(57)【要約】マクロラクタムは、置換開始ユニットとして芳香族アミノ酸を、天然の開始ユニット3-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸の生合成のための酵素をコードする遺伝子クラスターが欠失している、ゲルダナマイシン-産生微生物ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスgeldanus変種 NRRL 3602の変異株に供給することにより製造される。
2010516282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
【化１】
2010516282.tif 000036
［式中、
XはH、Cl、F、またはOMeであり;
R1、R2、およびR3は独立してHまたはOHであり;および、
R4およびR5は各々Hであるか、または合わさって結合を形成するが;
但し、(i)R1、R2、およびR3のうち少なくとも１つはHであり、(ii)部分：
【化２】
2010516282.tif 000037
は、
【化３】
2010516282.tif 000038
以外である］
により表される構造を有する化合物。
【請求項２】
式I-a:
【化４】
2010516282.tif 000039
により表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式I-b:
【化５】
2010516282.tif 000040
により表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
XがClまたはFである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
XがClまたはFである、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
式I-aの部分：
【化６】
2010516282.tif 000041
が、
【化７】
2010516282.tif 000042
からなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
式III-a:
【化８】
2010516282.tif 000043
により表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
式III-d：
【化９】
2010516282.tif 000044
により表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
式IV-a、IV-b、またはIV-c:
【化１０】
2010516282.tif 000045
により表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
式I-c：
【化１１】
2010516282.tif 000046
により表される構造を有する化合物の製造方法であって、工程：
(a)式IIまたはII-a：
【化１２】
2010516282.tif 000047
により表される構造を有する化合物を、3-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸の産生能力はないがゲルダナマイシンの合成のための無傷の遺伝子クラスターを有するストレプトマイセス・ハイグロスコピカスgeldanus変種 NRRL 3602株の培地に添加すること、および、
(b)式I-cにより表される構造を有する化合物を産生する条件下で該培地を発酵させることを含み、
式中、
XはH、Cl、F、またはOMeであり;
R6、-R7、およびR8は独立してHまたはOHであり;そして、
R9およびR10は各々Hであるか、または合わさって結合を形成するが;
但し、R6、-R7、およびR8の少なくとも１つはHである、
該製造方法。
【請求項１１】
式IIまたはII-aにより表される構造を有する化合物が、
【化１３】
2010516282.tif 000048
からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程(a)における化合物が、式IIにより表される構造を有し、該構造は、
【化１４】
2010516282.tif 000049
である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程(a)における化合物が、式IIで表される構造を有し、XがFまたはClである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
該ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスgeldanus変種 NRRL 3602株がK554-161株である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
該培地の発酵が吸収性樹脂の存在下で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
過剰増殖性疾患を患っている患者に、治療上有効な量の請求項１に記載の化合物を投与することを含む、該疾病を患っている患者における過剰増殖性疾患の治療方法。
【請求項１７】
該過剰増殖性疾患がNAD(P)H:キノン酸化還元酵素1の活性が欠乏した細胞により確認される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該過剰増殖性疾患が乳癌、卵巣癌、白血病、結腸癌、または肺癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
該化合物が、式III-a:
【化１５】
2010516282.tif 000050
により表される構造を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該化合物が、式III-d:
【化１６】
2010516282.tif 000051
により表される構造を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の化合物および医薬的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項２２】
該化合物が、式III-a:
【化１７】
2010516282.tif 000052
により表される構造を有する、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
該化合物が、式III-d:
【化１８】
2010516282.tif 000053
により表される構造を有する、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
標的細胞を有効な量の請求項１に記載の化合物と接触させることを含む、標的細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２５】
標的細胞がNAD(P)H:キノン酸化還元酵素1活性欠乏である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
標的細胞が乳癌、卵巣癌、白血病、結腸癌、または肺癌の細胞である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍特性を有するマクロラクタム、およびその製造および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により授与された付与番号5 R44 CA 096262-03の下、アメリカ合衆国政府の支援により達成された。アメリカ合衆国政府は、本発明において確かな権利を有する。
【０００３】
ゲルダナマイシンは、そのメンバーがベンゾキノン核、フェノール核またはヒドロキノン核において互いの２つのメタ位に架かるマクロラクタム環を特徴とする、アンサマイシン天然物ファミリーに属する。該アンサマイシンには、ゲルダナマイシンに加えて、マクベシン、ハービマイシン、TAN-420、およびレブラスタチンが含まれる。
【化１】
2010516282.tif 000003
【０００４】
ゲルダナマイシンおよびその誘導体は、アンサマイシンの中で最も広く研究されているものである。ゲルダナマイシンは、当初は抗生物質活性のスクリーニングの結果として同定されたけれども、現在では抗癌剤としてのその能力に関心が持たれている。それは、熱ショックタンパク質-90(「Hsp90」)、多くの「クライアントタンパク質」のフォールディングおよび活性化に関与するシャペロンタンパク質（シグナル伝達、細胞周期の制御および転写制御に関与する主要なタンパク質が含まれる）のインヒビターである。インヒビターがHsp90へ結合することにより、クライアントタンパク質とHsp90の相互作用を妨害し、結果的に機能の損失またはプロテアソーム-媒介分解に対する感受性を伴って、クライアントタンパク質が正確にフォールドされるのを阻止する。Hsp90クライアントタンパク質として、癌に関わる多くの変異タンパク質または過剰発現タンパク質（例えばp53変異体、Bcr-Ablキナーゼ、Raf-1キナーゼ、Aktキナーゼ、Npm-Alkキナーゼ、Cdk4、Cdk6、Wee1、HER2/Neu(ErbB2)、およびHIF-1α）がある。多数の発癌性クライアントタンパク質を同時に標的とすることができる可能性があることから、抗癌剤としてのHsp90インヒビターの開発に大きな関心がもたれている。例えば、非特許文献１を参照。
【０００５】
ゲルダナマイシンは抗癌剤としての開発が検討されたが、その肝毒性および生物学的利用能の乏しさから、臨床候補としては断念された。それでもなお、Hsp90阻害活性を有するが医薬的特性の範囲を改善したゲルダナマイシン誘導体の開発に対する関心が依然として残っている。ゲルダナマイシンのC17は、そのメトキシ基が求核試薬により容易に置換され、17-置換-17-デメトキシゲルダナマイシンの簡便な合成経路を供することから、化学的に言えば、ゲルダナマイシン誘導体の合成における魅力的な焦点である。構造活性相関 (「SAR」)研究により、化学的および立体的に多様な17-置換体が、抗腫瘍活性を破壊されることなく誘導され得ることが示されている。例えば、Sasaki et al.の特許文献１(1981年) (以降「Sasaki」); Schnur et al.の特許文献２(1999年); 非特許文献２; 非特許文献３;およびSanti et al.の特許文献３(2005年)を参照; その開示は引用により援用される。そのSAR推論は、17-置換体が結合ポケットから溶媒の方に突き出ることを示している、Hsp90およびゲルダナマイシン誘導体間の複合体のX線結晶共構造（X-ray crystal co-structure）により裏付けられる(非特許文献４)。最もよく知られた17-置換ゲルダナマイシン誘導体は17-アリルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン(17-AAGまたはタネスピマイシン（tanespimycin）、上記のSasakiとしても知られる)および17-(2-ジメチルアミノエチル)アミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン(17-DMAGまたはアルベスピマイシン（alvespimycin）Snader et al.の特許文献４(2005年)としても知られる)であり、その両方ともが現在、臨床試験中である。
【化２】
2010516282.tif 000004
【０００６】
ゲルダナマイシンにおける17-メトキシ置換以外の構造モチーフに基づく、より魅力的な特性範囲の可能性を有する、さらなるアンサマイシン治療薬の開発が望ましい。ある可能なモチーフは、非-ベンゾキノン芳香族核を有するアンサマイシンにより示される。上述の通り、いくつかのそのようなアンサマイシンは天然に存在する:マクベシンII、ハービマイシン、TAN420B、TAN420D、およびレブラスタチン。このモチーフを有するいくつかの半合成化合物がまた: Rinehart, Jr., et al.の特許文献５(1976年);Muroi et al.の特許文献６ (1983年);Schnurの特許文献７(1995年);Cullen et al.の特許文献８(1993年);Sasaki et al.の特許文献９(1982年);およびYamaguchi et al.の特許文献１０(2007年);で報告されており、その開示は引用により援用される。しかしながら、様々な理由から、下記の可能性を除いて、非ベンゾキノンアンサマイシンが薬剤候補として開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第4,261,989号明細書
【特許文献２】米国特許第5,932,566号明細書
【特許文献３】米国特許第6,872,715号明細書
【特許文献４】米国特許第6,890,917号明細書
【特許文献５】米国特許第3,987,035号明細書
【特許文献６】米国特許第4,421,688号明細書
【特許文献７】米国特許第5,387,584号明細書
【特許文献８】国際公開93/14215号
【特許文献９】特開昭57-163369号公報
【特許文献１０】国際公開2007/001049号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Xiao et al., Mini-Reviews Med. Chem. 2006, 6 (10), 1137-1143
【非特許文献２】Schnur et al., J. Med. Chem. 1995, 38 (19), 3806-3812
【非特許文献３】Schnur et al., J. Med. Chem. 1995, 38 (19), 3813-3820
【非特許文献４】Jez et al., Chemistry & Biology 2003, 10, 361-368
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書において、発明者らはHsp90インヒビターとして作用することができる新規のマクロラクタムを開示する。これらのマクロラクタムは、構造的に天然のアンサマイシンに関連しており、ゲルダナマイシン-産生微生物ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスgeldanus変種（Streptomyces hygroscopicus var. geldanus） NRRL 3602(文献中ではよく単にストレプトマイセス・ハイグロスコピカス NRRL 3602と言われる)の変異株を培養することにより、生合成的に得られる。該変異株は3-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸(「AHBA」)、ゲルダナマイシンの生合成経路における第１基質(または開始ユニット)、を産生することはできないが、別に無傷のゲルダナマイシン生合成遺伝子クラスターを含む。非天然の置換開始ユニット(すなわち、AHBA以外の芳香族アミノ酸)が供給されると、該変異株はそれらを新規のマクロラクタムに取り込む。とりわけ、発明者らは、AHBAの生合成に関与するahba-b遺伝子クラスターが欠失されているがそれ以外にゲルダナマイシン生合成の遺伝子クラスターの破壊はない、本明細書で株K554-161と呼ばれる変異株を構築した。
【化３】
2010516282.tif 000005
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、一実施態様において、本発明は、式I：
【化４】
2010516282.tif 000006
［式中、
XはH、Cl、F、またはOMeであり;
R1、R2、およびR3は独立してHまたはOHであり;そして、
R4およびR5は、各々Hであるか、合わさって結合を形成するが;
ただし、(i) R1、R2、およびR3のうちの少なくとも１つはHであり、(ii)部分：
【化５】
2010516282.tif 000007
は、
【化６】
2010516282.tif 000008
以外である］
により示される構造を有するマクロラクタムを提供する。
【００１１】
別の好ましい実施態様において、式I-a:
【化７】
2010516282.tif 000009
により示される構造を有するマクロラクタムに対応して、R4およびR5は各々Hである。
【００１２】
別の好ましい実施態様において、式I-b:
【化８】
2010516282.tif 000010
により示される構造を有するマクロラクタムに対応して、R4およびR5は合わさって結合を形成する。
【００１３】
一実施態様において、式I、I-a、またはI-bにおけるXはClまたはFである。別の実施態様において、式I、I-a、またはI-bにおけるXはHである。さらに別の態様において、式I、I-a、またはI-bにおけるXはOMeである。
【００１４】
別の実施態様において、式I-c：
【化９】
2010516282.tif 000011
により示される構造を有するマクロラクタムの製造方法であって、
(a)式IIまたはII-a：
【化１０】
2010516282.tif 000012
により示される構造を有する化合物を、3-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸を産生することはできないがゲルダナマイシンの合成のための無傷の遺伝子クラスターを有するストレプトマイセス・ハイグロスコピカスgeldanus変種 NRRL 3602株(好ましくは、該株はK554-161株である)の培養物に(置換開始ユニットとして)添加すること、および、
(b)式I-cにより示される構造を有する化合物を産生する条件下での培養を発酵させることの工程を含み、
式中、
XはH、Cl、F、またはOMeであり;
R6、R7、およびR8は独立してHまたはOHであり;そして、
R9およびR10は各々Hであるか、または合わさって結合を形成するが;
ただし、R6、-R7、およびR8のうち少なくとも１つはHである、
該方法を提供する。
【００１５】
前述の方法の好ましい実施態様において、工程(a)で添加した化合物は式IIの構造を有する。別の好ましい実施態様において、該添加化合物は式II-aの構造を有する。
【００１６】
ある好ましい実施態様において、式I、Ia、Ib、Ic、またはIIにおけるXはClまたはFである。別の好ましい実施態様において、式I、Ia、Ib、Ic、またはIIにおけるXはHである。
【００１７】
別の実施態様において、患者に治療上有効な量の本発明のマクロラクタムを投与することを含む、過剰増殖性疾患を患っている患者における該疾病の治療方法を提供する。好ましくは、治療される過剰増殖性疾患は乳癌、卵巣癌、白血病、結腸癌、または肺癌である。
【００１８】
別の実施態様において、本発明のマクロラクタムおよび医薬的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００１９】
別の実施態様において、標的細胞を有効な量の本発明のマクロラクタムと接触させることを含む、標的細胞の増殖を阻害する方法を提供する。好ましくは、阻害される標的細胞は乳癌、卵巣癌、白血病、結腸癌、または肺癌の細胞である。通常、有効な量は、約40から約10,000 nM、より好ましくは約40から約900 nMの濃度のマクロラクタムに相当する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図1は、S. ハイグロスコピカス NRRL 3602のahba-b遺伝子クラスターの欠失によるK554-161株の作成を概念的に説明する。
【図２】図2は、AHBA無添加のK554-161株の発酵から単離した生成物のLC-MSトレースである。
【図３】図3aは、1 mM AHBAの存在下で発酵させたK554-161株から単離した生成物のLC-MSトレースである。図3bは、図3aのLC-MSトレースから9.96分で溶出した物質のマススペクトルである。
【図４】図4aおよび4bは、各々、ゲルダナマイシン産生S. ハイグロスコピカスgeldanus変種NRRL 3602株の発酵から単離した生成物の、相対的LP-MSトレースおよび相対的マススペクトルである。
【図５】図5は、Hsp90クライアントタンパク質、およびHsp90の阻害により誘導されるタンパク質の濃縮物での、本発明のマクロラクタムに対する曝露の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（本発明の詳細な説明）
ゲルダナマイシンおよび他のアンサマイシンは、天然物のポリケチドスーパーファミリーのメンバーである。ポリケチドは、非常に異なるそれらの構造ではなく、むしろ、ポリケチドシンターゼ(「PKS」)と呼ばれる酵素により仲介されるそれらの生合成により、関連している。ゲルダナマイシンPKSは、I型(またはモジュラー)PKSであり、アセンブリーライン様式（assembly-line fashion）で配置された活性のモジュールに分けられる大きな多機能性酵素によりキャラクタライズされている。各モジュールは、ロードし、活性化させ、２炭素(ケチド)ユニットを縮合して成長ポリケチド鎖にする多くの酵素活性(「ドメイン」)を有し、添加直後のケチドユニットを化学的に変化(還元、脱水など)させるさらなる修飾ドメインを有しても良い。モジュールの数および順番、ならびに(もしあれば)各モジュールに含まれる修飾ドメインの種類が、得られたポリケチドの基本構造を決定する。PKSの一般的な概説については、Staunton et al., Nat. Prod. Rep. 2001, 18, 380-416を参照のこと。
【００２２】
ポリケチド合成は、１番目(または開始ユニット)のポリケチドが高エネルギーチオエステル結合を介してPKSにロードされる、ローディングモジュール（アシルトランスフェラーゼ(「AT」)およびアシルキャリアータンパク質(「ACP」)ドメインが含まれる）で開始される。続いて、ケトシンターゼ(「KS」)、AT、およびACPドメイン(まとめて最小PKSモジュールと呼ばれる)を含有するモジュール(「拡張モジュール（extender module）」)を、再びチオエステル結合を介して２炭素マロネートベースの拡張ユニットにロードする。(該用語「２炭素」とはポリケチド主鎖を示し; 該拡張ユニットもまた、メチルマロニル拡張ユニットの場合のように、側鎖に向かう運命にある炭素原子を有し得る。) ロードされた拡張ユニットは、場合によっては、２つの炭素によりポリケチド鎖を拡張するクライゼン反応において、ローディングモジュールまたは直前の拡張モジュールに結合した成長ポリケチド鎖と縮合する。次いで、存在する場合、修飾ドメイン（例えばケトレダクターゼ（ketodreductase）(「KR」)ドメイン、デヒドラターゼ(「DH」)ドメイン、エノイルレダクターゼ(「ER」)ドメイン、および/またはメチルトランスフェラーゼドメイン）が添加直後の２炭素ユニット上で作用し、還元、脱水などによりそれを修飾する。最後の拡張モジュールの作用後、放出ドメイン−典型的にはチオエステラーゼまたはアミダーゼドメイン−がPKSからポリケチドを放出し、末端アシル基と上流のヒドロキシル基またはアミノ基との環化によるプロセスにおいて、通常はラクトンまたはラクタムを形成する。他の酵素(「テーラリング酵素（tailoring enzyme）」または「修飾酵素」と呼ばれる)は、ポリケチドをさらに修飾することができ、これは後PKS修飾（post-PKS modification）と呼ばれる。テーラリング酵素は、例えば、オキシゲナーゼ、グリコシル-およびメチルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ハロゲナーゼ、シクラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、およびヒドロキシラーゼであり得る。
【００２３】
Hutchinson et al., 米国特許第2004/0077058（A1）号(2004)は、その開示が引用により本明細書に援用され、ゲルダナマイシンPKS遺伝子クラスターおよびS. ハイグロスコピカス NRRL 3602からのそのクローニングについて記載する。ゲルダナマイシンPKSは、開始ユニットとしてのAHBAを受け入れるローディングドメイン、および各々拡張ユニット(モジュールに応じて、マロニル、2-メトキシマロニル、または2-メチルマロニル)を添加する７つのモジュールを含有する。
【００２４】
該ゲルダナマイシンPKSの初期生成物はプロゲルダナマイシン（progeldanamycin）であり、それをいくつかのテーラリング酵素-媒介工程: C7ヒドロキシル基のカルバモイル化; C17のヒドロキシル化および導入されるヒドロキシル基のO-メチル化; C21のヒドロキシル化および酸化;およびC4-C5の脱水素:を介して、ゲルダナマイシンに変換する。
【化１１】
2010516282.tif 000013
【００２５】
新たなゲルダナマイシンアナログを製造する、ゲルダナマイシン生合成経路が生物工学により作られた。天然のATドメインを異なるPKSからのATドメインにより置換する、「AT-swap」として知られる技術（Tian et al., 米国特許第2005/0026894（A1）号(2005) (以降「Tian」)およびPatel et al., Chemistry & Biology 2004, 11, 1625-1633 (以降「Patel」)）を用いて、とりわけ、2-メチル基の非存在および以下のキノン酸化状態への芳香環の酸化の抑制によりキャラクタライズされるゲルダナマイシンアナログを製造する。
【化１２】
2010516282.tif 000014
【００２６】
Tianはまた、さらなるゲルダナマイシンアナログを製造するための、化学誘導体化の開始物質としてのこれらの化合物の使用を報告した。
【００２７】
Rascher et al., Applied Environmental Microbiology 2005, 71 (8), 4862-4871 (以降「Rascher」)は、オキシゲナーゼ遺伝子gdmMの破壊が、芳香環のヒドロキシル化と酸化の両方およびC4-C5酸化を抑制するゲルダナマイシンアナログ(KOS-1806)の産生をもたらすことを開示した。
【化１３】
2010516282.tif 000015
【００２８】
Rascherはまた、AHBA形成のための遺伝子クラスター(ahba-b)が欠失した別の変異株(K390-76-1)において、ゲルダナマイシンの産生は、抑制されるがAHBAの供給により復元できることを報告した。
【００２９】
本出願の優先日後、Kim et al., ChemBioChem 2007, 8, 1491-1494, は、S. ハイグロスコピカスduamyceticus亜種JCM4427（これもまたゲルダナマイシンの産生株である）におけるAHBAシンターゼ遺伝子の不活性化を開示した。得られた株を、様々なアミノまたはヒドロキシ安息香酸の存在下で増殖させた。これらの安息香酸の取り込みによる多くの代謝産物が、LC-MSによりキャラクタライズされた。
【００３０】
本出願の優先日後にまた、Martin et al.,国際公開第2007/122829（A2）号 (2007)は、非天然の開始ユニットをマクベシン産生生物に供給することによる18,21-ジデオキシマクベシンアナログの製造を開示した。開示された非天然の開始ユニットには、3-アミノ安息香酸、5-アミノ-2-フルオロ安息香酸、5-アミノ-3-フルオロ安息香酸、5-アミノ-2,3-ジフルオロ安息香酸、および5-アミノ-2,3,6-トリフルオロ安息香酸が挙げられる。
【００３１】
本発明者らは、K554-161株と命名した新たなS. ハイグロスコピカス NRRL 3602変異株（該ahba-b遺伝子クラスターは欠失されているが、置換開始ユニットとして特定の芳香族アミノ酸を供給した場合に新規のマクロラクタムを産生する）を創り出した。(AHBAを供給すると、K554-161株は、ゲルダナマイシンPKSが無傷であることが確かなゲルダナマイシンを産生した。)  
【００３２】
K554-161株に供給されてマクロラクタムを製造することができる、式IIまたはII-aの好ましい置換開始ユニットとしては:
【化１４】
2010516282.tif 000016
が挙げられる。
2-クロロ-5-アミノ安息香酸は特に望ましい基質ではなく; その供給により芳香環の脱塩素化がもたらされる。3-アミノ-2-ヒドロキシ安息香酸でもなく、それはポリケチドを産生することにより容易には産生微生物に受け入れられず、特に望ましい基質ではないと思われる。
【００３３】
当業者は、アミノ酸であるこれらの置換開始ユニットを、対応する共役酸の塩の形態（例えば塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩など）で発酵混合物に用い、扱い、または添加することができることを理解するであろう。あるいは、それらのカルボン酸塩の形態（例えばナトリウム塩またはカリウム塩）でそれらを用い、扱い、または添加することができる。もちろん、該双性イオン形態もまた用い、扱い、または添加することができる。
【００３４】
本発明の方法により製造された式I-aのマクロラクタムとして、式I-aにおける部分：
【化１５】
2010516282.tif 000017
が、
【化１６】
2010516282.tif 000018
からなる群から選択され、これらはその完全に記載された構造がIII-aからIII-q：
【化１７】
2010516282.tif 000019
【化１８】
2010516282.tif 000020
の化合物に各々対応するものが挙げられる。
【００３５】
上記のうち、化合物III-aおよびIII-dが好ましい。
【００３６】
K554-161株により産生されるマクロラクタムは、化合物III-aからIII-oにより例示されるように、ゲルダナマイシンで認められるC4-C5二重結合を欠く傾向にある。K554-161株へのAHBAの供給はゲルダナマイシンの産生をもたらすことから、本発明者らは、C4-C5テーラリング酵素は活性であるが、置換開始ユニットを用いてPKSにより最初に産生される該化合物はそれの下位の基質であると推測する。また、置換開始ユニットの芳香核は、場合によっては、C17および/またはC21でのヒドロキシル化が認められる部分的酸化が生じたけれども、キノン酸化状態には酸化されなかった。
【００３７】
該C4-C5テーラリング酵素が無傷であることのさらなる証拠として、本発明者らは少量で単離したいくつかの生成物におけるC4-C5酸化を観察した。例としては、各々、3-アミノ安息香酸、3-アミノ-5-クロロ安息香酸、3-アミノ-5-フルオロ安息香酸、および3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸の供給からの式IV-a、IV-b、IV-c、およびIV-d:
【化１９】
2010516282.tif 000021
の化合物が挙げられる。
【００３８】
様々な研究により、酵素NAD(P)H:キノン酸化還元酵素１(NQO1またはDTジアフォラーゼとも呼ばれる)によるゲルダナマイシン誘導体17-AAGおよび17-DMAGにおけるキノン基の、対応するヒドロキノン形態(各々、17-AAGH2および17-DMAGH2)への還元は、Hsp90インヒビターとしてのそれらの活性に重要であると結論づけられている。Kelland et al., J. Nat'l Cancer Inst. 1999, 91 (22), 1940-1949; Guo et al., Cancer Res. 2005, 65 (21), 10006-10015; Guo et al., Mol. Pharmacol. 2006, 70 (4), 1194-1203; Maroney et al., Biochemistry 2006, 45, 5678-5685; および、Gooljarsingh et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA), 2006, 103 (20), 7625-7630を参照。
【化２０】
2010516282.tif 000022
【００３９】
これらの研究により、還元型17-AAGH2および17-DMAGH2は親キノンよりも強力なHsp90のインヒビターであることが示唆される。ある研究において、一方を高レベルのNQO1を発現するようにトランスフェクトしたことを除いて同質の２つの乳癌細胞株を、17-AAGに曝露した。17-AAGは、非-NQO1発現細胞株に対してよりもNQO1発現細胞株に対しての方が約12倍有効であった。別の研究において、該ヒドロキノン形態は、対応するキノンよりも強固に（約40倍）Hsp90に結合しており、そしてより遅い解離速度であることが見いだされた。コンピューターモデリング計算（Computer modeling calculation）によってもまた、ヒドロキノン形態の結合がエネルギー的により好ましいことが予測される。
【００４０】
しかしながら、ゲルダナマイシン化合物のヒドロキノンは不安定であり、特に金属イオンの存在下において、溶液中で容易に酸化されてキノンに戻る。酸化を防ぐために特別な予防策（例えば、金属キレート剤、低いpHのバッファー、および/または抗酸化剤の存在下での保存溶液）が必要である。例えば、Adams et al., 米国特許第7,282,493（B2）号(2007); および、Ross et al., 米国特許第2006/0205705（A1）号(2006)を参照。従って、治療薬としてのヒドロキノンの使用は重大な製剤課題に直面する。とは言え、17-AAGH2の塩形態が臨床試験中である。
【００４１】
17-AAGおよび17-DMAGとは違って、本発明のマクロラクタムは、それらのHsp90阻害活性の増強のためのNQO1による還元に依存しない。ヒドロキノン基の欠損は、キノン形態への酸化を防ぐ特別な取り扱いおよび保存対策を必要としない。
【００４２】
本発明の化合物は、様々な増殖性疾患、例えば、限定はされないが、過剰増殖性疾患、例えば: 頭部、頸部、鼻腔、副鼻腔、上咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺の腫瘍および傍神経節腫を含む、頭頸部の癌; 肝臓および胆管の癌、特に肝細胞癌; 腸癌、特に結腸直腸癌; 卵巣癌; 小細胞および非小細胞肺癌; 乳癌、肉腫、例えば 線維肉腫、悪性線維性組織球腫、胎児性横紋筋肉腫（rhabdomysocarcoma）、平滑筋肉腫（leiomysosarcoma）、神経線維肉腫、骨肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫、および胞巣状軟部肉腫; 中枢神経系の腫瘍、特に脳癌; リンパ腫（例えばホジキンリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B細胞性大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、およびT細胞未分化大細胞リンパ腫）などの治療に用いることができる。より具体的には、治療対象となり得る癌としては、乳癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、結腸癌、肺癌(とりわけ非小細胞肺癌(NSCLC))、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、リンパ腫、膵臓癌、および白血病(とりわけ慢性骨髄性白血病(CML)および慢性リンパ性白血病もしくは(CLL))が挙げられる。
【００４３】
本発明の化合物を用いて標的細胞の増殖を阻害する場合、阻害される標的細胞は好ましくは、乳癌、卵巣癌、白血病、結腸癌、または肺癌細胞である。通常、有効な阻害量は、約40から約10,000 nM、より好ましくは約40から約900 nMの濃度のマクロラクタムであり得る。
【００４４】
細胞の過剰増殖によりキャラクタライズされる非癌疾患もまた、本発明の化合物により治療することができる。そのような疾患の実例として、限定はされないが: 萎縮性胃炎、炎症性溶血性貧血、移植片拒絶、炎症性好中球減少症、類天疱瘡、セリアック病、脱髄性ニューロパシー、皮膚筋炎（dermatomyositis）、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎およびクローン病)、多発性硬化症、心筋炎、筋炎、鼻ポリープ、慢性副鼻腔炎、尋常性天疱瘡、原発性糸球体腎炎、乾癬、術後癒着（surgical adhesion）、狭窄症または再狭窄症、強膜炎、強皮症、湿疹(アトピー性皮膚炎、刺激性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎を含む)、歯周病 (すなわち、歯周炎)、多発性嚢胞腎疾患、および１型糖尿病が挙げられる。他の例としては、血管炎 (例えば、巨細胞性動脈炎(側頭動脈炎、高安動脈炎)、結節性多発性動脈炎、アレルギー性血管炎および肉芽腫症(チャーグ・ストラウス病)、多発性血管炎重複症候群、過敏性血管炎(ヘノッホ・シェーンライン紫斑病)、血清病、薬剤誘発性血管炎、感染性血管炎、腫瘍性血管炎、結合組織障害関連血管炎、補体系の先天性欠損関連血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、中枢神経系の血管炎、バージャー病および全身性硬化症); 胃腸系疾病(例えば、膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、原発性硬化性胆管炎、特発性のもの（ideopathic）(例えば、胆管、食堂、一二指腸、小腸または結腸の狭窄)を含むあらゆる原因の良性狭窄; 呼吸器系疾病(例えば、喘息、過敏性肺炎、石綿肺症、珪肺症および他の形態のじん肺症、慢性気管支炎および慢性閉塞性気道疾患); 鼻涙管疾病(例えば、特発性を含むあらゆる原因の狭窄); および耳管（eustachean tube）疾病(例えば、特発性を含むあらゆる原因の狭窄)が挙げられる。
【００４５】
本発明の化合物は、別の医薬品有効成分(API)、例えば他の抗癌剤または細胞傷害性薬物（アルキル化薬、血管新生抑制薬、代謝拮抗薬、DNA切断剤、DNA架橋剤、DNA挿入剤、DNA副溝結合剤、エンジイン、熱ショックタンパク質90インヒビター、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬、微小管安定剤、ヌクレオシド(プリンまたはピリミジン)アナログ、核外輸送インヒビター、プロテアソームインヒビター、トポイソメラーゼ(IまたはII)阻害薬、チロシンキナーゼ阻害薬が含まれる）と組み合わせて投与することができる。具体的な抗癌剤または細胞傷害性薬物として、β-ラパコン、アンサミトシンP3、アウリスタチン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カリスタチン（callistatin）A、カンプトテシン、カペシタビン、CC-1065、シスプラチン、クリプトフィシン、ダウノルビシン、ジソラゾール、ドセタキセル、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ダイネミシン（dynemycin）A、エポチロン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル（fluoruracil）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イマチニブ、インターフェロン、インターロイキン、イリノテカン、マイタンシン、メトトレキサート、ミトマイシンC、オキサリプラチン、パクリタキセル、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)、チオテパ、トポテカン、トリコスタチンA、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビンデシンが挙げられる。ゲフィチニブ(Iressa（登録商標）)、ボルテゾミブ(Velcade（登録商標）)、パクリタキセル(Taxol（登録商標）)、ドセタキセル、サリドマイド(Thalomid（登録商標）)、レナリドマイド(Revlimid（登録商標）)、およびハーセプチン（登録商標）との組み合わせが好ましい。別のAPIとの併用療法において、他のAPIはそれぞれの製剤で別個に投与することができるか、あるいは受け入れられる場合、本発明の化合物の製剤に添加されたさらなる成分として投与することができる。
【００４６】
本発明の化合物の製剤は、賦形剤、例えば担体、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤（solid binder）、分散剤または懸濁剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、抗凍結剤、溶解保護剤（lyoprotectant）、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、保存剤、等張剤、およびそれらの組み合わせを含んでよい。適した賦形剤の選択および使用が、Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)において教示されており、その開示は引用により本明細書に援用される。
【００４７】
本発明は、関心が持たれる特定の哺乳類(ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、などを含む)に対して適当に調節した単位用量を用いて、獣医学的目的で実施することができるけれども、本発明の化合物の対象は、典型的にはヒトである。
【００４８】
研究者、獣医、臨床医、または医師により標的とされた培養細胞、組織系、動物、またはヒトにおいて、生物学的反応または医薬的反応（治療される疾病または疾患の症状の軽減など）を誘導する化合物量である、本発明の化合物の治療上有効な量。該投与量は、投与頻度に応じて、約4 mg/m2から約4000 mg/m2の範囲に及び得る。
【００４９】
本発明のマクロラクタムに用いることができるアンサマイシンと共に使用するために開発された製材技術には、様々な鎖長のトリグリセリド(Ulm et al., 米国特許第2006/0014730（A1）号(2006); Ulm et al., 米国特許第2006/0148776（A1）号(2006); およびIsaacs et al., 国際公開第2006/094029（A2）号(2006))、DMSO/レシチン組み合わせ(Tabibi et al., 米国特許第6,682,758（B1）号(2004)); ポリオキシエチレンヒマシ油（polyethoxylated castor oil）(Zhong et al., 米国特許第2005/0256097（A1）号(2005)); 様々な可溶化剤または分散剤(Mansfield et al., 米国特許第2006/0067953（A1）号(2006)); ジメチルドルビド（dimethylsorbide）(Desai et al., 国際公開第WO 2006/034147（A2）号(2006)); およびナノ粒子懸濁液(Tao et al., Am. Assoc. Cancer Res., 96th Annual Meeting (Apr. 16-20, 2005), abstract no. 1435; Licari et al., 米国特許第2007/0203110（A1）号(2007)); に基づく製剤が挙げられ、それらの開示は引用により本明細書に援用される。
【００５０】
本発明の実施は、実例を通じて提供され、かつ限定されることのない、以下の実施例を参照することにより、さらに理解することができる。置換開始ユニットのいくつかは市販されているので、それらの合成方法は提供しない。その他については、合成方法を提供する。
【実施例】
【００５１】
実施例 1:  K554-161株の調製
概要
S. ハイグロスコピカス NRRL 3602のahba-b遺伝子クラスターは、ゲルダナマイシン(gdm)PKS遺伝子から30 kbより離れた付近で分離され、AHBAの合成用酵素(Rascher, 上記)をコードする６つのORFを含有する。クラスターの境界にある約1 kbの２つのDNAフラグメントをPCRで増幅し、ホモロジーアーム（homology arm）として用い、pFDneoS由来のカナマイシン抵抗性カセットに隣接させた。該構築物を、アプラマイシン抵抗性マーカーおよび温度感受性レプリコンを含有する接合性プラスミドpKC1139に挿入した。
【００５２】
染色体に破壊カセットが挿入された変異クローンを、制限された温度で培養物を培養することにより選択した。次に、200コロニーをカナマイシン抵抗性/アプラマイシン感受性表現型についてスクリーニングし、ダブルクロスオーバーについて予期した。選択されたコロニーのPCRによる遺伝学的解析により、ahba-b遺伝子クラスターの６つのORFがカナマイシン抵抗性カセットにより置換されたクローン(K554-161株)を同定した。
【００５３】
K554-161株のサンプルを、2006年11月15日のブダペスト条約の条項に従って、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, Virginia 20108, USA,に受託番号PTA-8002の下に寄託した
【００５４】
株、培地、および増殖条件
S. ハイグロスコピカスgeldanus変種NRRL 3602を、農業研究局の北部地域研究所（Northern Regional Research Laboratory）から入手した。Escherichia coli XL1-blue(Strategene)をDNA操作に用いた。E. coli ET12657/pUZ8002 (Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics (The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 2000))(以降「Kieser」)を、E. coli - S. ハイグロスコピカス接合におけるドナーとして用いた。増殖および胞子形成については、S. ハイグロスコピカスを、28℃で14日間、トマトペーストアガーで増殖させた(Patel,上記)。E. coli株はLB培地で増殖させた。S. ハイグロスコピカス株は、20％グリセロール中の胞子懸濁液として80℃で維持した。
【００５５】
プライマーおよびPCR条件
プライマーOli1およびOli2(表1)を、ahba-3遺伝子のフラグメントを含有する右のホモロジーアームのPCR増幅に用いた。プライマーOli3およびOli4を、ahba-1b遺伝子のフラグメントを含有する左のホモロジーアームのPCR増幅に用いた(図1参照)。上記のKieserによる記載のとおり調製したS. ハイグロスコピカスゲノムDNAを鋳型として用い、PCR fail-safeキット(Epicentre)をメーカーの使用説明書に従って用いて、PCR増幅を行った。
【表１】
2010516282.tif 000023
【００５６】
破壊カセットの構築 
ahba-b破壊カセットを、以下のDNAフラグメント: BamHI-XhoIで消化したアップストリームアーム（upstream arm）PCR産物 、XhoI-NsiIで消化したpFDneoSからのカナマイシン抵抗性カセット(Denis et al., Gene 1992, 111 (1), 115-8)、NsiI-SpeIで消化したダウンストリームアーム（downstream arm）PCR産物、およびBamHI-SpeIで消化したpKC1139ベクターのライゲーションの４断片を調製することにより、pKC1139 接合性プラスミド(Bierman et al., Gene 1992, 116 (1), 43-9)に１工程で構築した。得られたプラスミドをpKOS554-106と名付け、その構造をシークエンスにより確認した。プラスミドpKOS554-106は、図1に示すとおり、カナマイシン抵抗性カセット(KmR)に隣接するahba-3遺伝子およびahba-1遺伝子、アプラマイシン抵抗性マーカー(ApraR)、および複製(ori)由来のpsG5温度感受性を含有した。
【００５７】
E. coli - S. ハイグロスコピカス接合 
プラスミドpKOS554-106を、S. ハイグロスコピカス var. geldanus NRRL 3602に、E. coli ET12657/pUZ8002 をドナーとして用いて、上記のKieserに記載のとおり接合により導入した。第１接合完了体（exconjugant）を、5 mLのカナマイシン(50 mg/L)含有R5液体培地(Kieser, 上記)中、30℃で2日間、増殖させた。変異体を選択するため、0.2 mLのこれらの細胞を用いて5 mLのカナマイシン含有R5に接種し、37 ℃で2日間増殖させた。この工程を1回繰り返し、細胞を希釈してトマトアガープレートに播種し、28℃で14日間培養した。ダブルクロスオーバーを有する特定のコロニーを、アプラマイシン添加(100 mg/L)R5プレートへのレプリカの播種によるアプラマイシン抵抗性の欠如により同定した。
【００５８】
遺伝学的解析による挿入破壊の確認
コロニー(カナマイシン抵抗性およびアプラマイシン感受性)を液体R5で増殖させ、ゲノムDNAをKieserに記載の通り得た。プライマー対Oli5/Oli6およびOli7/Oli8(表1および図1)を用いたPCR解析をPCR fail-safeキットを用いて行い、挿入破壊を確認した。
【００５９】
K554-161株およびゲルダナマイシン産生
図2は、K554-161株のみ(いかなるAHBA添加もない)の発酵から単離した産物のLC-MSトレースを示す。産生される場合、ゲルダナマイシンは、用いたHPLC条件下においてちょうど10分未満で溶出するはずであった。図が示す通り、ゲルダナマイシンは産生されなかった。図3aは、K554-161株を1 mM AHBAの存在下で発酵させた場合に単離された生成物のLC-MSトレースを示す。9.96分に大きな溶出ピークが認められ、そこでゲルダナマイシンが溶出したと予期された。図3bは、ゲルダナマイシンとしての固有性が確認された9.96分の物質のマススペクトルである(ゲルダナマイシンのm/z計算値は559.3 [M-H]-である)。図4aおよび4bは、各々、天然のゲルダナマイシン-産生微生物S. ハイグロスコピカス NRRL 3602を発酵させた対照実験から単離した生成物のLC-MSトレースおよびマススペクトル(9.97分に溶出する物質について)である。ゲルダナマイシンの産生が、図4aおよび4bにより明確に示されている。
【００６０】
実施例 2: 3-アミノ-5-クロロ安息香酸
置換開始ユニット3-アミノ-5-クロロ安息香酸の塩酸塩を以下:
【化２１】
2010516282.tif 000024
に示すとおり製造した。
【００６１】
3-クロロ-5-ニトロベンゾニトリル
濃H2SO4(440 mL)をクラッシュアイス(1200 g)にゆっくりと添加し、2-アミノ-3-クロロ-5-ニトロベンゾニトリル(43.8 g)を得られたH2SO4溶液に懸濁した。2-プロパノール(1600 mL)の添加後、該混合液を激しく撹拌しながら内部温度40℃に加熱した。NaNO2(66.0 g)/水(100 mL)溶液を滴下した。添加完了後、該混合液を40℃でさらに3時間維持し、次いで周囲温度に冷却してCH2Cl2で抽出した。該有機抽出物を、水、0.1 N NaOH、水および食塩水で連続的に洗浄し、次いでMgSO4で乾燥させ、シリカゲルのパッドを通して濾過し、エバポレートして、粗生成物を黄色の固形物として得た。シリカゲルでのクロマトグラフィー(20％ EtOAc/ヘキサン)の後、2-プロパノールからの結晶化により黄色の結晶物として生成物を得た。1H-NMR (CDCl3): δ 8.47 (1H, t, J = 2.0 Hz), 8.43 (1H, dd, J = 1.4, 2.0 Hz), 7.98 (1H, dd, J = 1.4, 2.0 Hz).  13C-NMR (CDCl3): δ 148.8, 137.4, 137.0, 128.1, 125.3, 115.4, 115.3.
【００６２】
3-クロロ-5-ニトロ安息香酸
3-クロロ-5-ニトロベンゾニトリル(30.0 g)を水(85 mL)およびH2SO4(250 mL)の混合液に溶解し、N2雰囲気下において150℃で2時間加熱した。該混合液を周囲温度に冷却し、氷(1 L)上に注ぎ入れた。得られた固形物を減圧濾過により集め、該濾過物を酢酸エチルで抽出した。該抽出物および固形物を合わせて水および食塩水で洗浄し、次いでMgSO4で乾燥させ、濾過し、エバポレートした。該残渣を、1:1の水/MeOH(200 mL)に加熱しながら溶解し、脱色炭で処理して濾過した。水(100 mL)を添加し、該混合液を冷却して結晶化した。該生成物を、淡黄色の結晶物として得た。1H-NMR (d6-DMSO): δ 14.00 (1H, br s), 8.51 (2H, m), 8.29 (1H, m). 13C-NMR (d6-DMSO): δ 164.9, 149.2, 135.2, 135.0, 134.5, 127.7, 122.9.
【００６３】
3-アミノ-5-クロロ安息香酸 塩酸塩
MeOH (100 mL)および6N HCl(30 mL)中の3-クロロ-5-ニトロ安息香酸(10.0 g)および10％ Pd/C(0.3 g)の混合液をパール装置において30 psiのH2下で30分間振盪した後、セライトを通して濾過し、エバポレートした。該残渣を6N HClから結晶化して生成物を得た。水からの2回目の結晶化により、さらに高い精製度の物質を得た。1H-NMR (d4-CD3OD): δ 7.24 (1H, dd, J = 1.4, 2.0 Hz), 7.20 (1H, dd, J = 1.6, 2.0 Hz), 6.87 (1H, t, J = 2.0 Hz). 13C-NMR (d4-CD3OD): δ 167.6, 149.5, 134.3, 132.7, 117.8, 117.4, 113.9.
【００６４】
実施例 3: 3-アミノ-5-フルオロ安息香酸
置換開始ユニット3-アミノ-5-フルオロ安息香酸の塩酸塩を、以下:
【化２２】
2010516282.tif 000025
の通り製造した。
【００６５】
MeOH(100 mL)および6 N HCl(20 mL)中の3-フルオロ-5-ニトロ安息香酸(5.0 g)および10％ Pd/C(0.3 g)の混合液を、30 psiのH2下で30分間振盪した。触媒を濾過により除去し、該溶液を乾固するまでエバポレートした。該残渣を6 N HClから結晶化させて生成物を得た。13C-NMR (D2O): δ 167.6, 162.5 (d, JCF = 246 Hz), 133.8 (d, JCF = 8 Hz), 132.6 (d, JCF = 10 Hz), 119.7(d, JCF = 3 Hz), 116.7(d, JCF = 23 Hz), 115.2(d, JCF = 24 Hz).
【００６６】
実施例 4: 3-アミノ-6-フルオロ安息香酸
置換開始ユニット3-アミノ-6-フルオロ安息香酸の塩酸塩を、以下:
【化２３】
2010516282.tif 000026
の通り製造した。
【００６７】
MeOH(100 mL)および6 N HCl (15 mL)中の2-フルオロ-5-ニトロ安息香酸(5.0 g)溶液を、0.15 gの10％ Pd/Cとともに30 psiのH2下で30分間振盪した。触媒を濾過により除去し、該濾過物をエバポレートした。該残渣を6N HClから結晶化して生成物を得た。1H-NMR (D2O): δ 7.82 (1H, dd, J = 2.8, 6.0 Hz), 7.55 (1H, ddd, J = 2.8, 4.0, 8.9 Hz), 7.27 (1H, dd, J = 8.9, 14.0 Hz).  13C-NMR (D2O): δ 166.5 (d, JCF = 2 Hz), 161.3 (d, JCF = 260 Hz), 129.7 (d, JCF = 10 Hz), 126.6, 126.0 (d, JCF = 3 Hz), 120.0 (d, JCF = 11 Hz), 118.9 (d, JCF = 25 Hz).
【００６８】
実施例 5: 3-アミノ-4-フルオロ安息香酸
置換開始ユニット3-アミノ-4-フルオロ安息香酸の塩酸塩を、以下:
【化２４】
2010516282.tif 000027
の通り製造した。
【００６９】
MeOH(100 mL)および6 N HCl(15 mL)中の4-フルオロ-5-ニトロ安息香酸(5.0 g)溶液を、0.15 gの10％ Pd/Cとともに30 psiのH2下で30分間振盪した。触媒を濾過により除去し、該濾過物をエバポレートした。該残渣を6N HClから結晶化して生成物を得た。1H-NMR (D2O): δ 7.89 (2H, m), 7.25 (1H, t, J = 10 Hz).
【００７０】
実施例 6: 3-アミノ-2-フルオロ安息香酸
置換開始ユニット3-アミノ-2-フルオロ安息香酸のトリフルオロ酢酸塩を、以下:
【化２５】
2010516282.tif 000028
の通り製造した。
【００７１】
2-フルオロイソフタル酸
1,3-ジメチル-2-フルオロベンゼン(4 g)／水(75 mL)の混合液をKMnO4(11.0 g)で処理し、濃い紫色の混合液をゆっくりと加熱還流した。12時間還流した後、該混合液を冷却し、セライトパッドを通して減圧濾過した。無色の濾過物をpH 1に酸性化して、すぐに該生成物を結晶化した。減圧濾過により生成物を得た。1H-NMR (CD3OD/CDCl3): δ 8.10 (2H, dd, J = 6.4, 7.6 Hz), 7.31 (1H, t, J = 7.6 Hz).  13C-NMR (CD3OD/CDCl3): δ 165.5, 161.1 (d, JCF = 271 Hz), 136.1, 123.4 (d, JCF = 5 Hz), 120.6 (d, JCF = 11 Hz).
【００７２】
2-フルオロイソフタル酸モノメチル
2-フルオロイソフタル酸をMeOH(100 mL)に溶解し、10℃に冷却して、SOCl2(5 mL)で滴下処理した。添加完了後、該混合液を周囲温度に昇温させて終夜撹拌し、次いで乾固するまでエバポレートした。該残渣をEtOAcに溶解し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、エバポレートしてジメチルエステルを得た。該ジメチルエステルをMeOH(50 mL)に溶解し、1.0モル当量の5N NaOHにより周囲温度で終夜処理した。該混合液を濃縮して、該残渣を水およびCH2Cl2に分配した。該水相を6N HClで酸性化し、得られた沈殿物を濾過により集めて風乾し、生成物を得た。1H-NMR (CD3OD): δ 8.10  (2H, m), 7.34 (1H, t, J = 8.0 Hz), 3.93 (3H, s).
【００７３】
3-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-フルオロ安息香酸メチル
2-フルオロイソフタル酸モノメチル(0.4 g)／tert-ブチルアルコール(10 mL)溶液を、Et3N(0.56 mL)およびジフェニルホスホリルアジド(0.75 mL)で処理した。1時間後、該混合液を24時間加熱還流し、次いで冷却して濃縮した。該残渣をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートした。シリカゲルクロマトグラフィー(アセトン/ヘキサングラジエント)により生成物を得た。1H-NMR (CDCl3): δ 8.31 (1H, br t, J = 7.2 Hz), 7.55 (1H, ddd, J = 1.6, 6.8, 8.0 Hz), 7.16 (1H, ddd, J = 1.2, 8.0, 8.0 Hz), 6.80 (1H, br s), 3.93 (3H, s), 1.54 (9H, s).
【００７４】
3-アミノ-2-フルオロ安息香酸 トリフルオロ酢酸塩
3-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-フルオロ安息香酸メチル／1 N NaOH混合液を周囲温度で2時間撹拌し、次いで酸性化して酢酸エチルで抽出した。該抽出物をMgSO4で乾燥させ、濾過し、エバポレートした。該残渣を5 mLのトリフルオロ酢酸に溶解して10分間維持し、その後、乾固するまでエバポレートして生成物を得た。1H-NMR (D2O): δ 7.80 (1H, ddd, J = 1.6, 8.0, 8.0 Hz), 7.54 (1H, ddd, J = 1.2, 4.0, 4.0 Hz), 7.28 (1H, t, J = 8.0 Hz).  13C-NMR (D2O): δ 167.2, 154.1 (d, JCF = 257 Hz), 130.2, 127.9, 124.9, 122.5, 120.1.
【００７５】
実施例 7: 3-アミノ-5-メトキシ安息香酸
置換開始ユニット3-アミノ-5-メトキシ安息香酸の塩酸塩を、以下:
【化２６】
2010516282.tif 000029
の通り製造した。
【００７６】
3-メトキシ-5-ニトロ安息香酸
3,5-ジニトロ安息香酸(866 mg)を1 M LiOMe／MeOH(1.3 mL)に溶解し、次いで乾固するまでエバポレートした。得られた固形物を30 mLのヘキサメチルホスホラミドに溶解し、80℃で16時間加熱した。次いで、該混合液を冷却して、クラッシュアイス(250 g)および6N H2SO4(42 mL)の混合液に注ぎ入れた。該混合液をエーテルで抽出し、該抽出物を水および食塩水で洗浄した後、MgSO4で乾燥させ、濾過し、エバポレートしてオレンジ色の固形物を得た。9:1のCH2Cl2/MeOHを用いたシリカゲルによる濾過の後、エバポレートして624 mgの生成物を得た。1H-NMR (d6-アセトン): δ 8.36 (1H, dd, J = 1.6, 2.0 Hz), 7.97 (1H, t, J = 2.0 Hz), 7.91 (1H, dd, J = 1.6, 2.0 Hz), 4.03 (3H, s).
【００７７】
3-アミノ-5-メトキシ安息香酸 塩酸塩
上記からの生成物をMeOH(20 mL)に溶解し、H2雰囲気下で30分間、6 N HCl(2 mL)および10％ Pd/C(50 mg)で処理した。触媒を濾過により除去し、該混合液を乾固するまでエバポレートした。6N HClからの結晶化により、生成物を得た。1H-NMR (D2O): δ 7.43 (1H, dd, J = 1.3, 2.5 Hz), 7.40 (1H, dd, J = 1.3, 2.0 Hz), 7.02 (1H, t, J = 2.2 Hz), 3.72 (3H, s).  13C-NMR (D2O): δ 168.6, 160.1, 133.0, 131.6, 116.0, 115.1, 113.6, 55.8.
【００７８】
実施例 8: 3-アミノ-5-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸
置換開始ユニット3-アミノ-5-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸の塩酸塩を、以下:
【化２７】
2010516282.tif 000030
の通り製造した。
【００７９】
3-クロロ-4-ヒドロキシ安息香酸(5.0 g)を、氷上で冷却された撹拌発煙HNO3(90％, 15 mL)に少量で添加した。添加完了後、該オレンジ色の混合液を20℃に温め、2時間撹拌し続けた。氷水(50 mL)を添加し、沈殿した生成物を減圧濾過により集めて、5.4 gの3-クロロ-4-ヒドロキシ-5-ニトロ安息香酸を鮮黄色の固形物として得た。
【００８０】
メタノール(100 mL)および6N HCl(20 mL)中の3-クロロ-4-ヒドロキシ-5-ニトロ安息香酸(5 g)および10％パラジウム/炭素(0.1 g)の混合液を、30 psiの水素下で30分間、パールシェーカーを用いて振盪した。触媒を濾過により除去し、該溶液を乾固するまでエバポレートした。生成物を6N HClから結晶化した。1H-NMR (400 MHz, D2O): δ 7.78 (1H, d, J = 3 Hz), 7.71 (1H, d, J = 3 Hz). 13C-NMR (100 MHz, D2O): δ 167.7, 150.6, 131.4, 123.8, 122.4, 121.5, 120.3.
【００８１】
実施例 9: マクロラクタムの産生用種菌の調製
種培養をK554-161株の胞子懸濁液1 mL(108胞子)を50 mLのYPDブロス(Sigma)に播種することにより調製し、28℃で24時間、250 mL三角フラスコの中で撹拌しながら培養した。5 mLのこの培養物を、250 mLバッフル付三角フラスコ中の40 mLの改変DeBoerビートモラセス培地（Modified DeBoer Beet Molasses Medium）(グルコース(Sigma), 36.4 g/L; 小麦ペプトンE1(Organotechnie), 5 g/L; 大豆ペプトン タイプSL(Marcor), 5 g/L; bacto酵母エキス（bacto yeast extract）(BD), 2.5 g/L; オートミール(Gerber), 5 g/L; ビートモラセス(Minn-Dak), 10 g/L（NaOHでpH 7に平衡化した）)に播種した。DMSO(100 mM)に溶解した置換開始ユニットを、1 mMの濃度になるまで添加した。培養物を、28℃で撹拌しながら、アンサマイシン産生が同レベルになるまで培養した。全ての実験において対象として、AHBAは添加するが前駆体は添加しない培養物および野生型株の培養物を調製した。
【００８２】
1ミリリットルの20％(v/v)グリセロール中のK554-161株の凍結胞子を、250-mLバッフル付三角フラスコ中の、10 g/LのBacto酵母エキス(BD)、20 g/Lの大豆ペプトン タイプSL(Marcor)、および20 g/Lのグルコースから成る50 mLの濾過滅菌したYSD培地に播種した。該細胞を、2-インチストロークのロータリーシェーカーにおいて190 rpmで、28℃で22〜24時間培養した。第２次種培養は、22.5 mLの第１次種培養を450 mLのYSD培地を含む2.8Lのバッフル付フェルンバッハ（Fernbach）フラスコに移し入れることにより調製した。これらの培養物を、28℃および190 RPMで16〜18時間増殖させた。
【００８３】
実施例 10: XAD-16HP 樹脂を用いない、マクロラクタムの製造および単離
以下は、置換開始ユニットとして3-アミノ-5-クロロ安息香酸または3-アミノ-5-フルオロ安息香酸を用いる典型的な方法である。他の置換開始ユニットによる製造を、同様に行うことができる。本明細書において後者は、XAD-16HPなどの樹脂の存在下における別の方法を説明する。
【００８４】
発酵
4.5 Lの改変DeBoerビートモラセス培地を含む5リットルのバイオリアクター(B.Braun)を121℃で60分間オートクレーブ処理した。次いで、225 mLの第２次種培養とともに培養した。28℃、通気速度0.4 v/v/m、および初期撹拌速度400 rpmで発酵を行った。溶解した酸素は、段階的な400〜1000 rpmでの撹拌により30％の空気飽和度に制御した。培養物のpHは、2.5 N 硫酸または2.5 N 水酸化ナトリウムの自動的な添加により、7.0に維持した。発泡は、100％ UCON LB-625の自動的な添加により制御した。置換開始ユニットを、DMSO中の濃縮1 M溶液として調製した。最終濃度0.5 mMに播種の翌日、それらを産生培養に添加した。４日間、発酵させた。
【００８５】
化合物III-aの単離
置換開始ユニットとして3-アミノ-5-クロロ安息香酸を用いた10リットルの発酵ブロスを、2時間で同量のメタノールで抽出し、濾過した。該濾過物を、1.2 LのHP-20SS吸着剤(Supelco)で、ステップグラジエント(2.5カラム容積(CV)の40:60(v/v) メタノール:水、2.5 CVの50:50(v/v) メタノール:水、2.5 CVの60:40(v/v) メタノール:水、および2.5 CVの100％メタノール)によりクロマトグラフィー処理した。LC-MS(m/z = 551 [M-H]-)に基づいて標的化合物を含有するフラクションを合わせて、1.0 LのC18吸着剤(Bakerbond, 40 μm)で、ステップグラジエント(4 CVの50:50(v/v) メタノール:水、4 CVの55:45(v/v) メタノール:水、4 CVの60:40(v/v) メタノール:水、および4 CVの65:35(v/v) メタノール:水)によりクロマトグラフィー処理した。LC-MSに基づいて標的化合物III-aを含有するフラクションを合わせて、30:70(v/v) アセトニトリル:水において、同一のC18 処理カラムでのC18クロマトグラフィーによりさらに精製した。濃縮（enriched）生成物プール中に残った少量の不純物を、30:70(v/v) アセトニトリル:水において、プレパラティブHPLC(Inertsil ODS-3, 8 μm, 250 mm x 300 mm)により分離した。総量52 mgの化合物III-aを、淡黄色の固形物として単離した。
【００８６】
化合物III-dの単離
置換開始ユニットとして3-アミノ-5-フルオロ安息香酸を用いた9リットルの発酵ブロスを、遠心により沈降させた。該上清を、1.0 LのHP-20SS吸着剤で、ステップグラジエント(3 CVの40:60(v/v) メタノール:水、3 CVの50:50(v/v) メタノール:水、3 CVの60:40(v/v) メタノール:水、3 CVの70:30(v/v) メタノール:水、および3 CVの80:20(v/v) メタノール:水)により、クロマトグラフィー処理した。LC-MS(m/z = 535 [M-H]-)に基づいて標的化合物を含有するフラクションを合わせて、1.0 LのC18吸着剤で、50:50(v/v) メタノール:水においてさらに精製した。LC-MSに基づいて標的化合物III-dを含有するフラクションを合わせて、濃縮生成物プール中の少量の不純物を、30:70(v/v) アセトニトリル:水におけるプレパラティブHPLCにより分離した。総量241 mgの化合物III-dを、淡黄色の固形物として単離した。
【００８７】
化合物IV-cの単離
化合物IV-cを、III-dを産生した上記の発酵物(すなわち、XAD-16HPの非存在下)から単離した。LC-MS(m/z = 533 [M-H]-)に基づいて標的化合物IV-cを含有する、化合物III-dの精製におけるC18クロマトグラフィーおよびプレパラティブHPLC工程からのフラクションを合わせた。該生成物プールを、27:73(v/v) アセトニトリル:水におけるプレパラティブHPLCにより精製して、1.8 mgの化合物IV-cを黄色の固形物として得た。
【００８８】
実施例 11: XAD-16HP樹脂を用いたマクロラクタムの製造
本発明者らは、発酵中における吸収性樹脂の添加がマクロラクタムの収率を向上させることを発見した。理論にとらわれず、樹脂はマクロラクタムを吸着し、それらを分解または解重合から保護すると考えられる。
【００８９】
該吸収性樹脂は好ましくは、非イオン性(官能化されていない)の、疎水性ポリマー、例えばポリスチレンまたはスチレン-ジビニルベンゼン共重合体を含む。そのような樹脂は高い浸透性であり、水性媒体からの有機分子を可逆的に吸着することができる。代表的な適した樹脂としては、Amberlite（商標）XAD 樹脂(特に、グレードXAD16、XAD-16HP、XAD7、XAD8、XAD1180、およびXAD5)、Amberchrom（商標）樹脂(特に、グレードCG161)、DIAION（商標）樹脂(特に、グレードHP20)およびSEPABEADS（商標）樹脂が挙げられる。Amberlite（商標）およびAmberchrom（商標）樹脂はRohm & Haasから入手可能であり、一方、DIAION（商標）およびSEPABEADS（商標）樹脂は三菱化学から入手可能である。該樹脂は好ましくはXAD-16HPである。当業者は、所望のタイプおよび樹脂の量を経験的に決定することが望ましいかもしれないことを理解するであろう。
【００９０】
発酵
90 gのXAD-16HP(Rohm & Haas)および200 mLの脱イオン水を含有する1Lのフラスコを、長い1/2”シリコンチューブを用いて、各々5Lのバイオリアクターに取り付け、固定した後、滅菌した。該バイオリアクターは4.5 Lの改変DeBoerビートモラセス培地を含み、121℃で60分間オートクレーブ処理した。滅菌後、該シリコンチューブを緩め、該樹脂を産生培地に添加した。次いで、該バイオリアクターに225 mLの第２次種培養を播種した。これらの発酵を、吸収性樹脂（adsorber resin）を用いない発酵に関する記載と同一の条件下で実施した。
【００９１】
化合物III-aの単離
置換開始ユニットとして3-アミノ-5-クロロ安息香酸を用いた38リットルの発酵ブロスを遠心により沈降させた。該上清を静かに移し、XAD-16HP樹脂および細胞ペレットを10 Lの100％メタノールで抽出した。該抽出物の混合を濾過し、該濾過物を1.75 LのHP-20SS吸着剤で、ステップグラジエント(3 CVの40:60(v/v) メタノール:水、3 CVの50:50(v/v) メタノール:水、3 CVの60:40(v/v)のメタノール:水、3 CVの70:30(v/v) メタノール:水、および3 CVの80:20(v/v) メタノール:水)によりクロマトグラフィー処理した。化合物III-aを含有するフラクションを合わせて、1.0 LのC18吸着剤で45:55 (v/v) メタノール:水においてクロマトグラフィー処理した。濃縮フラクションを、400 mLのC18吸着剤で30:70(v/v) アセトニトリル:水においてさらに精製し、357 mgの化合物III-aを黄色の固形物として得た。
【００９２】
化合物III-dの単離
置換開始ユニットとして3-アミノ-5-フルオロ安息香酸を用いた9リットルの発酵ブロス を遠心により沈降させた。該上清を静かに移して取っておいた。XAD-16HP樹脂および細胞ペレットを9 Lのメタノールで抽出し、濾過した。次いで、該濾過物および上清を合わせて、1.5 LのHP-20SS吸着剤でステップグラジエント(3 CVの40:60(v/v) メタノール:水、3 CVの50:50(v/v) メタノール:水、3 CVの60:40(v/v) メタノール:水、および3 CVの70:30(v/v) メタノール:水)により、クロマトグラフィー処理した。化合物III-dを含有するフラクションを合わせて、1.0 LのC18吸着剤で50:50(v/v) メタノール:水においてクロマトグラフィー処理した。濃縮フラクションを、400 mlのC18吸着剤で27:73(v/v) アセトニトリル:水においてさらに精製し、1.3 gの化合物III-dを黄色の固形物として得た。
【００９３】
化合物IV-bの単離
化合物IV-bを、XAD-16HPの存在下において化合物III-aを産生した発酵物(上記)から単離した。LC-MS(m/z = 565 [M-H]-)に基づいて標的化合物IV-bを含有する、化合物III-aの精製における最初のC18クロマトグラフィー工程からのフラクションを合わせた。該生成物プールを、400 mLのC18吸着剤で42:58(v/v) メタノール:水においてクロマトグラフィー処理した。濃縮フラクションを、27:73(v/v) アセトニトリル:水におけるプレパラティブHPLCによりさらに精製して、23 mgの化合物IV-bを黄色の固形物として得た。
【００９４】
実施例 12:マクロラクタムのキャラクタライズ
たいていの場合、置換開始ユニットのK554-161株への供給は、表2に要約される通り、マクロラクタムの混合物の産生をもたらした。(場合によって、表2に記載の通り、置換開始ユニットは市販の物質であった。)
【表２】
2010516282.tif 000031
【００９５】
産生されたマクロラクタムの分析に基づく特性を以下に提供する。
【００９６】
化合物III-a.  1H NMR (400 MHz, THF-d8, 320 K) δ 8.44 (1H, s), 7.68 (非常にブロードなs), 7.42 (1H, ブロードなs), 6.76 (1H, d, J = 2.5 Hz), 5.87 (1H, t, J = 6.5 Hz), 5.75 (2H, ブロードなs), 5.31 (1H, d, J = 10.0 Hz), 5.06 (1H, d, J = 6.0 Hz), 3.52 (1H, dd, J = 7.0, 4.0), 3.35 (3H, s), 3.32 (3H, s), 3.31 (1H, m), 3.13 (1H, dt, J = 8.0, 4.0 Hz), 2.80 (1H, dd, J = 14.0, 5.5 Hz), 2.48 (1H, dqd, J = 10.0, 7.0, 6.5 Hz), 2.44 (1H, dd, J = 14.0, 5.5 Hz), 2.31 (1H, m), 2.15 (1H, m), 1.96 (1H, m), 1.80 (3H, s), 1.68 (1H, m), 1.50 (3H, s), 1.40 (2H, m), 1.21 (1H, m), 0.99 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.88 (3H, d, J = 7.0 Hz). 13C NMR(100 MHz, THF-d8, 320 K) δ 170.7, 157.3, 148.6, 134.7, 133.5, 133.4, 132.7, 131.5, 130.2, 125.5, 120.8, 120.4, 82.6, 81.4, 80.9, 75.1, 58.7, 57.0, 37.1, 35.3, 34.6, 32.4, 30.9, 25.2, 19.8, 17.0, 13.4, 12.9.  HR-ESI-MS m/z 575.2479 [M + Na]+; 計算値 C28H41O735ClN2Na, 575.2495.
化合物III-b.  ESI-MS m/z 567.3; 計算値 C28H4035ClN2O8 [M-H]-: 567.3.
化合物III-c.  ESI-MS m/z 551.3; 計算値 C28H4035ClN2O7 [M-H]-: 551.3.
化合物III-d.  1H NMR (400 MHz, THF-d8, 330 K) δ 8.39 (1H, s), 7.96 (1H, d, J = 1.0 Hz), 7.25 (1H, d, 3JH-F =11.5 Hz), 6.63 (1H, s), 5.92 (1H, ブロードなt, J = 7.0 Hz), 5.70 (2H, ブロードなs), 5.35 (1H, d, J = 10.0 Hz), 5.08 (1H, d, J = 5.5 Hz), 3.51 (1H, dt, J = 7.0, 4.0 Hz)  3.35 (3H, s), 3.32 (3H, s), 3.32 (1H, m), 3.17 (1H, d, J = 4.0 Hz, 交換可能), 3.15 (1H, dt, J = 8.0, 4.0 Hz), 2.75 (1H, dd, J = 14.0, 6.0 Hz), 2.50 (1H, dqd, J = 10.0, 7.0, 6.5 Hz), 2.44 (1H, dd, J = 14.0, 6.0), 2.32 (1H, m), 2.17 (1H, m), 1.92 (1H, dqtd, J = 7.5. 7.0, 6.0, 5.5 Hz), 1.79 (3H, d, J = 1.0 Hz), 1.66 (1H, ddd, J = 14.0, 8.0, 5.5 Hz), 1.53 (3H, d, J = 1.5 Hz), 1.47 (2H, m), 1.29 (1H, ddd, J = 14.0, 7.5, 4.0 Hz), 0.99 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.89 (3H, d, J = 7.0 Hz); 13C NMR(100 MHz, THF-d8, 335 K) δ 170.5, 157.3, 152.2 (d, JC-F =235 Hz), 140.5 (d, JC-F = 15 Hz), 134.5, 133.9 (ブロード), 132.9, 132.4 (JC-F = 11 Hz), 120.9 (ブロード), 131.6, 131.0, 107.2 (JC-F = 23 Hz), 82.9, 81.6, 80.9, 75.4, 58.6, 57.1, 36.4, 35.2, 35.1, 32.7, 30.9, 25.3, 20.2, 16.7, 13.3, 12.9  HR-ESI-MS m/z 559.2806 [M + Na]+; 計算値 C28H41O7FN2Na, 559.2790.
化合物III-e.  ESI-MS m/z 551.3; 計算値 C28H40FN2O8 [M-H]-:  551.3.
化合物III-f.  ESI-MS m/z 535.3; 計算値 C28H40FN2O7 [M-H]-:  535.3.
化合物III-g.  ESI-MS m/z 531.3; 計算値 C29H43N2O7 [M-H]-:  531.3.
化合物III-h.  HR-ESI-MS m/z 525.2950; 計算値 C28H42N2O6Na [M+Na]+:  525.2935.
化合物III-i.  HR-ESI-MS m/z 541.2880; 計算値 C28H42N2O7Na [M+Na]+:  541.2884.
化合物III-j.  ESI-MS m/z 551.3; 計算値 C28H4035ClN2O7 [M-H]-:  551.3.
化合物III-k.  ESI-MS m/z 535.3; 計算値 C28H40FN2O7 [M-H]-:  535.3.
化合物III-l.  ESI-MS m/z 519.3; 計算値 C28H40FN2O6 [M-H]-:  519.3.
化合物III-m.  ESI-MS m/z 535.3; 計算値 C28H40FN2O7 [M-H]-:  535.3.
化合物III-n.  ESI-MS m/z 535.3; 計算値 C28H40FN2O7 [M-H]-:  535.3.
化合物III-o.  ESI-MS m/z 519.3; 計算値 C28H40FN2O6 [M-H]-:  519.3.
化合物III-p. ESI-MS m/z 517.3; 計算値 C28H42N2O7 [M-H]-: 517.3.
化合物III-q. ESI-MS m/z 567.3; 計算値 C28H41ClN2O8 [M-H]-: 567.3.
化合物IV-a.  HR-ESI-MS m/z 539.2749; 計算値 C28H40N2O7Na [M+Na]+:  539.2728.
化合物IV-b.  HR-ESI-MS m/z 589.2299; 計算値 C28H3935ClN2O8Na [M+Na]+:  589.2287.  1H NMR (400 MHz, THF-d8, 335 K) δ 8.37 (1H, s), 7.98 (1H, ブロードなs), 7.72 (1H, ブロードなs), 6.97 (1H, ブロードなd, J = 11.5 Hz), 6.46 (1H, td, J = 11.5, 1.5 Hz), 5.8-5.2 (4H, m), 5.00 (1H, d, J = 1.5 Hz), 4.34 (1H, d, J = 9.5 Hz), 3.35 (1H, m), 3.33 (3H, s), 3.15 (3H, s), 2.85 (1H, dd, J = 13.5, 9.0), 2.77 (1H, m), 2.64 (1H, dd, J = 13.5, 3.0 Hz), 1.88 (3H, d, < 1.0 Hz), 1.88 (1H, 重複), 1.73 (3H, s), 0.98 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.93 (3H, d, J = 7.0 Hz).  13C NMR(100 MHz, THF-d8, 335 K) δ 168.5, 157.3, 147.8, 145.8, 137.2, 134.9, 134.6, 133.3, 127.3, 125.8, 122.7, 118.2, 117.8, 111.6, 82.4, 82.1, 81.9, 75.4, 57.0, 56.5, 36.3, 34.1, 33.7, 30.3, 23.2, 13.1, 12.8, 12.7.
化合物IV-c.  ESI-MS m/z 533.3; 計算値 C28H38FN2O7 [M-H]-:  533.3.
化合物IV-d. ESI-MS m/z 515.3; 計算値 C28H40N2O7 [M-H]-: 515.3.
【００９７】
実施例 13: 癌細胞増殖の阻害
本発明のマクロラクタムの癌細胞の増殖を阻害する能力を、上記のPatelの方法を用いて評価した。その結果を表3に表す。MCF-7、SKBr3、MX-1、BT-474、およびNCI/ADRはヒト乳癌細胞株であり、後者は多剤耐性である。SKOV3はヒト卵巣癌細胞株である。K-562はヒト白血病細胞株(慢性骨髄性白血病、もしくはCML)である。RPMI-8226は別のヒト白血病細胞株(骨髄腫)である。MV-4-11はさらに別のヒト白血病細胞株(急性骨髄性白血病もしくはAML)である。HCT-116、HT-29、およびCOLO 205はヒト結腸癌細胞株である。比較のため、従来技術の化合物17-AAGおよび17-DMAGのデータもまた含む。アッセイを複数回実施した場合には、測定値の範囲を提示する。
【表３】
2010516282.tif 000032
【表４】
2010516282.tif 000033
【００９８】
該データは、本発明の化合物が癌細胞に対する生物活性化合物であり、とりわけ化合物III-a、III-dおよびIV-bは、概して、試験された癌細胞株に対して17-AAGおよび17-DMAGと同じくらい効果があることを示す。
【００９９】
実施例 14: 有効性およびNQO1活性
上記の通り、Hsp90インヒビターとしての増強された活性のために、キノン酸化状態においてゲルダナマイシン誘導体は、酵素NQO1に依存してそれらをそのヒドロキノン誘導体 に還元する。しかしながら、いくつかの癌細胞はNQO1活性を欠いており、従ってキノンからヒドロキノンへの変換をもたらすことができない。本発明のマクロラクタムはNQO1-依存でないため、そのような癌細胞株に対して有効であろう。この予想を、マクロラクタムIII-a、マクロラクタムIII-d、マクロラクタムIV-b、17-AAG、および17-DMAGを前述の実施例と同一の方法を用いてNQO1-欠損乳癌(MDA-468)および肺癌(NCI-H596)細胞に対する阻害効果について比較した表4に示す結果により確認した。データが示す通り、本発明のマクロラクタムは実質的により有効である。
【表５】
2010516282.tif 000034
【０１００】
異なる実験によっても同一の結論がもたらされる。17-AAG、17-DMAG、化合物III-a、および化合物III-dを、SKBr3およびMCF7癌細胞(上記の実施例12参照)（その両方ともNQO1を発現する）に対して、NQO1の公知のインヒビターであるジクマロールを添加および添加せずに試験した。ジクマロールの存在下においては、17-AAGおよび17-DMAGのHsp90阻害活性は約1桁低下したが、一方、化合物III-aおよびIII-dの阻害活性は実質的に変化がなかった。該結果を表5に示す。
【表６】
2010516282.tif 000035
【０１０１】
従って、前述の結果は、本発明の化合物(特に化合物III-a、III-d、およびIV-b)が、例えば癌、とりわけ乳癌、卵巣癌、肺癌、白血病(特にCML、骨髄腫およびAML)および結腸癌といった過剰増殖性疾患の治療における使用に適していることを示す。
【０１０２】
実施例 15: クライアントタンパク質における効果
Hsp90インヒビターとしての本発明のマクロラクタムの活性を、Hsp90クライアントタンパク質およびHsp90阻害により誘導されたタンパク質においてそれらへの曝露効果をモニターすることにより確認した。対照としての17-AAGとともに、SKBr3乳癌細胞を連続的に1 μM試験化合物に曝露した場合の結果を図5に示す。Munster et al., Cancer Research 2002, 62, 3132-3137に記載の方法を用いた。
【０１０３】
ErbB2タンパク質はHsp90クライアントタンパク質であり、それ自体はHsp90阻害において間接的に阻害される(Schnur et al., J. Med. Chem. 1995, 38 (19), 3813-3820)。図5の一番上のゲル像は、17-AAGのように、マクロラクタムIII-aおよびマクロラクタムIII-dがErbB2を阻害したことを示す。熱ショックタンパク質-70(「Hsp70」)、シャペロン機能を果たす別のタンパク質は、Hsp90の阻害において誘導されるタンパク質である(Brodsky & Chiosis, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6 (11), 1215-1225)。従って、Hsp70の誘導は、Hsp90の阻害に対するマーカーとして用いることができる。図5の真ん中のゲル像は、ちょうど17-AAGによるのと同様に、Hsp70がマクロラクタムIII-aおよびマクロラクタムIII-dにより誘導されたことを示す。従って、本発明のマクロラクタムは、公知のHsp90インヒビター17-AAGのような作用の同一のメカニズムを明らかに有する。(3列目はグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)の濃度を示す。GAPDHは解糖に関与する酵素であり、構造的に全ての細胞で発現しており、ウエスタンブロッティング実験におけるローディングコントロールとしての選択マーカーである。)
【０１０４】
本発明の前述の詳細な説明は、本発明の特定の部分または態様に、主にまたは独占的に関与している一節を含む。これは明確性および便宜のためであり、具体的な特徴が開示されている一節のみではなくそれ以上に関連してもよく、本明細書における開示は異なる一節に認められる情報の適当な組み合わせの全てを含むことが理解される。同様に、本明細書の様々な図面および説明は本発明の特定の実施態様に関連するけれども、特定の特徴が具体的な図面または実施態様の範囲内で開示される場合、そのような特徴は適用の範囲内で、別の図面または実施態様の範囲内で、別の特徴と組み合わせて、あるいは本発明の通例において用いることができると理解される。
【図１】
2010516282.tif 000054
【図２】
2010516282.tif 000055
【図３】
2010516282.tif 000056
【図４】
2010516282.tif 000057
【図５】
2010516282.tif 000058
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月1日(2009.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
【化１】
2010516282.tif 000059
［式中、
XはH、Cl、F、またはOMeであり;
R1、R2、およびR3は独立してHまたはOHであり;および、
R4およびR5は各々Hであるか、または合わさって結合を形成するが;
但し、(i)R1、R2、およびR3のうち少なくとも１つはHであり、(ii)部分：
【化２】
2010516282.tif 000060
は、
【化３】
2010516282.tif 000061
以外である］
により表される構造を有する化合物。
【請求項２】
式I-aまたはI-b:
【化４】
2010516282.tif 000062
により表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
XがClまたはFである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式I-aの部分：
【化５】
2010516282.tif 000063
が、
【化６】
2010516282.tif 000064
からなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
式III-aまたはIII-d:
【化７】
2010516282.tif 000065
により表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式IV-a、IV-b、またはIV-c:
【化８】
2010516282.tif 000066
により表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
式I-c：
【化９】
2010516282.tif 000067
により表される構造を有する化合物の製造方法であって、工程：
(a) 式IIまたはII-a：
【化１０】
2010516282.tif 000068
により表される構造を有する化合物を、3-アミノ-5-ヒドロキシ安息香酸の産生能力はないがゲルダナマイシンの合成のための無傷の遺伝子クラスターを有するストレプトマイセス・ハイグロスコピカスgeldanus変種 NRRL 3602株の培地に添加すること、および、
(b) 式I-cにより表される構造を有する化合物を産生する条件下で該培地を発酵させることを含み、
式中、
XはH、Cl、F、またはOMeであり;
R6、R7、およびR8は独立してHまたはOHであり;そして、
R9およびR10は各々Hであるか、または合わさって結合を形成するが;
但し、R6、R7、およびR8の少なくとも１つはHである、
該製造方法。
【請求項８】
式IIまたはII-aにより表される構造を有する化合物が、
【化１１】
2010516282.tif 000069
からなる群から選択される、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
工程(a)における化合物が、式IIにより表される構造を有し、該構造は、
【化１２】
2010516282.tif 000070
である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１０】
工程(a)における化合物が、式IIで表される構造を有し、XがFまたはClであり、該ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスgeldanus変種 NRRL 3602株がK554-161株であり、該培地の発酵が吸収性樹脂の存在下で行われる、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１１】
過剰増殖性疾患の治療用医薬の製造における、請求項１から６のいずれかひとつに記載の化合物の使用。
【請求項１２】
該過剰増殖性疾患がNAD(P)H:キノン酸化還元酵素1の活性が欠乏した細胞により確認される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
該過剰増殖性疾患が乳癌、卵巣癌、白血病、大腸癌、または肺癌である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
該化合物が、式III-aまたは式III-d:
【化１３】
2010516282.tif 000071
により表される構造を有する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
医薬的に許容される賦形剤および請求項１から６に記載の化合物を含有する医薬組成物。
【国際調査報告】
2010516282.tif 000072