(57)【要約】  本発明は微生物、特にラクトコッカス・ラクティスにより分泌された免疫優勢抗原の粘膜送達による自己免疫疾患及びアレルギー性疾患の治療に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における免疫反応関連疾患を治療するための、粘膜送達で使用される抗原を分泌する微生物であって、前記免疫反応関連疾患が、アレルギー性喘息、多発性硬化症、１型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギー又はセリアック病から成る群から選択される、微生物。
【請求項２】
患者におけるアレルギー性喘息、多発性硬化症、１型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギー又はセリアック病から成る群から選択される免疫反応関連疾患を治療、予防及び／又は緩和するための粘膜送達で使用される組成物であって、前記組成物が、抗原を分泌する少なくとも１つの微生物を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項３】
上記微生物が乳酸菌又は酵母、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（ＬＬ）である、請求項１に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２に記載の使用される組成物。
【請求項４】
前記抗原が構成的に分泌される、請求項１又は３のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２又は３に記載の使用される組成物。
【請求項５】
前記微生物が毎日投与される、請求項１、３又は４のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２、３又は４のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項６】
前記抗原が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する、請求項１又は３〜５のいずれか一項に記載の使用する抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜５のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項７】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＦｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞である、請求項６に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項６に記載の使用する組成物。
【請求項８】
前記抗原が免疫優勢脱アミド化抗原である、物請求項１又は３〜７のいずれか一項に記載の使用する抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜７のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項９】
前記抗原がＨＬＡ−ＤＱ２又はＨＬＡ−ＤＱ８に関連して認識される、請求項１又は３〜８のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜８のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項１０】
前記抗原がα−グリアジン又はホルデインである、請求項１又は３〜９のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜９のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項１１】
前記抗原が配列番号：２、４、６又は８を含むか、又はそれから成る、請求項１０に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項１０に記載の使用される組成物。
【請求項１２】
前記抗原が、脾臓細胞及び鼠径リンパ節細胞の増殖を低減する、請求項１又は３〜１１のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜１１のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項１３】
前記抗原が、炎症性抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制する、請求項１又は３〜１２のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜１２のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項１４】
前記粘膜送達が、直腸送達、口腔内送達、肺内送達、眼内送達、経鼻送達、膣内送達及び経口送達から成る群から選択される、請求項１又は３〜１３のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜１３のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項１５】
前記微生物が、少なくとも１週間、より好ましくは少なくとも１ヶ月又は１年間送達される、請求項１又は３〜１４のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜１４のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項１６】
前記微生物が、少なくとも１日１回、好ましくは１日２回送達される、請求項１又は３〜１５のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜１５のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項１７】
前記微生物が、１日１００ｆｇ（フェムトグラム）〜１０ｍｇ、又は１日１ｐｇ〜１ｍｇ、又は１日１０ｐｇ〜１００μｇ、又は１日１００ｐｇ〜１０μｇ、又は１日１ｎｇ〜１μｇ、又は１日１０ｎｇ〜１００ｍｇ等のように、１日に少なくとも１０ｆｇ〜１００ｍｇの用量で送達される、請求項１又は３〜１６のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜１６のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項１８】
前記微生物が噴霧剤、カプセル剤、エアロゾル、舐剤、巨丸剤、錠剤、サシェ、液剤、懸濁剤、乳剤又はトローチ剤により送達される、請求項１又は３〜１７のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜１７のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項１９】
前記微生物又は組成物が薬剤、メディカルフード又は栄養補助食品として処方される、請求項１又は３〜１８のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜１８のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【請求項２０】
患者における免疫反応関連疾患を治療、予防及び／又は緩和する方法であって、抗原を発現する微生物を含む組成物の粘膜送達を含み、前記抗原が分泌され、且つ前記組成物を毎日送達する、方法。
【請求項２１】
前記微生物が、乳酸菌又は酵母、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（ＬＬ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が、アレルギー性喘息、多発性硬化症、１型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギー又はセリアック病から成る群から選択される、請求項２０又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記分泌が構成的である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原が制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔｒｅｇ細胞がＦｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原が免疫優勢脱アミド化抗原である、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原が、ＨＬＡ−ＤＱ２又はＨＬＡ−ＤＱ８に関連して認識される、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原がα−グリアジン又はホルデインである、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原が、配列番号：２、４、６若しくは８を含むか、又はそれから成る、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原が、脾臓細胞及び鼠径リンパ節細胞の増殖を低減する、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原が、炎症性抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制する、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記粘膜送達が、直腸送達、口腔内送達、肺内送達、眼内送達、経鼻送達、膣内送達及び経口送達から成る群から選択される、請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物が、少なくとも１週間、より好ましくは少なくとも１ヶ月又は１年間送達される、請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物が、少なくとも１日１回、好ましくは１日２回送達される、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記微生物が、１日１００ｆｇ（フェムトグラム）〜１０ｍｇ、又は１日１ｐｇ〜１ｍｇ、又は１日１０ｐｇ〜１００μｇ、又は１日１００ｐｇ〜１０μｇ、又は１日１ｎｇ〜１μｇ、又は１日１０ｎｇ〜１００ｍｇ等のように、１日に少なくとも１０ｆｇ〜１００ｍｇの用量で送達される、請求項２０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物が、噴霧剤、カプセル剤、エアロゾル、舐剤、巨丸剤、錠剤、サシェ、液剤、懸濁剤、乳剤又はトローチ剤により送達される、請求項２０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
微生物を含む組成物であって、前記微生物が、アレルギー性喘息、多発性硬化症、１型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギー又はセリアック病の誘導に関与する抗原を構成的に分泌する、組成物。
【請求項３８】
前記微生物が乳酸菌又は酵母、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（ＬＬ）である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記微生物が、１００ｆｇ（フェムトグラム）〜１０ｍｇ、又は１ｐｇ〜１ｍｇ、又は１０ｐｇ〜１００μｇ、又は１００ｐｇ〜１０μｇ、又は１ｎｇ〜１μｇ、又は１０ｎｇ〜１００ｍｇ等のように、少なくとも１０ｆｇ〜１００ｍｇの用量で存在する、請求項３７又は３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の組成物を含む製品。
【請求項４１】
前記製品が噴霧剤、カプセル剤、エアロゾル、舐剤、巨丸剤、錠剤、サシェ、液剤、懸濁剤、乳剤又はトローチ剤から成る群から選択される、請求項４０に記載の製品。
【請求項４２】
少なくとも１つの微生物を含む、免疫反応関連疾患を含む疾患又は障害を治療、予防及び／又は緩和するための薬剤、栄養補助食品又はメディカルフードであって、前記微生物が、アレルギー性喘息、多発性硬化症、１型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギー又はセリアック病の誘導に関与する抗原を構成的に分泌する、薬剤、栄養補助食品又はメディカルフード。
【請求項４３】
前記微生物が乳酸菌又は酵母、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス（ＬＬ）である、請求項４２に記載の薬剤、栄養補助食品又はメディカルフード。
【請求項４４】
前記抗原が前記患者において持続的に存在するように調製される、請求項１又は３〜１９のいずれか一項に記載の使用される抗原を分泌する微生物、又は請求項２〜１９のいずれか一項に記載の使用される組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物、特にラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）により分泌された免疫優勢抗原の粘膜送達による自己免疫疾患及びアレルギー性疾患の治療に関する。
【０００２】
発明の分野
免疫系は、自己と非自己とを識別する課題を有する。呼吸器、消化器及び尿生殖器に沿って存在する粘膜免疫系は、食物、空気中の抗原又は共生細菌フロラ等の多数の細菌及び無害な抗原と共に共存する追加の負担を負う。粘膜免疫系の主要な特徴は、それがこれらの抗原に対して寛容であり続けるが、効果的に病原体を忌避する能力を保持することができることである。注射によろうと損傷によろうと、抗原の導入は、全身的に炎症細胞の局所浸潤及び特異的免疫グロブリン産生に至る。対照的に、消化管及び尿生殖器等の粘膜表面に導入された抗原は、それらの抗原に対する免疫反応の能動的な阻害を全身的に誘発する。消化管を介した抗原の投与によるこれらの調節された反応の特異的誘導は、経口寛容として既知である。抗原の経口投与は、全身不反応性に至ることがあり、（ステロイドのように）望まれない副作用を有する免疫抑制性医学発明物の魅力的な代替物である。本発明は、特に、低用量の抗原への繰り返し曝露により得られる低用量寛容の分野にある。粘膜を介する寛容の誘導は、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患に対する処置戦略として提案されてきた。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景に関する以下の議論は単に、読者が本発明を理解するのを助けるために提供され、本発明に対する先行技術を記載又は構成すると認められるものではない。
【０００４】
自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患は、患者及び社会に多大な負担をかけ、生活の質の低下及び莫大な費用をもたらす。さらに、許容可能な副作用がないか、又は社会的に適切である適正な治療は存在しない。自己免疫疾患に対する現在の治療は、大いに姑息的であり、概して免疫抑制的又は抗炎症的である。橋本甲状腺炎又は１型糖尿病におけるホルモン補充等の非免疫療法は、自己攻撃的反応の結果を治療するものである。ステロイド治療又はＮＳＡＩＤ治療は、多くの疾患の炎症性症状を制限するものである。ＩＶＩＧはＣＩＤＰ及びＧＢＳに対して使用される。ＴＮＦα拮抗薬であるエタネルセプト（etanercept）のようなより特異的な免疫調節療法は、ＲＡを治療する上で有用であることが示されている。それでもなお、これらの免疫療法は、感染に対する感受性の増大等の有害作用の危険性の増加に関連し得る。慢性小腸炎症を特徴とし得るセリアック病は、小麦、ライ麦又は大麦を含有する食物を生涯にわたって完全に断つことを必要とする、社会的な食事制限でしか効果的に治療することができない。徹底的な無グルテン食は腸の治癒をもたらし得るが、グルテンに対する不耐性は恒久的である。
【０００５】
セリアック病（セリアックスプルー又はグルテン過敏性腸疾患としても知られる）は、グルテンを含有する特定の食物中の穀物に対する免疫反応から発症する慢性炎症性疾患である。診断は、標準的な症状（classical presentation）である下痢、脂肪便、腹部膨満及び筋痙攣、体重減少、代謝性骨疾患、貧血、並びにグリアジン及び組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）に対して特異性を有する血清抗体（抗筋内膜抗体とも称される）の存在に基づいて為され得る。粘膜病変は小腸の近位部に局在し、絨毛萎縮、腺窩細胞過形成、並びにグリアジンに反応してＩＬ−２及びＩＦＮ−γ等の炎症性サイトカインを放出する、上皮及び固有層のリンパ球浸潤を特徴とする。セリアック病は、ヒトにおいて最も一般的な食物過敏性の腸疾患であると見なされ、生涯のどの時点においても発症し得る。有病率は欧米人、アラビア人及びインド人の集団において１：１００〜１：３００の範囲である。該疾患は、グルテンとは別に、手術、ウイルス感染、強い感情的ストレス、妊娠又は出産後に初めて誘導される可能性がある。
【０００６】
したがって、抗原特異的な経口寛容の誘導は、魅力的な治療アプローチであり得る。
経口寛容は１９１１年に最初に記載されたが、研究者が、関係するメカニズムに取り組み始めたのは１９７０年代後半になってからであった（非特許文献１）。経口寛容の発生には、抗特異的Ｔ細胞の除去、過大な免疫偏向、及びアネルギーの誘導からＴｒｅｇによる抑制まで幾つかのメカニズムが提案されてきた（非特許文献２）。大部分の研究者は、経口寛容を得る二つの別個の方法があることに意見が一致しており、それらは、抗原の単回高用量後に得られる、アネルギー及び／又は除去に基づく高用量寛容（非特許文献３）並びに低用量の抗原への繰り返し曝露によって得られる、Ｆｏｘｐ３＋、ＩＬ−１０及び／又はＴＧＦ−β産生制御性Ｔ細胞を含めたＣＤ４＋Ｔ細胞による免疫反応の能動的な抑制によって媒介される低用量寛容である。重要なことに、粘膜寛容により誘導される制御性Ｔ細胞は、あるタンパク質に特異的な制御性細胞が別のタンパク質に対する近くのエフェクター細胞の反応を抑制する過程であるバイスタンダー抑制を媒介することが示された。器官特異的自己免疫を誘導する抗原のプールが主として未知であることから、バイスタンダー抑制は抗原誘導性抑制の重要な特徴であり、これはエピトープスプレッディングの現象を無効にする。エピトープスプレッディングは、初期の免疫反応が時間と共に拡大し、他の抗原に対する反応を含むようになる、自己免疫性疾患及びアレルギー性疾患の合併症である。
【０００７】
治療的適用及び予防的適用のための、ターゲティングされた、さらに効率的な分子の送達は、製薬業界にとって優先事項である。有効な戦略は、所望の作用部位に分子を集中させることにより必要な用量を減少させ、安全性を上げ、且つ有効性を高めるはずである。粘膜経路の薬物送達及びワクチン送達は、注射に比べて多くの物流の利点及び生物学的利点を与える。経口送達は、投与の容易さを受けて特に魅力的である。しかし、消化管分解及び低レベルの吸収は、一般にこの経路のペプチド性及びタンパク質性薬物の送達を無効にする。鼻、直腸、肺及び眼経路等の代替的な粘膜経路もまた研究されている。
【０００８】
したがって、当技術分野において抗原の寛容を効果的に誘導する問題が残る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Mayer andShao, 2004a   J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 39,S746-S747
【非特許文献２】Mucida et al.,2005   J. Clin. Invest. 1 15, 1923-1933
【非特許文献３】Friedman andWeiner, (1994).  Proc. Natl. Acad. Sci, 91 ,6688-6692
【発明の概要】
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、患者の粘膜部に送達され、好ましくは持続的に存在する免疫優勢抗原が抗原特異的免疫寛容を誘導することを見出した。特に、免疫優勢抗原を構成的に発現及び分泌する、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（ＬＬ）等の微生物を粘膜部に毎日送達すると、抗原特異的免疫寛容が誘導された。本発明者らは、微生物ラクトコッカス・ラクティスによるこのような抗原の粘膜送達により、該抗原又は該微生物単独の粘膜送達と比較して有意に良好な抗原特異的免疫反応の抑制がもたらされることを観察した。
【００１１】
本発明者らは、本発明によって、抗原又は対照のラクトコッカス・ラクティス単独を用いる単独療法よりもはるかに高い有効性で経口寛容を誘導することができることを実証する。抗原特異的制御性Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化が強く促進された。具体的には、遺伝子操作ラクトコッカス・ラクティスによる、ＤＱ８媒介性Ｔ細胞反応に対して免疫優勢であるグリアジン誘導ペプチドの粘膜送達は、局所及び全身のＤＱ８拘束性Ｔ細胞反応の抑制を誘導する。治療により脾細胞及び鼠径リンパ節細胞の増殖能の抗原特異的な低下がもたらされたが、これはＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの産生に非常に依存的であり、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の有意な誘導と関連していた。このアプローチの抗原送達細菌は、過敏性が確立された設定においても経口寛容を増強する能力を有するため、セリアック病並びに他の自己免疫疾患及び／又はアレルギー性疾患の治療に適用可能である。本発明の有効性は、自己免疫疾患及びアレルギー性疾患のマウスモデルにおいて、並びに治療剤の免疫不活化に関連して実証された。
【００１２】
本発明の詳細な説明
この開示全体にわたり、様々な公報、特許及び公開された特許明細書は、確認引用文献により参照される。これらの公報、特許及び公開された特許明細書の開示は、本発明が属する現行の技術水準をさらに完全に説明するために、これによって本開示への参照により組み入れられる。
【００１３】
一般的な技法
本発明の実施は、特に示さない限り、当該技術の熟練の範囲内である有機化学、薬理学、分子生物学（組み換え技法を含む）、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技法を採用する。そのような技法は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Second Edition(Sambrooket al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984);"Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods inEnzymology" (Academic Press, Inc.)のシリーズ;"Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C.Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M.Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in MolecularBiology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987及び定期刊行物);"Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., eds., 1994); 及び "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al.,eds., 1991）等の文献に十分に説明されている。
【００１４】
定義
本明細書に使用する特定の幾つかの用語は以下の定義した意味を有し得る。明細書及び特許請求の範囲に使用する単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、状況が明らかに別のものを指示しない限り複数の参照を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含めた複数の細胞を含む。同様に、本明細書に記載される処置又は薬剤の調製のための「化合物」の使用は、状況が明らかに別のものを指示しない限り、そのような処置又は調製のために本発明の一つ又は複数の化合物を使用することを考えている。
【００１５】
本明細書に使用する用語「含んでいる」は、その組成物及び方法が、引用された要素を含むが、その他を排除しているわけではないことを意味することを意図する。組成物及び方法を定義するために使用されるときの「から本質的に成る」は、その組み合わせから任意の本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的に成る組成物は、単離精製法からの微量混入物、及びリン酸緩衝生理食塩水、保存料等の薬学的に許容され得る担体を除外しない。「から成る」は、他の成分の微量を超える要素及び本発明の組成物を投与するための実質的な方法のステップを除外することを意味するものとする。これらの転換する用語のそれぞれにより定義される実施の形態は、本発明の範囲内に属する。
【００１６】
発明
本発明者らは、好ましくはラクトコッカス・ラクティス等の微生物により分泌された免疫優勢抗原の粘膜送達により、局所及び全身のＴ細胞反応の抑制が誘導されることを実証する。治療により脾細胞及び鼠径リンパ節細胞の増殖能の抗原特異的な低下がもたらされたが、これはＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの産生に非常に依存的であり、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の有意な誘導と関連していた。このアプローチの抗原送達細菌は、過敏性が確立された設定においても経口寛容を増強する能力を有するため、セリアック病並びに他の自己免疫疾患及び／又はアレルギー性疾患の治療に適用可能である。本発明の有効性は、自己免疫疾患及びアレルギー性疾患のマウスモデルにおいて、並びに治療剤（therapeutics）の免疫不活化に関連して実証された。
【００１７】
本発明の第１の態様は、微生物による上記抗原の粘膜送達を含む、抗原に対する免疫寛容を誘導する方法である。
【００１８】
好ましくは本発明は、患者において免疫反応関連疾患を治療する粘膜送達のための薬剤、メディカルフード又は栄養補助食品の調製に対する、抗原を分泌する微生物、好ましくは非病原性微生物、より好ましくは乳酸菌又は酵母、さらにより好ましくはラクトコッカス・ラクティスの使用に関し、該抗原は好ましくは上記患者において持続的に存在する。
【００１９】
好ましくは上記抗原は、抗原発現微生物によって送達される。好ましくは該抗原は、抗原分泌微生物若しくは抗原提示微生物又は細胞内抗原によって送達される。したがって、本発明は、該抗原が該抗原発現微生物の表面に提示されるか、又は該抗原が分泌されるか、若しくは該抗原が消化時に解放される実施の形態を包含する。
【００２０】
好ましくは、本発明は、免疫寛容を誘導する粘膜送達のための薬剤の調製に対する抗原発現微生物の使用に関する。
【００２１】
好ましくは、上記免疫寛容は患者に誘導される。該患者は動物であることが好ましい。該動物は哺乳動物であることが好ましく、好ましくは、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ及びヒトから成る群から選択される。好ましくは、上記哺乳動物はヒトである。好ましくは、上記免疫寛容は粘膜寛容である。
【００２２】
粘膜
本明細書に使用する「粘膜」は、口腔粘膜、直腸粘膜、尿道粘膜、膣粘膜、眼粘膜、頬粘膜、肺粘膜及び鼻粘膜等の任意の粘膜であり得る。本出願にわたり使用される「粘膜送達」は、粘膜への送達を包含する。経口粘膜送達には、口腔内、舌下及び歯肉経路の送達が含まれる。したがって、本発明は、上記粘膜送達が、直腸送達、口腔内送達、肺内送達、眼内送達、経鼻送達、膣内送達及び経口送達から成る群から選択される方法に関するものである。好ましくは、上記粘膜送達は経口送達であり、上記寛容は経口寛容である。
【００２３】
本出願にわたり本明細書に使用する「粘膜寛容」は、（ヒトを含む）動物が粘膜経路で上記抗原に曝露された後の、動物における抗原に対する特異的免疫反応性の阻害である。好ましくは、上記粘膜寛容は全身寛容である。抗原のその後の曝露は、非経口注射、粘膜送達、又は自己抗原の場合等の内因生産性による曝露等の、当業者に既知のそれぞれの曝露であり得る。「経口寛容」は、（ヒトを含む）動物が経口経路で抗原に曝露された後の、動物における抗原に対する特異的免疫反応性の阻害である。「低用量経口寛容」は、低用量の抗原により誘導される経口寛容であり、ナイーブなホストに寛容を伝達することができるシクロホスファミド感受性制御性Ｔ細胞により媒介される能動的な免疫抑制を特徴とする。「高用量経口寛容」は、高用量の抗原により誘導される経口寛容であり、シクロホスファミド処置に非感受性であり、抗原特異的Ｔ細胞のアネルギー及び／又は除去によりＴ細胞反応性低下の誘導に取りかかる。シクロホスファミドに対する感受性の差異は、低用量及び高用量寛容を識別するために使用することができる（Strobel et al., 1983）。好ましくは上記経口寛容は、非特許文献１により記載された低用量経口寛容である。
【００２４】
したがって本発明は、本明細書に記載される方法又は使用に関するものであり、ここで、免疫寛容の上記誘導は、上記誘導の前の少なくとも１．５倍、好ましくは２倍、又はさらに好ましくは３倍以上である。又は上記抗原は、上記誘導の前の少なくとも１．５倍、２倍、又は３倍以上寛容化されている。免疫寛容の誘導は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。好ましくは、免疫寛容の上記誘導は、上記動物におけるサイトカインレベルの調節により測定することができる。それとしてその調節は、サイトカインレベルの増加であることがあり、例えばサイトカインレベルの上記増加は、上記誘導前の少なくとも１．５倍、２倍、又は３倍以上である（例えばＩＬ−１０又はＴＧＦ−β）。又は上記調節は、特定のサイトカインレベルのレベルの減少であり、例えばサイトカインレベルの上記減少は、上記誘導前の少なくとも１．５分の１、２分の１、又は３分の１以下である（例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１７及びＩＦＮ−γ）。調整される（modulated）サイトカインは、任意の関連するサイトカインから選択することができ、好ましくは該サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＭＣＰ−１、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＫ−Ｌ及びＦｌｔ３Ｌから成る群から選択される。
【００２５】
構築物、送達及び組み込み
本発明では、微生物は抗原を目標とする部位、すなわち粘膜へと送達する。微生物が該抗原を発現した後、抗原は細胞表面に曝露されるか又は分泌される。したがって、好ましい実施の形態では、ラクトコッカス・ラクティス等の微生物は、異種抗原が分泌される、及び／又は目標とする粘膜での条件下、例えば胃腸管において異種抗原が細胞表面に曝露されるように、異種抗原、例えば免疫寛容を誘導するために使用される抗原を細胞内に発現可能な発現ベクターを含む。微生物、例えばラクトコッカス・ラクティスは、異種抗原が分泌される、及び／又は異種抗原が免疫寛容を誘導するのに十分な程度まで細胞表面に曝露されるように、異種抗原を細胞内に発現可能な発現ベクターを含み得る。細胞又は治療を受ける宿主の生存能力を損なうことなく可能な限り高い発現の程度が想定される。発現が高いと、寛容目的のためにはより低い頻度及びより低い用量が必要とされ得る。当然、投与計画は抗原の量だけでなく、抗原の種類及び組成物中の因子を刺激又は抑制する他の免疫原性の存在又は非存在に依存する。
【００２６】
通常、発現系は、好ましくは宿主の（hosting）微生物において配列の発現を誘導可能なプロモーターに操作可能に連結する、所望の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む。好適には、発現される抗原は、宿主の好ましいコドンの使用に適する核酸配列によりコードされ得る。該構築物は、当業者に既知のように、選択された宿主において操作可能なエンハンサー、転写開始配列、シグナル配列、レポーター遺伝子、転写終結配列等を含む他の（全ての）適当な要素（複数可）をさらに含有してもよい。構築物は好ましくは、ベクター、プラスミド又はミニ染色体等の、宿主の形質転換に適当な形態、及び／又は宿主において安定して維持することができる形態である。プロモーター配列、ターミネーター断片、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む適切な制御性配列を含有する、微生物、例えば細菌への導入のための核酸を含む適当なベクターは選択又は構築することができる。ベクターは必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えばファージ、又はファージミドであってもよい。さらに詳細には、例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al.,1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。核酸の操作に関する多くの既知の技法及びプロトコル、例えば核酸構築物の調製、突然変異生成、シークエンシング、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析は、Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al.eds., John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。Sambrook etal.及びAusubel et al.の開示は参照により本明細書中に援用される。好ましい実施の形態では、生物学的に活性なポリペプチド及び抗原に対するコード配列はオペロン、すなわち多シストロン発現のための核酸構築物に含有される。オペロンにおいては、プロモーターからの転写は、各々が上流のリボソーム結合部位に適切に位置する１つより多くのコード配列を含むｍＲＮＡをもたらす。したがって、単一のｍＲＮＡから１つより多くのポリペプチドが翻訳され得る。オペロンの使用によって、調整される生物学的に活性なポリペプチド及び抗原の発現が可能となる。より好ましくは、食品用の構築物が使用される。
【００２７】
一実施の形態では、本発明は安定して形質転換される微生物、すなわち抗原をコードする遺伝子が宿主のゲノムに組み込まれている微生物に関する。安定して形質転換される微生物を確立する技法は当該技術分野で既知である。例えば、対象の遺伝子は相同組み換えにより宿主のゲノムにクローン化してもよい。好ましくは、宿主の必須遺伝子は遺伝子の欠失のように、相同組み換えの際に破壊されるか、１つ又は複数のアミノ酸置換によって、必須遺伝子によりコードされるタンパク質の不活性型がもたらされるか、又はフレームシフト変異によって、必須遺伝子によりコードされるタンパク質の切断型が生じる。一実施の形態では、必須遺伝子はｔｈｙＡ遺伝子である。好ましい技法は国際公開第０２／０９０５５１号パンフレット（その全体が具体的に本明細書中に援用される）に記載される。形質転換プラスミドは、破壊された必須遺伝子、例えばｔｈｙＡ遺伝子を補完することができない限り任意のプラスミドであり得る。プラスミドは、好ましくは１つ又は複数の対象の遺伝子及び１つ又は複数の耐性マーカーを保有する自己複製プラスミドであってもよく、又はプラスミドは組込みプラスミドである。後者の場合、組込みプラスミド自体は、必須遺伝子の位置、例えばｔｈｙＡ部位で組み込みを引き起こすことにより必須遺伝子を破壊するために使用されてもよく、それにより必須遺伝子、例えばｔｈｙＡ遺伝子の機能が破壊される。好ましくは、ｔｈｙＡ遺伝子等の必須遺伝子は、ｔｈｙＡ標的部位等の必須遺伝子への挿入を目的とするターゲティング配列が横に位置する、対象の遺伝子（複数可）を含むカセットによる二重相同組み換えにより置換される。これらのターゲティング配列は、標的部位への対象の遺伝子の組み込みを可能とするのに十分に長く、且つ十分に相同であることが理解されよう。
【００２８】
したがって、本発明の抗原をコードする遺伝子構築物は、過剰染色体として（extra-chromosomally）、好ましくは自身の複製起点を用いて自律的に複製する宿主細胞に存在していてもよく、又は微生物のゲノムＤＮＡ、例えば、細菌又は酵母の染色体、例えばラクトコッカス属の染色体に組み込まれていてもよい。後者の場合、単一又は多コピーの上記核酸が組み込まれていてもよく、組み込みは、上記のように染色体のランダム部位、又はその所定部位、好ましくは、好適で非限定的な例ではラクトコッカス属、例えばラクトコッカス・ラクティスのｔｈｙＡ位置のような所定部位で起こってもよい。
【００２９】
したがって、一実施の形態では、本発明の抗原をコードする遺伝子構築物は、宿主細胞のゲノム、例えば、染色体への上記遺伝子構築物の挿入を達成するように構成される配列をさらに含んでいてもよい。
【００３０】
一例としては、宿主細胞のゲノムの特定の部位、例えば染色体への遺伝子構築物の挿入は、相同組み換えにより促進され得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞のゲノム、例えば染色体の該組み込み部位との１つ又は複数のホモロジー領域を含んでいてもよい。ゲノム、例えば染色体の該部位の配列は、天然、すなわち自然に発生するものであってもよく、又は事前の遺伝子操作により導入された外来性配列であってもよい。
【００３１】
例えば、上記ホモロジー領域（複数可）は、少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも１００ｂｐ、例えば、少なくとも２００ｂｐ、より好ましくは少なくとも３００ｂｐ、例えば、少なくとも４００ｂｐ、さらにより好ましくは少なくとも５００ｂｐ、例えば、少なくとも６００ｂｐ又は少なくとも７００ｂｐ、さらに好ましくは少なくとも８００ｂｐ、例えば、少なくとも９００ｂｐ、又は少なくとも１０００ｂｐ以上であり得る。
【００３２】
好ましい例では、２つのホモロジー領域が、本発明の遺伝子構築物中に存在する関連発現単位の両側に１つが隣接して含まれていてもよい。かかる構成は、関連配列を有利に挿入し得る、すなわち、少なくとも１つがコードされ、宿主細胞中の対象の抗原の発現を達成し得る。特に細菌宿主において相同組み換えを実行する方法及び組み換え体を選択する方法は概して、当該技術分野で既知である。
【００３３】
微生物の形質転換方法は当業者に既知であり、例えばプロトプラスト形質転換及びエレクトロポレーションである。
【００３４】
高程度の発現は微生物、例えばラクトコッカス・ラクティスに存在する発現ベクター上の相同発現及び／又は分泌シグナルを用いて達成することができる。好適には、実施例の構築物に存在するような発現制御シグナルが有用である。他の発現シグナルは当業者に明らかである。発現ベクターは、それが組み込まれる微生物、例えばラクトコッカス・ラクティスに応じた発現に最適化することができる。例えば、ラクトコッカス属、ラクトバチルス・ラクティス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・カゼイ（casei）及びラクトバチルス・プランタラム（plantarum）において十分なレベルの発現をもたらす特異的発現ベクターは既知である。さらに、非病原性、非コロニー形成、非侵襲性の食品用細菌であるラクトコッカス・ラクティスにおける異種抗原の発現のために開発されたシステムが知られている（英国特許第２２７８３５８号明細書（参照により本明細書中に援用される）を参照）。本発明による特に好ましい構築物は、国際出願第ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５号明細書（国際公開第９６／３２４８７号パンフレット）に記載されている、抗原をコードするヌクレオチド配列が組み込まれた多コピー発現ベクターを含む。このような構築物は乳酸菌、特にラクトバチルス属（Lactobacillus）における所望の抗原の高い発現レベルでの発現に特に適当であり、細菌の細胞表面に発現される産物を指向するためにも有利に使用することができる。（例えば国際出願第ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５号明細書の）構築物は、少なくともリボソーム認識及びＲＮＡ安定化に必要な最小限の配列を含む５’非翻訳核酸配列が、抗原をコードする核酸配列の前に来ることを特徴とし得る。この後に翻訳開始コドンが続き、その後（直後）に乳酸菌遺伝子の翻訳核酸配列の５’末端部の少なくとも５つのコドンの断片、又はその断片の構造的若しくは機能的等価物が続いていてもよい。該断片は、プロモーターにより制御されていてもよい。国際出願第ＰＣＴ／ＮＬ９５／００１３５号明細書の内容（本明細書中で開示のものとは異なる実施の形態も含む）、及び本明細書中で言及される他の全ての文献は、参照により本明細書中に援用される。本発明の一態様は、宿主における高レベルの異種遺伝子の制御された発現、及び発現を分泌に結びつけることを可能にする方法を提供する。さらに好ましい実施の形態では、Ｔ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ及びその同族プロモーターを、国際公開第９３／１７１１７号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）に従う強力な発現系を発達させるために使用する。好ましくは発現プラスミドはｐＴ１ＮＸに由来する。
【００３５】
本発明に従って採用されるプロモーターは、好ましくは細菌において構成的に発現される。本発明者らは、抗原の構成的発現が誘導性発現とは対照的に免疫寛容の増大をもたらすことを観察した。さらに、構成的プロモーターの使用は、発現を起こす誘導因子又は他の制御性シグナルの供給が必要となるのを回避する。好ましくはプロモーターは、増殖が維持されなくとも細菌の宿主細胞が生存可能であり続ける、すなわち幾つかの代謝活性を保持するレベルで発現を誘導する。また、有利には、かかる発現は低いレベルであってもよい。例えば、発現産物が細胞内に蓄積する場合、発現のレベルは、細胞タンパク質の約１０％未満、好ましくは約５％又は５％未満、例えば約１％〜３％の発現産物の蓄積がもたらされるレベルであってもよい。プロモーターは、採用される細菌と同種のもの、すなわち天然の細菌に見られるプロモーターであってもよい。例えば、ラクトコッカス属のプロモーターをラクトコッカス属において使用してもよい。ラクトコッカス・ラクティス（又は他のラクトコックス属）で使用するのに好ましいプロモーターは、ラクトコッカス・ラクティスの染色体に由来する「Ｐ１」である（Waterfield, N R, Lepage, R W F, Wilson, P W, et al. (1995). Theisolation of lactococcal promoters and their use in investigating bacterialluciferase synthesis in Lactococcus lactis. Gene 165(1), 9-15）。別の好ましいプロモーターはｕｓｐ４５プロモーターである。
【００３６】
核酸構築物（複数可）は分泌シグナル配列を含んでいてもよい。したがって、好ましい実施の形態では、（単一配列をコードする核酸配列を、抗原をコードする核酸配列に適切に結合することによって）抗原をコードする核酸は、該抗原の分泌をもたらし得る。核酸を有する細菌の抗原を分泌する能力は、生物体の生存能力を維持する培養条件においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。好ましい分泌シグナル配列は、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）及びラクトバチルス属等のグラム陽性菌において活性を有する配列のいずれかを含む。かかる配列は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquetaciens）のα−アミラーゼ分泌リーダー配列、又はグラム陽性及びグラム陰性の宿主の両方において機能すると知られている、一部のスタフィロコッカス属（Staphylococcus）株により分泌されるスタフィロキナーゼ酵素の分泌リーダー配列（"GeneExpression Using Bacillus", Rapoport (1990) Current Opinion inBiotechnology 1:21-27を参照）、又は多数の他のバチルス属酵素又はＳ層タンパク質からのリーダー配列（pp341-344 of Harwood and Cutting, "Molecular Biological Methodsfor Bacillus", John Wiley & Co. 1990を参照）を含んでいてもよい。好ましくは、上記分泌シグナルはｕｓｐ４５に由来する（Van Asseldonk et al. 1993 Mol. Gen. Genet. 240:428-434）。好ましくは、上記抗原は構成的に分泌される。
【００３７】
代替的な実施の形態では、生物学的に活性なポリペプチドコード配列及び抗原のコード配列は、同じ核酸ベクターの一部であるか、又は別個のベクターの一部であり、個々に別個のプロモーターの調整制御下にある。プロモーターは同じであっても又は異なっていてもよい。本発明のさらなる態様により、生物学的に活性なポリペプチドのコード配列及び抗原のコード配列（ここで、各コード配列は非侵襲性宿主、例えばラクトコッカス属において発現プロモーターの制御下にある）をオペロンとして（又はそうではなくとも）含む、核酸構築物又はベクターが提供される。
【００３８】
抗原
抗原をコードする配列は、任意の天然源から得ることができ、及び／又は既知のＤＮＡ合成技法を用いて合成的に調製することができる。抗原をコードする配列を次に（例えば）適当な発現ベクターに組み込んで、本発明の遺伝子構築物を得て、これを次に目標とする宿主に形質転換又は形質移入するために使用する。このように得られる組み換え体を次に培養するが、このとき、採取した細胞を、任意で粉末を形成する凍結乾燥等のさらなる精製工程及び／又は処理工程の後、組成物を処方するために使用することができる。
【００３９】
抗原は当業者に既知の任意の抗原であり得る。本願にわたって本明細書中で使用される抗原は、好ましくは動物の体内に導入されると免疫反応を引き起こす任意の物質であり、ここで上記免疫反応はＴ細胞媒介性及び／又はＢ細胞媒介性の反応であり得る。抗原はＴ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープを含み得る。抗原の長さは、該抗原を本発明の微生物において発現させることができるならば特に限定されない。抗原はポリペプチド又はペプチド等のタンパク質又はその一部であり得る。本発明による抗原は、直線状エピトープ及び／又は立体構造エピトープを含む。Ｔ細胞媒介性反応はＴｈ１反応、Ｔｈ２反応及び／又はＴｈ１７反応に及ぶ。抗原は、アレルゲン（食物アレルゲンを含む）、アロ抗原、自己抗原（self-antigens）、自家抗原（auto-antigens）、及び免疫反応を誘導する治療用分子又は抗原等（これらに限定されない）の任意の抗原であり得る。好ましくは、該抗原は免疫反応関連疾患の誘導に関与する。さらにより好ましくは、該抗原はアレルギー性喘息、多発性硬化症、１型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギー、セリアック病又は移植片対宿主疾患の誘導に関与する。
【００４０】
本発明者らは、分泌された本発明の免疫優勢抗原が全身炎症性Ｔ細胞反応を抑制し、これらの抗原が有意な寛容原性効果の誘導に必要且つ十分であることを観察した。
【００４１】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は経口寛容の誘導及び維持において重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇの誘導は幾つかの自己免疫疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患に対する免疫療法の主要な目標である。抗原特異的サプレッサー細胞の治療的誘導に対する現在の戦略は大きな障壁に直面しており、通常は適正な数の制御性細胞を単離し、扱い、移行するのに大変な技法を要する。本発明の微生物、例えばラクトコッカス・ラクティスの抗原送達システムは、これらの問題を回避し、抗原特異的Ｔｒｅｇを効果的に誘導する。本発明では、Ｔｒｅｇの誘導は、粘膜免疫系を低用量の抗原に曝露することにより達成することができると実証された。低用量の抗原への曝露は、好ましくは連続曝露である。したがって、本発明はＴｒｅｇ細胞、好ましくはＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ細胞を誘導及び／又は増大する抗原に関する。
【００４２】
本発明では、本発明による抗原により誘導及び／又は増大されるＴｒｅｇ細胞は、ＴＧＦ−β及び／又はＩＬ−１０に依存的な機序によって機能することがさらに実証された。以前に、ＴＧＦ−βは経口寛容及び末梢誘導Ｔｒｅｇの発生において重要な役割を果たすことの証拠が提供されている。
【００４３】
これにより、本発明は、内因性ＴＧＦ−β及び／又はＩＬ−１０発現を誘発する免疫優勢抗原を提供する。
【００４４】
さらに、抗原特異的ＴＧＦ−β産生Ｔｈ３細胞は、末梢において抗原特異的Ｆｏｘｐ３＋制御性細胞の分化を促進することが示されている。その上、末梢ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のＣＤ２５＋、ＣＤ４５ＲＢ−／ｌｏｗサプレッサー細胞へのＴＧＦ−β依存的変換が報告されている。ＣＴＢ共役Ａｇにより誘導される経口寛容は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞及びＦｏｘｐ３−ＣＤ２５−ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の両方、並びにＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５−ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞及びＦｏｘｐ３−ＣＤ２５−ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の両方の生成によるＴＧＦ−βの増大に関連することが示されている。これらのデータは、Ｆｏｘｐ３＋「適応」Ｔｒｅｇの経口寛容の誘導及び維持における重要な役割を示唆している。本発明者らはまた、有意な粘膜Ｆｏｘｐ３誘導を示す。さらに、ラクトコッカス・ラクティスは単独でＧＡＬＴにおいてこのＦｏｘｐ３上方制御を誘導することができないため、「粘膜」誘導される制御性Ｔ細胞は抗原特異的である傾向がある。これにより、本発明は、好ましくはＦｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞に関する。
【００４５】
本発明によって、本発明による抗原により誘導及び／又は増大されたＴｒｅｇ細胞が、特に脾臓細胞及び鼠径リンパ節細胞において炎症を抑えることがさらに実証された。さらに、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の産生が減少した。これにより、本発明は、内因性ＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−１２の産生を減少させ、及び／又は内因性ＴＧＦ−β及び／又はＩＬ−１０の発現を誘発する免疫優勢抗原を提供する。さらに、本発明は、脾臓細胞及び／又は鼠径リンパ節細胞の増殖を低減する抗原に関する。本発明は炎症性抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制する抗原にも関することが理解されよう。
【００４６】
或る特定のＨＬＡ−ＤＱアイソフォームが或る特定の自己免疫疾患に、より一般に関連することを理解されたい。例えば、セリアック病を定義する慢性小腸炎症は、摂取グルテンペプチドへの寛容の喪失を特徴とし、ＨＬＡ−ＤＱ２又はＨＬＡ−ＤＱ８拘束性Ｔ細胞反応に強く関連する。ＨＬＡ−ＤＱ２又はＨＬＡ−ＤＱ８の発現は、セリアック病の発現に必要であり、欧米人の集団において最大で４０％の遺伝的危険率をもたらす。セリアック病の病因において最も重要な側面の１つは、Ｔヘルパー１免疫反応の活性化であり、これはＨＬＡ−ＤＱ２／ＤＱ８分子を発現する抗原提示細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対してグルテンペプチドを提示する場合に起こる。
【００４７】
ＤＱ８は、セリアック病だけでなく若年性糖尿病とのその強い関連性のために際立っている。ＤＱ８は、ＲＡにかかわると共に、危険性を増大させ得るＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子にも関係している。ＨＬＡ−ＤＱは一様に分布しておらず、或る特定の集団において危険性が高い。しかしながら、この危険性は多くの場合、環境（グルテン消費）に依存的であり、幾つかの疾患の有病率（prevelance）の上昇は、危険性の低い環境から危険性の高い環境への個体の移動の結果であり得る。
【００４８】
本発明によるＨＬＡ−ＤＱ８は、ＤＱＡ１：ＤＱＢ１ハプロタイプの血清型の表現である。ＤＱ８は、ＤＱＡ１＊０３０１：ＤＱＢ１＊０３０２ハプロタイプ、ＤＱＡ１＊０３０２：ＤＱＢ１＊０３０２ハプロタイプ、又はＤＱＡ１＊０３０３：ＤＱＢ１＊０３０２ハプロタイプを表す。これらのハプロタイプは、最も一般的な既知の自己免疫疾患の一部に関連する。ＤＱＡ１＊０３０１：ＤＱＢ１＊０３０２は、これら３つのハプロタイプの中で最も頻度が高く、全世界のＤＱ８の約８０％に相当する。本発明はしたがって、ＤＱＡ１＊０３０１：ＤＱＢ１＊０３０２ハプロタイプ、ＤＱＡ１＊０３０２：ＤＱＢ１＊０３０２ハプロタイプ、及び／又はＤＱＡ１＊０３０３：ＤＱＢ１＊０３０２ハプロタイプ（「ＤＱ８エピトープ」とも称される）により認識される抗原に関する。
【００４９】
ＨＬＡ−ＤＱ２は、セリアック病の人々の９０％超において発現されている。ＨＬＡ  ＤＲ３−ＤＱ２は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１：ＤＱＡ１：ＤＱＢ１ハプロタイプの血清型の表現である。ＤＲ３−ＤＱ２は主として、ＤＲＢ１＊０３０１：ＤＱＡ１＊０５０１：ＤＱＢ１＊０２０１ハプロタイプを表す。ＤＲ３−ＤＱ２は西半球において比較的多い。ＤＱ２は、他のα対立遺伝子と共にＤＱＢ１＊０２対立遺伝子によりコードされる。２つの最も一般的なＤＱ２β鎖は非常に似ている。本発明はしたがって、ＤＱＢ１＊０２０１ハプロタイプ、ＤＱＢ１＊０２０２ハプロタイプ及び／又はＤＱＢ１＊０２０３ハプロタイプ（「ＤＱ２エピトープ」とも称される）により認識される抗原に関する。
【００５０】
本発明は、好ましくは糖タンパク質に由来する抗原に関する。好ましくは、該抗原はグリアジン、好ましくはα−グリアジン及び／又はホルデインに由来する。α−グリアジン、γ−グリアジン及びω−グリアジン、並びにホルデインに細分することができるグリアジンは当該技術分野で既知であり、それらの配列はＮＣＢＩ等の公のドメインライブラリにより容易に検索可能である。好ましくは、該α−グリアジンはコムギ（T. aestivum）又はリベットコムギ（T. turgidum）等のコムギ属（Triticum）に由来する。
【００５１】
本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＤＱ２又はＤＱ８に関連して天然グルテンペプチドを認識することを実証する。
【００５２】
一実施の形態では、本発明はＤＱ８エピトープ：ＱＹＰＳＧＱＧＳＦＱＰＳＱＱＮＰＱＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬエントリのＱ９Ｍ４Ｌ６により検索可能な配列の残基２０３〜２２０に対応する）（配列番号：４）に関する。
【００５３】
上記天然ＤＱ８エピトープは、好ましくはヌクレオチド配列５’−ｃａａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｔｃａ  ｇｇｔ  ｃａａ  ｇｇｔ  ｔｃａ  ｔｔｃ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｃａ  ｃａａ  ｃａａ  ａａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｇｃｔ−３’（配列番号：３）によりコードされる。
【００５４】
一実施の形態では、本発明はＤＱ２エピトープ：ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬエントリのＱ９Ｍ４Ｌ６により検索可能な配列の残基５７〜８９に対応する）（配列番号：８）に関する。
【００５５】
上記ＤＱ２エピトープは、好ましくはヌクレオチド配列５’−ｔｔａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｔｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｔｃ（配列番号：７）によりコードされる。
【００５６】
抗原は一般に、腸において例えば内因性組織トランスグルタミナーゼにより脱アミド化される。脱アミド化抗原は、脱アミド化されていない抗原よりも免疫反応性であり、容易に認識される。内因性組織トランスグルタミナーゼの存在は、抗原が他の手段により脱アミド化される場合と変わらない（indifferent）。一実施の形態では、本発明は、エピトープのグルタミン残基に対するコドンが、好ましくはグルタミン酸残基に対するコドンに置換されたヌクレオチド配列によりコードされる脱アミド化抗原に関する。
【００５７】
特に、本発明は脱アミド化ＤＱ８エピトープ：ＱＹＰＳＧＥＧＳＦＱＰＳＱＥＮＰＱＡ（配列番号：２）に関する。
【００５８】
上記脱アミド化ＤＱ８エピトープは、好ましくはヌクレオチド配列５’−ｃａａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｔｃａ  ｇｇｔ  ｇａａ  ｇｇｔ  ｔｃａ  ｔｔｃ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｅａ  ｃａａ  ｇａａ  ａａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｇｃｔ−３’（配列番号：１）によりコードされる。
【００５９】
特に、本発明は、脱アミド化ＤＱ２エピトープ：ＬＱＬ  ＱＰＦ  ＰＱＰ  ＥＬＰ  ＹＰＱ  ＰＱＬ  ＰＹＰ  ＱＰＥ  ＬＰＹ  ＰＱＰ  ＱＰＦ（配列番号：６）に関する。
【００６０】
上記脱アミド化ＤＱ２エピトープは、好ましくはヌクレオチド配列：５’−ｔｔａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｔｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｇａａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｇａａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｔｃ（配列番号：５）によりコードされる。
【００６１】
エピトープ配列へのタグ等の付加配列の存在は免疫反応に影響を与えないことがさらに実証された。これにより、さらなる実施の形態では、該エピトープはさらなるアミノ酸、例えば５０個のアミノ酸、４３個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸を含み得る。したがって、本発明は、最大で５０個の付加アミノ酸を含むＤＱ８エピトープに関する。さらなる実施の形態では、本発明は、ＤＱ８エピトープ及びｅタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ（配列番号：３１））を含むアミノ酸配列：ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲＱＹＰＳＧＥＧＳＦＱＰＳＱＥＮＰＱＡ（配列番号：１６）に関する。
【００６２】
免疫反応
本明細書に使用する免疫反応関連疾患は、抗原に対する身体の望まれない免疫反応により起こる疾患であり、ここで上記抗原は、異種抗原又は自己抗原のいずれかであり得る。免疫反応関連疾患には、食物アレルギーを含めたアレルギー反応、セリアック病、アレルギー性喘息、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病及び多発性硬化症が含まれるが、それに限定されるわけではない。免疫反応関連疾患には、移植片対宿主病又は非内因性第ＶＩＩＩ因子に対する抗体産生等の薬物療法の免疫活性化等の望まれない免疫反応もまた含まれる。好ましくは、その疾患は、アレルギー性喘息、食物アレルギー、セリアック病、Ｉ型糖尿病及び治療薬の免疫不活性化から成る群から選択される。したがって、免疫反応関連疾患には、食物アレルギーを含めたアレルギー反応、セリアック病、アレルギー性喘息、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病及び多発性硬化症が含まれるが、それに限定されるわけではないと認識されよう。免疫反応関連疾患には、移植片対宿主病又は非内因性第ＶＩＩＩ因子に対する抗体産生等の薬物療法の免疫活性化等の望まれない免疫反応もまた含まれる。好ましくはその疾患は、アレルギー性喘息、食物アレルギー、セリアック病、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病及び治療薬の免疫不活性化から成る群から選択される。
【００６３】
本発明によると、用語「免疫優勢」とは免疫反応を誘導する主要な抗原を指す。
【００６４】
したがって、上記の点を考慮して、本発明は本明細書中に記載されるような方法又は使用に関し、該方法又は使用は治療的及び／又は予防的であることが理解されよう。
【００６５】
本発明のさらなる態様は、免疫調節化合物産生微生物の粘膜送達と共に、微生物による抗原の粘膜送達を含む、抗原に対する免疫寛容を誘導する方法に関する。免疫調節化合物及び抗原は同じ微生物によって送達されてもよく、又は微生物は異なる微生物であってもよい。
【００６６】
薬剤及び投与
「化合物」は、単純又は複合の有機分子及び無機分子、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、タンパク質複合体、抗体、炭水化物、核酸又はその誘導体を含めた任意の化学的又は生物学的な化合物又は複合体を意味する。免疫調節化合物は、免疫系の機能を改変する化合物である。本明細書に使用する免疫調節化合物は、寛容誘導化合物であり、寛容の誘導は、非限定的な例としてＴｒｅｇ、Ｔｒ１若しくはＴｒ３等の制御性Ｔ細胞を誘導することによる、又はＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｒ１若しくはＴｒ２に傾けることによる直接的な方法で、あるいは未熟樹状細胞から寛容化樹状細胞への活性化及び／又は成熟樹状細胞上の「共刺激」因子の発現を誘導しているＴｈ２免疫反応を阻害することによる間接的な方法で得ることができる。免疫調節化合物及び免疫抑制化合物は、当業者に既知であり、それらには、スペルグアリン等の細菌代謝物、タクロリムス、ラパマイシン又はシクロスポリン等の真菌及びストレプトミセス代謝物、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＴＧＦβ（制御性Ｔ細胞に関する選択的アジュバントとして）、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＳＬＰ、ＣＴＢ及びＲａｎｋ−Ｌ（選択的寛容原性ＤＣ誘導因子として）、抗体及び／又はアンタゴニスト、例えば抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ３、抗ＩＬ−６（又はＩＬ６Ｒ）、並びにＣＴＬ−４  Ｉｇ又はＣＴＬＡ−４アゴニスト融合タンパク質等のタンパク質、ペプチド又は融合タンパク質が含まれ得るが、それに限定されるわけではない。
【００６７】
したがって免疫調節化合物は、当業者に既知の任意の免疫調節化合物であり得る。好ましくは、該免疫調節化合物は免疫抑制化合物であり、なおさらに好ましくは、該化合物は免疫抑制サイトカイン又は抗体である。好ましくは、該免疫抑制サイトカインは、寛容増強サイトカイン又は抗体である。免疫抑制サイトカインは当業者に既知であり、それらには、制御性Ｔ細胞に対する選択的アジュバントとしてのＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−α及びＴＧＦβ；並びに選択的寛容原性ＤＣ誘導因子としてのＦｌｔ３Ｌ、ＴＳＬＰ、ＣＴＢ及びＲａｎｋ−Ｌが含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、上記免疫抑制サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα及びＦｌｔ３Ｌから成る群から選択される。本発明が、その機能的ホモログにもまた関することは、当業者に認識されていよう。機能的ホモログは、少なくとも意図される目的について本質的に同一又は類似の機能を有するが構造的に異なり得る分子を意味する。最も好ましくは、上記免疫抑制寛容増強サイトカインは、ＩＬ−１０又はその機能的ホモログである。好ましくは、上記免疫抑制抗体は、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ１２、抗ＩＬ６及び抗ＩＦＮ−γから成る群から選択される。
【００６８】
本明細書に使用する「送達」は、当業者に既知の送達の任意の方法を意味し、それには、任意に粘膜送達及び／又は粘膜取り込みを高めることができる化合物の存在下での、送達する化合物のコーティングされた、又はコーティングされていない薬学的製剤、送達する化合物を含むか、若しくは保有するカプセル、リポソーム、油体若しくはポリマー粒子、又は送達する化合物を分泌、表出若しくは蓄積している微生物が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００６９】
本明細書に記載される化合物又は組成物は、純粋な形態で、他の活性成分と組み合わせて、又は薬学的に許容され得る無毒性賦形剤若しくは担体と組み合わせて投与することができる。経口組成物は、一般に不活性な希釈担体又は食用担体を含むものである。薬学的に適合性の結合剤及び／又はアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、浣腸剤等は、以下の成分又は類似の性質の化合物のいずれかを含むことがある：微結晶セルロース、トラガカントゴム若しくはゼラチン等の結合剤；デンプン若しくは乳糖等の賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ若しくはトウモロコシデンプン等の分散剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤（glidant）；ショ糖若しくはサッカリン等の甘味料；又はペパーミント、サリチル酸メチル若しくはオレンジ香味料等の香味料。ユニット投薬形態がカプセルの場合、カプセルは、上記の種類の物質に加えて、脂肪油等の液体担体を含むことがある。加えて、ユニット投薬形態は、投薬ユニットの物理的形態を改変する様々な他の物質、例えば砂糖、セラック又は腸溶剤等のコーティングを含むことがある。さらにシロップは、活性化合物に加えて、甘味料としてショ糖及びある種の保存料、色素、着色料及び香味料を含むことがある。薬学的に許容され得る担体の形態及び性質は、その担体が組み合わされる活性成分の量、投与経路、及び他の既知の変数により指示されることが認識されているものである。担体は、その製剤の他の成分と適合する意味で「許容され」なければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。
【００７０】
投与のための代替調製物には、滅菌した水性又は非水性の液剤、懸濁剤及び乳剤が含まれる。非水性溶媒の例は、ジメチルスルホキシド、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、アルコール及び水の混液、緩衝媒質及び生理食塩水が含まれる。静注用ビヒクルには、液体栄養補液、リンゲルデキストロースに基づく補液のような電解質補液等が含まれる。保存料、及び例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガス等の他の添加物もまた存在し得る。これらの送達法のために、生理食塩水、アルコール、ＤＭＳＯ及び水性溶液を含めた様々な液体製剤が可能である。
【００７１】
好ましくは、上記免疫抑制サイトカインは、低量で、好ましくはマウスの実験設定で投与される細菌用量あたり０．１μｇ以下で発現され、ヒトの疾患設定においてその量を変換することができる。
【００７２】
本明細書に使用する「処置」及び「処置する」等の用語には、発生した精神病若しくは状態が一度確立したならばその改善若しくは除去、又は該疾患又は状態の特徴的な症状の緩和が含まれる。本明細書に使用するこれらの用語は、患者の状態に応じて、疾患又は状態に伴う苦痛の前にそれに関連する疾患若しくは状態又は症状の重症度を低減することを含めて、上記疾患若しくは状態又はそれに関連する症状の開始を予防することもまた包含する。苦痛の前のそのような予防又は低減は、投与時にその疾患若しくは状態に苦しんでいない患者に本発明の化合物又は組成物を投与することを表す。「予防」は、例えば回復期後に疾患若しくは状態、又はそれに関連する症状の再発を予防すること、すなわち再燃予防もまた包含する。精神状態が身体愁訴を担い得ることも明らかなはずである。この点で、「処置する」という用語には、身体疾患若しくは状態の予防、又は発生した身体疾患若しくは状態が一度確立したならばその身体疾患又は状態の改善若しくは除去、又はその該状態の特徴的な症状の緩和もまた含まれる。
【００７３】
本明細書に使用する「薬剤」という用語は、「薬物」、「治療薬」、「一服」又は治療若しくは予防効果を有する調製物を示すために医学の分野で使用される他の用語もまた包含する。
【００７４】
本発明の化合物、すなわち抗原は、治療有効量で送達又は発現されることもまた認識されているものである。本明細書に使用する「治療有効量」という用語は、所望の処置方式により投与した場合に所望の治療的又は予防的な効果又は反応を誘発するものである、本発明の化合物又は組成物の量を表すことを意味する。免疫優勢抗原が持続的に存在する場合、炎症性抗原特異的細胞反応はさらに低下することが観察される。この低下は抗原自体、微生物自体の投与、又は抗原の非持続的な存在と比較して有意に大きい。本発明による用語「持続的に存在する」又は「持続的な存在」とは、目標とする粘膜部、例えば炎症部位での本発明による抗原の持続する又は中断されない存在を指す。抗原の存在は、例えば実施例の節及び上記に詳述するようなＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ又は免疫沈降技法等の当該技術分野で既知の技法により測定することができる。さらに、ラクトコッカス・ラクティスの存在は抗原の存在の尺度であり得る。また、抗原による影響、例えば内因性ＴＧＦ−β若しくはＩＬ−１０の存在又はそのレベルの上昇、又はＩＦＮ−Ｙ又はＩＬ−１２のレベルの低下、又は本明細書中に記載されるようなＴｒｅｇ細胞の存在、又は脾細胞及び流入領域リンパ節細胞の増殖能の低下は、抗原の存在の尺度であり得る。したがって、抗原のレベルは変化し得るが、それでも抗原は持続的に存在すると見なされることが理解されよう。
【００７５】
好ましくは、その化合物又は組成物は、ユニット投薬形態、例えば錠剤、カプセル剤、浣腸剤又は定量エアロゾル用量で提供されることにより、１回用量が対象、例えば患者に投与される。
【００７６】
活性成分は、所望の活性を示すのに十分な、１日に１〜６回投与されることがある。これらの１日量は、１日１回の単回投与として与えることもできるし、全体で特定の１日量となる２回以上の小用量として、１日の同じ時間又は異なる時間に与えることもできる。好ましくは、活性成分は１日に１回又は２回投与される。例えば、一つの活性成分は朝に摂取し、もう一つはその後に日中に摂取することもできよう。
【００７７】
本発明の全ての態様において、１日維持用量は、患者に臨床的に望まれる期間、例えば１日間から最長数年間（例えばその哺乳動物の全残存寿命）；例えば約（２若しくは３若しくは５日間、１若しくは２週間、又は１ヶ月）より長く、且つ／又は例えば最長約（５年間、１年間、６ヶ月、１ヶ月、１週間、又は３若しくは５日間）与えることができる。約３から約５日間又は約１週間から約１年間の１日維持用量の投与が典型的である。液体製剤の他の構成成分には、保存料、無機塩、酸、塩基、緩衝液、栄養素、ビタミン又はその他の医薬品が含まれることがある。
【００７８】
抗原を投与している微生物は、１日に少なくとも１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）から１０１２ＣＦＵ、好ましくは１日に１０６ＣＦＵから１０１２ＣＦＵ、最も好ましくは１日に１０９ＣＦＵから１０１２ＣＦＵの用量で送達することができる。Steidler et al.（Science 2000）に記載された方法に従って、例えば約１０９ＣＦＵの免疫調節化合物は、少なくとも１ｎｇから１００ｎｇまで分泌される。当業者に既知のＥＬＩＳＡにより、当業者は、任意の他の用量のＣＦＵに関して免疫調節化合物及び／又は抗原の分泌範囲を計算することができる。
【００７９】
抗原は低用量反応を誘導する用量で送達することができる。好ましくは、該抗原は、少なくとも１日１０ｆｇから５００μｇ、好ましくは１日１ｐｇから２５０μｇ、さらに好ましくは１日１００ｐｇから２００μｇ、また好ましくは１ｎｇから１５０μｇ、さらに好ましくは１日１０ｎｇから１２５μｇ、さらにより好ましくは１日１００ｎｇから１００μｇ、さらに好ましくは１日１μｇ及び９０μｇ、最も好ましくは１日１０μｇから７５μｇ、の用量で送達することができる。例えば、１日２５μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ及び７０μｇ。
【００８０】
好ましくは化合物又は組成物は、ユニット投薬形態、例えば錠剤、液剤、カプセル剤又は定量エアロゾル用量で提供されることにより、１回用量が対象、例えば患者に投与される。
【００８１】
投与様式、例えば経口又は上記の投与様式のうち任意のものに応じて、当業者は、患者に投与される実際の用量を規定又は計算する方法を知っている。当業者は、患者、微生物、ベクター等に応じて用量を調整することに精通しているものである。
【００８２】
本発明の化合物は、薬理学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物又は代謝物の形態を採ることもある。薬理学的に許容され得る塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸及びマンデル酸等を含むがこれらに限定されない無機酸及び有機酸の塩基性塩が含まれる。本発明の化合物がカルボキシ基等の酸性官能基を含む場合、カルボキシ基についての適切な薬学的に許容され得る陽イオンの対は、当業者に既知であり、それらには、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム及び第四アンモニウム陽イオン等が含まれる。
【００８３】
微生物
本発明による微生物は、粘膜送達に適した、細菌、酵母又は真菌を含めた任意の微生物であり得る。好ましくは、該微生物は非病原微生物であり、なおさらに好ましくは、該微生物はプロバイオティック微生物である。プロバイオティック生物は、当業者に既知である。プロバイオティック生物には、Lactobacillus sp.、Lactococcus sp.等の細菌及びSaccharomyces cerevisiae亜種boulardii等の酵母が含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、上記細菌は乳酸菌である。なおさらに好ましくは、該乳酸菌は、Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Lactococcus、Streptococcus、Aerococcus、Carnobacterium、Enterococcus、Oenococcus、Teragenococcus、Vagococcus及びWeisellaから成る群から選択される。さらに好ましい一実施の形態では、上記微生物はLactococcus lactisである。別の好ましい実施の形態では、該微生物はSaccharomycescerevisiaeであり、なおさらに好ましくは、上記酵母はSaccharomyces cerevisiae亜種Boulardiiである。
【００８４】
乳酸菌による、経口及び膣送達の両方を含めた粘膜への異種タンパク質（すなわち非乳酸菌タンパク質）の送達が記載されており（Steidler and Rottiers, 2006; Liu et al., 2006）、それによりこれらの乳酸菌は抗原及び免疫抑制化合物の両方の送達に極めて適したものになっていることから、最も好ましくは、上記プロバイオティック微生物は乳酸菌である。ラクトコッカス・ラクティスは非病原性、非侵襲性、非コロニー形成のグラム陽性菌である。多様な遺伝子操作ラクトコッカス・ラクティス株が、腸粘膜への免疫調節タンパク質の局所合成及び送達のために作成されている。さらに、遺伝子操作ラクトコッカス・ラクティスの臨床応用を実現可能な戦略とする生物学的封じ込めシステムが確立されている。
【００８５】
好ましい一実施の形態では、該微生物はラクトコッカス・ラクティスｔｈｙＡ突然変異体である。特に好ましい実施の形態では、ラクトコッカス・ラクティスｔｈｙＡ突然変異体が使用され、ここで抗原をコードする遺伝子はｔｈｙＡ遺伝子を破壊するために使用されている。
【００８６】
栄養補助食品及びメディカルフード
本発明の化合物及び組成物は、ニュートラシューティカル（nutraceutical）、機能性食品若しくはメディカルフードとして、又は上記ニュートラシューティカル、機能性食品、若しくはメディカルフード中の添加物として使用され得ることが認識されよう。別の実施の形態は、好ましくはヒトの消費に適合する、ニュートラシューティカル及び香味料を含む食品又は飲料を提供し、ここで、そのニュートラシューティカルは、農産物からの抽出物を含む。
【００８７】
液体抽出物の形態であろうと乾燥組成物の形態であろうと、ニュートラシューティカルは食用であり、ヒトが直接食てもよいが、好ましくは添加物又は栄養補助食品の形態で、例えば健康食品店で販売されている類の錠剤の形態で、又は食用固形物中の成分、より好ましくはシリアル、パン、豆腐、クッキー、アイスクリーム、ケーキ、ポテトチップ、プレッツェル、チーズ等の加工食品として、及び飲用液体、例えば牛乳、ソーダ、スポーツ飲料及び果汁等の飲料に入れてヒトに提供される。したがって一実施の形態では、有効な量のニュートラシューティカルと食品又は飲料を混合して、食品又は飲料の栄養価を高めることによる、食品又は飲料の栄養価を高めるための方法が提供される。
【００８８】
別の実施の形態は、ニュートラシューティカルと食品又は飲料を混合して栄養的に高まった食品又は飲料を生産することを含む、食品又は飲料の栄養価を高めるための方法を提供し、ここで、そのニュートラシューティカルは、その食品又は飲料の栄養価を高めるために有効な量で混合され、ここで、そのニュートラシューティカルは、本発明の抗原を含む農作物からの抽出物を含み、ここで、栄養的に高まった食品又は飲料は、さらに香味料を含むことがある。好ましい香味料には、砂糖、コーンシロップ、果糖、デキストロース、マルトデキストロース、シクラメート、サッカリン、フェニルアラニン、キシリトール、ソルビトール、マルチトール及びハーブ甘味料、例えばステビア等の甘味料が含まれる。
【００８９】
本明細書に記載されるニュートラシューティカルは、ヒトの消費を意図され、したがってそれらを得るための工程は、好ましくは優良製造規範（ＧＭＰ）及び該工程に適用される任意の適用可能な政府規制にしたがって行われる。特に好ましい工程は、天然由来溶媒のみを利用する。本明細書に記載されるニュートラシューティカルは、好ましくは比較的高レベルの健康増進物質を含む。ニュートラシューティカルを、相互に混合してその健康増進効果を増大することができる。
【００９０】
ニュートラシューティカルとは対照的に、いわゆる「メディカルフード」は、一般の人々に使用されることを予定しておらず、店舗又はスーパーマーケットでは入手できない。メディカルフードは、低脂肪食品又は低ナトリウム食品等の、疾患のリスクを減少させるための健康食の中に含まれる食品ではなく、体重減少製品でもない。疾患状態又は健康状態を管理するために患者が特殊な栄養要求を有し、その患者が医師の継続的な治療を受けている場合に、その医師はメディカルフードを処方する。ラベルは、その製品が特定の医学的障害又は状態を管理するために使用されることを意図することをはっきりと提示しなければならない。メディカルフードの例は、慢性炎症状態を有する患者のためにターゲティングされた栄養支援を提供するように設計された栄養的に多様なメディカルフードである。この製品の活性化合物は、例えば本明細書に記載される化合物の一つ又は複数である。機能性食品は、低脂肪食品若しくは低ナトリウム食品、又は体重減少製品等の、疾患のリスクを減らす健康食の中に含まれる食品を包含することがある。したがって本発明は、本発明によるニュートラシューティカルを含む食品又は飲料を考えている。
【００９１】
当業者は、本発明の好ましい実施の形態に多数の変更及び改変を加えることができ、そのような変更及び改変は本発明の精神から逸脱せずに行うことができることを認識しているものである。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神及び範囲の中に属するそのような均等な改変の全てを包含することが意図される。
【００９２】
加えて、本発明の化合物の記載に使用される全ての用語は、当技術分野において既知であるそれらの意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ＬＬ−ＯＶＡの経口摂取がＤＴＨ反応を有意に低減することを示す図である。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目にＯＶＡ／ＣＦＡの皮下注射により感作し、２１日目にＯＶＡ／ＩＦＡのブースト免疫を行なった。７日目〜１１日目、１４日目〜１８日目、２１日目〜２５日目及び２８日目〜３１日目にマウスをＢＭ９、ＬＬｐＴＲＥＸＩ、ＬＬ−ＯＶＡ及び１μｇのＯＶＡで経口処理した。３１日目に、マウスの耳介に１０μｌの生理食塩水中１０μｇのＯＶＡを抗原投与した。抗原投与の２４時間後、ＤＴＨ反応は、両耳へのＯＶＡ抗原投与の前後の耳厚の差異として表れた。図中英文は以下の意味：Increase in ear thickness mm-2   耳厚の増加（ｍｍ−２）
【図２】ＬＬ−ＯＶＡの経口摂取が、バルク脾細胞のＯＶＡ特異的増殖（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ）産生、ＩＬ−６（Ｃ）産生及びＩＬ−１０（Ｄ）産生を有意に低減することを示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目にＯＶＡ／ＣＦＡの皮下注射により感作し、２１日目にＯＶＡ／ＩＦＡのブースト免疫を行なった。２１日目〜２５日目及び２８日目〜３１日目に、マウスをＢＭ９、ＬＬｐＴＲＥＸ１及びＬＬ−ＯＶＡで経口処理した。３１日目に、バルク脾細胞を単離し、ＯＶＡ特異的増殖（異なるＯＶＡ濃度での平均ｃｐｍ±ＳＥＭとして表される）、並びに１００μｇ／ｍｌのＯＶＡでのｅｘ  ｖｉｖｏ刺激の７２時間後のＩＦＮ−γ産生、ＩＬ−６産生及びＩＬ−１０産生について試験した。図中英文は以下の意味：Bulk splenocytes  バルク脾細胞Bulk spleen IFN-g バルク脾臓ＩＦＮ−ｇBulk spleen IL-6  バルク脾臓ＩＬ−６Bulk spleen IL-10 バルク脾臓ＩＬ−１０
【図３】ＬＬ−ＯＶＡの経口摂取が、ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞のＯＶＡ特異的増殖を有意に低減することを示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目にＯＶＡ／ＣＦＡの皮下注射により感作し、２１日目にＯＶＡ／ＩＦＡのブースト免疫を行なった。２１日目〜２５日目及び２８日目〜３１日目に、マウスをＢＭ９（Ａ）、ＬＬｐＴＲＥＸＩ（Ｂ）及びＬＬ−ＯＶＡ（Ｃ）で経口処理した。３１日目に、バルク脾細胞を単離し、１００μｇ／ｍｌのＯＶＡでの９０時間のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激の後、ＣＦＳＥ及びＣＤ４−ＡＰＣ標識及びフローサイトメトリー分析によりＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞のＯＶＡ特異的増殖について試験した。図中英文は以下の意味：CD4+ SpleenＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞Count 数
【図４】ＬＬ−ＯＶＡ処理マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞が、未処理レシピエントに寛容を移行することを示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目にＯＶＡ／ＣＦＡの皮下注射により感作し、２１日目にＯＶＡ／ＩＦＡのブースト免疫を行なった。２１日目〜２５日目及び２８日目〜３１日目に、マウスをＢＭ９、ＬＬｐＴＲＥＸ１及びＬＬ−ＯＶＡで経口処理した。３１日目にＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞を単離し、寛容移行能を試験した。ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞によるＬＬ−ＯＶＡ及びＬＬ−ｐＴＲＥＸ処理マウスから未処理レシピエントへの寛容の移行は、ＤＴＨ反応に関する未処理レシピエントの感作及び抗原投与により評価したが、これは抗原投与の２４時間後に、両耳へのＯＶＡ抗原投与の前後の耳厚の差異として表れた。図中英文は以下の意味：Increase in ear thickness mm-2  耳厚の増加（ｍｍ−２）LLpTREX CD4+spleenic T cells ＬＬｐＴＲＥＸ  ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞LLOVA CD4+spleenic T cells   ＬＬ−ＯＶＡ  ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞
【図５】ＮＯＤ  ＡＢ０  ＤＱ８トランスジェニックマウスを、１日目にＣＦＡ中１００μｇのｅＤＱ８ｄを皮下注射することにより免疫化した。１〜１０日目にマウスをＬＬ−ｅＤＱ８ｄ又はＬＬ−ｐＴ１ＮＸで経口処理した。対照マウスにはＢＭ９を与えた。１０日目に、マウスの耳介に１０μｌの生理食塩水中１０μｇのｅＤＱ８ｄを抗原投与した。ＤＴＨ反応は、注射の２４時間後の増大の平均値からｅＤＱ８ｄ抗原投与前の耳厚を減算した値として表す。結果は１群に６匹のマウスを含む３つの独立実験のデータをまとめたものである。図中英文は以下の意味：Increase in ear thickness mm-2  耳厚の増加（ｍｍ−２）Control 対照（ＢＭ９）Control 対照（ＮＯＤ  ＡＢ０）
【図６】ＤＴＨ測定の後、ＢＭ９群（対照）、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ群及びＬＬ−ｅＤＱ８ｄ群の脾臓（Ａ）及び鼠径リンパ節（Ｂ）を単離し、５０μｇのｅＤＱ８ｄペプチドでｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激した。バルク脾細胞（ｐ＝０．０４８）及び鼠径リンパ節細胞（ｐ＝０．００２２）のｅＤＱ８ｄ特異的増殖反応は、平均ｃｐｍとして表した。図中英文は以下の意味：Control 対照（ＢＭ９）
【図７】脾臓細胞（Ａ）及び鼠径リンパ節細胞（Ｂ）の上清中のサイトカイン測定を再刺激の２４時間後に実行した。結果は少なくとも２つの別個の実験を表すサイトカイン分泌の平均（ｐｇ／ｍｌ）である。図中英文は以下の意味：Control 対照（ＢＭ９）
【図８】脾臓ｅＤＱ８ｄ特異的増殖の減少がＩＬ−１０及びＴＧＦ−βに依存することを示す図である。
【実施例】
【００９４】
実施例Ａ：ＯＶＡを送達する遺伝子操作ラクトコッカス・ラクティスによるＯＶＡ感作野生型マウスへのＯＶＡ特異的寛容の誘導
序論
この目的で本発明者らは、ＯＶＡ分泌ＬＬ（ＬＬ−ＯＶＡ）を遺伝子工学によって作成し、自己免疫／アレルギーに対する治療モデル、すなわちＯＶＡ免疫化モデルにおいて全身寛容の誘導を評価した。
【００９５】
材料及び方法
細菌及び培地：ラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３（ＬＬ）株を遺伝子操作し、この研究全体にわたって使用した。０．５％グルコース及び５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Abbott）で補充したＭ１７ブロスから成るＧＭ１７Ｅ培地（Difco Laboratories、Detroit、MI）において細菌を培養した。ＬＬ株の懸濁原液（Stock suspensions）は、ＧＭ１７Ｅ培地で５０％グリセロール中−２０℃で保管した。懸濁原液をＧＭ１７Ｅ培地で５００倍に希釈し、３０℃で一晩インキュベートした。１６時間以内に、２×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの飽和密度に達した。遠心分離により細菌を採取し、ＢＭ９培地に２×１０１０細菌／ｍｌで再懸濁した。各マウスに１００μｌのこの懸濁液を胃内カテーテルによって毎日与えた。
【００９６】
プラズミド：Gallus gallus（ニワトリ）卵アルブミンをコードしているｍＲＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ（アクセッション番号ＡＹ２２３５５３）及び公開されているデータから検索した。総ＲＮＡをニワトリ子宮部から単離し、ｃＤＮＡは、体積２５μｌ中の総ＲＮＡ  ２μｇ、２μＭオリゴｄＴプライマー（Promega Corporation Benelux, Leiden, The Netherlands）、０．０１ｍＭ  ＤＴＴ（Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands）、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（Invitrogen, Merelbeke, Belgium）、Ｒｎａｓｉｎ（PromegaIncorporation Benelux）２０Ｕ、及びｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）１００Ｕを使用して合成した。ＯＶＡ  ｃＤＮＡ断片は、以下のプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた：フォワードプライマー：５’−ＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴ−３’（配列番号：９）及びリバースプライマー：５’−ＡＣＴＡＧＴＴＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡ−３’（配列番号：１０）。反応条件は９４℃２分に続いて、９４℃４５秒、６２℃３０秒、及び７２℃９０秒を３０サイクル。増幅された断片は、ラクトコッカスＰ１プロモーター１７の下流で、エリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させた。ＯＶＡ  ｃＤＮＡを保有するプラスミドで形質転換したＭＧ１３６３株は、ＯＶＡを分泌しているラクトコッカス・ラクティス（ＬＬ−ＯＶＡ）とした。空のベクターであるｐＴＲＥＸ１を含むＭＧ１３６３であるラクトコッカス・ラクティス−ｐＴＲＥＸ１（ＬＬ−ｐＴＲＥＸ）を対照として利用した。
【００９７】
マウス：７週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Charles River Laboratories（Calco, Italy）から得た。これらのマウスを特定病原体除去条件で飼育し、標準的な実験室用飼料及び水道水を自由摂取させた。動物実験は、Ghent大学、the Department for MolecularBiomedical Researchの倫理委員会により承認された（ファイル番号０７／０２９）。
【００９８】
抗原：全ての実験において、無傷のＬＰＳフリーＯＶＡグレードＶタンパク質（Sigma Aldrich）を抗原として使用した。
【００９９】
マウスの免疫化及び経口寛容の誘導：第１日目に、ＣＦＡ（Difco、BD Bioscience、Erembodegem、Belgium）と生理食塩溶液との１：１の混合物１００μｌ中１００μｇのＯＶＡを尾の付け根へ皮下注射することにより、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。７日目〜１１日目、１４日目〜１８日目、２１日目〜２５日目及び２８日目〜３１日目（計画１）、及び２１日目〜２５日目及び２８日目〜３１日目（計画２）に、１００μｌのＢＭ９に溶解したＬＬ−ＯＶＡ、ＬＬ−ｐＴＲＥＸ１、又は１μｇの精製ＯＶＡを毎日投与した。対照マウスにはＢＭ９のみを与えた。抗原又は細菌の懸濁液を、１８ゲージステンレス動物給餌ニードルを用いて胃に導入した。２１日目に、ＩＦＡ（Sigma-Aldrich）の１：１混合物１００μｌ中１００μｇのＯＶＡを皮下注射することにより、ブースト免疫を行なった。寛容誘導をＤＴＨ反応、サイトカイン及びＯＶＡ特異的増殖の測定、及び養子移入実験により評価した。
【０１００】
遅延型過敏反応：３１日目に、抗原特異的ＤＴＨ反応をＯＶＡの注射により評価した。２４時間後、ＤＴＨ測定を実行した。抗原特異的ＤＴＨ反応の測定のために、マウスの耳介に生理食塩水１０μｌ中１０μｇのＯＶＡで抗原投与した。抗原投与による耳厚の増大として定義される耳の腫脹を、抗原投与の２４時間後にデジタルマイクロメータ（Conrad、Belgium）を用いて盲検方式で測定した。ＤＴＨ反応は、両耳へのＯＶＡ抗原投与前後の耳厚の差異として表れた。
【０１０１】
ＯＶＡ特異的増殖及びサイトカイン検定：３９日目に、脾臓を採取し、脾細胞をＯＶＡ特異的増殖及びサイトカイン産生について評価した。細胞を７０μｍセルストレーナー（Becton/Dickinson Labware）に通すことにより、脾臓の単一細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液中の赤血球を、赤血球溶解バッファーとのインキュベートにより溶解した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット及びｍｉｄｉＭＡＣＳカラム（Miltenyi Biotec、Germany）を用いて濃縮した。
【０１０２】
全脾細胞集団の増殖を検定するために、２×１０５個の細胞を、９６ウェルＵ底プレートにおいて全容量で２００μｌの完全培地（すなわち、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａｍａｘ、０．４ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ−１６４０）中で、単独で、又は１．２μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加したＯＶＡと共に培養した。５，６−ＣＦＳＥ標識（Invitrogen、Merelbeke、Belgium）により増殖をさらに評価した。脾細胞をＰＢＳ中に１０７／ｍｌで再懸濁し、最終濃度１０μＭのＣＦＳＥ中で３７℃で１２分間インキュベートした。標識された細胞を氷冷完全培地で２回洗った後、９６ウェルＵ底プレートにおいて全容量で２００μｌの完全培地中で１００μｇ／ｍｌのＯＶＡと共に２×１０５個の細胞数で培養した。加湿インキュベーターにおいて３７℃及び５％ＣＯ２中での９０時間の培養後、細胞を採取し、細胞をアロフィコシアニン標識抗ＣＤ４（BD、Biosciences）で染色し、フローサイトメトリー（FACSCanto、BD Biosciences）を用いて増殖を求めた。
【０１０３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を検定するために、２×１０５個の細胞数のＣＤ４＋Ｔ細胞を、全容量で２００μｌの完全培地中１／１、１／０．３、１／０．１、１／０．０３及び１／０の比率の抗原提示細胞として働くマイトマイシンＣ処理ＯＶＡ負荷脾細胞と共に、９６ウェルＵ底プレートにおいて培養した。細胞を加湿インキュベーターにおいて３７℃及び５％ＣＯ２で９０時間培養した。増殖検定のために、培養の最後の１８時間に１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジンを添加し、ガラス繊維フィルタマット（Perkin Elmer、Boston、USA）上でＤＮＡを採取し、ＤＮＡ結合放射能をシンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定した。サイトカイン測定のために、異なる増殖検定で使用された細胞培養上清を７２時間の培養後に回収し、−２０℃で凍結した。サイトカイン産生を、Ｍｏｕｓｅ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（BD Biosciences、Mountain View、CA、USA）を用いて定量化した。
【０１０４】
養子移入実験：３９日目に、脾臓を処理群から回収した。脾臓を刻み、７０μｍセルストレーナー（Becton／Dickinson Labware）を通して濾すことにより、単一細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を上記のようにＣＤ４＋Ｔ細胞について濃縮した。ＣＤ４＋濃縮細胞を、１×１０６個のＣＤ４＋Ｔ細胞の静脈注射により未処理ＢＡＬＢ／ｃ受容マウスに養子移入した。養子移入の１日後に、１００μｇのＯＶＡ／２５μｌの生理食塩水／２５μｌのＩＦＡ（Sigma-Aldrich）を尾の付け根に皮下注射することにより全マウスを感作し、その５日後に、上記のＤＴＨプロトコルに従ってマウスに抗原投与した。
【０１０５】
統計分析：群間での耳厚及びサイトカイン測定の差異の有意性を、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて試験した。統計有意性は、＊（ｐ＜０．０５）又は＊＊（ｐ＜０．０１）として示す。
【０１０６】
結果
ＬＬ−ＯＶＡは、ＯＶＡ免疫化モデルにおいて寛容誘導能を遊離ＯＶＡと比較して有意に高める。
経口寛容の誘導を研究するために、マウスを上記のように経口摂取させた。ＯＶＡ感作ＢＡＬＢ／ｃマウスへのＬＬ−ＯＶＡの投与により、ＤＴＨ反応において、感作対照マウス（ＢＭ９群）及びＬＬ−ｐＴＲＥＸ１又は１μｇの精製ＯＶＡで処理したマウスと比較して有意な減少がもたらされた（図１）。
【０１０７】
これらのデータでは、ＬＬ−ＯＶＡ処理マウスのバルク脾細胞の増殖能、並びにＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０及びＩＬ−６の産生（図２）において、ＢＭ９処理群又はＬＬ−ｐＴＲＥＸ１処理群と比較して有意な減少が見られる。
【０１０８】
ＬＬ−ＯＶＡはＣＤ４＋Ｔ細胞を介して経口寛容を高める。
ＣＤ４＋Ｔ細胞が経口寛容の誘導を媒介するか否かを評価するために、脾細胞においてＯＶＡ特異的増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を研究した。フローサイトメトリーによって、ＬＬ−ＯＶＡ群のＯＶＡ再刺激の後、ＢＭ９群及びＬＬ−ｐＴＲＥＸ１群の４．５％及び１１．６％と比較して、ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞の０．８％しか増殖しないことが実証された（図３）。さらに、ＬＬ−ＯＶＡ処理群から未処理ＢＡＬＢ／ｃマウスへのＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞の養子移入によって、受容マウスのＯＶＡでの免疫化及び抗原投与の後、これらの細胞がＤＴＨ反応を低減可能であるように、これらの細胞は寛容を移行することができることが実証された（図４）。
【０１０９】
結論
ここで、本発明者らは、ＯＶＡ分泌ラクトコッカス・ラクティスの胃内投与により、ＣＤ４＋制御性の誘導を介してＯＶＡ特異的Ｔ細胞反応が抑制されることを実証した。本発明者らは、この免疫寛容誘導は遊離ＯＶＡタンパク質よりも強力であり、これは治療の設定において確立することができることを実証した。
【０１１０】
実施例Ｂ：ＤＱ８特異的免疫優勢グリアジンエピトープをグルテン感作クラスＩＩトランスジェニックマウスに送達する遺伝子操作ラクトコッカス・ラクティスによる抗原特異的経口寛容の誘導。
序論
セリアック病（セリアックスプルー又はグルテン過敏性腸疾患としても知られる）は、グルテンを含有する特定の食用穀物に対する免疫反応から発症する慢性炎症性疾患である。セリアック病は、ヒト白血球抗原変異体であるＨＬＡ−ＤＱ２又はＨＬＡ−ＤＱ８をコードする遺伝子と強く関連する複合多遺伝子性障害である。セリアック病の病因において最も重要な側面の１つは、Ｔヘルパー１免疫反応の活性化である。これはＨＬＡ−ＤＱ２／ＤＱ８分子を発現する抗原提示細胞が、毒性グルテンペプチドをＣＤ４（＋）Ｔ細胞に対して提示する場合に起こる。グルテンタンパク質クラスのグリアジン及びグルテニンは共に、ＤＱ２及びＤＱ８に結合するペプチドを含有する。グルテン特異的Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの産生等の免疫反応は、セリアック病患者の小腸において粘膜の破壊を誘発することが一般に認められている。したがって、セリアック病患者の腸における有害な免疫Ｔ細胞反応の活性化は、疾患の発症及び進行において鍵であると思われる。
【０１１１】
抗原特異的免疫抑制は、セリアック病の治療の魅力的な治療目標である。ラクトコッカス・ラクティス（ＬＬ）の遺伝子操作による組み換えグルテンタンパク質／ペプチドの腸粘膜での能動的送達によって、寛容誘導に対する新規の治療アプローチがもたらされる。この目的で、本発明者らは、脱アミド化ＤＱ８エピトープ分泌ＬＬ（ＬＬ−ｅＤＱ８ｄ）を遺伝子操作し、グルテン感作ＮＯＤ  ＡＢ０  ＤＱ８クラスＩＩトランスジェニックマウスにおける経口補給後の局所及び全身の免疫反応を評価した。
【０１１２】
ここで、本発明者らは、グリアジンペプチド産生ラクトコッカス・ラクティスの経口送達が、抗原特異的ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の誘導を介してグリアジン特異的免疫反応を抑制することを実証する。
【０１１３】
材料及び方法
細菌及び培地：ラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３（ＬＬ）株を遺伝子操作し、この研究全体にわたって使用した。細菌をＧＭ１７Ｅ培地（０．５％グルコース及び５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Abbott）で補充したＭ１７ブロス（Difco、Laboratories、Detroit、MI））中で培養した。ＬＬ株の懸濁原液は、ＧＭ１７Ｅ培地において５０％グリセロールに入れて−２０℃で保管した。懸濁原液をＧＭ１７Ｅ培地で２００倍に希釈し、３０℃で一晩インキュベートした。１６時間以内の培養で、２×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの飽和密度に達した。細菌を遠心分離により採取して、ＢＭ９接種バッファー中で２×１０９細菌／１００μｌで１０倍に濃縮した。処理のために、各マウスに１００μｌのこの懸濁液を胃内カテーテルにより毎日与えた。
【０１１４】
プラスミド：脱アミド化ＤＱ８エピトープをコードする配列（コード化ＤＱ８ｄ：ｃａａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｔｃａ  ｇｇｔ  ｇａａ  ｇｇｔ  ｔｃａ  ｔｔｃ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｃａ  ｃａａ  ｇａａ  ａａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｇｃｔ（配列番号：１））を公表データから検索した。手短に言うと、α−グリアジンペプチド中の２つのグルタミン残基をグルタミン酸に変換し、ＤＱ８保有セリアック病患者に対して脱アミド化免疫優勢α−グリアジン反応を誘発させると、このエピトープはこれらのマウスのＴ細胞により認識される。ＤＱ８ｄのｃＤＮＡ断片を合成的に作成し（オペロン、The Netherlands）、以下のフォワードプライマー：５’−ｃａａｔａｃｃｃａｔｃａｇｇｔｇａａｇｇｔｔｃ−３’（配列番号：１１）及びリバースプライマー：５’−ｃｇａｃｔａｇｔｔａａｇｃｔｔｇｔｇｇｇｔｔｔｔｃｔｔｇｔｇａｔ−３’（配列番号：１２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。検出目的で、断片に以下の配列：ｇｇｔ  ｇｃｔ  ｃｃａ  ｇｔｔ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｇａｔ  ｃｃａ  ｃｔｔ  ｇａａ  ｃｃａ  ｃｇｔ（配列番号：１３）から成るｅタグ（ｅ）を付けた。ｅタグをＤＱ８ｄ遺伝子の５’末端に付加するために、工程１において作成したＰＣＲ産物（ＤＱ８ｄ）をＰＣＲにおいて鋳型として、オリゴヌクレオチド：５’−ｇｇｔｇｃｔｃｃａｇｔｔｃｃａｔａｃｃｃａｇａｔｃｃａｃｔｔｇａａｃｃａｃｇｔｃａａｔａｃｃｃａｔｃａ−３’（配列番号：１４）及び５’−ｃｇａｃｔａｇｔｔａａｇｃｔｔｇｔｇｇｇｔｔｔｔｃｔｔｇｔｇａｔ−３’（配列番号：１５）と共に使用した。増幅断片を、ラクトコッカスＰ１プロモーターの下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合した。ｅＤＱ８ｄのｃＤＮＡを保有するプラスミドで形質転換したＭＧ１３６３株を、ｅＤＱ８ｄを分泌するラクトコッカス・ラクティス（ＬＬ−ｅＤＱ８ｄ）とした。空のベクターｐＴ１ＮＸを含有するＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸを対照とした。
【０１１５】
分泌されたエピトープの機能分析：分泌されたｅＤＱ８ｄエピトープの機能分析のために、セリアック病（ＣＤ）患者の腸に由来するヒトＴ細胞クローンを用いた増殖検定を実行した。細菌を上記のように一晩増殖させ、１：５０に希釈し（deluded）、それぞれさらに４時間又は６時間増殖させた。グルテンに特異的なＴ細胞のクローンを、数年間無グルテン食をとっていたオランダ人の成人ＣＤ患者である患者Ｓから採取した小腸の生検から作成した。該患者には研究に対して、病院倫理委員会によって承認されているインフォームドコンセントを与えた。該患者はＨＬＡ−ＤＲ３／４、ＤＱ２／８であると血清学的に分類され、したがってＣＤ関連ＤＱダイマーの両方を保有していた。Ｔ細胞クローンＩＩ２９はＨＬＡ−ＤＱ８に結合する場合に、最小限の９個のアミノ酸コア：ＱＧＳＦＱＰＳＱＱを有するα−グリアジン誘導ペプチドに応答することを見出した。組織トランスグルタミナーゼの活性によるＰ１及び／又はＰ９グルタミン残基（Ｑ）のグルタミン酸（Ｅ）への脱アミド化が、このグルテンペプチドのＴ細胞刺激能を実質的に高めることを見出した。増殖検定は、幾つかの濃度の上清の非存在又は存在下で１０５個のＨＬＡ−ＤＱに適合した３０００ＲＡＤ照射末梢血単核細胞で刺激した１０４個のＴ細胞を用いて、９６ウェル平底プレート（Falcon）において１５０μｌの培養培地（Iscoves）中で二連又は三連で実行した。４８時間後、培養物を０．５ｕＣｉの３Ｈ−チミジンでパルスして、その１８時間後に採取し、増殖の指標として３Ｈ−チミジン取り込みを求めた。
【０１１６】
マウス：内因性ＭＨＣ  ＩＩ欠損背景においてＨＬＡ−ＤＱ８を発現するトランスジェニックマウス（ＡＢ０  ＤＱ８＋）を、ＮＯＤマウスに１０世代の間戻し交配し、交雑させてコンジェニックＮＯＤ  ＡＢ０  ＤＱ８＋マウスを作成した。７週〜１６週齢のマウスを実験に使用した。マウスは離乳させ、８週〜１２週齢まで従来の動物施設において維持した。
【０１１７】
抗原及び抗体：ｅタグを有する（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲＱＹＰＳＧＥＧＳＦＱＰＳＱＥＮＰＱＡ（配列番号：１６））、及び有しない（ＱＹＰＳＧＥＧＳＦＱＰＳＱＥＮＰＱＡ（配列番号：２））脱アミド化ＤＱ８エピトープを合成した。Ｔ細胞の表現型検定のために、ＣＤ４抗体及びＣＤ２５抗体をBD-Biosciences（San Jose、CA）から、及びＡＰＣ抗Ｆｏｘｐ３染色キットをeBiosciences（San Diego、USA）からそれぞれ購入した。抗ＩＬ−１０中和モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、クローンＪＥＳ０５２Ａ５）、ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、クローン１Ｄ１１）及びＬＡＰ中和抗体（１μｇ／ｍｌ、クローン２７２３５）はR&D systems（Minneapolis、MN）から得た。
【０１１８】
経口給餌及びＤＴＨ（遅延型過敏）反応：無グルテン飼料を与えていたＮＯＤ  ＡＢ０  ＤＱ８マウスを、１日目に１００μｌの１：１ＣＦＡ（Difco of Becton、Dickinson and Company、San Jose、CAから購入）生理食塩溶液中１００μｇの脱アミド化ｅＤＱ８ペプチドを尾の付け根に皮下注射することにより感作した。感作に使用されるペプチドは分泌されたエピトープと同じ配列を有していた。マウスに陰性対照としてＢＭ９、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ又はＬＬ−ｅＤＱ８ｄ（全て１日目〜１０日目に１００μｌのＢＭ９中に溶解した）を給餌した。給餌は、抗原又は細菌の懸濁液を１８ゲージステンレス強制飼養ニードルを用いて胃内投与することにより実行した。免疫化の１０日後、抗原特異的ＤＴＨ反応を評価した。その２４時間後、ＤＴＨ測定を実行した。抗原特異的ＤＴＨ反応の測定のために、マウスの耳介に生理食塩水１０μｌ中１０μｇのｅＤＱ８ｄを抗原投与した。耳厚の増大を、抗原投与の２４時間後に技術者用マイクロメータ（Mitutoyo、Tokyo、Japan）を用いて盲検方式で測定した。ＤＴＨ反応は抗原投与前の耳厚を減算した後のｅＤＱ８ｄ注射の２４時間後の増大の差として表した。続いてマウスを屠殺して、脾臓及びリンパ節を採取し、細胞をＤＱ８ｄ特異的増殖及びサイトカイン産生について評価した。ｅタグ干渉のために、１日目にＮＯＤ  ＡＢ０  ＤＱ８マウスを尾の付け根で、１：１完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Difco、BD）生理食塩溶液１００μｌ中のＥタグを有する（ｅＤＱ８ｄ）又は有しない（ＤＱ８ｄ）脱アミド化ＤＱ８ペプチド１００μｇで免疫化した。７日目に、マウスのＤＴＨ測定を、免疫化に使用されるペプチドと対応するｅタグを有する又は有しない１０μｇのＤＱ８ｄを用いて上記のように実行した。
【０１１９】
細胞培養、増殖及びサイトカイン産生の検定：脾臓及びリンパ節の細胞懸濁液を、実験の１１日目に１×ＰＢＳ中で組織グラインダーを用いて組織を均質化することにより組織を均質化した。ＡＣＫ（塩化アンモニウム／カリウム（溶解バッファー））とインキュベートすることにより、赤血球を脾臓細胞懸濁液から除去した。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、培地単独、１０μｇのＣｏｎ  Ａ、又は５０μｇのｅＤＱ８ｄエピトープのいずれかを含有する補充物を有するＲＰＭＩ１６４０（１．５％Ｈｅｐｅｓ、１％Ｐｅｎｓｔｒｅｐ及び１０％ＦＢＳ）中、０．２ｍｌの容量で５×１０５細胞／ウェルで３７℃でインキュベートした。別個の実験では、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０＆ＴＧＦ−β又はＬＡＰ中和抗体を、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄ処理マウスの脾細胞に添加した。培養の最後の２４時間に１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジンを添加することにより、２４時間後に増殖を評価した。ＤＮＡ結合放射能をガラス繊維フィルタマット上で採取し、チミジンの取り込みをシンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定した。結果は三連のウェルの平均ｃｐｍとして表した。サイトカイン測定のために、上記の異なる増殖検定において使用した細胞培養物の上清を培養の２４時間後に回収し、サイトカイン分析を実行するまで−２０℃で凍結した。サイトカイン産生をＭｏｕｓｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（BD Biosciences）を用いて定量化した。
【０１２０】
フローサイトメトリー分析：ＢＭ９、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ又はＬＬ−ｅＤＱ８ｄ処理マウスの脾臓及び腸管関連リンパ節組織（ＧＡＬＴ）を単離して、上記のように調製し、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３について染色した。細胞内染色を、メーカーの使用説明書（eBiosciences、San Diego、CA）に従ってＦｏｘｐ３について実行し、続いてBecton DickinsonのＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでのフローサイトメトリーを用いて測定した。分析のために、細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−亜集団に分け（gated）、これらの集団内で、Ｆｏｘｐ３ヒストグラムを平均蛍光強度（ＭＦＩ）を求めるために使用した。
【０１２１】
統計分析：サイトカイン測定からの結果は平均±ＳＥＭとして表す。ｅＤＱ８ｄ特異的増殖、耳厚及びサイトカイン測定の有意性を、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてスチューデントｔ検定比較（２つの試料を等分散であると仮定する）を用いて試験し、個々の群間の差異を求めた。両試験の統計有意性を示すために、全試験でｐ値＜０．０５：＊、＜０．０１：＊＊を使用した。
【０１２２】
結果
ラクトコッカス・ラクティスによるｅＤＱ８ｄエピトープの粘膜送達は、バルク脾臓細胞及び鼠径リンパ節細胞のＤＱ８ｄ誘導ＤＴＨ反応及び増殖能を有意に減少させた。
ｅＤＱ８ｄ免疫化ＮＯＤ  ＡＢ０  ＤＱ８クラスＩＩトランスジェニックマウスにおけるＬＬ−ｅＤＱ８ｄの毎日の胃内投与により、ＤＴＨ反応において感作陰性対照マウス（図５）と比較して有意な減少がもたらされた。（ＢＭ９を給餌した）対照マウスはｅＤＱ８ｄに対して明らかに免疫化されていたが、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄの毎日の胃内投与は、ＤＴＨを有意に低下させた（１３．１×１０−２ｍｍ対５．１×１０−２ｍｍ、ｐ＝０．００３１）。ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ処理マウスでは、耳腫脹も対照と比較してわずかに低下したが（９．３×１０−２ｍｍ対１３．１×１０−２ｍｍ、ｐ＝０．０３４３）、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄ処理マウスよりも程度は低かった。非ＤＱ８トランスジェニックＮＯＤ  ＡＢ０マウスは、わずかな耳厚の増大（３．２×１０−２ｍｍ）のみを示した。これらのデータは、経口投与されるＬＬ−ｅＤＱ８ｄが免疫化ＮＯＤ  ＡＢ０  ＤＱ８トランスジェニックマウスにおいて全身炎症性Ｔ細胞反応を抑制し、分泌された抗原が有意な寛容原性効果の誘導に必要であることを示す。これらのデータでは、脾細胞及び鼠径リンパ節細胞の増殖能の有意な減少が認められる（図６）。増殖反応の低下は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの脾細胞のｅＤＱ８ｄ刺激後のＩＬ−１０の有意な上方制御、及びＩＬ−１２産生の下方制御を伴っていた（図７）。さらに、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄは鼠径リンパ節において、ｅＤＱ８ｄ誘導ＩＦＮ−γ産生をＢＭ９及びＬＬ−ｐＴ１ＮＸ処理マウスと比較して有意に低下した。これらのデータは共に、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄ処理がｅＤＱ８ｄ刺激後のＴ細胞活性化を抑制することを示し、ＤＣ活性化も調節され得る（my also be）ことを示唆している。
【０１２３】
脾臓ｅＤＱ８ｄ特異的増殖の減少はＩＬ−１０及びＴＧＦ−βに依存し、ＬＬ−ＤＱ８ｄ処理は脾臓及びＧＡＬＴのＦｏｘｐ３発現を有意に増大させる
ｅＤＱ８ｄ特異的脾臓増殖反応に対するＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、及びＬＡＰ（膜関連ＴＧＦ−β）の機能的重要性を中和抗体を用いて分析した。ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β又はＬＡＰの中和抗体は、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄ処理マウスの脾臓増殖反応の低下を有意に阻害しなかったが、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０中和モノクローナル抗体の組み合わせを添加することで、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄ処理マウスの脾細胞のｅＤＱ８ｄ特異的増殖能の低下が完全になくなった（図８）。これらのデータは、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄ処理により、ｅＤＱ８ｄ免疫化ＮＯＤ  ＡＢ０  ＤＱ８クラスＩＩトランスジェニックマウスにおけるＴ細胞活性化が抑制可能となり、この抑制はＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの両方に依存的であることを強く示唆している。さらに、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄ処理マウスの脾臓ＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞集団において、対照（ＢＭ９）と比較して有意なＦｏｘｐ３の上方制御が見られる（それぞれＭＦＩ  １７１対６１及び３５対６）。注目すべきことに、ＣＤ４＋ＣＤ２５−集団ではＬＬ−ｅＤＱ８ｄ処理マウスの腸管関連リンパ節組織（ＧＡＬＴ）においても、ＢＭ９処理と比較してＦｏｘｐ３が上方制御されたが（ＭＦＩ  ７３対３０）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団のＧＡＬＴにおいては上方制御されなかった。ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ給餌によっても幾らかのＦｏｘｐ３上方制御が誘導されるが、脾臓ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞集団に限られ、ＬＬ−ｅＤＱ８ｄよりも程度が低かった（それぞれＭＦＩ  １５対３５）。
【０１２４】
結論
本発明者らのデータによって、遺伝子操作ラクトコッカス・ラクティスによるＤＱ８媒介性Ｔ細胞反応に免疫優勢なグリアジン誘導ペプチドの粘膜送達が、ＮＯＤ  ＡＢ０  ＤＱ８クラスＩＩトランスジェニックマウスにおいて局所及び全身ＤＱ８拘束性Ｔ細胞反応の抑制を誘導することが実証された。処理は脾細胞及び鼠径リンパ節細胞の増殖能の抗原特異的な低下をもたらすが、これはＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの産生に非常に依存的であり、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の有意な誘導と関連していた。このアプローチの抗原送達細菌は、過敏性が確立された設定であっても経口寛容を増強する能力を有するため、該細菌はセリアック病の治療、場合によっては他の自己免疫疾患及び／又はアレルギー性疾患に適用可能であり得る。
【０１２５】
天然ＤＱ８エピトープ
上記の実験を天然α−グリアジンエピトープ、すなわちＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬエントリのＱ９Ｍ４Ｌ６で検索可能な配列の残基２０３〜２２０に対応する、ＱＹＰＳＧＱＧＳＦＱＰＳＱＱＮＰＱＡ（配列番号：４）を用いて繰り返した。該天然ＤＱ８エピトープはヌクレオチド配列：５’−ｃａａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｔｃａ  ｇｇｔ  ｃａａ  ｇｇｔ  ｔｃａ  ｔｔｃ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｃａ  ｃａａ  ｃａａ  ａａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｇｃｔ−３’（配列番号：３）によってコードされる。
【０１２６】
天然α−グリアジンＤＱ８エピトープでの結果は、脱アミド化α−グリアジンＤＱ８エピトープに関する上記の結果と本質的に同一である。
【０１２７】
ＤＱ８エピトープを用いたセリアック病患者での試行
前述の研究において、本発明による改変したラクトコッカス・ラクティスを、セリアック病の患者での試行における治療剤として使用する。本発明者らの研究結果によって、このアプローチが抗原特異的な方法で効果的であることが保証される。
【０１２８】
セリアック病は、抗原を一次反応の部位に送達して直接的な寛容及びバイスタンダー寛容の両方を達成するＬＬの能力により（due tot）、このアプローチにとって特に魅力的な標的である。
【０１２９】
ＤＱ２エピトープを用いたセリアック病患者での試行
上記で使用されたようなＨＬＡ−ＤＱ８マウスに相当する、内因性ＭＨＣ  ＩＩ欠損背景でＨＬＡ−ＤＱ２を発現するトランスジェニックマウスは存在しない。これにより、ＤＱ８エピトープに対する上記の実験は、適切なマウスモデルにおいて可能ではなかった。したがって、本発明者らは、セリアック病の患者において、天然及び脱アミド化α−グリアジンＤＱ２エピトープの両方を用いて幾つかの予備実験を実施する。
【０１３０】
具体的には、上記の実験をヌクレオチド配列：５’−ｔｔａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｔｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｇａａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｇａａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｔｃ（配列番号：５）によりコードされる脱アミド化ＤＱ２エピトープ：ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号：６）、及びヌクレオチド配列：５’−ｔｔａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｔｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｔｔｃ（配列番号：７）によりコードされる天然ＤＱ２エピトープ：ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号：８）を用いて繰り返した。
【０１３１】
天然及び脱アミド化α−グリアジンＤＱ２エピトープでの結果は、α−グリアジンＤＱ８エピトープに関する上記の結果と本質的に同一である。
【０１３２】
実施例Ｃ：第ＶＩＩＩ凝固因子及び第ＩＸ凝固因子を分泌しているラクトコッカス・ラクティスの経口投与後の上記因子に対する寛容の誘導
序論
インターフェロン、第ＶＩＩＩ／ＩＸ因子、及び抗体（レミケード）等の幾つかの治療用（組み換え）タンパク質は、長期処置期間にわたり高用量で投与される。しかし、その使用に伴う合併症は、抗体等のタンパク質特異的免疫反応の発生である。阻害物質とも呼ばれるこれらの抗体（Ａｂ）は、治療用タンパク質をあまり効果的でないものにする。例には、血友病における第ＶＩＩＩ／ＩＸ因子、慢性腎不全の治療を受けている患者におけるエリスロポイエチン（Ｅｐｏ）、及び多発性硬化症のための治療を受けている患者におけるＩＦＮ−に対する阻害物質の形成が含まれる。ここでは、ＩＬ−１０産生ラクトコッカス・ラクティスによる第ＶＩＩＩ因子（及び第ＩＸ因子）の経口送達が、抗原特異的ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の誘導により上記因子に対する阻害物質の形成を抑制することを実証する。
【０１３３】
材料及び方法
細菌及びプラスミド：ラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３株をこの研究全体にわたり使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）中で培養する。全ての株の懸濁原液は、ＧＭ１７中の５０％グリセロールに入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、懸濁原液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベートする。これらは１６時間以内に２×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの飽和密度に達する。この研究にわたり、混合した細菌懸濁液を使用する。したがって、混合した細菌を遠心分離により採集し、両細菌培養物のペレットをＢＭ９培地に入れて１０倍濃縮する（Schotte, Steidler et al. 2000）。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液１００μｌの投与を受ける。
【０１３４】
ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを代表するヒトＦＶＩＩＩ及びＦＩＸのｃＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片を増幅させ、ラクトコッカスＰ１プロモーターの下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。
【０１３５】
ヒトＦＶＩＩＩ（及び／又はエピトープ断片）、ＦＩＸ（及び／又はエピトープ断片）を保有するプラスミドで形質転換したＭＧ１３６３株を、ＬＬ−ＦＶＩＩＩ、ＬＬ−ＦＩＸを分泌するラクトコッカス・ラクティスとする。空のベクターｐＴ１ＮＸを含有するＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸを対照とする。
【０１３６】
ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸの定量化：それぞれＬＬ−ＦＶＩＩＩ及びＬＬ−ＩＸ由来のＦＶＩＩＩ又はＦＩＸは、上述したヒトＦＶＩＩＩ及びＦＩＸ特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（Chuah et al., 2003）を使用して求める。組み換えタンパク質は、記載されたようにウエスタンブロット分析及びＣＯＡＴｅｓｔ及びａＰＴＴ検定（Chuah et al., 2003; VandenDriessche et al., 1999）によっても分析する。このタンパク質のＮＨ２末端は、自動エドマン分解により求める。ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸは、肝臓に通常発現し、そこでそれらは大規模な翻訳後修飾を受けることから、操作されたラクトコッカス・ラクティスから産生された凝固因子は、生物学的に不活性であり得る。しかし、これらの翻訳後の差異は、これらのラクトコッカス・ラクティスに産生された組み換えタンパク質が免疫寛容を誘導する能力に影響を有しない傾向がある。実際に、これまでに詳細に特徴づけられた大部分の阻害物質は、典型的にはグリコシル化部分よりもアミノ酸残基を認識する（Villard et al., 2003）。
【０１３７】
動物：（Bi et al.（1995）及びWang et al.（1997）により記載されたように、ＥＳ細胞における相同組換えを使用してマウスＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ遺伝子をノックアウトすることによって得た血友病Ａ又はＢマウスを、研究室で繁殖させる。これらのレシピエントマウスは、ＣＦＡの存在下で精製組み換えＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ抗原を用いて抗原投与したときに中和抗体を産生する（Mingozzi et al., 2003）。この阻害物質の状態は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ検定又は抗ＦＶＩＩＩ／抗ＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡを使用して経時的にモニターすることができる。ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ（＋ＣＦＡ）を用いて抗原投与されたレシピエントマウスは、典型的には抗原投与の２〜３週間後に阻害物質を発生する。
【０１３８】
実験の設定：４〜６週齢のマウスに、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＬＬ−ＦＶＩＩＩ、ＬＬ−ＦＩＸ若しくはＬＬ−ｐＴ１ＮＸ又はＬＬ−ＯＶＡ（無関係の抗原）（１μｇ又は１０μｇ）の投与を受けさせる。寛容誘導のための陽性対照として、肝細胞特異的プロモーターからＦＩＸを発現しているアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）をマウスに注射する。レシピエント動物は、ＦＩＸ＋ＣＦＡを用いたその後の抗原投与の際の抗ＦＩＸ抗体の誘導を防止するＦＩＸ特異的免疫寛容を発生する。
【０１３９】
予防の設定では、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＬＬ−ＦＶＩＩＩ及びＬＬ−ＦＩＸを単独で胃内カテーテルを使用して異なる処置間隔及び用量を使用して血友病Ａ又はＢマウスに経口投与する。続いてＣＦＡの存在下で精製組み換えＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ抗原を用いてこれらのレシピエントマウスを抗原投与する（Mingozzi et al., 2003）。対照動物は、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ及びＬＬ−ＯＶＡに曝露する。眼窩後採血により血漿を採集する。ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸに対する抗体の産生は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ検定（Kasper et al., 1975）を使用して、又は改変抗ＦＶＩＩＩ又は抗ＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡ（VandenDriessche et al., 1999）を使用して異なる時間間隔で評価する。
【０１４０】
治療の設定では、記載されたようにＦＶＩＩＩ又はＦＩＸを血友病Ａ又はＢマウスに最初に免疫する（Mingozzi et al., 2003）。Ｂｅｔｈｅｓｄａ検定又は抗ＦＶＩＩＩ／抗ＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡを使用して阻害物質の状態を経時的にモニターする。低い又は高い阻害物質力価を有するマウスは、続いてＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＬＬ−ＦＶＩＩＩ、ＬＬ−ＦＩＸ単独で異なる処置間隔及び用量を使用して処置し、阻害物質の力価を経時的に求める。ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＬＬ−ＦＶＩＩＩ、ＬＬ−ＦＩＸの投与を単独で、無関係な抗原（破傷風トキソイド又はＯＶＡ）を用いて抗原投与することによって、可能な免疫寛容の特異性を評価する。
【０１４１】
細胞培養、増殖及びサイトカイン検定：脾臓及びリンパ節の単細胞懸濁液は、細胞に７０μｍフィルタ細胞ストレーナー（Becton/Dickinson Labware）を通過させることにより調製する。赤血球溶解緩衝液と共にインキュベートすることによって、脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去する。
【０１４２】
総脾臓細胞集団の増殖検定、２×１０５個の細胞を、単独又は精製ＦＶＩＩＩ若しくはＦＩＸと一緒のいずれかで、抗ＩＬ−１０又は抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下又は非存在下のいずれかで、９６ウェルＵ底プレート中で総体積２００μｌの完全培地に入れて培養する。ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸを１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で加える。中和抗体は、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ及び０．０１μｇ／ｍｌで加える。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の増殖検定のために、０．２×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、抗原提示細胞として作用する１×１０５個の放射線照射ＣＤ４−細胞及びＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ（０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）と共に、中和抗体の存在下又は非存在下のいずれかの合計体積２００μｌの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーターに入れて７２時間後に、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能を１６時間〜１８時間後にガラス繊維フィルタマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、チミジンの取込みをシンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定する。
【０１４３】
サイトカイン測定のために、異なる増殖検定に使用される細胞培養物の上清を培養の２４時間、４８時間及び７２時間後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−２０℃で凍結する。サイトカイン産生は、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量化する。
【０１４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ制御性活性検定：マウスにおける抗体形成の能動的な抑制を試験するために、異なる実験のラクトコッカス・ラクティス処置群から単離した脾臓細胞、ビーズ精製ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞をナイーブＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに養子移入する。未処置マウスを対照として使用する。移入された細胞数は、全脾臓細胞、亜集団枯渇脾臓細胞、又は正の選択をされたＣＤ４＋細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞について１０７個である。養子移入の３６時間後にｃＦＡ中のｈＦ．ＩＸ  ５μｇをレシピエントマウス（実験コホートあたりｎ＝４〜５）に皮下注射した。免疫の２．５週間後に血漿中の抗ｈＦ．ＩＸ  ＩｇＧ力価を測定した。
【０１４５】
結果
ＬＬ−ＦＶＩＩＩ及びＬＬ−ＩＸは遊離ＦＶＩＩＩ又は遊離ＦＩＸと比較して血友病Ａ又はＢマウスにおいての寛容誘導能を有意に高める
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口給餌する。ＬＬ−ＦＶＩＩＩ又はＬＬ−ＦＩＸの添加は、ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸに対する寛容誘導を有意に高める。それは、対照及び遊離ＦＶＩＩＩ群又は遊離ＦＩＸ群に比べてこの群において脾臓細胞の因子特異的増殖反応が有意に減少するからである。
【０１４６】
ＬＬ−ＦＩＩＩＶ及びＬＬ−ＦＩＸは、ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸの特異的力価とＩＦＮ−γとの減少並びに上記因子に反応したＩＬ１０及びＴＧＦ−βのより多い産生に関連して経口寛容を強化する
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口給餌する。脾臓細胞及びリンパ節におけるＦＶＩＩＩ及びＦＩＸ特異的抗体並びに上記因子に反応したサイトカインの産生は、上記のように定量化する。対照群及び遊離ＦＶＩＩＩ／ＩＸ群に比べてＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ群では、阻害物質の形成及び炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γの産生は大幅に減少し、免疫抑制サイトカインであるＩＬ−１０及びＴＧＦ−βは有意に増加する。
【０１４７】
ＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸはＣＤ４＋Ｔ細胞を介して経口寛容を高める
ＣＤ４＋Ｔ細胞が経口寛容の誘導を媒介するかどうかを評価するために、脾臓細胞及びリンパ節における因子特異的増殖性ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を研究する。したがって、上記（実験の設定）のようにマウスに経口給餌し、「細胞培養、増殖及びサイトカイン検定」に記載されるように因子特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を求める。ＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ群における因子特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、対照群及び遊離ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ群に比べて有意に減少する。
【０１４８】
ＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ治療後に抗原に誘導されるＴ制御性細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ阻害物質形成からの防御を伝達することができる
経口寛容プロトコルで処置されたマウスにおける抗体形成の能動的な抑制について試験するために、上記の異なる処置群からの脾臓細胞を養子移入する（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ制御性活性検定）。対照及び遊離ＦＶＩＩＩ／ＩＸ群に比べて、抗因子ＩｇＧの形成はＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ群で有意に減少し、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコルにおける制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。
【０１４９】
結論
本発明者らのデータにより、組み換えＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ分泌ラクトコッカス・ラクティスの粘膜送達は、ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸ特異的阻害物質の形成の抑制に関して、それぞれ血友病Ａ及びＢマウスにおいて、遊離ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸよりも強力であることが実証される。
【０１５０】
実施例Ｄ：アレルゲンＤｅｒ  ｐ  １を分泌しているラクトコッカス・ラクティスを経口投与後の上記アレルゲンに対する寛容の誘導
序論
アレルギー性喘息は、気道の慢性炎症性障害である。アレルギー性喘息は、可逆性気道閉塞、アレルゲン特異的免疫グロブリンＥの血清レベルの上昇、粘液の過剰分泌、及び気管支痙攣原性刺激に対する気道反応亢進（ＡＨＲ）を特徴とする。その症状は、患者が感作されたアレルゲン（例えば樹木、草及び雑草の花粉、塵及び塵性ダニ、カビ、動物のフケ）への曝露により悪化する。２型Ｔヘルパー（Ｔｈ２）リンパ球は、この疾患の発症、進行及び持続に重大な役割を果たす。現在のデータは、アレルゲンに対するＴｈ２反応が通常は制御性Ｔ細胞により抑制されることを示唆している。さらにアレルギーを有する個体では、このサブセットによる抑制は減少する。ここで、本発明者らは、ラクトコッカス・ラクティスのアレルゲンの経口送達が、抗原特異的ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の誘導を介して喘息様反応を抑制することを実証する。
【０１５１】
材料及び方法
ヒト疾患を模倣するアレルギー性喘息の２つのマウスモデルは、ＯＶＡアレルゲンモデル及びヒト化ＳＣＩＤモデルである。
【０１５２】
ＯＶＡアレルゲンモデル：ヒトアレルギー性喘息に高度に特徴的な所見であるＴｈ２サイトカイン依存性好酸球性気道炎症、気管支反応性亢進、及びＩｇＥ産生に至るＯＶＡエアロゾルを用いてＯＶＡ感作マウスを吸入により抗原投与する（Brusselle, 1994, Clin Exp Allergy 24:73; Kips et al. 1996, Am JRespir Crit Care Med 153:535; Brusselle et al. 1995, Am J Respir Cell Mol Biol12:254）。
【０１５３】
細菌：この研究にわたりラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３株を使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）で培養する。全ての株の懸濁原液は、ＧＭ１７中の５０％グリセロールに入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、懸濁原液を新鮮ＧＭ１７で５００倍に希釈し、３０℃でインキュベートする。これらは１６時間以内に２×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの飽和密度に達する。細菌は遠心分離により採集し、ＢＭ９培地に入れて１０倍に濃縮する。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液１００μｌの投与を毎日受ける。
【０１５４】
プラスミド：Gallus gallus卵アルブミンをコードしているｍＲＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋ（アクセッション番号ＡＹ２２３５５３）から検索する。総ＲＮＡはニワトリ子宮部から単離し、ｃＤＮＡは、体積２５μｌ中の総ＲＮＡ  ２μｇ、２μＭオリゴｄＴプライマー（Promega Corporation Benelux, Leiden, The Netherlands）、０．０１ｍＭ  ＤＴＴ（Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands）、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（Invitrogen, Merelbeke, Belgium）、Ｒｎａｓｉｎ（PromegaIncorporation Benelux）２０Ｕ、及びｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）１００Ｕを使用して合成する。ＯＶＡ  ｃＤＮＡ断片は、以下の条件を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させる：以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて９４℃２分に続いて９４℃４５秒、６２℃３０秒、及び７２℃９０秒を３０サイクル５’−ＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴ−３’（配列番号：１７）及び５’−ＡＣＴＡＧＴＴＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣ−ＡＣＡＴＣＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡ−３’（配列番号：１８）。
【０１５５】
増幅された断片は、ラクトコッカスＰ１プロモーター下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。
【０１５６】
ＯＶＡ  ｃＤＮＡを保有するプラスミドで形質転換したＭＧ１３６３株を、ＬＬ−ＯＶＡとする。空のベクターを含有するＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴＲＥＸ１を対照とする。
【０１５７】
ＯＶＡの定量化：ＬＬ−ＯＶＡからのＯＶＡは社内で開発したＯＶＡ特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して求める。組み換えタンパク質の産生は、ウエスタンブロット分析によっても評価する。
【０１５８】
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）は、Charles River Laboratories（Calco, Italy）から購入する。マウスは、特定病原体未感染の状態で維持する。
【０１５９】
マウスの免疫：水酸化アルミニウム（ミョウバン）１ｍｇ中のＯＶＡ（グレードＶ；Sigma-Aldrich）１０μｇをマウスに腹腔内免疫する。この免疫は、２１日で繰り返す（０日及び２１日）。対照マウスは、ＯＶＡ／ミョウバン溶液の代わりに生理食塩水の注射を受ける。免疫の２６日後に、感作されたマウスは、ＰＢＳに溶解した１％ＯＶＡのエアロゾル化溶液を１０分間吸入する。ＯＶＡの吸入は、３日連続で行う（４７日、４８日及び４９日）。対照マウスは実験群に使用するものと同じ条件でＰＢＳ単独を吸入する。
【０１６０】
経口寛容の誘導：０日〜４日、７日〜１１日、１４日〜１８日及び２１日〜２５日にＬＬ−ＯＶＡ、ＬＬ−ｐＴＲＥＸ１、１μｇ  ＯＶＡ又はＢＭ９をマウスに補給する。経口寛容誘導のための陽性対照として、胃内カテーテルによる最初の免疫ＯＶＡの３０ｍｇをマウスに給餌し、その給餌は気管支好酸球及び気道反応性亢進を減少させ、高用量給餌の方が低用量給餌よりも有効である。
【０１６１】
気道反応性亢進（ＡＨＲ）の測定：最後の吸入（５０日目）の２４時間後に、メタコリン誘導性気流閉塞により気道反応性亢進を評価する。噴霧した生理食塩水（Otsuka Pharmaceutical）にマウスを２．５分曝露し、続いて漸増する用量（１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ）の噴霧したメタコリンに曝露する。噴霧後にこれらのマウスを全身プレチスモグラフに２．５分入れ、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＸＡ  ＷＢＰシステム（Buxco Electronics）を使用して休止の増大（enhanced pause）（Ｐｅｎｈ）を測定する。「Ｐｅｎｈ」は肺気流閉塞を表し、次式を使用して計算される：Ｐｅｎｈ＝（（Ｔｅ−Ｔｒ）／（Ｔｒ×ＰＥＦ／ＰＩＦ）)（式中、Ｐｅｎｈ＝休止の増大（無次元）、Ｔｅ＝呼気時間（秒）、Ｔｒ＝緩和時間（秒）、ＰＥＦ＝最大呼気流量（ミリリットル／秒）、及びＰＩＦ＝最大吸気流量（ミリリットル／秒）とする）。ほぼ５秒毎にＰｅｎｈを測定し、平均し、累積値を各時点についてのＰｅｎｈの値として平均する。気道反応性亢進はＰＣ２００Ｍｃｈ（メタコリン誘発濃度２００％）として表現し、これは、ベースラインのＰｅｎｈ値を２倍にしたメタコリン濃度である。
【０１６２】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の分析：気道反応性亢進の測定後に、気管支肺胞洗浄液試料を得る。過量のケタミン及びキシラジンの腹腔内注射によりマウスを麻酔し、それから生理食塩水０．５ｍｌで４回肺を洗浄する。洗浄液を遠心分離し、１％ＢＳＡを有する生理食塩水１ｍｌに細胞を再懸濁する。総細胞数は、血球計数器を使用して計数する。サイトスピン試料は、この懸濁液を３００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって調製する。好酸球を好中球とはっきりと識別するために、三つの異なる染色、すなわちDiff-Quick、メイ−グリュンワルト−ギムザ、及びハンセル（エオシン）染色を適用する。標準的な形態基準に基づき、少なくとも３００個の白血球を光学顕微鏡により識別する。ＢＡＬＦ中のＩＬ−１３、ＩＬ−４及びＩＬ−５レベルは、製造業者の説明書に従ってＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）により検出する。
【０１６３】
血清総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的Ｉｇの測定：５０日目に、麻酔下で眼窩後静脈叢（retro-orbital sinus）から血液試料を得る。試料が完全に凝固した後で、試料を遠心分離し、血清を収集し、使用まで−８０℃で保存する。総ＩｇＥは、ペアＡｂ（BD Pharmingen）を使用して製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡにより検定する。血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａを測定するために、マイクロタイタープレート（Maxisorp, Nunc, VWR International, Haasrode, Belgium）を２μｇ／ｍｌ  ＯＶＡでコーティングする。続いて、ウェルをＰＢＳ中の０．１％カゼインで遮断し、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ［SouthernBiotechnology Associates (SBA), Imtec ITK Diagnostics, Antwerpen, Belgium、１：５０００希釈］、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ、又はヤギ抗マウスＩｇＥ−ＨＲＰ（ＳＢＡ、１：５０００希釈）と共に０．１％カゼイン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＣＴ）で１：１０から１：２０４８０に希釈したマウス血清試料と共に、そのプレートをインキュベートする。洗浄後、基質［３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質試薬、Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium］を各ウェルに加える。最後に、ウェルに１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させる。４５０ｎｍで吸光度を読み取る。ＥＬＩＳＡスコアは、計算されたカットオフ値よりも高いＯＤ４５０をまだ有した最高希釈の逆数である力価として表現する。カットオフは、５匹の非免疫マウスの平均ＯＤ４５０にＳＤの３倍を加えたものとして計算する。
【０１６４】
肺組織の組織学的検査：肺胞洗浄液試料を得た後に、生理食塩水で肺を潅流し、マウスから切除する。この肺を中和緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋する。切片（厚さ３μｍ）をＨ＆Ｅ又は過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で染色する。肺における組織学的変化の強度は、１）上皮剥離又は気管支上皮細胞核の凹凸、２）杯細胞数の増加、３）血管から気管支及び気管支周囲間質の粘膜及び粘膜下領域への炎症細胞の浸潤、並びに４）平滑筋細胞層の肥大及び肥厚という所見の分布及び強度に従って、４つの等級スコア（０：炎症なし、１：微弱／軽度、２：中度、及び３：重度）で評価する。
【０１６５】
肺におけるサイトカイン及びケモカイン遺伝子発現の分析のためのＲＴ−ＰＣＲ：生理食塩水で潅流後に肺を取り出し、製造業者の説明書に従ってＩＳＯＧＥＮ（Nippon Gene）を使用して総ＲＮＡを抽出する。総ＲＮＡ（１０μｇ）は、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー（Promega）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｎａｓｅ  Ｈ逆転写酵素（InvitrogenLife Technologies）を使用して４２℃で２時間逆転写する。各試料が同量のｃＤＮＡを含んでいたことを確認するために、β−アクチン特異的プライマーを使用して各試料のβ−アクチンｃＤＮＡ濃度を最初に求める。適切なサイクル数の間増幅させることによって、これらの試料はＰＣＲ産物の量が増幅曲線の直線部に残った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動させ、臭化エチジウム染色により視覚化した。以下の特異的プライマーセットを使用してＩＬ−１３、エオタキシン、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＧＦ−βのレベルを求める。
βアクチンについてのセンスプライマー：５’−ＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：１９）及び
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＧＴＡＧＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧ−３’（配列番号：２０）。
ＩＬ−１３についてのセンスプライマー：５’−ＴＣＴＴＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＴＣＧＣ−３’（配列番号：２１）及び
アンチセンスプライマー：５’−ＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：２２）。
エオタキシンについてのセンスプライマー：５’−ＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号：２３）及び
アンチセンスプライマー：５’−ＣＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号：２４）。
ＩＬ−１０についてのセンスプライマー：５’−ＴＡＣＣＴＧＧＴＡＧＧＡＧＴＧＡＴＧＣＣ−３’（配列番号：２５）及び
アンチセンスプライマー：５’−ＧＣＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴＡＣＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号：２６）。
ＩＦＮ−γについてのセンスプライマー：５’−ＣＡＴＡＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡ−３’（配列番号：２７）及び
アンチセンスプライマー：５’−ＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＧＴＡＡＴ−３’（配列番号：２８）。
ＴＧＦ−βについてのセンスプライマー：５’−ＣＴＴＴＡＧＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＴＴ−３’（配列番号：２９）及び
アンチセンスプライマー：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＡＡＴＣＡＴＧＴＴ−３’（配列番号：３０）。
【０１６６】
細胞培養、増殖及びサイトカイン検定：最後の吸入（第５０日）の１日後に、細胞に７０μｍフィルタ細胞ストレーナー（Becton/Dickinson Labware）を通過させることにより、脾臓及び縦隔リンパ節の単細胞懸濁液を調製する。赤血球溶解緩衝液と共にインキュベートすることにより脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去する。それぞれＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）、及びＭＡＣＳカラム（ｍｉｄｉＭＡＣＳ；Miltenyi Biotec）を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を濃縮する。
【０１６７】
バルク脾臓細胞集団及びＬＮ集団の増殖検定、２×１０５個の細胞は、総体積２００μｌの完全培地に入れて、単独又は精製ＯＶＡの存在下のいずれかで９６ウェルＵ底プレート中で培養する。ＯＶＡは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加する。ＣＤ４＋Ｔ細胞集団及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の増殖検定のために、２×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、抗原提示細胞として作用する、１ｍｇ／ｍｌ  ＯＶＡを１６時間ロードされたマイトマイシン処理脾臓細胞と共に、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞／ＡＰＣの比が１／１、１／０．３、１／０．１、１／０．０３、１／０で、合計体積２００μｌの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で１６時間培養する。３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で７２時間後に、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能は、１８時間後にガラス繊維フィルタマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、チミジンの取込みはシンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定する。
【０１６８】
サイトカイン測定のために、異なる増殖検定に使用される細胞培養物の上清を培養の２４、４８及び７２時間後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−８０℃で凍結する。サイトカイン産生は、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量化する。
【０１６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ制御性活性の検定：最後の吸入（第２１日）の１日後に、処置マウスの脾臓を０．１％コラゲナーゼ（Sigma-Aldrich）を用いて３７℃で２０分間消化する。一部の実験では、全脾臓細胞の単細胞懸濁液を調製し、ＣｏｎＡ（２μｇ／ｍｌ；Sigma-Aldrich）と共に４８時間培養する。細胞を収集し、１０７個の細胞をナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内養子移入する。負の選択のために、ビオチン化抗マウスＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９及びＣＤ１１ｂｍＡｂ（BD Pharmingen）を有する磁気ビーズ（MACS; MiltenyiBiotec）を製造業者の説明書に従って使用して、全脾臓細胞からＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１９＋又はＣＤ１１ｂ＋細胞を枯渇させる。枯渇の効率は、フローサイトメトリーにより調べる（＞９９％）。ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット、制御性Ｔ細胞単離キットを製造業者の説明書に従って使用してＣＤ４＋細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を精製する。正の選択をされた細胞の純度は、フローサイトメトリーを使用してチェックする。細胞移入実験のために、ＯＶＡ／ミョウバンを用いたそれらの最初の免疫の直前又はそれらの２回目の免疫の直後にＢＡＬＢ／ｃマウスに尾静脈から細胞を移入する。移入された細胞数は、全脾臓細胞、亜集団枯渇脾臓細胞、又は正の選択をされたＣＤ４＋細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞について１０７個である。
【０１７０】
ヒト化ＳＣＩＤ（ｈｕ−ＳＣＩＤ）モデルにおいて（Duez et al., 2000; Hammad et al., 2000に記載された通り）
このモデルでは、屋内塵性ダニ（ＨＤＭ）アレルゲンであるＤｅｒ  ｐ  １に対するアレルギー性免疫反応を研究することができる。ＨＤＭアレルギー患者からのＰＢＭＣを用いて腹腔内再構成し、続いてＨＤＭエアロゾルに曝露した該ｈｕ−ＳＣＩＤマウスはヒトＩｇＥを産生し、活性化Ｔ細胞及びＤＣから成る肺浸潤液を発生し、気管支収縮剤に反応してＡＨＲを示す（Pestel et al. 1994, J Immunol, 153:3804; Duez et al., Am J RespirCrit Care Med, vol 161 , ppp 200-206, 2000）。
【０１７１】
細菌
この研究にわたりラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３株を使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MＩ）で培養する。全ての株の懸濁原液は、ＧＭ１７中の５０％グリセロールに入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、懸濁原液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベートする。これらは１６時間以内に２×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの飽和密度に達した。細菌を遠心分離により採集し、ＢＭ９培地に入れて１０倍に濃縮する。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液１００μｌの投与を毎日受ける。
【０１７２】
プラスミド
２２２アミノ酸残基の球状糖タンパク質であるＤｅｒ  ｐ  １は、Dermatophagoides pteronyssinus（Ｄｐｔ）ダニ由来の主要アレルギンの一つである。Ｄｅｒ  ｐ  １タンパク質をコードしている、最適のラクトコッカス・ラクティスコドン利用を有するＤＮＡ配列を合成し、増幅させ、ラクトコッカスＰ１プロモーターの下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。Ｄｅｒ  ｐ  １、Ｄｅｒ  ｐ  １  ａａ５２−７１及びＤｅｒ  ｐ  １  ａａ１１７−１３３ｃＤＮＡを保有するプラスミドで形質転換したＭＧ１３６３株を、ＬＬ−Ｄｅｒ  ｐ  １、ＬＬ−Ｄｅｒ  ｐ  １  ａａ５２−７１及びＬＬ−Ｄｅｒ  ｐ  １  ａａ１１７−１３３とする。空のベクターｐＴ１ＮＸを含有するＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸを対照とする。
【０１７３】
Ｄｅｒ  ｐ  １の定量化
ＬＬ−Ｄｅｒ  ｐ  １由来のＤｅｒ  ｐ  １は、社内で開発したＤｅｒ  ｐ  １特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して求める。組み換えタンパク質の産生は、ウエスタンブロット分析によっても評価する。
【０１７４】
患者
血液は、屋内塵性ダニに感受性又は非感受性のドナーから収集する。アレルギー患者は、屋内塵性ダニ感作の通常の特徴を提示する。Dermatophagoides pteronyssinus（Ｄｐｔ）アレルゲンに関する皮膚穿刺試験（Stallergenes, Fresnes, France）（直径≧１０ｍｍ)は陽性であり、全ての患者は血清中特異的ＩｇＥ抗体を有する。総ＩｇＥ濃度は１５０ＩＵ／ｍｌ（１５０〜１６００ＩＵ／ｍｌ）を超える。健康なドナーは陰性対照として試験する（合計ＩｇＥレベルは１５０ＩＵ／ｍｌ未満であり、彼らは通常に吸入されたアレルギンに関して陰性の皮膚穿刺試験を有する）。
【０１７５】
ヒト末梢血単核細胞の調製
遠心分離（１２０×ｇ、１５分間）後に血小板に富む血漿を得て、捨てる。それから血球をＲＰＭＩ１６４０（Life Technologies, Paisley, Scotland）（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配（Pharmacia, Uppsala, Sweden）の上に層化する。遠心分離（４００×ｇ、３０分間）後に、界面でＰＢＭＣを採集し、滅菌ＲＰＭＩ培地で３回洗浄してから移し替える。
【０１７６】
マウス
Ｃ．Ｂ．−１７  ＳＣＩＤマウス（６〜８週齢）を、特定動物施設の中で無菌床敷を有する隔離飼育器で維持する。ＥＬＩＳＡによりマウス血清免疫グロブリンの非存在についてＳＣＩＤコロニーを定期的にチェックする。
【０１７７】
ＳＣＩＤマウスへの末梢血単核細胞の移入：ＰＢＭＣ  ｈｕ−ＳＣＩＤマウス
ＳＣＩＤマウスは、細胞移入時に６〜８週齢である。アレルギー患者又は健康ドナーからの単核細胞１０×１０６個をＲＰＭＩ  ４００μｌに入れたものを２３ゲージの針を通して腹腔内注射することにより、マウスを再構成する。同じ日に、これらのマウスに２反応性指数［ＩＲ］ユニットのＤｐｔの投与を腹腔内で受けさせる。細胞の再構成の４日後に、１００ＩＲユニットのＤｐｔ（１００ＩＲユニットはＤｐｔ抽出物に含まれるタンパク質約２００μｇに等しい）を含むアレルゲンエアロゾルにＳＣＩＤマウスを連続４日間毎日曝露する（第０日から第４日）。対照群はＤｐｔに曝露しない。気道反応性の測定（第３５日及び第６０日）の１日前に、１００ＩＲユニットのＤｐｔ溶液の別のエアロゾルにｈｕ−ＳＣＩＤマウスを曝露する。
【０１７８】
実験の設定
Ｄｅｒ  ｐ  １又は陰性対照として無関係の抗原（ＯＶＡ）を発現するように遺伝子操作されたラクトコッカス・ラクティスの投与をマウスに受けさせる。
遺伝子操作されたラクトコッカス・ラクティス細菌は、ＰＢＭＣ再構成の１日後に開始して、異なる処置間隔及び用量を用いて胃内カテーテルを使用してＳＣＩＤマウスに経口投与する。経口寛容の誘導は、ヒト血清ＩｇＥ抗体の測定、肺浸潤の分析、ＡＨＲの測定、並びにＢＡＬＦ中の細胞集団及びサイトカイン産生の分析により評価する。さらに、寛容の誘導は、Ｄｅｒ  ｐ  １に対する増殖Ｔ細胞反応の分析により評価する。
【０１７９】
気道反応性（ＡＨＲ）の評価
気道反応性（肺抵抗の５０％の増加を引き起こすカルバコールの誘発用量として表現）は、Duez et al.,2000により記載されたように第３５日又は第６０日に測定する。
【０１８０】
ヒトＩｇＥの測定
ヒト細胞の移植の数日後に、エーテル麻酔下でマウスの眼窩後静脈叢から採血する。ε鎖に特異的な二つの異なるマウスｍＡｂ（Immunotech International, Luminy, France）を使用して二部位免疫放射法により総ヒトＩｇＥを研究する。少なくとも２０μｌの血清を２回繰り返しの試験に使用する。方法の感度は、０．１ＩＵｉｍｌ（０．２４ｎｇ／ｍｌ）の検出を許容する。
【０１８１】
Ｄｐｔアレルゲンに対する特異的ＩｇＥ  Ａｂは、ＥＬＩＳＡにより定量化する。簡潔には、０．１Ｍ炭酸／重炭酸バッファー（ｐＨ９．６）中のＤｐｔアレルゲンでプラスチック試験管（Maxisorb Startube, Nunc, Denmark）を４℃で一晩コーティングし、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１％ＢＳＡで室温で２時間飽和させる。洗浄後、ＢＳＡ（１％）及びＴｗｅｅｎ（０．０１％）を含むＰＢＳで希釈したＨｕ−ＳＣＩＤマウス血清と共に試験管を室温で２時間、及び４℃で一晩インキュベートする。大規模に洗浄後、ＨＲＰ標識化抗ヒトＩｇＥ  Ａｂを加える。洗浄後、基質［３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質試薬、Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium]を各ウェルに加える。最後に、ウェルに１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止する。吸光度を４５０ｎｍで読み取る。
【０１８２】
肺の組織検査
肺を３５日目に切除し、パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋用に加工する。パラフィン組織切片は、ヒトＣＤ４５＋細胞の検出用に染色し、その後、マウス肺切片上のヒト細胞は、Duez et.al.,2000に記載されたように組織スコア付けにより定量化した。
【０１８３】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の分析
ＯＶＡアレルゲンモデルに記載したようにＢＡＬＦを分析する。
【０１８４】
細胞培養、増殖及びサイトカイン検定：
脾臓の単細胞懸濁液は、細胞に７０μｍのフィルタ細胞ストレーナー（Becton/Dickinson Labware）を通過させることによって調製する。赤血球は、赤血球溶解バッファーと共にインキュベートすることによって脾臓細胞懸濁液から除去する。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、それぞれヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）又はヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）、及びＭＡＣＳカラム（ｍｉｄｉＭＡＣＳ;Miltenyi Biotec）を使用して濃縮する。
【０１８５】
バルク脾臓細胞の増殖検定、２×１０５個の細胞は、単独又は精製Ｄｅｒ  ｐ  １存在下のいずれかで、且つ抗ＩＬ−１０又は抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下又は非存在下のいずれかの合計体積２００μｌの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。Ｄｅｒ  ｐ  １は、１〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で加える。中和抗体は、１、０．１及び０．０１μｇ／ｍｌで加える。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びヒトＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の増殖検定のために、２×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、中和抗体の存在下又は非存在下のいずれかの合計体積２００μｌの完全培地に入れて、抗原提示細胞として作用する、１ｍｇ／ｍｌ  Ｄｅｒ  ｐ  １を１６時間ロードされたマイトマイシン処理ヒトＰＢＭＣと共に、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞／ＡＰＣの比が１／１、１／０．３、１／０．１、１／０．０３、１／０で９６ウェルＵ底プレート中で培養する。３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で７２時間後に、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能は、１８時間後にガラス繊維フィルタマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、チミジンの取込みは、シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定する。
【０１８６】
サイトカイン測定のために、異なる増殖検定に使用される細胞培養物の上清を培養の２４時間、４８時間及び７２時間後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−８０℃で凍結する。サイトカイン産生は、ヒト炎症サイトメトリービーズ検定（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量化する。
【０１８７】
結果
ＬＬ−ＯＶＡ及びＬＬ−Ｄｅｒ  ｐ  １はそれぞれ、喘息についてのＯＶＡモデル及びｈｕＳＣＩＤマウスモデルにおける寛容誘導能を有意に高める
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。ＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １の添加はＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １への寛容誘導を有意に高める。それは、対照群及び遊離ＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １群に比べてＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １群において脾臓細胞のアレルゲン特異的増殖反応が有意に減少するからである。
【０１８８】
ＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １は、上記アレルゲンに反応したＡＨＲ、好酸球浸潤、血清ＩｇＥレベルの減少、並びにＩＬ−１３、ＩＬ−４及びＩＬ−５サイトカイン産生の低下と関連して経口寛容を強化する。
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。上記抗原に反応したＡＨＲ、好酸球のＢＡＬＦ浸潤、ＩｇＥ力価、及びサイトカイン産生を上記のように求める。ＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １群では、対照及び遊離ＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １群に比べてＡＨＲ、好酸球ＢＡＬＦ浸潤、ＩｇＥ力価は大きく減少し、ＩＬ−１３、ＩＬ−４及びＩＬ−５は有意に低下する。
【０１８９】
ＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １はＣＤ４＋Ｔ細胞を介して経口寛容を高める
ＣＤ４  Ｔ細胞が経口寛容の誘導を媒介するかどうかを評価するために、脾臓細胞及びリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。したがって、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給し、「細胞培養、増殖及びサイトカイン検定（Cellculture, proliferation and cytokine assay）」に記載されるようにアレルゲン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を求める。ＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １群におけるアレルゲン特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、対照群及び遊離ＯＶＡ／Ｄｅｒ  ｐ  １群に比べて有意に減少する。
【０１９０】
ＬＬ−ＯＶＡ治療後に抗原に誘導されたＴ制御性細胞は、喘息様反応からの防御をｉｎ  ｖｉｖｏで伝達することができる
経口寛容プロトコルで処置されたマウスにおける喘息様反応の能動的な抑制について試験するために、上記（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ制御性活性検定）の異なる処置群由来の脾臓細胞を養子移入する。対照群及び遊離ＯＶＡ群と比べて、喘息様反応は、ＬＬ−ＯＶＡ群において有意に減少しており、これは、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコルにおける制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。
【０１９１】
結論
本発明者らのデータにより、アレルゲン分泌ラクトコッカス・ラクティスの粘膜送達は、過敏性が確立された設定であっても、抗原特異的ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の誘導を介してアレルゲン特異的免疫寛容を誘導するのに遊離アレルゲンよりも強力であることが実証される。
【０１９２】
実施例Ｅ：ＢＬＧ食物アレルゲンを分泌しているラクトコッカス・ラクティスの経口投与後の該食物アレルゲンに対する寛容の誘導
【０１９３】
導入
食物アレルギーは、人口の約２％から５％を苦しめる疾患である。ヒトでは、高いＩｇＥ抗体及びＩＬ−４産生抗原特異的Ｔリンパ球の存在はＴｈ２偏向メカニズムを示唆する。ここで、食物アレルゲンの経口送達が、抗原特異的ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の誘導を介してアレルゲン特異的免疫反応を抑制することを実証する。
【０１９４】
実施例に対する材料及び方法
細菌及びプラスミド
ラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３株をこの研究にわたり使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）で培養する。全ての株の懸濁原液は、ＧＭ１７中の５０％グリセロールに入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、懸濁原液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベートする。それらは、１６時間以内に２×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの飽和密度に達する。遠心分離により細菌を採集し、ＢＭ９培地に入れて１０倍に濃縮する。処置のために、胃内カテーテルによりこの懸濁液の１００μＬの投与を各マウスに毎日受けさせる。ウシβ−ラクトグロブリンｃＤＮＡを増幅させ、ラクトコッカスＰ１プロモーターの下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。マウスＢＬＧを保有するプラスミドを用いて形質転換されたＭＧ１３６３株は、ＬＬ−ＢＬＧと呼ぶ。空のベクターｐＴ１ＮＸを含むＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸは対照として役立つ。
【０１９５】
ウシβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）の定量化
ＬＬ−ＢＬＧ由来のＢＬＧは、社内で開発したＢＬＧ特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びウエスタンブロット分析を使用して求める。
【０１９６】
実験の設定
ラクトコッカス・ラクティスの防御効果を探求するために使用する食物アレルギーのマウスモデルは、Frossard et al.,（J Allergy Clin Immunol113:958-964, 2004）に記載された食物誘導ＩｇＥ型反応のマウスモデルである。マウスは、ＬＬ−ＢＬＧ又は陰性対照として無関係の抗原（ＯＶＡ）の投与を受ける。寛容誘導の陽性対照として、飲料水に入れた高用量のＢＬＧの投与をマウスに受けさせ、その飲料水はＢＬＧの経口抗原投与の際のアナフィラキシーからマウスを予防する。
【０１９７】
予防の設定では、ＢＬＧを産生するように遺伝子操作をされたラクトコッカス・ラクティス細菌を、異なる処置間隔及び用量を用いて、胃カテーテルを使用してマウスに経口投与する。その後、コレラ毒素の存在下で、精製ＢＬＧ抗原を用いてこれらのレシピエントマウスを経口抗原投与する。ＢＬＧを発現せず（代わりにＯＶＡを発現する）対照ベクターで遺伝子操作されたラクトコッカス・ラクティスに対照動物を曝露する。寛容の誘導は、胃内抗原投与後のアナフィラキシーの分析により、血清及び便中のＢＬＧ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＥ力価の測定により、脾臓及びＰＰ中の抗体分泌細胞数を求めることにより、ＭＬＮ、ＰＰ及び脾臓におけるＴ細胞増殖及びサイトカイン産生の分析により評価する。
【０１９８】
ＢＬＧへの免疫寛容の誘導がラクトコッカス・ラクティスにより高まり得るかどうかを評価するために、ＬＬ−ＢＬＧ又は１μｇの遊離ＢＬＧをマウスに投与する。
【０１９９】
ＢＬＧに対する経口感作
０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３中のＢＬＧ（Sigma）２０ｍｇ及びList Biological Laboratoriesから購入したＣＴＸ１０μｇを、０日目、７日目、１４日目及び２１日目に４〜５週齢雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪマウス（Charles River）に胃内強制投与により免疫する。陽性対照群（寛容化マウス）は飲料水に入れた０．８ｍｇ／ｍＬ  ＢＬＧを４週間自由に与えられる。与えるタンパク質の合計量（２２．４ｍｇ）は感作されたマウスに投与されたＢＬＧの合計量と類似している。この寛容化手順が永続的に末梢性免疫系も活性化し、粘膜免疫系だけを活性化するわけではないことを実証するために、ミョウバン１ｍｇに吸着させたＢＬＧ８０μｇを寛容化マウスの群に第２８日及び第４２日に２回腹腔内注射する。
【０２００】
抗原の抗原投与
第２８日に、０．２ｍｏｌ  ＮａＨＣＯ３  ０．４ｍＬ中のＢＬＧ１００ｍｇを用いて全てのマウスを胃内強制投与により抗原投与する。アナフィラキシーを観察し、他（Frosssard et al., 2001）に詳細に記載された反応スコア（０：無反応〜３：重度の反応又は死亡）を使用することにより等級分けする。中核体温は、抗原投与前及び強制投与の３０分後に耳で赤外線により測定する。動物を屠殺し、心穿刺により血液をＥＤＴＡ含有試験管に収集し、市販のＥＬＩＳＡキット（Immunotech, Marseille, France）によるヒスタミン測定のために血漿を得る。
【０２０１】
細胞培養、増殖及びサイトカイン検定
脾臓、腸間膜リンパ節及びＰＰの単細胞懸濁液は、Frossard et al.,2004により記載されたように調製する。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、それぞれＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）及びＭＡＣＳカラム（ｍｉｄｉＭＡＣＳ、MiltenyiBiotec）を使用して濃縮する。
【０２０２】
バルク脾臓細胞及びＬＮ集団の増殖検定、２×１０５個の細胞は、単独又は精製ＢＬＧの存在下のいずれかで、且つ抗ＩＬ−１０又は抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下又は非存在下のいずれかの合計体積２００μｌの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。ＢＬＧは１〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で加える。中和抗体は、１、０．１及び０．０１μｇ／ｍｌで加える。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の増殖検定のために、２×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、抗原提示細胞として作用する、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＬＧを１６時間ロードされたマイトマイシン処理脾臓細胞と共に、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞／ＡＰＣの比率が１／１、１／０．３、１／０．１、１／０．０３、１／０で、中和抗体の存在下又は非存在下のいずれかの合計体積２００μｌの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃で７２時間後に、１μＣｉ／ウェル［３Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡと結合した放射能は、１８時間後にガラス繊維フィルタマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、チミジンの取込みは、シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定する。
【０２０３】
サイトカイン測定のために、異なる増殖検定に使用される細胞培養物の上清を培養の２４時間、４８時間及び７２時間後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−８０℃で凍結する。サイトカイン産生は、マウス炎症サイトメトリビーズ検定（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量化する。
【０２０４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ制御性活性の検定
マウスにおける抗体形成の能動的な抑制について試験するために、異なる実験のラクトコッカス・ラクティス処置群から単離した脾臓細胞、ビーズ精製ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞をナイーブＣ３Ｈ／ＨｅＯｕＪマウスに養子移入する。未処置マウスは対照として使用する。移入した細胞数は、全脾臓細胞、亜集団を枯渇させた脾臓細胞、又は正の選択をされたＣＤ４＋細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞について１０７個である。Ｔｒｅｇが関係しているならば、ＢＬＧ抗原を用いたこれらのマウスのその後の抗原投与は、ＢＬＧに対する体液性免疫反応及びアナフィラキシーの誘導を予防するはずである。
【０２０５】
ＢＬＧ特異的な血清抗体及び便抗体についての酵素結合免疫吸着検定
０日目、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目の尾採血から血清を得る。同時に便を得て、ペプスタチン１：１０００（Fluka）を０．１ｍｇ／ｍＬ補充したＰＢＳ＋１％ＦＣＳ（Lifetechnologies）に再懸濁する。試料を機械的に脱凝集させ、２分間ボルテックス処理し、続いて１４０００ｒｐｍで４℃で２０分間、２回の遠心分離を行う。
【０２０６】
Adel-Patientet al.,（2000, J. Immunol Methods）から改良した方法により、ＢＬＧ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＡ抗体レベルについて血清及び便を評価する。簡潔には、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Nunc）に２５０ｎｇ／ウェルのストレプトアビジン（Fluka）を室温で１８時間、続いてポリビニルピロリドンＫ２５（Fluka）溶液３００μＬを一晩コーティングする。ビオチン化ＢＬＧ  １μｇを３時間インキュベートし、０．５μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＩｇＡ、ラット抗マウスＩｇＧ１、又は抗マウスＩｇＧ２ａペルオキシダーゼ標識抗体（Southern Biotechnologies）の存在下でＰＢＳ＋１０％ウマ血清中で希釈した血清（ＩｇＧ１について１：６６６６及び１：２２２２、ＩｇＧ２ａについて１：６６６及び１：２２２、ＩｇＥについて１：６６及び１：２２）又は便（１：３、１：１０、及び１：３３）を、２回の繰り返しで２時間加える。ＩｇＥの測定のために、ラット抗マウスＩｇＥモノクローナルＡｂ（クローンＲ３５−７２、BD Pharmingen）に続いてペルオキシダーゼ結合抗ラットＡｂ（Caltag）を加える。吸光度を４９０ｎｍで測定する。結果は任意の単位として表現し、ＢＬＧ＋ミョウバンで免疫されたマウス由来のプール血清を基準血清として使用する。
【０２０７】
抗原特異的抗体の産生ＥＬＩＳＰＯＴにより測定する
腸管からパイエル板を機械的に切除し、５ｍｍｏｌ  ＥＤＴＡ（Life Technologies）を補充したＨＢＳＳ培地中で３０分間インキュベートする。同様に、パイエル板及び腸間膜リンパ節を穏やかに破砕し、７０ｍのナイロンフィルタを通して濾過する。脾臓細胞は、トリス緩衝ＮＨ４Ｃｌ中で５分間予備インキュベートして赤血球を除去する。リンパ芽球は、Ｐｅｒｃｏｌｌの６０％／６６％勾配（Amersham）で単離する。
【０２０８】
ＢＬＧ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ抗体の測定のために、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Millipore）にストレプトアビジンを３７℃で一晩コーティングし、続いてビオチン化ＢＬＧ  １μｇを３時間加える。Ｐｅｒｃｏｌｌの６０％／６６％勾配で単離したリンパ芽球は、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢ及び５％ＦＣＳを補充したイスコフ改変ダルベッコ培地中で二つの異なる濃度、すなわち１×１０６個及び２×１０６個で３７℃で２４時間再懸濁し、続いて抗ＩｇＡ、抗ＩｇＧ１及び抗ＩｇＧ２ａ抗体（Southern Biotechnology）と共に４℃で一晩インキュベートする。１００μＬ／ウェルのアミノエチルカルバゾールを１０分間加え、ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴ４．２．１ソフトウェア（Zeiss）を使用してスポットを自動計数し、細胞１０６個あたりの細胞形成単位（ＣＦＵ）として表わす。
【０２０９】
食物アレルギーのマウスモデルにおいてＬＬ−ＢＬＧがＢＬＧの寛容誘導能を有意に高める
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。ＬＬ−ＢＬＧの添加はＢＬＧへの寛容誘導を有意に高める。それは、ＬＬ−ＢＬＧ群における脾臓細胞のアレルゲン特異的増殖反応は対照群及び遊離ＢＬＧ群に比べて有意に減少するからである。
【０２１０】
ＬＬ−ＢＬＧは、ＢＬＧ特異的抗体反応の減少及び上記アレルゲンに反応したＩＬ−４サイトカイン産生の低下に関連する経口寛容を強化する
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスを経口補給する。ＢＬＧ特異的抗体反応及び上記因子に反応したサイトカイン産生は上記のように求める。ＬＬ−ＢＬＧ群におけるＢＬＧ特異的抗体レベル及びＩＬ−４は、対照群及び遊離ＢＬＧ群に比べて有意に低下する。
【０２１１】
結果
ＬＬ−ＢＬＧは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を介して経口寛容を高める
ＣＤ４  Ｔ細胞が経口寛容の誘導を媒介するかどうかを評価するために、脾臓細胞及びリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。したがって、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給し、「細胞培養、増殖及びサイトカイン検定」に記載されるようにアレルゲン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を求める。ＬＬ−ＢＬＧ群におけるアレルゲン特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、対照群及び遊離ＢＬＧ群に比べて有意に減少する。
【０２１２】
ＬＬ−ＢＬＧ治療後に抗原に誘導されるＴ制御性細胞はｉｎ  ｖｉｖｏアレルギー様反応からの防御を伝達することができる
経口寛容プロトコルで処置したマウスにおけるアレルギー様反応の能動的な抑制について試験するために、上記（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ制御性活性検定）の異なる処置群からの脾臓細胞を養子移入する。遊離ＢＬＧ群におけるアレルギー様反応は、対照群及び遊離ＢＬＧ群に比べて有意に減少し、これは、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコルにおける制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。
【０２１３】
結論
本発明者らのデータにより、アレルゲン分泌ラクトコッカス・ラクティスの粘膜送達は、抗原特異的ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の誘導を介してアレルゲン特異的免疫寛容を誘導するのに遊離アレルゲンよりも強力であることが実証される。
【０２１４】
実施例Ｆ：上記自己抗原を分泌しているラクトコッカス・ラクティスを経口投与後の、インスリンに対する寛容性の誘導
導入
自己免疫は、自発性の炎症性組織損傷及び自己抗原に対する寛容の欠如に起因する生理学的機能不全を特徴とする。自己免疫は、部分的に活動しすぎる免疫系と関連し、その免疫系は、過剰のＴヘルパー（Ｔｈ）細胞を特徴とする。感受性遺伝子等の素因及び環境因子は影響することが困難であるため、免疫療法を開発する近年の努力は、病原性エフェクター細胞を枯渇させ、且つ／又は免疫制御性Ｔ細胞を高めることにより、病原性エフェクター細胞と免疫制御性Ｔ細胞との間の機能的均衡を再確立することに向けられている。膵島β細胞の自己免疫性破壊は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の主要な原因である。この破壊は、幾つかのβ細胞自己抗原に対する細胞性及び体液性免疫反応と関連し、両方の免疫反応が疾患の臨床的発症に先行することがある。
【０２１５】
ここでは、ラクトコッカス・ラクティスを送達する自己抗原の経口送達が、抗原特異的ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の誘導により糖尿病特異的免疫反応を抑制することを実証する。
【０２１６】
材料及び方法
細菌及びプラスミド
この研究全体にわたりラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３株を使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）で培養する。全ての株の懸濁原液は、ＧＭ１７中の５０％グリセロールに入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、懸濁原液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベートする。それらは、１６時間以内に２×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの飽和密度に達する。遠心分離により細菌を採集し、ＢＭ９培地に入れて１０倍に濃縮する。処置のために、胃内カテーテルによりこの懸濁液１００μＬの投与を各マウスに毎日受けさせる。ヒトプロインスリンＩＩ  Ｂ２４−Ｃ３６ペプチド（ｈｐＩＩｐ）、ブタインスリン及び免疫優性ペプチドＩｎｓＢ９−２３（Ｂ９−２３は、ヒト、ラット及びマウスという多種にわたり本質的に同一である）をコードしている、最適のラクトコッカス・ラクティスコドン利用を有するＤＮＡ配列を合成し、増幅させ、ラクトコッカスＰ１プロモーターの下流で、エリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。
【０２１７】
マウスＩＬ−１０、ｈｐＩＩｐ、インスリン、ＩｎｓＢ９−２３を保有するプラスミドを用いて形質転換されたＭＧ１３６３株は、ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン、ＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３と呼ぶ。空のベクターｐＴ１ＮＸを含むＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸは対照として役立つ。これらのタンパク質の発現は、抗原特異的ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット分析を使用して求める。
【０２１８】
マウス
雌性及び雄性非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス及びＮＯＤ重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）（ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド）マウスは、Jackson laboratoryから購入する。ＢＡＬＢ／ｃ野生型（ＷＴ）マウスは、CharlesRiver Italyから購入する。マウスは、特定病原体を除去した中央動物施設で維持する。施設のガイドラインに沿ってマウスを処置及び使用する。
【０２１９】
実験の設定
予防の設定では、ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン、ＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３を、２１日齢（離乳）から開始して、最適な補給方式を使用して、又は（大部分のマウスが糖尿病を発症する）１００日齢までＮＯＤマウスに経口投与する。加えて、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸを陰性対照として経口投与する。陽性（寛容化）対照群について、３週齢のＮＯＤマウスをヒトインスリンｈｐＩＩｐ／ＩｎｓＢ９−２３０．８ｍｇで週３回２週間又は４週間経口投与する。糖尿病の発症は、週３回及び血中グルコースレベルの糖尿モニタリングの場合に、尿グルコースレベルの連続モニタリングにより求める。１２〜２３週及び実験の終了時（３５週）に膵臓を収集し、連続切片をヘマトキシリン／エオシンで染色し、単核細胞の浸潤を評点するか、又は免疫組織化学によりＴ細胞の浸潤を分析する。
【０２２０】
治療の設定では、ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン、ＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３を、安定した糖尿及び高血糖を示している糖尿病ＮＯＤ雌に経口投与する（１２〜２３週）。加えて、陰性対照としてＬＬ−ｐＴ１ＮＸを経口投与する。陽性（寛容化）対照群について、Bresson et al.,2006に記載されたように糖尿病ＮＯＤマウスを処置する。完全寛解は、糖尿の消失及び正常血糖への復帰と定義する。
【０２２１】
同系膵島移植の設定においては、発症間際の糖尿病の雌ＮＯＤマウスをＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン、ＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３で、又は陰性対照としてＬＬ−ｐＴ１ＮＸで３週間経口処理する。３週間後、非糖尿病ＮＯＤマウスから新鮮分離した５００個の膵島細胞を糖尿病ＮＯＤマウスに移植する。次に血中グルコースを糖尿病が再発するまで、又は移植後１５週間、週に３回モニタリングする。グルコースレベルが２回連続して≧２５０ｍｇ／ｄＬの動物は糖尿病と見なし、続いて血清回収及び移植片の組織学的分析のために屠殺する。
【０２２２】
寛容誘導の詳細なメカニズムは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、特異的自己抗原をＮＯＤマウスに再抗原投与後にｉｎ  ｖｉｖｏで、及びＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにＴ細胞を養子移入することにより分析する。
【０２２３】
糖尿病の検出：
グルコースのモニタリング：尿グルコースはＤｉａｓｔｉｘ（Miles）により測定し、血中グルコースモニタリングシステムＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ（LifeScan Inc.）を用いた血中グルコース測定により確認する。糖尿病は、２５０ｍｇ／ｄｌを超える２回の連続する血中グルコース値として定義する。
【０２２４】
膵島炎：マウスは、ＣＯ２を用いた窒息により屠殺し、膵臓を１０％ホルマリン中で一晩固定し、パラフィンに包埋し、５μｍの連続切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色する。膵島炎スコア（平均±ＳＤ）は、以下のように１０〜１５膵島／マウスにおける細胞浸潤度を顕微鏡で等級分けすることにより求める：０：膵島浸潤の徴候はみられない、１：膵島周囲への浸潤、２：＜５０％の浸潤、３：＞５０％の浸潤。
【０２２５】
膵島単離及び移植：膵島炎及び糖尿病を有しない１４日齢〜２１日齢のドナーＮＯＤマウスの膵島を、膵腺をハンクス平衡塩溶液中で激しく振盪しながらコラゲナーゼで消化することによる無菌（asceptic）除去後に単離する。膵島単離は、実体顕微鏡下での直接のハンドピッキングにより実行する。糖尿病レシピエントＮＯＤマウスをａｖｅｒｔｉｎ（０．０２ｍｌ／ｇ  ＢＷＴ）の腹腔内注射により麻酔し、左腎を腰部切開により露出させ、新鮮分離した５００個の膵島細胞を腎被膜下に入れた。
【０２２６】
免疫組織化学
膵臓β細胞におけるインスリン、ＣＤ４及びＣＤ８の発現を検出するために、一次Ａｂ（Dakoからのモルモット抗ブタインスリン［希釈１：３００］、抗ＣＤ４  ＲＭ４．５、及びBDBiosciencesからの抗ＣＤ８ａ  ＩＨＣ［希釈１：５０］）を、Christen et al.,2004に記載されたように凍結組織切片に適用する。
【０２２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖検定
脾臓、腸間膜ＬＮ（ＭＬＮ）及びＰＬＮの単細胞懸濁液を調製する。総脾臓細胞集団の増殖検定、２×１０５個の細胞は、完全培地単独あるいは段階濃度（１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）の精製ヒトインスリン又はＣＤ４  Ｔ細胞（ＩｎｓＢ９−２３、（Ｈ−２ｄ又はＨ−２ｇ拘束性）若しくはＣＤ８  Ｔ細胞(ＩｎｓＢ１５−２３、Ｋｄ拘束性）（Sigma）に特異的なペプチドの存在下で、且つ抗ＩＬ−１０又は抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下又は非存在下のいずれかの合計体積２００μｌの完全培地に入れて、９６ウェルＵ底プレート中で培養する。中和抗体は、１、０．１及び０．０１μｇ／ｍｌで加える。総ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞集団の増殖検定のために、０．２×１０５個のＴ細胞は、インスリン又はＧＡＤ６５又はＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的なペプチドをロードされたＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃマウスからの照射した脾臓細胞１×１０５個と共に、中和抗体の存在下又は非存在下のいずれかの合計体積２００μｌ完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で７２時間後に、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能を１６〜１８時間後にガラス繊維フィルタマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）でチミジンの取込みを測定する。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋単離キット（ＭＡＣＳ、Milteny Biotec, Auburn, CA）を使用した磁気ビーズ分離による負の選択によりＰＬＮ又は脾臓から精製する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、総細胞として使用するか、又はＣＤ２５＋単離キット（Milteny Biotec）を使用したＭＡＣＳによりＣＤ２５＋及びＣＤ２５−にさらに分離する。細胞集団の純度（＞９０％）は、フローサイトメトリー分析により求める。
【０２２８】
サイトカイン測定のために、上記の異なる増殖検定（抗原特異的刺激）に使用される細胞培養物の上清を培養の７２時間後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−８０℃で凍結する。サイトカイン産生は、マウス炎症サイトメトリービーズ検定（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量化する。精製ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞を培養し、それらの細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８混合物（各１μｇ／ｍｌ）で２４時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非特異的に刺激するか、又は対照として未刺激のままとする。上清を採集し、ＢＤ（商標）サイトメトリービーズ検定フレックスセットをＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで使用して、ＦＣＡＰアレイソフトウェア（BD Biosciences）を使用して、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＦＮγ産生について分析する。捕捉ＥＬＩＳＡ実験は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット（R&D Systems）を使用してＴＧＦ−β１を求めるために使用する。
【０２２９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞増殖阻害検定
最近糖尿病になった雌性ＮＯＤ（８〜１２週）から単離した精製総脾臓ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞２×１０４個は、ＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の、Ｔ細胞が枯渇し、放射線照射され、インスリン又はペプチドをロードした脾臓細胞２×１０４個の存在下で、異なる実験群からの脾臓、ＭＬＮ又はＰＬＮから単離した様々な数のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞集団と共に、共培養する。３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で７２時間後に、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能を、１６〜１８時間後にガラス繊維フィルタマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）でチミジンの取込みを測定する。
【０２３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性検定
使用するリンパ芽球ターゲットは、ＢＡＬＢ／ｃマウスからのＣｏｎ  Ａ活性化脾臓細胞である。合計１０６個のターゲット細胞を１００μＣｉの５１Ｃｒ（Amersham International, Buckinghamshire, U.K）で３７℃で９０分標識し、３回洗浄し、それから１μｇ／ｍｌのペプチド（ＩｎｓＢ１５−２３又は無関係のペプチド）と共に３７℃で１時間インキュベートする。ターゲット細胞を２回洗浄し、１０４個／ウェルで播種する。脾臓、ＭＬＮ及びＰＬＮから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞を各ウェルに３回の繰り返しで様々なエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で加える。プレートを５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、３７℃で４時間インキュベートする。インキュベート後に、５１Ｃｒの放出［％溶解＝１００×（試験ｃｐｍ−自発ｃｐｍ）／（総ｃｐｍ−自発ｃｐｍ）］の求めるために上清を収集する。間接的致死検定のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクターと共にインキュベートする前に５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、Pharmingen）と共にインキュベートする。
【０２３１】
糖尿病の養子移入
８〜１０週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、糖尿病雌性ＮＯＤマウス（６週、１２週及び１８週）から単離した脾臓細胞２×１０７個を静脈内で、又は５×１０６個を腹腔内で、異なるラクトコッカス・ラクティス処置実験群から単離した、段階数のビーズ精製ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と組み合わせて、又は組み合わせずに注射する。未処置マウスを対照として用いる。糖尿病の発症を週に３回、血中グルコースレベルの連続モニタリングにより求める。
【０２３２】
結果
ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン、ＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３は同系膵島移植後の糖尿病の再発を遅らせる
ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン及びＬＬ−ＩｎｓＢ（９−２３）が経口寛容を誘導するか否かを評価するために、同系膵島移植後の糖尿病の再発を研究する。このため、マウスを上記（実験の設定）のように経口摂取させ、膵島細胞を記載（膵島単離及び移植）のように移植する。糖尿病の再発は、対照と比較してＬＬ−ｈｐＩＩｐ／インスリン／ＩｎｓＢ９−２３群において遅延した。
【０２３３】
ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン及びＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３は、非肥満糖尿病マウスにおける遊離ｈｐＩＩｐ、インスリン、及びＩｎｓＢ９−２３の寛容誘導能を有意に高める。
【０２３４】
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。ＬＬ−ｈｐＩＩｐ／インスリン／ＩｎｓＢ９−２３群における脾臓細胞の自己抗原特異的増殖反応は、対照群及び遊離ｈｐＩＩｐ／インスリン／ＩｎｓＢ９−２３群に比べて有意に減少することから、ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン及びＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３の添加は、自己抗原への寛容誘導を有意に高める。
【０２３５】
ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン及びＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３は、膵島炎の低減、β細胞破壊の速度減少、及び脾臓細胞によるＩＬ−１０産生増加と関連して経口寛容を強化する。経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。膵島炎の存在、β細胞破壊速度、及び上記自己抗原に対するサイトカイン産生は、上記のように求める。組織学的分析は、対照群及び遊離−ｈｐＩＩｐ／インスリン／ＩｎｓＢ９−２３群に比べてＬＬ−ｈｐＩＩｐ／インスリン／ＩｎｓＢ９−２３群において有意に低度の膵島炎及びβ細胞破壊、並びにＩＬ−１０産生増加を示す。
【０２３６】
ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−インスリン及びＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３はＣＤ４  Ｔ細胞を介して経口寛容を高める
ＣＤ４  Ｔ細胞が経口寛容の誘導を媒介するかどうかを評価するために、脾臓細胞及びリンパ節における自己抗原特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。したがって、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給し、自己抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を記載（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖検定）のように求める。対照群及び遊離ｈｐＩＩｐ／インスリン／ＩｎｓＢ９−２３群に比べたＬＬ−ｈｐＩＩｐ／インスリン／ＩｎｓＢ９−２３群における自己抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応を用いて、サイトカイン産生を定量化する。
【０２３７】
実施例Ｆ５：ＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３治療後のＮＯＤマウスにおいて自己攻撃性ＣＤ８＋反応は抑制される
本発明者らの組み合わせアプローチが、バイスタンダー抑制メカニズムにより糖尿病を調節することができる抑制性ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導するかどうかを調べるために、ＣＤ８＋自己攻撃性Ｔ細胞が受ける効果を分析する。抗原特異的自己攻撃性ＣＤ８＋細胞の割合及び／又は活性は、ＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３治療後に強く減少する。
【０２３８】
ＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３治療後の抗原誘導性Ｔ制御性細胞は、アレルギー様反応の防御をｉｎ  ｖｉｖｏで伝達することができる。
経口寛容プロトコルで処置したマウスにおける糖尿病様反応の能動的抑制を試験するために、上記のように異なる処置群からの脾臓細胞を養子移入する（糖尿病の養子移入）。対照及び遊離ＩｎｓＢ９−２３群に比べて、ＬＬ−ＩｎｓＢ９−２３群では、糖尿病様反応は有意に減少し、これは、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコルにおける制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示している。
【０２３９】
結論
本発明者らは、自己抗原送達ラクトコッカス・ラクティスの経口送達が、糖尿病特異的免疫反応を抗原特異的ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の誘導を介して抑制することを実証する。
【０２４０】
考察
全体的に見て、上記に提示したデータは、抗原を分泌する遺伝子操作ラクトコッカス・ラクティスの経口補給は、感作した被験者においても、この抗原により誘導される全身炎症を減少させ得ることを示す。有利なことに、ラクトコッカス属媒介性抑制は多くの場合、遊離抗原の粘膜投与後より強力であると思われる。抑制は、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の誘導により媒介される可能性がある。
【０２４１】
［引用文献］
- Friedman A. and Weiner, H. L. (1994).Induction of anergy or active suppression following oral tolerance isdetermined by antigen dosage. Proc. Natl. Acad. Sci, 91 , 6688-6692. &#8211; 
- Gasson,M.J. Plasmid complements ofStreptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci afterprotoplast-induced curing. J. Bacteriol. 154, 1-9 (1983). 
Liu, et al., (2006) Engineered vaginalLactobacillus strain for mucosal delivery of the human immunodeficiency virusinhibitor Cyanovirin-N. A.A.C. 50, 3250-3259.
- Marietta, E. et al. A new model for dermatitis herpetiformis thatuses HLA-DQ8 transgenic NOD mice. J. Clin. Invest 114, 1090-1097 (2004). &#8211; 
- Mayer, L. and Shao, L. (2004a). The use oforal tolerance in the therapy of chronic inflammatory/autoimmune diseases. J.Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 39, S746-S747.
- Mazzarella,G. et al. An immunodominant DQ8restricted gliadin peptide activates small intestinal immune response in invitro cultured mucosa from HLA-DQ8 positive but not  HLA-DQ8negative coeliac patients. Gut 52, 57-62 (2003). &#8211; 
- Mucida, D., Kutchukhidze, N., Erazo, A.,Russo, M., Lafaille, JJ. and Curotto de  Lafaille, M.A. (2005). Oral tolerance inthe absence of naturally occurring Tregs. J. Clin. Invest. 1 15, 1923-1933.
- Steidler, L. and Rottiers, P. (2006)Therapeutic drug delivery by genetically modified  Lactococcus lactis. Ann N Y Acad. Sci.1072, 176-186. 
- Strobel, S., Mowat, A.M., Drummond, H. E., Pickering,M. G. and Ferguson,A. (1983)Immunological responses to fed proteinantigens in mice. Il oral tolerance for CMI is due to activation ofcyclophosphamide-sensitive cells by gut-processed antigen. Immunology, 49,451-456.
- TobagusJ.T., Thomas, W.R., & HoIt1P.G. Adjuvant costimulation during secondary antigen challenge directsqualitative aspects of oral tolerance induction, particularly during theneonatal period. J. Immunol. 172, 2274-2285 (2004).
- Van Asseldonk,M. et al. Cloning of Usp45, AGene Encoding A Secreted Protein from  Lactococcus-Lactis Subsp Lactis Mg1363.Gene 95, 155-160 (1990). &#8211;
- Waterfield.N.R., Lepage,R.W.F., Wilson, P.W., & WeIIs1J.M. The Isolation of Lactococcal Promoters and Their Use in InvestigatingBacterial Luciferase Synthesis in  Lactococcus-Lactis. Gene 165, 9-15 (1995). 
【図１】
2010516269.tif 000002
【図２】
2010516269.tif 000003
【図３】
2010516269.tif 000004
【図４】
2010516269.tif 000005
【図５】
2010516269.tif 000006
【図６】
2010516269.tif 000007
【図７】
2010516269.tif 000008
【図８】
2010516269.tif 000009
【配列表】
2010516269000001.app
【国際調査報告】
2010516269.tif 000010
2010516269.tif 000011
2010516269.tif 000012
2010516269.tif 000013
2010516269.tif 000014
2010516269.tif 000015
2010516269.tif 000016