(57)【要約】  本発明は、陽イオン交換クロマトグラフィーに基づいたＦｃ含有タンパク質の精製のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ含有タンパク質を液体から分離および精製する方法であって、以下のステップ：
ａ．陽イオン交換樹脂に前記Ｆｃ含有タンパク質を結合させ；
ｂ．前記Ｆｃ含有タンパク質の等電点より約１ｐＨ単位低く、そして約２〜６ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する緩衝液を用いて、前記陽イオン交換樹脂を洗浄し；および
ｃ．塩勾配を増加させながら、前記Ｆｃ含有タンパク質の前記等電点より約１ｐＨ単位低い緩衝液を用いて、前記Ｆｃ含有タンパク質を溶出すること
を含む、少なくとも１つの陽イオン交換クロマトグラフィー精製ステップを含む、前記方法。
【請求項２】
陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーから選択されるさらなる精製ステップへ、前記陽イオン交換クロマトグラフィーステップの前記溶出液を供することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーでの、２つのさらなる精製ステップをいずれかの順で含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーの素通り画分が回収される、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）における前記Ｆｃ含有タンパク質の結合が、ｐＨ５未満で行なわれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）における前記陽イオン交換樹脂への結合に先立って、前記Ｆｃ含有タンパク質が、約ｐＨ７．０において、４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率になるように水で希釈される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）における前記洗浄が、ｐＨが約７〜約８．５において、約２〜６ｍＳ／ｃｍの伝導率で行なわれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）における前記洗浄が、約ｐＨ８において、約３．５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有するリン酸緩衝液を用いて行なわれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）において、塩勾配の増加が浅い勾配である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）において、約７〜約８．５のｐＨにおいて、約２〜約１５ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導率で、塩勾配を増加させながら、前記Ｆｃ含有タンパク質が前記陽イオン交換樹脂から溶出される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）において、ステップ（ｃ）における前記Ｆｃ含有タンパク質が、約７〜約ｐＨ８．５の範囲のｐＨにおいて、約０〜約１５０ｍＭの範囲でＮａＣｌ勾配を増加させながら、前記陽イオン交換樹脂から溶出される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）において、溶出ピークの後部の切り取りが行なわれる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）における前記陽イオン交換樹脂が、強陽イオン交換樹脂である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記強陽イオン交換樹脂が、フラクトゲル  ＥＭＤ  ＳＥ  ハイキャップ（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ）（Ｍ）樹脂である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）が、約ｐＨ４で、および約１５ｍＳ／ｃｍの伝導率で、ならびに充填された陽イオン交換樹脂の１リットルあたり約４０〜４７ｇのＦｃ含有タンパク質の動的容量で、前記陽イオン交換樹脂を装填することを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）から得られる前記陽イオン交換樹脂の前記溶出液が、１０，０００ｐｐｍ未満または５，０００ｐｐｍ未満のＨＣＰレベルを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）から得られる前記陽イオン交換樹脂の前記溶出液が、１％未満の凝集体レベルを有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）から得られる前記陽イオン交換樹脂の前記溶出液が、１ｍｃｇのＦｃ含有タンパク質を装填するときに、非還元条件および銀染色下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出することのできない不完全Ｆｃ含有タンパク質のレベルを有する、請求項１〜１７記載の方法。
【請求項１９】
前記不完全Ｆｃ含有タンパク質断片が、遊離の抗体重鎖および／または軽鎖を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｆｃ含有液体が浄化採取物である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、約７．５〜約９．５の間の等電点を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
一またはそれ以上の限外濾過のステップをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記精製Ｆｃ含有タンパク質を医薬組成物へ製剤化することをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記定常領域がヒト定常領域である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫グロブリンがＩｇＧ1である、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
前記定常領域がＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、免疫グロブリン可変領域をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｆｃ含有タンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２５、ＩＦＮ−ガンマ、ＥｐＣＡＭ、ＴＡＣＩ−Ｒからなる群から選択される抗原と特異的に結合する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、配列番号１で示される前記アミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域、および配列番号２で示される前記アミノ酸配列を含むヒトカッパ軽鎖可変領域、またはその保存的配列改変体、を有する抗ＣＤ−２５抗体である、請求項記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、（ｉ）配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４のＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号５のＶＨ  ＣＤＲ３ならびに配列番号６のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７のＶＬ  ＣＤＲ２および配列番号８のＶＬ  ＣＤＲ３；または（ii）（ｉ）で定義された前記配列のいずれか一つの保存配列の改変体、を含む抗ＣＤ−２５抗体である、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
液体からＦｃ含有タンパク質を捕獲するための陽イオン交換クロマトグラフィーの使用であって、前記陽イオン交換樹脂への前記Ｆｃ含有タンパク質の結合の後、前記樹脂が前記Ｆｃ含有タンパク質の等電点よりも約１ｐＨ単位低い緩衝液を用いて洗浄される、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、タンパク質精製の分野にある。より具体的には、それはＦｃ含有タンパク質の精製に関する。当該方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製ステップを少なくとも含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質は、通常「生物製剤」と呼ばれる薬剤として商業的に重要となった。最も重要な挑戦の一つが、工業規模でのタンパク質精製のための、対費用効果が高く、そして効率的な方法の開発である。タンパク質の工業規模での製造のための多くの方法が現在利用可能である一方、細胞培養上清のような粗生成物は、所望の産物のみならず不純物も含み、そしてそれは、所望の産物から分離することが困難である。細胞が無血清培地中で増殖されるならば、組み換えタンパク質産物を発現する細胞の細胞培養上清は、あまり不純物を含まないかもしれないが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、精製工程において依然として除去されていないままである。さらに、保健機関はヒトへの投与を目的としたタンパク質の高水準の純度を要求する。
【０００３】
タンパク質精製のために広く使用されている、多くのクロマトグラフ系が知られている。
【０００４】
イオン交換クロマトグラフィー系は、電荷の違いに基づいて、タンパク質の分離のために主として使用される。
【０００５】
陰イオン交換体は、弱性または強性のいずれかとして分類され得る。弱陰イオン交換体上の電荷を帯びた置換基は弱塩基であり、そしてそれは脱プロトン化され、したがってその電荷を高いｐＨで失う。ＤＥＡＥ−セファロースは、弱陰イオン交換体の例であり、そしてそこで、アミノ基はｐＨが約９未満においてプラスに荷電しており、そしてより高いｐＨ値において、しだいにその電荷を失う。例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはジエチル−（２−ヒドロキシ−プロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）は対イオンとして塩素を有する。一方、強陰イオン交換体は、強塩基を含み、そしてそれはイオン交換クロマトグラフィーにおいて通常使用されるｐＨの範囲（ｐＨ１〜１４）においてプラスに荷電されたままである。Ｑ−セファロース（Ｑは四級アンモニウムを表す）は、強陰イオン交換体の例である。
【０００６】
陽イオン交換体も同様に、弱性または強性のいずれかに分類され得る。強陽イオン交換体は、ｐＨ１〜１４において荷電されたままである（スルホプロピル基のような）強酸を含み、一方、弱陽イオン交換体は（カルボキシメチル基のような）弱酸を含み、そしてそれはｐＨを４または５未満に落とした時にその電荷を失う。例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）およびスルホプロピル（ＳＰ）は対イオンとしてナトリウムを有する。
【０００７】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、タンパク質の疎水性基とマトリクス上に存在する不溶性の固定化された疎水性基との間の疎水性相互作用に基づいて、タンパク質を分離するために使用される。通常、高塩濃度緩衝液中のタンパク質調製物が、ＨＩＣカラム上に装填される。緩衝液中の塩は、溶液中のタンパク質の溶媒和を減らすために水分子と相互作用し、それにより、その後マトリクス上の疎水性基によって吸着される、タンパク質中の疎水性領域を曝露する。当該分子が疎水性であればあるほど、結合を促進するために塩があまり必要とされない。通常、塩勾配の減少は、カラムからタンパク質を溶出させるために使用される。イオン強度が減少するために、タンパク質の親水性領域の曝露が増加し、そしてタンパク質は、疎水性の増加する順にカラムから溶出される。
【０００８】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）は、低いｐＨ値においてイオン化するヘテロ環リガンドのｐＨ依存的挙動に基づいた、クロマトグラフィーの別の様式である。このカラムの様式に基づく吸着は疎水性相互作用によって起こるが、イオン化されたリガンドと結合タンパク質（例えば、バイオセプラ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）製の吸着剤ＭＥＰ  ハイパーセル）との間の電荷反発力を引き起こすためにｐＨを下げることによって、脱着は促進される。
【０００９】
タンパク質を精製するさらなる方法は、関心のあるタンパク質とカラム樹脂に固定化された別のタンパク質との親和性に基づく。当該固定化されたリガンドの例は、細菌性細胞膜タンパク質であるプロテインＡおよびプロテインＧであり、そしてそれらは特定の免疫グロブリンのＦｃ部位と特異性を有する。プロテインＡおよびプロテインＧのいずれも、ＩｇＧ抗体と強い親和性を有するが、それらは他の免疫グロブリンクラスおよびアイソタイプに対しても変動親和性を有する。
【００１０】
プロテインＡを固定化したアフィニティクロマトグラフィーによって、一ステップのみで、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ウィルス、抗体の不完全形態のような不純物の９９．５％以上を除去することができる。しかし、この精製技術の主要な欠点は、樹脂の費用である。イオン交換性樹脂よりも約３０倍高価であり、そして大量精製のために使用される原料の全経費の約３５％に相当し得る。プロテインＡ樹脂はまた、潜在的に免疫原性であるプロテインＡ残留物が溶出液中で見られ、したがって除去される必要があるという、幾つかの安定性の問題を示す。水酸化ナトリウムのような一般的な浄化溶液によってリガンドが容易に変性するため、プロテインＡ樹脂はまた浄化するのが困難であり、そしてこのことは、樹脂の再利用に悪影響が生じる可能性のある汚染事象の発生における主要な問題を示す。
【００１１】
コンビナトリアルケミストリーは、プロテインＡの作用を模倣することのできる幅広い種類のリガンド、例えばプロテインＡの疎水性コア構造におけるＰｈｅ−１３２、Ｔｙｒ−１３３ジペプチド結合領域を模倣するトリアジン誘導体（プロメティック（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ）社によって、マブゾーベント（ＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ）Ａ１Ｐ、Ａ２ＰおよびＡ３Ｐとして市販されている）の合成を可能とした。
【００１２】
抗体を精製するさらなる方法は、ラクダ科の重鎖抗体断片を使用することによって開発されたアフィニティリガンドを使用する（バイオアフィニティカンパニー（Ｂｉｏ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からのキャプチャーセレクト（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）（登録商標）製品）。
【００１３】
抗体精製の分野において、ＦｏｌｌｍａｎとＦａｈｒｎｅｒ（２００４）は、プロテインＡクロマトグラフィーを組み込んだ方法を用いてなされた同じ宿主細胞タンパク質の除去が、アフィニティクロマトグラフィーステップを経ない方法を使用することでなされ得ることを見出した。彼らは、従来のプロテインＡ法に匹敵する水準までＣＨＯＰ（チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質）を除去する、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、３つの非親和性精製方法を見出した（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．２００４．Ｊａｎ  ２３；１０２４（１−２）：７９−８５）；国際公開第０３／１０２１３２Ａ２号）。彼らはまた、非アフィニティクロマトグラフィーと高性能タンジェンシャルフローろ過（ＨＰＴＦＦ）との組み合わせに関するタンパク質精製のための手法を開示している。陽イオン交換クロマトグラフィーにおける第一精製（捕獲）ステップの後、当該宿主細胞タンパク質の量は、約１４，０００ｐｐｍであった。
【００１４】
抗体または免疫グロブリン（Ｉｇ）は、ジスルフィド結合によって互いに結合された軽鎖および重鎖からなる。それぞれの鎖のアミノ末端に位置する第一のドメインは、アミノ酸配列が可変であり、そしてそれは、非常に広範囲の抗体結合特異性を提供する。これらのドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）として知られている。それぞれの鎖のその他のドメインは、アミノ酸配列が不変であり、そしてそれは重鎖定常領域（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）として知られている。
【００１５】
抗体の主要クラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり；そしてこれらのクラスは、サブクラス（アイソタイプ）へさらに分けられてもよい。例えば、ＩｇＧクラスは、４つのサブクラス、すなわちＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、およびＩｇＧ4を有する。
【００１６】
抗体クラス間の違いは、定常ドメイン１〜４（ＣＨ１〜ＣＨ４）を含む、重鎖定常領域の違いに由来し、そしてそれは免疫グロブリンクラスに依存する。いわゆるヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置している。ヒンジ領域は、タンパク質切断に特に敏感であり；当該タンパク質分解は、正確な切断部位に依存する、２または３個の断片をもたらす。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域部分はまた、場合により、ヒンジ領域と一緒になって、免疫グロブリンの「Ｆｃ」部と呼ばれる。したがって抗体は、Ｆｃ含有タンパク質である。
【００１７】
治療用タンパク質として使用される、幾つかの抗体が知られている。市販の組み換え抗体の例は、例えば：アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、イブリツモマブ、ベバシズマブまたはオマリズマブである。
【００１８】
Ｆｃ含有タンパク質の別の形態は、いわゆるＦｃ融合タンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、高頻度で免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である免疫グロブリンのＦｃ領域と融合した、抗体のＦａｂ領域または受容体の結合領域のような、タンパク質のエフェクター領域からなるキメラタンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質は、それらが、Ｆｃ領域によって付与される以下のような利点を提供するため、治療薬として広く使用されている：
−  ＩｇＧのアイソタイプに従って変化する親和性を用いた、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用した精製の可能性。ヒトＩｇＧ1、ＩｇＧ2、およびＩｇＧ4は、プロテインＡと強く結合し、そしてＩｇＧ3を含む全てのヒトＩｇＧは、プロテインＧと強く結合する；
−  Ｆｃ領域が、リソソーム分解から守るサルベージ受容体ＦｃＲｎと結合するため、循環系における増加した半減期；
−  Ｆｃ融合タンパク質の医学的用途に応じて、Ｆｃエフェクター機能は好ましいだろう。そのようなエフェクター機能は、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を通じた抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、および補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）と結合することによる補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を含む。
【００１９】
血清中半減期およびエフェクター機能は、Ｆｃ融合タンパク質を対象とした治療的用途に応じて、Ｆｃ領域をＦｃＲｎ、ＦｃγＲおよびＣ１ｑそれぞれへの結合を増加させるか、または減少させるように操作することにより調節され得る。
【００２０】
ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージのような、免疫エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）と結合し、標的細胞の貪食または溶解を引き起こす。
【００２１】
ＣＤＣにおいて、抗体は、補体カスケードを誘発することによって、標的細胞を破壊する。ＩｇＧアイソフォームは、ＩｇＧ4＜ＩｇＧ2＜ＩｇＧ1＝ＩｇＧ3の順で増加する、異なるレベルのエフェクター機能を発揮する。ヒトＩｇＧ1は、高いＡＤＣＣおよびＣＤＣを示し、そして、病原菌および癌細胞に対する治療的用途に最も好適である。
【００２２】
特定の状況下において、例えば標的細胞の減少が好ましくない時、エフェクター機能の抑制が必要とされる。反対に、腫瘍に対する使用を対象とした抗体の場合において、エフェクター機能の増加はそれらの治療活性を改善するかもしれない（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００２３】
エフェクター機能の修飾は、したがって、ＦｃγＲもしくは補体因子の結合を改善または減少させるＦｃ領域を操作することにより達成され得る。
【００２４】
活性ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIａ、ＦｃγＲIII ａ、およびＦｃγＲIII ｂ）ならびに抑制性ＦｃγＲ（ＦｃγＲIIｂ）、または補体第一成分（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合は、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。ＣＨ２ドメインの二つの領域は、ＦｃγＲおよび補体Ｃ１ｑの結合において重要であり、そしてＩｇＧ2およびＩｇＧ4において特有な配列を有する。例えば、２３３〜２３６番目の位置にあるＩｇＧ2残基のヒトＩｇＧ1への置換は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを大幅に減少させた（Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９およびＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００２５】
多くの変異がＩｇＧのＣＨ２ドメイン中になされ、そしてＡＤＣＣおよびＣＤＣに対するそれらの効果がインビトロで試験された（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，  Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１および２０００，Ｓｔｅｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。特に、Ｅ３３３におけるアラニンの変異は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を増加させることが報告された（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１および２０００）。
【００２６】
治療抗体の血清中半減期の増加は、その有効性を増加させる別の方法であり、そしてそれにより、より高い血中濃度、より少ない頻度の投与および投与用量低下を可能とする。これは、新生児のＦｃＲ（ＦｃＲｎ）へのＦｃ領域の結合を高めることによって達成され得る。内皮細胞表面上に発現しているＦｃＲｎは、ｐＨ依存的にＩｇＧと結合し、そしてそれを分解から守る。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の接触面に位置する幾つかの変異は、ＩｇＧ1の半減期を増加させることを示した（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４およびＶａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【００２７】
以下の表１は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の幾つかの既知の変異を要約したものである（インビボジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）のウェブサイトから取られた）。
【００２８】
【表１】
2010516651.tif 000002
【００２９】
Ｆｃ含有タンパク質、特に抗体およびＦｃ融合タンパク質の治療的有用性を前提として、ヒトへの投与のために十分な、相当量の高度に精製されたタンパク質が必要とされている。効率的な精製方法は、Ｆｃ含有タンパク質の大規模精製において好適である。
【発明の概要】
【００３０】
発明の概要
本発明は、Ｆｃ含有タンパク質の精製のための陽イオン交換クロマトグラフィーステップの開発に基づく。
【００３１】
したがって、第一の実施形態において、本発明は、Ｆｃ含有タンパク質を液体から分離および精製する方法であって、以下のステップ：
ａ．陽イオン交換樹脂に前記Ｆｃ含有タンパク質を結合させ；
ｂ．前記Ｆｃ含有タンパク質の等電点より約１ｐＨ単位低く、そして約２〜６ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する緩衝液を用いて、前記陽イオン交換樹脂を洗浄し；および
ｃ．塩勾配を増加させながら、前記Ｆｃ含有タンパク質の前記等電点より約１ｐＨ単位低い緩衝液を用いて、前記Ｆｃ含有タンパク質を溶出すること
を含む、陽イオン交換クロマトグラフィーを少なくとも含む、前記方法に関する。
【００３２】
本発明の方法に従って、陽イオン交換クロマトグラフィーステップの溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーから選択される、一またはそれ以上のさらなる精製ステップに供され得る。
【００３３】
この方法は、好ましくは、抗体およびＦｃ融合タンパク質から選択されるＦｃ含有タンパク質の精製のために使用される。
【００３４】
驚くべきことに、陽イオン交換クロマトグラフィーステップの溶出液中におけるＨＣＰレベルは１０，０００ｐｐｍ未満または５，０００ｐｐｍ未満であり、そして凝集体レベルは１％未満に減少することが示された。
【００３５】
洗浄ステップ（ｂ）によって、例えば遊離の重鎖または軽鎖からなる不完全抗体断片のような、不完全Ｆｃ含有タンパク質断片を除去できることがさらに示された。したがって、本発明の第二の実施形態は、溶液、好ましくは浄化細胞培養上清から、Ｆｃ含有タンパク質を捕獲させるための陽イオン交換クロマトグラフィーの使用であって、陽イオン交換樹脂へのＦｃ含有タンパク質の結合の後に、当該樹脂がＦｃ含有タンパク質の等電点より約１ｐＨ単位低い緩衝液を用いて洗浄される、前記使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、実施例１に記載された陽イオン交換クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィーのプロファイルを示す。１−装填、２−洗浄、３−ＮａＣｌ勾配中で溶出、４−再生／衛生化、５−再平衡化。ｐＨ５での溶出：０〜１ＭのＮａＣｌ勾配、ｐＨ６：０〜０．８ＭのＮａＣｌ勾配、ｐＨ７：０〜０．６ＭのＮａＣｌ勾配、ｐＨ８：０〜０．４５ＭのＮａＣｌ勾配。
【図２】図２は、実施例２に記載されている陽イオン交換クロマトグラフィー捕獲ステップ中において製造された異なる画分の、非還元性の、銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：分子量マーカー；レーン２：標準物質、抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ；レーン３：抗体、抗ＣＤ２５採取物；レーン４：抗体、ｐＨ４に調節された抗ＣＤ２５採取物；レーン５：素通り画分；レーン６：洗浄；レーン７：溶出ピーク；レーン８：溶出ピーク後部。
【図３】図３は、実施例２に記載されている陽イオン交換クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィーのプロファイルを示す。（ａ）伝導率（ｍＳ／ｃｍ）、（ｂ）２８０ｎｍにおけるＯＤ、（ｃ）緩衝液Ｂ１（％）。１−装填、２−洗浄、３−溶出、４−再生、５−衛生化、６−再平衡化。
【図４】図４は、実施例３および４に記載された３ステップの精製工程のステップ２および３における、非還元の、銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１−分子量マーカー；レーン２−標準物質、抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ；レーン３−ＡＥＸ  素通り画分（ステップ２、工程１）；レーン４−ＨＩＣ溶出液（ステップ３、工程１由来のバルク）；レーン５−ＨＩＣ溶出液（ステップ２、工程２）；レーン６−ＡＥＸ素通り画分（ステップ３、工程２由来のバルク）。
【図５】図５は、ラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）９０による電気泳動図を示す。点線：工程１由来のバルク。実線：工程２由来のバルク。Ａ：軽鎖（約２５ｋＤａ）、Ｂ：重鎖（約５０ｋＤａ）、Ｃ：抗ＣＤ２５  ｒｈＡｂ。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、液体またはＦｃ含有タンパク質の組成物中に存在するかもしれない不完全Ｆｃ含有タンパク質断片、凝集体および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のような不純物の量または程度を著しく減少させることができる、陽イオン交換クロマトグラフィーステップに基づく、精製方法の開発に基づく。
【００３８】
本発明はしたがって、Ｆｃ含有タンパク質を液体から分離および精製する方法であって、以下のステップ：
ａ．陽イオン交換樹脂に前記Ｆｃ含有タンパク質を結合させ；
ｂ．前記Ｆｃ含有タンパク質の等電点より約１ｐＨ単位低く、そして約２〜６ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する緩衝液を用いて、前記陽イオン交換樹脂を洗浄し；および
ｃ．塩勾配を増加させながら、前記Ｆｃ含有タンパク質の前記等電点より約１ｐＨ単位低い緩衝液を用いて、前記Ｆｃ含有タンパク質を溶出すること
を含む、陽イオン交換クロマトグラフィーを少なくとも含む、前記方法に関する。
【００３９】
この精製ステップは、本明細書において陽イオン交換クロマトグラフィーステップ（ＣＥＸ）と呼ばれるだろう。
【００４０】
Ｆｃ含有タンパク質を含む液体は、ヒトまたは動物由来の体液のような任意の組成物または調製物でも、あるいは細胞培養上清または細胞培養採取物のような細胞培養由来の液体でもよい。好ましくは、それは浄化細胞培養採取物である。それはまた、例えば捕獲ステップ由来の溶出液または素通り画分のような別の精製ステップ由来の液体でも、あるいは陽イオン交換クロマトグラフィーステップに先立つ、他の好適な精製ステップ由来の液体であってもよい。
【００４１】
本発明に従って、Ｆｃ含有タンパク質を含む液体は、最初に陽イオン交換クロマトグラフィーに供される。当該液体は、好ましくは、細胞培養物質、例えば可溶化された細胞、より好ましくは細胞培養上清であってもよい。本明細書において使用されている用語「細胞培養上清」とは、細胞が培養され、そしてタンパク質が分泌されている、好適な細胞シグナルいわゆるシグナルペプチドを含む培地のことである。Ｆｃ含有タンパク質を発現している細胞は、無血清培養条件下において培養されていることが好ましい。したがって好ましくは、当該細胞培養上清は動物血清由来成分を欠いている。最も好ましくは、当該細胞培養培地は既知組成培地である。
【００４２】
好ましくは、本発明に従って精製されたタンパク質は、例えば抗体のようなＦｃ含有タンパク質であって、より好ましくはヒト定常領域を含む、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であって、好ましくはＩｇＧ１抗体であって、それはまた、好ましくはＦｃ融合タンパク質である。Ｆｃ含有タンパク質は、高頻度で免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である、免疫グロブリンのＦｃ領域と融合した、例えば抗体のＦａｂ領域または受容体の結合領域のようなタンパク質のエフェクター領域からなるキメラタンパク質である。
【００４３】
本発明の方法に従った陽イオン交換クロマトグラフィーは、一またはそれ以上の追加的なステップを有する精製方法において使用されてもよい。当該追加的なステップは、陽イオン交換クロマトグラフィーステップの前または後に行なわれてもよい。好ましくは、それらは、陽イオン交換クロマトグラフィーステップの後に行なわれる。より好ましくは、それらは、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）から選択される。
【００４４】
したがって、好ましい実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用した精製ステップの溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーから選択される、さらなる精製ステップに供される。
【００４５】
さらに二つの精製好ましい実施形態において、本発明に従った方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーステップに加えて、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いたステップをいずれかの順番で含む。
【００４６】
陰イオン交換クロマトグラフィーの素通り画分は、好ましくは回収される。したがって、本発明の方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーステップを含んでもよい。必要であれば、一またはそれ以上のさらなる精製ステップが、本発明の方法の前または後に行なわれてもよい。
【００４７】
陽イオン交換クロマトグラフィー上にＦｃ含有タンパク質を含む液体を装填する前に、当該液体は、５未満のｐＨに好ましくは約４のｐＨに調節されるか、または別法として約ｐＨ７で約４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率となるように水を用いて希釈されるかの、好ましくはいずれかである。これは、陽イオン交換樹脂とＦｃ含有タンパク質が結合するために不可欠である。
【００４８】
５未満のｐＨとは、例えば、約５．０、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１または約２．０であってもよい。
【００４９】
４ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率とは、例えば、４．０、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０または１．９ｍＳ／ｃｍであり得る。それは、好ましくは約２．８ｍＳ／ｃｍである。
【００５０】
約４へのｐＨの調節は、それが、濃酢酸の添加により、装填量を著しく増加させることなく容易に行なわれるので好ましい。さらに、陽イオン交換樹脂としてフラクトゲルＳＥハイキャップ（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ）（充填された樹脂の１リットルあたり４０〜５０ｇのＩｇＧ１が入っている）を使用した時に、動的容量が高い。
【００５１】
本発明に従った陽イオン交換クロマトグラフィーのステップ（ｂ）において、当該陽イオン交換樹脂は、約２〜約６ｍＳ／ｃｍの伝導率を有し、そしてＦｃ含有タンパク質の等電点より約１ｐＨ単位低いｐＨである緩衝液を用いて洗浄された。
【００５２】
ステップ（ｂ）における緩衝液は、例えば、約２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９または６ｍＳ／ｃｍの伝導率を有していてもよい。
【００５３】
さらに好ましい実施形態において、当該陽イオン交換カラムは、ステップ（ｂ）において、ｐＨが約７〜約８．５の範囲であって、約２〜６ｍＳ／ｃｍの伝導率である緩衝液を用いて洗浄される。当該ｐＨは、例えば、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、７．５、７．５５、７．６、７．６５、７．７、７．７５、７．８、７．８５、７．９、７．９５、８、８．０５、８．１、８．１５、８．２、８．２５、８．３、８．３５、８．４、８．４５または約８．５であってもよい。
【００５４】
最も好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）における陽イオン交換樹脂は、約ｐＨ８であって、約３．５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有するリン酸緩衝液を用いて洗浄される。
【００５５】
さらに好ましい実施形態において、当該洗浄ステップは、約１０〜３０ｍＭの、好ましくは２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む緩衝液中で行なわれる。当該緩衝液は、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｍＭのリン酸ナトリウムを含んでもよい。
【００５６】
本発明に従った陽イオン交換クロマトグラフィーのステップ（ｃ）において、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質の等電点よりも約１単位分低いｐＨで、塩勾配を増加させながら、陽イオン交換樹脂から溶出される。
【００５７】
Ｆｃ含有タンパク質の溶出は、任意の好適な塩、例えばＮａＣｌまたはＫＣｌを使用して行われてもよい。ＮａＣｌを増加させるような塩勾配は望ましい。
【００５８】
本発明の方法に従った塩勾配の増加は、好ましくは浅い勾配である。
【００５９】
好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質は、約２〜約１５ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導率で、約７〜約８．５のｐＨで、塩勾配を増加させながら、陽イオン交換樹脂から溶出される。約２〜約１５ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導率勾配は、０ｍＭ〜約１５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度の増加によって生じるかもしれない。ｐＨは当該勾配をかけている間は一定に維持され、そしてｐＨは７．０〜８．５の間であるかもしれない。
【００６０】
好ましい実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、陽イオン交換樹脂から約７．０〜約８．５のｐＨの範囲で、約０〜約１５０ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の緩衝液で塩勾配を増加させながら溶出される。緩衝液の塩勾配の増加は、約０〜約１５５、０〜１４５、５〜１４５、５〜１５０、５〜１５５、１０〜１４５、１０〜１５０または約１０〜約１５５ｍＭのＮａＣｌの範囲である。
【００６１】
溶出緩衝液のｐＨは、約７．０、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、７．５、７．５５、７．６、７．６５、７．７、７．７５、７．８、７．８５、７．９、７．９５、８、８．０５、８．１、８．１５、８．２、８．２５、８．３、８．３５、８．４、８．４５、または約８．５であり得る。
【００６２】
さらに好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）におけるＦｃ含有タンパク質は、陽イオン交換樹脂から、Ｆｃ含有タンパク質の等電点よりも約１ｐＨ単位分低いｐＨで、伝導率の勾配をかけながら溶出される。
【００６３】
Ｆｃ含有タンパク質の溶出は、２８０ｎｍの吸光度で検出され、そしてフラクションは、吸光度のピーク相が下っている間は回収される。フラクションはその後、溶出ピークの後部に存在する凝集体およびＨＣＰを避けるために貯留され、これは本明細書において「後部からの切り取り」という。溶出ピークの後部には、好ましくは主ピークから除かれてもよい、はっきりと見える肩が存在するかもしれない。または定組成溶離が、凝集体およびＨＣＰの溶出を防ぐだろう伝導率およびｐＨの緩衝液を用いて行なわれ得る。好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質は、約ｐＨ８で約０〜約１５０ｍＭ  ＮａＣｌの、増加するＮａＣｌ勾配を用いた緩衝液で溶出される。
【００６４】
さらに好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）における溶出は、リン酸ナトリウム、トリス（Ｔｒｉｓ）またはヘペス（ＨＥＰＥＳ）から選択される緩衝液で行なわれる。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態において、溶出ピークの後部からの切り取りは、陽イオンクロマトグラフィーステップのステップ（ｃ）において行なわれる。
【００６６】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば発明の背景において、上で説明された弱陽イオンまたは強陽イオン交換体のような任意の好適な陽イオン交換樹脂上で行なわれてもよい。
【００６７】
好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて使用される陽イオン交換樹脂は、強陽イオン交換樹脂である。フラクトゲルＥＭＤ  ＳＥハイキャップ（Ｍ）（メルク製）という名前で市販されているカラムが、本発明の方法との関連において特に好適である陽イオン交換樹脂の例である。
【００６８】
好ましい実施形態において、陽イオン交換樹脂は、遠心分離またはろ過による沈殿物質の除去の後、濃酢酸の添加によってｐＨ４に調節された浄化細胞培養上清を用いて装填される。別の実施形態において、陽イオン交換樹脂は、遠心分離またはろ過によって沈殿物質および細胞片を除去した後に、濃酢酸の添加によってｐＨ４に調節された細胞培養物質を用いて装填される。さらに好ましい実施形態において、フラクトゲルＥＭＤ  ＳＥハイキャップ樹脂は、充填された陽イオン交換樹脂の１リットルあたり４０〜４７ｇの動的容量で、約ｐＨ４のｐＨに、そして約１５ｍＳ／ｃｍの伝導率に調節されたＦｃ含有タンパク質を含む液体を用いて装填される。約１５ｍＳ／ｃｍの液体の伝導率とは、例えば、１５．９、１５．８、１５．７、１５．６、１５．５、１５．４、１５．３、１５．２、１５．１、１５、１４．９、１４．８、１４．７、１４．６、または１４．５ｍＳ／ｃｍであり得る。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、ステップ（ａ）において陽イオン交換樹脂上に装填されたＦｃ含有液は、浄化採取物（すなわち、浄化細胞培養上清）であってもよい。
【００７０】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは捕獲ステップとして使用され、したがって、Ｆｃ含有タンパク質の精製に、特に宿主細胞タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質凝集体およびＦｃ含有タンパク質の不完全断片の削減、減少または除去において、ならびにＦｃ含有タンパク質調製物の濃縮に役立つ。
【００７１】
本明細書において使用される用語「不完全Ｆｃ含有タンパク質」または「不完全Ｆｃ含有タンパク質断片」とは、免疫グロブリン定常ドメイン、または完全なさらなるドメインを含まないドメインに由来する、本発明に従って精製されるＦｃ含有タンパク質の幾つかの部分を含む意味である。したがって、Ｆｃ含有タンパク質が免疫グロブリン可変ドメインを含むのであれば、不完全Ｆｃ含有タンパク質断片は可変領域の特定の重要な部分を含まない。Ｆｃ含有タンパク質がＦｃ融合タンパク質であるならば、不完全Ｆｃ含有タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質の治療用部分における特定の重要な部分を含まない。Ｆｃ含有タンパク質が抗体であるならば、不完全Ｆｃ含有断片は標的抗体のアミノ酸配列の一部のみを含むポリペプチドである。これらの断片は、標的抗体の不完全な合成に起因して、一またはそれ以上の内部ペプチド結合の切断に起因して、または、例えば抗体の遊離の重鎖または遊離の軽鎖を生じさせる、独立したサブユニット間のジスルフィド架橋の欠如に起因して生じる可能性がある。
【００７２】
本発明に従って、陽イオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは２０〜３５０倍の範囲内における、すなわち、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０倍の範囲内におけるＨＣＰの除去または減少のために使用され得る。したがって、ステップ（ｃ）により生じる陽イオン交換樹脂の溶出液は、１０，０００ｐｐｍ未満、または９，５００ｐｐｍ未満、または９，０００ｐｐｍ未満、または８，５００ｐｐｍ未満、または８，０００ｐｐｍ未満、または７，５００ｐｐｍ未満、または７，０００ｐｐｍ未満、または６，５００ｐｐｍ未満、または６，０００ｐｐｍ未満、または５，５００ｐｐｍ未満、または５，０００ｐｐｍ未満、または４，５００ｐｐｍ未満、または４，０００ｐｐｍ未満のＨＣＰレベルを有する。
【００７３】
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーは、約１０倍まで凝集体のレベルを減少させるというさらなる利点を有する。したがって本発明の実施形態において、陽イオン交換カラムの溶出液は、１％未満、または０．９％未満、または０．８％、または０．７％未満、または０．６％未満または０．５％未満、または０．５％未満、または０．４％未満、または０．３％未満、または０．２％未満、または０．１％未満の凝集体レベルを有する。
【００７４】
さらに、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーは、不完全Ｆｃ含有タンパク質のレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される検出レベルよりも低いところまで減少させる。したがって、好ましい実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出液は、１ｍｃｇのＦｃ含有タンパク質を装填した時の、非還元条件および銀染色下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出することができない程度の不完全Ｆｃ含有タンパク質のレベルを有する。当該不完全Ｆｃ含有タンパク質は、好ましくは、遊離の抗体重鎖および／または軽鎖を含む。
【００７５】
本明細書における用語「凝集体」とは、タンパク質凝集体のことを意味し、そして例えば高分子量の凝集体となる、精製されるべきＦｃ含有タンパク質の多量体を含む。
【００７６】
非常に好ましい実施形態において、本発明の方法は、以下のステップ：
ｉ．本発明の方法にしたがって前記Ｆｃ含有タンパク質を含み、そして５未満のｐＨに調節された、または伝導率が４ｍＳ／ｃｍ未満になるまで水で希釈された液体を、陽イオン交換クロマトグラフィーへ供すること；
ii．ステップ（ｉ）の溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーに供すること；
iii ．ステップ（ii）の溶出液または素通り画分を疎水性相互作用または陰イオン交換クロマトグラフィーに供すること
を含む、Ｆｃ含有タンパク質の精製計画の第一ステップとして使用される。
【００７７】
本発明に従って、陽イオン交換クロマトグラフィーステップまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ由来の溶出液は、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーに供され得る。当該陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば発明の背景において上で説明された弱または強陰イオン交換体のような、任意の好適な陰イオン交換樹脂上で行なわれてもよい。好ましくは、当該陰イオン交換クロマトグラフィーは、強陰イオン交換樹脂上で行なわれる。ポロス（Ｐｏｒｏｓ）５０ＨＱ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製）という名前で市販されている樹脂が、本発明の陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて特に好適である陰イオン交換樹脂の例である。
【００７８】
陰イオン交換カラムはまた、好ましくは、好適な緩衝液を用いて平衡化される。
【００７９】
好ましくは、前のステップからの溶出液は、それを陰イオン交換カラム上に装填する前に好適な装填用緩衝液で希釈されるか、または透析される。陰イオン交換カラムはまた、好ましくは装填用緩衝液を用いて平衡化される。好適な平衡化／装填用／洗浄用緩衝液は、例えば、約５〜約２５ｍＭの範囲のリン酸ナトリウムである。
【００８０】
約５〜約２５ｍＭの緩衝液濃度とは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５ｍＭであってもよい。装填用緩衝液の好ましい伝導率は約１．０〜約４．５ｍＳ／ｃｍの範囲内、例えば２、２．５、３、３．５、４、４．５ｍＳ／ｃｍである。
【００８１】
装填用緩衝液の好適なｐＨの範囲は、等電点よりも約０．５〜１単位低い。好適なｐＨ値は、７．０〜９．０の範囲、好ましくは約７．５〜約９．０の範囲であり、例えば約７．５、７．５５、７，６、７．６５、７．７、７．７５、７．８、７．８５、７．９、７．９５、８．０、８．０５、８．１、８．１５、８．２、８．２５、８．３、８．３５、８．４、８．４５、８．５、８．５５、８．６、８．６５、８．７、８．７５、８．８、８．８５、８．９または８．９５である。
【００８２】
好適な平衡化／装填用／洗浄用緩衝液は、例えば約５ｍＭの濃度であって、そして約８．５のｐＨであるリン酸ナトリウムであってもよい。装填する物質は、そのような緩衝液に対して透析されるか、または透析濾過されるか、あるいは別法として、それが約１ｍＳ／ｃｍの伝導率となるように水で希釈される。本発明の枠内において、関心のあるＦｃ含有タンパク質を含む素通り画分（または漏出画分ともよばれる）は回収される。
【００８３】
本発明に従って、陽イオン交換クロマトグラフィーステップ由来の溶出液、または陰イオン交換クロマトグラフィーステップ由来の素通り画分は、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供される。当該疎水性相互作用クロマトグラフィーは、任意の好適な疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂上で行なわれてもよい。フェニルセファロース６ファストフローハイサブ（Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）およびフェニルセファロースＨＰ（ＧＥヘルスケア製）の名前で市販されている２つの樹脂が、本発明の方法の疎水性相互作用クロマトグラフィーにとって特に好適であるＨＩＣ樹脂の例である。
【００８４】
疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムは、好ましくは好適な平衡化緩衝液で平衡化される。
【００８５】
好ましくは、前のステップ由来の溶出液は、それを疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上に装填する前に希釈されるか、透析されるか、または透析濾過され、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー由来の素通り画分は、好ましくは装填用緩衝液中へ希釈される。装填用緩衝液への希釈に先立って、陽イオン交換クロマトグラフィーステップ由来の溶出液は、好ましくは約ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム中へ最初に透析濾過され、そして約２〜４倍に濃縮される。
【００８６】
好適な装填用緩衝液は、例えば、１００ｍＭのリン酸ナトリウムおよび０．５〜０．６Ｍの硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）からなる緩衝液である。平衡化／洗浄用／装填用緩衝液のための好適なｐＨ値は、約５．０〜約８．０の範囲であり、好ましくは約６．５〜約７．５の範囲であり、例えば、約６．５、６．５５、６．６、６．６５、６．７、６．７５、６．８、６．８５、６．９、６．９５、７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５または７．５である。例えば約１．０〜１．２Ｍの硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）のような、硫酸ナトリウム以上に抗カオトロピックな他の塩が使用されてもよい。または、塩化ナトリウムも約３．５〜４Ｍの濃度で使用され得る。
【００８７】
装填後、カラムは好適な洗浄用緩衝液で洗浄され、その後Ｆｃ含有タンパク質は、好適な溶出緩衝液を用いてＨＩＣ樹脂から溶出される。ＨＩＣカラムからの溶出は、定組成溶離または勾配溶離でなされ得る。
【００８８】
好適な平衡化／洗浄用緩衝液は、例えば、０．５〜０．６ＭのＮａ2ＳＯ4もしくは１．０〜１．２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4または３．５〜４．０ＭのＮａＣｌを含む、ｐＨ７の１００ｍＭリン酸ナトリウムであり得る。
【００８９】
ＨＩＣカラムからの溶出は、定組成溶離または勾配溶離でなされ得る。定組成溶離のための好適な溶出緩衝液は、約５〜約２５ｍＭの、好ましくは１０、１５または２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。勾配溶離が行なわれる時、Ｆｃ含有タンパク質は、約１００ｍＭ〜約１０ｍＭのリン酸ナトリウム中に、約０．５Ｍ〜０ＭのＮａ2ＳＯ4、または約１．０〜０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、または約４〜０ＭのＮａＣｌを含む、塩勾配を減少させる緩衝液を用いてＨＩＣ樹脂から溶出される。
【００９０】
本発明の枠内において、関心のあるＦｃ含有タンパク質を含む、ＨＩＣの溶出液が回収される。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、約７．５〜約９．５の間に等電点（ｐＩ）を有する。当該等電点は、例えば、約７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４または約９．５である。
【００９２】
樹脂の容量、使用されるカラムの長さおよび直径、ならびに本発明の様々なステップにおいて使用される動的容量および流速は、処理されるべき液体の容積、本発明の方法に供される液体中のタンパク質の濃度などのような、幾つかのパラメーターに依存する。それぞれのステップのこれらのパラメーターの決定は、当業者の平均的技術の十分範囲内である。
【００９３】
本精製方法の好ましい実施形態において、一またはそれ以上の限外濾過ステップが行なわれる。限外濾過は、先のクロマトグラフィーステップから得られた溶出液中の小さい有機分子および塩の除去のために、好適な緩衝液中でＦｃ含有タンパク質を平衡化するために、または所望の濃度にＦｃ含有タンパク質を濃縮するために有用である。そのような限外濾過は、分子量が５、１０、１５、２０、２５、３０ｋＤａよりも低い分子量、またはそれを超える分子量を有する成分の除去をすることができる細孔径を有する膜を用いた、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）として知られている技術によって行なわれる。
【００９４】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の方法に従って精製されたＦｃ含有タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域、最も好ましくはヒト定常領域を含む。
【００９５】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ含有タンパク質」はまた、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４ドメイン、またはその任意の組み合わせから選択される、ならびに好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインから選択される免疫グロブリン定常ドメインを少なくとも一つ有する、任意のタンパク質のことである。免疫グロブリン定常ドメインは、任意のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またその組み合わせ、もしくはそのアイソタイプに由来してもよい。好ましくは、それは例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4のようなＩｇＧである。より好ましくは、それはＩｇＧ1である。
【００９６】
好ましい実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、免疫グロブリン可変領域、例えば一またはそれ以上の重鎖可変ドメインおよび／または一またはそれ以上の軽鎖可変ドメインを含む。好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質は、一または二つの重鎖可変ドメインを含む。より好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質は、一または二つの軽鎖定常および／または可変ドメインをさらに含む。
【００９７】
本明細書において使用されている用語「Ｆｃ含有タンパク質」とは、本明細書において「Ｆｃ部位」と呼ばれる免疫グロブリン由来部位、および疾患の治療が意図されているか否かに関係なく、本明細書において「治療用部位」と呼ばれる第二の非免疫グロブリンタンパク質由来の部位を含むタンパク質、特に治療用タンパク質を含む意味である。Ｆｃ部位と融合した組み換えポリペプチドは、関心のある任意のポリペプチド、特に細胞中の細胞分泌および／または細胞産生が望ましい、ポリペプチドに相当してもよい。
【００９８】
Ｆｃ融合タンパク質はまた、好ましくは本発明の方法に従うＦｃ含有タンパク質である。
【００９９】
Ｆｃ部位は、ヒトまたは動物免疫グロブリン（Ｉｇ）由来であって、好ましくはＩｇＧ由来であってもよい。当該ＩｇＧは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4であってもよい。Ｆｃ部位は、免疫グロブリンの定常領域ドメインの全てまたは一部を含んでもよい。Ｆｃ部位は少なくともＣＨ2およびＣＨ3ドメインを有することが好ましい。Ｆｃ部位は、Ｉｇヒンジ領域、ＣＨ2およびＣＨ3ドメインを含むことがさらに好ましい。特にＦｃ部位が、ヒンジ領域と共に、またはヒンジ領域を有さないで、ＩｇＧ  ＣＨ2およびＣＨ3ドメインを含むことが好ましい。
【０１００】
本発明のＦｃ含有タンパク質は、単量体または二量体であってもよい。当該Ｆｃ含有タンパク質は、二量体Ｆｃ部位（例えば、ジスルフィドで架橋された、２つのヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3構築物の二量体）であって、そのうちの一つのみが治療部位と融合しているものを含む「擬似二量体」であってもよい。Ｆｃ含有タンパク質は、二つの異なる治療部位を含むヘテロ二量体であってもよく、または単一の治療部位の二つのコピーを含むホモ二量体であってもよい。好ましくは、Ｆｃ融合タンパク質は二量体である。本発明のＦｃ含有タンパク質はまた、ホモ二量体であることが好ましい。
【０１０１】
本発明に従って、Ｆｃ部位はまた、エフェクター機能を調節するために修飾されてもよい。例えば、ＥＵインデックス番号（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）に従った以下のＦｃ変異は、Ｆｃ部位がＩｇＧ1に由来するものであるならば導入され得る：
−  Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ
−  Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ  ＋  Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ
−  Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／７Ｇ２３６  ＋  Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ
−  Ｅ３３３Ａ；  Ｋ３２２Ａ。
【０１０２】
さらなるＦｃの変異は、例えば３３０、３３１、２３４もしくは２３５またはその組み合わせから選択されるＥＵインデックス番号での置換であってもよい。ＣＨ2ドメイン中にあるＥＵインデックス番号２９７におけるアミノ酸の置換はまた、本発明においてＦｃ部位へ導入されてもよく、そしてそれはＮ−結合型炭水化物付着の潜在的部位を除去する。ＥＵインデックス番号２２０のシステイン残基はまた、セリン残基と交換されてもよく、そしてそれは、通常免疫グロブリン軽鎖定常領域とのジスルフィドを形成するシステイン残基を除去する。
【０１０３】
Ｆｃ含有タンパク質の治療部位は、例えばＥＰＯ、ＴＰＯ、増殖ホルモン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、ＰＤＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、Ｌ−１８結合タンパク質、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、またはＴＮＦ−ベータであってもよく、またはそれらに由来してもよい。
【０１０４】
Ｆｃ含有タンパク質の治療部位はまた、受容体、例えば膜貫通受容体に由来してもよく、好ましくは受容体の細胞外ドメインに由来してもよく、そして特に、任意の受容体の細胞外部位またはドメインのリガンド結合断片に由来してもよい。治療的に興味深い受容体の例は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１６４、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット（ＩＬ−１８Ｒ−アルファ、ＩＬ−１８Ｒ−ベータ）、ＥＧＦ受容体、ＭＩＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、インテグリン  アルファ４  １０ベータ  ７、インテグリンＶＬＡ４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、内皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、（細胞障害性Ｔリンパ球抗原である）ＣＴＬＡ４、Ｆｃ−ガンマ−Ｉ受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、例えばＴＮＦ１（ｐ５５）、ＴＮＦＲ２（ｐ７５）の細胞外ドメインに由来する断片のような、ＴＮＦＲスーパーファミリーに属する受容体の断片、ＯＸ４０、オステオプロテジェリン、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＤＲ３、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＡＩＬ−Ｒ４、ＮＧＦＲ、ＡＩＴＲ，ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩである。
【０１０５】
本発明に従って精製される治療用Ｆｃ融合タンパク質、すなわち動物の疾患の治療または予防を意図した、またはヒトへの治療または投与を意図したＦｃ融合タンパク質は、本発明の枠内における使用において特に好適である。
【０１０６】
最も好ましくは、前記Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＡＣＩ受容体の断片（例えば国際公開第０２／０９４８５２号参照）またはＩＦＮ−ベータ（例えば国際公開第２００５／００１０２５号参照）の断片のいずれかを含む。
【０１０７】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従って精製され得るＦｃ含有タンパク質は抗体である。好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体である。当該抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。抗体は、抗体をコードする、一つ、二つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを形質移入した宿主細胞中で産生されるか、あるいはハイブリドーマから産生されるかのいずれかであってもよい。
【０１０８】
本明細書において使用される用語「抗体」とは、治療部位が少なくとも一つの免疫グロブリン（Ｉｇ）の可変領域を含む、Ｆｃ含有タンパク質のことである。好ましい免疫グロブリンは、哺乳類の免疫グロブリンである。より好ましい免疫グロブリンは、ラクダ科の免疫グロブリンである。さらにより好ましい免疫グロブリンは、げっ歯類の、特にラットまたはマウス由来の免疫グロブリンである。最も好ましい免疫グロブリンは霊長類、特にヒト免疫グロブリンである。
【０１０９】
用語「抗体」は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントのことであり、そして、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む。当該用語は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、ヒト、キメラ、一本鎖、合成、組み換え、ハイブリッド、変異型、移植型、またはインビトロ産生抗体を含むが、それらに限定されない。抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのような任意の既知の抗体クラスから選択されてもよい。抗体は、単量体、二量体、または三量体もしくは五量体のような多量体であってもよい。
【０１１０】
「抗体」は、ジスルフィド結合によって分子間で接続されている少なくとも二つの重鎖（Ｈ）および二つの軽鎖（Ｌ）を含む、またはその抗原結合部位を含む糖タンパク質のことである。それぞれの重鎖は、（本明細書においてＶＨと省略されている）重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。全ての軽鎖は、（本明細書においてＶＬと省略されている）軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含む。ＶＨおよびＶＬは、抗原への結合特異性を保持しており、そして相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域にさらに細分化され得る。ＣＤＲは、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域と共に散在している。ＶＨおよびＶＬのそれぞれは、３つのＣＤＲと４つのフレームワーク領域を含み、そしてそれは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順番で並んでいる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【０１１１】
本発明に従って精製され得る抗体の例は、ＣＤ３（例えばＯＫＴ３、ＮＩ−０４０１）、ＣＤ１１ａ（例えば、エファリズマブ）、ＣＤ４（例えば、ザノリムマブ、ＴＮＸ−３５５）、ＣＤ２０（例えば、イブリツモマブチウキセタン、リツキシマブ、トシツモマブ、オクレリズマブ、オファツムバブ、ＩＭＭＵ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、ＧＡ−１０１）、ＣＤ２３（例えば、ルミリキシマブ）、ＣＤ２２（例えば、エプラツズマブ）、ＣＤ２５（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えば、パニツムマブ、セツキシマブ、ザルツムマブ、ＭＤＸ−２１４）、ＣＤ３０（例えば、ＭＤＸ−０６０）、細胞表面糖タンパク質ＣＤ５２（例えば、アレムツマブ）、ＣＤ８０（例えば、ガリキシマブ）、血小板ＧＰIIｂ／III ａ受容体（例えば、アブシキシマブ）、ＴＮＦアルファ（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ）、インターロイキン−６受容体（例えば、トシリズマブ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（例えば、９９ｍＴｃ−ベシレソマブ（ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ））、アルファ−４／ベータ−１インテグリン（ＶＬＡ４）（例えば、ナタリズマブ）、アルファ−５／ベータ−１インテグリン（ＶＬＡ５）（例えば、ボロシキシマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ））、ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）（例えば、オマリズマブ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、トラスツズマブ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）（例えば、１１１Ｉｎ−カプロマブペンデチド、ＭＤＸ−０７０）、ＣＤ３３（例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン）、ＧＭ−ＣＳＦ（例えば、ＫＢ００２、ＭＴ２０３）、ＧＭ−ＣＳＦ受容体（例えば、ＣＡＭ−３００１）、ＥｐＣＡＭ（例えば、アデカツムマブ）、ＩＦＮ−ガンマ（例えば、ＮＩ−０５０１）、ＩＦＮ−アルファ（例えば、ＭＥＤＩ−５４５／ＭＤＸ−１１０３）、ＲＡＮＫＬ（例えば、デノスマブ）、肝細胞増殖因子（例えば、ＡＭＧ１０２）、ＩＬ−１５（例えば、ＡＭＧ７１４）、ＴＲＡＩＬ（例えば、ＡＭＧ６５５）、インスリン様増殖因子受容体（例えば、ＡＭＧ４７９、Ｒ１５０７）、ＩＬ−４およびＩＬ１３（例えば、ＡＭＧ３１７）、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ受容体３（ＢＲ３）（例えば、ＣＢ１）、ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ）からなる群から選択されるタンパク質に対する抗体である。
【０１１２】
好ましくは、本発明に従って精製され得る抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２５、ＩＦＮ−ガンマ、ＥｐＣＡＭ、ＴＡＣＩからなる群から選択されるタンパク質に対する抗体である。
【０１１３】
最も好ましくは、前記抗体は、ＣＤ４抗体（例えば、国際公開第９７／１３８５２号参照）、抗ＣＤ１抗体（例えば、国際公開第９８／２３７６１号参照）および抗ＣＤ２５抗体（例えば、国際公開第２００４／０４５５１２号参照）からなる群から選択される。
【０１１４】
好ましい実施形態において、精製されるべき抗体は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２に記載されているアミノ酸配列を含むヒトカッパ軽鎖可変領域を有するＩｇＧ１サブクラスの抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ、またはその保存配列の改変体である。
【０１１５】
さらに一層好ましい実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４のＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号５のＶＨ  ＣＤＲ３ならびに配列番号６のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７のＶＬ  ＣＤＲ２および配列番号８のＶＬ  ＣＤＲ３；または、（ｉｉ）（ｉ）で定義された配列の、任意の一つの保存配列の改変体、を含む抗ＣＤ−２５抗体である。
【０１１６】
ＴＮＦ、Ｂｌｙｓまたはインターフェロン−γに対する抗体は、治療的に興味深い抗体のさらなる例である。
【０１１７】
本発明の方法に従って精製されたタンパク質がヒトへの投与を予定しているならば、当該方法において、ウィルスの除去の１またはそれ以上のステップを含むことは有利となる。
【０１１８】
例えば、貯留または輸送を促進するために、前記材料は凍結され、そして本発明の任意の精製ステップの前および／または後に解凍されてもよい。
【０１１９】
本発明に従って、組み換えＦｃ含有タンパク質は、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞のような、真核生物の発現系において産生されてもよく、その結果、グリコシル化Ｆｃ含有タンパク質となる。
【０１２０】
本発明に従って、動物培養細胞株またはヒト培養細胞株のような哺乳動物細胞において、Ｆｃ含有タンパク質を発現することは最も好ましい。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはマウス骨髄腫培養細胞株ＮＳ０は、精製されるべきＦｃ含有タンパク質の発現のために特に好適である培養細胞株の例である。Ｆｃ含有タンパク質はまた、好ましくは、例えば、ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０培養細胞株、ヒト網膜芽細胞腫培養細胞株ＰＥＲＣ６、もしくはヒト胚腎臓培養細胞株２９３のような、または例えば欧州特許第１２３０３５４号明細書に記載されている永久羊膜培養細胞株のような、ヒト培養細胞株中において産生され得る。
【０１２１】
精製されるべきＦｃ含有タンパク質が、それを分泌する哺乳動物細胞によって発現されるのであれば、本発明の精製方法の出発物質は、採取物もしくは粗製採取物とも呼ばれる細胞培養上清である。当該細胞が動物血清を含む培地において培養されるのであれば、細胞培養上清はまた、不純物としての血清タンパク質を含む。
【０１２２】
好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質を発現および分泌する細胞は、無血清条件下において培養される。Ｆｃ含有タンパク質はまた、既知組成培地において産生されてもよい。この場合において、本発明の精製方法の出発材料は、不純物として宿主細胞タンパク質を主として含む、無血清細胞培養上清である。例えばインスリンのような増殖因子が、細胞培養培地へ添加されるならば、これらのタンパク質は、精製過程中に同様に排除されるだろう。
【０１２３】
細胞培養上清中へ放出される、溶解性の分泌Ｆｃ含有タンパク質を産生するために、Ｆｃ含有タンパク質の治療部位の天然型シグナルペプチドが使用されるか、または好ましくは異種性シグナルペプチド、すなわち、例えば、ウシもしくはヒト増殖ホルモンシグナルペプチドまたは免疫グロブリンシグナルペプチドのような、特定の発現系において有効である他の分泌タンパク質由来のシグナルペプチドが使用されるかのいずれかである。
【０１２４】
任意のまたは保存的アミノ酸置換の保存的配列の改変は、ある群のメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保持するという著しく類似の物理学的性質を有する当該群内の同義のアミノ酸を含んでもよい（Ｇｒａｎｔｈａｍ，１９７４）。
【０１２５】
本発明に従って精製されるＦｃ含有タンパク質はまた、残基上の、またはＮ−末端基もしくはＣ−末端基上の側鎖において、当技術分野において既知の方法によって、官能基修飾されてもよい。かかる修飾されたＦｃ含有タンパクは、それらが、上で定義された未修飾のＦｃ含有タンパク質の活性と実質的に同じであるタンパク質の活性を破壊せず、そしてそれを含む組成物において毒性を付与しない限り、本発明に含まれる。
【０１２６】
例えば、Ｆｃ含有タンパク質は、例えば、安定性、半減期、バイオアベイラビリティ、ヒトの身体に対する寛容性、または免疫原性のような、タンパク質の特性を改善するために、重合体と複合化され得る。この目的を達成するために、Ｆｃ含有タンパク質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と連結されてもよい。ペグ化は、例えば、国際公開第９２／１３０９５号に記載されている既知の手法によって行なわれてもよい。
【０１２７】
第二の実施形態において、本発明は、陽イオン交換樹脂へのＦｃ含有タンパク質の結合に続いて、当該樹脂がＦｃ含有タンパク質の等電点より約１単位低いｐＨである緩衝液で洗浄される、液体からＦｃ含有タンパク質を捕獲させるための陽イオン交換クロマトグラフィーの使用に関する。Ｆｃ含有タンパク質は、好ましくは、樹脂から塩勾配をかけて溶出される。さらに、溶出ピークの後部の切り取りが行なわれ得る。
【０１２８】
本発明は、本発明に従う精製法によって精製されたタンパク質にさらに関する。以下において、当該タンパク質はまた、「精製Ｆｃ含有タンパク質」と呼ばれる。
【０１２９】
当該精製Ｆｃ含有タンパク質は、好ましくは高度の精製Ｆｃ含有タンパク質である。高度精製Ｆｃ含有タンパク質は、例えば、１レーンあたり２ｍｃｇの量のタンパク質をロードした後の、銀染色された、非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける単一のバンドの存在によって決定される。精製Ｆｃ含有タンパク質はまた、ＨＰＬＣにおいて溶出時に単一のピークとして示されてもよい。
【０１３０】
本発明の精製方法で得られるＦｃ含有タンパク調製物は、少なくとも２０％未満の不純物を含んでいてもよく、好ましくは１０％、５％、３％、２％、または１％未満の不純物を含んでいてもよく、あるいはそれは、均一的に、すなわち、検出可能なタンパク質性の汚染物質をまったく含んでいないように精製されてもよい。
【０１３１】
精製Ｆｃ含有タンパク質は、治療的用途を、特にヒト患者への投与を目的としたものであってよい。精製Ｆｃ含有タンパク質が患者へ投与されるのであれば、それは好ましくは全身投与で、そして好ましくは皮下もしくは筋肉内または局所的にすなわち局在的に投与される。直腸内またはくも膜下腔内投与はまた、精製Ｆｃ含有タンパク質の特定の医学的用途に応じて好適であるかもしれない。
【０１３２】
この目的のために、本発明の好ましい実施形態において、精製Ｆｃ含有タンパク質は、医薬組成物中に、すなわち、薬学的に許容される担体、賦形剤または同様のものと共に製剤化されてもよい。
【０１３３】
「薬学的に許容される」の定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を阻害せず、そしてそれが投与される宿主に対して毒性のない、任意の担体を含む意味である。例えば、非経口投与のために、活性タンパク質（複数）は、生理食塩水、ブドウ糖溶液、血清アルブミンおよびリンゲル溶液のようなビヒクル中の、注射用の単位投薬剤形で製剤化されてもよい。
【０１３４】
本発明の医薬組成物の活性成分は、様々な方法で個人に投与され得る。投与経路は、皮内、経皮（例えば、徐放製剤において）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所、直腸内、および鼻腔内経路を含む。治療上有効な他の投与経路は、例えば、上皮または内皮組織を通じた吸収によって、または活性薬剤をコードするＤＮＡ分子が患者へ（ベクターを経由して）投与され、活性薬剤がインビボにおいて発現および分泌される遺伝子治療によって使用され得る。さらに、本発明のタンパク質（複数）は、薬学的に許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルのような生物学的に活性のある薬剤の他の成分と共に投与され得る。
【０１３５】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与のために、活性タンパク質（複数）は、薬学的に許容される非経口用ビヒクル（例えば水、生理食塩水、デキストロース溶液）、および等張性を維持する添加剤（例えばマンニトール）、または化学的安定性を維持する添加剤（例えば保存剤および緩衝液）と共に、溶液、懸濁液、乳液または凍結乾燥された粉末として製剤化され得る。当該製剤は、通常使用される技術によって無菌化される。
【０１３６】
活性タンパク質（複数）の治療上の有効量は、Ｆｃ含有タンパク質の種類、リガンドに対するＦｃ含有タンパク質の親和性、投与経路、患者の臨床状況を含む、多変数の内の１関数となるだろう。
【０１３７】
「治療上の有効量」とは、投与されるときに、Ｆｃ含有タンパク質が、上で説明したようなＦｃ融合タンパク質治療部位のリガンドの阻害をするような量である。
【０１３８】
単回投与で、または複数回投与で個人に投与される用量は、Ｆｃ含有タンパク質の薬物動態的特性、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、体格）、症状の程度、並行して行なわれる治療法、治療頻度ならびに期待される効果を含む、様々な要素に依存して変化するだろう。確立された用量範囲の調節および操作は、当業者の能力ならびに個人における治療部位の天然型リガンドの阻害を決定するインビトロおよびインビボにおける方法の範囲内に十分ある。
【０１３９】
精製Ｆｃ含有タンパク質は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で、または約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で、または約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重の量で、または約１〜３ｍｇ／ｋｇ体重の量で、または約２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用されてもよい。
【０１４０】
さらに好ましい実施形態において、精製Ｆｃ含有タンパク質は、毎日または１日おきに、または一週間に３回または一週間に１回投与されてもよい。
【０１４１】
一日用量は通常分割投与で、または所望の結果を得るために有効な持続放出製剤の形態で与えられる。第二の、または続いて起こる投与は、同様の用量で、個人へ投与された初期または先の用量未満またはそれを超える量で行なわれ得る。第二の、または続いて起こる投与は、発症中または発症に先立って投与され得る。
【０１４２】
本発明は、Ｆｃ含有タンパク質を含む組成物中における、ＨＣＰ、凝集体、および不完全Ｆｃ含有タンパク質断片濃度の減少のための、陽イオン交換クロマトグラフィーの使用にさらに関する。
【０１４３】
好ましい実施形態において、ＨＣＰレベルは、１０，０００ｐｐｍ未満、または９，５００ｐｐｍ未満、または９，０００ｐｐｍ未満、または８，５００ｐｐｍまたは８，０００ｐｐｍ未満、または７，５００ｐｐｍ未満、または７，０００ｐｐｍ未満、または６，５００ｐｐｍ未満、または６，０００ｐｐｍ未満、または５，５００未満、または５，０００ｐｐｍ未満、または４，５００ｐｐｍ未満、または４，０００ｐｐｍ未満に減らされる。凝集体レベルは、１％未満、または０．９％未満、または０．８％、または０．７％未満、または０．６％未満、または０．５％未満、または０．５％未満、または０．４％未満、または０．３％未満、または０．２％未満、または０．１％未満に減らされる。遊離の重鎖および／または遊離の軽鎖のような、不完全Ｆｃ含有タンパク質のレベルは、１ｍｃｇのＦｃ含有タンパク質を装填して、非還元条件および銀染色下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される検出レベルよりも低いところまで減らされる。
【０１４４】
本発明を十分に記載してきたので、等価なパラメーター、濃度、および条件の広い範囲内で、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、および過度の実験を行なうことなく、同じことが行なわれ得ることが当業者によって十分に理解されるだろう。
【０１４５】
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されたが、それはさらなる修飾を行ない得ることが理解されるだろう。本用途は、本発明の任意の変形、使用または適用を包含することを意図しており、一般的に本発明の原理に従い、そして本発明が関連する技術分野内における既知または慣習の範囲内であり、および添付された特許請求の範囲内に従うものとして上文において説明されている基本的特徴に適用されてもよい、本開示から逸脱したものを含む。
【０１４６】
学術論文または要約、公開されたもしくは未公開の米国または外国特許出願、発行された米国もしくは外国特許、あるいはその他の参考文献を含む、本明細書において引用されている全ての参考文献は、引用された参考文献中に存在する全てのデータ、表、図および文章を含めて、全体で、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書に引用されている参考文献中に引用された文献の全ての内容もまた、完全に、参照により組み込まれる。
【０１４７】
既知の方法ステップ、慣行法ステップ、既知の方法または慣行法は、本発明の全ての態様、記載、または実施形態が、関連技術において開示、教示、または提示されていると認めることには決してならない。
【０１４８】
特定の実施態様についての前述の記載は、本発明の一般的性質を十分に明らかにすることになるので、当業者は（本明細書において引用されている参考文献の内容を含めて）当技術内における知識を適用することによって過度の実験を要せず、本発明の一般的概念から離れることなくかかる特定の実施形態を様々な適用のために容易に修飾および／または適用することができる。したがって、かかる適用および修飾は、本明細書において示されている教示および指針に基づいて、開示された実施形態と等価の範囲の意味にあることを意図する。本明細書における表現および専門用語は、記述の目的のためのものであって、限定されるものではなく、そして本明細書の表現および専門用語は、本明細書に記載されている教示および指針の点から、当技術分野における通常の技術の一つの知識と組み合わせて、当業者によって解釈されるものと理解され得る。
【実施例】
【０１４９】
実施例：無血清ＣＨＯ細胞上清由来の組み換え抗体の精製
実施例を通じて頻繁に使用される略語
Ａｂ：抗体
ＡＥＸ：陰イオン交換クロマトグラフィー
ＢＶ：総容積
ＣＥＸ：陽イオン交換クロマトグラフィー
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
Ｃｏｎｄ：伝導率
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法
ＨＣＰ：宿主細胞タンパク質
ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィー
Ｋ：カリウム
ｋＤ：キロダルトン
Ｎａ：ナトリウム
ＮａＡｃ：酢酸ナトリウム
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム
ＳＥ−ＨＰＬＣ：サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（Ａｂ凝集体の定量化）
ｐｐｍ：１００万分率
ｒｈ：組み換えヒト
ＲＴ：室温
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム  ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥ−ＨＰＬＣ：サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
ＵＶ：紫外線
【０１５０】
装置
Ａｋｔａエキスプローラー１００（ＧＥヘルスケア）
フラクションコレクターＦｒａｃ−９５０（ＧＥヘルスケア）
ＸＫ１６クロマトグラフィーカラム，直径１．６ｃｍ（ＧＥヘルスケア）
０．６６ｃｍクロマトグラフィーカラム（オムニフィット（Ｏｍｎｉｆｉｔ））
デジタルバランスＰＭ６１００（メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ））
７１２コンダクトメーター（メトローム（Ｍｅｔｒｏｈｍ））
７１３ｐＨメーター（メトローム）
【０１５１】
実施例１：捕獲ステップ−陽イオン交換クロマトグラフィー−溶出条件
陽イオン交換クロマトグラフィーを、ＣＨＯ細胞中で産生された抗ＣＤ２５組み換えヒトモノクローナル抗体（抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ）の捕獲のために使用した。この実験の目的は、溶出ステップの収率および純度（すなわちＨＣＰの量）に対して、溶出緩衝液のｐＨの効果を評価することである。５つの異なる溶出条件を、以下の手順に従って試験した：
【０１５２】
出発物質は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を含むヒトγ１重鎖可変領域、および配列番号２に記載されているアミノ酸配列を含むヒトカッパ軽鎖可変領域を有する抗ＣＤ２５ｒｈＡｂの浄化採取物であった。無血清条件下においてＣＨＯ細胞中で発現されたヒトモノクローナル抗体の分子量は、約１５０キロダルトン（ｋＤａ）であり、そして等電点（ｐＩ）は、約９であった。全ての操作を室温で行い、そして流速を１００ｃｍ／時間で、一定に維持した。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを全ての時間で記録した。
【０１５３】
カラム
フラクトゲルＥＭＤ  ＳＥハイキャップ（Ｍ）樹脂（メルク）を、直径０．６６ｃｍ、カラム高さ（ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ）４ｃｍの、体積１．４ｍｌのカラム中へ充填した。
【０１５４】
緩衝液
Ａ１＝ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０またはｐＨ８．０である、２０ｍＭクエン酸／リン酸
Ａ２＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ
Ｂ１＝２０ｍＭクエン酸／リン酸＋１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、６．０、７．０または８．０
【０１５５】
平衡化
カラムを、少なくとも１０ＢＶの十分な量の緩衝液Ａ１を用いて平衡化した。
【０１５６】
装填
約１ｇ／Ｌの滴定濃度である７０ｍｌの抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ採取物を、はじめに濃酢酸の添加によってｐＨ４．５に調節し、そして０．２２μｍで濾過された（ｃｏｎｄ．１５．０ｍＳ／ｃｍ）。装填用量は、充填された樹脂の１ｍｌあたり、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイによって決定されるように、４７ｍｇの抗ＣＤ２５ｒｈＡｂであった。
【０１５７】
洗浄ステップ
カラムを、少なくとも１０ＢＶの十分な量の緩衝液Ａ１を用いて洗浄した。
【０１５８】
溶出
カラムを、ｐＨ５．０、６．０、７．０、または８．０で、２５ＢＶの、緩衝液Ａ１から緩衝液Ｂ１への直線状のＮａＣｌ勾配（表１、列１参照）の後に、５ＢＶの緩衝液Ｂ１を用いて溶出した。１．４ｍｌのフラクションを回収した。
【０１５９】
再生および衛生化
カラムを５ＢＶの緩衝液Ａ２を用いて再生した。
【０１６０】
再平衡化
カラムを、少なくとも５ＢＶの十分な緩衝液Ａ１を用いて再平衡化した。
【０１６１】
結果
捕獲カラムからの抗ＣＤ２５ｒｈＡｂの溶出を、以下に記載する条件においてＮａＣｌ勾配を増加させることによって行なった。定組成溶離（ｐＨおよび塩濃度が一定である）も同様に試験した。
【０１６２】
【表２】
2010516651.tif 000003
【０１６３】
図１は、（定組成溶出を除いた）表１に示す条件での洗浄および溶出ステップ実験の重複クロマトグラムを示す。
【０１６４】
上の表１で示されるように、全ての溶出条件（塩勾配、または定組成）で得られた抗体収率は、７９％以上であった。ｐＨ８での洗浄ステップの後、勾配をかけた溶出によって、溶出ピークにおいて純度が２０５００ｐｐｍのＨＣＰとなり、ｐＨ５で得られたレベル、すなわち９７６００ｐｐｍよりも４．７倍低いレベルとなった。これらの結果は、ｐＨ８の条件に相当する、表１の最も大きい洗浄ピークと相関する。同一のｐＨ（表１）において、定組成溶離よりも勾配の使用により、より多くのＨＣＰの排除を可能とした。これは、ＨＣＰが洗浄ステップのみならず（６．４％）、溶出ピークの後部においても排除されるからである（２２．２％）。
【０１６５】
結論
洗浄および溶出条件が、著しいＨＣＰの排除を提供する一方で、産物の回収を最大化するように最適化された。
【０１６６】
実施例２：捕獲ステップ−陽イオン交換クロマトグラフィー−「スケールアップ」
実施例１の最適化された溶出条件を、１．４から２０ｍｌへスケールアップされたカラムを使用して、抗ＣＤ２５ｒｈＡｂを捕獲させるために使用した。
【０１６７】
出発物質は、無血清条件下で培養されたＣＨＯ細胞中で発現された抗ＣＤ２５ｒｈＡｂの浄化採取物であった。全ての操作を室温で行い、そして流速を１５０ｃｍ／時間で、一定に維持した。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを全ての時間で記録した。
【０１６８】
カラム
フラクトゲルＥＭＤ  ＳＥハイキャップ（Ｍ）樹脂（メルク）を、直径１．６６ｃｍ、カラム高さ１０ｃｍの、体積２０ｍｌのカラム中へ充填した。
【０１６９】
緩衝液
Ａ１＝１００ｍＭ  ＮａＡｃ  ＋  １２８ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０、伝導率１４．７ｍＳ／ｃｍ
Ａ２＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ  ＋  ２Ｍ  ＫＣｌ
Ａ３＝２０ｍＭリン酸、ｐＨ８．０
Ｂ１＝２０ｍＭリン酸  ＋  １Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
【０１７０】
平衡化
カラムを、少なくとも１０ＢＶの十分な量の緩衝液Ａ１を用いて（または標的となる、伝導率１４．７ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ４．０±０．１に到達するまで）平衡化した。
【０１７１】
装填
装填に先立って、約１ｇ／Ｌの滴定濃度であるＣＤ２５ｒｈＡｂ浄化採取物を、はじめに濃酢酸の添加によってｐＨ４．０に調節し、そして０．２２μｍで濾過された。カラムを、その動的容量の８０％で、すなわち１ｍあたり３６．７ｍｇの抗ＣＤ２５ｒｈＡｂで、１５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ調製採取物を用いて装填した。
【０１７２】
洗浄ステップ
カラムを、少なくとも２０ＢＶの十分な量の緩衝液Ａ３を用いて洗浄した。
【０１７３】
溶出
カラムを、２５ＢＶ以上で、緩衝液Ｂ１  ０〜１５％の濃度勾配（すなわち、２０ｍＭリン酸ｐＨ８中における、０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ）で溶出した。１５ｍｌのフラクションを回収した。
【０１７４】
再生化
カラムを、５ＢＶの緩衝液Ｂ１を１００％（すなわち１Ｍ  ＮａＣｌを）用いて再生した。
【０１７５】
衛生化
その後、カラムを少なくとも３ＢＶの緩衝液Ａ２（０．５Ｍ  ＮａＯＨ  ＋  ２Ｍ  ＫＣｌ）を用いて、上昇流モードで衛生化した。１時間のインキュベート後、カラムを２ＢＶの緩衝液Ａ２を用いて洗浄した。
【０１７６】
再平衡化
カラムを少なくとも５ＢＶの緩衝液Ａ１を用いて再平衡化した。
【０１７７】
結果
抗体収率、ＨＣＰおよび凝集体の排除に関する結果を表２に示す：
【０１７８】
【表３】
2010516651.tif 000004
【０１７９】
この捕獲ステップを、ｐＨ４．０における４７ｍｇ／ｍｌの５％漏出画分の、その限度容量に基づいたフラクトゲルＥＭＤ  ＳＥハイキャップ樹脂の選択によって最適化し（結果は示されていない）、そして、ｐＨ８の２０ｍＭリン酸ナトリウムを用いた洗浄およびｐＨ８．０でのＮａＣｌ勾配における溶出によって、ＨＣＰをより良く除去することができた。装填容量を最大化するために必要となる、浄化採取物のｐＨを４．０にする調節は、０．２２μｍのフィルター上における濾過によって除去される、重要な沈殿物の形成を引き起こす。しかし、沈殿物があったにもかかわらず、抗ＣＤ２５ｒｈＡｂの回収が９３％であった。
【０１８０】
捕獲ステップのクロマトグラムにおいて（図３）、洗浄ステップにおいて、２８０ｎｍの吸光度でかなりの量のピーク（すなわち、タンパク質）観察された。図２のＳＤＳ−ＰＡＧＥのプロファイルは、洗浄ステップによって、抗体の遊離の重鎖および遊離の軽鎖（それぞれ、約５０および２５ｋＤａのバンド）ならびにＨＣＰを含む、低分子量のタンパク質の除去ができたことを示している。これらの２つのバンドは、溶出ピーク（レーン７）には存在しない。洗浄ステップによって、（遊離の軽鎖および遊離の重鎖を含む）抗体断片ならびにＨＣＰの除去をすることができた（表２参照）。
【０１８１】
図２のレーン７に見られるように、抗ＣＤ２５ｒｈＡｂに相当する１５０ｋＤａの唯一つの主バンドが存在するため、溶出産物は比較的純粋である。
【０１８２】
捕獲ステップ後の抗体収率は８９％であった（表２）。洗浄ステップを用いて、そして溶出ピーク後部の切り取りによって、ＨＣＰレベルは、ｐＨ４で１０，０００ｐｐｍ未満の最終レベルに調節された純化採取物と比較して１１９倍減少した。最終的に、捕獲溶出液中の凝集体のレベルは０．２％であった。溶出ピークの後部は、高レベルの凝集体を含む、はっきりと見える肩を示し（クロマトグラム参照）、そしてこのフラクションが溶出フラクションと共に貯留されなければ、高純度の産物が得られる。
【０１８３】
結論
ＣＥＸ上の捕獲ステップのために開発された条件を用いて、以下の不純物はかなり低いレベルまで減少した：
ＨＣＰ（＜１０，０００ｐｐｍ）
凝集体（＜１％）
（非還元条件および銀染色下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによっては検出されない）重鎖および軽鎖のような抗体断片
【０１８４】
実施例３：３ステップの精製工程：ＣＥＸ−ＡＥＸ−ＨＩＣ（工程１）
３ステップの精製工程を、組み換え抗体の精製のために開発した。第一ステップであるＣＥＸ上の捕獲ステップの後に、２通りの可能な順番でＡＥＸおよびＨＩＣステップを行なった。
【０１８５】
３．１  ステップ１：陽イオン交換クロマトグラフィー
実施例２に記載されたとおりの捕獲ステップ。
【０１８６】
３．２  ステップ２：陰イオン交換クロマトグラフィー
出発物質
好適な装填用緩衝液（５ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ８．５）中で透析された、ＣＥＸ上における捕獲ステップ由来の溶出物は（実施例２）、陰イオン交換クロマトグラフィーのための出発物質として使用した。
【０１８７】
カラム
５０ＨＱ樹脂（アプライドバイオシステムズ）を、カラム高さ１０ｃｍのおよび直径１．６ｃｍのカラム中に２０ｍｌ容積分を充填した。
【０１８８】
全ての操作を室温で行い、そして流速を１５０ｃｍ／時間で維持した。２８０ｎｍでのＵＶシグナルは、全ての時間で記録された。
【０１８９】
緩衝液
Ａ１＝５ｍＭ  リン酸、ｐＨ８．５、伝導率１．１ｍＳ／ｃｍ
Ａ２＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ
Ａ３＝０．５Ｍ  リン酸、ｐＨ８．５
【０１９０】
平衡化
カラムを、少なくとも１０ＢＶの緩衝液Ａ１を用いて平衡化した（５ｍＭ  リン酸、ｐＨ８．５または標的伝導率１．１ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ８．５±１に到達するまで）。
【０１９１】
素通り画分中の抗ＣＤ２５ｒｈＡｂの装填、洗浄およびそれに付随する回収
カラムを、５ｍＭリン酸緩衝液中、１．５ｇ／Ｌの濃度である、ｐＨ８．５（ｐＨ８．５±０．１、伝導率１．１±１ｍＳ／ｃｍ）の捕獲前物質を用いて装填した。カラムをその後、１０ＢＶの緩衝液Ａ１で洗浄した。素通り画分および洗浄フラクションを回収した。
【０１９２】
溶出
カラムを、５ＢＶの緩衝液Ａ３を用いて溶出した。
【０１９３】
衛生化
カラムを、５ＢＶの緩衝液Ａ２を用いて衛生化した。
【０１９４】
前平衡化
カラムを、５ＢＶの緩衝液Ａ３を用いて前平衡化した。
【０１９５】
再平衡化
カラムを、５ＢＶの緩衝液Ａ１を用いて再平衡化した。
【０１９６】
３．３  ステップ２：疎水性相互作用クロマトグラフィー
出発物質
この精製ステップのために使用された出発物質は、陰イオン交換クロマトグラフィーの素通り画分であった（実施例３．２参照）。
【０１９７】
カラム
フェニルセファロース６ファストフローサブ樹脂（ＧＥヘルスケア）を、直径０．６６ｃｍおよびカラム高さ４ｃｍのカラムへ１．４ｍｌ容積分充填した。
【０１９８】
全ての操作を室温で行い、そして流速を１００ｃｍ／時間で一定に維持した。２８０ｎｍにおけるＵＶシグナルを、全ての時間で記録した。
【０１９９】
緩衝液
Ａ１＝１００ｍＭ  リン酸、ｐＨ７．０
Ａ２＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ
Ａ３＝１０ｍＭ  リン酸、ｐＨ７．０
Ｂ１＝１００ｍＭ  リン酸＋１Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4、ｐＨ７．０
【０２００】
平衡化
カラムを、緩衝液Ａ１と緩衝液Ｂ１（それぞれ５０％）との混合物１０ＢＶを用いて平衡化した。
【０２０１】
装填
緩衝液Ｂ１で２倍希釈された実施例３．２の陰イオン交換クロマトグラフィーの素通り画分を用いてカラムを装填した。カラムを、８０％の容量（すなわち、充填された樹脂１ｍｌあたり１６．３ｍｇの抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ）で装填した。
【０２０２】
洗浄ステップ
カラムを、緩衝液Ａ１と緩衝液Ｂ１との混合液（それぞれ５０％）を５ＢＶ用いて洗浄した。
【０２０３】
溶出
緩衝液Ｂ１を５０％〜０％の濃度勾配で２０ＢＶ以上用いて、カラムを溶出した。１ＢＶのフラクションを回収し、その後緩衝液Ａ３で洗浄した。
【０２０４】
衛生化および再生化
５ＢＶの緩衝液Ａ２を用いて衛生化。１時間のインキュベーションの後、カラムを３ＢＶの水を用いて洗浄した。
【０２０５】
再平衡化
カラムを、緩衝液Ａ１と緩衝液Ｂ１との混合液（それぞれ５０％）を５ＢＶ用いて再平衡化した。
【０２０６】
実施例４：３ステップの精製工程：ＣＥＸ−ＨＩＣ−ＡＥＸ（工程２）
この工程において、実施例２のＣＥＸ捕獲ステップの後に、ＨＩＣステップが行なわれ、そして最後にＡＥＸステップが行なわれた。実施例３．２および実施例３．３中に記載されているものと同一の手順に、幾つかの異なるパラメーターの例外を用いて行なった。
【０２０７】
４．１  ステップ１：陽イオン交換クロマトグラフィー
実施例２に記載されている通りの捕獲ステップ
【０２０８】
４．２  ステップ２：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ＣＥＸ上における捕獲ステップ（実施例２）由来の溶出液を、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸緩衝液中で透析濾過し、そして（約４倍に）濃縮した。上記実施例３．３中に記載されているステップをその後、以下の相違を伴って追随した：カラムサイズ、溶離（勾配の代わりに定組成）。
【０２０９】
カラム
フェニルセファロース６ファストフローサブ樹脂（ＧＥヘルスケア）を、直径１．６ｃｍおよびカラム高さ１０ｃｍのカラム中に２０ｍｌ容量分充填した。
【０２１０】
装填
透析濾過され、そしてｐＨ７．０の緩衝液Ｂ１（１００ｍＭリン酸＋１Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4）で２倍希釈されたＣＥＸ捕獲ステップ由来の溶出液を用いて装填した。カラムを、８０％の容量（すなわち、充填される樹脂１ｍｌあたり１６．３ｍｇの抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ）で装填した。
【０２１１】
溶出
１５ＢＶの緩衝液Ａ３を用いてカラムを溶出し、そして１５ｍｌのフラクションを回収した。
【０２１２】
４．２  ステップ３：陰イオン交換クロマトグラフィー
当該工程の最終ステップにおいて、小規模およびより低い流速（すなわち、１００ｃｍ／時）で、ＡＥＸを行なった。上の実施例３．２のステップを、幾つかの相違を除いて追随した：
【０２１３】
カラム
ポロス５０ＨＱ樹脂（アプライドバイオシステムズ）を、カラム高さ４ｃｍおよび直径０．６６ｃｍのカラム中に１．４ｍｌ容量分充填した。
【０２１４】
装填
カラムを、濃度２．４ｇ／Ｌ、ｐＨ８．５（ｐＨ８．５±０．１、伝導率１．１±１ｍＳ／ｃｍ）であって、５ｍＭリン酸緩衝液中で透析された、ＨＩＣステップ由来の溶出液（実施例４．２）を用いて装填した。
【０２１５】
結果（実施例３および４）
抗体精製のための２つの工程を試験した。両方の場合において、ＣＥＸ上の捕獲ステップの後に、以下の順番：ＡＥＸ−ＨＩＣ（工程１）またはＨＩＣ−ＡＥＸ（工程２）のうちの一つである２つのクロマトグラフィーステップを行なった。抗体収率、ＨＣＰおよび凝集体に関する、当該方法の結果を以下の表３に示す。
【０２１６】
【表４】
2010516651.tif 000005
【０２１７】
２８０ｎｍにおけるＯＤによって測定される当該方法の全体的な収率は、工程１において約５８％、そして工程２においては約６４％であった（表３）。両方の場合において、２０ｐｐｍ未満のＨＣＰを最終バルクにおいて得た（注記：捕獲溶出液のＨＣＰの値は、２つの異なるＣＥＸ溶出液が共に混合されている、表２における値とは異なる）。両方の方法における最終的な凝集体の量は、０．１％未満である。図４（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）は、工程１（レーン４）が、（非常に薄い軽鎖のバンドが存在する）Ａｂ標準（レーン２）と同程度の純度である最終バルクを与えることを示している。工程２において、遊離の軽鎖および遊離の重鎖を示すバンドは、視認可能であった。これらの結果を、図５における電気泳動図によって確認し（ラブチップ９０分析）、そしてそこで観察される主ピークが、精製された抗体に相当する。工程１によって得られた産物は、遊離の重鎖を含んでいない（点線のピーク２を参照）。以下の表４における値は、遊離の重鎖および遊離の軽鎖の濃度が非常に低い（＜１％）ことを裏付けている：
【０２１８】
【表５】
2010516651.tif 000006
【０２１９】
さらに、工程１からの、精製されたバルク中のＤＮＡレベル（Ａｂ１ｍｇあたり８．９ｐｇ）は、プロテインＡアフィニティ−ＣＥＸ−ＡＥＸによる方法を用いて得られたもの（Ａｂ１ｍｇあたり９．４ｐｇ）と同程度である（記載せず）。
【０２２０】
結論
ＣＥＸ−ＡＥＸ−ＨＩＣの順番からなる、工程１を用いて製造された精製バルクから得えられる純度（ＨＣＰ、凝集体、不完全断片、ＤＮＡ）は、プロテインＡアフィニティ−ＣＥＸ−ＡＥＸの順番からなる方法を用いたものと同程度である。
【０２２１】
全体の結論
ＣＥＸ上における抗体の捕獲ステップのために開発された条件を用いて、非常に低いレベルのＨＣＰ（＜１０．０００ｐｐｍ）および凝集体（＜１％）が得られることが示された。遊離の重鎖および遊離の軽鎖のような抗体断片は著しく減少し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検出不能となった。
【０２２２】
この最適化された捕獲ステップは、ＨＣＰ、凝集体および抗体断片に対して高純度の抗体を与える（＞９０％以上）。さらに、浄化採取物をｐＨ４（４７ｇ／Ｌ）で装填したときの捕獲カラムの高い動的容量は、このステップを非常に費用効率のよいものとする。
【０２２３】
ＡＥＸおよびＨＩＣステップを追加した３ステップの方法は、ＨＣＰ、凝集体および抗体断片に関して、プロテインＡ上のアフィニティクロマトグラフィーを用いた方法に匹敵する最終物質の純度を、しかしより低い費用で与える（資料未記載）。
【０２２４】
（工程１または２のいずれかにしたがった）３ステップの方法により、全体の０．１％未満への凝集体の減少、全体の１５〜２０ｐｐｍへのＨＣＰの減少、および全体の１％未満への遊離軽鎖および重鎖の減少した、高度に精製された抗ＣＤ２５ｒｈＡｂとなった。
【０２２５】
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１３．国際公開第０３／１０２１３２Ａ２号
１４．国際公開第２００４／０４５５１２号
１５．国際公開第２００５／００１０２５号
１６．国際公開第９２／１３０９５号
１７．国際公開第９７／１３８５２号
１８．国際公開第９８／２３７６１号
【配列表フリーテキスト】
【０２２６】
配列表の簡単な説明
配列番号１：抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ軽鎖可変領域（ＶＨ）。
配列番号２：抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ重鎖可変領域（ＶＬ）。
配列番号３：抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ重鎖可変領域のＣＤＲ１。
配列番号４：抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ重鎖可変領域のＣＤＲ２。
配列番号５：抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ重鎖可変領域のＣＤＲ３。
配列番号６：抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ軽鎖可変領域のＣＤＲ１。
配列番号７：抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ軽鎖可変領域のＣＤＲ２。
配列番号８：抗ＣＤ２５ｒｈＡｂ軽鎖可変領域のＣＤＲ３。
【図１】
2010516651.tif 000007
【図２】
2010516651.tif 000008
【図３】
2010516651.tif 000009
【図４】
2010516651.tif 000010
【図５】
2010516651.tif 000011
【配列表】
2010516651000001.app
【国際調査報告】
2010516651.tif 000012
2010516651.tif 000013
2010516651.tif 000014