(57)【要約】本発明は、一部において、核酸を鋳型とする化学が、複数の生物学的標的の同時検出において適用できるという発見に基づく。本発明は、一部において、ポリメチン色素が、核酸を鋳型とする化学によって合成することができるという発見に基づく。本発明のアッセイは、体外、原位置、または体内において行うことができる。本発明は、核酸を鋳型とする化学、例えば、蛍光ポリメチン色素を生成することによる生物学的標的（例えば、核酸およびタンパク質）の検出のための組成物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機触媒の存在下で水性条件においてアルデヒドと活性水素成分との間でアルドール縮合を行うステップを含む、ポリメチン色素を作製するための方法。
【請求項２】
前記縮合反応は以下の通りであり、
【化２８】
2010504983.tif 000030
式中、
Ｚ’＝Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｐ、ＮＨ２、ＮＲ、Ｃ（ＣＨ３）２であり、Ｒはアルキル基であり、
ｎ＝０、１、２．．．であり、
Ｒ＝Ｈ、アルキルであり、
Ｒ’’＝Ｈ、アルキル、アルキルカルボン酸であり、
Ｒ’＝ＰｈまたはＮ−複素環、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲであり、Ｒはアルキル基であり、
前記有機触媒は、第二級アミン、第一級アミン、または二官能性アミン−酸触媒である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二級アミンは、ピロリジン、ピペリジン、ノルニコチン、またはその類似体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一級アミンは、３つより少ないアミノ酸単位を有するバリンまたはペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記二官能性アミン−酸触媒は、ピロリジン／ＡｃＯＨである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記有機触媒は、ピロリジニルメチル−ピロリジン、アミノメチルピロリジン、ジメチルエタン−１，２−ジアミン、プロパン−１，２−ジアミン、１−（２−アミノエチル）−ピペリジン、またはジメチルエチレン−１，２−ジアミンである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
請求項２の方法によって調製される（Ｉ）の化学構造を有するヘミシアニン色素であって、
【化２９】
2010504983.tif 000031
式中、
Ｚ’＝Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｐ、ＮＨ２、ＮＲ、Ｃ（ＣＨ３）２であり、Ｒはアルキル基であり、
ｎ＝０、１、２．．．であり、
Ｒ＝Ｈ、アルキルであり、
Ｒ’’＝Ｈ、アルキル、アルキルカルボン酸であり、
Ｒ’＝ＰｈまたはＮ−複素環、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲであり、Ｒはアルキル基である、
ヘミシアニン色素。
【請求項８】
ＩＩもしくはＩＩＩの化学構造を有するヘミシアニン色素であって、
【化３０】
2010504983.tif 000032
式中、
ｎ１＝１、２、３、４、５であり、
ｎ２、ｎ３＝０から１６であり、
Ｒ１＝アルキルであり、
Ｒ２＝Ｐｈ、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基であり、
Ｒ３＝Ｐｈ、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基であり、
（ＩＩ）
【化３１】
2010504983.tif 000033
式中、
ｎ１＝１、２、３、４、５であり、
ｎ２、ｎ３＝０から１６であり、
Ｒ１＝アルキルであり、
Ｒ２＝Ｐｈ、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基であり、
Ｒ３＝Ｐｈ、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基である、
（ＩＩＩ）
ヘミシアニン色素。
【請求項９】
ＩＶもしくはＶの化学構造を有するアルデヒドであって、
【化３２】
2010504983.tif 000034
式中、
ｎ１＝１、２、３、４、５であり、
ｎ２＝０から１６であり、
Ｒ１＝アルキルであり、
Ｒ２＝Ｐｈ、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基であり、
（ＩＶ）
【化３３】
2010504983.tif 000035
式中、
ｎ１＝１、２、３、４、５であり、
ｎ２＝０から１６であり、
Ｒ１＝アルキルであり、
Ｒ２＝Ｐｈ、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基である、
（Ｖ）
アルデヒド。
【請求項１０】
ＶＩもしくはＶＩＩの化学構造物を有する第四級塩であって、
【化３４】
2010504983.tif 000036
第四級塩。
【請求項１１】
以下の化学構造を有する第四級塩−核酸抱合体であって、
【化３５】
2010504983.tif 000037
式中、
ｎ＝０から１６であり、
Ｚ１＝Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｐ、ＮＨ２、ＮＲ１、Ｃ（ＣＨ３）２であり、Ｒ１は、アルキル基であり、
Ｒ＝任意の置換ベンジルもしくは高融合ベンジル環、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基であり、
Ｚ２＝ベンゼンまたは任意のＮ−複素環である、
第四級塩−核酸抱合体。
【請求項１２】
以下の化学構造を有するアルデヒド−核酸抱合体であって、
【化３６】
2010504983.tif 000038
式中、
ｎ１＝１、２、３、４、５であり、
ｎ２＝０から１６であり、
Ｒ１＝Ｈ、アルキルであり、
Ｒ２＝ＰｈまたはＮ−複素環、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基である、
アルデヒド−核酸抱合体。
【請求項１３】
以下の化学構造を有するヘミシアニン色素−核酸抱合体であって、
【化３７】
2010504983.tif 000039
【請求項１４】
ヘミシアニン−核酸抱合体を作製するための方法であって、請求項１３に記載のヘミシアニンを作製するための、請求項１２に記載のアルデヒドと請求項１１に記載の第四級塩との間で核酸を鋳型とする反応を行うステップを含む、方法。
【請求項１５】
前記核酸を鋳型とする反応は、螺旋構造の端部にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸を鋳型とする反応は、螺旋構造の中部にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
所望の蛍光特性を有する色素を選択するための方法であって、
（ａ）核酸を鋳型とする合成を介してオリゴヌクレオチドコード化色素のライブラリを調製するステップと、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドコード化色素を、固体支持体上で固定化された空間的に整列した相補的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリタイズするステップと、
（ｃ）前記固体支持体上で直接前記オリゴヌクレオチドコード化色素の吸収および蛍光特性を測定するステップと、
（ｄ）前記固定化された相補的オリゴヌクレオチドプローブの位置に基づいて、前記所望の蛍光特性を有する前記色素をコード化する前記オリゴヌクレオチドを特定するステップと、
（ｅ）前記所望の蛍光特性を有する前記色素の化学構造を特定し、特徴付けるステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
複数の標的ヌクレオチド配列を検出するための方法であって、
（ａ）多数のプローブ対を提供するステップであって、前記数は、標的ヌクレオチド配列の数と同じであり、各プローブ対は、（１）（ｉ）第１のオリゴヌクレオチド配列、および（ｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチド配列と連結した第１の反応基を含む第１のプローブと、（２）（ｉ）第２のオリゴヌクレオチド配列、および（ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチド配列と連結した第２の反応基を含む、対応する第２のプローブと、を含み、前記第１のオリゴヌクレオチド配列および前記第２のオリゴヌクレオチド配列は、対応する標的ヌクレオチド配列の２つの個別の領域に相補的である、ステップと、
（ｂ）前記プローブ対を、サンプルに存在する場合、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブが前記標的ヌクレオチド配列のそれらのそれぞれの相補的領域とハイブリタイズするという条件の下、前記標的ヌクレオチド配列の存在について検査されるサンプルと組み合わせることによって、前記第１の反応基および前記対応する第２の反応基を反応するように近接させるステップと、
（ｃ）前記第１の反応基と前記対応する第２の反応基との間の１つ以上の反応を検出することによって、前記標的ヌクレオチド配列の存在を判定するステップと、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記標的ヌクレオチド配列の数は、２から２０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的ヌクレオチド配列の数は、２から６である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的ヌクレオチド配列は、液相にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的ヌクレオチド配列は、固体支持体に付着している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の反応基と前記対応する第２の反応基との間の前記１つ以上の反応は、検出され得る蛍光化合物を生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の反応基と前記対応する第２の反応基との間の前記１つ以上の反応は、検出され得る化学発光化合物を生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の反応基と前記対応する第２の反応基との間の前記１つ以上の反応は、アルドール縮合反応を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の反応基と前記対応する第２の反応基との間の前記１つ以上の反応は、ウィッティヒ反応を含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年９月２８日出願の米国特許出願第６０／８４７，８５９号、２００７年３月７日出願の同第６０／９０５，３６４号、および２００７年３月１４日出願の同第６０／９１８，０２３号、および米国受理官庁における２００７年９月１８日出願のＬａｎｄｓｍａｎらによる、「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」という名称のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／ 号の利点および優先権を主張するものであり、参照することにより、各特許出願の開示の全体は、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して、生物学的検出および診断法におけるプローブおよびその使用に関する。より具体的には、本発明は、核酸を鋳型とする化学（例えば、核酸またはタンパク質の多重検出における所望の蛍光、化学発光もしくは発色特性を有する化合物の合成）を使用する生物学的検出のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
蛍光および着色化合物は、生体分子の存在、不在、状態、量、および組成を検出するために、生物学的研究および医学の分野において使用されている。蛍光および着色化合物を使用するアッセイは、体外、原位置、もしくは体内において行うことができる。ＤＮＡおよびＲＮＡの検出のための一般的に使用される体外アッセイの例としては、リアルタイムおよびエンドポイントポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡ基配列決定法、およびＤＮＡミクロアレイ技術が挙げられる。
【０００４】
近年、多検体の検出方法に関して公開された文献の量が増加しているが、それらのほとんどは遺伝分析に関与し、タンパク質検出に関するものもある。例えば、特許文献１を参照。
【０００５】
診断および分子生物学研究に使用される典型的核酸検出方法では、対象遺伝子に相補的な同義遺伝子プローブは、分光的、電気化学的、生化学的もしくは免疫化学的手段によって検出することができる小分子で標識される。ＰＣＲは、概して、標的化遺伝子配列の増幅のために組み込まれる。多検体を検出するためには、すぐに利用可能な蛍光色素により、蛍光ベースの技術がしばしば使用されている。例えば、プライマーは、異なる蛍光色素で標識され、蛍光の変化は、それらの相補体とのハイブリタイゼーションの後、モニタされる（例えば、特許文献２）。他の場合は、多重検出は、ＤＮＡ制限断片分析、および周波数領域蛍光寿命検出方法によるキャピラリー電気泳動において、挿入色素を標識として使用することによって行われる（非特許文献１）。これらの方法では、あらかじめ標識された蛍光色素を使用するため、検出感度は、標的結合および非結合蛍光標識プローブの分離に大きく依存する。標的遺伝子の固相固定化（例えば、蛍光の原位置でのハイブリタイゼーション）は、単に非結合蛍光標識プローブを洗浄することによって分離効率を改善することができるが、これによって、余分な工程が増える。しかしながら、潜在的背景は依然として高く、手順は困難である可能性がある。この問題に対処するためには、蛍光シグナルが、ハイブリタイゼーションの後のみに生じるように、非蛍光ラベル部分を、プローブに付着することができる。近年、ＤＮＡプログラム化学の発展により、原位置での蛍光色素の生成に対する新規の手法がもたらされた。例えば、非特許文献２；特許文献３を参照。
【０００６】
ポリメチン色素は、その優れた蛍光および光化学特性のために、色素レーザ、写真増感剤、および蛍光プローブとして広く使用されている。しかしながら、ポリメチン色素は、概して、無水条件下での酸／塩基触媒縮合によって合成されるが、核酸を鋳型とする化学と同等ではない（非特許文献３）。近年、文献は、ルイス酸（非特許文献４）およびエナミンベースの有機触媒（非特許文献５）を使用した水における改善されたアルドール縮合を報告した。しかしながら、アルデヒドで縮合するために使用されるポリメチン前駆体（活性水素成分）の第四級塩は、従来のアルドール縮合における前駆体（アルデヒドのアルファ炭素）とは本質的に異なる。
【０００７】
そのため、上述の生物学的検出方法に内在する欠点の多くに対処する新しい蛍光および測色技術の必要性が存在する。例えば、核酸を鋳型とする化学による、検出不能な前駆体からのポリメチン色素合成の方法、およびそのような化学の生物学的検出への適応の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，８９０，７４１号明細書
【特許文献２】国際公開第２００２／０５７４７９号パンフレット
【特許文献３】米国特許第７，０７０，９２８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｃｌｎｔｏｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００２，２３，１４７３−１４７９
【非特許文献２】Ｌｉ，Ｘ．；Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００４，４３，４８４８−４８７０
【非特許文献３】Ｊｅｄｒｚｅｊｅｗｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ  ２００３，５８，４７−５８
【非特許文献４】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，８２８７−８２８８
【非特許文献５】Ｍａｓｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，７３４−７３５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一部において、核酸を鋳型とする化学が、複数の生物学的標的の同時検出において適用できるという発見に基づく。本発明は、一部において、ポリメチン色素が、核酸を鋳型とする化学によって合成することができるという発見に基づく。本発明のアッセイは、体外、原位置、または体内において行うことができる。
【００１１】
一態様において、本発明は、有機触媒の存在下で水性条件においてアルデヒドと活性水素成分との間でアルドール縮合を行うステップを含む、ポリメチン色素を作製するための方法に関する。
【００１２】
一部の実施形態において、縮合反応は以下のものであり、
【００１３】
【化１】
2010504983.tif 000002
【００１４】
式中、
Ｚ’＝Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｐ、ＮＨ２、ＮＲ、Ｃ（ＣＨ３）２であり、Ｒはアルキル基であり、
ｎ＝０、１、２．．．であり、
Ｒ＝Ｈ、アルキルであり、
Ｒ’’＝Ｈ、アルキル、アルキルカルボン酸であり、
Ｒ’＝ＰｈまたはＮ−複素環、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲであり、Ｒはアルキル基であり、
有機触媒は、第二級アミン、第一級アミン、二官能性アミン−酸触媒、またはジアミンである。第二級アミンは、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ノルニコチン、またはその類似体であり得る。第一級アミンは、例えば、３つ未満のアミノ酸単位を有するバリンまたはペプチドであってもよい。二官能性アミン−酸触媒は、例えば、ピロリジン／ＡｃＯＨであり得る。ジアミン触媒は、例えば、Ｎ１，Ｎ１−ジメチルエタン−１，２−ジアミン、プロパン−１，２−ジアミン、１−（２−アミノエチル）−ピペリジン、またはその類似体であり得る。
【００１５】
他の態様では、本発明は、概して、例えば、本明細書で開示される方法によって調製される（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の化学構造を有するヘミシアニン色素に関し、
【００１６】
【化２】
2010504983.tif 000003
【００１７】
式中、
Ｚ’＝Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｐ、ＮＨ２、ＮＲ、Ｃ（ＣＨ３）２であり、Ｒはアルキル基であり、
ｎ＝０、１、２．．．であり、
Ｒ＝Ｈ、アルキルであり、
Ｒ’’＝Ｈ、アルキル、アルキルカルボン酸であり、
Ｒ’＝ＰＨまたはＮ−複素環、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲであり、Ｒはアルキル基である。
【００１８】
【化３】
2010504983.tif 000004
【００１９】
さらに他の態様では、本発明は、概して、ＩＶもしくはＶの化学構造を有するアルデヒドに関し、
【００２０】
【化４】
2010504983.tif 000005
【００２１】
【化５】
2010504983.tif 000006
【００２２】
さらに他の態様では、本発明は、概して、ＶＩもしくはＶＩＩの化学構造を有する第四級塩に関し、
【００２３】
【化６】
2010504983.tif 000007
【００２４】
さらに他の態様では、本発明は、概して、以下の化学構造を有する第四級塩−核酸抱合体に関し、
【００２５】
【化７】
2010504983.tif 000008
【００２６】
ｎ＝０から１６であり、
Ｚ１＝Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｐ、ＮＨ２、ＮＲ１、Ｃ（ＣＨ３）２であり、Ｒ１は、アルキル基であり、
Ｒ＝任意の置換ベンジルもしくは高縮合ベンジル環、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基であり、
Ｚ２＝ベンゼンまたは任意のＮ−複素環である。
【００２７】
さらに他の態様では、本発明は、概して、以下の化学構造を有するアルデヒド−核酸抱合体に関し、
【００２８】
【化８】
2010504983.tif 000009
【００２９】
式中、
ｎ１＝１、２、３、４、５であり、
ｎ２＝０から１６であり、
Ｒ１＝Ｈ、アルキルであり、
Ｒ２＝ＰｈまたはＮ−複素環、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ１）２、ＯＲ１であり、Ｒ１は、アルキル基である。
【００３０】
さらに他の態様では、本発明は、概して、以下の化学構造を有するヘミシアニン色素−核酸抱合体に関し、
【００３１】
【化９】
2010504983.tif 000010
【００３２】
さらに他の態様では、本発明は、概して、本明細書で開示されるヘミシアニンを作製するために、本明細書で開示されるアルデヒドと第四級塩との間で核酸を鋳型とする反応を行うステップを含む、ヘミシアニン−核酸抱合体を作製することに関する。
【００３３】
一部の実施形態において、核酸を鋳型とする反応は、螺旋構造の端部にある。一部の他の実施形態において、核酸を鋳型とする反応は、螺旋構造の中部にある。
【００３４】
さらに他の態様では、本発明は、概して、所望の蛍光特性を有する色素を選択するための方法に関する。該方法は、（ａ）核酸を鋳型とする合成を介してオリゴヌクレオチドコード化色素のライブラリを調製するステップと、（ｂ）オリゴヌクレオチドコード化色素を、固体支持体上で固定化された空間的に整列した相補的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリタイズするステップと、（ｃ）固体支持体上で直接オリゴヌクレオチドコード化色素の吸収および蛍光特性を測定するステップと、（ｄ）固定化された相補的オリゴヌクレオチドプローブの位置に基づいて、所望の蛍光特性を有する色素をコード化するオリゴヌクレオチドを特定するステップと、（ｅ）所望の蛍光特性を有する色素の化学構造を特定し、特徴付けるステップと、を含む。
【００３５】
さらに他の態様では、本発明は、概して、複数の標的ヌクレオチド配列を検出する方法に関する。該方法は、（ａ）多数のプローブ対を提供するステップであって、その数は、標的ヌクレオチド配列と同じ数であり、各プローブ対は、（１）（ｉ）第１のオリゴヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチド配列と連結した第１の反応基を含む第１のプローブと、（２）（ｉ）第２のオリゴヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチド配列と連結した第２の反応基を含む、対応する第２のプローブと、を含み、第１のオリゴヌクレオチド配列および第２のオリゴヌクレオチド配列は、対応する標的ヌクレオチド配列の２つの個別の領域に相補的である、ステップと、（ｂ）プローブ対を、サンプルに存在する場合、第１のプローブおよび第２のプローブが標的ヌクレオチド配列のそれらのそれぞれの相補的領域とハイブリタイズするという条件の下、標的ヌクレオチド配列の存在について検査されるサンプルと組み合わせることによって、第１の反応基および対応する第２の反応基を反応するように近接させるステップと、（ｃ）第１の反応基と対応する第２の反応基との間の１つ以上の反応を検出することによって、標的ヌクレオチド配列の存在を判定するステップと、を含む。
【００３６】
標的ヌクレオチド配列の数は、約２から約２０、例えば、２から６であり得る。標的ヌクレオチド配列は、液相であり得る。標的ヌクレオチド配列は、固体支持体に付着し得る。一部の実施形態において、第１の反応基と対応する第２の反応基との間の１つ以上の反応は、検出され得る蛍光化合物を生成する。一部の実施形態において、第１の反応基と対応する第２の反応基との間の１つ以上の反応によって、検出され得る化学発光化合物が生成される。
【００３７】
第１の反応基と対応する第２の反応基との間の１つ以上の反応は、例えば、アルドール縮合反応を含み得る。第１の反応基と対応する第２の反応基との間の１つ以上の反応は、ウィッティヒ反応を含み得る。
【００３８】
本発明は、本明細書に記載されるプローブの１つ、２つ、もしくはそれ以上を提供するキットを包含する。より具体的には、本発明は、生物学的標的の存在を検出するための方法として、検出可能なシグナルの生成のために核酸を鋳型とする化学を使用するプローブの１つ、２つ、もしくはそれ以上を提供するキットを包含する。
【００３９】
本発明の前述の態様および実施形態は、以下の図面、発明を実施するための形態、および特許請求の範囲を参照することにより、さらに十分に理解することができる。
【００４０】
定義
本明細書で使用される「ＤＮＡプログラム化学」または「ＤＰＣ」という用語は、核酸を鋳型とする化学、例えば、（１）関連反応基を有する１つ以上の鋳型を提供すること、（２）鋳型とのハイブリタイゼーションを可能にする条件の下で、アンチコドン（例えば、１つ以上の鋳型を有する相補的配列）を有する１つ以上の転移基（試薬）および反応基を接触させること、および（３）生成物を得るための反応基の反応、によって行われる、特定の生成物を得るための化学反応体の配列特異的制御を指す。例えば、一段階の核酸を鋳型とする反応では、「鋳型」および「相補的」オリゴヌクレオチドのハイブリタイゼーションによって、反応基が結び付き、その後、所望の生成物をもたらす化学反応が生じる。反応物および生成物の構造は、鋳型および転移基オリゴヌクレオチドを含有する核酸のそれらと関連しなくてもよい。例えば、それらは全て、それらの存在において参照することにより本明細書に明確に取り込まれる、Ｌｉｕらによる、米国特許第７，０７０，９２８号および米国特許公報第２００４／０１８０４１２Ａ１号、Ｇａｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐｐ．１６０１−１６０５；Ｄｏｙｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＪＡＣＳ，ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１２３７２−１２３７３を参照。また、２００６年５月３日出願のＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／１６９９９号、Ｃｏｕｌｌらによる、「Ｔｕｒｎ  Ｏｖｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、および２００６年５月２６日出願の米国特許出願第１１／４４１，８０４号、Ｃｏｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．による、「Ｂｉｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」を参照。
【００４１】
本明細書で使用される「核酸」、「オリゴヌクレオチド」（単に「オリゴ」と言及される場合もある）または「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを指す。ポリマーは、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学修飾塩基、生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、挿入塩基、修飾糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト連結）を含み得る。核酸およびオリゴヌクレオチドは、固定核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）等の、修飾骨格を有する塩基の他のポリマーも含み得るが、これらに限定されない。
【００４２】
本説明全体にわたって、組成物が特定の成分を有する、含む、もしくは含有すると記載される、または工程が特定の工程ステップを有する、含む、もしくは含有すると記載される場合、本発明の組成物が、記載される成分で本質的に構成される、もしくは記載される成分で構成もされ、本発明の工程が、記載される工程ステップで本質的に構成され、もしくは記載される工程ステップで構成もされることを意図する。さらに、ステップの順序またはある動作を行うための順序は、本発明が使用可能である限り重要ではないことを理解されるべきである。また、２つ以上のステップまたは動作は、同時に行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明は、以下の図面によってさらに理解することができる。
【図１】ポリメチン、シアニン、およびヘミシアニン色素の一般化学構造を示す図である。
【図２】重合化に有用なヘミシアニン色素、およびそれらのアルデヒドおよび第四級塩前駆体の一般化学構造を示す図である。
【図３】４重ヘミシアニン−ＤＮＡ染色システムの化学構造、およびそれらの分光特性を示す図である。
【図４】多検体に対する液相ベースのＤＰＣ蛍光アッセイの略図である。
【図５】多検体に対する固相ベースのＤＰＣ蛍光アッセイの略図である。
【図６】非ジップコード形式の構造における、多重ファミリー受容体二量体に対する免疫組織化学検査の略図である。
【図７】ジップコード形式の構造における、多重ファミリー受容体二量体に対する免疫組織化学検査の略図である。
【図８】本発明の一実施形態における生物学的標的の検出のための方法の略図である。
【図９】本発明の一実施形態における生物学的標的の検出のための方法の略図である。
【図１０】濃度、温度、および単一塩基対のミスマッチの有無によって影響されるハイブリタイゼーションの例を示す図である。
【図１１】ある融解曲線実験において使用される例示的なオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図１２】本発明の一実施形態における生物学的標的の検出のための方法の略図である。
【図１３】本発明の一実施形態における血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の検出のための方法の略図である。
【図１４】アプタマーを標的結合部とするスプリント付き、ジップコード形式の検出システムの例示的な実施形態を示す図である。
【図１５】抗体を標的結合部とするスプリント付き、ジップコード形式の検出システムの例示的な実施形態を示す図である。
【図１６】抗体を標的結合部とするスプリント付き、ジップコード形式の検出システムの例示的な実施形態を示す図である。
【図１７】は、ＤＰＣ反応混合物（螺旋端部）の吸収および蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図１８】ＤＰＣ反応混合物（螺旋端部）の吸収および蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図１９】粗ＤＰＣ反応混合物のＬＣ−ＭＳデータを示す図である。
【図２０】ＤＰＣ反応生成物のＬＣ−ＭＳデータを示す図である。
【図２１】ＤＰＣ反応混合物の吸収および蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図２２】ＤＰＣ反応生成物のＬＣ−ＭＳデータを示す図である。
【図２３】ＤＰＣ反応の、ある蛍光強度データを示す図である。
【図２４】ＤＰＣ反応の、ある蛍光強度データを示す図である。
【図２５】４つのヘミシアニン色素の蛍光励起および発光スペクトルを示す図である。
【図２６】４重ヘミシアニン色素生成に対して有用な例示的なＤＮＡ配列を示す図である。
【図２７】螺旋中部ＤＰＣ反応のからの４つのＤＮＡ抱合ヘミシアニン色素の正規化蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図２８】螺旋構造の端部における２つのＤＰＣ反応の蛍光動態解析を示す図である。
【図２９】トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）およびアジドクマリン（ＡｚＣ）レポータ化学による蛍光シグナルの生成および生物学的標的検出の実施例を示す図である。
【図３０】ＴＰＰおよびＡｚＣレポータ化学を介する蛍光シグナルの生成および生物学的標的検出の実施例を示す図である。
【図３１】オリゴヌクレオチド濃度のＴｍに及ぼす影響を示す融解曲線の特定の実施例を示す図である。
【図３２】アビジンの存在下および不在下におけるビオチン化オリゴヌクレオチドのＤＮＡハイブリタイゼーション融解曲線の特定の実施例を示す図である。
【図３３】アビジンとの結合時における、相補的ビオチン化オリゴのＴｍ変化の、ある例を示す図である。
【図３４】オリゴヌクレオチド＋／−ビオチンのＴｍに対する、塩およびマグネシウム濃度の影響の、ある例を示す図である。
【図３５】アビジン対オリゴヌクレオチドの異なる比率におけるビオチン化オリゴヌクレオチドの融解温度挙動の、ある例を示す図である。
【図３６】アビジンの存在下および不在下におけるビオチン−５’（＋）鎖オリゴで二重になった５’および３’（−）ビオチン−鎖オリゴの融解曲線の、ある例を示す図である。
【図３７】アビジンの存在下および不在下におけるＡＴリッチビオチン化オリゴ二量体の融解曲線の、ある例を示す図である。
【図３８】本発明の一実施形態における生物学的標的の検出のための方法の略図である。
【図３９】本発明の一実施形態における生物学的標的の検出に関する実験結果の例を示す図である。
【図４０】図４０Ａは、本発明の一実施形態における生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物におけるホルムアミドの影響）の例を示す図である。図４０Ｂは、本発明の一実施形態における生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物におけるホルムアミドの影響）の例を示す図である。
【図４１】図４１Ａは、本発明の一実施形態における生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物におけるホルムアミドの影響）の例を示す図である。図４１Ｂは、本発明の一実施形態における生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物におけるホルムアミドの影響）の例を示す図である。
【図４２】本発明の一実施形態における生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物におけるホルムアミドの影響）の例を示す図である。
【図４３】本発明の一実施形態における生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物の経時変化）の例を示す図である。
【図４４】本発明の一実施形態における生物学的標的の検出に関する実験結果（反応混合物の経時変化）の例を示す図である。
【図４５】本発明の一実施形態における生物学的標的の検出に関する実験結果（プローブ比率）の例を示す図である。
【図４６】ジップコード形式の検出システムによるＰＤＧＦの検出の実施例を示す図である。
【図４７】アプタマーおよびレポータの比率に関する実験を示す図である。
【図４８】ＰＤＧＦの検出のための「一体化」の検出システムの実施形態を示す図である。
【図４９】図式１である。
【図５０】図式２である。
【図５１】図式３である。
【図５２】図式４である。
【図５３】図式５である。
【図５４】図式６である。
【図５５】図式７である。
【図５６】図式８である。
【図５７】図式９である。
【図５８】図式１０である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
最も簡単な意味において、本発明は、例えば、標的核酸またはタンパク質を鋳型とする核酸を鋳型とする反応によって生成されたポリメチン色素の蛍光の測定による核酸を鋳型とする化学で標的分析物の存在を検出するためのものである。本発明は、好都合、正確、かつ高精度な方法において、多検体の分析方法を提供する。例えば、核酸の検出において、該方法は、非蛍光前駆体（例えば、アルデヒドおよびメチル第四級塩）に抱合された核酸プローブを使用して、ポリメチン多重色素を、標的核酸のハイブリタイゼーション時におけるプローブの化学反応により生成する。さらに、本発明は、ポリメチン色素の新規化学組成物、および、水性条件の下での従来の反応において、および核酸を鋳型とする化学により、ポリメチン色素を合成する方法を提供する。
【００４５】
ポリメチン染料化学
ポリメチン色素は、それらのポリエン鎖の反対端に電子供与体（Ｄ）および電子受容体（Ａ）を有するメチン（−ＣＨ＝）基の鎖によって特徴付けられる（図１、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｃｏｌｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，３ｎｄ  Ｅｄｎ．，Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｐｏｓｔｆａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２００３）。ポリメチン色素の典型的ＡおよびＤ末端（図１に示すように）は、チアゾール、ピロール、ピロリン、インドール、１，３，３−トリメチルインドリン、テトラゾール、ピリミジン、ピリジン、キノリン、および高縮合Ｎ−複素環もしくは任意の置換ベンジル環を含む。末端が両方とも複素環を含有するＮ−原子である場合、化合物は、シアニンと称される。１つのＮ−原子のみが環系の一部である場合、化合物は、ヘミシアニンと称される。ポリエン鎖におけるビニル基の数を変更することにより、ポリメチン色素の蛍光発光波長は、近紫外線から近赤外線へ調整することができる。末端基は、さらなる微調整の手段も提供できる。
【００４６】
図式１は、水性緩衝液における有機触媒アルドール縮合によるヘミシアニン形成を図示する。ピロリジン類似体等の一般有機触媒の一部がここに掲載されている。触媒を使用することによって、ヘミシアニン形成に対する反応条件は、無水から水性条件へ切り替えることができる。使用される水分含量の割合は、出発物質の溶解度のみに依存する。
【００４７】
図式２は、有機触媒の存在下におけるＤＰＣによるヘミシアニン色素生成の略図である。成分Ａ（アルデヒド＿ＤＮＡ）、成分Ｂ（活性水素成分を担持する第四級塩）、およびヘミシアニン＿ＤＮＡ抱合体の一般化学構造も記載されている。ヘミシアニン色素の蛍光発光波長は、ポリエン鎖（ｎ）におけるビニル基の数を変更することにより、もしくは成分Ｂにおける異なる置換基（Ｒ’）および末端基を使用することにより、調整することができる。
【００４８】
図２は、重合化に有用なヘミシアニン色素、およびそれらのアルデヒドおよび第四級塩前駆体の一般化学構造を示す。一般構造から得られる、４重ヘミシアニン＿ＤＮＡ色素、およびそれらの最大紫外線吸収および蛍光の発光波長の実施例が図３に記載される。
【００４９】
【化１０】
2010504983.tif 000011
【００５０】
Ｚ’＝Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｐ、ＮＨ２、ＮＲ、Ｃ（ＣＨ３）２であり、Ｒは、アルキル基であり、
ｎ＝０、１、２．．．であり、
Ｒ＝Ｈ、アルキルであり、
Ｒ’’＝Ｈ、アルキル、アルキルカルボン酸であり、
Ｒ’＝ＰｈまたはＮ−複素環、Ｈ、アルキル、ＳＯ３Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲであり、Ｒは、アルキル基である。
【００５１】
有機触媒：
１）ピロリジン、ピペリジン類似体
２）バリンまたは小ペプチド等のアミノ酸
３）ピロリジン／ＡｃＯＨ等の二官能性アミン−酸触媒
４）ジメチルエチレン−１，２−ジアミン、プロパン−１，２−ジアミン等のジアミン
【００５２】
【化１１】
2010504983.tif 000012
【００５３】
図４は、多検体が関与した多重検出のための液相ベースのＤＰＣ蛍光アッセイの略図である。各対は、ＰＣＲ増幅生成物であり得るウイルスの感染の診断判定における、特定の多形性部位もしくは遺伝子型を示す配列に相補的な非蛍光前駆体で標識される。ハイブリタイゼーションの後、ＤＰＣ蛍光生成物が形成される。塩および温度等のハイブリタイゼーション条件を変更することにより、マッチした対のみが蛍光シグナルを生成する。任意の非蛍光前駆体を除去するための洗浄工程は必要としない。この方法は、ポリヌクレオチド配列を分析または検出するために有用であるだけではなく、例えば、核酸抱合抗体を使用する抗体ベースのアッセイにおいても使用することができる。
【００５４】
図５は、多検体に対する固相ベースのＤＰＣ蛍光アッセイの略図である。ガラス板、ポリマー、または金めっき等の異なる固体支持体を、対象遺伝子を固定するために使用することができる。ハイブリタイゼーション、および触媒ＤＰＣによる蛍光化合物形成の後、固体支持体は、洗浄の必要性なしに、蛍光顕微鏡検査により直接可視化、または蛍光リーダにより検出することができる。
【００５５】
図６は、多重ファミリー受容体二量体に対する多重免疫組織化学（ＩＨＣ）検査を示す。各対は特定のホモもしくはヘテロ二量体を対象にし、固有のＤＰＣ生成物（例えば、示されるように各対からの固有の蛍光シグナル）を有する、プローブの複数の対は、多重受容体二量体の同時検出およびプロファイリングを提供することができる。図７に示されるように、ジップコード形式の、および非ジップコード形式のプローブ対の両方は、重合化試験において使用することができる。例えば、米国受理官庁における２００７年９月１８日出願のＬａｎｄｓｍａｎらによる、「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ」という名称のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／＿＿＿＿号を参照。
【００５６】
ここで開示される検出方法には多数の利点がある。１）ゼロ背景。ポリメチン生成物の励起波長で励起される場合、アルデヒドおよび第四級塩前駆体に対して背景蛍光シグナルはない。ＤＰＣ反応は、触媒の存在下のみで生じ、アルデヒドおよび第四級塩前駆体は、非常に安定しているため、前駆体の分解は見られず、そのため、分解生成物の背景蛍光はない。２）簡素。蛍光生成は、ワンポットで行われ、生成物の単離せずに原位置で検出される。３）特異性。蛍光生成は、配列に特異的な核酸相互作用に基づくため、シグナル生成は、核酸配列に特異的である。４）従来の方法と比較して、多数の分析物を検出することができる。ポリメチン色素の蛍光発光波長は、遠紫外線から近赤外線へ簡単に調整することができるため、多重波長色素は、多重コドンＤＮＡを使用することによりワンポットで生成することができる。検出可能な分析物の数は、ＤＰＣおよび染料化学によって制限されない。
【００５７】
核酸を鋳型とする化学の様々な、および一般的な態様は、以下で詳細に議論される。追加情報は、全てそれらの存在において参照することにより本明細書に明確に取り込まれる、Ｌｉｕらによる、米国特許第７，０７０，９２８号、および７，２２３，５４５号、欧州特許第１，４２３，４００Ｂ１号、および米国特許公報第２００４／０１８０４１２Ａ１号（ＵＳＳＮ１０／６４３，７５２号）、Ｇａｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐｐ．１６０１−１６０５；Ｄｏｙｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＪＡＣＳ，ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１２３７２−１２３７３、において見ることができる。また、２００６年５月３日出願の第ＰＣＴＷＯ０７／００８２７６Ａ２号、Ｃｏｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．による、「Ｔｕｒｎ  Ｏｖｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」を参照。
【００５８】
ＤＰＣ塩基のタンパク質検出
核酸を鋳型とする化学ベースのプローブを使用する生物学的検出の方法および組成物は、それらの存在において参照することにより本明細書に明確に取り込まれる、Ｃｏｕｌｌらによる、ＷＯ０６１２８１３８Ａ２号において記載される。
【００５９】
図８および図９は、タンパク質標的の検出のための本発明の一実施形態を示す。
【００６０】
図８は、ＤＰＣ塩基のプローブによるタンパク質標的の検出の実施形態を示す。２つのプローブは、標的結合部、相補的オリゴヌクレオチド、および化学反応性の高いＸおよびＹをそれぞれ含有する。ハイブリタイゼーションの際、ＸおよびＹは反応し、両プローブを共有連結し得る、またはし得ない（例えば、蛍光）化合物を生成するシグナルを作成する。ＸおよびＹの反応生成物は、非結合可溶性化合物として水溶液へ放出される場合がある。タンパク質標的は、ビーズ、スライドガラス（マイクロアレイ）等の表面等の固相に付着、または水溶液中にあってもよい。標的結合部は、例えば、アプタマー、抗体、抗体断片（すなわち、Ｆａｂ）、受容体タンパク質、もしくは小分子であり得る。
【００６１】
図９には、より具体的に２つのプローブを有するデュアルプローブ法の実施例が示され、それぞれ、「プレフルオロフォア」前駆体（Ｒ１およびＲ２）を持ち、互いにアニールするように設計された標的およびオリゴヌクレオチド配列に対する結合部を含有する。この実施形態では、検出は、プレフルオロフォアオリゴが、標的の不在下で互いにアニールしないような条件の下で行われる。これらの条件は、概して、周囲温度が、標的の不在下でのオリゴヌクレオチド対のＴｍより高くなるように選択される（オリゴ対が、目的の標的分析物の不在下でアニールしないように）。しかしながら目的の標的の存在下では、オリゴの局所的高濃度により、ハイブリタイゼーションが生じるように、それらの二本鎖複合体のＴｍが上昇し、シグナル生成核酸を鋳型とする反応（Ｒ１とＲ２との間の反応）が続く。シグナル生成核酸を鋳型とする反応は、プレフルオロフォアの局所的高濃度のために、上昇するが、互いに対するプレフルオロフォア基の近接および配向によっても促進される場合がある。シグナル生成のこの構成は、様々な生体分子、細胞、表面の検出、および原位置でのアッセイの設計のためのキットの作成を可能にする潜在能力を有する。シグナル生成は酵素を必要とせず、一様な形式は、サンプル操作の必要がない。
【００６２】
図９に２つのオリゴヌクレオチドが示され、それぞれ、任意のスペーサアームにより、この場合は抗体として示されるように個別の結合剤に連結されるが、アプタマーまたは小分子等の他の結合剤であり得る。各抗体は、タンパク質等の一般的な標的分析物上にある個別のエピトープを認識する。スペーサアームは、オリゴと結合剤との間の一方、もしくは両方のオリゴヌクレオチドに追加することができる。場合により、このスペーサアームは、所望の反応性を得るために、近接要件を満たすように要求される場合がある。原則として、スペーサアームは、任意の適切な群、例えば、線状もしくは分岐脂肪族炭素鎖Ｃ３からＣ５、Ｃｌ０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ２５、Ｃ３０、Ｃ３５、Ｃ４０、もしくはＣｌ００基、１から１０、１５、２０、３０、５０もしくは１００塩基長のＤＮＡ配列、または適切な長さのポリエチレングリコールオリゴマーであり得る。
【００６３】
プレフルオロフォアは、「螺旋端部」構成（図９上）で存在し得、一方はオリゴの５’端部に付着し、他方は３’端部に付着する（例えば、配列内に２つのプレフルオロフォアを配置する、または一方のオリゴを部分的ヘアピン構造（例えば、１００オングストローム長）にハイブリタイズさせる等を含む、他の構成を適用することができる）。第１の例では、一方のオリゴヌクレオチドは、５’からスペーサアームおよび標的結合剤に付着し、他方の３’は、スペーサアームおよび標的結合剤に付着する。非相補的ＤＮＡ配列から成り得るスペーサアーム、もしくはエチレングリコールのオリゴマー等の合成スペーサアームは、近接要件を満たすために追加することができる。そのようなスペーサアームは、非常に柔軟であることが可能であり、剛性スペーサで生じる可能性がある結合に関する、いかなる立体障害をも克服する利点を有する。適度に長いスペーサアームの設計によって、オリゴヌクレオチドが、逆平行構成でアニールすることができ、反応基が互いに反応できるようにする限り、両方のオリゴヌクレオチドは、５’からそれらの結合剤（図９下）、もしくは３’と連結することができる。最適スペーサアーム長は、各標的に対して設計され得る。過度に長いスペーサアームは、システムにおける特異性を低減、またはＴｍ増加の効果を低減させる場合があるため、避けるべきである。
【００６４】
オリゴヌクレオチドの対を繋ぐことによって生じる近接効果は、水溶液において遊離した２つのオリゴヌクレオチドと比較して、２つの相補的オリゴヌクレオチド配列のアニールの動力学に影響を与える場合がある。さらに重要なことに、局所的高濃度によって、遊離複合体と比較して、融解曲線が上昇し、すなわち、複合体のＴｍが増加する。バルク水溶液では、以下の方程式で示されるように、Ｔｍは、総オリゴヌクレオチド濃度に依存することが周知である。Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉ．Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２６，２２７−２５９。
Ｔｍ＝（１０００＊ΔＨ）／（Ａ＋ΔＳ＋Ｒ１ｎ（Ｃｔ／４）−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ  Ｎａ＋）
式中、ΔＨおよびΔＳは、螺旋形成に対するエンタルピーおよびエントロピーであり、Ｒは、モル気体定数であり、Ｃｔは、総オリゴマー濃度であり、Ｎａ＋は、水溶液におけるナトリウムイオンのモル濃度である。
【００６５】
図１０は、０．１Ｍの塩における短オリゴヌクレオチドの範囲内でのＴｍに対する濃度の傾斜は、上記の方程式に基づいて、オリゴヌクレオチド（図１１の配列）の濃度の１０倍の増加に対して、約＋７℃の依存性を有することを示す。そのため、例えば、局所濃度の１０００倍の増加は、約＋２１℃、Ｔｍを上昇させると考えられる。
【００６６】
Ｒ１およびＲ２の反応生成物は、化学転換の結果として、ハイブリタイゼーション複合体から放出され得る。そのため、フルオロフォアまたは発色団は、ハイブリタイゼーション複合体から分離され、独立して分析され得るか、フルオロフォアまたは発色団およびアニールされたオリゴヌクレオチドは、サンプルのさらなる一連の調査を行うことができるように、一旦検出されたら除去され得る。Ｒ１とＲ２のとの間の反応は、生成物が形成されると、２つのプローブと共有連結され得る、またはされ得ない。
【００６７】
図１２は、核酸鋳型ベースの生物学的検出に対する「ジップコード形式」のスプリント構造を使用する本発明の他の実施形態を示す。この実施形態では、核酸を鋳型とする反応をハイブリタイズし、設定する相補的オリゴヌクレオチドに直接連結されている（任意でスペーサ基を介して）標的結合部の代わりに、標的結合部は、「ジップコード」オリゴヌクレオチド配列に連結される。各対応するレポータオリゴヌクレオチドは、（核酸を鋳型とする反応を設定する「レポータ」配列に加えて）相補的な「抗ジップコード」配列を有する。核酸を鋳型とする化学反応は、反応し、検出可能なシグナルを生成する反応基と連結されるレポータオリゴのハイブリタイゼーションによって引き起こされる。プローブの各オリゴヌクレオチド配列は、検出システムにおいて、その目的のハイブリタイゼーションパートナーとのみ相補的であり、他のオリゴヌクレオチドに相補的ではないことが重要である。
【００６８】
このジップコード形式の構造は、抗ジップコード配列によって異なる下流レポータオリゴヌクレオチドで集合する、単一レポータ−オリゴヌクレオチド抱合体を作成することを支持する。固有の抗ジップコードと連結した異なるレポータのライブラリは、単に、その相補的ジップコードを有する結合剤−ジップコードオリゴヌクレオチド抱合体の化学量で互いに混合することによって、試験され得る。
【００６９】
図１３は、標的結合部が２つのアプタマーである、ジップコード形式のスプリント付き構造法の説明図である。実例となるオリゴ配列およびレポータ化学（例えば、トリフェニルホスフィン、ＴＰＰ、７−アジドクマリン、およびＡｚＣ）を使用しての血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の検出に対するこの例では、ＴＰＰレポータオリゴヌクレオチドは、ＴＰＰレポータオリゴヌクレオチド上でのジップコード配列（ＮＮＮ．．．．．）に相補的抗ジップコード配列（Ｎ’Ｎ’Ｎ’．．．．．）のハイブリタイゼーションにより、ＰＤＧＦアプタマーオリゴヌクレオチドへ自己集合する。レポータオリゴヌクレオチドは、例示的な１０塩基のレポータ配列および５’−ＴＰＰ基で終了する。異なるジップコードおよび抗ジップコード（対で互いに相補的）を有するオリゴヌクレオチドの別の対も、自己集合して、ＡｚＣレポータ配列および３’−ＡｚＣ基を提供する。ＡｚＣオリゴヌクレオチドは、ＴＰＰオリゴヌクレオチドに相補的であり、逆平行であるため、ＴＰＰおよびＡｚＣ基は、ＴＰＰおよびＡｚＣオリゴヌクレオチドが互いにアニールする場合、末端間で終了する。
【００７０】
図１４は、実例となるオリゴ配列およびレポータ化学（ＴＰＰおよびＡｚＣ）を使用してのＰＤＧＦの検出のためのジップコード形式のスプリント付き構造法をより詳細に示す。ＴＰＰ対は、まず、５’−末端上にあるＰＤＧＦ−アプタマー、Ｃ１８ポリエチレン−グリコールベースのスペーサ、および１８−ｍｅｒジップコード配列を含む。ＴＰＰレポータ配列は、その３’末端上にある相補的抗ジップコード配列、Ｃ１８ＰＥＧスペーサ、および５’ＴＰＰ基で終了する１０塩基対レポータ配列を含む。オリゴヌクレオチドのＡｚＣ対は、Ｃ１８ＰＥＧスペーサによって別のジップコード、５’抗ジップコードと連結した検出オリゴヌクレオチド、Ｃ１８ＰＥＧスペーサ、および３’ＡｚＣ基で終了するレポータオリゴヌクレオチド（ＴＰＰオリゴヌクレオチドに相補的）を介して３’アプタマー連結を含む。
【００７１】
図１５は、標的結合部として、アプタマーの代わりに抗体が使用される、対応する構造の例を示す。
【００７２】
「ジップコード形式」法の１つの利点は、レポータオリゴヌクレオチドを個別に作成し、結合剤および核酸鋳型活性化化学の両方の活性を維持する条件の下で結合剤によって、それらを互いに集合させる能力である。
【００７３】
ジップコード形式のシステムはオリゴヌクレオチドの２つの対に基づき、各対は、固有のジップコードと抗ジップコード対との塩基対合によって互いに結合される。「ジップコード」は、それらの相補的配列と特異的に結合するオリゴヌクレオチド配列であり、好ましくは、周知のゲノム配列（サンプルが、ゲノムＤＮＡを含有し得る場合、関連する）に相補的ではなく、同様なＴｍ値を有し、重要な二次構造を有さず、検出システムにおいて他のジップコードもしくは抗ジップコード配列にアニールしないように設計される。
【００７４】
本発明の方法は、第１および／または第２のオリゴヌクレオチド配列の酵素的もしくは化学的連結反応を必要としないことを指摘すべきである。
【００７５】
ジップコード形式の構造の設計を最適化する際に考慮され得る因子としては、例えば、（１）任意の立体障害を防ぐために、例えば、ハイブリタイゼーションパートナーが互いに到達することができるようにする、アプタマー／抗体とジップコードとの間のスペーサ基（例えば、オリゴヌクレオチドおよび／または非塩基群）（スペーサ１）、（２）複合体を形成するための抗ジップコード配列に対する十分安定したアニールを形成するためのジップコード配列の長さ、および（３）例えば、任意の立体障害を防ぐための、抗ジップコードとレポータ配列との間のスペーサ基（スペーサ２）を含む。
【００７６】
オリゴヌクレオチドに付着した結合剤（標的結合部）は、標的分子に特異的に結合し、本発明の設計が作用するようにする任意の化学的部分であり得る。例として、（１）抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｆａｂ’ｓ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｄａｂ、Ｆｖ、もしくはＳｃＦｖ断片、（２）小分子結合剤、例えば、抑制剤、薬剤、共同因子、（３）タンパク質検出のための受容体、および、受容体検出のためのタンパク質、（４）ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡアプタマー、（５）ＤＮＡ結合および調節タンパク質に対するＤＮＡ配列、（６）タンパク質結合モチーフを表すペプチド、（７）ファージ提示法、ランダム合成、突然変異生成により発見されたペプチド、（８）自然結合タンパク質対および複合体、（９）抗原（抗体検出のための）、および（１０）異なる特異性の２つの個別の結合剤として作用し得る２つのオリゴヌクレオチドに個別に付着した単一ポリクローナル抗体、等の広範囲の官能基を含む。
【００７７】
オリゴヌクレオチドに付着した標的結合部は、同標的内にある異なる部位を対象にした異種型であり得る。例えば、２つの結合剤は、２つの異なる抗体、抗体および受容体、抗体および小分子結合剤、受容体およびペプチド、アプタマーおよび共同因子、もしくは任意の他の組み合わせであり得る。
【００７８】
標的分析物は、標的が２つの（またはそれ以上の）結合部位を提供するのであれば、任意の形であることが可能である。単量体型およびホモ二量体もしくは高次重合相にあって、平衡状態で存在する分子は、同結合剤であるが異なる相補的ＤＮＡ配列を含有する一対のプローブによって検出され得る。適切な標的としては、タンパク質、細胞表面、抗体、抗原、ウイルス、バクテリア、有機表面、膜、細胞小器官、固定された細胞の原位置での分析、タンパク質複合体が挙げられる。本発明は、特に、融合タンパク質（例えば、ＢＣＲおよびＡＢＬの存在下でのＢＣＲ−ＡＢＬ）の検出に適切であり得る。
【００７９】
プローブの設計において、考慮すべき一事柄は、反応基を持つ２つのレポータ配列のＴｍである。二本鎖のＴｍは、標的の不在下で室温未満でなければならないため、この配列は、通常、短い、例えば、６〜１５塩基および／またはＡ−Ｔリッチであるべきである。典型的レポータ長の１０塩基対は、低塩濃度で約３０℃のＴｍを有する可能性がある。したがって、短配列に対しても、温度をさらにアッセイ温度未満に下げる、もしくはアッセイ温度を上げるために１０％から４０％ｖ／ｖのホルムアミドを追加することが、しばしば必要となる。非常に短いレポータオリゴヌクレオチドは、特異性の欠如で損害を受け、望ましくないジップコード配列（これらが使用されている場合）との一部の結合を提示する場合がある。
【００８０】
プローブの設計における他の因子は、任意のジップコード配列を含む、結合部とレポータ配列との間にあるオリゴヌクレオチドの長さである。これらは、レポータオリゴヌクレオチドが互いに到達し、アニールするために十分な長さでなければならない。配列は、柔軟なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーが組み入れられ得、任意の立体障害に対するさらなる保護を提供することができる。例えば、オリゴヌクレオチドの全長は、約３５塩基の長さであり得る。０、１つ、もしくは２つのＣ１８ＰＥＧスペーサ、またはホモポリマー経路を含有するオリゴヌクレオチドを使用することができる（すなわち、Ｃ１０）。
【００８１】
第３の考慮すべき事柄は、ジップおよび抗ジップ配列が使用されている場合、これらの長さである（すなわち、図１３および図１６）。各ジップコードが、任意の他のジップコード、抗ジップコード、またはレポータ配列ではなく、その抗ジップコードのみにアニールする必要性に加えて、重要なパラメータは、ジップコードと抗ジップコードとの間の二本鎖のＴｍである。Ｔｍは、レポータオリゴヌクレオチドが結合部にしっかりと付着した状態でいるために、アッセイにおいて使用される最高温度より実質的に高くなければならない。実際には、レポータ配列の約２倍の長さのジップコード（すなわち、全長１５〜３０塩基）が、望ましく、一般的にこれらの基準を満たす。
【００８２】
シグナル生成に関して、核酸を鋳型とする化学は、例えば、蛍光、化学発光、もしくは比色分子の作成または破壊等、光シグナルをもたらす標識を作成または破壊するために使用され得る。また、検出反応は、検出可能な標識、例えば、光標識を作成する反応を触媒する、光標識を作成する反応を抑制する、蛍光消光剤である、蛍光エネルギー移動分子である、Ｒａｍｅｎ標識を作成する、電気化学的発光標識（すなわちルテルニウムビピリジル）を作成する、電子スピン標識分子を製造する、等の生成物を直接または間接的に作成する生成物を作成または破壊するように設計され得る。
【００８３】
以下の実施例は、その様々な実施形態における本発明の履行に採用することができる重要な追加情報、例示およびガイダンス、およびその同等物を含む。本発明の履行は、例示のみを目的として、本明細書で提示されるこれらの以下の実施例からさらに十分に理解され、いかなる方法においても制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８４】
実施例１から４は、ＤＮＡプローブ調製に関連する。活性水素成分を担持するアルデヒドおよび複素環式前駆体の両方は、アミド結合形成によってＤＮＡと抱合することができる。まず、酸複素環式もしくは芳香族前駆体を合成する。その後、酸を、アミン機能性を担持するＤＮＡと容易に反応する活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）に変換する。
【００８５】
オリゴヌクレオチドは、標準ホスホラミダイト化学を使用して調製し、逆相Ｃ１８カラム（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ，ＵＳＡ）によって精製した。５’−アミノ基を担持するオリゴヌクレオチドは、５’−アミノ−修飾因子５を使用して調製し、３’−アミノ基を担持するオリゴヌクレオチドは、３’−アミノ−修飾因子Ｃ７ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して調製した。ＤＮＡおよび複素環式抱合ＤＮＡの濃度は、紫外線吸光度により２６０ｎｍで判定した。複素環式抱合ＤＮＡにおける複素環式部分からの２６０ｎｍでの紫外線吸光度の寄与は、ごくわずかであり、考慮しなかった。
【００８６】
【表２】
2010504983.tif 000013
【００８７】
実施例１  ＤＮＡ抱合第四級塩
図式３は、活性水素成分（インドリニウム＿ＤＮＡ）を担持するＤＮＡ抱合第四級塩を合成する一実施例を示す。２，３，３−トリメチルインドレニンは、市販されている。酸性官能基は、Ｎ−四級化によってインドリン環に導入した。
【００８８】
【化１２】
2010504983.tif 000014
【００８９】
化合物１の合成：５−ブロモ吉草酸（２．４３５ｇ、１３．４５ｍｍｏｌｅ）に、２，３，３−トリメチルインドレニン（２．１４１ｇ、１３．４５ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応混合物を、一晩、１１０℃で厳密に撹拌しながら加熱した。得られた濃紅な粘着性のある油をグレガー抽出器に移動し、一晩、ＥｔＯＡｃで抽出した。明るい赤の固体を得た。固体を、３０ｍＬのＭｅＯＨで再溶解した。ＭｅＯＨは減圧下で除去し、残渣は１０ｍＬのＥｔＯＡｃで処理した。褐色の固体が沈殿し、ろ過した。固体を、２×５０ｍＬのアセトンおよび２×１００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。合計１．５９０ｇの明褐色の固体を得た（収率３５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δｐｐｍ：７．９８（ｍ、１Ｈ）、７．８４（ｍ、１Ｈ）、７．６１（ｍ、２Ｈ）、４．４９（ｔ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、３Ｈ）、２．３０（ｔ、２Ｈ）、１．８４（ｍ、２Ｈ）、１．６３（ｍ、２Ｈ）、１．５３（ｓ、６Ｈ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（陽性モード）：２６０．２４１９。
【００９０】
化合物２の合成：化合物１（０．１ｇ、０．２９４ｍｍｏｌｅ）、Ｎ−ヒドロキシサクシミド（０．０６８ｇ、０．５８８ｍｍｏｌｅ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．０８５ｇ、０．４１１ｍｍｏｌｅ）を、１．５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。反応混合物を、３７℃で１時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を、ろ過によって除去し、ろ液を１５ｍＬのエーテルで処理した。明るい橙色の固体を、１０ｍＬのエーテルので３回洗浄し、数時間、真空下で乾燥させた。得られた固体は、直接次の反応のために使用した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（陽性モード）：３５７．１５９０。
【００９１】
インドリニウム化合物でのＤＮＡの標識化：２０ｎｍｏｌｅのＤＮＡを含有する１．５ｍＬの遠心分離バイアルに、ｐＨ７．８の４１．６μＬの０．１Ｍのナトリウムリン酸緩衝液（ＮａＰｉ）、Ｎ−メチル２−ピロリドン（ＮＭＰ）（９６ｍＭ）中の４１．６μＬの化合物２、および４１．６μＬのＮＭＰを加えた。バイアルを、撹拌器に入れ、３７℃で４時間振とうした。反応混合物を、セファデックスＧ−２５を使用してゲルろ過によって脱塩し、その後、逆相Ｃ８カラムによって精製した。インドリニウム＿ＥＤＣ２（ＤＮＡ：配列番号７５）：収率１５％。ＬＣ−ＭＳ（陰性モード）：Ｃ１６３Ｈ２１２Ｎ５７Ｏ９０Ｐ１５に対する計算（モノアイソトピック）：１２１６．７３７９［Ｍ−５Ｈ］−４、結果：１２１６．９５５２［Ｍ−５Ｈ］４−、インドリニウム＿ＥＤＣ４（ＤＮＡ：配列番号７７）：収率２２％。ＬＣ−ＭＳ（陰性モード）：Ｃ１７２Ｈ２２１Ｎ６０Ｏ９６Ｐ１５に対する計算（モノアイソトピック）：１２８０．５００２［Ｍ−５Ｈ］−４、結果：１２８０．７３５６［Ｍ−５Ｈ］−４、インドリニウム＿ＥＤＣ５（ＤＮＡ：配列番号７８）：収率１５％。ＬＣ−ＭＳ（陰性モード）：Ｃ１６６Ｈ２２０Ｎ５１Ｏ９５Ｐ１５に対する計算（モノアイソトピック）：１２２６．７４２６［Ｍ−５Ｈ］−４、結果：１２２６．９６５７［Ｍ−５Ｈ］−４。インドリニウム＿抗ジップ５（ＤＮＡ：配列番号７２）：収率１０％。ＬＣ−ＭＳ（陰性モード）：Ｃ３０７Ｈ４０１Ｎ１０８Ｏ１８０Ｐ２９に対する計算（平均）：１３４０．２６１４［Ｍ−８Ｈ］７−、結果：１３４０．２７０５［Ｍ−８Ｈ］７−。インドリニウム＿抗ジップ５ｍ（ＤＮＡ：配列番号７１）：収率１０％。ＬＣ−ＭＳ（陰性モード）：Ｃ３０８Ｈ４０４Ｎ１０９Ｏ１７７Ｐ２９に対する計算（モノアイソトピック）：１３３６．４９６９［Ｍ−８Ｈ］７−、結果：１３３６．６７３［Ｍ−８Ｈ］７−。インドリニウム＿抗ジップ３（ＤＮＡ：配列番号７０）：収率５％。ＬＣ−ＭＳ（陰性モード）：Ｃ３０７Ｈ４０４Ｎ１０７Ｏ１７８Ｐ２９に対する計算（モノアイソトピック）：１３３２．４０３４［Ｍ−８Ｈ］７−、結果：１３３２．６２９３［Ｍ−８Ｈ］７−。
【００９２】
実施例２  ＤＮＡ抱合第四級塩
図式４は、インドリニウム＿ＤＮＡと同様の経路をたどる、活性水素成分（ベンゾインドリニウム＿ＤＮＡ）を担持するＤＮＡ抱合第四級塩を合成する他の実施例を提供する。
【００９３】
【化１３】
2010504983.tif 000015
【００９４】
化合物３の合成：（化合物１の合成と同手順）：１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾインドール（２．７３ｇ、１３ｍｍｏｌｅ）および５−ブロモ吉草酸（２．３６ｇ、１３ｍｍｏｌｅ）を、一晩、１１０℃で厳密に撹拌しながら加熱した。オフホワイトの固体として合計３．０１６ｇの４を加工後に得た（収率５９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：８．３０（ｍ）、８．１５（ｍ）、８．０５（ｄ）、７．７（ｍ）、４．６６（ｔ、２Ｈ）、２．４５（ｔ、２Ｈ）、２．１（ｍ、２Ｈ）、１．８５（ｍ、２Ｈ）、１．８５（ｓ、３Ｈ）、１．８３（ｓ、６Ｈ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（陽性モード）：３１０．２０９．
化合物４の合成：化合物４は、化合物２の合成と同手順に従い合成し、エーテル沈殿後のＤＮＡの標識化のために直接使用した。
【００９５】
ベンゾインドリニウム化合物でのＤＮＡの標識化：インドリニウム＿ＤＮＡの合成と同手順に従い、５０ｎｍｏｌｅのＥＤＣ７から、合計１１．２ｎｍｏｌｅのベンゾインドリニウム＿ＥＤＣ７（ＤＮＡ：配列番号７９）を得た：収率２２％。ＬＣ−ＭＳ（陰性モード）：Ｃ１６８Ｈ２１６Ｎ５６Ｏ９２Ｐ１５＋に対する計算（モノアイソトピック）：１６５０．０００３［Ｍ−４Ｈ］−３；結果：１６５０．０３５９［Ｍ−４Ｈ］３−。
【００９６】
実施例３  ＤＮＡ抱合アルデヒド
図式５は、ＤＮＡ抱合アルデヒドの合成の一実施例を提供する。アルデヒド前駆体における酸性官能基は、過酸化水素によるシアノ基の加水分解によって導入される（Ｂｒａｄｙ，Ｊ．Ｄ．；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｓ．Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，１８８１２−１８８１８）。
【００９７】
【化１４】
2010504983.tif 000016
【００９８】
化合物５の合成：Ｎ−メチル−Ｎ−シアノエチル−４−アミノベンズアルデヒド（１．０２４ｇ、５．４４ｍｍｏｌｅ）を含有する５０ｍＬの円形フラスコに、２７．２ｍＬの５ＮのＮａＯＨ水溶液および６．８ｍＬの３０％Ｈ２Ｏ２を加えた。反応混合物を、２時間還流した。冷却後、反応混合物は、濃縮ＨＣｌ（３７重量％）を追加することにより中性化し、２×１００ｍＬのＥｔＯＡｃおよび１×１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を混合し、５０ｍＬのブラインで１回洗浄し、蒸発濃縮した。粗生成物は、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈＣｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィシステムの４０ｇのＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）によって精製した。合計０．７０２ｇの明るいピンク色の固体を得た（６２％）。エレクトロスプレーＭＳ：Ｍ＋Ｈ２０８．０７３５（Ｂｒａｄｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，１８８１２−１８８１８）。
【００９９】
アルデヒドでのＤＮＡの標識化：５のＮＨＳエステルを、化合物２と同手順に従い合成した。ろ過によりＤＣＵを除去した後、ろ液は、ＤＮＡ抱合（ＤＭＦにおける０．２Ｍ生成物として計算）のために直接使用した。５０ｎｍｏｌｅのＤＮＡを含有する１．５ｍＬの遠心分離バイアルに、ｐＨ８．６の１０４μＬの０．１ＭのＮａＰｉ、１２５μＬの上記のろ液、および８３μＬのＮＭＰを加えた。バイアルを、撹拌器に入れ、３７℃で一晩、振とうした。反応混合物を、セファデックスＧ−２５を使用してゲルろ過によって脱塩し、その後、逆相Ｃ８カラムによって精製した。アルデヒド＿ＥＤＣ２（ＤＮＡ：配列番号７５）（収率４４％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５９Ｈ２０４Ｎ５７Ｏ９１Ｐ１５に対する計算（モノアイソトピック）：１２０３．９７１０［Ｍ−４Ｈ］４−；１６０５．６３０６［Ｍ−３Ｈ］３−結果：１２０３．９６６４［Ｍ−４Ｈ］４−；１６０５．６３０５［Ｍ−３Ｈ］３−；アルデヒド＿ＥＤＣ３（ＤＮＡ：配列番号７６）：（収率４９％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５９Ｈ２０４Ｎ５９Ｏ９１Ｐ１５に対する計算（モノアイソトピック）：１２１３．９７２５［Ｍ−４Ｈ］４−；１６１８．９６６０［Ｍ−３Ｈ］３−結果：１２１３．９６２０［Ｍ−４Ｈ］４−；１６１８．９５９０［Ｍ−３Ｈ］３。アルデヒド＿抗ジップ２受容体１（ＤＮＡ：配列番号６９）（収率３０％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ３０３Ｈ３９６Ｎ１１０Ｏ１７７Ｐ２９に対する計算（モノアイソトピック）：１３２８．２４５８［Ｍ−７Ｈ］７−；結果：１３２８．３０５１［Ｍ−７Ｈ］７−。
【０１００】
実施例４  ＤＮＡ標識α，β−不飽和アルデヒド
図式６は、ＤＮＡ標識α，β−不飽和アルデヒド１を合成する実施例を提供する。ウィッティヒ試薬を、アルデヒドの対応するα，β−エナルへの二炭素ホモログ化のために使用した（Ｅｉｔｅｌ，Ｍ．；Ｐｉｎｄｕｒ，Ｕ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９８９，３６４−３６７）。アルデヒド前駆体における酸性官能基は、濃縮ＨＣｌによるシアノ基の加水分解によって導入した（Ｂｒａｔｅｎｋｏ，Ｍ．Ｋ．；Ｃｈｏｒｎｏｕｓ，Ｖ．Ａ．；Ｖｏｖｋ，Ｍ．Ｖ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ２００４，４０，１２７９−１２８２）。
【０１０１】
【化１５】
2010504983.tif 000017
【０１０２】
化合物６の合成：Ｎ−メチル−Ｎ−シアノエチル−４−アミノベンズアルデヒド（１．１１６ｇ、５．９ｍｍｏｌｅ）およびイリド（２．７１ｇ、８．９ｍｍｏｌｅ）を含有する１００ｍＬの円形フラスコに、５７ｍＬの乾燥トルエンを加えた。反応混合物を、一晩、還流させながら加熱し、冷却し、ろ過紙でろ過した。溶媒をろ液から除去した後、残留物を、まず、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈＣｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィシステムの４０ｇのＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラム（トルエン／エーテル）、その後、分取ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｉｅｎｄ  Ｐｒｅｐ−Ｃ１８、３０×１００ｍｍ、１０ｕｍ）によって精製し、０．２７ｇの純生成物を得た（２１％）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（陽性モード）：２１５．２２６。
【０１０３】
化合物７の合成：化合物６（０．１ｇ、０．４７ｍｍｏｌｅ）を含有する５０ｍＬの円形フラスコに、３０ｍＬの濃縮ＨＣｌを加えた。反応混合物を、沸騰させ、１時間、室温（ＲＴ）で放置した。ＨＰＬＣ分析によって、１つの生成物のみが形成され、出発物質は反応混合物に残らなかったことが示された。ＨＣｌのほとんどを除去した後、化合物を、水に溶解し、凍結乾燥させて生成物を得た。
【０１０４】
α，β−不飽和アルデヒドでのＤＮＡの標識化：化合物７のＮＨＳエステルは、化合物２と同手順に従い合成したが、代わりにシリカゲルクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製した。数時間、真空下で乾燥した後、化合物７のＮＨＳエステルを、ＮＭＰ（９６ｍＭ）で溶解し、アルデヒド＿ＤＮＡの標識化と同手順に従いＤＮＡを標識化するために使用した。アルデヒド１＿ＥＤＣ８（ＤＮＡ：配列番号８０）：収率４６％。Ｃ１６３Ｈ２１５Ｎ４８Ｏ９９Ｐ１５に対する計算（モノアイソトピック）：１６２９．９６９８［Ｍ−３Ｈ］−３；結果：１６２９．９９９５［Ｍ−３Ｈ］３−。アルデヒド１＿抗ジップ２レポータ１（ＤＮＡ：配列番号６９）：収率４０％。Ｃ３０５Ｈ３９８Ｎ１１０Ｏ１７７Ｐ２９に対する計算（モノアイソトピック）：１３３１．９６２３９［Ｍ−７Ｈ］−７；結果：１３３２．０７７８［Ｍ−７Ｈ］−７。
【０１０５】
実施例５から８は、ＤＮＡ抱合に対するインドールおよびインドリニウム類似体の調製に関連する。
【０１０６】
インドール類似体は、酸性条件の下でアリールヒドラゾンをインドールに変換することによって、一般的なＦｉｓｃｈｅｒ−インドール合成に従って合成することができる（図式７）。まず、第一級芳香族アミンおよび亜硝酸を、反応させ、ジアゾニウム塩を得る。その後、ジアゾニウム塩を、ヒドラジンに還元する（Ｈｕｎｓｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９５６，２１，３９４−３９９）。最後に、ヒドラジンは、３−メチルブタン−２−オンと反応させ、アリールヒドラゾンを形成し、ＮＨ３の異性化および除去によりインドールが形成される（Ｌｉｎｄｓｅｙ  ｅｔ．  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８９，４５，４８４５−４８６６）。
【０１０７】
図式７：インドールおよびインドリニウム類似体への一般合成経路
【０１０８】
【化１６】
2010504983.tif 000018
【０１０９】
実施例５：５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドールの合成
６０ｍＬの濃縮ＨＣｌ中の４−メトキシアニリン（２．４６ｇ、２０ｍｍｏｌ）の水溶液に、滴下で、０℃の３５ｍＬのＨ２Ｏ中のＮａＮＯ２（１．３８ｇ、２０ｍｍｏｌ）の水溶液に加えた。０℃で０．５時間撹拌した後、反応混合物を滴下で、０℃の３５ｍＬの濃縮ＨＣｌ中のＳｎＣｌ２（９．０３ｇ、４０ｍｍｏｌ）の水溶液に加え、その後、０℃で１．５時間撹拌し続けた。その後、２ＮのＮａＯＨを、ｐＨが９から１０になるまで加え、反応を止めた。水層をＤＣＭ（５０ｍＬ×３）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。ろ過および濃縮の後、所望の生成物、（４−メトキシフェニル）ヒドラジンを得（０．９８ｇ、収率３５％）、次のステップで直接使用した。
【０１１０】
２０ｍＬのＨＯＡｃ中の（４−メトキシフェニル）ヒドラジン（０．９８ｇ、７．１ｍｍｏｌ）および３−メチルブタン−２−オン（１．５３ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）の混合物を、一晩、１００℃で加熱した。混合物は、濃縮し、ｐＨが９から１０になるまで、１ＮのＮａＯＨを加えた。水溶液を酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出した。混合した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。ろ過および濃縮の後、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製し、６１０ｍｇの５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドールを得た（４５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：７．４３（ｄｄ、１Ｈ）、６．８１（ｍ、２Ｈ）、３．８３（ｓ、３Ｈ）、２．２６（ｓ、３Ｈ）、１．２８（ｓ、６Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）：１９０．１６。
【０１１１】
実施例６：４（６）−ニトロ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドールの合成
（３−ニトロフェニル）ヒドラジン（ＭＷ＝１８９．６、６８５ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）および０．７５ｍｌの３−メチル−２−ブタノンを、１０分間室温で、その後、１５分間４０℃で、８ｍＬのＥｔＯＨにおいて撹拌した。エタノールを減圧下で除去した。残留物を２０ｍＬの濃縮ＨＣｌに取り、２時間、１００℃で加熱した。その後、ＨＣｌ水溶液を減圧下で除去した。固体を２ｍＬの氷水で粉末にし、ろ過し、２ｍＬの氷水で洗浄した。空気中で乾燥させた後、固体の重さは、３００ｍｇであった。しかしながら、ＴＬＣは、それが２つの生成物の混合物を含有することを示した。水層を１ＮのＮａＯＨでｐＨ約８．０まで中性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した（５０ｍＬ×３）。有機層および前もって得られた固体を混合し、一晩、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。有機溶液をろ過し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、７０ｇ）によって精製し、ヘキサンにおいて８−１５％ＥｔＯＡｃで溶出し、２つの留分を得た。第１の留分は、淡黄色油として、２１７ｍｇ得たが（収率３０％）、１Ｈ  ＮＭＲによって化合物４−ニトロ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドールと同定された。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．０（ｄｄ、１Ｈ）、７．８９（ｄｄ、１Ｈ）、７．５０（ｔ、１Ｈ）、２．７３（ｓ、３Ｈ）、１．５０（ｓ、６Ｈ）。第２の留分は、黄色固体として、２４５ｍｇ得たが（収率３３％）、１Ｈ  ＮＭＲによって６−ニトロ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドールと同定された。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：８．３３（ｄ、１Ｈ）、８．１２（ｄｄ、１Ｈ）、７．５０（ｔ、１Ｈ）、７．３８（ｄ、１Ｈ）、２．３３（ｓ、３Ｈ）、１．２７（ｓ、６Ｈ）。
【０１１２】
実施例７：２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ベンゾ［ｇ］インドール−５−スルホン酸の合成
Ｈ２Ｏ（１５ｍＬ）中のナトリウム４−アミノナフタレン−１−スルホン酸塩（２．４５ｇ、１０ｍｍｏｌ）の水溶液に、１０〜１５℃でＨ２Ｏ（２ｍＬ）中のＮａＮＯ２（０．７０ｇ、１０ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。その後、水溶液を０．５ｍＬのＨ２Ｏ中の濃縮Ｈ２ＳＯ４（０．５４ｇ、５．５ｍｍｏｌ）の冷水溶液に加えた。温度を１０℃未満に維持し、混合物は、追加が完了した後、１．５時間撹拌した。その後、混合物は、２．５ｍＬの濃縮ＨＣｌおよび１．５ｍＬのＨ２Ｏ中のＳｎＣｌ２（３．８ｇ、１７ｍｍｏｌ）の冷水溶液に滴下で加えた。反応温度は、１０℃未満に維持し、一晩、放置した。それをろ過し、Ｈ２Ｏで十分に洗浄した。固体をブフナー漏斗で２回除去し、Ｈ２Ｏに懸濁し、ろ過した。得られた固体を真空下で乾燥させ、１．４ｇの４−ヒドラジニルナフタレン−１−スルホン酸（５９％）を得た。該物質は、次のステップで直接使用した。３ｍＬのＨＯＡｃ中の４−ヒドラジニルナフタレン−１−スルホン酸（０．７ｇ、２．９ｍｍｏｌ）の水溶液を、３−メチルブタン−２−オン（０．５ｍＬ、１．５ｅｑ．）、ＮａＯＡｃ（０．４７ｇ、２．０ｅｑ．）に加えた。混合物を３．５時間、１１０℃で撹拌した。冷却し、エーテルを追加した後、沈殿物をろ過し、７００ｍｇを得た。固体をＤＣＭに溶解し、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨを使用して、ＳｉＯ２上でフラッシュクロマトグラフィによって精製し、２７３ｍｇの生成物を得た。母液も濃縮し、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィによって精製し、３７２ｍｇの追加生成物を得た。全体の収率は、７７％であった。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δｐｐｍ：８．８（ｄｄ、１Ｈ）、８．４（ｄｄ、１Ｈ）、８．０（ｓ、１Ｈ）、７．５（ｍ、２Ｈ）、３．１（ｓ、５Ｈ）、２．３（ｓ、４Ｈ）、１．３（ｓ、６Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ：２８８．２［Ｍ−Ｈ］。
【０１１３】
実施例８：３−（４−カルボキシブチル）−１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−７−スルホン酸塩の合成
１５ｍｌのＨ２Ｏ中の６−アミノナフタレン−２−スルホン酸（２．２３ｇ、１０ｍｍｏｌ）の水溶液に、２ＮのＮａＯＨ（０．７５ｍｌ）を加えた。混合物を室温で５分間撹拌し、濃縮Ｈ２ＳＯ４（０．６８ｇ、６．９ｍｍｏｌ）を、滴下で０℃で加えた。２ｍｌの凍ったＨ２Ｏの後、２ｍｌのＨ２Ｏ中のＮａＮＯ２（１．０４ｇ、１５ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。水溶液を２時間０℃で撹拌した後、ジアゾニウム塩を、ろ過により除去し、冷水で洗浄した。その後、塩を３．２ｍｌの濃縮ＨＣｌおよび１．８ｍｌのＨ２Ｏ中のＳｎＣｌ２（４．９ｇ、２２ｍｍｏｌ）の冷（＜０℃）水溶液に少しずつ加えた。混合物を一晩、撹拌した。固体をろ過し、水で２回洗浄し、真空下で乾燥させ、１．８４ｇの６−ヒドラジニルナフタレン−２−スルホン酸（７７％）を得、それを次のステップで直接使用した。
【０１１４】
３ｍｌのＨＯＡｃ中の６−ヒドラジニルナフタレン−２−スルホン酸（０．７ｇ、２．９ｍｍｏｌ）の溶液に、３−メチルブタン−２−オン（０．５ｍｌ、１．５ｅｑ．）、ＮａＯＡｃ（０．４７ｇ、２．０ｅｑ．）を加えた。混合物を３．５時間、１１０℃で撹拌した。冷却した後、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＭｅＯＨで溶解し、３．０ｇのＳｉＯ２を加えた。ＭｅＯＨを除去し、シリカゲルを、シリカゲルカラムに搭載し、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨで溶出し、所望の生成物、１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−７−スルホン酸を得た（８７４ｍｇ、収率＞９５％）。ＬＣ−ＭＳ：２８８．２［Ｍ−Ｈ］。
【０１１５】
メタノール（５ｍＬ）中の１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−７−スルホン酸（７２３ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、イソプロパノール（３．１３４％、４．９１３ｇ、１．１ｅｑ．）中の水酸化カリウムの飽和溶液を加え、得られた懸濁液を２時間還流で加熱した。その後、混合物を濃縮し、対応するカリウム塩を得た。窒素雰囲気下において、３−メチル−２−ブタノン（５ｍＬ）中のカリウム１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−７−スルホン酸塩および５−ブロモ吉草酸（５８５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）の混合物を、２０時間１４０℃で加熱した。溶媒の除去およびクロマトグラフィ（ジクロロメタン／メタノール）による精製によって、３−（４−カルボキシブチル）−１，１，２−トリメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−７−スルホン酸塩（７０ｍｇ、単離収率７．２％）を得た。ＬＣ−ＭＳ：３９０．１８［Ｍ＋］。
【０１１６】
実施例９  水性緩衝液における有機触媒ヘミシアニン合成
図式８は、様々な触媒の存在下での水性緩衝液におけるヘミシアニン８を合成する実施例を提供する。ヘミシアニン形成の程度は、解析逆相ＨＰＬＣ（５４５ｎｍでの紫外線）によって容易にモニタされた。ヘミシアニン８の最大蛍光励起波長は５３５ｎｍであり、発光最大は５８０ｎｍである。生成物のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析によって、構造（Ｍ＋：４４９．１９９２）を確認した。実験データは、（Ｓ）−ピロリジンメチルピロリジン（（Ｓ）−ＰＭＰ）は、他の触媒より優れた触媒能力を有することを示した。
【０１１７】
【化１７】
2010504983.tif 000019
【０１１８】
触媒：
（１）Ｌ−バリン（０．３水当量）、（２）Ｌ−プロリン（０．３水当量）、（３）（Ｓ）−ピロリジンメチルピロリジン（０．３  ５０ｍＭのナトリウム緩衝液当量、ｐＨ８．５）、（４）（Ｓ）−２−ピロリジンメタノール（０．３水当量）、（５）亜鉛−プロリンまたはＺｎ（Ｐｒｏ）２（０．１  ２０Ｍのナトリウムリン酸緩衝液当量、ｐＨ８．５）、（６）ピロリジン／酢酸（０．４／０．２水当量）、（７）ピロリジン／１０−カンファースルホン酸（０．４／０．２水当量）
反応条件：それぞれ２５ｍＭの出発物質、水またはナトリウムリン酸緩衝液中の２０％ＮＭＰおよび必要な触媒、室温で１６時間
実施例１０〜１３は、ヘミシアニン形成のＤＰＣに関連する。
【０１１９】
実施例１０  ＤＰＣヘミシアニン形成（螺旋構造の端部）
図式９は、螺旋構造の端部によるＤＰＣヘミシアニン形成の実施例を提供する。アニール時には、２つのヘミシアニン前駆体は、反応するように螺旋端部に近接させ、縮合の後、両方のＤＮＡと連結したヘミシアニンを形成した。
【０１２０】
【化１８】
2010504983.tif 000020
【０１２１】
ＤＰＣ反応の進行を蛍光分光によってモニタした。図１７は、様々な条件における、インドリニウムおよびアルデヒドＤＮＡ（Ｉ＿ＥＤＣ２およびＡ＿ＥＤＣ４）（ＤＮＡ：配列番号７５；配列番号７７）のＤＰＣ反応混合物の蛍光発光を示す。まず、反応緩衝液においてヘミシアニン前駆体Ｉ＿ＥＤＣ２（ＤＮＡ：配列番号７５）およびＡ＿ＥＤＣ４単独の背景蛍光発光はない（図１７の２および３）。次に、ＤＰＣ反応は触媒依存性であるが、ｐＨ依存性ではない。（Ｓ）−ＰＭＰの追加なしでは、蛍光シグナルはない。反応条件のｐＨを単にｐＨ８．４から１０．０へ増加させても、シグナルは生成されなかった（図１７の５および６）。最後に、ＤＰＣ反応は、ワトソン−クリック配列に特異的である（核酸依存性）。ＥＤＣ４を、３つのミスマッチ核酸塩基ＤＮＡ（ＥＤＣ３、ＤＮＡ：配列番号７６）と切り替えたが、１４０分後でも蛍光シグナルは生成されなかった。微量の蛍光シグナルのみが、１６時間後に検出された（図１８）。１６時間後、ＬＣ−ＭＳは、反応１に対して、生成物の約９０％の変換を示した（図１９）。図２０は、構造を確認する、精製されたＤＰＣ生成物（ＥＤＣ４＿Ｈ＿ＥＤＣ２）（ＤＮＡ：配列番号７７；配列番号７５）のエレクトロスプレーのマスデータを示す。ＥＤＣ２＿Ｈ＿ＥＤＣ４（ＤＮＡ：配列番号７５；配列番号７７）に対して測定された相対量子収率は、蛍光標準としてスルホローダミン１０１を使用して、水中で約０．１であった。５５０ｎｍでのＥＤＣ２＿Ｈ＿ＥＤＣ４（ＤＮＡ：配列番号７５；配列番号７７）の消散係数は、水中で約８７０００であった。
【０１２２】
ＤＰＣ反応：反応は、特別の定めのない限り、室温で１０ｍＭの（Ｓ）−ＰＭＰ、ｐＨ８．４の５０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液、１ＭのＮａＣｌにおいて、２００ｎＭの各試薬で行った。触媒（Ｓ）−ＰＭＰは、両方の試薬を反応緩衝液に混合した後、加えた。
【０１２３】
実施例１１  ＤＰＣヘミシアニン形成（螺旋構造の中部）
図式１０は、反応物が、単一鋳型に相補的であり得る２つのプローブに標識化された螺旋中部構造を介するＤＰＣヘミシアニン形成の他の実施例を提供する。アニール時には、２つのヘミシアニン前駆体は、反応するように螺旋端部に近接させ、両方のＤＮＡと連結したヘミシアニンを形成した。実験データによって、鋳型が存在する場合にのみ、蛍光シグナルが生成されることが示された（図２１）。ＥＤＣ２＿Ｈ＿ＥＤＣ５（ＤＮＡ：配列番号７５；配列番号７８）は、精製し、その構造は、マスデータによって確認した（図２２）。ＥＤＣ２＿Ｈ＿ＥＤＣ５（ＤＮＡ：配列番号７５；配列番号７８）単独に対して測定された相対量子収率は、ＥＤＣ２＿Ｈ＿ＥＤＣ４（ＤＮＡ：配列番号７５；配列番号７７）と同様であった（水中で０．１）。５５０ｎｍでのＥＤＣ２＿Ｈ＿ＥＤＣ５（ＤＮＡ：配列番号７５；配列番号７８）の消散係数は、水中で約７５０００であった。
【０１２４】
【化１９】
2010504983.tif 000021
【０１２５】
ＤＰＣ反応：１０ｍＭの（Ｒ）−ＰＭＰ、ｐＨ８．４の５０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液、１ＭのＮａＣｌにおいて、温室で、各２００ｎＭのインドリニウム＿ＥＤＣ５（ＤＮＡ：配列番号７８）、アルデヒド＿ＥＤＣ５（ＤＮＡ：配列番号７８）、ＥＤＣ１（ＤＮＡ：配列番号７４）で、反応を行った。（Ｓ）−ＰＭＰは、試薬および鋳型の両方を反応緩衝液に混合した後、加えた。
【０１２６】
実施例１２  ヘミシアニンＤＰＣの動態検査
螺旋端部（実施例１０）および螺旋中部（実施例１１）ＤＰＣの両方に対する反応率を、蛍光分光によって調査した（図２３および図２４）。両反応に対する動態プロファイルは、非常に類似していた。約１６時間後、蛍光シグナルは、反応の完了を示す停滞期に達した。
【０１２７】
実施例１３  螺旋中部ＤＰＣを介しての４つの蛍光ヘミシアニン色素の生成
図３は、ＤＰＣによって生成することができる４重ヘミシアニン＿ＤＮＡ色素の実施例を提供する。この実施例では、合計２つの第四級塩前駆体（インドリニウムＩおよびベンゾインドリニウムＢＩ）および２つのアルデヒド（Ａ０、Ａ１）が、４つのＤＮＡヘミシアニン色素を生成するために必要である。これらの前駆体は、構造的類似性を共有するため、第四級塩およびアルデヒドに対するＤＰＣ条件は、類似しているはずである。文献データによると、ベンゾインドリニウム化合物は、概して、２０ｎｍの赤方偏移を与えるが、一方、１つの追加の二重結合抱合が、可視範囲（ヘミシアニン色素に対しては約８０ｎｍ）に向かって、蛍光発光波長をシフトさせる。図３には、これらの４つのヘミシアニン＿ＤＮＡ色素の分光特性が掲載される。
【０１２８】
小分子ヘミシアニン色素（９から１２）を、まず合成し、それらの蛍光励起および発光スペクトルを記録した（図２５）。予測したように、１つの追加のフェニル置換は、蛍光発光を、赤の方向に、２０ｎｍシフトさせたが（化合物９および１０）、ポリエン鎖における各追加ビニル基は、約８０ｎｍシフトした（９および１１、１０および１２）。ＤＮＡコドンの有用性およびＤＮＡプローブ調製の簡便性を最大限にするために、ＩおよびＢＩを標識化するために２つのＤＮＡ鎖のみが使用され、４つの鋳型鎖を有するアルデヒドに対して２つのＤＮＡ鎖を使用した（図２６）。各鋳型は、１つのヘミシアニン色素を生成するために、１セットのアルデヒドおよび第四級塩前駆体とワトソン−クリック塩基対合のみを行うことができる２つの固有のコドンを有した。ＤＰＣは、ワンポットにおける組み合わせ法で行った。図２７は、上述のＤＮＡコドンを使用する、インドリニウム／アルデヒド（ａ）、ベンゾインドリニウム／アルデヒド（ｂ）、インドリニウム／α，β−不飽和アルデヒド１（ｃ）、およびベンゾインドリニウム／α，β−不飽和アルデヒド１（ｄ）との間の４つの個別のＤＰＣ反応の正規化蛍光発光スペクトルを示す（図２６）。これらのＤＰＣ反応から４色が生成された。小分子ヘミシアニン色素からの蛍光データと同様に（図２５）、約１５ｎｍの蛍光発光波長差が、１つの追加のフェニル置換に対して見られた（化合物１３および１４、１５および１６）。ポリエン鎖における１つの追加ビニル基は、約８０ｎｍの蛍光発光波長でシフトした（化合物１３および１５、１４および１６）。
【０１２９】
ＤＰＣ反応：反応は、室温で、１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤＡ）、ｐＨ８．４の５０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌにおいて２００ｎＭの各鎖および鋳型を使用して行った。触媒は、両方の試薬と鋳型を反応緩衝液に混合した後、加えた。
【０１３０】
実施例１５  螺旋端部ＤＰＣを介する２つの蛍光ヘミシアニン色素の生成
２つのヘミシアニン生成物は、抗ジップ３＿インドリニウムと、それぞれ抗ジップ２レポータ１＿Ａ０および抗ジップ２レポータ１＿Ａ１を混合することによって形成した（ＤＮＡ：配列番号６９）。抗ジップ３＿インドリニウム（ＤＮＡ：配列番号７０）と抗ジップ２レポータ１＿Ａ０（ＤＮＡ：配列番号６９）の間で形成された生成物（１７）は、５４０ｎｍの最大励起および６００ｎｍの最大発光を有したが、抗ジップ３＿インドリニウム（ＤＮＡ：配列番号７０）と抗ジップ２レポータ１＿Ａ１（ＤＮＡ：配列番号６９）との間で形成された生成物（１８）は、６００ｎｍの最大励起および６７０ｎｍの最大発光を有した（図２８）。
【０１３１】
ＤＰＣ反応：反応は、３０℃で、１５ｍＭのＤＭＥＤＡ、ｐＨ８．０の５０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２において２００ｎＭの各試薬を使用して行った。総反応体積は５０μＬであった。触媒ＤＭＥＤＡは、両方の試薬を反応緩衝液に混合した後、加えた。蛍光は、触媒ＤＭＥＤＡを追加した直後に記録した。
【０１３２】
ＤＰＣ塩基のタンパク質検出に関する一般例
実施例１６  ハイブリタイゼーション誘導のアジドクマリン還元による蛍光の作成
５つのオリゴヌクレオチドは、標準ホスホラミダイト化学（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して調製した。５’−アミノ基（オリゴ２およびオリゴ６）を担持するオリゴヌクレオチドは、５’−アミノ−修飾因子５を使用した調製し、３’−アミノ基（オリゴ４およびオリゴ５）を担持するオリゴヌクレオチドは、３’−アミノ−修飾因子Ｃ７  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して調製した。
【０１３３】
【化２０】
2010504983.tif 000022
【０１３４】
【化２１】
2010504983.tif 000023
【０１３５】
オリゴ１、オリゴ４、およびオリゴ５は、合成担体から除去し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。オリゴ２およびオリゴ６のアミノ基は、それらのトリフェニルホスフィン誘導体と樹脂結合する間に変換し、これらを精製、単離し（Ｓａｋｕｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．，２００５，１２７，ｐｐ１６６０−１６６７）、それぞれオリゴ２−ＴＰＰおよびオリゴ−６ＴＰＰを得た。
【０１３６】
オリゴ４およびオリゴ５を担持するアミノ基は、７−アジド−４−メチルクマリン−３−酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの各オリゴの反応によって、それらのアジドクマリン誘導体（それぞれ、オリゴ４−ＡｚＣおよびオリゴ５−ＡｚＣ）に変換した（Ｔｈｅｖｅｎｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）Ｖｏｌ．２０６，ｐｐ−４７１−４７７）。反応は、１μＬのトリフルオロ酢酸を５μＬのＮ−メチルモルホリンに加えることによって行い、６．６ｎｍｏｌのオリゴ４もしくはオリゴ５を含有する１０μＬの水を加え、その後、ジメチルホルムアミド中のクマリンＮＨＳ−エステルの３０μＬの０．１６Ｍの水溶液を追加した緩衝液を調製した。各反応は、室温で２時間、継続し、その後、５０μＬの０．１Ｍの含水酢酸トリエチルアンモニウムを加えた。混合物をＮＡＰ−５脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ  ＵＳＡ）に加え、取扱説明書に従い溶出し、溶出液をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、それぞれ７７％および７０％の収率でオリゴ４−ＡｚＣおよびオリゴ５−ＡｚＣを得た。生成物の同一性は、Ｍａｌｄｉ−ＴｏＦ質量分析によって確認した。
【０１３７】
蛍光のハイブリタイゼーションに特異的な作成を証明するために、アジド−クマリンおよびトリフェニルホスフィン部分を担持する相補的および非相補的オリゴヌクレオチドの様々な組み合わせを、３０％含水ホルムアミド、５０ｍＭのＮａＣｌ、およびｐＨ７．２の１０ｍＭのナトリウムから成る緩衝液において、室温で反応させた。反応進行は、サンプルを３６０ｎｍで励起し、４５５ｎｍで光の放射をモニタするように設定したＶｉｃｔｏｒ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ蛍光光度計（ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃｈ，Ｔｕｒｋｕ  Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して経時的にモニタした。
【０１３８】
図２９は、オリゴ４−ＡｚＣおよびオリゴ２−ＴＰＰを、それぞれ２００ｎＭおよび４００ｎＭの最終濃度に混合する場合、蛍光の急速な増加が見られることを示す。この図において、００４は、オリゴ４−ＡｚＣを意味し、００２は、オリゴ２−ＴＰＰを意味し、００６は、オリゴ６−ＴＰＰを意味する。オリゴ６−ＴＰＰがオリゴ２−ＴＰＰに置換した場合、蛍光は生じない。オリゴ２−ＴＰＰは、オリゴ４−ＡｚＣに対するその塩基対合能力において完全に相補的であるが、オリゴ６−ＴＰＰは、３つのミスマッチのヌクレオチドを含有するため、相補的ではない。結果は、蛍光の作成が、オリゴ２−ＴＰＰのオリゴ４−ＡｚＣとハイブリダイズする能力によること、従って、得られたハイブリッドにおいてＴＰＰとアジドクマリン部分との間の反応を促進するという結論が裏付ける。オリゴ６−ＴＰＰとオリゴ４−ＡｚＣの反応の場合におけるシグナルの欠如は、これらの２つのオリゴヌクレオチドの二本鎖を形成する能力がないことに一致し、したがって、反応は促進されない。各単一オリゴヌクレオチドを含む対照反応は、いかなる非特異的効果をも排除するために行った。
【０１３９】
三重複合体に関与する追加実験の結果を図３０に示す。これらの実験において、オリゴ１は、ハイブリタイゼーションによって、２つの完全に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ５−ＡｚＣおよびオリゴ−２ＴＰＰ）を結合させるその能力と、１つの完全に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ５−ＡｚＣ）および１つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ６−ＴＰＰ）を結合させるその能力を比較するために試験した。オリゴ１およびオリゴ５−ＡｚＣは、２００ｎＭの最終濃度で、オリゴ２−ＴＰＰおよびオリゴ６−ＴＰＰは、４００ｎＭの最終濃度で使用した。図３０において、００１は、オリゴ１を意味し、００２は、オリゴ２−ＴＰＰを意味し、００５は、オリゴ５−ＡｚＣを意味し、００６は、オリゴ６−ＴＰＰを意味する。結果として、蛍光は、完全に相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ１、オリゴ５−ＡｚＣおよびオリゴ２−ＴＰＰ）の組み合わせが存在する場合にのみ生成された。
【０１４０】
実施例１７  オリゴヌクレオチドのハイブリタイゼーション、濃縮、および融解温度
１０塩基の相補的領域および１０塩基の一本鎖のスペーサアームを有し、さらに６炭素スペーサアームと連結した２つの２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを含むモデルシステムを調製した。これらのオリゴは、５’−ビオチン（６炭素スペーサアームを有する）の存在および不在の両方で合成した。以下に示されるように、相補的領域には、下線が引かれている。第３のオリゴは、（−）鎖オリゴと同一であるが、（＋）鎖に対して４つの塩基ミスマッチ（イタリック体）がある。
【０１４１】
【化２２】
2010504983.tif 000024
【０１４２】
１０塩基対オリゴヌクレオチド対（オリゴ２６＋オリゴ２７）の融解曲線は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒにおいて、二本鎖ＤＮＡと結合するＳＹＢＲ色素の蛍光を測定することによって調べた（Ｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，４７［４］，６３５−４４）。最大値が、曲線の屈曲点を表すように、結合曲線は、融解曲線の傾斜の第１の誘導体として表した（Ｔｍ、または二本鎖の部位の混合群の場合、「局部」Ｔｍ）。結合曲線は、アビジンが、７０℃以上までビオチン結合活性を保持するため、少なくともこの温度まで得た。
【０１４３】
この特定の対のオリゴヌクレオチドの濃度に対する依存性を調べるために、融解曲線を、５００から２０ｎＭの範囲で変化したオリゴヌクレオチド対に対して生成した（図３１）（例えば、Ｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，４７［４］，６３５−４４を参照）。得られたＴｍは、図３１のグラフにおける予測と同様に、オリゴヌクレオチド対の濃度が１０分の１になるごとに、約１０℃の割合で低下した（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。融解曲線は、ビオチン化および非ビオチン化オリゴヌクレオチド対に対して本質的に同一であった。４塩基のミスマッチ対は、本質的に、二本鎖構造を示さなかった。
【０１４４】
（＋）および（−）鎖をタンパク質標的に結合することが、Ｔｍを増加させるかどうかを試験するために、ビオチン化したこれらのオリゴヌクレオチドを、アビジンの存在下でインキュベートした。アビジンは、比較的互いに近く配置され、非常に堅く（Ｋａ約＜１０−１５Ｍ）、非協力的にビオチンと結合する、４つの同等物結合部位を含有する。
【０１４５】
ビオチン化した形でのオリゴヌクレオチド＃２６および＃２７の等モル濃度を見ると、ビオチン結合部位の約半分がオリゴヌクレオチドの相補的な対によって占められ、約半分が、同オリゴヌクレオチド（非相補的な対）で示されることが予想される。アビジンの存在下で２つの融解曲線ピークが見られることが予測される。１つのピークは、いずれかがアビジン（水溶液中で遊離）と非結合である、もしくはＴｍに対して近接効果を提示しないはずであるアビジンとの２つの結合のうちの１つのパートナーのみを有する、任意の対のオリゴヌクレオチドの結果である。有意に高いＴｍの第２のピークは、近接効果を提示するはずである両方がアビジンと結合した一対のビオチン化オリゴを提示する。
【０１４６】
そのような実験は、図３２で示されるように行われた。オリゴヌクレオチドは、６０℃に維持された、いわゆるホットスタートで、アビジンの存在下または不在下の水溶液に加えた。「ホットスタート」において、オリゴヌクレオチドは、水溶液におけるそれらのＴｍをはるかに上回る温度で、ビオチン結合部位と結合し、それらが一本鎖であることを確実にする。その後、水溶液を１０℃に下げ、７０℃に上昇させて、融解曲線分析を行なった。図３２に示されるように、アビジンの存在下または不在下における非ビオチン化オリゴ対の融解曲線は、３０〜３２℃のＴｍを示した（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。しかしながら、アビジンの存在下では、２つの十分に離れたＴｍピークが、３３℃および５２℃のＴｍ値で生成された。上昇温度ピーク（ほぼ２０℃に上昇したＴｍ）は、アビジンの存在下における２つの相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドの存在下でのみ見られた。ビオチン存在下と不在下のＴｍの差は、低塩濃度で最も高い傾向を示し（図３３）、１０ｍＭの塩化マグネシウムの存在下においてわずかに高い（図３４）（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。ビオチン化オリゴヌクレオチド対アビジンの最適モル比は、約３．５：１であることがわかり（オリゴ＋アビジンの総濃度＝０．７μＭ）、４つの同等物結合部位を有するアビジンに一致した（図３５）（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。これは、オリゴヌクレオチドは、アビジンの同分子と結合するという、Ｔｍ効果を得るための要件を実証するため重要なことである。５’ビオチン化鎖オリゴヌクレオチドに対する３’ビオチン化（−）鎖オリゴへの置換は、両方のオリゴヌクレオチドが、５’ビオチン化であった過去の結果に対し、Ｔｍ値の差はほとんど示さなかった（図３６）（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。
【０１４７】
室温で両方のオリゴヌクレオチドの等モル量を加え、６０℃に上昇し、その後、融解曲線を得ることによって実験を行ったが、結果は本質的に同一であった。この方法（およびホットスタート法）では、適切な融解曲線は、必要に応じて、各オリゴのアビジンに対する過剰モルを加えることによって生成することができる（しかしながら、予測されるように、オリゴ対の大過剰によって、低Ｔｍピークの大きさが増加する）。オリゴ対は、等モル量で一緒に加える限り、ビオチン結合部位を得るために同等に競合したため、これは、高ＴｍハイブリッドＤＮＡを形成する際に有害ではなかった。オリゴを、一度に１つずつ加えた場合、第１のオリゴ対アビジンの約２：１のモル比、その後、第２のオリゴ対アビジンを２：１で加えることが重要であった。逐次追加では、いずれかのオリゴのアビジンに対する過剰モル量を加えることによって、第１のオリゴによりアビジンの全ての結合部位が占領され、第２の相補的オリゴは、隣接する部位の占領できなくなり、Ｔｍ効果上昇が提示されない。これらの観察は、Ｔｍピークの上昇を提示するハイブリッドを得るための、相補的オリゴの隣接する対の２つの隣接するビオチン結合部位との結合であるメカニズムに一致する。
【０１４８】
実験は、全体がＡおよびＴから成る１０塩基の自己相補的オリゴヌクレオチドでも行った（オリゴ３１：５’−ビオチン−スペーサアーム−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡ）（配列番号２７）。このオリゴヌクレオチドは、塩基組成において均一であり、全体がＡＴから成るため、上に記載のモデルシステムより低いＴｍで融解し、相当急な融解曲線を形成した。アビジンの存在下では、そのＴｍは、３０．５℃から６１．５℃に増加した（図３７）（ＲＦＵは、相対蛍光単位を示す）。このオリゴヌクレオチドは自己相補的であるため、全ての結合は、結合の２分の１のみではなく、相補的鎖に至る。そのため、Ｔｍの増加の単一ピークのみが見られた。
【０１４９】
これらの実験は、アビジンではなく、抗ビオチン抗体を標的として使用して繰り返された。抗ビオチン抗体は、抗体のＦａｂ部分の端部の近くに位置する２つのビオチン結合部位を含有するが、結合部位は、アビジン上のビオチン結合部位よりさらに離れている。
【０１５０】
実施例１８  アプタマーを標的結合剤とする、タンパク質標的の検出
ここで、２つの相補的ＤＮＡプローブのアプタマー結合およびアニール時におけるタンパク質標的を検出するために、核酸を鋳型とするアジドクマリン（ＡｚＣ）−トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）化学を使用する例示的なシステムを設計した。
【０１５１】
材料
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＡは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（それぞれ、２２０−ＢＢおよび２２０−ＡＡ）から得た。抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂサブユニットモノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＡＢ２２０１）から得た。緩衝液は、ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２で、トリス／Ｍｇ緩衝液を含んだ。以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０１５２】
【化２３】
2010504983.tif 000025
【０１５３】
【化２４】
2010504983.tif 000026
【０１５４】
方法
ＤＰＣ反応条件  指定のない限り、１００μｌの総体積において、各１００マイクロリットルの反応物は、１×トリス／Ｍｇ緩衝液、４０ピコモルのＴＰＰおよびＡｚＣ反応プローブ、４０ピコモルの標的オリゴヌクレオチドもしくは標的タンパク質、および典型的に２５〜３０％ｖ／ｖのホルムアミドを含有した。サンプルは、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ１４２０分光光度計において２５℃でインキュベートし、蛍光の増加を、３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光でモニタした。
【０１５５】
結果：アプタマー−ＤＰＣプローブによるＰＤＧＦ−ＢＢの検出
図３８に示されるように、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）Ｂ−サブユニットに対して標的されたアプタマー配列を選択した（Ｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ＢｉｏＣｈｅｍ．２００３，４，８２９−３４）。これは、ＰＤＧＦ−Ｂサブユニット（約１０−９Ｍ）に対する高い親和性、およびＰＤＧＦ−Ａサブユニットに対して約１０分の１の低い親和性を有する一群のアプタマーに属する（Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１４４１３−２４，１９９６）。プローブ配列を合成し、それぞれ、相補的１０−ｍｅｒＤＮＡ配列、Ｃ１０スペーサ配列、および同３５−ｍｅｒアプタマー配列を含有した（オリゴ＃２０１、＃２０２）。各配列は、それぞれ３’もしくは５’と連結したアプタマーを有する５’−ＴＰＰもしくは３’−ＡＺＣ基を含有した。第２のＡｚＣプローブであるオリゴ＃２０３は、そのアニール配列が、完全に、ＴＰＰオリゴ（＃２０１）とミスマッチしたこと以外は、オリゴ＃２０２と同じであった。
【０１５６】
図３９に示されるように、３０％（体積）ホルムアミドの存在下では、ＴＰＰおよびＡｚＣプローブの互いの反応は、完全に、プローブ上のＰＤＧＦ−ＢＢおよび相補的ＤＮＡ配列の存在に依存した。反応は、いずれかのプローブの不在下においては不成功に終わった。
【０１５７】
反応のＤＮＡ依存性は、アッセイ温度に対するＤＮＡの融解温度に非常に依存した。０％ホルムアミドの存在下では（計算され、観測されたＴｍ＞Ｔアッセイで）、反応は、標的タンパク質ＰＤＧＦ−ＢＢの存在または不在下において行った（図４０Ａ）。実際には、これらの条件の下、ＰＤＧＦ−ＢＢの追加によって、反応率が、約５０％増加ではなく減少した。１０％ホルムアミドでは、ＰＤＧＦ−ＢＢは、それほど抑制的ではなかった（図４０Ｂ）。２０％ホルムアミド（図４１Ａ）では、状況は完全に逆であり、反応率は、ＰＤＧＦ−ＢＢの存在下を除いて、弱くなかった。３０％ホルムアミド（図４１Ｂ）では、反応は、完全に、ＰＤＧＦ−ＢＢの存在に依存した。４０％ホルムアミドでは、反応は、いかなるセットの反応物でも非常に遅かった（図４２）。全ての場合において、ミスマッチのプローブは、反応をほとんど、または全く生じなかった。
【０１５８】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎてモニタされた、相補的配でのＤＮＡ融解実験は、ホルムアミドの不在下におけるトリス／Ｍｇ緩衝液において配列のＴｍは約３０℃、およびホルムアミドの１０％の増加ごとに配列のＴｍが約７℃低下することを示した。検出アッセイに対する最適ホルムアミド濃度３０％に対するＴｍは、１０℃であった。
【０１５９】
０％ホルムアミドでは、オリゴヌクレオチドは、ＰＤＧＦ−ＢＢの不在下においても、少なくとも部分的二本鎖を形成することができる（Ｔｍは、Ｔアッセイよりわずかに高い）。２０％および３０％ホルムアミドにおける反応のＤＮＡ標的依存性は、タンパク質標的の不在下においてＴｍより高い温度で行ったアッセイによって説明される。反応は、複合体のＴｍが、２つのプローブのＰＤＧＦ−ＢＢ標的との結合によって増加しない限り、起こらない。４０％ホルムアミドでは、反応は、いかなる反応物のセットでも起こらない。可能性として、Ｔｍが減少しすぎたため、ＰＤＧＦ−ＢＢとの結合によって、それをＴアッセイ上に上昇させることができなかった、または、ホルムアミドが、ＰＤＧＦ−ＢＢのアプタマーへの結合を抑制したと説明できる。より複雑な状況は、ホルムアミドの不在下でのＰＤＧＦ−ＢＢの追加時における反応率の観測された抑制である。ＰＤＧＦ−ＢＢによって形成された二本鎖の半分は、非生産的であるため（５０％は、ホモ二本鎖）、率の低下は、恐らく、ＰＤＧＦ−ＢＢ結合によって、これらのホモ二本鎖が、ヘテロ二本鎖を形成する相補的対と、水溶液において解離そして再連結しないようになることによる可能性が高い。この状況は、特にヘテロ二量体標的における異なる結合部位を標的にするプローブ対の使用によって生じないはずである。
【０１６０】
当該アッセイの感度（図４３）は、ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度の希釈系列から生成された反応率を測定することによって計算した。Ｗａｌｌａｃ機器での最小検出レベルは、アッセイの背景雑音の標準偏差の３倍の計算値に基づいて、１００マイクロリットルアッセイ体積において０．８ピコモルと予想した。
【０１６１】
アッセイ感度も、ＰＤＧＦ−ＡＡを標的として使用して判定された。アプタマーモノマーは、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する親和性の約１０倍弱いＰＤＧＦ−ＡＡに対する親和性を有すると考えた。しかしながら、アッセイは、２つのアプタマー二量体といずれかの型のＰＤＧＦとの複合性の形成に関与するため、二量体の結合の親和力は、モノマーの親和性より堅いと考えられ、その親和性は、標的ＰＤＧＦの試験された濃度より（約１ナノモノマー低下）実質的に堅い（低Ｋｉ）べきである。図４４に示されるように、低もしくは高濃度（０、１．２５、２．５、５、１０、２０、および４０ピコモルのＰＤＧＦ−ＡＡ）でのＰＤＧＦ−ＡＡとのアプタマーＤＰＣプローブの反応率は、ＰＤＧＦ−ＢＢとの反応率と実質的に異ならない。これは、二量体として結合し、親和力の増加を提示するアプタマー対のモデルに一致する。
【０１６２】
ＡｚＣプローブに対するＴＰＰの比率  反応メカニズムのモデルを確認するために（図８、ＴＰＰ対ＡｚＣプローブの最適比率は、１：１と予測される）、図４５は、２つのプローブの比率は変化するが、２つのプローブの総量は、８００ｎｍｏｌｅのプローブ／反応で一定にした実験である。最高反応率を生じる比率は、約１：１であり、予測されたメカニズムに一致した。
【０１６３】
そのため、このモデルシステムでは、アプタマーが結合し、２つのプローブにおける相補的配列が互いにアニールしない限り、蛍光は生成されなかった。
【０１６４】
実施例１９  アプタマー結合剤での核酸を鋳型とする化学ベースの生物学的検出に対するジップコード形式の構造
図１４［１５×］は、例示的なジップコード構造をより詳細に示す。ＴＰＰ対は、まず、５’−末端上のＰＤＧＦ−アプタマー、Ｃ１８ポリエチレン−グリコールベースのスペーサ、および１８−ｍｅｒジップコード配列を含有した。ＴＰＰレポータ配列は、その３’末端上の相補的抗ジップコード配列、Ｃ１８ＰＥＧスペーサ、および５’ＴＰＰ基で終了する１０塩基対レポータ配列を含有した。ＡｚＣ検出プローブを含むオリゴヌクレオチド対は、Ｃ１８ＰＥＧスペーサによって別のジップコードと連結した３’−アプタマー、および５’抗ジップコード、Ｃ１８ＰＥＧスペーサ、および３’ＡｚＣ基で終了するレポータオリゴヌクレオチド（ＴＰＰオリゴヌクレオチドに相補的）と連結する検出オリゴヌクレオチドを含有した。
【０１６５】
２２℃の３５％ホルムアミドでは、反応は、両方のレポータオリゴヌクレオチド、両方のアプタマーオリゴヌクレオチド、および標的ＰＤＧＦ−ＢＢの存在に依存した（図４６）。２２℃でのホルムアミドの不在下では、反応は、ＰＤＧＦの存在とは関係なく進行した。これは、上に記載の「一体化」構造の性質に一致し、３５％ホルムアミドにおける蛍光生成のメカニズムが、ＰＤＧＦの追加時における、ホルムアミドにおけるレポータ配列二本鎖熱安定性の増加に依存することを反映する。２２℃でのホルムアミドの不在下において、レポータオリゴヌクレオチド二本鎖は、ＰＤＧＦの存在または不在下の両方において安定した。
【０１６６】
モデルの正確さは、ＴＰＰ対ＡｚＣアプタマーオリゴの比率を変えた実験によって確認した（図４７）。これらの実験は、アプタマーオリゴの最適比は、予測された１：１の比率（すなわち、０．４μＭのＰＤＧＦおよびアプタマーオリゴの総濃度で、５０％ＴＰＰオリゴ）であったことを示した。総レポータオリゴヌクレオチド対総アプタマーオリゴの最適比も、１：１であった。ＰＤＧＦ依存性反応は、受容体もしくはアプタマーオリゴヌクレオチドのいずれか１つの完全不在下では生じなかった。レポータオリゴヌクレオチドの化学量論的濃度以上では、ＰＤＧＦ非依存性シグナルは増加したが（背景）、ＰＤＧＦ依存性シグナルは、ほぼ一定であった。これらの観察の両方は、複合体が、各アプタマーオリゴ、各レポータオリゴ、およびＰＤＧＦに対して、１：１：１の比率で集合するモデルに一致した。
【０１６７】
これらの実験は、各ジップコードおよびその抗ジップコードが、レポータ配列またはアプタマー配列との最小の干渉の中で互いにアニールするように、複合体は、水溶液において自己集合することを示した。
【０１６８】
追加の順序、したがって、アプタマーおよびレポータプローブの集合の様態が、重要であったかどうかを判定するためにも、実験を行った。全てのプローブを混合物に一度に加えることと比較して、レポータオリゴヌクレオチドを加える前に、アプタマーオリゴヌクレオチドを、まずＰＤＧＦでインキュベートした場合、わずかに遅い反応率が得られた。アプタマーオリゴヌクレオチドおよびレポータオリゴヌクレオチドの各対を、混合し、ＰＤＧＦでインキュベートする前に、２つのセットを、まずインキュベートし、互いに集合できるようにした場合、幾分高い反応率が得られた。この理由は、アプタマープローブが、既に標的と結合している場合、アプタマープローブにアニールするジップコードと抗ジップコードに対して多少の立体障害があるからである可能性がある。
【０１６９】
対照として、ジップコード−抗ジップコード配列ではなく、ジップコード配列のみを含有する、１セットの一体化ＴＰＰおよびＡｚＣプローブを比較した（図４８）。この一体化システムの反応率は、ＰＤＧＦの追加による率の改善が、典型的に、二体化システムよりもわずかに良好であることを除いて、二体化システムのそれと同様であった。
【０１７０】
アプタマー含有ＴＰＰおよびＡｚＣプローブの配列も、設計に対する任意の制約を判定するために、体系的に変化させた。アプタマー含有ＴＰＰおよびＡｚＣオリゴを合成し、両方とも、図１４に記載されるように同じ配列を有したが、次の変更があった。（１）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの省略（オリゴ１１９および１２２）、（２）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの配列Ｃ１０−での置換（オリゴ１２０および１２３）、（３）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの配列Ｃ２０−での置換（オリゴ１２１および１２４）、（４）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの省略、およびジップコード領域における３つの３’塩基の省略（１５塩基への長さの減少）（オリゴ１２７および１２９）、および（５）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサの省略、およびジップコード領域における６つの３’塩基の省略（１２塩基への長さの減少）（オリゴ１２８および１３０）。
【０１７１】
この実施例で使用したオリゴヌクレオチドは、以下を含む。
【０１７２】
【化２５】
2010504983.tif 000027
【０１７３】
【化２６】
2010504983.tif 000028
【０１７４】
これらの、いずれの変更によっても、システムの性能に有意差は生じなかった。実験４）および５）も、レポータオリゴヌクレオチドにおけるＣ１８スペーサのすぐ上流で３および６塩基の一本鎖（ジップコードにアニールしない）構造をもたらした。
【０１７５】
これらの実験の結果は、アプタマーベースのＰＤＧＦ検出システムは、結合およびＤＰＣ機能を２つの個別のオリゴヌクレオチドに分離することによって構成できることを示す。適切なジップコード配列の選択によって、図１３に記載される検出形式は、一体形成で合成されたオリゴヌクレオチドと同様に機能する、アニールされたオリゴヌクレオチドの対に自己集合した。レポータおよびアプタマーオリゴヌクレオチドは、標的の導入前に、個別に集合され得るか、もしくは、全ての種は、ほぼ任意の順序で、一緒に追加され得る。この工程は、例えば、複数の標的を検出するために、アニールされた検出オリゴの１つ以上の対の溶液相集合に拡張し得る。複数の標的の検出は、個別で認識できるシグナル（例えば、放射光の異なる波長）を生成する異なるレポータオリゴヌクレオチドの使用を必要とする場合がある。
【０１７６】
これらの結果は、例えば、アプタマー含有オリゴヌクレオチドを使用して、ジップコード形式の報告法を、効果的に設計することができることを示す。
【０１７７】
アプタマーシステムでの結果が、結合とレポータ配列との間の安定複合体は、単に、ジップコードおよび抗ジップコード領域をアニールすることによって形成することができることを示したが、レポータ反応基の活性を高い可能性で保持する、共有結合的および不可逆的に２つのオリゴヌクレオチドを互いに連結する技術があることに注意するべきである。例えば、オリゴヌクレオチドは、ジップコードおよび抗ジップコードがほとんど二本鎖であり、残りの配列は一本鎖である温度において、対（核酸を鋳型とする化学に対する結合剤オリゴヌクレオチドおよび反応性オリゴヌクレオチド）でインキュベートすることができる。Ｔｒｉｏｘａｌｅｎ等の光活性化可能な挿入架橋剤を加え、その後、紫外線を照射することによって、２つの鎖を不可逆的にクロスリンクすることができる。同様に、紫外線照射によって、アニールされた配列の個別の鎖の間にチミジン二量体を導入し得る。別様に、配列は、後にＤＮＡリガーゼと結紮し得る、短標的（接合）ＤＮＡ、隣接した３’および５’に相補的に導入し得る。接合オリゴヌクレオチドは、別様に、ＲＮＡから成ってもよく、ＤＮＡにアニールされたＲＮＡを加水分解するＲＮａｓｅＨとの結紮の後に除去してもよい。これによって、２つのオリゴヌクレオチドを、単一の一本鎖ＤＮＡに変換することができる。これらの方法により、特定の標的に対する検出キットにおけるオリゴヌクレオチド試薬を、費用効率良く製造することができる。
【０１７８】
この実施例に関連する参照文献は、Ｃａｐａｌｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２０００，２８［７］，ｅ２１．；Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．，２００４，７１６１−７２；Ｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，４，８２９−３４．；Ｇｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９９，２９２，２５１−６２を含む。
【０１７９】
実施例２０  ＤＰＣ塩基の生物学的検出に対するジップコード形式の構造−抗体結合剤
他の実施形態において、アプタマー配列は、抗体等の非ＤＮＡ結合剤と置き換えられる。ＰＤＧＦおよび他のタンパク質標的に対して、アプタマー配列は、アルデヒド等の化学的活性基と置き換え、タンパク質標的に対する抗体または受容体等の非ＤＮＡ結合剤配と反応させる（図１６）。結合剤およびレポータオリゴヌクレオチドに対する最適設計は、結合剤の大きさおよび形状、および標的の結合部位の大きさおよび形状に配慮して得ることができる。例えば、より長い、もしくはより短いスペーサアームを、標的上の結合部位の間の距離を最適に補い、結合剤自体による立体障害を回避するために使用され得る。
【０１８０】
図１６を参照すると、ＴＰＰレポータ分子とハイブリタイズするように設計されたジップコード形式のオリゴヌクレオチドを５’−アミノ基を含有するように合成した。ＡｚＣレポータ分子とハイブリタイズするように設計されたジップコード形式のオリゴヌクレオチドは、３’−アミノ基を含有した。オリゴヌクレオチドと抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体との抱合体の合成は、ＳｏｌｕＬｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって行われた。
【０１８１】
抗体およびオリゴヌクレオチドの抱合のためのＳｏｌｕＬｉｎｋ技術は、まず、アセトンヒドラゾンを抗体上に取り込むために、スクシンイミジル２−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾンによる抗体の第一級アミノ基の修飾が必要である。オリゴヌクレオチドの第一級アミンは、スクシンイミジル４−安息香酸ホルミルで個別に活性化した。２つの活性分子は、所望の比率（典型的に、６：１）で混合し、安定したヒドラゾン連結を形成するために、弱酸性のｐＨで反応させた。この化学の詳細は、ｗｗｗ．ＳｏｌｕＬｉｎｋ．ｃｏｍで閲覧可能である。２つの抱合体を調製し、一方は、ＡｚＣ含有レポータオリゴヌクレオチドにアニールするためのジップコードを含有し、他方は、ＴＰＰ含有レポータオリゴヌクレオチドにアニールするためのジップコードを含有した。
【０１８２】
ＳｏｌｕＬｉｎｋから入手した抗体−オリゴヌクレオチド抱合体は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４の０．０１Ｍのカリウムリン酸塩−０．１３８Ｍの塩化ナトリウム）においてＳｕｐｅｒｄｅｘＳ−２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１．６×６０ｃｍカラムのゲルクロマトグラフィによってさらに精製した。カラム体積の約０．６倍で溶出する主要抗体ピークを採取し、汚染している非抱合オリゴヌクレオチドの後の溶出ピークは、処分した。抗体抱合体は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）３０Ｋ分画分子量Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒによる逆透析で濃縮した。タンパク質含有量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用して測定し、オリゴヌクレオチド含有量は、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ結合色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して測定した。抱合体は、両方とも、タンパク質分子当たり平均約３オリゴヌクレオチドを含有することが判定された。
【０１８３】
組み換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（２２０−ＢＢ）およびマウスモノクローナル抗ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＭＡＢ２２０）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）から入手した。
【０１８４】
本研究において使用した配列は、以下のものを含む（ＡｚＣは、アジドクマリンを示し、ＴＰＰは、トリフェニルホスフィンを示す）。
【０１８５】
【化２７】
2010504983.tif 000029
【０１８６】
なお、５’アミノ修飾因子Ｃ６は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ホスホラミダイト１１０−１９０６）から入手した。３’−アミノ修飾因子Ｃ７は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＣＰＧ２０−２９５７）から入手した。Ｃ１８ＰＥＧは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ホスホラミダイト１０−１９１８）から入手した。
【０１８７】
抗体−オリゴ抱合体とレポータオリゴヌクレオチドとの集合
それらのレポータを有する２つの抗体−オリゴ抱合体は、まず、１０μｌの体積において個別に集合させた。各集合体は、ｐＨ８の０．０５Ｍのトリス／ＨＣｌ−０．０１Ｍの塩化マグネシウムにおいて、０．５μＭ（５ピコモル）の抗体−オリゴヌクレオチド抱合体、および０．１５μＭ（１５ピコモル）の相補的レポータオリゴヌクレオチドを含有した。それぞれ、検出反応混合物における使用の前に、少なくとも１５分、４℃でインキュベートした。
【０１８８】
ＰＤＧＦ−ＢＢでの抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＤＰＣ抱合体／レポータの検出反応
検出反応を行うために、各反応物は、５０μｌの体積中に、上のように調製された各１０μｌの抱合集合体、および、可変量のＰＤＧＦ−ＢＢを、ｐＨ８の０．０５Ｍのトリス／ＨＣｌ、０．０１Ｍの塩化マグネシウム、４０％ｖ／ｖホルムアミドの緩衝液において、含み得る。抱合体は、０．２μＭでこの反応混合物に存在する。サンプルは、２５℃のＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ照度計内の黒い９６ウェルのマイクロプレートのウェルでインキュベートする。蛍光は、３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光で、時間に対して追求することができる。
【０１８９】
反応は、典型的に、２５℃で行い、反応生成物である７−アミノクマリンの波長の最適条件で蛍光生成をモニタし得る。
【０１９０】
参照による援用
本明細書で言及される各出版物および特許文献の開示の全体は、各個別の出版物もしくは特許文献が、そのように個別で示されるのと同じ程度で、あらゆる目的のために、全体として参照することにより援用される。
【０１９１】
同等物
本発明は、その精神もしくは本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形で具体化されてもよい。したがって、前述の実施形態は、あらゆる点で、本明細書に記載される本発明への制限ではなく、実例となるものとみなされる。そのため、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の請求項の範囲によって示され、特許請求の同等の意味および範囲内に入る全ての変更は、本明細書に包含されることを意図する。
【図１】
2010504983.tif 000040
【図２】
2010504983.tif 000041
【図３】
2010504983.tif 000042
【図４】
2010504983.tif 000043
【図５】
2010504983.tif 000044
【図６】
2010504983.tif 000045
【図７】
2010504983.tif 000046
【図８】
2010504983.tif 000047
【図９】
2010504983.tif 000048
【図１０】
2010504983.tif 000049
【図１１】
2010504983.tif 000050
【図１２】
2010504983.tif 000051
【図１３】
2010504983.tif 000052
【図１４】
2010504983.tif 000053
【図１５】
2010504983.tif 000054
【図１６】
2010504983.tif 000055
【図１７】
2010504983.tif 000056
【図１８】
2010504983.tif 000057
【図１９】
2010504983.tif 000058
【図２０】
2010504983.tif 000059
【図２１】
2010504983.tif 000060
【図２２】
2010504983.tif 000061
【図２３】
2010504983.tif 000062
【図２４】
2010504983.tif 000063
【図２５】
2010504983.tif 000064
【図２６】
2010504983.tif 000065
【図２７】
2010504983.tif 000066
【図２８】
2010504983.tif 000067
【図２９】
2010504983.tif 000068
【図３０】
2010504983.tif 000069
【図３１】
2010504983.tif 000070
【図３２】
2010504983.tif 000071
【図３３】
2010504983.tif 000072
【図３４】
2010504983.tif 000073
【図３５】
2010504983.tif 000074
【図３６】
2010504983.tif 000075
【図３７】
2010504983.tif 000076
【図３８】
2010504983.tif 000077
【図３９】
2010504983.tif 000078
【図４０】
2010504983.tif 000079
【図４１】
2010504983.tif 000080
【図４２】
2010504983.tif 000081
【図４３】
2010504983.tif 000082
【図４４】
2010504983.tif 000083
【図４５】
2010504983.tif 000084
【図４６】
2010504983.tif 000085
【図４７】
2010504983.tif 000086
【図４８】
2010504983.tif 000087
2010504983.tif 000088
【図４９】
2010504983.tif 000089
【図５０】
2010504983.tif 000090
2010504983.tif 000091
【図５１】
2010504983.tif 000092
【図５２】
2010504983.tif 000093
【図５３】
2010504983.tif 000094
【図５４】
2010504983.tif 000095
【図５５】
2010504983.tif 000096
【図５６】
2010504983.tif 000097
【図５７】
2010504983.tif 000098
2010504983.tif 000099
【図５８】
2010504983.tif 000100
2010504983.tif 000101
【配列表】
2010504983000001.xml
【国際調査報告】
2010504983.tif 000119
2010504983.tif 000120
2010504983.tif 000121