(57)【要約】  本発明は、全般に、種々の形態の充実性腫瘍およびリンパ腫の治療におけるヒトＩＬ−１８の組み合わせの使用に関する。特に、本発明は、（１）ヒトＩＬ−１８と、癌細胞の表面上において発現される抗原に対するモノクローナル抗体の組み合わせ、および（２）ヒトＩＬ−１８と化学療法剤の組み合わせに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）担体と組み合わせたヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物、および（ｉｉ）癌細胞の表面上において発現される抗原に対するモノクローナル抗体を患者に個別投与する工程を含む、必要とする患者において癌を治療する方法であって、該抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を有し、かつ該抗体が抗ＣＤ２０抗体ではないところの方法。
【請求項２】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物およびモノクローナル抗体の投与が同時である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物およびモノクローナル抗体の投与が逐次であり、ここに、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）が最初に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物および抗体の投与が逐次であり、モノクローナル抗体が最初に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗原が、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＡＸＬ−１、ＦＧＦＲ、インテグリン受容体、ＣＥＡ、ＣＤ４４、およびＶＥＧＦＲからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原がＨＥＲ−２であり、モノクローナル抗体がＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
癌が、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＭＭ、他の白血病、卵巣癌、乳癌、肺癌、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、神経膠芽腫、および他の脳腫瘍、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、黒色腫、腎細胞癌、ならびに皮膚癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）担体と組み合わせたヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物、および（ｉｉ）化学療法剤を患者に個別投与する工程を含む、必要とする患者において癌を治療する方法。
【請求項９】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物および化学療法剤の投与が同時である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物および化学療法剤の投与が逐次であり、ここに、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）が最初に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物および化学療法剤の投与が逐次であり、ここに、化学療法剤が最初に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
化学療法剤が、ドキシル、トポテカン、ＤＮＡ改変剤、カルボプラチン、代謝拮抗剤、ゲムシタビン、細胞分裂を阻害する薬剤、ビンクリスチン、抗血管新生剤、およびパゾパニブからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
癌が、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＭＭ、他の白血病、卵巣癌、乳癌、肺癌、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、神経膠芽腫、および他の脳腫瘍、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、黒色腫、腎細胞癌、ならびに皮膚癌からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
化学療法剤と組み合わせたヒトＩＬ−１８（配列番号１）を含む組成物を患者に投与する工程を含む必要とする患者において癌を治療する方法であって、これによる治療の結果、患者における長期間にわたる生存および／または癌再発の防止ならびに免疫記憶の誘導がもたらされる方法。
【請求項１５】
化学療法剤が、ドキシル、トポテカン、ＤＮＡ改変剤、カルボプラチン、代謝拮抗剤、ゲムシタビン、細胞分裂を阻害する薬剤、ビンクリスチン、抗血管新生剤、およびパゾパニブからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
癌が、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＭＭ、他の白血病、卵巣癌、乳癌、肺癌、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、神経膠芽腫、および他の脳腫瘍、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、黒色腫、腎細胞癌、ならびに皮膚癌からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
癌細胞の表面上において発現される抗原に対するモノクローナル抗体と組み合わせたヒトＩＬ−１８（配列番号１）を含む組成物を患者に投与する工程を含み、ここに、該抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を有し、かつ該抗体が抗ＣＤ２０抗体ではないところの、必要とする患者において癌を治療する方法であって、これによる治療の結果、患者における長期間にわたる生存および／または癌再発の防止ならびに免疫記憶の誘導がもたらされる方法。
【請求項１８】
抗原が、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＡＸＬ−１、ＦＧＦＲ、インテグリン受容体、ＣＥＡ、ＣＤ４４、およびＶＥＧＦＲからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌が、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＭＭ、他の白血病、卵巣癌、乳癌、肺癌、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、神経膠芽腫、および他の脳腫瘍、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、黒色腫、腎細胞癌、ならびに皮膚癌からなる群
から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、先の２件の米国仮出願である、２００７年７月２６日に出願された米国出願第６０／９５２，００２号、および２００７年３月２３日に出願された米国出願第６０／８９６，８５５号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、全般に、癌を治療するための、癌細胞の表面上において発現されるモノクローナル抗体と組み合わせた、または化学療法剤と組み合わせた、インターフェロン−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）としても知られるＩＬ−１８の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、自然免疫応答および獲得免疫応答の両方において役割を果たす強力なサイトカインである。前臨床試験において、ＩＬ−１８は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるＩＦＮ−γの合成を誘導し、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の細胞溶解活性を増強し、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞のヘルパーエフェクター細胞への分化を促進し、免疫記憶を誘導する。広範なスペクトルにわたる免疫刺激特性に基づき、ＩＬ−１８は、前臨床的な各種の腫瘍モデルにおいて研究されている。単剤療法として用いられるＩＬ−１８の抗腫瘍活性が、免疫原性である腫瘍において観察された。もっとも強力な抗腫瘍効果は、ＭＯＰＣ−３１５形質細胞腫（高度に免疫原性である腫瘍）の進行性腫瘍（＞１００ｃｍ３）モデルにおいて観察された。腫瘍は通常、非免疫原性であるので、前臨床研究の焦点は、ＩＬ−１８のモノクローナル抗体または化学療法剤との組み合わせ療法に当てられた。これらの研究により、異なる腫瘍殺滅機構を有する２種類の異なる薬剤を組み合わせると、相乗的な抗腫瘍活性がもたらされるという利益が示された。
【０００４】
活性ヒトＩＬ−１８は、１５７アミノ酸残基を含有する。ＩＬ−１８は、Ｔ細胞および脾臓細胞によるインターフェロン−γ生成の誘導、ＮＫ細胞の殺滅活性の増強、および未感作ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化の促進を包含する強力な生物学的活性を有する。加えて、ヒトＩＬ−１８は、ＧＭ−ＣＳＦの生成を増強し、ＩＬ−１０の生成を低減する。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、すべての免疫応答の中心的な調節要素である。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、２つのサブセットであるＴｈ１およびＴｈ２に分かれる。各サブセットは、異なるサイトカインを分泌する能力により定義される。興味深いことに、分化のもっとも強力な誘導物質は、サイトカイン自身である。未感作前駆体からＴｈ２細胞への発達は、ＩＬ−４によって誘導される。ＩＬ−１８の発見以前においては、ＩＬ−１２が主要なＴｈ１誘導性サイトカインであると考えられていた。
【０００５】
Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−２、インターフェロン−γ、およびＴＮＦ−βを分泌する。Ｔｈ１サイトカインの代名詞であるインターフェロン−γは、マクロファージに直接に作用してその殺菌活性および食細胞活性を増強する。結果として、活性化マクロファージは、細胞内病原体および腫瘍細胞を効果的に破壊することができる。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を生成し、これらは、Ｂ細胞が抗体産生細胞へと発達する一助となることによって作用する。まとめると、Ｔｈ１細胞が主に細胞媒介性免疫の一因となり、一方、Ｔｈ２細胞は体液性免疫の一因となる。
【０００６】
広範なスペクトルにわたる免疫刺激特性に基づき、ＩＬ−１８は、前臨床的な各種の腫瘍モデルにおいて研究されている。単剤療法として用いられるＩＬ−１８の抗腫瘍活性が、免疫原性である腫瘍において観察された。最も強力な抗腫瘍効果は、ＭＯＰＣ−３１５形質細胞腫（高度に免疫原性である腫瘍）の進行性腫瘍（＞１００ｃｍ３）モデルにおいて観察された。該モデルでは、約３０日間にわたるネズミＩＬ−１８の毎日の投与（５ｍｇ／Ｋｇ）の結果、再現可能な腫瘍の退縮および治癒がもたらされた。もとの腫瘍による再感作の結果として腫瘍の拒絶がもたらされたことは、免疫記憶の誘導を示唆した。該モデルにおける細胞性免疫の関与についてのさらなる証拠は、進行性ＭＯＰＣ−３１５腫瘍を有する重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて実施された実験において、ＩＬ−１８による同様のスケジュールを用いたところ該腫瘍が退縮しなかったことから得られる。ＩＬ−１８介在性細胞性免疫に対するさらなる裏付けはまた、対照マウスおよびＩＬ−１８治療マウスにおいて確立されたＭＯＰＣ−３１５腫瘍に対して実施された免疫組織化学からも得られる。これにより、ＩＬ−１８治療動物では、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、活性化マクロファージ、および樹状細胞からなる細胞浸潤物が、対照と比べて増大することが示された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＩＬ−１８で治療された動物由来のＰＢＭＣまたは脾臓細胞が、腫瘍に対するＮＫおよびＣＴＬ細胞毒性を示した。加えて、無傷Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド経路が、抗腫瘍応答に有益であると思われる。
【０００７】
リツキシマブ（Rituximab）は、ヒトＩｇＧ１定常領域に融合したヒトＣＤ２０抗原を認識するマウス抗原結合部位からなるキメラモノクローナル抗体である。単剤としてのリツキシマブは、無痛性ＮＨＬにおいて有意な活性を有する。再発性または不応性の無痛性ＮＨＬに罹患する１６６例の患者を対象とする単一群によるピボタル臨床試験では、全般的奏功率が４８％で、完全寛解（ＣＲ）率が６％であった（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、第１６巻、２８２５〜２８３３頁（１９９８））。無痛性ＮＨＬに罹患し過去に治療を受けていない患者において、リツキシマブ療法は、６４〜７３％の全般的奏功率および１５〜２６％のＣＲ率を有する（Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈら、Ｂｌｏｏｄ、第９５巻、３０５２〜３０５６頁（２０００）；Ｃｏｌｏｍｂａｔら、Ｂｌｏｏｄ、第９７巻、１０１〜１０６頁（２００１））。さらに、複数の無作為化第ＩＩＩ相試験では、従来の化学療法へのリツキシマブの追加により、ＮＨＬ患者の生存が改善されることが示されている（Ｍａｒｃｕｓら、Ｂｌｏｏｄ、第１０５巻、１４１７〜１４２３頁（２００５）；Ｍａｒｃｕｓら、Ｂｌｏｏｄ、第１０４巻、３０６４〜３０７１頁（２００４）；Ｈｉｄｄｅｍａｎｎら、Ｂｌｏｏｄ、第１０６巻、３７２５〜３７３２（２００５）；Ｆｅｕｇｉｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、第２３巻、４１１７〜４１２６頁（２００５））。しかしながら、化学療法による高度の毒性のために、リツキシマブの単剤療法が、依然として無痛性リンパ腫患者における選択肢として考えられている。
【０００８】
リツキシマブの抗腫瘍活性を増強する方法を決定し、その有効性を改善する研究が進行中である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるリツキシマブの有効性には、いくつかの機構が寄与しうる。リンパ腫細胞表面上におけるＣＤ２０へのリツキシマブの結合により、アポトーシスまたはプログラム細胞死をもたらす細胞内シグナル伝達経路を始動することができる（Ｓｈａｎら、Ｂｌｏｏｄ、第９１巻、１６４４〜１６５２頁（１９９８）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、第９９巻、１３１４〜１３１９頁（２００２））。さらに、リツキシマブは、補体分子種を活性化し、補体依存性細胞溶解を引き起こすことができる（Ｃｒａｇｇら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、１０４５〜１０５２頁（２００３）；Ｍａｎｃｈｅｓら、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、９４９〜９５４頁（２００３））。しかしながら、蓄積される証拠によれば、リツキシマブの投与後における腫瘍細胞の除去では、ＡＤＣＣが主要な役割を果たすことが示唆される（Ｍａｎｃｈｅｓら、前出；Ｇｏｌａｙら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、第８８巻、１００２〜１０１２頁（２００３）；Ｃｌｙｎｅｓら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、第６巻、４４３〜４４６頁（２０００））。抗体の定常（Ｆｃ）領域が、ＮＫ細胞または単球／マクロファージ系細胞など、エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＣが始動する。
【０００９】
ヒトＢ細胞リンパ腫のマウスモデルにおいて、Ｆｃ受容体の活性化を欠くマウスでは、リツキシマブの有効性が無効化された。これに対し、阻害性Ｆｃ受容体を欠くマウスでは、モノクローナル抗体療法が増強された。Ｆｃ受容体保有エフェクター細胞が、該モデルにおけるリツキシマブの有効性にとって重要であった。ヒトにおける主要な活性化Ｆｃ受容体はＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）であり、これは、ＮＫ細胞および単球により発現される。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子の位置１５８における遺伝子多型（フェニルアラニン対バリン）が、リツキシマブへの応答と相関することが示されている。１５８ＶＶのホモ接合性遺伝子型が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＩｇＧのヒトＮＫ細胞へのより強力な結合および同細胞によるＡＤＣＣの始動と関連し（Ｋｏｅｎｅら、Ｂｌｏｏｄ、第９０巻、１１０９〜１１１４頁（１９９７）；Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第６４巻、４６６４〜４６６９頁（２００４））、また、リツキシマブ療法後におけるより高い奏功率とも関連する（Ｗｅｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、第２１巻、３９４０〜３９４７頁（２００３）；Ｃａｒｔｒｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、第１０４巻、２６３５〜２６４２頁（２００４））。これらのデータは、ＮＫ細胞を介するＡＤＣＣが、リンパ腫患者におけるリツキシマブ療法の有効性にとって重要であるという仮説を裏付ける。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
リツキシマブの有効性を改善する１つの戦略は、ＮＫ細胞および単球／マクロファージ系細胞を包含するＦｃ受容体保有エフェクター細胞の増殖および／または活性化を引き起こすことのできるサイトカインを投与することである。第Ｉ相臨床試験により、リツキシマブは、リンパ腫患者に対して、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて安全に投与できることが示されている（Ｒｏｓｓｉら、Ｂｌｏｏｄ、第１０６巻、２７６０頁（抄録２４３２頁）（２００５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、第１６巻（付録５）、ｖ６８頁（抄録１０４頁）（２００５）；Ａｎｓｅｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、第９９巻、６７〜７４頁（２００２）；Ｅｉｓｅｎｂｅｉｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第１０巻、６１０１〜６１１０頁（２００４）；Ｇｌｕｃｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第１０巻、２２５３〜２２６４頁（２００４）；Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｔｍａｔｏｌ．、第１１７巻、８２８〜８３４頁（２００２））。２２〜７９％の全般的な客観的奏功率および５〜４５％の完全寛解率が、これらの試験で観察された。加えて、絶対ＮＫ細胞カウントおよびｅｘ  ｖｉｖｏでのＡＤＣＣ活性などのバイオマーカーが、奏功率と相関した。これらの試験の大半は、再発性および不応性の疾患、ならびに侵襲性のリンパ腫亜型（ＤＬＢＣＬおよびマントル細胞リンパ腫）に罹患する患者を主に包含した。これらの好ましくない患者集団における相対的に高い客観的奏功率は、サイトカインとリツキシマブとの組み合わせが、Ｂ細胞リンパ腫におけるさらなる研究に値することを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
一態様において、本発明は、（ｉ）担体と組み合わせたヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物、および（ｉｉ）癌細胞の表面上において発現される抗原に対するモノクローナル抗体を患者に同時または逐次に個別投与する工程を含む、必要とする患者において癌を治療する方法であって、該抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を有し、さらに、該抗体が抗ＣＤ２０抗体ではない方法に関する。
【００１２】
該第１の方法は、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、およびＩＧＦ−１Ｒ、ＡＸＬ−１、ＦＧＦＲ、インテグリン受容体、ＣＥＡ、ＣＤ４４、ＶＥＧＦＲからなる群から選択される抗原に対するモノクローナル抗体を含む組成物を投与することを含みうる。別の態様では、抗原がＨＥＲ−２であり、モノクローナル抗体がＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ（登録商標）である。加えて、該方法は、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＭＭ、他の白血病、卵巣癌、乳癌、肺癌、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、神経膠芽腫、および他の脳腫瘍、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、黒色腫、腎細胞癌、ならびに皮膚癌からなる群から選択される癌を治療することを含む。
【００１３】
第２の態様において、本発明は、（ｉ）担体と組み合わせたヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物、および（ｉｉ）化学療法剤を患者に同時または逐次に個別投与する工程を含む、必要とする患者において癌を治療する方法に関する。本方法における化学療法剤は、ドキシル、トポテカン、ＤＮＡ改変剤（例えば、カルボプラチン）、代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン）、細胞分裂を阻害する薬剤（例えば、ビンクリスチン）、および抗血管新生剤（例えば、パゾパニブ）からなる群から選択されうる。本方法において、治療される癌は、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、乳癌、肺癌、肉腫、膀胱癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、ウィルムス腫瘍、神経膠芽腫、結腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、黒色腫、および腎細胞癌からなる群から選択される。
【００１４】
別の態様において、本発明は、癌の治療に使用される、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物、および癌細胞の表面上において発現される抗原に対するモノクローナル抗体であって、該抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を有し、かつ、該抗体が抗ＣＤ２０抗体ではないところの抗体を提供する。ｈＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物および抗体は、所望により同時または逐次に患者に個別投与してもよい。
【００１５】
別の態様において、本発明は、患者における癌の治療のための医薬の製造における、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物、および癌細胞の表面上において発現される抗原に対するモノクローナル抗体の使用であって、該モノクローナル抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を有し、かつ、該抗体が抗ＣＤ２０抗体ではないところの使用を提供する。ｈＩＬ−１８ポリペプチドと抗体とは、所望により同時または逐次に患者に個別投与してもよい。
【００１６】
別の態様において、本発明は、患者における癌の治療のために癌細胞の表面上において発現される抗原に対するモノクローナル抗体と組み合わせて用いられる医薬の製造における、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物の使用であって、顔モノクローナル抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を有し、かつ該抗体が抗ＣＤ２０抗体ではないところの使用を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、患者における癌の治療のためにヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）との組み合わせを含む組成物で用いられる医薬の製造における、癌細胞の表面上において発現される抗原に対するモノクローナル抗体の使用であって、該モノクローナル抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を有し、かつ該抗体が抗ＣＤ２０抗体ではないところの使用を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、癌の治療に使用される、（ｉ）ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物、および（ｉｉ）化学療法剤を提供する。ｈＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物と化学療法剤とは、所望により同時または逐次に患者に個別投与してもよい。
【００１９】
別の態様において、本発明は、癌の治療のための医薬の製造における、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む組成物、および化学療法剤の使用を提供する。ｈＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）と化学療法剤とは、所望により同時または逐次に患者に個別投与してもよい。
【００２０】
別の態様において、本発明は、癌を治療するための組成物のために化学療法剤と組み合わせて用いられる医薬の製造における、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）の使用を提供する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、癌の治療においてヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）との組み合わせを含む組成物で用いられる医薬の製造における、化学療法剤の使用を提供する。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、それを化学療法剤または癌細胞の表面上において発現される抗原に対するモノクローナル抗体と組み合わせたヒトＩＬ−１８（配列番号１）を含む組成物を患者に投与する工程を含む、必要とする患者において癌を治療する方法であって、該抗体が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を有し、さらに該抗体が抗ＣＤ２０抗体ではない方法を提供し、これにより、治療の結果、患者における長期間にわたる生存および／または癌再発の防止ならびに免疫記憶の誘導がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、天然ヒトＩＬ−１８（配列番号１）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、ネズミＩＬ−１８（配列番号２）のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、ヒトＢ細胞リンパ腫ネズミモデルにおける、ＲＩＴＵＸＡＮＲと組み合わせたｍＩＬ−１８（配列番号２）の抗腫瘍活性を示す図である。
【図４】図４は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍＲを用いて図３に由来するデータをグラフ表示および解析するときの統計学的有意性を示す図である。具体的に、この図では、移植後第１９日における腫瘍体積を比較する。
【図５】図５は、ヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるネズミＩＬ−１８（配列番号２）／ＲＩＴＵＸＡＮＲの組み合わせによる移植後第２５日における腫瘍体積を示す図である。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるネズミＩＬ−１８（配列番号２）／ＲＩＴＵＸＡＮＲの組み合わせによる腫瘍成長体積の中央値および平均を示す図である。
【図７】図７は、ヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるネズミＩＬ−１８（配列番号２）／ＲＩＴＵＸＡＮＲの組み合わせによる移植後第２７日における腫瘍体積を、いずれかの薬剤単独との対比で示す図である。
【図８】図８は、ヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるネズミＩＬ−１８（配列番号２）／ＲＩＴＵＸＡＮＲの組み合わせによる移植後第２７日における腫瘍体積を、いずれかの薬剤単独との対比で示す図である。
【図９】図９は、ドキソルビシンと組み合わせたｍＩＬ−１８（配列番号２）による治療後のＥＬ−４  Ｔ細胞生存を、ドキソルビシン単独およびＩＬ−１８単独の両方との対比で示す図である。
【図１０】図１０は、図９に示されたデータの生存確率プロットを示す図であり、ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫モデルにおける投与された薬剤用量と抗腫瘍活性との間の関係を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫モデルにおけるドキソルビシン／ＩＬ−１８の組み合わせによる移植後第１３日におけるＰＢＬ（図１１Ａ）および脾臓細胞（図１１Ｂ）のＦａｃｓ解析を、ｍＩＬ−１８（配列番号２）単独およびドキソルビシン単独の両方との対比で示す図である。
【図１２】図１２は、ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫モデルにおけるドキソルビシン／ｍＩＬ−１８（配列番号２）の組み合わせによる治療の２１時間後におけるＮＫ細胞毒性アッセイを、ＩＬ−１８単独およびドキソルビシン単独の両方との対比で示す図である。
【図１３】図１３は、ＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ００５試験のＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＰＣ３１５ネズミ形質細胞腫の成長に対する、ｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法の効果を示す図である（データは、平均＋／−ＳＤとして示す）。
【図１４】図１４は、ＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ００５試験のＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＰＣ３１５ネズミ形質細胞腫の成長に対する、ｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法の効果を示す図である（データは、中央値＋／−ＳＤとして示す）。
【図１５】図１５は、ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＰＣ３１５ネズミ形質細胞腫の成長に対する、ｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとの組み合わせ療法による移植後第２４日における腫瘍体積の統計学的な差を示す図である（データは、平均＋／−ＳＤとして示す）。
【図１６】図１６は、ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ００５マウス形質細胞腫の成長に対する、ｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとの組み合わせ療法による移植後第２４日における腫瘍体積を示す図である（データは、中央値＋／−ＳＤとして示す）。
【図１７】図１７は、ＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ０３試験のＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＰＣ３１５ネズミ形質細胞腫の成長に対する、ｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法の効果を示す図である（データは、平均＋／−ＳＤとして示す）。
【図１８】図１８は、ＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ０３試験のＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＰＣ３１５ネズミ形質細胞腫の成長に対する、ｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法の効果を示す図である（データは、中央値＋／−ＳＤとして示す）。
【図１９】図１９は、ＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ０３試験におけるｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法に由来する、ＳＣＩＤマウスにおける移植後第２４日におけるＭＯＰＣ３１５マウス形質細胞腫体積を示す図である（データは、平均＋／−ＳＤとして示す）。
【図２０】図２０は、ＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ０３試験におけるｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法に由来する、ＳＣＩＤマウスにおける移植後第２４日におけるＭＯＰＣ３１５マウス形質細胞腫体積を示す図である（データは、中央値＋／−ＳＤとして示す）。
【図２１】図２１は、接種後第２４日の同系ネズミＣｏｌｏ２６結腸癌モデルにおける、ｍＩＬ−１８（配列番号２）と５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とによる組み合わせ療法の効果を示す図である（データは、平均＋／−ＳＤとして示す）。
【図２２】図２２は、接種後第２４日の同系ネズミＣｏｌｏ２６結腸癌モデルにおける、ｍＩＬ−１８（配列番号２）と５−ＦＵとによる組み合わせ療法の効果を示す図である（データは、中央値＋／−ＳＤとして示す）。
【図２３】図２３は、接種後第２４日の同系ネズミＣｏｌｏ２６結腸癌モデルにおける、ｍＩＬ−１８（配列番号２）と５−ＦＵとによる組み合わせ療法の効果を示す図であり、ＩＬ−１８単独および５−ＦＵとの組み合わせの間の統計学的有意性をより良好に示すため、対照群を除外する（データは、平均＋／−ＳＤとして示す）。
【図２４】図２４は、同系ネズミＣｏｌｏ２６結腸癌モデルにおける、ｍＩＬ−１８（配列番号２）と５−ＦＵとによる組み合わせ療法の効果を示す図である（データは、中央値＋／−ＳＤとして示す）。
【図２５】図２５は、同系ネズミＣｏｌｏ２６結腸癌モデルにおける、ｍＩＬ−１８（配列番号２）と５−ＦＵとによる組み合わせ療法の効果を示す図である（データは、平均＋／−ＳＤとして示す）。
【図２６】図２６は、接種後第２４日の同系ネズミＣｏｌｏ２６結腸癌モデルにおける、ｍＩＬ−１８（配列番号２）と５−ＦＵとによる組み合わせ療法の効果を示す図である（データは、カプラン−マイヤー生存曲線として示す）。
【図２７】図２７は、マウス腎癌の進行型同系モデルにおける移植後第３２日の腫瘍成長に対する、ｍＩＬ−１８（配列番号２）と、ＶＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲおよびｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼの阻害剤であるパゾパニブ（ＧＷ７８６０３４）とによる組み合わせ療法の効果を示す図である（ｃ−Ｋｉｔ受容体は、細胞外のリガンド結合ドメインと細胞内のキナーゼドメインとからなる、ＩＩＩ型チロシンキナーゼ受容体に属する。ｃ−Ｋｉｔ受容体は、多種多様な正常組織および新生物組織において発現される）。
【図２８】図２８は、マウス腎癌の進行型同系モデルにおける移植後第３２日の腫瘍成長に対する、ｍＩＬ−１８（配列番号２）とパゾパニブ（ＧＷ７８６０３４）とによる組み合わせ療法の効果を示す図であるが、対照群を除外している。このグラフでは、ＩＬ−１８単独またはパゾパニブ単独による単剤療法に対する組み合わせの統計学的有意性が比較される。
【図２９】図２９は、ＥＬ−４腫瘍生存マウスまたは未感作対照に由来する細胞の適合移植を受けた、ＩＬ−２により治療された免疫欠損マウスの体重増加を示す図である。
【図３０】図３０は、ＥＬ−４腫瘍接種後においてＩＬ−２療法を受ける、Ｐｆｐ／Ｒａｇ２レシピエントマウスの生存百分率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
腫瘍は通常非免疫原性であるため、前臨床研究の焦点は、ＩＬ−１８の化学療法剤またはモノクローナル抗体との組み合わせ療法に当てられた。各々が異なる腫瘍殺滅機構を有する２種類の異なる薬剤の組み合わせにより、相乗的な抗腫瘍活性がもたらされる。ＩＬ−１８による組み合わせ療法の４つの実施例を以下に示す。
【００２５】
実施例１では、ヒトＢ細胞リンパ腫における、ＲＩＴＵＸＡＮＲと組み合わせたＩＬ−１８の使用に焦点が当てられる。該試験の目的は、ヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＩＬ−１８とＲＩＴＵＸＡＮＲとの組み合わせにより、ＩＬ−１８またはＲＩＴＵＸＡＮＲ単独による単剤療法を上回る有益性が得られるかどうかを調べることにある。リツキシマブは、ヒトＣＤ２０抗原およびヒトＩｇＧ１定常領域を認識するネズミ抗原結合部位からなる、承認済みのキメラモノクローナル抗体である。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるリツキシマブの有効性の一因となる作用機序は、ＣＤ２０陽性で、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）で、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）であるリンパ腫細胞への結合時におけるアポトーシスの誘導を含む。蓄積される証拠によれば、リツキシマブの投与後における腫瘍細胞の除去では、ＡＤＣＣが主要な役割を果たすことが示唆される。抗体の定常（Ｆｃ）領域が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、または単球／マクロファージ系細胞など、エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＣが始動する。ＩＬ−１８はＡＤＣＣエフェクター細胞を増強し活性化するので、これら２種類の試薬の組み合わせは、優れた抗腫瘍活性をもたらす相乗作用を示すことが期待される。
【００２６】
リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮＲ）は、ヒトＩｇＧ１定常領域に融合したヒトＣＤ２０抗原を認識するネズミ抗原結合部位からなるキメラモノクローナル抗体である。ＣＤ２０抗原は、悪性および非悪性のＢリンパ球上で発現される。単剤としてのＲＩＴＵＸＡＮＲは、ＮＨＬにおいて有意な活性を有する。ＲＩＴＵＸＡＮＲは市販されている。
【００２７】
ドキソルビシン（アドリアマイシン）は、市販される化学療法剤であり、乳癌、リンパ腫、肉腫、肺癌、膀胱癌、甲状腺、肝癌、胃癌、ウィルムス腫瘍、神経膠芽腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、および卵巣癌の治療に用いられる。
【００２８】
実施例２は、ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫モデルにおける、ＩＬ−１８とドキソルビシンとの組み合わせを示す。該試験の目的は、同系ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫モデルにおいて、ＩＬ−１８とドキソルビシンとの組み合わせを探索し、ＩＬ−１８またはドキソルビシン単独による単剤療法を上回る組み合わせ療法の有益性を示すことにあった。該同系モデルにより、宿主免疫細胞に対するＩＬ−１８による免疫刺激活性の完全な有益性が示される。２種類の試薬は極めて異なる作用機序を有するので、互いに補足し合うことが可能であり、その結果、抗腫瘍活性の上昇がもたらされる。化学療法剤が、腫瘍抗原に対する直接の細胞傷害作用、フラグメント化、および変調をもたらすのに対し、ＩＬ−１８は、エフェクター細胞を増強し活性化する結果、優れた抗原提示および相乗的な抗腫瘍活性をもたらすことが示唆される。
【００２９】
組成物中におけるＩＬ−１８のモノクローナル抗体との組み合わせ、例えば、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮＲ）を伴うＩＬ−１８により、進行段階腫瘍モデル（ＳＣＩＤマウス異種移植モデル）における相乗的な抗腫瘍活性が示された。リツキシマブは、ヒトＣＤ２０抗原およびヒトＩｇＧ１定常領域を認識するマウス抗原結合部位からなる、承認済みのキメラモノクローナル抗体である。単剤としてのリツキシマブは、無痛性非ホジキンリンパ腫において有意な活性を有する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるリツキシマブの有効性の一因となる作用機序は、ＣＤ２０陽性で、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）で、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）であるリンパ腫細胞への結合時におけるアポトーシスの誘導を含む。実施例１に示す前臨床データにより、ＩＬ−１８とリツキシマブとの組み合わせは、相乗的な抗腫瘍活性をもたらすことが示される。リツキシマブは、ＣＤ２０を発現するヒト腫瘍細胞のみに結合するので、抗腫瘍活性の評価は、ＳＣＩＤマウス異種移植モデルに限定された。ＩＬ−１８とリツキシマブとによる抗腫瘍活性および相乗作用は、ＩＬ−１８およびネズミＣＤＣに応答してＳＣＩＤマウスにおいて活性化されるＮＫ細胞に起因すると考えられる。ＳＣＩＤマウスはＴ細胞を活性化する能力を有さないので、潜在的なＣＴＬの増強および記憶の生成という免疫的装備をこのモデルで調べることはできない。
【００３０】
組成物におけるＩＬ−１８と化学療法剤との組み合わせは、癌の各種形態を治療するのに有益な治療的効果を有する可能性が高い。例えば、実施例２により、ＩＬ−１８とドキソルビシンとの組み合わせが同系進行型ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫モデルにおいて、相乗的な抗腫瘍活性を有することが示されている。該データは、ＩＬ−１８の作用機序が、優れた抗原提示、抗腫瘍活性において重要な役割を果たす抗腫瘍ＣＴＬ細胞および抗腫瘍ＮＫ細胞の増殖を含むことを示唆する。これらの結果に基づくと、ＩＬ−１８と他の化学療法剤との組み合わせが、腫瘍の退縮、腫瘍の治癒、および免疫記憶の誘導がもたらす可能性が高い。
【００３１】
臨床試験において、ＩＬ−１８単剤療法は、バイオマーカー変化により測定される場合、安全で忍容性が良好であり、生物学的に活性であることが示された。前臨床試験において、ＩＬ−１８単剤療法は、免疫感受性腫瘍モデルのみにおいて作用した。非免疫原性モデルは、ＩＬ−１８を他の抗癌剤と組み合わせた場合に限り、抗腫瘍活性を示した。
【００３２】
組み換えネズミＩＬ−１８（配列番号２）は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、およびＮＫ細胞のほか、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路、およびＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１などのサイトカイン／ケモカインの活性化、ならびに腫瘍内へのエフェクター細胞の浸潤、および免疫記憶の誘導を包含する各種の機序を介する前臨床的な抗腫瘍活性を示している。細胞溶解性Ｔ細胞の誘導、活性化ＮＫ細胞の増殖、および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）において重要な役割を果たす細胞の増殖など、ＩＬ−１８の有益性が本発明者らの前臨床モデルで示されている。
【００３３】
下記の実施例では、ＩＬ−１８と他の臨床的に重要な癌治療との組み合わせが、ヒトＩＬ−１８単剤療法単独よりも優れた抗腫瘍活性の増強をもたらすかどうかを調べた。本出願では、ＩＬ−１８組み合わせ療法の５つの例：（１）ヒトＢ細胞リンパ腫異種移植モデルにおけるＩＬ−１８とＲＩＴＵＸＡＮＲとの組み合わせ、（２）Ｔ細胞リンパ腫同系モデルにおけるＩＬ−１８とドキソルビシンとの組み合わせ、（３）ネズミ形質細胞腫モデルにおけるＩＬ−１８とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとの組み合わせ、ならびに（４）ネズミ結腸腫瘍モデルにおけるＩＬ−１８と５−ＦＵとの組み合わせ、ならびに（５）ネズミ腎癌モデルにおけるＩＬ−１８と、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、およびｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼの阻害剤であるパゾパニブとの組み合わせが例示される。これらの組み合わせのすべてにより、ＩＬ−１８、ＲＩＴＵＸＡＮＲ、ドキソルビシン、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ、５−ＦＵ、またはパゾパニブ単独による単剤療法を上回る有益性が得られた。
【００３４】
モノクローナル抗体との組み合わせにより、腫瘍細胞殺滅のＡＤＣＣ機序の増強に対する可能性が得られる。本出願において開示される前臨床データはこの機序を裏付けており、ｍＩＬ−１８（配列番号２）と組み合わせたＲＩＴＵＸＡＮＲの抗腫瘍活性の増強が示された。いくつかの機序がＲＩＴＵＸＡＮＲの有効性の一因となりうるが、蓄積される証拠によれば、ＲＩＴＵＸＡＮＲの投与後における腫瘍細胞の除去では、ＡＤＣＣが主要な役割を果たすことが示唆される。抗体の定常（Ｆｃ）領域が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または単球／マクロファージ系細胞など、エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体に結合すると、ＡＤＣＣが始動する。ヒトＢ細胞リンパ腫のネズミモデルにおいて、Ｆｃ受容体の活性化を欠くマウスでは、ＲＩＴＵＸＡＮＲの有効性が無効化された（Ｃａｒｔｒｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、第９９巻、７５４〜７５８頁（２００２）；Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第６４巻、４６６４〜４６６９頁（２００４）；Ｋｏｅｎｅら、Ｂｌｏｏｄ、第９０巻、１１０９〜１１１４頁（１９９７）；Ｗｅｎｇら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、第２１巻、３９４０〜３９４７頁（２００３））。かくして、Ｆｃ受容体保有エフェクター細胞が、ＲＩＴＵＸＡＮＲの有効性にとって重要であった。ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）はヒトにおける重要なＦｃ受容体であり、これは、ＮＫ細胞およびマクロファージにより発現される（同上）。実施例１のデータは、ＮＫ細胞介在性ＡＤＣＣが、リンパ腫患者におおけるＲＩＴＵＸＡＮＲ療法の有効性にとって重要であるという仮説を裏付ける。
【００３５】
ＲＩＴＵＸＡＮＲの有効性を改善する１つの有望な戦略は、ＮＫ細胞および単球／マクロファージ系細胞を包含するＦｃ受容体保有エフェクター細胞の増殖および／または活性化を引き起こすことができるＩＬ−１８などのサイトカインを投与することである。実施例１における、ＲＩＴＵＸＡＮＲと組み合わせたＩＬ−１８による前臨床マウス腫瘍モデル試験により、単剤療法を上回る有益性が示された。該モデルでは、ＮＫ機能細胞のみを有するＳＣＩＤ免疫不全マウスへのヒト異種移植が必要とされるため、ＩＬ−１８の完全な有益性を調べることはできなかった。しかしながら、実施例１におけるデータは、これらのＡＤＣＣ  ＮＫエフェクター細胞の増殖により、ＩＬ−１８とＲＩＴＵＸＡＮＲとの組み合わせにおける有益性が示されたことを裏付ける。単剤療法としてのＲＩＴＵＸＡＮＲは、被験最高用量で活性であった。しかしながら、より低用量のＲＩＴＵＸＡＮＲをｍＩＬ−１８（配列番号２）との組み合わせで用いても同様レベルの活性が見られたことは、該モデルがＲＩＴＵＸＡＮＲの機序に対して感受性であること、およびＩＬ−１８により応答が増強されうることを共に示す。ＩＬ−１８の、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＡＸＬ−１、ＦＧＦＲ、インテグリン受容体、ＣＥＡ、ＣＤ４４、ならびにＶＥＧＦＲ、および他の抗血管新生剤などの抗原に対する他のモノクローナル抗体との組み合わせにより、同じ相乗効果が示されると考えられる。実際、ＩＬ−１８の、腫瘍細胞表面で見出され、それに対してモノクローナル抗体が生成される受容体を発現する抗原に対する他のモノクローナル抗体との同様の組み合わせも、同様に作用することがさらに見込まれる。こうした受容体が、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＦｃ受容体を含有し、ＡＤＣＣエフェクター活性に関与する他のいずれかの細胞に結合することが理想的である。
【００３６】
実施例１および２のデータは、抗癌剤とＩＬ−１８との組み合わせにより、２種類の異なる作用機序（１つが腫瘍細胞に対する直接の効果であり、一方、ＩＬ−１８は患者の免疫細胞を増強する能力を有する）がもたらされるので、これらの組み合わせにより臨床的有益性が示される可能性があることを示唆する。これらの２種類の機序は互いに補足し合うことが可能であり、免疫記憶を発生させるＩＬ−１８の能力に起因する長期持続的で優れた抗腫瘍活性がもたらされる可能性がある。総じて、実施例１および２は、ＩＬ−１８と、モノクローナル抗体または化学療法剤の抗腫瘍剤との組み合わせの結果、相乗作用および優れた活性がもたらされることを示す。
【００３７】
ＩＬ−１８の、化学療法剤であるドキソルビシンとの組み合わせにより、ＩＬ−１８単独またはドキソルビシン単独のいずれも上回る優れた抗腫瘍活性が示された。注目すべきことに、実施例２は、ＩＬ−１８のドキソルビシンとの組み合わせにより、ＩＬ−１８治療に応答して増殖する活性化免疫細胞が破壊されなかったことを示す。驚くべきことだが、その反対に、実施例２は、該組み合わせにより、活性化Ｔ細胞および同ＮＫ細胞が増強され、その細胞溶解機能が維持されることを示す。
【００３８】
実施例３は、ＣＤ２０＋  Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に罹患する患者における、リツキシマブと組み合わせたＩＬ−１８の安全性および生物学的活性を評価する、現在進行中の第Ｉ相臨床試験プロトコールである。この試験では、用量を漸増させるＩＬ−１８と組み合わせたリツキシマブの標準的な治療方針を用いて、選択されたバイオマーカー（例えば、活性化ＮＫ細胞）により示される場合の、安全かつ忍容性であり最大の生物学的効果を与える用量を同定する。この試験から選択された用量は、再発性濾胞性リンパ腫患者におけるＩＬ−１８／リツキシマブによる組み合わせの有効性を評価する将来の第ＩＩ相試験で用いられる。転移性黒色腫患者に対する単剤療法として投与された場合における、ＩＬ−１８の良好な安全性および忍容性のプロファイルを踏まえるなら、この試験で組み合わせの最大耐量（ＭＴＤ）に達することはないと予測されるが、この試験では、非ホジキンリンパ腫患者において用量制限毒性が同定される場合のＭＴＤを定めることを目的とする。
【００３９】
実施例４では、ネズミ形質細胞腫（ＭｏＰＣ３１５細胞にＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）をトランスフェクトした）の成長に対する、ヒトＩＬ−１８とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとの組み合わせ療法についての解析およびデータを提示する。データの詳細な解析により、ＩＬ−１８とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法が、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ単独による単剤療法を上回ることが示された。これらのデータに基づくと、ヒトＩＬ−１８は、腫瘍細胞上で発現される抗原に対する他の抗体との療法的組み合わせに有効であると考えられる。
【００４０】
実施例５では、ＩＬ−１８と５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）との組み合わせ療法の有効性を、５−ＦＵ単独またはＩＬ−１８単独による単剤療法と比較して評価する。５−ＦＵは、結腸直腸癌および膵臓癌治療用の第一選択化学療法剤の１つとして現在臨床で用いられるピリミジン類似体である。しかしながら、該化学療法剤は、多岐にわたる重篤な副作用を有し、他の薬剤との組み合わせ療法を用いてその用量を低減する可能性が望ましい。この試験は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるマウス結腸癌Ｃｏｌｏ  ２６の十分に確立された皮下同系モデルで実施された。実施例５における腫瘍体積データについての詳細な解析により、１０μｇのＩＬ−１８と７５μｇの５−ＦＵとによる組み合わせ療法が、腫瘍成長に対して対照群との比較で有意な効果を有する唯一の治療群であることが示された。単剤療法は対照よりも良好な治療効果を示さなかったので、これは、組み合わせ療法（７５μｇ／１０μｇ）が、５−ＦＵ単独またはｍＩＬ−１８単独による単剤療法群を上回ったことを意味する。ＩＬ−１８と組み合わせる他の化学療法剤には、ドキシル、トポテカン、ＤＮＡ改変剤（例えば、カルボプラチン）、代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン）、細胞分裂を阻害する薬剤（例えば、ビンクリスチン）、および抗血管新生剤（例えば、パゾパニブ）などがある。
【００４１】
実施例６では、マウス腎細胞癌モデルにおけるＩＬ−１８と、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、およびｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼの阻害剤であるパゾパニブ（ＧＷ７８６０３４）との組み合わせ療法の有効性についての試験が提供される。ｃ−Ｋｉｔ受容体は、細胞外のリガンド結合ドメインと細胞内のキナーゼドメインとからなる、ＩＩＩ型チロシンキナーゼ受容体に属する。ｃ−Ｋｉｔ受容体は、多種多様な正常組織および新生物組織において発現される。これらのデータは、パゾパニブとＩＬ−１８との組み合わせの結果、各単剤療法単独と比較して統計学的に有意な抗腫瘍活性（相乗作用）がもたらされることを示す。
【００４２】
実施例７は、長期間にわたる生存および腫瘍再発の防止をもたらす記憶誘導剤としてのＩＬ−１８の役割を扱う試験である。該実施例は、ＥＬ−４腫瘍モデルにおける有効性を調べるものであり、ここに、ネズミＩＬ−１８（配列番号２）とドキソルビシンとの組み合わせによりマウスを治療した。生存マウスのリンパ球を移植されたＥＬ−４レシピエントマウスは、未感作の正常ドナーマウスに由来するリンパ球を移植された対照マウスよりも有意に長期間にわたり生存した。データは、生存マウスからの適合移植が、ＥＬ−４腫瘍レシピエントマウスに対して防護的な効果を及ぼしたことを示唆する。これらのデータにより、ＥＬ−４腫瘍生存マウスにおける記憶Ｔ細胞に対する間接的な裏付けが得られる（図２９および図３０）。これは、いずれかの化学療法剤またはｍＡｂとＩＬ−１８との組み合わせを、いずれかの単剤療法よりも優れた癌治療としうる重要な知見である。腫瘍を「異物」として認識して再発を防止することのできる記憶Ｔ細胞の誘導は高度に有益であり、良好な安全性プロファイルを有するＩＬ−１８は任意の潜在的な組み合わせ療法用の薬剤となるであろう。
【００４３】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、ＥＰ０６９２５３６Ａ２、ＥＰ０７１２９３１Ａ２、ＥＰ０７６７１７８Ａ１、およびＷＯ９７／２４４１で開示されている。天然ヒトＩＬ−１８（「ｈＩＬ−１８」）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、インターフェロン−γ誘導性ポリペプチドである。これらは、Ｔ細胞および脾臓細胞によるインターフェロン−γ産生の誘導、ＮＫ細胞の殺滅活性の増強、および未感作ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化の促進を包含する細胞媒介性免疫の誘導において主要な役割を果たす。
【００４４】
本発明によるポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸抽出法、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー法、ホスホセルロースクロマトグラフィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー法、および高速液体クロマトグラフィーを包含するよく知られた方法により、組み換え細胞培養物から回収および精製することができる。細胞内の合成、単離、および／または精製時に該ポリペプチドが変性される場合は、タンパク質のリフォールディングについてのよく知られた技法を用いて、活性な立体配座を再生することができる。活性のヒトＩＬ−１８を精製および作製する方法は、ＷＯ０１／０９８４５５に示されている。
【００４５】
本発明はまた、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）およびこれらの組み合わせを含む医薬組成物も提供する。こうした組成物は、治療的な有効量の化合物を含み、医薬上許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含みうる。こうした医薬担体は、水およびピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、石油、動物、植物、または合成由来の油を含む油など、無菌の液体でありうる。医薬組成物が静脈内投与される場合は、水を担体として用いることができる。例えば、注射溶液用の液体担体としては、生理食塩液ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液もまた用いることができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所望の場合、少量の保湿剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤もまた含有しうる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放製剤などの形態をとりうる。組成物は、トリグリセリドなど従来の結合剤および担体を有する坐剤として調合することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど、標準的な担体を含みうる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」で説明されている。こうした組成物は、多くは精製された形態における治療的な有効量の化合物と共に、適量の担体を含有し、該形態に患者への適正な投与をもたらす。製剤は投与方式に適するものとする。
【００４６】
本発明の一実施形態において、組成物は、ルーチンな手順に従い、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として処方される。典型的に、静脈内投与用の組成物は、無菌で等張性の水性緩衝液中の溶液である。適切な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位における疼痛を和らげるリグノカインなどの局所麻酔剤も含みうる。一般に、成分は、例えば、活性剤の量を表示するアンプルまたは小袋などの密封容器内における乾燥凍結粉末または水を含まない濃縮物として、単位用量形態で個別にまたは一括混合されて供給される。組成物を注入投与する場合、無菌の医薬グレードの水または生理食塩液を格納する注入ボトルにより分注することができる。組成物を注射投与する場合、無菌の注射用水または生理食塩液のアンプルを供給して、投与前に成分を混合することができる。
【００４７】
したがって、ポリペプチドは、薬剤の製造において用いることができる。本発明の医薬組成物は、非経口投与用の溶液または凍結乾燥粉末として調合することができる。粉末は、使用前に、適切な希釈剤または他の医薬上許容される担体の添加により還元することができる。液体製剤は、緩衝済みで等張性の水溶液でありうる。適切な希釈剤の例は、通常の等張性生理食塩液、水または酢酸ナトリウム緩衝液もしくは酢酸アンモニウム緩衝液中に５％の標準的なデキストロースである。こうした製剤は、非経口投与にとりわけ適切であるが、経口投与に用いることもでき、吸入用の用量計量型吸入器または噴霧器中に格納することもできる。こうした医薬組成物には、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシアガム、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムなどの賦形剤を添加することが望ましい場合がある。
【００４８】
別法では、ポリペプチドは、経口投与用にカプセル化することも、錠剤化することも、乳剤またはシロップに調製することもできる。医薬上許容される固体または液体の担体を添加して、組成物を増強または安定化することもでき、組成物の調製を容易化することもできる。固体の担体は、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、滑石、ペクチン、アカシアガム、寒天、またはゼラチンを含む。液体の担体は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、生理食塩液、および水を含む。担体はまた、単独またはロウを伴うモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの徐放用材料も含みうる。固体担体の量は様々であるが、用量単位当たり約２０ｍｇ〜約１ｇである。医薬製剤は、錠剤形態の場合、適切ならば、粉砕、混合、造粒、および圧縮、硬質ゼラチンカプセル形態の場合、粉砕、混合、および充填を含む従来の製薬法に従い作製される。液体の担体を用いる場合、製剤は、シロップ、エリキシル剤、乳剤、または水性もしくは非水性の懸濁液の形態である。こうした液体製剤は、経口（ｐ．ｏ．）で直接にまたは軟質ゼラチンカプセル中に充填して投与することができる。
【００４９】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、医薬上許容される担体中における有効成分としての有効量のポリペプチドを含有する医薬組成物として調製することができる。本発明の組成物では、注射用に用意された形態における、生理的ｐＨで緩衝済みのポリペプチドを含有する水性懸濁液または水溶液を用いることができる。非経口投与用組成物は通常、本発明のポリペプチド溶液または水性担体などの医薬上許容される担体中で溶解されたそのカクテルを含む。例えば、０．４％生理食塩液、０．３％グリシンなど、各種の水性担体を用いることができる。これらの溶液は無菌であり、一般に粒状物質を含まない。これらの溶液は、従来のよく知られた滅菌法（例えば、濾過法）により滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整剤または緩衝剤など、生理的条件を近似するのに必要な医薬上許容される補助物質を含有しうる。こうした医薬製剤中における本発明によるポリペプチドの濃度は広い範囲、すなわち、重量で約０．５％未満から、通常約１％または少なくとも約１％を経て、１５または２０％までの範囲で変化することが可能であり、選択される具体的な投与方式に従い、流体容量、粘稠度などに主に基づき選択される。
【００５０】
かくして、本発明の筋肉内注射用医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明によるポリペプチドとを含有するように調製することができる。同様に、本発明の静脈内注入用医薬組成物は、約２５０ｍＬの滅菌リンゲル液と、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明によるポリペプチドとを含有するように調製することができる。非経口投与用組成物の実際の調製法は当業者によく知られるかまたは明らかであろうし、例えば、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ」、第１５版、ペンシルベニア州、イーストン、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ社においてより詳細に説明されている。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、医薬製剤において調製される場合、単位用量形態で存在していてもよい。適切な治療有効用量は、当業者により容易に決定することができる。こうした用量は、適切な場合、奏功期間中において医師により適切であるとして選択された適切な時間間隔で反復投与することができる。加えて、所望により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイを用いて、最適な用量範囲を同定する一助とすることもできる。製剤において用いられる正確な用量はまた、投与経路および疾患または障害の重症度にも依存し、医師の判断および各患者の状況に従い決定されるものとする。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルによる試験系から導出された用量−反応曲線から外挿することができる。
【００５２】
ポリペプチドの場合、患者へと投与される用量は、典型的に、患者体重当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。患者へと投与される用量は、患者体重当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、または代替的に、患者体重当たり１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇでありうる。一般に、ヒトポリペプチドは、異種ポリペプチドに対する免疫応答のために、他の種に由来するポリペプチドよりも、ヒト体内における半減期が長い。こうして、より低用量のヒトポリペプチドおよびより少ない回数の投与が可能となることが多い。さらに、本発明によるポリペプチドの投与用量および投与回数は、例えば、脂質化などの改変によりポリペプチドの取り込みおよび組織透過（例えば、脳内への）を増強する工程を介して低減することができる。
【００５３】
本発明はまた、本発明による医薬組成物の１種類または複数種類の成分により満たされた１つまたは複数の容器を含む医薬用パックまたはキットも提供する。所望の場合、こうした（１つまたは複数の）容器には、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形態での公示書であって、ヒトへの投与についての製造、使用、または販売に対する該機関による承認を反映する公示書を添付することができる。本発明の別の実施形態において、キットには、具体的な適応に対する治療についての用量要件を満たすのに必要な適切な数の容器を用意することができる。
【００５４】
別の実施形態では、化合物または組成物を、ベシクル、特に、リポソームにより送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４９巻、１５２７〜１５３３頁（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、「ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＩＮＦＥＣＴＩＯＵＳ  ＤＩＳＥＡＳＥ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ」、Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、ニューヨーク、Ｌｉｓｓ社、３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書、３１７〜３２７頁を参照されたい；同書全体を参照されたい）。
【００５５】
さらに別の実施形態では、化合物または組成物を制御放出系により送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いることができる（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、第１４巻、２０１頁（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、第８８巻、５０７頁（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３２１巻、５７４頁（１９８９）を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を用いることができる（「ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ」、  ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、フロリダ州、ボカラトン、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社（１９７４）；「ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＤＲＵＧ  ＢＩＯＡＶＡＩＬＡＢＩＬＩＴＹ，  ＤＲＵＧ  ＰＲＯＤＵＣＴ  ＤＥＳＩＧＮ  ＡＮＤ  ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ」、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、ニューヨーク、Ｗｉｌｅｙ社（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２３巻、６１頁（１９８３）を参照されたい；Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２２８巻、１９０頁（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、第２５巻、３５１頁（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、第７１巻、１０５頁（１９８９）もまた参照されたい）。さらに別の実施形態では、制御放出系を治療標的、すなわち、脳に近接して配置し、これにより、全身用量の一部分のみを必要とすることが可能である（Ｇｏｏｄｓｏｎ、「ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ  ＲＥＬＥＡＳＥ」、前出、第２巻、１１５〜１３８頁（１９８４）を参照されたい）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４９巻、１５２７〜１５３３頁（１９９０））による総説で説明されている。
【００５６】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）は、いずれかの適切な体内経路により投与することができ、必要に応じて、例えば、１日間〜約３週間にわたり毎日１〜３回から、毎週１回または隔週で１回までの回数で反復投与することができる。別法では、該ペプチドを変化させて電荷密度を低減し、これにより、経口バイオアベイラビリティーを可能とすることができる。治療用量および治療期間は、本発明による分子のヒト循環中における相対的存続時間に関係し、患者の治療される状態および全般的な健康に応じて、当業者による調整が可能である。
【００５７】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む本発明の化合物または医薬組成物の有効量をヒト患者へ投与することによる、治療、阻害、および予防の方法を提供する。本発明の一実施形態では、化合物が実質的に精製されている（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。投与処方および投与方法は、化合物が上記で説明されたポリペプチドを含む場合に用いることができ、本明細書の以下で説明される投与製剤および投与経路から、さらに適切な投与製剤および投与経路を選択することができる。
【００５８】
リポソーム中への封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現する能力を有する組み換え細胞、受容体を介するエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６２巻、４４２９〜４４３２頁（１９８７）を参照されたい）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など、各種のデリバリーシステムが知られており、本発明による化合物の投与に用いることができる。導入法は、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路を含むがこれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好適な経路、例えば、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚による内膜（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介する吸収により投与することができ、他の生物活性剤と共に投与することができる。投与は、全身投与または局所投与でありうる。加えて、本発明の医薬化合物または医薬組成物は、脳室内注射およびくも膜下注射を含む任意の適切な経路により中枢神経系に導入することが望ましい場合があり、脳室内注射は、例えば、オンマヤリザーバーなどの容器に取り付けた脳室内カテーテルにより容易化することができる。例えば、吸入器または噴霧器およびエアゾール剤を有する製剤の使用により、肺内投与もまた用いることができる。
【００５９】
本発明は、その精神または不可欠の属性から逸脱しない限りにおいて他の具体的な形態で実施することができ、したがって、本発明の範囲を示すものとしては、前出の明細書または後続の実施例ではなく、付属の特許請求の範囲を参照するものとする。
【００６０】
用語集
以下の定義は、前出の本明細書で頻繁に用いられる一部の用語を理解しやすくする目的で提供される。
【００６１】
本明細書で用いられる「抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」および「抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能」とは、いずれも、これにより、免疫系のエフェクター細胞が、特異的な抗体が結合した標的細胞を活発に溶解する細胞媒介性免疫機序に関する。ＡＤＣＣとは、それを介して体液性免疫応答の一部としての抗体が作用して感染を制限し封じ込めうる機序の１つである。本来のＡＤＣＣはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により媒介されるが、別法のＡＤＣＣは好酸球により用いられ、蠕虫として知られる一部の寄生虫を殺滅する。ＡＤＣＣは、その先行する抗体反応への依存により、適応的免疫応答の一部である。
【００６２】
典型的なＡＤＣＣは、ＮＫ細胞の活性化に関与し、ＮＫ細胞表面上のＦｃ受容体による、抗体に被覆された感染細胞の認識に依存する。Ｆｃ受容体は、病原体に感染した標的細胞の表面に結合するＩｇＧなどの抗体のＦｃ（定常）部分を認識する。ＮＫ細胞の表面上に存在するＦｃ受容体は、ＣＤ１６またはＦｃγＲＩＩＩと呼ばれる。ＩｇＧのＦｃ受容体に結合すると、ナチュラルキラー細胞は、標的細胞内に侵入し、アポトーシスを始動することにより細胞死を促進するＩＦＮ−γなどのサイトカイン、ならびにパーフォリンおよびグランザイムなどの細胞傷害性顆粒を放出する。このＡＤＣＣエフェクター機能は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による応答と同様であるが、これには依存しない。
【００６３】
本明細書で用いられる「担体」という用語は、それと共に治療物質が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。
【００６４】
本明細書で用いられる「完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」という用語は、治療に応答した癌のすべての徴候の消滅を意味する。当業者は、「完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」を「完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）」とも呼ぶ。以下の実施例で用いられるモデルにおいて、動物が「完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」を達成するとは、測定可能な腫瘍が測定できない段階へと退縮したことを意味する。言い換えれば、動物は「治癒」し、健康と考えられることを意味する。
【００６５】
「単離」とは、「人間の手により」天然状態から変化した、すなわち、それが自然において生じる場合、その本来の環境から変化したもしくは除去された、またはその両方が生じたことを意味する。例えば、該用語が本明細書で用いられる通り、生体内に天然で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態のその共存する少なくとも１種類の細胞物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されている。さらに、形質転換、遺伝子操作、または他の任意の組み換え法により生体内に導入されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが前記生体（その生体が生きている場合も生きていない場合もあるが）内に依然として存在する場合であっても、「単離」されている。
【００６６】
本明細書で用いられる「医薬（pharmaceutical）」という用語は、本発明の獣医学的適用を含む。「治療的な有効量」という用語は、選択された状態を緩和するのに有用である治療作用物質の量を指す。
【００６７】
本明細書で用いられる「医薬上許容される」という用語は、動物、およびより具体的にはヒトにおける使用について、連邦政府または州政府の規制機関により承認されているか、または米国薬局方または他の一般的に認められた薬局方中に収載されていることを意味する。
【００６８】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチド同配体（isostere）により互いに連結された２個以上のアミノ酸を含む任意のポリペプチドを指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと称する短鎖、および一般にタンパク質と称する長鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０種類の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含みうる。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの天然の過程によるか、または当技術分野でよく知られる化学修飾法により修飾されたアミノ酸配列を含む。こうした修飾については、基本的な教科書およびより詳細な専門書のほか、膨大な研究文献で十分に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド中の任意の箇所で生じうる。同じ種類の修飾が、所与のポリペプチドの複数の部位において、同じまたは様々な程度で存在しうることを理解されたい。また、所与のポリペプチドは、多くの種類の修飾も含みうる。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状でありえ、分枝を伴うかまたは伴わずに円環状でありうる。円環状、分枝状、および分枝円環状のポリペプチドは、翻訳後の自然過程から生じる場合もあり、合成法により作製される場合もある。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化など、転移ＲＮＡを介するタンパク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化を含む（例えば、「ＰＲＯＴＥＩＮＳ―ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ」、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、ニューヨーク、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３年；Ｗｏｌｄ，Ｆ．、「Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」、１〜１２頁、「ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８３年；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、第１８２巻、６２６〜６４６頁、１９９０年；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第６６３巻、４８〜６２頁（１９９２）を参照されたい）。
【００６９】
本明細書で用いられる「（１匹または複数匹の）生存動物」という用語は、腫瘍に関連する自然死により死亡することがなかったか、または腫瘍体積が非人道的に巨大な所定のサイズに達することにより安楽死させられることがなかったか、または薬剤毒性関連の理由により安楽死させられることがなかった（１匹または複数匹の）動物を意味する。
【実施例】
【００７０】
生物学的方法／実施例
実施例１：ヒトＢ細胞リンパ腫ネズミモデルにおけるＩＬ−１８とＲＩＴＵＸＡＮＲとの組み合わせ療法のための実験プロトコール
ヒトＩＬ−１８（配列番号１）は、エシェリヒア・コリ非病原性株において発現されるヒトインターロイキン−１８の組み換え成熟形態である。ＩＬ−１８は、一次構造がＩＬ−１βおよびＩＬ−１のトレフォイル型サブファミリーと極めて密接に関連する、１８Ｋｄの非グリコシル化単量体である。マウスおよびヒトのＩＬ−１８  ｃＤＮＡは、１９２アミノ酸および１９３アミノ酸からなる前駆体タンパク質（それぞれ、配列番号２および１）をコードする。ｐｒｏ−ＩＬ−１８は、その生物学的活性を媒介するために、カスパーゼによる生物活性成熟タンパク質（１５７アミノ酸）へのプロセシングを必要とする。ヒトＩＬ−１８とマウスＩＬ−１８との間の相同性は６５％である。以下に概観される前臨床試験では、ＩＬ−１８の完全な免疫潜在能力を解析しうるｉｎ  ｖｉｖｏにおける同系システムを提供するため、マウスＩＬ−１８（配列番号２）を用いた。
【００７１】
本試験は、Ｔ細胞およびＢ細胞を共に欠く、異系交配の雌ＳＣＩＤホモ接合マウス（ＩＣＲ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）において実施された。近親交配株よりも異系交配株を用いることの利点は、異系交配ＩＣＲ  ＳＣＩＤ株が、Ｔ細胞およびＢ細胞の漏出（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）を示さないことである（１０〜１２月齢のマウスであっても）。
【００７２】
もとは３歳のバーキットリンパ腫患者に由来する、ヒトラモスＢ細胞リンパ腫株（ＡＴＣＣカタログ、ＣＲＬ  １５９６）をマウスに注射した。腫瘍の１：１０のホモジネートを、マウス１匹当たり０．５ｍｌの用量で６〜８週齢のマウスに接種した。腫瘍体積は毎週２〜３回測定し、マウスは治療群に無作為に分配し、該群が同等の腫瘍体積分布を有するようにした。各群の腫瘍体積中央値が８０〜１５０ｍｍ３に達したとき（腫瘍接種後第１２日）に、治療を開始した。加えて、設定した限界を超える容量を有する腫瘍を増殖させたマウスは、試験から除外した。
【００７３】
第１の試験では、治療群（ｎ＝６）に、対照群（治療なし）、３種類のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）静脈内単剤療法群（それぞれ、毎週２回１２．５、２５、および５０μｇ／匹）、ｍＩＬ−１８皮下単剤療法群（毎日１回１００μｇ／匹）、および各群が毎日１回１００μｇ／匹のＩＬ−１８皮下投与と、それぞれ、１２．５、２５、または５０μｇ／匹のＲＩＴＵＸＡＮＲ静脈内投与とを受ける、３種類の組み合わせ療法群を含めた。
【００７４】
第２の試験において、投与は、毎日１回のスケジュールにおける１００μｇ／匹のｍＩＬ−１８（配列番号２）と、毎日４または３回のスケジュールにおける２５および１２．５μｇのＲＩＴＵＸＡＮＲとからなった。統計学的有意性を測定するのにより良好な標本数を得るため、動物数をｎ＝１２まで増やした。腫瘍体積は、ベニヤ製カリパスを用いて、毎週２〜３回測定した。
【００７５】
ヒトＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＩＬ−１８とＲＩＴＵＸＡＮＲとによる組み合わせ療法では、ＩＬ−１８またはＲＩＴＵＸＡＮＲ単独による単剤療法を上回る有益性が得られる。以下に詳述される２つの実験により、本モデルにおける組み合わせ療法の統計学的に有意な有益性が示される。
【００７６】
図３に示す第１の実験では、高用量のＲＩＴＵＸＡＮＲ（１００μｇ／回）により単剤療法としての強力な抗腫瘍活性が示されたが、低用量（１２．５μｇ／回）のＲＩＴＵＸＡＮＲは活性を有さなかった。マウスＩＬ−１８（配列番号２）は、単剤（１００μｇ／回）としての活性を有さなかった。しかし、より低用量のＲＩＴＵＸＡＮＲと組み合わせると、ｍＩＬ−１８（配列番号２）は、相加的／相乗的活性を示した（１００μｇのｍＩＬ−１８（配列番号２）と組み合わせた１２．５μｇ／回のＲＩＴＵＸＡＮＲ）。
【００７７】
ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍＲを用いてデータをグラフ表示および解析するときの統計学的有意性を以下の図４および図５に示す。これらのグラフのうちの第１のグラフである図４では、移植後第１９日において腫瘍体積を比較する。統計学的解析では、非治療対照群と比較されたすべての治療群における腫瘍成長の有意な低下（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＜ｐ＜０．００１）が示された。第２のグラフである図５では、組み合わせ療法の方が、単剤療法単独よりも有効（統計学的に有意、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）であったことが示される。
【００７８】
第２の実験では、動物数を増加させる（ｎ＝１２）ことにより、組み合わせ療法に応答して、より良好な統計学的に有意な相加的／相乗的抗腫瘍活性がもたらされた。図６Ａおよび６Ｂのグラフは、腫瘍成長容量の中央値および平均を表わす。本試験は、腫瘍移植後第２７日に解析した。本試験は進行中であり、腫瘍体積の中央値が２０００ｍｍ３に達したときに終了する（ＡＣＵＣプロトコール）。しかし、移植後第２７日におけるデータ解析である図７および８は、ＲＩＴＵＸＡＮＲ単独（２５μｇ／匹）またはｍＩＬ−１８（配列番号２）単剤療法単独（１００μｇ／匹）と比較して、組み合わせ療法（２５／１００μｇ／匹）により治療したマウスでは腫瘍体積の統計学的に有意な減少がみられることを示す。
【００７９】
この前臨床データは、ＩＬ−１８とリツキシマブとの組み合わせの結果、相乗的な抗腫瘍活性がもたらされることを示す。リツキシマブは、被験最高用量での単剤療法としては活性であった。しかし、より低用量のリツキシマブをマウスＩＬ−１８（「ｍＩＬ−１８」）と組み合わせて用いたところ、同様のレベルの活性が見られたことは、本モデルがリツキシマブに対して感受性であり、該応答がＩＬ−１８により増強されうることを示す。マウスＩＬ−１８は、おそらく、ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣ活性を増強することによりリツキシマブ活性を増強した。ＳＣＩＤマウスはＢ細胞応答およびＴ細胞応答を共に欠くので、ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞活性を介して抗腫瘍応答を増強している。
【００８０】
加えて、非ヒト霊長動物に対するＩＬ−１８の投与により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮＫ細胞および単球の活性化がもたらされ、単球上におけるＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ）の上方調節がもたらされた（Ｈｅｒｚｙｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、第２０巻、３８〜４８頁（２００２））。ＳＣＩＤマウスモデルにおいてＩＬ−１８をＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）と組み合わせて用いる場合にもまた相乗的な抗腫瘍活性が観察されたことは、ＩＬ−１８がＮＫ細胞活性を介してＡＤＣＣ活性を上昇させているという仮説を裏付ける。
【００８１】
実施例２：ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫におけるＩＬ−１８とドキソルビシンとの組み合わせのための実験プロトコール
雌Ｃ５７／ＢＬ／６マウスにおいて試験を実施した。全般的なプロトコールとしては、Ｃ５７／ＢＬマウスに、０．２ｃｃのＥＬ−４株細胞を腹腔内注射した。ＥＬ−４マウスＴリンパ腫細胞は、１０％ＦＣＳを伴うＲＰＭＩ中で増殖させた。すべての動物は、食物および水を不断に与えられる試験群当たり６または７匹ずつに無作為化した。ＥＬ−４細胞は、第０日に回収し、カウントし、５×１０５個のＥＬ−４リンパ腫細胞を腹腔内移植した。動物は、第３日に６または７匹ずつの治療群に無作為化した。移植後第３日および第１０日にドキソルビシンを静脈内投与した。ｍＩＬ−１８（配列番号２）は、第３〜１６日に皮下投与した。毒性および死亡について、動物を毎日観察した。
【００８２】
大まかな観察では、すべての動物が、投与スケジュールおよび投与レベルを十分に忍容した。第１６日にすべての投与を終了し、第１７．５日にビヒクル群中央値数の死亡が生じた。移植後第１６〜１８日には、すべてのビヒクル群マウスが死亡した。寿命の延伸は、試験群／ビヒクル群−１×１００％により計算した。ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫におけるｍＩＬ−１８（配列番号２）のドキソルビシンとの組み合わせ療法では、生存期間の中央値および寿命の延伸に関してデータを解析した。
【００８３】
ｍＩＬ−１８（配列番号２）とドキソルビシンとによる組み合わせ療法に応答する寿命の延伸を、ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫を有する雌Ｃ５７／Ｂｌ／６マウスの同系腫瘍モデルにおいて評価した。ｍＩＬ−１８（配列番号２）単独またはドキソルビシン単独による単剤療法を上回る組み合わせ療法の有益性が、以下に詳述される複数の実験において示された。抗腫瘍活性および寿命の延伸の例を図９に示す。以下で説明する通り、ビヒクル群動物の死亡時（第１６日）にすべての投与を終了した。第１７．５日にビヒクル群中央値数の死亡が生じ、移植後第１６〜１８日にはすべてのビヒクル群マウスが死亡した。
【００８４】
これらの結果は、ＥＬ−４  Ｔ細胞リンパ腫におけるドキソルビシンとｍＩＬ−１８（配列番号２）との組み合わせの結果、生存の延伸を伴う相乗的な抗腫瘍活性がもたらされることを示す。ドキソルビシンによる単剤療法は、１２ｍｇ／ｋｇの用量で最小限の寿命の延伸を示した。１、５、および２５ｕｇ／回の用量でのＩＬ−１８単剤療法は、寿命の延伸を示さなかった。１２ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンを２５μｇ／回のＩＬ−１８と組み合わせたとき、生存の延伸および治癒の増大への移行が見られた。これらの動物を腫瘍により再感作したところ、防護を示した。
【００８５】
次いで、本発明者らは、ＩＬ−１８とドキソルビシンとの組み合わせ療法についての生存見込みを検討し、相乗的な抗腫瘍活性を結果としてもたらすのに最良の用量を両方の試薬について同定するのが有利であることを認めた。図９に示すデータの生存確率プロットを、図１０に示す。
【００８６】
この解析のため、本発明者らは、０、４．２、７．２、１２ｍｇ／ｋｇの用量でのドキソルビシン、および／または０、１、５、２５μｇ／匹の用量でのｍＩＬ−１８（配列番号２）を用いる組み合わせ試験または単剤療法試験に由来するデータを用いた。プロットでは、死亡危険性を最小化する治療組み合わせに対応する表面確率の最大値を用いる。この表面により、各治療組み合わせにおける、少なくとも３０日間にわたる生存の予測確率が与えられる。
【００８７】
リンパ球の生存能力、増殖、活性化、および機能性を解析する一連の実験において、ＩＬ−１８とドキソルビシンとの組み合わせ療法に応答する免疫細胞に対する効果を扱った。ドキソルビシン（１２ｍｇ／ｋｇ）、ｍＩＬ−１８（配列番号２）（２５μｇ／回）、または両者の組み合わせにより治療された動物において、リンパ球の表現型プロファイルを測定した。活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および活性化ＮＫ細胞のプロファイルについて調べ、データを図１１Ａおよび１１Ｂに示す。
【００８８】
ｍＩＬ−１８（配列番号２）とドキソルビシンとの組み合わせにより、ドキソルビシン単独の場合と同数の活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ＮＫ細胞、および活性化ＮＫ細胞が増大／維持された。これらの細胞は、細胞媒介性細胞傷害作用（特異的な腫瘍殺滅）において重要な役割を果たしうる。ドキソルビシン／ＩＬ−１８の組み合わせに応答しての活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増強は、脾臓細胞中と比較して、循環ＰＢＬ中においてより増強された。
【００８９】
ドキソルビシンにより、ＩＬ−１８により増強されたＮＫ細胞活性（非特異的な腫瘍殺滅）が低下しないことを示す実験を行うことが重要であった。図１２は、ドキソルビシンのみによって治療された動物ではＮＫ細胞による細胞傷害作用が損なわれるのに対し、ｍＩＬ−１８（配列番号２）単独またはドキソルビシンとの組み合わせを投与された動物はいずれも、ＮＫ細胞による頑健な細胞傷害作用を示したことを示す。
【００９０】
実施例３：ＩＬ−１８のリツキシマブとの組み合わせに対する第Ｉ相臨床試験のためのプロトコール
この第Ｉ相試験は、ＣＤ２０＋  Ｂ細胞ＮＨＬに罹患する対象において１２週間にわたり用量を漸増（１〜１００μｇ／ｋｇ）させるヒトＩＬ−１８（配列番号１）の安全性および忍容性を探索する、標準的なリツキシマブ療法と組み合わせたヒトＩＬ−１８に対するオープンラベルの用量漸増試験である。
【００９１】
リツキシマブおよびヒトＩＬ−１８（配列番号１）の投与は、ずらして行う。したがって、被験者は、第１〜４週の第１日において、毎週リツキシマブの静脈内注入（３７５ｍｇ／ｍ２）を受ける。ヒトＩＬ−１８（配列番号１）は、第１〜４週の第２日および第５〜１２週の第２日（＋／−１日）において毎週静脈内注入として投与する。ヒトＩＬ−１８（配列番号１）の出発用量は、１μｇ／ｋｇであり、用量漸増は、１００μｇ／ｋｇの名目最高用量まで進めるように計画する。
【００９２】
各コホート内における投与はずらして行い、１例の被験者には第１日にリツキシマブの第１回の投与を行い、第２日にヒトＩＬ−１８（配列番号１）の第１回の投与を行い、次いで、少なくとも２４時間にわたり施設内でモニターする。安全性または忍容性の懸念がみられなければ、少なくとも２４時間後に該コホート内における次の被験者に投与し、また、その第１回のヒトＩＬ−１８（配列番号１）投与後２４時間にわたる施設内でのモニターも行う。その何週間後か（第２〜１２週）に、ヒトＩＬ−１８の投与後６時間にわたり被験者をモニターし、次いで、施設から退院させることができる。すべての被験者には、少なくとも２時間間隔で投与する。いずれのコホートにおいても、１日当たり２例を超える被験者に投与を行うことはできない。
【００９３】
第１の用量レベル（１μｇ／ｋｇ／週）では、３例の被験者に処置する。コホートにおける投与の完了（すなわち、全３例の被験者が試験の第１〜６週を完了した）後に試験薬剤に対する関連が「疑われる」または「推定される」グレード２を超える毒性の証拠がみられなければ、３例ずつの被験者を、後続の各コホートにおいて、以下の投与レベル：３μｇ／ｋｇ／週、１０μｇ／ｋｇ／週、２０μｇ／ｋｇ／週、３０μｇ／ｋｇ／週、および１００μｇ／ｋｇ／週で治療する。
【００９４】
リツキシマブのすべての注入では、注入の開始から注入の終了まで、用量の完全なデリバリーが４時間未満であってはならない。ヒトＩＬ−１８の注入は、２時間にわたって行われる。
【００９５】
本試験の目的は、ＣＤ２０＋  Ｂ細胞リンパ腫に罹患する被験者における標準的なリツキシマブ治療と組み合わせて用いる場合に安全なヒトＩＬ−１８の生物学的に有効な最高用量を決定することである。かつての第Ｉ相試験で釣り鐘型であることが見出されたヒトＩＬ−１８（配列番号１）の用量−反応関係を評価するため、１〜１００μｇ／ｋｇの用量範囲を用いて、ＣＤ２０＋  Ｂ細胞リンパ腫に罹患する被験者における生物学的に活性な範囲の下端（低用量）および上端（中用量または高用量）を検討する。
【００９６】
リツキシマブの用量は、ＣＤ２０＋  Ｂ細胞ＮＨＬ患者用の承認済みの表示において推奨される標準的なレジメンである。ヒトＩＬ−１８（配列番号１）の用量は、腎細胞癌患者および転移性黒色腫患者を伴う試験に由来するかつての第Ｉ相安全性、薬物動態、および薬力学データに基づいて選択する。本試験で用いるリツキシマブの用量は、ＣＤ２０＋  Ｂ細胞ＮＨＬ患者用の承認済みの表示において推奨される標準的なレジメンである。
【００９７】
ヒトＩＬ−１８（配列番号１）の用量は、腎細胞癌患者および転移性黒色腫患者に関わる試験に由来するかつての第Ｉ相安全性、薬物動態、および薬力学データに基づいて選択した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、第２２巻、１７８頁（抄録７１３頁）（２００３）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、第２２巻、１７６頁（抄録２５５３頁）（２００４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、第２３巻、１６９頁（抄録２５１３頁）（２００５）；Ｋｏｃｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、第２３巻、１７４頁（抄録２５３５頁）（２００５）；Ｋｏｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第４巻、第１２号、８６頁（２７０頁）（２００６））。最長２４週間にわたり毎週投与された被験最高用量である２０００μｇ／ｋｇで有意な毒性がもたらされなかったので、最大耐量は同定されず、したがって、薬力学データを用いて、本試験用の用量範囲の上限を選択した。
【００９８】
最長２４週間にわたり毎週投与された最高被験用量である２０００μｇ／ｋｇでは有意な毒性がもたらされなかったので、最大耐量は同定されず、したがって、薬力学データを用いて、本試験用の用量範囲の上限を選択する。
【００９９】
実施例４：マウス形質細胞腫モデルにおけるＩＬ−１８とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとの組み合わせ
ＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ００５試験およびＭＯＰＣ．Ｄ３ｊ０３試験を共に解析して、マウスＩＬ−１８（配列番号２）のＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとの組み合わせ療法の、マウス形質細胞腫の増殖に対する効果を評価した。この実験で、本発明者らは、ＭＯＰＣ３１５細胞にＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）をトランスフェクトしなければならなかった。トランスフェクションで、本発明者らは、説明される通り、Ｇｉｂｃｏ社製のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）培地およびＯｐｔｉｍｅｍ（商標）培地によるリポソーム型トランスフェクション法を用い、６ウェルディッシュ中に１．５ｕｇのＥｒｂＢ２発現ベクター（ＢｉｏＣａｔ社製：１０８９１２−ｐｃｄｎａ３．１（−）ＥｒｂＢ２）を用いた。２日後に、培養物に選択圧としてのネオマイシン（４５０ｕｇ／ｍｌのＧ４１８；Ｓｉｇｍａ社製、Ｇ６８１６）を添加した。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８で標識したＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲモノクローナル抗体により染色したｉｎ  ｓｉｔｕ培養物の蛍光顕微鏡観察により初期陽性集団を選択し、限界希釈法（２０６４３４  ｐ  ７０−７２）によりクローニングした。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８で標識したＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲによるフローサイトメトリー法により、Ｄ３  ＥｒｂＢ２の発現を調べた。ＭＯＰＣ．Ｄ３細胞株を選択し、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとＩＬ−１８とによる抗腫瘍効果の評価に用いた。
【０１００】
抗腫瘍活性を測定したところ、データの詳細な解析により、ＩＬ−１８とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法がＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ単独による単剤療法を上回ることが示された。注目すべきことに、この差は統計学的に有意かつ頑健であるが、これは、統計学的な差を判定するにはそれほど高感度でなく、また、それほど強力でもないノンパラメトリック検定を用いて判定された。
【０１０１】
データの詳細な解析により、ＩＬ−１８とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法がＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ単独による単剤療法を上回ることが示された。注目すべきことに、この差は統計学的に有意かつ頑健であるが、これは、統計学的な差を判定するにはそれほど高感度でなく、また、それほど強力でもないノンパラメトリック検定を用いて判定された。
【０１０２】
ａ．試験番号：ＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ００５
本試験では、ｍＩＬ−１８（配列番号２）と、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体抗体であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとの組み合わせ療法を乳癌の臨床試験で用いることを目的として、この療法を用いた。十分に確立されたマウス形質細胞腫細胞株であるＭＯＰＣ３１５において、組み合わせ療法を調べた。ＡＴＣＣから腫瘍株を入手し、施設内でＨｅｒ２受容体を形質導入した。この腫瘍株は、ＢＡＬＢ／ｃ同系細胞株である。投与は以下の通りであった：マウスＩＬ−１８（配列番号２）（皮下投与により毎日１００μｇ／匹）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ（静脈内投与により毎週２回、２００、１００、または５０μｇずつ）。ＭＯＰＣ３１５．Ｄ３ｊ００５試験における治療は腫瘍が増殖し始めた後に開始し、これは移植後第１４日であった。
【０１０３】
本試験の結果を図１３および１４に示し、平均＋／−ＳＤ（図１３）および中央値＋／−範囲（図１４）としてデータを表わす。本発明者らは、まず、データが正規分布（ガウス近似）に従うかどうかを確認して検証し、標準偏差の値を比較して、ばらつきが均等であることを確認した（図１４および１５を参照されたい）。本発明者らは、生データには正規分布がみられるが、標準偏差は治療群間で高度に可変的（＞３倍）であり、したがって、解析にパラメトリック検定（ＡＮＯＶＡなど）を用いることができなかった。本発明者らは、ｌｏｇ１０を用いてデータを変換し、変換されたデータが正規性およびばらつきの均等性についての検定に合格するかどうかを検討した（以下に示す試料解析―第２４日における選択群の場合）。変換されたデータは、正規性の検定に合格しなかった。したがって、本発明者らは、統計学的評価にノンパラメトリック検定（クルスカル−ワリス解析）を選択した。詳細なデータおよびｐ値を図１３および１４に示す。
【０１０４】
統計学的解析により、ｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法の方が、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ単独による単剤療法よりも良好であることが示された。図１５は、２００μｇ／匹のＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ単独による投与群と、２００μｇ／匹のＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲおよび１００μｇ／匹のヒトＩＬ−１８の両者による治療群との間の統計学的な差（クルスカル−ワリス解析、ｐ＜０．０５）を示す。図１６は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとＩＬ−１８とによる組み合わせ治療が、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ単独またはＩＬ−１８単独と比較して最良レベルの抗腫瘍活性を示したことを表わす。
【０１０５】
ｂ．試験番号：ＭＯＰＣ．Ｄ３Ｊ０３
本試験は、移植後第７日において、腫瘍が肉眼で明らかとなる前に治療を開始したことを例外として、上記のＭＯＰＣ３１５．Ｄ３Ｊ００５試験（実施例４．ａ．）と同一であった。加えて、本試験では、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮの最大用量が１００μｇ／匹であり、最小用量が２５μｇ／匹であった。
【０１０６】
平均＋／−ＳＤ（図１７）および中央値＋／−範囲（図１８）としてデータを表わす。本発明者らは、まず、データが正規分布（ガウス近似）に従うかどうかを確認し、標準偏差の値を比較して、ばらつき均等性の検定が合格することを確認した。本発明者らは、生データが正規分布に従わず、変換されたデータ（ｌｏｇ１０またはｌｎ）もまたガウス分布に従わず、ばらつき均等性の検定にも合格しなかった。したがって、本発明者らはパラメトリック検定（ＡＮＯＶＡなど）を用いることができず、統計学的評価にノンパラメトリック検定（クルスカル−ワリス解析）を選択した。詳細なデータおよびｐ値を以下の図１９および２０に示す。
【０１０７】
結論として、本試験の統計学的解析により、ｍＩＬ−１８（配列番号２）とＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲとによる組み合わせ療法の方が、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ単独による単剤療法よりも良好であることが示された。図１９および２０のグラフは、組み合わせ療法群（１００μｇ／匹のｍＩＬ−１８（配列番号２）および１００μｇ／匹のＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ）において、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ単独（１００μｇ／匹）による単剤療法と比較して著明に良好な腫瘍の退縮を示す。単剤療法としてのＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲが有する活性は最小であるが、これが、ＩＬ−１８組み合わせ療法により増強される。ＨＥＲ２が細胞内にトランスフェクトされて以後、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲは、ＨＥＲ２に対する結合しかもたらすことができず、アポトーシス（腫瘍細胞の死）の誘導はもたらすことができない。したがって、抗腫瘍活性は組み合わせ療法の結果であり、ここでは、ＩＬ−１８によりＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性において重要な役割を果たす細胞（ＩＬ−１８治療により増強される細胞）が増強されつつ、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮによりＨＥＲ２に対する特異的な結合がもたらされ、これがＡＤＣＣ／ＣＤＣ標的として用いられる。
【０１０８】
実施例５：マウス結腸癌Ｃｏｌｏ２６による同系モデルにおけるＩＬ−１８および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の組み合わせ療法に対する解析
本試験では、ｍＩＬ−１８（配列番号２）による５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）との組み合わせ療法の、５−ＦＵ単独またはｍＩＬ−１８（配列番号２）単独による単剤療法と比較した有効性を評価することを目的とした。本試験は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて十分に確立された、マウス結腸癌Ｃｏｌｏ２６による皮下同系モデルで実施した。ｍＩＬ−１８（配列番号２）による投与は、腫瘍接種後第１０〜３０日における毎日１０μｇ／匹の皮下投与により実施した。５−ＦＵ投与は、用量を２７、４５、および７４μｇ／匹と漸増させる毎週２回の腹腔内投与で実施した。
【０１０９】
腫瘍体積データに対する詳細な解析により、１０μｇのｍＩＬ−１８（配列番号２）と７５μｇの５−ＦＵとによる組み合わせ療法が、腫瘍成長に対して対照群との比較で有意な効果を有する唯一の治療群であることが示された。単剤療法は対照よりも良好な治療効果を示さなかったので、これは、組み合わせ療法（７５μｇ／１０μｇ）が、５−ＦＵ単独またはｍＩＬ−１８（配列番号２）単独による単剤療法群を上回ったことを意味する。この差が統計学的に有意かつ頑健であることを知ることは重要であるが、これは、統計学的な差を判定するにはそれほど高感度でなく、また、それほど強力でもないノンパラメトリック検定を用いて判定された。加えて、生存解析により、組み合わせ療法（７５μｇ／１０μｇ）の方が、単剤療法群（７５μｇ）よりも著明に良好であることが示された。有意性は、ｐ＜０．０００１で極めて強力であった。
【０１１０】
選択された代表的な時点において、異なる治療群における腫瘍体積を比較するデータを評価し、平均＋／−ＳＤ（図２１）および中央値＋／−範囲（図２２）として表わした。まず、データを正規分布（ガウス近似）について確認し、標準偏差の値を比較して、ばらつきが均等であることを確認した。しかし、一部の生データの分布はガウス曲線に従わず、標準偏差もまた治療群間で高度に可変的（＞３倍）であり、したがって、解析にパラメトリック検定を用いることができなかった。ｌｏｇ１０を用いてデータを変換したが、それらは正規性およびばらつきの均等性についての検定に合格しなかった（以下に示す試料解析―選択群の場合）。したがって、統計学的評価にはノンパラメトリック検定（クルスカル−ワリス解析およびダンの比較検定）を用いた。詳細なデータおよびｐ値を以下の図２３のグラフに示す。図２４（中央値＋／−ＳＤ）および図２５（平均＋／−ＳＤ）は、同じＣｏｌｏ２６による結腸腫瘍同系モデルにおけるＩＬ−１８と５−ＦＵとによる組み合わせ療法の効果を示す。腫瘍体積が８０〜１００ｍｍ３のサイズに達したときに、ＩＬ−１８単独、５−ＦＵ単独、または両薬剤の組み合わせにより動物を治療した（進行腫瘍モデル）ことが明らかである。組み合わせ治療について、抗腫瘍活性および相乗作用に対するより良好な図解を図２６に示す。
【０１１１】
異なる治療群におけるＣｏｌｏ２６保有マウスの生存をカプラン−マイヤー生存曲線解析においてプロットし、ログランク検定により評価し、図２６に示す。治療群間における生存には統計学的な差が存在し、最良の群は、１０μｇのｍＩＬ−１８（配列番号２）と７５μｇの５−ＦＵとによる組み合わせ療法であった。
【０１１２】
実施例６：マウス腎細胞癌モデルにおけるＩＬ−１８とパゾパニブ（ＧＷ７８６０３４）とによる組み合わせ療法の有効性
本試験（ＲＥＮＪ０２試験）では、マウス腎癌の進行型同系モデルにおけるｍＩＬ−１８（配列番号２）と、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、およびｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼの阻害剤であるパゾパニブとによる組み合わせ療法の有効性について調べた。この動物モデルは、マウス皮下充実性腎癌モデルである。ＢＡＬＢ／ｃマウスと同系であるマウスＲＥＮＣＡ細胞株を、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントに移植した。用いられた投与スケジュールを、以下の表１に示す。ＩＬ−１８は、第１４〜４２日において毎日１回皮下投与した。パゾパニブは、第１４〜４２日において毎日１回経口投与した。
【０１１３】
まず、統計学的解析のために、群間比較に良好な時点を決定した。次いで、データを正規性検定にかけ、解析に適する統計学的検定を決定した。第３２日を代表的な時点として選択した（もとは各群７匹ずつのマウスで開始されたのであるが、毒性または腫瘍サイズのために一部のマウスをこの時点までに安楽死させなければならず、したがって、群は５〜７匹のマウスを示す）。データはガウス（正規）分布を示さず、したがってノンパラメトリック検定を用いた。ノンパラメトリック検定（パラメトリック検定よりも差の検出力が低い）を用いなければならなかったが、単剤療法と組み合わせ療法との間の統計学的な差を判定し、図２８に示す。評価に用いられた統計学的ソフトウェアには、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄおよびＳｉｇｍａＳｔａｔが含まれた。
【０１１４】
【表１】
2010522239.tif 000002
【０１１５】
図２８では、図２７と同じデータを解析する。しかし、図２８には、対照群が含まれていない。このさらなるグラフを作製して単剤療法群および組み合わせ療法群のみを比較することにより、「より明確な」解析を実施した。これらのデータにより、パゾパニブ（ＧＷ７８６０３４）とＩＬ−１８とによる組み合わせ治療の結果、統計学的に有意な抗腫瘍活性がもたらされることが示される。
【０１１６】
実施例７：長期間にわたる生存および腫瘍再発の防止を結果としてもたらす記憶誘導剤としてのＩＬ−１８の役割に対する取り組み
本発明者らは、マウスＩＬ−１８（配列番号２）とドキソルビシンとの組み合わせによりマウスを治療したＥＬ−４腫瘍モデルにおける有効性を調べることによりこの問題に取り組む。腫瘍による再感作時に治癒していたこれらのマウスが腫瘍の定着／増殖に対して抵抗性であったことは、これらマウスが、ＩＬ−１８とドキソルビシンとによる治療を介して誘導された記憶機序を有することを示唆する。生存したＥＬ−４腫瘍マウスにおける記憶Ｔ細胞の存在、およびこれらの腫瘍がＩＬ−１８とドキソルビシンとによる治療を介して治癒したことが、以下の実験で示される（図２９および図３０）。
【０１１７】
この実験デザインは以下の通りであった。Ｐｆｐ／Ｒａｇ２マウス（ＮＫ細胞およびＣＴＬ細胞の活性が重度に枯渇するＨ２ｂハプロタイプ）に、ＩＬ−２（毎日１回、１匹当たり３０００Ｕの皮下投与）により治療した生存マウスまたは対照Ｃ５７ＢＬ／６マウス（生存マウスおよび対照マウスのいずれもがＩＬ−２治療を受けた）に由来する２．５×１０７個の脾臓細胞およびリンパ節細胞の適合移植を行った。適合移植の２週間後、すべてのマウスをＥＬ−４腫瘍細胞により感作した（ＥＬ−４は、発癌物質により誘導されたＣ５７ＢＬ／６（Ｈ２ｂ）由来のマウスリンパ腫である）。すべてのレシピエントマウスを、適合移植後３日間にわたり（適合移植日に始まる）ＩＬ−２（毎日１回、１匹当たり３０００Ｕの皮下投与）により治療した。レシピエント株は、接種された腫瘍と同じ遺伝的バックグラウンドを有するように意図的に選択した。マウスの体重および生存を記録して体重減少／増加の時系列を確立し、腹腔を触診してＥＬ−４接種後数週間における触知可能な腫瘍塊の存在について判定した。
【０１１８】
Ｐｆｐ／Ｒａｇ２マウスは、入手できる最大数―雄４匹および雌４匹―で購入した。本発明者らはまた、過去の試験から残った２匹の老齢マウスも有した。群当たりの試料数を可能な限り増大させるため、本発明者らは、これらすべてのマウスを用いた：結果に対する性別および年齢の影響を回避するため決定した結果、１群にはＥＬ−４生存マウスに由来するリンパ球を移植し、他の群には正常対照Ｂ６マウスに由来する細胞を移植する２つの群間で、性別および年齢を均等に分布させた。
【０１１９】
結果は、ＥＬ−４感作後第１週において、２群のマウス間に重量の有意差はみられず、すべてのマウスにおいて体重増加が停滞した（図２９）。この結果は、最初の３日間において、すべてのマウスが皮下ＩＬ−２投与を受けてその免疫応答を促進していた事実に起因しうる。ＥＬ−４感作後第２および第３週において、本発明者らは、対照群において、急速な体重増加ならびに触知可能な腫瘍および／または腹水の形成を観察した。対照マウスはすべて２週間以内に死亡したが、生存マウス細胞のレシピエントマウスは、２匹（５匹中）が腹部に触知可能な腫瘍を有したが、すべて生存した。１匹のマウスは、腫瘍の急速な増殖に起因する倫理的な理由のために安楽死させなければならなかった。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
表２は、ＩＬ−１８／ドキソルビシン治療マウスにおける腫瘍感作に対する防護に関する知見の要約を、正常対照動物との対比で示す。ＩＬ−１８／ドキソルビシン治療動物に由来するリンパ球を移植されたマウスが防護されたのに対し、対照動物に由来するリンパ球は腫瘍の定着／増殖を示した。
【０１２２】
生存マウスのリンパ球を移植されたＥＬ−４レシピエントマウスは、未感作の正常ドナーマウスに由来するリンパ球を移植された対照マウスよりも著明に長期間にわたり生存した。データは、生存マウスからの適合移植が、ＥＬ−４腫瘍レシピエントマウスに対して防護的な効果を及ぼしたことを示唆する。これらのデータにより、ＥＬ−４腫瘍生存マウスにおける記憶Ｔ細胞に対する間接的な裏付けが得られる（図２９および図３０）。
【０１２３】
これは、任意の化学療法剤またはｍＡｂのＩＬ−１８との組み合わせを、いかなる単剤療法よりも優れた癌治療としうる重要な知見である。腫瘍を「異物」として認識して再発を防止する記憶Ｔ細胞の誘導は高度に有益であり、良好な安全性プロファイルを有するＩＬ−１８は任意の潜在的な組み合わせ療法用の薬剤となるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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