(57)【要約】  本発明は、（ｉ）バチルス・リケニフォルミス細胞を提供するステップと、（ii）脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列でバチルス・リケニフォルミス細胞を形質転換するステップと、（iii）プロモーター配列の制御下で前記細胞において脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるステップとを含む、脂質アシルトランスフェラーゼの製造方法に関する。本発明はさらに、脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるためのバチルス・リケニフォルミスの使用、異種の脂質アシルトランスフェラーゼを含むバチルス・リケニフォルミス宿主細胞、及びバチルス・リケニフォルミスと相同性を有するプロモーター配列に作動可能に連結された脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクターに関する。
2010516271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）バチルス・リケニフォルミス細胞を提供するステップと、
（ii）脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列でバチルス・リケニフォルミス細胞を形質転換するステップと、
（iii）プロモーター配列の制御下で前記細胞において脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるステップと
を含む、脂質アシルトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項２】
プロモーター配列が、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と天然には結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする前記異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
脂質アシルトランスフェラーゼを単離／回収する追加のステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーター配列が宿主細胞と同種である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーター配列が、α−アミラーゼプロモーター配列、プロテアーゼプロモーター配列、サブチリシンプロモーター配列、グルタミン酸特異的プロテアーゼプロモーター配列及びレバンスクラーゼプロモーター配列からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記プロモーター配列が、α−アミラーゼプロモーター配列である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、ＧＤＳｘモチーフ及び／又はＧＡＮＤＹモチーフを含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１又は複数である）を含む酵素であることを特徴とする脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、１又は複数の以下の属、即ち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デスルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルホロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソリゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダに属する生物から得ることができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、アエロモナス属に属する生物から得ることができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号３５で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のＮ−８０に対応する位置にアスパラギン酸残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１６で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
異種の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むバチルス・リケニフォルミス宿主細胞。
【請求項１６】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、ＧＤＳｘモチーフ及び／又はＧＡＮＤＹモチーフを含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１又は複数である）を含む酵素であることを特徴とする脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１５又は１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
脂質アシルトランスフェラーゼが、１又は複数の以下の属、即ち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デスルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルホロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソリゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダに属する生物から得ることができる、請求項１５〜１７のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１９】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、アエロモナス属に属する生物から得ることができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１５〜１７のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２０】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号３５で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のＮ−８０に対応する位置にアスパラギン酸残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１５〜１９のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２１】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１６で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１５〜２０のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２２】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１５〜２１のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２３】
異種の脂質アシルトランスフェラーゼの製造におけるバチルス・リケニフォルミス宿主細胞の使用。
【請求項２４】
バチルス・サブチリス宿主細胞での発現と比べて発現が増加する、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
バチルス・リケニフォルミスと同種のプロモーター配列に作動可能に連結された脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項２６】
プロモーターが、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と天然には結合しない、請求項２５に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項２５又は２６に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
プロモーター配列が、α−アミラーゼプロモーター配列、プロテアーゼプロモーター配列、サブチリシンプロモーター配列、グルタミン酸特異的プロテアーゼプロモーター配列及びレバンスクラーゼプロモーター配列からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２９】
プロモーター配列がα−アミラーゼプロモーター配列である、請求項１〜２８のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項３０】
（ｉ）バチルス・サブチリス以外のバチルス細胞を提供するステップと、
（ii）脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列で、バチルス・サブチリス以外のバチルス細胞を形質転換するステップと、
（iii）プロモーター配列の制御下で前記細胞において脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるステップと
を含む、脂質アシルトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項３１】
異種の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、バチルス・サブチリス以外の細胞であるバチルス宿主細胞。
【請求項３２】
異種の脂質アシルトランスフェラーゼの製造における、バチルス・サブチリス以外のバチルス宿主細胞の使用。
【請求項３３】
実施例及び図面を参照して本明細書に実質的に記載された使用。
【請求項３４】
実施例及び図面を参照して本明細書に実質的に記載された発現ベクター。
【請求項３５】
実施例及び図面を参照して本明細書に実質的に記載されたバチルス・リケニフォルミス宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
以下の関連出願、即ち、米国特許出願第２００２−０００９５１８号明細書、米国特許出願第２００４−００９１５７４明細書、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット、国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレット、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット、国際公開第２００５／０６６３５１号パンフレット、２００６年２月２日に出願した米国仮出願第６０／７６４，４３０号及び国際公開第２００６／００８５０８号パンフレットを参照されたい。これらの各出願、及びこれらの各出願において引用された各文献（「出願引用文献」）、及び出願引用文献において文中で又はこれらの出願の審査手続の間で参照又は引用された各文献、並びにこのような審査手続中に提出された特許性を支持するすべての主張は、参照により本明細書に組み込まれる。様々な文献が本明細書でも引用されている（「本明細書引用文献」）。各本明細書引用文献、及び本明細書引用文献中で引用又は参照された各文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
［技術分野］
【０００２】
本発明は脂質アシルトランスフェラーゼの製造に関する。特に、バチルス（Bacillus）宿主細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）宿主細胞において脂質アシルトランスフェラーゼを発現させることにより脂質アシルトランスフェラーゼを製造する方法。加えて、本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるためのバチルス（好ましくはバチルス・リケニフォルミス）の使用、及び脂質アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をゲノム中に含むバチルス宿主細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
脂質アシルトランスフェラーゼは、食品への適用において有利であることが知られている。脂質アシルトランスフェラーゼは、食品中で著しいアシルトランスフェラーゼ活性を有することが見出された。この活性は、食品の調製方法において驚くべき有益な用途を有する。
【０００４】
例えば、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレットは、脂質アシルトランスフェラーゼの使用による乳化剤のインサイチュでの製造方法、及びこれに伴う利点を開示している。
【０００５】
したがって、脂質アシルトランスフェラーゼの商業的な製造方法が必要とされる。
【０００６】
しかし、一般に、遺伝子は異種宿主で発現させることが難しい場合があり、宿主細胞での脂質アシルトランスフェラーゼの発現は難題となり得る。
【０００７】
国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレットは、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）及び大腸菌（Escherichia Coli）での２種類のアエロモナス（Aeromonas）脂質アシルトランスフェラーゼの発現を開示する。しかし、バチルス・サブチリスでの発現は低く、一方、大腸菌はＧＲＡＳ生物ではないため、食品産業で使用される酵素の宿主には適さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
米国特許第６，２５５，０７６号明細書は、バチルス宿主細胞でポリペプチドを製造する方法を開示する。しかし、このような方法は、各プロモーター配列がポリペプチド配列をコードする核酸配列のシングルコピーに作動可能に連結されているタンデムプロモーターの使用を必要とする。したがって、脂質アシルトランスフェラーゼの改善された製造方法が当技術分野では必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様は、特許請求の範囲及び以下の説明に提示される。
【００１１】
本発明の一態様は、
（ｉ）宿主細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス細胞であるバチルス宿主細胞を提供するステップと、
（ii）脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列で、宿主細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス細胞であるバチルス宿主細胞を形質転換するステップと、
（iii）プロモーター配列の制御下で細胞において脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるステップと
を含む、脂質アシルトランスフェラーゼの製造方法に関する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、異種の脂質アシルトランスフェラーゼを含むバチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス宿主細胞であるバチルス宿主細胞に関する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、異種の脂質アシルトランスフェラーゼの製造におけるバチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス宿主細胞であるバチルス宿主細胞の使用に関する。
【００１４】
適切には、バチルス・サブチリス以外の宿主であり、好ましくはバチルス・リケニフォルミスであるバチルス宿主での発現により、バチルス・サブチリスでの発現と比べて発現が増加し得る。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、適切な宿主又は宿主細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス以外の宿主（又は細胞）であるバチルス宿主（又は細胞）、好ましくはバチルス・リケニフォルミス又はバチルス・リケニフォルミス細胞において、調節配列が、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現できるように、１又は複数の調節配列に作動可能に連結された脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００１６】
適切には、脂質アシルトランスフェラーゼは、組換え脂質アシルトランスフェラーゼであってよい。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の第１の態様では、
（ｉ）宿主細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス細胞であるバチルス宿主細胞を提供するステップと、
（ii）脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列で、宿主細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス細胞であるバチルス宿主細胞を形質転換するステップと、
（iii）プロモーター配列の制御下で細胞において脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるステップと
を含む、脂質アシルトランスフェラーゼの製造方法が提供される。
【００１８】
さらに、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする前記異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結していてよい。
【００１９】
適切には、本発明の方法はさらに、脂質アシルトランスフェラーゼを単離／回収する追加のステップを含んでよい。
【００２０】
別の態様では、本発明は、異種の脂質アシルトランスフェラーゼを含むバチルス・リケニフォルミス宿主細胞に関する。
【００２１】
適切には、脂質アシルトランスフェラーゼは、組換え脂質アシルトランスフェラーゼであってよい。
【００２２】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用に応じて用いられるプロモーター配列は、宿主細胞と同種であってよい。「宿主細胞と同種である」とは宿主生物由来であること、即ち、宿主生物に自然に見出されるプロモーター配列を意味する。適切には、プロモーター配列は、α−アミラーゼプロモーター、プロテアーゼプロモーター、サブチリシンプロモーター、グルタミン酸特異的プロテアーゼプロモーター及びレバンスクラーゼプロモーターをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択することができる。適切には、プロモーター配列は、ＬＡＴ（例えばＡｍｙＬとしても知られる、バチルス・リケニフォルミス由来のα−アミラーゼプロモーター）、ＡｐｒＬ（例えばサブチリシンカールスバーグプロモーター（Carlsberg promoter））、ＥｎｄｏＧｌｕｃ（例えばバチルス・リケニフォルミス由来のグルタミン酸特異的プロモーター）、ＡｍｙＱ（例えばバチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）アルファ−アミラーゼプロモーター由来のアルファ−アミラーゼプロモーター）及びＳａｃＢ（例えばバチルス・サブチリスレバンスクラーゼプロモーター）をコードするヌクレオチド配列であってよい。
【００２３】
本発明の一実施形態では、プロモーター配列は、アルファアミラーゼプロモーターの−３５〜−１０配列、好ましくはバチルス・リケニフォルミスα−アミラーゼプロモーターの−３５〜−１０配列である。「−３５〜−１０配列」は、転写開始部位に対する位置を示す。「−３５」及び「−１０」はいずれも、ボックス、即ちいくつかのヌクレオチドであり、それぞれが６個のヌクレオチドを含み、これらのボックスは１７個のヌクレオチドで隔てられている。これらの１７個のヌクレオチドはしばしば「スペーサー」と呼ばれる。これは図５５に図示されており、−３５及び−１０ボックスに下線が引かれている。誤解を避けるため、「−３５〜−１０配列」が本明細書で使用される場合、これは−３５ボックスの開始から−１０ボックスの終わり、即ち−３５ボックス、１７個のヌクレオチド長スペーサー及び−１０ボックスを共に含む配列を指す。
【００２４】
いくつかの態様では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ＧＤＳｘモチーフ及び／又はＧＡＮＤＹモチーフを含み得る。
【００２５】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１又は複数である）を含む酵素であることを特徴とする。
【００２６】
適切には、本発明のベクター、宿主細胞、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、１又は複数の以下の属、即ち、アエロモナス、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、ラクトコッカス（Lactococcus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、デスルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、バチルス、カンピロバクター（Campylobacter）、ビブリオナシエ（Vibrionaceae）、キシレラ（Xylella）、スルホロブス（Sulfolobus）、アスペルギルス（Aspergillus）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、リステリア（Listeria）、ナイセリア（Neisseria）、メソリゾビウム（Mesorhizobium）、ラルストニア（Ralstonia）、ザントモナス（Xanthomonas）及びカンジダ（Candida）に属する生物から得ることができ、好ましくは得られる。好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、アエロモナス属由来の生物から得ることができ、好ましくは得られる。
【００２７】
本発明のいくつかの態様では、本発明のベクター、宿主細胞、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のＮ−８０に対応する位置にアスパラギン酸残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【００２８】
さらに又は別法として、本発明のベクター、宿主細胞、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列、又はこれと７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【００２９】
本明細書では用語「異種の」とは、別個の遺伝源又は種に由来する配列を意味する。異種配列は、非宿主配列、修飾配列、異なる宿主細胞株由来の配列、又は宿主細胞の異なる染色体位置由来の相同配列である。
【００３０】
「同種」配列は、同じ遺伝源又は種で見出される、即ち宿主細胞の関連種において自然発生する配列である。
【００３１】
本明細書では用語「組換え脂質アシルトランスフェラーゼ」とは、脂質アシルトランスフェラーゼが遺伝子組換えにより製造されたことを意味する。例えば、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、クローニングベクターに挿入され、異種の脂質アシルトランスフェラーゼの存在を特徴とするバチルス・リケニフォルミス細胞をもたらす。
【００３２】
宿主細胞
本発明の一実施形態では、本発明の方法及び／又は使用に用いる宿主細胞は、バチルス・リケニフォルミス宿主細胞である。
【００３３】
バチルス・リケニフォルミス宿主細胞の使用は、バチルス・サブチリスなど他の生物と比べて脂質アシルトランスフェラーゼの発現が増加することが見出されている。
【００３４】
アエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）由来の脂質アシルトランスフェラーゼは、バチルス・サブチリス、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）及びアスペルギルス・ツビゲンシス（Aspergillus tubigensis）での発現にそれぞれ最適となるように設計された、いくつかの従来の発現ベクターに挿入された。しかし、ハンゼヌラ・ポリモルファ、シゾサッカロミセス・ポンベ及びアスペルギルス・ツビゲンシスでは、きわめて低いレベルのみが検出された。発現レベルは１μｇ／ｍｌ未満であり、量産を始めるのに十分なタンパク質を産出する細胞を検出することはできなかった（結果は示さず）。反対に、バチルス・リケニフォルミスは、経済的に実現可能な生産にとって魅力的なタンパク質レベルを製造することができた。
【００３５】
特に、バチルス・リケニフォルミスでの発現は、ａｐｒＥプロモーター制御下でのバチルス・サブチリスにおける発現より約１００倍高く、又はＡ４プロモーター制御下でのストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）における発現より約１００倍高く、セルロースに融合されることが見出された（本明細書では結果は示さず）。
【００３６】
別の実施形態では、宿主細胞はバチルス・サブチリス以外のいずれかのバチルス細胞であってよい。好ましくは、前記バチルス宿主細胞は、以下の種、即ち、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アルカロフィラス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・クラウジ（B. clausii）、バチルス・コアグランス（B. coagulans）、バチルス・フィルムス（B. firmus）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・プミルス（B. pumilus）又はバチルス・ステアロサーモフィルスの１つに由来する。
【００３７】
本発明に関して、用語「宿主細胞」には、本明細書に記載されている脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列又は上述のような発現ベクターのいずれかを含む、本明細書に定義されている特定の特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼの組換え生産に使用される、任意の細胞が含まれる。
【００３８】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドを発現するヌクレオチド配列を含む（例えばヌクレオチド配列で形質転換された又はこれをトランスフェクトされた）宿主細胞を提供する。
【００３９】
適切には、いくつかの実施形態では、宿主細胞はプロテアーゼ欠損若しくはプロテアーゼ陰性株、及び／又はα−アミラーゼ欠損若しくはα−アミラーゼ陰性株であってよい。
【００４０】
調節配列
いくつかの適用では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ配列は、選択された宿主細胞（バチルス・リケニフォルミス細胞など）などによって、ヌクレオチド配列の発現を提供することができる調節配列に作動可能に連結することができる。
【００４１】
一例として、本発明は、こうした調節配列に作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを含む。即ち、前記ベクターは発現ベクターである。
【００４２】
用語「作動可能に連結された」とは、記載された構成要素が意図された様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に連結された」調節配列は、制御配列に適合する条件下で前記コード配列の発現が達成されるように連結(ligate)される。
【００４３】
用語「調節配列」には、プロモーター及びエンハンサー及び他の発現調節シグナルが含まれる。
【００４４】
用語「プロモーター」は、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位など、当技術分野の通常の意味で使用される。
【００４５】
本明細書に定義されている特定の特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現増強はまた、本来は前記酵素をコードするヌクレオチド配列に対する調節領域ではない、例えばプロモーター領域、分泌リーダー領域及びターミネーター領域などの調節領域を選択して達成することもできる。
【００４６】
適切には、本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に連結することができる。
【００４７】
適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ターミネーター配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。本発明のベクター、宿主細胞、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる適切なターミネーター配列の例には、α−アミラーゼターミネーター配列（例えば、CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA（配列番号６４））、アルカリプロテアーゼターミネーター配列（例えば、CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA（配列番号６５））、グルタミン酸特異的ターミネーター配列（例えば、ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATTGT（配列番号６６））、レバナーゼターミネーター配列（例えば、TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT（配列番号６７））及びサブチリシンＥターミネーター配列（例えば、GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG）が含まれる。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、バチルス・リケニフォルミスα−アミラーゼターミネーターなど、α−アミラーゼターミネーターに作動可能に連結することができる。
【００４８】
プロモーター
本発明により使用されるプロモーター配列は、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列にとって異種又は同種であってよい。
【００４９】
前記プロモーター配列は、最適な宿主細胞において脂質アシルトランスフェラーゼの発現を誘導することができる任意のプロモーター配列であってよい。
【００５０】
適切には、前記プロモーター配列は、バチルス種、例えばバチルス・リケニフォルミスと同種であってよい。好ましくは、プロモーター配列は最適な宿主細胞と同種である。
【００５１】
本発明での使用に適切なプロモーター配列には、バチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス・リケニフォルミスサブチリシン遺伝子のプロモーター、バチルス・サブチリスサブチリシン遺伝子のプロモーター、バチルス・リケニフォルミスアルカリプロテアーゼ遺伝子（サブチリシンカールスバーグ遺伝子）のプロモーター、バチルス・リケニフォルミスグルタミン酸特異的プロテアーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス・アミロリクエファシエンスアルファ−アミラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス・サブチリスレバンスクラーゼのプロモーター、及びアルファ−アミラーゼ遺伝子の「−３５」領域に対し配列TTGACAを、「−１０」領域に対し配列TATAATを有する「コンセンサス」プロモーター（即ち−３５〜−１０プロモーター）が含まれる。
【００５２】
本発明の方法において核酸配列の転写を誘導するのに適切なプロモーターのその他の例には、バチルス・レンタスアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＨ）のプロモーター、バチルス・サブチリスアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・リケニフォルミスペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）のプロモーター、バチルス・サブチリスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター、及び／又はバチルス・チューリンゲンシス亜種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis）ＣｒｙIIIＡ遺伝子のプロモーターが含まれる。
【００５３】
好ましい実施形態では、プロモーター配列はα−アミラーゼプロモーター（バチルス・リケニフォルミスα−アミラーゼプロモーターなど）である。好ましくは、プロモーター配列は、バチルス・リケニフォルミスα−アミラーゼプロモーターの−３５〜−１０配列を含む（図５３及び５５参照）。
【００５４】
シグナルペプチド
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現により宿主細胞により生成される脂質アシルトランスフェラーゼは、使用される配列及び／又はベクターに応じて細胞内に分泌又は含有され得る。
【００５５】
シグナル配列は、特定の細胞膜を介したコード配列の分泌を誘導するのに使用することができる。シグナル配列は、脂質アシルトランスフェラーゼコード配列に対し天然性又は外来性であってよい。例えば、シグナルペプチドコード配列は、バチルス種由来、好ましくはバチルス・リケニフォルミス由来のアミラーゼ又はプロテアーゼ遺伝子から得ることができる。
【００５６】
適切なシグナルペプチドコード配列は、以下の遺伝子、即ち、マルトジェニックα−アミラーゼ遺伝子、サブチリシン遺伝子、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子、中性プロテアーゼ遺伝子、ｐｒｓＡ遺伝子、及び／又はアシルトランスフェラーゼ遺伝子の１又は複数から得ることができる。
【００５７】
好ましくは、シグナルペプチドは、バチルス・リケニフォルミスα−アミラーゼ、アエロモナスアシルトランスフェラーゼ（例えば、mkkwfvcllglialtvqa（配列番号２１））、バチルス・サブチリスサブチリシン（例えば、mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa（配列番号２２））又はバチルス・リケニフォルミスサブチリシン（例えば、mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa（配列番号２３））のシグナルペプチドである。適切には、シグナルペプチドは、バチルス・リケニフォルミスα−アミラーゼのシグナルペプチドであってよい。
【００５８】
しかし、発現した脂質アシルトランスフェラーゼを選択したバチルス宿主細胞（好ましくはバチルス・リケニフォルミス宿主細胞）の分泌経路に誘導することができる、任意のシグナルペプチドコード配列を用いるのがよい。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態では、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最適な脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。
【００６０】
最適な脂質アシルトランスフェラーゼは、本明細書に定義されている宿主細胞において融合タンパク質として発現することができる。
【００６１】
発現ベクター
用語「発現ベクター」は、インビボ又はインビトロで発現することができる構築物を意味する。
【００６２】
好ましくは、発現ベクターは、バチルス・リケニフォルミス宿主などの生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれた」は、好ましくはゲノムへの安定な組み込みを含む。
【００６３】
本明細書に定義されている脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、調節配列が適切な宿主生物（バチルス・リケニフォルミスなど）にヌクレオチド配列を発現させることができるように、前記ヌクレオチド配列が調節配列に作動可能に連結されているベクターにおいて存在し得る。即ち、ベクターは発現ベクターである。
【００６４】
本発明のベクターは、本明細書に定義されている脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を提供するため、上述のような適切な宿主細胞に形質転換することができる。
【００６５】
例えばプラスミド、コスミド、ウイルス又はファージベクター、ゲノムインサートなど、ベクターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞によってしばしば決まる。本発明は、同等の機能を果たす、及び同等の機能である、又は同等の機能になる、当技術分野で既知の、発現ベクターの他の形態を含むことができる。
【００６６】
最適な宿主細胞に形質転換されると、前記ベクターは、宿主細胞のゲノムとは無関係に複製及び機能することができ、又はゲノムにそれ自体を組み込むことができる。
【００６７】
ベクターは、１又は複数の選択可能なマーカー遺伝子（抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与える遺伝子など）を含有することができる。或いは、選択は、（国際公開第９１／１７２４３号パンフレットに記載されている）同時形質転換により実現することができる。
【００６８】
ベクターは、例えばＲＮＡ生成のためインビトロで使用する、又は宿主細胞をトランスフェクト若しくは形質転換するのに使用することができる。
【００６９】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、ヌクレオチド配列を複製可能なベクターに導入し、そのベクターを適合する宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下でその宿主細胞を増殖させることにより、本発明のベクター、宿主細胞、他の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる、本発明のヌクレオチド配列又は本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【００７０】
ベクターは、さらに、ベクターの当該宿主細胞での複製を可能にするヌクレオチド配列を含むことができる。こうした配列の例は、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1及びpIJ702の複製起点である。
【００７１】
脂質アシルトランスフェラーゼ
本発明の方法、ベクター及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、天然脂質アシルトランスフェラーゼ又は変異体脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【００７２】
例えば、本発明で用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット、国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレット、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット、又は国際公開第２００６／００８５０８号パンフレットに記載されているものであってよい。これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
本明細書では用語「脂質アシルトランスフェラーゼ」は、好ましくは（一般にＥ．Ｃ．２．３．１．ｘ、例えば２．３．１．４３に分類される）アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を意味する。アシルトランスフェラーゼ活性により、酵素はアシル基を脂質から、以下の、即ち、ステロール、スタノール、糖質、タンパク質、タンパク質サブユニット、アスコルビン酸及び／又はグリセロールなどの糖アルコール−好ましくはグリセロール及び／又はコレステロールなどのステロールの１又は複数など、１又は複数のアクセプター基質へ転移させることができる。
【００７４】
好ましくは、本発明のベクター、宿主細胞、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、（本明細書に定義されている）リン脂質からアスコルビン酸及び／又はグリセロールなどの糖アルコール、最も好ましくはグリセロールへアシル基を転移させることができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【００７５】
いくつかの態様では本発明による「アシルアクセプター」は、例えば、グリセロールを含む多価アルコール；ステロール；スタノール；糖質；フルーツ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、及びアスコルビン酸を含むヒドロキシ酸；例えばアミノ酸、タンパク質加水分解物及びペプチド（部分的に加水分解されたタンパク質）などのタンパク質又はこのサブユニット；及びこれらの混合物及び誘導体など、ヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む任意の化合物であってよい。好ましくは、本発明による「アシルアクセプター」は水ではない。好ましくは、本発明による「アシルアクセプター」は、ポリオール、最も好ましくはグリセロールなどの糖アルコールである。本発明の目的のためにはアスコルビン酸も糖アルコールと見なされる。
【００７６】
アシルアクセプターは、好ましくはモノグリセリドではない。
【００７７】
アシルアクセプターは、好ましくはジグリセリドではない。
【００７８】
一態様では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、アシル基を脂質からグリセロールへ転移させることができるだけでなく、さらに、アシル基を脂質から以下の、即ち、糖質、タンパク質、タンパク質サブユニット、ステロール及び／又はスタノールの１又は複数へ転移させることもでき得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。好ましくは、前記脂質アシルトランスフェラーゼは、アスコルビン酸及び／又はグリセロールなどの糖アルコール、最も好ましくはコレステロール、及び／又は植物ステロール／スタノールなどのステロールの両方へ転移させることができる。
【００７９】
好ましくは、脂質アシルが作用する脂質基質は、以下の脂質、即ち、レシチンなどのリン脂質、例えばホスファチジルコリンの１又は複数である。
【００８０】
この脂質基質は、本明細書では「脂質アシル供与体」と呼ばれる場合がある。本明細書ではレシチンという用語は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルグリセロールを包含する。
【００８１】
いくつかの態様では、好ましくは本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリド及び／又は２−モノグリセリドに作用することができない、又は作用することが実質的にできない脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【００８２】
いくつかの態様では、好ましくは本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さない、又は著しいトリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さない脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【００８３】
トリグリセリドを加水分解する能力（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３活性）は、リパーゼ活性により決定することができ、オリーブ油及びｐＨ６．５の代わりにヒマワリ油及びｐＨ５．５に修正した食品化学規格（Food Chemical Codex） (3rd Ed., 1981, pp 492-493)により決定される。リパーゼ活性は、リパーゼ単位ヒマワリ（ＬＵＳ， lipase units sunflower）として測定される（１ＬＵＳは、上記アッセイ条件下でヒマワリ油から１分あたり１［ｍｕ］ｍｏｌの脂肪酸を放出することができる酵素量として定義される）。或いは国際公開第９８４５４５３号パンフレットに定義されているＬＵＴアッセイを使用することができる。この参照は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、トリグリセリドに作用することが実質的にできない、１０００未満のＬＵＳ／ｍｇ、例えば５００未満（３００未満など）、好ましくは２００未満、より好ましくは１００未満、より好ましくは５０未満、より好ましくは２０未満、より好ましくは１０未満（５未満、２未満など）、より好ましくは１未満のＬＵＳ／ｍｇを有し得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。或いはＬＵＴ／ｍｇ活性は、５００未満（３００未満など）、好ましくは２００未満、より好ましくは１００未満、より好ましくは５０未満、より好ましくは２０未満、より好ましくは１０未満（５未満、２未満など）、より好ましくは１未満のＬＵＴ／ｍｇである。
【００８５】
本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、モノグリセリドに作用することが実質的にできない、ＬＵＳアッセイでのヒマワリ油の代わりにモノオレエート（Ｍ７７６５  １−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール  ９９％）を用いて決定され得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。１ＭＧＨＵは、該アッセイ条件下でモノグリセリドから１分あたり１［ｍｕ］ｍｏｌの脂肪酸を放出することができる酵素量として定義される。
【００８６】
本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、トリグリセリドに作用することが実質的にできない、５０００未満のＭＧＨＵ／ｍｇ、例えば１０００未満、例えば５００未満（３００未満など）、好ましくは２００未満、より好ましくは１００未満、より好ましくは５０未満、より好ましくは２０未満、より好ましくは１０未満（５未満、２未満など）、より好ましくは１未満のＭＧＨＵ／ｍｇを有し得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【００８７】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、以下のホスホリパーゼ活性、即ち、ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）及び／又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）の１又は複数を示し得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。前記脂質アシルトランスフェラーゼは、ホスホリパーゼＢ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．５）も有し得る。
【００８８】
適切には、いくつかの態様では脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質から糖アルコール、好ましくはグリセロール及び／又はアスコルビン酸へアシル基を転移させることができ得る。
【００８９】
いくつかの態様では、好ましくは本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、リン脂質からステロール及び／又はスタノールへアシル基を転移させて少なくともステロールエステル及び／又はスタノールエステルを形成することができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【００９０】
前記脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質からグリセロールなどのポリオール、及び／又はコレステロール若しくは植物ステロール／スタノールなどのステロールへアシル基を転移させることができる。したがって、一実施形態では本発明による「アシルアクセプター」は、グリセロール及び／又はコレステロール若しくは植物ステロール／スタノールであってよい。
【００９１】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の基準、即ち、
酵素が、エステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を有し、これにより、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分が、アシルアクセプター、好ましくはグリセロール又はコレステロールに転移して新たなエステルを形成すること、及び
酵素が、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１又は複数である）を含むこと
により特徴づけることができる。
【００９２】
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、Ｌ又はＹである。より好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、Ｌである。したがって、好ましくは本発明による酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＬを含む。
【００９３】
ＧＤＳＸモチーフは、４つの保存アミノ酸からなる。好ましくは、モチーフ内のセリンは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の触媒セリンである。適切には、ＧＤＳＸモチーフのセリンは、Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064)に教示されたアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のＳｅｒ−１６に対応する位置にあってよい。
【００９４】
タンパク質が本発明によるＧＤＳＸモチーフを有するかどうかを決定するには、配列を、好ましくは、参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット又は国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレットに教示された手順により、ｐｆａｍデータベースの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭ, hidden markov model プロファイル）と比較する。
【００９５】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を用いて整列させることができる（詳細は国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット又は国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレット参照）。
【００９６】
好ましくは、ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）との正の一致（positive match）は、本発明によるＧＤＳＬ又はＧＤＳＸドメインの存在を示す。
【００９７】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列させた場合、本発明の方法又は使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくとも１個、好ましくは２以上、好ましくは３以上の以下のＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックを有し得る。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘブロック及びＧＡＮＤＹブロックを有し得る。或いは、その酵素はＧＤＳｘブロック及びＨＰＴブロックを有し得る。好ましくは、その酵素は、少なくともＧＤＳｘブロックを含む。さらなる詳細については、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット又は国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレットを参照されたい。
【００９８】
好ましくは、ＧＡＮＤＹモチーフ残基は、ＧＡＮＤＹ、ＧＧＮＤＡ、ＧＧＮＤＬ、最も好ましくはＧＡＮＤＹから選択される。
【００９９】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列させた場合、本発明の方法又は使用に用いる酵素は、参照アエロモナス・ヒドロフィラポリペプチド配列、即ち配列番号１と比べて少なくとも１個、好ましくは２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは５以上、好ましくは６以上、好ましくは７以上、好ましくは８以上、好ましくは９以上、好ましくは１０以上、好ましくは１１以上、好ましくは１２以上、好ましくは１３以上、好ましくは１４以上、好ましくは１５以上の以下のアミノ酸残基、即ち、２８ｈｉｄ、２９ｈｉｄ、３０ｈｉｄ、３１ｈｉｄ、３２ｇｌｙ、３３Ａｓｐ、３４Ｓｅｒ、３５ｈｉｄ、１３０ｈｉｄ、１３１Ｇｌｙ、１３２Ｈｉｄ、１３３Ａｓｎ、１３４Ａｓｐ、１３５ｈｉｄ、３０９Ｈｉｓを有する。
【０１００】
ｐｆａｍ００６５７  ＧＤＳＸドメインは、このドメインを有するタンパク質を他の酵素と区別する唯一の識別子である。
【０１０１】
ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列は、配列番号２として図３に示されている。これは、Ｐｆａｍファミリー００６５７、データベースバージョン６（本明細書ではｐｆａｍ００６５７．６と呼ばれる場合もある）の同定から得られる。
【０１０２】
コンセンサス配列は、Ｐｆａｍデータベースのさらなる発表を用いて更新することができる（例えば国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレット又は国際公開第２００４／０６４９８７号パンフレット参照）。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下の基準、即ち、
（ｉ）酵素が、エステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を有し、これにより、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分が、アシルアクセプター、好ましくはグリセロール又はコレステロールへ転移されて新たなエステル、好ましくはそれぞれモノグリセリドエステル又はコレステロールエステルを形成すること、
（ii）酵素が、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１又は複数である）を含むこと、
（iii）酵素がＨｉｓ−３０９を含む、又は図２及び４（配列番号１又は配列番号３）に示されたアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含むこと
により特徴づけることができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１０４】
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基はＬである。
【０１０５】
配列番号３又は配列番号１では、最初の１８個のアミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、即ちシグナル配列を含むタンパク質であるＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、即ちシグナル配列のない配列のＨｉｓ−２９１に等しい。
【０１０６】
一実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下の触媒３つ組残基（catalytic triad）、即ち、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６及びＨｉｓ−３０９を含むか、又は図４（配列番号３）若しくは図２（配列番号１）に示されたアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６及びＨｉｓ−３０９に対応する位置に、それぞれセリン残基、アスパラギン酸残基及びヒスチジン残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。上述の通り、配列番号３又は配列番号１に示された配列では、最初の１８個のアミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、即ちシグナル配列を含むタンパク質であるＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６及びＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、即ちシグナル配列のない配列のＳｅｒ−１６、Ａｓｐ−２８８及びＨｉｓ−２９１に等しい。Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列では、図３（配列番号２）に示されているように、活性部位残基は、Ｓｅｒ−７、Ａｓｐ−３４５及びＨｉｓ−３４８に相当する。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下の基準、即ち、
酵素が、エステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を有し、これにより、第１の脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分が、アシルアクセプターへ転移されて新たなエステルを形成すること、及び
酵素が、少なくともＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９を含む、又は配列番号３若しくは配列番号１に示されたアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の、それぞれＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６びＨｉｓ−３０９に対応する位置にグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸及びヒスチジン残基を含むこと
により特徴づけることができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１０８】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下のヌクレオチド配列、即ち、
（ａ）配列番号３６で示されるヌクレオチド配列（図２９参照）、
（ｂ）配列番号３８で示されるヌクレオチド配列（図３１参照）、
（ｃ）配列番号３９で示されるヌクレオチド配列（図３２参照）、
（ｄ）配列番号４２で示されるヌクレオチド配列（図３５参照）、
（ｅ）配列番号４４で示されるヌクレオチド配列（図３７参照）、
（ｆ）配列番号４６で示されるヌクレオチド配列（図３９参照）、
（ｇ）配列番号４８で示されるヌクレオチド配列（図４１参照）、
（ｈ）配列番号４９で示されるヌクレオチド配列（図５７参照）、
（ｉ）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列（図５８参照）、
（ｊ）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列（図５９参照）、
（ｋ）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列（図６０参照）、
（ｌ）配列番号５３で示されるヌクレオチド配列（図６１参照）、
（ｍ）配列番号５４で示されるヌクレオチド配列（図６２参照）、
（ｎ）配列番号５５で示されるヌクレオチド配列（図６３参照）、
（ｏ）配列番号５６で示されるヌクレオチド配列（図６４参照）、
（ｐ）配列番号５７で示されるヌクレオチド配列（図６５参照）、
（ｑ）配列番号５８で示されるヌクレオチド配列（図６６参照）、
（ｒ）配列番号５９で示されるヌクレオチド配列（図６７参照）、
（ｓ）配列番号６０で示されるヌクレオチド配列（図６８参照）、
（ｔ）配列番号６１で示されるヌクレオチド配列（図６９参照）、
（ｕ）配列番号６２で示されるヌクレオチド配列（図７０参照）、
（ｖ）配列番号６３で示されるヌクレオチド配列（図７１参照）
の１つ、
（ｗ）又は
配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２又は配列番号６３で示される配列のいずれか１つと７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
であってよい。
【０１０９】
適切にはヌクレオチド配列は、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２又は配列番号６３で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上及びさらにより好ましくは９５％以上の同一性を有し得る。
【０１１０】
一実施形態では、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、及び配列番号６３で示される配列のいずれか１つと７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。適切にはヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、及び配列番号６３で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上及びさらにより好ましくは９５％以上の同一性を有し得る。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４９で示される配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上及びさらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。
【０１１２】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下のアミノ酸配列、即ち、
（ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列
（ii）配列番号４で示されるアミノ酸配列
（iii）配列番号５で示されるアミノ酸配列
（iv）配列番号６で示されるアミノ酸配列
（ｖ）配列番号７で示されるアミノ酸配列
（vi）配列番号８で示されるアミノ酸配列
（vii）配列番号９で示されるアミノ酸配列
（viii）配列番号１０で示されるアミノ酸配列
（ix）配列番号１１で示されるアミノ酸配列
（ｘ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列
（xi）配列番号１３で示されるアミノ酸配列
（xii）配列番号１４で示されるアミノ酸配列
（xiii）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（xiv）配列番号１５で示されるアミノ酸配列
の１若しくは複数又は
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、若しくは配列番号１５で示される配列のいずれか１つと７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１１３】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３若しくは配列番号４若しくは配列番号１若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号３で示されるアミノ酸配列、若しくは配列番号４で示されるアミノ酸配列、若しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列、若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１１４】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、又は配列番号１５で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上及びさらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１１５】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下のアミノ酸配列、即ち、
（ａ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１〜１００で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１０１〜２００で示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基２０１〜３００で示されるアミノ酸配列、又は
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
の１又は複数を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１１６】
適切には、本発明の方法及び使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列、即ち、
（ａ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基２８〜３９で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基７７〜８８で示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１２６〜１３６で示されるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１６３〜１７５で示されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基３０４〜３１１で示されるアミノ酸配列、又は
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
の１又は複数を含むことができる。
【０１１７】
一態様では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、欧州特許第１２７５７１１号に教示されているカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の脂質アシルトランスフェラーゼであり得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。したがって、一態様では本発明の方法及び使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１７又は配列番号１８に教示されたアミノ酸配列の１つを含む脂質アシルトランスフェラーゼであってよい。
【０１１８】
きわめて好ましくは、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、若しくはさらにより好ましくは９８％以上、若しくはさらにより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシル基転移酵素（lipid acyl transferase）（脂質アシルトランスフェラーゼ（lipid acyltransferase））であり得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。この酵素は変異体酵素と見なすことができる。
【０１１９】
一態様では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ, lecithin:cholesterol acyltransferase）又はこの変異体（例えば分子進化により作られた変異体）であり得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１２０】
適切なＬＣＡＴは、当技術分野で既知であり、以下の生物、例えば、哺乳類、ラット、マウス、ニワトリ、キイロショウジョウバエ、シロイヌナズナ及びイネ（Oryza sativa）を含む植物、線虫、真菌並びに酵母の１又は複数から得ることができる。
【０１２１】
一実施形態では本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ受託番号ＮＩＣＭＢ  ４１２０４及びＮＣＩＭＢ  ４１２０５のもとに、２００３年１２月２２日付で、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約下で、Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, DenmarkのDanisco A/S社よりNational Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria（ＮＣＩＭＢ）23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GBに寄託されたpPet12aAhydro及びpPet12aASalmoを有する大腸菌株ＴＯＰ １０から得ることができる脂質アシルトランスフェラーゼ、好ましくは得られる脂質アシルトランスフェラーゼであってよい脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１２２】
本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、リン脂質グリセロールアシルトランスフェラーゼをコードすることができる。リン脂質グリセロールアシルトランスフェラーゼには、アエロモナス種、好ましくはアエロモナス・ヒドロフィラ又はアエロモナス・サルモニシダ、最も好ましくはアエロモナス・サルモニシダ若しくはこの変異体から単離されたものが含まれる。本発明での使用に最も好ましい脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１、３、４、１５及び１６によりコードされている。アシルトランスフェラーゼのシグナルペプチドは、該トランスフェラーゼの発現中に切断されることが好ましいことは、当業者に認識されよう。配列番号１、３、４、１５及び１６のシグナルペプチドは、アミノ酸１〜１８である。したがって最も好ましい領域は、配列番号１及び配列番号３（アエロモナス・ヒドロフィラ）についてはアミノ酸１９〜３３５、並びに配列番号４、配列番号１５及び配列番号１６（アエロモナス・サルモニシダ）についてはアミノ酸１９〜３３６である。アミノ酸配列の同一性の相同性を決定するのに使用される場合、本明細書で記載されているアラインメントは、成熟配列を使用することが好ましい。
【０１２３】
したがって相同性（同一性）を決定するのに最も好ましい領域は、配列番号１及び３（アエロモナス・ヒドロフィラ）についてはアミノ酸１９〜３３５、並びに配列番号４、１５及び１６（アエロモナス・サルモニシダ）についてはアミノ酸１９〜３３６である。配列番号３４及び３５は、それぞれアエロモナス・ヒドロフィラ及びアエロモナス・サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼの成熟タンパク質配列である。
【０１２４】
本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、サーモビフィダ（Thermobifida）、好ましくはサーモビフィダ・フスカ（T. fusca）、最も好ましくは配列番号２８によりコードされているものから単離することもできる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１２５】
本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、ストレプトマイセス、好ましくはストレプトマイセス・アベルミチス（S. avermitis）、最も好ましくは配列番号３２によりコードされているものから単離することもできる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。ストレプトマイセス由来の、本発明に用いる可能性のある他の酵素には、配列番号５、６、９、１０、１１、１２、１３、１４、 ３１、及び３３によりコードされているものが含まれる。
【０１２６】
本発明に用いる酵素は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、好ましくはコリネバクテリウム・エフィシエンス（C. efficiens）、最も好ましくは配列番号２９によりコードされているものから単離することもできる。
【０１２７】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７、３８、４０、４１、４３、４５若しくは４７で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又はこれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は配列番号３６、３９、４２、４４、４６、若しくは４８で示されるヌクレオチド配列のいずれか１つ、又はこれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされた、脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１２８】
一実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核配列は、
ａ）配列番号３６に示されるヌクレオチド配列を含む核酸、
ｂ）遺伝子コードの変性により配列番号３６のヌクレオチド配列と関連した核酸、及び
ｃ）配列番号３６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸
からなる群から選択される。
【０１２９】
一実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７に示されるようなアミノ酸配列、又はこれと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１３０】
さらなる実施形態では本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７、３８、４０、４１、４３、４５若しくは４７で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又はこれらのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は配列番号３９、４２、４４、４６若しくは４８で示されるヌクレオチド配列のいずれか１つ、又はこれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされた脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１３１】
さらなる実施形態では本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８、４０、４１、４５若しくは４７で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又は本明細書に記載の使用のため該アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１３２】
さらなる実施形態では本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載の使用のため、配列番号３８、４０、若しくは４７で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又は該アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１３３】
より好ましくは、一実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４７で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４３又は４４で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１３５】
別の実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号３６に示されるヌクレオチド配列を含む核酸、
ｂ）遺伝子コードの変性により配列番号３６のヌクレオチド配列と関連した核酸、及び
ｃ）配列番号３６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸
からなる群から選択される。
【０１３７】
一実施形態では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、それぞれ受託番号ＮＩＣＭＢ  ４１２２６及びＮＣＩＭＢ  ４１２２７のもとに、２００４年６月２５日、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約下で、Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, DenmarkのDanisco A/S社よりNational Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria（ＮＣＩＭＢ）23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GBに寄託されたストレプトマイセス株Ｌ１３０又はＬ１３１から得ることができ、好ましくは得られる脂質アシルトランスフェラーゼであってよい。
【０１３８】
本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列は、脂質アシルトランスフェラーゼ（配列番号１６）をコードするポリヌクレオチドをコードすることができ、又は脂質アシルトランスフェラーゼ（配列番号１７）のアミノ酸配列をコードすることができる。
【０１３９】
本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列は、デフォルト設定によるＶｅｃｔｏｒＮＴＩのＣｌｕｓｔａｌ ＷペアワイズアラインメントアルゴリズムのＡｌｉｇｎ Ｘを用いて、Ｌ１３１（配列番号３７）配列とのアラインメントにより同定することができるアミノ酸配列をコードすることができる。
【０１４０】
Ｌ１３１のアラインメント並びにストレプトマイセス・アベルミチリス（S. avermitilis）及びサーモビフィダ・フスカ由来の相同体は、ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１及びストレプトマイセス・アベルミチリス及びサーモビフィダ・フスカにおけるＧＤＳＹ）、ＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬのいずれかであるＧＡＮＤＹボックス、及びＨＰＴブロック（保存された触媒ヒスチジンと考えられる）の保存を示す。これらの３つの保存ブロックは、図４２にハイライトされている。
【０１４１】
ｐｆａｍのＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列（国際公開第０４／０６４９８７号パンフレットに記載されている）及び／又は本明細書に開示されたＬ１３１配列（配列番号３７）のいずれかと整列させた場合、３つの保存領域である、ＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック及びＨＴＰブロックを同定することができる（さらなる詳細は国際公開第０４／０６４９８７号パンフレット参照）。
【０１４２】
ｐｆａｍのＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列（国際公開第０４／０６４９８７号パンフレットに記載されている）及び／又は本明細書に開示されたＬ１３１配列（配列番号３７）のいずれかと整列させた場合、
ｉ）本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ＧＤＳｘモチーフ、より好ましくはＧＤＳＬ又はＧＤＳＹモチーフから選択されるＧＤＳｘモチーフを有する脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得、
且つ／又は
ii）本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ＧＡＮＤＹブロック、より好ましくはアミノ基ＧＧＮＤｘ、より好ましくはＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬを含むＧＡＮＤＹブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得、
且つ／又は
iii）本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、好ましくはＨＴＰブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼをコードし、
好ましくは、
iv）本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、好ましくはＧＤＳｘ又はＧＤＳＹモチーフ、及びアミノ基ＧＧＮＤｘ、好ましくはＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬを含むＧＡＮＤＹブロック、及びＨＴＰブロック（保存されたヒスタジン）を有する脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得る。
【０１４３】
変異体脂質アシルトランスフェラーゼ
好ましい実施形態では本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、変異体脂質アシルトランスフェラーゼである脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１４４】
リン脂質に対する加水分解活性の増加及び／又はトランスフェラーゼ活性の増加、好ましくはトランスフェラーゼ活性の増加など、リン脂質に対する活性が増加した変異体を使用することができる。
【０１４５】
好ましくは変異体脂質アシルトランスフェラーゼは、上記に定義されている脂質アシルトランスフェラーゼの１又は複数のアミノ酸修飾により調製される。
【０１４６】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、変異体脂質アシルトランスフェラーゼであってよい脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができるとき、この場合酵素は、酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含むことを特徴とすることができる。ここで、Ｘは、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１又は複数であり、変異体酵素は、（国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に定義されている）セット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されたアミノ酸残基のいずれか１又は複数において、親配列と比べて１又は複数のアミノ酸修飾を含む。
【０１４７】
例えば変異体脂質アシルトランスフェラーゼは、酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含むことを特徴とすることができる。ここで、Ｘは、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１又は複数であり、変異体酵素は、本明細書に定義されたＰ１０４８０の構造モデルと構造的に整列された親配列（好ましくは国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に定義されている１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び／又は１ＤＥＯ．ＰＤＢとのＰ１０４８０結晶構造座標の構造アラインメントにより得られる）により同定される、（国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に定義されている）セット２又はセット４又はセット６又はセット７に詳述されたアミノ酸残基のいずれか１又は複数において、前記親配列と比べて１又は複数のアミノ酸修飾を含む。
【０１４８】
さらなる実施形態では本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含むことを特徴とすることができる変異体脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。ここで、Ｘは、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１又は複数であり、変異体酵素は、親配列が、ｐｆａｍコンセンサス配列（配列番号２−図３）と整列され、並びに国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に定義されているように最も一致した重複を確保するためＰ１０４８０の構造モデルにより修飾された場合に同定されるセット２に教示されたアミノ酸残基のいずれか１又は複数において、前記親配列と比べて１又は複数のアミノ酸修飾を含む。
【０１４９】
適切には本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４との配列アラインメントにより同定される、（国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に定義されている）セット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されたアミノ酸残基のいずれか１又は複数における１又は複数のアミノ酸修飾を除き、アミノ酸配列が、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３３で示される、アミノ酸配列を含み得る変異体脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードすることができる。
【０１５０】
或いは、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書に定義されたＰ１０４８０の構造モデルと構造的に整列させた前記親配列（好ましくは国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に教示されている１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び／又は１ＤＥＯ．ＰＤＢとのＰ１０４８０結晶構造座標の構造アラインメントにより得られる）により同定される、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に定義されているセット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されたアミノ酸残基のいずれか１又は複数における１又は複数のアミノ酸修飾を除き、アミノ酸配列が、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３３で示される、アミノ酸配列を含む変異体脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードすることができる。
【０１５１】
或いは、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、前記親配列が、ｐｆａｍコンセンサス配列（配列番号２）と整列され、並びに国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に教示されているように最も一致した重複を確保するためＰ１０４８０の構造モデルにより修飾された場合に同定されるセット２に教示されたアミノ酸残基のいずれか１又は複数における１又は複数のアミノ酸修飾を除き、アミノ酸配列が、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３３で示される、アミノ酸配列を含む変異体脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードすることができる。
【０１５２】
好ましくは、親酵素は、配列番号３４及び／又は配列番号１５及び／又は配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含む、又はそれと相同である酵素である。
【０１５３】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、国際公開第２００５／０６６３４７号パンフレット及び以下に定義されているセット２又はセット４又はセット６又はセット７に規定されたアミノ酸残基のいずれか１又は複数における１又は複数のアミノ酸修飾を除き、アミノ酸配列が、配列番号３４、配列番号３５で示される、アミノ酸配列を含む変異体酵素をコードすることができる。
【０１５４】
セットの定義
アミノ酸セット１：
アミノ酸セット１（これらは１ＩＶＮでのアミノ酸であることに注意−図５３及び図５４）
Ｇｌｙ８、Ａｓｐ９、Ｓｅｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｔｙｒ１５、Ｇｌｙ４４、Ａｓｐ４５、Ｔｈｒ４６、Ｇｌｕ６９、Ｌｅｕ７０、Ｇｌｙ７１、Ｇｌｙ７２、Ａｓｎ７３、Ａｓｐ７４、Ｇｌｙ７５、Ｌｅｕ７６、Ｇｌｎ１０６、Ｉｌｅ１０７、Ａｒｇ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｐｒｏ１１０、Ｔｙｒ１１３、Ｐｈｅ１２１、Ｐｈｅ１３９、Ｐｈｅ１４０、Ｍｅｔ１４１、Ｔｙｒ１４５、Ｍｅｔ１５１、Ａｓｐ１５４、Ｈｉｓ１５７、Ｇｌｙ１５５、Ｉｌｅ１５６、Ｐｒｏ１５８
【０１５５】
ＧＤＳｘ及び触媒残基など、高度に保存されたモチーフは、セット１から除外された（下線を引いた残基）。重複を避けるため、セット１は、１ＩＶＮモデルの活性部位におけるグリセロールの中心炭素原子から１０Å以内にあるアミノ酸残基を規定する。
【０１５６】
アミノ酸セット２：
アミノ酸セット２（アミノ酸の番号付けはＰ１０４８０成熟配列でのアミノ酸を指すことに注意）
Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９及びＶａｌ２９０。
【０１５７】
【表１】
2010516271.tif 000003
2010516271.tif 000004
【０１５８】
アミノ酸セット３：
アミノ酸セット３はセット２と同一であるが、アエロモナス・サルモニシダ（配列番号４）コード配列を指し、即ちアミノ酸残基番号数は、セット３では１８多い。これは、シグナル配列（配列番号２５）を含むタンパク質に比べた成熟タンパク質（配列番号３４）でのアミノ酸番号付け間の差を反映するためである。
【０１５９】
アエロモナス・サルモニシダＧＤＳＸ（配列番号４）及びアエロモナス・ヒドロフィラＧＤＳＸ（配列番号３４）の成熟タンパク質は、５つのアミノ酸において異なる。これらは、Ｔｈｒ３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１８２Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３０９Ａｌａ、Ｓｅｒ３１０Ａｓｎ、及びＧｌｙ３１８−であり、サルモニシダ残基が最初に挙げられ、ヒドロフィラ残基は最後に挙げられている。ヒドロフィラタンパク質は３１７アミノ酸長のみであり、３１８位の残基を欠いている。アエロモナス・サルモニシダＧＤＳＸは、アエロモナス・ヒドロフィラタンパク質よりもガラクトリピド基質などの極性脂質に対しかなり高い活性を有する。すべての５つのアミノ酸位置に対し部位スキャニングが行われた。
【０１６０】
アミノ酸セット４：
アミノ酸セット４は、Ｓ３、Ｑ１８２、Ｅ３０９、Ｓ３１０、及び−３１８である。
【０１６１】
アミノ酸セット５：
Ｆ１３Ｓ、Ｄ１５Ｎ、Ｓ１８Ｇ、Ｓ１８Ｖ、Ｙ３０Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｅ、Ｄ１５７Ｎ、Ｙ２２６Ｆ、Ｄ２２８Ｎ  Ｙ２３０Ｆ。
【０１６２】
アミノ酸セット６：
アミノ酸セット６は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８である。
【０１６３】
セット６でのアミノ酸の番号付けは、Ｐ１０４８０（配列番号２５）におけるアミノ酸残基を指し、即ち他の配列骨格（sequence backbone）での対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮとの相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントにより決定することができる。
【０１６４】
アミノ酸セット７：
アミノ酸セット７は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８、Ｙ３０Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷから選択される）、Ｙ２２６Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷから選択される）、Ｙ２３０Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷから選択される）、Ｓ１８Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ又はＹから選択される）、Ｄ１５７Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹから選択される）である。
【０１６５】
セット７でのアミノ酸の番号付けは、Ｐ１０４８０（配列番号２５）におけるアミノ酸残基を指し、即ち他の配列骨格での対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮとの相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントにより決定することができる。
【０１６６】
適切には、変異体酵素は、親酵素と比べて以下のアミノ酸修飾、即ち
Ｓ３Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｎ、Ｔ又はＧ
Ｅ３０９Ｑ、Ｒ又はＡ、好ましくはＱ又はＲ
−３１８Ｙ、Ｈ、Ｓ又はＹ、好ましくはＹ
の１又は複数を含む。
【０１６７】
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸはＬである。したがって、好ましくは、親酵素はアミノ酸配列モチーフＧＤＳＬを含む。
【０１６８】
適切には、前記最初の親脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、即ち、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３３のいずれか１つを含むことができる。
【０１６９】
適切には、前記第２の関連した脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、即ち、配列番号３、配列番号３４、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３３のいずれか１つを含むことができる。
【０１７０】
変異体酵素は、親酵素と比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含まなければならない。いくつかの実施形態では、変異体酵素は、親酵素と比べて少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくは少なくとも８つ、好ましくは少なくとも９つ、好ましくは少なくとも１０のアミノ酸修飾を含むことができる。
【０１７１】
本明細書で特定のアミノ酸残基を指す場合、番号付けは、配列番号３４又は配列番号３５で示される参照配列との変異体配列のアラインメントから得られるものである。
【０１７２】
一態様では、好ましくは、変異体酵素は以下のアミノ酸置換、即ち、
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｌ１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｓ１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｙ３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ；及び／又は
Ｇ４０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｋ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｗ１１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；及び／又は
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ａ１１４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｙ１１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ；及び／又は
Ｌ１１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｐ１５６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｇ１５９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｑ１６０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ１６１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ  Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｐ１６２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｓ１６３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ａ１６４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｒ１６５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｓ１６６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｑ１６７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｋ１６８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｖ１６９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｖ１７０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｅ１７１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ａ１７２Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ；及び／又は
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ１８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｑ１８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＫ；及び／又は
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｌ２１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｙ２２６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ；及び／又は
Ｙ２３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ；及び／又は
Ｋ２８４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｍ２８５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｖ２９０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ；及び／又は
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ
の１又は複数を含む。
【０１７３】
それに加えて、又はその代わりに、１又は複数のＣ末端伸長があり得る。好ましくは追加のＣ末端伸長は、１又は複数の脂肪族アミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸、より好ましくはＩ、Ｌ、Ｖ又はＧを含む。したがって、本発明はさらに、以下のＣ末端伸長、即ち、３１８Ｉ、３１８Ｌ、３１８Ｖ、３１８Ｇの１又は複数を含む変異体酵素を提供する。
【０１７４】
好ましい変異体酵素は、ホスファチジルコリン（ＰＣ，phosphatidylcholine）などのリン脂質に対する加水分解活性が低下している場合があり、リン脂質からのトランスフェラーゼ活性も増加している場合がある。
【０１７５】
好ましい変異体酵素は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質からのトランスフェラーゼ性が増加している場合があり、リン脂質に対する加水分解活性も増加している場合がある。
【０１７６】
以下の残基の１又は複数の修飾は、リン脂質に対する絶対トランスフェラーゼ活性が増加する変異体酵素をもたらし得る：
Ｓ３、Ｄ１５７、Ｓ３１０、Ｅ３０９、Ｙ１７９、Ｎ２１５、Ｋ２２、Ｑ２８９、Ｍ２３、Ｈ１８０、Ｍ２０９、Ｌ２１０、Ｒ２１１、Ｐ８１、Ｖ１１２、Ｎ８０、Ｌ８２、Ｎ８８；Ｎ８７
【０１７７】
リン脂質からのトランスフェラーゼ活性が改善する変異体酵素を提供し得る特定の好ましい修飾は、以下の、即ち、
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｐ又はＭ、最も好ましくはＳ３Ａ
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＤ１５７Ｓ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、Ｑ、Ｋ又はＣ
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＳ３１０Ｔ〜３１８Ｅ
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＥ３０９Ｒ、Ｅ、Ｌ、Ｒ又はＡ
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ；好ましくはＹ１７９Ｄ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、Ｑ又はＳ、より好ましくはＥ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ又はＱ
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ２１５Ｓ、Ｌ、Ｒ又はＹ
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＫ２２Ｅ、Ｒ、Ｃ又はＡ
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＱ２８９Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｐ又はＮ
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ  Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＭ２３Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ又はＳ
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＨ１８０Ｑ、Ｒ又はＫ
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＭ２０９Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、Ｖ又はＬ
Ｌ２１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＬ２１０Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｗ又はＭ
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＲ２１１Ｔ
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＰ８１Ｇ
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ；好ましくはＶ１１２Ｃ
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ８０Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｐ、Ｔ、Ｅ、Ｖ、Ａ又はＧ
Ｌ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＬ８２Ｎ、Ｓ又はＥ
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ８８Ｃ
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ；好ましくはＮ８７Ｍ又はＧ
の１又は複数から選択することができる。
【０１７８】
以下の残基の１又は複数の好ましい修飾は、リン脂質に対する絶対トランスフェラーゼ活性が増加する変異体酵素をもたらす：
Ｓ３Ｎ、Ｒ、Ａ、Ｇ
Ｍ２３Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｓ
Ｈ１８０Ｒ
Ｌ８２Ｇ
Ｙ１７９Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ又はＱ
Ｅ３０９Ｒ、Ｓ、Ｌ又はＡ
【０１７９】
１つの好ましい修飾は、Ｎ８０Ｄである。これは特に、参照配列（配列番号３５）を骨格として用いた場合に当てはまる。したがって、参照配列は、配列番号１６であってよい。この修飾は、１又は複数のさらなる修飾と組み合わせることができる。したがって本発明の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５、又は配列番号３５と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、若しくはより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
【０１８０】
上述の通り、本明細書で特定のアミノ酸残基に言及する場合、番号付けは、配列番号３４又は配列番号３５で示される参照配列との変異体配列のアラインメントから得られたものである。
【０１８１】
きわめて好ましくは、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、若しくはより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質をコードすることができる。この酵素は変異体酵素と見なすことができる。
【０１８２】
本発明の目的では、同一性の程度は、同一である配列要素の数に基づく。アミノ酸配列に関する、本発明による同一性の程度は、適切にはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ １０（Invitrogen Corp.社製）など、当技術分野で既知のコンピュータプログラムにより決定することができる。ペアワイズアラインメントに用いられるスコアは、好ましくはギャップオープンペナルティーを１０．０、及びギャップ伸長ペナルティーを０．１としたＢＬＯＳＵＭ６２である。
【０１８３】
適切には、アミノ酸配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の隣接するアミノ酸で、好ましくは少なくとも３０個の隣接するアミノ酸で、好ましくは少なくとも４０個の隣接するアミノ酸で、好ましくは少なくとも５０個の隣接するアミノ酸で、好ましくは少なくとも６０個の隣接するアミノ酸で決定される。
【０１８４】
適切には、アミノ酸配列に関する同一性の程度は、配列全体で決定することができる。
【０１８５】
適切には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ／脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下の属、即ち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デスルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルホロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソリゾビウム、ラルストニア、ザントモナス、カンジダ、サーモビフィダ及びコリネバクテリウムの１又は複数から得ることができてよく、好ましくは得られてよい。
【０１８６】
適切には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ／脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下の生物、即ち、アエロモナス・ヒドロフィラ、アエロモナス・サルモニシダ、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・リモサス（Streptomyces rimosus）、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトマイセス・サーモサッカリ（Streptomyces thermosacchari）、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、デスルフィトバクテリウム・デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）、バチルス種、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ビブリオナシエ、キシレラ・ファスティディオサ（Xylella fastidiosa）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、シゾサッカロミセス・ポンベ、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitides）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ラルストニア・ソラナセラム（Ralstonia solanacearum）、ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ザントモナス・アクソノポディス（Xanthomonas axonopodis）、カンジダ・パラプシロシス、サーモビフィダ・フスカ及びコリネバクテリウム・エフィシエンスの１又は複数から得ることができてよく、好ましくは得られてよい。
【０１８７】
一態様では、好ましくは、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、１又は複数のアエロモナス種、アエロモナス・ヒドロフィラ又はアエロモナス・サルモニシダから得ることができ、好ましくは得られ又は由来する。
【０１８８】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼとして機能する酵素は、国際公開第２００４／０６４５３７号パンフレットの実施例１２に教示されたアッセイを用いて一般的な方法で同定することができる。約９５％というきわめて高い含水量があるこのアッセイを用いると、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ／脂質アシル基転移酵素は、少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性（相対トランスフェラーゼ活性）、好ましくは少なくとも５％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくはなくとも１０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％、２６％、２８％、３０％、４０％、５０％、６０％又は７５％の相対トランスフェラーゼ活性を有するものである。
【０１８９】
ホスホリパーゼは、低水分環境（water environment）ではアシル−トランスフェラーゼ酵素として作用することができる。したがって、食用油又は脂肪の改変過程が低水分環境で起こる場合、リン脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の代わりに、又はリン脂質アシルトランスフェラーゼ酵素に加えて、ホスホリパーゼ酵素を用いることができると考えられる。
【０１９０】
本明細書では用語「高い含水量」は、３％を超える、好ましくは４％を超える、５％を超える、６％を超える、７％を超える、８％を超える、９％を超える、１０％を超える、２０％を超える、３０％を超える、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える又は９０％を超える含水量を有する任意の基質又は食品を意味する。
【０１９１】
本明細書では用語「低い含水量」は、３％未満、好ましくは２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０５％未満、又は０．０１％未満の含水量を有する任意の基質又は食品を意味する。
【０１９２】
誤解を避けるため、乳汁は高水分環境であるのに対し乳脂肪は低水分環境である。
【０１９３】
本発明に用いる適切なホスホリパーゼには、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、又はホスホリパーゼＢが含まれる。ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、又はホスホリパーゼＢは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性と協調して使用することもできる。ホスホリパーゼＣ及び／又はＤは、国際公開第２００５／０８９５６２号パンフレットと同様に、脂質アシルトランスフェラーゼ活性／ホスホリパーゼＡ１、Ａ２及び／又はＢ活性と協調して使用することもできる。好ましいホスホリパーゼには、国際公開第２００４／９７０１２号パンフレット（Novozymes/Chr. Hansen）に開示されたLecitase TM、即ちフザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）及びチューバー・アルビドゥム（Tuber albidum）ホスホリパーゼなどのホスホリパーゼＡ２を含めることができる。フザリウム・ベネナツムホスホリパーゼは、MAX YIELD（商標）としてNovozymes社より販売されている。
【０１９４】
単離
一態様では、本発明の方法は、脂質アシルトランスフェラーゼを回収する／単離する追加のステップを含む。したがって、製造された脂質アシルトランスフェラーゼは、単離された形態にあってよい。
【０１９５】
別の態様では、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、単離された形態にあってよい。
【０１９６】
用語「単離された」は、配列又はタンパク質が天然には自然に結合する、及び天然に見出されるような、少なくとも１つの他の成分を、配列又はタンパク質が実質的に含まないことを意味する。
【０１９７】
精製
一態様では、本発明の方法は、脂質アシルトランスフェラーゼを精製する追加のステップを含む。
【０１９８】
別の態様では、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、精製された形態にあってよい。
【０１９９】
用語「精製された」は、配列が比較的純粋な状態（例えば少なくとも約５１％純粋、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋又は少なくとも約９８％純粋）にあることを意味する。
【０２００】
本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチド、又は修飾に適したポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを生成する任意の細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する様々な方法が当技術分野で知られている。
【０２０１】
例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、ポリペプチドを生成する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列が既知である場合、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成及び使用して、該生物から調製されたゲノムライブラリーから、ポリペプチドをコードするクローンを同定することができる。或いは、別の既知のポリペプチド遺伝子と相同な配列を含有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ポリペプチドをコードするクローンを同定することができる。後者の場合、ストリンジェンシーがより低いハイブリダイゼーション及び洗浄の条件が使用される。
【０２０２】
或いは、ポリペプチドをコードするクローンは、プラスミドなどの発現ベクターにゲノムＤＮＡ断片を挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーで酵素陰性細菌を形質転換し、次いでポリペプチドにより阻害される酵素を含有する寒天に形質転換細菌をプレーティングし、これによってポリペプチドを発現するクローンの同定を可能にすることにより同定することができる。
【０２０３】
さらなる代替法では、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的方法、例えばBeucage S. L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869により記載されたホスホラミダイト方法、又はMatthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805に記載された方法により合成的に調製することができる。ホスホロアミダイト方法では、オリゴヌクレオチドは、合成され（例えば自動ＤＮＡ合成機で）、精製され、アニールされ、ライゲートされ及び適切なベクター中でクローニングされる。
【０２０４】
ヌクレオチド配列は、標準的技術により、合成起源、ゲノム起源、又はｃＤＮＡ起源（必要に応じて）の断片をライゲートして調製された、混合ゲノム及び合成起源、混合合成及びｃＤＮＡ起源、又は混合ゲノム及びｃＤＮＡ起源であり得る。ライゲートされた各断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４，６８３，２０２号又はSaiki R K et al (Science (1988) 239, pp 487-491)に記載されているように、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ， polymerase chain reaction）により調製することもできる。
【０２０５】
ヌクレオチド配列
本発明は、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含することもできる。本明細書では用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びに変異体、相同体、断片及びこれらの誘導体（これらの部分など）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源又は合成起源又は組換え起源であってよく、センス鎖に相当しようとアンチセンス鎖に相当しようと２本鎖又は１本鎖であってよい。
【０２０６】
本発明との関連では用語「ヌクレオチド配列」には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡが含まれる。好ましくはヌクレオチド配列は、コード配列のＤＮＡ、より好ましくはｃＤＮＡを意味する。
【０２０７】
好ましい実施形態では、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体は、天然環境中の天然ヌクレオチド配列が、天然では連結する同じく天然環境中の配列に結合している場合の天然ヌクレオチド配列を対象としない。参照を容易にするため、本発明者らはこの好ましい実施形態を「非天然（non-native）ヌクレオチド配列」と呼ぶ。この点で、用語「天然（native）ヌクレオチド配列」は、天然の環境にあるヌクレオチド配列全体を意味し、自然に結合されるプロモーター全体に作動可能に連結される場合、そのプロモーターも天然の環境にある。したがって、本発明のポリペプチドは、天然生物中のヌクレオチド配列により発現することができるが、ヌクレオチド配列は、前記生物中で自然に結合されるプロモーターの制御下にはない。
【０２０８】
好ましくはポリペプチドは、天然ポリペプチドではない。この点で、用語「天然ポリペプチド」は、天然の環境にある、及び該ペプチドがこの天然ヌクレオチド配列により発現された場合の、ポリペプチド全体を意味する。
【０２０９】
典型的には、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（即ち組換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかし、本発明の別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の化学的方法を用いて、全体的に又は部分的に合成することができる（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232参照）。
【０２１０】
分子進化
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離され、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が同定された後、選択されたヌクレオチド配列を修飾することが望ましい場合があり、例えば本発明による酵素を調製するために配列を変異させることが望ましい場合がある。
【０２１１】
変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有する。
【０２１２】
適切な方法は、Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p646-649)に開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)に記載されている。
【０２１３】
上述されたような部位特異的変異誘発の代わりに、例えばStratagene社製GeneMorph PCR変異誘発キット、又はClontech社製Diversify PCRランダム変異誘発キットなどの市販のキットを用いて、変異をランダムに導入することができる。欧州特許第０  ５８３  ２６５号は、ＰＣＲベースの変異誘発を最適化する方法に言及する。これは、欧州特許第０  ８６６  ７９６号に記載されたものなど変異原性ＤＮＡアナログの使用と組み合わせることもできる。エラープローンＰＣＲ技術は、好ましい特徴を有する脂質アシルトランスフェラーゼ変異体の製造に適している。国際公開第０２０６４５７号パンフレットは、リパーゼの分子進化に言及する。
【０２１４】
新規配列を得る第３の方法は、任意の数の制限酵素又はDnase Iなどの酵素を用いて同一でないヌクレオチド配列を断片化し、機能タンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再構築することである。或いは、完全ヌクレオチド配列の再構築中に、１又は複数の同一でないヌクレオチド配列を使用し、変異を導入することもできる。ＤＮＡシャッフリング及びファミリーシャッフリング技術は、好ましい特徴を有する脂質アシルトランスフェラーゼ変異体の製造に適している。「シャッフリング」を実施する適切な方法は、欧州特許第０  ７５２  ００８号、欧州特許第１  １３８  ７６３号、欧州特許第１  １０３  ６０６号に見出すことができる。シャッフリングは、米国特許第６，１８０，４０６号及び国際公開第０１／３４８３５号パンフレットに記載されているＤＮＡ変異誘発の別の形態と組み合わせることもできる。
【０２１５】
したがって、多数の部位特異的又はランダム突然変異を、インビボ又はインビトロでヌクレオチド配列中に製造し、続いて、コードされたポリペプチドの機能性の改善を様々な手段によりスクリーニングすることができる。インシリコ及びエキソ媒介（exo mediated）組換え方法（国際公開第００／５８５１７号パンフレット、米国特許第６，３４４，３２８号、米国特許第６，３６１，９７４号参照）を用いて、例えば、製造された変異体が、既知の酵素又はタンパク質に対してきわめて低い相同性を保持する場所で、分子進化を実施することができる。これにより得られたこのような変異体は、既知のトランスフェラーゼ酵素と著しい構造類似性を有し得るが、きわめて低いアミノ酸配列相同性を有し得る。
【０２１６】
非限定的な例として、さらに、ポリヌクレオチド配列の変異又は天然変異体は、新たな変異体を生成するため、野生型又は他の変異又は天然変異体と組換えることができる。このような新たな変異体をスクリーニングすることによっても、コードされたポリペプチドの機能性の向上を調べることができる。
【０２１７】
上述の及び類似した分子進化方法を適用することにより、タンパク質構造又は機能が事前にわからなくても、好ましい特徴を有する本発明の酵素変異体の同定及び選択を可能になり、予測できない有益な変異又は変異体の製造が可能になる。酵素活性を最適化又は変更するのに、当技術分野には分子進化の多くの適用例がある。このような例には、以下の、即ち、宿主細胞又はインビトロでの最適化された発現及び／又は活性、酵素活性の増加、基質及び／又は生成物特異性の変化、酵素又は構造安定性の増加又は減少、好ましい環境条件（例えば温度、ｐＨ、基質）での酵素活性／特異性の変化の１又は複数が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１８】
当業者には明らかなように、分子進化ツールを用いて酵素を変化させ酵素の機能性を向上させることができる。
【０２１９】
適切には、本発明に用いられる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、変異体脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができ、即ち、該脂質アシルトランスフェラーゼは、親酵素と比べて少なくとも１個のアミノ酸置換、欠失又は付加を含有することができる。酵素変異体は、親酵素と少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の相同性を保持する。適切な親酵素は、エステラーゼ又はリパーゼ活性を有する任意の酵素が含まれ得る。好ましくは、親酵素は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列させる。
【０２２０】
好ましい実施形態では、変異体脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロックに見出されるｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列アミノ酸残基の少なくとも１又は複数を保持し、又は包含する。
【０２２１】
水性環境では脂質アシルトランスフェラーゼ活性がない又は低いリパーゼなどの酵素は、分子進化ツールを用いて変異させトランスフェラーゼ活性を導入又は増大させることができ、これにより本発明の組成物及び方法で用いるのに適切な著しいトランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を製造することができる。
【０２２２】
適切には、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、親酵素と比べて極性脂質、好ましくはリン脂質及び／又は糖脂質に対する酵素活性が増大した変異体であることができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。好ましくは、このような変異体はまた、リゾ極性脂質に対する活性が低い、又は活性を持たない。極性脂質、リン脂質及び／又は糖脂質に対する活性増大は、加水分解活性及び／若しくはトランスフェラーゼ活性又は両方の組合せの結果であり得る。
【０２２３】
変異体脂質アシルトランスフェラーゼは、親酵素と比べてトリグリセリド、及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対する活性が低下する場合がある。
【０２２４】
適切には変異体酵素は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対する活性を持たない場合がある。
【０２２５】
或いは、変異体酵素は、トリグリセリドに対する活性が増加する場合があり、及び／又は以下の、極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、糖脂質、ジガラクトシルモノグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリドの１若しくは複数に対する活性も増加する場合がある。
【０２２６】
脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は既知であり、このような変異体の１又は複数は、本発明による方法及び使用、並びに／又は本発明による酵素組成物に用いるのに適切な場合がある。一例にすぎないが、脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は、以下の参考文献に記載されており、本発明により使用することができる：Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269 (3): 2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7 (3): 587-99。
【０２２７】
アミノ酸配列
本発明はまた、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列も包含する。
【０２２８】
本明細書では、用語「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。いくつかの例では、用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義である。
【０２２９】
アミノ酸配列は、適切なソースから調製／単離することができ、又は合成することができ又は組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。
【０２３０】
適切には、アミノ酸配列は、標準的技術により本明細書に教示された単離ポリペプチドから得ることができる。
【０２３１】
単離ポリペプチドからアミノ酸配列を決定する１つの適切な方法は以下の通りである。
【０２３２】
精製ポリペプチドは凍結乾燥させることができ、凍結乾燥した材料１００μｇは、８Ｍの尿素及び０．４Ｍの炭酸水素アンモニウム、ｐＨ８．４の混合物５０μｌに溶解させることができる。溶解したタンパク質は、窒素で覆い、４５ｍＭのジチオスレイトール５μｌを添加した後に、５０℃で１５分間変性させ、還元させることができる。室温に冷却後、１００ｍＭのヨードアセトアミド５μｌを添加し、窒素下暗所で室温で１５分間システイン残基を誘導体化することができる。
【０２３３】
水１３５μｌ、及びエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ５μｇの水溶液５μｌを上記の反応混合物に添加することができ、窒素下３７℃で２４時間消化を行うことができる。
【０２３４】
得られたペプチドは、溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液及び溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液を用いて、VYDAC C18カラム（０．４６×１５ｃｍ；１０μｍ；The Separation Group社製， California, USA）で、逆相ＨＰＬＣにより分離することができる。選択されたペプチドは、Ｎ末端の配列決定前に、同じ溶媒系を用いてDevelosil C18カラムで再度クロマトグラフにかけることができる。配列決定は、製造者（Applied Biosystems社, California, USA）の指示に従いパルス液体高速サイクルによりApplied Biosystems 476A配列決定装置を用いて行うことができる。
【０２３５】
配列同一性又は配列相同性
本明細書では、用語「相同体」は、対象アミノ酸及び対象ヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実体を意味する。本明細書では、用語「相同性」は、「同一性」と見なすことができる。
【０２３６】
相同なアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持し、且つ／又は酵素活性を高めるポリペプチドを提供及び／又はコードする。
【０２３７】
本文脈では、相同配列は、対象配列に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であることができるアミノ酸配列を含むと解釈される。典型的には、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。相同性は、類似性の観点から考えることもできるが（即ち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文脈では配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。
【０２３８】
本文脈では、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であることができるヌクレオチド配列を含むと解釈される。典型的には、相同体は、活性部位等をコードする、対象配列と同じ配列を含む。相同性は、類似性の観点から考えることもできるが（即ち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文脈では配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。
【０２３９】
相同性比較は、目視、又はより通常は、容易に入手できる配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の％相同性を計算することができる。
【０２４０】
％相同性は、隣接配列、即ち他の配列と整列した１つの配列で計算することができ、一方の配列における各アミノ酸は、他方の配列における対応するアミノ酸と、１回に１残基が直接比較される。これは、「ギャップなし（ungapped）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数で行われる。
【０２４１】
これはきわめて単純及び一貫した方法であるが、例えば、１つの挿入又は欠失があると、これ以外は同一の配列対では、続くアミノ酸残基がアラインメントから押し出される原因になることを考慮しておらず、したがってグローバルアラインメントが行われる場合、％相同性が大きく低下する可能性がある。この結果、ほとんどの配列比較方法は、全体の相同性スコアを過度に損なうことなく、起こり得る挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントをもたらすように設計されている。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して局所の相同性を最大化するようにすることで実現される。
【０２４２】
しかし、これらのより複雑な方法は、同じ数の同一のアミノ酸では、できるだけギャップの少ない配列アラインメントが、（２つの比較される配列間の高い関連性を反映して）ギャップが多いものより高いスコアを達成するように、アラインメントに生じる各ギャップに対し「ギャップペナルティー」を割り当てる。典型的には、ギャップの存在に対しては比較的高いコストを、該ギャップ中の後続の各残基に対してはより小さいペナルティーを科す「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然のことながらギャップのより少ない最適なアラインメントをもたらす。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを修正することができる。しかし、配列比較にこのようなソフトウェアを用いる場合は、デフォルト値を用いることが好ましい。
【０２４３】
したがって、最大％相同性の計算は、ギャップペナルティーを考慮しつつ、最適なアラインメントを行うことが先ず必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータプログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Invitrogen Corp.社製）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4thEd - Chapter 18参照）及びＦＡＳＴＡ（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）が含まれるが、これらに限定されない。BLAST及びFASTAはいずれも、オンライン及びオフライン検索で利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60参照）。しかし、いくつかの適用では、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムを用いることが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅと呼ばれる新規のツールも、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較するのに利用可能である（FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照）。
【０２４４】
最終％相同性は、同一性の観点から測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、典型的には絶対的な一対比較には基づかない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づきペアワイズ比較ごとにスコアを割り合てる、相対的な（scaled）類似性スコアマトリックスが一般的に用いられる。このような一般に使用されるマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴプログラムスイート用のデフォルトマトリックス）である。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムは、一般に、公開デフォルト値、又は提供されていればカスタムシンボル比較表を使用する（さらなる詳細はユーザマニュアル参照）。いくつかの適用では、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩパッケージ用のデフォルト値を使用することが好ましい。
【０２４５】
或いは、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244）に類似したアルゴリズムに基づき、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Invitrogen Corp.社製）の複数のアラインメント機能を用いて計算することもできる。
【０２４６】
ソフトウェアが最適なアラインメントを作成した後、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することができる。ソフトウェアは、典型的には、これを配列比較の一環として行い、数値結果を生成する。
【０２４７】
配列同一性を決定する場合は、ギャップペナルティーを使用すべきであり、次いで、好ましくは以下のパラメータがペアワイズアラインメントに使用される：
【０２４８】
【表２】
2010516271.tif 000005
【０２４９】
【表３】
2010516271.tif 000006
【０２５０】
一実施形態では、好ましくはヌクレオチド配列の配列同一性は、上記に定義されているギャップペナルティー及びギャップ伸長セットによりＣＬＵＳＴＡＬを用いて決定される。
【０２５１】
適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の隣接するヌクレオチドで、好ましくは少なくとも３０個の隣接するヌクレオチドで、好ましくは少なくとも４０個の隣接するヌクレオチドで、好ましくは少なくとも５０個の隣接するヌクレオチドで、好ましくは少なくとも６０個の隣接するヌクレオチドで、好ましくは少なくとも１００個の隣接するヌクレオチドで決定される。
【０２５２】
適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、配列全体で決定することができる。
【０２５３】
一実施形態では本発明によるアミノ酸配列同一性の程度は、適切にはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ １０（Invitrogen Corp.社製）など、当技術分野で既知のコンピュータプログラムにより決定することができる。ペアワイズアラインメントに用いられるマトリックスは、好ましくはギャップオープンペナルティーを１０．０、及びギャップ伸長ペナルティーを０．１としたＢＬＯＳＵＭ６２である。
【０２５４】
適切には、アミノ酸配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の隣接するアミノ酸で、好ましくは少なくとも３０個の隣接するアミノ酸で、好ましくは少なくとも４０個の隣接するアミノ酸で、好ましくは少なくとも５０個の隣接するアミノ酸で、好ましくは少なくとも６０個の隣接するアミノ酸で決定される。
【０２５５】
適切には、アミノ酸配列に関する同一性の程度は、配列全体で決定することができる。
【０２５６】
配列は、サイレント変化を生じ、機能的に同等の物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有することもできる。意図的なアミノ酸置換は、物質の第２の結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性的性質における類似性に基づき実施することができる。例えば、負に帯電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に帯電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ、並びに類似した親水性値を有する、非帯電極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０２５７】
保存的置換は、例えば以下の表に従って行うことができる。２列目の同じブロック、及び好ましくは３列目の同じ行のアミノ酸を互いに置換することができる。
【０２５８】
【表４】
2010516271.tif 000007
【０２５９】
本発明はまた、生じ得る相同置換（置換及び交換（replacement）は、いずれも本明細書では、代わりの残基との既存のアミノ酸残基の交換を意味するのに使用される）、即ち塩基性には塩基性、酸性には酸性、極性には極性などの同種（like-for-like）置換も包含する。非相同置換、即ち１つの残基クラスから別の残基クラスへの置換、或いはオルニチン（以後、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以後、Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含を伴う置換も生じ得る。
【０２６０】
交換は非天然アミノ酸によっても行うことができる。
【０２６１】
変異体アミノ酸配列には、グリシン、又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーのほか、メチル、エチル又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の、任意の２個のアミノ酸残基間に挿入することができる適切なスペーサー基を含み得る。さらなる変異の形態は、ペプトイド型での１又は複数のアミノ酸残基の存在を含み、当業者には十分に理解されよう。誤解を避けるため、「ペプトイド型」は、α−炭素置換基が、α−炭素ではない残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指すのに使用される。ペプトイド型のペプチドを調製する工程は、当技術分野で知られている（例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134）。
【０２６２】
本発明で用いるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義された特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、合成又は修飾ヌクレオチドが含まれ得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当技術分野で知られている。これらには、メチルホスホネート及びホスホロチオエート骨格、並びに／又は分子の３’及び／若しくは５’末端でのアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的では、本明細書に記載されたヌクレオチド配列は、当技術分野で利用可能な任意の方法により修飾できることを理解されたい。このような修飾は、ヌクレオチド配列のインビボ活性を高める、又は寿命を延ばすために実施することができる。
【０２６３】
本発明は、本明細書で論じられた配列、又は任意の誘導体、断片若しくはこれらの誘導体に相補的であるヌクレオチド配列の使用も包含する。配列がこれらの断片に相補的である場合、配列は、他の生物における類似したコード配列を同定するのにプローブとして使用することができる。
【０２６４】
本発明の配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、いくつかの方法で得ることができる。本明細書に記載された配列の他の変異体は、例えば、様々な個体、例えば異なる集団由来の個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプローブして得ることができる。加えて、他の変異体／細菌、又は細胞相同体、特に哺乳類細胞（例えばラット、マウス、ウシ及びサル細胞）で見出される細胞相同体を得ることができ、このような相同体及びこの断片は、一般に、本明細書の配列リストに示された配列に選択的にハイブリダイズすることができる。このような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリー又は他の動物種由来のゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすること、及び中〜高ストリンジェンシー条件下で、添付配列リストのいずれか１つの配列の全部又は一部を含むプローブによりこのようなライブラリーを探索することで得ることができる。同様の考慮は、本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得ることに当てはまる。
【０２６５】
変異体及び株／種相同体は、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする、変異体及び相同体内の配列を標的にするように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲにより得ることもできる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体由来のアミノ酸配列を整列させて予測することができる。配列アラインメントは、当技術分野で既知のコンピュータソフトウェアを用いて実施することができる。例えばGCG Wisconsin PiIeUpプログラムが幅広く使用されている。
【０２６６】
縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１又は複数の縮重位置を含有し、既知の配列に対し単一の配列プライマーで配列をクローニングするのに使用されるものより低いストリンジェンシー条件で使用されるであろう。
【０２６７】
或いは、このようなポリヌクレオチドは、特徴づけられた配列の部位特異的変異誘発により得ることができる。これは、例えばサイレントなコドン配列変化が、ポリヌクレオチド配列を発現している特定の宿主細胞に対するコドン選択を最適化するのに必要とされる場合に、有用となり得る。制限ポリペプチド認識部位を導入する、或いはポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの特性又は機能を変更するのに、他の配列変化が望まれる場合もある。
【０２６８】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー（例えば選択的増幅反応用プライマーであるＰＣＲプライマー）、プローブ（例えば放射性又は非放射性標識を用いる従来の手段による顕示標識（revealing label）で標識された）を生成するのに使用することができ、又はポリヌクレオチドはベクターにクローニングすることができる。このようなプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチド長であり、これらもまた、本明細書では本発明のポリヌクレオチドという用語により包含される。
【０２６９】
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド及びプローブは、組換え、合成、又は当業者に利用可能な任意の手段により製造することができる。これらは、標準的技術によりクローニングすることもできる。
【０２７０】
一般に、プライマーは、１回に１ヌクレオチドという所望の核酸配列の段階的な製造を含む合成手段により製造されるであろう。自動化技術を用いてこれを実現する方法は、当技術分野で容易に利用可能である。
【０２７１】
より長いポリヌクレオチドは、一般的に組換え手段により、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術により製造される。これは、クローニングが望まれる脂質標的配列の領域に隣接するプライマー対（例えば約１５〜３０ヌクレオチドの）を作製すること、該プライマーを動物又はヒト細胞から得られたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、増幅された断片を単離（例えばアガロースゲルで反応混合物を精製して）すること、及び増幅されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローニングできるように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
【０２７２】
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の配列に相補的な配列、又は本発明の配列若しくはこれに相補的な配列にハイブリダイズできる配列も包含する。
【０２７３】
本明細書では用語「ハイブリダイゼーション」には、「核酸鎖が塩基対合を介して相補鎖と連結するプロセス」、及びポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅プロセスが含まれるものとする。
【０２７４】
本発明はまた、本明細書で論じられた対象配列、又は任意の誘導体、断片若しくはこれらの誘導体に相補的である配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列の使用も包含する。
【０２７５】
本発明はまた、本明細書で論じられたヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列に相補的である配列も包含する。
【０２７６】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されている、ヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、以下に説明されるような定義された「ストリンジェンシー」を付与する。
【０２７７】
最大ストリンジェンシーは、典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）で、高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度で、中ストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度で、及び低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で生じる。当業者には理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定又は検出するのに使用することができるのに対し、中（又は低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似の又は関係するポリヌクレオチド配列を同定又は検出するのに使用することができる。
【０２７８】
好ましくは、本発明は、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、高ストリンジェンシー条件又は中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる配列に相補的である配列を包含する。
【０２７９】
より好ましくは、本発明は、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、高ストリンジェントな条件下（例えば６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ−クエン酸  ｐＨ７．０｝）でハイブリダイズできる配列に相補的である配列を包含する。
【０２８０】
本発明はまた、（本明細書で論じられた配列の相補配列も含めて）本明細書で論じられたヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列にも関する。
【０２８１】
本発明はまた、（本明細書で論じられた配列の相補配列も含めて）本明細書で論じられたヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列に相補的であるヌクレオチド配列にも関する。
【０２８２】
中〜最大ストリンジェンシー条件下、本明細書で論じられたヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列も、本発明の範囲内に含まれる。
【０２８３】
好ましい態様では、本発明は、ストリンジェントな条件下（例えば５０℃及び０．２×ＳＳＣ）、本明細書で論じられたヌクレオチド配列又はこの補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。
【０２８４】
より好ましい態様では、本発明は、高ストリンジェントな条件下（例えば６５℃及び０．１×ＳＳＣ）、本明細書で論じられたヌクレオチド配列又はこの補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。
【０２８５】
ポリペプチドの発現
本発明に用いるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。ベクターは、適合した宿主細胞中で及び／又は宿主細胞から、ポリペプチドの形態で、ヌクレオチド配列を複製し、発現させるのに使用することができる。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む制御配列を用いて制御することができる。原核生物プロモーター、及び真核細胞で機能するプロモーターを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用することができる。上述の２つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラプロモーターも使用することができる。
【０２８６】
ヌクレオチド配列の発現により宿主組換え細胞により生成されたポリペプチドは、使用される配列及び／又はベクターに応じて分泌されてよく、又は細胞内に含有されてよい。コード配列は、特定の原核又は真核細胞膜を介して物質コード配列の分泌を誘導するシグナル配列により設計することができる。
【０２８７】
構築物
「結合体」、「カセット」及び「ハイブリッド」などの用語と同義である用語「構築物」は、プロモーターに直接又は間接的に結合した、本発明により用いる、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接結合の例は、プロモーター及び本発明のヌクレオチド配列の中間にある、イントロン配列（Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンなど）などの適切なスペーサー基の提供である。同じことが、本発明に関して用語「融合された」にも当てはまり、直接又は間接結合を含む。いくつかのケースでは、これらの用語は、これらがどちらも自然環境にある場合、通常は野生型遺伝子プロモーターに関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の自然の組合せを含まない。
【０２８８】
構築物は、遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーを含有する、又は発現することもできる。
【０２８９】
いくつかの適用では、好ましくは構築物は、少なくとも本発明のヌクレオチド配列、又はプロモーターに作動可能に連結された、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２９０】
生物
本発明に関して用語「生物」は、本発明によるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／又はこれらから得られる生成物を含み得る任意の生物を含む。
【０２９１】
本発明に関して用語「トランスジェニック生物」は、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／若しくはこれから得られる生成物を含む、並びに／又はプロモーターが、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の生物内での発現を可能にすることができる、任意の生物を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生物のゲノムに組み込まれる。
【０２９２】
用語「トランスジェニック生物」は、自然環境での配列が、同じく自然環境にある天然プロモーターの制御下にある場合、その配列をコードする天然ヌクレオチドを含まない。
【０２９３】
したがって、本発明のトランスジェニック生物には、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書に定義されている構築物、本明細書に定義されているベクター、本明細書に定義されているプラスミド、本明細書に定義されている細胞、若しくはこれらの生成物のいずれか１つ又は組合せを含む生物が含まれる。例えば、トランスジェニック生物は、脂質アシルトランスフェラーゼを天然にコードする配列には関連のないプロモーターの制御下で、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。
【０２９４】
宿主細胞／生物の形質転換
原核生物宿主の形質転換に関する教示は、当技術分野では十分に記載されており、例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。原核生物宿主が使用される場合、ヌクレオチド配列は、イントロン除去によるなど、形質転換前に適切に修飾する必要があり得る。
【０２９５】
バチルス種の形質転換に関しては様々な方法が知られている。
【０２９６】
分泌
ポリペプチドは、発現宿主から、酵素をより容易に回収することができる培養培地に分泌されることが望ましい場合が多い。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づき選択することができる。ハイブリッドシグナル配列も、本発明の文脈で使用することができる。
【０２９７】
脂質アシルトランスフェラーゼを天然にコードするヌクレオチド配列には関連のない、分泌リーダー配列の典型例は、真菌のアミログルコシダーゼ（ＡＧ, amyloglucosidase）遺伝子（例えばアスペルギルス由来のｇｌａＡ−１８及び２４アミノ酸型）、α−因子遺伝子（酵母、例えばサッカロミセス、クルイベロミセス（Kluyveromyces）及びハンゼヌラ）又はα−アミラーゼ遺伝子（バチルス）に由来するものである。
【０２９８】
検出
アミノ酸配列発現を検出及び測定する様々なプロトコルが当技術分野で知られている。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ, enzyme-linked immunosorbent assay）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ, radioimmunoassay）及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ, fluorescent activated cell sorting）が含まれる。
【０２９９】
多種多様な標識及び結合技術が当業者に知られており、様々な核酸及びアミノ酸アッセイで使用することができる。
【０３００】
Pharmacia Biotech社（Piscataway, NJ）、Promega社（Madison, Wl）、及びUS Biochemical Corp社（Cleveland, OH）などいくつかの会社が、これらの手順のための市販のキット及びプロトコルを供給している。
【０３０１】
適切なレポーター分子又は標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、又は発色剤、並びに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが含まれる。このような標識の使用を教示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、米国特許第３，８５０，７５２号、米国特許第３，９３９，３５０号、米国特許第３，９９６，３４５号、米国特許第４，２７７，４３７号、米国特許第４，２７５，１４９号及び米国特許第４，３６６，２４１号が含まれる。
【０３０２】
同様に、組換え免疫グロブリンは、米国特許第４，８１６，５６７号に示されているように製造することができる。
【０３０３】
融合タンパク質
本発明の方法では、脂質アシルトランスフェラーゼは、融合タンパク質として生成して、例えばこの抽出及び精製に役立つことができる。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質配列の除去を可能にするため、融合タンパク質パートナーと所望のタンパク質配列との間にタンパク質分解性切断部位を含めることも好都合となり得る。好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げない。
【０３０４】
大腸菌での遺伝子融合発現系は、Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6 (5): 501-6に概説されている。
【０３０５】
本発明の別の実施形態では、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、非天然配列にライゲートして融合タンパク質をコードすることができる。例えば、物質の活性に影響することができる薬剤に関してペプチドライブラリーをスクリーニングするには、市販抗体により認識される非天然エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用であり得る。
【０３０６】
本発明を、これより、以下の図及び実施例を単なる例として参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】Ａｓｎ８０Ａｓｐの変異を有する変異体アエロモナス・サルモニシダ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列を示す（特に、アミノ酸８０は成熟配列にある）（配列番号１６）図である。
【図２】アエロモナス・ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ  ＃７９６５）由来の脂質アシルトランスフェラーゼであるアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図３】データベースバージョン６からのｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号２）を示す図である。
【図４】生物アエロモナス・ヒドロフィラ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から得られるアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図５】生物アエロモナス・サルモニシダ（ＡＡＧ０９８４０４；ＧＩ：９９６４０１７）から得られるアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図６】生物ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）（Genbank受託番号ＮＰ＿６３１５５８）から得られるアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。
【図７】生物ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）（Genbank受託番号：ＣＡＣ４２１４０）から得られるアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。
【図８】生物サッカロミセス・セレビシエ（Genbank受託番号Ｐ４１７３４）から得られるアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。
【図９】生物ラルストニア（Genbank受託番号：ＡＬ６４６０５２）から得られるアミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。
【図１０】配列番号９  Ｓｃｏｅ１  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ３９７０７．１  Ｇｌ：４５３９１７８の保存された仮想タンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１１】配列番号１０  Ｓｃｏｅ２  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＣ０１４７７．１  Ｇｌ：９７１６１３９の保存された仮想タンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］で示されるアミノ酸を示す図である。
【図１２】アミノ酸配列（配列番号１１）Ｓｃｏｅ３  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ８８８３３．１  Ｇｌ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１３】アミノ酸配列（配列番号１２）Ｓｃｏｅ４  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ８９４５０．１  Ｇｌ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１４】アミノ酸配列（配列番号１３）Ｓｃｏｅ５  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ６２７２４．１  Ｇｌ：６５６２７９３の推定リポタンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１５】アミノ酸配列（配列番号１４）Ｓｒｉｍ１  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＡＡＫ８４０２８．１  Ｇｌ：１５０８２０８８のＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトマイセス・リモサス］を示す図である。
【図１６】アエロモナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ（Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida）（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。
【図１７】配列番号１９  Ｓｃｏｅ１  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ３９７０７．１  Ｇｌ：４５３９１７８の保存された仮想タンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］を示す図である。
【図１８】アエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異誘発に使用される融合構築物のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す図である。下線を引いたアミノ酸は、キシラナーゼシグナルペプチドである。
【図１９】ストレプトマイセス由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列を示す（配列番号２６）図である。
【図２０】サーモビフィダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列を示す（配列番号２７）図である。
【図２１】サーモビフィダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列を示す（配列番号２８）図である。
【図２２】コリネバクテリウム・エフィシエンスＧＤＳｘ  ３００アミノ酸（配列番号２９）由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチドを示す図である。
【図２３】ノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Novosphingobium aromaticivorans）ＧＤＳｘ  ２８４アミノ酸（配列番号３０）由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチドを示す図である。
【図２４】ストレプトマイセス・セリカラーＧＤＳｘ  ２６９アミノ酸（配列番号３１）由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチドを示す図である。
【図２５】ストレプトマイセス・アベルミチリス＼ＧＤＳｘ  ２６９アミノ酸（配列番号３２）由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチドを示す図である。
【図２６】ストレプトマイセス（配列番号３３）由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチドを示す図である。
【図２７】生物アエロモナス・ヒドロフィラ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から得られるアミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である（特に、これは成熟配列である）。
【図２８】変異体アエロモナス・サルモニシダ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号３５）を示す図である（特に、これは成熟配列である）。
【図２９】ストレプトマイセス・サーモサッカリ由来のヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す図である。
【図３０】ストレプトマイセス・サーモサッカリ由来のアミノ酸配列（配列番号３７）を示す図である。
【図３１】サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘ  ５４８アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号３８）を示す図である。
【図３２】サーモビフィダ・フスカ由来のヌクレオチド配列（配列番号３９）を示す図である。
【図３３】サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘ由来のアミノ酸配列（配列番号４０）を示す図である。
【図３４】コリネバクテリウム・エフィシエンス／ＧＤＳｘ  ３００アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号４１）を示す図である。
【図３５】コリネバクテリウム・エフィシエンス由来のヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す図である。
【図３６】ストレプトマイセス・セリカラー／ＧＤＳｘ  ２６８アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号４３）を示す図である。
【図３７】ストレプトマイセス・セリカラー由来のヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す図である。
【図３８】ストレプトマイセス・アベルミチリス由来のアミノ酸配列（配列番号４５）を示す図である。
【図３９】ストレプトマイセス・アベルミチリス由来のヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す図である。
【図４０】サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘ由来のアミノ酸配列（配列番号４７）を示す図である。
【図４１】サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘ由来のヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す図である。
【図４２】Ｌ１３１のアラインメント並びにストレプトマイセス・アベルミチリス及びサーモビフィダ・フスカ由来の相同体は、ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１及びストレプトマイセス・アベルミチリス及びサーモビフィダ・フスカにおけるＧＤＳＹ）、ＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬのいずれかであるＧＡＮＤＹボックス、及びＨＰＴブロック（保存された触媒ヒスチジンと考えられる）の保存を示す図である。これらの３つの保存ブロックがハイライトされている。
【図４３】カンジダ・パラプシロシス由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１７を示す図である。
【図４４】カンジダ・パラプシロシス由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１８を示す図である。
【図４５】活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造のリボン表現（ribbon representation）を示す図である。図は、Deep View Swiss-PDBビューアを用いて作成された。
【図４６】活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造（Deep View Swiss-PDBビューアを用いた側面）を示す図である。グリセロールの活性部位から１０Å以内にある残基が黒く塗られている。
【図４７】活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造（Deep View Swiss-PDBビューアを用いた上面）を示す図である。グリセロールの活性部位から１０Å以内にある残基が黒く塗られている。
【図４８】アラインメント１を示す図である。
【図４９】アラインメント２を示す図である。
【図５０−１】図５０及び５１は、Ｐ１０４８０との１ＩＶＮのアラインメントを示す図である（Ｐ１０４８０はアエロモナス・ヒドロフィラ酵素のデータベース配列である）。このアラインメントは、ＰＦＡＭデータベースから得られモデル構築過程で使用された。
【図５０−２】図５０及び５１は、Ｐ１０４８０との１ＩＶＮのアラインメントを示す図である（Ｐ１０４８０はアエロモナス・ヒドロフィラ酵素のデータベース配列である）。このアラインメントは、ＰＦＡＭデータベースから得られモデル構築過程で使用された。
【図５１】図５０及び５１は、Ｐ１０４８０との１ＩＶＮのアラインメントを示す図である（Ｐ１０４８０はアエロモナス・ヒドロフィラ酵素のデータベース配列である）。このアラインメントは、ＰＦＡＭデータベースから得られモデル構築過程で使用された。
【図５２】Ｐ１０４８０がアエロモナス・ヒドロフィラのデータベース配列であるアラインメントを示す図である。この配列は、モデル構築及び部位選択に使用される。完全なタンパク質（配列番号２５）が描かれ、成熟タンパク質（配列３４に等しい）は残基１９で開始する。Ａ．ｓａｌはアエロモナス・サルモニシダ（配列番号４）ＧＤＳＸリパーゼであり、Ａ．ｈｙｄはアエロモナス・ヒドロフィラ（配列番号３４）ＧＤＳＸリパーゼである。コンセンサス配列は、リストされた配列間で違いのある位置に＊を含む。
【図５３】実施例１で使用された遺伝子構築物を示す図である。
【図５４】実施例１で使用されたコドン最適化遺伝子構築物（no. 052907）を示す図である。
【図５５】ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を含有するXhoIインサートの配列を示す図である。−３５及び−１０ボックスに下線が引かれている。
【図５６】１％トリブチリン寒天で３７℃にて４８時間増殖させた後のＢＭＬ７８０ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０（配列番号１６を含む−上のコロニー）及びＢＭＬ７８（空の宿主株−下のコロニー）を示す図である。
【図５７】シグナル配列（ｐｒｅＬＡＴ−位置１〜８７）を含むアエロモナス・サルモニシダ（配列番号４９）由来のヌクレオチド配列を示す図である。
【図５８】生物アエロモナス・ヒドロフィラから得られた本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す図である。
【図５９】生物アエロモナス サルモニシダから得られた本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す図である。
【図６０】生物ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）（Genbank受託番号ＮＣ＿００３８８８．１：８３２７４８０．．８３２８３６７）から得られた本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す図である。
【図６１】生物ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）（Genbank受託番号ＡＬ９３９１３１．１：２６５４８０．．２６６３６７）から得られた本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５３）を示す図である。
【図６２】生物サッカロミセス・セレビシエ（Genbank受託番号Ｚ７５０３４）から得られた本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す図である。
【図６３】生物ラルストニアから得られた本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５５）を示す図である。
【図６４】ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ３９７０７．１  Ｇｌ：４５３９１７８の保存された仮想タンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする配列番号５６で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６５】Ｓｃｏｅ２  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＣ０１４７７．１  Ｇｌ：９７１６１３９の保存された仮想タンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする配列番号５７で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６６】Ｓｃｏｅ３  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ８８８３３．１  Ｇｌ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする配列番号５８で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６７】Ｓｃｏｅ４  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ８９４５０．１  Ｇｌ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする配列番号５９で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６８】Ｓｃｏｅ５  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＣＡＢ６２７２４．１  Ｇｌ：６５６２７９３の推定リポタンパク質［ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）］をコードする、配列番号６０で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６９】Ｓｒｉｍ１  ＮＣＢＩタンパク質受託コードＡＡＫ８４０２８．１  Ｇｌ：１５０８２０８８のＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトマイセス・リモサス］をコードする配列番号６１で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図７０】アエロモナス・ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ＃７９６５）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号６２）を示す図である。
【図７１】アエロモナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号６３）を示す図である。
【図７２】キシラナーゼシグナルペプチドを含むアエロモナス・ヒドロフィラ由来の酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す図である。
【実施例１】
【０３０８】
バチルス・リケニフォルミスにおけるＫＬＭ３’の発現
脂質アシルトランスフェラーゼ（配列番号１６、以後ＫＬＭ３’と呼ぶ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４９）を、バチルス・リケニフォルミス［アルファ］−アミラーゼ（ＬＡＴ）のシグナルペプチドを有する融合タンパク質としてバチルス・リケニフォルミスで発現させた（図５３及び５４参照）。バチルスでの最適な発現のため、コドン最適化遺伝子構築物（no. 052907）をGeneart社（Geneart AG, Regensburg, Germany）で注文した。
【０３０９】
構築物（no. 052907）は、ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子の前に不完全なＬＡＴプロモーター（−１０配列のみ）を、ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子の下流にＬＡＴ転写（Ｔｌａｔ）を含有する（図５３及び５５参照）。５’末端で完全なＬＡＴプロモーターに、及び３’末端でＬＡＴターミネーターに隣接されるＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を含有するXhoI断片を作製するため、プライマーPlat5XhoI_FW及びEBS2XhoI_RVにより、遺伝子構築物０５２９０７をテンプレートとして、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅を行った。
Plat5XhoI_FW：
ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattc ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg
EBS2XhoI_RV：tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
【０３１０】
ＰＣＲは、製造者の指示に従いPhusion High FidelityＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes OY社製、Espoo, Finland）によりサーモサイクラーで実施した（アニーリング温度５５［度］Ｃ）。
【０３１１】
得られたＰＣＲ断片を、供給者（Invitrogen社、Carlsbad, Calif. USA）の指示により制限酵素XhoIで消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでXhoI消化plCatHにライゲートした。
【０３１２】
ライゲーション混合物を、米国特許出願第２００２１８２７３４号明細書（国際公開第０２／１４４９０号パンフレット）に記載されているようにバチルス・サブチリス株ＳＣ６．１に形質転換した。ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を含有するXhoIインサートの配列を、ＤＮＡ配列決定（BaseClear社製、Leiden, The Netherlands）により確認し、正しいプラスミドクローンの１つをplCatH-KLM3' (ori1)に指定した（図５３）。plCatH-KLM3' (ori1)を、許容温度（３７［度］Ｃ）でバチルス・リケニフォルミス株ＢＭＬ７８０（ＢＲＡ７及びＢＭＬ６１２の誘導体、国際公開第２００５１１１２０３号パンフレット参照）に形質転換した。
【０３１３】
１つのネオマイシン耐性（ｎｅｏＲ）及びクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）形質転換体を選択し、BML780 (plCatH-KLM3' (ori1))に指定した。BML780 (plCatH-KLM3' (ori1))中のプラスミドを、バチルス・リケニフォルミスゲノムのｃａｔＨ領域に、５［ｍｕ］ｇ／ｍｌクロラムフェニコールを有する培地で非許容温度（５０［度］Ｃ）にて該株を増殖させることにより組み込んだ。１つのＣｍＲ耐性クローンを選択し、BML780-plCatH-KLM3' (ori1)に指定した。BML780-plCatH-KLM3' (ori1)を、抗生剤なしで許容温度にて数世代再び増殖させてベクター配列をループアウトさせ、次いで１つのネオマイシン感受性（ｎｅｏＳ）の、ＣｍＲクローンを選択した。このクローンでは、染色体上のplCatHのベクター配列を切除し（ネオマイシン耐性遺伝子を含め）、catH-LATKLM3'カセットのみを残す。次に、染色体上のcatH-LATKLM3'カセットを、クロラムフェニコール濃度を上げながら培地中／上で該株を増殖させることにより増幅した。様々な増幅ラウンドの後、１つのクローン（５０［ｍｕ］ｇ／ｍｌクロラムフェニコールに対して耐性）を選択し、BML780-KLM3' CAP50に指定した。ＫＬＭ３’発現を検証するため、catH-LATKLM3'及びＢＭＬ７８０（空の宿主株）を、１％トリブチリンを有するHeart Infusion（Bacto社製）寒天プレートで３７［度］Ｃにて４８時間増殖させた。脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示すクリアなゾーンは、宿主株ＢＭＬ７８０の周辺ではなくcatH-LATKLM3'コロニーの周辺で明らかに見られた（図５６参照）。この結果は、相当量のＫＬＭ３’がバチルス・リケニフォルミス株catH-LATKLM3'において発現していること、これらのＫＬＭ３’分子が機能性であることを示している。
【０３１４】
比較例１
ベクター構築物
プラスミド構築物は、pCS32new N80Dである。これは、ｐ３２プロモーターの制御下、位置８０でＡｓｎがＡｓｐに置換する、及びＣＧＴａｓｅシグナル配列を有する、天然のアエロモナス・サルモニシダグリセロリン脂質−コレステロールアシルトランスフェラーゼの成熟形態をコードする配列を保有するpCCmini誘導体である。
【０３１５】
発現に使用される宿主株は、バチルス・サブチリスＯＳ２１ΔＡｐｒＥ株にある。
【０３１６】
発現レベルは、トランスフェラーゼ活性として測定され、％エステル化コレステロールで表され、供与体分子であるＰＣ（Ｔｐｃ）及びアクセプター分子であるコレステロールとの反応において、参照試料中の遊離コレステロールと酵素試料中の遊離コレステロールの差から計算される。
【０３１７】
培養条件
５０ｍｇ／ｌカナマイシンを補充した、ＬＢブロス（カゼイン酵素消化物、１０ｇ／ｌ；低ナトリウム酵母抽出物、５ｇ／ｌ；塩化ナトリウム、５ｇ／ｌ；不活性錠剤化助剤、２ｇ／ｌ）５ｍｌを単一のコロニーに播種し、２０５ｒｐｍで６時間３０℃にてインキュベートした。この培養物０．７ｍｌを用いて、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ及び高マルトースデンプン加水分解物溶液（６０ｇ／ｌ）を補充したＳＡＳ培地（Ｋ２ＨＰＯ４、１０ｇ／ｌ；ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）、４０ｇ／ｌ；塩化ナトリウム、５ｇ／ｌ；消泡剤（Ｓｉｎ２６０）、５滴／ｌ；脱脂大豆粉、２０ｇ／ｌ；Biospringer 106（１００％ｄｗ  ＹＥ）、２０ｇ／ｌ）５０ｍｌをインキュベートした。インキュベーションを３０℃、１８０ｒｐｍで４０時間継続した後、培養上清を３０分間１９０００ｒｐｍで遠心分離により分離した。上清をクリーンな試験管に移し、トランスフェラーゼ活性測定に直接使用した。
【０３１８】
基質の調製及び酵素反応
ＰＣ（Avanti Polar Lipid社製#441601）及びコレステロール（Sigma社製C8503）を比９：１でスケーリングし、クロロホルムに溶解し、蒸発乾固した。基質は、３％ＰＣ：コレステロール９：１を５０ｍＭ  ＨｅｐｅｓバッファーｐＨ７に分散させて調製した。０．２５０ｍｌ基質溶液をネジ蓋付き３ｍｌガラス試験管に移した。０．０２５ｍｌ培養上清を添加し、混合物を４０℃で２時間インキュベートした。酵素の代わりに水を有する参照試料も調製した。反応混合物を沸騰水浴中で１０分間加熱し、酵素反応を停止させた。９９％エタノール２ｍｌを反応混合物に添加した後、コレステロールアッセイ分析に供した。
【０３１９】
コレステロール アッセイ
コレステロールオキシダーゼ（SERVA Electrophoresis GmbH社製、cat.No 17109）１．４Ｕ／ｍｌ、ＡＢＴＳ（Sigma社製A-1888）０．４ｍｇ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ（Sigma社製6782）６Ｕ／ｍｌを含有する基質１００μｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．６及び０．５％Triton X-100（Sigma社製X-100）溶液を、３７℃で５分間インキュベートした後、反応混合物試料５μｌを添加し混合した。反応混合物をさらに５分間インキュベートし、ＯＤ４０５を測定した。コレステロール含量を、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．２０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、及び０ｍｇ／ｍｌコレステロールを９９％ＥｔＯＨに含有するコレステロール標準溶液の分析から計算した。
【０３２０】
結果
表は８種類の別個の発現培養物の平均を示す。
【０３２１】
【表５】
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【０３２２】
上記明細書で言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及びシステムの様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく当業者には明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態と関連して記載されたが、特許請求に係る発明が、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明白な、本発明を実施するための記載された方法の様々な修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2010516271.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０−１】
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【図５０−２】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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