(57)【要約】  キメラ分子が、腫瘍治療で使用するためのエンドスタチンと、腫瘍抗原特異的結合分子の全部又は一部分とを含む。前記キメラ分子は、エンドスタチン、エンドスタチン変異体及びバリアントと、所望の腫瘍抗原に特異的な抗体又はアプタマーとを含む。癌の治療方法は前記キメラ融合分子を投与することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体結合ドメインと、エンドスタチンポリペプチド、野生型エンドスタチンポリペプチドと比較してアミノ酸置換を少なくとも１個を含むエンドスタチンポリペプチド、これらのペプチド、変異体、バリアント又は断片とを含むキメラ融合分子組成物を動物被験体に治療上の有効な投与量で投与するステップと、前記動物被験体の前記腫瘍を治療するステップとを含むことを特徴とする、動物患者の腫瘍を治療する方法。
【請求項２】
前記結合ドメインは、単離された抗体、この断片又はアプタマーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エンドスタチンポリペプチドは、６−４９、５０−９２、９３−１３３及び１３４−１７８番目のアミノ酸部位に１個又は２個以上の突然変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記エンドスタチンポリペプチドは、９３−１３３番目のアミノ酸部位に１個又は２個以上の突然変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記エンドスタチンポリペプチドは、ヒトエンドスタチンの１２５番目の部位及び／又はインテグリンモチーフにアミノ酸置換を含むヒトエンドスタチンポリペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１２５番目の部位の前記アミノ酸置換は、プロリンからアラニンへの置換（Ｐ１２５Ａ）であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原結合ドメインは、単離された抗体、この断片又はアプタマーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原結合ドメインは、１個又は２個以上の腫瘍抗原に特異的に結合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ホスファターゼ及びテンシン類似体（ＰＴＥＮ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）キナーゼ、Ｅｐｈ受容体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＶＥＧＦ受容体、ＰＩキナーゼ受容体、ＰＴＥＮ、ＥＧＦ受容体、Ｍｕｃ−１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、Ｃｄ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＴＡＡ、ＰＳＭＡ、ｗｔ−１、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、脳由来増殖因子受容体、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ｂＦＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦ−Ｆ）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１−Ｒ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）、Ｇタンパク質共役受容体、ケモカイン受容体、受容体型チロシンキナーゼ、増殖因子受容体、インテグリン及びトル様受容体と、これらの断片、バリアント、アレル及び類似体とを含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記エンドスタチンポリペプチド及びこのＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドは、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及び／又はＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、前記エンドスタチン及びＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドのアミノ（ＮＨ２−）末端及び／又はカルボキシ（ＣＯＯＨ−）末端及び／又は９３−１３３番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、前記エンドスタチン及びＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドの１２５番目の部位のプロリン又はアラニンの後の１２６−１２８番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記キメラ融合分子は、エンドスタチン、Ｐ１２５Ａエンドスタチン及びこれらの組み合わせの多量体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記キメラ融合分子は、エンドスタチン又はＰ１２５Ａエンドスタチンと、これらの組み合わせとの２量体を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体又はこの断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＤであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記キメラ融合タンパク質は、シトキマブと、スニチニブと、ソラフェニブと、セレブレックスと、ＭＴＯＲ阻害剤と、ＡＫＴ阻害剤と、ＰＩ３Ｋ阻害剤と、ベバシズマブ（アバスチン）と、シグナル伝達阻害剤と、タモキシフェンと、トレミフェンと、ラロキシフェンと、ドロロキシフェンと、ヨードキシフェンと、酢酸メゲストロールと、アナストロゾールと、レトラゾールと、ボラゾールと、エキセメスタンと、フルタミドと、ニルタミドと、ビカルタミドと、酢酸シプロテロンと、酢酸ゴセレリンと、リュープロリドと、フィナステリドと、ハーセプチンと、メトトレキサートと、５−フルオロウラシルと、シトシンアラビノシドと、ドキソルビシンと、ダウノマイシンと、エピルビシンと、イダルビシンと、マイトマイシンＣと、ダクチノマイシンと、ミトラマイシンと、シスプラチンと、カルボプラチンと、メルファランと、クロランブシルと、ブスルファンと、シクロホスファミドと、イホスファミドと、ニトロソウレアと、チオテファンと、ビンクリスチンと、タキソールと、タキソテールと、エトポシドと、テニポシドと、アムサクリンと、イリノテカンと、トポテカンと、エポチロンと、チロシンキナーゼ阻害剤と、イレッサ又はＯＳＩ−７７４と、血管新生阻害剤と、ＥＧＦ阻害剤と、ＶＥＧＦ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤と、Ｈｅｒ１／２阻害剤と、増殖因子受容体に対して定められるモノクローナル抗体とのうち１種類又は２種類以上を用いて、同時に、及び／又は、別の治療で患者に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記キメラ融合タンパク質は、シトキマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、セレブレックス、ＭＴＯＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ベバシズマブ（アバスチン）、シグナル伝達阻害剤及び抗ｈｅｒ２抗体を含む１種類又は２種類以上の抗体を、組み合わせて及び／又は別の治療で投与されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記キメラ融合タンパク質は、スニチニブ、ソラフェニブ及びアンジオスタチンを含む抗血管新生因子の１種類又は２種類以上を、組み合わせて及び／又は別の治療で投与されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記キメラ融合タンパク質はメトロノーム投与計画下で投与されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
キメラ融合分子は、抗腫瘍抗原結合ドメインと、ヒトエンドスタチンタンパク質、このペプチド、変異体、バリアント又は断片の少なくとも１個とを含むことを特徴とする、医薬品組成物。
【請求項２１】
前記エンドスタチン変異体は、ヒトエンドスタチンの１２５番目の部位に、天然又は非天然のアミノ酸及び／又はインテグリンモチーフのいずれかでのアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の医薬品組成物。
【請求項２２】
１２５番目の部位の前記置換は、プロリンからアラニンへの置換（Ｐ１２５Ａ）であることを特徴とする、請求項２０に記載の医薬品組成物。
【請求項２３】
前記キメラ融合分子は、エンドスタチン、Ｐ１２５Ａエンドスタチン及びこれらの組み合わせの多量体を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の医薬品組成物。
【請求項２４】
前記抗原結合ドメインは、単離された抗体又はこの断片か、アプタマーかを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の医薬品組成物。
【請求項２５】
前記抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原と、ホスファターゼ及びテンシン類似体（ＰＴＥＮ）と、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）キナーゼと、受容体／リガンド複合体と、受容体と、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＶＥＧＦ受容体、ＰＩキナーゼ受容体、ＰＴＥＮ受容体、ＥＧＦ受容体、Ｍｕｃ−１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、Ｃｄ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＴＡＡ、ＰＳＭＡ、ｗｔ−１、Ｅｐｈ、これらのアレル、変異体及びバリアントを含む腫瘍抗原とに結合することを特徴とする、請求項２０に記載の医薬品組成物。
【請求項２６】
前記受容体は、血管新生に関係する受容体、チロシンキナーゼ受容体−タンパク質、過剰増殖に関係する受容体又はシグナル伝達受容体を含むことを特徴とする、請求項２５に記載の医薬品組成物。
【請求項２７】
前記受容体は、Ｅｐｈ受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、脳由来増殖因子受容体、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ｂＦＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦ−Ｆ）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１−Ｒ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）、Ｇタンパク質共役受容体、ケモカイン受容体、受容体型チロシンキナーゼ、増殖因子受容体、インテグリン、トル様受容体、これらの変異体、バリアント、アレル及び断片を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の医薬品組成物。
【請求項２８】
前記抗体又はこの断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４であることを特徴とする、請求項２３に記載の医薬品組成物。
【請求項２９】
前記抗体又はこの断片は、１本鎖、２本鎖、ダイアボディ、ミニボディ、二重特異性、多重鎖のポリクローナル、モノクローナル、キメラ及びヘテロ免疫グロブリンのタンパク質及び糖タンパク質を含むことを特徴とする、請求項２４に記載の医薬品組成物。
【請求項３０】
前記抗体又は断片は、ヒト抗体又はヒト化抗体であることを特徴とする、請求項２４に記載の医薬品組成物。
【請求項３１】
前記抗体の可変領域は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖの断片のうち１個又は２個以上を含むことを特徴とする、請求項２４に記載の医薬品組成物。
【請求項３２】
前記エンドスタチンタンパク質、Ｐ１２５Ａエンドスタチンタンパク質、これらのペプチド、変異体、アレル、バリアント又は断片は、抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインの３’末端に融合されることを特徴とする、請求項２０に記載の医薬品組成物。
【請求項３３】
前記ヒトエンドスタチンポリペプチド及びこのＰ１２５Ａヒトエンドスタチンポリペプチドは、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及び／又はＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の医薬品組成物。
【請求項３４】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、前記エンドスタチン及びＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドのアミノ（ＮＨ２−）末端及び／又はカルボキシ（ＣＯＯＨ−）末端及び／又は９３−１３３番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項３３に記載の医薬品組成物。
【請求項３５】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、前記エンドスタチン及びＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドの１２５番目の部位のプロリン又はアラニンの後の１２６−１２８番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項３３に記載の医薬品組成物。
【請求項３６】
抗原特異的結合ドメインと、エンドスタチンか、少なくとも１個のアミノ酸置換を含むエンドスタチンポリペプチドかとを含むキメラ分子をエンコードすることを特徴とする、核酸。
【請求項３７】
前記抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＶＥＧＦ受容体、ＰＩキナーゼ受容体、ＰＴＥＮ、ＥＧＦ受容体、Ｍｕｃ−１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、Ｃｄ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＴＡＡ、ＰＳＭＡ、ｗｔ−１、Ｅｐｈ、これらのアレル、変異体及びバリアントを含む腫瘍抗原に特異的に結合することを特徴とする、請求項３６に記載の核酸。
【請求項３８】
前記受容体は、Ｅｐｈ受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、脳由来増殖因子受容体、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ｂＦＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦ−Ｆ）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１−Ｒ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）、Ｇタンパク質共役受容体、ケモカイン受容体、受容体型チロシンキナーゼ、増殖因子受容体、インテグリン及びトル様受容体を含むことを特徴とする、請求項３６に記載の核酸。
【請求項３９】
前記エンドスタチンポリペプチドは、１２５番目のアミノ酸部位のアミノ酸置換を含むヒトポリペプチド配列であることを特徴とする、請求項３６に記載の核酸。
【請求項４０】
１２５番目の部位の前記アミノ酸置換は、ヒトエンドスタチンポリペプチド配列（Ｐ１２５Ａエンドスタチン）のプロリンからアラニンへの置換であることを特徴とする、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
前記キメラ分子は、エンドスタチン、Ｐ１２５Ａエンドスタチン及びこれらの組み合わせの多量体を含むことを特徴とする、請求項３６に記載の核酸。
【請求項４２】
前記エンドスタチン分子及びこの変異体は、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及び／又はＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上を含むことを特徴とする、請求項３６に記載の核酸。
【請求項４３】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、前記ヒトエンドスタチン及びヒトＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドのアミノ（ＮＨ２−）末端及び／又はカルボキシ（ＣＯＯＨ−）末端及び／又は９３−１３３番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項３６に記載の核酸。
【請求項４４】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、前記ヒトエンドスタチン及びヒトＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドの１２５番目の部位のプロリン又はアラニンの後の１２６−１２８番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４５】
抗腫瘍抗原結合ドメインと、エンドスタチンタンパク質、少なくとも１個のアミノ酸置換を含むエンドスタチンタンパク質、これらのペプチド、変異体、バリアント又は断片か、複数の前記エンドスタチン分子かとを含むことを特徴とする、キメラ融合タンパク質。
【請求項４６】
前記抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原、腫瘍特異的抗原、受容体／リガンド複合体又は受容体に結合することを特徴とする、請求項４５に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項４７】
前記エンドスタチン変異体は、ヒトエンドスタチンの１２５番目の部位のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項４５に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項４８】
１２５番目の前記置換は、プロリンからアラニンへの置換（Ｐ１２５Ａ）及び／又はインテグリンモチーフへの置換であることを特徴とする、請求項４５に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項４９】
前記キメラタンパク質は、エンドスタチン、Ｐ１２５Ａエンドスタチン及びこれらの組み合わせの多量体を含むことを特徴とする、請求項４５に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５０】
前記受容体は、血管新生に関係する受容体、チロシンキナーゼ受容体−タンパク質、過剰増殖に関係する受容体、シグナル伝達受容体、これらのアレル、変異体、断片及びバリアントを含むことを特徴とする、請求項４６に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５１】
前記受容体は、Ｅｐｈ受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、脳由来増殖因子受容体、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ｂＦＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦ−Ｆ）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１−Ｒ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）、Ｇタンパク質共役受容体、ケモカイン受容体、受容体型チロシンキナーゼ、増殖因子受容体、インテグリン及びトル様受容体を含むことを特徴とする、請求項５０に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５２】
前記抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＶＥＧＦ受容体、ＰＩキナーゼ受容体、ＰＴＥＮ、ＥＧＦ受容体、Ｍｕｃ−１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、Ｃｄ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＴＡＡ、ＰＳＭＡ、ｗｔ−１、Ｅｐｈ、これらのアレル、変異体及びバリアントを含む腫瘍抗原に特異的に結合することを特徴とする、請求項４５に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５３】
前記ヒトエンドスタチン及びヒトＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドは、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及び／又はＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上を含むことを特徴とする、請求項４８に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５４】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、アミノ（ＮＨ２−）末端及び／又はカルボキシ（ＣＯＯＨ−）末端及び／又は９３−１３３番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項５３に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５５】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、ヒトエンドスタチン及びヒトＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドの１２５番目の部位のプロリン又はアラニンの後の１２６−１２８番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項５３に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５６】
前記抗原結合ドメインは、単離された抗体、この断片又はアプタマーを含むことを特徴とする、請求項４５に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５７】
前記抗体又はこの断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むことを特徴とする、請求項５６に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５８】
前記抗体又は断片は、ヒト抗体又はヒト化抗体であることを特徴とする、請求項５７に記載のキメラ融合タンパク質。
【請求項５９】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的結合ドメインと、ヒトエンドスタチン分子及び／又は１２５番目の部位にプロリンから置換されたアラニンを有するヒトエンドスタチン分子（Ｐ１２５Ａエンドスタチン）とを含むキメラ融合分子の治療上有効量を患者に投与するステップと、前記患者を治療するステップとを含むことを特徴とする、Ｈｅｒ２の低レベルないし検出不可能レベルを示している腫瘍患者の治療方法。
【請求項６０】
前記キメラ融合分子は、エンドスタチンと、１２５番目の部位にプロリンから置換されたアラニンを有するエンドスタチンを含むエンドスタチン変異体と、これらの組み合わせとの多量体を含むことを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
エンドスタチンドメインと、抗原特異的ドメインとを含むキメラ分子を含む組成物を動物被験体に投与するステップを含むことを特徴とする、動物被験体の腫瘍細胞をエンドスタチンの標的にする方法。
【請求項６２】
前記キメラ融合分子は、エンドスタチンと、エンドスタチンの１２５番目の部位にプロリンから置換されたアラニンを含むエンドスタチン変異体と、これらの組み合わせとの多量体を含むことを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＶＥＧＦ受容体、ＰＩキナーゼ受容体、ＰＴＥＮ、ＥＧＦ受容体、Ｍｕｃ−１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、Ｃｄ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＴＡＡ、ＰＳＭＡ、ｗｔ−１、Ｅｐｈ、これらのアレル、変異体及びバリアントを含む腫瘍抗原に特異的に結合することを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記受容体は、Ｅｐｈ受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、脳由来増殖因子受容体、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ｂＦＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦ−Ｆ）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１−Ｒ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）、Ｇタンパク質共役受容体、ケモカイン受容体、受容体型チロシンキナーゼ、増殖因子受容体、インテグリン及びトル様受容体を含むことを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原結合ドメインと、エンドスタチンタンパク質と、１２５番目のアミノ酸部位にプロリンから置換されたアラニンを有するエンドスタチン、これらのペプチド、変異体、バリアント又は断片とを含むキメラ融合分子を含むことを特徴とする、キット。
【請求項６６】
抗腫瘍抗原結合ドメインと、エンドスタチンタンパク質と、１２５番目のアミノ酸部位にプロリンから置換されたアラニンを有するエンドスタチン、これらのペプチド、変異体、バリアント又は断片とを含むキメラ分子をエンコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、核酸。
【請求項６７】
前記抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＶＥＧＦ受容体、ＰＩキナーゼ受容体、ＰＴＥＮ、ＥＧＦ受容体、Ｍｕｃ−１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、Ｃｄ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＴＡＡ、ＰＳＭＡ、ｗｔ−１、Ｅｐｈ、これらのアレル、変異体及びバリアントを含む腫瘍抗原に特異的に結合することを特徴とする、請求項６６に記載の核酸。
【請求項６８】
前記キメラ融合分子は、エンドスタチンと、１２５番目の部位にプロリンから置換されたアラニンを含むエンドスタチン変異体（Ｐ１２５Ａエンドスタチン）と、これらの組み合わせとの多量体を含むことを特徴とする、請求項６６に記載の核酸。
【請求項６９】
前記エンドスタチン及びＰ１２５エンドスタチンポリペプチドは、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及び／又はＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上を含むことを特徴とする、請求項６８に記載の核酸。
【請求項７０】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、ヒトエンドスタチン及びヒトＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドのアミノ（ＮＨ２−）末端及び／又はカルボキシ（ＣＯＯＨ−）末端及び／又は９３−１３３番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項６８に記載の核酸。
【請求項７１】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、ヒトエンドスタチン及びヒトＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドの１２５番目の部位のプロリン又はアラニンの後の１２６−１２８番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項６９に記載の核酸。
【請求項７２】
抗腫瘍抗原結合ドメインか、エンドスタチンタンパク質と、少なくとも１個のアミノ酸置換を有するエンドスタチンとか、これらのペプチド、変異体、バリアント又は断片か、複数のエンドスタチン分子かとを含むキメラ分子をエンコードするベクター又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、単離された細胞。
【請求項７３】
前記抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原、腫瘍特異的抗原、受容体／リガンド複合体又は受容体に結合することを特徴とする、請求項７２に記載の単離された細胞。
【請求項７４】
前記エンドスタチン変異体は、ヒトエンドスタチンの１２５番目の部位及び／又はインテグリンモチーフのアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項７２に記載の単離された細胞。
【請求項７５】
１２５番目の部位の前記置換はプロリンからアラニンへの置換（Ｐ１２５Ａエンドスタチン）であることを特徴とする、請求項７２に記載の単離された細胞。
【請求項７６】
前記エンドスタチン分子及びこのＰ１２５Ａエンドスタチンは、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及び／又はＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上を含むことを特徴とする、請求項７２に記載の単離された細胞。
【請求項７７】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、ヒトエンドスタチン及びヒトＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドのアミノ（ＮＨ２−）末端及び／又はカルボキシ（ＣＯＯＨ−）末端及び／又は９３−１３３番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項７６に記載の単離された細胞。
【請求項７８】
前記ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上は、ヒトエンドスタチン及びヒトＰ１２５Ａエンドスタチンポリペプチドの１２５番目の部位のプロリン又はアラニンの後の１２６−１２８番目のアミノ酸部位に配置されることを特徴とする、請求項７６に記載の単離された細胞。
【請求項７９】
前記受容体は、血管新生に関係する受容体、チロシンキナーゼ受容体−タンパク質、過剰増殖に関係する受容体、シグナル伝達受容体、これらのアレル、変異体、断片及びバリアントを含むことを特徴とする、請求項７３に記載の単離された細胞。
【請求項８０】
前記抗原結合ドメインは、単離された抗体、この断片又はアプタマーを含むことを特徴とする、請求項７２に記載の単離された細胞。
【請求項８１】
前記抗体又はこの断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むことを特徴とする、請求項８０に記載の単離された細胞。
【請求項８２】
前記抗原結合ドメインは、ヒト抗体又はヒト化抗体であることを特徴とする、請求項７２に記載の単離された細胞。
【請求項８３】
前記キメラ融合分子は、１２５番目の部位でのプロリンからアラニンへの置換と／か、ＮＧＲ及び／又はＲＧＤのモチーフの挿入と／かを含むエンドスタチン変異体と、エンドスタチンと、これらの組み合わせとの多量体を含むことを特徴とする、請求項７２に記載の単離された細胞。
【請求項８４】
前記抗原結合ドメインは、Ｅｐｈ受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、脳由来増殖因子受容体、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ｂＦＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦ−Ｆ）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１−Ｒ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）、Ｇタンパク質共役受容体、ケモカイン受容体、受容体型チロシンキナーゼ、増殖因子受容体、インテグリン、トル様受容体、これらのアレル、バリアント、変異体及び断片を含む受容体に結合することを特徴とする、請求項７２に記載の単離された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞の活性を標的として、変調するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、腫瘍抗原標的化ドメインと、抗腫瘍エフェクター機能ドメインとを有するキメラ融合分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗血管新生腫瘍療法は、作用のスペクトルが広く、毒性が低く、薬剤耐性がないために、近年強い興味を引いている。エンドスタチンは近年特徴付けられた抗血管新生剤である。エンドスタチンの作用機序は未だに明らかではないが、エンドスタチンの抗腫瘍活性は、内皮細胞の増殖及び遊走を阻害することに関係する場合がある。さらに、エンドスタチンは腫瘍細胞でのＶＥＧＦの発現を下向き調節する場合がある。
【０００３】
多くの動物実験と、ヒトの臨床試験とが、エンドスタチンの抗腫瘍性効果を評価するために実施された。１０ｍｇ／ｋｇのエンドスタチンの全身投与は、ヌードマウスの異種移植モデルでヒト腎臓細胞癌の増殖を抑制した。初期のヒト第１相臨床試験において、腫瘍異種移植研究で確立された活性レベルの範囲内の高投与量レベル（２４０ｍｇ／ｍ２／日）でエンドスタチンを投与することは、ＶＥＧＦ及び塩基性ＦＧＦの尿中排泄レベルのような生物学的エンドポイント（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）で有意な検出変化を全く示さなかった。しかし、多少の臨床的有用性が患者１５人中３人で観察された。膵内分泌腫瘍の患者１人は軽度の腫瘍縮小があり、別の患者２人の症状は一時的に落ち着いた。別のヒト第１相臨床試験は、エンドスタチンが、６００ｍｇ／ｍ２／日までの投与量レベルで十分に許容され、用量規制毒性を誘発しなかったが、マウスモデルで有効であると以前に報告された用量レベルを超える循環レベルでさえ、抗腫瘍活性が患者２５人でほとんど見られなかったことを示した。患者２人（肉腫が１人、黒色腫が１人）は、弱くかつ一時的な抗腫瘍活性を示した。最初の２つの第１相臨床試験は、エンドスタチンがさまざまな投与計画で非常に安全な薬剤であることを証明した。しかし、これらの結果は実質的なエンドスタチンの抗腫瘍活性を示さなかった。用量及び用法が最適とはいえなかったかもしれない、及び／又は、後期患者の巨大腫瘤病巣（ｂｕｌｋｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）が組換えヒトエンドスタチンに応答するのに最適ではなかったかもしれない。
【０００４】
抗血管新生遺伝子療法は、高濃度の抗血管新生因子を持続的に提供するための代替的な方法として提案された。ウイルスベクターを用いる抗血管新生剤の遺伝子トランスフェクションは、さまざまなマウスモデルで腫瘍の増殖を阻害する場合がある。しかし、ウイルスベクターは、反復注射で炎症及び免疫学的応答の原因となる場合があり、毒性／安全性の配慮が、近い将来、ヒトでの前記ウイルスベクターの使用を排除する場合がある。さらに、遺伝子が導入された造血幹細胞を使用することは、エンドスタチンの持続的な産生にもかかわらず、モデル動物では有効ではなかった。さらに、遺伝子ベクターを用いる生物製剤を投与することは、ベクター力価、導入効率及び発現レベルの変動のために、標準化することが非常に困難である。したがって、改善された抗腫瘍療法の当業者のニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要
本発明は、腫瘍を（１）抗血管新生剤と、（２）Ｉｇ分子の全部又は一部分のような担体ドメインとの両方を含むキメラ分子の標的にするための方法及び組成物を提供する。
【０００６】
キメラ融合分子の長所は多くの治療上の利点を提供する。例えば、エンドスタチン分子の半減期の増大、投与の容易性、２量体としてのエンドスタチンの提示、多目的に標的にすること、ｈｅｒ２を低発現している腫瘍に対する活性と３＋の腫瘍に対する持続期間／応答速度との増大、エンドスタチン及びハーセプチンの有効性の増大、従来の処置、例えば、ハーセプチン、トラスツズマブ及びいずれかの化学療法剤に耐性となった腫瘍の治療である。治療上のエフェクタードメイン、例えば、抗血管新生ドメインは、別の特異性、例えば、抗−ＣＤ２０、ＭＵＣ−１、ＥＤＢを提供するために融合される場合がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
好ましい実施態様では、動物被験体の腫瘍の治療処置と、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段とを含む治療方法は、抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインと、エンドスタチンタンパク質、このペプチド、変異体、バリアント又は断片とを含むキメラ融合分子組成物を前記動物被験体に治療上の有効投与量で投与するステップを含む。前記抗原結合ドメインは、単離された抗体、この断片又はアプタマーを含むことが好ましい。１つの実施態様では、キメラ融合タンパク質をエンコードするベクターが患者に投与される。
【０００８】
別の好ましい実施態様では、腫瘍又は癌の患者を治療するためのキメラ融合分子中の前記エンドスタチン分子は、６−４９、５０−９２、９３−１３３及び１３４−１７８番目のアミノ酸部位、及び／又は、インテグリン又はインテグリン型のモチーフ、例えば、ＮＧＲ、ＲＧＤ等に１個又は２個以上の突然変異を含む。
【０００９】
別の好ましい実施態様では、癌患者を治療するための前記キメラ融合分子は、９３−１３３番目のアミノ酸部位に１個又は２個以上の突然変異を有するエンドスタチンを含む。
【００１０】
別の好ましい実施態様では、癌患者を治療するための前記キメラ融合分子は、ヒトエンドスタチンの１２５番目の部位にアミノ酸の置換を有するエンドスタチンの変異体を含む。
【００１１】
好ましい実施態様では、置換は、天然又は非天然の類似体又はバリアントのアミノ酸のいずれかを含む。
【００１２】
別の好ましい実施態様では、１２５番目の部位の置換は、プロリンからアラニンへの置換である（Ｐ１２５Ａ）。
【００１３】
さらに別の好ましい実施態様では、癌患者を治療するための前記キメラ融合分子は、抗原結合ドメインが、１種類又は２種類以上の腫瘍抗原に特異的に結合する単離された抗体、この断片又はアプタマーを含む前記抗原結合ドメインを含む。
【００１４】
好ましい実施態様では、前記腫瘍抗原は、ＨＥＲ２と、ホスファターゼ及びテンシン類似体（ＰＴＥＮ）と、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）キナーゼと、これらのバリアントと、アレルと、類似体とを含む。
【００１５】
別の好ましい実施態様では、癌患者を治療するための前記キメラ融合分子が、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及び／又はＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上を含む、エンドスタチン分子及びこのバリアントを含む。前記エンドスタチン変異体分子に加えてこれらのインテグリン又はインテグリン型のモチーフは、エンドスタチン分子の１２５番目のアミノ酸部位に１個又は２個以上の突然変異と、６−４９、５０−９２、９３−１３３及び１３４−１７８番目のアミノ酸部位に１個又は２個以上の突然変異とを含む。
【００１６】
別の好ましい実施態様では、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上が、アミノ（ＮＨ２−）末端及び／又はカルボキシル（ＣＯＯＨ−）末端及び／又は９３−１３３番目のアミノ酸部位に配置される。
【００１７】
別の好ましい実施態様では、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及びＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上が、１２５番目のアミノ酸部位のプロリン又はアラニンの後の１２６−１２８番目のアミノ酸部位に配置される。
【００１８】
別の好ましい実施態様では、癌患者を治療するためのキメラ融合分子が、抗体又はこの断片を含む抗原特異的ドメインを含み、該抗体又はこの断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＤを含む。
【００１９】
別の好ましい実施態様では、キメラ融合タンパク質は、シトキマブ（ｃｙｔｏｘｉｍａｂ）と、スニチニブと、ソラフェニブと、セレブレックスと、ＭＴＯＲ阻害剤と、ＡＫＴ阻害剤と、ＰＩ３Ｋ阻害剤と、ベバシズマブ（アバスチン）と、シグナル伝達阻害剤と、タモキシフェンと、トレミフェンと、ラロキシフェンと、ドロロキシフェンと、ヨードキシフェンと、酢酸メゲストロールと、アナストロゾールと、レトラゾールと、ボラゾールと、エキセメスタンと、フルタミドと、ニルタミドと、ビカルタミドと、酢酸シプロテロンと、酢酸ゴセレリンと、リュープロリドと、フィナステリドと、ハーセプチンと、メトトレキサートと、５−フルオロウラシルと、シトシンアラビノシドと、ドキソルビシンと、ダウノマイシンと、エピルビシンと、イダルビシンと、マイトマイシンＣと、ダクチノマイシンと、ミトラマイシンと、シスプラチンと、カルボプラチンと、メルファランと、クロランブシルと、ブスルファンと、シクロホスファミドと、イホスファミドと、ニトロソウレアと、チオテファンと、ビンクリスチンと、タキソールと、タキソテールと、エトポシドと、テニポシドと、アムサクリンと、イリノテカンと、トポテカンと、エポチロンと、チロシンキナーゼ阻害剤と、イレッサ又はＯＳＩ−７７４と、血管新生阻害剤と、ＥＧＦ阻害剤と、ＶＥＧＦ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤と、Ｈｅｒ１／２阻害剤と、抗増殖因子受容体モノクローナル抗体とのうち１種類又は２種類以上を用いて、同時に、及び／又は、別の治療で患者に投与される。
【００２０】
別の好ましい実施態様では、予防的及び／又は治療的ないずれかの患者の治療方法は、シトキマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、セレブレックス、ＭＴＯＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ベバシズマブ（アバスチン）、シグナル伝達阻害剤及び抗ｈｅｒ２抗体を含む抗体のうち１種類又は２種類以上と、スニチニブ、ソラフェニブ及びアンジオスタチンを含む抗血管新生因子のうち１種類又は２種類以上とを、組み合わせて、及び／又は、別の治療で前記キメラ融合タンパク質を投与することを含む。
【００２１】
好ましい実施態様では、治療上の有効投与量がメトロノーム投与計画（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｉｍｅｎ）下で投与される。
【００２２】
好ましい実施態様では、医薬品組成物がキメラ融合分子を含み、該キメラ融合分子は、抗腫瘍抗原結合ドメインと、少なくとも１個のヒトエンドスタチンタンパク質、このペプチド、変異体、バリアント又は断片とを含む。前記融合分子の特異性は、所望の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む融合ペプチドによって所望の抗原のいずれかに向けられる場合がある。
【００２３】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合分子は、前記エンドスタチン分子の６−４９、５０−９２、９３−１３３及び１３４−１７８番目のアミノ酸部位に１個又は２個以上の突然変異を含み、かつ、インテグリン又はインテグリン様のモチーフ、例えば、ＮＧＲ、ＲＧＤ等を含む。
【００２４】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合分子は９３−１３３番目のアミノ酸部位に１個又は２個以上の突然変異を有するエンドスタチンを含む。
【００２５】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチンは１２５番目のアミノ酸部位に突然変異のあるエンドスタチン変異体である。前記変異体は、置換、欠失、バリアント等の場合がある。ある局面では、前記エンドスタチン変異体は、ヒトエンドスタチンの１２５番目の部位のアミノ酸置換を含む。
【００２６】
別の好ましい実施態様では、１２５番目の部位の前記置換は、プロリンからアラニンへの置換である（Ｐ１２５Ａ）。
【００２７】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチンは多量体である。
【００２８】
別の好ましい実施態様では、前記多量体は、１個又は２個以上のエンドスタチン分子、１個又は２個以上のエンドスタチン変異体分子、及び／又は、これらの組み合わせを含む。
【００２９】
別の好ましい実施態様では、前記抗原結合ドメインは、単離された抗体又はこの断片か、アプタマーかを含む。
【００３０】
さらに別の実施態様では、前記抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原か、腫瘍抗原か、受容体／リガンド複合体か、受容体かに結合する。前記受容体は血管新生に関係する受容体であることが好ましい。
【００３１】
別の好ましい実施態様では、前記抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原か、ホスファターゼ及びテンシン類似体（ＰＴＥＮ）か、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）キナーゼか、受容体／リガンド複合体か、受容体かを含む抗原に特異的に結合する。
【００３２】
別の好ましい実施態様では、前記受容体及びこのリガンドは、例えば、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びその血管新生受容体（ＫＤＲ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ１）タンパク質及びその受容体、インテグリンアルファＶベータ３、アルファＶベータ５及びアルファＶベータ１のような血管新生に関係する受容体であり、血管新生を変調する。
【００３３】
別の好ましい実施態様では、キメラ融合分子は、胚発生、血管新生及び腫瘍形成を変調する。
【００３４】
別の好ましい実施態様では、前記受容体及びこのリガンドは、チロシンキナーゼ受容体−タンパク質を含む。例えば、Ｅｐｈ受容体ファミリーである。このファミリーは現在までに同定された受容体型チロシンキナーゼの最大のファミリーである。前記Ｅｐｈ受容体及びこの膜結合型リガンドのエフリンは、双方向性シグナリングを仲介する。
【００３５】
さらに別の実施態様では、細胞の過剰増殖に関係する前記受容体は、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、脳由来増殖因子受容体、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦ−Ｒ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ｂＦＧＦ−Ｒ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦ−Ｆ）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１−Ｒ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）及びエリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）等と、これらの制御因子及びリガンドとを含む。
【００３６】
別の好ましい実施態様では、前記受容体は、膜貫通、細胞内及び細胞表面の受容体を含むシグナル伝達受容体を含む。例えば、Ｇタンパク質共役受容体、例えば、ケモカイン受容体、受容体型チロシンキナーゼ、例えば、増殖因子受容体、インテグリン、トル様受容体等である。
【００３７】
別の好ましい実施態様では、キメラ融合分子が抗原特異的結合ドメインを含み、該ドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＤを含む抗体又はこの断片を含む。
【００３８】
別の好ましい実施態様では、前記抗体又はこの断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。
【００３９】
別の好ましい実施態様では、前記抗体ドメイン又はこの断片は、１本鎖、２本鎖、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、二重特異性、多重鎖のポリクローナル、モノクローナル、キメラ及びヘテロ免疫グロブリンのタンパク質及び糖タンパク質のいずれかである。
【００４０】
別の好ましい実施態様では、前記抗体又は断片は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００４１】
別の好ましい実施態様では、単離された抗体又は免疫グロブリンの可変領域は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖの断片のうち１個又は２個以上を含む。
【００４２】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチンタンパク質、Ｐ１２５Ａエンドスタチンタンパク質、これらのペプチド、変異体、アレル、バリアント又は断片は、抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインの３’末端に融合される。
【００４３】
別の好ましい実施態様では、キメラ分子をエンコードする核酸は、抗原特異的結合ドメインと、治療上の有効ドメインとを含む。
【００４４】
ある好ましい実施態様では、前記抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＶＥＧＦ受容体、ＰＩキナーゼ受容体、ＰＴＥＮ、ＥＧＦ受容体、Ｍｕｃ−１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、Ｃｄ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＴＡＡ、ｗｔ−１、Ｅｐｈ、これらのアレル、変異体及びバリアントを含む腫瘍抗原に特異的に結合する。
【００４５】
別の好ましい実施態様では、前記核酸は、エンドスタチン、Ｐ１２５エンドスタチン、これらの変異体、バリアント、断片及びアレルを含む治療上の有効ドメインをエンコードする。
【００４６】
別の好ましい実施態様では、キメラ融合タンパク質は、抗腫瘍抗原結合ドメインと、エンドスタチンタンパク質、このペプチド、変異体、バリアント又は断片か、複数の前記エンドスタチン分子かとを含む。
【００４７】
別の好ましい実施態様では、前記抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原か、腫瘍特異的抗原か、受容体／リガンド複合体か、受容体かに結合する。
【００４８】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合タンパク質は、エンドスタチン分子の６−４９、５０−９２、９３−１３３及び１３４−１７８番目の部位にアミノ酸置換を有する前記エンドスタチン変異体を含む。前記アミノ酸は、天然、非天然、バリアント、類似体、置換された分子のいずれかを含む。前記分子は、ＮＧＲ、ＲＧＤ等を含むインテグリン又はインテグリン様のモチーフを含む１個又は２個以上の置換をさらに含む。
【００４９】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合タンパク質は、ヒトエンドスタチンの１２５番目の部位にアミノ酸置換を有するエンドスタチン変異体を含む。
【００５０】
別の好ましい実施態様では、１２５番目の部位の前記置換は、プロリンからアラニンへの置換である（Ｐ１２５Ａ）。
【００５１】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチンは多量体である。
【００５２】
別の好ましい実施態様では、前記多量体は、１個又は２個以上のエンドスタチン分子、１個又は２個以上のエンドスタチン変異体分子、及び／又は、これらの組み合わせを含む。
【００５３】
別の好ましい実施態様では、キメラ融合タンパク質は、抗腫瘍抗原結合ドメインと、エンドスタチンタンパク質、このペプチド、変異体、バリアント又は断片か、複数の前記エンドスタチン分子かとを含む。
【００５４】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合タンパク質は、血管新生に関係する受容体、チロシンキナーゼ受容体−タンパク質、過剰増殖に関係する受容体、シグナル伝達受容体、これらのアレル、変異体、断片及びバリアントに特異性を有する抗原特異的結合ドメインを含む。
【００５５】
別の好ましい実施態様では、前記抗原結合ドメインは、単離された抗体、これらの断片又はアプタマーを含み、該抗体又はこの断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＤである。ある局面では、前記抗体又はこの断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。
【００５６】
別の好ましい実施態様では、前記抗体又は断片は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００５７】
別の好ましい実施態様では、Ｈｅｒ２の低レベルないし検出不可能なレベルを示している腫瘍患者の治療方法は、抗ＨＥＲ２特異的結合ドメインと、１２５番目の部位でプロリンから置換されたアラニンを有するエンドスタチン分子とを含むキメラ融合分子の治療上の有効量を患者に投与することを含む。
【００５８】
別の好ましい実施態様では、動物被験体の腫瘍細胞をエンドスタチンの標的にするための方法が提供され、該方法は、エンドスタチンドメインと、抗原特異的ドメインとを含むキメラ分子を含む組成物を前記動物被験体に投与するステップを含む。
【００５９】
別の好ましい実施態様では、キットは、抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインと、エンドスタチンのタンパク質、このペプチド、変異体、バリアント又は断片とを含むキメラ融合分子を含む。
【００６０】
別の好ましい実施態様では、単離された細胞は、抗原特異的結合ドメインと、治療上の有効ドメインとを含むキメラ分子をエンコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６１】
別の好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチドが抗原結合ドメインをエンコードし、該抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＶＥＧＦ受容体、ＰＩキナーゼ受容体、ＰＴＥＮ、ＥＧＦ受容体、Ｍｕｃ−１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、Ｃｄ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＴＡＡ、ｗｔ−１、Ｅｐｈ、これらのアレル、変異体及びバリアントを含む腫瘍抗原に特異的に結合する。
【００６２】
別の好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチドが治療上の有効ドメインをエンコードし、該治療上の有効ドメインは、エンドスタチン、Ｐ１２５Ａエンドスタチン、これらの変異体、バリアント、断片及びアレルを含む。
【００６３】
別の好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチドはエンドスタチンの多量体をエンコードする。ある実施態様では、前記多量体は、２量体及び／又は３量体である。
【００６４】
別の好ましい実施態様では、前記多量体は、１個又は２個以上のエンドスタチン分子、１個又は２個以上のエンドスタチン変異体分子、及び／又は、これらの組み合わせを含む。
【００６５】
別の好ましい実施態様では、単離された細胞は、抗腫瘍抗原結合ドメインと、エンドスタチンタンパク質、このペプチド、変異体、バリアント又は断片か、複数の前記エンドスタチン分子かとを含むキメラ分子をエンコードするベクター又はポリヌクレオチドを含む。
【００６６】
別の好ましい実施態様では、抗原結合ドメインが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原か、腫瘍特異的抗原か、受容体／リガンド複合体か、受容体かに結合するキメラ分子をエンコードするベクター又はポリヌクレオチドを含む前記単離された細胞が提供される。
【００６７】
別の好ましい実施態様では、前記単離された細胞は、キメラ分子をエンコードするベクター又はポリヌクレオチドを含み、エンドスタチン変異体がヒトエンドスタチンの１２５番目の部位のアミノ酸置換を含む。ある局面では、１２５番目の部位の前記置換は、プロリンからアラニンへの置換である（Ｐ１２５Ａ）。本発明の別の局面では、前記エンドスタチン分子は、天然、非天然、バリアント、類似体、置換された分子のいずれかを含むアミノ酸置換を含む。前記分子は、ＮＧＲ、ＲＧＤ等を含むインテグリン又はインテグリン様のモチーフを含む１個又は２個以上の置換をさらに含む。
【００６８】
別の好ましい実施態様では、前記単離された細胞がキメラ分子をエンコードするベクター又はポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドはエンドスタチンの多量体をエンコードする。ある実施態様では、前記多量体は、２量体及び／又は３量体である。
【００６９】
別の好ましい実施態様では、前記多量体は、１個又は２個以上のエンドスタチン分子、１個又は２個以上のエンドスタチン変異体分子、及び／又は、これらの組み合わせを含む。
【００７０】
別の好ましい実施態様では、前記単離された細胞はキメラ分子をエンコードするベクター又はポリヌクレオチドを含み、抗原結合ドメインは、血管新生に関係する受容体、チロシンキナーゼ受容体−タンパク質、過剰増殖に関係する受容体、シグナル伝達受容体、これらのアレル、変異体、断片及びバリアントを含む受容体に結合する。前記抗原結合ドメインは、単離された抗体、この断片、アプタマー又はインテグリンを含む。
【００７１】
ある局面では、前記抗体又はこれらの断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＤである。
【００７２】
別の局面では、前記抗体又はこの断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
【００７３】
別の好ましい実施態様では、前記抗体又は断片は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００７４】
ある実施態様では、前記受容体はチロシンキナーゼ受容体−タンパク質である。
【００７５】
別の好ましい実施態様では、前記受容体は過剰増殖に関係する受容体である。
【００７６】
別の好ましい実施態様では、前記抗体又はこの断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＤを含む。前記抗体又はこの断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４であることが好ましい。
【００７７】
別の好ましい実施態様では、前記抗体ドメイン又はこの断片は、１本鎖、２本鎖、ダイアボディ、ミニボディ、二重特異性、多重鎖のポリクローナル、モノクローナル、キメラ及びヘテロ免疫グロブリンのタンパク質及び糖タンパク質のいずれかである。
【００７８】
別の好ましい実施態様では、前記抗体又は断片は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００７９】
別の好ましい実施態様では、単離された抗体又は免疫グロブリンの可変領域は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖの断片を含む。
【００８０】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチンタンパク質、このペプチド又は断片は抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインの３’末端に融合される。
【００８１】
別の好ましい実施態様では、抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原か、腫瘍抗原か、受容体／リガンド複合体か、受容体かに結合する。
【００８２】
別の好ましい実施態様では、動物被験体の腫瘍細胞をエンドスタチンの標的にするための方法が提供され、該方法は、エンドスタチンドメインと、Ｉｇドメインとを含むキメラ分子を含む組成物を前記動物被験体に投与するステップを含む。
【００８３】
別の好ましい実施態様では、動物被験体の腫瘍の治療方法が提供され、該方法は、抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインと、エンドスタチンタンパク質、このペプチド、変異体、バリアント又は断片とを含むキメラ融合分子を含むキメラ融合分子組成物を動物被験体に投与するステップを含み、かつ、前記組成物の投与は前記動物被験体の前記腫瘍を寛解する。
【００８４】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ結合タンパク質は、タモキシフェンと、トレミフェンと、ラロキシフェンと、ドロロキシフェンと、ヨードキシフェンと、酢酸メゲストロールと、アナストロゾールと、レトラゾールと、ボラゾールと、エキセメスタンと、フルタミドと、ニルタミドと、ビカルタミドと、酢酸シプロテロンと、酢酸ゴセレリンと、リュープロリドと、フィナステリドと、ハーセプチンと、メトトレキサートと、５−フルオロウラシルと、シトシンアラビノシドと、ドキソルビシンと、ダウノマイシンと、エピルビシンと、イダルビシンと、マイトマイシンＣと、ダクチノマイシンと、ミトラマイシンと、シスプラチンと、カルボプラチンと、メルファランと、クロランブシルと、ブスルファンと、シクロホスファミドと、イホスファミドと、ニトロソウレアと、チオテファンと、ビンクリスチンと、タキソールと、タキソテールと、エトポシドと、テニポシドと、アムサクリンと、イリノテカンと、トポテカンと、エポチロンと、チロシンキナーゼ阻害剤と、イレッサ又はＯＳＩ−７７４と、血管新生阻害剤と、ＥＧＦ阻害剤と、ＶＥＧＦ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤と、Ｈｅｒ１／２阻害剤と、抗増殖因子受容体モノクローナル抗体とのうち１種類又は２種類以上を用いて、同時に、及び／又は、別の治療で患者に投与される。
【００８５】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合タンパク質は、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（アバスチン）及び抗ｈｅｒ２抗体を含む１種類又は２種類以上の抗体を、組み合わせて、及び／又は、別個の治療で投与される。
【００８６】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合タンパク質は、スニチニブ、ソラフェニブ及びアンジオスタチンを含む１種類又は２種類以上の抗血管新生因子を、組み合わせて、及び／又は、別個の治療で投与される。
【００８７】
別の好ましい実施態様では、キットは、抗ＨＥＲ２抗原結合ドメインと、エンドスタチンタンパク質、このペプチド、変異体、バリアント又は断片とを含むキメラ融合分子を含む。
【００８８】
本発明の他の局面は以下に説明される。
【００８９】
本発明は添付される請求の範囲で詳細に示される。本発明の上記及びさらなる利益は附属の図に関連してもたらされた以下の説明に言及することによって、より理解される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３ヒトエンドスタチン融合タンパク質を示す概念図（図１Ａ）。前記エンドスタチンドメイン（オレンジ色）は、矢印と、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ＣＨ３−エンドスタチン融合タンパク質（野生型及び変異体型Ｐ１２５Ａ）の表示とによって示される。［３５Ｓ］メチオニンで標識され、プロテインＡで免疫沈降され、非還元及び還元の条件下で解析された分泌ヒトエンドスタチン融合タンパク質を示す写真の取込画像（図１Ｂ）。抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ＣＨ３−マウスエンドスタチン融合タンパク質が対照として用いられた。
【図２】ＨＥＲ２抗原及びＨＵＶＥＣｓに抗ＨＥＲ２ヒトエンドスタチン融合タンパク質が結合し、抗ヒトエンドスタチン抗体によって認識されることを示す一連のＦＡＣＳ解析図（図２Ａ−Ｆ）。ヒト乳癌細胞と、ＳＫ−ＢＲ−３（Ｉ、ＩＶ）と、マウス乳腺腫瘍細胞と、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２（ＩＩ、Ｖ）及びＥＭＴ６（ＩＩＩ）と、ＨＵＶＥＣｓ（ＶＩ）とは、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ（薄い黒線、赤色で塗りつぶされた）か、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ（薄い黒線、塗りつぶされていない）か、アルファＨＥＲ２  ＩｇＧ３（薄い緑線、塗りつぶされた）か、ヒトエンドスタチン（薄い青線）か、アイソタイプ対照（抗−ダンシルＩｇＧ３、薄い黒線、灰色で塗りつぶされた）かで示された。塗りつぶされた薄い黒線は染色されていない（第２試薬のみ）。結合された融合タンパク質は、抗−ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣでコンジュゲート化された（Ｉ−ＩＩＩ）か、ビオチン化された抗−ヒトエンドスタチン抗体で認識され、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲート（ＩＶ−ＶＩ）で二次的に染色されるかのいずれかで同定された。
【図３Ａ】ＥＣの管形成と、ＥＣの増殖とにおける抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の効果を示す写真（図３Ａ）。ＨＵＶＥＣｓ（細胞４×１０４個）は、マトリゲルで被覆されたプレートに播種する前に、３００μＬの完全内皮細胞増殖培地に再懸濁され、さまざまなアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質で処理された（図３Ａ）。１６−２０時間の培養後、管形成が倒立光学顕微鏡によって観察された。完全培地が陰性対照（Ｉ）として用いられた。アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３（ＩＩ、４５．４６ｎＭ）と、ｈｕＥｎｄｏ（ＩＩＩ、４５．４６ｎＭ）とを用いる管形成は、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ（ＩＶ−ＶＩ、４．５５ｎＭ、２２．７３ｎＭ、４５．４６ｎＭそれぞれ）と、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ（ＶＩＩ−ＩＸ、４．５５ｎＭ、２２．７３ｎＭ、４５．４６ｎＭそれぞれ）とを用いる管形成と比較された。実験は少なくとも２回繰り返された。
【図３Ｂ】ＥＣの管形成と、ＥＣの増殖とにおける抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の効果を示すグラフ（図３Ｂ）。ＨＵＶＥＣｓ（細胞４×１０３個）はエンドスタチン融合タンパク質の濃度を増大しながら処理され、増殖が７２時間で測定された（図３Ｂ）。Ｉ、ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）によって誘導されたＨＵＶＥＣの増殖。ＩＩ、ＦＧＦ：ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）によって誘導されたＨＵＶＥＣの増殖。データは、３回繰り返された測定値の平均±標準偏差として示される。実験は２回繰り返された。
【図４】抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の抗腫瘍効果を示すグラフ（図４Ａ及びＢ）。ＳＣＩＤマウス（５匹）は、ＳＫ−ＢＲ−３  ２×１０６個が０日目に右腹側部の背側に皮下注射され、その後、前記マウスは、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質（４２μｇ）か、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３（３４．９μｇ）か、ヒトエンドスタチン（８μｇ）か、ＰＢＳかが１日おきに静脈注射された（開始５日目が矢印で示された）。腫瘍の成長は測径器で測定された（図４Ａ）。腫瘍容積は、４／３×３．１４×｛（長軸＋短軸）／４｝３として算出された。測定値は、マウス５匹の腫瘍容積（ｍｍ３）の平均±標準誤差を示す。処理グループあたりのマウス生存率（図４Ｂ）。腫瘍容積が２０００ｍｍ３よりも大きなマウスは安楽死させられた。
【図５】同系マウスモデルにおけるアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合−Ｐ１２５Ａタンパク質の抗腫瘍活性を示すグラフ（図５Ａないし図５Ｆ）。ＢＡＬＢ／ｃマウス（グループあたり３−８匹）は、ＥＭＴ６（Ｉ−ＩＩＩ）（図５Ｆ）と、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２（ＩＶ−ＶＩ）（図５Ｅ）とを用いて対側性に皮下注射（マウスあたり細胞１×１０６個）され、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ（４２μｇ）（図５Ｂ）か、ヒトエンドスタチン（８μｇ）（図５Ｄ）か、ＰＢＳ（図５Ｃ）かが６日後から１日おきに等モル注射（１１回）された。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合タンパク質で処理されたマウスの個別の腫瘍測定値が示される（図５Ａ）。１６日目における、標的にされていない腫瘍と、標的にされた腫瘍との腫瘍成長の比較（図５Ｂ）。個別のマウスのＥＭＴ６及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２の腫瘍測定値が１組にされ、示される。薄い赤線は平均測定値を示す。
【図６】腫瘍の血管分布解析を示す写真及びグラフ。ＢＡＬＢ／ｃマウス（グループあたり４匹）は、ＥＭＴ６及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２を用いて対側性に皮下注射（マウスあたり細胞１×１０６個）され、４日後からアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ（４２μｇ）か、ＰＢＳ（図５Ｃ）かが１日おきに等モル注射（処理７回）された。１２日目に、マウス２匹が処理４回後に血管解析のために屠殺された。屠殺された前記マウス由来の腫瘍の組織切片は、ＰＥＣＡＭ（ＩＩ−ＩＶ、ＶＩ−ＶＩＩＩ；緑色）の免疫蛍光染色を用いて解析された。ＤＡＰＩ（Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ；青色）が核の対比染色のために用いられた。ＰＢＳ（Ｉ−ＩＶ）又はアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ（Ｖ−ＶＩＩＩ）で処理されたＥＭＴ６−ＨＥＲ２の腫瘍の典型的な免疫蛍光染色図が示される。拡大率は、５０倍（Ｉ−ＩＩＩ、Ｖ−ＶＩＩ）又は１００倍（ＩＶ、ＶＩＩＩ）である。棒は、Ｉ−ＩＩＩ及びＶ−ＶＩＩでは５００μｍであり、ＩＶ及びＶＩＩＩでは２００μｍである。
【図７】エンドスタチンシグナル伝達網を示す概念図。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
詳細な説明
本発明は、腫瘍を（１）活性剤と、（２）免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、アプタマーの全部又は一部分のような担体ドメインとの両方を含む治療上のキメラ分子の標的にするための方法及び組成物を提供する。前記活性剤は、調節性、例えば、抗血管新生又は細胞溶解性の場合がある。抗体融合タンパク質を用いて抗血管新生タンパク質の標的化は、抗ＨＥＲ２抗体及びエンドスタチンの臨床活性を向上させ、別の抗体の特異性を用いてか、あるいは別の抗血管新生又は細胞溶解性のドメインを用いて別の腫瘍標的に適用される場合がある多用途のアプローチを提供するであろう。
【００９２】
下記の好ましい実施態様は、これらの組成物及び方法の適用を例示する。それにもかかわらず、これらの実施態様の説明から、本発明の別の局面は以下に提供された説明にもとづいて、製造され、及び／又は、実行される場合がある。
【００９３】
従来の生物学的手法を含む方法は本明細書で説明される。かかる手法は当業者に一般的に知られ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１−３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版社、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９と、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、ニューヨーク州、１９９２（定期的に更新される）とのような方法論の専門書で詳細に説明される。免疫学的方法（例えば、抗原−特異的抗体の調製法、免疫沈降法及び免疫ブロット法）は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク州、１９９１と、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍａｓｓｅｙｅｆｆら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク州、１９９２とに説明される。
【００９４】
定義
本発明の公開前に、本明細書で用いられるであろう特定の用語の定義を明らかにし、これらを理解するのに役立つ場合がある。
【００９５】
本明細書で用いられるところの単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、内容が別に明示される場合を除いて複数の指示対象を含む。
【００９６】
本明細書で用いられるところの「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ及びヘテロの免疫グロブリン（モノクローナル抗体が好ましい）のクラスに属する、１本鎖、２本鎖及び多重鎖のタンパク質及び糖タンパク質を指し、それは、これらの免疫グロブリンの合成及び一般的に設計されたバリアントも含む。「抗体断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖの断片と、所望の標的エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）に対する特異性を有する抗体の一部分のいずれかとを含む。
【００９７】
本明細書で用いられるところの「免疫グロブリン」又は「抗体」は互換的に用いられ、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にエンコードされた１個又は２個以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパー、ラムダ、アルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン及びミューの定常領域の遺伝子と、無数の免疫グロブリンの可変領域の遺伝子とを含む。完全長の免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５ＫＤａ又は２１４個のアミノ酸）は、ＮＨ２−末端（約１１０個のアミノ酸）の可変領域の遺伝子と、ＣＯＯＨ−末端のカッパー又はラムダの定常領域の遺伝子とによってエンコードされる。完全長の免疫グロブリンの「重鎖」（約５０ＫＤａ又は４４６個のアミノ酸）は、可変領域の遺伝子（約１１６個のアミノ酸）と、別の前記定常領域の遺伝子１個、例えば、（約３３０個のアミノ酸をエンコードする）ガンマとによって同様にエンコードされる。免疫グロブリン１個の形状は、抗体の基本的な構造単位を構成する。この形状は４量体であり、免疫グロブリン鎖２個の同一の組み合わせからなり、各組み合わせが、軽鎖１個と、重鎖１個とを有する。各組み合わせでは、前記軽鎖及び重鎖の可変領域は、ともに抗原への結合を担い、前記定常領域が抗原のエフェクター機能を担う。さらに、抗体、免疫グロブリンは、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２と、２機能性のハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７，  １０５  （１９８７））とを含むさまざまな別の形状と、１本鎖（例えば、引用により本明細書に取り込まれる、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５、５８７９−５８８３（１９８８）及びＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３−４２６（１９８８））とで存在する場合がある。（引用により本明細書に取り込まれる、Ｈｏｏｄら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、ニューヨーク州、第２版（１９８４）と、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ及びＨｏｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２３、１５−１６（１９８６）とを一般的に参照せよ）。前記抗体は、ヒトか、ヒト化されたものか、あるいは所望の種のいずれかに由来する場合がある。
【００９８】
本明細書で用いられるところの「ヒト化抗体」は、親抗体の抗原結合の性質を保持するか、あるいは実質的に保持するが、ヒトで免疫原性のない、非ヒト抗体、典型的にマウスに由来する抗体を指す。これは、（ａ）ヒトネットワークに非ヒトＣＤＲｓのみと、重大なネットワーク残基を保持するか、あるいは保持しない定常領域とを移植すること、又は、（ｂ）全部の非ヒト可変ドメインを移植することを含むが、表面残基の置換によってそれらをヒト様の部分で「覆い隠すこと」は含まない、さまざまな方法によって達成される場合がある。本発明を実行するのに役立つようなかかる方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１（３）：１６９−２１７（１９９４）で開示された方法を含む。
【００９９】
本明細書で用いられるところの「キメラ分子」は、例えば、アプタマー、抗体の配列のような標的化配列と、該標的化配列、例えば、抗体の断片に遺伝的に融合される治療上のエフェクター分子、例えば、エンドスタチン及びこの変異体とを含む。例えば、キメラ分子は、ＣＨ３末端で抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３重鎖に遺伝的に融合され、かつ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＫ軽鎖とともに発現されるエンドスタチンを含む。
【０１００】
本明細書で用いられるところの「バリアント」とは、技術用語として了解されている意味に加えて、その野生型からの分子のいかなる変化をも含む。例えば、アレル、断片、変異体、天然又は類似体の化合物での置換、スプラスバリアント、グリコシル化、種のバリアント等である。前記用語は、野生型又は「正常な」分子からの変化又は逸脱のうち、いずれか１つのタイプに限られない。
【０１０１】
抗体又はアプタマーへの「特異的な（又は選択的な）結合」か、「特異的な（又は選択的な）免疫反応」かという文言は、タンパク質の不均一な集団その他の生物でタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、特異的な抗体は、指定されたイムノアッセイ条件下において試料中に別のタンパク質が存在するために十分な量を実質的に結合しないバックグランドで特定のタンパク質に少なくとも２倍結合する。かかる条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質のためにその特異性が選択される抗体を必要とする場合がある。例えば、ラット、マウス又はヒトのような特定種からマーカー「Ｘ」を生じさせるポリクローナル抗体は、マーカー「Ｘ」の多型バリアント及びアレルを除外して、別のタンパク質には特異的な免疫反応をしないが、マーカー「Ｘ」と特異的な免疫反応をする前記ポリクローナル抗体のみを得るために選択される場合がある。この選択は、別の種からマーカー「Ｘ」分子との交差反応をする抗体を除外することによって達成される場合がある。さまざまなイムノアッセイフォーマットは、特定のタンパク質との特異的な免疫反応をする抗体を選択するために用いられる場合がある。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質との特異的な免疫反応をする抗体を選択するために日常的に用いられる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８）、ｆｏｒ  ａ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒｍａｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ（特異的な免疫反応性を決定するために用いられる場合があるイムノアッセイのフォーマット及び条件の説明用）を参照せよ。）。特異的又は選択的な反応は、バックグラウンドのシグナル又はノイズの少なくとも２倍であることが典型的であり、バックグラウンドよりも１０ないし１００倍以上であることがより典型的である。
【０１０２】
本明細書で用いられるところの「薬学的に許容できる」成分は、妥当な利益／リスク割合に相応の（毒性、刺激作用及びアレルギー応答のような）不適切で有害な副作用なしにヒト及び／又は動物で使用するのに適切なものである。
【０１０３】
本明細書で用いられるところの「安全かつ有効な量」又は「治療量」という用語は、本発明のやり方で用いられた際に、妥当な利益／リスク割合に相応の（毒性、刺激作用又はアレルギー応答のような）不適切で有害な副作用なしに所望の治療応答を生じさせるのに十分な成分量を指す。「治療上の有効量」は、所望の治療応答を生じさせるのに有効な本発明の化合物量を意味する。例えば、肉腫又はリンパ腫のいずれかの癌の成長又は発生を遅延させるか、あるいは前記癌の収縮又は転移を妨げるための有効量である。特定の安全かつ有効な量か、治療上の有効量かは、治療されている特定の条件と、患者の身体の状態と、治療されている哺乳類又は動物のタイプと、治療の持続期間と、（存在する場合には）同時療法の性質と、供された特定の剤形かつ化合物又はその誘導体の構造とのようなかかる因子で変わるであろう。
【０１０４】
本明細書で用いられるところの「癌」は、白血病、リンパ腫、黒色腫、カルシノーマ及び肉腫を含むが、これらに限られない、癌又は新生物、哺乳類で発見された良性又は悪性の腫瘍の全てのタイプを指す。癌の例は、脳と、胸部と、膵臓と、子宮頸部と、大腸と、頭部及び首部と、腎臓と、肺と、非小細胞肺と、黒色腫と、中皮腫と、卵巣と、肉腫と、胃と、前立腺と、精巣と、子宮と、髄芽腫との癌である。
【０１０５】
本発明によるキメラ融合分子で治療される場合があるその他の癌は、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、本態性血小板増多症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、大腸癌、悪性膵臓性インスラノーマ（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性皮膚病変（ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｓｋｉｎ  ｌｅｓｉｏｎｓ）、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、性泌尿器管癌（ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｎｃｅｒ）、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌及び前立腺癌を含む。
【０１０６】
「退縮」は、標準的な手法を用いて測定された際の腫瘍の質量及びサイズの減少を指す。
【０１０７】
「診断の」又は「診断した」は、病状の存在又は性質を同定することを意味する。診断方法は、感度及び特異度に違いがある。診断アッセイの前記「感度」は、テスト結果が陽性の病人の百分率である（「真の陽性」の百分率）。前記アッセイによって検出されない病人は「偽陰性」である。前記アッセイで、病気ではなく、かつ、テスト結果が陰性である被験者は「真の陰性」と称される。診断アッセイの前記「特異度」は、１から偽陽性度を減算した差であり、前記「偽陽性」度は、テスト結果が陽性であるが、その症状を有しない被験者の割合として定義される。特別な診断方法が症状の決定的な診断を提供しない場合があるが、前記方法は診断の目的とする陽性指標を提供すれば十分である。
【０１０８】
「患者」又は「個人」という用語は本明細書で互換的に用いられ、治療される哺乳類の被験体を指し、ヒトの患者となることが好ましい。ある場合には、本発明の方法は、マウス、ラット及びハムスターを含むげっ歯類と、霊長類とを含むが、これらに限られない実験動物と、獣医学の用途と、疾患の動物モデルの開発とでの使用がある。
【０１０９】
「処置」は、疾患の発生を妨げるか、あるいは疾患の症状又は徴候を変更する意図で実施された介入である。したがって、「処置」は、治療上の治療と、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段との両方を指す。処置を必要とするものは、前記疾患を既に罹患しているものと、前記疾患が予防されるべきものとを含む。腫瘍（例えば、癌）の治療では、治療薬が腫瘍細胞の症状を直接的に減少するか、あるいは別の治療薬、例えば、放射線及び／又は化学療法によって、前記腫瘍細胞をより治療しやすくする場合がある。本明細書で用いられるところの「改善した」又は「処置」は、ある徴候が（例えば、健康な患者又は個人で得られた値）正常値に近付くことを指し、前記徴候は、例えば、日常的な統計試験を用いて決定された際に、正常値との相違が５０％未満であり、好ましくは正常値との相違が約２５％未満であり、より好ましくは正常値との相違が１０％未満であり、さらにより好ましくは正常値と有意な差がない。
【０１１０】
「癌又は腫瘍細胞の処置」は、以下の効果、（１）（ｉ）増殖速度の低下、（ｉｉ）血管新生の阻害及び（ｉｉ）完全な増殖停止を含む腫瘍の成長のある程度の阻害、（２）腫瘍の細胞数の減少、（３）腫瘍のサイズの現状維持、（４）腫瘍のサイズの低下、（５）末梢器官への腫瘍細胞の浸潤の（ｉ）低下、（ｉｉ）速度の低下又は（ｉｉ）完全な予防を含む阻害、（６）転移の（ｉ）低下、（ｉｉ）速度の低下又は（ｉｉ）完全な予防を含む阻害、（７）（ｉ）腫瘍のサイズの現状維持、（ｉｉ）腫瘍のサイズの減少、（ｉｉｉ）腫瘍の成長速度の低下、（ｉｖ）浸潤の減少、速度低下又は予防をもたらす場合がある抗腫瘍免疫応答の増大、及び／又は、（８）疾患に関係する１種類又は２種類以上の徴候の重症度又は数のある程度の軽減のうち１種類又は２種類以上をもたらすことができる明細書と、以下の実施例とを通して説明されたキメラ融合分子の量を指す。
【０１１１】
本明細書で用いられるところの「メトロノーム」療法は、本明細書で説明される治療薬及び／又はキメラ融合分子の低投与量の連続投与を指す。
【０１１２】
融合分子
一般的に、本発明は抗原−結合融合タンパク質を提供し、治療上の有効なドメインが、抗体単独か、調節性／細胞溶解性の原子団単独のいずれかの血清半減期（ｔ１／２）を越える有意な血清半減期を有する調節性又は細胞溶解性の原子団の場合がある。調節性及び細胞溶解性の抗原−結合融合タンパク質は、抗原−結合部位の活性又は機能をより多く有する。融合抗原−結合タンパク質の調節性又は細胞溶解性の原子団は、融合パートナー又はパートナーの調節性又は細胞溶解性の性質のうち一部分又は全部を前記タンパク質に加えるであろう。
【０１１３】
したがって、本発明は、調節性及び／又は細胞溶解性の１価又は多価の治療上の活性ドメインと、抗原−結合ドメインとを含むキメラ融合分子と、１本鎖かつ多価の調節性及び細胞溶解性の抗原−結合融合タンパク質の組成物と、１本鎖かつ多価の調節性及び細胞溶解性の抗原−結合融合タンパク質の製造及び精製の方法と、１本鎖かつ多価の調節性及び細胞溶解性の抗原−結合融合タンパク質の使用とに関する。本発明は、少なくとも１個の１本鎖抗原−結合融合タンパク質分子を有する調節性又は細胞溶解性の抗原−結合融合タンパク質を提供する。１本鎖抗原−結合融合タンパク質分子のそれぞれは、第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドとを有し、リンカーによって連結される場合がある。前記ポリペプチドのそれぞれは、抗体の重鎖又は軽鎖可変領域その他のアプタマーのような抗原特異的原子団の結合部分を有する。別の結合原子団は、インテグリンモチーフ及びＮＧＲモチーフを含む。図１Ａは、前記キメラ分子のある実施態様を示すように限定又は解釈されることを意図しない概念図である。
【０１１４】
好ましい実施態様では、例えば、抗体の抗原特異的結合ドメインのような標的化原子団に融合された治療上の有効な抗腫瘍分子を含む組成物が提供される。例として、前記組成物は、例えば、ヒト化又はヒトの抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３抗体の３’末端に融合されるエンドスタチン及び／又はこれらの変異体の抗腫瘍抗体特異的なＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原を含む。
【０１１５】
好ましい実施態様では、前記エンドスタチン分子は、プロリンがアラニンに置換される１２５番目のアミノ酸の突然変異を含む。ヒトエンドスタチンの１２５番目の部位への点突然変異の導入（プロリンからアラニンへ；ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ）は、野生型エンドスタチン分子と比較して、内皮細胞への結合、抗血管新生活性及び抗腫瘍活性を増大する。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合バリアントの変異体は、αＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏよりもより効果的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＵＶＥＣの管形成と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍の成長とを阻害した。
【０１１６】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチン分子及びこの変異体は、１個又は２個以上のＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）を含む。ヒトエンドスタチンは、１２５番目のプロリンの後の１２６−１２８番目の部位にＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）を含む。好ましい実施態様では、前記エンドスタチン分子は、アミノ（ＮＨ２−）末端及び／又はカルボキシル（ＣＯＯＨ−）末端に１個又は２個以上のＮＧＲモチーフ、及び／又は、１２６−１２８番目の前記ＮＧＲモチーフの後か、１２５番目のプロリン又はアラニンの前かにＮＧＲ分子の繰り返し鎖を含む。
【０１１７】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチンは、１２５番目のアミノ酸部位のプロリン又はアラニンの前又は後にＲＧＤモチーフを含む。
【０１１８】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチン分子は、該エンドスタチン分子の６−４９、５０−９２、９３−１３３及び１３４−１７８番目の部位にアミノ酸置換を有するエンドスタチン変異体を含む。前記アミノ酸は、天然、非天然、バリアント、アナログ、置換された分子のいずれかを含む。前記分子は、ＮＧＲ、ＲＧＤ等を含むインテグリン又はインテグリン様のモチーフを含む１種類又は２種類以上の置換をさらに含む。これらのモチーフは、エンドスタチンの６−４９、５０−９２、９３−１３３及び１３４−１７８番目の１箇所又は２箇所以上のアミノ酸部位の場合がある。したがって、当業者は、キメラ融合分子がエンドスタチンの多量体を含む場合があり、これらの分子が、同一のエンドスタチン分子の組み合わせの場合か、あるいはエンドスタチン分子と、アミノ酸置換を有する分子と、前記エンドスタチン分子中にアミノ酸置換と、インテグリン及びインテグリン様のモチーフとを有する分子との組み合わせを含む場合があると理解するであろう。
【０１１９】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ分子は、ＮＧＲモチーフに加えてか、あるいはＮＧＲモチーフの代わりに、インテグリンモチーフ、例えば、ＲＧＤを含む。
【０１２０】
前記キメラ融合分子が核酸分子からエンコードされるため、前記キメラ融合分子は一般的に融合される場合があり、例えば、前記分子はフレーム中に操作可能に連結される。前記分子は、以下の実施例で詳細に説明されるように、アミノ酸レベルで融合される場合がある。
【０１２１】
別の好ましい実施態様では、前記分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記融合分子を検出し、かつ、治療中にキメラ分子の効果を監視するための標識を含む。
【０１２２】
「検出可能な原子団」又は「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫科学的又は化学的な方法によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識は、３２Ｐか、３５Ｓか、蛍光色素か、高電子密度試薬か、（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に用いられるような）酵素か、ビオチン−ストレプトアビジンか、ジゴキシゲニンか、抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質か、標識に相補的な配列を有する核酸分子かを含む。前記検出可能な原子団は、試料中で結合した検出可能な原子団の量を定量するために用いることができる放射性、発色性又は蛍光性のシグナルのような測定可能なシグナルをしばしば生成する。前記シグナルの定量は、例えば、シンチレーション測定、濃度測定又はフローサイトメトリーによって達成される。
【０１２３】
好ましい実施態様では、前記キメラ融合分子は、抗ＨＥＲ２抗体−ヒトエンドスタチンＰ１２５Ａ分子、これらのバリアント、変異体、アレル、置換体、断片及び類似体をエンコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合分子は、ヒトエンドスタチンＰ１２５Ａに融合された抗ＨＥＲ２特異的抗体を含むポリペプチドを含む。前記エンドスタチンは単量体の場合があるが、例えば、エンドスタチンの２量体及び３量体と、これらの変異体とのような多量体が好ましい。
【０１２５】
別の好ましい実施態様では、前記多量体は、エンドスタチン分子と、エンドスタチンの変異体型、例えば、Ｐ１２５Ａエンドスタチンと、これらの組み合わせとを含む。したがって、前記多量体が３量体である場合には、その際、前記分子は、野生型エンドスタチン分子及びエンドスタチンの変異体２個か、野生型エンドスタチン分子２個及びエンドスタチン分子の変異体１個か、野生型エンドスタチン分子３個か、エンドスタチン分子の変異体３個かを含む場合がある。
【０１２６】
別の好ましい実施態様では、前記２量体は、エンドスタチンの変異体、例えば、Ｐ１２５Ａエンドスタチンと、正常又は野生型のエンドスタチンとか、これらの組み合わせ、これらのバリアント、変異体、アレル、置換体、断片及び類似体かを含む。
【０１２７】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチンは、ヒトエンドスタチン、このバリアント及びアレルである。しかし、エンドスタチンはいずれかの種から得られる場合がある。
【０１２８】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチン分子は、エンドスタチン変異体、例えば、Ｐ１２５Ａエンドスタチンをエンコードする１個又は２個以上のヌクレオチドに突然変異を有するポリヌクレオチドを含む。
【０１２９】
全ての実施態様では、前記分子は、いずれかの立体異性体、例えば、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体等の場合がある。全ての実施態様では、前記融合分子又はこの一部分は、これらの全てのバリアント、変異体、アレル、置換体、断片及び類似体を含む。
【０１３０】
別の好ましい実施態様では、前記エンドスタチンは、１２５番目の部位に１個又は２個以上のアミノ酸置換を含む。ある実施態様では、プロリンからアラニンへの置換が好ましい。しかし、別のアミノ酸置換は、例えば、共通のアミノ酸２０種類のうちいずれかを、トリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシンのような遺伝的にエンコードされたアミノ酸にする場合がある。別のアミノ酸は、例えば、荷電性極性側鎖（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ等）、非荷電性極性側鎖（Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等）として分類されたアミノ酸を含む。
【０１３１】
別の好ましい実施態様では、前記アミノ酸突然変異は、４−４９、５０−９２、９３−１３３及び１３４−１７８番目に１個又は２個以上のいずれかのアミノ酸部位に生じる場合がある。前記突然変異は、９３−１３３番目の部位のアミノ酸をエンコードする１個又は２個以上の核酸、及び／又は、９３−１３３番目のアミノ酸部位でのアミノ酸レベルであることが好ましい。
【０１３２】
前記突然変異は、核酸レベル又はアミノ酸レベルで導入される場合がある。特定の核酸配列に関して、遺伝暗号の縮重のために、機能的に同一の核酸の多くは特定のタンパク質のいずれかをエンコードする。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵの全てのコドンは、アミノ酸のアラニンをエンコードする。したがって、コドンによって特定されるアラニンの全ての部位で、前記コドンが、エンコードされたポリペプチドを変更することなく、説明された対応するコドンのいずれかに変更される場合がある。かかる核酸の変化は、保存的に改変された変化の１種である「サイレント変化」である。核酸レベルの突然変異が特定のアミノ酸をエンコードするために導入される場合には、その後、１個又は２個以上の核酸は変化される。例えば、プロリンは、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ、ＣＣＵによってコンコードされ、したがって、例えば、ＣＣＣ（プロリン）からＧＣＣへの１塩基の変化は、アラニンを生じさせる。したがって、例として、天然又は非天然のポリペプチドをエンコードする本明細書の天然又は非天然の核酸配列の全ては、天然又は非天然の核酸の候補のサイレント変化全てを説明する。当業者は、（通常、メチオチンの唯一のコドンであるＡＵＧと、通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧとを除いて）天然又は非天然の核酸の各コドンは、機能的に同一の分子か、異なる分子かを生成するために改変される場合があると認識するであろう。したがって、天然及び非天然のポリペプチドをエンコードする天然及び非天然の核酸の各サイレント変化は、説明された配列それぞれに暗示される。
【０１３３】
核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の配列への個別の置換、欠失又は付加が、エンコードされた配列の天然及び非天然のアミノ酸１個か、あるいは天然及び非天然のアミノ酸を低い百分率で変更、付加又は欠失し、前記変化は、アミノ酸の欠失か、アミノ酸の付加か、化学的に類似のアミノ酸での天然及び非天然のアミノ酸の置換かを生じさせる。機能的に類似の天然アミノ酸を提供する保存的な置換表は、当業者に周知である。かかる保存的に改変されたバリアントは、本明細書で説明された方法及び組成物の多型バリアント、種間類似体及びアレルに追加され、これらを除外しない。
【０１３４】
別の好ましい実施態様では、エンドスタチン変異体は、１種類又は２種類以上の非天然又は類似体のアミノ酸を含む。
【０１３５】
「非天然のアミノ酸」とは、２０種類の共通のアミノ酸のうちの１個か、ポリリジンか、セレノシステインかではないアミノ酸を指す。「非天然のアミノ酸」という用語と同義的に用いられる場合がある別の用語は、「非天然的にエンコードされたアミノ酸」と、「非天然のアミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）」と、「非天然的に生じるアミノ酸」と、これらのさまざまなハイフンで結ばれた説明及びハイフンで結ばれていない説明とである。「非天然のアミノ酸」という用語は、（前記２０種類の共通アミノ酸か、ピロリジン及びセレノシステインかを含むが、これらに限られない）天然にエンコードされたアミノ酸の改変によって天然に生じるアミノ酸に限られず、使用者の操作なしに、伸長中のポリペプチド鎖に翻訳複合体によって取り込まれないアミノ酸も含む。天然にエンコードされない「天然に生じるアミノ酸」の例は、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリンと、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニンと、Ｏ−ホスホチロシンとを含むが、これらに限られない。さらに、「非天然のアミノ酸」という用語は、天然に生じず、かつ、合成的に得られる場合があるか、あるいは非天然のアミノ酸の改変によって得られる場合があるアミノ酸を含むが、これらに限られない。
【０１３６】
ある場合には、前記非天然アミノ酸の置換又は取込は、別の化学的、物理学的、薬理学的及び／又は生物学的な特徴に影響を及ぼすポリペプチド中の別の付加、置換又は欠失と組み合わせられるであろう。ある場合には、前記別の付加、置換又は欠失は、前記ポリペプチドの（タンパク質分解に対する耐性を含むが、これらに限られない）安定性を増大するか、あるいはその適切な受容体、リガンド及び／又は結合タンパク質に関する前記ポリペプチドの親和性を増大する場合がある。ある場合には、前記別の付加、置換又は欠失は、前記ポリペプチドの可溶性を増大する場合がある。ある実施態様では、部位は、天然にエンコードされたか、あるいは非天然のアミノ酸との置換に加えて、組換え宿主細胞中で発現する前記ポリペプチドの安定性を増大する目的で非天然のアミノ酸の取り込むための別の部位のために選択される場合がある。ある実施態様では、前記ポリペプチドは、関連リガンド、結合タンパク質及び／又は受容体に関する親和性を変調するか、受容体の２量体化を（増加又は低下を含むが、これらに限られない）変調するか、受容体の２量体を安定にするか、循環半減期を変調するか、放出又は生物学的利用能を変調するか、精製を促進するか、特定の投与経路を改善又は変更するかの別の付加、置換又は欠失を含む。同様に、前記非天然のアミノ酸のポリペプチドは、化学的又は酵素の開裂配列か、プロテアーゼ開裂配列か、官能基か、（ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓを含むが、これらに限られない）抗体−結合ドメインその他の（ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ又はＧＳＴ等を含むが、これらに限られない）配列を利用した親和性か、（ＧＦＰを含むが、これらに限られない）同定、精製、組織又は細胞膜を介する輸送、プロドラッグの放出又は活性化、サイズの縮小その他の前記ポリペプチドの特徴を向上する（ビオチンを含むが、これらに限られない）結合された分子かを含む場合がある。
【０１３７】
本明細書で説明された方法及び組成物は、ポリペプチドに１種類又は２種類以上の非天然のアミノ酸を取り込むことを含む。１種類又は２種類以上の非天然のアミノ酸は、前記ポリペプチドの活性を消出しない１箇所又は２箇所以上の特定の部位に取り込まれる場合がある。これは、非天然又は天然の疎水性のアミノ酸で疎水性のアミノ酸を置換すること、非天然又は天然の大きなアミノ酸で大きなアミノ酸を置換すること、非天然又は天然の親水性アミノ酸で親水性アミノ酸を置換すること、及び／又は、活性に必要とされない部位に非天然のアミノ酸を挿入することを含むが、これらに限られない「保存的な」置換を作成することによって達成される場合がある。
【０１３８】
さまざまな生化学的及び構造的なアプローチは、前記ポリペプチドの非天然アミノ酸での置換のための所望の部位を選択するために供される場合がある。前記ポリペプチド鎖のいずれかの部位が非天然アミノ酸を取り込むための選択に適していおり、選択は、合理的な計画か、いずれかの特定の所望の目的のためか、あるいは特定の所望の目的が全くないランダム選択かを利用する場合がある。所望の部位の選択は、（さらに改変されるか、あるいは改変されずに維持される場合がある）非天然アミノ酸のポリペプチドの生成に利用される場合があり、該ポリペプチドが、作動薬か、スーパー作動薬（ｓｕｐｅｒ−ａｇｏｎｉｓｔｓ）か、部分作動薬か、逆作動薬か、拮抗薬か、受容体結合変調因子か、受容体活性変調因子か、結合パートナーに結合する変調因子か、結合パートナー活性変調因子か、結合パートナー構造変調因子か、２量体又は多量体の形成か、天然の分子と比較して活性又は性質に変化が全くないか、可溶性、凝集又は安定性のような前記ポリペプチドの物理学的又は化学的な性質のいずれかの操作かを含むが、これらに限られない所望の性質又は活性のいずれかを有する。例えば、ポリペプチドの生物学的活性に必要とされた前記ポリペプチドの部位は、点突然変異解析、アラニンスキャニング又は類似体スキャニングの方法を含むが、これらに限られない方法を用いて同定される場合がある。アラニン又は類似体のスキャニングミュータジェネシスを含むが、これらに限られない方法によって生物学的活性に重要であるとして同定された残基以外の残基は、前記ポリペプチドについて探索された所望の活性に依存する非天然アミノ酸での置換のための優れた候補である場合がある。代替的に、生物学的活性に重要だとして同定された前記部位は、前記ポリペプチドについて探索された所望の活性に再び依存する非天然アミノ酸での置換のための優れた候補である場合もある。別の代替方法は前記ポリペプチド鎖の各部位で非天然アミノ酸での連続的な置換を作成し、前記ポリペプチドの活性への影響を観察するであろう。いずれかのポリペプチドに非天然アミノ酸での置換のための部位を選択する手段、手法又は方法のいずれかは、本明細書で説明された方法、手法及び組成物の使用に適している。
【０１３９】
欠失を含むポリペプチドの天然の変異体の構造及び活性は、非天然アミノ酸での置換に寛容なタンパク質の領域を決定するために調べられる場合がある。非天然アミノ酸での置換に不寛容な残基が一度調べられた際には、残りの部位それぞれにおける目的とした置換の影響は、関連ポリペプチドと、関係するリガンド又は結合タンパク質のいずれかとの３次元構造を含むが、これらに限られない方法を用いて調べられる場合がある。多くのポリペプチドのＸ線結晶学的構造及びＮＭＲ構造は、プロテイン・データ・バンク（ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）、タンパク質及び核酸の巨大分子の３次元構造データを含む集中化データベースで利用可能であり、１個が非天然アミノ酸で置換される場合があるアミノ酸の部位を同定するのに用いられる場合がある。さらに、３次元構造のデータが利用できない場合には、モデルが、ポリペプチドの２次及び３次の構造を調査するのに作成される場合がある。したがって、非天然アミノ酸で置換される場合があるアミノ酸部位の同定は、容易に行なわれる場合がある。非天然アミノ酸の模範的な取込部位は、候補の受容体結合領域か、結合タンパク質又はリガンドに結合するための領域かから場外される部位を含むが、これらに限られず、該部分は、完全又は部分的に溶媒に曝露される場合があり、近傍の残基との水素結合相互作用が最小限であるか、あるいは全くない場合があり、近傍の反応性残基に最小限に曝露される場合があり、及び／又は、関係する受容体、リガンド又は結合タンパク質を用いて特定のポリペプチドの３次元結晶構造によって予測されたような高可動性の領域の場合がある。
【０１４０】
広範な非天然アミノ酸は、ポリペプチドの特定の部位で置換されるか、あるいは取り込まれる場合がある。例として、特定の非天然アミノ酸は、それに関連のあるリガンド、受容体及び／又は結合タンパク質を用いるポリペプチドの３次元結晶構造の試験と、保存的な置換の優先度とを利用する取込のために選択される場合がある。
【０１４１】
別の治療上のエフェクタードメイン
別の好ましい実施態様では、変調性ドメインは、エンドスタチン、アンジオゲニン、アンジオスタチン、ケモカイン、アンジオアレスチン、アンジオスタチン（プラスミノゲン断片）、抗血管新生因子由来の基底膜コラーゲン（タムスタチン、カンスタチン又はアレスチン）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、シグナル伝達阻害剤、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体断片、フィブロネクチン断片、ｇｒｏ−ベータ、へパリナーゼ、ヘパリン六糖類断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロン・アルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノゲン断片）、メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノゲン活性化因子阻害剤、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、さまざまなレチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）等を含む。これらの分子は、全て形状、これらのバリアント、変異体、アレル、置換体、断片及び類似体を含む。
【０１４２】
別の好ましい実施態様では、キメラ融合分子の変調性ドメインは、エンドスタチン、アンジオスタチン、タムスタチン、アレスチン及びカンスタチンと、これらのバリアント、変異体、アレル、置換体、断片及び類似体とを含む。
【０１４３】
別の好ましい実施態様では、前記分子は、エンドスタチン、アンジオスタチン、タムスタチン、アレスチン及びカンスタチンと、これらのバリアント、変異体、アレル、置換体、断片及び類似体とのうち１種類又は２種類以上の組み合わせを含む。
【０１４４】
別の好ましい実施態様では、標的化ドメインは、抗体、アプタマー、受容体に対するリガンド（例えば、ＶＥＧＦ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ペプチド、リポ多糖類、インテグリン等を含む。
【０１４５】
抗原結合ドメインの別の特異性
別の好ましい実施態様では、キメラ融合分子は別の腫瘍抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む。前記結合ドメインは、抗体又はアプタマー、受容体、リガンド等の場合がある。
【０１４６】
別の好ましい実施態様では、本発明は、Ｆｃ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）及びＦｖ断片と、所望の標的エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）に対する特異性を有する抗体の一部分のいずれかとを含む抗体融合分子を提供する。好ましいものは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、二重特異性及びヘテロの免疫グロブリン（モノクローナル抗体が好ましい）に属している、抗体又は抗体断片か、１本鎖、２本鎖及び多重鎖のタンパク質及び糖タンパク質かであり、好ましいものは、これらの免疫グロブリンの合成的かつ遺伝的に設計されたバリアントも含む。
【０１４７】
別の好ましい実施態様では、前記抗原結合ドメインはアプタマーである。好ましい実施態様では、前記キメラ分子は、エンドスタチン分子、このバリアント、変異体及び断片に融合されたアプタマーを含む。前記アプタマーは、１種類又は２種類以上の腫瘍抗原のいずれかに特異的な場合がある。
【０１４８】
本明細書で用いられるところの「アプタマー」又は「選択された核酸結合種」という用語は、特異的かつ高親和性で標的分子に結合するために設計される核酸配列、ＤＮＡ又はＲＮＡの短鎖を指す。前記核酸配列は、改変されていないか、あるいは化学的に改変されたＲＮＡ又はＤＮＡを含む。選択方法は親和性クロマトグラフィーによるが、これらに限られない場合があり、増幅方法は、逆転写（ＲＴ）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＳＥＬＥＸアプタマー法を用いる反復性の繰り返し等の場合がある。
【０１４９】
多くの腫瘍抗原は当業者に周知である。例えば、全体として引用により本明細書に取り込まれる、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  ＢＪら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７；  ９：  ６８４−９３と、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ＡＮら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；  １３：  １３４−１４０と、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２００２；  １８８：  ５１−６４とを参照せよ。代替的に、腫瘍抗原に対する多くの抗体は商業的に入手可能である。
【０１５０】
別の好ましい実施態様では、前記腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、Ｍｕｃ−１、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＴＡＡ、ＧＤＲ抗原、ＶＥＧＦＲ等を含む。
【０１５１】
腫瘍抗原の別の非限定的な例は、アルファ−アクチニン−４（肺癌）、ＣＡＳＰ−８（頭部及び首部の有棘細胞癌）、ベータ−カテニン（黒色腫）、Ｃｄｃ２７（黒色腫）、ＣＤＫ４（黒色腫）、伸長因子２（肺有棘細胞癌）、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質（黒色腫）、ＨＬＡ−Ａ２ｄの過剰発現（腎臓細胞癌）、ｈｓｐ７０−２（腎臓細胞癌）、ＫＩＡＡＯ２０５（膀胱腫瘍）、ＭＡＲＴ２（黒色腫）、ＭＵＭ−１ｆ（黒色腫）、ＭＵＭ−２（黒色腫）、ＭＵＭ−３（黒色腫）、ｎｅｏ−ＰＡＰ（黒色腫）、ミオシンクラスＩ（黒色腫）、ＯＳ−９ｇ（黒色腫）、ＰＴＰＲＫ（黒色腫）のような突然変異を生じる腫瘍抗原を含む。分化腫瘍抗原の例は、ＣＥＡ（腸管癌）、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７（黒色腫）、カリクレイン４（前立腺）、マンマグロビン−Ａ（乳癌）、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１（黒色腫）、ＰＳＡ（前立腺癌）、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５（黒色腫）、ＴＲＰ−２（黒色腫）、チロシナーゼ（黒色腫）を含むが、これらに限られない。過剰又は低発現の腫瘍抗原は、ＣＰＳＦ（遍在性）、ＥｐｈＡ３、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ（胃、肝臓、膵臓）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、消化器系カルボキシルエステラーゼ（肝臓、腸管、腎臓）、アルファ−フェトプロテイン（肝臓）、Ｍ−ＣＳＦ（肝臓、腎臓）、ＭＵＣ１（腺上皮）、ｐ５３（遍在性）、ＰＲＡＭＥ（精巣、卵巣、子宮内膜、副腎）、ＰＳＭＡ（前立腺、ＣＮＳ、肝臓）、ＲＡＧＥ−１（網膜）、ＲＵ２ＡＳ（精巣、腎臓、膀胱）、サバイビン（遍在性）、テロメラーゼ（精巣、胸腺、骨髄、リンパ節）、ＷＴ１（精巣、卵巣、骨髄、脾臓）、ＣＡ１２５（卵巣）を含むが、これらに限られない。腫瘍の細胞膜で優先的に発現される抗原は標的として好ましい。
【０１５２】
別の好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも２つの結合原子団が同一の標的上の異なる結合部位に対して特異性を有する複数の結合原子団を有する化合物を特徴とする。好ましい実施態様では、複数の結合原子団はポリペプチドを含む。別の好ましい実施態様では、標的化原子団は、所望の標的上の異なる部位に結合する全ての結合ポリペプチドである。ある好ましい実施態様では、前記標的は、タンパク質か、受容体か、受容体／リガンド複合体かであり、前記結合ポリペプチドは、前記タンパク質か、前記受容体か、前記受容体／リガンド複合体かの異なるエピトープに結合する。
【０１５３】
別の好ましい実施態様では、前記標的は、血管新生、過剰増殖の疾患又は創傷治癒に関係する受容体である。別の実施態様では、前記標的は、例えば、タンパク質−チロシンキナーゼ受容体のような受容体のファミリーを含む。特に好ましい実施態様では、前記標的は、Ｆｌｔ−１及びＫＤＲ、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−１、−２又は−３）か、該ＫＤＲ／ＶＥＧＦ及びＦｌｔ−１／ＶＥＧＦの複合体かであり、結合原子団、特に結合ペプチドは、Ｆｌｔ−１及びＫＤＲか、該ＫＤＲ／ＶＥＧＦ及びＦｌｔ−１／ＶＥＧＦの複合体かの異なるエピトープに結合する。例えば、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１及びＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ−４である。
【０１５４】
固形腫瘍治療に関して、本発明は、外科手術、放射線療法、化学療法等のような古典的アプローチとの組み合わせで用いられる場合がある。したがって、本発明は、治療用組成物が、外科手術又は放射線治療の前又は後に同時に用いられるか、あるいは従来の化学療法剤、放射線療法剤その他の抗血管新生剤か、標的にされた免疫毒素又はコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）かの前又は後に患者に投与される併用療法を提供する。
【０１５５】
別の好ましい実施態様では、キメラ分子は、１種類又は２種類以上の細胞溶解性その他のエフェクター分子を含む。抗体又はこれらの断片に融合するために用いられる場合がある細胞溶解性分子は、ＴＮＦ−アルファと、ＴＮＦ−ベータと、リシン、アブリン、ジフテリア、ゲノニン、シュードモナス・エンドトキシンＡ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ）、クロタルス・ドゥリッセウス・テリフィカス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ）の毒素、クロタルス・アドメンテウス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｄａｍｅｎｔｅｕｓ）の毒素、ナジャ・ナジャ（Ｎａｊａ  ｎａｊａ）の毒素及びナジャ・モカムビク（Ｎａｊａ  ｍｏｃａｍｂｉｑｕｅ）の毒素のようなペプチド毒素をエンコードするもののような適切なエフェクター遺伝子とを含むが、これらに限られない。（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｈｕｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １５：４４３，  １９９６と、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ４２：１１５，  １９９６と、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３４：２５９，  １９９８と、Ｍａｕｃｅｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：４３１１；  １９９６とを参照せよ。）。
【０１５６】
ＩＣＥ−ファミリーのシステインプロテアーゼ、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質、Ｂａｘ、ＢｃｌＸｓ及びカスパーゼのようなアポトーシスを誘導又は仲介する遺伝子も適切である（Ｆａｖｒｏｔら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：７２８，  １９９８と、ＭｃＧｉｌｌら、Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２：Ｄ３５３，  １９９７と、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、Ｓｅｍｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  ６：５３，  １９９５とを参照せよ。）。別の潜在的な抗腫瘍剤は、アポプチン（ａｐｏｐｔｉｎ）と、低分子薬剤の化学療法ができないときでさえ、アポトーシスを誘導するタンパク質とである（Ｐｉｅｔｅｒｓｅｎら、Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ４６５：１５３，  ２０００）。Ｋｏｇａらは、アポトーシス遺伝子Ｃａｓｐａｓｅ−８に結合したｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモーターを用いるテロメラーゼ−特異的遺伝子療法（ＦＬＩＣＥ）を提案する（Ｈｕ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１：  １３９７，  ２０００）。
【０１５７】
細胞傷害性Ｔリンパ球又はＬＡＫ細胞がこれらの標的に送達する可溶性パッケージ中に存在する酵素も興味深い。パーフォリン、膜孔形成タンパク質と、Ｆａｓリガンドとは、これらの細胞の主要な細胞可溶性分子である（Ｂｒａｎｄａｕら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６：３７２９，  ２０００、Ｃｒｕｚら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８１：８８１，  １９９９）。ＣＴＬｓは、４種類の１次基質特異性を有するグランザイムと称される少なくとも１１種類のセリンプロテアーゼのファミリーも発現する（Ｋａｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １４７７：３０７，  ２０００）。ストレプトリシン０及びニューモリシンの低濃度はグランザイムＢ依存性アポトーシスを促進する（Ｂｒｏｗｎｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９：８６０４，  １９９９）。
【０１５８】
別の適切なエフェクターは、細胞に対する毒性そのものではなく、前記細胞を代謝的に変えるか、無毒性プロドラッグを致死性薬剤に変化するかのいずれかによって、細胞を別の無毒性化合物に対して感受性にする活性を有するポリペプチドをエンコードする。単純ヘルペスウイルスに由来する場合があるようなチミジンキナーゼ（ｋｔ）と、触媒的に同等なバリアントとが模範的である。ＨＳＶ  ｔｋは、増殖細胞のＤＮＡ複製を阻害する毒性産物に抗ヘルペス剤ガンシクロビル（ＧＣＶ）を変換する。
【０１５９】
必要ではないが所望の場合には、因子は、ケモカイン、サイトカイン、例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＩＬ−１１と、別のインターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子、インターフェロン、例えば、ガンマ−インターフェロン、エリスロポエチンとを含むが、これらに限られない場合もある。
【０１６０】
併用療法
別の好ましい実施態様では、本発明は、例えば、エンドスタチン、アンジオゲニン、アンジオスタチン、ケモカイン、アンジオアレスチン、アンジオスタチン（プラスミノゲン断片）、抗血管新生因子由来の基底膜コラーゲン（タムスタチン、カンスタチン又はアレスチン）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体断片、フィブロネクチン断片、ｇｒｏ−ベータ、へパリナーゼ、ヘパリン六糖類断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロン・アルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノゲン断片）、メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノゲン活性化因子阻害剤、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、さまざまなレチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）等のようなの１種類又は２種類以上の化合物のカクテルとともに前記キメラ融合分子を投与することを提供する。
【０１６１】
別の好ましい実施態様では、本発明のキメラ融合分子は、シグナル伝達阻害剤と、ベバシズマブ（アバスチン）と、例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、セレブレックス、ＭＴＯＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤等のような抗血管新生化合物とを含む１種類又は２種類以上の化合物とともに投与される。当業者は、別の治療用化合物がキメラ融合分子の投与計画を含む治療と組み合わせて投与される場合があると確認するであろう。
【０１６２】
別の好ましい実施態様では、キメラ融合分子の１種類又は２種類以上のタイプが患者に投与される場合がある。例えば、治療上のエフェクタードメインが、エンドスタチン、アンジオゲニン、アンジオスタチン、ケモカイン、アンジオアレスチン、アンジオスタチン（プラスミノゲン断片）、抗血管新生因子由来の基底膜コラーゲン（タムスタチン、カンスタチン又はアレスチン）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、シグナル伝達阻害剤、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体断片、フィブロネクチン断片、ｇｒｏ−ベータ、へパリナーゼ、ヘパリン六糖類断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロン・アルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノゲン断片）、メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノゲン活性化因子阻害剤、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、さまざまなレチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）等を含むキメラ融合分子である。これらの分子は、全ての形状、これらのバリアント、変異体、アレル、置換体、断片及び類似体を含む。
【０１６３】
メトロノーム療法
本発明に従って、前記キメラ融合分子の組成物はメトロノーム療法と組み合わせて患者に投与される。例えば、キメラ融合分子と、１種類又は２種類以上の治療剤との低投与量の連続的な投与である。治療剤は、例えば、シクロホスファミド（ＣＴＸ、２５ｍｇ／ｋｇ／日、経口）、タキサン（パクリタキセル又はドセタキセル）、ブスルファン、シスプラチン、シクロホスファミド、メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メルファラン、クラドリビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びクロラムブシルのような化学療法剤を含む場合がある。メトロノーム療法は、例えば、エンドスタチン、アンジオゲニン、アンジオスタチン、ケモカイン、アンジオアレスチン、アンジオスタチン（プラスミノゲン断片）、抗血管新生因子由来の基底膜コラーゲン（タムスタチン、カンスタチン又はアレスチン）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体断片、フィブロネクチン断片、ｇｒｏ−ベータ、へパリナーゼ、ヘパリン六糖類断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロン・アルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノゲン断片）、メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノゲン活性化因子阻害剤、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、さまざまなレチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）、シグナル伝達阻害剤等のような１種類又は２種類以上の化合物のカクテルとともに抗体融合分子を投与することも含む。別の例は、シグナル伝達の受容体、このリガンド及び／又は複合体を標的にする抗体を含む。
【０１６４】
シグナル伝達阻害剤の例は、グリベック（標的Ｂｃｒ−ａｂｌ）、ハーセプチン（モノクローナル抗体−標的Ｈｅｒ２（ｎｅｕ））、イレッサ（低分子阻害剤−ＥＧＦＲ）、アービタックス（モノクローナル抗体−ＥＧＦＲ）、タルセバ  （低分子阻害剤）、Ｒａｓ阻害剤Ｒ１１５７７（ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤）、ｍＴＯＲ阻害剤、ラパミューン（ラパマイシン）、ルボキシストーリン（低分子阻害剤）、アバスチン（モノクローナル抗体）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４、ネオバスタット、ＡＢＸ−ＥＧＦ（モノクローナル抗体）、ＴｈｅｒａＣＩＭ（モノクローナル抗体）、混合系統キナーゼ（Ｍｉｘｅｄ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｋｉｎａｓｅｓ）−ＣＥＰ１３４７（低分子阻害剤）、チロシンキナーゼ−ＣＥＰ７０１（低分子阻害剤）、サイクリン依存性キナーゼ−フラボピリドール（低分子阻害剤）、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ（デコイ受容体（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ））を含むが、これらに限られない。
【０１６５】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合タンパク質分子は、単独か、あるいは抗癌剤とともに投与される場合がある。本発明の前記化合物は、放射線療法のような既知の抗癌治療か、例えば、シスプラチン又はドキソルビシンのようなＤＮＡ相互作用剤と、エトポシドのようなトポイソメラーゼＩＩ阻害剤と、ＣＰＴ−１１又はトポテカンのようなトポイソメラーゼＩ阻害剤と、パクリタキセル、ドセタキセル又はエポチロンのようなチューブリン相互作用剤と、タモキシフェンのようなホルモン剤と、５−フルオロウラシルのようなチミジル酸シンターゼ阻害剤と、メトトレキセートのような抗代謝剤と、イレッサ及びＯＳＩ−７７４（タルセバ（商標））のようなチロシンキナーゼ阻害剤と、ベバシズマブ（アバスチン）と、ハーセプチンと、血管新生阻害剤と、ＥＧＦ阻害剤と、ＶＥＧＦ阻害剤と、ＣＤＫ阻害剤と、Ｈｅｒ１／２阻害剤と、アービタックス（ＥＧＦ）及びハーセプチン（Ｈｅｒ２）成長因子受容体か、血管新生因子かに対するモノクローナル抗体とに限られないような細胞分裂阻害剤又は細胞傷害剤かとともに（一緒にか、あるいは連続的に投与される）組み合わせて用いられる場合もある。
【０１６６】
チロシンキナーゼ阻害剤の例は、Ａｂｌ、ＣＤＫ’ｓ、ＥＧＦ、ＥＭＴ、ＦＧＦ、ＦＡＫ、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＨＥＲ−２、ＩＧＦ−Ｒ、ＩＲ、ＬＣＫ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦ、Ｓｒｃ及びＶＥＧＦのチロシンキナーゼ酵素の阻害剤を含む。一般的に、阻害剤は、例えば、前立腺肥大症、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、アテローム性動脈硬化、肺線維症、関節炎、乾癬、糸球体腎炎、血管形成術又は血管の外科手術の再狭窄、肥厚性瘢痕の形成、炎症性消化管疾患、移植拒絶反応、エンドトキシンショック及び真菌症のような異常な細胞増殖を特徴とするいずれかの疾患過程の治療に役立つ場合がある可逆性細胞分裂阻害剤として作用する場合がある。
【０１６７】
別の好ましい実施態様では、異常な細胞増殖又は癌の治療は、本発明のエンドスタチン融合分子が放射線療法及び／又は化学療法とを組み合わせて被験者に投与される併用治療を含む。
【０１６８】
「化学療法剤」という用語は、細胞又は組織の成長が望ましくない増殖中のかかる細胞又は組織の成長を阻害する化学試薬を含むことが意図される。化学療法剤は当業者に周知であり（例えば、Ｇｉｌｍａｎ  Ａ．  Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｓｅｃ  １２：１２０２−１２６３  （１９９０））を参照せよ。）、新生物疾患、腫瘍及び癌を治療するために用いられることが典型的である。
【０１６９】
「放射線療法」という用語は、望ましくない細胞増殖と関係する徴候又は症状を抑制、低下又は阻害するために被験者に、制限され、かつ、無制限の両方のＸ線を遺伝的かつ体細胞的に安全なレベルで適用することを含むことが意図される。Ｘ線という用語は、臨床的に許容可能な放射性元素及びこれらの同位体と、そこからの放射性放出とを含むことが意図される。放出のタイプの例は、アルファ線、硬ベータを含むベータ線、高エネルギー電子及びガンマ線を含む。放射線療法は当業者に周知であり（例えば、Ｆｉｓｈｂａｃｈ，  Ｆ．、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔｓ、第３版、Ｃｈ．  １０：  ５８１−６４４  （１９８８）を参照せよ。）、新生物疾患、腫瘍及び癌を治療するために用いられることが典型的である。
【０１７０】
化学療法剤の例は、ブレオマイシン、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン、エダトレキセート、エトポシド、フィナステリド（プロスカー）、フルタミド（ユーレキシン（Ｅｕｌｅｘｉｎ））、ゲムシタビン（ジェムザール）、ゴセレリン酢酸塩（ゾラデックス）、グラニセトロン（カイトリル）、イリノテカン（カンプト／カンプトサール）、オンダンセトロン（ゾフラン）、パクリタキセル（タキソール）、ペガスパルガーゼ（オンキャスパー）、ピロカルピン塩酸塩（サラジェン）、ポルフィマーナトリウム（フォトフリン）、インターロイキン−２（プロロイキン）、リツキシマブ（リツキサン）、トポテカン（ハイカムチン）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、トレチノイン（レチン−Ａ）、トリアピン、ビンクリスチン及びビノレルビン酒石酸塩（ナベルビン）を含む。化学療法剤の別の例は、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、クロラムブシル等）のようなアルキル化剤、エチレンイミン、メチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ等）、アルキルスルホン酸塩（例えば、ブスルファン等）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）等）、トリアゼン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド））、アルキル化剤（例えば、シス−ジアンミンジクロロ白金ＩＩ（ＣＤＤＰ））等を含む。
【０１７１】
化学療法剤の別の例は、葉酸類似体のような抗代謝剤（例えば、メトトレキセート（アメトプテリン））と、ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル（’５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン）、Ｆｕｄｒ、シタラビン（シトシンアラビノシド）等）と、プリン類似体（例えば、（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）及びペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン））等とを含む。化学療法剤の別の例は、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）及びビンクリスチン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、トポテカン、９−アミノ−カンプトテシン  ＣＰＴ−１１等）と、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、アドリアマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシン（マイトマイシンＣ）、タキソール、タキソテール、等）と、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）と、生物学的応答調節物質（例えば、インターフェロン−インターロイキン２等）とを含む。別の化学療法剤は、シス−ジアミンジクロロ白金ＩＩ（ＣＤＤＰ）と、カルボプラチンと、アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）と、ヒドロキシウレアと、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン）と、副腎皮質抑制剤（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔｓ）（例えば、ミトタン、アミノグルテチミド等）とを含む。別の化学療法剤は、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）と、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール等）と、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール、エテニルエストラジオール、等）と、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン等）と、アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、等）と、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）と、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（例えば、ロイプロリド）とを含む。
【０１７２】
外科手術としては、外科的処置のいずれかが本発明と組み合わせて行なわれる場合がある。放射線療法としては、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波さらには電子放出等のような腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する機構のいずれかが意図される。放射性アイソトープを腫瘍細胞に送達することが意図され、これは標的化抗体その他の標的化手段に関して用いられる場合がある。
【０１７３】
サイトカイン療法は、併用の治療計画のための効果的なパートナーであると証明された。さまざまなサイトカインが、かかる併用アプローチで供される場合がある。サイトカインの例は、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦベータ、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマを含む。サイトカインは、患者の症状及びサイトカインの相対的毒性のような臨床指標と調和して標準的な投与計画に従って投与される。ウテログロビンが、転移を阻害又は抑制するために用いられる場合がある（米国特許第５，６９６，０９２号明細書は引用により本明細書に取り込まれる。）。
【０１７４】
別の好ましい実施態様では、本明細書で説明される融合分子は、１種類又は２種類以上の抗血管新生因子と組み合わせて投与される場合がある。広範な別の抗血管新生因子は本発明に関して利用される場合がある。典型的な例は、血小板因子４（シグマケミカル社、＃Ｆ１３８５）と、プロタミン硫酸塩（クルペイン）（シグマケミカル社、＃Ｐ４５０５）と、（ズワイ蟹（ｑｕｅｅｎ  ｃｒａｂ）の甲羅から調製された）硫酸キチン誘導体、シグマケミカル社、＃Ｃ３６４１；Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１：２２−２６、１９９１）と、硫酸多糖類ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、エストロゲン及びクエン酸タモキシフェンのようなステロイドの存在によって増大される場合がある。）と、スタウロスポリン（シグマケミカル社、＃Ｓ４４００）と、例えば、プロリン類似体｛［（Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸（ＬＡＣＡ）（シグマケミカル社、＃Ａ０７６０））、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロキシプロリン（シグマケミカル社、＃Ｄ０２６５）、チアプロリン（シグマケミカル社、＃Ｔ０６３１）］、アルファ、アルファ−ジピリジル（シグマケミカル社、＃Ｄ７５０５）、フマル酸ベータ−アミノプロピオニトリル（シグマケミカル社、＃Ａ３１３４）］｝を含むマトリクス代謝の変調体と、ＭＤＬ  ２７０３２（４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メリオンメレルダウリサーチインスティチュート（Ｍｅｒｉｏｎ  Ｍｅｒｒｅｌ  Ｄｏｗ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））と、メトトレキセート（シグマケミカル社、＃Ａ６７７０；Ｈｉｒａｔａら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ３２：１０６５−１０７３、１９８９）と、ミトキサントロン（Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ及びＮｏｖａｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １４０：９０１−９０７）と、ヘパリン（Ｆｏｌｋｍａｎ，  Ｂｉｏ．  Ｐｈａｒ．  ３４：９０５−９０９、１９８５；  シグマケミカル社、＃Ｐ８７５４）と、インターフェロン（例えば、シグマケミカル社、＃１３２６５）と、２マクログロビン−血清（シグマケミカル社、＃Ｍ７１５１）と、ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：１７３２１−１７３２６、１９９２）と、キモスタチン（シグマケミカル社、＃Ｃ７２６８；Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２８６：４７５−４８０、１９９２）と、ベータ−シクロデキストリンテトラデカスルフェート（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  Ｔｅｔｒａｄｅｃａｓｕｌｆａｔｅ）（シグマケミカル社、＃Ｃ４７６７）と、エポネマイシンと、カンプトテシンと、フマギリン（シグマケミカル社、＃Ｆ６７７１；カナダ国特許第２，０２４，３０６号明細書；Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５５−５５７、１９９０）と、金チオリンゴ酸ナトリウム（「ＧＳＴ」；シグマ：Ｇ４０２２；Ｍａｔｓｕｂａｒａ及びＺｉｆｆ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７９：１４４０−１４４６、１９８７）と、Ｄ−ペニシラミン（「ＣＤＰＴ」；  シグマケミカル社、＃Ｐ４８７５又はＰ５０００（ＨＣｌ））と、ベータ−１−抗コラゲナーゼ−血清と、アルファ２−抗プラスミン（シグマケミカル社：Ａ０９１４；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２（４）：１６５９−１６６４、１９８７）と、ビサントレン（米国国立癌研究所）と、ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントラニル酸二ナトリウム又は「ＣＣＡ」；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３６：３１２−３１６、１９９２）と、サリドマイドと、アンゴスタチックステロイド（Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｒｏｉｄ）と、ＡＧＭ−１４７０と、カルボキシアミノリミダゾールと、ＢＢ９４のようなメタロプロテイナーゼ阻害剤とを含む。
【０１７５】
上記の抗血管新生因子が例示の目的のために提供されたが、本発明は全く限定されないと理解されるべきである。特に、特定の抗血管新生因子は特に上記されるが、本発明は、かかる抗血管新生因子の類似体、誘導体及びコンジュゲートを含むと理解されるべきである。例えば、パクリタキセルは、パクリタキセルの通常の化学的に利用可能な形状だけでなく、類似体（例えば、上記のタキソテール）及びパクリタキセルコンジュゲート（例えば、パクリタキセル−ＰＥＧ、パクリタキセル−デキストラン又はパクリタキセル−キシロース）も指すと理解されるべきである。別の好ましい実施態様では、本発明の融合分子は、血管新生関連疾患を治療するために分子の標的が定められる場合もある。「血管新生関連疾患」という用語は、明細書及び請求項の目的のために、血管新生が異常に延長されるヒトでの特定の病理学的過程を示すために本明細書で用いられる。かかる血管新生関連疾患は糖尿病性網膜症、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍及び最も多いタイプのヒト固形腫瘍を含む。
【０１７６】
抗血管新生剤の変異体
前記抗血管新生剤は、未消化の分子か、前記薬剤の機能的な断片か、天然に生じるか、あるいはヒトによって製造される前記薬剤の変異体かの場合がある。例えば、本発明で有用なエンドスタチンドメインは、例えば、ＶＥＧＦの産生又は新たな脈管形成を阻害するためのエンドスタチンの機能的な活性を共有する天然のエンドスタチンから得られる分子のいずれかを含む。前記エンドスタチンドメインは、天然のエンドスタチンの機能的な活性を保持する天然のエンドスタチンか、天然のエンドスタチンの断片かの場合がある。前記エンドスタチンドメインは、天然のエンドスタチンの機能的な活性を保持するエンドスタチンの天然には生じない形状（例えば、アミノ酸置換によって生じる変異体型）の場合もある。好ましい実施態様は、１２５番目の部位にアミノ酸変化を有するエンドスタチン変異体である。本発明の融合分子を含む前記エンドスタチン分子変異体は、天然、非天然、改変された、得られたアミノ酸等を含む。
【０１７７】
したがって、「エンドスタチン」という用語の定義は、タンパク質、そのサブユニット及びペプチド断片の改変又は突然変異を含む。かかる突然変異は、特異的な部位で天然アミノ酸を、天然及び非天然のアミノ酸を含むが、これらに限られない別の分子で置換することを含む。かかる置換は抗血管新生タンパク質の生物活性を改変し、生物学的又は薬理学的な作動薬又は拮抗薬を生成する場合がある。改変は、タンパク質配列中で改変されたアミノ酸か、プロテアーゼ活性を阻害するか、あるいはその逆で前記タンパク質の安定性を増大し、タンパク質変性を低下する未消化のタンパク質配列に改変することかを含む。かかる改変は当業者に周知である。
【０１７８】
改変されたタンパク質は、誘導体タンパク質又は類似体として本明細書に言及される。「誘導体」又は「類似体」という用語は本明細書で特に示された配列に実質的に同一なアミノ酸残基配列を有するタンパク質／ポリペプチドのいずれかを含み、前記実質的に同一なアミノ酸残基配列は、１種類又は２種類以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換され、本明細書で説明されたような活性を示す。保存的な置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのようなある非極性（疎水性）残基を別の残基に置換すること、アルギニンとリジンと、グルタミンとアスパラギンと、スレオニンとセリンとのようなある極性（親水性）残基を別の残基に置換すること、又は、アスパラギン酸又はグルタミン酸のようなある酸性残基を別の残基に置換することを含む。
【０１７９】
「保存的な置換」という文言は、必要な阻害活性を示すかかるポリペプチドを提供した誘導体化されていない残基の代わりに化学的に誘導体化された残基を使用することもを含む。
【０１８０】
「化学的な誘導体」は、機能的な側鎖の反応によって化学的に誘導体化された１種類又は２種類以上の残基を有する対象のポリペプチドを指す。かかる誘導体化された分子は、例えば、遊離のアミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するために誘導体化されたこれらの分子を含む。遊離のカルボキシル基は、塩か、メチル及びエチルエステルか、別のタイプのエステル又はヒドラジドかを形成するために誘導体化される場合がある。遊離のヒドロキシル基は、Ｏ−アシル化又はＯ−アルキル化誘導体を形成するために誘導体化される場合がある。ヒスチジンのイミダゾールの窒素は、Ｎ−イムベンジルヒスチジンを形成するために誘導体化される場合がある。化学的な誘導体として含まれるものは、２０種類の標準的なアミノ酸の１種類又は２種類以上の天然のアミノ酸誘導体を含むこれらのペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに置換される場合があり、５−ヒドロキシリジンはリジンに置換される場合があり、３−メチルヒスチジンはヒスチジンに置換される場合があり、ホモセリンはセリンに置換される場合があり、オルニチンはリジンに置換される場合がある。本発明のポリペプチドは、必要な活性が保持されるする限り、本明細書で示されるポリペプチド配列に関連する、１種類又は２種類以上の残基の付加及び／又は欠失を有するポリペプチドのいずれかを含む。
【０１８１】
本発明は、本明細書で説明されたタンパク質の配列と、これらのタンパク質をエンコードする核酸配列とに類似するアミノ酸残基の配列を意図する。改変及び変化が前記タンパク質の生物学的機能を実質的に変更することなしに行なわれる場合があると当業者に周知である。かかる変化が行なわれる際に、同様のアミノ酸残基の置換が、側鎖の置換の相対的な類似性、例えば、これらのサイズ、電荷、疎水性、親水性等にもとづいて行なわれる場合がある。説明されたタイプの変更は、ペプチドの効力か、酵素的な分解に対する安定性か、薬物動態かを増大するために行なわれる場合がある。したがって、本発明の技術的範囲内として考えられた配列は、アミノ酸残基の配列又はタイプの変化によって特徴付けられたこれらの類似の配列を含み、前記変化は、基本的な性質と、前述の抗血管新生タンパク質、誘導体、変異体、断片及び／又は融合タンパク質の生物学的活性とを変更しない。
【０１８２】
「エンドスタチン」という用語は、断片として本明細書に言及された短縮されたタンパク質又はペプチドを含み、該タンパク質又はペプチドは、１個又は２個以上のアミノ酸が、エンドスタチンの末端の片方又は両方からか、あるいは前記タンパク質の内部領域から除去されるにもかかわらず、生じる分子は内皮増殖阻害活性を保持すると理解されるであろう。「エンドスタチン」という前記用語は、伸長されたタンパク質又はペプチドも含み、該伸長されたタンパク質又はペプチドは、１個又は２個以上のアミノ酸が、エンドスタチンの末端の片方又は両方に、あるいは前記タンパク質の内部領域に付加されるにもかかわらず、結果として生じる分子は内皮増殖阻害活性を保持する。例えば、第１部位に付加されたチロシンを有するかかる分子は、アッセイで使用するための１２５−ヨウ素（１２５Ｉ）での放射性ヨウ素化のような標識に役立つ。別の放射性同位体を用いる標識化は、エンドスタチン受容体を含む標識細胞を殺すための分子ツールを提供するのに役立つ場合がある。リシンのような分子を用いる別の標識化は、抗血管新生タンパク質受容体を用いて細胞を殺す機構を提供する場合がある。
【０１８３】
本発明の抗血管新生融合タンパク質は、本明細書で説明された前記タンパク質、変異体、誘導体又は断片と、当業者に知られた別の抗血管新生分子とのうち１種類又は２種類以上を含むタンパク質を含む。例えば、本発明によって含まれる融合タンパク質が、別のエンドスタチン又はエンドスタチン変異体に結合されたエンドスタチンをエンコードするポリヌクレオチドによってエンコードされる場合があり、発現された前記融合タンパク質は、単量体の野生型エンドスタチンか、エンドスタチン変異体かのいずれかを超える前記融合タンパク質の生物学的活性の合理的な増大をもたらす、エンドスタチン及びエンドスタチン変異体の両方の活性を含む。本発明によって含まれる融合タンパク質の別のタイプは、２つの縦列のエンドスタチン分子か、エンドスタチン変異体か、リンカーによって任意に結合されたこれらの組み合わせかをエンコードするポリヌクレオチドによってコンコードされた融合タンパク質の場合がある。また、前記融合タンパク質が、前記単量体エンドスタチンよりもより高い活性となるであろうと予測するのに合理的である。
【０１８４】
本発明の抗血管新生融合タンパク質の別の例は、前記タンパク質のコンジュゲートを含む。かかる融合タンパク質は、それらが得られるものから個別のタンパク質に開裂される場合があるか、あるいは開裂されない場合がある。本明細書で用いられるところの「抗血管新生タンパク質のコンジュゲート」という用語は、コンジュゲートを形成するための別のタンパク質に化学的に結合された抗血管新生タンパク質を意味する。コンジュゲートの例は、アルブミンか、別の抗血管新生タンパク質からのペプチド断片かに結合したタンパク質断片を含む。
【０１８５】
本明細書で用いられるところの「抗血管新生活性」という用語は、血管の成長を阻害するための分子の能力を指す。本明細書で用いられるところの「内皮阻害活性」という用語は、通常は血管新生を阻害するため、例えば、線維芽細胞増殖因子その他の既知の増殖因子の存在下で培養中のウシ毛細血管内皮細胞の成長又は遊走を阻害するための分子の能力を指す。本発明の抗血管新生タンパク質、変異体、誘導体、断片又は融合タンパク質は、その「内皮阻害活性」をテストした際の効力にもとづいて特徴付けられる場合がある。内皮阻害活性の別の測定法は本明細書で説明される。
【０１８６】
本発明の前記抗血管新生タンパク質は、血管新生によって仲介されるか、あるいは関係する疾患又は過程の治療に有効である。本発明は、本明細書で説明された方法によって生成された抗血管新生融合タンパク質か、生物学的に活性的なこれらの変異体、誘導体、断片又は融合タンパク質か、抗血管新生の活性か、抗血管新生作動薬又は拮抗薬の活性かを集団的に保持するタンパク質の組み合わせかの有効量で、血管新生を仲介する疾患を治療する方法を含む。
【０１８７】
本明細書で用いられるところの「血管新生」という用語は、組織又は器官への新しい血管の発生を意味し、内皮細胞の増殖に関係する。正常な生理的条件下では、哺乳類（ヒト又は動物）は、非常に限られた特定の状態でのみ血管新生を起こす。例えば、血管新生は、創傷治癒と、胎児及び胚の発生と、黄体、子宮内膜及び胎盤の形成とで正常に観察される。「子宮内膜」という用語は、漿液腔（ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｖｉｔｉｅｓ）、リンパ管及び血管に並ぶ扁平上皮細胞の薄層を意味する。
【０１８８】
本明細書で用いられるところの「血管新生関連因子」という用語は、血管新生を阻害か、促進かのいずれかをする因子を意味する。血管新生関連因子の例は、血管新生プロモーターである塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような血管新生増殖因子である。血管新生関連因子の別の例は、アンジオスタチンのような血管新生阻害因子である。
【０１８９】
本明細書で用いられるところの「増殖因子」という用語は、細胞の増殖、複製又は合成活性を促進する分子を意味する。
【０１９０】
前記血管新生を仲介する疾患は、固形腫瘍と、白血病のような血液由来の腫瘍と、腫瘍の転移と、良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経鞘腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫と、関節リウマチと、乾癬と、眼内血管新生性疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体線維増殖症、虹彩炎と、オスラー・ウェーバー病と、心筋血管新生と、プラーク血管新生（ｐｌａｑｕｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）と、毛細管拡張症と、血友関節症と、血管線維腫と、創傷肉芽形成、腸管癒着、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症及び肥厚性瘢痕、例えば、ケロイドとを含むが、これらに限られない疾患を含む。本明細書で説明された前記抗血管新生タンパク質は、胚着床に必要とされる脈管形成を阻害する避妊薬として用いられる場合がある。前記タンパク質は、猫引っ掻き病（ロシェル・ミナリア・クイントサ（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ））と、潰瘍（ヘリコバクター・ピロリ）とのような病的な事象として血管新生を有する疾患の治療にも役立つ。
【０１９１】
放射性標識
別の好ましい実施態様では、本発明の前記融合分子は放射性標識される場合がある。使用は、診断の目的のための治療及び画像処理を含む。標識は、放射性原子、酵素又は発色原子団の場合がある。抗体を標識するための方法は、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ及びＧｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ、１４４：９４５（１９６２）と、Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４−１０２１（１９７４）とで説明された。抗体を標識するための追加の方法は、米国特許第３，９４０，４７５号明細書及び米国特許第３，６４５，０９０号明細書で説明された。オリゴヌクレオチドプローブを標識するための方法は、例えば、Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８３）  ８０：４０４５と、Ｒｅｎｚ及びＫｕｒｚ、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４）  １２：３４３５と、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＧｕｍｐｏｒｔ、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８３）  １１：６１６７と、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８５）  １３：２３９９と、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）  １３８：２６７とで説明された。
【０１９２】
前記標識は放射性の場合がある。有用な放射性標識のある例は、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ及び３Ｈを含む。放射性標識の使用は、英国第２，０３４，３２３号明細書、米国特許第４，３５８，５３５号明細書及び米国特許第４，３０２，２０４号明細書で説明された。
【０１９３】
非放射性標識のある例は、酵素と、発色団と、電子顕微鏡によって検出可能な原子及び分子と、これらの磁性の性質によって検出可能な金属イオンとを含む。
【０１９４】
ある有用な酵素標識は、基質に検出可能な変化をもたらす酵素を含む。ある有用な酵素と、これらの基質とは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ピロガロール及びｏ−フェニレンジアミン）と、ベータ−グルコシダーゼ（フルオレセイン・ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド）と、アルカリホスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム）とを含む。酵素標識の使用は、英国第２，０１９，４０４号明細書と、欧州第６３，８７９号明細書と、Ｒｏｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、４７、１９８１−１９９１（１９６１）とで説明された。
【０１９５】
有用な発色団は、例えば、蛍光、化学発光及び生物発光の分子及び色素を含む。本発明で有用なある特異的な発色団は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノールを含む。
【０１９６】
前記標識は、当業者に周知な方法によって、抗体又はヌクレオチドのプローブにコンジュゲート化される場合がある。前記標識は、前記プローブ上の官能基を介して直接的に結合される場合がある。前記プローブは、かかる官能基を含むか、含むように生じさせられる場合があるかのいずれかである。適切な官能基のある例は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基を含む。代替的には、酵素及び発色団のような標識は、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド等のような薬剤と結合することによって、抗体又はヌクレオチドにコンジュゲート化される場合がある。
【０１９７】
前記標識は、上記の方法によって前記プローブに結合したリガンドと、前記標識に結合したリガンドに対する受容体とを介して前記プローブにコンジュゲート化される場合もある。既知のリガンド−受容体の組み合わせのいずれかは適切である。ある適切なリガンド−受容体の対合は、例えば、ビオチン−アビジン又はビオチン−ストレプトアビジンと、抗体−抗原とを含む。
【０１９８】
別の好ましい実施態様では、本発明のキメラ融合分子は画像処理のために用いられる場合がある。画像処理の使用では、複合体がその本体の外側で検出される場合があるように、複合体は標識化される。典型的な標識は放射性同位体であり、通常は短い半減期を有する放射性同位体である。１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴＣ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１８Ｆ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３２Ｐのような有用な画像化放射性同位体が用いられる場合がある。ガドリニウム−１５３のような核磁気共鳴（ＮＭＲ）の画像化エンハンサーは、ＮＭＲによる検出のための前記複合体を標識するために用いられる場合がある。ポリヌクレオチド又はタンパク質中の原子団のいずれかの標識を実施するための方法及び試薬は、当業者に既知であると考えられる。
【０１９９】
ドメイン分子
上記のように、本発明は、抗血管新生剤ドメインと、担体ドメインとの両方を含むキメラ分子を提供する。前記担体ドメインがキメラ分子に機能的性質を与える際に、前記抗血管新生剤ドメインは腫瘍の成長を（血管新生を阻害することによって）低下させる。例えば、前記担体ドメインがＩｇドメインである際に、前記担体ドメインは、特定の部位に前記キメラ分子の標的にするため（例えば、前記抗体の抗原結合部位が標的細胞によって発現された抗原に結合し、及び／又は、前記ＩｇドメインのＦｃ部分はＦｃ受容体−関連細胞を前記キメラ分子の標的にする場合がある）か、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ貯蔵又はｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために）前記キメラ分子の安定性を増大するためか、前記キメラ分子にエフェクター機能（例えば、免疫応答−刺激、細胞傷害性等）を付与するためか、前記キメラ分子の精製を促進するためかに機能する場合がある。
【０２００】
前記担体ドメインは、前記キメラ分子に機能を付与する物質のいずれかの場合がある。例えば、担体ドメインは、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ貯蔵又はｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために）前記キメラ分子の安定性を増大するか、前記キメラ分子にエフェクター機能（例えば、免疫応答−刺激、細胞傷害性等）を導入するか、前記キメラ分子の精製を促進するかの分子の場合がある。前記キメラ分子の安定性を増大するために、前記キメラドメインは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ貯蔵又はｉｎ  ｖｉｖｏ送達の設定で分子を安定化することが示されているタンパク質の場合がある。例えば、前記キメラ分子の安定性を増大するための担体ドメインは、Ｉｇ分子からの１種類又は２種類以上のドメイン（例えば、ＣＨ２−ＣＨ３断片）を含む。前記キメラ分子を安定化するために用いられる場合がある別の担体ドメインは経験的に同定される場合がある。例えば、分子は抗血管新生剤に該分子をコンジュゲート化し、かつ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの安定性アッセイでコンジュゲート化した産物をテストすることによって、担体ドメインとしての安定性のためにスクリーニングされる場合がある。
【０２０１】
別の好ましい実施態様では、本発明の担体ドメインは前記キメラ分子の精製を促進する。キメラ分子の精製を促進するための既知の分子のいずれかが用いられる場合がある。かかる担体ドメインの典型的な例は、抗体断片と、親和性タグ（例えば、ＧＳＴ、ＨＩＳ、ＦＬＡＧ及びＨＡ）とを含む。親和性タグを含むキメラ分子は、免疫親和性手法（例えば、アガロース親和性ゲル、グルタチオン−アガロースビーズ、抗体及びニッケルカラムクロマトグラフィー）を用いて精製される場合がある。担体ドメインとしてＩｇドメインを含むキメラ分子は、当業者に知られた免疫親和性クロマトグラフィー手法（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧのクロマトグラフィー）を用いて精製される場合がある。
【０２０２】
前記キメラ分子を精製するために用いられる場合がある本発明の別の担体ドメインは、機能的なアッセイで前記分子をテストすることによって容易に同定される場合がある。例えば、分子は、抗血管新生剤に前記分子を融合すること、及び、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで純度及び生産性に関して前記融合体をテストすることによって担体分子としての安定性についてスクリーニングされる場合がある。組換えタンパク質の精製は、従来手法、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にクマシーブルーでゲルを染色することによって評価される場合がある。
【０２０３】
多くの別の担体ドメインが、前記キメラ分子にエフェクター機能を付与するために用いられる場合がある。これらは、別の細胞毒、薬剤、検出可能な標識、標的化リガンド及び運搬体を含む。これらの例は、米国特許第６，５１８，０６１号明細書と、米国公開公報第２００２０１５９９７２号明細書とで説明される。
【０２０４】
前記キメラ分子の使用のための好ましい担体ドメインは、Ｉｇか、Ｉｇの一部分かである。前記Ｉｇドメインは、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦＶ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｉｇ重鎖又は１箇所又は２箇所以上の定常領域が除去されているＩｇの形状をとる場合がある。前記Ｉｇドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びこれらのサブクラスのいずれかを含むＩｇクラスのいずれかから得られる場合がある。ある用途では、Ｉｇドメインが大きなヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ３由来のヒンジ領域を含むことが好ましい。
【０２０５】
別の好ましい実施態様では、前記Ｉｇドメインはミニボディである。「ミニボディ」と称される小さなタンパク質スキャフォールドは、鋳型としてＩｇのＶＨドメインの一部分を用いて設計された（Ｐｅｓｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：３６７−６９（１９９３））。インターロイキン−６に高親和性（解離定数（Ｋｄ）約１０−７Ｍ）を有するミニボディは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２に対応するループをランダム化し、その後、ファージディスプレイ法を用いて変異体を選択することによって同定される（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９４  １５番；  １３（２２）：  ５３０３-５３０９）。これらの実験は、前記抗体機能の本質がより小さいシステムに移転される場合があることを示した。したがって、前記キメラ融合分子は、ミニボディのＩｇドメインを含む場合がある。
【０２０６】
キメラ分子は、分子生物学又はタンパク質化学の従来手法を用いて調製される場合がある。前記キメラ分子が融合タンパク質である場合に、分子生物学の方法がフレーム中に遺伝子２個又は３個以上を１個の核酸に結合するために用いられる場合がある。その後、前記核酸は、前記キメラ分子が生成される条件下の適切な宿主細胞で発現される場合がある。担体ドメインは、かかる分子２個をともに結合するために当業者に知られた別の方法によって抗血管新生剤のドメインに（例えば、共有結合で）コンジュゲート化される場合もあった。例えば、前記抗血管新生剤のドメインは、直接か、リンカー（スペーサー）を用いるかのいずれかで担体ドメインと化学的に誘導体化される場合がある。この結合を仲介するためのさまざまな方法及び試薬（例えば、クロス−リンカー）が既知である。例えば、ピアス化学会社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）のカタログと、Ｍｅａｎｓ及びＦｅｅｎｅｙ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ社、カリフォルニア州サンフランシスコ、１９７１と、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ａｉｍｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｂｕｌｌｅｔ」、Ｔｈｏｒｐｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１６８−１９０頁（１９８２）と、Ｗａｌｄｍａｎｎ  （１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１６５７と、米国特許第４，５４５，９８５号明細書及び米国特許第４，８９４，４４３号明細書とを参照せよ。
【０２０７】
抗血管新生剤のドメインは、さまざまな配向性で担体ドメインに融合されるか、あるいはコンジュゲート化される。例えば、前記担体ドメインは、抗血管新生剤のドメインのアミノ末端か、カルボキシ末端かのいずれかに結合される場合がある。前記抗血管新生剤のドメインは担体ドメインの内部領域に結合される場合があるか、あるいはその逆に、前記担体ドメインが抗血管新生剤のドメインの内部部位に結合される場合がある。
【０２０８】
ある場合には、前記キメラ分子がその標的部位に到達する際には、前記抗血管新生剤のドメインから担体ドメインを除去することが望ましい。したがって、前記ドメインの１つが前記標的部位で放出される際には、前記標的部位の近傍で開裂可能であるリンカーを特徴としているキメラコンジュゲートが用いられる場合がある。前記担体ドメインを抗血管新生剤のドメインから放出するための結合を開裂することは、酵素活性か、前記コンジュゲートが標的細胞の中か、前記標的部位の近傍かのいずれかで曝される条件かによって促進される場合がある。前記標的部位が腫瘍である際には、前記腫瘍部位にある条件下で（例えば、腫瘍関連酵素又は酸性ｐＨに曝された際に）、開裂可能であるリンカーが用いられる場合がある。異なる開裂可能なリンカーの多くが当業者に知られる。例えば、米国特許第４，６１８，４９２号明細書と、米国特許第４，５４２，２２５号明細書と、米国特許第４，６２５，０１４号明細書とを参照せよ。これらのリンカー基から薬剤を放出するための機構は、例えば、感光性結合の照射と、酸によって触媒される加水分解とを含む。例えば、米国特許第４，６７１，９５８号明細書は、患者の補体系のタンパク質分解酵素によってｉｎ  ｖｉｖｏにおいて前記標的部位で開裂されるリンカーを含む免疫コンジュゲートの説明を含む。タンパク質にさまざまな放射性診断薬、放射性治療薬、薬物、毒物その他の薬剤を結合することについて報告されている方法の多くを考慮して、当業者は抗血管新生剤のドメインに特定の担体ドメインを結合するための適切な方法を決定できるであろう。
【０２０９】
二重特異性キメラ分子
別の好ましい実施態様では、調節性又は細胞溶解性ドメインを含むキメラ分子は、二重特異性抗体のドメイン又はこの断片に融合される。本発明のある局面では、前記二重特異性抗体はモノクローナル抗体２個を含む。しかし、前記二重特異性抗体は、ポリクローナル抗体２個か、設計された二重特異性抗体かを含む場合がある。
【０２１０】
前記二重特異性抗体の特異性のそれぞれは、腫瘍抗原、及び／又は、特定の細胞又は組織の１種類又は２種類以上に向けられることが好ましい。抗体は、患者由来の腫瘍抗原のいずれかに対してもたらされる場合がある。したがって、前記キメラ分子の標的化は、前記腫瘍が異なる抗原を提示する際に、それぞれに適合させられる場合がある。
【０２１１】
二重特異性抗体は、ハイブッリド−ハイブリドーマ法か、特異的抗体を共有結合するか、ダイアボディアプローチのような別のアプローチ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｗら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７７（１９９８）、７６３−７７３）かによって構築される場合がある。本発明のある局面では、前記二重特異性抗体は単鎖抗体のコンストラクトである。
【０２１２】
成果を探知するために、前記二重特異性抗体は直接的に標識されるか、あるいは前記二重特異性抗体の領域に特異的な第２抗体が標識される。前記キメラ分子の局在の検出は、フローサイトメトリーのような細胞を分類する手法を介することが好ましい。例えば、試料は、画像化及び診断の目的のために前記キメラ分子の投与後に異なる時間間隔で取得される。
【０２１３】
本発明に従って、前記二重特異性抗体はｉｎ  ｖｉｖｏで特定の部位をキメラ分子の標的にする。例えば、前記部位は、心筋組織、胸部、肝臓、脾臓、卵巣、精巣、肝細胞、腎臓等の場合がある。前記二重特異性抗体は、前記キメラ分子の標的にされる特異的な抗原を決定する。
【０２１４】
上記のように、前記抗体ドメインの特異性は、特定の腫瘍抗原に特異性を有する前記腫瘍が検出される特定の組織抗原に向けられる場合がある。代替的に、前記二重特異性抗体のドメインは前記腫瘍によって発現される腫瘍抗原２個に向けられる。前記二重特異性ドメインは、上記の調節性又は細胞溶解性のドメインのいずれかに融合される場合がある。
【０２１５】
本発明の別の好ましい実施態様では、前記二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）のコンストラクトは、第１又は第２の抗原としての１個又は２個以上の腫瘍抗原と、第２抗原としての細胞又は組織特異的抗原とに結合する二重特異性抗体である。前記抗体は、調節性又は細胞溶解性の分子に共有結合される場合があり、かつ、前記キメラ分子は、化学的結合、及び、前記抗体と、改変された又は改変されていない原核生物又は真核生物の調節性又は細胞溶解性の分子とからの融合タンパク質又はモザイクタンパク質の生成によって構築される場合がある。さらに前記抗体は、多量体化ドメインを介して調節性又は細胞溶解性の分子に結合される場合がある。
【０２１６】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明のキメラポリペプチド、例えば、エンドスタチンのコンストラクトは、改変された又は改変されていないエンドスタチンと、改変された又は改変されていない調節性又は細胞溶解性の分子との融合コンストラクトである。前記コンストラクトは、二重特異性抗体のドメインに、例えば、多量体化ドメインによってｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで結合される場合がある。前記キメラ分子のコンストラクトは、上記のような融合タンパク質として、特に、化学的結合から生じる場合があるか、組換えで生成される場合があるか、あるいは生成される場合がある。ある局面では、原子団は腫瘍抗原の少なくとも１個に特異的に結合する。
【０２１７】
本発明の組成物は、以下に説明されるような細胞傷害性薬剤のいずれかを含む場合がある。例えば、ある局面では、前記毒物は、ポリペプチドの毒物、例えば、ＰＥ３８、ＰＥ４０又はＰＥ３７か、これらの切断型かのようなシュードモナスのエキソトキシンか、ゲロニンタンパク質と相互作用するリボソーム（例えば、Ｂｏｙｌｅ、（１９９６）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８：２２１−２３０）等かの場合がある。本発明の前記組成物は、例えば、０．１３１１（例えば、Ｓｈｅｎ、（１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  ８０（１２  Ｓｕｐｐｌ．）：  ２５５３−２５５７）と、銅−６７（例えば、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、（１９８８）  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２９：２１７−２２５）とのような、例えば、細胞傷害性薬剤で放射性標識された細胞傷害性の医薬品のいずれかにコンジュゲート化される場合がある。
【０２１８】
ある実施態様では、前記キメラ分子のコンストラクトは、融合（ポリ）ペプチド又はモザイク（ポリ）ペプチドである。前記融合（ポリ）ペプチドは、本明細書で説明されるようなコンストラクトのドメインと、この機能的な断片とを単に含む場合がある。しかし、前記融合（ポリ）ペプチドは、追加のドメイン及び／又は機能的な伸縮を含むと認識される。したがって、前記融合（ポリ）ペプチドは、少なくとも１つの追加のドメインを含む場合があり、このドメインは、共有又は非共有の結合によって結合されている。かかるコンストラクトの結合と、構築とは、本明細書で説明されたか、あるいは当業者に知られた（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらが示したものと、Ａｕｓｕｂｅｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８９）と）方法に従う遺伝的な融合を利用する場合があるか、あるいは例えば、国際公開第ＷＯ９４／０４６８６号明細書に説明された、例えば、化学的なクロス−リンクによって実施される場合がある。前記コンストラクト中に存在する前記追加のドメインは、（ポリ）ペプチドリンカーのような可動性のリンカーによって結合される場合があり、前記（ポリ）ペプチドリンカーが、追加のドメインのＣ末端と、前記ペプチド、（ポリ）ペプチド又は抗体のＮ末端とか、その逆かの距離を補うのに十分な長さの複数の親水性のペプチドに結合されたアミノ酸を含む場合がある。前記リンカーは、特に、グリシン、セリン及び／又はグリシン／セリンのリンカーの場合がある。追加のリンカーはオリゴマー化ドメインを含む。オリゴマー化ドメインは、機能的な分子１個中の２個又はさまざまな抗原か、これらの断片かの組み合わせを促進する場合がある。オリゴマー化ドメインの非限定的な例は、（ｊｕｎ−ｆｏｓ、ＧＣＮ４、Ｅ／ＥＢＰと、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８（１９９２）、１５４７−１５５３と、Ｚｅｎｇ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４（１９９７）、３６７３−３６７８と、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ５（１９９１）、１５５３−１５６３と、Ｓｕｔｅｒ、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、第１１章、（１９９６）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓとのような）ロイシンジッパー、定常ドメインＣＨ１及びＣＬのような抗体由来オリゴマー化ドメイン（Ｍｕｅｌｌｅｒ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２２（１９９８）、２５９−２６４）、及び／又は、ＧＣＮ４−ＬＩのような４量体化ドメイン（Ｚｅｒａｎｇｕｅ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７  （２０００）、３５９１−３５９５）を含む。
【０２１９】
別の好ましい実施態様では、前記リンカーは、例えば、ＮＧＲモチーフ（Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）及び／又はＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）の１個又は２個以上と、これらの組み合わせとのようなインテグリンモチーフをを含む。さらに、本明細書で説明されたような本発明で用いられるための前記キメラ融合コンストラクトは、少なくとも１つの追加のドメイン、特に、例えばヒスチジン伸張のような精製手段を提供するドメインを含む場合がある。前記追加のドメインは、共有結合又は非共有結合によって結合される場合がある。
【０２２０】
前記結合は、当業者に知られ、かつ、本明細書で説明された方法に従う遺伝的な融合を利用する場合があるか、あるいは例えば、国際公開第ＷＯ９４／０４６８６号明細書に説明された、例えば、化学的なクロス−リンクによって実施される場合がある。前記コンストラクト中に存在する追加のドメインは、結合部位ドメインの１個に対するポリペプチドリンカーのような可動性のリンカーによって結合される場合があり、前記ポリペプチドリンカーが、前記ドメインの１個のＣ末端と、前記ペプチドの別のＮ末端との距離を補うのに十分な長さの複数か、親水性か、ペプチドかに結合されたアミノ酸を含む場合があり、前記ポリペプチドは、水溶液に溶解された際に結合に適切な構造と推測する。
【０２２１】
免疫活性化キメラ融合分子
本発明の使用、組成物及び方法について開示されたコンストラクトは、免疫調節剤のように機能する場合がある追加のドメインを含むと認識される。前記免疫調節剤は、サイトカイン、リンホカイン、Ｔ細胞共刺激リガンド等を含むがこれらに限られない。好ましくは、前記キメラ融合分子は腫瘍細胞を標的にし、かつ、調節性又は細胞溶解性の分子を腫瘍細胞に輸送し、かつ、免疫細胞及び／又は活性化された免疫細胞を前記腫瘍細胞に補充する。
【０２２２】
ナイーブＴ細胞の初回抗原刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）で生じる適切な活性化は、
一次免疫応答に重要であり、樹状細胞様のプロフェッショナルＡＰＣｓ（抗原提示細胞）由来の２つのシグナルに依存する。第１のシグナルは抗原特異的であり、クローン型のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の刺激によって正常に仲介され、前記受容体は、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの分子の中身として提示された処理済み抗原によって誘導される。しかし、この第１刺激はナイーブＴ細胞の初回抗原刺激応答を誘導するために重要ではなく、第２シグナルが必要とされ、該シグナルは抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）上の共刺激リガンド分子に結合するＴ細胞表面特異的分子の相互作用によって提供され、初回抗原刺激されたＴ細胞の増殖をさらに支持する。したがって、「Ｔ細胞共刺激リガンド」という用語は、第１刺激と、Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）、４−１ＢＢリガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンドを含むＢ７ファミリーのメンバーのタンパク質を含むが、これらに限られないものとを組み合わせてナイーブＴ細胞の初回抗原刺激を支持することができる本発明の分子を考慮して示す。
【０２２３】
本明細書で説明された前記キメラ融合分子のコンストラクトは、追加の受容体又はリガンドの機能を含む場合があり、かつ、免疫調節エフェクター分子又はこの断片を含む場合がある。免疫調節エフェクター分子は、液性及び／又は細胞性の免疫系、特に、その細胞性及び／又は非細胞性の成分、その機能、及び／又は、別の生理学的システムとのその相互作用に積極的及び／又は消極的に影響を及ぼす。前記免疫調節エフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、マクロファージ遊走阻止因子（Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ（１９９８）、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７６（３−４）；  １５１−６１か、Ｍｅｔｚ  （１９９７）、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６６、１９７−２２３かに説明されたようなＭＩＦ）、Ｔ細胞受容体及び可溶性ＭＨＣ分子を含むグループから選択される場合がある。かかる免疫調節エフェクター分子は当業者に周知であり、特に、Ｐａｕｌ、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州（１９８９）で説明される。特に、既知のサイトカイン及びケモカインは、Ｍｅａｇｅｒ、「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」（１９９８）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ有限会社、チチェスター、ウェストサセックス州、英国と、（Ｂａｃｏｎ（１９９８）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ９（２）：１６７−７３か、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ（１９９７）、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２、２６８２−６か、Ｔａｕｂ（１９９４）、Ｔｈｅｒ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １（４）、２２９−４６か、Ｍｉｃｈｉｅｌ（１９９２）、Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ３（１）、３−１５か）とで説明される。
【０２２４】
測定される場合がある免疫細胞の活性は、（１）ＤＮＡ複製を測定することによる細胞増殖と、（２）ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ又はＴＮＦ−アルファのようなサイトカンのための特別な測定を含む増大されたサイトカイン産生と、（３）標的によって仲介された細胞の殺傷又は溶解と、（４）細胞分化と、（５）免疫グロブリン産生と、（６）表現型の変化と、（７）走化性を有するケモタクチン（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｎ）に応答可能なことを意味する走化性因子又は走化性の産生と、（８）ある別の免疫細胞タイプの活性を阻害することによる免疫抑制と、（９）異常な活性の徴候のような特定の環境下で活性化された免疫細胞の断片化を指すアポトーシスとを含むが、これらに限られない。
【０２２５】
改変されたキメラ分子
本発明のコンストラクトは、ある種、例えば、ヒトのような哺乳類から生じているドメインを含む場合がある。しかし、キメラ及び／又はヒト及び／又はヒト化のコンストラクトは、本発明の技術的範囲内であると認識される。
【０２２６】
さらに、本発明の前記ポリヌクレオチド／核酸分子は、例えば、チオエステル結合及び／又はヌクレオチド類似体を含む場合がある。改変することは、例えば、細胞中のエンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼに対して、核酸分子を安定化することに役立つ場合がある。これらの核酸分子は、細胞中で該核酸分子を転写可能なキメラ遺伝子を含む適切なベクターによって転写される場合がある。本発明の前記ポリヌクレオチド／核酸分子は、単独か、組み合わせかのいずれかで組換えて生成された前記核酸分子のいずれかを含むキメラ核酸分子の場合がある。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡか、合成的に生成されたＤＮＡ又はＲＮＡか、単独か、組み合わせかのいずれかで組換えて生産されたこれらのポリヌクレオチドのいずれかを含むキメラ核酸分子かの場合がある。前記ポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、組換えウイルスを含む、例えば、発現ベクターの一部の場合がある。前記ベクターは、適切な宿主細胞中で、かつ、適切な条件下で前記ベクターを選択可能なマーカー遺伝子のような追加の遺伝子を含む場合がある。
【０２２７】
ある局面では、本発明の前記ポリヌクレオチドは、原核生物又は真核生物の細胞で、発現可能な発現制御配列に効果的に結合される。前記ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへの前記ポリヌクレオチドの転写を含む。哺乳類細胞のような真核生物の細胞を含む細胞中で発現を保証している調節エレメントは当業者に周知である。それらは、翻訳の開始を保証している調節配列と、任意に、転写の終止及び転写産物の安定性を保証しているポリＡシグナルとをしばしば含む。追加の調節エレメントは、転写及び翻訳のエンハンサー、及び／又は、天然に備わった又は異種のプロモーター領域を含む場合がある。原核生物の宿主細胞で発現可能な模範的な調節エレメントは、例えば、大腸菌中のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃのプロモーターを含み、真核生物の宿主細胞で発現可能な調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１又はＧＡＬ１のプロモーターか、ＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）か、ＣＭＶ−エンハンサーか、ＳＶ４０−エンハンサーか、哺乳類その他の動物細胞のグロビンのイントロンかである。本発明の前記核酸は、転写の開始に応答可能なエレメントに加えて、他のエレメントと、かかる調節エレメントと、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位又はｔｋ−ポリ−Ａ部位のような転写終止シグナルとを含む（終止配列はポリヌクレオチドをコードしている配列の下流であることが典型的である。）。さらに、用いられた発現系次第で、細胞性画分に前記ポリペプチドを向けること、又は、培地中にそれを分泌することを可能にするリーダー配列をエンコードする核酸配列は、本発明の前記ポリペプチドのコード配列に付加される場合があり、かかるリーダー配列は当業者に周知である。前記リーダー配列は、翻訳、開始及び終止の配列を有する適切な相に集められる。ある局面では、前記リーダー配列は、翻訳されたキメラタンパク質又はこの一部分を細胞膜周辺の空間か、細胞外の培地か分泌することを可能にする。任意に、異種の配列は、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化又は単純化された精製を付与しているＮ−末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をエンコードする場合があり、上記を参照せよ。この文脈において、適切な発現ベクターは、オカヤマ−バークｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）のような従来技術として知られる。発現制御配列は真核生物の宿主細胞を形質転換又はトランスフェクション可能なベクターの真核生物のプロモーター系の場合があり、原核生物の宿主のための制御配列が用いられる場合もある。一度、前記ベクターが適切な宿主に取り込まれると、前記宿主は前記ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適切な条件下で維持される場合があり、所望の場合には、本発明の前記ポリペプチドの収集及び精製が後に続く場合がある。
【０２２８】
上記のように、本発明の前記ポリヌクレオチドは、本発明のキメラ融合分子を発現するために、単独又はベクター（例えば、発現ベクター又は組換えウイルス）の一部分としてか、あるいは細胞で用いられる場合がある。本発明の前記キメラ融合分子のうちいずれか１個をエンコードするＤＮＡ配列を含む前記ポリヌクレオチド又はベクターは、興味のある前記ポリペプチドを実際に生成する前記細胞に導入される場合がある。
【０２２９】
本発明は、本発明のキメラ融合分子をエンコードするポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージか、あるいは遺伝子工学で従来的に用いられた発現系のいずれかに関する。前記ベクターは、発現ベクター及び／又は遺伝子導入又はターゲッティングベクターの場合がある。レトロウイルス、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はウシパピローマウイルスのようなウイルスから得られた発現ベクターが、本発明の前記ポリヌクレオチド又はベクターを標的にされた細胞集団への送達のために用いられる場合がある。当業者に周知の方法が組換えベクターを構築するために用いられる場合があり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、ニューヨーク州と、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク州（１９８９）とで説明された手法を参照せよ。代替的に、本発明の前記ポリペプチド及びベクターは、標的細胞に送達するためのリポソームに再構築される場合がある。本発明の前記ポリペプチドを含む前記ベクターは、細胞性宿主のタイプに非常に依存する周知の方法によって前記宿主細胞に導入される場合がある。例えば、塩化カルシウムトランスフェクション法は原核生物の細胞に一般的に利用される一方、リン酸カルシウム処理又は電気穿孔法は別の細胞性宿主のために用いられる場合があり、上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照せよ。
【０２３０】
一度発現されると、本発明の前記キメラ融合分子は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当業者に標準的な手順に従って精製される場合があり、Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州（１９８２）を参照せよ。代替的な局面では、本発明は、少なくとも約９０％ないし約９５％の均一性と、約９５％ないし約９８％の均一性と、約９８％ないし約９９％又はそれ以上の均一性との実質的に純粋なキメラポリペプチドに関し、これらの「実質的に純粋」なポリペプチドが医薬品の調製で用いられる場合がある。部分的か、あるいは所望のような均一性に一度精製されると、その後、前記ポリペプチドは、（体外的なものを含む）治療か、あるいはアッセイ手順の開発又は実施で用いられる場合がある。
【０２３１】
さらに追加の実施態様では、本発明は、本発明の前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞か、本発明のポリヌクレオチド又はベクター形質転換された宿主細胞かに関する。代替的な局面では、特に、前記ポリペプチドの治療上の使用が考えられる場合には、哺乳類の細胞のような前記宿主／細胞は真核生物の細胞である。当然、特に、生成されたポリペプチドが非医薬品の目的、例えば、診断テスト又はキットか、スクリーニング方法かで用いられる場合には、酵母及び原核生物、例えば細菌の細胞は十分に役立つ。
【０２３２】
前記宿主細胞に存在する本発明の前記ポリヌクレオチド又はベクターは、前記宿主細胞のゲノムに統合されるか、例えば、エピソームのように染色体外に保持されるかのいずれかの場合がある。
【０２３３】
「原核生物の」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを発現するためにＤＮＡ又はＲＮＡの分子で形質転換又はトランスフェクションされる場合がある全ての細菌を含むことを意味する。原核細胞の宿主は、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス及び枯草菌のようなグラム陰性及びグラム陽性の細菌を含む場合がある。「真核生物の」という用語は、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞を含むことを意味する。組換え体の生成手順で供された宿主次第で、本発明の前記キメラ融合分子はグリコシル化されるか、あるいはグリコシル化されない場合がある。本発明のキメラ融合分子は、開始メチオニンのアミノ酸残基を含む場合もある。本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、当業者に一般的に知られた手法のいずれかを用いて前記宿主を形質転換又はトランスフェクションするために用いられる場合がある。
【０２３４】
ある局面では、（ベクター、例えば、プラスミド又はウイルスの核酸配列を含む）本発明の前記キメラポリペプチドをエンコードする前記核酸は、エピトープタグ、例えば、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ及び／又はＣ末端Ｈｉｓタグをエンコードする配列に遺伝的に融合されたものをさらに含む。ある局面では、前記ＦＬＡＧタグの長さは約４個ないし８個のアミノ酸か、長さが約８個のアミノ酸かである。融合されたもの、実施して結合された遺伝子を調製すること、及び、例えば、哺乳類細胞又は細菌でそれらを発現することのための方法は当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９）。そこで説明された遺伝的なコンストラクト及び方法は、真核生物又は原核生物の宿主で本発明のポリペプチドを発現するために利用される場合がある。一般的に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターが、前記宿主に関して用いられる場合がある。前記発現ベクターは、複製起点、プロモーター及びターミネーターと、形質転換された細胞の表現型選択を提供することが可能な特定の遺伝子とを含むことが典型的である。さらに、本発明の核酸又は細胞を含む哺乳類（例えば、マウス、ヤギ）のようなトランスジェニック非ヒト動物が、本発明の前記キメラポリペプチドの大規模生成のために用いられる場合がある。
【０２３５】
追加の実施態様では、本発明は、前記キメラ融合分子のコンストラクトの発現に適切な条件下で本発明の（宿主）細胞を培養すること、及び、前記細胞又は培地から前記ポリペプチドを単離することを含む本発明のポリペプチドの調製のための処理に関する。形質転換された宿主は、至適な細胞増殖を達成するために、培養器（ｆｅｒｍｅｎｔｏｒｓ）で増殖され、当業者に知られた手法に従って培養される場合がある。その後、本発明の生成されたコンストラクトは、増殖培地、細胞可溶化物又は細胞膜の画分から単離される場合がある。本発明のポリペプチドの発現された（微生物で発現された）ポリペプチドの単離及び精製は、例えば、調製用クロマトグラフィー分離のような従来の手段と、例えば、本発明の前記ポリペプチドのタグか、追加された例で説明されたものかに対するモノクローナル又はポリクローナルの抗体の使用を含むもののような免疫学的分離とのいずれかによって行われる場合がある。
【０２３６】
前記宿主細胞次第で、復元手法が適切な構造を達成するために必要とされる場合がある。必要な場合には、結合を至適化するために探求している点置換は、従来のカセットミュータジェネシスその他の本明細書で記載されたようなタンパク質工学の方法論を用いるＤＮＡで作成される場合がある。本発明の前記ポリペプチドの調製は、酵素か、毒物か、増殖因子か、細胞分化因子か、受容体か、抗代謝産物か、ホルモンか、さまざまなサイトカイン又はリンホカインかのような生理活性タンパク質のアミノ酸配列（、又は、対応するＤＮＡ又はＲＮＡ配列）の知識に依存する場合がある。かかる配列が文献で報告され、コンピューター化されたデータバンクを介して利用可能である。本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってエンコードされたか、あるいは本明細書の上部で説明された方法によって生成されたキメラポリペプチドにさらに関する。
【０２３７】
追加的に、本発明は、本明細書で説明されたような前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記宿主及びキメラ融合分子を含む組成物を提供する。
【０２３８】
本発明の内容の「組成物」という用語は、本明細書で説明されたような本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、キメラポリヌクレオチドのうち少なくとも１つを含む。前記組成物は、任意に、免疫系を変調及び／又は干渉することが可能な分子のような単独か、組み合わせかのいずれかの別の分子をさらに含む。前記組成物は、固体、液体又は気体の場合があり、特に、粉末、錠剤、溶液又は噴霧剤の場合がある。代替的な実施態様では、前記組成物は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４又は５個以上の本発明の化合物を含む。前記組成物は、任意に、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤をさらに含む医薬品組成物の場合がある。
【０２３９】
ヒト化抗体
好ましい実施態様では、本発明の抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体を含む。ヒト化抗体は、軽鎖及び重鎖の遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリンの可変領域及び定常領域の遺伝子から典型的に遺伝子工学によって構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する前記遺伝子の可変セグメントは、ガンマ１及びガンマ３のようなヒト定常セグメントに結合される場合がある。したがって、別の哺乳類が用いられる場合があるが、典型的な治療上のキメラ抗体は、マウス抗体に由来する可変又は抗原結合のドメインと、ヒト抗体に由来する定常又はエフェクターのドメインとからなるハイブリッドタンパク質である。
【０２４０】
本明細書で用いられるところの「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトのフレームワーク領域と、非ヒト（通常、マウス又はラット）の免疫グロブリンに由来する１個又は２個以上のＣＤＲとを含む免疫グロブリンを指す。前記ＣＤＲを提供する前記非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と称され、前記フレームワークを提供する前記ヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。定常領域が存在する必要はないが、定常領域がある場合には、それらは、例えば、少なくとも約８５−９０％、好ましくは約９５％又はそれ以上の同一性で、ヒト免疫グロブリンの定常領域と実質的に同一となれなければならない。したがって、おそらく前記ＣＤＲを除く、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応している部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖の免疫グロブリンを含む抗体であり、例えば、キメラ抗体の完全な可変領域は非ヒトである。結果として生じるヒト化抗体が前記ＣＤＲを提供する前記ドナー抗体のように同一の抗原に結合することが期待されるため、前記ドナー抗体はヒト化処理によって「ヒト化」されていると言われることがある。
【０２４１】
前記ヒト化抗体は、抗原結合その他の免疫グロブリン機能に実質的に全く影響を及ぼさない追加の保存的なアミノ酸置換を有する場合があると理解される。保存的な置換によるものは、Ｇｌｙ、Ａｌａと、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕと、Ａｓｐ、Ｇｌｕと、Ａｓｎ、Ｇｌｎと、Ｓｅｒ、Ｔｈｒと、Ｌｙｓ、Ａｒｇと、Ｐｈｅ及びＴｙｒとのような組み合わせが意図される。
【０２４２】
ヒト化抗体を含むヒト化免疫グロブリンは、遺伝子工学によって構築される。以前に説明された多くのヒト化免疫グロブリンは、特定のヒト免疫グロブリン鎖と、前記アクセプターと、非ヒトドナー免疫グロブリン鎖に由来する３つのＣＤＲとのフレームワークと同一である該フレームワークを含んでいる。
【０２４３】
フレームワークが、ヒト化すべき前記ドナーの免疫グロブリンと通常ではありえないほど相同である特定のヒト免疫グロブリンから、アクセプターとして用いられるというのが原則であるが、多くのヒト抗体に由来する連続的なフレームワークを用いる。例えば、データバンク（例えば、国立生物医学研究財団のタンパク質同定情報源（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ））中のマウスの重鎖（又は軽鎖）の可変領域の配列と、ヒトの重鎖（又は軽鎖）の可変領域とを比較することは、異なるヒト領域に対する相同性の程度が典型的に約４０％から約６０−７０％まで大きく変化することを示す。前記ドナー免疫グロブリンの前記ヒト重鎖（各軽鎖）の可変領域に最も相同性である前記ヒト重鎖（各軽鎖）の可変領域の１つを前記アクセプター免疫グロブリンとして選択することによって、アミノ酸は前記免疫グロブリンから前記ヒト化免疫グロブリンまでほとんど変化されないであろう。したがって、理論によって結合されることが再び意図されないで、それらの構造を破壊するＣＤＲの近傍のアミノ酸を変化する機会はほとんどないと考えられる。さらに、前記ＣＤＲを破壊する機会を低下させる場合には、ヒト化免疫グロブリン鎖を含む正確なヒト化抗体の全体形状は、ドナー抗体の形状により密接に似る場合がある。
【０２４４】
典型的に、少なくとも約１０ないし２０個の個別のヒト重鎖の典型的な収集物中で最も相同性の重鎖可変領域配列３ないし５個のうち１個は、重鎖のフレームワークと、軽鎖のフレームワークとを提供するためにアクセプターとして選択されるであろう。好ましくは、１−３個の最も相同性の可変領域の１個が用いられであろう。選択されたアクセプター免疫グロブリン鎖は、ドナー免疫グロブリンに対するフレームワーク領域で少なくとも約６５％の相同性を有することが最も好ましいであろう。
【０２４５】
多くの場合、アクセプター配列として同一のヒト抗体に由来する好ましい軽鎖及び重鎖を使用すること、つまりヒト化軽鎖及び重鎖とすることは、各々に好ましい接触を起こすであろうと考えられる場合がある。いかに前記アクセプターが選択されるかにかかわらず、高親和性は、前記アクセプターよりもむしろドナーでそれぞれの部位のアミノ酸が同一となるようにヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワークで少数のアミノ酸を選択することによって達成される場合がある。
【０２４６】
ヒト化抗体は、ヒトの療法での使用のために、マウス抗体か、あるいはある場合にはキメラ抗体よりも一般的に利益を有し、エフェクター部分がヒトであるために、ヒト免疫系の別の部分とより相互作用する（例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によってより効果的に前記標的細胞を破壊する）場合があり、ヒト免疫系が外来のヒト化抗体のフレームワーク又は定常領域を認識すべきではなく、したがって、かかる抗体に対する抗体応答は、全体的に外来のマウス抗体か、部分的に外来のキメラ抗体かに対してよりもより低くなるべきである。
【０２４７】
抗体は遺伝的に設計される場合もある。腫瘍抗原、例えば、ＨＥＲ２のような所望な抗原に結合可能なドナー免疫グロブリンに由来する重鎖又は軽鎖のＣＤＲをエンコードする組換えＤＮＡセグメントを発現することによって生成され、アクセプターのヒトフレームワーク領域をエンコードするＤＮＡセグメントに結合されるヒト化免疫グロブリンが特に好ましい。
【０２４８】
前記ＤＮＡセグメントは、天然に備わった又は異種のプロモーター領域を含む配列をコードしているヒト化免疫グロブリンに実施して連結された発現制御ＤＮＡ配列をさらに含むことが典型的である。好ましくは、前記発現制御配列は原核生物の宿主細胞を形質転換又はトランスフェクション可能なベクターの真核生物のプロモーターシステムとなるであろうが、原核生物の宿主のための制御配列が用いられる場合もある。一度、前記ベクターが適切な宿主に取り込まれると、前記宿主はヌクレオチド配列の高レベルの発現に適切で条件下で維持され、かつ、所望の場合には、ヒト化軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖の２量体又は昆虫の抗体か、結合断片か、別の免疫グロブリンの形状の採取及び精製が後に行なわれる場合がある（引用により本明細書に取り込まれるＳ．  Ｂｅｙｃｈｏｋ、Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、（１９７９）を参照せよ。）。
【０２４９】
ヒト定常領域のＤＮＡ配列は、周知の手順に従って、さまざまなヒト細胞から単離される場合があるが、不死化されたＢ細胞が好ましい。本発明の好ましい免疫グロブリンを生成するためのＣＤＲは、ヒトＴ細胞受容体ＣＤ３複合体のような予定された抗原に結合可能なモノクローナル抗体から同様に得られ、抗体を産生可能なマウス、ラット、ウサギその他の脊椎動物を含む従来の哺乳類の供給源のいずれかにおいて周知の方法によって生成されるであろう。前記定常領域及びフレームワークのＤＮＡ配列のための適切な供給源の細胞と、免疫グロブリンの発現及び分泌のための宿主細胞とは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のような多くの供給源から得られる場合がある（引用により本明細書に取り込まれる「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、第６編、（１９８８）  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）。
【０２５０】
天然の配列に対して別の「実質的に相同な」改変された免疫グロブリンは、当業者に周知のさまざまな組換えＤＮＡ手法を利用して容易に設計され、生産される場合がある。例えば、前記フレームワークは、さまざまなアミノ酸置換、末端及び中間の付加及び欠失等によって１次構造レベルを変更する場合がある。さらに、さまざまな異なるヒトフレームワーク領域は、単独か、本発明のヒト化免疫グロブリンの基礎との組み合わせかで用いられる場合がある。一般的に、遺伝子の改変は、部位特異的変異体作製法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のようなさまざまな周知の手法によって容易に達成される場合がある（引用により本明細書に取り込まれるＧｉｌｌｍａｎ及びＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ、８、８１−９７（１９７９）と、Ｓ．  Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２８、７３１−７３４（１９８７）との両方を参照せよ。）。
【０２５１】
実質的に相同な免疫グロブリン配列は、基準の免疫グロブリンタンパク質と、少なくとも約８５％の相同性と、通常少なくとも約９０％と、好ましくは少なくとも９５％の相同性とを示すものである。
【０２５２】
代替的に、抗体の１次構造の一部分のみを含むポリペプチド断片が生成される場合があり、前記断片は、１種類又は２種類以上の免疫グロブリン活性（例えば、補体結合活性）を有する。これらのペプチド断片は当業者に周知の方法による完全抗体のタンパク質分解によってか、あるいは部位特異的変異体作製法を用いて当業者に知られたベクターの所望の部位に終止コドンを挿入することによって生成される場合がある。
【０２５３】
上記のように、ＤＮＡ配列が発現制御配列に実施して連結された（例えば、発現制御配列の機能を保証するために配置された）後、前記配列は宿主で発現される場合がある。これらの発現ベクターは、エピソームか、宿主の染色体ＤＮＡの不可欠な部分かのいずれかとして宿主生物で複製可能であることが典型的である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞を検出可能にするために、例えば、テトラサイクリン又はネオマイシンの耐性の選択マーカーを含む（例えば、引用により本明細書に取り込まれる米国特許第４，７０４，３６２号明細書を参照せよ。）。
【０２５４】
大腸菌は、特に、本発明の前記ＤＮＡ配列をクローニングするために役立つ原核生物の宿主の１つである。使用のために適切な別の微生物の宿主は、枯草菌のような桿菌と、サルモネラ菌、セラチア菌及びさまざまなシュードモナス菌種のような別の腸内細菌とを含む。これらの原核生物の宿主では、前記宿主細胞で互換性のある発現制御配列（例えば、複製開始点）を典型的に含むであろう発現ベクターとなる場合もある。さらに、ラクトースプロモーターシステムか、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステムか、ベータ−ラクタマーゼプロモーターシステムか、ラムダファージ由来のプロモーターシステムかのような周知のさまざまなプロモーターが多く提供されるであろう。前記プロモーターは、転写及び翻訳の開始又は終止するために、任意にオペレーター配列を有し、かつ、リボソーム結合部位配列等を有する発現ベクターであろうことが典型的である。
【０２５５】
酵母のような別の微生物が発現のために用いられる場合もある。サッカロマイセス属は好ましい宿主であり、適切なベクターが、３−ホスホグリセリンキナーゼその他の解糖酵素を含むプロモーターと、所望の複製開始点、終止配列等との発現制御配列を有する。
【０２５６】
微生物に加えて哺乳類の組織細胞培養が、本発明のポリペプチドを発現及び生成するために用いられる場合もある（引用により本明細書に取り込まれるＷｉｎｎａｃｋｅｒ、「Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ」、ＶＣＨ出版社、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８７）を参照せよ。）。完全免疫グロブリンを分泌可能な適切な宿主細胞株の多くは、当業者に開発されているため、真核生物の細胞が実際に好ましく、ＣＨＯ細胞株と、さまざまなＣＯＳ細胞株と、Ｈｅｌａ細胞と、好ましい黒色腫細胞株等と、形質転換されたＢ細胞又はハイブリドーマとを含む。これらの細胞のための発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサーのような発現制御配列（引用により本明細書に取り込まれるＱｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ、８９、４９−６８（１９８６））と、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリＡ化部位及び転写終止配列のような必須なプロセッシング情報部位とを含む場合がある。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するプロモーターである。
【０２５７】
興味のあるＤＮＡセグメント（例えば、重鎖及び軽鎖をエンコードする配列及び発現制御配列）を含むベクターは、細胞性の宿主のタイプに非常に依存する周知の方法によって前記宿主細胞に導入される場合がある。例えば、塩化カルシウムトランスフェクション法が原核生物の細胞のために一般的に利用される一方、リン酸カルシウム処理又は電気穿孔法が別の細胞性の宿主に用いられる場合がある。（一般的に、引用により本明細書に取り込まれるＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８２）を参照せよ。）
【０２５８】
一度発現されると、本発明の完全な抗体か、この２量体か、軽鎖及び重鎖のそれぞれか、別の免疫グロブリンの形状かは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当業者に標準的な手順に従って精製される場合がある（一般的に、Ｒ．  Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州（１９８２））。医薬品の使用のために、少なくとも約９０ないし９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが精製され、９８ないし９９％か、それよりも高い均質性でたいては精製される。部分的か、あるいは所望の均一性で、一度精製されると、その後、ポリペプチドは、（体外的なものを含む）治療か、あるいはアッセイ手順、免疫蛍光染色等の開発又は実施かで用いられる場合がある。（一般的に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１巻及び第２巻、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ及びＰｅｒｎｉｓ、編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、ニューヨーク（１９７９及び１９８１）を参照せよ。）
【０２５９】
一般的に、ヒト化抗体は、腫瘍抗原、好ましくはＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する抗体の重鎖及び軽鎖の可変配列をエンコードする核酸配列を得ること、重鎖及び軽鎖の可変配列のＣＤＲを同定すること、及び、かかるＣＤＲ核酸配列をヒトフレームワーク核酸配列に融合することによって生成される。
【０２６０】
好ましくは、選択されたヒトフレームワークは、例えば、免疫原性を示さない、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適切であると期待されるフレームワークとなるであろう。これは、例えば、かかる抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用の事前実験と、アミノ酸配列の類似性研究とによって決定される場合がある。近年のアプローチでは、ヒト化のための前記抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列が既知のヒトフレームワーク領域の配列と比較され、かつ、選択されたＣＤＲの融合のために用いられるヒトフレームワーク領域は、親抗体、例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合するマウス抗体の領域と最も類似するサイズ及び配列を含む。多くのヒトフレームワーク領域が単離されており、これらの配列は文献で報告されている。例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２、６６０９−６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （１９９１））を参照せよ。これは、抗原結合構造と、親抗体の結合親和性とを顕著に保持する選択されたヒトフレームワーク領域に融合された前記親（例えば、マウス）抗体のＣＤＲを含む、結果として生じるＣＤＲが融合された「ヒト化」抗体の可能性を増大する。
【０２６１】
免疫グロブリンをエンコードする核酸配列をクローニングのための方法は当業者に周知であり、以下の実施例で詳細に説明される。かかる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって適切なプライマーを用いてクローニングするための免疫グロブリン配列の増幅を一般的に含む。免疫グロブリン核酸配列と、特異的にマウス重鎖及び軽鎖の可変配列とを増幅するための適切なプライマーが前記文献で報告されている。かかる免疫グロブリン配列がクローニングされた後、これらは当業者に周知な方法によってシークエンスされる。これは、ＣＤＲ及びＦＲを構成する重鎖及び軽鎖の可変配列と、より特異的なこれらの一部分とを同定するために影響されるであろう。これは周知の方法によって影響される場合がある。
【０２６２】
一度ヒト化するためにクローニングされた抗体配列の前記ＣＤＲ及びＦＲが同定されると、その後、ＣＤＲをエンコードするアミノ酸配列は（核酸配列及び遺伝暗号を利用する予測と、以前の抗体配列の比較とによって）同定され、対応する核酸配列は選択されたヒトＦＲに融合される。これは適切なプライマー及びリンカーの使用によって達成される場合がある。所望の核酸配列の結合を提供するための適切なプライマー及びリンカーの選択方法は当業者に周知であり、Ｂｏｓｓらの米国特許第４，８１６，３９７明細書と、Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，２２５，５３９号明細書とで開示された方法を含む。
【０２６３】
ＣＤＲは選択されたヒトＦＲに融合された後、結果として生じる「ヒト化」重鎖及び軽鎖の可変配列は、その後、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕに結合するヒト化キメラ融合分子を生成するために発現されるであろう。ヒト化重鎖及び／又は軽鎖の可変配列は、例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する未消化のキメラ融合分子が生成されるように融合タンパク質として発現されるであろう。
【０２６４】
別の好ましい実施態様では、前記重鎖及び軽鎖の配列は、例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合するヒト化Ｆｖキメラ融合分子を生成するために定常配列なしで発現される場合もある。しかし、ヒト化可変領域にヒト定常配列を融合することは、例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する、結果として生じるヒト化抗体が、その後、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性のようなヒトエフェクター機能を有するため、潜在的に望ましい。
【０２６５】
以下の引用文献は、本発明を実施するのに利用される場合がある組換え免疫グロブリンの発現に適切な方法及びベクターの典型である。Ｗｅｉｄｌｅら、Ｇｅｎｅ、５１：２１−２９（１９８７）と、Ｄｏｒａｉら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３（１２）：４２３２−４２４１（１９８７）と、Ｄｅ  Ｗａｅｌｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７６：２８７−２９５（１９８８）と、Ｃｏｌｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４９：１７３８−１７４５（１９８９）と、Ｗｏｏｄら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５（ａ）：３０１１−３０１６（１９９０）と、Ｂｕｌｅｎｓら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９５：２３５−２４２（１９９１）と、Ｂｅｇｇｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏｌ．  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９（１９９２）と、Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、２８１：３１７−３２３（１９９２）と、Ｐａｇｅら、Ｂｉｏｌ．  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：６４（１９９１）と、Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、２９０：７２３−７２９（１９９３）と、Ｃｈａｕｄａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：３９４−３９７（１９８９）と、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）と、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４４：６５−９２（１９８８）と、Ｂｅｎｈａｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１：１２０５１−１２０５５（１９９４）と、Ｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０：２８４４−２８５７（１９９３）と、Ｃｏｏｔｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３（３）：２１５−２１９（１９９４）と、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６：１００２９−１００３３（１９８９）と、Ｃａｒｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、３２：６７６１−６７６７（１９９２）と、Ｃｏｔｏｍａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、１５２：８９−１０９  （１９９２）とを参照せよ。さらに、組換え抗体の発現に適切なベクターは商業的に入手可能である。前記ベクターは、例えば、裸の核酸セグメント、担体関連核酸セグメント、ヌクレオプロテイン、プラスミド、ウイルス、ウイロイド又は転位性エレメントの場合がある。
【０２６６】
機能的な免疫グロブリンを発現することが可能な既知の宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞と、ＣＯＳ細胞と、ＮＳＯ及びＳＰ２／０細胞のようなミエローマ細胞と、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような細菌と、サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と、別の宿主細胞とを含む。ＳＰ２／０細胞は、本発明に役立つ宿主細胞の好ましいタイプのの１つである。
【０２６７】
発現後、結果として生じるヒト化抗体の抗原結合親和性は、既知の方法、例えば、スキャッチャード解析によってアッセイされるであろう。特に好ましい実施態様では、前記ヒト化抗体の抗原結合親和性は、例えば、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕの親抗体の親和性の少なくとも５０％となるであろうし、前記ヒト化抗体の親和性は親抗体の親和性の少なくとも約７５％となるでろうことがより好ましく、前記ヒト化抗体の親和性は親抗体の親和性の少なくとも約１００％、１５０％、２００％又は５００％となるでろうことがより好ましい。
【０２６８】
ある例では、選択されたヒトフレームワーク領域に（例えばＨＥＲ／ｎｅｕのような例えば腫瘍抗原に結合する抗体からの）ＣＤＲを融合することによって生成されたヒト化抗体は、ＨＥＲ／ｎｅｕに対する所望の親和性を有するヒト化抗体を提供する場合がある。しかし、抗原の結合を増大するために前記選択されたヒトフレームワークの特定の残基をさらに改変することが必要又は所望される場合がある。これは、いくつかのフレームワーク残基が抗原結合に必要か、あるいは少なくとも影響すると考えられるために生じる場合がある。好ましくは、組み合わせている部位構造を維持するか、あるいは影響する前記親（例えば、マウス）抗体のこれらのフレームワーク残基は維持されるであろう。これらの残基は、前記親抗体又はＦａｂ断片のＸ線結晶解析、つまり、抗原結合部位の３次元構造を同定することによって同定される場合がある。また、抗原結合に関係するフレームワーク残基は、以前に報告されたヒト化マウス抗体配列を利用して潜在的に同定される場合がある。したがって、それは、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕの結合を至適化するための親マウス抗体に由来するかかるフレームワーク残基その他の残基を維持するために有用な場合がある。好ましくは、かかる方法論は結果として生じるヒト化抗体に「ヒト様」の特徴、つまり、免疫原性を消失している一方、内部を維持し、かつ、抗原結合に影響する残基に接触する特徴を付与するであろう。
【０２６９】
本発明は、本明細書に列挙されたヒト化抗体及び抗体断片に実質的に相同なバリアント及び同等な物をさらに含む。これらは、例えば、保存的な置換突然変異、例えば、類似のアミノ酸による１個又は２個以上のアミノ酸の置換を含む場合がある。例えば、保存的な置換は、同一の一般的なクラス内で別のアミノ酸でのあるアミノ酸の置換、例えば、別の酸性アミノ酸でのある酸性アミノ酸の置換か、別の塩基性アミノ酸でのある塩基性アミノ酸の置換か、別の天然アミノ酸でのある天然アミノ酸の置換かを指す。保存的なアミノ酸置換によって意図されることは当業者に周知である。
【０２７０】
キメラ分子の細胞への送達方法
本発明は抗血管新生剤−担体キメラ分子を細胞に送達する方法も提供する。本発明の前記キメラ分子は、既知の方法のいずれかによって細胞に送達される場合がある。例えば、キメラ分子を含む組成物は、培地に懸濁された細胞に添加される場合がある。代替的に、キメラ分子は、前記キメラ分子がｉｎ  ｓｉｔｕで前記細胞に結合するために、前記キメラ分子に結合する受容体を発現している細胞を有する動物に（例えば、非経口経路によって）投与される場合がある。例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＩｇドメインを特徴とする本発明の前記キメラ分子は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰に発現する腫瘍細胞、例えば、乳癌及び卵巣癌の細胞に結合するための標的化原子団として特に相応しい。
【０２７１】
動物への組成物の投与
ｉｎ  ｓｉｔｕで腫瘍細胞を標的にするために、上記の前記組成物は、いずれかの適切な処方でヒトを含む動物に投与される場合がある。例えば、腫瘍細胞を標的にするための組成物は、薬学的に許容可能な担体か、生理食塩水又は緩衝塩水溶液のような希釈剤かで処方される場合がある。適切な担体及び希釈剤は、投与の様式及び経路と、標準的な薬務とにもとづいて選択される場合がある。典型的な薬学的に許容可能な担体及び希釈剤と、医薬品の処方とは、レミントンの薬学と、この分野の標準的な教科書と、ＵＰＳ／ＮＦとで知られる場合がある。別の物質が、前記組成物を安定化及び／又は保護するために組成物に添加される場合がある。
【０２７２】
本発明の前記組成物はいずれかの従来手法によって動物に投与される場合がある。前記組成物は、例えば、体内又は体外の標的部位への外科的な送達か、あるいは血管による到達可能な部位へのカテーテルによって直接的に標的部位に投与される場合がある。送達の別の方法、例えば、リポソーム送達か、前記組成物で満されたデバイスからの拡散かが当業者に知られる。前記組成物は、単回ボーラス投与か、複数回注射か、持続投与（例えば、静注）かで投与される場合がある。非経口投与のために、前記組成物は、パイロジェンを含まない殺菌された剤形で処方されることが好ましい。好ましい実施態様では、前記組成物は、静注、非経口、筋注等で投与される。
【０２７３】
治療方法
好ましい実施態様では、癌患者を治療する方法は、本明細書で説明されたキメラ融合分子を含む該キメラ融合分子を患者に投与することを含む。
【０２７４】
好ましい実施態様では、前記キメラ融合分子は、抗ＨＥＲ２結合ドメインと、１２５番目のアミノ酸部位でプロリンがアラニンで置換されたエンドスタチン分子とを含むポリペプチドを含む。
【０２７５】
本明細書で説明された前記キメラ分子は、エンドスタチン又はハーセプチンの単体と比較して、優れた抗血管新生の特徴を示すことが発見されている。例えば、ハーセプチン単体での腫瘍の治療は、ハーセプチン耐性をもたらし、前記腫瘍は増殖することを続ける。さらに、これらのキメラ分子は、低レベルのＨｅｒで、かつ、ハーセプチンで治療できないＨｅｒ２−と称される腫瘍を治療する。したがって、前記キメラ融合分子はＨｅｒ２難治性腫瘍の治療に役立つ。
【０２７６】
エンドスタチンでの臨床実験は失敗した（Ｔｈｏｍａｓ  ＪＰら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；２１（２）：２２３−３１、Ｈａｎｓｍａ  ＡＨら、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００５；１６（１０）：１６９５−７０１、Ｋｕｌｋｅ  ＭＨら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；２４（２２）：３５５５−６）。初期のヒト第１相試験では、さまざまな投与レベル及び計画でｈｕＥｎｄｏを投与することは、実行可能かつ安全であった。しかし、抗腫瘍活性又は生物活性に関する一貫した証拠が全く示されなかった。第２相試験において１日あたり２回の皮下注射で投与されるｈｕＥｎｄｏで治療された進行性膵内分泌腫瘍又はカルチノイド腫瘍の患者４２人で、ｈｕＥｎｄｏが最小毒性と関係付けられた。しかし、部分的な応答を達成した患者は全く存在せず、患者２人のみが生化学反応を有した。したがって、初期臨床試験は、さまざまな投与計画で送達されたエンドスタチンが非常に安全な薬物である一方、それらはマウスモデルで見られた抗腫瘍活性と比較して、同等の抗腫瘍活性を示さなかったと証明した。反対に、本明細書で説明された前記キメラ融合分子は治療上有効である。その結果の詳細は以下の実施例で示される。
【０２７７】
好ましい実施態様では、前記キメラ融合分子は腫瘍特異的抗原のいずれかを標的にする場合がある。例は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原、ホスファターゼ及びテンシン類似体（ＰＴＥＮ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）キナーゼ及びこの受容体、Ｅｐｈ、ＶＥＧＦ及びこの受容体、受容体／リガンド複合体、これらのリガンド、受容体、アレル及びバリアントを含むが、これらに限られない。
【０２７８】
別の好ましい実施態様では、本明細書に説明された前記融合分子は、単独か、１種類又は２種類以上の別の化合物との組み合わせかのいずれかで一定の間隔で（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ）投与される。これらの化合物は、例えば、抗血管新生剤、化学療法剤、細胞周期停止剤、ケモカイン、サイトカイン等を含む。例は、アンジオゲニン、アンジオスタチン、ケモカイン、アンジオアレスチン、アンジオスタチン（プラスミノゲン断片）、抗血管新生因子由来の基底膜コラーゲン（タムスタチン、カンスタチン又はアレスチン）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、シグナル伝達阻害剤、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体断片、フィブロネクチン断片、ｇｒｏ−ベータ、へパリナーゼ、ヘパリン六糖類断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロン・アルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノゲン断片）、メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノゲン活性化因子阻害剤、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、さまざまなレチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）等を含むが、これらに限られない。これらの分子は、全て形状、これらのバリアント、突然変異、アレル、置換、断片及び類似体を含む。
【０２７９】
別の好ましい実施態様では、前記キメラ融合分子治療は、シグナル伝達阻害剤と、ベバシズマブ（アバスチン）と、例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、セレブレックス、ＭＴＯＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤等のような抗血管新生剤とを含む１種類又は２種類以上の化合物を用いて投与した。当業者は、別の治療化合物がキメラ融合分子の投与計画を含む治療と組み合わせて投与される場合があると確認するであろう。
【０２８０】
動物への組成物の投与
ｉｎ  ｓｉｔｕで腫瘍細胞を標的にするために、上記の前記組成物は、いずれかの適切な処方でヒトを含む動物に投与される場合がある。例えば、腫瘍細胞を標的にするための組成物は、薬学的に許容可能な担体か、生理食塩水又は緩衝塩水溶液のような希釈剤かで処方される場合がある。適切な担体及び希釈剤は、投与の様式及び経路と、標準的な薬務とにもとづいて選択される場合がある。典型的な薬学的に許容可能な担体及び希釈剤と、医薬品の処方とは、レミントンの薬学と、この分野の標準的な教科書と、ＵＰＳ／ＮＦとで知られる場合がある。別の物質が、前記組成物を安定化及び／又は保護するために組成物に添加される場合がある。
【０２８１】
本発明の前記組成物はいずれかの従来手法によって動物に投与される場合がある。前記組成物は、例えば、体内又は体外の標的部位への外科的な送達か、あるいは血管による到達可能な部位へのカテーテルによって直接的に標的部位に投与される場合がある。送達の別の方法、例えば、リポソーム送達か、前記組成物で満されたデバイスからの拡散かが当業者に知られる。前記組成物は、単回ボーラス投与か、複数回注射か、持続投与（例えば、静注）かで投与される場合がある。非経口投与のために、前記組成物は、パイロジェンを含まない殺菌された剤形で処方されることが好ましい。
【０２８２】
処方
抗体又はこの断片を単独で投与することを可能にする一方、医薬品の処方として提供することが好ましい。活性成分が、前記処方の９９．９９９９重量％と等量を含む場合があるが、例えば、０．００１重量％から１００重量％まで、例えば、処方の１重量％から５０重量％までを含む場合がある。
【０２８３】
局部投与のための適切な剤形は、眼、耳又は鼻への投与に適切な塗布剤と、ローション剤と、クリーム剤と、軟膏剤又はペースト剤と、ドロップ剤とのような治療が必要とされる部位に皮膚を介する浸透のための適切な液体又は半液体の調製物を含む。本発明に応じるドロップ剤は、滅菌水又は油性水溶液又は懸濁液を含む場合があり、殺菌剤及び／又は殺真菌剤及び／又はいずれかの別の適切な保存剤の適切な水溶液に活性成分を溶解することによって調製される場合があり、かつ、界面活性剤を含むことが好ましい。その後、結果として生じる溶液は濾過によって浄化及び滅菌され、無菌的手法によって容器に移される場合がある。ドロップ剤に含有するのに適切な殺菌剤及び殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀又は酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）及び酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性水溶液の調製物のための適切な溶媒は、グリセロール、希釈アルコール及びプロピレングリコールを含む。
【０２８４】
キット
本発明に応じるキットは、解凍すること（任意に後にさらに希釈すること）によってか、あるいは（好ましくは緩衝された）液性媒体に懸濁することによって再構成される凍結された又は凍結乾燥されたキメラ融合分子か、ヒト化抗体又はヒト抗体か、ヒト化又はヒト抗体断片かのそれぞれを含む。前記キットは、投与に適切な剤形を生成するために前記融合分子又は抗体断片と混合する目的の（液性又は凍結された形状の）緩衝剤及び／又は賦形溶液か、水で再構築される緩衝剤及び／又は賦形剤の粉末調製物かを含む場合もある。したがって、前記キメラ融合分子、ヒト化抗体又はヒト化抗体断片を含む前記キットは、熱か、水か、前記キットで提供された溶液かの予定量を添加することが、癌の治療又は診断のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用を有効とするための十分な濃度及びｐＨの剤形を生じるであろう濃度で、凍結か、凍結乾燥か、事前希釈か、事前混合かされることが好ましい。かかるキットは、癌を治療又は検出するための前記キメラ融合分子、ヒト化抗体又はヒト化抗体断片の組成物を再構築及び使用するための説明書も含むであろうことが好ましい。前記キットは、再構築された活性組成物のための２種類又は３種類以上の構成部分を含む場合もある。例えば、前記キメラ融合分子、ヒト化抗体又はヒト化抗体断片に加えて第２の構成部分は、前記ヒト化抗体又はヒト化抗体断片、これらのシステムにコンジュゲート化された形状と混合された際に、２機能性キレート剤か、２機能性キレートか、放射性核種のような治療剤かの場合がある。上記の緩衝剤、賦形剤その他の構成部分は、キットと個別又は一緒に販売される場合がある。
【０２８５】
本発明のキメラ融合分子、抗体又は抗体断片の個別投与量の最適の量及び投与間隔は、治療されている症状の性質及び程度と、投与の剤形、経路及び部位と、治療されている特定の動物とによって決定されるであろし、かつ、かかる至適条件が従来手法によって決定される場合があると当業者によって認識されるであろう。治療の至適過程、例えば、規定日数について１日あたりに与えられた本発明の抗体又はこの断片の投与量は、治療決定テストの従来過程を用いて当業者によって確かめられる場合があると当業者によって認識されるであろう。
【０２８６】
抗癌分子及びキメラ融合分子の混合物
ヒト化キメラ融合分子を含むキメラ融合分子は、別の抗癌剤、例えば、別の抗体又は薬物との組み合わせで投与される場合もある。また、前記キメラ分子又は断片は、治療上の活性を有するエフェクターに直接的又は間接的に結合される場合がある。適切なエフェクター原子団は、例として、サイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ、インターフェロン、コロニー刺激因子、ＩＬ−１等）、サイトトキシン（シュードモナス・エンドトキシン、リシン、アブリン等）、なかでも９０Ｙ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉのような放射性核種、薬物（メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン等）、免疫調節剤、治療酵素（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ）、抗増殖剤等を含む場合がある。所望のエフェクターに抗体を結合することは周知である。例えば、Ｃｈｅｎｇらの米国特許第５，４３５，９９０号明細書を参照せよ。さらに、かかる結合を促進するための２機能性リンカーは周知であり、かつ、広く利用可能である。また、放射性核種の結合を提供するキレート物質（キレート剤又はキレート）は周知であり、かつ、利用可能である。
【０２８７】
前記キメラ融合分子は、単独か、例えば、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕの別の抗体との組み合わせかで用いられる場合がある。
【０２８８】
追加の記述なしに、当業者は、前の説明を用いて最大限に本発明を利用する場合があると考えられる。以下の実施例は、限定のつもりでなく、例示のつもりで提供される。特定の例が提供される一方、上記の説明は例示であり、限定するものではない。以前に説明された実施態様の特徴のうち１つ又は２つ以上のいずれかは、本発明の別の実施態様のいずれかのうち１つ又は２以上の特徴を有する方法のいずれかと組み合わされる場合がある。さらに、本発明の変更の多くは、明細書を検討して当業者に明らかとなるであろう。
【０２８９】
本出願で引用された全ての刊行物及び特許文献は、あたかも刊行物又は特許文献の各々が個別に表示されるように、同一の程度に全ての目的のために適切な部分で引用により取り込まれる。本明細書においてさまざまな引用文献を引用することによっては、特定の引用文献が本発明に対して「先行技術」でない旨を本発明の出願人は認める。
【実施例１】
【０２９０】
本発明は以下の特定の実施例によってさらに例示される。前記実施例は、実施例は例示目的のみで提供され、本発明の技術的範囲を限定するようには構成されていない。
【０２９１】
材料及び方法
細胞株及び動物
ＣＴ２６、ＣＴ−２６−ＨＥＲ２、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３及びトランスフェクションされたＳｐ２／０細胞は、５％ウシ血清（ＧＩＢＣＯ、インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いてイスコフ改変ダルベッコ培地（ＭＩＤＭ、セルグロ、メッディアテック社、バージニア州ハードン）で培養された。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（４−６週齢）及びＳＣＩＤマウス（４−６週齢）が、ジャクソン・ラボラトリー（メリーランド州バーハーバー）から購入された。動物の管理及び使用の手順は、実験動物の管理及び使用のための国立衛生研究所の手引きに説明された基準に従って行なわれた。
【０２９２】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質のコンストラクト、発現及び特徴
実験のマウスエンドスタチン遺伝子が、プライマー  ５’−ＣＣＣＣＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１）と、５’−ＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号２）とを用いるＰＣＲによってｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１−エンドスタチンから得られた。ＰＣＲ産物はｐ−ＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ベクター（プロメガ、ウィンスコンシン州マディソン）にサブクローニングされ、その後、検証のためにシークエンスされた。サブクローニングされたエンドスタチン遺伝子のＥｃＯＲＶ−ＥｃＯＲ１断片は、以前に説明されたように（Ｓｈｉｎ  Ｓ  Ｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；  １５８（１０）：４７９７−８０４）、ｐＡＴ１３５ベクター中のヒトＩｇＧ３の重鎖の定常ドメイン（ＣＨ３）のカルボキシル末端に結合された。コンストラクトを完成するために、その後、前記ＩｇＧ３のエンドスタチンの重鎖の定常領域（ＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ）は、真核生物の選択のためのＨｉｓＤ遺伝子を含む発現ベクター（ｐＳＶ２−ｈｉｓ）中の組換えヒト化モノクローナル抗体４Ｄ５−８の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ可変領域（ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、ハープセプチン、ジーンテック、カリフォルニア週サンフランシスコ）に結合された（Ｃｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ  Ｐ  Ｍ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１６０（７）：３４１９−２６及びＣｏｌｏｍａ  Ｍ  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９２；  １５２：８９−１０４）。完成された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖ＩｇＧ３−エンドスタチン構築ベクターは、完全な抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質を構築するために抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＫ軽鎖を安定に発現しているＳｐ２／０細胞に電気穿孔法によってトランスフェクションされた。トランスフェクションされた細胞は５ｍＭのヒスチジノールで選択され、融合タンパク質を生成しているトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ）が、プレートに被覆された抗ヒトＩｇＧ抗体と、抗ヒトカッパー検出抗体（シグマ、ミズーリ州セントルイス）とを用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって同定された。前記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質は［３５Ｓ］メチオニン（アマシャム・バイオサイエンス、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で生合成的に標識化され、還元なしに５％リン酸ナトリウムで緩衝されたポリアクリルアミドゲルか、０．１５Ｍのベータ−メルカプトエタノールで３７°Ｃ、３０分間処理した後１２．５％トリス−グリシンで緩衝されたポリアクリルアミドゲルかのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。前記融合タンパク質は、セファロース４Ｂファストフロー（シグマ、ミズーリ州セントルイス）に不動化されたプロテインＡを用いて培養上清から精製された。
【０２９３】
活性エンドスタチンを得るために、マウスエンドスタチン発現ベクター（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１−エンドスタチン）は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞と、選択されたＧ４１８（０．６μｇ／ｍＬ）耐性細胞とにｐｃＤＮＡ３．１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、カリフォルニア州パロアルト）で同時トランスフェクションされた。分泌されたエンドスタチンは血清が除去された馴化培地から採取され、ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラムで精製された。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色によって評価された。ウエスタンブロット解析のために、前記融合タンパク質はベータ−メルカプトエタノールで処理され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画され、かつ、メンブレンに移された。ウサギ抗エンドスタチン（ボディテック、韓国カンウォンドー）が１次抗体として用いられ、ＨＲＰでコンジュゲート化されたマウス抗ラビットＩｇＧ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）が２次抗体として用いられた。ＨＲＰでコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）がヒト抗体を検出するために用いられた。
【０２９４】
絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ
ＶＥＧＦ／ｂＦＧＦ誘導性血管新生を阻害するための抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの能力は、胚発生１２−１４日目のレッグホーンニワトリ胚（チャールズ・リバーＳＰＡＦＡＳ、マサチューセッツ州ウィルミントン）を用いたＣＡＭアッセイによってテストされた。ビトロジェンゲルペレット（コラーゲン・バイオマテリアルズ、カリフォルニア州パロアルト）は、（ａ）ＰＢＳ単体中で媒体（０．１％ＤＭＳＯ）（陰性対照）、（ｂ）ＶＥＧＦ／ｂＦＧＦ（１００ｎｇ及び５０ｎｇ／ペレットそれぞれ、陽性対照）、又は、（ｃ）ＶＥＧＦ／ｂＦＧＦと、さまざまな濃度（０．５−１０μｇ／ペレット）の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン又はエンドスタチンのいずれかとで補充され、かつ、３７°Ｃで２時間重合することが許容される。その後、ペレットはナイロンメッシュ（孔サイズ２５０μｍ、Ｔｅｔｋｏ社、米国）上に置かれ、重合されたメッシュが前記胚の絨毛尿膜の外部領域に置かれ、説明されたように２４時間培養された（Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ  Ｍ  Ｌら、Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  １９９７；  ７８（１）：６７２−７及びＩｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ  Ｍ  Ｌら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９９；  １００（１３）：１４２３−３１）。血管を可視化するために、４００μＬのルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（１００μｇ／ｍＬ、シグマ、米国）がニワトリ胚の血流に注射された。５−１０分間の培養後、前記ニワトリ胚は、３．７％ホルムアルデヒドで５分間局所的に固定された。その後、埋め込まれたメッシュは切断され、スライド上に載置された。蛍光強度はコンピュータ支援画像プログラム（ＮＩＨイメージ１．５９）で解析された。
【０２９５】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの薬物動態及び生体分布
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３（１００μｇ）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン（１００μｇ）、抗ダンシルＩｇＧ３（１００μｇ）及びエンドスタチン（１００μｇ）は、クロラミンＴ法によって０．５ｍＣｉの［１２５Ｉ］（アマシャム・バイオサイエンス、ニュージャージー州ピスカタウェイ）でヨウ素化された（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ  Ｍら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９５；９２：５５９２）。ＢＡＬＢ／ｃマウス（４−６週齢）は、１×１０６個のＣＴ２６−ＨＥＲ２又はＣＴ２６の細胞のいずれかを用いて皮下注射で注射されたか、あるいは左側が注射されなかった。ＣＴ２６−ＨＥＲ２又はＣＴ２６腫瘍を有するか、あるいは腫瘍が全くないマウス３匹のグループは、３２μＣｉの［１２５Ｉ］−抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３、３０μＣｉの［１２５Ｉ］−抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン、３２μＣｉの［１２５Ｉ］−抗ダンシルＩｇＧ３又は２４μＣｉの［１２５Ｉ］−エンドスタチンのいずれかを用いて静注で注射された。血液試料は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン又は抗ダンシルＩｇＧ３のいずれかで注射されたマウスの後眼窩静脈叢から１５分から９６時間までの範囲のさまざまな間隔で連続的に得られた。エンドスタチン単独で注射されたマウスは、静注後、１５秒から６０分以内に採血された。各血液試料のＴＣＡ沈殿性放射活性がガンマカウンターで測定された。薬物動態パラメーターは、以前に説明されたように、血漿放射活性データを二次指数関数方程式（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）に適合することによって算出された（Ｓｈｉｎ  Ｓ  Ｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；  １５８（１０）：４７９７−８０４、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｔら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  １９９２；２６３：８９７、Ｐｅｎｉｃｈｅｔ  Ｍ  Ｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；  １６３（８）：４４２１−６）。
【０２９６】
Ｃｐ（ｔ）＝Ａｌｅ−Ｋ１ｔ＋Ａ２ｅ−Ｋ２ｔ
【０２９７】
前記方程式は、導関数を使用しない非線形回帰分析（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｆｒｅｅ  ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＰＡＲＢＭＤＰ、ＵＣＬＡ健康科学コンピューター計算施設で開発された生物医学コンピューターＰシリーズプログラム）を用いて血漿データに適合された。データは体重＝１／（濃度）２を用いて評価され、濃度は、マイクロリットルあたり（μＬ）のカウント毎分（ｃｐｍ）か、ミリリットルあたりの％ＩＤ（注射された投与量の百分率）かのいずれかである。血漿中薬物濃度曲線下面積（ＡＵＣ）と、平均滞留時間（ＭＲＴ）とは、二次指数関数方程式の傾き及び切片から算出された。抗体の配分量（ＶＤ）は、注射後の各時間での対応する血漿のマクロリットルあたりの壊変毎分によって割られた器官のグラムあたりの壊変毎分の割合から決定された。抗体の器官透過性表面積（Ｋｉ）は以下から算出された。
【０２９８】
Ｋｉ＝［ＶＤ−Ｖ０］Ｃｐ（Ｔ）／ＡＵＣ（ｔ）
【０２９９】
上記のＣｐ（Ｔ）は最終血漿濃度であり、Ｖ０は器官血漿量である。抗体の器官送達は以下から決定された。
【０３００】
％ＩＤ／ｇ＝Ｋｉ×ＡＵＣ（ｔ）
【０３０１】
上記のＫｉ及びＡＵＣ（ｔ）は、注射後の１、４８又は９６時間に一致した。
【０３０２】
薬物動態パラメーターが、以前に説明されたように血漿ＴＣＡ−沈殿性放射活性データを二次指数関数方程式に適合することによって算出された（Ｓｈｉｎ  Ｓ  Ｕら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；  １５８（１０）：４７９７−８０４、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｔら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  １９９２；２６３：８９７、Ｐｅｎｉｃｈｅｔ  Ｍ  Ｌ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；  １６３（８）：４４２１−６、Ｇｉｂａｌｄｉ  Ｍ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、１９８２、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  Ｗ  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  １９９５；  ８４：９４３−８）。血漿クリアランス、初期血漿容積、全身分布容積、定常状態の血漿中薬物濃度曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）及び平均滞留時間も決定された。
【０３０３】
薬物動態実験後に、マウスは、１２５Ｉ−標識化抗体−エンドスタチン融合タンパク質の組織分配の測定のためにＰＢＳ  ２０ｍＬでの灌流によって失血させられた。心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、筋肉及び腫瘍が、除去され、秤量され、ガンマ線が計測され、かつ、組織のグラムあたりの注射された投与量の百分率が算出された。特定の腫瘍の標的化は、放射性局在指標（ｒａｄｉｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）として表される（血液の％ＩＤ／ｇによって割られた腫瘍の％ＩＤ／ｇ）。
【０３０４】
反対側の腹側部にＣＴ２６及びＣＴ２６−ＨＥＲ２の腫瘍を同時に移植されたマウスで１２５Ｉ−標識化タンパク質の優先的な配分及び局在を決定するために、マウス３匹のグループは、５μＣｉ［１２５Ｉ］−抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質か、５μＣｉ［１２５Ｉ］−抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３かのいずれかで静注された。動物は、標識化タンパク質の注射後に異なる時間（６、２４及び９６時間）で屠殺され、器官（例えば、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、ＣＴ２６腫瘍、ＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍、血液及び尿）が、ＰＢＳでのマウスの灌流後に単離され、秤量され、ガンマシンチレーションカウンターで計測された。各組織のグラムあたりの注射された投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ）が、上記のように決定された。
【０３０５】
ｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍効果
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍の有効性が、ＣＴ２６−ＨＥＲ２  ＢＡＬＢ／ｃ同系マウスモデルと、ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌が異種移植されたＳＣＩＤマウスモデルとを用いて調べられた。抗体ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの標的化及び有効性を決定するために、ＢＡＬＢ／ｃ（８匹／グループ、４−６週齢）のマウスは右腹側部にＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞１×１０６個が皮下注射され、左腹側部に対照ＣＴ２６細胞１×１０６個が皮下注射された。７日目に、マウス（８匹／グループ）は、前記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質（４２μｇ／注射、２×１０−１０モル、エンドスタチン８μｇと等モル）か、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３単独（３４μｇ／注射、２×１０−１０モル）か、エンドスタチン単独（８μｇ／注射、４×１０−１０モル）か、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３（３４μｇ）及びエンドスタチン（８μｇ）の組み合わせか、対照としてのＰＢＳかで静注された。全てのマウスは２日間の間隔で処理７回を受けた。腫瘍のサイズ及び成長率が記録され、以下の方程式を用いて算出された。
【０３０６】
腫瘍容積（ｍｍ３）＝４／３×３．１４×｛（長軸＋短軸）／４｝３
【０３０７】
ＳＣＩＤマウスへのヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ−３の異種移植が、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質の抗腫瘍活性を評価するために用いられた。ＳＫ−ＢＲ−３（マウスあたり細胞１×１０６個）がＳＣＩＤマウスの腹側部に移植された。１５日目に、（８匹／グループ）は、前記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質（４２μｇ）か、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３（３４μｇ）か、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３（３４μｇ）及びエンドスタチン（８μｇ）の前記組み合わせかで静注された。この処理は１日置きに繰り返された。目視できる腫瘍が測径器を用いて測定され、前記腫瘍成長率は上記のように解析された。
【０３０８】
血管形成の免疫組織化学及び画像解析
マウスは実験の最後に殺された。腫瘍はＯＣＴコンパウンド（ティシュ−Ｔｅｋ、インディアナ州エルクハート）中に置かれ、液体窒素で冷却されたイソペンタン中で凍結された。凍結された腫瘍は、さらなる使用まで−８０°Ｃで保存された。従来の免疫組織化学法を用いて、５μｍの組織切片がクライオスタット（シャンドン、ペンシルバニア州ピッツバーグ）を用いて切られ、陽性に電荷されたスライド（フィッシャーサイエンティフィック、ペンシルバニア州ピッツバーグ）上に置かれた。腫瘍切片は風乾され、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定された。腫瘍の微小血管形成を解析するために、切片は、ラット抗マウス血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１；ＣＤ３１）ＭＡｂ（ファーミンジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）と、その後のＡＢＣ法（ベクターＬａｂ、カリフォルニア州バーリンゲーム）とで染色された。腫瘍でのＨＥＲ２／ｎｅｕの発現が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質抗体で腫瘍切片を染色して調べられた。全ての切片はヘマトキシリン（シグマ、ミズーリ州セントルイス）で対比染色された。陽性染色された血管内皮細胞（茶色）は可視化され、ツァイスの顕微鏡（カールツァイス、ニューヨーク州ソーンウッド）に取り付けられたデジタルカメラを用いて画像化された。
【０３０９】
共焦点顕微鏡解析のために、３０μｍの凍結切片が切られ、ラット抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体で染色された。血管は抗ラットＩｇＧ−アレクサ５９４（モレキュラープローブ、オレゴン州ユージーン）で可視化され、カバーガラスが退色防止マウント試薬（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）（ベクターシールド：ベクターＬａｂ、カリフォルニア州バーリンゲーム）とともに切片の小片の上に置かれた。その後、これらの蛍光性の血管はＬＳＭ５共焦点顕微鏡（カールツァイス、ニューヨーク州ソーンウッド）を通して観察され、切片あたり１４−２１枚のデジタル画像が得られた。これらのデジタル画像は血管密度を測定するために各切片あたり１枚の画像として構成され、その後、血管面積（ピクセル２）が、腫瘍あたりの血管密度を測定するために構成画像から計算され、平均化された。画像は、腫瘍血管の二値画像を形成するためにカラー画像をＮＩＨ画像Ｊ  ｖ１．３１ソフトウェアを用いて解析された。
【０３１０】
統計解析
抗血管新生活性、薬物動態、生体分布及び腫瘍成長は、平均±標準誤差として表される。両側スチューデントＴ検定が、２グループの平均の有意差を決定するために用いられた。違いは、Ｐが０．０５未満であり、統計的に有意と考えられた。全ての統計テストが両側検定された。
【０３１１】
病巣形成アッセイ（Ｆｏｃｕｓ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）
病巣形成アッセイは、腫瘍関連ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に抗増殖効果を発揮した抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質を決定するために用いられた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＭＣＦ７−ＨＥＲ２（陽性腫瘍細胞）及びＭＣＦ７（陰性腫瘍細胞）が、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質の異なる濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍＬ）で処理された。６０ｍｍディッシュの０．３３％寒天を含む培地  １．５ｍＬ中に播種された腫瘍細胞１００個が、凝固された０．５％寒天培地上に重層された。軟寒天アッセイに用いられた前記培地は１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭであり、前記エンドスタチン融合タンパク質が含まれた。前記軟寒天プレートは各５−７日間培地  ０．５ｍＬで満たされ、１４日後に前記細胞が（３７°Ｃかつ５％ＣＯ２で）生体色素（ｖｉｔａｌ  ｄｙｅ）ｐ−インドニトロテトラゾールバイオレット（シグマ）を用いて一晩染色され、かつ、計測された。結果として生じる病巣はクリスタルバイオレットで染色され、計測される。
【０３１２】
ＭＴＴアッセイ
腫瘍細胞は軟寒天アッセイで適切に成長しなかった場合には、ＭＴＴアッセイがＨＥＲ２／ｎｅｕを発現している腫瘍で抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質の抗増殖効果を評価するために用いられた。ＳＫ−ＢＲ−３か、ＢＴ４７４か、ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ＨＥＲ２か、ＣＴ２６及びＣＴ−ＨＥＲ２／ｎｅｕか、ＥＭＴ６及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２／ｎｅｕかのような腫瘍細胞は、異なる濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍＬ）の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質又は対照で処理された。簡潔に、腫瘍細胞は９６ウェルプレート上に２−５×１０３細胞／ウェルで播種され、一晩接着させられた。後日、腫瘍細胞はさまざまな濃度のエンドスタチン融合タンパク質又は対照で処理され、さらに４８−７２時間インキュベーションされた。細胞の成長を決定するために、２０ｐＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ（３−（４，４−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；シグマ）が各ウェルに添加され、前記プレートは３７°Ｃ、５％ＣＯ２中でさらに３時間インキュベーションされた。上清が除去され、形成された結晶はジメチルスルホキシド２００μＬに溶解された。その後、前記プレートは、マイクロプレートリーダーで５９５ないし６００ｎｍのそれらの吸光度を決定することによって定量された。成長阻害は、処理ウェルと、対照ウェルとの吸光度の違いを対照に対する百分率として示すことによって算出された。各アッセイは３回繰り返して行なわれた。
【０３１３】
ＶＥＧＦ分泌の影響
以下の細胞株は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３対照及び／又はエンドスタチンの効果と、エンドスタチン、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体又は両方のタンパク質に応答した有用な細胞株の同定とのために試験された。ＶＥＧＦファミリーの発現における抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質の効果を調べるために、ＳＫ−ＢＲ−３か、ＢＴ４７４か、ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ＨＥＲ２、ＣＴ２６及びＣＴ−ＨＥＲ２／ｎｅｕか、ＥＭＴ６及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２／ｎｅｕかのような腫瘍細胞が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質で処理された。１ウェルあたり腫瘍細胞５×１０５個が２４ウェルプレート（ファルコン）に播種された。細胞は一晩接着され、その後、異なる濃度（０．１、１、１０、１００μｇ／ｍＬ）のエンドスタチン融合タンパク質、エンドスタチン又は抗体で処理された。細胞は異なる時点（２４、４８、９６時間）で遠心分離によって除去され、上清が孔サイズ０．２２μｍのフィルターで濾過された。分泌されたＶＥＧＦレベルは、ＶＥＧＦのスプライス型全部が検出されるサンドウィッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス、米国）によって解析された。ヒト組換えＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス、米国）が基準として提供された。
【０３１４】
内皮細胞増殖アッセイ
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質の抗増殖効果がＣ−ＰＡＥ細胞を用いてテストされた。前記細胞がファイブロネクチン（１０μｇ／ｍＬ）が被覆された２４ウェルプレートの２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ  ０．５ｍＬに細胞１２，５００個／ウェルで播種された。３７°Ｃで２４時間インキュベーション後、培地は、エンドスタチン融合タンパク質及びエンドスタチン（１、１０、又は１００μｇ／ｍＬ）とともにか、あるいは無しに、３ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス、米国）を含む新鮮なＤＭＥＭ及び２％ＦＢＳに交換された。前記細胞は２４時間１μＣｉの［３Ｈ］チミジンでパルスされた。培地は吸引され、細胞がＰＢＳで３回洗浄され、その後、１．５ＮのＮａＯＨ（１００μＬ／ウェル）を添加することによって可溶化され、３７°Ｃで３０分間インキュベーションされた。細胞関連放射活性が液体シンチレーションカウンターで測定された。
【０３１５】
遊走アッセイ
ｂＦＧＦへのヒト内皮細胞（ＥＣＶ３０４）の遊走を阻害するための抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質の能力を決定するために、遊走アッセイが、ポリカーボネートメンブレン（２５×８０ｍｍ、ＰＶＤ無し、孔８μｍ；ポアティックス社、カリフォルニア州リバモア）とともに２ウェルのボイデンケモタキシスチャンバー（ニューロプローブ社）を用いて行なわれた。前記チャンバーへの増殖因子の非特異的結合が、０．５％ゼラチン、１ｍＭのＣａＣｌ２及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む溶液を前記チャンバーに３７°Ｃで一晩被覆することによって防止された。ＥＣＶ３０４細胞は、５ｎｇ／ｍＬの１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩＣ１８；モレキュラープローブ、オレゴン州ユージーン）を含む１０％ＦＢＳで一晩増殖され、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄された。トリプシン処理後、前記細胞が計測され、０．５％ＦＢＳを含む培地で３００，０００細胞／ｍＬに希釈された。下部のチャンバーは２５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む培地で満たされた。上部のチャンバーは、異なる濃度（１、１０、１００μｇ／ｍＬ）のエンドスタチン融合タンパク質とともに１５，０００細胞／ウェルで播種された。細胞は３７°Ｃで４時間遊走された。その時に、メンブレンの上部表面上の前記細胞がセルスクレーパーで除去され、下部表面の前記（遊走した）細胞は３％ホルムアルデヒドで固定され、ＰＢＳで洗浄された。固定されたメンブレンの画像はデジタルカメラを有する蛍光顕微鏡の５５０ｎＭで得られ、各メンブレンの細胞数が決定される。
【０３１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏマトリゲルアッセイ
マトリゲルでの毛細管形成アッセイが内皮細胞の分枝形態形成を決定するための有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイであり、前記分枝形態形成は血管の形成を制御する複合体発生プログラムである。マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン、ニュージャージー州フランクリンレイクス）が２４ウェルプレートを４°Ｃで被覆するために用いられ、３７°Ｃで３０分間重合された。ＨＵＶＥＣｓがマトリゲルが被覆されたプレート上に播種された（細胞５×１０４個／ウェル）。細胞は、エンドスタチン融合タンパク質又はエンドスタチン（１、１０、１００μｇ／ｍＬ）とともにか、あるいは無しに、２％ＦＢＳを含む内皮細胞基本培地でＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）を用いてインキュベーションされた。細胞が、３７°Ｃで２４時間又は９６時間インキュベーションされた後、毛細管形成は位相差顕微鏡下で視覚的に調べられ、撮影された。完全な管の数が倍率１００倍のランダム観察６回で計測された。
【０３１７】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質のアポトーシス活性
内皮細胞及び非内皮細胞でのエンドスタチン融合タンパク質の作用機序を解析するために、Ｃ−ＰＡＥ細胞又はＨＵＶＥＣｓは、ＦＡＣＳを用いるアネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色と、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに仲介されたｄＵＴＰニック末端標識アッセイ（ＴＵＮＥＬ染色）とを測定することによってアポトーシスを調べられた。抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ＸＬの低下をもたらすエンドスタチンが添加された際に、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質の存在下でこれらの抗アポトーシスタンパク質の発現はウエスタンブロット解析によって監視された。
【０３１８】
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色アッセイ
アネキシンＶ、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して高親和性を有するカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質が、初期段階のアポトーシスを検出するために用いられた。Ｃ−ＰＡＥ細胞又はＨＵＶＥＣｓ（２×１０５個）が、２％ＦＣＳ及び３ｎｇ／ｍＬのｂ−ＦＧＦを含むＤＭＥＭ中のファイブロネクチンで被覆された６ウェルのプレート上に置かれた。異なる濃度（１−１００μｇ／ｍＬ）の抗体−エンドスタチン融合タンパク質、対照抗体又はエンドスタチンが各ウェルに添加され、細胞は、処置後１８時間で回収され、かつ、処理された。時間経過研究のために、１０μｇ／ｍＬの抗体−エンドスタチン融合タンパク質、対照抗体又はエンドスタチンが添加され、細胞は３、４、６、１２及び１８時間で加工された。ヒト組換えＴＮＦ−アルファ（４０ｎｇ／ｍＬ）が陽性対照として用いられた。前記細胞はＰＢＳで洗浄され、結合緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２）に再懸濁された。アネキシンＶ−ＦＩＴＣは１００ｎｇ／ｍＬの終濃度で添加され、前記細胞は暗がりで１０分間インキュベーションされ、その後、ＰＢＳで２回洗浄され、結合緩衝液３００μＬに再懸濁された。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）１０μＬがフローサイトメーター解析の前に各試料に添加された。前記細胞はベクトン・ディッキンソンのＦＡＣＳｔａｒプラスフローサイトメーターを用いて解析された。各試料では、最小限の細胞１０，０００個が計測され、リストモード（ｌｉｓｔｍｏｄｅ）で保存された。データ解析が標準のセル・クエスト（Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ）ソフトフェア（ベクトン・ディッキンソン）で行なわれた。
【０３１９】
ＴＵＮＥＬ染色の顕微鏡検出
Ｃ−ＰＡＥ細胞又はＨＵＶＥＣｓが細胞５，０００個／ウェルの濃度でファイブロネクチンが被覆された（１０μｇ／ｍＬ）Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバースライドに播種され、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ  ０．４ｍＬ中で増殖された。２日後、古い培地が吸引され、２％ＦＣＳを含有する新鮮なＤＭＥＭが添加され、前記細胞は一晩飢えさせられた。後日、３ｎｇ／ｍＬのｂ−ＦＧＦを含む新しい培地０．３６ｍＬ（２％ＦＣＳ含有）が、抗体−エンドスタチン融合タンパク質、対照抗体又はエンドスタチン（１０μｇ／ｍＬ）か、ＴＮＦ−アルファ（２０ｎｇ／ｍＬ）かとともに添加された。対照試料のために、ｂＦＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）を含む新鮮な培地（２％ＦＣＳ）が添加された。インキュベーション（２４時間）後、前記スライドはＰＢＳで２回洗浄され、その後に、新鮮な４％ホルムアルムアルデヒド／ＰＢＳで４°Ｃ、２５分間固定された。前記スライドはＰＢＳで洗浄され、前記細胞は０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで氷上で５分間透過処理され、その後、新鮮なＰＢＳで２回それぞれ５分間室温で洗浄され、ＴＵＮＥＬアッセイは、終濃度が１μｇ／ｍＬで用いられたヨウ化プロピジウム（シグマ）を除去して、ＡｐｏＡｌｅｒｔ  ＤＮＡ断片化アッセイキット（クロンテック）で説明されたように行われた。前記アッセイ後、少量の退色防止溶液が添加され、前記スライドの処理された部分はカバーガラスで覆われ、縁が透明なマニキュア液で密封された。スライドは、緑色（５２０ｎｍ）及び赤色蛍光（＞６２０ｎｍ）のための２元的なフィルターセットを用いる蛍光顕微鏡下で即座に観察された。画像はデジタルカメラを用いて撮られた。画像はＮＨＩｍａｇｅ  １．５９に取り込まれ、蛍光強度の測定値が陽性ピクセルとして得られる。陽性対照（ＴＮＦ−アルファ：５視野）を除く全ての試料のためにランダムな１５視野が選択され、視野あたりの緑色及び赤色の細胞数は計測された。
【０３２０】
抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬの発現のウエスタンブロット解析
Ｃ−ＰＡＥ細胞及びＨＵＶＥＣｓ（１×１０６個）が、３ｎｇ／ｍＬのｂ−ＦＧＦを含む２％ＦＣＳの存在下のファイブロネクチン（１０μｇ／ｍＬ）でプレ被覆された１０ｃｍのペトリディッシュに播種された。抗体−エンドスタチン融合タンパク質、対照抗体又はエンドスタチンが１０μｇ／ｍＬで添加され、細胞は処理後１２、２４及び４８時間で回収された。細胞はＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で３回洗浄され、前記細胞は、新たに添加されたプロテアーゼ完全阻害錠剤（ベーリンガーマンハイム）、１００μｇ／ｍＬのぺファブロック、１μｇ／ｍＬのペプスタチンを含む１×ＥＢＣ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０）１ｍＬに再懸濁された。全細胞溶解物中のタンパク質濃度がビシンコニン酸（ＢＣＡ）法（ピアス）によって測定された。全細胞抽出物３０μｇが、４−１５％勾配ポリアクリルアミドゲル上に充填された。トランスファーは半乾燥トランスブロット装置（バイオ−ラッド）を用いて行なわれた。メンブレンは５％乾燥脱脂乳を有する洗浄緩衝液（１×Ｔｒｉｓで緩衝された生理食塩水）でブロッキングされ、３７°Ｃで１時間インキュベーションされた。ヒトＢｃｌ−２に対するヤギ抗体と、Ｂａｘ及びＢｃｌ−ＸＬに対するマウスポリクローナル抗体と（サンタ・クルズ・バイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルズ）が、１次抗体として用いられた。抗アクチンポリクローナル抗体（シグマ）がタンパク質充填を標準化するために用いられた。２次抗体は、ＨＲＰにコンジューゲート化された抗ヤギ、マウス及びラビットの免疫グロブリン（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）であった。免疫反応性が高感度化学発光試薬（ピアス）で検出された。画像はフラットベッドスキャナーを用いて走査され、ＮＩＨ画像１．５９ソフトフェアによって定量化された。標準値は、各実験のアクチンシグナルでＢｃｌ−２シグナルを除算することによって算出された。
【０３２１】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチンの抗血管新生の特徴のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
ｉｎ  ｖｉｖｏの抗血管新生のために、融合の効果が、エンドスタチン融合タンパク質又はエンドスタチン単体とともにＶＥＧＧＦ又はＶＥＧＦを用いてマウスのマトリゲル血管新生モデルで試験された。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６−８週齢、ｎ＝３）が、エンドスタチン融合タンパク質、抗体又はエンドスタチン（１ないし１００μｇ／ｍＬ）とともにか、あるいは無しに、１５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含むマトリゲル０．５ｍＬ（９−１０ｍｇ／ｍｌ）を２６ゲージの針を用いることによって腹部正中線の近くに皮下注射された。マトリゲル注射後１週間目に、マウスが屠殺され、覆っている皮膚及び腹膜とともにマトリゲル移植片（ｐｌｕｇ）が摘出され、ＰＢＳで緩衝化された４％ホルムアルデヒドで固定された。前記移植片はパラフィンに包埋され、切片化され、内皮細胞の増殖を評価するためのＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１）及び増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）か、Ｋｉ６７（ＭＩＢ−１）かのようなエンドスタチン特異的抗原に対する抗体（ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）を用いて４°Ｃで一晩インキュベーションすることによって染色された。その後、切片はビオチン化抗体（ＡＢＣキット）を用いて室温で４０−４５分間、その後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣキット）を用いて４５分間インキュベーションして処理された。抗原−抗体複合体は新たに調製された３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢキット、ベクターラボラトリズ）でインキュベーションすることによって可視化された。切片はヘマトキシリン−エオジンで対比染色された。１０視野は倍率４００倍の顕微鏡を用いてランダムに選択され、デジタルカメラを用いて写真を撮られた。ＰＥＣＡＭ−１−陽性、ＰＣＮＡ−陽性、Ｋｉ６７−陽性の細胞が計測された。
【０３２２】
免疫組織化学染色による腫瘍における抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチンの抗血管新生活性
ＢＡＬＢ／ｃ又はＢＡＬＢ／ｃ  ＢＣＤＭが、右腹側部に１０６個のＥＭＴ６−ＨＥＲ２／ｎｅｕ又はＣＴ２６−ＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞と、左腹側部に対照の１０６個のＥＭＴ６又はＣＴ２６とをそれぞれ一緒に腹側部に皮下注射された。さらに、ＳＣＩＤマウスは、右腹側部に１０６個のＭＣＦ７−ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＳＫ−ＢＲ−３又はＢＴ４７４の細胞と、左腹側部に対照の１０６個のＭＣＦ７とを一緒に腹側部に皮下注射された。
【０３２３】
７日目に、マウスは、抗体−エンドスタチン融合タンパク質（４２μｇ）、等モルの対照抗体（３４μｇ）又は等モルのエンドスタチン（８μｇ）で静注された。この処理は１日おきに７回繰り返された。覆っている皮膚及び取り囲んでいる組織とともに目視可能な腫瘍が、さまざまな時点（処理後の２日目、８日目、１６日目、３匹／時点）で摘出され、組織切片はＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１、ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）のようなエンドスタチン特異的抗原に特異的なマウス抗体で免疫組織化学染色され、かつ、内皮細胞の増殖を評価するための増殖性細胞核抗原に特異的なマウス抗体（ＰＣＮＡ、ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）か、Ｋｉ６７（ＭＩＢ−１、ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）かで二重組織染色された。
【０３２４】
組織切片は４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ  ｐＨ７．４で固定され、エンドペルオキシダーゼ活性を除去するために反応停止溶液（３％過酸化水素／６０％メタノール）に浸され、その後、ＰＥＣＡＭ−１、Ｋｉ６７又はＰＣＮＡに対するマウス抗体か、対照としてマウスＩｇＧかを用いて４°Ｃで一晩インキュベーションする前に、１０％通常ブロッキング血清（ＡＢＣキット、ベクターラボラトリズ社、カリフォルニア州バーリンゲーム）中に２０分間静置された。その後、組織切片はビオチン化抗体（ＡＢＣキット）を用いて室温で４０−４５分間、その後、前記アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣキット）を用いて４５分間インキュベーションして処理された。抗原−抗体複合体は新たに調製された３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢキット、ベクターラボラトリズ）でインキュベーションすることによって可視化され、前記組織はヘマトキシリンで対比染色された。１０視野は倍率４００倍の顕微鏡を用いてランダムに選択され、デジタルカメラを用いて写真を撮られた。ＰＥＣＡＭ−１−陽性、ＰＣＮＡ−陽性、Ｋｉ６７−陽性の細胞が計測された。
【０３２５】
腫瘍でのＶＥＧＦ発現及び血管新生における抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチンの抗血管新生活性
エンドスタチンの抗腫瘍活性はＶＥＧＦ発現の下向き調節に関係する。
上記の実験が、前記抗体−エンドスタチン融合タンパク質（４２μｇ）、等モルの対照抗体（３４μｇ）又は等モルのエンドスタチン（８μｇ）の抗血管新生活性を評価するために、ＳＣＩＤマウス（ｎ＝３）でのヒト乳癌異種移植（ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ＨＥＲ２）で繰り返された。この処理は１日おきに７回繰り返された。覆っている皮膚及び取り囲んでいる組織とともに目視可能な腫瘍が、さまざまな時点（処理後の２日目、８日目、１６日目、３匹／時点）で摘出された。組織は上記されたようなＰＥＣＡＭ又はＫｉ６７を用いて増殖性内皮細胞に関して染色され、前記組成切片はＶＥＧＦファミリーに対する特異的抗体（ＶＥＧＦ−Ａ、ネオマーカー；ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄ、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー、カリフォルニア州サンタクルズ）を用いて染色された。
【０３２６】
血清が上記のようなエンドスタチン融合タンパク質の抗血管新生活性を測定するためのＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州）のために、さまざまな時間（処理前、処理後２日目、８日目、１６日目）で採取された。疾患状態では、ＶＥＧＦがさまざまな腫瘍細胞で検出される場合があり、１２１個、１４５個、１６５個、１８９個及び２０６個のアミノ酸を有する異なるＶＥＧＦアイソフォーム５個はＶＥＧＦ遺伝子１個から交代性スプライシングの結果として産生される場合がある。これらのアイソフォームは、分子量と、ヘパリン又はヘパラン−硫酸プロテオグリカンと、異なるＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲｓ）とに結合する能力のような生物学的特徴とにおいて異なる。スプライス型ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５及びＶＥＧＦ１６５が分泌される一方、ＶＥＧＦ１８９は細胞表面のヘパラン−硫酸にしっかりと結合され、ＶＥＧＦ２０６は内在性膜タンパク質である。対照的に、別のスプライス型のＶＥＧＦ１２１は、ヘパリン又は細胞外マトリクスプロテオグリカンに結合しない。シグナル伝達性チロシンキナーゼ受容体のＶＥＧＦＲ−１（ｆｌｔ−１、ｆｍｓ−様チロシンキナーゼ１）は、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５と結合し、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ、キナーゼドメイン領域／ｆｌｋ−１、胎仔肝キナーゼ１）はさらに（特定のＶＥＧＦ−関連ペプチドを除いて）ＶＥＧＦ１４５と結合する。
【０３２７】
ＶＥＧＦアイソフォームのｍＲＮＡ発現は、切除された腫瘍のＲＴ−ＰＣＲによって決定された。ＲＴ−ＰＣＲのために、凍結された試料（１ｇ）は液体窒素下のメノウの乳鉢で粉砕され、ＲＮＡはフェノール−グアニジウムチオシアネート法によって単離され、イソプロパノールによって精製され、エタノール沈殿が繰り返され、かつ、混入しているＤＮＡはＲＮａｓｅを含有しないＤＮａｓｅ１で消化（２５°Ｃで２０分間）することによって破壊された。前記ＤＮａｓｅの不活性化（６５°Ｃで１５分間）後、ｃＤＮＡが、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー  １μＬ（２０ｐｍｏｌ）（アマシャム）と、スーパースクリプトＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ）  ０．８μＬとを用いて３７°Ｃで６０分間インキュベーションして生成された。ＰＣＲのために、ｃＤＮＡ  ４μＬが、水  ３０．５μＬ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２  ４μＬ、ｄＮＴＰ  １ｐＬ、１０ｘＰＣＲ緩衝液  ５μＬ、（２．５Ｕ）のプラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ）  ０．５μＬ及び以下のプライマー（１０ｐｍｏｌを含む各２．５μＬ）を用いてインキュベーションされ、前記プライマーは、全てのＶＥＧＦスプライス・バリアント非選択用の５’−ＡＴＧ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＧＧＧ−ＣＡＧ−ＣＡＴ−３’（センス）（配列番号３）と、５’−ＴＴＧ−ＧＴＧ−ＡＧＧ−ＴＴＴ−ＧＡＴ−ＣＣＧ−ＣＡＴ−ＣＡＴ３’（アンチセンス）（配列番号４）とが２５５ｂｐの断片をもたらし（４０サイクル、アニーリング温度５５°Ｃ）、ＶＥＧＦスプライス・バリアント選択用の５’−ＣＣＡ−ＴＧＡ−ＡＣＴ−ＴＴＣ−ＴＧＣ−ＴＧＴ−ＣＴＴ−３’（センス）（配列番号５）と、５’−ＴＣＧ−ＡＴＣ−ＧＴＴ−ＣＴＧ−ＴＡＴ−ＣＡＧ−ＴＣＴ−３’（アンチセンス）（配列番号６）とが各バリアントに関する異なる断片サイズをもたらす（４０サイクル、アニーリング温度５５°Ｃ）。選択プライマーが用いられた際には、５２６ｂｐの産物はＶＥＧＦ１２１に、５９８ｂｐの産物はＶＥＧＦ１４５に、６５８ｂｐの産物はＶＥＧＦ１６５に、７３０ｂｐの産物はＶＥＧＦ１８９に、かつ、７８１ｂｐの産物はＶＥＧＦ２０６に対応する。
【０３２８】
実施例１
抗ＨＥＲ２抗体−ヒトエンドスタチンＰ１２５Ａタンパク質の標的にされた送達が、マウス及びヒトの乳癌モデルで増大された抗腫瘍効果をもたらす。
【０３２９】
抗ＨＥＲ２ヒトエンドスタチン融合タンパク質２個が、ヒト野生型又は変異型のヒトエンドスタチン（ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ）をヒト化抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３抗体の３’末端に融合することによって生成された。野生型エンドスタチン融合タンパク質（アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ）、エンドスタチン単体又は抗ＨＥＲ２抗体（アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３）よりもより大規模に、ＨｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ抗体融合タンパク質（アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ）はＶＥＧＦを阻害し、かつ、ｂＦＧＦはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管内皮細胞の増殖と、毛細管形成とを誘導した。抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合体とともにＳＫＢＲ−３乳癌異種移植を処理することは、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３、ヒトエンドスタチン又は抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏのいずれかで処理されたマウスと比較して、完全な寛解をもたらし、生存期間を改善した。マウスのＨＥＲ２を発現している腫瘍に特異的に標的に定められたアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質は、マウス入選腫瘍細胞株ＥＭＴ６と、ＨＥＲ２抗原（ＥＭＴ６−ＨＥＲ２）を発現するために設計されたＥＭＴ６とを同時に移植された。アルファＨＥＲ２ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合抗体は、抗血管新生及び抗腫瘍の増大された活性を示し、ｈｕＥｎｄｏ（ｐ＝０．００３）又はアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ（ｐ＝０．００４）よりもより効果的にＥＭＴ６−ＨＥＲ２の増殖を阻害した。
【０３３０】
材料及び方法
細胞株、材料及び動物
ヒトＨＥＲ２を発現しているマウス乳癌を生成するために、該マウス乳癌細胞株ＥＭＴ６はヒトＨＥＲ２遺伝子（ＥＭＴ６−ＨＥＲ２）をエンコードするｃＤＮＡを含むレトロウイルスコンストラクトを使用して形質導入された。ＥＭＴ６、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２、前記ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３と、トランスフェクションされたＳｐ２／０又はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞とが、５％ウシ血清とともにイスコフ改変ダルベッコ培地で培養された。
【０３３１】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、クロンテック・ラボ社（カリフォルニア州パロアルト）から得られ、継代３代目から継代５代目までで用いられ、内皮細胞基本培地２（ＥＢＭ−２）を含み、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ゲンタマイシン、アムホテリシンＢ、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ヒト上皮細胞増殖因子及びインスリン様増殖因子１を追加したＥＧＭ２−ＭＶ培地（クロンテック、カリフォルニア州パロアルト）で維持された。
【０３３２】
ヒト組換えエンドスタチンはシグマ（Ｅ８１５４、ミズーリ州セントルイス）から購入され、ビオチンでコンジュゲート化された抗ＣＤ３１抗体はＢＤバイオサイエンスから購入された（ニュージャージー州フランクリンレイクス）。アレクサ・フルオロ４８８はインビトロジェンから得られ（カリフォルニア州カールスバッド）、ＤＡＰＩはモレキュラープローブから得られた（カリフォルニア州カールスバッド）。
【０３３３】
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（４−６週齢）と、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（４−６週齢）とが、ジャクソン・ラボラトリー（メリーランド州バーハーバー）から購入され、示されたようなｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍成長及び異種移植の実験（ＳＫ−ＢＲ−３）に用いられた。全ての実験は実験動物の管理及び使用のためのＮＩＨの指針に従って行なわれ、マイアミ大学の動物管理及び使用委員会機構によって承認された。
【０３３４】
アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の構築、発現及び特徴
前記ヒトエンドスタチン（ｈｕＥｎｄｏ）遺伝子が、５’−ＣＣＣＣＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧ−３’（配列番号１）と、５’−ＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号２）とを用いるＰＣＲによってヒトＸＶＩＩＩ型コラーゲンアルファ１遺伝子からクローニングされた。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングされ、シークエンスされた。野生型ヒトエンドスタチン中の１２５番目の部位に点突然変異１箇所を有するクローンは、リン酸化されたプライマー  ５’ｐ−ＧＧＣＴＣＧＧＡＣＧＣＣＡＡＣＧＧＧＣＧＣ−３’（配列番号７）でのＰＣＲを用いる部位特異的変異作製法によって得られた。アラニン残基が、部位特異的変異作製法によって１２５番目の部位のプロリンと置換された。ヒトエンドスタチンの１２５番目の部位の点突然変異（プロリンからアラニンへの置換、ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ）は、内皮細胞結合及び抗血管新生活性を増大することが報告された。サブクローニングされたｈｕＥｎｄｏ及びｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ遺伝子が、ｐＡＴ１３５ベクターのヒトＩｇＧ３の重鎖定常ドメインのカルボキシル末端に読み枠で結合された（Ｓｈｉｎ  ＳＵら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７；  １５８：４７９７-８０４）。前記エンドスタチン重鎖定常領域は、真核生物の選択のためのＨｉｓＤ遺伝子を含む発現ベクター（ｐＳＶ２−ｈｉｓ）中の組換えヒト化モノクローナル抗体４Ｄ５−８（トラスツズマブ、ジーンテック、カリフォルニア州サンフランシスコ）の抗ＨＥＲ２可変領域に結合された。
【０３３５】
活性型エンドスタチン融合タンパク質を得るために、前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合コンストラクトが、以前に説明されたような電気穿孔法によって、抗ＨＥＲ２カッパー軽鎖を発現しているＳＰ２／０又はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３のミエローマ細胞に安定にトランスフェクションされた（Ｓｈｉｎ  ＳＵら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８９；  １７８：４５９-７６）。前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質は、［３５Ｓ］メチオニン（アマシャム・バイオサイエンス、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で生合成的に標識され、ＩｇＧＳｏｒｂ懸濁液（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞）を用いて免疫沈降され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。前記エンドスタチン融合タンパク質はセファロース４Ｂファストフロー（シグマ、ミズーリ州セントルイス）に不動化されたプロテインＡを用いて培養上清から精製された（Ｓｈｉｎ  ＳＵら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８９；１７８：４５９-７６）。
【０３３６】
フローサイトメトリー
ＨＥＲ２抗原へのアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の結合を検出するために、ヒト乳癌細胞と、ＳＫ−ＢＲ−３又はマウス乳癌細胞と、ＥＭＴ６及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２とは、１μｇ／ｍＬのエンドスタチン融合タンパク質、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３又は対照のアイソタイプとともに４°Ｃでインキュベーションされた。１５分後に前記細胞が、０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳで洗浄され、結合された融合タンパク質は、ＦＩＴＣでコンジュゲート化された抗ヒトＩｇＧ−で同定されたか、前記エンドスタチンドメインがビオチン化された抗ヒトエンドスタチン抗体で認識され、かつ、４°Ｃでストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートを用いて２次的に染色されて同定されたかのいずれかである。インキュベーション後、前記細胞が２回洗浄され、ＰＢＳ  ０．４ｍＬに再懸濁された。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーがデータ取得のために用いられた。バックグラウンド染色が、ＦＩＴＣ又はＰＥで標識された２次抗体単体でのインキュベーション後に推定された。
【０３３７】
マトリゲル管形成アッセイ
マトリゲル管形成アッセイは、以前に報告されたように４８ウェルプレートで行なわれた（Ｍｅｒｃｈａｎ  ＪＲら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００５；  １１３（３）：４９０−８）。事前に冷却された４８ウェル細胞培養プレートの各ウェルは重合化されていないマトリゲル１００μＬ（７ｍｇ／ｍＬ）で被覆され、３７°Ｃで３０−４５分間インキュベーションされた。ＨＵＶＥＣｓはトリプシンで回収され、細胞４×１０４個が完全内皮細胞増殖培地（上記を参照せよ。）３００μＬに再懸濁され、マトリゲルで被覆された前記プレート上に播種する前に、エンドスタチンか、対照抗体か、さまざまなアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質かで処理された。インキュベーション１６時間後、内皮細胞管形成は倒立顕微鏡で評価され、各ウェルの中心の顕微鏡写真は低出力（４０Ｘ）で撮られた。完全内皮細胞増殖培地中での非処理のＨＵＶＥＣｓによる管形成が対照として用いられた。
【０３３８】
ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ
１％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する前記内皮細胞基本培地１００μＬ中の全部で細胞４×１０３個が９６ウェルプレートの各ウェル中に播種され、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質及び対照で処理され、３７°Ｃで７２時間インキュベーションされ、対照細胞は上記のように、基本培地、１％ＦＢＳ及び抗生物質で培養された。ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）又はｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）が内皮細胞増殖の刺激物質として添加された。７２時間のインキュベーション後、ＷＳＴ−１（１０μＬ、ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）が各ウェルに添加され、かつ、３時間のインキュベーション後、４５０ｎｍで吸光度がマイクロプレートリーダー（バイオ−ラッド  ラボラトリズ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて各ウェルについて決定された。示されたデータは、２回繰り返された３組の実験の平均である。
【０３３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長アッセイ
アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の抗腫瘍活性を評価するために、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（マウスあたり２×１０６個）がＳＣＩＤマウスの腹側部に皮下注射で移植された。５日目に、マウス（グループあたり５匹）は、精製されたアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質（４２μｇ）、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３（３４μｇ）又はヒトエンドスタチン（８μｇ）の等モル量を静注された。この処理は１３回の投与のために１日置きに繰り返された。腫瘍サイズが測径器測定され、成長率は記録され、以下の方程式を用いて算出された。
【０３４０】
腫瘍容積（ｍｍ３）＝４／３ｘ３．１４ｘ｛（長軸＋短軸）／４｝３
【０３４１】
マウス乳癌ＥＭＴ６細胞は、以前に説明されたようなヒトＨＥＲ２抗原をエンコードするレトロウイルスベクターで形質導入された（Ｃｈｏ  ＨＭら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００５；４（６）：９５６−６７）。これらの研究で用いられたＥＭＴ６−ＨＥＲ２細胞は、親のＥＭＴ６細胞のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同一の割合で増殖する。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍の有効性及び特異性が、同系のＢＡＬＢ／ｃマウスに対側性に同時移植されたＥＭＴ６及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２の前記細胞株を用いて調べられた。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の有効性を決定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（グループあたり３−８匹、４−６週齢）は、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２細胞１×１０６個を右腹側部に及び／又は対照ＥＭＴ６細胞を左腹側部に皮下注射された。６日目に、マウスは、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質（４２μｇ／注射、２ｘ１０−１０ｍｏｌ、ヒトエンドスタチン８μｇに等モル）、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３単体（３４μｇ／注射、２ｘ１０−１０ｍｏｌ）、エンドスタチン単体（８μｇ／注射、４ｘ１０−１０ｍｏｌ）又は対照としてのＰＢＳを用いて静注された。全てのマウスは２日間の間隔で全部で１１回の注射を受け、腫瘍成長が上記のように解析された。
【０３４２】
免疫蛍光染色
アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合タンパク質で処理された腫瘍の血管形成を調べるために、ＥＭＴ６及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２の細胞株（１×１０６個）が、上記されたように同系のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）に対側性に移植された。４日目に、マウスは、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ（４２μｇ／注射）又は対照としてのＰＢＳを用いて２日おきに静注された。１２日目に、マウス２匹は４回の処理後の血管分布を解析のために屠殺された。１８日目に、別のマウス２匹は処理７回後に解析のために屠殺された。腫瘍が前記屠殺されたマウスから摘出され、液体窒素で凍結され、凍結切片８μｍが調製された。前記腫瘍切片はメタノールで１０分間固定され、ＰＢＳで３回洗浄され、ブロッキング溶液を用いて湿潤箱内で１時間インキュベーションされた。その後、スライドはＰＢＳで１０分間３回洗浄された。免疫蛍光染色のために、ＰＢＳで希釈された１次抗体（ビオチンでコンジュゲート化された抗ＣＤ３１抗体：１：２００）が各スライドに添加された。室温で一晩インキュベーション後、前記切片は、ＰＢＳで希釈されたアレクサフルオロ４８８でコンジュゲート化された２次抗体（１：５００）と、その後に希釈されたＤＡＰＩ（１：５０００）とを用いて湿潤箱内でインキュベーションされ、Ｇｅｌ封入剤（バイオメダ社、カリフォルニア州フォスターシティー）で封入された。染色された画像はツァイスの顕微鏡で観察された。各処理から得られた腫瘍のデジタル画像は血管面積（ピクセル２）として測定され、腫瘍あたりの血管密度を測定するために平均化された（ｎ＝５）。画像はカラーによる腫瘍血管の二値画像を形成するためにＮＩＨ画像Ｊソフトウェアを用いて解析された。
【０３４３】
統計解析
統計解析がグラフパッド・プリズム４（グラフパッドソフトウェア社、カリフォルニア州ラホヤ）で実施された。ヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ−３異種移植でのＨＵＶＥＣの増殖性と、抗腫瘍の有効性とが、二元配置反復測定（ＲＭ）分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後のボンフェローニの事後検定によって解析された。１６日目に、同系マウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍の有効性が各処理グループ内で（独立、両側）ステューデントｔ検定によって解析され、かつ、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後のボンフェローニの多重比較検定によって３種類の異なる処理間で解析された。血管密度は、各カテゴリー内で（独立、両側）ステューデントｔ検定によって解析された。グラフは信頼区間（ＣＩ）９５％の平均値として示された。違いはＰが０．０５未満であり、統計的に有意と考えられる。
【０３４４】
結果
アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の構築及び精製
我々は、単独又は組み合わせで送達される抗ＨＥＲ２抗体及び／又はマウスエンドスタチンで観察されたものと比較して、抗ＨＥＲ２抗体−ｍＥｎｄｏ融合タンパク質の抗腫瘍活性の増大を以前に示した。ヒトでの使用を可能にするための調製と、抗原性を減少するための試みとにおいて、前記融合タンパク質は、マウスエンドスタチン融合ドメインをヒトエンドスタチン配列に置換することによって「ヒト化」された。前記ヒトエンドスタチン（ｈｕＥｎｄｏ）遺伝子はＰＣＲによってヒトＸＶＩＩＩ型コラーゲン、アルファ１遺伝子からクローニングされた。野生型ヒトエンドスタチンを含むクローンが同定された。以前に位置付けられたエンドスタチンの血管新生ドメイン内のヒトエンドスタチンの１２５番目の部位の点突然変異（プロリンからアラニンへの置換；ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ）が、内皮細胞結合性を増加し、抗血管新生活性を増大させた。Ｐ１２５Ａ突然変異は部位特異的突然変異作製法を用いてヒトエンドスタチンに導入された。サブクローニングされたｈｕＥｎｄｏ及びｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ遺伝子がヒトＩｇＧ３の重鎖定常ドメインのカルボキシル末端に読み枠で結合され、その後、前記エンドスタチン重鎖定常領域は、真核生物の選択のためのＨｉｓＤ遺伝子を含む発現ベクター（ｐＳＶ２−ｈｉｓ）中のヒト化モノクローナル抗体４Ｄ５−８（ＨＥＲ２、トラスツズマブ、ジーンテック）の抗ＨＥＲ２可変領域に結合された。結果として生じる融合タンパク質の概念図が図１Ａに示される。
【０３４５】
その後、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質のコンストラクトは、完全抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏ（アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ）及び抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ（アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ）を構築するために、抗ＨＥＲ２カッパー軽鎖を安定に発現しているＳＰ２／０又はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３のミエローマ細胞に安定にトランスフェクションされた（図１Ａ）。前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質が［３５Ｓ］メチオニンで生合成的に標識され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。予測された分子量のアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質が完全に構築されたＨ２Ｌ２型として分泌された（図１Ｂ）。分泌された［３５Ｓ］メチオニン標識化タンパク質は非還元条件下で〜２２０ｋＤａの分子量を有し、サイズが結合されたエンドスタチン分子（各２５ｋＤａ）２個を有する完全抗体（１７０ｋＤａ）として予測された（図１Ａ）。還元後、予測された分子量の重鎖及び軽鎖が観察された（それぞれ８５ｋＤａ及び２５ｋＤａ）（図１Ｂ）。その後、前記エンドスタチン融合タンパク質はプロテインＡカラムを用いて培養上清から精製された。
【０３４６】
ＨＥＲ２標的抗原及びＨＵＶＥＣｓへの抗ＨＥＲ２ヒトエンドスタチン融合タンパク質の結合能力
前記エンドスタチン融合タンパク質がＨＥＲ２抗原を認識する場合があるかどうかの調査が行なわれた（図２）。前記ＨＥＲ２を発現しているヒト乳癌細胞株、ＳＫ−ＢＲ−３と、マウス腫瘍細胞ＥＭＴ６及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２とが検出抗体としての抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてＨＥＲ２抗原への結合をテストするために用いられ、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ及びアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａは前記ＨＥＲ２＋ＳＫＢＲ３乳癌細胞と、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２細胞とに結合した（図２Ａ及び２Ｂそれぞれ）一方、アイソタイプの対照抗体（抗ダンシルＩｇＧ３）は、ＳＫ−ＢＲ−３及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２に結合しなかった。アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ又はアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａは、ＨＥＲ２抗原を全く発現しなかった親のＥＭＴ６細胞に結合しなかった（図２Ｃ）。
【０３４７】
前記融合タンパク質のヒトエンドスタチン原子団の構造インテグリティー（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を調べるために、抗ＨＥＲ２ヒトエンドスタチン融合タンパク質が、ＳＫ−ＢＲ−３、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２及びＥＭＴ６を用いてインキュベーションされた。ＳＫ−ＢＲ−３及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２に結合した融合タンパク質の前記ヒトエンドスタチンドメインがビオチン化された抗ヒトエンドスタチンで検出され、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートで染色された。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ及びアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａが、抗ヒトエンドスタチン検出抗体によって認識され、かつ、その後にＳＫ−ＢＲ−３及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２に結合する（図２Ｄ及び２Ｅ）一方、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３と、アイソタイプの対照抗体とは検出されなかった。エンドスタチンは、１次抗体としてのアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ又はアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａのいずれかを用いて検出される場合があり、両方の融合タンパク質は、ＨＥＲ２＋ＳＫ−ＢＲ−３と、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２の細胞とに類似の親和性で結合した。
【０３４８】
内皮細胞に結合する場合があるアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質を決定するために、ＨＵＶＥＣｓは、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３、ｈｕＥｎｄｏ又はアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質を用いて処理され、かつ、ＨＵＶＥＣｓに結合したヒトエンドスタチンドメインはビオチン化ヒトエンドスタチンを用いて検出され、ストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートを用いて染色された。ＨＵＶＥＣｓへのヒトエンドスタチン及びアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の結合が容易に検出される一方、アイソタイプの対照又はアルファＨＥＲ２ＩｇＧ３の結合は検出されなかった（図２Ｆ）。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａは、ヒトエンドスタチン又はアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏのいずれかと比較してＨＵＶＥＣｓへの僅かに強い結合を示したことは特筆すべきことである。
【０３４９】
アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質による内皮管形成の阻害
ヒトエンドスタチン抗体融合タンパク質の抗血管新生の特徴を評価するために、前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の効果は、ヒトエンドスタチン細胞がマトリゲル上に播種され、自発的に凝集し、血管刺激（例えば、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＢＳ）に対する応答で多細胞性毛細管様管状構造を構築するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗血管新生アッセイでテストされた。親抗体又はヒトエンドスタチン単体のいずれも管形成の評価可能な阻害を示さなかった。対照的に、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質処理は管状構造への凝集を強く阻害し、細胞が、投与量依存性様式でプラスチック上に播種されたまま維持され、接着性の細胞に似ている形態を示す（散在型表現型）（図３）。前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ及びアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合タンパク質（図３Ｄ−３Ｉ）は、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３（図３Ｂ）又はヒトエンドスタチン（図３Ｃ）と比較して、ＨＵＶＥＣのより強い管形成阻害を顕著に示した。天然のエンドスタチンと比較して、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合体の増大されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗血管新生効果は、２量体としてのエンドスタチンの提示の結果の場合がある。
【０３５０】
アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ（図３Ｇ−３Ｉ）で見られた細管凝集の阻害は、管状形成の完全な崩壊と、大きな形態的変化とをもたらした４５ｎＭと同濃度でのＨＵＶＥＣの処理においてアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ（図３Ｄ−３Ｆ）で見られたものよりも顕著に大きかった（分散）（図３Ｈ−３Ｉ）。したがって、融合タンパク質のヒトエンドスタチンの１２５番目のアミノ酸部位でのプロリンからアラニンへの突然変異が、天然のエンドスタチン（ｈｕＥｎｄｏ、図３Ｃ）又は野生型エンドスタチン融合タンパク質（アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ、図３Ｄ−３Ｆ）と比較して、内皮細胞による管状形成の阻害を増大した。
【０３５１】
アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質による内皮細胞の増殖
前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の効果は、内皮細胞（ＥＣ）の増殖で評価された。ＨＵＶＥＣｓは、ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦのいずれかの存在下又は非存在下で融合タンパク質の濃度を増加しながら７２時間曝露された。野生型及び変異型の両方の抗体−エンドスタチン融合タンパク質は、ＶＥＧＦ（図４Ａ）又はｂＦＧＦ（図４Ｂ）のいずれかによって内皮細胞の増殖を著しく阻害した。ＨＵＶＥＣの増殖は、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ（ＶＥＧＦ存在下でｐ＝０．００８５、ｂＦＧＦ存在下でｐ＝０．００３４）か、エンドスタチン単体（ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦの存在下でｐ＝０．０００３）かによってよりも同濃度でアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａによってより有効に抑制された（図４）。
【０３５２】
ヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ−３の異種移植における抗腫瘍の有効性
ＳＫ−ＢＲ−３は、ＳＣＩＤマウスで緩慢に成長するＨＥＲ２−増幅ヒト乳癌細胞株である。トラスツズマブ、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１は、ＨＥＲ２を過剰発現しているヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ−３の成長を単独か、あるいは化学療法との組み合わせで阻害可能である。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質の抗腫瘍活性は、ＳＣＩＤマウスでのヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ−３異種移植に対して評価された。典型的な実験が図５に示される。タンパク質の等モルの投与量が１日おきに４週間注射された（図５）。図５Ａでは、エンドスタチン及びアルファＨＥＲ２ＩｇＧ３は非処理グループ（ＰＢＳ、ｐ値＝０．１５０４）と比較して２９日目まで腫瘍の成長を顕著に阻害せず、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３は非処理グループ（ＰＢＳ、ｐ＝０．００４５）と比較して腫瘍の成長を非常に顕著に阻害した一方、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ及びＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａでの処理が成長のより顕著な大きな阻害をもたらした（ｐ＜０．０００１、各々）。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａで処理されたマウスは、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ（ｐ＝０．０１６１）、ヒトエンドスタチン（ｐ＝０．０３４３）又はアルファＨＥＲ２ＩｇＧ３（ｐ＝０．０２５３）で処理されたマウスと比較して腫瘍の成長阻害を顕著に増大した（図５Ａ）。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ、ヒトエンドスタチン又はアルファＨＥＲ２ＩｇＧ３での前記処理間で成長阻害において全く有意差が存在しない。
【０３５３】
アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａでの処理は３０日後に腫瘍を完全に根絶し、最高の阻害度を示した。腫瘍がなく生き残ったものの割合は、ＰＢＳ（５匹中０匹）、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３及びヒトエンドスタチン（５匹中１匹）、及び、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ（５匹中２匹）と比較して、示された実験でアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａグループ（５匹中５匹）がより高かった（図５Ｂ）。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａで処理されたマウスは、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ、ヒトエンドスタチン単体又はアルファＨＥＲ２ＩｇＧ３単体で処理されたマウスと比較して生存期間の向上を示した（図５Ｂ）。同様の結果は、典型的な実験が示される２回繰り返された実験で見られた。
【０３５４】
抗腫瘍の有効性はＨＥＲ２標的の提示を要求する。
ＨＥＲ２を発現している腫瘍をアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合タンパク質の特異的な標的にするための能力が有効性を向上したかどうかを調べるために、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＥＭＴ６及びＥＭＴ６−ＨＥＲ２の腫瘍を反対側の腹側部に同時に移植された。その後、マウスは、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ又はヒトエンドスタチンのいずれかで処理された。マウスへのアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａの等モル投与は、腹側部に対側性に移植された親のＥＭＴ６と比較した際に、１６日目でＥＭＴ６−ＨＥＲ２の優先的に増殖阻害を示した（図６Ａ、ＥＭＴ６の平均腫瘍容積＝１３９１ｍｍ３、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２の平均腫瘍容積＝３６０．８ｍｍ３、平均腫瘍容積間の差異＝１０３０±１５２．１、９５％ＣＩ＝７０３．６ないし１３５６、ｐ＜０．０００１）。ＰＢＳ（図６ＣＡ、ＥＭＴ６の平均腫瘍容積＝１６７７ｍｍ３、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２の平均腫瘍容積＝１５２７ｍｍ３、平均腫瘍容積間の差異＝１４０．７±１５０．０、９５％ＣＩ＝−２７５．７ないし１５０．０、ｐ＝０．４０１４）と、エンドスタチン（図６Ｄ、ＥＭＴ６の平均腫瘍容積＝１１６９ｍｍ３、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２の平均腫瘍容積＝８７７．８ｍｍ３、平均腫瘍容積間の差異＝２９１．１±１９１．３、９５％ＣＩ＝−１５０．０ないし７３２．２、ｐ＝０．１６６５）とは、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２及びＥＭＴ６の腫瘍の優先的阻害で有意差を全く示さなかった。３種類の異なる処理間において、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ（図６Ｅ、ｐ＜０．００１）が、１６日目でＰＢＳ（図６Ｅ、ｐ＜０．００１）又はエンドスタチン（ｐ＜０．００１）よりもＥＭＴ６−ＨＥＲ２の腫瘍成長をより有効に阻害した。しかし、前記処理間において、ＨＥＲ２陰性ＥＭＴ６親腫瘍の阻害で全く有意差がなかった（図６Ｆ、ｐ＞０．０５）。したがって、ＨＥＲ２を発現する腫瘍を選択的に標的化することが、最大の有効性のために必要とされた。
【０３５５】
標的化された腫瘍の血管免疫蛍光染色
腫瘍の血管新生におけるアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合タンパク質の効果を調べるために、腫瘍が切除され、腫瘍の組織学切片は、処理４回又は７回の後に処理マウス及び非処理マウスから得られ、かつ、腫瘍の微小血管は抗ＰＥＣＡＭ蛍光免疫染色を用いて可視化された（図７）。ＥＭＴ６−ＨＥＲ２腫瘍の免疫蛍光染色が、ＰＢＳで処理されたグループのもの（図７Ｂ）と比較して、抗体エンドスタチン−融合体で処理されたグループは処理４回後の１２日目で、薄く、短くかつ断片化された血管を示したことを示した（図７Ａ）。全ての血管密度（Ｖｄ）が、血管によって占有された面積を決定することによって測定された。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合タンパク質での処理は、腫瘍の総Ｖｄ値で統計的に有意な減少をもたらした（図７Ｃ、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合体で処理された平均総Ｖｄ値＝３２０２０ピクセル２、ＰＢＳで処理された平均総Ｖｄ値＝５８５６０ピクセル２、平均総Ｖｄ値間の差異＝２６５４０±６５７４、９５％ＣＩ＝１１３８０ないし４１７００、ｐ＝０．００３８）。平均血管面積を調べるために、総Ｖｄ値は血管数で除算された。エンドスタチン融合体で処理された腫瘍はＶｄ平均値の非常に有意な減少を示した（図７Ｄ、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合体で処理された平均Ｖｄ平均値＝４４．０７ピクセル２、ＰＢＳで処理された平均Ｖｄ平均値＝１１２．１ピクセル２、平均Ｖｄ平均値間の差異＝６８．０５±１３．２５、９５％ＣＩ＝３７．５０ないし９８．６０、ｐ＝０．０００９）。１８日目（処理７回）までに、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａで処理されたマウス２匹中のうち１匹からのＥＭＴ６−ＨＥＲ２腫瘍が完全に退行し、かつ、処理されたグループの別の１匹は明らかに染色可能な血管が全くない非常に小さな腫瘍を示した一方、血管はＰＢＳで処理された腫瘍で容易に示された。
【０３５６】
議論
エンドスタチンによる抗血管新生療法は、さまざまなマウスモデルでの多数回の療法にもかかわらず、耐性発生についての証拠がほとんどないか、あるいは全くなしにマウスの腫瘍の成長を阻害することが示された。さまざまなマウスモデルにおいて、エンドスタチンを用いて繰り返された処理は腫瘍の恒久的な根絶をもたらした。しかし、それぞれの臨床試験は、さまざまな投与計画で用いられた際に、ヒトエンドスタチンが非常に安全な薬物であることを証明したが、ヒトエンドスタチンの第１相／第２相の研究はマウスモデルで見られた抗腫瘍活性のレベルを示さなかった（Ｈａｎｓｍａ  ＡＨら、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００５；  １６（１０）：１６９５−７０１、Ｋｕｌｋｅ  ＭＨら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；２４（２２）：３５５５−６１）。より高い局部濃度と、より高い特異性とを達成するために、エンドスタチンの半減期が延長され、かつ、エンドスタチンが腫瘍を特異的な標的にされる場合には、エンドスタチンの高投与量での長期間治療のロジスティクスな不利益の多くが克服される場合があると私達は仮説を立てた。さらに、私達は、抗体融合タンパク質の状態で２量体として送達された場合に、エンドスタチンがより有効の場合があったと仮説を立てた。私達は、抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ３−ＣＨ３−マウスエンドスタチン融合タンパク質が、抗血管新生活性を保持し、延長された血清半減期及び安定性を示し、ＨＥＲ２関連腫瘍を特異的に標的にし、血管形成を阻害し、かつ、エンドスタチン又は抗ＨＥＲ２抗体の単独か、あるいは組み合わせで送達されたよりもｉｎ  ｖｉｖｏでより有効に腫瘍の成長を阻害したことを示した（Ｃｈｏ  ＨＭら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００５；  ４（６）：９５６−６７）。私達はＨＥＲ２＋腫瘍に選択的に局在化するためのかかる融合体の前記能力を示し、かつ、ヒトＨＥＲ２を発現するために設計されたＣＴ２６−ＨＥＲ２、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２のマウス腫瘍を含むさまざまなマウスモデルと、ＨＥＲ２を高レベルで恒常的に発現するＳＫＢＲ３の異種移植とに対する向上した有効性を特筆した。
【０３５７】
ヒトの用途のための調製においてマウスエンドスタチン融合ドメインの候補の抗原性を低下するために、私達は、ヒトエンドスタチンと、増大した抗血管新生の性質を有するエンドスタチン変異体とを利用して新しい融合体２個を現在構築している。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ及びアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａの融合タンパク質が、内皮管形成と、ＨＵＶＥＣの増殖とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで顕著に阻害し、かつ、ヒトエンドスタチンよりも非常に有効に阻害した。前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合タンパク質は、天然のエンドスタチンか、野生型アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合体かのいずれかよりもｉｎ  ｖｉｔｒｏで管形成をより大きく阻害することを示した。前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合体を用いるＳＣＩＤマウスで確立されたＳＫ−ＢＲ−３の異種移植処理は、アルファＨＥＲ２ＩｇＧ３、ヒトエンドスタチン又はアルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質で処理されたマウスと比較して、より大きな成長阻害をもたらした。前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質はＨＥＲ２を発現している腫瘍を特異的に標的にし、かつ、ＥＭＴ６と、ＥＭＴ６−ＨＥＲ２とを同時に移植された同系のマウスで腫瘍の成長を阻害した。アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａは、ＰＢＳ又はヒトエンドスタチンよりもＥＭＴ６−ＨＥＲ２の腫瘍成長をより有効に阻害した（ｐ値＝０．００３）。抗ＨＥＲ２抗体の標的化能力と、融合抗体の状態で２量体で提供されたヒトエンドスタチンの抗血管新生活性とを組み合わせることは、内皮管形成及びＨＵＶＥＣの増殖の阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで向上し、かつ、抗腫瘍活性をｉｎ  ｖｉｖｏで増大する。
【０３５８】
内皮管形成実験で、前記ヒトエンドスタチン融合タンパク質はＨＵＶＥＣに激しい形態変化をもたらし、管形成を阻害した。ヒト又はマウスのエンドスタチン処理は、管状構造へのＨＵＶＥＣの凝集をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害し、細胞は、特徴的な毛細管様の管への凝集よりもむしろ分散されたまま、かつ、プラスチック上で接着性細胞に似ている形態を示す。内皮細胞の運動性を促進したエンドスタチンの２量体又は３量体は、促進しなかった単量体の除いて、エンドスタチンのオリゴマー化が管形成活性の有効な阻害のために重要であることを示した。前記アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質が融合タンパク質でエンドスタチンドメイン２個を保持するため、融合タンパク質は２量体としてのエンドスタチンを有効に提供する場合があり、このことは、これらの実験で見られたより分散され、かつ、バラバラなＨＵＶＥＣｓの形態をもたらす場合がある。前記融合タンパク質のエンドスタチンドメインの２量体化は、インテグリン、パールカン及びグリピカンへの結合と、融合タンパク質活性の増加とをさらに促進する場合があった。変異体アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏ−Ｐ１２５Ａ融合バリアントは、アルファＨＥＲ２−ｈｕＥｎｄｏよりもより有効にｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＵＶＥＣの管形成と、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長とを阻害した。
【０３５９】
エンドスタチンを抗体に結合することが、トラスツズマブの前記抗腫瘍活性を顕著に増大する場合がある。トラスツズマブに対するＨＥＲ２＋乳癌の全体の応答割合は相対的に低いままであり（１５−３４％）（Ｆｒｉｃｋｅ  Ｉら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；１３（１６）：４８４０−８、Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９６；１４：７３７−４４、Ｖｏｇｅｌ  ＣＬら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２；２０（３）：７１９−２６、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ＨＪら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；  ２１（１５）：２８８９−９５）、このアプローチはトラスツズマブと比較して応答割合及び持続時間の両方の増加を保証し続け、単独か、別の細胞傷害性剤（カルボプラチン、ドセタキセル）及び／又は抗血管新生剤（例えば、ベバシズマブ；抗ＶＥＧＦ抗体、トロンボスポンジン１）のような別の抗腫瘍計画との組み合わせかで与えられたトラスツズマブの抗腫瘍活性スペクトルを拡張する場合がある。エンドスタチンの投与が非常に安全であることが明らかなため、抗体−エンドスタチン融合タンパク質はアジュバントの調製での使用に適切な場合もある。さらに、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−マウスエンドスタチン融合体と、前記抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブとがマウスを含むＳＫ−ＢＲ−３の異種移植と組み合わせて与えられた際に、私達は著しい相助作用を観察している。これは、前記抗体融合体が、別の抗血管新生アプローチと組み合わせられた際に、役立つ場合があることを示す。
【０３６０】
エンドスタチンに加えて、別の抗血管新生ドメインは融合体（例えば、アンジオスタチン、タムスタチン等）に取り込まれる場合もある。エンドスタチンが血管新生遺伝子発現の強力かつ包括的な調節因子であるため、私達は候補融合体としてのエンドスタチンの初期実験に専念した。最後に、前記ＨＥＲ２の抗原性標的に加えて、抗血管新生タンパク質に抗体を用いて定めることは、別の抗体の特異性／可変ドメインでの置換によって（上皮増殖因子受容体又は前立腺特異的膜抗原のような）別の腫瘍標的に適用される場合がある多目的のアプローチである。このアプローチは、親抗体（例えば、セツキシマブ）が適度の有効性のみを示す腫瘍抗原に定められた抗体の有効性及び有用性を向上するために用いられる場合がある。
【実施例２】
【０３６１】
実施例２  キメラ分子
Ｉｇ−エンドスタチンキメラ分子の例は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｓｃＦｖ−Ｅｎｄｏ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ１−Ｅｎｄｏ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−Ｈ−Ｅｎｄｏ及び抗Ｅｎｄｏ−抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３の融合タンパク質を含む。抗体融合タンパク質を生成するためのある方法では、ヒンジ直後のＣＨ１エキソン３’末端か、ＣＨ３エキソンの３’末端かのユニークな制限酵素部位と、ヒトカッパー軽鎖及びＩｇＧ３のＩｇＧ３重鎖の両方の可変ドメインとを含んだベクターが用いられた。これらのコンストラクトを用いて、エンドスタチンが抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３のＣＨ１の後で抗ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合される場合があり、かつ、Ｅｎｄｏ−ＩｇＧ３のエンドスタチンは可動性のリンカー（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３を用いて可変領域のアミノ末端で結合される場合がある。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ重鎖（ＦｖＨ）及び軽鎖（ＦｖＬ）の可変領域遺伝子のＦｖ遺伝子がＰＣＲによってクローニングされる場合があり、クローニングされたＦｖ遺伝子断片は可動性のリンカー（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３と結合した。エンドスタチンはｓｃＦｖ−Ｅｎｄｏを作成するためにＦｖＬ−（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３−ＦｖＨ遺伝子の３’末端で結合された。構築された融合遺伝子がミエローマ細胞株ＳＰ２／０で発現される場合があった。例えば、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏ融合体、エンドスタチン、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３及び特異性の制御に関係がない抗ダンシルＩｇＧ３を発現しているトランスフェクトーマが生成されている。宿主細胞によって産生された前記融合タンパク質を精製するために、該タンパク質は、ＣＨ３−Ｅｎｄｏ及びＥｎｄｏ−ＩｇＧ３のためのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介してか、あるいはプロテインＡ結合部位を欠如するｓｃＦｖ−Ｅｎｄｏ、ＣＨ１−Ｅｎｄｏ及びＨ−Ｅｎｄｏのための（エンドスタチン原子団に結合する）ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いて培養培地から単離された。重鎖及び軽鎖の両方を含む融合タンパク質のために、サイズ及びＨ２Ｌ２形状への凝集がＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価される。ウサギ抗エンドスタチン血清のウエスタンブロット解析が、結合したエンドスタチン原子団を検出するために用いられる場合がある。前記融合タンパク質の予測された特徴が以下に示される。
【０３６２】
【表１】
2010531666.tif 000003
【実施例３】
【０３６３】
実施例３  血清の安定性研究
前記抗体−エンドスタチン融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態パターンを特徴付けるために、腫瘍を移植された／移植されていないマウス（ＣＴ２６又はＣＴ２６−ＨＥＲ２／ｎｅｕ）が、［１２５Ｉ］で標識された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏ、エンドスタチン及び対照抗ダンシルＩｇＧ３を用いて静注され、かつ、融合体のエンドスタチンの浄化値が測定された。［１２５Ｉ］−エンドスタチンは、腫瘍のある／腫瘍のないマウスの血漿分画から急速に除去された（Ｔ１／２２除去：０．５−３．８時間）一方、［１２５Ｉ］で標識された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏ（Ｔ１／２２：４０．２−４４．０時間）の除去の割合は、［１２５Ｉ］で標識された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３（Ｔ１／２２：３９．９−６３．８時間ｈｒｓ）と、対照抗ダンシルＩｇＧ３（Ｔ１／２２：４３．７−４６．５時間）とに類似した。
【０３６４】
［１２５Ｉ］で標識された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏ、エンドスタチン及び抗ダンシルＩｇＧ３の前記血清の安定性を解析するために、血漿試料はＴＣＡで沈殿され、かつ、計測された。注射後９６時間、血清中の前記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏの約９０％が影響のないままだった。エンドスタチンは６０分間の循環でほとんど残さずに急速に除去された。エンドスタチンについて、約９０％が注射後２分間影響を受けないままであり、循環中の残っているエンドスタチンの５５％のみが６０分間影響を受けずに維持された。対照的に、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３及び抗ダンシルＩｇＧ３に似ている動態で非常に緩慢に除去された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる血清試料の解析は、循環中の前記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏは影響を受けないままであったことを証明した。
【実施例４】
【０３６５】
実施例４  生体局在研究
前記エンドスタチン融合タンパク質の生体分布及び生体局在を測定するために精製されたエンドスタチン融合タンパク質が１２５Ｉで標識された。腫瘍を有するマウスへの静注後９６時間で、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏ及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３の放射性局在指標（血中の％ＩＤ／ｇによって除算された腫瘍の注射投与量の％［ＩＤ］／ｇ）が類似した。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏが、ＣＴ２６−ＨＥＲ２／ｎｅｕの腫瘍／血液の割合３．７６と、ＣＴ２６の腫瘍／血液の割合０．５０とを示した一方、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３は、ＣＴ２６−ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＣＴ２６それぞれ、割合２．８３及び０．４７を示した。腫瘍への標的化の増大は、エンドスタチン単体に関して全く見れなかった。したがって、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質はＨＥＲ２／ｎｅｕ関連腫瘍に局在化するための能力を維持した。
【０３６６】
ＣＴ２６の腫瘍と、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現しているＣＴ２６（ＣＴ２６−ＨＥＲ２）の腫瘍とを反対側の腹側部に同時に移植されたマウスで、１２５Ｉで標識された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３がＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍に優先的に局在化した抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの特異的な腫瘍局在化指標値は、さまざまな個別実験で抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３の指標値よりも実際により大きかった。これは、腫瘍を標的にした抗体−エンドスタチン融合体の相対的な局在がＨＥＲ２／ｎｅｕ標的抗原への結合の結果だったことを示した。
【０３６７】
【表２】
2010531666.tif 000004
【実施例５】
【０３６８】
実施例５  抗腫瘍研究
ＢＡＬＢ／ｃマウスでＨＥＲ２／ｎｅｕを発現しているＣＴ２６の成長を阻害するための抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３及びエンドスタチンの能力が調べられた。ＢＡＬＢ／ｃマウスは細胞１×１０６個を皮下注射され、腫瘍の成長が測定された。７日目で、マウスの多くは触知可能な腫瘍（直径約５ｍｍ）を発生し、腫瘍を有するマウス（グループあたり５匹）の処理が、１日おきに抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３、抗ダンシルＩｇＧ３、エンドスタチン又は対照ＰＢＳの静注（５回）によって始まった。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３又はエンドスタチンで処理されたマウスの腫瘍成長は、抗ダンシルＩｇＧ３又は対照ＰＢＳと比較して低下された。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏでの処理は腫瘍容積のさらなる低下をもたらした。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン単体と比較して２倍モル過剰に投与されたＰＢＳ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３又はエンドスタチンと比較して顕著な成長阻害（ｐ＜０．０５）を示した。エンドスタチン単体の１０倍の増加がさらに有効性を増大した。
【０３６９】
反対側の腹側部にＣＴ２６及びＣＴ２６−ＨＥＲ２／ｎｅｕを同時に移植されたマウスにおいて、マウスへの抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの等モル投与は、対側性に移植されたＣＴ２６親腫瘍と比較してＣＴ２６−ＨＥＲ２／ｎｅｕの優先的な阻害を示した。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンは、エンドスタチンか、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３抗体か、抗体及びエンドスタチンの組み合わせかよりもより有効に阻害した（ｐ＜０．０５）。
【０３７０】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンか、エンドスタチンか、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３抗体か、抗体及びエンドスタチンの組み合わせかがＳＣＩＤマウスでヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ−３の成長を阻害するであろうかどうかが調べられた。ＳＣＩＤマウス（グループあたり８匹）はＳＫ−ＢＲ−３の細胞１×１０６個を皮下注射され、腫瘍の成長が測定された。１５日目までに、マウスのほとんどは触知可能な腫瘍（直径約５ｍｍ）を発生し、処理が、１日おきに抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏか、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３か、エンドスタチンか、抗体及びエンドスタチンの組み合わせかの静注（１０回）を用いて始まった。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏか、エンドスタチンか、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３抗体か、抗体及びエンドスタチンの組み合わせかで処理されたマウスでは、全てが腫瘍成長の阻害を示した。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−Ｅｎｄｏの投与は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体単独か、エンドスタチン単独か、組み合わせで与えられた抗体及びエンドスタチンかのいずれかと比較して、腫瘍容積のより大きな低下を着実にもたらした（ｐ＜０．０５）。
【実施例６】
【０３７１】
実施例６  抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの産生及び特徴付け
予測分子量の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質が、完全に構築されたＨ２Ｌ２型として安定にトランスフェクションされたＳｐ２／０細胞株から産生され、かつ、分泌された。分泌された３５Ｓ−メチオニンで標識された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンは非還元条件下で約２２０ｋＤａの分子量を有し、そのサイズは結合したエンドスタチン（２５ｋＤａ）の分子２個を有する完全抗体（１７０ｋＤａ）として予測された。還元後、予測分子量のＨ鎖及びＬ鎖が観察された。前記エンドスタチン原子団が前記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンタンパク質中に存在したと証明するために、精製された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン及びエンドスタチンは非還元条件下で溶解された。ウエスタンブロット後、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンは、抗ヒトＩｇＧ又は抗エンドスタチン抗体によって２２０ｋＤａの分子量で同定された。還元後、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンに由来する主な重鎖のバンドは、８５ｋＤａの予測サイズに移動した。
【実施例７】
【０３７２】
実施例７  抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの抗血管新生活性
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶＥＧＦ／ｂＦＧＦ誘導性血管新生を阻害ためのエンドスタチンの能力が絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイを用いてテストされた。ビトロジェン及びＶＥＧＦ／ｂＦＧＦ（１００ｎｇ及び５０ｎｇ／ペレットそれぞれ）と、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３（０．５−１０μｇ／ペレット：２．９５−５９ｐｍｏｌ／ペレット）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン（０．５−１０μｇ／ペレット：２．２５−４５ｐｍｏｌ／ペレット）又はエンドスタチン（０．５−１０μｇ／ペレット：２０−４００ｐｍｏｌ／ペレット）のいずれかとを含むペレットが、新しい毛細管の侵入について測定された。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質の個別の調製物２個が、投与量依存性のやり方でＶＥＧＦ／ｂＦＧＦによって仲介された血管新生応答を抑制することができ、特異的活性はエンドスタチンで見られた応答に類似する。対照的に、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３は抗血管新生応答を全く示さなかった。したがって、遺伝的に設計された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＩｇＧ３−エンドスタチンはＶＥＧＦ／ｂＦＧＦによって仲介された前記血管新生応答を阻害するための能力を保持する。
【実施例８】
【０３７３】
実施例８  血清除去及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの安定性
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの薬物動態を特徴付けるために、腫瘍２６（ＣＴ又はＣＴ２６−ＨＥＲ２）を移植した／移植されていないマウスは、［１２５Ｉ］−抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン、エンドスタチン又は対照の抗ダンシルＩｇＧ３を静注され、注射された放射性標識化タンパク質の除去が測定された。ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現しているＣＴ２６腫瘍を移植したマウスと、全てのグループのマウスに関する薬物動態のデータとに由来する典型的な結果が表１にまとめられた。［１２５Ｉ］−エンドスタチンが腫瘍のある又は腫瘍のないマウスの血漿分画から急速に除去された（Ｔ１／２２除去：０．５−３．８時間）一方、［１２５Ｉ］−抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン（Ｔ１／２２：４０．２−４４．０時間）の除去の割合は、［１２５Ｉ］−抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３（Ｔ１／２２：３９．９−６３．８時間）及び抗ダンシルＩｇＧ３（Ｔ１／２２：４３．７−４６．５時間）の除去の割合に類似した。したがって、抗体と融合されたエンドスタチンはエンドスタチン単体よりも非常に緩慢に末梢分画から除去された。
【０３７４】
ＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍を有するマウス（表１）では、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの血漿中薬物濃度曲線下面積（ＡＵＣ）は、より長い半減期の除去（６９倍の増加：２，６４０分  対  ３８分）と、「平均滞留時間」（ＭＲＴ）の増加（５６倍の増加：２８００分  対  ５０分）との両方を結果の際に、エンドスタチンと比較して５６倍（１３，１００％ＩＤ分／ｍＬ  対  ２３３％ＩＤ分／ｍＬ）に増加された。エンドスタチンは主に糸球体濾過及び腎クリアランスによって３０分以内に血清から急速に除去されたが、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３及び抗ダンシルＩｇＧ３の除去と同様に、血清からの非常に緩慢な除去を示した。
【０３７５】
［１２５Ｉ］で標識された抗ＨＥＲ／ｎｅｕＩｇＧ３、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−ＣＨ３−エンドスタチン、エンドスタチン及び抗ダンシルＩｇＧ３の血清安定性を解析するために、血漿試料がＴＣＡで沈殿され、かつ、計測された。注射後９６時間、血清中の前記抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの約９０％は影響を受けないままだった。エンドスタチンについて、約９０％は注射後２分間は影響を受けず、かつ、循環中のエンドスタチンで残っている５５％のみが６０分間影響を受けないままだった。対照的に、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３及び抗ダンシルＩｇＧ３に似ている動態で非常に緩慢に除去された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる血清試料の解析は、循環中の前記抗ＨＥＲ／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンは影響を受けないままだったと証明した。したがって、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質の抗体の原子団が、遺伝的に融合されたエンドスタチンを血流中で非常に安定にする。
【実施例９】
【０３７６】
実施例９  抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの生体分布及び生体局在
ＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍を有するマウスへの静注後９６時間で、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３は主に前記腫瘍及び血液中で見られた（それぞれ５．６７及び２．１０％ＩＤ／ｇ）。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３の注射後９６時間の放射性局在指標（血液の％ＩＤ／ｇによって除算された腫瘍の％ＩＤ／ｇ）は類似した。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンは、ＣＴ２６−ＨＥＲ２について３．７６と、ＣＴ２６について０．５０との腫瘍／血液割合を示した一方、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３は、ＣＴ２６−ＨＥＲ２及びＣＴ２６についてそれぞれ２．８３及び０．４７の腫瘍／血液割合を示した。したがって、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−エンドスタチン融合タンパク質の両方は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現している腫瘍に優先的に局在した。
【０３７７】
抗原性標的への抗体−エンドスタチン融合タンパク質の局在を測定するために、ＣＴ２６及びＣＴ２６−ＨＥＲ２の腫瘍を反対の腹側部に同時に移植したマウスは、１２５Ｉで標識された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質か、１２５Ｉで標識された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体かのいずれかを静注された（表２）。標識されたタンパク質の生体分布及び生体局在が標識されたタンパク質の注射後異なる時間（６、２４及び９６時間）で調べられた。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３はＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍に優先的に局在した。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの特異的腫瘍放射性局在指標は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３の指標よりも実際に大きかった（表２）。これは、腫瘍を標的にした抗体−エンドスタチン融合体の相対的な局在がＨＥＲ２／ｎｅｕ標的抗原への結合の結果だったことを示した（表２）。
【実施例１０】
【０３７８】
実施例１０  抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性
マウス大腸腺癌ＣＴ２６細胞は、以前に説明したようにＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の遺伝子を用いて形質導入された。ＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞がこれらの研究で用いられ、かつ、親ＣＴ２６細胞と同一の割合でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖された。予備実験はＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した前記ＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍が前記親のＣＴ２６腫瘍と同一の割合で成長した（Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌを参照せよ。）ことを示した。
【０３７９】
ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６−ＨＥＲ２の成長における抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−エンドスタチン、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３及びエンドスタチンの抗腫瘍効果が研究された。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３又はエンドスタチンで処理したマウスの腫瘍成長は、アイソタイプの抗ダンシルＩｇＧ３対照又はＰＢＳ対照と比較して低下された。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンでの処理は腫瘍容積のさらなる低下をもたらした。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンは、ＰＢＳ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３又はエンドスタチンが投与された際と比較して顕著により良好な成長阻害を示した。前記ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３へのエンドスタチンの遺伝的融合体は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３又はエンドスタチン単体のいずれかよりもより有効に腫瘍成長を阻害することを最初に示した。
【０３８０】
予備実験を確固たるものにするために、マウスはＣＴ２６及びＣＴ２６−ＨＥＲ２を反対の腹側部に同時に移植された。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの投与は、対側性に移植したＣＴ２６親腫瘍と比較してＣＴ２６−ＨＥＲ２の成長の優先的な阻害を示した。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンは、エンドスタチンか、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３抗体か、抗体及びエンドスタチンの組み合わせかよりもより有効に阻害した（ｐ＜０．０５）。
【０３８１】
ハーセプチン、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ１は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰に発現するＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞の増殖を阻害できた。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンか、エンドスタチンか、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３抗体か、抗体及びエンドスタチンの両方の組み合わせかは、ＳＣＩＤマウスでヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ−３の異種移植片の成長を阻害するかどうかが次に示された。ＳＫ−ＢＲ−３はＳＣＩＤマウスの腹側部に移植された。処理が１０回繰り返された。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンの投与は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体単独か、エンドスタチン単独か、組み合わせで与えられた抗体及びエンドスタチンかと比較して、腫瘍容積のより大きな減少をもたらした（ｐ＜０．０５）。
【実施例１１】
【０３８２】
実施例１１  抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質で処理したＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍の血管形成
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質の抗腫瘍活性の機構をより良く理解するために、腫瘍の血管形成が解析された。マウスが、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチン融合タンパク質か、ＰＢＳかのいずれかを静注されたとき、前記マウスはＣＴ２６及びＣＴ２６−ＨＥＲ２の腫瘍を反対の腹側部に同時に移植され、かつ、前記腫瘍の直径が４−６ｍｍまで成長させられた。ＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍は、上記のそれらと類似する動態を有する別の処理と比較して、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンで処理されたマウスで緩慢に成長した。処理１５回後、前記腫瘍は除去され、かつ、腫瘍の凍結切片がこれらの腫瘍の血管形成を可視化するための抗ＰＥＣＡＭ−１抗体で内皮細胞について免疫組織化学染色された。親のＣＴ２６腫瘍組織と、処理されていないＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍組織とは、エンドスタチン融合タンパク質で処理されたＣＴ２６−ＨＥＲ２よりもより血管を有することを示した。
【０３８３】
前記血管形成を鑑別するために、前記腫瘍の切片がラット抗マウス抗ＰＥＣＡＭ抗体で染色され、抗ラットＩｇＧ−アレクサ５９４で検出され、かつ、その後、共焦点顕微鏡によって解析された。これらの腫瘍の共焦点顕微鏡解析は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンその他のもので処理されたＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍の血管で著しい相違を示し、該相違が上記で観察された腫瘍成長の変化を説明する場合がある。１４−２１枚のデジタル顕微鏡画像からなる画像は、エンドスタチン融合体で処理された／処理されていない前記親ＣＴ２６腫瘍と、ＰＢＳで処理されたＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍との血管が、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＩｇＧ３−エンドスタチンで処理されたＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍の血管よりもより組織化し、かつ、分枝したように見えたことを示した。
【０３８４】
血管の変化は、血管密度を測定することによって定量化された。前記血管密度は血管によって占有された面積を決定することによって測定され、各腫瘍内に血管面積量を提供した。この測定を用いると、エンドスタチン融合体で処理されたＨＥＲ２／ｎｅｕを発現している腫瘍は、処理されていないＣＴ２６−ＨＥＲ２の腫瘍よりも顕著に狭い血管面積（１６％）であった（表３）。
【実施例１２】
【０３８５】
実施例１２  虚血／非虚血組織のＶＥＧＦの血管新生効果
抗体−エンドスタチン融合タンパク質の抗血管新生効果が、治療上の血管新生の動物下肢モデルを用いて調査されるであろう。ラット又はウサギの下肢虚血モデルが利用可能である。ウサギモデルの虚血レベルは、最大、重度又は適度の虚血条件として操作される場合がある。
【０３８６】
ウサギ下肢虚血モデル
外科手術（腸骨の結紮及び大腿の切除）後１時間での動脈及び毛細管の正常な分布で、腸骨及び大腿の動脈を介する血流がなくなることが虚血であることを示す。顕著な側副発生と、肢への血流の回復とがあったけれども、大腿動脈及びその関連血管を介する血流はまだなかった。顕著な炎症、壊死又は組織傷害は、筋肉が顕著に再灌流されたことを示す重篤な初期虚血にもかかわらず検出されなかった。対照的に、ＶＥＧＦで処理された肢は大腿動脈の末梢分枝に完全な血流を回復した。最初の血管造影からのこれらの血管の定量化は、処理された肢で外径１００μｍより大きい側副血管が１０倍より多いことをを示した。前記ＶＥＧＦで処理された肢での新たな血管発生は、脈管形成、血管新生及び動脈形成の組み合わせに関係する場合がある。
【０３８７】
非虚血モデルでのＶＥＧＦの血管新生効果
非虚血組織の血管新生は、ラットの皮下の腹膜脂肪パッドと、マウスの外耳（ｅａｒ  ｆｌａｐ）で調べられた。両方の場合で、縫合は前記組織で結紮され、２×１０９ｐｆｕのＡｄ−ＣＭＶ−ＶＥＧＦ又はＡｄ−ベータ−Ｇａｌが縫合周辺部に注射された。組織が３週間後に解析された。新しい血管は、ベータ−ｇａｌではなくＡｄ−ＣＭＶ−ＶＥＧＦが注射された両方の組織で明確に目視できた。前記ＶＥＧＦが注射された組織は漏出性の血管の示す可視の紅潮も含んだ。これらの結果は、ＶＥＧＦが非虚血組織で血管新生／脈管形成を活性化可能なことを示した。
【実施例１３】
【０３８８】
実施例１３  別の抗血管新生戦略との組み合わせ処理
ＰＤＧＦの遮断
ハーセプチンが進行性乳癌の治療のために承認されており、グリベック（ＳＴＩ５７、イマチニブ、ノバルティスファーマＡＧ）は、慢性骨髄性白血病及び消化管間質腫瘍のために承認されている。イマチニブは、ＰＤＧＦＲの効果によって腫瘍の血管新生と周皮細胞との関係を破壊する。エンドスタチンが初期の血管形成を阻害する一方、イマチニブは周皮細胞の効果によって成熟に影響を及ぼす場合がある。最初に、左右の腹側部に同時に移植されたＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ＨＥＲ２の腫瘍のそれぞれは、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ３−ｈｕＥｎｄｏと、融合タンパク質と、イマチニブとの組み合わせで処理されるであろう。イマチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ）が、１日に２回経口投与されるであろう。腫瘍での前記血管形成及び腫瘍成長は、上記されたように調べられるであろう。
【０３８９】
ＶＥＧＦの遮断
ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ、アバスチン（商標）、ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ、ジーンテック）は、転移性大腸癌の第３相臨床試験で化学療法と組み合わせて使用するために承認されている。アバスチン（商標）は、乳癌の第２相臨床試験で１７％の臨床的有用性（完全及び部分的な応答に加えて６ヶ月の安定（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ））を有することが報告されている。アバスチン（商標）は腎細胞癌でも活性を有し、かつ、乳癌の第３相臨床試験でタキサンの活性を増大することが報告されている。アバスチン（商標）はＶＥＧＦ−Ａの主要なアイソフォームの全てに結合し、かつ、中和し、血管容積、微小血管密度、間質液圧及び生存可能な循環している内皮細胞数を減らす。融合タンパク質と、アバスチン（商標）とを組み合わせることは、両方のアプローチの活性を増大する場合がある。ＳＣＩＤマウスのＳＫ−ＢＲ−３か、ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ＨＥＲ２かの腫瘍は、アバスチン（商標）（５０μｇ／注射）と、抗ＨＥＲ２抗体−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質（１０、５０及び２５０μｇ／注射、静注、ｑ．ｏ．ｄ．）か、ヒトエンドスタチンか、抗体単独かとを組み合わせて処理されるであろう。
【０３９０】
メトロノーム療法
腫瘍内で新しい血管を形成している内皮細胞の増殖は、多くの化学療法の細胞傷害性効果に影響を受け易い。最大耐容量での従来の化学療法の投与計画は、内皮画分を修復できる静止期間の拡張を必要とする。しかし、「メトロノーム」療法（例えば、連続的な低投与量の投与）は抗血管新生効果を維持する場合がある。ＭＣＦ７／ＭＣＦ７−ＨＥＲ２腫瘍は、さまざまな濃度の抗ＨＥＲ２抗体−ｈｕＥｎｄｏ融合タンパク質（１０、５０及び２５０μｇ／注射、静注、ｑ．ｏ．ｄ．）と、低投与量のシクロホスファミド（ＣＴＸ、２５ｍｇ／ｋｇ／日、経口）か、７９−８０か、単独かとを組み合わせてＳＣＩＤマウスにおいて処理されるであろう。癌治療のための「メトロノーム」投与計画を用いて低投与量のタキサン（パクリタキセル又はドセタキセル）を反復投与することもテストされるであろう。
【０３９１】
他の実施態様
発明は本明細書の詳細な説明とともに関連して説明されたが、前述の説明は例示することを意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。他の局面、利点及び変更は以下の特許請求の範囲に記載の範囲内である。
【０３９２】
本明細書で言及された全ての文献は、全体として引用により取り込まれる。
【図３Ｂ】
2010531666.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図６】
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【配列表】
2010531666000001.app
【国際調査報告】
2010531666.tif 000013