(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４５〜７０個の主鎖第３アミン基、９０〜１４０個の主鎖第２アミン基、０より大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基、および０より大きな正数ｑ個の、式（２）で示される、環状カーボネートの開環した構造を有する主鎖停止カルバメート基：
【化１】
0006293150.tif 000062
を有する分岐ポリアミン。（ここで、（ｎ′＋ｑ）は、４５〜７０に等しい数であり、式（２）の星印の結合が分岐ポリアミンの主鎖窒素に結合し、Ｌ′は、炭素数３〜３０個の２価ラジカルであり、ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、９〜４７％に等しい。）
【請求項２】
前記分岐ポリアミンは、ｎ′個の第１エチレンイミン繰り返し単位、９０〜１４０個の第２エチレンイミン繰り返し単位、４５〜７０個の第３エチレンイミン繰り返し単位、およびｑ個の、式（２）のカルバメート基からなる、請求項１に記載の分岐ポリアミン。
【請求項３】
前記分岐ポリアミンは、カルバメートで官能化され、数平均分子量が８５００〜１５０００の分岐ポリエチレンイミンである、請求項１に記載の分岐ポリアミン。
【請求項４】
前記分岐ポリアミンは、Ｎ／Ｐ１０〜Ｎ／Ｐ５０で細胞毒性を有しない、請求項１に記載の分岐ポリアミン。
【請求項５】
Ｌ′は、糖残基を有し、前記糖残基は、マンノース、ガラクトース、またはグルコース残基である、請求項１に記載の分岐ポリアミン。
【請求項６】
４５〜７０個の主鎖第３アミン基、９０〜１４０個の主鎖第２アミン基、０より大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基および０より大きな正数ｑ個の、式（４）で示される主鎖停止カルバメート基：
【化２】
0006293150.tif 000063
を有する分岐ポリアミン。
（式（４）の星印の結合が分岐ポリアミンの主鎖窒素に結合し、
Ｒ１は、水素原子、メチル基、またはエチル基であり、
Ｒ２は、水素原子または炭素数が１〜２７個の１価ラジカルであり、
（ｎ′＋ｑ）は、４５〜７０の数であり、
ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％が、９〜４７％に等しい。）。
【請求項７】
４５〜７０個の第１アミン基、複数の第２アミン基、および複数の第３アミン基を有する分岐した第１のポリマーを、環状カーボネート・モノマーと、前記環状カーボネート・モノマーを重合させることなく処理し、
ｉ）４５〜７０個の主鎖第３アミン基、
ｉｉ）９０〜１４０個の主鎖第２アミン基、
ｉｉｉ）０より大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基、および
ｉｖ）０より大きな正数ｑ個の下記式（２）で示される主鎖停止カルバメート基：
【化３】
0006293150.tif 000064
を有する分岐ポリアミンを形成する方法。
（ここで、（ｎ′＋ｑ）は、４５〜７０に等しい数であり、式（２）の星印の結合が分岐ポリアミンの主鎖窒素に結合し、
Ｌ′は、３〜３０の炭素を有する２価ラジカルであり、
ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、９〜４７％に等しい。）
【請求項８】
前記環状カーボネート・モノマーは、６員環の環状カーボネート・モノマーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
分岐した前記第１のポリマーは、
構造
【化４】
0006293150.tif 000065
を有する４５〜７０個の第１エチレンイミン繰り返し単位、
構造
【化５】
0006293150.tif 000066
を有する９０〜１４０個の第２エチレンイミン繰り返し単位、
および
構造
【化６】
0006293150.tif 000067
を有する４５〜７０個の第３エチレンイミン繰り返し単位からなり、各星印の結合は、主鎖の他の繰り返し単位に結合することを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記環状カーボネート・モノマーは、
【化７】
0006293150.tif 000068
およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子と、
４５〜７０個の主鎖第３アミン基、９０〜１４０個の主鎖第２アミン基、０より大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基および０より大きな正数ｑ個の、式（２）で示される、環状カーボネートの開環した構造を有する主鎖停止カルバメート基：
【化８】
0006293150.tif 000069
を有する分岐ポリアミンと
を含む複合体。
（上記中、（ｎ′＋ｑ）は、４５〜７０に等しい数であり、式（２）の星印の結合が分岐ポリアミンの主鎖窒素に結合し、Ｌ′は、炭素数が３〜３０個の２価ラジカルであり、ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、９〜４７％に等しい。）
【請求項１２】
前記遺伝子は、ｓｉＲＮＡである、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の複合体を細胞に接触させる、処理方法（ただし、人間を手術、治療又は診断する方法を除く。）。
【請求項１４】
前記細胞は、ヒトの腫瘍細胞、ガン化した肝細胞、ガン化した子宮頚管細胞、ガン化した卵巣細胞およびヒト間葉系幹細胞を含む群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
下記式（５）の構造を有する分岐ポリアミン。
【化９】
0006293150.tif 000070
（ここで、ｊ，ｋ，ｍ，ｎ′およびｑは、０より大きいモル量を示し、ｊは、１８５〜２８０の値を有し、ｋは、４５〜７０の値を有し、ｍは、９０〜１４０の値を有しており、（ｎ′＋ｑ）は、４５〜７０の値を有し、ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％が、９％〜４７％の値を有し、それぞれＺ′は、独立して、下記の基： 
【化１０】
0006293150.tif 000071
およびそれらの組み合わせからなる群から選択される基である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
共同研究に対する当事者合意
本発明は、インターナショナル・ビジネスマシーンズ・コーポレイションと、エージェンシー  フォア  サイエンス，テクノロジー  アンド  リサーチとの間の共同研究合意にもとでなされたものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、生物学的に活性な材料をデリバリーするための分岐ポリアミンに関し、より詳細には、遺伝子デリバリーのためのカルバメート疎水性末端基を有する、カルバメートで官能化した分岐ポリエチレンイミンに関する。
【０００３】
核酸に基づく治療は、人間の疾病の治療において大きな保障を提供する。原理的に欠陥や欠点のある遺伝子を修正したり、機能性の遺伝子で置換したりするばかりではなく、冗長な遺伝子発現は、また、ＲＮＡ干渉を使用することにより通常のレベルに再発現させることもできるであろう。一般的には、遺伝子デリバリー・ベクターには、２つの主要なタイプがあり、これらは、ウィルス性ベクターおよび非ウィルス性ベクターである。ウィルス性ベクターは、形質導入能に優れるが、ウィルス性ベクターの免疫源性および発ガン性の可能性は、それらの療法的応用を制限する。この問題を迂回するために、多くの非ウィルス性の遺伝子デリバリー系が提案されてきており、これらは、（１）脂質、ポリマーおよびペプチドを含む種々のカチオン性分子と、核酸との複合体および（２）例えば、コレステロールおよび細胞侵入性のペプチドといった天然リガンドと核酸とのコンジュゲーションを挙げることができる。非ウィルス性遺伝子デリバリー・ベクターは、生物学的安全性、低い製造コスト、輸送および貯蔵容易性、再生産性、ターゲットとする特定の細胞タイプへの官能性の可調整性のために益々注目を受けている。
【０００４】
種々のタイプの非ウィルス性ベクターの中でも、第１、第２、第３アミン基を含有する分岐ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ）は、in vitroで高い遺伝子トランスフェクション効率を提供する。具体的には、重量平均分子量（Ｍｗ）が約２５ｋＤａであり、数平均分子量（Ｍｎ）が約１０ｋＤａのｂＰＥＩ（これを本明細書においてｂＰＥＩ−２５として参照する）は、工業的標準として認識されている。ｂＰＥＩ−２５は、約２０％のアミン基（すなわち第１アミン基）がプロトン化された場合、生理学的なｐＨにおいて高いカチオン電荷密度を有する。これは、ｂＰＥＩ−２５が広いｐＨ範囲にわたり負に帯電した核酸と静電的に相互作用すること、およびナノ粒子中で複合化することを可能とする。一度、ｂＰＥＩ−２５／核酸のナノ複合体が細胞に取り込まれると、第２および第３アミンが“プロトン・スポンジ効果”を通してエンドソームからの核酸の放出を可能とする。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の場合、放出された核酸の細胞核への取り込みが高い遺伝子移入効率を与える。
【０００５】
その高い遺伝子トランスフェクション効率にも関わらず、ｂＰＥＩ−２５の全体の正電荷は、特にin vivoにおいて毒性、凝集性および細胞・非細胞成分と、ｂＰＥＩ−２５／核酸コンプレックスとの望ましくない非特異的相互作用に関する主要な欠点を有する。不利な影響としては、肝壊死、凝固血小板の付着および高い投与量での全身注入の後のショックなどを挙げることができる。
【０００６】
ｂＰＥＩ−２５により直面する細胞毒性の点では、低分子量の分岐ポリエチレンイミン（Ｍｗ約２．０ｋＤａ、Ｍｎ約１．８ｋＤａ、以下、本明細書では、ｂＰＥＩ−２として参照する。）は、その好ましい細胞毒性プロファイルもあって興味を集めている。しかしながら、ｂＰＥＩ−２の主要な欠点は、遺伝子トランスフェクション・ベクターとして使用するには、不十分な程に、トランスフェクション能力が不十分なことにある。
【０００７】
したがって、より効果的でより細胞毒性の低い、生物学的に活性な材料のデリバリーのためのポリエチレンイミンを開発することが依然として要求されていた。
【発明の概要】
【０００８】
すなわち、約４５〜約７０個の主鎖第３アミン基、約９０〜約１４０個の主鎖第２アミン基、０より大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基、および０より大きな正数ｑ個の下記式（２）で示される主鎖停止カルバメート基
【０００９】
【化１】
0006293150.tif 000002
を有する分岐ポリアミンが開示される。
ここで、（ｎ′＋ｑ）は、約４５〜約７０に等しい数であり、式（２）の星印の結合が分岐ポリアミンの主鎖窒素に結合し、
Ｌ′は、３〜３０の炭素を有する２価ラジカルであり、
ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、約９〜約４７％に等しい。
【００１０】
また、約４５〜約７０個の主鎖第３アミン基、約９０〜約１４０個の主鎖第２アミン基、０よりも大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基、および０より大きな正数ｑ個の下記式（４）で示される主鎖停止カルバメート基
【００１１】
【化２】
0006293150.tif 000003
を有する分岐ポリアミンが開示される。
ここで、式（４）の星印の結合が分岐ポリアミンの主鎖窒素の結合し、
Ｒ１は、水素原子、メチル基、またはエチル基である、
Ｒ２は、水素原子または炭素数が１〜２７個の１価ラジカルであり、
（ｎ′＋ｑ）は、約４５〜約７０の数であり、
ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％が、約９〜約４７％に等しい。
【００１２】
さらに、
約４５〜約７０個の第１アミン基、複数の第２アミン基および複数の第３アミン基を有する第１のポリマーを、環状カーボネート・モノマーを重合させることなく環状カーボネート・モノマーで処理して、ｉ）約４５〜約７０個の主鎖第３アミン基、ｉｉ）約９０〜約１４０個の主鎖第２アミン基、ｉｉｉ）０より大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基、およびｉｖ）０より大きな正数ｑ個の下記式（２）で示される主鎖停止カルバメート基
【００１３】
【化３】
0006293150.tif 000004
を有する分岐ポリアミンを形成する方法が開示される。
ここで、（ｎ′＋ｑ）は、約４５〜約７０に等しい数であり、式（２）の星印の結合が分岐ポリアミンの主鎖窒素に結合し、
Ｌ′は、３〜３０の炭素を有する２価ラジカルであり、
ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、約９〜約４７％に等しい。
【００１４】
また、
遺伝子と、
約４５〜約７０個の主鎖第３アミン基、約９０〜約１４０個の主鎖第２アミン基、０より大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基、および０より大きな正数ｑ個の下記式（２）で示される主鎖停止カルバメート基
【００１５】
【化４】
0006293150.tif 000005
を有する分岐ポリアミンと
を含む複合体が開示される。
ここで、（ｎ′＋ｑ）は、約４５〜約７０に等しい数であり、式（２）の星印の結合が分岐ポリアミンの主鎖窒素に結合し、
Ｌ′は、３〜３０の炭素を有する２価ラジカルであり、
ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、約９〜約４７％に等しい。
【００１６】
細胞を上述した複合体で処理することを含む、細胞の処理方法が開示される。
【００１７】
さらに、式（５）の構造を有する分岐ポリアミンが開示される。
【００１８】
【化５】
0006293150.tif 000006
ここで、ｊ，ｋ，ｍ，ｎ′およびｑは、０より大きいモル量を示し、ｊは、約１８５〜約２８０の値を有し、ｋは、約４５〜約７０の値を有し、ｍは、約９０〜約１４０の値を有しており、（ｎ′＋ｑ）は、約４５〜約７０の値を有し、ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％が、約９％〜約４７％の値を有し、それぞれＺ′は、独立して、下記およびそれらの組み合わせからなる郡から選択される基である。
【００１９】
【化６】
0006293150.tif 000007
0006293150.tif 000008
【００２０】
本発明の上述し、かつ他の特徴および効果は、後述する詳細な説明、図面および添付する請求項から、当業者により認識され、理解されるところのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、カルバメート官能化分岐ポリエチレンイミンポリマーＡ，Ｂ，Ｃで調整した緑蛍光性タンパク（ＧＦＰ）レポータ遺伝子複合体の粒径を示す棒グラフである。Ａ，Ｂ，Ｃは、市販のものが利用できるｂＰＥＩ−２５から調整した。遺伝子複合体は、Ｎ／Ｐ５〜３０で調整した。“Ｎ／Ｐ”は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーの窒素原子の、遺伝子リン酸基に対するモル比を示し、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５／遺伝子複合体の全体の電荷を示す。ｂＰＥＩ−２５の対照遺伝子複合体を、Ｎ／Ｐ１０（不図示）で調整したところ、これは、約８４ｎｍの平均粒径および約２２ｍＶのゼータ電位を有した。
【図２】図２は、Ｎ／Ｐ１０〜５０で調整したカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＳ，Ｔ，Ｆ，Ｇ，Ｌ，ＭおよびＮのルシフェラーゼリポータ遺伝子複合体の粒径を示す棒グラフである。
【図３】図３は、Ｎ／Ｐ１０〜５０で調整したカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＵ，Ｒ，ＩおよびＨのルシフェラーゼリポータ遺伝子複合体の粒径を示す棒グラフである。
【図４】図４は、Ｎ／Ｐ１０〜５０で調整したカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＶ，Ｐ，Ｋ，Ｊ，およびＯのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体の粒径を示す棒グラフである。
【図５】図５は、図１のＧＦＰレポータ遺伝子複合体のＮ／Ｐ１０〜３０におけるゼータ電位に対応する棒グラフである。対照ｂＰＥＩ−２５／遺伝子複合体は、Ｎ／Ｐ１０（不図示）で調整し、その粒径は、約８４ｎｍであり、ゼータ電位が約２２ｍＶであった。
【図６】図６は、図２のカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５／遺伝子複合体のＮ／Ｐ１０〜５０でのゼータ電位を示す棒グラフである。
【図７】図７は、図３のカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５／遺伝子複合体のＮ／Ｐ１０〜５０でのゼータ電位を示す棒グラフである。
【図８】図８は、図４のカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５／遺伝子複合体のＮ／Ｐ１０〜５０でのゼータ電位を示す棒グラフである。
【図９】図９は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＡのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１０】図１０は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＢのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１１】図１１は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＣのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１２】図１２は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＦのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１３】図１３は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＧのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１４】図１４は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＳのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１５】図１５は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＴのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１６】図１６は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＬのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１７】図１７は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＭのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１８】図１８は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＮのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図１９】図１９は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＵのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図２０】図２０は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＲのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図２１】図２１は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＩのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図２２】図２２は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＨのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図２３】図２３は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＶのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図２４】図２４は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＰのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図２５】図２５は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＫのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図２６】図２６は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＪのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図２７】図２７は、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＯのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体について得られたＤＮＡラダーの写真である。
【図２８】図２８は、ｂＰＥＩ−２５のルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体のＤＮＡラダーの写真である。
【図２９】図２９は、ｂＰＥＩ−２（Ｍｗ２０００、Ｍｎ１８００）のルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体のＤＮＡラダーの写真である。
【図３０】図３０は、ＧＦＰレポータ遺伝子で調整した種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマー複合体のＮ／Ｐの関数としてＨｅｐＧ２細胞内でのＧＦＰトランスフェクション効率を示す棒グラフである。遺伝子単独でのトランスフェクション効率（ＤＮＡラダー単独としてラベルした）およびｂＰＥＩ−２５で調整した対照複合体もまた示されている。
【図３１】図３１は、ＧＦＰレポータ遺伝子で調整した種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマー複合体のＮ／Ｐの関数としてＨｅｐＧ２細胞内でのＧＦＰトランスフェクション効率を示す棒グラフである。遺伝子単独でのトランスフェクション効率（ＤＮＡラダー単独としてラベルした）およびｂＰＥＩ−２５で調整した対照複合体もまた示されている。
【図３２】図３２は、ＧＦＰレポータ遺伝子で調整した種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマー複合体のＮ／Ｐの関数としてＨｅｐＧ２細胞内でのＧＦＰトランスフェクション効率を示す棒グラフである。遺伝子単独でのトランスフェクション効率（ＤＮＡ単独としてラベルした）およびｂＰＥＩ−２５で調整した対照複合体もまた示されている。
【図３３】図３３は、ＧＦＰレポータ遺伝子で調整した種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマー複合体Ｏ，Ｋ，Ｐ４３およびＰ４４のＮ／Ｐの関数としてＨｅｐＧ２細胞内でのＧＦＰトランスフェクション効率を示す棒グラフである。Ｐ４３は、ベンジルエステルを有し、Ｐ４４は、２−フェニルウレアエチルエステル基を有する。
【図３４】図３４は、ＧＦＰレポータ遺伝子で調整した種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマー複合体Ａ，Ｂ，Ｃ，ＦおよびＧのＮ／Ｐの関数としてＨｅＬａ２細胞内でのＧＦＰトランスフェクション効率を示す棒グラフである。遺伝子単独でのトランスフェクション効率（ＤＮＡ単独としてラベルした）およびｂＰＥＩ−２５で調整した対照複合体もまた示されている。
【図３５】図３５は、ＧＦＰレポータ遺伝子で調整した種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマー複合体Ｏ，Ｋ，Ｐ４４，Ｐ４６，Ｐ４８〜Ｐ４９のＮ／Ｐの関数としてＳＫ−ＯＶ−３細胞内でのＧＦＰトランスフェクション効率を示す棒グラフである。Ｐ４４は、芳香族ウレア基を有する。Ｐ４６は、コレステリル基を有する。
【図３６】図３６は、ＧＦＰレポータ遺伝子で調整したカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマー複合体Ａ，ＢおよびＣで調整したルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体による異なるＮ／Ｐ比でのＨｅｐＧ２細胞内でのin vitroルシフェラーゼ発現レベルを示す棒グラフである。対照群は、ｂＰＥＩ−２５のルシフェラーゼ遺伝子複合体、ルシフェラーゼ単独（ＤＮＡのみとラベルした）およびポリマー単独（“０”とラベルした）である。結果は、平均±３×標準偏差で示す。
【図３７】図３７は、Ｎ／Ｐ比を２〜５０とし、種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ２５ポリマーのＧＦＰレポータ遺伝子複合体で培養した後のＨｅｐＧ２細胞の細胞生存性を示す棒グラフである。また、ｂＰＥＩ−２５の対照群を示す。
【図３８】図３８は、Ｎ／Ｐ比を２〜５０とし、種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ２５ポリマーのＧＦＰレポータ遺伝子複合体で培養した後のＨｅｐＧ２細胞の細胞生存性を示す棒グラフである。また、ｂＰＥＩ−２５の対照群を示す。
【図３９】図３９は、Ｎ／Ｐ比を２〜５０とし、種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ２５ポリマーのＧＦＰレポータ遺伝子複合体で培養した後のＨｅｐＧ２細胞の細胞生存性を示す棒グラフである。また、ｂＰＥＩ−２５の対照群を示す。
【図４０】図４０は、Ｎ／Ｐ比を２〜５０とし、種々のカルバメート官能化ｂＰＥＩ２５ポリマーのＧＦＰレポータ遺伝子複合体で培養した後のＨｅＬａ細胞の細胞生存性を示す棒グラフである。また、ｂＰＥＩ−２５の対照群を示す。
【図４１】図４１は、Ｎ／Ｐ５０でのカルバメート官能化ｂＰＥＩ２５ポリマーＡ，ＢおよびＣのｓｉＲＮＡ複合体によるＨｅＬａ細胞内でのＢｃｌ−２  ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを示すグラフである。ｓｉＲＮＡ濃度は、１００ｎＭであった。
【図４２】種々のＮ／Ｐ比でのカルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体による処理後のＨｅＬａ細胞の細胞生存性を示す棒グラフである。
【図４３】ヒト間葉系幹細胞におけるＮ／Ｐ比の関数とした、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＴ，Ｓ，Ｇ，Ｍ，ＫおよびＯとルシフェラーゼレポータ遺伝子について、ルシフェラーゼ発現レベルを示すグラフである。
【図４４】図４４は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に対するルシフェラーゼ複合体Ｔ，Ｓ，Ｇ，Ｍ，ＫおよびＯの細胞毒性を示すグラフである。
【図４５】図４５は、異なるＮ／Ｐ比における、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５ポリマーＰ４５，Ｐ４６（比較例）およびＰ４７（比較例）のＧＦＰレポータ遺伝子複合体のＨｅｐＧ２細胞におけるトランスフェクション効率を比較した棒グラフである。Ｐ４５は、コレステロールで置換した環状カーボネート（Ｃｈｏｌ−ＭＴＣ）から調整した。Ｐ４６は、コレステロールクロロホルメートから調整し、Ｐ４７は、ブチルクロロホルメートから調整した。
【図４６】図４６は、異なるＮ／Ｐ比におけるＰ４５，Ｐ４７のＧＦＰレポータ遺伝子複合体の存在下でのＨｅｐＧ２細胞の細胞生存性を比較したグラフである。
【図４７】図４７は、異なるＮ／Ｐ比におけるＯ，Ｋ，Ｐ４４，Ｐ４６，Ｐ４８，Ｐ４９のＧＦＰレポータ遺伝子複合体の存在下でのＳＫ−ＯＶ−３細胞の細胞生存性を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
開示されるのは、遺伝子、タンパク、薬剤、これらのいずれか１つまたは全部を含む生物学的に活性な材料のデリバリーのための分岐ポリアミンである。分岐ポリアミンは、好ましくは、疎水性環状カルボネートと、約４０〜約７０個の第１アミン基、複数の第２アミン基および複数の第３アミン基を含む分岐ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ）とを反応させることにより調整される。明確化のため、カルバメート形成反応のための環状カルボネート・モノマーとの反応の出発材料である、分岐ポリエチレンイミンについて、後述する詳細な説明では非修飾分岐ポリエチレンイミン（“非修飾ｂＰＥＩ”）として参照する。反応生成物は、カルバメート官能化ｂＰＥＩポリマーであり、修飾された分岐ポリエチレンイミン（“修飾ｂＰＥＩ”）として参照する。被修飾ｂＰＥＩは、約８０００〜約１２０００の数平均分子量（Ｍｎ）および約８０００〜３００００の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。より具体的な分岐ポリアミンは、ｂＰＥＩ−２５（以下、“非修飾ｂＰＥＩ−２５”として参照する）を環状カーボネート化合物で処理することにより形成される。得られた分岐ポリアミンは、カルバメート官能化ポリアミンであり、これらは、“修飾ｂＰＥＩ−２５”ポリマーとして参照される。分岐ポリエチレンイミン以外の分岐アミン含有ポリマーは、カルバメート形成反応（例えば、約４５〜７０個の第１アミン基、複数の第２アミン基および複数の第３アミン基を有するアミン樹状基）のために使用することができる可能性がある。
【００２３】
分岐ポリアミンは、遺伝子トランスフェクションのプロセス中で遺伝子に対するキャリアとして機能することができる。例えば、修飾ｂＰＥＩポリマーは、ＨｅｐＧ２細胞（ガン化したヒト肝細胞）、ＳＫ−ＯＶ−３細胞（ガン化した卵巣細胞）、ｍＨＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）のいずれかまたは全部では、非修飾ｂＰＥＩの遺伝子複合体に比較して、より有効な遺伝子トランスフェクション剤である。修飾ｂＰＥＩ／遺伝子複合体は、またＮ／Ｐ比が２０〜５０では、Ｎ／Ｐ比が２０以上で高い細胞毒性を示す対応非修飾ｂＰＥＩの遺伝子複合体と比較して、その細胞毒性はより低い。加えて修飾ｂＰＥＩおよびルシフェラーゼレポータ遺伝子によって調整した複合体でトランスフェクションした細胞は、対応する非修飾ｂＰＥＩのルシフェラーゼ複合体と同等、またはこれを超えるレベルでルシフェラーゼ遺伝子を発現させることができる。
【００２４】
非修飾ｂＰＥＩは、複数の２官能エチレン基（＊−ＣＨ２ＣＨ２−＊）、複数の主鎖第３アミン基、複数の主鎖第２アミン基、および複数の主鎖停止第１アミン基を含有する。より具体的には、Ｍｎの範囲およびエチレンイミン・サブユニットの分子量が４３であることに基づき、非修飾ｂＰＥＩは、約１８５〜約２８０個のエチレン基、約４５〜約７０個の主鎖第３アミン基、約９０〜約１４０個の主鎖第２アミン基、約４５〜約７０個の主鎖停止第１アミン基を有する。非修飾ｂＰＥＩの主鎖末端ユニットは、第１アミン基を含む。
【００２５】
したがって、非修飾ｂＰＥＩは、本質的に下記構造の約４５〜約７０個の第１エチレンイミン繰り返し単位、
【００２６】
【化７】
0006293150.tif 000009
下記構造の約９０〜約１４０個の第２エチレンイミン繰り返し単位、
【００２７】
【化８】
0006293150.tif 000010
、および下記構造の約４５〜約７０個の第３エチレンイミン繰り返し単位
【００２８】
【化９】
0006293150.tif 000011
を含み、存在しうる上述した繰り返し単位の如何なる水性塩を含まない。上述した繰り返し単位の各星印の結合は、非修飾ｂＰＥＩの他の繰り返し単位への結合ポイントを示す。
【００２９】
非修飾ｂＰＥＩは、また本明細書では、式（１）で示される。
【００３０】
【化１０】
0006293150.tif 000012
上式中、ｊ，ｋおよびｎは、非修飾ｂＰＥＩ構造のそれぞれ独立した官能基のモルを表し、ｊは、約１８５〜約２８０であり、ｋは、約４５〜約７０の値を有し、ｍは、約９０〜約１４０の値を有し、ｎは、約４５〜約７０の値を有する。式（１）の記法により、括弧（）の各セットは、ポリマー鎖ではなく、鍵括弧[]の内側で開始し、鉤括弧の外側で停止する非修飾ｂＰＥＩの独立した官能基であることを理解されたい。星印の結合は、ブラケットの反対側の星印の結合への結合ポイントを示す。したがって、鉤括弧の右手側の各窒素原子は、鉤括弧の左手側のエチレン基の炭素原子に結合する。
【００３１】
例えば、上述した市販に利用できる分岐ポリエチレンイミンであるｂＰＥＩ−２５は、２５０００の重量平均分子量（Ｍｗ）、約１００００の数平均分子量（Ｍｎ）を有し、平均で５８個の主鎖第３アミン基、１１６個の主鎖第２アミン基、５８個の主鎖停止第１アミン基、および２３３個のエチレン基（Ｍｎおよびエチレンイミン繰り返し単位の分子量が平均で４３に等しいことに基づく）。この例においては、ｊ＝２３３、ｋ＝５８、ｍ＝１１６、ｎ＝５８である。この材料はまた、本明細書で“非修飾ｂＰＥＩ−２５”として参照される。
【００３２】
他の実施例として、上述した市販に利用できる分岐ポリエチレンイミンであるｂＰＥＩ−２は、２０００の重量平均分子量（Ｍｗ）、約１８００の数平均分子量を有し、平均で１０個の主鎖第３アミン基、２０個の主鎖第２アミン基、１０個の主鎖停止第１アミン基および３５個のエチレン基を含有する（Ｍｎおよびエチレンイミン繰り返し単位の分子量が平均で４３に等しいことに基づく）。この例では、ｊ＝３５、ｋ＝１０、ｍ＝２０およびｎ＝１０である。この材料を、本明細書では、ｂＰＥＩ−２または“非修飾ｂＰＥＩ−２”として参照する。
【００３３】
非修飾ｂＰＥＩの主鎖停止第１アミン基は、環状カーボネート化合物でカルバメートを形成する開環反応を行うことで、分岐ポリアミンを形成する。この開環反応は、環状カーボネート化合物に最小の重合、またはまったく重合させないで生じることが好ましい。
【００３４】
分岐ポリアミンは、約４５〜約７０個の主鎖第３アミン基、約９０〜約１４０個の主鎖第２アミン基、０より大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基および０より大きな正数ｑ個の、下記式（２）で示される主鎖停止カルバメート基を含む。
【００３５】
【化１１】
0006293150.tif 000013
上記式（２）中の星印つきの結合は、分岐ポリアミンの主鎖窒素原子に結合し、ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％が、約９〜約４７％に等しく、（ｎ′＋ｑ）が、約４５〜約７０の数に等しく、Ｌ′が３〜３０の炭素原子を含む２価架橋基である。
【００３６】
より具体的な分岐ポリアミンは、
ｉ）０より大きい正数ｎ′個の主鎖停止第１エチレンイミン繰り返し単位の構造が、
【００３７】
【化１２】
0006293150.tif 000014
であり、
ｉｉ）約９０〜約１４０個の主鎖第２エチレンイミン繰り返しユニットの構造が、
【００３８】
【化１３】
0006293150.tif 000015
であり、
ｉｉｉ）約４５〜約７０個の主鎖第３エチレンイミン繰り返し単位の構造が、
【００３９】
【化１４】
0006293150.tif 000016
であり、
ｉｖ）０より大きな正数ｑ個の主鎖停止カルバメート末端基が式（２）
【００４０】
【化１５】
0006293150.tif 000017
である構造を有する。
上記構造中、星印の結合は、主鎖ポリアミンの他の繰り返し単位への結合ポイントを示し、ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％が約９％〜約４７％に等しく、（ｎ′＋ｑ）は、約４５〜約７０の数に等しく、Ｌ′は、炭素数３〜３０個の２価架橋基である。式（２）の星印の結合は、分岐ポリアミンの主鎖窒素原子に結合する。１実施形態では、分岐ポリアミンは、本質的に上述した第１エチレンイミン繰り返し単位、第２エチレンイミン繰り返し単位、第３エチレンイミン繰り返し単位、およびカルバメート停止基からなる。他の実施形態では、分岐ポリアミンは、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５（すなわち、修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマー）である。他の実施形態では、Ｌ′は、非帯電基であり、分岐ポリアミンは、第４アミン基をまったく含有しない。
【００４１】
分岐ポリアミンはまた下記式（３）で表される。
【００４２】
【化１６】
0006293150.tif 000018
上記式中、ｊ，ｋ，ｍ，ｎ′およびｑは、式（３）の括弧内に含まれる独立した官能基それぞれの０よりも大きなモルを示し、ｊは、約１８５〜約２８０の値を有し、ｋは、約４５〜約７０の値を有し、ｍは、約９０〜約１４０の値を有し、ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、約９％〜約４７％の値を有する。ブラケットおよび括弧を用いた記法は、式（１）について説明したと同一の意味を有する。Ｌ′は、炭素数３〜３０個の２価架橋基である。
【００４３】
分岐ポリアミンを製造する方法において、反応混合物は、環状カーボネート化合物および２修飾ｂＰＥＩを含有し、環状カーボネート化合物は、非修飾ｂＰＥＩの第１アミン基の全モルに基づいて、５０ｍｏｌ％未満で存在する。したがって、非修飾ｂＰＥＩの少なくとも５０％の第１アミン基が、分岐ポリアミンに残留する。１実施形態では、式（３）でｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、約９％〜約２５％に等しい。さらに具体的な実施形態では、式（３）でｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、約９％〜約１２％に等しい。
【００４４】
分岐ポリアミンのそれぞれの主鎖第３アミン基、主鎖第２アミン基、主鎖停止第１アミン基のいずれかまたは全部は、フリーな塩基または水性塩（例えば、負に帯電した、例えば水酸基、塩化物イオン、酢酸イオン、スルホン酸基のいずれか１つまたは全部といったカウンタイオンを伴う、正に帯電したプロトン化アミン）として存在しうる。
【００４５】
他のより具体的な分岐ポリアミンは、約４５〜約７０個の主鎖第３アミン基、約９０〜約１４０個の主鎖第２アミン基、０より大きな正数ｎ′個の主鎖停止第１アミン基および０より大きい正数ｑ個の下記式（４）で示される主鎖停止カルバメート基を含む。
【００４６】
【化１７】
0006293150.tif 000019
式（４）の星印の結合は、分岐ポリアミンの主鎖窒素原子の結合する、Ｒ１は、水素原子、メチル基またはエチル基である。Ｒ２は、水素原子または炭素数が１〜２７個の一価ラジカルである。（ｎ′＋ｑ）の値は、約４５〜約７０に等しく、ｑ／（ｎ′＋ｑ）×１００％は、約９％〜約４７％に等しい。
【００４７】
他のより具体的な分岐アミンは、
ｉ）０より大きな正数ｎ′個の、構造式が、
【００４８】
【化１８】
0006293150.tif 000020
である主鎖停止第１エチレンイミン繰り返し単位、
ｉｉ）約９０〜約１４０個の、構造式が、
【００４９】
【化１９】
0006293150.tif 000021
である主鎖第２アミン繰り返し単位、
ｉｉｉ）約４５〜約７０個の、構造式が、
【００５０】
【化２０】
0006293150.tif 000022
である主鎖第３アミン繰り返し構造単位、
ｉｖ）０より大きな正数ｑ個の、式（４）
【００５１】
【化２１】
0006293150.tif 000023
である主鎖停止カルバメート末端基を含む。
ここで、星印を付けた結合は、分岐ポリアミンの他の繰り返し単位に結合し、Ｒ１は、水素原子、メチル基、またはエチル基であり、Ｒ２は、水素原子または炭素数が１〜２７個の基であり、（ｎ′＋ｑ）×１００％は、約９％〜約４７％の値を有する。１実施形態では、分岐ポリアミンは、本質的に第１エチレンイミン繰り返し単位、第２エチレンイミン繰り返し単位、第３エチレンイミン繰り返し単位、第２エチレンイミン繰り返し単位、第３エチレンイミン繰り返し単位およびカルバメート末端基を含む。他の実施形態では、分岐ポリアミンは、カルバメート官能化ｂＰＥＩ−２５である。
【００５２】
１実施形態では、式（４）のＲ２は、＊−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ３であって、Ｒ３は、１〜２６個の炭素を有する。
【００５３】
Ｒ３は、糖残基を有していても良い。例示的なＲ３基は、マンノース、ガラクトース、グルコースのいずれか１つまたは全部のエステル類を含むことができる。
【００５４】
Ｒ３は、炭素数が１〜２６個の一価の炭化水素ラジカルを含むことができる。例示的な一価炭化水素ラジカルとしては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、セプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、およびドデシル基を挙げることができる。一価の炭化水素ラジカルは、分岐または直鎖とすることができる。
【００５５】
他のＲ３としては、ベンジルエステル類および尿素基を含むエステル類を挙げることができる。
【００５６】
分岐ポリアミンは、約８５００〜約１５０００の数平均分子量（Ｍｎ）を有することができる。分岐ポリアミンは、約８５００〜約３５０００の重量平均分子量を有することができる。
【００５７】
こカルバメート基は、任意的に１つ、またはそれ以上の保護基を有していても良い。これらの例において、分岐ポリアミンを形成する方法は、さらに選択的に１つまたはそれ以上の保護基を除去することを含む。
【００５８】
例示的な環状カーボネート・モノマーとしては、表１の化合物を挙げることができる。
【００５９】
【表１】
0006293150.tif 000024
【００６０】
環状カーボネート・モノマーの追加的な例としては、表２に掲げる化合物を挙げることができる。
【００６１】
【表２】
0006293150.tif 000025
0006293150.tif 000026
【００６２】
環状カーボネート・モノマーは、単独でまたは組み合わせて使用することができる。
【００６３】
さらにより具体的な分岐ポリアミンは、式（５）の構造を有する。
【００６４】
【化２２】
0006293150.tif 000027
ここで、ｊ，ｋ，ｎ′およびｑは、０よりも大きなモル数を示し、ｊは、約３５〜約６０の値を有し、ｋは、約８〜約２０の値を有し、ｍは、約１５〜約４０の値を有し、（ｎ′＋ｑ）は、約４５〜約７０の値を有し、（ｎ′＋ｑ）×１００％は、約９％〜約４７％を有し、Ｚ′は、下記および下記の組み合わせからなる群から独立して選択される。
【００６５】
【化２３】
0006293150.tif 000028
0006293150.tif 000029
【００６６】
また、開示されるものは、遺伝子と上述した分岐ポリアミンとを含む複合体である。さらに開示されるものは、細胞を上記の複合体と接触して細胞を処理する方法である。
【００６７】
後述する実施例は、マンノース、ガラクトース、グルコース分子およびトリメチレンカーボネート、脂肪族炭化水素、ベンジル、芳香族ウレア基を、非修飾ｂＰＥＩ−２５に複数導入することによって、分岐ポリアミン（修飾ｂＰＥＩ−２５）を形成する容易な方法を示すものである。環状カーボネートは、有機触媒（１，８−ジアザビシクロウンデク−７−エン、ＤＢＵ）を使用し、または使用すること無くして開環させることができる。ＤＢＵが無い場合、第１アルコールを有するカルバメートを形成できる。ＤＢＵを使用すると、第１アミン基が環状カーボネートよりも過剰に存在する場合には、また、第１アルコールを有するカルバメートが形成される（例えば、それぞれ非修飾ｂＰＥＩ−２５マクロ分子には、約５８の第１アミン基が存在するため、環状カーボネートと非修飾ｂＰＥＩ−２５とを２５：１および８：１のモル比でそれぞれ使用する）。しかしながら、非修飾ｂＰＥＩ−２５に対する環状カーボネートのモル比が、７５：１では、ポリ（カーボネート）鎖を有する修飾ｂＰＥＩ−２５は、非修飾ｂＰＥＩ−２５の第１アミンに結合する傾向にある。
【００６８】
種々の修飾ｂＰＥＩ−２５／遺伝子複合体のＤＮＡ結合、粒径、ゼータ電位、および遺伝子発現特性について説明する。ＨｅｐＧ２（ヒト肝ガン細胞ライン）、ＳＫ−ＯＶ−３（ヒト卵巣ガン細胞ライン）およびヒト間葉系幹細胞における遺伝子トランスフェクション効率および細胞毒性を、ルシフェラーゼレポータ遺伝子および緑蛍光タンパク（ＧＦＰ）レポータ遺伝子を使用して検討し、非修飾ｂＰＥＩ−２５と比較した。さらにマンノース修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーの、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡターゲットＢｃｌ−２、のデリバリー能力を例示すために、アポトーシスの開始後およびしばしばガン細胞において発現過剰となるシトクロムＣの放出をブロックしたタンパクを使用し、ヒト上皮ガンＨｅＬａ細胞ラインにデリバリーした。細胞中のＢｃｌ−２  ｍＲＮＡ発現レベルは、マンノース修飾ｂＰＥＩ−２５／Ｂｃｌ−２ｓｉＲＮＡでの処理後、リアルタイム・リバース・トランスクリプション・ポリメラーゼ・チェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して測定した。ＨｅＬａ細胞の細胞生存性は、ｓｉＲＮＡ複合体で培養した後に、ＭＴＴアッセイにより分析した。
【実施例】
【００６９】
後述する実施例において使用した材料を、表３に纏める。
【００７０】
【表３】
0006293150.tif 000030
【００７１】
本明細書において、Ｍｎは、数平均分子量であり、Ｍｗは、重量平均分子量であり、ＭＷは、１分子の分子量である。
【００７２】
１．８−ジアザビシクロ[５，４，０]ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）をＣａＨ２上で攪拌し、グローブボックスに移す前に真空蒸留した。重量平均分子量２５ｋＤａ（ｂＰＥＩ−２５）および１．８ｋＤａ（ｂＰＥＩ−２）の分岐ポリエチレンイミン、細胞毒性アッセイのための１−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−３，５−ジフェニルホルマザン（ＭＴＴ）、およびポリマー合成のための他の試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈから市販ものが利用でき、これらを特に記載しない限り、さらに精製すること無く使用した。Ｂｃｌ−２ターゲットｓｉＲＮＡデュプレックス（シーケンス：sense 5’-GUA CAU CCA UUA UAA GCU G; antisense 5’-CAG CUU AUA AUG GAU GUA C)、βアクチンターゲットｓｉＲＮＡデュプレックスおよびスクランブルｓｉＲＮＡ（ネガティブ・コントロール）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｕ．Ｓ．Ａ）から購入した。ルシフェラーゼ・サブストレートおよび５×ｌｙｓｉｓバッファは、Ｐｒｏｍｅｇａ（シンガポール）から購入した。ＧＦＰレポータ遺伝子（サイトメガロウィルス・プロモータにより機能させる野生タイプＧＦＰのレッドシフトした変異体をエンコードしたもの）およびルシフェラーゼレポータ遺伝子（サイトロメガロウィルス・プロモータで機能させる６．４ｋｂのホタル・ルシフェラーゼをエンコードした）は、それぞれ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｕ．Ｓ．Ａ）およびＣａｒｌ  Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｖｉｃａｌ（Ｕ．Ｓ．Ａ）から入手した。ＢＣＡタンパクアッセイ・キットは、Ｐｉｅｒｃｅ製のものを使用した。ＨｅｐＧ２（肝）、ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣）、ＨｅＬａ（子宮頸管）のヒトガン細胞ラインは、ＡＴＣＣ（Ｕ．Ｓ．Ａ）から購入した。
【００７３】
ＭＴＣ−ＯＨは、Ｒ．Ｃ．Ｐｒａｔｔら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００８、１１４−１１６の方法に従って調整した。
【００７４】
ＭＴＣ−Ｃ６Ｈ５（ＭＷ３２６．２）の調整
【００７５】
【化２４】
0006293150.tif 000031
0006293150.tif 000032
【００７６】
１００ｍＬの丸底フラスコに、ｂｉｓＭＰＡ（７）、（５．００ｇ、３７ｍｍｏｌ、ＭＷ１３４．１）、ｂｉｓ−（ペンタフロロフェニル）カーボネート（ＰＦＣ、３１．００ｇ、７８ｍｍｏｌ、ＭＷ３９４．１）および７０ｍｌｓのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で洗浄したＣｓＦ（２．５ｇ、１６．４ｍｍｍｏｌ）を投入した。反応の最初には、不均一系であったが、１時間後には透明で均一な溶液が形成され、これを２０時間攪拌した。溶液を真空除去し、残留物をメチレンクロライドに再溶解した。溶液を、約１０分間静置し、その時点でペンタフロロフェニルバイプロダクトが沈殿し、これを定量的に回収した。このペンタフロロバイプロダクトは、１９ＦＮＭＲにてペンタフロロフェノールに特徴的な３つのピークを示し、ＧＣＭＳで、質量１８４の単一ピークを示した。濾過物を重炭酸ナトリウム、水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空中で留去し、生成物を再結晶（酢酸エチル／ヘキサン混合物）して、白色結晶固体としてＭＴＣ−Ｃ６Ｆ５を得た。ＧＣＭＳでは、質量３２６ｇ／ｍｏｌの単一ピークを有した。Ｃ１２Ｈ７Ｏ５について計算した分子量は、当該構造と一致した。1H-NMR (400MHz in CDCl3): delta 4.85 (d, J = 10.8Hz, 2H, CHaHb), 4.85 (d, J = 10.8Hz, 2H, CHaHb), 1.55 (s, 3H, CCH3)
【００７７】
Ｉ．モノマー合成
実施例１；ＭＴＣ−Ｃｌ（ＭＷ１７８．６）の調整
【００７８】
【化２５】
0006293150.tif 000033
【００７９】
５０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のオキザリルクロライド（２．４８ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ）に、５−メチル−５−カルボキシル−１，３−ジオキサン−２−オン（ＭＴＣ−ＯＨ）（２．７５ｇ、１７．２ｍｍｏｌ、ＭＷ１６０．１）の５０ｍＬの乾燥ＴＨＦ溶液を滴下して添加し、その後、窒素雰囲気下で３０ｍｉｎ以上かけて触媒量（３滴）の無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加えた。Ｎ２をバブルさせながら反応溶液を１時間攪拌して、揮発分を除去した、反応後、溶液を真空下で留去して、ＭＴＣ−Ｃｌを得た。これはさらに精製を行わなかった。
【００８０】
実施例２：ＭＴＣ−Ｃ２（ＭＷ１８８．２）の調整
【００８１】
【化２６】
0006293150.tif 000034
【００８２】
Ｉ）ビスＭＰＡ（２２．１ｇ、０．１６５ｍｏｌ、ＭＷ１３４．１）を、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５（６．８ｇ）を含むエタノール（１５０ｍＬ）に添加し、一晩環流した。樹脂をその後、フィルタ除去し、濾液を留去した。ジクロロメタン（２００ｍＬ）を残留した粘調な液体に加え、未反応の試薬およびバイプロダクトを濾別した。溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、留去した後、エチル２，２−ｂｉｓ（メチロイル）プロピオネート（ＭＷ１６２．２）を、透明な無色液体として得た（２４．３ｇ、９１％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3, 22℃): delta 4.09 (q, 2H, -OCH2CH3), 3.74 (d, 2H, -CH2OH), 3.57 (d, 2H, -CH2OH), 1.18 (t, 3H, -OCH2CH3), 0.98 (s, 3H, -CH3).
【００８３】
ＩＩ）ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中のトリホスゲン（１１．７ｇ、０．０３９ｍｏｌ）を、エチル２，２−ビス（メチロイル）プロピオネート（１２．６ｇ、０．０７８ｍｏｌ、ＭＷ１６２．２）およびピリジン（３９ｍＬ、０．４７ｍｏｌ）に３０ｍｉｎ以上かけて、ドライアイス／アセトンの−７５℃、窒素雰囲気下で滴下して加えた。反応混合物をさらに２時間冷却下で攪拌し、その後室温まで暖めた。反応を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（７５ｍＬ）を添加して停止し、その後、有機層を１ＭＨＣＬ水溶液（３×１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１×１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥、濾過および留去した。残留物を酢酸エチルから再結晶して、ＭＴＣ−Ｃ２（ＭＷ１８８）を白色結晶（８．０ｇ、５５％）として得た。
【００８４】
実施例３：ＭＴＣ−Ｃ８（ＭＷ２７２．３）の調整
【００８５】
【化２７】
0006293150.tif 000035
【００８６】
ＭＴＣ−Ｃ６Ｆ５（５．５ｇ、１６．９ｍｍｏｌ、ＭＷ３２６．２）、オクタノール（２．０ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）、ＰＲＯＴＯＮ  ＳＰＯＮＧＥ（３．２９ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（８ｍＬ）をフラスコに投入した。反応混合物を１２時間攪拌し、過剰の酢酸アンモニウムを添加した。反応混合物をさらに３時間攪拌し、その後、直接シリカゲルカラムに添加した。生成物を、溶離液をヘキサン／酢酸エチルとしたカラムクロマトグラフィーで分離し、油状のＭＴＣ−Ｃ８を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3, 22℃): delta 4.71 (d, 2H, -CH2OCOO), 4.23 (d, 2H, -CH2OCOO), 4.22 (t, 2H, -OCH2CH2), 1.68 (t, 2H, -OCH2CH2(CH2)5), 1.36 (s, 3H, - CH3), 1.31 (t, 10H, -CH2(CH2)5 CH3), 0.90 (t, 3H, - (CH2)5CH3).
【００８７】
実施例４：ＭＴＣ−Ｃ１２（ＭＷ３２８．４）を、エタノールをドデカノールに変えたことを除き、概ね実施例３の手順に従って製造した。
【００８８】
【化２８】
0006293150.tif 000036
【００８９】
ＭＴＣ−Ｃ１２：1H NMR (400 MHz, CDCl3, 22℃): delta 4.69 (d, 2H, -CH2OCOO), 4.23 (d, 2H, -CH2OCOO), 4.21 (t, 2H, -OCH2CH2), 1.68 (t, 2H, -OCH2CH2(CH2)5), 1.35 (s, 3H, - CH3), 1.28 (t, 10H, -CH2(CH2)5 CH3), 0.90 (t, 3H, - (CH2)5CH3).
【００９０】
実施例５：ＭＴＣ−Ｂｎ（ＭＷ２５０．３）の合成
【００９１】
【化２９】
0006293150.tif 000037
【００９２】
２，２−ビス（メチロイル）プロパン酸（ｂｉｓ−ＭＰＡ）（２０ｇ、１４９．１ｍｍｏｌ、ＭＷ１３４．１）および水酸化ナトリウム（５．９６ｇ、１４９．１ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬのＤＭＳＯ中で混合し、一晩８０℃で攪拌した。ベンジルブロマイド（３０．６ｇ、１７８．９ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。溶液が透明化し、反応をＮＭＲでモニタした。反応が完了した後、溶液を室温まで冷却し、水（５００ｍＬ）を添加した。溶液をジエチルエーテルで数回抽出し、ジエチルエーテル溶液を２５０ｍＬまで濃縮減容した。この溶液を水、重炭酸ナトリウム、食塩水で洗浄し、固化するまで濃縮した。固体をＴＨＦ／ヘキサンから再結晶して、白色結晶のＭＰＡ−Ｂｎ（１０．０ｇ、３０％）を得た。ＭＰＡ−Ｂｎ（４．７６ｇ、２１．２ｍｍｏｌ、ＭＷ２２４．３）およびトリメチルアミン（５．４ｇ、５３．１）をその後乾燥ＴＨＦ（２１０ｍＬ）に溶解し、０℃まで冷却した。窒素下で、エチルクロロホルメート（５．１ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）を滴下して加え、溶液を攪拌した。この溶液を室温まで温め、１８時間反応させた。反応溶液をその後、固化するまで濃縮し、この固体をジエチルエーテルから２度再結晶してＭＴＣ−Ｂｎを、白色結晶として得た（３．８６ｇ、７２．６％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3, 22℃): delta 7.38 (m, 2H, C5H6), 5.24 (s, 2H, -OCH2C5H6)  4.72 (d, 2H, -CH2OCOO), 4.21 (d, 2H, -CH2OCOO), 4.21 (t, 2H, -OCH2C5H6), 1.36 (s, 3H, - CH3).
【００９３】
保護された糖ペンダント基を有する環状カーボネート・モノマーＭＴＣ−ＩＰＭＡＮ、ＭＴＣ−ＩＰＣＧＡＬ、ＭＴＣ−ＩＰＧＬＵ
【００９４】
実施例６：ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮ（ＭＷ４０２．２）の調整
【００９５】
【化３０】
0006293150.tif 000038
【００９６】
ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮの調整は、代表的なものである。ＭＴＣ−Ｃｌを上述したとおりに製造し、乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）５０ｍＬに溶解した。５０ｍＬの乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の２，３，５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−マンノフラノース（ＩＰＭＡＮ）（４．１３ｇ、１５．８ｍｍｏｌ、ＭＷ２６０．３）およびトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０．６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温にて溶液に３０ｍｉｎ以上かけて滴下して加えた。その後、反応混合物を、４０℃で４８時間加熱した。混合物を室温まで冷却した後、この溶液を濃縮し、１００ｍＬＴＨＦを加えてトリエチルアミン塩を析出させた。塩を濾別し、溶液を除去した後、得られた粗生成物を、酢酸エチルおよびヘキサン（２０／８０〜５０／５０）を使用した傾斜溶出法によりシリカゲルカラムを通過させて、粘着性のある無色のオイルとして生成物を得た。これはゆっくりと白色固体に固形化した（５．８５ｇ、８５％）。
1H-NMR (400MHz, CDCl3, 22℃): delta 6.17 (s, 1H, H-a), 5.79 (dd, 1H, H-b), 4.83 (m, 1H, H-d), 4.66 (d, 2H, H-c), 4.41 (m, 1H, H-g), 4.22 (m, 2H, H-c), 4.03 (m, 2H, H-e + H-f), 3.73 (m, 1H, H-e), 1.33-1.50 (m, 15H, H-h + H-i).
【００９７】
実施例７：ＭＴＣ−ＩＰＧＡＬ（ＭＷ４０２．２）の調整
【００９８】
【化３１】
0006293150.tif 000039
【００９９】
ＭＴＣ−ＩＰＧＡＬを、実施例６の手法および１，２，３，４−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−ガラクトピラノースを使用して調整した。収率８１％。
1H-NMR (400MHz, CDCl3, 22℃): delta 5.54 (d, 1H, H-a), 4.70 (m, 2H, H-c), 4.62 (m, 1H, H-b), 4.41 (m, 1H, H-f), 4.33 (m, 2H, H-d and H-e), 4.26 (m, 3H, H-c and H-g), 4.03 (m, 1H, H-g), 1.32-1.49 (5 s, 15H, H-h + H-i).
【０１００】
実施例８：ＭＴＣ−ＩＰＧＬＵ（ＭＷ４０２．２）の調整
【０１０１】
【化３２】
0006293150.tif 000040
【０１０２】
ＭＴＣ−ＩＰＧＬＵを、実施例６の手法および１，２，５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−グルコフルクトース（ＩＰＧＬＵ、２６０．３）を使用して調整した。収率７５％。1H-NMR (400MHz, CDCl3, 22℃): delta 5.90 (d, 1H, H-a), 5.39 (d, 1H, H-b), 4.69 (d, 2H, H-c), 4.46 (d, 1H, H-g), 4.18 (m, 2H, H-c), 4.06 (m, 2H, H-e and H-f), 4.00 (m, 1H, H-e), 1.30-1.52 (5 s, 15H, H-h + H-i).
【０１０３】
ペンダントフェニルウレア基を有する環状カーボネートをスキーム１に従って調整した。
【０１０４】
【化３３】
0006293150.tif 000041
【０１０５】
実施例９：ＭＴＣ−ＰＵＣ２（ＭＷ３２２．３）の合成
【０１０６】
１）エタノールアミン（５．０ｇ、４８．５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を、攪拌棒を装着し、乾燥させた１００ｍＬ丸底フラスコに投入し、乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）を添加した。得られた溶液を、氷浴中で０℃に冷却した。フェニルイソシアネート（５．１９ｇ、４．７４ｍＬ、４３．６ｍｍｏｌ、０．９ｅｑ）および３０ｍＬの乾燥ＴＨＦを、エタノールアミン／ＴＨＦ混合物へと滴下ファネルを通して３０ｍｉｎ以上かけて滴下して添加した。得られた混合物を室温まで暖まるまで放置し、さらに１６時間攪拌した。ＴＨＦを除去するためにローテーション留去を用いた。得られた粗生成物を、さらに４時間激しく攪拌させ、酢酸エチルから再結晶させた。再結晶した固体を濾過して分離し、さらに酢酸エチルで洗浄し、重量が一定になるまで乾燥させ、収量７．０ｇ（〜８０％）の中間体フェニルウレアエタノール（スキーム１のｎ＝２）を得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, 22℃): delta 8.55 (s, 1H, -NHPh), 7.36 (d, 2H, PhH), 7.20 (t, 2H, PhH), 6.88 (t, 1H, PhH), 6.18 (t, 1H, -CH2NHCO-), 4.76 (t, 1H, -OH), 3.43 (q, 2H, -CH2OH), 3.15 (q, 2H, -CH2NHCO-).
【０１０７】
２）ＭＴＣ−ＯＨ（４．３ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）を、上述したようにオキザリルクロライドを使用してＭＴＣ−Ｃｌに変換した。ＭＴＣ−Ｃｌを、５０ｍＬの乾燥メチレンクロライドに溶解し、追加のファネルに充填した。攪拌棒を装着した５００ｍＬの乾燥した丸底フラスコにフェニルウレアエタノール（５．５５ｇ、２５ｍｍｏｌ）、ピリジン（１．９７ｇ、２．０２ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）および乾燥メチレンクロライド（１５０ｍＬ）を充填した。追加のファネルを窒素雰囲気下で装着し、氷浴を使用してフラスコを０℃に冷却した。ＭＴＣ−Ｃｌ溶液を、３０ｍｉｎの期間の間に滴下して加え、得られた溶液をさらに３０ｍｉｎ攪拌した。氷浴を撤去し、溶液を室温まで温め、さらに１６時間攪拌した。粗生成物を、シリカゲルを使用したカラムクロマトグラフィーで精製した。メチレンクロライドを最初に溶離液とし、極性を徐々に増加させながら最終的に５ｖｏｌ％のメタノールの最終濃度とした。生成物フラクションを回収し、溶液をローテーション流去で除去した。分離した生成物を重量が一定になるまで真空乾燥して、８．０ｇ（約８０％）のオフホワイト／黄色みがかったオイルを得、放置により結晶化させた。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, 22℃): delta 8.59 (s, 1H, -NHPh), 7.38 (d, 2H, PhH), 7.21 (t, 2H, PhH), 6.89 (t, 1H, PhH), 6.26 (t, 1H, -CH2NHCO-), 4.57 (d, 2H, -COOCH2CH2-), 4.35 (d, 2H, -CH2OCOO-), 4.16, (t, 2H, -CH2OCOO-), 3.35 (q, 2H, -CH2NHCO-), 1.20 (s, 3H, -CH3).
【０１０８】
実施例１０：ＭＴＣ−ＰＵＣ８（ＭＷ４０６．５）を実施例９の手順および８−アミノ−１−オクタノールを使用して調整した。収率８６％。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, 22℃): delta 8.37 (s, 1H, -NHPh), 7.38 (d, 2H, PhH), 7.21 (t, 2H, PhH), 6.86 (t, 1H, PhH), 6.10 (t, 1H, -CH2NHCO-), 4.57 (d, 2H, -COOCH2CH2-), 4.39 (d, 2H, -CH2OCOO-), 4.17, (t, 2H, -CH2OCOO-), 3.06 (q, 2H, -CH2NHCO-), 1.26-1.40 (2 s, 15H, -(CH2)6- and -CH3).
【０１０９】
実施例１１：ＭＴＣ−ＰＵＣ１２（ＭＷ４６２．６）を、実施例９の手順および１２−アミノ−１−ドデカノールを使用して調整した。収率６５％。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, 22℃): delta 8.37 (s, 1H, -NHPh), 7.34 (d, 2H, PhH), 7.17 (t, 2H, PhH), 6.83 (t, 1H, PhH), 6.09 (t, 1H, -CH2NHCO-), 4.51 (d, 2H, -COOCH2CH2-), 4.33 (d, 2H, -CH2OCOO-), 4.09, (t, 2H, -CH2OCOO-), 3.02 (q, 2H, -CH2NHCO-), 1.28-1.56 (m, 23H, -(CH2)10- and -CH3).
【０１１０】
ＩＩ．ｂＰＥＩ−２５修飾
ＭＴＣ−ＩＰＧＡＬ修飾ｂＰＥＩ−２５
スキーム２にしたがってマンノース修飾ｂＰＥＩ−２５を製造した。
【０１１１】
【化３４】
0006293150.tif 000042
0006293150.tif 000043
0006293150.tif 000044
【０１１２】
上記構造中、波括弧のセットは、ポリマー鎖を囲んでおり、下付文字（例えば、ｘ、ｘ′）は、鎖中の繰り返し単位の数を表す。ｎ′＋ｑの量は、非修飾ｂＰＥＩ−２５の巨大分子当たりの第１アミン基の平均全モル量である。ｍ′＋ｐは、非修飾ｂＰＥＩ−２５の巨大分子当たりの第２アミン基の平均全モル量である。
【０１１３】
実施例１２：ポリマーＡ、マンノース修飾ｂＰＥＩ−２５の合成。ポリマーＡを形成するためのｂＰＥＩ−２５によるＭＴＣ−ＩＰＭＡＮの開環手順は、代表的な実施例である。グローブボックスにＭＴＣ−ＩＰＭＡＮ（０．２５ｇ、０．６２５ｍｍｏｌ、ＭＷ＝４０２．１５ｇ）に、ｂＰＥＩ−２５（０．２５ｇ、１モル＝１０，０００ｇ＝Ｍｎとして０．０２５ｍｍｏｌ）の２ＭｌＤＣＭ溶液を添加し、次いで１，８−ジアザビシクロ[５，４，０]ウンデク−７−エン（ＤＢＵ、４．７マイクロリットル、０．０３１ｍｍｏｌ）を加えた。ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮの質量供給比は１：１であり、モル比は、１：２５であった。反応溶液を１時間攪拌した。メタノール１０ｍＬおよび１ＭＨＣｌ（ａｑ．）１０ｍＬを添加した。得られた反応混合物を室温に冷却する前に２時間過熱環流した。最後に上記混合物をＶｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器（カットオフ分子量（ＭＷＣＯ）＝５ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、ゲッチンゲン、ドイツ）内で限外濾過し、脱イオン水（ＤＩ）で３度洗浄し、凍結乾燥を行った（０．３６ｇ、８０％）1H-NMR (400MHz, D2O, 22℃): delta 4.08 (s, 40H, H-d and H-e), 2.70-3.65 (br, m, 992H, H-e, H-f, H-g and分岐ポリエチレンイミンのH), 1.06 (s, 61H, H-i).
【０１１４】
ｂＰＥＩ−２５は、１モル＝１００００ｇということに基づき、０．０２５ｍｍｏｌのｂＰＥＩ−２５が、１．４５ｍｍｏｌの平均で５８個の第１アミン基、１１６個の第２アミン基、５８個の第３アミン基、および２３３個のエチレン基を有する、すなわち、０．０２５ｍｍｏｌのｂＰＥＩ−２５は、環状カーボネート・モノマーと反応する可能性のある１．４５ｍｍｏｌの第１アミン、１．４５ｍｍｏｌの第２アミンを有する。しかしながら、ｂＰＥＩ−２５の第１アミンサイトは、より反応性に富み、ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮに比較して過剰に存在する。上述した反応条件下で、ｂＰＥＩ−２５の第１アミン基は、ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮとだけ反応し、ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮの開環重合は、観測されなかった（ポリマーＡについてのスキーム２の上記構造において、ｘ＝０およびｘ′＝０）。ポリマーＡに対するスキーム２の最終的な構造における理論上の下付き文字の値は、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 25, n' = 33, k = 58, and j = 233である。ＮＭＲによる実際の値は、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 20, n' = 38, k = 58, and j = 233であることが見出された。
【０１１５】
実施例１３および１４：実施例１２の手順を使用し、ポリマーＢ、およびＣを、ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮのモル供給比を１：８および１：７５を使用してそれぞれ合成した。ポリマーＢについてのＮＭＲによるｂＰＥＩ−２５マンノースモル比は、１：７であった。したがって、ポリマーＢについては、スキーム２の最終構造中、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 7, n' = 51, k = 58, and j = 233であった。ポリマーＣの場合では、使用可能なアミンサイトに比較して過剰のＭＴＶＣ−ＩＰＭＡＮを使用した。過剰のＭＴＣ−ＩＰＭＡＮは、第２アミンサイトと反応するか、または修飾第１アミンサイトの最初に開環したサブユニットを含むアルコールにより開始される開環重合を生じさせる。ポリマーＣについてＮＭＲにより見出されたｂＰＥＩ−２５マンノースモル比は、１：６７であった。すなわち、ポリマーＣについては、スキーム２の最終構造において、x ≧ 0, x ≧ 0, p ≧ 0 , m' ≦ 116, q = 58, n' = 0, k = 58, and j = 233であった。
【０１１６】
実施例１５および実施例１６：ＤＢＵの不存在下でのマンノース修飾ｂＰＥＩ−２５の合成。実施例１２の手順を使用し、ｂＰＥＩ−２５：ＩＰＭＡＮのモル供給比として１：２５を用いて、酸性化前にポリマーＦおよびＧをそれぞれ１８時間および１時間で合成した。各場合において、利用可能なアミンサイトは、利用可能なＭＴＣ−ＩＰＭＡＮよりも過剰であった。ポリマーＦについてＮＭＲで見出されたｂＰＥＩ−２５：マンノース比は、１：２３であった。ポリマーＦについては、スキーム２の最終構造において、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 23, n' = 35, k = 58, and j = 233であった。ポリマーＧについてＮＭＲで観測されたｂＰＥＩ−２５：マンノースモル比は、１：２３であった。ポリマーＧについては、スキーム２の最終構造中、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 23, n' = 35, k = 58, and j = 233であった。
【０１１７】
実施例１７、１８、および１９：実施例１２の手順を使用し、ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮのモル供給比として１：５８、１：１２０および１：４００を用いて、酸性化前にポリマーＬ、ＭおよびＮをそれぞれ質量供給比１：２．３、１：５、および１：１６を使用して１時間調整した。ポリマーＬについてＮＭＲにより見出されたｂＰＥＩ−２５：マンノースモル比は、１：５３であった。ポリマーＬについては、スキーム２の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 53, n' = 5, k = 58, and j = 233であった。ポリマーＭの場合については、ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮは、利用可能な第１アミンサイトよりも過剰であった。過剰なＭＴＣ−ＩＰＭＡＮは、第２アミンサイトと反応するか、または修飾第１アミンサイトの最初に開環したサブユニットを含むアルコールにより開始される開環重合を生じさせる。ポリマーＭについてＮＭＲにより見出されたｂＰＥＩ−２５：マンノースモル比は、１：１２０であった。ポリマーＭについては、スキーム２の最終構造で、x ≧ 0, x' ≧ 0, p ≧ 0 , m' ≦ 116, q = 58, n' = 0, k = 58, and j = 233であった。ポリマーＮの場合については、ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮは、利用可能な第１アミンサイトおよび利用可能な第２アミンサイトよりも過剰であった。過剰なＭＴＣ−ＩＰＭＡＮは、第２アミンサイトと反応するか、または修飾第１アミンサイトの最初に開環したサブユニットを含むアルコールにより開始される開環重合を生じさせる。ポリマーＮについてＮＭＲにより見出されたｂＰＥＩ−２５：マンノースモル比は、Ｄ２Ｏ中でポリマーが自己組織化する傾向のため、決定できなかった。ポリマーＮについては、スキーム２の最終構造で、x ≧ 0, x' ≧ 0, p ≧ 0 , m' ≦ 116, q = 58, n' = 0, k = 58, and j ＞ 1と見積もった。
【０１１８】
実施例２０および２１：ＤＢＵを使用しないマンノース修飾ｂＰＥＩ−２５の合成。実施例１２の手順を使用し、ＤＢＵを用いること無く、ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮのモル供給比として１：１２．５、および１：６を用いて、酸性化前にポリマーＬ、ＭおよびＮをそれぞれ質量供給比２：１．および４：１を使用して１時間調整した。ポリマーＳについてＮＭＲにより見出されたｂＰＥＩ−２５：マンノースモル比は、１：１２．２であった。ポリマーＳについては、スキーム２の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 12.2, n' = 45.8, k = 58, and j = 233であった。ポリマーＴについてＮＭＲにより見出されたｂＰＥＩ−２５：マンノースモル比は、１：５．５であった。ポリマーＴについては、スキーム２の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 5.5, n' = 52.5, k = 58, and j = 233であった。
【０１１９】
ＭＴＣ−ＩＰＧＡＬ修飾ｂＰＥＩ−２５
グルコース修飾ｂＰＥＩ−２５をスキーム３にしたがって製造した。
【０１２０】
【化３５】
0006293150.tif 000045
0006293150.tif 000046
【０１２１】
実施例２２：ポリマーＨの調整。実施例１２の手順を使用し、ＤＢＵを用いること無く、ＭＴＣ−ＩＰＧＬＵ（ＭＷ４０２．１５）とｂＰＥＩ−２５（１モル＝１００００ｇ）の反応を、ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＩＰＧＬＵのモル供給比として１：２５および質量供給比１：１を使用して行った。反応時間を酸性化前１時間とし、限外濾過により精製してポリマーＨを得た。ポリマーＨについては、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５グルコースモル比が、１：２３であることが見出された。ポリマーＨについては、スキーム３の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 23, n' = 35, k = 58, and j = 233であった。
【０１２２】
ＭＴＶＣ−ＩＰＧＡＬ修飾ｂＰＥＩ−２５
スキーム４に従ってガラクトース修飾ｂＰＥＩ−２５を製造した。
【０１２３】
【化３６】
0006293150.tif 000047
0006293150.tif 000048
【０１２４】
実施例２３：ポリマーＩの調整。実施例１２の手順を使用し、ＤＢＵを用いること無く、ＭＴＣ−ＩＰＧＡＬ（ＭＷ４０２．１５）とｂＰＥＩ−２５（１モル＝１００００ｇ）の反応を、ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＩＰＧＡＬのモル供給比として１：２５および質量供給比１：１を使用して行った。反応時間を酸性化前１時間とし、限外濾過により精製してポリマーＩを得た。ポリマーＩについては、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：ガラクトースモル比が、１：２４であることが見出された。ポリマーＩについては、スキーム４の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 24, n' = 34, k = 58, and j = 233であった。
【０１２５】
実施例２４：ポリマーＲを、実施例２３の手順を使用し、ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＩＰＧＡＬのモル供給比として１：１２．５および質量供給比２：１を使用して調整した。ポリマーＲについては、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：ガラクトースモル比が、１：１２であることが見出された。ポリマーＲについては、スキーム４の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 12, n' = 46, k = 58, and j = 233であった。
【０１２６】
実施例２５：ポリマーＲを、実施例２３の手順を使用し、ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＩＰＧＡＬのモル供給比として１：６および質量供給比４：１を使用して調整した。ポリマーＵについては、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：ガラクトースモル比が、１：５．６であることが見出された。ポリマーＵについては、スキーム４の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 5.6, n' = 52.4, k = 58, and j = 233であった。
【０１２７】
スキーム５に従い、ＴＭＣ修飾ｂＰＥＩ−２５を調整した。
【０１２８】
【化３７】
0006293150.tif 000049
【０１２９】
実施例２６：ポリマーＪの調整。実施例１２の手順を使用し、ＤＢＵを用いること無く、ＴＭＣ（ＭＷ１０２．１）と、ｂＰＥＩ−２５（１モル＝１００００ｇ）の反応を、ｂＰＥＩ−２５：ＴＭＣのモル供給比として１：１００および質量供給比１：１を使用して行った。反応時間を１時間とした。ポリマーＪについては、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：開環ＴＭＣのモル比が、１：１０９であることが見出された。ポリマーＪについては、スキーム４の最終構造で、x ≧ 0, x' ≧ 0, p ≧ 0 , m' ≦ 116, q = 58, n' = 0, k = 58, and j = 233であった。
【０１３０】
実施例２７：実施例２６の手順を使用し、ｂＰＥＩ−２５：ＴＭＣのモル供給比として１：２５および質量供給比４：１を使用してポリマーＫを合成した。ポリマーＫについては、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：開環ＴＭＣのモル比が、１：２７であることが見出された。ポリマーＫについては、スキーム４の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 25, n' = 33, k = 58, and j = 233であった。
【０１３１】
実施例２８：実施例２６の手順を使用し、ｂＰＥＩ−２５：ＴＭＣのモル供給比として１：８および質量供給比１２：１を使用してポリマーＰを合成した。ポリマーＰについては、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：開環ＴＭＣのモル比が、１：７であることが見出された。ポリマーＰについては、スキーム４の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 8, n' = 50, k = 58, and j = 233であった。
【０１３２】
実施例２９：実施例２６の手順を使用し、ｂＰＥＩ−２５：ＴＭＣのモル供給比として１：１および質量供給比１００：１を使用してポリマーＶを合成した。ポリマーＶについては、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：開環ＴＭＣのモル比が、１：１であることが見出された。ポリマーＶについては、スキーム４の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 1, n' = 57, k = 58, and j = 233であった。
【０１３３】
実施例３０：ポリマーＯ。ＭＴＣ−Ｃ２修飾ｂＰＥＩ−２５をスキーム６に従って調整した。
【０１３４】
【化３８】
0006293150.tif 000050
【０１３５】
ポリマーＯを、実施例１２の手順およびＭＴＣ−Ｃ２を使用して合成した。ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−Ｃ２のモル供給比として１：２５および質量供給比２：１を使用した。ポリマーＯについては、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：開環したＭＴＣ−Ｃ２のモル比が、１：２７であることが見出された。ポリマーＯについては、スキーム６の最終構造で、x = 0, x' = 0, p = 0 , m' = 116, q = 25, n' = 33, k = 58, and j = 233であった。
【０１３６】
ＭＴＣ−Ｂｎ修飾ｂＰＥＩ−２５
実施例３１。ポリマーＰ４３。実施例１２の手順を使用し、スキーム７に従い、ＭＴＣ−Ｂｎ修飾ｂＰＥＩ−２５を調整した。
【０１３７】
【化３９】
0006293150.tif 000051
【０１３８】
ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−Ｂｎのモル供給比として１：２５および質量供給比１．６：１を使用した。反応時間を、エーテルによる析出精製前に１時間とした。製造されたＰ４３では、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：カルバメートのモル比が、１：２９であることが見出された。ポリマーＰ４３については、スキーム７の最終構造で、m = 116, q = 29, n' = 29, k = 58, and j = 233であった。
【０１３９】
実施例３２（比較例）：ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−Ｂｎのモル供給比として１：３（ｂＰＥＩ−２５の１モル＝１００００ｇであり、ＭＴＣ−ＢｎのＭＷ＝２５０．３であることに基づき）、および質量供給比１３．３：１を使用した。反応時間を、エーテルによる析出精製前に１時間とした。製造されたＰ４８では、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：カルバメートのモル比が、１：３であることが見出された。ポリマーＰ４８については、スキーム７の最終構造で、m = 116, q = 3, n' = 55, k = 58, and j = 233であった。
【０１４０】
ＭＴＣ−ＰＵＣ２修飾ｂＰＥＩ−２５
実施例３３。ポリマーＰ４４、ＭＴＣ−ＰＵＣ２修飾ｂＰＥＩ−２５を、スキーム８に従って調整した。
【０１４１】
【化４０】
0006293150.tif 000052
【０１４２】
ポリマーＰ４４を、疎水性モノマーＭＴＣ−ＰＵＣ２を使用して実施例１２に従い合成した。ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＰＵＶＣ２のモル供給比として１：２５および質量供給比１．２：１を使用した。反応時間を、エーテルによる析出精製前に１時間とした。製造されたＰ４４では、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：カルバメートのモル比が、１：２７であることが見出された。ポリマーＰ４４については、スキーム８の最終構造で、m = 116, q = 27, n' = 31, k = 58, and j = 233であった。
【０１４３】
実施例３４（比較例）ポリマーＰ４９、ＭＴＣ−ＰＵＣ２修飾ｂＰＥＩ−２５を、実施例３３に従い調整した。ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−ＰＵＶＣ２のモル供給比として１：３および質量供給比１０．４：１を使用した。反応時間を、エーテルによる析出精製前に１時間とした。製造されたポリマーＰ４９では、ＮＭＲにより、ｂＰＥＩ−２５：カルバメートのモル比が、１：３．４であることが見出された。ポリマーＰ４９については、スキーム８の最終構造で、m = 116, q = 3.4, n' = 54.6, k = 58, and j = 233であった。
【０１４４】
コレステリル修飾ｂＰＥＩ−２５
コレステリル担持環状カーボネート・モノマーＣｈｏｌ−ＭＴＣを、市販に利用できるコレステリルクロロホルメート（Ｃｈｏｌ−Ｃｌ）から、スキーム９に従って合成した。
【０１４５】
【化４１】
0006293150.tif 000053
【０１４６】
調整は、以下の３ステップを含む：１）クロロホルメートＣｈｏｌ−Ｃｌと、２ブロモエチルアミンハイドロブロマイドを、ジクロロメタン中で、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を反応させ、カルバメートＣｈｏｌ−Ｂｒを形成する、２）Ｃｈｏｌ−Ｂｒと、アシッドジオールビスＭＰＡをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／ＫＯＨ中で塩基触媒反応させ、ジオールエステルＣｈｏｌ−ＭＰＡを形成する、３）Ｃｈｏｌ−ＭＰａのトリホスゲンを介在した環状化により、環状カーボネート・モノマーＣｈｏｌ−ＭＴＣを形成する。これはオーバーオールの収率で約２６％である。上記３ステップそれぞれの詳細な手順を、以下に説明する。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲを、中間体および環状カーボネート・モノマーの構造を確認するために使用した。
【０１４７】
Ｃｈｏｌ−Ｂｒの調整。マグネチック攪拌バーを装着した５００ｍＬの丸底フラスコに、コレステリルクロロホルメート（２５．０ｇ、５５．７ｍｍｏｌ、１．０当量）および２−ブロモエチルアミンハイドロブロマイド（１２．９ｇ、６３．０ｍｍｏｌ、１．１当量）を、ジクロロメタン（２００ｍＬ）中に懸濁し、この懸濁物を氷浴中で冷やした。この懸濁物にジクロロメタン（１００ｍＬ）中のトリエチルアミン（ＴＥＡ）（１８．０ｍＬ、１３．０６ｇ、１２９．１ｍｍｏｌ、２．３当量）を１時間以上かけて滴下した。反応混合物を、浴中でさらに１時間保持し、室温まで暖めた。反応を、その後さらに１４時間行い、その後、ジクロロメタンを真空除去し、得られた固体を酢酸エチルおよびヘキサン１：１混合物（３００ｍＬ）中に懸濁させた。有機層を、飽和食塩水（１００ｍＬ）、脱イオン水（５０ｍＬ）の混合物で２度洗浄し、飽和食塩水（１００ｍＬ）で一度洗浄した。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を真空除去し、ペールイエロー黄色の固体（２９．１ｇ、９７．４％）を得た。粗生成物は、１ＨＮＭＲにより充分な純度を有していることを確認し、さらに精製を行わなかった。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δ、ｐｐｍ）：5.38 (コレステロールのCH=C), 5.03 (側鎖のNHCOO), 4.50 (コレステロールのCH-OCONH), 3.58 (BrCH2CH2NH), 2.45 - 0.6 (コレステロールの残りのプロトン).
【０１４８】
Ｃｈｏｌ−ＭＰＡの合成。マグネチック攪拌バーを装着した５００ｍＬ丸底フラスコ中、ＫＯＨ（８５％、２．０ｇ、３０．３ｍｍｏｌ、１．１当量）、ビス−ＭＰＡ（４．２０ｇ、３１．３ｍｍｏｌ、１．１当量）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２００ｍＬ）の混合物を１００℃で１．５時間加熱した。均一な溶液が形成され、Ｃｈｏｌ−Ｂｒ（１５．０ｇ、２８．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を熱い溶液に加えた。攪拌を続けながら１６時間加熱し、ほとんどのＤＭＦを減圧除去して、油状の半固体を得、これをその後、２：１酢酸エチル：ヘキサン混合物（３００ｍＬ）に溶解した。有機溶液を飽和食塩水（１００ｍＬ）および脱イオン水（１００ｍＬ）で洗浄した。得られた水層を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出して、洗浄プロセスで失われたＣｈｏｌ−ＭＰＡを回収した。混ぜた有機層を、飽和食塩水（８０ｍＬ）および脱イオン水（２０ｍＬ）混合物で洗浄した。混ぜた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を真空除去してペールホワイトのワックス状の固体（１６．５ｇ）として、粗生成物を得た。粗生成物を、充填剤としてシリカ、溶離液としてヘキサン−酢酸エチルのグラジエントを使用したフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、ワックス状の固体（１０．７ｇ、６４．８％）として最終生成物であるＣｈｏｌ−ＭＰＡを得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δ、ｐｐｍ）：5.35 ( コレステロールのCH=C および側鎖の NHCOO), 4.47 (コレステロールのCH-OCONH), 4.26 (CH2CH2NHCOO), 3.88 and 3.72 (CH2OH) 3.45 (CH2CH2NHCOO), 3.34 (OH), 2.50 - 0.60 (コレステロールおよびビス−ＭＰＡのCH3).
【０１４９】
Ｃｈｏｌ−ＭＴＣの調整。マグネチック攪拌バーを装着した５００ｍＬ底フラスコ中で、Ｃｈｏｌ−ＭＰＡ（１０．１ｇ、１７．１ｍｍｏｌ、１．０当量）を、無水ジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解した。ピリジン（８．２ｍＬ、８．０ｇ、１０１．５ｍｍｏｌ、５．９当量）を加え、溶液をドライアイス−アセトン浴（−７８℃）で冷却した。この冷却した反応混合物にトリホスゲン（２．６９ｇ、９．０６ｍｍｏｌ、トリホスゲンの機能当量に基づき１．９当量）溶液（ジクロロメタン５０ｍＬに溶解した）を１時間以上かけて滴下した。１時間後、反応混合物を−７８℃から室温まで暖め、２時間後反応を飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて、停止させた。有機層を１．０Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）および飽和食塩水（８０ｍＬ）、次いで飽和食塩水（５０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）の混合物で２度洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させた。溶媒を真空除去して、組成製物を、わずかに黄味がかった固体として得た。粗生成物をさらに、充填剤としてシリカ、クロロホルム酢酸エチル（４：１）混合物のグラジエントを溶離液として精製して、ワックス状の白色固体として最終生成物を得た。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δ、ｐｐｍ）：5.35 (コレステロールのCH=C), 4.95(NHCOO), 4.86 and 4.27 (CH2OCOOCH2), 4.47 (コレステロールのCH-OCONH), 4.27 (CH2CH2NHCOO), 3.45 (CH2CH2NHCOO), 2.40 - 0.60 (コレステロールおよび環状カーボネート・モノマーの残りのCH3).
【０１５０】
実施例３５：ポリマーＰ４５の調整。Ｃｈｏｌ−ＭＴＣ修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＰ４５を、スキーム１０に従って調整した。
【０１５１】
【化４２】
0006293150.tif 000054
【０１５２】
この実施例では、３つのコレステリル基を含有する側鎖基が、最終ポリマーに不溶性を与えるべく、目的とするｑの値は、３であり目的とするｎ′の値は、５５である。ｂＰＥＩ−２５：Ｃｈｏｌ−ＭＴＣモル供給比を１：３（１モルのｂＰＥＩ−２５＝１００００ｇであり、Ｃｈｏｌ−ＭＴＣＭＷ６１５．９であることに基づく）とし、質量供給比を５．４１：１とした。反応時間を、エーテルによる精製前の１時間とした。ポリマーＰ４５について、ＮＭＲによれば、ｂＰＥＩ−２５：カルバメートのモル比は、１：２．９１であることが見出された。ポリマーＰ４５について、m = 116, q = 2.9, n' = 55.1, k = 58, and j = 233であった。
【０１５３】
実施例３６（比較例）ポリマーＰ４６の調整。コレステリルクロロホルメート修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＰ４６をスキーム１１に従って調整した。
【０１５４】
【化４３】
0006293150.tif 000055
【０１５５】
この例では、目的とするｑの値は、３であり、目的とするｎ′の値は、５５である。反応を、ｂＰＥＩ−２５：Ｃｈｏｌ−Ｃｌモル供給比を１：３．２（１モルのｂＰＥＩ−２５＝１００００ｇであり、ＣｈｏｌＣｌＭＷ４４９．１１であることに基づく）とし、質量供給比を７：１とした。反応時間を、エーテルによる精製前の２時間とした。ポリマーＰ４６について、ＮＭＲによれば、ｂＰＥＩ−２５：カルバメートのモル比は、１：２．２であることが見出された。ポリマーＰ４６について、m = 116, q = 2.2, n' = 55.8, k = 58, and j = 233であった。
【０１５６】
ブチルクロロホルメート修飾ｂＰＥＩ−２５
実施例３７（比較例）ポリマーＰ４７の調整。ブチルクロロホルメート（ＢｕＯＣＯＣｌ）修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＰ４７をスキーム１２に従って調整した。
【０１５７】
【化４４】
0006293150.tif 000056
【０１５８】
この例では、目的とするｑの値は、２５であり、目的とするｎ′の値は、３３である。反応を、ｂＰＥＩ−２５：ＢｕＯＣＯＣｌモル供給比を１：２５．２（１モルのｂＰＥＩ−２５＝１００００ｇであり、ＢｕＯＣＯＣｌＭＷ１３６．５７であることに基づく）とし、質量供給比を２．９：１とした。反応時間を、エーテルによる精製前の２時間とした。ポリマーＰ４７について、ＮＭＲによれば、ｂＰＥＩ−２５：カルバメートのモル比は、１：２４．４であることが見出された。ポリマーＰ４７について、m = 116, q = 24.4, n' = 33.6, k = 58, and j = 233であった。
【０１５９】
表４にポリマーの調整を纏めた。
【０１６０】
【表４】
0006293150.tif 000057
【０１６１】
表５に修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーのＮＭＲによる分析を纏めた。
【０１６２】
【表５】
0006293150.tif 000058
【０１６３】
ＩＩＩ．生物学的活性材料の複合体
細胞培養
ＨｅｐＧ２、ＨｅＬＡ、およびＳＫ−ＯＶ−３細胞を、ミニマム・エッセンシャル・メディアム・イーグル（ＨｅｐＧ２についてＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、シンガポール）およびＲＰＭＩ  １６４０培地（ＨｅＬａおよびＳＫ−ＯＶ−３について、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、シンガポール）中で培養した。両方の培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、シンガポール）、１００マイクログラム／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、２ｍＭのＬ−グルタミン酸および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、シンガポール）で補養した。細胞は、３７℃でＣＯ２５％、湿度９５％の空気雰囲気中で培養した。すべての細胞ラインは、９０％のコンフルエンスの時点でトリプシン／ＥＤＴＡ培地を使用して分離した。
【０１６４】
ポリマー／ｓｉＲＮＡおよびポリマー／ＤＮＡ複合体の形成
ｂＰＥＩ−２５およびｂＰＥＩ−２をＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水およびＨＰＬＣ水中にそれぞれ溶解して、ポリマーの水溶液を作成した。複合体を形成するために、約１０秒間、穏やかな渦流下で、等容量のｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ溶液をポリマー溶液中に滴らせて所望するＮ／Ｐ比（核酸のリン酸に対するポリマーの窒素含有量のモル比）を得た。この混合物を、後続する検討の前に、室温で３０ｍｉｎ平衡化して、ポリマーとｓｉＲＮＡまたはＤＮＡ分子との間で静電的に相互作用させた。
【０１６５】
ポリマー／ＤＮＡ複合体の平衡化前の粒径およびゼータ電位を、６５８ｎｍのＨｅ−Ｎｅを使用したレーザ動的光散乱（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｕ．Ｓ．Ａ）で散乱角を９０°として測定し、かつＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌｔｄ．  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、で測定した。
【０１６６】
表６は、２つのＮ／Ｐ比におけるいくつかの修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマー／ＧＦＰレポータ遺伝子複合体の流体動力学的粒径をリストする。
【０１６７】
【表６】
0006293150.tif 000059
【０１６８】
典型的には、２０〜２００ｎｍのサイズ範囲のポリマーナノ粒子は、腎臓における糸球体濾過を介した早期の排出を防止する程度に充分大きく、血管に侵入し、浸透を向上させ、またターゲット腫瘍組織に受動的に蓄積されるための遅延（ＥＰＲ）効果を得るに充分なだけ小さい。図１〜図４に示されるように、ＧＦＰレポータ遺伝子（図１）およびルシフェラーゼレポータ遺伝子（図２〜４）を使用したＤＮＡ複合体のサイズは、概ねＮ／Ｐ比が増加するにしたがって減少する。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ＤＮＡとの間のより強い静電的相互作用が、カチオン性ポリマーとアニオン性ＤＮＡとの間のより緊密な複合体を形成させることを示す。この効果は、ポリマーＡ，Ｂ，Ｆ，Ｕ，Ｒ，ＰおよびＪで、より顕著であった。ポリマーＡおよびＢのＧＦＰ遺伝子複合体は、Ｎ／Ｐ５でそれぞれ４００〜１０００ｎｍからＮ／Ｐ３０における１１９ｎｍおよび１０３ｎｍに減少した。ポリマーＲＦ，Ｕ，Ｒ，ＰおよびＪのルシフェラーゼ遺伝子複合体は、Ｎ／Ｐ１０での２５０ｎｍ、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、２７０ｎｍおよび２６０ｎｍから、それぞれ、Ｎ／Ｐ５０での９１ｎｍ、９６ｎｍ、９９ｎｍ、１１３ｎｍ、１３１ｎｍに低下した。ポリマーＧ／ルシフェラーゼ遺伝子複合体の粒径は、Ｎ／Ｐ１０での２６９ｎｍから所望するナノサイズ範囲であるＮ／Ｐ５０での２０２ｎｍに減少した。ポリマーＳ，Ｔ，ＵおよびＶについては、環状カーボネート・モノマーで修飾された第１アミン基のパーセンテイジが最も低く、図２〜図４における他のポリマー２比較してより緊密なルシフェラーゼ遺伝子複合体が観測された。ポリマーＶは、最小のルシフェラーゼ遺伝子複合体（８７ｎｍ）を形成した。ポリマーＣおよびＬは、他のポリマーの様に効率的に遺伝子複合体を形成せず、Ｎ／Ｐ比が高くとも大粒子を形成した（図１および図２）。遺伝子複合体Ａ，Ｂ，Ｓ，Ｔ，Ｆ，Ｇ，Ｌ，Ｕ，Ｒ，Ｉ，Ｈ，Ｖ，Ｐ，Ｊ，ＫおよびＯについては、狭い粒径分布が得られ、それぞれ、0.178, 0.200, 0.168, 0.104, 0.129, 0.078, 0.150, 0.130, 0.120, 0.207, 0.209, 0.149, 0.075, 0.104, 0.097 および0.123の多分散指数を有していた。遺伝子複合体ＭおよびＮの多分散指数は、それぞれ０．４および０．７よりも大きかった。比較として、非修飾ｂＰＥＩ−２５のＮ／Ｐ１０のルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体は、８４ｎｍの粒径を有していた。
【０１６９】
遺伝子複合体の全正電荷は、複合体の細胞膜の負に帯電したリン脂質表面との相互作用に影響し、したがってまた遺伝子トランスフェクション効率に影響する。図５は、ＧＦＰレポータ遺伝子複合体Ａ、Ｂ、Ｃのゼータ電位を示す。図６は、ルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体Ｓ，Ｔ，Ｇ，Ｌ，ＭおよびＮのゼータ電位を示す。ＧＦＰ遺伝子複合体Ａ，Ｂ，Ｓ，Ｔ，ＦおよびＧは、Ｎ／Ｐ１０〜Ｎ／Ｐ５０でカチオン性の表面電荷密度を有し、これは非修飾ｂＰＥＩ−２５のＧＦＰ遺伝子複合体の値と同程度である。ルシフェラーゼ遺伝子複合体Ｓ，Ｔ，ＦおよびＧは、非修飾ｂＰＥＩ−２５／ルシフェラーゼ遺伝子複合体と同程度、またはわずかに低い値のカチオン性表面電荷を有する。したがって、遺伝子複合体Ａ，Ｂ，Ｓ，Ｔ，ＦおよびＧの遺伝子複合体のゼータ電位は、１５ｍＶから約２６ｍＶの範囲だが、Ｎ／Ｐ１０で調整したｂＰＥＩ−２５の対応する遺伝子複合体は、約２２ｍＶ（ｂＰＥＩ−２５／ＧＦＰ）または２６ｍＶ（ｂＰＥＩ−２５／ルシフェラーゼ）のゼータ電位を有した（不図示）。
【０１７０】
遺伝子複合体Ｃ（ＧＦＰ）、Ｌ（ルシフェラーゼ）、Ｍ（ルシフェラーゼ）およびＮ（ルシフェラーゼ）は、同一のＮ／Ｐ比で顕著に低いカチオン性電荷密度を有した（図５および図６）。ゼータ電位は、複合体Ｃについては、５ｍＶ〜１３ｍＶであり、複合体Ｌについては、−１１ｍＶ〜２ｍＶであり、複合体Ｍについては、−１４ｍＶ〜−８ｍＶであり、複合体Ｎについては、−２５ｍＶ〜−１４ｍＶであった。理論に関連づけるわけではないが、ポリマーＣ、Ｌ，ＭおよびＮの遺伝子複合体は、それらの大きな粒径および低いゼータ電位のため、より効率的ではないトランスフェクション剤と考えられる。
【０１７１】
ルシフェラーゼ遺伝子複合体Ｉ，Ｒ，Ｕ（ガラクトース修飾ｂＰＥＩ−２５）およびＨ（グルコース修飾ｂＰＥＩ−２５）のゼータ電位は、全Ｎ／Ｐ比において７〜２０ｍＶであった（図７）。これらの値は、Ｎ／Ｐ比が１０の非修飾ｂＰＥＩ−２５のものよりわずかに低い。同様に、ルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体Ｖ，Ｐ，Ｋ，Ｊ，Ｏのゼータ電位は、全Ｎ／Ｐ比で７〜２０ｍＶであった（図８）。
【０１７２】
ゲル遅延度アッセイ
ポリマー／ＤＮＡ複合体の種々の配合を、Ｎ／Ｐ比を１〜３０の範囲で上述したように調整した。平衡化後、ＤＮＡラダー複合体を１％アガロースゲル上でエレクトロポレートした。アガロースゲルは、アガロース溶液５０ｍＬにつき１０ｍｇ／エチジウムブロマイド５マイクロリットルで染色した。ゲルを０．５×ＴＢＥバッファで、８０Ｖ５０ｍｉｎ動作させ、その後、ＵＶイルミネータ（Ｃｈｅｍｉ  Ｇｅｎｉｕｓ、Ｅｖｏｌｖｅ、シンガポール）で、コンプレックス化したＤＮＡおよびネイキッドのＤＮＡプラスミドの相対位置を検査した。
【０１７３】
図９〜図２７は、種々の修飾ポリマーのルシフェラーゼレポータ遺伝子複合体のＤＮＡラダーの写真を示す。Ａ（図９）、Ｂ（図１０）、 Ｆ（図１２）、Ｇ（図１３）、Ｓ（図１４）、Ｔ（図１５）、Ｕ（図１９）、Ｒ（図２０）、Ｉ（図２１）、Ｈ（図２２）、Ｖ（図２３）、Ｐ（図２４）、Ｋ（図２５）、Ｊ（図２６）およびＯ（図２７）は、ＤＮＡに効率的に結合してこれを濃縮し、完全に複合体中でのＮ／Ｐ３以下でのＤＮＡ移動度を遅延した。これと比較して、Ｃ（図１１）、Ｌ（図１６）、Ｍ（図１７）およびＮ（図１８）は、ＤＮＡ結合性に乏しく、完全なＤＮＡ結合は、ＣについてＮ／Ｐ１５でだけ、観察された。Ｎ／Ｐ３０でもＬ，Ｍ，Ｎは、効率的にＤＮＡに結合せず、またＤＮＡラダーを濃縮しなかった（より多くのアミン基がカーボネート−マンノース結合のために消費された。）。
【０１７４】
図２８は、非修飾ｂＰＥＩ−２５／ルシフェラーゼ複合体についてのＤＮＡラダーの写真を示す。図２９は、非修飾ｂＰＥＩ−２／ルシフェラーゼ複合体についてのＤＮＡラダーの写真を示す。図２８および図２９は、Ｎ／Ｐ比３で各複合体が完全なＤＮＡ結合を達成しているのを示す。
【０１７５】
In vitro遺伝子発現
修飾ｂＰＥＩ−２５ポリ真生のＧＦＰレポータ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子複合体のin vitro遺伝子トランスフェクション効率を、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａおよびＳＫ−ＯＶ−３細胞ラインを使用して検討した。ＨｅｐＧ２およびＨｅＬａ細胞は、ＧＦＰ遺伝子デリバリーのために１２ウェルプレートに、１ウェル当たり、１０００マイクロリットルにつき２×１０５セルの密度でシードした。ＨｅｐＧ２細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子デリバリーのために、２４ウェルプレートに、１ウェル当たり、５００マイクロリットルにつき１×１０５セルの密度でシードした。ＳＫ−ＯＶ−３細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子デリバリーのために、２４ウェルプレートに、１ウェル当たり、５００マイクロリットルにつき８×１０４セルの密度でシードした。２４時間後、プレートの培養液を、新鮮な成長培養液に交換し、次いで種々のＮ／Ｐ比で１００マイクロリットルの複合体溶液（３．５マイクログラムのＧＦＰプラスミドＤＮＡを含有）または５０マイクロリットルの複合体溶液（２．５マイクログラムのルシフェラーゼプラスミドＤＮＡを含有）を滴下して加えた。その後、４時間培養し、遊離の複合体を各ウェル内の培養液を交換することによって除去した。さらに培養６８時間後、各ウェル内の細胞培養培液を除去し、細胞を０．５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で一回洗浄した。
【０１７６】
ＧＦＰタンパク発現を解析するために、０．３ｍＬのトリプシンを各ウェルのデタッチ細胞に加えた。新鮮な成長培養液（０．３ｍＬ）をその後加え、細胞懸濁液を１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。さらに２回、再懸濁および遠心分離の細胞洗浄サイクルをＦＡＣＳバッファ（２％のウシ血清アルブミンで付養したＰＢＳ）内で行った。ＧＦＰを発現した細胞のパーセンテイジを、その後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を使用して１００００例から決定し、平均±標準偏差の３倍として記載した。
【０１７７】
ルシフェラーゼ発現アッセイのため、０．２ｍＬのレポータ・リシス・バッファを各ウェルに添加した。冷凍（−８０℃、３０ｍｉｎ）および解凍を２サイクル行った後、細胞溶解物を１４０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して清浄化し、その後、ルミノメータ（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、ドイツ）を使用して相対光度ユニット（ＲＬＵ）を決定するために、２０マイクロリットルのスーパーネータントを１００マイクロリットルのルシフェラーゼ基質に混合した。ＲＬＵの読値は、ＢＣＡタンパクアッセイを使用して決定したスーパーネータントのタンパク濃度に対して規格化し、全ルシフェラーゼ発現効率を得た。in vitro遺伝子発現においては、ネイキッドＤＮＡを、ネガティブ対照群として使用した。非修飾ｂＰＥＩ−２５／遺伝子複合体、およびいくつかの例としての非修飾ｂＰＥＩ−２／遺伝子複合体をポジティブ対照群とした。これらの対照群は、高い遺伝子発現効率を有しつつ、５０％以上の細胞生存性を提供する、最適なＮ／Ｐ比（すなわち、ｂＰＥＩ−２５で、Ｎ／Ｐ１０、ｂＰＥＩ−２でＮ／Ｐ４０）で調整した。データは、平均±標準偏差の４倍で表した。
【０１７８】
後述する手順は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションおよびリアルタイム・リバース・トランスクリプション−ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）に対して使用したものである。ポリマーのin vitro  ｓｉＲＮＡデリバリー特性を、ＨｅＬａ細胞ラインを使用して検討した。細胞は、１２ウェルプレートにウェルにつき、１０００マイクロリットル当たり１×１０５の密度でシードした。２４時間後、プレート培養液を新鮮な成長培養液に交換し、次いでＮ／Ｐ比５０で、１００マイクロリットルの複合体溶液（１００ｎＭ  ｂｃｌ−２ｓｉＲＮＡまたは種々のポリマーで複合体としたネガティブ対照群のｓｉＲＮＡを含有する）を滴下して添加した。その後４時間培養し、遊離した複合体を、各ウェルの培養液を交換することによって除去した。さらに６８時間培養し、各ウェルの細胞培養液を除去し、細胞にＲＮＡイクストラクションを適用した。
【０１７９】
各条件を繰り返して行い、結果の再現性を保障し、各サンプルを、１２ウェルプレートの別々のウェルから採取した。未処理のＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡまたはポリマーｂｃｌ−２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした全ＲＮＡ、またはネガティブ対照群のｓｉＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  ハンドブックに従って、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、シンガポール）で抽出した。その後、全ＲＮＡＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、シンガポール）により、製造者の指示に従って、オリゴ（ｄＴ）１８プライマーを用いてリバース−トランスクリプトした。得られたｃＤＮＡに対し、リアルタイムＰＣＲ反応を適用した。これは、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＰＣＲマスタミックス（２ｘ）（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ、シンガポール）で行い、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅａｓｅｒｃｈ）を使用して検出した。Ｂｃｌ−２（ターゲット遺伝子）およびβ−アクチン（内在性対照群）のカスタム・プライマーは、購入した。各配列は、以下の通りである。Ｂｃｌ−２：sense 5’-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3’、antisense 5’-CCGCATGCTGGGGCCGTA CAGTTCC-3’; β-アクチン, sense 5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’, antisense 5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’。β−アクチン・プライマー配列は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩリバース−トランフェクションキットで与えられたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎプライマーに基づいたものであり、３５３−ｂｐ生成物を得た。カスタムＢｃｌ−２プライマーは、文献（Ｈｕａｎｇら、ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉａ  Ｓｉｎｉｃａ、２００６、Ｆｅｂ、２７（２）：２４２−２４８）に基づいた。２５マイクロリットルの反応混合物は、１２．５マイクロリットルのＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ  ＰＣＴＲマスタミックス（２ｘ）、１０マイクロリットルの各プライマー、９．５マイクロリットルのＤＥＰＣ−処理水および２マイクロリットルのｃＤＮＡサンプルを含んでいた。反応条件は、以下のように設定した：（１）９５℃で１０ｍｉｎ培養；（２）４５サイクルで増幅（各サイクルについて、９５℃で４５ｓｅｃ、５５℃で、４５ｓｅｃ、７２℃で９０ｓｅｃ）；（３）最終イクステンションのため７２℃で７ｍｉｎ、１サイクル；（４）ステップあたり１度の変化で各ステップの間に５ｓｅｃの間隔を開け、７２℃〜９５℃に昇温。種々の処理にあたってのＢｃｌ−２の遺伝子発現レベルの平均フォールド・チェンジは、β−アクチンの自家培養遺伝子に対し、２−ΔΔＣＴ法を使用して規格化した（Ｌｉｖａｋら、Ｍｅｔｈｏｄ、２５、４０２−４０８（２００１）。
【０１８０】
ＨｅｐＧ２細胞におけるＧＦＰトランスフェクション効率
図３０〜図３３は、種々のＮ／Ｐ比での種々の修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーにより行ったＨｅｐＧ２細胞におけるin vitroＧＦＰ遺伝子のトランスフェクション効率を示す棒グラフである。図３４は、種々のＮ／Ｐ比での種々の修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーにより行ったＨｅＬａ細胞におけるin vitroＧＦＰ遺伝子のトランスフェクション効率を示す棒グラフである。結果は、平均±標準偏差の３倍で表示した。Ｎ／Ｐ比で特定したポリマー濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、以下の通りである：非修飾ｂＰＥＩ−２５- 0, 0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4.0, 6.0, 8.0, 12.0, 16.0 および 20.0 mg／L; A, F, G, H, I, J - 0, 3.3, 4.9, 6.6, 8.2, 12.3, 16.4, 24.6, 32.8 および 41.0 mg／L; B - 0, 2.2, 3.3, 4.4, 5.5, 8.2, 11.0, 16.4, 21.9 および 27.4 mg／L; C - 0, 6.6, 9.9, 13.1, 16.4, 24.6, 32.8, 49.3, 65.7 および 82.1  mg／L. K - 0, 2.1, 3.1, 4.1, 5.2, 7.7, 10.3, 15.5, 20.6 および 25.8 mg／L; L - 0, 4.4, 6.7, 8.9, 11.1, 16.7, 22.2, 33.3, 44.4, および 55.5 mg／L; M - 0, 9.5, 14.3, 19.1, 23.9, 35.8, 47.7, 71.6, 95.5, および 119.3 mg／L; N - 0, 28.1, 42.2, 56.3, 70.3, 105.5, 140.7, 211.0, 281.3, および 351.7 mg／L; T, U - 0, 2.0, 3.1, 4.1, 5.1, 7.7, 10.2, 15.3, 20.4, 25.5 mg／L; R, S - 0, 2.5, 3.7, 4.9, 6.2, 9.2, 12.3, 18.5, 24.6, および 30.8 mg／L; V - 0, 1.7, 2.5, 3.3, 4.2, 6.2, 8.3, 12.5, 16.6, および 20.8 mg／L; P - 0, 1.8, 2.7, 3.6, 4.5, 6.7, 8.9, 13.4, 17.8, および 22.3 mg／L; O - 0, 2.4, 3.6, 4.8, 6.0, 9.1, 12.1, 18.1, 24.2, および 30.2 mg／L.  P43 - 0, 2.7, 4.0, 5.3, 6.7, 10.0, 13.4, 20.0, 26.7, および 33.4 mg／L; P44 - 0, 3.0, 4.5, 5.9, 7.4, 11.1, 14.8, 22.3, 29.7, および 37.1 mg／L.
【０１８１】
図３０の棒グラフに示すように、いくつかのマンノース修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマー（Ａ，Ｂ，Ｓ，ＴおよびＧ）のＧＦＰ複合体は、高いＧＦＰトランスフェクション効率をＨｅｐＧ２細胞において示した（約２０％〜約５０％）。一般に、Ｎ／Ｐ比が増加することで、トランスフェクション効率は高まる。非修飾ｂＰＥＩ−２５の対照ＧＦＰトランスフェクション効率レポータ遺伝子複合体は、４．８％の効率をＮ／Ｐ１５で有しており、Ｎ／Ｐ４０および５０で約２５％の一定に達した。Ｎ／Ｐが３０以下では、ＡおよびＢは、ＭＴＣ−ＩＰＭＡＮ結合の後、より未反応のアミン基を有しており、このため、非修飾ｂＰＥＩ−２５程度のＧＦＰトランスフェクション効率を有している。Ｎ／Ｐ３０〜５０では、ポリマーＡおよびＢのＧＦＰトランスフェクション効率は、非修飾ｂＰＥＩ−２５を超える。Ｃ，Ｌ，ＭおよびＮのＧＦＰ複合体は、非修飾ｂＰＥＩ−２５に比較して、ずっと低いトランスフェクション効率を有する。これは、これらの大きな粒径、広い粒径分布、および表面の低いカチオン性電荷密度のためである。全マンノース修飾ポリマーの中では、Ｓ，Ｔ，Ｇが、非修飾ｂＰＥＩ−２５について試験した全部のＮ／Ｐ比で、より高いＧＦＰトランスフェクション効率（Ｎ／Ｐ５０でそれぞれ、３７％、３６％、および４７％）を有する（図３０）。
【０１８２】
グルコースおよびガラクトース修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーのうち、ポリマーＲ（ｂＰＥＩ−２５：ガラクトース＝１：１２．５）は、最も高いＧＦＰトランスフェクション効率（３７％）を、Ｎ／Ｐ５０で達成した。ポリマーＵ（ｂＰＥＩ−２５：ガラクトース１：６）、Ｉ（ｂＰＥＩ−２５：ガラクトース＝１：２５）およびＨ（ｂＰＥＩ＝２５：グルコース１：２５）は、非修飾ｂＰＥＩ＝２５と同程度のＧＦＰトランスフェクション効率を有していた（図３１）。
【０１８３】
図３２に示すように、修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＰ，ＫおよびＯは、疎水性環状カルボニル・モノマー（ＴＭＣおよびＭＴＣ−Ｃ２）で調整されており、とりわけポリマーＫ（ｂＰＥＩ−２５：ＴＭＣ＝１：２５）で非修飾ｂＰＥＩ−２５に比較してＨｅｐＧ２細胞では大きく向上したＧＦＰトランスフェクション効率を有した。Ｎ／Ｐ５０でのそのトランスフェクション効率は、６４％に達し、全ポリマーの中で最も高い値を達成した。ポリマーＰ（ｂＰＥＩ−２５：ＴＭＣ＝１：８）およびＯ（ｂＰＥＩ−２５：ＭＴＣ−Ｃ２＝１：２５）は、Ｎ／Ｐ５０でそれぞれ、３５％および４８％のＧＦＰトランスフェクション効率を有した。ポリマーＪ（ｂＰＥＩ−２５：ＴＭＣ＝１：１００）およびＶ（ｂＰＥＩ−２５：ＴＭＣ＝１：１）は、Ｎ／Ｐ５０で非修飾ｂＰＥＩ−２５と同程度のＧＦＰトランスフェクション効率（２２％〜２６％）を有した。
【０１８４】
カルバメート基内のエステルを含むベンジルエステルまたはフェニルウレア修飾ｂＰＥＩ−２５は、非修飾ｂＰＥＩ−２５よりも、より低いＧＦＰトランスフェクション効率を、ＨｅｐＧ２細胞ライン（図３３）で有した。すなわち、ポリマーＰ４３（第１アミン基の４６％が修飾されたベンジルエステル）およびＰ４３（第１アミンの４６％が修飾されたフェニルウレアエステル）は、それぞれＮ／Ｐ５０で、約１２および約１５％のＧＦＰトランスフェクション効率を有した。
【０１８５】
ＨｅＬａ細胞においては、非修飾ｂＰＥＩ−２５のＧＦＰレポータ遺伝子複合体は、修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＡ，Ｂ，Ｃ，ＦおよびＧの複合体に比較してより高いＧＦＰトランスフェクション効率（８〜９％）を示した（図３４）。ポリマーＦは、Ｎ／Ｐ５０で、ＨｅＬａ細胞に対して６．９％の最も高いＧＦＰトランスフェクション効率を有した。しかしながら、Ｎ／Ｐ２０〜５０では、非修飾ｂＰＥＩ−２５は、また、ポリマーＦに比較してより高い細胞毒性を示した（図４０）。ＧＦＰトランスフェクション効率を同等の細胞生存性で比較する場合、非修飾ｂＰＥＩ−２５は、より低いトランスフェクション効率を有した（Ｎ／Ｐ２０で＜２％）（図３４）。
【０１８６】
ＳＫ−ＯＶ−３細胞におけるＧＦＰトランスフェクション効率
図３５に、ＳＫ−ＯＶ−３細胞ラインにおける修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＯ，ＫおよびＰ４４，Ｐ４６およびＰ４９のＧＦＰトランスフェクション効率を比較した。Ｎ／Ｐ１０では、Ｏ，ＫＰ４８およびＰ４９の効率は、（６０％〜６８％）であり、これらは、非修飾ｂＰＥＩ−２５（４５％）を超えていた。Ｎ／Ｐ１５では、ポリマーＯおよびＫは、非修飾ｂＰＥＩ−２５（約７０５）に比較してわずかに高いＧＦＰトランスフェクション効率（それぞれ、約７２％および約７８％）を有した。Ｎ／Ｐ１５よりも上では、修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーは、非修飾ｂＰＥＩ−２５に比較してその効率が低下した。非修飾ｂＰＥＩ−２５は、約８０％の最大効率をＮ／Ｐ２０で示した。コレステリル修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマー４６は、少なくともＮ／Ｐ１０〜２０では最小の効率を示し（約５％〜２０％）、最大効率は、Ｎ／Ｐ２０〜３０の約２５％であった。
【０１８７】
ＧＦＰトランスフェクション効率は、ＧＦＰ発現のために、ＧＦＰプラスミドで成功裏にトランスフェクトされたパーセンテイジを反映し、ルシフェラーゼ・アッセイは、トランスフェクトされた細胞における平均タンパク発現を検出する。図３６に示されるように、ポリマーＡ、Ｂおよび非修飾ｂＰＥＩ−２５のルシフェラーゼ発現プロファイルは類似し、Ｎ／Ｐ比が約１５まではルシフェラーゼ発現レベルが増加し、Ｎ／Ｐ比が１５〜４０で１×１０９ＲＬＵ／ｍｇのタンパクでレベルが低下する。Ｃにより誘導されたルシフェラーゼ発現レベルは、非修飾ｂＰＥＩ−２５のものよりも２桁低かった。Ｃ／ＤＮＡによる低い遺伝子トランスフェクションは、そのサイズおよびゼータ電位データに関連づけられた（図１および図５）。図３６で特定されるＮ／Ｐ比におけるポリマー濃度は、以下の通りである：非修飾 ＰＥＩ−２５ - 0, 1.1, 2.3, 3.4, 4.6, 5.7, 8.6, 11.5, 17.2 and 22.9 mg／L; A - 0, 2.3, 4.7, 7.0, 9.4, 11.7, 17.6, 23.4, 35.1 および 46.8  mg／L; B - 0, 1.6, 3.1, 4.7, 6.3, 7.8, 11.7, 15.6 23.5 および 31.3 mg／L; C - 0, 4.7, 9.4, 14.1, 18.8, 23.5, 35.2, 46.9, 70.4 および 93.8 mg／L.
【０１８８】
細胞毒性試験手順
修飾ｂＰＥＩ−２５／遺伝子複合体および修飾ｂＰＥＩ−２５／ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性を、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａおよびＳＫ−ＯＶ−３細胞について、標準ＭＴＴアッセイ・プロトコルを使用して検討した。ＧＦＰプラスミドを、複合体形成およびＨｅｐＧ２およびＨｅＬａ細胞を処理するために使用し、ルシフェラーゼプラスミドを、ＳＫ−ＯＶ−３細胞の複合体形成および処理のために使用した。
【０１８９】
ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａおよびＳＫ−ＯＶ−３細胞を、９６ウェルプレートに、ウェル当たり、１００００セル、５０００セル、１６０００セルの密度でそれぞれシードし、処理前にコンフルエンシが６０％〜７０％となるように培養した。ポリマー／遺伝子またはポリマーｓｉＲＮＡ複合体をその後、１０マイクロリットルのポリマー／核酸複合体および１００マイクロリットルのフレッシュな成長培養液で３７℃、４時間培養した。培養の後、培養液をフレッシュな成長培養液で交換し、さらに６８時間培養した。続いて、１００マイクロリットルの成長培養液および２０マイクロリットルのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中、５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え、細胞を３７℃で４時間培養した。成長培養液を除去し、各ウェル内に形成されたホルマザン結晶を１５０マイクロリットルのＤＭＳＯを使用して溶解した。各ウェルからの１００マイクロリットルのアリコートをその後、新たな９６ウェルプレートに移し、マイクロプレート分光器を使用して、５５０ｎｍおよび６９０ｎｍの吸光度を決定した。相対的な細胞生存性を、[（Ａ５５０−Ａ６９０）サンプル／（Ａ５５０−Ａ６９０）対照群]×１００％として表現した。Ｎ／Ｐ比ごとに少なくとも８回の繰り返しに対するデータを平均±標準偏差で表現した。
【０１９０】
ＨｅｐＧ２およびＨｅＬａ細胞ラインにおける細胞毒性
図３７〜３９は、種々のＮ／Ｐ比において、修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＡ，Ｂ，Ｃ，Ｓ，Ｔ，Ｆ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｕ，Ｒ，Ｉ，Ｈ，Ｖ，Ｐ，Ｋ，Ｊ，Ｏおよび非修飾ｂＰＥＵ−２５のＧＦＰレポータ遺伝子複合体で培養した後のＨｅｐＧ２細胞生存率を示す棒グラフである。図４０は、種々のＮ／Ｐ比において、修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＡ，Ｂ，Ｃ，Ｆ，Ｇおよび非修飾ｂＰＥＩ−２５のＧＦＰレポータ遺伝子で培養した後のＨｅＬａ細胞の細胞生存率を示す棒グラフである。修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーのすべての遺伝子複合体は、両方の細胞ラインで、Ｎ／Ｐ２０〜５０で非修飾ｂＰＥＩ−２５よりもより低い細胞毒性であった。結果を、少なくとも８回の繰り返しについての平均±標準偏差で表現した。Ｎ／Ｐ比の順でポリマー濃度を特定した非修飾ｂＰＥＩ−２５：- 0, 0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4.0, 6.0, 8.0, 12.0, 16.0 および 20.0 mg／L; A, F, G, H, I, J - 0, 1.6, 3.3, 4.9, 6.6, 8.2, 12.3, 16.4, 24.6, 32.8 および 41.0 mg／L; B - 0, 1.1, 2.2, 3.3, 4.4, 5.5, 8.2, 11.0, 16.4, 21.9 および 27.4 mg／L; C - 0, 3.3, 6.6, 9.9, 13.1, 16.4, 24.6, 32.8, 49.3, 65.7 and 82.1  mg／L; K - 0, 1.0, 2.1, 3.1, 4.1, 5.2, 7.7, 10.3, 15.5, 20.6 and 25.8 mg／L; L - 0, 2.2, 4.4, 6.7, 8.9, 11.1, 16.7, 22.2, 33.3, 44.4, and 55.5 mg／L; M - 0, 4.8, 9.5, 14.3, 19.1, 23.9, 35.8, 47.7, 71.6, 95.5, and 119.3 mg／L; N - 0, 14.1, 28.1, 42.2, 56.3, 70.3, 105.5, 140.7, 211.0, 281.3, and 351.7 mg／L; T, U - 0, 1.0, 2.0, 3.1, 4.1, 5.1, 7.7, 10.2, 15.3, 20.4, 25.5 mg／L; R, S - 0, 1.2, 2.5, 3.7, 4.9, 6.2, 9.2, 12.3, 18.5, 24.6, および 30.8 mg／L; V - 0, 0.8, 1.7, 2.5, 3.3, 4.2, 6.2, 8.3, 12.5, 16.6, および 20.8 mg／L; P - 0, 0.9, 1.8, 2.7, 3.6, 4.5, 6.7, 8.9, 13.4, 17.8, および 22.3 mg／L; O - 0, 1.2, 2.4, 3.6, 4.8, 6.0, 9.1, 12.1, 18.1, 24.2, and 30.2 mg／L.
【０１９１】
図３７に示されるように、非修飾ｂＰＥＩ−２５／遺伝子複合体で処理したＨｅｐＧ２およびＨｅＬａ細胞は、１５より大きなＮ／Ｐ比で急激に減少する（非修飾ｂＰＥＩ−２５濃度の増加につれて）。ＨｅｐＧ２細胞の細胞生存率は、Ｎ／Ｐ２０以上で６０％未満であった。ＨｅＬａ細胞の細胞生存率は、Ｎ／Ｐ３０以上で４６％未満であった（図４０）。非修飾ｂＰＥＩ−２５／ＤＮＡ複合体で処理した場合、特にＮ／Ｐ５０では、細胞の細胞生存率は、ＨｅｐＧ２については約２０％に過ぎず、ＨｅＬａ細胞では、４．６％に過ぎなかった。しかしながら、Ｎ／Ｐ５０で、ＤＮＡ結合複合体Ａ、Ｂ，Ｃ，Ｓ，Ｔ，Ｆ，Ｇ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｕ，Ｒ，Ｉ，Ｈ，Ｖ，Ｐ，Ｋ，Ｏで処理したＨｅｐＧ２細胞の細胞生存率は、それぞれ、7%, 57%, 82%, 84%, 87%, 63%, 73%, 95%, 94%, 94%, 87%, 81%, 87%, 82%, 75%, 91%, 87%, 89%, 99%であった（図３７〜３９）。Ｎ／Ｐ５０でＤＮＡ複合体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｆ，Ｇにより処理されたＨｅＬａ細胞の細胞生存率は、各場合について１００％であった（図４０）。
【０１９２】
非修飾ｂＰＥＩ−２５は、ＨｅｐＧ２細胞ラインにおいて約２５％（Ｎ／Ｐ４０）、およびＨｅＬａ細胞ラインではＮ／Ｐ５０で、約９％のピークトランスフェクション効率を示すものの、Ｎ／Ｐ１５より高いところにおける、その高い毒性は、通常顕著な治療効果を達成するためには高いポリマー濃度が要求される、in vivo用途の可能性を失わせてしまう。本検討においては、細胞生存性は、マンノース機能化環状カーボネートおよび他の官能化環状カーボネートにより、顕著に改善された。マンノースは、普通の代謝物であり、本検討は、哺乳動物のグリコプロテイン生合成の直接的な利用を示した。したがって、細胞に対していかなる毒性も与えることはない。非修飾ｂＰＥＩ−２５（ＨｅｐＧ２細胞でＮ／Ｐ１５よりも上、ＨｅＬａ細胞でＮ／Ｐ２０よりも上で細胞生存率＜６０％）に比較し、Ｎ／Ｐ３０および５０でマンノース修飾ｂＰＥＩ−２５が高いパーセンテイジで生存し、Ｎ／Ｐ５０であってもすべてのＨｅＬａ細胞は、生存していた。重要なことは、Ｎ／Ｐ３０〜５０では、修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーにより提供される遺伝子トランスフェクション効率は、Ｎ／Ｐ１５における非修飾ｂＰＥＩ２５のそれよりも顕著に高いことである（図３０〜３４）。ガラクトース、グルコース、および疎水性基で修飾したｂＰＥＩ−２５もまた、非修飾ｂＰＥＩ−２５に比較して細胞毒性が低減されていた。
【０１９３】
ＳＫ−ＯＶ−３細胞ラインにおける細胞毒性
Ｏ／ＧＦＰ遺伝子複合体の存在下でのＳＫ−ＯＶ−３細胞の細胞生存生は、Ｎ／Ｐ１５から４０の修飾ｂＰＥＩ−２５の複合体よりも低かった（図４７）。しかしながら、ポリマーＫ（４６％アミン修飾のＴＭＣで調整したもの）は、Ｎ／Ｐ１０〜１５で効率（約７５％）および細胞生存率（９０％以上）と両方とも非修飾ｂＰＥＩ−２５より好ましいものであった。
【０１９４】
ＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡによるＢｃｌ−２ノックダウンの調整
図４１の棒グラフに示されるように、ｓｉＲＮＡは、ポリマーＡおよびポリマーＢを使用してＨｅＬａ細胞内に良好に導入され、ｍＲＮＡレベルでＢｃｌ−２のダウンレギュレーションが明確であった。図４１には、使用した対応ポリマーの濃度は、非修飾ｂＰＥＩ−２５- 8.4 mg／L; A - 17.1 mg／L; B - 11.4 mg／L; C - 34.3 mg／Lであった。ポリマーＡ／ｓｉＲＮＡおよびポリマーＢ／ｓｉＲＮＡ複合体によるＢｃｌ−２のノックダウンについて、ｍＲＮＡ発現レベルは、それぞれ未処理のＨｅＬａ細胞のそれの２５％および２９％であり、これは、非修飾ｂＰＥＩ−２５／ｓｉＲＮＡ複合体（２６％）により誘起されるノックダウンレベルと同程度であった。ネガティブ対照群ｓｉＲＮＡ（すなわち、スクランブルしたｓｉＲＮＡ）を使用した対照実験において、ｍＲＮＡのダウンレギュレーションはまったく観測されなかった。しかしながら、ポリマーＣによるｓｉＲＮＡのデリバリーは、Ｂｃｌ−２ｍＲＮＡの量が依然として未処理の細胞のそれの８５％であることから、良好ではなかった。
【０１９５】
ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体で処理した後のＨｅＬａ細胞の細胞生存性
図４２は、修飾ｂＰＥＩ−２５／ｓｉＲＮＡ複合体で処理した後のＨｅＬａ細胞の細胞生存率を示す棒グラフである。しＲＮＡ濃度は、１００ｎＭに固定した。異なるＮ／Ｐ比に対応するポリマー濃度を用いた。非修飾ｂＰＥＩ−２５- 0.7, 1.0, 1.3, 1.7, 2.5, 3.4, 5.0, 6.7, 8.4 および 10.1 mg／L; A - 1.4, 2.1, 2.7, 3.4, 5.1, 6.9, 10.3, 13.7, 17.1 および 20.6  mg／L; B - 0.9, 1.4, 1.8, 2.3, 3.4, 4.6, 6.9, 9.2, 11.4 and 13.7 mg／L; およびC - 2.7, 4.1, 5.5, 6.9, 10.3, 13.7, 20.6, 27.4, 34.3 および 41.2 mg／Lであった。
【０１９６】
本検討で試験したｓｉＲＮＡおよびポリマー濃度において、ＨｅＬａ細胞は、Ｂｃｌ−２ｓｉＲＮＡに誘発された細胞死に対し、抵抗性を示した。図４２に示されるように、Ｂｃｌ−２ｓｉＲＮＡまたはスクランブルしたｓｉＲＮＡ（ネガティブ対照群）をＨｅＬａ細胞に種々のＮ／Ｐ比でデリバーした場合、細胞毒性にはまったく差異は見られなかった。したがって、細胞生存性におけるいかなる相違でも、使用したポリマーの性質によるものである。非修飾ｂＰＥＩ−２５／Ｂｃｌ−２ｓｉＲＮＡ複合体に対し、８２％の細胞は、Ｎ／Ｐ比６０での処理後でも生存していた。Ａ、Ｂ、Ｃ／Ｂｃｌ−２ｓｉＲＮＡ複合体では、ほぼ１００％のＨｅＬａ細胞が、Ｎ／Ｐ６０でも生存した。ｍＲＮＡノックダウンのデータと共に、ポリマーＡおよびＢは、負に帯電したｓｉＲＮＡの複合化およびＨｅＬａ細胞内へのｓｉＲＮＡの取り込みの調整に有効であり、このことは、良好な細胞生存性を維持しながら、非修飾ｂＰＥＩ−２５と同レベルで良好なＢｃｌ−２ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを生じさせたといえる。ＨｅＬａ細胞は、Ｂｃｌ−２ｍＲＮＡのノックダウン後の細胞死に抵抗性を示すが、これは、このｍＲＮＡのノックダウンが、ガン細胞を抗ガン剤に鋭敏化させることを示す。
【０１９７】
表７は、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａおよびＳＫ−ＯＶ−３細胞ラインにおける選択した修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーおよび非修飾ｂＰＥＩ−２５について、細胞生存率が８０％以上で得られた最大ＧＦＰトランスフェクション効率を比較する。また、表７には、細胞生存率が８０以上の最大Ｎ／Ｐ比をリストした。
【０１９８】
【表７】
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【０１９９】
ＨｅｐＧ２細胞ライン（表７）においては、非修飾ｂＰＥＩ−２５は、最大Ｎ／Ｐ比が１５であり、細胞生存率が８０％以上につき、５％の最大ＧＦＰトランスフェクション効率を有する。一般に、環状カーボネート修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーは、より高いＮ／Ｐ比（Ｎ／Ｐ２０〜５０）およびより高い最大ＧＦＰトランスフェクション効率（８％〜６４％）を有する。ポリマーＪおよびＶを除き、ＧＦＰトランスフェクション効率は、約１：６〜約１：２５のｂＰＥＩ−２５環状カーボネートモル供給比（約１０％〜約４５％の第１アミン基が修飾される）を使用すると、１０％を超えた。不溶性により、コレステロール修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＰ４５およびＰ４６（比較例）は、約５％の第１アミン基の修飾に制限された。この修飾レベルについて、Ｐ４５およびＰ４６は、最大Ｎ／Ｐ比および最大ＧＦＰトランスフェクション効率が、非修飾ｂＰＥＩ−２５と同様であった。ＢｕＯＣＯＣｌ修飾ｂＰＥＩ−２５（Ｐ４７，４３％の第１アミン基が修飾された）は、また、最大Ｎ／Ｐ比および最大ＧＦＰトランスフェクション効率が、非修飾ｂＰＥＩ−２５と同程度であった。これらの結果は、第１アミン基を環状カーボネートで修飾することは、最大Ｎ／Ｐ比および最大ＧＦＰトランスフェクション効率に好ましく、ＴＭＣ（ポリマーＫ）は、約４５％の修飾レベル（モル供給比１：２５）を有しているためとりわけ好ましいものとなっていることを示す。
【０２００】
ＨｅＬａ細胞ラインにおいても、選択したポリマーについて全ＧＦＰトランスフェクション効率は低いものの、同一の傾向が観察された。
【０２０１】
修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーと非修飾ｂＰＥＩ−２５との間で小さな差は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞ラインで見られた。この例においては、非修飾ｂＰＥＩ−２５は、最大Ｎ／Ｐ比が１５であり、最大効率が７０％であった。ポリマーＫは、ｓａｉｄａｉＮ／Ｐ比２０および最大効率７５％を示した。ポリマーＯは、最大Ｎ／Ｐ比１５で、最大効率が約７８％であった。
【０２０２】
これらの結果は、ポリカーＫが、非修飾ｂＰＥＩ−２５に比較して多種のガン細胞に対する、より有効であり、より毒性のないトランスフェクション剤であることを示すものである。
【０２０３】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）におけるin vitroルシフェラーゼ発現
Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（商標）ヒト間葉系幹細胞（ｍＨＳＣ）をＬｏｎｚａ，シンガポールから購入し、間葉系幹細胞の基本培地（ＭＳＣＢＭ）（Ｌｏｎｚａ、シンガポール）で培養した。基本培地は、間葉系幹細胞成長サプリメント（ＭＣＧＳ）、Ｌ−グルタミン酸、ＧＡ−１０００（ＭＳＣＧＭ（商標）ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｅｓ（商標）、Ｌｏｎｚａ、シンガポール）により付養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％の空気下で培養した。トリプシン／ＥＤＴＡ培養液を使用してコンフルエンスが９０％に達した時に分離した。
【０２０４】
修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマー／ＤＮＡ複合体のｍＨＳＣ中でのin vivo遺伝子トランスフェクション効率を評価するために、細胞を２４ウェルプレートに、ウェルごとに、５００マイクロリットルあたり１×１０５セルの密度でシードした。２４時間後、プレートの培養液をフレッシュな成長培養液に交換し、次いで５０マイクロリットルの複合体溶液（１．７５マイクログラムのＧＦＰプラスミドＤＮＡまたは２．５マイクログラムのルシフェラーゼプラスミドＤＮＡを含有する）を種々のＮ／Ｐ比で滴下して加えた）。その後、４時間培養を行い、遊離した複合体を、各ウェル内の培養液を交換して除去した。さらに６８時間の培養の後、各ウェル内の細胞培養液を除去し、細胞を０．５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１度洗浄した。０．２ｍＬのレポータ・リシス・バッファを各ウェルに添加した。凍結（−８０℃、３０ｍｉｎ）および乾燥を２サイクル行なった後、細胞溶解物を回収し、１４，０００ｒｐｍで、５ｍｉｎ遠心分離して清浄化し、その後、２０マイクロリットルのスーパーネータントを、１００μリットルのルシフェラーゼ基質と混合し、光度計（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、ドイツ）を使用して、相対光度ユニット（ＲＬＵ）を決定した。ＲＬＵの読値は、ＢＣＡタンパクアッセイを使用して決定したスーパーネータントのタンパク濃度に対して規格化し、全ルシフェラーゼ発現効率を得た。すべてのin vitro遺伝子発現実験において、未処理細胞をネガティブ対照群とし、非修飾ｂＰＥＩ−２５／ＤＮＡ複合体で処理した細胞をポジティブ対照群として使用した。データを、３度繰り返し、平均±標準偏差で表した。
【０２０５】
図４３は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）における修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＴ，Ｓ，Ｇ，Ｍ，ＫおよびＯについての、Ｎ／Ｐ比の関数としてルシフェラーゼ発現レベルを示したグラフである。ポリマーＧ（マンノース修飾ｂＰＥＩ−２５）は、ヒト間葉系幹細胞に対し、ポリマーＫ（ＴＭＣ修飾ｂＰＥＩ−２５）およびＯ（ＭＴＣ−Ｃ２修飾ｂＰＥＩ−２５）よりも高いルシフェラーゼ発現レベルを有していた。この理由は、細胞がマンノース・レセプタを過剰発現するためである。他の組成物に比較してＧは、遺伝子トランスフェクションにおいて最適であった。
【０２０６】
ポリマー／ＤＮＡ複合体の細胞毒性を、標準ＭＴＴアッセイ手法を使用して検討した。トランスフェクションの一日前に、ｈＭＳＣを９６ウェルプレートに、ウェルあたり１００００セルの密度でシードした。各ウェル内の細胞をその後、１０マイクロリットルのポリマー／ＤＮＡ複合体および１００マイクロリットルのフレッシュな培養液を含む成長培養液で、３７℃、４時間培養した。培養後、培養液をフレッシュな培養液で交換し、さらに６８時間培養した。次いで、１００マイクロリットルの成長培養液と２０マイクとリットルのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中、４ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、細胞をさらに３７℃で４時間培養した。各ウェル内に形成されたホルマザン結晶を、成長培養液の除去に際して１５０マイクロリットルのＤＭＳＯを使用して溶解させた。波長５５０ｎｍおよび６９０ｎｍでマイクロプレート分光計を用いて吸光度を測定した。相対細胞生存率を、[（Ａ５５０−Ａ６９０）サンプル／（Ａ５５０−Ａ６９０）対照群]×１００％として表現した。少なくとも８回繰り返して、データを、平均±標準偏差として表した。
【０２０７】
図４４は、Ｔ、Ｓ，Ｇ，Ｍ，Ｋ，Ｏのルシフェラーゼ複合体の細胞毒性を示すグラフである。Ｇ／ＤＭＮＡ複合体は、細胞に対して顕著な毒性を示さなかった。細胞生存率は、Ｎ／Ｐ４０において、７５％よりも高かった。
【０２０８】
Ｐ４５〜Ｐ４７でのＧＦＰトランスフェクション効率およびＨｅｐＧ２細胞の細胞生存率
Ｐ４５〜Ｐ４７のＧＦＰレポータ遺伝子複合体を、概ね上述した手順にしたがって異なるＮ／Ｐ比で調整した。図４５は、ＨｅｐＧ２細胞内でのこれらの複合体のＧＦＰトランスフェクション効率を示す棒グラフである。ブチルクロロホルメートで修飾したｂＰＥＩ−２５は、最も低い、約５％の効率を有していた。コレステロールクロロホルメートで修飾したｂＰＥＩ−２５は、３つの修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーの中で、約２５％の最も高い効率を有していた。上述の結果は、Ｐ４５〜Ｐ４７が、Ｇ（図３０で約５０％の効率）およびＫ（図３２、約６５％の効率）に比較してＨｅｐＧ２細胞内におけるより、遙かに低いＧＦＰトランスフェクション効率を有することを示す。
【０２０９】
図４６は、ＧＦＰ複合体Ｐ４５〜Ｐ４７によるＨｅｐＧ２細胞生存率を比較した棒グラフである。トランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞は、Ｎ／Ｐ３０〜Ｎ／Ｐ５０で約７０％が生存していた。
【０２１０】
修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーの抗微生物活性
ミューラー・ヒントン寒天培地（ＩＩ）（ＭＨＢ）パウダーおよびイースト・モールド・ブロス（ＹＭＢ）パウダーを使用して、製造者の指示に従って培地を調整した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｐｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣＮｏ．６５３８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣＮＯ．２５９２２）を、ＡＴＣＣ（Ｕ．Ｓ．Ａ）から入手し、指示されたプロトコルに従って再培養した。３−[４，５−ジメチルチアゾリル−２]−２，５−ジフェニルテトラゾールブロマイド（ＭＴＴ）を、受け取ったままで使用した。
【０２１１】
修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、ブロス・マイクロ・ダイリューション法を使用して測定した。修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーを、ＤＩ水に５０００ｍｇ／Ｌで溶解した。サンプルをさらに、ＭＨＢまたはＹＭＢを使用して、７．８１２５、１５．６２５、３１．２５、６２．５、１２５、２５０．０、 ５００．０ および１０００ｍｇ／Ｌに希釈した。バクテリア溶液の光学密度を、ＭＨＢまたはＹＨＢの添加により、ＯＤ６００ｎｍ＝０．０７〜０．０８に調整した。このバクテリア溶液をさらに、１０００倍に希釈した。カチオン性化合物溶液（１００マイクロリットル）を９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）の各ウェルに移し、次いで、１００マイクロリットルのバクテリア溶液を添加した。ＭＨＢまたはＹＭＢを対照群として使用した。バクテリア溶液の光学濃度の読みは、所定の時間でＯＤ６００ｎｍを読み取ることによりモニタした。アッセイを、各サンプルについて６回繰り返し、かつ実験を少なくとも３度繰り返した。表８は、選択した修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーに対するＥ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓのＭＩＣをリストする。
【０２１２】
【表８】
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【０２１３】
結果は、Ｇｒａｍ陰性であるＥ．ｃｏｌｉおよびＧｒａｍ陽性であるＳ．ａｕｒｅｕｓに対する修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーＧ，Ｓ，Ｔ，Ｋの抗微生物活性は、非修飾ｂＰＥＩ−２５と同程度であることを示す。
【０２１４】
まとめ
非修飾ｂＰＥＩ−２５は、種々の供給モル比のカーボネート−マンノース／ガラクトース／疎水性基で良好に修飾できた。修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーの遺伝子複合体のＨｅｐＧ２細胞中でのトランスフェクション効率は、ｂＰＥＩ−２５を環状カーボネート・モノマーの第１アミンを、約９％〜約４７％修飾して、それぞれポリマーＡ、Ｂ，Ｆ，Ｇ，Ｓ，Ｔ，Ｈ，Ｉ，Ｒ，Ｕ，Ｋ，Ｐとして好ましいものであった。ポリマーＣ，Ｌ，Ｍ，Ｎは、４７％以上の第１アミンが修飾されており、大粒子を形成し、その表面電荷が低いことから遺伝子トランスフェクション効率が低かった。修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーの遺伝子複合体の細胞毒性は、ＨｅｐＧ２およびＨｅＬａ細胞においては、対応する非修飾ｂＰＥＩ−２５複合体よりも著しく低く、また遺伝子トランスフェクション効率は、ＨｅｐＧ２細胞で２倍（５０％対非修飾ｂＰＥＩ−２５の２５％）であった。加えて、マンノース修飾ポリマーは、効果的にＢｃｌ−２  ｓｉｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にデリバーし、明らかな細胞毒性無しに、Ｂｃｌ−２  ｓｉｍＲＮＡを、通常レベルの１／４にまでダウングレードした。上述の種々の官能化を施した修飾ｂＰＥＩ−２５ポリマーは、ターゲット治療遺伝子のデリバリー（例えば、ケラチノサイト、マクロファージ、樹状細胞へのマンノース、肝細胞をターゲットとしたガラクトース）のためのベクターとして大きな可能性を有している。
【０２１５】
特に、トランスフェクション効率および細胞生存率は、非帯電のカルバメート修飾基だけを使用して改善された。さらに、修飾ｂＰＥＩポリマーのいずれもが、第４アミンを含有してはいない。
【０２１６】
修飾した分岐ポリエチレンイミンポリマーは、また、タンパク、または薬剤のうちのいずれか１つまたは両方をデリバーするための部比来るとして使用できる。
【０２１７】
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのみに使用され、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される単数形態“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、文脈が明らかに他を示さない限り、同様に複数形態を含むことを意図する。さらに本明細書における用語“含む”または“含んでいる”、またはそれら両方は、記述された特徴、整数、ステップ、操作、要素、またはコンポーネント、またはこれらの如何なる組み合わせの存在を規定するものであって１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、コンポーネントまたはそれらのグループやこれらの如何なる組み合わせを排除するものではない。可能な値の範囲を表現するために２つの数値限定ＸおよびＹ（例えば、濃度ＸｐｐｍからＹｐｐｍ）を使用する場合、他のことが記述されない限り、値は、Ｘ，Ｙ、またはＸとＹの間の如何なる数とすることができる。
【０２１８】
本発明の記述は、例示および説明の目的のために提示されたのであって、本発明を開示された形態に終止させるものであるとか、本発明を制限するものとかを意図するものではない。実施形態は、本発明の原理、実際的な適用を、当業者が本発明を理解することを可能とするため最適に説明するべく選択され、記述されたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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