(57)【要約】  特定の種類の分析法、特に近接分析法に有益な表面増強ラマン散乱スペクトルを生成する方法。この方法は、２つのＳＥＲＳ活性ナノ粒子を供給するステップを含む。第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、第一の波長の光子を吸収し、第二の波長のラマンシフト光子を放出する。第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、第二の波長の光子を吸収し、第三の波長のラマンシフト光子を放出する。したがって、第一と第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が相互に近接しており、第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が第一の波長で照明されると、第二の波長のラマンシフト光子が放出されるかもしれない。この光子は第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子によって吸収されることが可能で、これによって第三の波長の第二のラマンシフト光子の検出可能な放出が起こる。上記に基づいて各種の分析法を設計できる。２つのＳＥＲＳ活性ナノ粒子を使った近接分析法は、有利な背景信号特性を有する。
2010525333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトルを生成する方法であって、
第一の波長の光子を吸収し、第二の波長のラマンシフト光子を放出する第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を提供するステップと、
前記第二の波長の光子を吸収し、第三の波長のラマンシフト光子を放出する第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を提供するステップと、
前記第一と第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を相互に近接させるステップと、
前記第一の波長で前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を照明し、それによって前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子に前記第二の波長のラマンシフト光子を放出させ、前記第二の波長のラマンシフト光子が、前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子によって吸収され、それによって、前記第三の波長の第二のラマンシフト光子を放出させるようにするステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子と前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が異なる形状を有することを特徴とする請求項１に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトル生成方法。
【請求項３】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が球形であり、前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が非球形であることを特徴とする請求項２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトル生成方法。
【請求項４】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が中実であり、前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が中空であることを特徴とする請求項２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトル生成方法。
【請求項５】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が均一な組成であり、前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子がコア−シェルとして異なる組成を有することを特徴とする請求項２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトル生成方法。
【請求項６】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が単独の金属でなり、前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が２つの金属の混合物または合金でなることを特徴とする請求項２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトル生成方法。
【請求項７】
前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、ＡｕとＡｇの混合物または合金でなることを特徴とする請求項６に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトル生成方法。
【請求項８】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子の吸光度極大は前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子の吸光度極大から２００ｃｍ-1から３５００ｃｍ-1の範囲内の差で離れていることを特徴とする請求項１に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）スペクトル生成方法。
【請求項９】
近接分析法であって、
第一の波長の光子を吸収し、第二の波長のラマンシフト光子を放出する第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子と、
前記第二の波長の光子を吸収し、第三の波長のラマンシフト光子を放出する第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子と、
前記第一の波長の光を放出するように構成された光源と、
前記第三の波長の光を検出するように構成された検出器と、
を含むことを特徴とする近接分析法。
【請求項１０】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子と前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は異なる形状を有することを特徴とする請求項９に記載の近接分析法。
【請求項１１】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が球形であり、前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が非球形であることを特徴とする請求項１０に記載の近接分析法。
【請求項１２】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が中実であり、前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が中空であることを特徴とする請求項１０に記載の近接分析法。
【請求項１３】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が均一な組成であり、前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子がコア−シェルとして異なる組成を有することを特徴とする請求項１０に記載の近接分析法。
【請求項１４】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が単独の金属でなり、前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が２つの金属の混合物または合金でなることを特徴とする請求項１０に記載の近接分析法。
【請求項１５】
前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、ＡｕとＡｇの混合物または合金でなることを特徴とする請求項１４に記載の近接分析法。
【請求項１６】
前記第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子の吸光度極大は前記第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子の吸光度極大から２００ｃｍ-1から３５００ｃｍ-1の範囲内の差で離れていることを特徴とする請求項９に記載の近接分析法。
【請求項１７】
対象検体を検出する方法であって、
前記対象検体を、エネルギーｖ１でＳＥＲＳ活性振動ピークを有するラマンリポータに関連付けるステップと、
周波数Ｌを有する光で前記ラマンリポータを照明するステップと、
周波数Ｌ−（２ｖ１）で放出される光を検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示される実施形態は、各種の分析プラットフォームの構築または実用にＳＥＲＳ活性ナノ粒子、すなわち表面増強ラマン散乱ナノタグ（ＳＥＲＳナノタグ）を使用する方法とシステムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物学、化学、法医学、ゲノム、医学および遺伝学の分野では、多種多様な生物学的分析、化学分析、免疫分析法またはこれと同様の分析および試験がよく知られている。このような分析や試験の多くは、標識された、あるいはその他、より容易に、より迅速に、より高い信頼性で検出できるようにするためのタグと関連付けられた物質または検体の検出を特徴としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ナタン（Ｎａｔａｎ）米国特許第６，５１４，７６７号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１９２，７７８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，８６１，２６３号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】マルヴァニ（Ｍｕｌｖａｎｅｙ）他（２００３）、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９：４７８４−４７９０
【非特許文献２】ロング（Ｌｏｎｇ）（２００２）、Ｔｈｅ  Ｒａｍａｎ  Ｅｆｆｅｃｔ
【非特許文献３】チチェスタのジョン・ワイリ＆サンズ・リミテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．）、Ａ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ
【非特許文献４】チチェスタのジョン・ワイリ＆サンズ・リミテッド、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  （１９９６）
【非特許文献５】マサチューセッツ州マルデンのブラックウェル・サイエンス・リミテッド（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｉｔｏｎｓ  ｏｆ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  （１９９９）
【非特許文献６】モスコヴィッツ（Ｍｏｓｋｏｖｉｔｓ）、（１９８５）Ｒｅｖ．  Ｍｏｄ．  Ｐｈｙｓ．  ５７：７８３−８２６
【非特許文献７】オットー他（１９９２）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．  Ｃｏｎｄ．  Ｍａｔ．４：１１４３−１２１２
【非特許文献８】キャンピオン（Ｃａｍｐｉｏｎ）とカンバンパティ（Ｋａｍｂｈａｍｐａｔｉ）（１９９８）、Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｒｅｖ．２７：２４１−２４９
【非特許文献９】ティアン（Ｔｉａｎ）他、（２００２）Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  １０６：９４６３−９４８３
【非特許文献１０】ＣＡＳオンライン検索２００４年４月、ベルリン  ハイデルベルク  Ｋ．ネイップ（Ｋｎｅｉｐｐ）、Ｍ．モスコヴィッツ、Ｈ．ネイップ、Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，２００７
【非特許文献１１】エモリ（Ｅｍｏｒｙ）他、（１９９８）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１２０：８００９−８０１０
【非特許文献１２】モイエ（Ｍｏｙｅｒ）他、（２０００）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１２２：５４０９−５４１０
【非特許文献１３】ニー（Ｎｉｅ）とエモリ、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１１０２−１１０６
【非特許文献１４】ネイップ他、（１９９７）Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．７８：１６６７−１６７０
【非特許文献１５】マイケルズ（Ｍｉｃｈａｅｌｓ）他、（１９９９）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１２１：９９３２−９９３９
【非特許文献１６】シュウ（Ｘｕ）他、（１９９９）Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  ８３：４３５７−４３６０
【非特許文献１７】グーレット（Ｇｏｕｌｅｔ）他、（２００３）Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．７５：１９１８−１９２３
【非特許文献１８】Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００１，１２３，７９６１
【非特許文献１９】ムジーク（Ｍｕｃｉｃ）他、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９８，１２０，１２６７４
【非特許文献２０】ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）他、２００４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０１（５２）：１７９３０−５
【非特許文献２１】タリ（Ｔａｌｌｅｙ）他、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  （２００５）
【非特許文献２２】アスラム（Ａｓｌａｍ）とデント（Ｄｅｎｔ）（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ニューヨーク州ニューヨークのグローブズ・ディクショナリーズ社（Ｇｒｏｖｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）
【非特許文献２３】Ｂ．Ｎｉｋｏｏｂａｋｈｔ；ＭＡ．エルサイード（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ）“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｒｏｄｓ  （ＮＲｓ）  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｔｈｏｄ”ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ，  １５（１０）：１９５７−１９６２  ＭＡＹ  ２０  ２００３
【非特許文献２４】Ａ．ゴール（Ｇｏｌｅ）、ＣＪ．マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）“Ｓｅｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｒｏｄｓ：  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｅｄ”ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ，  １６（１９）：  ３６３３−３６４０  ＳＥＰ  ２１  ２００４
【非特許文献２５】ＲＣ．ジン（Ｊｉｎ）、ＹＣ．カオ（Ｃａｏ）、ＥＣ．ハオ（Ｈａｏ）他“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ”ＮＡＴＵＲＥ，  ４２５（６９５７）；４８７−４９０  Ｏｃｔ  ２  ２００３
【非特許文献２６】ＪＥ．ミルストーン（Ｍｉｌｌｓｔｏｎｅ）、ＧＳ．メトロー（Ｍｅｔｒａｕｘ）、ＣＡ．マーキン（Ｍｉｒｋｉｎ）“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｄｇｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐｒｉｓｍｓ  ｖｉａ  ａ  ｓｅｅｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ”ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ，１６（９）：１２０９−１２１４  ＪＵＮ  ６  ２００６
【非特許文献２７】ＹＧ．サン（Ｓｕｎ）、ＹＮ．シャ（Ｘｉａ）“Ｓｈａｐｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ａｎｄ  ｓｉｌｖｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”ＳＣＩＥＮＣＥ，２９８（５６０１）：２１７６−２１７９  ＤＥＣ  １３  ２００２
【非特許文献２８】ＹＧサン、ＹＮシャ“Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  ｓｉｌｖｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ａ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｓ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｎｇｅ  ｆｒｏｍ  ４００  ｔｏ  ７５０ｎｍ”ＡＮＡＬＹＳＴ，１２８（６）：６８６−６９１  ２００３
【非特許文献２９】ＢＪ．ワイリ（Ｗｉｌｅｙ）、ＹＣ．チェン（Ｃｈｅｎ）、ＪＭ．マクレラン（ＭｃＬｅｌｌａｎ）他“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｉｌｖｅｒ  ｎａｎｏｂａｒｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｒｉｃｅ”ＮＡＮＯ  ＬＥＴＴＥＲＳ，７（４）：１０３２−１０３６  ＡＰＲ  ２００７
【非特許文献３０】ＲＡ．アルヴァレズ−プエブラ（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｐｕｅｂｌａ）、ＤＪ．ロス（Ｒｏｓｓ）、ＧＡ．ナズリ（Ｎａｚｒｉ）他“Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｎ  ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ”ＬＡＮＧＭＵＩＲ，２１（２３）：１０５０４−１０５０８  ＮＯＶ  ８  ２００５
【非特許文献３１】ＡＭ．シュワルツバーグ（Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ）、ＴＹ．オシロ（Ｏｓｈｉｒｏ）、ＪＺ．ザング（Ｚｈａｎｇ）他“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ３０−ｎｍ  ｈｏｌｌｏｗ  ｇｏｌｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，７８（１３）：４７３２−４７３６  ＪＵＬ  １  ２００６
【非特許文献３２】ＳＪ．オルデンブルグ（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ）、ＪＢ．ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、ＳＬ．ウェストコット（Ｗｅｓｔｃｏｔｔ）他“Ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ”ＡＰＰＬＩＥＤ  ＰＨＹＳＩＣＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ，７５（１９）：２８９７−２８９９  ＮＯＶ  ８  １９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
既知のタグは、多くの点で制限されていることがある。たとえば、タグは検体との関連付けが困難であることがあり、あるいは検出が困難であることがあり、特に既知のタグは迅速、正確、または微量での検出が困難であることがある。既知のタグは劣化することがある。既知のタグは、検出対象の材料または検体の特性を改変する、またはその他、これらと相互作用することがある。さらに、既知のタグとタグ群に、多数の独立した種類のタグを別々に読み取り、分別するような非常に多重的な試験を実行するのに十分なメンバーが含まれていないことがある。本発明は、上記の問題の１つまたはそれ以上を克服することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
分析プラットフォームの構築または改善に表面増強ラマン散乱ナノタグ（ＳＥＲＳナノタグ）を使用するためのいくつかの方法とシステムが開示される。本明細書において具体的に記されている分析のフォーマットは、本発明の範囲を限定するものではない。したがって、別々のタグ要素の使用を特徴とするどのような分析、試験、診断プロトコルまたはこれに類する技術でも、ＳＥＲＳナノタグを利用して実施することができる。ＳＥＲＳナノタグを特徴とする分析法は、対象検体の検出、たとえば、ただしこれらに限定されないが、細胞、ウイルス、細菌、たんぱく質、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいは、あらゆる種類の生物学的（動物界または植物界）もしくは環境的試料、たとえば、ただしこれらに限定されないが、全血もしくは血清、肉眼で見えない試料、尿、糞便、空気、飲料水、ファージ、あらゆる有機体、細胞の多細胞群、たとえば、がん組織ホモジネート、無機化合物またはその他の種類の検体の中の小さな分子の検出に利用することができる。
【０００７】
１つの実施形態は、特定の種類の分析法、特に近接分析法に有益な表面増強ラマン散乱スペクトルを生成する方法である。この方法は、２つのＳＥＲＳ活性ナノ粒子を供給するステップを含む。第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、第一の波長の光子を吸収し、第二の波長のラマンシフト光子(Raman-shifted photon)を放出する。第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、第二の波長の光子を吸収し、第三の波長のラマンシフト光子を放出する。したがって、第一と第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が相互に近接しており、第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子が第一の波長で照明されると、第二の波長のラマンシフト光子が放出されるかもしれない。この光子は第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子によって吸収されることが可能で、これによって第三の波長の第二のラマンシフト光子の検出可能な放出が起こる。上記に基づいて各種の分析法を設計できる。２つのＳＥＲＳ活性ナノ粒子を使った近接分析法は、有利な背景信号特性を有する。
【０００８】
異なる吸光特性と発光特性を有する第一と第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を作製するには、各種の手法を利用できる。第一と第二のナノ粒子は、異なる形状であってよい。第一のナノ粒子は球形であってもよく、第二のナノ粒子は非球形であってもよい。あるいは、第一のナノ粒子は中実であってもよく、第二のナノ粒子は中空であってもよい。各々のＳＥＲＳ活性ナノ粒子の組成も、その吸光および発光特性に影響を与えることがある。たとえば、第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は均一な組成であってもよく、第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、コアとシェル等、別の構造で異なる組成を有していてもよい。発光特性の違いは、各々のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を作製するのに用いられる材料の違いによることもある。たとえば、一方のナノ粒子はＡｕ等の単独の金属で作製してもよく、第二の粒子はＡｕと他の物質との合金または混合物で作製してもよい。あるいは、異なる金属元素、その混合物または合金の粒子を用いてもよい。
【０００９】
前述のように、第一と第二のナノ粒子の吸光度と発光特性は異なるであろう。たとえば、第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子の最大吸光度と第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子の最大吸光度との差は、２００ｃｍ-1から３５００ｃｍ-1の範囲かもしれない。吸光度または発光特性の別の好適な差は、上記の範囲内でもこの範囲外でもよい。
【００１０】
第一と第二の発光波長つまり周波数の間の関係は、特定の例において、照明波長つまり周波数に直接関係しているかもしれない。たとえば、エネルギーｖ１でＳＥＲＳ活性振動ピークを有するＳＥＲＳリポータを使用してもよい。第三の波長で放出されるラマンシフト光子の検出は、Ｌ−（２ｖ１）の周波数で実現されてもよく、Ｌはレーザ励起周波数に対応する第一の波長である。
【００１１】
前述の方法は、少なくとも２つのＳＥＲＳ活性ナノ粒子を相互に近接させる各種の近接分析法を実施するのに用いることができる。第一のナノ粒子は第一の波長で励起され、第二の波長で発光する。すると、第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、第二の波長で励起され、第三の波長で発光するものとしてもよい。この分析法では、第三の波長の光を検出するように構成された検出器を用いるであろう。前述の近接分析法は、背景発光の影響を比較的受けないことを特徴とする。近接分析法は、前述のように、どのようなタイプのＳＥＲＳ活性ナノ粒子を用いても実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の選択された実施形態の実現に適したＳＥＲＳナノタグの概略図である。
【図２】５つの異なるリポータ分子を担持するＳＥＲＳナノタグのＳＥＲＳスペクトルを比較するグラフである。
【図３】２種類のＳＥＲＳ活性ナノ粒子を特徴とする近接分析法の実施形態の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
Ｉ．ＳＥＲＳナノタグとＳＥＲＳ活性ナノ粒子の一般的議論
本明細書に記載される分析法の多くは、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子またはＳＥＲＳタグを特徴とする。本明細書において使用する場合、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子とは、ラマン散乱増強に適した表面を有するナノサイズの粒子である。たとえば、金または銀ナノ粒子である。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の作製には、その他の材料も使用できる。後述するように、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、各種の形状と構造を有していてもよい。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子の主な特徴は、それがラマンスペクトルを増強させる表面を有することである。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、ラマンリポータまたはラマン色素等のラマン活性物質に関連付けられてもよい。あるいは、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、ラマン活性物質と関連付けられていなくてもよい。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、いくつの物質で機能化されても、あるいはいくつの物質で被覆されていてもよい。たとえば、１つの具体的なタイプのナノ粒子である、後に詳述するＳＥＲＳタグは通常、周囲を被覆されている。よって、ＳＥＲＳナノタグのナノ粒子のコアそのものがＳＥＲＳ活性ナノ粒子である。
【００１４】
ＳＥＲＳナノタグは、検出タグとしての固有の利点を少なくとも６つ有する。（１）広い波長範囲で励起が可能である一方で、特にＳＥＲＳタグは近赤外線で励起できるため、全血における測定に利用できる。（２）ＳＥＲＳナノタグは光退色に耐えるために、より高出力のレーザとより長いデータ取得時間を利用できることから、より高感度の測定を行える。（３）多数の異なるタグが存在するため、高度に多重的な分析が可能となる。（４）ＳＥＲＳナノタグは、多くの検体や物質に対して無反応である。（５）ＳＥＲＳナノタグは耐久性がある。（６）ＳＥＲＳナノタグは、扱いと保管が容易である。このように、ＳＥＲＳタグは、耐凝集性があり、溶剤または空気中での分解に対して安定化され、化学的に不活性で、ＳＥＲＳ活性を失わずに、遠心分離と再分散が可能である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＳＥＲＳナノタグは、生物学および化学分析で蛍光タグに代わって用いられる。実際、ＳＥＲＳナノタグは、それが先行技術による蛍光色素分子に基づく光学タグよりはるかにすぐれたものとなるような多数の特徴を有する。たとえば、蛍光色素分子の検出を用いた分析法は一般に、自己蛍光の存在やその他の背景的影響により妨害を受ける。さらに、多くの分析法が、多数の異なる蛍光色素分子の使用を必要とする。つまり、異なる蛍光色素分子は一般に、異なる吸着化学物質を必要とし、環境的要求や感度もそれぞれ異なる。特筆すべきは、何らかの蛍光色素分子がたんぱく質と結合されたときに観察される蛍光活性の消失(quenching)である。最後に、三重項または一重項励起状態の創出によって非可逆的(non-reversible)化学反応が起こり、その後、不可逆的(irreversible)光分解が行われて励起状態が永久的になくなることにより、検出感度が大きく制約される。これに対し、ＳＥＲＳナノタグは光退色も光分解もせず、均一な化学的および物理的特性を有し、背景から容易に分離(resolve)できる。
【００１６】
ＳＥＲＳナノタグは、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）（非特許文献１、特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）に基づく新規なナノ粒子による光学的検出タグである。ＳＥＲＳは、分子について、一般的な蛍光よりはるかに狭い特徴を有する指紋様の振動スペクトルを発生するレーザに基づく光学的分光法である。ラマン散乱は幅広い範囲の波長を使って励起可能で、この波長範囲には単色性遠赤色光または近赤外光が含まれ、その光子エネルギーは非常に小さいため、生体試料の中の固有の背景蛍光を励起しない。ラマンスペクトルは一般に、３００−３５００ｃｍ-1の振動エネルギーをカバーし、１２個（またはそれ以上）のタグを同時に、すべて１つの光源で測定することが可能である。しかしながら、通常のラマンスペクトルは非常に弱く、臨床分析化学への有益性が限定される。ＳＥＲＳにおいて、分子がナノスケールの粗度を有する貴金属表面（金、銀、銅）に非常に近接していると、散乱効率が１００万倍から１兆倍増大する［増強係数（ＥＦ）と言われる］（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。
【００１７】
より重要な点として、ＳＥＲＳは、個々の金属ナノ粒子に吸着した分子を検出するのに使用でき（非特許文献１１、非特許文献１２）、単一分子検出の実証に用いられてきた（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。
【００１８】
一般的なＳＥＲＳナノタグ１０を図１に示す。図のＳＥＲＳナノタグ１０は、金属ナノ粒子のコア１２とＳｉＯ2（シリカ）のシェル１４を含む。その他の材料、たとえば、これらに限定されないが、各種の高分子もまた、本発明に適合する方法で、被覆材(encapsulant)またはシェルとして使用することができる。さらに、高分子はリポータとして使用でき、多機能性高分子であればリポータと被覆材の両方として使用できる。金属ナノ粒子のコア１２は、そのものがコア−シェル粒子であっても、中空粒子であっても、あるいは２つまたはそれ以上の材料を十分に定義された、あるいは定義されていない幾何学的配向で含んでいてもよい。一般的なＳＥＲＳナノタグの使用、製造および特徴に関する詳細は、“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”と題する特許文献１および特許文献２に記載されており、両特許を引用により本願に援用する。本発明は、単独のナノ粒子のコア１２から作製されるＳＥＲＳナノタグに関して説明されているが、ＳＥＲＳナノタグの作製にはナノ粒子コアのクラスタや凝集体も利用できると理解するものとする。金属コロイドのクラスタまたは凝集体の作製方法は、当業者の間で周知である。特許文献３に記載されているようなサンドイッチ型の粒子の使用もまた想定されており、同特許を引用によって本願に援用する。
【００１９】
ナノ粒子のコア１２は、ラマン増強効果があると当業界で知られているどの材料であってもよい。ナノ粒子のコア１２は、同方性でも異方性でもよい。異方性のナノ粒子は、ある長さとある幅を有していてもよい。粒子１２は、同じまたは異なるサイズ、同じまたは異なる形状、または異なるサイズや異なる形状が混合した２つまたはそれ以上の粒子の集合であってもよい。ある実施形態において、異方性ナノ粒子の長さは、そのナノ粒子が生成される孔に平行の寸法である。異方性ナノ粒子の場合、ある実施形態において、ナノ粒子の直径（幅）は３５０ｎｍ以下である。他の実施形態において、ナノ粒子の直径は２５０ｎｍ以下であり、またある実施形態において、直径は１００ｎｍ以下である。ある実施形態において、幅は１５ｎｍから３００ｎｍである。ある実施形態において、ナノ粒子の長さは約１０−３５０ｎｍである。
【００２０】
ＳＥＲＳナノタグのコアとするのに適したナノ粒子には、コロイド金属、中空または中実のナノバー、磁性、常磁性、導電性または絶縁性ナノ粒子、合成粒子、ヒドロゲル（コロイドまたはバー）等がある。本発明において使用されるナノ粒子は、単独ナノ粒子としても、あるいはナノ粒子のクラスタまたは凝集体としても存在できる。
【００２１】
当業者であれば、ナノ粒子はさまざまな形状、たとえば、これらに限定されないが、回転楕円体、ロッド、ディスク、角錐、立方体、円柱、ナノヘリックス(nanohelix)、ナノスプリング、ナノリング、ロッド形ナノ粒子、矢印形ナノ粒子、涙形ナノ粒子、テトラポッド形ナノ粒子、プリズム形ナノ粒子およびその他さまざまな幾何学的および非幾何学的形状で存在することができる。これまで述べられたナノ粒子の別の分類には、内表面領域を有するものもある。これらには、中空の粒子および多孔質または半多孔質粒子が含まれる。さらに、これらの形状の粒子を作製する方法と、ある場合において、これらの形状のＳＥＲＳ活性粒子を作製する方法は、文献に記載されていると理解される。粒子の形状とアスペクト比がナノ粒子の物理的、光学的、電子的特性に影響を与えうると認識されているが、特定の形状、アスペクト比または内表面領域の有無は、粒子がナノ粒子とされるか否かには関係しない。
【００２２】
ナノ粒子にはまた、金属がコア−シェル粒子等の他の構成要素を含むようなナノ粒子も含まれる。例えば、非特許文献１８に記載されているようなＡｇコア／Ａｕシェル粒子または、Ａｕコア／Ａｇシェル粒子または、ＳＥＲＳ活性金属を含むあらゆるコア−シェル複合体を使用できる。コア−シェル粒子への使用に適したその他の複合体、たとえば、Ａｕ−またはＡｇナノ粒子機能化シリカ／アルミナコロイド、ＡｕまたはＡｇ機能化ＴｉＯ2コロイド、Ａｕナノ粒子修飾Ａｕナノ粒子（たとえば、特許文献１９参照）、Ａｕナノ粒子修飾ＴｉＯ2コロイド、Ｓｉコアと金属シェル（「ナノシェル」）を有する粒子、たとえば銀修飾ＳｉＯ2コロイドまたは金修飾ＳｉＯ2コロイドも本発明に含まれる。（たとえば、非特許文献２０、非特許文献２１参照。）中空のナノスフィアや中空のナノクリスタルをはじめとする中空のナノ粒子もまた、ＳＥＲＳナノタグに使用できる。
【００２３】
当業者は、ＳＥＲＳナノタグが他の、非ＳＥＲＳ活性粒子上に形成できることを理解するであろう。たとえば、ＳＥＲＳ活性金属ナノ粒子は、シリカ粒子上に固定化することができる。リポータを取り入れることができ、結果として得られた粒子をシリカで被覆することができる。
【００２４】
各ＳＥＲＳナノタグは、ナノ粒子のコアとガラスその他の適当な被覆材のシェルとの間の界面にある有機または無機分子でなる特異なリポータ１６でコード化される。このような検出タグのアプローチは、高分解能の分子分光測定ツールとしてのラマン散乱の強度とＳＥＲＳに関わる増強を利用し、その一方で、再現の困難さと選択可能性の欠如等、単独のＳＥＲＳ基板を作製する際にしばしば遭遇する欠点を回避することができる。特異なリポータ１６は、分子の複合体を含んでいてもよい（より複雑なスペクトルを発現させる）。２つ（またはそれ以上の）リポータの比を変化させることによって、異なるタグを作ることができる。ＳＥＲＳナノタグは、６３３と７８５ｎｍの励起波長で強力なスペクトルを呈し（増強係数１０6超）、この波長は全血等の生体試料およびガラスやプラスチック等の母材における固有の背景蛍光を回避するのに優れている。基本的にＳＥＲＳ不活性のシリカコーティングは、凝集しないように粒子を安定化させ、リポータが拡散するのを防止し、不要な種の競争的吸収(competitive absorption)を防止し、バイオアッセイの開発のために生体分子を結合できる、非常によく安定化された表面を提供する（非特許文献２２）。他の実施形態では、ある程度のＳＥＲＳ活性を有する被覆材も、これらがリポータ分子のスペクトルと干渉しないかぎり、使用でき（ラマンスペクトルから差し引くことができ）る。
【００２５】
多数の固有のフレーバを有するタグを使用できる。図２は、多項目分析(multiplexed assay)に利用可能な、明らかに異なる特徴を有する５つの固有のＳＥＲＳタグのスペクトルのグラフ１８を示す。多項目分析では、得られるのは１つのスペクトルであり、そのスペクトルを定量的にその成分に分離する必要がある。個々の成分のスペクトルを分離し、定量化するために、改善された市販のソフトウェアパッケージを使い、各タグの純スペクトルを基準として線形最小二乗分析を行うことができる。
【００２６】
上述のＳＥＲＳタグの独特な特徴により、粒子は、あらゆる種類の生物学的、化学的または診断用分析のためのリポータまたは指標タグとしての使用によく適したものとなる。ＳＥＲＳタグを使って実施できるさまざまな分析法の非限定的な例を以下に紹介する。この説明は、ＳＥＲＳタグを用いて行うのに適した分析法の代表的な例のみに関しており、本発明の範囲を限定するものではない。当業者であれば、下記以外にも多くの分析法でＳＥＲＳナノタグをリポータまたは指標タグとして使用できることを容易に理解するであろう。
【００２７】
ＩＩ．分析法の例
競合免疫分析法
免疫分析法による分析は、抗体がその抗原と特異的に結合することを利用している。単クローン抗体がしばしば使用されるのは、それが普通は特定の分子の１つの部位にしか結合せず、従って、より特異的で正確な試験を行うことができ、他の分子の存在による混同が起こりにくいからである。選ばれる抗体は、抗原に対する高い親和性を有していなければならない（利用可能な抗原がある場合、その大部分がその抗体に結合しなければならない）。
【００２８】
抗原と抗体のどちらの存在も測定可能である。たとえば、感染を検出する場合、病原体に対する抗体の存在が測定される。インシュリン等のホルモンを測定する場合、インシュリンが抗原として作用する。
【００２９】
数値的な結果を出すために、測定対象となる流体の応答を既知の濃度の基準と比較しなければならない。これは通常、グラフ上に基準曲線を描くことによって行われ、次にその曲線上で未知のものの応答の位置を調べるため、未知のものの数量がわかる。抗体または抗原の数量または存在の検出は、さまざまな方法で行うことができる。たとえば、抗体または抗原のどちらもＳＥＲＳナノタグと結合でき、またはその他、ＳＥＲＳナノタグで標識することができる。ＳＥＲＳナノタグに関連付けられたリポータ分子のラマンスペクトルを前述のように検出してもよい。
【００３０】
競合免疫分析法では、未知の試料の中の抗原は標識された抗原と競合して抗体と結合する。抗体の部位に結合した標識された抗原の量が測定される。この方法では、応答は未知のものの抗原の濃度に反比例するであろう。これは、応答が大きいほど、未知のものの中の、標識された抗原との競合に利用できる抗原が少なかったからである。抗原は、ＳＥＲＳナノタグで標識してもよい。
【００３１】
サンドイッチ型免疫分析法
「サンドイッチ型」免疫分析法は、非競合分析法とも呼ばれ、未知のものの中の抗原が抗体の部位に結合され、次に、標識された抗体が抗原に結合される。抗体は、１つまたは複数のＳＥＲＳナノタグで標識されていてもよい。次いで、その部位における標識された抗体の量が測定される。競合法とは異なり、非競合法で得られる結果は、抗原の濃度に正比例する。これは、ＳＥＲＳナノタグで標識された抗体は、抗原が未知の試料内に存在しないと結合しないからである。
【００３２】
免疫分析法には均一系と不均一系がある。不均一系免疫分析法では、結合しなかった抗体または抗原を部位から除去するための洗浄ステップが追加で必要となる。不均一系免疫分析法は、洗浄不要分析法(no-wash assay)とも呼ばれ、洗浄ステップがなく、結合していない抗体または抗原が存在する状態で検出が行われる。均一系分析法には洗浄ステップが不要であるため、一般に、より迅速かつ容易に実行できる。均一系分析法は、結合していない抗体または抗原が存在するため、読取の精度と容易さが低下することがある。
【００３３】
酵素免疫分析法
固相酵素免疫分析法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、つまりＥＬＩＳＡは、主として免疫学において試料中の抗体または抗原の存在を検出するために使用される生化学的手法である。これは、２つの抗体を用いる。一方の抗体は抗原に対して特異的である。もう一方は、抗原抗体複合体に反応し、酵素と結合される。この第二の抗体が、この試験方法の名前に“ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ”がつく理由であり、ＳＥＲＳナノタグと結合またはその他連結され、検出可能な信号を生成することができる。ＥＬＩＳＡは、試料中の抗原の存在または抗体の存在のいずれかを評価するために行うことができるため、血清中の抗体濃度の測定（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）試験または西ナイルウイルス等）と抗原の存在の検出のどちらにも有益なツールである。ＥＬＩＳＡには、直接的および間接的な変形型がある。基本的なＥＬＩＳＡをサンドイッチ型および競合型に変形させたものも知られている。すべて、ナノタグを検出／リポータ手段として用いることによって実行できる。
【００３４】
ラテックス凝集分析法
一般的なラテックス凝集分析法は、複数の粒子からなる凝集体を形成する能力を有し、その表面上に試料中に存在すると疑われるリガンドと同じ、またはこれと異なるリガンドを担持する複数の粒子を有する試薬系を提供するステップを含む。粒子の少なくとも１つはＳＥＲＳナノタグであってもよい。試薬系はまた、試料中のリガンドと粒子上に担持されているリガンドの両方に特異な、ある量の受容体を含む。受容体の量は、粒子を安定化させるのに十分な量とすべきである。
【００３５】
一般的なラテックス凝集法はさらに、試薬系を試料と接触させることによって試験用混合物を形成するステップと、試験用混合物を、粒子より大きく、凝集体より小さい孔を有するフィルタに通し、これによって濾液を生成するステップを含む。その後、濾液の中で結合している、またはフィルタを通過したＳＥＲＳナノタグを検出して、リガンドを有する粒子の有無を調べる。試料中にリガンドが存在しないことは、濾液中にリガンドを有する粒子が存在することによって確認され、試料中にリガンドが存在することは、濾液中にリガンドを有する粒子が存在しないことによって確認される。
【００３６】
たんぱく質−たんぱく質およびたんぱく質−リガンド分析法
抗体を利用しない、たんぱく質ベースの各種の分析法が実用可能である。たとえば、たんぱく質−たんぱく質およびたんぱく質−リガンド分析法は、新薬発見と新薬開発から製薬にいたるあらゆる分野において、ごく一般的である。ＳＥＲＳナノタグは、上記の種類の分析法において、さまざまなフォーマット、たとえば、これらに限定されないが、粒子−粒子および粒子−表面モード等で容易に使用できる。
【００３７】
ゲル電気泳動
ゲル電気泳動は、マクロ分子、一般的には核酸またはたんぱく質を、大きさ、電荷およびその他の物性に基づいて分離するための分離分析法である。ゲルは固体状のコロイドである。電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）という用語は、電界の影響を受けた帯電粒子の移動を表す。電気（ｅｌｅｃｔｒｏ）とは、電気エネルギーを指す。泳動（ｐｈｏｒｅｓｉｓ）とは、ギリシャ語の「移動し、運ぶ」を意味する動詞、ｐｈｏｒｏｓを語源とする。したがって、ゲル電気泳動は、電流によって分子がゲルの存在する範囲を強制的に移動されるようにする手法を指す。ゲルのいずれかの端部にある電極が作動されて、駆動力を供給する。分子の特性は、電解がゲル状媒質中で分子をどれだけ速く移動させることができるかを決定する。
【００３８】
アミノ酸、ペプチド、たんぱく質、ヌクレオチドおよび核酸等の多くの重要な生体分子はイオン化グループを有するため、どのｐＨでも、溶液中でカチオンまたはアニオンのいずれかの帯電種として存在する。有効電荷の性質に応じて、帯電粒子は陰極または陽極のいずれかに移動する。
【００３９】
ゲル電気泳動は分離技術である。電気泳動が起こった後、分子が陰極または陽極のいずれかにもう少しで到達するとき、ゲル中の分子は従来、染色され、可視化される。しかしながら、この方法で分離された分子にＳＥＲＳナノタグを結合または接合することにより、また別の検出手段とすることができる。一般に、ゲル電気泳動の後に、次に説明するブロット法等の特定の検出ルーチンが実行される。
【００４０】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットは、大きな分子、一般には組織ホモジネートまたは抽出物の試料中のたんぱく質を検出するのに用いられる。ゲル電気泳動またはその他の適当な分離技術により、ネイティブのたんぱく質を形状および／または大きさによって分離する。次いで、たんぱく質をゲルから膜（一般に、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）の上に移動させる。すると、研究者は、ある試料中のたんぱく質の大きさ、プロセシングまたは量を調べ、いくつかのグループを比較することができる。
【００４１】
検出プロセス中、修飾抗体で膜の中の対象たんぱく質が「探索(probe)」される。従来、修飾抗体はリポータ酵素と連結され、これは、好適な基質に曝されると、比色反応を起こし、色を発生する。しかしながら、前述のように、ラマンスペクトルを通じて検出されるＳＥＲＳナノタグに修飾抗体を結合または接合してもよい。さまざまな理由で、検出ステップは従来、２ステップのプロセスで実行されているが、現在は、特定の用途で１ステップの検出方法を採ることができる。ＳＥＲＳナノタグは、いずれの場合にも適当な検出手段となりうる。
【００４２】
通常、結合されていないプローブは洗浄されるため、ウェスタンブロットは、標識され、対象たんぱく質と結合したプローブを検出できる状態となる。実際面では、すべてのウェスタンが膜内の１つのバンドのみのたんぱく質を明らかにするとは限らない。従来、大きさの近似は、染色されたバンドを電気泳動中に装填されたマーカまたはラダーのそれと比較することによって行われた。従来のブロット染色の強度は、比色測定を使って評価されている。従来の測定はすべて、前述のようにＳＥＲＳナノタグをリポータとして使用して、得られるＳＥＲＳスペクトルの質と強度を調べることによって改善できる。
【００４３】
サザンブロット
サザンブロットは、分子生物学においては、ＤＮＡ試料中のＤＮＡ配列の存在を確かめるのに日常的に使用される。サザンブロッティングは一般に、ＤＮＡを大きさによって分離するためのアガロースゲル電気泳動を、大きさによって分離されたＤＮＡをフィルタ膜に移動させて、プローブのハイブリダイゼーションを行う方法と組み合わせる。この方法の名前は、発明者であるイギリス人生物学者、エドウィン・サザンに由来する。プローブにＳＥＲＳナノタグを含め、検出能力を高めてもよい。
【００４４】
サザンブロットの準備と検査に含まれるステップは一般に、制限エンドヌクレアーゼまたはその他の方法によって高分子量ＤＮＡ鎖をより小さな断片に切断するステップを含む。次いで、ＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動によって大きさで分離される。ＤＮＡ断片の中に１５ｋｂより大きいものがあれば、ゲルを希釈ＨＣｌ等の酸で処理し、これによってＤＮＡ断片を脱プリンし、ＤＮＡをより小さな小片に切断し、このようにしてゲルを膜へとより効率的に移動させるようにしてもよい。
【００４５】
１枚のニトロセルロース（あるいはナイロン）の膜をゲルと接触させる。膜を均一に圧迫し、ゲルと膜が十分かつ均一に接触するようにする。次いで、毛管現象によるバッファ転送を使って、ＤＮＡをゲルから膜へと移動させる。ＤＮＡが負の電荷、膜が正の電荷を有するため、イオン交換相互作用によってＤＮＡが膜に結合する。
【００４６】
次に、膜を焼き（ニトロセルロースの場合）、または膜に紫外線を照射し（ナイロンの場合）、ＤＮＡを膜に永久的かつ共有結合的に架橋させてもよい。
【００４７】
その後、膜をハイブリダイゼーションプローブに露出させるが、このプローブは一般に、標的ＤＮＡの中の存在が測定されるべき特定の配列を持つ１つのＤＮＡ断片である。場合により、ハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡではなくＲＮＡから作製してもよい。プローブをＳＥＲＳナノタグで標識し、前述の方法を使ってこれを検出できるようにしてもよい。ハイブリダイゼーションの後、膜から余分なプローブを洗浄し、結合されたタグのラマンスペクトルを検出してもよい。
【００４８】
ノーザンブロット
ノーザンブロットは、技術的には前述のサザンブロットと似ているが、電気泳動とハイブリダイゼーションプローブでの検出によって分析される物質はＤＮＡではなくＲＮＡである。（サザンブロットと比較した場合の）手順の主な違いは、アガロースゲルに、変性剤として作用するホルムアルデヒドを添加する点である。サザンブロットと同様に、ハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡから作製できる。ハイブリダイゼーションプローブに、ＳＥＲＳナノタグマーカを含めてもよい。
【００４９】
逆ノーザンブロットと呼ばれる、この手順の変形が採用されることがある。この手順において、基質である核酸（膜に付着される）は分離されたＤＮＡ断片の集合であり、プローブは組織から抽出され、標識されたＲＮＡである。前述のように、プローブを１つまたは複数のＳＥＲＳナノタグで標識してもよい。その他のブロット方法も知られているか、あるいは開発中である。すべて、検出プローブに結合されたＳＥＲＳナノタグを用いて実行することが可能である。
【００５０】
クロマトグラフィ
クロマトグラフィは、混合物分離のための試験方法の種類を表す包括的な用語である。クロマトグラフィには、「移動相」で溶解された混合物に静止相を通過させ、混合物内の他の分子から測定対象の検体を分離し、隔離するステップが関わる。さまざまな種類のクロマトグラフィが一般的に用いられており、たとえば、これらに限定されないが、以下のものがある。コラムクロマトグラフィ、プラナクロマトグラフィ、ペーパークロマトグラフィ、薄層クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、熱分解ガスクロマトグラフィ、高速たんぱく質液体クロマトグラフィ、向流クロマトグラフィ等。
【００５１】
クロマトグラフィは、分取的でも分析的でもよい。分取クロマトグラフィは、混合物の成分を、その後の使用のために分離しようとするもので（、したがって精製の１形態で）ある。分析クロマトグラフィは通常、より少量の材料で行われ、混合物中の検体の相対的割合を測定しようとするものである。これらの２つは相互に排他的ではない。いずれの場合も、ＳＥＲＳナノタグを、検体を調べるためのプローブに結合しても、あるいは検体に直接結合してもよい。こうすると、ＳＥＲＳナノタグは、前述の方法で検出できる。
【００５２】
質量分析法
質量分析法は、イオンの質量対電荷比を測定するために用いられる分析方法である。これは、試料の成分の質量を表す質量スペクトルを生成することによって、物理的試料の組成を見出すのに最も一般的に使用される。質量分析法は、たんぱく質やその他の大きな分子を特徴付けるための、重要な、新たに考案された方法である。たんぱく質全体をイオン化するための２つの主な方法は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）とマトリクス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）である。利用できる質量分析計の性能と質量範囲に合わせて、２つのアプローチでたんぱく質の特徴付けが行われる。第一のアプローチとして、上記の２つの方法のいずれかによって無傷のたんぱく質をイオン化し、その後、質量分析器に入れる。第二のアプローチでは、トリプシンやペプシン等の媒介を使い、酵素によってたんぱく質をより小さなペプチドへと消化する。上記以外のたんぱく質分解媒介も使用される。その後、ペプチド生成物の集合を質量分析器に入れる。これはしばしば、たんぱく質分析の「要素還元的(bottom-up)」アプローチと呼ばれる。
【００５３】
生物学の研究者が関心を寄せるたんぱく質は通常、生物学的媒質の中に共存する他のたんぱく質や分子との非常に複雑な混合物の一部である。これによって、２つの大きな問題が生じる。第一に、大きな分子に使用される２つのイオン化技術は、混合物に略同量の構成要素が含まれる場合しかうまく働かないが、生体試料では、異なるたんぱく質がきわめてばらばらの量で存在する傾向がある。このような混合物がエレクトロスプレーまたはＭＡＬＤＩによってイオン化されると、より多くの種が、より少ない種からの信号を「かき消す」傾向がある。第二の問題は、複雑な混合物からの質量スペクトルは、混合物の成分の数が圧倒的であることから、解釈が非常に困難であることである。この問題は、たんぱく質の酵素による消化によって多くのペプチド生成物が作られる事実から、より深刻となる。
【００５４】
いくつかの最近の方法により、質量分析法によるたんぱく質の定性化が可能となる。歴史的に、炭素（Ｃ１３）または窒素（Ｎ１５）の安定した（たとえば、放射能を持たない）、より重い同位体が１つ試料の中に取り込まれ、もう一方の試料が対応する軽い同位体（たとえば、Ｃ１２とＮ１４）で標識される。定量的質量分析に関連する従来の標識は、異なるフレーバのＳＥＲＳナノタグとすることができる。一般に、２つの試料は分析前に混合される。異なる試料から得られたペプチドは、その質量の差によって区別し、前述のＳＥＲＳナノタグ検査方法を使って定量的に比較することができる。ＳＥＲＳナノタグを使用すると、本明細書では詳述しない多数のその他の質量分析方式も同様に改善される。
【００５５】
たんぱく質アレイまたはチップ
たんぱく質アレイとは、ガラス、膜、マイクロタイタウェル、質量分析プレート、ビーズまたはその他の粒子を含む基板上に固定化されたたんぱく質を使った、固相リガンド結合分析系である。この分析法は、超並列型（多重的）であり、小型化されることが多い（マイクロアレイ、たんぱく質チップ等）。その利点としては、迅速で自動化が可能であること、高感度であること、試薬が経済的であること、１回の実験で豊富なデータを提供することなどがある。生物情報学的な支援が重要であり、データの取扱には高度なソフトウェアとデータ比較分析が必要となる。主なフォーマットの１つが捕捉アレイであり、これにおいて、一般的には抗体であるが、他のベースとなるたんぱく質(protein scaffold)、ペプチドまたは核酸アプタマとすることもできるリガンド結合試薬を使って、プラズマまたは組織抽出物等の混合物の中の標的分子が検出される。診断では、捕捉アレイを使って、複数の免疫分析法を平行して実行することができ、たとえば個別の血清中の複数の検体についての試験と多数の血清試料の同時試験の両方を行える。プロテオミクスでは、捕捉アレイは、健康および病気の異なる試料中のたんぱく質レベルの定量化と比較、つまり、たんぱく質発現プロファイリングに用いられ、この中で、たんぱく質アレイは２ＤＥ技術に代わるものとなるかもしれない。特定のリガンドバインダ以外のたんぱく質は、たんぱく質−たんぱく質、たんぱく質−ＤＮＡ、たんぱく質−薬剤、受容体−リガンド、酵素−基質等、体外での機能的相互作用スクリーンのためのアレイフォーマットで使用される。これらはまた、ＳＮＰによって生じる多形転移をたんぱく質の機能と相関させるのに用いてもよい。捕捉試薬そのものは、多くのたんぱく質について選択、篩い分けすることが必要であり、これも複数のたんぱく質標的に対して複数のアレイフォーマットで行うことができる。
【００５６】
以上のように、概して、たんぱく質アレイを応用できる主な分野は少なくとも４つあり、その各々に適切当なフォーマットと読取方法が必要となる。主な分野には以下が含まれる。
診断：血液試料中の抗原と抗体の検出、新たな病変マーカを発見するための血清のプロファイリング、環境および食品モニタ
プロテオミクス：たんぱく質発現プロファイリング、特定器官および特定病変ごとのアレイ
さらに表現または操作するための、ディスプレイライブラリからの各メンバーの隔離：捕捉アレイで使用するための、ファージまたはリボゾームディスプレイライブラリからの抗体およびベースとなるたんぱく質の選択
たんぱく質機能分析：たんぱく質−たんぱく質相互作用、受容体のリガンド結合特性、酵素活性、抗体の交差反応性および特異性、エピトープマッピング
【００５７】
アレイを構成するために、たんぱく質の由来としては、遺伝子組み換えたんぱく質の細胞ベース発現系、天然たんぱく質源からの精製、無細胞翻訳系による生体外生成、ペプチドの合成方法等がある。これらの方法の多くは、生産スループットを高めるために自動化することができる。捕捉アレイとたんぱく質機能分析にとって、たんぱく質が正しく折り畳まれ、機能的であるべきであることが重要である。これは常に当てはまるとは限らず、たとえば、遺伝子組み換えたんぱく質が変性条件下で細菌から抽出される場合は当てはまらない。それでも、変性たんぱく質のアレイは、交差反応性に関して抗体を篩い分けし、自己抗体を同定し、リガンド結合たんぱく質を選別するのに有益である。
【００５８】
蛍光標識および検出方法は従来、たんぱく質アレイとともに使用されている。たとえば、異なるディスプレイのために、捕捉（たとえば抗体）アレイを２つ異なる細胞状態からの、蛍光により標識されたたんぱく質で探索することができ、この場合、細胞溶解物が異なる蛍光色素分子と結合され、混合される。同様の検出方式が、ＳＥＲＳナノタグを検出手段として実行できるであろう。たとえば、各細胞状態からのたんぱく質を異なるフレーバのＳＥＲＳタグで標識することができ、すると、これは前述のように検出される。ＳＥＲＳナノタグを使って実行できる関連マイクロアレイ技術には、これらに限定されないが、ＤＮＡマイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、細胞マイクロアレイおよび化合物マイクロアレイがある。
【００５９】
フローサイトメトリ
フローサイトメトリは、流体の流れの中に浮遊している微細な粒子を係数、検査、分別するための技術である。これにより、光学および／または電子検出装置の中を流れる単細胞の物理的および／または化学的特性を同時に複数のパラメータについて分析することが可能となる。一般的なフローサイトメータは、サイトメトリの流れに照準を当てた光源、一般的にレーザ光源を備える。
【００６０】
従来、光線を通過する各浮遊粒子は何らかの態様で光を散乱させ、その粒子の中に見出される、またはその粒子に付着した蛍光性化学物質が励起され、光源より低周波数の光が放出されるかもしれない。このような散乱光と蛍光の組み合わせが検出器によって選び出され、各検出器（各蛍光放出ピークにつき１つ）での明るさの変化を分析することにより、個々の粒子の物理的および化学的構造に関する各種の情報を推定することができる。ＳＥＲＳナノタグは、流体の流れの中に浮遊している粒子と関連付けてもよい。この場合、前述のようなＳＥＲＳタグの補足的な検査とともに従来のフローサイトメトリ測定を行ってもよい。ＳＥＲＳナノタグを同様に用いて、フローサイトメトリに基づく細胞の選別およびこれに類する関連の技術を改善することができる。熟練者は、ＳＥＲＳナノタグが、微量レーザスキャニングサイトメトリ等、他のさまざまなサイトメトリ方式にも使用できることがわかるであろう。さらに、ＳＥＲＳタグは、細胞選別および／または分離の非サイトメトリ方式とも組み合わせることができる。たとえば、単細胞は、流れの方向と速度を制御する、リソグラフィで作製されるデバイスの中で選別できる。
【００６１】
マイクロ流体分析法
多くの種類の分析法で、マイクロ流体工学(microfluidics)を利用して、流体の流れを制御および／または小規模化している。ＳＥＲＳナノタグは、さまざまな方法でマイクロ流体分析法に取り入れることができる。一例では、ＳＥＲＳナノタグがマイクロ流体工学を利用した方法によって試料内に組み込まれる。別の例では、試料がマイクロ流体を利用した方法によって成分に分離され、ＳＥＲＳナノタグが１つまたは複数の成分に加えられる。マイクロ流体工学は、ＳＥＲＳナノタグの結合された種を、結合されていない種から分離するのに用いることができる。このような種は、分子、高分子、細胞または粒子であってもよい。たとえば、サンドイッチ型免疫分析法は、捕捉抗体とラテックスビーズおよび検出抗体とＳＥＲＳナノタグを使って実行できる。マイクロ流体工学デバイスは、ＳＥＲＳナノタグが結合されたラテックスビーズ（抗原の存在による）をＳＥＲＳタグが結合されていないラテックスビーズから分離することができる。さらに、分離されたビーズとナノタグの複合体は、マイクロ流体工学を使って濃縮できる。
【００６２】
その他の光学分析法
ＳＥＲＳナノタグは、生物学、化学、工学、材料科学、診断および／または医薬において使用される上記以外の光学的手法とも一緒に使用できる。たとえば、光ピンセットを使って１つまたは複数の種（粒子、細胞、物体）を捉え、調査する。ＳＥＲＳナノタグもまたピンセットで捕捉でき、あるいは、ＳＥＲＳナノタグは、光ピンセットで捉えられた種に結合されていれば、検査できる。同様に、ＳＥＲＳナノタグは、分析フォーマットの各種の多光子法で検出できる。たとえば、表面増強ハイパーラマンは、ＳＥＲＳナノタグを使った光学的背景のない(optical background free)分析法の開発に使用できる。この場合、１５００ｎｍの２つの光子を使用し、７５０ｎｍのラマンシフト光子を検出かもしれない。あるいは、分析法にコヒーレント検出法（ＣＡＲＳ等）を用いることも可能であろう。
【００６３】
また、その他の各種の光学的手法も、ＳＥＲＳとともに使用できる。たとえば、光散乱は、粒子の有無を検出するためのスクリーンとして、ＳＥＲＳタグから測定することができる。すると、ＳＥＲＳ測定を行って、粒子の同定を行うことができる。このような方法は、粒子の存在を迅速に判断できるため、高スループットのスクリーニングにおいて非常に有益である。同様に、この方法は側流式またはその他のイムノクロマトグラフィ分析法で使用でき、このような分析法では、粒子の検出がまず散乱光に基づいて目視で行われ、次いで、計器を用いたＳＥＲＳの読取によって、ＳＥＲＳナノタグの数と種類が定量化される。
【００６４】
背景削減(Reduced Background)近接分析法
ＳＥＲＳ活性粒子（たとえば、これに限定されないが、ＳＥＲＳナノタグ）が関わる新規な分析方法は、他のプロセスの刺激に、特定の周波数のラマン光子放出を利用することに基づいている。多くのバイオアッセイフォーマットで、最終的な分析感度は、非特異的結合および／またはその他の要因による背景信号によって限定される。したがって、「背景のない」または背景の削減された信号を生成できる分析フォーマットは非常に有利である。その良い例が２光子蛍光プロセスを含む分析法であり、波長１０００ｎｍの２つの光子を使って、５００ｎｍを超える波長で検出される発光プロセスを刺激する。５００ｎｍの光子は入力されないため、生体試料、ガラス製品等における検出周波数で発生しうる背景蛍光を避けることができる。
【００６５】
上記以外の種類で有益な分析法は、（２つまたはそれ以上の）成分が合わされたときだけ信号が生成されることに基づくものである。一般に近接分析法と呼ばれるこのような分析法が各種存在する。たとえば、相補的(complementation)分析法では、蛍光たんぱく質を２つの部分に分割し、各部分を異なる分子（たとえば、ＡとＢ）に付着させる。ＡとＢが離れていれば、蛍光は不可能である。しかしながら、ＡとＢが近接していると（つまり、相互に結合していると）、蛍光たんぱく質の断片が十分に近いため、機能的たんぱく質を再構成し、光励起によって発光が起こる。したがって、蛍光光子の検出は、Ａ：Ｂ複合体の形成に関係する。
【００６６】
より有利である可能性のある分析法は、背景削減分析法と近接分析法の両方の考え方を取り入れたものである。たとえば、近接結合の結果としての背景ノイズのない周波数で検出できる光子の生成である。本明細書で述べるＳＥＲＳ活性ナノ粒子のプラズモン属性により、このような分析フォーマットの実現が可能となる。
【００６７】
ナノ粒子プラズモンの励起がＳＥＲＳ活性と強力に関係していることはよく理解される。２つの最も一般的なタイプのＳＥＲＳ活性ナノ粒子はＡｕとＡｇである。球形Ａｕコロイド粒子は通常、その直径に応じて５２０−５６０ｎｍの範囲のプラズモン共鳴を示し、球形Ａｇナノ粒子は、同様にその直径に応じて、４００−４５０ｎｍの範囲の共鳴を示すことが可能である。さらに、ＳＥＲＳに関係するラマン散乱強度の増強は、プラズモンが近接した２つ以上の粒子を含む場合（たとえば、二重体、三重体または凝集体）、有意に高まることは良く知られている。調整可能なプラズモン反応を有するＳＥＲＳ活性粒子の具体例を以下に詳しく述べる。
【００６８】
たとえば、アスペクト比１．５から１０の金ナノロッドの対応する吸光度極大は６００から１３００ｎｍであることが実証されている（非特許文献２３）。同様に、アスペクト比２３以下の金ナノロッドの成長が行われた。（非特許文献２４）。新規な照明方法を使い、得られるナノプリズムのエッジ長さが３８−１２０ｎｍ、吸収バンドが４７０−１０００ｎｍとなるようにして銀ナノプリズムを成長させることができることもまた実証されている（非特許文献２５）。また、湿式化学法を、エッジ長さ１００−３００ｎｍ、吸収バンド１２００ｎｍ超の金プリズムの合成に利用できることも紹介されている（非特許文献２６）。
【００６９】
銀ナノキューブを作り、金「ナノボックス」を作製するための犠牲テンプレートとして用いてもよい（非特許文献２７）。可視光スペクトル内のナノ粒子のプラズモン共鳴を調整するための方法がある（非特許文献２８）。より最近では、銀ナノバーと「ナノライス(nanorice)」の合成が紹介されており、この粒子のプラズモン共鳴は９００ｎｍ付近まで延びている（非特許文献２９）。
【００７０】
同様の方法により、犠牲テンプレートとして銀ナノスフィアを用いて、吸光度極大が４００−９９０ｎｍの中空金粒子が作製されている（非特許文献３０）。吸光度極大が約６００ｎｍの小型の単分散中空金シェルが、前駆体にコバルトナノ粒子を用いて生成されている（非特許文献３１）。シリカコアの上に金を被覆し、遠赤から２２００ｎｍまでの強力なプラズモン共鳴を発生させるための簡潔な方法が知られている（非特許文献３２）。プラズモン応答を調整できるＳＥＲＳ活性ナノ粒子の上記以外の生成方法も現在知られているか、あるいは今後開発されるであろう。このようなタイプの粒子の一部または全部は、本明細書で述べる新規なスペクトルと分析法において有益であるかもしれない。
分析法の説明
【００７１】
ＳＥＲＳ活性近接分析法は、適当なプラズモン特性を有するのであれば、どのような粒子でも設計できる。以下に述べる理論実施例は限定的な意味を持たない。近接分析法３０の非限定的な代表例が図３に概略的に描かれている。この代表的な分析法は、表面プラズモンが６００ｎｍ、つまり１６，６６６ｃｍ-1で最大となる第一のＳＥＲＳ活性粒子３２を含む。これに、１６６６ｃｍ-1で強力なラマンバンドを有する分子３４が吸着されているか、あるいは非常に近接している。粒子／分子には、レーザ３７からの６００ｎｍの単色光３６が照射される。この系から放出されるストークスシフト(Stokes-shifted)光子３８は１６，６６６−１，６６６、つまり１５，０００ｃｍ-1であり、これは６６６ｎｍの波長に等しい。放出された光子３８の強度は、単粒子ＳＥＲＳ効果により、一般的なラマン実験の場合より大きく。形状と組成に応じて、１０4から１０7倍の増強が期待できる。
【００７２】
代表的な分析法３０はまた、分子３４を間に挟んで第一の粒子に近接された第二のＳＥＲＳ活性粒子４０を含む。第二の粒子は、６６６ｎｍで急峻な表面プラズモンピークを有する。６００ｎｍのレーザ励起でも、この第二の粒子からのＳＥＲＳは励起されない。しかしながら、第一の粒子３２からのラマンシフト光子３８は、これがちょうど吸光度極大に対応するため、励起される。第二の粒子から放出されるストークスシフト光子４２は（第二の粒子が分子３４にも非常に近接しているため）１５，０００−１，６６６、つまり１３，３３４ｃｍ-1、つまり７５０ｎｍで発生する。したがって、この系では、１つの波長（６００ｎｍ）での励起によって、入射される光子エネルギーと、それぞれ振動周波数の１倍と２倍の数値との間の差に対応する２つの異なる波長、６６６ｎｍと７６０ｎｍでの発光が得られる。７５０ｎｍでの発光は検出器４４で検出することができ、検出された信号の背景ノイズ特性は削減されているであろう。前述の励起波長と発光波長は非限定的な代表例に過ぎない点に注意することが重要である。しかしながら、励起波長と発光波長の関係は一般化してもよい。特に、使用される受容体がエネルギーｖ１でＳＥＲＳ活性振動ピークを有する場合、検出は周波数Ｌ−（２ｖ１）で行うことができ、Ｌはレーザ励起周波数である。
【００７３】
２つのナノ粒子の吸光度極大がいずれかの適当な量だけ分離される機能的分析法を準備してもよい。吸光度極大が約２００ｃｍ-1と３５００ｃｍ-1だけ離れている粒子は、本明細書で述べる近接分析法の実施に特に適している。上で詳細に述べたように、適切に分離され、個別に調整された吸光度極大を有する粒子は、形状の異なる２種類のナノ粒子を使用することによって調合できる。たとえば、一方の粒子は球形、もう一方は非球形であってもよい。あるいは、第一の粒子は中実で、第二の粒子は中空であってもよい。第一の粒子は均一の組成で、第二の粒子はコアとシェルのように、異なる組成または構造を有していてもよい。粒子の吸光度特性はまた、各粒子について選択された材料によっても影響を受けることがある。たとえば、一方の粒子は、１つの金属元素から作製してもよく、もう一方の粒子は混合物、合金または異なる金属から作製してもよい。たとえば、第一の粒子はＡｕであり、第二の粒子はＡｇである。いずれの粒子も、Ａｕ、Ａｇまたはその他の元素、組成物または材料の合金または混合物であってよい。
【００７４】
図３に関して説明したような分析法を設計する簡便な方法は、ＤＮＡかたんぱく質のいずれかを用いるサンドイッチ型分析法を実行することである。たとえば、サンドイッチ型免疫分析法では、第一の粒子３２を捕捉抗体（Ａｂ）で被覆することができ、第二の粒子４０を検出用Ａｂで被覆することができる。いずれかのＡｂがＳＥＲＳ活性リポータ（つまり、分子３４）で修飾されている場合、抗原の存在によってサンドイッチが形成されると、必然的にＳＥＲＳ活性リポータは粒子と粒子の間に入る。あるいは、ＳＥＲＳ活性粒子の表面の一部が吸着されたリポータ分子で被覆され、一部がＡｂで被覆された粒子を使用してもよい。
【００７５】
ラマン断面は、たとえＳＥＲＳを用いても小さいため、前述の代表例を使用した場合、放出される７５０ｎｍの光子の数は、放出される６６６ｎｍの光子の数と比較して少ないであろうことがよくわかる。しかしながら、７５０ｎｍでの背景信号は、６６６ｎｍでの場合と比較して、非常に小さいか、ゼロである。
【００７６】
さらに、以下のようにして、生成される７５０ｎｍの光子の数を最大にするように分析法を調整してもよい。両方のタイプのＡｂ被覆粒子の混合物を検体の含まれる試料の中に導入するのではなく、この分析法では、検体を第一の粒子に関連するＡｂに当初から結合させることが有利かもしれない。すると、第二の粒子を導入するとサンドイッチが形成されるが、第二の粒子は完全に第一の粒子を取り囲んでいる状態である。これは、第一の粒子が４パイステラジアン（つまり、全空間）に６６６ｎｍの光子を放出するため、最適である。理想的には、第二の粒子で第一の粒子を三次元で完全に取り囲むことにより、ラマン散乱が７５０ｎｍで光子を生成する可能性が最大となる。
【００７７】
要約すれば、新規な近接分析法を前述のように準備または実行できる。本明細書に記載された代表的な光子の特徴は限定的ではない点に留意することが重要である。検出されたエネルギーのエネルギーレベルと波動特性は、粒子とリポータの物理的特性によって決定され、前述のように、選択された形状、大きさ、表面構造を有する選択された材料から粒子を作製することによって微調整してもよい。たとえば、ＳＥＲＳナノ粒子Ａが１３，０００ｃｍ-1で光子を吸収し、１１，７００ｃｍ-1でラマン光子を放出し、ＳＥＲＳナノ粒子Ｂが（１３，０００ｃｍ-1ではなく）１１，７００ｃｍ-1で励起され、１０，０００ｃｍ-1で散乱光子を放出する場合、原理上、ＡとＢの粒子の集合を１３，０００ｃｍ-1で励起し、ちょうど１０，０００ｃｍ-1で光子を検出することができる。実践上、このような現象が検出可能なレベルで発生するのは、粒子が効率的な散乱体、効率的な吸収体であり、最も重要なこととして、相互に非常に近接しているときだけである。したがって、適切に設計されたＳＥＲＳナノタグのペアは各種の近接分析法に使用でき、種１と種２の結合または結合解除(de-binding)を特定のＳＥＲＳ信号の有無によって検出することができる。
【００７８】
別のタイプの近接分析法は、ＳＥＲＳを起こさせる電磁界増強がしばしば、単独の粒子の場合より、非常に狭い間隔で離間された粒子間のほうが大きなオーダーとなりうるとの事実を利用するものである。したがって、個々の粒子からのＳＥＲＳ信号は検出されないが、狭い間隔で離間された粒子からのＳＥＲＳ信号は検出できるように検出レベルを設定できる。このような例では、検出された分子は、ＳＥＲＳ活性粒子の一方または両方の表面上のリポータとなり得、この場合、近接分析法ではより強力な（したがって、検出可能な）リポータのスペクトルが得られる。あるいは、各粒子のリポータのＳＥＲＳが検出可能であるように検出レベルを調整することもでき、粒子を粒子間の分子と近接させる。その一例は、サンドイッチ型免疫分析法の抗原である。このような例では、ＳＥＲＳスペクトルは、リポータのスペクトルからリポータのスペクトルに抗原のスペクトルを加えたものへと変化する。
【００７９】
上記のタイプの近接分析法はすべて多重化することができ、つまり、複数の粒子上の複数のリポータを使用することにより、複数の検体を検出および／または定量化することができる。
【００８０】
あるいは、ＳＥＲＳタグは、ＵＳ−ｖｉｓまたは吸光分析法に関連して使用できる。経路の長さが短いデバイス（たとえば、薄層セル）でのＳＥＲＳナノタグの固定化はＵＶ−ｖｉｓで行うことができ、続いてＳＥＲＳ検査による定量化が行われる。
【００８１】
電気化学的分析法
ＳＥＲＳナノタグは、電極および電気化学的方法と一緒に使用することができる。たとえば、ＳＥＲＳナノタグを金属表面に固定化できる。結合されるタグの総数は、電極容量の変化によって決定でき、タグの数と名前は、ＳＥＲＳを用いた光学検査(optical interrogation)によって決定できる。ここで、容量は結合される粒子の数を確認するために使用される。あるいは、ＳＥＲＳナノタグを上述の１つ以上の方法（たとえば、免疫分析法）を通じて電極表面に結合してもよい。すると、タグの数と名前はＳＥＲＳによって決定できる。次に、粒子を電気化学的に酸化することにより、金属含有量を測定できる。その他の電気化学的方法、たとえば、これらに限定されないが、電位差測定法、電量分析法、電界電量分析法等も使用できる。
【００８２】
重量分析およびその他の分析法
ＳＥＲＳナノタグはまた、さまざまな質量感知技術にも利用可能である。たとえば、水晶重量分析は、ナノ粒子の存在の検出およびその後のＳＥＲＳ検査に使用できる。あるいは、ずり(shear)の差によって、またはその他の手段によって質量を検出する、より高感度のＭＥＭＳベースセンサおよび／または水晶もしくは金属振動子を使って、少数のＳＥＲＳナノタグの存在を検出し、その後ラマンによる同定を行うことができる。
【００８３】
電気化学および重量分析法は、ＳＥＲＳナノタグの有無を検出する、またはその総数を数値で表すための「直交法」でなる。これらはスペクトル情報を提供しない（したがって、多重的には利用できない）が、それでもなお（たとえば、スクリーニング、絶対定量化または擬陽性の排除等）のために有益であろう。たとえば、ごくわずかな数のＳＥＲＳナノタグ、おそらくは１つの粒子のみの検出に基づいて、超高感度の分析法を開発することができるであろう。その１つまたは複数の粒子を非光学的方法で平行検出することにより、測定の信頼水準は有意に上昇する。
【００８４】
そのほかにもさまざまな直交検出方法が存在し、たとえば、これらに限定されないが、原子吸光および原子発光、Ｘ線回折、Ｘ線散乱、中性子散乱、電子顕微鏡分析法、原子間力顕微鏡分析法、走査型トンネル顕微鏡分析法、その他の走査プローブ顕微鏡分析法、Ｘ線蛍光分析法がある。
【００８５】
ＳＥＲＳナノタグは、ラマン分光計以外の計器を使っても検出できる。したがって、蛍光を読み取るように設計された蛍光光度計で、蛍光色素分子の発光と同じ波長で光子を放出するように調整されたリポータを担持するＳＥＲＳナノタグを検出することができる。実際に、適当なフィルタセットを使えば、非常に安価な計器でＳＥＲＳナノタグを検出できる。
【００８６】
ＩＩＩ．その他の分析フォーマットと標識方式
ＳＥＲＳナノタグは、本明細書において特に説明したもの以外のタイプの分析法でも、マーカ、タグまたは検出手段その他として使用できる。たとえば、ＳＥＲＳナノタグは、（これらに限られないが）以下のような分析法で使用できる。
キャピラリ電気泳動
誘電泳動
等電点電気泳動
その他あらゆる分析フォーマット
【００８７】
さらに、ＳＥＲＳナノタグは、分離等のその後の分析ステップを行う前に、細胞や材料を標識するために使用できる。ＳＥＲＳタグは多くの場合、分離その他、その後の分析ステップの性質を気にすることなく使用してもよい。初期標識の１つの非排他的な代表例は、遺伝子発現、多重的ＰＣＲ標識、ＳＥＲＳ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、多重病原菌検出、またはリアルタイムＰＣＲ等における応用である。たとえば、マイクロアレイ遺伝子発現の中の既知のＣｙ５およびＣｙ３蛍光染料の代わりに、ＳＥＲＳタグを、患者のＲＮＡまたはＤＮＡを標識するために使用してもよい。別の代表例では、多重ＳＥＲＳタグ標識プライマを使って、各種のウイルスＲＮＡを増幅したり、ウイルス性病原菌を同時に検出したりできる。
【００８８】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、標識された相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖（つまり、プローブ）を利用して、組織のある部分もしくは切片（ｉｎ  ｓｉｔｕ（原位置））または組織全体（ホールマウントＩＳＨ）における特定のＤＮＡ（核の染色体内）またはＲＮＡ（細胞質内）の局在をつきとめる手法である。これは、組織切片におけるたんぱく質の局在を特定する免疫組織化学とは異なる。
【００８９】
ハイブリダイゼーションのために、試料となる細胞と組織は通常、標的転写を所定の位置に固定し、プローブのアクセスを増大させるように処理される。プローブは、高温下で標的配列にハイブリダイズされ、その後、余分なプローブが洗い流される。温度、塩および／または洗剤濃度等の溶液のパラメータを操作して、非特異的なハイブリダイゼーションを取り除くことができる。次に、標識されたプローブの組織内の局在が特定され、定量化される。
【００９０】
従来、プローブは3Ｈの32Ｐ35Ｓで標識されたが、最近では、一般により多用途の非放射性ラベルが開発された。ＳＥＲＳナノタグは、同等またはより高い感度を実現し、一般により迅速に結果を出し、また同じく重要なことには、有害材料を取り扱わずに済む代替の標識のひとつになりうる。
【００９１】
ＳＥＲＳ  ＩＳＨ対ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）
標識に使用するための蛍光染色の考案により、同時に複数のプローブを可視化することが可能となった。標識としてのＳＥＲＳナノタグは、より高度な多重化とより高い感度等、はるかに多くの利点を有し、病気の検査と診断に新たな可能性を開いた。これは、たとえば、これに限定されないが、診断を下し、予後診断を評価し、がん等の病気の寛解を評価し、あるいは病原菌の種を特定し、患者の組織の小さな試料からのゲノムを比較することである。したがって、治療を特に当該の患者に合わせて調整することができる。
【００９２】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲとｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ
従来のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションには、分解可能な配列のコピー数の点で制約がある。この技術の分解能を改善する１つの方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせることとされてきた。それによって、遺伝子配列のシングルコピーまたは低レベルの細胞質ｍＲＮＡを分解できる。これは、ウイルス性ＤＮＡに感染した細胞の検出と同定のための診断ツールとして特に有益であることがわかっている。検出能力を高めるために、プローブにはＳＥＲＳナノタグを設けてもよい。
【００９３】
ＰＲＩＮＳ（プライムドｉｎ  ｓｉｔｕ標識）
ＰＲＩＮＳは、分裂中期の染色体伸展標本(spread)または間期核における染色体を同定するための、従来のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに代わる方法である。この方法では、背景ノイズの少ない、迅速な検出が可能となる。変性ＤＮＡは、短いＤＮＡ断片または設計されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。次に、標識ヌクレオチドの存在下で適当なポリメラーゼによるプライマ伸張が行われる。標識された部位は、適当なＳＥＲＳナノタグ結合抗体を使って検出できる。
【００９４】
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）
ＲＰＡは、他のＤＮＡ増幅方法より有利なＤＮＡ増幅技術である。ＲＰＡで、特定のＤＮＡ断片の等温増幅は、鋳型ＤＮＡに対向するオリゴヌクレオチドプライマを結合し、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマを伸張させることによって実現される。この分析法は、迅速で感度が高い。ＲＰＡプロセスをサポートし、維持するためのハードウェアはほとんど、またはまったく不要であるため、ポイント・オブ・ケア（医療現場）および臨床分野において理想的である。ＳＥＲＳナノタグを磁気ビーズと組み合わせてこの分析法に応用し、ＳＥＲＳ−ＲＰＡ方式を確立することができる。この分析法では、ビオチン化５’プライマとＳＥＲＳタグ結合３’プライマを特定の標的ＤＮＡに結合させる。ＲＰＡの後、ニュートロアビジンで被覆された磁気ビーズを添加し、その後、ビーズを分離し、信号を取得する。ＳＥＲＳ−ＲＰＡは、ヒト病原菌、ＧＭＣ植物の同定と、血液バンクでのスクリーニングその他のための超高感度で迅速な診断方法となる。
【００９５】
ＩＶ．独立した分離方法の例
上述の分析法のいくつかにおいては、分析による結果検出の前に、ゲル電気泳動等の特殊化された分離ステップを利用する。多くの分析法は、たとえば、生物学的マトリクス等、他のコンポーネントから検体を独立して分離した後に行うことができる。分離ステップを含むいずれの分析法も、ＳＥＲＳナノタグを検体の成分に取り付け、その中に組み込み、あるいは他の方法で関連付けることによって改善、または実行することができる。上に挙げた具体例以外の代表的な独立分離方法としては、たとえば、これらに限定されないが、以下のものがある。濾過、遠心分離、クロスフロー濾過、フィールドフロー分画、マイクロ流体工学、静電選別、密度勾配濾過、電気化学分離、キャピラリ電気泳動、磁気ビーズ分離、およびその他の機械的、物理的、化学的、電気的または生物学的分離技術。
【図１】
2010525333.tif 000003
【図２】
2010525333.tif 000004
【図３】
2010525333.tif 000005
【国際調査報告】
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