(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタインフルエンザCウイルスの株による感染から哺乳動物を防御するワクチンであって、免疫学的に有効な量の不活化ブタインフルエンザCウイルスを含み、前記ブタインフルエンザCウイルスが配列番号１２、１１、１３、１４、１５、１６、１７および１８の配列を有する８つのインフルエンザCポリペプチド（PB1、PB2、P3、HE、NP、M、NS1およびNS2）をコードする核酸分子を含み、前記ブタインフルエンザCウイルスゲノムがヒトインフルエンザCウイルスのゲノムと65％以下の相同性を有する、前記ワクチン。
【請求項２】
ブタインフルエンザCウイルスの株がブタから単離された株であり、ヒトインフルエンザCウイルスのゲノムと50％未満の相同性を有する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
水中油アジュバントを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
水中油アジュバントが少なくとも１０％の量で存在する、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
インフルエンザCウイルスがバイナリーエチレンイミンで不活化されている、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
動物が病原性ブタインフルエンザでチャレンジされた後のウイルス排出を顕著に低下させる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
配列番号１２、１１、１３、１４、１５、１６、１７および１８の配列を有する８つのインフルエンザCポリペプチド（PB1、PB2、P3、HE、NP、M、NS1およびNS2）をコードする核酸分子を含むブタインフルエンザCウイルスであって、前記核酸分子がヒトインフルエンザCウイルス株のゲノムと65％以下の相同性を有する、前記ブタインフルエンザCウイルス。
【請求項８】
核酸分子が、ヒトインフルエンザCウイルス株のゲノムと50％未満の相同性を有する、請求項７に記載のブタインフルエンザCウイルス。
【請求項９】
請求項７に記載のブタインフルエンザCウイルスの存在を少なくとも1つのサンプルにおいて検出する方法であって、以下の工程（a）及び（b）を含む前記方法：
（a）フォワード及びリバースプライマーを含む少なくとも1つの精製オリゴヌクレオチドプライマー対を用いて該サンプル由来の少なくとも1つの核酸の1つ以上のセグメントを増幅させる工程であって、該フォワードプライマーが配列番号：1を含み、さらにリバースプライマーが配列番号：2を含み、少なくとも1つの増幅生成物を生成する、前記工程；及び
（b）該増幅生成物を検出し、それによって該サンプル中のブタインフルエンザCウイルスの存在を検出する工程。
【請求項１０】
（b）が該サンプル中のブタインフルエンザCウイルスの量を決定する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（b）が逆転写リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
参照による組み入れ
本出願は、米国特許出願13/385,004（2012年1月27日出願、この出願の開示は引用により本明細書に含まれる）の優先権を主張する。
本発明はインフルエンザCウイルスおよびインフルエンザCウイルスワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザCは、ほとんどの個体が小児のときに感染するのでヒトのありふれた病原体である。インフルエンザCは、感冒に類似する軽度の呼吸器症状を引き起こす。中国でブタから単離されたインフルエンザCに関して1つの報告が存在する（Yuanji and Desselberger 1984, J. Gen. Virol. 65:1857-72）。さらにまた前記研究は、ブタインフルエンザCウイルスはブタに感染しブタの間で伝播され得ることを示した。いくつかの他の論文がインフルエンザCと反応する抗体をブタで同定し、ブタがインフルエンザCの保菌動物であるか又はヒトがこのウイルスを極めて通常的にブタに広めることを示唆した（Kimura et al. 1997, Virus Res. 48:71-9；Yamaoka et al. 1991, J Gen Virol. 72:711-714；Brown et al. 1995, Epidemiol. Infect. 114:511-20；Ohwada et al. 1987, Microbiol Immunol. 31:1173-80）。
【発明の概要】
【０００３】
インフルエンザCはこれまで1つの論文でしか報告されなかったように、ブタで発見されるのは稀なことである。単離され特徴が明らかにされたウイルスは、インフルエンザCの極めて稀な変種である。公知インフルエンザCウイルスとこのウイルスとの全体的なパーセント相同性はわずかに約65％であり、このウイルスが、これまでに記載されたことがない完全に新規な系列のウイルスであること、さらにこれまでに記載されたウイルスとは希薄な関係を有するだけであることを示している。この低レベルの相同性は、典型的なヒトインフルエンザCウイルスに対して作製されたワクチンはC/ブタ/Oklahoma/1334/2011に対して防御作用をもたないであろうということを示唆している。“ユニバーサル”インフルエンザCプライマーセットもまたこのウイルスを検出できなかったという知見もまた、このウイルスの新規性を物語っている。さらにまた、ヒト及びブタでの抗体力価の検出は、当該ウイルスのブタ及びフェレットでの複製能力と同様に、このウイルスがブタ及びヒトで症状を引き起こすことができることを示唆する。我々は、ブタの感染を防ぐワクチンを作製できること及び学術論文もまたこのワクチンがヒトを防御し得ることを支持するであろうということ示す。
【０００４】
ある特徴では、本発明は、以前に特徴が明らかにされたいずれのインフルエンザCウイルスとも低い相同性しかもたない新規なインフルエンザCウイルスである。チャレンジ実験は、前記ウイルスはブタに感染しブタの間で伝播され得ることを示す。さらにまた、インフルエンザCは一般的にヒトの病源体と考えられ、血清学的実験を実施して、ブタ及びヒトの両方でこのウイルスに対する抗体の発生に注目した。ブタの約10％及びヒトの30％がこのウイルルスに対する抗体を有する。さらに補足的な実験データは、このウイルスがフェレット（ヒトの感染実験の代用動物）に感染し伝播され得ることを示す。
第二の特徴では、本発明は、この新規なインフルエンザCウイルスに対するワクチンである。
第三の特徴では、本発明は、この新規なインフルエンザCウイルスの部分ゲノムである。
別の特徴では、本発明は、この新規なインフルエンザCウイルスを動物で検出する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】本発明の新規なインフルエンザCウイルスの電子顕微鏡写真である。
【図２】ワクチン接種及び非ワクチン接種ブタのHI力価を示すグラフである。
【図３】ワクチン接種及び非ワクチン接種ブタのリアルタイムPCR閾値を示すグラフである。
【図４】本発明のウイルスでチャレンジしたフェレットの組織培養感染用量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
ウイルスの単離
ニューポート・ラボラトリーズ（Newport Laboratories）に付託したサンプルは、インフルエンザ様の病気の徴候を示すブタから得た鼻の拭き取り検体であった。サンプルはリアルタイム逆転写PCRではインフルエンザAについて陰性であった。前記サンプルのアリコットをコンフルエントなブタ精巣（ST）細胞単層に適用し、存在する一切のウイルスの増殖を試みた。5日後に細胞傷害作用が明瞭で、このブタ精巣細胞でウイルスが増殖したことを示した。細胞培養上清サンプルをQPCRによってインフルエンザAについて分析し、陰性であった。シチメンチョウ赤血球を血球凝集させる能力について細胞培養上清を分析した（血球凝集アッセイ）。血球凝集アッセイは以下のプロトコルにしたがって実施した（実験#1）。
実験#1
1.0序
ブタインフルエンザウイルスを定量する
2.0材料
−容器
−96ウェルマイクロタイターV底プレート
−マルチチャンネルピペッター及びチップ（100−200μL）
−100−1000μLピペット
−10−100μLピペッター
−ピペットチップ
−身体防御用装備（PPE：実験衣、防護メガネ、手袋）
−バイオセーフティーキャビネット
−カバープレート／蓋
−タイマー
−50mLファルコンチューブ
−遠心分離機
3.0試薬／媒体
−Lampireのシチメンチョウ赤血球（TRBC）
−1ｘDPBS
4.0媒体処方
シチメンチョウ赤血球溶液（0.5％）
−TRBCはアルスバー溶液で到着。50mLの円錐チューブで2000rpm、10分間遠心分離する。上清を吸引して廃棄する。
−最初の血液と等体積の1ｘDPBSを添加して、前記RBCを洗浄する。逆さまにしてさらに穏やかに震盪する。遠心分離し上清を廃棄する。さらに2回繰り返す。集積細胞を4℃で保存する。
−50mLの1xDPBSを50mLチューブに加える。250μLの1ｘPBSを取り出す。250μLのシチメンチョウ集積RBCを加える。穏やかに混合する。プレート当たり5mLが必要である。稀釈細胞を4℃で保存する。
5.0手順
準備
−8サンプルについて1枚の96ウェルプレートに横方向に走らせる。試験するべきサンプルを基準に何枚のプレートが必要かを計算し、適切なペーパーワークに書き入れる。
−代替設定：12サンプルについて1枚の96ウェルプレートに縦方向に走らせることができる。
試験手順
−プレートの全ウェルを50μLのDPBSで満たす。
−サンプル#1の50μLをウェルのA1に、サンプル#2をB1に入れ、以下同様である。
−プレートの各試験セットと一緒に陰性コントロール（単にDPBS）を最後のプレートで試験する。
−列1から始めて列12まで50μLを用いてプレートを稀釈し（陰性コントロールの行は除く）、残りの50μLは廃棄する。
−プレートを稀釈した後で、全ウェルを50μLの0.5％TRBCで満たす（前記TRBCはチューブを逆さまにして血球を混合し、攪拌しない）。プレートを軽く叩き、覆いをして室温で2時間までインキュベートする。
−代替設定：12サンプルを縦方向に走らせるために、サンプル#1の50μLをウェルA1に、サンプル#2をA2に入れる。
−行Aから始めて行Hまで50μLを用いてプレートを稀釈し（陰性コントロールの列は除く）、残りの50μLは廃棄する。
−プレートを稀釈した後で、全ウェルを50μLの0.5％TRBCで満たす（前記TRBCはチューブを逆さまにして血球を混合し、攪拌しない）。プレートを軽く叩き、覆いをして室温で2時間までインキュベートする。
6.0判読 
−プレートを30−45°傾けて読み取る。読み取りに際して、完全な涙滴形態（teardrop）のない最後のウェルが終末点である。対応するペーパーワークに印をつける。
−HA力価を対応するペーパーワークに列挙する。
−陰性コントロール行（又は列）は完全な涙滴形態で、血球凝集を示さないはずである。
この未同定ウイルスは1280の力価でcrbcを血球凝集させる能力を有していた。多くのウイルスが、細胞（赤血球を含む）にウイルスを結合させることができるヘマグルチニンタンパク質をコードする遺伝子を含む。インフルエンザウイルスは赤血球を凝集させる能力を有する。
【０００７】
実験#2
電子顕微鏡検査のために、未知のウイルスを感染させたST細胞のフラスコをミネソタ大学獣医診断学研究室（University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory）に送った。ウイルスの画像はオルトミクソウイルス科（family Orthomyxoviridae）と一致した（図1）。この科はインフルエンザA、B、C及びトゴトウイルスから成る。
実験#3
インフルエンザA、B又はCのいずれかを特異的に検出するように設計したプライマーを用いてPCRを試みた（表1）。全てのPCR反応が陰性であった。さらにまた、ノイラミニダーゼの基質メチルウンベリフェリルN-アセチルノイラミン酸を用いて、ノイラミニダーゼ活性アッセイを実施した。このウイルスはノイラミニダーゼ活性をもたなかった（インフルエンザA及びBはともにノイラミニダーゼを有する）。次に、4-ニトロフェニルアセテート（Sigma Aldrich N8130）を用いて、エステラーゼ活性アッセイを実施した。このウイルスはエステラーゼ活性を示した。赤血球を血球凝集させる能力及びエステラーゼ活性を有することは、インフルエンザC及びコロナウイルス科のいくつかのメンバーの特徴である。ヘマグルチニンエステラーゼ活性を及び電子顕微鏡検査を基準にして、このウイルスは予備的にインフルエンザCと同定したが、ただしPCRではインフルエンザCについては陰性であった。
【０００８】
表1：ウイルス検出のためにリアルタイム逆転写PCRで用いたプライマー及びプローブ（IABkQ＝アイオワブラックホールクェンチャー）
0006257529.tif 000002
【０００９】
実験#4−ゲノム配列決定
ウイルスを細胞培養で増やして、2560の血球凝集（HA）力価を有する細胞培養採集物200mLを生成した。細胞培養液を0.2ミクロンフィルターでろ過して細胞残屑を除去した。続いて前記液を110,000ｘgで3時間遠心分離してウイルスをペレットにした。続いてこのウイルスを1mLのリン酸緩衝食塩水に再懸濁し、DNase（New England Biolabs M0303S）及びRNase（New England Biolabs M0243S）を用い37℃で1時間消化した。前記ウイルス溶液を続いて静かに35mLの25％シュクロース溶液の最上部に重層し、110,000ｘgで3時間遠心分離してウイルスをペレットにした。キアゲン(商標)ウイルスRNAミニキット（Qiagen, Inc., 27220 Turnberry Lane Suite 200 Valencia, CA 91355）を製造業者の指示にしたがって用いて、ウイルスRNAを前記ウイルスペレットから抽出した。簡単に記せば、担体RNAを含む700μLの緩衝液AVLに前記ウイルスペレットを再懸濁し、10分間室温でインキュベートした。次に、560μLのエタノールを前記サンプルに添加し、続いてこのサンプルをQIAampTMミニカラムに6000ｘgの遠心分離によってロードした。次にこのカラムをそれぞれ500μLの緩衝液AW1及びAW2で連続して洗浄し、14,000ｘgで2分間遠心分離して乾燥させ、その後60μLの水で溶出させた。続いてプロメガ（Promega）逆転写キット（Promega Corp., 2800 Woods Hollow Rd., Madison WI 53711; www.promega.com）を同封のランダムプライマーとともに用いて、前記ウイルスRNAからcDNAを逆転写した。GoScriptTM逆転写系が便利なキットであり、前記は、PCR増幅用調製物中に、逆転写酵素及び第一鎖cDNAの効率的な合成のために設計された最適化試薬セットを含んでいる。GoScriptTM逆転写系の成分を用いて、全RNA、ポリ(A)+mRNA又は合成転写物RNAのいずれかで開始してRNA鋳型を逆転写することができる。
次にこのcDNAをRNaseH（New England Biolabs M0297S）で37℃、1時間消化して、RNA-cDNAハイブリッドからRNAを除去した。DNAポリメラーゼのクレノウフラグメント（New England Biolabs M0210S）を用いて、前記一本鎖cDNAを二本鎖にした。
BioRuptor(商標)ソニケーションシステム（Diagenode Inc. North America, 376 Lafayette Rd., Suite 102, Sparta, NJ 07871）を用いて、前記二本鎖cDNAを超音波処理して、前記ウイルスcDNAをフラグメントにした。次に、ライフテクノロジーズ（Life TechnologiesTM）イオンプラスフラグメントライブラリーキットプロトコル（www.lifetechnologies.com）にしたがい、前記フラグメント化cDNAを用いてcDNAライブラリーを以下のように構築した：50マクロリットルのフラグメント化cDNAを108マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、40マイクロリットルの5ｘ末端修復緩衝液、及び2マイクロリットルの末端修復酵素と混合した。この反応物を室温で20分インキュベートした。インキュベーションの後で、360マイクロリットルのAgencourt(商標)Ampure(商標)ビーズを前記サンプルに添加し、続いて前記を回転装置に8−10rpmで10分置いた。このサンプルをパルススピンし、DynaMagTM-2マグネットラックに置いた。溶液が清澄になった後、上清を取り出し廃棄した。続いてこの後のプロトコルを用いてサンプルを2回洗浄した。サンプルをマグネットから移動させずに、500マイクロリットルの新しく作成した70％エタノールを前記サンプルに添加した。前記サンプルを含むチューブをマグネット上で2回回転させてビーズを周辺に移動させた。溶液が清澄になった後、エタノールを除去した。この洗浄手順を反復した。第二の70％エタノール洗浄及び上清の除去に続いて、前記サンプルチューブをパルススピンし、前記マグネットラックに戻した。残留エタノールを吸引し、サンプルを室温でほぼ5分間乾燥させた。50マイクロリットルの1ｘTE（10mMトリス塩酸、1mMのEDTA(pH8.0)）をcDNAに添加し、撹拌し、パルススピンし、さらにマグネットラックに戻した。溶液が清澄になった後、溶出cDNAを含む上清を新しい1．5mLのLoBindチューブ(商標)に移した。
【００１０】
20マイクロリットルの10ｘリガーゼ緩衝液、77マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、50マイクロリットルのアダプター（Adapter）及び3マイクロリットルのDNAリガーゼを50マイクロリットルのcDNAとともに混合した。前記混合物を室温で30分インキュベートした。溶液が清澄になった後、上清を取り出し廃棄した。続いてこの後のプロトコルを用いてサンプルを2回洗浄した：サンプルをマグネットから移動させずに、500マイクロリットルの新しく作成した70％エタノールを前記サンプルに添加した。前記サンプルを含むチューブをマグネット上で2回回転させてビーズを周辺に移動させた。溶液が清澄になった後、エタノールを除去した。この洗浄手順を反復した。第二の70％エタノール洗浄及び上清の除去に続いて、前記サンプルチューブをパルススピンし、前記マグネットラックに戻した。残留エタノールを吸引し、サンプルを室温でほぼ5分間乾燥させた。30マイクロリットルの1ｘTEをcDNAに添加し、ボルテックスで撹拌し、パルススピンし、さらにマグネットラックに戻した。溶液が清澄になった後、溶出cDNAを含む上清を新しい1．5mLのLoBindチューブ(商標)に移した。
30マイクロリットルのcDNAの全てを2％アガロースゲルにロードし、110Vで80分間ゲル電気泳動に付した。ゲル電気泳動の後、180−210塩基対のために前記サンプルをサイズ選別した。QIAquick(商標)PCR精製キット（Qiagen, Inc., 27220 Turnberry Lane Suite 200 Valencia, CA 91355; www.qiagen.com）を製造業者の指示にしたがって用いて、サイズ選別cDNAライブラリーをゲル精製した。前記ゲルから切り出したcDNAフラグメントを秤量し、ゲル1体積につき3体積の緩衝液QGを添加した。ゲルスライスが完全に溶解するまで、前記混合物を回転装置上にて室温でインキュベートした。ゲルスライスが完全に溶解したら直ちに、前記溶液をQIAquick(商標)スピンカラム（Qiagen, Inc., 27220 Turnberry Lane Suite 200 Valencia, CA 91355; www.quiagen.com）に適用し、2mLのコレクションチューブを提供し、最大速度（ほぼ16,000rcf）で1分遠心分離した。フロースルーを廃棄し、QIAquick(商標)カラムを同じチューブに戻した。750マイクロリットルの緩衝液PEを前記カラムに添加し最大速度（ほぼ16,000rcf）で前記を1分間遠心分離することによって、cDNAを含むカラムを洗浄した。フロースルーを廃棄し、QIAquick(商標)カラムを同じチューブに戻し、さらに最大速度で4分遠心分離した。続いて、前記QIAquick(商標)カラムを清浄な1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブに入れた。40マイクロリットルの緩衝液EBをQIAquick(商標)カラムメンブレンに添加し、数分間室温でインキュベートし、その後前記カラムを1分間遠心分離してcDNAを溶出させた。
ライフテクノロジーズ(商標)イオンプラスフラグメントライブラリーキット（www.lifetechnologies.com）プロトコルにしたがい、溶出させたサイズ選別cDNAライブラリーをニックトランスレーションして増幅させた。40マイクロリットルのサイズ選別cDNAを200マイクロリットルのPlatinum(商標)PCR SuperMix High Fidelity及び10マイクロリットルのライブラリーアンプリフィケーションプライマーミックスと混合した。125マクロリットルのアリコットを2本のPCRチューブの各々に移し、以下のパラメーターにしたがってサーモサイクラーを稼働させた：
【００１１】
表2：PCRサーモサイクラーパラメーター
0006257529.tif 000003
【００１２】
サンプルを新しい1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブにプールし、375マイクロリットルのAgencourt Ampure(商標)ビーズを前記サンプルに添加し、前記を回転装置上にて室温で10分インキュベートして精製した。このサンプルをパルススピンし、DynaMag(商標)-2マグネットラックに置いた。溶液が清澄になった後、上清を取り出し廃棄した。続いてこの後のプロトコルを用いてサンプルを2回洗浄した。サンプルをマグネットから移動させずに、500マイクロリットルの新しく作成した70％エタノールを前記サンプルに添加した。前記サンプルを含むチューブをマグネット上で2回回転させてビーズを周辺に移動させた。溶液が清澄になった後、エタノールを除去した。この洗浄手順を反復した。第二の70％エタノール洗浄及び上清の除去に続いて、前記サンプルチューブをパルススピンし、前記マグネットラックに戻した。残留エタノールを吸引し、サンプルを室温でほぼ5分間乾燥させた。50マイクロリットルの1ｘTEをcDNAに添加し、ボルテックスで撹拌し、パルススピンし、さらにマグネットラックに戻した。溶液が清澄になった後、溶出cDNAを含む上清を新しい1．5mLのLoBindチューブに移した。
cDNAの量は、イオンライブラリー定量キット（www.lifetechnologies.com）を製造業者のプロトコルにしたがって用いて定量した。以下の表にしたがって、大腸菌（E. coli）DH10Bコントロールライブラリーから5つの連続10倍希釈を調製した。
【００１３】
表3：大腸菌DH10Bコントロールライブラリーの希釈
0006257529.tif 000004
ヌクレアーゼフリー水でサンプルライブラリーの1：20稀釈を先ず初めに調製した。以下の表に記載するように、1：2000及び1：20000の連続希釈をその後で調製した。
【００１４】
表4：サンプルライブラリーの稀釈
0006257529.tif 000005
各qPCR反応がトリプリケートで実施されるので、マスターミックスは、各qPCR反応につき250マイクロリットルのイオンライブラリーTaqMan(商標)qPCRミックス2ｘ、25マイクロリットルのイオンライブラリーTaqMan(商標)定量アッセイ20ｘ、及び100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を混合することによって調製した。各反応のために、15マイクロリットルのマスターミックスをPCRプレートのウェルに分注した。稀釈したコントロール又はサンプルライブラリーの5マイクロリットルを適切な各ウェルに添加した。鋳型無しのコントロール（NTC）として5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を用いた。ウェルに封をして、簡単に遠心分離し、以下のリアルタイムPCR条件に付した。
【００１５】
表5：qPCR反応のPCR条件
0006257529.tif 000006
鋳型の稀釈係数は以下の等式を用いて計算した：
鋳型希釈係数＝[(qPCR相対量)*(サンプルライブラリーの希釈倍数)]/0.32
サンプルをそのようにして稀釈し、Ion XpressTM鋳型キットv2.0（www.lifetechnologies.com）を用いた配列決定のために調製した。エマルジョンオイル(商標)（Emulsion OilTM）を冷蔵庫から取り出して混合した。9ミリリットルのエマルジョンオイル(商標)をIKA(商標)DT-20チューブに添加した。この充填IKA(商標)チューブを使用の準備ができるまで氷上に置いた。582マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、200マイクロリットルの5ｘPCR試薬ミックス、100マイクロリットルの10ｘPCR酵素ミックス、100マイクロリットルの Ion Sphere (商標)粒子（添加前に1分間ボルテックスで撹拌）及び18マイクロリットルの稀釈サンプルライブラリーを混合することによって水性PCRミックスを作製した。前記混合物を5秒間ボルテックスで撹拌して傍らに置き、その間にエマルジョンオイルを含むIKA(商標)DT-20チューブをIKA(商標)Ultra-Turrax(商標)チューブドライブに設置し適所に固定した。IKA(商標)DT-20チューブの蓋上の粘着ラベルを取り除き、サンプルのローディング口を露出させた。IKA(商標)Ultra-Turrax(商標)上のスタートボタンを押し、前記水性PCRミックスの全体積をIKA(商標)DT-20チューブの蓋の該開口部から分配した。IKA(商標)Ultra-Turrax(商標)チューブドライブ上で5分間混合した後、前記エマルジョンを氷上に約5分間置いた。前記エマルジョンを移すために、ピペットの先端からほぼ5mmを切り取って大きな内径を有するチップを作製した。この大きな内径のチップを取り付けたエッペンドルフ(商標)リピーター(商標)ピペットを用い、前記エマルジョンを抜き出し、ほぼ90ウェルが満たされるまで、96ウェルPCRプレートの各ウェルに100マイクロリットルの増加分で分配した。前記96ウェルプレートに蓋をし、以下のPCRパラメーターにしたがってサーマルサイクラーにかけた。
【００１６】
表6：配列決定のためのPCRパラメーター
0006257529.tif 000007
PCRの後で、ウェルの内容物を可能なかぎりマルチチャンネルピペットを用いてマルチチャンネルピペット溶液保持部分に移した。ほぼ1.2ミリリットルのエマルジョンを6つの1.5mL微小遠心分離チューブの各々に移した。6つの微小遠心分離チューブの全てを15,500ｘgで2分間遠心分離してエマルジョンを収集した。遠心分離の間に、2ミリリットルのリカバリーソリューション（Recovery SolutionTM）及び6ミリリットルの1-ブタノールを混合することによって、ブレーキングソリューション（Breaking SolutionTM）を作製した。続いて、前記ブレーキングソリューションを白色の微細な乳化物質が形成されるまで約1分間ボルテックスで撹拌した。前記エマルジョンを遠心分離した後、各チューブから油の清澄な最上部分画を除去した。白色のエマルジョンを含む6つのチューブをそれぞれ1mLのブレーキングソリューションで処理し、30秒間ボルテックスで撹拌し、さらに15,500ｘgで2分間遠心分離した。遠心分離後、各チューブの最上部有機相を除去した。各サンプルチューブに1mLのリカバリーソリューションを加え、30秒間ボルテックスで撹拌し、続いて15,500ｘgで2分間遠心分離した。各チューブの上清をほぼ100マイクロリットルのみが残されるまで除去した。同じピペットチップを用いて、6つのチューブの全てのペレットを再懸濁して新しい1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブに移した。もとのチューブのうち3つを200マイクロリットルの一アリコット分のリカバリーソリューションを用いてリンスした。三番目のチューブをリンスした後、１つにまとめて再懸濁したペレットを含むチューブに前記溶液を移した。この手順を残りの3つのチューブで繰り返した。
全体積が1.5mLになるまでリカバリーソリューションを前記1つにまとめたチューブに添加した。続いて、前記チューブを30秒間ボルテックスで撹拌し、さらに15,500ｘgで3分間遠心分離した。ほぼ100マイクロリットルだけ残すように前記上清を除去した。残留物質を再懸濁し、新しい1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブに移した。100マイクロリットルのウォッシュソリューション（Wash SolutionTM）をもとのチューブに添加してリンスし、続いて前記サンプルを含む前記新しいチューブに移した。このサンプルを、1mLのウォッシュソリューション(商標)を添加し、30秒間ボルテックスで撹拌し、続いて15,500ｘgで3分間チューブを遠心分離することによって2回洗浄した。100マイクロリットルだけ残すように上清を除去した。この洗浄手順を繰り返した。
【００１７】
鋳型陽性イオンスフェア(商標)（Ion SphereTM）粒子の濃縮をイオンエクスプレス(商標)（Ion XpressTM）テンプレートキットv2.0プロトコル（www.lifetechnologies.com）にしたがって実施した。ダイナビーズ(商標)MyOneTMストレプトアビジンC1ビーズをボルテックスで撹拌した。10マイクロリットルのMyOneTMビーズを1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブに移し、70マイクロリットルのウォッシュソリューション(商標)で洗浄し、ボルテックスで撹拌し、マグネット上に2分間置いた。続いて上清を廃棄した。前記MyOneTMビーズを10マイクロリットルの新しいウォッシュソリューション(商標)に再懸濁し、続いてイオンスフェア粒子(商標)（ISP）を含むサンプルチューブに移した。捕捉を行うために、100マイクロリットルのアニーリングバッファー(商標)（Annealing BufferTM）もまた前記サンプルチューブに添加した。続いて前記チューブを回転装置上に室温で10分間置いた。サンプルチューブを遠心分離し、溶液が清澄になるまでマグネット上に置いた。上清を“未結合”と標識したチューブに移した。前記ビーズを200マイクロリットルのウォッシュソリューション(商標)で2回洗浄し、混合し、さらに上清を“未結合”チューブに移す前にマグネット上に戻した。新しいメルトオフソリューション(商標)（Melt-OFF SolutionTM）を、分子グレード水中の200マイクロリットルの１M NaOH、16マイクロリットルの10％トゥイーン(商標)20、及び1.38ミリリットルの分子グレード水を混合することによって調製した。イオンスフェア粒子をダイナビーズ(商標)MyOneTMストレプトアビジンC1ビーズから溶出させるために、400マイクロリットルのメルトオフ溶液(商標)を前記サンプルチューブに添加し、混合し、続いて7分間回転装置に置いた。その後上清を取り出し、“濃縮1”と標識したチューブに入れた。前記“濃縮1”のチューブをボルテックスで撹拌し、続いて15,500ｘgで4分間回転させた。100マイクロリットルの上清を除いて全てを廃棄した。続いて1マイクロリットルのウォッシュソリューション(商標)を前記“濃縮1”チューブに適用し、ボルテックスで撹拌し、15,500ｘgで4分間回転させた。さらにもう一度、100マイクロリットルの上清を除いて全てを除去した。残留サンプルを混合し、“濃縮1”チューブを前記マグネットに戻した。数分後に上清を取り出し、前記を“濃縮2”と標識したチューブに入れた。
【００１８】
ライフテクノロジーズイオン配列決定キットv2.0ユーザーマニュアル（www.lifetechnologies.com）にしたがい、DNA配列決定を実施した。“濃縮2”チューブのサンプルの50マイクロリットルを新しい0.2mL PCRチューブに移した。5マイクロリットルのコントロールイオンスフェア(商標)（Control Ion SpheresTM）及び150マイクロリットルのアニーリングバッファー(商標)を添加し、前記溶液を混合し、15,500ｘgで2分間遠心分離した。9マイクロリットルだけ残すように上清を除去した。5マイクロリットルのシーケンシングプライマー(商標)（Sequencing PrimerTM）を前記サンプルに添加し、一サイクル（95℃で2分、続いて37℃で2分）のためにサーマルサイクラーに置いた。続いて前記サンプルをサーマルサイクラーから取り出し、1マイクロリットルのシーケンシングポリメラーゼ（商標）（Sequencing PolymeraseTM）とともに混合し、室温で5分インキュベートした。
一方、新しいチップをパッケージから取り出し、イオン(商標)遠心分離アダプター/ローターバケットに置いた。レイニン(商標)（Rainin(商標)）SR-L200Fピペットチップを用いて、50マイクロリットルの100％イソプロパノールをチップの大きな口に添加し、続いて他方の口から吸引した。前記チップを2回50マイクロリットルのアニーリングバッファー(商標)で前記チップの大きい口から洗浄し、前記バッファーを他方の口から吸引した。
PGMTMシークェンサーのメインメニューの“実験”タブを押した。シークェンサーが動き出したとき、古いチップを新しいチップに交換した。バーコードスキャナーを用いて、該パッケージのチップバーコードをスキャンした。バーコードが入力された後、“チップチェック”ボタンを押した。チップチェック完了後、“次へ”のボタンを押して、チップのカリブレーションに進んだ。カリブレーションの後、チップを取り出し、イオン(商標)遠心分離アダプター/ローターバケットに戻し、50マイクロリットルのアニーリングバッファーでチップの大きい口から洗浄し、前記バッファーをチップの他方の口から吸引した。レイニン(商標)SR-L200Fチップ付きレイニン(商標)ピペット-ライト(商標)（Pipette-Lite(商標)）LTS-20ピペットを用いて、7マイクロリットルのサンプルを前記チップの大きい口に配置した。続いて前記チップの他方の口に移動した液体を除去した。続いてイオンチップ(商標)（Ion ChipTM）を遠心分離器に移し、4分間回転させた。新しいレイニン(商標)SR-L200Fチップを用いて、サンプルの残りを前記チップのローディング口に配置した。異動した液体を他方の口から除去し、チップを再び4分間遠心分離した。最後の回転が終了した後、PGMスクリーン上の“次へ”のボタンを押し、前記チップをイオントーレント（Ion Torrent）PGMTMマシーンに戻してロードし、配列決定を開始させた。
【００１９】
配列判読物は、DNAStarソフトウェアSeqmanNexGen(商標)（DNASTAR, Inc., 3801 Regent Street, Madison, WI 53705; www.dnastar.com）を用いde novoアッセンブリーオプションでアッセンブリングした。配列アッセンブリーによって7つのコンティーグが同定され、それらコンティーグは、それらの各々に関係する10,000を超える判読物を含んでいた。これらのコンティーグを、それらが完全なオープンリーディングフレームを表すようにトリミングした。前記トリミング配列及び対応するタンパク質配列は、配列番号：4−17として本出願に含まれる。仮説的な翻訳オープンリーディングフレームのBLASTP分析によって、ヒトインフルエンザCの単離株の7つのセグメントとの相同性が明らかになり前記単離株をC/ブタ/Oklahoma/1334/2011と命名した。各セグメントのもっとも近縁なホモローグを下記に示す。非構造タンパク質（NS）をコードすると注釈が付されたセグメントはmRNAに転写され、選択的スプライシングにより下記表7のように2つの異なるタンパク質（NS1及びNS2）が得られる。陽性パーセンテージは、単離されたインフルエンザCウイルスと公開データベース中に存在する、各セグメントに対してもっとも近縁なホモローグとの間のパーセント類似性を示す。PB1はヒトインフルエンザC単離株C/Johannesburg/1/66と中等度の相同性（85％類似性）を示したが、他の全てのセグメントは、以前に配列決定されたインフルエンザCとは低い相同性を示した（他のセグメントに対する％類似性は48−71％）。C/ブタ/Oklahoma/1334/2011と以前に配列決定されたウイルスとの間のこの低い全体的類似性は、本ウイルスの固有性を示している。
【００２０】
表7：BLAST相同性
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【００２１】
蔓延性を決定するための血清学的調査
C/ブタ/Oklahoma/1334/2011をヒトインフルエンザCと低い配列相同性を有する新規なウイルスと立証したので、血清学的調査を実施して、ヒト及びブタの両方で感染発生率を決定した。多数の州からニューポートラボラトリーズに付託された、約200の任意抽出ブタ血清サンプルを、血球凝集阻害アッセイを用いてC/ブタ/Oklahoma/1334/2011に対する抗体について分析した。約8％のサンプルがHIアッセイで陽性で、10−160の力価を示した。
同様に、セント・ジュード小児病院（St Jude’s Children’s Hospital；Memphis, TN）の共同研究者らは、カナダの高齢者（65−95歳）から収集したヒト血清バンクでHIアッセイを実施した。約28％のサンプルが10−80の陽性HI力価を示した。総合すれば、これらの結果は、ヒト及びブタはC/ブタ/Oklahoma/1334/2011に広く曝露されていることを示している。これらの結果はまた、このウイルスがヒト及びブタに感染できることを示唆している。
ブタのワクチン免疫及びチャレンジ実験
C/ブタ/Oklahoma/1334/2011を高力価（HA=2560）に増殖させ、バイナリーエチレンイミンで不活化し、続いて10％トリゲン（Trigen）（水中油アジュバント）を添加して死滅ウイルスワクチンを作製した。C/ブタ/Oklahoma/1334/2011に対する抗体について血清学的に陰性の22匹のブタに、0日目及び14日目に2mLの不活化ウイルスワクチンの筋肉内デリバリーによりワクチン接種した。血清サンプルを0、14及び28日目に収集してHI力価について分析した。28匹のブタもまた非ワクチン接種コントロールとして含まれた。ワクチン接種ブタは28日までに血清転換を示し、平均HI力価は433を有した。非ワクチン接種ブタはHIアッセイで陰性であった。表8及び図3はそれらの結果を示す。ワクチン接種ブタは強い血清転換を示した。インフルエンザAでの大ざっぱな指針は、40を超えるHI力価は防御能力を示す。チャレンジ前のワクチン接種ブタの血清で測定した抗体は、防御抗体が存在していたことを示唆している。このデータはチャレンジ結果と一致する。
【００２２】
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【００２３】
28日目に、11匹のワクチン接種ブタ及び11匹の非ワクチン接種ブタを、6.2log10 TCID/mLのC/ブタ/Oklahoma/1334/2011の2mLにより鼻内にチャレンジした。チャレンジ後2日目に、11匹のワクチン接種及び11匹の非ワクチン接種ブタを当該部屋に加え、接触曝露チャレンジグループとして供した。チャレンジ日からチャレンジ後14日まで1日おきに体温を測定した。表9は結果を示す
【００２４】
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【００２５】
処置グループ間に相違は観察されず、インフルエンザが典型的には発熱をもたらすようには、このウイルスは発熱を引き起こさないことが示された。同様に、鼻拭き取り検体をチャレンジ日からチャレンジ14日後まで1日おきに収集した。
【００２６】
ウイルスの存在をアッセイする方法
拭き取り検体からRNAを調製し、インフルエンザCの存在を逆転写リアルタイムPCR（rt-RT-PCR）によってアッセイした。C/ブタ/Oklahoma/1334/2011のゲノム配列を基にして設計した以下のプライマー及びプローブを用いた。プライマー及びプローブのヌクレオチド配列は本出願には配列番号：1−3として含まれ、ここでフォワードプライマー＝5’-GCT GTT TGC AAG TTG ATG GG-3’（配列番号：1）；リバースプライマー＝5’-TGA AAG CAG GTA ACT CCA AGG-3’（配列番号：2）、及びプローブ＝Cy5-標識-5’-TTC AGG CAA GCA CCC GTA GGA TT-3'-（配列番号：3）-IABkQである。
結果は表10及び図3に示す。“Ct”はサイクル閾値を意味する。リアルタイムPCRでは、遺伝物質（RNA又はDNA）は、以下のように多様な温度でサンプル/酵素をサイクルさせることによってポリメラーゼにより複写される。リアルタイムPCRは、生成されたDNA産物と結合する蛍光レポーターを使用する。サイクルが進行しDNA生成物が蓄積するにつれ、より多くの蛍光が生成される。いくつかの時点で、蛍光がPCRマシーンによって検出される。一定レベルの蛍光の検出は閾値と呼ばれる。この閾値レベルを超える蛍光を生成するために必要なサイクル数はCtと称される。リアルタイムPCRは、より多くのDNA/RNAがPCR開始前に存在する場合に閾値を超える蛍光の生成に必要なサイクル/ダブリング数がより小さくなるように、出発サンプル中のRNA/DNAの量を定量できる。
したがって、より低いCt値はもとのサンプル中のより高レベルのDNA/RNAに一致する。
【００２７】
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【００２８】
上記の図表のCt値は鼻拭き取り検体におけるウイルスRNAレベルを示す。37.1は陰性である。37.1未満の値はいずれもウイルスRNA陽性である（したがってウイルスが排出されている）。このデータはまた図3に図示されている。非ワクチン接種チャレンジグループのウイルスRNA排出数は、ワクチン接種動物と顕著に相違する。我々は前記データに関してスチューデントt-検定を実施し、直接チャレンジの非ワクチン接種動物は、他のグループよりも高いレベルでウイルスを排出した（P＜0.001）。したがって、このワクチンはブタを防御した。ウイルスは、直接曝露又は接触曝露のどちらかでチャレンジ後にただ1匹のワクチン接種ブタから検出されただけであった。対照的に、非ワクチン接種ブタはチャレンジ後3日目に（直接チャレンジ）又は暴露後6日目に（接触チャレンジ）ウイルスを排出し始めた。この実験は、本ウイルスはブタに感染できブタで複製可能で、環境及び接触動物にウイルスを排出することを示している。さらにまた、相同なワクチンでワクチン免疫されたブタは感染から完全に防禦される。
フェレットのチャレンジ
典型的にはヒトインフルエンザウイルスはフェレットで良好に複製するので、インフルエンザの研究でフェレットはヒトの代用動物として一般的に用いられる。インフルエンザCは一般的にはヒトの病源体と考えられるので、C/ブタ/Oklahoma/1334/2011をフェレットのチャレンジに用いて、このウイルスがヒトの病源体であり得るか否かを決定した。3匹のフェレットの鼻内に6.0log10組織培養感染用量50/mL（TCID50/mL）を用いてチャレンジした。チャレンジ後1日目に3匹のフェレットを当該囲いに加え、接触動物として供した。さらにまた、3匹のフェレットを別個の囲いに収容して、エーロゾル曝露のみの動物として供した。表11及び図4に結果を示す。
【００２９】
表11：直接接種、直接接触又はエーロゾル接触によってC/ブタ/Oklahoma/1334/2011に感染させたフェレットの鼻拭き取り検体洗浄液で検出されたウイルスのTCID50/mL
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【００３０】
ウイルスはST細胞の滴定によって鼻拭き取り検体で検出した。ウイルスは、鼻内チャレンジ動物でチャレンジ後3日目までに、接触チャレンジフェレットで暴露後6日目までに検出された。エーロゾル曝露フェレットではウイルスは検出されなかった。このデータはC/ブタ/Oklahoma/1334/2011は、直接チャレンジ又はチャレンジ動物との接触のどちらかによって曝露フェレットに感染できることを示している。しかしながら、このウイルスはエーロゾル伝播を介しては拡散しないように思われる。このことは、C/ブタ/Oklahoma/1334/2011はおそらくヒトに感染できることを示唆する。
【００３１】
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載した方法及び材料と同様又は等価の方法及び材料を用いて本発明を実施又は試験することができるが、適切な方法及び材料が下記に記載される。本明細書に記載した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、該当する法律及び規制が容認する範囲で参照によりその全体が本明細書に含まれる。矛盾が生じる場合は、本明細書（定義を含む）が優先するであろう。
本発明は、本発明の趣旨又は本質的属性から外れることなく他の具体的な形態で実施することが可能であり、したがって、本実施態様はあらゆる点から例示的であり非制限的であると考えられ、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲を本発明の趣旨を示すために照合することが所望される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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