(57)【要約】  本発明は、癌及び起源組織を、特異的なマイクロＲＮＡ及びそれに関連する核酸分子の発現パターンの解析によって分類するためのプロセスを提供する。マイクロＲＮＡの木に基づいた発現の枠組みに従う分類は、治療の最適化及び特異的な療法の決定を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料の起源組織を分類する方法であって、
（ａ）対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の、配列番号１〜９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の発現プロファイルを決定するステップと、
（ｃ）前記発現プロファイルを参照発現プロファイルと比較するステップとを含み、
それによって、前記核酸配列のうちのいずれかの示差的な発現が、前記試料の起源組織の分類を可能にする方法。
【請求項２】
前記組織が、肝臓、肺、膀胱、前立腺、乳房、結腸、卵巣、精巣、胃、甲状腺、膵臓、脳、子宮内膜、頭頚部、リンパ節、腎臓、メラニン形成細胞、髄膜、胸腺、及び前立腺からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌又は過形成を分類する方法であって、
（ａ）対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料中の、配列番号１〜９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップと、
（ｃ）前記得られた測定値を前記核酸の参照存在量と比較するステップとを含み、
それによって、前記核酸配列のうちのいずれかの示差的な発現が、前記癌又は過形成の分類を可能にする方法。
【請求項４】
前記試料を、原発不明癌（ＣＵＰ）を有する、原発性癌を有する、又は転移性癌を有する対象から得る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、リンパ節癌、腎臓癌、メラノーマ、髄膜癌、胸腺癌、前立腺癌、消化管間質癌、及び肉腫からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記肝臓癌が、肝細胞腫、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝胆管癌、肝芽腫、肝血管肉腫、肝細胞腺腫、及び肝血管腫からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記膵臓癌が、膵臓管腺癌、膵臓インスリノーマ、膵臓グルカゴーマ、膵臓ガストリノーマ、膵臓カルチノイド腫瘍、及び膵臓ビポーマからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記膀胱癌が、膀胱扁平上皮細胞癌、膀胱移行上皮癌、及び膀胱腺癌からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記前立腺癌が、前立腺癌、前立腺肉腫、及び良性前立腺過形成（ＢＰＨ）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記精巣癌が、セミノーマ、精巣奇形腫、精巣胚性癌腫、精巣奇形癌腫、精巣絨毛癌、精巣肉腫、精巣間質細胞癌腫、精巣線維腫、精巣線維腺腫、精巣腺腫様腫瘍、及び精巣脂肪腫からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記肺癌が、肺カルチノイド、肺胸膜中皮腫、及び肺扁平上皮細胞癌からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記卵巣癌が、卵巣癌腫、未分類卵巣癌腫、漿液性乳頭癌腫、卵巣顆粒膜−包膜細胞腫瘍、卵巣未分化胚細胞腫、及び卵巣悪性奇形腫からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記消化管間質癌が、小腸腺癌及び小腸カルチノイド腫瘍からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記脳癌が、神経膠芽腫、神経膠腫、髄膜腫、星状細胞腫、髄芽腫、乏突起神経膠腫、神経外胚葉癌、及び神経芽腫からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記乳癌が、小葉癌及び乳管癌からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記頭頚部癌が、扁平上皮細胞癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結腸癌が、腺癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記子宮内膜癌が、子宮内膜腺癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンパ節癌が、ホジキンリンパ腫である、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記甲状腺癌が、乳頭癌腫である、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的試料が、体液、細胞系及び組織試料からなる群から選択される、請求項１又は３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組織が、新鮮組織、凍結組織、固定組織、ロウ埋包組織、又はホルマリン固定パラフィン埋包（ＦＦＰＥ）組織である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現プロファイルが、転写プロファイルである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの分類子アルゴリズムの使用をさらに含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの分類子が、決定木分類子、ロジスティック回帰分類子、最近傍分類子、ニューラルネットワーク分類子、ガウシアン混合モデル（ＧＭＭ）、及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類子からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料中の、配列番号１〜４からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、肝臓起源の癌の指標となる、肝臓起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料中の、配列番号１〜６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、精巣起源の癌の指標となる、精巣起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料中の、配列番号１〜８、２５、２６、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜８４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、肺起源の癌の指標となる、肺起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料中の、配列番号１〜８、３１、３２、３７、３８、４５〜４８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、肺カルチノイド起源の癌の指標となる、肺カルチノイド起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料中の、配列番号１〜１４、１９〜４０、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、肺胸膜起源の癌の指標となる、肺胸膜起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料中の、配列番号１〜８、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４５、４６、５７〜６４、６９〜７４、８５、８６及び８９〜９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、肺扁平上皮起源の癌の指標となる、肺扁平上皮起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料中の、配列番号１〜８、３１、３２、３７、３８、４５〜５６、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、膵臓起源の癌の指標となる、膵臓起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料中の、配列番号１〜８、３１、３２、３７、３８、４５〜５２、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、結腸起源の癌の指標となる、結腸起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料中の、配列番号１〜８、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４５、４６、５７〜６４、６９〜７４、８５、８６及び８９〜９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、頭頚部起源の癌の指標となる、頭頚部起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜９０、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、卵巣起源の癌の指標となる、卵巣起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料中の、配列番号１〜１４、１９〜３６、４１〜４４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、消化管間質起源の癌の指標となる、消化管間質起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料中の、配列番号１〜１４、１９〜２４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、脳起源の癌の指標となる、脳起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、乳房起源の癌の指標となる、乳房起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料中の、配列番号１〜８、２５、２６、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜８４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、膀胱起源の癌の指標となる、膀胱起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、前立腺起源の癌の指標となる、前立腺起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜７８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、甲状腺起源の癌の指標となる、甲状腺起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４２】
前記試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜９０、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、子宮内膜起源の癌の指標となる、子宮内膜起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４３】
前記試料中の、配列番号１〜１４、１９〜４０、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、腎臓起源の癌の指標となる、腎臓起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料中の、配列番号１〜１８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、メラニン形成細胞起源の癌の指標となる、メラニン形成細胞起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料中の、配列番号１〜１４、１９〜２８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、髄膜起源の癌の指標となる、髄膜起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料中の、配列番号１〜１４、１９〜３６、４１〜４４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、肉腫起源の癌の指標となる、肉腫起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料中の、配列番号１〜８、３１、３２、３７、３８、４５〜５６、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、胃起源の癌の指標となる、胃起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料中の、配列番号１〜１８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、リンパ節起源の癌の指標となる、リンパ節起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項４９】
前記試料中の、配列番号１〜１４、１９〜２８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、胸腺−Ｂ２起源の癌の指標となる、胸腺−Ｂ２起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料中の、配列番号１〜８、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜７８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み、前記核酸配列の存在量が、胸腺−Ｂ３起源の癌の指標となる、胸腺−Ｂ３起源の癌を分類するための請求項３に記載の方法。
【請求項５１】
生物学的試料の起源組織を分類する方法であって、
（ａ）対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料の遺伝子セット中の各遺伝子の個々の遺伝子発現を決定するステップであって、前記遺伝子セットがマイクロＲＮＡを含むステップと、
（ｃ）前記試料について、起源組織を少なくとも１つの分類子によって分類するステップと
を含む方法。
【請求項５２】
少なくとも１つの分類子が、決定木モデルである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
（ａ）配列番号１〜９６、
（ｂ）（ａ）の相補的な配列、及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列
からなる群から選択された核酸配列を含むプローブを含む、癌の分類のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の分類及び癌の起源組織の同定のための方法に関する。具体的には、本発明は、特定の癌と関係があるマイクロＲＮＡ分子、及び特定の癌に関連する又は由来する種々の核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡは、腫瘍形成に関与し４、著しい組織特異性を示す５〜７新規のクラスの非コードの、制御ＲＮＡ遺伝子１〜３である。これらは、高度に組織特異的なバイオマーカーとして出現し２，５，６、分化の発生の決定をコードする場面において重要な役割を担うと仮定されている。種々の研究が、マイクロＲＮＡを、特異的な悪性腫瘍の発生に関係付けている４。
【０００３】
転移性の原発不明癌（ＣＵＰ）が、新しい癌の全症例の３〜５％を占め、群としては、通常、非常に攻撃的な疾患であり、予後は芳しくない１０。ＣＵＰの概念は、そのような患者の適切な治療を顕著に遅らせる場合がある、複雑で高価なプロセスであることが多いにもかかわらず、癌の起源を同定する現在の方法に限界があることに由来する。最近の研究から、ＣＵＰについての証拠に基づいた治療がないことから、臨床管理における大きな変動が明らかになった１１。多くのプロトコールが評価された１２が、比較的小さな利益しか示されていない１３。したがって、腫瘍の起源組織を決定することが、分子診断の重要な、臨床における適用となる９。
【０００４】
腫瘍の起源組織についての分子的分類研究１４〜１７は、一般に、ドメインに特異的な知識を活用しない分類アルゴリズムを使用してきた。すなわち、組織は、推測的に等価であるとして扱われ、胚形成における共通の発生学的起源を有する組織型間の根本的な類似性は無視された。注目すべき例外は、病態の分類木に基づいたＳｈｅｄｄｅｎらによる研究である１８。これらの研究は、生物学的特色（例えば、ｍＲＮＡの発現レベル）の効果を平均する機械学習の方法、すなわち、自動処理にはより適しているが、推定機構を使用したり、生み出したりはしないアプローチを使用した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
種々のマーカーが、特定の型の癌及び腫瘍の起源組織を指し示すために提案されている。しかし、腫瘍マーカーの診断精度は、まだ定義されていない。したがって、特定の型の癌を診断及び分類するためのより効率的且つ有効な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、特定の癌及び腫瘍の起源組織の同定、分類及び診断において使用するための特異的な核酸配列を提供する。また、生物学的試料中の核酸配列の存在量に基づいて、核酸配列を、対象の予後の評価及び適切な治療の決定のための予後マーカーとして使用することもできる。
【０００７】
本発明は、腫瘍の分類のための、マイクロＲＮＡに基づいた分類子の開発に一部基づく。マイクロＲＮＡ発現レベルを、２２個の異なる腫瘍の組織及び転移に由来するパラフィンに包埋した４００個の新鮮凍結試料において測定した。２５３個の試料のマイクロＲＮＡのマイクロアレイのデータを使用して、それぞれが特異的な示差的診断の役割に連結した４８個のマイクロＲＮＡに基づいて、分類子を構築した。試料のうちの３分の２が、９０％を超える精度を有する高い信頼度で分類された。８３個の試料の独立した盲検の試験セットにおいては、高い信頼度の全般的な精度は、８９％に達した。分類の精度は、１３１個の転移試料を包含する、大部分の組織のクラスについては１００％に達した。マイクロＲＮＡバイオマーカーの有意性を、６５個の追加の盲検の試験試料を使用して、高感度ｑＲＴ−ＰＣＲによってさらに確認した。これらの知見によって、ＣＵＰについての新規のバイオマーカーとしてのマイクロＲＮＡの有用性が実証されている。分類子は、統計学的に意味のある信頼度の尺度を提供し、広い生物学的な及び診断における適用を有し得る。
【０００８】
第１の態様によれば、本発明は、生物学的試料の起源組織を同定する方法を提供し、この方法は、対象から生物学的試料を得るステップと；マイクロＲＮＡのあらかじめ決定したセット中の個々の核酸の発現を決定するステップと；前記試料について起源組織を分類子によって分類するステップとを含む。１つの実施形態によれば、前記分類子は、決定木モデルである。
【０００９】
別の態様によれば、本発明は、生物学的試料の起源組織を分類する方法を提供し、この方法は、対象から生物学的試料を得るステップと；前記試料中の、配列番号１〜９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の発現プロファイルを決定するステップと；前記発現プロファイルを参照発現プロファイルと比較するステップとを含み、それによって、前記核酸配列のうちのいずれかの示差的な発現が、前記試料の起源組織の同定を可能にする。
【００１０】
特定の実施形態によれば、前記組織は、肝臓、肺、膀胱、前立腺、乳房、結腸、卵巣、精巣、胃、甲状腺、膵臓、脳、子宮内膜、頭頚部、リンパ節、腎臓、メラニン形成細胞、髄膜、胸腺、消化管及び前立腺からなる群から選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、前記生物学的試料は、癌性の試料である。
【００１２】
別の態様によれば、本発明は、癌又は過形成を分類する方法を提供し、この方法は、対象から生物学的試料を得るステップと；前記試料中の、配列番号１〜９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップと；前記得られた測定値を、前記核酸の存在量を示す基準値と比較するステップとを含み、それによって、前記核酸配列のうちのいずれかの示差的な発現が、前記癌又は過形成の分類を可能にする。
【００１３】
１つの実施形態によれば、前記試料を、転移性の癌を有する対象から得る。別の実施形態によれば、前記試料を、原発不明癌（ＣＵＰ）を有する対象から得る。さらなる実施形態によれば、前記試料を、原発性癌を有する対象から得る。さらに別の実施形態によれば、前記試料は、未同定起源の腫瘍、転移性腫瘍又は原発性腫瘍である。
【００１４】
特定の実施形態によれば、前記癌は、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、リンパ節癌、腎臓癌、メラノーマ、髄膜癌、胸腺癌、前立腺癌、消化管間質癌及び肉腫からなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、前記癌は、肺カルチノイド、肺胸膜中皮腫及び肺扁平上皮細胞癌からなる群から選択された肺癌である。
【００１６】
その他の実施形態によれば、前記試料は、体液、細胞系及び組織試料からなる群から選択される。いくつの実施形態によれば、前記組織は、新鮮組織、凍結組織、固定組織、ロウ埋包組織又はホルマリン固定パラフィン埋包（ＦＦＰＥ）組織である。
【００１７】
本発明の分類方法は、少なくとも１つの分類子アルゴリズムの使用をさらに含み、前記分類子アルゴリズムは、決定木分類子、ロジスティック回帰分類子、直線回帰分類子、（Ｋ最近傍をはじめとする）最近傍分類子、ニューラルネットワーク分類子、ガウシアン混合モデル（ＧＭＭ）分類子、及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類子からなる群から選択される。統合された又は大多数の決定に達するために、分類子は、（２分木をはじめとする）決定木構造又は（加重票決をはじめとする）票決スキームを使用して、１つ又は複数の分類子アルゴリズムの分類を比較することができる。
【００１８】
本発明は、肝臓起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜４からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、肝臓起源の癌の指標となる。
【００１９】
本発明は、精巣起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、精巣起源の癌の指標となる。
【００２０】
本発明は、肺起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、２５、２６、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜８４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、肺起源の癌の指標となる。
【００２１】
本発明は、肺カルチノイド起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、３１、３２、３７、３８、４５〜４８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、肺カルチノイド起源の癌の指標となる。
【００２２】
本発明は、肺胸膜起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜１４、１９〜４０、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、肺胸膜起源の癌の指標となる。
【００２３】
本発明は、肺扁平上皮起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４５、４６、５７〜６４、６９〜７４、８５、８６及び８９〜９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、肺扁平上皮起源の癌の指標となる。
【００２４】
本発明は、膵臓起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、３１、３２、３７、３８、４５〜５６、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、膵臓起源の癌の指標となる。
【００２５】
本発明は、脳起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜１４、１９〜２４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、脳起源の癌の指標となる。
【００２６】
本発明は、乳房起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、乳房起源の癌の指標となる。
【００２７】
本発明は、前立腺起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、前立腺起源の癌の指標となる。
【００２８】
本発明は、子宮内膜起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜９０、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、子宮内膜起源の癌の指標となる。
【００２９】
本発明は、甲状腺起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜７８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、甲状腺起源の癌の指標となる。
【００３０】
本発明は、頭頚部起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４５、４６、５７〜６４、６９〜７４、８５、８６及び８９〜９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、頭頚部の癌の指標となる。
【００３１】
本発明は、結腸起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、３１、３２、３７、３８、４５〜５２、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、結腸起源の癌の指標となる。
【００３２】
本発明は、膀胱起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、２５、２６、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜８４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、膀胱起源の癌の指標となる。
【００３３】
本発明は、卵巣起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜９０、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、卵巣起源の癌の指標となる。
【００３４】
本発明は、リンパ節起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜１８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、リンパ節起源の癌の指標となる。
【００３５】
本発明は、腎臓起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜１４、１９〜４０、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、腎臓起源の癌の指標となる。
【００３６】
本発明は、メラニン形成細胞起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜１８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、メラニン形成細胞起源の癌の指標となる。
【００３７】
本発明は、髄膜起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜１４、１９〜２８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、髄膜起源の癌の指標となる。
【００３８】
本発明は、胸腺細胞（胸腺腫−Ｂ２型）起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜１４、１９〜２８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、胸腺細胞（胸腺腫−Ｂ２型）起源の癌の指標となる。
【００３９】
本発明は、胸腺細胞（胸腺腫−Ｂ３型）起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、２９、３０、３３、３４、３７、３８、４５、４６、４９、５０、５７〜６４、６９〜７８、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、胸腺細胞（胸腺腫−Ｂ３型）起源の癌の指標となる。
【００４０】
本発明は、消化管間質起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜１４、１９〜３６、４１〜４４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、癌の指標となる。
【００４１】
本発明は、肉腫起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜１４、１９〜３６、４１〜４４、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、消化管間質起源の癌の指標となる。
【００４２】
本発明は、胃起源の癌を分類するための方法をさらに提供し、この方法は、対象から得た試料中の、配列番号１〜８、３１、３２、３７、３８、４５〜５６、９５及び９６からなる群から選択された核酸配列、又はそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の相対的な存在量を測定するステップを含み；前記核酸配列の存在量が、胃起源の癌の指標となる。
【００４３】
別の態様によれば、本発明は、癌を分類するためのキットを提供し、前記キットは、配列番号１〜９６；それらの相補的な配列；及びそれらに対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列からなる群から選択された核酸配列を含むプローブを含む。
【００４４】
本発明のこれら及びその他の実施形態が、以下の図、説明及び特許請求の範囲を併せると明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】原発性腫瘍の試料と転移性腫瘍の試料とにおけるマイクロＲＮＡの発現の比較を示すグラフである。原発性結腸癌の試料と転移性結腸癌の試料とを比較し、セットのうちの少なくとも１つにおいてシグナルの閾値を超える各マイクロＲＮＡについて、ｐ値（対数シグナル上での対応のないｔ−検定）を計算する。ソートしたｐ値は、ｐ値の不規則分布と一致する（０〜１の範囲において均一、黒色の点線）。下の方にある線は、１０％の誤発見率（ＦＤＲ）の線を示し、この線より下のｐ値は、１０％の誤発見の確率を有する。結腸癌の転移については、いずれの特色も、１０％の誤発見試験には合格しない。
【図１Ｂ】原発性腫瘍の試料と転移性腫瘍の試料とにおけるマイクロＲＮＡの発現の比較を示すグラフである。原発性結腸癌試料対転移性結腸癌試料の平均ｌｏｇ２シグナルのドットプロット（十字；点線は、視覚を補助するものであり、発現が等しい対角線を示す）。
【図１Ｃ】原発性腫瘍の試料と転移性腫瘍の試料とにおけるマイクロＲＮＡの発現の比較を示すグラフである。（Ａと同様）原発性胃癌とリンパ節に転移した胃癌との比較。最も低いｐ値を有する最初の３つのマイクロＲＮＡは、（１０％の誤発見率における）誤発見試験に合格する。
【図１Ｄ】原発性腫瘍の試料と転移性腫瘍の試料とにおけるマイクロＲＮＡの発現の比較を示すグラフである。（Ｂと同様）原発性胃癌対リンパ節に転移した胃癌のドットプロット。ＦＤＲ試験に合格する３つのマイクロＲＮＡが強調されている：ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号９７）及びｍｉＲ−１４３（配列番号９９）は、原発性腫瘍中で過剰発現し、ｍｉＲ−１５０（配列番号１０１）は、転移において過剰発現する。
【図２】決定木分類子の構造を示す図であり、２４個のノード（番号を付けてある、表２）、及び２５個の葉を有する。各ノードは、試料の２つのセット間の二分決定であり、それらの決定は、ノードの左と右にある。一連の二分決定は、ノード＃１から始まり、下方に移動し、木の「葉」である、可能な腫瘍型のうちの１つに至る。ノード＃１において左のブランチに分類された試料は、「肝臓」のクラスに帰属する。それ以外の試料は、ノード＃２に進む。エンドポイント（木の「葉」）に達し、この試料についての予測されるクラスが示されるまで、引き続いて、ノードにおいてマイクロＲＮＡの発現レベルを使用して、決定を行う。例えば、「乳房」として分類される試料は、ノード＃１、＃２、＃３、＃１２、＃１６及び＃１７を通る経路を通り、ノード＃３、＃１６及び＃１７においては左のブランチをとり、ノード＃１、＃２及び＃１２においては右のブランチをとる必要があり、その他のノードではいずれにおいても決定は必要ではない。木の構造を特定するにあたっては、トレーニングセットのデータにおいて観察された特性を有する臨床病理学的な事柄を組み合わせた。例えば、胸腺の試料は、上皮に関連するマイクロＲＮＡの発現が異なる、それらの組織学的な型に従って２つの群に分けた。この発現の差は、Ｂ２型腫瘍におけるリンパ球のより高い比率に明白に起因する。最初の主要な分岐（ノード＃３）は、上皮起源の組織を、その他の起源又は混合起源の組織から、すなわち、それらのマイクロＲＮＡの発現プロファイル、特に、ｍｉＲ−１４１（配列番号６９）／２００（配列番号３、１１）ファミリーの発現において反映される生物学的な差を分ける。ここでは、胸腺Ｂ２腫瘍を、非上皮性組織又は混合性組織と共に（右のブランチ上に）グループ化し、後に、胸腺Ｂ２腫瘍は、それらとは分かれる（図４）。肝臓及び精巣は、木の最初に置いた。これは、これらの組織が、それらを容易に同定することができ、その後の干渉を減少させるマイクロＲＮＡ（それぞれ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａ（配列番号１）及びｈｓａ−ｍｉＲ−３７２（配列番号５））の非常に特異的な発現を含有することによる。それに続くノードは、消化管とその他の上皮組織との、ｍｉＲ−１９４（配列番号３７）及び追加のマイクロＲＮＡを使用する分離（ノード＃１２）を反復した（図３Ｂ）。肺カルチノイド腫瘍は、その他の型の肺の腫瘍とは対照的に、ｍｉＲ−１９４の高い発現を有することが見出された。これは、それらの独特な生物学的特徴に関連し得る。したがって、これらの腫瘍は、ノード＃１２においては、消化管組織と共にグループ化し、ノード＃１３においては、その他のマイクロＲＮＡを使用して、それらとは分ける（図３Ａ）。食道癌は、それらの組織学的な型によれば、分類のために使用するマイクロＲＮＡの発現が実質的に異なる：食道胃接合部の腺癌は、胃癌の試料に類似し、一方、扁平上皮の試料は、上皮性の高い頭頚部癌に対して高い類似性を有した。したがって、「胃＊」のクラスは、胃癌及び食道胃接合部の腺癌の両方を包含し；「頭頚部＊」のクラスは、頭頚部の癌及び食道の扁平上皮癌を包含する。「ＧＩＳＴ」は、消化管間質腫瘍を示す。患者の性別又は利用可能な臨床病理学的な情報等の追加の情報は、再度のトレーニングの必要なしで、葉又はブランチを刈り込むことによって、容易に木に組み込まれる。
【図３Ａ】決定木のノードにおける二分決定を示すグラフである。所与のノードについて、決定アルゴリズムをトレーニングする場合、このノードの可能な成果（「葉」）である試料のクラスのみを、トレーニングのために使用する。ノード＃１３（図２を参照されたい）においては、肺カルチノイド腫瘍（三角、７つの試料）が、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１（配列番号３１）及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号４７）の発現レベルを使用して、消化管起源の腫瘍（灰色、中抜きの四角、４９個試料）から容易に分かれる（１つの外れ値を有する）。木においてそれより前に枝分れしたその他の試料、及びこれらのマイクロＲＮＡによっては十分に分けられないその他の試料（丸、２８３個の試料）は考慮されない。重要なことには、消化管起源の転移性の試料（中抜きの四角、２３個の試料）は、原発性腫瘍と共に分布する。実線は、ノード＃１３のロジスティック回帰モデルが確率Ｐ＝０．５を割り当てるｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅの値を示す。線より上の点には、確率Ｐ＞０．５が割り当てられ、これらは、左のブランチをとり（ノード＃１４へ）、線より下の点は、右のブランチをとり、肺カルチノイドとして分類される。
【図３Ｂ】決定木のノードにおける二分決定を示すグラフである。木中のノード＃１２におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１９４（配列番号３７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５（配列番号４５）及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０５（配列番号７）の発現レベル（図２）。これらのマイクロＲＮＡを使用して、ノード＃１２の左のブランチ、すなわち、胃、膵臓、結腸又は肺カルチノイドからの試料（灰色の四角、５６個の試料、中抜きの四角は、転移性の試料を示す）と、ノード＃１２の右のブランチ中のその他の上皮性の試料（灰色の三角、１５２個の試料、中抜きの三角は、転移性の試料を示す）との間を分けることができる。
【図３Ｃ】決定木のノードにおける二分決定を示すグラフである。ｑＲＴ−ＰＣＲによる、ノード＃１で使用したマイクロＲＮＡ（表２）の確認：肝臓（四角、９個の試料）及び肝臓以外の試料（三角、７１個の試料）は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａ（配列番号１）及びｈａｓ−ｍｉＲ−１４１（配列番号６９）を使用して容易に分かれる（図５）。各試料について示すシグナルは、Ｕ６とマイクロＲＮＡとの間のサイクル閾値（Ｃｔ）の差である。より大きな差は、このマイクロＲＮＡのより高い発現を意味する。肝臓の腫瘍は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａのより高い発現及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４１のより低い発現を有する。線は、ロジスティック回帰の決定の閾値を示す（図５）。
【図３Ｄ】決定木のノードにおける二分決定を示すグラフである。ｑＲＴ−ＰＣＲによる、ノード＃１２において使用したマイクロＲＮＡ（表２）の確認：消化管腫瘍の試料（四角、１３個の試料）は、その他の上皮性の腫瘍（三角、５２個の試料）と比較して、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５（配列番号４５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４（配列番号３７）及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０５（配列番号７）の独特な発現レベルを示す（図５）。ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた結果は、このノードにおけるマイクロアレイのプラットフォームによって得られた結果（パネルＢ）と非常に類似し、類似の分布を示す。
【図４】一次元におけるロジスティック回帰モデルを示すグラフである。木中のノード＃８についてのロジスティック回帰モデル（表２）は、左のブランチの群（すなわち、胸腺Ｂ２）に属する各試料に、試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−２０５（配列番号７）の発現レベルの関数（挿入図）としての確率（Ｐ、実線の曲線）を割り当てる（Ｍは、測定した発現レベルの自然対数である）。棒は、胸腺Ｂ２の試料（ノード＃８の左）及び試料（ノード＃８の右）中のｈｓａ−ｍｉＲ−２０５の発現レベル分布を示す。数は、各瓶中の試料の数を示す。Ｍ＞９．２を有する試料は、Ｐ＞０．５を有し（灰色の点線）、胸腺のクラスに帰属させ、一方、全てのその他の試料は、ノード＃８においては右のブランチに帰属させ、その他の決定ノードによる分類を続ける。
【図５Ａ】ｑＲＴ−ＰＣＲデータを用いた分類の精度を示すグラフである。受信者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）によって、臨床的な測定基準の異なるカットオフ値について、感度を、偽陽性率（１−特異性）に対してプロットする。ＲＯＣ曲線は、分類の性能の尺度である。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、測定基準の臨床的な性能を査定することができる。無作為の分類子は、ＡＵＣ＝０．５を有し、完璧な感度及び１００％の特異性を有する最適な分類子は、ＡＵＣ＝１を有する。ｑＲＴ−ＰＣＲにおいて測定したｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａ（配列番号１）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４１（配列番号６９）の発現レベルを使用して、肝臓の試料を、肝臓以外の試料から分けるためにトレーニングしたロジスティック分類子の確率（Ｐ）出力（図３Ｃ）。四角は、９つの肝臓の試料を示し、三角は、７１個の肝臓以外の試料を示す。Ｐｔｈ＝０．８における閾値は、これらの２つのクラスを容易に分け、１つの外れ値を有する。
【図５Ｂ】ｑＲＴ−ＰＣＲデータを用いた分類の精度を示すグラフである。受信者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）によって、臨床的な測定基準の異なるカットオフ値について、感度を、偽陽性率（１−特異性）に対してプロットする。ＲＯＣ曲線は、分類の性能の尺度である。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、測定基準の臨床的な性能を査定することができる。無作為の分類子は、ＡＵＣ＝０．５を有し、完璧な感度及び１００％の特異性を有する最適な分類子は、ＡＵＣ＝１を有する。対応するＲＯＣ曲線は、ＡＵＣ＝０．９８８を有し、これは、ほぼ最適である。丸は、Ｐｔｈ＝０．８を示し、これは、肝臓の試料の同定に関して１００％の感度及び９９％の特異性を有する。
【図５Ｃ】ｑＲＴ−ＰＣＲデータを用いた分類の精度を示すグラフである。受信者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）によって、臨床的な測定基準の異なるカットオフ値について、感度を、偽陽性率（１−特異性）に対してプロットする。ＲＯＣ曲線は、分類の性能の尺度である。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、測定基準の臨床的な性能を査定することができる。無作為の分類子は、ＡＵＣ＝０．５を有し、完璧な感度及び１００％の特異性を有する最適な分類子は、ＡＵＣ＝１を有する。ｑＲＴ−ＰＣＲにおいて測定したｈｓａ−ｍｉＲ−１４５（配列番号４５）、ｈｓａ−ｍｉＲ１９４（配列番号３７）及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０５（配列番号７）の発現レベル（決定木中のノード＃１２、図２）を使用して、消化管（ＧＩ）の試料を、消化管以外の試料から分けるためにトレーニングしたロジスティック分類子の確率（Ｐ）出力（図３Ｄ）。四角は、１３個の結腸又は膵臓の試料を示し、三角は、５２個のその他の上皮性の試料（ノード＃１２における右のブランチ）を示す。Ｐｔｈ＝０．５における閾値は、６つのエラーを有する。
【図５Ｄ】ｑＲＴ−ＰＣＲデータを用いた分類の精度を示すグラフである。受信者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）によって、臨床的な測定基準の異なるカットオフ値について、感度を、偽陽性率（１−特異性）に対してプロットする。ＲＯＣ曲線は、分類の性能の尺度である。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、測定基準の臨床的な性能を査定することができる。無作為の分類子は、ＡＵＣ＝０．５を有し、完璧な感度及び１００％の特異性を有する最適な分類子は、ＡＵＣ＝１を有する。対応するＲＯＣ曲線は、ＡＵＣ＝０．９１４を有する。丸は、Ｐｔｈ＝０．５を示し、これは、消化管の試料の同定に関して９２％の感度及び９１％の特異性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、特異的な核酸配列を、癌を分類するために使用することができるという発見に基づく。本発明は、異なる組織及び腫瘍起源を見分けるために使用することができる高感度で、特異的且つ正確な方法を提供する。腫瘍の組織起源を決定するために、新しい、マイクロＲＮＡに基づいた分類子を開発した。この分類子は、驚くほど少数のマイクロＲＮＡに基づいて、約９０％の精度を達成する。この分類子は、透過的アルゴリズムを使用し、特異的なバイオマーカーの明確な解釈を可能にする。この分類子は、わずか４８個のマイクロＲＮＡマーカーを使用して、２２個のクラス間で、盲検の試験試料上、及び１３０個超の転移について約９０％の全般的な精度を達成する。本発明によれば、分類木中の各ノードを、独立した示差的診断ツールとして、例えば、異なる型の肺癌の同定において使用することができる。驚くほど少数のマーカーを使用する分類子の性能は、マイクロＲＮＡの、組織特異的な癌のバイオマーカーとしての有用性を強調し、ＣＵＰの診断を促進するための有効な手段を提供する。
【００４７】
異なる腫瘍起源を見分けることが可能になれば、最良で且つ最適な治療の患者への提供が促進されることになる。
【００４８】
本発明は、本発明の特異的なマイクロＲＮＡ分子のレベルを比較することによる、癌を検出、診断、モニター、段階付け及び予知するための、定量及び定性の両面における診断アッセイ及び診断方法を提供する。そのようなレベルを、好ましくは、生検、腫瘍試料、細胞、組織及び／又は体液のうちの少なくとも１つ中で測定する。本発明は、生検、腫瘍試料、細胞、組織又は体液中の前記マイクロＲＮＡ分子のレベルの変化を解析することによる、特異的な癌の存在を診断するための方法を提供する。
【００４９】
本発明においては、生検、腫瘍試料、細胞、組織又は体液中の前記マイクロＲＮＡレベルの存在を決定することは、異なる癌を見分けるのに特に有用である。
【００５０】
本発明の全ての方法は、場合により、その他の癌マーカーのレベルを測定するステップをさらに包含してよい。前記マイクロＲＮＡ分子に加えて、本発明において有用なその他の癌マーカーは、試験されている癌によって異なり、当業者には既知である。
【００５１】
患者から得た試料中の、本発明の核酸配列等の遺伝子発現のレベルを決定するために使用することができるアッセイの技法は、当業者には周知である。そのようなアッセイの方法として、これらに限定されないが、放射免疫アッセイ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、競合的結合アッセイ、ノーザンブロット解析、ＥＬＩＳＡアッセイ、核酸マイクロアレイ、及びバイオチップ解析が挙げられる。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態では、相関関係及び／又は階層的クラスタ分析を使用して、特異的な試料と癌試料の異なる標本との間において、本発明の核酸配列の発現レベルの類似性を査定することができる。１つ又は複数の核酸配列の発現レベルについて自由裁量による閾値を設定して、試料又は癌試料を２つの群のうちの１つに帰属させることができる。或いは好ましい実施形態では、１つ又は複数の本発明の核酸配列の発現レベルを、ロジスティック回帰等の方法によって組み合わせて、測定基準を定義し、次いで、これを、以前に測定した試料又は閾値と比較する。帰属のための閾値をパラメータとして扱い、このパラメータを使用して、試料を各クラスに帰属させる信頼度を定量化することができる。帰属のための閾値を増減させて、臨床の筋書きに応じて、感度又は特異性に有利な計らいをすることができる。参照データに対する相関値は、増減させることができる連続的なスコアを生成し、試料が特定のクラスの癌の起源又は型に属する可能性についての診断情報を提供する。多変量解析においては、マイクロＲＮＡのサインが、高いレベルの予後の情報を提供する。
【００５３】
定義
本明細書で使用する用語法は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、制限するものではないことを理解されたい。明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数の形態である「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうではないことが明確に分かる場合以外は、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。
【００５４】
本明細書において数の範囲を列挙する場合、それらの間に介在する数のそれぞれが、同一の程度の細密さで明確に企図される。例えば、６〜９の範囲の場合、７及び８の数も、６及び９に加えて企図され、６．０〜７．０の範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０の数が、明確に企図される。
【００５５】
異常な増殖
本明細書で使用する場合、「異常な増殖」という用語は、正常な、適切な又は予想される経過から逸脱する細胞の増殖を意味する。例えば、異常な細胞の増殖として、ＤＮＡ又はその他の細胞構成成分が損傷又は欠損している細胞の不適切な増殖を挙げることができる。異常な細胞の増殖として、その特徴が、不適切に高いレベルの細胞分裂、不適切に低いレベルのアポトーシス若しくは両方が引き起した、それらが媒介した、又はそれらに至る徴候と関係がある細胞の増殖を挙げることができる。そのような徴候は、例えば、癌性であっても若しくは非癌性であっても、又は良性であっても若しくは悪性であっても、単一若しくは複数の局所的な、細胞、細胞群又は（１つ若しくは複数の）組織の異常増殖によって特徴付けることができる。
【００５６】
約
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、＋／−１０％を指す。
【００５７】
結び付けた
本明細書で使用する場合、「結び付けた」又は「固定化した」は、プローブと固体の支持体との間の結合が、結合、洗浄、解析及び除去の条件下で十分に安定である、プローブ及び固体の支持体手段を指す。結合は、共有結合であっても、又は非共有結合であってもよい。共有結合は、プローブと固体の支持体との間に直接形成させてもよく、そうでなければクロスリンカーによって、或いは固体の支持体若しくはプローブのいずれか又は両方の分子上の特異的な反応性の基の内包によって形成させてもよい。非共有結合は、静電気的相互作用、親水性相互作用及び疎水性相互作用のうちの１つ又は複数であってよい。ストレプトアビジン等の分子を支持体に共有結合により結び付け、且つビオチン標識したプローブをストレプトアビジンに非共有結合により結合させることは、非共有結合として挙げられる。固定化にはまた、共有結合による相互作用と非共有結合による相互作用との組合せが関与する場合もある。
【００５８】
生物学的試料
本明細書で使用する場合、「生物学的試料」は、核酸を含む生物学的な組織又は流体の試料を意味する。そのような試料として、これらに限定されないが、対象から単離した組織又は流体が挙げられる。生物学的試料としてまた、生検試料及び剖検試料等の組織切片、ＦＦＰＥ試料、組織学的な目的で得た凍結切片、血液、血液画分、血漿、血清、痰、便、涙液、粘液、毛髪、皮膚、尿、浸出液、腹水、羊水、唾液、脳脊髄液、子宮頚部の分泌物、膣の分泌物、子宮内膜の分泌物、消化管の分泌物、気管支の分泌物、細胞系、組織試料、又は乳房からの分泌物も挙げられる。生物学的試料は、対象から細胞試料を取り出すことによって提供することができるが、また、以前に単離した（例えば、別のヒトによって、別の時期に、及び／若しくは別の目的で単離した）細胞を使用することによって、又は本明細書に記載する方法をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施することによっても達成することができる。また、治療又は予後の履歴を有する組織等の記録保管されている組織も使用することができる。生物学的試料としてはまた、動物又はヒトの組織に由来する外植片並びに初代細胞培養物及び／又は形質転換細胞培養物も挙げられる。
【００５９】
癌
「癌」という用語は、組織病理的な型又は侵襲性の段階に関わりなく、全ての型の癌性の増殖若しくは癌化の過程、転移組織、又は悪性に形質転換した細胞、組織若しくは臓器を包含することを意味する。癌の例として、これらに限定されないが、アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、Ｗａｌｋｅｒ、基底細胞、基底扁平、Ｂｒｏｗｎ−Ｐｅａｒｃｅ、管、Ｅｈｒｌｉｃｈ腫瘍、非小細胞肺（例えば、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌及び肺未分化大細胞癌）、燕麦細胞、乳頭、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞及び移行細胞）、組織球性障害、白血病（例えば、Ｂ細胞、混合細胞型、ヌル細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞慢性、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連、リンパ球性急性、リンパ球性慢性、肥満細胞及び骨髄性）、悪性組織球増殖症、ホジキン病、免疫増殖性小、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網内皮症、メラノーマ；軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、Ｅｗｉｎｇ肉腫、骨膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉細胞腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、絨毛性腫瘍、腺癌、腺腫、胆管腫、胆脂腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、肝細胞腫、汗腺腫、膵島細胞腫瘍、Ｌｅｙｄｉｇ細胞腫、乳頭腫、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞腫、莢膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上衣腫、神経節腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、角化血管腫、好酸球増多を伴う血管リンパ組織過形成、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管外皮腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、嚢胞肉腫、葉状、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、Ｅｗｉｎｇ、実験的、Ｋａｐｏｓｉ及び肥満細胞）、神経線維腫症、及び子宮頚部異形成、並びに細胞が不死化又は形質転換されているその他の状態をはじめとする、固形腫瘍及び白血病が挙げられる。
【００６０】
分類
分類という用語は、個々の項目を、（形質、変数、特徴、特色等と呼ばれる）当該項目に固有の１つ又は複数の特徴についての定量的な情報に基づいたり、統計学的なモデル及び／又は以前にラベルした項目のトレーニングセットに基づいたりして、群又はクラスに配置する手順及び／又はアルゴリズムを指す。「分類木」は、カテゴリ変数をクラスに配置する決定木である。
【００６１】
相補体
本明細書で使用する場合、核酸を指すための「相補体」又は「相補的な」は、ヌクレオチド間又は核酸分子のヌクレオチド類似体間でワトソン−クリック塩基対（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）又はフーグスティーン塩基対を形成することを意味することができる。完全な相補体又は完全に相補的であるは、ヌクレオチド間又は核酸分子のヌクレオチド類似体間で１００％相補的な塩基対を形成することを意味する。
【００６２】
Ｃｔ
本明細書で使用する場合、「Ｃｔ」は、ｑＲＴ−ＰＣＲのサイクル閾値を指し、これは、蛍光が閾値を越える分別のサイクル数である。
【００６３】
データ処理ルーチン
本明細書で使用する場合、「データ処理ルーチン」は、獲得したデータの生物学的な有意性（すなわち、アッセイ又は解析の最終的な結果）を決定するソフトウエア中で具体化することができるプロセスを指す。例えば、データ処理ルーチンは、収集したデータに基づいて起源組織を決定することができる。本明細書のシステム及び方法においては、データ処理ルーチンはまた、決定した結果に基づいてデータ収集ルーチンをコントロールすることもできる。データ処理ルーチンとデータ収集ルーチンとを統合し、フィードバックを提供して、データの獲得を行い、したがって、アッセイに基づいて判断する方法を提供することができる。
【００６４】
データセット
本明細書で使用する場合、「データセット」という用語は、解析から得た数値を指す。解析に関係があるこれらの数値は、ピーク高さ及び曲線下面積等の値であってよい。
【００６５】
データ構造
本明細書で使用する場合、「データ構造」という用語は、２つ以上のデータセットの組合せを指し、１つ又は複数の数学的操作を、１つ又は複数のデータセットに適用して、１つ又は複数の新しいデータセットを得るか、２つ以上のデータセットを操作して、新しい方法でデータを視覚的に説明する形態となす。２つ以上のデータセットの操作から作製したデータ構造の例として、階層的クラスタ分析がある。
【００６６】
検出
「検出」は、試料中の構成成分の存在を検出することを意味する。検出はまた、構成成分が存在しないことを検出することも意味する。検出はまた、構成成分のレベルを、定量的又は定性的のいずれかで決定することも意味する。
【００６７】
示差的発現
「示差的発現」は、細胞及び組織の内部及びそれらの間の、時間的及び／又は空間的な遺伝子発現パターンにおける定性的又は定量的な差を意味する。したがって、例えば、正常組織と疾患組織とを比べて示差的に発現した遺伝子は、活性化又は不活性化をはじめとして、その発現が定性的に変化している場合がある。特定の状況下では、別の状況と比べて、遺伝子のスイッチが入る又は切れる場合があり、したがって、２つ以上の状況の比較が可能となる。定性的に制御される遺伝子は、ある状況又は細胞型の中では、標準的な技法によって検出可能であり得る、ある発現パターンを示す場合がある。いくつかの遺伝子は、１つの状況又は細胞型において発現するが、両方では発現しない場合がある。或いは発現の差は、調節される、上方制御されて転写物の量の増加に至る、又は下方制御されて転写物の量の減少に至る点で、定量的である場合もある。発現が異なる程度は、発現アレイ、定量的逆転写ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、リアルタイムＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びリボヌクレアーゼ保護等の標準的な特徴付けの技法によって定量化するのに十分に大きいことのみが必要である。
【００６８】
発現プロファイル
「発現プロファイル」という用語は、広義に使用して、ゲノムの発現プロファイル、例えば、マイクロＲＮＡの発現プロファイルを包含する。プロファイルは、核酸配列のレベルを決定するための任意の好都合な手段、例えば、マイクロＲＮＡ、標識したマイクロＲＮＡ、増幅したマイクロＲＮＡ、ｃＤＮＡ等の定量的ハイブリダイゼーション、定量的ＰＣＲ、定量化のためのＥＬＩＳＡなどによって求めることができ、２つの試料間の示差的遺伝子発現の解析を可能にする。対象又は患者の腫瘍試料、例えば、細胞、又はそれらのコレクション、すなわち、組織等をアッセイする。試料を、当技術分野で既知の任意の好都合な方法によって収集する。対象とする核酸配列は、上記で提供した核酸配列をはじめとする、予測的であることが見出されている核酸配列であり、発現プロファイルは、列挙した核酸配列の全てを包含する、５、１０、２０、２５、５０又は１００個以上の核酸配列についての発現データを包含することができる。いくつかの実施形態によれば、「発現プロファイル」という用語は、測定した試料中の核酸配列の存在量を測定することを意味する。
【００６９】
発現比
本明細書で使用する場合、「発現比」は、２つ以上の核酸の相対的な発現レベルを指し、これは、生物学的試料中の対応する核酸の相対的な発現レベルを検出することによって決定する。
【００７０】
遺伝子
本明細書で使用する場合、「遺伝子」は、転写及び／若しくは翻訳の制御配列、並びに／又はコード領域、並びに／又は非翻訳配列（例えば、イントロン、５’−及び３’−非翻訳配列）を含む、天然の遺伝子（例えば、ゲノムの遺伝子）であっても、又は合成の遺伝子であってもよい。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であっても、又はｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ等の機能性ＲＮＡであってもよい。遺伝子はまた、コード領域（例えば、エクソン及びｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡであってもよく、これは、場合により、それらに連結している５’−又は３’−非翻訳配列を含む。遺伝子はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生成した増幅核酸分子であってもよく、これは、コード領域の全部若しくは一部及び／又はそれらに連結している５’−若しくは３’−非翻訳配列を含む。
【００７１】
溝の結合剤／副溝の結合剤（ＭＧＢ）
「溝の結合剤」及び／又は「副溝の結合剤」は、互換的に使用することができ、二本鎖ＤＮＡの副溝に、典型的には配列特異的な様式ではまる小型分子を指す。副溝の結合剤は、三日月様の形状をとり、したがって、しばしば水に置き換わって、二重らせんの副溝中にぴったりはまることができる、長く平坦な分子であってよい。副溝に結合する分子は、典型的には、フラン環、ベンゼン環又はピロール環等のねじれの自由を有する結合によって接続されている、いくつかの芳香環を含む。副溝の結合剤は、ネトロプシン、ジスタマイシン、ベレニル（ｂｅｒｅｎｉｌ）、ペンタミジン及びその他の芳香族ジアミジン等の抗生物質、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＳＮ６９９９、クロモマイシン及びミトラマイシン等のａｕｒｅｏｌｉｃな抗腫瘍薬、ＣＣ−１０６５、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ３）、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート（ＣＤＰＩ３）、さらにそれらの内容が参照によって本明細書に組み込まれているＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  ｅｄ．、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ及びＧａｉｔ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６並びにＰＣＴ出願公開第ＷＯ０３／０７８４５０号に記載されているものをはじめとする、関連の化合物及び類似体であってよい。副溝の結合剤は、プライマー、プローブ、ハイブリダイゼーションタグ相補体の構成成分、又はそれらの組合せであってよい。副溝の結合剤は、それらが結び付いているプライマー又はプローブのＴｍを上昇させることができ、そのようなプライマー又はプローブがより高い温度で有効にハイブリダイズするのを可能にする。
【００７２】
宿主細胞
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、天然に存在する細胞であっても、又はベクターを含有することができ、当該ベクターの複製を支援することができる形質転換細胞であってもよい。宿主細胞は、培養細胞、外植片、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞などであってよい。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核細胞であっても、又は酵母、昆虫、両生類若しくは哺乳動物の細胞等、すなわちＣＨＯ細胞及びＨｅＬａ細胞等の真核細胞であってもよい。
【００７３】
同一性
本明細書で使用する場合、「同一である」又は「同一性」は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈においては、配列が、特定の領域にわたって同一である、特定のパーセントの残基を有することを意味する。パーセントは、２つの配列を最適に整列させ、特定の領域にわたって２つの配列を比較し、両方の配列中に同一の残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を求め、マッチした位置の数を特定の領域中の位置の全数で割り、結果に１００をかけて、配列同一性のパーセントを求めることによって計算することができる。２つの配列が異なる長さであり又はアラインメントが１つ若しくは複数のずれた末端をもたらし、比較の特定の領域が単一の配列のみを包含する場合には、単一の配列の残基を、計算の分母には含めるが、分子には含めない。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列とを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）とを同等であるとみなしてよい。同一性は、手作業で又はＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０等のコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって実施することができる。
【００７４】
ｉｎ  ｓｉｔｕにおける検出
本明細書で使用する場合、「ｉｎ  ｓｉｔｕにおける検出」は、元々の部位における発現又は発現レベルの検出を意味し、元々の部位とは、生検等の組織試料中の部位を意味する。
【００７５】
ｋ−最近傍
「ｋ−最近傍」という句は、ある点を、当該点とトレーニングデータセット中の点との間の距離を計算することによって分類する分類方法を指す。次いで、この方法は、当該点を、ｋ（但し、ｋは整数である）個のその最近傍の間で最も一般的であるクラスに帰属させる。
【００７６】
標識
本明細書で使用する場合、「標識」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段又はその他の物理学的手段によって検出可能な組成物を意味する。例えば、有用な標識として、３２Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、（例えば、ＥＬＩＳＡ中で一般的に使用されるような）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、又は検出可能となすことができるハプテン及びその他の実体が挙げられる。標識は、核酸及びタンパク質中に任意の位置において組み込むことができる。
【００７７】
ノード
「ノード」は、分類（すなわち、決定）木における決定点である。また、その他のノードからの入力を組み合わせ、活性化機能の適用を通して出力を発生させるニューラルネット中の点。「葉」は、さらには分かれることのないノード、すなわち、分類木又は決定木における末端の配置である。
【００７８】
核酸
本明細書で使用する場合、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、共有結合によって一緒に連結されている少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸はまた、描写した一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を、所与の核酸と同一の目的で使用することができる。したがって、核酸はまた、実質的に同一な核酸及びそれらの相補体も包含する。一本鎖は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズすることができるプローブをもたらす。したがって、核酸はまた、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００７９】
核酸は、一本鎖若しくは二本鎖であってもよく、又は二本鎖配列及び一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。核酸は、ＤＮＡ、すなわち、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方であってもよく、ＲＮＡであってもよく、又はハイブリッドであってもよい。ハイブリッドにおいては、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンをはじめとする、塩基の組合せを含有することができる。核酸は、化学的な合成方法によって又は組換えの方法によって得ることができる。
【００８０】
核酸は、一般的には、リン酸ジエステル結合を含有するが、核酸として、少なくとも１つの異なる連結、例えば、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はＯ−メチルホスホロアミダイトの連結、並びにペプチド核酸の骨格及び連結を有する場合がある核酸類似体を挙げることができる。その他の類似体核酸として、参照によって本明細書に組み込まれている米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号に記載されているものをはじめとする、正の骨格を有するもの；非イオン性の骨格を有するもの、及び非リボース骨格を有するものが挙げられる。１つ又は複数の天然には存在しないヌクレオチド又は改変されたヌクレオチドを含有する核酸もまた、核酸の１つの定義の範囲に包含される。改変されたヌクレオチド類似体は、例えば、核酸分子の５’−末端及び／又は３’−末端に位置することができる。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖又は骨格が改変されたリボヌクレオチドから選択することができる。しかし、また、ヌクレオベース改変リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在するヌクレオベースの代わりに天然には存在しないヌクレオベースを含有するリボヌクレオチド、具体的には、５位において改変されたウリジン又はシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位において改変されたアデノシン及びグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザアデノシン；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンも適切であることに留意しなければならない。２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２又はＣＮから選択された基によって置換することができ、但し、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニル又はアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。改変されたヌクレオチドとしてまた、例えば、参照によって本明細書に組み込まれているＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：６８５−６８９（２００５）、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８（２００４）、及び米国特許公開第２００５０１０７３２５号に記載されているヒドロキシプロリノール連結を介してコレステロールとコンジュゲートしたヌクレオチドも挙げることができる。追加の改変されたヌクレオチド及び核酸が、参照によって本明細書に組み込まれている米国特許公開第２００５０１８２００５号に記載されている。リボース−リン酸骨格は、多様な理由で、例えば、そのような分子の生理環境における安定性及び半減期を向上させるために、細胞膜を介する拡散を増強させるために、又はバイオチップ上のプローブとして改変することができる。骨格の改変はまた、細胞のエンドサイトーシスの厳しい環境等における分解に対する抵抗性を増強させることもできる。骨格の改変はまた、肝臓及び腎臓等における肝細胞による核酸のクリアランスを低下させることもできる。天然に存在する核酸と類似体との混合物を作製してよく；或いは異なる核酸類似体の混合物、及び天然に存在する核酸と類似体との混合物を作製してもよい。
【００８１】
プローブ
本明細書で使用する場合、「プローブ」は、１つ又は複数の型の化学的な結合により、通常は相補的な塩基の対の形成、すなわち、通常は水素結合の形成により、相補的な配列の標的核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは、ハイブリダイゼーション条件の厳密度に依存して、プローブ配列に対する完全な相補性には欠ける標的配列に結合することができる。標的配列と本明細書に記載する一本鎖の核酸との間におけるハイブリダイゼーションを妨げる任意の数の塩基対のミスマッチがあってよい。しかし、変異の数が非常に多いので、最も低い厳密度のハイブリダイゼーション条件下であっても、ハイブリダイゼーションを起こすことができない場合には、当該配列は、相補的な標的配列とはならない。プローブは、一本鎖であっても、又は部分的に一本鎖であり且つ部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖の状態は、標的配列の構造、組成及び特性によって決定付けられる。プローブは、ストレプトアビジン複合体が後に結合することができるビオチンを用いて等、直接的に標識しても、又は間接的に標識してもよい。
【００８２】
基準値
本明細書で使用する場合、「基準値」という用語は、アッセイの結果と比較した場合に、特定の成果と統計学的に相関関係を示す値を意味する。好ましい実施形態では、基準値は、マイクロＲＮＡの発現を既知の臨床成果と比較する研究の統計学的解析から決定する。
【００８３】
厳密なハイブリダイゼーション条件
本明細書で使用する場合、「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複合体混合物等において、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズする条件を意味する。厳密な条件は、配列依存性であり、異なる状況においては異なる。厳密な条件を選択して、特異的な配列の、規定されたイオン強度、ｐＨにおける融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低い状態となすことができる。Ｔｍは、平衡状態において、標的に対して相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨ及び核濃度下の）温度であってよい（Ｔｍにおいて、標的配列が過剰に存在する場合、プローブの５０％が平衡状態において利用されている）。厳密な条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０から８．３において、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン等、約１．０Ｍ未満のナトリウム（又はその他の塩の）イオンの濃度であり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０個のヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、約５０個超のヌクレオチド）の場合には少なくとも約６０℃である条件であってよい。厳密な条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤を添加して達成することもできる。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションのためには、正のシグナルが、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの少なくとも２から１０倍であってよい。例示的な厳密なハイブリダイゼーション条件として、以下のものが挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベートし、又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、６５℃洗浄する。
【００８４】
実質的に相補的である
本明細書で使用する場合、「実質的に相補的である」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００個以上のヌクレオチドの領域にわたって、第２の配列の相補体と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％同一であること、又は２つの配列が、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００８５】
実質的に同一である
本明細書で使用する場合、「実質的に同一である」は、第１の配列と第２の配列とが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％同一であること、又は核酸に関して、第１の配列が、第２の配列の相補体に対して実質的に相補的である場合を意味する。
【００８６】
対象
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物を指し、ヒト及びその他の哺乳動物の両方を包含する。本発明の方法は、好ましくは、ヒト対象に適用する。
【００８７】
標的核酸
本明細書で使用する場合、「標的核酸」は、別の核酸が結合することができる核酸又はその変異体を意味する。標的核酸は、ＤＮＡ配列であってよい。標的核酸は、ＲＮＡであってよい。標的核酸は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はＰｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ、又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は抗ｍｉＲＮＡを含むことができる。
【００８８】
標的核酸は、標的ｍｉＲＮＡ結合部位又はその変異体を含むことができる。１つ又は複数のプローブが、標的核酸に結合することができる。標的結合部位は、５〜１００又は１０〜６０個のヌクレオチドを含むことができる。標的結合部位は、全部で５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６１、６２又は６３個のヌクレオチドを含むことができる。標的部位の配列は、それらの内容が本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／３８４，０４９号、第１１／４１８，８７０号又は第１１／４２９，７２０号に開示されている標的ｍｉＲＮＡ結合部位の配列のうちの少なくとも５個のヌクレオチドを含むことができる。
【００８９】
組織試料
本明細書で使用する場合、組織試料は、組織生検から、関連の医術における当業者に周知の方法を使用して得た組織である。本明細書で使用する場合、「癌の疑いがある」という句は、医術における当業者によって癌性細胞を含有すると考えられている癌組織試料を意味する。生検から試料を得るための方法として、腫瘤を肉眼で見分ける方法、顕微解剖、レーザーに基づいた顕微解剖、又は当技術分野で既知の細胞を分離する方法が挙げられる。
【００９０】
腫瘍
本明細書で使用する場合、「腫瘍」は、悪性にしても又は良性にしても、全ての新生物細胞の成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。
【００９１】
変異体
本明細書で使用する場合、核酸に関する「変異体」は、（ｉ）参照するヌクレオチド配列の一部；（ｉｉ）参照するヌクレオチド配列の相補体若しくはその一部；（ｉｉｉ）参照する核酸と実質的に同一である核酸、若しくはその相補体；又は（ｉｖ）厳密な条件下で参照する核酸とハイブリダイズする核酸、その相補体、若しくはそれと実質的に同一である配列を意味する。
【００９２】
野生型
本明細書で使用する場合、「野生型」の配列という用語は、その配列についての天然の又は正常な機能を果たす配列の対立遺伝子の形態であるコード配列、非コード配列又はインターフェイス配列を指す。野生型の配列は、同族の配列の複数の対立遺伝子の形態を包含し、例えば、野生型の配列の複数の対立遺伝子が、コード配列がコードするタンパク質配列に対するサイレント又は保存的な変化をコードする場合がある。
【００９３】
本発明は、ｍｉＲＮＡを、特異的な癌の同定、分類及び診断のため、並びにそれらの起源組織の同定のために利用する。
【００９４】
マイクロＲＮＡのプロセシング
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする遺伝子を転写させて、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして知られているｍｉＲＮＡの一次転写物の産生をもたらすことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ステムアンドループ構造を有するヘアピンを含むことができる。ヘアピンのステムは、ミスマッチした塩基を含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、いくつかのヘアピンを、ポリシストロニックな構造として含むことができる。
【００９５】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、Ｄｒｏｓｈａによって認識され得る。Ｄｒｏｓｈａは、リボヌクレアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼである。Ｄｒｏｓｈａは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ中の末端のループを認識し、ステムに入ってらせん約２巻きのところで切断して、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られている、６０−７０ｎｔの前駆体を産生することができる。Ｄｒｏｓｈａは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを切断し、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼに典型的な、ずれた切断部をもたらし、５’リン酸及び約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムループをもたらすことができる。Ｄｒｏｓｈａ切断部位から伸長する、ステムのらせん約１巻き（約１０個のヌクレオチド）が、効率的なプロセシングに不可欠である場合がある。次いで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ−ＧＴＰ及び搬出受容体Ｅｘ−ｐｏｒｔｉｎ−５によって核から細胞質へ能動的に輸送され得る。
【００９６】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって認識され得る。Ｄｉｃｅｒもまた、リボヌクレアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼである。Ｄｉｃｅｒは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの二本鎖のステムを認識することができる。Ｄｉｃｅｒもまた、末端のループを、ステムループの基部から、らせん２巻き離れて取り去り、追加の５’リン酸及び約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを残すことができる。ミスマッチを含むことができる、得られたｓｉＲＮＡ様二重鎖は、成熟したｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊として知られている類似の大きさの断片を含む。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの向かい合ったアームに由来することができる。ｍｉＲＮＡ＊配列は、クローン化ｍｉＲＮＡのライブラリー中に見出すことができるが、その頻度は典型的には、ｍｉＲＮＡよりも低い。
【００９７】
ｍｉＲＮＡは、最初は、ｍｉＲＮＡ＊と共に二本鎖の種として存在するが、最終的には、一本鎖ＲＮＡとして、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているリボ核タンパク質複合体中に組み込まれ得る。種々のタンパク質が、ＲＩＳＣを形成することができ、これらは、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊の二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの（抑制又は活性化の）活性、及びｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊の二重鎖のいずれの鎖がＲＩＳＣ中に取り込まれるかに関する多様性をもたらすことができる。
【００９８】
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖が、ＲＩＳＣ中に取り込まれる場合には、ｍｉＲＮＡ＊が除去され、分解され得る。ＲＩＳＣ中に取り込まれるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の二重鎖の鎖は、５’末端の対形成の堅固さの程度が低い鎖であってよい。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両方の末端が、ほぼ同等の５’の対形成を有する場合には、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の両方が、遺伝子サイレンシングの活性を有することができる。
【００９９】
ＲＩＳＣは、標的核酸を、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の高いレベルの相補性に基づいて、特にｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７により同定することができる。動物においては、ｍｉＲＮＡとその標的との間の相互作用が、ｍｉＲＮＡの全長に沿うという１例が報告されているに過ぎない。これは、ｍｉｒ−１９６及びＨｏｘ  Ｂ８について示されたものであり、その後、ｍｉｒ−１９６が、Ｈｏｘ  Ｂ８  ｍＲＮＡの切断を媒介することが示された（Ｙｅｋｔａら、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４−５９４）。これ以外は、そのような相互作用は、植物においてのみ知られている（Ｂａｒｔｅｌ及びＢａｒｔｅｌ  ２００３、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３２−７０９）。
【０１００】
いくつかの研究は、翻訳の効率的な阻害を達成するための、ｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間における塩基対形成の要件に注目している（Ｂａｒｔｅｌ  ２００４、Ｃｅｌｌ  １１６−２８１によって総説されている）。哺乳動物細胞中では、ｍｉＲＮＡの最初の８個のヌクレオチドが、重要である場合がある（Ｄｏｅｎｃｈ及びＳｈａｒｐ  ２００４  ＧｅｎｅｓＤｅｖ  ２００４−５０４）。しかし、また、マイクロＲＮＡのその他の部分がｍＲＮＡとの結合に参画する場合もある。さらに、３’における十分な塩基対形成が、５’における不十分な塩基対形成を補うこともできる（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら、２００５  ＰＬｏＳ  ３−ｅ８５）。全ゲノム上でのｍｉＲＮＡの結合を解析した計算研究から、標的結合における、ｍｉＲＮＡの５’における塩基２〜７の特異的な役割が示唆されているが、また、通常は「Ａ」であることが見出される、最初のヌクレオチドの役割も認識された（Ｌｅｗｉｓら、２００５  Ｃｅｌｌ  １２０−１５）。同様に、Ｋｒｅｋらは、ヌクレオチド１〜７又は２〜８を使用して、標的を同定及び確認した（２００５、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３７−４９５）。
【０１０１】
ｍＲＮＡ中の標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲにおいてであっても、又はコード領域においてであってもよい。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡが、同一のｍＲＮＡ標的を、同一又は複数の部位を認識することによって制御する場合がある。最も遺伝子的に同定されている標的における複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在から、複数のＲＩＳＣの共同作用が最も効率的な翻訳阻害をもたらすことが暗示され得る。
【０１０２】
ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを指揮して、遺伝子発現を、ｍＲＮＡの切断又は翻訳抑制の２つ機構のうちのいずれかによって下方制御することができる。ｍＲＮＡが、ｍｉＲＮＡに対して特定の程度の相補性を有する場合には、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断を特定することができる。ｍｉＲＮＡが切断を導く場合には、切断は、ｍｉＲＮＡの残基１０及び１１に対して対形成しているヌクレオチドとヌクレオチドとの間でなされる場合がある。或いはｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡに対して必要とされる程度の相補性を有しない場合には、ｍｉＲＮＡは、翻訳を抑制する場合もある。翻訳の抑制は、動物においてより多く見られる場合がある。これは、動物では、ｍｉＲＮＡと結合部位との間の相補性の程度がより低い場合があるからである。
【０１０３】
ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ＊との任意の対の５’末端及び３’末端は、多様性であり得ることに留意しなければならない。この多様性は、切断部位に関するＤｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒの酵素によるプロセシングの多様性に起因し得る。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の５’末端及び３’末端の多様性はまた、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステム構造中のミスマッチにも起因し得る。ステム鎖のミスマッチが、異なるヘアピン構造の集団をもたらす場合がある。ステム構造の多様性はまた、Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒによる切断の産物における多様性をもたらす場合もある。
【０１０４】
核酸
本明細書では、核酸を提供する。核酸は、配列番号１〜９６又はそれらの変異体の配列を含む。変異体は、参照するヌクレオチド配列の相補体であってよい。変異体はまた、参照するヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列、又はその相補体であってもよい。変異体はまた、厳密な条件下で参照するヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、その相補体、又はそれと実質的に同一であるヌクレオチド配列であってもよい。
【０１０５】
核酸は、約１０から約２５０までのヌクレオチド長を有することができる。核酸は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００又は２５０のヌクレオチド長を有することができる。核酸は、合成してもよく、又は細胞中で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて）本明細書に記載する合成遺伝子を使用して発現させてもよい。核酸は、一本鎖分子として合成し、実質的に相補的な核酸とハイブリダイズさせて、二重鎖を形成させることができる。核酸は、細胞、組織若しくは臓器に、一本鎖若しくは二本鎖の形態で導入する場合もあり、又は参照によって組み入れられている米国特許第６，５０６，５５９号に記載されているものをはじめとする、当業者に周知の方法を使用して合成遺伝子によって発現させることが可能である場合もある。
【０１０６】
核酸複合体
核酸は、以下のうちの１つ又は複数をさらに含むことができる：ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ−ＤＮＡのハイブリッド、抗体、抗体断片、Ｆａｂ断片及びアプタマー。
【０１０７】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ
核酸は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はその変異体の配列を含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜３０，０００、５０〜２５，０００、１００〜２０，０００、１，０００〜１，５００又は８０〜１００個のヌクレオチドを含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書に記載するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊、並びにそれらの変異体を含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号１〜９６又はそれらの変異体の配列のうちのいずれかを含むことができる。
【０１０８】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造を含むことができる。ヘアピン構造は、実質的に相補的である第１の核酸配列及び第２の核酸配列を含むことができる。第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、３７〜５０個のヌクレオチドであってよい。第１の核酸配列と第２の核酸配列とは、８〜１２個のヌクレオチドの第３の配列によって隔たる場合がある。ヘアピン構造は、その内容が参照によって本明細書に組み込まれているＨｏｆａｃｋｅｒら、Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ  ｆ．Ｃｈｅｍｉｅ  １２５：１６７−１８８（１９９４）に記載されているＶｉｅｎｎａアルゴリズムによって、デフォルトパラメータを用いて計算した場合、−２５Ｋｃａｌ／モル未満の自由エネルギーを有することができる。ヘアピンは、４〜２０、８〜１２又は１０個のヌクレオチドの末端のループを含むことができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、少なくとも１９％のアデノシンヌクレオチド、少なくとも１６％のシトシンヌクレオチド、少なくとも２３％のチミンヌクレオチド、及び少なくとも１９％のグアニンヌクレオチドを含むことができる。
【０１０９】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ
核酸はまた、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はその変異体の配列を含むこともできる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０、６０〜８０又は６０〜７０個のヌクレオチドを含むことができる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書に記載するｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊を含むことができる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列はまた、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの５’末端及び３’末端から０〜１６０個のヌクレオチドを排除したｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列であってもよい。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号１〜９６又はそれらの変異体の配列を含むことができる。
【０１１０】
ｍｉＲＮＡ
核酸はまた、（ｍｉＲＮＡ＊を含めた）ｍｉＲＮＡ又はその変異体の配列も含むことができる。ｍｉＲＮＡの配列は、１３〜３３、１８〜２４又は２１〜２３個のヌクレオチドを含むことができる。ｍｉＲＮＡはまた、全部で少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個のヌクレオチドを含むこともできる。ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３個のヌクレオチドであってよい。ｍｉＲＮＡの配列はまた、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最後の１３〜３３個のヌクレオチドであってもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号１〜９６又はそれらの変異体の配列を含むことができる。
【０１１１】
プローブ
また、本明細書に記載する核酸を含むプローブも提供する。プローブは、以下に概要を述べるように、スクリーニング及び診断の方法のために使用することができる。プローブは、バイオチップ等の固体の基材に結び付ける又は固定化することができる。
【０１１２】
プローブは、８から５００、１０から１００、又は２０から６０のヌクレオチド長を有することができる。プローブはまた、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０又は３００のヌクレオチド長を有することもできる。プローブは、１０〜６０個のヌクレオチドのリンカー配列をさらに含むことができる。
【０１１３】
バイオチップ
また、バイオチップも提供する。バイオチップは、固体の基材を含み、これは、結び付けられた１つ又は複数の本明細書に記載するプローブを含む。プローブは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、標的配列とハイブリダイズすることが可能であり得る。プローブを、基材上の空間的に規定されたアドレスにおいて結び付けることができる。標的配列当たり、２つ以上のプローブを使用することができ、それらは、ある特定の標的配列の重複するプローブ又はある特定の標的配列の異なる区分に対するプローブのいずれかである。プローブは、当業者が認識する単一の障害に関係がある標的配列とハイブリダイズすることが可能であり得る。プローブは、最初に合成し、それに続いて、バイオチップに結び付けてもよく、又はバイオチップ上に直接合成してもよい。
【０１１４】
固体の基材は、プローブを結び付ける又はつなげるのに適した個々の部位を個別に含有するように改変することができる材料であってよく、少なくとも１つの検出方法に適している。基材の代表的な例として、ガラス及び改変された又は機能性のガラス、（アクリル、ポリスチレン及びスチレンとその他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ＴｅｆｌｏｎＪ等をはじめとする）プラスチック、多糖、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、ケイ素及び改変されたケイ素をはじめとする、シリカ又はシリカに基づいた材料、炭素、金属、無機ガラス、並びにプラスチックが挙げられる。基材は、顕著に蛍光を発することなく、光学的な検出を可能にすることができる。
【０１１５】
基材は、平面であってよいが、また、基材のその他の構造形状を使用してもよい。例えば、流入式の試料解析のためには、プローブをチューブの内側表面上に置いて、試料体積を最小化することができる。同様に、基材は、軟質フォーム等、柔軟性があってもよく、これには、特定のプラスチックで作製された独立気泡フォームが挙げられる。
【０１１６】
バイオチップ及びプローブは、化学的な官能基を用いて誘導体化し、それに続いて、それら２つを結び付けることができる。例えば、バイオチップを、これらに限定されないが、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基又はチオール基をはじめとする、化学的な官能基を用いて誘導体化することができる。これらの官能基を使用すれば、プローブ上の官能基を使用して、プローブを、直接的に又はリンカーを使用して間接的に結び付けることができる。プローブは、５’末端により、３’末端により、又は内部ヌクレオチドを介してのいずれかで、固体の基材に結び付けることができる。
【０１１７】
プローブはまた、固体の基材に、非共有結合によって結び付けることもできる。例えば、ビオチン標識したオリゴヌクレオチドを作製することができ、これは、ストレプトアビジンで共有結合によりコートした表面に結合し、結び付くことができる。或いは光重合及びフォトリソグラフィー等の技法を使用して、プローブを表面上で合成することもできる。
【０１１８】
診断
本明細書で使用する場合、「診断する」という用語は、病態又は症状を分類し、病態の重症度（グレード若しくは段階）を決定し、病態の進行をモニターし、病態の結果及び／又は回復の見込みを予報することを指す。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、「それを必要とする対象」という句は、癌を有する、癌を有する危険がある［例えば、遺伝的素因がある対象、癌の病歴及び／若しくは家族歴を有する対象、発癌性物質、職業上の危険、環境上の危険に暴露したことがある対象］ことが知られている動物又はヒトの対象、並びに／或いは癌が疑われる臨床徴候［例えば、便中の血液若しくは血便、説明のつかない疼痛、発汗、説明のつかない発熱、摂食障害に至る説明のつかない体重減少、便通習慣の変化（便秘及び／若しくは下痢）、テネスムス（特に直腸癌の場合の不完全な排便感）、貧血及び／又は全般的な脱力感］を示す対象を指す。その上に又はそれに代わって、それを必要とする対象は、定期的な健康検査を受ける健康なヒトの対象であってもよい。
【０１２０】
悪性又は前悪性の細胞の存在の解析は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施しても、又はｅｘ−ｖｉｖｏにおいて実施してもよく、後者の場合、生物学的試料（例えば、生検）を取り出す。そのような生検試料は、細胞を含み、切開性の生検であっても、又は切除性の生検であってもよい。或いは細胞を、完全な摘出から取り出してもよい。
【０１２１】
本教示を利用しながら、治療計画、治療コースの決定及び／又は疾患の重症度の測定に関する追加の情報を集めることができる。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、「治療計画」という句は、それを必要とする対象（例えば、ある病態を有すると診断された対象）に提供する治療の型、用量、スケジュール及び／又は治療の持続期間を特定する治療のプランを指す。選択された治療計画は、最良の臨床成果（例えば、病態の完全な治癒）を得られることが予想される攻撃的なものであってもよく、又は病態の症状を緩和することができるが、病態を完全には治癒することはない中等度のものであってもよい。特定の場合には、治療計画には、対象に対する何らかの不快感又は有害な副作用（例えば、健常な細胞若しくは組織に対する損傷）が伴う場合があることを理解されたい。治療の型として、外科的な介入（例えば、病変、病気の細胞、組織若しくは臓器の除去）、細胞置換療法、治療用薬物（例えば、受容体アゴニスト、アンタゴニスト、ホルモン、化学療法剤）の局所的又は全身的なモードでの投与、外部的な源（例えば、体外照射）及び／又は内部的な源（例えば、ブラキセラピー）を使用する放射線療法への暴露、並びに／或いはそれらの任意の組合せを挙げることができる。治療の用量、スケジュール、持続期間は、病態の重症度及び選択された型の治療に依存して変化させてよく、当業者であれば、当該型の治療を、治療の用量、スケジュール、持続期間によって加減することができる。
【０１２３】
また、診断方法も提供する。この方法は、生物学的試料中の特定の癌と関係がある核酸の発現レベルを検出するステップを含む。試料は、患者から得ることができる。患者における癌の特異的な状況の診断によって、予後診断及び治療戦略の選択が可能となり得る。さらに、細胞の発生段階を、一時的に発現した、特定の癌と関係がある核酸を決定することによって分類することができる。
【０１２４】
標識したプローブと組織アレイとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うことができる。熟練した当業者であれば、個々の試料間でフィンガープリントを比較して、所見に基づいて診断、予後診断又は予測を行うことができる。さらに、診断を指し示す核酸配列は、予後診断を指し示す核酸とは異なる場合があり、細胞の状態の分子プロファイリングからは、応答性条件と不応性条件との間の区別が得られる場合があり、又は成果を予測できる場合があることも理解されたい。
【０１２５】
キット
また、キットも提供し、このキットは、本明細書に記載する核酸を、以下のうちのいずれか又は全てと一緒に含むことができる：アッセイ用試薬、緩衝液、プローブ及び／又はプライマー、並びに無菌の食塩水又は別の薬学的に許容できる乳濁液用及び懸濁液用の基剤。さらに、キットは、本明細書に記載する方法を実行するための指示（例えば、プロトコール）を含有する指導用の材料を包含することができる。キットは、発現プロファイルのデータ解析のためのソフトウエアのパッケージをさらに含むことができる。
【０１２６】
例えば、キットは、標的核酸配列の増幅、検出、同定又は定量化のためのキットであってよい。キットは、ポリ（Ｔ）プライマー、順方向プライマー、逆方向プライマー及びプローブを含むことができる。
【０１２７】
本明細書に記載する組成物はいずれも、キット中に含むことができる。非限定的な例においては、アレイを使用してｍｉＲＮＡを単離し、ｍｉＲＮＡを標識し且つ／又はｍｉＲＮＡの集団を評価するための試薬を、キット中に包含する。キットは、ｍｉＲＮＡプローブを生み出す又は合成するための試薬もさらに包含することができる。したがって、キットは、適切な容器手段中に、標識されたヌクレオチド又はそれに続いて標識される未標識のヌクレオチドを組み込むことによりｍｉＲＮＡを標識するための酵素を含む。キットはまた、反応用緩衝液、標識用緩衝液、洗浄用緩衝液又はハイブリダイゼーション用緩衝液等の１つ又は複数の緩衝液、ｍｉＲＮＡプローブを調製するための化合物、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための構成成分、及びｍｉＲＮＡを単離するための構成成分も包含することができる。本発明のその他のキットは、ｍｉＲＮＡを含む核酸アレイを作製するための構成成分を包含することができ、したがって、例えば、固体の基材を包含することができる。
【０１２８】
本発明のいくつかの実施形態をより十分に例証するために、以下の実施例を示す。しかし、いかなる場合であっても、それらが、本発明の広範な範囲を制限するものであると解釈してはならない。
【実施例】
【０１２９】
方法
１．腫瘍試料
腫瘍の試料を、いくつかの源から得た。全ての試料について、それぞれの施設内のＩＲＢ又はＩＲＢと同等のガイドラインに従って、施設内審査による承認を得た。ホルマリン固定パラフィン埋包（ＦＦＰＥ）試料について、最初の診断、組織学的な型、グレード、及び腫瘍のパーセントを、病理学者が、試料の最初及び／又は最後の切片上で実施したヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライド上で決定した。試料は、原発性腫瘍、転移性腫瘍と、前立腺腫瘍試料（示さず）に類似する発現プロファイルを示した良性前立腺過形成試料（ＢＰＨ）の２つの試料とを包含した。非定義試料は、この研究には包含しなかった。９０％のＦＦＰＥ試料において、腫瘍含有量が５０％超であった。
【０１３０】
２．ＲＮＡ抽出
凍結組織について、大きさが約０．５ｃｍ３の試料を、ＲＮＡ抽出のために使用した。全ＲＮＡを、ｍｉＲｖａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離用キット（Ａｍｂｉｏｎ製）を使用して、製造者の指示に従って抽出した。手短にいうと、試料を変性用溶解溶液中でホモゲナイズし、続いて、酸−フェノール：クロロホルム抽出を行う。最後に、試料を、ガラス繊維製フィルター上で精製する。
【０１３１】
ＦＦＰＥ試料について、全ＲＮＡを、７から１０個の１０μｍ厚さの組織切片から、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓにおいて開発されたｍｉＲｄｉｃｔｏｒ（商標）抽出プロトコールを使用して単離した。手短にいうと、試料を、キシレン中、５７℃で数回インキュベートして、過剰なパラフィンを除去し、続いて、エタノール洗浄を行う。タンパク質を、プロテイナーゼＫ溶液によって、４５℃で数時間分解させる。ＲＮＡを、酸フェノール：クロロホルムを用いて抽出し、続いて、エタノール沈殿及びデオキシリボヌクレアーゼ消化を行う。全ＲＮＡの量及び質を、分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ製ＮＤ−１０００）によって調べる。
【０１３２】
３．ｍｉＲｄｉｃａｔｏｒ（商標）アレイプラットフォーム
特注のマイクロアレイを、ＤＮＡオリゴヌクレオチドのプローブを、６８８個のヒトマイクロＲＮＡにプリントすることによって作製した。各プローブは、三つ組みでプリントされており、プローブを、コートしたガラス製スライドにカップルさせるために使用するアミン基に加えて、マイクロＲＮＡの相補配列の３’末端において２２ヌクレオチド（ｎｔ）までのリンカーを保有する。２０μＭの各プローブを、２×ＳＳＣ＋０．００３５％ＳＤＳ中に溶解させ、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ（登録商標）Ｓｌｉｄｅ  Ｅでコートしたマイクロアレイスライド上に、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標）ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ  ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ  ＩＩを使用して、ＭｉｃｒｏＧｒｉｄの製造者の指示に従って、三つ組みでスポットした。５４個の陰性の対照プローブを、異なるマイクロＲＮＡのセンス配列を使用して設計した。２つの群の陽性の対照プローブを設計して、ｍｉＲｄｉｃａｔｏｒ（商標）アレイにハイブリダイズさせた：（ｉ）合成の小型ＲＮＡをＲＮＡにスパイクさせてから標識して、標識化の効率を検証し、（ｉｉ）豊富な小型ＲＮＡ（例えば、小型核ＲＮＡ（Ｕ４３、Ｕ４９、Ｕ２４、Ｚ３０、Ｕ６、Ｕ４８、Ｕ４４）、５．８ｓ及び５ｓのリボゾームＲＮＡ）についてのプローブを、アレイ上にスポットして、ＲＮＡの質を検証した。スライドを、５０ｍＭエタノールアミン、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、５０℃で、２０分間ブロックし、次いで、水を用いて十分に濯ぎ、脱水した。
【０１３３】
４．ｍｉＲｄｉｃａｔｏｒ（商標）アレイのためのｍｉＲＮＡのＣｙ染料による標識化
ＲＮＡリンカー、ｐ−ｒＣｒＵ−Ｃｙ／染料（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ製）を、Ｃｙ３又はＣｙ５を有する３’末端に連結させる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００４，１：４７−５３）ことによって、５μｇの全ＲＮＡを標識した。標識化反応は、全ＲＮＡ、スパイク（０．１〜２０フェントモル）、３００ｎｇのＲＮＡ−リンカー−染料、１５％ＤＭＳＯ、１×リガーゼ用緩衝液、及び２０単位のＴ４  ＲＮＡリガーゼ（ＮＥＢ製）を含有し、４℃で１時間進行させ、続いて、３７℃に１時間保った。標識したＲＮＡを、３×ハイブリダイゼーション用緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ製）と混合し、９５℃で３分間加熱し、次いで、ｍｉＲｄｉｃａｔｏｒ（商標）アレイの上端上に添加した。スライドを、４２℃中で１２〜１６時間ハイブリダイズさせ、続いて、１×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳを用いて室温中で２回洗浄し、最後に０．１×ＳＳＣを用いて洗浄した。
【０１３４】
アレイを、Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ  Ｂｕｎｄｌｅ  Ｇ２５６５ＢＡ（出力１００％において、１０μｍの分解能）を使用して走査した。アレイの画像を、ＳｐｏｔＲｅａｄｅｒソフトウエア（Ｎｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を使用して解析した。
【０１３５】
５．アレイのシグナルの計算及び正規化
各プローブについて、三つ組みのスポットを組み合わせて、信頼できるスポットの対数平均を得ることによって、１つのシグナルを求めた。全てのデータを（自然）対数変換し、解析を対数空間において実施した。正規化のための参照データのベクトルＲを、各プローブについて、全部の試料にわたって発現レベルの中央値を得ることによって計算した。各試料データのベクトルＳについて、試料データと参照データとの間に最良のフィットをもたらすように２次の多項式Ｆを見出し、したがって、Ｒ≒Ｆ（Ｓ）となした。離れたデータ点（「外れ値」）は、多項式Ｆをフィットするためには使用しなかった。試料中の各プローブ（ベクトルＳ中の要素Ｓｉ）について、最初の値Ｓｉから、（対数空間において）正規化した値Ｍｉを、最初の値を、多項式Ｆを用いて変換することによって計算し、したがって、Ｍｉ＝Ｆ（Ｓｉ）となる。図３Ａ、Ｂ中のデータを、（指数をとることによって）線形空間に置き換え直した。トレーニングセットの試料のみを使用して、参照データのベクトルを求めても、結果に影響を及ぼさなかった。
【０１３６】
６．ロジスティック回帰
ロジスティック回帰モデルの目的は、いくつかのマイクロＲＮＡの発現レベル等、いくつかの特色を使用し、２分決定木中のあるノードの２つのブランチ等、２つの可能な群のうちの１つに属する確率を割り当てることである。ロジスティック回帰は、オッズ比、すなわち、第１の群、例えば２分決定木のあるノード中の左のブランチに属する確率（Ｐ）と、第２の群、例えばそのようなあるノード中の右のブランチに属する確率（１−Ｐ）との比の自然対数を、（対数空間における）異なる発現レベルの線形の組合せとして形に表す。ロジスティック回帰は、
【数１】
2010522554.tif 000002
であり、
但し、式中、β０は、バイアスであり、Ｍｉは、決定ノード中で使用したｉ番目のマイクロＲＮＡの（対数空間において正規化された）発現レベルであり、βｉは、その対応する係数である。βｉ＞０は、このマイクロＲＮＡの発現レベル（Ｍｉ）が増加すると、左のブランチをとる確率（Ｐ）が増加することを示し、βｉ＜０は、反対の場合を示す。ノードが単一のマイクロＲＮＡ（Ｍ）のみを使用する場合には、Ｐを解くと、（図４）が得られる。
【数２】
2010522554.tif 000003
【０１３７】
各試料についての回帰エラーは、割り当てられた確率Ｐとこの試料の本当の「確率」との間の差である。すなわち、この試料が、左のブランチの群中にあるときは１であり、そうでなければ０である。ロジスティック回帰モデルのトレーニング及び最適化は、パラメータβ及びｐ値を（各マイクロＲＮＡについては、Ｗａｌｄ統計量によって、全体的なモデルについては、χ２（カイ二乗）の差によって）計算し、データから得たモデルの尤度を最大化し、全体的な回帰エラーを最小化する。
【数３】
2010522554.tif 000004
【０１３８】
ここで、ロジスティックモデルの確率の出力を、Ｐを、ＰＴＨで表す閾値と比較することによって二分決定に変換する。すなわち、Ｐ＞ＰＴＨのときは、試料が左のブランチ（「第１の群」）に属し、逆の場合には、結果も逆になる。各ノードにおいて、＞０．５の確率を有するブランチを選ぶ、すなわち、０．５の確率の閾値を使用すると、回帰エラーの和が最小化される。しかし、ゴールは、（それらの確率ではなく）誤分類の全体的な数の最小化であることから、各ノードにおける誤りの全体的な数を最小化するために、確率の閾値（ＰＴＨ）を加減する改変を使用した（表２）。各ノードについて、新しい確率の閾値ＰＴＨに対する閾値を、分類エラーの数を最小化するように最適化した。確率の閾値のこの変化は、クラスの以前の頻度の変化を反映することができるバイアスβ０の改変と（分類の観点からは）同等である。
【０１３９】
７．ステップワイズロジスティック回帰及び特色の選択
元々のデータは、各試料について、数百個のマイクロＲＮＡの発現レベルすなわち、数百個のデータの特色を含有する。各ノードについて、分類子をトレーニングする場合には、これらの特色の小さなサブセットのみを選択し、ロジスティック回帰モデルを最適化するために使用した。最初のトレーニングにおいては、これを、前方ステップワイズスキームを使用して行った。特色を、対数尤度が減少する順番にソートし、ロジスティックモデルに着手し、第１の特色を用いて最適化した。次いで、第２の特色を追加し、モデルを再度最適化した。これらの２つのモデルの回帰エラーを比較した：特色の追加により、有意な利点がもたらされない場合（７．８８未満のχ２の差、０．００５のｐ値）には、新しい特色を破棄した。それ以外では、追加した特色を維持した。新しい特色を追加すると、以前の特色と重複する場合がある（例えば、それらの相関性が非常に高い場合）。これについて調べるために、プロセスが、（上記のχ２の差を失うことなく）最も低い尤度を有する特色を破棄することができるか否かを反復的に調べる。特色の現在のセットが、この意味においてコンパクトであることを確実にしてから、プロセスは、ソートしたリスト中の次の特色を試験し続け、特色を使い果たす。特色の数に関する制限は、アルゴリズム中に挿入しなかったが、ほとんどの場合、２〜３つの特色が選択された。
【０１４０】
ステップワイズロジスティック回帰の方法を、トレーニングセットの試料のサブセット上で、繰り返し（「ブートストラップ」）を有するトレーニングセットを、２３回の実行のうちのそれぞれが、試料の約３分の２を少なくとも１回は含有し、任意の１つの試料が、少なくとも１回は外される＞９９％の機会を有するように、再度試料採取することによって使用した。この結果、平均して、１つのノード当たり２〜３つ（より困難なノードにおいては、４〜８つ）の特色を得た。ブートストラップセット中の繰り返して選ばれた特色を、以前の証拠と比較し、それらのシグナルの強度及び信頼性を考慮することによって、１つのノード当たり２〜３つの特色のロバストなセット（表２）を選択した。これらの選択された特色を使用して分類子を構築する場合、ステップワイズのプロセスは使用せず、トレーニングが、ロジスティック回帰モデルのパラメータのみを最適化した。
【０１４１】
８．性別及び肺からの転移によるクラスの制限
決定木の枠組みによって、利用可能な臨床情報を容易に分類することが可能になる。２つのそのようなデータ、すなわち、性別及び肺からの転移を使用する。女性患者からの試料は、精巣及び前立腺に由来するとしては分類されず；したがって、ノード＃２に達した女性患者の試料は、右のブランチに、且つ同様にノード＃１７においては左のブランチ（＝乳房）に自動的に分類された。男性患者からの試料は、子宮内膜及び卵巣に由来するとしては分類されず、ノード２０においては左のブランチに自動的に分類された。肺からの転移が指し示された試料は、肝臓に由来するとしては分類されず、ノード＃１においては右のブランチに分類された。したがって、追加の情報は、一般性を喪失することもなく、分類子を保持する必要もなく、容易に活用される。
【０１４２】
９．Ｋ最近傍（ＫＮＮ）分類アルゴリズム
ＫＮＮアルゴリズム（例えば、Ｍａら、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２００６、１３０：４６５−７３を参照されたい）は、任意の試料の、トレーニングセット中の全ての試料に対する距離（ピアソンの相関関係）を計算し、試料を、最も類似するｋ個の試料の大多数の票決によって分類する（ｋは、分類子のパラメータである）。相関関係を、組織型（クラス）の全ての対を調査し、任意の２つのクラス間で有意に示差的に発現したマイクロＲＮＡを収集することによって選択したマイクロＲＮＡ（データの特色）のあらかじめ定義したセット上で計算する。決定木によって使用された４８個のマイクロＲＮＡを有するこのリストの共通部分のみを使用しても、性能が低下することはなく、これらのマイクロＲＮＡの情報内容が強調された。ｋ＝１，３，５を用いたＫＮＮアルゴリズムを比較し、ｋ＝３及びマイクロＲＮＡのより小さなセットを使用して、最適なパフォーマーを選択した。
【０１４３】
１０．ｑＲＴ−ＰＣＲ
１μｇの全ＲＮＡに対して、以前の記載（Ｓｈｉ及びＣｈｉａｎｇ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００５、３９：５１９−５２５）に従って、ポリアデニル化反応を行う。手短にいうと、ＲＮＡを、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）（Ｔａｋａｒａ−２１８０Ａ）、ＭｎＣｌ２及びＡＴＰの存在下、３７℃で１時間インキュベートする。逆転写を、全ＲＮＡ上で実施する。逆方向プライマーに対して相補的なコンセンサス配列をもつｏｌｉｇｏｄＴプライマー、ｏｌｉｇｏｄＴデンプン、Ｎヌクレオチド（全Ａ、Ｃ及びＧの混合物）並びにＶヌクレオチド（４つのヌクレオチドの混合物）を、逆転写反応に使用する。プライマーを、最初に、ポリＡ−ＲＮＡにアニールさせ、次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）の逆転写反応を行う。次いで、ｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲ反応によって、マイクロＲＮＡに特異的な順方向プライマー、ＴａｑＭａｎプローブ、及びオリゴｄＴテイルの３’配列に対して相補的な汎用逆方向プライマーを使用して増幅する。反応物を、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃１５秒間及び６０℃１分間を４２サイクル行う。
【０１４４】
図３Ｃに、Ｕ６  ｓｎＲＮＡについて正規化したデータを示す（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００６、２０：２２０２−２２０７を参照されたい）。図３Ｄ中のデータをＵ６によって正規化し、（底が２の指数によって）線形空間に変換し、定数（５９，０００）をかけて、数値を、アレイのシグナルと同一の中央値を有するようにシフトさせた。マイクロアレイとｑＲＴ−ＰＣＲのデータとの間で、２つの別々の試料のサブセット中３つのマイクロＲＮＡ（全部で６群）の分布を比較して、コルモゴルフ−スミルノフ統計量の平均値０．３２を得た。（６群のうちの）わずか２つの群が有意に異なる分布（ＫＳ統計量＜０．０５）を有したに過ぎず、大部分の群は、コルモゴルフ−スミルノフ検定によっては、有意に異なることはなかった。
【０１４５】
（実施例１）
試料及びプロファイリング
ホルマリン固定パラフィン埋包（ＦＦＰＥ）により記録保管されている試料は、腫瘍材料のための重要な源であることから、マイクロＲＮＡ画分を保存しているＦＦＰＥのブロックからＲＮＡを抽出するための方法を開発した。新鮮凍結試料、ホルマリン固定試料又はＦＦＰＥ試料から抽出したＲＮＡを比較し、ＲＮＡの量及び質が、全ての保存方法にわたり類似することを実証した。さらに、マイクロＲＮＡのプロファイルは、ＦＦＰＥ試料中で、１１年もの長い保管期間にわたり安定であった。
【０１４６】
マイクロＲＮＡプロファイリングを、ｍｉＲＢａｓｅ（バージョン９）３中に全てのマイクロＲＮＡについてのプローブを含有するＲｏｓｅｔｔａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ製のｍｉＲｄｉｃａｔｏｒ（商標）マイクロアレイ１９上で実施した。
【０１４７】
２０５個の原発性腫瘍及び１３１個の転移性腫瘍を包含し、２２種の異なる腫瘍起源又は「クラス」を示す、３３３個のＦＦＰＥ試料及び３つの新鮮凍結試料を収集し、プロファイリングした。（試料の概要については表１を参照されたい）。腫瘍のパーセントは、９０％超の試料について、少なくとも５０％であった。試料のうち８３個（各クラスの約２５％）を、盲検の試験セットとして無作為に選択した。６５個の追加の原発性腫瘍の試料（５３個のＦＦＰＥ試料及び１２個の新鮮凍結試料）を、選択されたマイクロＲＮＡについての確認として、ｑＲＴ−ＰＣＲ上のみでプロファイリングした。全体で４０１個の試料が、この研究には包含された。
【０１４８】
（実施例２）
原発性腫瘍と転移性腫瘍との比較
十分な数の転移性の試料を得るのが困難であることに起因して、この研究は、試料セットを増大させるために、原発性腫瘍を利用している。原発性の試料と転移性の試料との間における発現プロファイルの差は、腫瘍における根本的な生物学的な差から又は付近の組織からの混入から予想することができる。そのような効果は、転移性の試料上での腫瘍の分類子の性能を妨げる場合がある。
【０１４９】
乳癌又は結腸癌等の大部分の組織起源については（図１Ａ、Ｂ）、原発性腫瘍と転移性腫瘍との間では有意な差は見出されなかった。その他の場合では、マイクロＲＮＡの小さなセットが、示差的に発現した。例えば、胃の原発性腫瘍の試料を、胃からリンパ節へ転移した試料と比較すると、３つのマイクロＲＮＡが、有意に示差的に発現した（図１Ｃ、Ｄ）。上皮層に特徴的であるＨｓａ−ｍｉＲ−１４３５（配列番号９９）、及び筋肉組織に特徴的であるｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ２（配列番号９７）が、胃から得た原発性腫瘍中で過剰発現し；対照的に、リンパ球中での発現が高いと以前に同定されたｈｓａ−ｍｉＲ−１５０２０（配列番号１０１）は、リンパ節から得た転移性の試料中により高いレベルで存在した。さらに、周囲の筋肉組織を含有することが多い、前立腺又は頭頚部等の原発性腫瘍からの試料は、顕著な発現レベルのｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２０６及びｍｉＲ−１３３ａを示し、これらは、骨格筋に特異的なマイクロＲＮＡである２。我々は、転移についての分類子のトレーニングにおいては、原発性腫瘍を使用することができるが、慎重に且つ特異的なマーカー及び状況に注意を払って使用しなければならないと結論付けた。これらの効果からの潜在的な偏りを低減させるために、交差汚染が交絡効果を有する恐れがあるノードにおけるマイクロＲＮＡの使用を最小限に留めた。例えば、筋肉に関連するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１／１３３／２０６）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１５０は使用しなかった。
【０１５０】
（実施例３）
決定木分類子アルゴリズム
腫瘍の分類子を、マイクロＲＮＡの発現レベルを使用して、２分木分類スキームを適用することによって築いた（図２）。この枠組みを設定して、組織の分化及び胚形成におけるマイクロＲＮＡの特異性を活用する：異なるマイクロＲＮＡが、組織の特異化の種々の段階に関与するので、それらを、異なる決定点又は「ノード」において、アルゴリズムに使用した。木は、複雑な複数組織の分類の問題を、より単純な二分決定のセットに分割する。各ノードにおいては、木においてそれより前に枝分れするクラスは考慮されず、無関係の試料からの干渉を減少させ、決定をさらに単純化する（図３Ａ）。次いで、各ノードにおける決定を、分類における十分に定義された役割を有する少数のマイクロＲＮＡバイオマーカーのみを使用して達成することができる（表２）。２分木の構造は、組織の発生及び形態学的な類似性の階層に基づき１８、マイクロＲＮＡの発現パターンの目立つ特色によって改変された（図２）。例えば、マイクロＲＮＡの発現パターンは、肺カルチノイドとその他の肺癌の型との間で有意な差を指し示し、したがって、これらは、ノード＃１２において（図３Ａ、Ｂ）、別のブランチに分かれる（図２）。興味深いことに、データを２分の分類木に分配するための自動化アルゴリズムからは、類似の構造を有する木が生成したが、構造及び個々のノードの分類子に関する柔軟性を欠き、その性能は顕著により不十分であった。
【０１５１】
個々のノードのそれぞれについて、ロジスティック回帰モデルを使用した。これは、分類子のロバストなファミリーであり、連続的なデータの特色を組み合わせて二分決定を得るために疫学的研究及び臨床研究において頻繁に使用される（図３Ａ、図４、及び方法）。遺伝子発現の分類子は、遺伝子の特色の選択に関して内在的な重複性を有するので、トレーニング試料セット上で、ブートストラップすることを、各ノードについて安定なマイクロＲＮＡのセットを選択するための方法として使用した（方法）。この結果、１つのノード当たり少数（通常、２〜３つ）のマイクロＲＮＡの特色を、全体的な分類子については全部で４８個のマイクロＲＮＡを得た（表２）。我々のアプローチは、示差的発現についての新しいバイオマーカーを同定するための系統だったプロセスを提供する。
【０１５２】
（実施例４）
分類子の性能：クロス確認及び高い信頼度の分類
最初のステップとして、分類子の性能を、トレーニングセット内で、１つとって置き法による確認（ＬＯＯＣＶ）を使用して試験した。ＬＯＯＣＶは、見知らぬ試料上での分類アルゴリズムの性能をシミュレートする。ＬＯＯＣＶでは、アルゴリズムを繰り返して再度トレーニングし、その度に、１つの試料を除外し、各試料を、この試料なしでトレーニングした分類子上で試験する。決定木アルゴリズムは、７８％の平均感度又は精度、及び９９％の特異性に達し、異なるクラス間では顕著な変動を有した。この性能を、通常使用されるＫ最近傍（ＫＮＮ）分類アルゴリズム８，５，１８の性能と比較した。ＫＮＮアルゴリズムは、（最適なｋ＝３においては）この木よりも不十分な性能を示し（７１％の平均感度及び等しい特異性）、異なるクラスが、アルゴリズム間において、感度の有意な差を有した。
【０１５３】
診療においては、しばしば、異なる程度の信頼度の情報を査定することが有用である１７，１８。特にＣＵＰの診断においては、決定的な診断を下すことができない場合には、確率の高い可能性の短いリストが実用的な選択肢である。決定木及びＫＮＮアルゴリズムは、設計が異なり、独立にトレーニングされることから、それらの分類を組み合わせ、比較することによって、改善された精度及びより高い信頼度を得ることができる。これらの２つのアルゴリズムによって得た予測を融合させると、症例の８５％において正確なクラスが含まれた。症例の６９％において、これらの２つのアルゴリズムが一致し、単一の、高い信頼度の予測をもたらした。満足なことには、これらの高い信頼度の予測の９３％が、試料の正確なクラスを正確に同定し、２２種の腫瘍のクラスのうちの半分超が１００％の感度を達成した。
【０１５４】
（実施例５）
分類子の性能：独立した盲検の試験セット
分類アルゴリズムの最も重要な試験は、盲検の試験セット上のものである。試料の約４分の１を、異なるクラスを代表するように無作為に選択して、独立した試験セットとして残しておき、分類子の性能を試験した（表３）。試験セット上での性能は、トレーニングセットにおけるＬＯＯＣＶの性能と比較して低下しなかった。これは、分類子の非常に望ましい特色であり、この分類子がロバストであり、過学習ではないことを示している。症例の８６％が、これらの２つの予測因子の融合によって正確に予測された（大部分のクラスが、１００％の感度を有した）。高い信頼度の予測は、症例の３分の２に当たり、このうち、８９％が正確に分類された。盲検の試験セットにおいてさえも、２２個のクラスのうちの圧倒的な１６個が、高い信頼度の予測において１００％の精度を有した。最後に、盲検の試験セットの転移性の試料上で分類の性能を調べた。ここでもまた、分類子は、高い信頼度の分類について、８５％の感度を達成した。盲検の転移性の試料上での性能がそのように高いという事実は、トレーニングセットを、原発性腫瘍を用いて増大させ、同時に潜在的に交絡するマーカーも回避するアプローチを支持する。
【０１５５】
（実施例６）
独立したプラットフォームであるｑＲＴ−ＰＣＲによる確認
アレイプラットフォームに基づいて開発した上記の決定木アルゴリズムは、組織群間の二分決定において、特異的な役割をマイクロＲＮＡに帰属させる。特定のプラットファームの効果を排除するために、これらのマイクロＲＮＡのサブセットの有意性を、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ製ｍｉＲｄｉｃａｔｏｒ（商標）高感度ｑＲＴ−ＰＣＲプラットフォーム（方法）上で、元々の試料のうちの１５個に、６５個の独立した試料を足して使用して確認した。測定したシグナルの値は、プラットフォーム間で異なるが、マイクロＲＮＡは、それらの診断における役割を維持し（図３Ｃ、Ｄ）、正確な分類のために使用することができる（図５）。
【０１５６】
表１：癌の型、クラス及び組織診断
【表１】
2010522554.tif 000005
【０１５７】
表２：決定木のノード、及び各ノードにおいて使用したマイクロＲＮＡ
【表２−１】
2010522554.tif 000006
【表２−２】
2010522554.tif 000007
†ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４１は、１つの予測されたポリシストロニックなｐｒｉ−ｍｉＲ６の部分であり、発現が非常に類似する。これらの２つのマイクロＲＮＡは、木において、結果に対して非常にわずかな効果しか示さず、互換的に使用することができる。ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃは、（トレーニングセットにおいては）ノード＃１において、わずかにより良好な性能を有した。
ａ肝臓への転移が示された試料については、このノードにおいては右のブランチに分類し、ノード＃３に進む。
１女性患者に由来することが示された試料については、このノードにおいては右のブランチに分類し、ノード＃３に進む。
２女性患者に由来することが示された試料については、このノードにおいては左のブランチに分類し、乳房として分類する。
３男性患者に由来することが示された試料については、このノードにおいては左のブランチに分類し、ノード＃２１に進む。
【０１５８】
「胃＊」のクラスは、胃癌及び食道胃接合部の腺癌の両方を包含し；「頭頚部＊」のクラスは、頭頚部の癌及び食道の扁平上皮癌を包含する（図２を参照されたい）。「ＧＩＳＴ」は、消化管間質腫瘍を示す。
【０１５９】
決定木のスキームにおいては、いくつかのマイクロＲＮＡが、木の大きな区分を分け、その後のノードに至る２つのブランチのいずれに進むかを決め；その他のノードでは、２つのブランチのうちの少なくとも１つが、特定の組織型に至る末端のノードに分かれた。この木のデザインが意味することは、２つのブランチ間を分けるマイクロＲＮＡはまた、このノードの２つの選択的なブランチの「葉」である、任意の２つの単一の組織型間を分けるためにも使用することができる点である。例えば、ノード＃１２においては、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４が、ノード＃１３に至るブランチと、ノード＃１６に至るブランチとの間を分ける。「結腸」が、ノード＃１３の（ノード＃１４を介する）間接的な葉であり、「乳房」が、ノード＃１６の（ノード＃１７を介する）間接的な葉であることから、このことは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４はまた、その他の組織型が不在の場合には、「結腸」と「乳房」との間を分けるためにも使用することができることを意味する。
【０１６０】
表３に、トレーニングセット及び試験セット中の試料の数を示し、且つ盲検の試験セット上での分類の性能を、各クラスについて個別に及び全ての試料にわたり平均して全体的に示す。「Ｓｅｎｓ」は、感度を示し、「Ｓｐｅｃ」は、特異性を示す。「Ｔｒｅｅ」は、決定木アルゴリズムを指し；「Ｕｎｉｏｎ」は、決定木アルゴリズム及びＫＮＮアルゴリズムの両方の予測を収集することによって得られる、１つ／２つの答えである。「Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｆ．Ｆｒａｃ」は、決定木アルゴリズム及びＫＮＮアルゴリズムの両方が分類に関して一致する、高い信頼度の予測を有する試料の割合である。「Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｆ．Ｓｅｎｓ」は、高い信頼度の予測の間の感度である。最後の列は、転移性癌の試料である、試験セットのサブセット上での性能を示す。「胃＊」のクラスは、胃癌及び食道胃接合部の腺癌の両方を包含し；「頭頚部＊」のクラスは、頭頚部の癌及び食道の扁平上皮癌を包含する（図２を参照されたい）。「ＧＩＳＴ」は、消化管間質腫瘍を示す。
【０１６１】
表３：盲検の試験セット上での分類の性能
【表３】
2010522554.tif 000008
【０１６２】
表２中のマイクロＲＮＡのいくつかについては、類似のシード配列（同一のヌクレオチド２〜８）を有する、その他の変異体マイクロＲＮＡが、ヒトゲノム中で知られており（表４を参照されたい）、したがって、これらは、非常に類似したセットの（ｍＲＮＡをコードする）遺伝子を（ＲＩＳＣ機構を介して）標的にするとみなされている。同一のシード配列を有するこれらのマイクロＲＮＡは、表示するｍｉＲと置き換わることができる。
【０１６３】
表４：同一のシード配列を有するマイクロＲＮＡ
【表４−１】
2010522554.tif 000009
【表４−２】
2010522554.tif 000010
【表４−３】
2010522554.tif 000011
【０１６４】
表２中のマイクロＲＮＡのいくつかについては、ゲノム上でごく接近して位置する（ゲノムのクラスタ）、その他のマイクロＲＮＡが、ヒトゲノム中で知られており（表５を参照されたい）、これらは、表示するｍｉＲと一緒に、同じように発現する場合がある。ほぼ同一のゲノムの位置からのこれらのマイクロＲＮＡは、表示するｍｉＲと置き換わることができる。
【０１６５】
表５：同一のゲノムのクラスタ内のマイクロＲＮＡ（距離＜１０ｋｂ）
【表５−１】
2010522554.tif 000012
【表５−２】
2010522554.tif 000013
【表５−３】
2010522554.tif 000014
【表５−４】
2010522554.tif 000015
【０１６６】
表２中のマイクロＲＮＡのいくつかについては、類似の配列（配列中に６つ未満のミスマッチ）を有する、その他のマイクロＲＮＡが、ヒトゲノム中で知られており（表６を参照されたい）、したがって、これらはまた、同一の設計を有するプローブによって捕捉することもできる。類似の全体的な配列を有するこれらのマイクロＲＮＡは、表示するｍｉＲと置き換わることができる。
【０１６７】
表６：類似の配列を有するマイクロＲＮＡ
【表６−１】
2010522554.tif 000016
【表６−２】
2010522554.tif 000017
【０１６８】
2010522554.tif 000018
【０１６９】
これまでに記載した、特定の実施形態から、本発明の一般的な性質が非常に十分に明らかになるので、他者は、現在の知識を適用することによって、過度の実験なしに、一般的概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を容易に改変及び／又は適合させて、種々の応用例を得ることができる。したがって、そのような適合形態及び改変形態は、開示した実施形態の均等物の意味及び範囲のうちで把握されるべきであり、そのように意図されている。本発明を、その特定の実施形態と共に説明してきたが、多くの代替形態、改変形態及び変形形態が、当業者には明らかになるであろうことは明白である。したがって、添付の請求項の精神及び広範な範囲に属する、そのような代替形態、改変形態及び変形形態は全て包含されるものとする。
【０１７０】
詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、本発明の精神及び範囲に属する種々の変化形態及び改変形態が、この詳細な説明から、当業者には明らかになるであろうことから、これら詳細な説明及び特定の実施例は、説明のために提供されているに過ぎないことを理解されたい。
【図１Ａ】
2010522554.tif 000019
【図１Ｂ】
2010522554.tif 000020
【図１Ｃ】
2010522554.tif 000021
【図１Ｄ】
2010522554.tif 000022
【図２】
2010522554.tif 000023
【図３Ａ】
2010522554.tif 000024
【図３Ｂ】
2010522554.tif 000025
【図３Ｃ】
2010522554.tif 000026
【図３Ｄ】
2010522554.tif 000027
【図４】
2010522554.tif 000028
【図５Ａ】
2010522554.tif 000029
【図５Ｂ】
2010522554.tif 000030
【図５Ｃ】
2010522554.tif 000031
【図５Ｄ】
2010522554.tif 000032
【配列表】
2010522554000001.xml
【国際調査報告】
2010522554.tif 000065
2010522554.tif 000066
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