(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ｓｔ−Ｒ１−Ｓ１−Ｑ−Ｓ２−Ｒ２
を有するポリペプチドであって、
式中、
Ｓｔは軸配列であり、該軸配列は、該ポリペプチドが標的細胞の表面に発現する場合、ＲおよびＱエピトープを該細胞表面から突出させ；
Ｒ１およびＲ２は、各々配列番号１、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するリツキシマブ結合エピトープであり；
Ｓ１およびＳ２はスペーサー配列であり、該スペーサー配列は同じまたは異なり得、Ｒ１とＲ２との間の距離は、該ポリペプチドがリツキシマブの両方の抗原結合部位に同時に結合するには長過ぎるように、該スペーサー配列は、合わせて少なくとも１０アミノ酸の長さを有し；そして
Ｑは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＱＢＥｎｄ１０結合エピトープである、ポリペプチド。
【請求項２】
Ｒ１とＲ２との間の距離は、７６．５７Åより大きい、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記軸配列は、ＣＤ８αから誘導可能である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記軸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４で示される配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
目的のタンパク質（ＰＯＩ）に融合した、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＰＯＩは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ポリペプチドと前記目的のタンパク質との間に、自己切断ペプチドを含む、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項６〜８のいずれかに記載の融合タンパク質をコードすることが可能な核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
目的の導入遺伝子をさらに含む請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記目的の導入遺伝子は、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードし、その結果、前記ベクターが標的細胞を形質導入するために使用される場合、該標的細胞は、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドと、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体とを共発現する、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１４】
前記細胞表面に前記ポリペプチドおよび目的のタンパク質（ＰＯＩ）を共発現する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項９に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１６】
Ｔ細胞である、請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１７】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のベクターで細胞をエキソビボにおいて形質導入またはトランスフェクトする工程を含む、請求項１３〜１６のいずれかに記載の細胞を作製するための方法。
【請求項１８】
以下の工程：
（ｉ）請求項１０〜１２のいずれかに記載のベクターでエキソビボにおいて細胞を形質導入する工程；および
（ｉｉ）該細胞の表面における前記ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープの発現を検出することにより、工程（ｉ）の形質導入効率を調査する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程：
（ｉ）請求項１１に記載のベクターで、エキソビボにおいてトランスフェクトまたは形質導入した細胞の表面における前記ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープの発現を検出する工程；および
（ｉｉ）該ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを発現すると同定された細胞を選択する工程を含む、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現する細胞を選択するための方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法を用いて、細胞の集団から目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現する細胞を選択する工程を含む、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現する細胞について富化された細胞の精製集団を調製するための方法。
【請求項２１】
以下の工程：
（ｉ）請求項１１に記載のベクターで、エキソビボにおいて患者から単離した細胞の集団を形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉ）請求項２０に記載の方法によって、形質導入またはトランスフェクトされた細胞集団から、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現する細胞を選択する工程
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞について富化され、従って目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現する細胞について富化された細胞集団。
【請求項２３】
リツキシマブを含む、請求項１３〜１６のいずれかに記載の細胞を消失させるための組成物であって、前記組成物が前記細胞に曝露されることを特徴とする、組成物。
【請求項２４】
請求項１３〜１６のいずれかに記載の細胞、または請求項２２に記載の細胞集団を含む、被験体における疾患の処置において使用するための組成物であって、前記組成物が該被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項２５】
被験体における疾患の処置において使用するための組成物であって、
細胞が、前記被験体から単離され、請求項１１に記載のベクターで形質導入またはトランスフェクトされること、および
前記投与が、該形質導入またはトランスフェクトされた細胞が該被験体へ戻されることであることをさらに特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
被験体における疾患の処置において使用するための組成物であって、がんの処置において使用するためのものである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
養子細胞移入における使用のための、請求項１３〜１６のいずれかに記載の細胞または請求項２２に記載の細胞集団を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養子細胞療法（ＡＣＴ）において有用なポリペプチドに関連する。そのポリペプチドは、形質導入細胞の選択を可能にするエピトープ、およびそのポリペプチドを発現する細胞が消失させることを可能にするエピトープを含む。本発明はまた、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含む細胞、およびその治療的使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
養子細胞療法（ＡＣＴ）は、悪性および感染性疾患に対する臨床適用において、将来性を示した。例えば、幹細胞または臓器移植後の移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を治療するために、エプスタイン・バーウイルス特異的細胞障害性Ｔ細胞（ＥＢＶ−ＣＴＬ）が開発された（Ｂｒｅｗｉｎら（２００９）１１４：４７９２−４８０３）。濾胞性リンパ腫を治療するために、ＣＤ１９を認識するように遺伝子操作されたＴ細胞が使用された（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１６：４０９９−４１０２）。抗腫瘍Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変された自己リンパ球を用いるＡＣＴが、転移性黒色腫を治療するために使用された（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＤｕｄｌｅｙ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２３３−２４０）。
【０００３】
黒色腫およびＥＢＶ−関連悪性腫瘍の治療に関する腫瘍抗原特異的Ｔリンパ球の報告された成功は、エフェクターＴ細胞を再び標的とし、そしてそれによって、治療し得る腫瘍の範囲を拡大する努力を導いた。
【０００４】
新しい特異性を有するようにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞が操作された。Ｔ細胞受容体由来のシグナル伝達エンドドメインと結合した、典型的には抗体由来の抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も開発された。従って、ＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞障害性エフェクターメカニズムと結びついた抗体の特異性を有する。
【０００５】
Ｂ細胞系統悪性腫瘍の免疫療法のための、ＣＡＲ改変型Ｔリンパ球を用いた多くの臨床試験が進行中である（Ｋｏｈｎら（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：４３２−４３８）。抗ＧＤ２  ＣＡＲ−形質導入Ｔ細胞が、神経芽細胞腫の治療における使用のために、現在臨床開発中である（Ｐｕｌｅら（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４：１２６４−１２７０）。成人リンパ腫におけるＣＡＲの臨床試験において、有効性を示すデータもまた報告された。さらなる例を挙げると、黒色腫抗原を認識する天然Ｔ細胞受容体で形質導入したＴ細胞は、汎発性黒色腫の劇的な寛解を引き起こした。
【０００６】
自殺遺伝子
養子免疫療法の有効性の増加は、重篤な有害事象の報告と関連していた。サイトカインストームのような急性有害事象が、操作したＴ細胞の注入後に報告された。それに加えて、慢性の有害事象が起こり、そして他の事象が動物モデルによって予測された。例えば、腎がんによって発現される抗原、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）に再指向化したＴ細胞は、胆管上皮における予測しないＣＡＩＸの発現に起因して、数人の患者で肝毒性を生じさせた。黒色腫に対する、天然Ｔ細胞受容体移入試験は、皮膚および虹彩における標的抗原の発現に起因して、患者において白斑および虹彩炎を引き起こした。ＴＣＲの交差対形成（ｃｒｏｓｓ  ｐａｉｒｉｎｇ）による移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）様症候群が、天然ＴＣＲ移入後のマウスにおいて報告された。同時刺激を組み込む、いくつかのＣＡＲによる養子移入後の動物モデルにおいて、リンパ増殖性疾患が報告された。最後に、ベクター挿入による突然変異誘発のリスクが常に存在する。急性毒性は、注意深い投薬によって対処し得るが、慢性毒性は、細胞用量非依存性のようである。
【０００７】
操作したＴ細胞は、増殖し、そして投与後何年間も存続し得るので、毒性に直面した場合に、養子的に注入されたＴ細胞の選択的な除去を可能にする安全メカニズムを含むことが望ましい。
【０００８】
自殺遺伝子は、インビボにおいて形質導入細胞の選択的除去を可能にする。２つの自殺遺伝子：ＨＳＶ−ＴＫおよびｉＣａｓｐ９が、臨床試験中である。
【０００９】
Ｔ細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の発現は、ガンシクロビルに対する感受性を与える。このウイルスタンパク質は、高度に免疫原性であるので、ＨＳＶ−ＴＫの使用は、ハプロタイプ一致の骨髄移植のような、重度の免疫抑制の臨床状態に制限される。さらに、それはサイトメガロウイルス治療のためのガンシクロビルの使用を不可能にする。
【００１０】
より最近には、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）が記載され、それを小分子薬剤（ＡＰ２０１８７）の投与によって活性化し得る。ｉＣａｓｐ９の使用は、臨床グレードのＡＰ２０１８７の利用可能性に依存する。それに加えて、遺伝子操作した細胞産物に加えて、実験的小分子の使用は、規制問題を引き起こし得る。
【００１１】
従って、公知の自殺遺伝子に関する誘導薬物の免疫原性および利用可能性に伴う問題を克服する、改善された自殺遺伝子に対するニーズが存在する。
【００１２】
マーカー遺伝子
養子細胞療法の有効性を最大限にするために、形質導入効率をモニタリングし、そして形質導入細胞を選択するメカニズムを有することが望ましい。形質導入細胞の精製された集団を、次いで患者に与え得る。
【００１３】
いくつかのＴ細胞操作戦略は、容易に検出可能な表面タンパク質のトランスジェニック発現を引き起こさない。これらの場合、形質導入の測定および末梢血において細胞を追跡することは困難である。さらに、いくつかの状況において、例えばＧｖＨＤ遺伝子治療プロトコールにおいて、形質導入Ｔ細胞のみを投与することが必須である。ここで、臨床グレードのソートを可能にするマーカーが必要である。
【００１４】
いくつかのマーカー遺伝子が記載された。最初は、ネオマイシン耐性遺伝子であり、この異種タンパク質は抗生物質選択による遅いソートを可能にするのみであるので、今は歴史的に興味深い。低親和性神経成長因子受容体も提案された。免疫原性ではないが、それは予測しない生物学的効果を示した。
【００１５】
より最近には、トランケート型ＣＤ３４がマーカーとして使用された。これは、臨床グレードのソートのために、ＣＤ３４  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ選択システムが容易に利用可能であるという利点を有する。しかし、ＣＤ３４のための導入遺伝子を含むことは、形質導入Ｔ細胞の異常なホーミングを引き起こし得ることが報告された（Ｌａｎｇｅら（２００７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１６：２９７−３０４）。
【００１６】
また、トランケート型ＣＤ３４でさえも長いコード配列を有し、このタンパク質をマーカー遺伝子として含むことは、ベクターのパッケージング能力および転写効率に負担をかける可能性がある。
【００１７】
従って、公知のマーカー遺伝子に関する免疫原性、予測しない生物学的活性、および長いコード配列に伴う問題を克服する、改善されたマーカー遺伝子に対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｂｒｅｗｉｎら（２００９）１１４：４７９２−４８０３
【非特許文献２】Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら（２０１０）Ｂｌｏｏｄ  １１６：４０９９−４１０２
【非特許文献３】ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＤｕｄｌｅｙ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２３３−２４０
【非特許文献４】Ｋｏｈｎら（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：４３２−４３８
【非特許文献５】Ｐｕｌｅら（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４：１２６４−１２７０
【非特許文献６】Ｌａｎｇｅら（２００７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１６：２９７−３０４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（本発明の態様の概要）
本発明は、マーカー部分および自殺部分を両方含む、コンパクトなポリペプチドを提供する。そのポリペプチドは、ＴＣＲまたはＣＡＲをコードする遺伝子のような、治療的導入遺伝子と共発現し得る。
【００２０】
そのマーカー部分は、ＣＤ３４の最小限のエピトープを含み、それは例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ３４  ｃｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを用いた、形質導入細胞の効率的な選択を可能にする。
【００２１】
その自殺部分は、ＣＤ２０由来のエピトープに基づく最小限のエピトープを含む。この配列を含むポリペプチドを発現する細胞を、リツキシマブのような溶解抗体を用いて、選択的に死滅させ得る。
【００２２】
組み合わせたマーカーおよび自殺ポリペプチドは、例えばそのコード配列のレトロウイルス形質導入後、細胞表面に安定に発現する。
【００２３】
ベクターのパッケージングの限界およびＣＤ３４およびＣＤ２０両方の複雑な生物学的効果に起因して、治療的導入遺伝子（ＴＣＲまたはＣＡＲをコードする導入遺伝子のような）に加えてＣＤ２０およびＣＤ３４を共発現することは、技術的に困難である。これらのタンパク質由来の結合エピトープを含むポリペプチドを提供することによって、本発明者らは、高度にコンパクトなマーカー／自殺ポリペプチドを提供し、そのコード配列は、容易にパッケージングされ、そしてＴ細胞操作導入遺伝子と共発現するのに十分小さいが、マーカー選択および自殺部分を介する選択的消失に関して機能性を維持する。結合エピトープを提供することによって、組み合わせたマーカー／自殺ポリペプチドは、全長ＣＤ２０およびＣＤ３４分子に関連する生物学的影響を回避する。
【００２４】
従って、第１の局面において、本発明は、式：
Ｓｔ−Ｒ１−Ｓ１−Ｑ−Ｓ２−Ｒ２
を有するポリペプチドを提供し、
式中、
Ｓｔは軸配列（ｓｔａｌｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、それはそのポリペプチドが標的細胞の表面に発現した場合、ＲおよびＱエピトープを細胞表面から突出させ；
Ｒ１およびＲ２は、各々配列番号１、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するリツキシマブ結合エピトープ、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体であり；
Ｓ１およびＳ２は任意選択のスペーサー配列であり、それは同じまたは異なり得；そして
Ｑは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＱＢＥｎｄ１０結合エピトープ、またはＱＢＥｎｄ１０結合活性があるその変異体である。
【００２５】
Ｒ１およびＲ２は、各々配列番号７で示される配列を有し得る。
【００２６】
Ｒ１とＲ２との間の距離は、ポリペプチドがリツキシマブの両方の抗原結合部位に同時に結合するには長過ぎであり得る。
【００２７】
スペーサー配列Ｓ１およびＳ２は、合わせて少なくとも約１０アミノ酸の長さを有し得る。
【００２８】
Ｒ１とＲ２との間の距離は、７６．５７Åより大きくてもよい。
【００２９】
その軸配列は、ＣＤ８αから誘導可能であり得る。
【００３０】
その軸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含み得る。
【００３１】
そのポリペプチドは、配列番号４で示される配列、または配列番号４で示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含み得、そしてそれは（ｉ）ＱＢＥＮＤ１０に結合し；（ｉｉ）リツキシマブに結合し、そして（ｉｉｉ）細胞表面に発現した場合、リツキシマブの存在下で、細胞の補体媒介性死滅を誘導する。
【００３２】
第２の局面において、本発明は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）に融合した、本発明の第１の局面によるポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【００３３】
そのＰＯＩは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり得る。
【００３４】
その融合タンパク質は、そのポリペプチドと目的のタンパク質との間に、自己切断ペプチドを含み得る。
【００３５】
第３の局面において、本発明は、本発明の第１の局面によるポリペプチド、または本発明の第２の局面による融合タンパク質をコードすることが可能な核酸配列を提供する。
【００３６】
第４の局面において、本発明は、本発明の第３の局面による核酸配列を含むベクターを提供する。
【００３７】
そのベクターはまた、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードし得る、目的の導入遺伝子を含み得る。
【００３８】
第５の局面において、本発明は、本発明の第１の局面によるポリペプチドを発現する細胞を提供する。
【００３９】
その細胞は、そのポリペプチドおよびＰＯＩを細胞表面に共発現し得る。
【００４０】
本発明の第３の局面による核酸配列を含む細胞も提供される。
【００４１】
その細胞は、Ｔ細胞であり得る。
【００４２】
第６の局面において、本発明は、本発明の第５の局面による細胞を作製する方法を提供し、それは細胞を、本発明の第４の局面によるベクターで形質導入またはトランスフェクトする工程を含む。
【００４３】
第７の局面において、本発明は、遺伝子治療法の形質導入効率を調査するための方法を提供し、それは、本発明の第４の局面によるベクターでトランスフェクトまたは形質導入した細胞の表面における、ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープの発現を検出する工程を含む。
【００４４】
第８の局面において、本発明は、以下の工程を含む、ＰＯＩを発現する細胞を選択するための方法を提供する：
（ｉ）本発明の第４の局面によるベクターでトランスフェクトまたは形質導入した細胞の表面における、ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープの発現を検出する工程；および
（ｉｉ）ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを発現すると同定された細胞を選択する工程。
【００４５】
第９の局面において、本発明は、ＰＯＩを発現する細胞について富化された細胞の精製集団を調製するための方法を提供し、それは本発明の第８の局面による方法を用いて、細胞の集団からＰＯＩを発現する細胞を選択する工程を含む。
【００４６】
その方法は、以下の工程を含み得る：
（ｉ）本発明の第４の局面によるベクターで、エキソビボにおいて患者から単離した細胞の集団を形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉ）本発明の第８の局面による方法によって、形質導入／トランスフェクトされた細胞集団から、ＰＯＩを発現する細胞を選択する工程。
【００４７】
第１０の局面において、本発明は、本発明の第１の局面によるポリペプチドを発現する細胞について富化され、従ってＰＯＩを発現する細胞にについて富化された細胞集団を提供する。
【００４８】
第１１の局面において、本発明は、インビボで形質導入細胞を追跡する方法を提供し、それは細胞表面において、本発明の第１の局面によるポリペプチドの発現を検出する工程を含む。
【００４９】
第１２の局面において、本発明は、本発明の第５の局面による細胞を消失させる方法を提供し、それはその細胞をリツキシマブに曝露する工程を含む。
【００５０】
第１３の局面において、本発明は、被験体における疾患を処置するための方法を提供し、それは本発明の第５の局面による細胞、または本発明の第１０の局面による細胞集団を投与する工程を含む。
【００５１】
その方法は、以下の工程を含み得る：
（ｉ）被験体から単離した細胞のサンプルを、本発明の第４の局面によるベクターで形質導入またはトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）その形質導入／トランスフェクトされた細胞を患者へ戻す工程。
【００５２】
その方法は、がんを治療するためであり得る。
【００５３】
第１４の局面において、本発明は、養子細胞移入による治療において使用するための、本発明の第５の局面による細胞、または本発明の第１０の局面による細胞集団を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
式：
Ｓｔ−Ｒ１−Ｓ１−Ｑ−Ｓ２−Ｒ２
を有するポリペプチドであって、
式中、
Ｓｔは軸配列であり、該軸配列は、該ポリペプチドが標的細胞の表面に発現する場合、ＲおよびＱエピトープを該細胞表面から突出させ；
Ｒ１およびＲ２は、各々配列番号１、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するリツキシマブ結合エピトープ、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体であり；
Ｓ１およびＳ２は任意選択のスペーサー配列であり、該スペーサー配列は同じまたは異なり得；そして
Ｑは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＱＢＥｎｄ１０結合エピトープ、またはＱＢＥｎｄ１０結合活性があるその変異体である、ポリペプチド。
（項目２）
Ｒ１とＲ２との間の距離は、前記ポリペプチドがリツキシマブの両方の抗原結合部位に同時に結合するには長過ぎる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記スペーサー配列Ｓ１およびＳ２は、合わせて少なくとも約１０アミノ酸の長さを有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
Ｒ１とＲ２との間の距離は、７６．５７Åより大きい、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目５）
前記軸配列は、ＣＤ８αから誘導可能である、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目６）
前記軸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む、項目５に記載のポリペプチド。
（項目７）
配列番号４で示される配列、または配列番号４で示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含み、
（ｉ）ＱＢＥＮＤ１０に結合し；（ｉｉ）リツキシマブに結合し、そして（ｉｉｉ）細胞の表面に発現した場合、リツキシマブの存在下で、該細胞の補体媒介性死滅を誘導する、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目８）
目的のタンパク質（ＰＯＩ）に融合した、前記項目のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
（項目９）
前記ＰＯＩは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、項目８に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
前記ポリペプチドと前記目的のタンパク質との間に、自己切断ペプチドを含む、項目８または９に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
項目１〜７のいずれかに記載のポリペプチド、または項目８〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質をコードすることが可能な核酸配列。
（項目１２）
項目１１に記載の核酸配列を含むベクター。
（項目１３）
目的の導入遺伝子をさらに含む項目１２に記載のベクター。
（項目１４）
前記目的の導入遺伝子は、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードし、その結果、前記ベクターが標的細胞を形質導入するために使用される場合、該標的細胞は、項目１〜７のいずれかに記載のポリペプチドと、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体とを共発現する、項目１３に記載のベクター。
（項目１５）
項目１〜７のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞。
（項目１６）
前記細胞表面に前記ポリペプチドおよびＰＯＩを共発現する、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
項目１１に記載の核酸配列を含む細胞。
（項目１８）
Ｔ細胞である、項目１５〜１７のいずれかに記載の細胞。
（項目１９）
項目１２〜１４のいずれかに記載のベクターで細胞を形質導入またはトランスフェクトする工程を含む、項目１５〜１８のいずれかに記載の細胞を作製するための方法。
（項目２０）
項目１２〜１４のいずれかに記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入した細胞の表面における前記ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープの発現を検出する工程を含む、遺伝子治療法の形質導入効率を調査するための方法。
（項目２１）
以下の工程：
（ｉ）項目１３に記載のベクターで、トランスフェクトまたは形質導入した細胞の表面における前記ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープの発現を検出する工程；および
（ｉｉ）該ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを発現すると同定された細胞を選択する工程を含む、ＰＯＩを発現する細胞を選択するための方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法を用いて、細胞の集団からＰＯＩを発現する細胞を選択する工程を含む、ＰＯＩを発現する細胞について富化された細胞の精製集団を調製するための方法。
（項目２３）
以下の工程：
（ｉ）項目１３のいずれかに記載のベクターで、エキソビボにおいて患者から単離した細胞の集団を形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉ）項目２２に記載の方法によって、形質導入／トランスフェクトされた細胞集団から、前記ＰＯＩを発現する細胞を選択する工程
を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
項目１〜７のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞について富化され、従ってＰＯＩを発現する細胞にについて富化された細胞集団。
（項目２５）
前記細胞表面における、項目１〜７のいずれかに記載のポリペプチドの発現を検出する工程を含む、インビボで形質導入細胞を追跡するための方法。
（項目２６）
前記細胞をリツキシマブに曝露する工程を含む、項目１５〜１８のいずれかに記載の細胞を消失させるための方法。
（項目２７）
項目１５〜１８のいずれかに記載の細胞、または項目２４に記載の細胞集団を被験体に投与する工程を含む、該被験体における疾患を処置するための方法。
（項目２８）
以下の工程：
（ｉ）項目１３に記載のベクターで、被験体から単離した細胞のサンプルを形質導入またはトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）該形質導入／トランスフェクトされた細胞を該患者へ戻す工程、
を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
がんを処置するための項目２８に記載の方法。
（項目３０）
養子細胞移入における使用のための、項目１５〜１８のいずれかに記載の細胞または項目２４に記載の細胞集団。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、全長ＣＤ３４（ＣＤ３４）、リンカーを介して（ＱＬ８）、リンカー無しで（Ｑ８）ＣＤ８の軸に融合したエピトープ、またはＣＤ８α膜貫通ドメインに直接融合したエピトープ（Ｑ）に対するＱＢＥＮＤ１０の結合を示す。使用したレトロウイルスベクターは、ｅＧＦＰを共発現する。ＱＢＥＮＤ１０の効率的な結合のために、スペーサーは必要であるが、柔軟なリンカーは必要でないという結論が出された。
【図２】図２は、低力価の上清で形質導入したＴ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ３４選択キットを用いて、純粋近くまで富化し得ることを示す。
【図３】図３は、真下に示すＦＡＣＳによる結合による、リツキシマブ結合剤に対する異なる試みを示す：（ａ）全長ＣＤ２０。残りは全てＣＤ８の軸に結合している。（ｂ）ジスルフィド結合の両側の５残基を含む、ＣＤ２０の主な細胞外ループ；（ｃ）ジスルフィド結合システインからのＣＤ２０の主な細胞外ループ；（ｄ）Ｐｅｒｏｓａ（２００７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：７９６７−７９７４）の環状ミモトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）；（ｅ）Ｐｅｒｏｓａ（２００７、上記と同じ）の直鎖状ミモトープ。他の構築物は結合しなかったか、あまり結合しなかったか、または二相性の結合パターンを示したので、構築物（ｄ）が選択された。
【図４】図４は、（ａ）ＲＱＲ８の構造を示す図を示す；（ｂ）ＱＢＥＮＤ１０の結合を、全長ＣＤ３４のものと比較する（左）；リツキシマブのＲＱＲ８に対する結合を、全長ＣＤ２０のものと比較する（右）。ｅＧＦＰが共発現していることに注意；（ｃ）生細胞における補体およびリツキシマブゲーティングに対する曝露後の死滅効率は、実質的に全ての形質導入Ｔ細胞の消失を示す。
【図５】図５は、（ａ）ＦＡＣＳによって検出される、ヒトＴ細胞における第３世代抗ＧＤ２  ＣＡＲの発現、および（ｂ）ＧＤ２＋標的細胞系に対するクロム放出アッセイにおける、非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、抗ＣＤ１９Ｔ細胞、および抗ＧＤ２  Ｔ細胞（ＨｕＫ）の機能を示す。（ｃ）テトラマー染色によって検出された、ＥＢＶ特異的ＣＴＬ上に発現したＨＡ−１マイナー組織適合抗原を認識する天然ＴＣＲαβ。（ｄ）これらの形質導入ＥＢＶ−ＣＴＬによる、ＨＡ−１陽性ＨＬＡ−Ａ２＋ＰＨＡ芽細胞の死滅（ＨＨ）、およびＨＡ−１陰性（ＲＲ）ＨＬＡ−Ａ２＋芽細胞の死滅の欠如。
【図６】図６は、ＧｖＨＤのモデルを示す。Ｂａｌｂ／ｃレシピエントマウスに照射し、そして１０７のＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＴ細胞枯渇骨髄細胞を投与した。コントロールマウスには、さらなる細胞を投与しなかった；テストマウスに、ＲＱＲ８で形質導入した、３×１０６の磁気的にソートしたＣ５７ＢＬ／６脾細胞を投与した。（ａ）ＢＭＴの２９日後に、ＣＤ４およびＴｈｙ１．１に関して染色した脾細胞のＦＡＣＳ。残留性のレシピエントリンパ球（Ｔｈｙ１．１＋）が、コントロールマウスに存在するが、レシピエントマウスには存在せず、ＧｖＨＤを示す。（ｂ）ＱＢＥｎｄ１０で染色した２９日目の脾細胞−形質導入リンパ球が、再びレシピエントマウスに移植されたことが認められ得る。（ｃ）コントロールマウスの腸組織学、および（ｄ）後者において明らかな腸ＧｖＨＤを示すレシピエントマウス。
【図７】図７は、ＧｖＨＤのマウスモデルにおける形質導入脾細胞のＢＬＩを示す。（ａ）本発明者らは、ＲＱＲ８を、自己切断２Ａ配列によって隔てられた、本発明者らの赤色移動コドン最適化ホタルルシフェラーゼと共にインフレームでクローニングした（ＲＱＲ８−２Ａ−ＦＬｕｃ）。（ｂ）Ｂｌａｃｋ６脾細胞を、上記のベクターで形質導入し、ソートおよびＤＬＩとして投与した。（ｂ）生きた動物、および（ｃ）解剖した腸管において、７日後に生物発光イメージングを行った。
【図８】図８は、組換えＲｉｔｕｘ−マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｒｉｔｕｘ−ｍＧ２ａ）の、非形質導入Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、ＱＢＥｎｄ１０エピトープのみの構築物で形質導入したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、およびＲＱＲ８構築物のみで形質導入したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対する結合を示す（ｅＧＦＰが共発現している）。
【図９】図９は、ＲＱＲ８と、（ａ）抗ＧＤ２  ＣＡＲまたは抗ＨＡ１天然ＴＣＲのいずれかとを共発現している構築物を示す。
【図１０】図１０は、（ａ）ＣＤ８の軸にＱｂｅｎｄ１０エピトープ（Ｑ８、コントロールとして）、（ｂ）ＲＱＲ８単独を有するか、あるいは（ｃ）ｉＣａｓｐ９または（ｄ）ＨＳＶ−ＴＫのいずれかと共発現するＱ８を有する提案された構築物を示す。ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を共発現するよう操作された構築物も示す。
【図１１】図１１は、ＱＢＥｎｄ１０結合のより精密なエピトープマッピングを示す。
【図１２】図１２は、ミモトープ結合構築物に基づくリツキシマブ結合エピトープを示す。
【図１３】図１３は、再操作した構築物を示す。
【図１４】図１４は、再操作した構築物によるＣＤＣアッセイを示す。
【図１５】図１５は、ＧｖＨＤモデル評価を示す。
【図１６】図１６は、結晶構造およびおよその距離を示す概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
（詳細な説明）
本発明は、マーカーエピトープおよび自殺エピトープを含むポリペプチドを提供する。
【００５６】
（マーカー遺伝子）
マーカー遺伝子は、成功した形質導入の同定を可能にする、通常標的細胞によって発現されないタンパク質である。
【００５７】
本発明のポリペプチドにおいて、ＣＤ３４由来のマーカーを使用する。ＣＤ３４は、細胞表面糖タンパク質であり、そして細胞−細胞接着因子として機能する。それはまた、幹細胞の骨髄細胞外マトリックスへの結合、または間質細胞への直接的な結合を媒介する。
【００５８】
ＣＤ３４は、最終分化した造血性系統により発現されないので、改変されたＴ細胞の理想的なマーカーである。
【００５９】
ＣＤ３４を発現する細胞を、臨床的な幹細胞単離に一般に使用される試薬である、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ磁気細胞選択システムを用いて、容易に同定および単離し得る。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４選択システムは、細胞の選択を達成するために、ＱＢＥｎｄ１０モノクローナル抗体を利用する。
【００６０】
本発明者らは、ＣＤ３４抗原内からＱＢＥｎｄ１０結合エピトープをマッピングし（実施例を参照のこと）、そしてそれが配列番号２で示されるアミノ酸排列を有することを決定した。
【００６１】
ＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳ（配列番号２）
【００６２】
本発明のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＱＢＥｎｄ１０結合エピトープ、またはＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持するその変異体を含む。
【００６３】
本明細書中で使用される「有する」という用語は、「含む」という用語と同義である。
【００６４】
変異体ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープは、配列番号２で示される配列に基づくが、そのエピトープがＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持するという条件で、アミノ酸挿入、置換、または欠失のような、１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。特に、その配列は、一方または両方の末端で、例えば１または２アミノ酸短縮され得る。
【００６５】
計画的なアミノ酸置換を、そのエピトープのＱＢＥｎｄ１０結合活性が保持される限り、その残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行い得る。例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；正に荷電したアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含む；および同様の親水性の値を有する、無電荷の極性ヘッド基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
【００６６】
例えば、下記の表に従って、保存的置換を行い得る。２番目の列の同じブロック、および３番目の列の同じ行のアミノ酸を、お互いに置換し得る：
【表１】
0006257584.tif 000002
【００６７】
ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープは、配列番号２で示される配列と比較して、例えば５またはそれより少ない、４またはそれより少ない、３またはそれより少ない、２またはそれより少ない、あるいは１アミノ酸の変異を含み得る。
【００６８】
ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープは、配列番号２で示される配列、またはＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持するその変異体から本質的に成り得る。ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープは、配列番号２で示される配列、またはＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持するその変異体から成り得る。
【００６９】
（自殺遺伝子）
自殺遺伝子は、細胞死を引き起こす誘導能力を有するタンパク質をコードする。
【００７０】
本発明のポリペプチドにおいて、ＣＤ２０  Ｂ細胞抗原に基づく自殺部分を使用する。
【００７１】
ＣＤ２０発現細胞を、抗体リツキシマブによる処置によって、選択的に除去し得る。ＣＤ２０発現は、形質細胞には存在しないので、Ｂ細胞区画の欠失にも関わらず、リツキシマブ処置後も、液性免疫は保持される。
【００７２】
ＣＤ２０由来のリツキシマブ結合エピトープ配列は、ＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣ（配列番号５）である。
【００７３】
Ｐｅｒｏｓａら（２００７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：７９６７−７９７４）は、一連のシステイン制限７マー環状ペプチド（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ７−ｍｅｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を記載しており、それは抗ＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブによって認識される抗原モチーフを有するが、異なるモチーフを囲むアミノ酸を有する。以下の表で示すように、全部で１１個のペプチドが記載された：
【表２】
0006257584.tif 000003
【００７４】
Ｌｉら（２００６、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３９：１３６−４３）も、以下の配列を含む、リツキシマブのミモトープを記載している：
ＱＤＫＬＴＱＷＰＫＷＬＥ（配列番号１）
【００７５】
本発明のポリペプチドは、配列番号１、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するリツキシマブ結合エピトープ、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体を含む。
【００７６】
本発明のポリペプチドは、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する、リツキシマブ結合エピトープ、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体を含み得る。
【００７７】
変異体リツキシマブ結合エピトープは、配列番号１、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６から成る群から選択される配列に基づくが、そのエピトープがリツキシマブ結合活性を保持するという条件で、アミノ酸挿入、置換、または欠失のような、１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。特に、その配列は、一方または両方の末端において、例えば１または２アミノ酸トランケートされ得る。
【００７８】
計画的なアミノ酸置換を、そのエピトープのリツキシマブ結合活性が保持される限り、その残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行い得る。例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；正に荷電したアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含む；および同様の親水性の値を有する、無電荷の極性ヘッド基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
【００７９】
例えば、前のセクションで示した表に従って、保存的置換を行い得る。２番目の列の同じブロック、および３番目の列の同じ行のアミノ酸を、お互いに置換し得る。
【００８０】
そのリツキシマブ結合は、配列番号１、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６から成る群から選択される配列と比較して、例えば３またはそれより少ない、２またはそれより少ない、あるいは１アミノ酸の変異を含み得る。
【００８１】
そのリツキシマブ結合は、配列番号１、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６で示される配列のうちの１つ、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体から本質的に成り得る。そのリツキシマブ結合エピトープは、配列番号１、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６で示される配列、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体から本質的に成り得る。
【００８２】
２つの同一の（または同様の）リツキシマブ結合アミノ酸配列を使用する場合、２つのＲ部分をコードするために、異なるＤＮＡ配列を使用することが最善であり得る。多くの発現システムにおいて、相同的な配列は、望ましくない組換えの事象を引き起こし得る。遺伝コードの縮重を用いて、代替コドンを使用して、タンパク質配列を変えずにＤＮＡ配列の変化を達成し得、それによって相同組換えの事象を予防する。
【００８３】
（軸配列）
本発明のポリペプチドは、軸配列を含み、それは、そのポリペプチドが標的細胞の表面に発現した場合、ＲおよびＱエピトープを、標的細胞の表面から遠くへ突き出させる。
【００８４】
その軸配列は、例えばリツキシマブおよび／またはＱＢＥｎｄ１０の結合を促進するために、ＲおよびＱエピトープを細胞表面から十分離す。
【００８５】
その軸配列は、エピトープを細胞表面から持ち上げる。
【００８６】
その軸配列は、実質的に直鎖状のアミノ酸配列であり得る。その軸配列は、ＲおよびＱエピトープを標的細胞の表面から離すために十分長くあり得るが、そのコード配列がベクターのパッケージングおよび形質導入効率を損なうほど長くはない。その軸配列は、例えば３０と１００アミノ酸との間の長さであり得る。その軸配列は、約４０〜５０アミノ酸の長さであり得る。
【００８７】
その軸配列は、高度にグリコシル化され得る。
【００８８】
その軸配列は、以下の配列を含み得るか、または長さがおよそ同等であり得る：
ＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号３）
【００８９】
その軸配列はさらに、任意で細胞内アンカー配列と共に、膜貫通ドメインを含み得る。その膜貫通ドメインおよび細胞内アンカー配列は、その軸配列の細胞外部分と同じタンパク質由来であり得るか、またはそれ／それらは異なるタンパク質由来であり得る。その膜貫通ドメインおよび細胞内アンカー配列は、ＣＤ８から誘導可能であり得る。
【００９０】
膜貫通ドメインおよび細胞内アンカーを含むＣＤ８軸配列は、以下の配列を有し得る：
【化１】
0006257584.tif 000004
【００９１】
この配列内で、下線部分はＣＤ８α軸に対応する；中央部分は、膜貫通ドメインに対応する；および太字の部分は細胞内アンカーに対応する。
【００９２】
（スペーサー）
本発明のポリペプチドは、以下の式：
Ｓｔ−Ｒ１−Ｓ１−Ｑ−Ｓ２−Ｒ２
を有し、
ここで
Ｓｔは軸配列である
Ｒ１およびＲ２は、リツキシマブ結合エピトープである；および
Ｑは、ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープである。
【００９３】
上記の式において、Ｓ１およびＳ２は、任意選択のスペーサー配列であり、それらは同じまたは異なり得る。
【００９４】
リツキシマブは、Ｙ形の分子の各先端に１つずつ、２つの抗原結合部位を有する古典的抗体分子である。
【００９５】
そのスペーサー配列は、そのポリペプチドが細胞表面に発現した場合、Ｒ１とＲ２との間の距離が長過ぎて、そのポリペプチドがリツキシマブ分子の両方の抗原結合部位に同時に結合できないような長さおよび立体配置であり得る。
【００９６】
そのスペーサー配列Ｓ１およびＳ２は、合わせて少なくとも約１０アミノ酸の長さを有し得る。
【００９７】
発現したポリペプチドにおいて、Ｒ１とＲ２との間の距離は、７６．５７Åより長くてもよい。例えば、そのスペーサー配列の長さおよび立体配置は、Ｒ１とＲ２との間の距離が、少なくとも７８、８０、または８５Åになるような距離であり得る。この計算の目的のために、直鎖状骨格における別個のアミノ酸間の分子距離を、アミノ酸あたり約３Åと仮定し得る。
【００９８】
そのリンカー配列は、実質的に直鎖状であり得る。それらはセリンおよびグリシン残基を含み得るか、またはそれらから成り得る。そのリンカー配列は、以下の一般式を有し得：
Ｓ−（Ｇ）ｎ−Ｓ
ここでＳはセリンであり、Ｇはグリシンであり、そしてｎは２と８との間の数字である。そのリンカー、または各リンカーは、配列Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓを含み得るか、またはそれから成り得る。
【００９９】
Ｑエピトープおよびスペーサーの合わせた長さ（すなわち、そのペプチドのＳ１−Ｑ−Ｓ２部分の長さ）は、少なくとも２８アミノ酸であり得る。
【０１００】
（ＲＱＲ８配列）
本発明のポリペプチドは、配列番号４で示される１３６アミノ酸の配列を含み得るか、またはそれから成り得る。
ＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号４）
【０１０１】
そのポリペプチドはまた、アミノ末端にシグナルペプチドを含み得る。そのシグナルペプチドは、例えば配列番号１８で示される配列を含み得るか、またはそれから成り得る。
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡ（配列番号１８）
【０１０２】
そのようなシグナルペプチドおよび上記で示した１３６アミノ酸の配列を含むポリペプチドは、従って以下の１５７アミノ酸の配列を有する：
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶ（配列番号１９）
【０１０３】
いったんそのポリペプチドが標的細胞によって発現されたら、そのシグナルペプチドは切断され、１３６ａａの成熟ペプチド産物を生じる。
【０１０４】
天然ＣＤ３４タンパク質は、３８５アミノ酸残基の長さであり、従って全長ＣＤ３４の発現のためには１ｋｂを超えるＤＮＡ配列が必要である。従って、ＲＱＲ８構築物全体は、ＣＤ３４タンパク質単独のサイズの約１／３である。
【０１０５】
従ってそのＲＱＲ８構築物は、全長ＣＤ３４マーカー遺伝子よりも、はるかに管理しやすいサイズである。それは、少なくとも全長ＣＤ２０によって示されるものと同等の溶解感受性を有する自殺遺伝子エレメントを含むというさらなる利点を有する。
【０１０６】
本発明のポリペプチドは、配列番号４で示される配列の変異体を含み得るか、またはそれから成り得、それは、配列番号４のポリペプチドの機能的活性を保持する限り、配列番号４で示される配列と少なくとも７０％、８０％、または９０％の同一性を有する。例えば、その変異体配列は、（ｉ）ＱＢＥＮＤ１０に結合し；（ｉｉ）リツキシマブに結合し、および（ｉｉｉ）細胞表面に発現した場合、リツキシマブの存在下で補体媒介性の細胞の死滅を誘導しなければならない。
【０１０７】
眼によって、またはＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージのような、容易に利用可能な配列比較プログラムの補助によって、相同性比較を行い得る。
【０１０８】
（融合タンパク質）
本発明のポリペプチドは、融合タンパク質の形式であり得、ここでそのポリペプチドは、目的のタンパク質（ＰＯＩ）に融合している。
【０１０９】
その融合タンパク質は、ポリペプチドと目的のタンパク質との間に、自己切断ペプチドを含み得る。そのような自己切断ペプチドは、標的細胞内のそのポリペプチドおよびＰＯＩの共発現、続く切断を可能にするため、そのポリペプチドおよびＰＯＩは、細胞表面において別個のタンパク質として発現する。例えば、その融合タンパク質は、口蹄疫自己切断２Ａペプチドを含み得る。
【０１１０】
（目的のタンパク質）
その目的のタンパク質は、標的細胞の表面において発現するための分子である。そのＰＯＩは、その標的細胞がインビボにある場合、治療的または予防的効果を発揮し得る。
【０１１１】
そのＰＯＩは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり得る。
【０１１２】
抗原認識ドメイン（外部ドメイン）を、シグナル伝達分子の膜貫通および細胞内部分（エンドドメイン）に連結させることによって、キメラ抗原受容体を産生する。その外部ドメインは、最も一般には抗体可変鎖（例えばＳｃＦｖ）由来であるが、Ｔ細胞受容体可変ドメインまたは他の分子からも産生され得る。そのエンドドメインは、ＣＤ３−ζの細胞内部分を含み得る。そのエンドドメインは、ＣＤ２８−ＯＸ４０−ＣＤ３ζ３部構成細胞質ドメインを含み得る。
【０１１３】
そのＰＯＩは、腫瘍関連抗原、すなわちがん細胞において発現または過剰発現しているタンパク質に対する特異性を有するＣＡＲまたはＴＣＲであり得る。そのようなタンパク質は、１５−２０％の乳がん患者において過剰発現しており、そしてより侵攻性の疾患（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）と関連するＥＲＢＢ２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）；ほとんどのＢ細胞悪性腫瘍に発現するＣＤ１９；多くの場合腎細胞がんにおいて過剰発現する、カルボキシ−アンヒドラーゼ−ＩＸ（ｃａｒｂｏｘｙ−ａｎｈｙｄｒａｓｅ−ＩＸ）；神経芽細胞腫細胞に発現するＧＤ２；ｐ５３；ＭＡＲＴ−１（ＤＭＦ５）；ｇｐ１００：１５４；ＮＹ−ＥＳＯ−１；およびＣＥＡを含む。
【０１１４】
（核酸配列）
本発明の第２の局面は、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードすることが可能な核酸配列に関する。
【０１１５】
その核酸は、標的細胞によって発現される場合、コードされたポリペプチドを、標的細胞の細胞表面に発現させる。その核酸がポリペプチドおよびＰＯＩの両方をコードする場合（例えば融合タンパク質として）、本発明のポリペプチドおよびＰＯＩの両方を、標的細胞の表面に発現させるはずである。
【０１１６】
その核酸配列は、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡのようなＤＮＡであり得る。
【０１１７】
（ベクター）
本発明はまた、本発明の核酸配列を含むベクターを提供する。そのベクターはまた、目的の導入遺伝子、すなわちＰＯＩをコードする遺伝子を含み得る。
【０１１８】
そのベクターは、標的細胞が本発明のポリペプチドおよび必要に応じて目的のタンパク質を発現するように、標的細胞をトランスフェクトまたは形質導入することが可能でなければならない。
【０１１９】
そのベクターは、プラスミドのような非ウイルスベクターであり得る。
【０１２０】
そのベクターは、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターのようなウイルスベクターであり得る。
【０１２１】
そのベクターは、ポリペプチドをコードする核酸、およびＰＯＩを含む核酸を、別個の実体として、または単一のヌクレオチド配列として含み得る。それらが単一のヌクレオチド配列として存在する場合、それらは、下流の配列の翻訳を可能にするために、２つのコード部分の間に、１つまたは複数の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含み得る。
【０１２２】
（細胞）
本発明はまた、本発明の第１の局面によるポリペプチドを発現する細胞を提供する。その細胞は、細胞表面に、そのポリペプチドおよびＰＯＩを共発現し得る。
【０１２３】
本発明はまた、本発明の第１の局面によるポリペプチドをコードすることが可能な核酸配列を含む細胞を提供する。
【０１２４】
その細胞を、本発明によるベクターで形質導入またはトランスフェクトし得た。
【０１２５】
その細胞は、養子細胞療法に適切であり得る。
【０１２６】
その細胞は、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のようなＴ細胞であり得る。そのＴ細胞は、既存の特異性を有し得る。例えば、それはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）特異的Ｔ細胞であり得る。
【０１２７】
その細胞は、患者由来であり得る。例えば、その細胞を、患者から除去し、次いでエキソビボで本発明によるベクターによって形質導入し得る。
【０１２８】
ＡＣＴに適切なＴ細胞集団は、バルク末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＣＤ８＋細胞（例えば、ＣＤ４枯渇ＰＢＭＣ）；制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を選択的に枯渇したＰＢＭＣ；単離セントラルメモリー（Ｔｃｍ）細胞；ＥＢＶ特異的ＣＴＬ；およびｔｒｉ−ウイルス特異的ＣＴＬを含む。
【０１２９】
本発明はまた、本発明による細胞を含む細胞集団を含む。その細胞集団は、本発明によるベクターによって形質導入されていてもよい。その細胞集団の細胞の一部は、細胞表面に、本発明の第１の局面によるポリペプチドを発現し得る。その細胞集団の細胞の一部は、細胞表面に、本発明の第１の局面によるポリペプチドおよびＰＯＩを共発現し得る。その細胞集団は、エキソビボにおける患者由来細胞集団であり得る。
【０１３０】
（マーカー配列を用いた選択）
本発明は、目的の導入遺伝子（それは目的のタンパク質ＰＯＩをコードする）による形質導入を測定する方法を提供し、それは細胞の集団を、本発明のポリペプチドおよび目的のタンパク質を共発現するベクターによって形質導入し、そして細胞表面におけるＱＢＥｎｄ１０結合エピトープの発現を検出する工程を含み、ここで本発明のポリペプチドを発現する細胞の割合は、目的の導入遺伝子で形質導入された細胞の割合に対応する。
【０１３１】
本発明はまた、ＰＯＩを発現する細胞を選択するための方法を提供し、それは以下の工程を含む：
（ｉ）ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列を含む、本発明のベクターによってトランスフェクトまたは形質導入された細胞の表面における、ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープの発現を検出する工程；および
（ｉｉ）ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを発現すると同定された細胞を選択する工程。
【０１３２】
細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ３４  ｃｌｉｎｉＭＡＣＳシステムを用いてソートし得る。このシステムを、ＧＭＰ施設における臨床グレードのソートにおいて使用するために十分に適合させる。
【０１３３】
ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープを発現する細胞を、ＦＡＣＳのような、当該分野で公知の方法によって同定および／またはソートし得る。
【０１３４】
本発明はまた、ＰＯＩを発現する細胞にについて富化された精製細胞集団を調製する方法を提供し、それは上記で記載した方法を用いて、細胞集団からＰＯＩを発現する細胞を選択する工程を含む。
【０１３５】
本発明はまた、そのような方法によって調製された、ＰＯＩ発現細胞の精製集団を提供する。
【０１３６】
精製細胞集団において、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の細胞が、ＰＯＩ（および本発明によるポリペプチド）を発現し得る。
【０１３７】
本発明はまた、インビボで、形質導入細胞を追跡するための方法を提供し、それは細胞表面における本発明のポリペプチドの発現を検出する工程を含む。細胞を、生物発光イメージングのような、当該分野で公知の方法によってインビボで追跡し得る。そのような適用に関して、本発明のポリペプチドを、ルシフェラーゼのような検出可能なタンパク質と共発現するよう操作し得る。
【０１３８】
自殺配列を用いた消失
本発明はまた、本発明によるベクターによって形質導入した細胞を消失させるための方法を提供し、それはその細胞を補体およびリツキシマブに曝露する工程を含む。
【０１３９】
本発明のポリペプチドが細胞の表面に発現する場合、リツキシマブの、ポリペプチドのＲエピトープへの結合が、細胞の溶解を引き起こす。
【０１４０】
細胞表面に発現するポリペプチドあたり、１つより多くのリツキシマブの分子が結合し得る。ポリペプチドの各Ｒエピトープは、別々のリツキシマブの分子に結合し得る。
【０１４１】
細胞の消失は、例えばリツキシマブを患者へ投与することによって、インビボで起こり得る。
【０１４２】
移入した細胞を消失する決定は、その移入した細胞に起因する、患者において検出される望ましくない効果から生じ得る。例えば、許容できないレベルの毒性を検出し得る。
【０１４３】
（治療方法）
遺伝子改変したＴ細胞の養子移入は、抗腫瘍免疫応答のような、望ましい免疫応答を生じさせるために魅力的なアプローチである。
【０１４４】
本発明は、被験体において疾患を治療および／または予防する方法を提供し、それは本発明による細胞を被験体に投与する工程を含む。その方法は、細胞集団を被験体に投与する工程を含み得る。その細胞集団を、上記で記載した方法を用いて、目的の導入遺伝子を発現する細胞にについて富化し得る。
【０１４５】
その方法は、以下の工程を含み得る：
（ｉ）血液サンプルのような細胞のサンプルを患者から採取する工程、
（ｉｉ）Ｔ細胞を抽出する工程、
（ｉｉｉ）そのＴ細胞を、マーカー／自殺配列および目的の導入遺伝子をコードする核酸配列を含む本発明のベクターによって形質導入またはトランスフェクトする工程、
（ｉｖ）その形質導入細胞を、エキソビボで増殖させる工程、
（ｖ）その細胞を患者へ戻す工程。
【０１４６】
その形質導入細胞は、腫瘍特異的標的化および死滅の増強のような、望ましい治療的性質を有し得る。
【０１４７】
本発明の細胞を、がんを治療するために使用し得る。ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＤｕｄｌｅｙ（２００９−上記と同じ）において説明されるように、実質的に全ての腫瘍が、ＡＣＴアプローチを用いた溶解に対して同等に感受性であり、そして腫瘍抗原に遭遇場合抗腫瘍リンパ球からのサイトカイン放出を刺激し得る。
【０１４８】
本発明の細胞を、例えばリンパ腫、Ｂ細胞系統悪性腫瘍、転移性腎細胞がん（ＲＣＣ）、転移性黒色腫または神経芽細胞腫を治療するために使用し得る。
【０１４９】
あるいは、本発明の細胞を、非がん性疾患を治療または予防するために使用し得る。その疾患は、感染性疾患、または移植に関連する状態であり得る。
【０１５０】
本発明の細胞を、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を治療または予防するために使用し得る。
【０１５１】
本発明をさらに、実施例によって説明し、それは当業者が本発明を実行することを補助するのに役立つことを意味し、そしていかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【０１５２】
（実施例１−ＣＤ３４抗原由来のＱＢＥｎｄ１０エピトープをエピトープマッピングする）
本発明者らは、まずＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４選択システムにおいて使用される抗体、ＱＢＥＮＤ１０に結合するＣＤ３４のエピトープを発見しようとした。この目的のために、彼らは天然ＣＤ３４抗原由来の推定ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープのレトロウイルスライブラリーを生成した。
【０１５３】
ＱＢＥｎｄ１０結合ドメインを単離したら、ＱＢＥｎｄ１０結合エピトープのさらなる最小化を、二方向性欠失戦略を用いて達成した（図１１）。
【０１５４】
１６アミノ酸残基のみを含み、そして配列ＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳを有する、最終的な最小エピトープ結合構築物が得られた。
【０１５５】
（実施例２−ＣＤ３４エピトープを細胞表面から離すために、スペーサーを導入する）
エピトープの提示における改善を調査するために、様々な軸およびリンカーの組み合わせを試験した。マーカー遺伝子の結合効率を試験するために、成功したトランスフェクションのマーカーとしてｅＧＦＰを発現する、バイシストロニックなベクターを使用した。
【０１５６】
使用した軸は、ＣＤ８α由来であった。この高度にグリコシル化された構造は、有効なスペーサーとして作用し、そのエピトープを細胞表面から持ち上げる。それは比較的短い長さ：たった４９アミノ酸長である。
【０１５７】
３つの構築物を検討した：推定エピトープを細胞表面から離して突き出すための柔軟なリンカー配列ありおよび無しの、２つのＣＤ８軸結合構築物を、より小さい膜近位構築物に対して比較した。そのＣＤ８軸結合構築物は、全長ＣＤ３４に関して、同等のＱＢＥＮＤ１０の結合を達成し得た（図１）。この構築物で形質導入したＴ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＱＢＥｎｄ１０ビーズを用いて、容易に磁気的にソートされることが示された（図２）。
【０１５８】
（実施例３−リツキシマブ結合エピトープの包含）
本発明者らは、推定自殺遺伝子として、ＣＤ２０  Ｂ細胞抗原をエピトープマッピングすることを決定した。リツキシマブは、ＣＤ２０発現標的に関して高度に溶解性である。最近の結晶学的データは、リツキシマブ−結合相互作用を、大きな細胞外ループに局在化するとして同定した。このデータに基づいて、本発明者らは、この最小ループ構造のバージョンを発現する一対の構築物を生成した。
【０１５９】
彼らは、まず結晶学によってリツキシマブ結合部位であると同定された、ＣＤ２０の主な細胞外ループの異なる断片を共発現した。これらの構築物は、リツキシマブに結合しなかった。
【０１６０】
次に、彼らは直鎖状および環状リツキシマブ結合ミモトープ（Ｐｅｒｏｓａら（２００６）によって上記のように説明される）を試した。ミモトープは、ファージディスプレイによって同定されたペプチド配列であり、それは標的抗体の優れた結合を示す。彼らは、検討のために、ジスルフィド結合で制約された環状ミモトープ、および直鎖状ミモトープの両方を選択した（図１２）。環状ミモトープ（１１アミノ酸）を含むことは、良好なリツキシマブ結合を与えた（図３）。
【０１６１】
有効なリツキシマブ結合を示したら、次いで彼らは機能的アッセイを行って、インビトロＣＤＣアッセイを用いて、その組み合わせ構築物の機能的有効性を評価した。しかし、補体媒介性死滅は、６５％のみで不十分だった（データは示していない）。この問題を解決する試みにおいて、変異体構築物を生成した（図１３）。
【０１６２】
ＣＤ８の軸上で、単一のＱＢＥｎｄ１０エピトープに隣接する２つのＣＤ２０環状ミモトープを構成する最終的な構築物は、最適なＱＢｅｎｄ１０およびリツキシマブの結合、ならびに高度に有効な補体媒介性死滅を可能にした（ＲＱＲ８と呼ばれる、図４および１４）。
【０１６３】
このＲＱＲ８構築物は、たった１３６アミノ酸長である。ＱＢＥＮＤ１０の結合は、全長ＣＤ３４のものと同様である。ＲＱＲ８で形質導入したＴ細胞を、ＣＤ３４  ｃｌｉｎｉＭＡＣＳを用いて、効率的にソートし得る（データは示していない）。リツキシマブの結合は、天然ＣＤ２０と比較して３．４倍増加した。補体媒介性死滅は、＞９７％の形質導入されたソートＴ細胞を消失させ得る。
【０１６４】
（実施例４−リツキシマブのマウスＩｇＧ２ａバージョンの構築）
ヒトＩｇＧ１定常領域を有するリツキシマブは、マウスにおいて特に溶解性ではない。ハイブリドーマＩＤＥＣ−２Ｂ８は、リツキシマブ可変領域の供給源であるが、マウスＩｇＧ１ハイブリドーマである。リツキシマブのマウス同等物を産生するために、マウスＩｇＧ２ａバージョンを生成することが必要であった。本発明者らは、マウスカッパ／ＩｇＧ２ａ定常領域とインフレームで、重鎖および軽鎖可変領域をクローニングした。次いで組換えｍＡｂ（Ｒｉｔｕｘ−ｍＧ２ａと命名）を、Ｋ５６２細胞懸濁液から生成した。これはＲＱＲ８に結合し（図８）、そして補体媒介性溶解およびＡＤＣＣに関して、マウスモデルにおけるリツキシマブの機能的同等物である。
【０１６５】
（実施例５−Ｔ細胞がん遺伝子治療適用のためのＲＱＲ８の使用）
本発明者らは、以前に第３世代抗ＧＤ２キメラ抗原受容体を生成した［図５（ａ）および（ｂ）］。彼らはまた、トランスジェニック発現のために、ＨＡ−１１８天然ＴＣＲを最適化した［図５（ｃ）および（ｄ）］。両方とも、ＲＱＲ８と共発現した。
【０１６６】
ＲＱＲ８遺伝子を（ａ）ＣＡＲまたは（ｂ）天然ＴＣＲのいずれかと共発現する、２つのテスト構築物を構築する（図８）。口蹄疫自己切断２Ａペプチドは、共発現を可能にする。
【０１６７】
共発現／２Ａ切断の効率を、正常なドナーＴ細胞において、フローサイトメトリー（図５に示すように）およびウェスタンブロッティングによって試験した。ソートされていない形質導入Ｔ細胞およびソートされた形質導入Ｔ細胞の機能を、標的およびコントロールに対する応答における、クロム放出アッセイ、増殖、およびサイトカインビーズアレイによって比較する。
【０１６８】
ソートされたＴ細胞およびソートされていないＴ細胞の延長された表現型も特徴付ける。リツキシマブ／補体による枯渇の前および後に、形質導入バルク集団のエフェクター活性の喪失を測定する。
【０１６９】
（実施例６−ＲＱＲ８のインビボ試験および他の自殺遺伝子とのインビボ比較）
本発明者らは、ＧｖＨＤのマウスモデルを開発した。ＲＱＲ８で形質導入した脾細胞は、投与後ＧｖＨＤを引き起こす（図６）。インビボでＲＱＲ８を試験するために、移植マウスに、ＲＱＲ８−２Ａ−ＦＬｕｃまたはコントロールＱ８−２Ａ−ＦＬｕｃで形質導入した脾細胞のいずれかを投与する［（ａ’）および（ｂ’）図１０］。半数のマウスに、体重減少によってＧｖＨＤが明らかである１０日目に、Ｒｉｔｕｘ−ｍＧ２ａを投与する。
【０１７０】
インビボにおける使用のために最適化したホタルルシフェラーゼによる生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって、インビボでＴ細胞を追跡することが可能である（図７）。この実験において、ＢＬＩシグナルは減衰し、そして体重を７日にわたって比較する。この後、マウスを屠殺する。ドナーＴ細胞の持続を、血液、骨髄、および脾臓から、定量的フローサイトメトリーによって測定する。ＧｖＨＤを、腸管および肝臓の組織学的評価によって測定する。
【０１７１】
図１５に示すように、生存およびＧｖＨＤの解明（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）によって示されるように、マウスにＲＱＲ８を投与する明らかな利点が存在する。骨髄が、ドナー細胞の貯蔵場所のようである。この画像によって示されるデータは、マウスリツキシマブ媒介性消失後の、レシピエントマウスにおけるトランスジェニック細胞の残存性の生着を示す。棒の高さは、実験の最後における、マウスのＴ細胞区画の割合としての、移植Ｔ細胞の割合レベルを示す。明らかに、赤い棒は緑の棒よりかなり高く、リツキシマブ媒介性消失の非存在下におけるトランスジェニック細胞の生着レベルを示す。
【０１７２】
ｉＣａｓｐ９およびＨＳＶ−ＴＫをＲＱＲ８と比較するために、構築物（ｂ’）、（ｃ’）、および（ｄ’）で形質導入した脾細胞を、移植マウスに投与する。１０日目に、ｒｉｔｕｘ−ｍＧ２ａ、ＡＰ２０１８７、およびガンシクロビルをそれぞれ投与する。ＢＬＩシグナルの継時的な減衰および体重減少を測定し、続いて１７日目の屠殺時に、組織学によってドナーＴ細胞の持続およびＧｖＨＤを定量した。
【０１７３】
（結論）
本発明者らは、Ｔ細胞の１３６アミノ酸のマーカー／自殺遺伝子を作成した。レトロウイルス形質導入後、翻訳されたタンパク質は、細胞表面に安定に発現する。それは、全長ＣＤ３４と同じ親和性でＱＢＥＮＤ１０に結合する。さらに、その構築物は、リツキシマブに結合し、そして２重エピトープデザインは、高度に有効な補体媒介性死滅を引き起こす。構築物の小さいサイズに起因して、それをＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体および他のような、典型的なＴ細胞操作導入遺伝子と容易に共発現し得、容易な検出、細胞の選択、および許容できない毒性に直面した場合の、市販の臨床グレード試薬／医薬による細胞の消失を可能にする。
【０１７４】
上記の明細書中で言及された全ての出版物は、参照によって本明細書中に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な改変および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明が、特定の好ましい実施態様に関連して記載されたが、請求される本発明は、そのような特定の実施態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、細胞治療、Ｔ細胞操作、分子生物学、または関連する分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載された形態の様々な改変が、以下の請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（ａ）】
0006257584.tif 000011
【図７（ｂ）】
0006257584.tif 000012
【図７（ｃ）】
0006257584.tif 000013
【図８】
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【図９（ａ）】
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【図９（ｂ）】
0006257584.tif 000016
【図１０】
0006257584.tif 000017
【図１１】
0006257584.tif 000018
【図１２】
0006257584.tif 000019
【図１３】
0006257584.tif 000020
【図１４】
0006257584.tif 000021
【図１５】
0006257584.tif 000022
【図１６】
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【配列表】
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