(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＲ１乃至ＦＲ４のアミノ酸配列を持つ水溶性ＶＨドメイン抗体骨格であって、前記Ｈドメイン抗体骨格が、下記ＦＲ１乃至ＦＲ４のアミノ酸配列を持つ骨格中から選択されることを特徴とする水溶性ＶＨドメイン抗体骨格。
0006293829.tif 000051
0006293829.tif 000052
0006293829.tif 000053
【請求項２】
ＦＲ１乃至ＦＲ４のアミノ酸配列を持つ水溶性ＶＨドメイン抗体骨格であって、前記Ｈドメイン抗体骨格が、下記ＦＲ１乃至ＦＲ４のアミノ酸配列を持つ骨格中から選択されることを特徴とする水溶性ＶＨドメイン抗体骨格。
0006293829.tif 000054
0006293829.tif 000055
【請求項３】
ＦＲ１乃至ＦＲ４のアミノ酸配列を持つＶＨドメイン抗体骨格が以下のものである、請求項１又は２に記載のＶＨドメイン抗体骨格。
0006293829.tif 000056
【請求項４】
配列番号５０、６２、６３、９６、１０３、１０４、１０７、１０８、１１７、１２４、１３３、１３９、及び１４０からなる群から選択される一つ以上の配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のＶＨドメイン抗体骨格。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＶＨドメイン抗体骨格をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＶＨドメイン抗体骨格を持つＶＨドメイン抗体。
【請求項７】
請求項６に記載のＶＨドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＶＨドメイン抗体骨格にヒト由来無作為（ｒａｎｄｏｍ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が挿入されたＶＨドメイン抗体ライブラリー。
【請求項９】
前記挿入されたＣＤＲＨ３のアミノ酸残基の個数は、５〜１５であることを特徴とする請求項８に記載のＶＨドメイン抗体ライブラリー。
【請求項１０】
前記挿入されたＣＤＲＨ３のアミノ酸残基の個数は、７〜１３であることを特徴とする請求項８に記載のＶＨドメイン抗体ライブラリー。
【請求項１１】
前記ヒト由来無作為（ｒａｎｄｏｍ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、突然変異か誘発されたことを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＶＨドメイン抗体ライブラリー。
【請求項１２】
カバット（Ｋａｂａｔ）配列順番体系を基準に、ＣＤＲＨ１の３０番及び３１番、ＣＤＲＨ２の５３番及びＣＤＲＨ３の９７番、９９番、１００番、１００ａ番位置で選択された一つ以上の位置で突然変異が誘発されたことを特徴とする請求項１１に記載のＶＨドメイン抗体ライブラリー。
【請求項１３】
前記ライブラリーは未感作（ｎａｉｖｅ）、合成または免疫ライブラリーであることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか一項に記載のＶＨドメイン抗体ライブラリー。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか一項に記載のＶＨドメイン抗体ライブラリーを利用した目的とする抗原に対する結合能を持つＶＨドメイン抗体の選別方法。
【請求項１５】
前記目的とする抗原に対する結合能を持つＶＨドメイン抗体の選別は、固定された目的とする抗原に結合したＶＨドメイン抗体を除いて固定された目的抗原に結合しないＶＨドメイン抗体を溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）して行うことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固定された目的抗原に結合しないＶＨドメイン抗体を溶出する過程は二回以上繰り返すことを特徴とする請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Tat信号配列に目的蛋白質と抗生剤耐性蛋白質を結合させて、これを大腸菌で発現させて、水溶性(soluble)であり熱力学的安定性が優れた目的蛋白質、特にヒト生殖細胞由来免疫グロブリン可変ドメイン(Immunoglobulin  variable  domain、VHまたはVL)の目的蛋白質を選別するTat経路基盤蛋白質水溶性スクリーニング(TAPE:Tat-Associated  Protein  Engineering)と命名された方法及びTAPE方法によって選別された水溶性であり熱力学的安定性が優れたヒトVH及びVLドメイン抗体及びヒトVH及びVLドメイン抗体骨格(scaffold)に関し、そのようなVH及びVLドメイン抗体及びそのような抗体骨格(scaffold)のアミノ酸配列及びこれをエンコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
本発明により選別されたヒトVHまたはVL骨格(scaffold)を含むVHまたはVLドメイン抗体は、CDR配列と関係なく該当ヒトVH及びVLドメイン抗体骨格を持つ場合、依然として水溶性であり熱力学的安定性を維持する。
【０００３】
また本発明は、TAPE方法によって選別されたヒトVHまたはVLドメイン抗体骨格に無作為的(random)  CDR配列を含むライブラリー及びその製造方法に関する。
【０００４】
本発明は、そのようなライブラリーを利用して選別された目的蛋白質に結合能を持つVHまたはVLドメイン抗体、そのようなドメイン抗体のアミノ酸配列及びこれをエンコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００５】
断片化された小さい大きさの抗体は、既存のモノクローナル抗体(monoclonal  antibody、mAb)とは違った差別性によって既存の抗体治療剤の限界を克服できる抗体形態で有望である。一般的な断片化抗体は、一本鎖抗体(single  chain  antibody:scFv)、Fab(Fragment  antibody-binding)、VHやVLのようなイムノグロブリン可変領域抗体(Immunoglobulin  variable  domain  antibody)等があって、これらの変形形態であるタンデム(tandem)  scFv、二重特異性抗体(diabody)、低分子抗体(minibody)等がある(Better  et  al.,  Science  1988  240(4855):1041-3;  Huston  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U  S  A.  1988  85(16):5879-83;  Bird  et  al.,  Science  1988  242(4877):423-6;  Pei  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U  S  A.  1997  94(18):9637-42;  Iliades  et  al.,FEBS  Lett.  1997  409(3):437-41;  Ward  et  al.,  Nature  1989  341(6242):544-6)。
【０００６】
従来のモノクローナル抗体と比較すると、断片または小型抗体の場合は、Fc(crystallizable  fragment)の機能が喪失された場合が多いので、Fcの存在による血中半減期(hALFLife)増大及び細胞殺害機能(effector  function)等の効果が期待できないとの短所がある。
【０００７】
しかし、小さい大きさの断片化抗体は、既存の全抗体(whole  antibody)の大きい大きさによる短所である構造的に隠されているエピトープ(epitope)接近の限界性、薬の浸透性(penetration)及び分布(biodistribution)、形態の可変性(format  flexibility)、高生産費用などの限界を克服できる次世代抗体の形態として浮上している(Zhao  et  al.,Blood  2007  110(7):2569-77;  Holliger  et  al.,  Nat.  Biotechnol.  2005  23(9):1126-36;  Hudson  et  al.,Med.  Microbiol.  Immunol.  2009  198(3):157-74;  Enever  et  al.,  Curr.  Opin.  Biotechnol.  2009  20(4):405-11)。
【０００８】
さらには、各種断片及び小型抗体は、化学的または、組換え蛋白質融合の方法で連結して二重または多重特異性を簡単に実現することができる長所がある。
【０００９】
このような長所を活用して、最近既存抗体のFc機能をモジュール(module)化された形態で多重特異性を導入すると短所と指摘されてきたエフェクター(effector)機能及び短い血中半減期の補完が可能な形態に発展している。例えば、ヒト血漿アルブミン(Human  Serum  Albumin)に対する結合特異性を持つ断片または小型抗体をモジュールとして導入して、二重特異性抗体を実現して血中半減期を伸ばしたり、自然殺害細胞(Natural  Killer)やT細胞のような免疫機能の細胞に特異的に親和的な小型抗体をモジュールとして導入して抗体に細胞殺害機能を与えることができる(Els  et  al.,  J  Biol  Chem.  2001  9;  276(10):7346-50;  Bargou  et  al.,  Science  2008  321(5891):974-7;  et  al.,  Mol.  Cancer  Ther.  2008  7(8):2288-97)。そして、それぞれ異なる作用モードを期待する二つ以上の分子ターゲットに対して、一つの抗体に特異性を与えることができる形態で設計が可能だあるため、抗体の効能と経済性を画期的に改善させる可能性を広げることができる。
【００１０】
ヒト抗体の構造で抗原特異的結合の機能を有した最小限の単位は、軽鎖または重鎖のN-末端に位置する可変ドメインである重鎖可変領域ドメイン(VH:heavy  chain  variable  domain)と軽鎖可変領域ドメイン(VL:light  chain  variable  domain)である。各二つのN-末端は、互いに相補的な構造に進化したので、プラズマB細胞からモノクロナール抗体が生産される時、軽鎖と重鎖が合体される過程でVHとVLは、非共有結合形態の複合体を成してこれを介して構造的安定性を維持する。ヒト抗体可変ドメインVHセグメント(segment)の場合、エピトープに結合するCDR  (Complementary  Determinant  Region)部分を除いたフレームの部分のアミノ酸配列の相同性により七つのファミリー(family)で区分(VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7)され、各ファミリーは、三つで２２種類の固有のアミノ酸配列が含まれている。軽鎖のVLの場合は、V  kappaとV  lamdaに区分されて、それぞれV  Kappaは６種類、V  lamdaは１０種類のファミリーに分類される(Chothia  et  al.,  1992  J.  Mol.  Biol.  227、  799-917;  Tomlinson  et  al.,1995  EMBO  J.  14、4628-4638;  Williams  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  264、  220-232)。数多くのVH及びVLは、互いの相互親和程度により好まれるVH/VL組み合わせがあると知られてね抗体レパートリー(repertoire)の多様性を増大させるのにこのような遺伝子の組み合わせによる再配列(combinatorial  rearrangement)が重要な役割をすると知られている(Ruud  et    al.,J.  Mol.  Biol.  1999、  285、  895-901)。
【００１１】
結合された形態のVH/VLは、６個のCDR組み合わせにより互いに相補的に特定抗原に対する結合特異性を与える。軽鎖の可変ドメインに３個(light  chain  CDR1、2、及び3)、重鎖の可変ドメインに３個(heavy  chain  CDR1、2、及び3)、合計６個のCDRが抗原の結合に参加している。ヒト生殖系列塩基配列分析を介した研究結果によると、それぞれのCDRの多様性は、多くは重鎖可変ドメインのCDR3によって決定されることが明らかになった。従って、このような分析結果は、抗原の結合特異性も、重鎖のCDR3の可変性によって大部分決定することができるという点を示唆する。(J.  Mol.  Recogni.  2000,  13,  167-187)。
【００１２】
これとは異なって、ラクダとラマのような系列の動物及びサメのような軟骨構造を持つ魚類の場合、軽鎖構造が存在しなかった単一重鎖構造の抗体を有している。従って、このような抗体の可変ドメインは、ひたすら重鎖単一可変ドメイン(Camelid及びSharkそれぞれVHH及びVNAR)からなり、抗原結合及び中和能力においては、軽鎖の可変ドメインと重鎖の可変ドメインが同時に抗原の結合に参加するヒト抗体に比べて何ら不足がないと知られている。ヒトの場合重鎖疾患(heavy  chain  diseases)を持つ患者(Hendershot  et  al.,  J.  Cell.  Biol.  1987  104(3):761-7;  Prelli  et  al.,  J.  Immunol.  1992  148(3):  949-52)以外には、VHまたはVLが単独で存在する場合は非常に珍しい。なぜならはVHまたはVLの構造的相補性によって単独で分離する場合、構造的に不安定で蛋白質凝集(aggregation)現象が起き易いからである。部分的にこのような蛋白質凝集現象は、VHとVLが接する部位は主に疏水性のアミノ酸残基(hydrophobic  patch)が分布して、これによる疏水性相互親和作用(hydrophobic  interaction)に起因すると知られている。ラクダ抗体の場合は、特異的にVH/VL隣接表面に位置するアミノ酸の場合、ヒト抗体とは異なり親水性特性を持つアミノ酸残基が露出していることが分かるが、特にラクダ抗体と最も類似するアミノ酸配列を持つヒトVH3ファミリーと特異的に他の四地点のアミノ酸をテトラド(tetrad)と称し、カバットナンバリングシステム(Kabat  numbering  system、Kabat  et  al.,  1991  J.  Immunol.  147(5)、1709-1719)で37、44、45、及び47番アミノ酸を称する。このようなアミノ酸配列の差で、単一可変ドメイン抗体(VHH)の安定性を説明することもある。時々ヒト可変ドメイン抗体にテトラド位置のアミノ酸をラクダ抗体の親水性アミノ酸で交替(G44E/L45R/W47G)して改良されたラクダ化(camelized)抗体を作ろうとする試みがあった。
【００１３】
その結果、物理化学的特性においてある程度水溶性が改善されたが(Coppieters  et  al.,  Arthritis  Rheum.  2006  54(6):1856-66;  Dolk  et  al.,  Proteins.  2005  59(3):555-64;  Ewert  et  al.,  Biochem.  2002  41(11):3628-36;  Kortt  et  al.,  J.  Protein  Chem.  1995  14(3):167-78;  Martin  et  al.,  Protein  Eng.  1997  10(5):607-14)、返って蛋白質発現収率が落ちて熱安定性が減少するなど、ラクダ抗体ほどの安定性を確保することは難しかった。(Davies  et  al.,  FEBS  Lett.  1994  Feb  21;339(3):285-90;  Aires  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  2004  340(3):525-42)。これに対する原因としては、ヒト抗体のVH/VL隣接部位のアミノ酸を変形させた場合、該当部位のベータシーツ(beta-sheet)構造に変形が誘発されるためであると明らかになった(Riechmann  et  al.,J.  Mol.  Biol.  1996  259(5):957-69)。ラクダ抗体でCDR3部分はヒト抗体に比べて異常に長いループ(loop)構造を有している。構造学的分析によると、このループ構造が、ヒト抗体のVH/VL隣接部位に該当する位置まで折りたたまれて入っていることが明らかになり、このような特異的構造が隣接部分に位置している一部疏水性パッチ(patch)を塞ぐことによって保護膜効果を示してラクダ抗体の安定化を助けるとの理論が提示された(Joost  et  al.,2010  Drug  Discovery  Today:  Tehcnologies  7(2),  139-146)。
【００１４】
このような保護膜効果は、ヒト抗体では相対的に短いCDR3ループ構造によって期待するのが難しい。結論的にヒト単一可変ドメインはそれ自体ではラクダドメイン抗体に比べて不足する物理化学的特性を持つので、特定抗原に対する結合リガンドの骨格構造(scaffold)として活用するには不十分である。これを克服するための方法として、単にラクダ抗体のシグネチャ(signature)であるテトラド(tetrad)アミノ酸を交替することでは不十分であり、追加的に蛋白質構造的な設計と分子進化的スクリーニング方法が必要である。
【００１５】
自然界に存在するヒト免疫グロブリン可変ドメイン(VHまたはVL)は、抗原結合特性を維持できる最小の大きさの抗体(モノクロナール抗体の1/12の大きさ)であるため、既存のモノクロナール抗体と比較して治療蛋白質としての物性と治療効果において差別性を期待できる点で、可変ドメイン中一つだけを持つヒト抗体の開発に対する需要は高まっているが、それにもかかわらずVHまたはVLが単独で存在する時、自らの蛋白質の凝集(aggregation)現象及び不安定性向は、特定抗原に対する結合骨格構造(binding  scaffold)と開発するに当たり克服しなければならない主要な障害物として残っている。
【００１６】
従って、抗体断片及び小型抗体の場合、一般的なモノクロナール抗体が提供できない長所を提供して、自らの競争力を持つためには物質自体の強固な(robust)製薬学的及び物理化学的特性の確保が重要である。
【００１７】
ヒト重鎖は軽鎖の可変ドメインを自主的に安定させるために従来にもいくつかの分子進化的蛋白質工学手法が試みられた(Barthelemy  et  al.,J.  Biol.  Chem.  2008  283(6):3639-54)。VHのCDR変形ライブラリーからファージディスプレー(phage  display)システムを構築した後、選別段階で熱変形ストレスを加えた後、プロテインA(protein  A)結合活性が生きているVHを選別した。このような方法を介して、ラクダのドメイン抗体のように物理的に水溶性が増大して、蛋白質熱変性後、可逆的再フォールディング(reversible  folding)が可能なCDR変形ヒトVHを選別した報告があって(Jespers  et  al.,Nat.  Biotechnol.  2004  22(9):1161-5)、熱変性処理なしにCDR3部位とフレームの部分に突然変異を誘導した多様なライブラリーを製作して、同じ方法でファージディスプレー後、高いプロテインA結合活性を示すVHを選別して、選別されたVHをヒト生殖細胞系列の野生型(wild  type)  VHと比較した時、熱力学的に安定で水溶性発現が増大した突然変異VHを得ることができたことを確認したとの報告もある(Barthelemy  et  al.,  J  Biol  Chem.  2008  283(6):3639-54)。ファージディスプレーシステムでは、目的蛋白質のN-末端に融合されたpelB蛋白質のSec信号(signal)配列によって目的蛋白質がSec経路に誘導される。しかし、この場合、内在的な蛋白質移動経路の限界によって大腸菌細胞質(cytoplasm)内ですでにフォールディングされた蛋白質は、経路を通過できない。なぜなら、一般的なファージディスプレーの場合、大腸菌の代表的な蛋白質移動経路であるSec経路を利用して、この経路の特性上目的蛋白質は、細胞質内のシャペロン(chaperon)の助けを借りて三次構造を成さない線形(linear)構造の形態で細胞膜を通過するためである。自然界上で存在するSec経路特異的蛋白質は、特徴的に蛋白質転写直後SecBといったシャペロンの助けでフォールディングされない線形状態で細胞質に存在する。SecBの案内により細胞内膜に存在するSec  A、SecYEG、及びSecDFYajCからなるトランスロカーゼ(translocase)複合体に移動したSec経路対象蛋白質は、三次構造を成さない線形状態で膜を通過することになり、通過したアミノ酸鎖は細胞膜間(periplasm)に達してはじめてDsbAとDsbBの酸化、還元作用によって二硫化結合を含む完ぺきな三次構造を作る(Baneyx  and  Mujacic  Nature  Biotech.  2004,22,1399~1408)。従って、もしある蛋白質が自らの特性上細胞質でフォールディングと三次構造の形成が早く起きるならば、この蛋白質は、Sec経路でデザインされたファージディスプレースクリーニングシステムとは互いに互換性がない。
【００１８】
また、バクテリアじゅうたんが敷かれたプレートでプラーク(plaque)サイズの大きさを基準としてクローンを直接選別した時、物理化学的改善された野生型VHを選び出すことができたとの報告もある(To  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  2005  280(50):41395-403)。しかし、プレート基盤スクリーニングは大規模処理が不可能であるため、ライブラリーの大きさを減らすために生体外(in  vitro)でプロテインA選別過程を経たVH3ファミリーだけを対象に最初開始ライブラリーを製作した。
【００１９】
一方、組換え蛋白質のフォールディング(folding)特性を改善するために、遺伝的進化方法が試みられたが(Maxwell  et  al.,  Protein  Sci.  1999  8(9):1908-11;  Wigley  et  al.,  Nat.  Biotechnol.  2001  19(2):131-6;  Cabantous  et  al.,  Nat  Biotechnol.  2005  23(1):102-7;  Waldo  GS.  Curr.  Opin.  Chem.  Biol.  2003  7(1):33-8)、組換え蛋白質のフォールディング特性改善のための代表的な方法の一つは、関心蛋白質と遺伝子組換え技術で融合しているリポーター蛋白質(reporter  protein)の活性度を測定することによって、間接的に関心蛋白質のフォールディング程度を測定することができる。しかし、実際の関心蛋白質が単独形態で存在する際にフォールディングを正確に反映できない限界がある。
【００２０】
また、蛋白質の水溶性を増大させるために、バクテリア固有のフォールディング品質検査機能を有した蛋白質移動経路であるTat(Twin-arginine  translocation)経路を蛋白質フォールディングの有無を区別する生物学的境界膜(filter)で活用した分子進化方法も開発された。具体的に、大腸菌内で関心蛋白質をリポーター遺伝子とTat信号配列(Tat  signal  sequence)と融合させてTat経路に発現させた後、蛋白質のフォールディングと水溶性の有無によりTat  ABCトランスロカーゼ複合体(translocase  complex)の蛋白質フォールディング検証機能を経るようにする。もし目的蛋白質が十分に水溶性を有している場合、目的蛋白質とリポーター蛋白質からなる融合蛋白質は、大腸菌の内壁を通過して周辺細胞質(periplasm)に到達することになる。周辺細胞質に到達した融合蛋白質は、抗生剤耐性測定などの方法で検出することで所望の水溶性特性を持つ蛋白質をスクリーニングすることができる(Fisher  et  al.,  Protein  Sci.  2006  15(3):449-58)。自然界のTat経路気質蛋白質でない組換え蛋白質をTat経路に応用した場合も、有意に蛋白質の水溶性及び安定性に比例してTat経路を通過することがわかる(Lim  et  al.,Protein  Sci.2009  18(12):2537-49)。また、Tat経路を利用して大腸菌細胞質内で蛋白質フォールディングが起きる一本鎖抗体(single  chain  antibody:scFv)を効果的に選別できるとの報告がある(Fisher  AC  and  DeLisa  MP.  J  Mol  Biol.  2009  385(1):  299-311)。前記文献によれば、非水溶性で大腸菌で発現するscFv13を鋳型塩基配列にして、実験室的に分子進化に成功することができた。scFv内に存在する二重硫化結合(disulfide  bond)は、約4-6  kcal/molの水準で蛋白質分子の安定化に寄与する。この結合は、バクテリアの周辺細胞質や真核細胞の細胞質網状構造(endoplasmic  reticulum:ER)と同じ酸化的な環境(oxidized  environment)で行われる。バクテリアの周辺細胞質は、DsbAと細胞内膜(inner  membrane)に存在するDsbBの間の電子の流れを介して常に酸化条件を維持している。従って、scFv13変形ライブラリーからTat経路を人為的に通過して選別されたscFv13変形蛋白質の場合は、酸性条件の周辺細胞質でない還元条件の細胞質内で二重硫化結合形成することなく自主的にセルフフォールディング(self-folding)されたイントラボディー(intrabody)が優先的に選別される。具体的に、蛋白質をTat経路に導く核心的な経路信号配列(signal  sequence)を目的蛋白質のN-末端(terminal)に融合させて、目的蛋白質のC-末端にリポーター蛋白質(reporter  gene)機能ができるようにTEM-1β−ラクタマーゼ(betalactamase)を融合させた遺伝子を大腸菌で発現させると、三重機能融合蛋白質(Tripartide)が発現する。
【００２１】
発現した三重機能蛋白質は、Tat経路へ向かうようになり、細胞内膜に存在するトランスロカーゼ(Translocase)複合体であるTat  ABC作用機序(machinery)により蛋白質フォールディング検証を経る。多くの組換え蛋白質のうちひたすら水溶性があるものだけTat経路の特異的な作用機序(machinery)と互換性が(compatible)維持されることが様々な研究結果から明らかになった。(Sanders  et  al.,  Mol.  Microbiol.  2001  41(1):241-6;  DeLisa  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U  S  A.  2003  100(10):6115-20;  Matos  et  al.,  EMBO  J.  2008  27(15):2055-63;  Fisher  AC  and  DeLisa  MP.  J.  Mol.  Biol.  2009  385(1):  299-311;  Lim  et  al.,  Protein  Sci.  2009  18(12):  2537-49)。
【００２２】
しかし、前記のような蛋白質のフォールディング特性改善のための方法が、ドメイン抗体、特にVHまたはVLドメイン抗体などの選別に適用された場合はない。
結論から、今までのヒトVHドメイン抗体の工学的変形及びスクリーニングは例外なしでファージディスプレー及びプロテインA結合(binding)活性に基づいた方法から成ってきた(Kristensen  P  and  Winter  G.  Fold.  Des.  1998  3(5):321-8;  Sieber  et  al.,  Nat.  Biotechnol.  1998  16(10):955-60;  Jung  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  1999  294(1):163-80;  Woern  A  and  Pluckthun  A.  J.  Mol.  Biol.  2001  305(5):  989-1010)。
【００２３】
従って、現状は、より効率的に水溶性で、熱力学的安定性が高いVHドメイン抗体を選別する方法に対する開発の必要性が切実で、さらに選別されたドメイン抗体の特性を活用して効能が向上した最小単位の次世代抗体開発が緊急である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Better  et  al.,  Science  1988  240(4855):1041-3
【非特許文献２】Huston  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U  S  A.  1988  85(16):5879-83
【非特許文献３】Bird  et  al.,  Science  1988  242(4877):423-6
【非特許文献４】Pei  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U  S  A.  1997  94(18):9637-42
【非特許文献５】Iliades  et  al.,FEBS  Lett.  1997  409(3):437-41
【非特許文献６】Ward  et  al.,  Nature  1989  341(6242):544-6
【非特許文献７】Zhao  et  al.,Blood  2007  110(7):2569-77
【非特許文献８】Holliger  et  al.,  Nat.  Biotechnol.  2005  23(9):1126-36
【非特許文献９】Hudson  et  al.,Med.  Microbiol.  Immunol.  2009  198(3):157-74
【非特許文献１０】Enever  et  al.,  Curr.  Opin.  Biotechnol.  2009  20(4):405-11
【非特許文献１１】Els  et  al.,  J  Biol  Chem.  2001  9;  276(10):7346-50
【非特許文献１２】Bargou  et  al.,  Science  2008  321(5891):974-7
【非特許文献１３】Chothia  et  al.,  1992  J.  Mol.  Biol.  227、  799-917
【非特許文献１４】Tomlinson  et  al.,1995  EMBO  J.  14、4628-4638
【非特許文献１５】Williams  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  264、  220-232
【非特許文献１６】Ruud  et    al.,J.  Mol.  Biol.  1999、  285、  895-901
【非特許文献１７】J.  Mol.  Recogni.  2000,  13,  167-187
【非特許文献１８】Hendershot  et  al.,  J.  Cell.  Biol.  1987  104(3):761-7
【非特許文献１９】Prelli  et  al.,  J.  Immunol.  1992  148(3):  949-52
【非特許文献２０】Kabat  numbering  system、Kabat  et  al.,  1991  J.  Immunol.  147(5)、1709-1719
【非特許文献２１】Coppieters  et  al.,  Arthritis  Rheum.  2006  54(6):1856-66
【非特許文献２２】Dolk  et  al.,  Proteins.  2005  59(3):555-64
【非特許文献２３】Ewert  et  al.,  Biochem.  2002  41(11):3628-36
【非特許文献２４】Kortt  et  al.,  J.  Protein  Chem.  1995  14(3):167-78
【非特許文献２５】Martin  et  al.,  Protein  Eng.  1997  10(5):607-14
【非特許文献２６】Davies  et  al.,  FEBS  Lett.  1994  Feb  21;339(3):285-90
【非特許文献２７】Aires  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  2004  340(3):525-42
【非特許文献２８】Riechmann  et  al.,J.  Mol.  Biol.  1996  259(5):957-69
【非特許文献２９】Joost  et  al.,2010  Drug  Discovery  Today:  Tehcnologies  7(2),  139-146
【非特許文献３０】Barthelemy  et  al.,J.  Biol.  Chem.  2008  283(6):3639-54
【非特許文献３１】Jespers  et  al.,Nat.  Biotechnol.  2004  22(9):1161-5
【非特許文献３２】Barthelemy  et  al.,  J  Biol  Chem.  2008  283(6):3639-54
【非特許文献３３】To  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  2005  280(50):41395-403
【非特許文献３４】Maxwell  et  al.,  Protein  Sci.  1999  8(9):1908-11
【非特許文献３５】Wigley  et  al.,  Nat.  Biotechnol.  2001  19(2):131-6
【非特許文献３６】Cabantous  et  al.,  Nat  Biotechnol.  2005  23(1):102-7
【非特許文献３７】Waldo  GS.  Curr.  Opin.  Chem.  Biol.  2003  7(1):33-8
【非特許文献３８】Fisher  et  al.,  Protein  Sci.  2006  15(3):449-58
【非特許文献３９】Lim  et  al.,Protein  Sci.2009  18(12):2537-49
【非特許文献４０】Fisher  AC  and  DeLisa  MP.  J  Mol  Biol.  2009  385(1):  299-311
【非特許文献４１】Sanders  et  al.,  Mol.  Microbiol.  2001  41(1):241-6
【非特許文献４２】DeLisa  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U  S  A.  2003  100(10):6115-20
【非特許文献４３】Matos  et  al.,  EMBO  J.  2008  27(15):2055-63
【非特許文献４４】Kristensen  P  and  Winter  G.  Fold.  Des.  1998  3(5):321-8
【非特許文献４５】Sieber  et  al.,  Nat.  Biotechnol.  1998  16(10):955-60
【非特許文献４６】Jung  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  1999  294(1):163-80
【非特許文献４７】Woern  A  and  Pluckthun  A.  J.  Mol.  Biol.  2001  305(5):  989-1010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、前記のような問題を解決しようと、水溶性で、熱力学的安定性が高いVHまたはVLドメイン抗体を効率的に選別できるTAPE(Tat-Associated  Protein  Engineering)と命名された方法を提供する。
【００２６】
さらに本発明は、TAPE方法によって選別された水溶性であり熱力学的安定性が優れたヒトVH及びVLドメイン抗体及びヒトVH及びVLドメイン抗体骨格(scaffold)を提供して、そのようなVH及びVLドメイン抗体及びそのような抗体骨格(scaffold)のアミノ酸配列及びこれをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
本発明により選別されたヒトVHまたはVL骨格(scaffold)を含むVHまたはVLドメイン抗体は、CDR配列と関係なく該当ヒトVH及びVLドメイン抗体骨格を持つ場合、依然として水溶性であり熱力学的安定性を維持する。
【００２８】
さらに本発明は、TAPE方法によって選別されたヒトVHまたはVLドメイン抗体骨格に無作為的(random)  CDR配列を含むライブラリー及びその製造方法を提供する。
本発明は、そのようなライブラリーを利用して、選別された目的蛋白質に結合能を持つVHまたはVLドメイン抗体、そのようなドメイン抗体のアミノ酸配列及びこれをエンコードするポリヌクレオチドに関する。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
目的蛋白質のN-末端にTat-信号配列が結合され、C-末端には抗生剤耐性付与蛋白質が結合された融合蛋白質をコードする遺伝子構造体。
（項目２）
前記目的蛋白質は、免疫グロブリン可変ドメイン、抗体断片、受容体または受容体リガンドであることを特徴とする項目１に記載の遺伝子構造体。
（項目３）
前記目的蛋白質は、免疫グロブリンの重鎖可変ドメインであることを特徴とする項目２に記載の遺伝子構造体。
（項目４）
追加的に分離精製または検出のためのアミノ酸タグ(Tag)が結合されていることを特徴とする項目１に記載の遺伝子構造体。
（項目５）
前記アミノ酸タグは、6xHisタグ、フラグタグ及びc-mycタグからなる群から選択されたことを特徴とする項目４に記載の遺伝子構造体。
（項目６）
前記Tat-信号配列は、TorA、CuoO、DmsA、FdnG、FdoG、HyaA、NapA、Suf1、WcaM、TagT、YcbK、YcdB、YdhX及びYnfEからなる群から選択されたことを特徴とする項目１に記載の遺伝子構造体。
（項目７）
前記抗生剤耐性付与蛋白質は、TEM-1ベータ-ラクタマーゼであり、前記Tat-信号配列は、TorAであることを特徴とする項目１に記載の遺伝子構造体。
（項目８）
項目１から７のいずれかに記載の遺伝子構造体を含むベクター。
（項目９）
前記ベクターは、pET22b、pAE34、pET9a及びΔpMKから選択されたいずれか一つのベクターに遺伝子構造体が挿入されたことを特徴とする項目８に記載のベクター。
（項目１０）
前記ベクターは、pET-TAPEであることを特徴とする項目８に記載のベクター。
（項目１１）
項目８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
（項目１２）
前記宿主細胞は、大腸菌であることを特徴とする項目１１に記載の宿主細胞。
（項目１３）
項目１から７のいずれかに記載の遺伝子構造体で形質転換された一つ以上の宿主細胞で構成された宿主細胞群。
（項目１４）
前記宿主細胞群に含まれた各宿主細胞は、互いに異なる目的蛋白質を含む融合蛋白質をコードする遺伝子構造体に形質転換されたことを特徴とする項目１３に記載の宿主細胞群。
（項目１５）
前記宿主細胞は、グラム-陰性(gram-negative)菌であることを特徴とする項目１３に記載の宿主細胞群。
（項目１６）
下記の工程を含んで構成される水溶性目的蛋白質の選別方法:
(1)項目１３に記載の宿主細胞群を抗生剤が含まれた液状培地で培養する工程;
宿主細胞群を抗生剤が含まれた液状培地で培養する工程;
(2)生存した宿主細胞を回収してプラスミド(plasmid)  DNAを回収する工程;
(3)回収されたプラスミドDNAで目的蛋白質をコードする核酸配列を回収する工程;  及び
(4)回収された核酸配列から目的蛋白質の配列を確認して選別する工程。
（項目１７）
工程(3)以後、
(3‘)回収された核酸配列を再びTat-信号配列をコードする遺伝子及び抗生剤耐性付与遺伝子に作動可能に連結させた遺伝子構造体を製作して、これを再び宿主細胞群に形質転換させる工程;及び
(3‘’)別途の遺伝子構造体製作なしに回収された核酸配列を含むプラズミドを直ちに宿主細胞群に形質転換させる工程;のうち選択された一つの工程を追加的に含み、
工程(1)乃至工程(3‘)または工程(1)乃至(3“)は、2ラウンド(round)以上繰り返すことを特徴とする項目１６に記載の水溶性目的蛋白質の選別方法。
（項目１８）
前記抗生剤は、アンピシリン(ampicillin)またはカルベニシリン(carbenicillin)であることを特徴とする項目１６または項目１７に記載の水溶性目的蛋白質の選別方法。
（項目１９）
前記抗生剤は、ラウンドが繰り返されるにつれ少しずつ高い濃度で添加されることを特徴とする項目１７に記載の水溶性目的蛋白質の選別方法。
（項目２０）
最初ラウンドでの抗生剤の濃度は、0.05〜0.2μg/mlであることを特徴とする項目１６に記載の水溶性目的蛋白質の選別方法。。
（項目２１）
下記FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ水溶性VHドメイン抗体骨格:
1)  FR1:  X0VQLX1X2X3GX4X5X6X7X8PGX9SX10X11X12X13CX14X15X16GX17X18X19
前記FR1のアミノ酸配列において、
X0は、Eまたは、Qであり、
X1は、Vまたは、Lであり、
X2は、Eまたは、Qであり、
X3は、Sまたは、Aであり、
X4は、Gまたは、Aであり、
X5は、G、M、N、Vまたは、Eであり、
X6は、L、Vまたは、Wであり、
X7は、V、K、Aまたは、Iであり、
X8は、Q、Kまたは、Hであり、
X9は、G、T、A、R、E、Sまたは、Tであり、
X10は、L、V、Rまたは、Mであり、
X11は、Rまたは、Kであり、
X12は、L、Iまたは、Vであり、
X13は、S、Aまたは、Tであり、
X14は、A、E、V、R、I、K、Tまたは、Sであり、
X15は、A、G、P、Vまたは、Tであり、
X16は、S、F、または、Yであり、
X17は、F、Y、R、Gまたは、Lであり、
X18は、T、A、S、N、T、P、I、N、Hまたは、Aであり、
X19は、F、L、Vまたは、Cであり、
2)  FR2:  WX20RX21X22PGX23GX24X25X26X27X28
前記FR2のアミノ酸配列において、
X20は、V、Aまたは、Lであり、
X21は、Q、N、R、I、K、Y、V、M、S、Q、W、F、L、Vまたは、Cであり、
X22は、A、G、K、S、V、Mまたは、Tであり、
X23は、K、Q、E、Rまたは、Tであり、
X24は、L、N、I、P、Y、T、V、W、A、R、Mまたは、Sであり、
X25は、Vまたは、Eであり、
X26は、W、I、V、P、F、H、M、Y、L、Cまたは、Rであり、
X27は、V、M、Iまたは、Lであり、
X28は、S、Aまたは、Gであり、
3)  FR3:X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DX52X53X54YX55CX56X57
前記FR3のアミノ酸配列において、
X29は、R、H、Qまたは、Tであり、
X30は、F、V、Lまたは、Iであり、
X31は、T、Sまたは、Iであり、
X32は、I、L、V、Mまたは、Rであり、
X33は、S、Tまたは、Dであり、
X34は、R、A、V、Nまたは、Iであり、
X35は、D、Nまたは、Aであり、
X36は、N、T、D、I、R、K、Yまたは、Eであり、
X37は、A、S、Vまたは、Tであり、
X38は、K、R、T、Q、V、E、M、Nまたは、Iであり、
X39は、N、R、T、K、S、Dまたは、Vであり、
X40は、T、M、S、V、I、Yまたは、Aであり、
X41は、L、V、Aまたは、Mであり、
X42は、F、Y、N、D、Hまたは、Sであり
X43は、Lまたは、Mであり、
X44は、Q、E、Hまたは、Nであり、
X45は、M、L、V、Iまたは、Wであり、
X46は、N、T、K、D、Y、Iまたは、Sであり、
X47は、Sまたは、Nであり、
X48は、Lまたは、Vであり、
X49は、R、Kまたは、Tであり
X50は、D、A、S、P、T、V、Iまたは、Sであり、
X51は、E、A、Dまたは、Sであり、
X52は、T、Nまたは、Sであり、
X53は、S、Aまたは、Gであり、
X54は、V、I、Lまたは、Mであり、
X55は、Yまたは、Fであり、
X56は、A、G、Vまたは、Sであり、
X57は、R、S、K、T、L、Nまたは、Fであり、
4)  FR4:  X58GX59GX60X61VTVSS
前記FR4のミノ酸配列において、
X58は、W、C、Y、G、Sまたは、Aであり、
X59は、Q、Rまたは、Lであり、
X60は、A、T、Iまたは、Vであり、
X61は、L、M、P、Vまたは、Tである。
（項目２２）
前記FR1乃至FR4は、下記アミノ酸配列を持つことを特徴とする項目２１に記載のVHドメイン抗体骨格:
1)  FR1:  X0VQLX1X2SGGX5X6X7X8PGX9SX10RX12SCX14X15SGX17X18X19
前記FR1のアミノ酸配列において、
X0は、Eまたは、Qであり、
X1は、Vまたは、Lであり、
X2は、Eまたは、Qであり、
X5は、G、M、N、Vまたは、Eであり、
X6は、Lまたは、Vであり、
X7は、V、または、Kであり、
X8は、Q、Kまたは、Hであり、
X9は、G、T、A、R、E、または、Tであり、
X10は、L、または、Vであり、
X12は、L、または、Vであり、
X14は、A、E、V、I、Kまたは、Sであり、
X15は、A、Gまたは、Vであり、
X17は、F、Y、R、Gまたは、Lであり、
X18は、T、A、S、N、T、P、I、N、Hまたは、Aであり、
X19は、F、L、Vまたは、Cであり、
2)  FR2:  WVRX21X22PGX23GX24X25X26X27X28
前記FR2のアミノ酸配列において、
X21は、Q、N、R、I、K、Y、V、M、S、Q、W、F、L、Vまたは、Cであり、
X22は、A、G、K、Sまたは、Mであり、
X23は、K、Q、E、Rまたは、Tであり、
X24は、L、N、I、P、Y、T、V、W、A、R、Mまたは、Sであり、
X25は、Vまたは、Eであり、
X26は、W、I、V、P、F、H、M、Y、L、Cまたは、Rであり、
X27は、V、M、Iまたは、Lであり、
X28は、S、Aまたは、Gであり、
3)  FR3:RX30TX32SX34DX36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DTAX54YX55CX56X57
前記FR3のアミノ酸配列において、
X30は、F、V、Lまたは、Iであり、
X32は、I、L、Vまたは、Mであり、
X34は、R、A、V、Nまたは、Iであり、
X36は、N、T、D、I、R、K、Yまたは、Eであり、
X37は、A、S、Vまたは、Tであり、
X38は、K、R、T、Q、V、E、M、Nまたは、Iであり、
X39は、N、R、T、K、S、Dまたは、Vであり、
X40は、T、M、S、V、I、Yまたは、Aであり、
X41は、L、V、Aまたは、Mであり、
X42は、F、Y、N、D、Hまたは、Sであり、
X43は、Lまたは、Mであり、
X44は、Q、E、Hまたは、Nであり、
X45は、M、L、V、Iまたは、Wであり、
X46は、N、T、K、D、Y、Iまたは、Sであり、
X47は、Sまたは、Nであり、
X48は、Lまたは、Vであり、
X49は、R、Kまたは、Tであり、
X50は、D、A、S、P、T、V、Iまたは、Sであり、
X51は、E、A、Dまたは、Sであり、
X54は、V、I、Lまたは、Mであり、
X55は、Yまたは、Fであり、
X56は、A、G、Vまたは、Sであり、
X57は、R、S、K、T、L、Nまたは、Fであり、
4)  FR4:  X58GQGX60X61VTVSS
前記FR4のアミノ酸配列において、
X58は、W、C、Y、G、Sまたは、Aであり、
X60は、A、T、Iまたは、Vであり、
X61は、L、M、Vまたは、Tである。
（項目２３）
下記FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ骨格中から選択されることを特徴とする項目２１に記載のVHドメイン抗体骨格:
【表１０−１】
0006293829.tif 000002
【表１０−２】
0006293829.tif 000003
【表１０−３】
0006293829.tif 000004
【表１０−４】
0006293829.tif 000005
【表１０−５】
0006293829.tif 000006
.
（項目２４）
下記FR1乃至FR4のアミノ酸配列を持つ骨格中から選択されることを特徴とする項目２１に記載のVHドメイン抗体骨格:
【表１１−１】
0006293829.tif 000007
【表１１−２】
0006293829.tif 000008
【表１１−３】
0006293829.tif 000009
【表１１−４】
0006293829.tif 000010
【表１１−５】
0006293829.tif 000011
.
（項目２５）
項目２１から２４のいずれかに記載のVHドメイン抗体骨格をコードするポリヌクレオチド。
（項目２６）
項目２１から２４のいずれかに記載のVHドメイン抗体骨格を持つVHドメイン抗体。
（項目２７）
項目２６に記載のVHドメイン抗体をコードするポリヌクレオチド。
（項目２８）
項目２１から２４のいずれかに記載のVHドメイン抗体骨格にヒト由来無作為(random)  CDRH1、CDRH2及びCDRH3が挿入されたVHドメイン抗体ライブラリー。
（項目２９）
前記挿入されたCDRH3のアミノ酸残基の個数は、5〜15であることを特徴とする項目２８に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
（項目３０）
前記挿入されたCDRH3のアミノ酸残基の個数は、7〜13であることを特徴とする項目２８に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
（項目３１）
前記ヒト由来無作為(random)  CDRH1、CDRH2及びCDRH3は、突然変異か誘発されたことを特徴とする項目２８に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
（項目３２）
カバット(Kabat)配列順番体系を基準に、CDRH1の30番及び31番、CDRH2の53番及びCDRH3の97番、99番、100番、100a番位置で選択された一つ以上の位置で突然変異が誘発されたことを特徴とする項目３１に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
（項目３３）
前記ライブラリーは未感作(naive)、合成または免疫ライブラリーであることを特徴とする項目２８に記載のVHドメイン抗体ライブラリー。
（項目３４）
項目２８に記載のVHドメイン抗体ライブラリーを利用した目的とする抗原に対する結合能を持つVHドメイン抗体の選別方法。
（項目３５）
前記目的とする抗原に対する結合能を持つVHドメイン抗体の選別は、固定された目的とする抗原に結合したVHドメイン抗体を除いて固定された目的抗原に結合しないVHドメイン抗体を湧出(elution)して行うことを特徴とする項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記固定された目的抗原に結合しないVHドメイン抗体を湧出する過程は二回以上繰り返すことを特徴とする項目３４に記載の方法。
本発明では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインライブラリー(library)または、組み合わせ(combinatorial)ライブラリーから高水溶性を持って、熱力学的安定性が高いリガンド、特にVH及びVLドメイン抗体を効率的に選別できるTAPE(Tat-Associated  Protein  Engineering)と命名された方法を提供する。
【００３０】
また、本発明では、前記リガンドを選別するためのシステム、ベクター及び宿主細胞を提供して、前記TAPE方法によって選別されたリガンド、特にVH及びVLドメイン抗体を提供する。
【００３１】
特に、驚くべきことに、本発明に係るTAPE方法によって選別されたVHドメイン抗体は、高い水溶性と熱安定性を有しているだけでなく、VHドメイン抗体骨格、すなわち、FR1乃至FR4のフレームが維持される限り、挿入されるCDR配列、すなわちCDR1乃至CDR3の配列と関係なく高い水溶性と熱安定性が維持される可能性があることを発見した。
【００３２】
このような観点から本発明は、本発明のTAPE方法によって選別されたVHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレーム及びこのようなVHドメイン抗体の骨格に無作為的(randomized)のヒト由来CDR配列、すなわちCDR1乃至CDR3の配列が挿入されたVHドメイン抗体のライブラリー及びこれの構築方法を提供する。
【００３３】
また、前記構築されたライブラリーから目的とするターゲットに対する結合能を持つVHドメイン抗体を選別する方法を提供する。
【００３４】
本発明で提供される高い水溶性と熱安定性を持つVHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレームは次のようなアミノ酸配列を持つ。
FR1のアミノ酸配列:
X0VQLX1X2X3GX4X5X6X7X8PGX9SX10X11X12X13CX14X15X16GX17X18X19-式1)
前記式1）にいおいて、
X0は、Eまたは、Qであり、
X1は、Vまたは、Lであり、
X2は、Eまたは、Qであり、
X3は、Sまたは、Aであり、
X4は、Gまたは、Aであり、
X5は、G、M、N、Vまたは、Eであり、
X6は、L、Vまたは、Wであり、
X7は、V、K、Aまたは、Iであり、
X8は、Q、Kまたは、Hであり、
X9は、G、T、A、R、E、Sまたは、Tであり、
X10は、L、V、Rまたは、Mであり、
X11は、Rまたは、Kであり、
X12は、L、Iまたは、Vであり、
X13は、S、Aまたは、Tであり、
X14は、A、E、V、R、I、K、Tまたは、Sであり、
X15は、A、G、P、Vまたは、Tであり、
X16は、S、F、または、Yであり、
X17は、F、Y、R、Gまたは、Lであり、
X18は、T、A、S、N、T、P、I、N、Hまたは、Aであり、
X19は、F、L、Vまたは、Cである。
【００３５】
FR2のアミノ酸配列:
WX20RX21X22PGX23GX24X25X26X27X28  -式2)
前記式2)  にいおいて、
X20は、V、Aまたは、Lであり、
X21は、Q、N、R、I、K、Y、V、M、S、Q、W、F、L、Vまたは、Cであり、
X22は、A、G、K、S、V、Mまたは、Tであり、
X23は、K、Q、E、Rまたは、Tであり、
X24は、L、N、I、P、Y、T、V、W、A、R、Mまたは、Sであり、
X25は、Vまたは、Eであり、
X26は、W、I、V、P、F、H、M、Y、L、Cまたは、Rであり、
X27は、V、M、Iまたは、Lであり、
X28は、S、Aまたは、Gである。
【００３６】
FR3のアミノ酸配列:
X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DX52X53X54YX55C  X56X57            -式3)
前記式3)  にいおいて、
X29は、R、H、Qまたは、Tであり、
X30は、F、V、Lまたは、Iであり、
X31は、T、Sまたは、Iであり、
X32は、I、L、V、Mまたは、Rであり、
X33は、S、Tまたは、Dであり、
X34は、R、A、V、Nまたは、Iであり、
X35は、D、Nまたは、Aであり、
X36は、N、T、D、I、R、K、Yまたは、Eであり、
X37は、A、S、Vまたは、Tであり、
X38は、K、R、T、Q、V、E、M、Nまたは、Iであり、
X39は、N、R、T、K、S、Dまたは、Vであり、
X40は、T、M、S、V、I、Yまたは、Aであり、
X41は、L、V、Aまたは、Mであり、
X42は、F、Y、N、D、Hまたは、Sであり、
X43は、Lまたは、Mであり、
X44は、Q、E、Hまたは、Nであり、
X45は、M、L、V、Iまたは、Wであり、
X46は、N、T、K、D、Y、Iまたは、Sであり、
X47は、Sまたは、Nであり、
X48は、Lまたは、Vであり、
X49は、R、Kまたは、Tであり、
X50は、D、A、S、P、T、V、Iまたは、Sであり、
X51は、E、A、Dまたは、Sであり、
X52は、T、Nまたは、Sであり、
X53は、S、Aまたは、Gであり、
X54は、V、I、Lまたは、Mであり、
X55は、Yまたは、Fであり、
X56は、A、G、Vまたは、Sであり、
X57は、R、S、K、T、L、Nまたは、Fである。
【００３７】
FR4のアミノ酸配列:
X58GX59GX60X61VTVSS    -式4)
前記式4)  にいおいて、
X58は、W、C、Y、G、Sまたは、Aであり、
X59は、Q、Rまたは、Lであり、
X60は、A、T、Iまたは、Vであり、
X61は、L、M、P、Vまたは、Tである。
【００３８】
また、本発明は、前記VHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレームのアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
より好ましくは、本発明で提供される高い水溶性と熱安定性を持つVHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレームは次のようなアミノ酸配列を持つ。
FR1のアミノ酸配列:
X0VQLX1X2SGGX5X6X7X8PGX9SX10RX12SCX14X15SGX17X18X19    -式5)
前記式5）にいおいて、
X0は、Eまたは、Qであり、
X1は、Vまたは、Lであり、
X2は、Eまたは、Qであり、
X5は、G、M、N、Vまたは、Eであり、
X6は、Lまたは、Vであり、
X7は、V、または、Kであり、
X8は、Q、Kまたは、Hであり、
X9は、G、T、A、R、E、または、Tであり、
X10は、L、または、Vであり、
X12は、L、または、Vであり、
X14は、A、E、V、I、Kまたは、Sであり、
X15は、A、Gまたは、Vであり、
X17は、F、Y、R、Gまたは、Lであり、
X18は、T、A、S、N、T、P、I、N、Hまたは、Aであり、
X19は、F、L、Vまたは、Cである。
【００４０】
FR2のアミノ酸配列:
WVRX21X22PGX23GX24X25X26X27X28  -式6)
前記式6)  にいおいて、
X21は、Q、N、R、I、K、Y、V、M、S、Q、W、F、L、Vまたは、Cであり、
X22は、A、G、K、Sまたは、Mであり、
X23は、K、Q、E、Rまたは、Tであり、
X24は、L、N、I、P、Y、T、V、W、A、R、Mまたは、Sであり、
X25は、Vまたは、Eであり、
X26は、W、I、V、P、F、H、M、Y、L、Cまたは、Rであり、
X27は、V、M、Iまたは、Lであり、
X28は、S、Aまたは、Gである。
【００４１】
FR3のアミノ酸配列:
RX30TX32SX34DX36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DTAX54YX55CX56X57  -式7)
前記式7)  にいおいて、
X30は、F、V、Lまたは、Iであり、
X32は、I、L、Vまたは、Mであり、
X34は、R、A、V、Nまたは、Iであり、
X36は、N、T、D、I、R、K、Yまたは、Eであり、
X37は、A、S、Vまたは、Tであり、
X38は、K、R、T、Q、V、E、M、Nまたは、Iであり、
X39は、N、R、T、K、S、Dまたは、Vであり、
X40は、T、M、S、V、I、Yまたは、Aであり、
X41は、L、V、Aまたは、Mであり、
X42は、F、Y、N、D、Hまたは、Sであり、
X43は、Lまたは、Mであり、
X44は、Q、E、Hまたは、Nであり、
X45は、M、L、V、Iまたは、Wであり、
X46は、N、T、K、D、Y、Iまたは、Sであり、
X47は、Sまたは、Nであり、
X48は、Lまたは、Vであり、
X49は、R、Kまたは、Tで
X50は、D、A、S、P、T、V、Iまたは、Sであり、
X51は、E、A、Dまたは、Sであり、
X54は、V、I、Lまたは、Mであり、
X55は、Yまたは、Fであり、
X56は、A、G、Vまたは、Sであり、
X57は、R、S、K、T、L、Nまたは、Fである。
【００４２】
FR4のアミノ酸配列:
X58GQGX60X61VTVSS    -式8)
前記式8)  にいおいて、
X58は、W、C、Y、G、Sまたは、Aであり、
X60は、A、T、Iまたは、Vであり、
X61は、L、M、Vまたは、Tである。  
【００４３】
また、本発明は、前記VHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレームのアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４４】
より好ましくは、本発明で提供される高い水溶性と熱安定性を持つVHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレームは表1に記載されたアミノ酸配列を持つ。
【００４５】
【表１−１】
0006293829.tif 000012
【表１−２】
0006293829.tif 000013
【表１−３】
0006293829.tif 000014
【表１−４】
0006293829.tif 000015
【表１−５】
0006293829.tif 000016
【００４６】
また、本発明は、前記VHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレームのアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４７】
特に、前記フレームの一部アミノ酸配列の変異を通して改良されたVHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレームは、表2に記載されたアミノ酸配列を持つ。
【００４８】
【表２−１】
0006293829.tif 000017
【表２−２】
0006293829.tif 000018
【表２−３】
0006293829.tif 000019
【表２−４】
0006293829.tif 000020
【表２−５】
0006293829.tif 000021
【００４９】
本発明に係るVHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレームのアミノ酸配列を含むVH領域は
FR1-X-FR2-X-FR3-X-FR4      -式9)
で表示されるアミノ酸配列を持つ。前記式9)でXは、左側から順にCDR1、CDR2及びCDR3を意味する。
具体的に、本発明に係るFR1乃至FR4のフレームのアミノ酸配列を含むVH領域は、表3及び表4に記載された通り、配列番号37乃至89及び配列番号90乃至131によるアミノ酸配列を持つ。
【００５０】
【表３−１】
0006293829.tif 000022
【表３−２】
0006293829.tif 000023
【表３−３】
0006293829.tif 000024
【表３−４】
0006293829.tif 000025
【表３−５】
0006293829.tif 000026
【表３−６】
0006293829.tif 000027
【表３−７】
0006293829.tif 000028
【００５１】
【表４−１】
0006293829.tif 000029
【表４−２】
0006293829.tif 000030
【表４−３】
0006293829.tif 000031
【表４−４】
0006293829.tif 000032
【表４−５】
0006293829.tif 000033
【表４−６】
0006293829.tif 000034
【表４−７】
0006293829.tif 000035
【００５２】
また、本発明は、前記VHドメイン抗体骨格、すなわちFR1乃至FR4のフレームのアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５３】
本発明を詳細に説明する前に、本発明で用いられた用語及び略語を先に定義して本発明の理解を助けることにする。
【００５４】
ヒト免疫グロブリン可変ドメイン:ヒトの免疫グロブリンとG(Immunoglobulin  G)の構造を成して12個のドメイン(VH、CH1、CH2、CH3、VL、CLそれぞれ一対)のうち抗原の結合に直接参加する可変ドメインである重鎖可変ドメイン(Heavy  chain  variable  domain、VH)または軽鎖可変ドメイン(Light  chain  variable  domain、VL)を意味する。VHまたはVLは、9個のベータ-シーツ鎖(beta-sheet  strand)が交差している構造を有している。VHの場合、N-末端から始まって二番目と三番目のベータ-シーツとの間、四番目と五番目との間、八番目と九番目との間に可変区間(variable  region)が存在するが、これをそれぞれCDR  (Complementary  Determinant  Region)1、CDR2、CDR3と称する。VHのN-末端からCDR1区間を除いた一番目と二番目のベータ-シーツ(beta-sheet)区間全体をフレーム1(Frame  1、FR1)といって、三番目と四番目のベータ-シーツ区間を含むCDR1とCDR2との間の区間をフレーム2(Frame  2、FR2)といって、CDR2とCDR3との間の区間をフレーム3(Frame  3、FR3)といって、CDR3以後の区間をフレーム4(Frame  4、FR4)という。それぞれのフレームは、可変ドメインにもかかわらず抗原との結合には直接参加しなく、この区間は、ヒト免疫グロブリン上で大部分のアミノ酸配列が一定に保存されている。フレーム区間のアミノ酸配列の相同性(homology)により、VHは合計7種類ファミリー(family)に区分されて(VH1、2、3、4、5、6及び7)、VLはVkappaとVlamdaに区分されて、VKappaは6種類、Vlamdaは10種類familyに分類される(Chothia  et  al.,  1992  J  Mol  Biol  227,799-917;  Tomlinson  et  al.,1995  EMBO  J  14,4628-4638;  Williams  et  al.,  J  Mol  Biol  264,220-232)。
【００５５】
CDR(Complementary  Determinant  Region):超可変領域(hypervariable  region)ともいい、抗体の構造のうち重鎖または軽鎖の可変ドメイン内に位置して、抗原のエピトープとの直接的な結合に参加する区間を意味する。各可変ドメインは、3個のCDR区間があって種々の長さのアミノ酸で構成されている。
【００５６】
抗体骨格(scaffold):抗体の構造のうち抗原に直接結合する超可変領域(hypervariable  region)、すなわちCDRを除いた残りの構造であり、CDR変形ライブラリー製作時アミノ酸塩基配列が維持される部分を意味する。すなわち、抗体のアミノ酸配列のうち超可変領域であるCDR1、CDR2及びCDR3を除いた残りのアミノ酸配列を意味する。本発明では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインのうちCDR1、CDR2及びCDR3を除いた残りの領域であるフレーム(FR:frame)  1乃至フレーム4を全部合わせた領域を意味する。
【００５７】
すなわち、本発明でのVHドメイン抗体骨格は、VHドメイン抗体のうちCDR1乃至CDR3を除いたフレーム(FR:frame)  1乃至フレーム4を全部合わせた領域を意味する。
このような抗体骨格は、目的とするターゲット(target)に結合する蛋白質、特にVHドメイン抗体選別のためのCDR変形ライブラリー製作のための骨格として活用することができる。
【００５８】
ドメイン抗体(Domain  antibody):広い意味でヒト免疫グロブリンと構造を成しているドメインのうち一部を含む特定の抗原に結合できる変形された形態の蛋白質を意味する。狭い意味ではヒト免疫グロブリン可変ドメイン(VHまたはVL)を治療用抗体で用いるのに適合した形態で変形した形態を意味する。
【００５９】
特に単一ドメイン抗体(single  domain  antibody)の場合には、一般的に重鎖でだけなす単一重鎖抗体(single  heavy  chain  antibody)から由来した可変ドメインを意味する。ヒトコブラクダ(dromedary)由来の単一ドメイン抗体は、VHH(heavy  chain  variable  domain  from  single  heavy  chain  antibody)といい、サメのような軟骨魚類由来の単一ドメイン抗体はVNAR(Variable  new  antigen  receptor)と称する。
【００６０】
本発明での単一ドメイン抗体、例えばVHドメイン抗体またはVLドメイン抗体は、特別な限定がない限り、ヒト由来の可変ドメインのうち重鎖または軽鎖一つだけで構成された抗体を意味する。
【００６１】
目的蛋白質:TAPE方法において、ライブラリーで蛋白質特性向上のために選別しようとする対象関心蛋白質(protein  of  interest)を意味する。本発明では、pET-TAPE発現ベクターのTat信号配列とTEM-1ベータラクタマーゼ遺伝子との間に機能的に連結される遺伝子によってエンコードされる蛋白質を意味する。水溶性特性が求められる蛋白質ならいずれも制限なしに使用可能であるが、ヒト抗体及びその断片、受容体または受容体リガンドなどを含み、特にヒト生殖細胞由来自然型(natural)ヒト免疫グロブリン可変ドメイン及びその人為的突然変異蛋白質を共に含む。
【００６２】
リガンド:ライブラリーで選別された目的蛋白質のうち特定レセプターまたはターゲットとする蛋白質に結合能力がある蛋白質を意味する。
【００６３】
多重特異性(multi-specific):一つ以上のエピトープに対して特異的結合ができる抗体の特性を意味する。一つの対象物質に二つ以上のエピトープを認知する特性を意味してもよく、二つ以上の対象物質に結合する特性を意味してもよい。
【００６４】
融合蛋白質:核酸でエンコードされた少なくとも二つ以上の機能が異なる蛋白質またはペプチドが互いに機能的に連結されている蛋白質であり、例えば、Tat信号配列と目的蛋白質が機能的に連結されているものなどを意味する。ここに追加的にTEM-1ベータ-ラクタマーゼのようなレポーター遺伝子(reporter  gene)または、6xHis及びフラグ(Flag)のようなタグ(Tag)等が連結されてもよい。機能的に互いに連結された蛋白質の遺伝子は、発現ベクター上で一つのプロモーター(誘導型、持続型、その他)により発現が調節される。
【００６５】
自然型または野生型(wild  type):自然界上で得られる遺伝子またはその遺伝子の産物(例えば蛋白質)を意味する。これは、人為的または自然的に遺伝子の配列が変わって産物が他の特性に変わる突然変異(mutant)、多重性(polymorphism)、変異(variant)とは相反する概念である。
【００６６】
前記のような用語及び略語の定義に基づいて本発明を詳細に説明する。
前記説明した通り、本発明に係るTAPE方法及びこれのためのTAPEシステムは、Tat信号配列に目的蛋白質と抗生剤耐性蛋白質が結合された遺伝子構造体(construct)を製造して、これを含むベクターを宿主細胞、特に大腸菌に形質転換させることによって、融合蛋白質を大腸菌で発現させて、水溶性(soluble)であり熱力学的安定性が優れたヒト生殖細胞由
来免疫グロブリン可変ドメイン(Immunoglobulin  variable  domain、VHまたはVL)やリガンドなどの目的蛋白質を選別できる方法及びそのような方法を行うためのシステムである。
【００６７】
「Tat信号配列(Tat  signal  sequence)」とは、Tat(Twin-arginine  translocation)経路によって認知される配列である。バクテリアでは、細胞質で細胞内膜を通過する経路に蛋白質を誘導して、葉緑体(chloroplast)では、ストロマ(stroma)からチラコイド(thylak
oid)に移動する経路を誘導する。一般にTat信号配列は、次の三つのモチーフ(motif)に区分される。プラスの電位を示すN-末端モチーフであるn-領域(region)、中間の疏水性(hydrophobic)アミノ酸からなるh-領域、C-末端モチーフであるc-領域からなっている。多く
のTat信号配列を分析した結果、n-領域とh-領域にかけてTat信号配列の特徴的な保存配列であるS/T-R-R-x-F-L-Kが存在することが明らかになった。この中二つのアルギニン(arginine:R)は、すべてのTat信号配列において変わりがない理由からツイン-アルギニン(Twin-arginine)と名付けられた。
【００６８】
Tat信号配列は、TorA、CuoO、DmsA、FdnG、FdoG、HyaA、NapA、Suf1、WcaM、TagT、YcbK、YcdB、YdhX及びYnfEなどから選択されるが、これらに限定されない。細胞質内で、シャペロン等または種々の補助因子(cofactor)等と結合を介して完全な三次構造をなす蛋白質は、Tat経路を介して細胞膜を移動してバクテリアの一般的な細胞膜移動経路であるSec信号とは互いに符合しない。すなわち、Tat  ABCからなるトランスロカーゼ(translocase)
複合体によって細胞質でフォールディングが行われて完ぺきな三次構造が形成された蛋白質だけ認知するので、Sec経路とは異なった特性の蛋白質の移動経路に関与する(Baneyx  and  Mujacic,Nat.  Biotech.  2004,22,1399~1408)。
【００６９】
本発明に係るTAPE方法は、前記のようなTat-信号経路の特性を利用したもので、ライブラリー(例えば、ヒトVHドメインライブラリー)由来の目的蛋白質が、TAPEスクリーニングシステム経路を通過するには、胞質内で完全にフォールディングされてTat  ABCトランスロカーゼ複合体によって認知されなければならないので、従って、細胞内膜に存在するこの複合体は、Tat経路に適合した気質だけを取り除く適合性フィルター(fitness  filter)の役割を果たすといえる。従って、他の様々な研究によって明らかになったように、蛋白質が概ね細胞質で正確にフォールディングが行われた時だけTat経路を通過し、概ね蛋白質
の水溶性及びはやいフォールディングの可否に従属的な特徴を示す点を利用した(DeLisa  et  al.,  2003  PNAS  100(10):  6115-6120;  Snaders  et  al.,  2001  Mol  Microbiol  41(1):  241-246;  Matos  et  al.,  2008  EMBO  J  27(15):  2055-2063;  Fisher  et  al.,  2006  Protein  Sci  15(3):  449-458;  Lim  et  al.,  2009  Protein  Sci  18(12):  2537-2549)。本発明で用いることができるTat経路信号配列は、前記
考察した通り、TorA、CueO、DmsA、FdnG、FdoG、HyaA、NapA、Suf1、WcaM、YagT、TcbK、YcdB、YdhX及びYnfE蛋白質の信号配列のうち選択されることが好ましいが、これらに限定されない。
【００７０】
すなわち、Tat経路の特性上蛋白質フォールディングが行われる大腸菌の細胞質は、二硫化結合を行うことができない還元条件であるため、VHドメイン抗体ライブラリー中特異的に二硫化結合の助けがなくて自発的に(autonomously)速くかつ正確なフォールディングが行われるVHドメインを取り除くことができる。還元環境内で機能を有した抗体で自発的にフォールディングする抗体を探すのは、還元環境の細胞質内に存在する特定ターゲット抗原に作用する抗体、すなわちイントラボディー(intrabody)の開発において核心的な要素
である。本願発明のスクリーニングシステムを介して選別を経た生殖細胞のヒトVHドメインまたは変形された(engineered)  VHドメインが、どのような物理化学的特性を見せるかは、選別されたVHドメインの特性分析を介してだけで知ることが出来る。このように細胞質内での自発的なフォールディングを成す目的蛋白質の特性が、さらに抗体治療剤としてのどんな物理化学的特性(例えば、蛋白質水溶性、蛋白質熱力学的安定性、長期保管安定
性、及び蛋白質構造的安定性等)に寄与するのかは、単純には予測し難い。本願発明の目的は、前記のようなTAPE方法を導入及び開発して、これを蛋白質工学に適用させることであり、より具体的にこのスクリーニング方法を介して改良されたヒト免疫グロブリン可変ドメイン抗体(VHまたはVL)の選別に応用して、これから出てきた向上した物性の可変ドメイン抗体を新規治療用抗体の開発のための骨格構造(scaffold)に応用することである。
【００７１】
本発明に係るTAPE方法は、従来の方法と比較すると次のような長所を持つ。
従来のファージディスプレー(phage  display)技術を利用してドメイン抗体ライブラリーに温度のような一定のストレスを与えた後、プロテインA(protein  A)に付く活性を測定
して、パニングを行う方法(Jepsers  L.  et  al.,  Nat.  Biotechnol.  2004  22(9):  1161-5;  Barthelemy  P.  A.  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  2008  283(6):  3639-54)等により、NIHグループの場合は特別な選別を経ないで実験的に偶然にドメイン形態で
安定したm0というドメインを発見したことがある(J.  Biol.  Chem.  2009  May  22;  284(21):  14203-14210)。
【００７２】
しかし、本発明では、大腸菌のTat経路を利用したTAPE方法を利用して、高い水溶性及び熱的安定性を持つヒト免疫グロブリン可変ドメインを容易に選別することができる。
【００７３】
また、プレート基盤のスクリーニング方法を利用してTat信号配列が含まれたライブラリーから水溶性の蛋白質を発掘する方法も知られている。しかし、この方法は、抗生剤が含まれた固形培地(プレート)に一定倍率で希釈された発現菌株を塗抹して抗生剤耐性で生き残った個別クローンを確保する過程を経なければならないので(Fisher  A.  C.  et  al.,  Protein  Sci.  2006  Mar.  15(3):  449-58)  Fisher  A.  C.  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  2009  385(1):  299-311)、プレート基盤のスクリーニング方法の特性上一つ
のプレートに105個以上の個別クローンを分離し難い。一般的な結合活性を選別するための目的の抗体ライブラリーの大きさが、109乃至1010個であることを勘案すると、普通の大きさのライブラリーを前記のような方法で全部処理することは、物理的にかなり難しいのでスクリーニングにおいてハイスルプット(high  throughput)形態を実現するのが実質的に難しい結果を招く。また、従来の方法(例えばISELATE)を用いた場合、多くの場合に
おいてプレートで抗生剤耐性で選別された個別菌株のプラスミド構造遺伝子塩基配列を確認してみると、目的遺伝子が断片化された形態でクローニングされて短い形態の蛋白質が発現される場合、または、目的遺伝子がなしでレポーター(reporter)遺伝子(例えばTEM1-1  b-lactamase)だけ存在する場合がしばしば発見される(Fisher  A.  C.  et  al.,J.  Mol.  Biol.  2009  385(1):  299-311)。このようにペプチド水準(10〜20個のアミノ酸
で構成)の短い蛋白質は二次三次構造に影響を多くは受けないために、それ自体で非常に水溶性が高い場合が多くて、結果的に偽陽性(false  positive)で示されることになる。
既存のTat基盤蛋白質フォールディング選別方法(例えばISELATE、Fisher  JMB  2009)では、このような偽陽性の比が、抗生剤耐性を利用した選別次数が増えるほど増幅される傾向があって、蛋白質水溶性スクリーニングを不可能にさせる実質的な障害として作用する。従って、このような多くの方法は、大規模なライブラリーを検査するよりは、水溶性を確保しにくい目的蛋白質の小規模の大きさの突然変異ライブラリーから(105乃至106の大
きさ)蛋白質変形を介して水溶性発現を確保して結晶構造を研究するための目的で利用する(Pedelacq  et  al.,  Nat  Biotechnol.  2002  20(9):927-32;  Yang  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  2003  100(2):  455-60)。
【００７４】
しかし、本発明に係るTAPE方法は、既存の固形培地(プレート)を基盤にする蛋白質水溶性選別方法の代わりにライブラリー全体を選別抗生剤(例えば、アンピシリン)が含まれた液体培地に接種する方式で、培地の体積を増やす場合、一度にスクリーニングに適用できるライブラリー(大腸菌)の大きさに対する制限がなくなるので、ハイスルプットスクリーニング(high  throughput  screening)が可能になる。そして、すでに説明した通り、従来
の方法においては、抗生剤が含まれた液体培地でライブラリーを選別した後、ライブラリーの発現ベクター(例えばpET-TAPE)へのクローニング過程中の自己連結(self-ligation)
さらた空ベクター(mockベクター)と上で言及したペプチド水準の遺伝子断片が入ったクローンが偽陽性で存在する確率が非常に高い。このようなリガーゼ(ligase)を利用したクローニング方法の内在的問題によって引き起こされるペプチド水準の大きさの遺伝子断片による偽陽性問題を解決するための方法として、回収された大腸菌から全てのプラスミドを
回収して、すでにデザインされた目的蛋白質とTEM-1ベータ-ラクタマーゼ融合蛋白質発現遺伝子の両側終端に制限酵素を処理して完全な大きさの選別遺伝子をゲル電気泳動(gel  electrophoresis)及びゲル溶出(gel  elution)方法で分離すると、TAPE方法によって一次選別されたすべての真陽性(true  positive)  VHドメイン遺伝子だけをもれなく回収することができる。従って、本発明に係るTAPE方法は、反復的な抗生剤耐性選別次数が増えるにも関わらず偽陽性が増幅されず完全な目的蛋白質の遺伝子構造体(construct)だけ含ま
れた真陽性(true  positive)クローンだけ抗生剤耐性の程度により選別できるという長所も持っている。
【００７５】
具体的に、本発明に係るTAPEシステムは、目的蛋白質、特に重鎖可変ドメインのN-末端にTat-信号配列が機能的に連結されており、C-末端には、抗生剤耐性蛋白質、特に成熟した(自体Sec経路信号配列が除外された)  TEM-1ベータ-ラクタマーゼ(betalactamase)等の抗生剤耐性を与える蛋白質が機能的に結合された融合蛋白質をコードする遺伝子構造体を利用する。
【００７６】
TAPEシステムまたはこれを利用したTAPE方法は、前記遺伝子構造体が、宿主細胞、特に大腸菌に形質転換された後、抗生剤を添加した培養条件で、Tat-信号配列によって抗生剤耐性蛋白質が水溶性形態に良好にフォールディングされて発現した大腸菌だけが生存できる原理を利用する。
【００７７】
一つの宿主細胞には一つの遺伝子構造体だけを形質転換させることによって、生存した宿主細胞に含まれた目的蛋白質は、水溶性形態に良好にフォールディングされたと見なすことができる。
【００７８】
また、異なる目的蛋白質をコードする遺伝子構造体が形質転換された多数の宿主細胞群、特に大腸菌群を利用して本発明に係るTAPE方法を通して大規模ハイスルプット(high  throughput)方式で水溶性目的蛋白質を選別することができる。
【００７９】
TAPE方法は、
(1)目的蛋白質、特に重鎖可変ドメインのN-末端にTat-信号配列が機能的に連結されており、C-末端には抗生剤耐性蛋白質が機能的に連結されている融合蛋白質をコードする遺伝子構造体に形質転換された宿主細胞群を抗生剤が含まれた液状培地で培養する工程;
(2)生存した宿主細胞を回収してプラスミド(plasmid)  DNAを回収する工程;
(3)回収されたプラスミドDNAで目的蛋白質をコードする核酸配列を回収する工程;
(4)回収された核酸配列から目的蛋白質の配列を確認して選別する工程;を含んで構成されて、
特に、工程(3)以後、
(3‘)回収された核酸配列を再びTat-信号配列をコードする遺伝子及び抗生剤耐性付与遺伝子に作動可能に連結させた遺伝子構造体を製作して、これを再び宿主細胞群に形質転換させる工程;及び
(3‘’)別途の遺伝子構造体製作なしに回収された核酸配列を含むプラズミドを直ちに宿主細胞群に形質転換させる工程;のうち選択された一つの工程を追加的に含んでも良い。
(3‘’)工程は、(3‘)工程に比べてより迅速に次の工程が進行できるとの長所がある。
【００８０】
工程(1)乃至工程(3‘)または工程(1)乃至(3“)は、2ラウンド(round)以上繰り返すことができるが、このような繰り返し過程によって水溶性であり安定化水準が高い目的蛋白質を選別することができる。
(1)工程乃至(3‘)工程または(3‘’)工程が、2回以上繰り返される場合、最終的に(3‘)工程または(3’‘)工程以後(4)工程で目的蛋白質の配列を確認して選別する工程を行って、目的蛋白質を同定(identification)することができる。
【００８１】
TAPE方法をより具体的に考察すると、
(1)宿主細胞、特に大腸菌細胞質で目的蛋白質、特にヒト可変ドメインライブラリーを融合蛋白質形態で発現する。ここで、それぞれの宿主細胞、特に大腸菌は、一つの特定融合蛋白質だけ発現する。ここで融合蛋白質は、Tat経路信号配列が目的蛋白質、例えば、ヒ
ト免疫グロブリン可変ドメイン、特にVHのN-末端に機能的に連結されておりC-末端には成熟した(自体Sec経路信号配列が除外された)  TEM-1ベータ-ラクタマーゼ(betalactamase)等の抗生剤耐性を与える蛋白質が機能的に連結されている。
【００８２】
(2)融合蛋白質が発現されたライブラリーを抗生剤が含まれた液体選別培地に接種して選別圧力(selection  pressure)を加える。この時、液体選別培地に含まれる抗生剤の濃度は、0.1  ug/mlを基準(1x)に最初ラウンドでの濃度が1x、2x、3x、4xまたは、5x、8xまたは、10xになってもよい。この時用いられる抗生剤は、アンピシリン(ampicillin)また
はカルベニシリン(carbenicillin)等を用いても良いが、これらに制限されるのではなく、前記工程(1)で用いられる抗生剤耐性蛋白質に応じて用いられることができる適切な抗生剤ならばいずれも制限なしに使用可能である。発現した融合蛋白質は、目的蛋白質の特性に応じてTat経路を経て細胞膜間に移動するか、目的蛋白質の特性上移動に失敗した、
すなわち水溶性を持たない融合蛋白質は、封入体(inclusion  body)を形成するか、またはTatプルーフリーディング(proof  reading)機序によって細胞質内で消滅(degradation)される。Tat経路のフォールディング検索機能を通過して周辺細胞質(periplasm)に融合蛋白質が移動した大腸菌だけが目的蛋白質のC-末端に機能的に連結されたTEM-1ベータ-ラクタマーゼなどの抗生剤耐性付与蛋白質の作用によって抗生剤が含まれた液体選別培地で耐性を獲得することができる。
【００８３】
(3)液体選別培地で生き残った大腸菌を回収してプラスミド(plasmid)  DNAを回収した後、すでにデザインされた制限酵素を処理して、全体融合蛋白質のうち目的蛋白質とベータ-ラクタマーゼなどの抗生剤耐性付与蛋白質の融合の部分だけをエンコードする核酸だ
けを電気泳動及びゲル抽出方法などで回収するか、または
(3‘)液体選別培地で生き残った大腸菌を回収してプラスミドDNAを回収した後、これを実施例5で記述した通り直ちに大腸菌に形質転換して、次のラウンドに進行する。
(4)回収された核酸を再びTat経路信号配列の部分と再び機能的に連結するためにモック(mock)ベクター(pET-TAPE)にクローニングする。
【００８４】
以後、1)〜3)の過程を繰り返して、ライブラリーから所望の特性の蛋白質を発現する遺伝子の比を強化(enrichment)することができる。この時、次のラウンド(round)の液体培地
選別は、以前のラウンドよりさらに高い抗生剤濃度で実施してもよい。
【００８５】
本発明での目的蛋白質、特にTAPE方法によって選別することができる目的蛋白質は、目的とする機能を有するいかなる形態の蛋白質も利用可能で、好ましくは特定ターゲットに対する結合能力がある蛋白質(scFv、イントラボディー、ドメイン抗体、Fab)、受容体蛋白
質、特にTCR(T-cell  receptor)または受容体リガンドなどが利用されるが、これらに限定されるのではなく、特に好ましくはドメイン抗体、例えばVHドメイン抗体またはVLドメイン抗体である。
【００８６】
本発明での目的蛋白質は、突然変異を有するものであってもよい。目的蛋白質の突然変異誘発のために特定部位のアミノ酸が無作為に変異されるようにデザインされたオリゴマーを合成してこれを利用したオーバーラッピング(over-lapping)重合連鎖反応(PCR)を利用
するかDNAポリメラーゼ(polymerase)のエラー(error)比を人為的に増加させた重合反応条件で無作為部位の無作為変異を誘発する方法(error-prone  PCR)のような増幅を基盤とする突然変異方法が利用されるが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明での目的蛋白質を含む融合蛋白質は、分離精製または検出(detection)を容易にするために、C-末端に特定のアミノ酸配列からなるタグ(Tag)を含んでも良い。このようなタグは、本発明が属する技術分野で通常用いられるタグを制限なしに使用可能であるが、例えば6xHisタグ、フラグタグ(Flag  tag)、c-mycタグなどから選択されるが、これらに
限定されない。また、精製工程は可変ドメインの種類、例えばＶＨ３によるタンパク質Ａ新化度カラムを使用して行われる。
【００８８】
融合蛋白質発現のためのベクターとしては、大腸菌で発現可能になるもので、本発明が属する技術分野で知られるいかなるベクターでも制限なしに使用可能であるが、このようなベクターの非制限的な例としては、pET22b(Novagen)、pAE34(AthenaES)、pET9a  (Novagen)またはΔpMK  (Lim  HK  et  al.  Production  Characteristics  of  Interferon-a
Using  an  L-arabinose  Promoter  System  in  a  High-cell-density  Culture.  Appl.  Microbiol.  Biotechnol.  53(2):  201-208.)等がある。  プロモーターとして
は、lacプロモーター(promoter)、T7プロモーター、アラビノース(arabinose)プロモーターなどが融合蛋白質の発現誘導のために用いられてもよい。
【００８９】
TAPE方法を用いて選別されたライブラリーから目的遺伝子だけを回収して新しい発現ベクターでクローニングしてN-末端とC-末端にそれぞれあったTat信号(signal)とTEM-1ベータ-ラクタマーゼなしに目的蛋白質だけを単独で発現させた後、個別hitの精製過程を経る。この時、目的蛋白質のC-末端に精製及び分析を容易に行うために、タグを含ませて精製過程を容易に行うことがきるが、用いられるタグは、前記説明した通り本発明が属する技術分野で通常用いられるタグを制限なしに使用可能であるが、例えば6xHisタグ、フラグタ
グ(Flag  tag)、c-mycタグなどから選択されるが、これらに限定されない。
【００９０】
本発明に係るTAPE方法によって用いられたライブラリーの種類によって所望の特性を持つリガンドを選別してもよい。このようなリガンドには免疫グロブリン可変ドメイン、特にドメイン抗体と受容体及び受容体リガンドなどがあるが、これらに限定されない。特に前記リガンドは、野生型(wild  type)だけでなく、前記説明した通りライブラリーなどに突然変異を誘発して、リガンドに突然変異が誘導されたものであってもよい。
【００９１】
また、選別されたリガンドは、常法によってそのようなリガンドをコードする遺伝子配列、すなわち塩基配列を収得してもよい。
本発明のTAPE方法を通して収得されたリガンド、例えば、生殖ライン塩基配列で選別した野生型リガンドまたは突然変異リガンドは、結合蛋白質として好ましい物理化学的特性を示すことを確認した。特に、水溶性、長期保存安定性、還元環境の細胞質内で自主的にフォールディングできる能力、熱力学的安定性が向上されることを確認することができた。
【００９２】
特に好ましいリガンドは、例えばヒト免疫細胞cDNAライブラリーから収得されたヒト免疫グロブリン可変ドメイン及びその突然変異体が挙げられる。前記突然変異は、特定野生型ヒト免疫グロブリン可変ドメインのフレーム(frame)部分の特定の位置にNNKプライマー(primer)等を利用してアミノ酸を変形させたライブラリーを用いて選別、収得されてもよい。
【００９３】
本発明に係るTAPE方法によって選別されたヒト免疫グロブリンの重鎖または軽鎖可変領域ドメイン、すなわちVHまたはVLドメイン抗体は、CDR配列と関係なく該当ヒトVH及びVLド
メイン抗体の骨格を持つ場合、依然として水溶性であり熱力学的安定性を維持する。
【００９４】
従って、前記のような特性を利用して、本発明を通じて選別された高い水溶性と熱力学的安定性などを持つ優れた物性のVH骨格は、目的とするターゲット、すなわち抗原を標的に
する特定リガンド、すなわちドメイン抗体を収得するためのライブラリーの骨格構造(scaffold)として活用することができる。具体的に、選別された突然変異VHドメイン抗体の骨格を維持しながら、無作為CDR配列を挿入して、ライブラリーを構築して、これからパニ
ング(panning)等の常法を用いて目的とするターゲット、すなわち抗原に結合能を持つ抗体を選別することができる。
【００９５】
具体的には、通常のファージディスプレー方法などと類似して固定された目的とする抗原に結合したVHドメイン抗体を除いた残りの結合しないVHドメイン抗体を湧出(elution)し
て選別することができ、前記固定された目的とする抗原に結合しないVHドメイン抗体を湧出する過程を二回以上繰り返してより高い目的とする抗原に対する結合能を持つVHドメイン抗体を選別することができる。
【００９６】
前記説明した通り、本発明で収得されたVHドメイン抗体の骨格を利用してCDR突然変異ライブラリーを構築するために、該当可変区間(ヒト免疫グロブリン可変ドメインである場合、該当ドメインのCDR)を種々の長さ、すなわちアミノ酸残基の個数を変化させるか、特定アミノ酸残基を他の無作為アミノ酸に変えるか、CDR内の超可変領域(hyper  variable
region)のいくつかの特定部位だけを無作為に変形してもよい。
【００９７】
従って、本発明は、TAPE方法によって選別されたVHまたはVLドメイン抗体の骨格に無作為的(random)に  CDR配列を含むライブラリー及びその製造方法を提供して、そのようなラ
イブラリーを利用して所望のターゲット蛋白質に結合能を持つVHまたはVLドメイン抗体を選別する方法及びそのような方法によって選別されたVHまたはVLドメイン抗体を提供して、選別されたドメイン抗体のアミノ酸配列及びこれをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００９８】
このような方法により、ヒト単一可変ドメイン抗体、特にVHドメイン抗体の物性を改善させて既存の自然界上では得ることはできない程度の水溶性と熱力学的安定性が確保されたヒト単一可変ドメイン抗体、特にVHドメイン抗体を収得することができる。
【発明の効果】
【００９９】
本発明で提供されるTAPE方法は、高い水溶性、熱的安定性、長期保存安定性を持つ目的蛋白質を容易に選別でき、特にTAPE方法を通して選別されたヒトVH及びVLドメイン抗体骨格の場合、様々なCDR変形、すなわちCDR配列と関係なく高い水溶性及び熱的安定性を維持する優れた特性を示した。
従って、選別されたヒトVHまたはVLドメイン抗体の骨格を利用してCDR配列を無作為または論理的(rational)に突然変異させたライブラリー構築が可能で、構築されたライブラリーから治療用薬品に利用することができる優れた特性を持ったドメイン抗体を選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】TAPE方法による選別された水溶性蛋白質の選別能力を示す図面。
【図２】TAPE方法で水溶性蛋白質を選別する方法に関する模式図。(a)宿主細胞群を抗生剤が含まれた液状培地で培養する工程(b)宿主細胞群の成長曲線を抗生剤の濃度に応じて確認する工程(c)プラスミドを回収して目的蛋白質をコードする核酸の有無を確認する工程(d)回収された核酸配列を再びTat-信号配列をコードする遺伝子及び抗生剤耐性付与遺伝子に作動可能に連結させた遺伝子構造体を製作して、これを再び宿主細胞群に形質転換させる工程あるいは回収されたプラスミドを直接宿主細胞群に形質転換させる工程
【図３】ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子ライブラリーからTAPE方法を利用して選別されたヒトVHドメインのアミノ酸配列を示す図面。(a)選別されたヒトVHドメインのFR1、CDR  H1、FR2、及びCDR  H2配列(b)選別されたヒトVHドメインのFR3、CDR  H3及びFR4配列
【図４】ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子ライブラリーからTAPE方法を利用して選別されたヒトVHドメインの大腸菌での発現様子をSDS-PAGEを利用して分析した結果を示す図面。solは、細胞破砕後水溶性画分(soluble  fraction)を、Inclは細胞破砕後非水溶性画分(insoluble  fraction)を意味して、矢印は、該当VH分子量位置のバンドを表示。(a)既に水溶性が良いと知られたVHドメインの発現様子(b)左側ボックスは、ヒト生殖細胞から由来したヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインライブラリーから無作為に選別したVH、右側ボックスは、TAPE方法によって選別されたVHドメインの発現様子
【図５】TAPE方法によって1次選別されたVHドメイン抗体骨格の変形ライブラリーの製造方法を示す図面。
【図６ａ】VHドメイン抗体骨格の変形ライブラリーを利用してTAPE方法によって選別されたヒトVHドメインのアミノ酸配列を示す図面。(a)選別されたヒトVHドメインのFR1、CDR  H1、FR2、及びCDR  H2配列(b)選別されたヒトVHドメインのFR3、CDR  H3及びFR4配列
【図６ｂ】VHドメイン抗体骨格の変形ライブラリーを利用してTAPE方法によって選別されたヒトVHドメインのアミノ酸配列を示す図面。(a)選別されたヒトVHドメインのFR1、CDR  H1、FR2、及びCDR  H2配列(b)選別されたヒトVHドメインのFR3、CDR  H3及びFR4配列
【図７】VHドメイン抗体骨格の変形ライブラリーを利用してTAPE方法によって選別されたヒトVHドメインの大腸菌での発現様子をSDS-PAGEを利用して分析した結果を示す図面。１レインはラクダドメイン抗体ＶＨＨ、２レインはＣＤＲ合成人間ドメイン抗体ＨＬ４、３レインはＭＧ２Ｘ１、４〜３２レインはフレイム変形ライブラリーから選別されたＶＨ骨格発現様子をあらわす。各レイン別フレイムは、レイン4:MG8-14  レイン5:MG2-47  レイン6:MG2-55  レイン7:MG2-57    レイン8:MG2-59レイン9:MG4-2        レイン10:MG4-5      レイン11:MG4-6        レイン12:MG4-7レイン13:MG4-12    レイン14:MG4-13    レイン15:MG4-17      レイン16:MG4-20レイン17:MG4-28    レイン18:MG4-32    レイン19:MG4-33      レイン20:MG8-4レイン21:MG8-5      レイン22:M8-6      レイン23:MG8-8        レイン24:MG8-11レイン25:MG8-12    レイン26:MG8-13    レイン27:MG2-7I      レイン28:MG2-9Iレイン29:MG2-10I  レイン30:MG2-11I  レイン31:MG2-12I    レイン32:MG2-12L
【図８】VHドメイン抗体骨格の変形ライブラリーを利用してTAPE方法によって選別されたヒトVHドメインのの円偏光二色性分光計(CD)比較結果を示す図面。
【図９】VHドメイン抗体骨格の変形ライブラリーを利用してTAPE方法によって選別されたヒトVHドメインのの円偏光二色性分光計(CD)比較結果を示す図面。
【図１０】TAPE方法によって選別されたVHドメインの長期保管安定性を示す図面。
【図１１】変形されたCDR長さを持つ変形ライブラリー製作方法を示す図面。
【図１２】抗原結合力を向上させるための戦略的ライブラリー突然変異位置を示す図面。(a)FR1、CDR  H1、及びFR2配列(b)CDR  H2及びFR3配列(C)CDR  H3及びFR4配列
【図１３】選択的CDR突然変異ライブラリー製作方法を示す図面。
【図１４】CDRH3変形時、CDRH3のアミノ酸残基の個数に応じたVH骨格の大腸菌での発現様子をSDS-PAGEで分析した結果を示す図面。(a)CDRH3のアミノ酸残基の個数が7である場合(b)CDRH3のアミノ酸残基の個数が8である場合(c)CDRH3のアミノ酸残基の個数が9である場合(d)CDRH3のアミノ酸残基の個数が10である場合(e)CDRH3のアミノ酸残基の個数が11である場合(f)CDRH3のアミノ酸残基の個数が12である場合(g)CDRH3のアミノ酸残基の個数が13である場合(h)CDRH3のアミノ酸残基の個数変化がない場合
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
以下、実施例を通して、本発明をより一層詳細に説明する。この実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界の通常の知識を有する者には自明である。
【実施例】
【０１０２】
実施例1.TAPEシステム構築のためのpET-TAPEの製造
Tat(Twin-arginine  transport)システム基盤蛋白質水溶性スクリーニングシステムを構築するために、pET9aベクターに目的蛋白質N-末端にTat気質蛋白質であるTorA  (E.coli  trimethylamine  N-oxide  reductase)の経路信号配列(signal  sequence)のssTorAを連結してC-末端にTEM-1ベータ-ラクタマーゼを連結してpET-TAPEを製作した。
【０１０３】
但し、Tat経路に誘導する信号配列は、上で言及した通りssTorAに限定されず全Tat経路蛋白質の信号配列が利用できることは、通常の技術者には自明である。また用いられるベクターは、pET9a  (New  England  Biolab)だけでなくアラビノース誘導プロモーター(Arabinose  induction  promoter)を用いるDpMA  (韓国特許1996-007784)、ラック(lac)プロモーターを用いるpAE34等本発明の目的に合ういかなるベクターでも利用可能であることも通常の技術者には自明である。
【０１０４】
pET9aをベクターとしてい用いる場合、最適化された培養条件で、IPTGによってssTorA、目的蛋白質、及びTEM-1ベータ-ラクタマーゼからなる融合蛋白質の発現が誘導されると、信号配列(signal  sequence)のガイドにより融合蛋白質はTat移動経路を経ることになる。この時、Tat機序(machinery)  (Tat  A、B、C)によって水溶性でありフォールディングが完成された融合蛋白質だけ細胞内膜を通過することになり、結果的に目的蛋白質のフォールディング特性によって目的蛋白質に連結されたTEM-1ベータ-ラクタマーゼは、大腸菌の細胞周辺質(periplasm)に移動することになる。細胞周辺質のTEM-1ベータ-ラクタマーゼの存在の可否により大腸菌の抗生剤耐性が決定される。
【０１０５】
本発明では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの選別のためのスクリーニングのシステムとして、pET-TAPEベクターのssTorAとTEM-1ベータ-ラクタマーゼとの間に目的遺伝子であるヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン  ライブラリーを挿入した。
【０１０６】
より詳しく実験過程を説明すると、次のとおりである。ssTorA遺伝子とヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインVHファミリータイプ(Family  type)  2の代表的な遺伝子(Stefan  Ewert  et  al.,  Stability  improvement  of  antibodies  for  extracellular  and  intracellular  applications:  CDR  grafting  to  stable  frameworks  and  structure-based  framework  engineering.  Methods  34  (2004)  184-199)の融合遺伝子は、DNAオリゴマー合成と重複連鎖重合反応(Overlapping  polymerase  chain  reaction)を介して合成した(Genscript  USA  Inc.、US)。合成されたssTat-VH2遺伝子を鋳型にしてNdeI塩基配列を含む5’方向プライマー(配列番号1)とNotI、6Xhis、BamHI塩基配列を含む3’方向プライマー(配列番号2)を利用して連鎖重合反応を誘導した。
【０１０７】
PCR反応は前記二つのプライマーと1  mM、0.5  U  I-pfu  DNA重合酵素(iNtRON)、各2.5  mMの4種類のdNTP、及び5μLの10X反応バッファーで構成し、蒸溜水で最終体積が50μlになるべく補充した。PCR反応は、95℃で2分露出後、94℃で15秒、56℃で15秒、72℃で30秒露出を30回繰り返して、最後に72℃で5分間反応させた。増幅されたDNAは、1%アガロースゲルにロードして電気泳動を行った後、QIAquickゲル摘出キット(QIAGEN、Valencia、CA、USA)で分離した。
【０１０８】
PCRを通して増幅されたNdeI-ssTorA-VH2-NotI-6xHis-BamHI遺伝子は、pET9aベクターのマルチクローニングサイト(Multi-Cloning  Site:MCS)に存在するNdeIとBamHI切断位置に挿入してpET9a-ssTorA-VH2プラスミドを製作した。TEM-1β-lactamase  (bla)遺伝子を鋳型にして5’プライマー(配列番号3)、3’プライマー(配列番号4)でPCR反応を行ってて分離したNotI-TEM-1ベータ-ラクタマーゼ-BamHI切片をpET9a-ssTorA-VH2のNotIとBamHI切断位置に挿入して、pET-TAPEと命名した。以後、ライブラリー製作は、pET-TAPEでVH2部分を除去してライブラリー遺伝子を挿入する方法で行った。構築したTAPEシステムが、該当蛋白質の水溶性(solubility)に依存的であるか否かを確認するために、すでに大腸菌で水溶性発現(soluble  expression)程度が知られた代表的な自然型ヒト免疫グロブリンドメイン抗体(Dp47d、VH2、VH3)及び陰性(VH3-Bla、no  signal  sequence)、陽性(ssTorA-Bla)対照群遺伝子をpET-TAPEに導入した後、TEM-1ベータ-ラクタマーゼの抗生剤耐性程度を測定した。VHファミリータイプ2は、概ね大腸菌発現時水溶性発現が非常に不利であると知られており、VH3とDP47dは、大腸菌で水溶性発現が相対的に良好であると知られている(Ewert  et  al.,Stability  improvement  of  antibodies  for  extracellular  and  intracellular  applications:CDR  grafting  to  stable  frameworks  and  structure-based  framework  engineering.Methods  34  (2004)  184-199)。
【０１０９】
具体的には、すでに蛋白質の水溶性程度が知られた対照群ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインと陰性(pET-TAPE)にVHファミリータイプ3の代表的遺伝子を挿入してssTorAを除去してTEM-1ベータ-ラクタマーゼが細胞周辺質で到達できなくした構造体(construct)及び陽性(pET-TAPE)自体にVH遺伝子を挿入しないでssTorAと連結してTEM-1ベータ-ラクタマーゼマンを発現させる構造体対照群をTAPEシステムに装着した後、抗生剤含培養液に接種して、水溶性程度に応じた抗生剤耐性程度を生菌数を測定した。用いられた培地は、アンピシリン50μg/mlが含まれたLB培地が用いられ、IPTGで3時間誘導して生きている細胞数を計算した。
【０１１０】
その結果、該当遺伝子の知られた水溶性は、pET-TAPEシステム下で抗生剤耐性の程度と比例する結果を示した(図1参照)。図1で単位細胞濃度当たりカウント(count)が多いほど抗生剤耐性が強いことを意味する。
【０１１１】
実施例2.ヒト生殖細胞由来免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VH)ライブラリー製造
ヒト肝(Liver)、末梢血液単核細胞(peripheral  blood  mononuclear  cell:PBMC)、脾臓(Spleen)、甲状腺(Thyroid)で得たmRNAから逆転写(reverse  transcription)を介してcDNAライブラリーを確保した。
【０１１２】
これからヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのDNA配列を確保するために、配列番号5乃至配列番号13に記載された混合プライマーをデザインして、ヒト生殖細胞系列で可用するすべてのヒト重鎖可変ドメイン遺伝子を確保した。確保したヒト重鎖可変ドメイン遺伝子ライブラリーは、pET-TAPEのNdeI/BamHIサイトに挿入して、約108の大きさのライブラリーを完成した。
【０１１３】
具体的には、ヒト脾臓、末梢血液単核細胞、肝、胸腺で抽出したRNA  (Clontech、Madison、WI、US)から逆転写反応を介してcDNAを製造した。AMV逆転写酵素とRNase抑制剤は、プロメガ(Madison、WI、USA)から購入した。それぞれのRNAを1μLのdNTP混合物(0.2  mM)と1μLのオリゴｄＴプライマーと混合して、ヌクレアーゼが除去された水を総体積が12μLになるべく投与した。RNAを変成させるために、混合物を65℃で培養した後、4μLの5Xストランドバッファー、1μLのRNase抑制剤、2μLの0.1  M  DTTを投与した。逆転写反応を42℃、15分間進行させて、70℃で15分間放置した。PCRに用いられたプライマーは、各ファミリータイプ別VHドメインを得るためにいくつかの縮退(degenerative)プライマーを同時に用いた。
【０１１４】
配列番号5から13まで(表5参照)と記載される順方向(Forward)  NcoI配列含プライマー及び配列番号14及び15  (表5参照)と記載される逆方向(Reverse)  NotI配列含プライマー(Intergrated  DNA  Technologies、Inc.、Coralville、Iowa、US)を用いた。鋳型として逆転写反応を介して製作されたcDNA、前記プライマーそれぞれ10  pmolar、0.5  UのI-pfu  DNA重合酵素(Interon、韓国)、4種類のdNTP各2.5  mM、5μLの10Xバッファーを利用してDNAを増幅した。PCR条件は、95℃で2分露出後、94℃で20秒、56℃で20秒、72℃で2分露出を30回繰り返して、最後に72℃で7分間反応させた。PCR以後反応混合物を1%アガロースゲルを利用した電気泳動で分離して、続いてゲル抽出キット(QIAGEN、Valencia、CA、USA)で精製した。増幅されたPCR産出物とpET9a-TAPEプラスミドは、NcoIとNotI制限酵素で切断して、PCR精製キット(QIAGEN)とゲル抽出キットでそれぞれ精製した。増幅されたVH遺伝子をpET9a-TAPEのNcoIとNotI切断位置に挿入することによって、ヒト生殖細胞由来VHライブラリープラスミドを製作した。製作されたライブラリーは、エタノール沈殿法を利用して濃縮した。
【０１１５】
大腸菌ElectroMAXTM  DH5α-ETM  (Invitrogen、Carlsbad、CA、US)は、electrophoration  (BTX  model  ECM630、Holliston、MA、USA)を通して1μgのDNAに形質転換した。ライブラリーの大きさを検証するために、形質転換された大腸菌を10-4〜10-8で順次希釈してカナマイシンが含まれたLB寒天培地に培養後、コロニー数を計算した。
【０１１６】
その結果、VH1ファミリーのライブラリーの大きさが9.1x106、VH3の大きさが1.56x109、VH5の大きさが6.05x108個であることを確認した。この中50個の単一コロニーを無作為に分離してカナマイシンが含まれたLB液状培養液に培養後、それぞれのプラスミドをDNA精製キット(QIAGEN、Valencia、CA、USA)を利用して分離した後、確保したVH遺伝子の塩基配列を確認した結果、90%以上の遺伝子が転写可能な形態で維持されていることを確認した。
【０１１７】
【表５−１】
0006293829.tif 000036
【表５−２】
0006293829.tif 000037
【表５−３】
0006293829.tif 000038
ここで、ＫはＧまたはＴ，ＳはＣまたはＧ，ＲはＡまたはＣ，そして、ＮはＡ，Ｔ，ＧまたはＣを意味する。
【０１１８】
本発明での「抗体配列順番システム」とは、免疫グロブリン可変ドメインであるVHまたはVLのアミノ酸配列に番号を与えるシステムを意味する。抗体のCDRは、そのアミノ酸の個数が抗体毎に異なるので、多くの種類の個別VHまたはVLに対して保存アミノ酸配列(例えば、フレームの部分)と可変部分に一定に定めた規則でN-末端を始め順番を与える必要がある。代表的には、Kabat、Chotia、及びIMGT順番付与(numbering)システムがあって、それぞれはCDR部分のアミノ酸にどの順序で番号を与えるかにより異なる。本発明においては、カバット(Kabat)順番付与システムを利用する。例えば、カバットシステムでは、CDR1部分のアミノ酸の番号を指定する際に、次のような原則に指定する。基本的な前提は、抗体の可変区間(CDR)内でもアミノ酸変異の程度により超可変区間(hypervariable  region)とこれを構造的に支えている基本構造(canonical  structure)で区分できるという点である。例えば、VHの最初の保存フレームであるフレーム1が30番目に終わって、最初の可変区間(CDR1)中基本構造(canonical  structure)である31番目のアミノ酸から35番目のアミノ酸を各31番から35番でまず指定した後、もし35番目以上のアミノ酸がフレーム2部分と一致しない可変アミノ酸と判断されると、その次からは35a、35b、35c…のように極可変区間が終る時まで順に番号を与える。従って、カバットシステムによると、フレーム2区間は必ず36番から始まるようになっている。カバット順番付与システムによるCDR2部分の順番付与の場合も同様にCDR2で必ず存在する基本構造である50番から52番までアミノ酸に対し先に番号が付与されて、その次からは52a、52b、52c…と順に指定した後、引き続き出てくる後ろの部分のCDR2の基本構造に対しては53番から65番まで順に番号を与える。従って、フレーム3のアミノ酸は必ず66番から始まる。CDR3の場合も同様にCDR3が始まる基本構造95番から100番まで番号をまず付与して、次の順序の極可変区間のアミノ酸を順番どおり100a、100b、100c…の順に与える。引き続きCDR3の後ろの部分の基本構造に101番から102番まで番号を与える。従って、以後連結される最後のフレーム4部分は、必ず103番から始まるようにになっている。
【０１１９】
実施例3.TAPE  (Tat-associated  protein  engineering)を介したヒト生殖細胞由来VHライブラリースクリーニング
(1)ヒト生殖細胞由来VHライブラリー構築
大腸菌T7  Express  LysY/Iqを電気穿孔法(electroporation)方法でpET-TAPEライブラリーで形質転換した。以後SOC培養液で37℃、一時間培養後、50μg/ml  (1X)カバニシリンが含まれたLB培養液に接種、培養した。大腸菌のOD値が0.6になった時遠心分離を利用して大腸菌を回収して、プラスミドDNA精製キット(QIAGEN、Valencia、CA、USA)を利用して分離後、制限酵素NcoIとBamHIで切断した。切断された遺伝子は、VHライブラリーとβ-lactamase遺伝子を含んでおり、これは以後液状パニング過程で誘発される可能性がある肯定的エラー(false  positive)を排除するためである。pET-TAPEプラスミドも制限酵素NcoIとBamHIで切断した。切断後、各DNAは、ゲル抽出キット(QIAGEN)で精製した。カバニシリンLB培養液で選別されたpET9a-TAPEライブラリーから収得したVH遺伝子をpET-TAPEのNcoIとBamHI切断位置に挿入して、これを再び大腸菌T7  Express  LysY/Iqに電気トランスフォーメーションした。以後、液状パニングは、培養液上のカバニシリン濃度を250μg/ml  (5X)、500μg/ml  (10X)で高めながら前記過程を繰り返し実行した。各過程の模式図は、図2に示された通りである。
【０１２０】
最終的に、各カバニシリン濃度別液状パニングを経た後、アンピシリンが含まれたLB寒天プレートで単独コロニーを50個選んで液状培養して、プラスミドを回収して塩基配列を分析した。選別されたクローンのVHドメイン特性を分析するための培養方法は次の通りである。大腸菌DH5αとT7  Express  LysY/Iqは、NEB(New  England  BioLabs,INC.,Beverly,MA,US)から購入した。大腸菌は、pET-TAPEプラスミド系列を含んでいる場合、50μg/ml濃度のカナマイシンが含まれたLB培養液で培養して、pET22bベクターを含んでいる場合は、50μg/mlアンピシリンあるいはカバニシルを添加した。Seed培養のために、LB固形培地で単一コロニー形態で分離したクローンを前記の抗生剤が含まれたLB液状培養液に接種した後、これから37℃、  200rpmで12時間以上培養した。蛋白質発現を誘導するために、Seed培養液の細胞濃度が1:100に希釈されるように培養培地に接種した。
【０１２１】
(2)ヒト生殖細胞由来VHライブラリースクリーニング結果
前記記述した通り作ったヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子ライブラリーから前記TAPEシステムを利用してスクリーニングされた自然型ヒトVHドメイン抗体のアミノ酸配列を図3に示して、表1にスクリーニングされた自然型ヒトVHドメイン抗体の骨格、すなわち、FR1乃至FR4の配列を記載した。
その結果、最終3次液状パニングから分離した合計154個のVH配列のうち繰り返し出てきた同じ配列は、一度だけ表示した場合、合計54個の独特の(unique)配列を確保することができた。合計154個の配列のうち96%に該当する148の配列がVH3ファミリータイプと判明した。VH3ファミリーは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン7個のファミリーのうち最も水溶性が相対的に高いと知られてきたので、これは本発明のTAPEシステムを利用したスクリーニングが統計的に有意に水溶性に基づいた選別能力を見せることを証明する結果である。
【０１２２】
そして、個別54個の配列のうち19個の配列のフレーム配列が独特であることが明らかになり、そのうち13種類がさらにVH3ファミリータイプに分類された。
選別された個別VH遺伝子をレポーター遺伝子であるTEM-1ベータ-ラクタマーゼなしに単独で大腸菌で発現させた時、果たして水溶性発現水準がどの程度になるのか調べるために、VH発現誘導後水溶性画分(soluble  fraction)と非水溶性画分(insoluble  fraction)を分離した後、SDS-PAGEを介して各種対照群VHドメインと比較してみた(図4参照)。
【０１２３】
該当遺伝子を発現ベクターは、pET-22b(+)にクローニングして、宿主細胞としてE.coli  NEBT7に形質転換(transformation)させて発現した。骨格(scaffold)の発現条件としては、37℃、200rpm条件で培養をした後、ODが0.6〜0.8になった時、1mM  IPTGで誘導(induction)して、25℃、180rpm条件で3.5時間後細胞を回収した。
【０１２４】
蛋白質の水溶性及び非水溶性画分分離は、B-PER  Reagent  (Thermo  scientific)を利用した。細胞を破砕した後、細胞浸漬(cell  down)を介して、水溶性画分(上澄み液の部分)を得ることができ、沈殿物(pellet)をPBSで洗浄した後、溶解バッファー(solubilization  buffer、pH  7.4、50mM  NaH2PO4、6M  UREA、0.5M  NaCl、4mM  DTT)で再懸濁(resuspension)して非水溶性画分を得た。これらの発現は、SDS-PAGEを利用して分析した。
【０１２５】
その結果、ライブラリーで選別過程を経ないで無作為に選択したVHドメインの場合(M1-33、M8-24、M10-5)、多くは、蛋白質発現誘導後、水溶性画分に該当の大きさのVHが殆どないことが分かり、TAPE選別過程を経たVHドメインの場合(MG4x4-44,  MG4x4-25,  MG10-10,  MG2x1)、水溶性発現が明らかに増加していることがわかる(図4(b)参照)。一般的に、水溶性発現程度が優れると知られたVHドメイン(VH2、VH3、VH6、DP47d、HEL4)と比較した場合もTAPEシステム選別を経たVHの場合が相対的に水溶性発現率が非常に優れることがわかる。
【０１２６】
実施例4.  MG2x1  VH骨格基盤フレーム変形合成ライブラリーの製造
TAPE方法によって選別された最適な自然型ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VH)候補群のうちM2X1  VH骨格を基盤に追加的な溶解性と安定性を与えるために、VHの構造的な分析に基づいて戦略的(rational)に選択された特定7ヶ所のアミノ酸部位に突然変異を導入する「フレーム変形合成ライブラリー」を構築した。
【０１２７】
MG2X1  VH骨格でのアミノ酸突然変異位置は、カバットナンバリング(Kabat  numbering)システムを基準に図6の四角ボックス(■)と表示された部位である。
具体的に、TAPE方法で1次選別したMG2X1骨格を基盤として、M2X1  VH骨格配列に突然変異を誘発したが、具体的に突然変異を誘発するための連鎖重合反応戦略は次のとおりである。
【０１２８】
全遺伝子配列を二つの切片で分けて、連鎖重合反応ができるプライマーを製作した。最初の切片の3’プライマーと二番目の切片の5’プライマーに突然変異を誘導するプライマーを製作してそれぞれの遺伝子切片をPCRを介して作った後(表5の配列17及び18参照)、二つの遺伝子切片の重複(overlapping)  PCRを介して最終MG2X1基盤フレーム変形合成ライブラリーを構築した(表5の配18及び19参照;図5参照)。増幅されたDNAは、アガロースゲルから分離して、NcoIとNotI制限酵素を処理した後pET-TAPEベクターに挿入して、pET-TAPEフレーム変形重鎖可変ドメイン合成ライブラリーを製作した。
【０１２９】
実施例5.TAPE(Tat-associated  protein  engineering)システムを通したMG2X1  VH骨格
基盤変形VHドメインの選別
前記記述した通り、本発明のTAPEシステムを利用して溶解性と安定性を向上した新しい合成VH骨格を選別した。TAPEを行う際に、ラクタム系抗生剤カバニシリン(Carbenicillin)は、50μg/ml  (以下「1X  TAPE」という)、100μg/ml  (以下「2X  TAPE」という)、200μg/ml  (以下「4X  TAPE」という)、400μg/ml  (以下「8X  TAPE」という)の順に濃度を高めながら各工程を行った。
【０１３０】
1X  TAPEを経た後、20個の単独コロニーの塩基配列を分析した結果、TEM-1β-ラクタマーゼ遺伝子だけ含むpET-TAPEライブラリーは発見されないことを確認することによって、窮極的に本発明のTAPEシステムによって偽陽性(false  positive)をスクリーニング初期工程で排除できることを確認した。以後、2X、4X、8X  TAPEを進行する際に、NcoI、BamHI制限酵素反応後VH遺伝子だけ回収して再びTAPEシステムに導入する方法と、このようなクローニング作業なしに細胞培養液から分離したpET-TAPE  VHプラズミドライブラリーをそのまま大腸菌に形質転換する方法を同時に行った。二つの方法で共に偽陽性(false  positive)コロニーは発見されなかった。最終的に8X液状パニングを経た後、アンピシリンが含まれたLB固形培地で単独コロニーを50個選んで液状培養して、これからプラスミドを回収してアミノ酸配列を分析した。
【０１３１】
その結果、7ヶ所の変形位置のうちカバット順番付与システムを基準に50番及び58番の位置が特定アミノ酸に偏って選択される現象を発見した。具体的に、41個中16個のクローンで50番アラニン(Alanine)がトリプトファン(Tryptophan)に、41個中24個のクローンで58番チロシン(tyrosine)がトリプトファン(Tryptophan)に変形されたことを確認した。残りの位置のアミノ酸は、特別な偏り現象が観察されなかった。
【０１３２】
【表２−６】
0006293829.tif 000039
【表２−７】
0006293829.tif 000040
【表２−８】
0006293829.tif 000041
【表２−９】
0006293829.tif 000042
【表２−１０】
0006293829.tif 000043
【表２−１１】
0006293829.tif 000044
【０１３３】
実施例6.スクリーニングされたVH骨格候補群の分離精製及び物理化学的性質分析
選別したヒト由来のVH骨格候補群(図3参照)と合成突然変異を介したVH骨格候補群(図6参照)の物理化学的性質を調べるために三種類の分析を実施した。
【０１３４】
一番目は、VH骨格候補群の水溶性程度を確認するために大腸菌での単独発現時水溶性発現率を確認し、二番目は、各骨格候補の熱力学的安定性を確認するために円偏光二色性分光測定法(Circular  Dichroism、CD)を行い、三番目は、単独で分離精製した骨格候補の蛋白質の凝集現象回避(aggregation  free)特性をゲルろ過クロマトグラフィー(gel  filtration  chromatography)を介した単量体(monomer)の比と長期保存安定性で確認した。
【０１３５】
(1)スクリーニングされた候補VH骨格候補群の分離精製
選別された遺伝子を大腸菌発現ベクターに移して単独で発現した。NcoI制限酵素塩基配列を含む5’プライマー(表6の配列20)とXhoIを含む3’プライマー(表6の配列21)を利用して、pET-TAPE-VH候補群プラスミドを鋳型でPCRを行った。PCRで増幅して分離したDNAの断片をNcoIとXhoI制限酵素で処理した後、pET22b(+)プラスミド  ベクターのNcoIとXhoI切断位置に挿入することによって、pET22b-VHプラスミドを製作した。製作されたプラスミドは、大腸菌T7  Express  LysY/Iqに形質転換した後、単一コロニーを分離して、それぞれ100μg/mLアンピシリン、20mM  MgCl2、2%(w/v)グルコースが含まれたSB培養液に接種した。培養液の吸光度(Optical  Density)が0.6になった時、1mM  IPTGを添加して、蛋白質発現のために25℃で4時間培養した。培養液は遠心分離して大腸菌を回収した後、リン酸塩緩衝食塩水(Phosphate-buffered  Saline、PBS)に再懸濁(resuspension)した。浮遊された大腸菌は細胞壁粉砕のために4回凍らせて溶かす過程を経て、遠心分離を行って上澄み液を回収した。回収した上澄み液にNaClを0.5Mになるべく添加して、5N  NaOHを利用してpHを7.4にした後、0.22μmフィルターでろ過した。蛋白質の分離は、Ni-NTA親和クロマトグラフィーを利用して行って、洗浄過程は100  mMイミダゾール(imidazole)で、溶離は300  mMイミダゾールで実施した。精製された蛋白質は、インビトロゼンから購入したNuPAGE  4-12%  Bis-Trisゲルで電気泳動した後、クマシーブルー(Coomassie  blue)染色を通して分離した蛋白質を確認した。溶離された蛋白質は、PD-10脱塩(desalting)コラム(GE  Healthcare  Life  Science、Piscataway、NJ、USA)を介してリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で緩衝液交換を行った。
【０１３６】
【表６−１】
0006293829.tif 000045
【表６−２】
0006293829.tif 000046
【表６−３】
0006293829.tif 000047
ここで、ＫはＧまたはＴ，ＳはＣまたはＧ，ＲはＡまたはＣ，そして、ＮはＡ，Ｔ，ＧまたはＣを意味する。
【０１３７】
(2)スクリーニングされたVH候補群の大腸菌で水溶性発現程度分析
MG2X1  VH骨格を基盤としたフレーム変形ライブラリーからTAPEを介して一次に選別したVHの大腸菌での水溶性発現様子を確認するために、前記実施例3の(2)のような方法で該当VHを単独で発現した後、水溶性画分と非水溶性画分を分離して、SDS-PAGEで分析した。
その結果、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインライブラリーから分離した自然型MG2X1と比較して水溶性発現が向上したVH骨格候補を得ることができた。図7に示された通り、多くの選別されたVHは、大腸菌で水溶性として発現した
【０１３８】
特に、  MG8-14,  MG2-55,  MG4-5,  MG4-13及び  MG8-4骨格候補（図７で矢印で表す）の水溶性発見が優れていることが確認でき、水溶性発見が優れていたＶＨらは非水溶性画分においてＶＨ発見比率を分析した結果、非水溶性発見比率が減少することが確認できた(図７参照)。
【０１３９】
(3)熱力学的安定性分析
VH骨格候補群に対する二次元蛋白質構造を分析を介した熱力学的安定性を調べるために、TAPE過程を経て選別した後精製したVH骨格候補群に対して円偏光二色性分光測定法(Circular  Dichroism、CD)でTm(Temperature  melting;全水溶液状蛋白質の50%が熱変性を起こす温度)を計算した。
【０１４０】
フォールディング比率(folding  fraction)は  加熱前吸光度にたいする特定温度での吸光度比率である。温度による235nm波長で吸光度観測した。これから得たシグモイド曲線(sigmoidal  curve)からフォールディング比率(folding  fraction)が50%に減る時点での温度を示す。
【０１４１】
自然型ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインライブラリーとM2x1  VH骨格基盤フレーム変形合成ライブラリーから選別した骨格候補VHを精製して、0.2〜0.3  mg/ml濃度で希釈した後、CD  (Jasco  J-715  model、Jascoinc、Easton、MD、USA)を測定した。25〜85℃の温度範囲で1分に1℃ずつ上げながら235  nm波長でCD信号を記録して測定した。
【０１４２】
一般に自然型ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VH)は、単独で水溶液上に存在する場合、多くは蛋白質凝集現象が起きるので、水溶液上の蛋白質を分析するCD分析特性から測定が不可能である。
凝集現象が起きない特異なVH、例えば、  MG3-10  (表7参照)のような自然型VHの場合、一般にCD分析によるTm値は、約45℃を示す。これを基準として比較した時、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインライブラリーからTAPEシステムを経て選別された自然型  MG4x4-44、  MG4x4-25、  MG10-10、及び  MG2x1の場合、Tm値が55℃〜60℃の  間で測定されて、平均的な自然型VHと比較すると、約10℃以上熱力学的安定性が向上したことを確認した(図８及び表7参照)。
【０１４３】
MG2x1  VH骨格基盤フレーム変形合成ライブラリーからTAPEシステムを経て選別されたVH  (例えば、  MG2-12I、  MG2-12L、  MG4-13、  MG8-4、  MG8-14等)のTmの場合、平均60℃〜70℃水準で測定されて、平均20℃  以上熱力学的安定性が向上したことを確認した(図９及び表7参照)。
【０１４４】
【表７】
0006293829.tif 000048
【０１４５】
(4)蛋白質凝集(aggregation)程度分析
長期保管(long-term  incubation)による候補VHフレームの凝集(aggregation)を測定することによって蛋白質安定性を調べた。0.2〜0.8  mg/mLの濃度で精製されたVH骨格候補群を37℃で60%の湿度で保管した。約20日間の保管中一定間隔でサンプルを取って遠心分離して凝集した蛋白質を除去した後、水溶液状態として残っている蛋白質の濃度を測定してその比を計算した。
【０１４６】
また、NuPAGE  4-12%  Bis-Trisゲルで電気泳動した後、クマシーブルー(Coomassie  blue)染色を通して残っている蛋白質の品質を確認した。その結果、リン酸塩緩衝食塩水(PBS)に溶けられている蛋白質の多くが加速条件(37℃)で60日以上蛋白質凝集なしに安定的に維持されることが分かった。それぞれのデータ点等は、初期蛋白量を1にした時、水溶液上で凝集しないで残っている蛋白量の比を示す(図10参照)。
【０１４７】
実施例7.候補VH骨格に抗原結合力を与えるためのCDRH3長さ別変形ライブラリー構築
ヒト生殖細胞由来VHライブラリーからTAPE方法で選別されたMG2x1と、フレーム変形ライブラリーからTAPEで選別されたMG8-4とMG8-14の骨格構造に抗原結合力の多様性を与えるために、該当骨格のCDRH3部分にアミノ酸の長さ別(7個〜  13個)  CDR3変形ライブラリーを構築した。これは従来の研究を通して、ヒトVHドメインの安定性に最も適して標的蛋白質との結合能を有しているVHドメインのCDR3長さが7個〜13個とのことから類推した(Christoper  J  Bond.  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  2005  348:  699-709)。また、アミノ酸をNNKヌクレオチド(nucleotide)でコードすることによって、NNNとNNSより終止コドンの比を低くしながらも20個すべてのアミノ酸をコードできるようにした。さらに、Ｒ９４ＳＮＮＫライブラリーは前記載した方法により、構造化されることによりセリンからアルギニンに置換されたＣＤＲ３の柔軟性が強化された。
【０１４８】
重合酵素連鎖反応エラーを最小化するために、先に突然変異が入らない鋳型断片をPCRで構築した。鋳型としてM2x1及びM8-4  cDNAにそれぞれ10  pmolarの5’プライマー(表6の配列番号23)と3’プライマー(表6の配列番号24)、0.5  UのI-pfu  DNA重合酵素、各2.5  mMの4種類dNTP、5μLの10Xバッファーを利用してDNAを増幅した。PCRは、94℃で2分露出後、94℃で20秒、56℃で20秒、72℃で25秒露出を25回繰り返して、最後に72℃で5分間反応させる条件で25回繰り返した
【０１４９】
前記の鋳型DNAに抗原結合力の多様性を与えるために、CDRH3の長さが7個から13個までになるようにする突然変異が入ったプライマー(配列番号25乃至配列番号31)を製作して構築された鋳型断片と5’プライマー、長さ別突然変異誘発3’プライマー(配列番号25乃至配列番号31)を利用して、PCRを介して「長さ別CDR3変形ライブラリー」を構築した。PCRは次の条件で25回繰り返した:94℃で2分露出後、94℃で20秒、56℃で20秒、72℃で40秒露出を25回繰り返して、最後に72℃で5分間反応させた。図11は、抗原結合力の多様性を与えるための長さ別CDRH3変形ライブラリーを構築模式図を示す。
【０１５０】
実施例8.候補VH骨格に抗原結合力多様性を与えるための戦略的(rational)  CDR変形ライブラリー構築
実施例7と同じ目的でMG2x1またはMG8-4または  MG8-14基盤骨格VHに抗原結合力多様性を与えるためのCDR変形ライブラリーを構築した。実施例7でCDRH3長さ別多様性を与えたのとは異なって、CDR長さは維持したまま突然変異を誘発させた時、抗原結合力を持つようになると予想される配列だけを戦略的(rational)に選択して該当遺伝子に無作為突然変異を導入した。三つのCDRの長さは、固定したまま、構造分析を通して抗原と結合する可能性を示す位置(SDRs:Specific  Determining  Residues)にだけ選択的に突然変異を誘導した。これは、CDR中最小限の位置にだけ突然変異を誘導させることによって、CDR変形による安定性変化と免疫原性(immunogenecity)問題を最小化させることができる長所がある。SDRは、先にCDR1とCDR2はカノニカル(canonical)構造の把握を通して選定して、カノニカル構造が知られていないCDR3の場合には配列整列(sequence  alignment)を介して同じCDR3を持っているHEL4蛋白質(PDBコード:1OHQ)のCDR3構造を利用して選定した。
【０１５１】
また、アミノ酸を抗原結合力が他のアミノ酸より高いと知られるチロシン(tyrosine)とセリン(serine)の比を相対的に上げた偏りヌクレオチドを導入して、同じライブラリーの大きさでもつく可能性があるクローンの比が高いようにデザインした(Akiko  Koide  et  al.  et  al.,  PNAS  2007  104(16):6632-6637)。突然変異誘発位置は、図12に示した。図12に示した通り、CDR1、CDR2及びCDR3それぞれに突然変異を誘発させるために、遺伝子を三つの部分に分けて突然変異を導入した。フレーム  MG2x1またはフレームMG8-4、MG8-14cDNAを鋳型にして次のような方法でそれぞれの切片をPCR方法で確保した。
【０１５２】
MG8-4、MG8-14の初のDNAの切片は、5’プライマー(配列番号22)と3’プライマー(配列番号39)、二番目のDNAの切片は、5’プライマー(配列番号40)と3’プライマー(配列番号41)、三番目のDNAの切片は、5’プライマー(配列番号42)と3’プライマー(配列番号43)を使用してＰＣＲを通じてＣＤＲ変形ライブラリーを合成した。
ＤＮＡ短編の合成プライマーはそれぞれ10  pmolar、0.5  Uのvent  DNA重合酵素、各10  mMの4種類dNTP、5μLの10Xバッファーを利用してPCRを通して合成した。PCRは、94℃で2分露出後、94℃で15秒、56℃で20秒、72℃で25秒露出を25回繰り返して、最後に72℃で5分間反応させた。前記反応を介して得られた鋳型断片3個と5’プライマー(配列番号23)と3’プライマー(配列番号44)を利用した重複PCR(Overlapping  PCR)を通して全体の大きさの戦略的CDR変形ライブラリーを完成した。PCRは、94℃で2分露出後、94℃で20秒、56℃で20秒、72℃で40秒露出を25回繰り返して、最後に72℃で5分間反応条件で行った。図13は、抗原結合力の多様性を与えるための戦略的(rational)  CDR変形ライブラリー構築模式図を示す。
【０１５３】
実施例9.TAPEで選別したVH骨格基盤ライブラリー(CDR3長さ別変形ライブラリー及び戦略的CDR変形ライブラリー)のCDR変形が蛋白質安定性に及ぼす影響を調べる
CDR変形がVH骨格構造の安定性に及ぼす影響の確認のために、CDRH3長さ7〜13個の合成ライブラリー及びCDRH1、CDRH2及びCDRH3の特定位置に戦略的に突然変異を導入したライブラリーで無作為に遺伝子を選別して(各CDR変形ライブラリー当たり約8個の遺伝子を選別)、単独発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、pET-22b(+)を利用して、これを宿主細胞であるE.coli  DH5aに形質転換(transformation)した。形質転換されたコロニー(colony)を無作為に選別した後、配列を分析して、終止コドン(Stop  codon)なしに全体の遺伝子を良好に保存しているプラスミドを分離して、宿主細胞であるE.coli  NEBT7に再び形質転換させて該当遺伝子の発現を誘導した。発現条件としては、37℃、200rpm条件で培養をした後、ODが0.6〜0.8になった時1  mM  IPTGに誘導して、25℃、180rpm条件で3.5時間後収穫した。蛋白質の水溶性及び非水溶性の部分の分離は、実施例3と同じ方法で行った。
【０１５４】
それぞれのCDR変形ライブラリーで無作為に選別したVHを単独発現した後、水溶性及び非水溶性の部分に分けてSDS-PAGEで分析した結果、CDRH3の長さが7個である場合、一つの試料を除いて全部水溶性に発現することを確認することができた(図14(a)参照)。
【０１５５】
CDRH3の長さが8個である場合、8個の試料のうち7個の試料が水溶性に発現することを確認した(図14(b)参照)。CDRH3の長さが9個である場合、すべての試料が水溶性に発現することを確認した(図14(c)参照)。CDRH3の長さが10個である場合、9個の試料のうち8個が水溶性に発現することを確認した(図14(d)参照)。CDRH3の長さが11個である場合、9個の試料全部水溶性に発現することを確認した(図14(e)参照)。CDRH3の長さが12個である場合、8個のうち6個の試料で水溶性に発現することを確認した(図14(f)参照)。CDRH3の長さが13個である場合、7個のうち6個の試料で水溶性に発現することを確認した(図14(g)参照)。
戦略的CDR変形ライブラリーの場合、すべての試料が水溶性に発現することを確認した。まとめると、TAPE方法で選別したVHドメイン抗体のフレームを基盤に作ったCDR変形ライブラリーでCDR変形にもかかわらず、全般的に水溶性発現が安定することを確認した(図14及び表8参照)。
【０１５６】
【表８】
0006293829.tif 000049
【０１５７】
実施例10.TAPE方法で選別されたVH骨格を持つVHドメイン抗体ライブラリーを利用したディスプレイ技術基盤VHドメイン抗体候補群の選別
本発明でTAPE方法で選別されたVH骨格を持つVHドメイン抗体ライブラリーを利用してVHドメイン抗体候補群の選別するために用いることができるディスプレイ技術は、ファージディスプレー(Phage  Display)、イーストディスプレイ(Yeast  Display)、及びリボソームディスプレイ(Ribosome  Display)等が好ましいが、これらに制限されない。
【０１５８】
ファージディスプレーとは、バクテリオファージのカプシド蛋白質に外来ペプチドと蛋白質を挿入、融合させてファージの表面に外来蛋白質を発現するようにする技術である(Smith  et  al.,  Science  1985  228(4705):1315-1317)。本発明では固定されたファージの表面に発現する融合蛋白質に目標とする抗原を結合して強い結合力を持ったドメイン抗体を選別した。
【０１５９】
特定抗原に対する結合能を有するＶＨ選別のため、下に明示されたパニングー法(Panning)が使用された.(Carlos  F.  Barbas  III  et  al.  Phage  Display  -  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press);
ファージベクター(pComb3X)中にクロニングーさらたＶＨライブラリークロニングー（実施例７及び８）；
ＶＨドメインはファージ段部に発見；
目的タンパク質と発現さらたＶＨドメインを接触；
目的タンパク質に優秀な結合能を有するＶＨドメインを選別する。
ファージ段部に発現されたＶＨドメインと目的ドメインを接触させた後、非結合ファージを清浄してＶＨドメインー目的段パク質複合体を溶出させる。結果的に発現されたＶＨドメインファージだけを濃縮する。
前記述したパニングー(Panning)過程を５〜６回反復して、標的抗原に強く結合するＶＨドメイン抗体を選別することができる。
【０１６０】
本発明ではまた酵母(yeast)の表面発現ベクターにVHライブラリー(実施例7及び8)をクローニングした後、酵母の表面にVHドメインを発現させた後、標的蛋白質と結合させて結合能が良いドメインだけを選別して湧出するイーストディスプレイ(Yeast  display)技法を用いた(Ginger  Chao.  et  al.,  Nature  Protocol  2006  1(2):  755-768)。標的蛋白質にタグ(tag)を付着したりビオチンを標識させて、これをディスプレイされたVHドメインと反応させた後、結合された蛋白質を標的する蛍光蛋白質とディスプレイされたVHドメインを標的する蛍光蛋白質をそれぞれ標識した。FACS(Fluorescence  Activated  Cell  Sorting)を利用して所望の領域に現れる標識された酵母-標的蛋白質複合体だけを湧出させて、標的蛋白質に特異的なVHドメインをディスプレイした酵母細胞だけを回収した。
【０１６１】
本発明ではまた、特定抗原に結合力を持つVHを選別するために選別したVH骨格をコードするmRNAに終止コドン(termination  codon)を除去してin  vitro蛋白質合成を行って、蛋白質と共にそれに相応するmRNAが一緒に連結されたリボソーム複合体を形成させるリボソームディスプレイ(ribosome  display)技法を用いた(Mingyue  H.  et  al.,  Nature  Protocol  2007  4(3):281-288)。目標抗原に対するパニング(panning)を行って所望の抗体を持っている複合体を選別して、結果的に目的とする複合体を濃縮することができた。選別されたmRNAは、DNAに逆転写されて目標に到達する時までこの過程を3〜4回繰り返した。  実施例7及び8によって作られた抗原結合ライブラリーを前記方法によってスクリーニングを行った場合、目標抗原に強く結合して、安定した物性を持ったVHドメイン抗体を選別することができた。  
【０１６２】
記述した三つのスクリーニング法によりヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とヒト表皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）に高い親和性を有するＶＨドメインをＨＳＡまたはＨＥＲ３を目標抗原として使用して選別することができた。選別されたＶＨドメインらは大腸菌からＶＨ骨格を維持し、水溶性で高い生産性を現した。表９に目標抗原ＨＳＡとＨＥＲ３に高い親和度を有するＶＨのアミノ酸配列と親和度を表した。
【０１６３】
【表９】
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「符号の説明」
配列番号  1  〜  48は本発明に使用されたプライマー配列である。
配列番号  49は骨格名MG1X8に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  50は骨格名MG2X1に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  51は骨格名MG2X1-34に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  52は骨格名MG2X2-12に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  53は骨格名MG2X2-13に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  54は骨格名MG3X1に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  55は骨格名MG3X10に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  56は骨格名MG4X1-8に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  57は骨格名MG4X1-33に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  58は骨格名MG4X1-35に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  59は骨格名MG4X3-27に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  60は骨格名MG4X4-2に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  61は骨格名MG4X4-4に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  62は骨格名MG4X4-25に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  63は骨格名MG4X4-44に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  64は骨格名MG4X5-30に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  65は骨格名MG4X6-27に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  66は骨格名MG4X6-48に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  67は骨格名MG4X7-15に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  68は骨格名MG4X8-24に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  69は骨格名MG0.5X-1に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  70は骨格名MG0.5X-3に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  71は骨格名MG0.5X-4に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  72は骨格名MG0.5X-14に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  73は骨格名MG0.75X-4に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  74は骨格名MG2X-5に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  75は骨格名MG2X-15に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  76は骨格名MG4X-5に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  77は骨格名MG1-4に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  78は骨格名MG1-6に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  79は骨格名MG1-7に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  80は骨格名MG1-8に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  81は骨格名MG1-9に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  82は骨格名MG1-10に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  83は骨格名MG5-1に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  84は骨格名MG5-2に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  85は骨格名MG5-4に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  86は骨格名MG5-5に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  87は骨格名MG5-6に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  88は骨格名MG5-7に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  89は骨格名MG5-9に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  90は骨格名MG10-1に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  91は骨格名MG10-2に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  92は骨格名MG10-4に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  93は骨格名MG10-5に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  94は骨格名MG10-6に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  95は骨格名MG10-8に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  96は骨格名MG10-10に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  97は骨格名MG2に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  98は骨格名MG5に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  99は骨格名MG6に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  100は骨格名MG7に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  101は骨格名MG10に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  102は骨格名MG8-21に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  103は骨格名MG2-12Lに対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  104は骨格名MG2-7Iに対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  105は骨格名MG2-9Iに対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  106は骨格名MG2-10Iに対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  107は骨格名MG2-11Iに対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  108は骨格名MG2-12Iに対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。  
配列番号  109は骨格名MG2-32に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  110は骨格名MG2-34に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  111は骨格名MG2-40に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  112は骨格名MG2-46に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  113は骨格名MG2-47に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  114は骨格名MG2-48に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  115は骨格名MG2-51に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  116は骨格名MG2-53に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  117は骨格名MG2-55に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  118は骨格名MG2-57に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  119は骨格名MG2-58に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  120は骨格名MG2-59に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  121は骨格名MG2-60に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  122は骨格名MG2-64に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  123は骨格名MG4-12に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  124は骨格名MG4-13に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  125は骨格名MG4-17に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  126は骨格名MG4-18に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  127は骨格名MG4-20に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  128は骨格名MG4-28に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  129は骨格名MG4-2に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  130は骨格名MG4-32に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  131は骨格名MG4-33に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  132は骨格名MG4-34に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  133は骨格名MG4-5に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  134は骨格名MG4-6に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  135は骨格名MG4-7に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  136は骨格名MG8-11に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  137は骨格名MG8-12に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  138は骨格名MG8-13に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  139は骨格名MG8-14に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  140は骨格名MG8-4に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  141は骨格名MG8-5に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  142は骨格名MG8-6に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
配列番号  143は骨格名MG8-8に対するＶＨ領域のアミノ酸配列である。
【図１】
0006293829.tif 000057
【図２】
0006293829.tif 000058
【図３】
0006293829.tif 000059
【図４】
0006293829.tif 000060
【図５】
0006293829.tif 000061
【図６ａ】
0006293829.tif 000062
【図６ｂ】
0006293829.tif 000063
【図７】
0006293829.tif 000064
【図８】
0006293829.tif 000065
【図９】
0006293829.tif 000066
【図１０】
0006293829.tif 000067
【図１１】
0006293829.tif 000068
【図１２】
0006293829.tif 000069
【図１３】
0006293829.tif 000070
【図１４】
0006293829.tif 000071
【配列表】
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