(57)【要約】  キメラ呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ポリペプチド抗原を提供する。開示したポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン、Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン、および第２のＦタンパク質ポリペプチドドメインを含む。本開示はまた、キメラＲＳＶポリペプチドをコードしている核酸、およびキメラＲＳＶポリペプチドを含む医薬組成物、ならびにその生成および使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端の方向で、
（ｉ）第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン、
（ｉｉ）Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン、および
（ｉｉｉ）第２のＦタンパク質ポリペプチドドメイン
を含む、キメラ呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ポリペプチド。
【請求項２】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）が少なくともＦタンパク質のＦ２ドメインのアミノ酸部分配列を含む、請求項１に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項３】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）がネイティブＦタンパク質ポリペプチドの残基２４〜残基１０７のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項４】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）が少なくともｐｅｐ２７のアミノ酸部分配列をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項５】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）がネイティブＦタンパク質ポリペプチドの残基１１０〜残基１３０のアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項６】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項７】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）がネイティブＦタンパク質ポリペプチドの残基１〜残基１０９のアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項８】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）が天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換がキメラＲＳＶ抗原の溶解度または安定性を増加させる、前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項９】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）がネイティブＦ０ポリペプチドに関して残基７９でメチオニン以外のアミノ酸を含む、前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１０】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）が残基７９でイソロイシンを含む、請求項９に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも１つのアミノ酸改変が、天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質中に存在するフューリン切断部位を排除するアミノ酸の欠失または置換を含む、請求項８に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１２】
第２のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉｉ）が少なくともＦタンパク質のＦ１ドメインのアミノ酸部分配列を含む、前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１３】
第２のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉｉ）がネイティブＦタンパク質ポリペプチドの残基１６１〜残基５２４のアミノ酸配列を含む、請求項１から１２のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１４】
第２のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉｉ）が天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、少なくとも１つのアミノ酸改変がキメラＲＳＶポリペプチドの溶解度または安定性を増加させる、請求項１から１３のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１５】
第２のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉｉ）がネイティブＦタンパク質ポリペプチドの残基１５１〜残基５２４のアミノ酸配列を含む、請求項１から１４のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１６】
Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉ）がネイティブＧタンパク質ポリペプチドの少なくとも１つの免疫優勢のＴ細胞エピトープを含む、請求項１から１５のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１７】
免疫優勢のＴ細胞エピトープがネイティブＧタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基１８３〜残基２０３を含む、請求項１６に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１８】
Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉ）がネイティブＧタンパク質ポリペプチドの残基１５２〜残基２２９のアミノ酸配列を含む、請求項１から１７のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項１９】
Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉ）がネイティブＧタンパク質ポリペプチドの残基１４９〜残基２２９のアミノ酸配列を含む、請求項１から１８のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２０】
Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉ）がネイティブＧタンパク質ポリペプチドの残基１２８〜残基２２９のアミノ酸配列を含む、請求項１から１９に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２１】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）とＧタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉ）との間、またはＧタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉ）と第２のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉｉ）との間、または第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）とＧタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉ）との間およびＧタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉ）と第２のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉｉ）との間の両方に、１つまたは複数の介在アミノ酸を含む、前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２２】
介在アミノ酸がリンカーを含む、請求項２１に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２３】
天然に存在するＲＳＶポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＲＳＶ抗原を対象に投与した場合に、アミノ酸置換が、ワクチンで増強したウイルス性疾患を減少または予防する、前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２４】
ＲＳＶ抗原をヒト対象に投与した場合に、ワクチンで増強したウイルス性疾患が減少または予防される、請求項２１に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２５】
Ｇタンパク質の残基１９１でアスパラギンからアラニンへの置換（Ｎ１９１Ａ）を含む、請求項２１または２４に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２６】
第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉ）、Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉ）、および第２のＦタンパク質ポリペプチドドメイン（ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つが、配列がＲＳＶ  Ａロング株に対応している、前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２７】
ポリヒスチジンタグをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０および４５またはその部分配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項２９】
部分配列が、選択した配列のアミノ酸残基１〜２３を欠いている、請求項２８に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項３０】
少なくとも１つのシステインのアミノ酸置換を含む、請求項１から２７のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項３１】
少なくとも１つのシステインが残基４０、７２、２９１、３９２、４０１、４１２、４２２、および５１８から選択される、請求項３０に記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項３２】
残基３６〜４１および／または残基４００〜４０１から選択される疎水性アミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１から２７、３０または３１のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項３３】
ネイティブＲＳＶタンパク質の１つまたは複数の免疫優勢のエピトープを含む、前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項３４】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＲＳＶ  Ｇタンパク質の両方の少なくとも１つの免疫優勢のエピトープを含む、前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド。
【請求項３５】
前記請求項のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチドの多量体を含む組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３６】
キメラポリペプチドの三量体を含む、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ抗原。
【請求項３７】
請求項１から３４のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチド、および担体または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
【請求項３８】
担体または賦形剤が医薬上許容される担体または賦形剤である、請求項３７に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
担体または賦形剤がバッファーを含む、請求項３７または３８に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
担体または賦形剤が、溶解度、安定性、または溶解度および安定性の両方を安定化させる少なくとも１つの成分を含む、請求項３７から３９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
担体または賦形剤が洗剤を含む、請求項４０に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
洗剤がラウロイルサルコシンおよびｔｗｅｅｎのうちの少なくとも１つを含む、請求項４１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
担体または賦形剤がアルギニンを含む、請求項４０に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
担体または賦形剤がガラス形成ポリオールを含む、請求項４０に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
担体または賦形剤がスクロースを含む、請求項４４に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
複数の担体または賦形剤を含む、請求項４０に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
アジュバントをさらに含む、請求項３７から４６のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
アジュバントが新生児に投与するために適している、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
アジュバントが、６５歳以上のヒトにおいて免疫応答を増強させることができる、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
アジュバントがＴｈ１に偏らせるアジュバントである、請求項４７から４９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
アジュバントがＴＬＲ−４リガンドである、請求項５０に記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
脂質Ａ誘導体が、３Ｄ−ＭＰＬおよび脂質Ａの任意の合成誘導体から選択される、請求項５１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
粒子状担体をさらに含む、請求項５０から５２のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項５４】
前記担体がミョウバンである、請求項５３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
アジュバントが水中油乳剤を含む、請求項４７から５２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５６】
医薬に使用するための、請求項３７から５５のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項５７】
ヒト対象に投与した後にＲＳＶの感染症の予防または減少に使用するための、請求項３７から５５のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項５８】
ヒト対象に投与した後にＲＳＶの感染症によって引き起こされた病理的応答の予防または減少に使用するための、請求項３７から５５に記載の免疫原性組成物。
【請求項５９】
ヒト対象に投与した後にＲＳＶの感染症を減少または予防する、請求項３７から５５のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項６０】
ヒト対象に投与した後にＲＳＶの感染症によって引き起こされた病理的応答を減少または予防する、請求項３７から５５に記載の免疫原性組成物。
【請求項６１】
ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１つのさらなる抗原をさらに含む、請求項３７から５５のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項６２】
病原性生物がＲＳＶ以外のウイルスである、請求項６１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
免疫原性ウイルスがパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）である、請求項６２に記載の免疫原性組成物。
【請求項６４】
病原性生物が、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、ジフテリア、テタヌス、パータシス、ヘモフィルスインフルエンザ、ポリオウイルス、およびニューモコッカスから選択される、請求項６１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
請求項１から３４のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸。
【請求項６６】
キメラポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列が、選択した宿主細胞中での発現に最適化された少なくとも１つのコドンを含む、請求項６５に記載の組換え核酸。
【請求項６７】
請求項６５または請求項６６に記載の組換え核酸を含むベクター。
【請求項６８】
原核または真核発現ベクターを含む、請求項６７に記載のベクター。
【請求項６９】
請求項６５もしくは６６に記載の核酸または請求項６８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７０】
細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞の群から選択される、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項７１】
ＲＳＶ感染症を治療する医薬品の調製における、請求項１から３４のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチドまたは請求項６５から６８のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項７２】
医薬品を、ＲＳＶ感染症の予防的治療を目的として投与する、請求項７１のキメラＲＳＶポリペプチドまたは核酸の使用。
【請求項７３】
対象に、免疫原性上有効な量の、請求項１から３４のいずれかに記載のキメラＲＳＶポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する免疫応答を誘発させる方法。
【請求項７４】
キメラＲＳＶポリペプチドを含む組成物を投与することが、ＲＳＶと接触した後にウイルス性疾患を増強させずにＲＳＶに特異的な免疫応答を誘発させる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
免疫応答がＴｈ１型の免疫応答を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
免疫応答が、ＲＳＶの感染症を減少もしくは予防するおよび／またはＲＳＶの感染後の病理的応答を減少もしくは予防する保護的免疫応答を含む、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
対象がヒト対象である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
キメラＲＳＶポリペプチドを含む組成物を投与することが、鼻腔内経路による投与を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
キメラＲＳＶポリペプチドを含む組成物を投与することが、筋肉内経路による投与を含む、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その開示が全体として本明細書中に参考として組み込まれている、２００７年３月２１日出願の米国仮出願第６０／８９６，２０１号の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
（米国特許法施行規則第１．７１条第（ｅ）項に準じた著作権）
本特許文書の開示の一部は、著作権保護を受ける内容を含む。著作権の所有者は、米国特許商標方の特許ファイルまたは記録に掲載された特許文書または特許開示は誰が複製しようと異存はないが、それ以外では、何であれ、すべての著作権を留保する。
【０００３】
（技術分野）
本開示は免疫学の分野に関する。より詳細には、本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に特異的な免疫応答を誘発させる組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、生後６カ月未満の乳児および妊娠３５週間以下の未熟児における下気道感染症（ＬＲＩ）の、最も一般的な世界的な原因である。ＲＳＶ疾患の範囲には、鼻炎および耳炎から肺炎および細気管支炎までの様々な呼吸器症状が含まれ、後者２つの疾患は相当な罹患率および死亡率に関連している。ヒトがＲＳＶの唯一の知られている保有宿主である。汚染した鼻水からのウイルスの拡大は大きな呼吸飛沫を介して起こるため、伝染には感染した個体または汚染した表面との密な接触が必要である。ＲＳＶは玩具または他の物体上に数時間残留することができ、このことが、院内ＲＳＶ感染率が特に小児科病棟で高いことを説明している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＲＳＶの全世界の年間の感染および死亡数は、それぞれ６４００万および１６万人であると推定されている。米国単独では、ＲＳＶは、年間１８，０００〜７５，０００件の入院および９０〜１９００件の死亡の原因になっていると推定される。温帯気候では、ＲＳＶは、細気管支炎および肺炎を含めた急性ＬＲＩの毎年の冬季流行の原因として十分に文書化されている。米国では、ほぼすべての子供が２歳までにＲＳＶに感染している。それ以外は健康な子供におけるＲＳＶ関連ＬＲＩの発生率は、生後２年間の間に３７／１０００人の子供−年間（６カ月齢未満の乳児では４５／１０００人の子供−年間）と計算され、入院の危険性は、６／１０００人の子供−年間（生後６カ月間の間では１１／１０００人の子供−年間）と計算された。発生率は、心肺疾患に罹患している子供および未熟児で生まれた子供でより高く、これらは米国におけるＲＳＶ関連の入院のほぼ半数を構成する。ＲＳＶによって引き起こされるより重篤なＬＲＩを経験した子供は、後の小児期喘息の発生率が増加する。重篤なＬＲＩおよびその続発症に罹患している子供を看護する費用は相当であり、ＲＳＶはまた、高齢者におけるインフルエンザ様の病気からの罹患率の重要な原因としても益々認識されており、ＲＳＶ誘導性疾患に対して保護することができる安全かつ有効なワクチンの必要性が明らかとなっている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、キメラ呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。キメラＲＳＶ抗原は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン、Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン、および第２のＦタンパク質ポリペプチドドメインを含む。開示する抗原は、対象に投与した場合に免疫応答を誘発し、ＲＳＶ感染症の症状を治療および／または予防するために使用することができる。また、キメラ抗原をコードしている核酸、キメラ抗原を含む免疫原性組成物、ならびにキメラ抗原の生成および使用方法も開示する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造的特徴を明らかにする模式図である（５７４個のアミノ酸）。図１Ｂは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の構造的特徴を明らかにする模式図である（２９８個のアミノ酸）。図１Ｃは、例示的な真核Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原の構造的特徴を明らかにする模式図である（５６２個のアミノ酸）。
【図２】例示的なＦ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原の模式図である。
【図３】Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原をコードしているポリヌクレオチド配列を含む例示的な発現構築物を例示する模式図である。
【図４】図４Ａ〜Ｌは、ＲＳＶの様々な株（または単離体）のＦタンパク質間の類似度および変異を例示する配列アラインメントである。
【図５】図５Ａ〜ＱＱは、ＲＳＶの様々な株（または単離体）のＧタンパク質間の類似度および変異を例示する配列アラインメントである。
【図６】Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原によるヒト血清の中和を例示する棒グラフである。
【図７】Ｆ２ＧＦ１キメラ抗原を投与した後のＲＳＶに対する保護を示すグラフである。
【図８】Ｆ２ＧＦ１キメラ抗原を用いた免疫化によって誘発された抗体による血清の中和を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
配列表の説明
配列番号１：ＲＳＶロング（Ｌｏｎｇ）株融合（Ｆ）タンパク質のヌクレオチド配列である。
【０００９】
配列番号２：ＲＳＶロング株融合（Ｆ）タンパク質のアミノ酸配列である。
【００１０】
配列番号３：ＲＳＶロング株Ｇタンパク質のヌクレオチド配列である。
【００１１】
配列番号４：ＲＳＶロング株Ｇタンパク質のアミノ酸配列である。
【００１２】
配列番号５：Ｐ３−１キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１８０９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置４００〜４０５および７１２〜７１７で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。
【００１３】
配列番号６：Ｐ３−１  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。アミノ酸１〜２６はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。アミノ酸２７〜１３３は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０に対応する（Ｆ２）。アミノ酸１３６〜２３７は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９に対応する。アミノ酸２４０〜６０３は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４に対応する。Ｆ領域とＧ領域との間のリンカーは、位置１３４〜１３５および２３８〜２３９に位置する。
【００１４】
配列番号７：Ｐ３−２キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３３０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１０７をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド３３７〜５７９は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９をコードしている。ヌクレオチド５８６〜１６７７は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置３３１〜３３６および５８０〜５８５で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。
【００１５】
配列番号８：Ｐ３−２  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。アミノ酸１〜２６はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。アミノ酸２７〜１１０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１０７に対応する（Ｆ２）。アミノ酸１１３〜１９３は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９に対応する。アミノ酸１９６〜５５９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４に対応する（Ｆ１）。Ｆ領域とＧ領域との間のリンカーは、位置１１１〜１１２および１９４〜１９５に位置する。
【００１６】
配列番号９：Ｐ３−３キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。アミノ酸１〜２６はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。アミノ酸２７〜１１０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１０７に対応する（Ｆ２）。アミノ酸１１３〜１９３は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９に対応する。アミノ酸１９６〜５５９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４に対応する（Ｆ１）。Ｆ領域とＧ領域との間のリンカーは、位置１１１〜１１２および１９４〜１９５に位置する。
【００１７】
配列番号１０：Ｐ３−３  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。アミノ酸１〜２６はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。アミノ酸２７〜１１０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１０７に対応する（Ｆ２）。アミノ酸１１３〜２１４は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９に対応する。アミノ酸２１７〜５８０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４に対応する（Ｆ１）。Ｆ領域とＧ領域との間のリンカーは、位置１１１〜１１２および２１５〜２１６に位置する。
【００１８】
配列番号１１：Ｐ３−４キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜６４８は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９をコードしている。ヌクレオチド６５５〜１７４６は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置４００〜４０５および６４９〜６５４で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。
【００１９】
配列番号１２：Ｐ３−４  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。アミノ酸１〜２６はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。アミノ酸２７〜１３３は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０に対応する（Ｆ２）。アミノ酸１３６〜２１６は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９に対応する。アミノ酸２１９〜５８２は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４に対応する。Ｆ領域とＧ領域との間のリンカーは、位置１３４〜１３５および２１７〜２１８に位置する。
【００２０】
配列番号１３：Ｐ３−５キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１８０９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置４００〜４０５および７１２〜７１７で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。
【００２１】
配列番号１４：Ｐ３−５  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。アミノ酸１〜２６はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。アミノ酸２７〜１３３は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０に対応する（Ｆ２）。アミノ酸１３６〜２３７は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９に対応する。アミノ酸２４０〜６０３は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４に対応する。Ｆ領域とＧ領域との間のリンカーは、位置１３４〜１３５および２３８〜２３９に位置する。
【００２２】
配列番号１５：Ｐ３−６キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３３０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１０７をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド３３７〜５７９は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９をコードしている。ヌクレオチド５８６〜１６７７は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置３３１〜３３６および５８０〜５８５で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。
【００２３】
配列番号１６：Ｐ３−６  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。アミノ酸１〜２６はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。アミノ酸２７〜１１０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１０７に対応する（Ｆ２）。アミノ酸１１３〜１９３は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９に対応する。アミノ酸１９６〜５５９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４に対応する（Ｆ１）。Ｆ領域とＧ領域との間のリンカーは、位置１１１〜１１２および１９４〜１９５に位置する。
【００２４】
配列番号１７：Ｐ３−７  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３３０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１０７をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド３３７〜６４２は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド６４９〜１７４０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置３３１〜３３６および６４３〜６４８で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。
【００２５】
配列番号１８：Ｐ３−７  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。アミノ酸１〜２６はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。アミノ酸２７〜１１０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１０７に対応する（Ｆ２）。アミノ酸１１３〜２１４は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９に対応する。アミノ酸２１７〜５８０は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４に対応する（Ｆ１）。Ｆ領域とＧ領域との間のリンカーは、位置１１１〜１１２および２１５〜２１６に位置する。
【００２６】
配列番号１９：Ｐ３−８  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜６４８は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９をコードしている。ヌクレオチド６５５〜１７４６は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置４００〜４０５および６４９〜６５４で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。
【００２７】
配列番号２０：Ｐ３−８  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。アミノ酸１〜２６はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。アミノ酸２７〜１３３は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０に対応する（Ｆ２）。アミノ酸１３６〜２１６は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９に対応する。アミノ酸２１９〜５８２は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４に対応する。Ｆ領域とＧ領域との間のリンカーは、位置１３４〜１３５および２１７〜２１８に位置する。
【００２８】
配列番号２１：Ｆ２ＧＦ１−１  Ｃ−Ｖ１をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号２２である）。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１８０９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置４００〜４０５および７１２〜７１７で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。４個の変更されたコドンが、ヌクレオチド位置１１７５、１２３５、１２６５および１５５３（アミノ酸残基３９２、４１２、４２２および５１８）でのシステインからセリンへの置換をコードしている。
【００２９】
配列番号２３：Ｆ２ＧＦ１−１  Ｃ−Ｖ２をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号２４である）。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１８０９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置４００〜４０５および７１２〜７１７で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。４個の変更されたコドンが、ヌクレオチド位置１１９、２１５、８７２および１２０２（アミノ酸残基４０、７２、２９１および４０１）でのシステインからセリンへの置換をコードしている。
【００３０】
配列番号２５：Ｆ２ＧＦ１−１  Ｃ−Ｖ１２をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号２６である）。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１８０９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置４００〜４０５および７１２〜７１７で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。８個の変更されたコドンが、ヌクレオチド位置１１９、２１５、８７２、１１７５、１２０２、１２３５、１２６５および１５５３（アミノ酸残基４０、７２、２９１、３９２、４０１、４１２、４２２および５１８）でのシステインからセリンへの置換をコードしている。
【００３１】
配列番号２７：Ｆ２ＧＦ１−１  Ｃ−Ｖ１２’をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号２８である）。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１８０９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６１〜５２４をコードしている。Ｆ領域とＧ領域との間の２つの６個のヌクレオチドの架橋を、位置４００〜４０５および７１２〜７１７で、それぞれの断片を一緒に連結するために作製した。どちらの架橋も２個のグリシンアミノ酸残基をコードしている。１２個の変更されたコドンが、ヌクレオチド位置１０６、１０７、１１６、１１８、１２１、１２２、２１５、８７２、１１７５、１１９８、１１９９、１２０１、１２０２、１２３５、１２６５および１５５３でのシステインからセリンへの置換をコードしている。
【００３２】
配列番号２９：Ｆ２ＧＦ１−１  ｄｅｌ１をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号３０である）。これは、Ｆ１部分が切断されてＦ１の最初の４７個のアミノ酸が欠失した、Ｆ２ＧＦ１−１の変形である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１６６８は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２０８〜５２４をコードしている。
【００３３】
配列番号３１：Ｆ２ＧＦ１−１  ｄｅｌ２をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号３２である）。これは、Ｆ１部分が切断されてＦ１の最初の４２個のアミノ酸が欠失した、Ｆ２ＧＦ１−１の変形である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１６８３は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２０３〜５２４をコードしている。
【００３４】
配列番号３３：Ｆ２ＧＦ１−１  ｄｅｌ３をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号３４である）。これは、Ｆ１部分が切断されてＦ１の２４個の最初のアミノ酸が欠失した、Ｆ２ＧＦ１−１の変形である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１７３７は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１８５〜５２４をコードしている。
【００３５】
配列番号３５：Ｆ２ＧＦ１−１  ｄｅｌ４をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号３６である）。これは、Ｆ１部分が切断されたＦ２ＧＦ１−１の変形である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１６７７は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２０５〜５２４をコードしている。
【００３６】
配列番号３７：Ｆ２ＧＦ１−１  ｄｅｌ５をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号３８である）。これは、Ｆ１部分の両末端が切断された、Ｆ２ＧＦ１−１の変形である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１５４５は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２０６〜４８１をコードしている。
【００３７】
配列番号３９：Ｆ２ＧＦ１−１  ｄｅｌ６をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号４０である）。これは、Ｆ１部分の両末端が切断された、Ｆ２ＧＦ１−１の変形である。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１５６９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２０６〜４８１をコードしている。
【００３８】
配列番号４１：Ｆ２ＧＦ１−１  ｄｅｌ５  Ｃ−Ｖ１２をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号４２である）。これは、Ｆ１部分の両末端が切断された、Ｆ２ＧＦ１−１の変形である。また、８個のコドンがヌクレオチド位置１１９、２１５、７３７、１０４０、１０６７、１１００、１１３０および１４１８で改変されている。これは、ｄｅｌ５およびＣ−Ｖ１２の改変の組合せである。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１５４５は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２０６〜４８１をコードしている。改変したコドンをハイライトで示した。
【００３９】
配列番号４３：Ｆ２ＧＦ１−１  ｄｅｌ６  Ｃ−Ｖ１２をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号４４である）。これは、Ｆ１部分の両末端が切断された、Ｆ２ＧＦ１−１の変形である。また、８個のコドンがヌクレオチド位置１１９、２１５、７５５、１０５８、１０８５、１１１８、１１４８および１４３６で改変されている。これは、ｄｅｌ６およびＣ−Ｖ１２の改変の組合せである。ヌクレオチド１〜７８はベクターに由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜３９９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている（Ｆ２）。ヌクレオチド４０６〜７１１は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。ヌクレオチド７１８〜１５６９は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２０６〜４８１をコードしている。
【００４０】
配列番号４５：Ａｎ−Ｇポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号４６である）。ヌクレオチド１〜７２は、Ｎ末端ヒスチジンタグをコードしている。ヌクレオチド７３〜３７８は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。
【００４１】
配列番号４７：Ａｎ−Ｇ−Ｏポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号４８である）。コドンが最適化されたＧタンパク質ポリペプチド。ヌクレオチド１〜７２は、Ｎ末端ヒスチジンタグをコードしている。ヌクレオチド７３〜３７８は、Ｇタンパク質のアミノ酸１２８〜２２９をコードしている。
【００４２】
配列番号４９：Ａｎ−ＧＴポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号５０である）。ヌクレオチド１〜７２は、Ｎ末端ヒスチジンタグをコードしている。ヌクレオチド７３〜３１２は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９をコードしている。
【００４３】
配列番号５１：Ａｎ−ＧＴ−Ｏポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号５２である）。ヌクレオチド１〜７２は、Ｎ末端ヒスチジンタグをコードしている。ヌクレオチド７３〜３１２は、Ｇタンパク質のアミノ酸１４９〜２２９をコードしている。
【００４４】
配列番号５３：Ｆ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号５４である）。ヌクレオチド１〜７８はベクター（ｐＥＴ１９ｂ）の一部であり、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜１１５８は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸１６２〜５２４をコードしている。
【００４５】
配列番号５５：Ｆ１  ｄｅｌ５をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号５６である）。Ｆ１コード配列の両末端が切断された、Ｆ１ポリペプチドの変形である。ヌクレオチド１〜７８はベクター（ｐＥＴ１９ｂ）の一部であり、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７９〜９００は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２０８〜４８１をコードしている。
【００４６】
配列番号５７：Ｆ１  ｄｅｌ５  Ｃ−Ｖ１をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号５８である）。Ｆポリペプチドのこの変形は、Ｆ１  ｄｅｌ５に類似している。４個のコドンを変更して、システインからセリンへの４つの点突然変異を生じさせた。
【００４７】
配列番号５９：Ｆ１  ｄｅｌ５  Ｃ−Ｖ２’をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号６０である）。Ｆポリペプチドのこの変形は、Ｆ１  ｄｅｌ５に類似している。３個のコドンを変更して３つの点突然変異を生じさせた。
【００４８】
配列番号６１：Ｆ１  ｄｅｌ５  Ｃ−Ｖ１２’をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号６２である）。Ｆポリペプチドのこの変形は、Ｆ１  ｄｅｌ５に類似している。７個のコドンを変更して、Ｆ１  ｄｅｌ５  Ｃ−Ｖ１およびＦ１  ｄｅｌ５  Ｃ−Ｖ２’の置換を一緒に合わせて、点突然変異を生じさせた。
【００４９】
配列番号６３：Ｆ２ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号６４である）。ヌクレオチド１〜７２はベクター（ｐＥＴ１９ｂ）に由来し、１０個のヒスチジンのＮ末端タグを含む。ヌクレオチド７３〜３９３は、Ｆ０タンパク質のアミノ酸２４〜１３０をコードしている。
【００５０】
配列番号６５：Ｆ２  Ｃ−Ｖ２’をコードしているヌクレオチド配列である（コードされているアミノ酸配列は配列番号６６である）。この変形はＦ２に類似している（配列番号４１）。５個のコドンを変更して点突然変異を生じさせた。
【００５１】
配列番号６７：例示的な真核キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号６８：真核キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号６９：フューリン切断部位が欠失した、例示的な真核キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である（真核Ｆ２ＧＦ１  ｄｅｌｆｕｒ）。
【００５４】
配列番号７０：真核Ｆ２ＧＦ１  ｄｅｌｆｕｒのアミノ酸配列である。
【００５５】
詳細な説明
概論
ＲＳＶ感染症によって引き起こされる症状および続発症に対して保護するワクチンの開発は、宿主の免疫応答が疾患の病因に役割を果たしていると考えられることによって、複雑となっている。１９６０年代の初期の研究により、ホルマリンで失活させたＲＳＶワクチンでワクチン接種した子供は、後にウイルスに曝露した場合に、ワクチン接種しなかった対照の対象よりも重篤な疾患を患ったことが示されている。これらの初期治験は、ワクチン接種した者の８０％の入院および２人の死亡をもたらした。疾患の増強した重篤度は動物モデルでも再現され、不十分な血清中和抗体レベル、局所免疫の欠乏、肺好酸球増加症における２型ヘルパーＴ細胞様（Ｔｈ２）免疫応答の過剰な誘導ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５サイトカインの産生増加から生じると考えられている。対照的に、ＲＳＶ感染症に対して保護する成功したワクチンは、ＩＬ−２およびγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）の産生によって特徴づけられる、Ｔｈ１型の免疫応答を誘導する。
【００５６】
健康集団および危険性のある集団において耐久性があり保護的な免疫応答を生じる安全かつ有効なＲＳＶワクチンを生産するために、様々な手法が試みられている。しかし、現在までに評価された候補はどれも、下気道感染症（ＬＲＩ）を含めたＲＳＶ感染症を予防することおよび／またはＲＳＶ疾患を減少もしくは予防することを目的とした、ワクチンとして安全かつ有効であると判明していない。
【００５７】
本開示は、容易に溶解するキメラＲＳＶ抗原を組換え発現系で産生できるように、ＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドの内部に位置するＧタンパク質の優勢の免疫保護的エピトープを含む、キメラＲＳＶ抗原に関する。これらの新規キメラＲＳＶ抗原は、予防的および治療的ワクチンとして投与するために適した安全かつ有効なキメラＲＳＶ抗原を生産する以前の試みで遭遇したいくつかの顕著な欠点を克服している。
【００５８】
一態様では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端の方向で第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン、Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン、および第２のＦタンパク質ポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドを含む、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原に関する。そのようなキメラ抗原は、本明細書中でＦ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原と呼ぶ。第１のＦタンパク質ポリペプチドドメインは、ｉｎ  ｖｉｖｏでフューリン切断によって産生した、少なくともＦ２（またはＦ２）サブユニット（またはドメイン）のアミノ酸部分配列、たとえば、ネイティブＦタンパク質ポリペプチドの残基２４〜１０７のアミノ酸配列を含むことができる。ネイティブＦタンパク質ポリペプチドは、ＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂ株の任意のＦタンパク質から選択することができる。特定の例示的な実施形態では、Ｆタンパク質はＲＳＶロング株から選択される（配列番号２によって表す、ＡＴＣＣカタログ＃ＶＲ−２６、ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＹ９１１２６２）。本開示の理解を容易にするために、すべてのアミノ酸残基の位置は、ＲＳＶロング株のアミノ酸位置を参照して（すなわち、アミノ酸残基の位置はそれに対応する）示すが、匹敵するアミノ酸を任意のＲＳＶ  ＡまたはＢ株から使用することができる。任意の他のＲＳＶ  ＡまたはＢ株の匹敵するアミノ酸位置は、容易に入手可能かつ周知のアラインメントアルゴリズム（ＢＬＡＳＴなど、たとえば、図４および５に示す初期設定パラメータを使用する）を用いて、選択したＲＳＶ株のアミノ酸配列をロング株のそれとアラインメントすることによって、当業者が容易に決定することができる。さらに、第１のＦタンパク質ポリペプチドドメインは、「ｐｅｐ２７」のアミノ酸配列の全体または一部を含むこともできる（たとえば、ネイティブＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基１１０〜１３０全体または一部分を含む）。それに加えて、またはその代わりに、第１のＦタンパク質ポリペプチドドメインは、シグナルペプチドを含むことができる。そのようなシグナルペプチドは、ネイティブＦ０シグナルペプチド（たとえばＦ０ポリペプチドのアミノ酸１〜２３）であるか、または、異種シグナルペプチド、たとえば選択した発現系に基づいて選択したものであることができる。例示的な一実施形態では、シグナルペプチドを含むＦ２ドメインは、ネイティブＦ０ポリペプチドのアミノ酸残基１〜１０９を含む。
【００５９】
所望により、キメラＲＳＶ抗原の第１のＦタンパク質ポリペプチドドメインは、天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。たとえば、そのようなアミノ酸改変は、キメラＲＳＶ抗原の溶解度および／または安定性を改善する（たとえば増加させる）ことができる。そのような改変は、１つもしくは複数のアミノ酸の置換、１つもしくは複数のアミノ酸の欠失または１つもしくは複数のアミノ酸の付加であることができる。一例では、キメラＲＳＶ抗原は、位置７９（ネイティブＦ０ポリペプチドと比較して）でメチオニン以外のアミノ酸（イソロイシンなど）を有する、第１のＦタンパク質ポリペプチドドメインを含む。この例示的なキメラＲＳＶ抗原は、第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン内の第２の開始部位を排除するために操作されている。別の例では、アミノ酸改変には、天然に存在するＲＳＶ  Ｆタンパク質中に存在するフューリン切断部位を排除するアミノ酸の欠失または置換が含まれる。たとえば、例示的なキメラＲＳＶ抗原は、たとえば、位置１０６〜１０９でフューリン切断部位の全体または一部を除去することによって（欠失および／または置換のどちらかによる）、サブユニットＦ２をｐｅｐ２７から分離する天然に存在するフューリン切断部位を排除するように、改変することができる。
【００６０】
第２のＦタンパク質ポリペプチドドメインは、典型的には、ｉｎ  ｖｉｖｏでフューリン切断によって産生した、Ｆ１（またはＦ１）サブユニット（またはドメイン）のアミノ酸配列の全体または一部を含む。たとえば、第２のＦタンパク質ポリペプチドドメインは、ネイティブＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列１６１〜５２４の全体または一部を含むことができる（たとえばネイティブＦタンパク質のアミノ酸１５１〜アミノ酸５２４）。所望により、第２のＦタンパク質ポリペプチドドメインは、キメラＲＳＶ抗原の溶解度および／または安定性を改善する（たとえば増加させる）少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。
【００６１】
キメラＲＳＶ抗原中の第１のＦタンパク質ポリペプチドドメインと第２のＦタンパク質ポリペプチドドメインとの間には、Ｇタンパク質ポリペプチドドメインが位置する。介在Ｇタンパク質ポリペプチドドメインは、配列番号４によって表すロング株Ｇタンパク質などのネイティブＧタンパク質ポリペプチドの全体または一部を含むことができる。例示的な一実施形態では、Ｇタンパク質ポリペプチドは、ネイティブＧタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基１５１〜２２９の全体または一部（たとえば１４９〜２２９）を含む、ネイティブＧタンパク質ポリペプチドの部分配列（または断片）である。別の実施形態では、Ｇタンパク質ポリペプチドドメインは、ネイティブＧタンパク質ポリペプチドの残基１２８〜２２９のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
キメラＲＳＶ抗原の特定の実施形態では、Ｇタンパク質ドメインは、ＲＳＶ抗原を対象（ヒト対象など）に投与した場合に、ワクチンで増強したウイルス性疾患が減少または予防されるように、改変されている。そのようなキメラＲＳＶ抗原は、好都合には、Ｇタンパク質の位置１９１のアスパラギンからアラニンへの置換（Ｎ１９１Ａ）を含む。
【００６３】
特定の実施形態では、第１のＦタンパク質ポリペプチドドメイン、Ｇタンパク質ポリペプチドドメイン、および／または第２のＦタンパク質ポリペプチドドメインのうちの少なくとも１つ、場合によっては２つ、一部の場合では３つすべては、配列がＲＳＶ  Ａロング株に対応している。あるいは、ドメインのうちの１つまたは複数は、配列が別のＲＳＶ  ＡまたはＢ株に対応している（またはそれに由来する）。したがって、キメラは、ＲＳＶの１つまたは複数の株からのＦタンパク質およびＧタンパク質のアミノ酸配列を含むことができ、これにより、２つのＦタンパク質成分およびＧタンパク質成分のそれぞれは、同一の株または異なる株に由来するものとすることができる。異なる株を選択した場合、Ｆタンパク質およびＧタンパク質成分は、それぞれ、Ａ株由来、もしくはＢ株由来、またはＡおよびＢ株の組合せ由来であることができる。
【００６４】
一部の例では、ポリペプチドドメインの１つまたは複数は、それが由来する天然に存在する株のアミノ酸配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を有する。たとえば、改変は、１つまたは複数のアミノ酸（たとえば、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、約１０個までのアミノ酸、またはそれ以上）の置換であることができる。特定の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、システイン残基、たとえば、Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸残基４０、７２、２９１、３９２、４０１、４１２、４２２、および／または５１８（ネイティブＦ０ポリペプチドの残基３７、６９、２１２、３１３、３２２、３３３、３４３および４３９に対応）から選択されるシステイン残基を置き換える、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。あるいは、システインのうちの１つまたは複数は、ロイシン、イソロイシンまたはバリンなどの疎水性残基によって置き換えられることができる。それに加えて、またはその代わりに、キメラＲＳＶ抗原は、疎水性アミノ酸、たとえば、Ｆ０の残基３３〜３９および３２１〜３２２に対応する位置３６〜４１および／または位置４００〜４０１から選択される疎水性アミノ酸を置き換える、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。
【００６５】
その代わりに、またはそれに加えて、改変には、１つもしくは複数のアミノ酸の欠失および／または１つもしくは複数のアミノ酸の付加が含まれ得る。実際、所望する場合は、ポリペプチドドメインの１つまたは複数は、どの単一の株にも対応しないが、複数の株から、さらにはＲＳＶウイルスポリペプチドの複数の株をアラインメントすることによって推定したコンセンサス配列からの成分部分配列を含む、合成ポリペプチドであることができる。特定の実施形態では、ポリペプチドドメインの１つまたは複数は、続く処理または精製を容易にするタグを構成するアミノ酸配列を付加することによって改変する。そのようなタグは、抗原もしくはエピトープタグ、酵素タグまたはポリヒスチジンタグであることができる。典型的には、タグは、キメラタンパク質のどちらか一方の末端、たとえば、キメラ抗原または融合タンパク質のＣ末端またはＮ末端に位置する。
【００６６】
例示的なＲＳＶ抗原を、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０のアミノ酸配列によって表す。これらの例示的なＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９と呼ぶ。さらなる例示的なＲＳＶ抗原は、配列番号２１〜４３によって表し、例示的な真核Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドは、配列番号６８および７０（ヌクレオチド配列は配列番号６７および６９）によって表す。
【００６７】
発現された際、キメラＲＳＶ抗原は、成熟した切断されたＦタンパク質のアセンブリによく似たコンホメーションへと折り畳まれる。Ｇタンパク質成分は、Ｆ２およびＦ１ポリペプチドサブユニットの間に位置してループを形成し、その中で、免疫優勢のＧタンパク質エピトープが折り畳まれたタンパク質の外側に位置する。特定の実施形態では、ＲＳＶ抗原はキメラポリペプチドの多量体である。たとえば、ＲＳＶ抗原は、好都合には、Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶポリペプチドの三量体、またはより高次のアセンブリもしくは多量体の複合体へとアセンブルすることができる。
【００６８】
本開示の別の特徴は、医薬上許容される担体または賦形剤と組み合わせたＦ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原を含有する、または含む、免疫原性組成物に関する。医薬上許容される担体および賦形剤は周知であり、当業者が選択することができる。たとえば、担体または賦形剤は、好都合には、バッファーを含有することができる。所望により、担体または賦形剤は、溶解度および／または安定性を安定化する少なくとも１つの成分も含む。可溶化剤／安定化剤の例には、洗剤、たとえば、ラウレルサルコシンおよび／またはｔｗｅｅｎが含まれる。別の可溶化剤／安定化剤には、アルギニン、およびガラスを形成するポリオール（スクロース、トレハロースなど）が含まれる。
【００６９】
所望により、免疫原性組成物にはアジュバントも含まれる。ＲＳＶに対する保護的免疫応答を誘発する目的で対象に投与するために適した免疫原性組成物のコンテキストでは、免疫原性組成物（抗原およびアジュバントの組合せ）は、Ｔｈ１型の免疫応答を誘発させるように選択する。
【００７０】
アジュバントは、免疫原性組成物を投与する対象、または対象の集団において安全かつ最小限の反応原性であるように選択する。キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチド抗原を含有する免疫原性組成物のコンテキストでは、安全のために、アジュバントは、抗原と組み合わせて投与した場合に、対象において、Ｔｈ２型免疫応答に関連する悪化したＲＳＶ疾患などの免疫病理学的応答をもたらさない。免疫原性組成物を、ＲＳＶ感染症に罹患し易い（またはその危険性が高まっている）特定の年齢群の対象に投与する場合、アジュバントは、対象または対象の集団において安全かつ有効であるように選択する。したがって、高齢対象（６５歳を超える対象など）に投与するためにキメラＲＳＶ抗原を含有する免疫原性組成物を配合する場合、アジュバントは、高齢対象において安全かつ有効であるように選択する。同様に、キメラＲＳＶ抗原を含む免疫原性組成物が新生児または乳児対象（生後から２歳までの対象など）への投与を意図する場合、アジュバントは、新生児および乳児において安全かつ有効であるように選択する。
【００７１】
さらに、アジュバントは、典型的には、免疫原性組成物を、投与する投与経路によって投与した場合に、保護的免疫応答が増強されるように、選択する。たとえば、キメラＲＳＶ抗原を含有する免疫原性組成物を経鼻投与のために配合する場合、プロテオソームおよびプロトリンは好都合なＴｈ１に偏らせるアジュバントである。対照的に、免疫原性組成物を筋肉内投与のために配合した場合、３Ｄ−ＭＰＬ、スクワレン（たとえばＱＳ２１）、リポソーム、および／または油と水の乳剤のうちの１つまたは複数を含むアジュバントが好都合に選択される。
【００７２】
特定の例示的な実施形態では、キメラＲＳＶ抗原を含有する免疫原性組成物は、バッファーおよび３Ｄ−ＭＰＬを含むアジュバントを、所望によりミョウバンまたはＱＳ２１と共に、たとえばリポソーム配合物中で、新生児に投与するために適した濃度で含有する、医薬上許容される賦形剤中で、筋肉内注射のために配合する。別の実施形態では、キメラＲＳＶ抗原は、水中油乳剤中で（たとえば、３Ｄ−ＭＰＬを用いてまたは用いずに）配合する。別の例示的な実施形態では、キメラＲＳＶ抗原を含む免疫原性組成物は、高齢対象において免疫応答を増強させるアジュバントの濃度を用いて、同様に配合する。別の例示的な実施形態では、キメラＲＳＶ抗原を含む免疫原性組成物は、プロテオソームまたはプロトリンアジュバントを用いて、鼻腔内投与のために配合する。
【００７３】
特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＲＳＶの感染症を減少または予防するために投与する（たとえば予防的に）。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ＲＳＶの感染後の病理的応答を減少または予防するために、予防的に投与する。所望により、キメラＲＳＶ抗原を含む免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原性生物の少なくとも１つのさらなる抗原を用いて配合する。たとえば、病原性生物は、気道の病原体（呼吸器感染症を引き起こすウイルスまたは細菌など）であることができる。特定の場合では、免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原性ウイルス、たとえば、インフルエンザまたはパラインフルエンザなどの気道の感染症を引き起こすウイルスに由来する抗原を含む。他の実施形態では、さらなる抗原は、投与を容易にするため、または対象を複数の感染性生物に対して保護するために必要な接種の回数を減少するために選択する。たとえば、抗原は、とりわけ、Ｂ型肝炎、ジフテリア、テタヌス、パータシス、ヘモフィルスインフルエンザ、ポリオウイルス、またはニューモコッカスのうちの任意の１つまたは複数に由来することができる。
【００７４】
本開示の別の態様は、上述のキメラＲＳＶ抗原をコードしている組換え核酸に関する。特定の実施形態では、組換え核酸は、選択した原核または真核宿主細中での発現にコドンが最適化されている。複製および発現を容易にするために、核酸を、原核または真核発現ベクターなどのベクター内に取り込ませることができる。組換えＦ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原をコードしている核酸を含む宿主細胞も本開示の特徴である。好都合な宿主細胞には、イー・コリなどの原核（すなわち細菌）宿主細胞、ならびに真菌（たとえば酵母）細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞など）を含めた数々の真核宿主細胞が含まれる。
【００７５】
したがって、ＲＳＶの曝露または感染症を（その後に治療的に、またはその前に予防的に）処置するための医薬品（たとえば免疫原性組成物）の調製における、キメラＲＳＶ  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチド、およびそれをコードしている核酸の使用も、本開示の特徴である。同様に、対象においてＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法が本開示の特徴である。そのような方法は、免疫原性上有効な量のＦ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原を含む組成物を、ヒト対象などの対象に投与することを含む。一般的に、組成物は、免疫応答を増強させるアジュバントを含む。組成物は、ＲＳＶと接触した後のウイルス性疾患を増強させずにＲＳＶに特異的な免疫応答を誘発させるために、配合する。すなわち、免疫原性組成物は、ＲＳＶの感染症を減少もしくは予防するおよび／またはＲＳＶの感染後の病理的応答を減少もしくは予防する免疫応答のために配合し、それがもたらされる。組成物は様々な異なる経路によって投与することができるが、最も一般的には、免疫原性組成物は筋肉内または鼻腔内の投与経路によってデリバリーする。
【００７６】
用語
別段の説明がない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の技術者によって一般的に理解されているものと同じ意味を持つ。分子生物学の一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ（遺伝子Ｖ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ出版、１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ他（編）、分子生物学百科事典（Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．出版、１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；ならびにＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、分子生物学および生命工学：包括的な卓上参考書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．出版、１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）に見つけることができる。
【００７７】
単数形用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によりそうでないと明らかに示される場合以外は、複数形の指示対象が含まれる。同様に、単語「または」には、文脈によりそうでないと明らかに示される場合以外は、「および」が含まれることを意図する。用語「複数」とは、２つ以上をいう。さらに、核酸またはポリペプチドについて与えるすべての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさ、およびすべての分子量または分子質量値は、近似であり、説明のために提供することを理解されたい。さらに、抗原などの物質の濃度またはレベルに関して与える数値限定は、近似であることを意図する。したがって、濃度が少なくとも（たとえば）２００ｐｇであると示した場合、濃度が少なくともおよそ（または「約」）２００ｐｇであると理解されることを意図する。
【００７８】
本明細書中に記載のものと類似または均等の方法および材料を、本開示の実施または試験に使用できるが、適切な方法および材料を以下に記載する。用語「含む」とは「含まれる」ことを意味する。したがって、文脈によりそうでないことが必要な場合以外は、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載した化合物もしくは組成物（たとえば、核酸、ポリペプチド、抗原）または工程、あるいは化合物または工程の群が包含されることを意味するが、任意の他の化合物、組成物、工程、またはその群の排除を意味しないことを理解されたい。略記「たとえば（ｅ．ｇ．）」はラテン語ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書中では非限定的な例を示すために使用する。したがって、略記「たとえば（ｅ．ｇ．）」は用語「たとえば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
【００７９】
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、以下の用語の説明を提供する。さらなる用語および説明は本開示の文脈中で提供されている場合がある。
【００８０】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科、ニューモウイルス属の病原性ウイルスである。ＲＳＶのゲノムは、１１個のタンパク質をコードしている、長さが１５，２２２個のヌクレオチドの、一本鎖のマイナス鎖ＲＮＡ分子である。ＲＮＡゲノムとウイルスＮタンパク質との密な会合により、ウイルス外被内に包まれたヌクレオカプシドが形成される。Ｇ糖タンパク質の抗原性の差異に基づいて、２つの群のヒトＲＳＶ株、ＡおよびＢ群が記載されている。数々のＲＳＶ株が現在までに単離されている。例示的な株は、図４および５にＧｅｎＢａｎｋおよび／またはＥＭＢＬ受託番号によって示す。さらなるＲＳＶ株が単離される可能性が高く、ＲＳＶの属に包含される。同様に、ＲＳＶの属には、遺伝的浮動によって天然に存在する（たとえば、以前にもしくは後に同定された株）、または人工合成および／もしくは組換えから生じる変異体が包含される。
【００８１】
用語「Ｆタンパク質」または「融合タンパク質」または「Ｆタンパク質ポリペプチド」または「融合タンパク質ポリペプチド」とは、ＲＳＶ融合タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全体または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質をいう。同様に、用語「Ｇタンパク質」または「Ｇタンパク質ポリペプチド」とは、ＲＳＶ付着タンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全体または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質をいう。数々のＲＳＶ融合および付着タンパク質が記載されており、当業者に知られている。図４および５は、本開示の出願日時点で公的に入手可能な、例示的なＦおよびＧタンパク質変異体（たとえば天然に存在する変異体）を示す。
【００８２】
「キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチド」または「Ｆ２ＧＦ１抗原」または「Ｆ２ＧＦ１ポリペプチド抗原」とは、典型的にはＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＲＳＶ  Ｇタンパク質の両方の抗原決定基またはエピトープを含めたポリペプチド成分を取り込み、Ｎ末端からＣ末端の配向で、Ｆ２サブユニットまたはドメインの少なくとも１つの部分配列または断片（たとえば、ネイティブＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸残基１〜１０７の全体または一部を含み、所望により、ｐｅｐ２７ドメイン、たとえばＦ０のアミノ酸残基１０８〜１３０を含む）、Ｇタンパク質ポリペプチドの少なくとも１つの部分配列、およびＦ１サブユニットまたはドメインの少なくとも１つの部分配列（たとえば、ネイティブＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸１５１〜５２４の全体または一部を含む）を含むキメラポリペプチドである。用語サブユニットおよびドメインは、Ｆタンパク質および／またはＦ０ポリペプチドの構造的ドメインに関連して、互換性があるように使用する。２つの保存されたフューリンコンセンサス配列、すなわちＲＡＲ／ＫＲ１０９（ＦＣＳ−２）およびＫＫＲＫＲＲ１３６（ＦＣＳ−１）での、フューリンプロテアーゼによる、成熟Ｆ０ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏのタンパク質分解的切断により、３つのタンパク質分解断片、すなわち、そのＮ末端に疎水性融合ペプチドを有する膜に固定された大きなサブユニットＦ１、ジスルフィド架橋によってＦ１と連結した小さなサブユニットＦ２、および最初は２つの切断部位の間に位置していた２７個のアミノ酸（ｐｅｐ２７）からなる小さなペプチドの生成がもたらされる。当業者には、略記Ｆ０、Ｆ１およびＦ２は、科学文献中では一般的にＦ０、Ｆ１およびＦ２と呼ばれることが理解されよう。本コンテキストにおける用語キメラには、ＦおよびＧタンパク質成分がどちらも同一の血清型または株に由来するポリペプチド、ならびに個々のＦおよびＧタンパク質成分が異なる血清型または株に由来するポリペプチドが含まれる。
【００８３】
核酸またはタンパク質（たとえば、ＲＳＶ  ＦもしくはＧタンパク質もしくはタンパク質ドメイン、またはＦ２ＧＦ１キメラポリペプチド）を参照する場合の「変異体」とは、参照核酸またはタンパク質とは異なる核酸またはポリペプチドである。通常、変異体と参照核酸またはタンパク質との差異（複数可）は、参照と比較して比例的に少数の差異を構成する。そのような差異は、アミノ酸の付加、欠失または置換であることができる。したがって、変異体は、典型的には、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の約１％以下、または２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％が異なる。したがって、ＲＳＶ  ＦもしくはＧタンパク質、またはキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドのコンテキストにおける変異体は、典型的には、参照タンパク質、たとえば、配列番号２および４に例示した参照配列、または本明細書中に開示する例示的なＦ２ＧＦ１ポリペプチドのうちの任意のものと、少なくとも８０％、もしくは８５％、より一般的には少なくとも約９０％以上、たとえば９５％、またはさらには９８％もしくは９９％の配列同一性を共有する。本開示の特徴として含まれるさらなる変異体は、図４に提供する例示的な配列のうちの任意のもの（同一または異なる株のどちらか）からの、Ｆ２を取り込んだキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチド（たとえば、アミノ酸２４〜１０７の全体もしくは一部を含む、配列番号２とのアラインメントによって数値的に指定）および／またはＦ１成分（たとえば、アミノ酸１６１〜５２４の全体もしくは一部を含む、配列番号２とのアラインメントによって数値的に指定）、ならびに図５に提供する例示的な配列のうちの任意のものから選択されるＧタンパク質成分（たとえば、アミノ酸１４９〜２２９の全体または一部、配列番号４とのアラインメントによって数値的に指定）である。変異体は、遺伝的浮動によって生じることができるか、あるいは、部位特異的もしくはランダム突然変異誘発を用いて、または２つ以上の既存の変異体の組換えによって人工的に生成することができる。たとえば、変異体Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０の例示的なＦ２ＧＦ１キメラと比較して１個、または２個、または５個または１０個、または１５個、または５０個または約１００個までのヌクレオチドの差異を含むことができる。
【００８４】
ポリペプチドまたはタンパク質の「ドメイン」とは、ポリペプチドまたはタンパク質内の構造的に定義された要素である。本開示のコンテキストでは、「フューリン切断ドメイン」とは、フューリンプロテアーゼによる前駆体ポリペプチドの切断によって定義されるドメインである。たとえば、Ｆタンパク質を、Ｆ０と呼ぶ単一のポリペプチドとして合成する。続いて、Ｆ０ポリペプチドはフューリンプロテアーゼによって２つのコンセンサスフューリン認識モチーフで切断されて、Ｆ２およびＦ１と呼ぶ２つの構造的に独立したポリペプチド単位が生じる。Ｆ２は、アミノ酸２４（シグナルペプチドの後）から第１の（ＮからＣ末端の方向）フューリン切断認識部位まで伸びる。Ｆ１は、第２のフューリン切断部位からＦ０ポリペプチドのＣ末端まで伸びる。
【００８５】
用語「ネイティブ」および「天然に存在する」とは、天然の場合と同じ状態で存在するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸などの要素をいう。すなわち、要素は人工的に改変されていない。本開示のコンテキストでは、ＲＳＶタンパク質またはポリペプチドの数々のネイティブ／天然に存在する変異体、たとえば、ＲＳＶの様々な天然に存在する株または単離体から得たものが、存在することを理解されたい。
【００８６】
用語「ポリペプチド」とは、単量体がアミド結合によって一緒に結合したアミノ酸残基であるポリマーをいう。本明細書中で使用する用語「ポリペプチド」または「タンパク質」には、任意のアミノ酸配列が包含されることを意図し、糖タンパク質などの修飾された配列が含まれる。用語「ポリペプチド」とは、天然に存在するタンパク質、および組換えまたは合成によって生成したものを包含することを具体的に意図する。ポリペプチドを参照した用語「断片」とは、ポリペプチドの一部分（すなわち部分配列）をいう。用語「免疫原性断片」とは、完全長の参照タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの優勢の免疫原性エピトープを保持している、ポリペプチドのすべての断片をいう。ポリペプチド内の配向は、一般に、個々のアミノ酸のアミノおよびカルボキシ部分の配向によって定義されるＮ末端からＣ末端の方向で記載する。ポリペプチドは、Ｎすなわちアミノ末端からＣすなわちカルボキシ末端に向かう方向で翻訳される。
【００８７】
「シグナルペプチド」とは、新しく合成された分泌または膜タンパク質を膜、たとえば小胞体の膜に向かわせ、それを通るように指示する、短いアミノ酸配列（たとえば、およそ１８〜２５個のアミノ酸の長さ）である。シグナルペプチドは、しばしばポリペプチドのＮ末端に位置するが普遍的ではなく、しばしば、タンパク質が膜を通過した後にシグナルペプチダーゼによって切断除去される。シグナル配列は、典型的には、３つの共通の構造的特徴、すなわち、Ｎ末端極性塩基性領域（ｎ−領域）、疎水性の核、および親水性のｃ−領域を含む。
【００８８】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸配列」とは、少なくとも１０個の塩基の長さのヌクレオチドの高分子形態をいう。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはどちらかのヌクレオチドの改変形態であることができる。この用語には、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態が含まれる。「単離ポリヌクレオチド」とは、それが由来する生物の天然に存在するゲノム中で、それが直接連続的なコード配列の両方と直接連続的でないポリヌクレオチドを意味する（一方が５’末端上、他方が３’末端上）。一実施形態では、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードしている。核酸の５’および３’方向は、個々のヌクレオチド単位の結合性を参照して定義し、デオキシリボース（またはリボース）糖環の炭素位置に応じて命名される。ポリヌクレオチド配列の情報（コード）内容は、５’から３’の方向で読み取られる。
【００８９】
「組換え」核酸とは、天然に存在しない配列、または他の場合では２つの別々の配列セグメントの人工的な組合せによって作製した配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学合成によって、または、より一般的には、核酸の単離したセグメントの人工操作によって、たとえば、遺伝子操作技術によって、達成することができる。「組換え」タンパク質とは、細菌または真核細胞などの宿主細胞内に導入された、異種（たとえば組換え）核酸によってコードされているものである。核酸は、導入された核酸によってコードされているタンパク質を発現することができるシグナルを有する発現ベクター上で導入するか、または、核酸は、宿主細胞の染色体内に取り込ませることができる。
【００９０】
用語「精製」（たとえば、病原体または病原体を含む組成物に関して）とは、存在が望ましくない成分を組成物から除去するプロセスをいう。精製は相対的な用語であり、望ましくない成分のすべての痕跡を組成物から除去することを必要としない。ワクチン生成のコンテキストでは、精製には、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製または沈殿などのプロセスが含まれる。したがって、用語「精製した」は絶対的純度を必要とせず、むしろ、これは相対的な用語であることを意図する。したがって、たとえば、精製した核酸調製物とは、指定したタンパク質が、その生成環境中、たとえば、細胞または生物化学反応チャンバ内での核酸よりも濃縮されているものである。実質的に純粋な核酸またはタンパク質の調製物は、所望の核酸が調製物の全核酸含有量の少なくとも５０％を表すように、精製することができる。特定の実施形態では、実質的に純粋な核酸は、調製物の全核酸またはタンパク質含有量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％以上を表す。
【００９１】
「単離した」生物学的成分（核酸分子、タンパク質またはオルガネラなど）とは、成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分、たとえば他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびにオルガネラから、実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準の精製方法によって精製した核酸およびタンパク質が含まれる。この用語にはまた、宿主細胞中の組換え発現によって調製した核酸およびタンパク質ならびに化学合成した核酸およびタンパク質も包含される。
【００９２】
「抗原」とは、動物において抗体の産生および／またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質であり、動物に注射する、吸収される、または他の方法で導入する組成物が含まれる。用語「抗原」には、すべての関連する抗原性エピトープが含まれる。用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位をいう。「優勢の抗原性エピトープ」とは、それに対して機能的に顕著な宿主免疫応答、たとえば、抗体応答またはＴ細胞応答が行われるエピトープである。したがって、病原体に対する保護的免疫応答に関して、優勢の抗原性エピトープとは、宿主の免疫系によって認識された場合に、病原体によって引き起こされる疾患からの保護をもたらす、抗原性部分である。用語「Ｔ細胞エピトープ」とは、適切なＭＨＣ分子と結合した場合に、Ｔ細胞によって（Ｔ細胞受容体を介して）特異的に結合されるエピトープをいう。「Ｂ細胞エピトープ」とは、抗体（またはＢ細胞受容体分子）によって特異的に結合されるエピトープである。
【００９３】
「アジュバント」とは、非特異的な様式で免疫応答の生成を増強する薬剤である。一般的なアジュバントには、抗原がその上に吸着される鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液；油中水ならびに水中油（および二重乳剤や可逆的乳剤を含めたその変形）を含めた乳剤、リポ糖、リポ多糖、免疫賦活核酸（ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）、リポソーム、Ｔｏｌｌ受容体作用剤（特に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９作用剤）、ならびにそのような成分の様々な組合せが含まれる。
【００９４】
「免疫原性組成物」とは、特異的な免疫応答、たとえば、ＲＳＶなどの病原体に対するものを誘発することができる、ヒトまたは動物対象への投与に適した組成物である。したがって、免疫原性組成物は、１つまたは複数の抗原（たとえばポリペプチド抗原）または抗原性エピトープを含む。免疫原性組成物にはまた、賦形剤、担体、および／またはアジュバントなど、免疫応答を誘発または増強させることができる、１つまたは複数のさらなる成分も含まれることができる。特定の場合では、免疫原性組成物は、病原体によって誘導される症状または状態に対して対象を保護する免疫応答を誘発させるために、投与する。一部の場合では、病原体によって引き起こされる症状または疾患は、対象が病原体に曝された後に、病原体（たとえばＲＳＶ）の複製を阻害することによって、予防される（または減少もしくは寛解される）。本開示のコンテキストでは、用語、免疫原性組成物には、ＲＳＶに対する保護的または対症的な免疫応答を誘発させるために対象または対象の集団に投与することを意図する組成物（すなわち、ワクチン組成物またはワクチン）が包含されることを理解されたい。
【００９５】
「免疫応答」とは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球などの免疫系の細胞の、刺激に対する応答である。免疫応答は、抗原に特異的な中和抗体などの特異的抗体の産生をもたらすＢ細胞応答であることができる。免疫応答はまた、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答であることもできる。一部の場合では、応答は特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原に特異的な応答」）。抗原が病原体に由来する場合、抗原に特異的な応答は「病原体に特異的な応答」である。「保護的免疫応答」とは、病原体の有害な機能もしくは活性を阻害する、病原体による感染症を減少させる、または病原体による感染症から生じる症状（死を含む）を減少させる、免疫応答である。保護的免疫応答は、たとえば、溶菌斑減少アッセイもしくはＥＬＩＳＡ−中和アッセイにおけるウイルス複製または溶菌斑形成の阻害によって、あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏの病原体によるチャレンジに対する耐性を測定することによって、測定することができる。
【００９６】
「Ｔｈ１」型免疫応答は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞によって特徴づけられている。対照的に、「Ｔｈ２」型免疫応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を産生するＣＤ４＋ヘルパー細胞によって特徴づけられている。
【００９７】
「免疫学的に有効な量」とは、対象において免疫応答を誘発させるために使用する組成物（典型的には免疫原性組成物）の量である。一般的に、所望の結果は、対象を病原体に対して保護することができる、またはそれに貢献する、抗原（たとえば病原体）に特異的な免疫応答の生成である。しかし、病原体に対する保護的免疫応答を得ることは、免疫原性組成物の複数の投与を必要とする場合がある。したがって、本開示のコンテキストでは、用語、免疫学的に有効な量には、以前のまたは続く投与と組み合わせて保護的免疫応答を達成するために貢献する、分割用量が包含される。
【００９８】
形容詞「医薬上許容される」とは、その対象物が、対象（たとえば、ヒトまたは動物対象）への投与に適していることを示す。レミントンの医薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルバニア州Ｅａｓｔｏｎ、第１５版（１９７５）は、免疫原性組成物を含めた治療および／または予防的組成物の医薬的デリバリーに適した、組成物および配合物（希釈剤を含む）を記載している。
【００９９】
「溶解度」とは、所定量の別の物質、通常は液体に溶ける、物質（本開示のコンテキストではポリペプチド）の量の尺度である。したがって、溶解度の増加は、凝集せずにまたはそれを溶かす物質（たとえば液体）から分離せずに保たれるポリペプチドの量の増加である。
【０１００】
ポリペプチドに言及する場合、「安定性」とは、分解に対するポリペプチドの耐性の尺度である。したがって、安定性の増加は、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ貯蔵寿命の増加として測定して、ポリペプチドが分解に耐える能力の増加を反映する。
【０１０１】
免疫応答などの応答に言及する用語「変調させる」とは、応答の発生、規模、持続期間または特徴を変更または変動させることを意味する。免疫応答を変調させる薬剤は、免疫応答の発生、規模、持続期間もしくは特徴のうちの少なくとも１つを、その投与後に変更するか、または、発生、規模、持続期間もしくは特徴のうちの少なくとも１つを、参照薬剤と比較して変更する。
【０１０２】
用語「減少させる」とは、相対的な用語であり、薬剤は、応答または状態が、薬剤を投与した後に定量的に減っている場合、または、参照薬剤と比較して、薬剤を投与した後に減っている場合に、応答または状態を減少させている。同様に、用語「予防する」とは、応答または状態の少なくとも１つの特徴が排除されている限りは、必ずしも薬剤が応答または状態を完全に排除することを意味しない。したがって、感染症または病理的応答などの応答、たとえば、ワクチンで増強したウイルス性疾患を減少または予防する免疫原性組成物は、そのような感染症または応答を完全に排除する場合があるが、感染症または応答が測定可能な程度に減っている限りは、たとえば、薬剤が存在しない場合、または参照薬剤と比較した、感染症または応答の少なくとも約５０％、たとえば少なくとも約７０％、または約８０％、またはさらには約９０％（すなわち１０％以下まで）減っている限りは、必ずしも完全に排除しない。
【０１０３】
「対象」とは、生きた多細胞の脊椎動物生物である。本開示のコンテキストでは、対象は、非ヒト動物、たとえば、マウス、コットンラット、または非ヒト霊長類などの実験対象であることができる。あるいは、対象はヒト対象であることができる。
【０１０４】
Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原
ＲＳＶのウイルス外被は、ウイルスにコードされているＦ、ＧおよびＳＨ糖タンパク質を含む。ＦおよびＧ糖タンパク質は、ＲＳＶに特異的な中和抗体を誘導することが知られている、ＲＳＶビリオンのただ２つの成分である。本明細書中に開示するキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、ネイティブＦタンパク質の構造的特徴を取り込む一方で、同時にＲＳＶ  Ｇタンパク質の重要な免疫優勢のエピトープを示すように設計された。産生中の折り畳みおよびアセンブリを容易にするために、フューリンプロテアーゼによるＦ０前駆体ポリペプチドの翻訳後切断によって生じる、Ｆタンパク質の２つのドメイン（Ｆ１およびＦ２）を、単一のアミノ酸鎖中で発現させた。Ｆ２およびＦ１の間のコンホメーションによる距離の制約を考慮して、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の抗原部分をＦ２およびＦ１ドメインの間に取り込ませた。これらの構築物の設計は、タンパク質の融合後状態３Ｄモデルに基づいてモデリングした。この配座異性体は、タンパク質の最も安定した形態であると予測された。
【０１０５】
図１Ａは、本明細書中に記載の例示的なＲＳＶ  Ｆタンパク質および特異的な構造的領域ドメインを例示する模式図である。ＲＳＶのＦタンパク質は、Ｆ０と呼ぶ単一のポリペプチド前駆体として翻訳される。Ｆ０は折り畳まれ、タンパク質分解および他の翻訳後修飾を受ける。最初に、シグナルペプチド（Ｓｐ）が新生ポリペプチドの翻訳を小胞体（ＲＥ）の標的とし、これは後にシグナルペプチダーゼによって切断される。その後、新生ポリペプチドはＲＥ内で、白色三角形によって表す３つの部位でＮ−グリコシル化される。Ｆ２およびＦ１はフューリン切断（黒色の逆三角形）によって生成され、ヘテロ二量体の三量体として一緒に折り畳まれる（３×Ｆ２−Ｆ１）。フューリンは、対合した塩基性アミノ酸プロセッシング部位で前駆体タンパク質を効率的に切断することができる、カルシウム依存性のセリンエンドプロテアーゼである。典型的には、そのようなプロセッシング部位は、塩基性アミノ酸標的配列（標準的にはＡｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）を含む。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、位置１０９および１３６の２つのフューリン切断部位を含む。ＲＳＶ  Ｆタンパク質のフューリンプロセッシングの説明、および当分野で認識されている用語の定義は、Ｚｉｍｍｅｒ他「呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質のタンパク質分解性活性化。（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：３１６４２〜３１６５０、２００１、ならびにＺｉｍｍｅｒ他、「フューリンコンセンサス配列ＲＡＲ／ＫＲ１０９での切断および呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質の介在ペプチドの存在は、細胞培養物中でのウイルス複製に必要でない。（Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｆｕｒｉｎ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＲＡＲ／ＫＲ１０９  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｅ  ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７６：９２１８〜９２２４、２００２に見つかる。タンパク質は、白色菱形（ＴＭ）によって示すその膜貫通ヘリックスを用いて、Ｃ末端領域中で膜に固定されている。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、１５個のシステイン残基、４個の特徴的な中和エピトープ、２個のコイルドコイル領域および脂質化モチーフを特徴とする。
【０１０６】
図１Ｂは、例示的なＲＳＶ  Ｇタンパク質（２９８個のアミノ酸）を表す模式図である。Ｇタンパク質は、その膜貫通疎水性領域（アミノ酸４１〜６３）によってビリオン膜に固定されている。アミノ酸６５〜２９８は、ＲＳＶの表面で曝露されているＧタンパク質の一部分を含む。それぞれの末端には、高度にＯ−グリコシル化されたムチン様領域が位置する。５つのＮ−グリコシル化モチーフも、これら２つの領域中に存在する。グリコシル化されていない中心は、１）構造的データが入手可能なＧの唯一の部分である、システインヌース（アミノ酸１７３〜１９０）、２）アミノ酸１８３〜２０３の免疫優勢のＭＨＣクラスＩＩエピトープ、ならびに３）宿主細胞表面上へのウイルス付着のプロセスに関連づけられている、ケモカインフラクタルカイン受容体（Ｃ３ＸＣＲ）およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合モチーフを含めた、いくつかの重要な構造モチーフを含む。
【０１０７】
本開示は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の部分配列に対応する第１のポリペプチド成分、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の免疫優勢のエピトープを含むポリペプチド成分、およびＲＳＶ  Ｆタンパク質の部分配列に対応する第２のポリペプチド成分を含む、キメラＲＳＶ抗原に関する。例示的なＦ２ＧＦ１ポリペプチドの模式図を図１Ｃに表す。
【０１０８】
当業者には、任意のＲＳＶ  Ｆおよび／またはＧタンパク質の配列を、組換えキメラＲＳＶ  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドの構築に用いることができることが明らかであろう。本明細書中に開示する例示的な実施形態では、ロング株をモデルとして選択した。ウイルス外被と標的細胞膜との融合を担っているＦタンパク質の配列は、ＲＳＶ単離体間で高度に保存されている。対照的に、ウイルス付着を担っているＧタンパク質の配列は比較的可変性である。ＲＳＶ  ＦおよびＧタンパク質の配列のアラインメントは、異なるタンパク質間の同一性および変異を例示しており、それぞれ図４および５に提供する。これらのアラインメントから、保存領域および可変領域が容易に明らかである。
【０１０９】
Ｆタンパク質のＦ２およびＦ１ドメインを選択するにあたって、当業者は、Ｆ２および／またはＦ１ドメインの全体を含めることが厳密には必要でないことを理解されよう。典型的には、Ｆ２ドメインの部分配列（または断片）を選択する際にはコンホメーションの考慮が重要である。したがって、Ｆ２ドメインには、典型的には、キメラポリペプチドのアセンブリおよび安定性を容易にするＦ２ドメインの一部分が含まれる。特定の例示的な変異体では、Ｆ２ドメインはアミノ酸２４〜１０７を含む。所望により、Ｆ２ドメインは、ネイティブＦ０ポリペプチドのシグナルペプチド（たとえばアミノ酸１〜２３）を含むことができる。同様に、Ｆ２ドメインは、所望により、ｐｅｐ２７ドメインなどのさらなるアミノ酸を含むことができる。たとえば、特定の例示的な変異体では、Ｆ２ドメインはアミノ酸２４〜１３０を含む。
【０１１０】
典型的には、Ｆ１ドメインの少なくとも部分配列（または断片）は、Ｆタンパク質の免疫優勢のエピトープを含む安定したコンホメーションが維持されるように選択および設計する。たとえば、アミノ酸２６２〜２７５（パリビズマブ中和）および４２３〜４３６（Ｃｅｎｔｏｃｏｒのｃｈ１０１Ｆ  ＭＡｂ）の領域中に中和抗体によって認識されるエピトープを含む、Ｆ１ポリペプチドドメインの部分配列を選択することが、一般に望ましい。さらに、Ｔ細胞エピトープを、たとえば、アミノ酸３２８〜３５５の領域に含めることが望ましい。最も一般的には、Ｆ１サブユニット（たとえばアミノ酸２６２〜４３６にわたる）の単一の連続的な部分として、しかし、エピトープは、これらの免疫優勢のエピトープが安定したコンホメーションでアセンブルした不連続的な要素として含まれる合成配列で保持することができる。したがって、Ｆ１ドメインポリペプチドは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも大体アミノ酸２６２〜４３６を含む。本明細書中に提供する非限定的な一例では、Ｆ１ドメインは、ネイティブＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸１６１〜５２４を含む。別の非限定的な例では、Ｆ１ドメインは、ネイティブＦタンパク質ポリペプチドのアミノ酸１５１〜５２４を含む。当業者は、さらなるより短い部分配列を、従事者の判断で使用できることを理解されよう。
【０１１１】
同様に、Ｇタンパク質ポリペプチド成分は、免疫優勢のＴ細胞エピトープ（複数可）を保持するＧタンパク質の少なくとも部分配列（または断片）が、たとえば、アミノ酸１８３〜１９７の領域に含まれるように選択する。本明細書中に開示する例示的な変異体には、たとえば、ネイティブＧタンパク質のアミノ酸１５１〜２２９、１４９〜２２９、または１２８〜２２９を含むＧタンパク質の部分配列または断片が含まれる。当業者は、選択した部分がＦ２ＧＦ１キメラの発現、折り畳みまたはプロセッシングをコンホメーション的に不安定化または破壊しない限りは、Ｇタンパク質のより長いまたは短い一部分も使用できることを容易に理解されよう。所望により、Ｇタンパク質ドメインは、ホルマリンで失活させたＲＳＶワクチンに関連する好酸球増加症によって特徴づけられた増強した疾患の減少および／または予防に関与していると以前に示されている、位置１９１でアミノ酸置換を含む。天然に存在するおよび置換された（Ｎ１９１Ａ）Ｇタンパク質の特質のより詳細な説明は、たとえば、すべての目的のために本明細書中に参考として組み込まれている米国特許公開第２００５／００４２２３０号に見つけることができる。
【０１１２】
所望する場合は、当分野で知られているアンカーモチーフまたはニューラルネットもしくは多項式決定などの他の方法を用いて、さらなるＴ細胞エピトープを同定することができる。たとえば、ＲＡＮＫＰＥＰ（ワールドワイドウェブのｍｉｆ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌで利用可能）、ＰｒｏＰｒｅｄＩ（ワールドワイドウェブのｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄＩ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能）、Ｂｉｍａｓ（ワールドワイドウェブのｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能）、およびＳＹＦＰＥＩＴＨ（ワールドワイドウェブのｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍで利用可能）を参照されたい。たとえば、アルゴリズムを用いて、ペプチドの「結合閾値」を決定し、それらに特定の親和性で高確率のＭＨＣまたは抗体結合を与えるスコアを有するものを選択する。アルゴリズムは、ＭＨＣ結合に対する特定の位置での特定のアミノ酸の効果、抗体結合に対する特定の位置での特定のアミノ酸の効果、または結合に対するモチーフ含有ペプチド中の特定の置換の効果のいずれかに基づいている。免疫原性ペプチドのコンテキスト内では、「保存された残基」とは、ペプチド内の特定の位置でランダム分布によって予測されるよりも有意に高い頻度で出現するものである。アンカー残基とは、ＭＨＣ分子との接触点を提供する保存された残基である。そのような予測的方法によって同定されたＴ細胞エピトープは、特定のＭＨＣタンパク質とのその結合を測定することによって、およびＭＨＣタンパク質のコンテキスト中で提示された場合にＴ細胞を刺激するその能力によって、確認することができる。
【０１１３】
キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチド抗原の免疫原性を実証するために、８個の例示的な原核変異体を最初に生成した。キメラポリペプチドの発現を増強するために以下の改変を取り込ませた。ネイティブシグナルペプチド、ならびに疎水性融合ペプチド、および膜貫通αヘリックス構造から開始されるタンパク質のＣ末端領域を除去した。例示的なＦ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０によって表し、これらは図２に模式図を例示する。図２に示すように、これらの変異体は、アミノ酸２４からアミノ酸１０７または１３０のどちらかまで伸びる部分配列が、アミノ酸１４９〜２２９または１２８〜２２９まで伸びるＧタンパク質の部分配列と組み合わせられるように、Ｆ２およびＧドメインの様々な部分配列の組合せを表す。Ｐ３−１、Ｐ３−２、Ｐ３−３およびＰ３−４（それぞれ配列番号６、８、１０および１２）は、ネイティブＧタンパク質のアミノ酸位置１９１に対応する位置で単一のアミノ酸置換を含む一方で、Ｐ３−５、Ｐ３−６、Ｐ３−７およびＰ３−８には、位置１９１で天然に存在するアスパラギンを含む。さらなる詳細は、以下の実施例のセクションに提供する。
【０１１４】
さらなる例示的な変異体には、ジスルフィド架橋の形成に関与している可能性のある特定のシステインを除去するように改変された、キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドが含まれる。Ｆ２ドメイン中には２個のそのようなシステインが存在し、Ｇドメイン中には４個、およびＦ１ドメイン中には１２個存在する。したがって、これらのシステインのうちの１個または複数を排除した変異体を、たとえば、アミノ酸セリンで１つまたは複数のシステインを、たとえば、Ｐ３−１  Ｆ２ＧＦ１配列のアミノ酸４０、７２、２９１、３９２、４０１、４１２、４２２および／または５１８に対応する位置で置換することによって、生成することができる。あるいは、セリン（または別のアミノ酸）でシステインを置換する代わりに、疎水性残基（ロイシン、イソロイシン、またはバリンなど）でシステインまたはその付近を置き換えることができる。たとえば、以下のアミノ酸置換は、位置４０および４０１の近傍の１つまたは複数のアミノ酸を、１つまたは複数の疎水性残基で置き換える：Ｙ３６Ｌ、Ｔ３９Ｉ、Ｃ４０Ｇ、Ｓ４１ＶおよびＬ４００Ｓ、Ｃ４０１Ｉ。
【０１１５】
他の例示的な実施形態は、１つまたは複数のアミノ酸の欠失を有する変異体である。たとえば、コイルドコイル構造の一部分をアミノ酸５１〜６６で省略した変異体を生成することができる。コイルドコイル構造は疎水性相互作用によって駆動されているため、この構造の大きさの減少は、キメラポリペプチドの溶解度を増加させると予測される。あるいは、変異体はさらなるアミノ酸を含むことができる。たとえば、変異体は、精製を容易にする（たとえばポリヒスチジンタグ）さらなるアミノ酸、または安定性を増加させるさらなるアミノ酸、たとえば、イソロイシンジッパードメインなどの安定化ドメインを含むことができる。
【０１１６】
他の例では、Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原をコードしているポリヌクレオチドは、真核（たとえば、昆虫、植物、または哺乳動物細胞）中の導入および発現に適した発現ベクターのために設計し、それに取り込ませる。好都合には、そのような核酸は、選択したベクター／宿主細胞中での発現にコドンが最適化されている。例示的な真核キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、上述の原核構築物と比較して軽微な変化で生成することができる。これらの改変は、ポリペプチドのグリコシル化および他の翻訳後プロセッシングが起こることができる、真核発現系中で産生した際に、キメラポリペプチドの発現および安定性を増強するために導入する。たとえば、真核構築物は、典型的には、発現系に対応するシグナルペプチド、たとえば、哺乳動物またはウイルスのシグナルペプチドを含むように設計し、たとえば、キメラポリペプチドを哺乳動物細胞中で発現させる場合はＲＳＶ  Ｆ０ネイティブシグナル配列が好都合に選択される。あるいは、シグナルペプチド（バキュロウイルスシグナルペプチド、またはメリチンシグナルペプチドなど）を、昆虫細胞中での発現のために置換することができる。植物発現系が好ましい場合は、適切な植物シグナルペプチドが当分野で知られている。所望する場合は、真核細胞内のフューリンプロテアーゼによるプロセッシングを排除するために、フューリン切断部位の一方または双方を除去することができる。さらに、本明細書中に記載の例示的な実施形態では、ＧおよびＦ１の境界は、原核構築物の境界とわずかに異なり、これは、Ｆ２ＧＦ１ポリペプチド抗原中のさらなる適切な変異を示す。たとえば、具体的な例では、Ｇペプチドドメインには、原核の変形のアミノ酸１４９〜２２９の代わりにアミノ酸１５２〜２２９が含まれ、Ｆ１ドメインは、原核の変形中に存在する１６１〜５２４の代わりにアミノ酸１５１〜５２４を含む。したがって、この例示的な真核キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、以下の配列を含む。Ｎ末端から、キメラポリペプチドは、Ｆ０ポリペプチドのアミノ酸１〜１０９を含む。アミノ酸１１０にグリシンリンカーが存在し、次いで、Ｇタンパク質のアミノ酸１５２〜２２９（天然に存在するＧタンパク質由来、または位置１９１でアスパラギンの代わりにアラニンの置換を含む）が位置１１１〜１８８に存在する。位置１８９〜５６２のＧタンパク質ドメインに次いで、Ｆ１ドメインのアミノ酸１５１〜５２４が存在する。したがって、この変異体では、ネイティブｐｅｐ２７、融合ペプチドおよびフューリン認識モチーフの一方または双方が、Ｇタンパク質ドメインによって置き換えられている。また、真核Ｆ２ＧＦ１キメラポリペプチド内に任意のさらなる改変を導入できることが理解されよう。
【０１１７】
キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチド抗原をコードしている核酸
本開示の別の態様は、上述のキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしている組換え核酸に関する。組換え核酸は、５’から３’の方向で、ＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドのフューリン切断ドメイン２（Ｆ２ドメイン）の少なくとも一部分または断片をコードしている第１のポリヌクレオチド配列、ＲＳＶ  Ｇタンパク質ポリペプチドの少なくとも一部分または断片をコードしている第２のポリヌクレオチド配列、およびＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチドのフューリン切断ドメイン１（Ｆ１ドメイン）の少なくとも一部分または断片をコードしている第３のポリヌクレオチド配列を含む。３つの成分ポリヌクレオチド配列は、典型的には、コードされているポリペプチドセグメントが、Ｎ末端からＣ末端の配向で、Ｆ２ポリペプチド成分、Ｇタンパク質成分、およびＦ１ポリペプチド成分を含む単一の連続的なキメラポリペプチドで産生されるように、結合されている。
【０１１８】
特定の実施形態では、組換え核酸は、哺乳動物、植物または昆虫細胞などの選択した原核または真核宿主細中での発現に、コドンが最適化されている。複製および発現を容易にするために、核酸を、原核または真核発現ベクターなどのベクター内に取り込ませることができる。本明細書中に開示する核酸は、様々なベクターのうちの任意の１つ（たとえば、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスおよび多数の他のものなどのウイルスＤＮＡを含む）の中に含めることができるが、最も一般的には、ベクターは、ポリペプチド発現産物の産生に適した発現ベクターである。発現ベクターでは、Ｆ２ＧＦ１キメラをコードしている核酸は、典型的には、ｍＲＮＡ合成を指示するために、適切な転写制御配列（プロモーター、および所望により１つまたは複数のエンハンサー）の近傍および配向で配置されている。すなわち、目的のポリヌクレオチド配列は、適切な転写制御配列と作動可能に連結している。そのようなプロモーターの例には、ＣＭＶの前初期プロモーター、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、バキュロウイルスの多角体プロモーター、イー・コリのｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージＴ７およびλＰＬプロモーター、ならびに原核もしくは真核細胞またはそのウイルス中の遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが含まれる。発現ベクターは、典型的には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターも含む。ベクターは、所望により、発現を増幅するための適切な配列を含む。さらに、発現ベクターは、所望により、真核細胞培養物にはジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性、またはイー・コリにはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などの、形質転換させた宿主細胞を選択するための表現型形質を提供する、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含む。
【０１１９】
発現ベクターはまた、たとえば翻訳効率を改善するために、さらなる発現要素を含むことができる。これらのシグナルは、たとえば、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含むことができる。一部の場合では、たとえば、翻訳開始コドンおよび関連する配列要素が、適切な発現ベクター内に、目的のポリヌクレオチド配列（たとえばネイティブ開始コドン）と同時に挿入されている。そのような場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要ない。しかし、ポリペプチドコード配列、またはその一部分のみが挿入されている場合は、ＡＴＧ開始コドンを含めた外来の翻訳制御シグナルを、キメラＦ２ＧＦ１配列の発現のために提供する。開始コドンは、目的のポリヌクレオチド配列の翻訳を確実にするために、正しい読み枠で配置する。外来の転写要素および開始コドンは、天然および合成の様々な起源のものであることができる。所望する場合は、使用する細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって、発現効率をさらに増加させることができる（Ｓｃｈａｒｆ他（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ、２０：１２５〜６２；Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３：５１６〜５４４）。
【０１２０】
当業者を組換えＦ２ＧＦ１核酸の産生に導くために十分な例示的な手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子学クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子学クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ他、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９９２（および２００３年の補遺）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ他、分子生物学の手短なプロトコル：分子生物学の最新プロトコルの方法の大要（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第４版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９に見つけることができる。
【０１２１】
キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしている例示的な核酸は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９によって表す。さらなる変異体は、既知の（または後に）発見されたＲＳＶの株、たとえば図４および５に示すもののうちの任意のものから選択される、類似のＦ２、Ｆ１およびＧタンパク質ポリペプチド配列のアセンブリを行うことによって、生成することができる。例示的な変異体と配列同一性を共有するさらなる配列変異体は、当業者が生成することができる。典型的には、核酸変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の１％以下、または２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％が異なるポリペプチドをコードしている。すなわち、コードされているポリペプチドは、少なくとも８０％、または８５％、より一般的には、少なくとも約９０％以上、たとえば９５％、またはさらには９８％もしくは９９％の配列同一性を共有する。当業者には、Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列は、それ自体が、遺伝暗号の冗長さが原因でより低い配列同一性を共有する場合があることが、すぐに理解されるであろう。
【０１２２】
当業者には、キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドとポリヌクレオチド配列との間の類似度は、ポリペプチドとヌクレオチド配列とで一般的にそうであるように、配列間の類似度に関して表すことができ、配列同一性とも呼ばれることが、理解されよう。配列同一性は、多くの場合、同一性（または類似度）の割合に関して測定する。割合が高ければ高いほど、２つの配列の一次構造はより類似している。一般に、２つのアミノ酸（またはポリヌクレオチド）配列の一次構造が類似していれば類似しているほど、折り畳みおよびアセンブリから生じる高次構造がより類似している。キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の変異体は、１つまたは少数のアミノ酸の欠失、付加または置換を有することができるが、それにもかかわらず、そのアミノ酸、および一般にそのポリヌクレオチド配列の非常に高い割合が共通している。
【０１２３】
配列同一性を決定する方法は当分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２、１９８１；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３、１９７０；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３：２３７、１９８８；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１、１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６：１０８８１、１９８８；ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４、１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、６：１１９、１９９４は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な検討を提示している。ＮＣＢＩの基本ローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３、１９９０）が、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと接続して使用するために、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）およびインターネットを含めたいくつかの供給源から利用可能である。このプログラムを用いてどのように配列同一性を決定するかの説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトから利用可能である。
【０１２４】
２つの核酸間の配列類似度の別の兆候は、ハイブリダイズする能力である。２つの核酸の配列が類似していれば類似しているほど、それらがハイブリダイズする条件はよりストリンジェントになる。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは配列依存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。したがって、特定のストリンジェンシー度合をもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般に、ハイブリダイゼーションの温度ならびにハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特にＮａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）によりハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定されるが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を与える。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃〜２０℃低いように選択される。Ｔｍとは、標的配列の５０％が、完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨ下）である。核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの計算は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子学クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、２００１；Ｔｉｊｓｓｅｎ、核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション、パートＩ：理論および核酸の調製（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）、生化学および分子生物学の実験室技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ニューヨーク州ＮＹ、１９９３、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ他、分子生物学の手短なプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９９に見つけることができる。
【０１２５】
本開示の目的のために、「ストリンジェントな条件」には、ハイブリダイゼーション分子と標的配列との間に２５％未満のミスマッチしか存在しない場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件が包含される。「ストリンジェントな条件」は、より正確な定義のために、具体的なストリンジェンシーレベルに分類することができる。したがって、本明細書中で使用する「中等度のストリンジェンシー」条件は、２５％を超える配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「中間のストリンジェンシー」の条件は、１５％を超えるミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高いストリンジェンシー」の条件は、１０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。「非常に高いストリンジェンシー」の条件は、６％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。対照的に、「低いストリンジェンシー」条件下でハイブリダイズする核酸には、はるかに低い配列同一性を有するもの、または核酸の短い部分配列にわたる配列同一性のみを有するものが含まれる。したがって、本開示によって包含される核酸の様々な変異体が、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、６７または６９のうちの少なくとも１つと、実質的にその全長にわたってハイブリダイズできることを、理解されたい。
【０１２６】
キメラＲＳＶ抗原ポリペプチドの産生方法
本明細書中に開示するＦ２ＧＦ１キメラＲＳＶポリペプチドは、組換えタンパク質を発現および精製するための十分に確立された手順を用いて産生する。当業者を導くために十分な手順は、たとえば、上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌの参考文献に見つけることができる。さらなるかつ具体的な詳細は、本明細書以下に提供する。
【０１２７】
（それだけには限定されないが）配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、６７および／または６９によって表される例示的な核酸などの、Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原をコードしている組換え核酸を、ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて、電気穿孔、リポソーム媒介形質移入、リン酸カルシウム沈殿、感染、形質移入などの、様々な周知の手順のうちの任意のものによって、宿主細胞内に導入する。
【０１２８】
したがって、組換えＦ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原をコードしている核酸を含む宿主細胞も、本開示の特徴である。好都合な宿主細胞には、イー・コリなどの原核（すなわち細菌）宿主細胞、ならびに、真菌（たとえば、サッカロマイセス・セレビシエやピキア・パストリスなどの酵母）細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞など）を含めた数々の真核宿主細胞が含まれる。組換えＦ２ＧＦ１核酸は、たとえば、発現ベクターなどのベクターを介して、宿主細胞内に導入する（たとえば、形質導入、形質転換または形質移入する）。上述のように、ベクターは、最も典型的にはプラスミドであるが、そのようなベクターは、たとえば、ウイルス粒子、ファージなどであることもできる。適切な発現宿主の例には、イー・コリ、ストレプトマイセス、およびサルモネラ・チフィムリウムなどの細菌細胞；サッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、およびニューロスポラ・クラッサなどの真菌細胞；ドロソフィラおよびスポドプテラ・フルギペルダなどの昆虫細胞；３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫などの哺乳動物細胞；藻類細胞を含めた植物細胞などが含まれる。
【０１２９】
宿主細胞は、必要に応じて、プロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、または挿入したポリヌクレオチド配列を増幅するために改変した、慣用の栄養素培地中で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、典型的には、発現のために選択された以前に宿主細胞で用いたものであり、当業者に明らかであり、また、たとえば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）動物細胞の培養、基本技術の手引き（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中に引用される参考文献を含めた、本明細書中で引用した参考文献から明らかである。本発明の核酸に対応する発現産物は、植物、酵母、真菌、細菌などの非動物細胞中で産生させることもできる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、細胞培養に関する詳細は、Ｐａｙｎｅ他（１９９２）液体系における植物細胞および組織培養物（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）植物細胞、組織および器官培養（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）；基礎方法のシュプリンガーの実験室手引き（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ならびにＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）微生物培地のハンドブック（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ）（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎに見つけることができる。
【０１３０】
細菌系では、発現した産物に意図する使用に応じて、いくつかの発現ベクターを選択することができる。たとえば、抗体を産生するために大量のポリペプチドまたはその断片が必要な場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指示するベクターを好都合に用いる。そのようなベクターには、それだけには限定されないが、目的のコード配列、たとえば、上述の本発明のポリヌクレオチドを、ベクター内に、アミノ末端の翻訳開始メチオニンおよび続くβ−ガラクトシダーゼの７個の残基の配列とインフレームでライゲーションして、触媒活性のあるβガラクトシダーゼ融合タンパク質を生じることができる、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６４：５５０３〜５５０９）；アミノ末端のメチオニンがヒスチジンタグとインフレームでライゲーションされているｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）などの、多機能イー・コリクローニングおよび発現ベクターが含まれる。
【０１３１】
同様に、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母では、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモーターを含むいくつかのベクターを、所望の発現産物を産生するために使用できる。総説には、Ｂｅｒｇｅｒ、Ａｕｓｕｂｅｌ、および、たとえば、Ｇｒａｎｔ他（１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５１６〜５４４）を参照されたい。哺乳動物宿主細胞では、プラスミドおよびウイルスに基づいた系をどちらも含めた多くの発現系を利用することができる。
【０１３２】
宿主細胞は、所望により、挿入した配列の発現を変調する、または発現されたタンパク質を所望の様式でプロセッシングするその能力について、選択する。そのようなタンパク質の修飾には、それだけには限定されないが、グリコシル化（ならびに、たとえば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化）が含まれる。たとえば、タンパク質の前駆体形態を成熟形態へと切断する（たとえばフューリンプロテアーゼによって）翻訳後プロセッシングを、宿主細胞のコンテキストで所望により行う。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの様々な宿主細胞が、そのような翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的な機構を有しており、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするために選択することができる。
【０１３３】
本明細書中に開示する核酸によってコードされている組換えキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドの長期的な高収率産生には、安定した発現系を典型的には使用する。たとえば、キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドを安定に発現する細胞系を、ウイルス複製起点または内在性発現要素および選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて、宿主細胞内に導入する。ベクターを導入した後、細胞を１〜２日間、強化培地中で増殖させ、その後、これを選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えるためであり、その存在により、導入された配列の発現が成功している細胞の増殖および回収が可能となる。たとえば、安定に形質転換された細胞の耐性の群またはコロニーは、細胞種に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしている核酸で形質転換させた宿主細胞は、所望により、コードされているタンパク質を細胞培養物中で発現させてそれから回収するために適した条件下で、培養する。
【０１３４】
適切な宿主細胞系に形質導入し、宿主細胞を適切な細胞密度まで増殖させた後、適切な手段（たとえば、温度変化または化学誘導）によって選択したプロモーターを誘導し、細胞をさらなる期間の間培養する。その後、分泌されたポリペプチド産物を培地から回収する。あるいは、細胞を遠心分離によって収集し、物理的または化学的手段によって破壊し、生じる粗抽出物をさらなる精製のために保持することができる。タンパク質の発現に用いた真核または微生物細胞は、凍結−解凍のサイクル、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または当業者に周知の他の方法を含めた、任意の好都合な方法によって破壊することができる。
【０１３５】
発現されたキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（たとえば、本明細書中に記載したタグ付け系のうちの任意のものを用いる）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含めた、当分野で周知のいくつかの方法のうちの任意のものによって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。所望に応じて、成熟タンパク質の立体配置を完成させるためにタンパク質の再折り畳み工程を用いることができる。最後に、最終精製工程で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。上述の参考文献に加えて、たとえば、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）タンパク質のバイオ分離（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ他（１９９６）タンパク質方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ  （１９９６）タンパク質プロトコルのハンドブック（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ、ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ（１９９０）タンパク質精製の応用：実用的な手法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、英国Ｏｘｆｏｒｄ；Ｓｃｏｐｅｓ  （１９９３）タンパク質精製：原理および実施（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ；ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ（１９９８）タンパク質精製：原理、高分解能方法および応用（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；ならびにＷａｌｋｅｒ（１９９８）ＣＤ−ＲＯＭ版タンパク質プロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪに記載ものを含めた、様々な精製方法が当分野で周知である。
【０１３６】
特定の例では、核酸を、原核細胞、たとえばイー・コリ細胞中の導入および発現に適したベクター内に導入する。たとえば、Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原をコードしているポリヌクレオチド配列を含む核酸を、ｐＥＴシリーズの発現ベクター（たとえば、ｐＥＴ１９ｂおよびｐＥＴ２１ｄ）などの、様々な市販または独自所有のベクターのうちの任意のものに導入することができる。コード配列の発現はＩＰＴＧによって誘発可能であり、高レベルのタンパク質発現がもたらされる。キメラＲＳＶ抗原をコードしているポリヌクレオチド配列は、ファージＴ７プロモーター下で転写される。熱誘発可能なλｐＬプロモーターを含む、ｐＵＲＶ２２などの代替ベクターも適している。
【０１３７】
発現ベクターを、（たとえば電気穿孔によって）適切な細菌宿主内に導入する。数々の適切なイー・コリ株が利用可能であり、当業者が選択することができる。たとえば、ＲｏｓｅｔｔａおよびＢＬ２１（ＤＥ３）株は、Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原をコードしているポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターの発現に好都合であることが判明している。
【０１３８】
別の例では、キメラＲＳＶ抗原をコードしているポリヌクレオチドを、哺乳動物細胞（たとえばＣＨＯ細胞）内への導入に適したベクター内にクローニングする。この例示的な実施形態では、キメラＲＳＶ抗原をコードしているポリヌクレオチド配列を、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社によって開発されたｐＥＥ１４ベクター内に導入する。キメラポリペプチドは、構成的プロモーターである前初期ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター下で発現される。キメラを発現する安定に形質移入され細胞の選択は、形質移入した細胞がグルタミン源を存在させずに増殖する能力に基づいて行う。ｐＥＥ１４の取り込みが成功した細胞は、ｐＥＥ１４ベクターがＧＳ（グルタミン合成酵素）酵素を発現するため、外因性のグルタミンが存在しない場合でも増殖することができる。選択された細胞はクローニングによって拡大し、キメラポリペプチドの発現について特徴づけることができる。
【０１３９】
別の例では、Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原をコードしているポリヌクレオチド配列は、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて昆虫細胞内に導入する。昆虫細胞に感染することができる組換えバキュロウイルスは、市販のベクター、キットおよび／または系、たとえばＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅのＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ系を用いて作製することができる。手短に述べると、Ｆ２ＧＦ１キメラＲＳＶ抗原をコードしているポリヌクレオチド配列を、ｐＡｃＳＧ２移行ベクター内に挿入する。その後、宿主細胞ＳＦ９（スポドプテラ・フルギペルダ）を、バキュロウイルスオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の直鎖状にしたゲノムＤＮＡを含む、ｐＡｃＳＧ２−キマープラスミドおよびＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄによって同時形質移入する。形質移入の後、ｐＡｃＳＧ２プラスミドおよびバキュロウイルスゲノムの間で相同組換えが起こり、組換えウイルスが生じる。一例では、キメラＲＳＶ抗原は、ポリヘドリンプロモーター（ｐＨ）の調節制御下で発現させる。塩基性（Ｂａ）およびｐ１０プロモーターなどの他のプロモーターを用いて、同様の移行ベクターを生成することができる。同様に、Ｓｆ９と密に関連しているＳＦ２１、およびキャベツのシャクトリムシ、トリコプルシア・ニに由来するＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）細胞系などの別の昆虫細胞を用いることができる。
【０１４０】
形質移入ならびに発現の誘導（選択したプロモーターおよび／もしくはエンハンサーまたは他の調節要素による）の後、発現されたキメラポリペプチドを回収し（たとえば、精製または濃縮）、抗原活性のあるコンホメーションへと折り畳まれていることを確実にするために、再変性させる。ＲＳＶ  Ｆ２ＧＦ１キメラ抗原の濃縮および再変性の例示的な手順は以下のとおりである。
【０１４１】
原核細胞から産生する例示的な手順では、ＲＳＶ  Ｆ２ＧＦ１キメラ抗原は、細菌（たとえばイー・コリ）細胞から産生する。精製を容易にするために、Ｆ２ＧＦ１キメラ抗原はＣ末端またはＮ末端のｈｉｓタグを含む。手短に述べると、イー・コリ細胞ペレットを溶解バッファーに再懸濁させ、細胞を、超音波処理、フレンチプレス、微量流動化装置および／または乳化剤によって破壊する。細胞溶解液を１００００〜２００００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、上清を廃棄する。封入体（ＩＢ）ペレットを洗浄バッファーに再懸濁させ、室温で少なくとも１時間、２２５ＲＰＭの振盪で振盪する。洗浄した溶解物を１００００〜２００００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、上清を廃棄する。洗浄した封入体を可溶化バッファー（２０ｍｌ／ｇのＩＢ）に再懸濁させ、室温で４時間、２２５ＲＰＭの振盪でインキュベーションする。その後、この混合物を２００００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、ペレットを廃棄する。
【０１４２】
可溶化した封入体を、ＩＭＡＣローディングバッファーで事前に平衡化したＩＭＡＣ樹脂（固定金属アフィニティークロマトグラフィー）に載せる。その後、キメラタンパク質を、カラムから、ＩＭＡＣ溶出バッファーで溶出させる。Ｆ２ＧＦ１を含む画分をプールし、プールした画分を、サイズ排除クロマトグラフィー工程のために限外濾過膜で濃縮する。濃縮されたＩＭＡＣプールを、ＳＥＣバッファーで平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーカラムに載せ、キメラタンパク質は同一バッファー中で溶出された。溶出されたＦ２ＧＦ１タンパク質を含む画分を再度プールし、その後、２８０ｎｍの吸光度によって定量し、アリコート分割し、再変性まで−２０℃で凍結した。
【０１４３】
ＲＳＶ  Ｆ２ＧＦ１キメラ抗原の再変性の例示的な手順は以下のとおりである。Ｆ２ＧＦ１タンパク質の濃度を、ＳＥＣバッファーで希釈することによって１ｍｇ／ｍｌにした。タンパク質を、接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて、ラウロイルサルコシン濃度を０．１％まで低下させるために再折り畳み前用バッファー（ｐｒｅ−ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）でダイアフィルトレーションする。再折り畳み前用バッファー中に１ｍｇ／ｍｌのタンパク質を、予冷した再折り畳み用バッファーで迅速に１０倍希釈し、生じた混合物を３０分間、４℃で攪拌し、その後、攪拌せずに終夜、４℃でインキュベーションした。
【０１４４】
続く再変性プロセス中、キメラタンパク質は使用時まで４℃または凍結を維持する。終夜のインキュベーション後、混合物をＴＦＦによって１０×濃縮する。生じた濃縮水の容量を同一のＴＦＦカートリッジで、５〜１０倍容量の１Ｍのアルギニン再折り畳み用バッファーを用いて、ダイアフィルトレーションし、容量を一定に保つ。その後、生じた濃縮水を、５〜１０倍容量の最終３００ｍＭのアルギニン再折り畳み用バッファーでダイアフィルトレーションし、ここでも容量を一定に保つ。その後、濃縮水を２００００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、上清を収集する。タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄのＲＣＤＣアッセイ（変法Ｌｏｗｒｙ比色アッセイ）を用いて決定する。再変性したＦ２ＧＦ１をアリコート分割し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで使用するために−２０℃で保存する。
【０１４５】
表１は、精製および再変性プロセスで使用したバッファーの説明を提供する。
【０１４６】
動物（たとえばヒト）対象に投与するための免疫原性組成物に含めることにやはり適した再変性の代替賦形剤を、以下に詳述する。
【０１４７】
【表１】
2010522540.tif 000002
【０１４８】
免疫原性組成物および方法
また、キメラＲＳＶ  Ｆ２ＧＦ１抗原および医薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む免疫原性組成物も提供する。数々の医薬上許容される希釈剤および担体ならびに／または医薬上許容される賦形剤が当分野で知られており、たとえば、レミントンの医薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルバニア州Ｅａｓｔｏｎ、第１５版（１９７５）に記載されている。
【０１４９】
一般に、希釈剤、担体および／または賦形剤の性質は、用いる特定の投与様式に依存する。たとえば、非経口配合物には、通常、水、生理的生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどの医薬上かつ生理的に許容される液体がビヒクルとして含まれる、注射用の液体が含まれる。特定の配合物（たとえば、散剤形態などの固体組成物）では、液体希釈剤を用いない。そのような配合物では、たとえば、医薬グレードのトレハロース、マンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含めた、無毒性の固体担体を使用することができる。
【０１５０】
したがって、当業者が適切な賦形剤および担体を選択して、選択した投与経路によって対象にデリバリーするために適した配合物を生成することができる。
【０１５１】
具体的な例を上記表１に示す。さらなる賦形剤には、それだけには限定されないが、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ガラス形成ポリオール（ソルビトール、トレハロースなど）Ｎ−ラウロイルサルコシン（たとえばナトリウム塩）、Ｌ−プロリン、非洗剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、トリメチルアミンオキシド、ＫＣｌ、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋（および他の二価陽イオン関連の塩）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスロール、β−メルカプトエタノール、洗剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＮＰ−４０、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、および臭化セチルトリメチルアンモニウム）が含まれる。
【０１５２】
特定の好都合な例では、免疫原性組成物にはアジュバントも含まれる。キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドを含む免疫原性組成物で使用するための適切なアジュバントは、本明細書中に開示するＦ２ＧＦ１抗原と組み合わせて、対象に投与した場合に安全かつ最小限の反応源性であるアジュバントである。
【０１５３】
Ｆ２ＧＦ１キメラ抗原と組み合わせて使用するための１つの適切なアジュバントは、無毒性の細菌リポ多糖誘導体である。適切な無毒性の脂質Ａの誘導体の例は、モノホスホリル脂質Ａ、またはより詳細には３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。３Ｄ−ＭＰＬは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｎ．Ａ．によって商品名ＭＰＬの下で販売されており、本文書全体にわたってＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬと呼ぶ。たとえば、米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６，０３４号および第４，９１２，０９４号を参照されたい。３Ｄ−ＭＰＬは、主に、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を促進する。３Ｄ−ＭＰＬは、ＧＢ２２２０２１１  Ａに開示されている方法に従って生成することができる。化学的には、これは、３、４、５または６本のアシル化された鎖を有する３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。本発明の組成物中では、小粒子の３Ｄ−ＭＰＬを使用することができる。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍのフィルターを通して滅菌濾過できるような粒子径を有する。そのような調製物は、ＷＯ９４／２１２９２に記載されている。
【０１５４】
３Ｄ−ＭＰＬなどの前記リポ多糖は、免疫原性組成物のヒトの１用量あたり１〜５０μｇの量で使用することができる。そのような３Ｄ−ＭＰＬは、約２５μｇ、たとえば２０〜３０μｇ、適切には２１〜２９μｇまたは２２〜２８μｇまたは２３〜２７μｇまたは２４〜２６μｇ、または２５μｇのレベルで使用することができる。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒトの用量は、３Ｄ−ＭＰＬを、約１０μｇ、たとえば５〜１５μｇ、適切には６〜１４μｇ、たとえば７〜１３μｇまたは８〜１２μｇまたは９〜１１μｇ、または１０μｇのレベルで含む。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒトの用量は、３Ｄ−ＭＰＬを、約５μｇ、たとえば１〜９μｇ、または２〜８μｇまたは適切には３〜７μｇまたは４〜６μｇ、または５μｇのレベルで含む。
【０１５５】
他の実施形態では、リポ多糖は、米国特許第６，００５，０９９号およびＥＰ特許第０  ７２９  ４７３  Ｂ１号に記載のように、β（１〜６）グルコサミン二糖であることができる。当業者は、これらの参考文献の教示に基づいて、３Ｄ−ＭＰＬなどの様々なリポ多糖を容易に生成できるであろう。それでもなお、これらの参考文献のそれぞれは、本明細書中に参考として組み込まれている。前述の免疫賦活剤（構造がＬＰＳまたはＭＰＬもしくは３Ｄ−ＭＰＬと類似のもの）に加えて、ＭＰＬの上記構造の一部分であるアシル化された単糖および二糖の誘導体も適切なアジュバントである。他の実施形態では、アジュバントは脂質Ａの合成誘導体であり、その一部は、ＴＬＲ−４作用剤であると説明されており、それだけには限定されないが、以下のものが含まれる。
【０１５６】
ＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシルジハイドロジェンホスフェート）、（ＷＯ９５／１４０２６）
【０１５７】
ＯＭ２９４  ＤＰ（３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（ジハイドロジェンホスフェート）（ＷＯ９９／６４３０１およびＷＯ００／０４６２）
【０１５８】
ＯＭ１９７  ＭＰ−Ａｃ  ＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−ジハイドロジェンホスフェート１０−（６−アミノヘキサノエート）（ＷＯ０１／４６１２７）
【０１５９】
使用できる他のＴＬＲ４リガンドは、ＷＯ９８／５０３９９または米国特許第６，３０３，３４７号に開示されているものなどのアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）（ＡＧＰの調製方法も開示されている）、適切にはＲＣ５２７もしくはＲＣ５２９または米国特許第６，７６４，８４０号に開示されているＡＧＰの医薬上許容される塩である。一部のＡＧＰはＴＬＲ４作用剤であり、一部はＴＬＲ４拮抗剤である。どちらもアジュバントとして有用であると考えられている。
【０１６０】
ＴＬＲ−４を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができる他の適切なＴＬＲ−４リガンド（Ｓａｂｒｏｅ他、ＪＩ、２００３、ページ１６３０〜５）は、たとえば、グラム陰性細菌由来のリポ多糖およびその誘導体、またはその断片、特にＬＰＳの無毒性の誘導体（３Ｄ−ＭＰＬなど）である。他の適切なＴＬＲ作用剤は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５または９０；界面活性物質タンパク質Ａ、ヒアルロナンオリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノーゲンペプチドおよびｂ−デフェンシン−２、ならびにムラミルジペプチド（ＭＤＰ）である。一実施形態では、ＴＬＲ作用剤はＨＳＰ６０、７０または９０である。他の適切なＴＬＲ−４リガンドは、ＷＯ２００３／０１１２２３およびＷＯ２００３／０９９１９５に記載されているものであり、たとえば、ＷＯ２００３／０１１２２３のページ４〜５またはＷＯ２００３／０９９１９５のページ３〜４に開示されている化合物Ｉ、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩ、特に、ＷＯ２００３／０１１２２３にＥＲ８０３０２２、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５７、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０、およびＥＲ８０４７６４として開示されている化合物である。たとえば、１つの適切なＴＬＲ−４リガンドはＥＲ８０４０５７である。
【０１６１】
さらなるＴＬＲ作用剤は、アジュバントとしても有用である。用語「ＴＬＲ作用剤」とは、直接リガンドとしてまたは内因性もしくは外因性のリガンドを生成することによって間接的に、ＴＬＲシグナル伝達経路を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができる薬剤をいう。そのような天然または合成ＴＬＲ作用剤を、代替のまたはさらなるアジュバントとして使用することができる。ＴＬＲのアジュバント受容体としての役割の簡単な総説は、ＫａｉｓｈｏおよびＡｋｉｒａ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１５８９：１〜１３、２００２に提供されている。これらの潜在的なアジュバントには、それだけには限定されないが、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９の作用剤が含まれる。したがって、一実施形態では、アジュバントおよび免疫原性組成物は、ＴＬＲ−１作用剤、ＴＬＲ−２作用剤、ＴＬＲ−３作用剤、ＴＬＲ−４作用剤、ＴＬＲ−５作用剤、ＴＬＲ−６作用剤、ＴＬＲ−７作用剤、ＴＬＲ−８作用剤、ＴＬＲ−９作用剤、またはその組合せからなる群から選択されるアジュバントをさらに含む。
【０１６２】
本発明の一実施形態では、ＴＬＲ−１を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤を使用する。適切には、ＴＬＲ−１を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤は、トリアシル化リポペプチド（ＬＰ）；フェノール可溶性モジュリン；マイコバクテリア・ツベルクローシスＬＰ；細菌リポタンパク質のアセチル化されたアミノ末端を模倣するＳ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ、トリヒドロクロリド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）ＬＰおよびボレリア・バーグドルフェリ由来のＯｓｐＡ  ＬＰから選択される。
【０１６３】
代替実施形態では、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤を使用する。適切には、ＴＬＲ−２を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤は、エム・ツベルクローシス、ビー・バーグドルフェリまたはティー・パリダム由来のリポタンパク質、ペプチドグリカン、細菌リポペプチドのうちの１つまたは複数；ストレプトコッカス・アウレウスを含めた種由来のペプチドグリカン；リポテイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリアのポリン、細菌綿毛、エルシニアの病原性因子、ＣＭＶビリオン、麻疹赤血球凝集素、および酵母由来のザイモサンである。
【０１６４】
代替実施形態では、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤を使用する。適切には、ＴＬＲ−３を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、またはポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）、ウイルス感染症に関連する分子核酸パターンである。
【０１６５】
代替実施形態では、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤を使用する。適切には、ＴＬＲ−５を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤は、細菌フラゲリンである。
【０１６６】
代替実施形態では、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤を使用する。適切には、ＴＬＲ−６を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤は、マイコバクテリアリポタンパク質、ジアシル化するＬＰ、およびフェノール可溶性モジュリンである。さらなるＴＬＲ６作用剤はＷＯ２００３／０４３５７２に記載されている。
【０１６７】
代替実施形態では、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤を使用する。適切には、ＴＬＲ−７を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ロキソリビン、位置Ｎ７およびＣ８のグアノシン類似体、もしくはイミダゾキノリン化合物、またはその誘導体である。一実施形態では、ＴＬＲ作用剤はイミキモドである。さらなるＴＬＲ７作用剤はＷＯ２００２／０８５９０５に記載されている。
【０１６８】
代替実施形態では、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤を使用する。適切には、ＴＬＲ−８を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子、たとえばレシキモド（Ｒ８４８）であり、レシキモドはＴＬＲ−７による認識も可能である。使用できる他のＴＬＲ−８作用剤には、ＷＯ２００４／０７１４５９に記載のものが含まれる。
【０１６９】
代替実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤を使用する。一実施形態では、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤は、ＨＳＰ９０である。あるいは、ＴＬＲ−９を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるＴＬＲ作用剤は、細菌またはウイルスＤＮＡ、メチル化されていないＣｐＧヌクレオチドを含むＤＮＡ、特に、ＣｐＧモチーフとして知られる配列構成である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、優位にＴｈ１応答を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、たとえば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および第５，８５６，４６２号に記載されている。適切には、ＣｐＧヌクレオチドはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。本発明の免疫原性組成物で使用するための適切なオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、所望により、少なくとも３つ、適切には少なくとも６つ以上のヌクレオチドによって分離された２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含むものである。ＣｐＧモチーフとは、シトシンヌクレオチドに続いてグアニンヌクレオチドである。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチド内の間のヌクレオチドはホスホロジチオエート、または適切にはホスホロチオエート結合であるが、リン酸ジエステルおよび他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内にある。また、本発明の範囲には、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを生成する方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、第５，２７８，３０２号およびＷＯ９５／２６２０４に記載されている。
【０１７０】
キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドを有する免疫原性組成物中で、たとえば、それ自体でまたは３Ｄ−ＭＰＬもしくは本明細書中に記載の別のアジュバントと組み合わせて使用できる他のアジュバントは、ＱＳ２１などのサポニンである。
【０１７１】
サポニンは、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，ＭおよびＷａｇｎｅｒ  Ｈに教示されている。（１９９６。サポニンの生物活性および薬理活性の総説（Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓａｐｏｎｉｎｓ）。Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、ページ３６３〜３８６）。サポニンは、植物および海生動物の界に広く分布されている、ステロイドまたはトリテルペングリコシドである。サポニンは、水中でコロイド状溶液を形成し、振盪した際に泡立ち、コレステロールを沈殿させることが知られている。サポニンが細胞膜の付近にある場合、これらは膜中に孔様構造を作製し、それにより膜の破裂が引き起こされる。赤血球の溶血がこの現象の例であり、これは特定のサポニンの特性であるがすべてのサポニンの特性ではない。
【０１７２】
サポニンは、全身投与のためのワクチンのアジュバントとして知られている。このアジュバントおよび個々のサポニンの溶血活性は、当分野で大規模に研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−ＤｕｂｏｉｓおよびＷａｇｎｅｒ、上記）。たとえば、Ｑｕｉｌ  Ａ（南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来）、およびその画分は、ＵＳ５，０５７，５４０および「ワクチンアジュバントとしてのサポニン（Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ）」、Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ、１９９６、１２（１〜２）：１〜５５；およびＥＰ０  ３６２  ２７９  Ｂ１に記載されている。免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる、Ｑｕｉｌ  Ａの画分を含む粒子状構造は溶血性であり、ワクチンの製造に使用されている（Ｍｏｒｅｉｎ，Ｂ．、ＥＰ０  １０９  ９４２  Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１；ＷＯ９６／３３７３９）。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ  ＡのＨＰＬＣ精製した画分）は強力な全身性アジュバントとして記載されており、その生成方法は、本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ０  ３６２  ２７９  Ｂ１に開示されている。全身性ワクチン接種の研究で使用されている他のサポニンには、ジプソフィラおよびサポナリアなどの他の植物種に由来するものが含まれる（Ｂｏｍｆｏｒｄ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０（９）：５７２〜５７７、１９９２）。ＱＳ２１は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する、Ｈｐｌｃ精製した無毒性の画分である。ＱＳ２１を生成する方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。ＱＳ２１を含む非反応源性アジュバント配合物は、ＷＯ９６／３３７３９に記載されている。前述の参考文献は、本明細書中に参考として組み込まれている。ＱＳ２１などの前記免疫学的に活性のあるサポニンは、免疫原性組成物のヒトの１用量あたり１〜５０μｇの量で使用することができる。有利には、ＱＳ２１は、約２５μｇ、たとえば２０〜３０μｇ、適切には２１〜２９μｇまたは２２〜２８μｇまたは２３〜２７μｇまたは２４〜２６μｇまたは２５μｇのレベルで使用する。別の実施形態では、免疫原性組成物のヒトの用量は、ＱＳ２１を、約１０μｇ、たとえば５〜１５μｇ、適切には６〜１４μｇ、たとえば７〜１３μｇまたは８〜１２μｇまたは９〜１１μｇまたは１０μｇのレベルで含む。さらなる実施形態では、免疫原性組成物のヒトの用量は、ＱＳ２１を、約５μｇ、たとえば１〜９μｇまたは２〜８μｇまたは適切には３〜７μｇまたは４〜６μｇまたは５μｇのレベルで含む。そのような、ＱＳ２１およびコレステロールを含む配合物は、抗原と一緒に配合した場合に、Ｔｈ１を刺激する成功したアジュバントであることが示されている。したがって、たとえば、キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、ＱＳ２１およびコレステロールの組合せを含むアジュバントを有する免疫原性組成物で好都合に使用することができる。
【０１７３】
所望により、アジュバントは、アルミニウムまたはカルシウム塩などの鉱物塩、特に、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムを含むことができる。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬをアルミニウム塩（たとえば、水酸化アルミニウムまたは「ミョウバン」）と組み合わせて含むアジュバントは、ヒト対象に投与するためのキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドを含む免疫原性組成物中に配合するために適している。
【０１７４】
キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドを用いた配合物中で使用するための、Ｔｈ１に偏らせる適切なアジュバントの別のクラスは、ＯＭＰ系の免疫賦活組成物を含む。ＯＭＰ系の免疫賦活組成物は、たとえば鼻腔内投与用の粘膜アジュバントとして特に適している。ＯＭＰ系の免疫賦活組成物は、それだけには限定されないがナイセリア種などのグラム陰性細菌に由来する外膜タンパク質（ＯＭＰ、一部のポリンを含む）の調製物の属であり（たとえば、Ｌｏｗｅｌｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６７：６５８、１９８８；Ｌｏｗｅｌｌ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：８００、１９８８；Ｌｙｎｃｈ他、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、４５：１０４、１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ、「新生代ワクチン（Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」第２版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ、ページ１９３、１９９７；米国特許第５，７２６，２９２号；米国特許第４，７０７，５４３号参照）、これらは担体として、または細菌もしくはウイルス抗原などの免疫原の組成物中で有用である。一部のＯＭＰ系の免疫賦活組成物は、「プロテオソーム」と呼ぶことができ、これらは疎水性かつヒトでの使用に安全である。プロテオソームは、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍの小胞または小胞様ＯＭＰクラスターへと自己アセンブルし、タンパク質抗原（Ａｇ）、特に疎水性部分を有する抗原を非共有的に取り込む、それと配位、会合（たとえば、静電気的もしくは疎水的に）、または他の様式で協同する能力を有する。小胞、または１つもしくは複数のＯＭＰの複数分子膜状構造もしくは溶融した球状様ＯＭＰ組成物を含めた小胞様形態の外膜タンパク質成分をもたらす、任意の調製方法が、プロテオソームの定義内に含まれる。プロテオソームは、たとえば、当分野に記載のように調製することができる（たとえば、米国特許第５，７２６，２９２号または米国特許第５，９８５，２８４号参照）。プロテオソームはまた、ＯＭＰポリンを生成するために使用した細菌（たとえばナイセリア種）に由来する内在性リポ多糖またはリポオリゴ糖（それぞれＬＰＳまたはＬＯＳ）を含むことができ、これは一般に、全ＯＭＰ調製物の２％未満である。
【０１７５】
プロテオソームは、ナイセリア・メニンジティディス由来の化学抽出した外膜タンパク質（ＯＭＰ）から主に構成され（ほとんどがポリンＡおよびＢならびにクラス４ＯＭＰ）、洗剤によって溶液中に維持される（Ｌｏｗｅｌｌ  ＧＨ。改善した経鼻、経口、または注射用ワクチンのためのプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｎａｓａｌ，Ｏｒａｌ，ｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）。Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ、Ｗｏｏｄｒｏｗ  ＧＣ、Ｋａｐｅｒ  ＪＢ、Ｃｏｂｏｎ  ＧＳ編、新世代ワクチン（Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）。Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９９７；１９３〜２０６）。プロテオソームは、本明細書中に開示するキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドを含めた、ウイルス源に由来する精製または組換えタンパク質などの様々な抗原を用いて、たとえば、ダイアフィルトレーションまたは従来の透析方法によって、配合することができる。洗剤を徐々に除去することにより、直径およそ１００〜２００ｎｍの粒子状の疎水性複合体の形成が可能となる（Ｌｏｗｅｌｌ  ＧＨ。改善した経鼻、経口、または注射用ワクチンのためのプロテオソーム（Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｎａｓａｌ，Ｏｒａｌ，ｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）。Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ、Ｗｏｏｄｒｏｗ  ＧＣ、Ｋａｐｅｒ  ＪＢ、Ｃｏｂｏｎ  ＧＳ編、新世代ワクチン（Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）。Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９９７；１９３〜２０６）。
【０１７６】
本明細書中で使用する「プロテオソーム：ＬＰＳまたはプロトリン」とは、たとえば外因的に加えることによって少なくとも１種類のリポ多糖と混合されて、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物を提供する、プロテオソームの調製物をいう（これは免疫賦活組成物として機能することができる）。したがって、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物は、プロトリンの塩基性成分のうちの２つからなることができ、これは（１）ナイセリア・メニンジティディスなどのグラム陰性細菌から調製したプロテオソームの外膜タンパク質の調製物（たとえばＰｒｏｊｕｖａｎｔ）、および（２）１つまたは複数のリポ糖の調製物を含む。リポオリゴ糖は内在性であることができるか（たとえば、ＯＭＰプロテオソーム調製物に天然に含まれる）、外因的に調製したリポオリゴ糖由来のＯＭＰ調製物（たとえば、ＯＭＰ調製物とは異なる培養物もしくは微生物から調製）と混合もしくは合わせることができるか、またはその組合せであることができる。そのような外因的に加えたＬＰＳは、ＯＭＰ調製物を調製したものと同一のグラム陰性細菌に由来するか、異なるグラム陰性細菌に由来することができる。プロトリンには、所望により、脂質、糖脂質、糖タンパク質、小分子など、およびその組合せが含まれることも理解されよう。プロトリンは、たとえば、米国特許出願第２００３／００４４４２５号に記載のように調製することができる。
【０１７７】
また、本明細書中に前述したものなどの様々なアジュバントの組合せを、キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドを用いた組成物に使用することもできる。たとえば、既に言及したように、ＱＳ２１を３Ｄ−ＭＰＬと一緒に配合することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比は、典型的には、１：１０〜１０：１の桁、たとえば１：５〜５：１、多くの場合は実質的に１：１である。典型的には、比は、２．５：１〜１：１の３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１の範囲である。別の組合せアジュバント配合物は、３Ｄ−ＭＰＬおよび水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩を含む。組み合わせて配合した場合、この組合せは、抗原に特異的なＴｈ１免疫応答を増強させることができる。
【０１７８】
一部の例では、アジュバント配合物には、水中油乳剤、またはカルシウムもしくはアルミニウム塩、たとえば、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウムなどの鉱物塩が含まれる。
【０１７９】
水中油乳剤の一例は、スクワレンなどの代謝可能な油、α−トコフェロールなどのトコール、およびポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０などの界面活性物質を、水性担体中で含み、かつ、さらなる免疫賦活剤を全く含まない、具体的には、これは無毒性の脂質Ａ誘導体（３Ｄ−ＭＰＬなど）またはサポニン（ＱＳ２１など）を含まない。水性担体は、たとえば、リン酸緩衝生理食塩水であることができる。さらに、水中油乳剤は、ｓｐａｎ８５および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含むことができる。
【０１８０】
本発明の別の実施形態では、抗原または抗原組成物を含むワクチン組成物、ならびに水中油乳剤および所望により１つまたは複数のさらなる免疫賦活剤を含むアジュバント組成物を提供し、前記水中油乳剤は、０．５〜１０ｍｇの代謝可能な油（適切にはスクワレン）、０．５〜１１ｍｇのトコール（適切にはα−トコフェロール）および０．４〜４ｍｇの乳化剤を含む。
【０１８１】
具体的な一実施形態では、アジュバント配合物は、水中油乳剤などの乳剤の形態で調製した３Ｄ−ＭＰＬを含む。一部の場合では、乳剤は、ＷＯ９４／２１２９２に開示されているように、直径が０．２μｍ未満の小さな粒子径を有する。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬの粒子の粒子は、０．２２ミクロンの膜を通して滅菌濾過されるほど十分に小さい場合がある（欧州特許第０  ６８９  ４５４号に記載）。あるいは、３Ｄ−ＭＰＬは、リポソーム配合物中で調製することができる。所望により、３Ｄ−ＭＰＬ（またはその誘導体）を含むアジュバントには、さらなる免疫賦活成分も含まれる。
【０１８２】
たとえば、キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチド抗原を有する免疫原性組成物を、乳児に投与するために配合する場合、アジュバントの用量は、乳児対象において有効かつ比較的非反応源性であるように決定する。一般に、乳児配合物中のアジュバントの用量は、成人（たとえば６５歳以上の成人）に投与するために設計された配合物中で使用されるものよりも低い。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬの量は、典型的には、１用量あたり１μｇ〜２００μｇ、たとえば１０〜１００μｇ、または１０μｇ〜５０μｇの範囲である。乳児用量は、典型的には、この範囲の下端、たとえば、約１μｇ〜約５０μｇ、たとえば約２μｇ、または約５μｇ、または約１０μｇから約２５μｇまで、または約５０μｇまでである。典型的には、ＱＳ２１を配合物中で使用する場合、範囲は比較可能である（かつ上記指示した比に従う）。成人および高齢者集団では、配合物には、典型的には、アジュバント成分が、乳児配合物中に典型的に見つかるよりも多く含まれる。水中油乳剤を用いた具体的な配合物では、そのような乳剤は、さらなる成分、たとえば、コレステロール、スクワレン、αトコフェロール、および／またはｔｗｅｅｎ８０もしくはｓｐａｎ８５などの洗剤を含むことができる。例示的な配合物では、そのような成分は、以下の量、すなわち、約１〜５０ｍｇのコレステロール、２〜１０％のスクワレン、２〜１０％のαトコフェロールおよび０．３〜３％のｔｗｅｅｎ８０で存在することができる。典型的には、スクワレン：αトコフェロールの比は、より安定した乳剤をもたらすため、１以下である。一部の場合では、配合物は安定化剤も含むことができる。ミョウバンが、たとえば３Ｄ−ＭＰＬと組み合わせて存在する場合は、その量は、典型的には、１用量あたり約１００μｇ〜１ｍｇ、たとえば約１００μｇ、または約２００μｇから約７５０μｇまで、たとえば約５００μｇである。
【０１８３】
免疫原性組成物は、典型的には、免疫保護的量（またはその部分的用量）の抗原を含み、慣用技術によって調製することができる。ヒト対象に投与するためのものを含めた免疫原性組成物の調製は、一般に、医薬生命工学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第６１巻、ワクチンの設計−サブユニットおよびアジュバントの手法（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｒｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５。ワクチンの新しい動向および開発（Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、Ｖｏｌｌｅｒ他編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ、米国メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９７８に記載されている。リポソーム内へのカプセル封入は、たとえば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。タンパク質の巨大分子へのコンジュゲーションは、たとえば、Ｌｉｋｈｉｔｅ、米国特許第４，３７２，９４５号およびＡｒｍｏｒ他、米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１８４】
典型的には、免疫原性組成物のそれぞれの用量中のタンパク質の量は、典型的な対象において顕著な有害な副作用なしに免疫保護的応答を誘導する量として選択する。このコンテキストにおける免疫保護的は、感染症に対する完全な保護を必ずしも意味せず、これは、症状または疾患、特にウイルスに関連する重篤な疾患に対する保護を意味する。抗原の量は、用いる具体的な免疫原に依存して変化する場合がある。一般に、それぞれのヒトの用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、たとえば約１μｇ〜約１００μｇ、たとえば約１μｇ〜約５０μｇ、たとえば約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、または約５０μｇを含むことが予測される。免疫原性組成物中で利用する量は、対象集団（たとえば、乳児または高齢者）に基づいて選択する。特定の組成物の最適な量は、対象における抗体力価および他の応答の観察を含む標準の研究によって確認することができる。最初のワクチン接種後、対象は約４週間後に免疫追加を受けることができる。
【実施例】
【０１８５】
実施例１：例示的なキメラＲＳＶ  Ｆ２ＧＦ１ポリペプチド抗原
８個の例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドを、３個の異なる変異体ドメインの組合せに基づいて構築した。これら８個の変異体Ｆ２ＧＦ１ポリペプチドを図２に例示し、以下に詳述する。
【０１８６】
Ｆ２ＧＦ１−１（Ｐ３−１）。例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、６０３個のアミノ酸の長さであり、Ｎ末端からＣ末端の配向で、Ｆ２ドメインのアミノ酸２４〜１３０；位置１９１でアスパラギンの代わりにアラニンの単一のアミノ酸置換を有する、Ｇタンパク質変異体アミノ酸１２８〜２２９；およびＦ１ドメインのアミノ酸１６１〜５２４を含む。それぞれのセグメントの間（Ｆ２−ＧおよびＧ−Ｆ１）には、２個のグリシン残基をコードしている６個のヌクレオチドのリンカーが導入されている。
【０１８７】
Ｆ２ＧＦ１−２（Ｐ３−２）。例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、５５９個のアミノ酸の長さであり、Ｎ末端からＣ末端の配向で、Ｆ２ドメインのアミノ酸２４〜１０７；位置１９１でアスパラギンの代わりにアラニンの単一のアミノ酸置換を有する、Ｇタンパク質変異体アミノ酸１４９〜２２９；およびＦ２ドメインのアミノ酸１６１〜５２４を含む。それぞれのセグメントの間（Ｆ２−ＧおよびＧ−Ｆ１）には、２個のグリシン残基をコードしている６個のヌクレオチドのリンカーが導入されている。内部転写開始は、５５９個のアミノ酸の完全長産物の産生を最適化するために改変されている。
【０１８８】
Ｆ２ＧＦ１−３（Ｐ３−３）。例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、５８０個のアミノ酸の長さであり、Ｎ末端からＣ末端の配向で、Ｆ２ドメインのアミノ酸２４〜１０７；位置１９１でアスパラギンの代わりにアラニンの単一のアミノ酸置換を有する、Ｇタンパク質変異体のアミノ酸１２９〜２２９；およびＦ２ドメインのアミノ酸１６１〜５２４を含む。それぞれのセグメントの間（Ｆ２−ＧおよびＧ−Ｆ１）には、２個のグリシン残基をコードしている６個のヌクレオチドのリンカーが導入されている。
【０１８９】
Ｆ２ＧＦ１−４（Ｐ３−４）。例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、５８２個のアミノ酸の長さであり、Ｎ末端からＣ末端の配向で、Ｆ２ドメインのアミノ酸２４〜１３０；位置１９１でアスパラギンの代わりにアラニンの単一のアミノ酸置換を有する、Ｇタンパク質変異体のアミノ酸１４９〜２２９；およびＦ２ドメインのアミノ酸１６１〜５２４を含む。それぞれのセグメントの間（Ｆ２−ＧおよびＧ−Ｆ１）には、２個のグリシン残基をコードしている６個のヌクレオチドのリンカーが導入されている。
【０１９０】
Ｆ２ＧＦ１−５（Ｐ３−５）。例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、Ｇポリペプチドには位置１９１で天然に存在するアスパラギンを含む以外は、Ｐ３−１と類似している。内部転写開始は、６０３個のアミノ酸の完全長産物の産生を最適化するために改変されている。
【０１９１】
Ｆ２ＧＦ１−６（Ｐ３−６）。例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、Ｇポリペプチドには位置１９１で天然に存在するアスパラギンを含む以外は、Ｐ３−２と類似している。
【０１９２】
Ｆ２ＧＦ１−７（Ｐ３−７）。例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、Ｇポリペプチドには位置１９１で天然に存在するアスパラギンを含む以外は、Ｐ３−３と類似している。
【０１９３】
Ｆ２ＧＦ１−８（Ｐ３−８）。例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、Ｇポリペプチドには位置１９１で天然に存在するアスパラギンを含む以外は、Ｐ３−４と類似している。
【０１９４】
例示的な真核Ｆ２ＧＦ１ポリペプチド。例示的な真核キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、設計が、原核発現について上記設計したＦ２ＧＦ１−２およびＦ２ＧＦ１−６構築物と類似するように生成した。上述の変異体のうちの任意のものは、本明細書中に記載の真核ベクターのコンテキスト中でも生成できることを理解されたい。真核の変形はＦ０ネイティブシグナル配列を含む一方で、上述の原核構築物は分泌シグナルを保有しない。シグナル配列の取り込みはグリコシル化などの翻訳後修飾を増強させる。例示的な実施形態では、一方または双方のフューリン認識モチーフを除去する。さらに、ＧおよびＦ１の境界は、上述の原核構築物の境界とわずかに異なる。Ｇペプチドドメインは、原核の変形のアミノ酸１４９〜２２９の代わりにアミノ酸１５２〜２２９を含み、Ｆ１ドメインは、原核の変形中に存在する１６１〜５２４の代わりにアミノ酸１５１〜５２４を含む。したがって、この例示的な真核キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドは、以下の配列を含む。Ｎ末端から、キメラポリペプチドは、Ｆ０ポリペプチドのアミノ酸１〜１０９を含む（シグナルペプチド、Ｆ２ドメインおよび第１のフューリン切断モチーフを含む）。アミノ酸１１０にグリシンリンカーが存在し、次いで、Ｇタンパク質のアミノ酸１５２〜２２９（天然に存在するもの、または位置１９１でアスパラギンの代わりにアラニンの置換を含む）位置１１１〜１８８に存在する。位置１８９〜５６２のＧタンパク質ドメインに次いで、Ｆ１ドメインのアミノ酸１５１〜５２４が存在する。したがって、この変異体では、ネイティブｐｅｐ２７、融合ペプチドおよび一方または双方のフューリン認識モチーフが、Ｇタンパク質ドメインによって置き換えられている。
【０１９５】
この例示的な組換えタンパク質は、ＧＳ発現系を用いて哺乳動物チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させるように設計されている。グルタミンを含まない培地中で増殖させたＣＨＯ細胞は、最適な増殖のために外来のグルタミンを必要とする。ＣＨＯ細胞を、キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むｐＥＥ１４ベクターで形質移入したあと、この系は、ｐＥＥ１４ベクターによってグルタミン合成酵素の発現のため、代謝欠乏により安定したクローンの選択を可能にする。ここに記載する構築物はＣＨＯ細胞中で発現させるために作製したが、これらの構築物は、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いた発現用にも同様に作製することができる。ＣＨＯ用に作製した構築物（コード領域）は、ＢＥＶＳでのより良好な翻訳効率のためにコドンを最適化したが、アミノ酸配列はそのＣＨＯ相同体と同じままに保った。ＢＥＶＳでは、ＲＳＶの最適化された遺伝子をシャトルベクターｐＡｃＳＧ２内にクローニングする。このプラスミドは、直鎖状にしたバキュロウイルスのゲノム配列で、昆虫細胞を同時形質移入するために単独で用いる。特異的な組換え現象が細胞内で起こって、組換えバキュロウイルスが生成される。感染プロセス中、目的の遺伝子はポリヘドリンプロモーター下で、最晩期段階で発現される。
【０１９６】
実施例２：キメラＦ２ＧＦ１ポリペプチドによるヒト血清中の中和阻害
ボランティアドナーから得たヒト血清を、ＥＬＩＳＡによってＲＳＶ  Ａに対する反応性についてスクリーニングし、中和阻害（ＮＩ）アッセイにおいて、事前のＲＳＶ中和潜在性滴定に基づいた関連する希釈率で使用した。血清を、例示的なキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチド、Ｐ３−１、Ｐ３−２、Ｐ３−３、Ｐ３−４またはキメラＦＧ抗原と、０、２、１０および２５μｇ／ｍｌの濃度で混合し、１．５〜２時間、３７℃でインキュベーションした。丸底の９６ウェルプレートで、血清およびタンパク質を固定濃度のＲＳＶ  Ａと混合し、２０分間、３３℃でインキュベーションした。
【０１９７】
その後、血清−阻害剤−ウイルスの混合物を、ベロ細胞を事前に接種した平底の９６ウェルプレートに入れ、５〜６日間、３３℃で、５％のＣＯ２と共に、ＮＩ力価を検出するための免疫蛍光アッセイまでさらにインキュベーションした。
【０１９８】
Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ方法を用いて力価を計算し、以下の式に従ってＮＩの割合を計算した：
（２５μｇ／ｍｌの阻害剤のＮＩ力価−０μｇ／ｍｌの阻害剤のＮＩ力価）÷０μｇ／ｍｌの阻害剤のＮＩ力価×１００。
【０１９９】
図６に示す例示的な結果は、試験したドナーの１１／１４人でｐｒｅＦのＮＩがＦＧよりも優れており、残りの３人のドナーでは同等であったことが実証された。
【０２００】
実施例３：キメラＦ２ＧＦ１はＲＳＶを用いたチャレンジに対して保護する
マウスを、リポソーム配合物中のＦ２ＧＦ１ポリペプチドを含む免疫原性組成物ならびにＭＰＬおよびＱＳ２１を含むアジュバントで免疫化した。マウスのグループを、２週間の間隔で３回、２μｇのキメラＦ２ＧＦ１ポリペプチド（Ｐ３−２、Ｐ３−３、Ｐ３−６およびＰ３−７）で免疫化し、３回目の筋肉内注射の３週間後にチャレンジした。感染は、チャレンジの４日後に肺のホモジネート中に存在する生ウイルスを滴定することによって評価した。
【０２０１】
図７に示すように、３つの用量の２μｇのＦ２ＧＦ１抗原を含む免疫原性組成物が、アジュバントと組み合わせて、アジュバントのみを受けた対照マウスと比較して、ＲＳＶチャレンジに対する有意な保護を誘発する。
【０２０２】
実施例４：キメラＦ２ＧＦ１抗原を用いた免疫化後の中和抗体の産生。
上述のように、マウスを、２μｇのＦ２ＧＦ１（ｒＰ３−２、ｒＰ３−３、ｒＰ３−６およびｒＰ３−７）で、２週間の間隔で３回免疫化し、３回目の筋肉内注射の３週間後にチャレンジした。血清をチャレンジの直前に採取して、ＲＳＶに特異的な中和抗体の産生を定量した。
【０２０３】
免疫化したマウスの血清を段階希釈し、固定量のＲＳＶの存在下に置いて、抗ＲＳＶ抗体の中和活性を評価した。中和抗体の力価は、Ｆｉｎｎｅｙによって改変されたＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ方法を用いて計算した。結果（表２および図８に例示）により、ｒＰ３−３およびｒＰ３−７で免疫化した動物の血清中でＲＳＶに対するより優れた中和抗体が検出されたことが実証された。
【０２０４】
【表２】
2010522540.tif 000003
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2010522540.tif 000010
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図５Ａ】
2010522540.tif 000019
【図５Ｂ】
2010522540.tif 000020
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
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【図５Ｐ】
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【図５Ｑ】
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【図５Ｒ】
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【図５Ｓ】
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【図５Ｔ】
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【図５Ｕ】
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【図５Ｖ】
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【図５Ｗ】
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【図５Ｘ】
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【図５Ｚ】
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【図５ＡＡ】
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【図５ＢＢ】
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【図５ＣＣ】
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【図５ＤＤ】
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【図５ＥＥ】
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【図５ＦＦ】
2010522540.tif 000049
【図５ＧＧ】
2010522540.tif 000050
【図５ＨＨ】
2010522540.tif 000051
【図５ＩＩ】
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【図５ＪＪ】
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【図５ＫＫ】
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【図５ＬＬ】
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【図５ＭＭ】
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【図５ＮＮ】
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【図５ＯＯ】
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【図５ＰＰ】
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【図５ＱＱ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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