(57)【要約】シクロデキストリンの高度架橋ナノ多孔性ポリマーの、パクリタキセル、ドセタキセル、タモキシフェン、カンプトテシンおよびこれらの誘導体から選択される薬剤との複合体を開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロデキストリンの高度架橋ナノ多孔性ポリマーの、パクリタキセル、ドセタキセル、タモキシフェン、カンプトテシンおよびこれらの誘導体から選択される薬剤との複合体。
【請求項２】
前記高度架橋ポリマーが、β−シクロデキストリンから得られる、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記薬剤がパクリタキセルである、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
前記薬剤がタモキシフェンである、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項５】
前記薬剤がカンプトテシンである、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項６】
適切なビヒクルもしくは賦形剤と混合した、請求項１から５に記載の複合体を含む医薬製剤。
【請求項７】
非経口投与に適した、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
経口投与に適した、請求項６に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水に不溶な抗腫瘍剤、特にパクリタキセルおよび他のタキサン、カンプトテシンならびにタモキシフェン用ビヒクルとして、シクロデキストリンを基材とするナノスポンジを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明への背景
薬剤の溶解性は、しばしばその臨床適用性を制約する因子である。したがって、新たな戦略は常に、活性成分の溶解性および放出動態を改良することを目指して検討されている。
【０００３】
シクロデキストリン（ＣＤ）は、特徴的な円錐−台形−形状の構造を有する、１，４−α−グリコシド結合によって連結されたグルコース分子６〜８個からなる非還元性環状オリゴ糖である。グルコース分子の官能基の配置は、分子表面が極性である一方、内部空洞が比較的親油性であるようなものである。
【０００４】
この親油性空洞によって、ＣＤでは、適切な極性および寸法の有機分子による、溶液中においてさえも安定である包接複合体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成することが可能になる。
【０００５】
このため、ＣＤはすでに研究されており、種々の化学分野（医薬品、分析、触媒、化粧品など）において数多くの用途を有し、包接化合物の特性が活用されている。
【０００６】
医薬技術において、これらの複合体は、薬剤の溶解速度、溶解度および安定性を高めるため、不快な匂いを隠蔽するため、または液体物質を固体に変換するためなどに、使用することができる。
【０００７】
医薬分野では、共溶媒、界面活性剤、複合体および微粒子系の使用などの、溶解性を改良する種々の製剤の取組みが用いられている。
【０００８】
特にそれらの薬剤が不溶性であるので、製剤の面がとりわけ非常に重要である薬剤は、抗腫瘍剤であるパクリタキセル、ドセタキセルおよび一般にタキサン構造を有する誘導体、カンプトテシンならびにタモキシフェンである。
【０００９】
パクリタキセルは、タキサン  ファミリーに属し植物由来の製品である重要な抗腫瘍剤であり、有糸分裂紡錘体の形成を阻害することによって、それらの抗腫瘍作用が発揮される。
【００１０】
パクリタキセルは、水および生物系中に実質的に不溶であり、そのため注射用製剤の配合のため問題を提起している。パクリタキセルは現在、脂質エマルジョンの形態で製剤され（クレモホル）、それによって静脈内投与することが可能になっている。しかし、このエマルジョンの成分は、強力なアレルゲンであり、重大な過敏性反応の原因となる恐れがある。その上、パクリタキセルを投与するのに使用される材料は、ポリ塩化ビニルで作ることはできない。
【００１１】
カンプトテシンは、植物由来の薬剤であり、細胞成長を制御するのに重要な酵素であるトポイソメラーゼＩを阻害する。肺および結腸直腸腫瘍を治療するため、カンプトテシンからトポテカンおよびイリノテカンも開発されている。
【００１２】
タモキシフェンは、乳癌を治療し、発赤（ｆｌａｒｅ−ｕｐｓ）を予防するのに使用されるエストロゲンのアンタゴニストである。この場合、この薬剤は長期間経口投与される。
【００１３】
全てのこれらの薬剤は、水中において溶解性が低く、もしくは存在しないため、生体適合性および／または製剤の問題を提起している。
【００１４】
したがって、特により単純でリスクの少ない医薬製剤を開発することによって、これらの制約を克服する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
発明の説明
それらが特に「ナノ多孔性」構造であるため「ナノスポンジ」と呼ばれる、シクロデキストリンの高度架橋（ｈｙｐｅｒｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ）ポリマーが、水に不溶な薬剤を有利に運搬することができることが今回見い出された。
【００１６】
シクロデキストリンのナノスポンジは、他の方法では不溶な薬剤を分子レベルで分散させて、それらの構造を安定化し、また化学剤による攻撃に対し、それらを保護することを可能にする。その結果、この薬剤は、その複合体形成されない形態よりも長時間有効なまま残ることができる。
【００１７】
したがって、本発明の第一の態様は、シクロデキストリンを基材とするナノスポンジとの、パクリタキセル、ドセタキセル、タモキシフェン、カンプトテシンおよびこれらの誘導体から選択される薬剤の複合体に関する。
【００１８】
本発明は、経口的もしくは非経口的に投与することができ、また活性成分として、適切なビヒクルまたは賦形剤と混合した前記複合体を使用する医薬製剤にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】DSC分析によるパクリタキセル包接複合体の形成を示す図である。
【図２】パクリタキセルの相溶解度を示す図である。
【図３】７２時間におけるAT84株に関する実験データを示す図である。
【図４】低濃度のパクリタキセルを用いてヒト細胞株に関して行った実験結果を示す図である。
【図５】低濃度のパクリタキセルを用いてヒト細胞株に関して行った実験結果を示す図である。
【図６】４８時間においてCal株に関して行った実験結果を示す図である。
【図７】経口投与後のマウスのパクリタキセル血漿中濃度を示す図である。
【図８】ナノスポンジで運搬されたタモキシフェンの細胞毒性活性を示す図である。
【図９】ナノスポンジで複合体形成したカンプトテシンの細胞毒性活性を示す図である。
【００２０】
シクロデキストリンを基材とするナノスポンジは、架橋剤／シクロデキストリン比率２〜１６、好ましくは４を用い、欧州特許第1786841号または国際公開第03085002号中において記述される通りに調製される。シクロデキストリンは天然の、好ましくはβ−シクロデキストリン、またはメチルβ−シクロデキストリン、アルキルオキシカルボニルシクロデキストリンなどの一部化学修飾されたものとすることができる。ナノスポンジは、種々の百分率（５〜３０重量％）の直鎖デキストリンを含有することもできる。
【００２１】
ナノスポンジは、磁気的性質を有する化合物が存在する状態で調製される場合、磁化することもできる。
【００２２】
本発明による複合体は、シクロデキストリンを基材とするナノスポンジの水性懸濁液中に過剰の薬剤を添加するステップにより、調製される。好ましくは室温で、この懸濁液を１〜８時間撹拌し、過剰の非可溶化薬剤を濾過してこの複合体が回収される。複合体の形成は、ＤＳＣ分析により実証される。
【００２３】
得られた複合体は、従来の技術および賦形剤を使用し、経口もしくは注射用製剤を調製するため、直接使用することができる。例えば、注射用製剤については、複合体は、非経口投与に適した無菌の水、生理的食塩水もしくは他の水溶液に簡単に運搬させることができる。経口投与については、複合体はカプセルおよび錠剤を調製するのに適した賦形剤、希釈剤、滑剤および固化防止剤のマトリックス中に分散できる。用量は、複合体形成される薬剤の型によって決まり、またそれらの薬剤の改良されたバイオアベイラビリティーおよび薬物動態のため、臨床的実施において現在推奨される用量と少なくとも同等、またはより好ましくはそれ未満となるであろう。
【００２４】
本発明による製剤の優位性は、例えば、腫瘍細胞株についての細胞増殖試験を使用し、生体外におけるパクリタキセルの抗増殖作用を、ナノスポンジで複合体形成したパクリタキセル（「複合体」）の抗増殖作用と比較した場合明確に現れる。
【００２５】
以下の例は、本発明をさらに詳細に例証するものである。
【００２６】
実施例１．ナノスポンジの調製
１７．００ｇの無水β−シクロデキストリン、０．９３ｇの無水デキストリン２０、および８０ｇのジフェニルカーボネート（ＤＰＣ）を、全て微細に均質化して、２５０ｍｌフラスコに入れる。この系を機械的撹拌下で１００℃まで段々と加熱し、４時間反応させる。この期間が終わると、反応混合物は固化し、蒸留水で繰り返し洗浄し、次いでアセトンで洗浄して、未反応のＤＰＣ、および反応の副生成物として存在するフェノールを除去する。２０．２ｇのナノスポンジが得られる。
【００２７】
実施例２．ナノスポンジの調製
３ｇのデキストリン２０、２０．０ｇのベータシクロデキストリン、および１７．１２ｇのジフェニルカーボネートを、全て微細に予備混合して、フラスコに入れる。この系を機械的撹拌下で１００℃まで加熱し、４時間反応させる。この期間が終わると、得られた塊を過剰の水中に入れ、濾過し、水で続いてアセトンで完全に洗浄して、未反応のＤＰＣ、および反応の副生成物を除去する。濾液を、真空下のオーブンに入れ、８０℃で２時間乾燥する。
実施例２の２．ナノスポンジの調製
実施例２の手順に従っているが、２．０ｇのコバルト粉末を添加する。得られたナノスポンジ粒子は、それらの複合体形成性状を保持し、かつ磁石に付くこともできる。
【００２８】
実施例３．包接複合体の調製
一定量（５ｍｇ）のナノスポンジの重量をはかり、撹拌下で２５ｍｌフラスコ内の蒸留水中に分散させた。過剰の、パクリタキセルなどの薬剤を添加し、この懸濁液を、一定撹拌のもとに４時間保持した。この時間が終わると、遠心濾過機（ＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  マサチューセッツ州０１７３０、米国）を通して懸濁液を濾過して、未可溶化パクリタキセルから可溶化物を分離した。濾液をＨＰＬＣにより分析して、パクリタキセル含量を測定した。包接複合体の形成は、ＤＳＣ分析により立証された（図１）。
【００２９】
実施例４．溶解度の検討
ＨｉｇｕｃｈｉおよびＣｏｎｎｏｒｓ方法に従って溶解度測定を行った。特に、１０ｍｇのパクリタキセルを、種々の百分率のナノスポンジ（０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．１２、０．１５および０．２％）の水溶液（１０ｍｌ）を入れた三角フラスコに添加した。室温で機械的振盪機上において三角フラスコを撹拌した。定常状態に達すると（４８時間）、３０００ダルトン分子フィルター（ＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ  マサチューセッツ州０１７３０、米国）を使用し遠心により懸濁液を濾過した。得られた溶液は、複合体を凍結乾燥し、知られている量のメタノール中にパクリタキセルを抽出した後、移動相としてアセトニトリル：水６２：３８ｖ：ｖを使用し、２７７ｎｍにおいてＨＰＬＣにより分析して、パクリタキセル濃度を測定した。ｍｇにおけるパクリタキセル濃度を、ナノスポンジの百分率濃度に対しプロットした。線状回帰を使用しデータを統計的に処理した。溶解度分析によって、ナノスポンジの０．５重量／重量％懸濁液で、可溶化ピークに到達していることが示される。この限界を超えた、パクリタキセルの溶解度のさらなる増加は観察されなかった。
【００３０】
結論として、５ｍｇのナノスポンジによって、１ｍｇの薬剤が可溶化される（図２）。
【００３１】
実施例５．癌細胞に対する活性の試験
この試験は、漸次変化する用量の２つの製剤の存在における、期間２４、４８および７２時間の細胞のインキュベーションに基づいており、同一量の活性成分が常に投与されることを確保している。種々の細胞株について、具体的には、特発性マウス口腔扁平上皮癌ＨＳＣのＡＴ８４細胞、および特発性ヒト口腔扁平上皮癌のＣａｌ細胞について実験を行った。
【００３２】
インキュベーション期間が終わると、生存細胞によってのみ代謝されるテトラゾール塩の溶液を細胞に添加した。３時間インキュベーションした後、過剰の塩を除去し、細胞にＤＭＳＯを添加した。これにより、前記減少した細胞では色変化が生じ、したがって、生存細胞の数に正比例している代謝テトラゾール量の比色評価が可能になる。提示されたデータ（いくつかの実行された実験に関して）は、天然のパクリタキセル（ｎａｔｉｖｅ）も、複合体形成したパクリタキセルも添加しなかった細胞からなる対照標準と比較したそれぞれの処置についての生存細胞の百分率として表される。これらのデータは、８回行われた実験の結果である。
【００３３】
使用した濃度範囲（常にパクリタキセルのモル濃度に基づいている）は、パクリタキセルだけについて文献中にあるデータを基準に画定した。
【００３４】
２４時間におけるデータは、２つの処置群の間で何ら有意差を示さないが、４８および７２時間では本複合体の抗増殖効果が、より大きいことが観察された。
【００３５】
図３は、７２時間におけるＡＴ８４株に関する実験についてのデータを示す。それらのデータは、本複合体の抗増殖作用が、パクリタキセルだけの抗増殖作用よりも遥かに顕著であり（ほぼ３倍大きい）、かつより低い用量で主として明示されることを明らかに示す。効果は、より高い用量でも同様である。
【００３６】
パクリタキセルの高い毒性を考慮すると、より低い用量で同様のもしくはより良好な治療効果が得られるという可能性は、治療を延長し、その効力を増大させ、かつその副作用を限定できることを意味するであろう。その上、新たな製剤は単純であり、蒸留水中に分散させ、溶媒としてさえも他の有機物質の使用を伴わないものである。
【００３７】
他の細胞についても、それぞれの細胞株の濃度間隔特性が異なっているが、同様の結果が得られた。
【００３８】
ナノスポンジに結合させた場合を除いてパクリタキセルが作用しないと思われた特に低濃度に注目して、図４および５は、極めて低濃度でヒト細胞株に関して行った実験結果を示す。いずれの場合も、本複合体は、１ナノモルという低濃度で増殖を３０〜５０％低下させるが、複合体形成されないパクリタキセルは不活性でありもしくはあまり活性ではない。
【００３９】
それぞれの実験の内部対照物は、複合体形成しないナノスポンジ、および同濃度のＤＭＳＯ（パクリタキセルだけを可溶化するのに必要とされる）であった。これらの状態はいずれも、細胞増殖性に影響を有しなかった（図６は、４８時間においてＣａｌ株に関して行った実験についてのデータを示す。）。
【００４０】
腫瘍細胞株に関してこれまで行った実験により得られたデータは、ナノスポンジで複合体形成したパクリタキセルの抗増殖作用が、パクリタキセルだけの抗増殖作用よりも遥かに強調されることを示唆する。
【００４１】
この成果は、非常に低濃度（およそ１ｎＭ）で特に明らかである。ナノスポンジだけでは、試験した細胞株に関して何ら抗増殖性もしくは細胞毒性効果が示されなかった。
【００４２】
実施例６．本製剤のバイオアベイラビリティーの測定
ナノスポンジにより複合体形成したパクリタキセルの経口バイオアベイラビリティーにおける何らかの増加があるかどうか評価するために、６週齢メスＢａｌｂ／ｃマウス２０匹について実験を行った。
【００４３】
動物を無作為に２群に分割し、麻酔の後、経口胃用（ｏｒｏｇａｓｔｒｉｃ）プローブによって、クレモホルによるパクリタキセル５０ｍｇ／ｋｇを投与し（「対照」群）、または等モル当量の生理的食塩溶液中に再懸濁させたパクリタキセル−ナノスポンジ複合体を投与した（「複合体」群）。
【００４４】
複合体群の動物４匹および対照群の動物４匹から予め設定した間隔（３０分、１、２および４時間）で、血液試料を採取した。次いで血清を分離し、ＨＰＬＣ分析のため直ちに凍結させた。
【００４５】
２つの製剤、すなわち市販製剤（タキソール（Ｔａｘｏｌ））および本ナノスポンジ懸濁液を経口投与した後、逆相高圧クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法を使用して、マウスの血漿中のパクリタキセルを定量した。分析に使用した機器は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社ＵＶ検出器（ＬＣ−９５）に接続したＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社バイナリーポンプ（ＬＣ２５０）であった。移動相として１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ＝５．０：メタノール：アセトニトリル（５０：１０：４０、ｖ／ｖ／ｖ）の緩衝混合物を使用して測定を行った。一方固定相はＶａｒｉａｎ社ＯＤＳカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）であった。分析測定は、波長２２７ｎｍのＵＶ検出器により流速１ｍｌ／１０分で行われた。
【００４６】
生物学的試料の調製：知られている体積の血漿（一般に２５μｌ）に濾過水２００μｌとメタノール２５０μｌを添加した。渦流で撹拌後、混合物からジエチルエーテルで３回抽出する。
【００４７】
エーテル相を集め、窒素下で蒸発乾固する。残渣を、水：メタノール：アセトニトリル５０：１０：４０ｖ／ｖ／ｖ溶液で溶解し、撹拌後ＨＰＬＣに直接注入する。
【００４８】
図７は得られた結果を示し、その結果は経口投与４時間後のマウスの血液中に、高濃度のパクリタキセルが存在することを実証している。
【００４９】
実施例７
対照標準としてビヒクルを含まない薬剤を使用し、ＭＣＦ−７細胞株（ヒト乳癌細胞）についてナノスポンジで運搬されたタモキシフェンの細胞毒性活性を測定した。その結果を図８に示している。
【００５０】
４８時間のインキュベーション後、ナノスポンジで運搬されたタモキシフェンは、活性成分だけのものを超える細胞毒性活性を示した。特に、濃度１００ｎｇ／ｍｌのタモキシフェンと一緒にこれらの細胞をインキュベートすると、生存するのは細胞のおよそ４０％であるが、ビヒクルなしでこの薬剤を使用すると生存細胞の百分率は７０％を超えている。
【００５１】
実施例８
対照標準として複合体形成しない薬剤を使用し、ＨＣＰＣ１（ハムスター頬袋癌腫）細胞株についてナノスポンジで複合体形成したカンプトテシンの細胞毒性活性を測定した。その結果を図９に示している。７２時間のインキュベーション後、ナノスポンジで運搬されたカンプトテシンは、活性成分だけのものを超える細胞毒性活性を示した。特に、濃度６４ｎＭのカンプトテシンと一緒にこれらの細胞をインキュベートすると、生き残るのは細胞の２０％未満であるが、ビヒクルなしでこの薬剤を使用すると生存細胞の百分率は９０％を超えている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010531827.tif 000008
【図８】
2010531827.tif 000009
【図９】
2010531827.tif 000010
【国際調査報告】
2010531827.tif 000011
2010531827.tif 000012
2010531827.tif 000013
2010531827.tif 000014
2010531827.tif 000015