(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロシロキサン化合物が形成した重合体を含む細胞培養基板であって、
前記シクロシロキサン化合物は、下記の化学式１で表され、
【化１】
0006401307.tif 000010
前記式において、
Ａは、
【化２】
0006401307.tif 000011
であり（ｎ＝１〜８の整数）；
Ｒ１は、互いに独立して水素またはＣ２−１０アルケニルであり；
Ｒ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、ハロ、金属元素、Ｃ５−１４ヘテロシクロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、またはＣ３−１０シクロアルケニルであり、
前記シクロシロキサンは、Ｒ１位置にｎ＋１個またはｎ＋２個のＣ２−１０アルケニルを有する細胞培養基板。
【請求項２】
前記シクロシロキサン化合物は、２，４，６，８−テトラ（Ｃ１−１０）アルキル−２，４，６，８−テトラ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、１，３，５−トリ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５−トリ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロトリシロキサン、１，３，５，７−テトラ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７−テトラ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロペンタシロキサン、１，３，５−トリ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５−トリ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロトリシロキサン、１，３，５，７−テトラ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７−テトラ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロペンタシロキサン、１，３，５−トリ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５−トリ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロトリシロキサン、１，３，５，７−テトラ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７−テトラ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロペンタシロキサン、ヘキサ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロトリシロキサン、オクタ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、デカ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロペンタシロキサン、及びこれらの組合せで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板。
【請求項３】
前記シクロシロキサン化合物が形成した重合体は、前記シクロシロキサン化合物である第１単量体と、これと重合することができる第２単量体と、が形成した共重合体であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板。
【請求項４】
前記第２単量体は、第１単量体と異なるシクロシロキサン化合物であることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養基板。
【請求項５】
前記第２単量体は、第１単量体との重合のための炭素二重結合を有する化合物であることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養基板。
【請求項６】
前記第２単量体は、ビニル基を有するシロキサン、メタクリレート系単量体、アクリレート系単量体、芳香族ビニル系単量体、アクリルアミド系単量体、無水マレイン酸、ビニル基を有するシラザンまたはシクロシラザン、ビニル基を有するＣ３−１０シクロアルカン、ビニルピロリドン、２−（メタクリロイルオキシ）アセト酢酸エチル、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、ビニルイミダゾール、ビニルピリジン、ビニル基を有するシラン、及びこれらの組合せで構成された群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の細胞培養基板。
【請求項７】
前記細胞培養基板は、細胞スフェロイド形態の細胞集合体の製造用であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の細胞培養基板上で細胞を培養する段階を含む細胞スフェロイド形態の細胞集合体の製造方法。
【請求項９】
前記細胞は、体細胞、生殖細胞、癌細胞または幹細胞であることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の化学式１で表されるシクロシロキサン化合物を単量体として含む重合体薄膜を蒸着を通じて基板上に形成させる段階を含む請求項１から９のいずれかに記載の細胞培養基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロシロキサン化合物が形成した重合体を含む細胞培養基板と、その製造方法、及び該細胞培養基板を用いて細胞スフェロイド形態の細胞集合体または誘導万能幹細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞培養は、動物体から生体組織を切り取って細胞を分離した後、培養器内で増殖させる過程を意味する。細胞の種類によって、寒天倍地などの基質に付着させて培養する方法と培養液に浮遊させる方法などがあるが、３次元培養細胞を得るための多様な培養法が多く研究された（非特許文献１）。
【０００３】
このような方法としては、コラーゲン、多孔性支持体（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、ヒドロゲルなどの支持体を用いる方法があり（非特許文献２〜４）、支持体に依存しない方法としては、細胞スフェロイド（ｃｅｌｌ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成する懸滴培養（ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ  ｃｕｌｔｕｒｅ）方式がある。前記懸滴培養方式は、支持体を使わないという長所はあるが、１ｍｍ以下の微小細胞組織のみ製造することができる限界がある。
【０００４】
最近、細胞の表面に付着するＲＧＤ塩基配列を有する磁化されたヒドロゲルとナノマイクロ粒子サイズの物質重合体とを用いた磁力浮上を基盤とする新たな培養法が開発された（非特許文献５）。しかし、この培養方法は、細胞表面に人工的な物質を付着しなければならない限界点がある。
【０００５】
一方、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、ｉＰＣＳ）とは、胚芽幹細胞とは異なって、受精卵や女性の卵子を使わず、倫理的問題から自由でありながらも、分化能力は、胚芽幹細胞と類似しているレベルである幹細胞である。これは、体細胞に遺伝子の変形を加えて胚芽幹細胞と類似している分化特性を有する幹細胞を誘導する方式で作られるが、その方法には、体細胞から分離した核と核を除去した卵子とを結合して胚芽幹細胞を作る方法と、体細胞に４種の遺伝子を注入する方法、そして、最近発表された外部環境的刺激を通じて分化能力を誘導する方法などが知られている。
【０００６】
既存の方法のうち、核置換方法は、成功率が低く、卵子を使うために、生命倫理的な論難から自由ではないという問題があり、同時に免疫反応が１つの問題点として指摘された。２０１２年ノーベル生理医学賞を受賞した日本京都大学の山中伸弥（やまなかしんや）教授研究チームによって、体細胞に４種の遺伝子発現因子を注入する方式で誘導万能幹細胞を作るには成功したが、ウイルスを用いるために、副作用として癌の発生が高くなるという短所を解決することができなかった状態である。また、細胞を採取し、幹細胞に逆分化させる過程を経て安定性を確保するためには、少なくとも６ヶ月の時間がかかるために、癌患者の治療に効果的に使われにくいという短所も存在する。
【０００７】
最近、日本で体細胞を遺伝子操作なしに弱酸性に浸して置くことだけで、如何なる細胞にも分化することができる万能細胞を誘導することができるという発表があったが、実験結果を操作したという論難があるなど現在としては信頼するほどの結果として見られる状態ではない。
【０００８】
このような研究に先立って、中国の研究チームによって、遺伝子を使わず、７種の小分子化合物を用いて誘導万能幹細胞を作った研究も存在するが、既存の遺伝子を用いた方法よりも注入される小分子化合物の数がさらに多いだけではなく、効率も既存の誘導万能幹細胞の誘導方法のように１％にも及ばないという限界を有している。
【０００９】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈａｙｃｏｃｋ  ＪＷ．．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，６９５（２０１１），ｐｐ．１−１５
【非特許文献２】Ｃｈｅｖａｌｌａｙ  Ｂ，Ｈｅｒｂａｇｅ  Ｄ．，Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｇ  Ｃｏｍｐｕｔ，３８（２）（２０００），ｐｐ．２１１−２１８
【非特許文献３】Ｍａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，１２（４）（２０１０），ｐｐ．７５３−７６０
【非特許文献４】Ｔｉｂｂｉｔｔ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１０３（４）（２００９），ｐｐ．６５５−６６３
【非特許文献５】Ｓｏｕｚａ  ＧＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，５（４）（２０１０），ｐｐ．２９１−２９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、前記問題点を解決するために鋭意努力した結果、シクロシロキサン化合物が形成した同種重合体または共重合体上で癌細胞、幹細胞及び体細胞のような多様な細胞を培養して、誘導万能幹細胞の初期分化段階として知られた細胞スフェロイドを形成させ、遺伝子及びタンパク質の発現分析を通じて、これら細胞スフェロイドがリプログラミングされたことを確認することによって、前記重合体を細胞培養のためのプラットフォームとして活用することができるということを確認し、本発明を完成した。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、細胞培養基板を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、細胞スフェロイド形態の細胞集合体の製造方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、誘導万能幹細胞の製造方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、細胞培養基板の製造方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一態様によれば、本発明は、シクロシロキサン化合物が形成した重合体を含む細胞培養基板を提供する。
【００１８】
本発明者らは、前記問題点を解決するために鋭意努力した結果、シクロシロキサン化合物が形成した同種重合体または共重合体上で癌細胞、幹細胞及び体細胞のような多様な細胞を培養して、誘導万能幹細胞の初期分化段階として知られた細胞スフェロイドを形成させ、遺伝子及びタンパク質の発現分析を通じて、これら細胞スフェロイドがリプログラミングされたことを確認することによって、前記重合体を細胞培養のためのプラットフォームとして活用することができるということを確認した。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、シクロシロキサン化合物が形成した重合体を含む細胞培養基板と、その製造方法、及び前記細胞培養基板を用いて細胞スフェロイド形態の細胞集合体または誘導万能幹細胞を製造する方法を提供する。
（ｉｉ）本発明の細胞培養基板上で細胞を培養することによって、容易に細胞スフェロイド形態の細胞集合体を形成させ、さらに前記細胞培養基板は、誘導万能幹細胞の製造のための細胞培養プラットフォームとして活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施例による細胞培養基板の模式図を示す。
【図２】蒸着前後の細胞培養基板の表面接触角を測定した結果を示す。
【図３】本発明の細胞培養基板上で培養して形成された細胞スフェロイドのイメージを示す。
【図４】免疫染色法を通じる細胞スフェロイドの分析結果を示す。スケールバーは、１００μｍである。
【図５】免疫染色法を通じる細胞スフェロイドの分析結果を示す。スケールバーは、１００μｍである。
【図６】細胞スフェロイドの遺伝子の分析結果を示す。
【図７】細胞スフェロイドのタンパク質の分析結果を示す。
【図８】細胞スフェロイドでＮａｎｏｇが発現されたことを示す。スケールバーは、１００μｍである。
【図９】多様なシクロシロキサン化合物が形成した重合体で表面コーティングされたそれぞれの細胞培養基板上で培養して形成された細胞スフェロイドのイメージを示す。
【図１０】シクロシロキサン化合物を含む多様な共重合体で表面コーティングされたそれぞれの細胞培養基板上で培養して形成された細胞スフェロイドのイメージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書で使われた表現、“シクロシロキサンが形成した重合体を含む細胞培養基板”は、シクロシロキサンが形成した重合体が細胞培養基板の一部である場合（例えば、前記重合体で表面がコーティングされた細胞培養基板）を意味するだけではなく、シクロシロキサンが形成した固相の重合体自体を細胞培養基板として使えるということを意味するために使われる。
【００２２】
本発明によれば、前記細胞培養基板は、細胞を培養することができる任意の空間を提供することで十分であるために、その形態は制限もない。例えば、前記細胞培養基板は、ディッシュ（培養皿）、シャレープレート（例えば、６ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、９６００ウェルなどのマイクロタイタープレート、マイクロプレート、ディープウェルプレートなど）、フラスコ、チャンバスライド、チューブ、セルファクトリー、ローラーボトル、スピナーフラスコ、中空繊維（ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒｓ）、マイクロキャリア、ビーズなどの形状を有しうる。
【００２３】
また、支持性を有する物質であれば、前記細胞培養基板として制限なしに使い、例えば、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、金属、シリコン及びガラスなどを細胞培養基板として使うことができる。本発明の一実施例による細胞培養基板の構造は、図１に示されている。
【００２４】
本明細書で使われた表現、“シクロシロキサン化合物が形成した重合体”は、（ｉ）同種のシクロシロキサン化合物が重合して形成した同種重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）、（ｉｉ）異種のシクロシロキサン化合物が重合して形成した共重合体（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、及び（ｉｉｉ）同種または異種のシクロシロキサン化合物と他の単量体化合物とが重合して形成した共重合体をいずれもを包括する意味として使われる。本明細書で、前記共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互共重合体またはグラフト共重合体であり得るが、これらに制限されるものではない。
【００２５】
したがって、本発明の一具現例によれば、前記シクロシロキサン化合物が形成した重合体は、同種のシクロシロキサン化合物が重合して形成した同種重合体である。
【００２６】
本発明の他の一具現例によれば、前記シクロシロキサン化合物が形成した重合体は、前記シクロシロキサン化合物である第１単量体と、これと重合することができる第２単量体と、が形成した共重合体である。下記の実施例から確認したように、シクロシロキサン化合物を含む共重合体上で細胞を培養することによって、細胞スフェロイド形態の細胞集合体を製造することができる（図１０参照）。
【００２７】
１つの特定例によれば、前記第２単量体は、第１単量体と異なるシクロシロキサン化合物である（異種のシクロシロキサン化合物が形成した共重合体）。
【００２８】
他の１つの特定例によれば、前記第２単量体は、第１単量体との重合のための炭素二重結合を有する化合物である。この際、第１単量体も、第２単量体との重合のための炭素二重結合を有しうる。このような第２単量体化合物は、例えば、ビニル基を有するシロキサン（例えば、ヘキサビニルジシロキサン、テトラメチルジシロキサンなど）、メタクリレート系単量体、アクリレート系単量体、芳香族ビニル系単量体（例えば、ジビニルベンゼン、安息香酸ビニル、スチレンなど）、アクリルアミド系単量体（例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドなど）、無水マレイン酸、ビニル基を有するシラザンまたはシクロシラザン（例えば、２，４，６−トリメチル−２，４，６−トリビニルシクロシルラザンなど）、ビニル基を有するＣ３−１０シクロアルカン（例えば、１，２，４−トリビニルシクロヘキサンなど）、ビニルピロリドン、２−（メタクリロイルオキシ）アセト酢酸エチル、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、ビニルイミダゾール、ビニルピリジン、ビニル基を有するシラン（例えば、アリルトリクロロシラン、アクリロキシメチルトリメトキシシランなど）、及びこれらの組合せで構成された群から選択されうる。
【００２９】
前記メタクリレート系単量体には、例えば、メタクリレート、メタクリル酸、グリシジルメタクリレート、パーフルオロメタクリレート、ベンジルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、フルフリルメタクリレート、３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０−ヘプタデカフルオロデシルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、無水メタクリル酸、ペンタフルオロフェニルメタクリレート、プロペニルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレート、ブチルメタクリレート、メタクリロイルクロリド、及びジ（エチレングリコール）メチルエステルメタクリレートなどがある。
【００３０】
前記アクリレート系単量体には、例えば、アクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、エチレングリコールジアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，７Ｈ−ドデカフルオロヘプチルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，７Ｈ−ドデカフルオロヘプチルアクリレート、イソボニルアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、１Ｈ，１Ｈ，７Ｈ−ドデカフルオロヘプチルアクリレート、及びプロペニルアクリレートなどがある。
【００３１】
本発明の共重合体は、本明細書で言及した単量体以外に他の単量体を共単量体として追加含みうる。
【００３２】
本発明の一具現例によれば、前記共重合体には、シクロシロキサン化合物が少なくとも５０％以上含有される。１つの特定例によれば、前記共重合体には、シクロシロキサン化合物が少なくとも６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上含有される。このような含有量は、流量（ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ；単位：ｓｃｃｍ）を基準とし、９０％は、９：１の流量比率（シクロシロキサン化合物：他の単量体）で各単量体を流動させて（流した）形成された共重合体に含まれたシクロシロキサン化合物の含有量を意味し、８０％は、８：１の流量比率で、７０％は、７：１の流量比率で、６０％は、６：１の流量比率で流動させて形成された共重合体に含まれたシクロシロキサン化合物の含有量を意味する。
【００３３】
本明細書で使われた用語、“シクロシロキサン化合物”は、シクロシロキサン構造を基本骨格として有しながら、そのケイ素原子位置に官能基（例えば、アルキル基、アルケニル基など）を有する化合物を包括するために使われる。
【００３４】
本発明の一具現例によれば、前記シクロシロキサン化合物は、下記の化学式１で表される。
【化１】
0006401307.tif 000002
前記式において、
Ａは、
【化２】
0006401307.tif 000003
であり（ｎ＝１〜８の整数）；
Ｒ１は、互いに独立して水素またはＣ２−１０アルケニルであり（但し、Ｒ１のうち少なくとも２箇所は、Ｃ２−１０アルケニルである）；
Ｒ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、ハロ、金属元素、Ｃ５−１４ヘテロシクロ、Ｃ３−１０シクロアルキル、またはＣ３−１０シクロアルケニルである。
【００３５】
本明細書で使われた用語、“アルキル”は、直鎖状または分枝鎖状の非置換または置換の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソブチル、ペンチルまたはヘキシルなどを含む。Ｃ１〜Ｃ１０アルキルは、炭素数１〜１０のアルキルユニットを有するアルキル基を意味し、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルが置換された場合、置換体の炭素数は含まれていないものである。
【００３６】
本発明の一具現例によれば、本明細書で、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００３７】
本明細書で使われた用語、“アルケニル”は、指定された炭素数を有する直鎖状または分枝鎖状の非置換または置換の不飽和炭化水素基を示し、例えば、ビニル、プロペニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ｔ−ブテニル、ｎ−ペンテニル及びｎ−ヘキセニルを含む。Ｃ２−１０アルケニルは、炭素数１〜１０のアルケニルユニットを有するアルケニル基を意味し、Ｃ２−１０アルケニルが置換された場合、置換体の炭素数は含まれていないものである。
【００３８】
本発明の一具現例によれば、本明細書で、Ｃ２−１０アルケニルは、Ｃ２−８アルケニル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−５アルケニル、Ｃ２−４アルケニルまたはＣ２−３アルケニルである。
【００３９】
本発明の一具現例によれば、前記Ｒ１のうち少なくとも３箇所は、Ｃ２−１０アルケニルである。
【００４０】
本発明の一具現例によれば、前記シクロシロキサンは、Ｒ１位置にｎ＋１個またはｎ＋２個のＣ２−１０アルケニルを有する。例えば、ｎが２である場合、化学式１の化合物は、Ｒ１位置に３または４個のＣ２−１０アルケニルを有するシクロテトラシロキサンになる。このようなアルケニル基は、重合反応に関与する。
【００４１】
本明細書で使われた用語、“ハロ”は、ハロゲン族元素を示し、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを含む。
【００４２】
本明細書で使われた用語、“金属元素”は、アルカリ金属元素（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ）、アルカリ土類金属元素（Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ）、アルミニウム族元素（Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）、錫族元素（Ｓｎ、Ｐｂ）、貨幣金属元素（Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）、亜鉛族元素（Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ）、希土類元素（Ｓｃ、Ｙ、５７−７１）、チタン族元素（Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ）、バナジウム族元素（Ｖ、Ｎｂ、Ｔａ）、クロム族元素（Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ）、マンガン族元素（Ｍｎ、Ｔｃ、Ｒｅ）、鉄族元素（Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ）、白金族元素（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ）、及びアクチノイド元素（８９〜１０３）のような金属性単元素物質を作る元素を意味する。
【００４３】
本明細書で使われた用語、“ヘテロシクロ”は、一部または完全に飽和されたモノサイクル型またはバイサイクル型の５員〜１４員のヘテロシクロ環を意味する。Ｎ、Ｏ及びＳは、ヘテロ原子の例である。ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、テトラゾール、１，２，３，５−オキサチアジアゾール−２−オキシド、トリアゾール、オキサジアゾール、イソオキサゾール、オキサチアゾリジンジオン、３−ヒドロキシピロ−２，４−ジオン、５−オキソ−１，２，４−チアジアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、インドール、イソインドール、インダゾール、フタラジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン及びカルボリンは、Ｃ５−１４ヘテロシクロの例である。
【００４４】
本明細書で使われた用語、“シクロアルキル”は、サイクリック炭化水素ラジカルを意味し、これは、シクロプロピル、シクロブチル及びシクロペンチルを含む。Ｃ３−１０シクロアルキルは、リング構造を形成する炭素数が３〜１０であるシクロアルキルを意味し、Ｃ３−１０シクロアルキルが置換された場合、置換体の炭素数は含まれていないものである。
【００４５】
本発明の一具現例によれば、本明細書で、Ｃ１〜Ｃ１０シクロアルキルは、Ｃ１〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ７シクロアルキル、またはＣ１〜Ｃ６シクロアルキルである。
【００４６】
本明細書で使われた用語、“シクロアルケニル”は、少なくとも１つの二重結合を有するサイクリック炭化水素基を意味し、例えば、シクロペンテン、シクロへキセン及びシクロヘキサジエンを含む。Ｃ３−１０シクロアルケニルは、リング構造を形成する炭素数が３〜１０であるシクロアルケニルを意味し、Ｃ３−１０シクロアルケニルが置換された場合、置換体の炭素数は含まれていないものである。
【００４７】
本発明の一具現例によれば、本明細書で、Ｃ２−１０シクロアルケニルは、Ｃ２−８シクロアルケニル、Ｃ２−６シクロアルケニル、Ｃ２−５シクロアルケニル、Ｃ２−４シクロアルケニル、またはＣ２−３シクロアルケニルである。
【００４８】
本発明の一具現例によれば、前記Ｒ２は、互いに独立して水素、Ｃ１−１０アルキルまたはＣ２−１０アルケニルである。１つの特定例によれば、前記Ｒ２のうち少なくとも２箇所または少なくとも３箇所は、Ｃ１−１０アルキルまたはＣ２−１０アルケニルであり得る。１つの特定例によれば、前記シクロシロキサンは、Ｒ２位置にｎ＋１個またはｎ＋２個のＣ１−１０アルキルまたはＣ２−１０アルケニルを有しうる。
【００４９】
本発明の一具現例によれば、前記ｎは、１〜７の整数、１〜６の整数、１〜５の整数、１〜４の整数、または１〜３の整数である。
【００５０】
本発明の一具現例によれば、前記シクロシロキサン化合物は、２，４，６，８−テトラ（Ｃ１−１０）アルキル−２，４，６，８−テトラ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、１，３，５−トリ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５−トリ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロトリシロキサン、１，３，５，７−テトラ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７−テトラ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロペンタシロキサン、１，３，５−トリ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５−トリ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロトリシロキサン、１，３，５，７−テトラ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７−テトラ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロペンタシロキサン、１，３，５−トリ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５−トリ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロトリシロキサン、１，３，５，７−テトラ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７−テトラ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ１−１０）アルキル−１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロペンタシロキサン、ヘキサ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロトリシロキサン、オクタ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロテトラシロキサン、デカ（Ｃ２−１０）アルケニルシクロペンタシロキサン、及びこれらの組合せで構成された群から選択される。
【００５１】
１つの特定例によれば、前記シクロシロキサン化合物は、２，４，６，８−テトラ（Ｃ１−６）アルキル−２，４，６，８−テトラ（Ｃ２−４）アルケニルシクロテトラシロキサン（一例として、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサン）、１，３，５−トリ（Ｃ１−６）アルキル−１，３，５−トリ（Ｃ２−４）アルケニルシクロトリシロキサン（一例として、１，３，５−トリイソプロピル−１，３，５−トリビニルシクロトリシロキサン）、１，３，５，７−テトラ（Ｃ１−６）アルキル−１，３，５，７−テトラ（Ｃ２−４）アルケニルシクロテトラシロキサン（一例として、１，３，５，７−テトライソプロピル−１，３，５，７−テトラビニルシクロテトラシロキサン）、１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ１−６）アルキル−１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ２−４）アルケニルシクロペンタシロキサン（一例として、１，３，５，７，９−ペンタイソプロピル−１，３，５，７，９−ペンタビニルシクロペンタシロキサン）、１，３，５−トリ（Ｃ１−６）アルキル−１，３，５−トリ（Ｃ２−４）アルケニルシクロトリシロキサン（一例として、１，３，５−トリ−ｓｅｃ−ブチル−１，３，５−トリビニルシクロトリシロキサン）、１，３，５，７−テトラ（Ｃ１−６）アルキル−１，３，５，７−テトラ（Ｃ２−４）アルケニルシクロテトラシロキサン（一例として、１，３，５，７−テトラ−ｓｅｃ−ブチル−１，３，５，７−テトラビニルシクロテトラシロキサン）、１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ１−６）アルキル−１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ２−４）アルケニルシクロペンタシロキサン（一例として、１，３，５，７，９−ペンタ−ｓｅｃ−ブチル−１，３，５，７，９−ペンタビニルシクロペンタシロキサン）、１，３，５−トリ（Ｃ１−６）アルキル−１，３，５−トリ（Ｃ２−４）アルケニルシクロトリシロキサン（一例として、１，３，５−トリエチル−１，３，５−トリビニルシクロトリシロキサン）、１，３，５，７−テトラ（Ｃ１−６）アルキル−１，３，５，７−テトラ（Ｃ２−４）アルケニルシクロテトラシロキサン（一例として、１，３，５，７−テトラエチル−１，３，５，７−テトラビニルシクロテトラシロキサン）、１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ１−６）アルキル−１，３，５，７，９−ペンタ（Ｃ２−４）アルケニルシクロペンタシロキサン（一例として、１，３，５，７，９−ペンタエチル−１，３，５，７，９−ペンタビニルシクロペンタシロキサン）、ヘキサ（Ｃ２−４）アルケニルシクロトリシロキサン（一例として、ヘキサビニルシクロトリシロキサン）、オクタ（Ｃ２−４）アルケニルシクロテトラシロキサン（一例として、オクタビニルシクロテトラシロキサン）、デカ（Ｃ２−４）アルケニルシクロペンタシロキサン（一例として、デカビニルシクロペンタシロキサン）、及びこれらの組合せで構成された群から選択される。
【００５２】
本発明の一具現例によれば、前記細胞培養基板は、細胞スフェロイド形態の細胞集合体の製造のための細胞培養基板である。分化または未分化細胞を、本発明の細胞培養基板上で培養して、細胞スフェロイド形態の細胞集合体を形成させることができる。
【００５３】
本発明の一具現例によれば、前記細胞培養基板は、誘導万能幹細胞の製造のための細胞培養基板である。体細胞、生殖細胞、癌細胞などの分化された細胞を、本発明の細胞培養基板上で培養して、これら分化細胞から万能幹細胞を誘導（形成）することができる。
【００５４】
本発明の一具現例によれば、前記シクロシロキサン化合物が形成した重合体は、細胞培養基板の上にコーティングされる。このような重合体の表面コーティングは、当該分野によく知られた化学気相蒸着法でなされうる。
【００５５】
本発明の一具現例によれば、前記細胞培養基板は、細胞培養のための培養器具（培養装置）内に備えられうる。
【００５６】
本発明の一具現例によれば、前記細胞培養基板は、水接触角が９０°以上（例えば、９０〜１００°）である。
【００５７】
本発明の他の態様によれば、本発明は、本発明の細胞培養基板上で細胞を培養する段階を含む細胞スフェロイド形態の細胞集合体の製造方法を提供する。
【００５８】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の細胞培養基板上から分化された細胞を培養する段階を含む誘導万能幹細胞の製造方法を提供する。
【００５９】
本発明の一具現例によれば、前記細胞の培養は、培地で実施する。すなわち、細胞の培養は、培地の存在下でシクロシロキサンが形成した重合体上でなされる。本明細書で使われた用語、“培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）”は、体外培養条件で細胞の生存を支持させうる培養液を意味し、細胞の培養に適切な当分野で使われる通常の培地をいずれも含む。また、細胞の種類によって、培地と培養条件とを異なるように選択することができる。培養に使われる培地としては、例えば、細胞培養最小培地（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ；ＣＣＭＭ）を使い、前記細胞培養最小培地は、一般的に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地には、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、αＭＥＭ（α  Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、及びＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍなどがある。
【００６０】
細胞の培養方法や培養条件は、本発明の細胞培養基板を使う点を除けば、通常の細胞培養方法や培養条件をそのまま使うことができる。動物細胞の培養方法及び培養条件は、当該分野によく知られた参考書籍であるＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第３版（Ｍａｓｔｅｒｓ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に示されており、細胞培養のための試薬及びキット類は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社などの販売業者から入手可能である。
【００６１】
細胞の培養は、細胞スフェロイド形態の細胞集合体が形成されるまでなされ、例えば、１０時間〜６０時間（一例として、１０時間〜４８時間、または２０時間〜４８時間）の間になされうる。
【００６２】
本発明の一具現例によれば、前記分化された細胞は、体細胞または癌細胞である。前記体細胞は、生体を構成する細胞のうち、生殖細胞以外のあらゆる細胞を含む。１つの特定例によれば、前記体細胞は、哺乳類（例えば、マウス、ラット、兎、豚、羊、山羊、牛、猿及びヒト）の体細胞である。
【００６３】
本発明の一具現例によれば、細胞スフェロイド形態の細胞集合体の製造のために、本発明の細胞培養基板上で培養される細胞は、分化された細胞（例えば、体細胞、生殖細胞、癌細胞）または未分化細胞（例えば、間葉幹細胞と脂肪由来幹細胞のような幹細胞）である。
【００６４】
本発明の一具現例によれば、前記細胞スフェロイドは、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４またはＮａｎｏｇを発現する。
【００６５】
本発明の一具現例によれば、前記細胞スフェロイドは、β−カテニンとサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）タンパク質の付着細胞に比べて、さらに高いレベルに発現する。
【００６６】
下記の実施例では、重合体薄膜が蒸着された細胞培養基板で体細胞を培養して、細胞スフェロイド形態の集合体を形成させた後、細胞スフェロイドの遺伝子及びタンパク質の発現の態様が、本来の細胞と差があることを確認して、細胞がリプログラミングされたことを確認した（図３ないし図８参照）。また、ラット由来の線維芽細胞を前記細胞培養基板で培養した結果、未分化多能性幹細胞で必ず発現されなければならない遺伝子であるＯＣＴ４とＮａｎｏｇとが発現されたことを確認し（図５及び図８参照）、ＲＴ−ＰＣＲを通じて遺伝子レベルでも多能性と関連した遺伝子であるＳＯＸ２の発現を確認した（図６参照）。
【００６７】
誘導万能幹細胞の形成を確認する方法（細胞多能性を確認する方法）としては、ＡＰ染色、細胞蛍光染色、幹細胞−特異的遺伝子発現及びウイルス遺伝子サイレンシングの定量ＰＣＲ分析、キメラ形成分析、及び生殖系トランスミッション検出などの方法を利用できる。
【００６８】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、シクロシロキサン化合物を単量体として含む重合体薄膜を蒸着を通じて基板上に形成させる段階を含む本発明の細胞培養基板の製造方法を提供する。
【００６９】
本発明の一具現例によれば、前記重合体薄膜は、化学気相蒸着法で基板上に形成される。一例として、前記重合体薄膜は、開始剤を用いる化学気相蒸着法（ｉＣＶＤ）で基板上に形成されうる。ｉＣＶＤは、工程全体で添加剤や溶媒が全く使われず、生成された高分子薄膜の純度が非常に高いために、細胞培養への適用において、有害な溶媒を使わないという長所がある。ｉＣＶＤによる蒸着は、重合体薄膜が蒸着される基板表面の温度を３５〜４５℃、反応器内のチャンバの圧力を２００〜２５０ｍｂａｒに保持しながら、３０〜６０分間実施することができる。
【００７０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００７１】
実施例
実施例１．重合体薄膜が表面コーティングされた細胞培養基板の製造
図１に示すように、化学気相蒸着反応器（ｉＣＶＤ、Ｄａｅｋｉ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）の単量体タンクに単量体であるＶ４Ｄ４（２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れ、７０℃に加熱した。ＴＢＰＯ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を開始剤として、それを開始剤タンクに入れて常温で保持した。ポリスチレン細胞培養プレートを基板として蒸着を進行した。Ｖ４Ｄ４蒸着時に、Ｖ４Ｄ４単量体とＴＢＰＯとを１：１の比率（流量基準、単位：ｓｃｃｍ）で化学気相蒸着反応器内に流しながら、反応器内のフィラメントの温度を２００℃、反応器内の基板温度を４０℃、反応器内のチャンバの圧力を２００ｍｂａｒに保持しながら、４０分蒸着を行って、約２００ｎｍ厚さのｐＶ４Ｄ４（ｐｏｌｙ−Ｖ４Ｄ４）が蒸着された細胞培養基板を製造した。
【００７２】
実施例２．接触角の測定
重合体薄膜を蒸着した後、接触角の測定装備（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｓ．Ｅ．Ｏ．Ｃｏ．Ｌｔｄ）を用いて、各測定ごとに８μｌ蒸溜水の水泡を基板の表面に落とし、基板の表面接触角を測定した。
【００７３】
その結果、図２に示されたように、シリコンウェーハ表面の重合体薄膜蒸着前後の接触角の写真を比較する時、重合体薄膜が基板の表面に均一に塗布されながら、接触角が蒸着後に変わることを確認することができた（図２）。
【００７４】
実施例３．細胞スフェロイドの形成
実施例１で製造した重合体薄膜が蒸着された細胞培養基板（皿）で細胞を培養した後、細胞スフェロイドの形成の有無を確認した。使った細胞は、図３に示したヒト由来の癌細胞、幹細胞、体細胞、及びラット由来の体細胞と癌細胞である。癌細胞の培養は、最小培地（ＣＣＭＭ）に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ）及び５％の１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ）を添加した組成の培地を使って実施し、ＮＩＨ３Ｔ３のような体細胞とｈＭＳＣ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）とｈＡＤＳＣ（Ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）のような幹細胞の培養は、下記の表１（ヒト幹細胞）及び表２（ラット幹細胞）に示した組成の培地（Ｇｉｂｃｏ）を使って実施した。培養は、２４時間実施した。
【００７５】
【表１】
0006401307.tif 000004
【００７６】
【表２】
0006401307.tif 000005
【００７７】
図３に示されたように、重合体薄膜上で多様な細胞を培養した結果、培養２４時間内に特定細胞に限定されず、あらゆる細胞で細胞スフェロイド形態の細胞集合体が得られた（図３）。
【００７８】
実施例４．細胞スフェロイドの免疫蛍光染色
実施例１で製造した重合体薄膜が蒸着された細胞培養基板（皿）から得られた細胞スフェロイドを免疫蛍光染色法を通じて染色した。免疫蛍光染色法のために、細胞スフェロイドを０．１％ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）でコーティングされたカバーガラス（Ｃｏｖｅｒ  ｇｌａｓｓ）に移して一日間培養した。細胞を室温で１０分間４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を用いて固定させた。ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ｀ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）を用いて３回洗浄した後に、１５分間室温で０．１％トリトン  Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に細胞透過させ、再びＤＰＢＳを用いて３回洗浄した。１次抗体の非特異的反応を防ぐために１０分間１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を処理した。細胞をＤＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで希釈させたテネイシン（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）に付着する１次抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を使って４℃で１２時間反応した。洗浄後、細胞を１時間室温でＤＰＢＳに希釈させたＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）が付着された２次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を使って反応した。洗浄した後、細胞をＤＰＢＳに２μｇ／ｍｌで希釈させたＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に５分間対比染色した。カバーガラスは、マウンティングミディアム（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いてスライドガラス（Ｓｌｉｄｅ  ｇｌａｓｓ）上に固定してニコン共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で分析した。使われた抗体を、表３に示した。
【００７９】
【表３】
0006401307.tif 000006
【００８０】
その結果、図４及び図５に示されたように、本来の細胞とは変わった遺伝子の発現現象が、細胞スフェロイドの内部に存在するということを確認した（図４及び図５）。
【００８１】
実施例５．細胞スフェロイドの遺伝子分析
実施例１で製造した重合体薄膜が蒸着された細胞培養基板（皿）から得られた細胞スフェロイドを対象にして遺伝子分析を実施した。全体ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）は、Ｈｙｂｒｉｄ−ＲＴＭキット（ＧｅｎｅＡｌｌ）を使って形成された細胞スフェロイドから抽出した。ｃＤＮＡ合成は、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使って行った。重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、次の条件によってＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒｓ  ＰＣＲ機械（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使って行った。４２℃で６０分間ｃＤＮＡ合成を、次いで９５℃で５分間あらかじめ変性過程（ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）を、再び９５℃で３０秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｏｎ）を、５５℃で３０秒間熱処理過程（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）を、７２℃で１０秒間延長過程（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を終えて変性過程への繰り返しを３５周期（ｃｙｃｌｅｓ）実施し、７２℃で５分間最後延長した。使ったプライマーを、表４に示した。
【００８２】
【表４】
0006401307.tif 000007
【００８３】
その結果、図６に示されたように、既存のＰＳ細胞培養皿で培養された細胞に比べて、遺伝子の発現程度が変わり（図６）、このような結果は、細胞がリプログラミングされたことを示す。
【００８４】
実施例６．細胞スフェロイドのタンパク質分析
実施例１で製造した重合体薄膜が蒸着された細胞培養基板（皿）から得られた細胞スフェロイドをタンパク質レベルで分析した。形成された細胞スフェロイドをタンパク質分解酵素抑制剤混合物（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれたＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、氷で１５分間培養した後、４℃で１０分間２０，０００ｇで遠心分離した。上澄み液を分離してＢｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使ってタンパク質濃度を測定した。分離されたタンパク質をＳＤＳ  ＰＡＧＥに分画し、４℃で電気移動装置を用いてＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）メンブレイン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でタンパク質を移動させた。膜を室温で３０分間０．１％トウイーン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）と５％脱脂乳（Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）とが含まれたＰＢＳで反応させ、４℃で１２時間５％脱脂乳が含まれたＰＢＳに希釈された１次抗体（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｂｅｔａ  ｃａｔｅｎｉｎ、ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｓｕｒｖｉｖｉｎ）を反応させた。０．１％トウイーン−２０が含まれたＰＢＳで３回洗浄した後、膜をＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付着された２次抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）で室温で１時間反応した。前記バンドをＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）溶液で視覚化した。バンドをＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ  ＭＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使ってタンパク質密度を分析し、ローディング対照群（ＧＡＰＤＨ）バンドで標準化した。使われた抗体を、前記表３に示した。
【００８５】
その結果、図７に示されたように、既存のＰＳ細胞培養皿で培養された細胞に比べて、タンパク質の発現程度が変わり（図７）、このような結果は、細胞がリプログラミングされたことを示す。
【００８６】
実施例７．マウス胚芽線維芽細胞の細胞スフェロイドの形成
Ｎａｎｏｇが発現されれば、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）が同時に発現されるように遺伝子変形された雌ラット（ＳＴＯＣＫ  Ｔｇ（Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ，Ｐｕｒｏ）１Ｙａｍ（Ｎｏ．ＲＢＲＣ０２２９０）、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）で、妊娠後、１６日目の胚芽状態のラットを採取して体細胞（Ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を培養した。実施例１から製作された重合体薄膜が蒸着された細胞培養基板（皿）で７日間培養する間に、培養液を１回交換した。細胞培養液の場合、表２に示した培養成分が含まれたラット幹細胞の培養液を使った。培養７日目に形成された細胞スフェロイドは、共焦点顕微鏡で観察するために、固定液（４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を使って固定し、該固定された細胞スフェロイドを共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。
【００８７】
その結果、図８に示されたように、形成された細胞スフェロイドで緑色蛍光タンパク質が発現されることを確認し（図８）、このような結果は、幹細胞の標識因子の１つであるＮａｎｏｇが、細胞スフェロイド内で発現されることを示す。
【００８８】
実施例８．多様なシクロシロキサン重合体の細胞スフェロイドの形成効果
実施例１のように、化学気相蒸着反応器（ｉＣＶＤ、Ｄａｅｋｉ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）の単量体タンクに単量体である表５のシクロシロキサン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れ、７０℃に加熱した。ＴＢＰＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を開始剤として、それを開始剤タンクに入れて常温で保持した。ポリスチレン細胞培養プレートを基板として蒸着を進行した。蒸着時に、単量体とＴＢＰＯとを１：１の比率（流量基準、単位：ｓｃｃｍ）で化学気相蒸着反応器内に流しながら、反応器内のフィラメントの温度を２００℃、反応器内の基板温度を４０℃、反応器内のチャンバの圧力を２００ｍｂａｒに保持しながら、４０分蒸着を行って、約２００ｎｍ厚さのシクロシロキサン重合体が蒸着された細胞培養基板を製造した。
【００８９】
【表５】
0006401307.tif 000008
【００９０】
以後、シクロシロキサン重合体薄膜が蒸着された細胞培養基板で細胞を培養した後、細胞スフェロイドの形成の有無を確認した。使った細胞は、図９に示した癌細胞であり、その培養は、最小培地に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ）及び５％の１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した組成の培地を使って４８時間実施した。
【００９１】
実験の結果は、図９に示した。図９の（１）は、１，３，５−トリイソプロピル−１，３，５−トリビニルシクロトリシロキサンが形成した重合体上でＴ４７Ｄ細胞を培養した結果を示し、（２）は、１，３，５，７−テトライソプロピル−１，３，５，７−テトラビニルシクロテトラシロキサンが形成した重合体上でＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を培養した結果を示し、（３）は、１，３，５，７，９−ペンタイソプロピル−１，３，５，７，９−ペンタビニルシクロペンタシロキサンが形成した重合体上でＨＥＬＡ細胞を培養した結果を示し、（４）は、１，３，５−トリ−ｓｅｃ−ブチル−１，３，５−トリビニルシクロトリシロキサンが形成した重合体上で２２ＲＶ１細胞を培養した結果を示し、（５）は、１，３，５，７−テトラ−ｓｅｃ−ブチル−１，３，５，７−テトラビニルシクロテトラシロキサンが形成した重合体上で２２ＲＶ１細胞を培養した結果を示し、（６）は、１，３，５，７，９−ペンタ−ｓｅｃ−ブチル−１，３，５，７，９−ペンタビニルシクロペンタシロキサンが形成した重合体上でＵ２５１細胞を培養した結果を示し、（７）は、１，３，５−トリエチル−１，３，５−トリビニルシクロトリシロキサンが形成した重合体上でＣＡＣＯ２細胞を培養した結果を示し、（８）は、１，３，５，７−テトラエチル−１，３，５，７−テトラビニルシクロテトラシロキサンが形成した重合体上でＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を培養した結果を示し、（９）は、１，３，５，７，９−ペンタエチル−１，３，５，７，９−ペンタビニルシクロペンタシロキサンが形成した重合体上でＵ２５１細胞を培養した結果を示し、（１０）は、ヘキサビニルシクロトリシロキサンが形成した重合体上でＨＥＰＧ２細胞を培養した結果を示し、（１１）は、オクタビニルシクロテトラシロキサンが形成した重合体上でＭＣＦ−７細胞を培養した結果を示し、（１２）は、デカビニルシクロペンタシロキサンが形成した重合体上でＭＣＦ−７細胞を培養した結果を示す。
【００９２】
図９に示されたように、多様なシクロシロキサン化合物が形成したそれぞれの重合体上で細胞を培養することによって、細胞スフェロイドを形成させることができた（図９）。
【００９３】
実施例９．共重合体の細胞スフェロイドの形成効果
化学気相蒸着反応器（ｉＣＶＤ、Ｄａｅｋｉ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）の単量体タンクに第１単量体であるＶ４Ｄ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と表６から選択された第２単量体とを入れ、それぞれ加熱した。この際、加熱温度は、次の通りであった。Ｖ４Ｄ４：７０℃、（１）番単量体：７０℃、（２）番単量体：４０℃、（３）番単量体：３５℃、（４）番単量体：加熱しない（常温）、（５）番単量体：５０℃、（６）番単量体：８０℃、（７）番単量体：４０℃、（８）番単量体：５０℃、（９）番単量体：加熱しない（常温）、（１０）番単量体：４０℃、（１１）番単量体：５０℃、（１２）番単量体：５０℃。ＴＢＰＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を開始剤として、それを開始剤タンクに入れて常温で保持した。ポリスチレン細胞培養プレートを基板として蒸着を進行した。Ｖ４Ｄ４と第２単量体の共重合体薄膜蒸着時に、Ｖ４Ｄ４単量体、第２単量体、そして、ＴＢＰＯを９：１：９の比率（流量基準、単位：ｓｃｃｍ）で反応器内に流しながら、反応器内のフィラメントの温度を２００℃、反応器内の基板温度を４０℃、反応器内のチャンバの圧力を２５０ｍｂａｒに保持しながら、４０分蒸着を行って、約２００ｎｍ厚さの共重合体が蒸着された細胞培養プレートを得た。
【００９４】
【表６】
0006401307.tif 000009
【００９５】
以後、シクロシロキサン共重合体薄膜が蒸着された細胞培養基板で細胞を培養した後、細胞スフェロイドの形成の有無を確認した。使った細胞は、図１０に示した癌細胞であり、その培養は、最小培地に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ）及び５％の１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した組成の培地を使って４８時間実施した。
【００９６】
実験の結果は、図１０に示した。図１０の（１）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンと１，３，５−トリビニル−１，３，５−トリメチルシクロトリシロキサンとの共重合体の表面でＨｅｐ３Ｂ細胞を培養した結果を示し、（２）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンとヘキサビニルジシロキサンとの共重合体の表面でＯＶＣＡＲ３細胞を培養した結果を示し、（３）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンとグリシジルメタクリレートとの共重合体の表面でＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を培養した結果を示し、（４）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンとパーフルオロメタクリレートとの共重合体の表面でＨＴ２９細胞を培養した結果を示し、（５）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンとベンジルメタクリレートとの共重合体の表面でＨｅｐＧ２細胞を培養した結果を示し、（６）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンと３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０−ヘプタデカフルオロデシルメタクリレートとの共重合体の表面でＨｅｐ３Ｂ細胞を培養した結果を示し、（７）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンと４−ビニルピリジンとの共重合体の表面でＢ１６ＢＬ６細胞を培養した結果を示し、（８）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンとブチルメタクリレートとの共重合体の表面でＢ１６ＢＬ６細胞を培養した結果を示し、（９）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンとスチレンとの共重合体の表面でＡ５４９細胞を培養した結果を示し、（１０）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンと１−ビニルイミダゾールとの共重合体の表面でＢＴ４７４細胞を培養した結果を示し、（１１）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンとジビニルベンゼンとの共重合体の表面でＢＴ４７４細胞を培養した結果を示し、（１２）は、２，４，６，８−テトラメチル−２，４，６，８−テトラビニルシクロテトラシロキサンとプロペニルアクリレートとの共重合体の表面でＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を培養した結果を示す。
【００９７】
図１０に示されたように、シクロシロキサンが形成した多様な共重合体上で細胞を培養することによって、細胞スフェロイドを形成させることができた（図１０）。
【００９８】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な技術は、単に一具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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