(57)【要約】本発明は、タンパク質S6K2、PKCε、およびB-Rafのうち2つまたはそれ以上を含む複合体に関する。本発明は、複合体に特異的に結合する抗体、複合体の阻害剤、ならびに患者の化学療法抵抗性の診断および予防における抗体、阻害剤、および複合体の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
S6K2、B-Raf、およびPKCεのうち2つまたはそれ以上を含む複合体。
【請求項２】
癌細胞において化学療法抵抗性を誘発する能力のある、請求項1記載の複合体。
【請求項３】
S6K2が図1に提示される配列を含む、請求項1または2記載の複合体。
【請求項４】
B-Rafが図2に提示される配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の複合体。
【請求項５】
PKCεが図3に提示される配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の複合体。
【請求項６】
請求項1記載の複合体に特異的に結合する抗体。
【請求項７】
S6K2、PKCε、およびB-Rafのうち2つまたはそれ以上を発現する細胞に、試験化合物を接触させる段階、ならびに複合体が形成されたかどうかを決定する段階を含む、請求項1記載の複合体の阻害剤を同定する方法。
【請求項８】
S6K2、PKCε、およびB-Rafのうち2つまたはそれ以上に、試験化合物を接触させる段階、ならびに複合体が形成されたかどうかを決定する段階を含む、請求項1記載の複合体の阻害剤を同定する方法。
【請求項９】
請求項1記載の複合体の阻害剤。
【請求項１０】
請求項6または7記載の方法により同定される、請求項9記載の阻害剤。
【請求項１１】
B-Rafの発現を阻害する、請求項9記載の阻害剤。
【請求項１２】
PKCεの発現を阻害する、請求項9記載の阻害剤。
【請求項１３】
S6K2の発現を阻害する、請求項9記載の阻害剤。
【請求項１４】
S6K2、B-Raf、および/またはPKCεの会合を予防する、請求項9記載の阻害剤。
【請求項１５】
請求項1記載の複合体の阻害剤を細胞に投与する段階を含む、癌細胞において化学療法抵抗性を予防または逆行させる方法。
【請求項１６】
阻害剤が請求項6または7記載の方法によって同定される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
癌細胞が小細胞肺癌(SCLC)細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
阻害剤が、RNAi、アンチセンスRNA、リボザイムRNA、または抗体である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
請求項9〜14のいずれか一項記載の阻害剤、および薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
患者の癌細胞においてS6K2、B-Raf、およびPKCεを含む複合体を検出する段階を含む、癌患者において化学療法抵抗性を診断する方法。
【請求項２１】
患者の癌細胞におけるS6K2活性化のレベルを検出する段階、および患者の非癌細胞または非癌患者の細胞におけるS6K2活性化のレベルと比較する段階であって、S6K2活性化のレベルが、非癌細胞または非癌患者の細胞よりも癌細胞において高ければ、癌細胞が化学療法に抵抗性である段階を含む、癌患者において化学療法抵抗性を診断する方法。
【請求項２２】
2つまたはそれ以上の時点において細胞のS6K2活性化のレベルを測定する段階であって、時点間でS6K2活性化のレベルが上昇すれば、癌細胞が化学療法抵抗性を発生する可能性が高い段階を含む、癌細胞が化学療法抵抗性を発生する可能性を予測する方法。
【請求項２３】
細胞におけるS6K2レベルを検出する段階を含む、癌細胞において化学療法抵抗性を診断する方法。
【請求項２４】
癌細胞における化学療法抵抗性を予防または逆行するための薬剤の製造における、請求項1記載の複合体の阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質S6K2、PKCε、およびB-Rafのうち2つまたはそれ以上を含む複合体に関する。本発明は、複合体に特異的に結合する抗体、複合体の阻害剤、ならびに患者の化学療法抵抗性の診断および予防における抗体、阻害剤、および複合体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌はしばしば化学療法によって治療され、これは細胞毒性薬のような化学物質を1つまたは複数用いて癌細胞を「殺す」ものである。しかし、癌によってはこれらの薬剤に対して抵抗性になるものがあり、その治療はより困難に、または場合によっては不可能になる。たとえば、小細胞肺癌（SCLC）の患者は、しばしば化学療法抵抗性のために死亡する。小細胞肺癌（SCLS）はすべての肺腫瘍の20％にあたる。初めは感受性なのにもかかわらず、化学療法抵抗性疾患の再発は早く、全生存率は非常に悪い。化学療法抵抗性は、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、および膵臓癌のような他の癌にも起こり得る。
【０００３】
したがって、癌細胞のこの化学療法抵抗性を予防または逆行させる切迫した必要性がある。
【０００４】
成長因子は成長促進性のシグナルを提供し、特に線維芽細胞成長因子-2（FGF-2）はSCLCを含む癌の化学療法抵抗性の推進に関与しているとされてきた（Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003）。さらに、FGF-2の血清濃度の上昇は、SCLCの不利な転帰の独立した予後因子である（Ruotsalainen et al., 2002）。FGF-2は細胞外調節キナーゼシグナル伝達経路（MEK/ERK）の活性化を誘導し、それによりSCLCの治療に一般的に使用される薬剤エトポシドに対する抵抗性を誘発する（Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003）。生存促進効果は、抗アポトーシス分子Bcl-2、Bcl-XL、XIAP、およびcIAP1の翻訳の増加を介して起こった（Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003）。線維芽細胞成長因子-2（FGF-2）は抗アポトーシスタンパク質XIAPおよびBcl-XLの発現を上昇させ、SCLC細胞の化学療法抵抗性を誘発する。
【０００５】
40sリボソームタンパク質S6は真核細胞のリボソームの40sサブユニットの成分である。S6タンパク質はホルモンまたは成長因子に誘導される増殖のような、特定の細胞シグナル伝達イベントに応答して、2つのS6キナーゼによりリン酸化される。
【０００６】
S6KαおよびS6Kβとしても知られるリボソームS6キナーゼS6K1およびS6K2（Gout et al., 1998; Lee-Frumen et al., 1999; Shima et al., 1998）はいずれも翻訳機構を調節する（Dufner and Thomas, 1999）。各々のキナーゼは細胞質および核型を持つが、大部分の研究は細胞質のタンパク質に焦点を当てており、本明細書では単純化のためこれらをS6K1およびS6K2と呼ぶ。これらはいずれもS6タンパク質をリン酸化するため、重複する機能を持つと考えられる。しかし、最近のデータでは、これらの基質および役割は異なっていることが示唆されている。ただし、S6K2の正確な機能はまだ明らかではない（Richardson et al., 2004; Valovka et al., 2003）。したがって、相同性は高いものの、これらのNおよびC末端ドメインは実質的に異なっている；S6K1ノックアウトマウスは、S6K2の発現レベルが高くなっているものの体は小さく（Shima et al., 1998）、一方S6K2ヌルマウスは明らかな表現型を示さない（Pende et al., 2004）；S6K1の活性化はMEK阻害に感受性ではないが、本発明者らおよび他の研究者は、S6K2がMEKシグナル伝達の新規の標的であることを示した（Martin et al., 2001; Pardo et al., 2001; Wang et al., 2001）。WO 00/08173はS6K2の同定、およびインビトロでリボソームS6タンパク質をリン酸化するキナーゼとしてのその機能を記述した。
【０００７】
S6K2は、SCLC細胞を含むいくつかの細胞系でMEK/ERKの活性化に関与しているタンパク質ファミリー（Kawauchi et al., 1996; Seufferlein and Rozengurt, 1996; Zou et al., 1996）であるタンパク質キナーゼC（PKC）によっても調節されている（Valovka et al., 2003）。PKCファミリーは、在来型（cPKC：PKCα、PKCβ、PKCγ）、新型（nPKC：PKCδ、PKCε、PKCη、PKCθ）、および非典型（aPKC：PKCζおよびPKCι/λ）クラスを含む。cPKCの活性化はCa2+およびホルボールエステルの両方に依存しているが、nPKCはホルボールエステルしか必要とせず、aPKCはいずれの薬剤にも依存しない（Way et al., 2000）。使用される刺激によって、異なるサブクラスのPKCは異なる生理学的効果をもたらす（Way et al., 2000）。PKCεは肺癌細胞において生存促進/化学療法抵抗性を仲介するが（Ding et al., 2002）、この効果の根底にあるシグナル伝達機序は未同定である。Raf-1および/またはB-Rafは成長因子受容体のMEK/ERKおよびPKCへのカップリングに関与している（Cheng et al., 2001; Hamilton et al., 2001）。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、PKCε、B-Raf、およびS6K2がFGF-2処理に応答してシグナル伝達複合体を形成することを思いがけなく見つけた。PKCεのダウンレギュレーションは、SCLC細胞の薬剤に誘導される細胞死を誘導するが、PKCεの過剰発現はこれから保護する。これは驚くべきことにS6K2活性の上昇と相関しているが、S6K1活性とは相関していない。S6K2キナーゼ活性の上昇も、細胞の生存を増強するがS6K1は増強せず、S6K2のダウンレギュレーションはFGF-2を介した抗アポトーシス効果を予防するがS6K1はしない。
【０００９】
S6K1、Raf-1、および他のPKCアイソフォームは、同様な複合体を形成しない。RNAiを介したB-Raf、PKCε、またはS6K2のダウンレギュレーションは、FGF-2を介した生存を消滅させる。反対に、SCLC細胞におけるPKCεの過剰発現はXIAPおよびBcl-XLレベルならびに化学療法抵抗性を増加させる。テトラサイクリン誘導系では、増加したS6K2キナーゼ活性はXIAP、Bcl-XLおよび生存促進効果のアップレギュレーションを誘発する。しかし、増加したS6K1キナーゼ活性にはそのような効果はない。したがって、S6K2は生存促進/化学療法抵抗性シグナル伝達を仲介するが、S6K1はしない。
【００１０】
これらの予測できなかった結果は、S6K2とS6K1の生物活性が互いに異なることを示している。したがって、S6K1とは異なりS6K2は、PKCεおよびB-Rafを含むシグナル伝達複合体中に選択的に採用され、細胞死の調節に関与するmRNAのFGF-2を介した翻訳を制御する。
【００１１】
本発明は、S6K2、PKCε、およびB-Rafのうち2つまたはそれ以上を含む複合体に関する。この複合体は、化学療法抵抗性の発生に関与していることが見つかった。好ましくは複合体はS6K2、PKCε、およびB-Rafを含む。
【００１２】
第1の局面の好ましい特徴として、複合体は癌細胞の化学療法抵抗性を誘導することができる。S6K2は図1に提示されるような配列を含む可能性があり、B-Rafは図2に提示されるような配列を含む可能性があり、および/またはPKCεは図3に提示されるような配列を含む可能性がある。
【００１３】
本発明の第2の局面は、第1の局面の複合体に特異的に結合する抗体に関する。そのような抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、当技術分野で公知の任意の方法によって生産および単離される可能性がある。
【００１４】
そのような抗体は、第1の局面の複合体の検出または第1の局面の複合体の阻害に有用な場合がある。抗体は複合体中の2つまたはそれ以上のタンパク質S6K2、PCKε、またはB-Rafのうち任意のものに特異的に結合できる。抗体はタンパク質が複合体を形成した時にのみ利用でき接近できるようになるエピトープに結合する可能性がある。そのようなエピトープは、当業者に公知の方法によって同定できる。
【００１５】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性のある部分、すなわち、天然にせよ、部分的もしくは全体が合成によって生産されたにせよ、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。この用語は、抗体結合ドメインであるか、これに相同である結合ドメインを持つ、任意のポリペプチドまたはタンパク質も含む。これらは天然起源から得られるか、または部分的もしくは全体が合成によって生産される可能性がある。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、およびIgA）およびそのアイソタイプのサブクラス；Fab、scFv、Fv、dAb、Fdのような抗原結合ドメインを含む断片；ならびにダイアボディ（diabody）である。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。
【００１６】
モノクローナルおよび他の抗体を用いて、組み換えDNA技術を使って、もとの抗体の特異性を保持した他の抗体またはキメラ分子を生産することが可能である。そのような技術では、1つの抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域（CDR）をコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域とフレームワークとを合わせた領域に導入する。たとえば、EP-A-184187、GB 2188638A、またはEP-A-239400を参照されたい。ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞は、遺伝的変異または他の変化を受ける可能性があり、これにより産生される抗体の結合特異性が変わる場合も変わらない場合もある。
【００１７】
抗体はいくつかの方法で修飾できるので、「抗体」という用語は、必要な特異性を持つ結合ドメインを持つ、任意の特異的結合をするメンバーまたは物質を含むと理解する必要がある。したがって、この用語は、天然にせよ、または全体もしくは部分的に合成されたにせよ、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含め、抗体断片、誘導体、抗体の機能的同等物および相同体、ヒト化抗体を含む。したがって、免疫グロブリン結合ドメイン、または同等物を含み、別のポリペプチドに融合されたキメラ分子は、これに含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP-A-0120694およびEP-A-0125023に記述されている。ヒト化抗体は、非ヒト、例、マウス、の抗体の可変領域、およびヒト抗体の定常領域を持つ修飾抗体である可能性がある。ヒト化抗体の作製方法は、たとえば、USP 5225539に記述されている。
【００１８】
抗体全体の断片が抗原への結合機能を実行できることが示されている。結合する断片の例は、(i) VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなるFab断片；(ii) VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；(iii) 単一の抗体のVLおよびVHドメインからなるFv断片；(iv) VHドメインからなるdAb断片（Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)）；(v) 単離されたCDR領域；(vi) 2つの連結したFab断片を含む2価の断片であるF(ab’)2断片；(vii) VHドメインとVLドメインがペプチドリンカーで連結しており、それにより2つのドメインが会合して抗原結合部位を形成する、単鎖Fv分子（scFv）（Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85:5879-5883 (1988)）；(viii) 二重特異性単鎖Fv二量体（PCT/US92/09965）、および (ix) 遺伝子融合によって作製された多価または多特異性断片である「ダイアボディ」（WO94/13804; P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)である。
【００１９】
ダイアボディはポリペプチドの多量体であって、各々のポリペプチドは免疫グロブリンL鎖の結合領域を含む第1のドメイン、および免疫グロブリンのH鎖の結合領域を含む第2のドメインを含み、2つのドメインは連結しているが（例えば、ペプチドリンカーにより）、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない：抗原結合部位は多量体の中の1つのポリペプチドの第1のドメインと多量体の中の別のポリペプチドの第2のドメインとの会合により形成される（WO94/13804）。
【００２０】
二重特異性抗体が使用される場合は、これらは様々な方法で製造できる、例えば、化学的またはハイブリッドのハイブリドーマから調製される、従来の二重特異性抗体（Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449 (1993)）であってもよく、上記の任意の二重特異性抗体であってもよい。抗体全体よりも、scFv二量体またはダイアボディを使用する方が好ましい場合もある。ダイアボディおよびscFvは、可変ドメインのみを使用してFc領域なしに作製できるので、抗イディオタイプ反応の効果を軽減できる可能性がある。二重特異性抗体の他の形態には、Traunecker et al., EMBO Journal 10:3655-3659 (1991)に記述された単鎖「Janusins」が含まれる。
【００２１】
二重特異性抗体全体と異なり、二重特異性ダイアボディは、容易に作製でき、大腸菌（E. coli）で発現できるので、これも有用である可能性がある。適当な結合特異性を持つダイアボディ（および抗体断片のような他の多くのポリペプチド）は、ライブラリーからファージディスプレイ（WO94/13804）を用いて容易に選択できる。たとえば、ダイアボディの1つのアームを抗原Xに対する特異性を持つように一定にすれば、他のアームが変化に富むライブラリーを作製でき、適当な特異性を持つ抗体が選択できる。
【００２２】
本発明の第3の局面は、第1の局面の複合体の阻害剤を同定する方法を提供し、この方法はS6K2、PKCε、およびB-Rafのうち2つまたはそれ以上を発現する細胞に、試験化合物を接触させる段階、ならびに複合体が形成されたかどうかを決定する段階を含む。
【００２３】
このような方法は、当技術分野で公知の方法によって実行できる。たとえば、方法にはレポーター遺伝子が含まれる可能性がある。この場合、複合体が形成されなければ、レポーター遺伝子の発現のスイッチはオンまたはオフになり（複合体が直接または間接的に発現を活性化するか阻害するかによって）、複合体が形成されたかどうかを示すことができる。このようなレポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼなどの、発現が活性化されたか阻害されたかを明らかに示す、当技術分野で公知の任意のレポーター遺伝子でよい。
【００２４】
S6K2、PKCε、およびB-Rafのうち2つまたはそれ以上に試験化合物を接触させる段階、ならびに複合体が形成されたかどうかを決定する段階を含む、第1の局面の複合体の阻害剤を同定するさらなる方法も提供される。
【００２５】
本方法は、試験化合物の存在下で、複合体形成タンパク質の1つに特異的に結合する抗体を用いた、複合体形成タンパク質の免疫沈降を含む可能性がある。1つまたは複数のタンパク質が抗体によって「引き落とされ」ない場合は、複合体の形成は、化合物によって阻害されている。もちろん、当業者は、試験化合物が複合体の形成を阻害するかどうかを決定する別の方法が利用でき、当技術分野で周知であることを理解するだろう。
【００２６】
本発明の第5の局面は、S6K2、PKCε、およびB-Rafのうち2つまたはそれ以上を含む複合体の阻害剤を提供する。好ましくは、阻害剤は本発明の第3および第4の局面の方法によって同定される。阻害剤はB-Rafの発現、および/またはPKCε、および/またはS6K2の発現を阻害する可能性がある。または、阻害剤はS6K2、PKCε、および/またはB-Rafの会合を予防してもよい。
【００２７】
癌細胞における化学療法抵抗性の予防または逆行の方法も、第6の局面として提供されるが、これはS6K2、PKCε、およびB-Rafのうち2つまたはそれ以上を含む化合物の阻害剤を細胞に投与する段階を含む。本方法が適用される癌細胞は、好ましくは小細胞肺癌（SCLC）細胞である。本方法の阻害剤は、RNAi、アンチセンスRNA、リボザイムRNA、または抗体である可能性がある。
【００２８】
本発明の第7の局面は、第5の局面の阻害剤、および薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００２９】
本発明に係る薬学的組成物は、通常は薬学的に許容されるキャリアを含む無菌の薬学的組成物の一部として、普通は提供される。この薬学的組成物は、任意の適切な形態でよい（対象への望ましい投与方法による）。
【００３０】
これは単位剤形中で提供される可能性があり、通常は密封容器中で提供され、キットの一部として提供される可能性もある。このようなキットは、通常（必然ではないが）、使用説明書を含む。単位剤形を複数含む場合もある。
【００３１】
薬学的組成物は、たとえば、経口（口腔または舌下を含む）、局所（口腔、舌下、または経皮を含む）、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、または皮内を含む）の経路のような任意の適切な経路によって投与するために適応できる。そのような組成物は、薬学の当技術分野で公知の任意の方法、たとえば、活性成分を無菌条件下でキャリアまたは賦形剤と混合させることによって調製できる。
【００３２】
経口投与に適応させた薬学的組成物は、カプセルまたは錠剤のような個別の単位として；粉末または顆粒として；溶液、シロップ、または懸濁液として（水性もしくは非水性の液体中；または食用泡もしくはホイップとして；または乳濁液として）、提供できる。
【００３３】
錠剤または硬ゼラチンカプセルのために適した賦形剤には、ラクトース、トウモロコシデンプン、またはその誘導体、ステアリン酸またはその塩が含まれる。軟ゼラチンカプセルとの使用に適した賦形剤には、たとえば、植物油、ワックス、脂肪、半固形、または液体ポリオール等が含まれる。
【００３４】
溶液およびシロップの調製に使用できる賦形剤には、たとえば、水、ポリオール、および糖が含まれる。懸濁液の調製には、水中油または油中水懸濁液を提供するために油（例えば植物油）が使用できる。経皮投与に適応させた薬学的組成物は、長期間にわたり受容者の表皮に密接に接着することを意図した個別のパッチとして提供できる。たとえば、活性成分は、Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986)に一般的に記述されたイオン導入法によって、パッチから送達できる。
【００３５】
局所投与に適応させた薬学的組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾル、またはオイルとして調合できる。眼または他の外部組織、たとえば口および皮膚の感染には、好ましくは組成物は局所投与の軟膏またはクリームとして塗布される。軟膏中に調合される場合は、活性成分はパラフィンまたは水混和性の軟膏基剤と共に利用できる。または、活性成分は水中油クリーム基剤または油中水基剤と共にクリーム中に調合できる。
【００３６】
眼の局所投与に適応させた薬学的組成物には、活性成分が適当なキャリア、特に水性溶媒に溶解または懸濁した点眼剤が含まれる。
【００３７】
非経口投与に適応させた薬学的組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図される受容者の血液と実質的に等張にする溶質を含む可能性のある、水性および非水性無菌注射溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含む可能性のある水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。注射溶液に使用できる賦形剤には、たとえば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油が含まれる。組成物は、たとえば、密封アンプルおよびバイアルのような、単位投与量または複数回投与量の容器中で提供でき、使用の直前にたとえば注射用水のような無菌の液体キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存することができる。無菌の粉末、顆粒、および錠剤から、即時調合注射液および懸濁液を調製することもできる。
【００３８】
薬学的組成物は、保存料、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、着臭剤、塩（本発明の物質自身が薬学的に許容される塩の形態で提供されることがある）、緩衝材、コーティング剤、または抗酸化剤を含む可能性がある。本発明の物質に加えて、さらに治療活性のある薬剤も含む可能性もある。
【００３９】
本発明の物質の投与量は、治療する疾患または疾病、治療する個体の状態等によって広い範囲で変わる可能性があり、最終的に医師が、使用する適切な投与量を決定する。投与は適切な限り繰り返すことができる。副作用が発生した場合は、通常の臨床診療にしたがって投与する量および/または頻度を減らすことができる。
【００４０】
本発明の1つの局面として、癌患者において化学療法抵抗性を診断する方法も提供され、これはS6K2、B-Raf、およびPKCεのうち2つまたはそれ以上を含む複合体を検出する段階を含む。検出は、抗体または当業者に公知の他の任意の方法で行なえる。
【００４１】
患者の癌細胞におけるS6K2の活性化レベルを検出する段階、および患者の非癌細胞または癌ではない患者の細胞におけるS6K2の活性化レベルと比較する段階であって、非癌細胞または癌ではない患者の細胞よりも癌細胞の方がS6K2の活性化レベルが高ければ癌細胞は化学療法抵抗性である段階を含む、癌患者において化学療法抵抗性を診断する方法も提供される。レベルの検出は、抗体、定量的免疫沈降、および/またはウェスタンブロットまたは同様なもので行なうことができ、非癌細胞または癌ではない患者の細胞との比較は、S6K2の活性化の正常レベルの基準として行なう。S6K2の活性化レベルの上昇は、化学療法抵抗性の可能性を示す。
【００４２】
活性化というのは、複合体を形成する、および/または化学療法抵抗性を誘導する能力のある形態のS6K2を意味する。
【００４３】
癌細胞において決定したS6K2の活性化レベルが上昇していなければ、すなわち、非癌細胞または癌ではない患者の細胞と同様のレベルが決定されれば、癌細胞はおそらく化学療法感受性であることも、当業者は理解するであろう。
【００４４】
癌細胞が化学療法抵抗性を発生する可能性を予測する方法も提供され、これは2つまたはそれ以上の時点でS6K2の活性化レベルを測定する段階を含み、測定時点間でS6K2の活性化レベルが上昇していれば、化学療法抵抗性を発生する可能性が高い。
【００４５】
測定時点は、癌の種類、患者の状態、癌の進行速度、および他の因子によって、毎日、毎週、毎月のように任意の合理的な間隔で良い。活性化S6K2のレベルが測定時点間で上昇していなければ、おそらく癌細胞は化学療法感受性である。
【００４６】
細胞におけるS6K2レベルを検出する段階を含む、癌細胞の化学療法抵抗性の診断方法も提供される。S6K2のレベルは当業者に公知の任意の方法で決定できる。S6K2のレベルの上昇が検出されれば、細胞は化学療法抵抗性の可能性が高い。
【００４７】
第12の局面は、癌細胞の化学療法抵抗性の予防または逆行のための薬剤の製造における、第1の局面の複合体の阻害剤の利用を提供する。
【００４８】
各々の局面のすべての好ましい特徴は、必要な変更を加えてすべての他の局面に適用される。
【００４９】
本発明は以下の非限定的な実施例および図を参照して記述される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】S6K2の核酸およびアミノ酸配列を示す。
【図２】B-Rafの核酸およびアミノ酸配列を示す。
【図３】PKCεの核酸およびアミノ酸配列を示す。
【図４】PKCεレベルがSCLC細胞内でXIAPおよびBcl-XLの発現ならびにErkのリン酸化と相関することを示す：(A) H69およびH510細胞溶解物を、PKCα、PKCε、XIAP、Bcl-XLおよびアクチンの発現に関してウェスタンブロットした。(B) (A)の代表的ブロットをアクチンについて標準化した光学的濃度計測によって定量した。(C) 空(V)またはwt-PKCε-GFPを発現するベクター(ε)でトランスフェクトしたH69細胞のホスホERK、XIAP、およびBcl-XLレベルを解析した。(D) 10%FCS中で増殖しているV-H69およびε-H69細胞のベースラインの細胞死レベルはアネキシンV染色を用いたフローサイトメトリーにより決定した。(E) SFM中のε-H69およびV-H69細胞は0.1μMのエトポシド(VP-16)の存在下または非存在下で処理し、96時間後に細胞数を決定した。4重反復で実験を行ない、平均細胞数±SEMを未処理に対する倍数として表示した。(F) SFM中のH510細胞を40μMのεTI-TITAT、αTI-TITAT、またはTITATの存在下または非存在下で4時間処理した後、FGF-2 (0.1 ng/ml)の存在下または非存在下で5分間刺激した。細胞溶解物はビホスホ（biphospho）ERKについてウェスタンブロットした。（F、下パネル）3回の独立した実験の結果は、光学的濃度計測で解析し、平均±SEMを対照の倍数として表示した。(G) PKCεまたはスクランブルした(sc) siRNAをトランスフェクトしたH510細胞をFGF-2の存在下または非存在下で刺激した。溶解物のPKCεおよびErkリン酸化を解析した。（A、C、F、およびG）ラミンBおよびアクチンの免疫検出はローディングコントロールとして使用された。
【図５】PKCεが、FGF-2の後にH510細胞においてB-RafおよびS6K2と多タンパク質複合体を形成し、S6K2活性を調節することを示す。(A) SFM中のH510およびH69細胞は、示された時間の間FGF-2で処理された。細胞溶解物は、PKCε抗体を用いて免疫沈降させてから、示された分子に関してウェスタンブロット(WB)が行われた。（A、下パネル）全細胞溶解物を用いて示されたようにウェスタンブロットが行われた。（BおよびE）S6K2は、εTI-TITAT、αTI-TITAT、およびTITATの存在下または非存在下での4時間の処理後に、V-H69およびε-H69（B）、またはH510細胞（E）から免疫沈降させた。免疫沈降物はS6-ペプチドを基質としてインビトロのキナーゼアッセイにかけた。示された結果は各々の実験の3重反復の平均cpm±SEMである。(C) εTI-TITATの存在下または非存在下で処理されたSFM中のV-H69およびε-H69細胞から得られた内在性S6タンパク質のリン酸化は、ホスホS6抗体を用いて決定された。（DおよびF）PKCεを再発現している（KO+ε）またはしていない（KO）PKCεKO MEFは、(D) 10% FCSで増殖させ、ホスホ-S6レベルを分析、または (F) FGF-2およびFCSの存在下または非存在下で刺激した後、S6K2免疫沈降および示されたようにウェスタンブロットを行なった。（CおよびD）ラミンBおよびアクチンの免疫検出をローディングコントロールとして用いた。（A〜F）示された結果は少なくとも3回の独立した実験を代表するものである。
【図６】B-RafがS6K2と会合するためにはPKCεが必要なことを示す。(A) HEK 293細胞をFGF-2で刺激し、示された分子について免疫沈降(IP)させ、B-RafまたはPKCεのウェスタンブロット(WB)で解析した。(B) B-Raf、PKCα、PKCε、PKCδ、またはスクランブル対照(sc)のsiRNAiをトランスフェクトしたHEK 293細胞をFGF-2で刺激し、S6K2の免疫沈降物をB-RafおよびPKCεのWBで解析した。（C）PKCεを再発現している（KO+ε）またはしていない（KO）PKCεKOマウスから得られたMEFは、FGF-2の存在下または非存在下で刺激された。B-Raf免疫沈降物は、S6K2のWBにより解析された。（DおよびE）組み換えPKCε、V600EB-Raf、およびS6K2タンパク質を示されたように組み合せ、32P-γATP (D)または非放射性ATP (E)を用いたインビトロキナーゼアッセイにかけた。組み換えGST-MEKはV600EB-Raf活性の陽性対照として使用された。サンプルはSDS-PAGEに流し、クーマシー染色するか（D、上パネル）、ニトロセルロースに移し（E）、X線フィルムに曝露させるか（D、下パネル）、示された分子のWBを行なった（E）。示された結果は最低3回の独立した実験を代表するものである。
【図７】HEK 293細胞でS6K2キナーゼ活性を特異的に誘導すると、細胞の生存性が上昇し、Bcl-XLがアップレギュレーションされることを示す。キナーゼ活性S6K1 (1KA)、S6K2 (2KA)の誘導ベクターまたは空のベクターをトランスフェクトしたHEK 293-Tetクローンをテトラサイクリンで6時間処理した後、(A) 示されたようなウェスタンブロット(WB)、または(B) S6ペプチドを基質として用いたS6K1または2キナーゼアッセイを行なった。(C) V-、1KA-、および2KA-293細胞は、血清あり（白抜き）もしくはなし（斜線）でテトラサイクリンの非存在下で18時間、または血清なしでテトラサイクリンと（黒）インキュベーションし、アネキシンV染色を用いて、アポトーシス細胞の割合を決定した。(D) テトラサイクリン、FGF-2、およびPD098059の存在下または非存在下で処理された2KAおよび1KA-293細胞の細胞溶解物について、Bcl-XL発現およびS6リン酸化の解析をした。(E) 血清除去(18h)の前にFGF-2の存在下または非存在下でインキュベートされた(4h) HEK-293細胞は、アネキシンV染色により解析された。（A、D、F）アクチンおよびラミンBの免疫検出は、ローディングコントロールとして使用された。（B、C、E）結果は3重反復の平均±SEMを表す。(A〜E) 結果は最低3回の独立した実験を代表するものである。
【図８】哺乳類細胞において、S6K2およびPKCεのダウンレギュレーションは細胞の生存性およびクローン形成性細胞増殖を低下させることを示す。(A) HEK 293細胞に、空のベクター(pSR)、またはS6K1 (S6K1pSR)もしくはS6K2 (S6K2pSR) のRNAi配列をコードするpSRをトランスフェクトした。細胞は5% FCSまたは無血清培地で18時間増殖させ、細胞生存率をトリパンブルー排除によって決定した。(B) pSR、S6K1pSR、またはS6K2pSRを発現するH510細胞の溶解物を、示されたように（上パネル）ウェスタンブロットした。10% FCS中のベースラインの細胞死は、アネキシンV染色（中パネル）によって決定された。ラミンB切断は、カスパーゼ3活性の読み出し情報として使用された（下パネル）。FGF-2で処理されたpSR細胞（pSR+F）は陰性対照として使用された。(C) MCF-7、A549、HEK 293、およびNIH3T3細胞は、示されたpSR shRNAiコンストラクトによりトランスフェクトされ、5% FCS中で10日間培養された。クリスタルバイオレット染色したコロニーのODは590nmで決定された。各々の細胞株について、結果はpSR空ベクター細胞の吸光度で標準化された。(D) KOまたはKO+ε MEFはFCSの非存在下で、示された時間プレートに播かれ、トリパンブルー陽性細胞の割合が決定された。（A、下パネル）および（B、中パネル）では、結果は3重反復の平均±SEMを表す。（A〜C）では、結果は最低3回の独立した実験を代表するものである。
【図９】S6K2のダウンレギュレーションはFGF-2が仲介するH510およびHEK 293細胞の生存を予防するが、S6K1のダウンレギュレーションは予防しないことを示す。（A〜C）H510細胞において、pSR RNAiレトロウイルスベクター（A、B）、またはオリゴヌクレオチドRNAi（C）のいずれかにより、示されたタンパク質のダウンレギュレーションをおこなった。（A）細胞はFGF-2の存在下または非存在下でプレインキュベーションした後、エトポシド処理(VP-16)を行なった。（B）示されたベクターが感染し、示されたような処理をしたH510細胞の溶解液を用いて、XIAPおよびBcl-XLのウェスタンブロットを行なった。（C）オリゴヌクレオチドRNAiで処理されたH510細胞を、（上パネル）溶解し、示されたようにウェスタンブロットを行なうか、（下パネル）（A）に記述したように処理した。（D〜F）HEK 293細胞を用いて、RNAiをコードするpSRベクターのトランスフェクションにより、示されたタンパク質のダウンレギュレーションを行なった。（D）細胞はFGF-2の存在下または非存在下でプレインキュベーションした後、血清を除去した。（AおよびD）生存はトリパンブルー排除によって決定した。（E）HEK 293細胞は示されたようにトランスフェクションし、ホスホS729-PKCε (P-PKCε)のウェスタンブロットを行なった。（F）トランスフェクションしたHEK 293細胞は、FGF-2の存在下または非存在下でインキュベーションし、ホスホS412-S6K2のウェスタンブロットを行なった。（A、C、D）結果は4重反復の平均±SEMであり、（A、C）pSR（A）またはSc（C）で標準化した。（B、E、F）ラミンBまたはアクチンの免疫検出は、ローディングコントロールとして使用された。（A〜F）結果は最低3回の独立した実験を代表するものである。
【図１０】（A、B、C、およびD）SCLC細胞においてFGF-2が仲介するErkリン酸化をPKCεが制御することを示す。（A）H510細胞は、ある用量範囲のGF109203X (GF)、Go6976 (Go)、ヒスピジン(Hispidin) (His)、BAPTA (BA)、またはロットレリン(Rottlerin) (Rot)の存在下または非存在下で1時間処理した後、FGF-2 (0.1 ng/ml)またはPDBu (400nM)のいずれかの存在下または非存在下で5分間刺激した。細胞溶解物はSDS-PAGE/biphospho-ERKのウェスタンブロットで解析した。ラミン免疫検出はローディングコントロールとして使用された。（B、上パネル）SCLC細胞株由来の等量のタンパク質を用いてPKC発現パターンが比較された。（B、下パネル）SFM中のSCLC細胞は、FGF-2の存在下および非存在下で5分間刺激され、細胞溶解物はSDS-PAGE/Erkリン酸化のWBで解析された。PKCεおよびPKCαのレベル（左パネルのOD）は、これらのSCLC細胞株においてErkをリン酸化する能力と比較された。示された結果は、最低3回の独立した実験を代表するものである。
【図１１】PKCεがH510細胞中でB-RafおよびS6K2と多タンパク質複合体を形成することを示す。（AおよびB）SFM中のH510細胞は示された時間の間、FGF-2で処理された。細胞溶解物はS6K1または2のいずれか（A）、B-RafまたはRaf-1（B）の抗体を用いて免疫沈降を行なった後、SDS-PAGE/S6K1および2、B-Raf、Raf-1、ならびにPKCεのウェスタンブロット(WB)を行なった。（AおよびB）示された結果は最低3回の独立した実験を代表するものである。
【図１２】B-RafがS6K2と会合するためにPKCεが必要であることを示す。（A） S6K1、S6K2、PKCε、PKCα、B-Raf、およびRaf-1に対する、単一のsiRNAiオリゴヌクレオチド配列（1および2）、およびSmartpool（P）の有効性。HEK293細胞にオリゴヌクレオチドをトランスフェクトし、48時間後にSDS-PAGE/WBによって細胞溶解物における標的のダウンレギュレーションを解析した。（B、C、およびD）HEK293細胞において、pSRレトロウイルスRNAiベクターを用いてPKCα(α)、およびB-Raf（B）またはPKCε（ε）をダウンレギュレーションし、空のベクターのみ（V）をトランスフェクトした細胞と、RNAiの標的の発現、およびFGF-2に応答してErkをリン酸化する能力（BおよびC）またはS6K2/PKCε/B-Raf多タンパク質複合体を形成する能力（D）を比較した。（A〜D）結果は最低3回の独立した実験を代表するものである。
【図１３】S6K2キナーゼ活性はHEK293細胞を血清除去から保護し、Bcl-XLおよびXIAPの発現を誘導することを示す。（AおよびB）テトラサイクリン誘導性キナーゼ活性S6K1（1KA）または2（2KA）を発現するHEK293は、テトラサイクリンの存在下または非存在下で6時間（B）または示された時間（A）処理された。（A）細胞はFCSの非存在下で増殖させ、細胞死の経時変化を追った。細胞死はトリパンブルー陽性を決定することによって、顕微鏡的に評価した。結果は3重反復の平均±SEMで示されている。（C）HEK293細胞は25μM PD098059の存在下または非存在下で1時間処理した後、FGF-2で4時間刺激した。（BおよびC）細胞溶解物はSDS-PAGE/WBによりBcl-XLおよびXIAPレベルを解析した。アクチンはローディングコントロールとして使用された。結果は最低3回の独立した実験を代表するものである。
【図１４】S6K2およびB-Rafの単一siRNA配列は、エトポシド処理されたH510細胞のFGF-2が仲介する救済を予防するが、S6K1の場合はしない。SFM中で増殖したH510細胞に、示されたように、S6K1、S6K2、またはB-Rafを標的とする2つのsiRNA単一配列（図3A中の＃1および＃2）のいずれかをトランスフェクトした。対照として2つの非標的配列（sc＃1および2）が使用された。細胞はFGF-2 （F）と4時間プレインキュベーションしてから、エトポシド処理（E）した。細胞死はトリパンブルー排除により顕微鏡的に決定した。示された結果は3重反復の平均±SEMで、最低3回の独立した実験を代表するものである。
【図１５】ヒトSCLC生検材料において、S6K2染色が化学療法抵抗性と相関することを示す。診察時にSCLCおよびNSCLCの22人の患者から得られたホルマリン固定およびパラフィン包埋した生検から切片を切り、マウス抗S6K2モノクローナル抗体（Prof. Gout、UCL、Londonから提供された）およびEnvision検出システム（DAKO）を用いて免疫染色した。標的タンパク質の特異性は、既知の陽性（H510）および陰性（II型肺細胞）サンプル、無関係な抗体、および競合するS6K2を含む標準的なプロトコールを用いて制御した。報告のバイアスを避けるため、病理学者（Dr. Neil Sebire, Hammersmith Hospitals）には臨床転帰のデータは明かされなかった。本試験および進行中のSCLCおよびNSCLC生検材料の採取は、病院の倫理委員会が検討し承認した。上パネル：化学療法抵抗性腫瘍の患者から得られた生検の大部分の癌細胞において観察される強いS6K2免疫染色（元の倍率x 100）。中パネル：部分的に化学療法抵抗性の疾患を持つ患者から得られた生検における、中程度のS6K2染色の巣状部分（元の倍率x 100）。下パネル：化学療法感受性疾患を持つ患者から得られた生検のS6K2染色の欠如（元の倍率x 100）.
【００５１】
これらの結果は、SCLCの患者において、化学療法抵抗性の患者の2/4、部分的に化学療法抵抗性の患者の3/3、および化学療法感受性の患者の6/6で見られた。これらの結果を実証するため、数人のNSCLC患者から得られた生検におけるS6K2染色レベルも調べた。治療抵抗性の1人の患者では、腫瘍はびまん性に陽性であり、早期再発患者4人のうち3人では腫瘍はS6K2染色に関して巣状に陽性であったが、化学療法感受性腫瘍の4人のうち3人では陰性であった。SCLCおよびNSCLC生検の両方の染色の結果を合わせたものが隣の表にまとめられている。これらの結果を合わせると、肺癌の患者から得られた生検におけるS6K2タンパク質発現レベルが化学療法抵抗性と相関することが示唆される。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
実施例
材料と方法
細胞培養
SCLC細胞株は以前に記述されたようにして維持された（Pardo et al., 2001）。実験目的で、細胞はSFM（RPMI 1640に5μg/mlインスリン、10μg/mlトランスフェリン、30 nM亜セレン酸ナトリウム、0.25%ウシ血清アルブミンを添加）で増殖させ、3〜7日後に使用された。A549、HEK293、HEK293Tet、NIH-3T3、MCF-7、およびCos 7細胞は、10% FCSを含むDMEM培地中で37℃、10% CO2で増殖させた。実験のために、HEK293細胞は成長因子刺激の前に無血清DMEM中に6時間置かれた。
【００５３】
トランスジーン発現細胞株の確立
H69細胞に、Lipofectinを製造元の指示に従って用いて、野生型PKCεをコードするpEGFPコンストラクトをトランスフェクトし、1 mg/ml G418中で細胞を選択した。RNAi発現H510細胞は、H510細胞にマウスエコトロピック受容体（EcoR）をコードする両栄養性ウイルスを感染させることにより確立された。G418を用いた選択後、PKCα、PKCε、S6K1、S6K2、B-Raf、またはRaf-1の短鎖ヘアピンRNAiをコードするマウスレトロウイルスを細胞に感染させた。2μg/mlのピューロマイシンの存在下で細胞を培養することにより、安定的な遺伝子のダウンレギュレーションが達成された。A549、HEK293、NIH-3T3、MCF-7、およびCos 7細胞にLipofectamin Plusを用いて関連するpSRコンストラクトをトランスフェクトすることによって、B-Raf、Raf-1、PKCε、S6K1、またはS6K2 RNAiの一過性発現が達成できた。トランスジーン発現または標的タンパク質のダウンレギュレーションは、ウェスタンブロットにより評価した。
【００５４】
テトラサイクリン誘導性S6K1およびS6K2細胞株の確立
リン酸カルシウム沈殿法を用いて、70％の密集度のHEK293Tet-on細胞（Invitrogen）に25μgのpCDNA4-S6K2-T412D、pCDNA4-S6K1-T401D、またはpCDNA4（対照）をトランスフェクトした。細胞は50 mg/mlゼオシン中で選択した。各々のトランスフェクションからシリンダーを用いて15個のコロニーを単離し、クローン細胞株を確立し、ウェスタンブロット解析によって、1 mg/mlテトラサイクリンとのインキュベーション後にS6K1またはS6K2の発現を検定した。
【００５５】
細胞死アッセイ
SCLC細胞（5 x 104細胞/ml SFM）は4時間0.1 ng/ml FGF-2の存在下または非存在下で前処理した後、0.1μMエトポシドで処理して、37℃で96時間インキュベートした。HEK 293-Tet細胞は48ウェルプレート（104細胞/ウェル）に播き、4時間0.1 ng/ml FGF-2の存在下または非存在下で前処理した後、18時間血清を除去することによって細胞死を誘導した。細胞死の割合は、以前に記述されたようにトリパンブルー排除またはアネキシンV染色およびフローサイトメトリーのいずれかで決定した（Pardo et al., 2002）。
【００５６】
細胞透過性PKCεおよびPKCα転移阻害ペプチド
PKCε転移阻害ペプチド（EAVSLKPT）およびPKCα転移阻害ペプチド（SLNPEWNET）（Souroujon and Mochly-Rosen, 1998; Yedovitzky et al., 1997）は、HIV由来のTITAT配列（GRKKRRQRRRPPQ）に連結することにより、細胞透過性にした。RPMI中のH510細胞は、40μMの転移阻害ペプチドまたはTITATのいずれかと4時間インキュベートした後に、さらに処理をした。これらのERKリン酸化阻害剤の活性は、ウェスタンブロットにより評価した。
【００５７】
免疫共沈降実験
SFM中で増殖したSCLC細胞は、RPMI 1640中で洗浄し、2 x 106細胞をこの培地中で37℃で30分間インキュベートした。HEK 293細胞を洗浄して、DMEM中で6時間インキュベートした。その後、細胞は図の説明文に示される時間の間、FGF-2を用いて刺激された。細胞は4℃で1 mlの溶解緩衝液中で溶解し、溶解物は15,000gで10分間遠心して透明にし、関連する抗体とプロテインAまたはGのいずれかとを用いて1.5時間免疫共沈降を行なった。
【００５８】
S6K1/2免疫複合体およびインビトロキナーゼアッセイ
補足情報を参照されたい。
【００５９】
クローン形成性増殖アッセイ
関連するコンストラクトがトランスフェクトされたA549、HEK293、NIH-3T3、MCF-7、およびCos 7細胞は、6ウェルプレートに播き（2 x 103細胞/プレート）、DMEM/5% FCS中で37℃/10% CO2で10日間増殖させた。その後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、10%酢酸溶液を用いてコロニーを可溶化し、595nmの吸光度を測定した。
【００６０】
RNAi配列
PKCα、PKCε、S6K1、S6K2、B-Raf、およびRaf-1のRNAiを介するダウンレギュレーションは、pSUPER Retroコンストラクトにクローニングされた短鎖ヘアピン配列、またはオリゴヌクレオチドsiRNAを用いて行なった。配列に関しては補足情報を参照されたい。
【００６１】
オリゴヌクレオチドヌクレオフェクション
血清培地中で増殖した1.5 x 106 SCLC細胞は、製造元の指示に従って、Amaxa NucleofectorのプログラムT-16を用いて、100μlのNucleofector Solution V中の6μlの20μM siRNAをトランスフェクトした。トランスフェクション後に、細胞をRPMI/10% FCS中に一晩移した後、解析に使用した。
【００６２】
免疫複合体キナーゼアッセイ
SFM中のV-H69およびH69細胞は、RPMI 1640で3回洗い、この培地中で2 x 106細胞を37℃で30分間インキュベートした。細胞は、示されたように40μMのεTI-TITAT、αTI-TITAT、またはTITATペプチドの存在下または非存在下で4時間処理してから、記述されたようにしてS6K1またはS6K2の免疫複合体キナーゼアッセイを行なった（Pardo et al., 2001）。別の実験では、テトラサイクリン誘導性キナーゼ活性細胞質型S6K1またはS6K2を発現するHEK293Tet細胞を、テトラサイクリンの存在下または非存在下でインキュベーションした後、溶解および免疫複合体キナーゼアッセイを行なった。
【００６３】
インビトロキナーゼアッセイ
0.5μgの組み換えHis-S6K、および4μgの組み換えPKCεは、組み換え活性V600EB-Rafの存在下または非存在下で、50mM TRIS (pH 7.5)、100 mM NaCl、0.1 mM EDTA、および0.1% TritonX-100、0.3 (v/v)%βメルカプトエタノール、および1 mM Na3VO4中で氷上でインキュベートした。反応は、33 nCi/μl［γ-32P］ATPの存在下または非存在下で、100μM ATP、10mM MgCl2の最終濃度になるようにATP混合物を添加することで開始し、30℃で30分間インキュベートした。陽性対照として、組み換えGST-MEKがV600EB-Rafの基質として使用された。反応はSDS-サンプル緩衝液中で終結させ、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより解析した。
【００６４】
RNAi配列
PKCα、PKCε、S6K1、S6K2、B-Raf、およびRaf-1のRNA-iを介するダウンレギュレーションは、pSUPER Retroコンストラクトにクローニングされた短鎖ヘアピン配列、またはオリゴヌクレオチドsiRNAを用いて行ない、これは補足データに列挙されている。pSUPER Retroを介するダウンレギュレーションでは、3つの異なる短鎖ヘアピン配列を用いて、各々のタンパク質を同時に標的とした。配列は以下の通りである：
2010516228.tif 000002
。S6K2およびS6K1に対するオリゴヌクレオチドsiRNAは、SMARTpoolとしてDharmaconから購入した。配列は以下の通りである：
2010516228.tif 000003
。B-Rafを標的とするオリゴヌクレオチドは、単一配列：
2010516228.tif 000004
を用いて行なった。
【００６５】
試薬
エトポシドはCalbiochemから購入した。PKCα、PKCβ、PKCδ、PKCλ、PKCγ、PKCζ、PKCα、PKCε、Bcl-XL、およびXIAP抗体は、Becton Dickinsonから購入した。ホスホPKCαおよびホスホS6タンパク質抗体は、Cell Signallingから購入した。Ser729に対するホスホPKCε抗体および追加のPKCε抗体（ウェスタンブロット用のみ）はUpstateから入手した。Thr566に対するホスホPKCε抗体は、以前に記述されている（Parekh et al., 1999）。S6K1、B-Raf、Raf-1、ラミンB、およびアクチンの抗体は、Santa Cruzから購入した。S6K2抗体は以前に記述されている（Gout et al., 1998）。プロテインAおよびGはAmershamから入手した。Lipofectin、Lipofectamin Plus、G418、ゼオシン、およびピューロマイシンはInvitrogenから入手した。活性化ERK抗体、エトポシド、ポリブレン、およびクリスタルバイオレットはSigmaから入手した。FGF-2、PD098059、Go6976、ヒスピジン、BAPTA、ロットレリン、およびGF109203XはCalbiochemから購入した。
【００６６】
実施例1
PKCεレベルはBcl-XLおよびXIAP発現ならびに細胞の生存と相関する
まず最初に、PKCεレベルが、H510およびH69 SCLC細胞の生存の既知の調節因子であるBcl-XLおよびXIAPの発現と相関するかどうかが調べられた（Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003）。ウェスタンブロットでは、低レベルのPKCεを持つH69細胞は、高レベルのPKCεを含むH510細胞よりも、低いレベルのBcl-XLおよびXIAP発現を示すことが明らかになった（図4Aおよび4B）。別の7つのSCLC細胞株でも、PKCε XIAPおよびBcl-XLレベルとの間に同様な相関が見られたが、PKCδを含む他のPKCでは見られなかった（データは示さず）。また、大部分の細胞株では、PKCαおよびPKCεのレベルの間に逆の相関が存在するようであった（図4Aおよび図10C）。これらの結果は、SCLC細胞においてPKCεがBcl-XLおよびXIAPの発現を制御している可能性を示唆する。実際に、野生型PKCεを過剰発現するε-H69細胞は、ベクター単独（V-H69）の細胞と比較して、Bcl-XLおよびXIAPの両方のレベルが上昇していた（図4C）。ε-H69細胞は、ERKのバックグラウンドのリン酸化の上昇（図4C）、正常な培養条件下での生存の増大（図4D）、およびエトポシド（VP-16）誘導細胞死への抵抗性も示した（図4E）。
【００６７】
実施例2
FGF-2に誘導されるERKリン酸化はPKCεが仲介する
FGF-2に誘導されるMEK/ERKシグナル伝達は、SCLC細胞においてBcl-2、Bcl-XL、XIAP、およびcIAP1発現を上昇させる（Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003）。PKCεなどのPKCが、H510細胞においてFGF-2に誘導されるMEK/ERKシグナル伝達を仲介するかどうかが調べられた。この考えを調べるために、細胞透過性Ca2+キレート剤BAPTA、およびそれぞれPKCα/β1、PKCβ、nPKCを標的とする、または非選択性である、Go6976、ヒスピジン、ロットレリン、およびGF109203Xを含む阻害剤のパネルの効果が調べられた。化合物は急性のPDBuに誘導されるERKリン酸化を阻害したのですべて活性であったが、GF109203Xおよびロットレリンのみが、H510細胞においてFGF-2の仲介するERKリン酸化を阻害した（図10A）。ロットレリンはPKCδ（Gschwendt et al., 1994）およびPKCε（Davies et al., 2000）の両方を阻害するが、以前の所見と合わせると、PKCεがH510細胞においてFGF-2に誘導されるERKシグナル伝達の決定的な仲介物質であると考えられる。これと一致することに、7つのSCLC細胞株におけるPKCアイソフォームの発現レベルを比較すると、PKCεのみがFGF-2に誘導されるERKのリン酸化と相関していた（図10B）。
【００６８】
FGF-2に仲介されるERKシグナル伝達へのPKCεの関与を確認するために、PKCεの細胞透過性転移阻害ペプチド（εTI-TITAT）を用いて、PKCα阻害ペプチド（αTI-TITAT）またはキャリアペプチド単独（TITAT）との比較が行なわれた（Vives et al., 1997）。εTI-TITATで処理すると、FGF-2に応答したERKリン酸化が60%阻害された（図4F）。対照的に、αTI-TITATもTITATもこの応答を阻害しなかった。これらの所見を検証するため、smart pool (P)としての合成の短い干渉RNA (siRNA)またはデコンヴォルーションした（deconvoluted）個々のsiRNAのいずれかを用いて、H510細胞においてPKCがダウンレギュレーションされた。予備実験では、これらのプールしたまたは個々のsiRNAの有効性および選択性が確認された（図12Aおよび示されていないデータ）。図4Gは、そのようなダウンレギュレーションがFGF-2に誘導されるERK活性化を完全に予防した一方で、スクランブルsiRNAは効果がなかったことを示す。同様な結果は、同じsiRNA分子（データは示さず）またはPKCε内の別個の配列を標的とした単鎖ヘアピンRNAi (shRNAi)をコードするpSRベクター（図12C）のいずれかを用いたHEK293細胞でも見られた。対照的に、PKCδを含む他のPKCアイソフォームを標的とした並行して行なった実験では、そのような効果は見られなかった(データは示さず)。これらの結果を合わせると、H510およびHEK293の両方の細胞において、PKCεはFGF-2を介したERKシグナル伝達に関与していることになる。
【００６９】
実施例3
PKCε、B-Raf、およびS6K2はH510細胞においてFGF-2処理の後に多タンパク質複合体を形成する
H510 SCLC細胞においては、FGF-2によるS6K2の活性化にはMEK/ERKのシグナル伝達が必要である。しかし、FGF受容体がMEK/ERKから分離しているH69細胞では、FGF-2はS6K2を活性化せず（Pardo et al., 2001）、化学療法抵抗性も誘導しない（Pardo et a., 2002）。したがって、これらの2つの細胞株における更なる検討は、FGF-2刺激の後にPKCεがS6K2およびERKの両方にシグナルを組込む分子機序を明らかにするために、価値のある機会を提供した。FGF-2の存在下または非存在下で処理されたH510およびH69細胞の溶解物は、PKCεのリン酸化および結合パートナーの潜在的な差を同定するために、免疫共沈降された。PKCεのT566およびS729のリン酸化はこのキナーゼ活性と相関することが知られているので（Cenni et al., 2002）、これらの部位に対するホスホ特異的抗体を利用して解析が行なわれた。H510細胞では、FGF-2は5分以内にこれらの両方の部位のリン酸化を増加させたが（図5A上パネル）、これはERKリン酸化の経時変化と一致している（図5A下パネル）。これはS6K2およびB-Rafの免疫共沈降と相関するが、S6K1またはRaf-1とは相関しない。反対に、H69細胞では、FGF-2はPKCεのT566またはS729残基のリン酸化を誘導しなかった（図5A）。さらに、FGF-2はPKCεとS6K2、S6K1、B-Raf、またはRaf-1の会合を誘発せず、また以前に記述されたように、これらの細胞でERKのリン酸化を誘導しなかった。しかし、これらのタンパク質はH69細胞の総細胞溶解物中では容易に検出された（図5A、下パネル）。したがって、FGF-2はPKCεを活性化すると考えられ、H510細胞中でPKCε/B-RafおよびS6K2を含む新規のシグナル伝達複合体の形成を誘導する可能性がある。
【００７０】
この新しいFGF-2誘導性シグナル伝達複合体のタンパク質のアイデンティティは、S6K2、S6K1、Raf-1、またはB-Rafに対する抗体を用いた免疫共沈降を繰り返すことによって、H510細胞中で確認された（図11AおよびB）。再三にわたりB-Rafの活性化がERKのシグナル伝達に関与するとされてきたように（Calipel et al., 2003; Dillon et al., 2003; Erhardt et al., 1999; Peraldi et al., 1995; Wan et al., 2004）、この結果は、FGF-2の下流のERKリン酸化にB-RafおよびPKCεの両方を必要とする可能性のあるシグナル伝達モジュールの存在を示唆する。さらに、FGF-2に依存するS6K2のPKCεへの会合は、S6K2の活性化にこのPKCアイソフォームが関与しているという可能性を示した。
【００７１】
これを検討するために、PKCεを過剰発現するH69細胞（ε-H69）におけるS6K2の基礎活性が、空のベクターをトランスフェクトされた細胞（V-H69）と比較された。バックグラウンドのS6K2活性は、V-H69細胞と比較して、ε-H69細胞では2倍に増加していた（図2B）。PKCεをεTI-TITATで阻害すると、ε-H69細胞におけるS6K2活性はV-H69細胞と同等なレベルにまで低下したので（図5B）、この増加はPKCεの基礎活性に依存している。対照的に、ε-H69細胞をPKCα転移阻害ペプチド（αTI-TITAT）またはTITAT単独とインキュベーションしても、S6K2活性には影響がなかった。この上昇したS6K2活性は、インビボでのS6リン酸化の増加と相関していたが、これはεTI-TITATによって予防された（図5C）。逆に、PKCεヌルMEF（KO）では、PKCεの再発現（KO+ε）（Ivaska et al., 2002）は、血清またはFGF-2に応答したS6のリン酸化を増強した（図5Dおよび示されていないデータ）。KO+εMEF細胞株は、PKCεの発現レベルがわずかに上昇しているのにもかかわらず、野生型MEF細胞株と同等の生理的応答を示す（Ivaska et al., 2002; Kermorgant et al., 2004）。さらに、H510細胞では、FGF-2に誘導されるS6K2活性化は、やはりεTI-TITATで阻害されるが、αTI-TITATまたはTITATでは阻害されない（図5E）。FGF-2または血清によるS6K2の活性化におけるPKCεの役割をさらに実証するために、PKCεヌルMEF（KO）は、S6K2とPKCεの会合、およびこのキナーゼの活性化と相関することが知られている部位であるS6K2のC末端のT388のリン酸化に関して、KO+ε細胞と比較された。KO+εMEFのみが、FGF-2に誘導されるPKCεとS6K2の会合を示し、これはS6K2のT388のリン酸化の増強と並行していた（図5F）。血清もこれらの2つのキナーゼの会合を誘導したが、しかしFGF-2とは異なり、KOおよびKO+ε細胞の両方でT388のリン酸化を刺激した。これらのデータを合わせると、PKCε、B-Raf、およびS6K2は、FGF-2刺激に応答して形成され、S6K2活性を調節する多タンパク質複合体の一部であることが示される。
【００７２】
実施例4
HEK293細胞でPKCε、B-Raf、およびS6K2の複合体が形成される：PKCεのダウンレギュレーションはB-RafとS6K2の会合を破壊する
FGF-2が他の細胞タイプにおいてBRaf/PKCε/S6K2複合体の形成を誘導することができるかどうかを決定するために、本発明者らはHEK293細胞、KO、およびKO+ε細胞を利用した。B-Rafは、293細胞またはKO+εにおいてFGF-2刺激の後に、PKCεまたはS6K2のいずれとも免疫共沈降したが、PKCεを欠如したKO細胞ではしなかった（図6A、6C、5F、および示されていないデータ）。さらに、PKCα、Raf-1、S6K1のいずれもS6K2と会合しなかった（データは示さず）。したがって、FGF-2によるこの新規のシグナル伝達複合体の誘導は、SCLC細胞に限定されない。
【００７３】
この多タンパク質複合体の会合に関与する相互作用の起こり得る順序を同定するために、B-Raf、PKCε、または対照としてPKCαおよびPKCδが選択的にダウンレギュレーションされ、複合体の形成に対する効果が評価された。HEK293細胞に、プールされたもしくは個々のsiRNAまたはshRNAiをコードするpSRベクターをトランスフェクトした。標的の選択性、およびFGF-2に誘導されるERKリン酸化を阻害する能力が決定された（補足図6A〜C、および示されていないデータ）。FGF-2に応答したB-RafおよびPKCεのS6K2との会合に対する、これらのタンパク質のダウンレギュレーションの効果が評価された。PKCδもしくはαのノックダウンまたはスクランブルRNAiの使用は、複合体の形成には影響を与えなかった（図6Bおよび図12D）。B-Rafがない場合にも、PKCεはやはりS6K2と会合した。しかし、PKCεがないと、B-RafはS6K2と会合しなかった（図6Bおよび図12D）。重要なことに、異なる配列を標的とするsiRNAまたはshRNAi戦略でも、同一の結果が得られたが、前者の方がより効率的に標的タンパク質をノックダウンした。これは、PKCεのS6K2への会合は直接であるが、B-RafがS6K2に会合するためにはPKCεが必要なことを示唆する。これと一致することに、FGF-2はKO+εにおいてB-RafとS6K2の会合を誘導するが、KO細胞ではしなかった（図6C）。
【００７４】
これをさらに検討し、PKCεおよび/またはB-RafがS6K2のリン酸化状態を調節できるかどうかを調べるために、これらのキナーゼの精製された調製物を様々な組み合せで32Pi-ATPとともにインキュベーションした。活性化したB-Raf（V600EB-Raf）がS6K2とともにインキュベーションされると、S6K2のリン酸化は見られなかったが、並行する実験では、V600EB-RafはMEKを効率的にリン酸化した（図6D下パネル）。対照的に、PKCεはS6K2を顕著にリン酸化し、これはV600EB-Rafを添加するとさらに増強した（図6D下パネル）。クーマシー染色では、これらの変化が、添加したキナーゼが不均等にローディングされた結果ではないことが確認された（図6D上パネル）。非放射性のATPを用いてこの実験を繰り返し、T388S6K2のウェスタンブロットを行なうと（T389S6K1およびPKCεの同等の部位も検出する）、これはPKCεまたはV600EB-Rafにより誘導されたS6K2上のリン酸化部位ではないことが示された（図6E）。これらの結果を合わせると、PKCεはS6K2と直接会合し、これをリン酸化できるが、一方でB-Rafが複合体に加わるためにはおそらくPKCεの存在が必要であることを示す。
【００７５】
実施例5
S6K2キナーゼ活性は生存を上昇させ、Bcl-XLおよびXIAPをアップレギュレーションするがS6K1はしない
FGF-2に誘導される細胞の生存には、B-RafおよびS6K2と複合体を形成するがS6K1を排除するPKCεが必要であるので、この2つのS6Kアイソフォームは細胞の生存を制御する能力が異なっていると考えられる。この仮説を検証するために、本発明者らはS6K1およびS6K2の両方の細胞質型の、キナーゼ活性テトラサイクリン誘導性コンストラクトを発現するHEK293Tet細胞（Invitrogen）のクローンをいくつか作製した。試験した全てのクローンにおいて、テトラサイクリンはトランスフェクトされたS6Kアイソフォームのタンパク質レベルを選択的に上昇させたが、親細胞株（293Tet）には影響がなかった（図7Aおよび示されていないデータ）。インビトロキナーゼアッセイおよびS6リン酸化のウェスタンブロットでは、FGF-2刺激後と同様に（(Pardo et al., 2001)および示されていないデータ）、テトラサイクリン処理によって対応するキナーゼの活性が上昇したことが確認された（図7B、D）。その後、このキナーゼ活性の選択的上昇が、HEK293Tet細胞クローンの血清除去時の生存能力に対して与える影響が評価された。テトラサイクリンがない場合には、細胞死の割合はKA-S6K1、KA-S6K2、およびベクター単独のHEK293Tet細胞で類似していた。テトラサイクリンに曝露すると、KA-S6K2を過剰発現する細胞でのみ（図7C）、血清除去の12〜24時間後に細胞死が低下した（図13A）。KA-S6K2発現細胞ではV-293Tet細胞と比較してDNA合成の上昇が見られなかったので、これらの結果は細胞増殖が増強したためではない。しかし、Bcl-XLおよびXIAPの発現は、KA-S6K2細胞で選択的に増加していた。これはFGF-2によってさらに誘導されることはなく、PD098059による選択的MEK阻害により抑制されず、KA-S6K1または野生型S6K2過剰発現細胞のいずれにも見られなかった（図7Dおよび示されていないデータ）。KA-S6K2過剰発現細胞と同様に、FGF-2でHEK293Tet細胞を刺激すると、生存ならびにBcl-XLおよびXIAP発現の増加が見られたが、後者はMEK阻害により阻害された（図7E、補足図13C）。これらの結果を合わせると、S6K2はBcl-XLおよびXIAP発現を調節するがS6K1は調節せず、また活性化したS6K2はFGF-2に誘導される生存促進効果を再現するのに充分であることが示唆される。
【００７６】
実施例6
S6K2のダウンレギュレーションは細胞死を増強し、クローン形成性増殖を阻害するが、S6K1の場合はしない
S6K2が細胞の生存に決定的に重要な仲介物質であるという考えをさらに支持するために、RNAiを利用してS6Kアイソフォームを特異的にダウンレギュレーションし、生存細胞を計数することにより細胞死を調べた。まず、S6K1またはS6K2のRNAi pSRベクターをHEK293細胞にトランスフェクトし、それぞれの標的の選択的ダウンレギュレーションがウェスタンブロットによって検証された（図8A上パネル）。S6K1（S6K1pSR）と比較して、S6K2（S6K2pSR）のダウンレギュレーションは、正常な増殖条件下で細胞死を約2倍に増加させた（図8A下パネル）。血清を除去すると、バックグラウンドの細胞死はベクターおよびS6K1ノックダウン細胞の両方で増加した。しかし、S6K2ノックダウンのほうが細胞死の誘導は多かった（図8A下パネル）。
【００７７】
H510細胞では、S6K1pSRおよびS6K2pSRはやはり対応するタンパク質の特異的なダウンレギュレーションを誘導した（図8B上パネル）。さらに、S6K1pSRの発現は、空のベクター対照（pSR）と比較して細胞の生存に影響を与えないが、S6K2ダウンレギュレーションは対照の2倍を超えて基礎細胞死を増加させた（図8B下パネル）。これはカスパーゼ3および7の基質であるラミンBの切断の増加と相関していた（図8B下パネル）。さらに、S6K2pSR-H510はpSR-またはS6K1pSR-H510細胞とは異なり、細胞死のために培養中で増殖できなかった（データは示さず）。これらの結果は、細胞の生存促進においてS6K2はきわめて重大な役割を果たすがS6K1はそうではないという、本発明者らの以前の所見を支持するものである。
【００７８】
S6K2の特異的な効果を調べるための別の手法として、クローン形成アッセイが利用され、これは少なくとも一部は細胞の生存を反映するものである。図8Cは、RNAiを介するS6K2発現のノックダウンのみがHEK293細胞のクローン形成性増殖を阻害し、S6K1の場合はしなかったことを示す。同様な所見は、shRNAiによるPKCεのノックダウンでも観察された（図8C）。重要なことに、これらの結果はHEK293細胞に特異的ではなく、ヒトの非SCLC（NSCLC）細胞A549およびヒト乳癌細胞株MCF7でも再現できた（図8C）。マウス線維芽細胞NIH 3T3において同じベクター（保存配列を標的とする）を用いてS6K2をダウンレギュレーションしてもクローン形成性増殖の低下が誘導されたので、S6K2ダウンレギュレーションの効果は、種特異的でもない（図8C）。対照的に、ヒトとマウスの間で保存されていない、ここで用いられたPKCεを標的とする配列は、NIH 3T3細胞のPKCεレベルまたはクローン形成性増殖を低下させなかった（図8Cおよび示されていないデータ）。しかし、マウス細胞の生存促進効果の仲介におけるPKCεの重要性は、KO細胞よりも血清除去時により多く生存したKO+ε細胞で示された（図8D）。これらのデータを合わせると、S6K2はHEK293およびH510 SCLC細胞の生存を促進し、哺乳類細胞のクローン形成性増殖の調節に広く関与している可能性があるが、S6K1はそうではないことが示される。
【００７９】
実施例7
S6K2のダウンレギュレーションはFGF-2の抗アポトーシス効果を阻害するがS6K1のダウンレギュレーションはしない
上記の結果はS6K2がFGF-2の生存促進効果を仲介することを示唆している。これを実証するために、H510細胞中でS6K1および2を標的として、上記のレトロウイルスRNAiベクターを使用し、得られた細胞株に対してFGF-2の存在下または非存在下でエトポシド処理を行なった。空ベクター（pSR）およびS6K1をダウンレギュレーションした（S6K1pSR）H510細胞は、エトポシドに応答して同等量の細胞死を示し、いずれもFGF-2とのプレインキュベーションによって救済された（図9A）。以前に記述されたように（Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003）、この救済はBcl-XLおよびXIAPタンパク質レベルの上昇に反映されている（図9B）。対照的に、S6K2をノックダウン（S6K2pSR）したH510細胞は、バックグラウンドの細胞死の割合が上昇しており、エトポシドによってほぼ完全に枯渇した（図9A）。さらに、FGF-2を用いて前処理をしてもXIAPまたはBcl-XLのアップレギュレーションは得られず、エトポシドによる細胞死からこれらの細胞は救済されなかった（図9AおよびB）。これらの結果は、S6K2がFGF-2に誘導される化学療法抵抗性を仲介するという仮説を支持するものである。
【００８０】
しかし、エトポシドに誘導される圧倒的な細胞死、およびH510 S6K2pSR細胞において上昇したバックグラウンドの細胞死の割合が、FGF-2の生存促進効果を観察する能力に干渉する可能性がある。したがって、これらの実験は、pSR shRNAiによって認識されるものとは異なる、B-Raf、S6K2、またはS6K1内の配列を標的とする、プールされたsiRNA用いて、繰り返された。図9C（上パネル）は、HEK293細胞で見られた結果と同様に（図12A）、各々のプールされたsiRNAによって、H510細胞においてB-Raf、S6K2、およびS6K1が選択的にダウンレギュレーションされたことを示す。さらに、S6K2の一時的なダウンレギュレーションは、エトポシドによる細胞死からのFGF-2の誘発する救済効果を完全に阻止した（図9C、下パネル）。同様な結果は、B-Raf siRNAを用いても得られた（図9C、下パネル）。対照的に、S6K1の一時的ノックダウンは、FGF-2に誘導される化学療法抵抗性を阻止しなかった。異なる標的配列に対する個々のsiRNAを用いてこれらの実験が繰り返された時にも、同様な結果が得られた（図14）。したがって、H510 SCLC細胞におけるエトポシドによる細胞死を予防する生存促進シグナルをFGF-2が提供するために、B-RafおよびS6K2は必要とされるが、S6K1は必要ではない。
【００８１】
異なる細胞系において、FGF-2に誘導される生存促進シグナル伝達におけるS6K2およびB-Rafの重要性を示すために、同じpSRコンストラクトをHEK293細胞に一時的にトランスフェクトし、その後FGF-2の存在下または非存在下で血清を除去した。さらに、PKCε、PKCα、およびS6K1に対するRNAiベクターも並行して試験された。pSRとS6K2pSR細胞の血清除去によって同様な量の細胞死が誘導された一方で、FGF-2はpSR細胞の生存のみを増加させた（図9D）。同様に、FGF-2はS6K2と相互作用することが示された2つのタンパク質であるB-RafまたはPKCεのダウンレギュレーションをした細胞の救済もしなかった。対照的に、FGF-2はPKCαのノックダウンされたHEK293細胞を完全に救済した（図9D）。興味深いことに、これらの細胞は、血清およびFGF-2の非存在下で高い基礎生存率を示した。これは、キナーゼ活性に結びついている部位であるS729におけるPKCεのリン酸化の上昇によって、説明できる可能性がある（図9E）。または、PKCαはHEK293細胞の細胞死の誘導に必要である可能性もある。驚くべきことに、S6K1をダウンレギュレーションすると、細胞死のレベルはFGF-2で処理したpSR細胞で観察されるのと同等になった（図9D）。これはS6K1の細胞死誘導への関与を反映している可能性がある。しかし、S6K1をダウンレギュレーションすると、FGF-2刺激への応答で見られるのと同様に、S6K2活性と相関があることが知られている部位であるS6K2のS401部位のリン酸化が増強した（図9F）。対照的に、S401の基礎リン酸化レベルは、対照pSR細胞と比較した場合に、S6K2を標的とするRNAiの存在下では大きく低下していた（図9F）。したがって、おそらくS6K1のダウンレギュレーションは、FGF-2により誘導される生存促進効果と同じく、S6K2の基礎活性を上昇させると考えられる。さらに、これらの細胞ではすでに活性化したS6K2が存在しているのであるから、S6K1のノックダウン細胞の生存をなぜFGF-2の添加がさらに改善しなかったかの説明となる可能性がある。これらのデータを合わせると、S6K2がFGF-2生存促進効果の仲介物質であることが示される。また、細胞の生存においてS6K1とS6K2が重複しない役割を持つことも明らかになる。
【００８２】
本発明者らは、SCLC細胞およびHEK 293細胞の両方において、FGFRをMEK/ERK、Bcl-XL、およびXIAPのアップレギュレーションならびに生存促進効果にカップリングさせるために、PKCεは必要かつ充分であることを発見した。したがって、(1) SCLC細胞株のパネルにおいてPKCファミリーメンバーの発現レベルを比較すると、PKCεのみが、FGF-2がMEK/ERKシグナル伝達ならびにBcl-XLおよびXIAPのアップレギュレーションを誘導する能力に相関していることが示され、(2) PKCεの過剰発現はMEK/ERKシグナル伝達、Bcl-XLおよびXIAPのアップレギュレーション、ならびに生存促進効果を誘導するために充分であって、(3) PKCε機能または発現を選択的に抑制するとこれらのFGF-2に誘導される効果が予防された。
【００８３】
PKCεがMEK/ERKシグナル伝達にカップリングする機序は、以前に検討された。内皮細胞では、PKCεおよびPKCαは、ストレスが仲介するMEK/ERK活性化においてRaf-1と免疫共沈降できる（Cheng et al., 2001）。NIH-3T3細胞では、PKCεはRaf-1との潜伏性および不活性の複合体中に存在することができ、これはホルボールエステルにより刺激され、MEK/ERKシグナル伝達を誘発し得る（Hamilton et al., 2001）。これらの報告とは対照的に、本発明者らはSCLCまたはHEK293細胞のいずれにおいても、PKCεまたはPKCαとRaf-1との複合体を示すことができなかった。しかし、結果はFGF-2がPKCεとB-Rafの会合を誘導することを示した（図5、6、および12）。さらに、様々な選択的RNAi種でB-Rafをダウンレギュレーションすると、FGF-2に誘導されるMEK/ERKシグナル伝達および生存促進効果が阻止される（図9、12、および14）。
【００８４】
FGF-2に誘導されるMEK/ERKシグナル伝達は、生存促進効果に必要で（Pardo et al., 2002; Pardo et al., 2003）、S6K2の活性化にも必要であるがS6K1には必要ではない（Pardo et al., 2001）。他のいくつかの所見は、S6K2が序論で考察したような別個の機能を持つ可能性を示唆した。したがって、本発明者らは、S6K2がPKCε/BRaf複合体と会合し、化学療法抵抗性を仲介する可能性があると考えた。
【００８５】
これらの新規の所見は、S6K2が実際にFGF-2に誘導されるPKCε/B-Raf複合体と会合するがS6K1はしないことを示し、この所見はSCLC、HEK293、およびMEF細胞に共通している。興味深いことに、おそらく会合が弱いか、一過性であるか、抗体の認識を阻止するために、この複合体中でMEKまたはERKの存在を再現的に示すことはできなかった。それでも、無傷の細胞におけるRNAiノックダウン研究、およびインビトロの精製キナーゼの会合研究では、PKCεとS6K2との会合が直接的であり、S6K2のリン酸化を引き起こすことが示されている。対照的に、B-Rafは無傷の細胞中でPKCεの存在下でのみS6K2と会合し、PKCεが存在しないとS6K2を直接リン酸化することができない。しかし、これらの3つの酵素を合わせてインキュベーションすると、S6K2のリン酸化がさらに増強され、PKCεが存在する場合にB-RafがS6K2をリン酸化するという可能性を浮かび上がらせる。または、B-RafはPKCεおよび/またはS6K2の立体配座を変化させ、S6K2上にさらにPKC部位を提供することも考えられる。ホルボールエステルに刺激されたHEK293細胞を調べた最近の報告では、S6K2のC末端ドメイン内にあるS486がPKCに調節される部位の1つである可能性が高いことが示唆されている（Valovka et al., 2003）。明らかに、FGF-2による生理的刺激後のPKCεおよび/またはB-Rafにより調節されるS6K2リン酸化部位の性質は、さらに検討する必要がある。しかし、これらの部位の性質にかかわらず、PKCε機能または発現の選択的過剰発現または阻害に関する本発明者らの結果は、このキナーゼがFGF-2に誘導されるS6K2の活性化を仲介することを示す（図5）。
【００８６】
S6K2およびS6K1のテトラサイクリン誘導性キナーゼ活性変異体を用いて、HEK293細胞において、S6K2のみがXIAPおよびBcl-XLのアップレギュレーションを誘発し、生存促進効果を誘導することが示された（図7）。さらに、HEK293およびSCLC細胞の両方におけるRNAiノックダウン試験は、S6K2のダウンレギュレーションは生存を予防するがS6K1のダウンレギュレーションはしないことを示す（図8、図13）。さらに、いくつかの異なる細胞株において、S6K2はクローン形成性増殖の支持にも重要である（図8）。非常に重要なことに、S6K2の選択的ダウンレギュレーションは、SCLCおよびHEK293細胞の両方において、FGF-2に誘導されるXIAPおよびBcl-XLのアップレギュレーションを阻止し、さらにエトポシドおよび血清除去に応答した細胞死もそれぞれ阻害するが、S6K1はしない（図9、図14）。したがって、S6K2は、FGF-2に誘導される生存促進シグナル伝達の仲介に必要かつ充分である。
【００８７】
興味深いことに、本発明者らは最近、SCLCおよびNSCLC生検の両方においてS6K2のタンパク質発現レベルの上昇が、化学療法抵抗性の発生と相関しているようであることを発見した（図15）。
【００８８】
PKCε/BRafおよびS6K2を含むがS6K1を含まない、FGF-2に誘導される新規のシグナル伝達複合体。この複合体の形成は、キナーゼドメイン間に高度の相同性があるにもかかわらず、どのようにしてS6K1およびS6K2が異なる細胞コンパートメントに誘導され、異なる基質を標的とするのかを説明する可能性がある。実際に、S6K2（S6K1は関与しない）を介して、この複合体はBcl-XLおよびXIAPタンパク質発現をアップレギュレーションし、それにより生存/化学療法抵抗性を促進する。したがって、S6K1とは対照的なS6K2の異なる機能が明らかにされた。S6K2が、細胞の翻訳機構と選択的に相互作用をして抗アポトーシスタンパク質のサブセットの差別的制御を行なう分子機序を、さらに検討する必要がある。重要なことに、PKCε/BRaf/S6K2シグナル伝達複合体の個々のメンバーまたはその会合を標的とすると、化学療法抵抗性を逆行させる新規の治療戦略の開発が可能になりうる。さらに、S6K2および複合体の他のメンバーの発現レベルも、新規の予後バイオマーカーを提供する可能性がある。
【００８９】
参考文献
2010516228.tif 000005
2010516228.tif 000006
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月22日(2009.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010516228000001.app
【国際調査報告】
2010516228.tif 000023
2010516228.tif 000024
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