(57)【要約】  本発明はタンパク質工学技術に関する。さらに詳細には、本発明は、ＩｇＧまたはＩｇＭに対する免疫活性が弱いエピトープ構造に結合する、ヒトＩｇＥ抗体およびその誘導体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体タンパク質に対するリガンドの結合または酵素に対する基質の結合を防止しうる組み換えＩｇＥモノクローナル抗体またはその機能的断片の製造方法であって、以下の工程を包含する製造方法。
ａ）ヒト由来サンプルのＩｇＥ産生細胞から総ｍＲＮＡを単離し、
ｂ）上記工程ａ）で得られた総ｍＲＮＡに基づいて、ＩｇＥ Ｆｄ遺伝子領域およびカッパ／ラムダ軽鎖遺伝子をコードするｃＤＮＡを合成して、ＩｇＥ発現ライブラリーを構築し、
ｃ）受容体タンパク質または酵素を目的の標的タンパク質とし、該標的タンパク質あるいは該タンパク質を表面に発現している細胞または粒子に対して発現ライブラリーをスクリーニングし、
ｄ）該タンパク質に対して、１０7 Ｍ-1を超える中度から高度の親和性を示すクローンを該ライブラリーから単離し、
ｅ）上記工程ｄ）で単離したクローンから、受容体タンパク質に対するリガンドの結合または酵素に対する基質の結合を防止するＩｇＥモノクローナル抗体クローンを選択し、そして
ｆ）所望により、上記工程ｅ）で得たＩｇＥモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離する。
【請求項２】
工程ｅ）において選択したＩｇＥモノクローナル抗体クローンが、該受容体タンパク質に対する全てのリガンドの結合または該酵素に対する全ての基質の結合を防止するクローンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該受容体タンパク質または酵素には、複数種のリガンドまたは基質が存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記工程ｅ）において選択したＩｇＥモノクローナル抗体クローンが、該受容体タンパク質に対する１種の特定のリガンドの結合または該酵素に対する１種の特定の基質の結合を防止するクローンであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該受容体タンパク質が薬剤耐性ポンプであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該薬剤耐性ポンプが多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２）であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該リガンドが、抱合型または非抱合型の有機アニオン、例えばグルタチオン抱合体、グルクロニド抱合体、ロイコトリエン、メトトリキセート、オクラトキシンＡまたはＰＡＨ、であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該リガンドが、エストラジオール−１７−ｂ−Ｄ−グルクロニドであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程ｅ）において選択したＩｇＥモノクローナル抗体クローンが、ＭＲＰ２に対する１種または数種のリガンドの結合を防止するが、ＡＴＰ−結合カセットトランスポーター（ＡＢＣ−トランスポーター）に対するリガンドの結合は防止しないクローンであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｅ）において選択したＩｇＥモノクローナル抗体クローンが、ＭＲＰ２に対する１種の特定のリガンドの結合を防止するクローンであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
受容体タンパク質に対するタンパク質リガンドの結合を防止しうる組み換えＩｇＥモノクローナル抗体またはその機能的断片である、タンパク質−タンパク質相互作用の調節因子の製造方法であって、以下の工程を包含する方法。
ａ）ＩｇＥ抗体から同定したアミノ酸配列を有する軽鎖をコードする核酸配列のプールであって、複数の軽鎖の核酸配列または単一の軽鎖の核酸配列に限定されたプールを選択し、
ｂ）該軽鎖核酸配列を、複数のアレルギー患者のリンパ球から単離したＩｇＥ重鎖遺伝子の多様なプールと組み合わせることで、ＩｇＥ発現ライブラリーを構築し、
ｃ）受容体タンパク質を目的の標的タンパク質とし、該標的タンパク質あるいは該タンパク質を表面に発現している細胞または粒子に対して発現ライブラリーをスクリーニングし、
ｄ）該タンパク質に対して、１０7 Ｍ-1を超える中度から高度の親和性を示すクローンを該ライブラリーから単離し、
ｅ）上記工程ｄ）で単離したクローンから、該受容体タンパク質に対する該タンパク質リガンドの結合を防止するＩｇＥモノクローナル抗体クローンを選択し、そして
ｆ）所望により、上記工程ｅ）で得たＩｇＥモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離する。
【請求項１２】
該軽鎖が、表５で定義したＣＤＲ−Ｌｌ配列およびＣＤＲ−Ｌ２配列からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列を包含することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該ＣＤＲ−Ｌ２配列が下記アミノ酸配列を包含することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
ＬＬＩＹＸＡＳＳ／Ｔ  （配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である。）
【請求項１４】
該ＣＤＲ−Ｌ２配列が下記アミノ酸配列を包含することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
ＬＬＸＸＸＡＳＳ／ＴＸＸＸ  （配列番号２）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である。）
【請求項１５】
該ＣＤＲ−Ｌ２配列が下記アミノ酸配列を包含することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
ＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳ  （配列番号３）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質工学技術に関する。さらに詳細には、本発明は、ＩｇＧまたはＩｇＭに対する免疫活性が弱いエピトープ構造に結合する、ヒトＩｇＥ抗体およびその誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、抗体は、最も有効なヒト治療用薬剤として急速な発展を見せている。ＦＤＡは、アメリカ合衆国における癌、炎症、移植や感染症などの種々の疾患の治療を目的した、１８種の抗体の使用を認可している（Carter 2006）。治療用途に理想的な完全なヒト抗体の単離を可能とする、抗体ファージディスプレイライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用に基づく新規な抗体産生技術が、開発工程を著しく加速した。治療用抗体に関する現在の市場規模は、約１５０億ドルであるが、２０１０年までには３００億ドルを超えると予測される。ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクスおよびインタラクトミクスの急速な発展は、治療用標的の同定に革命をもたらした。治療用標的とは、所望の作用メカニズム（例えば、タンパク質／リガンド相互作用やタンパク質／タンパク質相互作用の阻害または活性化）を伴う特異的認識が可能な抗体の開発を必要とする標的である。
【０００３】
エピトープとは、抗体が結合する抗原表面の局在領域であり、エピトープは糖、脂質またはアミノ酸で構成されている。抗体に認識されるエピトープの大部分が抗原分子の三次元表面構図である。例外は直鎖状エピトープであり、これはタンパク質の立体的な三次元構造ではなく、アミノ酸配列（即ち、一次構造）によって決定されるものである。タンパク質データバンクから現在入手可能な８２腫の異なる抗原−抗体免疫複合体のほぼ全てがＩｇＧ−抗原複合体である。ＩｇＧエピトープの構造要素（α−へリックス、β−鎖とループ）およびエピトープの形状（凸状、平面状、凹状）の解析によると、エピトープの半分はループのみで構成されており、残りの半分はループと二次構造要素の両方を含んでいる（図１を参照）。ＩｇＧエピトープの大部分（６８％）が抗原の凸状領域または露出したループ領域に位置する。従って、タンパク質構造のクレフト（clefts）および／または窪み（depressions）、ならびに平面状表面はＩｇＧエピトープ構造としては好ましくない。近年、ヒトコブラクダおよびサメから同定された抗体クラス、即ち、単一ドメイン抗体と呼ばれるＨＣＤＲ３ループのあるＶＨ領域のみを有する抗体は、酵素基質部位などのクレフト領域を認識し結合することが確認された（De Genst et al. 2006）。しかし、これら抗体はヒト由来ではないため、治療用途には好ましくない。免疫原性の低い構造、クレフトおよび平面状表面を認識しうるヒト抗体は、ヒトの治療と診断のための新規な結合性物質を開発するための貴重な材料を提供するであろう。
【０００４】
近年明らかになった、アレルゲン（β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ，Bos d 5））と複合体を形成したＩｇＥ Ｆａｂ抗体の構造は、ＩｇＥ抗体がＩｇＧ抗体とは異なる結合部位を好むことを示唆している（出版準備中）。この発見は、免疫療法および診断における新たな構想の可能性を広げる。ＩｇＥ／Ｆａｂ軽鎖のＣＤＲループは、ＢＬＧの平坦なβ−シート領域への結合を担っている。抗原の露出したループ領域に通常は位置するＩｇＧエピトープと比べると、このＩｇＥエピトープは驚くほど異なっている。さらにＩｇＥ−ＶＨ領域、特にそのＨＣＤＲ３ループをＩｇＧ抗体と比較すると、構造的な違い、即ち、アレルゲン表面に存在する空隙を認識するループ構造の形成が認められた。この知見に基づけば、ＩｇＧ型抗体またはＩｇＭ型抗体の定常部位にＩｇＥ Ｖ領域を融合させたものからなるキメラヒト抗体であって、平面状表面または平坦なβ−シート並びタンパク質表面には露出していない構造（例えば、酵素の基質結合部位や薬剤耐性ポンプ）に対する結合特異性を必要とする治療用標的に対するヒト抗体の開発は可能であると考えられる。
【０００５】
発明の概要 
本発明は、タンパク質表面には露出していない構造、例えば、窪み、クレフトまたはチャネル（例えば、耐性トランスポーターの薬剤チャネル、酵素の基質結合部位、および受容体のリガンド結合部位）、あるいはタンパク質−タンパク質相互作用を仲介する平坦な表面、に結合するヒトＩｇＥ抗体およびその誘導体に関する。
【０００６】
従って、本発明は、種々のイムノアッセイ法ならびにヒトの免疫療法やフォーカスド抗体ライブラリーの構築に使用するための新規な試薬の製造方法を提供する。また、本発明は、均一な品質を保持する上記の特異的な試薬の保証された継続的供給を可能とし、ポリクローナル抗血清に固有のバッチ間の品質のばらつきを排除する。これらの有用な効果によって、本発明は、均一な品質の、新規であり、特異的であり且つ経済的な免疫学的試薬の製造を可能にする。
【０００７】
上記から明かなように、本発明の方法の特定の目的の一つは、ヒトＩｇＥモノクローナル抗体、その断片、または該抗体の誘導体であって、生物学的サンプルに対して行う定性的および定量的な測定ならびにイメージングのみならず、免疫療法にも使用可能な十分に高い結合親和性および特異性を標的タンパク質に対して示すものを提供することである。本発明の方法によって得られる抗体は、所望の様式において治療用または診断用の標的に対して特異的な結合性を示し、このような結合性は他の材料から開発されたモノクローナル抗体の範疇にはない。
【０００８】
本発明の更なる目的の一つは、ここで得られた構造データを、治療用および診断用の標的に対するフォーカスドＩｇＥ抗体ライブラリーの構築のために使用する方法を提供することにあり、ここで得られる抗体の結合特異性は、タンパク質構造中の、ＩｇＧ／ＩｇＭに対する免疫活性の弱い領域に対するものである。
【０００９】
本発明の諸目的、諸特徴および諸利益は、添付の図面および詳細な説明の記載から明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明および実施例は本発明の好ましい態様を示すものの、あくまでもそれを例示しているに過ぎず、本発明の精神および発明の範囲内で行われる種々の変更および改良は、以下の詳細な説明より当業者には明らかであることを理解されたい。
尚、添付の図面において、構造を示す図面はいずれも実寸ではない。
【００１０】
略称 
ｃＤＮＡ      相補的デオキシリボ核酸
ＣＤＲ        相補性決定領域
ＤＮＡ        デオキシリボ核酸
E. coli Escherichia coli 
ＥＤＴＡ      エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ    酵素免疫測定法
Ｆａｂ        特異的抗原結合性を有する断片
Ｆｄ          重鎖の可変ドメインおよび第１定常ドメイン
Ｆｖ          特異的抗原結合性を有する、抗体の可変領域
ＩｇＥ        免疫グロブリンＥ
ｍＲＮＡ      メッセンジャーリボ核酸
ＭＲＰ２      多剤耐性関連タンパク質２
ＭＲＰ１      多剤耐性関連タンパク質１
ＰＣＲ        ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ        リボ核酸
ｓｃＦｖ      一本鎖抗体
ＴＥＡ        トリエタノールアミン
ＶH          重鎖の可変領域
ＶL          軽鎖の可変領域
【００１１】
発明の詳細の説明 
本願明細書で使用した用語の一部について、その定義を提供する。「免疫グロブリン」、「重鎖」、「軽鎖」および「Ｆａｂ」は欧州特許願第０１２５０２３号と同様に使用した。
【００１２】
本願明細書において使用した種々の活用形の「抗体」という用語は集合名詞であり、免疫グロブリン分子および／または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位、即ち、抗原結合部位またはパラトープを有する分子、の総称である。
【００１３】
「抗原結合性部位」または「パラトープ」とは、抗体分子において、抗原に特異的に結合する構造上の部位である。
【００１４】
抗体の例としては、免疫グロブリン分子のパラトープを含む部分、例えばＦａｂやＦｖとして使える部分が挙げられる。
【００１５】
「Ｆａｂ」（特異的抗原結合性を有する断片）とは、実質的に完全な抗体に対してパパインによるタンパク質分解を公知の方法で実施することで得られる抗体の一部分である。例えば、米国特許第４，３４２，５６６号を参照されたい。Ｆａｂ断片は遺伝子組み換え法によって産生することもでき、このような方法は当業者によく知られている。例えば、米国特許第４，９４９，７７８号を参照されたい。
【００１６】
「ドメイン」は、タンパク質の独立した折りたたみ部分を意味する。天然のタンパク質におけるドメイン間の境界に関する一般的な構造上の定義については、Argos, 1988を参照されたい。
【００１７】
「可変ドメイン」または「Ｆｖ」とは、抗原またはハプテンの結合を担う、免疫グロブリン分子中の領域である。通常この領域は、免疫グロブリン分子の軽鎖および重鎖のそれぞれのＮ末端から数えて約１００個のアミノ酸からなる領域である。
【００１８】
「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）とは、抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変ドメインがリンカーペプチドを介して結合した連続したアミノ酸鎖であって、一本のｍＲＮＡ分子（転写物）から合成されたものである。
【００１９】
「リンカー」とは、天然または工学的に作られたタンパク質中の隣接する２つのドメインの間に存在するアミノ酸配列である。
【００２０】
「ＩｇＥ産生細胞」とは、例えば、リンパ球などの白血球である。
【００２１】
「ヒト由来サンプル」としては、ヒト患者、好ましくはアレルギーを発症した患者、から得た血液または血清が好ましい。
【００２２】
「受容体タンパク質」とは、リガンドに結合しうるタンパク質であって、このリガンド／受容体の関係が、細胞の生物学的に重要な活性に関連するものを意味する。このようなリガンド／受容体関係の一例は、アセチルコリン（リガンド）とアセチルコリン受容体（例えば、ニコチン性やムスカリン性のコリン受容体）との関係であり、アセチルコリンの結合に対して、生物活性の変化によって応答するものである。上記リガンドは別のタンパク質でも良い。
【００２３】
ヒト ＩｇＥ ＶＨ領域を含む、ヒト抗体（ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは全長抗体）のライブラリー
Ｄ１ ＩｇＥ ＦａｂのＩｇＥ ＶＨ領域、特にそのＨＣＤＲ３ループをＩｇＧ抗体と比較すると、構造的な違いが認められた（図１を参照）。この知見に基づけば、ヒト ＩｇＥ ＶＨ領域を含む抗体であって、例えば、ＩｇＧ／ＩｇＭに対する免疫活性の弱い、表面に露出していないタンパク質構造（受容体、薬剤耐性ポンプや酵素の基質結合部位など）に対する結合特異性を必要とする治療用標的について、抗体の開発が可能となる（De Genst et al. 2006）。ヒト リンパ球由来の多様なＩｇＥ ＶＨプールを構成単位として使用し、ｓｃＦｖ型、Ｆａｂ型または全長抗体型の機能的なヒト抗体ライブラリーを構築した。得られたライブラリーをＩｇＧ／ＩｇＭに対して免疫活性を示さない構造、例えば、クレフト構造や平面表面、に対する特異的認識を必要とする治療用標的に対して選択した。
【００２４】
従って、本発明の目的は、受容体タンパク質に対するリガンドの結合または酵素に対する基質の結合を防止しうる組み換えＩｇＥモノクローナル抗体またはその機能的断片の製造法であって、以下の工程を包含する製造方法を提供することである。
ａ）ヒト由来サンプルのＩｇＥ産生細胞から総ｍＲＮＡを単離し、
ｂ）上記工程ａ）で得られた総ｍＲＮＡに基づいて、ＩｇＥ Ｆｄ遺伝子領域およびカッパ／ラムダ軽鎖遺伝子をコードするｃＤＮＡを合成して、ＩｇＥ発現ライブラリーを構築し、
ｃ）受容体タンパク質または酵素を目的の標的タンパク質とし、該標的タンパク質、あるいは該タンパク質を表面に発現している細胞または粒子に対して発現ライブラリーをスクリーニングし、
ｄ）該タンパク質に対して中度から高度の（即ち、１０7 Ｍ-1を超える）親和性を示すクローンを該ライブラリーから単離し、
ｅ）上記工程ｄ）で単離したクローンから、受容体タンパク質に対するリガンドの結合または酵素に対する基質の結合を防止するＩｇＥモノクローナル抗体クローンを選択し、そして
ｆ）所望により、上記工程ｅ）で得たＩｇＥモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離する。
【００２５】
上記の方法は、工程ｅ）で得たクローンをＩｇＧ型またはＩｇＭ型の抗体に変換する工程ｇ）をさらに包含することが好ましい。抗体の型を変更するために、抗体の定常部位を変更する方法は当業界で広く知られている。
【００２６】
本発明の好ましい態様の１つにおいては、本発明の方法における目的の標的タンパク質は多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２）などの薬剤耐性ポンプである。薬剤耐性ポンプとは、細胞膜を隔てたアニオンの輸送を司る主要な胆管有機アニオントランスポーターである。ポンプの中には複数の異なるリガンドを有するものがある。本発明は、複数のリガンドを有するポンプと１種または数種のリガンドとの結合を防止するが、全てのリガンドの結合を防止することのないＩｇＥを主成分とする化合物の製造方法であることが好ましい。より好ましくは、上記ＩｇＥを主成分とする化合物は、複数のリガンドを有するポンプと１種の特定のリガンドとの結合のみを防止する化合物であり、その結果、他のリガンドはポンプに結合するが、上記特定のリガンドの結合のみがＩｇＥを主成分とする化合物のポンプへの結合によって防止される。従って本発明の方法は、複数のリガンドを有する薬剤耐性ポンプに結合するが、複数のリガンドの全てによる結合を防止またはブロックすることのないＩｇＥモノクローナル抗体を選択するための工程をさらに包含することが好ましい。上記工程は、複数のリガンドを有する薬剤耐性ポンプに結合するＩｇＥモノクローナル抗体であって、１種の特定のリガンドによる結合を防止またはブロックするが、該ＩｇＥモノクローナル抗体の結合したポンプに他のリガンドが結合することを可能とする抗体の選択を包含することがより好ましい。同様の方法を、複数の基質を有する酵素に対して用いることができる。
【００２７】
本発明の他の好ましい態様においては、複数のリガンドを有する薬剤耐性ポンプに結合し、全てのリガンドの結合を防止またはブロックするＩｇＥモノクローナル抗体を選択する。
【００２８】
本発明の他の好ましい態様においては、１種または数種のリガンドを有する第１の受容体タンパク質に結合するが、１種または数種のリガンドを有する第２の受容体タンパク質には結合しないＩｇＥモノクローナル抗体を選択する。第２の受容体タンパク質とは、第１の受容体タンパク質と関連し、１種または数種のリガンドを有するものである。例えば、標的タンパク質が複数のリガンドを有する薬剤耐性ポンプである多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２）である場合、ＭＲＰ２に対する１種または数種のリガンドの結合を防止するが、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター（即ち、ＡＢＣ−トランスポーター）などの、関連受容体タンパク質への１種または数種のリガンドの結合を防止しないＩｇＥ モノクローナル抗体を選択することが好ましい。このような状況において「関連受容体タンパク質」とは、構造の相同性、重複するリガンドまたは基質特異性、および／または細胞または組織において類似した機能を有する一群の受容体タンパク質を意味する。ＭＲＰ２の他の関連受容体タンパク質としては、例えば、多剤耐性関連タンパク質１（ＭＲＰ１）が挙げられる。ＭＲＰ１とＭＲＰ２の基質／リガンド特異性の大部分が重複するが、組織における局在性は異なる。ＭＲＰ２に対する公知のリガンドとしては、グルタチオン抱合体、グルクロニド抱合体（例えば、エストラジオール−１７−ｂ−Ｄ−グルクロニド）、ロイコトリン、メトトリキセート、オクラトキシンＡおよびｐ−アミノ馬尿酸（ＰＡＨ）などの、抱合型または非抱合型の有機アニオンが挙げられる。
【００２９】
本発明の他の好ましい態様の一例においては、多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２）に対する１種または数種のリガンドの結合を防止しうるＩｇＥモノクローナル抗体を次の方法で調製する。ヒトＩｇＥ ＶＨ／κＶＬまたはλＶＬのｓｃＦｖファージライブラリーを、初めにアレルギー患者のリンパ球から単離したｍＲＮＡから構築する。軽鎖および重鎖の可変領域ｃＤＮＡを、Ｆｄ ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＥに特異的なプライマーを用いて合成し、ヒト軽鎖のカッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖をヒトκ鎖およびλ鎖に特異的なプライマーを用いて合成した。軽鎖および重鎖の可変領域は、Ｖκ ｃＤＮＡ用のヒトκ鎖特異的プライマーとＶλ ｃＤＮＡ用のヒトκλ鎖特異的プライマーおよびＶH ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＥ特異的プライマーをそれぞれ用いてＰＣＲによって増幅した。これらのＰＣＲプライマーに導入しておいた制限部位を利用して、ｓｃＦｖファージディスプレイベクターに可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、ヒトＩｇＥ／ＩｇＧ ｓｃＦｖライブラリーを構築した。
【００３０】
次に、バイオパニング法を利用したファージディスプレイによって、ヒトＩｇＥ ＶＨ／κＶＬまたはＶＨ／λＶＬのｓｃＦｖライブラリーをＭＲＰ２含有ベシクル（ＭＲＰ２については、Borst et al. 2006を参照）に対して選択した。ＭＲＰ２ベシクルはマイクロプレートウエルに受動的に固定化することが好ましい。ファージの溶出は、ＴＥＡで行うことが好ましい。ファージ溶出液はE. coli細胞で増幅する。十分な回数のバイオパニングを繰り返した後、選択したｓｃＦｖ断片の結合特異性をＥＬＩＳＡで分析する。数種のＭＲＰ２特異的ｓｃＦｖ断片クローンが得られると考えられる。
【００３１】
本願明細書に記載したように、ファージディスプレイ法は、本発明の選択工程のためのヒトＩｇＥ ＶＨ／κＶＬまたはＶＨ／λＶＬ組み換え抗ＭＲＰ２抗体を開発するための有効かつ簡便な方法である。単離した抗ＭＲＰ２抗体は、ＭＲＰ２に対して高い親和性と特異性を示すことから、リガンド活性の測定によるＭＲＰ２の機能の特徴付けや、免疫化学染色法による細胞サンプルおよび組織サンプルにおけるＭＲＰ２分布の特定に有用である。さらに、単離した抗ＭＲＰ２抗体は、ＭＲＰ２の機能の詳細な調節、例えば、このトランスポーターに対する種々のリガンドの流出を不活性化または活性化すること、を行うための手段を提供する。単離したＩｇＥ抗体を、標的受容体、トランスポーターまたは酵素とそれに特異的なリガンドを用いた選択的な不活性化／活性化アッセイにも応用することで、細胞、組織または器官に存在する非常に関連性の高い相対物に対して影響を与えないクローンを発見することができる。
【００３２】
平坦な構造に対するフォーカスドＩｇＥ−抗体ライブラリー
薬剤の開発において最も難しい課題は、「医薬品になり得ない（undruggable）」標的、即ち、タンパク質−タンパク質相互作用によって形成された、生物学的なマクロ分子である。ホモ二量体、ヘテロ二量体、酵素基質や阻害剤との複合体、抗体-抗原複合体あるいは多成分複合体（例えば、リボソームやプロテオソーム）を含む種々のタンパク質-タンパク質複合体が、細胞、細胞小器官、組織および器官において重要な機能を仲介している。これらのタンパク質−タンパク質相互作用には、一般的に複数の接触部位を有する大きく且つ比較的平坦な表面領域が関与しているため、小分子薬剤の標的とするのは難しい。
【００３３】
アレルゲンであるβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ，Bos d 5）構造と複合体を形成したＩｇＥ Ｆａｂ抗体（Ｄ１ Ｆａｂ）の最近判明した構造は、ＩｇＥ抗体が、ＩｇＧ抗体とは構造的に異なる結合部位を好むことを示唆している（出版準備中）。ＢＬＧのエピトープは６種の異なる短いポリペプチド鎖断片からなり、そのほとんどがアレルゲン表面の平坦な領域を覆う二次構造要素、特にβ−鎖に位置している。ＩｇＥ／Ｆａｂ断片の６種のＣＤＲ（相補性決定領域）ループは、ＢＬＧの結合に関与する。ＩｇＥ／Ｆａｂ軽鎖のＣＤＲループは、ＢＬＧの平坦なβシート領域の結合に関与している。文献に開示されたＩｇＥ配列のアミノ酸配列比較は、多様なアレルゲン群に結合する公知のＩｇＥ抗体の軽鎖は驚くほど保存性が高いことを明らかにし（表５を参照）、これらの類似した軽鎖配列は、β−シートの平坦な表面または類似した平坦な部位（flat patch）にも結合しうることを示唆した。この結果は、診断または治療に適応可能な平坦な表面に特異的な抗体の単離に使用できる、フォーカスドライブラリーの構築に有効なツールを提供する。保存された軽鎖配列の情報は、ＩｇＥ抗体から同定された特徴的なアミノ酸配列を有する複数の軽鎖または単一の軽鎖に限定されたプールの構築に使用した。この軽鎖配列の情報を、複数のアレルギー患者から得たリンパ球から単離したＩｇＥ重鎖遺伝子の多様なプールと組み合わせた。結果として得られた、ディスプレー形式がｓｃＦｖ型またはＦａｂ型である抗体ファージディスプレイライブラリーは、実施例１の記載またはHoogenboom et al. (1998)およびHoogenboom (2005)の記載と実質的に同様の方法で行う、標的特異的ＩｇＥ抗体の選択に使用した。
【００３４】
本発明の抗体断片を得るために有効な選択方法の一つを記載したが、本発明の抗体断片を得ることが可能な多数の応用方法も当業者には明らかとなる。ｓｃＦｖ断片またはその誘導体のファージディスプレイライブラリーまたは微生物ディスプレイライブラリーから本発明のｓｃＦｖ断片を直接選択することが可能であることは明らかなはずである。本発明のｓｃＦｖ断片または他の抗体断片を表面タンパク質との融合タンパク質として提示するファージまたは微生物細胞は、本発明の更なる態様の一つである。また、フローサイトメトリーによってＭＲＰ−特異的抗体を単離することも可能である。
【００３５】
微生物細胞による本発明の抗体および抗体誘導体の発現は、免疫診断アッセイおよび免疫療法に適した均一な品質の高特異性試薬を効率よく且つ経済的に製造するための手段を提供する一方で、このような試薬またはその少なくとも一部が合成可能であることも示している。従来の遺伝子工学的手法を適用することにより、初めに得られた本発明の抗体断片をその結合特性を実質的に変えることなく改変する（例えば、新たな配列を連結する）ことができる。このような手法は、上記で定義した標的抗原に対する親和性および特異性の両方を保持する新規な結合性ハイブリッドタンパク質の製造にも用いることができる。
【００３６】
本発明の他の一つの態様においては、本発明の抗体および抗体誘導体をコードするＤＮＡ分子あるいは該ＤＮＡの断片であって、ＶLおよび／またはＶH領域のＣＤＲをコードするものを提供する。このようなＤＮＡはベクターにクローニングされていてもよく、具体的には、例えば、本発明の抗体の誘導体、少なくとも１つの抗体鎖または抗体鎖の一部を発現可能な発現ベクターにクローニングされていてもよい。
【００３７】
本発明の更なる一つの態様においては、本発明のＤＮＡ分子を含む、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞からなる群より選ばれる宿主細胞であって、本発明の抗体および抗体誘導体を発現することが可能な宿主細胞を提供する。したがって、本発明の抗体誘導体は、必要な抗体鎖を発現する本発明の宿主細胞を培養し、そして宿主細胞の産生した目的タンパク質を直接回収することで製造するか、あるいは、必要であれば個別の抗体鎖を回収し、それらを組み合わせることもできる。
【実施例１】
【００３８】
Ｉ．ヒトＩｇＥ／ＩｇＭ ｓｃＦｖファージライブラリーの構築
以前に構築したヒト ナイーブｓｃＦｖライブラリー（ＩｇＭ／カッパおよびＩｇＭ／ラムダ）ならびに牛乳アレルギーおよびラテックスアレルギーのＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリー（ＩｇＥ／カッパおよびＩｇＥ／ラムダ）を出発材料として、ＩｇＥ／ＩｇＭライブラリーを構築した。簡単に説明すると、ヒト ナイーブライブラリー（ＩｇＭ）は、５０人の健常血液ドナーのリンパ球から構築した。ＩｇＥライブラリーの構築のためには、合計１５０ｍｌの血液（ヘパリンを加えたもの）を異なるアレルギープロファイルを示すアレルギー患者３人から得た。リンパ球をIg-Prime Kit Protocol（Novagen社製）に従って次の手順で単離した。血液１０ｍｌあたり３０ｍｌの溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を加え、時々振とうしながら氷上で１５分間インキュベートした。４５０ｇで１０分間遠心分離した後、リンパ球、即ち白血球ペレット、を回収した。回収したペレットを溶解緩衝液で２回洗浄し、最後の遠心分離の後に得られたリンパ球ペレットをＤ−溶液（D-solution）に再懸濁した。リンパ球ＲＮＡをPromega社のRNAgents Total RNA Isolation kitを用いて製造者のマニュアルに従って単離した。初めのｃＤＮＡ合成はPromega社のReverse Transcription system kitを用いて行った。ＦｄフラグメントｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡの合成には、イプシロン（ε）鎖の定常領域のプライマー（Ｃε１）、ならびにカッパ鎖のプライマー（Ｃκ１）とラムダ鎖のプライマー（Ｃλ１）をそれぞれ用いた。ヒトＩｇＥ Ｆｄ領域および軽鎖のｃＤＮＡ合成とＰＣＲ増幅に用いたプライマーを表１および表２に示す。
【００３９】
ＰＣＲ増幅は２段階、具体的にはｃＤＮＡテンプレートからＦｄ鎖および軽鎖を増幅するための一次ＰＣＲと、一次ＰＣＲで得たＤＮＡ断片の５’末端に制限部位を加えるための二次ＰＣＲを行った。まず、重鎖の可変領域に特異的なプライマー（ＶＨ１ａ−ＶＨ７ａ）およびＣε１プライマーを用いてＦｄ領域をＰＣＲで増幅した。次に、カッパ鎖およびラムダ鎖を軽鎖可変領域に特異的なプライマー（それぞれＶκ１ａ−Ｖκ６ｂとＶλ１ａ−Ｖλ１０）およびＣκ／λ１プライマーを用いて増幅した。二次ＰＣＲでは、カッパ軽鎖領域のＰＣＲ増幅にはＣκ１、Ｖκ／λ１およびＣκプライマーを用い、カッパ軽鎖のＰＣＲ増幅にはＶκ／λ１およびＣλ１プライマーを用い、ラムダ軽鎖のＰＣＲ増幅にはＶλ１ＡおよびＣκ／λ１プライマーを用いた。一次ＰＣＲは以下の条件で行った：９３℃で３分間の変性を１サイクル；９３℃で１分間、６３℃で３０秒および５８℃で５０秒のアニーリング、次いで７２℃で１分間の伸長を７サイクル；９３℃で１分間、６３℃で３０秒および７２℃で１分間を２３サイクル；最後に７２℃で１０分間を１サイクル。二次ＰＣＲは以下の条件で行った：９５℃で３分間の変性を１サイクル；９４℃で１．５分間、６５℃で１分間のアニーリング、次いで７２℃で１．５分間の伸長を２５サイクル；および７２℃で１０分間を１サイクル。一次ＰＣＲと二次ＰＣＲの間、および二次ＰＣＲの後には、増幅したＤＮＡフラグメントを精製した。
【００４０】
種々の抗体断片の最終ＰＣＲ産物をプールし、適切な制限酵素で消化した。消化したＤＮＡ断片であり、ＩｇＥ Ｆｄ領域やκ軽鎖やλ軽鎖をコードするＤＮＡ断片をファージミドベクターに連結し、そのファージミドベクターでE. coli XL-1 Blue細胞を形質転換して１０6個の独立したクローンからなるＦａｂ−κライブラリーおよびＦａｂ−λライブラリーを得た。ファージ粒子上のＦａｂフラグメントの発現に関わる問題を防止するために、ｓｃＦｖ形式の抗体ライブラリーを構築した。κλ種々のライブラリーからファージミドＤＮＡを単離し、ヒトＩｇＥ重鎖およびヒトＩｇＥ軽鎖の可変領域を増幅するための鋳型ＤＮＡとして用いることで、ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κライブラリーおよびｓｃＦｖ−λライブラリーを構築した。
【００４１】
重鎖可変領域のＰＣＲ増幅は、ヒトＶH特異的プライマー（ＶＨ１−ＶＨ４とＶＨ１Ａ）を用いて行った。軽鎖可変領域の増幅は以下のプライマーペアを用いて行った：ヒト κカッパ鎖の増幅にはＶκ１−Ｖκ７，Ｖκ２−Ｖκ８，Ｖκ３−Ｖκ９，Ｖκ４−Ｖκ１０，Ｖκ５−Ｖκ１１およびＶκ６−Ｖκ１１を用い、ヒト ラムダλ鎖の増幅にはＶλ１−Ｖλ８，Ｖλ２−Ｖλ９，Ｖλ３−Ｖλ９，Ｖλ４−Ｖλ９，Ｖλ５−Ｖλ１０，Ｖλ６−Ｖλ１０およびＶλ７−Ｖλ１０を用いた（表３および表４参照）。ｓｃＦｖファージディスプレイベクターに連結するために、増幅したＤＮＡフラグメントを精製し消化した（図３）。連結用混合物でE. coli XL-1 Blue細胞を形質転換し、約１０5個の独立したクローンからなるヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κライブラリーおよびｓｃＦｖ−λライブラリーを得た。
【００４２】
最終的に、ナイーブライブラリーのカッパ鎖およびラムダ鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをＳａｃＩ制限酵素およびＮｏｔＩ制限酵素で消化した。次に、牛乳アレルギー患者由来のＩｇＥ可変領域をコードするｃＤＮＡまたはラテックスアレルギー患者由来のＩｇＥ可変領域をコードするｃＤＮＡのを含有する、ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ消化済みベクターのそれぞれに上記で得たＤＮＡ断片を個別に導入した（ＩｇＥ／ＩｇＭ牛乳およびＩｇＥ／ＩｇＭラテックス）。得られたプラスミドでE. coli XL-1 Blue細胞の形質転換を行った。ライブラリーのプラスミドＤＮＡを単離する際には、ＩｇＥ／ＩｇＭ牛乳プラスミドＤＮＡを保有する細胞とＩｇＥ／ＩｇＭラテックスプラスミドＤＮＡを保有する細胞を１つにプールすることで、ヒトＩｇＥ／ＩｇＭカッパライブラリーとＩｇＥ／ＩｇＭラムダライブラリーを得た。
【００４３】
II．ベシクルの作製
ＭＲＰ２トランスポーターをコードするｃＤＮＡを保有するバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を回収した（１０００ｇ、＋４℃、１０分）。細胞ペレットを冷たいＰＢＳで洗浄し、再度遠心分離した。細胞ペレットを回収用バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、３００ｍＭのマニトール、プロテアーゼ阻害剤カクテル）で２回洗浄し、再度遠心分離（８００ｇ、＋４℃、５分）に付した。細胞ペレットをメンブランバッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、５０ｍＭのマニトール、２ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、プロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁して均質化し、続いて氷中で１時間インキュベートし、遠心分離（８００ｇ、＋４℃、１０分）に付した。上清を超遠心（１００，０００ｇ、＋４℃、６０分）に付した。得られたベシクルのペレットをメンブランバッファーに再懸濁し、注射器とＧ２７の注射針を用いて均質化した。
【００４４】
III．ＭＲＰ２提示ベシクル上のヒトＩｇＥ／ＩｇＭライブラリーの選択
バッファーＡ（５０ｍＭのＭＯＰＳ−トリスＨＣｌ，ｐＨ７．０、７０ｍＭのＫＣｌ、７．５ｍＭのＭｇＣｌ2）中のＭＲＰ２を有するベシクルとＭＲＰ２を有していないベシクルをマイクロプレートのウエルに固定化した。ウエルをバッファーＡ−１％ ＢＳＡでブロッキングした後、ファージプールの除去を行った。ＩｇＥ／ＩｇＭカッパライブラリーとＩｇＥ／ＩｇＭラムダライブラリーのファージを１つにまとめ、バッファーＢ（５０ｍＭのＭＯＰＳ−トリスＨＣｌ，ｐＨ７．０、７０ｍＭのＫＣｌ、７．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１％ ＢＳＡ）で１：４に希釈し、終濃度がそれぞれ５０μＭと４ｍＭとなるようにβ−エストラジオールとＭｇＡＴＰを添加した。次に、ファージプールを、ＭＲＰ２を有していないベシクルと共に＋３７℃で３時間インキュベートすることで、ＭＲＰ２を有していないベシクルに結合したファージを除去した。未結合のファージは回収した（除去ファージプール）。
【００４５】
選択のために、除去ファージプールを両方のベシクルと共にインキュベートした。特異的結合性物質の富化に続いて、除去ファージプールを、ＭＲＰ２を有していないベシクルと共にインキュベートした。初めに、除去ファージプールをバッファーＢで１：２に希釈し、上記と同様にβ−エストラジオールとＭｇＡＴＰを添加し、次にベシクルと共にインキュベートした。結合したファージはＴＥＡで溶出した。最後に、E. coli XL-1 Blue細胞を溶出したファージに感染させて、富化したファージを増幅した。
【００４６】
IV．単離した抗体の特徴付け
ＭＲＰ２に対する抗体の結合特性の特徴付けをＥＬＩＳＡで行った。富化抗体ファージプールおよび／または個別のクローンから調製した抗体ファージを使用した。ＥＬＩＳＡにおいては、バッファーＡ（５０ｍＭのＭＯＰＳ−トリスＨＣｌ，ｐＨ７．０、７０ｍＭのＫＣｌ、７．５ｍＭのＭｇＣｌ2）中のＭＲＰ２を有するベシクルとＭＲＰ２を有していないベシクルをマイクロプレートのウエルに固定化した。ウエルをバッファーＡ−１％ ＢＳＡでブロッキングした後、ファージを添加し、室温で１時間、振とう下でインキュベートした。洗浄工程の後、抗Ｍ１３抗体を用いて結合ファージを検出した。二次抗体としては、ＡＦＯＳ−抱合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いた。基質であるｐ−ニトロフェニルホスファターゼの添加後、４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００４７】
基質（β−エストラジオールなど）の細胞膜を隔てた輸送を、ベシキュラー輸送アッセイで実施した。このアッセイによって、試験薬（活性化剤／阻害剤）とＭＲＰ２トランスポーターおよび／または関連ＡＴＰ−結合カセットトランスポーターとの相互作用を決定する。選択したｓｃＦｖ抗体クローン（種々の濃度）を、上述したように作製したＭＲＰ２ベシクルおよび対照ベシクルと共にインキュベートした。いずれのベシクルもアッセイバッファー（４０ｍＭのＭＯＰＳ−トリスＨＣｌ，ｐＨ７．０、５５ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ2）で希釈した。次に、終濃度５０ｍＭの標識基質（例えば、3Ｈ β−エストラジオール１７−（β−Ｄ−グルクロニド））を添加し、＋３７℃で５分間プレインキュベートした。反応は、終濃度４ｍＭのＭｇ−ＡＴＰの添加によって開始した。反応は、＋３７℃で１６分間行った。ベシクルをグラスフィルター（孔径０．７μｍ）上に回収し、液体シンチレーションシステムで測定する前に洗浄した。
【００４８】
【表１】
2010516747.tif 000002
【００４９】
【表２】
2010516747.tif 000003
【００５０】
【表３】
2010516747.tif 000004
【００５１】
【表４】
2010516747.tif 000005
【００５２】
【表５】
2010516747.tif 000006
【００５３】
参考文献
Argos, P. (1988) Protein Engineering 2, 101-113.
Borst, P., Zelcer, N. and van de Wetering, K. (2006) Cancer Letters, 234, 51-61.
Carter, P.J. (2006) Nature Reviews Immunology 6, 343-356.
De Genst E., Silence K., Decanniere K., Conrath K., Loris R., Kinne J., Muyldermans S., Wyns L. (2006) PNAS 103, 4586-4591.
Hoogenboom, H.R., de Bruine, A.P., Hufton, S.E., Hoet, R.M., Arends, J.-W. and Roovers, R.C. (1998) Immunotechnolgy 4, 1-20.
Hoogenboom, H.R (2005) Nature Biotechnology 23, 1105-1116.
Laukkanen, M.-L., Makinen-Kiljunen, S., Isoherranen, K., Haahtela, T., Soderlund, H., and Takkinen, K. (2003 J. Immunol. Meth. 278, 271-281.
Mirza, O., Henriksen, A., Ipsen, H., Larsen, J.N., Wissenbach, M., Spangfort, M.D., and Gajhede, M. (2000) J. Immunol. 165, 331-338.
Prasad, L., Waygood, E.B., Lee, J.S. and Delbaere, L.T.J. (1998) J. Mol. Biol. 280, 829-845
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＩｇＥ Ｄ１ ＦａｂアレルゲンおよびＩｇＧ−抗原免疫複合体のエピトープ構造の比較。Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂのβ−ラクトグロブリンに対する結合（左）、ＩｇＧ Ｆａｂ ＪＥＬ４２のリン酸輸送タンパク質に対するＩｇＧ抗体−抗原型結合（中央）（Prasad et al. 1998）およびＢＶ１６／Ｆａｂの花粉アレルゲンBet v 1に対するＩｇＧ−アレルゲン型結合（右）（Mirza et al, 2000）。
【図２】図２は、完全なヒトＩｇＥサブクラス抗体、Ｆａｂ断片および一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の該略図である。抗原結合部位は三角形で示す。
【図３】図３は、パニング法の概略図である。
【図４】図４は、ｓｃＦｖファージライブラリーの構築に使用したｓｃＦｖファージディスプレイベクターの概略図である。
【図５】図５は、Ｄ１／Ｆａｂ抗体の表面およびアレルゲンＢＬＧのリボンモデルである。この図においては、Ｄ１／Ｆａｂに含まれる、ヘベイン結合性ＩｇＥ抗体（クローンＩＣ２）（Laukkanen et al. 2003）と同一の残基を薄いグレーで示し、異なる残基を濃いグレーで示した。ａ）は正面図であり、ｂ）は側面図である。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列であって、配列中の第５番アミノ酸は任意のアミノ酸であり、第８番アミノ酸はセリンまたはスレオニンである。
配列番号２    ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列であって、配列中の第３番〜第５番アミノ酸は任意のアミノ酸であり、第８番アミノ酸はセリンまたはスレオニンであり、第９番〜第１１番アミノ酸は任意のアミノ酸である。
配列番号３  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列である。
配列番号４    ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５    ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６    ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７    ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号８    ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号９    ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１０  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１１  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１２  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１３  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１４  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１５  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１６  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１７  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１８  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号１９  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２０  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２１  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２２  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２３  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２４  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２５  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２６  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２７  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２８  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号２９  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３０  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３１  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３２  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３３  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３４  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３５  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３６  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３７  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３８  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号３９  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４０  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４１  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４２  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４３  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４４  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４５  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４６  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４７  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４８  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号４９  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５０  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５１  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５２  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５３  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５４  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５５  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５６  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５７  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５８  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号５９  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６０  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６１  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６２  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６３  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６４  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６５  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６６  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６７  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６８  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号６９  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７０  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７１  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７２  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７３  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７４  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７５  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７６  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７７  ＰＣＲによる増幅用のプライマー
配列番号７８  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号７９  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８０  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８１  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８２  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８３  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８４  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８５  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８６  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８７  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８８  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号８９  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号９０  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号９１  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号９２  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号９３  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号９４  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号９５  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号９６  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号９７  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号９８  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号９９  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１００  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０１  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０２  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０３  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０４  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０５  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
【図１】
2010516747.tif 000007
【図２】
2010516747.tif 000008
【図３】
2010516747.tif 000009
【図４】
2010516747.tif 000010
【図５】
2010516747.tif 000011
【配列表】
2010516747000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月2日(2009.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体タンパク質に対するリガンドまたは酵素に対する基質の結合を防止しうる組み換えＩｇＥモノクローナル抗体またはその機能的断片の製造方法であって、該リガンドまたは基質と結合する部位は、窪み、クレフト、チャネルまたは平面状表面を含んでおり、該結合部位は、ＩｇＧまたはＩｇＭに対して弱い免疫活性を示すことを特徴とする、以下の工程を包含する製造方法。
ａ）ヒト由来サンプルのＩｇＥ産生細胞から総ｍＲＮＡを単離し、
ｂ）上記工程ａ）で得られた総ｍＲＮＡに基づいて、ＩｇＥ Ｆｄ遺伝子領域およびカッパ／ラムダ軽鎖遺伝子をコードするｃＤＮＡを合成して、ＩｇＥ発現ライブラリーを構築し、
ｃ）該受容体タンパク質または酵素を目的の標的タンパク質とし、該標的タンパク質あるいは該標的タンパク質を表面に発現している細胞または粒子に対して発現ライブラリーをスクリーニングし、
ｄ）該タンパク質に対して、１０7 Ｍ-1を超える中度から高度の親和性を示すクローンを該ライブラリーから単離し、
ｅ）上記工程ｄ）で単離したクローンから、該リガンドまたは基質と結合する部位に含まれる窪み、クレフト、チャネルまたは平面状表面に結合し、該受容体タンパク質に対する該リガンドの結合または該酵素に対する該基質の結合を防止するＩｇＥモノクローナル抗体クローンを選択し、そして
ｆ）所望により、上記工程ｅ）で得たＩｇＥモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離する。
【請求項２】
工程ｅ）において選択したＩｇＥモノクローナル抗体クローンが、該受容体タンパク質に対する全てのリガンドの結合または該酵素に対する全ての基質の結合を防止するクローンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該受容体タンパク質または酵素には、複数種のリガンドまたは基質が存在することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記工程ｅ）において選択したＩｇＥモノクローナル抗体クローンが、該受容体タンパク質に対する１種の特定のリガンドの結合または該酵素に対する１種の特定の基質の結合を防止するクローンであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該受容体タンパク質が薬剤耐性ポンプであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該薬剤耐性ポンプが多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２）であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該リガンドが、抱合型または非抱合型の有機アニオン、例えばグルタチオン抱合体、グルクロニド抱合体、ロイコトリエン、メトトリキセート、オクラトキシンＡまたはＰＡＨ、であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該リガンドが、エストラジオール−１７−ｂ−Ｄ−グルクロニドであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程ｅ）において選択したＩｇＥモノクローナル抗体クローンが、ＭＲＰ２に対する１種または数種のリガンドの結合を防止するが、ＡＴＰ−結合カセットトランスポーター（ＡＢＣ−トランスポーター）に対するリガンドの結合は防止しないクローンであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｅ）において選択したＩｇＥモノクローナル抗体クローンが、ＭＲＰ２に対する１種の特定のリガンドの結合を防止するクローンであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
受容体タンパク質に対するタンパク質リガンドの結合を防止しうる組み換えＩｇＥモノクローナル抗体またはその機能的断片である、タンパク質−タンパク質相互作用の調節因子の製造方法であって、タンパク質リガンドと結合する部位は平面状表面を含んでおり、該結合部位は、ＩｇＧまたはＩｇＭに対して弱い免疫活性を示すことを特徴とする、以下の工程を包含する方法。
ａ）ＩｇＥ抗体から同定したアミノ酸配列を有する軽鎖をコードする核酸配列のプールであって、複数の軽鎖の核酸配列または単一の軽鎖の核酸配列に限定されたプールを選択し、
ｂ）該軽鎖核酸配列を、複数のアレルギー患者のリンパ球から単離したＩｇＥ重鎖遺伝子の多様なプールと組み合わせることで、ＩｇＥ発現ライブラリーを構築し、
ｃ）該受容体タンパク質を目的の標的タンパク質とし、該標的タンパク質あるいは該標的タンパク質を表面に発現している細胞または粒子に対して発現ライブラリーをスクリーニングし、
ｄ）該タンパク質に対して、１０7 Ｍ-1を超える中度から高度の親和性を示すクローンを該ライブラリーから単離し、
ｅ）上記工程ｄ）で単離したクローンから、該タンパク質リガンドと結合する部位に含まれる平面状表面に結合し、該受容体タンパク質に対する該タンパク質リガンドの結合を防止するＩｇＥモノクローナル抗体クローンを選択し、そして
ｆ）所望により、上記工程ｅ）で得たＩｇＥモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離する。
【請求項１２】
該軽鎖が、表５で定義したＣＤＲ−Ｌｌ配列およびＣＤＲ−Ｌ２配列からなる群より選ばれる１種または数種を包含することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該ＣＤＲ−Ｌ２配列が下記アミノ酸配列を包含することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
ＬＬＩＹＸＡＳＳ／Ｔ  （配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である。）
【請求項１４】
該ＣＤＲ−Ｌ２配列が下記アミノ酸配列を包含することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
ＬＬＸＸＸＡＳＳ／ＴＸＸＸ  （配列番号２）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸である。）
【請求項１５】
該ＣＤＲ−Ｌ２配列が下記アミノ酸配列を包含することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
ＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳ  （配列番号３）。
【国際調査報告】
2010516747.tif 000012
2010516747.tif 000013
2010516747.tif 000014
2010516747.tif 000015