(57)【要約】  本発明は、核受容体のリガンド結合ドメインを制御可能な形態で含む単離されたタンパク質、それを製造する方法、リガンドの同定のためのその使用、単離されたタンパク質を含む試験系及び試験系を使用して核受容体のリガンドをスクリーニングするための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核受容体のリガンド結合ドメインを制御可能な形態で含む単離されたタンパク質。
【請求項２】
核受容体が、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体（ＲＯＲ）、特にＲＯＲα、ＲＯＲβ又はＲＯＲγ、特にＲＯＲαである、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項３】
リガンド結合ドメインが、リガンド結合ドメインに対してアゴニストが結合する際に活性化可能である、請求項１又は２に記載の単離されたタンパク質。
【請求項４】
タンパク質が、マーカー、特にタグをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項５】
タグが、Ｈｉｓ−タグ、Ａｒｇ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｌａｇ−タグ、Ｔ７−タグ、Ｖ５−ペプチド−タグ、ｃ−Ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、ＨＡＴ−タグ、カルモジュリン−結合ペプチド−タグ、キチン−結合ペプチド−タグ、ＧＳＴ−タグ及びＭＢＰ−タグからなる群より選択される、請求項４に記載の単離されたタンパク質。
【請求項６】
マーカー又はタグが、特定の切断部位においてタンパク質分解的切断によりタンパク質から除去可能である、請求項４又は５に記載の単離されたタンパク質。
【請求項７】
配列番号１若しくは２の配列を含むか、又は配列番号１若しくは２の配列からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質を製造する方法であって：
ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸を含む細胞を、タンパク質の産生をもたらす適切な条件下で培養する工程、
ｂ）細胞培養物からタンパク質を単離する工程、及び
ｃ）工程ｂ）の単離されたタンパク質を、界面活性剤、特に飽和非分枝鎖Ｃ６〜Ｃ２０アルキル硫酸若しくは飽和非分枝鎖Ｃ６〜Ｃ２０アルキル炭酸のアルカリ塩、又はイソプレニル塩と接触させる工程、
を含む、方法。
【請求項９】
工程ｂ）の後にマーカー又はタグを除去することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
飽和非分枝鎖Ｃ６〜Ｃ２０アルキル硫酸又は飽和非分枝鎖Ｃ６〜Ｃ２０アルキル炭酸のアルカリ塩が、飽和非分枝鎖Ｃ９〜Ｃ１５アルキル硫酸のアルカリ塩、好ましくはドデシル硫酸のアルカリ塩、より好ましくはドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）である、請求項９又は１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）及び／又はｃ）が、リガンド結合ドメインのアゴニストの存在下で行われる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、動物細胞、植物細胞及び酵母細胞からなる群より選択され、特に細胞は昆虫細胞又はＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法に従って製造された、核受容体のリガンド結合ドメインを制御可能な形態で含む単離されたタンパク質。
【請求項１４】
核受容体のリガンド結合ドメインのリガンド、特にアゴニスト又はアンタゴニスト、特にアゴニストの同定のための、請求項１〜７及び／又は１３のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質の使用。
【請求項１５】
-  請求項１〜７及び／又は１３のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質、
-  補因子、並びに
-  核受容体のリガンド結合ドメインへのリガンド、特にアゴニストの結合の際のタンパク質と補因子との間の相互作用を検出するための手段、
を含む、試験系。
【請求項１６】
補因子が、マーカー、好ましくはタグで場合により標識された、グルココルチコイド受容体不活化タンパク質−１（ＧＲＩＰ−１）又はステロイド受容体コアクチベーター１（ＳＲＣ１）である、請求項１５に記載の試験系。
【請求項１７】
タンパク質がコアクチベーターに近接することにより、検出可能なシグナルが誘発される、請求項１５又は１６に記載の試験系。
【請求項１８】
タンパク質と補因子との間の相互作用を検出するための手段が、タンパク質又は補因子に特異的な少なくとも１つの抗体を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の試験系。
【請求項１９】
試験系が２つの抗体を含み、ここで第一の抗体がタンパク質に特異的であり、そして第二の抗体が補因子に特異的である、請求項１８に記載の試験系。
【請求項２０】
（ａ）第一の抗体が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のためのドナー部分で標識されており、そして第二の抗体がＦＲＥＴのためのアクセプター部分で標識されているか、若しくはその逆であり；又は
（ｂ）第一の抗体が時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）のためのドナー部分で標識されており、そして第二の抗体がＴＲ−ＦＲＥＴのためのアクセプター部分で標識されているか、若しくはその逆であり；又は
（ｃ）第一の抗体が増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）のためのドナー部分で標識されており、そして第二の抗体がＡＬＰＨＡのためのアクセプター部分で標識されているか、若しくはその逆である、
請求項１９に記載の試験系。
【請求項２１】
核受容体のリガンド結合ドメインのリガンドをスクリーニングするための方法であって：
ａ）請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の試験系を物質と接触させる工程、及び
ｂ）物質がリガンド結合ドメインに結合した際の測定可能なシグナルを検出し、それにより物質をリガンド結合ドメインのリガンドとして同定する工程、
を含む、方法。
【請求項２２】
試験系が請求項２０に規定されるとおりであり、そしてＦＲＥＴの存在がアゴニストの指標である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム性動脈硬化症、異常脂質血症、神経変性疾患、睡眠障害、概日リズムの疾患又は骨粗鬆症を予防及び／又は処置するための医薬についてのスクリーニングために使用される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核受容体のリガンド結合ドメインを制御可能な形態で含む単離されたタンパク質、それを製造する方法、リガンドの同定のためのその使用、単離されたタンパク質を含む試験系、及びこの試験系を使用して核受容体のリガンドをスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核受容体は、細胞内に見られ、そしてホルモン及びビタミンのようなリガンドのシグナルを誘発するタンパク質のスーパーファミリーを表す。それに応じて、アゴニストで活性化された核受容体は、一般的に他のタンパク質と共に、通常は活性化の際に特定の遺伝子の発現を増加させる。
【０００３】
従って、核受容体は、モノマー、ホモダイマー又はヘテロダイマーとして標的遺伝子のDNA応答エレメントと直接相互作用するアゴニスト誘導転写因子として、さらにはシグナル伝達経路を介して作用する。膜受容体及び膜結合受容体と対照的に、核受容体は細胞内に、細胞質又は核のいずれかに存在する。従って、核受容体は、真核細胞において見られる細胞間の可溶な、リガンドで調節される因子のクラスを含む。核受容体は、DNAに直接結合して、隣接する遺伝子の発現を調節する能力を有し；それ故これらの受容体は、転写因子として分類される。上で詳述したように、核受容体による遺伝子発現の調節はリガンド依存性であり、ここで核受容体は通常、アゴニストの存在下でのみ活性である。核受容体へのリガンド結合は、受容体におけるコンホメーション変化を生じ、これが今度は受容体を活性化して、一般的に遺伝子発現の上方調節を生じる。
【０００４】
ゲノムDNAの発現と直接相互作用し制御するそれらの特徴的な能力に起因して、核受容体は、生物の発達及びホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす。
【０００５】
核受容体のスーパーファミリーのメンバーは、４つのモジュラードメインの全体的な構造モチーフを示す: 
-  可変アミノ末端ドメイン(Ｎ−末端調節ドメインとも呼ばれる)、これは活性化機能１(AF−1)を含み、その作用はリガンドの存在に依存しない。AF−1の転写活性化は通常弱いが、AF−2と相乗作用して遺伝子発現を上方調節する。このドメインは種々の核受容体間で配列において高度に可変である。
-  高度に保存されたDNA結合ドメイン(DBD)は、２つの亜鉛フィンガーを含み、そしてホルモン応答エレメント(HRE)に結合する。
-  より低度に保存されたリガンド結合ドメイン(LBD)、配列は中程度しか保存されていないが、種々の核受容体間で構造は高度に保存されている。LBDの構造は、アルファ−らせんサンドイッチ折り畳みと呼ばれる。リガンドが結合する空洞は、３つの逆平行アルファらせんの直下でLBDの内部にあり、「サンドイッチ充填（sandwich filling）」を形成する。DBDと共に、LBDは受容体の二量化接触面に寄与し、そしてさらに、コアクチベーター及びコリプレッサータンパク質に結合する。さらに、これは活性化機能２(AF−2)を含み、その活性化は結合したリガンドの存在に依存し、AF−1と相乗作用する(上記を参照)。
-  可変カルボキシ末端ドメイン、これは種々の核受容体間で配列において可変である。
【０００６】
例として、RORα1の構造を図１Ａに示す。
【０００７】
それらの作用機序及びリガンドが存在しない場合の細胞内分布に依存して、核受容体(NR)は４つのクラスに分類される。
【０００８】
Ｉ型NRは、細胞質ゾル中に位置する核受容体である。Ｉ型NRに対するリガンドの結合は、熱ショックタンパク質の分離、ホモ二量体化、核への転位、及び可変長DNAにより隔てられた２つの半分の部位からなり、第二の半分の部位は第一の部位と逆の配列を有する（逆方向反復）HREへの結合を生じる。核受容体／DNA複合体の形成の後、他のタンパク質が補充され（recruited）、これがHREから下流のDNAをｍRNAに転写し、最終的には細胞機能の変化をもたらすタンパク質が生じる。
【０００９】
II型NRは、リガンドの存在下で及びリガンドが存在しない場合に核内にとどまる。これらはヘテロダイマーとして(通常はRXRと)DNAに結合する。リガンドが存在しない場合、II型NRはしばしばコリプレッサータンパク質と複合体化する。核受容体へのリガンドの結合は、コリプレッサーの分離並びにコアクチベータータンパク質及びRNAポリメラーゼを含むさらなるタンパク質の補充（recruitment）を引き起こし、これによりDNAのｍRNAへの翻訳が行われる。
【００１０】
III型核受容体はI型NRと同様であるが、逆方向反復HREではなく直接反復に結合する。
【００１１】
IV型NRは、モノマーとして又はダイマーとしてのいずれでも結合するが、受容体の単一のDNA結合ドメインのみが半分の部位のHREに結合する。
【００１２】
上で詳述したように、リガンド結合の際に活性化されてHREに結合した核受容体は、結合した標的遺伝子のｍRNAへの転写を変更するかなりの数の他のタンパク質を補充する。これらの転写共調節因子の機能は多様であり、標的遺伝子を多かれ少なかれ転写しやすくするためのクロマチンリモデリング、又は他の共調節タンパク質の結合を安定化する橋渡し機能を含む。共調節タンパク質（補因子とも呼ばれる）はコアクチベーターであってもよく、これはしばしば、 DNAへのヒストンの結合を弱め、従って転写を促進する固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT)活性を有する。それと対照的に、好ましくはアゴニストのNRへの結合の際に結合されたコリプレッサーは、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)を補充し、これがヒストンのDNAへの結合を促進し、従って転写を抑制する。
【００１３】
核受容体スーパーファミリーのメンバーは、グルココルチコイド(GR)、アンドロゲン(AR)、ミネラルコルチコイド(MR)、プロゲスチン(PR)、エストロゲン(ER)、甲状腺ホルモン(TR)、ビタミンD(VDR)、レチノイド(RAR及びRXR)、ペルオキシソーム(XPAR及びPPAR)及びイコサノイド（icosanoid）(IR)の受容体のような受容体を含む。
【００１４】
発達及びホメオスタシスにおけるそれらの役割に起因して、核受容体は、特定の機能へのそれらの関与を研究するための興味深い標的である。さらに、核受容体のいくつかはいわゆる「オーファン受容体」であり、その天然リガンドはまだ知られていない。従って、これらの未だ未知の天然リガンドを同定することは特に興味が持たれる。さらに、身体の生理学的及び病態生理学的機能へのそれらの関与に起因して、核受容体は薬理科学において興味深い標的である。核受容体と共調節因子との間の機能的相互作用に関するデータは、広範囲の疾患についての新規な薬剤治療の開発において新しい機会を提供する。ステロイド受容体を伴う細胞増殖に関与するコアクチベーター及びコリプレッサの役割に取り組む臨床方針は、例えば癌に新しい処置を提供するかもしれない。さらに、エネルギー代謝に関与する共調節因子及びシグナル伝達受容体の機能的重要性は、エネルギー代謝障害を伴う疾患に新しい機会を提供するかもしれない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかし、核受容体のリガンド結合ドメインを制御可能な形態で含むタンパク質（特にRORアルファについて）を単離することは不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
驚くべきことに、本発明者らは、核受容体のリガンド結合ドメインを制御可能な形態で含む単離されたタンパク質を提供することに成功した。本タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸を含む細胞を、適切な条件下で培養し、そして細胞培養物からタンパク質を単離することにより製造され得る。その後、単離されたタンパク質を界面活性剤（特にドデシル硫酸リチウム(LDS)と接触させ、これにより単離されたタンパク質の制御可能性が回復する。
【００１７】
従って、本発明の第一の局面は、核受容体のリガンド結合ドメインを制御可能な形態で含む単離されたタンパク質に関する。
【００１８】
核受容体のリガンド結合ドメイン(上記も参照のこと)は、リガンド結合に応じて作用し、核受容体のコンホメーション変化を引き起こして応答を誘発し、それにより転写活性を開始する分子スイッチとして作用する、核受容体のドメインである。リガンド結合ドメインは柔軟性のある単位であり、ここでリガンドの結合はそのコンホメーションを安定化し、これが今度は補因子の結合に有利に働いて受容体の活性を変更する。コアクチベーターは、リガンド結合ドメインの同じ末端においてアクチベーター機能２（AF−2）に結合し得る。異なるリガンドの結合は、リガンド結合ドメインのコンホメーションを変更し得、これが最終的には核受容体のDNA結合ドメインのDNA結合特異性に影響を及ぼす。種々の核受容体のリガンド結合ドメインは当該分野で周知であり、そして例えばEMBL−EBI (www.ebi.ac.uk)又はInterPro: IPR000536 (http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi−bin/wgetz?[interpro−AccNumber:IPR000536]＋−eを参照のこと)にまとめられている。
【００１９】
適切なリガンド結合ドメインの例としては:
-  レチノイン酸受容体関連オーファン受容体アルファ1(RORアルファ1)のアミノ酸271〜523
-  レチノイン酸受容体関連オーファン受容体ベータ(RORベータ)のアミノ酸267〜459
-  レチノイン酸受容体関連オーファン受容体ガンマ(RORガンマ)のアミノ酸325〜318
-  肝細胞核因子アルファ1(HNF4アルファ1)のアミノ酸192〜464
-  肝細胞核因子アルファ2(HNF4アルファ2)のアミノ酸192〜474
-  エストロゲン関連受容体 アルファ(ERRアルファ)のアミノ酸233〜423
-  エストロゲン関連受容体ベータ(ERRベータ)のアミノ酸248〜500
-  エストロゲン関連受容体ガンマ(ERRガンマ)のアミノ酸250〜435
【００２０】
核受容体はあらゆる公知の核受容体であり得る。それらの配列相同性によって、核受容体は７つのサブファミリーに分けられる。
【００２１】
サブファミリー１は、甲状腺ホルモン受容体類を含み、甲状腺ホルモン受容体−α及び−β、レチノイン酸受容体−α、−β及び−γ、ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体−α、−β／δ、γ、Rev−ErbA−α及び−β、RAR−関連オーファン受容体α、β及びγ、肝臓Ｘ受容体様受容体α及びβ、ファルネソイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体、プレグナンＸ受容体及び構成的アンドロスタン受容体が挙げられる。
【００２２】
サブファミリー２は、レチノイド（retinoic）Ｘ受容体類に関し、例えば肝細胞核受容体−４(α及びγ)、レチノイド（retinoic）Ｘ受容体(α、β及びγ)、精巣受容体(２及び４)、ショウジョウバエ無尾遺伝子のヒト相同体、光受容細胞特異的核受容体、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター−転写因子(Ｉ及びII)及びV−erbA関連受容体が挙げられる。
【００２３】
サブファミリー３はエストロゲン受容体類に関し、とりわけ、エストロゲン受容体(α及びβ)、エストロゲン関連受容体(α、β及びγ)、コルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、プロゲステロン受容体及びアンドロゲン受容体が挙げられる。
【００２４】
サブファミリー４は、神経成長因子IB類に関し、神経成長因子IB、核受容体関連１及びニューロン由来オーファン受容体１のような受容体が挙げられる。
【００２５】
サブファミリー５は、ステロイド産生因子類に関し、例えばステロイド産生因子１及び肝臓受容体相同体−１が挙げられる。
【００２６】
サブファミリー６は、生殖細胞核因子類に関し、生殖細胞核因子が挙げられる。
【００２７】
さらなるサブファミリー（サブファミリー０と呼ぶ）は、種々雑多な受容体、例えば用量感受性性逆転（dosage−sensitive sex reversal）、X染色体遺伝子１(DAX1)上の副腎形成不全臨界領域（adrenal hypoplasia critical region）、小ヘテロダイマーパートナー及び２つのDNA結合ドメインを有する核受容体(2DBD−NR)を含む。
【００２８】
本発明によれば、核受容体のリガンド結合ドメインは、単離されたタンパク質に含まれる。本発明の文脈における単離されたタンパク質は、天然環境にはないタンパク質に関する。従って、「単離されたタンパク質」は、タンパク質と会合しておらず、これは通常自然に見いだされるか、又はそのタンパク質が通常存在する細胞から単離されるか、同じものをコードする核酸が発現されている細胞から単離されるか、又は同じ細胞源からの他のタンパク質を本質的に含まない。このタンパク質は天然似存在するタンパク質であってもよく、好ましくは天然に存在する核受容体又はその一部であり、ここでこの部分はリガンド結合ドメインを含む。しかし、このタンパク質は、それが天然に存在しないという点において、又は天然にはリガンド結合ドメインに結合していない１つ又はそれ以上の部分を含み得る（例えば、核受容体のリガンド結合ドメイン及び例えば精製又は検出目的のために使用される第二のドメインのようなさらなるタンパク質を含むかそれらからなる融合タンパク質）という点において人工的であってもよい。
【００２９】
好ましくは、用語「単離されたタンパク質」は、その天然の環境の他の細胞構成要素と本質的に分離されたタンパク質分子を意味する。しかし、タンパク質の単離の後、細胞構成要素は、例えばシグナル伝達経路を測定するために、再び加えられてもよい。さらに、単離されたタンパク質が単離されたタンパク質の活性を可能にする適切な条件下（例えば適切な緩衝液、ｐＨ値、イオンなど）に維持されるべきであることを当業者は理解するだろう。
【００３０】
核受容体のリガンド結合ドメインを含む本発明の単離されたタンパク質の文脈における「制御可能な形態」は、 アゴニストのリガンド結合ドメインへの結合の際の活性化に対してなお修正可能であるタンパク質に関する。上で詳述したように、LBDは、アゴニストリガンドのLBDへの結合の際に活性化され、これにより標的遺伝子の遺伝子発現が変更される。しかし現在まで、 制御され得るか調節され得る、すなわちそれぞれのLBDのアゴニストリガンドの存在下又は存在しない場合に活性が有意には異ならないかほんの少ししか異ならない、核受容体のLBDを含むRORアルファタンパク質又は多くの他の単離されたタンパク質を製造することは不可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】RORα1の略図を示し、この核受容体の種々のドメインを示す。
【図１Ｂ】本発明の種々の構築物を示し、ここでRORα1のLBDは切断部位(TEV又はPreScission(PreSci))、His−タグ(His)及び場合によりグルタチオン−S−トランスフェラーゼ−タグ(GST)と連結されている。
【図１Ｃ】本発明に従うFRETアッセイの略図を示す。このアッセイにおいて、RORαは、FRETドナーユーロピウム(Eu)に結合された特異的抗体により検出される。コアクチベーター(CA)はビオチン標識されている。ビオチン標識は、ストレプトアビジンにより検出されており、これはFRETアクセプターアロフィコシアニン(APC)マーカーを含む。アゴニストがRORαに結合される場合、NRは活性化され、CAはNRに結合する。従って、APCはEuに近接し、FRETシグナルの検出をもたらす(左パネル)。アンタゴニストの存在下において、CAはRORαに結合せず、従ってFRETシグナルは全く生成されない(右パネル)。
【図２】実施例２のアッセイの結果を示す。コレステロール及びコレステロールサルフェートは、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイにおける蛍光強度比の増加により測定されるように、用量に依存してコアクチベーターペプチドSRC1−NR1＋2のRORαへの結合を誘導する。上の線(＋)は、増加する濃度のコレステロールサルフェートの存在下で行われたアッセイを表し、中間の線(○)は、増加する濃度のコレステロールの存在下で行われたアッセイを示す。下の線(□及び△)は、溶媒のみの存在下で行われた実験を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
従って、制御可能な形態の本発明の単離されたタンパク質は、それぞれのLBDのアゴニストリガンドの存在下又は存在しない場合に活性を比較することによって検出することができる。LBDの活性は、あらゆる適切な状況、例えばそれぞれのシグナル伝達経路の下流エレメントに対する影響、例えばそれぞれのシグナル伝達経路の下流構成要素のいずれかに対する結合（例えば共調節因子及び／又は標的DNA)を測定することにより決定され得る。このような作業の例は、実施例２に記載され、そして図１Ｃにおいて説明されている。
【００３３】
好ましくは、NRのLBDを制御可能な形態で含む単離されたタンパク質の活性は、アゴニストリガンドの存在下での活性をそれぞれのLBDのアゴニストリガンドが存在しない場合の活性と比較した場合、少なくとも1.2、より好ましくは少なくとも1.5、なおより好ましくは少なくとも２、３、４又は５、そして最も好ましくは少なくとも１０になる。
本発明の単離されたタンパク質は特に、そのタンパク質が構成的に活性ではない（これはそのタンパク質がそれぞれのLBDのアゴニストリガンドが存在しない場合に活性ではないことを意味する）、制御可能な形態でNRのリガンド結合ドメインを含む単離されたタンパク質に関する。
【００３４】
本発明の一実施態様において、単離されたタンパク質は、天然に存在する核受容体の全アミノ酸配列を含んでいても全アミノ酸配列からなっていてもよい。あるいは、単離されたタンパク質は、天然に存在する核受容体の一部を含んでいてもその一部からなっていてもよいが、ただしLBDは核受容体の一部になお存在している。
【００３５】
単離されたタンパク質は、上記の定義された核受容体のいずれかを含んでいても上記の定義された核受容体のいずれかからなっていてもよい。 この核受容体は、例えばタンパク質の精製を容易にするために、又はタンパク質を検出するため、又はタンパク質の活性を測定するために、さらなるドメインに融合され得る単離されたタンパク質であってもよい。
【００３６】
上で詳述したように、単離されたタンパク質はまた、核受容体のLBDがタンパク質の一部である限り、核受容体の一部を含んでいても核受容体の一部からなっていてもよい。従って、単離されたタンパク質はまた、核受容体の、アミノ末端調節ドメイン、DNA結合ドメイン、DNA結合ドメイン及びリガンド結合ドメインに接続しているヒンジ領域、並びに／又はカルボキシ末端ドメインを含み得る。さらなるドメイン及び領域は、互いに独立していても、LBDと同じ核受容体由来であっても、１つ又はそれ以上の他の核受容体由来であってもよい。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様において、核受容体は、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体(ROR)、特にRORα、RORβ又はRORγ、特にRORαである。
【００３８】
オーファン受容体RORは、RZRとも呼ばれ、最初はリガンドが同定されていなかった核受容体のサブファミリーを構成する。現在では、ROR受容体の３つのサブタイプが同定されている−RORα、RORβ、及びRORγ。ROR受容体はモノマー形態又はダイマー形態で、それぞれPuGGTCA型の配列に先行するA／Tが多い配列からなる特異的応答エレメントに結合し、標的遺伝子の転写を変更する。
【００３９】
選択的スプライシングに続いて、RORα遺伝子は、４つのアイソフォームα1、α2、α3及びα4 RZRAとなり、これらはそれらのＮ末端ドメインにおいて異なり、そしてDNA認識及び個々のトランス活性化特性を示す。
【００４０】
核受容体に関して、あらゆる哺乳動物ROR受容体が好ましく、そしてヒトROR受容体がなおさらに好ましい。
【００４１】
RORα(RAR関連オーファン受容体Ａ、RZRA、ROR1、ROR2、ROR3、NR1F1とも呼ばれる)は配列決定されており、その配列はNCBI (National Center for Biotechnology Information)データバンクより受入番号U04897で入手可能であり、これはヒトｍRNA及びタンパク質配列を提供している。RORαについての公知のアゴニストリガンドとしては、コレステロール、その誘導体及びおそらくメラトニンが挙げられる。
【００４２】
RORβ(RAR関連オーファン受容体Ｂ、RZRB、NR1F2とも呼ばれる)は配列決定されており、その配列はNCBI(National Center for Biotechnology Information)データバンクより受入番号Y08639で入手可能であり、これはヒトmRNA及びタンパク質配列を提供している。RORβの公知のアゴニストリガンドはレチノイン酸である。
【００４３】
RORγ(RAR関連オーファン受容体C、RZRG、RORG、NR1F3、TORとも呼ばれる)は配列決定されており、その配列はNCBI(National Center for Biotechnology Information)データバンクから受入番号U16997で入手可能であり、これはヒトmRNA及びタンパク質配列を提供している。
【００４４】
RORの３つの形態は以下を含む多数の重要な役割を果たす:
-  RORα：小脳の発達、骨の維持、リンパ節発達、免疫応答、骨格筋の発達、平滑筋細胞の分化、脂質代謝(疾患:例えば、小脳変性症、骨粗しょう症、虚血誘導血管形成、アテローム性動脈硬化症（artherosclerosis）、炎症性疾患)
-  RORβ：中枢神経系
-  RORγ：免疫応答、骨格筋、脂肪細胞分化
【００４５】
RORαのリガンド結合ドメインを制御可能な形態で含む単離されたタンパク質が特に好ましい。RORαの全長タンパク質は、523個のアミノ酸からなり、ここでアミノ酸271−523はリガンド結合ドメインをコードする。特に好ましいタンパク質を配列番号１に示す:
【化１】
2010540474.tif 000002
【００４６】
上記ドメインを含む典型的配列、さらにタグ及び切断部位を以下に示す: 以下のように示す:
【化２】
2010540474.tif 000003
【００４７】
単離されたタンパク質は、RORα1のアミノ酸270にHisタグ(HHHHHH；配列番号３)及びPreScission切断部位(LEVLFQGP；配列番号４)を挿入された配列番号１のドメインを含む。しかし、Hisタグは、例えば本明細書に記載されるような別の適切なタグ、さらには例えば以下に記載されるような別の適切な切断部位と置換されてもよい。それらの例を図１Ｂに示す。
【００４８】
本発明の一実施態様において、本発明の単離されたタンパク質は、マーカー、特にタグを含む。
【００４９】
本発明の文脈におけるマーカーは、容易に検出することができるあらゆる種類の分子であり得る。本発明において、この分子は単離されたタンパク質に結合され、従って、マーカーの存在は、単離されたタンパク質の存在の指標である。マーカー(標識とも呼ぶ)は当業者に公知であり、例えば放射性標識(例えば3H、32P、35S又は14C)、蛍光マーカー(例えばフルオレセイン、緑色蛍光タンパク質又はDyLight488)、酵素(例えばセイヨウワサビオキシダーゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−グルコシダーゼ)又は適切な抗体若しくは抗体フラグメントにより検出可能な抗原が挙げられる。
【００５０】
好ましくは、このマーカーはタグである。タグは通常、生化学的指標として使用されるタンパク質である。これらはタンパク質中に含まれていてもよく（例えば組み換えの発現されたタンパク質）、そしていくつかの目的に役立ち得る。好ましくは、これらはそれらが結合されたタンパク質を、特定のタグに適した標準的な条件を使用して精製するために使用される。しかし、タグはまた、特定のタンパク質の存在下で検出するために指標として使用され得る。
【００５１】
現在多数の(親和性)タグが知られている。これらは通常、それらの大きさにしたがって３つのクラスに分けられる:小さいタグは最大１２個のアミノ酸を有し、中程度の大きさのタグは最大６０個を有し、そしてより大きなタグは６０個より多くを有する。小さいタグとしては、Arg−タグ、His−タグ、Strep−タグ、Flag−タグ、T7−タグ、V5−ペプチド−タグ、及びc−Myc−タグが挙げられ、中程度の大きさのタグとしては、S−タグ、HAT−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、キチン結合ペプチド及びいくつかのセルロース結合ドメインが挙げられる。後者は189個までのアミノ酸を含み得、その結果GST−(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ−)及びMBP−タグ(マルトース結合タンパク質−タグ)のように、大きな親和性タグと見なされる。
【００５２】
特に純粋なタンパク質を製造するために、いわゆる二重タグ又はタンデムタグが開発された。この場合、タンパク質は２つの別々のクロマトグラフィー工程で精製され、各場合に第一のタグ、次いで第二のタグの親和性を利用する。このような二重タグ又はタンデムタグの例は、GST−His−タグ(ポリヒスチジン−タグに融合されたグルタチオン−S−トランスフェラーゼ)、6xHis−Strep−タグ(Strep−タグに融合された６個のヒスチジン残基)、6xHis−タグ100−タグ(哺乳動物MAP−キナーゼ２の12アミノ酸のタンパク質に融合された６個のヒスチジン残基)、8xHis−HA−タグ(血球凝集素−エピトープ−タグに融合された８個のヒスチジン残基)、His−MBP(マルトース−結合タンパク質に融合されたHis−タグ、FLAG−HA−タグ(血球凝集素−エピトープ−タグに融合されたFLAG−タグ)、及びFLAG−Strep−タグである。
【００５３】
好ましくは、本発明の単離されたタンパク質は、His−タグ、Arg−タグ、Strep−タグ、Flag−タグ、T7−タグ、V5−ペプチド−タグ、c−Myc−タグ、S−タグ、HAT−タグ、カルモジュリン−結合ペプチド−タグ、キチン−結合ペプチド−タグ、GST−タグ及びMBP−タグからなる群より選択されるタグを含む。しかし、あらゆる他のタグも使用され得るが、His−タグ、Arg−タグ、Strep−タグ、Flag−タグ又はGST−タグのようないくつかのタグが好ましい。
【００５４】
本発明の実施態様において、単離されたタンパク質は、マーカー又はタグを含み、ここでマーカー又はタグはタンパク質からタンパク質分解的切断により特異的切断部位（例えば酵素の切断部位）において除去可能である。これはLBDとマーカー又はタグとの間に位置し得る。切断部位は、例えばプロテアーゼ切断部位であり得る。プロテアーゼの例は、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、及びプラスミンであり；対応する切断部位は当業者に公知である。精製される分子はタンパク質であるので、特定のプロテアーゼ、特に通常は植物を攻撃するウイルス由来のプロテアーゼが好ましい。適切な特異的プロテアーゼの例は、トロンビン、第Xa因子、イガーゼ（Igase）、「タバコエッチウイルス」由来のTEV−プロテアーゼ、プロテアーゼPreScission (ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ)、エンテロキナーゼ又はKex2である。TEV−プロテアーゼ及びPreScissionが特に好ましい。
【００５５】
LBD、His−タグ及び精密（precision）切断部位を含むタンパク質の例が配列番号２に開示される。適切な核酸及びそのタンパク質をコードするベクターは、それぞれ配列番号５及び配列番号６で示される。さらに、本発明の典型的な単離されたタンパク質は、図１Ｂに示される。
【００５６】
配列番号６のベクターのヌクレオチド4021〜5040:
-  上の核酸配列：コード鎖(配列番号５)
-  下の核酸配列：テンプレート鎖
-  アミノ酸配列：His−タグ及びPreScission切断部位を含む（配列番号２）LBD（配列番号１で定義される)
【化３】
2010540474.tif 000004
【００５７】
【化４】
2010540474.tif 000005
【００５８】
ベクター(詳細については上記を参照のこと) (配列番号：６):
【化５】
2010540474.tif 000006
【００５９】
【化６】
2010540474.tif 000007
【００６０】
【化７】
2010540474.tif 000008
【００６１】
【化８】
2010540474.tif 000009
【００６２】
本発明のさらなる局面は、本発明の単離されたタンパク質を製造する方法に関し、この方法は:
ａ）本発明のタンパク質をコードする核酸を含む細胞を、タンパク質の産生をもたらす条件下で培養する工程、
ｂ）細胞培養物からタンパク質を単離する工程、及び
ｃ）工程ｂ）の単離されたタンパク質を、界面活性剤、特に飽和非分枝鎖C6−C20アルキル硫酸若しくは飽和非分枝鎖C6−C20アルキル炭酸のアルカリ塩、又はイソプレニル塩と接触させる工程、
を含む。
【００６３】
一般的に、本発明の方法の工程a)及びb)は、当業者に周知である。しかし、以下においてそれらは簡単にまとめられており、そして実施例により説明されている。当業者は、記載された方法が、単離される本発明のそれぞれのタンパク質、細胞培養に使用される細胞などに依存して改変され得ることを理解するだろう。
【００６４】
組み換えタンパク質の産生、すなわち生存細胞における外因性遺伝子産物の合成には、多様な発現系が利用可能である。これらは、一連の周知の生物及び細胞株(細菌、昆虫細胞、酵母、哺乳動物細胞など)、さらには異なるプロモーターを有する種々の発現ベクター、選択マーカー及び場合により融合パートナーを含む。組み換えタンパク質の産生は通常、プラスミド又はあらゆる他の適切なベクターへのコード遺伝子の導入を含む。一般に、適切なベクター又はプラスミドの選択は、意図された宿主細胞に依存する。次いでこのベクターを選択された標的細胞に導入し(形質転換又はトランスフェクション)、そしてこの標的細胞を培養する。プロモーターに依存して、遺伝子の発現は培養の期間にわたって生じ得るか、又は外部シグナルにより誘発され得る。
【００６５】
上で詳述したように、本発明のタンパク質をコードする適切な核酸又はそれを含むベクターを製造することが必要かもしれない。
【００６６】
本発明のタンパク質をコードする核酸は、上で定義されるような、核受容体をコードする天然に存在する遺伝子であってもよく、又は核受容体の一部をコードするその部分であってもよい。天然に存在するタンパク質又はその一部をコードする核酸の単離は、当業者に周知であり、そして適切なプローブ及び分離方法を使用する単離を含み得、又はこの核酸は販売業者から得てもよい。天然に存在する遺伝子に含まれない核酸（例えば、全長又は部分NR及びタグを含む融合タンパク質をコードする核酸）が使用される場合、融合タンパク質をコードするそれぞれの核酸は、遺伝子工学の周知の方法を含む標準的な手順にしたがって製造され得る。通常は、適切な制限エンドヌクレアーゼを、特定の部位でDNAを切断するために使用する。制限酵素により形成されるフラグメントは、リガーゼと一緒にされ得る。その後、このDNAは、遺伝物質を細胞に移入させるために適切なベクター中に導入され得る。このベクターは、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよい。適切なベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルスなどが挙げられる。市販のベクターの例は、pBR322、pUCシリーズ、pBluescript、pTZ、pSP及びpGEMである。あるいは、裸のDNAも細胞に導入され得る。核酸、すなわちDNA又はRNAがベクターなしで使用される場合、トランスフェクションは、それをカチオン性脂質と混合してリポソームを生成することにより行われ得、これが細胞膜と融合し、そして核酸を細胞内に挿入する。トランスフェクションはまた、リン酸カルシウムによっても行われ得、ここでは例えばリン酸イオンを含有するHEPES−緩衝生理食塩溶液を、トランスフェクトされるべきDNAを含有する塩化カルシウム溶液と混合する。２つの溶液が混合される場合、リン酸カルシウムの微細な沈殿が形成され、トランスフェクトされるべきDNAとその表面上で結合する。次いで沈殿物の懸濁液をトランスフェクトされるべき細胞に加える(通常、単層で培養された細胞培養物）。トランスフェクションのための他の方法としては、エレクトロポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、及びリポフェクタミン、Fugeneなどのようなトランスフェクション剤の使用が挙げられる。さらなるアプローチは、「遺伝子銃」であり、この場合DNAは不活性固体（通常は金）のナノ粒子とカップリングされ、次いでこれが標的細胞中に直接に発射される。
【００６７】
細胞のトランスフェクションは一時的でも安定でもよい。トランスフェクションプロセスの間に細胞中に導入された核酸が核ゲノム中に挿入されない場合、外来核酸は、後の段階で、細胞が有糸分裂を受ける際に失われるかもしれない。これは一時的トランスフェクションと呼ばれる。より好ましくは、トランスフェクションは安定トランスフェクションであり、この場合核酸は細胞のゲノムにとどまる。安定トランスフェクションを達成するために、通常は選択技術を使用し、ここで核酸を、選択的選択をもたらす別の遺伝子と同時トランスフェクトする（co−transfected）。追加の遺伝子は、特定の条件又は物質（例えば抗生物質又は代謝欠乏）に対する耐性を与え得る。適切な遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００６８】
本発明のタンパク質をコードする核酸を宿主に導入した後、その細胞を適切な条件下で増殖させる。タンパク質の産生のための一連の種々の宿主細胞は当業者に公知であり、これらには細菌、昆虫細胞、酵母、及び哺乳動物細胞が含まれる。このような細胞の例は、Sf9、Sf21、HEK 293細胞、CHO細胞、HeLa細胞、CaCo細胞又はNIH 3T3細胞である。
【００６９】
宿主細胞は、初代細胞でも細胞株でもよく、ここでは細胞株が好ましい。
【００７０】
本発明の核酸を含む細胞は、細胞の産生をもたらす条件下で増殖及び維持される。これには、場合により細胞インキュベーター中の適切な温度及び気体混合物（典型的には３７℃、５％CO2)が含まれる。培養条件は、各細胞の種類によって広く異なり、当業者に公知である。発現は例えば昆虫細胞において適切なバキュロウイルスベクター系を用いた形質転換後に起こり得る。このような場合、温度は２６℃に維持されるがCO2の制御は必要ない。
【００７１】
温度及び気体混合物に加えて、細胞培養系において最も一般的に変動する因子は、増殖培地である。増殖培地の配合は、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子及び特に他の栄養成分の存在の点で変化し得る。補給培地に使用される増殖因子は、しばしば、仔牛血清のような動物血液由来である。
【００７２】
当業者には、遺伝コードを考慮に入れてタンパク質配列から核酸配列（DNAでもRNAでもよい）を誘導する方法が知られている。当業者には、このような核酸配列を分子生物学の標準的な技術を使用して製造する方法も知られている。これは、例えば既存の配列を制限酵素を使用して使用及び組み合わせることにより達成することができる。核酸は、適切には、更なるエレメント、例えばプロモータ並びに転写開始及び停止シグナル並びに翻訳開始及び停止シグナルも含有する。
【００７３】
工程a)の後、当業者に公知のあらゆる適切な分離又は精製方法により細胞培養物からタンパク質を単離する。十分な量の標的タンパク質が培地中に分泌されている場合、それを用いて単離を続けることができる。そうでなければ、細胞を崩壊させることが必要かもしれない。これは、例えば超音波若しくは高張培地を用いて又は剪断により、例えば細胞の溶解により達成することができる。不溶性成分を除去するために、例えばサンプルを特に10,000ｘｇ〜15,000ｘｇで遠心分離することができ、そして得られた上清を工程ｃ）に使用することができるか、又はさらに精製若しくは濃縮してもよい。
【００７４】
工程ｂ）の単離は、代わりに、又は追加として、周知の精製濃縮工程、例えば抽出、沈殿、電気泳動法、クロマトグラフィー法などを含み得る。これらの例としては、細胞電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、SDS−PAGEクロマトグラフィー、又はアフィニティクロマトグラフィー、特に固定金属イオンアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)が挙げられる。
【００７５】
アフィニティ精製は、本発明の単離されたタンパク質が、上で定義されたように、適切なマーカー又はタグを含む場合に特に想定される。 アフィニティ精製は、吸着精製の特別な形態であり、ここでは担体上に２つのドメインの一方に対して高親和性、従って高い結合強度を有する基（結合パートナー）が存在し、その結果これらは優先的に吸着され、それ故他の物質から分離することができる。精製は第一及び第二のタグ（例えば、His−タグ及びGST−タグ)を使用して行うことができる。精製は、適切な結合パートナーに対する特異的結合により起こる。結合パートナーは、好ましくは固相に結合される。この固相は、通常の担体物質、例えばSepharose、Superflow、Macroprep、POROS 20又はPOROS 50であり得る。次いで分離は、例えばクロマトグラフィーにより、例えば重力、HPLC又はFPLC分離により行われる。目的のタンパク質は、変化した条件がもはやアフィニティマーカー若しくはタグと結合パートナーとの間の結合を可能にしないように条件を変更すること（例えばｐH値又はイオン強度の変更）により、又は分子を結合パートナーに結合したドメインと分離することにより、固相から溶出され得る。分離は、上で詳細に記載したように、例えば化学的手段又は特異的な酵素を使用することにより、分子と結合パートナーとの間の結合を切断することによりなされ得る。あるいは、特定の競合剤（これは過剰に加えられる）を使用することも可能である。あるいは、結合パートナーをビーズ、特に磁気ビーズに結合することもできる。このビーズをサンプルに加えた後、特定のドメインと対応する結合パートナーとの間の結合が生じる。次いで懸濁液を、例えば標識した分子がビーズとともに沈殿し、他の成分は上清に残り、そこからそれらを除去できるように遠心分離することができる。あるいは、ビーズの磁気特性を利用して懸濁液を分離する。一実施態様では、懸濁液をカラムに入れて、これを磁場に置く。磁気ビーズ及びそれらに結合した分子は磁場に保持されるので、サンプルの他の構成要素を何度か洗浄操作をして洗い流すことができる。次いで目的の分子を、例えば適切な溶離緩衝液を使用してビーズから洗い落とすことができ、又は例えばLBDとタグ若しくはマーカーとの間の切断部位における酵素的切断によりビーズから分離することができる。
【００７６】
工程ｂ）の後、LBDを制御可能な形態で提供するために、単離されたタンパク質を界面活性剤と接触させる。生物学的な意味での界面活性剤は、膜結合タンパク質を遊離及び可溶化するために細胞の二極性脂質膜を崩壊させるために一般的に使用される膜活性物質である。界面活性剤の有用性は、それらの両親媒性（amphophilic）の性質に由来する。各界面活性剤分子は、親水性の「頭」領域及び疎水性の「尾」領域を特徴とする。この特徴の結果、水性媒体中で疎水性の方向に沿って熱力学的に安定なミセルを形成する。疎水性コアは、疎水性の分子又はタンパク質のドメインの溶解を可能にする環境を提供する。界面活性剤はアニオン性でも、カチオン性でも両性イオン性でも非イオン性でもよい。アニオン性及びカチオン性の界面活性剤は典型的にタンパク質の構造を、他の２つのクラスよりも高い程度まで変更する。変更の程度は、個々のタンパク質及び特定の界面活性剤によって変化する。イオン性界面活性剤はまた、ｐＨ、イオン強度及び対イオンの性質により感受性であり、そして電荷に基づく分析方法と干渉し得る。あるいは、大部分の非イオン性界面活性剤は、非変性的であるが、タンパク質の集合を崩壊させる際にはより効果的でない。両性イオン性界面活性剤は、独特のいくつかの中間クラスの特性を与え、これはいくつかの用途においては他の３つの界面活性剤の種類よりも優れており、非イオン性界面活性剤の低い変性及び正味ゼロの電荷特性を与える。両性イオン（Zwitterionics）はまたタンパク質集合体を効果的に崩壊させる。
【００７７】
好ましくは、界面活性剤は飽和非分枝鎖C6−C20アルキル硫酸若しくは飽和非分枝鎖C6−C20アルキル炭酸のアルカリ塩であり又はイソプレニル塩である。アルカリ塩からは、リチウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩、特にリチウム塩が好ましい。
【００７８】
飽和非分枝鎖C6−C20アルキル硫酸塩は、n−ヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−ノニル、n−デシル、n−ウンデシル、n−ドデシル、n−トリデシル、n−テトラデシル、n−ペンタデシル、n−ヘキサデシル、n−ヘプタデシル、n−オクタデシル、n−ノナデシル、n−イコサイル（icosayl）硫酸塩であり得る。飽和非分枝鎖C6−C20アルキル炭酸塩は、n−ヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−ノニル、n−デシル、n−ウンデシル、n−ドデシル、n−トリデシル、n−テトラデシル、n−ペンタデシル、n−ヘキサデシル、n−ヘプタデシル、n−オクタデシル、n−ノナデシル、n−イコサイル炭酸塩であり得る。
【００７９】
本発明のさらに好ましい実施態様において、アルカリ塩はリチウム塩、好ましくはn−ヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−ノニル、n−デシル、n−ウンデシル、n−ドデシル、n−トリデシル、n−テトラデシル、n−ペンタデシル、n−ヘキサデシル、n−ヘプタデシル、n−オクタデシル、n−ノナデシル、n−イコサイル硫酸のリチウム塩、又はn−ヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−ノニル、n−デシル、n−ウンデシル、n−ドデシル、n−トリデシル、n−テトラデシル、n−ペンタデシル、n−ヘキサデシル、n−ヘプタデシル、n−オクタデシル、n−ノナデシル、n−イコサイル炭酸のリチウム塩である。
【００８０】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の単離されたタンパク質を製造する方法は、マーカー又はタグを工程ｂ）又は工程ｃ）の後に除去することをさらに含む。マーカーの除去は、例えば、マーカーを切除することにより行われ得る。マーカーは、タンパク質を特異的切断部位において特異的に切断する適切な酵素により切除され得る。切断部位は、プロテアーゼ切断部位であり得、これはマーカー又はタグとLBDとの間のスペーサーに位置し得る。プロテアーゼの例は、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ及びプラスミドであり；対応する切断部位は当業者に公知である。精製される分子はタンパク質であるので、特異的プロテアーゼ、特に通常は植物を攻撃するウイルス由来のプロテアーゼが好ましい。適切な特異的プロテアーゼの例は、トロンビン、第Xa因子、イガーゼ（Igase）、タバコエッチウイルス由来のTEV−プロテアーゼ、プロテアーゼPreScission(ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ)、エンテロキナーゼ又はKex2であり、TEV−プロテアーゼ及びPreScissionは特に好ましい。
【００８１】
本発明のさらに好ましい実施態様において、飽和分枝鎖C6−C20アルキル硫酸又は飽和分枝鎖C6−C20アルキル炭酸のアルカリ塩は、飽和分枝鎖C9−C15アルキル硫酸のアルカリ塩、好ましくはドデシル硫酸のアルカリ塩、より好ましくはドデシル硫酸リチウム(LDS)である。これに従って、飽和分枝鎖C9−C15アルキル硫酸塩は、n−ノニル硫酸、n−デシ
ル硫酸、n−ウンデシル硫酸、n−ドデシル硫酸、n−トリデシル硫酸、n−テトラデシル硫酸、又はn−ペンタデシル硫酸のリチウム塩、ナトリウム塩又はカリウム塩、特にn−ノニル硫酸リチウム 、n−デシル硫酸リチウム、n−ウンデシル硫酸リチウム、n−ドデシル硫酸リチウム、n−トリデシル硫酸リチウム、n−テトラデシル硫酸リチウム、又はn−ペンタデシル硫酸リチウム、さらに特にドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸カリウム、特にドデシル硫酸リチウムである。
【００８２】
本発明の別の実施態様において、界面活性剤は、イソプレニル塩である。イソプレニル塩は、イソプレンのあらゆる塩であり、例えばイソプレニル酢酸塩、イソプレニルジホスフェート、イソプレニルピロホスフェートである。本発明の別の実施態様において、界面活性剤は、1−4イソプレニル−単位及びヒドロキシル基からなるテルペン、又は対応する炭酸、硫酸、リン酸若しくはピロリン酸のアルカリ塩又はアンモニウム塩、特にゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルピロホスフェート、ファルネシルピロホスフェート若しくはゲラにルゲラにルピロホスフェートである。
【００８３】
本発明のさらなる実施態様において、工程ｂ)及び／又はｃ)は、LBDのアゴニストの存在下で行われ得る。このアゴニストは、天然に存在するアゴニスト又は機能的に活性なその誘導体であっても、天然に存在するアゴニストとは異なるアゴニストであってもよい。核受容体に結合して活性化する天然に存在するアゴニストリガンドには、内因性ホルモンのような親油性（lypophilic）物質、ビタミンＡ及びＢ並びに生体異物内分泌かく乱物質が含まれる。例えば、甲状腺ホルモン受容体は、甲状腺ホルモン、特にチロキシン(T4)の結合により活性化される。レチノイン酸受容体の天然に存在するリガンドは、オールトランスレチノイン酸及び9−cisレチノイン酸である。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体のリガンドは、遊離脂肪酸及びエイコサノイドであり; PPARγはPGJ2(プロスタグランジン)により活性化され、そしてPPARαはロイコトリエンB4により活性化される。肝臓Ｘ受容体α及びβは、偏性（obligate）パートナーRXRとヘテロダイマーを形成する。このヘテロダイマーは、LXRアゴニスト(例えばオキシステロール類)又はRXRアゴニスト(例えば9−cis レチノイン酸)でも活性化され得る。オキシステロールは、コレステロールの酸素化誘導体であり、例えば22(R)−ヒドロキシコレステロール、24 (S)−ヒドロキシステロール、27−ヒドロキシステロール及びコレステン酸（cholestenoic acid）である。他のアゴニストは、ビタミンＤ(ビタミンＤ受容体)、ステロイド類(エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体)、コルチゾール (グルココルチコイド受容体)、アルドステロン(鉱質コルチコイド受容体)又は脂肪酸(肝細胞核因子4)であり得る。天然に存在しないアゴニストリガンドは、グルココルチコイド受容体についてデキサメタゾン又はエストロゲンについてジエチルスチルベストロール(DES)を含む。RORファミリーのメンバーの適切なアゴニストリガンドには、コレステロール及びその誘導体、例えばコレステロールサルフェート、又はメラトニンが挙げられる。
【００８４】
上で詳述したように、本発明の単離されたタンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸を含む細胞を、タンパク質の産生をもたらす適切な条件下で培養することにより製造される。本発明の一実施態様において、細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母細胞からなる群より選択される。動物細胞の適切な細胞としては、哺乳動物細胞、特にヒト細胞が挙げられる。それらの細胞の例は上述した。あるいは、細胞は酵母細胞、例えばE. coli細胞又は昆虫細胞でもよい。
【００８５】
本発明の単離されたタンパク質を製造する典型的な方法は、実施例１に記載される。
【００８６】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法にしたがって製造された、核受容体のリガンド結合ドメインを制御可能な形態で含む単離されたタンパク質に関する。
【００８７】
当業者は、単離されたタンパク質が本発明の実施態様のいずれかにおいて、特に本発明の好ましい実施態様において、上で定義されたとおりであり得ることを理解するだろう。
【００８８】
本発明のさらなる局面は、核受容体のリガンド結合ドメインのリガンド、特にアゴニスト又はアンタゴニスト、特にアゴニストの同定のための、単離されたタンパク質の使用に関する。本発明によれば、本発明の単離されたタンパク質は、核受容体のLBDのリガンド、特にアゴニスト又はアンタゴニストの同定のために、例えば、下流シグナル伝達をオン又はオフに切り替えることにより使用され得る。これに従って、あらゆる下流シグナルは、リガンドの結合を検出するために検出又は評価され得る。それがアゴニストの探索のためである場合、そのアゴニストは下流シグナル経路の活性化により同定され得る。他方、アンタゴニストは、下流シグナル伝達をオフに切り替えることにより同定され得る。アンタゴニストの場合、アンタゴニストによるアゴニスト誘導シグナル伝達の不活化を検出するために、アゴニストと可能性のあるアンタゴニストとの組み合わせを使用することが必要であるかもしれない。上で詳述したように、核受容体のシグナル伝達は一般的に、多量体、特にダイマーの形成、コアクチベーター及び／若しくはコリプレッサーの結合、又は遺伝子転写の変更、しばしば遺伝子転写の誘導、従ってmRNA及びタンパク質の産生、それ故変化した細胞機能を含む。
【００８９】
上記のシグナル伝達に従って、変化したシグナル伝達は、第二のタンパク質(例えばコアクチベーター又はコリプレッサー)に対する目的のタンパク質の結合、標的遺伝子への結合、mRNA若しくはタンパク質の量の決定、又は変更された細胞機能を含むシグナル伝達の各レベルにおいて評価され得る。さらなるタンパク質又は標的遺伝子へのタンパク質の結合を決定する方法は当業者に周知であり、本明細書に記載されるものを含む。ｍRNAまたはタンパク質の量を決定するための方法もまた当業者に周知である。変化した細胞機能を観察する方法は、細胞機能の種類に大いに依存し、また当業者に周知である。
【００９０】
本発明のなおさらなる局面は、
-  本発明の単離されたタンパク質、
-  補因子、及び
-  核受容体のリガンド結合ドメインに対するリガンド、特にアゴニストの結合の際にタンパク質と補因子との間の相互作用を検出するための手段
を含む試験系に関する。
【００９１】
本発明によれば、本発明の単離されたタンパク質は、上記の局面及び実施態様、特に好ましい実施態様において特定されたとおりのタンパク質のいずれかであり得る。さらに、補因子（共調節因子、共調節タンパク質、又は転写共調節因子とも呼ばれ、コアクチベーター又はコリプレッサーも含む；上記も参照のこと）は、アゴニストリガンドの結合により活性化された核受容体に結合され、一方、コリプレッサーは、アンタゴニストリガンドの結合の際に核受容体により結合される。核受容体コアクチベーターの一般的な特徴は、それらがNR (核受容体)ボックスと呼ばれる１つ又はそれ以上のLXXLL結合モチーフ(５個のアミノ酸の連続した配列、ここでＬ＝ロイシンであり、そしてＸ＝任意のアミノ酸である)を含有するということである。LXXLL結合モチーフは、核受容体のLBDの表面上の構造に結合することが示されている。例としては以下が挙げられる:
-  NCOA−1 (核受容体コアクチベーター1)／SRC−1(ステロイド受容体コアクチベーター−1)
-  NCOA−2 (核受容体コアクチベーター2)／GRIP−1 (グルココルチコイド受容体相互作用タンパク質1)
-  NCOA−3 (核受容体コアクチベーター3)／AIB−1(胸部で増幅される)
-  NCOA−4 (核受容体コアクチベーター4)／ARA 70 (アンドロゲン受容体関連タンパク質70)
-  NCOA−5 (核受容体コアクチベーター5)
-  NCOA−6 (核受容体コアクチベーター6)
-  NCOA−7 (核受容体コアクチベーター7)
-  PGC−1 (増殖因子活性化受容体γコアクチベーター1)
-  CBP (cAMP応答エレメント結合(CREB)タンパク質結合タンパク質)
-  PCAF (p300／CBP関連因子)
-  ARA 54 (アンドロゲン受容体関連タンパク質54)
-  ARA 55 (アンドロゲン受容体関連タンパク質55)
【００９２】
コリプレッサータンパク質はまた、核受容体のリガンド結合ドメインの表面に結合するが、アミノ酸のLXXXIXXX(Ｉ／Ｌ)モチーフ（ここでＬ＝ロイシンであり、Ｉ＝イソロイシンであり、そしてＸ＝任意のアミノ酸である）を経由する。さらに、コリプレッサーは好ましくは、アゴニストの無い不活化形態、又は場合によりアンタゴニストが結合した形態の核受容体に結合する。コリプレッサーの例としては以下が挙げられる:
-  NCOR−1 (核受容体コリプレッサー)
-  NCOR−2 (核受容体コリプレッサー)／SMRT (レチノイド及び甲状腺ホルモン受容体のためのサイレンシングメディエーター(コリプレッサー))
-  LCoR (リガンド依存性コリプレッサー)
-  RCOR (RESTコリプレッサー)
-  CtBP 602618
-  Rb (網膜芽腫タンパク質)
-  SIN3 (SIN3a、SIN3b)。
【００９３】
二重機能アクチベーター／リプレッサーを有する補因子としては以下が挙げられる:
-  PELP−1 (プロリン、グルタミン酸及びロイシンリッチタンパク質１)
-  NSD−1
-  RIP−14 (RXR−相互作用タンパク質14)
【００９４】
コアクチベーターは、本発明に従う単離されたタンパク質に含まれるLBDに依存して選択され得る。当業者は、 補因子が、LBDが由来する核受容体のシグナル伝達に依存することを理解し、そしてリガンドの結合の際の補因子とLBDを含む単離されたタンパク質との間の相互作用を検出するための本発明の試験系に適した補因子を選択することができるだろう。
【００９５】
本発明の好ましい実施態様において、補因子は、場合によりマーカー、好ましくはタグで標識された、グルココルチコイド受容体不活化タンパク質−１ (GRIP−1)又はステロイド受容体コアクチベーター−１ (SRC−1)である。
【００９６】
GRIP−1は、いくつかの核受容体相互作用ドメイン及び固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を含む転写共調節タンパク質である。GRIP−1は、リガンド活性化核受容体、例えばROR、特にRORαによりDNA促進（promotion）部位に補強される。今度はGRIP−1が、DNA転写を促進するヒストンをアセチル化する。GRIP−1はSRC−２(ステロイド受容体コアクチベーター−２)又は転写メディエーター／仲介因子２(TIF−2)又は核受容体コアクチベーター２(NCOA2)とも呼ばれる。
【００９７】
SCR−1はまた、いくつかの核受容体相互作用ドメイン及び固有のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性も含む転写共調節タンパク質でもある。SRC−1は、リガンド活性化核受容体によりDNA促進部位に補強され、今度はこれがヒストンをアセチル化し、下流DNA転写を促進する。SRC−1は核受容体コアクチベーター−１(NCOA−1)とも呼ばれる。
【００９８】
本発明の一実施態様において、補因子は、マーカー、好ましくはタグで標識され得る。マーカー又はタグは上で定義されたとおりであり得る。マーカーは、補因子の精製に使用され得るか、又は単離されたタンパク質と補因子との間の相互作用を検出するために使用され得る。適切なマーカーとしては抗体、抗原、酵素、放射標識などが挙げられる。しかし、補因子は、単離されたタンパク質と補因子との間の相互作用のシグナル指標の検出を可能にするために試験系の他の構成要素との相互作用をなお可能にするやり方で標識されるべきである。
【００９９】
本発明の好ましい実施態様において、試験系は、タンパク質が補因子に近接することにより検出可能なシグナルが誘発される形で設計される。
【０１００】
単離されたタンパク質と補因子との近接は、単離されたタンパク質の補因子への結合により達成され得る。シグナルの誘発は、構成要素をそれぞれ標識することにより達成され得、ここで標識の近接により検出可能なシグナルが誘発される。誘発された検出可能なシグナルは、化学発光シグナル、色の変化、蛍光シグナル、放射線又はあらゆる他の適切なシグナルであり得る。シグナルは２つの標識の相互作用により誘発され得、ここで各ラベルは試験系の１つの構成要素、すなわち単離されたタンパク質及び補因子に結合される。このようなシグナルは、近接をシンチレーションカウンターで検出するために（シンチレーション近接アッセイ）、一方で放射標識、例えば125I、そして他方に適切なクエンチャーを含む。構成要素は、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動、以下を参照のこと）を検出する様式で標識された抗体に接近可能な抗原を含み得る。別の代替では、タンパク質の１つがキナーゼによりリン酸化することができる生体分子をその表面上に結合しており、そして他の構成要素がその表面に、例えば適切なリンカー（例えばニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、又は適切に置換されたＮ含有複素環、例えばトリアゾ複素環、例えばトリアゾシクロノナネオノナン（triazocyclononaneononane）、例えば1−プロピルアミノ−4−アセタト−1,4,7−トリアザシクロノナン）を介して錯化される三価金属を有する。化学発光シグナルは、ドナー粒子及びアクセプター粒子が近接する場合に生成され、これはタンパク質の補因子への結合の際に起こる(発光近接アッセイ)。
【０１０１】
本発明の１つの好ましい実施態様において、タンパク質と補因子との間の相互作用を検出するための手段は、そのタンパク質又は補因子に特異的な少なくとも１つの抗体を含む。上で詳述したように、単離されたタンパク質は、特異的な抗及び抗体の検出のための抗原を含み得る。本発明のなおより好ましい実施態様において、試験系は２つの抗体を含み、ここで第一の抗体はタンパク質に特異的であり、そして第二の抗体は補因子に特異的である。抗体は、それぞれの構成要素の存在の指標である適切なマーカーで標識され得る。あるいは、上述の一次抗体は、一次抗体に指向された適切な二次抗体により検出され得る。二次抗体は、例えば二次抗体に結合した場合に、一次抗体の存在を検出するために使用され得る。一次又は二次抗体は、上記のようなマーカー、例えば酵素、放射標識、蛍光マーカー、化学発光マーカーなどで標識され得る。あるいは、構成要素(タンパク質及び／又は補因子)は、適切な抗体で検出可能なタグを含んでいてもよい。
【０１０２】
試験系は、錯体の少なくとも１つの構成要素の分離のための精製系が使用され、そしてタンパク質及び補因子の錯体又は錯体の構成要素の各々の存在が検出される様式で使用され得る。例えば、錯体は、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、アフィニティ精製などにより精製され得、そして錯体は錯体の一方の構成要素又は錯体の両方の構成要素の指標である１種又は２種のシグナルの存在により検出され得る。例えば、構成要素の１つの錯体に特異的な分離技術が使用される場合、検出方法は他の構成要素に限定され得る。あるいは、精製方法は、構成要素の一方に特異的ではないかもしれず（例えばゲル電気泳動）、そして錯体の形成は２種のシグナル、例えば区別可能な蛍光マーカーで標識された２つの抗体により検出され得、ここで例えばゲルの同じ領域での両方の蛍光マーカーの存在は、錯体の指標である。
【０１０３】
本発明のなおさらなる実施態様において、本発明の試験系は以下のことを特徴とする、
ａ）第一の抗体が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のためのドナー部分で標識されており、そして第二の抗体はFRETのためのアクセプター部分で標識されているか、若しくはその逆であり；又は
ｂ）第一の抗体が時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR−FRET)のためのドナー部分で標識されており、そして第二の抗体がTR−FRETのためのアクセプター部分で標識されているか、若しくはその逆であり；又は
ｃ）第一の抗体が増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ（Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay）(ALPHA)のためのドナー部分で標識されており、そして第二の抗体がALPHAのためのアクセプター部分で標識されているか、若しくはその逆である。
【０１０４】
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、２つの発色団の間の無輻射エネルギー移動を表す。ドナー発色団はその励起状態において無輻射遠距離双極子−双極子カップリングメカニズムにより近接している(典型的に＜10nm)アクセプターフルオロフォアにエネルギーを移動することができる。両方の分子が蛍光性であるので、エネルギー移動はしばしば「蛍光共鳴エネルギー移動」と呼ばれるが、エネルギーは実際には蛍光により移動されない。FRETはタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−DNA相互作用、及びタンパク質コンホメーション変化を検出及び定量するための有用なツールである。１つのタンパク質の別のタンパク質への結合又は１つのタンパク質のDNAへの結合をモニタリングするために、分子の一方をドナーで標識し、他方をアクセプターで標識し、そしてこれらのフルオロフォア標識分子を混合する。それらが非結合状態で存在する場合、ドナーの発光がドナーの励起の際に検出される。分子が結合すると、ドナー及びアクセプターは近接し、そしてアクセプターの発光が、ドナーからアクセプターへの分子間FRETのために主に観測される。 FRETに適した隣接するもの（neighbors）は当該分野で公知であり、そして当業者は両方の抗体に適切な標識の組み合わせを選択することができる。ドナー及び対応するアクセプターに関して本明細書において使用される「対応する」は、ドナーの励起スペクトルと重なる発光スペクトルを有するアクセプター蛍光部分を指す。しかし、両方のシグナルは、互いに分離可能であるべきである。従って、アクセプターの発光スペクトルの極大波長は、好ましくは少なくとも30nm、より好ましくは少なくとも50nm、例えば少なくとも80nm、少なくとも100nm又は少なくとも150nm、ドナーの励起スペクトルの極大波長より大きい。
【０１０５】
FRET技術において種々のアクセプター蛍光部分とともに使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、B−フィコエリトリン、9−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローVS、4−アセトアミド−4’−イソチオシアナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸、7−ジエチルアミノ−3−(4’−イソチオシアナトフェニル)−4−メチルクマリン、1−ピレン酪酸スクシンイミジル（succinimdyl）、及び4−アセトアミド−4’−イソチオシアナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に依存して、LC−Red 610、LC −Red 640、LC−Red 670、LC −Red 705、Cy5、Cy5.5、リサミン（Lissamine）ローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミン×イソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート又はランタニドイオン（例えば、ユーロピウム又はテルビウム）の他のキレートが挙げられる。ドナー及びアクセプター蛍光部分は、例えばMolecular Probes (Junction City、OR)又はSigma Chemical Co. (St. Louis、MO)から入手することができる。
【０１０６】
あるいは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR−FRET)は、本発明の試験系に使用され得る。TR−FRETはTRF(時間分解蛍光)とFRETの原理を統合したものである。この組み合わせは、TRFの低いバックグラウンドの利点とFRETの均一アッセイ形式を兼ね備える。FRETは既に上で記載されているが、TRFは、ランタニド又は長寿命を有するあらゆる他のドナーの独特の特徴を利用する。TR−FRETに適したドナーとしては、とりわけ、ランタニドキレート(クリプタート)及びいくつかの他の金属リガンド錯体が挙げられ、これらはマイクロ秒〜ミリ秒の時間範囲の蛍光半減期を有し得、従ってマイクロ秒〜ミリ秒の測定でエネルギー移動が起こることも可能にする。蛍光ランタニドキレートは、７０年代後期にエネルギードナーとして使用されてきた。一般的に使用されるランタニドとしては、サマリウム(Sm)、ユーロピウム(Eu)、テルビウム(Tb)及びジスプロシウム(Dy)が挙げられる。それらの特定の光物理的特性及びスペクトル特性のために、ランタニドの錯体は生物学における蛍光応用に関して大いに興味が持たれる。詳細には、それらは大きなストロークシフト、及びより伝統的なフルオロフォアと比較して非常に長い発光半減期(マイクロ秒〜ミリ秒)を有する。
【０１０７】
通常は、有機発色団がアクセプターとして使用される。これらとしてはアロフィコシアニン(APC)が挙げられる。TR−FRETに関する適切な詳細、さらにはアクセプターはWO98／15830に記載される。
【０１０８】
本発明のさらなる実施態様において、本発明の試験系は、増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ(ALPHA)のために適合される。ALPHAは元々はPackard BioScienceにより開発された溶液ベースのアッセイである。ALPHAは発光ベースの近接アッセイであり、ここで一方の相互作用パートナーがドナービーズに付着され、他方はアクセプタービーズにカップリングされ、両方ともわずか約250nmの直径を有する。光増感剤化合物がドナービーズに包埋される。この化合物を用いて波長約680nmのレーザー光を照射すると、周囲酸素はエネルギーの高い単寿命の一重項酸素に変換される。アクセプタービーズが近接にない場合、一重酸素はシグナルを生じることなく減衰する。付着した生体分子の生物学的相互作用によりドナー及びアクセプタービーズが一緒になると(約250nm)、ドナービーズにより放出される一重項酸素は近隣のアクセプタービーズにおける発光／蛍光カスケードを開始し、520−620nm範囲において高度に増幅されたシグナルをもたらす。発光シグナルを適切なリーダーで検出する。ALPHA技術に関するより詳細は、Ullman et al.、1994、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 91、5426−5430を参照のこと。
【０１０９】
典型的な試験系及びその使用は実施例2に記載され、そして図１Ｃに図示される。
【０１１０】
本発明のなおさらなる局面は、核受容体のリガンド結合ドメインのリガンドをスクリーニングする方法に関し、この方法は、以下の工程:
ａ）本発明の試験系を物質と接触させる工程、及び
ｂ）物質がリガンド結合ドメインに結合した際に測定可能なシグナルを検出し、それにより物質をリガンド結合ドメインのリガンドとして同定する工程。
【０１１１】
本発明によれば、試験系は、本発明のこの説明において詳細に特定され得、特に好ましい実施態様として詳細に特定され得る。試験系は、細胞中に含まれても、無細胞系でもよい。無細胞系が好ましい。試験系を、測定可能なシグナルを検出するために適した条件下で試験物質と接触させ得る。これには、適切な温度、化学的環境(緩衝液、ｐＨ値など)、さらには物質の適切な温度及び適切な接触時間が含まれる。
【０１１２】
接触後、又は接触と同時にシグナルが観測され、ここでシグナルの検出はLBDのリガンドの指標である。シグナルは、本発明の試験系、及び本発明の単離されたタンパク質、並びにその使用の文脈において上で詳述したあらゆるシグナルであり得る。
【０１１３】
本発明の方法の好ましい実施態様において、試験系は、FRET若しくはTR−FRETのためのドナーで標識された第一の抗体、及びFRET若しくはT−FRETのためのアクセプター部分で標識された第二の抗体、又はその逆を含む。さらに、FRETの存在はアゴニストの指標である。
【０１１４】
本発明の好ましい実施態様において、スクリーニング方法は、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム性動脈硬化症、異常脂質血症、神経変性疾患、睡眠障害、概日リズムの疾患又は骨粗しょう症を予防及び／又は処置するための医薬についてのスクリーニングのために使用される。
【０１１５】
上述の疾患は、ROR、特にRORαと関係している。従って、ROR、特にRORα LBDのアゴニスト又はアンタゴニストは、これらの疾患に対して有益な影響を有し、従ってこれらの疾患を予防又は処置するために使用され得ることが推測される。
【０１１６】
以下において、本発明を図面及び実施例により説明するが、これらは本発明の範囲を限定することを意図されない。
【実施例】
【０１１７】
実施例１：RORα−発現、精製及びAD
RORアルファタンパク質の発現及び精製をKallen et al..2002、Structure、10 (1697)に従って行った。
発現及び精製のために、リガンド結合ドメイン(LBD、アミノ酸271−523)を含むRORα1のDNAを、６個の連続したヒスチジン残基及びHRV 3Cプロテアーゼの認識配列とともにpVL1393ベクターにクローニングした。Sf9昆虫細胞でのVirus生成及び発現を標準的な手順にしたがって行った。感染した細胞を感染７２時間後に採取し、そして細胞ペレットを−80℃で保存した。
【０１１８】
凍結した細胞ペレットを500mM NaCl、50mM Tris、pH 8.0、5mM β−メルカプトエタノール中に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤(完全EDTA−非含有、Roche Diagnostics)、さらにはBenzonase (Novagen)を加えた。溶解物を３０分間氷上で撹拌し、そして細胞を最終的に超音波処理で崩壊させた。遠心分離の後、透明の溶解物を、500mM NaCl、50mM Tris、pH 8.0で平衡化したNi2+−充填HisTrap FF (GE Healthcare)カラム上に入れた。500mM NaCl、500mMイミダゾール、pH 8.0への30CVでの線形グラジエントを用いて溶出を行った。フラクションをSDS−PAGEで分析し、そして対応するフラクションをプールし、そして30mM Hepes、pH 7.0、20mM NaCl、2mM DTT、5％グリセロールに対して透析した。
【０１１９】
さらなる精製のために、タンパク質を、30mM Hepes、pH 7.0、20mM NaCl、2mM DTTで平衡化したHiTrap Q FFアニオン交換カラム(GE Healthcare)上にロードした。タンパク質を30mM Hepes、pH 7.0、1 M NaCl、２mM DTTへの20CVグラジエントで溶出した。対応するフラクションをプールし、そして150mM NaCl、５mM DTT、50mM Tris、pH 7.5で平衡化したSuperdex 200 26／60ゲル濾過カラム(GE Healthcare)でさらに精製した。RORα LBDを含むフラクションをプールし、そして濃縮した。タンパク質フラクションは、SDS−PAGE及びキャピラリ電気泳動(Agilent 2100 Bioanalyzer)により少なくとも９５％の純度と判定された。
【０１２０】
タンパク質(2.3mg／ml)をアリコートに分けて−80℃で保存した。インビトロアッセイに使用する前に、タンパク質を20mM Tris、pH 7.5に対して８時間室温で透析した。ドデシル硫酸リチウム(LDS)を３mMの最終濃縮物に加え、そして混合物を室温で穏やかに振盪しながら終夜さらにインキュベートした。タンパク質をアリコートに分けて−80℃で保存した。
【０１２１】
精製してLDSで処理したRORαLBDタンパク質は、グルココルチコイド受容体−相互作用タンパク質１(GRIP1)及びステロイド受容体コアクチベーターＩ (SRC1)と補因子補強（recruitment）蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ(FRET)において相互作用することが示された。詳細には、２つの補因子の異なる核受容体ボックス(NR)から誘導されたペプチドGRIP1−NR1、GRIP1−NR2及びSRC1−NR1＋2はRORαと相互作用することが見いだされた。
【０１２２】
３つの場合全てにおいてコレステロールサルフェートは、22μMのEC50での用量依存的な補因子結合を誘導することができた。等モル量の蛍光性抗6xHis抗体で標識された20nM RORαLBDタンパク質を、 400nMのそれぞれビオチンで標識されたペプチド及び当モル量のストレプトアビジン−タグ化フルオロフォアとともに50mM Tris、100mM NaCl、1mM DTT及び0.1％ BSAを含有する緩衝液中で２時間インキュベートした。665nm及び612nmにおける蛍光比の時間分解測定は、 コレステロールサルフェート及びコレステロールのような既知のアゴニストによる用量依存性補因子補強を示した。
【０１２３】
実施例２：LXXLLペプチド、SRC1−NR1＋2とのRORアルファLBD相互作用を測定するTR−FRETアッセイ
TR−FTETアッセイのために以下の材料を使用した:
タンパク質: 
-  6xHis−RORアルファ:
供給源: Protein Production (Thomas Langer研究室)、３mM LDSで処理、1.5mg／mlストック溶液、−20℃で保存、室温でピペット操作、47,5μMに対応(分子量31,6 kD)、アッセイにおける濃度＝20nM
-  SRC1−NR1＋2:
供給源:JPT Peptide Technologies、250μMのストック溶液、−20℃で保存、アッセイにおける濃度＝400nM
フルオロフォア／標識:
-  抗6xHis抗体:
供給源: Perkin Elmer # AD0110、ストック溶液は各バッチで種々の濃度であった、−20℃で保存、アッセイにおける濃度＝20nM
-  strep−APC:
供給源: Perkin Elmer # AD0201、ストック溶液は各バッチで種々の濃度であった、再構成後＋４℃で保存、アッセイにおける濃度＝200nM(ストレプトアビジンに基づく)
アゴニスト:
-  コレステロールサルフェート:
供給源: SIGMA #C9523、DMSO中ストック溶液(30mM)、−20℃で保存
緩衝液:
-  50mM Tris、100mM NaCl、１mM DTT、0,1％ウシ血清アルブミン(それぞれの日に新鮮なBSAを加えた)、pHを7.4に調整
プレート:
-  試験プレート:CORNING Costar # 3639 (96ウェルハーフエリア)
【０１２４】
アッセイを以下のように行った:
全てのタンパク質、標識及び化合物をアッセイ設定の直前にアッセイ緩衝液で希釈した。このアッセイは96ウェルハーフエリアプレートで実現した。最終試験体積は20μlであった。これを２段階のピペット操作で分割した:
最初に、6xHis−RORアルファLBDタンパク質、ビオチンSRC1−NR1＋2ペプチド、抗6xHis抗体及びstrep−APCを含む混合物を氷上で以下の濃度で調製した:
試験濃度(最終):
６ｘＨｉｓ−ＲＯＲアルファＬＢＤ    ２７ｎＭ        ２０ｎＭ
ビオチンＳＲＣ１−ＮＲ１＋２        ５３３ｎＭ      ４００ｎＭ
抗６ｘＨｉｓ抗体                    ２７ｎＭ        ２０ｎＭ
ｓｔｒｅｐ−ＡＰＣ                  ２６７ｎＭ      ２００ｎＭ
→この混合物15μlをプレピペット処理（prepipetted）して白色96ウェルプレートに入れた
【０１２５】
第二の工程において、アゴニスト化合物５μlを４倍濃縮溶液として加えた。コレステロールサルフェートを典型的には300μM最終化合物濃度から２倍希釈段階で下げていき約10μMのEC50を得た。プレートを密閉して蒸発を防いだ。
【０１２６】
プレートを２時間柔らかい光の下で室温にてインキュベートし、そして室温にてTecan ULTRAで340nmの励起及びユーロピウム参照として612nmで、そしてAPC FRETシグナルとして665nmで読み取った。この試験の結果を図２に示す。
【図１Ａ】
2010540474.tif 000010
【図１Ｂ】
2010540474.tif 000011
【図１Ｃ】
2010540474.tif 000012
【図２】
2010540474.tif 000013
【配列表】
2010540474000001.app
【国際調査報告】
2010540474.tif 000014
2010540474.tif 000015