(57)【要約】  化合物、組成物、癌の治療方法がここに開示される。本発明の態様は式(I)：【化１】2010522759.tif 000016  ここで、R1が水素または置換もしくは非置換(C1-C6)アルキルもしくは(C3-C6)シクロアルキルから選択され、R2およびR3が、水素、置換もしくは非置換の(C1-C6)アルキルもしくは(C4-C6)シクロアルキルから独立して選択されるか、またはそれらが結合するN原子と共に３−６員のヘテロシクロアルキルを形成し、ｎが１−５である、を有する化合物を含む。本発明の態様はまた、式(I)の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物および当該治療を必要とする患者に当該化合物を投与することにより癌を治療する方法を含む。【選択図】なし
2010522759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2010522759.tif 000011
ここで、
R1が水素または置換もしくは非置換の(C1-C6)アルキルもしくは(C3-C6)シクロアルキルから選択され、
R2およびR3が、水素または置換もしくは非置換の(C1-C6)アルキルもしくは(C4-C6)シクロアルキルから独立して選択されるか、またはそれらが結合するN原子と共に３−６員のヘテロシクロアルキルを形成し、
nが１−５である、
を有する化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、nが１−３である化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、R1が水素であり、nが１である化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物であって、R2およびR3が水素であり、nが1である化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、R1が(C1-C3)アルキルである化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物であって、R1、R2、およびR3が水素であり、nが１である化合物。
【請求項７】
式：
【化２】
2010522759.tif 000012
ここで、
R1が水素または置換もしくは非置換の(C1-C6)アルキルもしくは(C3-C6)シクロアルキルより選択され、
R2およびR3が水素、置換もしくは非置換の(C1-C6)アルキル、(C4-C6)シクロアルキルから独立して選択されるか、またはそれらが結合するＮ原子と共に３−６員のヘテロシクロアルキルを形成し、
ｎが１−５である、
を有する化合物の単位用量またはその薬学的に許容される塩の単位用量；および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の薬学的組成物であって、R1、R2、およびR3が水素であり、ｎが１である薬学的組成物。
【請求項９】
滅菌した投薬形態にある請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項７に記載の薬学的組成物であって、当該薬学的に許容される塩が、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、トシレート、ベンゾイレート、およびメシレートからなる群より選択される薬学的組成物。
【請求項１１】
癌を治療する方法であって、
式：
【化３】
2010522759.tif 000013
ここで、
R1が水素または置換もしくは非置換の(C1-C6)アルキルもしくは(C3-C6)シクロアルキルから選択され、
R2およびR3が、水素または置換または非置換の(C1-C6)アルキルもしくは(C4-C6)シクロアルキルから独立して選択されるか、またはそれらが結合するN原子と共に３−６員のヘテロシクロアルキルを形成し、
nが１−５である、
を有する化合物を含む治療上効果的な量の組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、ｎが１−３である方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、R1が水素であり、nが１である方法。 
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、R2およびR3が水素であり、nが１である方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法であって、R1、R2、およびR3が水素であり、nが１である方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載の方法であって、当該癌が、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、リンパ腫、前立腺癌、および膵臓癌からなる群より選択される方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の方法であって、当該癌が子宮頸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、精巣癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮内膜／子宮癌、胃癌、肝臓癌、甲状腺癌、骨肉種、結合組織癌、筋肉癌、中枢神経系癌および白血病から選択される方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の方法であって、当該組成物が、患者への経口投与のための固形の投薬形態である方法。
【請求項１９】
式：
【化４】
2010522759.tif 000014
を有する化合物。
【請求項２０】
式：
【化５】
2010522759.tif 000015
を有する治療上効果的な量の化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む癌の治療方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、当該癌が、膵臓癌、前立腺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、またはリンパ腫から選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、2007年3月26日に出願された米国仮特許出願番号60/920,005の優先権を主張し、その開示は参照によりあらゆる目的のためにここに組み込まれる。
【０００２】
連邦政府により後援される研究に関する記載
この発明は、国立衛生研究所、国立癌協会により授与されたCA-23074の下、政府の支援により行われた。米国政府は、当該発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
この開示は、概してイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体、特に、イミノピロリドンチオールアミノ酸複合体化合物および薬学的組成物ならびに癌治療においてイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体を利用する方法に関連するがこれらに限定されない。
【０００４】
背景技術
癌はヒトおよび動物の中で主要な死亡原因である。そのようなものとして、当該疾患の多くの形態の治療に有用な化合物および組成物の同定および開発にかなりの財源が投資された。数多くの治療選択肢が広範囲の研究努力により開発され、多くの症例において治療における劇的な改善および癌患者の生存につながる一方、当該疾患の多くの形態を治療する上での継続的な発展は、さらなる治療選択肢の開発を必要とする。残念ながら、多くの場合、すべての患者が既存の治療薬に応答するわけではなく、治療が進行にするにつれ、患者は頻繁に現行の治療法に対する耐性を発達させる。これらの不都合のため、前記の耐性を克服するか、あるいは別の癌患者集団に効果的な治療を提供し得る新規の治療選択肢が望ましい。
【０００５】
発明の概要
本発明は、抗癌活性を有するイミノピロリドンアミノ酸複合体およびその薬学的に許容される塩、イミノピロリドンアミノ酸複合体を含む薬学的組成物、それを必要とする患者に対するイミノピロリドンアミノ酸接合体の投与による癌の治療方法、ならびにイミノピロリドンアミノ酸複合体および癌治療におけるそれらの使用のための説明書を含む医薬のキットに向けられる。
【０００６】
一つの側面において、本発明は以下の式を有する化合物を提供する
【化１】
2010522759.tif 000003
【０００７】
式（I）において、R1は水素、または置換もしくは非置換の(C1-C6)アルキルもしくは(C3-C6)シクロアルキルから選択される。R2およびR3は独立して水素、置換または非置換の(C1-C6)アルキル、(C4-C6)シクロアルキルから選択されるか、またはそれらが結合するN原子と共に、3-6員ヘテロシクロアルキルを形成し、nが1-5である。
【０００８】
別の側面において、本発明は単一用量の式（I）の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供し、ここにおいてR1、R2、R3およびnは上で定義される通りである。
【０００９】
別の側面において、本発明は、癌の治療方法であって、それを必要とする患者に式(I)の化合物を含む治療上効果的な量の組成物を投与することを含む方法を提供し、ここにおいてR1、R2、R3およびnは上で定義される通りである。
【００１０】
さらに別の側面において、本発明は、式（I）の化合物の薬学的に許容される塩を提供し、ここにおいてR1、R2、R3およびnは上で定義される通りである。
【００１１】
さらに別の側面において、本発明は、式（I）の化合物および当該化合物を癌治療において使用するための印刷された説明書を含む医薬キットを提供し、ここにおいてR1、R2、R3およびnは上で定義される通りである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、インビトロのA375ヒト悪性黒色腫細胞におけるシメキソニルホモシステインの細胞傷害性の腫瘍抑制効果を示す図である。
【図２】図２は、インビトロのPC-3ヒト前立腺癌細胞におけるシメキソニルホモシステインの細胞傷害性の腫瘍抑制効果を示す図である。
【図３】図３は、インビトロのDU-145ヒト前立腺癌細胞におけるシメキソニルホモシステインの細胞傷害性の腫瘍抑制効果を示す図である。
【図４】図４は、インビトロの化学療法感受性（8226/s）かつ化学療法耐性（8226/110）のヒト多発性骨髄腫細胞におけるシメキソニルホモシステインの細胞傷害性の腫瘍抑制効果を示す図である。
【図５】図5は、インビトロのMiaPaCaヒト膵臓癌細胞におけるシメキソニルホモシステインの細胞傷害性の腫瘍抑制効果と臨床試験で抗腫瘍活性を持つことが示された化学療法薬(イメキソン)の細胞傷害性の腫瘍抑制効果との比較を示す図である。
【図６】図６は、DBリンパ腫細胞についての一連のアポトーシスアッセイの結果を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
式（I）の化合物の態様、薬学的組成物および癌の治療方法はここに開示される。以下の記載において、数多くの具体的な詳細、例えば、種々の成分および構造の同定などが提供され、当該発明の態様の完全な理解を提供する。当業者は、しかしながら、当該発明が一つまたは一つ以上の具体的な詳細を伴わないで、あるいは他の方法、成分、材料などを伴って実行されることを認識するだろう。さらに他の例においては、周知の成分、材料、またはプロセスについて、当該発明の様々な態様のあいまいな側面を回避するために詳細を表示または記載していない。
【００１４】
この明細書を通じて、「一つの態様」または「態様」への言及は、当該態様に関連して記載される特定の特色、構造、成分、または特徴が、本発明の少なくとも一つの態様に含まれることを意味する。従って、この明細書全体における様々な箇所での当該成句「一つの態様において」または「態様において」の出現は、必ずしも同一の態様だけに言及しているとは限らない。さらに、当該特定の特色、構造、成分、または特徴は、一つまたは一つ以上の態様においていずれの適切な様式で組み合わされてもよい。
【００１５】
I. 定義
ここで使用されるとき、「薬学的に許容される」成分は、合理的な利点／リスク比率に釣り合った、過度の副作用（例えば、毒性、炎症、およびアレルギー反応など）なしに、ヒトおよび／または動物に対する使用に適している成分である。
【００１６】
ここで使用されるとき、当該「治療上効果的な量」の語は、所望の治療反応をもたらすのに効果的な量の成分または組成物をいう。当該治療上効果的な量は、特定の状態または治療される疾患の臨床パターン、当該患者の身体的状態、治療の存続期間、併用療法の性質（もしあれば）、および使用される特定の製剤などの要因によって変化してもよい。
【００１７】
「アルキル」の語はそれ自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、完全に飽和した、一不飽和の、または多価不飽和の、直鎖（すなわち、非分岐の）または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味し、指定された炭素原子番号を有する（例えば、C1-C10は、1〜10個の炭素を意味する）。飽和炭化水素ラジカルの例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、および、例えば、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル等の同族体および異性体などの群が含まれるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、一つまたは一つ以上の二重結合または三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例には、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニルならびに高級同族体および異性体が含まれるが、これらに限定されない。同様に、「アルキレン」の語は、それ自体または別の置換基の一部として、アルキルに由来する二価のラジカルを意味し、例えば、メチレン (-CH2-), エチレン (-CH2-CH2-)、プロピレン (-CH2-CH2-CH2-)およびイソプロピレン (-CH2(CH3)-CH2-)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
「ヘテロアルキル」の語はそれ自体でまたは別の語と組み合わせて、特に明記しない限り、少なくとも一つの炭素原子とO、N、およびSからなる群より選択される少なくとも一つのヘテロ原子からなる安定な直鎖または分岐鎖炭化水素基を意味し、ここにおいて、当該窒素および硫黄原子は、任意に酸化されてもよく、当該窒素へテロ原子は四級化されてもよい。当該へテロ原子O、N、およびSは、ヘテロアルキル基の内部のいずれかの部位、または当該へテロアルキル基が当該分子の残りの部分に結合する部位に位置してもよい。例えば、-CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, -O-CH3, -O-CH2-CH3, -NH-CH2-OH, -CH(OH)-CH3, -C(O)-CH2-OH, -C(O)-CH2-O-C(O)-CH2-CH3, -O-C(O)-C(CH)3および-O-C(O)-CH2-CH3が含まれるが、これらに限定されない。３つまでのヘテロ原子、例えば、-CH2-NH-OCH3、-N=N-N(CH3)2などが連続してもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」の語はそれ自体、または別の置換基の一部分として、ヘテロアルキルに由来する二価のラジカルを意味し、例えば、-CH2-CH2-S-CH2-CH2-、-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-などが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアルキレン基に関しては、ヘテロ原子もまた、鎖の末端のいずれかまたは両方を占める可能性がある（例えば、アルキレンオキソ、アルキレンジオキソ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンまたはヘテロアルキレン結合基に関しては、結合基の配向は、結合基の式の書かれている方向で示されるものではない。例えば、式-C(O)OR'- は、-C(O)OR'- および-R'OC(O)-の両方を表す。「ヘテロアルキル」が特定のヘテロアルキル基の列挙、例えば、-NR’R’’などを伴って記載される場合、ヘテロアルキルと-NR’R’’の語は重複せず、または互いに排他的ではない。むしろ、当該特定のヘテロアルキル基が記載され、明確性が付与される。したがって、「ヘテロアルキル」の語は、ここにおいて、特定のヘテロアルキル基、例えば-NR’R’’などを排除するとは解釈されるべきではない。
【００１９】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」の語は、特に明記しない限り、それ自体または他の語と組み合わせて、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式型を表す。加えて、ヘテロシクロアルキルに関しては、ヘテロ原子は複素環が分子の残りの部分に結合する部位を占有する。シクロアルキルの例には、シクロプロピルメチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるがこれらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例には、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、3-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1-ピペラジニル、2-ピペラジニル、1-ピロリジニル、2-ピロリジニルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００２０】
「ハロ」または「ハロゲン」の語は、それ自体でまたは別の置換基の一部分として、特に明記しない限り、フッ素、塩素、ホウ素、またはヨウ素原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」などの語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意図する。例えば、「ハロ(C1-C4)アルキル」の語は、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどを含むことを意図するがこれらに限定されない。
【００２１】
「アリール」の語は、特に明記しない限り、共に融合され、または共有結合的に結合した、単一環または多環（好ましくは1~3つの環）の可能性がある多価不飽和の、芳香族の、炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」の語は、N、O、Sから選択される１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）を称し、ここで窒素および硫黄原子は任意に酸化され、窒素原子は任意に四級化される。ヘテロアリール基は炭素またはヘテロ原子によって分子の残りの部分と結合してもよい。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、４−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノザリニル、５−キノザリニル、３−キノリル、および６−キノリルを含む。上で示したアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれのための置換基は、以下に記載される許容される置換基の群から選択されれる。「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」の語は、それぞれアリールおよびヘテロアリールの二価の誘導体を指す。
【００２２】
「アリール」の語が、略されて、他の語と共に使用される場合（例えば、アリロキソ、アリールチオキソ、およびアリールアルキル）、上で定義された通りアリールおよびヘテロアリール環の両方を含む。したがって、「アリールアルキル」の語は、アリール基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）がアルキル基に結合するそれらのラジカルを含むことを意味し、このアルキル基は、炭素原子（例えばメチレン基）が、例えば酸素原子に置換されたそれらのアルキル基（例えば、フェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ)プロピルなど）を含む。しかしながら、ここで使用される「ハロアリール」の語は、一または一以上のハロゲンで置換されるアリールのみを含むことを意味する。
【００２３】
「オキソ」の語は炭素原子に二重結合する酸素原子を意味する。
【００２４】
上記のそれぞれの語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」および「アリールアルキル」並びにその二価のラジカル誘導体）は、当該示されたラジカルの置換および非置換の形態の両方を含むことを意味する。ラジカルのそれぞれの種類の好ましい置換基は以下に示される。
【００２５】
アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルの一価および二価の誘導体ラジカル（多くの場合、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称されるそれらの基を含む）の置換基は以下から選択される種々の基の一または一以上であってよいが、これらに限定されない：０〜(2m’+1)、ここでm’は当該ラジカルの炭素原子の総数であり、この範囲の数において -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -ハロゲン, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R',-C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)OR', -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CNおよび-NO2である。R’、R’’およびR’’’はそれぞれ好ましくは、独立して水素、またはC1-C6アルキル、シクロアルキル、またはヘテロアルキルを指す。本発明の化合物が１よりも多くのR基を含む場合、特に明記しない限り、１よりも多くのこれらの基が存在する場合、各R基は独立してそれぞれR’、R’’、およびR’’基として選択される。
【００２６】
アルキルラジカルについて記載した置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基の代表的な置換基（並びにそれらの二価の誘導体）は多様であり、例えば以下から選択される：０から芳香環系の開放原子化価(open valences)の総数の範囲の数において-OR', -NR'R", -SR', -ハロゲン, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -C(O)NR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)OR', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN および-NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, フルオロ(C1-C4)アルコキソおよび フルオロ(C1-C4)アルキルであり、ここでR’, R’’, R’’’およびR’’’’は好ましくは独立してC1-C6アルキル、シクロアルキル、またはハロアルキルから選択される。本発明の化合物が１よりも多くのR基を含む場合、特に明記しない限り、１よりも多くのこれらの基が存在する場合、各R基は独立してそれぞれR’、R’’、およびR’’基として選択される。
【００２７】
ここで使用されるとき、「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」は酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、および硫黄（Ｓ）を含むことを意味する。
【００２８】
本発明の化合物は塩として存在してもよい。本発明は当該塩を含む。これらの塩は、当業者に既知の方法により調製されてもよい。「薬学的に許容される塩」は、相対的に毒性のない酸または塩基により調製される活性な化合物を含むことを意味し、ここに記載される化合物において見出される特定の置換基部分に依存する。本発明の化合物が相対的に酸性の官能基を含む場合、塩基付加塩は当該化合物の中性の形態を十分な量の所望の塩基と接触させることにより得ることができ、この塩基は純粋であるか（neat）又は適切な不活性溶媒中にあるかのいずれかである。薬学的に許容される塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、若しくはマグネシウム塩または同様の塩が含まれる。本発明の化合物が相対的に塩基性の官能基を含む場合、酸付加塩は当該化合物の中性形態を十分な量の所望の酸と接触させることにより得ることができ、この酸は純粋であるか又は適切な不活性溶媒中にあるかのいずれかである。薬学的に許容される酸付加塩の例には、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸水素酸 (monohydrogencarbonic)、 リン酸、リン酸水素 (monohydrogenphosphoric)、リン酸二水素(dihydrogenphosphoric)、 硫酸、 硫酸水素 (monohydrogensulfuric)、 ヨウ化水素酸または亜リン酸などの無機酸由来のもの並びに、酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トシルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸など相対的に毒性のない有機酸由来の塩を含む。さらに、アルギネートなどのアミノ酸の塩や、グルクロンまたはガラクツロン酸などの有機酸の塩を含む（例えば、Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照されたい)。本発明のある特定の化合物は、当該化合物を塩基または酸付加塩のいずれかに変換させる塩基性および酸性の両方の官能基を含む。
【００２９】
塩形態に加え、本発明はプロドラッグの形態の化合物をも提供する。ここに記載される化合物のプロドラッグは、生理的条件で直ちに化学変化を起こし本発明の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、エキソビボ環境において化学的または生化学的な方法により本発明の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、適当な酵素または化学試薬とともに経皮貼布パッチリザーバー内に置かれる場合、本発明の化合物に緩徐に変換され得る。
【００３０】
「一つの(a)」、「一つの(an)」、または「一つの(a(n))」は、ここにおける置換基の群に関して用いられる場合、少なくとも一つを意味する。例えば、化合物が「一つの」アルキルまたはアリール化合物により置換される場合、当該化合物は少なくとも一つのアルキル及び/または少なくとも一つのアリールにより任意に置換される。その上、ある部分がＲ置換基により置換される場合、当該基は「R-置換の」と称される。ある部分がR-置換である場合、当該基は「R-置換の」と称される。ある部分がR-置換である場合、当該部分は少なくとも一つのR置換基により置換され、それぞれのR置換基は任意に異なる。
【００３１】
II.  本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体
本発明の態様には、腫瘍、肉腫、黒色腫、白血病およびリンパ腫を含む癌の治療に有用なイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体化合物が含まれる。本発明に従う化合物は以下の式を有する：
【化２】
2010522759.tif 000004
【００３２】
式(I)において、R1は水素または置換もしくは非置換のC1-C6アルキルもしくはC3-C6シクロアルキルから選択され、R2およびR3は独立して、水素、置換もしくは非置換のC1-C6アルキル、C4-C6シクロアルキルから選択されるか、あるいはそれらが結合するN原子と共に３−６員のヘテロシクロアルキルを形成し、ｎは１−５である。本発明のある化合物は、２または２以上の構造異性体が平衡状態で存在し、一方が他方の異性体に直ちに変換される互変異型で存在してもよいことが理解されるだろう。当該化合物のすべてのこのような互変異型は本発明の範囲内に入ることが意図される。さらに、本発明の化合物は、当該イミノピロリドンチオールアミノ酸複合体の光学異性体または他の立体異性体を規定する一または一以上の不斉中心を含むことが理解されるだろう。当該立体異性体は、特に示さない限り、ここにおいて提供される式または記述に包含され、また当該化合物が、ラセミ混合物または立体異性的に豊富な（stereoisomerically-enriched）もしくは純粋な組成物として存在するという本発明の範囲内に入ることが意図される。
【００３３】
一つの態様において、本発明の化合物は、式(I)に矛盾しない構造を有する化合物を含み、ここにおいてR1、R2、およびR3は上に式(I)に関して定義されたとおりであり、nは1-3である。別の態様において本発明の化合物は、式(I)に矛盾しない構造を有する化合物を含み、ここでR2およびR3は上で式(I)に関して定義される通りであり、R1は水素であり、nは１である。さらに別の態様において、本発明の化合物は、式(I)に矛盾しない構造を有する化合物を含み、ここでR1は上で式(I)に関して定義される通りであり、R2およびR3は水素であり、nは１である。さらに別の態様において、本発明の化合物は、式(I)に矛盾しない構造を含み、ここにおいてR2、R3およびnは式(I)に関して上で定義した通りであり、R1は(C1-C3)アルキルである。好ましい態様において、R1、R2およびR3は水素であり、xは1である。
【００３４】
A.  イミノピロリドンチオールアミノ酸複合体の合成方法
本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体は、以下に概説する合成スキームに従って製造することが可能であり、また関連分野の当業者にとって一般的に明らかで理解しやすい実験技術である。スキームI-IVにおいて、R1、R2、R3およびnは式(I)に関して上で定義した通りであり、他のすべての変数は示されるスキームに関して定義される通りである。
【化３】
2010522759.tif 000005
【００３５】
スキーム(I)において、ジエチル-N-アセチルマロン酸エステルのナトリウムまたはカリウム塩１を、ICH2(CH2)nClの構造を有するクロロ-アルキルイオダイドと反応させることにより、アミノ酸官能基がメチレン基の可変長の鎖と結合し、それにより、ヨウ素原子の置換により中間化合物２を得る。理解される通り、クロロ-アルキルヨードは1-クロロ-2-ヨードエタン、1-クロロ-2-ヨードプロパン、1-クロロ-4-ヨードブタン、1-クロロ-5-ヨードペンタンまたは1-クロロ-6-ヨードヘキサンを含み、nが1-5の化合物を生成してもよい。中間体化合物2において硫化水素ナトリウムにより塩素原子を置換することにより、アミノ酸官能基およびスルフヒドリル部分を連結するメチレン基の所望の鎖を有するチオール化合物３を得る。次に、３のチオール部分を例えば、トリフェニルメチル（トリチル）基により保護し、保護された化合物４を得て、当該エチルエステルを次いで塩基により加水分解し、結果生じるジカルボン酸は脱炭酸され、トリチル保護されたチオールアミノ酸５を得る。
【００３６】
当該トリチル保護されたチオールアミノ酸５をトリフルオロ酢酸での処理により脱保護し、チオールアミノ酸６を得てもよい。代わりに、トリチル保護されたチオールアミノ酸５をエステルまたはアミン置換に供し、式(I)に関して以前に定義し、以下にさらに詳細に記載され説明される様々なR1、R2およびR3置換基を得てもよい。
【化４】
2010522759.tif 000006
【００３７】
スキーム(II)において、トリエチル保護されたチオールアミノ酸５のエステル置換は、まずアミノ基を例えばベンジルブロミドなどのアミノ保護基で保護することにより行われ、二保護された(di-protected)チオールアミノ酸7を得る。次にエステル基の付加は二保護されたチオールアミノ酸７をR4CHN2の構造を有する適切なジアゾアルカン、ここでR4は水素、アルキル、またはシクロアルキルであるが、これと反応させることにより達成され、エステル８を得る。当該アミノ酸保護基は次いで水素付加により除去され、当該エステル置換のトリチル保護されたチオールアミノ酸９を得てもよく、スキーム(I)とともに上で記載した通り、トリフルオロ酢酸による処理によって脱保護され、当該エステル置換されたチオールアミノ酸１０を得てもよい。理解される通り、９においてR4が水素の場合、R1は１０においてメチルであり、９においてR4がメチルである場合、１０においてR1はエチルである、などとなる。あるいは、当該エステル置換されトリチル保護されたチオールアミノ酸９は以下に記載する通り、アミン置換に供されてもよい。
【化５】
2010522759.tif 000007
【００３８】
スキーム(III)において、当該トリチル保護されたチオールアミノ酸５のアミン置換を様々な異なる合成経路を経て行い、所望の最終産物を得ることができる。示されてはいないが、エステル置換されたトリチル保護されたチオールアミノ酸９（スキーム(II)より）がスキーム(III)に示されるそれぞれの合成経路において出発物質を含み、エステルおよびアミン置換の両方を有する化合物を得ることができる。一つの経路において、トリチル保護されたチオールアミノ酸５をホルムアルデヒドおよびギ酸による反応によりメチル置換し、メチルアミノ化合物１１を得ることができる。これら同成分のさらなる反応により当該ジメチルアミノチオールアミノ酸１２を得ることができる。少なくとも１つの所望のアミン置換がより大きなアルキル置換を含む場合、当該適切なトリチル保護されたチオールアミノ酸5をシアノホウ化水素ナトリウムの存在下で適切なアルデヒド（例えば、アセトアルデヒド、プロピナルデヒド、ブチルアルデヒドなど）と接触させ、一置換化合物１３を得ることができる。当該一置換化合物１３を、上に記載したいずれかのアプローチにより次に２度目に置換し、二置換化合物１４または１５を得ることができる。当該スキーム(III)に記載され説明される合成経路において、R5およびR6は同じであっても異なっていてもよく、アルキル、シクロアルキル、またはアリールを含んでもよい。
【００３９】
スキーム(III)に説明される代替の合成経路において、当該トリチル保護されたチオールアミノ酸５を置換し、式TsO-CH2-(CH2)m-CH2-OTsを有するアルカンジトシレート、ここでmは０−３であるが、これとの反応によって複素環化合物１６を得ることができる。次にアミン置換された化合物１１、１２、１３、１４、１５、１６のそれぞれを、スキーム(I)と共に上で説明した通り、トリフルオロ酢酸での処理によって脱保護し、アミン置換チオールアミノ酸１７を得ることができる。理解される通り、R5またはR6が１３、１４または１５においてメチルである場合、１７においてR2またはR3はそれぞれエチルである、などとなる。
【化６】
2010522759.tif 000008
【００４０】
スキーム(IV)において、脱保護されたアミノ酸化合物６、１０または１７のいずれか一つを、本発明に従って当該チオールアミノ酸を(5RS) -4-アミノ-1,3-ジアザビシクロ[3.1.0]ヘクス-3-エン-2-オン (イメキソン)の１つの同等物と接触させることにより、イミノピロリドンチオールアミノ酸複合体１８に変換してもよく、ここで、R1、R2、R3およびnは式(I)に関して定義される通りである。一つの態様において、当該反応をpH 7.5、温度37℃、水性環境で行ってもよく、ここで当該反応をHPLCによりモニターし、生成物の濃度が最大になるときに-20℃で凍結させることにより反応を停止する。例えば、チオールアミノ酸がホモシステインである場合、当該反応時間は約５時間である。理解される通り、スキーム(IV)に示される当該チオールアミノ酸６、１０、および１７は、前のスキームからの例を表し、示されていないエステルおよびアミン置換の双方の組み合わせ、または式(I)に関して定義される種々の置換基R1、R2、R3およびnを有するイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体１８を生じるいずれかの組み合わせをも包含する。
【００４１】
代替の態様において、スキーム(IV)に関して記載される通り、R1、R2、およびR3が水素であり、nが１である好ましい化合物の合成は、ホモシステインチオラクトンをホモシステインに変換し、続いてイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体１８へ変換することにより行われてもよい。この代替の合成経路は、より詳細に例において記載される。
【００４２】
前述される通り、本発明の化合物は薬学的に許容される塩として存在してもよく、これは既知の方法により製造されてもよく、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、トシレート、ベンソイレートおよびメシレートを含んでもよいがこれに限定されない。
【００４３】
Ｂ. イミノピロリドンチオールアミノ酸複合体の抗癌活性の試験のための検定法
本発明の化合物は抗腫瘍薬として有用である。本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体の抗腫瘍活性を試験するために多くの生物学的検定法が利用可能である。これらの検定法はおおむね２つの群に分けることができる：これらは腫瘍細胞の選択された薬剤へのインビトロ暴露；及びげっ歯類モデル、まれにより大型の動物におけるインビボ抗腫瘍検定法を含む。両種類の検定法は、本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体が抗腫瘍活性を示すか否かの決定に等しく適用可能である。ここで使用されるとき、「抗腫瘍」の語は癌の成長を抑制または阻害することを意味し、既知の治療または処理の不在に関連する癌の成長を減少させることを含む。
【００４４】
インビトロ細胞傷害性検定法は、一般的に動物由来および、特にヒト由来の両者の確立した腫瘍細胞株の使用を伴う。これらの細胞株は、American Type Tissue Culture laboratory in Manassas, Virginiaなどの商業的な供給源、および研究機関の腫瘍バンクから得られてもよい。以下に記載され且つ示された参考文献に記載される方法により本発明の化合物に対する特定の腫瘍の種類の感受性を評価するために使用されてもよい特異的な癌を代表する典型的な細胞株モデルには、以下のヒト腫瘍細胞株が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
子宮頸癌：  HeLa; HeLa 229; HeLa S3; H1HeLa; Hs 588.T; GH329; GH354; HeLa NR1; C-4 I; C-4 II; DoTc2 4510; C-33 A; SW756; SiHa。
【００４６】
結腸直腸癌：   NCI-H548; Hs 255.T; SW837; NCI-H716; NCI-H747; NCI-H508; NCI-H498; WiDr; COLO 320DM; COLO 320HSR; DLD-1; HCT-15; SW480; SW403; SW48; SW1116; SW948; SW1417; LS123; LS 180; LS 174T; C2BBe1; Hs 257.T; Hs 587.Int; Caco-2; HT-29; SW1463; Hs 200.T; Hs 219.T; Hs 675.T; SNU-C2B; SNU-C2A; LS513; LS1034; LS411N; HCT 116; ATRFLOX; Hs 722.T。
【００４７】
腎臓癌：  A704; A-704; ACHN; 786-O; 769-P; A-498; Caki-2; G-402; Hs 926.T; G-401。
【００４８】
肺癌：  NCI-H1373; NCI-H1395; Hs 618.T; SK-LU-1; HCC2935; HCC4006; HCC827; Hs 229.T; NCI-H2066; NCI-H2286; Hs 573.T; A549; A-427; NCI-H596; NCI-H292; DMS 79; DMS 53; DMS 114; SW 1271; NCI-H2227; NCI-H1963; SHP-77; H69AR; NCI-H2170; NCI-H520; SW 900。
【００４９】
非小細胞肺癌：  NCI-H1581; NCI-H23; NCI-H522; NCI-H1435; NCI-H1563; NCI-H1651; NCI-H1734; NCI-H1793; NCI-H1838; NCI-H1975; NCI-H2073; NCI-H2085; NCI-H2228; NCI-H2342; NCI-H2347; NCI-H1703; NCI-H2135; NCI-H2172; NCI-H2444; NCI-H358; NCI-H1688; NCI-H1417; NCI-H1672; NCI-H1836; PLHC-1; NCI-H810; NCI-H2126。
【００５０】
乳癌：  Hs 274.T; Hs 280.T; Hs 281.T; Hs 343.T; Hs 362.T; Hs 739.T; Hs 741.T; Hs 742.T; Hs 190.T; Hs 319.T; Hs 329.T; Hs 344.T; Hs 350.T; Hs 371.T; Hs 748.T; Hs 841.T; Hs 849.T; Hs 851.T; Hs 861.T; Hs 905.T; Hs 479.T; Hs 540.T; Hs 566(B).T; Hs 605.T; Hs 606; BT-20; UACC-812; HCC1954; Hs 574.T; BT-483; BT-549; DU4475; Hs 578T; BT-474; HCC1806; HCC38; UACC-893; HCC70; HCC202; HCC1143; HCC1187; HCC1395; HCC1419; HCC1500; HCC1599; HCC1937; HCC2157; HCC2218; HCC1569。
【００５１】
膵臓癌：  BxPC-3; HPAF-II; HPAC; Panc 03.27; Panc 08.13; Panc 02.03; Panc 02.13; Panc 04.03; Panc 05.04; Capan-2; CFPAC-1; PL45; Panc 10.05; MIA PaCa-2; PANC-1。
【００５２】
精巣癌：  Cates-1B。
【００５３】
卵巣癌：  Caov-3; TOV-21G; TOV-112D; Hs 38.T; Hs 571.T; ES-2。
【００５４】
前立腺癌：  22rv1; PC-3; DU-145。
【００５５】
膀胱癌：  Hs 195.T; Hs 172.T; Hs 228.T; 5637; HT-1376; HT-1197; UM-UC-3; SW 780; J82; SCaBER; T24; TCCSUP; Hs 789.T; Hs 769.T。
【００５６】
子宮内膜／子宮癌：  KLE; HEC-1-A; HEC-1-B; RL95-2; SK-UT-1; SK-UT-1B; MES-SA; MES-SA/Dx5; MES-SA/MX2。
【００５７】
胃癌：  AGS; Hs 740.T; SNU-1。
【００５８】
肝臓癌：  C3A; SNU-398; SNU-449; SNU-182; SNU-475; Hep 3B2.1-7; Hep G2; SNU-387; SNU-423。
【００５９】
甲状腺癌；  TT; SW579。
【００６０】
骨肉種：  Hs 819.T; SW 1353; Hs 900.T; Hs 903.T; Hs 919.T; 143.98.2; MG-63; HOS; KHOS/NP (R-970-5); KHOS-240S; KHOS-321H; MNNG/HOS (Cl #5); Hs 3.T; Hs 39.T; Hs 184.T; Hs 188.T; Hs 387.T; Hs 704.T; Hs 707(A).T; Hs 735.T; Hs 755(B).T; Hs 781.T; Hs 792(B).T; Hs 805.T; Hs 811.T; Hs 866.T; Hs 870.T; Hs 871.T; Hs 889.T; Hs 890.T; Murphy; R-970-5; TE 417.T; TE 418.T; TO 203.T; HT 728.T; Hs 14.T; T1-73; 143B; 143B PML BK TK; Saos-2; U-2-OS; SK-ES-1; Hs 822.T; Hs 863.T; RD-ES; Hs 706.T; Hs 737.T; Hs 821.T; Hs 846.T; Hs 883.T; Hs 127.T; TE 76.T; TE 130.T。
【００６１】
結合組織癌：  TE 115.T; HT-1080; Hs 778(A).T; Hs 778(B).T; Hs 15.T; SW 684; Hs 93.T; Hs 5.T; SW 872; Hs 88.T; Hs 864.T; TE 441.T; TE 617.T; Hs 729.T; Hs 132.T; Hs 701.T。
【００６２】
筋肉癌：  TE 149.T; RD; A-673; Hs 729; A-204; Hs 94.T。
【００６３】
中枢神経系癌：  CCF-STTG1; SW 1088; SW 1783; A172; U-138 MG; DBTRG-05MG; LN-18; LN-229; U-87 MG; U-118 MG; M059K; M059J; T98G; LNZTA3WT4; LNZTA3WT11; Hs 683; D341 Med; Daoy; CHP-212; IMR-32; H4; PFSK-1。
【００６４】
黒色腫：  WM-115; Hs 600.T; Hs 688(A).T; Hs 839.T; Hs 852.T; Hs 906(A).T; Hs 906(B).T; Hs 908.Sk; Hs 936.T; Hs 936.T(C1); Hs 939.T; A101D; CHL-1; C32TG; C32; Hs 934.T; Hs 935.T; G-361; A-375; A375.S2; COLO 829; Hs 940.T; HT-144; Malme-3M; RPMI-7951; SK-MEL-5; SK-MEL-24; SK-MEL-28; SK-MEL-31。
【００６５】
白血病：  TF-1; TF-1a; TF-1.CN5a.1; HEL 92.1.7; SUP-B15; CCRF-SB; 8E5; KG-1; KG-1a; TALL-104; MOLT-4; CCRF-CEM; CCRF-HSB-2; MOLT-3; CEM/C2; CEM/C1; Loucy; Reh; THP-1; AML-193; Kasumi-1; Kasumi-3; BDCM; Kasumi-6; HL-60; HL-60/MX2; HL-60/MX1; J.CaM1.6; J.RT3-T3.5; D1.1; J45.01; MV-4-11; Kasumi-4; KU812; KU812E; KU812F; MEG-01; Mo-B; Mo; SUP-T1; GDM-1; CESS。
【００６６】
骨髄腫：  U266B1; RPMI 8226; NCI-H929。
【００６７】
リンパ腫：  RPMI 6666; 1A2; Hs 313.T; Hs 777.T; Hs 602; H9/HTLV-IIIB; HuT 78; HT 1417; JSC-1; BCP-1; 2B8; Daudi; NC-37; EB-3; Raji; Jiyoye; NAMALWA; HS-Sultan; CA46; GA-10; 20B8; HKB-11; 1G2; 2F7; EB1; Ramos (RA1); Ramos.2G6.4C10; H9; HH; MJ; Toledo; BC-1; BC-2; U-937; TUR; Hs 604.T; Hs 751.T; Hs 445; Hs 611.T; Hs 616.T; BC-3; DB; Hs 505.T; Hs 491.T; Hs 518.T.
いくつかの検定法（例えば、コロニー形成検定法）は、確立された細胞株または、癌患者から外科的に除去された新鮮な腫瘍バイオプシーのいずれかを用いてよい。当該細胞の本発明の化合物への暴露は、実験室での温度、酸素、および栄養利用性の擬似生理的条件下で行われてもよい。これらのインビトロ検定法の指標は、コロニー形成、生存可能な細胞によるミトコンドリア酵素の基質の減少（例えば、ブルーホルマザンに対するMTTの減少）、色素の細胞タンパク質（例えば、スルホローダミンB）への結合、非損傷の細胞膜により細胞から排除される「バイタル(vital)」色素の取り込み、または放射性標識栄養物の増殖性（生存可能な）細胞への取り込みを含んでよい。本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体の抗腫瘍活性を試験するためのインビトロ検定法のより詳細な記載は、Hersh et al., J Natl Cancer Inst. 84: 1238-1244 (1992); Salmon et al., J Natl Cancer Inst. 86: 228-230 (1994); Dvorakova et al., Blood 97: 3544-3551 (2001); and Dorr et al., Int J Gastrointest Cancer 36: 15-28に見られる。
【００６８】
一般的にインビボ抗癌検定法は、抗癌活性がインビトロ細胞傷害性検定法により確認された後で行われ、もっとも一般的には選択された化合物の抗腫瘍特性を評価するためにげっ歯類を用いる。インビボの腫瘍研究は、一般的に動物の皮下に移植されたヒト腫瘍細胞を用いて行われる。一般的に当該腫瘍を所定のサイズ（例えば、100-200 mg）まで成長させ、次に当該成長またはその欠如を調査化合物による処理期間の間、定期的に評価する。選択される化合物の当該インビボ抗腫瘍活性は、調査化合物により処理される動物および処理されないコントロール群における腫瘍重量から計算される腫瘍成長阻害の作用として評価することができる。腫瘍重量は、一般的に腫瘍の大きさの測定から評価され、これは当該動物の前脇腹に移植されることが多い。当該腫瘍成長阻害はT/C (%) = (処理される群の平均腫瘍重量(T)/コントロール群の平均腫瘍重量(C)) x 100で計算される。他の検定法において、特に非局在化腫瘍について、生存が、指標として用いられてもよく、処理された動物と治療されないコントロール群との間で行われる比較として用いられてもよい。本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体の抗腫瘍活性を試験するためのインビボ検定法のより詳細な記載は、Hersh et al., J Immunother 13: 77-83 (1993); Dorr et al., Invest New Drugs 13: 113-116 (1995); and Pourpak et al., Anticancer Drugs 17: 1179-1184 (2006)に見られる。
【００６９】
III. 本発明の薬学的組成物
本発明に従う化合物は、癌の治療に有用な薬学的組成物または医薬の製造に用いられてもよい。本発明の態様は、薬学的に許容される担体、および上に記載され、以下の式：
【化７】
2010522759.tif 000009
【００７０】
を有するイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体化合物を含む薬学的組成物を含む。
【００７１】
式(I)において、R1は水素または置換もしくは非置換(C1-C6)アルキルもしくは(C3-C6)シクロアルキルから選択され、R2およびR3は独立して水素、置換若しくは非置換(C1-C6)アルキル、(C4-C6)シクロアルキルから選択されるか、又はそれらが結合するN原子と共に３−６員のヘテロシクロアルキルを形成し、nは1−5である。好ましい態様において、本発明の薬学的組成物は薬学的に許容される担体およびR1、R2およびR3が水素であり、n が1である式(I)の化合物を含む。
【００７２】
本発明に従う薬学的組成物の態様は、イミノピロリドンチオールアミノ酸複合体の単位用量を含む。一つの態様において、本発明の化合物は悪性黒色腫、多発性骨髄腫、リンパ腫、前立腺癌または膵臓癌の治療に有用な薬学的組成物の製造に使用されてもよい。別の態様において、本発明の化合物は子宮頸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、精巣癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮内膜／子宮癌、胃癌、肝臓癌、甲状腺癌、骨肉腫、結合組織癌、筋肉癌、中枢神経系(CNS)癌、または白血病の治療に有用な薬学的組成物の製造に用いられてもよい。
【００７３】
A. 投与形態
本発明の薬学的組成物は、個人療法薬としてまたは他の治療薬と組み合わせて、医薬品と併せた使用に利用可能な従来のいずれかの手段による投与のために製剤化されてもよい。
【００７４】
イミノピロリドンチオールアミノ酸複合体は本発明の教示にしたがって、錠剤(tablets)、カプセル剤、錠剤(pills)、粉末剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤、または乳剤など、経口の投与形態に製剤化されてもよい。錠剤およびカプセル剤の両者は、即効型薬剤または徐放性薬剤として製造され、数時間の期間にわたる持続放出を提供し、患者の消化管における選択的な崩壊のための腸溶被覆であってよい。イミノピロリドンチオールアミノ酸複合体を含む組成物もまた、静脈内（ボーラスまたは注入）、腹腔内、皮下のまたは筋肉内形態の投与のために本発明に従って製剤化され、製薬分野の当業者に既知の多くの投与形態のうちいずれか一つを用いてもよい。
【００７５】
本発明の薬学的組成物は、様々な態様において、意図する投与形態に対して、また従来の薬務に矛盾しないように選択された適切な医薬希釈剤、増量剤、賦形剤、または担体（以降、集合的に薬学的に許容される担体と称する）との混合剤中にイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体を含んでもよい。薬学的に許容される担体は、本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体化合物と組み合わされ、固体または液体のいずれかの投与形態を生成してもよい。
【００７６】
本発明の経口の投与形態に製剤化するために使用される薬学的に許容される担体の具体例は、当業者に既知である。例えば、ここにおいて、参照により全体があらゆる目的のために組み込まれる米国特許番号3,903,297を参照されたい。本発明において有用な投与形態を製造するための技術および組成物もまた、当業者に既知である。例えば、ここにおいて、参照により全体があらゆる目的のために組み込まれる、7 Modern Pharmaceutics, Chapters 9 and 10 (Banker & Rhodes, Eds., 1979)、Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (Lieberman et al., 1981)、Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2nd Ed. (1976)、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985)、 Advances in Pharmaceutical Sciences (David Ganderton, Trevor Jones, Eds., 1992)、 Advances in Pharmaceutical Sciences Vol 7. (David Ganderton, Trevor Jones, James McGinity, Eds., 1995)、Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms (Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Series 36 (James McGinity, Ed., 1989)、Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 61 (Alain Rolland, Ed., 1993)、Drug Delivery to the Gastrointestinal Tract (Ellis Horwood Books in the Biological Sciences. Series in Pharmaceutical Technology; J. G. Hardy, S. S. Davis, Clive G. Wilson, Eds.)、Modern Pharmaceutics Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 40 (Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes, Eds.)を参照されたい。
【００７７】
本発明の薬学的組成物の非経口製剤もまた、選択される注入の種類または送達系に適合する製剤を製造する薬学的に許容される担体を含んでもよい。非経口投与のための滅菌した投与形態の製造物は製薬産業において周知であり、いくつかの殺菌方法は当該文献に詳細に記載される。多くの場合、化学療法薬の非経口製剤における安定性は凍結乾燥した投与形態に薬物を製剤化することにより最大化することができる。凍結乾燥の方法は、「フリーズ・ドライ」の方法としておおまかに記載されてもよく、ここにおいて、薬剤が賦形剤とともに、または賦形剤なしで適当な溶媒に溶解し、続いて、例えばバルク溶液を細菌保持性のフィルターに通過させることにより滅菌する。滅菌に続き、当該溶液を個々の容器に満たし、凍結乾燥チャンバー中で凍結する。最後に当該凍結乾燥チャンバーに真空を適用し、その結果、個々の容器から溶媒が昇華（一次乾燥）し、脱離し（二次乾燥）、続いて封をし、薬剤製品の滅菌状態を保持した。本発明の薬学的組成物は、滅菌または凍結乾燥した投与形態を含んでもよい。
【００７８】
理解される通り、本発明の薬学的組成物はまた、当業者に既知の他の投与形態に製剤化されてもよい。例えば、本発明の化合物は、小単層ベシクル、大単層ベシクルおよび多重膜ベシクルなどのリポソーム送達系として製剤化されてもよい。リポソームは、種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはフォスファチジルコリンなどから形成される可能性がある。本発明の化合物もまた、目標設定可能な薬剤担体またはプロドラッグとして、可溶性ポリマーへのカップリングを経て製剤化されてもよい。適切な可溶性のポリマーには、パルミトイル残渣で置換されたポリビニルピロリジン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシルプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタ−ミドフェノール、およびポリエチレンオキシド−ポリリシンが含まれる。さらに、本発明に従う化合物は、薬剤の制御放出の達成に有用な生体分解性のポリマーの部類、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリヒドロキシピラン、ポリシアノアセチレート、およびハイドロゲルの架橋または両親媒性のブロック共重合体と結合してもよい。
【００７９】
本発明の当該イノピロリドンチオールアミノ酸複合体の投与のための有用な投薬形態には以下のものが含まれる：
１． カプセル剤
多数の単位カプセル剤は、標準のツーピースの硬ゼラチンカプセルのそれぞれに粉末の活性成分（例えば、10〜500 mg）および一または一以上の以下の賦形剤：ラクトース（例えば、5〜150 mg）；セルロース(例えば、5〜50 mg)；およびステアリン酸マグネシウム（例えば、5〜10 mg）；を詰めることにより製造されてもよい。
【００８０】
２．軟ゼラチンカプセル
大豆油、綿実油、またはオリーブ油などの消化可能な油中の活性成分の混合物は調製され、容積移送式ポンプを用いてゼラチンに注入され活性成分（例えば、100〜500 mg）を含む軟ゼラチンカプセル剤を形成する。次に当該カプセルを洗浄、乾燥する。
【００８１】
３．錠剤
多くの錠剤は、適切な用量単位の活性成分（例えば、100〜500 mg）が一または一以上の以下の賦形剤：コロイド状二酸化ケイ素（例えば、0.1〜10 mg）、ステアリン酸マグネシウム（例えば、2〜5 mg）；微晶質セルロース（例えば、50〜275 mg）；デンプン（例えば、5〜15 mg）；およびラクトース（例えば、90〜100 mg）；と共に含まれるように従来の手順で調製されてもよい。適切なコーティングを適用し、遅延吸収の嗜好性（palatability）を増加させてもよい。
【００８２】
4．  注射剤
注射による投与に適する非経口組成物は、適切な量の活性成分（例えば、1-2%重量）を10%容量のプロピレングリコールおよび水中で攪拌することにより調製されてもよい。当該溶液を塩化ナトリウムにより等張にし、滅菌してもよい。
【００８３】
５．  懸濁液
水性懸濁液は、それぞれ5 mlが適切な量の微粉化した活性成分（例えば、100mg）および一または一以上の以下に示す賦形剤：カルボキシメチルナトリウム（例えば、200 mg）；ベンゾエートナトリウム（例えば、5 mg）；ソルビトール溶液（例えば、1 mg）；およびバニリン（例えば、0.025 mg）；を含むよう、経口投与のために調製されてもよい。
【００８４】
Ｂ．用量
上述した投薬形態は、単位あたり約1.0 mgから約5000 mgの活性成分を含んでもよい。化学療法薬の用量は従来、体表面積の平方メートルあたりミリグラム単位（mg/m2）で示される。典型的に、成人のヒトは約1.75 m2のBSAを有するだろう。特定の患者に対する適切な治療用量は、治療される特定の疾患に関連して患者のBSA測定基準から計算してもよく、一または一以上の用量で一日あたりまたは週当たり数回投与されてもよい。複数の用量単位が患者に治療上効果的な量を送達するために必要であり得ることが理解されるだろう。
【００８５】
一般的なガイダンスによると、治療上効果的な用量の本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体は、約10 mg/m2から約3500 mg/m2、好ましくは約150 mg/m2から約2000 mg/m2の範囲であってよい。他の好ましい用量は、約500 mg/m2から約1500 mg/m2の範囲である。
【００８６】
静脈注射において、もっとも好ましい投与の速度は、定速注入の間、約0.1から約10 mg/kg/分の範囲であってよい。本発明の薬学的組成物は単一日用量として投与されてもよく、または一日あたりの総用量は、一日あたり２、３、４回の分割用量で投与してもよい。
【００８７】
Ｃ．  医薬キット
本発明の薬学的組成物は、態様において医薬キットの成分を含んでもよい。当該医薬キットは、治療上効果的な量の本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体を含む薬学的組成物および癌治療において当該組成物を使用するための印刷された説明書を含んでもよい。本発明の医薬キットはさらに、必要に応じて、一または一以上の種々の従来の医薬キットの成分、例えば、当業者にとって直ちに明らかであろう一または一以上の薬学的に許容される担体を伴う容器、追加の容器などを含む。折り込み、またはラベルのいずれかとしての当該印刷された説明書は、当該投与される成分の量、投与のガイドライン、および／または当該成分を混合するためのガイドラインを示してもよい。当該規定の物質および条件は本発明を実行するのに重要ではあるが、本発明の利点が実現されることを妨げない限りにおいて、規定されていない物質および条件が除外されるわけではない。
【００８８】
一つの態様において、印刷された説明書は、癌患者の治療方法を参照して以下に記載される通り、本発明の化合物または組成物を癌の治療において使用することを記載してもよい。
【００８９】
IV.  癌患者の治療方法
上に示され、本発明の化合物および組成物を具体化する記載に従って製剤化される薬物製品は、種々の癌の治療において有用であり、これには例えば、悪性黒色腫、前立腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、精巣癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮内膜／子宮癌、胃癌、肝臓癌、甲状腺癌、骨肉腫、結合組織癌、筋肉癌、および中枢神経癌などの固形腫瘍だけでなく、多発性骨髄腫、リンパ腫、および白血病などの血液学的悪性腫瘍も
含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
理解される通り、本発明の教示に従うイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体化合物および組成物は、単独または第二抗腫瘍薬との組み合わせのいずれかで癌の治療に使用されてもよい。ここで使用されるとき、「併用療法」および「補助療法」の語は、薬剤を必要とする患者が、イミノピロリドンチオールアミノ酸複合体と共に当該疾患のための別の既知の薬剤により治療されることを意味する。種々の態様において、当該併用療法は、当該患者がまず初めに一つの薬剤により、次にもう一方の薬剤により治療される継続治療であってもよく、または当該２つの薬剤が同時に投与されてもよい。
【００９１】
本発明の教示に従うイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体化合物および組成物による癌の治療方法は、治療される特定の癌または腫瘍の種類の治療において効果的ないかなる適切な方法を含んでもよい。治療は経口、直腸、局所もしくは非経口投与または腫瘍もしくは癌への注射により容易にされてもよい。適切な薬学的に許容される担体により製剤化され、適用が容易になったイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体化合物の静脈内、皮下、または筋肉内への適用による非経口治療は、本発明の化合物または組成物の好ましい投与方法だろう。当該本発明の化合物および組成物は、製薬分野の当業者によく知られる通り、選択された投与経路に適用できる適切ないかなる様式で製剤化されてもよく、治療される特定の疾患、当該疾患の重症度、および治療に対する応答に応じて異なってもよい治療上効果的な用量で投与されてもよい。
【００９２】
当業者は、当該化合物の有用性がインビトロおよびインビボの双方の既知の癌細胞株を用いるルーチンのスクリーニングによって確認されてもよいことを認識するだろう。細胞株は、上述した通り、American Tissue Type Cultureまたは他の研究所から入手可能である。
【００９３】
Ａ．  医薬製剤への応答の測定
腫瘍負荷（tumor load）は、一般的に、当該腫瘍の客観的スキャン、例えばＸ線レントゲン写真、コンピュータ断層撮影（CATスキャン）、核磁気共鳴（NMR）スキャンなど、または腫瘍マスの直接的な身体の触診により治療の前に評価される。または、当該腫瘍はマーカー物質、例えば、結腸癌からのアルファフェトプロテイン、卵巣癌からのCA125抗原、または多発性骨髄腫からの血清骨髄腫「Ｍ」プロテインなどを分泌する。次にこれらの分泌生成物のレベルにより計算される全身腫瘍組織量(tumor burden)の評価が可能になる。これらの直接的および間接的な腫瘍負荷の測定は治療前に行われ、次に当該薬剤の投与に続く合間に、客観的な応答が得られたか否かを評価するために繰り返される。癌治療における客観的な応答は、一般的に50％以上の測定可能な癌疾患の縮小（部分応答）またはすべての測定可能な疾患の完全な消失（完全応答）を示す。典型的にこれらの応答はある一定の時間、通常一ヶ月保持されなければならず、真の部分応答か完全応答かに分類される。さらに、急速な腫瘍成長が安定化されるか、あるいは小応答または安定疾患（stable disease）と称される50%以下の腫瘍の縮小があってもよい。一般的に、増加した生存は治療に対する完全応答が得られることに関連し、長期間保持される場合、ある症例では部分応答もまた亢進した患者の生存に貢献してもよい。
【００９４】
化学療法を受ける患者もまた、化学療法が始まる前の彼らの疾患の程度に関して、一般に「段階的」であり、次に化学療法に従って再現され(restaged)、疾患の程度が変化したかどうか確かめる。ある状況では、広範にわたる疾患のため事前にそれが不可能な場合、当該腫瘍は十分に縮小し、もし転移がなければ、化学療法治療の後で可能な外科的切除を行ってもよい。この場合には、新規な薬学的組成物による当該化学療法治療が潜在的に治効のある手術の補助剤として使用されている。さらに、患者は、疼痛などの症候性の問題を生じる脊柱または他の場所の個々の障害を有し、これらは局所放射線療法を適用されることを必要としてもよい。これは、本発明の全身性薬学的組成物の使用に追加して行われてもよい。
【００９５】
Ｂ．  毒性の評価および投与計画の設定
患者はそれぞれの化学療法の経路で毒性について評価され、典型的には肝臓の機能酵素および腎臓の機能酵素、例えばクレアチニンの浄化値またはBUNなどに対する効果のみならず、骨髄に対する効果、典型的には感染と闘うために重要な顆粒球の抑制および／または止血または流血を止めるために重要な血小板の抑制も観察する。当該骨髄抑制薬に関して、治療の後1-3週間の間に正常血球数は最下点に達し、その後回復は次の1-2週間に渡って続く。当該正常白血球数の回復に基づき、治療が再開されてもよい。
【００９６】
一般的に、完全および部分応答は、少なくとも１−２の対数の腫瘍細胞数の減少に関連する（90-99%効果的な治療）。進行癌の患者は、一般的に診断時に109以上の腫瘍細胞を有しており、全腫瘍組織量を非常に低い状態まで減少させ、且つ疾患の治癒を得るために、複数の治療が必要とされることがよくあるだろう。
【００９７】
治療スケジュールまたは本発明に従う化合物もしくは薬学的組成物の投与計画は従来、当該化合物または併用療法のそれぞれの組成物の規定された用量が規定された間隔で患者に一サイクルの期間にわたって投与され、続くそれぞれのサイクルで繰り返される治療のサイクルを含む。一サイクルの期間は、いかなる適当な様式によって規定されてもよく、例えば２１日サイクル、２８日サイクルなどを含んでもよい。治療のサイクルの期間内で、規定される本発明に従う化合物の用量は、規定される間隔、例えば、一週間おきに連続５日間（例えば、28日サイクルの1-5日、15-19日）、週に一度（例えば、21日サイクルの1、8、および15日）などで患者に投与されてもよい。
【００９８】
Ｃ．  患者の臨床管理
本発明の薬学的組成物による治療サイクル、これは数週間の継続的な薬物投与を含む可能性があるが、この終わりに、患者は治療に対する応答（完全および部分緩解）、血液研究により測定される毒性および一般的な健康分類のパフォーマンス・ステータス（performance status）またはクオリティ・オブ・ライフ分析について評価されるだろう。後者には、患者の一般的な活動レベルおよび、その通常の日常機能を発揮する能力が含まれる。これは、応答の強力な予測材料であることがわかっており、いくつかの抗癌剤は有意な腫瘍縮小を起こさずに実際にパフォーマンス・ステータスおよび健康の一般的意識を改善する。代謝拮抗物質ゲムシタビンは、膵臓癌において全体の生存を変化させることなくクオリティ・オブ・ライフに役立つこと、または高い客観的奏効率を生ずることが認められる当該薬剤の例である。したがって、治癒できないいくつかの癌について、当該医薬製剤は同様に疾患の真の完全応答または部分応答に影響を及ぼすことなく、有意な利益や健康なパフォーマンス・ステータスなどを提供してもよい。
【００９９】
血液疾患、例えば多発性骨髄腫、リンパ腫、および白血病などにおいて、これらの疾患は体のリンパ性および造血性領域の至る所に広く転移性であるため、応答は腫瘍直径の測定によっては評価されない。したがって、これらの広く散在した疾患に対する応答は通常、骨髄バイオプシーの結果に関して測定され、この結果において、異常腫瘍細胞芽の数が定量化され、完全応答は骨髄バイオプシー標本のいかなる腫瘍細胞の検出（例えば、顕微鏡的検出）も欠如していることにより示される。B細胞腫瘍多発性骨髄腫のため、もし実質的に減少していれば血清マーカーであるＭプロテインが電気泳動により測定可能であり、これは原発腫瘍の応答の証拠である。さらに、多発性骨髄腫において、標本に存在する異常腫瘍プラズマ細胞の数を定量化するために骨髄バイオプシーを使用してもよい。これらの疾患について、より高い療法が一般的に用いられ、骨髄腫および／またはリンパ性の区画内の応答に影響する。
【０１００】
本発明は、限られた数の態様との関連において、かつ具体的な詳細および例を参照してここに記載されるが、当該発明は本発明の本質的な特徴の精神から外れることなく多くの形態に具体化される。当該例となりかつ記載される態様は、本発明の概要および要約に記載されたものを含み、よっていかなる点においても説明的でかつ非限定的であると考えられる。本発明の範囲は、前述の記載よりもむしろ添付の特許請求の範囲により示され、当該請求の範囲と同等の意味および範囲内でのいかなる変更も包含するものとする。
【０１０１】
例
以下の例は特許請求の範囲に記載された発明を説明するものであるが、これらに限定されない。
【０１０２】
材料
ヒト悪性黒色腫A375細胞、ヒト前立腺癌PC-3およびDU-145細胞、ヒト骨髄腫8226/sおよび8226/I10細胞、およびヒト膵臓癌MiaPaCa細胞をAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA)から得た。DBおよびRajiリンパ腫細胞は、Alan List (University of Arizona, Tucson, AZ)博士のご好意により提供された。すべての細胞株は、5% (v/v) (DBおよびRaji細胞に対して10%) 加熱不活性化子牛血清 (Hyclone Laboratories, Logan, UT)、2 mM L-グルタミン, 100 U/mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシン(それぞれInvitrogen, Carlsbad, CAから) により亢進されたRPMI 1640培地中、5% CO2を含む加湿したインキュベータで37°Cで培養した。
【０１０３】
イメキソンは寛大にもAmpliMed Corporation (Tucson, AZ)から寄付され、L-シメノキシルホモシステインをここに記載されるL-ホモシステインチオラクトン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)からの代表的な合成経路に従って製造した。ＭＴＴおよびＳＲＢ検定の色素は、Sigma Chemical Co.から、アネキシンV-FITC/PIおよび1X結合バッファーはBioVision Labs (Mountain View, CA)から得た。
【０１０４】
例１
例１はインビトロのイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体の抗腫瘍活性を測定する方法を説明する。96ウェル(well)のプレート(BD Biosciences, San Jose, CA)に、各プレートの最後の１１のカラムの各ウェルの160 μlの成長培養液中に約5000個の細胞を播種した。それぞれのプレートの一番目のカラムを細胞を含まない160 μlの成長培養液で満たし、ブランクとして使用した。24時間の培養期間の後、最後の１０個のカラムの当該細胞には、シメキソニルホモシステインまたはイメキソンのいずれか40 μlを成長培養液中に加えた（列１をブランクとして、また列２を阻害されていない細胞成長を伴うコントロールとして残す）。各カラムのウェルに加えた薬剤の量は一定であるが、カラム間で異なり、個々のウェルの総体積における結果的な濃度は1 μMから1000 μMである。シメキソニルホモシスインまたはイメキソンのいずれかを細胞に添加してから３日または4日後（具体的なタイミングは添付の図および表１に示される）、当該8226/s、 8226/I10、 DBまたはRaji細胞を含むプレートをMTTアッセイを用いて分析したが（例えば、Mosmann, T., J Immunol Met. 65: 55-63 (1983); Rubinstein et al., J Natl Cancer Inst. 82: 1113-1118 (1990)を参照されたい）、一方、A375、 PC-3、 DU-145およびMiaPaCa 細胞を含むプレートはSRBアッセイを用いて分析した（例えば、Skehan et al., J Natl Cancer Inst. 82: 1107-1112 (1990)を参照されたい)。
【０１０５】
シメキソニルホモシステインのA375ヒト悪性黒色腫、PC-3およびDU-145ヒト前立腺癌、8226/sおよび8226/I10ヒト骨髄腫における細胞傷害性、およびMiaPaCaヒト膵臓癌細胞におけるイメキソンの細胞傷害活性との比較は、図１−５において、薬剤濃度の機能としてのコントロール細胞成長のパーセンテージとして示される。IC50は、50%の成長阻害を達成するために必要な薬剤の濃度である。
【０１０６】
表１は、これらの細胞傷害性の研究の数値的結果を示す。
【表１】
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【０１０７】
図１および表１に示される通り、シメキソニルホモシステインはインビトロで種々の腫瘍細胞において細胞傷害活性を示す。その上、シメキソニルホモシステインの抗腫瘍活性が直接的にイメキソン、これはヒト臨床研究において実質的な抗癌活性を持つことが示されるが、これと比較される当該細胞傷害性アッセイの結果は、本発明のイミノピロリドンチオールアミノ酸複合体が癌治療における効果的な療法として重要な展望を持つことを示す。
【０１０８】
例２
例２はイミノプイロリドンチオールアミノ酸複合体によりインビトロで誘発されるアポトーシスを測定する方法を説明する。DBリンパ腫細胞を96ウェルのプレート(BD Biosciences)中、前述した通りの条件で培養した。24時間の培養期間の後、当該細胞にはシメキソニルホモシステイン培養液中に加え（あるいは加えず）、各ウェルにおいてそれぞれ０μM、４５μM、９０μM、１８０μMのいずれかの薬剤濃度を得た。薬剤暴露の48時間後、CellQuest Pro software (BD Biosciences)を用いるBectin Dickenson FACScan (San Jose, CA) 蛍光活性化細胞分別機と組み合わせて、製造者の指示に従いアネキシンV-FITC (fluorescein isothiocyanate labeled annexin V)アポトーシス検出キット(BioVision Labs)を用いて、それぞれのウェル中の壊死、生存、プロアポトーシス、およびアポトーシス細胞の割合を測定した。製造者の指示には以下を含む：(i) 遠心分離による1-5 x 105個の細胞の収集、(ii) 500 μl 1X 結合バッファー(HEPES, NaCl, CaCl2 at pH 7.4)中での細胞の再懸濁、(iii) 5μlアネキシンV-FITCおよび5μlプロピジウムヨウ化物の添加、(iv) 暗闇、室温での5分間の細胞アッセイのインキュベーション、および(v) フローサイトメトリーによる定量化。アポトーシスアッセイのより詳細な考察については、Koopman et al., Blood 84: 1415-1420 (1994)に見られる。
【０１０９】
各薬剤濃度それぞれにおける当該アポトーシスアッセイの結果を図６に示す。当該図に示されるように、シメキソニルホモシステインの濃度の増加は、DBリンパ腫においてアポトーシスを誘導し、これはより高い薬剤濃度でのプロアポトーシスおよびアポトーシス細胞の割合の増加に示される通りである。当該蛍光シグナルの閾値強度によりフローサイトメトリー分析においてプロアポトーシス細胞とアポトーシス細胞とを区別することができるが、両者とも当該薬剤によるアポトーシス誘導を示す。
【０１１０】
例３
例３は、L-シメキソニルホモシステインを合成し、生成し、且つ特性を決定する方法について示す。
【０１１１】
L-ホモシステインチオラクトン(2 mM, 307.2 mg)をアルゴン下で2 ml 5 N NaOHに溶解した。当該混合物を37°Cで30分間反応させ、次に12 N, 6 N,および1 N HClによりpH 7.5まで滴定した。直ちにイメキソン(2 mM, 222 mg)を添加し、当該混合物をHPLCでモニターしながら37 °Cで５時間反応させ、次に-20°Cで凍結させることにより停止させた（5時間は最大生成物濃度を得る期間として確認された。）。
【０１１２】
前述の合成スキームにより製造されるL-シメキソニルホモシステインは、分取HPLC（semi-preparative HPLC）により精製され、未反応の出発物質を除去し、さらなる特性決定の当該生成物を脱塩した。100%水移動相を有するC18 (10 μ, 250 x 10 mm) 分取カラムを当該精製のために用いた。L-シメキソニルホモシステインを手動で収集し、その相対保持時間(~ 6.4分)および継続ダイオードアレイUVスキャン(~ 200 nm)により特徴的な吸収を確認した。
【０１１３】
当該精製したL-シメキソニルホモシステインは、質量分析により特徴付けられ、Finnigan LCQ HPLC/MS機器のESI+によって246.9の質量を得、これを理論上の分子量246.3と比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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