(57)【要約】  本発明は、成熟全長ＰｒＰのごくＮ末端にある領域に結合する、抗体などの剤を用いた、試料中の感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の検出に関する。これらは、タンパク質分解の必要を伴わずに、ＴＳＥの検出において使用するためのＰｒＰｄに関する高感度イムノアッセイの発展を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＮＬＧＣＷＭＬＶＬＦＶＡＴＷＳＤＬＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号１）、
ＭＶＫＳＨＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号２）および
ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号３）
からなる群より選択されるアミノ酸配列に特異的に結合する、特異的結合メンバー。
【請求項２】
ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴおよびＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴからなる群より選択されるアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１記載の特異的結合メンバー。
【請求項３】
アミノ酸配列ＫＫＲＰＫＰＧに特異的に結合する、請求項２記載の特異的結合メンバー。
【請求項４】
アミノ酸配列ＰＧＧＧＷＮＴに特異的に結合する、請求項２記載の特異的結合メンバー。
【請求項５】
細胞性プリオンタンパク質（ＰｒＰｃ）に比較して、疾患型プリオンタンパク質（ＰｒＰｄ）に優先的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項記載の特異的結合メンバー。
【請求項６】
ＰｒＰｄに結合し、そしてＰｒＰｃに対して実質的に結合を示さない、請求項５記載の特異的結合メンバー。
【請求項７】
抗体分子である、請求項１〜６のいずれか１項記載の特異的結合メンバー。
【請求項８】
抗体分子が、ＹＷＨ１、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３からなる群より選択される抗体である、請求項７記載の特異的結合メンバー。
【請求項９】
抗体がＥＣＣＡＣ寄託番号０５０９１３０１を持つハイブリドーマによって産生される、請求項８記載の特異的結合メンバー。
【請求項１０】
抗体が、ＥＣＣＡＣ寄託番号０５０９１３０１を持つハイブリドーマによって産生される抗体と、ＰｒＰｄに対する結合に関して競合する、請求項８記載の特異的結合メンバー。
【請求項１１】
ＥＣＣＡＣ寄託番号０５０９１３０１を持つハイブリドーマによって産生される抗体のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３配列、ならびにＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を含む、請求項８記載の特異的結合メンバー。
【請求項１２】
試料中の疾患型プリオンタンパク質（ＰｒＰｄ）の存在を検出する方法であって
請求項１〜１１のいずれか１項記載の第一の特異的結合メンバーと試料を接触させ；そして
前記試料に対する前記の第一の特異的結合メンバーの結合を決定する、
ここで、前記試料に対する前記の第一の特異的結合メンバーの結合が、試料が疾患型プリオンタンパク質を含有することの指標となる
ことを含む、前記方法。
【請求項１３】
第一の特異的結合メンバーが検出可能標識を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
第一の特異的結合メンバーの結合が、第二の特異的結合メンバーを用いて決定される、請求項１２または請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記の第二の特異的結合メンバーが、前記の第一の特異的結合メンバーに結合する、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記の第二の特異的結合メンバーが検出可能標識を含む、請求項１４または請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
検出可能標識がランタニド元素である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
検出可能標識がコロイド金である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
第一の特異的結合メンバーが固定されている、請求項１２〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
第一の特異的結合メンバーが側方流動デバイス上に固定されている、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
試料中の疾患型プリオンタンパク質を検出する方法であって；
第一の特異的結合メンバーと試料を接触させ；そして
第二の特異的結合メンバーを用いて、前記試料中の分子に対する前記の第一の特異的結合メンバーの結合を決定する
前記結合の存在は、疾患型プリオンタンパク質の存在の指標となる、
ここで、前記の第一または第二の特異的結合メンバーの一方は、請求項１〜１１のいずれか１項記載の特異的結合メンバーであり、そして前記の第一または第二の特異的結合メンバーのもう一方は、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄの両方に結合する
ことを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記の第一または前記の第二の特異的結合メンバーが固定されている、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記の第一および第二の特異的結合メンバーの非固定化特異的結合メンバーが、検出可能標識を含む、請求項２１または請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記試料中の分子に対する前記の第一の特異的結合メンバーの結合が、検出可能標識の存在を検出することによって決定される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
第一または第二の特異的結合メンバーが、側方流動デバイス上で固定されている、請求項２２〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
検出可能標識が蛍光標識である、請求項２３または請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
蛍光標識がランタニド元素である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ランタニド元素がユーロピウムである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記標識の蛍光が増進剤または誘導剤で増進される、請求項２６〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
結合が、蛍光光度計を用いて蛍光を検出することによって決定される、請求項２６〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
蛍光光度計が時間分解蛍光光度計である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記試料中のＰｒＰの濃度が前記蛍光から決定される、請求項３０または請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記試料中のタンパク質を可溶化することを含む、請求項１２〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
タンパク質が、可溶化剤で試料を処理することによって可溶化される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
可溶化剤がカオトロピック剤である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
カオトロピック剤がグアニジン（Ｇｄ）塩である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
カオトロピック剤がＧｄＨＣｌである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
界面活性剤の存在下、カオトロピック剤で試料を処理する、請求項３５〜３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
界面活性剤の非存在下、カオトロピック剤で試料を処理する、請求項３５〜３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
試料が非生物学的表面から得られる、請求項１２〜３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
試料が個体から得られる、請求項１２〜３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
疾患型プリオンタンパク質の存在が、個体が感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を有する指標となる、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
試料が前記個体の組織試料または生物学的液体である、請求項４１または請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
生物学的液体が血液である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
組織試料が、脳、血液、扁桃腺、リンパまたは皮膚組織由来である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
組織試料の破壊によって試料を調製する、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
可溶化剤の存在下で組織試料を破壊する、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
試料をプロテアーゼ処理しない、請求項１２〜４７のいずれか１項記載の方法。
【請求項４９】
前記試料をプロテイナーゼＫ処理しない、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
抗体を産生する方法であって：
配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択されるペプチド配列を含む免疫原を動物に投与し；そして
前記動物から、前記ペプチド配列に結合する抗体を単離する
ことを含む、前記方法。
【請求項５１】
ペプチド配列が：ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴおよびＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴからなる群より選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
キメラペプチドがタンパク質キャリアーに連結されている、請求項５０または請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
抗体を産生する方法であって：
配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される配列を含むペプチドと、抗体の抗原結合ドメインの多様な集団を接触させ；そして
前記配列に対する前記集団のメンバーの結合を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項５４】
ペプチドが：ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴおよびＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴからなる群より選択される配列を含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
抗体の抗原結合ドメインが、ウイルス粒子表面上にディスプレイされる、請求項５３または請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
抗体の抗原結合ドメインが、抗体、あるいはｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄまたはディアボディ分子に含まれる、請求項５３〜５５のいずれか１項記載の方法。
【請求項５７】
ペプチドに結合する前記集団中の抗体の抗原結合ドメインを同定することを含む、請求項５３〜５６のいずれか１項記載の方法。
【請求項５８】
抗体の抗原結合ドメインをディスプレイするウイルス粒子を単離し、そして／または精製することを含む、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
抗体の抗原結合ドメインをコードする核酸が前記粒子から得られる、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記粒子から、特異的結合メンバーをコードする核酸を配列決定することを含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記粒子から得た前記核酸の配列を持つ核酸を発現させて、コードされる抗体の抗原結合ドメインを産生することを含む、請求項５９または請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
試料中のＰｒＰｄの存在を検出するためのキットであって：
請求項１〜１１のいずれか１項記載の１以上の抗体；および
試料に対する前記抗体の結合を決定するための検出試薬
を含む、前記キット。
【請求項６３】
個体から得た組織を取り扱い、そして／または保管するための装置を含む、請求項６２記載のキット。
【請求項６４】
前記組織由来の前記試料をホモジナイズし、そして／または抽出するための試薬を含む、請求項６２または請求項６３記載のキット。
【請求項６５】
可溶化剤を含む、請求項６２〜６４のいずれか１項記載のキット。
【請求項６６】
検出試薬が、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄの両方に結合する第二の抗体を含む、請求項６２〜６５のいずれか１項記載のキット。
【請求項６７】
１以上の抗体または第二の抗体が固定されている、請求項６６記載のキット。
【請求項６８】
側方流動デバイス中に、１以上の抗体または第二の抗体が固定されている、請求項６７記載のキット。
【請求項６９】
１以上の抗体または第二の抗体が検出可能標識で標識されている、請求項６６〜６８のいずれか１項記載のキット。
【請求項７０】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
【請求項７１】
抗体を産生する方法であって；
培地中で請求項７０記載のハイブリドーマ細胞を培養し；そして
前記培地から前記抗体を単離する
ことを含む、前記方法。
【請求項７２】
請求項７０記載のハイブリドーマを産生する方法であって；
配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される配列からなるペプチドで、非ヒト哺乳動物を免疫し
前記哺乳動物由来の抗体産生細胞および不死化細胞の１以上の融合体を産生して、ハイブリドーマ細胞集団を提供し；そして
前記集団をスクリーニングして、前記ペプチドに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項７３】
前記集団から前記ハイブリドーマを単離し、そして／または精製することを含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
培地中で前記ハイブリドーマを維持し、そして／または培養することを含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記培地から、前記ペプチドに結合する抗体を単離することを含む、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
感染性プリオンタンパク質の検出に有用な化合物に関してスクリーニングする方法であって、
配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される配列からなるペプチドと、試験化合物を接触させ；そして
ペプチドに対する化合物の結合を決定する
ことを含む、前記方法。
【請求項７７】
ペプチドに対する前記化合物の結合が、該化合物が感染性プリオンタンパク質の検出に有用であることの指標となる、請求項７６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の検出のための方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞性プリオンタンパク質（通常、ＰｒＰｃと称される）の疾患関連アイソフォーム（本明細書において、以後、ＰｒＰｄと称す）への変換は、ＴＳＥの病因形成における重要なプロセスである（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ  １９９８）。その結果、ＰｒＰｄの特異的検出は、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ヒツジ、ハムスターおよびマウスにおけるスクレイピー、シカおよびエルク（ｅｌｋ）における慢性消耗病、ならびにヒトにおけるクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）を含む、ＴＳＥの生化学的診断の基礎を形作る（Ｋａｓｃｓａｋ，  Ｆｅｒｓｋｏら  １９９７；  Ｋｕｂｌｅｒ，  Ｏｅｓｃｈら  ２００３）。
【０００３】
ＰｒＰｄの特異的検出のための既知の技術は、一般的に、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）またはトリプシンなどの酵素を用いた、ＰｒＰｃの示差タンパク質分解、その後、ウェスタンブロッティング（Ｍａｄｅｃ，  Ｇｒｏｓｃｈｕｐら  １９９８；  Ｓｃｈａｌｌｅｒ，  Ｆａｔｚｅｒら  １９９９；  Ｍａｄｅｃ，  Ｂｅｌｌｉら  ２０００；  Ｏｅｓｃｈ，  Ｄｏｈｅｒｒら  ２０００；  Ｃｏｏｌｅｙ，  Ｃｌａｒｋら  ２００１；  Ｓｔａｃｋ，  Ｃｈａｐｌｉｎら  ２００２）または他の免疫化学的手段（ＭｏｙｎａｇｈおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ  １９９９；  Ｇｒａｓｓｉ，  Ｃｏｍｏｙら  ２００１；  Ｂｉｆｆｉｇｅｒ，  Ｚｗａｌｄら  ２００２；  Ｓａｆａｒ，  Ｓｃｏｔｔら  ２００２）による、ＰｒＰのプロテアーゼ耐性コア（通常、ＰｒＰｒｅｓと称される）の検出を伴う。
【０００４】
しかし、ＰｒＰｒｅｓの検出が、疾患関連ＰｒＰ（すなわちＰｒＰｄ）の存在を反映することを確実にするには、タンパク質分解の正確な状態を同定する、注意深い最適化が必要である。さらに、疾患の最終段階における、動物由来の１種類の組織（例えば脳幹）中のＰｒＰｒｅｓの検出のために最適化されている条件は、前臨床疾患の検出に必要な、一次および二次リンパ組織または他の体液（例えば血液）中のＰｒＰｒｅｓの検出には不適切である可能性もある。これらの状況において、タンパク質分解に最適な条件は、常に再調整する必要があり、そして管理が困難である可能性もある。タンパク質分解での別の問題は、ハイスループット自動化から生じる制約であり、この場合、タンパク質分解の不適切な管理は、偽陽性および／または偽陰性を生じさせる可能性もある。
【０００５】
ＰｒＰｄに特異的な多様なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）が報告されてきている（Ｋｏｒｔｈ，  Ｓｔｉｅｒｌｉら  １９９７；  Ｃｕｒｉｎ  Ｓｅｒｂｅｃ，  Ｂｒｅｓｊａｎａｃら  ２００３；  Ｐａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓ，  Ｐｉｎａｒｄら  ２００３）。これらのＭａｂはすべて、比較的親和性が低く、そしてコンホメーション・エピトープを認識する。これは、ＰｒＰｄを変性させると、これらの抗体の結合が排除されることを意味する。変性しなければ、ＰｒＰｄの大部分は凝集状態で「ロック」される。その結果、これらの抗体の使用はいくぶん限定されており、そして検出感度は非常に減少している可能性もある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、予期せぬことに、成熟全長ＰｒＰのごくＮ末端にある領域に結合する剤が、ＰｒＰｄの検出法において有用であり、使用可能に特異的であることを認識した。これは、タンパク質分解に必要でない、ＰｒＰｄに関する高感度イムノアッセイの開発を可能にする。
【０００７】
本発明の１つの側面は、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列に結合する、特異的結合メンバーを提供する。
配列番号１、配列番号２および配列番号３は、それぞれ、全長ヒト、反芻動物およびネズミＰｒＰのごくＮ末端に相当する。
【０００８】
本明細書に記載するような特異的結合メンバーは、ヒト、反芻動物（ヒツジ、ウシおよびシカを含む）および／またはネズミＰｒＰｄに結合可能である。
配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群より選択されるアミノ酸配列に結合する特異的結合メンバーは、これらのアミノ酸配列の１以上、２以上または３つすべての中の、直鎖エピトープに特異的に結合可能である。例えば、特異的結合メンバーは、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のアミノ酸配列由来の６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上または１１以上の隣接アミノ酸からなるエピトープに結合可能である。
【０００９】
いくつかの態様において、特異的結合メンバーは、アミノ酸配列ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに結合可能であるか、あるいはアミノ酸配列ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴおよび／またはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴ内のエピトープに特異的に結合可能である。いくつかの好ましい態様において、特異的結合メンバーは、直鎖エピトープＫＫＲＰＫＰＧまたは直鎖エピトープＰＧＧＧＷＮＴに結合可能である。
【００１０】
本明細書に記載するような特異的結合メンバーは、本明細書記載の方法によって、生物学的材料から抽出されるＰｒＰｄに結合可能である。好ましくは、特異的結合メンバーは、ＰｒＰｄに特異的に結合する、すなわち抗体はＰｒＰｄに結合するが、同じ供給源由来のＰｒＰｃ、例えば本明細書に記載するような生物学的材料から抽出されるＰｒＰｃにはほとんどまたはまったく結合を示さない。
【００１１】
好ましくは、特異的結合メンバーは、変性ＰｒＰｄおよび未変性ＰｒＰｄの両方に結合するが、変性または未変性コンホメーションのいずれかであるＰｒＰｃには、ほとんどまたはまったく結合を示さない。組換えＰｒＰは、ＰｒＰｃのＮ末端を取り除くかまたはマスクしうる、翻訳後プロセスを経ない。したがって、本明細書に記載するような特異的結合メンバーは、また、組換えＰｒＰにも結合可能である。
【００１２】
特異的結合メンバーは、ＰｒＰ配列のごくＮ末端にある領域、例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはネズミＰｒＰ配列のごくＮ末端にある領域に結合可能である。例えば、特異的結合メンバーは、ＰｒＰ配列のＮ末端および最初のチロシン残基（例えばヒトＰｒＰのＴｙｒ３８およびウシＰｒＰのＴｙｒ４１）の間の領域、すなわちＰｒＰのＮ末端３８または４０アミノ酸からなる領域に結合可能である。
【００１３】
シグナルペプチドを含む全長ヒトＰｒＰのごくＮ末端にある領域である、配列番号１の中の直鎖エピトープに結合する特異的結合メンバー、特にアミノ酸配列ＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに結合する特異的結合メンバーは、ヒトＰｒＰｄに対する結合において特に有用でありうる。シグナルペプチドを含む全長ウシＰｒＰのＮ末端にある、配列番号２の中の直鎖エピトープ、特にアミノ酸配列ＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに特異的に結合する特異的結合メンバーは、ウシ、ヒツジまたはシカＰｒＰｄに対する結合において特に有用でありうる。シグナルペプチドを含む全長ネズミＰｒＰのごくＮ末端にある領域である、配列番号３の中の直鎖エピトープに結合する特異的結合メンバー、特にアミノ酸配列ＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに結合する特異的結合メンバーは、ネズミＰｒＰｄに対する結合において特に有用でありうる。
【００１４】
本発明記載の抗体には、本明細書記載のＹＷＨ１、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３抗体が含まれる。
ＹＷＨ１は、Ｊｏｈｎ  Ｃｏｗａｒｄによって、仮寄託番号０５０９１３０１で英国ウィルトシャー州ポートンダウンのＥＣＣＡＣに２００５年９月１日に寄託された、「ＹＷＨ１」と称されるハイブリドーマによって産生される。本明細書に記載するようなＹＷＨ１抗体は、寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３配列、ならびにＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を有することも可能であり、より好ましくは、抗体は、寄託されたハイブリドーマによって産生された抗体のＶＬおよびＶＨ領域を有する。いくつかの態様において、ＹＷＨ１抗体は、寄託されたハイブリドーマによって産生されてもよいし、または寄託されたハイブリドーマによって産生された抗体に同一であってもよい。他の態様において、本明細書に記載するようなＹＷＨ１抗体は、寄託されたハイブリドーマによって産生された抗体と、ＰｒＰｄに対する結合に関して競合しうる。
【００１５】
ターゲットエピトープに特異的に結合する結合メンバー（すなわち特異的結合メンバー）は、ポリペプチド中にエピトープが存在し、そしてアクセス可能である場合（例えばＰｒＰｄ）、ターゲットエピトープ（例えばＰｒＰのごくＮ末端にある領域中のターゲット）に有意な結合を示すことも可能であり、そしてターゲットエピトープが存在しないかまたは特異的結合メンバーに対してアクセス不能であるペプチドまたはポリペプチド（例えばＰｒＰｃ）に対してはほとんどまたはまったく結合を示さないことも可能である。特に、特異的結合メンバーは、試料中に存在する他のタンパク質、特に、哺乳動物の脳、皮膚、扁桃腺またはリンパ組織試料、あるいは血液、唾液または尿などの生物学的液体の試料中に存在する他のタンパク質に対する有意な結合をまったく示さないことも可能である。さらに、ＰｒＰｄのごくＮ末端にある領域内に特異的に結合する抗体は、この領域外で、ＰｒＰｄに対する有意な結合をまったく示さないことも可能である。
【００１６】
一般的に、ターゲットエピトープに特異的に結合する特異的結合メンバーは、約１０５モル／リットルより高い（例えば１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、および１０１２以上のモル／リットルの）結合親和性を有しうる。
【００１７】
特異的結合メンバーは、互いに結合特異性を有する分子対のメンバーである。特異的結合対のメンバーは、天然に由来してもよいし、あるいは完全にまたは部分的に合成的に産生されてもよい。分子対の一方のメンバーは、分子対の他方のメンバーに特異的に結合し、そしてしたがって該メンバーの特定の空間的構成および極性構成に相補的である、表面上領域または空洞を有する。したがって、対のメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合対の種類の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。本明細書に記載するような特異的結合メンバーは、例えばフォールディングされたドメインなどのペプチドまたはポリペプチドを形成するか、あるいは抗原に結合する能力に加えて、別の機能特性を分子に与える、免疫グロブリンまたは他のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１８】
好ましい特異的結合メンバーには、抗体分子が含まれる。抗体分子は、天然であっても、あるいは部分的にまたは完全に合成的に産生されてもよい、免疫グロブリンである。該用語には、抗体および抗体断片を含む、抗体結合ドメインを含む、いかなるポリペプチドまたはタンパク質も含まれる。抗原結合ドメインを含む抗体断片には、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、およびディアボディが含まれる。
【００１９】
いくつかの好ましい態様において、本明細書記載の特異的結合メンバーは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であってもよい。
本明細書に記載するような抗体を産生する方法は：
配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される配列を含む免疫原を、動物に投与し；そして
前記動物から、前記ペプチド配列に結合する抗体を単離する
ことを含んでもよい。
【００２０】
アミノ酸配列の断片は、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列由来の６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上または１１以上の隣接アミノ酸を含んでもよい。適切な断片には、ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴ、ＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴ、ＫＫＲＰＫＰＧおよびＰＧＧＧＷＮＴが含まれる。
【００２１】
免疫原は、キーホール・リンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニンなどのタンパク質キャリアーを含んでもよい。他の適切なキャリアーは当該技術分野に周知である。
【００２２】
いくつかの態様において、免疫原は、ヒツジまたはウシＰｒＰ配列のアミノ酸２５〜３６、および例えばヒツジまたはウシＰｒＰ配列のアミノ酸６２〜６９からなるキメラペプチド、あるいはヒトＰｒＰ配列のアミノ酸２３〜３４、および例えばヒトＰｒＰ配列のアミノ酸５９〜６６からなるキメラペプチドを含んでもよい。
【００２３】
当該技術分野に知られる多様な技術のいずれかを用いて、免疫した動物から抗体を得て、そして好ましくは、関心対象の抗原に対する抗体の結合を用いて、スクリーニングしてもよい。例えば、ウェスタンブロッティング技術、イムノアッセイまたは免疫沈降を用いてもよい（Ａｒｍｉｔａｇｅら（１９９２）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５７  ８０−８２）。
【００２４】
より好ましくは、抗体分子はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野に周知であり（例えば、Ｈａｒｌｏｗら  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８８）ｐｐ．３５３−３５５を参照されたい）、そして以下により詳細に記載される。例えば、免疫した哺乳動物から、抗体産生細胞を単離して、そして不死化細胞と融合させて、抗体産生ハイブリドーマ細胞集団を産生してもよく、次いでこれをスクリーニングして、最適な結合特性を示す抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定してもよい。
【００２５】
いくつかの態様において；
配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される配列を含む免疫原で、非ヒト哺乳動物を免疫し、
前記哺乳動物由来の抗体産生細胞および不死化細胞の１以上の融合体を産生して、ハイブリドーマ細胞集団を提供し；そして
前記集団をスクリーニングして、配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される配列に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する
ことを含む方法によって、ハイブリドーマを産生してもよい。
【００２６】
好ましくは、配列番号１〜３、およびその断片からなる群より選択される１以上のペプチド配列、例えばＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴ、あるいはこれらの配列の１つの中のペプチドエピトープに対する、集団の細胞によって産生される抗体の結合を試験することによって、ハイブリドーマ細胞集団をスクリーニングする。例えば、ウェスタンブロッティング技術、イムノアッセイまたは免疫沈降を用いてもよい。
【００２７】
ＰｒＰのごくＮ末端にある配列内のエピトープ（例えばウシＰｒＰのアミノ酸１〜４０またはヒトＰｒＰのアミノ酸１〜３８、好ましくはウシＰｒＰのアミノ酸２５〜３６またはヒトＰｒＰのアミノ酸２３〜３４）に結合する抗体を産生すると同定されたハイブリドーマ細胞を集団から単離し、そして／または精製してもよい。
【００２８】
単離後、当該技術分野に周知の方法を用いて、培地中でハイブリドーマを拡大し、維持し、そして／または培養してもよい。ハイブリドーマによって産生される抗体を前記培地から単離してもよい。本明細書に記載するように抗体を産生する方法は；
培地中で上述のように産生されたハイブリドーマ細胞を培養し；そして
上述のような抗体、例えば配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される１以上の配列、例えばＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに結合する抗体を、培地から単離する
ことを含んでもよい。
【００２９】
あるいは、多くの既知のディスプレイ技術およびコンビナトリアルライブラリーのいずれを用いて特異的結合メンバーを産生してもよい（Ｒｏｔｈｅ  Ａら  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２００６；  ２０：１５９９−６１０）。初期には、組換え技術を用いて、免疫グロブリンＶ領域が修飾のための骨格として用いられたが、近年、多くのアプローチが採用されてきている。２つの例には、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの関与が含まれる（Ｋｏｉｄｅ  Ａら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９８；  ２８４：１１４１−５１）。別の例は、ロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）に見られるキシラナーゼ由来の炭水化物結合モジュールの使用を伴う（Ｃｉｃｏｒｔａｓ  Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎ  Ｌら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  ２００４；  １７：２１３−２１）。ＰｒＰに対する別の結合パートナー（例えば核酸、グリコサミノグリカン等）が、当該技術分野に知られる他の方法によって発見可能である。
【００３０】
好ましい態様において、例えば、機能的免疫グロブリン結合ドメインを表面上にディスプレイするラムダ・バクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを用いて、発現された免疫グロブリン可変ドメイン、または抗体の抗原結合ドメインを含む他の分子の組換え的に産生されたライブラリーから、ＰｒＰのＮ末端配列内のエピトープに特異的なモノクローナル抗体を得てもよい；例えばＷＯ９２／０１０４７を参照されたい。ライブラリーは免疫学的に未処置であってもよく、すなわちエピトープを含むペプチドで免疫されていない生物から得た配列から構築するか、または関心対象の抗原に曝露されたことがある生物から得た配列を用いて構築したものであってもよい。本明細書に記載するような抗体を作製する方法は：
配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択されるペプチド配列を含む免疫原と、抗体の抗原結合ドメインの多様な集団を接触させ；そして
前記ペプチドに対する前記集団のメンバーの結合を決定する
ことを含んでもよい。
【００３１】
いくつかの態様において、免疫原は、ヒツジまたはウシＰｒＰ配列のアミノ酸２５〜３６、および例えばヒツジまたはウシＰｒＰ配列のアミノ酸６２〜６９からなるキメラペプチド、あるいはヒトＰｒＰ配列のアミノ酸２３〜３４、および例えばヒトＰｒＰ配列のアミノ酸５９〜６６からなるキメラペプチドを含んでもよい。
【００３２】
抗体の抗原結合ドメインは、ウイルス粒子表面上にディスプレイされてもよく、すなわち、多様な集団がファージディスプレイライブラリーであってもよい。
方法は、配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列、例えばＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに結合する、前記集団内の抗体の抗原結合ドメインを同定することを含んでもよい。
【００３３】
抗体の同定された抗原結合ドメインをディスプレイするウイルス粒子を単離し、そして／または精製し、そして抗体の抗原結合ドメインをコードする核酸を前記粒子から得てもよい。
【００３４】
抗体の抗原結合ドメインをコードする核酸を配列決定し、そして／または発現させて、配列番号１、配列番号２および／または配列番号３のペプチド配列内のエピトープに結合する、コードされる抗体の抗原結合ドメインを産生してもよい。
【００３５】
ルーチンの方法論を用いて、上述のように産生された抗体の抗原結合ドメインをさらに試験して、その特異性を決定する、すなわちペプチド配列の一方または両方に特異的に結合するかどうかを決定してもよい。
【００３６】
いくつかの態様において、例えば鎖シャフリングによるアフィニティー成熟、および部位特異的、ランダムまたはコンビナトリアル突然変異誘発を含む、標準的な抗体操作技術を用いて、抗体の抗原結合ドメインの結合特性をさらに最適化してもよい。
【００３７】
続く使用のため、標準的技術を用いて、抗体または抗体分子に含まれる抗体の抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄまたはディアボディ分子を、例えばＩｇＧ抗体に、再フォーマットしてもよい。
【００３８】
本発明の別の側面は、個体においてＴＳＥを検出する方法であって
個体から得た試料と、上述のような特異的結合メンバー、例えば配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列、例えばＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに特異的に結合する抗体分子を接触させ；そして
前記試料に対する前記抗体の結合を決定する
ことを含む方法を提供する。
【００３９】
試料に対する抗体の結合は、試料中にＰｒＰｄが存在する指標となり、これは個体がＴＳＥを有する指標となる。
結合量は、試料中のＰｒＰｄの量の指標となりうる。これは、個体におけるＴＳＥの度合いまたは進行の指標となりうる。
【００４０】
対照に比較して、抗体の結合を決定してもよい。適切な対照には、健康な個体（すなわちＴＳＥに罹患していない個体）由来の組織が含まれうる。
個体から得た神経組織（例えば脳組織）から、リンパ組織（例えば一次または二次リンパ組織）から、または細胞（例えば白血球、線維芽細胞）から、試料を調製してもよい。また、体液（例えば血液、唾液または尿）から試料を調製してもよい。
【００４１】
いくつかの好ましい態様において、個体由来の一次リンパ組織または二次リンパ組織を用いる。
個体から得た組織および液体を処理して、可溶化し、そして不溶性タンパク質凝集体および断片を抽出して、イムノアッセイにおける検出を容易にしてもよい。
【００４２】
適切な処理には、可溶化剤、例えば溶媒またはカオトロピック剤での処理、塩溶液での化学的処理、および超音波処理などの物理的処理が含まれうる。
カオトロピック剤は、タンパク質を変性させ、そして特に、タンパク質凝集体および断片の抽出を容易にしうる試薬である。適切なカオトロピック剤は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、グアニジン塩酸（ＧｄＨＣｌ）および尿素が含まれる。変性効果を生じるいかなる濃度でカオトロピック剤を用いてもよく、例えば８Ｍ  ＧｄＨＣｌを使用してもよい。
【００４３】
適切な溶媒もまた当該技術分野に周知であり、そしてこれにはメタノールが含まれる。適切な塩溶液には、飽和硫酸アンモニウムが含まれる。
抗体と接触させる前に、個体から得た組織を破壊し、そして／またはホモジナイズしてもよい。例えば、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ−２０ＴＭまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ＴＭの存在下または非存在下、カオトロピック剤の存在下で、組織をホモジナイズしてもよい。
【００４４】
好ましくは、組織または抽出物は、前記抗体と接触させる前に、プロテアーゼ処理には供されない（すなわち、組織または抽出物は、プロテアーゼ処理されない）。
いくつかの態様において、個体は非ヒト動物である。本明細書記載の方法を用いて、ヒツジおよびヤギにおけるスクレーピー、ハムスターおよびマウスにおける実験的スクレーピー、エルクおよびシカ（シカ科）における慢性消耗病、ならびに／あるいはウシまたは他の動物におけるＢＳＥを検出してもよい。
【００４５】
他の態様において、個体はヒトであり、そして本明細書記載の方法を用いて、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、クールー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群または家族性致死性不眠症（ＦＦＩ）を検出してもよい。
【００４６】
個体は、ＴＳＥに関連する行動上の変化または臨床的症状を示さなくてもよいし、あるいは、個体は、ＴＳＥに関連する、１以上の行動上の変化または臨床的症状を示してもよい。
【００４７】
配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される配列、例えばＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに結合し、そしてＰｒＰｄに特異的に結合可能な特異的結合メンバーを上述する。いくつかの態様において、特異的結合メンバーは、検出可能標識、または検出可能標識に結合するタグを含んでもよい。標識の存在を検出することによって、試料に対する特異的結合メンバーの結合を決定してもよい。検出した標識の量から、試料中のＰｒＰｄのレベル、量または濃度を決定してもよい。
【００４８】
適切な標識を、以下により詳細に記載する。
他の態様において、第一の特異的結合メンバーに結合し、そして検出可能標識を含む、第二の特異的結合メンバーを用いて、特異的結合メンバーの結合を決定してもよい。
【００４９】
好適には、サンドイッチアッセイ形式を使用してもよい。個体においてＴＳＥを検出する方法は；
第一の特異的結合メンバーと、前記個体由来の試料を接触させ；そして
第二の特異的結合メンバーを用いて、前記試料において、ＰｒＰｄ分子に対する前記の第一の特異的結合メンバーの結合を決定する
ことを含んでもよく、
前記結合の存在は個体におけるＴＳＥの存在の指標となり、ここで、前記の第一または第二の特異的結合メンバーの一方が、配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される配列、例えばＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに結合し、そして前記の第一または第二の特異的結合メンバーの他方が、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄの両方に結合する。
【００５０】
例えば、第一の特異的結合メンバーが、配列ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに結合可能であり、そして第二の特異的結合メンバーが、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄに結合可能であるか、あるいは第二の特異的結合メンバーが、配列ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴに結合可能であり、そして第一の特異的結合メンバーが、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄに結合可能である。
【００５１】
適切な特異的結合メンバーには、炭水化物、グリコサミノグリカン、核酸、ペプチド、および抗体分子を含むタンパク質が含まれてもよい。
ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄに結合する、抗体などの特異的結合メンバーは、当該技術分野に周知であり、そして例えば、両方のタンパク質型に共通のエピトープ、例えばＰｒＰ配列の残基５１〜９８に渡る８ペプチド反復領域を認識してもよい。
【００５２】
前記の第一および第二の特異的結合メンバーの一方が固定され、そして他方の特異的結合メンバーの結合を検出してもよい。好ましくは、第一の特異的結合メンバーが固定化される。特異的結合メンバーは、例えば不溶性支持体に対する付着によって固定化されていてもよい。支持体は、微粒子または固体型であってもよいし、そしてプレート、試験管、ビーズ、ボール、フィルターまたは膜が含まれてもよい。特異的結合メンバーは、例えば、アフィニティークロマトグラフィーで使用するのに適した不溶性支持体に固定されていてもよい。不溶性支持体に特異的結合メンバーを固定するための方法が、当業者に知られる。
【００５３】
固定されていない特異的結合メンバーは、検出可能標識を含んでもよい。例えば、抗体は、蛍光体、好ましくはユーロピウムなどのランタニド、放射性同位体、酵素または粒子、あるいは非同位体標識試薬、例えばビオチンまたはジゴキシゲニン、あるいは例えば特有の小分子、ペプチドまたは核酸であってもよい、他の任意の検出可能な「タグ」または標識で標識されていてもよい。
【００５４】
いくつかの態様において、固定されていない特異的結合メンバーに結合する第三の特異的結合メンバーを用いて、固定されていない特異的結合メンバーを検出してもよい。第三の抗体は、検出可能標識を含んでもよい。
【００５５】
特異的結合メンバーに対する検出可能標識の連結は、直接であっても、または間接的であっても、例えばペプチド結合を介して共有性であっても、または非共有性であってもよい。ペプチド結合を介した連結は、特異的結合メンバー（例えば抗体）および標識分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果であってもよい。非共有結合を介した連結は、ビオチン化抗体およびストレプトアビジン／アビジン連結標識分子の間の結合の結果であってもよい。
【００５６】
標識には、例えば、免疫クロマトグラフィー・ストリップなどの側方流動アッセイ、フロースルーアッセイ、凝集アッセイ、あるいはディップスティックまたはディップスティック櫛アッセイなどの固相アッセイを含む、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＴＲＦＩＡ、免疫組織化学、またはイムノアッセイによって、直接または間接的に、検出可能シグナルが、視覚的に観察されるか、電気的に検出されるかまたは別の方式で記録されることを可能にする、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ユーロピウムおよびテキサスレッドなどの蛍光体、発色原色素、例えばジアミノベンジジン、巨大分子コロイド性粒子または微粒子物質、例えば着色されるか、磁性であるかまたは常磁性であるラテックスビーズ、金属ゾル（例えば金ゾル）、色素ゾル、および生物学的または化学的活性剤が含まれる。適切に標識した分子の調製および使用は、当業者に周知である（例えばＥＰ０２９１１９４Ｂ１）。
【００５７】
生物学的または化学的に活性である剤には、例えば、発色させるかまたは変色させるか、あるいは電気的特性の変化を引き起こす反応を触媒する、酵素が含まれる。これらは、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトル吸収または放出を生じるように、分子的に励起可能でありうる。これらには、バイオセンサーと組み合わせて用いる、化学的実体が含まれてもよい。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出系を使用してもよい。さらなる例には、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼおよび化学発光が含まれる。
【００５８】
いくつかの好ましい態様において、検出可能標識は、ユーロピウム（Ｅｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、テルビウム（Ｔｂ）またはジスプロシウム（Ｄｙ）などのランタニド元素である。ユーロピウムなどのランタニドの蛍光は、天然蛍光よりもはるかにより長い期間に渡って崩壊するため、これらの標識を時間分解蛍光測定イムノアッセイ（ＴＲＦＩＡ）において用いて、バックグラウンドを減少させ、そして感度を上昇させてもよい。
【００５９】
他の好ましい態様において、ディップスティック、フロースルーデバイスまたは側方流動デバイスなどの固相デバイスを含む、イムノアッセイデバイス中に抗体を配置してもよい。適切なデバイスは当該技術分野に周知である（例えばＧＢ  １５８９２３４、ＥＰ  ０２２５０５４、ＥＰ  ０１８３４４２、ＥＰ０２９１１９４およびＥＰ  ０１８６７９９）。
【００６０】
本発明の方法は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＴＲＦＩＡ、免疫組織化学、またはイムノアッセイ、例えば側方流動、フロースルー、凝集または固相アッセイなどの、いかなる好適なアッセイ形式で行ってもよいが、いくつかの特に好ましい態様において、本明細書記載の方法を、ＤＥＬＦＩＡＴＭ（解離増進ランタニド蛍光イムノアッセイ）などのＴＲＦＩＡ形式で行う。
【００６１】
ＤＥＬＦＩＡＴＭは、増進溶液と組み合わせてランタニド標識を使用して、時間分解蛍光光度計上で測定される蛍光シグナルを生じる。ＤＥＬＦＩＡＴＭアッセイは、当該技術分野に周知である（例えばＡｌｌｉｃｏｔｔｉら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．  ２００３；  ２４（４）：  ３４５−５８；  Ｂｕｔｃｈｅｒら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００３  Ｊａｎ  １５；  ２７２（１−２）：  ２４７−５６を参照されたい）。
【００６２】
方法は、検出可能標識と蛍光増進剤を接触させて、そして前記標識から蛍光を検出することを含んでもよい。
結合を決定する様式は、本発明の特徴ではなく、そして当業者は、優先性および一般的な知識にしたがって、適切な様式を選択することが可能である。
【００６３】
本発明の他の側面は、ＴＳＥを検出する際に使用するための抗体分子などの特異的結合メンバーの産生における、配列番号１〜３およびその断片、あるいはヒツジまたはウシＰｒＰ配列のアミノ酸２５〜３６、および例えばヒツジまたはウシＰｒＰ配列のアミノ酸６２〜６９からなるキメラペプチド、あるいはヒトＰｒＰ配列のアミノ酸２３〜３４、および例えばヒトＰｒＰ配列のアミノ酸５９〜６６からなるキメラペプチド、からなる群より選択される配列からなるペプチドの使用、ならびにＴＳＥの検出における、配列番号１〜３およびその断片、例えばＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴ、からなる群より選択されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体分子などの特異的結合メンバーの使用を提供する。
【００６４】
本明細書に記載するような抗体分子などの特異的結合メンバーは、例えば、内容物が外部環境から保護されているバイアルなどの適切な容器中で、ＴＳＥを検出するかまたは診断するためのキットの一部を形成してもよい。
【００６５】
個体において、ＴＳＥを検出するかまたはＴＳＥの進行を評価するためのキットは：
上述のように、配列番号１〜３およびその断片、例えばＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴまたはＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴ、からなる群より選択されるアミノ酸配列に特異的に結合する、抗体分子などの１以上の特異的結合メンバー；ならびに
個体から得た試料に対する、前記の１以上の特異的結合メンバーの結合を決定するための検出試薬
を含んでもよい。
【００６６】
１以上の特異的結合メンバーは、溶液中に遊離していてもよいし、または磁気ビーズ、試験管、膜またはマイクロプレートウェルなどの固体支持体上に固定されていてもよい。
検出試薬は、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄ両方に結合する第二の特異的結合メンバーを含んでもよい。ＰｒＰｄに特異的な特異的結合メンバーまたは第二の特異的結合メンバーは、検出可能標識、例えばユーロピウムなどのランタニド、金または他のゾル粒子、着色ビーズ、あるいは検出可能標識に結合するタグで標識されていてもよい。適切なタグにはビオチンが含まれる。特異的結合メンバーがタグで標識されている場合、検出試薬はさらに、タグに結合する検出可能標識を含んでもよい。
【００６７】
検出試薬は、標識と反応してシグナルを生じる基質、例えば発色原、蛍光または化学発光基質をさらに含んでもよい。基質には、本明細書に記載するような、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）増進剤および洗浄溶液を含む、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）などのＴＲＦＩＡアッセイで使用するための、増進剤溶液および誘導剤が含まれてもよい。検出試薬は、緩衝溶液、洗浄溶液等をさらに含んでもよい。
【００６８】
キットはまた：個体から得た組織を取り扱い、そして／または保管するための装置；および前記組織由来の前記試料をホモジナイズし、そして／または抽出するための試薬、例えば界面活性剤を含むまたは含まないＧｄＨＣｌなどのカオトロピック剤の１つまたは両方も含んでもよい。
【００６９】
キットにはまた、本明細書に記載するような、例えば、試験試料中のＴＳＥ障害を検出する方法における、抗体分子または他の特異的結合メンバーの使用のための使用説明書も含まれてもよい。
【００７０】
本発明の多様なさらなる側面および態様は、本開示を考慮すると、当業者には明らかであろう。本明細書に言及するすべての文書は、その全体が本明細書に援用される。
本発明は、上述の特徴のあらゆる組み合わせおよびサブコンビネーションを含む。
【００７１】
本発明の特定の側面および態様が、ここに、例として、そして上述の図および以下に記載する表に関連して例示される。
表１は、組織学的に確認されたＢＳＥ陽性および陰性ウシ尾側髄質における、疾患関連ＰｒＰの測定を示す。
【実施例】
【００７２】
材料
組織
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ（ＶＬＡ），  Ｎｅｗ  Ｈａｗ，  Ａｄｄｌｅｓｔｏｎｅ，  Ｓｕｒｒｅｙ  ＫＴ１５  ３ＮＢ，  ＵＫから、ヒツジ吻側髄質および口蓋扁桃の試料を得た。これらには、組織学的に確認されたスクレーピー陽性材料および該疾患に曝露されたことがまったくないヒツジの群れ由来のニュージーランド（ＮＺ）陰性組織が含まれた。
【００７３】
さらに、組織学的に確認されたＢＳＥ陽性および陰性のウシ尾側髄質の試料が、ＶＬＡ，  Ｗｈｉｔｌｅｙ  Ｒｏａｄ，  Ｌｏｎｇｂｅｎｔｏｎ，  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ  ＮＥ１２  ９ＳＥ，  ＵＫによって入手可能となった。限られた数のヒト脳ホモジネートが、ＮＩＢＳＣ  ＣＪＤ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｂｌａｎｃｈｅ  Ｌａｎｅ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｍｉｍｍｓ，  Ｐｏｔｔｅｒｓ  Ｂａｒ  ＥＮ６  ３ＱＧ，  ＵＫ（Ｍｉｎｏｒ，  Ｎｅｗｈａｍら  ２００４）から入手可能である。
【００７４】
試薬
すべての緩衝液の基本的な構成要素およびＧｄＨＣｌ（８Ｍ；カタログ番号Ｇ−９２８４）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ  Ｌｔｄ．，  Ｆａｎｃｙ  Ｒｏａｄ，  Ｐｏｏｌｅ，  Ｄｏｒｓｅｔ  ＵＫから得た。２リットルのＭｉｌｌｉＱ水中に、１４．９ｇ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）プリセット結晶（ｐＨ  ７．７；カタログ番号Ｔ８０６８）、１８ｇ塩化ナトリウム（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ；カタログ番号Ｓ７６５３）；１ｇアジ化ナトリウム（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ；Ｓ８０３２）；１６ｍｇジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ；カタログ番号Ｄ６５１８）；４０ｍｇアマランス（カタログ番号Ａ１０１６）；０．２ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０（カタログ番号Ｐ７９４９）および１０ｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；カタログ番号Ａ３０５９）を溶解することによって、アッセイ緩衝液を調製した。２リットルのＭｉｌｌｉＱ水中に、ＰＢＳ粉末（ｐＨ  ７．４；Ｐ５３６８）の小袋２つおよび１ｇアジ化ナトリウム（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ；Ｓ８０３２）を溶解することによって、Ｍａｂコーティング緩衝液を調製した。２リットルのＭｉｌｌｉＱ水中に、ＰＢＳ粉末（ｐＨ  ７．４；Ｐ５３６８）の小袋２つ、１ｇアジ化ナトリウム（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ；Ｓ８０３２）および４０ｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；カタログ番号Ａ３０５９）を溶解することによって、Ｍａｂブロッキング緩衝液を調製した。すべての緩衝液を、必要になるまで４℃で保管した。
【００７５】
１リットルのＭｉｌｌｉＱ水中に、７２．９ｇ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）プリセット結晶（ｐＨ  ７．７；カタログ番号Ｔ８０６８）、９ｇ塩化ナトリウム（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ；カタログ番号Ｓ７６５３）；１ｇアジ化ナトリウム（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ；Ｓ８０３２）および５ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０（カタログ番号Ｐ７９４９）を溶解することによって、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）洗浄濃縮物を調製した。この溶液を室温で保管した。脱イオン水中で、濃縮物を２５倍に希釈することによって、洗浄溶液を調製した。
【００７６】
ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）増進溶液（カタログ番号１２４４−１０５）および標識試薬（カタログ番号１２４４−３０２）を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＵＫ  Ｌｔｄ，  Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｒｏａｄ，  Ｓｅｅｒ  Ｇｒｅｅｎ，  Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ，  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ  ＨＰ９  ２ＦＸ，  ＵＫから得た。
【００７７】
ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）装置
ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）を実行するには、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから得られうる以下の装置が必要である：（ｉ）プリンターおよびコンピュータを加えた時間分解蛍光光度計、例えばＶｉｃｔｏｒ  ＩＩ（カタログ番号１４２０−０１２または１４２０−０１６）；（ｉｉ）自動化洗浄装置、例えばＰｌａｔｅｗａｓｈ（カタログ番号１２９６−０２６／Ｒ）；（ｉｉｉ）自動化振盪装置、例えばＰｌａｔｅｓｈａｋｅ（カタログ番号１２９６−００３／Ｒ）；および（ｉｖ）増進溶液のための場合による分配装置（Ｐｌａｔｅ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅ；カタログ番号１２９６−０４１／Ｒ）。
【００７８】
ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）マイクロタイタープレート（カタログ番号ＤＩＳ−９７１−０７０Ｕ）およびプレート封印装置（カタログ番号ＤＩＳ−９８４−５０５Ｊ）を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＫ  Ｌｔｄ．，  Ｂｉｓｈｏｐ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｒｏａｄ，  Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ  ＬＥ１１  ５ＲＧ，  ＵＫから得た。
【００７９】
組織調製装置
ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）組織破壊装置、スクロース緩衝液およびさらなるポリプロピレンビーズを含有する粉砕試験管を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｈｏｕｓｅ，  Ｍａｙｌａｎｄｓ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，  Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ  ＨＰ２  ７ＴＤ，  ＵＫから得た。０．２ｍｍセラミックビーズを含有する衝撃抵抗性２ｍＬスクリューキャップ粉砕試験管（ＱＢＩＯｇｅｎｅ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄ；カタログ番号ＭＢＲ−２４７−１１０Ｙ）、２ｍＬ  Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋ（登録商標）エッペンドルフ試験管（カタログ番号ＴＵＬ−１５０−２９０Ｕ）および試料２４個分のローターを備えたＨｅｒａｅｕｓ  Ｂｉｏｆｕｇｅ（登録商標）Ｐｉｃｏ微量遠心分離装置（カタログ番号ＣＦＨ−２３０−０１０Ｈ）をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＫ  Ｌｔｄから得た。
【００８０】
あるいは、界面活性剤を含むおよび含まないＧｄＨＣｌ中でホモジネートを調製するため、ＥＴＤＳ  ＶＩＩＩ（Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｖｉｌｌａｇｅ，  Ｌｏｗｌａｎｄｓ  Ｅｓｔａｔｅ，  Ｂｒａｙｅ  Ｒｏａｄ，  Ｖａｌｅ，  Ｇｕｅｒｎｓｅｙ  ＧＹ３  ５ＸＨ，  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｉｓｌａｎｄｓ）を用いた。
【００８１】
イムノアッセイ標準
組換えヒツジＡＲＲおよびＶＲＱ  ＰｒＰを、ＴＳＥ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｃｏｍｐｔｏｎ，  Ｎｅｗｂｕｒｙ，  Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ  ＲＧ２０  ７ＮＮ，  ＵＫから得た。ウシおよびネズミＰｒＰを、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｏａｄ，  Ｐｏｏｌｅ，  Ｄｏｒｓｅｔ  ＢＨ１７  ７ＤＡ，  ＵＫから得た。２０μｇ／ｍＬの濃度のストック溶液を、８Ｍ  ＧｄＨＣｌ中で調製し、そして４℃で保管した。アッセイ直前に、０．４Ｍ  ＧｄＨＣｌを含有するアッセイ緩衝液中でストック溶液を希釈して、６つの作業標準、すなわち、０、０．３２、１．６、８、４０および２００ｎｇ／ｍＬの組換えヒツジＰｒＰを得た。
【００８２】
抗体の検出
残基５１〜９８に渡るＰｒＰｃの全８ペプチド反復領域を認識する精製ＢＳＡ不含Ｍａｂ  ＳＡＦ３２（Ｍｏｎｎｅｔ，  Ｍａｒｔｈｉｅｎｓら  ２００３）を、ＩＤＳ  Ｌｔｄ，  Ｂｏｌｄｏｎ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，  Ｂｏｌｄｏｎ，  Ｔｙｎｅ  ＆  Ｗｅａｒ  ＮＥ３５  ９ＰＤ，  ＵＫから得た。先に記載される方法（ＢａｒｎａｒｄおよびＳｙ  ２００３）にしたがって、ユーロピウムで抗体を標識した。
【００８３】
方法
Ｍａｂ  ＹＷＨ１の産生
ウシＰｒＰ由来のアミノ酸配列に基づいて、一連のキメラペプチドを合成した。これらの１つは、成熟タンパク質のごくＮ末端（アミノ酸２５〜３６）を、１つの８ペプチド反復（アミノ酸６２〜６９）と一緒に含んだ。ウシＰｒＰのＮ末端配列を図１に例示する。キメラペプチド免疫原の構造を図２に示す。先に記載される方法（Ｐｒｉｃｅ，  Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎら  １９９０）にしたがって、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ハイブリドーマを調製した。
【００８４】
ファージディスプレイ技術を用いたＹＷＨ２およびＹＷＨ３抗体の産生
自社所有（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）ＨｕＣＡＬ（登録商標）ファージディスプレイ技術を用いて、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３を同定した。簡潔には、３８４ウェル・マイクロプレート中に固定した後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）ライブラリーに対して、ヒトＮ末端キメラペプチド抗原（図３）をスクリーニングした。ＨｕＣＡＬ（登録商標）ライブラリーにおいて、ヒト抗体レパートリーの構造的多様性は、７つの重鎖および７つの軽鎖可変領域遺伝子によって示され、マスターライブラリーにおいて、４９のフレームワークを生じさせる。次いで、非常に変化する遺伝子カセットをこれらのフレームワーク上に重ね合わせて、全ヒト抗体レパートリーを模倣する。Ｆａｂ形式で、１００億を超える機能的ヒト抗体特異性があらかじめ組み立てられ、そしてファージライブラリー中で利用可能である。
【００８５】
自社所有技術（ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ）は、高親和性結合剤の簡単な溶出を提供し、そして堅固な３８４ウェルＥＬＩＳＡにおいて、候補をスクリーニングした。２つの陽性クローン（ＹＷＨ２およびＹＷＨ３）を細菌中で発現させ、そしてアフィニティー精製した。基本的な抗体形式は、一価Ｆａｂ断片であるが、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３の場合、これらは、Ｃ末端Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を持つ二価ミニ抗体に変換された。
【００８６】
ＹＷＨコーティングプレートの調製
ＰＢＳコーティング緩衝液中、精製ＹＷＨ抗体（１、２および３型）を希釈して、５μｇ／ｍＬの濃度にした。１２チャネルのデジタルピペットを用いて、２００μＬのコーティング溶液（ウェルあたり１μｇ  ＩｇＧ）を、ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）マイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。プレートを封印して、そして４℃で一晩保管した。続いて、プレートを洗浄溶液で１回洗浄し、そして吸収紙上で、軽く叩いて乾燥させた。２００μＬのブロッキング緩衝液を各ウェルに添加し、プレートを再封印して、そして使用するまで４℃で保管した。
【００８７】
ホモジナイズおよび組織の抽出
およそ３００ｍｇの脳またはリンパ組織を注意深く切り出し、重量測定し、そしてスクロース緩衝液、０．２ｍｍセラミックビーズおよび１つのより大きいポリプロピレンビーズを含有するＢｉｏ−Ｒａｄ粉砕試験管に移した。さらに、およそ２５０ｍｇの脳またはリンパ組織を注意深く切り出し、重量測定し、そして０．２ｍｍセラミックビーズおよび１つのより大きいポリプロピレンビーズを含有するＱＢＩＯｇｅｎｅ粉砕試験管（すなわち緩衝液を含まない）に移した。続いて、８００μＬの８Ｍ  ＧｄＨＣｌをＱＢＩＯｇｅｎｅ粉砕試験管に添加した。すべての粉砕試験管に栓をして、氷上で冷却し、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）組織破壊装置に移し、そして製造者の使用説明書にしたがって、最大速度で４５秒間、２回プロセシングした。
【００８８】
５０μＬのスクロース・ホモジネートを、２ｍＬエッペンドルフＳａｆｅ−Ｌｏｃｋ（登録商標）試験管内に注意深くピペッティングし、そして５０μＬの８Ｍ  ＧｄＨＣｌを添加した。試験管に栓をし、そしてボルテックスした。続いて、９００μＬのアッセイ緩衝液を添加し、試験管に栓をし、ボルテックスし、そして次いで、１３，０００ｒｐｍで５分間、微量遠心分離装置中で回転させた。
【００８９】
あるいは、組織を切り出し、正確に重量測定し、そしてＥＴＤＳ  ＶＩＩＩホモジナイザー試験管に移した。等体積の８Ｍ  ＧｄＨＣｌ（界面活性剤を含むまたは含まない）を添加した。試験管を集め、そしてＥＴＤＳ  ＶＩＩＩホモジナイザーを用いて、組織を２０秒間（脳）または４０秒間（リンパ組織）ホモジナイズした。続いて、アッセイ緩衝液を（使い捨てデバイスの中央試験管を通じて）添加することによって、ホモジネートを希釈した。ＥＤＴＳ  ＶＩＩＩホモジナイザーを用いて、希釈したホモジネートをさらに１０秒間混合し、そしてさらなる処理なしに用いた。
【００９０】
イムノアッセイ
ＹＷＨコーティングしたマイクロタイタープレートを、洗浄溶液で２回洗浄し、そして吸収紙上で、軽く叩いて乾燥させた。２００μＬの各標準または試料を、コーティングしたプレートの適切なウェルに２つ組で添加した。プレートを封印し、そして振盪装置上で、１８℃で２時間インキュベーションした。続いて、プレートを洗浄溶液で３回洗浄し、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させ、そして２００μＬのユーロピウム標識抗ＰｒＰ検出抗体（典型的にはＳＡＦ３２；アッセイ緩衝液中、１：２０００  ｖ／ｖで希釈）を各ウェルに添加した。振盪装置上で、プレートを１８℃でさらに６０分間インキュベーションした。次いで、プレートを６回洗浄し、軽く叩いて乾燥させ、１８０°回転させ、そしてさらに６回、再洗浄した。再び、プレートを吸収紙上で軽く叩いて乾燥させた。
【００９１】
２００μＬの増進溶液を添加し、プレートを１８℃で５分間振盪させ、そして時間分解蛍光光度計で蛍光を測定した。自社所有ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒデータ換算パッケージＭｕｔｉｃａｌｃ（登録商標）を用いて、ＰｒＰ濃度を決定した。
【００９２】
結果
ＹＷＨ１、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３の較正曲線
３つのＹＷＨ抗体に対する組換えヒツジおよびヒトＰｒＰの較正曲線を図４（線形Ｙ軸）および図５（対数Ｙ軸）に示す。Ｍｕｌｔｉｃａｌｃ（登録商標）によって計算した際の、ＰｒＰの最少検出可能濃度は、典型的には２０ｐｇ／ｍＬ未満であった（ウェルあたり４ｐｇ  ＰｒＰと同等）。図４は、３つの抗体がわずかに異なる特異性を有することを示す。ＹＷＨ１は、ヒツジおよびウシにより特異的であるが、ヒトＰｒＰとは限定された交差反応性しか持たない。一方、ＹＷＨ２は、ヒツジおよびヒトＰｒＰを等しく認識する。ＹＷＨ３は、ヒトとわずかにより高い交差反応性を有するが、組換えタンパク質を用いると高いバックグラウンドを与えるという事実によって、いくぶん難がある。
【００９３】
ＹＷＨ１、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３の交差反応
一連の重複ペプチドを調製して、抗体のＹＷＨシリーズのエピトープをマッピングした。競合的遮断アッセイを確立するため、これらのペプチド各々を、２ｎｇ／ｍＬ組換えヒツジＰｒＰを含有するアッセイ緩衝液中で希釈して、ある範囲のペプチド濃度（すなわち、０、１００、１０００および１０，０００ｎｇ／ｍＬ）を得た。２００μＬの各希釈を、コーティングしたプレートの適切なウェルに２つ組で添加した。プレートを振盪装置上、１８℃で２時間インキュベーションした。続いて、プレートを洗浄溶液で３回洗浄し、吸収紙上で軽く叩いて乾燥させ、そして２００μＬのユーロピウム標識抗ＰｒＰ検出抗体（典型的にはＳＡＦ３２；アッセイ緩衝液中、１：１０００  ｖ／ｖで希釈）を各ウェルに添加した。振盪装置上で、プレートを１８℃でさらに６０分間インキュベーションした。次いで、プレートを６回洗浄し、軽く叩いて乾燥させ、１８０°回転させ、そしてさらに６回、再洗浄した。再び、プレートを吸収紙上で軽く叩いて乾燥させた。２００μＬの増進溶液を添加し、プレートを１８℃で５分間振盪させ、そして時間分解蛍光光度計で蛍光を測定した。結果を図６に示す。
【００９４】
これらの結果は、ＹＷＨ１がＮ末端ペプチドのＣ末端のエピトープ（すなわちＰＧＧＧＷＮＴ）を判別することを示す。特に、強い相互作用には三重グリシンモチーフが必要であり、そしてこれは、この試薬がヒツジ／ウシ特異的であり、そしてＮ末端に二重グリシンモチーフしか持たないヒトＰｒＰには、いくぶん限定された交差反応を持つことを説明する。ＹＷＨ２のエピトープは、ごくＮ末端の塩基性領域中にある（すなわちＫＫＲＰＫＰＧ）。このエピトープが種間で保存されているため、これは、この試薬が、ヒツジならびにヒトＰｒＰを認識する理由を説明する。ＹＷＨ３との交差反応は、より複雑であり、そしてこれは、この試薬を用いて得られる高いバックグラウンドを説明しうる。
【００９５】
組織学的に確認されたＢＳＥ陽性および陰性ウシ脳組織における、疾患関連ＰｒＰの測定
Ｍａｂ  ＹＷＨ１を用いて、尾側から閂まで採取した４００のウシ脳組織試料（２００の組織学的に確認された陽性および２００の組織学的に確認された陰性）において、疾患関連ＰｒＰの濃度を決定した、そして表１に結果を示す。これらの結果は、ＹＷＨ１が、ＢＳＥ陽性および陰性の間を明らかに区別可能であることを示す（ｐ＜０．００１）。しかし、陽性試料においては、広い標準偏差があり、そしてこれは、これらの組織において、ＰｒＰｄのレベルが異なることを反映する。
【００９６】
スクロースまたはＧｄＨＣｌ中のホモジナイズ後、スクレーピー陽性および陰性組織における、ＹＷＨシリーズの抗体を用いた、疾患関連ＰｒＰの測定
ＹＷＨ１、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３を用いて、スクロースまたはＧｄＨＣｌいずれかにおけるホモジナイズ後、ヒツジ組織試料中の疾患関連ＰｒＰの濃度を決定した。図７に示す結果は、ＹＷＨ３が、組織由来ＰｒＰを認識する際に、比較的劣っていることを示す。これは、非特異的結合の問題のためでありうる。一方、ＹＷＨ１およびＹＷＨ２は、スクロース緩衝液または８Ｍ  ＧｄＨＣｌのいずれかでのホモジナイズ後、スクレーピー陽性動物から採取した組織を明らかに同定可能である。したがって、続く実験すべてにおいて、ＹＷＨ１およびＹＷＨ２のみを用いた。
【００９７】
組織学的に確認されたスクレーピー陽性および陰性ヒツジ口蓋扁桃における、疾患関連ＰｒＰの測定
ＹＷＨ１およびＹＷＨ２を用いて、ヒツジ口蓋扁桃組織の試料において、疾患関連ＰｒＰの濃度を決定した、そして結果を図８に示す。閂脳組織に対して、ＶＬＡによってスクレーピー診断を組織学的に確認する前に、これらのアッセイを盲検で行った。リンパ組織アッセイは、１００％の一致で、スクレーピー陽性を検出可能であった。
【００９８】
組織学的に確認されたスクレーピー陽性および陰性ヒツジ脳組織における、疾患関連ＰｒＰの測定
同様に、ＹＷＨ１およびＹＷＨ２を用いて、吻側から閂まで採取したヒツジ脳組織の同等の試料において、疾患関連ＰｒＰの濃度を測定した、そして結果を図９に示す。
【００９９】
正常およびｖＣＪＤヒト組織における、疾患関連ＰｒＰの測定
ｖＣＪＤ、特発性ＣＪＤ、正常脳および正常扁桃腺組織から調製した２つ組ホモジネート試料において、ＹＷＨ１およびＹＷＨ２を用いて、疾患関連ＰｒＰの濃度を決定した。結果を図１０に示す。本発明者らは、ｖＣＪＤ扁桃腺組織を試験することが不可能であったが、ＰｒＰｄが扁桃腺基質中で検出可能であることを立証するため、３つのヒト扁桃腺ホモジネートをｖＣＪＤ脳ホモジネートでスパイク処理して、１００％、３７．５％、１２．５％、２．８％、１．４％、０．０７％および０％のｖＣＪＤ脳組織を含有する混合物を産生した。ＹＷＨ２を用いて疾患関連ＰｒＰの濃度を決定し、そして結果を図１１に示す。
【０１００】
界面活性剤の存在下および非存在下の、ＧｄＨＣｌによる正常およびスクレーピー陽性ヒツジ脳組織における、疾患関連ＰｒＰの測定
多様な量の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ２０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含有するＧｄＨＣｌ中で調製したホモジネート（２つの陰性）の２つ組試料において、ＹＷＨ１およびＹＷＨ２で、疾患関連ＰｒＰの濃度を決定した。結果を図１２に示す。結果は、界面活性剤の存在が、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄ抽出両方の有効性を増加させうることを示す。
【０１０１】
代替抗体を用いた、ＧｄＨＣｌによる正常およびスクレーピー陽性ヒツジ脳組織における、疾患関連ＰｒＰの測定
８Ｍ  ＧｄＨＣｌまたは５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する８Ｍ  ＧｄＨＣｌ中で調製したホモジネートの２つ組試料（５つの陰性および１つの陽性）を用いて、（ｉ）ＹＷＨ１、ＹＷＨ２およびＳＡＦ３２；（ｉｉ）１１Ｇ５（エピトープ特異性１１５〜１３０）、８Ｂ４（エピトープ特異性３５〜４５）、４Ｈ２（エピトープ特異性１４５〜１５５）；（ｉｉｉ）Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｒｈｏｎｅ  Ｌｔｄ．，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ，  Ｋｅｌｖｉｎ  Ｃａｍｐｕｓ，  Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｇ２０  ＯＳＰから得たＰ４（エピトープ特異性８９〜１０５）；および（ｉｖ）ＴＳＥ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｃｏｍｐｔｏｎ，  Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，  ＵＫから得たＦＨ１１（エピトープ特異性６３〜９５）を含むＭａｂの別の組み合わせで、疾患関連ＰｒＰの濃度を決定した。結果を図１３Ａ（界面活性剤なし）および図１３Ｂ（界面活性剤あり）に示す。結果は、非ＹＷＨ抗体（Ｎ末端およびＣ末端）で、使用可能な特異性を達成可能であるが、正常および疾患を区別する能力は有意に減少することを示す。
【０１０２】
側方流動デバイスに対するホモジネートの効果
記載するように、８Ｍ  ＧｄＨＣｌ中で陰性ヒツジ脳ホモジネートを調製し、そして希釈した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を、この希釈したホモジネートのアリコット中にスパイク処理して、１００ｍｉＵ／ｍＬの濃度にした。スパイクしたホモジネートおよびスパイクしないホモジネートを２つの異なる種類の妊娠試験（Ａｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＢｏｏｔｓ自社ブランド）に適用した。結果を図１４に示す。結果は、希釈したホモジネートがディップスティックの流動を損なわないことを示す。
【０１０３】
側方流動検出を用いた組換えＰｒＰの測定
ＰｒＰ特異的ディップスティック・デバイスを産生した。２つの配置を発展させた。第一の配置において、先に記載されるように（Ｍａｒｔｉｎ  ＪＭら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  １９９０  １１：  ３１−４７）、ＹＷＨ１を金ゾル粒子にコンジュゲート化し、そしてＳＡＦ  Ｍａｂを、既知の方法（例えば米国特許５７１２１７２）に記載されるように、ニトロセルロース・ストリップ上に固定した。第二の配置において、金ゾル粒子にＳＡＦ  Ｍａｂをコンジュゲート化し（上述のとおり）、そしてＹＷＨ１をニトロセルロース・ストリップ上に固定した（上述のとおり）。適切なブランクと合わせた、３つの希釈（２００ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬおよび８ｎｇ／ｍＬ）の組換えＰｒＰでの２つの配置の結果を図１５に示す。配置１がより高感度であることが示され、そしてこの形式を用いた完全較正曲線を図１６に示す。
【０１０４】
側方流動検出を用いたＧｄＨＣｌによる、正常およびスクレーピー陽性ヒツジ脳組織における、疾患関連ＰｒＰの測定
ディップスティック検出デバイスを用いて、希釈したホモジネート中の疾患関連ＰｒＰの存在をＹＷＨ１で検出した（配置１）。２つの陽性と確認されたスクレーピーおよび陰性と確認されたスクレーピーの結果を図１７に示す。
【０１０５】
ユニークな抗ＰｒＰｄ抗体の産生および使用を本明細書に記載する。これらの抗体には、慣用的なＭａｂ産生技術によって産生された試薬（ＹＷＨ１）およびファージディスプレイ技術を用いて同定された２つの試薬（ＹＷＨ２およびＹＷＨ３）が含まれる。３つの抗体はすべて、ＰｒＰのごくＮ末端のエピトープを認識する。抗体の重要な特性の１つは、線形エピトープに対して比較的高い親和性を持つことである。このエピトープは、組換えＰｒＰに存在し、そして特異性および感度は、図４（線形Ｙ軸）および図５（対数Ｙ軸）に示す、ヒツジおよびヒトＰｒＰに関する較正曲線によって例示される。
【０１０６】
３つの抗体は、わずかに異なる特異性を有する。ＹＷＨ１は、ヒツジおよびウシにより特異的であるが、ヒトＰｒＰとは限定された交差反応性しか持たない。一方、ＹＷＨ２は、ヒツジおよびヒトＰｒＰを等しく認識する。ＹＷＨ３は、ヒトとわずかにより高い交差反応性を有するが、組換えタンパク質を用いると高いバックグラウンドを与えるという事実によって、いくぶん難がある。これらの知見はすべて、図６に示す交差反応性データによって支持される。これらの研究から、ＹＷＨ１がＮ末端ペプチドのＣ末端のエピトープ（すなわちＰＧＧＧＷＮＴ）を判別することが証明可能であった。一方、ＹＷＨ２のエピトープは、ごくＮ末端の塩基性領域中にある（すなわちＫＫＲＰＫＰＧ）。このエピトープが種間で保存されているため、これは、この試薬が、ヒツジならびにヒトＰｒＰを認識する理由を説明する。
【０１０７】
本明細書に記載する堅固な検出法は、きわめて高感度であり、そして検出限界は、ルーチンに、ウェルあたり５ｐｇ  ＰｒＰ未満である。これは、扁桃腺および他のリンパ組織において、凝集ＰｒＰを検出するのに十分に高感度である（図８、１０および１１を参照されたい）。したがって、方法は、血液または一次リンパ組織における初期段階から、凝集タンパク質が比較的高レベルでＣＮＳに存在する疾患の末期段階まで、疾患の発展を追跡するのに有用でありうる（図９および表１を参照されたい）。
【０１０８】
さらに、Ｍａｂの特異性は、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄを区別する示差タンパク質分解に関する必要性を取り除く。したがって、単純な該一工程抽出法は完全自動化に適しており、これは大規模試験が必要な場合に重要である。特に、本発明者らは、このアプローチが特異的でそして迅速な側方流動検出の発展に適していることを立証した。
参考文献
【０１０９】
【化１−１】
2010504502.tif 000002
【０１１０】
【化１−２】
2010504502.tif 000003
【０１１１】
【表１】
2010504502.tif 000004
【０１１２】
配列
【０１１３】
【化２】
2010504502.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、免疫原の構築用に選択したウシＰｒＰ同定ペプチドのＮ末端配列を示す。
【図２】図２は、ＹＷＨ１の産生のための免疫原として用いた、Ｎ末端ウシ・キメラペプチドを示す。
【図３】図３は、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３のパニングにおける抗原として用いた、Ｎ末端ヒト・キメラペプチドを示す。
【図４】図４は、ＹＷＨ１、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３に対する、ヒツジおよびヒト組換えＰｒＰの較正曲線を示す（線形Ｙ軸）。
【図５】図５は、ＹＷＨ１、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３に対する、ヒツジおよびヒト組換えＰｒＰの較正曲線を示す（対数Ｙ軸）。
【図６】図６は、ＹＷＨ１、ＹＷＨ２およびＹＷＨ３の交差反応を示す。
【図７】図７は、スクロースまたはＧｄＨＣｌ中のホモジナイズ後、スクレーピー陽性および陰性組織における、ＹＷＨシリーズの抗体を用いた疾患関連ＰｒＰの測定を示す。
【図８】図８は、組織学的に確認されたスクレーピー陽性および陰性ヒツジ口蓋扁桃における疾患関連ＰｒＰの測定を示す。ＰＧ１２０１／０４、ＰＧ１２０２／０４およびＰＧ１２０３／０４は、組織学的に確認されたスクレーピー陰性組織である。
【図９】図９は、組織学的に確認されたスクレーピー陽性および陰性吻側髄質における疾患関連ＰｒＰの測定を示す。
【図１０】図１０は、ヒト脳および扁桃腺ホモジネートにおける疾患関連ＰｒＰの測定を示す。
【図１１】図１１は、ｖＣＪＤでスパイク処理したヒト扁桃腺ホモジネートにおける疾患関連ＰｒＰの測定を示す。
【図１２】図１２は、８Ｍ  ＧｄＨＣｌを用いた陰性脳組織のホモジナイズにおいて、界面活性剤を含む影響を示す。
【図１３】図１３は、界面活性剤を含む（図１３Ｂ）および含まない（図１３Ａ）、脳組織ホモジネート中の疾患関連ＰｒＰの決定における、別の抗体の組み合わせを含む影響を示す。
【図１４】図１４は、記載するように調製し、そしてヒト絨毛性ゴナドトロピンでスパイク処理したホモジネートが、ディップスティック妊娠試験の側方流動には干渉しないことを立証する。
【図１５】図１５は、２つの異なる配置のＰｒＰ特異的ディップスティックの有用性を立証する。
【図１６】図１６は、ＰｒＰ特異的ディップスティック検出を用いた組換え体ＰｒＰの較正曲線を示す。
【図１７】図１７は、ＰｒＰ特異的ディップスティック検出を用いた、２つのスクレーピー陽性およびスクレーピー陰性ホモジネートにおける、ＰｒＰの測定を示す。
【図１】
2010504502.tif 000006
【図２】
2010504502.tif 000007
【図３】
2010504502.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010504502.tif 000012
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2010504502.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
2010504502.tif 000017
【図１３】
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【図１４】
2010504502.tif 000019
【図１５】
2010504502.tif 000020
【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月20日(2008.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の疾患型プリオンタンパク質（ＰｒＰｄ）の存在を検出する方法であって
ＭＡＮＬＧＣＷＭＬＶＬＦＶＡＴＷＳＤＬＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号１）、
ＭＶＫＳＨＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号２）および
ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号３）
からなる群より選択されるアミノ酸配列に特異的に結合する、第一の特異的結合メンバーと試料を接触させ；そして
前記試料に対する前記の第一の特異的結合メンバーの結合を決定する、
ここで、前記試料に対する前記の第一の特異的結合メンバーの結合が、試料が疾患型プリオンタンパク質を含有することの指標となる
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
第一の特異的結合メンバーが、以下：ＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴおよびＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴ、からなる群より選択されるアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一の特異的結合メンバーが、アミノ酸配列ＫＫＲＰＫＰＧに特異的に結合する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
第一の特異的結合メンバーが、アミノ酸配列ＰＧＧＧＷＮＴに特異的に結合する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
第一の特異的結合メンバーが、細胞性プリオンタンパク質（ＰｒＰｃ）に比較して、疾患型プリオンタンパク質（ＰｒＰｄ）に優先的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
第一の特異的結合メンバーが、ＰｒＰｄに結合し、そしてＰｒＰｃに対して実質的に結合を示さない、請求項５記載の方法。
【請求項７】
第一の特異的結合メンバーが抗体分子である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
第一の特異的結合メンバーが、ＥＣＣＡＣ寄託番号０５０９１３０１を持つハイブリドーマによって産生される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
第一の特異的結合メンバーが、ＥＣＣＡＣ寄託番号０５０９１３０１を持つハイブリドーマによって産生される抗体と、ＰｒＰｄに対する結合に関して競合する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
第一の特異的結合メンバーが、ＥＣＣＡＣ寄託番号０５０９１３０１を持つハイブリドーマによって産生される抗体のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３配列、ならびにＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
第一の特異的結合メンバーが検出可能標識を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
第一の特異的結合メンバーの結合が、第二の特異的結合メンバーを用いて決定される、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記の第二の特異的結合メンバーが、前記の第一の特異的結合メンバーに結合する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記の第二の特異的結合メンバーが検出可能標識を含む、請求項１２または請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
試料中の疾患型プリオンタンパク質を検出する方法であって；
第一の特異的結合メンバーと試料を接触させ；そして
第二の特異的結合メンバーを用いて、前記試料中の分子に対する前記の第一の特異的結合メンバーの結合を決定する、
前記結合の存在は、疾患型プリオンタンパク質の存在の指標となる、
ここで、前記の第一または第二の特異的結合メンバーの一方は、以下：
ＭＡＮＬＧＣＷＭＬＶＬＦＶＡＴＷＳＤＬＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号１）、
ＭＶＫＳＨＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号２）および
ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号３）
からなる群より選択されるアミノ酸配列に特異的に結合する、特異的結合メンバーであり、そして；
前記の第一または第二の特異的結合メンバーのもう一方は、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄの両方に結合する
ことを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記の第一および前記の第二の特異的結合メンバーの一方が固定されている、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記の第一および第二の特異的結合メンバーの非固定化特異的結合メンバーが、検出可能標識を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記試料中の分子に対する前記の第一の特異的結合メンバーの結合が、検出可能標識の存在を検出することによって決定される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記試料中のタンパク質を可溶化することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質が、可溶化剤で試料を処理することによって可溶化される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
可溶化剤がカオトロピック剤である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
試料が非生物学的表面から得られる、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
試料が個体から得られる、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
疾患型プリオンタンパク質の存在が、個体が感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を有する指標となる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
試料が前記個体の組織試料または生物学的液体である、請求項２３または請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
可溶化剤の存在下で組織試料を破壊する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
試料をプロテアーゼ処理しない、請求項１〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
試料中のＰｒＰｄの存在を検出するためのキットであって：
以下：
ＭＡＮＬＧＣＷＭＬＶＬＦＶＡＴＷＳＤＬＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号１）、
ＭＶＫＳＨＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号２）および
ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＲ（配列番号３）
からなる群より選択されるアミノ酸配列に特異的に結合する、１以上の第一の特異的結合メンバー；および
試料に対する前記結合メンバーの結合を決定するための検出試薬
を含む、前記キット。
【請求項２９】
個体から得た組織を取り扱い、そして／または保管するための装置を含む、請求項２８記載のキット。
【請求項３０】
前記組織由来の前記試料をホモジナイズし、そして／または抽出するための試薬を含む、請求項２８または請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
可溶化剤を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項記載のキット。
【請求項３２】
検出試薬が、ＰｒＰｃおよびＰｒＰｄの両方に結合する第二の特異的結合メンバーを含む、請求項２８〜３１のいずれか１項記載のキット。
【請求項３３】
１以上の第一の特異的結合メンバーまたは第二の特異的結合メンバーが固定されている、請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
側方流動デバイス中に、１以上の特異的結合メンバーまたは第二の特異的結合メンバーが固定されている、請求項３３記載のキット。
【請求項３５】
１以上の特異的結合メンバーまたは第二の特異的結合メンバーが検出可能標識で標識されている、請求項３２〜３４のいずれか１項記載のキット。
【請求項３６】
感染性プリオンタンパク質の検出に有用な化合物に関してスクリーニングする方法であって、配列番号１〜３およびその断片からなる群より選択される配列からなるペプチドと、試験化合物を接触させ、そして；ペプチドに対する化合物の結合を決定する、ことを含み、
ここで該ペプチドに対する該化合物の結合が、該化合物が感染性プリオンタンパク質の検出に有用であることの指標となる、前記方法。
【国際調査報告】
2010504502.tif 000024
2010504502.tif 000025
2010504502.tif 000026