(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする被験体における慢性腎臓病（ＣＫＤ）の予防または処置に使用するための、ペリオスチン遺伝子発現阻害剤であって、該ペリオスチン遺伝子阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該必要とする被検体が、高血圧性腎症に罹患している、阻害剤および薬学的に許容される担体を含む、高血圧性腎症の予防または処置に使用するための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、慢性腎臓病（ＣＫＤ）を予防および処置するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
慢性腎臓病（ＣＫＤ）は種々の原因から起こり得るが、最終的な経路は依然として、異常な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積に至る慢性炎症によって特徴付けられる腎線維症である。機能しているネフロン数の減少に至るこの線維化プロセスは依然として不明であり、ＣＫＤの進行の鍵となっている。従って、腎線維化の病態生理的機序への新たな洞察は、我々をより効果的な療法へと導くだろう。ＥＣＭの量は、タンパク質の合成と分解との間の平衡によって調節され、それは胚発達および病理状態の最中に特に重要である。線維化機序が進行中の研究の主題であるが、線維症の成分としてだけでなく、細胞−マトリックスシグナル伝達を介した組織再構築の活性調節因子としてのその重要性から、ＥＣＭタンパク質が注目されるようになった。前記を鑑みて、腎線維症の進行に関与するようであり、それ故、ＣＫＤの進行に関与するようである因子を同定し、これによりこのような疾病の処置のための新規なツールを構想する必要が当技術分野には存在する。
【０００３】
ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）は骨芽細胞特異的因子２（ＯＳＦ−２）とも呼ばれるが、これは、発達中におよび非常に初期の生後組織において発現される９０ｋＤａの細胞外タンパク質であり、健康な成人組織におけるその発現は非常に低いが、損傷後にかなり増加する。
【０００４】
ペリオスチンの発現は、形質転換増殖因子β−１（ＴＧＦβ１）および骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２）の両方によって有意に増加することが以前に示された。心臓の多くの研究により、ペリオスチンは線維芽細胞によって分泌され、コラーゲンの沈着を調節し、これにより、結合組織の器質的特性を変化させることが示された。ペリオスチンをノックアウトさせた場合、動物は、心筋梗塞後に減少した線維症を示した。このマトリックス細胞タンパク質はまた、テネイシン、フィブロネクチンなどの他のＥＣＭ成分と会合し、ａｖｂ３ ａｖｂｖなどのインテグリンと相互作用し、その結果、ＡｋｔまたはＰＩ３キナーゼ経路を活性化する能力を有する。近年、ペリオスチンは、多種多様な病態において記載されたが（癌、喘息など）、腎臓におけるペリオスチンおよび慢性腎臓病の進行におけるその潜在的な役割については殆ど知られていない。現在までに、ペリオスチンは、ヒト常染色体優性多発性嚢胞腎において記載され、上皮嚢胞細胞において新規に発現されることが示された（Wallace et al. 2008）。別の研究は、糸球体症および腎機能不全患者からの生検におけるいくつかのマトリックス細胞タンパク質の遺伝子発現プロファイルを記載し；それは、ペリオスチンが尿細管間質および線維化区画において高度に誘導され、腎機能に負に相関することを示した。近年、ペリオスチンは、Ｌ−ＮＡＭＥによって誘発された高血圧性腎症において、ＣＫＤの進行および減退の指標として同定された（Guerrot et al. 2012）。実際に、ペリオスチンの発現は、腎臓病の機能的マーカー（血漿中クレアチニン、タンパク尿、腎血流）に相関し、その局在は、実験的高血圧性腎症の特徴である血管周囲線維化領域に関連していたことが示された。興味深いことに、ペリオスチンはヒト腎臓病において過剰発現され、慢性同種移植腎症の損傷した線維化尿細管間質領域に見い出された。合わせて、これらの結果は、ペリオスチンが、腎線維症の進行およびおそらく減退の良好なマーカーであることを示す。しかしながら、これらの研究は、ペリオスチンが腎線維症およびＣＫＤの発症に関与するか否かの問題には取り組まなかった。
【０００５】
発明の概要：
本発明は、必要とする被験体における慢性腎臓病（ＣＫＤ）の予防または処置に使用するための、抗体、アプタマー、小有機分子およびポリペプチドからなる群より選択されるペリオスチンに結合する薬剤に関する。
【０００６】
本発明はまた、必要とする被験体におけるＣＫＤの予防または処置に使用するための、ペリオスチン遺伝子発現阻害剤に関する。
【０００７】
本発明はさらに、腎線維症を予防または低減させるための、抗体、アプタマー、小有機分子およびポリペプチドからなる群より選択されるペリオスチンに結合する薬剤またはペリオスチン遺伝子発現阻害剤に関する。
【０００８】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、腎線維症の確立におけるペリオスチンの関与に焦点を当てた。この目的を達成するために、本発明者らは、実験的尿細管間質性腎症におけるその役割および機序を調べ；それ故、本発明者らは、野生型（ＷＴ）およびペリオスチンノックアウト（ＫＯ）マウスで片側尿管閉塞モデル（ＵＵＯ）を実施し、ペリオスチンを欠失したマウスは、腎線維症および腎臓病の発症から防御されることを示した。
【０００９】
その後、本発明者らは、高血圧性腎症ラットモデル（Ｌ−ＮＡＭＥ処置ラット）へのペリオスチン遺伝子阻害剤（すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド）の投与もまた、腎線維症および腎臓病の発症からそれらを防御するのに有用であることを示した。合わせて、これらのデータは、ペリオスチンがＣＫＤの進行に対する有望な標的であり得るという初めての証拠を提供する。
【００１０】
従って、本発明の第１の目的は、必要とする被験体における慢性腎臓病（ＣＫＤ）の予防または処置に使用するための、抗体、アプタマー、小有機分子およびポリペプチドからなる群より選択されるペリオスチンに結合する薬剤に関する。
【００１１】
本明細書において使用される「ペリオスチン」という用語は、「骨芽細胞特異的因子
２」、「ＯＳＦ−２」または「ＰＯＳＴＮ」を含むがそれらに限定されない全ての同義語を包含することを意味し、天然に存在するペリオスチン並びにその変異体を含む。
【００１２】
「ペリオスチンタンパク質」という用語は、ＧｅｎＰｅｐｔデータベースでアクセッションナンバーＮＰ＿００６４６６で提供される８３４アミノ酸のペリオスチンタンパク質を指す。
【００１３】
本明細書において使用される「予防」という用語は、疾病または病態を有するとまだ診断されていない被験体において前記疾病または病態が起こることを予防することを指す。
【００１４】
本明細書において使用される「処置」という用語は、疾病または病態を阻止すること、すなわち、その発症を停止させること；疾病または病態を軽減すること、すなわち病態の減退を引き起こすこと；あるいは、疾病によって引き起こされた病態すなわち疾病の症状を軽減することを指す。
【００１５】
本明細書において使用される「慢性腎臓病」（ＣＫＤ）という用語は、数か月間または数年間の期間におよぶ腎機能の進行的低下を指す。ＣＫＤは、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、これは、腎臓、腎実質の破壊、および機能的ネフロンまたは糸球体の減少に影響を及ぼす数多くの病態を分類するために使用される。ＣＫＤは種々の原因から起こり得るが、最終的な経路は依然として腎線維症であることをさらに注記すべきである。ＣＫＤの病因の例としては、心血管疾患、高血圧、糖尿病、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、および腎移植拒絶が挙げられるがそれらに限定されない。
【００１６】
本明細書において使用される「腎線維症」または「腎線維化」という用語は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の異常な蓄積、例えば間質マトリックスである尿細管基底膜（ＴＢＭ）の組成の質的および量的変化、尿細管委縮、および筋線維芽細胞の蓄積に至る慢性炎症によって特徴付けられる病態機序を指す。機能しているネフロン数の減少に至るこの線維化プロセスは依然として不明であり、ＣＫＤの進行の鍵となる。
【００１７】
より正確には、国際腎臓病予後改善機構（ＫＤＩＧＯ）は初めて、ＣＫＤのステージの定義および分類のためのシステムを開発および公表した。従って、ＣＫＤは、以下の表１に再現されているように、ＫＤＯＱＩ ＣＫＤ分類表１１に従って列挙された基準に従って定義された（腎損傷の兆候と組み合わせた、糸球体ろ過速度（ＧＦＲ）の減少に基づいて）。
【００１８】
【表１】
0006293137.tif 000002
【００１９】
本発明の脈絡における「被験体」は、ヒト（男性または女性）である。典型的には、前記被験体は、ＣＫＤに至る疾病と以前に診断されている。
【００２０】
１つの態様において、それを必要とする患者は、腎症（例えば膜性腎症（ＭＮ）、糖尿病性腎症および高血圧性腎症）、糸球体腎炎（例えば膜性糸球体腎炎および膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、例えば急速進行性糸球体腎炎（ＲＰＧＮ））、間質性腎炎、ループス腎炎、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）（例えば微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）および巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ））、閉塞性尿路疾患、多発性嚢胞腎疾患（例えば常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）および常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患（ＡＲＰＫＤ））、心血管疾患、高血圧、糖尿病、および腎移植片拒絶（例えば急性および慢性腎拒絶）からなる群より選択される疾病に罹患している。
【００２１】
１つの態様において、前記薬剤は、抗体またはその一部である。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体はモノクローナル抗体である。
【００２２】
本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体はポリクローナル抗体である。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体はキメラ抗体である。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体の一部は抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体の一部は抗体の重鎖を含む。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体の一部は抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体の一部は抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体の一部は抗体のＦｃ部分を含む。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体の一部は抗体のＦｖ部分を含む。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体の一部は抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載された抗体またはその一部の１つの態様において、前記抗体の一部は抗体の１つ以上のＣＤＲドメインを含む。
【００２３】
本明細書において使用される「抗体」は、天然および非天然の抗体の両方を含む。特に、「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、並びにその一価および二価フラグメントを含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、完全合成抗体、一本鎖抗体、およびそのフラグメントを含む。前記抗体はヒト抗体または非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を低下させるために組換え法によってヒト化されていてもよい。
【００２４】
抗体は、従来の方法に従って調製される。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein（Nature, 256:495, 1975）の方法を使用して生成され得る。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウスまたは他の適切な宿主動物を、適切な間隔で（例えば１週間に２回、１週間に１回、１か月に２回、または１か月に１回）抗原性の形態ペリオスチンを用いて免疫化する。動物に、屠殺の１週間以内に最終抗原「ブースト」を投与し得る。免疫化の最中に免疫アジュバントを使用することがしばしば望ましい。適切な免疫アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、Hunter's Titermax、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１もしくはクイルＡ、またはＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは当技術分野において周知である。動物を、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内または他の経路によって免疫化し得る。所与の動物を、複数の経路によって複数の形態の抗原を用いて免疫化し得る。
【００２５】
簡潔に言えば、組換えペリオスチンは、組換え細胞株を用いての発現によって提供され得る。組換え形のペリオスチンは、任意の以前に記載されている方法を使用して提供され得る。免疫化計画後、リンパ球を、動物の脾臓、リンパ節または他の臓器から単離し、ポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。融合後、細胞を、記載されているような（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）標準的な方法を使用して、ハイブリドーマの増殖に許容されるがその融合パートナーの増殖は許容されない培地に入れる。ハイブリドーマの培養後、細胞上清を、所望の特異性の抗体、すなわち、抗原に選択的に結合する抗体の存在について分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降法およびウェスタンブロットが挙げられる。他のスクリーニング技術も当技術分野において周知である。好ましい技術は、コンフォメーション的にインタクトな天然に折り畳まれた抗原と抗体との結合を確認する技術、例えば非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよび免疫沈降法である。
【００２６】
重要なことには、当技術分野において周知であるように、抗体分子のほんの小さな部分、すなわちパラトープが、抗体とそのエピトープとの結合に関与している（一般的には、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照されたい）。Ｆｃ’およびＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原との結合には関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されたまたはｐＦｃ’領域を含まないように産生された抗体は、Ｆ（ａｂ'）２フラグメントと称されるが、インタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されたまたはＦｃ領域を含まないように産生された抗体は、Ｆａｂフラグメントと称されるが、インタクトな抗体分子の一方の抗原結合部位を保持する。さらに加工すると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖およびＦｄと称される抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄフラグメントは抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体の特異性を改変させることなく、１０個以下の異なる軽鎖と会合し得る）、Ｆｄフラグメントは単独でエピトープ結合能を保持する。
【００２７】
抗体の抗原結合部分内には、当技術分野において周知であるように、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、および、パラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的には、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照されたい）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメントおよび軽鎖の両方において、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳ）によって隔てられた４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より特定すると重鎖ＣＤＲＳは主に、抗体特異性に関与する。
【００２８】
哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域を、元来の抗体のエピトープ特異性を維持しつつ、同種または異種特異的抗体の類似領域を用いて置換し得ることが当技術分野において現在十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合させて機能的抗体が産生される「ヒト化」抗体の開発および使用に最も明瞭に顕現している。
【００２９】
本発明は、特定の態様において、ヒト化形の抗体を含む組成物および方法を提供する。本明細書に使用される「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のいくつか、殆どまたは全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換された抗体を記載する。ヒト化の方法としては、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号および第５，８５９，２０５号に記載されているものが挙げられるがそれらに限定されず、これらは、本明細書に参照により組み入れられる。上記の米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６１号並びに国際公開公報第９０／０７８６１号もまた、ヒト化抗体の設計に使用され得る４つの見込みある基準を提案する。第１の提案は、アクセプターについて、ヒト化しようとするドナー免疫グロブリンに対して珍しく相同である特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用すること、または多くのヒト抗体由来の共通フレームワークを使用することであった。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が異常であり、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列にとって典型的である場合、アクセプターではなくむしろドナーアミノ酸を選択し得るということであった。第３の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤＲのすぐ隣の位置に、アクセプターアミノ酸ではなくむしろドナーアミノ酸を選択し得るというものであった。第４の提案は、アミノ酸が抗体の３次元モデルにおいてＣＤＲの３Å以内に側鎖原子を有すると予測され、ＣＤＲと相互作用することができると予測されるフレームワーク位置に、ドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記の方法は当業者がヒト化抗体を作成するために使用することができるいくつかの方法の単なる例である。当業者は、抗体のヒト化のための他の方法も知っているだろう。
【００３０】
ヒト化形の抗体の１つの態様において、ＣＤＲ領域外のいくつか、殆どまたは全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のいくつか、殆どまたは全てのアミノ酸は不変である。アミノ酸の僅かな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、それらが所与の抗原と抗体が結合する能力を消失しない限り許容可能である。適切なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭの分子が挙げられる。「ヒト化」抗体は、元来の抗体と類似した抗原特異性を保持する。しなしながら、特定のヒト化法を使用して、抗体の結合の親和性および／または特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999（その内容は本明細書に参照により組み入れられる）によって記載されているような「指向的進化」法を使用して増加させ得る。
【００３１】
完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックであるマウスを免疫化することによって調製することができる。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５９８，３６９号、第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号、第６，１５０，５８４号、およびその中に引用されている文献（その内容は本明細書に参照により組み入れられる）を参照されたい。これらの動物は、内因性（例えばマウス）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子的に改変されている。動物は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むようにさらに改変され、よって、これらの動物の免疫化により、対象の抗原に対する完全なヒト抗体が産生される。これらのマウス（例えばXenoMouse (Abgenix)、 HuMAbマウス (Medarex/GenPharm)) の免疫化後、モノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製することができる。これらのモノクローナル抗体はヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、それ故、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘起しない。
【００３２】
ヒト抗体を産生するためのインビトロの方法も存在する。これらは、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号）およびヒトＢ細胞のインビトロでの刺激（米国特許第５，２２９，２７５号および第５，５６７，６１０号）を含む。これらの特許内容は本明細書に参照により組み入れられる。
【００３３】
従って、当業者には明らかであろうように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２ Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメント；キメラ抗体（Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒトまたは非ヒト配列によって置換されている）；キメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体（ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒトまたは非ヒト配列によって置換されている）：キメラＦａｂフラグメン抗体（ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒトまたは非ヒト配列によって置換されている）；およびキメラＦｄフラグメント抗体（ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同ヒトまたは非ヒト配列によって置換されている）を提供する。本発明また、いわゆる一本鎖抗体も含む。
【００３４】
種々の抗体分子およびフラグメントは、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むがそれらに限定されない、一般的に知られている免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むがそれらに限定されない。
【００３５】
別の態様において、本発明による抗体は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）または「ＶＨＨ」という用語は、軽鎖を天然的に欠失しているラクダ科哺乳動物に見出すことができる種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨはまた、「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。本発明によると、ｓｄＡｂは特にラマｓｄＡｂであり得る。
【００３６】
その後、本発明のために、一旦ペリオスチンに結合する抗体が得られれば、ペリオスチンの中和抗体が選択される。従って、特定の態様において、ペリオスチンに結合する抗体は、抗ペリオスチン中和抗体である（すなわち、腎線維症および腎臓における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰な蓄積の予防につながる、ペリオスチンの活性を遮断する抗体）。
【００３７】
中和抗体（ＭＺ−１）の一例はZhu et al.,20011に記載されており、これは本明細書に参照により組み入れられる。
【００３８】
抗ペリオスチン中和抗体を得るための方法は、特許出願の欧州特許第１９７８０３４号に開示されているように当業者には周知である。
【００３９】
別の態様において、前記薬剤はアプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物を表すクラスの分子である。アプタマーは、実質的にあらゆるクラスの標的分子を高い親和性および特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列またはオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C.およびGold L., 1990に記載のように、ランダム配列ライブラリーのSystematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)を通して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビトナトリアル化学合成によって得ることができる。このライブラリーにおいて、各メンバーは鎖状オリゴマー、最終的には化学的に修飾された独特な配列のオリゴマーである。このクラスの分子の可能な修飾、使用および利点は、Jayasena S.D., 1999に考察されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法(Colas et al., 1996)によってコンビナトリアルライブラリーから選択されるE. coliチオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によって提示されるコンフォメーション的に拘束された抗体可変領域からなる。
【００４０】
その後、本発明のために、ペリオスチンの中和アプタマーが選択される。
【００４１】
別の態様において、前記薬剤はポリペプチドである。特定の態様において、前記ポリペプチドは、ペリオスチンに結合することのできる細胞外マトリックスタンパク質または接着レセプターの機能的等価体である。本明細書に使用される「細胞外マトリックスタンパク質」は、フィブロネクチン、テネイシン−Ｃ、コラーゲン（例えばＩ型およびＶ型コラーゲン）からなる群より選択されるタンパク質である。本明細書に使用される「接着レセプター」は、インテグリン（例えばαｖβ３、αｖβ５およびα６β４）からなる群より選択されるレセプターである。
【００４２】
本明細書に使用される「細胞外マトリックスタンパク質または接着レセプターの機能的等価体」は、ペリオスチンに結合することのできる化合物である。「機能的等価体」という用語は、細胞外マトリックスタンパク質または接着レセプターのフラグメント、突然変異体およびムテインを含む。「機能的等価体」という用語は、従って、タンパク質類似体がペリオスチンに結合する能力を保持するように、アミノ酸配列を改変させることによって、例えば１つ以上のアミノ酸の欠失、置換または付加によって得られる、細胞外マトリックスタンパク質または接着レセプターの任意の等価体を含む。アミノ酸の置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点突然変異によって行なわれ得る。好ましくは、機能的等価体は、対応するタンパク質に対して少なくとも８０％相同である。好ましい態様において、機能的等価体は、例えばPileup配列分析ソフトウェア（Program Manual for the Wisconsin Package, 1996）などの任意の慣用的な分析アルゴリズムによって評価されるように少なくとも９０％相同である。このような分子は、ＣＫＤの予防または処置に有用であると想定される。なぜなら、これらの分子は、ペリオスチンに特異的に結合し、従って、ペリオスチンによって誘発される腎線維症を予防し、最終的にはＣＫＤを予防または処置するからである。本明細書に使用される「特異的に結合する」は、機能的等価類似体が、ペリオスチンに対して高い親和性を有するが、対照タンパク質に対しては高い親和性を有さないことを意味する。特異的な結合は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロットまたは免疫沈降法などの多くの技術によって測定され得る。好ましくは、機能的等価類似体は、ペリオスチンにナノモルまたはピコモルレベルで特異的に結合する。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、当業者には明らかであろうように、任意の適切な手段によって産生され得る。本発明に従って使用するための十分な量の細胞外マトリックスタンパク質、接着レセプターまたはその機能的等価体を産生するために、本発明のポリペプチドを含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、簡便に発現が達成され得る。好ましくは、ポリペプチドは、組換え手段によって、コードされている核酸分子からの発現によって産生される。多種多様な宿主細胞においてポリペプチドをクローニングおよび発現するためのシステムは周知である。
【００４４】
組換え形で発現される場合、ポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞においてコードされている核酸からの発現によって生成される。特定のシステムの個々の必要条件に依存して、任意の宿主細胞を使用し得る。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において利用できる哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、および多くのその他が挙げられる。細菌は操作および増殖させ易いために、細菌もまた組換えタンパク質の産生のための好ましい宿主である。一般的で好ましい細菌宿主はE.coliである。
【００４５】
特定の態様において、本発明の治療法に使用されるポリペプチドは、その治療効力を改善するために改変され得ると考えられる。このような治療化合物の改変を使用して、毒性を減少させるか、循環時間を増加させるか、または生体内分布を改変させ得る。例えば、重要である可能性のある治療化合物の毒性を、生体内分布を改変させる多種多様な薬物担体ビヒクルと組み合わせることによってかなり減少させ得る。例えばジペプチドの付加は、内因性輸送体を使用することによる循環剤の血液網膜関門を通した眼内への浸透を改善し得る。
【００４６】
薬物の存続性を改善させるための戦略は、水溶性ポリマーの使用である。種々の水溶性ポリマーが、生体内分布を改変させ、細胞による取り込みの様式を改善させ、生理学的障壁を通る透過性を変化させ、そして体内からの消失速度を改変することが示された。標的化効果または徐放性効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、またはポリマー鎖上の吊り下がった基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成された。
【００４７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高い生体適合度および改変のし易さから、薬物担体として広く使用されている。種々の薬物、タンパク質、およびリポソームへの付着は、滞留時間を改善させ、毒性を低減させることが示された。ＰＥＧを、鎖の末端のヒドロキシル基を通して、および他の化学的方法を介して活性薬剤に結合させ得るが；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子あたり最大で２個の活性薬剤に制限される。異なるアプローチにおいて、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマーは、ＰＥＧの生体適合特性を保持するが１分子あたり多くの付着点のさらなる利点を有し（より多くの薬物が負荷される）、多種多様な用途に適するように合成的に設計することができる、新規な生体材料として検討された。
【００４８】
当業者は、薬物の効果的な改変のためのＰＥＧ化技術を知っている。例えば、ＰＥＧと三機能性モノマー（例えばリシン）の交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーがVectraMed (Plainsboro, N.J.)によって使用された。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン以下）が、安定なウレタン結合を通して、リシンのａ−およびｅ−アミノ基に連結している。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って厳密に制御されかつ予め決定された間隔で反応性の吊り下がった基（リシンのカルボン酸基）を与えつつ、ＰＥＧの所望の特性を保持する。反応性の吊り下がった基は、誘導体化、架橋、または他の分子とのコンジュゲーションのために使用することができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、および薬物とポリマーの間の切断可能な連結を変化させることによって、安定で長時間循環するプロドラッグを産生するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔、およびコンジュゲートの分子量あたりの薬物の量（ＰＥＧセグメントが小さければ小さいほど、より多くの薬物が負荷される）に影響を及ぼす。一般的には、ブロックコポリマーコンジュゲートの全分子量の増加は、コンジュゲートの循環半減期を増加させるだろう。それにも関わらず、コンジュゲートは容易に分解可能であるか、または糸球体ろ過限界閾値未満の分子量（例えば、６０ｋＤａ未満）を有するかのいずれかでなければならない。
【００４９】
さらに、ポリマー骨格が循環半減期および生体内分布を維持するのに重要であるので、特異的トリガー、典型的には標的化組織における酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまで、治療剤をプロドラッグ形で維持するために、リンカーを使用し得る。例えば、この種類の組織活性化薬物送達は、特定の生体内分布部位への送達が必要とされ、治療剤が病変部位にまたは病変部位の近くに放出される場合に特に有用である。活性化薬物送達に使用するための連結基ライブラリーは当業者には公知であり、酵素動態、活性酵素の普及、および選択された疾病特異的酵素の切断特異性に基づき得る。このようなリンカーは、治療薬送達のために本明細書に記載されたタンパク質またはタンパク質フラグメントを改変するのに使用され得る。
【００５０】
本発明はさらに、腎線維症を予防または低減させるための、抗体、アプタマー、小有機分子およびポリペプチドからなる群より選択されるペリオスチンに結合する薬剤に関する。
【００５１】
本発明の別の目的は、必要とする被験体におけるＣＫＤの予防または処置に使用するためのペリオスチン遺伝子発現阻害剤に関する。
【００５２】
「発現阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然または合成化合物を指す。それ故、「ペリオスチン遺伝子発現阻害剤」は、ペリオスチン遺伝子発現を阻害する生物学的効果を有する天然または合成化合物を示す。
【００５３】
本発明の好ましい態様において、前記ペリオスチン遺伝子発現阻害剤はｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。
【００５４】
本発明に使用するためのペリオスチン遺伝子発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づき得る。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペリオスチンｍＲＮＡに結合することによってペリオスチンｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用し、よってタンパク質の翻訳を妨げるかまたはｍＲＮＡの分解を増加させ、よって細胞中のペリオスチンのレベル、従って活性を減少させる。例えば、少なくとも約１５塩基であり、ペリオスチンをコードするｍＲＮＡ転写物配列の独特な領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば慣用的なホスホジエステル技術によって合成し、例えば静脈内注射または点滴によって投与することができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；および第５，９８１，７３２号参照)。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドをホスホロチオエートを用いて改変して、ヌクレアーゼによるインビボでのその加水分解を妨げ得ることがさらに注記されるべきである。このような改変は当業者には周知である。
【００５６】
１つの態様において、ペリオスチンを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は配列番号１によって示される。
【００５７】
１つの態様において、ペリオスチンを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は配列番号２によって示される。
【００５８】
阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）はまた、本発明に使用するためのペリオスチン遺伝子発現阻害剤として機能し得る。ペリオスチン遺伝子発現は、腫瘍、対象または細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物と接触させることによって減少させることができ、よって、ペリオスチンの遺伝子発現は、特異的に阻害される（すなわちＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉ）。配列が公知である遺伝子のための、適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡコードベクターを選択するための方法は当技術分野において周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号；並びに、国際特許公開公報第０１／３６６４６号、国際公開公報第９９／３２６１９号および国際公開公報第０１／６８８３６号を参照されたい）。
【００５９】
リボザイムはまた、本発明に使用するためのペリオスチン遺伝子発現阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することのできる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のヌクレオチド鎖切断を含む。それ故、ペリオスチンｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒する工学操作されたヘアピンまたはハンマーヘッドモチーフのリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。あらゆる可能性あるＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は最初に、標的分子を、典型的には以下の配列（ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣ）を含むリボザイム切断部位について走査することによって同定される。一旦同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２０のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものとし得る二次構造などの予測される構造特徴について評価することができる。候補標的の適切性はまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが実行できるかを試験することによって評価され得る。
【００６０】
ペリオスチン遺伝子発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方が、公知の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホルアマダイト化学合成などによる化学合成技術を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボでの転写によって生成し得る。このようなＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する種々の改変を、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入することができる。可能な改変としては、分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド骨格内でのホスホジエステラーゼ結合ではなくむしろ、ホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルの使用が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、インビボにおいて単独でまたはベクターと結合させて送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸の、細胞への、好ましくはペリオスチンを発現している細胞への導入を促進することのできる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で得られるであろう分解度と比べて分解度を低減させつつ、核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明に有用なベクターとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組み込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源または細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられるがそれらに限定されない。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、これには、以下のウイルスに由来する核酸配列が含まれるがそれらに限定されない：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス。命名されていないが当技術分野において公知である他のベクターも容易に使用することができる。
【００６２】
好ましいウイルスベクターは、必須ではない遺伝子が対象の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスとしてはレトロウイルス（例えばレンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写、その後の宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験のために承認されている。最も有用なのは、複製欠損であるレトロウイルスである（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令できるが、感染性粒子は製造できない）。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボにおける遺伝子の高効率の形質導入のための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（外来性遺伝子材料をプラスミドに組み込む工程、パッケージング細胞株をプラスミドでトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株により組換えレトロウイルスを産生する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、および標的細胞をウイルス粒子で感染させる工程を含む）は、KRIEGLER (A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990)およびMURRY ("Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991)に提供される。
【００６３】
特定の適用のための好ましいウイルスは、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスであり、これらは遺伝子療法のヒトへの使用にすでに承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスを、複製欠損となるように工学操作することができ、多種多様な細胞型および細胞腫に感染させることができる。それはさらに、熱および脂質溶媒に対する安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い形質導入頻度；並びに、重複感染阻害がなく、従って、複数回の形質導入が可能となるなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを、ヒト細胞ＤＮＡに部位特異的に組み込むことができ、これにより、レトロウイルス感染に特徴的な挿入突然変異および挿入遺伝子発現のばらつきの可能性が最小限となる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００回を超える継代におよび組織培養中で続けられ、このことは、アデノ随伴ウイルスゲノム組込みが、相対的に安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外で機能することができる。
【００６４】
他のベクターはプラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において幅広く記載されており、当業者には周知である。例えば、SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。過去数年間において、プラスミドベクターは、抗原をコードする遺伝子をインビボで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。それらは、多くのウイルスベクターと同じ安全性の懸念を有さないために、ワクチンに特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性であるプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内に作動可能にコードされた遺伝子からのペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは当業者には周知である。さらに、プラスミドは、制限酵素およびライゲーション反応を使用してカスタム設計され、これにより、特定のＤＮＡフラグメントを除去および付加することができる。プラスミドは、多種多様な非経口、粘膜、および局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、または他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔内スプレーまたは液滴、直腸坐剤によっておよび経口的に投与され得る。それはまた、表皮または粘膜表面に遺伝子銃を使用して投与され得る。プラスミドは、水溶液中で与えられ得るか、金粒子上に乾燥させ得るか、または別のＤＮＡ送達システム（リポソーム、デンドリマー、コクリエートおよびマイクロカプセル封入を含むがそれらに限定されない）と組み合わせ得る。
【００６５】
本発明はさらに、腎線維症を予防または低減させるためのペリオスチン遺伝子発現阻害剤に関する。
【００６６】
本発明の別の目的は、抗体、アプタマー、小有機分子およびポリペプチドからなる群より選択されるペリオスチンに結合する少なくとも１つの薬剤またはペリオスチン遺伝子発現阻害剤の治療有効量をそれを必要とする被験体に投与する工程を含む、ＣＫＤの予防または処置のための方法に関する。
【００６７】
本発明の別の目的は、抗体、アプタマー、小有機分子およびポリペプチドからなる群より選択されるペリオスチンに結合する少なくとも１つの薬剤またはペリオスチン遺伝子発現阻害剤の治療有効量をそれを必要とする被験体に投与する工程を含む、腎線維症を予防または低減させるための方法に関する。
【００６８】
上記されているような薬剤またはペリオスチン遺伝子発現阻害剤の「治療有効量」によって、ＣＫＤを予防または処置するのに十分な量の薬剤または阻害剤を意味する。しかしながら、本発明の化合物および組成物の全１日量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されると理解される。任意の特定の被験体のための具体的な治療有効投与量レベルは、処置される疾患および疾患の重度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物；被験体の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、および排泄速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；並びに、医学分野において周知の同様な因子を含む、多種多様な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされる用量よりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで次第に用量を増加させることは十分に当技術分野の技能範囲内である。しかしながら、当該生成物の１日量は、１日あたり１人の成人あたり０．０１〜１，０００mgまで幅広い範囲で変化し得る。好ましくは、前記組成物は、処置しようとする被験体への投与量の症候による調整のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgの活性成分を含む。医薬品は、典型的には、約０．０１〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含む。有効量の薬物は、通常、１日あたり０．０００２mg/kgから約２０mg/kg（体重）、特に１日あたり約０．００１mg/kgから７mg/kg（体重）の投与量レベルで供給される。
【００６９】
本発明のペリオスチンに結合する薬剤またはペリオスチン遺伝子発現阻害剤を、薬学的に許容される賦形剤、および場合により徐放性マトリックス、例えば生分解性ポリマーと合わせて、治療組成物を形成し得る。
【００７０】
従って、本発明は、本発明による薬剤または阻害剤および薬学的に許容される担体を含む、ＣＫＤの予防または処置に使用するための薬学的組成物に関する。
【００７１】
本発明はまた、本発明による薬剤または阻害剤および薬学的に許容される担体を含む、腎線維症の予防または低減のための薬学的組成物に関する。
【００７２】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」は、適宜哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生じない、分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意の種類の無毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入材料または製剤化助剤を指す。
【００７３】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与のための本発明の薬学的組成物において、活性成分を単独でまたは別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口懸濁剤または液剤、舌下および頬側投与剤形、エアゾール剤、インプラント剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内および鼻腔内投与剤形並びに直腸投与剤形を含む。
【００７４】
好ましくは、薬学的組成物は、注射することのできる製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張性で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなどまたはこのような塩の混合物）、または乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物（これは場合に応じて、滅菌水または生理食塩水が添加されると、注射液の構成が可能となる）であり得る。
【００７５】
注射使用に適した剤形は、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射液または分散液の即時調製のための無菌散剤を含む。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジで容易に扱える程度まで流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防御されていなければならない。
【００７６】
本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容される塩として含む溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中および油中で調製することができる。通常の保存および使用の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００７７】
本発明のペリオスチンに結合する薬剤またはペリオスチン遺伝子発現阻害剤は、中性形または塩の形態の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が挙げられ、これは無機酸（例えば塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と形成されている。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。
【００７８】
担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えばレシチンの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらされ得る。
【００７９】
無菌注射液は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された種々の他の成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的には、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本分散媒体および上記に列挙された成分の中の必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌散剤の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が、以前に滅菌ろ過されたその溶液から得られる。
【００８０】
製剤化されると、液剤は、投与製剤と適合性の様式で治療的に有効な量で投与される。製剤は、上記した注射液の種類などの多種多様な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用され得る。
【００８１】
水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤をまず、十分な食塩水またはブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示を鑑みて当業者には公知であろう。例えば、１用量を１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し得、１０００mlの皮下点滴液に加え得るか、または提案された点滴部位に注入し得る。投与量の幾分の変更が、処置される被験体の病態に依存して必然的に行なわれるだろう。投与責任者が、いずれの事象においても、個々の被験体に対する適切な投与量を決定するだろう。
【００８２】
本発明のペリオスチンに結合する薬剤またはペリオスチン遺伝子発現阻害剤は、治療混合物内で、１用量あたり約０．０００１〜１．０mg、または約０．００１〜０．１mg、または約０．１〜１．０、またはさらには約１０mgを含むように製剤化され得る。複数の投与量を投与することもできる。
【００８３】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤形は、例えば錠剤または経口投与用の他の固形剤；リポソーム製剤；徐放性カプセル；および現在使用されている任意の他の剤形を含む。
【００８４】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例および図面は、いずれにしても本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】ペリオスチンの発現が、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）後のマウス腎皮質において高度に誘導されている。Ａ．ペリオスチンのｍＲＮＡ；Ｂ．ペリオスチンタンパク質。
【図１Ｂ】ペリオスチンの発現が、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）後のマウス腎皮質において高度に誘導されている。Ａ．ペリオスチンのｍＲＮＡ；Ｂ．ペリオスチンタンパク質。
【図２Ａ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯによって誘発される典型的な構造的変化から防御される。Ａ．尿細管の拡張；Ｂ．線維症；Ｃ．線維性コラーゲン蓄積（シリウスレッドによる染色）、およびＤ．コラーゲンＩＩＩｍＲＮＡ発現。
【図２Ｂ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯによって誘発される典型的な構造的変化から防御される。Ａ．尿細管の拡張；Ｂ．線維症；Ｃ．線維性コラーゲン蓄積（シリウスレッドによる染色）、およびＤ．コラーゲンＩＩＩｍＲＮＡ発現。
【図２Ｃ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯによって誘発される典型的な構造的変化から防御される。Ａ．尿細管の拡張；Ｂ．線維症；Ｃ．線維性コラーゲン蓄積（シリウスレッドによる染色）、およびＤ．コラーゲンＩＩＩｍＲＮＡ発現。
【図２Ｄ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯによって誘発される典型的な構造的変化から防御される。Ａ．尿細管の拡張；Ｂ．線維症；Ｃ．線維性コラーゲン蓄積（シリウスレッドによる染色）、およびＤ．コラーゲンＩＩＩｍＲＮＡ発現。
【図３Ａ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯ後により良好な腎実質保存度を示す。Ａ．尿細管の保存（ビメンチンＲＮＡ発現）；Ｂ．細胞増殖（Ｋｉ６７免疫染色）；Ｃ．アポトーシス。
【図３Ｂ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯ後により良好な腎実質保存度を示す。Ａ．尿細管の保存（ビメンチンＲＮＡ発現）；Ｂ．細胞増殖（Ｋｉ６７免疫染色）；Ｃ．アポトーシス。
【図３Ｃ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯ後により良好な腎実質保存度を示す。Ａ．尿細管の保存（ビメンチンＲＮＡ発現）；Ｂ．細胞増殖（Ｋｉ６７免疫染色）；Ｃ．アポトーシス。
【図４Ａ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯ後に鈍い炎症応答を有する。Ａ．ＭＣＰ−１ＲＮＡ発現；Ｂ．ＩＬ−１７ＲＮＡ発現；Ｃ．Ｆｏｘｐ３ＲＮＡ発現；Ｄ．ＲＯＲδＴ ＲＮＡ発現。
【図４Ｂ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯ後に鈍い炎症応答を有する。Ａ．ＭＣＰ−１ＲＮＡ発現；Ｂ．ＩＬ−１７ＲＮＡ発現；Ｃ．Ｆｏｘｐ３ＲＮＡ発現；Ｄ．ＲＯＲδＴ ＲＮＡ発現。
【図４Ｃ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯ後に鈍い炎症応答を有する。Ａ．ＭＣＰ−１ＲＮＡ発現；Ｂ．ＩＬ−１７ＲＮＡ発現；Ｃ．Ｆｏｘｐ３ＲＮＡ発現；Ｄ．ＲＯＲδＴ ＲＮＡ発現。
【図４Ｄ】ペリオスチン発現を欠失したマウスは、ＵＵＯ後に鈍い炎症応答を有する。Ａ．ＭＣＰ−１ＲＮＡ発現；Ｂ．ＩＬ−１７ＲＮＡ発現；Ｃ．Ｆｏｘｐ３ＲＮＡ発現；Ｄ．ＲＯＲδＴ ＲＮＡ発現。
【図５】インビボでの特異的ＯＤＮアンチセンス送達は、高血圧（Ｌ−ＮＡＭＥモデル）ラットの腎においてペリオスチンの発現を減少させる。
【図６Ａ】特異的なペリオスチンアンチセンスＯＤＮのインビボでの投与は、ラットの高血圧腎症で観察される典型的な構造的変化を鈍らせた。Ａ．尿細管の拡張；Ｂ．糸球体硬化症；Ｃ．血管肥大；Ｄ．線維症。
【図６Ｂ】特異的なペリオスチンアンチセンスＯＤＮのインビボでの投与は、ラットの高血圧腎症で観察される典型的な構造的変化を鈍らせた。Ａ．尿細管の拡張；Ｂ．糸球体硬化症；Ｃ．血管肥大；Ｄ．線維症。
【図６Ｃ】特異的なペリオスチンアンチセンスＯＤＮのインビボでの投与は、ラットの高血圧腎症で観察される典型的な構造的変化を鈍らせた。Ａ．尿細管の拡張；Ｂ．糸球体硬化症；Ｃ．血管肥大；Ｄ．線維症。
【図６Ｄ】特異的なペリオスチンアンチセンスＯＤＮのインビボでの投与は、ラットの高血圧腎症で観察される典型的な構造的変化を鈍らせた。Ａ．尿細管の拡張；Ｂ．糸球体硬化症；Ｃ．血管肥大；Ｄ．線維症。
【図７】タンパク尿が２ｇを超えている高血圧症ラットへの特異的ペリオスチンアンチセンスＯＤＮの投与は、実質的に死亡率を減少させた。
【００８６】
実施例：ＣＫＤの発症に関与する細胞外タンパク質であるペリオスチン
実施例１：ペリオスチンＫＯマウスは、実験的尿細管間質性腎症（ＵＵＯモデル）においてＣＫＤの発症から防御される。
材料および方法
動物：実験を、親切にもS.J. Conway (Indianapolis, Indiana)によって寄贈された野生型およびペリオスチンヌルマウス（ＰＯＳＴＮ ＫＯ）に対して実施した。これらのマウスは、ペリオスチン遺伝子の欠失、並びに、翻訳開始部位および最初のエキソンがｌａｃＺレポーター遺伝子（ｒｅｆ）によって置換されていることによって特徴付けられる。４〜６か月齢のＣ５７ＢＬ／６ＷＴおよびＰＯＳＴＮ ＫＯ雌マウスを使用した（ｎ＝９）。尿細管間質性腎症モデルは、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）によって誘発された。全身麻酔の導入後（ペントバルビタール５０mg/kgを腹腔内注射）、ＰＯＳＴＮ ＫＯマウスおよびＷＴ対応物の左側腹部を切開した。ＵＵＯは、二重の絹による縫合を使用して、腎盂尿管移行部における左尿管の完全結紮によって実施された。反対側の腎臓を対照として使用した。マウスを１５日目に屠殺した。
【００８７】
動物を、プロトコールの間、標準的な固形飼料および水道水に自由に近づけるように維持した。それらを全身麻酔（ペントバルビタール１５０mg/kg）下で屠殺した。腎臓を取り出し、４等分に分割した（ＲＮＡ、タンパク質、凍結切片およびパラフィン切片のために）。全ての手順は、実験動物の管理と使用に関する欧州連合指針に従い、地域倫理委員会により承認された。
【００８８】
腎の組織学的検査：腎臓をアルコール−ホルマリン−酢酸（ＡＦＡ）に２４時間浸し、パラフィンワックスに包埋し、その後、切片化した。組織を４μmの切片に切り出し、マッソントリクロームで染色した。スライドを、尿細管の拡張、血管周囲線維化（マウスおよびラットについて）、糸球体硬化症および血管肥大（ラットについて）のレベルに関して、以前に記載されているような０〜４の損傷尺度を使用して盲検的に独立して検査した。平均値を使用して動物群を比較した。
【００８９】
シリウスレッド：間質性線維症を、厚さ４μmのシリウスレッドで染色されたパラフィン切片上で４０倍の拡大率で偏光下で評価した。小葉間動脈を除く５つの皮質領を各腎臓から無作為に選択し、間質性線維症を反映する、全領域あたりの赤色に染色された領域を、コンピューターをベースとした形態計測分析ソフトウェア（Axionplan, Axiophot2, Zeiss, Germany）を使用して定量した。スコアリングは、番号付けされたスライド上で盲検的に実施された。データは、検査された陽性領域の比率の平均値として表現される。
【００９０】
ＩＨＣ：ペリオスチンについての染色を、５μmの凍結切片上で実施した。切片をモノクローナルラット抗マウスペリオスチン抗体（R&D Systems, 1/1000）と共に３７℃で１時間インキュベーションした。増殖、Ｔリンパ球およびマクロファージを染色するために、５μmのパラフィン包埋腎切片を脱脂し、９８℃のクエン酸溶液（ｐＨ６）中で３０分間加熱し、それぞれＫｉ６７（ポリクローナルウサギ抗体、Abcam、1/1000）、ＣＤ３（マウス抗ヒト抗体、Dako 1/200）、Ｆ４／８０（モノクローナルラット抗マウス抗体、AbD Serotec、1/200）と共にインキュベーションした。
【００９１】
二次抗体はN-Histofineキット(Nichirei Biochemicals, Japan)のものである。それらを室温で３０分間インキュベーションした。染色は、ＡＥＣ（Dako）を適用することによって明らかとし、ヘマトキシリンＱＳ（Vector, Burlingame, CA）を用いて対比染色し、永久標本用マウンティングメディア（Innovex）を用いて仕上げた。
【００９２】
β−ｇａｌ染色：β−ｇａｌ染色は、JS. Duffield et al.によって記載された。組織を、４％ＰＦＡを用いて４℃で１時間かけて固定し、１８％ショ糖を含むＰＢＳに移して一晩置き（４℃）、その後−８０℃で保存した。５μmの切片を切り出し、ＰＢＳ中で１０分間かけて洗浄し、遮断緩衝液（１mMのＭｇＣｌ２、０．０１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．０２％のＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０、および５mMのＥＧＴＡのＰＢＳ溶液）中で２０分間かけて室温でインキュベーションし、Ｘ−ｇａｌ混合物［１mMのＭｇＣｌ２、０．０１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．０２％のＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０、５mMのＥＧＴＡ、５mMのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５mMのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６・３Ｈ２Ｏ、および１μgのＸ−ｇａｌ；全てinvivogen製］中でインキュベーションし、注意を払って、中性ｐＨでＸ−ｇａｌ染色を実施し、インキュベーションを３７℃で１６時間行なった。５分間のＰＢＳによる洗浄後、切片をエオシン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用いて対比染色し、固定した。
【００９３】
インサイツにおけるアポトーシス細胞の検出のための末端標識：アポトーシス細胞を検出するために、ＡＦＡ中で固定しパラフィンに包埋した５μmの組織切片を、製造業者の指示に従って、ApopTag Plusペルオキシダーゼキット(Qbiogen, France S7101-KIT)を使用してＴＵＮＥＬアッセイによって染色した。各腎臓切片について、全皮質領域を、４０倍の拡大率で分析した。拡大した視野による染色されたアポトーシス細胞の数を手作業で計数し、平均値を使用して動物を比較した。
【００９４】
ＰＣＲ：本発明者らは、ＴＲＩｚｏｌ溶液（Life Technologies BRL, Gaithersburg, MD）を使用して腎皮質からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの品質を、２６０および２８０nmにおける光学密度の比を測定することによって確認し、残留ゲノムＤＮＡを３７℃で３０分間かけてのＤＮａｓｅＩによる処理によって除去した（Fermentas）。本発明者らは、１μgのＲＮＡをｃＤＮＡに変換するために、Revert Aid H minus First Strand DNA合成キット(Fermentas)を用いての逆転写を使用した。トランスクリプトーム分析をRT2Profiler PCR Array (Superarray, Bioscience Corp, Tebu Bio, Le Perray en Yvelines, France)を用いて実施した。ｃＤＮＡをLightCycler 480 (Roche Diagnostic)を使用して、ＳＹＢＲグリーン（Fast Start DNA Master SYBRGreen I; Roche Applied Science, Roche Diagnostic）、選択されたｍＲＮＡおよび６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２（ＲＰＬ３２）ハウスキーピング遺伝子のための特異的プライマーを使用して以下の条件下（９５℃で５分間、９５℃で１５秒間および６０℃で１５秒間を４５サイクル、その後、７２℃で１５秒間）でＰＣＲによって増幅させた。特異的なプライマーは、Universal Probe Library system (UPL, Roche Applied Science)によって設計された。ｑＲＴ−ＰＣＲの結果を標準化するために、本発明者らは、Roche LightCycler 2.0ソフトウェア（Roche Diagnostics）を使用した。本発明者らは２−ΔＣｐとして結果を表現し、Ｃｐはサイクル閾値数である。本発明者らは、全てのアンプリコンについて各々実行した後の解離曲線を分析して、ＳＹＢＲグリーンを使用した場合の定量化の特異性を評価した。
【００９５】
ウェスタンブロット分析：タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤混液の補充されたＲＩＰＡ緩衝液（Sigma-Aldrich）を使用して腎皮質から抽出した。ＳＤＳ試料緩衝液中に希釈した２０μgのタンパク質を７０℃で１０分間加熱し、４〜１５％のトリスＨＣＬゲル上で分離し、その後、ＰＶＤＦメンブラン（Thermo Scientific）に転写した。１×ＰＢＳ、５％ミルク（thermoscientific）中で室温で２時間かけて遮断した後、メンブランを一次抗体（ペリオスチン、Ｅ−カドヘリン）と共に４℃で一晩インキュベーションし、洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションさせた二次抗体（(SouthernBiotechまたはVector）と共に室温で２時間インキュベーションした。タンパク質バンドを、高感度supersignal（登録商標）west picochemiluminescent試薬を使用して製造業者（Thermoscientific）の指示に従って可視化し、濃度測定計（Chemicapt, Fisher Bioblock scientific）を使用して定量した。
【００９６】
統計：統計分析をＡＮＯＶＡを使用して実施し、その後、制約付き最小有意差フィッシャー検定（Statviewソフトウェア）によって実施した。ｐ＜０．０５の結果を統計学的に有意と判断した。全ての数値は平均値±ＳＥＭである。
【００９７】
結果
ペリオスチンの発現はＵＵＯ後に誘導される：ＲＴ−ｑＰＣＲによって調べられたペリオスチンのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、対照腎においてはペリオスチンの非常に低いベースライン発現を示す。この発現は、閉塞から１５日後に５０倍にアップレギュレーションされる（図１Ａ）。この所見は、対照腎において全くペリオスチンを示さず、ＵＵＯから５日後および１５日後に腎ペリオスチンの有意な誘導を示したイムノブロットによって確認される（図１Ｂ）。ペリオスチンの出現および場所を追跡するために、本発明者らは、ＵＵＯから２日後、５日後および１５日後のＫＯマウスにおけるβ−ガラクトシダーゼ染色、並びに、対応するＷＴについての免疫染色を実施した。β−ガラクトシダーゼおよびペリオスチン染色は、全ての対照腎において検出されなかった。ＵＵＯの後、β−ガラクトシダーゼは、ペリオスチンの発現が集合尿細管上皮細胞（２日目）、その後、尿細管上皮細胞（５日目、１５日目）および間質細胞（１５日目）に開始されることを示す。免疫組織化学的検査は、髄質に始まり（２日目）、皮質に広がる（５日目、１５日目）ペリオスチンについての間質染色を示す。要するに、このデータは、ペリオスチン発現がＵＵＯによって誘導され、損傷の進行と相関することを実証する。
【００９８】
ペリオスチンヌルマウスは、ＵＵＯによって誘発された尿細管拡張および線維症から防御される：腎組織学的検査の評価を、正常および閉塞した腎のマッソントリクローム染色によって評価した。ＵＵＯから１５日後、ＫＯマウスは、より少ない尿細管の拡張（図２Ａ）およびより少ない線維症を示す（図２Ｂ）。線維状コラーゲンの蓄積を強調するために、腎切片をシリウスレッドで染色し、形態計測分析により、ＫＯマウスがＷＴと比較してより少ない線維状コラーゲンを有していたことを証明した（図２Ｃ）。このデータは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって評価されたコラーゲンＩＩＩｍＲＮＡの発現によって確認された（図２Ｄ）。
【００９９】
ペリオスチンヌルマウスは、上皮尿細管細胞のより良好な保存を呈する：尿細管の拡張に関してＷＴマウスとＫＯマウスの間に観察された差異を解明するために、本発明者らは、細胞増殖（図３Ｂ）、尿細管の保存（図３Ａ）およびアポトーシス（図３Ｃ）を調べた。増殖はＫｉ６７免疫染色（増殖細胞マーカー）によって評価され；尿細管の保存は、ビメンチンＲＮＡ発現（間葉細胞マーカー）およびＥ−カドヘリンタンパク質レベル（上皮細胞接着分子）によって実証された。アポトーシスはＴＵＮＮＥＬによって評価された。１５日目に、上皮尿細管細胞は、ＷＴマウスと比較して、ＫＯマウスの閉塞腎においてより増殖している。ビメンチンＲＮＡレベルの増加は、ＷＴマウスについてのＥ−カドヘリンの減少と一致し、一方、ＫＯマウスは、ビメンチンのより少ない増加およびＥ−カドヘリンの維持を示した。逆に、アポトーシス細胞は、ＵＵＯの後にＷＴマウスおよびＫＯマウスにおいて同じように増加した。
【０１００】
ペリオスチンおよび炎症：閉塞性腎症は、尿細管の萎縮および間質性線維症を原因とする腎の炎症応答によって特徴付けられる。ＰＯＳＴＮ ＫＯマウスは、線維症および尿細管の損傷の点で防御されていたので、本発明者らは炎症を調べた。興味深いことに、ＵＵＯの後、ＲＴ−ｑＰＣＲは、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）のアップレギュレーションがＰＯＳＴＮ ＫＯマウスにおいては有意に鈍化したことを示した（図４Ａ）。しかしながら、ＩＬ−１７に関して（図４Ｂ）またはＲＯＲδＴ／Ｆｏｘｐ３発現に関して（図４Ｃおよび４Ｄ）、ＰＯＳＴＮ ＫＯマウスとＷＴマウスの間には有意差は全くなかった。マクロファージ浸潤はＩＨＣによって評価され、Ｆ４／８０＋細胞の差異はＵＵＯから１５日後も観察されなかった。
【０１０１】
実施例２：ペリオスチンアンチセンスオリゴヌクレオチドペリオスチンは、高血圧性腎症ラットモデル（Ｌ−ＮＡＭＥ処置ラット）の発症から防御する。
材料および方法
動物：体重２５０ｇの雄Sprague-Dawleyラットを、通常塩分の食餌で維持し、固形飼料および水に自由に近づけるようにした。高血圧性腎症モデルを誘発するために、ＮＯ合成阻害剤であるＬＮＡＭＥを、飲料水を介して３０mg/kg/日の用量で投与した。ペリオスチンの役割を調査するために、本発明者らは、その発現をダウンレギュレーションするためにアンチセンスアプローチを使用した。
【０１０２】
ペリオスチンに対するアンチセンス（ＡＳ）の投与：ペリオスチンの発現を遮断するために、本発明者らは、ホスホロチオエートを用いて修飾された特異的なＡＳオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を使用し、ヌクレアーゼによるインビボでのその加水分解を防いだ。ＡＳまたは混ぜた対照ＯＤＮを、腹腔内（ＩＰ、１μM）に予防的または治癒的のいずれかで投与した。予防的プロトコールにおいては、アンチセンスの注射はＬＮＡＭＥの投与と共に開始し、ラットを１９日目に屠殺した。しかしながら、治癒的プロトコールにおいては、アンチセンスの注射は、ＬＮＡＭＥの投与後に開始し、この時、ラットは１g/mmolのタンパク尿に達していた。ＬＮＡＭＥを維持したが、投与量は１５mg/kg/日まで減少させ、ラットをアンチセンスによる処置から１週間後に屠殺した。
【０１０３】
結果
図５に示されているように、インビボにおける特異的ＯＤＮアンチセンスの送達は、高血圧性（Ｌ−ＮＡＭＥモデル）ラットの腎におけるペリオスチンの発現を減少させる。図６に示されているように、インビボにおける特異的ペリオスチンアンチセンスＯＤＮの投与は、ラットの高血圧性腎症に観察される典型的な構造的変化（すなわち、尿細管の拡張、糸球体硬化症、血管肥大および線維症）を鈍化させた。さらに、図７に示されているように、タンパク尿が２ｇを超えた高血圧性ラットへの特異的ペリオスチンアンチセンスＯＤＮの投与は死亡率を実質的に減少させ、ＣＫＤの予防およびまた処置のためにペリオスチンを標的化（例えば、ペリオスチン遺伝子発現阻害剤によって、または抗ペリオスチン中和抗体もしくはアプタマーによって）する利点を実証する。
【０１０４】
結論：
本発明者らは、ペリオスチンが、先に記載されているような２つの明確に異なるモデルを使用することによって、腎線維症および腎におけるＥＣＭの過剰な蓄積の促進によるＣＫＤの発症に関与していることを示した。ペリオスチンに結合する薬剤（例えば抗ペリオスチン中和抗体またはアプタマー）およびペリオスチン遺伝子発現阻害剤が、腎線維症および腎におけるＥＣＭの過剰な蓄積を予防するのに有用であり、それ故、それを必要とする被験体におけるＣＫＤの予防または処置に有用であるという結果が得られる。
【０１０５】
参考文献：
本出願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
【表２】
0006293137.tif 000003
【図１Ａ】
0006293137.tif 000004
【図１Ｂ】
0006293137.tif 000005
【図２Ａ】
0006293137.tif 000006
【図２Ｂ】
0006293137.tif 000007
【図２Ｃ】
0006293137.tif 000008
【図２Ｄ】
0006293137.tif 000009
【図３Ａ】
0006293137.tif 000010
【図３Ｂ】
0006293137.tif 000011
【図３Ｃ】
0006293137.tif 000012
【図４Ａ】
0006293137.tif 000013
【図４Ｂ】
0006293137.tif 000014
【図４Ｃ】
0006293137.tif 000015
【図４Ｄ】
0006293137.tif 000016
【図５】
0006293137.tif 000017
【図６Ａ】
0006293137.tif 000018
【図６Ｂ】
0006293137.tif 000019
【図６Ｃ】
0006293137.tif 000020
【図６Ｄ】
0006293137.tif 000021
【図７】
0006293137.tif 000022
【配列表】
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