(57)【要約】  本発明は組換えニューカッスル病ウイルスゲノム転写ベクター、これに通じて製作された病原性ニューカッスル病ウイルスの表面抗原を有する弱病原性組換えニューカッスル病ウイルス、前記ゲノム転写ベクターを使用してニューカッスル病に対して優れた予防効能を有しながら病原性は低い組換えニューカッスル病ウイルスを製造する方法、及び前記組換えニューカッスル病ウイルスを含むニューカッスル病ワクチンに関するものである。
2010504751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆ蛋白質の１１３番から１１６番アミノ酸配列として下記の式２で表現される配列を有する弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＮＰ、Ｐ、Ｍ及びＬ蛋白質をコードするヌクレオチド配列;及び
Ｆ蛋白質の１１３番から１１６番アミノ酸配列として下記の式１で表現される配列を有する強病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、
前記Ｆ蛋白質コーディング配列において強病原性ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質の１１５番目アミノ酸のコーディングコドンがＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;ＵＡＣ及びＵＡＵチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換されたことを特徴とするニューカッスル病ウイルスのゲノム転写ベクター:
[式１]
113-X1X2X3X4-116
前記式のうち、
Ｘ１、Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立的にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）であり、
Ｘ２はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸である。
[式２]
113-X4X5X7X8-116
前記式のうち、
Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｘ５とＸ７は同時にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）でなく、
Ｘ８はアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）である。
【請求項２】
前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスはＩＩ型ニューカッスル病ウイルス菌株からなる群の中から選択されたものであり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスはＶＩ及びＶＩＩ型ニューカッスル病ウイルス菌株からなる群の中から選択されたものであることを特徴とする、請求項１に記載のゲノム転写ベクター。
【請求項３】
前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスはラソタ/４６菌株（ＡＹ８４５４００）であり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスはＫＢＮＰ-Ｃ４１５２（寄託番号:ＫＣＴＣ １０９１９ＢＰ）であることを特徴とする、請求項２に記載のゲノム転写ベクター。
【請求項４】
前記ＨＮ蛋白質コーディング配列が強病原性ニューカッスル病ウイルスのＨＮの５６９番目アミノ酸のＣ末端に弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＨＮ蛋白質の５７０番目後のアミノ酸配列が追加的に挿入された組換えＨＮ蛋白質をコーディングするものであることを特徴とする、請求項１に記載のゲノム転写ベクター。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列で表現されることを特徴とする、請求項１に記載のゲノム転写ベクター。
【請求項６】
Ｆ蛋白質の１１３番目から１１６番目アミノ酸配列として下記の式１
[式１]
113-X1X2X3X4-116
［前記式中、
Ｘ１、Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立的にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）であり、
Ｘ２はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸である］
で表現されるアミノ酸配列を有する弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＮＰ、Ｐ、Ｍ及びＬ蛋白質をコードするヌクレオチド配列、及び
Ｆ蛋白質の１１３番から１１６番アミノ酸配列として下記の式２
[式２]
113-X4X5X7X8-116
［前記式中、
Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｘ５とＸ７は同時にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）でなく、
Ｘ８はアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）である］
で表現されるアミノ酸配列を有する強病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有し、
菌株に含まれる前記Ｆ蛋白質コーディング配列が、強病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ蛋白質の１１５番目のアミノ酸をコードするコドンが、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;ＵＡＣ及びＵＡＵからなるチロシンコーディングコドンからなる群から選択されたいずれか１つのコドンで置換されたことを特徴とする、
ニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項７】
前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスがＩＩ型ニューカッスル病ウイルスからなる群から選択されたものであり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスがＶＩ及びＶＩＩ型ニューカッスル病ウイルスからなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項６に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項８】
前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスがラソタ/４６菌株（ＡＹ８４５４００）であり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスがＫＢＮＰ-Ｃ４１５２（寄託番号:ＫＣＴＣ １０９１９ＢＰ）であることを特徴とする、請求項７に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項９】
前記ＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列が、強病原性ニューカッスル病ウイルスのＨＮ蛋白質の５６９番のアミノ酸のＣ末端に、弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＨＮ蛋白質の５７０番目の後のアミノ酸配列が連結された、組換えＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列である、請求項６に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項１０】
寄託番号ＫＣＴＣ １０９８４ＢＰである、請求項６に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項１１】
Ｆ蛋白質の１１３番から１１６番アミノ酸配列として下記の式２で表現されるアミノ酸配列を有する弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列をＦ蛋白質の１１３番から１１６番アミノ酸配列として下記の式１で表現されるアミノ酸配列を有する強病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列で置換させ、前記Ｆ蛋白質の１１５番目アミノ酸のコーディングコドンをＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;及びＵＡＣ及びＵＡＵチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換させることを特徴とする組換えニューカッスル病ウイルスの製造方法:
[式１]
113-X1X2X3X4-116
前記式のうち、
Ｘ１、Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立的にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）であり、
Ｘ２はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸である。
[式２]
113-X4X5X7X8-116
前記式のうち、
Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｘ５とＸ７は同時にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）でなく、
Ｘ８はアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）である。
【請求項１２】
前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスはＩ型またはＩＩ型ニューカッスル病ウイルス菌株からなる群の中から選択されたものであり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスはＶＩ及びＶＩＩ型ニューカッスル病ウイルス菌株からなる群の中から選択されたものであることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスはラソタ/４６菌株（ＡＹ８４５４００）であり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスはＫＢＮＰ-Ｃ４１５２（寄託番号:ＫＣＴＣ １０９１９ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記ＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を強病原性ニューカッスル病ウイルスのＨＮの５６９番アミノ酸のＣ末端に弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＨＮの５７０番後のアミノ酸配列が追加的に挿入された組換えＨＮ遺伝子をコーディングするように変異させる段階を追加的に含むことを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項１乃至請求項５のうちのいずれか１つの請求項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスのゲノム転写ベクターを使用することを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記組換えニューカッスル病ウイルスはＫＣＴＣ １０９８４ＢＰであることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１７】
Ｆ蛋白質の１１３番から１１６番アミノ酸配列として下記の式２で表現されるアミノ酸配列を有する弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ蛋白質コーディング部分をＦ蛋白質の１１３番から１１６番アミノ酸配列として下記の式１で表現されるアミノ酸配列を有する強病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列で置換させ、前記Ｆ蛋白質の１１５番目アミノ酸のコーディングコドンをＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;及びＵＡＣ及びＵＡＵチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換させることを特徴とするニューカッスル病ウイルスの抗原性及び安定性増加及び弱毒化方法:
[式１]
113-X1X2X3X4-116
前記式のうち、
Ｘ１、Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立的にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）であり、
Ｘ２はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸である。
[式２]
113-X4X5X7X8-116
前記式のうち、
Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｘ５とＸ７は同時にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）でなく、
Ｘ８はアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）である。
【請求項１８】
前記ＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を強病原性ニューカッスル病ウイルスのＨＮの５６９番アミノ酸のＣ末端に弱病原性ニューカッスル病ウイルスＨＮの５７０番後のアミノ酸配列が追加的に挿入された組換えＨＮ蛋白質をコーディングするように変異させる段階を追加的に含むことを特徴とする、請求項１７に記載のニューカッスル病ウイルスの抗原性及び安定性増加及び弱毒化方法。
【請求項１９】
請求項６乃至請求項１０のうちのいずれか１つの請求項に記載の組換えニューカッスル病ウイルス菌株を含むニューカッスル病に対するワクチン。
【請求項２０】
前記ワクチンが、不活化された死毒ワクチン形態、活性ワクチン形態及びｉｎ ｏｖｏワクチン形態で構成された群より選択されたある１つの形態で使用される、請求項１９に記載のニューカッスル病ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本発明は韓国特許出願第２００６-０９３６２０号に基づいた優先権を主張し、前記出願明細書は本明細書に参照として含まれる。
【０００２】
本発明は組換えＮＤＶゲノム転写ベクター、これによって製作された病原性ＮＤＶの表面抗原を有する弱病原性組換えＮＤＶ、前記ゲノム転写ベクターを使用してニューカッスル病に対して優れた予防効能を有して病原性は低い組換えＮＤＶを製造する方法及び前記組換えＮＤＶを含むＮＤワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ニューカッスル病（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＮＤ）は国際的に最も重要な家畜疾病の１５種のうちの一つで急性熱性呼吸器疾病であり、免疫されていない家禽に感染した場合には１００％死亡する法廷第１種伝染病である。韓国はニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ、ＮＤＶ）常在地域で、この疾病の根絶に相当な困難があると予想される。また、韓国と活発な交易をしている東南アジア、中国及び台湾には多様なニューカッスル病ウイルスが流行していて潜在的な危害要因として存在するので、アジア型ニューカッスル病ワクチンの開発が切実な時点である。
ニューカッスル病ウイルスは単鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ）ＲＮＡウイルスでアブラウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ａｖｕｌａｖｉｒｕｓ）に属する。ニューカッスル病ウイルスはエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を保有していて、エンベロープにはウイルスを宿主細胞に結合させるＨＮ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ-Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）蛋白質とエンベロープと宿主細胞の融合を起こすＦ（Ｆｕｓｉｏｎ）蛋白質がある。Ｆ蛋白質とＨＮ蛋白質は糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）でエンベロープの表面に分布されている。
【０００４】
Ｆ蛋白質はI型膜糖タンパク質（ｔｙｐｅ I ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）で三量体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ）構造を形成する。Ｆ蛋白質は不活性前駆体形態（Ｆ０）に作られ、ゴルジ膜（Ｇｏｌｇｉ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を通って移動する間に活性形態のＦ１とＦ２に切られる。このような過程はＦ１サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）のアミノ末端で疎水性ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）を露出させ、これは成熟した蛋白質の生物学的活性に重要な役割を果たす。融合ペプチド（ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）と呼ばれる疎水性ドメインはパラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）Ｆ蛋白質でよく保存されていて膜融合を媒介するのに直接的に関与すると思われている。パラミクソウイルスＦ蛋白質は７個反復（ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔｓ）を含んでアルファヘリックス構造を形成する可能性のある２つの地域を含む複数の共通した構造形態を有している。２つの反復の中で最も長い７個反復Ａ（ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ Ａ）はＦ１のアミノ末端で疎水性融合ペプチドと隣接しており、７個反復Ｂは貫通膜（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）地域の上部に密着している。７個反復Ｂは毎７個残基ごとによく保存されたロイシンまたはイソロイシンの連続で構成されている。
【０００５】
ＨＮ蛋白質はII型膜糖タンパク質（ｔｙｐｅ II ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）でウイルスエンベロープの表面で四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）を形成して細胞膜に浸透する（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８:Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。ＨＮ蛋白質はビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）がグリコ接合（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）のシアル酸（ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ）に結合することによってホスト細胞表面に位置させる機能を持つ。ＨＮ蛋白質は貫通膜（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）ドメイン、茎（ｓｔａｌｋ）ドメイン及び球形（ｇｌｏｂｕｌａｒ）ドメインの３つの地域に分けられる。抗原性の収容体結合とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性位置は全て球形ドメインに位置している。融合誘導活性は茎ドメインに位置していて、これはＦ蛋白質と相互作用する（Ｓｅｒｇｅｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ ）。茎ドメインは予想される形態でα-ヘリックスと共に２つの７個反復地域Ａ（７４-８８位置）と７個反復地域Ｂ（９６-１１０位置）を有している。また、構造を破壊する何者かによる突然変異も収容体結合とノイラミニダーゼ活性を減少させる原因になるという報告がある。
【０００６】
ＮＤＶは鶏で疾病程度に応じて下記のような病原性タイプ（ｐａｔｈｏｔｙｐｅ）に分類される:１）消化器病変と高い死亡率を示す内臓親和強病原性（ｖｅｌｏｇｅｎｉｃ）ＮＤＶ;そして呼吸器及び神経学的症状が主に示されて高い死亡率を示す神経親和強病原性ＮＤＶ;２）低い死亡率、一部鳥類で急性呼吸器疾患及び神経性症状を示す亜病原性（ｍｅｔｈｏｇｅｎｉｃ）ＮＤＶ;３）軽症または無症状の呼吸器感染を誘発する弱病原性（ｌｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）及び無病原性（ａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）ＮＤＶ。
【０００７】
ＮＤＶが細胞に感染性を有するためにはＦ１及びＦ２に切断される前駆体糖蛋白質Ｆｏが必要である。この翻訳-後切断は宿主細胞プロテアーゼによって仲裁される。仮に切断行為が失敗すると非-感染性ウイルス粒子が生成され、さらにウイルス複製が進められない。毒性ウイルスのＦｏ蛋白質は広範囲なプロテアーゼによって切断され得るが、低い毒性のウイルスでＦｏ蛋白質はそれらの感受性に制約され、これらウイルスは単に特定宿主細胞タイプでのみ増殖可能である。
【０００８】
弱病原性の弱毒株ウイルスは単に呼吸器または腸管のようなトリプシン-のような酵素を有する領域でのみ複製する反面、毒性ウイルスは組織及び器官の範囲で複製することができて致命的な全身感染を招く。
【０００９】
Ｆｏ前駆体のアミノ酸を検査することにより、弱病原性ウイルスはＦ２及びＦ１鎖を連結する単一アルギニン（Ｒ）を有する反面、亜病原性以上の菌株は切断部位にＫ/Ｒ-Ｘ-Ｋ/Ｒ-Ｒ-Ｆのような２対を形成する追加の基本アミノ酸を保有するということを示した。さらに、亜病原性以上の病原性を有する菌株のＦ２鎖は一般にフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）残基で開示する反面、弱病原性以下の病原性を示す菌株のＦ２鎖は一般にロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）で開示する。
【００１０】
米国でニューカッスル病の同定は不活化ワクチンの使用を引き出した（Ｈｏｆｓｔａｄ， １９５３）。一部動物風土病ウイルスが単に軽い疾患を生産したという観察は最初に亜病原性生ワクチンローキン（Ｒｏａｋｉｎ）開発の結果をもたらし、次いで、さらに軽いＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１及びＬａＳｏｔａ（Ｇｏｌｄｈａｆｔ， １９８０）の開発を持ってきた。
【００１１】
生ワクチンの主な利点のうちの１つは費用の安い大量適用技術によって投与できるということである。通常の適用方法は水を飲むことを通じて行なわれる。
スプレー及びエアゾールによる生ワクチンの大量適用は複数の鳥類が短時間内にワクチン接種できるという容易性のためにまた非常に人気が高い。粒子が発生するノズルを調節することによって正確な粒子の大きさを達成することが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】韓国特許出願第２００６-０２６６６７号
【特許文献２】韓国特許出願第２００６-０９３６２０号
【特許文献３】韓国特許第０４５１８８３号
【特許文献４】米国特許出願 ＵＳ６，６９９，４７９Ｂ１
【特許文献５】米国特許出願 ＵＳ５，１６６，０５７
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】1.Kwon H.J.PhD Thesis. Seoul National University, 2000.
【非特許文献２】2.Lemniczi.B,Wehmann E., Herezeg J.,Ballagi-Pordny A.,Kaleta E.F., Werner O., Meulemans G., Jorgensen P.H., Mante A.P., Gielkens A.L.J., Capua I., and Damoser J., Arch Virol 143, 49-64, 1998.
【非特許文献３】Herezeg J., Wehmann E., Bragg R.R., Travassos Dias P.M., Hadjiev G., Werner O., and Lomniezi,B. Arch Virol 144, 2087-2099, 1999.
【非特許文献４】Yang C.Y., Shieh H.K., Lin Y.L., Chang P.C., Avian Dis 43, 125-130, 1999.
【非特許文献５】Kwon H.J., Cho S.H., Ahn Y.J., Seo S.H., Choi K.S., and Kim S.J., Vet Microbiol 95, 39-48, 2003.
【非特許文献６】Liu X.F., Wan H.Q., Ni X.X., Wu Y.T., and Liu W.B., (2003).Pathotypical and genotypical characterization of strains of Neweastle disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regeons of China during 1985-2001. Arch Virol, 148, 1387-1403.
【非特許文献７】Tsai H.J., Chang K.H., Tseng C.H., Frost K.M., Manvell R.J., and Alexander D.J., Vet Microbiol, 104, 19-30,2004.
【非特許文献８】‘Cho SH, Ahn YJ, Kim SJ, Kwon HJ. Characterization of a Newcastle disease virus with variation in the major Hemagglutinin-Neuraminidase (HN) linear epitope. The49th Annual Meeting of the Korean Society of Veterinary Science 2005, 45 (3,suppl), 199'
【非特許文献９】Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８
【非特許文献１０】Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８９
【非特許文献１１】Ｓｅｒｇｅｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３
【非特許文献１２】Ｈｏｆｓｔａｄ， １９５３
【非特許文献１３】Ｇｏｌｄｈａｆｔ， １９８０
【非特許文献１４】Ｘｉｏｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ３２，  Ｎｏ．１２ ｅ９８
【非特許文献１５】Ｓｐａｌａｔｉｎ,１９７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
最近使用される生ワクチンはいくつかの問題を持っている。これらワクチンは依然として若干の病原性を持っていて、場合によってはワクチン副作用が表れることがある。さらに、母系から遺伝された抗体が生ワクチンウイルスを中和して成功的な免疫形成が妨害されることもある。したがって、１次ワクチン接種はきわめて軽いウイルスを使用することが重要であり、母体移行抗体の克服が可能なワクチンが要求される。
【００１５】
不活化ワクチンはウイルスを殺すためにホルマリンまたはβ-プロピオラクトンで処理され、適切な補助剤と混合された感染性尿膜腔液から普通生産される。不活化ワクチンは筋肉または皮下注射で投与される。しかし、不活化ワクチンは生産して適用するのに費用が高い短所がある。
【００１６】
最近国内外で発生している強病原性ＮＤＶは抗原性でワクチン株と多くの差を示すと推定されるが、これに対する根拠としてはワクチン株の遺伝型と相当な差を示す野外株の発見とワクチン抗体力価が十分に高くない場合に死亡は防止することができるが、散乱率低下を防止することはできないという事実などが挙げられる。
ＮＤＶの遺伝型はＦ遺伝子の部分塩基配列に基づいた系統分析によってＩ型からＩＸ型までに分類される。国内に分布するニューカッスル病ウイルスは大概分子力学上ＶＩ型とＶＩＩ型に属する。このうち、ＶＩ型の場合には集中的なワクチン接種によって変異株が出現したが、ＶＩＩ型に比べては相対的に低い分離率を示し、２０００年後には大概ＶＩＩ型ウイルスのみ分離されていて絶滅の可能性もあると考えられている。したがって、塩基配列分析及びゲノム事業を通じた最近ＮＤＶの遺伝子構造結晶及び最近ＧｅｎＢａｎｋに登録されている全世界ＮＤＶとの遺伝子比較による分子力学研究は最適のワクチン株開発において非常に重要である。
【００１７】
現在商品化されたニューカッスル病（ＮＤ）不活化オイルワクチンは弱病原性ＮＤＶのクローン３０またはラソタ株を使用して生産されたものであり、強病原性ＮＤＶを利用した不活化ワクチンは安全性問題のために製造が禁止されている。したがって、より安全で経済的で野外株と類似の抗原性を示すＮＤワクチン生産技術の必要性が増大しているが、現在逆遺伝学（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）技術を利用したワクチン開発がこのような要求に最も近接した技術である。
【００１８】
ネガティブストランドＲＮＡウイルスの逆遺伝学技術はウイルスゲノムから感染性のあるウイルスを回収する技術として提案された方式である（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１６６，０５７等参照）。このような技術は最初にインフルエンザウイルスゲノムを操作するために提案されたものであるが、インフルエンザウイルス以外のＲＮＡウイルスである狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）をはじめとして多様な分節と非分節ネガティブストランドＲＮＡウイルスに成功的に適用されている。
【００１９】
本発明者らはこのような逆遺伝学技術を利用して新規ワクチン株開発のための研究を繰り返した結果、野外株と類似な抗原性を有する安全なＮＤワクチン株生産技術を開発して本発明を完成した。
【００２０】
本発明の目的は、組換えＮＤＶゲノム転写ベクターを提供することにある。
本発明の他の目的は、病原性ＮＤＶの表面抗原を有する弱病原性組換えＮＤＶを提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、前記のような組換えＮＤＶゲノム転写ベクターを使用してＮＤに対して優れた予防効能を有して病原性は低い組換えＮＤＶを製造する方法を提供することにある。
【００２２】
本発明の他の目的は、逆遺伝学技術を利用してＮＤＶの免疫原性は高めて病原性は下げるＮＤＶの弱毒化方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記組換えＮＤＶを含むＮＤワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は組換えニューカッスル病ウイルスゲノム転写ベクター、これを含む病原性ニューカッスル病ウイルスの表面抗原を有する弱病原性組換えニューカッスル病ウイルス、前記組換えニューカッスル病ウイルスゲノム転写ベクターを使用してＮＤに対して優れた予防効能を有して病原性は低い組換えＮＤＶを製造する方法及び前記組換えニューカッスル病ウイルスを含むニューカッスル病ワクチンに関するものである。
【００２４】
本発明のＦ遺伝子（３８４ｂｐ;Ｆ遺伝子ヌクレオチド位置１〜３８４ｂｐ）と近隣結合法を利用したニュケスルウイルスの系統分析の結果は次の通りである:
【表１】
2010504751.tif 000003
【００２５】
前記の図面に示された菌株は例示に過ぎず、現在幾多の種類のニューカッスル病ウイルス菌株が前記のようにＩ型乃至ＩＸ型に分類され、ニューカッスル病ウイルスを分子力学的に分類した結果が多く報告されていて、このような分類の基準と各類型に属する菌株はこの発明が属する技術分野の通常の知識を有する者が容易に分かると考えられる。本明細書での菌株分類及びその基準は次のような参考文献に記載された内容を引用し、下記の文献は全て本明細書に参照として含まれる:
【００２６】
【表２】
2010504751.tif 000004
【００２７】
現在ワクチン株として使用されるラソタ/４６はＩＩ型であることに対し、現在野外株として発見されている菌株はこれと遺伝的に距離が遠いＶＩ型乃至ＶＩＩ型が大部分である。例えば、ＮＤＶのＨＮ蛋白質で３４５-ＰＤＥＱＤＹＱＩＲ-３５３部位が中和抗体を形成する重要な線状抗原として知られている。国内病原性ＮＤＶはＶＩ型（９５-９８、９９-７０、９９-７１）とＶＩＩ型ウイルスが共存してきたが、ＶＩ型ＮＤＶは１９９９年を最後に２０００年から２００６年までは全く分離されず、１９９５年家禽から最初に分離されたＶＩＩａ型のＮＤＶはその後分離されず、ＶＩＩｄ型のＮＤＶのみ分離されている。
【００２８】
ＶＩ型ウイルスの場合、線状抗原の変異（Ｅ３４７Ｋ）が１９９３年と１９９４年分離株（ＳＮＵ９３５８ＧＧ、ＳＮＵ９４４４）で最初確認された後、９５-９８、９９-７０、９９-７１でも持続的に観察されて、このような変異株がしばらくは免疫を回避して生存してきたと判断され、２０００年後ＶＩＩｄ型ウイルスの全国的な拡散後ほとんど絶滅したと判断される。ＶＩＩ型ウイルスの場合、１９９５年から２００１まで分離されたウイルスはすべてラソタ株の線状抗原と同一であったが、２００２年に最初に線状抗原変異株（Ｅ３４７Ｋ）が出現し、２００５年には追加的な変異を示すＮＤＶが優占する様相を示した（下記表参照）。
【表３】
2010504751.tif 000005
【００２９】
このようなことを鑑みる時、従来のワクチン株ラソタ/４６では現在流行しているニューカッスル病に対する効果的な予防が不可能であると考えられ、本発明は野外株に対して優れた抗原性を有するワクチン株開発技術を提供するという点で最も大きい意味があると言える。
【００３０】
本明細書において、強病原性ニューカッスル病ウイルスは、別途の言及がない限り通常分類される強病原性ニューカッスル病ウイルスだけでなく、中間以上の病原性を有するすべての病原性ニューカッスル病ウイルスを含む意味として使用される。本発明において、強病原性ニューカッスル病ウイルスは動物の感染時に体内すべての細胞で感染性のあるウイルスが作られることによって病原性を示すもので、Ｆ蛋白質の１１３番目から１１６番目アミノ酸配列が次の式１のように表現される場合、体内大部分の細胞内に分布するフランまたはフラン類似蛋白質分解酵素（以下、フラン）によって切断されて活性を有する構造を有するので、ウイルスの感染能力が生じる。したがって、病原性ニューカッスル病ウイルスはＦ蛋白質の１１３番目から１１６番目アミノ酸配列のコーディング配列として次の式１で表現されるアミノ酸配列をコーディングする塩基配列を有すると定義される:
[式１]
113-X1X2X3X4-116            
【００３１】
前記式のうち、Ｘ１、Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立的にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）であり、Ｘ２はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群の中から選択されたアミノ酸である。
【００３２】
この時、Ｆの１１２番目アミノ酸もアルギニンまたはリシンのような塩基性アミノ酸である場合にさらに強い病原性を示す。
【００３３】
また、本明細書において弱病原性ニューカッスル病ウイルスは、別途の言及がない限り通常分類される弱病原性ニューカッスル病ウイルスだけでなく無毒ニューカッスル病ウイルスを含む意味として使用される。本発明において弱病原性ニューカッスル病ウイルスは動物感染時に体内一部細胞内と消化管及び呼吸器官の細胞外蛋白質分解酵素によってのみ活性化されて局所的なウイルス増殖が起こって弱い病原性を示すもので、Ｆの１１３番目から１１６番目アミノ酸配列が次の式２のように表現される場合を意味する。したがって、弱病原性ニューカッスル病ウイルスはＦの１１３番目から１１６番目アミノ酸配列のコーディング配列として次の式２で表現されるアミノ酸配列をコーディングする塩基配列を有すると定義される:
[式２]
113-X4X5X7X8-116
【００３４】
前記式のうち、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群の中から選択されたアミノ酸であり、Ｘ５とＸ７は同時にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）でなく、Ｘ８はアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）である。
【００３５】
ニューカッスル病ウイルスはフランによってＦ蛋白質に位置するフラン認識部位（ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）が切断されて細胞膜と融合するＦ蛋白質の融合ペプチド部位が露出されるとようやく感染能力を有する。フランは動物の全身に分布する酵素であるので、フランによるウイルス感染能力活性化は全身で発生して病原性を示す。したがって、ニューカッスル病ウイルスの病原性はＦ蛋白質に位置するフラン切断部位がフランによって認知されて切断される程度に応じて変わる。
【００３６】
ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質のフラン認識部位（１１３乃至１１６番目アミノ酸）が前記式１のアミノ酸配列のように少なくとも３個以上の塩基性アミノ酸（１１３-Ｒ-Ｘ-Ｋ/Ｒ-Ｒ-１１６）を有する場合、フランによるウイルス感染が全身的に起こるために病原性を示す。しかし、前記式２のアミノ酸配列のように、１つ以上の塩基性アミノ酸が非塩基性アミノ酸で置換される場合にはフランによる認識及び切断がほとんど起こらず、単に局所的に存在する細胞内または細胞外蛋白分解酵素によって切断が行なわれるので、致命的な全身感染が行なわれなくて病原性は低い。
【００３７】
本発明は弱病原性ニューカッスル病ウイルスのゲノムを根茎としながら、表面抗原と関するＦ蛋白質及びＨＮ蛋白質コーディング部位を国内及びアジア地域で流行する強病原性ウイルスのもので置換させることで強病原性ウイルスに対する防御効能を高めると同時に、強病原性ニューカッスル病ウイルスの１１５番目コドンを非塩基性アミノ酸をコーディングするコドンで置換し、少なくとも２回以上の点突然変異を経て塩基性アミノ酸をコーディングするコドンに変わる特定コドンで置換させて遺伝的に安定な弱毒組換えニューカッスル病ウイルスを製作する技術に関するものである。本発明による組換えニューカッスル病ウイルスは前記のように野外株と同一または類似の表面抗原を示して野外株に対する抗原性が高く、効果的に弱毒化されているだけでなく、１１５番コドンで少なくとも２回以上の点突然変異を経て強病原性に変換可能であるので、安定性と安全性面で優れた特性を持っている。
【００３８】
また、病原性ニューカッスル病ウイルスは細胞変成効果に応じて合胞体（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ）を形成する合胞体形と顆粒（ｇｒａｎｕｌｅｓ）を形成する顆粒型（ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）に分類することができるが、一般に合胞体型が顆粒型より病原性が強いと知られている。本発明はＦ及びＨＮコーディング部位を提供する強病原性ニューカッスル病ウイルスとして顆粒-型に属するウイルスクローンを使用して病原性を大幅減少させたという特徴がある。また、ニューカッスル病ウイルスのＨＮにおいても強病原性ニューカッスル病ウイルスは相対的に短い５７１個のアミノ酸のみ有する反面、弱病原性ニューカッスル病ウイルスはこれより長い５７７個または６１６個のアミノ酸を持っていて、ＨＮのＣ末端アミノ酸配列によって強病原性株と弱病原性株が区分される。したがって、本発明では前記のようなＨＮのＣ末端を弱病原性株と同一に変形（５７７個アミノ酸）させより弱毒化された組換えニューカッスル病ウイルスを製作した。
【００３９】
本明細書において、本発明によるニューカッスル病ウイルスのゲノム転写ベクターと組換えニューカッスル病ウイルスに含まれたものとして記載されたＰ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ及びＬ蛋白質のコーディング配列は前記それぞれの蛋白質を直接コーディングする塩基配列だけでなく、発現した蛋白質に影響を与えない限り、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ及びＬ遺伝子に存在し得る全ての非暗号化（ｎｏｎ-ｃｏｄｉｎｇ）配列も含むことができると解釈される。
【００４０】
より具体的に、本発明はニューカッスル病ウイルスのＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ及びＬ蛋白質のコーディング配列で構成された遺伝子切片;前記遺伝子切片に作動可能に連結されたプロモーター及びターミネーターを含むニューカッスル病ウイルスのゲノム転写ベクターで、前記ＮＰ、Ｐ、Ｍ及びＬ遺伝子は弱病原性ニューカッスル病ウイルスであるラソタ株ゲノムから由来したものであり、前記Ｆ及びＨＮ遺伝子は強病原性ニューカッスル病ウイルスのＫＢＮＰ-４１５２ゲノムで由来したものであり、前記Ｆ蛋白質コーディング配列において、ＫＢＮＰ-４１５２を含む強病原性ニューカッスル病ウイルスＦの１１５番目に位置する塩基性アミノ酸をコーディングするコドンがＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;及びＵＡＣ及びＵＡＵからなるチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換されたことを特徴とする、ニューカッスル病ウイルスのゲノム転写ベクターに関するものである。
【００４１】
前記ベクターのＨＮ遺伝子は１番から５６９番コドンまでは強病原性ニューカッスル病ウイルスのアミノ酸をコーディングし、５７０番後のコドンはラソタ株を含む弱病原性ニューカッスル病ウイルスのアミノ酸をコーディングするように追加的に変移されたものであり得る。
【００４２】
また、前記プロモーターとターミネーターは使用されたプラスミドでニューカッスル病ウイルスゲノムと作動可能に連結されるものであれば制限なく使用することができ、このようなプロモーターとターミネーターはこの発明が属する技術分野の通常の知識を有する者であれば容易に選択して使用することができる。本発明の１実施例において、前記プロモーター及びターミネーターとしてＴ７プロモーター及びＴ７ターミネーターを使用することができる。
【００４３】
本発明の具体的な例において、前記ゲノム転写ベクターはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ:２乃至７のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列または下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１の塩基配列を有するものであり得る（図２３参照、ｐＴＮＨ-ｃ４１５２Ｒ２Ｌと命名）。
【００４４】
【表４】
2010504751.tif 000006
【表５】
2010504751.tif 000007
【表６】
2010504751.tif 000008
【表７】
2010504751.tif 000009
【表８】
2010504751.tif 000010
【表９】
2010504751.tif 000011
【表１０】
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【表１１】
2010504751.tif 000013
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
2010504751.tif 000018
【００４５】
前記ゲノム転写ベクターｐＴＮＨ-ｃ４１５２Ｒ２Ｌによって発現するＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ及びＬ蛋白質のアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ:２乃至７に示した。
【００４６】
また他の側面において、本発明はＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ及びＬ遺伝子のコーディング部位を有するニューカッスル病ウイルスにおいて、前記ＮＰ、Ｐ、Ｍ及びＬ遺伝子のコーディング部位は弱病原性ニューカッスル病ウイルスから由来したものであり、前記Ｆ及びＨＮ蛋白質コーディング配列は強病原性ニューカッスル病ウイルスから由来したものであり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質の１１５番アミノ酸をコーディングするコドンがＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;ＵＡＣ及びＵＡＵからなるチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換されたことを特徴とする、組換えニューカッスル病ウイルスに関するものである。前記組換えニューカッスル病ウイルスのＨＮ遺伝子は１番から５６９番コドンまでは強病原性ニューカッスル病ウイルスのアミノ酸をコーディングし、５７０番後のコドンはラソタ株を含む弱病原性ニューカッスル病ウイルスのアミノ酸をコーディングするように追加的に変移されたものであり得る。
【００４７】
本発明の具体的な例において、前記組換えニューカッスル病ウイルスはＫＣＴＣ１０９８４ＢＰであり得る。
【００４８】
本発明による組換えニューカッスル病ウイルスは強病原性野外株と同一または類似な表面抗原を有するために野外株と同一または類似の抗原性を示しながら、従来の弱病原性ワクチン株より減少した病原性を示すことを特徴とする。病原性ニューカッスル病ウイルスはＦにフラン切断部位を有し、フランに切断されることによって細胞膜と融合するＦ蛋白質の融合ペプチドが露出することでウイルスの感染能力が生じる。フランは体内大部分の細胞内に分布するので、ニューカッスル病ウイルスの全身感染が起こって強病原性を示すことができる。
【００４９】
本発明のゲノム転写ベクターにおいて、前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスは前記で定義された通りであり、例えば、ニューカッスル病ウイルスＩ型またはＩＩ型に属する菌株からなる群の中から選択されたものであってもよく、本発明の具体的な例においてＩＩ型に属するラソタ/４６菌株（ＡＹ８４５４００）を使用することができる。前記強病原性ニューカッスル病ウイルスは前記で定義された通りであり、現在全世界的に流行する野外株としてＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＸＩ型を使用することができ、好ましくはニューカッスル病ウイルスＶＩ型及びＶＩＩ型菌株からなる群の中から選択されたものであってもよい。本発明の具体的な例において、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスはＫＢＮＰ-４１５２（寄託番号:ＫＣＴＣ１０９１９ＢＰ）であり得る。前記ＫＢＮＰ-４１５２菌株の製造方法及び特性は大韓民国特許出願第２００６-００２６６６７号及び‘Cho SH, Ahn YJ, Kim SJ, Kwon HJ. Characterization of a Newcastle disease virus with variation in the major Hemagglutinin-Neuraminidase (HN) linear epitope. The49th Annual Meeting of the Korean Society of Veterinary Science 2005, 45 (3,suppl), 199'に記載された通りである（前記文献は全て本明細書に参照として含まれる）。本明細書において、強病原性ニューカッスル病ウイルスと弱病原性ニューカッスル病ウイルスは特別な言及がない限り前記のように定義される。
【００５０】
従来の逆遺伝学を利用したニューカッスル病ウイルスの弱毒化では１１５番目アミノ酸をグリシンで置換させた例があったが、このようにグリシンで置換された場合には、これをコーディングするコドンの中で単に１つの塩基のみ変移されても塩基性アミノ酸であるリシンまたはアルギニンで置換されて再び病原性を回復するという問題があった。
【００５１】
しかし、本発明による組換えニューカッスル病ウイルスはＦ蛋白質の１１５番目コドンが少なくとも２回以上の点突然変異を経て塩基性アミノ酸をコーディングするコドンに変わる非塩基性アミノ酸コーディングコドンを有するので、病原性を回復する可能性が非常に低く、従来の弱毒化された変異株と比較して安定性が顕著に増加なされたことを特徴とする。本発明のようにＦ蛋白質のフラン切断部位が変形された場合には、フランによる切断が起こらなくて全身感染が生じず、一部体内細胞、呼吸器及び消化器官に分布するトリプシンまたはトリプシン類似酵素によってのみ分解されるために局所感染のみ起こる。
【００５２】
このような効果を達成するために本発明のＦ蛋白質の１１５番目コドンはＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;及びＵＡＣ及びＵＡＵチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換されたことを特徴でする。
【００５３】
また他の側面において、本発明は弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ蛋白質及びＨＮ蛋白質コーディング部位を強病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ蛋白質コーディング配列に置換させ、前記Ｆ遺伝子の１１５番コドンをＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;及びＵＡＣ及びＵＡＵチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンで置換させ、強病原性ニューカッスル病ウイルスと同一または類似の抗原性を発現させ、病原性を減少させることを特徴とする組換えニューカッスル病ウイルスの製造方法に関するものである。
【００５４】
前記組換えニューカッスル病ウイルスの製造のために前記ＨＮ遺伝子は１番から５６９番コドンまでは強病原性ニューカッスル病ウイルスのアミノ酸をコーディングし、５７０番後のコドンはラソタ株を含む弱病原性ニューカッスル病ウイルスのアミノ酸をコーディングするように追加的に変移させたものであり得る。
【００５５】
本発明の組換えニューカッスル病ウイルスの製造方法は前記のような本発明によるニューカッスル病ウイルスのゲノム転写ベクターを宿主細胞で発現させる段階を含むものであり得る。本発明で使用可能な宿主細胞には制限がなく、本発明の具体的な例においてＨｅｐ２及びＢＨＫ２１からなる群より選択された動物細胞を使用することができる。
また他の側面において、本発明は弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ遺伝子のコーディング部位を強病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ蛋白質コーディング配列に置換させ、前記Ｆ遺伝子の１１５番塩基性アミノ酸コーディングコドンをＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;ＵＡＣ及びＵＡＵチロシンコーディングコドンからなる群より選択されたコドンに置換させることを特徴とする、ニューカッスル病ウイルスの抗原性及び安定性増加及び弱毒化方法に関するものである。
【００５６】
前記方法は前記ＨＮ遺伝子は１番から５６９番コドンまでは強病原性ニューカッスル病ウイルスのアミノ酸をコーディングし、５７０番後のコドンはラソタ株を含む弱病原性ニューカッスル病ウイルスのアミノ酸をコーディングするように追加的に変異させる段階を追加的に含むものであり得る。また、前記方法は本発明による組換えニューカッスル病ウイルスゲノム転写ベクターを使用するものであり得る。
【００５７】
また他の側面において、本発明は前記のような抗原性が増加して病原性が減少した組換えニューカッスル病ウイルスを含むニューカッスル病ワクチンに関するものである。前記ニューカッスル病ワクチンは前記組換えニューカッスル病ウイルスを不活化させた死毒ワクチン形態であり得る。前記不活化はこの発明が属する技術分野で知られたすべての通常の方法を使用することができ、例えば、ホルムアルデヒドまたはブロモメチルアミンヒドロブロマイドなどを使用するものであり得る。また、前記ニューカッスル病ワクチンは病原性が非常に低くて安定性及び安全性の高い菌株であるので、生ワクチン形態に使用したり、受精卵に直接使用するｉｎ ｏｖｏワクチン形態で使用することができる。生ワクチン形態で使用される場合、その投与方法には制限がなく、症状及び目的に応じて皮下または筋肉投与、直接的な鶏胎児注射法（ｉｎ ｏｖｏワクチン）またはスプレーまたは飲料水などを利用して投与することができる。本発明のワクチン投与量は投与方法及び投与対象個体の状態に応じて変わり、例えば、１０１ＥＩＤ５０（５０％ｅｇｇ-ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｏｓｅ）乃至１０１２ＥＩＤ５０菌株/個体の量で使用可能である。具体的に、死毒ワクチンの場合、好ましくは１０６．０〜１２ＥＩＤ５０/数が適当であり、より好ましくは１０８．０〜１０ＥＩＤ５０/数量で使用することができる。Ｉｎ ｏｖｏワクチンの場合、種卵の母体移行抗体程度に応じて１０１〜９．０ＥＩＤ５０/種卵の量で使用することが可能であるが、より好ましくは１０３．０〜７．０ＥＩＤ５０/種卵の量で使用することができる。
前記のように、ニューカッスル病ウイルスの病原性はＦ蛋白質のフラン切断部位アミノ酸配列に応じて決められる。つまり、Ｆ蛋白質のフラン切断部位のアミノ酸配列がＲ-Ｘ-Ｋ/Ｒ-Ｒ（１１３番目から１１６番目アミノ酸位置、以下、特別な言及のない限りすべてのアミノ酸四量体に適用される）であればすべての細胞内に存在するフランによって切られて活性化されるので、全身感染が起こって強病原性を示す。しかし、Ｒ-Ｑ-Ｇ-ＲまたはＧ-Ｑ-Ｇ-Ｒのように塩基性アミノ酸が単に１つあるいは離れて１つのみ存在すると一部細胞内、消化管及び器官の上皮細胞一部に存在するトリプシン及び類似酵素によってのみ活性化されるので、局所感染のみ起こって病原性が低い。ＨＮにおいても強病原性ウイルスは相対的に短い５７１個のアミノ酸のみ有している。これに反し、弱病原性ニューカッスル病ウイルスの場合にはより長い５７７個または６１６個のアミノ酸を有し、その後の部分のアミノ酸によって強病原性株と区分される。したがって、Ｆのフラン切断部位とＨＮのＣ末端部位を多様に組み合わせた組換えウイルスを作って多様な段階の病原性を有するウイルスを製作することができる。
【００５８】
特に、本発明は誘電的変異によって病原性を獲得できないようにＦのフラン切断部位のアミノ酸配列をより安全なアミノ酸配列に変えたことを特徴とする。弱病原性のＦのフラン切断部位のアミノ酸配列はＲ-Ｑ-Ｇ-ＲまたはＫ-Ｑ-Ｇ-Ｒである。強病原性主になるためにはＲ-Ｘ-Ｋ/Ｒ-Ｒに変わらなければならないので、３番目に位置しているグリシン（Ｇ）がアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に変わらなければならない。しかし、ＧからＲ/Ｋへの変換は１つの点突然変異のみで容易に起こり得る。つまり、グリシンのコドンはＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧまたはＧＧＵであるが、アルギニン/リシンのコドンはＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ、ＡＡＡまたはＡＡＧであるので、グリシンのコドンがどれでもただ１回の突然変異でも容易にアルギニンやリシンに置換されて強病原性ニューカッスル病ウイルスに変換できることである。実際に２００１年オーストラリアでは非病原性ＮＤＶであるアルスター株が類似な機作で病原性が増加してＮＤＶが発生した事例が報告された。
【００５９】
したがって、本発明ではこのようなワクチン株の点突然変異による病原性増加確率を従来のワクチン株より顕著に下げるために、ＰＴＤＳ（ＰＣＲ ｂａｓｅｄ Ｔｗｏ ｓｔｅｐｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）技法など、通常知られた技術を利用して点突然変異によるリシン/アルギニンへのアミノ酸変化が起こる確率の低いアミノ酸とコドンを有する組換えウイルスを製作した。つまり、Ｒ-Ｑ-Ａ-ＲまたはＧ-Ｑ-Ａ-Ｒのように、従来の弱病原性ニューカッスル病ウイルスＦの１１５番アミノ酸グリシンをアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、セリン、スレオニン、バリン及びチロシンからなる群より選択されたアミノ酸で置換させることによって、これらアミノ酸のコーディングコドンの全部または一部は最少２個以上の塩基が同時に変異された場合のみＲ/Ｋに変異が起こるので、より安全なワクチン株の製造が可能になる。
【００６０】
本発明によって製作された組換えニューカッスル病ウイルスの病原性程度は平均死亡時間（Ｍｅａｎ Ｄｅａｔｈ Ｔｉｍｅ;ＭＤＴ）及び脳内病原性指数（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ;ＩＣＰＩ）を測定して決め、その生物学的性状はＥＩＤ５０（５０％のｅｇｇ-ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）及び血球凝集解離様相などによって確認した。このような測定結果、本発明の組換えニューカッスル病ウイルスは従来の弱病原性菌株よりも病原性が減少したことが明らかになった。
【発明の効果】
【００６１】
従来のワクチン株では現在流行しているニューカッスル病に対する効果的な予防が困難であると考えられ、本発明は野外株に対して優れた抗原性を有するワクチン株開発技術を提供するという点で最も大きい意味があると言える。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】国内強病原性ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）であるＫＢＮＰ-４１５２のゲノムＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲ結果と増幅産物の名称及び位置を示す図面である。
【図２】図１の増幅産物をＴＡ-クローニングベクターにクローニングした結果である。
【図３】組換えＮＤＶゲノムの両側末端を正確に作り出すように認識部位と切断部位が相異なる制限酵素であるＢｓｍＢＩとＢｓａＩ認識塩基配列を挿入する過程を示す図面である。
【図４】ＮＤＶゲノムＤＮＡクローニングのための母ベクターｐＴＭＨ製作のためのリンカー塩基配列とリンカーの製作のためのプライマー塩基配列を示す図面である。
【図５】ｐＴＭＨベクターの製造過程を模式的に示す図面である。
【図６】ｐＴＭＨの主要部位の塩基配列を示す図面である。
【図７】ｐＴＭＨベクターの全塩基配列を示す図面である。
【図８】ラソタ株のゲノムＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲ結果及び増幅産物の名称と位置を示す図面である。
【図９】図８の増幅産物をＴＡ-クローニングベクターにクローニングした結果である。
【図１０】ＮＤＶのゲノムＤＮＡクローニング過程を示す図面である。
【図１１】ＮＤＶのＮＰ、Ｐ及びＬ遺伝子発現プラスミドの製作過程を示す図面で、Ａの２、３、４レーンはそれぞれＮＰ、Ｐ、Ｌ遺伝子のＲＴ-ＰＣＲ結果であり、６、７、８レーンはそれぞれＮＰ、Ｐ、Ｌ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１/ｔｏｐｏにクローニングした後、ＮｏｔＩで処理して挿入遺伝子を確認した写真であり、Ｂはこれに対する模式図である。
【図１２】ＰＴＤＳ技法を利用したＦ及びＨＮ遺伝子半合成過程を示す図面である。
【図１３】本発明の組換えウイルスのＭ及びＦ遺伝子連結部及びＦ蛋白質のフラン認識部位のヌクレオチド配列を示す図面である。
【図１４】ＰＴＤＳ及び部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を利用したＦ蛋白質のフラン認識部位に突然変異が誘発された遺伝子合成過程を示す図面である。
【図１５】ＫＢＮＰ-４１５２ＨＮ（１-５６６）遺伝子とラソタ株のＨＮ末端（５６７-５７７番）遺伝子連結のためのＰＴＤＳ用プライマー設計図である。
【図１６】組換えウイルスであるＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの製作過程を示す図面である。
【図１７】多様なフラン認識部位を有する組換えウイルスクローンの製作過程を示す図面である。
【図１８】鶏胎児に接種したＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの増殖有無を平板血球凝集反応試験で確認した図面である。
【図１９】ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの病原性を調べるためのｐａｔｈｏｔｙｐｅ-ｓｐｅｃｉｆｉｃＲＴ-ＰＣＲ結果を示す図面である。
【図２０】ＫＢＮＰ-４１５２とＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２ＬのＦ蛋白質のフラン認識部位の塩基配列を比較した図面である。
【図２１】交差血球凝集抑制法を利用してラソタ株、ＫＢＮＰ-４１５２及びＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの抗原的関連性を示す図面である。
【図２２】ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの細胞変成効果を示す図面である。
【図２３】ｐＴＭＨにクローニングされたＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌのゲノム地図及びゲノムの塩基配列を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
以下、本発明を実施例をより詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるわけではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１:ウイルス遺伝子クローニング
１．１．ウイルスｃＤＮＡの合成
最近国内で流行する強病原性抗原性変異株ニューカッスル病ウイルスを代表するウイルスとして、ソウル大学校水医科大学鳥類疾病学室で分離されたＳＮＵ４１５２週を選定した。このウイルスを鶏胎児繊維亜細胞（ＣＥＦ）上で３回プラーク精製を行なってクローニングし、ＳＰＦ発育卵で２回継代培養してＫＢＮＰ-４１５２（寄託番号ＫＣＴＣ １０９１９ＢＰ）と命名した。
【００６５】
ＲＮＡの操作はＲＮａｓｅのないガラス製品及びプラスチック製品で行われ、使用されたすべての溶液は１％のジエチル-ピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を処理して高圧滅菌した３次蒸溜水（ＤＥＰＣ-ＤＷ）を使用した。その後、ウイルスをＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で４０℃、２１０００ｒｐｍで７０分間遠心分離し、ペレットを緩衝溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５， ５０ｍＭのＥＤＴＡ， ０．５％のＳＤＳ）に再浮遊させて攪拌しながら３７℃で９０分間プロテアーゼＫ（２００μｇ/ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．）を処理した後、酸性フェノール抽出法でＲＮＡを抽出した。その後、エタノール沈澱法でＲＮＡを沈殿させた後、７５％のエタノールで洗浄して乾燥した後、ＤＥＰＣ-ＤＷに浮遊させた。紫外線分光器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ， Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で定量（１５μｇ/μl）してＲＮＡ１μlと下記の表１に示すプライマー（１０ｐｍｏｌ/μl）１μlをＤＥＰＣ-ＤＷ１０μlと混合し、７０℃で１０分間変成させた後、５×ＲＴ緩衝溶液４μl（２５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２;ＧｉｂｃｏＢＲＬ/Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ＭのＤＴＴ２μl及び１０ｍＭのｄＮＴＰｓ（それぞれ２．５ｍＭ）２μlを添加して４２℃で２分間培養した。その後、逆転写酵素１μl（２００ｕｎｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．）を添加して４２℃で６０分間培養した。
【００６６】
【表１７】
2010504751.tif 000019
【００６７】
１．２．ウイルス遺伝子のクローニング
ＧｅｎｅＢａｎｋのデータに基づいて１５，１９２ｂｐに至る前記合成された９種のウイルスｃＤＮＡを次の表２に示したような９個のプライマー対でＰＣＲ法を通じて遺伝子を増幅し、クローニングして得られたクローンをZ１乃至Z９と命名した。
【表１８】
2010504751.tif 000020
【００６８】
ＰＣＲ過程中に発生する人為的な突然変異率を下げるために矯正機能のあるＤＮＡ重合酵素Ｐｗｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．）を使用し、ＰＣＲ増幅産物は溶液の場合Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社の精製キットをアガロースゲルの場合にはＱｉａｇｅｎ社の精製キットを使用した。
【００６９】
前記ＰＣＲの結果から得られたＫＢＮＰ-４１５２ウイルス遺伝子ＲＴ-ＰＣＲ及び各ＰＣＲ産物の位置を図１に示した。
【００７０】
前記で精製された９種の増幅産物はＸＬ-ｔｏｐｏ、ｐＣＲ８/ＧＷ/ＴｏｐｏまたはｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．）にＴＡクローニングし、それぞれ３個以上のクローンを確保してプラスミドを抽出精製して塩基配列を決めた。
【００７１】
すべての塩基配列はｃｙｃｌｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（ＰＲＩＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ ターミネーター ｋｉｔ）と自動塩基配列分析器（ＡＢＩ３１０、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏ．）に決めた。
【００７２】
塩基配列分析に使用されたプライマーはＭ１３ ｆｏｒｗａｒｄ、Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを使用し、これらプライマーで全て読み取りできない断片の場合、ｐｒｉｍｅｒ ｗａｌｋｉｎｇの方法によって次の表３のプライマーを使用して分析した。
【００７３】
【表１９】
2010504751.tif 000021
【００７４】
前記のようなＴＡ-クローニングベクターを下記の図２Ｂに示し、ＰＣＲを通じてＥｃｏＲＩで処理して挿入された切片の大きさを確認して図２Ａに示した。
【００７５】
ＫＢＮＰ-４１５２菌株は中国のガチョウ由来ＳＦ０２と最も高い塩基配列及びアミノ酸配列相同性を示したが、ウイルス蛋白質のうちＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｌの場合には９８％以上の高い相同性を示した反面、Ｐ、Ｖ及びＨＮの場合はそれぞれ９６．２％、９５．０％と９７．６％の比較的に低い相同性を示した。配列相同性の測定結果を表４に示した。
【００７６】
【表２０】
2010504751.tif 000022
【００７７】
特に、細胞内インターフェロン発現を妨害するＶ蛋白質での変異が大きいのは細胞内防御体系を克服する過程でアミノ酸変異が蓄積された結果であり得、ＨＮ蛋白質の変異が比較的に大きいのは-線状抗原の変異から分かるように-体液性免疫反応を回避する過程で特定アミノ酸変異を有するウイルスが選択されたためであると思われる。前記ＫＢＮＰ-４１５２菌株の遺伝子塩基配列及び各遺伝子のコーディングアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋに登録した（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＱ８３９３９７）。
【００７８】
この他にもＨＮ及びＦ蛋白質のシステイン及びＮ-ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ位置の変化、ＨＮの構造及び極性に影響を与え得るアミノ酸の変化及びＦの構造及び極性に影響を与え得るアミノ酸の変化を測定してそれぞれ表５乃至７に示した。
【００７９】
【表２１】
2010504751.tif 000023
【００８０】
【表２２】
2010504751.tif 000024
【００８１】
【表２３】
2010504751.tif 000025
【００８２】
前記結果から、本発明で使用されたＫＢＮＰ-４１５２菌株はＶＩＩ型と類似な遺伝子型を有することが分かり、従来のワクチン株であるラソタ株をはじめとして他の類型のウイルスと遺伝的に差がある菌株であることが確認された。
【００８３】
実施例２:ラソタ株を基本根茎（ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）にした組換えニューカッスル病ウイルスゲノム転写ベクターの製造
２．１．ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）発現母ベクターｐＴＭＨの設計及び製作
ＮＤＶのｃＤＮＡからウイルスを作り出すためにはウイルスゲノムの５'と３'両端に不要な塩基の添加なくウイルスゲノムと同じ構造で転写されなければならない。このような構造を得るために次のような特徴の母ベクターｐＴＭＨを製造した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８４）:
１）転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）開始部の直前にＴ７プロモーターを位置させた（図３及び４参照）。
２）ＮＤＶアンチゲノム（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡ直後には肝炎デルタウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ;ＨＤＶ）リボザイム（リボザイム）ＲＮＡを位置させてセルフクレイヴィジ（ｓｅｌｆ ｃｌｅａｖａｇｅ）が起こるようにした。
３）Ｔ７プロモーターとＨＤＶリボザイムの間には最終的にＮＤＶゲノムがクローニングできる制限酵素領域（ＭＣＳ）を有するようにした（図４参照）。
４）１５ｋｂに至るＮＤＶアンチゲノム全体を含んでもクローニングベクターが大腸菌内で安定的に存在するようにｐＢＲ３２２の複製開始塩基配列（ｏｒｉ）を有するようにした。
５）Ｔ７プロモーターとＮＤＶ転写開始が行なわれるアンチゲノム５'-末端の間、及びＮＤＶ転写が終了するアンチゲノム３'-末端とＨＤＶリボザイムの間にそれぞれ認識部位と切断部位が相異なるＢｓｍＢ ＩとＢｓａ Ｉ認識塩基配列を位置させてＮＤＶアンチゲノムからウイルスゲノムＲＮＡの両側末端を正確に転写した（図３参照）。
【００８４】
図４に示したように、リンカー製作用プライマーＴＭｐ１-ｐ４のうちのＴＭｐ２とＴＭｐ３は１．５ｐｍｏｌｅずつ、そしてＴＭｐ１とＴＭｐ４は３０ｐｍｏｌｅずつ１つのＰＣＲチューブに入れ、１０xＰＣＲバッファー５μl、２．５ｍＭのｄＮＴＰ５μl、Ｔａｑポリメラーゼ２．５Ｕをそれぞれ入れて全体積が５０μlになるようにＤＷを入れた後、９４℃-１分、９０℃-３０秒-５５℃-４５秒-７２℃-１５秒の反応を２５回繰り返し、７２℃-５分間反応させた。ＰＣＲ単位複製配列を確認した後、ｐＣＲ８/ＧＷ/ＴｏｐｏＴＡクローニングベクターにクローニングし、正確な塩基配列を有するクローンをｐＣＲ-ＴＭベクターと命名した。
【００８５】
前記ＨＤＶＦ、Ｒプライマーを利用してｐＴＶベクター（ＭＯＧＡＭ生命工学研究所pｐａｒｋ ｍａｎ ｈｏｏｎ博士提供）からＨＤＶリボザイムとＴ７ターミネーター部分をＰＣＲ方法で増幅して得られた断片もまたｐＣＲ８/ＧＷ/ＴｏｐｏＴＡｃｌｏｎｉｎｇベクターにクローニングし、正確な塩基配列を有するクローンをｐＣＲ-ＨＤＶと命名した。
ｐＣＲ-ＨＤＶベクターをＢｓａＩとＮｄｅＩ制限酵素で切断して得られたＨＤＶ断片とＢｓａＩとＮｄｅＩ制限酵素で切断したｐＣＲ-ＴＭベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、Ｔｏｐ１０Ｆ´適格細胞に変換して得られたベクターをｐＣＲ-ＴＭＨと命名した。大腸菌に安定的にクローニングできるようにｐＢＲ３２２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃｏ， Ｃａｔ．#Ｄ１５１１）にｐＣＲ-ＴＭＨベクターのＴ７プロモーター-ＭＣＳ-ＨＤＶリボザイム部分をＥｃｏＲＩとＮｄｅＩ制限酵素を利用してサブクローニングし、これをｐＴＭＨベクターと命名した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８４）。
【００８６】
前記ｐＴＭＨベクター製作過程を図５に模式的に示し、製作された母ベクターｐＴＭＰの概略的な開裂地図と主要部位塩基配列を図６に示し、製作されたｐＴＭＨベクターの塩基配列を図７に示した。
【００８７】
本実施例で製作された母ベクターｐＴＭＨの制限酵素認識部位は次の通りである:
（認識部位のない場合（Ｎｏ ｓｉｔｅ ｆｏｕｎｄ））
【表２４】
2010504751.tif 000026
【００８８】
２．２．ラソタ株の全体ｃＤＮＡクローニング
ラソタ/４６菌株（ＡＹ８４５４００）に対するＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成は前記実施例１に記載された方法によって実施した。
【００８９】
２．２．１．ＮＤＶ全長ｃＤＮＡのＰＣＲ
ＧｅｎＢａｎｋのデータに基づいて全１５，１８６ｂｐに至るＮＤＶｃＤＮＡ全体をクローニングするために全て８部分（Ｓ１乃至Ｓ９）に分けて下記の表８に記載したプライマーを使用して実施例１に記載された方法によって重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００９０】
【表２５】
2010504751.tif 000027
【００９１】
前記のようなラソタ株遺伝子ＲＴ-ＰＣＲ及び各ＰＣＲ産物の位置を図８に示した。
ラソタ株の遺伝子８部分をそれぞれＴＡ-クローニングベクターにクローニングした模様を図９Ｂに示し、ＰＣＲにＥｃｏＲＩで処理して挿入された切片のサイズを確認して図９Ａに示した。
【００９２】
２．２．２．ＮＤＶ全長ｃＤＮＡのクローニング及び塩基配列分析
前記ＰＣＲによって得られた産物はアガロースゲルで電気泳動した後、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ ＩＩＩＴＭ（Ｑｂｉｏ ｃｏ．）を使用して精製し、トップクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＸＬ-Ｔｏｐｏ Ｔｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローニングした。クローニングされた各クローンはベクター内にあるＭ１３ｆｏｒｗａｒｄ、Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅなどのようなプライマーを使用したり、下記の表９に記載されたプライマーを使用して全塩基配列分析を通じて公知のラソタ株の塩基配列と同一な、つまり、突然変異の発生しないクローンのみ選別した。
【００９３】
【表２６】
2010504751.tif 000028
【００９４】
塩基配列に変異のない全てのクローンは母ベクターのｐＴＭＨの多重制限酵素部位でそれぞれ順次に図１０に示したようにクローニングした。Ｌ ｇｅｎｅの間に新たな制限酵素認識部位（ＣｌａＩ）を導入した。前記クローニング過程を図１０に示した。
【００９５】
２．２．３．ＲＮＰ複合体を形成するためのＮＰ、Ｐ及びＬ遺伝子ゲノム転写ベクター製造
ニューカッスルウイルスＮＰ、Ｐ及びＬ遺伝子ゲノム転写ベクターを製造するために下記の表１０のプライマーでラソタ株のＮＰ、Ｐ及びＬ遺伝子をそれぞれＲＴ-ＰＣＲし、これをＴＡ-クローニングベクターにクローニングした。クローンを塩基配列分析した後、突然変異のないクローンのみＮｏｔＩで処理してｐｃＤＮＡ６/Ｖ５ベクターのＮｏｔＩ位置にサブ-クローニングした。
【００９６】
【表２７】
2010504751.tif 000029
【００９７】
前記ＲＴ-ＰＣＲによるＮＰ、Ｐ、Ｌ遺伝子増幅の結果を図１１のＡに示した。各遺伝子はＴＡ-ｃｌｏｎｉｎｇベクターにクローニングして塩基配列を分析し、突然変異のないクローンを選別した。このように選別されたクローンを図１１のＢに示した。
【００９８】
２．３．野外強病原性ＮＤＶの表面抗原を有する組換え弱病原性ＮＤＶ製造
２．３．１．強病原性ＫＢＮＰ-４１５２のＦとＨＮ遺伝子を弱毒化した組換えクローン製作
本実施例では最近国内で流行する強病原性ニューカッスル病ウイルスであるＫＢＮＰ-４１５２のＦとＨＮ誘電者をラソタ株を基本バックボーンとしたラソタ株転写ベクター（ｒＮＤＶ）に挿入した組換えＮＤＶゲノム転写ベクターを製作した。
【００９９】
２．３．２．組換えウイルスの遺伝子合成
それぞれのＦとＨＮ遺伝子は部位特異的突然変異誘発またはＰＴＤＳ（ＰＣＲ ｂａｓｅｄ Ｔｗｏ ｓｔｅｐｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を利用してフラン切断部位が変形されたそれぞれのＦとＨＮ遺伝子を得た（非特許文献１４、Ｘｉｏｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ３２，  Ｎｏ．１２ ｅ９８）。前記製作過程を図１２乃至図１５に示した。
【０１００】
（イ）ラソタのＭ遺伝子３'-末端部、ＫＢＮＰ-４１５２Ｆ遺伝子連結部及びフラン切断部位の塩基配列が変異された遺伝子を合成した。
【０１０１】
組換えウイルスを製造するために、Ｍ遺伝子３'-末端まではラソタ株のゲノム配列を有するようにし、遺伝子間塩基配列（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と遺伝子開始塩基配列（ｇｅｎｅ ｓｔａｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からはＫＢＮＰ-４１５２の塩基配列を有するように２つの遺伝子を融合させた（図１３参照）。Ｆ遺伝子を弱毒化するためにフラン切断部位のコドンらを塩基性アミノ酸が２つまたは１つのみコーディング（１１２-ＲＲＱＫＲＦ-１１７で１１２-ＧＲＱＡＲＬ-１１７）されるように遺伝子変異を起こし、図１４のようにプライマーを合成して矢印方向に組み合わせられたプライマーを入れて部位特異的突然変異誘発法及びＰＴＤＳ法で人工合成した。
【０１０２】
（ロ）その後、ＫＢＮＰ-４１５２ＨＮ（１-５６９）遺伝子とラソタ株のＨＮ遺伝子末端（５７０-５７７番）を連結させた。このように連結された連結部位の塩基配列は下記の通りである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８５、下線で示した部分からラソタ株のＨＮＣ-末端コーディング塩基配列である）。
【表２８】
2010504751.tif 000030
【０１０３】
（ハ）前記のようにＫＢＮＰ-４１５２ＨＮ遺伝子（１-５６９）とラソタ株のＨＮ遺伝子末端（５７０-５７７）を連結するために図１５のようにプライマーを設計してＰＴＤＳを行った。
【０１０４】
２．３．３．キメラＮＤＶ（ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌ）ｒｅｓｃｕｅ
Ｈｅｐ-２（韓国遺伝子銀行）またはＢＨＫ２１細胞株（ＭＯＧＡＭ生命工学研究所のｐａｒｋ ｍａｎ ｈｏｏｎ博士チームから提起）を６ウェル（孔）プレートで８０％程度育てた後（３７℃、５％のＣＯ２）、ｖａｃｃｉｎｉａＴ７ウイルス（ＭＯＧＡＭ生命工学研究所のｐａｒｋ ｍａｎ ｈｏｏｎ博士チームから提起）を感染させた。前記細胞株にＮＤＶのＲＮＰ複合体を形成するためのＮＰ、Ｐ、Ｌ遺伝子ゲノム転写ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１-ＮＰ、ｐｃＤＮＡ３．１-Ｐ及びｐｃＤＮＡ３．１-Ｌ３個のベクター（図１１のＢ）と弱毒化されたＫＢＮＰ-４１５２Ｆ遺伝子の転写開始部からＨＮ遺伝子５６９までをラソタ株ゲノム転写ベクター（ｒＮＤＶ）中Ｍ遺伝子後の遺伝子間配列（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部分とＨＮ遺伝子の５７０間に挿入して組換えＮＤＶゲノムを転写することができるｐＴＭＨ Ｃ４１５２-Ｒ２Ｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１、図２３参照）を製作した。
【０１０５】
前記プラスミドベクターをそれぞれ１:１:０．１:１比率で混合したプラスミドＤＮＡ４μｇ当り１０μlのリポフェクタミンＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．）と混合して形質移入した。ここに１μl/ｍｌのアセチル化トリプシンを添加して弱病原性組換えウイルスが生成されて感染性を有するようにした。得られた細胞株を２〜３日間３７℃で培養した後、６孔の細胞及び細胞培養液を収得して急凍結及び急解凍を３回経て９〜１１１日齢のＳＰＦ発育卵に接種し、尿膜液を収得して組換えニューカッスル病ウイルスを得て、これをＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌと命名した。前記菌株ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌは２００６年９月１２日付で大韓民国大田広域市儒城区魚隠洞５２番地に所在する韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託して寄託番号ＫＣＴＣ １０９８４ＢＰを与えられた。
このようなＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの生成過程を図１６に示した。
【０１０６】
前記と同様な方法で、Ｆ蛋白質のフラン切断部位に４個の塩基性アミノ酸を有する強病原性ＮＤＶ（ＲＲＱＫＲＦ;ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ４Ｌと命名）と１個の塩基性アミノ酸を有する弱病原性ＮＤＶ（ＧＧＱＡＲＬ;ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ１Ｌと命名）をそれぞれ製造した。前記菌株の名称はフラン切断部位の塩基性アミノ酸数によって定めたことで、Ｒの後の数字はフラン切断部位の１１２から１１６番アミノ酸中の塩基性アミノ酸の個数を意味し、Ｌ（ｌｏｎｇ）はＨＮ蛋白質の長さがラソタ株と同様な５７７個アミノ酸であることを示す。
【０１０７】
前記得られたＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ１Ｌ、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌ及びＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ４Ｌの模式図を図１７に示した。
【０１０８】
実施例３:ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌ分析
３．１．キメラＮＤＶの一般的特性調査
前記で得られたＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌを９〜１０令のＳＰＦ発育卵に接種した後、３〜５日後尿膜液を収得して平板血球凝集検査を通じて組換えＮＤＶの増殖有無を確認した。その結果を図１８に示した。図１８から分かるように、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌを接種して得られた尿膜液から血球凝集が観察され、これを通じてＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの増殖を確認した。
【０１０９】
ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌは大部分のＦ及びＨＮ遺伝子が野外強病原性株であるＫＢＮＰ-４１５２と同一であるが、Ｆのフラン切断部位が人工的に合成されたウイルスで強病原性ＮＤＶ特異プライマーを使用したＰＣＲではウイルスのＲＮＡが検出されず、全てのＮＤＶを共通に検出するプライマーを通じてのみウイルスのＲＮＡが検出されることが確認された。このような事実は表５のＮＤＶ-ｐｔ-ＲとＮＤＶｃｏｍＦ１５６プライマーを使用するＲＴ-ＰＣＲで増幅されたウイルスのＲＮＡ塩基配列を決定して組換えＮＤＶの遺伝子標識を確認した。前記ＲＴ-ＰＣＲ方法を通じてキメラウイルスを検出し、病原性類型を確認してその結果を図１９に示した。図１９に示したように、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２ＬはＮＤＶ共通プライマーで（ＮＤＶｃｏｍＦ１５６）は検出することができるが、病原性株特異プライマー（ＮＤＶ-ｐｔ-Ｒ、韓国特許第０４５１８８３号）では検出が不可能であった。
【０１１０】
より精密なウイルス同定のためにＲＴ-ＰＣＲ後塩基配列を分析して人工的に合成されたＦのフラン切断部位をコーディングする遺伝子塩基配列を確認してその結果を図２０に示した。
【０１１１】
図２０に示したように、母菌株であるＫＢＮＰ-４１５２のＦのフラン切断部位は１１２-ＲＲＱＫＲＦ-１１７の構造を有する反面、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌは１１２-ＧＲＱＡＲＬ-１１７の構造を有することが確認された。特に、１１５番目アミノ酸位置に存在するアラニン（Ａ）は自然系のＮＤＶが有していない本発明のキメラウイルスのみの特徴であると言える。
【０１１２】
３．２．キメラＮＤＶの血清学的特性調査
ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２ＬのＦ及びＨＮはＫＢＮＰ-４１５２と類似してラソタ株ワは明確な差を示すので、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２ＬはＫＢＮＰ-４１５２と血清学的に類似しているが、ラソタ株ワは差を示すと予想された。これを確認するために交差-血球凝集抑制検査を実施して血清学的特性を調査し、その結果を図２１に示した。予想した通り、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２ＬはＫＢＮＰ-４１５２と類似の血清学的特性を示すことが確認された。つまり、抗ラソタ抗血清はラソタ株と比較してＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌ及びＫＢＮＰ-４１５２に対して４乃至８倍低い血球凝集力価を示し、抗ＫＢＮＰ-４１５２抗血清は自分やＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌに対してほとんど類似な血球凝集力価を示すことが確認された。
【０１１３】
３．３．ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの病原性指数測定
３．３．１．平均死亡時間（Ｍｅａｎ Ｄｅａｔｈ Ｔｉｍｅ;ＭＤＴ）測定
ＭＤＴ測定はＡｌｅｘａｎｄｅｒ（１９８８）の方法に基づいて実施した。本発明のＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌを滅菌ＰＢＳに１０-６で希釈したウイルスを１０個の発育卵を５個ずつ１つのグループに分けて接種した。最初グループは午前９時に接種を実施し、第２グループは午後５時に実施した。接種後７日間３７℃で培養しながら毎日午前９時と５時に検卵を実施して死亡時間を記録してＭＤＴを計算した。測定されたＭＤＴが６０時間以内である場合には強病原性、６０〜９０時間以上である場合には中間毒、９０〜１２０時間は弱病原性、そして１２０〜∞は無病原性に判定した。ワクチンウイルスのＭＤＴは最少９０時間以上でなければならない。その結果、本発明のＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌは平均死亡時間が１６８時間以上で測定されて無病原性ＮＤＶに分類された。
【０１１４】
３．３．２．脳内病原性指数（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ、ＩＣＰＩ）測定
１日齢ヒヨコそれぞれ１０匹に滅菌食塩水で１０倍希釈した尿膜液（実施例２．３．３）５０μlを１ｃｃの注射器を利用して脳内に接種した後、毎日正常ヒヨコは０、病症を示したヒヨコは１、死亡したヒヨコは２に点数を付け、毎日合計を出して８日間の合計点数を８０に分けて計算した。無病原性は０．０〜０．２、弱病原性は０．２〜０．５、亜病原性は１．０〜１．５、強病原性は１．５〜２．０に分類した。国内でワクチンウイルスとして活用するためには最少０．５以下の病原性指数を示さなければならないので、０．０〜０．５までの組換えウイルスを選定した。
【０１１５】
ＫＢＮＰ-４１５２、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌ及びラソタ株のＩＣＰＩを測定した結果をそれぞれ表１１乃至１３に示した。
【０１１６】
【表２９】
2010504751.tif 000031
【０１１７】
【表３０】
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【０１１８】
【表３１】
2010504751.tif 000033
【０１１９】
前記平均死亡時間（ＭＤＴ）及びＩＣＰＩ結果を見ると、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２ＬはＭＤＴが１６８時間以上であり、ＩＣＰＩも０．０で病原性の殆どないウイルスとして確認された。このような病原性減少結果は本発明のＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌ菌株が従来の弱毒化されたラソタ株より非常に弱毒化されて病原性が低いということを示し、このような病原性の急激な低下は細胞変成効果において合胞体形成能力に優れた野外株のＦとＨＮ遺伝子の代わりに顆粒型の細胞変成効果を示す野外ＮＤＶのＦ及びＨＮ遺伝子を導入して作った組換えウイルスで現れ得る結果である。今まで強病原性ＮＤＶ中合胞体形と顆粒型の細胞変成効果を示すクローンが存在するという事実は全世界的にも国内でほとんど絶滅したことが疑われるＶＩ型ウイルスでのみ知られていたが、合胞体形ＮＤＶクローンであるＳＮＵ９３５８ＧＳ（ソウル大学校水医科大学鳥類疾病学室保有）のＩＣＰＩ数値（１．９５）より顆粒型クローンであるＳＮＵ９３５８ＧＧ（ＡＦ５３５８６１）の数値（１．７８）がさらに低くて病原性が低いということが知られていた。しかし、ＶＩＩ型を含む他のＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩＩ、ＸＩ型病原性ＮＤＶではこのような顆粒型細胞変成効果を起こすＮＤＶクローンは全く知られていなかったが、本研究者らはＶＩＩ型ＮＤＶで顆粒型ＮＤＶを最初にクローニングするのに成功して、このウイルスのＦ及びＨＮ遺伝子を利用して顆粒型細胞変成効果を示すラソタ株より低い病原性を有する組換えＮＤＶを製作するのに成功した。
【０１２０】
３．４．ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの誘電的安定性試験
本発明の組換えウイルスＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌを鶏胎児で９回以上系対培養した後、キメラゲノムヌクレオチド４０３０〜８８８９までをＲＴ-ＰＣＲで増幅した後、塩基配列分析した結果、塩基配列に変化がなくて非常に安定であることが確認された。
【０１２１】
３．５．ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの生産性測定:ＥＩＤ５０（５０％ｅｇｇ-ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）測定
ウイルスを１０進希釈（１０倍、１００倍、１０００倍など、２進数列では６，１２，２４時間など）して各稀釈倍数当り９〜１０日齢鶏胎児５〜７個に０．１ｍｌずつ尿膜腔内に接種し、５〜７日間３７℃で培養した後、鶏胎児を冷却しながら尿膜液を収得して血球凝集反応によってウイルスの増殖有無を判定し、定められた計算式によって算出した。その結果、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２ＬのＥＩＤ５０は１０１０．１/ｍｌで従来のラソタ株と類似して生産性が非常に高いことが確認された。
【０１２２】
３．６．血球解離様相測定
血球凝集解離に対する調査は（非特許文献１５,Ｓｐａｌａｔｉｎ,１９７０）の方法に準じて実施した。つまり、マクロプレート孔にＣＭＦ-ＰＢＳに２進稀釈したラソタ株とＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌそれぞれ０．５ｍｌに１％の鶏血球を０．２５ｍｌずつ入れて室温で１時間反応させた後、血球凝集力価を測定した。１次判読が終わった後、プレートを４℃で２４時間定置をした後に血球凝集力価を測定し、再浮遊２時間後に再び血球凝集力価を測定する。力価は凝集が起こる最高稀釈倍数の逆数にした。判定方法は解離様相の判定は血球凝集反応２４時間後に完全に解離が起こって再浮遊２時間後にも血球凝集が現れない場合にｒａｐｉｄ ｅｌｕｔｅｒ、そうではない場合にｓｌｏｗ ｅｌｕｔｅｒに判定した。
【０１２３】
その結果、ラソタ株はｓｌｏｗ ｅｌｕｔｅｒであったが、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌはｒａｐｉｄ ｅｌｕｔｅｒとしてＫＢＮＰ-４１５２と同一な生物学的特性を有することが確認された。
【０１２４】
３．７．細胞変成効果測定
鶏胎児繊維亜細胞（ＣＥＦ）を９６孔プレート全面に断層を形成するように培養した後、ラソタ株、ＫＢＮＰ-４１５２及びＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌでそれぞれ感染させた後（それぞれ２００ ＴＣＩＤ５０/ｗｅｌｌ）、ＦＢＳ０．５％、トリプシン２０μｇ/ｍｌを添加した培地に交替して培養し、３日後に観察した結果を図２２に示した。写真中間の赤い矢印はＮＤＶの典型的な細胞変成効果である合胞体が形成された模様を示すことで、実際にＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌはトリプシン添加時にＮＤＶの特徴的な合胞体を形成することを確認することができた（図２２のＥの赤い矢印）。
【０１２５】
このような細胞変成効果はキメラウイルスが合胞体形成にトリプシン依存性を有する弱病原性株であることを意味するが、ラソタ株とＫＢＮＰ-４１５２株とは異なって典型的な合胞体をほとんど形成せず、図２２のＤのように顆粒型の細胞変成効果を示した。
【０１２６】
３．８．ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの不活化ワクチン実験
ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの鶏胎児培養原液、これを１０倍濃縮した濃縮液及びラソタ株鶏胎児培養液をそれぞれ０．３％のフォルムアルデヒドで不活化し、不活化されたそれぞれのウイルス抗原浮遊液３０％にＩＳＡ７０オイル７０％を混合してそれぞれの不活化ワクチンを製造した。このように製造された不活化ワクチンを６週令のＳＰＦ鶏の皮下に接種し、ワクチン接種３週後に検疫院で標準として使用する校正円周１０６ＴＣＩＤ５０（ＡＹ６３０４００９）を鼻腔及び口腔で攻撃した。攻撃接種後１０日までの死亡率を観察し、その結果をの下の表１４に示した。
【０１２７】
【表３２】
2010504751.tif 000034
【０１２８】
前記表１４に示したように、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌはラソタ株に比べてＨＡ力価で計算した抗原量が低い場合にも抗体を形成させる能力は従来ワクチンに比べて優れていることが確認され、特に血清学的にラソタ株に比べて野外株に対する免疫をさらによく形成することが確認された。
【０１２９】
３．９．ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌのｉｎ ｏｖｏワクチン実験
ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌは現在ワクチンとして使用されている菌株よりも病原性が非常に低くてｉｎ ｏｖｏワクチンの可能性が高くて、これを確認するために１８日齢常用鶏の胎児を利用してｉｎ ｏｖｏワクチンを投与し、孵化率及び孵化２週後の増体率を対照群と比較し、２週令後の抗体価を検査することによって母体移行抗体克服の有無と免疫水準を比較し、２週後強病原性ウイルスを攻撃接種して防御率を確認した。
【０１３０】
試験に使用した鶏胎児は常用産卵鶏で１８日齢の鶏胎児に１０７．０ＥＩ  Ｄ５０/ｍｌになるように希釈した各ワクチン株を０．１ｃｃずつ接種した。また、陰性対照群には滅菌ＰＢＳ０．１ｃｃを接種した。母体移行抗体の水準を調べるために陰性対照群のうちの５匹を孵化直後犠牲させて血清を確保した。孵化後１７日齢に各グループ当り個体格別体重を測定して採血し、強毒株のＫＢＮＰ-４１５２ １０６．５ ＴＣＩＤ５０を鼻腔及び口腔で攻撃接種した。生存率は攻撃接種後１０日まで観察した。このようにして得られた結果を下記の表１５に示した。
【０１３１】
【表３３】
2010504751.tif 000035
【０１３２】
前記表１５のようにＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌ接種群と陰性対照群は孵化率及び増体率で有意的な差がなかったが、孵化後１７日齢の抗体力価は対照群に比べてＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌ接種群で高く維持されていることが確認できる。つまり、対照群の場合、１日齢の場合は母体移行抗体がラソタ株に対する血球凝集抑制（ＨＩ）力価が平均５．８±２．７から２．７±１．７に落ちた反面、ＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌ接種群はラソタ株に対して４．９±１．１、そして自分に対しては５．５±１．４で比較的に高い力価を示した。また、攻撃接種後対照群で３３．３％の死亡を示したが、組換えワクチン接種群の場合には１００％生存した。
【０１３３】
このような結果はＡｋｚｏ Ｎｏｂｅｌ Ｎ．Ｖ．（ＮＬ）社が持っている従来の"Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａｎ ｅｍｂｒｙｏ ｖａｃｃｉｎｅ"を題目とする"ＵＳ６，６９９，４７９Ｂ１"特許文献４より優れた結果であり、Ｐ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇによる弱毒化を利用せず新たな方法で開発されたＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌから得られたものである点で意味がある。
【０１３４】
最近先進国では接種の容易性及び経済性などの理由でヒヨコが孵化する前の鶏胎児に直接ワクチンするＩｎ ｏｖｏワクチンが好まれているが、ニューカッスル病の場合には現在まで知られたセンドクワクチン株は鶏胎児病原性があって適用に限界があった。しかし、本発明のＫＢＮＰ-Ｃ４１５２Ｒ２Ｌの場合は鶏胎児病原性がないことが確認されてｉｎ ｏｖｏワクチンとしての活用価値が非常に高いことが期待される。
【０１３５】
以上で説明したように本発明の組換えニューカッスル病ウイルスは国内及びアジア地域で流行する強病原性ニューカッスル病ウイルスと抗原性が類似しており、病原性は現在使用されているワクチン株と類似しているか顕著に低くてｉｎ ｏｖｏワクチンとして使用することができ、点突然変異による病原性獲得の可能性も従来のワクチン株に比べて非常に低い遺伝子構造を持っていて国内だけでなくアジア地域のニューカッスル病予防のための死毒ワクチンをはじめ生独ワクチン及びｉｎ ｏｖｏワクチンの製造に有用に使用することができる。
【０１３６】
［寄託書］
2010504751.tif 000036
2010504751.tif 000037
【図７】
2010504751.tif 000038
【図１４】
2010504751.tif 000039
【図１５】
2010504751.tif 000040
【図２０】
2010504751.tif 000041
【図２３】
2010504751.tif 000042
【図１】
2010504751.tif 000043
【図２】
2010504751.tif 000044
【図３】
2010504751.tif 000045
【図４】
2010504751.tif 000046
【図５】
2010504751.tif 000047
【図６】
2010504751.tif 000048
【図８】
2010504751.tif 000049
【図９】
2010504751.tif 000050
【図１０】
2010504751.tif 000051
【図１１】
2010504751.tif 000052
【図１２】
2010504751.tif 000053
【図１３】
2010504751.tif 000054
【図１６】
2010504751.tif 000055
【図１７】
2010504751.tif 000056
【図１８】
2010504751.tif 000057
【図１９】
2010504751.tif 000058
【図２１】
2010504751.tif 000059
【図２２】
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【配列表】
2010504751000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月22日(2009.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆ蛋白質の１１３番目から１１６番目アミノ酸配列として下記の式１
[式１]
113-X1X2X3X4-116
［前記式中、
Ｘ１、Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立的にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）であり、
Ｘ２はアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸である］
で表現されるアミノ酸配列を有する弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＮＰ、Ｐ、Ｍ及びＬ蛋白質をコードするヌクレオチド配列、及び
Ｆ蛋白質の１１３番から１１６番アミノ酸配列として下記の式２
[式２]
113-X4X5X7X8-116
［前記式中、
Ｘ５、Ｘ６及びＸ７はそれぞれ独立的にアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群より選択されたアミノ酸であり、Ｘ５とＸ７は同時にアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）でなく、
Ｘ８はアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）である］
で表現されるアミノ酸配列を有する強病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ及びＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有し、
菌株に含まれる前記Ｆ蛋白質コーディング配列が、強病原性ニューカッスル病ウイルスのＦ蛋白質の１１５番目のアミノ酸をコードするコドンが、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵからなるアラニンコーディングコドン;ＧＡＣ及びＧＡＵからなるアスパラギン酸コーディングコドン;ＵＵＣ及びＵＵＵからなるフェニルアラニンコーディングコドン;ＡＵＣ及びＡＵＵからなるイソロイシンコーディングコドン;ＵＵＡ及びＵＵＧからなるロイシンコーディングコドン;ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ及びＵＣＵからなるセリンコーディングコドン;ＡＣＣ及びＡＣＵからなるスレオニンコーディングコドン;ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ及びＧＵＵからなるバリンコーディングコドン;ＵＡＣ及びＵＡＵからなるチロシンコーディングコドンからなる群から選択されたいずれか１つのコドンで置換されたことを特徴とする、
ニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項２】
前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスがＩＩ型ニューカッスル病ウイルスからなる群から選択されたものであり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスがＶＩ及びＶＩＩ型ニューカッスル病ウイルスからなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項１に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項３】
前記弱病原性ニューカッスル病ウイルスがラソタ/４６菌株（ＡＹ８４５４００）であり、前記強病原性ニューカッスル病ウイルスがＫＢＮＰ-Ｃ４１５２（寄託番号:ＫＣＴＣ １０９１９ＢＰ）であることを特徴とする、請求項２に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項４】
前記ＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列が、強病原性ニューカッスル病ウイルスのＨＮ蛋白質の５６９番のアミノ酸のＣ末端に、弱病原性ニューカッスル病ウイルスのＨＮ蛋白質の５７０番目の後のアミノ酸配列が連結された、組換えＨＮ蛋白質をコードするヌクレオチド配列である、請求項１に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項５】
寄託番号ＫＣＴＣ １０９８４ＢＰである、請求項１に記載のニューカッスル病ウイルス菌株。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のうちのいずれか１つの請求項に記載の組換えニューカッスル病ウイルス菌株を含むニューカッスル病に対するワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンが、不活化された死毒ワクチン形態、活性ワクチン形態及びｉｎ ｏｖｏワクチン形態で構成された群より選択されたある１つの形態で使用される、請求項１９に記載のニューカッスル病ワクチン。
【国際調査報告】
2010504751.tif 000061
2010504751.tif 000062
2010504751.tif 000063
2010504751.tif 000064