(57)【要約】本発明は、ミエリン疾患の治療のために、ＣＸＣ―ケモカインを介したシグナリングを標的とする組成物および方法に関する。本発明は、ＣＸＣケモカインシグナリングを調節するために有効な量の生物活性剤を投与するステップ含む、対象の神経障害の治療を目的とする方法を提供する。本方法は、中枢神経系（ＣＮＳ）の免疫浸潤を減少させ神経細胞の移動、増殖、および／または分化を増強しうる。いくつかの実施形態においては、神経障害は、多発性硬化症を含むがこれに限られない、脱髄状態である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ベースのアッセイで確認した場合に、他のＣＸＣレセプターに対してＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を介したシグナリングを選択的に阻害する、治療的に有効な量の生物活性剤を、必要とする対象に投与するステップを含む、神経障害を改善する方法。
【請求項２】
グリア細胞を、前記グリア細胞におけるＣＸＣＲを介したシグナリングを阻害する生物活性剤に接触させるステップを含む、グリア細胞遊走を促進する方法であり、前記生物活性剤に接触させないグリア細胞と比較して、前記遊走が増加する、方法。
【請求項３】
グリア細胞を、細胞ベースのアッセイで確認した場合に、他のＣＸＣレセプターに対してＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を介したシグナリングを選択的に阻害する、生物活性剤に接触させるステップを含む、グリア細胞増殖および／または分化を促進する方法であり、前記生物活性剤に接触させないグリア細胞と比較して、前記増殖および／または分化が増加する、方法。
【請求項４】
脱髄病変がみられる対象に生物活性剤を投与するステップを含む、再ミエリン化を促進する方法であり、前記生物活性剤が、ＣＸＣＲを介したシグナリングによるグリオーシスの減少に有効であり、これにより前記対象における再ミエリン化を促進する、方法。
【請求項５】
細胞ベースのアッセイで確認した場合に、他のＣＸＣレセプターに対してＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を介したシグナリングを選択的に阻害する、治療上有効な量の生物活性剤を、必要とする対象に投与するステップを含む、グリオーシスを改善する方法。
【請求項６】
前記神経障害が、多発性硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記他のＣＸＣレセプターが、ＣＸＣＲ３またはＣＸＣＲ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＸＣＲを介したシグナリングが、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を介したものである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記生物活性剤が、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２に直接結合する、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物活性剤が、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７、またはＣＸＣＬ８を不活性化する、請求項２または４に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物活性剤が、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２の活性を低下させる、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物活性剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、低分子またはペプチドミメティックである、請求項２または４に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物活性剤が、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃおよび図１１の化合物の群より選択される、請求項１、２、４、または５に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物活性剤が、ＧＦＡＰ、ビメンチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳＰＧ）、ケラタン硫酸プロテオグリカン（ＫＳＰＧ）、またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）の発現を低下させる、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１５】
前記グリア細胞が、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、シュワン、アストロサイト、ミクログリアおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２または３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（相互参照）
本願は、２００６年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／８４７，６５６号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／８４７，６５６号は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
（政府の支援による研究に関する声明）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈによる、Ｇｒａｎｔ番号ＮＳ３６６７４、ＮＳ４７９２８、およびＮＳ３２１５１の下で、米国合衆国政府の支援によりなされた。
（発明の背景）
多発性硬化症（ＭＳ）は、再発寛解型から慢性進行型の発現パターンまで様々な臨床症状を伴う、中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄疾患である。ＭＳの原因は不明であるが、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞反応が、ミエリンおよびオリゴデンドロサイトに対する炎症性損傷を媒介すると認められる。（Ｂｒｕｃｋ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２０６：１８１―１８５（２００３））。ＣＮＳ病変は、ミエリン損傷の病巣領域を有し、軸索障害、神経細胞損傷およびアストログリア瘢痕形成とも関連する。（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ等、Ｌａｎｃｅｔ．３５９：１２２１―１２３１（２００２））。臨床症状には、失明、麻痺、感覚障害、ならびに協調および認知障害をはじめとする、様々な神経学的機能不全が含まれる。
【０００２】
さらに、ミエリンへの障害または損傷は、伝導速度および神経細胞の軸索崩壊に対する脆弱性に重大な影響を有する。さらに、軸索消失と進行性の臨床的障害の間には相関関係があり、軸索の完全性の維持には完全なミエリンが重要である。（Ｄｕｂｏｉｓ―Ｄａｌｃｑ等、Ｎｅｕｒｏｎ．４８，９―１２（２００５））。ヒトＭＳの初期には、自発的再ミエリン化が生じうるが、病気の後期段階における持続的なＣＮＳ炎症およびミエリン修復の失敗により、最終的には永久的衰弱がもたらされる。再ミエリン化失敗の理由の一部には、１）オリゴデンドロサイトの生存不足、２）オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖不足、３）前駆細胞の病変部位への移動不能、および／または４）前駆細胞の、成熟ミエリン形成細胞への分化不能または露出軸索髄鞘化不能が含まれうる（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：７０５―７１４（２００２））。
【０００３】
成人オリゴデンドロサイト前駆細胞は、再ミエリン化を担うと一般に考えられ、したがって再ミエリン化の失敗は、ミエリン形成不能につながる、成熟オリゴデンドロサイト生成の不足と少なくとも部分的に関連する。ミエリン形成は、オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞を特に局在化するものを含む、複数のシグナルの調整に依存する（Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３−３８３（２００２）；Ｔｓａｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６：１９１３―ｓ１９２２（２００６））。例えば、脊髄オリゴデンドロサイトの正常な成長（Ｔｓａｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６：１９１３―１９２２（２００６））、適切な細胞数の制御（Ｂａｒｒｅｓ等、Ｃｅｌｌ  ７０：３１―４６（１９９２）；Ｃａｌｖｅｒ等、Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：８６９―８８２（１９９８））、およびオリゴデンドロサイトとその標的軸索の間の相互作用の媒介のために、Ｎｅｔｒｉｎ―１が必要とされる。（ＳｈｅｒｍａｎおよびＢｒｏｐｈｙ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：６８３―６９０（２００５））。オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）は、たくさんの樹枝状分枝を有し、成人ＣＮＳに遍在的に見られる（ＢａｕｍａｎｎおよびＰｈａｍ―Ｄｉｎｈ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１―９２７（２００１)）。さらに、ＯＰＣｓは、抗原マーカーＮＧ２およびＰＤＧＦＲαの発現によりｉｎ  ｖｉｖｏで、Ａ２Ｂ５発現によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴づけされうる。軸索萎縮が、臨床的結果の低下と強く相関することが、証拠から示唆される（例えば、軸索生存に対する脱髄の効果）。
【０００４】
ＭＳにおける障害を改善するために、再ミエリン化が、軸索伝導を回復し、露出軸索に生じうるさらなる軸索障害を防ごうとする。
【０００５】
増殖により、成長する軸索をミエリン化するために十分な細胞が提供されうる（ＢａｕｍａｎｎおよびＰｈａｍ―Ｄｉｎｈ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１―９２７（２００１））。さらに、白質の再ミエリン化されたエリアには、脱髄されていない白質よりもオリゴデンドロサイトの数が多く（Ｆｒａｎｋｌｉｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：７０５―７１４（２００２））、有効な再ミエリン化プロセスのために細胞動員が必要であることを示している。ＯＰＣｓは、イオンチャネルおよび神経伝達物質レセプターを発現するという事実だけでなく、アストロサイトおよびミクログリアと形態が類似するにもかかわらず、成人ＣＮＳにおける前駆細胞であると考えられるが、これらの細胞は、アストロサイトとは異なる機能および抗原特性を有することが示されている（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．３１：４３７―４５５（２００２））。さらに、ＯＰＣｓは、ミクログリアおよび神経細胞とは異なるようにみえる（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ等、Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ  １４：７７―８２（２００１））。ＯＰＣｓは、移動の増加と、正常および損傷ＣＮＳの両方における広範な移動後のオリゴデンドロサイトへの分化とによって、傷害に迅速に反応する能力を有する（ＢａｕｍａｎｎおよびＰｈａｍ―Ｄｉｎｈ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１―９２７（２００１）；ＰｏｌｉｔｏおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ、Ｊ．Ａｎａｔ．２０７：７０７―７１６（２００５））。
【０００６】
ＯＰＣｓは、ケモカインレセプターＣＸＣＲ２を発現する一方、そのリガンドのＣＸＣＬ１は、アストロサイト、ミクログリアおよび神経細胞のサブセットにより生産される。ＭＳプラークにおける再増殖および再ミエリン化は、成人ＯＰＣｓに通常依存し、ＣＸＣＲ２のシグナリングが、ＯＰＣ増殖および移動を調節しうる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ４８：８６４―８７４（２００１）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０４５７―１０４６３（１９９８）；Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３―３８３（２００２）；Ｗｕ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２６０９―２６１７（２０００））。
【０００７】
ケモカインまたは走化性因子サイトカインは、白血球の活性化因子および走化性因子として典型的に機能し（Ｃｏｕｇｈｌａｎ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９７：５９１―６００（２０００）；ＲａｎｓｏｈｏｆｆおよびＴａｎｉ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１５４―１５９（１９９８））、血管形成（Ｕｅｄａ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：５３４６―５３５３（２００６））、癒傷（Ｄｅｖａｌａｒａｊａ等、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１５：２３４―２４４（２０００））、および腫瘍化（Ｌｏｕｋｉｎｏｖａ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９４）：６３７―６４４（２００１）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ４８：８６４―７３４（２００１））を調節できる、分子量の小さい（約８―１０ＫＤａ）誘導可能な分泌分子のファミリーを含む（ＨｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒおよびＨｏｒｕｋ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．５：１３―２６（１９９９））。ケモカインの機能の知識のほとんどは、その免疫調整および炎症の制御との関連により、免疫系の研究から得られる。多くの他の生物系に関わる役割が、徐々に解明されている。
【０００８】
ケモカインは、アミノ末端に保存されたシステイン残基の数にしたがって、四つのサブファミリーに典型的に分類される（Ｎｏｍｉｙａｍａ等、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．２：１１０−１１３（２００１））。ほとんどのケモカインは、四つのシステイン残基を伴う二つの主要なサブファミリーにあてはまる。これらのサブファミリーは、二つのアミノ末端のシステイン残基の間のアミノ酸の有無にしたがって典型的に分類され、そのためＣＣおよびＣＸＣケモカインと呼ばれる（ＨｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒおよびＨｏｒｕｋ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．５：１３―２６（１９９９））。高等脊椎動物に典型的に限定されるＣＸＣケモカインは、第一システイン残基に隣接したアミノ末端上のグルタミン酸―リシン―アルギニン（ＥＬＲ）モチーフの有無に従って、さらに分類されるのが通常である。以前にＧｒｏ―αとして知られたＣＸＣＬ１は、好ましいレセプターがＣＸＣＲ２である、ＣＸＣケモカインのＥＬＲファミリーのメンバーである（Ｗａｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１０７１―１０７７（２００３））。
【０００９】
ＣＸＣＲ２等のケモカインレセプターは、百日咳毒素（ＰＴＸ）感受性のＧｉタンパク質に典型的に連結されたＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲｓ）である（Ｂａｊｅｔｔｏ等、Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２２：１４７―１８４（２００１））。ＣＸＣＲのＮ末端ドメインが、リガンド結合特異性を決定するために重要であると考えられる。ＣＸＣＲ２は、ＣＸＣケモカインのＥＬＲ陽性ファミリーの可溶性の分泌走化性サイトカインであるＣＸＣＬ１を結合し、それらの相互作用が、増殖、分化、および移動等のプロセスを調節する細胞内シグナルを活性化する（Ｂａｊｅｔｔｏ等、Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２２：１４７―１８４（２００１））；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６７：４５１―４６７（２００２）；Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３―３８３（２００２））。アクチン依存性細胞プロセスおよび接着分子発現の調整により、移動に変化が生じると考えられる（Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．９８：５７―６８（１９９９））。ＣＸＣＲ２は、血管系におけるリガンドの結合時に、一部の白血球の表面上の接着分子の発現を調節して、回転、接着、停止、および組織浸潤のための血管外漏出を許容する（Ｓｍｉｔｈ等、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８９：Ｈ１９７６―８４（２００５））。これは、ケモカインレセプターＣＸＣＲ２を発現する単球および好中球において一般に観察される。組織に入ったこれらの細胞は、典型的には走化により、ケモカインによって炎症部位へとさらに誘導される。
【００１０】
各ケモカインレセプターは、通常は単一クラスのケモカインを結合するが、同じクラスのいくつかのメンバーを高親和性で結合しうる（Ｈｏｒｕｋ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１２：３１３―３３５（２００１）；Ｈｏｒｕｋ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２８８２―２８９０（１９９７））。さらに、一つのケモカインが、いくつかの異なるケモカインレセプターを結合できる（Ｈｏｒｕｋ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１２：３１３―３３５（２００１））。例えばＣＸＣＲ２は、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、およびＣＸＣＬ８を結合できる（ＭｉｌｌｅｒおよびＭｅｕｃｃｉ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：４７１―４７９（１９９９））。
【００１１】
ＣＸＣケモカインおよびそのレセプターは、脊椎動物のＣＮＳに発現されることが現在知られている（ＴｒａｎおよびＭｉｌｌｅｒ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：４４４―４５５（２００３））。ケモカインおよびケモカインレセプターは、白血球および他の免疫系の細胞の活性化因子および走化性因子として、最初に特徴付けされた。（ＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＬｏｌｉｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４２：４６９―４９９（２００２））。例えば、ＣＸＣＬ１ケモカインレセプターのＣＸＣＲ２は、神経細胞（ＣｈｏおよびＭｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．８：５７３―８４（２００２）；Ｃｏｕｇｈｌａｎ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９７：５９１―６００（２０００））、アストロサイト（Ｆｌｙｎｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：８４―９３（２００３））、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）（ＮｇｕｙｅｎおよびＳｔａｎｇｅｌ、Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２８：７７―８１（２００１））のサブセットに発現される。
【００１２】
ＣＮＳでは、神経細胞（Ｂａｊｅｔｔｏ等、２００１）；アストロサイト（Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ等、Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：２７９―２９０（２００３）；Ｆｌｙｎｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：８４―９３（２００３）；)、オリゴデンドロサイト（Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ等、Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：２７９―２９０（２００３）；Ｋａｄｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１３３―１４６（２００６）；Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３−３８３（２００２）；Ｗｕ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２６０９―２６１７（２０００））、およびミクログリア（Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃ等、Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：２７９―２９０（２００３）；Ｆｌｙｎｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：８４―９３（２００３）；)において、生理学的条件下で、機能的ケモカインレセプターの発現が示されている。ケモカインシグナリングは、免疫系およびＣＮＳの両方において、成長過程および病変後の細胞の移動、増殖、分化、および活性化を制御できる（非特許文献１）。しかし、ＣＸＣケモカインファミリーの祖先の系統発生学的役割は、免疫系ではなく神経系に存在することが報告されている（非特許文献２）。
【００１３】
さらに、ＣＮＳにおける通常の成長過程および病変プロセスにおける、いくつかのケモカインおよびＣＸＣＲ２（ＣＸＣＬ１―３、５―８を結合）等のそのレセプターの役割が、より広く研究されはじめている（Ｃｏｕｇｈｌａｎ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９７：５９１―６００（２０００）Ｆｌｙｎｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：８４―９３（２００３）；Ｏｍａｒｉ等、Ｇｌｉａ  ５３（１）：２４―３１（２００５））、ＣＸＣＲ３（ＣＸＣＬ９―１１を結合）（Ｃｏｕｇｈｌａｎ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９７：５９１―６００（２０００）；Ｆｌｙｎｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：８４―９３（２００３）；Ｏｍａｒｉ等、Ｂｒａｉｎ  １２８））、ＣＣＲ３（ＣＣＬ５，７，８，１１，１３，１５，２４，２６，２８を結合）（Ｃｏｕｇｈｌａｎ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９７：５９１―６００（２０００）；Ｆｌｙｎｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：８４―９３（２００３）；ＸｉａおよびＨｙｍａｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．５：３２―４１（１９９９））およびＣＸＣＲ４（ＣＸＣＬ１２を結合）（Ｆｌｙｎｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：８４―９３（２００３）Ｌｉｅｂｅｒａｍ等、Ｎｅｕｒｏｎ  ４７：６６７―６７９（２００５））。例えば、アストロサイトおよびミクログリアは、ＣＸＣＲ３を発現する（ＭｉｌｌｅｒおよびＭｅｕｃｃｉ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：４７１―４７９（１９９９））。ＣＸＣＲ３のリガンド、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０（ＭｉｌｌｅｒおよびＭｅｕｃｃｉ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：４７１―４７９（１９９９））が、脳損傷後にアップレギュレートされ、これらの細胞の走化を誘導する（Ｂｉｂｅｒ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１１２：４８７―４９７（２００２））。ＣＸＣＲ４シグナリングは、網膜成長円錐誘導  (Ｃｈａｌａｓａｎｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：１３６０―１３７１（２００３）)、哺乳類の運動軸索経路探索（Ｌｉｅｂｅｒａｍ等、Ｎｅｕｒｏｎ  ４７：６６７―６７９（２００５））、感覚神経前駆細胞の移動（Ｂｅｌｍａｄａｎｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：３９９５―４００３（２００５））、および四肢神経支配（Ｏｄｅｍｉｓ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：４９４―５０５（２００５））に重要である。ＣＸＣＲ４のリガンドＳＤＦ―１／ＣＸＣＬ１２による活性化は、神経前駆細胞をＣＮＳ内の損傷部位に誘導しうる（非特許文献３）。これらの神経前駆細胞は、神経細胞、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトを生み出しうる（非特許文献４）。
【００１４】
さらに、ＭＳにおける脱髄領域周辺のアストロサイトおよび血管において、ＣＸＣＬ１２がアップレギュレートされ、血液脳関門を通る免疫細胞浸潤を調節する役割をはたしうる（非特許文献５）。ＣＸＣＲ２は、脳および脊髄の投射神経細胞に発現され（Ｈｏｒｕｋ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２８８２―２８９０（１９９７））、その活性化が、海馬神経細胞の生存を高めることが示されている。アルツハイマー病においては、アミロイドβ前駆体タンパク質と共存して老人斑周辺にも発現され（ＸｉａおよびＨｙｍａｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．５：３２―４１（１９９９））、ラットの実験的な閉鎖性頭部外傷の後には、その発現が、そのリガンドＣＸＣＬ１の発現とともにアップレギュレートされる（Ｖａｌｌｅｓ等、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２２：３１２―３２２（２００６））。最後に、ＣＸＣＬ１は、ＣＮＳの発達中に、オリゴデンドロサイトの反応を調節することが示されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０４５７―１０４６３（１９９８）；Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３―３８３（２００２））。神経系発達および病変におけるケモカインの役割は広く研究されているが、免疫系におけるそれらの役割と比較して、今も比較的ほとんど知られていないため、研究が必要である。
【００１５】
ＯＰＣｓは、ケモカインレセプターＣＸＣＲ２を発現し、したがってＣＸＣＬ１に結合および応答しうる。マウスの初期生後発達の間には、ＣＸＣＬ１が、ＰＤＧＦ誘導性の増殖を増強し、ＯＰＣｓの移動を減少させうる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０４５７―１０４６３（１９９８）；Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３―３８３（２００２））。アストロサイトで分泌されたＣＸＣＬ１に応答したＣＸＣＲ２シグナリングが、ＯＰＣｓを予定白質に配置するのを助ける。それは、ＰＤＧＦに対する応答も局所的に調節し、成長する軸索を良好にミエリン化するために適切なオリゴデンドロサイトの数が達成されるように、ＯＰＣｓの増殖反応を強める（Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３―３８３（２００２））。
【００１６】
ＣＮＳおよび末梢神経系に関して多くの研究がなされているにもかかわらず、脱髄を含む神経障害の治療法を開発する必要が少なからず残る。本発明は、ケモカインを介したシグナリングを標的とすることにより、神経障害を治療するための方法を目的とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｋａｄｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１３３―１４６（２００６）
【非特許文献２】Ｈｕｉｓｉｎｇ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：３０７―３１３（２００３）
【非特許文献３】Ｉｍｉｔｏｌａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１８１１７―１８１２２（２００４）
【非特許文献４】Ｎｉ等、Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１５２：１５９―１６９（２００４）
【非特許文献５】Ｋｒｕｍｂｈｏｌｚ等、Ｂｒａｉｎ  １２９：２００―２１１（２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ＣＸＣケモカインシグナリングを調節するために有効な量の生物活性剤を投与するステップ含む、対象の神経障害の治療を目的とする方法を提供する。本方法は、中枢神経系（ＣＮＳ）の免疫浸潤を減少させ神経細胞の移動、増殖、および／または分化を増強しうる。
【００１９】
本発明の一態様においては、本発明は、細胞ベースのアッセイにおいて確認した場合に、他のＣＸＣレセプターに対してＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を介したシグナリングを選択的に阻害する生物活性剤を治療上有効な量、必要な対象に投与するステップを含む、神経障害を改善する方法を提供する。いくつかの実施形態においては、神経障害は、多発性硬化症を含むがこれに限られない、脱髄状態である。
【００２０】
さらに別の態様においては、本発明は、グリア細胞を、グリア細胞におけるＣＸＣＲを介したシグナリングを阻害する生物活性剤に接触させるステップを含む、グリア細胞移動を促進する方法であり、当該移動が、生物活性剤と接触させないグリア細胞と比較して増加する、方法を提供する。脱髄病変がみられる対象に生物活性剤を投与するステップを含む、再ミエリン化を促進する方法であり、生物活性剤が、ＣＸＣＲを介したシグナリングによるグリオーシスを抑制するのに有効であり、これにより対象における再ミエリン化を促進する、方法が、さらに提供される。いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲを介したシグナリングは、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を介したものである。
【００２１】
本発明においては、細胞ベースのアッセイにおいて確認した場合に、グリア細胞を、他のＣＸＣレセプターに対してＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を介したシグナリングを選択的に阻害する生物活性剤に接触させるステップを含む、グリア細胞の増殖および／または分化を促進する方法であり、増殖および／または分化が、生物活性剤と接触させないグリア細胞と比較して増加する、方法も提供される。別の態様では、本発明は、細胞ベースのアッセイにおいて確認した場合に、他のＣＸＣレセプターに対してＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を介したシグナリングを選択的に阻害する生物活性剤を治療上有効な量、必要な対象に投与するステップを含む、グリオーシスを改善する方法を提供する。いくつかの実施形態においては、他のＣＸＣレセプターは、ＣＸＣＲ３またはＣＸＣＲ４である。
【００２２】
本発明の別の態様では、生物活性剤は、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２に直接結合する。いくつかの実施形態においては、生物活性剤は、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７、またはＣＸＣＬ８を不活性化する。さらに他の実施形態においては、生物活性剤は、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２の活性を低下させる。
【００２３】
いくつかの実施形態においては、生物活性剤には、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、低分子またはペプチドミメティックが含まれるがこれに限定されない。様々な実施形態において、生物活性剤は、図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１１の化合物の群より選択される。
【００２４】
さらに別の態様においては、生物活性剤は、ＧＦＡＰ、ビメンチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳＰＧ）、ケラタン硫酸プロテオグリカン（ＫＳＰＧ）、またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）の発現を低下させうる。
【００２５】
さらに、本発明のグリア細胞は、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、シュワン、アストロサイト、ミクログリアおよびこれらの組み合わせからなる群より選択されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Ｃｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋マウスにおけるオリゴデンドロサイト系統細胞密度の領域差：（Ａ）ＷＴの性別をマッチさせた同腹仔と比較すると、Ｃｘｃｒ２−／−マウス全体が、ＣＮＳにおけるＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ発現強度の低下を示す。この強度低下は、ＣＮＳの領域間で異なったオリゴデンドロサイト系統細胞の数の減少と相関がなかった。（Ｂ，Ｃ）皮質および前交連の、ＥＧＦＰ＋細胞密度が低下した一方で、脊髄および脳梁は、増加したＥＧＦＰ＋細胞密度を含んだ。海馬（ＨＣ）または小脳（ＣＢ）においては、有意差は認められなかった。（Ｄ）ＷＴ（上）およびＣｘｃｒ２−／−（下）の脊髄の後索、脳梁、および前交連からの、ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋細胞のマッチング画像。Ｃｘｃｒ２−／−の脊髄後索におけるＥＧＦＰ＋細胞の数が多く、前交連における数が少ないことに留意せよ。データは、少なくとも３匹のＣｘｃｒ２−／−および３匹のＣｘｃｒ２＋／＋成体マウス（≧６週）からの、平均値＋／−２＊ＳＥＭとしてプロットされる。一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ値が決定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。目盛尺＝Ａでは１ｍｍ、Ｄでは１００μｍ。
【図２】Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおけるＮＧ２＋細胞の密度および突起樹枝状分枝の増加：（Ａ）Ｃｘｃｒ２−／−マウスの脊髄は、ＷＴよりも軟膜表面に集中した、ＮＧ２＋細胞の数が増加している。（Ｂ）Ｃｘｃｒ２−／−動物におけるＮＧ２＋細胞は、ＷＴマウスよりも強いＮＧ２の発現を伴う、より多くの突起を有する。（Ｃ）Ｃｘｃｒ２−／−の脊髄は、ＮＧ２＋細胞の密度が平均２２％増加している。データは、少なくとも３匹のＣｘｃｒ２−／−および３匹のＣｘｃｒ２＋／＋成体マウス（≧６週）からの平均値＋／−ＳＤとしてプロットされる。一元配置ＡＮＯＶＡにより、ｐ値が決定された。＊＝ｐ＜０．０５。目盛尺＝Ａでは２５０μｍ、Ｂでは５０μｍ。
【図３】ＢＡＬＢ／ｃおよびＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおける、増殖の減少および系統関連表現型の変化：（Ａ）混合ＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６背景のＣｘｃｒ２−／−マウスは、ＷＴ同腹仔と比較して、成長低下を示した。それらには、特定の顔の特徴もみられ、顔が丸く、鼻が短くなった。（Ｂ）成長低下は、ＢＡＬＢ／ｃＣｘｃｒ２−／−マウスにおいても認められたが、その程度はずっと小さかった。（Ｃ）Ｃｘｃｒ２−／−マウスからの脳は、ＷＴの性別をマッチさせた同腹コントロールより小さかった（混合背景のマウスからの脳が、図示される）。この減少は、体全体の大きさの減少と比例していた。体重データは、（Ａ）出生時から異なる年齢の範囲に分類された６０匹のＣｘｃｒ２−／−および５７匹のＣｘｃｒ２＋／＋マウス、および（Ｂ）各背景の各遺伝子型からの約１２匹の成体（≧６週）からの、平均値＋／−ＳＤとしてプロットされる。一元配置ＡＮＯＶＡにより、ｐ値が決定された。＊＝ｐ＜０．０５および＊＊＊＝ｐ＜０．００１；ＮＳ＝有意でない。
【図４】Ｃｘｃｒ２−／−マウスの脊髄における持続的な白質減少：（Ａ，Ｂ）全脊髄面積に対する白質の相対的面積の比較により、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおける白質面積の減少が示される。Ａの挿入図は、ｐ７Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴマウスからの脊髄の半分の断面を示し、白質の減少が示される。（Ａ）この差は、成長中に減少するが、成体期（≧６週）においてなお有意である。（Ｂ）Ｃｘｃｒ２−／−マウスの白質面積に全体的に平均１４％の減少が認められた。個々の年齢のデータが、平均値＋／−ＳＤとしてプロットされ、累積的データが、平均値＋／−２＊ＳＥＭとしてプロットされる。収集されたデータは、１０匹のＣｘｃｒ２−／−および１０匹のＣｘｃｒ２＋／＋マウスからのものである。一元配置ＡＮＯＶＡにより、ｐ値が決定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。目盛尺＝１００μｍ。
【図５】Ｃｘｃｒ２−／−マウスの脊髄における持続的なミエリン形成不全：（Ａ―Ｅ）ＷＴ（Ａ，Ｄ）およびＣｘｃｒ２−／−（Ｂ，Ｃ，Ｅ）マウスからの同様の大きさの軸索の電子顕微鏡写真は、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおいて、全ての大きさの軸索周辺でミエリン厚が減少していることを示す。（Ｆ）差を定量化し、その有意性を決定するために、様々な年齢の、マッチするＣｘｃｒ２−／−およびＷＴの性別をマッチさせた同腹マウスの脊髄から、１５０〜３５０のランダムな軸索を測定し、それらの軸索周囲長に対するミエリン厚の比を計算した。結果は、平均値＋／−２＊ＳＥＭとしてプロットされる。一元配置ＡＮＯＶＡにより、ｐ値が決定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。Ａ〜Ｅにおける目盛尺＝２００ｎｍ。
【図６】Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおける中枢神経伝導速度の減少：ＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６および純粋なＢＡＬＢ／ｃ背景の両方の、生後２〜４ヵ月のＣｘｃｒ２−／−およびＣｘｃｒ２＋／＋マウスの腰髄を、皮下電極で刺激し、脊髄誘発電位の記録を吻側で作製した。Ｃｘｃｒ２−／−において、遺伝的背景に関わらず伝導速度の有意な減少が認められ、これらの変化が成長表現型と関係ないことが示された。結果は、平均値＋／−ＳＤとしてプロットされ、一元配置ＡＮＯＶＡによりｐ値が決定された。＊＝ｐ＜０．０５および＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図７】Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおける正常なミエリン圧密化および周期性、および傍絞輪部および絞輪部の構造：（Ａ）Ｃｘｃｒ２−／−マウスからのミエリンは、薄いが正常な圧密化および周期性を有した。ボックスは、下のＷＴの画像の上に、同様の大きさの軸索からのＣｘｃｒ２−／−のミエリンを重ね合せたものを表わす。（Ｂ）Ｃｘｃｒ２−／−マウスでは、傍絞輪部ループおよび横帯がよく発達して配向され、(Ｃ) ランビエ絞輪および傍絞輪領域の構造には、顕著な差は明らかでなかった。Ａ〜Ｃにおける目盛尺＝２００ｎｍ。
【図８】ＣＮＳ軸索を髄鞘化するオリゴデンドロサイトの概略図を示す。
【図９】Ｃｘｃｒ２−／−脊髄から得た混合培養における、オリゴデンドロサイト成熟不全：ｐ８Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴ同腹仔からの混合脊髄培養が作製され、（Ａ―Ｂ）プレオリゴデンドロサイトのマーカーＯ４、および（Ｃ―Ｄ）新たに分化したオリゴデンドロサイトのマーカーＯ１で、プレーティングの４８時間後に染色された。Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴマウスからの培養において、細胞の総数に対する陽染細胞の数を定量化すると、Ｃｘｃｒ２−／−培養は、Ｏ１＋細胞の生成に有意な減少（〜６０％）がみられた（Ｆ）。しかし、Ｏ４＋細胞の生成には、Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴマウスの間で有意差がなかった（Ｅ）。結果は、平均値＋／−ＳＤとしてプロットされる。一元配置分散分析により、ｐ値が決定された。＊＝ｐ＜０．０５。目盛尺＝５０μｍ。
【図１０Ａ】様々なＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２アンタゴニストを示す。
【図１０Ｂ】様々なＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２アンタゴニストを示す。
【図１０Ｃ】様々なＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２アロステリック阻害剤を示す。
【図１１】ｒｅｐｅｒｔａｘｉｎ（Ｒ（―）―２―（４―イソブチルフェニル）プロピオニルメタンスルホンアミド）の構造式を示す。図のように、ｒｅｐｅｒｔａｘｉｎは、Ｌ―リシンにより塩化される。
【図１２】Ｃｘｃｒ２−／−マウスのＣＮＳにおける、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現低下：（Ａ）生後２〜４週間目のＣｘｃｒ２−／−マウスからの脳のウェスタンブロットで、性別または年齢にかかわらず、ＭＢＰの発現低下がみられた。４週間目のＣｘｃｒ２−／−マウスにおいて、ＰＬＰの発現も低下し、ミエリン形成不全と整合した。４週間目のＣｘｃｒ２−／−マウスからのウェスタンブロットにおいて、ＧＦＡＰの検出も同様に減少した。Ｃｘｃｒ２＋／−およびＣｘｃｒ２＋／＋マウスの間で、これらのタンパク質のレベルの差は明らかでなかった。（Ｂ，Ｃ）Ｃｘｃｒ２＋／＋：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋およびＣｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋マウスの脊髄（Ｂ）および脳（Ｃ）の免疫組織化学法を用いて、ウェスタンブロットにより観察されたＧＦＡＰの減少を確認した。β―アクチンが、全てのウェスタンブロットにおいてタンパク質負荷のマーカーとして使用された。スケールバー＝１００μｍ。
【図１３】ＣＸＣＲ２阻害が毒素誘発性脱髄の後のオリゴデンドロサイト生存を誘導すると思われる：Ｃｘｃｒ２＋／＋およびＣｘｃｒ２−／−の性別をマッチさせた同腹仔の間で、クプリゾン処置の前（Ａ―Ａ”およびＢ―Ｂ”）および４週後に（Ｃ―Ｃ”およびＤ―Ｄ”）ＭＢＰおよびＰＬＰの発現が比較される。ＰＬＰプロモータ誘導性のＥＧＦＰの発現が、これらのマウスにおいて、オリゴデンドロサイト系統の細胞のマーカーとして使用された。非処置群においては、Ｃｘｃｒ２−／−マウスは、Ｃｘｃｒ２＋／＋同腹仔（Ａ’＞Ｂ）と比較して、ＰＬＰ発現が低下していた（Ｂ’＜Ａ’）。４週間のクプリゾン曝露後、Ｃｘｃｒ２−／−マウスには、ＰＬＰ発現の変化はみられなかった（Ｂ’＝Ｄ’）が、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスには、ＰＬＰ発現の劇的な減少がみられた（Ａ’＞＞＞Ｃ’）。脳梁の細胞充実度も（ドットのエリアを指す矢印）、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスにおいては、処置前のレベル（Ｃ”＜Ａ”）および４週間のクプリゾン処置後のＣｘｃｒ２−／−の性別をマッチさせた同腹仔（Ｃ”＜Ｄ）のレベルと比較して、激減した。これは、野生型マウスにおいてはオリゴデンドロサイトが消失し、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおいては、オリゴデンドロサイトが細胞死から保護され、または生存が増強されることを示す。
【図１４】４週間のクプリゾン処置後の、Ｃｘｃｒ２−／−ではなく、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスの脳梁における脱髄：クプリゾン処置の開始４週間後の、性別をマッチさせたＣｘｃｒ２＋／＋およびＣｘｃｒ２−／−同腹マウスの、脳のマッチするエリアのＭＢＰ免疫組織化学法では、Ｃｘｃｒ２＋／＋にミエリン消失のエリアが見られた（Ａ、矢印））が、Ｃｘｃｒ２−／−マウスには見られなかった（Ｂ）。カラムＡ―Ａ”’の矢印によって示されるように、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスの脳のＭＢＰ染色がないエリア（Ａ）は、ＰＬＰ発現低下（Ａ’）および細胞充実性低下（Ａ”）のエリアと相関した。これらの変化は、Ｃｘｃｒ２−／−マウスには見られなかった（Ｂ―Ｂ”）。
【図１５】クプリゾン処置の７週後の、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスと比較したときの、Ｃｘｃｒ２−／−マウスの脳梁における病変量の減少：Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスの脳梁における、ＭＢＰおよびＰＬＰの両方の発現の欠如により、広範なミエリン崩壊のエリア（矢印）が観察できるが（Ａ―Ａ”、Ｃ―Ｃ”）、Ｃｘｃｒ２−／−の性別をマッチさせた同腹仔には観察できない（Ｂ―Ｂ”）。Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスからの組織のＭＢＰ染色では、非常に低レベルのＭＢＰを発現する一定のエリア（ドット、Ｃ）が、高密度のＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋細胞（ドット、Ｃ’）と相関し、これらの細胞が、脱髄病巣（ドット、Ｃ”）の再ミエリン化を試みていると考えられることが示唆された。
【図１６】クプリゾン処置の４週後の、Ｃｘｃｒ２−／−ではなく、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスの脳梁におけるアストログリオーシス：Ｃｘｃｒ２−／−およびＣｘｃｒ２＋／＋マウスからのＣＮＳ組織の分析から、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおけるＧＦＡＰの発現低下（Ｂ＜Ａ）が以前に明らかになり、ＣＸＣＲ２がアストロサイトの生理機能を調節しうることが示されている。この観察と整合して、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウス（Ｃ）において有意なＧＦＡＰアップレギュレーションが観察される時点である、４週間クプリゾンに曝露した後に、Ｃｘｃｒ２−／−にＧＦＡＰのアップレギュレーションは認められなかった（Ｄ）。この差は、脳梁内で、最も顕著だった（ドットのエリア）。
【図１７】クプリゾン処置の６週後の、Ｃｘｃｒ２−／−ではなく、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスの脳におけるアストログリオーシス：クプリゾン処置の６週目に、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスの脳梁に（ドットのエリア）顕著なアストログリオーシスがなお見られる（Ｂ）という事実にも関わらず、Ｃｘｃｒ２−／−組織のＧＦＡＰ染色（Ａ，Ｃ）は、処置前のレベルから区別がつかない。処置の６週目のＣｘｃｒ２＋／＋マウスにおけるＧＦＡＰ発現の増強（Ｂ）は、ＰＬＰ発現低下（Ｂ’）と相関する一方、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおいては、これらのパラメータの変化は一切見られなかった（Ａ―Ａ’、Ｃ―Ｃ’）。６週目のＣｘｃｒ２＋／＋マウスにおける脳梁の細胞充実性（Ｂ”、円）は、処置前より高く、ＧＦＡＰ発現増加（Ｂ、Ｂ”、円）およびＰＬＰ発現低下（Ｂ’、円）と相関し、オリゴデンドロサイトが常在していた病変部へのアストロサイトの浸潤が示された。
【図１８】Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおける、クプリゾン処置に対するミクログリアの反応の変化：非損傷Ｃｘｃｒ２−／−マウスは、Ｃｘｃｒ２＋／＋同腹コントロール（Ａ）と比較すると、ＩＢＡ―１発現が増加していた（Ｂ）。４および７週間のケモカイン処置は、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスにおいて、これらのＩＢＡ―１陽性ミクログリアの有意な活性化を誘導した（それぞれＣ、Ｅ）。Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおいては、４週目にはミクログリア活性化は観察されず、処置の７週目ではわずかだった（それぞれＤ、Ｆ）。７週目までに、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスの脳梁内のＩＢＡ―１＋細胞の密度は（Ｅ）、極めて高かったが、Ｃｘｃｒ２−／−マウスでは正常に近かった（Ｆ）。
【図１９】Ｃｘｃｒ２＋／＋およびＣｘｃｒ２−／−マウスにおける、クプリゾン処置に反応したＩＢＡ―１＋細胞の数および形の変化：Ｃｘｃｒ２＋／＋およびＣｘｃｒ２−／−マウスのクプリゾン処置の後にＩＢＡ―１＋細胞に観察される差は、これらの細胞の数および活性化状態または構造の両方によるものと思われる。Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスからのＩＢＡ―１＋細胞（Ａ，Ｃ）は、Ｃｘｃｒ２−／−マウスからのものより、概して太く、密度が高いように見受けられた。Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおけるＩＢＡ―１＋細胞（Ｂ，Ｄ）は、外観が太いかわりに、静止または休眠ミクログリアに典型的な複数の長く細い分枝を有することにより特徴付けられた。
【図２０】末梢神経系シュワン細胞のＣＸＣＲ２の発現：Ｃｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋およびＣｘｃｒ２＋／＋：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋マウスから得た座骨神経のＣＸＣＲ２の免疫組織化学法では、ＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋シュワン細胞のサブセットにＣＸＣＲ２の発現が見られた。
【図２１】Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおける座骨神経軸索のミエリン形成不全：Ｃｘｃｒ２−／−マウスは、ＣＮＳに観察されるものに加えて、末梢神経系（ＰＮＳ）にミエリン形成不全を有するように見受けられた。Ｃｘｃｒ２＋／＋およびＣｘｃｒ２−／−マウスの座骨神経からの同様の大きさの軸索の電子顕微鏡写真が示される。ミエリンの厚みが、全てのサイズの軸索周辺で減少するが、大きな軸索周辺で多く減少するように見受けられる。差を定量化し、それらの有意性を決定するために、一匹のＣｘｃｒ２−／−および二匹の野生型の性別をマッチさせた同腹マウスの座骨神経からの〜１００のランダムな軸索を測定し、軸索周囲長に対するミエリン厚の比を計算した。結果は、平均値＋／−２＊ＳＥＭとしてプロットされる。ｐ＝０．０００３。
【図２２】Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおける、神経インパルス伝導の低下への、末梢神経系の寄与の可能性：Ｃｘｃｒ２−／−動物は、ＷＴ同腹仔と比較すると、脊髄誘発電位および体感覚性誘発電位の中枢伝導の減失を示す。ＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６および純粋なＢＡＬＢ／ｃ背景の両方の、生後２〜４ヵ月のＣｘｃｒ２−／−およびＣｘｃｒ２＋／＋マウスの、腰髄（ＣＮＳ）または頸骨神経（ＰＮＳ＋ＣＮＳ）を、皮下電極で刺激し、吻側で記録を作成した。Ｃｘｃｒ２−／−においては、遺伝的背景に関わらず、伝導速度の有意な減少（１５〜３０％）が認められ、これらの変化が混合背景のマウスに観察される成長表現型と関係がないことが示された。伝導速度減少のパーセントを、末梢要素を含む実験またはＣＮＳに制限される実験の間で比較すると、末梢要素が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける伝導速度の減少に寄与している可能性があるように見受けられた。これは、図２１に示されるミエリン形成不全と整合する。
【図２３】脊髄におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞の発生および分散：脊髄のオリゴデンドロサイトは、脳室帯（ＶＺ）に生じ、局所的化学忌避および遠隔の化学誘引キューの組み合わせにより予定白質に移動し、そこで移動を止め、分裂促進シグナルに応答して増殖する（左）。増殖期が終わると、これらの細胞は、局所的な分化キューに応答し、最終的にミエリン形成オリゴデンドロサイトに成熟する（右）。（ＶＺ＝脳室帯；ＦＰ＝底板、ＮＴＣ＝脊索）
【図２４】オリゴデンドロサイトおよびアストロサイト細胞系統：神経細胞およびタイプＩアストロサイトと同様に最初に幹細胞から発生する、Ａ２Ｂ５、ＮＧ２、および血小板由来成長因子レセプターα（ＰＤＧＦＲα）を発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプレオリゴデンドロサイトに構成的に分化し、または骨形成医薬品４（ＢＭＰ４）によりタイプＩＩアストロサイトを産出するように誘導される能力を典型的に有する。プレオリゴデンドロサイトは、分化時に通常、単クローン抗体（ｍＡｂ）Ｏ４により同定されうるスルファチドを発現する。その後、典型的にガラクトセレブロシドを発現し、未熟オリゴデンドロサイトとして分類される。未熟オリゴデンドロサイトは、ｍＡｂ  Ｏ１でラベルでき、生存が特異的キュー／シグナルに典型的に依存し、その非存在下ではアポトーシスする。プログラム細胞死しない細胞は、さらに成熟しうる。未熟および非ミエリン形成およびミエリン形成成熟オリゴデンドロサイトは、典型的には、分裂促進因子ＰＤＧＦにもはや応答しない。ミエリンを生産可能な最も成熟した形態は、通常ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）等のミエリン特異的タンパク質を発現する。オリゴデンドロサイト系統の細胞は、成長の全段階で、ＤＭ２０および／またはＰＬＰを典型的に発現する。（ＢａｕｍａｎｎおよびＰｈａｍ―Ｄｉｎｈ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１―９２７（２００１）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６７：４５１―４６７（２００２）；ＰｏｌｉｔｏおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ、Ｊ．Ａｎａｔ．２０７：７０７―７１６（２００５））
【図２５】オリゴデンドロサイト、ミエリンおよび神経伝導：軸索に巻きつく、オリゴデンドロサイト細胞膜からの脂肪の絶縁体であるミエリンは、ＣＮＳにおける活動電位の迅速な伝達を助ける。無髄軸索（上）においては、活動電位が裸の軸索膜に沿って順に広がると同時に、連続的な脱分極波がある。有髄軸索（下）においては、エネルギーの流れは連続的ではなく、一つの絞輪から次へ「ジャンプ」し、そこに蓄積したナトリウムチャネルによって、活動電位が再び発生する。跳躍伝導と称されるプロセスにおいて脱分極が不連続になり、これにより神経インパルスの伝導が非有髄繊維よりも速くなる。（ＯＤ＝オリゴデンドロサイト、Ｎ＝神経細胞）
【図２６】脱髄後のナトリウムチャネル再編成および伝導速度の変化：絞輪間の下の軸索膜は、活動電位を再生するために必須であるナトリウムチャネルの濃度が非常に低いため、脱髄軸索では伝導遮断が生じうる。この膜が露出すると、髄鞘のないエリアに活動電位が広がることができない。その後、適切な伝導を回復しようとする中で、髄鞘により覆われていた膜に、ナトリウムチャネルのアップレギュレーション（茶色のドット）が生じる。（ＯＤ＝オリゴデンドロサイト）
【図２７】多発性硬化症のタイプ：脱髄疾患の多発性硬化症は、寛解の有無および機能障害性の症状の蓄積にしたがって、様々なタイプに分類される。良性寛解型（ＢＲ）ＭＳ（約１０％）においては、再発があるが、代償機構がベースライン機能を再発前のレベルに回復するのに十分であるように見受けられる。再発寛解型（ＲＲ）ＭＳ（約５０％）においては、再発後の回復が完全でなく、ある程度の障害が残る。再発が何度も生じるにつれ症状が悪化し、障害が増加する。二次進行型（ＳＰ）ＭＳ（約３０％）は、ＲＲＭＳとして始まるが、ある時点で明白な寛解が生じず、患者の健康が悪化し続ける。一次進行型（ＰＰ）ＭＳ（約１０％）においては、寛解はなく、機能障害性の症状が連続的に蓄積される。（ＪｏｙおよびＪｏｈｎｓｔｏｎ、Ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２００１））
【図２８】Ｇタンパク質共役ケモカインレセプターＣＸＣＲ２、そのリガンドおよびその機能：ケモカインレセプターＣＸＣＲ２は、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）ファミリーのメンバーである。ＣＸＣＲ２は、ＣＸＣケモカインのＥＬＲ陽性ファミリーの可溶性分泌化学誘引サイトカインである、ＣＸＣＬ１を結合しうる。それらの相互作用は、増殖、分化、および移動等のプロセスを調節する細胞内シグナルを活性化する。ＧＰＣＲｓは、７つの膜貫通レセプターであり、それらの細胞内カルボキシ末端および細胞質ループは、三つのサブユニット（α、β、γ）で構成されるヘテロ三量体Ｇタンパク質複合体を結合する。活性化時には、αおよびβγ部分が分離し、二次メッセンジャーとして働く細胞内エフェクターをさらに活性化する。それらの標的のいくつかは、活性化がホスファチジルイノシトール（ＰＩ）産生および細胞内カルシウム増加をもたらすホスホリパーゼ―Ｃ（ＰＬＣ）、および、生成物が走化中の極性移動のためにアクチン細胞骨格系を構築できるＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）である。ヘテロ三量体Ｇタンパク質複合体の活性化は、ＧＰＣＲｓの細胞質部分を結合し、ヘテロ三量体Ｇタンパク質複合体との相互作用を妨げる調節タンパク質である、アレスチンにより阻害されうる。アレスチン結合は、レセプターインターナリゼーションおよびリサイクリングも助け、これによりレセプターシグナリングを調節する。
【図２９】オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）に対するＣＸＣＬ１／ＣＸＣＲ２の効果：オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）は、化学忌避および化学誘引キューの組み合わせにより、予定の白質に導かれる。予定白質で、アストロサイトにより局所的に分泌されるケモカインＣＸＣＬ１に出会うと考えられる。ＯＰＣｓの表面上における、ＣＸＣＬ１のＣＸＣＲ２への結合により、これらの細胞が移動を止め、マイトジェンＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）に反応しやすくなるように誘導される。適切な数のオリゴデンドロサイトが成長して、局所的に成長する軸索のミエリン需要を満たすことを確保するために、増殖が必要である。
【図３０】ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によるＣｘｃｒ２遺伝子タイピング：テイルクリップから単離したマウスＤＮＡサンプルを、１．２％アガロースゲルのウェルの、既知のサイズのフラグメントの標準のＤＮＡラダーの隣にロードする。ゲルを含むチャンバが、電流を生成する。負に帯電したＤＮＡが、チャンバ上部の負電荷により反発され、底の正電荷により引きつけられる。ＤＮＡの移動時には、大きなサイズのＤＮＡフラグメントほどゆっくりと移動し、遠くに移動しない。Ｃｘｃｒ２−／−マウスは、Ｃｘｃｒ２遺伝子の欠失を有し、そのためＤＮＡが短く（野生型の３６０ｂｐに対して２８０塩基対（ｂｐ））、ゲル中でより遠くに移動する。
【図３１】脊髄に対する白質面積の測定：面積を測定するために、脊髄の端ならびに灰白質（中心）と白質（緑色端）の間の境界をトレースした。脊髄面積全体から灰白質の面積を引くことにより、白質の面積を計算し、これらの値を用いて、脊髄面積全体に対する白質面積の比を計算した。
【図３２】軸索周囲長に対するミエリン厚の測定：図は、黄色で重ねられた軸索周囲長のトレースと、黒色の三つの別個のミエリン厚測定値（線Ｘ，Ｙ，Ｚ）とを伴う、電子顕微鏡を用いて撮影された軸索の断面を示す。平均ミエリン厚を計算し、軸索周囲長で割ってそれらの比を決定した。
【図３３】精製された脊髄のアストロサイトはＣＸＣＬ１およびＣＸＣＲ２ｍＲＮＡを発現する：脊髄から得た精製アストロサイトから抽出されたＲＮＡに、ＲＴ  ＰＣＲが行われた。結果は、アストロサイトにＣＸＣＬ１およびＣＸＣＲ２が存在することを示す。
【図３４】アストロサイトおよびグリア瘢痕の誘導に対するＣＸＣＬ１の効果。精製されたアストロサイト培養物へのＣＸＣＬ１（０．５ｎｇ／ｍｌ）の添加は、ＣＳＰＧ発現を誘導し、形態を変更する。細胞をＣＸＣＬ１（０．５ｎｇ／ｍｌ）で３日間処置し、免疫細胞化学法により基質上へのＣＳＰＧ沈着をアッセイし、培地に放出した。ドットブロット（挿入図）によると、ＣＸＣＬ１は、ＣＳＰＧ（ＣＳＰＧに対する抗体）を増加させた。ＧＦＡＰ（赤）、ＣＳＰＧ（緑）。
【図３５】脱髄病変においてＣＸＣＬ１およびＣＸＣＲ２が誘導される。ＬＰＣ病変の３日後にＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を分析する免疫組織化学法。ＤＡＢ染色により示されるように、ＣＸＣＬタンパク質が病変内でアップレギュレートされる。ＣＸＣＲ２は、病変内ではＧＦＡＰ＋細胞と共局在するが、病変外では共局在しない。
【図３６】ＣＸＣＲ２の中和は脱髄ＬＰＣ病変を減少させる。中和抗ＣＸＣＲ２抗体のＬＰＣ誘導性病変への局所注入の結果、病変サイズの減少および実質的な形態回復が生じる。アイソタイプコントロール抗体（左パネル）またはＣＸＣＲ２に対する中和抗体（右パネル）で処置された、１０日のＬＰＣ病変のＬｕｘｏｌ  Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ染色（上パネル）および三次元再構築（下パネル）。再構築は、ＣＸＣＲ２遮断を伴う動物における、病変体積の９６％減少を示す（グラフ）。
【図３７】ＣＸＣＲ２の中和は、病変の外部領域における、ＧＦＡＰ免疫反応性およびＥＤ１＋反応性を低下させる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書に記載の全ての刊行物および特許出願が、個々の刊行物または特許出願が特に個々に参照により組み込まれるものと示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
一般的技術：
本発明の実行は、特に明記しない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ジェノミクスおよび組換えＤＮＡの従来技術を用い、それらは技術の熟練の範囲内である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等編、（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５）），ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ等（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））。
定義：
本明細書および請求項において用いられるところの、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から逆が明らかでない限り、複数への言及を含む。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、その混合物を含めて、複数の細胞を含む。
【００２８】
用語「コントロール」は、実験において比較目的で使用される代替物、細胞またはサンプルである。さらに、「コントロール」は、異なる時点を比較するための、実験中の同じ物、細胞またはサンプルを表すこともできる。
【００２９】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換可能に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの、任意の長さのポリマー型のヌクレオチドまたはそのアナログをさす。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し、既知または未知の任意の機能をはたしうる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコードまたは非コード領域、連鎖分析から定義される座位（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマ。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等の修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの構築の前または後に与えられうる。非ヌクレオチド成分により、ヌクレオチドの配列が中断されうる。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合等により、重合後にさらに修飾することができる。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡ（「転写産物」とも呼ばれる）がその後ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に変換されるプロセスを指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と集合的に呼ばれる。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡ由来である場合は、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【００３１】
用語「送達」および「投与」は、薬剤が対象、組織、または細胞に入ることを意味するために、本明細書において互換可能に使用される。本明細書の開示の全体にわたり使用される用語には、特定の用語が文法上変化したものも含まれる。例えば、「送達」は、「送達している」、「送達される」、「送達する」等を含む。生物活性剤の送達または投与の様々な方法は、公知技術である。例えば、本明細書に記載される一つ以上の薬剤が、非経口的に、経口的に、腹膜内に、静脈内に、動脈内に、経皮的に、筋肉内に、リポソームで、カテーテルまたはステントによる局所送達を介して、皮下に、脂肪内に、または髄腔内に送達されうる。さらに、薬剤の特性に応じて、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはリポソーム製剤およびミニ細胞を含む非ウイルスベクター系を介して、薬剤が送達されうる。
【００３２】
対象における、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用される、「特異的に発現される」という用語は、コントロールにおいて検出されるそれと比較した時の、その配列の過剰発現または過小発現をさす。過小発現は、コントロールと比較した時の、テスト対象における検出可能な発現の非存在により証明される、特定の配列の発現の非存在も含む。
【００３３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをさすために、本明細書において互換可能に使用される。ポリマーは線状でも分岐でもよく、修飾アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸により中断されうる。用語は、修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合等の任意の他の操作。本明細書で使用されるところの、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む、天然および／または非天然または合成のアミノ酸、およびアミノ酸アナログおよびペプチドミメティクスをさす。
【００３４】
「対象」、「個体」、または「患者」は、本明細書において互換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトをさす。哺乳類には、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サル（シミアン）ヒト、家畜、スポーツ用動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｖｏで得られた、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された、生物学的存在の組織、細胞およびそれらの子孫も含まれる。
【００３５】
「シグナル伝達」は、刺激または阻害シグナルが細胞内へまたは内部で伝達されて細胞内反応を誘発するプロセスである。「シグナル伝達経路のモジュレータ」は、同じ特異的シグナル伝達経路にマッピングされた一つ以上の細胞タンパク質の活性を調節する物質をさす。モジュレータは、シグナリング分子の活性および／または発現量またはパターンを増大または抑制しうる。ＣＸＣケモカインシグナリングの場合には、シグナリング経路の調節には、ＣＸＣケモカインまたはその対応するレセプターの発現量またはパターン、ならびにＣＸＣケモカインまたはその対応するレセプターがメンバーである経路（単数または複数）の任意の下流または上流のシグナリング分子のそれの変更が含まれる。
【００３６】
本明細書で使用されるところの「細胞」は、その通常の生物学的意味で使用され、多細胞生物全体をさすものではない。細胞は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば細胞培養にあり、または、鳥類、植物、およびヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、ネコ、マウスまたはラットなどの哺乳類等を含む多細胞生物に存在しうる。
【００３７】
本明細書で使用されるところの、「治療」または「治療する」または「改善する」は、本明細書において互換可能に使用される。これらの用語は、臨床的結果を含み、好ましくは臨床的結果である、有益または所望の結果を得るためのアプローチをさす。本発明の目的においては、有益または所望の臨床的結果には、以下の一つ以上が含まれるが、これに限定されない：（例えば、脱髄疾患の場合において）脱髄病変のサイズを縮小すること、ＯＰＣの増殖および成長または病変部位への移動を促進すること、オリゴデンドロサイトの分化を促進すること、神経障害の開始を遅らせること、脱髄疾患の発症を遅らせること、神経障害から生じる症状を減少させること、病気を患う者の生活の質を高めること、病気を治療するために必要な他の薬の量を減少させること、ターゲッティングおよび／またはインターナリゼーション等により、別の薬の効果を高めること、病気の進行を遅らせること、および／または個体の生存を延長すること。治療には、病気の予防、すなわち、病気の誘導前に保護組成物を投与することにより、病気の臨床症状が出ないようにすること；病気の抑制、すなわち、誘導事象の後であるが臨床的出現または再発の前に、保護組成物を投与することにより、病気の臨床症状が出ないようにすること；病気の阻害、すなわち、最初の所見の後に保護組成物を投与することにより、臨床症状の発症を妨げること；病気の再発防止、および／または病気の軽減、すなわち、最初の所見の後に保護組成物を投与することにより、臨床症状を退行させることが含まれる。
【００３８】
用語「薬剤」、「生物学的に活性な薬剤」、「生物活性剤」、「生物活性化合物」または「生物学的に活性な化合物」は、互換可能に使用され、さらに、記載の文脈において複数の言及を含む。本明細書に記載の本発明の一つ以上の組み合わせ治療法において利用されるこのような化合物には、単純または複合有機または無機分子、ペプチド、ペプチドミメティック、タンパク質（例えば抗体）、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそのアナログを含む核酸分子、炭水化物を含む分子、ホスホリピド、リポソーム、低分子干渉ＲＮＡ、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）、または組み合わせ外部ガイド配列（ＥＧＳ）等の生物または化学化合物が含まれるが、これに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用されるところの「アンタゴニスト」という用語は、標的ポリペプチドの生物学的機能を阻害する能力を有する分子をさす。したがって、用語「アンタゴニスト」は、標的ポリペプチドの生物学的役割の文脈において定義される。本明細書における一定のアンタゴニストは、標的と特異的に相互作用する（例えば、結合する）が、標的ポリペプチドがメンバーであるシグナル伝達経路の他のメンバーと相互作用することにより、標的ポリペプチドの生物活性を阻害する分子も、この定義に特に含まれる。アンタゴニストにより阻害される生物活性の一つは、ＯＰＣの増殖の増加、脱髄の阻害、および／または再ミエリン化の促進に関連する。例えば、アンタゴニストは、ＣＸＣケモカインおよび／またはＣＸＣケモカインレセプターと直接または間接的に相互作用して、ＣＸＣケモカインシグナリングの減少をもたらしうる。本明細書で定義されるところのアンタゴニストには、おとりオリゴヌクレオチド、アプタマー（ａｐａｔｍｅｒｓ）、抗ケモカイン抗体および抗体変異体、ペプチド、ペプチドミメティクス、非ペプチド低分子、アンチセンス分子、および小有機分子が、非限定的に含まれる。
【００４０】
本明細書で使用されるところの「アゴニスト」という用語は、標的ポリペプチドの生物学的機能を開始または増強する能力を有する分子をさす。したがって、用語「アゴニスト」は、標的ポリペプチドの生物学的役割の文脈において定義される。様々な実施形態において、本明細書のアゴニストは、標的と特異的に相互作用する（例えば、結合する）が、標的ポリペプチドがメンバーであるシグナル伝達経路の他のメンバーと相互作用することにより標的ポリペプチドの生物活性を阻害する分子も、この定義に特に含まれる。
【００４１】
例えば、アゴニストにより増強される生物活性の一つは、ＯＰＣの増殖の増加、脱髄の阻害、および／または再ミエリン化の促進に関連する。本明細書で定義されるところのアゴニストには、おとりオリゴヌクレオチド、アプタマー（ａｐａｔｍｅｒｓ）、抗ケモカイン抗体および抗体変異体、ペプチド、ペプチドミメティクス、非ペプチド低分子、アンチセンス分子、小有機分子、および本明細書に開示される任意の他の生物学的に活性な薬剤が、非限定的に含まれる。
【００４２】
用語「有効量」または「治療上有効量」は、（例えば、脱髄疾患の場合において）脱髄病変のサイズを縮小すること、ＯＰＣ移動、増殖、および成長を促進すること、神経障害の開始を遅らせること、脱髄疾患の発症を遅らせること、神経障害から生じる症状を減少させること、病気を患う者の生活の質を高めること、病気を治療するために必要な他の薬の量を減少させること、ターゲッティングおよび／またはインターナリゼーション等により、別の薬の効果を高めること、病気の進行を遅らせること、神経痕を減少させること、および／または個体の生存を延長すること等の臨床的結果を非限定的に含む、有益または所望の結果をもたらすために十分である薬剤の量をさす。治療上有効量は、治療される対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与の様式などにより変化し、従来技術の当業者により容易に決定されうる。用語は、本明細書に記載の画像化方法のいずれか一つによる検出のための画像を提供する用量にもあてはまる。具体的な用量は、選択される特定の薬剤、採用される薬剤投与計画、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、画像化される組織、担持される物理的送達システムにより変化する。
【００４３】
本明細書で用いられるところの「抗体」という用語は、組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、融合タンパク質、単クローン抗体等の、全ての形の抗体を含む。本発明は、ケモカインに結合（例えば、ＣＸＣレセプター（ＣＸＣＲ）またはインターロイキン、例えばＩＬ―８等のＣＸＣＲリガンドに結合）できる抗体機能的フラグメントにも適用できる。例示的な抗体は、結合する標的の生物活性および／または発現を増減できる。
【００４４】
用語「調節する」、「調節される」または「調節」は、互換可能に使用され、所与の文脈において直接的または間接的変化を意味する。例えば、エフェクターＴ細胞増殖／刺激の調節は、このような増殖が下方または上方へ調節されうることを意味する。別の例においては、調節は、エフェクターまたは自己反応性Ｔ細胞またはその機能／活性対これらの機能／活性の制御性Ｔ細胞のバランスの調節でありうる。
【００４５】
「アプタマー」という用語には、特定の分子に対する特異的結合特性に基づいて選択されるＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドが含まれる。例えば、アプタマー（単数または複数）は、従来技術で公知の方法を使用して、特定のＣＸＣＲを結合するために選択されうる。その後、当該アプタマー（単数または複数）が、免疫反応を調節または制御するために、対象に投与されうる。特定のタンパク質、ＤＮＡ、アミノ酸およびヌクレオチドに親和性を有するいくつかのアプタマーが記載されている（例えば、Ｋ．Ｙ．Ｗａｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１８９９―１９０４（１９９３）；Ｐｉｔｎｅｒ等、米国特許第５，６９１，１４５号；Ｇｏｌｄ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３―７９７（１９９５）；Ｓｚｏｓｔａｋ等、米国特許第５，６３１，１４６号）。高親和性および高特異性で結合するアプタマーが、コンビナトリアルライブラリから得られている（上記、Ｇｏｌｄ等）。アプタマーは、高親和性を有し、平衡解離定数は、使用されるセレクションによりミクロモルからサブナノモルまで変動する。アプタマーは例えば、７―メチルＧおよびＧの間（ＨａｌｌｅｒおよびＳａｒｎｏｗ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：８５２１―８５２６（１９９７））またはＤおよびＬ―トリプトファンの間（上記、Ｇｏｌｄ等）で１，０００倍の選別を示すなど、高い選択性も有しうる。
【００４６】
用語「おとり」は、所定のリガンドまたは未知のリガンドに優先的に結合するように設計された核酸分子、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ、またはアプタマーを含む意味である。このような結合により、標的分子の阻害または活性化が生じうる。おとりまたはアプタマーは、特異的リガンドの結合を天然の結合標的と争いうる。例えば、ＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現は、「おとり」として働くことができ、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質を効率的に結合し、これによりＨＩＶ  ＲＮＡにコードされるＴＡＲ配列への結合を妨げることが明らかになっている（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ等、Ｃｅｌｌ  ６３，６０１―６０８（１９９０））。これは特定の例にすぎず、当業者には当然のことながら、従来技術で公知の技術を使用して他の実施形態が容易に生成されうる。例えば、Ｇｏｌｄ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３―７９７（１９９５）；ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５―１３（２０００）；Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００―１０５（２０００）；Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７―３８（２０００）；ＨｅｒｍａｎｎおよびＰａｔｅｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０―８２５（２０００）；およびＪａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８―１６５０（１９９９）を参照。同様におとりは、標的抗原に結合してその活性部位を占めるように設計され、または、おとりは、標的分子に結合して別のリガンドタンパク質（単数または複数）との相互作用を妨げ、これにより細胞増殖または分化に関わる細胞シグナリング経路を短絡させるように設計されうる。
Ｉ．ケモカインシグナリング
本発明は、ＣＸＣＲを介したシグナリングを調節することにより再ミエリン化を促進するための、組成物および方法を提供する。一態様では、本発明の方法は、ＣＸＣＲを介したシグナリングを遮断または阻害することにより、グリオーシス（例えばアストログリオーシス）を減少または除去することを目的とする。本発明の別の態様は、対象に一つ以上の薬剤を投与することにより、神経障害を治療する方法であり、そのような一つ以上の薬剤が、ＣＸＣＲを介したシグナリングを遮断または阻害する、方法を目的とする。様々な実施形態において、ミエリン修復細胞の増殖、分化または移動を促進するために、細胞に接触するための方法が提供される。
【００４７】
本発明の他の態様においては、方法は、病変部位への前駆神経細胞（例えばＯＰＣｓ）の移動を促進することを対象とする。いくつかの実施形態においては、ミエリン修復細胞の病変部位への移動を促進するために、細胞または対象に薬剤を投与するための方法が提供される。さらなる実施形態においては、成熟細胞への前駆細胞の増殖および／または分化（例えばＯＰＣｓからオリゴデンドロサイトへ）を促進するために、一つ以上の薬剤が投与される。さらに、このような増殖および／または分化は、動物のＣＮＳまたは他の場所（例えば末梢神経系）で生じうる。例えば、このような増殖および／または分化は、造血環境（例えば幹細胞）またはＣＮＳ自体において生じうる。
【００４８】
一実施形態においては、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）の、成熟オリゴデンドロサイトへの分化を促進するために、薬剤が投与される。いくつかの実施形態においては、投与される単一の薬剤が、移動、増殖および／または分化を促進しうる。他の実施形態においては、二つ以上の薬剤の組み合わせが投与され、一つの薬剤が細胞の移動に有効であり、他方の薬剤が増殖および／または分化に有効である。このような実施形態の任意のものにおいて、細胞は神経細胞、または、より具体的にはグリア細胞である。
【００４９】
他の実施態様においては、このような薬剤が、ミエリン形成に関連する細胞またはミエリン形成に関係する機能的相互作用に関わる細胞の増殖を誘導しうる。このような細胞には、ＯＰＣｓ、シュワン細胞（ＳＣｓ）、嗅球鞘細胞、アストロサイト、ミクログリアおよび神経幹細胞（ＮＳＣｓ）が含まれるが、これらに限られない。したがって、例えばグリア細胞の移動は、病変部位へのＯＰＣｓの移動を促進しうる。一実施形態においては、対象に投与され、またはＯＰＣｓに接触させられる一つ以上の薬剤が、ＯＰＣｓの病変部位への／における移動、増殖、および／または分化を促進しうる。
【００５０】
ＣＸＣケモカインおよびそれらの対応するレセプター機能のアンタゴニスト、アゴニストおよびモジュレータが、本発明の範囲に特に含まれる。したがって、本発明のいくつかの態様では、ケモカインシグナリングの調節をもたらすために、薬剤が投与される。ケモカインが、オリゴデンドロサイト増殖および移動を制御することが示されている。（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０４５７―１０４６３（１９９８）；Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３―３８３（２００２））。さらに、ケモカインシグナリングが、細胞の移動、分化、活性化および増殖を制御することが示されている。（Ｗｕ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２６０９―２６１７（２０００）；Ｋａｄｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１３３―１４６（２００６））。一定のケモカインレセプターは、ケモカインシグナリングを調節し、したがって、ミエリン修復に関わる細胞の増殖を促進し、および／またはこのような細胞の損傷または傷害部位（例えば病変部位）への移動を促進することにより、ミエリン修復を増強しうる。ＣＸＣＬ１等のいくつかのケモカインが、ＯＰＣ増殖を誘導するとともに、オリゴデンドログリア細胞の成長の間に移動停止シグナルを提供し、それらを成長するＣＮＳに適切に配置することが示されている。（Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３―３８３（２００２））。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲ２シグナリングの阻害が、ＯＰＣの可用性増加を促進し、病変中心部へのＯＰＣｓまたはオリゴデンドロサイトの移動を増強し、増殖および／または分化を増強する。したがって、ケモカイン―シグナリング阻害が、免疫浸潤を妨げることにより損傷を防ぐと同時に、ミエリン形成／再ミエリン化に関わる細胞の可用性上昇を促進することにより、修復を刺激しうる。例えば、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ１の両方の活性部位に直接／間接的に結合する薬剤が投与されうる。
【００５２】
本発明の組成物および方法は、ケモカインを介した症状を治療するための、細胞または対象への薬剤の投与も提供することができ、薬剤が、ケモカインを介したシグナリング経路を遮断することにより、免疫調節をもたらす。免疫調節には、ＣＮＳへのＴ細胞浸潤等の、免疫細胞浸潤（「免疫浸潤」）の減少が含まれる（例えばＭＳにおける自己免疫反応）。
【００５３】
本発明のいくつかの態様においては、組み合わせプロセス、すなわちミエリン修復、再ミエリン化および／または軸索保護を伴うプロセスにおいて免疫調節をもたらすために、薬剤が投与され、このような免疫調節剤には、サイトカインおよびサイトカインレセプター、ケモカインおよびケモカインレセプター、抗体、補体関連バイオマーカー、接着分子、抗原プロセシングおよび／またはプロセシングマーカー、細胞周期およびアポトーシス関連マーカーが含まれるがこれらに限られない。このような因子、レセプターおよびマーカーは従来技術において周知であり、非限定的な例には、ＩＬ―１、ＩＬ―２、ＩＬ―６、ＩＬ―１０、ＩＬ―１２、ＩＬ―１８、ＴＮＦ―α、ＬＴ―α／β、ＴＧＦ―β、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＲ２／ＣＣＬ２、抗ミエリン特異的タンパク質／ペプチド抗体、抗分化抗原群（ＣＤ）抗体、ＣＳＦ  ＩｇＧ、抗ＭＯＧ抗体、抗ＭＢＰ抗体、Ｃ３、Ｃ４、活性化ネオＣ９、補体活性化制御因子、Ｅ―セレクチン、Ｌ―セレクチン、ＩＣＡＭ―１、ＶＣＡＭ―１、ＬＦＡ―１、ＶＬＡ―４、熱ショックタンパク質、パーフォリン、ＯＸ―４０、オステオポンチン、ＭＲＰ―８およびＭＲＰ―１６、ネオプテリン、アミロイドＡタンパク質、ソマトスタチン、Ｆａｓ、Ｆａｓ―Ｌ、ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ―２、およびＴＲＡＩＬが含まれる。
【００５４】
ＣＸＣ―シグナリングケモカインの阻害剤は、このようなケモカインを不活性のコンホメーションに固定し、または活性化部位を遮断することにより、活性化レセプター誘導性の細胞内シグナル伝達カスケードおよび免疫細胞をＣＮＳに導くのに必要な細胞反応を妨げうる。阻害剤は、ケモカインのアロステリック阻害剤でもよい。したがって、このような阻害剤が、伝達カスケード、または脱髄を生じる免疫細胞浸潤、例えばＴ細胞浸潤に必要な細胞反応を妨げうる。さらに、ＣＸＣ―シグナリングケモカインの阻害剤は、免疫浸潤に必要な細胞経路／機構を短絡（例えば、シグナリングを妨害または阻害）させ、これにより治療をもたらす任意の化合物でありうる。いくつかの実施形態においては、阻害剤は、ペプチド、ポリペプチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、小有機分子、調合薬または抗体、またはそれらの組み合わせである。
【００５５】
様々な実施形態において、方法は、ＣＸＣＲ、ＣＸＣ―リガンド（ＣＸＣＬ）またはインターロイキン（ＩＬ）に特異的な薬剤を、治療的に有効な量で投与することにより、ＣＸＣＲシグナリングを遮断することを目的とし、このような投与が、ＣＸＣを介したシグナリングを妨げることにより、Ｔ細胞、Ｂ細胞または組み合わせのＴ細胞／Ｂ細胞反応の低下を含めて、免疫反応を調節する。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲ２、またはＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７またはＣＸＣＬ８等のＣＸＣＲ２リガンドに特異的な一つ以上の薬剤を、治療的に有効な量で投与することにより、ＣＸＣＲ２によるＣＸＣＲシグナリングが遮断または阻害される。いくつかの実施形態においては、こうして投与されるこのような薬剤が、ＣＸＣＲ２シグナリングおよびＣＸＣＲ１シグナリングを減少または除去する。このような実施形態においては、一つ以上の薬剤が、他のＣＸＣＲｓと比較して、ＣＸＣＲ２および／またはＣＸＣＲ１を選択的に遮断または阻害する。
【００５７】
一実施形態においては、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２シグナリングの特異的遮断または阻害により、再ミエリン化が促進される。一実施形態においては、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２シグナリングのこのような遮断または阻害により、グリオーシスが減少または除去される。
【００５８】
いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲ阻害または遮断薬剤は、ポリペプチド、ペプチド、アプタマー、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ペプチドミメティック、小有機分子または化学化合物、またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態においては、このような薬剤は、ＣＸＣＲレセプター、ＣＸＣＲリガンドまたは同族のインターロイキンに特異的である。さらなる実施形態においては、薬剤は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、またはＩＬ―１からＩＬ―１８に特異的である。いくつかの実施形態においては、薬剤は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８またはＩＬ―８のアンタゴニストであり、このような薬剤の投与により、ＣＸＣを介したシグナリングが阻害される。一実施形態においては、このような薬剤が、他のＣＸＣＲｓに対してＣＸＣＲ１を選択的に遮断／阻害する。一実施形態においては、このような薬剤が、他のＣＸＣＲｓに対してＣＸＣＲ２を選択的に遮断／阻害する。別の実施形態においては、このような薬剤が、他のＣＸＣＲｓに対してＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を選択的に遮断または阻害する。さらなる実施形態においては、他のＣＸＣＲｓと比較して、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を選択的に遮断または阻害しうる、二つ以上の薬剤が投与される。
【００５９】
本明細書に開示される方法は、例えば神経細胞の変性が生じる、任意の神経病理学的状態、または脱髄を対象としうる。神経細胞脱髄は、ＣＮＳおよびＰＮＳの多数の遺伝性および後天性疾患において現れる。神経病理には、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎、橋中心髄鞘崩壊（ＣＰＭ）、抗ＭＡＧ病、ロイコジストロフィー：アドレノロイコジストロフィー（ＡＬＤ）、アレキサンダー病、カナヴァン病、クラッベ病、異染性ロイコジストロフィー（ＭＬＤ）、ペリツェウス―メルツバッヘル病、レフサム病、コケイン症候群、ファンデルクナップ症候群、およびツェルウェーガー症候群、ギラン―バレー症候群（ＧＢＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、脊髄損傷（例えば外傷または切断）、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、グリオーシス、アストログリオーシスおよび視神経炎が含まれるが、これに限定されない。これらは、ＣＮＳの特定の位置における神経細胞の変性に結び付けられており、神経細胞または脳の領域が本来の機能を果たせなくなる。さらに、本明細書に開示される方法は、はしか、狂犬病を引き起こす病原体、スクレイピーのような病原体、コイ病原体、パラミクソウイルス、コロナウイルス、エプスタイン―バーウイルス、帯状ヘルペス、単純ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、風疹、耳下腺炎、イヌジステンパー、マレックセムリキ森林ウイルス、動物およびヒトレトロウイルス、およびヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩ型を含むがこれに限られない病原体を原因とする、またはこれに関連する神経病理に等しく適用できる。
ＩＩ．生物活性剤
本明細書に開示される組成物および方法は、例えば、神経細胞の変性が生じる任意の神経病理学的状態、グリオーシス（例えばアストログリオーシス）または脱髄を対象としうる。生物活性剤は、このような神経病理学的状態を対象としうる。生物活性剤は、ケモカインレセプターまたはリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストでありうる。本発明のいくつかの実施形態においては、結合部位で同じ三次元構造を有する化合物が、アンタゴニストとして使用されうることが想定される。ケモカインの結合部位を含む活性部位の構造を決定するために、化学構造の三次元解析が用いられる。例えば、ハイスループットスクリーニングによるリード化合物が、ＣＸＣＲ２の選択的アンタゴニストを生成し、化学的に最適化するために用いられている。（Ｇａｎｊｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１００９５―１００９８（１９９８））。さらに、ＥＬＲおよび非ＥＬＲのＣＸＣケモカインを含む、ＣＸＣＲｓのリガンドの三次元構造を明らかにするために、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）が利用されうる。ＮＭＲの情報により、リガンドのレセプター特異性を実質的に変更しうるように、複数のケモカインのレセプター結合部位内で複数の置換が生成されうる。（例えば、Ｗｅｌｌｓ等、Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．１９９６；５９：５３―６０）。したがって、神経障害の治療を含む本発明の方法に使用するために、ケモカインを介したシグナリングを遮断または阻害する薬剤が設計されうる。さらに、本明細書に開示されるように、グリオーシスを減少または除去するとともに、再ミエリン化を促進する方法において、このような薬剤が使用されうる。
【００６０】
本発明の別の態様においては、ＣＸＣケモカインの発現を調節し、これによりＣＸＣを介したシグナリングに影響を与えるために、生物活性剤（単数または複数）が、治療上有効量で投与されうる。そして、このような調節が、グリア細胞移動、増殖および／または分化に影響しうる。さらなる実施形態においては、このような調節が、ＣＮＳへの免疫細胞浸潤に影響を与えうる。
【００６１】
様々な実施形態において、このような薬剤には、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、アプタマー、ｓｉＲＮＡｓ、外部ガイド配列（ＥＧＳ）小有機分子、抗体またはペプチドミメティクスが含まれるがこれに限られない。このような生物活性剤は、ＣＸＣケモカインの発現量を直接または間接的に調節し、したがってＣＸＣを介したシグナリングを減少または増強しうる。様々な実施形態において、発現が調節されるＣＸＣ―ケモカインには、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２またはＣＸＣＲ５が含まれる。いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＬ１および／またはＣＸＣＲ２の発現が調節される。いくつかの実施形態においては、グリア細胞が培養され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現コンストラクトによりトランスフェクションされ、その後対象に投与され、発現コンストラクトが、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２をコードする。したがって、いくつかの実施形態においては、ｅｘ  ｖｉｖｏの方法により、発現調節がもたらされる。
【００６２】
他の態様においては、標的細胞が、ミエリン修復を促進するもう一つの追加的薬剤を発現するように設計されうる。例えば、いくつかの実施形態においては、ミエリン修復促進神経成長因子等の薬剤が、例えば、標的細胞に形質転換される核酸配列によりコードされる。したがって、細胞ゲノムに統合されるか、従来技術において周知のプラスミドまたはウイルスベクターに存在しうる核酸配列から、所望の成長因子が発現される。
【００６３】
したがって、いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲを介したシグナリングを調節する薬剤をコードする核酸が、再ミエリン化を促進する薬剤をコードする核酸と、コンビナトリアル様式で共同投与されうる。例えば、核酸から発現される二つ以上の共同投与された薬剤が、グリオーシスを阻害または減少させるだけでなく、グリア細胞の移動、増殖および／または分化を促進しうる。核酸から発現される薬剤は、例えば、ＣＸＣＲ２活性またはＣＸＣＲ２リガンドを阻害することにより、ＣＸＣシグナリングを遮断または阻害しうる。他の実施態様においては、このような薬剤が、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２を介したシグナリングを遮断または阻害する。さらに他の実施形態においては、このような薬剤が、ＣＸＣＲ１を介したシグナリングを遮断または阻害する。したがって、ＣＸＣＲを介した（またはＣＸＣＬを介した）シグナリングを阻害または遮断する薬剤が、オリゴデンドロサイト生存を増強または促進すること等によりミエリン修復を促進する薬剤と組み合わせられうる。
【００６４】
薬剤に影響を受けたＣＸＣＲ媒介するシグナリングと共同投与されるこのような薬剤には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（Ｊｅａｎ等、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １３：６２７―６３１（２００２））、甲状腺ホルモン（ＴＨ）（Ｃａｌｚａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：３２５８―３２６３（２００２））、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）（Ｚａｖａｌａ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：２０１１―２０１９．（２００２））、シリア線毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）（Ｌｉｎｋｅｒ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：６２０―６２４（２００２））、線維芽細胞成長因子―２（ＦＧＦ―２）（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：８５７４―８５８５（２００２）．）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｂｕｔｚｋｕｅｖｅｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：６１３―６１９（２００２）．）、インシュリン様成長因子―１（ＩＧＦ―１）（Ｂｅｃｋ等、Ｎｅｕｒｏｎ  １４：７１７―７３０（１９９５））、グリア成長因子―２／ニューレグリン（ＧＧＦ―２／ＮＲＧ）（Ｋｅｒｂｅｒ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：１４９―１６５（２００３））およびＣＸＣＬｌ／成長制御癌遺伝子α（Ｇｒｏ―ａ）（Ｏｍａｒｉ等、Ｇｌｉａ  ５３：２４―３１（２００６）；Ｏｍａｒｉ等、Ｂｒａｉｎ  １２８：１００３―１０１５（２００５）；Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３−３８３（２００２））等の、オリゴデンドロサイト生存、増殖、移動および分化のプロセスに影響を与えことが示されている、いくつかの生体分子が含まれる。
【００６５】
さらなる実施形態においては、このような薬剤をコードする核酸配列の発現が誘導可能であり、したがって時間的に制御される。このような誘導可能または時間制御される転写制御エレメントは、従来技術において公知であり、本明細書にさらに開示されるとおりである。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、グリア細胞が、ＣＸＣケモカインの発現変更を提供するように、生物活性剤をコードする発現ベクター（または「発現コンストラクト」）によりトランスフェクションされうる。一実施形態においては、発現コンストラクトが、オリゴデンドロサイトにトランスフェクションされ、このような発現ベクターが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に投与され、トランスフェクションされたオリゴデンドロサイトが、非トランスフェクションオリゴデンドロサイトと比較して、ＣＸＣＲ２またはＣＸＣＬ１の発現量を変化させる。他の実施態様においては、このようなトランスフェクション細胞には、ＳＣｓ、ＮＳＣｓ、ＯＰＣｓ、アストロサイト、ミクログリア細胞、またはこのような細胞の組み合わせが含まれ、それらも培養またはｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションされる。いくつかの実施形態では、発現コンストラクトは、グリア細胞に特異的な細胞特異的または誘導性プロモータを含み、従来技術の当業者に公知であるとともに、本明細書に上述される。
【００６７】
典型的には、遺伝子発現が、構成的または誘導性プロモータ、組織特異的制御エレメント、およびエンハンサを含む一定の制御エレメントの制御下におかれる。このような遺伝子は、制御エレメントに「操作可能に連結される」といわれる。例えば、構成的、誘導性、または細胞／組織特異的プロモータが、宿主細胞に発現される遺伝子の発現を制御するために、発現ベクターに取り入れらうる。
【００６８】
いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲシグナリングの阻害剤は、このような阻害剤をコードする核酸配列から発現されうるポリペプチドであり、阻害剤をコードする核酸が、神経細胞に特異的な転写制御配列に、操作可能に連結されうる。典型的な転写制御配列／エレメントには、以下のタンパク質をコードする遺伝子より選択される転写制御配列／エレメントが含まれる：ＰＤＧＦαレセプター、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、グリア線維酸性遺伝子（ＧＦＡＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）および微小管関連タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）、Ｔｈｙ１．２、ＣＣ１、セラミドガラクトシル転移酵素（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、オリゴデンドロサイト―ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質０（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、チロシン水酸化酵素、ＢＳＦ１、ドーパミン３―ヒドロキシラーゼ、セロトニン２レセプター、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、およびスルファチド。さらに、神経細胞特異的プロモータの例は、米国特許出願公開第２００３／０１１０５２４号等に開示されるように、従来技術において周知である。ウェブサイト＜ｃｈｉｎｏｏｋ．ｕｏｒｅｇｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ｈｔｍｌ＞も参照。さらに、細胞／組織特異的プロモータも、従来技術において周知である。
【００６９】
いくつかの実施形態においては、転写制御エレメントは誘導性である。例えば、誘導性プロモータの非限定的な例には、メタロチオニンプロモータおよびマウス乳癌ウイルスプロモータが含まれる。本発明の組換えベクターの使用に有効なプロモータおよびエンハンサの他の例には、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＥＢＶ（エプスタイン―バーウイルス）、レトロウイルス、アデノウイルスプロモータおよびエンハンサ、および平滑筋特異的プロモータおよびエンハンサが含まれるが、これらに限定されない。異種プロモータとしての使用に適しうる強力な構成的プロモータには、アデノウイルス主要後期プロモータ、サイトメガロウイルス最初期プロモータ、β―アクチンプロモータ、またはβ―グロビンプロモータが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより活性化されるプロモータも、用いられうる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、遺伝子発現を制御するために使用されている誘導性プロモータには、テトラサイクリンオペロン、ＲＵ４８６、メタロチオネインプロモータ等の重金属イオン誘導性プロモータ；ＭＭＴＶプロモータまたは成長ホルモンプロモータ等のステロイドホルモン誘導性プロモータ；アデノウイルスＥ１Ａタンパク質により誘導可能なアデノウイルス初期遺伝子プロモータまたはアデノウイルス主要後期プロモータ等の、ヘルパーウイルスにより誘導可能なプロモータ；ＶＰ１６または１ＣＰ４等の、ヘルペスウイルスタンパク質により誘導可能なヘルペスウイルスプロモータ；ワクシニアまたはポックスウイルス誘導性プロモータまたはポックスウイルスＲＮＡポリメラーゼにより誘導可能なプロモータ；ポックスウイルスＲＮＡポリメラーゼにより誘導可能である、Ｔ７ファージからのもの等の細菌プロモータ；またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはエクジソンからのもの等の細菌プロモータが含まれる。一実施形態においては、プロモータエレメントは、低酸素ストレス中にタンパク質安定性および固有の転写能力の両方の大幅な増加を示す主要な哺乳類の転写因子の一つである、低酸素―誘引因子―１（ＨＩＦ―１）により認識される低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）である。ＨＲＥは、ＶＥＧＦおよびＥｐｏおよびいくつかの他の遺伝子の５’または３’隣接領域において報告されている。コア共通塩基配列は、（Ａ／Ｇ）ＣＧＴ（Ｇ／Ｃ）Ｃである。ＥｐｏおよびＶＥＧＦ遺伝子から単離されたＨＲＥｓが、低酸素腫瘍における自殺遺伝子およびアポトーシス遺伝子発現等、いくつかの遺伝子を制御することにより、腫瘍死滅を増強するために用いられている。
【００７１】
さらに、特定の細胞内位置における導入遺伝子の発現が所望される場合には、導入遺伝子が、従来技術で広く実践される組換えＤＮＡ技術により、対応する細胞内局在化配列に操作可能に連結されうる。例示的な細胞内局在化配列には、（ａ）遺伝子産物の分泌を細胞外に導くシグナル配列；（ｂ）細胞の形質膜または他の膜コンパートメントへのタンパク質の付着を許容する、膜アンカードメイン；（ｃ）コードされたタンパク質の核への転位を媒介する核局在化配列；（ｄ）コードされたタンパク質を主にＥＲに限定する小胞体保留配列（例えばＫＤＥＬ配列）；（ｅ）タンパク質を細胞膜と結合するために、タンパク質がファルネシル化されるように設計されうる；または、（ｆ）コードされたタンパク質生成物の特異的細胞内分布に関わる任意の他の配列が含まれるが、これに限定されない。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法で利用されるベクターには、ＳＶ―４０、アデノウイルスの誘導体、レトロウイルス由来のＤＮＡ配列および機能的哺乳類ベクターおよび機能的プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから得られるシャトルベクターが含まれうる。真核生物発現ベクターは、例えば参照により本明細書に組み込まれる、ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７―３４１（１９８２）；Ｓｕｂｒａｍｉｎｉ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４―８６４（１９８１），ＫａｕｆｉｎａｎｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１―６２１（１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４６５４―４６５９（１９８３）およびＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６―４２２０（１９８０）により記載されるもののように、周知である。本発明の方法で使用されるベクターは、ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスのベクターでありうる。複製欠損アデノウイルスが、好ましい。例えば、末端反復配列に含まれるウイルス制御配列の制御下で、レトロウイルスの構造遺伝子が目的の単一遺伝子により置き換えられる「単一遺伝子ベクター」、例えばマロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕｌＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびマウス骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭｕＭＰＳＶ）、および、細網内皮症ウイルス（Ｒｅｖ）およびニワトリ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）等のトリレトロウイルスが使用されればよく、参照により本明細書に組み込まれるＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎｄｅｒｓｅｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８―６１４（１９８８）に記載される。
【００７３】
複数の遺伝子が導入されうる組換えレトロウイルスベクターも、本発明の方法に従って使用されうる。独立プロモータの制御下のｃＤＮＡを含む内部プロモータを伴うベクター、例えば、ヒトアデノシンデアミナーゼ（ｈＡＤＡ）のｃＤＮＡがそれ自体の制御配列、ＳＶ４０ウイルス（ＳＶ４０）からの初期プロモータを伴って挿入された選択可能マーカー（ｎｅｏＲ）を伴うＮ２ベクターに由来するＳＡＸベクターが設計され、従来技術において公知の方法により本発明の方法にしたがって使用されうる。
【００７４】
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスベースの発現系が利用されうる。アデノウイルスが発現ベクターとして使われる場合においては、（例えば、治療可能薬剤をコードする）目的のヌクレオチド配列が、アデノウイルス転写または翻訳制御複合体、例えば後期プロモータおよびトリパータイトリーダー配列に連結されうる。その後このキメラ遺伝子が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入されうる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）への挿入により、感染宿主において生存可能およびＡＱＰ１遺伝子産物を発現可能な組換えウイルスが生じる（例えばＬｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８  １：３６５５―３６５９（１９８４）を参照）。
【００７５】
挿入された治療ヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために、特異的開始シグナルも必要とされうる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。治療遺伝子またはｃＤＮＡ全体が、それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含めて、適切な発現ベクターに挿入される場合には、追加的な翻訳制御シグナルは必要ないであろう。しかし、治療コード配列の一部だけが挿入される場合には、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルが提供されればよい。さらに、インサート全体の翻訳を確保するために、開始コドンが所望のコード配列の読み枠とそろっていればよい。これらの外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の様々な起源のものでありうる。適切な転写エンハンサエレメント、転写ターミネータなどの包含により、発現の効率が高められうる。（例えばＢｉｔｔｎｅｒ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５３：５１６−５４４（１９８７）を参照）。
【００７６】
いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲシグナリングの遮断または阻害に向けられた生物活性剤を変更されたレベルで産出するために、前述のベクターの利用により、グリア細胞等の神経細胞が遺伝子操作される。一実施形態においては、このような薬剤は、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２シグナリングを遮断または阻害する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の遺伝子操作またはトランスフェクションは、本明細書に上述した参考文献にて説明され、米国特許第６，９９８，１１８号；６，６７０，１４７号または６，４６５，２４６号に開示されるような、公知技術の方法を利用して行われうる。
【００７７】
いくつかの実施形態においては、生物活性剤が投与され、ＣＸＣケモカインを介したシグナリングに関わる一つ以上のタンパク質の発現レベルの変更をもたらしうる。あるいは、例えば神経細胞を生物活性剤と接触させて、ＣＸＣケモカインを介したシグナリングに関わる一つ以上のタンパク質の発現の変化を提供することにより、本明細書に記載の神経細胞が修飾されうる。一実施形態においては、このようなシグナリングはＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を介したシグナリングである。さらに、ポリペプチドの発現レベルを測定する方法は、従来技術の当業者に公知である。
【００７８】
本発明の一つ以上の方法で使用される神経細胞の例には、グリア細胞が含まれる。グリアは、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含むマクログリア、およびミクログリアに分けられる。ＣＮＳの微細環境中では、アストロサイトが支持および栄養を提供し、オリゴデンドロサイトは絶縁を提供し、ミクログリアが免疫防御を提供する。中間フィラメントタンパク質のグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現により一般に同定されるアストロサイトは、脳のホメオスタシスの維持を助け、神経興奮性を変更しうる、様々なイオンチャネル、輸送体、および神経伝達物質レセプターを有する。さらに、アストロサイトは、内皮細胞と相互作用し、これらの相互作用は、血液脳関門（ＢＢＢ）の発達および維持に重要であると考えられる。アストロサイトは、増殖、形態変更、増加プロセス、およびＧＦＡＰ発現の増加により、ＣＮＳ損傷に反応することが知られている。アストロサイトーシスまたはアストログリオーシスと称されるこの活性化は、細胞外基質分子（ＥＣＭ）の緻密繊維性瘢痕への沈着をもたらしうる。損傷に対するこのような反応は、修復に有害であると考えられる。さらに、損傷の後に、アストロサイトが、グルタミン酸レセプターを活性化して、興奮毒性および周辺細胞の死がもたらされうる。
【００７９】
本発明の神経細胞には、軸索を包んで情報が伝達される速度および確実性を高める脂肪絶縁体であるＣＮＳミエリンの、産生および維持を典型的に担うマクログリア細胞である、オリゴデンドロサイトも含まれる。オリゴデンドロサイトは、ＣＮＳにおいて、典型的にはまず脊髄および脳の腹側の脳室帯および脳室下帯から発生する。脊髄のオリゴデンドロサイトは、胚発生の間に典型的に脳室帯から生じ、その後白質に移動し、そこで増殖および分化する（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６７：４５１―４６７（２００２））（図２３）。それらの成熟および分化の間に、オリゴデンドロサイトは典型的に、細胞形態および特異的分子マーカー発現の明白な変化（図２４）により特徴づけられる、一連の成長段階を経る。各細胞集団に対するこれらのマーカーの特異性により、異なる段階にある細胞の同定および単離が可能になる。
【００８０】
いくつかの実施形態においては、グリア細胞はミクログリアであり、それは、名から示唆されるとおり三つのＣＮＳグリア細胞の中で最も小さく、それらが関連する骨髄由来単球およびマクロファージと特性を共有する。それらは、リンパ系組織の骨髄前駆細胞に由来し、その発達上の血管形成の間にＣＮＳに至ると考えられる。静止ミクログリアは、垂直な脊椎のような突起を伴う細長い双極細胞体を有する。ミクログリアは、高運動性の細胞であり、活性化されると、食作用、抗原の提示、および炎症性サイトカインの分泌を伴って、ＣＮＳにおいて免疫細胞のように働くと考えられる。アストロサイトおよびミクログリアは、抗原提示細胞として働きうるため、この細胞挙動が免疫反応を増幅し、無制御のミエリン崩壊につながりうる。
【００８１】
ある実施形態では、本発明の方法で利用される一つ以上の薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、またはモジュレータ）は、ＣＸＣケモカインおよびその対応するレセプターに結合する、抗体および免疫グロブリン変異体である。これらの薬剤は、線状または環化された形において提供されればよく、自然において一般に見られない少なくとも一つのアミノ酸残基または少なくとも一つのアミド同配体を選択的に含む。これらの化合物は、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、脂質化または他のプロセスにより修飾されうる。
【００８２】
様々な実施形態において、このような抗体により標的とされる一定のケモカインは、ＥＬＲケモカインである。‘ＥＬＲ’ケモカインは、そのＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２レセプターを介して炎症細胞を化学的に誘引し、活性化する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：５６５―５６８（１９９８）；ＡｈｕｊａおよびＭｕｒｐｈｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０５４５―２０５５０（１９９６））。ＣＸＣＲ１は典型的に、ＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ６／顆粒球走化性タンパク質―２（ＧＣＰ―２）に特異的であり、ＣＸＣＲ２は典型的に、ＣＸＣＬ８を高親和性で結合するが、マクロファージ炎症性タンパク質―２（ＭＩＰ―２）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ―７８、およびＣＸＣＬ６もやや低い親和性で結合する（例えば、ＢａｇｇｉｏｌｉｎｉおよびＭｏｓｅｒ、Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：６７５―６０５（１９９７）を参照）。ヒトＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２によりトランスフェクションされた細胞株におけるＣＸＣＬ８シグナリングは、概して等力の走化性応答を誘導する（Ｗｕｙｔｓ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：６７―７３（１９９８）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２３８３０―２３８３６（１９９８））。
【００８３】
様々な実施形態において、ＣＸＣを介したシグナリングを調節するために、抗ＣＸＣＲまたは抗ＣＸＣＬ抗体が対象に投与されて、グリア細胞増殖および／または分化の増強、および／または免疫細胞浸潤の減少がもたらされる。一実施形態においては、このような抗体は、例えば、ＣＸＣＲまたはＣＸＣＬの活性または発現レベルを阻害することにより、ＣＸＣを介したシグナリングを減少する。いくつかの実施形態では、ＣＸＣ―シグナリングを阻害する方法において、抗体がＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＥＬＲ＋ＣＸＣケモカイン、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７またはＣＸＣＬ８に特異的でありうる細胞／対象に、抗体が投与される。様々な実施形態において、抗体は、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ６またはＩＬ―８に特異的である。一実施形態においては、抗体は、ＡＭＸ―ＩＬ―８である（Ａｂｇｅｎｉｘ）。（Ｍａｈｌｅｒ等、Ｃｈｅｓｔ  １２６：９２６―９３４（２００４））。別の実施形態においては、抗体は、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１、またはＣＸＣＲ２に特異的である。いくつかの実施形態においては、一つ以上の薬剤が、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２シグナリングを遮断または阻害する。別の実施形態においては、このような一つ以上の薬剤が、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５またはＣＸＣＬ８を含むがこれに限られない、ＣＸＣＬｓを遮断または阻害する。一実施形態においては、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、またはそれらの組み合わせを遮断するために、一つ以上の薬剤が投与される。
【００８４】
本明細書に記載のケモカイン抗原に特異的な抗体の生産は、参照により各関連部分が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４９１，９１６号；６，９８２，３２１号；５，５８５，０９７号；５，８４６，５３４号；６，９６６，４２４号および米国特許出願公開第２００５００５４８３２号；２００４０００６２１６号；２００３０１０８５４８号；２００６００２９２１号および２００４０１６６０９９号に開示されるもの等、当業者に公知である。単なる一例においては、抗原を含む組成物をマウスに注射するステップと、血清サンプルを除去することにより抗体産生の存在を検証するステップと、Ｂリンパ球を得るために脾臓を除去するステップと、ハイブリドーマを生産するためにＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合するステップと、ハイブリドーマをクローニングするステップと、注射された抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択するステップと、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養するステップと、ハイブリドーマ培養から抗体を単離するステップにより、単クローン抗体が得られる。様々な確立した技術により、ハイブリドーマ培養から単クローン抗体が単離および精製されうる。このような単離技術には、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、およびイオン交換クロマトグラフィが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎの２．７．１  ２．７．１２頁および２．９．１  ２．９．３頁を参照。ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，７９  １０４頁のＢａｉｎｅｓ等、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），”（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）も参照。
【００８５】
標準的な技術を用いて、抗体作製のための、適切な量の十分に特徴づけされた抗原が得られる。例えば、Ｔｅｄｄｅｒ等、米国特許第５，４８４，８９２号明細書（１９９６）により記載される沈殿した抗体を用いて、細胞からケモカイン抗原が免疫沈降されうる。あるいは、目的の抗原を過剰生産するトランスフェクションされた培養細胞から、ケモカイン抗原タンパク質が得られる。公開されたヌクレオチド配列を用いて、これらのタンパク質の各々をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターが構築されうる。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１３７―１４６（１９９１）；Ｗｉｌｓｏｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５０１３―５０２４（１９９３）を参照。例として、相互プライミングロングオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡ分子を合成することにより、ＣＤ３をコードするＤＮＡ分子が得られる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，８．２．８〜８．２．１３頁（１９９０）を参照。また、Ｗｏｓｎｉｃｋ等、Ｇｅｎｅ  ６０：１１５―１２７（１９８７）；およびＡｕｓｕｂｅｌ等（編）、ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，第３版、８―８〜８―９頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５）も参照。ポリメラーゼ連鎖反応法を用いた確立された技術により、長さが１．８キロベースの大きさの遺伝子を合成することができる。（Ａｄａｎｇ等、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：１１３１―１１４５（１９９３）；Ｂａｍｂｏｔ等、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２：２６６―２７１（１９９３）；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１５巻：ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：ＣＵＲＲＥＮＴ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｗｈｉｔｅ（編）、２６３  ２６８頁の、Ｄｉｌｌｏｎ等、“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ，”（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９３））。変化形においては、目的の抗原をコードするｃＤＮＡで安定的にトランスフェクションされたネズミ前Ｂ細胞株で免疫したマウスからの脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合することにより、単クローン抗体が得られる。（Ｔｅｄｄｅｒ等、米国特許第５，４８４，８９２号を参照。）
一実施形態においては、比較的低用量の、裸の抗体全体または裸の抗体全体の組み合わせが使用される。いくつかの実施形態においては、抗体フラグメント、したがって完全抗体未満のものが利用される。他の実施形態においては、薬物、毒素または治療ラジオアイソトープと抗体の結合体が、有用である。二つ以上の抗原に結合するハイブリッド抗体を含む、ケモカイン抗原に結合する二重特異性抗体融合タンパク質が本発明により使用されうる。好ましくは、二重特異性およびハイブリッド抗体は、Ｔ細胞、形質細胞またはマクロファージ抗原をさらに標的とする。したがって、抗体には、単一特異性または多重特異性でありうる、裸の抗体および結合抗体および抗体フラグメントが含まれる。
【００８６】
本発明の一つ以上の方法において、マーカータンパク質およびその機能的フラグメントが、抗原特異的免疫調節成分として、抗原特異的寛容を誘導するために利用され、ミエリン修復を誘導するために送達される薬剤と組み合わされて相乗的治療結果をもたらしうる。（オリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞を含む）ミエリン形成細胞のマーカータンパク質の非限定的な例は、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシル基転移酵素（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、オリゴデンドロサイト―ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質０（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群より選択されうる。ＭＰＺ、ＰＭＰ２２およびＰ２は、シュワン細胞のいくつかのマーカーである。
【００８７】
いくつかの実施形態においては、ケモカイン―シグナリング阻害剤は、ｒｅｐｅｒｔａｘｉｎ（図１１）、ＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２アンタゴニスト（図１０Ａ〜１０Ｂ）（Ｂｉｚｚａｒｒｉ等、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１２：１３９―１４９（２００６））、ＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２アロステリック阻害剤（図１０Ｃ）（Ｂｉｚｚａｒｒｉ等、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１２：１３９―１４９（２００６））および米国特許第７，００８，９６２号に開示されるジアニリノスクアレート等のＩＬ―８アンタゴニストを含むがこれに限られない、低分子である。他の阻害剤には、３，４，５―トリ置換アリールニトロン（米国特許出願公開第２００５０２１５６４６号）および米国特許出願公開第２００６００１４７９４号に開示されるＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２アンタゴニストが含まれうる。いくつかの実施形態においては、生物活性剤は、米国特許出願公開第２００６０２３３７４８号（ペプチド）に開示されるようなＩＬ―８ミメティクスまたは第２００７０１６７３６０号に開示されるようなｓＲＡＧＥでありうる。
ＩＩＩ．細胞移植
本発明の別の態様では、露出軸索のミエリン修復または再ミエリン化に関わる細胞が、対象に投与され、当該細胞が、ＣＸＣシグナリングの低下、例えばＣＸＣＲ２シグナリングの低下を有するように改変される。このような細胞は、培養され、適切なベクターでトランスフェクションされて、細胞増殖、分化、または損傷または傷害部位（例えば脱髄部位）への移動の増強につながるポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態においては、再ミエリン化またはミエリン修復に関わる細胞が、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、またはＣＸＣＬ８の発現低下等、ＣＸＣリガンド発現が低下するように改変される。他の実施態様においては、細胞のＣＸＣレセプター発現が低下する。いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲ２またはそのリガンド、例えばＣＸＣＬ１を遮断または阻害するように、細胞が改変される。一実施形態においては、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を遮断または阻害するように、細胞が改変される。
【００８８】
様々な実施形態において、細胞（「細胞種類」）は、本明細書に開示されるものである。例えば、このような細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）、シュワン細胞（ＳＣｓ）、嗅覚鞘性細胞、アストロサイト、ミクログリアおよび神経幹細胞（ＮＳＣｓ）である。いくつかの実施形態においては、一つ以上の細胞種類が、ケモカイン発現およびケモカインレセプター発現を阻害するために改変され、神経障害を治療するために対象に投与される。一実施形態においては、ＯＰＣｓおよびアストロサイトを含む二つの細胞種類が投与される。いくつかの実施形態においては、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）の成熟オリゴデンドロサイトへの分化を促進するために、薬剤が投与される。あるいは、このような薬剤が、ミエリン形成に関わる細胞またはミエリン形成に関連した機能的相互作用に関わる細胞の増殖を誘導しうる。このような神経細胞には、ＯＰＣｓ、シュワン細胞（ＳＣｓ）、嗅覚鞘性細胞、アストロサイト、ミクログリアおよび神経幹細胞（ＮＳＣｓ）が含まれるがこれに限定されない。薬剤は、ＯＰＣｓ等のグリア細胞の移動も誘導しうる。生物活性剤の投与の前、同時、または後に、このような神経細胞が投与されうる。他の実施形態においては、一つ以上の種類の神経細胞が、一つ以上の種類の生物活性剤とともに投与されうる。明確のため、用語「種類」は、例えば、異なる種類の細胞（例えばオリゴデンドロサイトとアストロサイト）または異なる種類の生物活性剤（例えば抗体、アンチセンス分子、または低分子）を意味する。
【００８９】
一実施形態においては、細胞は、ＮＧ２プロテオグリカンを発現するグリア細胞（ＮＧ２（＋）細胞）であるが、それは、成熟オリゴデンドロサイトを生む能力に基づいて、中枢神経系（ＣＮＳ）のオリゴデンドロサイト前駆体（ＯＰＣｓ）であると考えられる。一実施形態においては、ＣＸＣＲ２により媒介されるケモカイン―シグナリングを調節するために、生物活性剤が対象に投与され、その結果ＮＧ２＋ＯＰＣｓの数が増加する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、シュワン細胞（ＳＣｓ）、嗅覚鞘性細胞、アストロサイト、ミクログリアまたは神経幹細胞（ＮＳＣｓ）が培養され、ケモカインをコードするベクターで形質転換され、移植前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させられる。他の実施形態においては、細胞が、ＣＸＣを介したシグナリングを阻害するタンパク質を発現するように、ｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクションまたは遺伝学的に改変されうる。
【００９１】
いくつかの実施形態においては、ミエリン産生細胞またはその前駆細胞には、胎児または成人ＯＰＣｓが含まれるが、これに限られない。一実施形態においては、ＯＰＣは、Ａ２Ｂ５＋ＰＳＡ−ＮＣＡＭ−表現型である（初期オリゴデンドロサイトマーカーＡ２Ｂ５が陽性であり、ポリシアル酸化神経細胞接着因子が陰性）。
【００９２】
様々な動物モデルにおいて、ＣＮＳ軸索の再ミエリン化が示されている。多くの最近の研究が、脱髄疾患における細胞移植の使用と関連した新技術および新規の機構を以後示している。成人脳から単離されたヒトＯＰＣｓは、ミエリン形成異常のマウス突然変異体に移植されると、裸の軸索を有髄化できた。重要なことに、成人前駆細胞の使用は、倫理的問題を回避しうる。ＯＰ細胞が内因性再ミエリン化を担う一方、ＮＳＣｓは、ミエリン修復を促進するための細胞の代用源である。ＮＳＣｓは、成人ＣＮＳに見られ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで大量に増殖させることができ、分化してＯＬｓ、アストロサイト、または神経細胞を形成できる。ＮＳＣｓは、再発または慢性型ＥＡＥを有する齧歯類に移植されると、ＣＮＳ炎症および脱髄のエリアに移動し、グリア細胞運命を優先的に選択することが示されている。さらに、移植マウスにおける臨床疾患の減衰が、脱髄病変の修復および軸索損傷の減少に関連づけられている。組織分析により、移植されたＮＳＣｓが主にＰＤＧＦＲ＋ＯＰ細胞に分化したことが確認された。
【００９３】
興味深いことに、ＮＳＣ移植ＥＡＥマウスにおいてＯＰ細胞の数が増加する一方、これらの細胞の大部分はドナー由来でなく、移植細胞が内因性オリゴデンドログリアの増殖を制御したことが示唆される。ＮＳＣｓがＥＡＥ改善および病変修復を促進する機構は、免疫抑制および神経保護機能を示す。ＮＳＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方でＴ細胞のアポトーシスを誘導し、ＮＳＣ移植ＥＡＥ齧歯類においてＣＮＳ浸潤Ｔ細胞を減少させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでミエリンペプチド特異的Ｔ細胞増殖を阻害することが示されている。ＣＮＳ炎症を減少および／またはＯＬ系統細胞生存を増強し、宿主ＣＮＳにおける再ミエリン化を促進しうる、神経栄養因子および様々な成長因子により、免疫調節および提唱される神経保護の性質が媒介されうる。
【００９４】
いくつかの実施形態においては、一つ以上の所望の生物活性剤の発現を可能にするために、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）、シュワン細胞（ＳＣｓ）、嗅覚鞘性細胞、および神経幹細胞（ＮＳＣｓ）が、従来技術において公知または本明細書に開示の方法を用いて、一つ以上の発現ベクターでトランスフェクションされる。このような生物活性剤は、ＣＸＣを介したシグナリングを妨げることにより、免疫調節を導きうる。別の実施形態においては、このような薬剤が、オリゴデンドロサイトの病変部位における増殖または病変部位への移動を促進しうる。さらに別の実施形態においては、このような薬剤が、ＯＰＣの成熟オリゴデンドロサイトへの分化および／または増殖または病変部位への移動を促進しうる。様々な実施形態において、培養における増殖の前、同時または後に、細胞がトランスフェクションされる。
【００９５】
当然のことながら、侵襲性、外科的、最小限侵襲性および非外科的手順を含む、従来技術で公知の方法を使用して、移植が行われる。対象、標的部位、および送達される薬剤（単数または複数）に応じて、従来技術で公知の方法を使用して、細胞の種類および数が所望どおり選択されうる。
ＩＶ．スクリーニングアッセイ
Ａ．細胞培養
本発明のいくつかの態様は、候補薬剤をスクリーニングして、このような薬剤がＣＸＣを介した細胞シグナリングを阻害するかを決定する方法を対象とする。免疫調節、ミエリン修復、または軸索保護を誘導する薬剤を組み合わせにおいてスクリーニングして、どの組み合わせが神経障害の治療において有益かを決定しうる。いくつかの実施形態では、神経細胞、特にグリア細胞、より具体的にはアストロサイト、オリゴデンドロサイト、ＳＣｓ、ＯＰＣｓまたはＮＳＣｓがスクリーニングのために培養および／または遺伝子操作される。
【００９６】
一実施形態においては、このような細胞培養に一つ以上の生物活性剤を接触させ、このような接触の前、同時、または後に、一つ以上のミエリン修復または軸索保護を誘導する薬剤も細胞に投与して、いずれの生物活性剤または生物活性剤の組み合わせが所望の効果または相乗効果をもたらすかを決定する。例えば、経時顕微鏡検査を利用して、前駆細胞種類からミエリン形成オリゴデンドロサイトへの転換を明らかにすることにより、培養において相乗効果が観察されうる。さらに、分化細胞検出における便利な蛍光顕微鏡法を促進するために、前駆細胞が膜標的化形態の強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）でトランスフェクションされうる。したがって、様々な実施形態において、米国特許第７，００８，６３４号；６，９７２，１９５号；６，９８２，１６８号；６，９６２，９８０号；６，９０２，８８１号；６，８５５，５０４号；または６，８４６，６２５号に開示されるような、従来技術で周知の技術を利用して、細胞が組み合わせ処置またはスクリーニングプロセスの構成成分であるマーカータンパク質または生物活性剤を発現するように、培養および／または遺伝子改変されうる。
【００９７】
一実施形態においては、発現ベクターが、細胞特異的プロモータエレメント（例えば、オリゴデンドロサイトを含むグリア細胞に特異的なＰＬＰまたはＰＤＧＦα）から発現されるマーカータンパク質（例えば蛍光マーカー）をコードしうる。さらに、同じ細胞が、ＣＸＣＬ１またはＣＸＣＬ８等のＣＸＣケモカインをコードする第二発現ベクターでトランスフェクションされうる。あるいは、単一の発現コンストラクトが、マーカータンパク質およびＣＸＣケモカイン等、二つ以上のポリペプチドをコードしうる。このような実施形態においては、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞または組織培養またはｉｎ  ｖｉｖｏ画像化等のための）蛍光顕微鏡法を含むがこれに限られない、公知技術の標準的な顕微鏡検査技術を使用して、ＣＸＣケモカインおよびマーカータンパク質を発現する細胞が検出されうる。
【００９８】
いくつかの実施形態においては、構成的、誘導性または神経細胞特異的プロモータに操作可能に連結され、ケモカイン―レセプターリガンドをコードする核酸分子が、神経細胞にトランスフェクションされる。このような細胞は、ＣＸＣＬを変更されたレベルで発現して、ケモカインを介したシグナリングが調節されるように形質転換されうる。さらに、このような細胞が、神経細胞増殖および／または移動を増強するために、対象動物に投与されうる。一実施形態においては、あるＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８またはＣＸＣＬ１０の発現変更を提供するために、細胞が遺伝的に改変される。一実施形態においては、神経細胞が遺伝子改変されることにより、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２の発現が増加する。本明細書に記載され当業者によく知られた要素および方法を利用した、ｈｏｍｏｌｇｏｕｓ組換え、組み込み、またはプラスミドまたはウイルスベクターの利用により、所望のＣＸＣＬをコードする核酸が標的細胞に形質転換されればよい。様々な実施形態実施形態において、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２の発現を減少させるために、神経細胞が遺伝子改変される。
【００９９】
当業者には当然のことながら、グリア細胞における発現レベルは、このようなグリア細胞に投与される発現コンストラクト上にコードされる所望のポリペプチドの発現により、変更されうる。あるいは、ＣＸＣＬ１またはＣＸＣＲ２等、所望のポリペプチドの発現にそれ自体が影響する生成物（例えばアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、アプタマー）をコードする発現コンストラクトを利用することにより、発現が調節されうる。アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡまたはアプタマーは、当業者によく知られ、または本明細書に上述されたプロセスを利用して選択されうる。上述のもののような抗体および低分子等の他の生物活性剤も、ＣＸＣシグナリングに関わるポリペプチド等、所望のポリペプチドの発現を変更しうる。ＣＸＣＲ２および／またはＣＸＣＲ１シグナリングは、その発現またはその上流のレギュレータまたはリガンド、またはその下流のエフェクターの発現の変更により、影響されうる。
【０１００】
遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイにおいて実時間で行われうる。一態様では、増幅産物が、ＤＮＡインターカレータおよびＤＮＡグルーブバインダを含むがこれに限られない蛍光ＤＮＡ―結合剤により、直接視覚化されうる。二本鎖ＤＮＡ分子に取り入れられるインターカレータの量が、増幅ＤＮＡ産物の量と典型的に比例するため、従来技術の光学系を使用して挿入色素の蛍光を定量化することにより増幅産物の量を都合よく決定できる。この用途に適したＤＮＡ―結合色素には、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、リン酸クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどが含まれる。
【０１０１】
別の態様においては、増幅産物の検出および定量化を促進するために、配列特異的プローブ等の他の蛍光ラベルが、増幅反応において用いられうる。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的検出に依存する。それは、蛍光、標的特異的プローブ（例えばＴａｑＭａｎプローブ）を利用し、特異性および感受性の増加がもたらされる。プローブベースの定量的増幅を実行する方法は、従来技術において確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号において教示される。
【０１０２】
さらに別の態様においては、ＣＸＣ―ケモカイン関連遺伝子と配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを用いた従来のハイブリダイゼーションアッセイが実行されうる。典型的には、ハイブリダイゼーション反応において、プローブに試験対象から得られる生体試料に含まれる標的ポリヌクレオチド（例えばＣＸＣＬまたはＣＸＣＲ遺伝子）との安定複合体を形成させる。当業者には当然のことながら、アンチセンスがプローブ核酸として使用される場合には、試料中に提供される標的ポリヌクレオチドが、アンチセンス核酸の配列に相補的であるように選択される。反対に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合には、標的ポリヌクレオチドが、センス核酸の配列に相補的であるように選択される。
【０１０３】
当業者に公知のように、ハイブリダイゼーションは様々なストリンジェンシーの条件下で実行されうる。本発明の実行に適切なハイブリダイゼーション条件は、プローブと標的ＣＸＣ関連遺伝子の間の認識相互作用が、十分に特異的かつ十分に安定するようなものである。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は、従来技術において公知であり、公開されている。例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、（１９８９），上記；Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，第２版）を参照。ハイブリダイゼーションアッセイは、ニトロセルロース、ガラス、シリコン、および様々な遺伝子アレイを含むがこれに限られない任意の固体担体上に固定されたプローブを使用して形成されうる。ハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号に記載されるような、高密度遺伝子チップ上で行われる。
【０１０４】
ハイブリダイゼーションアッセイの間に形成されるプローブ―標的複合体を都合よく検出するために、ヌクレオチドプローブが、検出可能な標識に結合される。本発明の使用に適する検出可能な標識には、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物が含まれる。適切な検出可能な標識の様々なものが、従来技術において周知であり、蛍光または化学発光標識、放射性同位体標識、酵素または他のリガンドが含まれる。様々な実施形態においては、蛍光標識または酵素タグ、例えばジゴキシゲニン、βガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体の利用が所望されうる。
【０１０５】
ハイブリダイゼーション強度を検出または定量化するために用いられる検出方法は、上に選択される標識に典型的に依存する。例えば、放射標識は、写真フィルムまたはホスホイメージャを使用して検出されうる。蛍光マーカーは、発光を検出するための光検出器を使用して、検出および定量化されうる。酵素標識は、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の反応により生成される反応生成物を測定することにより典型的に検出される。最後に、比色標識は、単に着色した標識を視覚化することにより検出される。
【０１０６】
対応する遺伝子産物を検査することによって、薬剤により誘導される発現ＣＸＣケモカイン関連遺伝子の変化を決定することもできる。タンパク質レベルの決定には、ａ）ミエリン形成細胞を含む生物サンプルに含まれるタンパク質をＣＸＣケモカイン関連タンパク質に特異的に結合する薬剤に接触させるステップと；（ｂ）そのようにして形成された任意の薬剤：タンパク質複合体を同定するステップを典型的に伴う。この実施形態の一態様においては、ＣＸＣケモカイン関連タンパク質を特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくは単クローン抗体である。
【０１０７】
前述の組成物および方法は、本明細書に後述される（例えば、ケモカインレセプターまたはそのリガンドによる）ケモカインシグナリングの遮断にむけられた、有効な量の治療剤のスクリーニングおよび治療のための方法に容易に適用され、ケモカインを介した免疫調節および／またはミエリン修復の増強をもたらしうることを理解されたい。
【０１０８】
マーカータンパク質を検出することにより、薬剤により誘導される発現ＣＸＣケモカイン関連遺伝子の変化、または薬剤により誘導される効果を決定してもよい。例えば、マーカータンパク質は、細胞の同定（例えば細胞運命マッピング）を促進するための公知技術の免疫染色技術の標的でありうる。（オリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞を含む）ミエリン形成細胞のマーカータンパク質の非限定的な例は、ＣＣ１、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、セラミドガラクトシル基転移酵素（ＣＧＴ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、オリゴデンドロサイト―ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ＮＯＧＯ、ミエリンタンパク質０（ＭＰＺ）、末梢性ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、タンパク質２（Ｐ２）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、スルファチドおよびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）からなる群より選択されうる。ＭＰＺ、ＰＭＰ２２およびＰ２は、シュワン細胞のマーカーである。
【０１０９】
必要に応じて、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは組織培養の細胞移動を追うために、たとえば、（培養またはｉｎ  ｖｉｖｏの）細胞が、蛍光マーカータンパク質を発現するように改変されうる。本発明で使用できるマーカー遺伝子の非限定的な例には、サンゴ礁由来蛍光タンパク質（ＲＣＦＰｓ）、ＨｃＲｅｄ１、ＡｍＣｙａｎ１、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ１、クラゲ蛍光タンパク質（ＦＰ）変異体、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ変異体Ｈ９、ＧＦＰ  Ｈ９―４０、ＥＧＦＰ、テトラメチルローダミン、Ｌｉｓｓａｍｉｎ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｋａｅｄｅ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｉｄｏｒｉ  Ｃｙａｎ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅおよびナフトフルオレセイン、またはこれらの強化された機能的変異体が含まれる。マーカーが本発明で使用可能である、フルオロフォアタンパク質マーカーをコードする多くの遺伝子が従来技術において周知である。ウェブサイト：＜ｃｇｒ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔｈｏｒｎｌａｂ／ｇｆｐｓ．ｈｔｍ＞を参照。より強度の高い光を放出するか、波長がシフトする蛍光タンパク質の変異型も本発明の組成物および方法で利用されうる。このような変異体は従来技術において周知であり、市販される。（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，２００５）を参照。
【０１１０】
顕微鏡観察技術により、動物から得られる細胞／組織サンプルの検査（例えば、共焦顕微鏡を用いたセクショニングおよび画像化による）ならびに生細胞の検査またはｉｎ  ｖｉｖｏの蛍光検出のいずれかにより、蛍光（例えば蛍光タンパク質をコードするマーカー遺伝子）の視覚化が行われうる。可視化技術には、従来技術において公知の共焦顕微鏡検査または光学スキャニング技術の利用が含まれるがこれに限られない。波長が増加するにともない、バックグラウンドノイズを増加させる散乱および自己蛍光の両方が減少するため、近赤外の放出波長を伴う蛍光ラベルが、一般に深部組織画像化により適する。ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化の例は、参照により各々の開示が本明細書に組み込まれる、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ等、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．１０：４１２０７（２００５）；Ｚｈａｎｇ等、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．３１：１０５４―１０６４（２００３）；Ｆｌｕｓｂｅｒｇ等、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９４１―９５０（２００５）；Ｍｅｈｔａ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１４：６１７―６２８（２００４）；Ｊｕｎｇ等；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９２：３１２１―３１３３（２００４）；米国特許第６，９７７，７３３号および６，８３９，５８６号により開示されるように、従来技術において周知である。
【０１１１】
スクリーニングアッセイも、特定のＣＸＣケモカインまたはＣＸＣＲを介したシグナリング経路を選択的に阻害する薬剤をスクリーニングおよび同定するための方法を提供しうる。例えば、薬剤が、ＣＸＣＲ２またはそのリガンドを、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、またはＣＸＣＲ４を介したシグナリング等の他のＣＸＣ関連タンパク質を介したシグナリング経路よりも効果的に阻害すること等により、ＣＸＣＲ２および／またはＣＸＣＲ１が媒介するシグナリングを阻害または遮断するかを同定するために、低分子または抗体、または他のＣＸＣ関連阻害剤候補がスクリーニングされうる。あるいは、薬剤が、ＣＸＣＲ１を選択的に阻害し、薬剤が、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、またはＣＸＣＲ４等、他のＣＸＣ関連タンパク質またはその経路よりも、ＣＸＣＲ１またはその経路の阻害において、より有効でありうる。いくつかの実施形態においては、阻害剤は、二つのＣＸＣレセプター、例えばＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２につき選択的でありうる。阻害剤は、ＣＸＣＲ３および／またはＣＸＣＲ４と比較して、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２、またはそのシグナリング経路の阻害につき、より有効でありうる。阻害剤は、ＣＸＣレセプターまたはそのリガンドを直接結合しうる。阻害剤は、ＣＸＣレセプターの活性部位、またはＣＸＣレセプターまたはリガンドの結合部位を直接結合しうる。あるいは、阻害剤は、アロステリック阻害剤でありうる。
【０１１２】
ＣＸＣＲ２発現または活性を選択的消極的に制御する、任意の種類の薬剤が、本発明の方法において選択的ＣＸＣＲ２阻害剤として使用されうる。ＣＸＣＲ１発現または活性を選択的消極的に制御する、任意の種類の薬剤が、本発明の方法において選択的ＣＸＣＲ１阻害剤として使用されうる。さらに、ＣＸＣＲ２発現または活性を選択的消極的に制御する、任意の種類の薬剤、またはＣＸＣＲ１発現または活性を選択的消極的に制御し、許容可能な薬理学的性質を有する薬剤が、本発明の治療法で選択的ＣＸＣＲ２阻害剤および／または選択的ＣＸＣＲ１阻害剤して使用されうる。
【０１１３】
各薬剤が所定の程度に活性を阻害する濃度を決定してから、結果を比較することにより、酵素活性（または他の生物活性）の阻害剤としての薬剤の相対的効力が確立されうる。様々な実施形態において、決定は、生化学的アッセイにおいて活性の５０％を阻害する濃度、すなわち、５０％阻害濃度または「ＩＣ５０」である。ＩＣ５０決定は、従来技術において従来の公知技術を使用して行われうる。一般に、一連の濃度の検討中の阻害剤の存在下で、所与の酵素の活性を測定することにより、ＩＣ５０が決定されうる。その後、実験的に得られた酵素活性の値が、使用された阻害剤濃度に対してプロットされる。（一切の阻害剤の非存在下での活性と比較して）５０％の酵素活性を示す阻害剤の濃度が、ＩＣ５０値とされる。同じように、他の阻害濃度が、適切な活性の測定により決定されうる。例えば、ある場合には、９０％阻害濃度、すなわちＩＣ９０等を確立することが望まれうる。
【０１１４】
したがって、選択的ＣＸＣＲ２阻害剤、またはＣＸＣＲ２を介したシグナリングを選択的に阻害する阻害剤は、ＣＸＣＲ２に関して、任意または全ての他のＣＸＣＲファミリーメンバーに関するＩＣ５０値よりも少なくとも少なくとも１０倍、好ましくは２０倍、より好ましくは、少なくとも３０倍低い、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）をもつ化合物をさすものと代替的に理解されうる。したがって、選択的ＣＸＣＲ１阻害剤、またはＣＸＣＲ２を介したシグナリングを選択的に阻害する阻害剤は、ＣＸＣＲ１に関して、任意または全ての他のＣＸＣＲファミリーメンバーに関するＩＣ５０値よりも少なくとも少なくとも１０倍、好ましくは２０倍、より好ましくは少なくとも３０倍低い、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）をもつ化合物をさすものと代替的に理解されうる。
【０１１５】
例えば結合アッセイで、ＣＸＣＲ２に結合するＣＸＣＬ８を選択的に置換する阻害剤のＩＣ５０を決定することにより、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２活性が決定されうる。コントロール細胞と比較した、好中球多形核白血球（ＰＭＮｓ）の動員の量により、ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２活性が決定されてもよい。ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の両方のリガンドであるＣＸＣＬ８は、ＰＭＮ動員を促進する。ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２阻害剤の効果を決定するために、ＰＭＮ接着アッセイ、ＰＭＮ活性化アッセイ、およびＴ細胞走化アッセイが行われうる（Ｃａｓｔｉｌｌｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａ．６９：３８５―３９５（２００５））。他のＣＸＣＲｓと比較した、遺伝子の発現レベル（例えばＲＴ―ＰＣＲによる）またはタンパク質の発現レベル（例えば免疫細胞化学法、免疫組織化学法、ウェスタンブロットによる）により、ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ２の選択的阻害が決定されてもよい。
【０１１６】
別の態様においては、本発明は、グリオーシスの改善に有効な生物活性剤のスクリーニングを提供する。脱髄疾患において、アストロサイトは、自らおよびミクログリアを活性化し、グリオーシスを誘導しうる。コントロールと比較した、生物活性剤で処置した細胞における肥大した反応性アストロサイトの同定を用いて、生物活性剤がグリオーシスの改善に有効かを決定しうる。免疫細胞化学法およびドットブロットアッセイにより、脊髄アストロサイトの培養をアッセイして、分泌および結合されたコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）を分析しうる。グリア線維酸性（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒａｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ）タンパク質（ＧＦＡＰ）ならびに、ビメンチン等の他の中間フィラメントタンパク質、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳＰＧ）、またはケラタン硫酸プロテオグリカン（ＫＳＰＧ）、およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）等、アストロサイトにより産生される他のプロテオグリカンの発現も検出しうる。
【０１１７】
グリア細胞の移動の促進に有効な生物活性剤も、決定されうる。例えば、ＬＰＣの脊柱への局所注射により成人ラットに脱髄病変を作製することにより、病変部位へのＯＰＣｓの移動が決定されうる。精製した標識されたＯＰＣｓを、病変エリアまたは隣接するスライスに注射し、それらの挙動をモニタして、この系における細胞移動を追うことができる。病変（単数または複数）内の再ミエリン化のレベルをアッセイするために、コントロールおよび治療された培養物を維持しうる。各スライスが独立しているため、単一の病変動物に複数のアッセイが行われうる。ＣＸＣ―シグナリング阻害剤（例えばｒｅｐｅｒｔａｘｉｎ）が最も有効である、病変後間隔および用量を決定し、これによりｉｎ  ｖｉｖｏ研究を促進しうる。
Ｂ．動物モデル
いくつかの態様においては、免疫調節およびミエリン修復／再ミエリン化または軸索保護を目的とする生物活性剤の、有益な治療効果のある組み合わせを決定するためのスクリーニングアッセイが、動物モデルを利用して行われる。いくつかの実施形態においては、動物は、小型齧歯動物、またはシミアン種である。さらなる実施形態においては、動物は、マウス、ラット、モルモット、またはサルである。
【０１１８】
いくつかの実施形態においては、動物は、一つ以上の所望の特性を伴う、「ノックアウト」または「ノックイン」でありうる、トランスジェニック動物である。例えば、いくつかの実施形態においては、トランスジェニック動物が、免疫調節、ミエリン修復／再ミエリン化または軸索保護を促進する薬剤を発現し、または変更されたレベル（すなわちアップまたはダウン）で発現するように、改変されうる。したがって、免疫調節、ミエリン修復／再ミエリン化または軸索保護を同様に目的とした複数の異なる生物活性剤をスクリーニングするために、このような動物が利用され、トランスジェニック動物が一つのエンドポイントを目的とした薬剤を含む場合には、異なるエンドポイント（単数または複数）を目的とした薬剤が動物に投与され、逆も同様にして、本明細書に上述される神経障害または関連した状態の相乗的治療結果をもたらす治療剤の組み合わせ候補が同定される。
【０１１９】
上述のように、トランスジェニック動物は、「ノックアウト」および「ノックイン」という二つのタイプに広く分類できる。「ノックアウト」は、好ましくは標的遺伝子発現がわずかまたは検知不能となるように、標的遺伝子の機能の減少をもたらすトランスジェニック配列の導入による、標的遺伝子の変更を有する。「ノックイン」は、例えば、標的遺伝子の追加的コピーの導入により、または標的遺伝子の内因性コピーの発現増強を提供する制御配列を操作可能に挿入することにより、標的遺伝子の発現増加をもたらす宿主細胞ゲノムの変更を有するトランスジェニック動物である。ノックインまたはノックアウトトランスジェニック動物は、標的遺伝子に関してヘテロ接合またはホモ接合でありうる。ノックアウトおよびノックインはいずれも、「バイジェニック」でありうる。バイジェニック動物は、少なくとも二つの変更された宿主細胞遺伝子を有する。一実施形態においては、バイジェニック動物は、神経細胞特異的リコンビナーゼをコードするトランスジーンと、神経細胞特異的マーカー遺伝子をコードする別のトランスジェニック配列を担持する。
【０１２０】
他の実施形態においては、神経細胞の再ミエリン化を促進するかこれに有益である生物活性剤の開発にも、トランスジェニックモデル系が使用されうる。例えば、免疫調節、ミエリン修復または軸索保護の表現型をもたらす薬剤を発現するように改変されたトランスジェニック動物が、未知化合物をスクリーニングして、（１）化合物が免疫寛容を増強し、炎症反応を抑制し、または再ミエリン化を促進するか、および／または（２）化合物が動物モデルにおいて相乗的治療効果をもたらすかを決定するための方法において利用されうる。さらに、ｅｘ  ｖｉｖｏの技術を含めて、細胞ベースまたは細胞培養の設定で行われるさらなる研究またはアッセイのために、本発明のトランスジェニック動物から神経細胞が単離されうる。さらに、モデル系を用いて、テスト薬剤が、有害効果を与えるか、または再ミエリン化を減少させるか（例えば脱髄後の傷害）をアッセイしうる。
【０１２１】
胚の顕微操作のための技術の進歩により、現在では哺乳類受精卵への異種ＤＮＡの導入も可能である。例えば、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムにより媒介される沈殿、リポソーム融合、レトロウイルスインフェクションまたは他の手段により、全能性または多能性幹細胞が形質転換されうる。そして、形質転換細胞が胚に導入された後、胚がトランスジェニック動物に成長する。一実施形態においては、インフェクションされた胚からトランスジーンを発現するトランスジェニック動物が生産されうるように、成長する胚が、所望のトランスジーンを含むウイルスベクターでインフェクションされる。他の実施形態においては、好ましくは単一の細胞分裂期において、所望のトランスジーンを胚の前核または細胞質に同時注入し、胚を成熟トランスジェニック動物に成長させる。トランスジェニック動物を作製するための、これらのおよび他の様々な方法は、従来技術において確立されているため、本明細書では詳述しない。例えば、米国特許第５，１７５，３８５号および第５，１７５，３８４号を参照。
【０１２２】
したがって、本発明は、いくつかの実施形態において、相乗効果のある、または相乗効果が高められたコンビナトリアル処置を検出および定量化するために、動物モデルを使用する方法を提供する。一実施形態においては、方法には、（ａ）免疫寛容を誘導する薬剤を発現する本発明のトランスジェニック動物において、脱髄傷害を誘導するステップと；（ｂ）候補薬剤を投与し、ミエリン修復が生じるのであればそれが生じるのを許容する時間を与えるステップと；（ｃ）細胞特異的マーカー遺伝子（単数または複数）の発現を検出および／または定量化するステップと（ｄ）再ミエリン化が生じたか、どのくらい生じたか、およびこのような再ミエリン化がコントロールと比較して増加したかを決定するステップが含まれる。このような例においては、コントロールは、疾患モデルが誘導される野生型、または候補薬剤が投与されないトランスジェニックでありうる。
【０１２３】
テスト動物に脱髄を誘導する多数の方法が、確立されている。例えば、病原体または物理的傷害、テスト動物の炎症および／または自己免疫反応を誘導する薬剤により、神経細胞脱髄をおこさせうる。様々な実施形態において、本発明の方法は、ＩＦＮ―γおよびクプリゾン（ビス―シクロヘキサノンオキサルジヒドラゾン）を含むがこれに限られない、脱髄誘導性薬剤を用いる。クプリゾン誘導性脱髄モデルは、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ等、（Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１１：１０７―１１６（２００１））に記載される。この方法では、試験動物に、クプリゾンを含む食餌が、約１〜約１０週の範囲で数週間、典型的に供給される。
【０１２４】
適切な方法による脱髄状態の誘導後、先に脱髄した病変の箇所またはその付近の再ミエリン化を許容するのに十分な時間、動物を回復させる。再ミエリン化された軸索を発達させるのに必要な時間は、異なる動物の間で異なるが、一般に少なくとも約１週間、より多くの場合には少なくとも約２〜１０週間、さらに多くの場合に約４〜約１０週間必要である。神経系における（例えば、中枢または末梢神経系における）有髄軸索の増加を観察することにより、またはミエリン形成細胞のマーカータンパク質のレベルの増加を検出することにより、再ミエリン化を確認しうる。
【０１２５】
脱髄の前、同時または後に、生物活性薬が動物に投与されてもよい。グリオーシスの量が決定され、コントロール動物と生物学的に活性な薬剤で治療された動物の間で比較されうる。グリオーシスの改善に有効な生物活性剤が、確認されうる。グリオーシスは、典型的には再ミエリン化および軸索再生に対する障壁である、グリア性瘢痕に寄与しうる。反応性アストロサイトにより、グリオーシスが誘導されうる。アストログリオーシスおよびマイクログリオーシスの存在は、脱髄不全および神経炎症性疾患に典型的な特徴であるため、アストロサイト活性化およびグリオーシスが、脱髄に寄与しうる。肥大した反応性アストロサイトの同定が、免疫細胞化学的方法により決定されうる。グリオーシスを同定するために、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ならびにビメンチン等の他の中間フィラメントタンパク質、ならびにヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳＰＧ）、ケラタン硫酸プロテオグリカン（ＫＳＰＧ）、およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）等、アストロサイトにより産生されるプロテオグリカンの発現も検出されうる。薬剤がグリオーシスの改善に有効かを決定するために、ＧＦＡＰ、ビメンチン、ＨＳＰＧ、ＤＳＰＧ、ＫＳＰＧ、および／またはＣＳＰＧの発現が、生物活性剤を伴ってまたは伴わずに治療された細胞の間で比較されうる。
【０１２６】
ＣＸＣＲ２および／またはＣＸＣＲ１を選択的に阻害する生物学的に活性な薬剤が、動物に投与されうる。ＣＸＣＲ２および／またはＣＸＣＲ１タンパク質のレベルがアッセイされ、傷害エリアのグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）発現と比較されうる。脊髄が切断され、免疫組織化学法または組織学法のために処理されうる。病変全体の切片が得られ、ミエリンの染色、Ｌｕｘｏｌファストブルーで染色されればよい（図３６）。病変体積および３次元イメージを構築できる３Ｄ  Ｄｏｃｔｏｒソフトウェアプログラムを使用して、病変が再構築されうる（図３６）。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＧＦＡＰ、ＥＤ１（マクロファージ／ミクログリア）およびビメンチンに対する抗体を用いた、標準的な免疫組織化学技術を使用して、病変内のタンパク質発現が分析されうる。
Ｖ．治療法
Ａ．用量
本明細書に開示のＣＸＣを介したシグナリングを標的とする生物活性剤（例えば低分子、ｒｅｐｅｒｔａｘｉｎまたはペプチド／ポリペプチド）は、治療する患者および状態、および投与ルートに応じて、一般的に１日につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜５００ｍｇＶの用量で、例えば平均的な人では約２０ｍｇ／日で投与される。範囲が広いのは、一般に異なる哺乳類に対する治療効果の有効性に幅があるためであり、用量は典型的に人間においてラットより（単位体重あたり）２０、３０または４０倍も少ない。同様に、投与様式が、用量に大きく影響しうる。したがって、例えばラットにおける経口用量は、注射用量の十倍でありうる。典型的な用量は、毎日一回の注射または毎日複数回の注射でありうる。様々な実施形態において、このような薬剤が投与され、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を遮断または阻害するように設計される。一実施形態においては、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８またはそれらの組み合わせを遮断または阻害するために、一つ以上の薬剤が投与される。
【０１２７】
技術者には当然のことながら、用量レベルは、特定の化合物、症状の重症度、および対象の副作用に対する感受性の関数として変化しうる。いくつかの特定のペプチドは、他より強力である。いくつかの実施形態においては、所与の複合体の用量は、様々な手段により当業者によって容易に決定可能である。例えば、一つの手段は、所与の化合物の生理的能力を測定することである。
【０１２８】
いくつかの実施形態においては、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体が、治療的であると決定された用量で投与されうる。いくつかの実施形態においては、本発明の一つ以上の組み合わせ方法の範囲内において、免疫調節成分には、１日につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜５００ｍｇＶの用量の抗体、ペプチド、タンパク質、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、低分子またはアンチセンスを含むがこれに限られない、ペプチドまたはポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態においては、このような薬剤が、同じまたは異なる用量で１日に３〜５、４〜６、５〜７、または６〜１０回の間で投与される。いくつかの実施形態においては、複数のサイクルで投与が繰り返され、各サイクルに、３〜５、４〜７、６〜９、７〜１０、８〜１２、９〜１６または１０〜２１日の間の薬剤投与が含まれる。
【０１２９】
いくつかの実施形態においては、ＣＸＣを介したシグナリングを標的とする抗体が、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的な健康状態および過去の既往歴等のファクターに依存する用量で投与される。典型的には、レシピエントに、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（薬剤量／患者の体重）の範囲の、抗体成分、免疫複合体または融合タンパク質の用量を提供することが望ましいが、状況によって、それを下回るか上回る投与量も投与されうる。患者に対する抗体（または本明細書に記載の任意の生物活性剤）の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内であり、局所カテーテルによる灌流または直接的な病巣内注射によればよい。治療タンパク質を注射により投与する場合には、投与は、連続注入または単回または複数回ボーラスによればよい。静脈内注射は、抗体が速やかに分布し、循環が完全であるため、有用な投与様式を提供する。このような抗体は、本明細書に開示される任意のケモカインに特異的でありうる。様々な実施形態において、このような抗体は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８またはＩＬ―８に特異的であり、神経障害を治療する方法において、このような抗体が、必要とする対象を治療するために投与される。いくつかの実施形態においては、ＣＸＣＲｓおよび／または、ＣＸＣＬｓを標的とする二つ以上の抗体が、当該ＣＸＣＲｓおよび／またはＣＸＣＬｓを発現する細胞に投与または接触させられうる。一実施形態においては、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８またはそれらの組み合わせを遮断または阻害するために、一つ以上の抗体が投与される。
【０１３０】
他の実施形態においては、製剤における治療的に活性な抗体または抗体フラグメント（例えばＦａｂまたはＦｃ部分）の濃度は、約０．１〜１００重量％まで変化しうる。一実施形態においては、抗体または抗体フラグメントの濃度は、０．００３〜１．０モルの範囲内である。患者を治療するために、抗体または抗体フラグメントの治療上有効な用量が投与されうる。本明細書における「治療上有効な用量」とは、投与が目的とする効果（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞の同時刺激の遮断）を生じる用量を意味する。厳密な用量は、治療の目的により、当業者によって公知の技術を使用して確認可能である。用量は、体重１ｋｇあたり０．０１〜１００ｍｇまたはそれ以上の範囲、例えば体重１ｋｇあたり０．１、１、１０、または５０ｍｇであればよく、１〜１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。従来技術において周知のように、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与の時間、薬物相互作用および病気の重症度だけでなく、抗体またはＦｃ融合体の劣化、全身対局所送達、および新規プロテアーゼ合成速度を考慮した調整が必要であり得、当業者によりルーチン試験によって確認可能である。このような抗体は、本明細書に開示の任意のケモカインに特異的でありうる。様々な実施形態においては、このような抗体は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８またはＩＬ―８に特異的である。いくつかの実施形態においては、一つ以上の抗体が投与され、各々がＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２に特異的である。
【０１３１】
好ましくは滅菌水溶液の形での、抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌｌｙ、経皮、局所（例えばゲル、塗剤、ローション、クリーム等）、腹膜内、筋肉内、肺内（例えば、Ａｒａｄｉｇｍから市販される吸入可能技術ＡＥＲｘ（登録商標）、またはＩｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから市販されるＩｎｈａｎｃｅ（商標）肺送達システム）、膣内、非経口、直腸、または眼内を含むがこれに限られない様々な方法で行われうる。いくつかの場合には、例えば創傷、炎症等の治療のために、抗体またはＦｃ融合体が、溶液またはスプレーとして直接適用されうる。周知のように、医薬組成物は、導入の様式に応じてしかるべく調製されうる。様々な実施形態において、抗体が、用量あたり２０ミリグラム〜２グラムのタンパク質等の低タンパク質用量で、一回または反復的に、非経口投与される。あるいは、用量あたり２０〜１０００ミリグラムのタンパク質、用量あたり２０〜５００ミリグラムのタンパク質、または用量あたり２０〜１００ミリグラムのタンパク質の用量で、抗体は投与される。いくつかの実施形態においては、このような薬剤が、３〜５、４〜７、６〜９、７〜１０、８〜１２、９〜１６または１０〜２１日の間で投与される。いくつかの実施形態においては、投与が複数のサイクルにおいて繰り返され、各サイクルに、３〜５、４〜７、６〜９、７〜１０、８〜１２、９〜１６または１０〜２１日の間の薬剤投与が含まれる。
【０１３２】
医薬的に有用な組成物を準備するために、単独またはリポソームに結合した抗体が、公知の方法に従って調製されればよく、治療タンパク質が、薬理学上許容可能な担体と混合物において組み合わせられる。組成物は、レシピエント患者がその投与に耐えられる場合に、「薬理学上許容可能な担体」であると言われる。滅菌リン酸塩緩衝食塩水は、薬理学上許容可能な担体の一例である。他の適切な担体は、当業者に周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１９版（１９９５）を参照。
【０１３３】
療法の目的で、抗体が、薬理学上許容可能な担体中治療上有効な量で患者に投与される。この点に関して、「治療上有効な量」は、生理的に有意なものである。その存在によって、レシピエント患者の生理機能の検出可能な変化が生じる場合に、薬剤は生理的に有意である。ここでの文脈においては、その存在によって、免疫細胞活性化、増殖または分化の遮断が生じる場合に、薬剤は生理的に有意である。いくつかの実施形態においては、免疫細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞である。
【０１３４】
治療的応用における抗体の作用の継続時間を制御するために、追加的な製剤方法が用いられうる。制御放出製剤が、抗体を合成または吸着するためのポリマーを用いて調製されうる。例えば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン―コ―ビニルアセテート）のマトリクスおよびステアリン酸二量体およびセバシン酸のポリアンヒドリドコポリマーのマトリクスが含まれる。（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６―１４４９（１９９２））。このようなマトリクスからの抗体の放出速度は、タンパク質の分子量、マトリクス中の抗体の量、および分散粒子のサイズに依存する。（ＳａｌｔｚｍａｎおよびＬａｎｇｅｒ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３―１７１（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ等、上記）。他の固体剤形は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１９版（１９９５)に記載される。
Ｂ．医薬組成物
医薬組成物は、ａが製薬学的用途のために調製される場合が予定される。このような組成物には、本明細書に開示される任意のケモカインのアンタゴニストが含まれうる。いくつかの実施形態においては、このような組成物は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８またはＩＬ―８のアンタゴニストである。いくつかの実施形態においては、このような組成物は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８またはそれらの組み合わせを阻害または遮断する。一実施形態においては、一つ以上の組成物が、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２を阻害または遮断する。
【０１３５】
所望の程度の純度を有するこのような薬剤を、任意の薬理学上許容可能な担体、賦形剤または安定剤と混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編、１９８０）、凍結乾燥製剤または水溶液の形で、このような薬剤の製剤が貯蔵のために調製される。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、採用される用量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、酢酸、および他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルオーベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン類；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３―ペンタノール；およびｍ―クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド類；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン類等のタンパク質類；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー類；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸類；グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物類；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖類；甘味料および他の香味剤；微結晶性セルロース、ラクトース、トウモロコシおよび他のデンプン類等の充填剤；結合剤；添加物；着色剤；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属複合体（例えばＺｎ―タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性活性剤を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態においては、本発明の生物活性剤を含む医薬組成物は、酸および塩基付加塩の両方を含む意味の薬理学上許容可能な塩類として存在するような、水溶性の形である。「薬理学上許容可能な酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的効果を保持し、生物学的またはその他の面で不適当でない、塩化水素、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸類、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ニッケイ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ―トルエンスルホン酸、サリチル酸等の有機酸類により形成される、塩類をさす。「薬理学上許容可能な塩基付加塩類」には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩類等に由来する無機塩基が含まれる。例えば、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩類が使用されうる。薬理学上許容可能な有機無毒性塩基類に由来する塩類には、第一、第二、および、第三アミン類、天然の置換アミン類を含む置換アミン類、環状アミン類およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミン等の塩基性イオン交換樹脂類の塩類が含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、好ましくは滅菌である。これは、濾過滅菌膜による濾過または従来技術で公知の他の方法により、容易に達成される。
【０１３７】
ＣＸＣＲ―シグナリングを標的とする薬剤が、免疫リポソームとして調製されてもよい。リポソームは、哺乳類への治療剤送達に有用な様々な種類の脂質類、ホスホリピド類および／または界面活性剤を含む小さなベシクルである。生物活性剤を含むリポソームは、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８―３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０―４０３４（１９９０）；米国特許第４，４８５，０４５号；４，５４４，５４５号；および国際公開第９７／３８７３１号に記載されるような、従来技術において公知の方法により調製される。循環時間が延長されたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示される。リポソームの成分は、生体膜の脂質配置と類似の二重層の形で一般に配置される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ―ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成できる。所定の孔径のフィルタによりリポソームが押出されて、所望の直径のリポソームが得られる。化学療法剤または他の治療的に活性な薬剤が、リポソームに選択的に含まれる（Ｇａｂｉｚｏｎ等、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８１：１４８４―１４８８（１９８９）。
【０１３８】
目的の薬剤は、制御放出製剤を得るように調製されてもよい。
【実施例】
【０１３９】
実施例１．実験動物
全てのマウスが、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒの、病原体のない環境でマイクロアイソレーションに保たれ、全ての手順が、承認されたＩＡＵＣガイドラインにしたがって行われた。ＣＸＣＲ２レセプター欠損マウス（ＢＡＬＢ／ｃ―Ｃｍｋａｒ２ｔｍ１Ｍｗｍ）およびマッチする野生型（ＷＴ）系統を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（バーハーバー、メイン州）から購入した。Ｃｘｃｒ２−／−マウスは、Ｃ１２９Ｓ２（Ｂ６）―Ｃｍｋａｒ２ｔｍ１Ｍｗｍドナー系統からこの背景に導入された、ｍＩＬ―８Ｒｈ／Ｃｘｃｒ２遺伝子の標的変異を含む（Ｃａｃａｌａｎｏ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：６８２―６８４（１９９４））。Ｗｅｎｄｙ  Ｍａｃｋｌｉｎ博士により、ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ（Ｃ５７ＢＬ／６）Ｔａｃｏｎｉｃマウスが提供された（Ｍａｌｌｏｎ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：８７６―８８５（２００２））。両方のマウス系統を、コロニーに近親交配することにより独立して増殖させ、そこからマウスを除去して、交配によりＣｘｃｒ２＋／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋マウスを作製した。Ｃｘｃｒ２＋／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋マウスの兄弟交配により、混合系統のコロニーを増殖および維持し、Ｃｘｃｒ２＋／＋ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋およびＣｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋兄弟を作製した。全ての実験が、少なくとも５回の交配からの、性別をマッチさせたＣｘｃｒ２＋／＋およびＣｘｃｒ２−／−同腹仔を用いて行われた。ＷＴおよび標的（ＫＯ）Ｃｘｃｒ２対立遺伝子を同定するために、テイル溶解から単離されたＤＮＡのＰＣＲにより、Ｃｘｃｒ２遺伝子型を確認した。Ｃｘｃｒ２遺伝子の特異的プライマは、ＩＭＲ４５３（５―ＧＧＴＣＧＴＡＣＴＧＣＧＴＡＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧ―３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＩＭＲ４５４（５―ＴＡＣＣＡＴＧＡＴＣＴＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧ―３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、およびＣｘｃｒ２−／−マウスにおける挿入ネオマイシン遺伝子では、ＪＭＲ０１３（５―ＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣ―３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、およびＪＭＲ０１４（５―ＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＴＣ―３；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）であった（Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３―３８３（２０００））。ＰＣＲ生成物が、１．２％のアガロースゲル上で分離された。野生型動物には、３６０ｂｐの単一バンドが確認され、Ｃｘｃｒ２−／−マウスは、より短い２８０ｂｐのバンドが確認され、ヘテロ接合体マウスは、両方が確認された。ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰコンストラクトの発現を評価するために、マウステイルのクリップが、蛍光顕微鏡検査法により直接視覚化された。
【０１４０】
クプリゾンによる脱髄の誘導
Ｃｘｃｒ２＋／＋：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋およびＣｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋の生後８〜１０週間目のマウスに、０．２％ｗｔ／ｗｔのクプリゾン（ビス―シクロヘキサノン―オキサルジヒドラゾン、Ｃ９０１２、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）粉砕噛み餌を与えた。コントロールマウスには、クプリゾンを伴わない普通の食餌を与えた。ケージにつき最高三匹のマウスを一緒に収容し、マウスは性別により分離した。処置開始後３〜４週または６〜７週目の屠殺時まで、食餌を持続的にマウスに供給した。マウスの虚弱または苦痛の兆候を一日おきにモニタし、毒性による影響が強いと思われるマウスは安楽死させた。
【０１４１】
リゾレシチンによる脱髄の誘導
ＢＡＬＢ／ｃおよびＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６のＣｘｃｒ２＋／＋およびＣｘｃｒ２−／−マウスの両方を、これらの実験に用いた。塩酸ケタミン、塩酸キシラジン、およびアセプロマジンを含むカクテルの腹腔内注射により、生後２〜３ヵ月のマウスを麻酔した。動物に麻酔が効いたら、体重を量り、背部を剃り、Ｏ．ＯｌｍＬのｔｕｒｂｏｇｅｓｉｃを背部に皮下注射した。その後、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍマウス脊椎アダプタ（＃５１６９０，Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．，イリノイ州ウッドデール）を伴う定位手術ベースプレートにおいて、横クランプ（＃５１６９１，Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．，イリノイ州ウッドデール）を使用して動物を安定させた。脊柱を露出させると、この機器によるマウスの位置により、背側椎弓切除術を必要とせずに脊髄後索のセグメントが見えた。ＰＨＤ２００ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ）に取り付けられた、１μｇ／μＬのリゾホスファチジルコリン溶液（リゾレシチンまたはＬＰＣ；Ｌ４１２９、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で満たされたホウ珪酸プルガラスマイクロピペットが、目に見える脊髄の背部血管に、ゆっくり導かれた。針を、硬膜を過ぎて脊髄後索にゆっくり挿入し、脊柱に毎分０．２５μＬ速度でｌｕＬの１％ＬＰＣを注射する前に、やや後退させた。逆流を防ぐために、流体を注射したあと、針を１〜２分間適所にとどまらせた。将来の特定を促進するために、注射部位に隣接する軟組織に縫合を施した。動物を７〜１４日間回復させてから、評価のために屠殺した。
【０１４２】
実施例２．組織調製
組織分析のために、マウスを、塩酸ケタミン、塩酸キシラジンおよびアセプロマジンの腹腔内注射で麻酔した後、０．１Ｍのリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＰＢ）中のヘパリン（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）、続いて０．１Ｍ  ＰＢ（４％ＰＦＡ）中の４％のパラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ペンシルベニア州ハットフィールド）でかん流した。脊柱および頭蓋が除去され、４％のＰＦＡ中で一晩後固定された。脳および脊髄を、０．１Ｍ  ＰＢ中の３０％のスクロース（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）中で冷凍保護した。クリオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ、ハイデルベルク）を使用して２０ｕｍで切断する前に、マッチするＣｘｃｒ２＋／＋およびＣｘｃｒ２−／−の脊髄または脳を、並べてまたは独立して包埋した。切片を、ガラススライドに連続的に集め、一晩乾燥させ、分析まで−２０℃で保存した。電子顕微鏡分析のために、麻酔された動物が、最初にヘパリン溶液、その後０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝剤Ｐｈ＝７．４中の３％ホルムアルデヒド／３％グルタルアルデヒドにより、かん流された（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ペンシルベニア州ハットフィールド）。組織を解剖し、１％のＯｓＯ４中で後固定した。試料を、段階的な一連のエタノール希釈で脱水し、Ｐｏｌｙ／Ｂｅｄ８１２樹脂（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ，ペンシルベニア州ワリントン）に包埋した。厚い（１μｍ）切片がトルイジンブルーで染色され、さらなる切断のために適切なエリアが選択された。Ｃｘｃｒ２−／−およびＣｘｃｒ２＋／＋組織ブロックのマッチするエリアからの、超薄切片（１００ｎｍ）が切断され、メッシュのニッケル／クーパーグリッド上に配置された。グリッドを繰り返し洗浄し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で二重染色し、電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  １２００ＣＸ）を８０ｋＶで使用して視覚化した。
【０１４３】
免疫組織化学法
同一の脊髄および脳領域からの切片を含むスライドの、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、ミエリン）、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、アストロサイト）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンＮＧ２（ＯＰＣｓ）、およびカルシウム結合タンパク質ＩＢＡ―１（ミクログリア）の、免疫組織化学法が行われた。ＭＢＰ染色では、スライドを解凍し、１０分間ＰＢＳ中で３回すすぎ、１０分間１００％のエタノールに浸し、すすぎ、一次抗体を加える前に１時間、ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）溶液中の０．５％トリトン―Ｘ―１００に浸漬した。１０％ＮＧＳ（普通のヤギ血清）および０．５％ＰＢＳＴを含む溶液中に希釈された、ウサギ抗ＭＢＰ抗体（１：１００、Ａｃｃｕｒａｔｅ、ＢＭＤＶ２０１７、ニューヨーク州ウェストベリー）が、加湿チャンバ内で試料に加えられ、一晩室温におかれた。ＧＦＡＰ染色では、スライドを解凍し、１０分間ＰＢＳで３回すすいだあと、１０％ＮＧＳ／１％ＰＢＳＴを含む溶液中に希釈されたウサギ抗ＧＦＡＰ抗体（１：５０、ＤＡＫＯ  Ｚ０３３４、カリフォルニア州カーピンテリア）を試料に加え、一晩室温の加湿チャンバ内においた。次の日に、抗ＭＢＰおよび抗ＧＦＡＰで処置されたスライドを１０分間ＰＢＳ中で６回すすいだ後に、１０％ＮＧＳ／０．５％ＰＢＳＴを含む溶液中に希釈された二次抗体ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  ５４６（１：４００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｌｌ０１０、カリフォルニア州カールズバッド）を、加湿チャンバ内で、室温で２時間加えた。その後、スライドをＰＢＳ中で６回すすぎ、４’，６―ジアミジノ―２―フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｄ１３０６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で対比染色し、ｃｉｔｉｆｌｕｏｒマウンティング培地をのせた。
【０１４４】
ＣＮＳ組織のＮＧ２およびＩＢＡの免疫組織化学的分析では、スライド（ｓｌｉｔｅｓ）を解凍し、０．２％ＰＢＳＴ中ですすぎ、０．３％過酸化水素／１０％トリトンＸ―１００でインキューベートし、１０％ヤギ血清／０．２％ＰＢＳＴで、室温で１時間ブロックした。ＩＢＡ―１染色では、１％ＢＳＡ／０．２％ＰＢＳＴ中に希釈されたマウス単クローンＩＢＡ―１抗体（１：１０００、Ｂｒｕｃｅ  Ｔｒａｐｐ博士―ＣＣＦ、オハイオ州クリーブランド寄贈）を、加湿チャンバ内で、一晩４℃で加えた。ＮＧ２染色では、切片を、抗ＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体（ＡＢ５３２０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）で、４℃で４日間インキューベートした。一次抗体ステップに続き、スライドをすすぎ、適切な二次抗体でインキューベートした。ＮＧ２では、スライドを、ビオチン化ヤギ抗―ウサギ―ｌ：１０００（ＢＡ―１０００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州バーリンゲーム）で、そして１％ＢＳＡ／０．２％ＰＢＳＴ中に希釈されたＡＢＣ―１：１０００（ＰＫ―６１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州バーリンゲーム）でインキューベートした。切片を、ＤＡＢ（３，３’―ジアミノベンジジン）／過酸化水素で室温で５分間処理し、ｄｄＨｋＯですすぎ、脱水し、マウントした。ＩＢＡ―１染色では、１％ＢＳＡ／０．２％ＰＢＳＴ中に希釈されたヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ５４６（１：６００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｌｌ０３０、カリフォルニア州カールズバッド）を、室温で２時間加えた。その後、スライドをＰＢＳ中で６回すすぎ、ＤＡＰＩ（Ｄ１３０６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）で対比染色し、ｃｉｔｉｆｌｕｏｒマウンティング培地をのせた。
【０１４５】
Ｃｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋およびＧｔｃｒ２＋／＋：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋マウスの切片を含むスライドの、ＣＸＣＲ２の免疫組織化学法を行った。これらのスライドを解凍し、１０分間ＰＢＳ中で３回すすぎ、十分間−２０℃で５％酸性メタノールに浸し、すすぎ、２０％ＮＧＳ／ＰＢＳ（トリトンを伴わない）で、室温で３０分間ブロックした。マウス抗ＣＸＣＲ２抗体（１：１００，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）をブロック中に希釈し、一晩４℃で加えた。すすぎの後、ブロック中に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８（１：２００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ２１１２１、カリフォルニア州カールズバッド）を、室温で１時間加えた。その後スライドをすすぎ、ＤＡＰＩで対比染色し、ｃｉｔｉｆｌｕｏｒマウンティング培地をのせた。Ｃｘｃｒ２−／−組織が、陰性コントロールとして使用された。
【０１４６】
実施例３．ＰＬＰ／ＥＧＦＰ＋およびＮＧ２＋細胞密度の定量化
オリゴデンドロサイト系統細胞の密度を比較するため、Ｃｘｃｒ２＋／＋：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋およびＣｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋の性別をマッチさせた兄弟からの、脳および脊髄の所定のエリアからのマッチする切片を選択し、ＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋細胞を自己蛍光（ａｕｔｏｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）により視覚化した。ＣＮＳ組織のＮＧ２組織学的および免疫組織化学的分析では、３０μｍの浮遊切片を、前述のように単離されたマウス脊髄から調製した。切片をＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００）中ですすぎ、１０％トリトンＸ―１００中０．３％の過酸化水素でインキューベートし、ＰＢＳＴ中１０％ヤギ血清により、室温で１時間ブロックした。そしてこれらを、抗ＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体（ＡＢ５３２０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）で、４℃で４日間インキューベートした。５日目に、適切なビオチン化ヤギ抗ラット―１：１０００（ＢＡ―９４００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州バーリンゲーム）で、その後ＡＢＣ―１：１０００（ＰＫ―６１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州バーリンゲーム）で、組織をインキューベートした。一次抗体の添加の後の、各インキュベーションステップの後に、切片をＰＢＳＴで３度洗浄した。全ての抗体ならびにＡＢＣが、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ中に希釈された。切片を、ＤＡＢ／過酸化水素で、室温で５分間処理し、ｄｄＨ２Ｏ中ですすぎ、脱水し、マウントした。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄヤギ―抗ラット１：１０００（ＴＩ―９４００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて免疫蛍光染色を行い、免疫前ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ、ミュンヘン、ドイツ）を陰性コントロールとして使用した。その後、切片をガラススライドにマウントして分析した。
【０１４７】
蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲ）を用いて、ＮＧ２染色またはＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋自己蛍光のスライドから、マッチするＣＮＳ領域を選択および記録した。画像を同様の強度レベルに調節し、所定のエリアにＩｍａｇｅ―Ｐｒｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて、異なるステージのオリゴデンドロサイト系統の細胞を表すＥＧＦＰ＋細胞、およびＯＰＣｓを表すＮＧ２＋細胞の総数をカウントした。全てのカウントを、動物の表現型に対する盲検観察により行い、カウントしたフィールドの面積で割って密度を決定した。各領域で、各表現型の少なくとも３匹の異なる動物を比較した。データをＣＮＳ領域ごとにプールし、平均値＋／−２ＳＥＭとして表わした。
【０１４８】
実施例４．相対的白質面積の測定
Ｃｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋およびＷＴの性別をマッチさせた兄弟同腹仔からの脊髄の隣り合う切片を含むスライドを、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲ）下で観察し、画像をＯｐｅｎＬａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）で記録した。Ｉｍａｇｅ―Ｐｒｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して画像を分析し、それを用いて脊髄全体の面積および灰白質の面積の測定を行った。強蛍光部の縁により灰白質と白質の間、および白質と脊髄端の間の境界を決定し、トレースして灰白質および脊髄全体の面積を得た。（脊髄全体の面積から灰白質を引くことにより計算される）白質面積の値を、全体の値で割って、脊髄全体に対する白質の面積の比を得た。各動物からの少なくとも６つの切片を、上述のように測定し、これらから、１０匹のＣｘｃｒ２＋／＋および１０匹のＣｘｃｒ２−／−マウスからのマッチする脊髄レベルの、脊髄全体に対する白質の面積の平均比を計算した。別々の年齢の結果が、平均値＋／−標準偏差として個別に表わされる。これらをさらにプールし、平均値＋／−２ＳＥＭとして表わした。
【０１４９】
実施例５．ミエリン厚およびランビエ絞輪の超微細構造の分析
Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ＳｃａｎＪｅｔ５３００Ｃスキャナを使用して、背側および腹側脊髄のマッチする領域のＥＭ画像をスキャンし、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して保存した。陰性画像を逆転し、Ｉｍａｇｅ―Ｐｒｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して、脊柱（皮質脊髄路を除く薄筋および楔状束）のランダムに選択された有髄軸索の軸索周囲長およびミエリン厚の両者の手動トレーシングにより、分析した。各軸索から、ミエリンの半径厚さの三つの別々の測定値をとり、平均して平均ミエリン厚を得た。この値を軸索周囲長の測定値で割って、軸索周囲長に対するミエリン厚の比を得た。五匹のＣｘｃｒ２−／−および６匹のＣｘｃｒ２＋／＋マウスを分析し、一連の異なる軸索サイズを評価して、軸索周囲長に対するミエリン厚の平均値を決定した。これは、繊維直径に対する軸索直径の比として定義される真のＧ―比ではないが、同等の測定値であり、本稿の全体にわたり擬似―Ｇ―比と呼ぶ。別個の年齢の結果が、平均値＋／−２ＳＥＭとして表わされる。背側および腹側脊髄の縦断切片を、絞輪構造および組織につき分析した。
【０１５０】
実施例６．脊髄誘発電位および中枢神経伝導速度
Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｖｉｋｉｎｇ  ＩＶ装置（Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、記録が行われた。動物を、上述のように麻酔した。０．４ｍｍの直径の、処分可能なＥＥＧ  ＳＳ―皮下の針を使用して、４．７Ｈｚの周波数で、脊髄の腰部を刺激した。各動物につき、両側の反復性四肢収縮のあらわれにより、刺激強度をセットした。脊髄誘発電位を、頭蓋の上の、正中から等距離で垂直の二つの位置で記録した。刺激から記録電極への潜時および振幅を、動物につき少なくとも三回の試験から記録して、再現可能な波形を得た。刺激および記録電極の間の距離をセンチメートルで測り、ミリ秒での潜時で割って、各マウスの平均中枢神経伝導速度を計算した。合計１０匹のＣｘｃｒ２−／−および１２匹のＣｘｃｒ２＋／＋マウスを、分析した。遺伝子型および遺伝的背景によって伝導速度の結果を分け、平均値＋／−標準偏差としてプロットした。
【０１５１】
体感覚性誘発電位（ＳＳＥＰｓ）および化合物（ＣＮＳおよびＰＮＳ）伝導速度
Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｖｉｋｉｎｇ  ＩＶ装置（Ｎｉｃｏｌｅｔ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ウィスコンシン州マディソン）を使用して、記録が行われた。麻酔されたマウスの後肢の脛骨領域を、３．１Ｈｚの周波数で刺激し、脊髄の胸部で記録を行い、潜時および振幅を決定した。平均潜時および伝導速度を決定するために、各動物につき三回の記録を行った。合計７匹のＣｘｃｒ２−／−および６匹のＣｘｃｒ２＋／＋マウスを評価して、平均伝導速度を決定した。
【０１５２】
実施例７．ウェスタンブロット
ｐ１３Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴの性別をマッチさせた同腹仔からの脳および脊髄を、瞬間冷凍し、必要になるまで−８０℃で保存した。ＲＩＰＡ溶解緩衝液／１０％プロテアーゼ阻害剤の溶液中で、組織を均質化した。Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｌｏｗｒｙアッセイを用いて、タンパク質濃度を決定した。約２０μｇ／ｍｌの上清をロードし、８〜１２％ＳＤＳ―ＰＡＧＥゲルで分離した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中３％ＢＳＡ／２％ミルク／０．０５％アジ化ナトリウムを含むブロック溶液の一次抗体で、一晩４℃で、以下の希釈でインキューベートした：ラビット抗ＧＦＡＰ多クローン抗体―１：１０００（Ｚ０３３４、ＤＡＫＯ、ミラノ、イタリア）；マウス単クローンＩｇＧ１抗βアクチン―１：１００（ｓｃ―８４３２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルス）；マウス単クローンＩｇＧ１抗ＭＢＰ―１：１０００（ＳＭＩ―９９；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ  Ｉｎｃ，メリーランド州ルーサーヴィル）；およびマウス単クローン抗―ＭＢＰ（ｍＡｂ３８１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，カリフォルニア州テメキュラ）。すすぎの後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）―結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ−１：１０００（５５６７６、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カリフォルニア州アーヴィン）またはＨＲＰ―結合ヤギ抗マウスＩｇＧ―１：１０００（６７４２８１、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カリフォルニア州アーヴィン）でブロットをインキューベートし、すすぎ、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ検出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，イリノイ州ロックフォード）で処理した。β―アクチン発現を、内部ローディングコントロールとして使用した。
【０１５３】
実施例８．脊髄細胞の解離培養の調製
ＷＴおよびＣｘｃｒ２−／−動物の間で、オリゴデンドロサイト系統細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長を比較するために、出生後８日の（ｐ８）脊髄の解離細胞培養が前述のように確立され（Ｗａｒｆ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：２４７７―２４８８（１９９１））、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２日後に、プレオリゴデンドロサイト（ｐｒｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）を同定するｍＡｂＯ４、および新規に分化したオリゴデンドロサイトを同定するｍＡｂＯ１でラベルされた（ＳｏｍｍｅｒおよびＳｃｈａｃｈｎｅｒ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８３：３１１―３２７（１９８１））。ＤＡＰＩ陽性細胞の総数との関係での各異なる細胞種類の相対数を、２つの異なる調製からの、少なくとも２つの異なるカバーグラスからとったランダムに選択された１０のフィールドからの表現型に対する盲検観察により、カウントした。データをプールし、平均＋／−標準偏差として表わした。
【０１５４】
統計的分析およびプロット
ＯｒｉｇｉｎソフトウェアのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストテストを用いた一元配置ＡＮＯＶＡおよび平均値比較により、データを分析した。有意性が、ｐ＜０．０５にセットされた。値は、テキスト中で実際のｐ値の前に平均値＋／−標準偏差として記載され、平均値＋／−標準偏差または平均値＋／−２ＳＥＭとしてプロットされる。全てのプロットで、アスタリスクにより有意性が示され、一つのアスタリスクはｐ＜０．０５を意味し、二つのアスタリスクはｐ＜０．０１を意味し、３つのアスタリスクはｐ＜０．００１を意味する。
【０１５５】
実施例９．Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおけるＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋細胞密度の変化
ＣＸＣＲ２欠損がオリゴデンドロサイト系統細胞およびミエリン形成におよぼす影響を評価するために、Ｃｘｃｒ２−／−マウス（Ｃａｃａｌａｎｏ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：６８２―６８４（１９９４））を、ＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋遺伝子導入マウス（Ｍａｌｌｏｎ等，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：８７６―８８５（２００２））に交配し、緑色蛍光によりオリゴデンドロサイト系統細胞の同定を可能にした。Ｃｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋マウスおよびＷＴ同腹仔からの白質および灰白質の複数の領域の比較は、Ｃｘｃｒ２−／−動物におけるＰＬＰ蛍光強度の全体的な減少を示し（図１Ａ）、オリゴデンドロサイト数の減少またはＰＬＰ発現強度の変化が示される。
【０１５６】
ＷＴおよびＣｘｃｒ２−／−マウスにおける、ＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋オリゴデンドロサイト系統細胞の定量化により、脳および脊髄の両方において、ラベルされた細胞の密度の局所的相対差が明らかになった。特に、ＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋細胞密度の増加が、Ｃｘｃｒ２−／−動物の脳梁（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．００２２９＋／−０．０００２４、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．００２５６＋／−０．０００２４、ｐ＝０．００１８９；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値）および脊髄（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．００２４０＋／−０．０００５５、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．００２７５＋／−０．０００７３、ｐ＝０．０００５９；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値）で観察された（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ）。Ｃｘｃｒ２−／−動物の後帯状皮質（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．０００５４＋／−０．００００５、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．０００４５＋／−０．００００４、ｐ＝０．００３１４；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値）および前交連（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．００２８４＋／−０．０００３１、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．００２３０＋／−０．０００２１、ｐ＝０．００００４；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値）で、減少が観察された（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ）。海馬または脳梁では、Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴマウスの間にＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋細胞の密度の差が観察されなかった（データは図示されない、それぞれｐ＝０．７５１７５、ｐ＝０．４１９６３）。
【０１５７】
ＷＴおよびＣｘｃｒ２−／−の脊髄のＯＰＣｓの密度を選択的に比較するために、ＮＧ２細胞の相対密度をアッセイした。Ｃｘｃｒ２−／−動物の脊髄は、性別をマッチさせたＷＴ同腹仔よりも、面積あたりに有意に多くのＮＧ２＋細胞を含んだ（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．００２６３＋／−０．０００１３、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．００３２１＋／−０．０００１８、ｐ＝０．０１１２６；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値、図２Ｃ）。さらに、Ｃｘｃｒ２−／−動物においては、ＮＧ２ラベル強度およびＮＧ２＋細胞突起のサイズおよび分岐が劇的に増加し（図２Ａ，Ｂ）、細胞が軟膜表面に向かって集中した（図２Ａ）。これらのデータを合わせると、ＣＸＣＲ２がオリゴデンドロサイト系統細胞数の確立に寄与し、局所的様式で寄与しうることが示される。さらに、ＣＸＣＲ２は、より成熟した系統段階に分化するＯＰＣｓの能力に影響し、またはＯＰＣｓの可用性を調節しうる。
【０１５８】
実施例１０．Ｃｘｃｒ２−／−マウスの成長不全および早死
Ｃｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋マウスの作製により、系統差異が明らかになった。（明白な全体の表現型を有さない）ＢＡＬＢ／ｃＣｘｃｒ２−／−マウスをＣ５７ＢＬ／６背景のＰＬＰ―ＥＧＦＰ動物に交配すると、混合背景の（ＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６）Ｃｘｃｒ２−／−動物には、体重増加の有意な減少（ｐ１０―１５：Ｃｘｃｒ２＋／＋＝６．６２＋／−１．４０、Ｃｘｃｒ２−／−＝４．６４＋／−１．５３、ｐ＝０．００；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値、図３Ａ）が観察され、約８０％がＰ１５前に死んだ（野生型の１０倍）。ＷＴマウスと比較してヘテロ接合体においては、死亡率増加は観察されなかった。ＥＧＦＰを発現しないＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６混合背景のＣｘｃｒ２−／−マウスも、この体重および死亡率表現型を示し、ＥＧＦＰ発現には関係ないことが示された。動物はいずれも繁殖できなかったため、ヘテロ接合兄弟交配からＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６Ｃｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋マウスが得られた。この混合背景のほとんどのＣｘｃｒ２−／−動物には、脳重量、サイズの減少（図３Ｂ）および顔の特徴の変化（図３Ａ）、ならびに姿勢、歩行の変化および前弯がみられた（データは図示されない）。これに対して、ＢＡＬＢ／ｃＣｘｃｒ２−／−動物は、前弯はあるものの、繁殖可能であり、コントロールと比較してそのような体重差または死亡率増加は特に見られなかった。
【０１５９】
実施例１１．Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおける脊髄白質面積の減少
新生仔動物においては、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＲ２シグナリングが、脊髄ＯＰＣの増殖および移動に影響する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ４８：８６４―８７４（２００１）：Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：１０４５７―１０４６３（１９９８）；Ｔｓａｉ等、Ｃｅｌｌ  １１０：３７３―３８３（２００２）；Ｗｕ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２６０９―２６１７（２０００））。ＣＸＣＲ２欠如によって白質形成の持続的変更が生じるかを決定するために、Ｃｘｃｒ２−／−：ＰＬＰ／ＤＭ２０―ＥＧＦＰ＋および性別をマッチさせたＷＴ同腹仔からのマッチする脊髄レベルにおいて、白質の相対的面積を比較した。脊髄全体における蛍光ＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋細胞の密度増加にもかかわらず、Ｃｘｃｒ２−／−マウスは、アッセイした全ての年齢で、白質面積が減少していた。ミエリン形成が継続中である出生後の第一週目の終わり、ｐ７に、白質面積の差が検出できた（図４Ａ）。例えば、図４Ａの挿入図のｐ７脊髄切片は、Ｃｘｃｒ２＋／＋（左）で０．３９３およびＣｘｃｒ２−／−（右）で０．３１３の比を示し、Ｃｘｃｒ２ヌル動物における白質面積の有意な減少が示される。Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴ動物の間の白質面積の差は、成体ではそれほど明白でなかったものの、成体までの成長の間持続した（ｐ７：Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．３８５＋／−０．０２０、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．３２６＋／−０．０１６、ｐ＝０．０００；成体：Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．６１４＋／−０．０１１、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．５９８＋／−０．０１４、ｐ＝０．０２４；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値；図４Ａプロット）。したがって、Ｃｘｃｒ２−／−動物の脊髄に含まれるオリゴデンドロサイト系統細胞の数は増加したが、脊髄白質の相対的面積は減少した（図４Ｂ）。さらに、生後発育の初期の間に差がより顕著であり、Ｃｘｃｒ２−／−マウスが遅い速度で成長し、成熟の間に部分的に回復することが示される。
【０１６０】
実施例１２．Ｃｘｃｒ２−／−マウスの脊髄白質のミエリン形成不全
成熟オリゴデンドロサイトの数の減少、ミエリン厚または軸索数の減少を含め、いくつかのファクターがＣｘｃｒ２−／−動物における白質減少の原因となりえたと考えられる。Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおけるＮＧ２＋およびＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋細胞密度の増加を前提とすると、オリゴデンドロサイトの数の減少は考えにくかった。Ｃｘｃｒ２−／−動物に軸索のサイズまたは数の変化、またはミエリン形成の減少があるかを決定するために、Ｃｘｃｒ２−／−および性別をマッチさせた同腹ＷＴコントロールの脊髄の、電子顕微鏡（ＥＭ）分析を行った。評価した全ての年齢で、Ｃｘｃｒ２−／−動物に、軸索のサイズに関係なく擬似―Ｇ―比の減少が観察された（図５）。図５Ｂおよび５Ｃの軸索は、５Ａおよび５Ｄのものよりやや小さいだけであるが、それらの周りのミエリンのターン数は大きく異なっていた。５Ｂおよび５Ｃの軸索は、それぞれ４回および６回のミエリンターンで取り巻かれていたが、５Ａおよび５Ｄのものは１１回および１２回のミエリンの巻きで取り巻かれていた。図Ｅに示される１０回の巻きを伴うもののような、Ｃｘｃｒ２−／−動物のより大きな軸索でも、Ｃｘｃｒ２＋／＋に見られるものと比較してミエリンが比較的薄いことが多かった。ＢＡＬＢ／ｃ（データは図示されない）およびＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７Ｂｌ／６動物の両方において、Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴ動物の間の擬似―Ｇ―比の同様の差が検出された。このミエリン形成不全は早くもｐ１１に検出可能であり（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．０３７＋／−０．０１０、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．０３５＋／−０．０１０、ｐ＝０．０３７；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値）、成長の間中維持された（ｐ１５：Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．０４７＋／−０．０１０、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．０４１＋／−０．０１１、ｐ＝０．０００；ｐ２１：Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．０４４＋／−０．０１０、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．０３９＋／−０．０１２、ｐ＝０．０００；成体（ＢＡＬＢ／ｃ）：Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．０５８＋／−０．０１７、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．０５４＋／−０．０１７、ｐ＝０．０２２；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値、図５Ｆ）。ミエリン厚の減少は、Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴ動物の間の軸索直径の変化と関連しなかった（データは図示されない、ｐ＝０．２３８―０．８０９）。脊髄の一致する領域の有髄および無髄軸索の総数および比率の推定値は、ＷＴ動物において単位面積あたり有髄軸索が多く無髄軸索が少ない傾向があったものの（データは図示されない、ｐ＝０．０９４）、Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴｓ動物の間で顕著な差はなかった。
【０１６１】
実施例１３．中枢神経伝導速度の低下
これらの構造差により生理的表現型が生じたかを評価するために、混合背景の動物で、脊髄誘発電位の記録を行った。生後２〜３ヵ月のＢＡＬＢ／ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、腰部誘発電位の中枢神経伝導速度の低下が観察された（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．６７０＋／−０．０３７、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．４６１＋／−０．０３２、ｐ＝０．０００；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値；図６、左）。これらの差が、混合系統のＣｘｃｒ２−／−動物の全身的変化の結果でないことを確かめるために、生後２〜４ヵ月のＢＡＬＢ／ｃマウスで研究を繰り返し、類似の結果を得た（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．０６４３＋／−０．０４３、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．５２７＋／−０．０７２、ｐ＝０．０１３；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値；図６、右）。ＢＡＬＢ／ｃおよび混合背景のＣｘｃｒ２＋／＋マウスの間（ｐ＝０．２７３）、またはＢＡＬＢ／ｃおよび混合背景のＣｘｃｒ２−／−マウスの間（ｐ＝０．０８２）に、統計学的有意差はなかった。これらのデータは、ＣＸＣＲ２の非存在により、成体の神経系に機能的欠損が生じ、これらの変化が神経系に固有であり、混合背景で観察される体重およびサイズに対する全身的影響とは関係がないことを示す。ＣＸＣＲ２ヌルおよびＷＴ動物の間に誘発電位振幅の有意差は見られず（データは図示されない、ｐ＝０．１５４）、中枢神経伝導速度の低下が固有の軸索欠損と関連しないことが示された。
【０１６２】
実施例１４．ミエリンおよび傍絞輪ジャンクションの超微細構造の分析
ミエリン形成不全およびミエリン圧密化の変化があるマウス（Ｎｅｕｂｅｒｇ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５３：５４２―５５０（１９９８））だけでなく、ミエリン厚または圧密化の変化がない（Ｂｏｓｉｏ等、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２９２：１９９―２１０（１９９８）；Ｂｏｙｌｅ等、Ｎｅｕｒｏｎ  ３０：３８５―３９７（２００１）；Ｐｏｐｋｏ，Ｇｌｉａ  ２９：１４９―１５３（２０００））、傍絞輪ジャンクション形成不全を伴うマウスモデルにおいて、伝導速度低下が観察されている。軸索―グリアジャンクション形成またはミエリン圧密化の変化が、Ｃｘｃｒ２−／−動物における伝導速度低下に寄与しうるかを決定するために、傍絞輪ジャンクションの構造成分ならびにミエリンの圧密化および周期性を分析した。電子顕微鏡観察により、Ｃｘｃｒ２−／−のミエリン鞘は、薄いながらも、周期線および周期間線の正常な圧密化および周期性が見られることが分かった（図７Ａ）。Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴ動物の両方の傍絞輪ジャンクションに、無傷の良好に配向された傍絞輪ループおよび横帯（図７Ｂ）も見られ、適切な軸索―グリアジャンクション形成が示された。さらに、Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴマウスの間で、ランビエ絞輪のサイズまたは構造の明白な差は検出されなかった（図７Ｃ）。これらのデータは、Ｃｘｃｒ２ヌル動物で形成されるミエリンが構造的に正常であるが、量が減少することを示す。
【０１６３】
実施例１５．グリアタンパク質発現の変化
Ｃｘｃｒ２−／−の脊髄における白質の組成をさらに分析するために、豊富なミエリンタンパク質、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のタンパク質発現を、ウェスタンブロット分析により比較した。ＷＴと比較して、Ｃｘｃｒ２−／−動物は、ミエリン形成不全と整合するＭＢＰレベルの低下と（図１２Ａ）、ＰＬＰ―ＥＧＦＰ発現低下を有した。興味深いことに、ＧＦＡＰレベルも、Ｃｘｃｒ２−／−動物で低下した（図１２）。ＧＦＡＰの大半は白質アストロサイトにより生産されるため、この所見は、これらの動物における白質の減少と整合する。
【０１６４】
ＣＸＣＲ２シグナリングの調節は、ＯＰＣｓ以外の神経細胞に間接的に影響する。Ｃｘｃｒ２−／−動物の脊髄には、白質面積、ＧＦＡＰ、ＰＬＰ、およびＭＢＰの減少がみられた。正常な成長の間には、ＧＦＡＰおよびＭＢＰの発現が一致することが多く（Ｄｚｉｅｗｕｌｓｋａ等、Ｆｏｌｉａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ３７：８１―６（１９９９）；Ｌａｎｄｒｙ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２５：１９４―２０３（１９９０）；ＴａｋａｓｈｉｍａおよびＢｅｃｋｅｒ、Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ．６：４５１―４５７（１９８４））、ＧＦＡＰヌルマウスには、白質の構造的異常およびミエリン形成不全がみられる（Ｌｉｅｄｔｋｅ等、Ｎｅｕｒｏｎ  １７：６０７―６１５（１９９６））。正常な白質構造の確立は、部分的にケモカインシグナリングにより媒介される、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト系統細胞の間の相互作用を反映する。
【０１６５】
実施例１６．Ｃｘｃｒ２−／−マウスからの脊髄培養におけるオリゴデンドロサイト分化の変化
オリゴデンドロサイト系統細胞数の差が、全身的変化の結果かＣＮＳ内の変化かを決定するために、ｐ８Ｃｘｃｒ２−／−およびＷＴ同腹マウスの培養を確立し、オリゴデンドロサイトの成長をアッセイした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２日後に、Ｃｘｃｒ２−／−（図９Ｂ，Ｅ）およびＷＴ動物（図９Ａ，Ｅ）の培養の、Ｏ４＋ＯＰＣｓの数には有意差がなかった（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．２４５＋／−０．１３７、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．２４４＋／−０．０９３、ｐ＝０．９７７；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値）。これに対して、ＷＴ（図９Ｃ，Ｆ）と比較して、Ｃｘｃｒ２−／−培養（図９Ｄ，Ｆ）において、Ｏ１＋分化オリゴデンドロサイトの数の有意な減少（Ｃｘｃｒ２＋／＋＝０．１３３＋／−０．０７１、Ｃｘｃｒ２−／−＝０．０４６＋／−０．０２４、ｐ＝０．０００；平均値＋／−ＳＤ、ｐ―値）がみられた。データは、Ｃｘｃｒ２ヌル動物においてオリゴデンドロサイトの成熟が障害されることを示し、成体ＣＮＳに観察される構造および機能的変化の基礎となる機構を研究するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を提供する。
【０１６６】
実施例１７．再ミエリン化を促進するためのＣＸＣを介したシグナリングのモジュレータのアッセイ
脊柱へのＬＰＣの局所注射により、成体ラットに脱髄病変を生成した。動物を傷害後最長７日まで存続させ、横および縦のスライス培養を調製する。精製されたラベルされたＯＰＣｓを、スライスの病変エリアの隣または中に注射し、それらの挙動をモニタすることにより、この系における細胞移動を追う。注射されたＯＰＣの挙動に対するＣｘｃｒ２遮断の影響をテストするために、コントロールスライスを標準の培地で成長させ、実験スライスを、異なる濃度のＣＸＣＲ２阻害剤（例えばｒｅｐｅｒｔａｘｉｎ）の存在下で成長させる。注射された細胞の挙動を、二つの条件下で比較する。一つのコントロール実験は、薬物添加により、精製ＯＰＣｓの、ＣＸＣＬ１により増強される、ＰＤＧＦにより促進される増殖を阻害し、アッセイして、おおよその用量処方計画を確立することである。さらに、もう一つのコントロール実験は、過去の研究において有効であることが示されている抗Ｃｘｃｒ２抗体を使用する。
【０１６７】
ＣＸＣＬ１、および病変の隣接領域におけるＯＰＣｓのレベルを上昇させた所見に基づけば、Ｃｘｃｒ２阻害剤の非存在下では、注射されたＯＰＣｓは、病変に向かって移動するが隣接組織で止まり、増殖する（Ｏｍａｒｉ等、Ｇｌｉａ，５３：２４―３１（２００６））。Ｃｘｃｒ２の阻害剤の存在下では、病変に向かって実質的により多くの移動が生じ、したがって前ミエリン形成細胞の病変エリアへの浸潤が促進される。成長研究において、Ｃｘｃｒ２シグナリングの除去により、脊髄スライス培養でより広範なＯＰＣ移動が生じた。
【０１６８】
コントロールおよび処置された培養の一部は、病変（単数または複数）における再ミエリン化のレベルをアッセイするために、より長く維持される。各スライスが独立しているため、単一の病変動物に複数のアッセイが行われる。ＣＸＣ―シグナリング阻害剤（例えばｒｅｐｅｒｔａｘｉｎ）が最も有効である病変後間隔および用量を決定し、これにより、より複雑なｉｎ  ｖｉｖｏ研究を促進しうる。病変／動物間の変動を考慮して、全ての研究が、少なくとも３匹の異なる病変動物からとった複数のスライスで行われる。
【０１６９】
実施例１８．脱髄病変の修復に対するＣｘｃｒ２の阻害剤の効果をアッセイする
成体ラットの脊柱に局所的脱髄病変を生成し、適切な傷害後間隔（１〜５日）をおいて、適切な用量の生物活性剤（例えばＣＸＣ―シグナリング阻害剤）を送達する浸透性ミニポンプを、動物の背部に外科的にインストールする。ポンプは、一つ以上の薬物を２４〜４８時間または必要に応じて送達し、動物を７〜１０日間回復させる。コントロール動物は、溶媒だけを伴うミニポンプを受ける。一つの陽性コントロールは、過去の研究で使用される、市販の機能遮断抗Ｃｘｃｒ２抗体の使用である。生物活性剤動物およびコントロール処置動物の、３次元再構築における病変サイズを比較することにより、修復を評価する。観察される病変の小ささ（例えば再ミエリン化）に基づいて、候補治療法を選択する。
【０１７０】
実施例１９．再ミエリン化を増強するためのＣＸＣを介したシグナリングのモジュレータによる処置
有効な量のＣＸＣＲ２―標的生物活性剤が、脱髄障害（例えばＭＳ）を患う対象に投与される。例えば、ｒｅｐｅｒｔａｘｉｎが、対象の体重および／または病期に基づいて決定される用量を用いて投与される。Ｒｅｐｅｒｔａｘｉｎは、直接または全身的に対象に投与され、投与量には、約１、２、５、７、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、３５または４０ｍｇ／ｋｇ（ｍｇ  ｒｅｐｅｒｔａｘｉｎ／ｋｇ体重）が含まれうる。さらに、毎日、毎週、または毎月の周期で、用量の複数回の投与がなされうる。例えば、複数回の投与には、毎日、毎週、または毎月１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０または４０回の投与が含まれうる。
【０１７１】
ＭＲＩ画像化、身体的器用さ、または他の臨床的評価法を含む、当業者によく知られた標準的プロセスを用いて、効力が測定される。（例えば、Ｎｏｓｅｗｏｒｔｈｙ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０：２０１―２１０（１９９７）を参照）。
【０１７２】
実施例１９．ＰＬＰ発現レベルはミエリンの変化を反映し、クプリゾン曝露後にＣｘｃｒ２＋／＋において大幅に低下するが、Ｃｘｃｒ２−／−マウスでは低下しない
ＭＢＰおよびＰＬＰは、ミエリンの重要な構造タンパク質である。過去の研究により、クプリゾン処置後の、脱髄および再ミエリン化を特徴づける事象と、ミエリン関連遺伝子の発現との間の、時間的相関が示された（Ｊｕｒｅｖｉｃｓ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８２：１２６―１３６（２００２）；ＭａｔｓｕｓｈｉｍａおよびＭｏｒｅｌｌ、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１１：１０７―１１６（２００１））。これらの研究（Ｊｕｒｅｖｉｃｓ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８２：１２６―１３６（２００２）；ＭａｔｓｕｓｈｉｍａおよびＭｏｒｅｌｌ、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１１：１０７―１１６（２００１））は、脱髄とＰＬＰおよびＭＢＰ遺伝子の発現低下との間、および、それらのその後の発現増加と再ミエリン化との間の、関連を示唆する。
【０１７３】
ＭＢＰおよびＰＬＰ発現は、ミエリン形成不全を呈するＣｘｃｒ２−／−マウスにおいて本質的に低下する（Ｐａｄｏｖａｎｉ―Ｃｌａｕｄｉｏ等、Ｇｌｉａ  ５４：４７１―４８３（２００６））。従って、クプリゾン処置の非存在下では、Ｃｘｃｒ２−／−マウス（図１３Ｂ’）は、各自のＣｘｃｒ２＋／＋の性別をマッチさせた同腹コントロール（図１３  Ａ’）よりも、ＰＬＰ―ＥＧＦＰの発現が低かった。しかし、Ｃｘｃｒ２＋／＋およびＣｘｃｒ２−／−マウスの脳のＰＬＰ―ＥＧＦＰ発現を、４週間のクプリゾン処置の後に比較すると、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスの脳梁において、ＰＬＰ―ＥＧＦＰの強度の有意な減少があった（図１３Ｃ’）。この減少は、評価した全ての実験の時点で、ＥＧＦＰシグナルの強度においてだけでなく、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスにおいてＥＧＦＰリポータを発現する細胞数の、両方において明らかであり、これらの変化は、脳梁の細胞充実度の低下と相関した（１３Ａ”、Ｂ”およびＤ”と比較した図１３Ｃ”）。処置後にＣｘｃｒ２＋／＋マウス後にみられる減少は、処置前（図１３Ａ’）のＣｘｃｒ２＋／＋マウスおよび処置前（図１３Ｂ’）および後（図１３Ｄ’）のＣｘｃｒ２−／−マウスのＰＬＰレベルの両方との関係で明白だった。Ｃｘｃｒ２−／−マウスには、ＰＬＰの発現の変化はなかった（図１３Ｂ’をＤ’と比較）。
【０１７４】
実験の４週目時点で、ＭＢＰ染色の欠如により明らかな脱髄エリアが、Ｃｘｃｒ２＋／＋（図１４Ａ、矢印）にみられたが、Ｃｘｃｒ２−／−マウス（図１４Ｂ）にはみられなかった。これらの脱髄巣は、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスにおけるＰＬＰ発現低下（図１４Ａ’矢印）および細胞充実度低下（図１４Ａ’矢印）の病巣と相関した。４週目のＰＬＰ発現低下、ミエリン消失および低細胞充実度の間の相関は、クプリゾン処置後の成熟オリゴデンドロサイトのアポトーシス、ミエリン遺伝子ダウンレギュレーション、および脱髄の報告と整合する（ＭａｔｓｕｓｈｉｍａおよびＭｏｒｅｌｌ、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１１：１０７―１１６（２００１））。これらの変化がＣｘｃｒ２−／−マウスにみられないという事実から、ＣＸＣＲ２の欠如により、これらのマウスにおいてオリゴデンドロサイトおよびミエリンに損傷からの保護が与えられ、またはオリゴデンドロサイト生存が促進されうることが示唆される。７週間のクプリゾン処置の後でも、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスからの組織には、ミエリンの広範な崩壊が認められることが多いが（図１５Ａ、Ａ”および１５Ｃ、Ｃ”）、Ｃｘｃｒ２−／−マウスからの組織にはみられない（図１５Ｂ、Ｂ”）。ミエリンの消失は、ＰＬＰ発現の消失と通常相関した（図１５Ａ、Ａ’、矢印および１５Ｃ、Ｃ’、Ｃ”、（矢印））。しかし、いくつかの場合においては、強い緑色のＰＬＰ―ＥＧＦＰ＋細胞が、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスにおいて顕著なＭＢＰ減少があるエリアにみられ（図１５Ｃ、Ｃ’、ドットのエリア）、マウスにおけるクプリゾン曝露により誘導される、確立された一連の事象と一致して（ＭａｔｓｕｓｈｉｍａおよびＭｏｒｅｌｌ、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１１：１０７―１１６（２００１））、オリゴデンドロサイトが再ミエリン化を試みている可能性があることを示唆する。
【０１７５】
実施例２０．Ｃｘｃｒ２−／−マウスはＣｘｃｒ２＋／＋マウスと異なり、クプリゾン曝露後に顕著なアストログリオーシスがみられない
ＰＬＰ発現低下に加えて、以前に報告されたように、普通の食餌を与えられたＣｘｃｒ２−／−マウスは、各自のＣｘｃｒ２＋／＋のコントロールよりもＧＦＡＰの発現が低かった（Ｐａｄｏｖａｎｉ―Ｃｌａｕｄｉｏ等、Ｇｌｉａ  ５４：４７１―４８３（２００６））。ＧＦＡＰは、アストロサイトのマーカーであり、そのアップレギュレーションはアストログリオーシスと関連する。アストロサイトおよびミクログリアは、通常はクプリゾン処置の３週間後にアップレギュレートされ、このアップレギュレーションは、５週間のクプリゾン曝露によりピークに達する傾向がある（ＭａｔｓｕｓｈｉｍａおよびＭｏｒｅｌｌ、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１１：１０７―１１６（２００１））。これと整合して、処置前にすでにＣｘｃｒ２−／−マウスより高かった（図１６Ｂ）、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスにおけるＧＦＡＰのレベル（図１６Ａ）に、処置開始後にさらなるアップレギュレーションがみられた（図１６Ｃ）。アストロサイトは、形態が変化するとともにその数が明白に増加し、反応性がより高いと思われた。それらの変化は、脳梁内で最も顕著だった（図１６Ｃ）。対照的に、Ｃｘｃｒ２−／−マウスには、クプリゾン処置後にＧＦＡＰ発現に有意な変化はみられず、これらのマウスの脳梁内には、アストロサイトがほとんど見られなかった（図１６Ｄ）。ＧＦＡＰ発現の同様の変化のプロフィールが、６週目に、Ｃｘｃｒ２−／−（図１７Ａ，Ｃ）およびＣｘｃｒ２＋／＋マウス（図１７Ｂ）の両方で観察された。野生型マウスにおけるＧＦＡＰ発現の増加は（図１７Ｂ）、ＰＬＰ―ＥＧＦＰ発現低下（図１７Ｂ’）、および脳梁の細胞充実度増加（図１７Ｂ’）と相関し、脱髄前にオリゴデンドロサイトが常在した脳梁への、アストロサイトの浸潤が示された（図１７Ｂ”’、Ａ”’およびＣ”’と比較）。アストロサイト瘢痕は、神経病理学的状態と関連する。したがって、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおけるＰＬＰおよびＭＢＰ発現の維持（図１６Ｄ、１７Ａ、Ｃ）とあわせたアストロサイト活性化の欠如により、ＣＸＣＲ２シグナリングの非存在下で病変からの保護または修復プロセスの増強があることが示される。
【０１７６】
実施例２１．クプリゾン曝露後に、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおいてミクログリアの活性化の減少が観察される。
【０１７７】
ミクログリアは食細胞であり、その活性化は、食作用によるミエリン崩壊をもたらしうる。Ｃｘｃｒ２−／−およびＣｘｃｒ２＋／＋マウスに普通の食餌が供給されると、ミクログリア／マクロファージ特異的カルシウム結合タンパク質ＩＢＡ―１の発現レベルは、Ｃｘｃｒ２−／−マウスでより高かった（図１８  Ｂ＞Ａ）。４週間食餌にクプリゾンを添加すると、Ｃｘｃｒ２＋／＋にはＩＢＡ―１の緩やかなアップレギュレーションがあったが（図１８Ｃ）、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにはなかった（図１８Ｄ）。７週間のクプリゾン処置により、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウス（図１８Ｅ）においては、ＥＢＡ―１発現および明白なミクログリア活性化の増加が劇的である一方で、Ｃｘｃｒ２−／−マウス（図１８Ｆ）においては、ミクログリアはわずかに活性化されただけのように見受けられた。ミクログリアの活性化の増加は、Ｃｘｃｒ２＋／＋マウスの脳梁で特に明らかであり、そこではミクログリアが丸い形態をとっていた（図１８Ａ、Ｃ）。これに対して、Ｃｘｃｒ２−／−マウスにおいては、ミクログリアのアップレギュレーションは最小限であり、ほとんどのＩＢＡ―１＋細胞は、静止ミクログリアに特徴的な、細胞質から伸びる長細い分枝を有した（図１８Ｂ、Ｄ）。
【０１７８】
実施例２２．脱髄病変におけるＣＸＣＬ１およびＣＸＣＲ２発現
成体（ＳＤ；雌）ラットの脊柱に、３≡ｌの１％リゾレシチン（ＮａＣｌ中）を注射して、局所的脱髄病変を誘導した。ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＬ１タンパク質のレベルをアッセイし、傷害エリアのグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）発現と比較した（図３５）。局所的脱髄病変において、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＲ２発現がアップレギュレートされる。ＣＸＣＲ２の発現増加は、病変外ではなく病変内のＧＦＡＰ＋アストロサイトと関連するようである。
【０１７９】
実施例２３．アストロサイトおよびグリア瘢痕誘導に対するＣＸＣＬ１の効果
精製アストロサイト培養に対するＣＸＣＬ１（０．５ｎｇ／ｍｌ）の添加は、ＣＳＰＧ発現を誘導し、形態を変更する。細胞をＣＸＣＬ１（０．５ｎｇ／ｍｌ）で３日間処置し、免疫細胞化学法により基質上へのＣＳＰＧ沈着をアッセイし、培地に放出した。ドットブロット（挿入図）によると、ＣＸＣＬ１が、ＣＳＰＧ（ＣＳＰＧに対する抗体）を増加させた。ＧＦＡＰ（赤）、ＣＳＰＧ（緑）（図３４）培養試験のために、脊髄アストロサイトの培養物の、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＲ２のｍＲＮＡ発現の基礎レベルを、ＲＴ―ＰＣＲによりアッセイした（図３３）。ＣＳＰＧタンパク質発現に対する３日間のＣＸＣＬ１タンパク質の添加（０．５ｎｇ／ｍｌ）の効果が、脊髄アストロサイト培養に、ならびに免疫細胞化学法およびドットブロットアッセイにより行われて、分泌および結合されたＣＳＰＧが分析された（図３４）。
【０１８０】
実施例２４．成体脊髄の脱髄病変および細胞培養における中和ＣＸＣＲ２抗体
成体（ＳＤ；雌）ラットの脊柱に、３≡ｌの１％リゾレシチン（ＮａＣｌ中）を注射して、局所的脱髄病変を誘導した。病変誘導の２日後に、ＣＸＣＲ２に対する５≡ｌの中和抗体またはアイソタイプＩｇＧコントロール抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；１００≡ｇ／ｍｌ）を、病変エリアに局所注射した。全生存期間は１０日であり、脊髄を切断し、免疫組織化学法または組織学法のために処理した。病変全体の切片を得、ミエリン染色のＬｕｘｏｌファストブルーで染色した（図３６）。３Ｄ  Ｄｏｃｔｏｒソフトウェアプログラムを使用して病変を再構築し、病変体積および３次元画像を構築した（図３６）。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＧＦＡＰ、ＥＤ１（マクロファージ／ミクログリア）およびビメンチンの抗体を用いた、標準的な免疫組織化学技術を使用して、病変内のタンパク質発現を分析した（図３７）。
【０１８１】
実施例２５．グリオーシスを改善するためのＣＸＣを介したシグナリングのモジュレータのアッセイ
成体（ＳＤ；雌）ラットの脊柱に、１％のリゾレシチン（ＮａＣｌ中）を注射して、局所的脱髄病変を誘導した。病変誘導の２日後に、グリオーシスを改善するための阻害剤候補（例えばｒｅｐｅｒｔａｘｉｎ、または図１０に開示される化合物）を、病変エリアに局所注射する。用量は、１日につき体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜５００ｍｇＶ、例えば約２０ｍｇ／日である。脊髄を切断し、免疫組織化学法または組織学法のために処理する。病変全体の切片を得、ミエリン染色のＬｕｘｏｌファストブルーで染色する。３Ｄ  Ｄｏｃｔｏｒソフトウェアプログラムを使用して病変を再構築し、病変体積および３次元画像を構築する。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＧＦＡＰ、ＥＤ１（マクロファージ／ミクログリア）、およびビメンチンの抗体を用いた、標準的な免疫組織化学技術を使用して、病変内のタンパク質発現を分析する。培養試験のために、脊髄アストロサイトの培養物の、ＣＸＣレセプターおよび／またはリガンドのｍＲＮＡ発現の基礎レベルを、ＲＴ―ＰＣＲによりアッセイする。脊髄アストロサイト培養物に免疫細胞化学法およびドットブロットアッセイを行って、分泌および結合されたＣＳＰＧを分析することにより、ＣＳＰＧタンパク質発現が検出される。
【０１８２】
本発明の好ましい実施形態を、本明細書に図と共に記載したが、当業者には当然のことながら、このような実施形態は例として提供されるにすぎない。本発明から逸脱することなく、多数の変化形、変更、および置き換えが当業者によって考えられる。当然のことながら、本発明を実施する際に、本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替物が用いられうる。本明細書に記載の請求が本発明の範囲を定義し、これらの請求の範囲内の方法および構造およびそれらの等価物が含まれることが意図される。
【図１】
2010504996.tif 000002
【図２】
2010504996.tif 000003
【図３】
2010504996.tif 000004
【図４】
2010504996.tif 000005
【図５】
2010504996.tif 000006
【図６】
2010504996.tif 000007
【図７】
2010504996.tif 000008
【図８】
2010504996.tif 000009
【図９】
2010504996.tif 000010
【図１０Ａ】
2010504996.tif 000011
【図１０Ｂ】
2010504996.tif 000012
【図１０Ｃ】
2010504996.tif 000013
【図１１】
2010504996.tif 000014
【図１２】
2010504996.tif 000015
【図１３】
2010504996.tif 000016
【図１４】
2010504996.tif 000017
【図１５】
2010504996.tif 000018
【図１６】
2010504996.tif 000019
【図１７】
2010504996.tif 000020
【図１８】
2010504996.tif 000021
【図１９】
2010504996.tif 000022
【図２０】
2010504996.tif 000023
【図２１】
2010504996.tif 000024
【図２２】
2010504996.tif 000025
【図２３】
2010504996.tif 000026
【図２４】
2010504996.tif 000027
【図２５】
2010504996.tif 000028
【図２６】
2010504996.tif 000029
【図２７】
2010504996.tif 000030
【図２８】
2010504996.tif 000031
【図２９】
2010504996.tif 000032
【図３０】
2010504996.tif 000033
【図３１】
2010504996.tif 000034
【図３２】
2010504996.tif 000035
【図３３】
2010504996.tif 000036
【図３４】
2010504996.tif 000037
【図３５】
2010504996.tif 000038
【図３６】
2010504996.tif 000039
【図３７】
2010504996.tif 000040
【国際調査報告】
2010504996.tif 000041
2010504996.tif 000042