(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で表される単離されたウリジン二リン酸(ＵＤＰ)-糖転移酵素タンパク質(ＰｇＵＧＴ７４Ａ１)。
【請求項２】
前記タンパク質が、チョウセンニンジン(ｇｉｎｓｅｎｇ)由来の請求項１に記載の単離されたＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、プロトパナキサジオール(ＰＰＤ)-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置に糖転移活性を持つ請求項１に記載の単離されたＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質。
【請求項４】
請求項１の単離されたＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４の前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５の前記発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
ＵＤＰ-糖の存在下で、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドと、配列番号１のアミノ酸配列で表される単離されたウリジン二リン酸(ＵＤＰ)-糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換体又は前記形質転換体のタンパク質を含む培養物とを反応させる工程を含む、プロトパナキサジオール(ＰＰＤ)-タイプのギンセノシドを転換することによって、グリコシル化されたギンセノシドを製造する方法であって、
前記グリコシル化されたギンセノシドの製造が、ＰＰＤからギンセノシドＲｈ２への転換又は化合物ＫからギンセノシドＦ２への転換であり、
前記形質転換体は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入されている、
方法。
【請求項８】
前記ＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質が、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置に対して糖転移活性を持つ請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記製造されたグリコシル化されたＰＰＤ-タイプのギンセノシドと、配列番号３のアミノ酸配列で表される単離されたＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体又は前記形質転換体のタンパク質を含む培養物との反応をさらに含み、
前記形質転換体は、配列番号３のアミノ酸配列で表されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入されている、
請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号３のアミノ酸配列で表される単離されたＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質によるギンセノシドＲｈ２からギンセノシドＲｇ３への転換又はギンセノシドＦ２からギンセノシドＲｄへの転換を含む請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ウリジン二リン酸(ＵＤＰ)-糖転移酵素に関し、具体的に、チョウセンニンジン由来の新規ＵＤＰ-糖転移酵素及びその用途に関するもので、ＵＤＰ-糖転移酵素を用いてプロトパナキサジオール(ＰＰＤ)-タイプのギンセノシドを転換してグリコシル化されたギンセノシドを製造する方法、前記ＵＤＰ-糖転移酵素、形質転換体又はその培養物を有効成分として含むＰＰＤ-タイプのギンセノシドをグリコシル化されたギンセノシドに転換する組成物であるＭｅＪＡ(ジャスモン酸メチル)を用いて前記ＵＤＰ-糖転移酵素の発現を増加させる方法及びＭｅＪＡを有効成分として含む前記ＵＤＰ-糖転移酵素の発現を増加させる組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
チョウセンニンジン(Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ. Ａ ｍｅｙｅｒ)は、健康増進のために広く用いられている最も人気のある薬草の１つである。チョウセンニンジンの根は、伝統医薬でハーブティーとして消費され、最近では、キャンディー、インスタントティー及びトニックウォーターを含む様々な製品に利用されている。チョウセンニンジンに含まれているグリコシル化されたトリテルペンであるギンセノシドは健康に良いとされており、特に、ギンセノシドは、免疫システムの増進及び体内機能の活性化などの様々な薬剤学的な効果を持つことが知られている。さらに、異なる４０種類のギンセノシドが、チョウセンニンジンの根で発見されている。しかし、各々のギンセノシドの大量生産が難しいため、特定のギンセノシドの効能、例えば、特定疾患に関する治療効果の解明に主な障害となっている。
【０００３】
ギンセノシドは、グリコシル化されたダンマラン-タイプの四環式トリテルペン(ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｃ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ)であり、それらのアグリコン構造に基づいて３つの異なるグループに分類することができる：プロトパナキサジオール(ＰＰＤ)-タイプのギンセノシド、プロトパナキサトリオール(ＰＰＴ)-タイプのギンセノシド及びオレアノール酸-タイプのギンセノシド。これらの３つのグループは、化学構造においてグリコシド結合による環のＣ-３、Ｃ-６及びＣ-２０番位置に付着した糖モイエティ(Ｓｕｇａｒ ｍｏｉｅｔｉｅｓ(アグリコン))の位置及び数によってさらに分類することができる。また、ＰＰＤ及びＰＰＴは、異なるヒドロキシル化パターンを持つ。ＰＰＤは、Ｃ-３、Ｃ-１２及びＣ-２０番位置に-ＯＨ基を持つが、それに対して、ＰＰＴは、Ｃ-３、Ｃ-６、Ｃ-１２及びＣ-２０番位置に-ＯＨ基を持つ。ＰＰＤ及びＰＰＴは、グルコース及び/又は様々なタイプの他の糖にグリコシル化されて多様なギンセノシドに転換され得る。代表的なＰＰＤ-タイプのギンセノシドには、ギンセノシドＲｈ２、ギンセノシドＲｇ３、化合物Ｋ(Ｃ-Ｋ)、ギンセノシドＦ２及びギンセノシドＲｄが含まれる。また、代表的なＰＰＴ-タイプのギンセノシドには、ギンセノシドＦ１、Ｒｇ１、 Ｒｅ、Ｒｈ１及びＲｇ２が含まれる。
【０００４】
ギンセノシドの生合成経路は、部分的にしか知られていない。前記ギンセノシドの生合成は、ＩＰＰイソメラーゼ(ＩＰＩ)、ＧＰＰ合成酵素(ＧＰＳ)、ＦＰＰ合成酵素(ＦＰＳ)、スクアレン合成酵素(ＳＳ)及びスクアレンエポキシダーゼ(ＳＥ)の働きによって、イソペンテニル二
リン酸及びＤＭＡＤＰ(ジメチル
アリル二リン酸)の一連の縮合反応が生じてオキシドスクアレン(ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ)が合成されるまで、他のトリテルペンの生合成経路を共有することが知られている(非特許文献１、２及び３)。オキシドスクアレンは、トリテルペン環化酵素(ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ ｃｙｃｌａｓｅ)であるＤＳ(ダンマレンジオール-ＩＩ合成酵素)によってダンマレンジオール-ＩＩに環化される。ダンマレンジオールＩＩは、Ｃ-３及びＣ-２０番位置にヒドロキシ基を持ち、ｐ４５０酵素であるＰＰＤＳ(プロトパナキサジオール合成酵素)によるＣ-１２番位置のヒドロキシル化によってＰＰＤに転換される。ＰＰＤＳは、他のｐ４５０酵素であるＰＰＴＳ(プロトパナキサトリオール合成酵素)によるＣ-６番位置のヒドロキシ化によってさらにＰＰＴに転換され得る。ＰＰＤは、Ｃ-３及び/又はＣ-２０番位置のグリコシル化によってＰＰＤ-タイプのギンセノシドに転換され、ＰＰＴは、Ｃ-６及び/又はＣ-２０番位置のグリコシル化によってＰＰＴ-タイプのギンセノシドに転換され得る。ＵＤＰ(ウリジン二リン酸)-糖転移酵素(ＵＧＴ)は、Ｏ-、β１,２-又はβ１,６-グリコシド結合を形成することで、様々なギンセノシドの合成経路に関与することが考えられる。ＤＳ、ＰＰＤＳ及びＰＰＴＳは、ギンセノシド生合成に関与する酵素として報告されているが、ＵＧＴがギンセノシド生合成に関与するか否かは確認されていない。
【０００５】
ＵＤＰ-糖転移酵素は、ＵＤＰ-糖からホルモン及び２次代謝産物などの様々な代謝産物に糖モイエティの伝達を触媒する酵素である。一般的に、ＵＧＴは、代謝産物の溶解度、安定性、貯蔵性、生体活性又は生物学的な利用可能性を増大させるために生合成経路の最終段階で作用する。植物の代謝産物の驚くべき多様性から理解できるように、植物のゲノムは、数百の異なるＵＧＴを保持している。例えば、モデル植物であるシロイスナズナ(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)は、アミノ酸配列に基づいた異なる１４のグループ(グループＡ〜グループＮ)に属する１０７種類のＵＧＴを含む。異なるＵＧＴは、糖供与体及び糖受容体の両方に対して基質特異性を示す。例えば、ＵＧＴ７８Ｄ２は、グルコースをＵＤＰ-グルコースからフラボノール(ケンプフェロール、クエルセチン)及びアントシアニン(シアニジン)のＣ-３番位置に伝達して、それぞれフラボノール-３-Ｏ-グルコシド及びシアニジン-３-Ｏ-グルコシドを生産する。このようなグリコシル化は、生体内安定性及び化合物の貯蔵性に必須であると思われる。一方で、ＵＧＴ８９Ｃ１は、ラムノースをＵＤＰ-ラムノースからフラボノール-３-Ｏ-グルコシドのＣ-７番位置に伝達して、フラボノール-３-Ｏ-グルコシド-７-Ｏ-ラムノシドを生産する。同様に、ＵＧＴ８９Ｃ１は、ＵＤＰ-グルコース及びアントシアニン-３-Ｏ-グルコシドを基質として使用せず、ＵＧＴ７８Ｄ２からのＵＤＰ-糖及び受容体に対して異なる特異性を持つ。従って、異なるタイプのＵＧＴに対する基質特異的の解明が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ajikumar et al. Science, 330, 70-74. 2010
【非特許文献２】Ro et al. Nature, 440, 940-943. 2006
【非特許文献３】Sun et al. BMC genomics, 11, 262, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、特定のギンセノシドの生合成に利用し得る基質特異性及び位置選択性を持つ新規ＵＤＰ-糖転移酵素の開発に鋭意努力した。その結果、本発明者らは、チョウセンニンジンからＰｇＵＧＴ７４Ａ１と呼ばれる新規糖転移酵素を同定し、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１が、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドであるＰＰＤ及びＣ-Ｋに特異的に作用してＣ-３番位置のＯ-グリコシル化を触媒し、ＰＰＤ及びＣ-ＫをそれぞれギンセノシドＲｈ２及びギンセノシドＦ２に転換する活性を持つことを見出した。このような活性を持つため、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、特定のグリコシル化されたギンセノシドの生産に利用され得る。
【問題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、チョウセンニンジン由来の新規ウリジン二リン酸(ＵＤＰ)-糖転移酵素タンパク質を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、ＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、ＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質を製造する方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記ＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質、前記形質転換体又はその培養物を用いてプロトパナキサジオール(ＰＰＤ)-タイプのギンセノシドを転換することで、グリコシル化されたギンセノシドを製造する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、ＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質、前記形質転換体又はその培養物を有効成分として含む、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドをグリコシル化されたギンセノシドに転換する組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、ＭｅＪＡ(ジャスモン酸メチル)を用いて前記ＵＤＰ-糖転移酵素の発現を増加させる方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、ＭｅＪＡを有効成分として含む、前記ＵＤＰ-糖転移酵素の発現を増加させる組成物を提供することである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の前記新規ＵＤＰ-糖転移酵素は、基質特異性及び位置選択性を持つことから、糖モイエティをＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置に特異的に伝達することができる。従って、ギンセノシドＲｈ２、Ｆ２、Ｒｇ３又はＲｄなどの特定のギンセノシドを大量生産するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＰＰＤ-タイプ及びＰＰＴ-タイプのギンセノシドの化学構造を示す；
【図２】各々のＵＤＰ-糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１が、それぞれのＵＧＴ７４及びＵＧＴ９４とクラスターを形成する概略図を示す。ＵＧＴのアミノ酸配列を、ＭＥＧＡ５ソフトウェアを利用して整列化し、前記整列を近隣結合法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ-ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｒｅｅ)で表した。ＰｇＵＧＴｓ(チョウセンニンジン、Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ)、ＳｉＵＧＴ９４Ｂ１、(Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍ Ｌ.)、ＢｐＵＧＴ９４Ｂ１(Ｂｅｌｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ)、Ｃｍ１,２ＲｈａＴ(Ｃｉｔｒｕｓ ｍａｘｉｍａ)及びＣａＵＧＴ３(Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ)を除いた全てのＵＳＴは、シロイヌナズナから由来する。
【図３】ＵＤＰ-糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７４Ａ１が、ＰＰＤをギンセノシドＲｈ２に転移し、化合物ＫをギンセノシドＦ２に転換する活性を持つことを表す薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)の結果を示す。図３ａは、本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１と異なる１０種類のギンセノシド(右パネル：ＰｇＵＧＴ７４Ａ１処理、左パネル：未処理)のＴＬＣ分析の結果を示す。そして、各々の異なる１０種類のギンセノシドをＵＤＰ-グルコース(ＵＤＰ-Ｇｌｃ)の存在下で、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１と反応させた。図３ａに示すように、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、１０種類のギンセノシド中、ＰＰＤ及びＣ-Ｋのみを、それぞれＲｈ２及びＦ２に転換する(三角形)。図３ｂは、本発明のＰＰＤ(左)及びＣ-Ｋ(右)と、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１を反応させた生成物の高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)の結果を示す。ＰＰＤ及びＣ-Ｋからそれぞれ転換されたＲｈ２及びＦ２を、三角形で表した；
【図４】ＵＤＰ-糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ９４Ｂ１が、ギンセノシドＲｈ２及びギンセノシドＦ２を、それぞれギンセノシドＲｇ３及びＲｄに転移する活性を持つことを表すＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析の結果を示す。図４ａは、本発明のＰｇＵＧＴ９４Ｂ１及び異なる１０種類のギンセノシドのＴＬＣ分析の結果を示す(右パネル：ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１処理、左パネル：未処理)。各々の異なる１０種類のギンセノシドを、ＵＤＰ-グルコース(ＵＤＰ-Ｇｌｃ)の存在下で、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１と反応させた。図４ａに示すように、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１は、１０種類のギンセノシド中、ギンセノシドＲｈ２及びギンセノシドＦ２のみを、それぞれギンセノシドＲｇ３及びギンセノシドＲｄに転換した(三角形)。図４ｂは、本発明のギンセノシドＲｈ２(左)及びギンセノシドＦ２(右)と、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１を反応させた生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す。ギンセノシドＲｈ２及びギンセノシドＦ２からそれぞれ転換されたギンセノシドＲｇ３及びギンセノシドＲｄを、三角形で表した；
【図５】ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の両方を使用する場合、ＰＰＤ及びＣ-Ｋは、それぞれギンセノシドＲｇ３及びＲｄに転換されることを証明するＨＰＬＣ分析の結果を示す。ＰＰＤ(上パネル)又はＣ-Ｋ(下パネル)を、ＵＤＰ-Ｇｌｃの存在下で、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１と共に培養した。その後、反応混合液をＨＰＬＣにより分析した。その結果、ＰＰＤ及びＣ-Ｋが、それぞれＲｇ３及びＲｄに転換されることが示された。前記の２つの酵素によって転換されたＲｇ３及びＲｄを、黒色の三角形で表した；
【図６】ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の相対発現レベルを示す。図６ａは、チョウセンニンジンの葉及び根におけるギンセノシドの生合成遺伝子の発現レベルを示し、図６ｂは、ＭｅＪＡ(ジャスモン酸メチル)で処理した後の葉におけるギンセノシドの生合成遺伝子の発現レベルの変化を示す。ＭｅＪＡを５日間毎日葉に噴射し、処理開始から６日目に、発現分析のためにサンプルを回収した。図６ｃは、ＭｅＪＡ処理後のギンセノシドの発現レベルの変化を示す。エラーバーは、３度の生物学的反復の標準偏差(ＳＤ)を示す；及び
【図７】本発明のＵＤＰ-糖転移酵素に関するＲｇ３及びＲｄのギンセノシドの生合成経路の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一態様として、本発明は、チョウセンニンジン由来の新規ウリジン二リン酸(ＵＤＰ)-糖転移酵素(ＵＧＴ)を提供する。
【００１８】
本発明における用語「ウリジン二リン酸(ＵＤＰ)-糖転移酵素」とは、グリコシル供与体からグリコシル受容体分子に単糖類モイエティの伝達を触媒する酵素で、具体的に、ＵＤＰ-糖をグリコシル供与体として使用する酵素を意味する。本発明において、前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、ＵＧＴと混用され得る。前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、プロトパナキサジオール(ＰＰＤ)及びプロトパナキサトリオール(ＰＰＴ)の様々なグリコシル化を触媒して様々な種類のギンセノシドを生産すると考えられる。しかし、これらの酵素がＵＤＰ-糖転移酵素活性を有しても、酵素の種類によって、異なる基質特異性及び位置選択性を持つ。従って、前記酵素が、チョウセンニンジンのサポニンであるギンセノシドに特異的に作用するＵＤＰ-糖転移酵素であるか否かを解明する必要がある。前記ＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置に特異的に作用し、糖モイエティを伝達してＰＰＤ又は化合物Ｋ(Ｃ-Ｋ)からギンセノシドＲｈ２又はＦ２を生産するチョウセンニンジン由来のＵＤＰ-糖転移酵素に関する報告はなされておらず、前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、本発明者らによって初めて解明された。
【００１９】
本発明の目的上、前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、チョウセンニンジン由来のＵＤＰ-糖転移酵素であり、好ましくは、コウライニンジン(ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ)由来のＵＤＰ-糖転移酵素であり、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＵＤＰ-糖転移酵素であってもよいが、それらに制限されるものではない。本発明の一実施例において、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＵＤＰ-糖転移酵素を、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１と命名した。
【００２０】
前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を持つタンパク質で、また、配列番号１のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上及び最も好ましくは９９％以上の配列相同性を持つアミノ酸配列を意味する。しかし、実質的に糖をチョウセンニンジンのギンセノシドに伝達可能なＵＤＰ-糖転移酵素活性を持つタンパク質であれば、制限なく使用できる。さらに、実質的にＵＤＰ-糖転移酵素と同程度又はそれに相応する生理活性を有する前記のような配列相同性を持つ前記タンパク質の場合は、アミノ酸配列の一部が、欠失、修飾、置換又は付加された部分を持つタンパク質の変異体であっても、本発明の範囲内に含まれる。
【００２１】
本発明における用語「相同性」とは、天然型タンパク質又はそれをコードするヌクレオチド配列のアミノ酸配列に対する類似性の程度を示し、本発明のアミノ酸配列又は塩基配列を持つ前記のようなパーセンテージ以上の相同性を持つ配列を含む。相同性の比較は、肉眼又は容易に利用可能な配列比較プログラムによって行うことができる。
【００２２】
好ましくは、本発明の前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドをグリコシル化されたギンセノシドに転換する活性を持つタンパク質を意味するが、それらに制限されるものではない。
【００２３】
本発明における用語「ＰＰＤ-タイプのギンセノシド」とは、ダンマラン-タイプのサポニンであり、その非糖部分(アグリコン)に２つのヒドロキシ基(-ＯＨ)を持つギンセノシドを意味し、その例として、ＰＰＤ(プロトパナキサジオール)、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒａ３、Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｒｓ１、Ｃ-Ｏ、Ｃ-Ｙ、Ｃ-Ｍｃ１、Ｃ-Ｍｃ、Ｆ２、Ｃ-Ｋ、ギペノシドＸＶＩＩ、ギペノシドＬＸＸＶ及びＲｓ２を含む。本発明の目的上、前記ＰＰＤ-タイプのギンセノシドは、本発明のＵＤＰ-糖転移酵素によってグリコシル化され得るギンセノシドであれば、制限されることなく、任意のギンセノシドであってもよい。好ましくは、Ｏ-グリコシル化され得るギンセノシドであり、より好ましくは、Ｃ-３番位置にグリコシル化され得るギンセノシドであり、最も好ましくは、ＰＰＤ又はＣ-Ｋであってもよいが、それらに制限されるものではない。本発明の一実験例において、本発明のＵＤＰ-糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７４Ａ１によってグリコシル化され得るＰＰＤ-タイプのギンセノシドとしてＰＰＤ及び化合物Ｋを使用した。ギンセノシド構造の概略図を図１に示す。
【００２４】
本発明における用語「グリコシル化されたギンセノシド」とは、ギンセノシドを構成する非糖部分(アグリコン)のヒドロキシ基に付着した単糖類又はより大きい糖分子を持つギンセノシドを意味し、その例として、ギンセノシドＲｈ２、Ｒｇ３、Ｆ２又はＲｄがあるが、それらに制限されるものではない。本発明の目的上、グリコシル化されたギンセノシドは、本発明のＵＤＰ-糖転移酵素によってグリコシル化されるギンセノシドであれば、制限されることなく、任意のグリコシル化されたギンセノシドを含む。前記グリコシル化されたギンセノシドは、好ましくは、Ｏ-グリコシド結合を持つギンセノシドを意味し、さらに好ましくは、Ｃ-３番位置の単糖類以上の糖類の糖を持つギンセノシドであるが、それらに制限されるものではない。本発明の一実施例において、ＰＰＤ及び化合物Ｋ(Ｃ-Ｋ)は、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１の活性によって、グリコシル化されたギンセノシドであるギンセノシドＲｈ２及びＦ２にそれぞれ転換される。
【００２５】
特に、本発明の配列番号１の前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、グルコースをＵＤＰ-グルコースからＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置のヒドロキシ基(-ＯＨ)に伝達してＯ-グリコシル結合を形成するため、グリコシル化されたギンセノシドを生産することができる。
【００２６】
具体的に、前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、グルコースモイエティをＵＤＰ-グルコースからＰＰＤのＣ-３番位置のヒドロキシ基に伝達してＯ-グリコシド結合を形成するため、ＰＰＤをギンセノシドＲｈ２に転換することができる。前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、グルコースモイエティをＵＤＰ-グルコースからＣ-ＫのＣ-３番位置のヒドロキシ基に伝達してＯ-グリコシド結合を形成するため、Ｃ-ＫをギンセノシドＦ２に転換することができる。一方で、前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-１２又はＣ-２０番位置のヒドロキシ基に作用しないが、特異的にＣ-３番位置のヒドロキシ基に糖を伝達する。さらに、ＰＰＴ-タイプのギンセノシドが、Ｃ-３番位置にヒドロキシ基を持つとしても、本発明のＵＤＰ-糖転移酵素は、ＰＰＴ-タイプのギンセノシドには作用しない。従って、本発明のＵＤＰ-糖転移酵素は、ＰＰＤ-タイプのギンセノシド、特に、ＰＰＤ及びＣ-ＫのＣ-３番位置のヒドロキシ基に対して基質特異性及び位置選択性を持つため、特異的なギンセノシドの転換、好ましくは、ＰＰＤ及びＣ-ＫをそれぞれＲｈ２及びＦ２に転換するのに利用することができる。
【００２７】
本発明の一実施例において、新規ＵＤＰ-糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、チョウセンニンジンから新たに単離され(実施例１)、前記配列分析の結果から、前記糖転移酵素がＵＧＴ７４ファミリーのクラスターであるが、シロイヌナズナのＵＧＴ７４サブファミリーのクラスターではないことが示された(実験例１及び図２)。さらに、糖転移酵素は、位置選択的にＰＰＤ-タイプのギンセノシドに作用し、１つのグルコースをＣ-３番位置のヒドロキシ基に伝達するため、グリコシル化されたギンセノシドを生産することができる(実験例２及び４；及び図３及び５)。ＰｇＵＧＴ７４Ａ１タンパク質の酵素活性は、図７に示す。
【００２８】
他の態様として、本発明は、前記ＵＤＰ-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する
【００２９】
前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、前述のとおりである。
【００３０】
前記ＵＤＰ-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列に対して、配列番号２のヌクレオチド配列で表されるポリヌクレオチドであることが好ましく、さらに、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上及び最も好ましくは９８％以上の配列相同性を持つ任意のヌクレオチド配列で、実質的に、ＵＤＰ-糖転移酵素活性を持つタンパク質をコードすることができるものであれば、制限されることなく含まれる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、適切な宿主細胞内で目的のタンパク質を発現させることができるベクターであり、核酸挿入物が、発現可能な必須の調節要素を含むＤＮＡコンストラクトを意味する。前記目的のタンパク質は、前記製造した組み換えベクターを宿主細胞に形質転換又は形質移入することによって獲得することができる。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドを含む前記発現ベクターは、それらに制限されないが、大腸菌由来のプラスミド(ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９)、枯草菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)由来のプラスミド(ｐＵＢ１１０及びｐＴＰ５)、酵母由来のプラスミド(ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４及びＹＣｐ５０)及びアグロバクテリウム(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)を介した形質転換に用いられるＴｉプラスミドを含む。ファージＤＮＡの具体的な例としては、λファージ(Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１及びλＺＡＰ)を含む。さらに、レトロウィルス、アデノウィルス又はワクチニアウイルスなどの動物ウィルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウィルス、二本鎖植物ウィルス(例、ＣａＭＶ)、一本鎖ウィルス又はジェミニウイルスから由来するウィルスベクターが使用され得る。
【００３３】
さらに、本発明のベクターとして、Ｂ４２を結合させた融合プラスミド(例、ｐＪＧ４-５)などの転写活性化
因子を使用してもよい。本発明で獲得した目的のタンパク質の精製を容易にするために、前記プラスミドベクターは、必要に応じてさらに他の配列を含んでもよい。前記融合プラスミドは、ＧＳＴ、ＧＦＰ、 Ｈｉｓタグ(Ｈｉｓ-ｔａｇ)、Ｍｙｃタグ(Ｍｙｃ-tag)などのタグを含んでもよいが、本発明の融合プラスミドは、これらの実施例に制限されるものではない。本発明の一実施例において、ＧＳＴ遺伝子が融合されたベクターであるｐＧＥＸ４Ｔ-１が、ＵＤＰ-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターのコンストラクションとして使用された。
【００３４】
さらに、融合配列を含むベクターによって発現される前記融合タンパク質は、親和性クロマトグラフィーにより精製してもよい。例えば、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼが、他の配列に融合される場合、この酵素の基質であるグルタチオンを使用してもよい。ヘキサヒスチジンが目的のタンパク質に対するタグとして使用される場合、前記目的のタンパク質は、Ｎｉ-ＮＴＡ Ｈｉｓ-結合レジンカラム(Ｎｏｖａｇｅｎ社製、アメリカ)を用いることで、容易に精製することができる。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドをベクターに挿入するために、精製したＤＮＡを、適切な制限酵素を使用して切断し、適切なベクターＤＮＡの制限部位又はクローニング部位に挿入してもよい。
【００３６】
本発明のＵＤＰ-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドは、ベクターに作動可能に連結され得る。本発明のベクターは、本発明のプロモーター及び核酸以外に、エンハンサーなどのシス要素、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列(ＳＤ配列)などをさらに含んでもよい。選択マーカーの例として、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子などを使用してもよいが、作動可能に連結された追加的な要素の種類は、これらの例で制限されるものではない。
【００３７】
本発明における用語「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主細胞に挿入し、ＤＮＡが染色体外因子として又は染色体組込によって複製可能なことを意味する。すなわち、形質転換は、外来のＤＮＡを細胞に導入することによる遺伝子の合成的変化を意味する。
【００３８】
本発明の形質転換は、任意の形質転換方法によって行ってもよく、以下のように当分野に公知の通常の方法によって容易に行うことができる。一般的に、形質転換方法の例としては、ＣａＣｌ２沈澱法、還元物質としてＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド)を用いることによってＣａＣｌ２法を改善させたＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション(ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ)、リン酸カルシウム沈殿法、原形質体融合法、シリコンカーバイド繊維(ｓｉｌｉｃｏｎ ｃａｒｂｉｄｅ ｆｉｂｅｒ)を用いた攪拌法、アグロバクテリウムを介した形質転換法、ＰＥＧを介した形質転換法、デキストラン硫酸-、リポフェクタミン-及び乾燥/抑制を介した形質転換を含む。本発明のＵＤＰ-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの形質転換方法は、これらの例で制限されるものではなく、また、前記形質転換又は形質移入法は、制限されることなく、当分野において通常用いられる。
【００３９】
本発明において、宿主細胞の種類は、本発明のポリヌクレオチドを発現できるものであれば、特に制限されない。本発明で使用可能な宿主細胞の具体的な例としは、大腸菌(Ｅ.ｃｏｌｉ)などのエシェリヒアコリ属(ｇｅｎｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)に属するバクテリア；枯草菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)などのバチルス属(ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ)に属するバクテリア；シュードモナス‐プチダ(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ)などの緑膿菌属(ｇｅｎｕｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)に属するバクテリア；サッカロマイセスセレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)及びシゾサッカロミセスポンベ(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ)などの酵母；動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞を含む。本発明で使用され得る大腸菌株の具体的な例としては、ＣＬ４１(ＤＥ３)、ＢＬ２１及びＨＢ１０１を含み、枯草菌株の具体的な例としては、ＷＢ７００及びＬＫＳ８７を含む。本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された植物の形質転換体の種類は、本発明の糖転移酵素を発現できるものであれば、特に制限されない。それらの例としては、タバコ(ｔｏｂａｃｃｏ)、シロイヌナズナ、ポテト(ｐｏｔａｔｏ)、チョウセンニンジン、ゴマ(ｓｅｓａｍｅ)、シトロン(ｃｉｔｒｏｎ)、ヒナギク(Ｂｅｌｌｉｓ)などを含むが、それらに制限されるものではない。
【００４０】
本発明のプロモーターとして、宿主細胞で本発明の核酸を発現できるものであれば、任意のプロモーターも使用され得る。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモータ及びＰＲプロモーターなどの大腸菌又はファージ由来のプロモーター；Ｔ７プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＭＡＳ又はヒストンプロモーターなどの大腸菌感染ファージ由来のプロモーターが使用可能である。ｔａｃプロモーターなどの合成的に修飾されたプロモーターも使用することができる。
【００４１】
前記の方法による本発明のＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換体は、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置にＯ-グリコシル結合を形成することでグルコースを伝達する生物学的活性を持つ。好ましくは、前記形質転換体は、ギンセノシドＰＰＤからギンセノシドＲｈ２への転換又はＣ-ＫからギンセノシドＦ２への転換可能な能力を持つ形質転換体を意味するが、それらに制限されるものではない。
【００４２】
他の態様として、本発明は、ＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質を製造する方法を提供する。
【００４３】
前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、前述のとおりである。
【００４４】
好ましくは、前記製造方法は、ＵＤＰ-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体を培養する(ａ)；前記培養した形質転換体からＵＤＰ-糖転移酵素を生産する(ｂ)；及び前記生産したＵＤＰ-糖転移酵素を回収することを含む。
【００４５】
前記形質転換体の培養は、当分野で使用される以下の通常の方法で行うことができる。形質転換体の増殖培地に含まれる炭素源は、形質転換体の種類に応じて当分野の当業者によって選択される。そして、培養時期と量を調節するために、好適培養条件が選択される。
【００４６】
他の様態として、本発明は、前記ＵＤＰ-糖転移酵素、前記形質転換体又はその培養物を用いてＰＰＤ(プロトパナキサジオール)-タイプのギンセノシドを転換して、グリコシル化されたギンセノシドを製造する方法を提供する。
【００４７】
前記ＵＤＰ-糖転移酵素、形質転換体、ＰＰＤ-タイプのギンセノシド及びグリコシル化されたギンセノシドは前述のとおりである。
【００４８】
より具体的に、前記方法は、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドが、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換体又はＵＤＰ-糖の存在下で形質転換体の培養物と反応する段階を含む。
【００４９】
本発明における用語「形質転換体の培養物」とは、微生物を培養する公知の方法によって形質転換体を培養して獲得した生成物を意味する。前記培養物は、本発明の配列番号１のＵＤＰ-糖転移酵素を含むため、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドをグリコシル化されたギンセノシドに転換し、例えば、ギンセノシドＰＰＤからギンセノシドＲｈ２への転換又は化合物ＫからギンセノシドＦ２への転換が可能である。
【００５０】
本発明の出発物質として用いたＰＰＤ-タイプのギンセノシドとして、単離及び精製したギンセノシド又はチョウセンニンジンの粉末、或いは抽出物に含まれるギンセノシドを使用することができる。すなわち、ギンセノシドを含むチョウセンニンジンの粉末、或いは抽出物は、本発明の方法を行うための出発物質として直接使用してもよい。本発明で使用されるチョウセンニンジンには、コウライニンジン(Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ)、アメリカニンジン(Ｐ. ｑｕｉｑｕｅｆｏｌｉｕｓ)、サンシチニンジン(Ｐ. ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ)、トチバニンジン(Ｐ. ｊａｐｏｎｉｃｕｓ)、三葉参(Ｐ. ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ)、ヒマラヤ参(Ｐ. ｐｓｅｕｄｏｇｉｎｓｅｎｇ)及びベトナム人参(Ｐ. ｖｉｅｔｎａｍｅｎｓｉs)などのチョウセンニンジンの公知の様々な種類を含むが、それらに制限されるものではない。
【００５１】
好ましくは、前記転換は、本発明のＵＤＰ-糖転移酵素、前記ＵＤＰ-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換体又は前記転換体の培養物によって、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドからグリコシル化されたギンセノシドへの生物変換反応を通じて起こり、糖をギンセノシドのＣ-３番位置のヒドロキシ基(-ＯＨ)に伝達することで達成できる。本発明の配列番号１のアミノ酸配列で表される前記タンパク質は、Ｃ-３番位置にヒドロキシ基を持つＰＰＤ-タイプのギンセノシド、好ましくはＰＰＤ又はＣ-Ｋをグリコシル化されたギンセノシドに転換することができる。本発明の配列番号１のアミノ酸配列で表されるタンパク質による生物変換反応は、ＰＰＤからＲｈ２への転換及びＣ-ＫからＦ２への転換を含む。従って、本発明の前記方法は、グリコシル化されたギンセノシド、特に、ギンセノシドＲｈ２及びＦ２は、必要とされる分野で使用することができる。
【００５２】
グリコシル化されたギンセノシドを製造する方法は、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドが、配列番号１のＵＤＰ-糖転移酵素、配列番号１のＵＤＰ-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体又は前記形質転換体の培養物と反応する段階において、配列番号３のアミノ酸配列で表される前記ＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された形質転換体又は前記形質転換体の培養物が、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドと反応する段階をさらに含んでもよい。
【００５３】
本発明のおける用語「配列番号３のアミノ酸配列で表されるＵＤＰ-糖転移酵素」とは、β１,２グリコシド結合を形成することで、糖モイエティをＵＤＰ-糖からギンセノシドに伝達できる酵素を意味する。配列番号３のアミノ酸配列で表される前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、糖モイエティをＵＤＰ-糖などの糖供与体から３-Ｏ-グリコシル化されたギンセノシドのような糖受容体に伝達する能力を持つため、β１,２グリコシド結合の形成が生じる。すなわち、３-Ｏ-グリコシル化されたギンセノシドをグリコシル化されたギンセノシドに転換する。配列番号３のアミノ酸配列で表されるＵＤＰ-糖転移酵素は、本発明者らによって初めて単離されたチョウセンニンジン由来の糖転移酵素であり、本発明のＰｇＵＧＴ９４Ｂ１と混用され得る。
【００５４】
配列番号３のアミノ酸配列で表されるＵＤＰ-糖転移酵素の糖受容体は、３-Ｏ-グリコシル化されたギンセノシドであり、好ましくは、ギンセノシドＲｈ２又はＦ２であるが、それらに制限されるものではない。つまり、ギンセノシドＲｈ２のＣ-３番位置のＯ-グリコシドにβ１,２グリコシド結合を形成することで、糖モイエティを伝達する活性を持つため、ギンセノシドＲｈ２をギンセノシドＲｇ３に転換することができる。同様に、糖転移酵素は、ギンセノシドＦ２のＣ-３番位置のＯ-グリコシドにβ１,２グリコシド結合を形成することで、糖モイエティを伝達する活性を持つため、ギンセノシドＦ２をＲｄに転換することができる。
【００５５】
従って、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置のヒドロキシ基に特異的に作用するＵＤＰ-糖転移酵素及び配列番号３のアミノ酸配列で表されるＵＤＰ-糖転移酵素の両方のＵＤＰ-糖転移酵素を使用する場合、ＰＰＤは、ギンセノシドＲｈ２に転換され、その次にＲｇ３に転換される。これらのプロセスを通じて、ＰＰＤをギンセノシドＲｇ３に転換することができる。Ｃ-Ｋを出発物質として使用する場合、Ｃ-Ｋは、本発明の転移酵素によってギンセノシドＦ２に転換され、その次にギンセノシドＲｄに転換される。これらのプロセスを通じて、Ｃ-ＫをギンセノシドＲｄに転換することができる。本発明の一実施例において、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の両方を、ＰＰＤからギンセノシドＲｇ３への転換及びＣ-ＫからギンセノシドＲｄへの転換に使用し、前記の両酵素を、ギンセノシドＲｇ３及びＲｄを高効率で生産するのに使用できることを確認した(図５)。
【００５６】
他の態様として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質、前記形質転換体又はその培養物を有効成分として含むＰＰＤ(プロトパナキサジオール)-タイプのギンセノシドをグリコシル化されたギンセノシドに転換する組成物を提供する。
【００５７】
前記ＵＤＰ-糖転移酵素タンパク質、前記形質転換体及びその培養物；及びＰＰＤ-タイプのギンセノシドからグリコシル化されたギンセノシドへの転換は、前述のとおりである。
【００５８】
前記組成物は、配列番号３アミノ酸配列で表されるのＵＤＰ-糖転移酵素、配列番号３のＵＤＰ-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含む前記ベクターが導入された形質転換体又は前記形質転換体の培養物であるＵＤＰ-糖転移酵素をさらに含んでもよい。
【００５９】
本発明の配列番号１のアミノ酸配列で表されるＵＤＰ-糖転移酵素は、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置のヒドロキシ基に選択的に１つの糖モイエティを伝達するため、ギンセノシドＲｈ２又はＦ２などのＣ-３番位置にグリコシル化されたギンセノシドを生産するのに使用することができる。
【００６０】
他の態様として、本発明は、チョウセンニンジンにジャスモン酸メチル(ＭｅＪＡ)という化合物を処理することを含む、チョウセンニンジンの前記ＵＤＰ-糖転移酵素の発現を増加させる方法を提供する。
【００６１】
前記ＵＤＰ-糖転移酵素は、前述のとおりである。
【００６２】
本発明のおける用語「 ＭｅＪＡ(ジャスモン酸メチル)」とは、植物防御及び根の成長などの様々な成長経路に関与する揮発性の有機化合物である。ＭｅＪＡは、メチル(１Ｒ、２Ｒ)-３-オキソ-２-(２Ｚ)-２- ペンテニル-シクロペンタン酢酸塩と混用して使用することができ、化学構造は以下のとおりである。
〔化学式１〕
0006257634.tif 000002
【００６３】
本発明の目的上、ＭｅＪＡは、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１の発現を増加させることができる化合物を意味する。ＭｅＪＡをチョウセンニンジンの葉に噴射すると、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１の発現が増加する。従って、チョウセンニンジンにＭｅＪＡを噴射することで、本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１の発現が増加するため、ＭｅＪＡを、ギンセノシドの生産に有用に利用することができる。本発明の一実施例において、ＭｅＪＡ処理でＰｇＵＧＴ７４Ａ１の発現が大幅に増加することを確認した(図６Ｂ)。
【００６４】
他の態様として、本発明は、有効成分としてＭｅＪＡを含むＵＤＰ-糖転移酵素の発現を増加させる組成物を提供する。
【００６５】
ＭｅＪＡ及びＵＤＰ-糖転移酵素は、前述のとおりである。
【００６６】
さらに、ＭｅＪＡが、本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１の発現を増加させることができることから、有効成分としてＭｅＪＡを含む本発明の組成物は、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１の発現を増加させるために使用することができ、好ましくは、チョウセンニンジンに適用してＰｇＵＧＴ７４Ａ１の発現を増加させることができる。
【発明を実施するための具体的内容】
【００６７】
本発明は、以下に提供する実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は、例示するためのものであって、請求項の発明を限定するためのものではない。
【００６８】
実施例１：チョウセンニンジンのＵＤＰ-糖転移酵素(ＰｇＵＧＴ)のクローニング及び精製
チョウセンニンジンのＥＳＴライブラリーから同定した２種類のＵＧＴ遺伝子は、以下の表１(配列番号５及び６、配列番号７及び８)で表したプライマーセットを用いてｐＧＥＸ４Ｔ-１ベクターにクローニングし、それぞれをＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１と命名した。
【００６９】
【表１】
0006257634.tif 000003
【００７０】
前記組み換えタンパク質であるＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１を形質移入した前記大腸菌細胞(Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１-ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ(ＤＥ３)-ＲＩＬ)を５０μｇ/ｍＬのアンピシリン及び３４μｇ/ｍＬのクロラムフェニコールが供給されたＬＢ培地で培養した。その後、細胞培養物から前記タンパク質を精製した。
【００７１】
目的の遺伝子の発現は、０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。その後、細胞培養物を４℃で１５分間、２，５００ｇで遠心分離して前記細胞のペレットを分離した。前記回収した細胞ペレットを１０ｍＭのＰＢＳ緩衝溶液(ｐＨ７．０)に懸濁し、前記細胞を超音波処理により破砕した(Ｖｉｂｒａ-ｃｅｌｌ、Ｓｏｎｉｃｓ&Ｍａｔｒｅｉａｌｓ、ＣＴ)。破砕されてない細胞及び細胞破壊片は、前記サンプルを４℃で１５分間、１０,０００ｇで遠心分離して除去し、上清液(Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ)を０．４５μｍの細孔サイズのシリンジフィルターに通してさらに精製した。前記組み換え体タンパク質を無細胞抽出物からグルタチオン-セファロース親和性クロマトグラフィー(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)により精製した。
【００７２】
実施例２：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 酵素アッセイ
糖転移酵素アッセイは、精製したＰｇＵＧＴ７４Ａ１又はＰｇＵＧＴ９４Ｂ１(３０μｇ)、ギンセノシド化合物(５ｍＭ)及びＵＤＰ-グルコース(５０ｍＭ)を含む反応緩衝溶液(１０ｍＭのＰＢＳ緩衝溶液、ｐＨ ７)で行った。これらのアッセイのために、ＰＰＤ(プロトパナキサジオール)、ＰＰＴ(プロトパナキサトリオール)、化合物Ｋ(Ｃ-Ｋ)、ギンセノシドＲｇ３、Ｒｈ２、Ｆ２、Ｒｄ、Ｒｇ２、Ｒｈ１及びＦ１を含む異なる１０種類のギンセノシドを使用した。前記ギンセノシドの構造を図１に示す。
【００７３】
反応混合物を３５℃で１２時間培養した後、その生成物を薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)又は高速液体クロマト
グラフィー(ＨＰＬＣ)により分析した。
【００７４】
ＴＬＣ分析は、移動相(アセトン:メタノール:ＤＤＷ＝６５:３５:１０(ｖｏｌ/ｖｏｌ)及び６０Ｆ２５４シリカゲルプレート(Ｍｅｒｃｋ, ドイツ)を使用して行った。ＴＬＣプレートに溶解された生成物は、ＴＬＣプレートに１０％(ｖｏｌ/ｖｏｌ)硫酸(Ｈ２ＳＯ４)を噴射して検出し、１１０℃で５分間加熱した。
【００７５】
ＨＰＬＣ分析は、ＯＤＳ(２)Ｃ１８カラム(Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製 、アメリカ)を用いて行った。水及びアセトニトリルの勾配適用時間；及び成分比率は、以下のとおりである：分当たり１ｍＬの流速で、６８％水及び３２％アセトニトリル；８分、３５％水及び６５％アセトニトリル；１２分、０％水及び１００％アセトニトリル；２０分、０％水及び１００％アセトニトリル；２０．１分、６８％水及び３２％アセトニトリル；及び２８分、６８％水及び３２％アセトニトリル。
【００７６】
ギンセノシドは、ＵＶ検出器(Ｙｏｕｎｇｌｉｎ、韓国)を用いて２０３ｎｍの波長で検出した。
【００７７】
実施例３：ＲＮＡ分離及びＲｅａｌ-ｔｉｍｅ ＰＣＲの分析
全ＲＮＡは、スペクトラム植物の全ＲＮＡキット(シグマアルドリッチ)を用いて１５ヶ月齢のチョウセンニンジンの葉又は根から分離した。２００μＭのジャスモン酸メチル(ＭｅＪＡ)を５日間毎日チョウセンニンジンの葉に噴射し、サンプルを６日目に回収した。全ＲＮＡの１μｇをｃＤＮＡ合成に用いた。
【００７８】
異なる遺伝子の発現レベルは、下記の表２で表すプライマーセットを用いて定量的ＲＴ-ＰＣＲにより確認し、その結果をチューブリンの発現レベルで標準化
した。
【００７９】
【表２】
0006257634.tif 000004
【００８０】
実験例１：ＵＤＰ-糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の配列分析
ギンセノシドの生合成に関与するＵＤＰ-糖転移酵素(ＵＧＴ)の役割を解明するために、まず、ＥＳＴデータベースの分析を行い、実験例１に記述した方法によりコウライニンジン(Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ)からＵＧＴ遺伝子をクローニングした。その中で、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１と命名した２種類のＵＧＴの機能を解明するために調査した。
【００８１】
配列分析の結果、シロイヌナズナ(Ａ. ｔｈａｌｉａｎａ)からＵＧＴを含む他の植物由来のＵＧＴと配列相同性で特定されないことが示された(図２)。より具体的に、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、シロイヌナズナのＵＧＴ７４ファミリーとクラスターを形成する。シロイヌナズナのＵＧＴ７４ファミリーは、５つのサブファミリー(ＵＧＴ７４Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ１及びＦ)に分類され得る７種類のＵＧＴから構成される。ＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、シロイヌナズナのＵＧＴ７４ファミリーとクラスターを形成するが、いずれの５つのサブファミリーにも属さないため、本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、シロイヌナズナの他のサブファミリーとは異なる新しいＵＧＴ７４サブファミリーに分類される。シロイヌナズナのＵＧＴ７４ファミリーの中で、ＵＧＴ７４Ｂ１は、グリコシルチオエステル(ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ)連結を形成して、グルコシノレート(ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ)の前駆体であるフェニルアセト
チオヒドロキシム酸(ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｏｔｈｉｏｈｙｄｒｏｘｉｍａｔｅ)をグリコシル化するが、それに対して、ＵＧＴ７４Ｅ２は、グリコシルエステル連結を形成して、 
インドールブチレート(ｉｎｄｏｌｅ ｂｕｔｙｌａｔｅ)をグリコシル化する。同様に、ＵＧＴ７４Ｆ１及びＵＧＴ７４Ｆ２もグリコシルエステル連結を形成して、サリチラー(ｓａｌｉｃｙｃｌａｔｅ)及びアントラニレート(ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ)をそれぞれグリコシル化する。一方で、ＵＧＴ７４ファミリーのメンバーは、グリコシルエステル連結以外にも、Ｏ-グリコシド結合も形成することができる。ＵＧＴ７４Ｆ１は、２-Ｏ-グリコシド結合を形成して、サリチラート(ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ)をグリコシル化することが知られている。さらに、ＵＧＴ７４Ｆ１及びＵＧＴ７４Ｆ２は、Ｏ-グリコシド結合を形成して、サリチラート及びアントラニレートの両方をグリコシル化することが知られている。
【００８２】
従って、シロイヌナズナのＵＧＴ７４ファミリーに属するＵＧＴでも、グリコシル化を形成させるためのそれらの基質及び結合の種類を同定するために調査する必要がある。
【００８３】
さらに、前記分析の結果、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１は、シロイヌナズナのＵＧＴ９４ファミリーとクラスターを形成しないが、その代わりに、ＢｐＵＧＴ９４Ｂ１(Ｂｅｌｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ、ヒナギク)、ＳｉＵＧＴ９４Ｄ１(Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍ Ｌ.、ゴマ)、ＣａＵＧＴ３(Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ、ニチニチソウ)及びＣｍ１,２ＲｈａＴ(Ｃｉｔｒｕｓ ｍａｘｉｍａ、晩白柚)のＵＧＴ９４サブファミリーとはクラスターを形成することが示唆された。その中で、ＢｐＵＧＴ９４Ｂ１は、β１,６結合を形成して、グルクロノシルモイエティをシアニジンの３-Ｏ-グルコシドに付加するが、それに対して、ＳｉＵＧＴ９４Ｄ１は、β１,６結合を形成して、グルコースをセサミノールの２-Ｏ-グルコシドに付加する。ＣａＵＧＴ３は、β１,６結合を形成して、グルコース分子をケルセチン-３-Ｏ-グルコシドに付加するが、それに対して、Ｃｍ１,２ＲｈａＴは、β１,６結合を形成して、ラムノースをフラボン７-Ｏ-グルコシドに付加する。
【００８４】
総合的に、前記結果から、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１が属する全てのＵＧＴ９４ファミリーメンバーが、糖供与体及び受容体の種類に関係なく、２つ目の糖分子をＯ-グリコシル化された受容体に付加するグリコシル化を触媒することを確認した。
【００８５】
これらの結果は、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１が、Ｏ-グリコシド結合又はグリコシルエステル連結を形成して、ギンセノシドのグリコシル化を触媒することを示唆するが、それに対して、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１は、β-グリコシド結合を形成して、グリコシル化されたギンセノシドに２つ目の糖を付加するため、グリコシル化を触媒する。図１のギンセノシド構造に示すように、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドは、Ｃ-３又はＣ-２０番位置、或いは両方の位置でＯ-結合を介してグリコシル化され得るが、それに対して、ＰＰＴ-タイプのギンセノシドは、Ｃ-６又はＣ-２０番位置、或いは両方の位置でＯ-結合を介してグリコシル化され得る。さらに、ギンセノシドＲｂ１、化合物Ｙ及び化合物Ｏを含む１つ以上の糖基を持つギンセノシドは、β-１,６結合を介してさらにグリコシル化され得る。
【００８６】
配列分析の結果に基づいて、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の実際の活性が、以下の実施例によって確認された。
【００８７】
実験例２：ＰｇＵＧＴ７４Ａ１によるＰＰＤ及びＣ-ＫからギンセノシドＲｈ２及びギンセノシドＦ２への転換
実験例１の分析結果に基づいて、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の基質特異性及び位置選択性が、以下のように確認された。
【００８８】
まず、実施例１の組み換えＰｇＵＧＴであるＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、ＵＤＰ-グルコースの存在下で、異なる１０種類のギンセノシド(ＰＰＤ、Ｃ-Ｋ、Ｒｈ２、Ｆ２、Ｒｇ３、Ｒｄ、Ｒｇ２、Ｒｈ１、Ｆ１及びＰＰＴ)と共に培養し、組み換えＰｇＵＧＴによって転換された前記生成物をＴＬＣにより分析した。その結果を図３ａに示した。
【００８９】
その結果、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、ＰＰＤ及びＣ-Ｋ以外のギンセノシドを転換しないことから、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１が、高い受容体特性を持つことが示された(図３ａ)。前記の結果は、ＴＬＣプレート上の移動したスポットで確認された。その結果、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、ＰＰＤ及びＣ-ＫをそれぞれギンセノシドＲｈ２及びギンセノシドＦ２に転換した。
【００９０】
前記結果は、図３ｂに示すように、高速
液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)によりさらに確認した。ＨＰＬＣの結果は、ＴＬＣ分析の結果で示すように、本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１が、ＰＰＤ及びＣ-ＫをそれぞれギンセノシドＲｈ２及びＦ２に転換したことを示した。実施例１のＰｇＵＧＴ９４Ｂ１は、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１と違って、ＰＰＤ及びＣ-Ｋを他のギンセノシドに転換しなかった(図３ｂ)。
【００９１】
ＴＬＣ及びＨＰＬＣの結果で示すように、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１が、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドであるＰＰＤ及びＣ-ＫのみをそれぞれギンセノシドＲｈ２及びギンセノシドＦ２に転換することから、基質特異性を持つことが示された。さらに、グリコシル化される炭素番号を確認すると、Ｏ-結合を介してＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置が特異的にグリコシル化されたが、それに対して、ＰＰＤのＣ-１２及びＣ-２０番位置のヒドロキシ基(-ＯＨ)などの他の位置及びＰＰＴのＣ-３、Ｃ-６、Ｃ-１２及びＣ-２０番位置のヒドロキシ基(-ＯＨ)は、グリコシル化されなかったことから、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドのＣ-３番位置に位置選択性を持つことが示唆された。これらの結果から、本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、Ｏ-グリコシド結合を形成してグリコシル化を誘導することが示された。
【００９２】
総合的に、前記の結果は、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１が、ＰＰＤ-タイプのギンセノシドに特異的に作用し、ＰＰＤ及びＣ-Ｋに対して強い基質特異性、並びにＣ-３番位置のグリコシル化に対して位置選択性を持つことが示された。
【００９３】
実験例３：ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１によるギンセノシドＲｈ２及びＦ２からギンセノシドＲｇ３及びギンセノシドＲｄへの転換
実施例１でクローニングされたＰｇＵＧＴ９４Ｂ１もＰｇＵＧＴ７４Ａ１のような基質特異性及び位置選択性を持つか否かを検討した。
【００９４】
まず、実施例１の組み換えＰｇＵＧＴであるＰｇＵＧＴ９４Ｂ１を、ＵＤＰ-グルコースの存在下で、異なる１０種類のギンセノシド(ＰＰＤ、Ｃ-Ｋ 、Ｒｈ２、Ｆ２、Ｒｇ３、Ｒｄ、Ｒｇ２、Ｒｈ１、Ｆ１及びＰＰＴ)と共に培養した後、組み換えＰｇＵＧＴによって転換された前記生成物をＴＬＣにより分析した。その結果を図４ａに示した。
【００９５】
その結果、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１が、ギンセノシドＲｈ２及びＦ２以外のギンセノシドは転換しなかったことから、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１が、高い受容体特異性を持つことが示唆された(図４ａ)。これらの結果は、ＴＬＣプレート上の移動したスポットで確認された。その結果、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１は、ギンセノシドＲｈ２及びギンセノシドＦ２をそれぞれギンセノシドＲｇ３及びギンセノシドＲｄに転換した。
【００９６】
その結果は、図４ｂに示すように、ＨＰＬＣによりさらに確認した。そのＨＰＬＣの結果、ＴＬＣ分析の結果で示したように、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１が、ギンセノシドＲｈ２及びＦ２を、ギンセノシドＲｇ３及びＲｄに転換したことが示された。一方で、本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１は、実験例２の結果で示したように、ギンセノシドＲｈ２及びＦ２を転換しなかった(図４ｂ)。
【００９７】
これらの結果によると、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１は、β-１,２結合を形成してＲｈ２及びＦ２のＣ-３番位置のＯ-グリコシドを特異的にグリコシル化するが、Ｃ-Ｋ及びＦ２のＣ-２０番位置のＯ-グリコシドはグリコシル化しなかった。前記の結果から、ＰｇＵＧＴ９４Ｂ１は、Ｒｈ２及びＦ２に対して基質特異性、並びにＣ-３番位置のＯ-グリコシドに対して位置選択性を持つことが示された。
【００９８】
実験例４：ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１によるＰＰＤ及びＣ-ＫからギンセノシドＲｇ３及びＲｄへの転換
実験例２及び３の結果に基づいて、２種類のＰｇＵＧＴを同時に使用する場合、チョウセンニンジンのＰＰＤは、ギンセノシドＲｈ２に転換されて、その次にＲｇ３に転換されるため、結果的にＰＰＤからＲｇ３を生産することができる。同様に、両方の酵素を使用する場合、Ｃ-Ｋは、ギンセノシドＦ２に転換され、その次にＲｄに転換されるため、結果的にＣ-ＫからＲｄを生産することができる。
【００９９】
これらを確認するために、１つの反応チューブでＰＰＤを基質とし、前記の２つの酵素と反応させた。その結果、ＰＰＤは見事にＲｇ３に転換されることが示された(図５の上パネル)。さらに、１つの反応チューブでＣ-Ｋを基質とし、２つの酵素と反応させた。その結果、Ｃ-Ｋも見事にＲｄに転換されることが示された(図５の下パネル)。
【０１００】
前記の結果から、本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の組み合わせを用いることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける１つの反応チューブで、ＰＰＤ及びＣ-Ｋを、それぞれＲｇ３及びＲｄに転換できることが示された。従って、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１は、Ｒｇ３及びＲｄの効率的な生産に使用され得る。
【０１０１】
実験例５：ＭｅＪＡ(ジャスモン酸メチル)によるＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の発現の増加
本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１が、伝統的に治療目的で使用されてきたチョウセンニンジンの根で主に発現するか否かを検討した。また、ＰｇＤＳ(ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ-ＩＩ ｓｙｎｔｈａｓｅ)、ＰｇＰＰＤＳ(ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ)及びＰｇＰＰＴＳ(ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ)などの異なる３種類のギンセノシドの生合成遺伝子に加えて、本発明の２種類のＰｇＵＧＴの器官特異的な発現パターンを測定した。１５ヶ月齢のチョウセンニンジンの葉と根を発現分析に使用した。
【０１０２】
その結果、前記ギンセノシドの生合成遺伝子の全てが、チョウセンニンジンの葉と根で発現し、特にグリコシル化が活性化された根で発現していた(図６ａ)。
【０１０３】
図６ａに示すように、目的の５つの遺伝子の全てが、チョウセンニンジンの葉と根で発現していたが、それらの発現レベルは異なっていた。本発明のＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の発現は、葉より根でより高かった。ギンセノシドの生合成に関するＰｇＤＳ及びＰｇＰＰＤＳ遺伝子は、チョウセンニンジンの葉でより高い発現レベルを示したが、それに対して、ＰｇＰＰＴＳは、チョウセンニンジンの根と葉の両方で同程度の発現レベルを示した。これらの結果から、ギンセノシドは、チョウセンニンジンの葉と根の両方で合成されるが、グリコシル化は葉に比べて根でより活発に起こることが示された。
【０１０４】
ジャスモン酸メチル(ＭｅＪＡ)は、毛状根培養でギンセノシドの生合成遺伝子の発現を増加させることが報告されている。ＭｅＪＡの効果から理解できるように、本発明のＵＤＰ-糖転移酵素の発現が、ＭｅＪＡによって増加するか否かを測定した。
【０１０５】
ＬＤ条件下において生育箱で１５ヶ月齢に成長したチョウセンニンジンを回収し、ＭｅＪＡを５日間毎日葉に噴射した。ギンセノシドの生合成遺伝子の発現レベルを分析するために、６日目にサンプルを回収した。本発明の２種類のＰｇＵＧＴは、ＭｅＪＡで処理したチョウセンニンジンの葉でより高い発現レベルを示したことから、ＭｅＪＡは、本発明のＵＧＴの発現を促進する能力を持つことが示唆された(図６ｂ)。前記ＰｇＵＧＴに加えて、 ＭｅＪＡもＰｇＤＳ及びＰｇＰＰＤＳの発現を増加させた。しかし、ＰｇＰＰＴＳの発現は、本発明の条件下で、ＭｅＪＡによって誘導されなかった。
【０１０６】
総合的に、発現分析の結果、ギンセノシド濃度は、ＭｅＪＡの添加により増加することが示唆された。このことから、チョウセンニンジンの葉にＭｅＪＡを噴射した後に４つの主要なギンセノシドの濃度を測定した。ＭｅＪＡの処理は、２つのＰＰＤ-タイプのギンセノシドであるＲｄ及びＲｂ１の濃度をそれぞれ１．５５及び１．１４倍に増加させた(図６ｃ)。さらに、ＭｅＪＡの処理は、２つのＰＰＴ-タイプのギンセノシドであるＲｇ１及びＲｅの濃度をそれぞれ２．６１及び１．４５倍に増加させた。
【０１０７】
これらの結果は、チョウセンニンジン植物へのＭｅＪＡの添加が、様々なギンセノシドの生合成遺伝子の発現を促進することから、チョウセンニンジンにおけるギンセノシドの生産を増加できることを示す。前記結果は、ＭｅＪＡが、本発明の代表的な糖転移酵素であるＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の発現を増加させることから、ＰｇＵＧＴ７４Ａ１及びＰｇＵＧＴ９４Ｂ１の発現を増加させるのにおいても有用であることを示す。
【０１０８】
以上の説明から、当分野の当業者は、本発明がその技術的原理又は必須的特徴を変更することなく、他の具体例として実施できることを理解することができるであろう。これと関連して、以上で記述した実施例は、あらゆる面において例示的なものであり、限定的ではないことを理解すべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明よりは、後述の請求項の意味、範囲及び等価概念から導出される全ての変更又は修正を含むものとして理解されるべきである。
【図１】
0006257634.tif 000005
【図２】
0006257634.tif 000006
【図３】
0006257634.tif 000007
【図４】
0006257634.tif 000008
【図５】
0006257634.tif 000009
【図６】
0006257634.tif 000010
【図７】
0006257634.tif 000011
【配列表】
0006257634000001.app