(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＡｄＶ−Ａ１３３７のヘキソンタンパク質、配列番号：８６のアミノ酸１〜９３１を含んでなるキャプシドを有する組換えアデノウイルスであって、該キャプシドは宿主細胞中における遺伝子の転写、翻訳及び／又は発現を指示する発現調節配列に操作可能に連結された遺伝子を保有する異種分子を包膜しているアデノウイルス。
【請求項２】
該キャプシドが、ＳＡｄＶ−Ａ１３３７のペントンタンパク質、配列番号：８１のアミノ酸１〜５３２をさらに含んで成る、請求項１に従う組換えアデノウイルス。
【請求項３】
該キャプシドが、ＳＡｄＶ−Ａ１３３７の繊維タンパク質、配列番号：９６のアミノ酸１〜４９０をさらに含んで成る、請求項１または２に従う組換えアデノウイルス。
【請求項４】
複製及び包膜に必要な５’及び３’アデノウイルスシス−要素をさらに含んでなる請求項１〜３のいずれかに従う組換えアデノウイルス。
【請求項５】
該アデノウイルスがＥ１遺伝子の全部又は一部を欠いている請求項１〜４のいずれかに従う組換えアデノウイルス。
【請求項６】
該アデノウイルスが複製−欠損である請求項５に従うアデノウイルス。
【請求項７】
サルアデノウイルスＡ１３３７（ＳＡｄＶ−Ａ１３３７）ヘキソンタンパク質のフラグメントを含有するヘキソンを含んでなるキャプシド及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７に異種である核酸配列を有する組換えアデノウイルスであって、ＳＡｄＶ−Ａ１３３７ヘキソンタンパク質のフラグメントは長さが約５０個のアミノ酸のＮ−末端もしくはＣ−末端切断を有するＳＡｄＶ−１３３７のヘキソンタンパク質、配列番号：８６のアミノ酸１〜９３１であるか、あるいは
配列番号：８６のアミノ酸残基１２５〜４４３；
配列番号：８６のアミノ酸残基１３８〜４４１；
配列番号：８６のアミノ酸残基１３８〜１６３；
配列番号：８６のアミノ酸残基１７０〜１７６；及び
配列番号：８６のアミノ酸残基４０４〜４３０
より成る群から選ばれる組換えアデノウイルス。
【請求項８】
該キャプシドがさらにＳＡｄＶ−１３３７のペントンタンパク質、配列番号：８１のアミノ酸１〜５３２を含む請求項７に従う組換えアデノウイルス。
【請求項９】
該キャプシドがさらにＳＡｄＶ−１３３７の繊維タンパク質、配列番号：９６のアミノ酸アミノ酸１〜４９０を含む請求項７または８に従う組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
該アデノウイルスが、複製及び包膜に必要な５’及び３’アデノウイルスシス−要素を含んでなるシュードタイプアデノウイルスであり、該シス−要素はアデノウイルス５’逆方向末端反復及びアデノウイルス３’逆方向末端反復を含んでなる請求項７〜９のいずれかに従う組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
アデノウイルスが、宿主細胞中における産物の発現を指示する配列に操作可能に連結された、該産物をコードする核酸配列を含む請求項７〜９のいずれかに従う組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
組換えアデノウイルスが１個もしくはそれより多いアデノウイルス遺伝子を含む請求項７〜９のいずれかに従う組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
組換えアデノウイルスが複製−欠損である請求項７〜９のいずれかに従う組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
組換えアデノウイルスがアデノウイルスＥ１において欠失している請求項１３に従う組換えアデノウイルス。
【請求項１５】
Ｅ１ａ、配列番号：１０３；
Ｅ１ｂ、スモールＴ／１９Ｋ、配列番号：７８；
Ｅ１ｂ、ラージＴ／５５Ｋ、配列番号：９８；
５２／５５Ｄ、配列番号：７９；
ＩＩＩａ、配列番号：８０；
ＶＩＩ、配列番号：８２；
Ｖ、配列番号：８３；
ｐＸ、配列番号：８４；
ＶＩ、配列番号：８５；
エンドプロテアーゼ、配列番号：８７；
１００ｋＤ、配列番号：８８；
２２ｋＤ、配列番号：９９；
ＶＩＩＩ、配列番号：８９；
Ｅ３／１２．５Ｋ、配列番号：９０；
ＣＲＩ−アルファ、配列番号：１００；
ｇｐ１９Ｋ、配列番号：９１；
ＣＲ１−ベータ、配列番号：９２；
ＣＲ１−ガンマ、配列番号：９３；
ＣＲ１−デルタ、配列番号：９４；
ＲＩＤ−ベータ、配列番号：９５；及び
Ｅ３／１４．７Ｋ、配列番号：１０１；
より成る群から選ばれる１種もしくはそれより多いサルアデノウイルスタンパク質を更に含んでなる請求項１〜１４のいずれかに従う組換えアデノウイルス。
【請求項１６】
製薬学的に許容され得る担体中に請求項１〜１５のいずれかに従う組換えアデノウイルスを含んでなる組成物。
【請求項１７】
標的細胞への分子の送達における使用のための、請求項１〜１５のいずれかに従うアデノウイルス又は請求項１６に従う組成物。
【請求項１８】
標的細胞への分子の送達に有用な薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれか１つに従う組換えアデノウイルス又は請求項１６に従う組成物の使用。
【請求項１９】
単離されたサルアデノウイルス、配列番号：７７のサルアデノウイルスＡ１３３７核酸１〜３６６３９及びその相補体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
電子形態で提示される資料（ｍａｔｅｒｉａｌ）の引用による挿入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ−ｂｙ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）
本明細書とともに電子形態で出願される配列表資料は、引用することによりその内容が本明細書の内容となる。このファイルは“ＵＰＮ＿Ｙ６３３４ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”と標識され、２０１３年５月１７日に作成され、３，０８５，６８７バイト（２．９４ＭＢ）である。
【０００２】
発明の背景
アデノウイルスは、約３６キロベース（ｋｂ）のゲノムサイズの二本鎖ＤＮＡウイルスであり、多様な標的組織において高度に有効な遺伝子導入を達成するその能力及び大きな導入遺伝子容量の故に、遺伝子導入用途のために広く用いられてきた。通常、アデノウイルスのＥ１遺伝子を欠失させ、選ばれるプロモーター、問題の遺伝子のｃＤＮＡ配列及びポリＡシグナルから成る導入遺伝子カセットで置き換え、複製欠損組換えウイルスを得る。
【０００３】
アデノウイルスは、３つの主要タンパク質、ヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ｐｅｎｔｏｎ  ｂａｓｅ）（ＩＩＩ）及び小塊状繊維（ｋｎｏｂｂｅｄ  ｆｉｂｒｅ）（ＩＶ）を複数の他の微量タンパク質（ｍｉｎｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａ及びＩＶａ２と共に含む２０面体キャプシドを有する特徴的な形態を有する［非特許文献１］。ウイルスゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を有する５’末端に共有結合した末端タンパク質を有する線状二本鎖ＤＮＡである。ウイルスＤＮＡは、高度に塩基性のタンパク質ＶＩＩ及び小さいペプチドｐＸ（以前はｍｕと命名された）と緊密に会合している。別のタンパク質、ＶがこのＤＮＡ−タンパク質複合体と一緒に詰め込まれ、タンパク質ＶＩを介するキャプシドへの構造的な結合を与える。ウイルスはウイルスによりコードされるプロテアーゼも含有し、それは成熟した感染性ウイルスを生ずるための構造タンパク質のいくつかのプロセシングのために必要である。
【０００４】
ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ及びオポッサムアデノウイルスを含むマストアデノウイルス科に関する分類案が開発されている。この分類案は、その科の中のアデノウイルス配列の、赤血球を凝集させる異なる能力に基づいて開発された。結果は、現在、亜群（ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦと称される６つの亜群であった。非特許文献２を参照されたい。
【０００５】
組換えアデノウイルスは、宿主細胞への異種分子の送達に関して記載されている。２種のチンパンジーアデノウイルスのゲノムを記載している特許文献１を参照されたい。サルアデノウイルス、Ｃ５、Ｃ６及びＣ７は特許文献２においてワクチンベクターとして有用であると記載されている。他のチンパンジーアデノウイルスは特許文献３においてアデノウイルスワクチン担体の作製のために有用であると記載されている。
【０００６】
当該技術分野において必要なのは、標的に分子を有効に送達し、集団中の選ばれたアデノウイルス血清型への既存の免疫性の影響を最小にするベクターである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，０８３，７１６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２４７，４７２号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５／１０７１０９３号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌ著，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：２５７３−３７０４（Ｎｏｖ  ２０００）
【非特許文献２】Ｂ．Ｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．編集のＦＩＥＬＤ’ｓ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第６版中のＴ．Ｓｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ“，Ｃｈ．６７，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６），ｐ．１１１−２１１２
【発明の概要】
【０００９】
発明の概略
６つの新規な亜科Ｅサルアデノウイルスの単離された核酸配列及びアミノ酸配列ならびにこれらの配列を含有するベクターを本明細書で提供する。本発明のベクター及び細胞を使用するための複数の方法も提供する。これらのアデノウイルスはＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７を含む。
【００１０】
本明細書に記載される方法は、本発明のベクターを投与することにより、１種もしくはそれより多い選ばれた異種遺伝子を哺乳類患者に送達することを含む。標的細胞への分子の送達における使用のための、本明細書に記載されるアデノウイルス又は組換えアデノウイルスも提供する。標的細胞への分子の送達のために有用な薬剤の製造における、本明細書に記載されるアデノウイルス又は組換えアデノウイルスの使用をさらに提供する。ワクチン接種のための本明細書に記載される組成物の使用は、防御免疫反応を引き出すために選ばれた抗原を与えることを可能にする。これらのサルアデノウイルスに基づくベクターを、試験管内で異種遺伝子産物を作るために用いることもできる。そのような遺伝子産物は、それら自身が本明細書に記載されるような多様な目的のために有用である。
【００１１】
本発明のこれらの、及び他の態様及び利点を下記にさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図面の簡単な記述
【図１】図１は、ＨＩＶｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）へのＴ細胞反応のための導入遺伝子を保有する、示されるアデノウイルスベクターを注入した後の８日及び１４日におけるＨＩＶｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）へのＴ細胞反応を反映する棒グラフである。Ｔ細胞反応は、免疫優性ＨＩＶ  ｇａｇ  ｓｈｏｒｔＣＤ８Ｔ細胞エピトープＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号：４１０）を用いてＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴにより分析された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な記述
すべてチンパンジーの排泄物から単離されたサルアデノウイルス、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７からの新規な核酸及びアミノ酸配列を提供する。
【００１４】
組換えタンパク質又はフラグメント又は他の試薬の試験管内作製における使用のための、これらの配列に基づく新規なアデノウイルスベクター及びベクターの作製のためのパッケージング細胞系も提供する。治療又はワクチン目的のための異種分子の送達における使用のための組成物をさらに提供する。そのような治療又はワクチン組成物は、挿入された異種分子を保有するアデノウイルスベクターを含有する。さらに、新規なＳＡｄＶ配列は
、組換えアデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの作製に必要な必須（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）ヘルパー機能を与えることにおいて有用である。かくしてそのような作製方法においてこれらの配列を使用するヘルパー構築物、方法及び細胞系を提供する。
【００１５】
核酸又はそのフラグメントに言及する場合、「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、適したヌクレオチド挿入又は欠失を以て別の核酸（又はその相補体）と最適に整列させた時に、整列した配列の約９６％、約９７％、約９８％及び約９９％を含んで少なくとも約９５〜９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【００１６】
アミノ酸又はそのフラグメントに言及する場合、「実質的相同性」又は「実質的類似性」という用語は、適したアミノ酸挿入又は欠失を以て別のアミノ酸（又はその相補体）と最適に整列させた時に、整列した配列の約９６％、約９７％、約９８％及び約９９％を含んで少なくとも約９５〜９９％においてアミノ酸配列同一性があることを示す。好ましくは、相同性は全長配列もしくはそのタンパク質又は長さが少なくとも８個のアミノ酸、又はより望ましくは少なくとも１５個のアミノ酸であるそのフラグメントに及ぶ。適したフラグメントの例は、本明細書に記載される。
【００１７】
核酸配列の関係における「パーセント配列同一性」又は「同一」という用語は、最大の一致に関して整列させた時に、２つの配列中で同じである残基を指す。１つの配列を別の配列と整列させるためにギャップ（ｇａｐｓ）が必要な場合、ギャップのペナルティーなしでより長い方の配列に関してスコアリング（ｓｃｏｒｉｎｇ）の程度を計算する。ポリヌクレオチド又はそれによりコードされるポリペプチドの機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を保存している配列は、より密接に同一である。配列同一性比較の長さは、ゲノムの全長（例えば約３６ｋｂｐ）、遺伝子のオープンリーディングフレーム、タンパク質、サブユニットもしくは酵素の全長（例えばアデノウイルスコード領域を与える表を参照されたい）に及ぶことができるか、あるいは少なくとも約５００〜５０００個のヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしながら、例えば少なくとも約９個のヌクレオチド、通常少なくとも約２０〜２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個かもしくはそれより多くのヌクレオチドのより小さいフラグメントの間の同一性も望ましいかも知れない。類似して、「パーセント配列同一性」を、タンパク質の全長又はそのフラグメントに及んで、アミノ酸配列に関して容易に決定することができる。適切には、フラグメントは長さが少なくとも８個のアミノ酸であり、最高で約７００個のアミノ酸であることができる。適したフラグメントの例は本明細書に記載される。
【００１８】
同一性は、デフォルト設定において本明細書で定義されるようなアルゴリズム及びコンピュータープログラムを用いて容易に決定される。好ましくは、そのような同一性はタンパク質、酵素、サブユニットの全長に及ぶか、あるいは長さが少なくとも８個のアミノ酸のフラグメントに及ぶ。しかしながら、同一性は、同一の遺伝子の産物が供されている使用に適したもっと短い領域に基づくことができる。
【００１９】
本明細書に記載される通り、整列は、公共的又は商業的に入手可能な多様な複数配列整列プログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ）のいずれか、例えばインターネット上のウェブサービスを介してアクセス可能な“Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ”を用いて行われる［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ著，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２２，４６７３−４６８０］。あるいはまた、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）ユーティリティー［Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ］も用いられる。上記のプログラム中に含有されるものを含む、ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いられ得る当該技術分野において既知の複数のアルゴリズムもある。他の例として、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１中のプログラムであるＦａｓｔａを用いてポリヌ
クレオチド配列を比較することができる。Ｆａｓｔａは、クエリー及びサーチ配列（ｑｕｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｅａｒｃｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の間の最大の重なりの領域の整列及びパーセント配列同一性を与える。例えば引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１に与えられるようなそのデフォルトパラメーター（６のワードサイズ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）及びスコアリングマトリックスに関するＮＯＰＡＭ因子）を有するＦａｓｔａを用いて、核酸配列の間のパーセント配列同一性を決定することができる。類似して、アミノ酸整列を行うためのプログラムが入手可能である。一般にこれらのプログラムはデフォルト設定で用いられるが、当該技術分野における熟練者はこれらの設定を必要通りに変えることができる。あるいはまた、当該技術分野における熟練者は、少なくとも言及されたアルゴリズム及びプログラムにより与えられるレベルのような同一性又は整列のレベルを与える別のアルゴリズム及びコンピュータープログラムを用いることができる。
【００２０】
ポリヌクレオチドに適用される場合、「組換え」は、ポリヌクレオチドがクローニング、制限又は連結段階ならびに自然において見出されるポリヌクレオチドと異なる構築物を生ずる他の方法の種々の組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。その用語はそれぞれ最初のポリヌクレオチド構築物の複製物及び最初のウイルス構築物の子孫を含む。
【００２１】
典型的に、「異種」は、それが比較されている存在の残部の遺伝子型と遺伝子型が異なる存在から誘導されることを意味する。異種核酸配列は、アデノウイルスベクターの天然に存在する核酸配列から単離されておらず、それから誘導されておらず、又はそれに基づいていない核酸配列を指す。「天然に存在する」は、自然において見出され、合成的に製造されたり改変されたりしていない配列を意味する。配列は、それが供給源から単離されるが、供給源遺伝子の正常な機能を崩壊させないように改変される（例えば欠失、置換（突然変異）、挿入又は他の改変により）時に、供給源に「由来する」。配列は、配列が供給源に実質的に類似である場合に、供給源に「基づく」。
【００２２】
例えば遺伝子工学法により異なる種（及び多くの場合に異なる属、亜科又は科）から誘導されるプラスミド又はベクター中に導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。本来のコード配列から取り出され、それが天然に連結しているのが見出されないコード配列に操作可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結したプロモーターは、異種プロモーターである。ウイルス又はウイルスベクターのゲノム中にクローニングされ、ここでウイルスのゲノムはそれを天然には含有していない特定の組換え部位は、異種組換え部位である。異種核酸配列には、アデノウイルスゲノム中に天然に見出されるが、アデノウイルスベクター内で本来の位置ではない位置に置かれた配列も含まれる。リコンビナーゼに関するコード配列を有するポリヌクレオチドが、正常にはリコンビナーゼを発現しない細胞を遺伝子的に改変するために用いられる場合、ポリヌクレオチド及びリコンビナーゼの両方は細胞にとって異種である。
【００２３】
異種ワクチンは、１種のウイルス又はウイルスベクターが別の種の病原性ウイルスに対する免疫性を誘導するために導入される状況を指す。この場合、「異種」という用語は、異なる種、属、亜科又は科特異性を有するウイルスから誘導される接種抗原（ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ）及びチャレンジ抗原（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）を指す。
【００２４】
本明細書及び請求項を通じて用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語ならびに他の変形の中でも「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を含むその変形は、他の成分、要素、整数、段階などを包含する。「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  ）」又は「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）
」という用語は、他の成分、要素、整数、段階などを排除する。
【００２５】
Ｉ．サルアデノウイルス配列
本発明は、サルアデノウイルスＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７の核酸配列及びアミノ酸配列を提供し、それらはそれらが自然において関連している他の材料から単離される。
【００２６】
Ａ．核酸配列
本明細書で提供されるＳＡｄＶ−Ａ１３０２核酸配列は、配列番号：１のヌクレオチド１−３６４３０を含む。本明細書のＳＡｄＶ−Ａ１３２０核酸配列は、配列番号：２５のヌクレオチド１−３６６０３を含む。本明細書で提供されるＳＡｄＶ−Ａ１３３１核酸配列は、配列番号：５０のヌクレオチド１−３６６４７を含む。本明細書で提供されるＳＡｄＶ−Ａ１３３７核酸配列は、配列番号：７７の１−３６６３９を含む。引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる配列表を参照されたい。
【００２７】
１つの態様において、本発明の核酸配列はさらに、配列番号：１、２５、５０又は７７の配列にそれぞれ相補的である鎖ならびに配列及びそれらの相補体に対応するＲＮＡ及びｃＤＮＡ配列を包含する。別の態様において、核酸配列はさらに、配列表に９８．５％より大きく同一、好ましくは約９９％より大きく同一である配列を包含する。１つの態様において、配列番号：１、２５、５０又は７７及びそれらの相補体中に与えられる配列の天然の突然変異体及び操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）改変も含まれる。そのような改変には、例えば当該技術分野において既知の標識、メチル化及び縮重ヌクレオチドを用いる天然に存在する１個もしくはそれより多いヌクレオチドの置換が含まれる。
【００２８】
【表１−１】
0006293738.tif 000002
【００２９】
【表１−２】
0006293738.tif 000003
【００３０】
【表１−３】
0006293738.tif 000004
【００３１】
１つの態様において、配列番号：１、２５、５０又は７７の配列及びそれらの相補体、それに相補的なｃＤＮＡ及びＲＮＡのフラグメントを、それに実質的な相同性を有するフラグメントと一緒に提供する。適したフラグメントは長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、機能性フラグメント、すなわち生物学的に興味深いフラグメントを包含する。例えば機能性フラグメントは所望のアデノウイルス産物を発現することができるか、あるいは組換えウイルスベクターの作製において有用であり得る。そのようなフラグメントは、本明細書中に挙げられる遺伝子配列及びフラグメントを含む。表は、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列中の転写領域及びオープンリーディングフレームを与える。ある遺伝子の場合、転写物及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）は、配列番号：１、２５、５０又は７７において示される鎖に相補的な鎖上に位置する。例えばＥ２ａ、Ｅ２ｂ及びＥ４を参照されたい。コードされるタンパク質の計算される分子量も示す。Ｅ１ａオープンリーディングフレーム、Ｅ２ｂオープンリーディングフレーム及びＥ４オープンリーディングフレームが内部スプライス部位を含有することに注目されたい。これらのスプライス部位を上記の表中に記す（ａｒｅ  ｎｏｔｅｄ）。
【００３２】
ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７アデノウイルス核酸配列は、治療薬としてならびに多様なベクター系及び宿主細胞の構築において有用である。本明細書で用いられる場合、ベクターには、裸のＤＮＡ、プラスミド、ウイルス、コスミド又はエピソームを含むいずれの適した核酸分子も含まれる。これらの配列及び産物を単独で、あるいは他のアデノウイルス配列又はフラグメントと組み合わせてあるいは他のアデノウイルス配列又は非−アデノウイルス配列からの要素と組み合わせて用いることができる。ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列は、アンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター又はワクチンベクターとしても有用である。かくしてＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列を含有する核酸分子、遺伝子送達ベクター及び宿主細胞をさらに提供する。
【００３３】
例えば本発明は、本発明のサルＡｄ  ＩＴＲ配列を含有する天然に存在しない核酸分子を包含する。「天然に存在しない」は、自然において見出され得ず、組換え、遺伝子工学又は他の方法を介して、合成され、配列し直され、又は改変された配列又は遺伝子要素を、それらを含有するベクター及び宿主細胞からの子孫と一緒に指す。別の例において、本発明は、所望のＡｄ遺伝子産物をコードする本発明のサルＡｄ配列を含有する核酸分子を提供する。本発明の配列を用いて構築されるさらに別の核酸分子は、本明細書で与えられる情報を見て、当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。
【００３４】
１つの態様において、本明細書で同定されるサルＡｄ遺伝子領域を、細胞への異種分子の送達のための多様なベクターにおいて用いることができる。例えばパッケージング宿主細胞においてウイルスベクターを生成させる目的で、アデノウイルスキャプシドタンパク質（又はそのフラグメント）の発現のためのベクターを作製する。そのようなベクターをトランスでの発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓ）のために設計することができる。あるいはまた、所望のアデノウイルス機能を発現する配列、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、末端反復配列、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４、Ｅ４ＯＲＦ６領域の１つもしくはそれより多くを安定して含有する細胞を与えるベクターを設計する。
【００３５】
さらに、アデノウイルス遺伝子配列及びそのフラグメントは、ヘルパー−依存性ウイルス（例えば必須の機能が欠失したアデノウイルスベクター又はアデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ））の作製のために必要なヘルパー機能を与えるために有用である。そのような作製法のために、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列を、ヒトＡｄに関して記載されているやり方に類似したやり方で、そのような方法において利用することができる。しかしながら、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列とヒトＡｄの配列の間の配列における相違のために、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列の使用は、ｒＡＡＶ作製の間に感染性アデノウイルス性汚染物を作製し得るヒトＡｄ  Ｅ１機能を保有する宿主細胞、例えば２９３細胞におけるヘルパー機能を用いる相同的組換えの可能性を非常に縮小するか（ｇｒｅａｔｌｙ  ｍｉｎｉｍｉｚｅ）又は排除する。
【００３６】
アデノウイルスヘルパー機能を用いるｒＡＡＶの作製法は、ヒトアデノウイルス血清型を用いて文献に詳細に記載されている。例えば米国特許第６，２５８，５９５号明細書及びそこで引用されている引用文献を参照されたい。米国特許第５，８７１，９８２号明細書；国際公開第９９／１４３５４号パンフレット；国際公開第９９／１５６８５号パンフレット；国際公開第９９／４７６９１号パンフレットも参照されたい。これらの方法を、ヒト以下霊長類ＡＡＶ血清型を含むヒト以下血清型ＡＡＶの作製においても用いることができる。必要なヘルパー機能を与えるＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＥ４  ＯＲＦ６）は、典型的にはヒト起源であるｒＡＡＶ−パッケージング細胞中に存在する他のアデノウイルスを用いる組換えの可能性を最小にするか又は排除しながら、必要なアデノウイルス機能を与えることにおいて、特に有用であり得る。かくしてＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列の選ばれた遺伝子又はオープンリーディングフレームをこれらのｒＡＡＶ作製法において利用することができる。
【００３７】
あるいはまた、組換えＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターをこれらの方法において利用することができる。そのような組換えアデノウイルスサルベクターには、例えばチンパンジーＡｄ配列が、例えばＡＡＶ３’及び／又は５’ＩＴＲｓならびに導入遺伝子の発現を調節する調節配列の調節下における導入遺伝子から成るｒＡＡＶ発現カセットにフランキングしているハイ
ブリッドチンパンジーＡｄ／ＡＡＶが含まれ得る。当該技術分野における熟練者は、さらに別のサルアデノウイルスベクター及び／又はＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７遺伝子配列がｒＡＡＶ及びアデノウイルスヘルパーに依存性の他のウイルスの作製に有用であろうことを認識するであろう。
【００３８】
さらに別の態様において、核酸分子は、所望の生理学的効果を達成するために、宿主細胞における選ばれたアデノウイルス遺伝子産物の送達及び発現のために設計される。例えばＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７  Ｅ１ａタンパク質をコードする配列を含有する核酸分子を、ガン治療薬としての使用のために患者に送達することができる。場合により、そのような分子は脂質に基づく担体中で調製され、優先的にガン細胞を標的とする。そのような調製物を他のガン治療薬（例えばシスプラチン、タキソールなど）と組み合わせることができる。本明細書に与えられるアデノウイルス配列に関するさらに別の使用は、当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。
【００３９】
さらに、当該技術分野における熟練者は、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列を、治療用分子及び免疫原性分子の試験管内、生体外又は生体内送達用の多様なウイルス及び非−ウイルスベクター系のための使用に容易に適合させ得ることを容易に理解するであろう。例えばＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７サルＡｄ配列を多様なｒＡｄ及び非−ｒＡｄベクター系において利用することができる。そのようなベクター系には、中でも例えばプラスミド、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクチニアウイルス及びアデノ−関連ウイルス系が含まれ得る。これらのベクター系の選択は、本発明の制限ではない。
【００４０】
本発明はさらに、本発明のサル及びサル−由来タンパク質の作製のために有用な分子を提供する。本発明のサルＡｄ  ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを保有するそのような分子は、裸のＤＮＡ、プラスミド、ウイルス又は他の遺伝子要素の形態にあることができる。
【００４１】
Ｂ．ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７アデノウイルスタンパク質
本明細書に記載されるアデノウイルス核酸によりコードされるタンパク質、酵素及びそれらのフラグメントのようなＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７アデノウイルスの遺伝子産物を提供する。他の方法により作製される、これらの核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有するＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７タンパク質、酵素及びそれらのフラグメントがさらに包含される。そのようなタンパク質には、上記の表中で同定されたオープンリーディングフレームによりコードされるもの、配列表中で与えられる配列番号に関連して（ｗｉｔｈ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ）下記の表中で同定されるタンパク質ならびにそれに実質的な相同性を有する配列が含まれる。本明細書で同定されるタンパク質及びポリペプチドのフラグメントも、それに実質的な相同性を有するフラグメントとともに示す。
【００４２】
【表２】
0006293738.tif 000005
【００４３】
かくして１つの側面において、実質的に純粋である、すなわち他のウイルス性及びタン
パク質性タンパク質を含まない独特のサルアデノウイルスタンパク質を提供する。好ましくは、これらのタンパク質は少なくとも１０％均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）であり、より好ましくは６０％均一であり、そして最も好ましくは９５％均一である。
【００４４】
１つの態様において、独特のサル−由来キャプシドタンパク質を提供する。本明細書で用いられる場合、サル−由来キャプシドタンパク質には、上記で定義されたＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシドタンパク質又はそれらのフラグメントを含有するいずれのアデノウイルスキャプシドタンパク質も含まれ、キメラキャプシドタンパク質、融合タンパク質、人工キャプシドタンパク質、合成キャプシドタンパク質及び組換えキャプシドタンパク質が含まれるがこれらに限られず、これらのタンパク質作製の手段への制限はない。本明細書で記載されるキャプシドは完全にＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７の１つのものであることができるか、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７の１つより多くのキャプシドタンパク質を含有することができるか、あるいは別のアデノウイルスのキャプシドタンパク質を含有することができる。
【００４５】
適切には、これらのサル−由来キャプシドタンパク質は、１つもしくはそれより多いＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７領域又はそれらのフラグメント（例えばヘキソン、ペントン、繊維又はそれらのフラグメント）を、種々のアデノウイルス血清型のキャプシド領域又はそのフラグメントあるいは本明細書で記載される改変されたサルキャプシドタンパク質又はそのフラグメントと組み合わせて含有する。本明細書で用いられる場合、「改変された親和性と関連するキャプシドタンパク質の改変」は、特異性が変わるように改変されたキャプシドタンパク質、すなわちペントン、ヘキソン又は繊維タンパク質領域又はそれらのフラグメント、例えば繊維領域のノブ（ｋｎｏｂ）ドメイン又はそれをコードするポリヌクレオチドが含まれる。サル−由来キャプシドを、本発明のサルＡｄの１つもしくはそれより多くあるいはヒト又はヒト以下起源のものであることができる別のＡｄ血清型を用いて構築することができる。ＡＴＣＣ、商業的及び学術的供給源を含む多様な供給源からそのようなＡｄを得ることができるか、あるいはＧｅｎＢａｎｋ又は他の適した供給源からＡｄの配列を得ることができる。
【００４６】
ＳＡｄＶ−Ａ１３０２［配列番号：５］、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０［配列番号：２９］、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１［配列番号：５４］又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７［配列番号：８１］のペントンタンパク質のアミノ酸配列を提供する。適切には、このペントンタンパク質又はその独特のフラグメントを多様な目的のために利用することができる。適したフラグメントの例には、上記及び配列番号：５、２９、５４又は８１中に与えられるアミノ酸番号付けに基づく、約５０個、１００個、１５０個又は２００個のアミノ酸のＮ−末端及び／又はＣ−末端切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を有するペントンが含まれる。他の適したフラグメントには、もっと短い内部、Ｃ−末端又はＮ−末端フラグメントが含まれる。さらに、当該技術分野における熟練者に既知の多様な目的のためにペントンタンパク質を改変することができる。
【００４７】
ＳＡｄＶ−Ａ１３０２［配列番号：９］、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０［配列番号：３４］、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１［配列番号：５９］又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７［配列番号：８６］のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列も提供する。適切には、このヘキソンタンパク質又はその独特のフラグメントを多様な目的のために利用することができる。適したフラグメントの例には、上記及び配列番号：９、３４、５９又は８６中に与えられるアミノ酸番号付けに基づく、約５０個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個又は５００個のアミノ酸のＮ−末端及び／又はＣ−末端切断を有するヘキソンが含まれる。他の適
したフラグメントには、もっと短い内部、Ｃ−末端又はＮ−末端フラグメントが含まれる。例えば１つの適したフラグメントは、ＤＥ１及びＦＧ１と称されるヘキソンタンパク質のループ領域（ドメイン）又はその超可変領域である。そのようなフラグメントには、配列番号：９、３４、５９又は８６を参照して、サルヘキソンタンパク質のアミノ酸残基の大体（ａｂｏｕｔ）１２５−４４３；大体１３８−４４１に及ぶ領域あるいはもっと小さいフラグメント、例えば大体残基１３８−残基１６３；大体１７０−大体１７６；大体１９５−大体２０３；大体２３３−大体２４６；大体２５３−大体３７４；大体２８７−大体２９７；及び大体４０４−大体４３０に及ぶフラグメントが含まれる。当該技術分野における熟練者は、他の適したフラグメントを容易に同定することができる。さらに、当該技術分野における熟練者に既知の多様な目的のためにヘキソンタンパク質を改変することができる。ヘキソンタンパク質はアデノウイルスの血清型に関する決定因子であるので、そのような人工のヘキソンタンパク質は人工の血清型を有するアデノウイルスを生ずる。本発明のチンパンジーＡｄペントン配列及び／又は繊維配列及び／又はそれらのフラグメントを用いて、他の人工のキャプシドタンパク質を構築することもできる。
【００４８】
１つの態様において、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ヘキソンタンパク質の配列を利用して改変されたヘキソンタンパク質を有するアデノウイルスを作製することができる。１つの適したヘキソンタンパク質の改変法は、米国特許第５，９２２，３１５号明細書に記載されており、その記載事項は引用することにより本明細書の内容となる。この方法では、アデノウイルスヘキソンの少なくとも１つのループ領域が別のアデノウイルス血清型の少なくとも１つのループ領域を用いて変更される。かくして、そのような改変されたアデノウイルスヘキソンタンパク質の少なくとも１つのループ領域は、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７のサルＡｄヘキソンループ領域である。１つの態様において、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ヘキソンタンパク質のループ領域を、別のアデノウイルス血清型からのループ領域により置き換える。別の態様において、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ヘキソンのループ領域を用いて、別のアデノウイルス血清型からのループ領域を置き換える。本明細書に記載する通り、ヒト及びヒト以下血清型の中から適したアデノウイルス血清型を容易に選ぶことができる。適した血清型の選択は、本発明の制限ではない。ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ヘキソンタンパク質配列に関するさらに別の使用は、当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。
【００４９】
ＳＡｄＶ−Ａ１３０２［配列番号：１９］、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０［配列番号：４４］、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１［配列番号：６９］又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７［配列番号：９６］の繊維タンパク質のアミノ酸配列を提供する。適切には、この繊維タンパク質又はその独特のフラグメントを多様な目的のために利用することができる。１つの適したフラグメントは、配列番号：１９、４４、６９又は９６内に位置するファイバーノブ（ｆｉｂｅｒ
ｋｎｏｂ）である。他の適したフラグメントの例には、配列番号：１９、４４、６９又は９６中に与えられるアミノ酸番号付けに基づく約５０個、１００個、１５０個又は２００個のアミノ酸のＮ−末端及び／又はＣ−末端切断を有する繊維が含まれる。さらに別の適したフラグメントには内部フラグメントが含まれる。さらに、当該技術分野における熟練者に既知の多様な方法を用いて、繊維タンパク質を改変することができる。
【００５０】
ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７のタンパク質の独特のフラグメントは、長さが少なくとも８個のアミノ酸である。しかしながら、他の所望の長さのフラグメントを容易に利用することができる。さらに、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ
−Ａ１３３７遺伝子産物の収率及び／又は発現を強化するために導入され得るような改変、例えばＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７遺伝子産物のすべて又はフラグメントを強化のための融合パートナーと融合させる（直接又はリンカーを介して）融合分子の構築を本明細書で提供する。他の適した改変には、通常切断されるプレ−又はプロ−タンパク質を除去するため及び成熟タンパク質又は酵素を与えるためのコード領域（例えばタンパク質又は酵素）の切断ならびに／あるいは分泌性遺伝子産物を与えるためのコード領域の突然変異が含まれるが、制限ではない。さらに別の改変は、当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。本明細書で提供されるＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７タンパク質に少なくとも約９８％、約９９％、約９９．５％又は約９９．９％の同一性を有するタンパク質がさらに包含される。
【００５１】
本明細書に記載する通り、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７のアデノウイルスキャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、中和抗体が他のＡｄ血清型に基づくベクターならびに他のウイルスベクターの有効性を低下させる用途における使用に特に十分に適している。ｒＡｄベクターは、繰り返し遺伝子治療又は追加の免疫反応（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ワクチン力価）のための再投与において特に有利である。
【００５２】
ある状況下では、抗体を作製するためにＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７遺伝子産物（例えばキャプシドタンパク質又はそのフラグメント）の１つもしくはそれより多くを用いるのが望ましいかも知れない。本明細書で用いられる場合、「抗体」という用語は、エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、例えば高親和性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、キメラ抗体、組換え抗体及びヒト化抗体を含む多様な形態で存在することができる。そのような抗体は、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥに由来する。
【００５３】
当該技術分野において既知の複数の方法を用いて、そのような抗体を作製することができる。周知の通常の方法、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びその多くの既知の修正法により、適した抗体を作製することができる。類似して、望ましい高力価抗体は、これらの抗原に対して生じた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）モノクローナル又はポリクローナル抗体に既知の組換え法を適用することにより作製される［例えばＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２；英国特許出願番号ＧＢ２１８８６３８Ａ；Ａｍｉｔ
ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３；ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＷＯ９００７８６１；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１を参照されたい］。あるいはまた、本発明の抗原への動物又はヒト抗体の相補性決定領域を操作することにより、抗体を作製することができる。例えばＥ．Ｍａｒｋ  ａｎｄＰａｄｌｉｎ，“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１３，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｊｕｎｅ，１９９４）；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８
８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；及びＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４３７を参照されたい。本発明はさらに、抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）及び抗−抗−イディオタイプ抗体（Ａｂ３）を提供する。例えばＭ．Ｗｅｔｔｅｎｄｏｒｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｉｎ  Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｅｄ．ｂｙ  Ｊ．Ｃｅｒｎｙ及びＪ．Ｈｉｅｒｎａｕｘ，１９９０  Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：ｐｐ．２０３−２２９を参照されたい。これらの抗−イディオタイプ及び抗−抗−イディオタイプ抗体は、当該技術分野における熟練者に周知の方法を用いて作製される。これらの抗体を、診断及び臨床法ならびにキットを含む多様な目的のために用いることができる。
【００５４】
ある状況下では、本発明のＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７遺伝子産物、抗体又は他の構築物の上に検出可能な標識又はタグを導入するのが望ましいかも知れない。本明細書で用いられる場合、検出可能な標識は、単独で、又は別の分子と相互作用すると、検出可能なシグナルを与えることができる分子である。最も望ましくは、標識は、免疫組織化学的分析又は免疫蛍光顕微鏡における即時の（ｒｅａｄｙ）使用のために視覚により、例えば蛍光により検出可能である。例えば適した標識にはフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、コリホスフィン−Ｏ（ＣＰＯ）又はタンデム染料、ＰＥ−シアニン−５（ＰＣ５）及びＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ＥＣＤ）が含まれる。これらの蛍光染料のすべては商業的に入手可能であり、それらの使用は当該技術分野に既知である。他の有用な標識には、コロイド金標識が含まれる。さらに別の有用な標識には放射性化合物又は元素が含まれる。さらに標識には、アッセイにおいて発色シグナル（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｓｉｇｎａｌ）を現すように働く多様な酵素系が含まれ、例えばグルコースオキシダーゼ（基質としてグルコースを用いる）は生成物として過酸化物を放出し、それはペルオキシダーゼ及びテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のような水素ドナーの存在下で酸化されたＴＭＢを与え、それは青色として見られる。他の例にはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）及びＡＴＰ、グルコース及びＮＡＤ＋と反応して、他の生成物の中でも３４０ｎｍの波長における吸光度の向上として検出されるＮＡＤＨを与えるグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼと結びついたヘキソキナーゼが含まれる。
【００５５】
本明細書に記載される方法において用いられる他の標識系は他の手段により検出可能であり、例えば染料が埋め込まれた着色ラテックス微粒子［Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａ］が酵素の代わりに用いられ、標的配列と共役体を形成し、適用可能なアッセイにおいて得られる複合体の存在を示す可視のシグナルを与える。
【００５６】
標識を所望の分子と結合させるか又は会合させる方法は、同様に当業者に慣用であり既知である。標識結合の既知の方法は記載されている［例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｐ．Ｍ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９９４／１９９５を参照されたい］。かくして標識及び結合法の選択は本発明を制限しない。
【００５７】
組換え体作製、化学合成又は他の合成手段を含むいずれの適した手段によっても、ＳＡ
ｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７の配列、タンパク質及びフラグメントを作製することができる。適した作製法は当該技術分野における熟練者に周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。あるいはまた、周知の固相ペプチド合成法によりペプチドを合成することもできる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６２）；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）ｐｐ．２７−６２）。これらの及び他の適した作製法は、当該技術分野における熟練者の知識の範囲内であり、本発明の制限ではない。
【００５８】
さらに当該技術分野における熟練者は、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７配列を、治療用分子及び免疫原性分子の試験管内、生体外又は生体内送達用の多様なウイルス及び非−ウイルスベクター系のための使用に容易に適合させ得ることを容易に理解するであろう。例えば１つの態様において、本明細書に記載されるサルＡｄキャプシドタンパク質及び他のサルアデノウイルスタンパク質は、遺伝子、タンパク質及び他の望ましい診断分子、治療用分子及び免疫原性分子の非−ウイルス性のタンパク質に基づく送達のために用いられる。１つのそのような態様において、本発明のタンパク質は、アデノウイルスに関するレセプターを有する細胞を標的とするために、分子に直接又は間接的に連結される。好ましくは、細胞表面レセプターに関するリガンドを有するヘキソン、ペントン、繊維のようなキャプシドタンパク質又はそれらのフラグメントがそのような標的化のために選ばれる。送達のために適した分子は、本明細書に記載される治療用分子及びそれらの遺伝子産物の中から選ばれる。脂質、ポリリシン（ｐｏｌｙＬｙｓ）などを含む多様なリンカーをリンカーとして利用することができる。例えばＭｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ  ＬＫ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  Ｍａｙ；８（１０）：７９５−８０３及びＭｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ  ＬＫ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  Ｄｅｃ；８（２３）：１７５３−１７６１に記載されているやり方に類似のやり方でサルペントン配列を用いる融合タンパク質の作製により、サルペントンタンパク質をそのような目的のために容易に利用することができる。あるいはまた、米国特許出願第２００１００４７０８１号明細書に記載されている通り、ベクターを標的として細胞表面レセプターに向けるために、サルＡｄタンパク質ＩＸのアミノ酸配列を利用することができる。適したリガンドにはＣＤ４０抗原、ＲＧＤ−含有又はポリリシン−含有配列などが含まれる。例えばヘキソンタンパク質及び／又は繊維タンパク質を含むさらに別のサルＡｄタンパク質を、これらの及び類似の目的のために用いることができる。
【００５９】
さらに別のＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７アデノウイルスタンパク質を単独で、又は他のアデノウイルスタンパク質と組み合わせて多様な目的のために用いることができ、目的は当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。さらに、ＳＡｄＶアデノウイルスタンパク質に関するさらに別の使用は、当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。
【００６０】
ＩＩ．組換えアデノウイルスベクター
本明細書に記載される組成物は、治療目的又はワクチン目的のいずれかのために異種分子を細胞に送達するベクターを含む。本明細書で用いられる場合、ベクターには裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、プラスミド又はウイルスを含むが制限ではない遺伝子要素が含まれ得る。そのようなベクターは、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７のサルアデノウイルスＤＮＡ及びミニ遺伝子を含有する。「ミニ遺伝子」又は「発現カセット」により
、選ばれた異種遺伝子ならびに翻訳、転写及び／又は宿主細胞における遺伝子産物の発現の駆動に必要な他の調節要素の組み合わせを意味する。
【００６１】
典型的には、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２−、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０−、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１−又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７−由来アデノウイルスベクターは、選ばれたアデノウイルス遺伝子にとって本来の領域に他のアデノウイルス配列を含有する核酸分子中にミニ遺伝子が置かれるように設計される。必要なら、ミニ遺伝子を現存する遺伝子領域中に挿入し、その領域の機能を崩壊させることができる。あるいはまた、部分的に又は完全に欠失したアデノウイルス遺伝子の部位中にミニ遺伝子を挿入することができる。例えば、選ばれ得る他の中でも機能性Ｅ１欠失又は機能性Ｅ３欠失の部位のような部位中にミニ遺伝子を置くことができる。「機能的に欠失した」又は「機能性欠失」という用語は、例えば突然変異又は改変により遺伝子領域の十分な量が除去されるか又はそうでなければ損傷を受け、遺伝子領域がもはや遺伝子発現の機能性産物を生産できないことを意味する。望ましければ、遺伝子領域全体を除去することができる。遺伝子崩壊又は欠失に関する他の適した部位は、出願中の他所で議論される。
【００６２】
例えば組換えウイルスの作製のために有用な生産ベクター（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）のために、ベクターはミニ遺伝子及びアデノウイルスゲノムの５’末端又はアデノウイルスゲノムの３’末端あるいはアデノウイルスゲノムの５’末端と３’末端の両方を含有することができる。アデノウイルスゲノムの５’末端は、パッケージング及び複製に必要な５’シス−要素；すなわち５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（複製の起点として機能する）及び天然の（ｎａｔｉｖｅ）５’パッケージングエンハンサードメイン（線状Ａｄゲノム及びＥ１プロモーターのためのエンハンサー要素のパッケージングに必要な配列を含有する）を含有する。アデノウイルスゲノムの３’末端は、パッケージング及び包膜に必要な３’シス−要素（ＩＴＲｓを含む）を含む。適切には、組換えアデノウイルスは５’及び３’の両方のアデノウイルスシス−要素を含有し、ミニ遺伝子は５’アデノウイルス配列と３’アデノウイルス配列の間に位置する。ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７に基づくアデノウイルスベクターは、追加のアデノウイルス配列も含有することができる。
【００６３】
適切には、これらのＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７に基づくアデノウイルスベクターは、本発明のアデノウイルスゲノムから誘導される１つもしくはそれより多いアデノウイルス要素を含有する。１つの態様において、ベクターはＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７及び同じアデノウイルス血清型からの追加のアデノウイルス配列からのアデノウイルスＩＴＲｓを含有する。別の態様において、ベクターは、ＩＴＲｓを与える血清型と異なるアデノウイルス血清型から誘導されるアデノウイルス配列を含有する。
【００６４】
本明細書で定義される場合、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）アデノウイルスは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質がＩＴＲｓを与えるアデノウイルスと異なるアデノウイルスからのものであるアデノウイルスを指す。
【００６５】
さらに、当該技術分野における熟練者に既知の方法を用い、本明細書に記載されるアデノウイルスを用いて、キメラ又はハイブリッドアデノウイルスを構築することができる。例えば米国特許第７，２９１，４９８号明細書を参照されたい。
【００６６】
ＩＴＲｓのアデノウイルス源及びベクター中に存在する他のアデノウイルス配列の供給源の選択は、本態様の制限ではない。多様なアデノウイルス株がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａか
ら入手可能であるか、あるいは多様な商業的及び研究的供給源から依頼により入手可能である。さらに、多くのそのような株の配列は、例えばＰｕｂＭｅｄ及びＧｅｎＢａｎｋを含む多様なデータベースから入手可能である。他のサル又はヒトアデノウイルスから調製される相同性アデノウイルスベクターは、公開文献中に記載されている［例えば米国特許第５，２４０，８４６号明細書を参照されたい］。Ａｄ５型［ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ７３３７０］を含む複数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。血清型２、３、４、７、１２及び４０のような、及びさらに現在同定されているヒト型を含むいずれの既知のアデノウイルス型からもアデノウイルス配列を得ることができる。類似して、ヒト以下の動物（例えばサル）に感染することが知られているアデノウイルスを本発明のベクター構築物において用いることもできる。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書を参照されたい。
【００６７】
本明細書に記載されるベクターの構築において用いられるウイルス配列、ヘルパーウイルス（必要なら）及び組換えウイルス粒子ならびに他のベクター成分及び配列は、上記の通りに得られる。本発明のＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７サルアデノウイルスのＤＮＡ配列は、ベクター及びそのようなベクターの作製において有用な細胞系の構築に用いられる。
【００６８】
配列欠失、挿入及び他の突然変異を含む本発明のベクターを形成する核酸配列の改変は、標準的な分子生物学的方法を用いて起こされ得、本態様の範囲内である。
【００６９】
Ａ．「ミニ遺伝子」
導入遺伝子の選択、クローニング及び「ミニ遺伝子」の構築及びそのウイルスベクター中への挿入にために用いられる方法は、本明細書に与えられる説明を得て、当該技術分野における熟練の範囲内である。
【００７０】
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、導入遺伝子にフランキングするベクター配列にとって異種の核酸配列であり、それは問題のポリペプチド、タンパク質又は他の産物をコードする。核酸コード配列は、宿主細胞における導入遺伝子の転写、翻訳及び／又は発現を可能にするやり方で調節要素に操作可能に連結している。
【００７１】
導入遺伝子配列の組成は、得られるベクターが供されるであろう使用に依存するであろう。例えば１つの型の導入遺伝子配列はリポーター配列を含み、それは発現されると検出可能なシグナルを生ずる。そのようなリポーター配列には、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリ性ホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む膜結合タンパク質、インフルエンザ血球凝集素タンパク質ならびにそれに向けられた高親和性抗体が存在するか又は通常の手段により作製され得る当該技術分野において周知の他のものならびに中でも血球凝集素又はＭｙｃからの抗原タグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれるが、制限ではない。これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節要素と連合すると、酵素、ラジオグラフィー、発色（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）、蛍光又は他の分光写真的アッセイ、蛍光活性化細胞分離アッセイならびに酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＺＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む通常の手段により検出可能なシグナルを与える。例えばマーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを保有するベクターの存在はベータ−ガラクトシダーゼ活性に関するアッセイにより検出される。導入遺伝子がＧＦＰ又はルシフェラーゼである場合、シグナルを保有するベクターを、色又はルミノメーターにおける発光により視覚的に測定することができる。
【００７２】
１つの態様において、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素又は触媒ＲＮＡのような生物学及び医学において有用な産物をコードする非−マーカー配列である。望ましいＲＮＡ分子にはｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡｓ及びアンチセンスＲＮＡｓが含まれる。有用なＲＮＡ配列の１つの例は、処置された動物において標的とされる核酸配列の発現を絶やす配列である。
【００７３】
導入遺伝子を、例えば遺伝的欠損（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）の処置のために、ガン治療薬又はワクチンとして、免疫反応の誘導のために、及び／又は予防的ワクチン目的のために用いることができる。本明細書で用いられる場合、免疫反応の誘導は、分子へのＴ細胞及び／又は体液性免疫反応を引き起こすその分子（例えば遺伝子産物）の能力を指す。本発明はさらに、例えばマルチ−サブユニットタンパク質（ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）により引き起こされる状態を修正するか又は改善するための多数の導入遺伝子の使用を含む。ある状況において、タンパク質の各サブユニットをコードするため、あるいは種々のペプチド又はタンパク質をコードするために異なる導入遺伝子を用いることができる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来成長因子又はジストロフィンタンパク質のために望ましい。細胞がマルチ−サブユニットタンパク質を生産するために、細胞を種々のサブユニットのそれぞれを含有する組換えウイルスに感染させる。あるいはまた、タンパク質の種々のサブユニットを同じ導入遺伝子によりコードすることができる。この場合、１つの導入遺伝子がサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを含み、各サブユニットのためのＤＮＡは内部リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）により隔てられている。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡのサイズが小さい場合、例えばサブユニット及びＩＲＥＳをコードするＤＮＡの合計サイズが５キロベースより小さい場合に望ましい。ＩＲＥＳの代わりに、ＤＮＡは２Ａペプチドをコードする配列により隔てられていることができ、それは翻訳後の事象において自己−切断する。例えばＭ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ  １）：１３−２１（Ｊａｎ  １９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４−８７３（Ｊｕｎｅ  ２００１）；Ｋｌｕｍｐ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１−８１７（Ｍａｙ  ２００１）を参照されたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳより有意に小さく、空間が制限因子である場合の使用にそれを十分に適したものとしている。しかしながら、選ばれる導入遺伝子はいずれの生物学的に活性な産物又は他の産物も、例えば研究のために望ましい産物をもコードすることができる。
【００７４】
当該技術分野における熟練者は容易に適した導入遺伝子を選択することができる。導入遺伝子の選択は、本態様の制限であると思われない。
【００７５】
２．調節要素
ミニ遺伝子に関して上記で同定した主要な要素の他に、ベクターは必要な通常の調節要素も含み、それはプラスミドベクターがトランスフェクションされたか、又は本発明により作製されるウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳及び／又は発現を可能にするやり方で導入遺伝子に操作可能に連結している。本明細書で用いられる場合、「操作可能に連結した」配列は、問題の遺伝子と隣接している発現調節配列及びトランスで（ｉｎ
ｔｒａｎｓ）又はある距離で作用して問題の遺伝子を調節する発現調節配列の両方を含む。
【００７６】
発現調節配列は、適した転写開始、終止、プロモーター及びエンハンサー配列；有効なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシング及びウサギベータ−グロブリンｐｏｌｙＡを含むボリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル；細胞質ＲＮＡを安定化する配列；
翻訳有効性を強化する配列（例えばコザック共通配列）；タンパク質安定性を強化する配列；ならびに望ましい場合はコードされる産物の分泌を強化する配列を含む。他の配列の中で、キメライントロンを用いることができる。
【００７７】
天然の、構成的、誘導可能及び／又は組織−特異的であるプロモーターを含む多数の発現調節配列が当該技術分野において既知であり、利用され得る。構成的プロモーターの例には、ＴＢＧプロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを伴うことができる）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを伴うことができる）［例えばＢｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が含まれるが、制限ではない。
【００７８】
誘導可能プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物により、温度のような環境因子により又は特殊な生理学的状態、例えば急性期（ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ）、細胞の特定の分化状態の存在により、あるいは複製中の細胞のみにおいて調節され得る。誘導可能プロモーター及び誘導可能系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＡｒｉａｄを含むが制限ではない多様な商業的供給源から入手可能である。他の多くの系が記載されており、当該技術分野における熟練者が容易に選択することができる。例えば誘導可能プロモーターには、亜鉛−誘導可能ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導可能マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターが含まれる。他の誘導可能系には、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際公開第９８／１００８８号パンフレット］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン−抑制可能系［Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン−誘導可能系［Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３７８：１７６６−１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９８８）も参照されたい］が含まれる。他の系にはＦＫ５０６ダイマー、カストラジオールを使用するＶＰ１６又はｐ６５、ジフェノールムリスレロン、ＲＵ４８６−誘導可能系［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７）］及びパラマイシン−誘導可能系［Ｍａｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１００：２８６５−２８７２（１９９７）］が含まれる。いくつかの誘導可能プロモーターの有効性は、時間を経て向上する。そのような場合、複数のリプレッサーを縦列に挿入することにより、そのような系の有効性を強化することができ、例えばＩＲＥＳによりＴｅｔＲに連結されたＴｅｔＲがそうである。あるいはまた、所望の機能に関するスクリーニングの前に少なくとも３日間待つことができる。この系の有効性を強化することが知られている手段により、所望のタンパク質の発現を強化することができる。例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）の使用。
【００７９】
別の態様において、導入遺伝子のための天然のプロモーターが用いられるであろう。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣するべきであることが望まれる場合に、天然のプロモーターが好ましいかも知れない。導入遺伝子の発現が一時的に又は発生的に（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ）、又は組織−特異的様式で、又は特定の転写刺激に反応して調節されねばならない時に、天然のプロモーターを用いることができる。さらに別の態様において、エンハンサー要素、ボリアデニル化部位又はコザック共通配列のような他の天然の発現調節要素を、天然の発現を模倣するために用いることもできる。
【００８０】
導入遺伝子の他の態様は、組織−特異的プロモーターに操作可能に連結された導入遺伝子を含む。例えば骨格筋における発現が望まれる場合、筋肉において活性なプロモーターが用いられるべきである。これらには骨格β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーターならびに天然に存在するプロモーターより高い活性を有する合成筋肉プロモーターが含まれる（Ｌｉ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５（１９９９））。組織−特異的であるプロモーターの例は、中でも肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）；アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８（１９８８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプター鎖）、ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ
ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１））及びニューロン−特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５））のようなニューロン性に関して既知である。
【００８１】
場合により、治療的に有用な、又は免疫原性である産物をコードする導入遺伝子を保有するベクターは、選択可能なマーカー又はリポーター遺伝子も含むことができ、それには中でもジェネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｉｃｉｎ）又はピューリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列が含まれ得る。そのような選択可能なリポーター又はマーカー遺伝子（好ましくはウイルス粒子中に詰め込まれるべきウイルスゲノムの外側に位置する）を用い、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）耐性のように、バクテリア細胞中のプラスミドの存在を知らせることができる。ベクターの他の成分には、複製の起点が含まれ得る。これらの、及び他のプロモーターならびにベクター要素の選択は慣習的であり、多くのそのような配列が利用可能である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ及びそこで引用されている参照文献を参照されたい］。
【００８２】
これらのベクターは、当該技術分野における熟練者に既知の方法と合わせて本明細書において提供される方法及び配列を用いて作製される。そのような方法には、教科書［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ］中に記載されているもののような通常のｃＤＮＡのクローニング法、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応及び所望のヌクレオチド配列を与える適した方法が含まれる。
【００８３】
ＩＩＩ．ウイルスベクターの作製
１つの態様において、サルアデノウイルスプラスミド（又は他のベクター）を用いてアデノウイルスベクターを作製する。１つの態様において、アデノウイルスベクターは、複製−欠損であるアデノウイルス粒子である。１つの態様において、アデノウイルス粒子はＥ１ａ及び／又はＥ１ｂ遺伝子における欠失により複製−欠損とされる。あるいはまた、アデノウイルスは、場合によりＥ１ａ及び／又はＥ１ｂ遺伝子を保持しながら他の手段によって複製−欠損とされる。類似して、いくつかの態様において、Ｅ２ｂ及び／又はＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子における欠失により、ベクターへの免疫反応を低下させることができる。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムへの他の突然変異、例えば温度−感受性突然変異又は他の遺伝子における欠失を含有することもできる。他の態様において、アデノウイルスベクター中に無損傷のＥ１ａ及び／又はＥ１ｂ領域を保持するのが望ましい。そのような無損傷のＥ１領域はアデノウイルスゲノム中のその天然の位置に位置するか、又は天然のアデノウイルスゲノム中の欠失の部位（例えばＥ３領域中）に置かれることができる。
【００８４】
ヒト（又は他の哺乳類）細胞への遺伝子の送達のための有用なサルアデノウイルスベクターの構築において、ある範囲のアデノウイルス核酸配列をベクター中で用いることができる。例えばアデノウイルス後初期遺伝子（ｄａｌａｙｅｄ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ）Ｅ３の全部又は一部を、組換えウイルスの一部を形成するサルアデノウイルス配列から除外することができる。サルＥ３の機能は、組換えウイルス粒子の機能及び作製と無関係であると思われる。Ｅ４遺伝子の少なくともＯＲＦ６領域、そしてより望ましくはこの領域の機能における重複性の故に、全Ｅ４領域の欠失を有するサルアデノウイルスベクターを構築することもできる。本発明のさらに別のベクターは、遅延初期遺伝子Ｅ２ａにおける欠失を含有する。サルアデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれかにおいて欠失を形成することもできる。類似して、中期遺伝子（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｇｅｎｅｓ）ＩＸ及びＩＶａ2における欠失はいくつかの目的のために有用であり得る。他の構造又は非−構造アデノウイルス遺伝子において、他の欠失を形成することができる。上記で議論された欠失を個別に用いることができ、すなわち本明細書に記載される使用のためのアデノウイルス配列は、１つの領域のみに欠失を含有することができる。あるいはまた、遺伝子全体又はその生物学的活性を破壊するのに有効なその一部の欠失を、いずれかの組み合わせにおいて使用することができる。例えば１つの代表的なベクターにおいて、アデノウイルス配列はＥ１遺伝子とＥ４遺伝子又はＥ１、Ｅ２ａ及びＥ３遺伝子又はＥ１及びＥ３遺伝子又はＥ３遺伝子の欠失を伴うかもしくは伴わないＥ１、Ｅ２ａ及びＥ４遺伝子などの欠失を有することができる。上記で議論した通り、そのような欠失を他の突然変異、例えば温度−感受性突然変異と組み合わせて用い、所望の結果を達成することができる。
【００８５】
必須のアデノウイルス配列（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４  ＯＲＦ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５）を欠いているアデノウイルスベクターを、欠けているウイルスの感染性及びアデノウイルス粒子の増殖に必要なアデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養することができる。これらのヘルパー機能を、１種もしくはそれより多いヘルパー構築物（例えばプラスミド又はウイルス）あるいはパッケージング宿主細胞の存在下でアデノウイルスベクターを培養することにより与えることができる。例えば１９９６年５月９日に公開され、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる国際特許出願国際公開９６／１３５９７号パンフレットにおいて、「最小」ヒトＡｄベクターの作製に関して記載されている方法を参照されたい。
【００８６】
１．ヘルパーウイルス
かくしてミニ遺伝子の保有のために用いられるウイルスベクターのサルアデノウイルス遺伝子の内容に依存して、ミニ遺伝子を含有する感染性組換えウイルス粒子の作製に必要な十分なサルアデノウイルス遺伝子配列を与えるために、ヘルパーアデノウイルス又は非−複製性ウイルスフラグメントが必要であり得る。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物中に存在しない、及び／又はベクターがトランスフェクションされるパッケージング細胞系により発現されない選ばれたアデノウイルス遺伝子配列を含有する。１つの態様において、ヘルパーウイルスは複製−欠損であり、上記の配列に加えて多様なアデノウイルス遺伝子を含有する。そのようなヘルパーウイルスは、望ましくはＥ１−発現細胞系と組み合わされて用いられる。
【００８７】
Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９９：４９（Ａｐｒｉｌ  １，１９９４）に記載されている通り、ヘルパーウイルスをポリ−カチオン共役体中に形成することもできる。ヘルパーウイルスは、場合により第２のリポーターミニ遺伝子を含有することができる。複数のそのようなリポーター遺伝子が当該技術分野に既知である。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子と異なるリポーター遺伝子がヘルパーウイルス上に存在することは、Ａｄベクターとヘルパーウイルスの両方を独立して監視することを可能にする。この第２のリポーターは、精製時に、得られる組換えウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を可能にするために用いられる。
【００８８】
２．補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）細胞系
上記の遺伝子のいずれかにおいて欠失した組換えサルアデノウイルス（Ａｄ）を作製するために、欠失した遺伝子領域の機能を、もしウイルスの複製及び感染性に必須であったら、ヘルパーウイルス又は細胞系、すなわち補完もしくはパッケージング細胞系により組換えウイルスに供給しなければならない。多くの状況において、チンパンジーＡｄベクターをトランス補完する（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）ために、ヒトＥ１を発現する細胞系を用いることができる。本発明のチンパンジーＡｄ配列と現在入手可能なパッケージング細胞中に見出されるヒトＡｄＥ１配列の間の多様性の故に、現在のヒトＥ１−含有細胞の使用は複製及び生成過程の間に複製−能力を有するアデノウイルスの生成を妨げるので、これは特に有利である。しかしながらある状況において、Ｅ１−欠失サルアデノウイルスの作製に用いられ得るＥ１遺伝子産物を発現する細胞系を用いることは望ましいであろう。そのような細胞系は記載されている。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書を参照されたい。
【００８９】
望ましければ、最低でも、選ばれる親細胞系における発現のためのプロモーターの転写調節下でＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７からのアデノウイルスＥ１遺伝子を発現するパッケージング細胞又は細胞系を作製するために、本明細書において提供される配列を利用することができる。誘導可能又は構成的プロモーターをこの目的のために用いることができる。そのようなプロモーターの例は、本明細書中の他所に詳細に記載されている。親細胞は、いずれかの所望のＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７遺伝子を発現する新規な細胞系の作製のために選ばれる。そのような親細胞系は、中でもＨｅＬａ［ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＣＬ  ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＣＬ  １８５］、ＨＥＫ  ２９３、ＫＢ［ＣＣＬ
１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ  ５１０，ＣＣＬ  ７２］及びＷＩ−３８［ＣＣＬ  ７５］細胞であることができるが、制限ではない。これらの細胞系はすべてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９から入手可能である。他の供給源から他の適した親細胞系を得ることができる。
【００９０】
そのようなＥ１−発現細胞系は、組換えサルアデノウイルスＥ１欠失ベクターの作製において有用である。さらに、又は代わりに、１種もしくはそれより多いサルアデノウイルス遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ及び／又はＥ４  ＯＲＦ６を発現する細胞系を、本質的に同じ方法を用いて構築することができ、組換えサルウイルスベクターの作製において用いる。そのような細胞系を、それらの産物をコードする必須の遺伝子において欠失したアデノウイルスベクターをトランス補完するため、あるいはヘルパー−依存性ウイルス（例えばアデノ−関連ウイルス）のパッケージングに必要なヘルパー機能を与えるために用いることができる。宿主細胞の作製は、選ばれたＤＮＡ配列の集成のような方
法を含む。通常の方法を用いてこの集成を行うことができる。そのような方法には、周知であり且つ上記で挙げたＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されているｃＤＮＡ及びゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わされたアデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、合成的方法ならびに所望のヌクレオチド配列を与える他の適した方法が含まれる。
【００９１】
さらに別の代替法において、必須のアデノウイルス遺伝子産物は、アデノウイルスベクター及び／又はヘルパーウイルスによりトランスで与えられる。そのような場合、適した宿主細胞を、原核（例えばバクテリア）細胞ならびに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳類細胞を含む真核細胞を含むいずれの生物からも選ぶことができる。特に望ましい宿主細胞は哺乳類種の中から選ばれ、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＨＥＫ  ２９３細胞もしくはＰＥＲＣ６（それらの両方は機能性アデノウイルスＥ１を発現する）［Ｆａｌｌａｕｘ，ＦＪ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８），Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９：１９０９−１９１７］、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターを含む哺乳類に由来する一次線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞のような細胞を含むが、制限ではない。細胞を与える哺乳類種の選択は本発明の制限ではなく；哺乳類細胞の型の選択、すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞なども本発明の制限ではない。
【００９２】
３．ウイルス粒子の組み立て及び細胞系のトランスフェクション
一般に、ミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する場合、約１ｘ１０4個の細胞〜約１ｘ１０13個の細胞、そして好ましくは約１０5個の細胞に約５μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、そして好ましくは約１０〜約５０μｇのＤＮＡの量でベクターを送達する。しかしながら、選ばれるベクター、送達法及び選ばれる宿主細胞のような因子を考慮して、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対的な量を調整することができる。
【００９３】
ベクターは、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルスなどを含む当該技術分野で既知の、あるいは上記で開示されたいずれのベクターであることもできる。宿主細胞中へのベクターの導入は、トランスフェクション及び感染を含む当該技術分野において既知の、あるいは上記で開示されたいずれの手段によっても行われ得る。１種もしくはそれより多いアデノウイルス遺伝子を、宿主細胞のゲノム中に安定して組み込むか、エピソームとして安定して発現させるか、あるいは過渡的に発現させることかできる。遺伝子産物のすべてが過渡的に、エピソーム上で、発現されるか、又は安定して組み込まれることができるか、あるいは遺伝子産物のいくつかは安定して発現され得るが、他は過渡的に発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子のそれぞれのためのプロモーターを、構成的プロモーター、誘導可能プロモーター又は天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選ぶことができる。例えば生物又は細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態により、又は複製細胞もしくは静止細胞において）あるいは外から加えられる因子により、プロモーターを調節することができる。
【００９４】
宿主細胞中への分子の導入（プラスミド又はウイルスとして）を、熟練者に既知の、且つ明細書を通じて議論される通りの方法を用いて行うこともできる。好ましい態様において、標準的なトランスフェクション法、例えばＣａＰＯ4トランスフェクション又はエレクトロポレーションが用いられる。
【００９５】
選ばれるアデノウイルスのＤＮＡ配列（ならびに導入遺伝子及び他のベクター要素）の、種々の中間プラスミドへの組み立てならびに組換えウイルス粒子の作製のためのプラスミド及びベクターの使用はすべて、通常の方法を用いて行われる。そのような方法には、教科書［上記で挙げたＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ］中に記載されているもののような
通常のｃＤＮＡのクローニング法、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応及び所望のヌクレオチド配列を与える適した方法が含まれる。標準的なトランスフェクション法及びコ−トランスフェクション法、例えばＣａＰＯ4沈降法が用いられる。用いられる他の通常の方法は、ウイルスゲノムの相同的組換え、寒天重層（ａｇａｒ  ｏｖｅｒｌａｙ）におけるウイルスのプラーク形成、シグナル発生の測定の方法などを含む。
【００９６】
例えば所望のミニ遺伝子−含有ウイルスベクターの構築及び集成に続き、ベクターをヘルパーウイルスの存在下でパッケージング細胞系中に試験管内でトランスフェクションする。ヘルパー及びベクター配列の間で相同的組換えが起こり、それはベクター中のアデノウイルス−導入遺伝子配列が複製され、ビリオンキャプシド中に詰め込まれるのを可能にし、組換えウイルスベクター粒子を生ずる。そのようなウイルス粒子の作製のための現在の方法はトランスフェクションに基づく。しかしながら、本発明はそのような方法に制限されない。
【００９７】
得られる組換えサルアデノウイルスは、選ばれる導入遺伝子の選ばれる細胞への導入において有用である。パッケージング細胞系中で生育した組換えウイルスを用いる生体内実験において、本発明のＥ１−欠失組換えサルアデノウイルスベクターは、非−サル細胞、好ましくはヒト細胞への導入遺伝子の導入において有用性を示す。
【００９８】
ＩＶ．組換えアデノウイルスベクターの使用
組換えサルアデノウイルスＡ１３０２（ＳＡｄＶ−Ａ１３０２）、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７に基づくベクターは、ヒト患者又は非−サルの獣医学的患者への試験管内、生体外及び生体内における遺伝子導入のために有用である。
【００９９】
本明細書に記載される組換えアデノウイルスベクターを、異種遺伝子によりコードされる産物の試験管内における生成のための発現ベクターとして用いることができる。例えばＥ１欠失の位置中に挿入された遺伝子を含有する組換えアデノウイルスを、上記のようなＥ１−発現細胞系中にトランスフェクションすることができる。あるいはまた、別の選ばれた細胞系において複製能力のあるアデノウイルスを用いることができる。トランスフェクションされた細胞を、次いで通常の方法で培養し、組換えアデノウイルスがプロモーターから遺伝子産物を発現するのを可能にする。次いで遺伝子産物を、培養物からのタンパク質単離及び回収の既知の通常の方法により培地から回収することができる。
【０１００】
ＳＡｄＶ−Ａ１３０２−、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０−、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１−又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７−由来組換えサルアデノウイルスベクターは、生物が１種もしくはそれより多いＡＡＶ血清型への中和抗体を有する場合でさえ、生体内又は生体外において選ばれた宿主細胞に選ばれた導入遺伝子を送達することができる有効な遺伝子導入ビヒクルを与える。１つの態様において、ｒＡＡＶ及び細胞を生体外で混合し；通常の方法を用いて感染細胞を培養し；そして形質導入された細胞を患者中に再−注入する。これらの組成物は、治療目的のため、及び防御免疫の誘導を含む免疫化のための遺伝子送達に特に十分に適している。
【０１０１】
より普通には、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７組換えアデノウイルスベクターは、下記のような治療用分子又は免疫原性分子の送達に用いられるであろう。両方の用途に関し、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、組換えアデノウイルスベクターの繰り返し送達を含む療法における使用に特に十分に適していることが容易に理解されるであろう。そのような療法は、典型的にはウイルスキャプシドが改変されている一系列のウイルスベクターの送達を含む。連
続的な投与のそれぞれに関して、あるいは特定の血清型のキャプシドのあらかじめ選ばれた回数（１回、２回、３回、４回又はもっと多く）の投与の後に、ウイルスキャプシドを変更することができる。かくして療法は、第１のサルキャプシドを有するｒＡｄの送達、第２のサルキャプシドを有するｒＡｄを用いる送達及び第３のサルキャプシドを用いる送達を含むことができる。単独で、互いに組み合わせて、あるは他のアデノウイルス（好ましくは免疫学的に交差反応性でない）と組み合わせて本発明のＡｄキャプシドを使用する多様な他の療法が、当該技術分野における熟練者に明らかであろう。場合により、そのような療法は他のヒト以下の霊長類のアデノウイルス、ヒトアデノウイルス又は本明細書に記載されるような人工の配列のキャプシドを有するｒＡｄの投与を含むことができる。療法の各段階（ｐｈａｓｅ）は、単一のＡｄキャプシドを用いる一系列の注入（又は他の送達経路）及びそれに続く異なるＡｄ源からの別のキャプシドを用いる一系列の投与を含むことができる。あるいはまた、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターを、他のウイルス系、非−ウイルス送達系、タンパク質、ペプチド及び他の生物学的に活性な分子を含む他の非−アデノウイルス−媒介送達系を含む療法において用いることができる。
【０１０２】
以下の節は、本発明のアデノウイルスベクターを介して送達され得る代表的な分子に焦点を当てる。
【０１０３】
Ａ．治療用分子のＡｄ−媒介送達
１つの態様において、上記の組換えベクターを、公開されている遺伝子治療のための方法に従ってヒトに投与する。選ばれた導入遺伝子を保有するサルアデノウイルスベクターを、好ましくは生物学的に適合性の溶液又は製薬学的に許容され得る送達ビヒクル中に懸濁させて、患者に投与することができる。適したビヒクルには無菌食塩水が含まれる。製薬学的に許容され得る担体であることが既知であり、且つ当該技術分野における熟練者に周知の他の水性及び非−水性等張無菌注入溶液ならびに水性及び非−水性無菌懸濁液をこの目的のために用いることができる。
【０１０４】
標的細胞への分子の送達における使用のための、本明細書に記載されるアデノウイルス又は組換えアデノウイルスも提供する。標的細胞への分子の送達のために有用な薬剤の調製における、本明細書に記載されるアデノウイルス又は組換えアデノウイルスの使用をさらに提供する。
【０１０５】
サルアデノウイルスベクターは、標的細胞を形質導入し、不必要な不利な影響なく、あるいは医学的に許容され得る生理学的影響を以て治療的利益を与えるのに十分なレベルの遺伝子導入及び発現を与えるのに十分な量で投与され、その量は医学的分野における熟練者により決定され得る。通常の、及び製薬学的に許容され得る投与経路には、網膜への直接送達及び他の眼内送達法、肝臓への直接送達、吸入、鼻内、静脈内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸的、経口的及び他の非経口的投与経路が含まれるが、これらに限られない。投与経路を、必要なら組み合わせることができるか、あるいは導入遺伝子もしくは状態に依存して調整することができる。投与経路は、主に処置されている状態の性質に依存するであろう。
【０１０６】
ウイルスベクターの投与量は、主に処置されている状態、患者の年令、体重及び健康のような因子に依存し、かくして患者間で様々であり得る。例えばウイルスベクターの治療的に有効な成人の投与量又は獣医学的投与量は、一般に約１ｘ１０6〜約１ｘ１０15個の粒子、約１ｘ１０11〜１ｘ１０13個の粒子又は約１ｘ１０9〜１ｘ１０12個の粒子の濃度のウイルスを含有する約１００μＬ〜約１００ｍＬの担体の範囲内である。投与量は、動物の大きさ及び投与経路に依存して変動するであろう。例えば筋肉内注入のために適したヒトの又は獣医学的（約８０ｋｇの動物の場合）投与量は、１つの部位に関してｍＬ当た
りに約１ｘ１０9〜約５ｘ１０12個の粒子の範囲内である。場合により、複数の投与部位を送達することができる。別の例において、経口用調製物のために適したヒトの又は獣医学的投与量は、約１ｘ１０11〜約１ｘ１０15個の粒子の範囲内であることができる。当該技術分野における熟練者は、投与経路及び組換えベクターが用いられる治療的又はワクチン的用途に依存してこれらの用量を調整することができる。導入遺伝子の発現のレベルあるいは免疫原の場合には循環する抗体のレベルを監視して、投与量の投与の頻度を決定することができる。投与のタイミング又は頻度の決定のためのさらに別の方法は、当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。
【０１０７】
方法の場合による段階は、ウイルスベクターの投与と同時に、あるいはその前又は後に、適した量の短時間作用性免疫モジュレーターを患者に共−投与することを含む。選ばれる免疫モジュレーターは、本発明の組換えベクターに向けられる中和抗体の形成を妨げることができるか、あるいはベクターの細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）除去を妨げることができる薬剤として本明細書で定義される。免疫モジュレーターは、Ｔヘルパーサブセット（ＴH1又はＴH2）とＢ細胞の間の相互作用を妨害し、中和抗体生成を妨げることができる。あるいはまた、免疫モジュレーターはＴH1細胞とＣＴＬｓの間の相互作用を妨げ、ベクターのＣＴＬ除去の発生を低下させることができる。多様な有用な免疫モジュレーター及びその使用のための投与量は、例えばＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（９）（Ｓｅｐｔ．，１９９６）；１９９６年５月２日に公開された国際特許出願国際公開９６／１２４０６号パンフレット；及び国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３０３５号明細書に開示されており、それらのすべての記載事項は引用することにより本明細書の内容となる。
【０１０８】
１．治療用導入遺伝子
導入遺伝子によりコードされる有用な治療用産物には、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦ、アクチビン、インヒビンを含むトランスフォーミング増殖因子スーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）のいずれか１つ、あるいは骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰｓ１−１５のいずれか、成長因子のヘレグルイン（ｈｅｒｅｇｌｕｉｎ）／ニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３及びＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１つ、ネトリン−１及びネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホグ（ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）ならびにチロシンヒドロキシラーゼを含むがこれらに限られないホルモンならびに成長及び分化因子が含まれる。
【０１０９】
他の有用な導入遺伝子産物には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８を含む）、単球化学誘引性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子及びインターフェロンのようなサイトカインおよびリンホカインならびに幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドを含むが、これらに限られない免疫系を調節するタンパク質が含まれる。免疫系により生成する遺伝子産物
も本発明において有用である。これらには、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、一本鎖Ｔ細胞レセプター、クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣ分子ならびに操作された免疫グロブリン及びＭＨＣ分子が含まれるが、制限ではない。有用な遺伝子産物には、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２及びＣＤ５９のような補体調節タンパク質も含まれる。
【０１１０】
さらに別の有用な遺伝子産物には、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質及び免疫系タンパク質に関するレセプターのいずれか１つが含まれる。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レセプター、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）レセプター及びスカベンジャーレセプターを含むコレステロール調節のためのレセプターを包含する。本発明は、グルココルチコイドレセプター及びエストロゲンレセプターを含むステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーのメンバー、ビタミンＤレセプターならびに他の核レセプターのような遺伝子産物も包含する。さらに、有用な遺伝子産物には、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びミオゲニン、ＥＴＳ−ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ−ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ−結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ−ボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３及びウィングドヘリックスタンパク質（ｗｉｎｇｅｄ  ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のフォークヘッドファミリー（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｆａｍｉｌｙ）のような転写因子が含まれる。
【０１１１】
他の有用な遺伝子産物には、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、シスタチオンベータ−シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（ＣＦＴＲ）配列及びジストロフィンｃＤＮＡ配列が含まれる。
【０１１２】
他の有用な遺伝子産物には、挿入、欠失もしくはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラもしくはハイブリッドポリペプチドのような天然に存在しないポリペプチドが含まれる。例えば一本鎖の操作された免疫グロブリンは、ある種の免疫無防備状態の患者において有用であり得る。他の型の天然に存在しない遺伝子配列には、標的の過剰発現を低下させるのに用いられ得るアンチセンス分子及びリボザイムのような触媒的核酸が含まれる。
【０１１３】
遺伝子の発現の低下及び／又はモジュレーションは、ガン及び乾癬がそうであるような過剰増殖細胞を特徴とする過剰増殖状態の処置に特に望ましい。標的ポリペプチドには、過剰増殖細胞中で独占的に又は正常細胞と比較してより高レベルで生成するポリペプチドが含まれる。標的抗原には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのようなガン遺伝子ならびに転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦによりコードされるポリペプチドが含まれる。標的抗原としてのガン遺伝子産物に加え、抗ガン処置
及び防御的療法の標的ポリペプチドには、いくつかの態様において自己免疫疾患のための標的抗原としても使用されるＢ細胞リンパ腫により作られる抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞レセプターの可変領域が含まれる。モノクローナル抗体１７−１Ａ及び葉酸結合ポリペプチドにより認識されるポリペプチドを含む、腫瘍細胞中でより高レベルで見出されるポリペプチドのような他の腫瘍−関連ポリペプチドを、標的ポリペプチドとして用いることができる。
【０１１４】
他の適した治療用ポリペプチド及びタンパク質には、細胞レセプターを含む自己免疫と関連する標的及び自己に向けられた抗体を生成する細胞に対する広範囲にわたる（ｂｒｏａｄ  ｂａｓｅｄ）防御免疫反応を与えることにより、自己免疫疾患及び障害に苦しむ患者を処置するのに有用であり得るものが含まれる。Ｔ細胞媒介自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの疾患のそれぞれは、内在性抗原に結合し、且つ自己免疫疾患と関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞レセプター（ＴＣＲｓ）を特徴とする。
【０１１５】
本発明のサルアデノウイルスベクターは、導入遺伝子の複数回のアデノウイルス−媒介送達が望ましい治療的療法に、例えば同じ導入遺伝子の再送達を含む療法又は他の導入遺伝子の送達を含む組み合わせ療法において、特に十分に適している。そのような療法は、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７サルアデノウイルスベクターの投与及び続く同じ血清型のアデノウイルスからのベクターを用いる再−投与を含むことができる。特に望ましい療法は、第一の投与で送達されるベクターのアデノウイルスキャプシド配列の供給源がその後の投与の１回もしくはそれより多くで用いられるウイルスベクターのアデノウイルスキャプシド配列の供給源と異なる、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７サルアデノウイルスベクターの投与を含む。例えばある治療的療法は、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターの投与ならびに同じ又は異なる血清型の１種もしくはそれ多いアデノウイルスベクターを用いる繰り返し投与を含む。別の例において、治療的療法は、アデノウイルスベクターの投与及び続く第一に送達されるアデノウイルスベクター中のキャプシドの供給源と異なるキャプシドを有するＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターを用いる繰り返し投与及び場合により、前の投与段階のベクターのアデノウイルスキャプシドの供給源と同じであるかもしくは好ましくは異なる別のベクターを用いるさらなる投与を含む。これらの療法は、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７サル配列を用いて構築されるアデノウイルスベクターの送達に限られない。そうではなくて、これらの療法は、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターと組合せて、他のサルアデノウイルス配列（例えばＰａｎ９もしくはＣ６８、Ｃ１など）、他のヒト以下霊長類アデノウイルス配列又はヒトアデノウイルス配列を含むがこれらに限られない他のアデノウイルス配列を容易に利用することができる。そのようなサル、他のヒト以下霊長類及びヒトアデノウイルス血清型の例は本文書の他所で議論される。さらに、これらの治療的療法は、非−アデノウイルスベクター、非−ウイルスベクター及び／又は多様な他の治療的に有用な化合物もしくは分子と組み合わされたＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７アデノウイルスベクターの同時もしくは逐次的送達を含むことができる。本発明はこれらの治療的療法に制限されず、多様な治療的療法が当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。
【０１１６】
Ｂ．免疫原性導入遺伝子のＡｄ−媒介送達
組換えＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターを、免疫原性組成物として用いることもできる。本明細書で用いられる場合、免疫原性組成物は、哺乳類、そして好ましくは霊長類への送達の後に免疫原性組成物により送達される導入遺伝子産物に対し、体液性（例えば抗体）もしくは細胞性（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）反応が高まる（ｍｏｕｎｔｅｄ）組成物である。組換えサルＡｄは所望の免疫原をコードする遺伝子を、そのアデノウイルス配列欠失のいずれか中に含有することができる。サルアデノウイルスは、ヒト起源のアデノウイルスと比較して、種々の動物種における生の組換えウイルスワクチンとしての使用により良好に適しているようであるが、しかしそのような使用に制限されない。組換えアデノウイルスを、免疫反応の誘導に非常に重要であり、且つ病原体の拡散を制限することが可能な抗原が同定されており、且つｃＤＮＡが利用可能であるいずれの病原体に対する予防的もしくは治療的ワクチンとしても用いることができる。
【０１１７】
そのようなワクチン（もしくは他の免疫原性）組成物は、上記のような適した送達ビヒクル中で調製される。一般に免疫原性組成物に関する用量は、治療用組成物に関して上記で定義された範囲内である。選択された遺伝子の免疫のレベルを監視して追加免疫の必要性（あれば）を決定することができる。血清中の抗体力価の評価に続き、場合による追加免疫免疫化が望ましいかもしれない。
【０１１８】
場合により、本発明のワクチン組成物を、例えばアジュバント、安定剤、ｐＨ調整剤、防腐剤などを含む他の成分を含有するように調製することができる。そのような成分はワクチンの技術分野における熟練者に周知である。適したアジュバントの例には、リポソーム、ミョウバン、モノホスホリル脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄＡ）及びサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンドのようないずれかの生物学的に活性な因子ならびに最適にはそれらの組合せが含まれるが、制限ではない。これらの生物学的に活性な因子のあるものを、例えばプラスミド又はウイルスベクターを介して生体内で発現させることができる。例えばそのようなアジュバントを、抗原をコードするＤＮＡワクチンのみを用いるプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）に際して生ずる免疫反応と比較して抗原−特異的免疫反応を高めるように、抗原をコードするプライミングＤＮＡワクチンと一緒に投与することができる。
【０１１９】
組換えアデノウイルスは「免疫原性量」で、すなわち所望の細胞をトランスフェクションし、且つ免疫反応を誘導するのに十分なレベルの選ばれた遺伝子の発現を与えるために、ある投与経路で有効である組換えアデノウイルスの量で投与される。防御免疫が与えられる場合、組換えアデノウイルスは、感染及び／又は再発性疾患の予防において有用なワクチン組成物であると考えられる。
【０１２０】
あるいはまた、もしくはさらに、本発明のベクターは、選ばれた免疫原に対する免疫反応を誘導するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする導入遺伝子を含有することができる。本明細書に記載される組換えＳＡｄＶベクターは、ベクターにより発現される挿入された異種抗原タンパク質に対する細胞溶解性Ｔ細胞及び抗体の誘導において、高度に有効であると期待される。
【０１２１】
例えば、免疫原を多様なウイルス科から選ぶことができる。それに対する免疫反応が望ましいウイルス科の例には、感冒の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属を含むピコルナウイルス科；ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス及びＡ型肝炎ウイルスのようなヒトエンテロウイルスを含むエンテロウイルス属；ならびに主にヒト以下の動物における口蹄疫の原因であるアフトウイルス属が含まれる。ウイルスのピコルナウイルス科内で、標的抗原にはＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４及びＶＰＧが含まれ
る。別のウイルス科には、流行性胃腸炎の重要な原因病原体（ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）であるノーウォーク群のウイルスを包含するカルシウイルス科が含まれる。ヒト及びヒト以下の動物において免疫反応を誘導するための抗原の標的化における使用に望ましいさらに別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、ならびにベネズエラ、東部及び西部ウマ脳炎を含むアルファウイルス属ならびに風疹ウイルスを包含するルビウイルスを包含するトガウイルス科である。フラビウイルス科には、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎及びダニ媒介脳炎ウイルスが含まれる。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎、あるいは感染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような複数のヒト以下ウイルス及び感冒を引き起こしうるヒト呼吸器コロナウイルスを包含するコロナウイルス科ならびに／あるいは非Ａ、非Ｂもしくは非Ｃ型肝炎から生じ得る。コロナウイルス科内で、標的抗原には、Ｅ１（Ｍもしくはマトリックスタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ２（Ｓもしくはスパイクタンパク質とも呼ばれる）、Ｅ３（ＨＥもしくはヘマグルチン−エルテロース（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ−ｅｌｔｅｒｏｓｅ）とも呼ばれる）糖タンパク質（すべてのコロナウイルスに存在するわけではない）又はＮ（ヌクレオキャプシド）が含まれる。さらに別の抗原を、ベシクロウイルス属（例えば水疱性口内炎ウイルス）及び一般的リッサウイルス（例えば狂犬病）を含むラブドウイルス科に対し標的化することができる。
【０１２２】
ラブドウイルス科内で、適した抗原をＧタンパク質又はＮタンパク質から誘導することができる。マールブルグ及びエボラウイルスのような出血熱ウイルスを包含するフィロウイルス科は、適した抗原の供給源であり得る。パラミクソウイルス科には、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎ウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹及びイヌジステンパーを含むモルビリウイルスならびにＲＳウイルスを含むニューモウイルスが含まれる。インフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科内に分類され、抗原（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）の適した供給源である。ブニヤウイルス科には、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス（リフトバレー熱）、ハンタウイルス（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス（ナイロビ羊病）及び多様な指定されていないブンガウイルスが含まれる。アレナウイルス科はＬＣＭ及びラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルス科には、レオウイルス、ロタウイルス（小児で急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルス及びクルチウイルス（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）属が含まれる。
【０１２３】
レトロウイルス科には、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ、レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス及びスプマウイルスを含む）のようなヒトの疾患及び獣医学的疾患を包含するオンコウイルス（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）亜科を包含する。レンチウイルス内で、多くの適した抗原が記載されており、容易に選択され得る。適したＨＩＶ及びＳＩＶ抗原の例には、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆ及びＲｅｖタンパク質ならびにそれらの種々のフラグメントが含まれるが、制限ではない。例えば、Ｅｎｖタンパク質の適したフラグメントには、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１のようなそのサブユニット又は例えば長さが少なくとも約８個のアミノ酸のもっと小さいそれらのフラグメントのいずれも含まれ得る。類似して、ｔａｔタンパク質のフラグメントを選ぶことができる。［米国特許第５，８９１，９９４号明細書及び米国特許第６，１９３，９８１号明細書を参照されたい。］Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（５）：２４６２−２４６７（Ｍａ
ｒｃｈ  ２００１）及びＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（６  Ａｐｒｉｌ  ２００１）に記載されているＨＩＶ及びＳＩＶタンパク質も参照されたい。別の例において、ＨＩＶ及び／又はＳＩＶ免疫原性タンパク質又はペプチドを用いて、融合タンパク質又は他の免疫原性分子を形成することができる。例えば、２００１年８月２日に公開された国際公開第０１／５４７１９号パンフレット及び１９９９年４月８日に公開された国際公開第９９／１６８８４号パンフレットに記載されているＨＩＶ−１  Ｔａｔ及び／又はＮｅｆ融合タンパク質ならびに免疫化療法を参照されたい。本発明は、本明細書に記述されるＨＩＶ及び／又はＳＩＶ免疫原性タンパク質もしくはペプチドに制限されない。さらに、これらのタンパク質への多様な改変が記載されているか、あるいは当該技術分野における熟練者が容易にそれを成すことができる。例えば米国特許第５，９７２，５９６号明細書に記述されている改変ｇａｇタンパク質を参照されたい。さらに、いかなる所望のＨＩＶ及び／又はＳＩＶ免疫原も単独で、又は組合せて送達することができる。そのような組合せは単一のベクターから、又は複数のベクターからの発現を含むことができる。場合により、別の組合せは、タンパク質の形態における１種もしくはそれより多い免疫原の送達を用いる１種もしくはそれより多い発現された免疫原の送達を含むことができる。そのような組合せを下記においてより詳細に議論する。
【０１２４】
パポバウイルス科には、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵ及びＪＣＵウイルス）ならびにパピローマウイルス亜科（ガン又は乳頭腫の悪性の進行と関連する）が含まれる。アデノウイルス科には、呼吸器疾患及び／又は腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）が含まれる。パルボウイルス科にはネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス及びブタパルボウイルスが含まれる。ヘルペスウイルス科には、シンプレックスウイルス（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）、バリセロウイルス（偽性狂犬病、帯状疱疹）属を含むアルファヘルペスウイルス亜科ならびにサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を含むベータヘルペスウイルス亜科ならびにリンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス及びラジノウイルス属を含むガンマヘルペスウイルス亜科が含まれる。ポックスウイルス科には、オルトポックスウイルス（大疱瘡（天然痘）及びワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス属を包含するコルドポックスウイルス亜科ならびにエントモポックスウイルス亜科が含まれる。ヘパドナウイルス科には、Ｂ型肝炎ウイルスが含まれる。抗原の適する供給源となりうる１種の分類されないウイルスは、デルタ肝炎ウイルスである。さらに別のウイルス源には、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス及びブタ呼吸及び繁殖症候群（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）ウイルスが含まれ得る。アルファウイルス科には、ウマ動脈炎ウイルス及び種々の脳炎ウイルスが含まれる。
【０１２５】
他の病原体に対してヒト又はヒト以下の動物を免疫化するのに有用である免疫原は、例えば、ヒト及びヒト以下の脊椎動物に感染するバクテリア、菌・カビ、寄生性微生物もしくは多細胞寄生動物あるいはガン細胞又は腫瘍細胞からのものを包含する。バクテリア性病原体の例には、肺炎双球菌；ブドウ球菌；及び連鎖球菌を含む病原性グラム−陽性球菌が含まれる。病原性グラム−陰性球菌にはメニンゴコックス（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）；淋菌が含まれる。病原性腸グラム−陰性桿菌には、腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；シュードモナス、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びエイケネラ（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；メリオイドシス（ｍｅｌｉｏｉｄｏｓｉｓ）；サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；シゲラ（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィルス（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセラ（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；Ｈ．ドゥクレイイ（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ（ｂｒｕｃｅｌｌａ）；フラニセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；エルシニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ）；ストレプトバシル
ス・モニリフォルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）及びスピリルム（ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）が含まれ；グラム−陽性桿菌には、リステリア・モノシトゲネス（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；エリジペロスリクス・ルシオパチエ（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（そ径部肉芽腫）；及びバルトネラ症が含まれる。病原性嫌気性バクテリアにより引き起こされる疾患には、破傷風；ボツリヌス中毒；他のクロストリジウム；結核；らい；及び他のマイコバクテリアが含まれる。病原性スピロヘータ疾患には、梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタ及び風土病性梅毒；ならびにレプトスピラ症が含まれる。より病原性の高いバクテリア及び病原性菌・カビにより引き起こされる他の感染には、放線菌症；ノカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症及びコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症及びムコール菌症；スポロトリクス症；パラコクシジオイデス真菌症、ペトリエリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫及びクロモマイコーシス；ならびに皮膚糸状菌症が含まれる。リケッチア感染には、発疹チフス、ロッキー山熱、Ｑ熱及びリケッチア痘が含まれる。マイコプラスマ及びクラミジア感染の例には：マイコプラスマ肺炎；性病性リンパ肉芽腫；オウム病；及び周産期クラミジア感染が含まれる。病原性真核生物には、病原性原生動物及び蠕虫が含まれ、それらにより起こされる感染には：アメーバ症；マラリア；リーシュマニア；トリパノソーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）；トリカンス（Ｔｒｉｃｈａｎｓ）；トキソプラスマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）もしくは吸虫（ｆｌｕｋｅｓ）；及び条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（条虫（ｔａｐｅｗｏｒｍ））感染が含まれる。
【０１２６】
これらの生物及び／又はそれらにより作られる毒素の多くは、生物学的攻撃における使用に関する可能性を有する薬剤として疾病対策センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）［（ＣＤＣ）、米国保健福祉省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）］により同定されている。例えば、これらの生物学的薬剤のいくつかには、現在すべてカテゴリーＡ薬剤として分類されている炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）及びその毒素（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大疱瘡（天然痘）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）ならびにウイルス性出血熱［フィロウイルス（例えばエボラ、マールブルグ）］ならびにアレナウイルス（例えばラッサ（Ｌａｓｓａ）、マチュポ（Ｍａｃｈｕｐｏ））；現在すべてがカテゴリーＢ薬剤として分類されているコクシエラ・ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（メロイドシス（ｍｅｌｏｉｄｏｓｉｓ））、リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）及びその毒素（リシントキシン）、クロスツリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）及びその毒素（イプシロン毒素）、ブドウ球菌種及びそれらの毒素（エンテロトキシンＢ）、クラミジア・プシタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全性に対する脅威（例えばビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｌｅｒａｅ）、クリトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ））、発疹チフス（リケッチア・ポワゼキ（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ  ｐｏｗａｚｅｋｋｉ））ならびにウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）；ならびに現在カテゴリーＣ薬剤として分類されているニパンウイルス（Ｎｉｐａｎ  ｖｉｒｕｓ）及びハン
タウイルス（ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）が含まれる。さらに、そのように分類されるか又は異なって分類される他の生物を、将来そのような目的のために同定及び／又は使用することができる。本明細書に記載されるウイルスベクター及び他の構築物が、これらの生物、ウイルス、それらの毒素又は他の副生成物からの抗原を送達するのに有用であり、その抗原はこれらの生物学的薬剤への感染又はそれらとの他の有害な反応を予防及び／又は処置するであろうことが容易に理解されるであろう。
【０１２７】
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するためのＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターの投与は、ＣＴＬｓを含む免疫反応を引き出し、それらのＴ細胞を除去することが予期される。ＲＡにおいて、疾患に含まれるＴＣＲｓのいくつかの特定の可変領域が特性化されている。これらのＴＣＲｓはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７及びＶα−１７を含む。かくしてこれらのポリペプチドの少なくとも１種をコードする核酸配列の送達は、ＲＡに含まれるＴ細胞を標的とするであろう免疫反応を引き出すであろう。ＭＳにおいて、疾患に含まれるＴＣＲｓのいくつかの特定の可変領域が特性化されている。これらのＴＣＲｓはＶ−７及びＶα−１０を含む。かくしてこれらのポリペプチドの少なくとも１種をコードする核酸配列の送達は、ＭＳに含まれるＴ細胞を標的とするであろう免疫反応を引き出すであろう。強皮症において、疾患に含まれるＴＣＲｓのいくつかの特定の可変領域が特性化されている。これらのＴＣＲｓはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４ならびにＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８及びＶα−１２を含む。かくしてこれらのポリペプチドの少なくとも１種をコードする組換えサルアデノウイルスの送達は、強皮症に含まれるＴ細胞を標的とするであろう免疫反応を引きき出すであろう。
【０１２８】
Ｃ．Ａｄ−媒介送達法
選ばれる遺伝子の治療レベル又は免疫性のレベルを監視して、追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）の必要性（あれば）を決定することができる。血清中のＣＤ８＋  Ｔ細胞反応又は場合により抗体力価の評価に続き、場合による追加免疫免疫化が望ましいかもしれない。場合により、組換えＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターを、一回の投与で、あるいは種々の組合せ療法において、例えば他の活性成分を含む処置の療法もしくは経路と組合せて、あるいはプライム−ブースト療法（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｒｅｇｉｍｅｎ）において送達しうる。多様なそのような療法が当該技術分野で記載されており、且つ容易に選択され得る。
【０１２９】
例えば、プライム−ブースト療法は、タンパク質のような通常の抗原又はそのような抗原をコードする配列を保有する組換えウイルスを用いる第二の追加免疫投与に対して免疫系をプライミングするためのＤＮＡ（例えばプラスミド）に基づくベクターの投与を含むことができる。例えば引用することにより記載事項が本明細書の内容となる２０００年３月２日に公開された国際公開第００／１１１４０号パンフレットを参照されたい。あるいはまた、免疫化療法は、抗原を保有するベクター（ウイルス又はＤＮＡに基づく）又はタンパク質に対する免疫反応を強化（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）するための組換えＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターの投与を含むことができる。さらに別の代替案において、免疫化療法は、タンパク質の投与及び続く抗原をコードするベクターを用いる追加免疫の投与を含む。
【０１３０】
１つの態様において、選ばれた抗原を保有するプラスミドＤＮＡベクターの送達及び続く組換えＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターを用いる強化による、その抗原に対する免疫反応のプライミング及び強化の方法を記載する。１つの態様において、プライム−ブースト療法はプライミング及び／又は強化ビヒクルからのマルチタンパク質（ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発現を含む。例えば、ＨＩＶ及びＳＩＶに対する免疫反応を生じさせるのに有用なタンパ
ク質サブユニットの発現のためのマルチタンパク質療法を記述するＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：６９−７４（６  Ａｐｒｉｌ  ２００１）を参照されたい。例えば、ＤＮＡプライミング（ＤＮＡ  ｐｒｉｍｅ）は、１つの転写物からのＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、ＶＰＸ及びＶｐｒならびにＥｎｖ、Ｔａｔ及びＲｅｖを送達することができる。あるいはまた、ＳＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＨＩＶ−１  Ｅｎｖは、組換えＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７アデノウイルス構築物中で送達される。さらに別の療法は国際公開第９９／１６８８４号パンフレット及び国際公開第０１／５４７１９号パンフレットに記載されている。
【０１３１】
しかしながら、該プライム−ブースト療法はＨＩＶに関する免疫化又はこれらの抗原の送達に制限されない。例えば、プライミングは、第一のＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターを用いる送達を含むことができ、それに第二のＡｄベクターを用いる、又はタンパク質の形態における抗原自身を含有する組成物を用いる強化が続くことができる。１つの例において、プライム−ブースト療法は、抗原が由来するウイルス、バクテリア又は他の生物に対する防御免疫反応を提供することができる。別の態様において、プライム−ブースト療法は、治療が施されている状態の存在の検出のための通常のアッセイを用いて測定され得る治療効果を与える。
【０１３２】
所望の免疫反応が目的とされている抗原に依存する用量依存的やり方で、体内の種々の部位においてプライミング組成物を投与することができる。注入の量又は部位あるいは製薬学的担体は制限ではない。むしろ、療法はプライミング及び／又は強化段階を含むことができ、それらのそれぞれは毎時、毎日、毎週もしくは毎月又は毎年投与される単一用量又は投与量を含むことができる。１つの例として、担体中に約１０μｇ〜約５０μｇのプラスミドを含有する１又は２用量を哺乳類に与えることができる。ＤＮＡ組成物の所望の量は約１μｇ〜約１０，０００μｇのＤＮＡベクターの範囲である。投与量は患者の体重の約１ｋｇ当たり約１μｇ〜１０００μｇのＤＮＡで変動しうる。送達の量又は部位は、望ましくは哺乳類の正体及び状態に基づいて選択される。
【０１３３】
哺乳類への抗原の送達に適したベクターの投与量単位を本明細書に記載する。ベクターを、等張の食塩水；等張塩溶液又はそのような投与における熟練者に明らかな他の調製物のような製薬学的に、又は生理学的に許容され得る担体中に懸濁又は溶解することにより、投与用に調製する。適した担体は当該技術分野における熟練者に明らかであり、且つ大部分において投与経路に依存するであろう。本明細書に記載される組成物を、生物分解性の生物適合性ポリマーを用いる徐放性調製物中で、又はミセル、ゲル及びリポソームを用いるその場での（ｏｎ−ｓｉｔｅ）送達により、上記の経路に従って哺乳類に投与することができる。場合により、プライミング段階は、本明細書に定義されるもののような適した量のアジュバントをプライミング組成物と一緒に投与することも含む。
【０１３４】
好ましくは、強化組成物は、哺乳類患者にプライミング組成物を投与してから約２〜約２７週間後に投与される。強化組成物の投与は、プライミングＤＮＡワクチンにより投与されると同じ抗原を含有するか又は送達することができる強化組成物の有効量を用いて行われる。強化組成物は、同じウイルス源（例えば本発明のアデノウイルス配列）又は別の供給源から誘導される組換えウイルスベクターから構成されていることができる。あるいはまた、「強化組成物」は、プライミングＤＮＡワクチン中でコードされると同じであるが、タンパク質又はペプチドの形態における抗原を含有する組成物であることができ、その組成物は宿主中で免疫反応を誘導する。別の態様において、強化組成物は、哺乳類細胞中でのその発現を指示する調節配列の調節下で抗原をコードするＤＮＡ配列、例えば周知のバクテリアもしくはウイルスベクターのようなベクターを含有する。強化組成物の主要件は、組成物の抗原がプライミング組成物によりコードされるものと同じ抗原又は交差反
応性抗原であることである。
【０１３５】
別の態様において、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターは、多様な他の免疫化及び治療的療法における使用にも十分に適している。そのような療法は、異なる血清型キャプシドのＡｄベクターと同時もしくは逐次的なＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターの送達、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターを非−Ａｄベクターと同時もしくは逐次的に送達する療法、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターをタンパク質、ペプチド及び／又は他の生物学的に有用な治療もしくは免疫原性化合物と同時もしくは逐次的に送達する療法を含むことができる。そのような用途は当該技術分野における熟練者に容易に明らかになるであろう。
【０１３６】
さらに別の態様において、本発明は、患者にアデノウイルスＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシドを送達することにより、免疫調節効果反応（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘導するため、あるいは他の活性薬剤への細胞障害性Ｔ細胞反応を強化するか又は助けるための、これらのウイルスのキャプシドの使用（場合により無損傷の又は組換えウイルス粒子あるいは中空キャプシドが用いられる）を提供する。ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシドを単独で、あるいは活性薬剤への免疫反応を強化するためのそれとの組み合わせ療法において、送達することができる。有利なことに、宿主を亜群Ｅアデノウイルスに感染させることなく、所望の効果を達成することができる。他の側面において、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシドを患者に送達することを含んでなる、インターフェロンアルファの生成が必要な患者においてそれを誘導する方法を提供する。さらに別の側面において、培養物において１種もしくはそれより多いサイトカイン（例えばＩＦＮ−α）／ケモカインを生成させる方法を提供する。この方法は、樹状細胞及び本明細書に記載されるＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシドを含有する培養物を、中でもアルファインターフェロンを含むサイトカイン／ケモカインの生成に適した条件下でインキュベーションすることを含む。
【０１３７】
そのようにして生成するサイトカインは多様な用途において有用である。例えばＩＦＮαの場合、本明細書に記載される生成は特に望ましく、それは、バクテリア中で作られるＩＦＮαの１つもしくは２つのサブタイプしか含有しない商業的に入手可能な組換え的に作製されるＩＦＮαを超える利点をそれが与えるであろうと思われるからである。対照的に、方法は天然のヒトＩＦＮαの多数のサブタイプを生ずることが予想され、それはより広い作用範囲を生むことが期待される。各サブタイプは特定の生物学的活性を用いると思われる。さらに、本明細書で提供される方法により作製される天然のインターフェロンは、天然に作られる患者のインターフェロンと免疫学的に区別され得ず、それにより、通常組換え的に作製されるインターフェロンに対する中和抗体の形成により引き起こされる患者の免疫系による薬剤の拒絶の危険が低下すると予想される。
【０１３８】
亜群Ｅアデノウイルスにより作製される他のサイトカインには、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、マクロファージ炎症タンパク質（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１アルファ（ＭＩＰ−１α）、ＲＡＮＴＥＳ及び腫瘍壊死因子アルファが含まれる。培養物からのこれらのサイトカイン／ケモカインの精製法ならびにこれらのサイトカイン／ケモカインの治療的又はアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）使用は、文献に記載されている。さらに、本発明に従って作製されるサイトカイン／ケモカインの精製のために、商業的に入手可能なカラム又はキットを用いることができる。本発明を用いて作製されるサイトカイン／ケモカインを、多様な適応症における使用のために調製することができる。
【０１３９】
例えば本明細書で記載されるサイトカインには、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、ＩＰ−１０（インターフェロンガンマ誘導性タンパク質）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びＩＬ−８が含まれる。ＩＦＮαは、インフルエンザ、肝炎（例えばＢ型及びＣ型肝炎を含む）ならびに多様な新生物、例えば腎臓（腎細胞ガン）、黒色種、悪性腫瘍、多発性骨髄腫、カルチノイド、リンパ腫及び白血病（例えば慢性骨髄性白血病及びヘアリーセル白血病）の処置において有用であることが記載されている。本明細書に記載される通りに作製されるＩＦＮαサブタイプの混合物を、既知の方法を用いて精製することができる。例えばモノクローナル抗体及びカラム精製の使用を記載する国際公開第２００６／０８５０９２パンフレットを参照されたい。他の方法は文献に記載されている。本明細書に記載される通りに作製されるＩＦＮαを、既知の方法を用いて精製することができる。例えば米国特許第４，６８０，２６０号明細書、米国特許第４，７３２，６８３号明細書及びＧ．Ａｌｌｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，２０７：３９７−４０８（１９８２）を参照されたい。ＴＦＮαは、例えば乾癬及び慢性関節リウマチを含む自己免疫疾患における処置に有用であることが記載されている。ＩＰ−１０、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質は脈管形成の有力な阻害剤として用いられ得、且つ有力な胸腺−依存性抗−腫瘍効果を有する。
【０１４０】
樹状細胞及びＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシドを含有する培養物を、サイトカインの生成に適した条件下でインキュベーションすることによりＩＦＮαを作製する方法を提供する。１つの態様において、健康なドナー（好ましくはヒト）から血液を採取し、既知の方法を用いて末梢血白血球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製する。１つの態様において、ＰＢＬを本発明の方法に従うサイトカイン−生成細胞として用いる。別の態様において、ＰＢＭＣをサイトカイン−生成細胞として用いる。別の態様において、既知の方法を用いて、例えば商業的に入手可能なキット、Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）による「ヒト形質細胞様樹状細胞単離キット（ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）」を用いて、ＰＢＬ又はＰＢＭＣから形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）を単離する。選ばれた細胞を、適した培地及びアデノウイルス亜群Ｅキャプシドタンパク質を有する懸濁液中で培養する。適した培地は、当該技術分野における熟練者により容易に決定され得る。しかしながら１つの態様において、培地はＲＰＭＩ−１６４０培地である。あるいはまた、他の培地を容易に選ぶことができる。適した容器、例えばマイクロタイターウェル、フラスコ又はもっと大きな容器中で細胞を培養することができる。１つの態様において、細胞の濃度は培地のｍＬ当たりに約百万個の細胞である。しかしながら、他の適した細胞濃度が当該技術分野における熟練者により容易に決定され得る。本発明は、プライマーとしてのインターフェロンの使用を必要としない。しかしながら、望ましければ、細胞成長を刺激するために、培地は適したサイトカイン、ＩＬ−３を含むことができる。１つの適した濃度は約２０ｎｇ／ｍＬである。しかしながら、他の濃度を用いることができる。１つの態様において、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシドタンパク質を、細胞を含有する培養物中に導入する。本明細書に記載されるいずれの形態（例えば中空キャプシド粒子を含むウイルス粒子、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシドを有するウイルスベクターなど）においても、アデノウイルスキャプシドタンパク質を培養物に送達することができる。典型的には、キャプシドタンパク質は適した担体、例えば培地、食塩水などの中に懸濁されるであろう。適切には、細胞当たりに約１００〜１００，０００個のアデノウ
イルス亜群Ｅ粒子の量で、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシドを培養物に加える。次いで混合物を、例えば約２８℃〜約４０℃の範囲内、約３５℃〜約３７℃の範囲内あるいは約３７℃においてインキュベーションする。典型的には、約１２〜９６時間又は約４８時間後に、細胞を遠心沈殿させ、上澄み液を集める。適切には、細胞ライシスを避ける条件下でこれを行い、それにより上澄み液中の細胞破片の存在を減らすか又は排除する。遠心分離は、細胞からのサイトカインの分離を可能にし、それにより雑に単離されたサイトカインを与える。アデノウイルス及びアデノウイルスキャプシドなどからのサイトカインのさらなる精製のために、サイジングカラム（ｓｉｚｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎｓ）ならびに他の既知のカラム及び方法が利用可能である。そのように精製されるこれらのサイトカインは、多様な用途における調製及び使用のために利用可能である。
【０１４１】
１つの態様において、中空ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７粒子（すなわちアデノウイルス又は導入遺伝子産物を発現するＤＮＡが詰め込まれていないアデノウイルスキャプシド）を細胞に送達することができる。別の態様において、非−感染性野生型ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７粒子あるいはＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７キャプシド（粒子）中に詰め込まれた組換えアデノウイルスベクターを用いることができる。そのようなウイルス粒子を不活化するための適した方法は当該技術分野において既知であり、例えばＵＶ照射（それはゲノムＤＮＡを有効に架橋して発現を妨げる）が含まれ得るが、制限ではない。
【０１４２】
以下の実施例は、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７のクローニング及び代表的な組換えＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ベクターの構築を記載している。これらの実施例は単に例示的であり、本発明の範囲を制限しない。
【実施例１】
【０１４３】
サルアデノウイルスの単離
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｕｉｓｉａｎａ  Ｎｅｗ  Ｉｂｅｒｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，４４０１  Ｗ．Ａｄｍｉｒａｌ  Ｄｏｙｌｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｎｅｗ  Ｉｂｅｒｉａ，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ，ＵＳＡにおいて、チンパンジーコロニーから糞便試料を得た。糞便懸濁液から濾過された上澄み液をヒト細胞系Ａ５４９の培養物中に接種した。培養物中で約１〜２週間の後、いくつかの接種材料を有する細胞培養物において、可視の細胞変性効果（ＣＰＥ）が明らかであった。この方法によって単離されたウイルスを、塩化セシウム勾配バンディング（ｃｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｂａｎｄｉｎｇ）の標準的なアデノウイルス精製法を用い、Ａ５４９細胞を用いて大規模調製に拡大した。精製されたアデノウイルスからのＤＮＡを単離し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにより完全に配列決定した。完全なゲノム配列の分析は、単離されたウイルスが以前に報告されたことがない新規な配列を有することを示した。
【０１４４】
ウイルスＤＮＡ配列の系統発生分析に基づき、サルアデノウイルスＡ１３０２（ＳＡｄＶ−Ａ１３０２）、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７と称されるアデノウイルスが、亜群（種）Ｅと同じ亜群内にあることが決定された。ウイルス拡大に関する平均収率は以下の通りであった：Ａ１３０２（１．４５ｘ１０13）、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０（１．３５ｘ１０13）、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１（５．６２ｘ１０13）及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７（６．５４ｘ１０13）。
【実施例２】
【０１４５】
ベクター構築
一般的に記載されている通りに、ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７（亜群Ｅ）を用いるＥ１欠失ベクターを作製することができる。
【０１４６】
ＳｗａＩがフランキングするＳｍａＩ、ＣｌａＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＶ部位を含有するリンカーを、ＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩを用いて切断されたｐＢＲ３２２中にクローニングする。ＸｂａＩを用いてウイルスＤＮＡを消化し、６ｋｂのフラグメント（左及び右末端）をゲル精製し（ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）、ＳｍａＩ及びＸｂａＩを用いて消化されたｐＳＲ５中に連結する。ＳｍａＩを用いて１２個のミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ）を診断し、予測されるフラグメントのサイズに関して評価する。ミニプレップを配列決定して、ウイルスＤＮＡ末端の一体性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を検査する。得られる配列を用いて左末端Ｑｉａｇｅｎ配列を修正し、同様に正しい右ＩＴＲ配列を推定する。
【０１４７】
ＳｎａＢＩ＋ＮｄｅＩを用いてプラスミドを消化し、ＮｄｅＩ部位をクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で満たす（ｆｉｌｌｅｄ  ｉｎ）。ｐＢｌｅｕＳＫ  Ｉ−ＰＩからのＥｃｏＲＶフラグメントを連結して入れる。あるいはまた、ＳｎａＢＩ及びＮｄｅＩによりプラスミドを消化し、ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩに関する認識部位を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを欠失したＥ１コード領域の代わりに連結する。ＰｓｔＩを用いてミニプレップを診断する。得られるプラスミドを、ＸｂａＩ＋ＥｃｏＲＶを用いて消化する。ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７からの右末端（ＸｂａＩ消化）フラグメントを連結して入れる。ＡｐａＬＩを用いてミニプレップを診断する。得られるプラスミドを、次いでＸｂａＩ＋ＥｃｏＲＶを用いて消化する。ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１又はＳＡｄＶ−Ａ１３３７ＤＮＡからのフラグメントを連結して入れ、ＭｆｅＩを用いてミニプレップを診断する。次いでリン酸カルシウム又はリポフェクタミン法を用い、製造者の案に従って２９３細胞をトランスフェクションする。
【実施例３】
【０１４８】
交差−中和抗体（ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の評価
Ａ．野生型ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７を、直接免疫蛍光法により監視される感染阻害中和抗体アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｓｓａｙ）を用いて、ヒトアデノウイルス５（亜種Ｃ）及びチンパンジーアデノウイルス７（ＳＡｄＶ−２４）ならびにヒトプールＩｇＧ（ｈｕｍａｎ  ｐｏｏｌｅｄ  ＩｇＧ）と比較して交差−中和活性に関して評価する。ヒトプールＩｇＧ［ＨｕプールＩｇＧ］は商業的に購入され、普遍的ヒト集団がさらされている複数の抗原に対する抗体をそれが含有しているので、免疫無防備状態の患者における投与に関して承認されている。ヒトプールＩｇＧに関するサルアデノウイルスに対する中和抗体の存在又は不在は、普遍的集団におけるこれらのアデノウイルスへの抗体の普及の反映である。
【０１４９】
アッセイは以下の通りに行われる。あらかじめＨＡｄＶ−５又はＳＡｄＶ−２４を注入されたウサギから得た血清試料を５６℃において３５分間、加熱不活化する。野生型アデノウイルス（ウェル当たり１０8個の粒子）を、血清を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で希釈し、ＤＭＥＭ中の熱−不活化血清試料の２−倍連続希釈液と一緒に、３７℃において１時間インキュベーションする。続いて、血清−アデノウイルス混合物を、１０５単層Ａ５４９細胞（１０５  ｍｏｎｏｌｙｅｒ  Ａ５４９  ｃｅ
ｌｌｓ）を有するウェル中のスライドに加える。１時間後、各ウェル中の細胞に１００μｌの２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）−ＤＭＥＭを補完し、５％ＣＯ2中で３７℃において２２時間培養する。次に、ＰＢＳを用いて細胞を２回濯ぎ、パラホルムアルデヒド中における固定（４％，３０分間）及び０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ中における浸透性化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（４℃，２０分間）の後に、ＤＡＰＩならびにＨＡｄＶ−５に対して産生された（ｒａｉｓｅｄ）、ＦＩＴＣ標識され、広く交差反応性のヒツジ抗体（Ｖｉｒｏｓｔａｔ）を用いて染色する。顕微鏡下でＦＩＴＣ陽性細胞の数を数えることにより、感染のレベルを決定する。天然の（ｎａｉｖｅ）血清標準と比較してアデノウイルス感染を５０％かもしくはそれより多く阻害する最高血清希釈としてＮＡＢ力価を報告する。＜１／２０の力価値が示される場合、中和抗体濃度は検出限界、すなわち１／２０より低い。
【０１５０】
Ｂ．野生型ＳＡｄＶ−Ａ１３０２、ＳＡｄＶ−Ａ１３２０、ＳＡｄＶ−Ａ１３３１及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７を、ヒトアデノウイルス５（ＨＡｄＶ−５；亜種Ｃ）と比較して交差−中和活性に関して評価した。結果を下記の表３に示す。ＨＡｄＶ−５に関する約４０％に対し、ヒト試料（ｎ＝２０）の集団の約１５％より少ない数が、同定されるアデノウイルスに関して２００より大きい中和抗体力価（Ｎａｂ力価）を有した。
【０１５１】
【表３】
0006293738.tif 000006
【実施例４】
【０１５２】
分子クローン構築
Ａ．ＳＡｄＶ−Ａ１３０２
ＳｎａＢＩ＋Ｎｄｅを用いてｐＳＲ７プラスミド（配列番号：２０２）を消化することにより、Ｅ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３０２クローンを作製し、末端をＣＩＰで処理し、野生型ＳＡｄＶ−Ａ１３０２配列（配列番号：１）をＮｄｅＩで消化して、プラスミド中への導入のための〜３０２１ｂｐの左末端（Ｓｔａｒｔ−ＮｄｅＩ）フラグメントを作製する。得られるプラスミド（ｐＳ２４０−１３０２）をＳｎａＢＩ＋Ｎｄｅで消化し、末端にクレノウを満たし、ＣＩＰで処理する。ｐＢｌｅｕＳＫ  Ｉ−ＰＩプラスミド（配列番号：２０３−Ｉ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩのための部位を宿している）をＳｍａＩ及びポリメラーゼＩを有するＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プラスミドｐＳ２４１−Ａ１３０２を作製する。ｐＳ２４１−Ａ１３０２を、次いでＰａｃ／ｅｘｏｎｕｃ−ｉｎａｃｔ／Ｎｄｅ／ＣＩＰで処理し、野生型ＳＡｄＶ−Ａ１３０２配列（配列番号：１）の〜７０７１ｂｐの右末端（Ｎｄｅ−末端）フラグメントをその中にクローニングして、ｐＳ２４２＿Ａ１３０２プラスミドを生ずる。ｐＳ２４２＿Ａ１３０２プラスミドを、次いでＮｄｅＩで消化し、ＣＩＰで末端を処理し、野生型ＳＡｄＶ−Ａ１３０２配列（配列番号：１）の〜
２６ｋｂｐのフラグメントをその中にクローニングして、ｐＳ２４３−Ａ１３０２プラスミドを生ずる。
【０１５３】
次いで適した導入遺伝子発現カセットをｐＳ２４３−Ａ１３０２中に導入する。導入遺伝子は、例えばｐＢｌｅｕＳＫ  Ｉ−ＰＩプラスミドフラグメントのＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩ部位を介するｅＧＦＰ、インフルエンザＡ核タンパク質又はＨＩＶ−ｇａｇ（例えばｐＳｈ−ＨＩＶ−ｓｈｏｒｔ−ｇａｇ（配列番号：１９８）から）のようなリポーターであることができる。ＨＩＶ  ｇａｇ  ｓｈｏｒｔ配列を、ｐ２３１１（配列番号：３９１）又はｐ０６２１（配列番号：３９４）らのメガヌクレアーゼカセットから、そのＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩ部位を介して得ることもできる。本明細書に記載される、及び当該技術分野において既知の、本実施例及び当該技術分野における熟練と矛盾しない追加の導入遺伝子を用いることができ、それらは本明細書により意図されている。
【０１５４】
提案されるＨＩＶ−ｇａｇ導入遺伝子を含有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３０２クローンを配列番号：１０４において同定する。
【０１５５】
Ｂ．ＳＡｄＶ−Ａ１３２０
Ｅ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３２０クローン（配列番号：２０６）、ｐ２８７０を以下の通りに作製し、すべての段階は標準的な分子生物学的方法を用いて行われた。野生型Ａ１３２０配列（配列番号：２５）の５’（左末端）、５’ＩＴＲからＮｈｅＩ部位までをシャトルプラスミドｐＳＲ７（配列番号：２０２）中にＳｍａ／ＮｈｅＩ部位において挿入した。配列番号：２５のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＶフラグメント（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ  １９ｋ及びＥ１ｂの〜７５％に関するコード配列）をメガヌクレアーゼクローニングカセット（ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＶ制限部位）で置き換えた。次いで野生型Ａ１３２０配列（配列番号：２５）の３’（右末端）、ＮｈｅＩ部位から３’ＩＴＲまでをシャトルプラスミド中に挿入した（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの置き換え）。アデノウイルスゲノム（配列番号：２５）の残る中間部分（ＮｈｅＩ／ＮｈｅＩ）を、次いでＮｈｅＩ部位を介してシャトルプラスミドに加えた。
【０１５６】
ＨＩＶ  ｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）配列を有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３２０クローンも作製した（配列番号：２４６；ｐ２８７６）。Ｅ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３２０クローン（配列番号：２０６）、ｐ２８７０をＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩで消化し、除去されたフラグメントをｐ０６２１（配列番号：３９４）からのメガヌクレアーゼカセットと、そのＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩ部位を介して置き換えた。
【０１５７】
Ｃ．ＳＡｄＶ−Ａ１３３１
ｐＳＲ５プラスミド（配列番号：２０１）をＳｍａＩ＋ＳｐｅＩで消化することによりＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３３１クローンを作製し、末端をＣＩＰで処理し、野生型ＳＡｄＶ−Ａ１３３１配列（配列番号：５０）をＳｐｅＩで消化していくつかのフラグメントを作製する。〜１０，６２９ｂｐのフラグメントをプラスミド中に導入する。得られるプラスミド（ｐＳ２３０−１３３１）をＢｓｉＷＩ＋ＮｄｅＩ又はＳｎａＢＩ＋ＮｄｅＩで消化し、ＳｎａＩＢ（ＢｓｉＷＩ）＋ＮｄｅＩ部位を介して、ＩＣｅｕＰＩＳｃｅＩメガヌクレアーゼカセット（配列番号：２０５）をその中にクローニングする。得られるプラスミド（ｐＳ２３１−１３３１）を次いでＥｃｏＲＶ＋ＳｐｅＩで消化し、ＳｐｅＩで消化された野生型ＳＡｄＶ−Ａ１３３１配列（配列番号：５０）の〜１３０１ｂｐのフラグメントをその中にクローニングし、ｐＳ２３２−Ａ１３３１プラスミドを生ずる。ｐＳ２３２−Ａ１３３１を次いでＳｐｅＩで消化し、ＣＩＰで処理し、ＳｐｅＩで消化された野生型ＳＡｄＶ−Ａ１３３１配列（配列番号：５０）の〜２４，７１８ｂｐのフラグメントをその中にクローニングし、ｐＳ２３３−Ａ１３３１プラスミドを生ずる。
【０１５８】
次いで適した導入遺伝子発現カセットをｐＳ２３３−Ａ１３３１プラスミド中に導入する。導入遺伝子は、メガヌクレアーゼカセットのＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩ部位を介するｅＧＦＰ、インフルエンザＡ核タンパク質又はＨＩＶ−ｇａｇ（例えばｐＳｈ−ＨＩＶ−ｓｈｏｒｔ−ｇａｇ（配列番号：１９８）から）のようなリポーターであることができる。ＨＩＶ  ｇａｇ  ｓｈｏｒｔ配列を、ｐ２３１１（配列番号：３９１）又はｐ０６２１（配列番号：３９４）らのメガヌクレアーゼカセットから、そのＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩ部位を介して得ることもできる。本明細書に記載される、及び当該技術分野において既知の、本実施例及び当該技術分野における熟練と矛盾しない追加の導入遺伝子を用いることができ、それらは本明細書により意図されている。
【０１５９】
提案されるＨＩＶ−ｇａｇ導入遺伝子を含有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３３１クローンを配列番号：１５１において同定する。
【０１６０】
Ｄ．ＳＡｄＶ−Ａ１３３７
Ｅ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３３７クローン（配列番号：２８７）、ｐ２８７５を以下の通りに作製し、すべての段階は標準的な分子生物学的方法を用いて行われた。野生型Ａ１３３７配列（配列番号：７７）の５’（左末端）、５’ＩＴＲからＮｈｅＩ部位までをシャトルプラスミドｐＳＲ７（配列番号：２０２）中にＳｎａＢＩ／ＮｄｅＩ部位において挿入した。配列番号：７７のＳｎａＢＩ／ＳｍａＩフラグメント（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ  １９ｋ及びＥ１ｂの〜５０％に関するコード配列）をメガヌクレアーゼクローニングカセット（ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＶ制限部位）で置き換え、ＰＩ−ＳｃｅＩ／ＮｄｅＩフラグメントをＰＩ−ＳｃｅＩ／ＮｄｅＩリンカーで置き換えて、さらにＥ１ｂから４００ｂｐを欠失させた。次いで野生型Ａ１３３７配列（配列番号：７７）の３’（右末端）、ＮｄｅＩ部位から３’ＩＴＲまでをシャトルプラスミド中に挿入した（ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントの置き換え）。アデノウイルスゲノム（配列番号：７７）の残る中間部分（ＮｄｅＩ／ＮｄｅＩ）を、次いでＮｄｅＩ部位を介してシャトルプラスミドに加えた。
【０１６１】
ＨＩＶ  ｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）配列を有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３３７クローンも作製した（配列番号：３３６；ｐ２８７８）。Ｅ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３３７クローン（配列番号：２８７）、ｐ２８７５をＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩで消化し、除去されたフラグメントをｐ０６２１（配列番号：３９４）からのメガヌクレアーゼカセットと、そのＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩ部位を介して置き換えた。
【実施例５】
【０１６２】
ベクター発現及び初期特性化
ＨＩＶ  ｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）配列を有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３２０クローン（配列番号２４６；ｐ２８７６）及びＨＩＶ  ｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）配列を有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３３７クローン（配列番号：３３６；ｐ２８７８）を、実施例４，Ｂ及びＤに記載した通りに作製した。通常の方法に従ってクローンをレスキューし、ベクターを増殖した（ｅｘｐａｎｄｅｄ）。保護時の特性化は、両方のベクターが細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すことを明らかにした。Ａ１３２０及びＡ１３３７ベクターに関し、それぞれｍＬ当たりに５．２６ｘ１０12個及び５．５５ｘ１０12個の粒子の力価が得られた。両方のベクターは、内毒素の生成なく作製された。
【実施例６】
【０１６３】
ベクター特性化−感染力価比
Ａ．方法
Ｔａｑｍａｎ  ＴＣＩＤ５０TMアッセイを用い、各ベクターに関して感染力価比を決定する。感度、再現性及び一巡時間を向上させるために、アデノウイルスベクターに関する感染力アッセイを開発し、プラークアッセイのような標準的な方法の代わりとして用いた
。Ｔａｑｍａｎ  ＴＣＩＤ５０TMアッセイは、ベクターの限界希釈及び陽性ウェルの感受性で定量的な合図（ｃａｌｌｉｎｇ）のためにリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ
ＰＣＲ）を用いるウイルスＤＮＡ複製の５０％終点決定に基づく。要するに、ベクターを連続希釈し（１０−倍希釈）、９６−ウェルプレートフォーマットにおいて２９３細胞に感染させるのに用いる（希釈当たりに８個の複製ウェル）。３日間のインキュベーション期間の後、複製されたＤＮＡを抽出し、導入遺伝子発現カセットに特異的なリアルタイムＰＣＲプライマー−プローブセット（例えばｐｏｌｙＡ）を用いて定量する。Ｋａｒｂｅｒｓ式に基づく基本的なコンピュータープログラムにより、５０％終点決定を行う。アッセイの有効性確認（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）は、力価（ＩＵ／ｍｌ）及び粒子対感染力（Ｐ：Ｉ）比の優れた再現性を示した（データは示されていない）。Ｐ：Ｉ比を試料（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の感染力の尺度として用い、低いＰ：Ｉ比はより感染性のベクター試料を示す。アッセイは一貫してＰ：Ｉ比を繰り返し（ｒｅｔｕｒｎｓ）、それらはプラークアッセイを用いて、あるいは細胞変性効果（ＣＰＥ）の観察に基づくＴＣＩＤ５０アッセイを用いて達成されるものよりずっと低い。Ｔａｑｍａｎ  ＴＣＩＤ５０由来のＰ：Ｉ比は、ベクターサブタイプ内のロット間の一貫性の尺度として最も有用である。
【０１６４】
Ｂ．結果
上記Ａの方法に従って、ＨＩＶ  ｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）配列を有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３２０クローン（配列番号２４６；ｐ２８７６）を調べた。８６１７の感染力価比が見出された。
【０１６５】
上記Ａの方法に従って、ＨＩＶ  ｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）配列を有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３３７クローン（配列番号：３３６；ｐ２８７８）を調べた。２７８の感染力価比が見出された。
【実施例７】
【０１６６】
Ｔ−細胞誘導
ＨＩＶ  ｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）配列を有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３２０クローン（配列番号２４６；ｐ２８７６）及びＨＩＶ  ｇａｇ（ｓｈｏｒｔ）配列を有するＥ１欠失ＳＡｄＶ−Ａ１３３７クローン（配列番号：３３６；ｐ２８７８）を、実施例４，Ｂ及びＤに記載した通りに作製した。通常の方法に従ってクローンを保護し、ベクターを拡大した。引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＲｏｙ，  ｅｔ  ａｌ．［“Ｐａｒｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈ５Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：６８４５−６８５１（Ａｕｇｕｓｔ  ６，２００７）］に含有される案を用い、得られる組換えアデノウイルスウイルスによるＴ細胞誘導を評価することができる。
【０１６７】
各ベクターの１ｘ１０10個の粒子を、ＨＩＶ−１−ｇａｇ−ｓｈｏｒｔ導入遺伝子を保有する標準ベクターとしてのＨＡｄＶ５と一緒に、ＢＡＬＢｃマウス中に筋肉内に注入する。ベクター投与から後の７又は８及び１４日に動物を犠牲にする。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＨＩＶ−１  ｇａｇ−ｓｈｏｒｔへのＴ細胞反応を分析する。Ｔ細胞反応は検出可能であり、７又は８日から１４日まで向上する。
【実施例８】
【０１６８】
サイトカイン誘導
酵素結合イムノソルベントアッセイ、インターフェロン−γ  酵素結合イムノスポットアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｓｓａｙ）及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）を含むＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００
７  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；８１（２１）：１１８４０−１１８４９（Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｅｌｉｃｉｔ  Ａｂｅｒｒａｎｔ  ＣＤ８+  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ）及びＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００８  Ｊｕｌｙ；１９（７）：６６３−６６９（Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ−Ｂａｓｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）の方法に従って、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターへのサイトカイン反応の特性化を行う。
【０１６９】
特性化は、ベクター投与に続くアデノウイルスサイトカインプロファイルを反映することが期待される。
【０１７０】
Ｂ．ＳＡｄＶ−Ａ１３２０（図１中で「ＳＡｄＶ１３２０」）及びＳＡｄＶ−Ａ１３３７（図１中で「ＳＡｄＶ１３３７」）ベクターの１ｘ１０10個の粒子を、ＨａｄＶ５、ＳＡｄＶ３６、ＳＡｄＶ１２９５、ＳＡｄＶ１３０９及びＳＡｄＶ１３２１ベクターと一緒に、ＢＡＬＢマウス中に筋肉内注入し、８日及び１４日にＨＩＶ−１  ｇａｇ−ｓｈｏｒｔへのＴ細胞反応をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。免疫優性ＨＩＶ  ｇａｇ  ｓｈｏｒｔ  ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号：４１０）を用いてＴ細胞反応を分析した。このペプチドはＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により合成され、２ｍｇ／ｍｌにおいてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解された。すべての実験においてペプチドは２μｇ／ｍｌの濃度で用いられ、ＤＭＳＯ濃度はすべての最終的なアッセイ混合物において０．１％（ｖ／ｖ）より低く保たれた。ベクター当たり及び時点当たりに（ｐｅｒ  ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔ）３個のＢＡＬＢ／ｃマウスに、対応するベクターを注入した。８日及び１４日におけるＴ細胞データの概要を図１に示す。
【０１７１】
上記で引用したすべての文書、配列表ならびに２０１２年５月１８日に申請された米国暫定特許出願第６１／６４９，００７号明細書及び２０１３年３月１４日に申請された米国暫定特許出願第６１／７８４，１４２号明細書の記載事項全体は、引用することにより本明細書の内容となる。多数の修正及び変動が上記で同定された明細書の範囲内に含まれ、当該技術分野における熟練者に明らかであると思われる。そのような組成物及び方法への修正及び改変、例えば異なるミニ遺伝子の選択あるいはベクター又は免疫モジュレーターの選択もしくは投与量は、本明細書に付随する請求項の範囲内であると思われる。
【０１７２】
【表４−１】
0006293738.tif 000007
【０１７３】
【表４−２】
0006293738.tif 000008
【０１７４】
【表４−３】
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【０１７５】
【表４−４】
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【０１７６】
【表４−５】
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【０１７７】
【表４−６】
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【０１７８】
【表４−７】
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【０１７９】
【表４−８】
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【０１８０】
【表４−９】
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【０１８１】
【表４−１０】
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【０１８２】
【表４−１１】
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【０１８３】
【表４−１２】
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【０１８４】
【表４−１３】
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【図１】
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【配列表】
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