(57)【要約】  ６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ３（ＰＦＫＦＢ３）の阻害方法及び、阻害化合物を提供する。また、細胞増殖の阻害方法、癌の治療方法及びＰＦＫＦＢ３阻害能を測定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。  【選択図】    図１
2010531304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ３（ＰＦＫＦＢ３）を阻害化合物と接触させることから成るＰＦＫＦＢ３を阻害する方法。
【請求項２】
前記阻害化合物が化学式（Ｉ）：
【化１】
2010531304.tif 000048
（式中、ＸはＣ又はＣＨであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、但し式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群からそれぞれ独立して選択され、Ｒ２及びＲ７は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｌ１は、存在又は不存在であってもよく、存在する場合は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ８、アルキレン基及び置換アルキレン基からなる群から選択され、式中、Ｒ８は水素原子、アルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｌ２は、存在又は不存在であってもよく、存在する場合は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ９、アルキレン基、置換アルキレン基及び三価の連結基からなる群から選択され、式中、Ｒ９は水素原子、アルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され、また三価の連結基は、Ａｒ２に結合する第１の原子、Ｘに結合する第２の原子及びＡｒ１及びＡｒ２からなる群の一つと結合する第３の原子からなり；及び
Ａｒ１及びＡｒ２はアリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基及び置換ヘテロアリール基からなる群より独立に選択される。）
で表わされる化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａｒ１及びＡｒ２の中の少なくとも一つがアザアリール基である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｌ１が不存在である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｌ２が存在し、Ｌ２がＣ２アルキレン基である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記化学式（Ｉ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩ）
【化２】
2010531304.tif 000049
（式中、Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣ又はＣＨであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群から、それぞれ独立に選択され、各Ｒ２及びＲ７は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；
Ｒ１０は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｒ１１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４及びＡ５は、それぞれ独立にＮ又はＣＲ１２であり、式中、各Ｒ１２は水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000050
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４はＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４は水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され：
Ｘ５は、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５は、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から選択され；
又は、Ｒ１０及び１個のＲ１２は、一緒にアルキレン基を形成し；
Ａｒ２は、次の化学式：
【化４】
2010531304.tif 000051
からなる群から選択され、
式中、各Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９は、Ｎ及びＣＲ１３からなる群から独立に選択され、式中、各Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000052
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４はＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４は、水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｘ５はＯ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５は、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群から選択され；
又は式中、Ｒ１０及び１個のＲ１３は、一緒にアルキレン基を形成し；及び
式中、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４、Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９の少なくとも一つはＮである。）で表わされる構造を有する化合物又はこれらの医薬的に許可された塩である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
Ｘ１がＯであり、ＸがＣである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ａｒ２が：
【化５】
2010531304.tif 000053
で表わされ；
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、かつ各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び、前記化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩ）で表わされる構造：
【化６】
2010531304.tif 000054
を有する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が以下の化合物：
【化７】
2010531304.tif 000055
からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ａｒ２が：
【化８】
2010531304.tif 000056
で表わされ、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１がＯ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群より独立に選択され；及び化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が、化学式（ＩＶ）で表わされる構造：
【化９】
2010531304.tif 000057
を有する請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記化学式（ＩＶ）で表わされる化合物が、
【化１０】
2010531304.tif 000058
である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ａｒ２が：
【化１１】
2010531304.tif 000059
であり；
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（Ｖ）で表わされる構造：
【化１２】
2010531304.tif 000060
を有する請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学式（Ｖ）で表わされる化合物が：
【化１３】
2010531304.tif 000061
である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞を有効量のＰＦＫＦＢ３阻害剤と接触させることから成る、細胞内の解糖フラックスを減少させる方法。
【請求項１５】
細胞を有効量の化学式（Ｉ）：
【化１】
2010531304.tif 000062
（式中、ＸがＣ又はＣＨであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、但し式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群からそれぞれ独立して選択され、Ｒ２及びＲ７が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｌ１が、存在又は不存在であってもよく、存在する場合は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ８、アルキレン基及び置換アルキレン基からなる群から選択され、式中、Ｒ８が水素原子、アルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｌ２が、存在又は不存在であってもよく、存在する場合は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ９、アルキレン基、置換アルキレン基及び三価の連結基からなる群から選択され、式中、Ｒ９が水素原子、アルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され、また三価の連結基が、Ａｒ２に結合する第１の原子、Ｘに結合する第２の原子及びＡｒ１及びＡｒ２からなる群の一つと結合する第３の原子からなり；及び
Ａｒ１及びＡｒ２が、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基及び置換ヘテロアリール基からなる群から独立に選択される。）
で表わされる化合物と接触させることから成る、細胞内の解糖フラックスを減少させる方法。
【請求項１６】
Ａｒ１及びＡｒ２の中の少なくとも一つがアザアリール基である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｌ１が不存在である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Ｌ２が存在し、Ｌ２がＣ２アルキレン基である請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
化学式（Ｉ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩ）で表わされる構造：
【化２】
2010531304.tif 000063
（式中、Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣ又はＣＨであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群から、それぞれ独立に選択され、各Ｒ２及びＲ７が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；
Ｒ１０が、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｒ１１が、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４及びＡ５が、それぞれ独立にＮ又はＣＲ１２であり、式中、各Ｒ１２が水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000064
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され：
Ｘ５が、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から選択され；
又は、Ｒ１０及び１個のＲ１２が、一緒にアルキレン基を形成し；
Ａｒ２が、次の化学式：
【化４】
2010531304.tif 000065
からなる群から選択され、
式中、各Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９が、Ｎ及びＣＲ１３からなる群から独立に選択され、式中、各Ｒ１３が、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000066
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が、水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｘ５がＯ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群から選択され；
又は式中、Ｒ１０及び１個のＲ１３が、一緒にアルキレン基を形成し；及び
式中、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４、Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９の少なくとも一つが、Ｎである。）
を有する化合物又はこれらの医薬的に許可された塩である請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
Ｘ１がＯであり、ＸがＣである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ａｒ２が：
【化５】
2010531304.tif 000067
であり；
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基、からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び、化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩ）で表わされる構造：
【化６】
2010531304.tif 000068
を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が、以下の化合物：
【化７】
2010531304.tif 000069
からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ａｒ２が：
【化８】
2010531304.tif 000070
であり、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され、化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＶ）で表わされる構造：
【化９】
2010531304.tif 000071
を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
化学式（ＩＶ）で表わされる化合物が：
【化１０】
2010531304.tif 000072
である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ａｒ２が：
【化１１】
2010531304.tif 000073
であり、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され、
化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（Ｖ）で表わされる構造：
【化１２】
2010531304.tif 000074
を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
化学式（Ｖ）で表わされる化合物が：
【化１３】
2010531304.tif 000075
である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞に有効量のＰＦＫＦＢ３阻害剤を接触させることから成る、細胞の増殖能を減少させる方法。
【請求項２８】
細胞に有効量の化学式（ＩＩ）
【化２】
2010531304.tif 000076
（式中、Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣ又はＣＨであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群から、それぞれ独立に選択され、各Ｒ２及びＲ７が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；
Ｒ１０が、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｒ１１が、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４及びＡ５が、それぞれ独立にＮ又はＣＲ１２であり、式中、各Ｒ１２が水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000077
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され：
Ｘ５が、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から選択され；
又が、Ｒ１０及び１個のＲ１２が、一緒にアルキレン基を形成し；
Ａｒ２が、次の化学式：
【化４】
2010531304.tif 000078
からなる群から選択され、
式中、各Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９が、Ｎ及びＣＲ１３からなる群から独立に選択され、式中、各Ｒ１３が、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000079
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が、水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｘ５がＯ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群から選択され；
又は式中、Ｒ１０及び１個のＲ１３が、一緒にアルキレン基を形成し；及び
式中、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４、Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９の少なくとも一つが、Ｎである。）
で表わされる化合物又はこれらの医薬的に許可された塩を接触させることから成る、細胞の増殖能を減少させる方法。
【請求項２９】
前記細胞が哺乳動物細胞である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が癌細胞である請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９の中の少なくとも一つが、ＣＲ１３であり、式中、Ｒ１３が構造：
【化３】
2010531304.tif 000080
（式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され：
Ｘ５が、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から選択される。）
を有する置換基である請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
Ｘ１がＯであり、ＸがＣである請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
Ａｒ２が：
【化５】
2010531304.tif 000081
であり；
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び
化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩ）で表わされる構造：
【化６】
2010531304.tif 000082
を有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４及びＹ５の中の少なくとも一つが、ＣＲ１３であり、式中、Ｒ１３が構造：
【化３】
2010531304.tif 000083
（式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され：
Ｘ５が、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から選択される。）
を有する置換基である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｘ５がＯであり、Ｘ６が水素原子、アルキル基、アラルキル基及びアリール基から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩａ）：
【化１４】
2010531304.tif 000084
で表わされる化合物である請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
Ａ３がＮである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩｂ）：
【化１５】
2010531304.tif 000085
で表わされる化合物である請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
Ａ４及びＡ５の中の一つがＮである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩｃ）：
【化１６】
2010531304.tif 000086
で表わされる化合物である請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
Ａ２がＮである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩｄ）：
【化１７】
2010531304.tif 000087
で表わされる化合物である請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が以下の化合物：
【化７】
2010531304.tif 000088
からなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
Ａｒ２が：
【化８】
2010531304.tif 000089
であり、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び
化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＶ）で表わされる構造：
【化９】
2010531304.tif 000090
を有する請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
Ｙ６及びＡ３が、それぞれＮである請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
化学式（ＩＶ）で表わされる化合物が：
【化１０】
2010531304.tif 000091
である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ａｒ２が：
【化１１】
2010531304.tif 000092
であり、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（Ｖ）で表わされる構造：
【化１２】
2010531304.tif 000093
を有する請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
Ａ３がＮである請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
化学式（Ｖ）で表わされる化合物が：
【化１３】
2010531304.tif 000094
である請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
１又は２以上の癌細胞において解糖フラックスを直接阻害するために、有効量のＰＦＫＦＢ３阻害剤を患者へ投与することから成る、治療を必要とする患者の癌を治療する方法。
【請求項５１】
有効量の化学式（ＩＩ）
【化２】
2010531304.tif 000095
（式中、Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣ又はＣＨであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群から、それぞれ独立に選択され、各Ｒ２及びＲ７が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；
Ｒ１０が、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｒ１１が、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４及びＡ５が、それぞれ独立にＮ又はＣＲ１２であり、式中、各Ｒ１２が水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000096
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され：
Ｘ５が、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から選択され；
又は、Ｒ１０及び１個のＲ１２が、一緒にアルキレン基を形成し；
Ａｒ２が、次の化学式：
【化４】
2010531304.tif 000097
からなる群から選択され、
式中、
各Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９が、Ｎ及びＣＲ１３からなる群から独立に選択され、式中、各Ｒ１３が、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000098
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が、水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｘ５がＯ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群から選択され；
又は式中、Ｒ１０及び１個のＲ１３が、一緒にアルキレン基を形成し；及び
式中、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４、Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９の少なくとも一つが、Ｎである。）
で表わされる化合物又はこれらの医薬的に許可された塩を患者へ投与することから成る、治療を必要とする患者の癌を治療する方法。
【請求項５２】
Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９の中の少なくとも一つが、ＣＲ１３であり、式中、Ｒ１３が、次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000099
（式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が、水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｘ５がＯ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群から選択される。）
で表わされる請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｘ１がＯであり、ＸがＣである請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
Ａｒ２が：
【化５】
2010531304.tif 000100
であり；
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基、からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び、
化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩ）で表わされる構造：
【化６】
2010531304.tif 000101
を有する請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４及びＹ５の中の少なくとも一つが、ＣＲ１３であり、式中、Ｒ１３が、次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000102
（式中、Ｘ４がＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４が、水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｘ５がＯ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５が、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６が、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群から選択される。）
で表わされる請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
Ｘ５がＯであり、Ｘ６が水素原子、アルキル基、アラルキル基及びアリール基から選択される請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩａ）：
【化１４】
2010531304.tif 000103
で表わされる化合物である請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
Ａｒ２がＮである請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩｂ）：
【化１５】
2010531304.tif 000104
で表わされる化合物である請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
Ａ４及びＡ５の中の一つがＮである請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩｃ）：
【化１６】
2010531304.tif 000105
で表わされる化合物である請求項５４に記載の方法。  
【請求項６２】
Ａ２がＮである請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＩＩｄ）：
【化１７】
2010531304.tif 000106
で表わされる化合物である請求項５４に記載の方法。  
【請求項６４】
化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物が以下の化合物：
【化７】
2010531304.tif 000107
からなる群から選択される請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
Ａｒ２が：
【化８】
2010531304.tif 000108
であり、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び
化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（ＩＶ）で表わされる構造：
【化９】
2010531304.tif 000109
を有する請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
Ｙ６及びＡ３がそれぞれＮである請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
化学式（ＩＶ）で表わされる化合物が：
【化１０】
2010531304.tif 000110
である請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
Ａｒ２が：
【化１１】
2010531304.tif 000111
であり、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣであり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１が、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２が、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び
化学式（ＩＩ）で表わされる化合物が化学式（Ｖ）で表わされる構造：
【化１２】
2010531304.tif 000112
を有する請求項５１に記載の方法。
【請求項６９】
Ａ３がＮである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
化学式（Ｖ）で表わされる化合物が：
【化１３】
2010531304.tif 000113
である請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記患者が哺乳動物である請求項５１に記載の方法。
【請求項７２】
前記癌が乳癌、肺癌、子宮頸癌、皮膚癌及び白血病からなる群から選択される請求項５１に記載の方法。
【請求項７３】
更に患者に１又は２以上の治療用化合物を投与することを含む請求項５１に記載の方法。
【請求項７４】
前記１又は２以上の治療用化合物がシスプラチン及びタキソールからなる群から選択される請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ（ＰＦＫＦＢ３）を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＰＦＫＦＢ３の３Ｄモデルを提供すること、但し該ＰＦＫＦＢ３モデルはフルクトース−６−リン酸塩（Ｆ６Ｐ）結合ポケットを含む；（ｂ）ある化合物の３Ｄモデルを提供すること；及び（ｃ）この化合物が、該ＰＦＫＦＢ３のＦ６Ｐ結合ポケット中の１又は２以上の溶媒接触部位に接触する能力を決定するために、ＰＦＫＦＢ３のモデルに対してこの化合物をスクリーニングすること、から成る方法。
【請求項７６】
腫瘍増殖を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＰＦＫＦＢ３の３Ｄモデルを提供すること、但し該ＰＦＫＦＢ３モデルはフルクトース−６−リン酸塩（Ｆ６Ｐ）結合ポケットを含む；（ｂ）ある化合物の３Ｄモデルを提供すること；及び（ｃ）この化合物が、該ＰＦＫＦＢ３のＦ６Ｐ結合ポケット中の１又は２以上の溶媒接触部位に接触する能力を決定するために、ＰＦＫＦＢ３のモデルに対してこの化合物をスクリーニングすること、から成る方法。
【請求項７７】
化合物をスクリーニングすることが、ＰＦＫＦＢ３のモデルに対して多くの化合物をスクリーニングして、それぞれの化合物が、該ＰＦＫＦＢ３のＦ６Ｐ結合ポケット中の１又は２以上の溶媒接触部位に接触する能力を決定することから成る請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年６月１８日に出願された米国仮出願60/936,030に基づく優先権を主張し、これは本明細書に引用される。
本明細書に開示した発明は米国防総省により与えられた助成金番号PCF OGMB04-1166のもとで支援された米国政府によって為された。従って、米国政府は、本明細書に開示した発明の一部の権利を有する。
本願発明は、解糖フラックス（流量）を減少させる方法及び化合物に関する。より詳細には、本願発明は、６−ホスホフルクトー２−キナーゼ（ＰＦＫ−２）の一誘導酵素である６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ３（以下「ＰＦＫＦＢ３」という。）を阻害する、アザカルコン及びこれらの類似化合物に関係する。解糖フラックスを減少させ、細胞増殖を阻害し及び癌を治療する化合物を使用する方法を記述する。更に、ＰＦＫＦＢ３の阻害能をもつ化合物のスクリーニング方法を記述する。
【背景技術】
【０００２】
解糖経路は真核細胞における糖代謝の基本的嫌気的経路である。解糖は２重の働きを有し、即ち糖を分解してエネルギー（ＡＴＰ）を産生し及び合成反応に使われる単純化合物を提供する。グルコースからピルビン酸塩への変換速度は、これら２種の主要な細胞必要物を満たすように調節されている。より詳細には、解糖系過程における不可逆反応を触媒するヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ及びピルビン酸キナーゼのような酵素は、解糖における制御点として調節されている。
【０００３】
１９３０年にワールブルグは、腫瘍は亢進した嫌気的解糖を行い、また相対的に酸素濃度が高い場合でも、解糖速度の減少を示さないことを指摘した。この調節的制御の喪失（即ち、パスツール効果）は、ワールブルグ効果と呼ばれ始めた。以来、その後の研究により、癌に特有な以下の性質が、常に確認された：ａ）グルコースの急速な消費；ｂ）活?な解糖活性（非特許文献１参照）；ｃ）早い細胞増殖（非特許文献２参照）；ｄ）乳酸産生及び蓄積（非特許文献３参照）；及びｅ）腫瘍周囲に外接して、低グルコース濃度を伴う細胞外の低ｐＨ。特許文献１を参照のこと。
【０００４】
癌細胞の代謝が、エネルギー及び高分子前駆体産生に関して、解糖フラックスが亢進した状態にシフトしているので、解糖の阻害を標的とする可能性を有する抗悪性腫瘍戦略として浮かび上がった。解糖経路の阻害効果による抗腫瘍特性を有するものとして、過去数十年にわたり、様々な小分子が同定されてきた。特に２種の分子、３−ブロモピルビン酸塩（３−ＢｒＰＡ）及び２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）の両者は、ヘキソキナーゼを標的とし、ミトコンドリア呼吸欠失した、又は低酸素下のトランスフォーム細胞に対して細胞毒性を示した。非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６を参照のこと。抗悪性腫瘍剤Imatinib(商品名Gleevec(R)、Novartis Pharmaceuticals Incorporation,East Hanover, New Jersey, USA)もまたヘキソキナーゼを抑制することが示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開20060035981号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Maublantほか、Bull Cancer, 85,935-950(1998）
【非特許文献２】Chesneyほか、Proc Natl Acad Sci USA、96,3047-3052(1999)
【非特許文献３】Baggetto、Biochimie,74,959-974(1992)
【非特許文献４】Xuほか、Cancer Res.,65,613-621(2005)
【非特許文献５】Luiほか、Biochemistry,40,5542-5547(2001)
【非特許文献６】Maherほか、Cancer Chemother.Pharmacol.,53,116-122(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
さらなる抗癌治療薬の要請があり、特に、癌と関連する亢進した解糖フラックスに関係するメカニズムを通して悪性細胞を標的とする抗ガン治療薬が要請されている。また、解糖に関わる酵素の阻害能を測定して化合物をスクリーニングするさらなる方法が要請されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書における開示の対象である発明は、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ３（ＰＦＫＦＢ３）を阻害化合物と接触させることから成るＰＦＫＦＢ３を阻害する方法を提供する。
【０００９】
幾つかの実施態様において、この方法は、ＰＦＫＦＢ３を化学式（Ｉ）：
【化１】
2010531304.tif 000003
（式中、ＸはＣ又はＣＨであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、但し式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群からそれぞれ独立して選択され、Ｒ２及びＲ７は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｌ１は、存在又は不存在であってもよく、存在する場合は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ８、アルキレン基及び置換アルキレン基からなる群から選択され、式中、Ｒ８は水素原子、アルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｌ２は、存在又は不存在であってもよく、存在する場合は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ９、アルキレン基、置換アルキレン基及び三価の連結基からなる群から選択され、式中、Ｒ９は水素原子、アルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され、また三価の連結基は、Ａｒ２に結合する第１の原子、Ｘに結合する第２の原子及びＡｒ１及びＡｒ２からなる群の一つと結合する第３の原子からなり；及び
Ａｒ１及びＡｒ２はアリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基及び置換ヘテロアリール基からなる群より独立に選択される。）
で表わされる化合物接触させることから成る。
【００１０】
幾つかの実施態様において、Ａｒ１及びＡｒ２の少なくとも１つは、アザアリール基である。幾つかの実施態様において、Ａｒ１及びＡｒ２の少なくとも一つは、ピリジン基、置換ピリジン基、キノリン基、置換キノリン基、イソキノリン基及び置換イソキノリン基からなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、Ｌ１は存在しない。幾つかの実施態様において、Ｌ２は存在して、Ｃ２アルキレン基である。
【００１１】
幾つかの実施態様において、この化学式（Ｉ）で表わされる化合物は、化学式（ＩＩ）
【化２】
2010531304.tif 000004
（式中、Ｘ、Ｘ２及びＸ３が、それぞれＣ又はＣＨであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群から、それぞれ独立に選択され、各Ｒ２及びＲ７は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；
Ｒ１０は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｒ１１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４及びＡ５は、それぞれ独立にＮ又はＣＲ１２であり、式中、各Ｒ１２は水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000005
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４はＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４は水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され：
Ｘ５は、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５は、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から選択され；
又は、Ｒ１０及び１個のＲ１２は、一緒にアルキレン基を形成し；
Ａｒ２は、次の化学式：
【化４】
2010531304.tif 000006
からなる群から選択され、
式中、各Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９は、Ｎ及びＣＲ１３からなる群から独立に選択され、式中、各Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の化学構造：
【化３】
2010531304.tif 000007
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４はＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４は、水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｘ５はＯ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５は、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群から選択され；
又は式中、Ｒ１０及び１個のＲ１３は、一緒にアルキレン基を形成し；及び
式中、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４、Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９の少なくとも一つはＮである。）
で表わされる構造を有する化合物又はこれらの医薬的に許可された塩である。
【００１２】
幾つかの実施態様において、Ｘ１はＯであり、かつＸはＣである。
幾つかの実施態様において、Ａｒ２は：
【化５】
2010531304.tif 000008
であり；
Ｘ、Ｘ２及びＸ３は、それぞれＣであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１は、水素原子及びアルキル基、からなる群から選択され、また各Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び、化学式（ＩＩ）で表わされる化合物は化学式（ＩＩＩ）で表わされる構造：
【化６】
2010531304.tif 000009
を有する。
【００１３】
幾つかの実施態様において、Ｘ１はＯである。幾つかの実施態様において、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ水素原子である。
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、以下の化学構造：
【化７】
2010531304.tif 000010
からなる群から選択される。
【００１４】
幾つかの実施態様において、Ａｒ２は：
【化８】
2010531304.tif 000011
であり、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３のそれぞれは、Ｃであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１は、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び化学式（ＩＩ）で表わされる化合物は化学式（ＩＶ）：
【化９】
2010531304.tif 000012
で表わされる構造を有する。
【００１５】
幾つかの実施態様において、Ｘ１は、Ｏである。幾つかの実施態様において、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ水素原子である。幾つかの実施態様において、化学式（ＩＶ）で表わされる化合物は、
【化１０】
2010531304.tif 000013
である。
【００１６】
幾つかの実施態様において、Ａｒ２は、
【化１１】
2010531304.tif 000014
であり；
Ｘ、Ｘ２及びＸ３は、それぞれＣであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１は、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び化学式（ＩＩ）で表わされる化合物は化学式（Ｖ）で表わされる構造：
【化１２】
2010531304.tif 000015
を有する。
【００１７】
幾つかの実施態様において、Ｘ１は、Ｏである。幾つかの実施態様において、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ水素原子である。幾つかの実施態様において、化学式（Ｖ）で表わされる化合物は、
【化１３】
2010531304.tif 000016
である。
【００１８】
幾つかの実施態様において、本明細書において開示した発明は、細胞を有効量のＰＦＫＦＢ３阻害剤と接触させることから成る、細胞内の解糖フラックスを減少させる方法を提供する。幾つかの実施態様において、本明細書に開示した発明は、細胞を有効量の化学式（Ｉ）で表わされる化合物と接触させることから成る、細胞内の解糖フラックスを減少させる方法である。
【００１９】
幾つかの実施態様において、本明細書で開示した発明は、細胞に有効量のＰＦＫＦＢ３阻害剤を接触させることから成る、細胞の増殖能を減少させる方法を提供する。幾つかの実施態様において、本明細書で開示した発明は、細胞に有効量の化学式（ＩＩ）で表わされる化合物を接触させることから成る、細胞の増殖能を減少させる方法を提供する。幾つかの実施態様において、該化合物は、以下の構造：
【化３】
2010531304.tif 000017
を有する置換基を含み、式中、Ｘ４は、ＮＲ１４，式中、Ｒ１４は水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；Ｘ６は、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５は、水素原子、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群より独立に選択され；及びＸ６は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から選択される。幾つかの実施態様において、Ｘ５は、Ｏであり、Ｘ６は水素原子、アルキル基、アラルキル基及びアリール基から選択される。
【００２０】
幾つかの実施態様において、該化合物は、下記化学式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）及び（ＩＩＩｄ）：
【化１４】
2010531304.tif 000018
【化１５】
2010531304.tif 000019
【化１６】
2010531304.tif 000020
及び
【化１７】
2010531304.tif 000021
の中の一つである。
【００２１】
幾つかの実施態様において、該細胞は、哺乳動物細胞である。幾つかの実施態様において、該細胞はヒト細胞である。幾つかの実施態様において、該細胞は、癌細胞である。
幾つかの実施態様において、本明細書に開示した発明は、有効量のＰＦＫＦＢ３阻害剤を患者へ投与することから成る、治療を必要とする患者の癌を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様において、本明細書に開示した発明は、有効量の化学式（ＩＩ）で表わされる化合物を患者へ投与することから成る、治療を必要とする患者の癌を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様において、該化合物は化学式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）及び（ＩＩＩｄ）の中の一つで表わされる化合物である。幾つかの実施態様において、該患者は、哺乳動物である。幾つかの実施態様において、該患者はヒトである。幾つかの実施態様において、該癌は、乳癌、肺癌、子宮頸癌、皮膚癌及び白血病からなる群から選択される。
【００２２】
幾つかの実施態様において、該方法は更に、患者に１又は２以上の付加的な治療用化合物を投与することを含む。幾つかの実施態様において、１又は２以上の付加的治療用化合物は、抗癌治療薬である。幾つかの実施態様において、１又は２以上の付加的治療用化合物は、シスプラチン及びタキソールからなる群から選択される。
【００２３】
幾つかの実施態様において、本明細書に開示した発明は、ＰＦＫＦＢ３を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＰＦＫＦＢ３の３Ｄモデルを提供すること、但し該ＰＦＫＦＢ３モデルはフルクトース−６−リン酸塩（Ｆ６Ｐ）結合ポケットを含む；（ｂ）ある化合物の３Ｄモデルを提供すること；及び（ｃ）この化合物が、該ＰＦＫＦＢ３のＦ６Ｐ結合ポケット中の１又は２以上の溶媒接触部位に接触する能力を決定するために、ＰＦＫＦＢ３のモデルに対してこの化合物をスクリーニングすること、から成る方法を提供する。幾つかの実施態様において、本明細書に開示した発明は、腫瘍増殖を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。幾つかの実施態様において、この化合物をスクリーニングすることが、ＰＦＫＦＢ３のモデルに対して多くの化合物をスクリーニングして、それぞれの化合物が、該ＰＦＫＦＢ３のＦ６Ｐ結合ポケット中の１又は２以上の溶媒接触部位に接触する能力を決定することから成る。
【００２４】
従って、ＰＦＫＦＢ３を阻害し、それにより解糖フラックスを調節する化合物を提供することが、本明細書に開示した発明の目的である。
上記のように記述した本明細書に開示した発明の目的及び本明細書に開示した発明により全体的に又は部分的に到達された他の目的は、以下に最善に記載して添付した図表を参照して、明細書が進むに従い明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１はこの経路により、フルクトース−２，６−ビスリン酸塩によるＰＦＫ−１の活性化を経由して、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ３（ＰＦＫＦＢ３）が解糖フラックスを亢進させることを示す、経路の概略図である。
【図２】図２Ａは、２次元構造で描写した６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ３（ＰＦＫＦＢ３）のホモロジーモデルの概略図である。この概略図はまた、結合部位における３−（３−ピリジニル）−１−（４−ピリジニル）−２−プロペン−１−オン（３ＰＯ）を示す。図２Ｂは、２．５Å以内の残基を示すＰＦＫＦＢ３結合ポケットの側面図の図解である。図２Ｃは、棒状の表示で示す前面残基を伴う結合ポケット残基のＣｏｎｎｅｌｌｙ表面（溶媒接触表面）を示す、ＰＦＫＦＢ３結合ポケットの端面図の図解である。
【図３】図３Ａはフルクトース−６−リン酸塩濃度（６０，８０，１６０，２４０，３２０，又は４００μＭ）の関数として、ＰＦＫＦＢ３酵素活性のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ２重逆数プロットを示すグラフである。キナーゼ検定は、ＤＭＳＯ（●）、６０μＭ  ３ＰＯ（Ｏ），１００μＭ  ３ＰＯ（▼）及び１５０μＭ  ３ＰＯ（▽）存在下で行った。３ＰＯは、化合物１、３−（３−ピリジニル）−１−（４−ピリジニル）―２−プロペン−１−オンを表す。図３Ｂは、ＰＦＫＦＢ３の比活性（Ｓ．Ａ），フルクトース−６−リン酸塩のＫｍ及び３ＰＯのＫｉを含む酵素反応速度パラメーターの表である。
【図４】図４Ａは、１，３，１０又は３３μＭ  ３ＰＯ又は溶媒（Ｖ）のみで処理後４８時間のＮＨＢＥ細胞（グラフの左側）及びトランスフォームＮＨＢＥ細胞（ｈｔ／Ｌｔ／ｒａｓ，グラフの右側）の細胞増殖を示す棒グラフである。非処理対照細胞分布（Ｃ）もまた示す。各棒は、代表的実験の３回の測定の平均細胞数（×１０３）を示す。誤差バーは、±１標準偏差（ＳＴＤ）を示し；＊はｐ−値＜０．０１を示す。図４Ｂは、様々な固形及び血液細胞株における化合物１（即ち、３ＰＯ）のＩＣ５０値（μＭ）の表である。各値は、溶媒のみによる対照細胞増殖の５０％に必要な１の濃度である。
【図５】図５Ａは増加する濃度（０．３，１，３，１０及び３３μＭ）の３ＰＯを３６時間処理した  Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖の棒グラフである。溶媒処理細胞（Ｖ）及び非処理対照  Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｃ）の細胞増殖もまた示す。各棒は、代表的実験の３回の測定の平均細胞数（×１０４）を示す。誤差バーは、±１標準偏差（ＳＴＤ）を示し；＊はｐ−値＜０．０１を示す。図５Ｂは、溶媒（●）又は１０μＭ  ３ＰＯ（○）存在下の  Ｊｕｒｋａｔ細胞の時間依存的増殖の測定を示すグラフである。各データポイントは、３回の独立した実験において測定した平均細胞数（×１０４）を示す。誤差バーは、±１標準偏差（ＳＴＤ）を示す。図５Ｃは、溶媒（●）又は１０μＭ  ３ＰＯ（○）処理した、Ｊｕｒｋａｔ細胞の経時的なＧ２／Ｍ期細胞集団パーセンテージ（％）を示すグラフである。各データポイントは、３回の独立した実験において測定した平均細胞数（×１０４）を示す。誤差バーは、±１標準偏差（ＳＴＤ）を示す。図５Ｄは、溶媒（実践）又は１０μＭ  ３ＰＯ（点線）で３６時間処理したＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリーにより測定した細胞周期ヒストグラムの合成画像である。図５Ｅは、１０μＭ  ３ＰＯ存在下又は不存在下での、時間の関数で表す、乳酸塩分泌（▼）、２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）取り込み（●）及びＦｒｕ−２，６−ＢＰ産生（○）を示すグラフである。誤差バーは±１標準偏差（ＳＴＤ）を示す。図５Ｆは、１０μＭ  ３ＰＯ存在下又は不存在下での、時間の関数で表す細胞全体のＮＡＤ＋（●）、ＮＡＤＨ（○）及びＡＴＰ（▼）濃度を示すグラフである。誤差バーは±１標準偏差（ＳＴＤ）を示す。図５Ｇは、溶媒（左側スペクトル）又は３ＰＯ（右側スペクトル）存在下、アラニン（Ａｌａ）及び細胞内乳酸塩（Ｌａｃ）への１３Ｃ取り込みを示す、２次元（２Ｄ）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルである。  ３回の独立した実験からの代表的スペクトルを示す。  点線ボックスの縁は、代表的代謝物の１３Ｃピークに対応し、これらは中心の内因性１２Ｃピークを囲む。
【図６】図６Ａは、その後ヒトテロメラーゼ（ｈｔ）、ラージＴ抗原（ＬＴ）及び腫瘍遺伝子Ｈ−ｒａｓｖ１２で不死化し、またトランスフォームした野生型（＋／＋）又はハプロ不全（＋／−）ＰＦＫＦＢ３マウスからの繊維芽細胞で測定した、Ｆ２，５ＢＰの細胞内濃度を表す棒グラフである。挿画は、繊維芽細胞におけるＰＦＫＦＢ３発現のウェスターンブロット解析を示す。図６Ｂは、その後ヒトテロメラーゼ（ｈｔ）、ラージＴ抗原（ＬＴ）及び腫瘍遺伝子Ｈ−ｒａｓｖ１２で不死化し、またトランスフォームした野生型（＋／＋）又はハプロ不全（＋／−）ＰＦＫＦＢ３マウスからの繊維芽細胞に対する３ＰＯの増殖抑制効果を示す棒グラフである。トランスフォームした野生型細胞（＋／＋）に対する細胞数（対照細胞の細胞数に対する％として表わす）を実線バーで表し、またハプロ不全細胞（＋／−）に対する細胞数をストライプバーで表す。グラフの底に示すように、細胞を溶媒又は増加する３ＰＯ量（５，１０，２０，３０，４０又は６０μＭ）とインキュベートして、生存細胞数を４８時間後に計数する。バーは、代表的実験からの３回の値の平均値±ＳＴＤを示す。＊ｐ−値＜０．０１は、溶媒対照及び３ＰＯ処理試料の間の統計的差異を表す。図６Ｃは、Ｔｅｔ−ｏｎシステム（＋ＰＦＫＦＢ３）及び空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）を含む対照細胞を用いて、ドキシサイクリン処理によりＰＦＫＦＢ３を過剰発現するよう加工したＪｕｒｋａｔ細胞を使って測定したＦ２，５ＢＰの細胞濃度の棒グラフである。細胞を１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理し、ＰＦＫＦＢ３蛋白質発現を誘導した。挿図は細胞内のＰＦＫＦＢ３発現のウェスターンブロット解析である。図６Ｄは、Ｔｅｔ−ｏｎシステムを用いて、ドキシサイクリン処理でＰＦＫＦＢ３を過剰発現するよう加工したＪｕｒｋａｔ細胞（＋ＰＦＫＦＢ３、ストライプバー）での３ＰＯの増殖抑制効果を示すう棒グラフである。３ＰＯ処理２４時間前に、ＰＦＫＦＢ３蛋白質レベルを誘導するために、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンをＰＦＫＦＢ３発現のためのベクターを含むＪｕｒｋａｔ細胞とインキュベートする。空ベクターを含む対照細胞（―ＰＦＫＦＢ３，実線バー）を同様にドキシサイクリン処理し、バックグランドＰＦＫＦＢ３発現として用いた。その後、両種の細胞を異なる濃度の３ＰＯ（１，３，１０，又は３３μＭ）又は溶媒（Ｖ）とインキュベートし、生存細胞数を４８時間後に解析した。バーは、代表的実験からの３回の値の平均値±ＳＴＤを示す。
【図７】図７Ａは、Ｃ５７／Ｂｌｋ６マウスに異種移植したＬｅｗｉｓ  Ｌｕｎｇ  カルシノーマ腫瘍の増殖に対する３ＰＯ処理の効果を示すグラフである。平滑末端のノギスを用いて毎日腫瘍を測定し、樹立した腫瘍（１３０〜１９０ｍｇ）を盲検的に無作為にＤＭＳＯ対照群（●、ｎ＝１１）又は３ＰＯ処理群（○、ｎ＝１４）に分けた。実験マウスの体重を測定し、毎日、表示した時点において、５０μＬ  ＤＭＳＯ、又は０．０７ｍｇ／ｇ  ３ＰＯを含む５０μＬ  ＤＭＳＯを腹腔内注射した。矢印（↓）は毎日の対照又は３ＰＯ投与を示す。最初の注射（２日目、ｐ−値＜０．０００３）後に、ＤＭＳＯ及び３ＰＯ群の間に統計的に有意の差異が得られた。  図７Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃ胸腺欠損マウスに異種移植した、株化したＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺癌腫瘍の増殖に対する３ＰＯ処理の効果を示すグラフである。ノギスを用いて毎日腫瘍を測定し、樹立した腫瘍（１３０〜１９０ｍｇ）を盲検的に無作為にＤＭＳＯ対照群（●、ｎ＝１４）又は３ＰＯ処理群（○、ｎ＝１３）に分けた。実験マウスの体重を測定し、研究期間（１４日）の間、継続する３日間の投与の後３日間は無投与という周期的投与計画に従い、５０μＬ  ＤＭＳＯ、又は０．０７ｍｇ／ｇ３ＰＯを含む５０μＬ  ＤＭＳＯを腹腔内注射した。矢印（↓）は対照又は３ＰＯ投与を示す。２日目以後、ＤＭＳＯ対照群及び３ＰＯ実験群の間に統計的な差異が得られた（ｐ−値＜０．０００１）。  図７Ｃは、Ｂａｌｂ／ｃ胸腺欠損マウスに異種移植した株化したＨＬ−６０急性前骨髄性白血病細胞の増殖への３ＰＯ処理効果を示すグラフである。ノギスを用いて毎日腫瘍を測定し、樹立した腫瘍（１３０〜１９０ｍｇ）を盲検的に無作為にＤＭＳＯ対照群（●、ｎ＝１１）又は３ＰＯ処理群（○、ｎ＝１２）に分けた。実験マウスの体重を測定し、研究期間（１４日）の間、継続する２日間のＤＭＳＯ又は３ＰＯの投与、その後７日間の休息期間という周期的投与計画に従い、５０μＬ  ＤＭＳＯ、又は０．０７ｍｇ／ｇ  ３ＰＯを含む５０μＬ  ＤＭＳＯを腹腔内注射した。矢印（↓）は対照又は３ＰＯ投与を示す。最初の注射後、ｐ−値＜０．０００１をもって、統計的な差異が得られた。
【図８】図８は、化合物２、３−（４−クロロフェニル）−１−（３−ピリジニル）−２−プロペン−１−オンのＰＦＫＦＢ３阻害活性を示す棒グラフである。１５０μＭ  ２で処理した遺伝子組み換えＰＦＫＦＢ３の反応速度は、同容量の溶媒（ＥｔＯＨ）処理のＰＦＫＦＢ３で観測される反応速度の３９．８％であった。
【図９】図９は、溶媒（ＤＭＳＯ）処理ＰＦＫＦＢ３酵素の活性と比較した、化合物３  （即ち、３−（１−ナフチル）−１−（４−ピリジニル）−２−プロペン−１−オン），４  （即ち１−（３−ピリジニル）−３−（２−キノリニル）−２−プロペン−１−オン），５  （即ち、Ｎ−{４−［３−オキソ−３−（４−ピリジニル）−１−プロペン−１−イル］フェニル}アセトアミド），６  （即ち、３−（２−クロロフェニル）−１−（２−ピリジニル）−２−プロペン−１−オン）及び７  （即ち、３−（２−クロロフェニル）−１−（３−ピリジニル）−２−プロペン−１−オン）のＰＦＫＦＢ３阻害活性を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、異なる濃度（１，３，１０又は３３μＭ）の化合物２、又は溶媒（ＥｔＯＨ）処理した、ＨＬ−６０細胞（灰色バー）及びＫ５６２細胞（白色バー）の細胞増殖を示す棒グラフである。バーは、代表的実験からの３回の値の平均値±ＳＴＤを示す。
【図１１】図１１は０．１（中程度灰色バー）、０．３（無色バー）、１．０（斜めストライプバー）、３．０（ダイアモンド塗りバー）、１０．０μＭ（水平ストライプバー）又は３０．０μＭ（点状バー）の化合物３をグラフの最上部に示すように、４８時間又は７２時間処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖を示す棒グラフである。４８時間、又は７２時間ＤＭＳＯ処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖（暗色バー）もまた表示する。
【図１２】図１２は、０．１（中程度灰色バー）、０．３（無色バー）、１．０（斜めストライプバー）、３．０（ダイアモンド塗りバー）、１０．０μＭ（水平ストライプバー）又は３０．０μＭ（点状バー）の化合物４をグラフの最上部に示すように、４８時間又は７２時間処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖を示す棒グラフである。４８時間、又は７２時間ＤＭＳＯ処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖（暗色バー）もまた表示する。
【図１３】図１３は、０．１（中程度灰色バー）、０．３（無色バー）、１．０（斜めストライプバー）、３．０（ダイアモンド塗りバー）、１０．０μＭ（水平ストライプバー）又は３０．０μＭ（点状バー）の化合物５をグラフの最上部に示すように、４８時間又は７２時間処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖を示す棒グラフである。４８時間、又は７２時間ＤＭＳＯ処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖（暗色バー）もまた表示する。
【図１４】図１４は、０．１（中程度灰色バー）、０．３（無色バー）、１．０（斜めストライプバー）、３．０（ダイアモンド塗りバー）、１０．０μＭ（水平ストライプバー）又は３０．０μＭ（点状バー）の化合物６をグラフの最上部に示すように、４８時間又は７２時間処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖を示す棒グラフである。４８時間、又は７２時間ＤＭＳＯ処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖（暗色バー）もまた表示する。
【図１５】図１５は、０．１（中程度灰色バー）、０．３（無色バー）、１．０（斜めストライプバー）、３．０（ダイアモンド塗りバー）、１０．０μＭ（水平ストライプバー）又は３０．０μＭ（点状バー）の化合物７をグラフの最上部に示すように、４８時間又は７２時間処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖を示す棒グラフである。４８時間、又は７２時間ＤＭＳＯ処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞増殖（暗色バー）もまた表示する。
【図１６】図１６は、化合物２〜７（０．３〜３３μＭにおける）存在下でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌細胞の増殖と生存率を示すグラフである。
【図１７】図１７は、化合物２〜７（０．３〜３３μＭにおける）存在下でのＡ５４９１肺腺癌細胞の増殖と生存率を示すグラフである。
【図１８】図１８は、化合物２〜７（０．３〜３３μＭにおける）存在下でのＫ５６２慢性骨髄性白血病細胞の増殖と生存率を示すグラフである。
【図１９】図１９は、化合物２〜７（０．３〜３３μＭにおける）存在下でのＨＬ−６０前骨髄性白血病細胞の増殖と生存率を示すグラフである。
【図２０】図２０は、化合物２〜７（０．３〜３３μＭにおける）存在下でのＣＲＬ−１１１７４メラノーマ細胞の増殖と生存率を示すグラフである。
【図２１】図２１は、化合物２〜７（０．３〜３３μＭにおける）存在下でのＨｅＬａ子宮頸癌細胞の増殖と生存率を示すグラフである。
【図２２】図２２は、Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞異種移植片を有するマウスに取り込まれた１８Ｆ−２−デオキシグルコースのマイクロポジトロン発光断層撮影（トモグラフィー）画像を示す。マウスには、１５０μキュリーの１８Ｆ−フルオロ−２−デオキシグルコースの腹腔注射（ｉ．ｐ．）３０分前に、５０μＬ  ＤＭＳＯ（溶媒）又は０．０７ｍｇ／ｇ  ３ＰＯ（＋３ＰＯ）を含むＤＭＳＯのｉ．ｐ．を行った。矢印は、右側腹部における心臓及び腫瘍異種移植片の位置を示す。
【図２３】図２３は、生後４ヶ月のトランスジェニックＭＭＴＶ−Ｎｅｕ乳腫瘍マウスにおける腫瘍に対する３ＰＯ処理の効果を示すグラフである。該マウスは、無作為に、等しい腫瘍負荷を有する２群に分けた。第１群（＋３ＰＯ）には、３日間投与（矢印で示す）及び３日間非投与の周期で、３ＰＯ（ＤＭＳＯ中、０．０７ｍｇ／ｇ；ｉ．ｐ．）を投与した。第２群（溶媒）には、ＤＭＳＯのみ注射した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本明細書において開示した発明を、代表的な実施態様を示す、実施例を参照しつつより詳細に以下に記載する。しかしながら、本明細書に開示した発明は、異なった形に具体化可能であり、本明細書に記載したように実施態様を制限すると解釈してはならない。むしろ、これらの実施態様は、開示が十分であり、完全であるように提供されており、当業者には、実施態様の範囲が十分に伝達されるであろう。
もし別に定義しなければ、本明細書で用いる技術及び科学用語は、本明細書に開示した発明が属する当業者の１人に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。全ての出版物、特許出願、特許、本明細書に述べた参考文献は、その全体が参考文献に取り込まれている。
仕様及び特許請求の範囲を通して、与えられた化学式又は化学名は、光学及び立体異性体、並びに異性体及び混合物が属するラセミ混合物を包含する。
【００２７】
この明細書では下記の略号を用いる：
２−ＤＧ＝２−デオキシグルコース
３−ＢｒＰＡ＝３−ブロモピルビン酸塩
３ＰＯ＝３−（３−ピリジニル）−１−（４−ピリジニル）−２−プロペン−１−オン
ＡＡ＝アミノ酸
ＡＴＰ＝アデノシン３リン酸
Ｃｉ＝キュリー
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルフォキシド
ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸
ＤＭＥＭ＝ダルベッコの改変イーグル培地
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸
Ｆ２，６ＢＰ＝フルクトース−２，６−ビスリン酸塩
Ｆ６Ｐ＝フルクトース−６−リン酸塩
ＨＩＦ−１＝低酸素症誘導因子１
ｈｔ＝ヒトテロメラーゼ
ＬＤＨ＝乳酸デヒドロゲナーゼ
ＬＴ＝ラージＴ抗原
μＭ＝マイクロモル
ｍｇ＝ミリグラム
ｍＬ＝ミリリットル
ｍｉｎ＝分
ｎｇ＝ナノグラム
ＮＨＢＥ＝正常ヒト気管支上皮
Ｎｉ＝ニッケル
ｎｍ＝ナノメートル
ＮＴＡ＝ニトリロ三酢酸
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥＰ＝ホスホエノールピルビン酸塩
ＰＦＫ−１＝６−ホスホフルクト−１−キナーゼ
ＰＦＫ−２＝６−ホスホフルクト−２−キナーゼ
ＰＦＫＦＢ３＝６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ３
ＰＫ＝ピルビン酸キナーゼ
ＰＭＳＦ＝フェニルメチルスルフォニルフッ化物
ＰＲＰＰ＝５−ホスホ−Ｄ−リボシル−１−ピロリン酸塩
ＲＮＡ＝リボ核酸
ＳＬＮ＝Ｓｙｂｙｌライン表記法
ＳＴＤ＝標準偏差
【００２８】
１．定義
本明細書で用いる用語"癌"は、無制御な細胞分裂及び細胞の転移力、又は他の位置での新増殖を確立する力により引き起こされる病気を表わす。用語"悪性な"、"悪性"、"新生物"、"腫瘍"及び様々なこれらの変形語は、癌細胞又は癌細胞群を表す。
癌の特定の種類としては、皮膚癌、結合組織癌、脂肪腫、乳癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、肛門性器癌、腎臓癌、膀胱癌、大腸癌、前立腺癌、中枢神経（ＣＮＳ）癌、網膜癌、血液及びリンパ球癌があるが、これらに制限されない。
【００２９】
用語"競争的阻害剤"は、酵素に結合することにより、酵素の正常な基質の結合を阻害する阻害剤を表す。
本明細書で用いるように、用語"アルキル基"は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オクテニル基、ブタジエニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基及びアレニル基を含む、直線（即ち、"直鎖"）の、分枝の、又は環状の、飽和の、又は少なくとも部分的に及びある場合は完全に不飽和な（即ち、アルケニル基及びアルキニル基）炭化水素鎖を含むＣ１−２０を表わす。"分枝状の"は、メチル基、エチル基又はプロピル基のような、低級アルキル基が直線型アルキル鎖に付加したアルキル基を表す。"低級アルキル基"は１から約８個の炭素原子（即ちＣ１−８アルキル基）、例えば、１，２，３，４，５，６，７又は８炭素原子、を有するアルキル基を表す。"高級アルキル基"は、約１０から約２０炭素原子、例えば、１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，又は２０炭素原子を有するアルキル基を表す。ある実施態様において、"アルキル基"は、特に、Ｃ１−８直鎖型アルキル基を表す。他の実施態様において、"アルキル基"は、特に、Ｃ１−８分枝型アルキル基を表す。
【００３０】
アルキル基は、任意に、同一又は異なる、１又は２以上のアルキル基置換体により置換することができる（"置換アルキル基"）。用語"アルキル基置換体"は、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリールアミノ基、アシル基、ヒドロキシル基、アリールオキシル基、アルコキシル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルオキシル基、アラルキルチオ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、オキソ基及びシクロアルキル基を含むが、これらに制限されない。アルキル鎖には、任意に、１又は２以上の酸素、硫黄、又は置換又は非置換窒素原子を挿入できるが、ここで窒素置換基は、水素原子、低級アルキル基（本明細書では、"アルキルアミノアルキル基"と表わす）、又はアリール基である。
従って、本明細書に用いるように、用語"置換アルキル基"には、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基及びメルカプト基が含まれるように、アルキル基の１又は２以上の原子又は官能基が他の原子又は官能基に置き変えられたアルキル基が含まれる。
【００３１】
本明細書で用いる、用語"アリール基"は、共有結合で連結した、又はメチレン基又はエチレン基の部分又はこれらに制限されない普通の置換基に連結した、単一の芳香族環、又は互いに縮合した多環芳香族であることが可能な芳香族置換体を表す。普通の連結基としてはまた、ベンゾフェノンにおけるようなカルボニル基、又はジフェニルエーテルにおけるような酸素原子、又はジフェニルアミンにおけるような窒素原子であることができる。用語"アリール基"は、特に複素環式芳香族化合物も包含する。該芳香族環は、特に、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ジフェニルエーテル基、ジフェニルアミン基及びベンゾフェノン基を含むことができる。特定の実施態様において、用語"アリール基"は、約５から約１０個の炭素原子、即ち、５，６，７，８，９，又は１０炭素原子、を含み、また５及び６員炭化水素及び複素環式環芳香族基を含む、環状芳香族基を意味する。
【００３２】
該アリール基は、任意に、同一又は異なる、１又は２以上のアリール基置換体により置換することができて、ここで"アリール基置換体"は、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリールオキシル基、アラルキルオキシル基、カルボキシル基、アシル基、ハロゲン、ニトロ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルコキシカルボニル基、アシルオキシル基、アシルアミノ基、アロイルアミノ基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、アリールチオ基、アルキルチオ基、アルキレン基及び−ＮＲ'Ｒ"を含み、ここでＲ'及びＲ"は、それぞれ独立に、水素、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基及びアラルキル基であることができる。
【００３３】
従って、本明細書に用いるように、用語"置換アリール基"は、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基及びメルカプト基が含まれるように、アリール基の１又は２以上の原子又は官能基が他の原子又は官能基に置き変えられたアリール基が含まれる。
アリール基の特別な例としては、シクロペンタジエニル基、フェニル基、フラン基、チオフェン基、ピロール基、ピラン基、ピリジン基、イミダゾール基、ベンズイミダゾール基、イソチアゾール基、イソクサゾール基、ピラゾール基、ピラジン基、トリアジン基、ピリミジン基、キノリン基、イソキノリン基、インドール基、カルバゾール基等々が含まれるが、これらに制限されない。
【００３４】
本明細書で用いるように、用語"アザ基"は、少なくとも１個の窒素原子を含む複素環式環状構造を表す。アザ基の例としては、ピロリジン基、ピペリジン基、キヌクリジン基、ピリジン基、ピロール基、インドール基、プリン基、ピリダジン基、ピリミジン基及びピラジン基を含むが、これらに制限されない。
用語"アザアリール基"は、アリール環又は環類の１又は２以上の原子が、窒素原子である複素環式アリール基を表す。アザアリール基の例としては単環又は二環のモノ−又はジアザアリール基（即ち、２個の窒素原子を含むアリール基）を含み、このアザアリール基は、非置換型、又は置換型であり、置換型の場合、例えばメチル基のような低級アルキル基；例えばメトキシ基のような低級アルコキシ基及び／又は例えば、塩素、又は臭素原子の様なハロゲン原子からなる群から選択された群の一つにより置換される。従って、該用語"アザアリール基"は、ピリジン基、ピリダジン基、ピリミジン基、ピラジン基、キノリン基、キナリジン基、キノクサリン基及びこれらの置換型の類似体を含む置換基を表わすが、これらに制限されない。幾つかの実施態様において、アザアリール基は、例えば、２−、３−、又は４−ピリジル基のようなピリジル基；例えば、４−キノリニル基又は１−イソキノリニル基のようなキノリニル基又はイソキノリニル基；イミダゾイル基；例えば、２−又は４−ピリミジニル基のようなピリミジニル基；例えば、３−ピリダジニル基のようなピリダジニル基；又は例えば、２−ピラジニル基のようなピラジニル基である。
【００３５】
本明細書において用いられるように以下：
【化１８】
2010531304.tif 000022
のような化学式で一般的に表される構造は環状構造と呼ばれ、例えば、３炭素、４炭素、５炭素、６炭素等々、脂肪族及び／又は芳香族環状化合物であるが、これらに制限されず、またこれらはＲ置換基を含み、Ｒは存在しても不存在でもよい、存在する場合は、１又は２以上のＲ基は、環状構造の１又は２以上の可能な炭素原子上で置換されることができる。Ｒ基の存在又は不存在及びＲ基の数は、整数ｎの値により決定される。もし１以上の場合、各Ｒ基は、他のＲ基上より、環状構造の可能な炭素上で置換される。例えば
【化１９】
2010531304.tif 000023
式中、ｎは０から２の間の整数であり、上記の構造は、以下の構造群：
【化２０】
2010531304.tif 000024
を含む化合物群を含むが、これらに制限されない。
【００３６】
化学構造において、結合を示す点線は、該結合が存在する、又は不存在であることを示す。例えば、下記：
【化２１】
2010531304.tif 000025
の置換基は、１重結合又は２重結合からなる置換基を表すことができる。
命名された原子又は置換基が"不存在"と定義される時、命名された原子又は置換基は、直接の結合により置換される。連結基又はスペーサー基が不存在であると定義される場合、連結基又はスペーサー基は直接結合により置換される。
【００３７】
幾つかの実施態様において、本明細書において開示した発明の化合物は、連結基を含む。本明細書で用いるように、用語"連結基"は、２又は３個の他の分子部分と結合して、安定な構造を形成するアルキレン基、又はこれに制限されない置換基、を含む２価の分子部分を含む。幾つかの実施態様において、Ｏ又はＳの様な単一原子は、連結基として働く。幾つかの実施態様において、連結基は、例えば、メチレンジオキシル(-O-CH2-O-)又はエチレンジオキシル(-O-CH2CH2-O-)のようなオキシ基又はチオ基を含むことができる。幾つかの実施態様において、該連結基は、フェニレン基、フラニル基、チエニル基、又はピロリール基のような、２価のアリール基であることができる。
【００３８】
用語"３価連結基"は、１又は２以上の化学置換基上で、３個の置換基又は３個の部位（例えば、原子）を連結する連結基を表す。例えば、３価の連結基は以下の化学式：
【化２２】
2010531304.tif 000026
であってもよく、式中、各Ｒは、独立に、１又は２以上のＯ、Ｓ，窒素、又は置換窒素原子、又は不飽和結合を含むことができる、Ｃ０〜Ｃ６アルキル基である。
【００３９】
"アルキレン基"は、１から約２０個の炭素原子、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，又は２０炭素原子を有する直鎖型又は分枝型２価脂肪族炭化水素を表す。アルキレン基は、直鎖型、分枝型、又は環状である。アルキレン基は、また任意に、不飽和であり及び／又は、１又は２以上の、ヒドロキシル基、ハロゲン、ニトロ基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、カルボキシル基、等々を含む、"アルキル基置換体"と置換されることができる。アルキレン基上に、１又は２以上の酸素、硫黄、又は置換又は非置換窒素原子（本明細書ではまた"アルキルアミノアルキル基"と表わす）を任意に挿入することができるが、ここで窒素置換基は、前述のようにアルキル基である。アルキレン基の例としては、メチレン基（−ＣＨ２−）；エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）；プロピレン基（−（ＣＨ２）３−）；シクロへキシレン基（−Ｃ６Ｈ１０−）；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−；−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ（Ｒ）−（ＣＨ２）ｒ―を含むが、式中、各ｑ及びｒは、独立に０から約２０までの整数であり、例えば、０，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９、又は２０であり、またＲは、水素又は低級アルキル基；メチレンジオキシル基（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）；及びエチレンジオキシル基（−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−）である。アルキレン基は、約２から約３個の炭素原子を有することができて、また更に６〜２０個の炭素を有することができる。
【００４０】
本明細書で用いるように、用語"アシル基"は、有機カルボン酸基を表し、ここでカルボキシル基の−ＯＨは他の置換体（即ち、ＲＣＯ−で表せるように、ここでＲは、アルキル基、アラルキル基、又は、置換アルキル基、アラルキル基及びアリール基を含む、本明細書で定義されたアリール基である）で置換される。従って、用語"アシル基"は、特に、アセチルフラン基及びフェナシル基の様な、アリールアシル基を含む。アシル基の特別な例として、アセチル基及びベンゾイル基が含まれる。
【００４１】
"環状"及び"シクロアルキル基"は、約３から約１０個の炭素原子、例えば、３，４，５，６，７，８，９又は１０炭素原子の、非芳香属性単環式又は多環式環状システムを表す。該シクロアルキル基は、任意に、部分的に不飽和であることができる。シクロアルキル基は、任意に、本明細書で定義したように、オキソ基及び／又はアルキレン基の様な、アルキル基置換体により置換されることができる。環状アルキル鎖に沿って、任意に、１又は２以上の酸素、硫黄、又は置換型の又は非置換型の窒素原子を挿入することができて、式中、窒素置換基は、水素、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、又は置換アリール基であり、従って、複素環式置換基を提供する。代表的な単環式シクロアルキル環は、シクロペンチル基、シクロヘキシル基及びシクロヘプチル基を含む。多環式シクロアルキル環は、アダマンチル、オクタヒドロナフチル基、デカリン、樟脳、カンファン及びノラダマンチルを含む。
【００４２】
"アルコキシル基"は、アルキル−Ｏ−基を表し、ここでアルキル基は、既述の通りである。本明細書で用いる、用語"アルコキシル基"は、例えば、メトキシル基、エトキシル基、プロポキシル基、イソプロポキシル基、ブトキシル基、ｔ−ブトキシル基及びペントキシル基と表すことができる。用語"オキシアルキル基"は、"アルコキシル基"と互換的に用いることができる。
"アリールオキシル基"は、アリール−Ｏ−基を表し、ここでアリール基は、置換アリール基を含み、既述の通りである。本明細書で用いる用語"アリールオキシル基"は、フェニルオキシル基又はヘキシルオキシル基及びアルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、又はアルコキシル置換フェニルオキシル基又はヘキシルオキシル基と表すことができる。
"アラルキル基"は、アリール−アルキル基を表し、ここでアリール基及びアルキル基は既述通りであり、また置換アリール基及び置換アルキル基を含む。アラルキル基の例として、ベンジル基、フェニルエチル基及びナフチルメチル基が含まれる。
"アラルキルオキシル基"は、アラルキル−Ｏ−基を表し、ここでアラルキル基は既述通りである。アラルキルオキシル基の例として、ベンジルオキシル基がある。
"ジアルキルアミノ基"は−ＮＲＲ'基を表し、ここでＲ及びＲ'のそれぞれは、既述のように、独立に、アルキル基及び／又は置換アルキル基である。アルキルアミノ基の例としては、エチルメチルアミノ基、ジメチルアミノ基及びジエチルアミノ基が含まれる。
【００４３】
"アルコキシカルボニル基"は、アルキル−Ｏ−ＣＯ−基を表す。アルコキシカルボニル基の例として、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基及びｔ−ブチルオキシカルボニル基が含まれる。
"アリールオキシカルボニル基"は、アリール−Ｏ−ＣＯ−基を表す。アリールオキシカルボニル基の例として、フェノキシ−及びナフトキシ−カルボニルが含まれる。
"アラルコキシカルボニル基"は、アラルキル−Ｏ−ＣＯ−基を表す。アラルコキシカルボニル基の例としては、ベンジルオキシカルボニル基がある。
"カルバモイル基"は、Ｈ２Ｎ−ＣＯ−基である。
"アルキルカルバモイル基"はＲ'ＲＮ−ＣＯ−基を表し、ここでＲ及びＲ'の中の一方は、水素であり、Ｒ及びＲ'の中の他方は、既述のように、アルキル基及び／又は置換アルキル基である。
"ジアルキルカルバモイル基"は、Ｒ'ＲＮ−ＣＯ基を表し、ここでＲ及びＲ'のそれぞれは、独立に、既述のようなアルキル基及び／又は置換アルキル基である。
"アシルオキシル基"は、アシル−Ｏ−基を表し、ここでアシル基は既述の通りである。
"アシルアミノ基"は、アシル−ＮＲ−基を表し、ここでアシル基は、既述の通りであり、Ｒは、水素原子又はアルキル基である。従って、該"アシルアミノ基"は、構造−ＮＲ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ'を有することができて、Ｒ'は、アルキル基、アリール基、アラルキル基等々である。
【００４４】
用語"アミノ基"は、−ＮＨ２基を表す。
用語"カルボニル基"は、−（Ｃ＝Ｏ）−基を表す。
用語"カルボキシル基"は、−ＣＯＯＨ基を表す。
本明細書で用いる様に、用語"ハロ"、"ハロゲン化物"又は"ハロゲン"は、フッ素、塩素、臭素及び沃素基を表す。
用語"ヒドロキシル基"は、−ＯＨ基を表す。
用語"ヒドロキシアルキル基"は、−ＯＨ基で置換されたアルキル基を表す。
用語"メルカプト基"は、−ＳＨ基を表す。
用語"オキソ基"は、本明細書で既述の化合物を表し、ここで炭素原子は酸素原子に置換される。
用語 "アザ基"は、炭素原子が窒素原子に置換された化合物を表す。
用語"ニトロ基"は、−ＮＯ２基を表す。
用語"チオ基"は、本明細書で既述の化合物を表し、ここで炭素又は酸素原子がイオウ原子に置換される。
用語"硫酸基"は、−ＳＯ４基を表す。
用語"カルコン"又は"カルコーン"は、１，３−ジフェニル−１−プロペン−３−オン：
【化２３】
2010531304.tif 000027
及びこの類似体（例えば、ジアリールプロペノン類、ジアリールプロペノン及びジアリールプロパンのチア及びアザ類似体）を表す。用語"アザカルコン"は、１又は２以上の窒素原子を含むカルコンを表す。特に該アザカルコンは、１又は２以上のアザアリール基を含むことができる。
【００４５】
用語"独立に選択される"を用いた場合、関係する置換体（例えば、Ｒ１又はＲ２基、又はＸ及びＹ基のようなＲ基）は同一であるか、又は異なる。例えば、Ｒ１及びＲ２の両者は、アルキル基により置換される、又はＲ１は水素であることができて及びＲ２は置換アルキル基等々であることができる。
名付けられた"Ｒ"、"Ｘ" 、"Ａ" 、"Ａｒ"、"Ｙ" 、又は"Ｌ" 基は、本明細書において特に他の名前で特定されなければ、一般的に当業者にその名前を有する置換基に対応すると認識される構造を有する。描画の目的のために、既述の代表的"Ｒ"、"Ｘ" 、"Ｙ"、 "Ｌ"、"Ａｒ"及び"Ａ" 基 は以下のように定義される。これらの定義は、補充と描画のために意図され、本明細書開示を閲覧した当業者に明らかな定義を排除しない。
【００４６】
ＩＩ．一般的考察
癌組織において解糖フラックスが増加の方向へシフトする正確なメカニズムを理解することは、ある時は、重要の研究の焦点であった。解糖の増加が起こるには、様々な因子：ａ）基質利用可能性、ｂ）解糖フラックスのために必要な代謝酵素の発現及びｃ）経路の特定の作用点で働くアロステリック活性化因子及び阻害剤のレベル、が含まれる。例えば、ＧＬＵＴ１の様な、グルコース輸送体の過剰発現は、亢進した解糖速度を維持するために必要な過剰なグルコースの供給を提供すると考えられており、他方ヘキソキナーゼ及びホスホフルクト−１−キナーゼ（ＰＦＫ１）の様な鍵となる律速酵素は、癌細胞において亢進していることが明らかとなっている。Vora ほか, Cancer Res., 45(7), 2993-3001 (1985); Macheda ほか, J. Cell Physiol., 202(3), 654-662 (2005); 及び Mathupala ほか, Oncogene, 25(34), 4777-4786 (2006)を参照されたい。最後に、解糖酵素のアロステリック調節酵素は、特にＰＦＫ１が関わる最初の不可逆的な、委ねられた律速段階において、グルコースフラックスに大きな役割を果たす。Van Schaftingen, ほか., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(6), 3483-3486 (1981)を参照されたい。
【００４７】
ＰＦＫ１活性は、原発腫瘍組織ばかりではなく、腫瘍細胞において増加すると観測されてきた。さらに、腫瘍遺伝子ｒａｓ又はｓｒｃをＲａｔ−１繊維芽細胞又はニワトリ胎児繊維芽細胞に導入すると、それぞれ、高いＰＦＫ１活性をもたらす。Hennipman ほか., Tumour Biol., 8(5), 251-263 (1987); Kole,ほか, Arch. Biochem. Biophys. 286(2), 586-590 (1991); 及びSanchez-Martinez 及びAragon, FEBS Lett., 409(1), 86-90 (1997)を参照されたい。しかしながら、形質転換細胞内の高いレベルのＰＦＫ−１活性は、蛋白質発現の増加によるのではなく、フルクトース−２，６−ビスリン酸塩（Ｆ２，６ＢＰ）の増加によることが分かった。Kole, ほか., Arch. Biochem. Biophys. 286(2), 586-590 (1991)を参照されたい。１９８０年代の初め、Ｆ２，６ＢＰに、ＰＦＫ１のアロステリック活性化因子の可能性が見出され、基質である、フルクトース−６−リン酸塩に対して低親和性から高親和性へ、ＰＦＫ１のコンホメーションの平衡をシフトすることにより、ＡＴＰの阻害効果を取り除くことができる。Van Schaftingen, ほか., Biochem. J., 192(3), 887-895 (1980); Van Schaftingen, ほか., Biochem. J., 192(3), 897-901 (1980); 及び Van Schaftingen, ほか, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78(6), 3483-3486 (1981)を参照されたい。従って、Ｆ２，６ＢＰレベルの亢進調節により、高エネルギー産生にも拘わらず（即ち、生理的ＡＴＰレベル）、癌組織が高い解糖的産生を維持することを可能にする。図１は、癌遺伝子ｒａｓが、如何に、癌細胞においてＰＦＫＦＢ３の発現及び活性を増加させ、従ってＦ２，６ＢＰ産生を亢進させ、律速ＰＦＫ−１の活性化及び、究極的に、高い解糖フラックスをもたらすと信じられ、またＲＮＡ，ＤＮＡ、アミノ酸（ＡＡｓ）及び脂肪酸を含む高分子の産生を増加させるかを表す。
【００４８】
細胞内のＦ２，６ＢＰレベルは、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビスホスファターゼ（ＰＦＫ−２／ＦＢＰａｓｅｓ）と名付けられた二機能性の酵素ファミリーにより維持され、また４種の遺伝子ＰＦＫＦＢ１〜４によりコードされている。ＰＦＫＦＢ１，２及び４は、それぞれ、肝臓／筋肉、腎臓／心臓及び精巣内に発現されると報告されており、ホスファターゼ活性に等しいキナーゼ活性を示す。ＰＦＫＦＢ３遺伝子によりコードされているＰＦＫ−２の誘導型イソ型（ｉＰＦＫ２、胎盤ＰＦＫ２，ユビキタス（遍在）ＰＦＫ２及びＰＧＲ１と報告されている）は、分裂、炎症及び低酸素刺激により亢進されることが示されてきた、またホスファターゼ領域内の突然変異により、キナーゼ：ホスファターゼ比が７４０：１であることを示す。
【００４９】
ＰＦＫＦＢ３は、大腸、前立腺、肺、乳房、膵臓及び卵巣を含む多くの種類の癌組織において、過剰発現していることが観測されてきた。Atsumi, ほか., Cancer Res., 62, 5881-5887 (2002)を参照されたい。不死化したマウス繊維芽細胞に腫瘍遺伝子ｒａｓを導入すると、ＰＦＫＦＢ３発現が高まり、ＰＦＫＦＢ３は癌化形質転換において必要不可欠の成分であるかもしれないことを示唆する。Ｃｈｅｓｎｅｙ及び共同研究者等は、ＰＦＫＦＢ３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、無胸腺マウスに異種移植したＫ５６２白血病細胞の抑制を示し、一方また、ヌクレオチド生合成の前駆体である５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸塩（ＰＲＰＰ）の減少を観測した。ヒトテロメラーゼ、ラージＴ抗原及び癌遺伝子Ｈ−ｒａｓｖ１２により、不死化し、続いてトランスフォームした異形接合のＰＦＫＦＢ３（＋／−）マウス繊維芽細胞において、Ｆ２，６ＢＰ産生は減少し、グルコースの乳酸への解糖フラックスは抑制された。より重要なことは、ｒａｓトランスフォーム繊維芽細胞においてＰＦＫＦＢ３レベルが低いために、軟寒天中の基質非依存性増殖の喪失がもたらされ、また無胸腺マウスにおける腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖が顕著に減少する。Telang ほか., Oncogene, 25, 7225-7234 (2006)を参照されたい。これとは別に、ｓｉＲＮＡによるＡ５４９肺癌細胞におけるＰＦＫＦＢ３の抑制は、Ｆ２，６ＢＰの減少をもたらし、軟寒天中のコロニー形成の喪失をもたらす。
小分子阻害剤による選択的なＰＦＫＦＢ３の標的化が、新しい抗ガン治療の戦略であると言う所見を、本明細書にはじめて開示した。
【００５０】
ＩＩＩ．ＰＦＫＦＢ３阻害剤
本明細書に開示した発明は、ＰＦＫＦＢ３の阻害方法を提供し、該方法はＰＦＫＦＢ３と阻害化合物との接触を含む。幾つかの実施態様において、該方法はＰＦＫＦＢ３と小分子阻害剤との接触を含む。
【００５１】
幾つかの実施態様において、本明細書に開示した発明は、ＰＦＫＦＢ３と、ＰＦＫＦＢ３を阻害する又は、そうでなければＰＦＫＦＢ３活性を変える化合物とを接触させる方法を提供し、式中、該化合物は以下の化学式（Ｉ）：
【化１】
2010531304.tif 000028
で表わされる化合物であり、
式中、Ｘは、Ｃ又はＣＨであり；
Ｘ１はＯ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、夫々独立に、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群から選択され、またＲ２及びＲ７は、夫々独立に、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｌ１は、存在又は不存在であってもよく、存在の場合、Ｏ、Ｓ、ＮＲ８、アルキレン基、置換アルキレン基からなる群から選択され、式中、Ｒ８は水素原子、アルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｌ２は、存在又は不存在であってもよく、存在の場合、Ｏ、Ｓ、ＮＲ９、アルキレン基及び置換アルキレン基及び３価連結基からなる群から選択され、式中、Ｒ９は水素原子、アルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され、また３価連結基は、Ａｒ２に結合する第１の原子、Ｘに結合する第２の原子及び、Ａｒ１及びＡｒ２からなる群の一つと結合する第３の原子を含む。
Ａｒ１及びＡｒ２は，独立にアリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基及び置換ヘテロアリール基からなる群から選択される。
【００５２】
幾つかの実施態様において、化学式（Ｉ）で表わされる化合物は、アザカルコンである。
幾つかの実施態様において、Ａｒ１及びＡｒ２の少なくとも一つは、アザアリール基である。幾つかの実施態様において、Ａｒ１及びＡｒ２の両者は、アザアリール基である。幾つかの実施態様において、Ａｒ１及びＡｒ２の少なくとも一つは、ピリジン、置換ピリジン、キノリン、置換キノリン、イソキノリン及び置換イソキノリンからなる群から選択される。
【００５３】
幾つかの実施態様において、Ａｒ１及びＡｒ２の少なくとも一つはアシルアミノ基により置換される。幾つかの実施態様において、化学式（Ｉ）で表わされる化合物は、アシルアミノ置換アザカルコンである。
幾つかの実施態様において、Ａｒ１は、アザアリール基である。幾つかの実施態様において、Ａｒ１は、２−、３−又は４−ピリジン又は置換２−、３−、又は４−ピリジンである。
【００５４】
幾つかの実施態様において、Ｌ１は不存在である。幾つかの実施態様において、Ｌ２は、存在して、Ｃ２アルキレン基である。
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩ）で表わされる化合物は、化学式（ＩＩ）：
【化２】
2010531304.tif 000029
で表わされる構造を有し、式中、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３は、それぞれＣ又はＣＨである。
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、Ｃ（Ｒ２）２、ＯＲ３、ＳＲ４、ＮＲ５Ｒ６及びＣ（Ｒ７）３からなる群から選択され、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６のそれぞれは、水素原子、アルキル基、アリール基、アラルキル基及びアシル基からなる群より独立に選択され、また各Ｒ２及びＲ７は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基から独立に選択され；
Ｒ１０は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ｒ１１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選択され；
Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４及びＡ５は、夫々独立に、Ｎ又はＣＲ１２であり、式中、各Ｒ１２は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び、次の構造：
【化３】
2010531304.tif 000030
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４は、ＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４は、水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｘ５は、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５は、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び
Ｘ６は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基から選択され；又は
式中、Ｒ１０及び１個のＲ１２は、一緒にアルキレン基を形成し；
Ａｒ２は以下の構造：
【化４】
2010531304.tif 000031
から選択され、式中、
各Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９は、Ｎ及びＣＲ１３からなる群から独立に選択され、式中、各Ｒ１３は、水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシル基、アシル基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、硫酸基及び次の構造：
【化３】
2010531304.tif 000032
を有する置換基からなる群から独立に選択され、
式中、Ｘ４は、ＮＲ１４であり、式中、Ｒ１４は、水素原子、アルキル基、ヒドロキシル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
Ｘ５は、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ１５）２及びＮＲ１４からなる群から選択され、式中、各Ｒ１５は、水素原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、アラルキル基及びアリール基からなる群から独立に選択され；及び、
Ｘ６は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、ヘテロアルキル基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基及びアルコキシ基からなる群から選択され；又は式中、Ｒ１０及び１個のＲ１３はともにアルキレン基であり；及び
式中、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９の中の少なくとも一つは、Ｎであり；
又はこれらの医薬的に許容された塩である。
【００５５】
幾つかの実施態様において、Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４，Ｙ５，Ｙ６，Ｙ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０，Ｙ１１，Ｙ１２，Ｙ１３，Ｙ１４，Ｙ１５，Ｙ１６，Ｙ１７，Ｙ１８及びＹ１９の中の２個は、Ｎである。
幾つかの実施態様において、Ｘ１は、Ｏであり、ＸはＣである。
幾つかの実施態様において、Ａｒ２は、次の構造：
【化５】
2010531304.tif 000033
であり；
Ｘ、Ｘ２及びＸ３は、それぞれＣであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１は水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び化学式（ＩＩ）で表わされる化合物は、化学式（ＩＩＩ）で表わされる構造：
【化６】
2010531304.tif 000034
を有する。
【００５６】
幾つかの実施態様において、Ｘ１は、Ｏである。幾つかの実施態様において、Ｒ１０及びＲ１１のそれぞれは、水素原子である。
幾つかの実施態様において、Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３，Ｙ４及びＹ５の中の少なくとも１つは、ＣＲ１３であり、式中、Ｒ１３は、構造：
【化３】
2010531304.tif 000035
を有する置換基である。
幾つかの実施態様において、Ｘ５は、Ｏであり、Ｘ６は、水素原子、アルキル基、アラルキル基及びアリール基より選択され、またＡｒ２は、アシルアミノ置換アリール基又はヘテロアリール基である。
【００５７】
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、化学式（ＩＩＩａ）：
【化１４】
2010531304.tif 000036
で表わされる化合物である。
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩａ）で表わされる化合物のＡ３はＮである。幾つかの実施態様において、Ａ３はＮであり、Ａ１，Ａ２，Ａ４及びＡ５のそれぞれは、ＣＲ１２であり、またＹ１，Ｙ２，Ｙ４及びＹ５は、ＣＲ１３である。
【００５８】
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、少なくとも１個のハロ置換体を含む。幾つかの実施態様において、該ハロ置換体はＣｌである。幾つかの実施態様において、該ハロ置換体は、アルケンに付加する炭素に対してオルソ位置である。幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、化学式（ＩＩＩｂ）：
【化１５】
2010531304.tif 000037
で表わされる化合物である。幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩｂ）で表わされる化合物のＡ４及びＡ５の中の１つは、Ｎである。幾つかの実施態様において、Ａ４及びＡ５の中の一つは、Ｎであり、Ａ１，Ａ２及びＡ３のそれぞれは、ＣＲ１２であり、またＹ２，Ｙ３，Ｙ４及びＹ５のそれぞれは、ＣＲ１３である。
【００５９】
幾つかの実施態様において、ハロ置換体は、アルケンに付加する炭素に対してパラ位置である。幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、化学式（ＩＩＩｃ）：
【化１６】
2010531304.tif 000038
で表わされる化合物である。幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩｃ）で表わされる化合物のＡ２は、Ｎである。幾つかの実施態様において、Ａ２はＮであり、Ａ１，Ａ３，Ａ４及びＡ５のそれぞれは、ＣＲ１２であり、またＹ１，Ｙ２，Ｙ４及びＹ５のそれぞれは、ＣＲ１３である。
【００６０】
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、２個のアザアリール基を含む。幾つかの実施態様において、該化合物は、１個の４−ピリジル基及び１個の３−ピリジル基を含む。幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、化学式（ＩＩＩｄ）：
【化１７】
2010531304.tif 000039
で表わされる化合物である。幾つかの実施態様において、Ａ１，Ａ２，Ａ４及びＡ５のそれぞれは、ＣＲ１２であり、またＹ１，Ｙ３，Ｙ４及びＹ５のそれぞれは、ＣＲ１３である。
【００６１】
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、以下の化学式：
【化７】
2010531304.tif 000040
からなる群から選択される。
【００６２】
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩ）で表わされる化合物は、Ａｒ２が：
【化８】
2010531304.tif 000041
である化合物であり、式中、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３のそれぞれは、Ｃであり；
Ｘ１はＯ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１は、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群より独立に選択され；及び化学式（ＩＩ）で表わされる化合物は、化学式（ＩＶ）：
【化９】
2010531304.tif 000042
で表わされる構造を有する。
【００６３】
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＶ）で表わされる化合物は、２個のアザアリール基を含む。幾つかの実施態様において、Ｙ６及びＡ３のそれぞれは、Ｎである。幾つかの実施態様において、Ａ１，Ａ２，Ａ４及びＡ５のそれぞれは、ＣＲ１２であり、またＹ７，Ｙ８，Ｙ９，Ｙ１０、Ｙ１１及びＹ１２のそれぞれは、ＣＲ１３である。幾つかの実施態様において化学式（ＩＶ）で表わされる化合物は：
【化１０】
2010531304.tif 000043
である。
【００６４】
幾つかの実施態様において、化学式（ＩＩ）で表わされる化合物は、Ａｒ２が：
【化１１】
2010531304.tif 000044
であり、
Ｘ、Ｘ２及びＸ３のそれぞれがＣであり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１及びＣ（Ｒ２）２からなる群から選択され、式中、Ｒ１は、水素原子及びアルキル基からなる群から選択され、また各Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基及びアルキル基からなる群から独立に選択され；及び該化合物は、化学式（Ｖ）：
【化１２】
2010531304.tif 000045
で表わされる構造を有する。
【００６５】
幾つかの実施態様において、Ａ３はＮである。幾つかの実施態様において、化学式（Ｖ）で表わされる化合物は：
【化１３】
2010531304.tif 000046
である。
【００６６】
幾つかの実施態様において、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＦＫＦＢ３を阻害するために用いることができて、又はそうでなければ、ＰＦＫＦＢ３に干渉又は相互作用する為に用いることができる。幾つかの実施態様において、該化合物は、ＰＦＫＦＢ３の競合的阻害剤である。幾つかの実施態様において、該化合物は、細胞又はＰＦＫＦＢ３を含む細胞抽出液と接触させるために用いることができる。幾つかの実施態様において、該化合物は、組織、組織抽出物、又は血液試料のような他の生物由来の試料と接触するために用いることができる。幾つかの実施態様において、哺乳動物又はトリのような生存被験者にＰＦＫＦＢ３が存在する場合、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物を、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＦＫＦＢ３に接触するために用いることができる。幾つかの実施態様において、哺乳動物はヒトである。ＰＦＫＦＢ３活性を阻害することにより、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物、又はこれらの医薬学的許容物を用いて、細胞中の解糖フラックスを減少させることができて、幾つかの場合特に腫瘍細胞の場合、解糖フラックスの減少により、細胞内乳酸塩及びフルクトース−２，６−ビスリン酸塩レベルを減少させる。
【００６７】
ＩＶ．医薬処方物
化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物、これらの医薬学的に許容された塩類、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物に対応する前駆薬剤及びこれらの医薬学的に許容された塩類の全ては、本明細書において、"活性化合物"と呼ぶ。前述の活性化合物を含む医薬処方物もまた、本明細書に提供されている。本明細書において記載されるように、これらの医薬処方物は、医薬学的に許容された担体の中に、活性化合物を含む。以下により詳細に考察する様に、医薬処方物を、経口、静脈内、又は噴霧剤として投与することができる。また、本明細書に開示した発明は、凍結乾燥し、再構成して投与のための医薬学的に許容された処方物（ヒトに対して医薬学的に許容された処方物も含め）を作成できる、活性化合物を提供する。
【００６８】
活性化合物の使用は、本明細書に記載された実施態様の範囲内であるが、全ての活性化合物の治療上有効な投与量は、化合物によって、また患者によって異なり、また患者の健康状態及び投与経路にも依存するであろう。一般的な計画としては、約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇの投与量は、治療効果を有するであろう、但しここで全ての重量は、塩類を用いた場合も含めて、活性化合物の重量に基づいて計算されてある。高濃度における毒性を考慮して、静脈内投与量を、約１０ｍｇ／ｋｇまでのように、低濃度に制限することができる、但しここで全ての重量は、塩類を用いた場合も含めて、活性化合物の重量に基づいて計算されてある。経口投与の場合、約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの投与量を採用することができる。一般的に、筋肉内注射に対して、約０．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇの投与量を採用することができる。静脈内又は経口投与に対して、好ましい化合物の投与量は、１μｍｏｌ／ｋｇから５０μｍｏｌ／ｋｇであり、より好ましくは、２２μｍｏｌ／ｋｇ及び３３μｍｏｌ／ｋｇである。治療期間は、通常、２から３週間の期間に対して１日１回であるか、又は健康状態が本質的に改善されるまでである。低頻度で低濃度の投与量を、感染の再発防止、又は発生率の低下のために、予防的に用いることができる。
【００６９】
本明細書に開示した方法に従い、本明細書に記載した医薬学的に活性化合物は固体又は液体として、経口的に投与できて、又は溶液、懸濁液又は乳状液として、筋肉内又は静脈内に投与することができる。あるいは、該化合物又は塩を、リポソーム懸濁物として、吸入、静脈内、又は筋肉内に投与することができる。吸入により投与する場合、活性化合物又は塩は、粒子サイズが約０．５から約５μｍ及び好ましくは、約１から約２μｍである、複数の固体粒子又はドロップの形をとる必要がある。
【００７０】
静脈内又は筋肉内注射に適した医薬処方物は、本明細書に提供されたさらなる実施態様である。該医薬処方物は、本明細書に記載した、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物、本明細書に記載した前駆薬剤、又は医薬学的に許容されたこれらの塩を、全ての医薬学的に許容された担体の中に含む。もし溶液が望まれるならば、水溶性化合物又は塩に関しては、水が選択された担体である。水溶性の化合物又は塩に関して、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はこれらの混合物のような有機溶媒が適切であることができる。後者の例において、有機溶媒は、多量の水を含むことができる。上記二例における溶液は、当業者には既知の適切な手段で、一般的には、０．２２μｍフィルターを通して、無菌化できる。無菌化に続いて、該溶液を、脱パイロジェン化したガラスバイアルのような、適切な容器に分配することができる。この分配を、好ましくは、無菌法で行う。次ぎに殺菌した栓をバイアル上に置くことができて、必要に応じて、バイアル内容物を凍結乾燥できる。
【００７１】
化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物又はこれらの塩又は前駆薬剤に加えて、医薬処方物は、ｐＨ調整添加剤のような他の添加剤を含むことができる。特に、有用なｐＨ調整試薬としては、塩酸のような酸、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、又はグルコン酸ナトリウムのような、塩又は緩衝剤が含まれる。更に、該処方物は、抗菌保存剤を含むことができる。有用な抗菌保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン及びベンジルアルコールが含まれる。抗菌保存剤は、一般的に、処方物が多回数投与量使用を表すバイアルに入れられる場合に、使われる。本明細書に記載される医薬処方物は、当業者に既知の技術を用いて凍結乾燥される。
【００７２】
本明細書に記載する発明の他の実施態様において、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物、又はこれらの塩を含む注射可能な、安定な、滅菌した処方物を提供する。該化合物又は塩は、密封した凍結乾燥物の形で提供される。該化合物又は塩を、適切な医薬学的に許容された担体と共に再構成可能であり、患者への注射に適した液体処方物を形成することができる凍結乾燥物として提供する。一般的に一回投与の形式は、約１０ｍｇから約１０ｇの化合物塩を含む。化合物又は塩が、実質的に、非水溶性の場合、生理学的に許容された、十分量の乳化剤が十分量使われ、該化合物又は塩を水溶性担体に乳化することができる。このような有用な乳化剤としては、ホスファチジルコリンがある。
【００７３】
他の医薬処方物を、本明細書に開示した、水溶性塩基乳化剤のような、非水溶性化合物又はこれらの塩から作成することができる。このような例の場合、該処方物は、十分量の医薬学的に許容された乳化剤を含み、必要量の化合物又はこれらの塩を乳化する。特に有用な乳化試薬は、ホスファチジルコリン及びレシチンを含む。
【００７４】
本明細書に提供された更なる実施態様には、本明細書に開示した活性化合物のリポソーム処方物が含まれる。リポソーム懸濁物を作成する技術は、既知の技法である。化合物が、水溶性塩である場合、従来のリポソーム技術を用いて、脂質小胞にこれを取り込むことができる。このような例において、活性化合物が水溶性であるために、該活性化合物は、実質的に親水性中心、又はリポソームのコアに取り込まれる。用いられる脂質層は、従来型のどの様な組成も可能であり、コレステロールを含む、又は含めないことができる。注目する活性化合物が非水溶性の場合、再び、従来型のリポソーム形成技術を用いて、塩は、リポソームの構造を作る疎水性脂質二重膜内に、実質的に取り込まれる。いずれにしても標準的超音波及びホモジナイズ技術により、作成されたリポソームのサイズを、小さくすることができる。
【００７５】
本明細書に開示された活性化合物を含むリポソーム処方物は、凍結乾燥により、凍結乾燥物を作ることができて、これは、水のような医薬学的に許容された担体を用いて、再構成して、リポソーム懸濁物を再生することができる。
【００７６】
また吸入による煙霧剤として投与に適した医薬処方物として提供される。これらの処方物は、本明細書に記載した望ましい化合物、又はこれらの塩、又は化合物又は塩の複数の固体粒子の溶液又は懸濁物を含む。望みの処方物を、小さな容器に入れ、霧状にすることができる。噴霧化は、圧縮空気又は超音波エネルギーによって行われ、化合物又は塩を含む複数の液体ドロップ又は固体粒子を形成する。液体ドロップ又は固体粒子のサイズは、約０．５から約１０μｍの範囲、より好ましくは、約０．５から約５μｍの範囲にあるべきである。固体粒子は、微粉化のような既知のいかなる方法によっても、固体化合物又はこれらの塩を処理して得ることができる。最も好ましくは、固体粒子又はドロップのサイズは、約１から約２μｍであろう。この点において、この目的を達するために、商品化された噴霧器を用いることができる。その開示物は本明細書参照文献にその全体が取り込まれているが、合衆国特許番号５６２８９８４で公にされた方法で吸入可能な粒子の煙霧懸濁液を通して、該化合物を投与することができる。
【００７７】
煙霧剤としての投与に適した医薬処方物が液体の場合、該処方物は、水を含む担体中の水溶性活性化合物を含むであろう。界面活性剤は、存在できて、処方物の表面張力を十分に低下させて、噴霧化した場合、望ましいサイズ範囲の小滴をもたらす。
【００７８】
既述の様に、水溶性及び非水溶性活性化合物が提供される。本明細書で用いるように、用語"水溶性"は約５０ｍｇ／ｍＬ又はそれ以上の量が水に溶ける全ての化合物を定義するつもりである。また、本明細書で用いるように、用語"非水溶性"は約２０ｍｇ／ｍＬ以下の水への溶解度を有する全ての組成物を定義するつもりである。幾つかの実施態様において、水溶性化合物又は塩が好ましいが、他方、他の実施態様において、非水溶性化合物又は塩が好ましい。
【００７９】
Ｖ．ＰＦＫＦＢ３阻害剤で細胞増殖阻害し、癌を治療する方法
本明細書に開示した発明は、細胞増殖を阻害するための方法及び組成物を提供する。より詳細には、本明細書に開示した発明は、ＰＦＫＦＢ３活性を阻害し、解糖フラックスを中断させる方法を提供する。解糖活性を中断することにより、細胞増殖は停止し、また、幾つかの場合、アポトーシスが引き起こされる。従って、本明細書に開示した発明は、望ましくない解糖活性及び／又は望ましくない細胞増殖が関与する、癌を含む病気を治療する方法を提供する。
【００８０】
幾つかの実施態様において、細胞増殖の阻害又は癌の治療のための方法は、本明細書に記載した活性化合物を必要とする患者に対する、活性化合物の投与を含む。既述のように、これらの活性化合物は、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物、これらの前駆薬剤及び医薬学的に許容されたこれら化合物と前駆薬剤の塩を含む。幾つかの実施態様において、該活性化合物は、既述のように、医薬処方物の中に存在する。
【００８１】
本明細書に開示した化合物は、皮膚癌、結合組織癌、脂肪腫、乳癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、肛門性器癌、腎臓癌、膀胱癌、大腸癌、前立腺癌、中枢神経癌（ＣＮＳ），網膜癌、血液及びリンパ液癌を含む、多種の腫瘍及び癌に対する治療を提供することができる。
【００８２】
癌の治療に関係して、本明細書で定義される"有効量"、は、癌細胞又は腫瘍の増殖を減らす、低減する、阻害する、又は他の方法で排除する量である。幾つかの実施態様において、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物を、患者の身体の特に病期に冒された、部位又は領域に局部的に輸送することができる。このような治療がより適切と考えられた幾つかの実施態様において、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物は、全身的に投与できる。例えば、該化合物を経口又は静脈内に投与できる。
【００８３】
さらに、癌の治療に対する治療上の恩恵は、ＰＦＫＦＢ３阻害化合物又は、本明細書で開示した他の化合物と、１又は２以上の他の抗癌剤又は治療と組み合わせた治療により実現することができる。その様な組合せの選択は、病気の種類、年齢及び患者の一般的健康状態、病気進行の攻撃性及び組合せに含められた試薬に対する患者の耐久力を含む、しかしこれらに限定されない、様々な因子に依存するであろう。例えば、ＰＦＫＦＢ３阻害剤は、腫瘍サイズを減少させる上で有効な他の試薬及び治療計画（例えば、放射線、手術、化学療法、ホルモン治療及び／又は遺伝子治療）と組み合わせることができる。さらに、幾つかの実施態様において、ＰＦＫＦＢ３阻害剤化合物を、病気の副次的影響又は治療試薬の一つの副作用を治療する、１又は２以上の薬剤と組み合わせることが望ましくできる、例えば、患者に、鎮痛剤、又は患者自身の免疫応答を高めるに有効な薬剤（例えば、コロニー刺激因子）を提供することである。
【００８４】
幾つかの実施態様において、本明細書に開示した方法及び化合物は、我々が本明細書では"好気性治療"として、全体的に又は個別的に表す、好気性の急速に増殖する細胞に焦点を当てた化学療法及び／又は放射線療法と結びつけて用いることができる。幾つかの実施態様において、本明細書で開示したＰＦＫＦＢ３阻害剤の使用は、通常最も抵抗性であり、また従って、好気的治療を用いてでは根絶することが最も難しい、固形腫瘍の内部コアに見られる嫌気的な遅速増殖腫瘍細胞を選択的に殺すことにより、癌治療の有効性を付け加える。
【００８５】
従って、本明細書で記載された発明の１又は２以上のＰＦＫＦＢ３阻害化合物と組み合わせて、"抗癌剤"又は"化学療法剤"としてもまた記載される様々な化学化合物を用いることができる。このような化合物としては、アルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、蛋白質合成阻害剤、ＤＮＡ又はＲＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ塩基類似体、トポイソメラーゼ阻害剤、抗脈管形成薬剤及びテロメラーゼ阻害剤又はテロメアのＤＮＡ結合化合物が含まれるが、これらに制限されない。例えば、適切なアルキル化剤としては、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル；ベンゾジゼパ、カルボコン、メツレデパ及びウレデパのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンティオホスホラミド及びトリメチルオルメラミンのようなエチレニミン及びメチルメラミン；クロランブシル、クロルナファジン、サイクロホスファミド、エストラムスティン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビチン（Ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎｅ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド及びウラシルマスタードのような、ナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンのようなニトロソウレアが含まれる。
【００８６】
癌の治療に用いられる抗生物質としては、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドクソルビシン、イダルビシン、硫酸ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン及びストレプトゾシンが含まれる。化学療法に使われる抗代謝薬剤としては、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ），フロクスウリジン、シタラビン、ペントスタチン、メトトレクセート及びアザチオプリン、アシクロビル、アデニンβ−１−Ｄ−アラビノシド、アメトプテリン、アミノプテリン、２−アミノプリン、アフィジコリン、８−アザグアニン、アザセリン、６−アザウラシル、２'−アジド−２'−デオキシヌクレオシド、５−ブロモデオキシシチジン、シトシンβ−１−Ｄ−アラビノシド、ジアゾオキシノルロイシン、ジデオキシヌクレオシド、５−フルオロデオキシシチジン、５−フルオロデオキシウリジン及びヒドロキシウレアが含まれる。
【００８７】
化学療法のための蛋白質合成阻害剤としては、アブリン、オーリントリカルボン酸、クロランフェニコール、コリシンＥ３，シクロヘキシミド、ジフテリア毒素、エデインＡ，エメチン、エリスロマイシン、エチオニン、フッ化物、５−フルオロトリプトファン、フシジン酸、ジホスホン酸グアニリルメチレン及びジホスホン酸グアニリルイミド、カナマイシン、カスガマイシン、キッロマイシン及びＯ−メチルスレオニンがある。さらなる蛋白質合成阻害剤としては、モデシン、ネオマイシン、ノルバリン、パクタマイシン、パラモマイシン、ピューロマイシン、リシン、シガ毒素、ショウドマイシン、スパルソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チオストレプトン及びトリメトプリムがある。硫酸ジメチル；マイトマイシンＣ；ナイトロジェンマスタード及びサルファーマスタードのようなアルキル化剤；アクリジン色素、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アントラセン、ベンゾピレン、エシジウムブロマイド、２ヨウ化プロピジウムのようなインターカレート試薬；ジスタマイシン及びネトロプシンのような薬剤；等のＤＮＡ合成阻害剤もまた、化学療法組成物中で、本明細書に開示した発明の化合物と組み合わせることができる。クメルマイシン、ナリジクス酸、ノボビオシン及びオキソリン酸のようなトポイソメラーゼ阻害剤；コルセミド、コルヒチン、ビンブラスチン及びビンクリスチンを含む細胞分裂阻害剤；及びアクチノマイシンＤ，α−アマニチン及び他のカビのアマトキシン、コルディセピン（３'−デオキシアデノシン）、ジクロロリボフラノシルベンズイミダゾール、リファンピシン、ストレプトバリシン及びストレプトリジギンを含むＲＮＡ合成阻害剤もまた、本明細書に開示した発明のＰＦＫＦＢ３阻害剤化合物と組み合わせて、適切な癌治療に提供することができる。
【００８８】
従って、本明細書に開示した発明のＰＦＫＦＢ３阻害剤と組合せて治療に用いることができる現在の化学療法薬剤としては、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ），エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ，マイトマイシン、シスプラチン、過酸化水素、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ビサルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドクソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ、ビンブラスチン及びメトトレクセート等々がある。
【００８９】
ＰＦＫＦＢ３阻害化合物及び、他の化学療法薬剤のような、他の治療薬剤を含む組合せ治療は、細胞を、ＰＦＫＦＢ３阻害剤及び他の薬剤と同時に接触させることにより達成することができる。このような組合せ治療は、該細胞を、両薬剤を含む単一組成物又は医薬処方物を接触させる、又は該細胞を、一方の組成物がＰＦＫＦＢ３阻害剤を含み、また他方が他の薬剤を含む、２種の別個の組成物又は処方物と同時に接触させることで達成することができる。
【００９０】
あるいは、ＰＦＫＦＢ３阻害化合物を用いる治療は、分から週単位の範囲の間隔で、他の薬剤治療の前、また後に適用することができる。他の薬剤及びＰＦＫＦＢ３阻害剤治療が、細胞に対して別々に行われる実施態様において、該薬剤及びＰＦＫＦＢ３阻害剤治療が、細胞上に有利な組合せ効果を示すことができる様に一般的に守られることは、両治療の間に長期の時間間隔が経ってしまいそれぞれの治療の間で失効しないことである。この様な場合、人は細胞を約１２〜２４時間以内に及び任意に、約６〜１２時間以内に、両治療法に接触させることになる。幾つかの状況において、治療の期間をかなり延長することが望まれるが、それぞれの投与間隔を、数日間（２，３，４，５，６又は７日間）から数週間（１，２，３，４，５，６，７又は８週間）に延長される。また、幾つかの状況下で、ＰＦＫＦＢ３阻害剤又は他薬剤の１回以上の投与が望まれる。
【００９１】
他の実施態様において、本明細書に開示した発明のＰＦＫＦＢ３阻害剤化合物、又はＰＦＫＦＢ３阻害剤と組み合わせて用いる他の抗癌化合物は、単一クローン抗体（例えば、齧歯動物又はヒト単一クローン抗体）のような標的薬剤と結合した細胞毒性試薬と組み合わされ、又はこの細胞性毒試薬と共有結合する。後者の組合せにより、より大きな特異性を持って癌細胞に細胞毒性薬剤を導入することができることが分かるであろう。従って、細胞毒性薬剤の活性型（例えば、フリーな形）は、抗体により標的とされた細胞の中にのみ存在することになろう。
【００９２】
他の癌治療法を、ＰＦＫＦＢ３阻害剤化合物の投与と組み合わせて用いることができる。例えば、本明細書に開示した発明のＰＦＫＦＢ３阻害剤化合物は、さらに外科的に取り除いた部分、又は全ての癌の増殖に対する試みを含む治療コースの一部として用いることができる。例えば、本明細書に開示した発明のＰＦＫＦＢ３阻害剤を、患者の外科的治療の後に投与して、全ての残された癌、又は転移した細胞を治療することができる。本明細書で開示した発明のＰＦＫＦＢ３阻害薬剤による治療は、手術に先んじて行い、腫瘍のサイズを縮退させ、切除する組織量を減らす試みができて、これにより手術をより非浸襲的及び非衝撃的にする。
【００９３】
本明細書に開示した発明のＰＦＫＦＢ３阻害薬剤による癌の治療は、放射線治療作用物を伴う１又は２以上の治療コースをさらに含み、ＤＮＡ損傷をもたらすことができる。放射線治療作用物には、例えば、ガンマ線照射、Ｘ−線、ＵＶ−照射、マイクロ波、電子発光、放射性同位元素、等々がある。治療は、上記の形の放射線を局所的腫瘍部位に照射することで達成することができる。
【００９４】
組合せ治療は、また、腫瘍細胞の表面に見出される腫瘍抗原に向けられた免疫治療を含めることができる。本明細書に開示したＰＦＫＦＢ３阻害剤で癌を治療することは、さらに、遺伝子治療に基づく治療と組み合わせることができて、p53,p16,p21、Rb,APC,DCC,NF-1,NF-2,BRCA2,FHIT,WT-1,MEN-I,MEN-II,BRCA1,VHL,FCC,MCC,ras,myc,neu,raf,erb,src,fms,jun,trk,ret,gsp,hst,bcl及びablのような、腫瘍遺伝子及び／又は細胞周期調節遺伝子、これらはしばしば癌組織中の正常細胞対応物の突然変異バージョンであるが、を標的とすることができる。
【００９５】
本明細書に開示した発明のＰＦＫＦＢ３阻害剤化合物は、試験を行い、癌細胞の増殖阻害能、癌細胞のアポトーシス誘導能、腫瘍負荷の減少能及び転移阻害能を測定することができる。例えば、ＭＴＴ試験により、細胞増殖を測定することができる。ＭＴＴ試験により測定した増殖試験は、広く既知である。ＭＴＴ試験において、癌細胞を様々な濃度の抗ガン化合物とインキュベートし、細胞生存能をテトラゾリウム塩、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロム化物（ＭＴＴ）の着色したホルマザン塩の形成を測定して決める。細胞死及び、又は細胞増殖を測定する他の既知の試験もまた用いることができる。
【００９６】
例えば、ＯＶＣＡＲ−５腫瘍細胞をヌードマウスに移植したマウス異種移植モデルを用いてｉｎ  ｖｉｖｏ試験を行うことができて、化学式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ），（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）で表わされる化合物で処理したこのマウスは、平均して、最初の投与後ある時期の間増殖するが、処理を続けると、腫瘍塊が縮小することが期待される。それに対して、対照（例えばＤＭＳＯ）処理を行ったマウスは、腫瘍塊が増殖し続けると期待される。本明細書に開示した化合物の抗癌効果を測定する更なる方法を、本明細書の以下の実施例において記載する。
【００９７】
ＶＩ．スクリーニング方法
本明細書に開示した発明は、化合物の持つＰＦＫＦＢ３への妨害（例えば、阻害又は競合的な阻害）能についてスクリーニングする方法を提供する。より詳細には、該方法は、（１）ＰＦＫＦＢ３のＦ６Ｐ結合ポケットを含むＰＦＫＦＢ３の３Ｄモデルの提供；（２）化合物（例えば、小分子）の３Ｄモデル；及び（３）ＰＦＫＦＢ３モデルのＦ６Ｐ結合ポケットの中の１又は２以上の溶媒接触表面との相互作用能を有する化合物のスクリーニングを含む。幾つかの実施態様において、該方法は、計算機（例えば、コンピューター内での）を用いて行うことができる。幾つかの実施態様において、該方法は、（ａ）複数の化合物（例えば、化合物のライブラリー又はデータベース）の３Ｄモデルの提供及び（ｂ）各化合物の個別のスクリーニング及びその後、（ｃ）複数の化合物中のある一個の化合物のＦ６Ｐ結合ポケットとの相互作用能と、他の化合物の相互作用能との比較；を含むことができる。
【００９８】
従って、一態様において、化合物をスクリーニングする方法は、一般的に、ＰＦＫＦＢ３のＦ６Ｐ結合ポケットの計算機モデルに対する選択した化合物（化学的実体）が持つ結合能を、計算機によって評価することを含む。例えば、この方法は、（ａ）選択した化合物とＰＦＫＦＢ３のＦ６Ｐ結合ポケットの間の嵌め込み操作を行うための計算機によるアプローチを用いるステップ；（ｂ）嵌め込み操作の結果を解析して、化合物と結合ポケットの間の結合を定量化するステップを含む。幾つかの実施態様において、目視検査、又は計算機を用いたドッキング（結合）実験を用いて、ある分子、又は分子のライブラリーを、ＰＦＫＦＢ３のＦ６Ｐ結合ポケットとの結合親和性について試験することができる。
【００９９】
幾つかの実施態様において、ＰＦＫＦＢ３の計算機モデルは、ＰＦＫＦＢ３アイソザイムの既知のＸ−線構造から導かれることができる。例えば、ＰＦＫＦＢ３のあるモデルは、ＰＦＫＦＢ３の残基配列をヒト肝ＰＦＫＦＢ１及びラット精巣ＰＦＫＦＢ４アイソザイムの同型配列に揃えて並べることにより導くことができる。ＰＦＫＦＢ３自体の結晶構造もまた記載されている。Kimほか,J.Biol.Chem.,281(5)2939-2944(2006)を参照されたい。
【０１００】
用語"結合ポケット"は、その形状の結果として、他の化合物（例えば、Ｆ６Ｐ又は阻害剤）と都合良く結合する分子又は、分子複合体のある領域を表す。用語"ポケット"は、裂け目、チャンネル、又は部位を含む、がこれらに制限されない。結合ポケットの形状は、大体は化合物との結合前にあらかじめ形成され、化合物との結合と同時に形成され、又は分子の異なる結合ポケットへ他の化学物質が結合し、このことが逆に結合ポケットの形状の変化を誘導する、ことにより形成されるかも知れない。
【０１０１】
用語"ドッキング（結合）"は、ディスタンスジオメトリー又はエネルギーに基づいて、結合ポケット、領域、分子、又は分子複合体又はこれらの部分における、化合物の配向；回転；平行移動を表す。ドッキングは、ディスタンスジオメトリー法によって行うことができて、この方法は結合ポケット、領域、分子又は分子複合体又はこれらの部分の球状プローブの中心の集合にマッチ（適合）する化合物の原子集合を見出す。Mengほか,J.Comp.Chem.,4,505-524(1992)を参照されたい。球状プローブ中心は、結合ポケット、領域、分子又は分子複合体又はこれらの部分において、原子（水素原子を除く）からの所与の距離に追加の半径を加えることで作り出される。リアルタイム相互作用エネルギー計算、エネルギー最小化、又は剛体最小化(Gschwend ほか,J.Mol Recognition,9:175-186(1996)参照）を行って、化合物を配向させて、ドッキングを容易にすることができる。例えば、相互作用をするドッキング実験を計画して、最小抵抗の経路に従うように設計することができる。相互作用的ドッキング実験において、使用者がエネルギー増加の方向へ動くならば、該システムは、その運動に抵抗する。しかしながら、もし該使用者が、エネルギー減少の方へ動くなら、該システムは、応答性が増加して動くことを好む。(Cohen,ほか,J.Med.Chem.,33,889-894(1990))ドッキングはまた、分子親和性ポテンシャルを用いて、ＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ探索技術と早いエネルギー評価を組み合わせることにより為し遂げることができる。Goodsell及びOlson,Proteins:Structure,Function and Genetics 8,195-202 (1990)を参照されたい。ドッキング機能を行うソフトウェアプログラムとしては、ＭＡＴＣＨＭＯＬ（Cory,ほか.J.Mol Graphics,2,39(1984));MOLFIT(Redington,Comput Chem.16,217(1992)参照）及びＤＯＣＫ（Ｍｅｎｇほか、上記参照）が含まれる、がこれらに制限されない。
【０１０２】
用語"３次元（Ｄ）構造の創出"又は"３次元表示の創出"は、構造座標のリストを３次元の構造モデル又はグラフによる表出に変換することを表す。これは、商業的に、又は公共で入手可能なソフトウェアにより行われる。従って、分子又は分子複合体の３次元構造のモデルは、構造座標が与えられ、また正しいソフトウェアをインストールした計算機により、計算機のスクリーン上に構築することができる。該３次元構造を表示すること、又は計算機モデリング又は当て嵌め操作を行うために用いることができる。さらに、表示されたモデルは無くとも、構造座標それ自体を用いて、計算機に基づくモデリング及び当て嵌め操作を行うことができる。
【０１０３】
幾つかの実施態様において化合物が持つ、結合ポケット又は溶媒接触表面との相互作用能を定量することができる。用語"接触スコア"は、化合物及び結合ポケットの間での形状相補性の指標を表し、これは、化合物の原子の全て又は部分及び結合ポケット内に結合したリガンドの原子の全て又は部分の間の最小自乗スーパーインポジション（重ね合わせ；superimposition）から得られる、ＲＭＳＤ値と相関する。接触スコア又はＲＭＳＤ値により、ドッキング過程を容易にすることができる。例えば、もし化合物が高いＲＭＳＤを有する位置に動くならば、システムはその動きに抵抗するであろう。化合物の配置の集合は、接触スコアにより、ランク付けすることができる。より低ＲＭＳＤ値はより高い接触スコアを与えるであろう。Ｍｅｎｇほか．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４，５０５−５２４（１９９２）を参照されたい。
【０１０４】
用語"二乗平均偏差"又は"ＲＭＳＤ"は、平均値からの変位の二乗の算術平均の平方根を意味する。これは、傾向又は対象からの変位又は偏差を表現する一方法である。用語"構造座標"は、結晶型のタンパク質又はタンパク質複合体の原子（散乱中心）による、Ｘ−線の単色光線の回折から得られたパターンに関係する数式から導かれたＣａｒｔｅｓｉａｎ（デカルト）座標を表す。回折データを用いて、結晶の繰り返し単位の電子密度地図を計算する。次ぎに、電子密度地図を用いて、分子又は分子複合体の個々の原子の位置を確定する。
【０１０５】
本明細書の発明を閲覧した当業者には理解できることであるが、計算機スクリーニング法のために、様々な小分子（即ち、１０００原子質量単位（ａｍｕ）又はそれ以下の分子量を有する化合物、７５０ａｍｕ又はそれ以下、又は５００ａｍｕ又はそれ以下）ライブラリーが、入手できる。用いることができる化学構造データベースは、ACD(Molecular Designs Ltd,現在 Elsevier MDL, San Ramon, California, USA),NCI(National Cancer Institute, Fredrick, Maryland, USA), CCDC(Cambridge Crystallographic Data Center, Cambridge,英国),CAST(Chemical Abstract Service, Columbus, Ohio, USA), Maybridge(Maybridge Chemical Company Ltd, Tintagel,英国),Aldrich(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin)及び Directory of Natural Products(天然物要覧、Chapman & Hall, London,英国)を含むが、これらに制限されない。
【０１０６】
CONCORD(Tripos Associates,St.Louis,Missouri, USA)又はDB-Converter(Molecular Simulations Ltd.,San Leandro,California, USA)のような計算機プログラムを用いて、２次元に表示されたデータセットを３Ｄに表示されたデータセットに変換するために用いることができる。望みのファーマコフォア（薬理原子団）を有する分子を同定するための３Ｄデタベースを探索するために適したプログラムとしては、MACCS-3D及び ISIS/3D(Molecular Design Ltd.,現在 Elsevier MDL, San Ramon California, USA) ChemDBS-3D(Chemical Design Ltd., Oxford,英国)及びSybyl/3 DB Unity(Tripos Associates, St.Louis, Missouri, USA)がある。本明細書で用いるように、"ファーマコフォア"又は"薬作用発生パターン"は、結合に対して重要であると信じられている、化合物の特徴の幾何学的配置である。
【０１０７】
化合物はまた、細胞をベースとしたスクリーニング法を用いて、ＰＦＫＦＢ３の阻害能についてスクリーニングすることができる。従って、幾つかの実施態様において細胞増殖停止能及び／又はＰＦＫＦＢ３発現細胞における乳酸塩産生能について、化合物をスクリーニングすることができる。幾つかの実施態様において、細胞をベースとしたスクリーニング法を用いて、前述のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング法で同定した化合物のＰＦＫＦＢ３阻害能をさらに証明するために化合物をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【０１０８】
一般的方法
対照と３ＰＯ処理の間の増殖阻害、乳酸塩産生及びｉｎ  ｖｉｖｏ研究についての統計的有意さは、Graph Pad Prism Version3.0(Graph Pad Software,San Diego,California, USA)を用いた２試料ｔ−検定により定められた。ｐ値＜０．０１は、統計的に有意であると考える。
【０１０９】
実施例１
ＰＦＫＦＢ３分子モデリング及び化合物スクリーニング
計算機によるモデリングは、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ａｒｒａｙ（１ＴＢ以上の記憶装置を備えた７１×Ｒ１２０００及びＲ１４００００プロセッサー），３２Ｐ  Ｒ１４０００  ５００ＭＨｚ  Ｏｒｉｇｉｎ  ２０００サーバー及び２Ｐ  Ｒ１２０００  ３００ＭＨｚ  ＯＣＴＡＮＥグラフィックワークステーション(SGI,Sunnyvale,California, USA)を用いて行った。ＰＦＫＦＢ３ホモロジーモデルは、構造上の原型としてラット精巣ＰＦＫＦＢ４（ＰＤＢコード１Ｂ１Ｆ）アイソザイムのＸ線構造を用いた。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアラインメントを作り出した。Chennaほか,Nucleic Acids Res.,31,3497-3500(2003)を参照されたい。４種のホモロジーモデルをModeller(Sali及びBlundell, J.Mol.Biol.,234,779-815(1993)参照）を用いて作成し、またＰＦＫＦＢ３結合部位（Chesney ほか,Proc.Natl.Acad Sci,96,3047-3052(1999)及びBertrandほか.,Eur.J.Biochem.,254,490-496(1998)参照）を最も良く再現した構造を更なる使用のために選択した。ＰＦＫＦＢ３のためのリガンド結合及びタンパク質活性に重要な残基(Chesney ほか,Proc.Natl.Acad.Sci,96,3047-3052(1999)及びBertrandほか,Eur.J.Biochem.,254,490-496(1998)参照）は、コンセンサス（共通）構造における等価な残基数と相関した。該モデルをInsightII (Accelrys, San Diego California, USA)に読み込み、また３種の重要な残基Ａｒｇ６６，Ｔｙｒ１６１及びＴｈｒ９４を仮想スクリーニング運転の重心標的として選択した。ＰＦＫＦＢ３ホモロジーモデルの描画を図２Ａ，２Ｂ及び２Ｃに示す。
【０１１０】
ホモロジーモデル（配列番号１）に対するアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビホスファターゼ３（ＧＥＮＥＢＡＮＫ（Ｒ）登録番号ＮＰ＿００４５５７）のアミノ酸配列３４〜４６６のアミノ酸に対応する。配列番号１は、ＧＥＮＢＡＮＫ（Ｒ）登録番号、ＮＭ＿００４５６６（配列番号２）のヌクレオチド４２９〜１７２７によりコードされている。
【０１１１】
配列番号１は：
ＳＰＴＶＩＶＭＶＧＬＰＡＲＧＫＴＹＩＳＫＫＬＴＲＹＬＮＷＩＧＶＰＴＫＶＦＮＶＧＥＹＲＲＥＡＶＫＱＹＳＳＹＮＦＦＲＰＤＮＥＥＡＭＫＶＲＫＱＣＡＬＡＡＬＲＤＶＫＳＹＬＡＫＥＧＧＱＩＡＶＦＤＡＴＮＴＴＲＥＲＲＨＭＩＬＨＦＡＫＥＮＤＦＫＡＦＦＩＥＳＶＣＤＤＰＴＶＶＡＳＮＩＭＥＶＫＩＳＳＰＤＹＫＤＣＮＳＡＥＡＭＤＤＦＭＫＲＩＳＣＹＥＡＳＹＱＰＬＤＰＤＫＣＤＲＤＬＳＬＩＫＶＩＤＶＧＲＲＦＬＶＮＲＶＱＤＨＩＱＳＲＩＶＹＹＬＭＮＩＨＶＱＰＲＴＩＹＬＣＲＨＧＥＮＥＨＮＬＱＧＲＩＧＧＤＳＧＬＳＳＲＧＫＫＦＡＳＡＬＳＫＦＶＥＥＱＮＬＫＤＬＲＶＷＴＳＱＬＫＳＴＩＱＴＡＥＡＬＲＬＰＹＥＱＷＫＡＬＮＥＩＤＡＧＶＣＥＥＬＴＹＥＥＩＲＤＴＹＰＥＥＹＡＬＲＥＱＤＫＹＹＹＲＹＰＴＧＥＳＹＱＤＬＶＱＲＬＥＰＶＩＭＥＬＥＲＱＥＮＶＬＶＩＣＨＱＡＶＬＲＣＬＬＡＹＦＬＤＫＳＡＥＥＭＰＹＬＫＣＰＬＨＴＶＬＫＬＴＰＶＡＹＧＣＲＶＥＳＩＹＬＮＶＥＳＶＣＴＨＲＥＲＳＥＤＡＫＫＧＰＮＰＬＭＲＲＮＳＶＴＰＬＡである。
【０１１２】
Ｌｕｄｉ(Accelrys,San Diego,California, USA)仮想スクリーニングプログラムを用いて、ChemNavigator iResearch library(ChemNavigator,San Diego,California, USA)を処理した。これらのスクリーニング運転の完了後、Ｌｕｄｉのスコアリングシステムを用いて５００以上のスコアの分子を、タンパク質の活性位置内で仮想的吟味を行い解析した。活性ポケット内に正しく結合したリガンドは、スクリーニングのために用いた標的及びライブラリーに従って目録に入れた。２００個のスコアが最高の分子を、Ｓｃｉｆｉｎｄｅｒ  Ｓｃｈｏｌａｒを用いて同定し、またトップ４５個の分子を実験検定可能あるものと選択した。
【０１１３】
ＰＦＫＦＢ３  Ｆ６Ｐ結合ポケット中に結合ポテンシャルを有すると決定された化合物の幾つかの構造を以下の表１に示す。本明細書に開示した発明の化合物は、Sigma-Aldrich(St.Louis,Missouri, USA)及びChembridge Corporation(San Diego,California, USA)の様な、しかしこれらに制限されない、適切な市販供給源から得ることができる。
【０１１４】
あるいは、カルコン、アザカルコン及びこれらの類似体もまた既知の方法で合成することができる。例えば、カルコン及びアザカルコンは、適切なアリールアルデヒド及びアリールケトンを縮合させ、その後脱水させ（Ｈ２Ｏの除去）、エノンを作成する。該縮合は、酸又は塩基を触媒とすることができる。幾つかの実施態様において、ベンズアルデヒド、置換ベンズアルデヒド又はこれらのアザ類似体を、アセトフェノン、置換アセトフェノン又はこれらのアザ類似体と、塩基（例えば、ＮａＯＨ水溶液）存在下に、適切な温度で、ある時間の間（例えば、分、１から数時間、１日又は２日以上）混ぜ合わせることができる。該溶液を疎水性溶媒を用いて抽出し、濃縮してカルコン及びアザカルコンを提供することができる。幾つかの実施態様において、該抽出物をさらに、クロマトグラフィー又は再結晶のようないかなる方法を用いても、精製することができる。
【０１１５】
【表１】
2010531304.tif 000047
【０１１６】
実施例２
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み変え酵素検定
ＰＦＫＦＢ３クローニング、発現及び精製：  ヒトＰＦＫＦＢ３  ｃＤＮＡを以下のプライマー：
PFKFB3F:  5'-CTTCATATGCCGTTGGAACTGACGCA-3' (配列番号３)
PFKFB3R:  5'-CTTCTCGAGGTGTTTCCTGGAGGAGTCAGC-3' (配列番号４)
を用いて、既存の哺乳動物発現プラスミドから増幅した。
該ＰＣＡ産物は、ＸｈｏＩ及びＮｄｅＩ制限酵素(Promega, Madison, Wisconsin, USA)で消化し、またｐＥＴ−３０ｂ（＋）ベクター(Novagen, San Diego, California, USA)の対応する位置にクローン化した。該ｐＥＴ−３０ｂ（＋）−ＰＦＫＦＢ３Ｃ−ｔｅｒｍＨｉｓ  ｐｌａｓｍｉｄをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．  ｃｏｌｉ  コンピテント細胞(Novagen, San Diego, California, USA)に形質導入した。
【０１１７】
ＰＦＫＦＢ３の発現及び精製のために、ＢＬ２１−ＰＦＫＦＢ３形質転換細胞の１Ｌ培養を１６時間、３７℃で振盪した。１６時間後に、この培養液に、さらに１Ｌの２ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；最終濃度＝１ｍＭ）を含むＬＢ培地を加えた、そして４時間３０℃で振盪した。細菌を遠心で集菌し、タンパク質精製をＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｌｏ，オランダ）に記載されたプロトコールに従い、自然条件下で行った。手短に言うと、細菌ペレットを１回Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝液(PBS;Invitrogen,Carlsbad,California, USA)で洗浄し、ペレットのグラム当たり２ｍＬの溶解緩衝液に懸濁し、この溶解緩衝液は、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍＬ  リゾチーム、１ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフッ化物（ＰＭＳＦ）を含みさらにプロテアーゼ阻害カクテル(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri, USA)１：１００稀釈液を添加したものである。次ぎに該細菌混合物を、１０秒間、８回超音波に懸け、遠心により上清を得た。溶解物を１時間、３ｍＬの５０％  Ｎｉ−ＮＴＡとインキュベートし、該混合物をＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム(BioRad,Hercules,California, USA)に載せた。ビーズを１ｍＭ  ＰＭＳＦ及びプロテアーゼ阻害カクテルの１：１００稀釈液を含む１５ｍＬの６ｘＨｉｓ洗浄緩衝液で洗浄し、ＰＦＫＦＢ３を、２００ｍＭイミダゾールを含む１．５ｍＬの溶出緩衝液で溶出した。さらなる精製のために、溶出分画を１６時間２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液に対して透析して、その後Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００カラム(Amersham,Piscataway,New Jersey, USA)によりゲル濾過した。
【０１１８】
ＰＦＫＦＢ３酵素検定：  既述のように、ＰＦＫＦＢ３活性を、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼを用いた酵素共役のキネティック検定により測定した。Bucher及びPfleiderer, Methods in Enzymology, 1, 435-440 (1955)を参照されたい。該検定は、化学量論的に１ｍｏｌ  ＡＴＰ：１ｍｏｌ  消費ＮＡＤＨに従い、３４０ｎｍでの吸光度の減少から分光学的にＮＡＤＨ消費を測定する。該検定を、３７℃で、最終２００μＬの反応溶液を用いて、９６ウェルプレートを用いて行ったが、該反応溶液には、１ｘＰＦＫＦＢ３  反応緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００μＭ  ＥＤＴＡ，  ５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ＝７．４）、４２０μＭ  ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ），５ｍＭ  ＡＴＰ，  ４００μＭ  ＮＡＤＨ，６１３ユニットのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、１０９２ユニットの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ），様々な濃度のフルクトース−６−リン酸（４０〜４００μＭ）及び１５μｇの精製ＰＦＫＦＢ３が含まれた。酵素検定のための対照反応として、Ｆ６Ｐ無しの活性ＰＦＫＦＢ３を用いた。化合物１阻害に対し、６０μＭ，１００μＭ又は１５０μＭ阻害剤存在下で、反応を行った。化合物１阻害に対する対照反応は、ＰＦＫＦＢ３の添加無しで、様々な濃度の１を用いた。検定は、BioTek POWERWAVE(R)プレートリーダー(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,Vermont, USA)を用いて、１５分以上のキネティックモードで、測定して、ＰＦＫＦＢ３の反応速度を測定した。SigmaPlot(R)9.0(SYSTAT Software,Inc., San Jose, California, USA)に対する酵素キネティック測定規準を用いて、ＰＦＫＦＢ３及び１阻害に対するキネティックパラメーター（Ｖｍａｘ，Ｋｍ及びＫｉ）を計算した。Ｖｍａｘは、ＰＦＫＦＢ３の比活性を、ｎｍｏｌＦ６Ｐ×ｍｉｎ―１×ｍｇ−１で表し、Ｋｍ及びＫｉは、それぞれ、Ｆ６Ｐ又は１に対して、μＭで表される。表示したデータは、２回の独立した実験の、３通りの実験の平均値±ＳＴＤである。
【０１１９】
図３Ａに示すように、Lineweaver-Burke2重逆数プロットにより、１はＰＦＫＦＢ３活性を競合的及び非競合的な、阻害機構によりＰＦＫＦＢ３活性を阻害していることが明らかとなる。１とのインキュベーションにより、低濃度のＦ６Ｐで、ＰＦＫＦＢ３酵素活性の顕著な用量依存的減少がもたらされる。しかしながら、この阻害は、Ｆ６Ｐ量の増加により克服されるので、ＰＦＫＦＢ３結合位置において、１とＦ６Ｐの間で競合が在ることが示唆される。これらの研究より、酵素反応速度パラメーターを、ＰＦＫＦＢ３活性及び化合物１阻害に対して計算した。組み換えＰＦＫＦＢ３の比活性は、２７７±９ｎｍｏｌ  Ｆ６Ｐ×ｍｉｎ―１×ｍｇ−１であることが分かり、またＦ６Ｐに対するＫｍは９７μＭと決定された。図３Ｂを参照されたい。１に対するＫｉは、２５±９μＭと決定され、この値は、Ｆ６Ｐに対するＫｍと比較して、約４分の１に減少した。これらの研究により、１は主にＦ６Ｐとの競合によるＰＦＫＦＢ３の阻害剤であり、競合的阻害剤に対する酵素基質結合位置の分子標的は、抗癌治療同定するための重要な方法であることが、確認できた。
【０１２０】
実施例３
形質転換した腫瘍細胞における化合物１の毒性
哺乳動物発現に対するＦＬＡＧ−ＰＦＫＦＢ３構築体の作成：  ＰＦＫＦＢ３全コード配列及びＮ−末端にＦＬＡＧ−エピトープを含むＦＬＡＧ−ＰＦＫＦＢ３をレトロウィルスＴｅｔ応答性ベクターｐＲｅｖＴＲＥ(Clontech,Mountain View,California, USA)内のＢａｍＨ１／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にサブクローン化した。組み換えレトロウィルスは、Lipofectamine(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)を仲立ちとするＰＴ６７パッケージ細胞株にｐＲｅｖＴＲＥ−ＦＬＡＧ−ＰＦＫＦＢ３構築体を形質導入することより作り出した。誘導可能ＦＬＡＧ−ＰＦＫＦＢ３を安定的に組み込み、また発現するＪｕｒｋａｔ細胞株を作るために、細胞をＦＬＡＧ−ＰＦＫＦＢ３を含む組み換えレトロウィルスで感染させ、４００μｇ／ｍＬ  ヒグロマイシン(Clontech, Mountain View, California, USA)存在下で安定なクローンを選択した。
【０１２１】
細胞培養：  Ｋ５６２，ＨＬ−６０，ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びメラノーマ（ＣＲＬ−１１１７４）ヒト癌細胞株をＡＴＣＣ(American Tissue Type Culture Collection,Manassas,Virginia, USA)から購入した。ＨｅＬａ，Ａ５４９，Ｌｅｗｉｓ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びメラノーマ細胞を１０％  仔牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ， USA）及び５０μｇ／ｍＬ  硫酸ゲンタマイシン(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)を補強したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）(Hyclone, Logan, Utah, USA)中で増殖させた。ＨＬ−６０、Ｋ５６２及びＪｕｒｋａｔ細胞は、１０％  仔牛胎児血清及び５０μｇ／ｍＬ  硫酸ゲンタマイシンを補強したＲＰＭＩ−１６４０培地(Hyclone,Logan,Utah, USA)で増殖させた。初代正常ヒト気管上皮（ＮＨＢＥ）細胞及びヒトテロメラーゼ（ｈｔ）及びラージＴ抗原（ＬＴ）で不死化し、また突然変異したｒａｓでトランスフォームした細胞（ｈｔ／ＬＴ／ｒａｓ細胞）は、５２μｇ／ｍＬ  仔牛脳下垂体抽出物、０．５μｇ／ｍＬ  ハイドロコーチゾン、０．５ｎｇ／ｍＬ  ヒト上皮成長因子、０．５μｇ／ｍＬ  エピネフィリン、１０μｇ／ｍＬ  トランスフェリン、５μｇ／ｍＬ  インシュリン、０．１ｎｇ／ｍＬ  レチノイン酸、６．５ｎｇ／ｍＬ  三ヨウ化チロニン、５０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン及び５０ｎｇ／ｍＬ  アンフォテリシンＢ(SingleQuots, Cambrex, Walkersville, Maryland, USA)を補強したBronchial Epithelial Cell Basal Growth Medium(Cambrex, Walkersville, Maryland, USA)中で培養した。全ての細胞株は、３７℃で、５％  ＣＯ２下で維持した。
【０１２２】
細胞周期解析及びフローサイトメトリー：  Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％  ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍＬ  硫酸ゲンタマイシンを補強したＲＰＭＩ培地中で１×１０５細胞／ｍＬの密度で蒔種した。細胞周期をVybrant DyeCycle Orange染色(Molecular Probes-Invitrogen, Eugene, Oregon, USA)を用い製造者の指針に従って行った。
【０１２３】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ増殖抑制：  全ての細胞株を１×１０５細胞／ｗｅｌｌの密度で、適切な培地中に蒔種した。懸濁細胞に対して、様々な濃度の１を直ちに培地に加えた、それに対して、接着細胞に対しては、化合物１処理は、翌日に開始した。用量依存性研究に於いて、３６時間にわたって様々な濃度の化合物１を加えた。時間依存性研究に於いて、１０μＭの化合物１を、０，４，８，１６，２４，又は３６時間目に加えた。ＰＦＫＦＢ３過剰発現研究のために、ＦＬＡＧ―ＰＦＫＦＢ３発現ベクター又は対照プラスミドを含むＪｕｒｋａｔ細胞を、化合物１とのインキュベーションの２４時間前にドキシサイクリン（１?ｇ／ｍＬ；Clontech,Mountain View,California, USA）投与により誘導した。
細胞を処理４８時間後に集め、細胞数及び生存率をトリパンブルー排除法により測定した。溶媒処理細胞増殖の５０％増殖に必要な化合物１濃度として、ＩＣ５０値を計算した。表示したデータは、３回の独立した実験からの３通りの測定の平均値±ＳＴＤである。
【０１２４】
乳酸塩測定：  １×１０５Ｊｕｒｋａｔ細胞を様々な濃度の１とインキュベートした。望みの時点で、培地試料を集め、製造者(Trinity, St.Louis, Missouri, USA)の指針に従い、乳酸オキシダーゼをベースとした５４０ｎｍで測定の比色検定により乳酸塩レベルを測定し、タンパク質濃度に対して規格化した。
【０１２５】
フルクトース−２，６−ビスリン酸塩検定：  Ｊｕｒｋａｔ細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で蒔種して、直ちに１０μＭ  化合物１と０，４，８，１６，２４又は３６時間インキュベートした。Ｆ２，６ＢＰ検定は、既述のように行った。Van Shaftingenほか,Eur.J.Biochem,129,191-195(1982)を参照されたい。
【０１２６】
２−デオキシ−グルコース取り込み：  Ｊｕｒｋａｔ細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で、１０％ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍＬ  硫酸ゲンタマイシンを補強したＲＰＭＩ培地に蒔種した。細胞を直ちに、溶媒（ＤＭＳＯ）又は１０μＭ  化合物１で、３６時間までの間、処理し、その後、グルコースを欠いたＲＰＭＩ培地に３０分間置いた。１４Ｃ−２−ＤＧ（０．２５?Ｃｉ／ｍＬ；Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA)を６０分間加えた。その後、細胞を３回氷冷したグルコースを欠いたＲＰＭＩで洗浄した。細胞溶解液を５００μＬの０．１％ＳＤＳ中に集め、溶解液４００μＬについてシンチレーション（ｃｐｍ）を計数した。計数値をタンパク質濃度について規格化した。２回の独立した実験について、２回の測定値の平均値±ＳＴＤで、データを表した。
【０１２７】
全細胞ＡＴＰ：  Ｊｕｒｋａｔ細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で蒔種し、様々な時点について１０μＭ  化合物１とインキュベートした。ＡＴＰレベルを、Molecular Probes-Invitrogen(Eugene, Oregon, USA)から得たＡＴＰ測定キットを用いて、製造者の指針に従って測定した。
【０１２８】
ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨレベル：  Ｊｕｒｋａｔ細胞を１×１０５細胞／ｍＬの密度で蒔種し、直ちに１０μＭ化合物１と、０，４，８，１６，２４又は３６時間インキュベートした。ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨレベルを、BioAssay Systems(Hayward,California, USA)から得たＥｎｚｙＣｈｒｏｍ  ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ検定キットを用いて、製造者の指針に従い測定した。
【０１２９】
ＮＭＲ：  Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１３Ｃ−グルコース存在下で、３６時間、溶媒（ＤＭＳＯ）又は１０μＭ  化合物１で処理した。同数の細胞をペレットにし、２回冷却したＰＢＳで洗浄して、残った培地を除き、最終的にペレットにし、液体窒素中で瞬時に凍結した。冷却したペレットから氷冷した１０％ＴＣＡで２回抽出し、その後凍結乾燥した。乾燥した抽出物を、０．３５ｍＬ  Ｄ２Ｏに再溶解し５ｍｍ  Ｓｈｉｇｅｍｉチューブに入れた。ＮＭＲスペクトルは、Varian Inova NMR スペクトロメーター(Varian,Inc., Palo Alto, California, USA)上で、２０℃で、９０°励起パルスを用いて、１４．１Ｔで、記録した。２次元ＴＯＣＳＹ及びＨＳＱＣ実験を行った。代謝物を、１Ｈ及び１３Ｃ化学シフト及びＴＯＣＳＹコネクティヴィティパターンを基に同定した。代謝物は、ＴＯＣＳＹ実験で積分により定量した。
【０１３０】
タンパク質抽出及びウェスターンブロット解析：  タンパク質抽出及びウェスターンブロット解析は、以前の記載のように行った。Telangほか, Oncogene, 25, 7225-7234 (2006)を参照されたい。ブロットは、抗−ＰＦＫＦＢ３抗体(Abjent, Inc., San Diego, California, USA)及び抗−β−アクチン抗体(Sigma, St.Louis, Missouri, USA)を用いて、先ずＰＦＫＦＢ３に対して探索し、その後プローブを外し、β−アクチンに対して再探索した。
【０１３１】
結果：  解糖フラックスの増加がトランスフォームした細胞増殖に必要と仮定すると、特別の理論に囚われることなく、ＰＦＫＦＢ３の阻害は、選択的に腫瘍細胞増殖を標的とする。トランスフォームしたＮＨＢＥ細胞（ｈｔ／ＬＴ／ｒａｓ）は、遺伝的に一致する初代細胞と比較して、１に対してより大きな感受性があった。図４Ａを参照のこと。初代ＮＨＢＥ細胞は、１とのインキュベーションに対して、試験した最高濃度（３３μＭ）で、顕著な感受性を示さなかった。しかしながら、トランスフォームした細胞を１μＭ以下の濃度で１と処理すると、細胞増殖停止を示し、また約１０μＭで完全に細胞毒性を示した。ＮＨＢＥ−ｈｔ／ＬＴ／ｒａｓ細胞に対する１のＩＣ５０は１．５μＭと測定された。従って、化合物１は、他の解糖阻害剤、２−ＤＧ及び３−ＢｒＰＡ、（それぞれ、低ｍＭ濃度から、１００μＭで有効であった）に比べて１０倍以上の阻害能を示した。
【０１３２】
固形腫瘍及び血液由来疾患由来の細胞株を含め、トランスフォームした細胞に対する１の効果を、さらに様々な腫瘍細胞に対する１のＩＣ５０を計算することにより吟味した。白血病細胞株は、接着細胞株に比べて、１の処理に対して増加した感受性（平均して約７倍）を示した。図４Ｂを参照されたい。Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ及びＨＬ−６０白血病細胞に対するＩＣ５０値は、それぞれ、３．２，１．４及び４．５μＭと決定された。接着細胞において、ＩＣ５０の差異は大きかった。２種の肺癌モデル、ヒトＡ５４９及びマウスＬＬＣ，では、ＩＣ５０値は、それぞれ、２４及び１９μＭであり、他方ＨｅＬａ子宮頸癌細胞のＩＣ５０値は，２４μＭであった。ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺癌細胞は化合物１との処理に対して、他の固形癌由来細胞株と比較して特に感受性が高く、計算したＩＣ５０値は、４．７μＭであった。最後に、メラノーマ細胞株のＩＣ５０値は１５μＭであった。従って、１は、腫瘍細胞増殖を選択的に標的とする抗癌化合物であろう。
【０１３３】
１とのインキュベーションは、ＪｕｒｋａｔＴ細胞白血病細胞の増殖の用量依存的低下をもたらした。図５Ａを参照されたい。０．３μＭほどの３ＰＯが、細胞増殖を低下させて、また１０μＭ  ３ＰＯは、３６時間にわたって、完全に細胞増殖を阻害した。図５Ａ及び５Ｂを参照されたい。細胞増殖の抑制は、ヨウ化プロピジウム染色で測定したように、Ｇ２／Ｍ期の細胞周期停止の結果であるようである。図５Ｃ及び５Ｄを参照されたい。またＦｒｕ−２，６−ＢＰ産生、２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）取り込み、乳酸塩分泌に対する１０μＭ  １の効果も調べた。図５Ｅを参照されたい。２−ＤＧ取り込み及びＦｒｕ−２，６−ＢＰは、４時間の処理の間に顕著に減少した。これらの代謝上の変化の後に、乳酸塩分泌（図５Ｅ；８時間を参照）、ＮＡＤＨ（図５Ｆ；１６時間参照）、ＮＡＤ＋（図５Ｆ；２４時間参照）及びＡＴＰ（図５Ｆ；２４時間参照）の減少が続く。１との処理の間、Ｊｕｒｋａｔ細胞を完全に標識した１３Ｃ−グルコースでパルスし、またＮＭＲ分光で１３Ｃ原子の運命を調べることにより、解糖の乳酸塩への直接のフラックスが抑制された。図５Ｇを参照されたい。
【０１３４】
１が細胞内のＦｒｕ−２，６−ＢＰ，２−ＤＧ取り込み及び乳酸塩分泌をＧ２／Ｍ期停止前に減少させると言う観察により、特定の理論に囚われることなく、１がエネルギー的及び同化的代謝の中断により細胞増殖を阻害すると言う仮説が、相当自然に支持される。ＨＬ−６０前骨髄球性白血病細胞において以前観察された様に、１によるＧ２／Ｍ期停止は、細胞周期のＧ２／Ｍ期間のＡＴＰの高い要求性と比べると、補助的でありうる。Sweet及びSingh,Cancer Res.,55,5164-5167(1995)を参照されたい。１３Ｃ−グルコースのＮＭＲ分光による追跡から、解糖のアラニンではなく、乳酸塩へのフラックスが阻害されたことが明らかとなった。アラニン及び乳酸塩は同じピルビン酸プールを分かち合うが、乳酸デヒドロゲナーゼは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを経る解糖フラックスの産物である、ＮＡＤＨの即応の補給を必要とするので、グルコースに由来する乳酸塩産生は、特に解糖阻害により影響を受ける。
【０１３５】
新しい抗ガン治療の最も困難な課題の一つは、ｉｎ  ｓｉｔｕの標的検証である。この問題に取り組むために、異なるＰＦＫＦＢ３発現レベルを有する２種の異なる細胞株を研究した。もし、ＰＦＫＦＢ３が真に１の標的であるならば、該酵素の発現が低下した細胞は、１の処理に対してより感受性があるか、又は逆である。従って、ＰＦＫＦＢ３半数不足型（＋／−）繊維芽細胞をヒトテロメラーゼ（ｈｔ）及びラージＴ抗原（ＬＴ）で不死化させ、突然変異型ｒａｓの発現によりトランスフォームさせた（ＰＦＫＦＢ３  ＋／−ｈｔ／ＬＴ／ｒａｓ）これらの繊維芽細胞は、約５０％のＰＦＫＦＢ３発現及び低下したＦ２，６ＢＰ産生を有することが示された。該＋／−ｈｔ／ＬＴ／ｒａｓトランスフォーム細胞及びこれらの野生型の遺伝子にマッチした対応細胞（＋／＋ｈｔ／ＬＴ／ｒａｓ）を様々な濃度の１とインキュベートした。
【０１３６】
図６Ａに示すように、ＰＦＫＦＢ３＋／−  ＬＴ／ｒａｓトランスフォーム繊維芽細胞は、野生型対応細胞に比べて、低下したＰＦＫＦＢ３タンパク質及び低下した細胞内Ｆ２，６ＢＰを発現する。野生型細胞における、Ｆ２，６ＢＰ濃度は、６０．３±３．７  ｐｍｏｌ／ｍｇであり、他方ＰＦＫＦＢ３＋／−ＬＴ／ｒａｓトランスフォーム繊維芽細胞では、Ｆ２，６ＢＰ濃度は、１０．３±１．５  ｐｍｏｌ／ｍｇであった。図６Ｂに示すように、ＰＦＫＦＢ３異形接合繊維芽細胞は野生型トランスフォーム細胞に比べて、１の処理に対してより感受性が高かった。＋／−繊維芽細胞に対する計算したＩＣ５０値（２６μＭ）は、＋／＋繊維芽細胞に対するＩＣ５０値（４９μＭ）の約半分であった。
【０１３７】
逆に、ＰＦＫＦＢ３の過剰発現は、細胞と１のインキュベーションによる細胞増殖の低下を抑制するはずである。Ｊｕｒｋａｔ細胞において、ドキシサイクリン応答性ＰＦＫＦＢ３  Ｔｅｔ−ＯＮシステムの影響下で、ＰＦＫＦＢ３レベルを操作した。ドキシサイクリン処理した、ＰＦＫＦＢ３発現ベクターを持たない対照  Ｊｕｒｋａｔ細胞に比較して、ドキシサイクリン処理によりＰＦＫＦＢ３発現が増加する。ＰＦＫＦＢ３タンパク質の異所性の発現は、Ｆ２，６ＢＰ濃度を増加させる。図６Ｃに示すように、＋ＰＦＫＦＢ３細胞におけるＦ２，６ＢＰ濃度は、３８．１±３．４ｐｍｏｌ／ｍｇであり、他方、対照細胞において、Ｆ２，６ＢＰの濃度は、９．２±０．９５ｐｍｏｌ／ｍｇであった。両種の細胞を様々な濃度の１とインキュベートした、そして、予想されたように、過剰発現したＰＦＫＦＢ３は、Ｊｕｒｋａｔ細胞への阻害剤の効果を抑制した（図６Ｄ）。ＰＦＫＦＢ３過剰発現細胞に対するＩＣ５０値は、１９．３μＭと決定されたが、ＰＦＫＦＢ３発現レベルの変わらぬＪｕｒｋａｔ細胞のＩＣ５０は８．９μＭと計算された。
総合すると、これらの研究は、ＰＦＫＦＢ３発現を調節することにより、１の細胞阻害効果を変えることができることを示し、ＰＦＫＦＢ３が１の有効なｉｎ  ｓｉｔｕ標的であることを示唆する。
【０１３８】
実施例４
化合物１を用いたＩｎ  Ｖｉｖｏ研究
対数増殖期のＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＨＬ−６０細胞を適切な培地に集め、２回洗浄して、２０×１０７細胞／ｍＬの密度でＰＢＳに再懸濁した。次ぎに細胞を１：１の割合でＭａｔｒｉｇｅｌマトリクス(BD Biosciences, Bedford, Massachusetts, USA)と混ぜ、０．１ｍＬの細胞懸濁液（１×１０７細胞）を雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（２０ｇ）の皮下に注射した。対数増殖期のＬｅｗｉｓ肺癌細胞を集め、２回洗浄し、ＰＢＳに懸濁した（１×１０７細胞／ｍＬ）。Ｃ５７Ｂｌｋ／６雌マウス（２０ｇ）の皮下に０．１ｍＬの容積で１×１０６細胞を注射した。体重及び腫瘍増殖を研究の間中、毎日観察した。重量（ｍｇ）＝［幅（ｍｍ２）×長さ（ｍｍ）］／２の式を用いて、腫瘍重量をノギスで測定した。Ｔａｅｔｌｅほか，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．，７１，２９７−３０４（１９８７）を参照されたい。樹立した腫瘍を有するマウス（１３０ｍｇ〜１９０ｍｇ）を無作為に溶媒対照又は化合物１処理群に分けた。指示した時点で、溶媒対照グループには、５０μＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を腹腔注射（ｉ．ｐ．）し、他方、処理群には、０．０７ｍｇ／ｇ  化合物１を含む５０μＬ  ＤＭＳＯをｉ．ｐ．注射した。
【０１３９】
結果：１の毒性研究により、副作用の発現の無かった最高の容認された投与量は、０．０７ｍｇ／ｇ  を含むＤＭＳＯの腹腔（ＩＰ）注射であった。試験した第１の腫瘍モデルは、Ｃ５７／Ｂｌｋ６マウスに異種移植増殖するマウスＬｅｗｉｓ肺癌細胞からなる。この研究のために、マウスにＤＭＳＯ又は計算した投与量の１を研究の期間（１４日間）、毎日一度、ＩＰ注射した。図７Ａに示したように、１の投与は、顕著にＤＭＳＯ対照群と比較して、Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞異種移植体の増殖を７３％抑えた。別個に、ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳腺癌をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに樹立した。このモデルにおいて、処理の低下が、Ｌｅｗｉｓ肺癌モデルで見られたと同じ効果をもたらすかどうか決めるために、投与量の回数を減らした。ＤＭＳＯ（対照）及び化合物１処理群の両者のマウスに対して、３日間毎日の注射後、３日間の無処理という周期的な投薬計画を行った。ＤＭＳＯ対照と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の異種移植体増殖の全阻害は最大６６％観察された（図７Ｂ）．３番目のｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに異種移植したＨＬ−６０白血病細胞である。処理計画はさらに減らして、２日間の連続注射後、７日間連続の無処理とした。図７Ｃに示すように、化合物１処理により、制限された投与にもかかわらず、ＤＭＳＯ対照と比較して、ＨＬ−６０腫瘍増殖が７４％以上阻害された。さらに、２回目の投与計画の効率は９日目の投与後の増殖低下が、増殖曲線上で見られる。Ｌｅｗｉｓ  肺癌及びＨＬ−６０異種移植モデルに対する化合物１の効果は、腫瘍増殖の後退が見られないことから、細胞増殖停止と思われる。しかしながら、ＭＤＡ−ＭＢ２３１モデルでは、化合物１阻害が、初期の細胞増殖停止効果から初期の腫瘍後退を導き、その後他の２モデルで見られるような細胞増殖停止をカバーするようである。まとめると、上記のデータから、化合物１がｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖を減少させる能力を有する抗癌剤の可能性を有するものと支持される。
【０１４０】
実施例５
化合物２〜７によるＰＦＫＦＢ３の阻害
化合物２〜７がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＦＫＦＢ３活性の阻害能を有することは、上記実施例２に記載した酵素検定法を用いて測定した。１５０μＭ化合物２の処理により、溶媒（ＥｔＯＨ）処理と比較してＰＦＫＦＢ３の反応速度を３９．８％減少させた。図８を参照されたい。溶媒（ＤＭＳＯ）処理と比較した、化合物３〜７の阻害効果は、図９に示されている。化合物４が最もＰＦＫＦＢ３を低下させ、８０％以上であった。
【０１４１】
実施例６
トランスフォーム腫瘍細胞における化合物２〜７の毒性
様々なトランスフォーム細胞株に対する化合物２〜７の毒性は、上記実施例３に記載したように検定した。化合物２は、２種の白血病細胞ＨＬ−６０及びＫ５６２細胞において、用量依存的細胞毒性を示した。図１０を参照されたい。Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞増殖への様々な濃度の化合物３〜７の効果を図１１〜１５に示す。
図１６〜２１は、様々なトランスフォーム細胞において、化合物濃度０．３，１，３，１０，又は３３μＭで処理した化合物２〜７の効果を示す。化合物２〜７の６種全ては、検定した固形腫瘍及び血液細胞タイプのそれぞれの増殖を阻害した。
【０１４２】
実施例７
Ｍｉｃｒｏ−Ｐｅｔにより観察したグルコース取り込みに対する化合物１の効果
Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウス（２０ｇ）に、１×１０６Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞を皮下に注射した。異種移植体の重量を測定して１５０及び１８０ｍｇの間になった時、該マウスを２群に分けた。１群には、０．０７ｍｇ／ｇの化合物１をｉ．ｐ．注射した。他の群を対照群として用い、５０μＬ  ＤＭＳＯをｉ．ｐ．注射した。注射４時間後腫瘍を取り除き、等容量の０．１Ｍ及び０．０５Ｍ  ＮａＯＨ中でホモジナイズした。Ｆ２，６ＢＰアッセイを既述のように行った。Van Shaftingenほか.,Eur.J.Biochem,129,191-195 (1982)を参照されたい。化合物１処理により、腫瘍異種移植体中のＦ２，６ＢＰ産生は溶媒処理の対照群と比較して、顕著に減少した。化合物１処理のマウス異種移植体中のＦ２，６ＢＰ濃度は８．５±１．７ｐｍｏｌ／ｍｇであり、他方、対照マウス異種移植体中のＦ２，６ＢＰ濃度は、１３．１±１．９ｐｍｏｌ／ｍｇであった。
【０１４３】
化合物１の効果をさらに調べるために、化合物１−処理マウスにおけるグルコースの取り込みをミクローポジトロン発光断層撮影法（ｍｉｃｒｏ―Ｐｅｔ）を用いて研究した。Ｌｅｗｉｓ肺癌異種移植体を担うマウスに５０μＬのＤＭＳＯ又は０．０７ｍｇ／ｇ  化合物１のＤＭＳＯ溶液をｉ．ｐ．注射した。最初の注射３０分後に、各マウスに２−（１８Ｆ）−フルオロ−２−デオキシグルコース（１８Ｆ−２−ＤＧ；１５０μＣｕｒｉｅ、１００μＬ  Ｈ２Ｏ中）をｉ．ｐ．注射した。さらに１５分後に、マウスを酸素中２％  イソフルランで麻酔し、R-4 Rodent Scanner Micro-Pet(CTI Concorde Microsystems, Inc.; Knoxville, Tennessee, USA）に移した。各群（即ち化合物１処置又は対照）３匹のマウスを研究した。図２２は、代表的な化合物１−処理マウス及び代表的対照群マウスから取ったｍｉｃｒｏ―Ｐｅｔ画像である。
【０１４４】
図２２に示すように、化合物１処理により、異種移植体内の１８Ｆ−２−ＤＧ取り込みは、対照群マウスと比較して著しく減少した。化合物１処理マウス及び対照群マウスの間で、心臓の１８Ｆ−２−ＤＧ取り込みにも差異が観測された。超音波心臓診断法を、Ｄａｗｎほか，Proc.Natl.Acad.Aci.,U.S.A.,102,3766-3771(2005)に記載されたように行った。マウスの心臓機能の超音波心臓診断により、駆出分画に急性の変化は見られなかった（対照（溶媒）：６９％±４％；化合物１：７１％±６％）。従って、心臓グルコース取り込みの差異は、化合物１の心臓毒性によるものではないようである。まとめると、１はｉｎ  ｖｉｖｏでＰＦＫ２活性を標的とし、解糖表現型を低下させる。
【０１４５】
実施例８
トランスジェニックマウスの腫瘍量への化合物１の効果
トランスジェニックＭＭＴＶ−Ｎｅｕ乳腫瘍マウスは、乳腺癌を生後３〜４ヶ月以内に発症し、マウス乳癌ウィルスプロモーター／エンハンサーの調節の下の癌遺伝子Ｎｅｕのトランスジェニック発現による。これらのマウスは、これらの腫瘍増殖の性質の陰険さ及び組織培養条件に起因する人為性がない結果として、異種移植体モデルと比べて、ヒト癌により密接に類似する。
トランスジェニックＭＭＴＶ−Ｎｅｕ乳癌マウスへの化合物１の効果を測るために、トランスジェニックマウスにおける相対的腫瘍率及び大きさを４ヶ月後に測定し、同等な腫瘍負荷になる様に無作為に２群に分けた。１群のマウスは、化合物１を３日間毎日の投与（０．０７ｍｇ／ｇ、ＤＭＳＯ中；腹腔投与；矢印を参照；腫瘍量が体重の１０％を越えるまで）、その後３日間無処理の繰り返しサイクル投与を行った。対照マウスには、溶媒対照（ＤＭＳＯのみ）で注射した。腫瘍量は、次の確立した式：重量（ｍｇ）＝（幅、ｍｍ２×長さ，ｍｍ）／２に従い測定した。統計的な有意性を得るために、（α値が０．０５及び指数が０．９０と仮定して）各群に３０匹のマウスを必要とした。長期にわたる腫瘍量への化合物１処理の効果を図２３に示す。
【０１４６】
本明細書に開示した対照事項の様々な詳細を、本明細書に開示した発明の範囲から離れることなく、変更できる。さらに、既に述べた記載は、説明の目的のためにのみ有り、制限付けの目的のためではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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