(57)【要約】  本発明は、高度分枝状アミロースおよびアミロペクチン・クラスターを酵素的に調製する方法に関する。α−グルカノトランスフェラーゼまたは分枝酵素が、デンプン中のアミロペクチン・クラスター間のセグメント結合を加水分解してアミロペクチン・クラスターを生成し、これと同時に、分枝酵素が、分枝状側鎖をアミロースに付着させて分枝状アミロースを生成し、その後、アミロペクチン・クラスターまたは分枝状アミロースをマルトース原性アミラーゼにより処理して長い側鎖を短い側鎖に切断し、グルコースを側鎖に移し、デンプンから高度分枝状アミロペクチン・クラスター、高度分枝状アミロース、または分枝状オリゴ糖を効果的に生成する。
2010516289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプンを、分枝酵素またはα−グルカノトランスフェラーゼおよびマルトース原性アミラーゼとともにインキュベートすることにより、高度分枝状アミロース、高度分枝状アミロペクチン・クラスター、または分枝状オリゴ糖を調製する方法。
【請求項２】
デンプンを、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離した分枝酵素、またはサーマス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）から単離したα−グルカノトランスフェラーゼとともに３０〜７５℃で３０分間〜４時間にわたりインキュベートして、アミロペクチン・クラスターまたは分枝状アミロースを生成するステップと、
得られたアミロペクチン・クラスターまたは分枝状アミロースを、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するマルトース原性アミラーゼにより４５〜６５℃で２〜４時間にわたり処理して、高度分枝状アミロース、高度分枝状アミロペクチン・クラスター、または分枝状オリゴ糖を調製するステップと
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記デンプンが、デンプン、デンプンを有する穀類、アミロペクチン、およびアミロースからなる群から選択されるデンプンである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１０４〜１０５の分子量および６〜２３ＤＰのα−１，６結合を有し、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法により調製される高度分枝状アミロペクチン・クラスター。
【請求項５】
８〜１８ＤＰのα−１，６結合のほか、α−１，４結合も有する請求項１から３のいずれか一項に記載の方法により調製される高度分枝状アミロース。
【請求項６】
ＴＬＣによれば２〜５ＢＤＰを有する請求項１から３のいずれか一項に記載の方法により調製される分枝状オリゴ糖。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法により調製される高度分枝状アミロースまたは高度分枝状アミロペクチン・クラスターを有効成分として含有する加工健康食品。
【請求項８】
抗糖尿病、抗肥満、または持続的なエネルギー供給の効果を有する請求項７に記載の加工健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度分枝状アミロースおよびアミロペクチン・クラスターを酵素的に調製する方法に関し、より具体的には、分枝酵素またはα−グルカノトランスフェラーゼによりアミロペクチンを加水分解してアミロペクチン・クラスターを生成し、これと同時に、分枝酵素によりアミロースを処理してグリコシド側鎖が分枝した分枝状アミロースを調製するステップと、マルトース原性アミラーゼのトランスグリコシル化活性を用いて、調製されたアミロペクチン・クラスターおよび分枝状アミロースから、高度分枝状アミロペクチン・クラスター、高度分枝状アミロース、または分枝状オリゴ糖を調製するステップと、を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度に水溶性であり、小腸におけるその消化を遅延させ、血中グルコース・レベルの上昇を阻止し、カロリーの持続的な供給により運動力を増強する新規の機能性材料である、高度分枝状アミロペクチン・クラスターおよびアミロースを効果的に調製する方法が必要とされる。
【０００３】
α−グルカノトランスフェラーゼまたは分枝酵素は、アミロペクチン・クラスター間のセグメントを加水分解してアミロペクチン・クラスターを生成する。さらに、分枝酵素は、アミロースと反応すると、分枝状アミロースを生成する。マルトース原性アミラーゼは、デンプンをおもにマルトース単位に加水分解し、また、各種のグリコシド結合の形成を介して、高度なトランスグリコシル化活性も示し、こうして、α−１，６結合によりグルコースが非還元末端に結合する、高度分枝状アミロペクチンおよびアミロースが生成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、マルトース原性アミラーゼ、およびα−グルカノトランスフェラーゼまたは分枝酵素を用いて、新規の機能性材料である高度分枝状アミロペクチンおよびアミロースを提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達するために、アミロペクチンまたはアミロースを、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８から単離した分枝酵素、またはサーマス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）から単離したα−グルカノトランスフェラーゼによりｐＨ５．５〜７．５および３０〜７５℃で処理し、その後、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から単離したマルトース原性アミラーゼにより４５〜６５℃で処理し、結果として、高度分枝状アミロペクチンおよびアミロースを生成した。
【０００６】
本発明は、デンプンを、分枝酵素またはα−グルカノトランスフェラーゼおよびマルトース原性アミラーゼと反応させることにより、高度分枝状アミロース、高度分枝状アミロース、または分枝状オリゴ糖を調製する方法を提供することを特徴とする。
【０００７】
該デンプンは、デンプン、デンプンを有する穀類、またはアミロペクチンおよびアミロースから選択してよい。
【０００８】
本発明の方法は、枯草菌から単離した分枝酵素、またはサーマス・スコトダクタスから単離したα−グルカノトランスフェラーゼをデンプンに添加し、３０〜７５℃で３０分〜４時間にわたりインキュベートして、アミロペクチン・クラスターまたは分枝状アミロースを生成するステップと、得られたアミロペクチン・クラスターまたは分枝状アミロースを、バチルス・ステアロサーモフィルスのマルトース原性アミラーゼにより４５〜６５℃で２〜４時間にわたり処理するステップとを含むことを特徴とする。
【０００９】
α−グルカノトランスフェラーゼ、分枝酵素、およびマルトース原性アミラーゼは、天然種の原核生物または真核生物から単離および精製された典型的な酵素でもよく、組換えＤＮＡ技術を用いて、その遺伝子の人工的な発現により調製してもよい。
【００１０】
本発明によるα−グルカノトランスフェラーゼは、サーマス・スコトダクタスのα−グルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子をクローン化し、これを枯草菌ＩＳＷ  １２１４に形質転換し、その発現酵素を精製することにより調製した。分枝酵素は、枯草菌１６８の分枝酵素をコードする遺伝子をクローン化し、これを枯草菌に形質転換し、その発現酵素を精製することにより生成した。マルトース原性アミラーゼも、バチルス・ステアロサーモフィルスのマルトース原性アミラーゼをコードする遺伝子をクローン化し、枯草菌ＬＫ８７に形質転換し、その発現酵素を精製することにより調製した。
【００１１】
上記の酵素の中で、分枝酵素は、枯草菌１６８から単離してもよく、遺伝子工学の方法を用いて調製してもよい。本発明の一例によれば、分枝酵素は、以下のステップ：
（ａ）枯草菌１６８から単離された分枝酵素をコードするＤＮＡ配列を挿入して組換えベクターを調製するステップ、（ｂ）組換えベクターを宿主細胞内に導入して形質転換体を調製するステップ、および（ｃ）形質転換体を培養してアミラーゼを生成するステップ
により生成される。
【００１２】
（ａ）ステップでは、分枝酵素をコードする配列を、典型的な発現ベクター、すなわち、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）内に挿入してよいが、宿主細胞に応じて適切なベクターを選択することが望ましい。本発明の一例では、図２に示される切断マップを有するｐ６ｘＨＴＫＮｄベクターを調製した。
【００１３】
（ｂ）の形質転換ステップでは、宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、または真核生物に由来する細胞、すなわち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、乳酸菌、酵母、真菌などでありうるがこれらに限定されない。形質転換の方法は、一般に知られた標準的な方法を用いて実施することができる。
【００１４】
（ｃ）の形質転換体を培養するステップでは、宿主細胞に応じて適する培地を選択してよく、その培養条件もまた、宿主細胞に応じて変化させてよい。本発明の一例として調製される大腸菌ＭＣ１０６１を、カナマイシンを含有するＬＢ培地で、３０〜３７℃で１６〜２０時間にわたり培養すると、多数の分枝酵素を生成しうる。
【００１５】
一方、分枝酵素を生成する方法は、（ｃ）ステップの後に、形質転換体からのアミラーゼ組換えタンパク質の精製ステップを含みうる。精製ステップは、形質転換された細胞を超音波処理するステップと、超音波処理された上清を用いるＮｉアフィニティー・クロマトグラフィー法を実施するステップとを含みうる。
【００１６】
分子酵素を生成する上記の方法は、低温で微生物を培養するステップと、その生成力をさらに増強するステップとにより、費用を低減する効果を有しうる。
【００１７】
本発明のアミラーゼは、一般に知られた標準的な方法を用いて容易に調製することができ、これは、本発明が属する技術分野に携わる当業者には明らかである。
【００１８】
上記の方法により調製された高度分枝状アミロペクチン・クラスターおよびアミロースの分子量および組成は、それぞれ、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ法（サイズ除外クロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱法）および高速イオン交換クロマトグラフィー法を用いて解析される。すなわち、高度分枝状アミロペクチンおよびアミロースの分子量は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬ法（サイズ除外クロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱法）を用いて決定することができ、高度分枝状アミロペクチンおよびアミロースの組成は、それをイソアミラーゼと反応させて脱分枝化した後で、高速イオン交換クロマトグラフィー法を用いて解析することができる。
【００１９】
本発明の一例によれば、高度分枝状アミロペクチン・クラスターは、以下のステップ：
ゼラチン化させたワックス状のコメ・デンプンを５０〜１００Ｕ／ｇ（ワックス状のコメ１ｇあたり５０単位）のα−グルカノトランスフェラーゼとともにインキュベートしてアミロペクチン・クラスターを生成するステップ、生成されたアミロペクチン・クラスターを１００〜５００Ｕ／ｇ（アミロペクチン・クラスター１ｇあたり１００〜５００単位）のマルトース原性アミラーゼにより４５〜６５℃で３〜５時間処理して高度分枝状アミロペクチン・クラスターを生成するステップにより生成および決定することができる。
【００２０】
各ステップ中において、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ法を用いてその分子量を決定したところ、ワックス状のコメ・デンプンの分子量が約１０８と決定されたのに対し、アミロペクチン・クラスターの分子量は約１０５と決定され、高度分枝状アミロペクチン・クラスターの分子量は約１０４と決定された。
【００２１】
アミロペクチン・クラスターおよび高度分枝状アミロペクチン・クラスターを０．２〜１Ｕ／ｍｇのイソアミラーゼ（基質１ｍｇあたり０．２〜１単位）により４５〜６０℃で２４〜４８時間処理してα−１，６結合を脱分枝化することができ、高速イオン交換クロマトグラフィー法を用いてそれらの組成を同定することができる。
【００２２】
１３を超えるＤＰを有する高度分枝状アミロペクチン・クラスターを確認するためには、その分枝度を同定するのが難しいので、β−アミラーゼで処理すべきである。結果として、１０４〜１０５の分子量および６〜２３ＤＰのα−１，６結合長を有する高度分枝状アミロペクチン・クラスターが生成されたと推定される。
【００２３】
一方、本発明の一例によれば、高度分枝状アミロースは、以下のステップ：
アミロース（馬鈴薯に由来するＩＩＩ型、Ｓｉｇｍａ社製）を５０〜１００Ｕ／ｍｇの分枝酵素（基質１ｍｇあたり５０〜１００単位）とともにインキュベートして分枝状アミロースを得るステップ、分枝状アミロースを０．２〜１Ｕ／ｍｇのマルトース原性アミラーゼ（基質１ｍｇあたり０．２〜１単位）により処理して高度分枝状アミロースを生成するステップにより生成される。
【００２４】
分枝状アミロースおよび高度分枝状アミロースを０．２〜１Ｕ／ｍｇのイソアミラーゼで処理して脱分枝化した後、高速イオン交換クロマトグラフィー法を実施すると、８〜１８ＤＰの新規のα−１，６結合のほかα−１，４結合も有する、高度分枝状アミロースが生成されたことが判定される。
【００２５】
加えて、本発明の一例によれば、シリカゲルＫ５Ｆ薄層クロマトグラフィー・プレートを用いて、高度分枝状アミロペクチン・クラスターの生成から生じたオリゴ糖を解析すると、長鎖のマルトオリゴ糖が、２〜５ＢＤＰの分枝状オリゴ糖に転換されたことが確認される。
【００２６】
本発明で用いられる「分枝状の」という用語は、グルコースが、α−１，６結合のほかα−１，４結合によっても結合している状態として定義される。加えて、「ＤＰ」とは「重合度」の略記であり、グルコース数を意味する。本発明では特に、イソアミラーゼにより脱分枝化されるグルコース数、すなわち、分枝鎖長を意味する。本発明において、「高度分枝状の」とは、６を超えるＤＰと定義される。
【００２７】
加えて、「ＢＤＰ」とは、「分枝状重合度」の略記であり、分枝状オリゴ糖は、低分子量を有し、その分枝度をＴＬＣ分析により決定することができるので、イソアミラーゼ処理を伴わないＢＤＰとして表わされる。
【００２８】
本発明は、抗糖尿病、抗肥満、または持続的なエネルギー供給の効果を有する加工健康食品を提供することを特徴とする。
【００２９】
本発明でいうところの「持続的エネルギー供給の効果」とは、高度分枝状アミロペクチンまたは高度分枝状アミロースがゆっくりと加水分解され、エネルギーを持続的に供給する結果をもたらしうることを意味する。
【００３０】
表１に示す通り、アミロペクチン・クラスターと高度分枝状アミロペクチン・クラスターとの間で、グルコアミラーゼ（α−１，４結合とα−１，６結合をどちらも加水分解することができるが、α−１，４結合に対する加水分解力の方が大きい）による加水分解反応速度を比較すると、アミロペクチン・クラスターは、高値のＫｃａｔおよび低値のＫｍのために、グルコアミラーゼにより容易に加水分解されることが推定される。ｋｍ値が低値である場合、その効率は高くなり、これにより、基質との強力な結合が誘導され、多量の生成物が生成される。これに対し、Ｋｍ値が高値である場合、その効率は低くなり、これにより基質との弱い結合が生じる。Ｋｃａｔが高値になるほど、基質を生成物に移すための分子がより多く存在する。したがって、高度分枝状アミロペクチン・クラスターは、グルコアミラーゼによりゆっくりと加水分解されると推定される。すなわち、高度分枝状形態の方がよりゆっくりと加水分解され、これにより、エネルギーを持続的に供給することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、高度分枝状アミロースおよびアミロペクチン・クラスターを酵素的に調製する方法に関する。α−グルカノトランスフェラーゼまたは分枝酵素が、デンプン中のアミロペクチン・クラスター間のセグメント結合を加水分解してアミロペクチン・クラスターを生成し、これと同時に、分枝酵素が、分枝状側鎖をアミロースに付着させて分枝状アミロースを生成し、その後、アミロペクチン・クラスターまたは分枝状アミロースをマルトース原性アミラーゼにより処理して長い側鎖を短い側鎖に切断し、グルコースを側鎖に移し、デンプンから高度分枝状アミロペクチン・クラスター、高度分枝状アミロース、または分枝状オリゴ糖を効果的に生成する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＢＳＭＡ（バチルス・ステアロサーモフィルスのマルトース原性アミラーゼ）およびα−ＧＴアーゼ（４−α−グルカノトランスフェラーゼ）または分枝酵素を用いて、アミロペクチンまたはデンプンから高度分枝状アミロペクチン・クラスターおよびアミロースを調製する手順を示す概略図である。
【図２】枯草菌１６８の分枝酵素をコードする遺伝子をクローン化する手順を示す概略図である。
【図３】大腸菌ＭＣ１０６１により生成される枯草菌１６８の分枝酵素の電気泳動写真である。
【図４】各ｐＨに応じての、組換えタンパク質である分枝酵素の活性を示すグラフである。
【図５】各温度に応じての、組換えタンパク質である分枝酵素の活性を示すグラフである。
【図６】α−ＧＴアーゼを用いて調製されたアミロペクチン・クラスターの分子量の低下を示す、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ解析の結果を示す図である。
【図７】高度分枝状アミロペクチン・クラスターおよび高度分枝状アミロペクチン・クラスターの側鎖分布を示すクロマトグラムである。
【図８】分枝状アミロースおよび高度分枝状アミロースの側鎖分布を示すクロマトグラムである。
【図９】ＢＳＭＡを用いて高度分枝状アミロースおよびアミロペクチン・クラスターを調製する過程中において生成される副産物である分枝状オリゴ糖のＴＬＣクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下で、本発明を下記の実施例によって詳細に説明する。しかし、実施例は、本発明の例示のために提供するものであり、その限定のために提供するものではない。
【実施例１】
【００３４】
枯草菌１６８からの分枝酵素のクローン化、生成、および特性
１−１．分枝酵素をコードする遺伝子のクローン化
分枝酵素を単離するために、順行プライマーＦ−ｇｌｇＢ（５’−ＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣ−３’）および逆行プライマーＲ−ｇｌｇＢ（５’−ＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＴＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＧＴＡＧＣＣＡ−３’）をそれぞれ調製した。次いで、枯草菌１６８（ＡＴＣＣ  ２３８５７Ｄ−５）の染色体ＤＮＡと、Ｅｘ  ｔａｑポリメラーゼ（日本、東京、宝酒造株式会社製）と、Ｅｘ  ｔａｑ緩衝液およびｄＮＴＰの混合物との混合物を用いてＰＣＲ法を実施した。ＰＣＲ法には、ＵＳ／７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｃｏｒｂｅｔｔ社製）を用いた。反応は、以下の通りに実施した：第１段階として、９５℃で５分間を１回、ならびに、第２段階として、９４℃で３０秒間および５５℃で３０秒間および７２℃で３分間を３０回反復し、最終段階として、７２℃で７分間実施した。反応は、４℃で４分間にわたり冷却することにより終結させた。上記の反応の結果として、１．８ｋｂのＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物は、制限酵素であるＮｃｏＩおよびＸｈｏＩにより処理し、対応する発現ベクターであるｐ６ｘＨＴＫＮｄとライゲーションし、ｐ６ｘＨＴＫＮＤｇｌｇＢを調製した。ｐ６ｘＨＴＫＮＤｇｌｇＢの切断マップを図２に示す。ｐ６ｘＨＴＫＮＤｇｌｇＢベクターは、分枝酵素をコードする遺伝子を有し、分枝酵素遺伝子の３’端に追加の６−ヒスチジン・タグを有する。
【００３５】
形質転換では、５ｍＬのＬＢ培地中、３７℃で１２時間にわたり大腸菌ＭＣ１０６１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）を予備培養した。１ｍＬの予備培養液を５０ｍＬの新鮮なＬＢ培地中に移し、６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．５になるまで培養した。次いで、１．５ｍＬの培地を４℃で遠心分離（７，０００×ｇ、５分間）し、次いで、沈殿物を回収し、０．７５ｍＬの形質転換用溶液（５０ｍＬのＣａＣｌ２）とともに再懸濁させ、３０分間にわたり氷中で静置した。１５ｍＬの懸濁液を、ｐ６ｘＨＴＫＮＤｇｌｇＢを含有する５００ｎｇのライゲーション液と混合し、１時間にわたり氷中で静置し、４２℃で２分間にわたり熱ショック処理した。熱ショック処理した溶液に０．８ｍＬのＬＢ培地を補充し、３７℃で１時間にわたり培養し、それをカナマイシン（最終濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天培地上に広げ、耐性微生物をスクリーニングした。
【００３６】
スクリーニングされた微生物を、カナマイシンを含有する５ｍＬのＬＢ液体培地中に接種し、３７℃で１２時間にわたり培養し、遠心分離して微生物を回収した。プラスミド単離キットを用いて回収された微生物からプラスミドを単離し、制限酵素であるＮｃｏＩおよびＸｈｏＩによりプラスミドを切断したところ、プラスミドは、約１．８ｋｂの分枝酵素を含有していることが示された。
【００３７】
１−２．形質転換体の調製
上記で調製されたｐ６ｘＨＴＫＮＤｇｌｇＢベクターを大腸菌ＭＣ１０６１に形質転換し、カナマイシン耐性微生物をスクリーニングした。スクリーニングされた形質転換体を、アンピシリンを含有する３ＬのＬＢ液体培地中に接種し、３７℃で１６時間にわたり培養した。
【００３８】
１−３．精製
上記で培養された形質転換体を遠心分離（４℃、７，０００×ｇで３０分間）により回収し、３００ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのイミダゾールを含有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に再懸濁させ、超音波処理した。超音波処理された溶液を遠心分離して上清を得、上清を７０℃で２０分間にわたり熱処理した。熱処理後、溶液を遠心分離（１０，０００×ｇ、３０分間）して上清を回収した。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィー法を用いて、上清から分枝酵素溶液を精製した。
【００３９】
１−４．酵素の活性およびｐＨ特性
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中の酵素溶液（２５μＬ）と、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中の０．１％アミロース溶液を混合し、３７℃で２０分間にわたりインキュベートした。反応を終結させ、ヨウ化物−ＨＣｌ溶液で着色した。吸光度は、６６０ｎｍで測定した。１単位の分枝酵素は、アミロースの標準曲線との対比で、１分間あたり１μｇ／ｍＬのアミロースを分解した酵素の量として定義された。
【００４０】
酵素の最適ｐＨを決定するために、各ｐＨのβ−シクロデキストリンを用いてその相対活性を測定した。
【００４１】
５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、および５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０〜１０．０）中にそれぞれ溶解させた２５μＬの０．１％（ｗ／ｖ）アミロース溶液を、各緩衝液で希釈した２５μＬの基質溶液に添加し、３０℃で２０分間にわたりインキュベートし、酵素の相対活性を決定した。
【００４２】
図４は、各ｐＨ条件に応じての、組換えタンパク質である分枝酵素の活性を示すが、分枝酵素は、ｐＨ７．５で最大活性を示し、ｐＨ９．０〜１０．０で５０％を超える活性を示した。
【００４３】
１−５．酵素の温度特性
分枝酵素の最適温度を決定するために、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中における２５μＬのアミロース溶液を各温度で５分間にわたり熱処理した。次いで、熱処理された溶液を２５μＬの分枝酵素と混合し、各温度で２０分間にわたりインキュベートし、酵素の相対活性を決定した。
【００４４】
図５は、温度に応じての、組換えタンパク質である分枝酵素の活性を示すが、分枝酵素は、３０℃で最大活性を示した。
【実施例２】
【００４５】
アミロペクチン・クラスターの調製
２−１．調製
デンプンの供給源としては、ワックス状コメ・デンプンを用いた。
【００４６】
α−グルカノトランスフェラーゼは、サーマス・スコトダクタスＡＴＣＣ  ２７９７８のα−グルカノトランスフェラーゼ遺伝子を枯草菌ＩＳＷ１２１４（宝酒造株式会社製）に形質転換し、Ｎｉアフィニティー・クロマトグラフィー法を用いてその発現酵素を精製することにより調製した。
【００４７】
２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて５％のワックス状コメ・デンプン溶液を調製し、沸騰水中で２０分間にわたり静置し、ゼラチン化させた。次いで、１００Ｕ／ｇのα−グルカノトランスフェラーゼ（ワックス状コメ・デンプン１ｇあたり１００単位）をゼラチン化したデンプン溶液に添加し、その混合物を７５℃で３０分間にわたりインキュベートした。混合物を３０分間にわたり沸騰させることにより、反応を停止させた。
【００４８】
２−２．ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ法（サイズ除外クロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱法）を用いる分子量の測定
０．５％（５ｍｇ／ｍＬ）のワックス状コメ・デンプンおよび０．５％（５ｍｇ／ｍＬ）のアミロペクチン・クラスターを１時間超にわたり沸騰させ、それぞれ、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ装置に注入してその分子量を測定した。測定は、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＭＡＬＬＳシステムを用い、Ｓｈｏｄｅｘ社製の接続されたＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０６（内径８．０ｍｍ×３００ｍｍ）およびＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０４（内径８．０ｍｍ×３００ｍｍ）からなるカラムを用いて実施した。結果は、図６に示した。
【実施例３】
【００４９】
アミロペクチン・クラスターからの高度分枝状アミロペクチン・クラスターの調製
３−１．高度分枝状アミロペクチン・クラスターの調製
マルトース原性アミラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルスＫＣＴＣ  ０１１４ＢＰのマルトース原性アミラーゼ遺伝子を、枯草菌ＬＫ８７（高麗大学大学院、「Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｍｏｌ  ｃｅｌｌｓ．１９９７年１２月３１日、第７巻、第６号、７８８〜９４頁）に形質転換し、Ｎｉアフィニティー・クロマトグラフィー法を用いてその発現酵素を精製することにより調製した。
【００５０】
次いで、１００Ｕ／ｇのマルトース原性アミラーゼ（アミロペクチン・クラスター１ｇあたり１００単位）と、実施例１においてその反応が停止された反応溶液とを、５５℃で４時間にわたりインキュベートした。３０分間超にわたり沸騰させることにより反応を停止させ、溶液を１２，０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離して、変性したタンパク質を除去した。反応溶液中に残存する塩を除去するため、反応溶液を陰イオン交換樹脂（Ｃ１００ＦＬ型、Ｐｒｏｌｉｔｅ社製）および陰イオン交換樹脂（Ａ４００型、Ｐｒｏｌｉｔｅ社製、）に通した。次いで、残存する多糖を除去するため、２倍容量のエタノールを添加し、高分子の糖を沈殿させ、溶液を再遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿物を凍結乾燥させ、粉末化した。
【００５１】
３−２．高速イオン交換クロマトグラフィー法を用いる反応溶液の解析
アミロペクチン・クラスターおよび高度分枝状アミロペクチン・クラスターにおける側鎖の分布および組成を確認するため、上記のクラスターを、それぞれ、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）中に溶解させ、１％溶液を調製した。０．５Ｕ／ｍｇ（基質１ｍｇあたり０．５単位）のイソアミラーゼにより、６０℃で４８時間にわたり溶液を処理した。ＣａｒｏｂｏＰＡＣ（商標）ＰＡ１型（４×５０ｍｍ）カラムの付いた高速イオン交換クロマトグラフ（ＧＰ４０型勾配ポンプ、Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いて、α−１，６結合が切断した各反応物質を解析した。１３を超えるＤＰを有する高度分枝状アミロペクチン・クラスター中の分枝部分を識別するのは困難であるので、解析を容易にするため、β−アミラーゼで処理した（図７）。
【実施例４】
【００５２】
グルコアミラーゼを用いる高度分枝状アミロペクチン・クラスターの加水分解反応速度
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から単離されたグルコアミラーゼ（Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を用いて、アミロペクチン・クラスターおよび高度分枝状アミロペクチン・クラスターの加水分解反応速度を検討した。
【００５３】
５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中における各濃度の基質溶液５０μＬを、５０℃で５分間にわたり予備加熱した。次いで、５０μＬ（０．３Ｕ）のグルコアミラーゼを基質溶液に添加し、６０℃の反応混合物アリコート（２０μＬ）を、５分間にわたり３０秒間または１分間ごとに採取した。２０μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨの添加により、反応を停止させた。ＧＯＤ−ＰＯＤ法（グルコース量決定試薬、Ａｓａｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）を用いて、アミロペクチン・クラスターまたは高度分枝状アミロペクチン・クラスターの加水分解量を測定した。
【００５４】
表１は、ＧＯＤ−ＰＯＤ法を用いるグルコアミラーゼによる、アミロペクチン・クラスターおよび高度分枝状アミロペクチン・クラスターの加水分解反応速度の測定結果および定量結果を示す。
【００５５】
【表１】
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【実施例５】
【００５６】
分枝状アミロースおよび高度分枝状アミロースの調製
５−１．分枝状アミロースの調製
分枝状アミロースを生成するため、９０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中における０．２％アミロース（馬鈴薯から抽出したＩＩＩ型、Ｓｉｇｍａ社製）１０ｍＬを用いた。アミロース溶液に、１０ｍＬの２００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）と、５０Ｕ／ｍｇの分枝酵素（基質１ｍｇあたり５０Ｕ）とを振とうしながら添加した。次いで、最終容量を４０ｍＬとするため、蒸留水を添加した。反応混合物を３０℃で４時間にわたり予備加熱し、沸騰水中で１０分間にわたり加熱することにより反応を停止させた。不溶性の塩を除去するため、２倍容量の１００％エタノールを添加し、−２０℃で３０分間にわたり静置し、４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、分枝状アミロースを含有する沈殿物を回収した。
【００５７】
５−２．高度分枝状アミロースの調製
高度分枝状アミロースを生成するため、実施例５−１の反応物質を５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中で混合し再懸濁させ、０．５Ｕ／ｍｇのＢＳＭＡ（基質１ｍｇあたり０．５単位）を添加した。反応混合物を５０℃で１２時間にわたりインキュベートし、１００℃の沸騰水中で１０分間にわたり加熱することにより反応を終結させた。生成されたオリゴ糖を除去するため、２倍容量の１００％エタノールを添加し、溶液を−２０℃で３０分間にわたり静置し、４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離し、沈殿物である高度分枝状アミロースを生成し、上清を廃棄した。
【００５８】
５−３．分枝状アミロースおよび高度分枝状アミロースの側鎖解析
分枝状アミロースおよび高度分枝状アミロースの側鎖の分布および組成を解析するため、試料を２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）中に懸濁させることにより調製し、１％溶液を作製した。０．５Ｕ／ｍｇのイソアミラーゼ（基質１ｍｇあたり０．５単位）とともに、６０℃で４８時間にわたり溶液をインキュベートした。ＣａｒｏＰＡＶ（商標）ＰＡ１型（４×５０ｍｍ）カラムを接続した高速イオン交換クロマトグラフ（ＧＰ４０型勾配ポンプ、Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用いて、脱分枝化した（α−１，６結合が切断した）試料を解析した。
【００５９】
図８は、高度分枝状アミロースが、分枝状アミロースと比較して、新たな分枝部分を有することを示す。
【実施例６】
【００６０】
高度分枝状アミロペクチン・クラスター反応溶液中のオリゴ糖の解析
高度分枝状アミロペクチン・クラスターの生成における副産物であるオリゴ糖を解析するために、マルトース原性アミラーゼとアミロペクチン・クラスターとの間の反応中における、０．５、１、３、５、１５時間後などの各時点において試料を採取した。試料を２倍容量のエタノールと混合し、−２０℃で３０分間にわたり静置し、巨大分子を沈殿させ、４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間にわたる遠心分離により上清を得た。薄層クロマトグラフィー分析を用いて各上清を解析した。１μＬの試料をプレート（Ｗｈａｔｍａｎ社製、Ｋ５Ｆ型シリカゲルＴＬＣプレート）上にスポットし、それをイソプロピルアルコール／エチル酢酸／水（３：１：１  ｖ／ｖ／ｖ）の溶媒混合物を入れたＴＬＣチャンバー内で一度に発色させた。プレートを完全に乾燥させ、これを０．３％（ｗ／ｖ）のＮ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンおよび５％（ｗ／ｖ）のＨ２ＳＯ４を含有するメタノール溶液中に速やかに浸漬することにより発色させた。プレートを乾燥させ、白色の背景上に黒色の斑点が現れるまで、１０分間にわたり１１０℃のオーブン中に入れた。
【００６１】
図９に示す通り、反応時間が経過するにつれ、長鎖のマルトオリゴ糖が２〜５ＢＤＰの分枝状オリゴ糖に転換されることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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