(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶによる感染を予防する及び／又は個体におけるＨＩＶ感染症の進行を予防する、ＨＩＶワクチンの製造方法に関する。特に本発明は、抗レトロウイルス療法後に選択された存在するＨＩＶ−亜型及び変異体に結合する、個体における免疫応答としてのＨＩＶ特異抗体の形成を提供する。本発明は、実質的に全てのＨＩＶ−アイソフォームを認識しかつ結合することが可能であるＨＩＶ特異抗体にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症を予防するＨＩＶ−ワクチンを製造する方法であって、
ｉ）ＨＩＶ−１亜型Ａ又はＢに感染した多数の個体から得られたＢ−リンパ球で発現されるモノクローナル抗体のファージミドライブラリーを作製する工程、
ii）未変性の又は組換ＨＩＶ−１ペプチドパンニングにより、抗体ファージミドライブラリーを濃厚化する工程、
iii）支持体に結合されたＨＩＶ−１ファージミドライブラリーを使用するリバースパンニング手法により、ＨＩＶ−１ペプチド／ポリペプチド／タンパク質材料を収集する工程、
iv）工程iii）において得られたペプチドの材料の同定及び特徴決定の工程、並びに
ｖ）発現システムにおけるグリコシル化された組換ＨＩＶ−１  ｅｎｖペプチドの作出において、工程iv）の結果を使用する工程、
（vi）組換ＨＩＶ−１  ｅｎｖペプチドを精製し、かつワクチン組成物を製造する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記ＨＩＶ材料が得られる個体が、同一又は異なるＨＩＶ亜型に感染されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス材料が得られる個体が、抗レトロウイルス療法ナイーブ患者又は抗レトロウイルス療法が施された患者である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
得られるウイルス材料が、支持体に接触される前に増幅される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
種々の異なるＨＩＶ特異抗体及び／又は抗体断片を保有する支持体が、ファージミドライブラリー、ペプチドマイクロチップ、又は細菌ライブラリーから選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ファージミドライブラリーが：
ａ）ＨＩＶに感染した多数の個体から得られたＢ−リンパ球において発現された免疫グロブリンの、各々、軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする核酸由来のＤＮＡ−断片を調製する工程；
ｂ）免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ−断片を連結し、免疫グロブリンの、各々、軽鎖及び重鎖の可変領域を含むポリペプチドの発現を可能にし、多数の異なる特異性を作製する工程；
ｃ）ファージミドベクター内の連結された断片をクローニングし、かつバクテリオファージの表面上での発現のために細菌株を形質転換する工程により調製される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）におけるＤＮＡ断片の調製が、抗レトロウイルス療法により治療された及び／又はされないＨＩＶ−１亜型Ａ及びＢ感染患者のＢ−リンパ球から得られたＲＮＡ−プールからのｃＤＮＡの調製、並びに軽鎖及び重鎖の可変領域の増幅を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記増幅が、表１〜７に列記されたプライマーの組合せのいずれかにより実行される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
得られたｓｃＦｖファージミド組換抗体が、ＨＡＡＲＴ−又は任意の他の抗レトロウイルス療法を経験した患者において実行された抵抗性ＨＩＶ変異株に対し特異性がある、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｉ）が、異なるドナーから単離された組換ｇｐ１２０−、ｇｐ４１−及び未変性のＨＩＶ−ポリペプチドによる、ＨＩＶ−特異抗体を結合するパンニング手法における抗体のＳｃＦｖ断片を提示しているファージミドライブラリーの濃厚化を更に含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（iii）における、ＨＩＶ−１  ｅｎｖペプチド／ポリペプチド／タンパク質の単離が、発明されたリバースパンニング技術を用いて実行される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
工程iv）における、ＬＣ質量分析が、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０及びその標準断片及び可変断片の定量分析、同定及び配列決定のために適用される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
工程ｖ）が、真核生物グリコシル化を伴う好適な宿主において、組換ＨＩＶ−１ペプチド／ポリペプチド／タンパク質を作製する工程を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
任意の免疫原性刺激因子、アジュバント又は担体の添加／複合により、ＨＩＶ予防ワクチン組成物を調製することに関与している、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
組換ｇｐ４１及びｇｐ１２０  ＨＩＶ−１亜型Ａ及びＢ  ｅｎｖペプチド／ポリペプチド／タンパク質を含有する、請求項１３記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１６】
立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）又はビロソーム及びそれらの可能な変種を、アジュバント−担体として更に含有する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のＨＩＶワクチン。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法により取得し得るＨＩＶ予防ワクチン。
【請求項１８】
請求項１６記載のＨＩＶワクチンの使用であって、ＨＩＶ感染症及びＡＩＤＳ疾患の罹患及び発症に対し、未感染の個体を免疫化するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶによる感染を予防する及び／又は個体におけるＨＩＶ感染症の進行を予防する、ＨＩＶワクチンの製造方法に関する。特に本発明は、抗レトロウイルス療法後に選択された存在するＨＩＶ−亜型及び変異体に結合する、個体における免疫応答としてのＨＩＶ特異抗体の形成を提供する。本発明は、実質的に全てのＨＩＶ−アイソフォームを認識しかつ結合することが可能であるＨＩＶ特異抗体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）は、ウイルス複製時に生じる変異の蓄積により引き起こされ、更に組換事象によっても引き起こされる、顕著な遺伝子変動性により特徴づけられる[1, 18, 24]。ＨＩＶ治療の化学療法の失敗は、このＨＩＶ−１ウイルス株の高度な変異原性の活性が原因である[8]。種々のコースの抗レトロウイルス療法後の患者において、及び更には複合療法（ＨＡＡＲＴ）後の患者においてであっても、耐性ウイルス変異株が迅速に生じることが早くに示された。これらの耐性ウイルスは、それらのタンパク質の高次構造及び構造に特異的変化を有する。通常ＨＩＶ−１が現在の治療から逃れることに寄与するそのような変異は、治療条件下での選択の結果として保存され(saved)かつ蓄積される。
【０００３】
抗−ＨＩＶ−１医薬品による治療は、ウイルス複製を完全には停止せず、このことは予め存在する耐性変異の選択及び蓄積、並びに新たな変異の発生及び蓄積を可能にし、その結果ウイルス生存の新たな入口を生じる。従って現存する抗レトロウイルス調製品（ＮＲＴＩ、ＮＮＲＴＩ、プロテアーゼインヒビター、融合インヒビター、更にはＨＡＡＲＴのような種々の薬剤の混合物）は全て、耐性ウイルス株が生じかつ繁殖するまで、多少延長された期間にわたりＨＩＶ−１複製を遅くすることができるのみである[7]。一般的抗−ＨＩＶ治療に耐える広く蔓延しているＨＩＶ−１耐性変異株は、特にＨＩＶ−感染した患者が通常抗レトロウイルス療法を受ける開発途上国において、重大な問題となり始めている[8]。
【０００４】
ＨＩＶ研究の２５年の歴史にわたり、ＨＩＶ免疫療法用のワクチン開発の数種のアプローチが提唱され、かつそれらの実践的結果が検証された。これらのアプローチは、ワクチン活性成分、それらの作用機序及びそのワクチンの製造法に従い、以下のように分類することができる：
１型：モノクローナルＨＩＶ−特異抗体−ベースのＨＩＶ／ＡＩＤＳワクチン、
２型：ＨＩＶ粒子破壊−ベースのワクチン、
３型：ＨＩＶ−ペプチド−ベースのワクチン、及び
４型：ＨＩＶペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡプラスミド又はウイルス（アデノ−、アデノ随伴、鶏痘、ワクシニアなど）ベクターワクチン。
【０００５】
１型：モノクローナルＨＩＶ−特異抗体−ベースのＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療用ワクチン、中でもｍＡｂとしての中和抗体、又は２〜３種のＨＩＶ−中和ｍＡｂのカクテル[5, 14, 28]
ＨＩＶ感染機構について最初に発見されたことは、ＣＤ４受容体並びにＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４共受容体を介した、リンパ球又は他の宿主細胞へのそれの侵入方法であった。次にＨＩＶエンベロープタンパク質構造が研究され（図１０ａ−ｂ）、ｇｐ１２０ループの３Ｄの変動性並びにＣＤ４及び共受容体の識別及び吸着のためのｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体形成の重要な役割が基本原則として設定された。ウイルスｅｎｖタンパク質を見つけ、ＨＩＶ細胞侵入に寄与するそれらのエピトープに結合し、又はＣＤ４受容体及び共受容体上の各ドメイン若しくはエピトープに結合し、その結果段階的ＨＩＶ感染プロセス若しくは細胞結合を妨害すると理解されるモノクローナル抗体は、ＨＩＶ中和抗体と称された。
【０００６】
抗体−ベースのワクチン開発における大きい問題点は、ＨＩＶ遺伝子変動性によっても引き起こされ、これは、一部のＨＩＶ抗原により誘発された組換抗体は、ＨＩＶ−１の異なる単離体を中和することが不可能であるということである。免疫化により誘発された抗−ＨＩＶ−１モノクローナル抗体の大部分は、貧弱な交差−中和活性を有するか又はこれを有さず、かつ典型的には、変異のためにウイルス毎に異なるか又は感染性ビリオンの表面に余り露出されていないかのいずれかである決定基に結合する。中和ｍＡｂのいくつかの異形が作出されたが、その後臨床試験が、エンベローブタンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１に対する中和抗体をベースにしたワクチンは、標的ＨＩＶタンパク質の表面エピトープの変動性及び変化という同じ理由により、１〜２ヶ月以内に働きを停止する（稀に、これらが開始時から働く場合）ことを示した。
【０００７】
説明されたワクチン開発アプローチの欠点は、動物の免疫化のためのウイルス抗原のどちらかの抗体のモノクローナル性の選択である。ウイルス標的−タンパク質の種々の変種に特異的な中和抗体のパネルが作製されるような場合であっても、各ｍＡｂは、細菌システムにおける組換モノクローンとして作製される。更に原核生物の組換抗体はそれらの抗原に対する親和性が、動物又はヒトの血清中の未変性のＡｂと比べ、少なくとも１０倍低い。動物において誘発されたポリクローナルＨＩＶ−特異的免疫グロブリンは通常、ヒトなどの種々の生物について免疫毒性である。それらを、診断目的に使用することは可能であるが、アナフィラキシー反応の発生機会の多さは、それらの免疫療法適用に関する当然の制約である。ハイブリドーマｍＡｂ作製技術は、免疫グロブリンにおける生物学的種の差異の問題点を解決しない。ヒト化ｍＡｂ又はキメラｍＡｂの作製技術は、非常に面倒であり、かなり時間がかかりかつ費用もかかる。従ってこの技術により、抗−ＨＩＶ免疫療法のための数十又は数百のｍＡｂ異形を作製することは不可能である。
【０００８】
２型：ＨＩＶ粒子破壊−ベースのワクチン[9, 20]。天然のＨＩＶビリオン及びＨＩＶペプチドを使用する発想は、１５年以上前に明らかにされ、かついくつかの形で生まれ変わった。中でも、小型ウイルスにとって致死的であるが、ペプチド結合及びタンパク質の高次構造に対する破壊作用が比較的低いことが周知である、β−プロピオラクトン、ソラレン又は類似物質による、ＨＩＶ粒子の感染性活性の保存が発想された。超遠心分離法による患者の血流由来の未変性ウイルスの濃縮は、一部の免疫化に適用可能なウイルス量を生じることができないことが急速に明らかになり始め、これはかろうじて研究分析のために若干の材料を送達することができる。そのため、この種のワクチンの実際上の変形は、実験室株のインビトロ感染培養、又は初代単離株の感染及びそれらのドナーリンパ球との培養のいずれかである。両方の場合において、免疫化後のＨＩＶタンパク質の免疫応答形成に必要な大量のウイルス粒子を提供するための、数百リットルの発酵槽中での大規模生成が唱えられている。
【０００９】
この発想それ自身は完全に悪くはなく、これは他の３種のワクチン型の以前には利点さえ有する。第一に、免疫化のための不活化されたウイルス粒子使用の安全性は、ショ糖ピロー(pillow)勾配における超遠心分離後に、ＨＩＶ  ＲＮＡコピーの実時間定量を試みる場合に、より自明のものとなる。ウイルスＲＮＡは大部分、小片に崩壊され、かつショ糖勾配における濃縮後に得られたＨＩＶビリオン又はそれらのタンパク質の実濃度よりも、１０4〜１０5より低い数のレベルへと破壊される。第二に、未変性ウイルスタンパク質の獲得は、現存する種々のＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質エピトープを対象とする見込みがよりあるように見える。しかしこの最後の説明は、この種のワクチンが働かない真の理由である。
【００１０】
ＨＩＶ粒子破壊−ベースのワクチン開発は、遺伝子変異選択のインビトロ条件が、動物又はヒト生物における同じプロセスの境界からどの程度異なるかの最良の例である。ウイルスペプチドの分析は、異なるウイルス亜型にのみではなく、同じ患者から単離されたウイルス変異株にさえも特異的である、抗原エピトープの高い変動性を明らかにした。しかし全ての実験室株、中でも高度に感染性のＢIIIのＡ４５５は、ｅｎｖペプチドの配列の一定でありかつより均質な組成を有する。実験室ＨＩＶ株に関して質量分析法又は３Ｄ構造的方法により分析されたｅｎｖペプチドライブラリーの多様性は、単独の一患者から採取した同等物から最大５％である。同じ傾向が、ドナー血液リンパ球又はＣＤ４、ＣＣＲ５若しくはＣＸＣＲ４−有するヒト細胞培養物とインビトロで共培養された初代ＨＩＶ単離株について認められる。これは、ウイルスのインビトロ感染に関する選択条件は、生物における天然のウイルス複製及びビリオン形成プロセスとは非常に異なり、ヒト生物におけるウイルス生存率(survivorship)に関するゲートは、インビトロ培養時よりも９５％より広いことを意味する。従って大規模インビトロ生成後の不活化ウイルス粒子を使用し抗−ＨＩＶワクチンを調製する全ての試みは失敗し、更には実験室ＨＩＶ株から供給されたペプチド−ベースのワクチンも失敗した。
【００１１】
３型：ＨＩＶ−ペプチド−ベースのワクチン[3, 6, 13, 15, 27, 33, 36]。この最新型のワクチンは、小型のＨＩＶペプチド、受容体認識及び感染活性に寄与するウイルスタンパク質のより大きいＨＩＶタンパク質偽エピトープの複数の小さい１５〜２０個のアミノ酸断片、これらの小型ペプチドのパネルを含む。小さいレンチウイルスファミリーのメンバーとして、ＨＩＶは、小数のペプチド（合計１８）からなり、ＨＩＶペプチドワクチンの大部分は、ｇｐ１２０（ｇｐ１４０、ｇｐ１６０）又はｇｐ１２０及びｇｐ４１の両方のｅｎｖタンパク質の断片を含有し、残りは、維持が困難な(little easy-to-maintain)マトリックスペプチド及びｐ２４断片を含む。このクラスの他の部分は、ＨＩＶ生活環に関して天然の提供されたグリコシル化により酵母において生成された完全長ｅｎｖペプチド若しくはそれらの大型断片、又はいわゆる糖質−ベースのＨＩＶワクチンである。ＨＩＶペプチドワクチンの一部は、治療的免疫化が意図され、一部は、予防活性を有することが言明されている。
【００１２】
しかしこれまで組換ＨＩＶペプチドのカクテルも合成１５〜２０個アミノ酸ペプチドのカクテルも、ウイルス感染及び複製からの防御を提供することができなかった。その主な理由は、どのようにこれらのペプチドが得られたかの原理の分析から明らかにすることができる。組換ペプチド配列は、長いＴａｑ−ポリメラーゼＰＣＲ（通常１０００〜３０００ｂｐ）により増幅されたＨＩＶゲノム断片のステージを含む、患者由来のウイルス材料からのＲＴ−ＰＣＲにより得られた試料の、又はＨＩＶ−特異的プライマーＰＣＲ後の患者のリンパ球由来のＤＮＡの配列の自動ＤＮＡ配列決定の技術、その後の形質転換された大腸菌株コロニーの選択により作製される。現在の技術は、高くないとして平均で多様な変種１０5〜１０6から１配列ケースの頻度での、ランダム様式のＨＩＶ遺伝子型のモノクローナル選択を基礎としており、それから平均感染性ウイルス力価は１％であり、そのためこれは感染活性のあるウイルスの１０3〜１０4コピーである。１個体の患者血液の同じ試料からこの技術で作製された二つの配列の完全なＨＩＶゲノムのデータは、劇的に異なることは、ＨＩＶゲノム配列を作製しそれら自身を分析する研究者には周知である。従ってこれらの組換ペプチド又は３〜４種の組換ペプチドのカクテルによる免疫化は、例え真核生物発現システムにおいて適切にグリコシル化された（糖鎖付加された(carbohydrated)）としても、現在対処されるべきウイルス変異株の不活化に特異的な免疫応答の形成を提供することはできない。従って、ＨＩＶワクチン開発アプローチは、これらの標準とは無関係であり、組換ペプチド配列の情報は、他の方法で作成されなければならない。
【００１３】
合成アミノ酸の小型ＨＩＶペプチド[27]は、矛盾したアプローチにより作製され−ペプチド結合形成の各サイクルに関して、公知のＨＩＶ配列における可能性のあるアミノ酸変種の混合物が添加される場合、数百の変種が自動ペプチドシンセサイザーにおいて混合物として作製されている。ｅｎｖタンパク質の可変領域の多くの変種は、ペプチドシンセサイザーを使用し得ることができる。しかしこれらのペプチドのサイズは、１５〜２０、最大３０個のアミノ酸に限定され、より長いペプチド型は、組換システムにおいてのみ作製が可能である。実際に、小型の合成ペプチド及びそれらのカクテルによる免疫化は、ＨＩＶ免疫反応について十分に高いが、それへの特異性が低いか若しくはないように追加免疫する。個々に、動物（アカゲザル(Rhesus macaques))の合成ＨＩＶペプチド免疫化の試みであっても、標準ＥＬＩＳＰＯＴ法により試験されたそれらの血液中にＨＩＶ特異抗体が存在しないという不満足な結果を引き出す。恐らくＨＡＡＲＴと組合せた治療目的の組成物としての、現存するペプチド−ベースのＨＩＶワクチンは、若干見込みがあるであろう。しかしペプチドワクチン組成物はひとつも、現在まで免疫化後のＨＩＶ感染症−予防作用を示していない。
【００１４】
４型：ＨＩＶペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡプラスミド又はウイルス（アデノ随伴、鶏痘、ワクシニア、レトロウイルスなど）ベクターワクチン[11, 12, 16, 21, 26, 29, 30]。世界中で９９の臨床試験に関して承認が得られた５５種の抗−ＨＩＶワクチン中でほとんどは、ＤＮＡ−ベースのクラスに属している。しかしひとつの候補だけが、第III相臨床試験を通過し、かつ第ＩＩｂ相を通過する若干の見込みがある[37, 42]。この種のワクチンを使用する発想は、ＤＮＡ免疫化は、自己免疫合併症及びアナフィラキシー反応などの即時型副作用を生じないという、健常なバックグラウンドを有し、そのためその臨床適用は、安全かつ容易である。この利点にもかかわらず、全てのウイルス及び非ウイルスＤＮＡワクチンは、それらの実際の抗−ＨＩＶ有効性の可能性に関して、希望を弱める多くの欠点を含む。
【００１５】
ＤＮＡは、それ自身いかなる免疫反応も引き起こさないので、このワクチン有効性は、下記の３つの条件の大きさであり、これらは各々同等に重要である：
１）トランスフェクション／感染効率、又はいかに多くの細胞が、一旦適用されたある量のＤＮＡから遺伝物質が供給され得るか；
２）発現レベル、又はどのくらい多くのタンパク質が、１種又は複数の遺伝子コピーを得る細胞において発現されているか；
３）免疫応答の継続、又はいかに長くＭＨＣが、標的化病原体を認識するｍＡｂの誘発を続けるか。
【００１６】
インビトロトランスフェクション／感染効率の測定は、細胞が分裂の次サイクルを通過するまでに遺伝子導入後２４時間に計測された現在のタンパク質を発現している細胞の割合であり、この割合は、同じ条件で同時に導入された蛍光タンパク質又はＬａｃＺを発現している細胞について計測される。非−ウイルス系プラスミドベクターに関して、インビトロ効率は、４０〜９０％を達成することができるが、同じベクターに関してインビボ静脈内投与は、最良の状態で１〜５％生じる。これらの４０〜９０％（インビボにおいて１〜５％）から、９８〜９９％は、２週間後には消滅する一過性又はエピソーム性の発現であり、かつトランスフェクトされた遺伝物質のわずかに１〜２％が、細胞ゲノムに挿入され、長期発現を提供する。プラスミドＤＮＡワクチン[16]の量は、その送達物質−それらにより作製された陽イオン性脂質及びリポソーム、陽イオン性ポリマー（ポリエチレンイミン、ポリリシン）、プルロニック並びにそれらの種々の組合せに関する、最大耐量により制限される。実際に、負帯電したＤＮＡに結合しかつ運搬することができる全ての陽イオン物質は、濃度１０5〜１０4Ｍ及びそれ以上で高度毒性である。非−ウイルスベクターの発現レベルは、ウイルスベクター発現と比べ、比較的高い。
【００１７】
ウイルスＤＮＡベクターの感染効率は可変性であるが、通常インビトロ実験の１０〜２０％を超えない。しかしウイルスベクターは、遺伝物質の直接ゲノムへの送達を提供するそれらの能力において魅力的となり始めている。そのためインビボ投与に関するウイルスベクターの感染効率は平均２〜５％であるにもかかわらず、標的タンパク質の発現は、主として長期間であり、一過性ではない。従ってウイルスＤＮＡベクターは、治療又は予防目的で免疫応答及び抗−ＨＩＶ活性の十分な持続を有すると仮定された。
【００１８】
しかしウイルスＤＮＡワクチン成分、及びいかにそれらが段階的に作用するかを研究するために、それらの予測される活性様式の制限を観察することができる。臨床試験に入っているＤＮＡベクターの第一のクラスは、アデノウイルス構築物(construction)であった。それらの最新型は既に０とは異なる感染効率を示し、及び免疫化ｍＡｂ後に誘発された力価は全ての免疫化学法により検出可能であるにもかかわらず、これらは決して単独投与において使用されない。このポイントは、アデノウイルスベクター−ＡＤＶ[11]、又はアデノ随伴ウイルスベクター−ＡＡＶ[29]は、予定された免疫化の２週間後のＥＬＩＳＡ、ＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴ又はウェスタンブロットアッセイにより通常認識されるタンパク質を送達する比較的低い発現のみを引き起こすことである。任意の組換タンパク質又はタンパク質混合物による標準免疫化の２週間後に抗体力価によりＡＤＶ及びＡＡＶに関するこれらのデータを比較する場合、ＡＤＶ及びＡＡＶワクチン接種に関して絶対数は５〜１０倍より低いことは明らかになり始める。これらの数に注目し、本研究者らは、可能性のある免疫応答の期間についていくつか結論づけることができる。
【００１９】
第III相臨床試験に到達し、かつ２００３年１０月以降タイにおいて１６０００名の未感染個体に適用されたただ一つのワクチン組成物は、２種のポックスウイルス（ワクシニアウイルス）−ＨＩＶワクチン接種（ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ）後の、プラスミドＤＮＡ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖワクチン（ＡＩＤＳＶＡＸ  Ｂ／Ｅ）による並べられたワクチン接種を基にしていた[12]。この特許のデータの検証は、ワクチン接種されたアカゲザルの血液試料由来の誘発された抗体の力価は、各免疫化後１〜３週間増加し、かつワクチン接種の残り１年間は、対照数からプラスのプロットへやや外れていくことを示している[12]。免疫応答の継続は、この場合これをいかにして評価するかという問題である。アデノウイルス及びポックスウイルスは、中でも最大のウイルスファミリーであり、これらは表面上及びウイルスマトリックス内にそれら自身のタンパク質を数百個露出していることも忘れてはならない。これは、投与後短期間（１〜２週間）でブーストされた免疫応答は、高度であるが、ほとんど非特異的であり、かつ加えて非特異性は、副作用として免疫毒性反応を引き起こすということを意味している。
【００２０】
ウイルスワクチンの有効性における唯一の例外は、レトロ−（レンチ−）ウイルスベクター−ベースのアプローチである[26]。ＨＩＶはそれ自身、レンチウイルスファミリーの良い例である。レトロウイルスベクターは、十分に高い（最大５％）インビボ感染効率を提供し、送達された遺伝子タンパク質の発現は、細胞ゲノムの感染のために安定していない場合にも十分でありかつ長い。レトロウイルスベクターは、癌治療用ワクチンとして、臨床試験において、あらゆる他の遺伝子構築物よりも、著しくより良い抗腫瘍反応を示した。ＨＩＶを含む全てのレトロウイルスのみが、それらの治療的適用であっても疑わしく、予防的ワクチン接種は注目に値しないものにするある性質を有し−これは、移動性遺伝エレメントとしてヒトゲノムへ侵入するそれらの能力、並びにある期間後そのカスケードが制御できなくなり始める複数の遺伝的変異を駆動し、種々の細胞及び組織において複数の癌悪性転換を引き起こす能力である。
【００２１】
ＤＮＡ−ベースのＨＩＶワクチンの一般的欠点は、ＰＣＲ及びモノクローニング後の標準ＤＮＡ配列決定などの、組換ＨＩＶペプチド組成物に関して先に説明された方法と同じ方法で得られた当初のヌクレオチド配列に関するものである。１０5〜１０6変種と等しい患者１名の血流中のＨＩＶ遺伝的変異の平均数を理解することは真実に近い。ランダム様式のこの方法で得られた一つ又はいくつかの配列データで作製された遺伝的構築体は、同じ患者に関してであってもＨＩＶ変異株の大半が基本的には働くことができない。並びに全てのプラスミドＤＮＡ及び任意のウイルスベクター−ベースのＤＮＡのＨＩＶワクチンは、単独のｅｎｖ、ｐｏｌ、ｇａｇ及びそれらの組合せ領域に関するＨＩＶゲノムの配列をベースにしている。これらの構築物がモノクローナルヌクレオチドＨＩＶゲノム領域の配列からなるようになるまで、ＨＩＶワクチン開発は袋小路にある。ＨＩＶ遺伝的変動性及び変異性を根絶するために、その現存する変異の定量分析を継続し、かつより頻繁に存在する変異株に関する見込みのあるワクチンを製剤することは必要である。
【００２２】
先に説明されたように、ＤＮＡ−ベースのＨＩＶワクチンの有効性に関する他の主な制限は、ウイルス及び非−ウイルスの遺伝子治療用ベクターのインビボ送達に関する不完全な公知の方法に起因した貧弱な免疫応答である。あらゆる種類の抗−感染症免疫化を提供するＤＮＡ−ベースのワクチン型の見込みが低いことを理解するための科学者の正確な比較は、以下である。任意のタンパク質又は抗原、及び原核生物大腸菌システムにおいて作出されたそれらの組換連結されたＩｇＧ軽鎖−重鎖変形に関する仮定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を想定して欲しい。ここで本発明者らは、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、イムノドットブロット、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡などの、全ての可能な実験室免疫反応アッセイにより、抗原がこれらの２種のｍＡｂ型へ結合するための親和性の比較を行うことを試みる。本発明者らが、これらの型がひとつのアッセイに収められた各状況において認めるものは、以下である−組換ｍＡｂの親和性は、常に天然の動物モノクローナル抗体の親和性よりも少なくとも１０倍低く、更には力価決定時の最小結合活性の差異は、１００〜２００倍に達し得る。ワクチン免疫原性のインビボ評価に関する同じ状況は、研究者が、動物免疫化に使用されるＤＮＡ−ベース組成物及びタンパク質−ベース組成物の活性を分析する場合に、認められる。免疫化された動物の血中の現在の抗原に関するｍＡｂの力価として測定された特異的免疫応答の有効性は、遺伝子ベクターとして送達される抗原の方が、当初のタンパク質−抗原よりも、数倍より低いであろう。ＤＮＡ変種に関する特異的抗原免疫応答の強度は、その「陽性対照」−タンパク質変種よりも常に５〜２０倍より低い。
【００２３】
可能性のあるＨＩＶワクチン候補として説明されている、更にひとつの小さい組成物の範疇が存在し−これは樹状細胞ワクチンとも称される。それらの開発は、幹細胞科学を基本にし、かつ樹状細胞ワクチンは、かなり経費が高い（平均患者１名の治療に４５０００〜６００００米ドル）にもかかわらず、適度に十分な治療結果を伴う化学療法又は放射線治療と組合せて、数種類の腫瘍の治療に適用される。しかしいくつかのある種の病理又は微生物を識別しかつ殺傷することがインサイチュにおいて示された樹状細胞−マクロファージ前駆体は、同じ患者の血流に自家的にのみ適用されることができるので、ＨＩＶ治療、更には感染症予防に関するそれらの効能はかなり疑わしい。マクロファージの「教え(teaching)」に関するウイルスのペプチドを得る場所に関する疑問は、同じであり、組換体は、数年配列が固定され、かつ未変性のものは、単離するために実在しないような高濃度で提供されなければならない。従って樹状細胞適用は、重大な抗−ＨＩＶワクチンの候補としては提唱することができない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
ＨＩＶ−１大流行の制御の唯一の可能性のある方法は、非−感染個体、特に高リスク群の代表者の免疫化を通じて、ＨＩＶ−１感染を防止及び／又はその発症を停止することができる、ある種のワクチンである。そのようなワクチンは、個別の天然のＨＩＶ−１ペプチドのエピトープの混合物、正確にはウイルス表面上外側にのみ存在する主要なＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ｇｐ１２０、その断片のエピトープ、及び同じく好適な外側部分を伴うｅｎｖ  ｇｐ１２０−ｇｐ４１四量体の原料としてのｇｐ４１ペプチド及び／又はワクチン接種される個体の免疫系を認識可能なエピトープを含有しなければならない。これらのペプチドは、先に言及された理由（３〜４頁１３〜３０、１〜２０行）のために、ウイルス由来の未変性のものであることはできない。並びに組換ペプチドに関して、正確な配列情報が誘導されなければならない。本発明者らは、以下を基にしたｅｎｖ配列研究を含む、本特許出願において詳細に特定されたＨＩＶワクチン開発の代替法を開発した。
１）未変性ウイルスペプチドのファージディスプレイリバースパンニング技術による収集及びアフィン(affine)精製；
２）ＨＩＶ−感染した個体の現在のコホート中の多数の変異株において表されたｇｐ１２０及びその断片の配列に関する情報を送達する一群のＬＣ−ＭＳ法を使用する、未変性ウイルスペプチドの引き続きの定量的かつ配列決定分析；
３）ＨＩＶ及び真核生物のグリコシル化と同じ組換ｅｎｖペプチド産生のためにリーシュマニア属システムを使用する、天然ｅｎｖペプチドエピトープの再構築；
４）ａ）必要な免疫ブースト期間の延長、ｂ）免疫毒性の制御：を提供する、免疫原性ｅｎｖペプチドのための立体的に安定したリポソームパッケージング又はビロソームのいずれかのアプローチを使用する、ＨＩＶ予防ワクチン組成物。
【００２５】
現在までに実行されたｇｐ１２０のプロテオーム解析は稀であり、かつ他のウイルスペプチド及び細胞タンパク質のカクテルから精製された未変性のペプチド変種は存在しないので、不完全であった。十分な吸着能を持つカラムでのウイルスｅｎｖペプチドのアフィン吸着によるリバースパンニング技術は、この問題点を解決することができる。ＨＩＶ感染に対する免疫化のためのワクチン組成物が製造される前に、ＨＩＶ感染した個体の現在のコホートの大半において提示されているｅｎｖペプチドのアイソフォームを選択することが必要である。
【００２６】
１名の患者について平均１０5の遺伝的変種という大きい変動性にもかかわらず、最も採用されかつより高い感染生存率を有する変種の選択が、各感染者において実行される。疫学的変動性のデータは、ＨＩＶ変異株の蔓延は、縄張り的境界、存在する遺伝子配列に応じた性的−又は注射薬物乱用（ＩＤＵ）−伝染の個人的接触依存性を有することを証明している。優性の(dominating)ウイルスペプチド変種の数は、遺伝的変種よりも決定的にはるかに小さいが、十分迅速に種々の数の優性に変更することができる。及び優性である感染的に危険な変種であるヌクレオチド配列は、情報を生じず、プロテオーム定量及び配列分析のみ行うことができる。本発明者らが試みたこの方法は、液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレーイオン化質量分析である。
【００２７】
未変性のｇｐ１２０  ＨＩＶペプチドは、高い免疫原性を有するが、エピトープ同一性を失っていない組換変種について同レベルを維持するためには、同様のグリコシル化を持つ組換システムが必要である。この問題点を解決するためには、細胞培養物、酵母培養物及びリーシュマニア属システムを使用することが可能である。真核細胞培養生成は、大腸菌における１０００と比べ平均数１０００万(decades of million)であるような多数の自己細胞タンパク質のために、ごくわずかな量の組換ペプチドをもたらす。酵母培養物は、十分な生産を提供するが、酵母における糖合成(carbohydration)は、先に提唱されたように、真核生物及びＨＩＶと非常に似ている訳ではない。従って本発明者らは、誘導性かつ高い発現で、真核生物に典型的なグリコシル化様式を伴うリーシュマニア属システムを選択した。リーシュマニア属において作製されたｇｐ１２０組換変種は、高度かつ１００％のＨＩＶ−特異的免疫応答を提供し、次の段階は、感染症発症の防止のためにこの反応を延長することであった。
【００２８】
立体的に安定したリポソームを、ペプチドワクチン担体として使用することができる方法には、下記のふたつの可能性がある：ペプチドが、リポソームベシクルの水内容物中に封入されるか、又は活性化された遠位ＰＥＧ末端に結合され、リポソームの表面上に提示されるかのいずれか。両方の場合において、ｅｎｖペプチドは、迅速なプロテアーゼ切断及び分解から保護され、その結果免疫ブースト期間は延長される。立体的に安定したリポソームは、無毒であり、かつそれら自身無害である。これらのベシクル(visicle)は、内部に数週間又は数ヶ月にわたり装荷された(enloaded)免疫原性ペプチドを保持することができ、かつ一度にではなくこの十分長い期間内にそれらの内容物を次第に放出する(lease)ことができる。このことは、１回のワクチン接種についてより多くのタンパク質量を使用することを可能にする。ＨＣＣに関する外来タンパク質とのより長い永久的接触が提供される場合に、より強力かつより長い免疫応答が形成される。予防的ＨＩＶ感染症の伝染及び発症に関するワクチンの成功は、重要であろう。
【００２９】
ＨＩＶワクチン候補の分析について留意する最後の点は、それらの有効性の前臨床評価のための適切なインビボモデルが存在しないことである。抗−レトロウイルス化学療法薬の開発を伴う更なる治療によるＨＩＶ感染症のモデル作製にチンパンジーを使用しようとする全ての試みは納得できかつ妥当であったが、チンパンジー又はアカゲザルにおいて抗−ＨＩＶ免疫応答を評価することは、不可能である。類人猿及びサルにおいて誘発される免疫原性反応は、同じ抗原免疫化によりヒトにおいて生じる反応とはスペクトルにおいて極めて異なる。更に例えばチンパンジーは、あらゆるＨＩＶ亜型に感染し、ヒトにとって致命的であるウイルス負荷のレベルで、疾患発症症状のささいな徴候を伴わずに数年間幸せに生存することができ、更にはチンパンジー独自のシミアンウイルス感染症が生じる。そのため、抗−ＨＩＶ免疫原性組成物の試験に関して、通常の実験マウスは、類人猿よりも劣ることはないが、統計学的に有意な数が入手でき、かつより頻繁な血液免疫検定ができる。臨床試験のみが、免疫防御作用が現在の新規ＨＩＶワクチンにより提供されるかどうかを判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１：ＣＤ−４５モノクローナル抗体、共焦点顕微鏡法により行ったＨＩＶ感染したヒトのＢリンパ球分析：  ａ、ｂ）ＨＩＶ−特異的ｍＡｂ  ＲＮＡ単離物の「良好な」給源；  ｃ、ｄ）進行性疾患段階の進行（ＡＩＤＳ）を伴う患者からの比較的「不良な」給源；  ｅ）感染した患者の血液由来のＴ及びＢリンパ球、透明度スキャニング。
【００３１】
【図２Ａ】図２：本発明の方法の好ましい実施態様に従うファージミドＤＮＡライブラリーの獲得手法のスキーム。
【図２Ｂ】図２：本発明の方法の好ましい実施態様に従うファージミドＤＮＡライブラリーの獲得手法のスキーム。
【図２Ｃ】図２：本発明の方法の好ましい実施態様に従うファージミドＤＮＡライブラリーの獲得手法のスキーム。
【００３２】
【図３】図３：本発明の好ましい実施態様に従うＥＬＩＳＡ技術による陽性抗体産生クローンの選択を示す略図。
【００３３】
【図４】図４：組換ファージライブラリー形成及びパンニング選択。
【００３４】
【図５】図５ａ−ｂ：「ヘッド」上に提示された濃厚化されたＨＩＶ  ｅｎｖペプチド−特異抗体ライブラリーを伴う、組換ヘルパーＭ１３ファージの構造。走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ又はＡＦＭ）接触モードは、Nikon Eclipse 2000UをベースにしたNanoWizard(JPK Instruments社, 独国)を用い、スティングカンチレバーCSC17/noAl、共鳴振動数１２ｋＨｚ(MicroMash社, エストニア)で行った。ファージの長さは平均８００ｎｍ、厚さは４０〜５０ｎｍであり、ＨＩＶ−特異的ＳｃＦｖライブラリーの提示は、１個のファージ粒子につき２〜１０抗体分子である；この「ヘッド」の測定されたサイズは、平均２００〜２５０ｎｍである。  ａ）組換Ｍ１３ファージ、及び提示されたＨＩＶ−特異抗体ライブラリーを伴うその「ヘッド」、  ｂ）対照Ｍ１３Ｋｏ７ヘルパーファージ。
【００３５】
【図６】図６ａ−ｂ：リバースパンニング技術に使用された、アフィニティ超マクロ多孔質モノリス構造のエポキシ−活性化されたカラムの構造。走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）接触モードは、スティングカンチレバーCSC17/noAlを伴うNanoWizard接触モードを用いて行った。  ａ）組換ファージ包埋以前の、超マクロ多孔質モノリス構造のエポキシ−活性化された吸着剤、  ｂ）Ｍ１３  ｍＡｂ包埋後の、提示された組換ファージＨＩＶ−特異的ＳｃＦｖライブラリーを伴う、超マクロ多孔質モノリス構造のエポキシ−活性化された吸着剤。
【００３６】
【図７】図７ａ、ｂ：ＨＩＶ  ｅｎｖペプチドを収集するためのリバースパンニング技術。  ａ）ＲＰアフィニティカラムから溶離された画分のプロファイル（亜型Ａプール単離物、ＰＥＧ−沈降及びそれに続く２０％ショ糖勾配中１０００００ｇでの超遠心を、濃縮に使用した）。ピークＡ及びＢは、ポリクローナル抗−ＨＩＶ抗体を使用するウェスタンブロットにより特異的ｅｎｖペプチドの存在についてチェックした。  ｂ）ＲＰアフィニティカラムから溶離された画分のプロファイル（亜型Ａプール単離物、限外濾過を、上清の濃縮に使用した）。ピークは、ポリクローナル抗−ＨＩＶ抗体を使用するウェスタンブロットによりチェックした。
【００３７】
【図８】図８ａ−ｂ：リバースパンニングカラムからのＨＩＶ亜型Ａ  ｅｎｖペプチドプールの溶離された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット（ＥＣＬ検出）：  ａ）１−ハイレンジマーカー；２−画分番号４；３−画分番号５；４−画分番号６；５−画分番号７；６−画分番号８；７−画分番号１１；８−画分番号９；−全てのアッセイは、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）と共に調製した。  ｂ）１−画分番号１  β−ＭＥあり；２−画分番号２  β−ＭＥあり；３−ＨＩＶ−ＰＥＧ  β−ＭＥあり；４−ＨＩＶ−沈降物  β−ＭＥあり；５−ＨＩＶ−上清  β−ＭＥあり；６−ハイレンジマーカー；７−画分番号１  β−ＭＥなし；８−画分番号２  β−ＭＥなし；９−画分番号６  β−ＭＥなし；１０−ＨＩＶ−ＰＥＧ  β−ＭＥなし；１１−ＨＩＶ−沈降物  β−ＭＥなし；１２−ＨＩＶ−上清  β−ＭＥなし。
【００３８】
【図９Ａ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。  a) #Al.RU.03.03RU20_06_13_AY500393    MKAKGMQRNYQHLWRWGXMLFWXIIM
【図９Ｂ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。
【図９Ｃ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。
【図９Ｄ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。
【図９Ｅ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。  b) B.RU.04.04RU128005_AY682547    MRARGIRKNYQGLLRWGTLLLGILMI
【図９Ｆ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。
【図９Ｇ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。
【図９Ｈ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。
【図９Ｉ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。  c) #B.RU.04.04RU129005_AY751406    MRAKGTRKNYQRLWRWGIMLLGMLMI
【図９Ｊ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。
【図９Ｋ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。
【図９Ｌ】図９ａ−ｃ：配列決定及び２Ｄ分析による、Ｅｎｖシグナルペプチドｇｐ１２０構造の再構築。
【００３９】
【図１０ＡＢ】図１０ａ−ｄ：ＨＩＶ−１エンベロープペプチドの概略的３Ｄ構造  ａ）ｇｐ１２０コアの概略的３Ｄ構造[40, 41]  ｂ）ｇｐ１２０  ＣＤ４−ＣＣＲ５結合エピトープの概略的３Ｄ構造[24]
【図１０Ｃ】図１０ａ−ｄ：ＨＩＶ−１エンベロープペプチドの概略的３Ｄ構造  ｃ）ＣＤ４−結合ループ形成におけるｇｐ１２０形質転換の概略的３Ｄ構造[22]
【図１０Ｄ】図１０ａ−ｄ：ＨＩＶ−１エンベロープペプチドの概略的３Ｄ構造  ｄ）ｇｐ４１エクトドメインの構造及び変動性[34]
【００４０】
【図１１Ａ】図１１ａ−ｂ：下記をコードするＨＩＶ  ｅｎｖペプチドＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：  ａ）全ｇｐ１２０、ｇｐ１２０内側及び外部ドメイン、並びにＶ２、Ｖ３及びＶ４ループ  ｂ）全ｇｐ４１及びｇｐ４１エクトドメイン。
【図１１Ｂ】図１１ａ−ｂ：下記をコードするＨＩＶ  ｅｎｖペプチドＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅：  ａ）全ｇｐ１２０、ｇｐ１２０内側及び外部ドメイン、並びにＶ２、Ｖ３及びＶ４ループ  ｂ）全ｇｐ４１及びｇｐ４１エクトドメイン。
【００４１】
【図１２】図１２：種々の発現システムにおけるＨＩＶ  ｅｎｖペプチド及びそれらの断片の生成：  ａ）誘導性発現のｇｐ１２０内部ドメイン、ｇｐ４１エクトドメイン、ＳＤ−ＰＡＧＥ  ｂ）永久発現のｇｐ１２０、ｇｐ４１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＣＬウェスタンブロット検出
【００４２】
【図１３】図１３：他のタンパク質発現システムにおけるグリコシル化と比較した、リーシュマニア・タレントラエ(Leishmania tarentolae)細胞（ＬＥＸＳＹ発現システム）におけるタンパク質のＮ−グリコシル化のスキーム。レター(letter)(Jena Bioscience社)において、哺乳類細胞及びリーシュマニア・タレントラエにおいて得られたグリコシル化パターンは、糖鎖末端のＮ−アセチルノイラミン酸の存在のみ異なる；
【００４３】
【図１４】図１４：１ｋｂスタッファー断片を置換する標的遺伝子のクローニング部位を持つ、ｐＬＥＸＳＹ＿Ｉ−２ベクターファミリーのマップ。５’ｏｄｃ及び３’ｏｄｃは、発現プラスミドのＳｗａＩによる線状化後の、宿主染色体への相同組換領域である。Ｌ．タレントラエａｐｒｔの０．４ｋ−ＩＲ由来のｕｔｒ１、１．４ｋ−ＩＲ  ｃａｍＣＢ由来のｕｔｒ２、及び１．７ｋ−ＩＲ由来のｕｔｒ３は、最適化された遺伝子−フランキング非翻訳領域であり、これは、ＬＥＸＳＹ宿主Ｔ７−ＴＲにおける標的遺伝子及びマーカー遺伝子の発現のための転写後ｍＲＮＡプロセシングのためのスプライシングシグナルを提供する。ＳＰは、Ｌ．メキシカナ(Leishmania mexicana)分泌された酸性ホスファターゼＬＭＳＡＰ１（７）のシグナルペプチドを、及びＨ６はヘキサヒスチジンストレッチを意味する。代わりのクローニング戦略は、標的タンパク質のサイトゾル型（ｃ）又は分泌型（ｓ）発現を生じる。サイトゾル型発現の５’挿入部位は、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、又はＳｌａＩであり、かつ分泌型発現については、ＳａｌＩ又はＸｂａＩである。このスタッファー断片の３’末端で、ＮｈｅＩ、ＭｓｐＣＩ、又はＫｐｎＩの制限部位は、Ｃ−末端Ｈｉｓ６ストレッチへの融合を生じるのに対し、ＮｏｔＩクローニング部位の利用は、このＨｉｓ６ストレッチを無効にする。マーカーとして、ｂｌｅ（ブレオマイシン耐性）遺伝子及びｎｅｏ（アミノグルコシドリン酸転移酵素）遺伝子が利用可能である(Jena Bioscience社)；
【００４４】
【図１５】図１５ａ−ｄ：ＨＩＶ  ｅｎｖ組換ペプチドのクロマトグラフィー精製の工程：  ａ）６Ｈｉｓｐ１２０ｉｄ１大腸菌発現（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ５〜２０％）、  ｂ）Ｎｉ−ＮＴＡカラム上の６Ｈｉｓｐ１２０ｉｄ１の精製、  ｃ）Biosuite Q -PEEK １０ｕｍ  ４．６×５０ｍｍカラム(Waters社, 米国)上の６Ｈｉｓｐ１２０ｉｄ１の精製  ｄ）Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２  １０／３００  ＧＬ上のゲル濾過クロマトグラフィーによる６Ｈｉｓｐ１２０ｉｄ１の精製。精製前及び精製後。
【００４５】
【図１６】図１６ａ−ｂ：ＨＩＶ  ｅｎｖ組換ペプチド免疫ブーストのためのリポソームアジュバントの種類：  ａ）ベシクルの水相の内側に装荷された組換ＨＩＶ  ｅｎｖペプチドを伴う、立体的に安定したリポソーム１５０ｎｍ、ＰＥＧ−４００の概略図；  ｂ）ＰＥＧ活性化された遠位端に結合された組換ＨＩＶ  ｅｎｖペプチドを伴う、立体的に安定化されたリポソーム２００ｎｍ、ＰＥＧ−２０００の概略図。
【００４６】
【図１７】図１７：ＳＳＬワクチン成分のガウス及びニコンプ(Nicomp)サイズ分布：ベシクルの平均直径は、１５５ｎｍである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、本ワクチンによりチャレンジされた個体において誘発された特異化された免疫応答により、その保護活性を提供する、ＨＩＶ、好ましくはＨＩＶ−１亜型Ａ及びＢの予防ワクチンを提供する。従って本活性物質は、以下に詳細に説明された複合技術により調製及び選択された組換ポリペプチド／ペプチド混合物である。基本的ワクチン成分は、ウイルスの表面タンパク質及びエンベロープタンパク質並びにそれらの断片により表され、これは好ましい実施態様に従い、グリコシル化の状態が異なるＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０（図１）及びｇｐ４１、ｇｐ１２０のＶ１−Ｖ３ループの保存ドメイン、ｇｐ１２０  Ｖ１−Ｖ５ループの耐性−関連した可変部分に対する抗体、ｇｐ４１のグリコシル化された変種；ＨＩＶ−１エンベロープスパイク及びｇｐ４１タンパク質の外部部分によるＣＤ４受容体の結合時に高次構造の変化を受ける近位Ｖ１／Ｖ２及びＶ３ループを伴う、ウイルスエンベロープタンパク質ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０へのＣＤ４結合エピトープ；ウイルスエンベロープタンパク質のＣＸＣＲ５及びＣＣＲ４共受容体結合部位；ｐ２４ウイルスペプチドの種々のエピトープ：を含んでなる。
【００４８】
これらの組換ポリペプチド及びそれらの混合物は、種々のドナーＢ−リンパ球ｍＲＮＡから作製された抗体の組換ファージディスプレイライブラリーを用い、収集され、同定され、かつクローニングされる。各々の作製されたファージ抗体ライブラリーは、組換ｇｐ１２０−、ｇｐ４１及び未変性のＨＩＶ−ポリペプチドの種々のエピトープの結合に対し、好ましくは組換ｇｐ１４０−、ｇｐ１６０−及びｐ２４  ＨＩＶ−１亜型Ａタンパク質上に存在するエピトープの結合に対しても、特異的である。
【００４９】
これらの組換ファージ抗体ライブラリーは、検出、分析及び／又は精製の手段として種々の適用において使用されてよい[23]。前記抗体ライブラリーを使用する適用は、免疫検定、免疫ブロット、クロマトグラフィーなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体は、ＨＩＶ治療及び／又は予防のための新規医薬品の開発に関しても有用である。
本発明の好ましい実施態様においては、Ｍ１３ＫＯ７ファージ上に提示された組換抗体が、ＨＩＶ予防ワクチンの開発に使用される。
【００５０】
ファージミドライブラリーにより展示された抗体断片は、本質的に保存された高次構造のＨＩＶタンパク質エピトープに結合するので、該抗体の標的は、ＨＩＶ感染症に対するワクチンとして適格であり、チャレンジ時に、個体の免疫系は、これらのエピトープに対する特異的免疫応答を生じるだろうから、すなわち最終的に記憶細胞となる成熟したＢ細胞及びＴ細胞はその個体に免疫を伝達することを示す。
【００５１】
本発明のＨＩＶワクチンは、組換ｇｐ４１及びｐ２４  ＨＩＶ−１亜型Ａタンパク質、並びにそれらの断片（実施例３の表９）は本発明の方法により調製された抗体に結合する、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０及びｇｐ１６０の断片、加えて通常の担体及び賦形剤及び任意に免疫刺激剤を含有する。
【００５２】
本ワクチンは、任意のＨＩＶウイルス、更には変異したＨＩＶウイルス上に存在し得るエピトープに特異的な、記憶細胞による個体の免疫系を提供することにより、ＨＩＶ感染症の獲得を防止し、かつ更なる進行も防止するであろう。
【００５３】
前記組換タンパク質及び／又は断片は、本発明の方法により得られたＨＩＶ−特異抗体により選択された未変性のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の結合及び分析により獲得された配列情報を基にしている。
詳細には、エンベロープタンパク質などのタンパク質は、超遠心分離及びウイルス粒子の溶解などの好適な方法により破壊されたウイルス粒子から得られる。
【００５４】
好適なタンパク質の選択は、当業者に公知の任意の好適なスクリーニング法により実行されてよい。好ましい実施態様において、この選択は、（ｉ）ウイルスのエンベロープタンパク質の収集のための提示された抗体による組換ファージを使用するファージパンニング、及び／又は（ii）培養のためにプラスチック表面に接着されたＨＩＶ−特異抗体のアフィン吸着、及び／又は（iii）カラムに包埋されたＨＩＶ−特異抗体による、ウイルスエンベロープタンパク質のアフィンクロマトグラフィー選択のいずれかにより実行されてよい。
【００５５】
次工程において、入手されかつ選択された未変性のウイルスタンパク質の配列及び／又はアイソフォームの３Ｄ高次構造が、同定されてよい。従って手順は、ＨＩＶ−１罹患個体の血流中、更にはＮＲＴＩ、ＮＮＲＴＩ及びＨＡＡＲＴの変形などの種々の投与計画で抗レトロウイルス療法を受け取った患者の血流中を循環するｇｐ１２０、ｇｐ４１及びｐ２４などの、ウイルスタンパク質の高度に特異的な可変断片及び／又は定常断片の数種の変種の混合物を提供する。
【００５６】
前記配列を基に、ウイルスタンパク質の組換ポリペプチド及び／又は断片が作出される。これらの配列は、それらに対する好適な免疫応答を誘導するために免疫系により認識され得るポリペプチドの作製に適した方法を使用することにより得ることができる。
【００５７】
前記組換ポリペプチドは、例えばリーシュマニア誘導型発現システムのような真核生物発現システム及び真核生物−様グリコシル化を備える酵母などの、任意の好適な発現システムにおいて得ることができる。
【００５８】
本発明のＨＩＶ−１  Ａ及びＢ亜型予防ワクチンの種々の変種の調製のための例証的かつ一般的技術は、以下により詳細に例証されている、工程１−９を含む：
１．ＨＩＶ−特異的ＳｃＦｖ抗体の断片を含む、ヒト組換ＩｇＧファージミドライブラリーの作製（ファージディスプレイ技術）；
２．ＨＩＶ−特異抗体のＳｃＦｖ断片を提示している組換ファージミドライブラリーの濃厚化（バイオパンニング）；
３．任意に、ＰＢＭＣ−ＭＴ感染法によるインサイチュでの抗レトロウイルス療法ナイーブのウイルス材料の増殖；
４．ＨＩＶ粒子及びペプチドの濃縮；ウイルス不活化及び破壊；
５．リバースパンニング技術によりファージミドライブラリーを提示しているＨＩＶ−特異的組換ＳｃＦｖによる未変性のＨＩＶ  ｅｎｖペプチドの収集；並びに
６．任意に、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法による、ｅｎｖペプチド変動性及び頻度の定量分析及び配列分析；
７．任意に、主要ＨＩＶ  ｅｎｖペプチドのクローニング、及びリーシュマニア・タレントラエにおけるワクチン開発のための組換ペプチドの作製；
８．任意に、組換ＨＩＶ  ｅｎｖペプチドのクロマトグラフィー精製及び３Ｄ構造解析；並びに
９．好ましくはワクチン送達のビヒクルとして立体的に安定したリポソーム又はビロソームを使用する、ＨＩＶ予防ワクチン免疫ブースト組成物の調製。
【００５９】
１．  ＨＩＶ−特異的ＳｃＦｖ抗体の断片を含む、ヒト組換ＩｇＧファージミドライブラリーの作製（ファージディスプレイ技術）；
ここで本発明の方法において、ファージミドライブラリーが、以下を含む段階ｉ）からiii）に従い、工程１）において作製される：
ｉ）各々、ＨＩＶに感染した多数の個体から得られたＢリンパ球において発現されたＩｇＧの、軽鎖及び重鎖の可変領域をコードするＲＮＡ由来のＤＮＡ断片の増幅が、調製される段階；
ii）ＩｇＧ重鎖の可変領域をコードする核酸に会合されているＩｇＧ軽鎖の可変領域をコードする核酸を含むひとつの構築体への、段階ｉ）で得られた軽鎖及び重鎖の二つのＤＮＡ断片の集成；
iii）ｐＣＡＮＴＡＢファージミドベクターへの形質転換。
【００６０】
詳細には、最初に、ＨＩＶにより感染していることがわかっており、かつその中にＨＩＶ特異抗体が存在することが予想される多くの個体から、Ｂ及び／又はＴリンパ球が単離される。抵抗性ＨＩＶ変異株を持つ個体も含まれてよい。これらのＢ細胞の単離は、任意の公知の技術、例えばロイコフェレーシス、引き続きのリンパ球集団からのＢ／Ｔ細胞の単離[19]などにより実行されてよい。引き続きＲＮＡが、Ｂ／Ｔリンパ球から、例えば論文[23]に例証されたような当該技術分野において周知の技術により、単離される。
【００６１】
ＳｃＦｖライブラリー作製のために、ＨＩＶ−特異的免疫グロブリンの配列を含むｍＲＮＡが単離されることが好ましい。これに関して、Ｂリンパ球の数は、ＲＮＡ単離前のＨＩＶ−感染者の血液中の、例えば共焦点顕微鏡分析によるＣＤ４５  ｍＡｂ免疫検定により、評価される。図１に示されたデータは、ＡＩＤＳ疾患及び症状の進行した段階の患者の一部は、総単離されたリンパ球に対するＢリンパ球の非常に低い比率を有し（図１ｃ、ｄ）、かつ通常低いＣＤ４５免疫染色は、高いウイルス負荷及び非常に低いＣＤ４：ＣＤ８状態に相関していることを示している。他のもの（図１ａ、ｂ）とは異なり、これらの患者は、ＨＩＶ−特異的ファージミドライブラリー作製のコホートに関してかなり不良な供給源である。先行する抗レトロウイルス治療に沿った又はその過程の高いウイルス負荷並びにそれらの頻度は、ＨＩＶ−特異的ＳｃＦｖライブラリーを得る機会を制限するものではない。
【００６２】
そのように得られた総ＲＮＡは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常領域に特異的な、例えばオリゴｄＴを使用するか、又は好ましい実施態様による、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用により、ｃＤＮＡに転写される。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の異なる定常領域の配列は、当該技術分野において周知であり、その結果ｃＤＮＡへの転写に好適なプライマーは、容易にデザインすることができる。従って手順は、関心のない材料はその第一工程において排除されるので、ＲＮＡプール（複数）中の免疫グロブリン転写産物の最初の選択、及び種々のドナーからの種々のＲＮＡ−試料のより容易な取り扱いを可能にする。同じくｍＲＮＡをｃＤＮＡへ転写する前の種々のドナーからのＲＮＡ−プールの組合せも構想され、かつこれはより大きい多様性が得られる（下記参照）ので好ましい。こうして調製されたｃＤＮＡの相補体は、当該技術分野において周知の技術により合成される。
【００６３】
十分量のＤＮＡ断片を調製するために、関心対象の領域は、Ｂ／Ｔリンパ球から得られたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は鋳型としてのｃＤＮＡから調製された二本鎖ＤＮＡを直接用いて増幅することができる。
【００６４】
前記ＰＣＲ反応に関して、増幅される核酸配列の５’末端及び３’末端にアニーリングする好適なプライマーが使用され、これらは一般に、長さ約１０〜４０、好ましくは１５〜３０、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチドである、オリゴヌクレオチドである。
【００６５】
リバースプライマーとして、その配列が、免疫グロブリンの定常領域に由来したオリゴヌクレオチドが使用されてよい。好ましくは該リバースオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する重鎖のＣＨ１領域に、又はλ型及びκ型軽鎖のＣλ又はＣκ領域にハイブリダイズする。使用されるフォワードプライマーは、重鎖及び軽鎖の可変領域の反対末端にハイブリダイズする。
【００６６】
好ましい実施態様において、一次ＰＣＲ増幅のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、V BASEデータ-ベース(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)から選ばれた、表１から３に示された核酸配列からなる群から選択される。このＰＣＲ反応は概して、長さ約７５０の断片を生じる。
【００６７】
【表１】
2010540674.tif 000002
【００６８】
【表２】
2010540674.tif 000003
【００６９】
【表３】
2010540674.tif 000004
【００７０】
次工程において、段階ｉ）において得られた軽鎖及び重鎖の二つのＤＮＡ−断片の、ＩｇＧ重鎖の可変領域をコードする核酸に会合されているＩｇＧ軽鎖の可変領域をコードする核酸を含むひとつの構築体への連結は、各々、ＩｇＧ軽鎖及び重鎖の可変領域ＳｃＦｖを含むポリペプチドの発現を可能にする。
【００７１】
好ましい実施態様により、可変軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片間の特異的連結を得るために、段階ｉ）において得られた試料の量は、例えば二つのパーツにアリコートとされ、かつ任意に希釈される。次に、ｍＲＮＡからの増幅によるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡのいずれかにより調製された該ＤＮＡ断片は、軽鎖又は重鎖に特異的なリンカーと個別に接触されてよく、その結果このリンカーは、各試料パーツ中のみのそれぞれのＤＮＡ断片に結合する。すなわち一方のパーツは、軽鎖のみに関するリンカーを有するのに対し、他方のパーツは、重鎖のみに関するリンカーを有するということである。使用されるリンカーは、互いに好適な条件下でのハイブリダイゼーションを可能にし、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含むＤＮＡ断片を生じるであろう。再度、これら二つのＤＮＡ断片の会合は、これら二つのＤＮＡ断片の連結がインフレームで実行され、その結果は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を持つポリペプチドを生じるであろう。同じ事が、望ましいならば、二つの重鎖及び二つの軽鎖を特異的に得るために実行することができる。表４及び５において、好ましいプライマーが列記されている。
【００７２】
【表４】
2010540674.tif 000005
【００７３】
【表５Ａ】
2010540674.tif 000006
【表５Ｂ】
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【００７４】
本発明のより好ましい実施態様において、（（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒ）3ポリペプチドリンカーをコードするリンカー断片が、免疫グロブリンの可変性の重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列に追加される。この重鎖及び軽鎖のリンカーパーツは、互いにアニーリングし、例えばＴａｑＳＥ  ＤＮＡポリメラーゼなどの、ＴａｑＳＥ  ＤＮＡポリメラーゼの存在下でフィルイン反応を刺激する。最後に重鎖及び軽鎖は、それらのＤＮＡリンカー断片パーツを使用し、単独の遺伝子に集成される。
【００７５】
従って手順は、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の可変領域をコードする核酸の、各々、当初得られたＲＮＡプール中に存在しない抗原結合部位を形成するために軽鎖及び重鎖の組合せも含む、別の免疫グロブリン軽鎖又は重鎖の可変領域をコードする核酸との無作為連結により、人工的に作製された非常に多くの抗体を得ることを可能にする。示されるように、免疫グロブリンの可変領域上の既に天然に予め形成された抗原結合部位のパーツを使用し、かつそれらを無作為に組合せて、ＨＩＶに感染した個体において天然に産生される抗体と比べ、ＨＩＶタンパク質に対し増強されかつ一定の結合親和性を示す抗体も作製される。
【００７６】
加えて制限部位が、こうして得られたＤＮＡ−断片に導入され、これは、例えばクローニング工程などの、後続の適用において有用である。原則として、任意の好適な制限部位が、必要に応じて使用されるが、当業者の知識内でこれはＣＨＯ−Ｋ１ｏｓｅの好適なものである。制限部位は、例えば制限部位の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用、又は各々、５’末端及び／若しくは３’末端に組合せられた制限部位の核酸配列を含むアダプター分子の使用などの、当該技術分野において公知のいずれか適当な方法により導入されてよい。
【００７７】
本発明の好ましい実施態様において、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位が、好ましい実施態様に従い軽鎖及び重鎖核酸配列を含む連結された核酸断片の末端に導入され、そこでこれらの制限部位は、クローニングベクターへの更なるクローニング工程に使用される。ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位は、各々、該連結された断片（ＳｃＦｖ遺伝子）の５’末端及び３’末端に付加される。これらの特定の制限部位は、抗体遺伝子において非常に低い頻度で生じ、例えば軽鎖及び重鎖核酸配列を含む、得られた連結断片のほとんどが、単独のＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ断片としてクローニングされることを可能にする。本発明のより好ましい実施態様において、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位は、オリゴヌクレオチドプライマーを介して導入される。好ましい使用されるＳｆｉＩ−部位−及びＮｏｔＩ−部位−含有するオリゴヌクレオチドプライマーは、論文[21]のプライマー配列を基にデザインされる。軽鎖及び重鎖核酸配列を含む得られた連結断片の末端でのＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位の導入に有用なプライマーは、表６に示されている。
【００７８】
【表６Ａ】
2010540674.tif 000008
【表６Ｂ】
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【００７９】
軽鎖及び重鎖核酸配列を含む得られた連結断片のクローニング及び発現に関して、当業者に公知のいずれか好適なクローニング及び／又は発現ベクターが使用されてよい。好ましい実施態様において、例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ．ｃｏｌｉファージミドベクターを含む、ファージミドベクターが使用される。
【００８０】
ファージミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅは、Ｍ１３及びＣｏ１Ｅ１プラスミドの両複製起点を含み、その結果好都合なことにプラスミドとして増幅されるか、あるいはＭ１３ＫＯ７などのヘルパーファージの助けにより、組換Ｍ１３ファージとしてパッケージされることができる。ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ消化された抗体可変領域遺伝子は、ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅファージミドベクター内のリーダー配列とＭ１３遺伝子３の本体(main body)の間でクローニングされる。得られる融合タンパク質は、両方の親タンパク質の機能を保持している。ｇ３ｐリーダー配列は、本タンパク質の大腸菌の内膜／ペリプラスムへの輸送を指示し、そこで主ｇ３ｐドメインは、該融合タンパク質を該集成ファージの先端へ結合する。ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅは、クローニングされたＳｃＦｖとｇ３ｐの配列の間の接合部に、アンバー翻訳停止コドンも含む。得られるｓｃＦｖ断片を含むｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅプラスミド誘導体のプールは、ＴＧ１などの、大腸菌ｓｕｐＥ株の形質転換に使用される。ｓｕｐＥにおいて、大腸菌株翻訳は、ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ内のアンバー停止コドンまで続き、そのファージ先端に展示されたＳｃＦｖ−ｇ３ｐ融合タンパク質を作製する。
【００８１】
【表７】
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ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、青色で記し、ＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、緑色で記している。
【００８２】
ＨＢ２１５１などの非サプレッサー株において、停止コドンが認識され、タンパク質合成は、ｓｃＦｖ遺伝子の末端で中断され、かつｇ３ｐ融合タンパク質は合成されない。この場合、得られるＳｃＦｖタンパク質は、細胞周辺腔に輸送されるが、これは該遺伝子３ドメインを欠いているので、ファージ粒子には集成されない。むしろ可溶型抗体断片が、ペリプラスム中に蓄積し、かつ延長されたインキュベーション時に、培地に漏出する。従って、ＨＢ２１５１及び類似の大腸菌株は、選択された抗原陽性ファージによる、それらの感染後の可溶型抗体の産生に使用され、かつ現在の適用においては使用することができない。ｓｃＦｖライブラリー作製の工程は、実施例１に示されている。
【００８３】
２．  ＨＩＶ−特異抗体のＳｃＦｖ断片を提示している組換ファージミドライブラリーの濃厚化（バイオパンニング）；
抗体の発現は、抗原に結合することが可能であるポリペプチドを得るのに適した宿主において得ることができ、及びこうして得られたポリペプチドは、異なるドナーから単離された組換ｇｐ１２０−、ｇｐ４１−及び未変性のＨＩＶ−ポリペプチドと共に得られた。これにより、発現されたポリペプチドが宿主の表面上に発現される場合に、これは有利ではあるが、必須ではない。抗体の発現に適した宿主は、ウイルスシステム、原核細胞及び真核細胞及び／又は細胞培養物を含む。
【００８４】
好ましい実施態様において、該抗体の断片は、ファージディスプレイライブラリーを作製するバクテリオファージＭ１３において発現され、これはファージディスプレイ技術の使用のために異なるファージにより各々提示される非常に多数の異なる構築体の展示を可能にする。このファージディスプレイアプローチは、免疫グロブリン遺伝子のクローニング並びに機能性抗体の発現及び検出のための強力なツールである。抗体の可変性の重鎖及び軽鎖断片を、モノクローナル抗体選択の段階を伴わずに、ＨＩＶ−特異抗体のプール又はライブラリーとしてファージ表面上に展示された融合タンパク質として、得ることができる。このアプローチは、任意の抗原に対する抗体を迅速に見つけ、かつ必要な場合には、他の発現システムにおけるグリコシル化を伴う及び／又は伴わずに、それらの可溶型変種を作製することを可能にする。
【００８５】
ファージミドライブラリーパンニングは、多数のクローンの非常に迅速なスクリーニングを可能にするインビトロ技術であり、ここで選択されたＨＩＶポリペプチドへの結合親和性を示しているそれらの表面に抗体を提示しているファージは、組換ファージミドの維持及び更なるスクリーニング工程のための新規ファージの作製のために同定されかつ使用することができる。ファージ−提示している抗体ライブラリーは、抗原−陽性クローンを同定するために、当該技術分野におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡスクリーニングのクロスサイクルにより、結合親和性に関して分析することができる。
【００８６】
展示されたＳｃＦｖ抗体断片は、それらの抗原−結合能を保持しているので、従って、親和性選択により、特異抗体を発現している組換ファージを濃厚化することは可能である。このアプローチにより、規定された特異性及び親和性の抗体は、集団から迅速に選択される。得られた抗体遺伝子ライブラリーは、抗原結合能を改善するように、スクリーニングされる。この技術の工程は、パンニングと称され、ＨＩＶ−特異的ＳｃＦｖ断片を提示しているファージが、引き続き：
ｉ）組換ｇｐ１２０−、ｇｐ１４０−、ｇｐ１６０−、ｇｐ４１  ＨＩＶ−１亜型Ａ及びＢ  ｅｎｖペプチド、
ii）種々のＨＩＶ−感染ドナーから単離された未変性のＨＩＶ  ｅｎｖポリペプチド：
に結合し、かつ収集されることを含む。好ましい実施態様において、先に列記された全てのポリペプチドに結合親和性を示すファージライブラリーが選択されるので、展示された抗体の数は、１０7〜１０12から１０2〜１０3へと減少する。該ポリペプチドの特異的組換ＨＩＶポリペプチドとの独立した接触サイクルのために、ここでこれらのポリペプチドの配列は、（ｉ）公知であり、かつ（ii）一定であり、並びに異なるドナーから単離された未変性のＨＩＶ−ポリペプチドにより、ここでこれらのポリペプチドにおいて変異が生じ、抗体を選択することが可能であり、これは本質的に公知のＨＩＶ変異体全てに結合し、このことは本抗体は、本質的に該ＨＩＶポリペプチド上の一定の高次構造を認識することができることを指摘している。
【００８７】
従って手順は、ファージの表面上に提示されたＨＩＶ−特異的組換抗体ライブラリーを誘導し、かつ感染した個体からのものの巨大なプールから選択されることを可能にし、これらは、二つの異なる方法：
ｉ）標準バイオパンニング手法[4]
ii）固形状態の固定された未変性のＨＩＶペプチドのニトロセルロースメンブレンでの包埋：により、例えこれらのポリペプチドにおいて変異が生じても、選択されたＨＩＶポリペプチドへの結合親和性を示す。
【００８８】
第一の方法に従い、ｉ）組換ファージ作製のために、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ４×１０10ｐｆｕを添加し、１時間のプレインキュベーション、並びに１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンの存在下、３７℃で、２５０ｒｐｍで攪拌しながら１２時間のインキュベーションの間に、対数期形質転換されたＴＧ１大腸菌培養物が調製された（典型的ファージは、１０10〜１０11アンピシリン−導入単位／ｍｌを生じた）。ファージは、他のプラスチック表面には、非特異的に吸着するので、ポリプロピレンチューブが推奨される。
【００８９】
その後ＰＥＧ沈降を行う。細菌培養物を、１０００ｇで１０分間遠心し、上清を収集し、冷却する。上清に、１／５ｖ／ｖ冷溶液、２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、０℃で６０分間インキュベーションし、その後Beckman JA-20ローターにおいて１００００ｇで、４℃で２０分間遠心する。上清は廃棄する。ペレット（これは容易に視認できないことがある）を、０．０１％チメロサールを含む２×ＹＴ培地１６ｍｌ中に再懸濁する。本発明者らは、上清が貯蔵される（４℃で）場合には、これを０．４５μｍフィルターを通らせ濾過することを推奨した。この組換ファージを含有する溶液は、パンニングに使用する。
【００９０】
ＰＥＧ沈降及びファージパンニングのサイクルは、一部のファージディスプレイ組換抗体調製品は不安定であるので、レスキュー後できる限り直ぐに実行されなければならない。最小培地プレートから対数期ＴＧ１細胞コロニーを、２×ＹＴ培地５ｍｌに移し、２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で一晩インキュベーションする。次に新鮮な２×ＹＴ培地１０ｍｌに、この一晩培養物１００μｌを接種し、かつ２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で、この培養物のＡ６００が０．３に到達するまで、インキュベーションする。
【００９１】
２５ｃｍ2組織培養フラスコを、例えばＰＢＳ又は０．０５Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ９．６）などの、好適な緩衝液中に１０μｇ／ｍｌに希釈された抗原５ｍｌでコーティングする。抗原によるコーティングは、室温で１〜２時間、又は４℃で一晩行うことができる。プレートのコーティングの条件、すなわち緩衝液並びにインキュベーションの温度及び時間は、抗原によって決まり、かつ該新規組換体が由来した当初のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のために使用される免疫検定の条件に類似していなければならない。抗原のコーティング濃度は、所望の組換ファージ抗体の親和性（抗原−結合能）に応じて変動することができる。高親和性抗体について、低親和性抗体よりも、より少ない量の抗原が必要である。しかし特異的親和性を伴う抗体の単離のためには、溶液−ベースの選択のほうが、選択に使用される抗原の量を、より正確に制御することができるので、固相選択よりも好ましい。
【００９２】
このフラスコを、ＰＢＳで３回洗浄し、各洗浄後にはこれを完全に空にする。次にこのフラスコを、フラスコ表面上のあらゆる残存する部位をブロックするために、ブロッキング緩衝液で完全に満たし、室温で１時間インキュベーションする。このフラスコを、ＰＢＳで再度３回洗浄し、各洗浄後にはこれを完全に空にする。
【００９３】
保存剤として０．０１％チメロサール又は０．０１％アジ化ナトリウムを含有するブロッキング緩衝液を、新たに調製する。ＰＥＧ−沈降された組換ファージ１６ｍｌを、ブロッキング緩衝液（保存剤を含有する）１４ｍｌで希釈し、かつ室温で１０〜１５分間インキュベーションする。パンニング工程時に、非−特異的疎水性タンパク質−タンパク質相互作用が、未変性Ｍ１３ファージタンパク質と一部の抗原の間で生じることがある。この相互作用は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が希釈されたファージ上清に最終濃度０．１％で添加された場合に、低下することができる。あるいは、グリシン又はトリプシン溶液による特異的結合ファージの溶離を行うことができる。希釈された組換ファージ２０ｍｌをフラスコに注ぎ、かつ３７℃で２時間インキュベーションする。次にこのフラスコを空にし、ＰＢＳ  ３０〜５０ｍｌで２０回、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有するＰＢＳで２０回洗浄する（洗浄瓶は、洗浄液の分注にうまく働く）。各回、フラスコは完全に空にする。
【００９４】
対数期のＴＧ１細胞全量１０ｍｌ（工程１参照）を、フラスコ又はパンニング容器に加え、３７℃で１時間インキュベーションする。１時間後、１０ｍｌの細胞懸濁液の１００μｌを取り出す。それらから、２×ＹＴ培地中に、細胞懸濁液の１０倍希釈液を調製する（１：１０、１：１００、１：１０００）。未希釈細胞１００μｌ及び各希釈物１００μｌを、個別のＳＯＢＡＧプレート上に、滅菌したガラス製スプレッダーを使用し、配置する。乾燥した場合、これらのプレートは倒置し、３０℃で一晩インキュベーションする。これらのコロニーがインキュベーション後に採取するには余りにも小さい場合は、このプレートを、３０℃で更に４〜８時間放置することができる。これらのＳＯＢＡＧプレートは、以下のように操作することができる：ａ）細胞をプレートからこすりとり、ストック培養物を作製する。このプレートを、２×ＹＴ培地５ｍｌに浸し、滅菌したガラス製スプレッダーで細胞を培地へこすりとる。グリセロールを最終濃度１５〜３０％となるよう添加し、−７０℃で貯蔵する。ｂ）このプレートを密封し、後日レスキューするために、４℃で最高２週間貯蔵する。
【００９５】
[25]ii）から改変された第二の方法に従い、未変性のＨＩＶペプチドの混合物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を泳動させ、引き続きウェスタン転写緩衝液（２５ｍＭトリス、１９３ｍＭグリシン、及び２０％メタノール）中で、ニトロセルロースメンブレン上に電気的に転写する。この抗原の位置は、メンブレンをポンソーレッド又はクマシーブリリアントブルーのいずれかで染色することにより決定される。タンパク質バンドを含むメンブレンの７×３０ｍｍ2切片を切り出し、１０％ブタゼラチン、５×１０11  ＣＦＵ／ｍｌヘルパーファージと共に、４℃で一晩インキュベーションすることによりブロックする。ブロック後、このメンブレンを、結合緩衝液（５％ゼラチン、３×１０11  ＣＦＵ／ｍｌヘルパーファージ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）に移し、ｓｃＦｖファージミド抗体ライブラリー１０12  ＣＦＵを添加する。ファージライブラリーは、メンブレンと共に、４℃で４時間、穏やかに揺動しながらインキュベーションする。このメンブレンを、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で６回（各洗浄につき容量１００ｍｌ）、及びＰＢＳで６回（各洗浄につき容量１００ｍｌ）洗浄する。あるいは、これらのスポットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で５分間かけて３回、２５％グリセロール含有する１０％ＭＰＢＳで２０分間かけて５回、及び最後にＰＢＳで５分間かけて３回洗浄する。タンパク質バンドを含むメンブレンを、レーザーブレードで切り出し、ファージを、１００ｍＭ  ＴＥＡにより、室温で１０分間かけて溶離する。中和後、溶離されたファージ粒子を、ゼラチン−ブロットされたメンブレン又はゼラチン−コーティングされたイムノチューブと共に、室温で３０分間インキュベーションする。その後上清を、ＴＧ１を感染するために使用する。ファージは、先に説明されたように、次の選択ラウンドのために大腸菌から調製される。
【００９６】
３．  ＰＢＭＣ−ＭＴ法による抗レトロウイルス療法ナイーブ患者のウイルス材料単離体の増殖；
ＨＩＶは、ＣＤ４−ＣＣＲ５−ＣＸＣＲ４受容体が濃厚化された細胞培養物においてうまく増殖することができることは公知であるが、実際にはこの方法には多くの制約がある。第一に、患者由来の未変性ウイルス材料又はインビトロ感染症の実験室株の感染力価は、種々の方法（リアルタイムＲＴ  ＰＣＲ、ｐ２４  ＥＬＩＳＡなど）で測定された総ウイルス濃度の１〜２％より多くなることはない。このことは、例えば、感染材料中のウイルスコピーの数が１０5である場合、研究者がインビトロ増殖から分析することができる最初のコピー数は、わずかに１０3であり、残りの１０2の当初のＨＩＶの可能性のある異形は、分析から外れるということを意味する。第二に、インビトロ感染選択を通過したＨＩＶ変異株の数は、最良の場合において、当初の１０3個からの数個の配列変種であり、従って実験室ウイルス株は、ＨＩＶ遺伝子及びペプチドの変動性の実際の状況を決して表していない。第三に、ＨＡＡＲＴ又は他の抗レトロウイルス療法で治療した患者由来のＨＩＶ  は、インビトロで増殖する能力を失っており、従って抵抗性ＨＩＶ変異株は、インビトロにおいて培養することができない。第二に、本発明者らの未変性ウイルス培養実験は、下記の場合に、最良の結果が得られることを証明している：
ｉ）ＨＩＶ−感染患者のリンパ球を、説明されたように[19]、フィコール−プラーク溶液を使用する、ヘパリン処理した新鮮な血液由来の健常ドナーのリンパ球と共にインキュベーションする。ロシア連邦領土に広がったＨＩＶ−１亜型Ａに関して、ＨＩＶ−感染したリンパ球が、説明されたような[19]健常ドナーの新鮮血液から単離された単球と共にインキュベーションされる場合に、ほとんどの場合において、感染はうまくいくことは、留意する価値がある。
ii）濃度０．２５×１０6／ｍｌで調製されたＨＩＶとのインキュベーションのために使用されるＭＴ−２又はＭＴ−４又は任意の他の株化細胞（ＣＣＲ５Ｆ−ＣＥＭ、ＰＭ−Ｉ、ＨｅＬａ、Ｕ９３７など）は、その後、ＲＰＭＩ−１６４０培地の総容量５０ｍｌまでの添加、及び４２５ｇで１０分間の遠心により、２回収集されるＨＩＶ−繁殖された同数の単球と共培養する。細胞混合物は、ＩＬ−２  １０μｌ／ｍｌを添加したＣＬ培地中に再懸濁し、２５ｃｍ2組織培養フラスコ中で直立した位置で３７℃でインキュベーションする。ウイルス−含有培地は、培養培地の半量を取り出し、これを同量の新鮮培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）と交換することにより、３〜４日毎に収集する。
【００９７】
ウイルス感染活性の有効性は、細胞死及びシンシチウム形成の顕微鏡分析並びに同じくｐ２４  ＥＬＩＳＡ試験によって、制御される。収穫された培養培地は、３０００ｒｐｍ（１０００ｇ）で１５分間の遠心により、細胞を透明化し、−８０℃で貯蔵する。
【００９８】
４．  ＨＩＶペレットの濃縮（限外濾過、超遠心分離による）、ウイルス不活化及び破壊；
ウイルス粒子を約２０重量％含有するストック溶液を、血漿又は培養上清から作製する。最初に、上清を、３０００ｒｐｍ（１０００ｇ）で１５分間遠心し、次に得られた上清を、１３２００ｒｐｍ（１６０００ｇ）で次の１５分間遠心する。２０％ショ糖の試料総容積の約半量を、超遠心チューブの底に積層し（ショ糖溶液の密度は１．１６−１．１８ｇ／ｓｍ3である）、その後レトロウイルス粒子を含有する上清を、このチューブの上方に注ぐ。チューブを、３８０００ｒｐｍで、ＭＬＳ−５０ローターＯｐｔｉｍａ  ＭＡＸ，  Ｂｅｃｋｍａｎｎ（１６００００ｇ）で、１時間３５分遠心する[19]。ペレットを、少量の培養培地（例えばＲＰＭＩ１６４０）に溶解する。
【００９９】
ＨＩＶの不活化
ＨＩＶペレットの溶解及びＨＩＶタンパク質の獲得
第一の方法を、論文［１］に説明されたように行う。ＨＩＶ溶解緩衝液（放射線免疫沈降緩衝液）の組成は、２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％デオキシコール酸、０．５％ＮＰ−４０、２μｇ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアポプロテイン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含有する。界面活性剤の添加後、磁気スターラーの上で低温加熱（５０℃）しながら、穏やかに混合する。
【０１００】
第二の方法は、質量分析及び結晶解析のためのペプチドの混合物の調製に関する標準である。得られたＨＩＶ−１タンパク質混合物のｐＨは、２Ｎ  ＨＣｌにより２．５に調節し、０．１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ブタペプシン(Sigma Chemical社, セントルイス, MO)と共に３７℃で４時間インキュベーションする。８０℃で１５分間加熱することにより、加水分解を停止し、その後ｐＨを、２Ｍ  ＮａＯＨの添加により、７．５〜８に調節する。その後加水分解したタンパク質混合物を、１０ｋＤａ加水分解メンブレン及びペプシンにより限外濾過し、残りの加水分解されないタンパク質を除去する。濾過された加水分化されたタンパク質混合物は、凍結乾燥し、−８０℃で貯蔵する。
【０１０１】
５．リバースパンニング技術によりファージミドライブラリーを提示しているＨＩＶ−特異的組換ＳｃＦｖによる未変性のＨＩＶ−１  ｅｎｖペプチドの収集；
抗原ファージを提示したライブラリーを使用するワクチン開発のためにファージディスプレイ技術を使うアプローチは、論文[35]において曖昧に説明されている。組換ファージＳｃＦｖライブラリーカラム包埋の手法を開始する前に、Ｍ１３提示されたライブラリーを、改変されたウェスタンブロット法により特異性に関してチェックする。プローブを、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、引き続きニトロセルロース上に電気的に転写する[25]。この抗原スポットを、１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ中に１時間最初に浸し、ブロットされたタンパク質を再生する。これらのメンブレンを、ＰＢＳ中の４％ゼラチン溶液により、３７℃で２時間更にブロックし、ファージ１０12  ＣＦＵ／ｍｌ（４％ゼラチン溶液中１．５％  ＢＳＡと室温で３０分間プレインキュベーションする）と共に室温で１時間インキュベーションする。その後メンブレンを、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回、及びＰＢＳで３回洗浄し、５％スキムミルク／ＰＢＳ中のＨＲＰ−複合された抗−Ｍ１３の１：８０００希釈物と共に室温で１時間インキュベーションし、ファージ結合を検出する。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０により３回及びＰＢＳにより３回洗浄後、これらのバンドを、ＥＣＬ検出(Amersham社)により可視化する。ＴＰＢＳ−ブロットによる過剰な洗浄後、これらのメンブレンを、ＥＣＬ試薬中で１分間インキュベーションする。各メンブレンは引き続き、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬと共にインキュベーションし、現像する。
【０１０２】
組換ｍＡｂは通常、その生物から単離された未変性の抗体と比べ、約１０〜３０％の親和性を示す。しかしウイルス変異株の各コホートに関する個体（患者）のパネルのファージディスプレイ技術から作製された、ＨＩＶ−特異的ｍＡｂ（ファージミドライブラリー）は、抗−ＨＩＶ−１予防ワクチンの開発のための主要なＨＩＶ  ｅｎｖ及び他のペプチド及びタンパク質を選択するのに十分である（図７ａ、ｂ、８ａ、ｂ）。
【０１０３】
組換ファージ作製を提示しているファージミドライブラリーに関して、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージがＴＧ１大腸菌一晩培養物へ添加され、１時間プレインキュベーションされ、並びに１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンの存在下、３７℃で１２時間インキュベーションされる（典型的ファージ収量は、１０10〜１０11アンピシリン−導入単位／ｍｌ）。この培養物を、１０００ｇで１０分間遠心し、上清を収集しかつ冷却する。その後ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌ）溶液の１／５ｖ／ｖを上清に添加し、氷中で１時間インキュベーションし、その後１００００ｇ、４℃で２０分間遠心し、沈殿を形成する。このペレットを、ＬＢ又は１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、０．４５μｍを通して濾過する。組換ファージは、０．０１％チメロサールを添加する場合は、４℃で貯蔵することができる。
【０１０４】
ｉ）不動化されたＭ１３−特異的ｍＡｂによる超マクロ多孔質モノリス構造のエポキシ活性化されたクリオゲル(Protista Biotechnology社)クロマトグラフィーカラムでの包埋
Ｍ１３−特異的ｍＡｂは、超マクロ多孔質モノリス構造のエポキシ-活性化されたクリオゲル(Protista Biotechnology社)に包埋する。このために、乾燥吸着剤を、０．５Ｍ  ０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．３）を含有するＮａＣｌ緩衝液中に再懸濁する。Ｍ１３−特異的ｍＡｂは、同じ緩衝液中に濃度１０ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解し、該吸着剤へ添加し、室温で１時間機械的に攪拌しながらインキュベーションする。インキュベーション後、この吸着剤を、同じ０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．３）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液の５容量で洗浄する。非特異的反応基をブロックするために、この吸着剤を、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）又は１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）と共に、室温で２時間インキュベーションし、その後５ｍｌクロマトグラフィーカラムに調節する。
【０１０５】
両方の方法に関して、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０及びそれらの断片、ｇｐ４１、ｐ２４に特異的な第一のファージＭ１３粒子は、先に説明されたように得られた（段階４）加水分解されたＨＩＶ−１ペプチド混合物と共に、３７℃で４０分間インキュベーションする。その後ファージ粒子を、不動化されたＭ１３ファージ-特異抗体の助けにより、いずれかで包埋する。
【０１０６】
包埋されたＭ１３−特異的ｍＡｂを伴う調製された超マクロ多孔質モノリス構造のエポキシ−活性化されたクリオゲルカラムは、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡とし、その後同じ緩衝液中の組換Ｍ１３を、液体クロマトグラフィーシステムActaPrime Plus(GE Healthcare社)を用い、速度０．５ｍｌ／分で、５時間かけて調節する。その後このカラムを、同じ０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液の５容量で洗浄する。
【０１０７】
組換ファージの包埋は、走査型プローブ顕微鏡法（原子力顕微鏡）により検査する。うまく包埋されたファージＨＩＶ−特異的ＳｃＦｖライブラリーを伴うクリオゲルは、図６ｂに示されており、対照の超マクロ多孔質モノリス構造のエポキシ−活性化されたクリオゲルカラム構造は、図６ａに示されている。
【０１０８】
０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中で加水分解されたＨＩＶ−１ペプチド混合物は、包埋されたアフィンカラムに、速度０．５ｍｌ／分で５時間かけて注がれる。その後このカラムを、同じ０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液の５容量で洗浄する。
【０１０９】
ＨＩＶペプチドに結合するファージは、０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．２）勾配により溶離される。得られた画分は、ファージ−抗原複合体が完全に再調節されるまで、０．００１Ｍ  ＰＭＳＦの存在下、グリシン溶離緩衝液中、室温で５時間インキュベーションされる。
【０１１０】
このＨＩＶペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Waters社)を用い、分析し[2]かつ精製する。分析用逆相ＨＰＬＣを、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、流量０．５ｍｌ／分）を装着したWaters 1525 ＨＰＬＣシステム上で行う。分取用逆相ＨＰＬＣを、Waters 1525 ＨＰＬＣシステム上で、Ｓｙｍｅｔｒｙ  Ｃ−１８カラム（１０μｍ、５．０ｃｍ×２５ｃｍ）及びWaters ＵＶ検出器を用いて行う。水／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリルの直線勾配を、結合したペプチドの溶離に使用する。
【０１１１】
６．  液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法による、ｅｎｖペプチド変動性及び頻度の定量分析及び配列分析；
未変性のＨＩＶ−１ペプチドを、リバースパンニングＨＩＶ−特異的ファージライブラリー由来の試料の給源として収集する。ｅｎｖペプチドの定量的選択、質量分布及び特徴決定は、一次元液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析）により行う。
【０１１２】
論文[10]に類似しているように見えるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのタンパク質ストリップ、及びペプチド質量フィンガープリントとして同定されない２Ｄからの単独のスポットを、Esquire 6000プラス装置(Bruker Daltonics社, ブレーメン, 独国)を用いるエレクトロスプレーイオン化四重極質量分析装置によるトラップ法により分析する。これらの試料の捕捉は、低速クロマトグラフィーシステムUltimate LC Packing及び試料選択装置Famos LC Packing(Dionx社, CA, 米国)オンラインレジメンから提供される。このクロマトグラフィーパーツは、二つの縦列に(consequently)連結されたカラムで、それらの間に電磁バルブを備えるものからなる。第一のカラム（１００μｍ×３ｓｍ）は、大きい細孔直径の、Ｃ8類似体の疎水性ポリマー相Poros R2を備え、これは試料の濃縮及び脱塩のために使用される。第二のカラム（７５μｍ×２５ｓｍ）は、粒度５μｍ、細孔直径３００Å、Ｃ18類似体のPhenomex吸着剤を備え、これはトリプシン処理されたペプチドの脱塩された混合物の分離のために使用される。クロマトグラフィー分離の条件は、以下である：２００μｌ／分で、スプリッター前の実際の排出(exaust)速度９００ｎｌ／分、及び分離時２００ｎｌ／分。５％から６０％までの溶液Ｂ（７５％アセトニトリル、２５％イソプロパノール、０．１％ギ酸）の直線勾配で、４８分間にわたるペプチド分離を行う。
【０１１３】
全ての測定は、３００〜２５００ｍ／ｚの間で行われ、捕捉質量最適化は７００と等しい。電荷数が２以上、かつ強度が閾値よりも高いイオンが、タンデム実験に使用される。得られた質量−プリントは、MASCOT検索システムへ送付される。この検索は、プロテオームデータ−ベースを介して試行され、結果は、ペプチドアイデンティフィケーションの確認のためのソフトウェア複合体Scaffold 01-07-00 (http://www.proteomesoftware.com)により検証される。９５％を超えるアイデンティフィケーション予測値(identification expectancy)を持つペプチドは、最終スケジュールに入れる。全ての観測されたペプチド質量は、計算された平均質量と０．５Ｄａ以内で合致する。
【０１１４】
これらのチャートは、ｅｎｖタンパク質分子におけるポリペプチド配列の疎水性断片（Ｙ軸正の指標）及び親水性断片（負の指標）の分布を表している（図３）。
ｏｎｆ：信頼性（０＝低い、９＝高い）
Ｐｒｅｄ：推定された二次構造（Ｈ＝ヘリックス、Ｅ＝鎖、Ｃ＝コイル）
ＡＡ：標的配列
疎水性アミノ酸相対指数：
【０１１５】
【数１】
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【０１１６】
【数２Ａ】
2010540674.tif 000012
【数２Ｂ】
2010540674.tif 000013
【数２Ｃ】
2010540674.tif 000014
【０１１７】
７．  主要ＨＩＶ  ｅｎｖペプチドのクローニング及びリーシュマニア・タレントラエにおけるワクチン開発のための組換ペプチドの作製；
ＨＩＶ生活環は、ヒト、サル又は齧歯類において生じ、かつそのタンパク質のグリコシル化は、哺乳類代謝に近い。真核生物発現システムは、酵母システム、糸状菌を含むが、昆虫、哺乳類及び／又は植物からの細胞培養物も含む。ｇｐ１２０及びｇｐ４１は両方とも、それらの外部ドメインにおいて高度にグリコシル化される。発現された断片又はタンパク質のグリコシル化が望ましい場合、発現は、真核生物システム、例えば酵母、哺乳類細胞培養物、リーシュマニア細胞培養物、バキュロウイルス発現培養物において実行されなければならない。ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター細胞）又はＣｏｓ−７（アフリカミドリザル腎上皮細胞）などの哺乳類細胞における発現は可能であるが、哺乳類細胞は細胞代謝における数百万のタンパク質を有するので、その組換物の発現はかなり低く、かつ作製された組換体は、クロマトグラフィーによる単離が難しい。結果的に本発明者らは、リーシュマニア・タレントラエをｅｎｖペプチド産生システムとして選択した。
【０１１８】
定量的質量分析後に、そのプール中の圧倒的多数を提示しているｇｐ１２０変種を、配列決定し、かつクローニングに進める。多数の刊行物に示されたように、ｇｐ４１配列異形は、ＨＩＶ−特異的免疫応答にとっては重要ではない（図１０ｄ、実施例４）。ｇｐ４１グリコシル化レベル及びｇｐ１２０へのカップリングは、その配列変動性よりもＨＩＶ−特異抗体の誘発にとって重要であるので[31]、本発明者らは、クローニングのための標準成分として、患者コホートからの１種の変種の遺伝子のみを採取することを考えた。得られたｇｐ１２０タンパク質配列を基に、ｇｐ１２０  ｅｎｖペプチド遺伝子をコードする対応するプロウイルスのＤＮＡ断片を、特異的プライマー対（表８）を使用し、患者のリンパ球ｃＤＮＡマトリックスから、２段階入れ子型ＰＣＲにより増幅する。プライマーそれ自身及びそれらのセットは、ＬＣ−ＭＳ分析の結果を基に変化することができる。
【０１１９】
ｇｐ１２０及びｇｐ４１の全ペプチド、ｇｐ１２０内部ドメイン及びｇｐ１２０外部ドメイン、ｇｐ４１エクトドメインをコードするＤＮＡ断片のクローニングを行うことは可能である（図１０ａ、ｂ、ｃのｇｐ１２０構造を参照のこと）。ｇｐ１２０、ｇｐ４１及びそれらの主要ドメインをコードするＨＩＶ−１  ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅スキームは、図１１ａ、ｂに示されている。ｅｎｖ  ｇｐ１２０、ｇｐ４１及びそれらのドメインの増幅のためのプライマーのセットは、表８に示されている。制限部位は、クローニングベクター変種に従い選択され、ＮｃｏＩに関してピンク色で、ＸｂａＩに関して青色で、ＮｏｔＩに関してオレンジ色で、ＮｈｅＩに関して緑色で印をつけている。どの領域が、各場合の最良の免疫化の結果のためのクローニングに最も適しているかは、かなり当該技術分野で重要であり、又は経験のある研究者の選択による。
【０１２０】
【表８】
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・１２０Ｆｏｒプライマーは、ｇｐ１２０内部ドメインの増幅のためのフォワードプライマーとして使用され、４１Ｆｏｒプライマーは、ｇｐ４１エクトドメインの増幅のためのフォワードプライマーとして使用される。
【０１２１】
ワクチン開発のための組換タンパク質製造に関する発現システムの選択に関して、いくつかの特徴が重要である。それらの発現は：ｉ）誘導性；ii）同様にグリコシル化されるか又は継代される哺乳類翻訳後修飾でなければならない。
【０１２２】
ｉ）誘導性発現は、組換ペプチドの妥当な量及び濃度を達成するために必要である。誘導性システムにおいて図１２に示されたように、組換タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡゲル電気泳動の走査により可視化できる（図１２ａ）。細胞が非誘導性発現ベクターによりトランスフェクションされる場合、通常これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては明白ではないので、これはウェスタンブロットにより検出されなければならない（図１２ｂ）。
【０１２３】
ii）ワクチン接種ために作製された組換ペプチドのグリコシル化は、可能な限りウイルス宿主−真核生物リンパ球細胞に関する天然の典型にマッチしなければならない。数百万のそれら自身のタンパク質の中で真核細胞培養物において組換タンパク質の十分な産生を得ることは、困難でありかつ経費がかかる。そのため、酵母株、昆虫細胞又は真核細胞の寄生システムにおいて、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ４１及び全ｇｐ１６０）の生成を試行することが可能である。本発明者らの考えた選択肢は、トリパノソーマ原虫宿主のリーシュマニア・タレントラエであり、これは容易な操作で真核生物タンパク質の発現／フォールディング／修飾型を組合せ、かつ哺乳類に対し病原性でもない。この発現システムの主な利点は、標的タンパク質の哺乳類型の翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化又はプレニル化などである（図１３）。
【０１２４】
最も簡便な方法は、Jena Bioscience社により設計されたＬＥＸＳＹｃｏｎ２発現キット及びＬＥＸＳｉｎｄｕｃｅ２発現キットからの、ｐＬＥＸＳＹベクターファミリーにおけるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のクローニングである。トリパノソーマ原虫において、ｍＲＮＡは、遺伝子間領域内のトランススプライシング及びポリアデニル化により、個々のｍＲＮＡへ転写後プロセシングされる、ポリシストロン性前駆体として転写される。これらの種におけるタンパク質発現の調節は、ＲＮＡレベルについて主に生じ、かつ遺伝子間領域の構造により影響を受けることがある。ｐＬＥＸＳＹベクターにおいて、Ｌ．タレントラエにおける異種タンパク質の発現に関して最適化された遺伝子間領域が使用される(Jena Bioscience社)。
【０１２５】
ｐＬＥＸＳＹ−２ベクターは、発現カセットの染色体１８Ｓ  ｒＲＮＡ座（ｓｓｕ）への組込み後に、分泌シグナルペプチド（図１４のＳＰ）を伴う又は伴わずのいずれかで、標的タンパク質の構成的発現を可能にする。従って同じベクターを、サイトゾル型発現又は分泌型発現のいずれかのために、ＯＲＦのクローニングに使用することができる。これらのベクター上にコードされたＬｍＳＡＰシグナルペプチドは、リーシュマニア・メキシカナの分泌された酸性ホスファターゼ（ｌｍｓａｐ１）の遺伝子に由来する。標的ＨＩＶ−１タンパク質のＯＲＦのこのシグナルペプチドへのインフレーム融合は、ＬＥＸＳＹ宿主における分泌型発現を可能にするが、このシグナルペプチド−コード配列の５’末端での任意の制限部位へのクローニングは、サイトゾル型発現を生じるであろう。
【０１２６】
標的遺伝子のｐＬＥＸＳＹ発現ベクターへの挿入
ｐＬＥＸＳＹ−２ベクターは、１ｋｂスタッファー断片の置換により、標的遺伝子カセットの方向性のある挿入を可能にする。得られたライゲーション混合物は、リーシュマニア配列に忍容性のあるコンピテント大腸菌細胞（Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ４、ＸＬ−１、ＸＬ−１０、ＳＵＲＥなど）の形質転換に使用される。この組換大腸菌クローンの選択は、アンピシリンにより実行される。大腸菌における構築後、この発現プラスミドは、ＳｗａＩによる完全な消化により線状とされ、その後標的遺伝子を伴うこの発現カセットは、相同組換によりＬＥＸＳＹ宿主Ｐ１０の染色体１８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｓｓｕ座に組込まれる。標的遺伝子挿入部位に先行する大腸菌における転写及び／又は翻訳に関するシグナルは存在せず、その結果大腸菌における遺伝子発現の欠如は、大腸菌にとって毒性であるタンパク質の構築体の作製にとって利点である。
【０１２７】
ＨＩＶ−１エンベロープシグナルペプチドにより支持された構成性サイトゾル型発現又は構成性分泌型発現に関して、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子（シグナルペプチド、ｇｐ１２０及びｇｐ４１をコードするｇｐ１２０、ｇｐ４１及び全ｅｎｖ遺伝子）は、ＮｃｏＩ（フォワード）及びＮｈｅＩ（リバース）部位を含むプライマーにより増幅され（表８）、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにより消化され、かつｐＬＥＸＳＹ−２ベクターにおいてクローニングされる。そのような配置において、本標的ＨＩＶ−１タンパク質は、Ｃ−末端Ｈｉｓ６ストレッチに融合される。他方で、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子は、ＮｃｏＩ（フォワード）及びＮｏｔＩ（リバース）部位を含むプライマーにより増幅され、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにより消化され、かつｐＬＥＸＳＹ−２ベクターにおいてクローニングされる。この場合、得られた標的ＨＩＶ−１タンパク質は、Ｃ−末端Ｈｉｓ６ストレッチを欠いている。
【０１２８】
ｐＬＥＸＳＹ−２ベクターからのＬｍＳＡＰシグナルペプチドにより保証された構成的分泌型発現に関して、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子（シグナルペプチドパーツを欠いている、ｇｐ１２０、ｇｐ４１及び全ｅｎｖ遺伝子）は、ＸｂａＩ（フォワード）及びＮｈｅＩ（リバース）を含むプライマーにより増幅され（表７）、ＸｂａＩ／ＮｈｅＩにより消化され、ｐＬＥＸＳＹ−２ベクターにおいてクローニングされる。そのような配置において、本標的ＨＩＶ−１タンパク質は、Ｃ−末端Ｈｉｓ６ストレッチに融合される。他方で、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子は、ＸｂａＩ（フォワード）及びＮｏｔＩ（リバース）部位を含むプライマーにより増幅され、ＸｂａＩ／ＮｏｔＩにより消化され、かつｐＬＥＸＳＹ−２ベクターにおいてクローニングされる。この場合、得られた標的ＨＩＶ−１タンパク質は、Ｃ−末端Ｈｉｓ６ストレッチを欠いている。
注意：前述のＸｂａＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位は、前の(former)ＳＵ由来のＨＩＶ−１亜型Ａ１  ｅｎｖ遺伝子に関しては稀である。ｐＬＥＸＳＹ−２ベクターのマップは、図１４に示されている。ＬＥＸＳｉｎｄｕｃｅ２発現キットは、ｐＬＥＸＳＹ＿Ｉ−ｎｅｏ２（アミノグルコシドリン酸転移酵素をコードする）を備え、ＬＥＸＳＹ宿主Ｔ７−ＴＲにおけるテトラサイクリン−誘導性バクテリオファージ−Ｔ７ポリメラーゼ−駆動した発現に適している。
【０１２９】
組換タンパク質発現
ｐＬＥＸＳＹ＿Ｉ−２ベクターは、分泌シグナルペプチドを伴う又は伴わずのいずれかで、標的タンパク質の誘導性発現を可能にする。従って同じベクターを、誘導性サイトゾル型発現又は誘導性分泌型発現のいずれかのために、ＯＲＦのクローニングに使用することができる。これらのベクター上にコードされたＬｍＳＡＰシグナルペプチドは、リーシュマニア・メキシカナの分泌された酸性ホスファターゼ（ｌｍｓａｐ１）の遺伝子から誘導される。標的タンパク質のＯＲＦのこのシグナルペプチドへのインフレーム融合は、ＬＥＸＳＹ宿主における分泌型発現を可能にするが、このシグナルペプチド−コード配列の５’末端での任意の制限部位へのクローニングは、サイトゾル型発現を生じるであろう（図５）。ｐＬＥＸＳＹ＿Ｉ−２ベクターファミリーは、本発現カセットのリーシュマニア・タレントラエＴ７−ＴＲレシピエント株の染色体オルニチンデカルボキシラーゼ（ｏｄｃ）座への組込み後の標的タンパク質の誘導性発現を保証し、これは宿主ＲＮＡポリメラーゼＩの制御下で、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びＴＥＴリプレッサーを構成的に発現する。第一のクローニング工程において、本標的遺伝子は、Ｔ７プロモーター／ＴＥＴオペレーター配置の下流でｐＬＥＸＳＹ＿Ｉ−２ベクターに挿入可能である制限部位を含むリンカー配列と共に、供給される。これらのベクターは、標的遺伝子挿入部位の側方に位置する最適化された非翻訳領域を含み、これは転写後ｍＲＮＡプロセシングのためのスプライシングシグナルを提供する。大腸菌における構築後、本発現プラスミドは線状とされ、相同組換により、ＬＥＸＳＹ宿主Ｔ７−ＴＲのｏｄｃ座に組込まれる。
【０１３０】
ＨＩＶ−１エンベロープシグナルペプチドにより保証されたテトラサイクリン誘導性サイトゾル型発現又はテトラサイクリン誘導性分泌型発現に関して、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子（シグナルペプチド、ｇｐ１２０及びｇｐ４１をコードする、ｇｐ１２０、ｇｐ４１及び全ｅｎｖ遺伝子）は、ＮｃｏＩ（フォワード）及びＮｈｅＩ（リバース）部位を含むプライマーにより増幅され、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにより消化され、かつｐＬＥＸＳＹ−２ベクターにおいてクローニングされる。そのような配置において、本標的ＨＩＶ−１タンパク質は、Ｃ−末端Ｈｉｓ６ストレッチに融合される。他方で、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子は、ＮｃｏＩ（フォワード）及びＮｏｔＩ（リバース）部位を含むプライマーにより増幅され、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにより消化され、かつｐＬＥＸＳＹ−２ベクターにおいてクローニングされる。この場合、得られた標的ＨＩＶ−１タンパク質は、Ｃ−末端Ｈｉｓ６ストレッチを欠いている。
【０１３１】
該ベクター由来のＬｍＳＡＰシグナルペプチドにより保証されたテトラサイクリン誘導性分泌型発現に関して、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子（シグナルペプチドパーツを欠いている、ｇｐ１２０、ｇｐ４１及び全ｅｎｖ遺伝子）は、ＸｂａＩ（フォワード）及びＮｈｅＩ（リバース）を含むプライマーにより増幅され、ＸｂａＩ／ＮｈｅＩにより消化され、かつｐＬＥＸＳＹ−２ベクターにおいてクローニングされる。そのような配置において、本標的ＨＩＶ−１タンパク質は、Ｃ−末端Ｈｉｓ６ストレッチに融合される。他方で、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子は、ＸｂａＩ（フォワード）及びＮｏｔＩ（リバース）部位を含むプライマーにより増幅され、ＸｂａＩ／ＮｏｔＩにより消化され、かつｐＬＥＸＳＹ−２ベクターにおいてクローニングされる。この場合、得られた標的ＨＩＶ−１タンパク質は、Ｃ−末端Ｈｉｓ６ストレッチを欠いている。
【０１３２】
ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ又はＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位においてｐＬＥＸＳＹベクターファミリーにクローニングされた全ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子、又は固有のシグナルペプチドを欠き、代わりｐＬＥＸＳＹベクター由来のＬｍＳＡＰシグナルペプチドに融合されているＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子（ＸｂａＩ／ＮｈｅＩ若しくはＸｂａＩ／ＮｏｔＩ部位でｐＬＥＸＳＹベクターにクローニングされる）は、プラスミド構築体の作製に使用することができ、特にｇｐ１２０配列の、種々のＨＩＶ−１ウイルス株から得られた他のｇｐ１２０配列変種による迅速な置換が可能である。この目的のために追加のＸｂａＩ部位が、位置特異的変異誘発により、ｇｐ１２０末端とｇｐ４１始端の間でｅｎｖ遺伝子配列に導入される。その後、ｐＬＥＸＳＹ：：ＨＩＶ−１  ｅｎｖプラスミド構築体が、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ（全ｅｎｖ遺伝子が、ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ若しくはＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位でクローニングされる場合）又はＸｂａＩ単独（その固有のシグナルペプチドを欠いたＨＩＶ−１  ｅｎｖが、ＸｂａＩ／ＮｈｅＩ若しくはＸｂａＩ／ＮｏｔＩ部位においてクローニングされる場合）により消化され、ｇｐ１２０配列が除去される。得られたプラスミド誘導体は、ＮｃｏＩ（フォワード）又はＸｂａＩ（フォワード）及びＸｂａＩ（リバース）部位を含むプライマーでの、ＰＣＲ増幅により、他のＨＩＶ−１ウイルス変異株から得られた、ｇｐ１２０配列のクローニングに適している。
【０１３３】
ＬＥＸＳＹ−２宿主及び発現株の培養
リーシュマニア属は、下記の二段階で、好気性条件下で増殖する：鞭毛を持つ前鞭毛型（昆虫宿主における野生型）及び脊椎動物宿主における無鞭毛型。インビトロにおいて、Ｔ７−ＴＲ  ＬＥＸＳＹ−２宿主の両方の段階は、複合培地（ＬＥＸＳＹ  ＢＨＩ、若しくはＬＥＸＳＹ  ＹＳ）又は化学的に規定された培地（合成ＬＥＸＳＹ培地）中で、暗所、２６℃で培養することができる。培地は、ＬＥＸＳＹ  ＢＨＩ粉末３７ｇ／ｌから調製され、オートクレーブ処理され（琥珀色）、最大６ヶ月間貯蔵される。使用前に、細菌感染の防止のために、培地には、５μｇ／ｍｌヘミン、及び１００μｇ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充される。この培地は、暗所で４℃で貯蔵され、補充後２週間以内に使用される。複合培地への血清の添加は不要であり、ウシ胎仔血清は、Ｌ．タレントラエの増殖を増強しない。前記宿主又はＬＥＸＳＹ株の増殖阻害の場合、細胞は２０００ｇで５分間遠心し、新鮮培地中に慎重に再懸濁し、かつインキュベーションを継続する。この株は、１：１０〜１：５０の割合で通常希釈される連続懸濁培養物として維持することができる。最良の結果は、中程度(mid-late)増殖相（ＯＤ  ２〜３；８×１０7〜１．４×１０8細胞／ｍｌ）時の接種により得られる。株維持に関して、１０ｍｌ培養物を、月曜日及び金曜日に１：２０で希釈し、かつＴＣフラスコを直立してインキュベーションすることが都合がよい。細胞生存能は、運動している鞭毛を持つ運動型前鞭毛型として顕微鏡下で目視可能であり；死滅細胞は、丸形であるか又は破壊された形状であり、これらは運動しない。
【０１３４】
組換タンパク質発現培養は、懸濁培養のための、培養容量１０〜２００ｍｌの通気した組織培養（ＴＣ）フラスコ、又は約１４０ｒｐｍでインキュベーター内で攪拌され、培養容量５０ｍｌ〜１Ｌのエレンマイヤーフラスコにおいて、又は最大１００Ｌの標準バイオリアクターにおいて行うことができる。ベクターｐＬＥＸＳＹ−ｎｅｏ２に関する組換体の選択は、５０μｇ／ｍｌネオマイシンの存在下で行う。
【０１３５】
ＬＥＸＳＹ宿主株及びＬＥＸＳＹ発現株は、２０％グリセロール中で、−８０℃で、少なくとも１年間貯蔵することができる。オートクレーブにかけたグリセロール（８０％）容量の１／４及び中増殖相からのＬＥＸＳＹ  ＢＨＩ＊培地中で増殖した培養物４〜８×１０7細胞／ｍｌ（ＯＤ  １．２〜１．８）の容量の３／４を、１５ｍｌファルコン管に加え、グリセロールと混合し、滅菌したクリオバイアルに分注する。バイアルは、室温で１０分間維持し、その後水の入った氷上で１時間、−２０℃でしばらくの間維持し、長期間貯蔵のために−８０℃に移す。グリセロールストックの再活性化に関して、クリオバイアルを、氷上で解凍し、その内容物を、補充培地１０個に注ぎ、直立の通気フラスコにおいて、２６℃で静止位置で、培養物が不透明となるまで２日間、インキュベーションする。
【０１３６】
ＬＥＸＳＹ宿主トランスフェクションのための発現プラスミドの調製
大腸菌から得られた標的遺伝子を含む発現プラスミド１〜５μｇを、ＳｗａＩにより完全に消化する。作製された大腸菌パーツを示している２．９ｋｂｐ断片、及びＬＥＸＳＹ宿主の染色体ｓｓｕ座に組み込まれるべき標的遺伝子を伴う線状化された発現カセットを示しているより大きい断片を、アガロースゲルで泳動する。より大きい断片の発現カセットは、アガロースゲル抽出キットを用いて単離する。酵素及び緩衝塩は、ＰＣＲ精製キットにより除去することができる。あるいは、この消化物をエタノールにより沈殿し、７０％エタノールにより洗浄し、かつ最大５０μｌの滅菌２回蒸留水又は１０ｍＭトリス（ｐＨ８）／トランスフェクションへ再溶解する。
【０１３７】
ＬＥＸＳＹ宿主株の電気穿孔法によるトランスフェクション
効率的トランスフェクションのために、Ｌ．タレントラエ予備培養物を、１０ｍｌ  ＬＥＸＳＹ  ＢＨＩ培地中に１：２０で接種し、組織培養（ＴＣ）フラスコ中で直立して、２６℃でインキュベーションし、予備培養の２日後、１０ｍｌ培地中に１：１０で希釈し、同じ条件で一晩インキュベーションする。増殖培養物は、６×１０7細胞／ｍｌ（ＯＤ  １．４、波長５５０〜６００ｎｍ、３％ホルマリン）含有しなければならず；これらの細胞は、生存し、かつ液滴状の形状であることは、顕微鏡により確証される。細胞は、２０００ｇ、室温で５分間遠心し、上清の１／２量を除去する。このペレットは、残留する培地中に再度懸濁し（１０8細胞／ｍｌ）、水の入った氷上に１０分間放置する。最大５０μｌの水又はトリス緩衝液中０．１〜５μｇ形質転換しているＤＮＡは、並行したチューブ中で水の入った氷上に直ちに配置する。予め氷冷した細胞３５０μｌを、ＤＮＡの入ったチューブに加え、気泡を避けるために水の入った氷上のｄ＝２ｍｍの電気穿孔キュベットに移す。電気穿孔のパラメータは、４５０Ｖ、４５０μＦ、パルス時間５〜６ミリ秒である。電気穿孔後、キュベットを、氷に、正確に１０分間戻す。その後電気穿孔された細胞を、キャピラリーにより、１０ｍｌ  ＬＥＸＳＹ  ＢＨＩへ移し、２６℃で一晩インキュベーションする（約２０時間、ＯＤ  ０．３〜０．４）。
【０１３８】
トランスジェニックＬＥＸＳＹ株の選択
発現株の確立のために、下記の二つの方法を、並行して慣習的に使用することが可能である。染色体の組込みのためにデザインされた線状化された発現カセットによるトランスフェクション後、クローン性又は非クローン性選択に由来した培養物を比較した場合、同様の発現レベルが、繰り返し認められる。しかし、環状発現プラスミドのトランスフェクションは、クローン性選択を必要とし、その理由は、これらのエピソームは、不均質様式で増幅しかつ最終的にゲノムへ組込む傾向があるからである。環状ＤＮＡによるトランスフェクション後の、懸濁培養液中の非クローン性選択は、通常低下した発現レベルを生じる。
【０１３９】
固形培地上への播種によるクローン選択
ＬＥＸＳＹ  宿主細胞は、新たに調製したカンテンプレート上で選択する。トランスフェクションされた１０ｍｌのｏ／ｎ培養物から２ｍｌのバッチを１〜４個採取し、残りの培養物は、非クローン性選択のために並行して使用する。細胞は、２０００ｇ、２０℃で５分間遠心し、そのペレットは、残渣培地５０〜１００μｌ中に再懸濁し、再懸濁した細胞は、５０μｇ／ｍｌネオマイシンが補充された新たに調製されたＬＥＸＳＹ  ＢＨＩカンテン上にカンテンの表面上に、配置されたニトロセルロースフィルター上に細胞を画線する方法により播種される。播種は、これらのメンブレン上で直接１％カンテン上よりもより容易であり、細胞の遊走(swarming)は消滅する。それ以外に、メンブレン上の播種は、例えば蛍光スキャニング又は所与の標的タンパク質に特異的検出法による、クローン性集団の発現プロファイルの試験のために、フィルターを持ち上げることができる。プレートは、パラフィルムで密封され、２６℃で逆さまで(bottom up)インキュベーションする。
【０１４０】
播種後５〜７日目に、小さい限定されたコロニーが出現し始め、播種後７〜９日目に、コロニーが直径１〜２ｍｍまで増殖した時点で、これらをピペットチップを用い、９６−ウェルプレート中の選択増殖培地０．２ｍｌに移し、１日インキュベーションした後−２４−ウェルプレート中の選択培地１ｍｌへ移すことができる。２６℃で更に２４〜４８時間インキュベーションした後、その培養物を、ＴＣフラスコ中の選択培地１０ｍｌに増殖し(expand)、評価及び凍結保存に使用することができる。
【０１４１】
懸濁培養における選択
トランスフェクション実験から得た１０ｍｌ  ｏ／ｎ培養物が、わずかに不透明になり始めた（ＯＤ600  ０．４、約１０7細胞／ｍｌ；通常電気穿孔の約２０時間後）直後に（４．４．参照）、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌを添加し、インキュベーションを２６℃で７日間継続する。組換細胞は、顕微鏡下で運動型であり、液滴様の形状であり、かつ「曇った」懸濁培養物として増殖するのに対し、陰性対照中の細胞は、選択時に、死滅し始め、顕微鏡下で鞭毛を伴わない、球形又は不規則な形状のように見える。通常、選択の７日目の１：１０接種割合のネオマイシンを含む新鮮な培地への１回の連続転移は、抗生物質−抵抗性組換株化細胞の不透明な培養物を得るのに十分である。
【０１４２】
ゲノム組込み及び組換ｅｎｖペプチド発現の確認
本発現カセットのｓｓｕ座への組込みは、鋳型としてトランスジェニック株のゲノムＤＮＡを使用する、診断的ＰＣＲ又は配列決定により確認することができる。ｐＬＥＸＳＹ Ｉ−２ベクター診断的ＰＣＲ（アニーリング温度５５℃）は、抗生物質耐性カセットフォワードプライマー及びｏｄｃリバースプライマーＰ１５１０により行う（表９）。本発現カセットのｏｄｃ座への組込みは、対照反応においては認められない特徴的断片（各々、１．９又は２．０ｋｂｐ）を生じる。加えて、ｏｄｃフォワードプライマーＡ１３０４及びａｐｒｔリバースプライマーＡ１７１５（標的遺伝子の５’ｕｔｒ内にハイブリダイズする）により、診断的ＰＣＲ（アニーリング温度６０℃）を行うことができる。本発現カセットのｏｄｃ座への組込みは、特徴的１．１ｋｂｐ断片を生じるが、対照反応においては得られず、ここで鋳型は、ＬＥＸＳＹ宿主株の発現プラスミド又はゲノムＤＮＡである。
【０１４３】
組換ＬＥＸＳＹ株における標的タンパク質の発現は、細胞抽出物の、又は分泌型発現の場合は上清のアリコートの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより評価する。最適な発現を得るために、任意に種々のテトラサイクリン濃度、各個別のタンパク質の培養条件及び収穫時間での、平均１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン発現の誘導にキャリブレーションされる。
【０１４４】
【表９】
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【０１４５】
８．組換ＨＩＶ  ｅｎｖペプチドの生成及びクロマトグラフィー精製
タンパク質生成に関して、本組換株は、複合ＬＥＸＳＹブロスＢＨＩ(Jena Bioscience社)において、ＯＤ  ６００  Ｄ２（１０8細胞／ｍｌ）まで増幅される。このタンパク質生成は、新鮮な培地に細胞を移して１時間後の、５ｍｇ／ｌ  テトラサイクリンの添加により誘導され、かつこの培養物は、ＭｕｌｔｉｔｒｏｎＩＩインキュベーター−振盪機(Infors AG社, スイス)において１３０ｒｐｍで攪拌しながら２６℃で、２４〜７２時間、ＯＤが約１．８に達するまで、インキュベーションされる。培養物上清中及び細胞中の組換ｇｐ１２０の存在は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロットにより決定する。Ｎ−グリコシル化の存在の確認のために、本発明者らは、培養物上清又は細胞を、Ｎ−グリコシダーゼで処理し、かつ処理したタンパク質の電気泳動移動度を分析する。
【０１４６】
タンパク質を発現しているリーシュマニア細胞は、２５００ｇで１０分間遠心し、そのペレットを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ中に再懸濁する。この細胞溶解液は、２０ｋＨｚで、超音波処理機を用い、１９ｍｍ探針による、氷中で１分間１０回のパルス適用が、パルス間の間隔２分間で行われる。透明化された上清を収集し、０．４５μｍ細孔メンブレンを通して濾過し、アガロースに結合されかつニッケルで帯電されたニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）を使用する、不動化された金属イオンを含むクロマトグラフィーカラム(GE Healthcare社)における、組換ｇｐ１２０のアフィニティ精製に使用される。簡単に述べると、このＮｉ−ＮＴＡカラムは、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦの緩衝液の３容量で、流量１ｍＬ／分ですすがれる(LC Akta Prime Plus社, GE Healthcare社)。次にこのカラムに、流量０．２５ｍＬ／分を利用し、組換ｇｐ１２０（ｒ−ｇｐ１２０）を含有する濾過した上清が充填される。充填後、このカラムは、洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）の３容量ですすがれる。このｒ−ｇｐ１２０は、カラム内部のエンテロキナーゼにより切断され、ポリヒスチジン尾部を除去する。この目的のために、Ｅｋの１国際単位（ＩＵ）が、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ８．０を含む緩衝液中のカラムへ導入され、この切断反応は、２５℃で１８時間進行される。あるいは、ポリヒスチジン尾部により標的化されたタンパク質は、イミダゾール勾配（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の０〜０．５Ｍイミダゾール）中で溶離される。タンパク質含有画分はプールされ、限外濾過により濃縮される。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色及び抗−ヒトｇｐ１２０抗体によるウェスタンブロットにより分析される。ｒ−ｇｐ１２０含有画分は、プールされ、０．１Ｍトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析され、標準アプローチ[2]を使用し、同じ緩衝液で平衡とされた陰イオン交換カラム(Q-PEEK 10um AXC Biosuite, Waters社）上に装加される。このタンパク質は、０〜１Ｍ  ＮａＣｌの勾配により溶離される。ｒ−ｇｐ１２０含有画分は最終的に、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ(GE-Healthcare社)を使用するゲル濾過により精製される。
【０１４７】
精製されたｒｈＥＰＯのＮ−末端配列決定は、自動エドマン分解により実行される。精製されたタンパク質の濃度は、ＢＣＡアッセイにより決定される。タンパク質発現及び精製の種々の段階を通じて得られた画分の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実行される。本タンパク質バンドは、クマーシーブリリアントブルーＲ−２５０又は銀染色により可視化される。
【０１４８】
ａ．  ワクチン送達のビヒクルとして立体的に安定したリポソームを使用する、ＨＩＶ予防ワクチン免疫ブースト組成物の調製
最も一般的には「ワクチン」と称される、将来の該疾患と接触する可能性のある症例において、いくつかの細菌又はウイルス感染症に対する特異的免疫応答を提供する目的で、経口（ｏｓ）、又は皮下、筋肉内、静脈内のいずれかによる投与のための任意の医薬品は、多くの必要要件を満たさなければならない。これらの必要要件の主なものは：
iii）免疫応答が、ある種の病原性微生物又は感染症に対し高度に特異的であること；
iv）免疫応答が、疾患症状の出現を妨げるよう、この特定の感染症の発症と闘うのに十分に強力であること；
ｖ）免疫応答が、長期間、数ヶ月及び数年間持続すること；
vi）前述の全てにもかかわらず、本ワクチンは、ヒト生物に関して反応原性（免疫毒性）でないこと：である。
【０１４９】
本発明のＨＩＶ予防ワクチンの有効性は、これを、免疫賦活剤又は免疫原性担体、例えばアジュバントなどと会合することにより増強される。未変性のＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質混合物に加え、ｇｐ１２０糖鎖付加された組換型は、高度に免疫原性であり、皮下に接種されることを容易に忍容できず、それら自身により強力な免疫反応をもたらす（実施例４）。しかし、全ての純粋なタンパク質に関して、生物におけるそれらの生分解は、迅速であり、かつペプチドが、任意の保存剤若しくはプロテアーゼインヒビターアジュバントと固定されない場合、免疫応答は２〜３週間以内に使い果たされる。本発明者らの最初の考えは、ｅｎｖペプチドを分解から保護し、細網内皮系に不可視であるよう、それらを立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）にパッケージすることであった。しかしマウスにおける極初期の実験から、ＳＳＬは、十分に長いことができるある期間装荷されるか又は結合されたペプチドを保持することができ、かつそれらの急性免疫毒性を減少することができることが見出された。ペプチドに関して、立体的に安定化されたリポソームのプラットフォームは、アントラサイクリンのリポソーム薬剤形状に関して示されたように、低い総免疫毒性及びより良い薬力学（薬剤の適時放出）の利点に順応する。リポソームペプチドは、正に細胞増殖抑制剤又は他の低分子量剤のようにゆっくりＳＳＬの外側で誘発され得る。即時型免疫反応の阻害は、単回投与のためのペプチド用量の増加、及び長い十分にブーストされた免疫化のためのウイルスｅｎｖペプチドのＭＨＣとの接合部接触の延長を可能にする。この方法のＳＳＬは、免疫ブーストアジュバントとして及びワクチン送達システムとして同時に活用される。
【０１５０】
従って本発明の効果的な組成物の具体的製剤は、該製剤が投与される際に被験者において、アジュバントを生分解性、安全かつ有効とするのに適した様式で実行されてよい。二つの考え方が更に説明される：
ｉ）ｅｎｖペプチド混合物は、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）に装荷される；
ii）ｅｎｖペプチドは、ＳＳＬのＰＥＧ−活性化された基に共有的に連結される；
iii）可能性のある構築体（ｐＮＬ３−４、ＩＲＩＶなど）のビロソーム上に提示されたｅｎｖペプチド。
【０１５１】
ｉ）立体的に安定化されたリポソーム調製品及びペプチド装荷
立体的に安定化されたリポソームは、リン脂質：コレステロールがおよそ７：３及び０．２〜０．５ｍｏｌ／％ポリエチレングリコール−ジステアロイル（ホスファチジル）エタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）からなる混合物からの、クロロホルムの真空乾燥法、及び窒素流下でのベシクル形成[40]を用いて調製される。使用される脂質混合物は：ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ３５０、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ４００などである(Avanti Polar Lipids社, バーミンガム, AL)。本リポソームの主成分は、ジオレオイル−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）であり、これは卵黄、脳組織又はダイズ豆などの天然の給源から抽出されるか、又は合成により調製することができる。コレステロールは、リポソーム膜内のリン脂質二層を安定化するために必要であり、ＰＥ−ＰＥＧは、膜の安定性及び硬度を提供し、これは懸濁液中のリポソームが融合及び分解することを防ぎ、かつこれらが数ヶ月間それらのサイズ分布及び漏出を伴わずに内側に装荷された物質を保存することができるようにする。ＳＳＬ中のＰＥＧの理想的分子量は、４００〜７００であり、１０００〜２０００のより長いＰＥＧ鎖は、リポソーム膜の硬度が、それらの内容物送達に必要なものよりも高くなり、かつ長いＰＥＧ  ＳＳＬ組成物は自己生分解の必要要件を満たさないので、ＳＳＬデザインにおいては利点ではない。ＤＳＰＥ−ＰＥＧの割合は、望ましい特性のリポソームを得るための細かい調整の主なものである。
【０１５２】
乾燥脂質は、有機溶媒−クロロホルム又はエタノール-クロロホルム−中で混合され、これらは次に回転蒸発器(Buchi R-200)において蒸発され、薄い脂質フィルムが形成される。リポソーム懸濁液は、溶解した物質（例えば５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を含む水性緩衝液中に更に水和され、３００〜４００ｒｐｍ、温度＋４５℃で、３０分間の攪拌時に調製される。大型多層ベシクル（ＭＬＶ、３００ｎｍ〜１μｍ）及び小型単層ベシクル（ＳＵＶ、８０〜２５０ｎｍ）の混合物が、生成される。ペプチドなどの任意の水溶性物質の送達に関して、小型単層ベシクルが必要であり、従って超音波処理（６００ｍＶ、Avanti Polar Lipids社)、及びポリカーボネート０．４〜０．２〜０．１μｍメンブレン(Avanti Polar Lipids社)を通るフィルター押出の数回のサイクルが実行される。加えて、０．２〜０．１μｍメンブレンを通る無菌条件(層流(laminar)及び無菌のシリンジ、メンブレン及びフラスコ)での押出は、免疫化にそのまま使用できる調製品を生じる。水性懸濁液中のリポソームのサイズ分布及び安定性は、ＤＬＳ  Ｎｉｃｏｍｐ−３８０装置を使用する、動的光散乱レーザーサブミクロン粒子サイズ分析法により決定される（図１７）。
【０１５３】
免疫化のための組換ペプチドの混合物は、脂質フィルムの水和の段階で、リポソーム組成物に導入され−ペプチド混合物は、リン酸緩衝食塩水中に溶解され、リポソームベシクルの内側水相として装荷され始める[40]。押出プロセス後、ＳＳＬは、Sephacryl S-200HR及びAkta Prime LCシステム(GE Healthcare社)を使用する、サイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィーにより移行され、かつベシクルの外側に出現した過剰なペプチドは、分離されかつカラム内に留まる。その後ＳＳＬ懸濁液は、必要ならば透析により濃縮され、免疫化にそのまま使用できるワクチン組成物を含む。
【０１５４】
ＳＳＬワクチン組成物の皮下投与は、ＭＨＣリポソームに対し中性の範囲外の(out of neutral)ｅｎｖ組換ペプチドの誘発の遅延のために、免疫化作用を阻害することがある。このプロセスは、感熱性リポソーム−ｔＳＳＬを用いて、調節することができる。ｔＳＳＬは、特別な量的組合せのメンブレン成分、又はリポソーム膜を温度がある温度、通常４０〜４５℃に到達すると直ちに融解するようにする、いくつかの追加のリン脂質成分を伴い、他のものから識別される。局所的加熱時に、感熱性リポソームは、破壊され、それらの内容物−ペプチド−は、その組織の外側に負荷される。例えば通常の立体的に安定化されたリポソームは、融解温度約５４〜５８℃を有し、脂質フィルム形成のための乾燥重量混合物は、ホスファチジルコリン：コレステロール：ジステアロイル−ホスファチジルエタノール−アミン−ＰＥＧからなり、その比は、ＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−４００について６．８５：２．７５：０．４（最大０．５）モル／％であり、及びより長いＰＥＧ鎖ＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００について６．９：２．９５：０．１５（最大０．２５）モル／％である。感熱性リポソームを調製するために、本研究者らは、いくつかのパラメータを変動することができ、第一に混合物中の脂質の比を、各々、コレステロール量を２７〜２９モル／％から３０〜３５モル／％に増加し、ＰＥ−ＰＥＧの割合を２〜５モル／％から１．５〜２モル／％へ減少する。リポソーム膜を柔らかくし、かつそれらの融解温度をより低い温度にシフトする別法は、より短い脂肪酸尾部のリン脂質を使用することであり、これは：ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ、Ｃ−１４）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、Ｃ−１６）、又はＤＯＰＣの同等部の代わりに、むしろＤＭＰＣ若しくはＤＳＰＣの３０〜４０モル／％である。
【０１５５】
ii）ＳＳＬのＰＥＧ−活性化された基に結合するｅｎｖペプチド；
ｅｎｖ組換ペプチド脂質混合物のためのリポソーム担体の第二の型は、ペプチドの結合のために活性化されたより長いＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００型を表している：ＰＤＰ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＣ、マレイミド（フェニルブチレート）−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＣ、ｐ−ニトロフェニル（カルボニル）−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＣ。これらの脂質混合物中のＰＥＧ−２０００の濃度は、１．５〜２モル／％を超えてはならず、その理由は比較的長いポリエチレングリコールは、比較的短い型よりもより効果的にリポソーム安定性を増大し、かつ同じ濃度は、ワクチン放出には余りにも硬いリポソーム膜及び脂質の有害な生分解を生じるからである。
【０１５６】
ＰＥＧの活性化された遠位端[38]とのペプチド複合の第一の方法は、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）中の脂質２５〜４０ｍｇにつきペプチド１ｍｇの比での、リポソーム懸濁液中のペプチドアミノ基による、ｐ−ニトロフェニル（カルボニル）−ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ反応である（総懸濁液量は５．５〜９ｍｌ）。反応は、ＮａＯＨ添加により、ｐＨを７．５〜８．５に上昇することにより終結され、かつ特別なペプチド処理は不要である。
【０１５７】
マレイミド−ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥとの方法[39]は、Ｔｒａｕｔｔ試薬（２−イミノチオラン）による先行するペプチドチオール化が必要である。ＩＣＯ−２５  １ｍｇを、Ｎａ3ＢＯ3及びＥＤＴＡを含有するホウ酸緩衝液に溶解し、次に乾燥Ｔｒａｕｔｔ試薬５０〜７０μｇを添加し、この混合物を、室温で１時間インキュベーションし、次に過剰なタンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）との同時緩衝液交換を伴う限外濾過により洗浄する。サイズ及び装荷された細胞増殖抑制剤濃度が均質であるリポソーム画分は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ(GE Healthcare社, スウェーデン)での液体クロマトグラフィーにより抽出される。
【０１５８】
ＰＤＰ−ＰＥＧ−ＰＥ含有リポソームに結合するＯＤＮ−ＨＩＶ  ｅｎｖペプチド
ＰＤＰ−ペプチド誘導体の調製のために、ペプチドを、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に、濃度１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、次にこのペプチド溶液に、ＤＭＦ中の２５ｍＭスクシンイミジル−４−ＭＰＢ（ＳＭＰＢ）溶液を、モル比２０：１（ＳＭＰＢ：ペプチド）までゆっくり添加し、室温で３０分間インキュベーションする。未結合のＳＭＰＢは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ  ＭＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．７）緩衝液中での、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲカラム(GE-Healthcare社)を使用するゲル濾過により、比較的低いpHで除去される。
【０１５９】
ＰＥＧ鎖の遠位端のピリジルジチオ基は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の最終濃度２０ｍＭまでの添加、及び室温で３０分間のインキュベーションにより、減少される。ＤＴＴは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ  ＭＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．７）で溶離されたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上のリポソームの通過により、上昇したｐＨ中で分離される。チオール化されたリポソームは、ＭＰＢ−ペプチド誘導体と共に、ペプチド／脂質比が約１：１０００で、室温で一晩インキュベーションされる。未結合のペプチドは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）により、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲカラムを通りリポソームが通過する、ゲル濾過により除去される。
【０１６０】
ＣＯＯＨ−ＰＥＧ−ＰＥ−リポソームに結合するＯＤＮ−ＨＩＶ  ｅｎｖペプチド
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４〜５．５）中のＨＯ２Ｃ−ＰＥＧ−ＰＥ−含有リポソームの懸濁液の３００ｕｌ（合計３ｕｍｏｌ脂質）へ、水中の０．２５Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド溶液の１２０ｕｌ、及び０．２５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド１２０ｕｌを添加する。この混合物を、室温で１０分間インキュベーションし、１Ｍ  ＮａＯＨによりｐＨ７．５に中和する。ＨＩＶ  ｅｎｖペプチド１５μＭを、活性化されたリポソームへ添加し、この反応混合物を、穏やかに攪拌しながら、４℃で８時間インキュベーションする。ペプチド−結合したリポソームを、ＰＢＳにより予め平衡とされたＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲカラム(GE Healthcare社)上の未結合のペプチドから分離される。空隙容量で溶離されたペプチド-結合したリポソームのピーク画分を収集し、プールし、必要ならば食塩水により必要な容量に希釈する。
【０１６１】
リポソーム組成物ＤＯＰＣ／ＤＯＧＳ−ＮＴＡ−Ｎｉ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００において、ｅｎｖペプチドを、ＰＣ尾部とＰＥＧ−ＤＳＰＥ尾部の間に定着(settle)されたニッケル−修飾されたリン脂質に結合することも可能である。しかし、ＤＯＧＳ−ＮＴＡは、粘膜及び他のＢ−リンパ球免疫応答を刺激することはわかっているにもかかわらず、ｅｎｖペプチドのＰＥＧ位置の下側への隠蔽は、その抗−ＨＩＶ特異性を弱める。この方法は以下に説明されている。
【０１６２】
この複合反応において、組換（Ｈｉｓ）６−ペプチド（１０〜８０ｕｇ）は、総容量５０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）中で、リポソーム（１μＭ）と一緒に、回転振盪しながら、３７℃又は室温で３０分間インキュベーションされる[17]。リポソームへのタンパク質複合は、複合反応の終了時の遊離タンパク質の量の測定により、間接的に定量される。未結合のタンパク質は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００遠心装置を用いて分離される。遠心分離の前に、このリポソーム−ペプチド混合物は、リン酸緩衝液中に最終容量２５０μｌに希釈される。１２，０００ｇで１３分間の遠心分離後、濾液２０ｕｌを、遊離タンパク質含量について、ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡアッセイを用いてアッセイされる。リポソームに結合したペプチドの量は、使用される総量から遊離タンパク質の量を減算することにより、決定される。このリポソームに結合しているＨｉｓ−タンパク質の間接定量法は、リポソーム−結合したペプチドが、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲゲルマトリックス(GE Healthcare社)において、遊離タンパク質のサイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィーによる分離後、ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡアッセイを用い直接定量される直接法と比較し、同じ結果を生じる。
【０１６３】
iii）可能性のある構築体（ｐＮＬ３−４、ＩＲＩＶなど）のビロソーム上に提示されたｅｎｖペプチド
小型のウイルス及びそれらで構築されたベクターは、ｅｎｖペプチドＨＩＶワクチンの発現及び提示に使用することが可能である。ビロソームは、予防ワクチン技術にあまり適してはおらず、かつＨＩＶ−特異的免疫ブースト作用は、いずれの場合にも、ワクチン送達のＳＳＬ技術がもたらすものよりも低い。このワクチン組成物は、小型ウイルス表面−ビロソーム−上に発現されたＨＩＶ  ｅｎｖペプチドのみを含み、ウイルスベクターにおいて送達されたｅｎｖペプチドの遺伝子は含まない。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスのような大型ウイルスは、ビロソームの候補としては良好ではなく、その理由はこれらは、それらのキャプシド上に発現された数百のペプチドを有し、かつこれらは投与後に特異的よりもむしろより非特異的に免疫応答をブーストするからである。ビロソームベクターは、欠損ＨＩＶ誘導体ｐＮＬ３−４、マラリア及びＡ型肝炎ワクチンにより有効性が証明されたインフルエンザベクターＩＲＩＶ、麻疹ウイルス誘導体、種々の脳炎病原体のαウイルス、黄熱病ウイルスのベクター及びその他の可能性のある変種を含む。
【０１６４】
本発明のアジュバント及びアジュバント-含有ワクチン組成物が有用に投与される宿主動物は、霊長類に加え、齧歯類又は他の哺乳類を含む。ＢａｌｂＣマウスは、初回免疫応答ブーストバリデーションに使用された。アジュバント装荷している２種のリポソームは、個別に使用され、かつ種々の割合で一緒に混合されることができる。
【０１６５】
３週齢のＢａｌｂＣマウスに、該動物にとって純粋なペプチドの投与量２０〜５０μｇが皮下的に免疫化され、乾燥脂質ＭＷのための懸濁液中のアジュバント濃度は、５ｍｇ／ｍｌである。各群には、７〜８匹又はそれよりも多いマウスが含まれる。この免疫化は、開始時固形食を摂食しかつ体重１１〜１４ｇである動物について３週齢マウスで初回、５週齢になった後２週間２回目、マウスが９週齢になった時１ヶ月後に３回目が実行される。組換ｇｐ１２０及びそのドメイン並びに組換ｇｐ４１及びそのエクトドメインは、個別に又は一緒に組成物を完成するために使用される。ＨＩＶ  ｅｎｖペプチド抗体の力価は、ｒ−ｇｐ１２０（ｇｐ１１０、ｇｐ１６０）変種、ファージミドライブラリーバイオパンニングに関して先に使用されたｒ−ｇｐ４１、更には未変性のＨＩＶタンパク質混合物で、ＥＬＩＳＡにより測定される。ＥＬＩＳＡ試験は、最後の皮下投与後、３日目、１４日目及び２８日目に行われる。結果の一部は、実施例４に示されている。
【０１６６】
二つの主要な結論を、マウスの実験から引き出すことができる：
１．ＢａｌｂＣマウスにおいて皮下接種される、ｇｐｌ２０及び全てのその誘導体、組換体に加え未変性のペプチドは、高度に免疫原性であり、かつ強力でＨＩＶ−特異的及び延長された免疫応答を誘発する。同じ様式で接種された組換ｇｐ４１及びそのエクトドメイン変種は、数倍低い力価の特異的モノクローナル及びポリクローナル抗体を誘発する。Ａｂ力価の同じ状況が、ＨＩＶ−感染したヒト血清中において、及びファージＭ１３上のＡｂライブラリー提示において認められる。患者において、この状況は、ウイルスエンベロープ中のｇｐ１２０下流(under)のｇｐ４１の内側位置で提供される。しかし、組換タンパク質免疫化による同じ現象は、ＨＩＶ予防ワクチン開発のために、ｇｐ１２０配列及びその組換体の代表の正しいアイデンティフィケーションが重要であり、かつｇｐ４１は、複合ペプチド「材料」として使用されるが、その配列の異形はあまり重要でないという本発明者らの立場を証明する。
【０１６７】
２．リポソームアジュバント組成物は、ペプチドのみの免疫化よりもより長い期間免疫応答ブーストを提供することができ、かつ同時に即時型免疫毒性反応を縮小することができ、その結果ＨＩＶ−予防的反応発生のために、ペプチド投与量を増加することができる。
本発明のアジュバント及びワクチン組成物に関する投与量の割合及び好適な剤形は、通常の抗体力価決定技術及び通常の生体有効性／生体適合性プロトコールの使用により、並びに特定のアジュバント型、望ましい治療作用、及び望ましい生体活性期間に応じて、過度な実験をすることなく、当業者により容易に決定されることができる。本ワクチン及びその成分の投与は、皮下注射、経皮、経真皮、鼻腔内及び筋肉内投与などの非経口法を含んでよい。
【０１６８】
開発されたＨＩＶ予防ワクチンは、ＨＩＶ−抗体ライブラリーがその選択及び作製のために試行された感染者のコホートのＨＩＶ変異株から蔓延した感染症に対するその活性に関して、個別化された医薬品に至る途中の工程である。本ワクチンは、単独のかつて開発された組成物として、蔓延しているＨＩＶ感染症に対する普遍的武器として働くことはできない。しかし２５年間にわたるＨＩＶ研究及びＡＩＤＳとの戦いで集められた全てのＨＩＶ疫学の知識は、その実践的開発に対し多くの支持をもたらすであろう。
【実施例】
【０１６９】
実施例１：下記電気泳動データは、ＨＩＶ−特異的ＳｃＦｖ抗体の断片作製を含む、ヒト組換ＩｇＧファージミドライブラリーの段階を図示している（ファージディスプレイ技術）：
ＰＣＲ−Ｉ結果−対応する部分的Ｃκ又はＣＬ断片を伴う、κ−及びλ−可変部。
ゲルから切り出した関心対象のバンドには、矢印で印をつけている。
略号：１ＶＬ−部分的ＣＬ断片を伴うλ可変部
２ＶＬ−部分的ＣＬ断片を伴うλ可変部
１ＶＫ−部分的Ｃκ断片を伴うκ可変部
１ａ−１０−種々のプライマー対
−ＶＫ−ＰＣＲ陰性対照
１００ｂｐ−GeneRuler(商標)100bp DNAラダー(Fermentas社)
GeneRuler(商標)、100bp DNAラダー
【化１】
2010540674.tif 000017
【０１７０】
ＰＣＲ−Ｉ結果−部分的Ｃκ断片を伴うκ可変部、ゲルから切り出した関心対象のバンドには、矢印で印をつけている。
１ａ−１０−種々のプライマー対１ＶＫ（２ＶＫ、３ＶＫ、４ＶＫ）
部分的Ｃκ断片を伴うκ可変部
１００ｂｐ−GeneRuler(商標)100bp DNAラダー(Fermentas社)
【化２】
2010540674.tif 000018
【０１７１】
ＰＣＲ−Ｉ結果−部分的ＣＬ断片を伴うλ可変部、並びに部分的ＣＨ１断片を伴うＩｇＭ及びＩｇＧ重（Ｈ）鎖可変部、ゲルから切り出した関心対象のバンドには、矢印で印をつけている。
１ＶＬ−ライブラリー１、部分的ＣＬ断片を伴うλ可変部
１ＶＨＭ（２ＶＨＭ、３ＶＨＭ、４ＶＨＭ）−部分的ＣＨ１断片を伴う重鎖可変部（ＩｇＭ）
１ＶＨＧ（２ＶＨＭ、３ＶＨＭ、４ＶＨＭ）−ライブラリー１、２、３、４、部分的ＣＨ１断片を伴う重鎖可変部（ＩｇＧ）
１ａ−１０−種々のプライマー対
−ＶＬ；−ＶＨＧ；−ＶＨＭ−ＰＣＲ陰性対照
１００ｂｐ−GeneRuler(商標)100bp DNAラダー(Fermentas社)
【化３】
2010540674.tif 000019
【０１７２】
ＰＣＲ−ＩＩ結果−（（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒ）3をコードする、追加されたリンカー断片を伴う重（Ｈ）鎖可変部、ゲルから切り出した関心対象のバンドには、矢印で印をつけている。
１ＨＧ（２ＨＧ、３ＨＧ、４ＨＧ）−ライブラリー１、２、３、４、ＩｇＧ  ｃＤＮＡプール由来の重鎖可変部；
１ＨＭ（２ＨＭ、３ＨＭ、４ＨＭ）−ライブラリー１、２、３、４、ＩｇＭ  ｃＤＮＡプール由来の重鎖可変部
１ａ−７ａ−種々のリンカー−含有するプライマー対
−Ｈ−ＰＣＲ陰性対照
【化４】
2010540674.tif 000020
【０１７３】
ＰＣＲ−ＩＩ結果−（（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒ）3をコードする、追加されたリンカー断片を伴うκ−及びλ−可変部、ゲルから切り出した関心対象のバンドには、矢印で印をつけている。
１Ｋ（２Ｋ、３Ｋ）−ライブラリー１、２、３、κ可変部
１Ｌ（２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ）−ライブラリー１、２、３、４、λ可変部
１ａ−８−種々のリンカー−含有するプライマー対
−Ｋ及び−Ｌ−ＰＣＲ陰性対照
１００ｂｐ−GeneRuler(商標)100bp DNAラダー(Fermentas社)
【化５】
2010540674.tif 000021
【０１７４】
ＰＣＲ−ＩＩ結果−（（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒ）3をコードする、追加されたリンカー断片を伴うκ−、λ−、及び重鎖（Ｈ）可変部、関心対象のバンドには、矢印で印をつけている。
１Ｋ（２Ｋ、３Ｋ、４Ｋ）−κ可変部
１Ｌ−ライブラリー１、λ可変部
２ＨＧ（３ＨＧ、４ＨＧ）−ライブラリー２、３及び４、ＩｇＧ  ｃＤＮＡプール由来の重鎖可変部；
３ＨＭ（４ＨＭ）−ライブラリー３及び４、ＩｇＭ  ｃＤＮＡ  プール由来の重鎖可変部
１ａ−８−種々のリンカー−含有するプライマー対
−Ｋ及び−Ｌ−ＰＣＲ陰性対照
１００ｂｐ−GeneRuler(商標)100bp DNAラダー(Fermentas社)
【化６】
2010540674.tif 000022
【０１７５】
集成されたＳｃＦｖ断片のゲル定量。種々のＶH−リンカー−Ｖkappa  ＳｃＦｖ変種（ライブラリー４）
【化７】
2010540674.tif 000023
【０１７６】
ＶH−リンカー−Ｖkappa  ＳｃＦｖ混合物（ライブラリー４由来）の再増幅。ゲルから切り出した関心対象のバンドには、矢印で印をつけている。
κ−１００ｂｐ  ＶH−リンカー−Ｖkappa  ＳｃＦｖ混合物
【化８】
2010540674.tif 000024
【０１７７】
実施例２：組換ＨＩＶ−特異的ライブラリーに関する特異性定量の結果
ａ）ＨＩＶ−１陽性血清による組換ｍＡｂクローンのＥＬＩＳＡ結果
【化９】
2010540674.tif 000025
【０１７８】
ｂ）ウイルスペプチドＡ４５５選択されたファージライブラリー由来の３８種のファージモノクローンのＥＬＩＳＡ結果(SigmaPlot 10.0統計解析)
【化１０】
2010540674.tif 000026
【０１７９】
ｃ）組換ｇｐ１１０−、ｇｐ１６０選択されたファージライブラリー由来の２６種のファージモノクローンのＥＬＩＳＡ結果(SigmaPlot 10.0統計解析)
【化１１】
2010540674.tif 000027
【０１８０】
実施例３：ＨＩＶ  ｅｎｖペプチドの変動性
ＨＩＶは、その極めて高いペプチド配列の異原性により、他の病原性ウイルスから区別される。変更された配列ペプチドの３Ｄ構造は、非常に異なっており、かつ多くの場合、これらの変更は、ウイルスの抵抗性表現型の出現後の同じ変異により引き起こされる。従ってモノクローナル抗体ライブラリーを使用し、頻繁に合致する変種を収集し、かつ表面ウイルスタンパク質の組換型を得ることが可能である。亜型Ａ及びＢに関するＨＩＶ  ｅｎｖペプチド配列の共通の異形の一部は、以下に示されている。変動性のアミノ酸は青色で、保存性のアミノ酸は赤色で印をつけている。これらの配列のいくつかは、本発明者らの実験室で以前に行われた。
【０１８１】
【表９Ａ】
2010540674.tif 000028
【表９Ｂ】
2010540674.tif 000029
【表９Ｃ】
2010540674.tif 000030
【表９Ｄ】
2010540674.tif 000031
【表９Ｅ】
2010540674.tif 000032
【表９Ｆ】
2010540674.tif 000033
【表９Ｇ】
2010540674.tif 000034
【表９Ｈ】
2010540674.tif 000035
【表９Ｉ】
2010540674.tif 000036
【表９Ｊ】
2010540674.tif 000037
【表９Ｋ】
2010540674.tif 000038
【表９Ｌ】
2010540674.tif 000039
【表９Ｍ】
2010540674.tif 000040
【表９Ｎ】
2010540674.tif 000041
【表９Ｏ】
2010540674.tif 000042
【表９Ｐ】
2010540674.tif 000043
【表９Ｑ】
2010540674.tif 000044
【表９Ｒ】
2010540674.tif 000045
【０１８２】
実施例４：動物の免疫化の予備的結果(SigmaPlot 10.0統計解析)
体重１１〜１４ｇの３週齢のＢａｌｂＣマウスを、該動物にとって純粋なペプチドの投与量２０〜５０μｇで皮下により免疫化し、脂質濃度ＭＷは５ｍｇ／ｍｌであった。この免疫化は、３週齢マウスにおいて行い、それらが５週齢になった後２週間２回目を、マウスが９週齢になった時１ヶ月後に３回目を行った。組換ｇｐ１２０は、組換ｇｐ４１エクトドメインよりも、平均で５倍高いレベルの免疫応答を誘発した。患者の血清から単離されたヒトポリクローナル抗体を、同濃度の組換ｇｐ１２０及びｇｐ４１のＥＬＩＳＡ染色に使用した場合にも、特異抗体力価の同じ差異が認められた。
【化１２】
2010540674.tif 000046
【０１８３】
参考文献
【表１０Ａ】
2010540674.tif 000047
【表１０Ｂ】
2010540674.tif 000048
【表１０Ｃ】
2010540674.tif 000049
【表１０Ｄ】
2010540674.tif 000050
【図１】
2010540674.tif 000051
【図２Ａ】
2010540674.tif 000052
【図２Ｂ】
2010540674.tif 000053
【図２Ｃ】
2010540674.tif 000054
【図３】
2010540674.tif 000055
【図４】
2010540674.tif 000056
【図５】
2010540674.tif 000057
【図６】
2010540674.tif 000058
【図７】
2010540674.tif 000059
【図８】
2010540674.tif 000060
【図９Ａ】
2010540674.tif 000061
【図９Ｂ】
2010540674.tif 000062
【図９Ｃ】
2010540674.tif 000063
【図９Ｄ】
2010540674.tif 000064
【図９Ｅ】
2010540674.tif 000065
【図９Ｆ】
2010540674.tif 000066
【図９Ｇ】
2010540674.tif 000067
【図９Ｈ】
2010540674.tif 000068
【図９Ｉ】
2010540674.tif 000069
【図９Ｊ】
2010540674.tif 000070
【図９Ｋ】
2010540674.tif 000071
【図９Ｌ】
2010540674.tif 000072
【図１０ＡＢ】
2010540674.tif 000073
【図１０Ｃ】
2010540674.tif 000074
【図１０Ｄ】
2010540674.tif 000075
【図１１Ａ】
2010540674.tif 000076
【図１１Ｂ】
2010540674.tif 000077
【図１２】
2010540674.tif 000078
【図１３】
2010540674.tif 000079
【図１４】
2010540674.tif 000080
【図１５】
2010540674.tif 000081
【図１６】
2010540674.tif 000082
【図１７】
2010540674.tif 000083
【配列表】
2010540674000001.app
【国際調査報告】
2010540674.tif 000084
2010540674.tif 000085
2010540674.tif 000086
2010540674.tif 000087