水溶液を添加した後、２〜３時間、２〜５回繰り返し抽出する。得られた抽出物を室温で徐々に冷却し、遠心分離を通したろ過により残渣と分離する。残渣に、混合生薬の総質量に対して１０〜１５倍の水、アルコールまたはアルコール水溶液を加えた後、加熱して、再抽出した後、ろ過して、以前のろ液と混合した後、再ろ過する。再ろ過は、水、アルコールまたはアルコール水溶液を残渣に加えて行われた後、ろ過することで、抽出効率を高めることができる。ここで、水、アルコールまたはアルコール水溶液の量が混合生薬の総質量の１０倍未満の場合、抽出物の溶解度が下がるため、抽出効率が低下する。一方、水、アルコールまたはアルコール水溶液の量が混合生薬の総質量の１５倍を超過すると、使用されるアルコールの量が増加し、減圧濃縮時間が長くなるため、非経済的であり、扱いに問題が生じる。
【００２２】
本発明のアルコールとして、脂肪族及び芳香族アルコール全て使用することができ、好ましくは脂肪族アルコール、更に好ましくは炭素数１〜６の低級アルコールが使用され得る。
【００２３】
更に、各段階別抽出効率を分析した結果、１次抽出に加えて再抽出を行うことにより、全体抽出量の約８０〜９０％の収率を得ることできることが分かったが、３次以上の追加抽出は収率の増加があまりないため、経済的ではない。
【００２４】
前述したように、水、アルコールまたはアルコール水溶液で抽出して得られた抽出液は、ろ過、濃縮された後、ろ液中に含まれる不必要なタンパク質、多糖類及び脂肪酸の不純物が精製される。本発明では、ろ液と同量のアルコール水溶液を溶媒として使用して、２〜５回層分離を実施し、溶媒分画を得ることで、前記不純物が除去される。
【００２５】
前記アルコールは炭素数１〜６のアルコール、更に好ましくは３０％エタノールであることが好ましい。低級アルコール水溶液の量がろ液に比べて少ない場合、脂肪酸のような不必要な成分により微粒子が形成されるため、層分離が円滑に行われず、また、有効成分の抽出含量が低くなるため、経済的ではない。
【００２６】
層分離後に得られた抽出液は、６０〜８０℃で減圧濃縮して、残っている溶媒を除去する。従って、得られた濃縮物に、減圧濃縮過程で集めたアルコールを加えて、５００〜１０００ｒｐｍで遠心分離したろ液を加え、再び減圧濃縮する。ここで、減圧濃縮温度が６０℃未満の場合、溶媒が完全に除去され得ない。一方、前記温度が８０℃を超過すると、濃縮物の安定性に問題が発生する。前記濃縮が５００ｒｐｍ未満のとき、アルコールからの濃縮物の分離が困難となる。
【００２７】
一方、１，０００ｒｐｍを超過すると、濃縮物の安定性に問題が生じる。
【００２８】
従って、得られた濃縮物を６０〜８０℃、０．０８〜０．３ｐａで乾燥し、３０〜８０メッシュのふるいにかけて滅菌し、粉末状の絡石藤とイチヤクソウの混合抽出物が最終的に得られる。それ故、得られた混合抽出物は、１種の生薬から得られたものと比べて、関節炎及び疼痛の治療効果が優れており、絡石藤とイチヤクソウを含有する混合生薬は炎症疾患の予防及び治療に有用である。
【００２９】
本発明で使用される前記生薬は、中国の河南省長沙市で採取された。前記混合生薬は、絡石藤の有効成分であるアクチインを０．５〜４．３ 質量％含有し、アクチインは生体指標として使用される。アクチインの分子式はＣ27Ｈ34Ｏ11である。
【００３０】
また、本発明は、前記粉末状抽出物を有効成分として含有する薬剤を、変性性関節炎および疼痛／炎症の治療薬として使用する方法に関する。絡石藤とイチヤクソウ抽出物から抽出された有効生理活性物質は、ＨＰＬＣを利用して分析された。その結果、アクチインとアルクチゲニンが薬剤に含有され、アクチインとアルクチゲニンはＴＮＦ−α阻害活性を有することが明らかになった［非特許文献３］（Int Immunopharmacol. 2004 Oct; 4(10-11):1419-29, Arctigenin, a phenylpropanoid dibenzylbutyrolactone lignan, inhibits MAP kinases and AP-1 activation via potent MKK inhibition: the role in TNF-α inhibition）。
【００３１】
イチヤクソウの主成分であるアルブチンは、炎症誘発因子であるＮＦ−悔κＢの活性を抑制することで知られている［非特許文献４］（J Dermatol Sci. 2003 May; 31(3):193-201, Downregulation of NF-κB activation in human keratinocytes by melanogenic inhibitors）。
【００３２】
本発明による炎症疾患の治療剤の場合、生体指標としてアクチインの含量は０．５〜１．１質量％含有されているときに目的とする治療効果が得られる。例えば、前記アクチインの含量が０．５質量％未満の場合、関節炎などの治療効果が大きく低下する。アクチインの含量に特別な上限はないが、前記範囲を超過するアクチインが含有されても、目的とする治療効果は増加しないだけでなく、その技術的及び経済的側面で好ましくない。従って、アクチイン含量は約０．８〜１．０質量％であることが好ましい。
【００３３】
本発明の生体指標であるアクチインは、炎症疾患の治療剤の必須成分であり、一定量が含有されるとき、相乗効果を発揮して優れた薬効を表す。更に、治療剤の有効成分だけでなく、その他の成分にも、炎症疾患を治療する優れた効果が含まれている。
【００３４】
本発明の炎症疾患の治療に有用な絡石藤抽出物の製造方法は、次の通りである。
【００３５】
本発明の絡石藤とイチヤクソウの混合抽出物を含有する複合薬剤は、通常の方法を利用して、錠剤、カプセル剤、注射剤などに剤形することができる。錠剤製造時に基剤として使用されるラクトース、微結晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウムなどの混合量と、絡石藤とイチヤクソウの混合抽出物の量を１：１〜１：１５の質量比で使用され、製造された錠剤は、関節炎のような炎症疾患の治療に効果的である。
【００３６】
生薬抽出物自体は治療剤として使用されるが、担体、賦形剤、希釈剤 などと一般的に混合され、粉末、顆粒、カプセル剤または注射剤に剤形される。本発明の絡石藤抽出物は、食用及び薬用として使用されてきた。投薬量に関しては特別な限定はないが、体内吸収度、体重、年齢、性別、健康状態、患者の食事、投与時間、投与方法、排出率、疾患の重傷度などによって異なる。一般的に、体重１ｋｇ当り生薬混合抽出物を約１０〜１０００ｍｇ、好ましくは５０〜５００ｍｇ投与することが好ましい。
【００３７】
従って、本発明の有効成分を含む組成物はその有効範囲を考慮して製造しなければならず、このように剤形化された単位投与製剤の投与は、必要に応じて監視される。更に、特別な投与は専門家の判断と患者の要求に応じて使用されるか、一定間隔で数回投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の実施例により製造された混合生薬抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】本発明のカラギーナンにより誘導された脚浮腫の増加率を比較したデータを表すグラフである。
【図３】本発明のＦＣＡにより誘導された慢性炎症の増加率を比較したデータを表すグラフである。
【図４】本発明の実施例により製造されたｉＮＯＳを使用したウエスタンブロット法により得たバンドの結果を表す。
【図５】本発明のＬＰＳによるマクロファージのＮＯ発現量の減少を表す。
【図６】本発明の実施例により製造されたＴＮＦ−α抗体を使用したウエスタンブロット法により得たバンドの結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の好ましい実施形態について詳しく説明するが、本発明の範囲をこれら実施形態により限定されるものではない。
【００４０】
参考例１：絡石藤抽出物の製造
絡石藤を減菌水で洗浄して乾燥させ、生薬の質量に対して５〜８倍の量の３０％エタノールを添加した後、攪拌して２時間単位で２回熱湯抽出をした。前記抽出物を室温まで冷却し、遠心濾過を行って不純物を除去した。濾液を混合して６０〜８０℃で減圧濃縮した。濃縮物をエタノール分画から回収されたエタノールと懸濁し、１０００ｒｐｍで遠心濾過を行い、６０℃で減圧濃縮し、０．０８ｐａの圧力下で乾燥させた後、８０メッシュのふるいでふるいをかけて滅菌した。得られた絡石藤抽出物をＨＰＬＣにより分析し、アクチイン３．０〜６．０質量％が含まれていることが分かった。
【００４１】
参考例２：イチヤクソウ抽出物の製造
イチヤクソウを減菌水で洗浄して乾燥させ、生薬の質量に対して５〜８倍の量の３０％エタノールを添加した後、攪拌して２時間単位で２回熱湯抽出をした。前記抽出物を室温まで冷却し、遠心濾過を行って不純物を除去した。濾液を混合して６０〜８０℃で減圧濃縮した。濃縮物をエタノール分画から回収されたエタノールと懸濁し、１０００ｒｐｍ で遠心濾過を行い、６０℃で減圧濃縮し、０．０８ｐａの圧力下で乾燥させた後、８０メッシュのふるいでふるいをかけて滅菌した。得られたイチヤクソウ抽出物をＨＰＬＣにより分析し、アルブチン０．１〜１．０質量％が含まれていることが分かった。
【００４２】
参考例３：混合生薬抽出物の製造
同量の絡石藤とイチヤクソウを減菌水で洗浄して乾燥させ、生薬の質量に対して５〜８倍の量の３０％エタノールを添加した後、攪拌して２時間単位で２回熱湯抽出をした。前記抽出物を室温まで冷却し、遠心濾過を行って不純物を除去した。濾液を混合して６０〜８０℃で減圧濃縮した。濃縮物をエタノール分画から回収されたエタノールと懸濁し、１０００ｒｐｍで遠心濾過を行い、６０℃で減圧濃縮し、０．０８ｐａの圧力下で乾燥させた後、８０メッシュのふるいでふるいをかけて滅菌した。得られた混合生薬組成物をＨＰＬＣにより分析し、その結果を表１に示した。
【００４３】
【表１】
2010516755.tif 000003
【００４４】
実施例１：ＴＰＡ誘導によるマウスの耳浮腫試験
前記参考例３で得られた混合生薬抽出物に対するＴＰＡ誘導によるマウスの耳浮腫への効果を調べた。６ｍｍパンチを利用して計測した耳の重さをその結果値として使用した。その結果を下記表２に示す。
【００４５】
［実験方法］
生後７週のＩＣＲマウスを各実験群に分離し、Ｊｏｉｎｓ（登録商標）（ＳＫケミカル、韓国）４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ、絡石藤抽出物４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ、イチヤクソウ抽出物４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇと、絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物４００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇを各々経口投与した。経口投与１時間後、炎症誘発剤であるＴＰＡ（２．５μｇ／２０μＬ）をアセトンに溶解した後、各マウスの右耳に均等に塗り、浮腫を誘発させた。実験の間、観察者は実験体を後方から完全に固定し、２次観察者がマイクロピペットを用いて浮腫誘導物質で各マウスの耳を刺激した。４時間後、耳浮腫が各実験群から観察された。頚椎脱臼を通してマウスを犠牲にした後、浮腫の重さを６ｍｍパンチを利用して計測した。
【００４６】
【表２】
2010516755.tif 000004
【００４７】
前記表２に示すように、本発明の混合生薬抽出物はＴＰＡ誘導による耳浮腫に対して優れた抑制効果を示した。特に、使用した混合生薬抽出物の濃度が４００ｍｇ／ｋｇのときに、浮腫抑制率が５４％で最高であった。
【００４８】
実施例２：アラキドン酸誘導によるマウスの耳浮腫試験
前記参考例３で得られた混合生薬抽出物に対するＴＰＡ誘導によるマウスの耳浮腫への効果を調べた。その結果を下記表３及び４に示す。
【００４９】
［実験方法］
生後７週のＩＣＲマウスを各実験群に分離し、Ｊｏｉｎｓ（登録商標）（ＳＫケミカル、韓国）４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ、絡石藤抽出物４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ、イチヤクソウ抽出物４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇと、絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物４００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇを各々経口投与した。経口投与１時間後、炎症誘発剤であるＴＰＡ（２ｍｇ／２０μＬ）をアセトンに溶解した後、各マウスの右耳に均等に塗り、浮腫を誘発させた。実験の間、観察者は実験体を後方から完全に固定し、２次観察者がマイクロピペットを用いて浮腫誘導物質で各マウスの耳を刺激した。１時間後、耳浮腫が各実験群から観察された。頚椎脱臼を通してマウスを犠牲にし、耳の厚さをマイクロメータを利用して測定した後、浮腫の重さを６ｍｍパンチを利用して計測した。
【００５０】
【表３】
2010516755.tif 000005
【００５１】
【表４】
2010516755.tif 000006
【００５２】
前記表３及び４に示すように、本発明の混合生薬抽出物はアラキドン酸誘導による耳浮腫に対して優れた抑制効果を示した。特に、使用した生薬抽出物の濃度が４００ｍｇ／ｋｇのときに、浮腫抑制率は各々６４％及び５６％で最高であった。
【００５３】
実施例３：λカラギーナン誘導によるラットの耳浮腫試験
前記参考例３で得られた混合生薬抽出物に対する急性炎症への効果を調べた。その結果を下記表５及び図２に示す。
【００５４】
［実験方法］
体重約２００gのＳＤラットに、Ｊｏｉｎｓ（登録商標）（ＳＫケミカル、韓国）４００ｍｇ／ｋｇ、絡石藤抽出物４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ、イチヤクソウ抽出物２００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇと、絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物２ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇを各々経口投与した。その後、１％カラギーナン生理食塩水１００μＬを左側の脚に注射して、脚浮腫を誘発させた。脚浮腫は、 マウス・ラット用足容積測定装置（Ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ７１４０、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ社）を利用して４時間後の脚の容積を測定して分析した（Ｎ＝７）。
【００５５】
2010516755.tif 000007
【００５６】
前記表５及び図２に示すように、本発明の混合生薬抽出物は急性関節炎に対して優れた治療効果を示した。特に、使用した混合生薬抽出物の濃度が４００ｍｇ／ｋｇのときに治療効果が最も優れていた。
【００５７】
実施例４：ＦＣＡ誘発によるラットの関節炎
前記参考例３で得られた混合生薬抽出物に対する慢性炎症への効果を調べた。その結果を下記図３に示す。
【００５８】
［実験方法］
生後７週のＳＤマウスを各実験群に分離し、経口投与のための投与量を計量するために、体重を測定した。その次、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を１ｍｇ／ｍＬ含有する完全フロイントアジュバント試薬０．１ｍＬ／ｐａｗ（シグマ社）を２９Ｇシリンジを利用して、後脚の裏の中央に皮内注射した。アジュバンド投与後、試験物質を２１日間、１日１回同一時間帯に経口投与し、脚浮腫の程度をマウス・ラット用足容積測定装置（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ社）を利用して、３日に１度測定した後、カラギーナンにより誘発する脚浮腫法と同様に、浮腫増加率を算出し、対照群と比較した。陽性対照群として、ジクロフェナク５ｍｇ／ｋｇが使用された。
【００５９】
実施例５：酢酸誘発によるマウスの血管透過度
前記参考例３で得られた混合生薬抽出物の血管透過度に対する抑制効果を調べた。その結果を下記表６に示す。
【００６０】
［実験方法］
生後７週のＩＣＲマウスを各実験群に分離し、絡石藤抽出物２０ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ、イチヤクソウ抽出物２０ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇと、絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物２ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗｔ．各々を濃度が０．１ｍＬ／１０ｇ ｂ．ｗｔ．となるように蒸留水に溶かした後、針（ｓｏｎｄｅ）を使用して経口投与した。
【００６１】
投与容積は、実験当日に測定した体重を基準にして算出され、対照群は、調剤用溶媒である蒸留水を０．１ｍＬ／１０ｇ ｂ．ｗｔ．の濃度で経口投与した。フェニルブタゾンは５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗｔ．の容量で０．５％メチルセルロースに懸濁した後、経口投与した。
【００６２】
実験前、１２時間絶食させたオスのＩＣＲマウスに、ホイットル（１９６４）の方法によって試験物質を投与した。経口投与３０分後、２．５％エバンスブルー溶液（０．１ｍＬ／１０ｇ ｂ．ｗｔ．）を尾静脈に投与した。エバンブルー溶液投与２０分後、０．６生理食塩水に溶かした酢酸を０．１ｍＬ／１０ｇ ｂ．ｗｔ．の濃度で腹腔内注射して、血管透過性の亢進を誘導した。酢酸投与２０分後、各マウスを頸部脱臼させ、生理食塩水５ｍＬを腹腔に加えて、軽く振った。腹腔から洗浄液を取った後、１０分間２，０００ｒｐｍで遠心分離し、分光光度計を使用して６３０ｎｍで上澄液の光吸度を測定することで、腹腔内に流出されたエバンブルー溶液の量を算出した。フェニルブタゾン（５０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗｔ．）とインドメタシン（１ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗｔ．）を陽性対照群として使用した。
【００６３】
【表５】
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【００６４】
前記表６に示されるように、本発明の混合生薬抽出物は、その他の対照群に比べて優れた抑制活性を表した。特に、使用された混合生薬抽出物の濃度が２００ｍｇ／ｋｇのとき、容量依存的に酢酸で誘導された血管透過性に対して高い抑制効果が観察された。更に、使用された混合生薬抽出物の濃度が２００ｍｇ／ｋｇのとき、フェニルブタゾン及びインドメタシンのような陽性対照群に比べて、酢酸で誘導された血管透過性に対して優れた抑制効果が観察されたことが分かった。
【００６５】
実施例６：酢酸誘発によるマウスのライジング反応
前記参考例３で得られた混合生薬抽出物の鎮痛効果を調べた。その結果を下記表７に示す。
【００６６】
［実験方法］
生後７週のＩＣＲマウスを各実験群に分離し、Ｊｏｉｎｓ（登録商標）（ＳＫケミカル、韓国）４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ、絡石藤抽出物４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ、イチヤクソウ抽出物４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇと、絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物４００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇを各々経口投与した。経口投与１時間後、各マウスに０．７％酢酸を腹腔内投与した（０．１ｍＬ／１０ｇ）。腹腔内投与１０分後、ストレッチング（ライジング：背中を伸ばしたり後足を完全に伸ばすこと）方法で観察し、その結果を痛覚指標として使用した。
【００６７】
【表６】
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【００６８】
前記表７に示されるように、本発明の混合生薬抽出物は、対照群と比べてライジング数が少ないことが分かった。特に、使用された混合生薬抽出物の濃度が４００ｍｇ／ｋｇのとき、高い痛覚効果が観察された。
【００６９】
実施例７：混合生薬のＮＯ、ｉＮＯＳ及びＴＮＦ−α生成に対する効果
前記参考例３で得られた混合生薬抽出物の炎症関連因子治療に対する効果を調べた。
【００７０】
［実験方法］
マウス由来マクロファージであるＲａｗ２６４．７細胞株をＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で処理した。処理２４時間後、培養液を集めて、酵素法及びラジカルクロマトグラフィーを通して分析し、ＬＰＳで処理した。４時間後、細胞を溶解させた後、ｉＮＯＳ抗体を利用したウエスタンブロット法により、内因性炎症誘発分子である一酸化窒素（ＮＯ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びＴＮＦ−αの発現量に対する絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物の効果を調べた。
【００７１】
ＮＯは、２４時間培養液１００μＬを集めた後、グリース溶液１００μＬと混合し、ＯＤ５４０ｎｍでの光吸度を測定した。
【００７２】
ｉＮＯＳ及びＴＮＦ−αは、Ｒａｗ２６４．７細胞株をＬＰＳで処理し（１μｇ／ｍＬ）、処理４時間後、前記細胞を溶解させて、溶解された総タンパク質を集めた。前記タンパク質を電気泳動により分離した後、ウエスタンブロット法によりナイロン膜に転換し、タンパク質の量をｉＮＯＳ及びＴＮＦ−α抗体を使用して分析した。
【００７３】
図４はｉＮＯＳの発現量の抑制を表し、図５はＬＰＳによりマクロファージ内のＮＯ生成抑制を表し、そして図６はＴＮＦ−αの発現抑制を表すため、本発明の混合生薬抽出物は抗炎症効果が優れていることを確認した。
【００７４】
実施例８：毒性試験
参考例３で得られた絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物１ｇの反復投与よる毒性を、１６時間絶食させた生後４〜５週のＩＣＲマウス（群当り５匹）を使用して調べた。０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に溶解した前記生薬抽出物１ｇを５日間経口投与した。その結果、全てのマウスが生存し、臓器損傷などの異常は観察されなかった。
【００７５】
製造例１：錠剤の製造
下に記載の組成にて絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物を含む経口投与用錠剤を湿式顆粒法または乾式顆粒法を利用して製造した。
[組成]
絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物                    ２００ｍｇ
軽質無水ケイ酸（light anhydrous silicic acid）            １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム（magnesium stearate）              ２ｍｇ
微細結晶セルロース（microcrystalline cellulose）          ５０ｍｇ
デンプングリコール酸ナトリウム（sodium starch glycolate） ２５ｍｇ
ラクトース（lactose）                                   １０１ｍｇ
ポビドン（povidone）                                      １２ｍｇ
無水エタノール（anhydrous ethanol）                          適量
【００７６】
製造例２：軟膏剤の製造
下に記載の組成にて絡石藤抽出物を含む軟膏剤を製造した。
[組成]
絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物                          ５ｇ
パルミチン酸セチル（cetyl palmitate）                       ２０ｇ
セタノール（cetanol）                                       ４０ｇ
ステアリル・アルコール（stearyl alcohol）                   ４０ｇ
ミリスチン酸イソプロピル（isopropyl myristate）             ８０ｇ
モノステアリン酸ソルビタン（sorbitan monostearate           ２０ｇ
ポリソルベート（polysolvate）                               ６０ｇ
パラオキシ安息香酸プロピル（propyl p-oxybenzoate）            １ｇ
パラオキシ安息香酸メチル（methyl p-oxybenzoate）              １ｇ
リン酸及び精製水                                              適量
【００７７】
製造例３：注射剤の製造
下に記載の組成にて絡石藤抽出物を含む注射剤を製造した。
[組成]
絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物                    １００ｍｇ
マンニトール（mannitol）                                １８０ｍｇ
第二リン酸ナトリウム（sodium phosphate dibasic）          ２５ｍｇ
注射用精製水                                          ２９７４ｍｇ
【００７８】
製造例４：経皮剤の製造
下に記載の組成にて絡石藤抽出物を含む経皮剤を製造した。
[組成]
絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物                      ０．４ｇ
ポリアクリル酸塩（poly acrylate）                         １．３ｇ
グリセリン（glycerin）                                    ３．６ｇ
水酸化アルミニウム（aluminium hydroxide）             ０．００４ｇ
メチルパラベン（methyl parabene）                         ０．２ｇ
アクリル接着溶液（acrylic adhesive solution）             １４ｍＬ
【産業上の利用可能性】
【００７９】
前述したように、本発明の絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物は、疼痛、急性炎症、慢性炎症及び急性浮腫、血管透過性及び炎症関連因子を治療するのに抑制効果が優れているため、炎症疾患の予防及び治療に効果的な成分及びその含量を調節することにより、絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物の規格化を達成することができる。
【００８０】
更に、本発明の絡石藤とイチヤクソウの混合生薬抽出物は、アクチインを生体指標として、生体指標の含量を調節することで炎症疾患の予防及び治療用薬剤を製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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