(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから前記免疫グロブリンを精製する方法であって、以下の順序で以下の工程：
（ａ）前記サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない前記免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られた前記フロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、前記免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および前記プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に前記免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、前記免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および前記混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に前記免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた前記溶出液を、２．５〜４．５の低いｐＨにおいて規定された時間にわたりインキュベートする工程
を含み、工程（ａ）および工程（ｃ）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも１０の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらす、方法。
【請求項２】
免疫グロブリンの製造プロセスにおいてウィルス安全性を高める方法であって、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝して、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない前記免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られた前記フロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、前記免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および前記プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に前記免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、前記免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および前記混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に前記免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた前記溶出液を、２．５〜４．５の低いｐＨにおいて規定された時間にわたりインキュベートする工程
を含み、工程（ａ）および工程（ｃ）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも１０の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらす、方法。
【請求項３】
さらに以下の工程：
（ｄ）工程（ｃ）の前記インキュベーション後の前記溶出液、またはそれに由来しかつ工程（ｃ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、ナノ濾過に曝す工程
を含む、請求項１または２に記載の方法であって、
工程（ａ）および工程（ｄ）について、非エンベロープウィルスに関して少なくとも１０の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし、または、工程（ａ）、工程（ｃ）、および工程（ｄ）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも１５の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし、あるいは、それらの両方をもたらす、方法。
【請求項４】
さらに以下の工程：
（ｃ２）工程（ｃ）において得られた前記溶出液、またはそれに由来しかつ工程（ｃ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、前記免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に前記免疫グロブリンを得る工程
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
工程（ａ）、工程（ｃ）、および工程（ｃ２）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも１５の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらす、方法。
【請求項５】
工程（ａ）、工程（ｃ）、工程（ｃ２）、および工程（ｄ）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも２０の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし、または、工程（ａ）、工程（ｃ２）、および工程（ｄ）について、非エンベロープウィルスに関して少なくとも１２の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし、あるいは、それらの両方をもたらす、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）の前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、メタクリレートポリマーマトリックスに結合するトリメチルアンモニウムエチル以外の強陰イオン交換クロマトグラフィーリガンドであるリガンドを含む強陰イオンクロマトグラフィーであり、前記リガンドは、四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分、四級アンモニウム部分、およびトリメチルアンモニウム部分からなる群から選択され、前記リガンドは好ましくはトリメチルアンモニウム（−Ｎ（ＣＨ３）３＋）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、捕捉工程、および／または捕捉工程に続く更なるポリッシング工程の前のプレクリーニング工程を用いて、細胞培養由来組成物から抗体を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術によって生産されるポリペプチドの精製について効率的かつ経済的な下流シーケンスの選択は、治療用途が意図されるあらゆる新しいバイオ医薬品の開発において重要な工程である。近年、医療用途における治療投与量が非常に高いために、より高い細胞密度およびより高い発現率をもたらす向上した細胞培養法を用いたモノクローナル抗体（ｍａｂ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の大規模精製プロセスの必要性がさらに高まっている。産物および夾雑物の培養液中の濃度上昇により、捕捉クロマトグラフィー、それに先行するサンプル清澄化工程、およびそれに続くポリッシングクロマトグラフィーの要求がより高く設定されている。下流プロセス全体が、（ｉ）産物量の上昇を管理し、（ｉｉ）増大したプロセス関連不純物および生産関連不純物を、規定された容認基準未満にまで効率的に除去し、かつ（ｉｉｉ）ｍａｂの経済的な収率および十分な品質を維持しなければならない。通常、下流プロセスは、治療抗体の総製造コストの主要な部分を占める。
【０００３】
粗画分中のｍａｂは典型的に、不純物、例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ：ｈｏｓｔ
ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、宿主細胞ＤＮＡ、ウィルス、凝集体、他の不所望の産物変異体、およびプロセス材料由来の種々の浸出物を伴う。これらの不純物の存在は、患者にとっての潜在的な健康リスクであるため、最終産物からそれらを無くすことが規制要件となる。非常に低い残留量のみが許容されるであろう。
【０００４】
細胞培養由来のポリペプチドを精製する従来の手順は、下流シーケンスの種々の位置での濾過工程、濃縮工程、または透析工程を伴う、捕捉−中間−ポリッシングクロマトグラフィーのシーケンスに従う。近年、ｍａｂ精製の分野において、プラットホームアプローチの確立に成功している。ｍａｂは、共通の物理化学的性質を有する糖タンパク質の明確に規定されたクラスであるため、一般的なプラットホームプロセスの使用が妥当である（非特許文献１）。そのような一般的なプロセスは、多かれ少なかれ産物特異的な適応があり、多くのｍａｂ、とりわけ、同じクラスまたはサブクラスの免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１に適用され得る。
【０００５】
ｍａｂ精製に最もよく用いられる捕捉工程の１つが、プロテインＡによる親和性クロマトグラフィーである。この捕捉は、Ｆｃ含有分子に対する特別な選択性を提供することによって、単一工程において夾雑物を９９．５％超除去する。しかしながら、その利点の他に、２つの不利点もまた言及されるべきである。一方の欠点は、毒性であることが知られているプロテインＡまたはプロテインＡのフラグメントの不所望の浸出である（非特許文献２）。他方の不利点は、特に治療抗体を精製するのに必須の工業規模での、このタイプの樹脂のコストが高いことである。プロテインＡ樹脂は、イオン交換樹脂よりもおよそ３０倍高価である。１０ｍ３の細胞培養の下流プロセシングについて、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーのコストは、約４００万〜５００万ＵＳＤであると算出された（非特許文献３）。
【０００６】
浸出プロテインＡの問題を克服する多くの解決策が公開されている（非特許文献２；非特許文献４）。いくつかのアプローチが、浸出プロテインＡを除去するポストプロテインＡクロマトグラフィー工程、例えば結合モード（特許文献１）またはフロースルーモード
（特許文献２）で用いられる陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー（特許文献３）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（特許文献４）、またはクロマトグラフィーの組合せ、例えばイオン交換クロマトグラフィーに続く疎水性相互作用クロマトグラフィー（特許文献５）、陰イオン交換クロマトグラフィーに続く陽イオン交換クロマトグラフィー（特許文献６）、もしくは任意の順序の陽イオン交換クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィー（特許文献７）と関連した。治療抗体に必要とされる純度の全体的な程度は極めて高いため、典型的なプラットホーム精製スキームは、陽イオン交換クロマトグラフィー、フロースルーの陰イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーから通常選択される少なくとも２つのポストプロテインＡクロマトグラフィーからなる（非特許文献４、非特許文献１、特許文献４、特許文献８、特許文献５、特許文献９、特許文献６）。
【０００７】
他のアプローチは、免疫グロブリンを溶出する前に、浸出したプロテインＡを除去する特別な洗浄工程を用いることによって、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー中において既に浸出物を減らすものである。塩または付加的な構成要素、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム等の疎水性電解質を含有する多くの中間洗浄バッファが開発された（非特許文献４）。
【０００８】
プロテインＡ溶出の源により近いいくつかの方法は、サンプルに由来するタンパク質分解活性を直接引き下げることによって効果を発揮するものである。プロテインＡ溶出の主要な部分は、タンパク質分解によって引き起こされる。そのような溶出の引下げは、低温によって、かつ／またはバッファへのプロテアーゼ阻害剤の添加によって達成された（特許文献１０）。
【０００９】
プロテインＡ浸出を回避する、または引き下げる特別な方法は、表面活性化合物、例えば、ウレアまたはグアンジン−ＨＣｌ等のカオトロピック物質によるプロテインＡ樹脂のプレ処理を含む（特許文献１１）。長い間、様々なタイプのプロテインＡ樹脂が、様々な程度の浸出を示すことが知られてきた（非特許文献５）。そのため、プロテインＡ材料の選択は、重要な要因である。リガンド自体の他に、骨格マトリックスもまた、浸出、結合能力、および流速に影響する（非特許文献４）。これらのパラメータは共に、カラムサイズと、プロセス時間と、従って親和性捕捉工程の経済性とを規定する。さらに、先の１０年の間に、クロマトグラフィーの供給者は、天然の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ配列の遺伝子工学によって提供されるよりロバストなプロテインＡリガンドを開発した。この向上した樹脂は、耐アルカリ性、高い結合能力、および低いリガンド漏出を可能にするように特に操作された向上組換えリガンドタンパク質と組み合わせた硬質マトリックスからなる。１つの例が、ＧＥヘルスケア・ライフ・サイエンス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のマブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）（商標）である（特許文献８）。この材料は、ランの後、最大０．５Ｍ  ＮａＯＨで迅速かつ効率的にクリーニングされ得る。しかしながら、これらの利点は相当な代償を伴う。マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）および匹敵する最新の樹脂は、以前のプロテインＡ樹脂世代よりもかなり高価である。従って、これらの新しい親和性媒体にもかかわらず、経済的な利益はなく、むしろ、真実は逆である。プロテインＡベースの親和性捕捉と関連する非常に高いコストを考慮すれば、免疫グロブリンの精製のために親和性クロマトグラフィーのあらゆる使用を完全に回避する代替戦略が開発されてきたことは、驚くべきことではない。１つの例が、非親和性クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または混合モードクロマトグラフィー（特許文献１２））と組み合わせた高性能タンジェント流濾過の使用である。
【００１０】
多くの場合、捕捉工程は、粗インプット（ロード）材料で実行され、これにより親和性カラム樹脂の汚染（親和性カラム樹脂上への不純物の蓄積）が生じるおそれがある。適切な再生工程の不在下では、これは、捕捉樹脂の正常な再使用を妨げるおそれがある。プロテインＡによる親和性捕捉の場合、リガンド浸出がプロテインＡ樹脂の寿命を制限する主要な要因ではないと強調されなければならない。脂質、オキシダント、凝集体または粒子、金属イオン、および他の物質等の、粗培養液中の夾雑物が、樹脂の汚染を促進する。プロテインＡ結合部分に及ぼす直接的な影響の他に、マトリックスも不可逆的に汚染されるおそれがある。ランからランまでの収容能力および流速の低下が、その結果である。この問題は、プロテインＡ樹脂に限られない。その稼動寿命にわたるクロマトグラフィー樹脂の汚染は、市販のバイオ分離の一般的な重大問題である。疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーに用いられる疎水性リガンドは、細胞培養由来の免疫グロブリンの捕捉工程として用いられる場合、培養液からの親油性夾雑物のトラップについて、とりわけ感受性である。ポストランクリーニング工程の洗練されたプロトコルにもかかわらず、捕捉カラムの寿命は制限される。捕捉カラムの寿命は、サイクル数、ランニングおよびクリーニングの稼働条件、ならびにサンプルの純度によって決まる。
【００１１】
混合モードクロマトグラフィーは、プロテインＡに対する下流のポリッシング工程の選択肢として、主に記載された（非特許文献１、特許文献１２）。ｍａｂ精製のための結合モードでのカプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ）の使用が知られている。特別な溶出条件が開発された（特許文献１３）。同様に、カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）が、好ましくはフロースルーモードで、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー後に実行されるフロースルー陰イオン交換クロマトグラフィー後の適切なポリッシング工程であることが示された（特許文献１４）。さらに、いくつかの様々な混合モード樹脂が、オーバーロードおよび溶出クロマトグラフィーモードで調査され、カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）が最も好まれた（特許文献１５）。
【００１２】
かなり汚染された培養液を清澄にするために、細胞残渣および凝集体のほとんどを除去する機械的分離工程が利用されてきた。遠心分離および濾過が、捕捉樹脂へのサンプルのロード前に実行される最も共通したプレ処理工程である。大容量では、遠心分離は細胞セパレータによって実行され、濾過工程はデプスフィルタおよび／またはミクロフィルタによって実行される。結果として生じた培養液はその場合、「清澄な細胞培養上澄み」と呼ばれる（非特許文献６）。収集された培養液のプロテインＡ樹脂上への直接的なロードが、頻繁に選択される方法であるが（非特許文献４）、捕捉カラムを保護するため、他のプラットホーム技術は、清澄化工程、すなわち遠心分離、デプス濾過、および／または精密濾過を利用している（非特許文献６、特許文献４、特許文献１６）。
【００１３】
遠心分離／濾過に対して代替的に、または付加的に実行されるプレクリーニングクロマトグラフィー工程は、散発的にのみ報告されている。結合モードでの固定金属（Ｚｎ２＋）キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ：ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）の使用が、非常に小規模に、プロテインＡに先立って用いられた（非特許文献７、非特許文献８）。対照的に、ＤＥＡＥセルロース上での弱陰イオン交換クロマトグラフィーは、遠心分離、濾過、および濃縮の後に用いられ、得られたフロースルーはその後、プロテインＡ上にロードされた（特許文献１７）。最後に、プロテインＡに先立つ培養液のプレ処理用のデプス濾過の利点が調査され、フロースルーモードのＴＭＡＥフラクトゲル（ＴＭＡＥ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標））上で効果のより低い陰イオン交換クロマトグラフィーと比較された（非特許文献９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】欧州特許第０３４５５４９号明細書
【特許文献２】国際公開第２００４０７６４８５号
【特許文献３】国際公開第２００９０５８８１２号
【特許文献４】国際公開第９５２２３８９号
【特許文献５】国際公開第２０１０１４１０３９号
【特許文献６】国際公開第２０１１０９０７２０号
【特許文献７】国際公開第２０１１１５０１１０号
【特許文献８】国際公開第２００９１３８４８４号
【特許文献９】国際公開第２０１１０１７５１４号
【特許文献１０】国際公開第２００５０１６９６８号
【特許文献１１】国際公開第０３０４１８５９号
【特許文献１２】国際公開第０３１０２１３２号
【特許文献１３】国際公開第２０１１０４９７９８号
【特許文献１４】国際公開第２０１３０６６７０７号
【特許文献１５】国際公開第２０１３０６７３０１号
【特許文献１６】国際公開第２００１１５０１１０号
【特許文献１７】欧州特許第０５５０４００号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ケリー（Ｋｅｌｌｙ）Ｂ、２００９年
【非特許文献２】ギャニオン（Ｇａｇｎｏｎ）Ｐ、１９９６年
【非特許文献３】ファリド（Ｆａｒｉｄ）ＳＳ、２００９年
【非特許文献４】ファーナ（Ｆａｈｒｎｅｒ）ＲＬ、２００１年
【非特許文献５】フグリスタラー（Ｆｕｅｇｌｉｓｔａｌｌｅｒ）Ｐ、１９８９年
【非特許文献６】リウ（Ｌｉｕ）ＨＦ、２０１０年
【非特許文献７】ヴァンダーム（ＶａｎＤａｍｍｅ）Ａ．−Ｍ．、１９９０年
【非特許文献８】ビュレンズ（Ｂｕｌｅｎｓ）Ｆ、１９９１年
【非特許文献９】イグソー（Ｙｉｇｓａｗ）Ｙ、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、免疫グロブリンの精製と、効率的で対費用効果が高くかつ満足のいく純度および収率で免疫グロブリンを精製する方法を提供する問題とに関する。特に、本発明は、かなりコストがかかるクロマトグラフィー材料の再使用の態様、特に下流プロセスの捕捉工程に用いられるクロマトグラフィー材料の寿命、および、精製プロセスの技術的複雑性を軽減しつつクロマトグラフィー材料の寿命を延長し得る方法について、対処する。
【００１７】
細胞培養液からの免疫グロブリンの精製のための従来の下流クロマトグラフィー法は、通常、免疫グロブリンを不純物と共に含むサンプルから免疫グロブリンが捕捉されなければならない捕捉クロマトグラフィー工程で始まる。免疫グロブリンは捕捉クロマトグラフィー樹脂に選択的に結合する一方で、不純物は樹脂に結合しないため、フロースルー中に得られるが、免疫グロブリンは溶出液中に得られ、この結果として、免疫グロブリンは大部分が不純物から分離される。
【００１８】
この捕捉クロマトグラフィー工程は、通常、免疫グロブリンの精製において最も高価な工程であり、下流プロセスのコスト全体の４０〜５０％に達する。捕捉工程は特に、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーが用いられる場合に、よりコストがかかる。免疫グロブリンの精製において捕捉クロマトグラフィー工程として代わりに用いられ得る混合モードクロマトグラフィーカラムも同様である。
【００１９】
大容量の細胞培養液および発酵ブロスからの、およびそのような液またはブロスに由来
するサンプルからの免疫グロブリンの対費用効果の高い精製の必要性が、継続して存在する。特に、純度および収率に関して、対費用効果が高く、なお効率的で満足のいく精製法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
捕捉クロマトグラフィー工程の上流に付加的なクロマトグラフィー工程を組み込むことによって、精製プロセスの全体的な出費がかなり引き下げられ得ることが分かった。捕捉クロマトグラフィー工程の上流の付加的なクロマトグラフィー工程は、コストがかかる捕捉クロマトグラフィー材料が曝される不純物負担を軽減する。このいわゆる「プレクリーニング」工程は、以降の捕捉工程に用いられるクロマトグラフィー材料と比較して、それほど高価でなく、かつよりロバストなクロマトグラフィー材料を用いて実行され、および再生するのが容易である。
【００２１】
精製プロセスをできるだけ単純に保つために、好ましい実施形態において、プレクリーニング工程は、フロースルーモードで実行される。すなわち、精製されるべき免疫グロブリンは、樹脂によって結合されないため、フロースルー画分中に得られる一方で、不純物は大部分が樹脂上に保持されることによって、免疫グロブリンから分離される。
【００２２】
さらに好ましい実施形態において、プレクリーニング工程および捕捉工程は、プレクリーニング工程のフロースルーが、採取管中に一時的に貯蔵されず、捕捉クロマトグラフィー樹脂に直ちに通されるように直列に接続される。
【００２３】
治療的使用が意図される免疫グロブリンの必要とされる高い純度を達成するために、プレクリーニング工程および捕捉クロマトグラフィー工程は、捕捉クロマトグラフィー工程後に、１つまたは複数のクロマトグラフィーポリッシング工程が続く。
【００２４】
本発明の根底にある問題は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法の提供によって解決され、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００２５】
本発明はさらに、免疫グロブリンの製造プロセスにおいてウィルス安全性を高める問題を解決する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】免疫グロブリンの従来の精製法のプロセススキームであって、大容量の細胞培養物からの免疫グロブリンの精製のための一般的プロセススキームを示す図。収集された培養液の遠心分離および／または濾過の後に得られる清澄なバルク材料から始めたプロセスは、プロテインＡ捕捉工程および以降の２つのポリッシング工程からなる。このスキームは、２つの典型的なウィルス安全性工程を含む。ウィルス不活性化工程が、プロテインＡ溶出液を低いｐＨに維持することによって実行され、ウィルス除去のためのナノ濾過工程が、最後のポリッシング工程の後に実行される。最終工程は、通常、免疫グロブリンの所望の濃度、および調合成分の濃度を設定するタンジェント流限外濾過および／または透析濾過（ＵＦ／ＤＦ−ＴＦＦ）である。
【図１Ｂ】免疫グロブリンの従来の精製法のプロセススキームであって、３つのクロマトグラフィーからなる、大容量の細胞培養物からの免疫グロブリンの精製のための従来のプロセススキームを示す図（例えば、ファーナ（Ｆａｈｒｎｅｒ）Ｒ．Ｌ．、２００１年またはケリー（Ｋｅｌｌｙ）Ｂ．、２００９年に従う）。ポリッシング工程が、陽イオン交換クロマトグラフィー（ポリッシング工程１）に続く陰イオン交換クロマトグラフィー（ポリッシング工程２）であることが開示されていること以外は、図１Ａと同じプロセスである。陽イオン交換クロマトグラフィーが結合モードで実行されるが、陰イオン交換クロマトグラフィーはフロースルーモードで実行されることが強調されなければならない。この従来のスキームの頻繁に適用される均等な変形形態が、ポリッシング工程１およびポリッシング工程２の順序を単に変えることであることが言及されるべきである。
【図２Ａ】プレクリーニング工程を用いた本発明の例示的なプロセススキームであって、プロテインＡ捕捉工程の前のプレクリーニング工程による大規模プロセススキームを示す図。収集された細胞培養液は、セパレータを用いた分取遠心分離に続くデプス濾過および精密濾過によって清澄化される。プレクリーニングクロマトグラフィー工程は、陰イオン交換カラムをフロースルーモードで用いることによって実行される。好ましい構成において、プレクリーニングカラムは、プロテインＡである捕捉クロマトグラフィーカラムに直接連結される。２つのポリッシング工程は、結合モードおよび溶出モードで利用される陽イオン交換クロマトグラフィー（ポリッシング工程１）に続く混合モードクロマトグラフィー（ポリッシング工程２）である。混合モード樹脂は、正に帯電するリガンドを有し、結合モードでもフロースルーモードでも実行され得る。この第２のポリッシング工程は任意選択的である。ウィルス安全性工程および最終ＵＦ／ＤＦ−ＴＦＦは、図１Ａの下で記載されている。
【図２Ｂ】プレクリーニング工程を用いた本発明の例示的なプロセススキームであって、プレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィーとプロテインＡ親和性クロマトグラフィーとの間に、更なる混合モードクロマトグラフィーが挿入されていること以外は、図２Ａのプロセスと類似する代わりの大規模プロセススキームを示す図。この混合モードクロマトグラフィーは、負に帯電するリガンドを含有する樹脂（例えばカプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ））で、または正に帯電しているもしくは帯電していないリガンドを含有する樹脂（例えばＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ））で実行され、および結合モードで実行される。従って、混合モードクロマトグラフィーは、このプロセスにおいて捕捉工程として機能するが、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーは、より適切には、このスキーム内で中間工程として規定される。最後のクロマトグラフィーとしての第２の混合モードクロマトグラフィー工程は任意選択的である。他の全ての工程は図２Ａの下で記載されている。
【図２Ｃ】プレクリーニング工程を用いた本発明の例示的なプロセススキームであって、プロテインＡ捕捉クロマトグラフィーが混合モード捕捉クロマトグラフィーと置き換えられていること以外は、図２Ａのプロセスと類似する代わりの更なる大規模プロセススキームを示す図。この混合モードクロマトグラフィーは、負に帯電するリガンドを含有する樹脂（例えばカプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ））で、または正に帯電しているもしくは帯電していないリガンドを含有する樹脂（例えばＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ））で実行され、および結合モードで実行される。このプロセスは、図２Ｂに示されるプロセスと対照的に、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを欠いている。他の全ての工程は図２Ａの下で記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書中で用いられる「サンプル」または「免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプル」は、注目する免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含む。サンプルは、免疫グロブリンを産生する宿主細胞または生物から直接的に得ることができる。サンプルは、収集された細胞培養液、細胞培養上澄み、またはプレ処理された細胞培養上澄みであってよい。サンプルは、遠心分離および／または濾過、例えば精密濾過、ダイアフィルトレーション、限外濾過、およびデプス濾過によって部分的に清澄化または精製されていてよい。
【００２８】
本明細書中で用いられる用語「プレ処理されたサンプル」は、例えば、本発明の方法において用いられるクロマトグラフィー工程用に、例えばサンプルを、バッファ交換、希釈、塩、洗剤、カオトロピック物質、または有機化合物の添加、ｐＨおよび／または導電率範囲および／または緩衝能力を調整するためのｐＨ滴定または濾過からなる１つまたは複数の調整にかけることによって、所望のクロマトグラフィー性能を達成するように、かつ免疫グロブリンを安定させるように調製された細胞培養上澄みである。哺乳類細胞から発現される免疫グロブリンは通常、培養プロセス中に細胞培養液中に分泌されるため、培養プロセス終了後の産物収集は、細胞培養液を細胞から分離することによって起こる。細胞分離法は、細胞崩壊を最小にするほど穏やかにして、細胞残渣の増大、ならびに免疫グロブリン産物の品質に影響を及ぼし得るプロテアーゼおよび他の分子の放出を回避するべきである。通常、哺乳類細胞培養物からの収集は、遠心分離に続いて濾過を受ける。拡張ベッド吸着クロマトグラフィーが、遠心分離／濾過法を回避する代替法である。クロマトグラフィー工程を介した精製に先立つサンプルの他の処理として、細胞培養上澄みの、特定の免疫グロブリン濃度、ｐＨの範囲、導電率、およびバッファ種濃度への濃縮および／またはダイアフィルトレーションがあり得る。
【００２９】
用語「不純物」および「夾雑物」は、本明細書中で互換的に用いられ、注目する免疫グロブリンと異なるあらゆる材料を指す。例として、細胞培養液構成要素、宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、ウィルス、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プロセス材料からの浸出物、および凝集体、またはそれらのフラグメントがあり得る。また、不純物として考えられるのは、凝集体、電荷変異体、誤って折りたたまれた分子、または精製されるべき注目する免疫グロブリンのフラグメントである。
【００３０】
本明細書中で用いられる用語である１つまたは複数の「クロマトグラフィー媒体」は、ビーズ、プレート、結晶、モノリス、膜、繊維、繊維のメッシュワーク、またはあらゆる他の固体相の形態のクロマトグラフィー材料または媒体として理解されなければならない。「媒体」は、「マトリックス」と呼ばれる骨格に結合する「リガンド」と呼ばれる官能基を有する。例外は、典型的にはいかなるリガンドも付着していない、サイズ排除クロマトグラフィー用のゲルクロマトグラフィー樹脂である。従って、用語「媒体」は、本発明の方法を、クロマトグラフィー樹脂を利用するカラムクロマトグラフィーにのみ限定するのではない。他のタイプのクロマトグラフィー、例えば、膜吸着体を利用する膜クロマトグラフィーもまた挙げられる。特に、陰イオン交換クロマトグラフィーでは、陰イオンクロマトグラフィー交換樹脂または陰イオン交換クロマトグラフィー膜吸着体は両方とも本発明に含まれる。
【００３１】
「樹脂」は、タンパク質または少なくとも１つの夾雑物と相互作用し得る官能基（リガンド）が結合したマトリックスを含む、ビーズの形態のあらゆるクロマトグラフィー材料または媒体を意味する。例外は、典型的にはいかなるリガンドも付着していない、サイズ排除クロマトグラフィー用のゲルクロマトグラフィー樹脂である。樹脂は、異なるサイズ
のビーズとして供給されて、カラム内に充填されてよい。あるいはまた、プレ充填カラムが購入されてもよい。
【００３２】
用語「結合モード」または「結合および溶出モード」は、精製されるべき免疫グロブリンを含有するサンプルが、クロマトグラフィー媒体に適用されて、免疫グロブリンがクロマトグラフィー媒体に結合するクロマトグラフィー状態を指す。そのため、免疫グロブリンは、クロマトグラフィー媒体上に保持されるが、サンプルの不純物は、フロースルー画分とも呼ばれる非結合画分中に存在し得る。クロマトグラフィー工程が結合モードで実行される場合、１つまたは複数の洗浄工程が、クロマトグラフィー媒体への免疫グロブリンの結合後に、および培地からの免疫グロブリンの溶出前に実行されてよい。免疫グロブリンを得るために、免疫グロブリンはその後、溶出されて溶出液中に得られ、これはその後、必要に応じて、更なるクロマトグラフィー工程においてさらに精製されてよい。免疫グロブリンの溶出は、夾雑物を媒体に結合させたままにすることが可能でありながら、免疫グロブリンが溶出する選択的条件を用いて実行されてよい。
【００３３】
「結合モード」でクロマトグラフィー工程を実行することは、注目する免疫グロブリンの１００％が結合することを必ずしも意味するわけではない。本発明に関連して、「クロマトグラフィー樹脂に結合する」または「クロマトグラフィー媒体に結合する」は、樹脂または媒体に、免疫グロブリンの少なくとも５０％が結合すること、好ましくは、免疫グロブリンの少なくとも７５％が結合すること、より好ましくは、免疫グロブリンの少なくとも８５％が結合すること、最も好ましくは、免疫グロブリンの９５％超が結合することを意味する。
【００３４】
用語「フロースルーモード」、「クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得ること」、および「クロマトグラフィー媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得ること」は、注目する免疫グロブリンを含有するサンプルが、クロマトグラフィー樹脂または媒体に適用されて、免疫グロブリンが、クロマトグラフィー樹脂に結合しないが、主に、樹脂または媒体に結合しない画分中に存在し、従ってフロースルー中に含有されるクロマトグラフィー条件を指す。
【００３５】
「フロースルーモード」でクロマトグラフィー工程を実行することは、注目する免疫グロブリンの１００％が結合せずにフロースルー中に含有されることを必ずしも意味するわけではない。本発明に関連して、「クロマトグラフィー樹脂に結合しない」または「クロマトグラフィー媒体に結合しない」は、樹脂または媒体に、免疫グロブリンの少なくとも５０％が結合しないこと、好ましくは、免疫グロブリンの少なくとも７５％が結合しないこと、より好ましくは、免疫グロブリンの少なくとも８５％が結合しないこと、最も好ましくは、免疫グロブリンの９５％超が結合しないことを意味する。不純物は、このモードで樹脂または媒体に結合し得る。
【００３６】
本発明に関連して、本発明のプレクリーニングクロマトグラフィー工程は、フロースルーモードで実行されると理解されるが、捕捉工程は、結合モードで実行される第１のクロマトグラフィー工程であると考えられる。
【００３７】
本発明に至る実験において、細胞フリーの収集材料（清澄な上澄み）はなお、精製されるべき免疫グロブリンと共に、捕捉樹脂に強く結合するいくつかの物質を含有することが観察された。これは、樹脂の再使用に影響を及ぼす。本発明の発見に従えば、適切なプレクリーニングカラムの挿入が、清澄な培養液の更なる迅速な精製の良好な解決策を表す。更なる不純物を結合することによって、プレクリーニングカラムは、サンプルの純度を向上させ、重大な汚染を縮小し、かつ高価な親和性カラムを保護する。プレクリーニングカラムは再使用可能であるべきであり、その再生は単純な手段によって可能であるべきであ
る。最も適しているのは、例えばヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ（商標）Ｑ）によって提供されるような、マトリックスがロバストであり、四級アミノエチル、四級アンモニウム、またはトリメチルアンモニウム部分の群から選択されるリガンドを有する、強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。フロースルーモードでプレクリーニング陰イオン交換カラムを用いることは、いくつかの利点がある：カラムは比較的小さく維持され得、かつ捕捉カラムに直接連結され得る。この構成は、陰イオン交換溶出液の一時的な採取および貯蔵を回避し、工程数を減らし、かつプロセス経済を向上させる。陰イオン交換カラムは、プロテインＡ樹脂、または混合モード樹脂（例えば、ベーカーボンドＡＢｘ（ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢｘ（商標））、カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ）、カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）、またはＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）））が続いてもよく、または再生するのが困難であるあらゆる他の高価な樹脂が続いてもよい。
【００３８】
用語「以下の順序で」は、言及するプロセス工程が、示された順序で実行されることを意味すると理解されるべきである。更なるプロセス工程は、示されるプロセス工程の前に、後に、および間に組み込まれてよい。
【００３９】
本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００４０】
本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー
樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００４１】
本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００４２】
本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００４３】
用語「更なるプロセシング工程」は、タンパク質精製プロトコル内、例えば濾過、透析、ウィルス不活化、希釈、濃縮、ｐＨの調整、導電率の調整、または中間クロマトグラフィー工程内で通常適用されるあらゆる工程を指す。更なるプロセシング工程が、本発明の全てのクロマトグラフィー工程間で適用されてよい。中間クロマトグラフィー工程は、サンプルを工程（ａ）の陰イオン交換クロマトグラフィーに曝す工程と、工程（ａ）において得られたフロースルーを工程（ｂ）のクロマトグラフィーに曝す工程との間以外、あらゆるクロマトグラフィー工程間で適用されてよい。特に、用語「更なるプロセシング工程」は、捕捉クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーとの間で適用される中間クロマトグラフィー工程を指す。中間クロマトグラフィー工程は、あらゆるクロマトグ
ラフィー媒体で実行されてよい。中間クロマトグラフィー工程は、あらゆるクロマトグラフィータイプを利用してよく、カラムクロマトグラフィーおよび膜クロマトグラフィーが挙げられる。
【００４４】
一実施形態において、サンプルを工程（ａ）の陰イオン交換クロマトグラフィーに曝す工程と、工程（ａ）において得られたフロースルーを工程（ｂ）のクロマトグラフィーに曝す工程との間で、更なるプロセシング工程は適用されない。
【００４５】
別の実施形態において、サンプルを工程（ａ）の陰イオン交換クロマトグラフィーに曝す工程と、工程（ａ）において得られたフロースルーを工程（ｂ）のクロマトグラフィーに曝す工程との間で、濾過、例えば滅菌濾過は適用されない。
【００４６】
プレクリーニング工程：陰イオン交換クロマトグラフィー
本発明の方法は、プレクリーニング工程として、捕捉工程の前にフロースルーモードの陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体であっても弱陰イオン交換クロマトグラフィー媒体であってもよく、陰イオン交換膜が挙げられる。
【００４７】
このプレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、通常であれば酸性ｐＨにおいて沈殿を生じるおそれがある不純物を効率的に保持すること、かつＤＮＡおよびＲＮＡ等の宿主核酸分子を結合し得ることが見出された。さらに、クロマトグラフィー捕捉カラム中の汚染を促進する粗サンプル由来の物質が、プレクリーニング陰イオン交換カラムによってプレ捕捉されて、以降の捕捉カラムに入ることが妨げられることが見出された。加えて、プレクリーニング工程は、プロテインＡ浸出に大きな影響を及ぼし、プロテインＡ浸出は、プレクリーニングクロマトグラフィーを用いることによって大いに引き下げられ得る。最後に、沈殿および／または混濁が、ウィルス不活化のためのプロテインＡ溶出液の保持工程中に観察される場合、この影響は、プレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた場合に完全に回避されることが観察された。プレクリーニング工程のクロマトグラフィー媒体が、クロマトグラフィープロセスにおいて不純物の最大ロードに曝されると、速くて、安価で、かつ効率的な再生およびクリーニング手順が、プレクリーニング工程のクロマトグラフィー媒体に必要とされる。陰イオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、樹脂または膜）の再生は、数工程のみを含む、速くて、安価で、かつ効率的なプロトコルで効率的に実行され得ることが見出された。陰イオン交換クロマトグラフィー媒体の再生のために、機能を損なうことなく短時間のクロマトグラフィー媒体のクリーニングを可能とする厳しい条件が使用されてよい。イオン交換クロマトグラフィーは、結合することになる分子とマトリックス上に固定された電荷との間の電荷−電荷相互作用に依存する。陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、結合することになる分子は負に帯電しており、固定された官能基（リガンド）は正に帯電している。通常用いられる陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、Ｑ媒体（四級アミンリガンド）、ＴＭＡＥ樹脂（トリメチルアミノエチルリガンド）、およびＤＥＡＥ樹脂（ジエチルアミノエチルリガンド）である。しかしながら、一般に、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、市販される通常の全ての陰イオン交換媒体で実行されてよい。陰イオン交換媒体は、プレ充填カラムの形態で、または膜として用いられてよい。あるいはまた、樹脂は、バルク材料、およびユーザによって充填されるカラムとして購入されてよい。収容能力およびカラムの寸法に関して、特異的な限定は、通常のもの以外にない。当業者は、用いられるべき陰イオン交換クロマトグラフィー媒体の量およびカラムのサイズを知っている。これは、プロセスの全体的な規模によって決まる。
【００４８】
本発明の目的に用いられ得る典型的な強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、官能基、例えば：四級アミノエチル（ＱＡＥ：ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ
）部分（樹脂として、例えば、トヨパール（登録商標）ＱＡＥ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＱＡＥ）（独国トーソー・バイオサイエンス（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）から入手可能）、セレクタセルＱＡＥ（Ｓｅｌｅｃｔａｃｅｌ（商標）ＱＡＥ）（セルロースの四級アミノエチル誘導体、米国ペンシルバニア州ポリサイエンシズ社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）から入手可能）、ＱＡＥセファデックス（ＱＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））（独国ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から入手可能）およびその他が挙げられる）；四級アンモニウム（Ｑ）部分（樹脂として、例えば、ＱセファロースＸＬ（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬ）、ＱセファロースＦＦ（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、ＱセファロースＨＰ（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ）、ＱセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ）、Ｑセファロース・ビッグ・ビーズ（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ）、ソースＱ（Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ）、リソースＱ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ）、カプトＱ（Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ）、カプトＱインプレス（Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍＰｒｅｓ）（全て独国ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から入手可能）、ポロスＨＱ（Ｐｏｒｏｓ（商標）ＨＱ）（独国アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、Ｑハイパーセル（Ｑ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標））、バイオセプラＱセラミック・ハイパーＤ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ（商標）Ｑ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ）（米国ニューヨーク州ポール（Ｐａｌｌ）から入手可能）、マクロ・プレップ・ハイＱ（Ｍａｃｒｏ  Ｐｒｅｐ（商標）  Ｈｉｇｈ  Ｑ）（米国カリフォルニア州バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））、トヨパール・スーパＱ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｓｕｐｅｒ  Ｑ）（独国トーソー・バイオサイエンス（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）から入手可能）、ウノスフェアＱ（ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ）（米国カリフォルニア州バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から入手可能）が挙げられ、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）として、例えば、フラクトゲルＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ）（独国メルク（Ｍｅｒｃｋ）ＫｇａＡ）が挙げられ、およびトリメチルアンモニウム樹脂として、例えば、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ（商標）Ｑ）（米国カリフォルニア州バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から入手可能）が挙げられる）を含む。
【００４９】
特に、強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、通常であれば酸性ｐＨにおいて沈殿を生じるであろう不純物を保持するのに、かつＤＮＡおよびＲＮＡ等の宿主核酸分子を結合するのに効果的であることが見出された。
【００５０】
好ましくは、四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分、四級アンモニウム部分、および、メタクリレートポリマーマトリックスに結合するトリメチルアンモニウムエチル以外のトリメチルアンモニウム部分からなる群から選択されるリガンドを含む強陰イオン交換クロマトグラフィー媒体が用いられる。
【００５１】
より好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーは、−Ｎ（ＣＨ３）３＋（トリメチルアンモニウム；米国カリフォルニア州バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から入手可能なヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ））官能基（リガンド）を有する強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、または類似の特徴を有する媒体を用いて実行される強陰イオン交換クロマトグラフィーであってよい。
【００５２】
そのため、本発明の好ましい実施形態は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフ
ィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００５３】
強陰イオン交換体であるヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）の特徴は、以下の通りである。
官能基：                  −Ｎ（ＣＨ３）３＋
総イオン収容能力          １００〜１７０μｍｏｌ／ｍｌ（１００〜１７０μｅｑ／ｍｌ）
動的結合能力              ≧１７０ｍｇ／ｍｌ
出荷時のカウンターイオン  Ｃｌ−
メジアン粒子サイズ        ８５±１５μｍ
推奨線形流速範囲          ５０〜６００ｃｍ／時
化学的安定性
１．０Ｍ  ＮａＯＨ（２０℃）    最長１週
１．０Ｍ  ＨＣｌ（２０℃）      最長５週
ゲルベッド圧縮比          １．１０〜１．１５（固定ベッド容量／充填ベッド容量）
ｐＨ安定性
短期間      ２〜１４
長期間      ４〜１２
出荷時の溶液２０％        エタノール＋ＮａＣｌ
再生                      １〜２Ｍ  ＮａＣｌ
衛生                      ０．５〜１．０  ＮａＯＨ
貯蔵条件                  ２０％エタノールまたは０．０１  ＮａＯＨ
好ましい実施形態において、プレクリーニング陰イオン交換カラムの直径は、捕捉カラムの直径よりも大きい。別の好ましい実施形態において、プレクリーニング陰イオン交換カラムのベッド高は、捕捉カラムのベッド高よりも短い。最も好ましい実施形態において、プレクリーニングカラムの直径は、捕捉カラムの直径よりも大きく、およびプレクリーニング陰イオン交換カラムのベッド高は、捕捉カラムのベッド高よりも短い。不純物の最適な捕捉のために、プレクリーニング陰イオン交換カラムについて最低でも約１０ｃｍのベッド高が必要とされる。
【００５４】
一部のタイプの不純物が、イオン性相互作用を介してだけでなく、疎水性相互作用を介して媒体に結合し得る。複合体形成も起こり得る。プレクリーニングクロマトグラフィー工程は、媒体に密に吸着される不所望の夾雑物用のフィルタとして機能するため、効果的な再生およびクリーニング手順を開発することが必須である。強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）等の−Ｎ（ＣＨ３）３＋リガンドを有する）から不純物のほとんどを除去するために、その使用後、以下の再生手順（定位置（ｉｎ  ｐｌａｃｅ）クリーニング）が、以下の順序で用いられてよい：（ａ）溶液Ａ：４０ｍＭリン酸Ｎａ、２Ｍウレア、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７〜８。（ｂ）溶液Ｂ：２Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭクエン酸。（ｃ）溶液Ｃ：水。（ｄ）溶液Ｄ：１Ｍ  ＮａＯＨ。（ｅ）溶液Ｅ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ。溶液Ａ〜溶液Ｅは、カラ
ムを連続的に通過する。溶液Ｅは貯蔵用に用いられてよい。逆流で再生を実行することが推奨される。
【００５５】
好ましくは、プレクリーニング工程および捕捉工程のカラムは、直列に連結されてよい。これは、プレクリーニング工程のフロースルーが、採取管内に一時的に保存されずに、捕捉クロマトグラフィーカラムに直ちに通されることを意味する。好ましい方法において、２つのカラムは、ランの後に連結を断たれて、別々に再生される（定位置クリーニング）。最も好ましい再生工程は、逆流で実行される。
【００５６】
捕捉工程
用語「捕捉工程」は、結合モードで行われる第１のクロマトグラフィー工程と理解される。培養液からの免疫グロブリンの精製のための捕捉工程は、通常、親和性クロマトグラフィー工程として実行される。プロテインＡまたはその誘導体が、ほとんどの場合、親和性捕捉として用いられる。しかしながら、他のクロマトグラフィー原理が、捕捉工程として用いられてもよい。本発明に従えば、混合モードクロマトグラフィーが、免疫グロブリンを捕捉するのに問題なく用いられ得る。
【００５７】
好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００５８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を曝して、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００６２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の
順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂のリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００６３】
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー
陰イオン交換プレクリーニングクロマトグラフィー工程の後の捕捉工程としてプロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程を用いることによって、本発明の方法は、対費用効果の高い免疫グロブリン精製法を提供すると同時に、免疫グロブリンの精製におけるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーの大きな結合特異性を利用する。
【００６４】
本明細書中で用いられる用語「免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー」は、微生物起源（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ））の組換えタンパク質もしくはそれに由来する変異体、または免疫グロブリンに結合する能力を有する、微生物起源であってよい合成ペプチドをリガンドとして利用する親和性クロマトグラフィーを指す。例示的な免疫グロブリン結合タンパク質として、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、またはプロテインＡ／Ｇがあり得る。好ましくは、免疫グロブリン結合タンパク質またはペプチドは、プロテインＡである。リガンドは、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインの１つまたは複数を含んでよい。より好ましくは、リガンドは、プロテインＡまたは操作したプロテインＺのドメインＢを含む。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）により組換えにより生産された２．３２×１０−２３ｋｇ（１４ｋＤ）のペプチドをリガンドとして利用する例示的な樹脂が、Ｉｇセレクト（ＩｇＳｅｌｅｃｔ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））である。更なる情報が入手可能でないこのリガンドは、全てのタイプのヒトＦｃに対して親和性が高いように特異的に設計されている。
【００６５】
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー材料に、厳しいクリーニング条件に対するより強い耐性を持たせるために、かつラン間の交差汚染の影響からの保護を提供するために、耐アルカリ性、高い結合能力、および低いリガンド漏出を確実にするように特異的に操作されたリガンドを有する向上したプロテインＡ親和性樹脂を用いることが今日一般的である。しかしながら、これらの向上した樹脂の１つの主要な欠点は、従来のプロテインＡ樹脂よりもかなりコストがかさむということである。従来のプロテインＡ樹脂、およびより最近の新世代プロテインＡ樹脂産物の両方が用いられ得ることが、本発明の方法の重要な利点である。プロテインＡ樹脂が曝される不純物負担はより低いため、従来のより安価なプロテインＡ樹脂が、かなり穏やかな再生条件に制限されるにもかかわらず、許容可能となる。しかしながら、本発明のプレクリーニング工程の結果として、かつ、選択されるプロテインＡ樹脂と独立して、従来のおよび新世代の樹脂の両方が、より長い寿命で用いられ得る。さらに、プロテインＡカラムのクリーニングがより容易になるという事実により
、プロセスもより節約される。
【００６６】
本発明の目的に用いられ得る共通のプロテインＡ樹脂の例として、限定されないが、ウノスフェア・スープラ（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）ＳＵＰｒＡ）（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））、プロテインＡセラミック・ハイパーＤ  Ｆ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（商標）  Ｆ）（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、ポロス・マブキャプチャＡ（Ｐｏｒｏｓ（商標）ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ）（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、プロセップＨＣ（ＰｒｏＳｅｐ（商標）ＨＣ）、プロセップ・ウルトラ（ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ）およびプロセップ・ウルトラ・プラス（ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ）（ＥＭＤミリポア（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））、プロテインＡセファロースＦＦ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ）、アールプロテインＡセファロースＦＦ（ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、ｒｍｐプロテインＡセファロースＦＦ（ｒｍｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、マブセレクト（ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標））、マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）、マブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）およびマブセレクト・エキストラ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、ならびにトヨパール・アールプロテインＡ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ）（トーソー・バイオサイエンス（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））が挙げられる。
【００６７】
本明細書中で用いられる場合、用語「プロテインＡ」は、ＣＨ２／ＣＨ３領域を有するタンパク質を結合する能力を保持する、天然のプロテインＡ源から回収されるプロテインＡ、合成的に、または生合成的に（例えば、ペプチド合成によって、または組換え技術によって）生産されるプロテインＡ、およびそれらの変異体を包含する。好ましくは、高い結合能力および／またはアルカリ安定性を有する樹脂が用いられてよい。例えば、プロテインＡ、プロテインＡ誘導体、アルカリ安定化プロテインＡ由来親和性媒体（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が用いられてよい。好ましくは、アルカリ安定化プロテインＡ由来（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））リガンドが用いられ得る。アルカリ安定化プロテインＡ由来リガンドは、高度に架橋されたアガロースマトリックスにカップリングされてよく、好ましくは、化学的に安定したチオエーテル結合により固定されてよい。１つの例が、ラン後、最大０．５Ｍ  ＮａＯＨで迅速かつ効率的にクリーニングされ得る、ＧＥヘルスケア・ライフ・サイエンス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のマブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）である。マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）のアルカリ安定化リガンドは、プロテインＡのＢドメインに由来し、より高い溶出ｐＨを与えるＶＨ３結合ドメインを本質的に欠いている。好ましい産物はマブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）であり、これはマブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）よりも高い結合能力を有する。
【００６８】
プロテインＡ樹脂マブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）の特徴は、以下の通りである：
マトリックス                    硬質、高度に架橋されたアガロース
リガンド                        アルカリ安定化プロテインＡ由来（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））
リガンドカップリング            単一点付着
リガンドカップリング            エポキシ
平均粒子サイズ（ｄ５０ｖ）＊        ８５μｍ
動的結合能力                    ６分の滞留時間にておよそ６０ｍｇヒトｌｇＧ／ｍｌ媒体
最大移動相速度                  ５００ｃｍ／時
ｐＨ作動（ｗｏｒｋｉｎｇ）範囲  ３〜１２
化学的安定性                    プロテインＡクロマトグラフィーにおいて通常用いられる全ての水溶性バッファ中で安定
定位置クリーニング安定性        ０．１〜０．５Ｍ  ＮａＯＨ
送達条件                        ２０％エタノール
プロテインＡ親和性クロマトグラフィーとプロテインＡカラムからの免疫グロブリンの溶出との間の、特別な洗浄バッファを利用する１つまたはいくつかの洗浄工程が含まれてよい。洗浄バッファは、プロテインＡ樹脂から不純物を除去するのに用いられるバッファであり、プロテインＡに結合した注目する免疫グロブリンを著しい量除去することはない。洗浄バッファは、塩および洗剤（例えばポリソルベート）；塩および溶媒（例えばヘキシレングリコール）；高濃度塩（例えば高モル濃度トリスバッファ）；または塩およびポリマー（例えばポリエチレングリコール）を含んでよい。さらに、洗浄バッファは、カオトロピック試薬（例えばウレアまたはアルギニン）および／またはプロテアーゼ阻害剤（例えばＥＤＴＡ）を含んでよい。
【００６９】
プロテインＡカラムからの注目する免疫グロブリンの溶出のために、溶出バッファが適用される。好ましくは、溶出バッファは、ｐＨが低いことによりタンパク質の配座を変えることによって、プロテインＡと注目する免疫グロブリンとの相互作用を崩壊させる。好ましくは、低ｐＨ溶出バッファは、ｐＨが約２〜約５の範囲、最も好ましくは約３〜約４の範囲である。この範囲内にｐＨを制御することになるバッファの例として、リン酸バッファ、酢酸バッファ、クエン酸バッファ、グリシンバッファ、およびアンモニウムバッファ、ならびにこれらの組合せが挙げられる。そのような好ましいバッファは、クエン酸バッファおよび酢酸バッファ、最も好ましくはクエン酸ナトリウムバッファまたは酢酸ナトリウムバッファである。高ｐＨバッファ（例えば、ｐＨが９以上のもの）、または注目する免疫グロブリンを溶出するためのＭｇＣＩ２（２ｍＭ）等の化合物または組成物を含むバッファが挙げられる他の溶出バッファが意図される。
【００７０】
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂は、０．１〜０．５  ＮａＯＨにより、好ましくはカラム内で（定位置クリーニング）、再生され得る。
特定の実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂のリガンドがアルカリ安定化プロテインＡ誘導体（例えばマブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ））であるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００７１】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、強陰イオン交換クロマトグラフィーのリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂のリガンドがアルカリ安定化プロテインＡ誘導体（例えばマブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ））であるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００７２】
捕捉工程としての混合モードクロマトグラフィー
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００７３】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００７４】
混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ：Ｍｉｘｅｄ  Ｍｏｄｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ）は、リガンドとサンプルの分子との間の複数の形態の相互作用を利用する。混合モード樹脂と呼ばれる樹脂は、帯電した疎水性イオン交換リガンド、または結晶質ミネラル、例えばヒドロキシアパタイトからなる官能基を有するクロマトグラフィー材料である。「混合モードクロマトグラフィー」の代わりに、用語「マルチモードクロマトグラフィー」または「疎水性帯電誘導クロマトグラフィー」がときに用いられている。混合モードクロマトグラフィーは、通常、少なくとも２つの原理の相互作用、疎水性相互作用およびイオン交換、または金属親和性相互作用およびイオン交換である。混合モードクロマトグラフィーは、イオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィー等の単一モードのクロマトグラフィー法によってそれぞれ再現され得ない、あまり予想できない選択性を提供する。正に帯電する疎水性リガンドは、陰イオン交換体混合モード（例えばカプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ））のグループに属し、負に帯電するリガンドは、陽イオン交換体混合モード（例えばカプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ））に属する。一部の混合モード樹脂は、双極性イオン特性（例えばベーカーボンドＡＢｘ（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ（商標）））を有する。他の混合モード樹脂は、イオン化可能であり、かつｐＨを低くすることによって非帯電から正に帯電するように変換される疎水性リガンドを有する（例えばＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）））。最後に、ヒドロキシアパタイト樹脂は、正に帯電するカルシウムイオンおよび負に帯電するリン酸基を有することによって、混合モード機能がより複雑となる。
【００７５】
好ましくは、イオン性および疎水性の機能性を示す混合モード樹脂が利用され、例えば、ベーカーボンドＡＢｘ（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ）（Ｊ．Ｔ．ベーカーＢａｋｅｒ）、カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）、カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、ＰＰＡハイパーセル（ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標））、またはＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ）（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））がある。より好ましくは、混合モードクロマトグラフィー樹脂ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）が利用される。
【００７６】
混合モードクロマトグラフィー樹脂ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）の特徴は、以下の通りである。
粒子サイズ（平均）                            ８０〜１００μｍ
ヒトＩｇＧに対する動的結合能力（１０％破過）  ≧２０ｍｇ／ｍｌ
リガンド                                      ４−メルカプト−エチル−ピリジン
リガンド密度                                  ８０〜１２５μｍｏ１／ｍＬ
作動ｐＨ（長期）                              ２〜１２
クリーニングｐＨ（６時間未満）                ２〜１４
耐圧性                                        ＜３００ｋＰａｇ（３ｂａｒｇ（４４ｐｓｉｇ））
典型的な作動圧                                  ＜１００ｋＰａｇ（１ｂａｒｇ（１４ｐｓｉｇ））
リガンドとして４−メルカプト−エチル−ピリジンを含む混合モードクロマトグラフィー樹脂（ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ））は、ｐＨが約６．５〜９．９であるバッファ、例えばＰＢＳ、ｐＨ７．４または５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８で平衡化されてよい。
【００７７】
リガンドとして４−メルカプト−エチル−ピリジンを含む混合モードクロマトグラフィー樹脂（ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ））からの注目する免疫グロブリンの溶出のために、溶出バッファが適用される。好ましくは、溶出バッファは、注目する免疫グロブリンとＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムとの相互作用を崩壊させるｐＨを有する。好ましくは、溶出バッファは、ｐＨが、約ｐＨ３〜約ｐＨ７、好ましくは約ｐＨ３
．５〜約ｐＨ６、より好ましくは約ｐＨ４〜約ｐＨ５．５の範囲にある。アルギニン（０．１〜１．０Ｍ、０．２〜０．８Ｍ、０．４〜０．６Ｍ）が溶出バッファ（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ溶出バッファ等）に加えられて、免疫グロブリンの凝集を減らし、かつ酸性ｐＨにおいて溶解度のロスを防止し得る。
【００７８】
混合モードクロマトグラフィーの利点は、樹脂に結合した免疫グロブリンが、例えば、従来の疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる場合に必要な、大量の塩（硫酸アンモニウム等）の添加を必要としないということである。
【００７９】
混合モードクロマトグラフィー（リガンドとして４−メルカプト−エチル−ピリジンを備える樹脂を利用する混合モードクロマトグラフィー等）の穏やかな溶出条件は、凝集を減らし得、かつ免疫グロブリンの生物活性を保存し得る。
【００８０】
混合モードクロマトグラフィー樹脂は、１０〜２００ｍＭクエン酸、１０ｍＭ  ＨＣ１、０．５〜１．０Ｍ  ＮａＯＨ、６Ｍ塩酸グアニジン、２〜８Ｍウレア、または４０％プロパノールによって再生され得る。好ましくは、プレクリーニング工程を適用することによって、混合モードクロマトグラフィー樹脂は、１００ｍＭクエン酸に続く０．５〜１．０Ｍ  ＮａＯＨによって簡単に再生され得る。
【００８１】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、リガンドが４−メルカプト−エチル−ピリジンである混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００８２】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、リガンドが４−メルカプト−エチル−ピリジンである混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００８３】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、リガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、リガンドが４−メルカプト−エチル−ピリジンである混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００８４】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｂ２）工程（ｂ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ２）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ２）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００８５】
好ましくは、工程（ｂ）工程の混合モードクロマトグラフィーについて、負に帯電するリガンドを含む混合モードクロマトグラフィー樹脂が用いられてよい。より好ましくは、負に帯電するリガンドを含む樹脂は、以下の式を有するマルチモード弱陽イオン交換体（カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ））である。
【００８６】
【化１】
0006293907.tif 000002
【００８７】
マルチモード弱陽イオン交換体カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）の特徴は、以下の通りである。
イオン収容能力                          ０．０７〜０．０９ｍｍｏｌ  Ｈ＋／ｍｌ媒体
化学的安定性                            通常用いられる全ての水溶性バッファ、１Ｍ酢酸、１Ｍ水酸化ナトリウム、８Ｍウレア、６Ｍ塩酸グアニジン、および７０％エタノール１）
貯蔵条件                                ４〜３０℃、２０％エタノール
ｐＨ安定性作動範囲                      ２〜１２
マトリックス                            高度に架橋されたアガロース
ｐＨ安定性定位置クリーニング（ＣＩＰ：Ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−Ｐｌａｃｅ）  ２〜１４
イオン交換体タイプ                      マルチモード弱陽イオン交換体
結合能力／ｍｌクロマトグラフィー媒体    ３０ｍＳ／ｃｍ２にて＞４５ｍｇＢＳＡ／ｍｌ媒体）
マルチモード弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からの注目する免疫グロブリンの溶出のために、バッファのｐＨおよび／または塩濃度が上げられてよい。好ましくは、ｐＨおよび塩濃度の両方が上げられてよい。溶出バッファの塩濃度は、０．２５Ｍ〜１．７５Ｍ、好ましくは０．５Ｍ〜１Ｍに及んでよい。溶出に用いられる例示的な塩／バッファは、リン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、および／またはＮＨ４Ｃ１であってよい。イオン強度は、０．０２〜０．３Ｍに及んでよい。バッファのｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ７〜８に及んでよく、より好ましくは、ｐＨが５．５〜７．５である付加的な洗浄工程が溶出前に適用される。
【００８８】
代替の実施形態において、更なるポリッシング工程が利用されてよい。更なるポリッシング工程は、ポリッシング工程に適したあらゆるクロマトグラフィー法であってよく、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または混合モードクロマトグラフィーがある。
【００８９】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドが負に帯電している混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー
樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｂ２）工程（ｂ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ２）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ２）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【００９０】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｂ２）工程（ｂ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ２）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ２）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含み、工程（ｂ）の混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドは、以下の式を有する。
【００９１】
【化２】
0006293907.tif 000003
【００９２】
ポリッシング工程としての陽イオン交換クロマトグラフィー
陽イオン交換クロマトグラフィーは、サンプル中のタンパク質と樹脂上に固定された電荷との間の電荷−電荷相互作用に依存する。陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて、結合することになる分子は正に帯電しており、固定された官能基（リガンド）は負に帯電
している。通常用いられる陽イオン交換樹脂は、Ｓ−樹脂（スルホネート）、ＳＰ樹脂（スルホプロピル）、ＳＥ樹脂（スルホエチル）、およびＣＭ樹脂（カルボキシメチル）である。
【００９３】
しかしながら、一般に、陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、市販される通常の全ての陽イオン交換樹脂または膜で実行されてよい。陽イオン交換樹脂は、プレ充填カラム、または、官能基、例えばスルホン酸が固定されている膜の形態で用いられてよい。あるいはまた、樹脂は、バルク材料、およびユーザによって充填されるカラムとして購入されてよい。収容能力およびカラムの寸法に関して、特異的な限定は、通常のもの以外にない。当業者は、用いられるべき陽イオン交換樹脂の量およびカラムのサイズを知っている。これは、プロセスの全体的な規模によって決まる。
【００９４】
典型的な市販の製品として、例えば、マクロ−プレップ・ハイＳ（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｓ）、マクロ−プレップＣＭ（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＭ）、ウノスフェア・ラピッドＳ（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｒａｐｉｄ  Ｓ）、ウノスフェア・ラピッドＳ４０（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓ４０）、ヌヴィアＳ（Ｎｕｖｉａ  Ｓ）、およびヌヴィアＨＲ−Ｓ（Ｎｕｖｉａ（商標）ＨＲ−Ｓ）（米国カリフォルニア州バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））、トヨパールＣＭ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＣＭ）、トヨパールＳＰ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ）、およびトヨパール・ギガキャップＳ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ）（独国トーソー・バイオサイエンス（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ミリポア・プロレスＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰｒｏＲｅｓ  Ｓ）、フラクトゲルＥＭＤ  ＣＯＯ−（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ−）、フラクトゲルＥＭＤＳＯ３−（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−）（独国メルク（Ｍｅｒｃｋ）ＫＧａＡ）、バイオセプラＣＭセラミック・ハイパーＤ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ（商標）ＣＭ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ）、バイオセプラＳセラミック・ハイパーＤ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ（商標）Ｓ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ）、Ｓハイパーセル（Ｓ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標））（米国ニューヨーク州ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、ポロスＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ）、ポロスＸＳ（Ｐｏｒｏｓ（商標）ＸＳ）（独国アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、ＹＭＣバイオプロ３０Ｓ（ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ３０Ｓ）、ＹＭＣバイオプロ７０Ｓ（ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ７０Ｓ）（欧州ＹＭＣ）、ＣＭ−セファロースＦＦ（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ）、ＳＰ−セファロースＦＦ（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、Ｓ−セファロースＦＦ（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、ＳＰ−セファロースＨＰ（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ）、ＳＰ−セファロースＸＬ（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ）、ＳＰ−セファロース・ビッグ・ビーズ（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ）、ＣＭ−セファデックス（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））、カプトＳ（Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ）、カプトＳＰインプレス（Ｃａｐｔｏ  ＳＰ  ＩｍｐＲｅｓ）、およびソースＳ（Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ）（全て独国ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が挙げられる。通常、４〜７のｐＨ値にてバッファを用いる陽イオン交換クロマトグラフィーが実行される。
【００９５】
本発明の好ましい陽イオン交換樹脂は、スルホネートまたはスルホプロピルリガンドを用いる強陽イオン交換体である。最も好ましいのは、高度に架橋されたアガロース等の硬質マトリックスにリンクされたスルホネートまたはスルホプロピルリガンドであり、例えばヌヴィアＨＲ−Ｓ（Ｎｕｖｉａ  ＨＲ−Ｓ）またはポリ（スチレンビニルベンゼン）、例えばポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）がある。
【００９６】
陽イオン交換体ポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）の特徴は、以下の通りである。
サポートマトリックス              架橋ポリ（スチレンジビニルベンゼン）
表面機能性                        スルホプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３）
１０００ｃｍ／時における動的結合能力  リゾチーム、ｐＨ６．２  ５５ｍｇ／ｍｌ
収縮／膨化                        ０〜１００％溶媒で＜１％
粒子サイズ                        ５０μｍ
１０ｃｍベッド長での推奨最大流速  １，０００ｃｍ／時
機械的抵抗性                      １０ＭＰａ（１５００ｐｓｉ、１００ｂａｒ）
媒体背圧                          １，０００ｃｍ／時（１０ｃｍベッド高）にて＜３００ｋＰａ（３ｂａｒ）
ポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）の代わりの好ましい材料が、スルホネート基および高度に架橋されたアガロースマトリックスに基づく強陽イオン交換体ヌヴィアＨＲ−Ｓ（Ｎｕｖｉａ  ＨＲ−Ｓ）である。
【００９７】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、ｐＨが約ｐＨ４〜約ｐＨ８であるバッファで平衡化されてよい。バッファ濃度は、１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、好ましくは２０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であってよい。
【００９８】
陽イオン交換クロマトグラフィーに用いられるバッファの例として、クエン酸、乳酸、ギ酸、ブタン二酸、酢酸、マロン酸、グリシン、ＭＥＳ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、またはそれらの混合物がある。
【００９９】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、免疫グロブリンの電荷変異体を分離し得、かつ、残留する宿主細胞タンパク質、凝集体、および浸出プロテインＡを除去し得る。
免疫グロブリンは、免疫グロブリンの等電点（ｐＩ）未満のｐＨ値、かつ低い導電率にて、樹脂に結合し得る。
【０１００】
溶出のために、単一の工程または勾配によって提供される溶出バッファのイオン強度の上昇が用いられてよい。陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出に用いられる例示的な塩として、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、または酢酸塩がある。好ましくは、ＮａＣｌまたはＫＣｌが用いられる。イオン強度は、最大１Ｍまで上昇してよい。
【０１０１】
あるいはまた、単一の工程または勾配によって提供される溶出バッファのｐＨの上昇が用いられてよい。
陽イオン交換クロマトグラフィーの性能に好ましい実施形態は、４〜６のｐＨ作動範囲であり、より好ましくは４．５〜５．５のｐＨ範囲である。バッファ物質として炭酸が用いられてよい。クエン酸が最も好ましい。
【０１０２】
さらに好ましい実施形態において、陽イオン交換樹脂に結合した免疫グロブリンの溶出は、ｐＨ値の変化、すなわちｐＨの上昇によって実行される。これは、２つの異なるバッファ溶液の混合によって提供される低ｐＨから高ｐＨへの勾配によって達成され得る。好ましいのは、低ｐＨ用のクエン酸バッファおよび高ｐＨ用のリン酸バッファである。最も好ましい実施形態において、ｐＨ勾配は、約ｐＨ５〜６のクエン酸バッファを約ｐＨ７〜９のリン酸バッファと混合することによって形成される。バッファは、１０〜５０ｍＭの濃度の酸のＮａ塩を用いることによって調製されてよい。
【０１０３】
あるいはまた、単一の工程または勾配によって提供される溶出バッファのｐＨおよびイオン強度の両方の上昇が、溶出に用いられてよい。
陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、３〜５カラム容量の１Ｍ  ＮａＣｌにより再生され得る。さらに、以下の工程を含む定位置クリーニング手順が適用されてよい：（ａ）１〜５カラム容量の１Ｍ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌによる洗浄、（ｂ）１〜５カラム
容量の１Ｍ酢酸またはＴＦＡによる洗浄、（ｃ）再平衡化。
【０１０４】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂のリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１０５】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂のリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１０６】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂のリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に
実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂のリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１０７】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂のリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である強陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂のリガンドがアルカリ安定化プロテインＡ誘導体（例えばマブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ））であるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂のリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明のプレクリーニング工程の後に、結合モードで実行される混合モードクロマトグラフィーが続き、結合モードで実行されるタンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーが続く。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明のプレクリーニング工程の後に、結合モードで実行される混合モードクロマトグラフィーが続き、結合モードで実行されるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーが続く。
【０１１０】
プロテインＡ親和性クロマトグラフィーについての詳細が、先に提供されており、およびまた混合モードクロマトグラフィーに続くプロテインＡクロマトグラフィーに当てはまる。
【０１１１】
免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーについての詳細が、先に提供されており、およびまた混合モードクロマトグラフィーに続くプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに当てはまる。
【０１１２】
付加的なポリッシング工程としての混合モードクロマトグラフィー
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフ
ィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１１３】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１１４】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー
樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１１５】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１１６】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１１７】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を
含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程
を含む。
【０１１８】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１１９】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによっ
て溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程
を含む。
【０１２０】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、陰イオン交換クロマトグラフィーのリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂のリガンドがアルカリ安定化プロテインＡ誘導体であるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１２１】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、陰イオン交換クロマトグラフィーのリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラ
フィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１２２】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂のリガンドがアルカリ安定化プロテインＡ誘導体であるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１２３】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガ
ンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１２４】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、陰イオン交換クロマトグラフィーのリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂のリガンドがアルカリ安定化プロテインＡ誘導体であるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程
を含む。
【０１２５】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、陰イオン交換クロマトグラフィーのリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程
を含む。
【０１２６】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂のリガンドがアルカリ安定化プロテインＡ誘導体であるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、混合モードクロマトグラフィー媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程
を含む。
【０１２７】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがマルチモード強陰イオン交換体である混合モードクロマトグラフィーに曝して、混合モードクロマトグラフィー媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程
を含む。
【０１２８】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマト
グラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｂ２）工程（ｂ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ２）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ２）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１２９】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｂ２）工程（ｂ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ２）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ２）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程
を含む。
【０１３０】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、リガンドが４−メルカプト−エチル−ピリジンである混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モード
クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１３１】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、リガンドが４−メルカプト−エチル−ピリジンである混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程
を含む。
【０１３２】
混合モード媒体または樹脂と呼ばれる媒体は、帯電した疎水性イオン交換リガンド、または結晶質ミネラル、例えばヒドロキシアパタイトからなる官能基を有するクロマトグラフィー媒体である。「混合モードクロマトグラフィー」の代わりに、用語「マルチモードクロマトグラフィー」または「疎水性帯電誘導クロマトグラフィー」がときに用いられている。混合モードクロマトグラフィーは、少なくとも２つの原理の相互作用、疎水性相互作用およびイオン交換、または金属親和性相互作用およびイオン交換である。混合モードクロマトグラフィーは、イオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィー等の単一モードのクロマトグラフィー法によってそれぞれ再現され得ない、あまり予想できない選択性を提供する。正に帯電する疎水性リガンドは、陰イオン交換体混合モード（例えばカプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ））のグループに属し、負に帯電するリガンドは、陽イオン交換体混合モード（例えばカプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ））に属する。一部の混合モード媒体は、双極性イオン特性（例えばベーカーボンドＡＢｘ（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ））を有する。他の混合モード媒体は、イオン化可能であり、かつｐＨを低くすることによって非帯電から正に帯電するように変換される疎水性リガンドを有する（例えばＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ））。最後に、ヒドロキシアパタイト媒体は、正に帯電するカルシウムイオンおよび負に帯電するリン酸基を有することによって、混合モード機能がより複雑となる。
【０１３３】
好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーに続く混合モードクロマトグラフィー工程は、正に帯電するリガンドを含む媒体で実行される。より好ましくは、正に帯電するリガンドは、以下の式を有するＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンである。
【０１３４】
【化３】
0006293907.tif 000004
【０１３５】
（例えば、独国ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ））。
混合モードクロマトグラフィー樹脂カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）の特徴は、以下の通りである。
【０１３６】
マトリックス      高度に架橋されたアガロース
官能基            マルチモード強陰イオン交換体
総イオン収容能力  ０．０９〜０．１２ｍｍｏｌ  Ｃｌ−／ｍｌ媒体
粒子サイズ        ７５μｍ（ｄ５０ｖ）
流速              粘性が＜０．３ＭＰａ（３ｂａｒ）にて水と同じプロセスバッファを用いて、２０ｃｍベッド高の１ｍ直径カラム内で２０℃にて少なくとも６００ｃｍ／時。
【０１３７】
ｐＨ安定性
−短期間          ２〜１４
−長期間          ３〜１２
作動温度          ４〜３０℃
化学的安定性      通常用いられる全ての水溶性バッファ、１Ｍ酢酸、１Ｍ水酸化ナトリウム
回避              酸化剤、陰イオン性洗剤
混合モードクロマトグラフィー樹脂カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）を結合端部溶出モードでロードする場合に、以下の条件が適用されてよい：ｐＨ６〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ７．０〜８．５；導電率０．５〜１０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは１〜４ｍＳ／ｃｍ。１つまたは複数の洗浄工程が用いられてよい。条件は、免疫グロブリンのｐＩによって決まる。
【０１３８】
カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）クロマトグラフィーに好ましいローディング条件は、以下の通りであってよい：樹脂は、０．５Ｍリン酸Ｎａ、ｐＨ８．２に続いて２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ８．２で平衡化される。サンプル（陽イオン交換プール）は、ｐＨ８．０〜８．５、導電率１〜４ｍＳ／ｃｍに調整されて、カラム上にロードされる。平衡バッファ２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ８．２での洗浄後、注目する免疫グロブリンは、カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）樹脂から、例えば２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ５〜７、優先的にはｐＨ５．５〜６．５で溶出され得る。
【０１３９】
フロースルーモードにおいて、ｐＨおよびイオン強度は、免疫グロブリンが混合モードのリガンドに結合しない一方で、一掃されるべき残留夾雑物（ＤＮＡ、凝集体、浸出プロテインＡ、宿主細胞タンパク質）が結合したままであるように調整されなければならない。条件は、免疫グロブリンのｐＩによって決まる。好ましくは、リン酸バッファまたはトリスバッファが６．５〜８．５のｐＨ範囲、より好ましくはｐＨ７〜８で用いられる。導電率は、ＮａＣｌ等の塩で、またはバッファ濃度によって調整される。最も好ましいのは、５０〜２００ｍＭの濃度範囲でＮａＣｌが補われた１０〜５０ｍＭの濃度範囲のリン酸Ｎａバッファである。塩濃度が高いと、イオン性相互作用を脱離させるが、疎水性相互作用を促進すると考えられなければならない。好ましい方法において、陽イオン交換クロマトグラフィーからの溶出液は、ｐＨ７．５〜８に調整され、導電率は、ＮａＣｌで１０〜１２ｍＳ／ｃｍになるように高められた。
【０１４０】
混合モード樹脂の再生（定位置クリーニング）は、低ｐＨ、高塩、および高ｐＨで実行され得、例えば１０〜２００ｍＭクエン酸、０．５〜２Ｍ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ〜１Ｍ  ＮａＯＨである。
【０１４１】
好ましい再生手順は、溶液Ａ〜Ｄで連続的に洗浄することによって実行される：溶液Ａ：１００ｍＭクエン酸、２Ｍ  ＮａＣｌ；溶液Ｂ：２Ｍ  ＮａＣｌ；溶液Ｃ：１Ｍ  ＮａＯＨ；溶液Ｄ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ。樹脂の貯蔵は、溶液Ｄ中で実行されてよい。
【０１４２】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、陰イオン交換クロマトグラフィーのリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂のリガンドがアルカリ安定化プロテインＡ誘導体であるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンである混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１４３】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを、陰イオン交換クロマトグラフィーのリガンドが−Ｎ（ＣＨ３）３＋である陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹
脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンである混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１４４】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂のリガンドがアルカリ安定化プロテインＡ誘導体であるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンである混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１４５】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換媒体に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを免疫グロブリン結合タンパク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および免疫グロブリン結合タン
パク質／ペプチド親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーのリガンドがスルホプロピルである陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を、混合モードクロマトグラフィー樹脂のリガンドがＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンである混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１４６】
ポリッシング工程として、他のクロマトグラフィータイプが利用されてもよい。例えば、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび陰イオン交換膜クロマトグラフィーが、最も好ましくはフロースルーモードで、ポリッシング工程として利用されてよい。
【０１４７】
タンパク質の等電点すなわちｐＩは、タンパク質の全体的な純電荷がゼロに等しいｐＨ、すなわちタンパク質の陽電荷および負電荷の数が等しいｐＨを指す。ｐＩの決定は、等電点電気泳動等の、先行技術において確立された技術に従って達成され得る。
【０１４８】
更なる実施形態において、精製は、第１のクロマトグラフィー工程の前に１つまたは複数の遠心分離工程を含んでよい。
別の実施形態において、精製は、第１のクロマトグラフィー工程の前に１つまたは複数の濾過工程を含んでよい。さらに好ましい実施形態において、精製は、１つの遠心分離工程および１つまたは複数の濾過工程を含んでよい。好ましい実施形態において、第１のクロマトグラフィー工程は、デプス濾過および精密濾過工程の後にある。より好ましい実施形態において、第１のクロマトグラフィー工程は、細胞分離工程、デプス濾過工程、および精密濾過工程の後にある。
【０１４９】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ｉ）サンプルを遠心分離して、上澄み中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた上澄みをデプス濾過して、濾液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた免疫グロブリンを精密濾過して、濾液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ａ）工程（ｉｉｉ）の濾液を陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に
実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１５０】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ｉ）サンプルを遠心分離して、上澄み中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた上澄みをデプス濾過して、濾液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた免疫グロブリンを精密濾過して、濾液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ａ）工程（ｉｉｉ）の濾液を陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｂ２）工程（ｂ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ２）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ２）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含む。
【０１５１】
更なる実施形態において、本発明は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法を提供し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ｉ）サンプルを遠心分離して、上澄み中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた上澄みをデプス濾過して、濾液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた免疫グロブリンを精密濾過して、濾液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ａ）工程（ｉｉｉ）の濾液を陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｂ２）工程（ｂ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフ
ィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ２）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ２）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）において得られた溶出液を混合モードクロマトグラフィーに曝して、混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程
を含む。
【０１５２】
デプス濾過
さらに、本発明の方法は、１つまたは複数のデプス濾過工程を含んでよい。膜の表面上に粒子を保持することによって分離する膜フィルタと対照的に、デプスフィルタは、繊維またはビーズのマトリックスからなり、表面上というよりもむしろマトリックスの全体を通して分離が行われる。デプスフィルタの例として、限定されないが、ＳＸＬＰ７００４１６およびＳＸＬＰＤＥ２４０８ＳＰフィルタカプセル（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、ミリスタックプラス（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋）ＸＯＨＣ、ＦＯＨＣ、ＤＯＨＣ、ＡＩＨＣおよびＢＩＨＣポッド（Ｐｏｄ）フィルタ（ＥＭＤミリポア（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））、またはゼータ２０プラス（Ｚｅｔａ  ２０  Ｐｌｕｓ）３０ＺＡ／６０ＺＡ、６０ＺＮ９０ＺＡ、デリピド（ｄｅｌｉｐｉｄ）、ＶＲ０７およびＶＲ０５フィルタ（３Ｍ）が挙げられる。
【０１５３】
好ましくは、デプスフィルタは、プレ抽出済み無機フィルタ助剤、セルロース、および強陽電荷をフィルタマトリックスに与える樹脂系で構成され、例えば英国スリーエム（３Ｍ）のゼータ・プラス（Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ（商標））である。
【０１５４】
本発明に用いられる最も好ましいデプスフィルタは、ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＰＤＥ２およびＰ７００シリーズのフィルタカプセルである。
【０１５５】
限外濾過、ウィルス濾過、精密濾過
さらに、本発明の方法は、１つまたは複数の精密濾過、限外濾過、および／またはナノ濾過工程を含んでよい。限外濾過は、静水圧が液体を半透膜に押しつける膜濾過の形態である。高分子量の懸濁固体および溶質が保持される一方で、水および低分子量の溶質が膜を通過する。限外濾過は、巨大分子溶液、とりわけタンパク質溶液を分離、精製、かつ濃縮する、通常使用される方法である。限外濾過は、透析濾過と組み合わされてよい。このモードは、反復される、または連続的な希釈および再濃縮を介して溶液から塩および他の小種を除去するためのバッファ交換に適している。限外濾過は、とりわけ大サンプル容量をプロセシングするためのタンジェント流濾過系またはクロスタンジェント流濾過系（ＴＦＦまたはＴＦ−ＵＦ）における積層膜で実行されてよい。あるいはまた、中空の繊維系が限外濾過に通常用いられる。膜カットオフサイズは、約１．６６×１０−２４〜４．９８×１０−２２ｋｇ（１〜３００ｋＤ）に及ぶ。免疫グロブリンについて、限外濾過膜の典型的なカットオフは約１．６６×１０−２３〜１．６６×１０−２２ｋｇ（１０〜１００ｋＤ）である。本発明の枠組みにおいて、ＵＦ膜について、約４．９８×１０−２３または８．３０×１０−２３ｋｇ（３０または５０ｋＤ）の分子量カットオフが好ましい。精密濾過は、孔サイズが約０．１〜１０μｍである膜を用いる粒子濾過法である。環境に特別な要件を与える滅菌濾過について、孔サイズが約０．２μｍである滅菌済みミクロフ
ィルタが用いられる。孔サイズがより大きい（０．４５μｍ、３μｍ）付加的なプレフィルタの使用が一般的である。これは、小さな孔サイズのフィルタの迅速なブロッキングによって、流の減少を防止する。最後に、生物薬剤生産において、ナノ濾過が主にウィルス濾過に用いられ、哺乳類の細胞培養において生産される治療タンパク質の安全性に必要とされる。ナノ濾過工程は通常、大半が精製済み免疫グロブリンで満たされているダウンストリーミングの終わりに実行される。頻繁に用いられるナノフィルタの孔サイズは、１５〜３５ｎｍに及ぶ（プラノバ（Ｐｌａｎｏｖａ（商標））、日本旭化成株式会社（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ）；またはビレソルブ（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標））、独国ＥＭＤ−ミリポア（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））。
【０１５６】
本発明の好ましい実施形態において、精製のプロセスは、１つまたは複数の限外濾過／透析濾過および／またはナノ濾過工程を含む。これらの濾過工程は、市販の濾過装置を用いて実行されてよく、例えばポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＥＭＤ−ミリポア（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、またはザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）から入手可能である。
【０１５７】
別の実施形態において、本方法は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーの溶出液を、２．５〜４．５の低いｐＨ、好ましくはｐＨ３〜４にて、規定された時間、好ましくは３０〜９０分間にわたりインキュベートする更なる工程を含む。
【０１５８】
別の実施形態において、本方法は、混合モードクロマトグラフィーの溶出液を、２．５〜４．５の低いｐＨ、好ましくはｐＨ３〜４にて、規定された時間、好ましくは３０〜９０分間にわたりインキュベートする更なる工程を含む。
【０１５９】
更なる実施形態において、本方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程から得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ陽イオン交換クロマトグラフィー工程の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、ナノ濾過に曝す更なる工程を含む。好ましくは、孔サイズが１５〜３５ｎｍ、最も好ましくは２０ｎｍであるフィルタが、ナノ濾過に適用されてよい。
【０１６０】
フロースルーモードの陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、ウィルスに関して、少なくとも５、少なくとも５．５、少なくとも６、少なくとも６．５のｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
【０１６１】
溶出液（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程または混合モードクロマトグラフィー工程から得られた）の低いｐＨでのインキュベーション工程は、エンベロープウィルスに関して、少なくとも５、好ましくは少なくとも５．５のｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
【０１６２】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、エンベロープウィルスに関して少なくとも５のｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
ナノ濾過工程は、エンベロープウィルスに関して少なくとも４のｌｏｇ１０減少率を、かつ／または非エンベロープウィルスに関して少なくとも５のｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
【０１６３】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程、および溶出液（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程または混合モードクロマトグラフィー工程から得られた）の低いｐＨでのインキュベーション工程は、エンベロープウィルスに関して少なくとも１０のｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
【０１６４】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程、および溶出液（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程または混合モードクロマトグラフィー工程から得られた）の低いｐＨでのインキュベーション工程は、エンベロープウィルスに関して少なくとも１０の、好ましくは少なくとも１１の、より好ましくは少なくとも１２の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
【０１６５】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程、溶出液（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程または混合モードクロマトグラフィー工程から得られた）の低いｐＨでのインキュベーション工程、およびナノ濾過工程は、エンベロープウィルスに関して少なくとも１５、好ましくは少なくとも１６の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
【０１６６】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程、溶出液（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程または混合モードクロマトグラフィー工程から得られた）の低いｐＨでのインキュベーション工程、および陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、エンベロープウィルスに関して、少なくとも１５の、好ましくは少なくとも１６の、より好ましくは少なくとも１７の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
【０１６７】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程、溶出液（プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程または混合モードクロマトグラフィー工程から得られた）の低いｐＨでのインキュベーション工程、陽イオン交換クロマトグラフィー工程、およびナノ濾過工程は、エンベロープウィルスに関して、少なくとも２０の、好ましくは少なくとも２１の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
【０１６８】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程、陽イオン交換クロマトグラフィー工程、およびナノ濾過工程は、非エンベロープウィルスに関して、少なくとも１２の、好ましくは少なくとも１３の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし得る。
【０１６９】
特定の実施形態は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法に関し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液を２．５〜４．５の低いｐＨにおいて、規定された時間にわたりインキュベートする工程
を含み、この方法は、工程（ａ）および工程（ｃ）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも１０の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらす。
【０１７０】
更なる実施形態は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法に言及し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液を２．５〜４．５の低いｐＨにおいて、規定さ
れた時間にわたりインキュベートする工程；
（ｄ）工程（ｃ）のインキュベーション後の溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｃ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、ナノ濾過に曝す工程
を含み、この方法は、工程（ａ）および工程（ｄ）について、非エンベロープウィルスに関して少なくとも１０の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし、かつ／またはこの方法は、工程、（ａ）、工程（ｃ）および工程（ｄ）について、非エンベロープウィルスおよび／もしくはエンベロープウィルスに関して少なくとも１５の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらす。
【０１７１】
更なる実施形態は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法に言及し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液を２．５〜４．５の低いｐＨにおいて、規定された時間にわたりインキュベートする工程；
（ｃ２）工程（ｃ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｃ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程
を含み、この方法は、工程（ａ）、工程（ｃ）および工程（ｃ２）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも１５の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらす。
【０１７２】
更なる実施形態は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法に言及し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた溶出液を２．５〜４．５の低いｐＨにおいて、規定された時間にわたりインキュベートする工程；
（ｃ２）工程（ｃ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｃ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ２）のインキュベーション後の溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｃ２）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、ナノ濾過に曝す工程
を含み、この方法は、工程（ａ）、工程（ｃ）および工程（ｃ２）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも１５の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし、かつ／または工程（ａ）、工程（ｃ）、工程（ｃ２）および工程（ｄ）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも２０の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし、かつ／または工程（ａ）、
工程（ｃ２）および工程（ｄ）について、非エンベロープウィルスに関して少なくとも１２の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらす。
【０１７３】
更なる実施形態は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法に言及し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；および
工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、ナノ濾過に曝す工程
を含み、この方法は、工程ａ）および工程ｄ）について、エンベロープウィルスおよび／または非エンベロープウィルスに関して少なくとも１０の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらす。
【０１７４】
更なる実施形態は、免疫グロブリンおよび少なくとも１つの不純物を含むサンプルから免疫グロブリンを精製する方法に言及し、この方法は、以下の順序で以下の工程：
（ａ）サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに曝し、および陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合しない免疫グロブリンをフロースルー中に得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られたフロースルーをプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンをプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させ、およびプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程、または混合モードクロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させ、および混合モードクロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；
（ｃ２）工程（ｂ）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｂ）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、陽イオン交換クロマトグラフィーに曝して、免疫グロブリンを陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合させ、および陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂からタンパク質を溶出することによって溶出液中に免疫グロブリンを得る工程；および
工程（ｃ２）において得られた溶出液、またはそれに由来し、かつ工程（ｃ２）の後に実行される１つもしくは複数の更なるプロセシング工程の後に得られた組成物を、ナノ濾過に曝す工程
を含み、この方法は、工程ａ）、工程ｃ２）および工程ｄ）について、エンベロープウィルスに関して少なくとも１５の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらし、および／またはこの方法は、工程（ａ）、工程（ｃ２）および工程（ｄ）について、非エンベロープウィルスに関して少なくとも１３の累積ｌｏｇ１０減少率をもたらす。
【０１７５】
先に記載された方法はまた、免疫グロブリンの製造プロセスにおけるウィルス安全性を高めることにも役に立つ。
本明細書中で言及する用語「規定された時間」のインキュベーションは、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間のインキュベーション、好ましくは３０分〜９０分間、より好ましくは４５分〜７５分間、最も好ましく
は６０分間のインキュベーションを指す。
【０１７６】
工程「低いｐＨでのインキュベーション」のｐＨは、２．５〜４．５のｐＨだけでなく、３〜４、好ましくは３．２５〜３．７５のｐＨ、より好ましくは３．５のｐＨを指す。
用語「エンベロープウィルス」は、リポタンパク質エンベロープがウィルスの核タンパク質コアを取り囲んでいるあらゆるウィルスを、例えば、ヘルペスウィルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、サイトウィルス（Ｃｙｔｏｖｉｒｕｓ）、ポックスウィルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、アレナウィルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）、アルテリウィルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）、ヘパドナウィルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）、フラビウィルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、トガウィルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）、コロナウィルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、オルソミクソウィルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、パラミクソウィルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ラブドウィルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ブニアウィルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）、フィロウィルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）、バキュロウィルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、イリドウィルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、およびレトロウィルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）を指し、ヒト病原体、および実験に用いられたモデルウィルスのマウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ：Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。
【０１７７】
用語「非エンベロープウィルス」は、ウィルスエンベロープを欠いているあらゆるウィルスを、例えば、アデノウィルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、カリモウィルス（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）、マイオウィルス（Ｍｙｏｖｉｒｕｓ）、フィコドナウィルス（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ）、テクティウィルス（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｕｓ）、パポーバウィルス（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）、サーコウィルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）、パーボウィルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、ビルナウィルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、レオウィルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、アストロウィルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、カリチウィルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、ピコルナウィルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ポティウィルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）、トバマウィルス（Ｔｏｂａｍａｖｉｒｕｓ）、カーラウィルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）、アネロウィルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）、およびヘペウィルス（Ｈｅｐｅｖｉｒｕｓ）を指し、ヒト病原体、および実験に用いられたモデルウィルスのマウス微小ウィルス（ＭＶＭ：Ｍｉｎｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ）が挙げられる。
【０１７８】
出発材料中の、および関連する産物画分中のウィルス力価の算出比は、ｌｏｇ１０減少率（ＬＲＦ：ｌｏｇ１０  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、ｌｏｇ１０減少値（ＬＲＶ：ｌｏｇ１０  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）、またはときに、単にｌｏｇ１０クリアランスと呼ばれるウィルスの減少を規定する。ＬＲＦ計算モードは、ウィルスのクリアランス研究に関連するガイドラインにおいて概説されている（例えば、ＥＭＡガイドライン（ＥＭＡ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）ＣＰＭＰ／ＢＷＰ／２６８／９５（１９９６年）「ウィルスバリデーション研究に関するガイダンス：ウィルスの不活化および除去を確認する研究の設計、寄与、および解釈（Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｏｎ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ：ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ，ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ）」の別表ＩＩ）。
【０１７９】
【数１】
0006293907.tif 000005
【０１８０】
「洗浄工程」は、サンプルがクロマトグラフィーカラム上にロードされた後であるが、タンパク質がカラムから溶出される前に実行される工程である。洗浄工程は追加的に、マトリックスに、免疫グロブリンに、かつ／またはリガンドにそれほど緊密に結合していない、または非特異的に結合している夾雑物を除去するが、注目する免疫グロブリンを樹脂から大幅に溶出することはない。洗浄工程において、樹脂は、所望の洗浄バッファで洗浄される（例えば、洗浄バッファは、カラムの出口において測定されるＵＶ吸収がベースラインに戻るまで、クロマトグラフィーカラムを通される）。
【０１８１】
用語「溶出」は、バッファ構成要素がクロマトグラフィー樹脂上のリガンド部位を注目する分子と競合するように溶液条件を変更することによって、クロマトグラフィー樹脂から注目する免疫グロブリンを脱離させるプロセスと理解される。別の溶出モードは、親和性クロマトグラフィーにおいて、例えばプロテインＡを用いて起こる。この場合、溶出バッファは、リガンドまたは免疫グロブリンの配座を変えることによって、結合を緩めることができる。注目する免疫グロブリンは、移動相中のバッファイオンがイオン交換樹脂の帯電イオン部位を分子と競合するように、イオン交換材料を取り囲むバッファのイオン強度を変更することによって、イオン交換樹脂から溶出され得る。あるいはまた、ｐＨの変化が、両性タンパク質に影響を及ぼし、タンパク質のｐＩを上回るｐＨの上昇が、陽イオン交換樹脂への結合をこれ以降防止し、タンパク質が溶出する。ｐＨがタンパク質のｐＩ未満に低下すると、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂上で同じ効果が起こる。
【０１８２】
本明細書中で理解される用語「溶出」は、先行する洗浄工程の有無にかかわらず、無勾配溶出、単一工程の溶出、および勾配溶出を含む。注目する免疫グロブリンの溶出は、移動相中のイオン強度または導電率を上げることによって行われてよく、これは、バッファ溶液中の塩濃度の上昇に影響される。あるいはまた、ｐＨ値の上昇または低下が適していることがあり得る。不連続な工程勾配、線形勾配、非線形勾配、またはそれら勾配の適切な組合せが利用されてよい。
【０１８３】
洗浄および溶出に適したバッファが、リン酸塩、硫酸塩、または塩化物、例えばＮａＣｌもしくはＫＣｌ等の塩を加えた、酢酸、クエン酸、トリス／ＨＣｌ、トリス／酢酸、リン酸、コハク酸、マロン酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ビストリス、グリシン、および他の適切なバッファから選択されてよい。溶出が達成されるイオン強度および塩濃度は、バッファ溶液のｐＨ値およびタンパク質のｐＩに左右される。洗浄バッファはさらに、洗剤（例えばポリソルベート）、溶媒（例えばヘキシレングリコール、イスプロパノール、またはエタノール）、またはポリマー（例えばポリエチレングリコール）を含んでよい。さらに、洗浄バッファは、カオトロピック試薬（例えばウレアまたはアルギニン）および／またはプロテアーゼ阻害剤（例えばＥＤＴＡ）を含んでよい。
【０１８４】
本明細書中で用いられる用語「バッファ」は、共役酸−塩基構成要素の作用によるｐＨの変化に耐える溶液を指す。
用語「免疫グロブリン」および「抗体」は、本明細書中で互換的に用いられる。免疫グロブリンは、所望の抗原結合活性を示す、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、およびそれらのフラグメントであってよい。天然の抗体は、様々な構造を有する分子である。例えば、天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド
結合によって連結される２つの同じ軽鎖および２つの同じ重鎖で構成される約１５０，０００グラム／モル（１５０，０００ダルトン）のヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）を有し、３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および場合によってはＣＨ４）が続く可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２タイプの１つに割り当てられ得る。
【０１８５】
「抗体フラグメント」は、一般にはその抗原結合領域または可変領域である、完全長の抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；単鎖抗体分子；二機能性抗体；線形抗体；ならびに抗体フラグメントから形成される多特異的抗体が挙げられる。
【０１８６】
好ましくは、免疫グロブリンはモノクローナル抗体である。本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る天然の突然変異を除いて、同一である。様々な決定要素（エピトープ）に向けられる様々な抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体の調製と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要素に向けられる。修飾子「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特性を示しており、特定のあらゆる方法による抗体の生産を必要とすると解釈されない。
【０１８７】
免疫グロブリンは、マウスのクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ、ヒトのクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤもしくはＩｇＥ、またはそれらの組合せもしくはフラグメントであってよい。
【０１８８】
免疫グロブリンは、タンパク質の任意の１つまたは組合せを認識し得、限定されないが、以下の抗原が挙げられる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β、およびそれらの類似体、ＰＬＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−ｐｌ、ＥＧＦ受容体、ＰＬＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、血小板受容体ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、トロンボポエイチン受容体、アポトーシス受容体ＰＤ−１、肝細胞増殖因子、オステオプロテゲリンリガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子ＢＬｙＳ、Ｔ細胞活性化調節因子ＣＴＬＡ−４、Ｃ５相補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ−２、患者の血清中に高レベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳房、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺および／もしくは腎臓の癌細胞上に、かつ／または黒色腫、神経膠腫もしくは神経芽細胞腫細胞上に発現する癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、α４β１およびα４β７インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ：ＲＡＮＫ  ｌｉｇａｎｄ）、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３：ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ
ｍｏｌｅｃｕｌｅ−３）、ロイコインテグリン接着因子、血小板糖タンパク質ｇｐ  Ｉ
ｌｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、スクレロスチン、ＭＨＣ  Ｉ、癌胚抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ：ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、Ｆｃ−ｙ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ  １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、ならびにＩＦＮ−γ。
【０１８９】
免疫グロブリンは、例えば、アフェリモマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アルシツモマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、デノスマブ、トラスツズマブ、イムシロマブ、カプロマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ、オマリズマブ、ダクリズマブ、イブリツモマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、ロモソズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、ガリキシマブ、フォラビルマブ、レクサツムマブ、ベバシズマブ、およびベドリズマブであってよい。
【０１９０】
本発明の免疫グロブリンは、好ましくは、ＩｇＧ分子、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子である。より好ましくは、免疫グロブリンはＩｇＧ１である。さらにより好ましくは、免疫グロブリンは、少なくともＦｃ部がヒトであるＩｇＧ１である。免疫グロブリンは、ＩｇＧ１のＦｃ部がヒトであるマウス−ヒトキメラＩｇＧ１であってよい。最も好ましくは、キメラ免疫グロブリンは、リツキシマブまたはインフリキシマブである。リツキシマブは、例えば国際公開第９４１１０２６号に詳細に記載されるキメラ抗ｃｄ２０抗体である。インフリキシマブは、例えば国際公開第９２１６５５３号に詳細に記載されるキメラ抗ＴＮＦα抗体である。
【０１９１】
免疫グロブリンは、マウスが祖先のヒト化ＩｇＧ１であってよい。最も好ましくは、ヒト化抗体は、トラスツズマブまたはベバシズマブである。トラスツズマブは、例えば国際公開第９２２２６５３号に詳細に記載されるヒト化抗ＨＥＲ２抗体である。ベバシズマブは、例えば国際公開第９８４５３３１号に詳細に記載されるヒト化抗ＶＥＧＦ抗体である。
【０１９２】
免疫グロブリンは、完全ヒトＩｇＧ１抗体であってよい。最も好ましくは、ヒト抗体は、アダリムマブまたはデノスマブである。アダリムマブは、例えば国際公開第９７２９１３１号に詳細に記載されるヒト抗ＴＮＦα抗体である。デノスマブは、例えば国際公開第０３００２７１３号に詳細に記載されるヒト抗ＲＡＮＫＬ抗体である。
【０１９３】
一実施形態において、抗体はリツキシマブであってもアダリムマブであってもよい。
本明細書中のモノクローナル抗体は、具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である、あるいは相同である一方で、鎖の残りが、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である、あるいは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物活性を示す限りにおいて、そのような抗体のフラグメントを含む。
【０１９４】
さらに、本明細書中のモノクローナル抗体はまた、「ヒト化」抗体を含む。そのような抗体は、非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」によって得られ、動物性免疫グロブリンに由来するシーケンスを最小限含有する。ほとんどの分子はヒト配列である。ヒトレシピエント抗体の超可変領域由来の残基が、所望の結合特性を有する非ヒトドナー抗体の超可変領域由来の残基と置き換えられる。
【０１９５】
最後に、本明細書中のモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体ライブラリのスクリーニングによって得ることができる完全ヒト抗体を含む。
好ましい実施形態において、サンプルは、組換えＣＨＯ細胞培養から得られる細胞培養上澄みに由来する。好ましくは、サンプルは、増殖相にある組換え細胞培養から得られる。
【０１９６】
クロマトグラフィー媒体は使い捨て可能であっても再使用可能であってもよい。一実施形態において、クロマトグラフィー媒体は再使用可能である。
特異的な実施形態において、工程（ａ）の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、再使用可能である。
【０１９７】
再使用可能なクロマトグラフィー媒体は、使い捨て可能品として構成されるクロマトグラフィー媒体と比較して、対費用効果が高い。特に第１のプレクリーニング工程について、大量のクロマトグラフィー媒体が用いられる。従って、再使用可能なクロマトグラフィー媒体、例えば、プレクリーニング工程用の再使用可能な陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いることは、特に有利である。
【０１９８】
本明細書中で用いられる用語「再使用可能な」は、媒体または樹脂が、複数回の精製サイクル、すなわち少なくとも２、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００回以上の精製サイクルに再使用されるように構成されていることを意味する。各サイクル間で、クロマトグラフィー媒体または樹脂は、洗浄され、かつ／または再生され、かつ／または保存され得る。
【０１９９】
別の特異的な実施形態において、全てのクロマトグラフィー工程のクロマトグラフィー媒体は、再使用可能である。
用語「マトリックス」または「固相」が意味するところは、リガンドが付着し得る非水性マトリックスである。本明細書中の注目するマトリックスは、通常、ガラス、セラミック、シリカ、セルロース、アガロース、メタクリレートポリマー、またはポリスチレンを含むものである。
【０２００】
「リガンド」が意味するところは、タンパク質と、または少なくとも１つの夾雑物と相互作用し、かつ「マトリックス」に共有結合するあらゆる官能基である。
「樹脂」は、タンパク質または少なくとも１つの夾雑物と相互作用し得る官能基（リガンド）が結合したマトリックスを含む、ビーズの形態のあらゆるクロマトグラフィー材料を意味する。例外は、典型的にはいかなるリガンドも付着していない、サイズ排除クロマトグラフィー用のゲルクロマトグラフィー樹脂である。樹脂は、異なるサイズのビーズとして供給されて、カラム内に充填されてよい。あるいはまた、プレ充填カラムが購入されてもよい。
【０２０１】
本発明の方法は、小規模および大規模での免疫グロブリン精製に用いられ得る。好ましくは、本方法は大規模に実行される。
「小規模」（「研究室規模」とも表される）は、免疫グロブリンを５０ｇ未満、免疫グロブリンを１０ｇ未満、または免疫グロブリンを１ｇ未満含有するサンプルの精製を指す。「小規模」はまた、捕捉工程のカラムから溶出されたタンパク質が免疫グロブリン５０ｇ未満、免疫グロブリン１０ｇ未満、または免疫グロブリン１ｇ未満になる精製プロセスを指す。
【０２０２】
「大規模」（「生産規模」または「製造規模」とも呼ばれる）は、免疫グロブリンを５０ｇ超、免疫グロブリンを１００ｇ超、免疫グロブリンを２００ｇ超、または免疫グロブ
リンを３００ｇ超含有するサンプルの精製を指す。「大規模」はまた、捕捉工程のカラムから溶出されたタンパク質が免疫グロブリン５０ｇ超、免疫グロブリン１００ｇ超、免疫グロブリン２００ｇ超、または免疫グロブリン３００ｇ超になる精製プロセスを指す。
【０２０３】
（実施例）
免疫グロブリンを精製する本発明の方法は、以下の実施例を参照することによって支持され、かつ例示される。これらの実施例が本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきでないことが強調されなければならない。
【０２０４】
実施例１：免疫グロブリンおよび細胞培養
本発明の方法は、特定の抗体や、免疫グロブリンの発現のために用いる特定の宿主細胞には依存しない。収集における最大収率のために最適化された発現モードおよび選択された培養条件についても同様である。様々なモノクローナル抗体が、本発明の方法の開発中に用いられた。これらは、本発明の方法に従って、種々の規模で成功裡に精製された。表に示される選択実験のほとんどが、リツキシマブ、マウス−ヒトキメラ、抗ＣＤ２０、ＩｇＧ１抗体で実行された。また、一部の他の実験が、アダリムマブ、完全ヒト、抗ＴＮＦα、ＩｇＧ１抗体で実行された。抗体は両方とも、様々な規模の流加培養において増殖するＣＨＯ細胞において、組換えにより発現させた。開発段階の実験は、主に、１００Ｌの研究室規模から収集した培養液で実行した。実施例において用いた生産規模および最大培養容量は、１０００Ｌであった。特に明記しない限り、規模は常に培養容量を指す。
【０２０５】
実施例２：細胞培養液の収集およびプレクリーニング濾過工程
以下の方法は、１０００Ｌ規模について記載する。細胞および細胞残渣は、９６００ｒｐｍにて１００Ｌ／時の流速のＬＡＰＸ４０４セパレータ（アルファ・ラヴァル（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ））を用いて分離することによって除去した。分離した培養液は、以下のフィルタ（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））によって順次濾過した：（ｉ）フィルタカプセルＳＸＬＰ７００４１６ＳＰ、（ｉｉ）フィルタカプセルＳＸＬＰＤＥ２４０８ＳＰ、および（ｉｉｉ）再度、フィルタカプセルＳＸＬＰＤＥ２４０８ＳＰ。デプス濾過および精密濾過の両方の原理は、このフィルタ構成によって達成される。第１のクロマトグラフィーに先立って、濾過した培養液は、追加的に、ザルトポア（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ）（商標）２／０．２μｍ膜フィルタ装置（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））を用いて、精密濾過にかけた。
【０２０６】
実施例３：クロマトグラフィー樹脂の選択（表１および表２）
様々な供給者からの一般的で潜在的に有用なプロセスクロマトグラフィー樹脂の比較的大きなコレクションを、プレクリーニング工程、捕捉工程、およびポリッシング工程としての広いスクリーニングプログラムにおける効率について、試験した（図２Ａおよび図２Ｃ参照）。これは、本発明の開発の初期のステージ中に実行した。小さなカラム（１０〜２０ｍｌ）内に樹脂を充填し、リツキシマブを含むサンプルを、１００Ｌの研究室規模から、分離および濾過（プレクリーニングおよび捕捉工程）後に直接的に、または、プロテインＡ溶出液（結合モードのポリッシング工程）からとった。プロテインＡおよびプレクリーニングクロマトグラフィーの後に得られた陽イオン交換クロマトグラフィープールを、フロースルーモードのポリッシング工程に用いた。クロマトグラフィーランは、アクタ浄化システム（Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で実行した。
【０２０７】
プレクリーニング樹脂：８つの異なる陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂をフロースルーモードで試験し、比較した。樹脂は、カプトＱ（Ｃａｐｔｏ  Ｑ）、Ｑ−セファロースＦＦ（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）、ウノスフェアＱ（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｑ）、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）、フラクトゲルＴＭＡＥ（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡ
Ｅ）、ポロスＨＱ（Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ）、Ｑハイパーセル（Ｑ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）、およびトヨパール・スーパＱ６５０（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０）であった。充填カラムは、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化した。試験基準は、（ｉ）夾雑物の破過までの通過サンプル容量に関する最大収容能力、（ｉｉ）再生（退色を含む）、および（ｉｉｉ）採取フロースルーのｐＨ５．０未満の酸性化後の沈殿の程度であった。４つの樹脂が、プレクリーニング工程に用いるのに最も適していることが分かり（表１）、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）以外は類似した結果をもたらした。しかしながら、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）が明らかに優れていると判明し、好ましい樹脂である（表２）。
【０２０８】
プロテインＡによる親和性捕捉クロマトグラフィー樹脂：合計９つの異なるプロテインＡ樹脂について、洗浄工程を適用せずに、結合および溶出モードで試験し、比較した。カラムサイズ、流速、および滞留時間に関して同じ条件を用いた。カラム平衡バッファは、４０ｍＭリン酸Ｎａ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４であった。溶出は、１００ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ３．５で実行した。試験した樹脂は、マブセレクト（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）、マブセレクト・エキストラ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ）、マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）、マブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）、ウノスフェア・スープラ（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｕｐｒａ）、プロセップ・ウルトラ・プラス（ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ）、プロテインＡセラミック・ハイパーＤ  Ｆ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ）、ポロス・マブキャプチャＡ（Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ）、およびトヨパール・アールプロテインＡ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ）であった。基準は、（ｉ）動的かつ特異的な結合能力（破過判定）、（ｉｉ）必要とされる再生手順、（ｉｉｉ）厳しいクリーニング（ＮａＯＨ、ウレア、Ｇｕ−ＨＣｌ）に対する感度、（ｉｖ）溶出液（残留ＨＣＰ、浸出プロテインＡ）の純度、および（ｉｖ）コスト計算であった。総合すると、３つの樹脂が優れており、かつ最も有用であることが分かった（表１）。ポロス・マブキャプチャＡ（Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ）、およびＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の２つのマブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）樹脂が、大規模プロセスの最も有望な樹脂候補であった。マブキャプチャＡ（ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ）は、マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）と比較して、ＨＣＰ除去能力が１５％低く、第２の選択肢である。最も好ましい樹脂は、結合能力がマブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）よりもやや高かったマブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）である（表２）。
【０２０９】
非親和性捕捉クロマトグラフィー樹脂：このカテゴリーでは合計５つの異なる樹脂を試験した。樹脂は、カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）（混合モード）、カプトＳ（Ｃａｐｔｏ  Ｓ）（陽イオン交換体）、ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）（混合モード）、ＰＰＡハイパーセル（ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）（混合モード）、およびトヨパールＡＦレッド（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ  Ｒｅｄ）（プロシオン・レッドＨＥ−３Ｂ（Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｒｅｄ  ＨＥ−３Ｂ）に基づく染色リガンド）であった。基準は、（ｉ）動的かつ特異的な結合能力（破過判定）、（ｉｉ）必要とされる溶出基準、（ｉｉｉ）再生手順（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）、および（ｉｖ）溶出液の純度（ＨＣＰ）であった。これらの全ての樹脂（表１）は、精製力は異なるが、効率的な捕捉能力を示した。溶出液中のＨＣＰは、質的かつ量的に異なった。非親和性捕捉工程は、続くプロテインＡ親和性クロマトグラフィーに先立って適用することができ（図２Ｂ参照）、その場合原理上は、高価なプロテインＡカラムの負荷をさらに低減する第２のプレクリーニング工程として機能する。しかしながら、２つの混合モード樹脂が優れていることが分かり、いかなるプロテインＡ親和性工程も欠く下流シーケンス内の捕捉工程としても用いられ得る（図２Ｃ参照）。これらの有望な樹脂は、カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）およびＭＥ
Ｐハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）であった（表２）。
【０２１０】
結合モードのポリッシングクロマトグラフィー用樹脂：このカテゴリーについて、１つの混合モードクロマトグラフィー樹脂を除いて、陽イオン交換体のみを考えた。多数（ｎ＝１４）の共通する陽イオン交換体を試験した：ポロスＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ）、ポロスＸＳ（Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ）、ＳＰセファロースＨＰ（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ）、カプトＳＰインプレス（Ｃａｐｔｏ  ＳＰ  Ｉｍｐｒｅｓ）、ＹＭＣバイオプロ３０Ｓ（ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ３０Ｓ）、ＹＭＣバイオプロ７０Ｓ（ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ
７０Ｓ）、ウノスフェア・ラピッドＳ（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓ）、ウノスフェア・ラピッドＳ４０（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓ４０）、ヌヴィアＳ（Ｎｕｖｉａ  Ｓ）、ヌヴィアＨＲ−Ｓ（Ｎｕｖｉａ  ＨＲ−Ｓ）、トヨパールＳＰ６５０Ｓ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ  ６５０Ｓ）、トヨパール・ギガキャップＳ６５０Ｓ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ  ６５０Ｓ）、ミリポア・プロレスＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰｒｏＲｅｓ  Ｓ）、およびフラクトゲルＥＭＤ  ＳＯ３（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３）。リツキシマブおよび少量の夾雑物を含み、平衡バッファで１０ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度に調整したプロテインＡ（マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ））溶出液をカラムにロードした。全ての樹脂を同程度に試験したわけではなかった。動的かつ特異的な結合能力（破過判定）の他にも、残留ＨＣＰおよび生産関連不純物（凝集体、不所望の電荷変異体）を分離する能力もまた研究した。溶出は、塩および／またはｐＨ勾配を上げることで実行した。樹脂は、酸（電荷変異体）画分および塩基（凝集体）画分中の不純物の分離に関して、著しい差異を示した。この基準は、免疫グロブリンポリッシング工程の意図する目的であるため、重きを置いた。合計６つの樹脂が、ポリッシング工程に適していることが分かった（表１）。ポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）、ＳＰセファロースＨＰ（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ）、カプトＳＰインプレス（Ｃａｐｔｏ  ＳＰ  ＩｍｐＲｅｓ）、ヌヴィアＨＲ−Ｓ（Ｎｕｖｉａ
ＨＲ−Ｓ）、トヨパールＳＰ６５０Ｓ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ  ６５０Ｓ）、およびフラクトゲルＥＭＤＳＯ３（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３）の内、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の陽イオン交換体、ポロスＨＳ５０（Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ  ５０）、およびバイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の一樹脂、ヌヴィアＨＲ−Ｓ（Ｎｕｖｉａ  ＨＲ−Ｓ）が、夾雑物のＨＣＰ、凝集体、不所望の電荷変異体、および浸出プロテインＡの最良の除去可能性を示した。加えて、ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の正に帯電する混合モード樹脂であるカプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）を、結合モードのポリッシング工程としての有用性について研究した。陽イオン交換体と同じようにして、同じサンプル、カラムサイズ、および基準を適用した。平衡バッファは、２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ８．２であり、サンプルのｐＨをＮａＯＨで８．２に調整し、さらに平衡バッファで希釈した。樹脂は、より多い量を結合し得るが、効率的な分離には、２０〜２３ｍｇ／ｍｌのリツキシマブのロードが必要とされる。結合タンパク質の溶出は、２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．０で実行した。結合モードのカプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）樹脂は、夾雑物について非常に有望な除去力を示し、ポリッシング工程に好ましい樹脂として選択した（表２）。
【０２１１】
非結合モードのポリッシングクロマトグラフィー用樹脂：このカテゴリーにおいて、陰イオン交換体および１つの混合モード樹脂のみを考えた。合計７つの様々な共通する陰イオン交換体を試験した：ポロスＨＱ（Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ）、カプトＱ（Ｃａｐｔｏ  Ｑ）、ウノスフェアＱ（Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｑ）、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）、トヨパール・ギガキャップＱ６５０（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ  ６５０）、Ｑハイパーセル（Ｑ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）、およびフラクトゲルＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ）。基準は：残留凝集体、ＨＣＤＮＡ、およびＨＣＰに特別焦点を合わせた、得られたフロースルー中のリツキシマブの最大純度であった。プロテインＡ（マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ））工程後の陽イオン
交換体（ポロスＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ））プールをカラムにロードした。
【０２１２】
３つの陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、ポロスＨＱ（Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ）、カプトＱ（Ｃａｐｔｏ  Ｑ）、およびヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）が、フロースルーモードのポリッシング工程に用いるのに最も適していることが分かった（表１）。加えて、ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の正に帯電する混合モード樹脂であるカプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）を、フロースルーモードのポリッシング工程の有用性について研究した。陰イオン交換体と同じようにして、同じサンプル、カラムサイズ、および基準を適用した。平衡バッファは、２０ｍＭリン酸Ｎａ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８であった。カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）樹脂は、フロースルーモードでも注目に値する夾雑物除去力を示し、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂よりも僅かに優れていた。これは、陰イオン交換機能を補う付加的な疎水性相互作用によって容易に説明される。そのため、カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）は、フロースルーモードのポリッシング工程に好ましい樹脂として選択した（表２）。
【０２１３】
表１：プレクリーニング工程、捕捉工程、およびポリッシングクロマトグラフィー工程として用いるのに適したプロセス樹脂［ＡＥＸ＝陰イオン交換クロマトグラフィー；ＣＥＸ＝陽イオン交換クロマトグラフィー；ＭＭＣ＝混合モードクロマトグラフィー］：
【０２１４】
【表１】
0006293907.tif 000006
【０２１５】
表２：好ましいクロマトグラフィー樹脂［ＡＥＸ＝陰イオン交換クロマトグラフィー；ＣＥＸ＝陽イオン交換クロマトグラフィー；ＭＭＣ＝混合モードクロマトグラフィー］：
【０２１６】
【表２】
0006293907.tif 000007
【０２１７】
実施例４：プレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィー工程
図２Ａ〜図２Ｃに示す下流シーケンスによって、１００Ｌ規模（リツキシマブまたはアダリムマブ）および１０００Ｌ規模（リツキシマブ）を精製した。プレクリーニングクロマトグラフィー工程に好ましい樹脂は、フロースルーモードで実行するヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）である。このプロセス工程は、実施例２に記載したプレクリーニング濾過手順の後に得られた培養液で実行した。プレクリーニングクロマトグラフィーは、以降の捕捉工程のために、不純物のロード（ＨＣＰ、ＨＣＤＮＡ、凝集体、脂質、色素その他）を減らすためのヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂によりフロースルーモードで実行した。樹脂を充填したカラム（１０００Ｌ規模の寸法＝６０ｃｍ直径×１６ｃｍ高、充填容量約４５Ｌ；１００Ｌ規模の寸法＝１４ｃｍ直径×２７ｃｍ高、充填容量約４．１Ｌ）は、ＷＦＩ（２ＣＶ）、１Ｍトリス酢酸ｐＨ６．０（３ＣＶ）、および２０ｍＭトリス酢酸ｐＨ７．２（４ＣＶ）で連続的に平衡化した。産物溶液が、カラム（１７ｇ／Ｌ樹脂）を通過し、約２００ｃｍ／時の流速のＷＦＩ（２ＣＶ）が続く。ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）樹脂の再生は、（ｉ）４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍウレア、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２（４ＣＶ）、（ｉｉ）１００ｍＭクエン酸、２Ｍ  ＮａＣｌ（１０ＣＶ）、（ｉｉｉ）ＷＦＩ（４ＣＶ）、（ｉｖ）１Ｍ  ＮａＯＨ（４ＣＶ）、および（ｖ）１０ｍＭ  ＮａＯＨ（２ＣＶ）で連続的に逆方向に洗浄することによって、実行した。カラムはその後、１０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液中に貯蔵した。
【０２１８】
実施例５：捕捉樹脂として用いたＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）の再使用に及ぼす、プレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィー工程の効果（表３）
ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）は、以降にプロテインＡ親和性工程があっても（図２Ｂ）なくても（図２Ｃ）、大規模プロセスに適用し得る捕捉工程にとって好ましい非親和性樹脂である。ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）カラムの汚染（ファウリング）は、極めて不利益であることが分かった。しかしながら、これは、本実施例ではヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）であったプレクリーニング陰イオン交換カラムを適用することによって、抑制または強く軽減し得る。ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）プレカラムがないと、ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）の再使用は、苛酷で、長期にわたり、かつ費用のかかる再生手順を必要とし、その場合には寿命も制限される。表２の実験は、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）およびＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）をそれぞれ充填した小さなモデルカラム（２０ｍｌ）で実行する。ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）クロマトグラフィーのサンプルロードおよび性能は、実施例４に記載した。フロースルーは、ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ
）上に調整なく直ちにロードした。並行して、第２の捕捉カラムに直接、すなわち、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）工程をバイパスして、実施例２に従う培養液をロードした。捕捉カラムは、最大収容能力に達し、および産物がフロースルー中に現れる（破過）まで、ロードした。結合したＩｇＧは、ｐＨの低下（ｐＨ４）によって、ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）カラムから溶出した。結合能力は、破過までの容量から算出した。混合モード樹脂は、次のランのために簡単に再生かつ再平衡化した。ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）の再生は、１００ｍＭクエン酸溶液に続いて１Ｍ  ＮａＯＨを逆流で通すことによって実行した。ＮａＯＨとの接触時間は６０分であり、その後カラムを、次の使用のために、再平衡化およびＮａＯＨ（ｐＨ制御）の完全除去によって調製した。ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）カラムは、実施例４に記載するようにして再生した。合計８サイクルを実行した（７回の再使用）。結果は表３に要約した。結果は、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）工程の優位性を支持している。ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ
Ｑ）プレクリーニングを適用した場合に結合能力の変化はなかった。対照的に、そのような工程がないと、ランからランで結合能力が低下し、８サイクル後には６４％にまで下がった。
【０２１９】
表３：捕捉工程として用いる混合モード樹脂ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）の再使用に及ぼす、プレクリーニング工程としてのフロースルーモードの陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）の効果（ｍｌ樹脂あたりのＩｇＧ結合能力）：
【０２２０】
【表３】
0006293907.tif 000008
【０２２１】
実施例６：カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）捕捉クロマトグラフィー
カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）樹脂は、負に帯電する混合モードクロマトグラフィー媒体であり（表２参照）、図２Ｂ（５カラムプロセス）および図２Ｃ（４カラムプロセス）のプロセスフロースキームにおいて示す下流シーケンス内で適用した。これらのシーケンスにおいて、カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）は、原理上、サンプルを精製し、かつ、以降のプロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂を害するおそれがあるプロテアーゼ等の重大な夾雑物を取り除く、第２のプレクリーニング工程として機能する。また、この工程は、著しいサンプル濃縮を可能にするため、プロテインＡクロマトグラフィーのプロセス時間を引き下げる。カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）クロマトグラフィーは、結合モードで実行し、酢酸でｐＨ５に調整された実施例４に記載したヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）フロースルーをロードした。リツキシマブの１００Ｌ規模および１０００Ｌ規模の両方を、この方法に従って精製した。１０００Ｌ規模のカラム寸法は、６０ｃｍ直径×１５ｃｍ高（充填容量約４２Ｌ）であり、１００Ｌ規模について、２０×１４ｃｍ（充填容量約４．４Ｌ）であった。樹脂は、２０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．０）で平衡化し、リツキシマブ結合カラムは、４０ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ６．５）で洗浄した。溶出は、回収が最大になるように最適化し、４０ｍＭリン酸Ｎａ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７
．５で実行した。流速は１５０〜２００ｃｍ／時であった。溶出液は、プロテインＡカラム上に直接ロードした。
【０２２２】
実施例７：プロテインＡ捕捉クロマトグラフィー
プロテインＡ捕捉クロマトグラフィーは、マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ
ＳｕＲｅ）（１００Ｌ規模）またはマブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）（１０００Ｌ）で実行した。カラムの規模を除いて、プロセシングパラメータは同じであった。サンプルは、実施例４において適用した方法（図２Ａのプロセス、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）フロースルー）の後に、または実施例６において適用した方法（図２Ｂのプロセス、カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）溶出液）の後に採った。１０００Ｌ規模のカラム寸法は、４０ｃｍ直径×３０ｃｍ高（充填容量約３８Ｌ）であり、１００Ｌ規模について、２０×１０．４ｃｍ（充填容量約３．２Ｌ）であった。プロテインＡカラムは、４０ｍＭリン酸Ｎａ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化した。特に明記しない限り、産物溶液は、２０ｇタンパク質／Ｌ樹脂（１００Ｌ規模）または３５ｇタンパク質／Ｌ樹脂（１０００Ｌ規模）でロードした。カラムは、平衡バッファ（２ＣＶ）に続いて、４０ｍＭリン酸Ｎａ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２Ｍウレア、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で洗浄した。溶出は、１００ｍＭクエン酸Ｎａ（ｐＨ３．５）で実行した。流速は１４０ｃｍ／時であった。マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ
ＳｕＲｅ）樹脂またはマブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）樹脂の再生は、（ｉ）０．２Ｍ  ＮａＯＨ（２ＣＶ）、（ｉｉ）ＷＦＩ（２ＣＶ）、３．５％酢酸、１００ｍＭ硫酸Ｎａ（２ＣＶ）、および（ｉｉｉ）ＷＦＩ（２ＣＶ）で連続的に逆方向に洗浄することによって実行した。カラムは次のランのために再平衡化し、または２０％エタノール中に貯蔵した。
【０２２３】
実施例８：浸出プロテインＡに及ぼすプレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィーの効果（表４）
プロテインＡ（マブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ））の浸出に及ぼす、プレクリーニングクロマトグラフィー（ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ））および温度の効果を調査するために、規模を縮小したプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにおいて一連の実験を実行した。用いたカラムは、容量が１２ｍｌであった。クロマトグラフィーランにアクタ浄化システム（Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を適用した。サンプルは、リツキシマブの１０００Ｌバッチから採った小アリコートであった。サンプルは、実施例２に記載した手順（ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）プレクリーニング工程前）の後に得られたプロセス工程から、または実施例３に記載した手順（ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）プレクリーニング工程後）の後に、採った。プロテインＡ親和性クロマトグラフィー法は、実施例７に従って実行した。カラムは、２５〜３０ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂でロードした。サンプルおよびプロテインＡ親和性クロマトグラフィーは、室温（２０〜２５℃）にて維持し、または冷却チャンバ（２〜８℃）内に置いた。２つの並行サンプルは、２つの異なるアリコートからそれぞれ採り、並行して精製かつ試験した。結果は、表４に示す。先行するヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）工程のない室温での浸出の２つの並行ランの平均値は、２３．４ｎｇ／ｍｇ（１ｍｇ  ＩｇＧあたりのプロテインＡ当量）であった。プレクリーニング工程の効果は明らかである（表４）。室温にて、サンプルがプロテインＡ工程の前にヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）カラムを通過した場合、わずか９．１ｎｇ／ｍｇ（＝３９％）の浸出を生じた。その効果は、浸出に及ぼす著しい効果をそれ自体が有している低温においても見られる。平均して、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）なしでの浸出は５．０ｎｇ／ｍｇであり、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）ありでの浸出は３．４ｎｇ／ｍｇ（６８％）であった（表４）。ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）工程により、プロテインＡ浸出は著しく低下し、親和性クロマトグラフィー工程にとってより好ましい室温を用いることができる。プロテインＡ浸出に及ぼすヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）の効果は、ヌヴィ
アＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）樹脂に結合するタンパク質分解活性能の捕捉によって、最も説明される。
【０２２４】
表４：プロテインＡ溶出液中で測定される（マブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）からの）浸出プロテインＡに及ぼす、プレクリーニング陰イオン交換（ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ））クロマトグラフィー工程の効果。２つの異なる温度にて２つのクロマトグラフィーを並行して実行した：
【０２２５】
【表４】
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【０２２６】
実施例９：プレクリーニングカラムおよび捕捉カラムの連結
ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）によるプレクリーニング陰イオン交換工程をフロースルーで実行するとともに、続くプロテインＡ親和性樹脂（マブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ））がこのフロースルーから免疫グロブリンを効率的に捕捉することが可能であるため、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）カラムをマブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）カラムと直接連結することが可能であった。図２Ａおよび図２Ｂにおいて要約した下流プロセスは、１０００Ｌ規模（リツキシマブ）から、このようなプレクリーニングカラムおよび捕捉カラムを連結してランした。しかし、１００Ｌ規模のプロセスも、特に明記しない限り、連結カラムで実行した。２つのカラムは別々に平衡化し、その後、バルブスイッチングによって連結した。産物溶液は、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）について実施例４に記載したように、約１００Ｌ／時（１０００Ｌ規模）または約１０Ｌ／時（１００Ｌ規模）でアップフロー方向に連結カラム上にロードした。ＷＦＩ（２ＣＶ）による洗浄後、ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）カラムは、クロマトグラフィースキッドにてバルブスイッチングによってバイパスし、実施例４に記載したように、逆流で再生した。プロテインＡカラムの更なるプロセシング、すなわち洗浄、溶出、および再生は、実施例７に記載した、連結を断った構成において実行した。
【０２２７】
実施例１０：ウィルス不活化
図１および図２に示すように、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー後に、ウィルスの不活化工程を行う。親和性マトリックスからの低ｐＨ溶出を利用する。そのような水性酸環境では、多くのウィルス、とりわけエンベロープタイプのウィルスは不安定であり、分解する。本発明について開発したプロテインＡ法は、ｐＨが３．５である溶出液が生じる（実施例７参照）。同様に、混合モード捕捉カラム（ＭＥＰハイパーセル（ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ）またはカプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ））の溶出液は、ｐＨが４と低い（実施例５および実施例６参照）。以降、マブセレクト・シュアＬＸ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ）溶出液（１０００Ｌ規模、リツキシマブ）のための不活化を記載する。プロテインＡカラムからモノクローナル抗体を、１００ｍＭクエン酸Ｎａバッファ、ｐＨ３．５中で、ウィルス不活化タンクＡ内に直接溶出した。タンクＡ内で直接、ＷＦＩによって溶出液を約２倍に希釈した。溶液のｐＨは、必要に応じて、１００ｍＭクエン酸で制御して３．５に再調整し、続いて溶液をウィルス不活化タンクＢに移し、そこで
、６５ｒｐｍで２０〜２４℃の温度にて６０分間撹拌した。その後、５０ｍＭ  ＮａＯＨで溶液のｐＨをｐＨ４．５に調整して、以降の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のための出発条件を与えた。
【０２２８】
実施例１１：ポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）による陽イオン交換クロマトグラフィー（ポリッシング１）
夾雑物および生産関連物質、例えば電荷変異体の分離は、第１のポリッシング工程である陽イオン交換クロマトグラフィーによって実行した。この工程は、全ての精製シーケンス（１００Ｌリツキシマブおよびアダリムマブ、１０００Ｌリツキシマブ）に含まれた。ポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）樹脂による充填カラム（１０００Ｌ規模の寸法＝６０ｃｍ直径×３２ｃｍ高、充填容量約９０Ｌ；１００Ｌ規模の寸法＝２５ｃｍ直径×１５ｃｍ高、充填容量約約７．３Ｌ）は、（ｉ）ＷＦＩ（注射用水、２ＣＶ）および（ｉｉ）２０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５（４ＣＶ）によって連続的に平衡化した。実施例１０に記載したウィルス不活化およびサンプル調整（ｐＨ４．５）後に得た産物溶液を、約８ｇタンパク質／Ｌ樹脂でカラム上にロードすることによって、０．４５μｍクリーンパック・ノバ（Ｋｌｅｅｎｐａｋ  Ｎｏｖａ）プレフィルタ（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に通した。続く勾配溶出の前に、カラムをＷＦＩ（１ＣＶ）で洗浄した。２０ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ５．５（バッファＡ）、および４０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．８（バッファＢ）を以下の比率およびシーケンスで混合することによって、勾配を形成した：（ｉ）１００％  Ａ（０．２ＣＶ）、（ｉｉ）４０％
Ａ＋６０％  Ｂ（２ＣＶ）への線形勾配；（ｉｉｉ）１００％  Ｂ（６ＣＶ）への線形勾配；（ｉｖ）１００％  Ｂ（２ＣＶ）。流速は１５０ｃｍ／時であった。溶出液は、画分に分離して、特異的プーリングを可能にした。ポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）樹脂の再生は、（ｉ）２Ｍ  ＮａＣｌ（１ＣＶ）および（ｉｉ）１Ｍ  ＮａＯＨ（２ＣＶ）で連続的に洗浄することによって実行した。カラムはその後、１０ｍＭ  ＮａＯＨ中に貯蔵した。
【０２２９】
実施例１２：カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）による混合モードクロマトグラフィー（ポリッシング２）
第２のポリッシング工程は任意選択的であり、リツキシマブの１００Ｌ規模および１０００Ｌ規模に適用した。２つのポリッシング工程があるプロセス（図２Ａおよび図２Ｂ）において最終クロマトグラフィーに選択した樹脂は、カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）であった。これは、リガンドＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを使用する。リガンドは、正に帯電する基を有するため、疎水性相互作用に加えて、陰イオン交換体の機能も実現する。クロマトグラフィーは、残っている微量の夾雑物、例えばＨＣＤＮＡおよびＨＣＰをさらに減らすことが可能である。残留浸出プロテインＡ、産物凝集体、および産物フラグメントもまた、この工程によって除去し得る。カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）ポリッシング工程は、フロースルーモードおよび結合モードで実行した。
【０２３０】
フロースルーモードのカプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）クロマトグラフィー：この最終クロマトグラフィー用のサンプルは、実施例１１に記載した手順の後のポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）プールであった。１０００Ｌ規模用の充填カラムのサイズは、１４ｃｍ直径×１３ｃｍ高（充填容量約２Ｌ）であり、１００Ｌ規模について、５×１３ｃｍ（充填容量約０．２Ｌ）であった。カラムは、２０ｍＭリン酸Ｎａ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８で平衡化した。プールした画分のｐＨは、０．２Ｍ  ＮａＯＨで７．８に調整し、導電率は、１Ｍ  ＮａＣｌで１０〜１２ｍＳ／ｃｍに上げた。調整したプールは、２５０〜２７５ｇタンパク質／Ｌ樹脂のロードでカプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）カラムを通過し、フロースルー全体を採取した。流速は３００ｃｍ／時であった。カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）樹脂の再生は、（ｉ）１００
ｍＭクエン酸、２Ｍ  ＮａＣｌ（２ＣＶ）、（ｉｉ）２Ｍ  ＮａＣｌ（１ＣＶ）、（ｉｉｉ）１Ｍ  ＮａＯＨ（２ＣＶ）、および（ｉｖ）１０ｍＭ  ＮａＯＨ（２ＣＶ）で連続的に洗浄することによって実行した。カラムはその後、１０ｍＭ  ＮａＯＨ中に貯蔵した。
【０２３１】
結合モードのカプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）クロマトグラフィー：実施例１１に記載した手順の後に得られたポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）プールのｐＨおよび導電率を、ｐＨ８．２および３．２ｍＳ／ｃｍにそれぞれ調整した。１０００Ｌ規模用の充填カラムのサイズは、４０ｃｍ直径×２８ｃｍ高（充填容量約３５Ｌ）であり、１００Ｌ規模について、１４×２７ｃｍ（充填容量約４．１Ｌ）であった。樹脂は、２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ８．２で平衡化した。産物溶液は、１５〜２０ｇタンパク質／Ｌ樹脂でカラム上にロードした。溶出は、２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．０で実行した。流速は３００ｃｍ／時であった。フロースルーモードの方法について記載したように、カラムを再生した。
【０２３２】
実施例１３：最終の濾過工程
最後のクロマトグラフィーと、最終バルクの薬剤物質の充填との間に、選択した貯蔵バッファ中に調合し、所望の濃度を固定し、かつウィルスを除去するために要求される、いくつかの濾過工程がある。免疫グロブリン用の本発明の精製法は、これらの濾過法には依存しない。従って、本実施例における方法、装置、および選択した膜は、ほんの１つの選択肢と理解されなければならず、自由裁量の変更が可能である。２つのポリッシング工程があるプロセスについての１０００Ｌ規模用の方法を、以下で簡潔に記載する。
【０２３３】
タンジェント流限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ：ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によるバッファ交換：カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）カラムからの溶出液は、ＵＦ／ＤＦスキッドのタンク内に採取して、オメガ・セントラセッティ（Ｏｍｅｇａ  Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ）膜カセット（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、３０ｋＤカットオフ）を用いて、８ｇ／Ｌに濃縮した。残留産物は、１０容量の調合バッファ（２５ｍＭクエン酸Ｎａ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を用いて限外濾過した。
【０２３４】
ナノ濾過によるウィルス除去：ナノ濾過は、ナノメートル範囲のサイズ排除に基づいて機能する、最も厳しく、かつ最も信頼性が高いウィルス除去工程である。限外濾過した産物溶液は、移動可能なタンク中に移してから、バイアソルブ・プロ・モダス１．３（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏ  Ｍｏｄｕｓ  １．３）フィルタ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２０ｎｍ孔サイズ）を用いたナノ濾過にかけた。フィルタは、産物溶液の濾過前に、２５ｍＭクエン酸Ｎａ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で調整した。ナノフィルタの保護のために、ザルトポア２ミディキャプス（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２  ＭｉｄｉＣａｐｓ）プレフィルタ（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、０．２μｍ孔サイズ）を適用した。濾過は、最大２００ｋＰａ（２ｂａｒ）の過剰圧によって実行した。
【０２３５】
タンジェント流限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）による濃縮および最終調合：ナノ濾過した産物溶液は、ＵＦ／ＤＦスキッドのタンク内に採取して、オメガ・セントラセッティ（Ｏｍｅｇａ  Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ）膜カセット（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、３０ｋＤカットオフ）を用いて、約１０．２ｇ／Ｌに濃縮した。濃縮した産物溶液は、移動可能なタンクに移した。層流空気流下にタンクを置いて、トゥイーン８０を加えて最終濃度を０．０９％（ｗ／ｗ）にした。
【０２３６】
最終の精密濾過（滅菌濾過）：最終の精密濾過は、０．２μｍミニ・クリーンパック（Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ）フィルタカプセル（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））で実行した。
【０２３７】
実施例１４：異なるプロセスによって得たバッチの最終純度（表５）
図２Ａの従来のプロセス（例えば、ファーナＲＬ（Ｆａｈｒｎｅｒ  ＲＬ）２００１年に従う）および図２Ｂの新たなプロセスによって生産した２つの代表的なバッチの最終純度に関する結果を、表５に要約する。免疫グロブリンはリツキシマブであり、１００Ｌ規模から精製した。従来の精製法のプロセス工程（プロセス１Ｂ）は、３つのクロマトグラフィー、（ｉ）マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）（捕捉）、（ｉｉ）ポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）（結合モード）、および（ｉｉｉ）ポロス５０ＨＱ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＱ）（フロースルーモード）からなる。新たなプロセス（プロセス２Ｂ）のクロマトグラフィーシーケンスは、（ｉ）ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ
Ｑ）（プレクリーニング）、（ｉｉ）カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）（捕捉）、（ｉｉｉ）マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）（中間）、（ｉｖ）ポロス５０ＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ）（結合モード、ポリッシング１）、および（ｖ）カプトアドヒア（ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ）（フロースルーモード、ポリッシング２）からなる。個々の工程は、実施例１、２、４、６、７、および１０〜１３に記載したように実行した。表５について、選択した純度パラメータは、（ｉ）ＩｇＧモノマーの相対量（％）、（ｉｉ）残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ、ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧ）、および（ｉｉｉ）残留宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ、ｐｇ／ｇ  ＩｇＧ）である。分析方法は、以下の実施例１５に記載する。新たなプロセス２Ｂに従って精製したバッチは、３つ全てのパラメータで見られるように、従来のプロセス１Ｂに従って精製したバッチと比較して、純度がより高かった（表５）。
【０２３８】
表５：２つの異なるプロセスである従来のプロセス（１Ｂ）および発明したプロセスの１つ（２Ｂ）によって得た２つの精製バッチの品質の比較。「プロセス１Ｂ」は、図１Ｂに示す、プレクリーニングクロマトグラフィー工程のない標準的なプロセスを指す。「プロセス２Ｂ」は、プレクリーニングクロマトグラフィー工程（ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）フロースルー）および混合モードクロマトグラフィー捕捉工程（カプトＭＭＣ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ））に続くプロテインＡ（マブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ））を含む、図２Ｂに示す発明したプロセスを指す。試験方法は：サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：Ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ−ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）であった。試験パラメータは、モノマーＩｇＧパーセント、１ｍｇ  ＩｇＧあたりの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ：ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、および１ｇ  ＩｇＧあたりの宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ：ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ＤＮＡ）であった。
【０２３９】
【表５】
0006293907.tif 000010
【０２４０】
実施例１５：分析方法
精製した免疫グロブリンの品質を特徴付けるために、プロセス中およびプロセス終了後の両方にていくつかの分析方法を適用した。これらの方法は、標準的な方法であり、例え
ばユーロ・ファーム（Ｅｕｒ．Ｐｈａｒｍ）といった文献に記載されていた。表の結果をもたらした方法の原理を、以下で簡潔に記載する。
【０２４１】
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）：ＳＥＣ−ＨＰＬＣ法は、分子量が免疫グロブリンの分子量と異なる不純物の判定のために適用した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、サイズと比例する流体力学的径に基づく分子の分離に基づく技術である。解像度が従来のＳＥＣよりもかなり良好な、ＳＥＣ用の高速液体クロマトグラフィー系（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を用いた。クロマトグラフィーは、免疫グロブリンのモノマー、ダイマー、凝集体、およびフラグメントを定量化するために、文献（例えば国際公開第２０１３０６７３０１号）に記載されているようにして、実行した。タンパク質の検出は、ＵＶ吸収に基づいた。相対純度は、一体にしたモノマーピークの面積の、全ピークの総面積の％を指す。試験結果は、反復測定値の平均から算出した。
【０２４２】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を定量化する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：測定は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によって実行した。ＣＨＯ宿主細胞タンパク質は、標準的な９６ウェルマイクロテストプレートのポリスチレン表面上に固定された特異的抗ＣＨＯ抗体に結合した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識した二次抗体に結合する。３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ：ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質をウェルに加えることによって酵素反応を実行した後、抗体−ペルオキシダーゼ結合体の存在に依存して、ＶＩＳ光吸収によって検出可能な有色の産物がもたらされる。マイクロテストプレートは、４５０ｎｍ（６２０ｎｍの参照波長）にて読んだ。
【０２４３】
浸出プロテインＡを定量化する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：測定は、レプリジェン（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）から市販されているマブセレクト・シュア・リガンドＥＬＩＳＡキット（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  Ｌｉｇａｎｄ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ）を用いて実行した。浸出したマブセレクト・シュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）リガンドは、標準的な９６ウェルマイクロテストプレートのポリスチレン表面上に固定された特異的抗プロテインＡウサギ抗体に結合した後、ビオチンで標識した二次抗体に結合する。結合したビオチンの存在は、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体と共にウェルをインキュベートすることによって検出した。３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質をウェルに加えることによって酵素反応を実行した後、抗体−ペルオキシダーゼ結合体の存在に依存して、ＶＩＳ光吸収によって検出可能な有色の産物がもたらされる。マイクロテストプレートは、４５０ｎｍ（６２０ｎｍの参照波長）にて読んだ。アッセイ感度は、０．１ｎｇ／ｍｌサンプルであった。
【０２４４】
宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）を定量化する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）：測定は、タックマン（ＴａｑＭａｎ）化学（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））に基づくリアルタイム定量的ＰＣＲ法によって実行した。この方法は、ＤＮＡ汚染の検出に非常に敏感であり、かつ特異的である。アッセイは、配列特異的プライマー（ＳＳＰ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）および蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブ（タックマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標））を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による配列特異的増幅および明確なＤＮＡフラグメントのリアルタイム蛍光検出に基づく。測定器、試薬、サンプリング、およびソフトウェアベースの計算を含む方法全体は、供給者の説明書に従って実行した。ＰＣＲ反応において、大量の二本鎖ＤＮＡは、特異的プライマーによって決定される出発ＤＮＡ領域から合成される。リポーターおよびクエンチャー色素で標識したオリゴヌクレオチドプローブは、増幅されるテンプレートＤＮＡの領域に結合する。ＰＣＲ反応中にＤＮＡポリメラーゼがプローブを分解する結果、２つの色素の物理的接近が途切れ、リポーター
色素は、ＰＣＲ反応の合成産物に比例する蛍光を発する。測定では、ＣＨＯ宿主細胞ＤＮＡの適切な領域の量を増幅させるＣＨＯ特異的なプローブおよびプライマーが測定に用いられる。この工程中に、蛍光シグナルは増大して、あるサイクル数の後、蛍光は閾値を上回る。このサイクル数は、ＤＮＡの出発量に比例する。サンプルで得たサイクル数を較正曲線と比較することによって、サンプル中の宿主細胞ＤＮＡの絶対量を判定することが可能である。
【０２４５】
実施例１６：ウィルスの除去および不活化のバリデーション
細胞培養によって生産されるモノクローナル抗体等の組換えタンパク質薬剤の製造工程には、ウィルスの除去および／または不活化が必要とされる。なぜなら、原材料または生産工程からのウィルスによる汚染が懸念されるためである。結果として、細胞培養に由来する生物学的治療タンパク質をもたらす製造プロセス毎のウィルス安全性について相当な規制要求がある。下流プロセスは、それぞれの規制当局、例えば欧州医薬品庁（ＥＭＡ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｇｅｎｃｙ）および米国食品医薬品局（ＦＤＡ：Ｆｏｏｄ  Ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の既存のガイドラインに従って、潜在的ウィルス汚染を除去かつ／または不活化する能力が確認されなければならない。実行するウィルスクリアランス研究の目的は、細胞培養源からの組換えタンパク質薬剤の安全性全体の実証の一部として、製造プロセス中のウィルスの有効な除去および不活化を実証することであった。
【０２４６】
プロセス工程の選択：ＩｇＧｌ抗体リツキシマブの下流プロセスを、選択した工程について確認した。分析したプロセス工程は、先の実施例において記載した対応する大規模工程の代表的な規模縮小バージョンであった。４つのプロセス工程を選択した。
【０２４７】
ａ）ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ）によるプレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィー（実施例４参照）
ｂ）低いｐＨのプロテインＡ溶出液のウィルス不活化（実施例１０参照）
ｃ）ポロスＨＳ（Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ）による陽イオン交換クロマトグラフィー（実施例１１参照）
ｄ）バイアソルブ・プロ（Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏ）によるナノ濾過（実施例１３参照）
ウィルスの選択：頻繁に用いられる２つのモデルウィルスを選択した。
【０２４８】
ａ）マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）
ｂ）マウス微小ウィルス（ＭＶＭ）
ＭｕＬＶは、レトロウィルス科のメンバであり、エンベロープを有し、約８０〜１００ｎｍのサイズである一本鎖ＲＮＡウィルスである。ＭＶＭは、パーボウィルス科のメンバであり、非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウィルスである。パーボウィルスは、知られている最も小さなウィルスに属し、サイズが２０〜２４ｎｍである。両方のウィルスとも、米国菌培養採取所（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られる。
【０２４９】
実験の性能：１つの大規模バッチ由来の基準中間プロセスサンプルを凍結貯蔵した（≦−１５℃）。実験前に２０ｍｌのアリコートを解凍して、高ウィルス力価のＭｕＬＶまたはＭＶＭでそれぞれスパイクした。プロセス工程ｂ）「低いｐＨのプロテインＡ溶出液のウィルス不活化」（実施例１０参照）は、ＭｕＬＶについてのみ試験した。裸のウィルスカプシドの形態構造のために、パーボウィルスは低ｐＨ処理に対する耐性が知られている。従って、ＭＶＭは低ｐＨインキュベーションについて試験しなかった。スパイクした出発材料およびプロセス済みサンプルは、ウィルス特異的細胞ベースの感染性アッセイおよびｑＰＣＲを用いて量的に分析し、減少率は、ｌｏｇ１０値として算出した。アッセイに
対する干渉について、全ての試験材料をプレ調査し、並行制御インキュベーションにより、実験の期間中のウィルスの安定性が証明される。感染性アッセイは、感染性ウィルスのみを検出するが、ｑＰＣＲは、感染性ウィルスおよび不活化ウィルスの両方を含む。プロセス工程毎およびウィルスタイプ毎に、二重のランを実行した。プロセス済みサンプルが、検出可能なウィルス力価を含有しなかった場合、アッセイの算出検出限界を最大力価として用いた。その場合、減少率は、少なくともｌｏｇ１０「≧」と表した。
【０２５０】
ウィルスクリアランス研究の結果：個々の実験の結果は、表６において、各ラン、工程、およびウィルスについて示した。フロースルーモードの単純な陰イオン交換クロマトグラフィー（樹脂ヌヴィアＱ（Ｎｕｖｉａ  Ｑ））に基づくプレクリーニング工程の高い減少率は、驚くべきものであった。ＭｕＬＶについて少なくとも６．５〜６．７、およびＭＶＭについて６．６のＬｏｇ１０減少率が見出された。この工程は、試験した４つの内、最も優れた工程であった。とりわけ、困難なパーボウィルスＭＶＭの場合には、このことは予想されなかった。さらに、プレクリーニング陰イオン交換クロマトグラフィーおよび単純な６０分の保持工程の組合せをプロテインＡ溶出液（ｐＨ３．５）に用いることによって、ＭｕＬＶ等のエンベロープウィルスについて、少なくとも１２．３の累積減少率を得ることができた。総累積ｌｏｇ１０減少率は、ＭｕＬＶおよび４つの工程について２１．７、およびＭＶＭおよび３つの工程について少なくとも１３．３であった。
【０２５１】
表６：２つのモデルウィルスであるマウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）およびマウス微小ウィルス（ＭＶＭ）を減少させる異なるプロセス工程のＬｏｇ１０減少率。工程およびウィルスあたり２ランを実行した。
【０２５２】
【表６】
0006293907.tif 000011
【０２５３】
参照文献のリスト
【０２５４】
【表７】
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【０２５５】
0006293907.tif 000013
【０２５６】
0006293907.tif 000014
【図１Ａ】
0006293907.tif 000015
【図１Ｂ】
0006293907.tif 000016
【図２Ａ】
0006293907.tif 000017
【図２Ｂ】
0006293907.tif 000018
【図２Ｃ】
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