(57)【要約】新規ユビキチン活性化酵素Ｕｂａ６を提供する。Ｕｂａ６経路を介してユビキチンを阻害するための組成物および方法を提供する。ユビキチン化の新規阻害剤を同定する方法も提供する。新規ＲＮＡｉ分子も提供する。
2010516254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｕｂａ６活性を阻害する方法であって、Ｕｂａ６を、ユビキチン−アデニル酸中間体の形成を阻害する化合物と接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記化合物が、Ｕｂａ６のアデニル化ドメインと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インビトロまたはインビボで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
組織培養細胞内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｕｂａ６活性を阻害する方法であって、Ｕｂａ６を、Ｕｂａ６のチオールエステル化を阻害する化合物と接触させることを含む方法。
【請求項６】
インビトロまたはインビボで行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組織培養細胞内で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ｕｂａ６活性を阻害する方法であって、Ｕｂａ６を、ユビキチン結合酵素へのユビキチン転移を阻害する化合物と接触させることを含む方法。
【請求項９】
前記化合物が、Ｕｂａ６のＵｂｌドメインと結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
インビトロまたはインビボで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
組織培養細胞内で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ユビキチン結合酵素が、Ｅ２Ｃ、Ｅ２Ｄ１、Ｅ２Ｄ２、Ｅ２Ｄ３、Ｅ２Ｄ４、Ｅ２Ｅ１、Ｅ２Ｇ、Ｅ２Ｓ、Ｅ２Ｔ、およびＥ２Ｚから成る群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ユビキチン結合酵素が、Ｅ２Ｚである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ユビキチン活性化を阻害する方法であって、Ｕｂａ６を、Ｕｂａ６の触媒性システインドメインを阻害する化合物と接触させることを含む方法。
【請求項１５】
インビトロまたはインビボで行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組織培養細胞内で行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｕｂａ６活性を必要とする生物内で、Ｕｂａ６活性を低下させる方法であって、
Ｕｂａ６のｍＲＮＡの一部と相補的な１種または複数種のｓｉＲＮＡを前記生物へ投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、および配列番号３から成る群より選択されるＲＮＡ配列である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｕｂａ６のｍＲＮＡの一部が、ＴｈｉＦドメイン、触媒性システインドメイン、アデニル化ドメイン、またはユビキチン様ドメインをコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物が、ヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ユビキチン化を必要とする生物内で、ユビキチン化を低下させる方法であって、
前記生物内でＵｂａ６活性の１種または複数種を阻害する１種または複数種の化合物を前記生物へ投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記化合物が、抗体またはｓｉＲＮＡである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物が、ヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｅ２Ｚのチャージングを阻害する化合物を同定する方法であって、
Ｅ２Ｚおよびユビキチンを含む試料を提供することと、
前記試料を前記化合物と接触させることと、
前記試料をＵｂａ６またはその生物活性部分と接触させることと、
前記化合物の存在下にて、ユビキチンがＥ２Ｚと結合しているかどうかを決定することとを含み、
前記化合物がＥ２Ｚのチャージングを阻害する場合は、ユビキチンがＥ２Ｚと結合していない、方法。
【請求項２５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でＥ２Ｚを視覚化することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｕｂａ６活性を阻害する化合物を同定する方法であって、
ユビキチン結合酵素およびユビキチンを含む試料を提供することと、
前記試料を前記化合物と接触させることと、
前記試料をＵｂａ６またはその生物活性部分と接触させることと、
前記化合物の存在下にて、ユビキチンが前記ユビキチン結合酵素と結合しているかどうかを決定することとを含み、
前記化合物がＵｂａ６活性を阻害する場合は、ユビキチンが前記ユビキチン結合酵素と結合していない、方法。
【請求項２７】
前記ユビキチン結合酵素が、Ｅ２Ｃ、Ｅ２Ｄ１、Ｅ２Ｄ２、Ｅ２Ｄ３、Ｅ２Ｄ４、Ｅ２Ｅ１、Ｅ２Ｇ、Ｅ２Ｓ、Ｅ２Ｔ、およびＥ２Ｚから成る群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ユビキチン結合酵素が、Ｅ２Ｚである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
Ｕｂａ６活性を阻害する化合物を同定する方法であって、
ユビキチンを含む試料を提供することと、
前記試料を前記化合物と接触させることと、
前記試料をＵｂａ６またはその生物活性部分と接触させることと、
前記化合物の存在下にて、ユビキチンが、Ｕｂａ６またはその生物活性部分と結合しているかどうかを決定することとを含み、
前記化合物がＵｂａ６活性を阻害する場合は、ユビキチンがＵｂａ６と結合していない、方法。
【請求項３０】
ユビキチンが、チオール結合を介して、Ｕｂａ６またはその生物活性部分と結合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ユビキチンが、固定化される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１、配列番号２、および配列番号３から成る群より選択される核酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有するＲＮＡ配列であって、前記ＲＮＡ配列が、Ｕｂａ６活性を阻害することができる、ＲＮＡ配列。
【請求項３３】
前記Ｕｂａ６活性が、ユビキチンの活性化、ユビキチン−アデニル酸中間体の形成、ユビキチンのチオールエステル化、ユビキチン結合酵素へのユビキチン転移、および標的ポリペプチドのユビキチン化から成る群より選択される、請求項３２に記載のＲＮＡ配列。
【請求項３４】
前記ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項３２に記載のＲＮＡ配列。
【請求項３５】
配列番号１、配列番号２、および配列番号３から成る群より選択される、ＲＮＡ配列。
【請求項３６】
前記ＲＮＡ配列が、Ｕｂａ６活性を阻害することができる、請求項３５に記載のＲＮＡ配列。
【請求項３７】
前記Ｕｂａ６活性が、ユビキチンの活性化、ユビキチン−アデニル酸中間体の形成、ユビキチンのチオールエステル化、ユビキチン結合酵素へのユビキチン転移、および標的ポリペプチドのユビキチン化から成る群より選択される、請求項３６に記載のＲＮＡ配列。
【請求項３８】
前記ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項３５に記載のＲＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所の助成金番号ＡＧ０１１０８５およびＧＭ５４１３７の下、政府の援助により成されたものである。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、その全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている、２００７年６月２８日出願の米国特許仮出願第６０／９４６，７５７号、および２００７年１月１８日出願の米国特許仮出願第６０／８８５，４３１号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチンプロテアソーム経路（ＵＰＰ）を介したタンパク質代謝回転は、細胞がシグナル伝達ネットワークを制御するために用いる主たるシステムを構成する。このプロセスにおいて、タンパク質はユビキチン分子鎖で標識され、ユビキチン分子鎖は、リジン残基とのイソペプチド結合を介して、標的と、およびユビキチン同士で結合する（Ｐｉｃｋａｒｔ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６９５：５５（２００４）；Ｐｉｃｋａｒｔ、Ｃｅｌｌ  １１６：１８１（２００４））。ユビキチンは、そのＣ末端グリシン残基を介してリジン残基と結合を形成する、７６個のアミノ酸から成るタンパク質である。一般に、プロテアソームによる認識には４個または５個以上のユビキチン分子の付加で十分であると考えられており、プロテアソームにおいてポリユビキチン化タンパク質は分解される（Ｌａｍ他、Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：７６３（２００２））。ＵＰＰを介したタンパク質代謝回転は、多様な細胞機能を制御し、ヒトの疾患と密接に関連していることが知られている（Ｐｅｔｒｏｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄｅｓｈａｉｅｓ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：９（２００５））。ユビキチンシステムのいくつかの構成成分が、癌において変異していることが発見されている。ＵＰＰシステムの変化により、腫瘍抑制因子の不適切な分解、および癌遺伝子の過剰発現が誘発され、これにより無制御の増殖が促進されるという場合が最も多い（Ｃａｒｄｏｚｏ  ａｎｄ  Ｐａｇａｎｏ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：７３９（２００４））。ＵＰＰの異常は、パーキンソン病などの神経変性疾患の原因ともなり得る。ユビキチン化は、標的タンパク質の分解において重大な役割を担っているが、タンパク質の局在化、膜タンパク質の機能、エンドサイトーシス、およびその他のプロセスの制御においても重要な役割を担っている。
【０００３】
タンパク質のユビキチン化には、三つの主要タンパク質の作用が関与することが知られている（Ｈｅｒｓｈｋｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８２０６（１９８３）；Ｇａｎｏｔｈ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２４１２（１９８８））。第一に、ユビキチンは活性化されて、Ｅ１ユビキチン活性化酵素と高エネルギーチオールエステル結合を形成する。このプロセスでは、まず、ＡＴＰの１分子が消費されてユビキチンのＣ末端グリシン（Ｇ７６）がアデニル化されたユビキチンが形成され、続いて、Ｇ７６カルボキシレートが活性部位システインへ転移されてチオールエステルが形成される（Ｈａａｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０３２９（１９８２））；Ｈａａｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２５４３（１９８２））。第二のステップでは、Ｅ１〜Ｕｂチオールエステル複合体が、Ｅ２ユビキチン結合酵素と、Ｅ１のＣ末端のＥ２結合ドメインを介して結合する。次に、ユビキチンは、Ｅ１の活性部位システインからＥ２の活性部位システインへ転移される（Ｐｉｃｋａｒｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１５７３（１９８５））。次に、Ｅ２〜Ｕｂ複合体はＥ１から解離し、ここで、Ｅ３ユビ
キチンリガーゼと相互作用して、基質上または成長中のポリユビキチン鎖上のリジン残基へのユビキチンの転移を促進することができる（Ｅｌｅｔｒ他、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：９３３（２００５））。したがって、Ｅ１酵素は、ユビキチンを活性化させ、ユビキチン転移を促進させることにより、ユビキチン化プロセスにおいて重大な役割を担っている。
【０００４】
ＵＰＰの構成成分を疾患に対する薬物標的として用いることに関して、広く注目が集まっている。実際、ＵＰＰを標的とした最初の薬物であるＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州，ケンブリッジ）が、２００３年にＦＤＡによって承認された（Ｐｏｐａｔ他、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．７：１３３７（２００６））。ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）は、２６Ｓプロテアソームを標的とし、それによって、その代謝回転にこのプロテアソームを必要とするすべてのタンパク質の分解を阻害する。ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）は、多発性骨髄腫の治療に有用であることが示された（上記文献）。その作用様式は、特定の種類の癌細胞の、プロテアソーム活性に対する感受性の上昇に依存するものであると考えられ、これは、プロテアソームに依存するＮＦκＢ経路の必要性の増大を反映している可能性が考えられる。しかし、プロテアソームの阻害は、正常細胞に対しても潜在的に有害であり、したがって、特異性の高い新規の薬物標的を得ることが有用であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｉｃｋａｒｔ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６９５：５５（２００４）
【非特許文献２】Ｐｉｃｋａｒｔ、Ｃｅｌｌ  １１６：１８１（２００４）
【非特許文献３】Ｌａｍ他、Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：７６３（２００２）
【非特許文献４】Ｐｅｔｒｏｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄｅｓｈａｉｅｓ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：９（２００５）
【非特許文献５】Ｃａｒｄｏｚｏ  ａｎｄ  Ｐａｇａｎｏ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：７３９（２００４）
【非特許文献６】Ｈｅｒｓｈｋｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８２０６（１９８３）
【非特許文献７】Ｇａｎｏｔｈ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２４１２（１９８８）
【非特許文献８】Ｈａａｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１０３２９（１９８２）
【非特許文献９】Ｈａａｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２５４３（１９８２）
【非特許文献１０】Ｐｉｃｋａｒｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１５７３（１９８５）
【非特許文献１１】Ｅｌｅｔｒ他、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：９３３（２００５）
【非特許文献１２】Ｐｏｐａｔ他、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．７：１３３７（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規ユビキチン活性化酵素Ｕｂａ６という驚くべき発見に一部基づいている。この発見は、ユビキチンに対しては単一の活性化酵素が存在するという当該技術分野における長年の定説を考えると、特に予想外のものである。Ｕｂａ６の酵素特性は、古典的
ユビキチン活性化酵素Ｕｂｅ１とは実質的に異なっており、このことは、Ｕｂａ６が、Ｕｂｅ１とは異なる生物学的役割を担っていることを示唆している。Ｕｂａ６は、その触媒メカニズムにおいてＡＴＰを利用することから、ヒトなどの生物においてＵｂａ６活性に特異的に依存するシグナル伝達経路を制御するには、選択的にＵｂａ６活性を阻害する小分子阻害剤が有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある実施形態においては、Ｕｂａ６活性を阻害する方法を提供する。ある態様においては、阻害は、ユビキチン−アデニル酸中間体の形成を阻害する化合物（例えば、Ｕｂａ６のアデニル化ドメインと結合する化合物）とＵｂａ６とを接触させること、Ｕｂａ６のチオールエステル化を阻害する化合物とＵｂａ６とを接触させること、またはユビキチン結合酵素へのユビキチンの転移を阻害する化合物（例えば、Ｕｂａ６のＵｂｌドメインと結合する化合物）とＵｂａ６とを接触させることによって達成される。ある態様においては、阻害は、インビトロで（例えば、細胞抽出物を用いて）、またはインビボで（例えば、組織培養細胞内、または生物内で）実施される。他の態様においては、ユビキチン結合酵素は、１種または複数種の、Ｅ２Ｃ、Ｅ２Ｄ１、Ｅ２Ｄ２、Ｅ２Ｄ３、Ｅ２Ｄ４、Ｅ２Ｅ１、Ｅ２Ｇ、Ｅ２Ｓ、Ｅ２Ｔ、およびＥ２Ｚ（本明細書では、Ｕｓｅ１ともいう）である。
【０００８】
別の実施形態においては、Ｕｂａ６の触媒性システインドメインを阻害する化合物とＵｂａ６とを接触させることを含む、ユビキチン活性化を阻害する方法を提供する。ある態様においては、阻害は、インビトロで（例えば、細胞抽出物）またはインビボで（例えば、組織培養細胞内、または生物内で）実施される。
【０００９】
別の実施形態においては、Ｕｂａ６活性を必要とする生物内で、Ｕｂａ６活性を低下させる方法であって、Ｕｂａ６のｍＲＮＡの一部と相補的な、１種または複数種のｓｉＲＮＡをその生物へ投与することを含む方法を提供する。ある態様においては、ｓｉＲＮＡは、１または複数の、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のＲＮＡ配列である。他の態様においては、前記Ｕｂａ６のｍＲＮＡの一部は、ＴｈｉＦドメイン、触媒性システインドメイン、アデニル化ドメイン、またはユビキチン様ドメインをコードする。さらに他の態様においては、前記生物はヒトである。
【００１０】
別の実施形態においては、ユビキチン化を必要とする生物内で、ユビキチン化を低下させる方法であって、生物内でＵｂａ６活性の１種または複数種を阻害する、１種または複数種の化合物を、生物へ投与することを含む方法を提供する。ある態様においては、前記化合物は、抗体またはｓｉＲＮＡである。他の態様においては、前記生物はヒトである。
【００１１】
さらに別の実施形態においては、Ｅ２Ｚのチャージング（ｃｈａｒｇｉｎｇ；負荷）を阻害する化合物を同定する方法であって、Ｅ２Ｚおよびユビキチンを含む試料を提供すること、この試料を化合物と接触させること、前記試料をＵｂａ６またはＵｂａ６の生物活性部分と接触させること、ならびにユビキチンが前記化合物の存在下でＥ２Ｚと結合しているかどうかを決定することを含み、前記化合物がＥ２Ｚのチャージングを阻害する場合は、ユビキチンはＥ２Ｚと結合していない、前記方法を提供する。ある態様においては、この方法は、さらに、Ｅ２ＺをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で視覚化することを含む。
【００１２】
さらに別の実施形態においては、Ｕｂａ６活性を阻害する化合物を同定する方法であって、ユビキチン結合酵素およびユビキチンを含む試料を提供すること、前記試料を化合物と接触させること、前記試料をＵｂａ６またはＵｂａ６の生物活性部分と接触させること、ならびにユビキチンが前記化合物の存在下でユビキチン結合酵素と結合しているかどうかを判定することを含み、前記化合物がＵｂａ６活性を阻害する場合は、ユビキチンはユ
ビキチン結合酵素と結合していない、前記方法を提供する。ある態様においては、ユビキチン結合酵素は、Ｅ２Ｃ、Ｅ２Ｄ１、Ｅ２Ｄ２、Ｅ２Ｄ３、Ｅ２Ｄ４、Ｅ２Ｅ１、Ｅ２Ｇ、Ｅ２Ｓ、Ｅ２Ｔ、およびＥ２Ｚから成る群より選択される。
【００１３】
さらに別の実施形態においては、Ｕｂａ６活性を阻害する化合物を同定する方法であって、ユビキチンを含む試料を提供すること、前記試料を化合物と接触させること、前記試料をＵｂａ６またはＵｂａ６の生物活性部分と接触させること、およびユビキチンが前記化合物の存在下で、Ｕｂａ６またはＵｂａ６の生物活性部分と結合しているかどうかを判定することを含み、前記化合物がＵｂａ６活性を阻害する場合は、ユビキチンはＵｂａ６と結合していない、前記方法を提供する。ある態様においては、ユビキチンは、Ｕｂａ６またはＵｂａ６の生物活性部分と、チオール結合を介して結合する。他の態様においては、ユビキチンは固定化されている。
【００１４】
別の実施形態においては、配列番号１、配列番号２、および配列番号３から成る群より選択される核酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有するＲＮＡ配列であって、Ｕｂａ６活性を阻害することができるＲＮＡ配列を提供する。ある態様においては、Ｕｂａ６活性は、１つまたは複数の、ユビキチン活性化、ユビキチン−アデニル酸中間体の形成、ユビキチンのチオールエステル化、ユビキチン結合酵素へのユビキチン転移、および／または標的ポリペプチドのユビキチン化から選択される。他の態様においては、前記ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
【００１５】
別の実施形態においては、配列番号１、配列番号２、および配列番号３から成る群より選択されるＲＮＡ配列を提供する。ある態様においては、前記ＲＮＡ配列は、ユビキチン活性化、ユビキチン−アデニル酸中間体の形成、ユビキチンのチオールエステル化、ユビキチン結合酵素へのユビキチン転移、および／または標的ポリペプチドのユビキチン化などのＵｂａ６活性を阻害することができる。他の態様においては、このＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本特許または出願ファイルには少なくとも１つのカラーで描かれた図面が含まれる。カラー図面付きの本特許または特許出願公開公報のコピーは、必要な料金と共に米国特許商標局へ申請することで提供される。前述の、およびその他の本発明の特徴と利点は、添付の図面と合わせて、以下に示す例示的実施形態の詳細な説明から、より十分に理解されるであろう。
【図１Ａ】Ｕｂａ６の物理的特性および機能的特性を示した図である。ヒト、ゼブラフィッシュ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）、およびアメリカムラサキウニ（Ｓ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）のＴｈｉＦドメイン含有タンパク質の系統樹。マウスのＵｂｅ１ｘタンパク質およびＵｂｅ１ｙタンパク質、ならびに出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵｂａ１ｐも含む。配列および系統樹は、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて作製した。
【図１Ｂ】Ｕｂａ６の物理的特性および機能的特性を示した図である。昆虫細胞で発現、精製されたＦｌａｇ標識Ｕｂａ６（Ｕｂａ６F）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（クーマシー染色）。
【図１Ｃ】Ｕｂａ６の物理的特性および機能的特性を示した図である。Ｕｂａ６は、ユビキチンに対しては活性化酵素として機能するが、いくつかのユビキチン様タンパク質（Ｕｌｐｓ）に対しては機能しない。ＧＳＴ−Ｕｌｐｓを、細菌内で発現させて精製し、ＡＴＰの存在下で精製Ｕｂａ６Fと混合した。３０℃で１０分後、反応混合物を非還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルーを用いて視覚化した。レーン４では、Ｕｂａ６FがＵｂａ６F〜ＧＳＴ−Ｕｂ抱合体へ変換されている。＊はＧＳＴ分解産物を示す。
【図１Ｄ】Ｕｂａ６の物理的特性および機能的特性を示した図である。Ｕｂａ６は、ユビキチンに対しては活性化酵素として機能するが、いくつかのユビキチン様タンパク質（Ｕｌｐｓ）に対しては機能しない。ＧＳＴ−Ｕｌｐｓを、細菌内で発現させて精製し、ＡＴＰの存在下で精製Ｕｂａ６Fと混合した。３０℃で１０分後、反応混合物を非還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルーを用いて視覚化した。レーン４では、Ｕｂａ６FがＵｂａ６F〜ＧＳＴ−Ｕｂ抱合体へ変換されている。Ｄ図では、ＧＳＴ−ＵｂおよびＡＴＰの必要性、ならびに前記抱合体が還元剤ＤＴＴに対して感受性を有することを実証するために、種々の成分を取り除いた。
【図１Ｅ】Ｕｂａ６の物理的特性および機能的特性を示した図である。関連するＥ１酵素Ｕｂｅ１Ｌは、ＩＳＧ１５の活性化を促進するが、ユビキチンには作用しない。特異性の指標として、ＧＳＴ−Ｕｂｅ１Ｌ（昆虫細胞より精製）の、ＧＳＴ−ＩＳＧ１５およびＧＳＴ−Ｕｂの活性化について分析した。予想通り、ＧＳＴ−Ｕｂｅ１ＬはＩＳＧ１５に対しては活性であったが、系統学的にはＵｂａ６よりもＵｂｅ１との関連性が高いにも関わらず、ＧＳＴ−Ｕｂを活性化することができなかった。ネガティブコントロールとして、ＧＳＴ−ＭＰ１を用いた。
【図１Ｆ】Ｕｂａ６の物理的特性および機能的特性を示した図である。本明細書にさらに記載するように、Ｕｂｅ１およびＵｂａ６によるユビキチン活性化の動態分析を実施した。エラーバーは、重複アッセイの標準偏差を示す。
【図１Ｇ】Ｕｂａ６の物理的特性および機能的特性を示した図である。Ｕｂａ６とユビキチン−アガロースとの結合。２９３Ｔ／Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６抽出物（ｐＨ７．５）を用いた、ユビキチン−アガロース上でのＥ１の捕捉。ＨＡ−Ｆｌａｇ−Ｕｂａ６を安定に発現する２９３Ｔ細胞からの抽出物で、Ｈｅｒｓｈｋｏの古典的ユビキチンアフィニティクロマトグラフィー実験（下記）を行った。抽出物を、ＡＴＰの存在下にてユビキチン−アガロースと共にインキュベートし、ユビキチンをチャージ（ｃｈａｒｇｅ；負荷）した。次に、ビーズを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有バッファーで洗浄し、続いて、ＤＴＴで溶離した。次に、ロード、フロースルー、洗浄液、溶離液、およびユビキチン−アガロースに結合したままのタンパク質を、抗Ｕｂｅ１抗体および抗ＨＡ抗体を用いてイムノブロッティングを行い、ＨＡ−Ｆｌａｇ−Ｕｂａ６を検出した。
【図１Ｈ】Ｕｂａ６の物理的特性および機能的特性を示した図である。脊椎動物におけるＵｂａ６の保存。ヒト（Ｈｓ）、マウス（Ｍｍ）、出芽酵母（Ｓｃ）、およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、Ｄｒ）由来のＵｂａ６およびＵｂｅ１のアラインメント。ゼブラフィッシュの配列は、ＸＰ＿６９５７５５．２の受入番号で提供された。ヒトとは異なり、マウスは、Ｘ染色体に位置するＵｂｅ１ｘおよびＹ染色体に位置するＵｂｅ１ｙという、２種類の関連性の高い（同一性９０％）Ｕｂｅ１タンパク質を有する。Ｕｂｅ１ｙタンパク質は、精子形成に関与していると考えられる（Ｌｅｖｙ他、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １１：１６４（２０００）；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：５２８（１９９２））。深緑色：アデニル化ドメイン；薄緑色：ＴｈｉＦモチーフ；赤色：触媒性システインドメイン（ＣＣＤ）；青色：ユビキチンフォールド（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｆｏｌｄ）ドメイン（Ｕｆｄ）。
【図２Ａ】Ｕｂａ６がインビボにおいてユビキチンでチャージされることを示すデータである。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６、Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625A、またはＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sを、レンチウイルスベクターを用いてＣＭＶプロモーター制御下で安定に発現する２９３Ｔ細胞を抽出バッファーに溶解し、抗ＨＡ抗体で免疫沈降した。免疫複合体を、非還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＨＡ、抗Ｎｅｄｄ８、もしくは抗ユビキチンでイムノブロットを行うか、または、ブロットをポンソーＳで染色して、タンパク質を明らかにした。
【図２Ｂ】Ｕｂａ６がインビボにおいてユビキチンでチャージされることを示すデータである。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６、Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625A、またはＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sを内在レベルに近いレベルで発現する２９３Ｔ細胞を溶解し、抽出物を用いて、抗ＨＡでイムノブロッティングを行ってＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６融合タンパク質を検出するか、または、抗Ｕｂａ６でイムノブロッティングを行って導入遺伝子のＵｂａ６タンパク質と内在性Ｕｂａ６タンパク質の両方を検出した。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sタンパク質は、二本のバンドで移動し、移動度の遅い方のバンドがユビキチンをチャージしたＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sに相当する。
【図２Ｃ】Ｕｂａ６がインビボにおいてユビキチンでチャージされることを示すデータである。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sと結合したユビキチンの同定。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６Ｃ625Sを発現する細胞の抽出物を、抗Ｆｌａｇ樹脂および抗ＨＡ樹脂を用いて精製し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。個々のバンドの質量分析を行った。移動度の遅い方のバンドは、ユビキチン由来の３種類のペプチドを含んでおり、一方、移動度の速い方のバンドは、結合ユビキチン由来のペプチドを欠いていた。
【図２Ｄ】Ｕｂａ６がインビボにおいてユビキチンでチャージされることを示すデータである。ＲＮＡｉを用いたＵｂａ６の除去。ＧＦＰ（コントロールとして）を標的とするｓｉＲＮＡまたはＵｂａ６を標的とするｓｉＲＮＡを、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて、２９３Ｔ細胞へトランスフェクトした。７２時間後、細胞を溶解し、抽出物を用いて、抗Ｕｂａ６抗体でイムノブロッティングを行った。Ｕｂａ６に対して用いたｓｉＲＮＡ配列は、＃１：ＣＣＵＵＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＵＧＡＵＧＵＡＡＡ（配列番号１）；＃２：ＡＣＡＣＵＧＡＡＧＵＵＡＵＵＧＵＡＣＣＧＣＡＵＵＵ（配列番号２）；＃３：ＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＧＡＣＣＧＵＡＣＡＵＧＧＡＡＡ（配列番号３）であった。精製したＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６を、イムノブロットのポジティブコントロールとして用いた。
【図３Ａ】Ｕｂａ６およびＵｂｅ１が、Ｅ２ユビキチン結合酵素のチャージングに対して異なった選択性を持つことを示すデータである。図に示したＥ２は、細菌のインビトロ翻訳系を用いて作製し、35Ｓ−メチオニンにより代謝的に標識した。Ｅ２を、Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６またはＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂｅ１（昆虫細胞より発現、精製）と混合し、３０℃で３０分間インキュベートした。反応混合物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、タンパク質をオートラジオグラフィーで可視化した。Ｅ２のアリコートをチャージングのコントロールとして含めた。
【図３Ｂ】Ｕｂａ６およびＵｂｅ１が、Ｅ２ユビキチン結合酵素のチャージングに対して異なった選択性を持つことを示すデータである。Ｅ２チャージングデータの概要である。
【図３Ｃ】Ｕｂａ６およびＵｂｅ１が、Ｅ２ユビキチン結合酵素のチャージングに対して異なった選択性を持つことを示すデータである。Ｅ２Ｄ１のチャージングを促進するＵｂａ６の能力には、活性部位システイン（Ｃ６２５）が必要である。
【図４Ａ】Ｕｂａ６のＥ２に対する特異性が、そのＣ末端Ｕｂｌドメインに存在することを示すデータである。触媒性ドメインおよびＣ末端ユビキチン様（Ｕｂｌ）ドメインの保存パーセントを示す、Ｕｂｅ１およびＵｂａ６のドメイン構造。
【図４Ｂ】Ｕｂａ６のＥ２に対する特異性が、そのＣ末端Ｕｂｌドメインに存在することを示すデータである。Ｕｂｅ１およびＵｂａ６のＣ末端Ｕｂｌドメインの保存性。アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて作製した。
【図４Ｃ】Ｕｂａ６のＥ２に対する特異性が、そのＣ末端Ｕｂｌドメインに存在することを示すデータである。Ｕｂａ６およびＵｂｅ１のＵｂｌドメインを互いに置き換えたキメラタンパク質を作製した。これらのタンパク質を、野生型およびＵｂｌ欠失変異体と共に、昆虫細胞中でＦｌａｇ−ＨＡ融合タンパク質として発現させ、精製して、Ｃｄｃ３４のチャージングを促進する能力について分析した。Ｃｄｃ３４は、Ｕｂｅ１によってチャージされるが、Ｕｂａ６によってはチャージされない（レーン２および３）。Ｕｂｌドメインが欠失したＥ１は、ともに不活性であったが、Ｕｂｅ１のＵｂｌドメインを含むＵｂａ６は、Ｃｄｃ３４のチャージングに対して活性であった。
【図５】ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のＵｂａ６をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号４）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１８２２７）を示す図である。
【図６】ヒトのＵｂａ６のアミノ酸配列（配列番号５）（ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿０６０６９７）を示す図である。
【図７】マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＵｂａ６をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号６）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１７２７１２）を示す図である。
【図８】マウスのＵｂａ６のアミノ酸配列（配列番号７）（ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿７６６３００）を示す図である。
【図９】ヒト由来Ｅ２ＺをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号８）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２３０７９．２）を示す図である。
【図１０】ヒト由来Ｅ２Ｚをコードするアミノ酸配列（配列番号９）（ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿０７５５６７．１、部分配列を有する）を示す図である。
【図１１Ａ】Ｕｂｅ１Ｃの末端ドメインおよびＵｂａ６のＣ末端ドメインが、Ｅ２特異性を制御することを示すデータである。Ｕｂａ６およびＵｂｅ１のドメイン構造、ならびにＣ末端Ｕｂｌドメインを置き換えてキメラタンパク質を形成する方法を示す概略図である。
【図１１Ｂ】Ｕｂｅ１Ｃの末端ドメインおよびＵｂａ６のＣ末端ドメインが、Ｅ２特異性を制御することを示すデータである。Ｎｅｄｄ８活性化酵素の結晶構造に基づくＥ１酵素のドメイン構造モデル。
【図１１Ｃ】Ｕｂｅ１Ｃの末端ドメインおよびＵｂａ６のＣ末端ドメインが、Ｅ２特異性を制御することを示すデータである。図に示したＥ１タンパク質およびＥ２結合酵素を用いてＥ２チャージングアッセイを行った。
【図１１Ｄ】Ｕｂｅ１Ｃの末端ドメインおよびＵｂａ６のＣ末端ドメインが、Ｅ２特異性を制御することを示すデータである。Ｕｂｅ１およびＵｂａ６のＵｂｌドメインの予測構造である。
【図１２】Ｅ２ＺのインビボでのチャージングにはＵｂａ６が必要であることを示すデータである。左図：Ｅ２Ｚ〜ユビキチンチオエステルの形成は、Ｅ２Ｚの活性部位システイン（Ｃ＞Ａ変異体）を必要とし、ＤＴＴの添加によって減少した。右図：ＲＮＡｉによるＵｂａ６の除去によって、インビボでのＥ２Ｚのチャージングが阻害されたが、Ｕｂｅ１では阻害されなかった。図に示したｓｉＲＮＡを、安定的にＦｌａｇ−ＨＡ−Ｅ２Ｚを発現する２９３Ｔ細胞内へトランスフェクトした。抽出物をＭＥＳバッファー（ｐＨ４．５）中に作製し、直ちにタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ニトロセルロースへの転写後、ブロットを図に示した抗体でプローブした。
【図１３Ａ】インビボでのＵｂａ６によるユビキチンの活性化を示す図である。培養細胞内でのＥ１の発現。抗Ｕｂａ６および抗Ｕｂｅ１を、コントロールとしての組換えＦｌａｇ−Ｅ１ａと共に、図に示した細胞株由来の抽出物のブロットのプローブとして使用した。
【図１３Ｂ】インビボでのＵｂａ６によるユビキチンの活性化を示す図である。２９３Ｔ／Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６細胞（野生型、Ｃ６２５ＳまたはＣ６２５Ａ；２０μｇ）由来のライセート（ｐＨ７．５）、または０．２ｍｇの抽出物からの抗ＨＡ免疫複合体を、４−１２％トリス−グリシン還元ゲルで分離し、抗Ｕｂａ６、抗ＨＡ、または抗ユビキチンでイムノブロットした。
【図１３Ｃ】インビボでのＵｂａ６によるユビキチンの活性化を示す図である。２９３Ｔ／Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６細胞（野生型、またはＣ６２５Ａ；２０μｇ）由来のライセート（ｐＨ４．５）、または０．２ｍｇの抽出物からの抗ＨＡ免疫複合体を、４−１２％ビス−トリス非還元ゲルで分離し、その後、抗ＨＡまたは抗ユビキチンでイムノブロットした。
【図１３Ｄ】インビボでのＵｂａ６によるユビキチンの活性化を示す図である。２９３Ｔ／Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６細胞ライセート（ｐＨ４．５、２ｍｇ）からＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６を免疫沈降し、４−１２％ビス−トリス非還元ゲルで分離した。
【図１３Ｅ】インビボでのＵｂａ６によるユビキチンの活性化を示す図である。ユビキチン活性化Ｕｂａ６の質量スペクトル分析。用いたＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sタンパク質については、本明細書にさらに記載する。
【図１４Ａ】Ｕｂａ６の標的に対するＥ２結合酵素の系統的な分析を示す図である。ユビキチンＥ１のＥ２チャージング活性を、活性Ｅ２の系統樹上に示した。
【図１４Ｂ】Ｕｂａ６の標的に対するＥ２結合酵素の系統的な分析を示す図である。Ｕｂａ６およびＵｂｅ１は、インビトロで、異なるＥ２チャージング活性を示す。アッセイでは、「方法」に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ３０抽出物中で作製された35Ｓ−メチオニン標識Ｅ２、ユビキチンノックアウト、および図に示したＥ１を用いた。＊は、非特異的翻訳産物。
【図１４Ｃ】Ｕｂａ６の標的に対するＥ２結合酵素の系統的な分析を示す図である。ヒトＵｂｅ１およびＵｂａ６の配列保存性。
【図１４Ｄ】Ｕｂａ６の標的に対するＥ２結合酵素の系統的な分析を示す図である。キメラＥ１タンパク質による、Ｃｄｃ３４Ｂ、ＵｂｃＨ５Ｄ、およびＵｓｅ１（本明細書ではＥ２Ｚともいう）のインビトロでのチャージングを、35Ｓ−メチオニン標識Ｅ２を用いて調べた。
【図１５Ａ】ユビキチン結合酵素Ｕｓｅ１およびＣｄｃ３４の、インビボでのチャージングに対する特徴的な要求性を示す図である。細胞内でのＥ２チャージングのメカニズムを示す模式図。Ｅ２は、チャージした形態とチャージしていない形態の混合物として存在し、これは、チャージした形態がいかに素早く生成し、使われるかに依存している。
【図１５Ｂ】ユビキチン結合酵素Ｕｓｅ１およびＣｄｃ３４の、インビボでのチャージングに対する特徴的な要求性を示す図である。ＨｅＬａ細胞を、図に示したｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。７２時間後、細胞をｐＨ４．５で溶解し、非還元４−１２％ビス−トリス濃度勾配ゲルでタンパク質を分離して、イムノブロットした。
【図１５Ｃ】ユビキチン結合酵素Ｕｓｅ１およびＣｄｃ３４の、インビボでのチャージングに対する特徴的な要求性を示す図である。Ｕｓｅ１は、哺乳類細胞において、触媒性システインを介してチャージされる。２９３Ｔ、または２９３Ｔ／Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｓｅ１（野生型またはＣ１９０Ａ）細胞を溶解し（ｐＨ４．５）、その後、非還元４−１２％ビス−トリス濃度勾配ゲルで分離して、イムノブロットした。レーン４では、試料をＤＴＴで前処理した（２００ｍＭ、５分）。
【図１５Ｄ】ユビキチン結合酵素Ｕｓｅ１およびＣｄｃ３４の、インビボでのチャージングに対する特徴的な要求性を示す図である。ユビキチンの活性化およびチャージングする２種類の独立したシステムを示すモデルである。
【図１６Ａ】Ｅ１の構造に関する情報を示す図である。Ｅ１の構造的構成。Ｕｂｅ１、ＵｂｅＬ１、およびＵｂａ６は、単鎖Ｅ１であるが、Ｕｂａ３／ＡＰＰ−ＢＰ１およびＵｂａ２／Ｓａｅ１は、ヘテロダイマーのＥ１である。
【図１６Ｂ】Ｅ１の構造に関する情報を示す図である。Ｕｂａ６およびＵｂｅ１のＵｆｄドメインの予測構造、ならびにＵｂａ３のＵｆｄドメインとの比較。予測構造は、ＳＵＭＯ  Ｅ１  Ｓａｅ２（ＰＤＢコード１Ｙ８Ｑ）をテンプレートとして、「Ｍｏｄｅｌｌｅｒ」ソフトウェア（リリース８ｖ２）を用いて作成し、Ｐｙｍｏｌを用いて表示した。ＵｆｄUbe1：残基９４８−１０５８。ＵｆｄUba6：残基９４９−１０５２。ＵｆｄUba3：残基３４９−４４０。
【図１６Ｃ】Ｅ１の構造に関する情報を示す図である。ヒトＵｂａ６、Ｕｂｅ１、およびＵｂｅ１Ｌの間での、ドメインに特異的な配列相同性。相同性パーセントおよび類似性パーセントを示す。
【図１７】Ｕｂａ６およびＵｓｅ１が、ヒト細胞株および組織中で広く発現されることを示す図である。比較のためにＵｂｅ１の発現を示す。発現パターンは、ノバルティス研究財団ゲノム研究所の転写プロファイリングリソース（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ）を用いて得た（Ｓｕ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：４４６５（２００２）；Ｓｕ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：６０６２（２００４））。
【図１８Ａ】ＧＳＴ−ＵＢＬタンパク質の分析を示す図である。Ｕｂｅ１ＬはＩＳＧ１５を活性化するが、ユビキチンは活性化しない。ＧＳＴ−Ｕｂｅ１Ｌ、ＧＳＴ−Ｕｂｅ１、またはネガティブコントロールとしてのＧＳＴ−ＭＰ１（３００ｎＭ）を、ＧＳＴ−ＩＳＧ１５またはＧＳＴ−Ｕｂ（６μＭ）を、２ｍＭのＡＴＰの存在下にて活性化する能力について調べた（３０分、３０℃）。反応混合物を４−１２％トリス−グリシンで分離し、クーマシーブルーでタンパク質を視覚化した。ＧＳＴ−Ｕｂｅ１Ｌ、ＧＳＴ−Ｕｂｅ１、およびＧＳＴ−ＭＰ１は、以前の記載のように、昆虫細胞内で発現させ、精製した（Ｚｈａｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：７５７８（２００４））。
【図１８Ｂ】ＧＳＴ−ＵＢＬタンパク質の分析を示す図である。ＧＳＴ−Ｎｅｄｄ８は、Ｕｂａ３／ＡＰＰＢＰ１によって、インビトロで活性化される。Ｕｂａ３／ＡＰＰＢＰ１（３００ｎＭ）を、６μＭのＧＳＴ−Ｎｅｄｄ８またはコントロールとしてのＧＳＴと共にインキュベートし（パネルaで説明したように）、非還元４−１２％トリス−グリシンで分離し、チオエステル形成について分析した。
【図１８Ｃ】ＧＳＴ−ＵＢＬタンパク質の分析を示す図である。Ｕｂａ６は、インビトロで、Ｎｅｄｄ８を活性化しない。Ｆｌａｇ−Ｕｂａ６（８ｎＭ）を、種々の濃度（０、５、１０、２０、４０、８０ｎｇ）のＧＳＴ−ＵｂまたはＧＳＴ−Ｎｅｄｄ８と共に、２ｍＭのＡＴＰの存在下にてインキュベートし、反応混合物を４−１２％トリス−グリシンで分離し、抗Ｆｌａｇ抗体を使用したイムノブロッティングを行った。Ｕｂａ６は、ＧＳＴ−Ｕｂを活性化したが、ＧＳＴ−Ｎｅｄｄ８は活性化しなかった。
【図１８Ｄ】ＧＳＴ−ＵＢＬタンパク質の分析を示す図である。ＧＳＴ−ユビキチン滴定。８ｎＭのＵｂａ６またはＵｂｅ１を、図に示した濃度のＧＳＴ−ユビキチンと共に、３０℃にて１０分間インキュベートした。試料を、４−１２％トリス−グリシン非還元ゲルで電気泳動し、その後、図に示した抗体でイムノブロッティングを行った。
【図１８Ｅ】ＧＳＴ−ＵＢＬタンパク質の分析を示す図である。ＧＳＴ−ユビキチン活性化の時間経過。反応物は、５００ｎＭのＧＳＴ−ユビキチン、および８ｎＭのＵｂａ６またはＵｂｅ１を含み、３０℃にて、図に示した時間インキュベートした。
【図１８Ｆ】ＧＳＴ−ＵＢＬタンパク質の分析を示す図である。ＵＢＬ活性化アッセイに用いたＧＳＴ−ＵＢＬタンパク質からのＣ末端ペプチドを同定する質量スペクトルデータの概要。
【図１９Ａ】インビボおよびインビトロにて、Ｕｂａ６はユビキチンを活性化するが、Ｎｅｄｄ８は活性化しないことを示す図である。２９３Ｔ細胞から単離されたＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sの移動度の遅い形態と共に移動するユビキチン由来ペプチドのタンデム質量スペクトル。ユビキチン由来のＴＬＳＤＹＮＩＱＫペプチドのスペクトルを示す。
【図１９Ｂ】インビボおよびインビトロにて、Ｕｂａ６はユビキチンを活性化するが、Ｎｅｄｄ８は活性化しないことを示す図である。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６を、ｐＨ７．５のバッファー中に溶解した図に示した細胞株由来の抽出物（１０ｍｇ）から単離し、タンパク質を非還元４−１２％トリス−グリシンで分離して、クーマシーブルーで染色した。上部のバンドおよび下部のバンドを質量分析器で処理した。同定されたユビキチンペプチドを示し、これらのペプチドに関連する統計値を、本明細書にさらに記載するように収集した。
【図２０Ａ】脊椎動物由来Ｕｓｅ１タンパク質の配列アラインメント、およびＥ２チャージングの分析を示す図である。Ｕｅｖに代表される非触媒性サブクラスを含む、ヒトＥ２ユビキチン結合酵素ファミリーの系統樹。系統樹の作成に用いた個々のＥ２ファミリーメンバーの受入番号を示す。Ｅ２配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷでアラインメントし、Ｔｒｅｅｖｉｅｗによって系統樹を表示した。
【図２０Ｂ】脊椎動物由来Ｕｓｅ１タンパク質の配列アラインメント、およびＥ２チャージングの分析を示す図である。アラインメントはＣｌｕｓｔａｌＷで作成した。カエル（ゼノパス  Ｘｅｎｏｐｕｓ）Ｕｓｅ１およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）Ｕｓｅ１の配列は、ヒトＵｓｅ１をクエリーとして用いたＥＳＴデータベースのブラスト解析（ｂｌａｓｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって得た。Ｍｍ  ｇｅｎｅ  ＩＤ：２６８４７０；Ｒｎ  ｇｅｎｅ  ＩＤ：３０３４７８；Ｈｓ  ｇｅｎｅ  ＩＤ：６５２６４；ゼブラフィッシュ受入番号：ＸＰ＿００１３３７５１１；ゼノパス受入番号：Ｑ６ＰＣＦ７；Ｓｐｕｒ（ムラサキウニＳ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）受入番号：ＸＰ＿７８５２９６。
【図２０Ｃ】脊椎動物由来Ｕｓｅ１タンパク質の配列アラインメント、およびＥ２チャージングの分析を示す図である。Ｕｂｃ５およびＵｓｅ１のチャージングには、Ｕｂａ６の触媒性システインが必要である。本明細書にさらに記載するように、野生型Ｕｂａ６または変異体（Ｃ６２５Ａ）Ｕｂａ６を用いてアッセイを行った。
【図２０Ｄ】脊椎動物由来Ｕｓｅ１タンパク質の配列アラインメント、およびＥ２チャージングの分析を示す図である。Ｕｂａ６による精製Ｕｓｅ１のチャージング。「方法」で説明するように、細菌からＵｓｅ１を精製した。Ｕｓｅ１（２．５μＭ）を用い、２５μＭのユビキチンおよび２ｍＭのＡＴＰの存在下にて、Ｆｌａｇ−Ｕｂａ６濃度を上昇させながら（０、０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０．４μＭ、昆虫細胞から精製）チャージングアッセイを行った。
【図２０Ｅ】脊椎動物由来Ｕｓｅ１タンパク質の配列アラインメント、およびＥ２チャージングの分析を示す図である。Ｕｂｅ１タンパク質およびＵｂａ６タンパク質のＵｆｄドメインのアミノ酸配列。黒色および灰色、Ｕｂｅ１およびＵｂａ６で保存；紫色、Ｕｂｅ１で保存；黄色、Ｕｂａ６で保存。
【図２０Ｆ】脊椎動物由来Ｕｓｅ１タンパク質の配列アラインメント、およびＥ２チャージングの分析を示す図である。ユビキチンＥ２のチャージングの程度を測定するアッセイ。本明細書にさらに記載するように、細胞をｐＨ３〜ｐＨ５のバッファー中に溶解し、非還元４−１２％ビス−トリスゲルで分離し、Ｃｄｃ３４Ａタンパク質とＣｄｃ３４Ｂタンパク質の両方と反応する抗Ｃｄｃ３４をプローブとしたイムノブロットを行った。レーン５〜８では、ライセートを２００ｍＭのＤＴＴの存在下で５分間煮沸し、その後、電気泳動を行った。
【図２０Ｇ】脊椎動物由来Ｕｓｅ１タンパク質の配列アラインメント、およびＥ２チャージングの分析を示す図である。Ｕｓｅ１抗体の特異性。図に示したｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞を得るための２９３Ｔ細胞の抽出物（トランスフェクションの７２時間後）を、還元条件下にて４−１２％トリス−グリシンで分離し、アフィニティ精製を行ったＵｓｅ１抗体でイムノブロットを行った。
【図２０Ｈ】脊椎動物由来Ｕｓｅ１タンパク質の配列アラインメント、およびＥ２チャージングの分析を示す図である。２９３Ｔ細胞をｐＨ４．５のＭＥＳ溶解バッファー中に溶解し、ＤＴＴの存在下または非存在下にて、１０μｇを４−１２％ビス−トリスゲルで電気泳動を行った。ゲルは、図に示した抗体をプローブとした。
【図２１Ａ】Ｕｂａ６Ufd−Ｕｓｅ１とＵｂｅ１Ufd−Ｃｄｃ３４との接触部分の構造モデルを示す図である。ヒトＵｂａ６、Ｕｂｅ１、およびＵｂａ３のモデルに基づいた配列アラインメント、ならびにＣｄｃ３４Ａ、Ｕｓｅ１、およびＵｂｃ１２のＨ１ヘリックスのアラインメント。接触部分に位置する残基を赤色で示す。同一残基を黒色の網掛けで示す。類似残基を灰色の網掛けで示す。
【図２１Ｂ】Ｕｂａ６Ufd−Ｕｓｅ１とＵｂｅ１Ufd−Ｃｄｃ３４との接触部分の構造モデルを示す図である。Ｕｂｃ１２−Ｕｂａ３Ufdの構造（Ｈｕａｎｇ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １７：３４１（２００５））。Ｕｂｃ１２を水色で示す。Ｕｂａ３Ufdを緑色で示す。接触部分の残基を図に示す。
【図２１Ｃ】Ｕｂａ６Ufd−Ｕｓｅ１とＵｂｅ１Ufd−Ｃｄｃ３４との接触部分の構造モデルを示す図である。Ｕｓｅ１−Ｕｂａ６Ufdのモデル。Ｕｓｅ１を水色で示す。Ｕｂａ６Ufdを緑色で示す。接触部分の残基を図に示す。
【図２１Ｄ】Ｕｂａ６Ufd−Ｕｓｅ１とＵｂｅ１Ufd−Ｃｄｃ３４との接触部分の構造モデルを示す図である。Ｃｄｃ３４ＡＵｂｅ１Ufdのモデル。Ｃｄｃ３４Ａを水色で示す。Ｕｂｅ１Ufdを緑色で示す。接触部分の残基を図に示す。
【図２１Ｅ】Ｕｂａ６Ufd−Ｕｓｅ１とＵｂｅ１Ufd−Ｃｄｃ３４との接触部分の構造モデルを示す図である。Ｕｂａ３Ufd（構造）、Ｕｂａ６Ufd（モデル）、およびＵｂｅ１Ufd（モデル）のチャージされた残基の表面を示す図。配向を示すために、対応するリボンイメージを示す。
【図２２】本明細書でさらに説明するように、試験された遺伝子配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一般に、Ｕｂｅ１は、すべての真核生物のゲノムにコードされるユビキチンに対する、唯一の活性化酵素であると考えられる。この結論は、出芽酵母に単一の必須ユビキチンＥ１が存在すること、およびＵｂｅ１に温度感受性変異を含むげっ歯類の組織培養細胞が、単一の遺伝子しか存在しないことと一致するような細胞周期停止表現型を示すという知見に基づいている（Ｆｉｎｌｅｙ他、Ｃｅｌｌ  ３７：４３（１９８４）；Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：２７（１９８４））。本明細書でさらに説明するように、驚くべきことに、この定説が間違っており、脊椎生物は２種類の異なるユビキチン活性化酵素を有することが発見された。理論に束縛されるものではないが、この新規な酵素Ｕｂａ６は、Ｕｂｅ１とは異なると考えられる方法で、ユビキチンのユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）への結合を促進する。したがって、Ｕｂａ６は、ユビキチン経路において特異的な機能を持つ可能性があるので、重要な薬物標的である。
【００１８】
ユビキチンプロテアソーム経路（ＵＰＰ）は、いずれも疾患状態において重要であるような、転写、細胞周期の進行、およびアポトーシスに関与する多くの重要な調節タンパク質の代謝回転において中心的な役割を担っている。例えば、Ｋｉｎｇ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７４：１６５２（１９９６）；Ｖｏｒｈｅｅｓ他、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：６３１６（２００３）；Ａｄａｍｓ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：３４９（２００４）を参照されたい。したがって、ユビキチン活性化酵素を標的とすることにより、細胞分裂および細胞シグナル伝達の統合性を維持するために重要な種々の生化学的経路を干渉する、特有の機会が提供される。Ｕｂａ６などのユビキチン活性化酵素は、ユビキチン結合経路の最初のステップで機能する。それゆえに、Ｕｂａ６酵素の阻害により、ユビキチン修飾による下流の生物学的結果が特異的に調節されるはずである。そのため、このような活性化酵素の阻害、およびその結果であるユビキチン結合の下流への影響の阻害は、細胞分裂、細胞シグナル伝達、および疾患メカニズムにとって重要である細胞生理機能のいくつかの局面を干渉する方法を意味している。それゆえに、Ｕｂａ６などのユビキチン活性化酵素は、多様な細胞機能の制御因子として、種々の疾患および障害（すなわち、「ユビキチン関連障害」）の治療のための新規なアプローチを同定するための潜在的に重要な治療標的である。
【００１９】
少なくともある実施形態においては、本明細書に記載のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚ（本明細書ではＵｓｅ１ともいう）の調節剤を、癌などの細胞増殖性障害の治療に用いることができる。腫瘍形成におけるＵＰＰ経路の役割は、潜在的な抗癌治療としてのプロテアソーム阻害研究のきっかけとなった。例えば、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）による２６Ｓプロテアソームの阻害によってＵＰＰ経路を調節することは、ある種の癌において効果的な治療であることが示されており、再発性多発性骨髄腫および不応性多発性骨髄腫の治療法として認可されている。
【００２０】
そのレベルがＵＰＰ経路によって制御されるタンパク質の例には、ＣＤＫインヒビターｐ２７Kip1およびＮＦκＢのインヒビターであるＩκＢが含まれる。Ｐｏｄｕｓｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：４５７９（２０００）；Ｒｅａｄ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：２３２６（２０００）、を参照されたい。ｐ２７の分解を阻害することにより、細胞周期のＧ１期およびＳ期を経由して細胞が進行することを阻止することができる。ＩκＢの分解を干渉することにより、ＮＦ−κＢの核局在
化、悪性表現型に関連した種々のＮＦ−κＢ依存性遺伝子の転写、および標準的な細胞毒性治療に対する抵抗性を阻止することができる。ＮＦ−κＢは、多くの炎症促進性メディエーターの発現において重要な役割を担っており、これは、炎症性障害におけるそのようなインヒビターの役割を示唆するものである。したがって、ＵＰＰの阻害は、関節リウマチ、喘息、多発性硬化症、乾癬、および再灌流障害などを含む炎症性障害の治療に有用である。
【００２１】
ＵＰＰの阻害は、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、トリプレットリピート病を含む神経変性障害；神経因性疼痛；脳卒中、梗塞、腎障害などの虚血性障害；および悪液質などの障害の治療にも有用である。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓ  Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１１６：６３７（２００１）；Ｅｌｌｉｏｔｔ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：２３５（２００３）；Ｔａｒｌａｃ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｅｙ
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７４：４０６（２００３）；Ｍｏｒｉ他、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３１：５３（２００５）；Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｃｕｒｒ．Ｐａｉｎ  Ｈｅａｄａｃｈｅ  Ｒｅｐ．８：１９２（２００４）；Ｄａｗｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｗｓｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：８１９（２００３）；Ｋｕｋａｎ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：３（２００４）；Ｗｏｊｃｉｋ  ａｎｄ
ＤｉＮａｐｏｌｉ  Ｓｔｒｏｋｅ  ３５：１５０６（２００４）；Ｌａｚａｒｕｓ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７：Ｅ３３２（１９９９）、を参照されたい。
【００２２】
細胞増殖性障害の治療には、急速増殖を含む、増殖の阻害が含まれることを意図している。本明細書で用いる「細胞増殖性障害」という用語には、多細胞生物における１つまたは複数の細胞サブセットの、望ましくないまたは不適切な増殖を特徴とする障害が含まれる。「癌」という用語は、様々な種類の悪性新生物を意味し、そのほとんどは、周囲組織に浸潤することができ、別の部位へ転移する可能性がある（例えば、ＰＤＲ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）、を参照されたい）。「新生物」および「腫瘍」という用語は、細胞増殖によって正常組織よりも急速に成長し、増殖を開始させた刺激が除去された後も成長を続ける異常組織を意味する（例えば、ＰＤＲ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）、を参照されたい）。そのような異常組織は、良性（すなわち、良性腫瘍）であっても悪性（すなわち、悪性腫瘍）であってもよいが、構造的な構成および正常組織との機能的な協調の、部分的にまたは完全な欠落を示す。
【００２３】
「細胞増殖性障害の治療」という言葉には、患者における新生物の増殖を防止すること、または患者に既に存在する癌の増殖を低減することが含まれることを意図している。阻害は、１つの部位から別の部位への癌の転移の阻害であってもよい。
【００２４】
ある実施形態においては、癌は固形腫瘍である。本発明の方法で治療することができる固形腫瘍の限定されない例には、膵臓癌；膀胱癌；結腸直腸癌；転移性乳癌を含む乳癌；アンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌を含む前立腺癌；例えば、転移性腎細胞癌腫を含む腎臓癌；肝細胞癌；例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、細気管支肺胞癌腫（ＢＡＣ）、および肺腺癌を含む肺癌；例えば、進行性上皮癌または原発性腹膜癌を含む卵巣癌；子宮頚癌；胃癌；食道癌；例えば、頭頚部の扁平細胞癌腫を含む頭頚部癌；メラノーマ；転移性神経内分泌腫瘍を含む神経内分泌癌；例えば、神経膠腫、退形成性乏突起神経膠腫、成人多形膠芽腫、および成人退形成性星状細胞腫を含む脳腫瘍；骨癌；ならびに軟部肉腫などが含まれる。
【００２５】
他のある実施形態においては、癌は、血液系悪性腫瘍である。血液系悪性腫瘍の限定されない例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；移行期ＣＭＬおよびＣＭＬ急性転化期（ＣＭＬ−ＢＰ）を含む慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；慢性
リンパ性白血病（ＣＬＬ）；ホジキン病（ＨＤ）；濾胞性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；多発性骨髄腫（ＭＭ）；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；不応性貧血（ＲＡ）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、および移行期のＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ−Ｔ）を含む骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；ならびに骨髄増殖性症候群などが含まれる。
【００２６】
細胞増殖性障害としては、さらに、アテローム性動脈硬化症および再狭窄を例とする増殖性心血管障害などの、血管平滑筋細胞の過剰増殖に伴う障害を挙げることができる。細胞増殖性障害には、例えば、Ｘ染色体性魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮解離性角質増殖症、および脂漏性皮膚炎などの増殖性皮膚障害などの障害も含まれる場合がある。細胞増殖性障害には、さらに、常染色体優性嚢胞腎疾患（ＡＤＰＫＤ）、肥満細胞症、およびウイルスなどの感染性病原体に起因する細胞増殖性障害などの障害が含まれる場合がある。
医薬化合物
本発明の化合物は、１種または複数種のユビキチン活性化酵素活性の阻害剤を含む。特に、この化合物は、１つまたは複数のＵｂａ６活性（例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１種または複数種のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へのユビキチン転移；および／または、１種または複数種の標的ポリペプチド（例えば、ユビキチン、Ｅ２、標的ポリペプチドおよび／またはタンパク質など）のユビキチン化）、および／または、１種または複数種のＥ２Ｚ活性（例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１種または複数種のユビキチン−タンパク質リガーゼ（例えば、Ｅ３）へのユビキチン転移；および／または、１種または複数種の標的ポリペプチド（例えば、ユビキチン、Ｅ３、標的ポリペプチドおよび／またはタンパク質など）のユビキチン化）の阻害剤として設計される。
【００２７】
阻害剤としては、これらに限定されないが、標的タンパク質へのユビキチンの結合を促進するＥ１酵素の効果を調節（例えば、低下）する（例えば、ユビキチン活性化を低下、および／またはユＥ２へのビキチン転移を促進する）化合物が挙げられる。阻害剤としては、さらに、これらに限定されないが、標的タンパク質へのユビキチン結合を促進するＥ２Ｚ酵素の効果を調節（例えば、低下）する（例えば、ユビキチン活性化を低下、および／またはＥ３へのユビキチン転移を促進する）化合物も挙げられる。したがって、本発明の化合物は、Ｕｂａ６酵素および／またはＥ２Ｚ酵素をインビトロまたはインビボ（例えば、細胞またはモデル動物内で）で阻害する能力について、本明細書でさらに詳細に述べる方法または当該技術分野で周知の方法に従って分析されてもよい。この化合物は、Ｕｂａ６酵素および／またはＥ２Ｚ酵素と結合能力、またはその活性を媒介する能力について直接評価することができる。または、化合物の活性は、間接的な細胞アッセイ、またはＵｂａ６阻害による下流効果の阻害を評価するためにＵｂａ６および／またはＥ２Ｚ活性化の下流効果のアッセイによって評価することができる。例えば、活性の評価は、ユビキチンが結合した基質（例えば、ユビキチンが結合したＥ２、ユビキチンが結合したＥ３、ユビキチン化基質など）の検出；下流タンパク質基質の安定化の検出；ＵＰＰ活性の阻害の検出などによって行うことができる。活性を評価するためのアッセイは、本明細書においてさらに説明され、および／または当該技術分野において周知である。
【００２８】
本発明の一実施形態は、本明細書で述べる化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。本発明の化合物は、官能基を誘導体化して、インビボで転換して親化合物へ戻ることができるプロドラッグ誘導体を提供することができることは理解されるであろう。そのようなプロドラッグの例には、化合物の
ヒドロキシル基または化合物のアミノ基から誘導されるカルバモイル部分から誘導されるメトキシメチルエステル、メチルチオメチルエステル、またはピバロイルオキシメチルエステルなど、生理学的に許容され、代謝的に不安定なエステル誘導体が含まれる。さらに、この代謝的に不安定なエステルまたはカルバメートと類似の、本明細書で述べる親化合物をインビボで生成することが可能な、生理学的に許容される本発明の化合物の同等物も、本発明の範囲内である。
【００２９】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩をこれらの組成物に用いる場合、塩は、無機または有機の酸および塩基から誘導することができる。適切な塩についての総説は、例えば、Ｂｅｒｇｅ  他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１（１９７７）；および、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．、ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００を参照されたい。
【００３０】
本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という用語は、これらに限定されないが、哺乳類（例えば、ヒト）などの対象レシピエントに対して適合性があり、活性薬剤を、その薬剤の活性を失うことなく標的部位へ送達するのに適した物質を含むことを意図している。担体に付随する毒性または有害な影響は、もし存在する場合は、活性薬剤の意図する使用に対する妥当なリスク対効果比に相応するものであることが好ましい。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、従来の造粒法、混合法、溶解法、カプセル化法、凍結乾燥法、または乳化のプロセスなど、当該技術分野で周知の方法によって製造することができる。組成物としては、様々な形状に製造することができ、顆粒、沈殿物、または粒子、フリーズドライ、ロータリードライ、もしくはスプレードライされた粉末を含む粉末、無定形粉末、錠剤、カプセル、シロップ、坐薬、注射液、エマルジョン、エリキシル剤、懸濁液、または溶液が挙げられる。製剤は、任意に、安定化剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、可溶化剤、生物学的利用能調節剤（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、およびこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００３２】
医薬製剤は、これらに限定されないが、油、水、アルコール、およびこれらの組み合わせなどの液体を用いて、懸濁液または溶液として調製してもよい。シクロデキストリンなどの可溶化剤を含んでいてもよい。薬学的に適切な界面活性剤、懸濁化剤、または乳化剤を、経口投与用製剤または非経口投与用製剤に添加してもよい。懸濁液は、例えば、ピーナッツ油、ゴマ油、綿実油、コーン油、およびオリーブ油などの油を含んでいてもよい。懸濁製剤はまた、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリド、およびアセチル化脂肪酸グリセリドなどの脂肪酸のエステルも含んでいてもよい。懸濁製剤は、これらに限定されないが、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロール、およびプロピレングリコールなどのアルコールを含んでいてもよい。これに限定されないが、ポリ（エチレングリコール）を含むエーテル、鉱物油および石油などの石油炭化水素；ならびに水も、懸濁製剤に用いてもよい。
【００３３】
これらの組成物に用いることができる薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩および炭酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンなどの塩または電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられる。
【００３４】
ある実施形態によると、本発明の組成物は、ヒトなどの哺乳類への医薬投与用に製剤される。そのような医薬組成物は、経口、非経口、吸入スプレー、局所、直腸内、鼻腔内、口内、膣内、またはインプラントリザーバー（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）により投与してもよい。本明細書で用いる「非経口」という用語は、これらに限定されないが、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄膜内、肝内、病変内、および頭蓋内への注射技術または輸液技術を含む。ある態様においては、組成物は、経口、静脈内、または皮下投与される。本発明の製剤は、短時間作用性、即効性、または長時間作用性となるように設計してもよい。さらに、化合物は、全身的手段ではなく、腫瘍部位への投与（例えば、注射による）のように局所的に投与することができる。
【００３５】
本明細書に記載される組成物の滅菌注射用形態は、水性の懸濁液であっても、油性の懸濁液であってよい。このような懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を用いて、当該技術分野で周知の技術に従って製剤することができる。滅菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール溶液など、無毒性の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒中の滅菌注射溶液または滅菌注射懸濁液であってもよい。用いることができる許容される媒体および溶媒の中には、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌固定油が、溶媒または懸濁媒体として通常用いられている。この目的のためには、合成モノ−グリセリドまたは合成ジ−グリセリドを含むいずれの無菌性固定油を用いてもよい。オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、注射液の調製に有用であり、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容される油、特にそのポリオキシエチル化型のものも有用である。このような油性溶液または懸濁液はまた、カルボキシメチルセルロースなどの長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはエマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に許容される剤形の製剤に一般的に用いられる類似の分散剤を含んでいてもよい。Ｔｗｅｅｎｓなどのその他の一般的に用いられる界面活性剤、および薬学的に許容される固形、液体、またはその他の剤形の製造に一般的に用いられるその他の乳化剤または生物学的利用能調節剤もまた、製剤の目的のために用いてもよい。化合物は、ボーラス注射または持続輸液など、注射による非経口投与用として製剤してもよい。注射用単位投与剤形は、アンプルの形態であっても、複数投与用容器の形態であってもよい。
【００３６】
医薬組成物は、これらに限定されないが、カプセル、錠剤、水性懸濁液、または溶液を含む、いずれの経口的に許容される剤形によっても経口投与することができる。経口用の錠剤の場合、一般的に用いられる担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も、通常添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口用に水性懸濁液が必要である場合は、活性成分は乳化剤および懸濁化剤と組み合わされる。所望により、特定の甘味料、香味料、または着色料を添加してもよい。
【００３７】
あるいは、医薬組成物は、直腸内投与のための坐薬の形で投与してもよい。これらは、室温では固体だが直腸内温度では液体であり、したがって、直腸内で融解して薬物を放出することになる適切な非刺激性賦形剤と薬剤とを混合することによって調製してもよい。そのような物質としては、ココアバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、特に、治療の標的が、眼、皮膚、または下部腸管の疾患を含む、局所投与によって容易に到達可能である領域または臓器を含む場合は、局所投与をしてもよい。適切な局所投与製剤は、これらの領域または臓器の各々に対して容易に調製される。
【００３９】
下部腸管への局所投与は、直腸坐薬製剤（上記参照）、または適切な浣腸製剤で行ってもよい。局所経皮性パッチを用いてもよい。局所投与には、医薬組成物は、１種または複数種の担体に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切な軟膏として製剤してもよい。本明細書に記載される化合物の局所投与のための担体としては、これらに限定されないが、鉱油、液体石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水が挙げられる。あるいは、医薬組成物は、１種または複数種の薬学的に許容される担体に懸濁または溶解された活性成分を含有する、適切なローションまたはクリームとして製剤してもよい。適切な担体としては、これらに限定されないが、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられる。
【００４０】
点眼用の場合、医薬組成物は、等張性でｐＨを調節した滅菌食塩水中に微粒子化懸濁液として、または、好ましくは、等張性でｐＨを調節した滅菌食塩水中の溶液として、塩化ベンジルアルコニウム（ｂｅｎｚｙｌａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などの保存剤を含んで、または含まずに、製剤してもよい。あるいは、点眼用の場合、医薬組成物は、ワセリンなどの軟膏として製剤してもよい。
【００４１】
医薬組成物はまた、鼻エアロゾルまたは鼻吸入によって投与してもよい。そのような組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたはその他の適切な保存剤、生物学的利用能を向上させる吸収促進剤、フッ化炭素、および／またはその他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、食塩水溶液として調製してもよい。
【００４２】
本明細書に記載される医薬組成物は、特に、本明細書に記載される障害（例えば、癌などの増殖性障害、炎症性障害、神経変性障害）に関する治療用途に有用である。ある実施形態においては、この組成物は、治療中の関連障害が再発しているか、または再発を起こすリスクを有するか、または再発中の患者に投与するために製剤される。本明細書で用いる「患者」という用語は、例えばヒトなどの哺乳類をなどの動物を意味することを意図している。ある実施形態においては、本明細書に記載される医薬組成物は、さらに、別の治療薬を含んでいてもよい。この治療薬は、治療中の障害、疾患、または状態を有する患者に通常投与されるものとすることができる。
【００４３】
「治療効果量」とは、単一用量または複数用量の投与によって、１つまたは複数のＵｂａ６酵素の活性の検出可能な低下、および／または、１つまたは複数の治療中の障害または疾患状態の重症度の検出可能な軽減を引き起こすのに十分である、化合物または組成物の量を意味する。「治療効果量」はまた、細胞の治療、治療中の障害もしくは疾患状態の進行の遅延または予防（例えば、癌のさらなる腫瘍増殖の予防、さらなる炎症反応の予防）、対象の障害の症状の、そのような治療を行わない場合に期待されるもの以上の、寛解、緩和、軽減、または改善を行うのに十分な量を含むことも意図している。
【００４４】
必要とするＵｂａ６酵素調節剤（例えば、阻害剤）の量は、所与の組成物の特定の化合物、治療中の障害の種類、投与経路、およびその障害の治療に要する時間の長さに応じて異なる。化合物の治療効果量（すなわち、効果用量）は、体重に対して、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。いずれの特定の患者に対しても、具体的な用量および治療レジメンは、使用される具体的な化合物の活性、患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別、および食事、投与の時間、排出速度、薬物の組み合わせ、治療を行う医師の判断、ならびに治療中の特定の疾患の重症度を含む種々の要因に依存することになることも
また理解されるべきである。別の薬剤と組み合わせて阻害剤が投与されるある態様においては、組成物中に存在する追加の治療薬の量は、通常は、その治療薬を唯一の活性薬剤として含む組成物として通常投与される量以下となる。ある態様においては、追加の治療薬の量は、その治療薬を唯一の治療活性薬剤として含む組成物中に通常存在する量の約５０％〜約１００％の範囲となる。
【００４５】
本発明の一実施形態は、試料中の１つまたは複数のＵｂａ６酵素活性を調節（例えば、阻害）または低下する方法に関し、その方法は、試料を１種または複数種の本明細書に記載される化合物および／または組成物と接触させることを含む。試料としては、これらに限定されないが、精製されたもしくは部分的に精製されたＵｂａ６酵素、培養細胞もしくは細胞培養物の抽出物、哺乳類から採取した生検細胞もしくは液体、またはその抽出物、および１つまたは複数の体液（例えば、血液、血清、唾液、尿、糞便、精液、涙、および母乳など）またはその抽出物を挙げることができる。試料中の１つまたは複数のＵｂａ６酵素活性の阻害は、インビトロ、インビボ、またはインサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で行ってもよい。
【００４６】
別の実施形態は、本明細書で述べる１つまたは複数のユビキチン関連障害を持つ患者、本明細書で述べる１つまたは複数のユビキチン関連障害の１つまたは複数の症状を持つ患者、および／または、本明細書で述べる１つまたは複数のユビキチン関連障害の再発のリスクを有するか、または再発中の患者を治療する方法である。そのような方法は、本明細書で述べる１種または複数種の化合物および／または医薬組成物を患者へ投与することを含む。本明細書で用いる「治療する」という用語は、これらに限定されないが、障害、障害の１つまたは複数の症状、または障害に対する素因を治療する、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、回復させる、寛解する、和らげる、改善する、または影響を与えることを含むことを意図している。
【００４７】
治療を受ける特定の障害または状態に応じて、１種または複数種のＵｂａ６酵素阻害剤が、１種または複数種の追加の治療薬と組み合わせて投与される。ある実施形態においては、追加の治療薬は、治療中の障害または状態を有する患者に対して通常投与されるものである。１種または複数種のＵｂａ６阻害剤を、単一の剤形、または別々の剤形で、他の治療薬と共に投与してもよい。別々の剤形として投与する場合は、他の治療薬は、１種または複数種のＵｂａ６阻害剤の投与の前に投与しても、同時に投与しても、後に続けて投与してもよい。
【００４８】
ある実施形態においては、１種または複数種のＵｂａ６阻害剤は、増殖性障害および癌の治療に適した、細胞傷害剤を含むがこれらに限定されない１種または複数種の治療薬、放射線療法、および免疫療法と組み合わせて投与される。１種または複数種のＵｂａ６阻害剤と組み合わせての使用に適した細胞傷害剤の限定されない例には、代謝拮抗物質（例えば、カペシタビン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシルまたは５−フルオロウラシル／ロイコボリン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、およびメトトレキサート）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ドキソルビシン、およびダウノルビシン）；ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン；例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルを含むタキサン）；白金薬剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン）；抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、アドリアマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシン、およびペグ化リポソームドキソルビシン）；アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、およびシクロホスファミド）；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ、お
よびゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、サリドマイド、および関連する類似体）；抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、およびベバシズマブ）；ミトキサントロン；デキサメタゾン；プレドニゾン；およびテモゾロミドなどが含まれる。
【００４９】
１種または複数種のＵｂａ６阻害剤と組み合わせることができる薬剤のその他の例には、抗炎症薬（例えば、副腎皮質ステロイド、ＴＮＦ遮断薬、Ｉｌ−１ＲＡ、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびスルファサラジン）；免疫調節剤および／または免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、インターフェロン、副腎皮質ステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、およびスルファサラジン）；抗菌薬および抗ウイルス薬；ならびにアルツハイマー病治療のための薬剤（例えば、ドネペジル、ガランタミン、メマンチン、およびリバスチグミン）が含まれる。
スクリーニングアッセイ
本発明は、調節剤、すなわち、１種または複数種のＵｂａ６酵素と結合するか、またはＵｂａ６の発現もしくは１種または複数種のＵｂａ６活性に対して刺激効果または阻害効果を有する候補化合物もしくは候補薬剤または試験化合物もしくは試験薬剤（例えば、ペプチド、環状ペプチド、ペプチド模倣剤、小分子、有機小分子、またはその他の薬物）を同定するための方法（本明細書では、「スクリーニングアッセイ」ともいう）を提供する。
【００５０】
本明細書で用いる用語「有機小分子」は、分子量が約２５ダルトンより大きく、約３０００ダルトン未満、好ましくは約２５００ダルトン未満、より好ましくは約２０００ダルトン未満であり、好ましくは約１００〜約１０００ダルトンの間であり、より好ましくは約２００〜約５００ダルトンの間である、天然または合成の有機分子を意味する。
【００５１】
一実施形態では、Ｕｂａ６、Ｕｂａ６ポリペプチドもしくはその生物活性部分、Ｅ２Ｚ、またはＥ２Ｚポリペプチドもしくはその生物活性部分と、結合もしくはその活性を調節する、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。試験化合物は、当該技術分野で周知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くの手法のいずれを用いても得ることができ、コンビナトリアルライブラリー法としては、生物学的ライブラリー；空間的に処アドレス可能な並列固相ライブラリーもしくは並列液相ライブラリー；デコンボリューションを要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィによる選択を用いる合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーによる手法は、ペプチドライブラリーに限定されるが、一方、他の４種類の手法は、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５（１９９７））。
【００５２】
分子ライブラリーの合成法の例は、当該技術分野において、例えば、ＤｅＷｉｔｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９（１９９３）；Ｅｒｂ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２（１９９４）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８（１９９４）；Ｃｈｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３）；Ｃａｒｒｅｌｌ他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９（１９９４）；Ｃａｒｅｌｌ他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１（１９９４）；およびＧａｌｌｏｐ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３（１９９４）を参照のこと。
【００５３】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２（１９９２））、またはビーズ上（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２（１９９１））、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５（１９９３））、細菌（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５（１９９２））、またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８（１９９０）；Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１（１９９Ｉ）；Ｌａｄｎｅｒ、前述）で提示することができる。
【００５４】
ランダム化核酸の分子ライブラリーを細胞集団へ導入する方法の例には、当該技術分野の、例えば、米国特許第６，３６５，３４４号を参照のこと。ランダム化核酸の分子ライブラリーにより、所望の表現型効果を有する候補化合物または試験化合物の直接選定することが可能となる。一般的な方法には、例えば、複数の細胞内にて、各々の核酸が異なるヌクレオチド配列を有するランダム化核酸の分子ライブラリーを発現させること、細胞内の候補化合物または試験化合物の存在に反応して生理機能の変化を図に示した細胞のスクリーニングを行うこと、ならびに細胞および／または候補化合物もしくは試験化合物を検出して単離することが含まれることがある。
【００５５】
一実施形態では、導入された核酸はランダム化され、単離されたランダム化発現産物のライブラリーとして細胞内で発現される。ランダム化発現産物は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ試薬、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム成分などの核酸、またはペプチド（例えば、環状ペプチド）であってもよい。例えば、ＲＮＡｉ試薬には、これらに限定されないが、Ｕｂａ６のコード配列（例えば、ヒトＵｂａ６（配列番号５）のシステイン６２５領域に対応する核酸配列（例えば、触媒性システインドメイン）；ヒトＵｂａ６（配列番号５）のアミノ酸９４７〜１０５２に対応する核酸配列（例えば、Ｃ末端ユビキチン様（Ｕｂｌ）ドメイン）；アデニル化ドメイン；および／または１つまたは複数のＴｈｉＦドメイン）に対応する二本鎖もしくはヘアピン配列が含まれる。ライブラリーは、所望の反応を示す１つまたは複数の細胞を提供するのに確率的に十分である範囲の細胞反応を引き起こすのに十分なほど、構造的に多様なランダム化発現産物の集団を提供するだろう。
【００５６】
導入された核酸、および得られた発現産物はランダム化されており、これは、核酸およびペプチドの各々が、それぞれ、実質的にランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸から成っていることを意味する。ライブラリーは、完全にランダムであっても、または、例えば、全体的にもしくは位置毎に、ヌクレオチド／残基の頻度に偏りがあってもよい。他の実施形態においては、ヌクレオチドまたは残基は、例えば、疎水性アミノ酸、プリンなどの所定のクラス内でランダム化される。
【００５７】
ランダム化発現産物の機能的および構造的な単離は、遊離の（すなわち、共有結合していない）発現産物を提供することによって行ってもよい。しかし、場合によっては、発現産物は、官能基または融合パートナー、好ましくは異種の（宿主細胞に対して）もしくは合成の（どの細胞由来でもない）官能基または融合パートナーと結合してもよい。基またはパートナーの例には、これらに限定されないが、ゴルジ、小胞体、核小体、核、核膜、ミトコンドリア、葉緑体、分泌小胞、およびリソソームなどの所定の細胞内部位へ発現産物を恒常的に局在化させることができるシグナル配列；発現産物の生物活性を維持したまま発現産物を所定のタンパク質へ結合させることができる結合配列；それ自体のまたは共結合したタンパク質の選択的な分解のシグナル伝達を行う配列；ならびに分泌シグナルおよび膜アンカーシグナルが含まれる。
【００５８】
ランダム化発現産物を立体構造的に制限して、細胞が利用可能な立体構造の数をより特異的に定めるパートナーを提供することが望ましい場合もある。例えば、そのようなパートナーは、合成提示構造；細胞内でランダム化ペプチドを立体構造制限ドメインとして提示可能である人工ポリペプチドであってよい。一般に、そのような提示構造には、ランダム化ペプチドのＮ末端部に連結した第一の部分、および該ペプチドのＣ末端部に連結した第二の部分を含まれる。提示構造の例には、例えばコイルドコイルなどの外部ループ上にペプチドを提示することによって、ペプチドへの接触性を最大化する（Ｍｙｓｚｋａ  ａｎｄ  Ｃｈａｉｋｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：２３６２（１９９４））。ランダム化発現産物の機能的単離を向上するため、提示構造は、標的細胞中で発現される生物活性が最小となるように選択または設計される。さらに、提示構造は、修飾、ランダム化、および／または成熟させて、ランダム化発現産物の提示配向性を変化させてもよい。例えば、ループの基部の決定基を修飾して、絶対的アミノ酸同一性は維持したまま、内部ループペプチドの三次構造を僅かに修飾してもよい。その他の提示構造には、ジンクフィンガードメイン、重要でない残基がランダム化されているβシートターン上のループおよびコイルドコイルステム構造；システインブリッジ、環状ペプチドなどによって連結されたループ構造が含まれる。
【００５９】
一実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、Ｕｂａ６タンパク質またはその生物活性部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、試験化合物が、例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１または複数のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へのユビキチン転移；および／または、１または複数の標的ポリペプチドのユビキチン化など、１または複数のＵｂａ６活性を調節する能力について測定する。別の実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、Ｅ２Ｚタンパク質またはその生物活性部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１または複数のユビキチン−タンパク質リガーゼ（例えば、Ｅ３）へのユビキチン転移；および／または、１または複数の標的ポリペプチドのユビキチン化など、１または複数のＥ２Ｚ活性を調節する試験化合物の能力について測定する。
【００６０】
試験化合物が１または複数のＵｂａ６活性、および／または１または複数のＥ２Ｚ活性を調節する能力の測定は、例えば、本明細書で述べる１または複数のアッセイを用いて、例えば、ユビキチン活性化、ユビキチン−アデニル酸中間体の形成、ユビキチンのチオールエステル化、１または複数のユビキチン結合酵素へのユビキチン転移、１または複数のユビキチン−タンパク質リガーゼへのユビキチン転移、および／または、１または複数の標的ポリペプチドまたは標的ポリペプチドのユビキチン化などをモニタリングすることによって行うことができる。
【００６１】
試験化合物がＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの１または複数の活性を調節する能力の測定は、例えば、Ｕｂａ６もしくはＵｂａ６基質（例えば、ユビキチン、Ｅ２、および／または標的ポリペプチドもしくは標的タンパク質）、および／またはＥ２ＺもしくはＥ２Ｚ基質（例えば、ユビキチン、Ｅ３、および／または標的ポリペプチドもしくは標的タンパク質）を放射性同位体または酵素標識と結合させ、Ｕｂａ６、Ｕｂａ６基質、Ｅ２Ｚ、および／またはＥ２Ｚ基質の変化（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の移動度の変化）を検出することによって、Ｕｂａ６、Ｕｂａ６基質、Ｅ２Ｚ、および／またはＥ２Ｚ基質の変化（例えば、ユビキチン化、チオールエステル化、もしくはユビキチンアデニル化などによる）を測定することによって行うことができる。例えば、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または3Ｈによって直接または間接的に化合物を標識することができ、放射線放出の直接測定またはシンチレーション測定によって放射性同位元素を検出することができる。あるいは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで
化合物を酵素標識し、適切な基質の生成物への変換を測定することによって、その酵素標識を検出することができる。
【００６２】
化合物がＵｂａ６および／またはＥ２Ｚと相互作用を起こす能力を、いずれの相互作用物も標識せずに測定することも、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を用いて、化合物、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚのいずれも標識せずに、化合物とＵｂａ６および／またはＥ２Ｚとの相互作用を検出することができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６（１９９２））。本明細書で用いる「マイクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（商品名））とは、光アドレス可能な電位鎖測定センサー（ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ）（ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物とＵｂａ６および／またはＥ２Ｚとの相互作用の指標として用いることができる。
【００６３】
別の実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚを発現する（例えば、ユビキチン、Ｅ２、Ｅ３、標的ポリペプチドまたは標的タンパク質を発現する）細胞を試験化合物と接触させること、ならびに、試験化合物が、Ｕｂａ６、Ｕｂａ６標的分子、Ｅ２Ｚ、および／またはＥ２Ｚ標的分子の活性を調節（例えば、刺激もしくは阻害）する能力を測定することが含まれる。試験化合物が、Ｕｂａ６、Ｕｂａ６標的分子、Ｅ２Ｚ、および／またはＥ２Ｚ標的分子の活性を調節する能力の測定は、例えば、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚが結合してユビキチン活性化を調節する能力を測定することによって行うことができる。
【００６４】
Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚがユビキチン活性化を調節する能力の測定は、直接結合を測定する前述の方法の１つによって行うことができる。例示的な実施形態では、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚがユビキチン活性化を調節する能力の測定は、例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１または複数のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へのユビキチン転移；１または複数のユビキチン−タンパク質リガーゼ（例えば、Ｅ３）へのユビキチン転移；および／または、１または複数の標的ポリペプチド（例えば、ユビキチン、Ｅ２、Ｅ３、または、標的ポリペプチドおよび／または標的タンパク質など）のユビキチン化など、１または複数のＵｂａ６活性および／またはＥ２Ｚ活性を検出することによって行うことができる。
【００６５】
さらに別の実施形態では、本発明のアッセイは細胞を用いないアッセイであり、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚを試験化合物と接触させ、試験化合物がＵｂａ６および／またはＥ２Ｚ、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの生物活性部分と結合する能力が測定される。本発明のアッセイに用いられるＵｂａ６の生物活性部分には、これらに限定されないが、ＴｈｉＦドメイン（例えば、ＴｈｉＦドメイン１に対して配列番号５のアミノ酸５０〜２００、ＴｈｉＦドメイン２に対して配列番号５のアミノ酸４６０〜６００）、触媒性システインドメイン（例えば、配列番号５のシステイン６２５を含むアミノ酸配列）、アデニル化ドメイン（配列番号５のアミノ酸１〜６１０）、およびＣ末端ユビキチン様（Ｕｂｌ）ドメイン（例えば、配列番号５のアミノ酸９４７〜１０５２）などが含まれる。試験化合物のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚへの結合は、前述のように、直接または間接的に測定することができる。例示的な実施形態では、このアッセイは、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚ、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの生物活性部分を、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚと結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成すること、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、ならびに試験化合物がＵｂａ６および／またはＥ２Ｚと相互作用を起こす能力を測定することを含み、ここで、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚと相互作用を起こす試験化合物の能力の測定には、試験化合物が、既知の化
合物と比較して、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚ、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの生物活性部分と優先的に結合する能力を測定することが含まれる。
【００６６】
別の実施形態では、アッセイは細胞を用いないアッセイであり、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚ、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの生物活性部分を試験化合物と接触させ、試験化合物がＵｂａ６および／またはＥ２Ｚ、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの生物活性部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力が測定される。試験化合物がＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を調節する能力の測定は、例えば、直接結合を測定する前述の方法の１つにより、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚが、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの標的分子と結合する能力を測定することによって行うことができる。Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚが、それぞれ、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの標的分子と結合する能力の測定は、リアルタイム生体分子相互作用分析（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）などの技術を用いて達成することもできる。（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５（１９９１）、およびＳｚａｂｏ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５（１９９５））。本明細書で用いる「ＢＩＡ」とは、いずれの反応体も標識せずに、リアルタイムで生体分子特異的な相互作用を研究する技術のことである（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商品名））。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象における変化を、生物学的分子間のリアルタイムでの反応の指標として用いることができる。
【００６７】
さらに別の実施形態では、細胞を用いないアッセイは、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚ、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの生物活性部分を、それぞれ、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚと結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成すること、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、ならびに試験化合物がＵｂａ６および／またはＥ２Ｚと相互作用を起こす能力を測定することを含み、ここで、試験化合物がＵｂａ６および／またはＥ２Ｚと相互作用を起こす能力の測定には、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの標的分子と優先的に結合するか、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの標的分子の活性（例えば、ユビキチンの活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１または複数のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へのユビキチン転移；１または複数のユビキチン−タンパク質リガーゼ（例えば、Ｅ３）へのユビキチン転移；および／または、１または複数の標的ポリペプチド（例えば、ユビキチン、Ｅ２、Ｅ３、または標的ポリペプチドおよび／または標的タンパク質など）のユビキチン化など）を調節する、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの能力を測定することが含まれる。
【００６８】
前述の本発明のアッセイ方法の二つ以上の実施形態では、非複合体形態の一方もしくは両方のタンパク質から複合体形態を分離することを促進するため、およびアッセイの自動化に適合させるために、Ｕｂａ６、Ｕｂａ６標的分子、Ｅ２Ｚ、および／またはＥ２Ｚ標的分子のいずれかを固定化することが望ましい場合がある。試験化合物のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚへの結合、または、候補化合物の存在下および非存在下におけるＵｂａ６および／またはＥ２Ｚと１または複数の標的分子との相互作用は、反応体を収容するのに適しているいかなる容器中でも行うことができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロチューブが含まれる。一実施形態では、一方または両方のタンパク質がマトリックスに結合できるようにするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ／Ｕｂａ６融合タンパク質、またはグルタチオンＳトランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）、またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、続いて、これを、試験化合物と混合し、または試験化合物と非吸着標的タンパク質もしくはＵｂａ６の
いずれかと混合し、この混合物を、複合体形成をもたらす条件下（例えば、塩およびｐＨについての生理的条件下）でインキュベートする。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して結合していない成分を取り除き、ビーズの場合はマトリックスを固定化し、例えば前述のようにして、複合体を直接または間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離し、標準的な方法を用いて、Ｕｂａ６の結合または活性レベルを測定することができる。
【００６９】
本発明のスクリーニングアッセイにおいては、タンパク質をマトリックス上へ固定化するその他の技術を用いることもできる。例えば、Ｕｂａ６、Ｕｂａ６標的分子、Ｅ２Ｚ、および／またはＥ２Ｚ標的分子を、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンの結合を用いることで固定化することができる。ビオチン化したＵｂａ６および／またはＥ２Ｚ、または標的分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から、当該技術分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州、ロックフォード）を用いて調製することができ、ストレプトアビジンをコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ社）のウェル中へ固定化することができる。あるいは、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚ、または標的分子に対する反応性を有し、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚがその標的分子と結合することを阻害しない抗体を、プレートのウェルへ誘導体化し、未結合の標的、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚを、抗体結合によってウェル中に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固定化複合体の検出についての前述の方法に加えて、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚ、または、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの１または複数の標的分子に対する反応性を有する抗体を用いた複合体の免疫検出、ならびにＵｂａ６および／またはＥ２Ｚと関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【００７０】
別の実施形態では、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中でのＵｂａ６タンパク質、Ｕｂａ６  ｍＲＮＡ、Ｅ２Ｚタンパク質、および／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡの発現を測定する方法によって、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現の調節剤が同定される。候補化合物の存在下におけるＵｂａ６タンパク質、Ｕｂａ６  ｍＲＮＡ、Ｅ２Ｚタンパク質、および／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡのレベルを、候補化合物の非存在下におけるＵｂａ６タンパク質、Ｕｂａ６  ｍＲＮＡ、Ｅ２Ｚタンパク質、および／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡのレベルと比較する。さらに、この比較に基づいて、候補化合物は、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質の発現、および／またはＵｂａ６  ｍＲＮＡおよび／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡの発現の調節剤として同定される。例えば、候補化合物の存在下におけるＵｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質の発現、および／またはＵｂａ６  ｍＲＮＡおよび／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡの発現が、非存在下よりも大きい（統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、それぞれ、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質の発現、および／またはＵｂａ６  ｍＲＮＡおよび／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡの発現の刺激剤として同定される。あるいは、候補化合物の存在下におけるＵｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質の発現、および／またはＵｂａ６  ｍＲＮＡおよび／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡの発現が、非存在下よりも小さい（統計的に有意に小さい）場合、この候補化合物は、それぞれ、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質の発現、および／またはＵｂａ６  ｍＲＮＡおよび／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡの発現の阻害剤として同定される。Ｕｂａ６  ｍＲＮＡおよび／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の細胞中における発現レベルは、Ｕｂａ６  ｍＲＮＡおよび／またはＥ２Ｚ
ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための本明細書に記載の方法によって測定することができる。
【００７１】
本発明のさらに別の態様では、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚは、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ他、Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２（１９９３）；Ｍａｄｕｒａ他、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４（１９９３）；Ｂａｒｔｅｌ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４（１９９３）；Ｉｗａｂｕｃｈｉ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６（１９９３）；および、Ｂｒｅｎｔ、国際公開第９４／１０３００号、を参照されたい）における「ベイトタンパク質（ｂａｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」として用いて、他のタンパク質を同定することができる。前記他のタンパク質は、Ｕｂａ６と結合するかまたは相互作用するものであり（「Ｕｂａ６結合タンパク質」）、１または複数のＵｂａ６活性（例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１または複数のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へのユビキチン転移；および／または１または複数の標的ポリペプチド（例えば、ユビキチン、Ｅ２、標的ポリペプチドおよび／またはタンパク質など）のユビキチン化）に関与するものである。あるいは、そのようなＵｂａ６結合タンパク質は、Ｕｂａ６阻害剤である可能性が高い。
【００７２】
別の実施形態では、アッセイは動物モデルに基づくアッセイであり、動物を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、および／またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を変化させる能力を測定することを含む。動物としては、これらに限定されないが、非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、およびマウスなどの哺乳類が挙げられる。
【００７３】
本発明は、さらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤に関する。したがって、本明細書で記載の適切な動物モデルにおいて本明細書に記載のように同定された薬剤を使用することも、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定された薬剤（例えば、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚ調節剤）を動物モデルに用いて、そのような薬剤による治療の効力、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載のように同定された薬剤を動物モデルに用いて、そのような薬剤の作用のメカニズムを決定することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載のユビキチン関連障害（例えば、細胞増殖性障害および／または神経変性障害）の治療のための、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤の使用にも関する。
Ｕｂａ６核酸配列およびアミノ酸配列
本発明の一態様は、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質、またはその生物活性部分をコードする単離核酸分子、ならびに、Ｕｂａ６をコードする核酸分子および／またはＥ２Ｚをコードする核酸分子（例えば、それぞれ、Ｕｂａ６ｍ  ＲＮＡおよび／またはＥ２Ｚ  ｍＲＮＡ）を同定するハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸断片、およびＵｂａ６核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するための核酸断片に関する。本明細書で用いる「核酸分子」という用語は、これらに限定されないが、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、およびヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことを意図している。核酸分子は、一本鎖ＤＮＡであってもよく、または二本鎖ＤＮＡであってもよい。
【００７４】
「単離」核酸分子は、核酸の天然源中に存在するその他の核酸分子から分離されたものである。例示的な実施形態では、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ内においては、生来その核酸に隣接している配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）は含んでいない。例えば、種々の実施形態においては、単離Ｕｂａ６核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、生来その核酸に隣接しているヌクレオチド配列を、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満含むことができる。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、遺伝子組換え技術によって作製された場合は、その他の細胞成分もしくは培養液を実質的に含まないことができ、または化学的に合成された場合は、化学的前駆体もしくはその
他の化学物質を実質的に含まないことができる。
【００７５】
例えば、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその一部など、本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を用いて単離することができ、その配列情報は本明細書に提供される。配列番号４もしくは配列番号６の核酸配列のすべてまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ，ｅｄ．、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９に記載）を用いてＵｂａ６核酸分子を単離することができる。さらに、配列番号４もしくは配列番号６のすべてまたは一部を含む核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、配列番号４または配列番号６の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて単離することができる。
【００７６】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはあるいは、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、増幅することができる。そのようにして増幅された核酸は、適切なベクター中へクローン化し、ＤＮＡ配列分析によって特性決定することができる。さらに、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機の使用など、標準的な合成技術によって作製することができる。
【００７７】
一実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号４もしくは配列番号６に示されるヌクレオチド配列、またはこれらいずれかのヌクレオチド配列の一部を含む。別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号４もしくは配列番号６に示されるヌクレオチド配列と相補的な核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部と相補的な核酸分子を含む。配列番号４または配列番号６に示されるヌクレオチド配列と相補的な核酸分子は、配列番号４または配列番号６に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それによって安定な二本鎖を形成することができるような、配列番号４または配列番号６に示されるヌクレオチド配列に対して十分に相補的である核酸分子である。
【００７８】
さらに別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号４もしくは配列番号６に示されるヌクレオチド配列の全長、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれを超える同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００７９】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号４または配列番号６の核酸配列の一部のみを含むことができ、例えば、プローブもしくはプライマーとして用いることができる断片、またはＵｂａ６タンパク質の生物活性部分をコードする断片である。配列番号４または配列番号６の核酸配列により、他のＵｂａ６ファミリーメンバー、および他の種由来のＵｂａ６ホモログの同定、および／またはクローニングに用いられるよう設計されたプローブおよびプライマーの作製が可能となる。
【００８０】
プローブ／プライマーは、通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、通常、配列番号４もしくは配列番号６のセンス配列、配列番号４もしくは配列番号６のアンチセンス配列、または配列番号４もしくは配列番号６の天然の対立遺伝子変異（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）もしくは突然変異（ｍｕｔａｎｔ）の、少なくとも約１２もしくは１５、約２０もしくは２５、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、もしくは７５の連続したヌクレオチドと、ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。例示的な実施形態では、本発明の核酸分子は、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜２０００、２０００〜２５００、２５００〜３０００、３０００〜３５００、３５００〜４０００、４０００〜４５００、４５００〜５０００、５１０１、５３８６、５０００〜５５００、またはこれを超えるヌクレオチド長であり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号４または配列番号６の核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
Ｕｂａ６ヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、同一のタンパク質もしくは相同タンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出することができる。ある実施形態においては、プローブは、それに結合した標識基をさらに含む。標識基は、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。そのようなプローブは、例えば、Ｕｂａ６  ｍＲＮＡレベルの検出またはゲノムＵｂａ６遺伝子が突然変異もしくは欠失しているかどうかを決定することなどによって、対象由来の細胞試料中のＵｂａ６をコードする核酸のレベルの測定によってＵｂａ６を異所性発現する細胞または組織を同定するための診断試験用キットの一部として用いることができる。
【００８２】
「Ｕｂａ６タンパク質の生物活性部分」をコードする核酸断片は、Ｕｂａ６の生物活性（Ｕｂａ６タンパク質の生物活性は本明細書に記載されている）を有するポリペプチドをコードする、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド配列の一部を単離し、Ｕｂａ６タンパク質のコード部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現により）、Ｕｂａ６のコード部分の活性を評価することによって調製することができる。
【００８３】
本発明は、さらに、遺伝コードの縮重のために配列番号４または配列番号６に示すヌクレオチド配列とは異なり、それゆえ、配列番号４または配列番号６に示すヌクレオチド配列によってコードされるものと同じＵｂａ６タンパク質をコードする核酸分子も含む。別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号５または配列番号７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００８４】
配列番号４または配列番号６のＵｂａ６ヌクレオチド配列に加えて、Ｕｂａ６タンパク質のアミノ酸配列に変化を引き起こすようなＤＮＡ配列多型が集団（例えば、ヒトの集団）内に存在する場合があることを、当業者であれば理解するであろう。Ｕｂａ６遺伝子におけるそのような遺伝多型は、対立遺伝子の自然変異により、集団内の個体間にも存在する場合がある。本明細書で用いる「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、哺乳類、またはマウス、またはゼブラフィッシュのＵｂａ６などのＵｂａ６をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味し、さらに、非コード制御配列およびイントロンを含んでいてもよい。
【００８５】
Ｕｂａ６の対立遺伝子変異には、機能的Ｕｂａ６タンパク質および非機能的Ｕｂａ６タンパク質の両方が含まれる。機能的な対立遺伝子変異は、Ｕｂａ６リガンドと結合する能力、および／または本明細書に記載するＵｂａ６活性のいずれかを調節する能力を維持している、Ｕｂａ６の自然発生的なアミノ酸配列変異である。機能的な対立遺伝子変異は、通常、配列番号５もしくは配列番号７の１つまたは複数のアミノ酸の保存的置換、または、このタンパク質の非重要領域の非重要残基の置換、欠失、もしくは挿入のみを含むであろう。
【００８６】
非機能的な対立遺伝子変異は、Ｕｂａ６リガンドと結合する能力、および／または本明細書に記載するＵｂａ６活性のいずれかを調節する能力を有していない、Ｕｂａ６の自然
発生的なアミノ酸配列変異である。非機能的な対立遺伝子変異は、通常、非保存的置換、欠失、もしくは挿入、または配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列の中途の切断（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、または重要残基もしくは重要領域の置換、欠失、または挿入を含むであろう。
【００８７】
本発明は、さらに、Ｕｂａ６タンパク質の非ヒトオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を提供する。Ｕｂａ６タンパク質のオルソログは、同一のＵｂａ６リガンド結合を有し、および／または本明細書に記載するいずれかのＵｂａ６活性を調節できるような、種々の生物から単離されたタンパク質である。Ｕｂａ６のオルソログは、配列番号５または配列番号７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むものとして容易に同定することができる。
【００８８】
さらに、その他のＵｂａ６ファミリーメンバーをコードし、それゆえ、配列番号４または配列番号６のＵｂａ６配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子も、本発明の範囲内であることを意図している。例えば、別のＵｂａ６ｃＤＮＡは、ヒトまたはマウスのＵｂａ６ヌクレオチド配列に基づいて同定することができる。さらに、異なる種由来のＵｂａ６タンパク質をコードし、それゆえ、配列番号４または配列番号６のＵｂａ６配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子も、本発明の範囲内であることを意図している。例えば、サルＵｂａ６のｃＤＮＡは、ヒトＵｂａ６またはマウスＵｂａ６のヌクレオチド配列に基づいて同定することができる。
【００８９】
本発明のＵｂａ６のｃＤＮＡの自然対立遺伝子変異およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書に開示するｃＤＮＡもしくはその一部を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーション技術に従ったハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本明細書に開示するＵｂａ６核酸との相同性に基づいて単離することができる。
【００９０】
したがって、別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、少なくとも１５、２０、２５、３０、またはそれを超える長さのヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下にて、配列番号４または配列番号６のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズする。その他の実施形態では、核酸は、少なくとも３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３０７、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５１０１、５３８６、または５５００ヌクレオチド長である。本明細書で用いる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに、少なくとも６０％の同一性を持つヌクレオチド配列同士が、通常、ハイブリダイズした状態で維持されるような、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明することを意図している。例示的な実施形態では、この条件は、互いに、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または９５％の同一性を有する配列同士が、通常、ハイブリダイズした状態で維持されるような条件である。そのようなストリンジェントな条件は、当業者に周知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６を参照のこと。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の限定されない例としては、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、約４５℃にてハイブリダイゼーションを行い、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、５０℃にて、ある態様においては５５℃にて、他の態様においては６０℃または６５℃にて、１回または複数回の洗浄を行うというものである。ある態様においては、ストリンジェントな条件下で配列番号４または配列番号６の配列とハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応している。本明細書で用いる「天然に存在する」核酸分子とは、自然に存在する（例えば、天然タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有す
るＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。
【００９１】
集団中に存在し得るＵｂａ６配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、変異によって配列番号４または配列番号６のヌクレオチド配列へ変化を導入することができ、それによって、Ｕｂａ６タンパク質の機能上の能力を変えることなく、コードされたＵｂａ６タンパク質のアミノ酸配列に、変化を引き起こすことができることを、当業者であればさらに理解するであろう。例えば、配列番号４または配列番号６の配列に、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を引き起こすヌクレオチド置換を生じさせることができる。「非必須」アミノ酸残基とは、生物活性を変化させることなく、Ｕｂａ６の野生型配列（例えば、配列番号５または配列番号７の配列）から変化させることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物活性に必要である。例えば、本発明のＵｂａ６タンパク質中で保存されているアミノ酸残基は、特に変化を起こしにくいと予想される。さらに、本発明のＵｂａ６タンパク質とＵｂａ６ファミリータンパク質のその他のメンバーとの間で保存されるような、付加的なアミノ酸残基は、変化を起こしやすくないようだ。
【００９２】
したがって、本発明の別の態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含むＵｂａ６タンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなＵｂａ６タンパク質は、配列番号５または配列番号７とはアミノ酸配列が異なるが、生物活性を維持している。一実施形態では、単離核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号５または配列番号７に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９３】
配列番号５または配列番号７のタンパク質と相同なＵｂａ６タンパク質をコードする単離核酸分子は、コードされたタンパク質に、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加、または欠失が導入されるように、配列番号４または配列番号６のヌクレオチド配列に、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって生成することができる。配列番号４または配列番号６への突然変異の導入は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発などの標準的な技術によって行うことができる。ある実施形態においては、非必須であると予測される１つまたは複数のアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換が行われる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷をもたない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。ある態様においては、Ｕｂａ６タンパク質において非必須であると予測されるアミノ酸残基が、同一の側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基と置換される。あるいは、別の実施形態では、飽和突然変異誘発などにより、Ｕｂａ６コード配列の全体または一部にランダムに突然変異を導入することができ、得られたミュータントをＵｂａ６の生物活性についてスクリーニングして、活性を保持している突然変異体を同定することができる。配列番号４または配列番号６の突然変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換え技術によって発現させ、そのタンパク質の活性を測定することができる。
【００９４】
例示的な実施形態においては、Ｕｂａ６突然変異タンパク質は、（１）ユビキチンを活性化する能力；（２）ユビキチン−アデニル酸中間体の形成を媒介する能力；（３）ユビ
キチンのチオールエステル化を媒介する能力；（４）１または複数のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へユビキチンを転移する能力；および／または（５）１または複数の標的ポリペプチド（例えば、ユビキチン、Ｅ２、または標的ポリペプチドおよび／または標的タンパク質など）をユビキチン化する能力についてアッセイを実施することができる。別の例示的な実施形態では、Ｅ２Ｚ突然変異タンパク質が（１）ユビキチンを活性化する能力；（２）ユビキチン−アデニル酸中間体の形成を媒介する能力；（３）ユビキチンのチオールエステル化を媒介する能力；（４）１または複数のユビキチン−タンパク質リガーゼ（例えば、Ｅ３）へユビキチンを転移する能力；および／または（５）１または複数の標的ポリペプチド（例えば、ユビキチン、Ｅ３、または標的ポリペプチドおよび／または標的タンパク質など）をユビキチン化する能力についてアッセイを実施することができる。
【００９５】
前述のＵｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質をコードする核酸分子に加えて、本発明の別の態様は、それらに対してアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸にと相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的、またはｍＲＮＡ配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合することができる。アンチセンス核酸は、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚのコード鎖全体と相補的であっても、またはそれらの一部のみと相補的であってもよい。一実施形態では、アンチセンス核酸分子は、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味する。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、コード領域に隣接し、アミノ酸へ翻訳されない５’配列および３’配列を意味する（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいう）。
【００９６】
本発明の実施形態は、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質の１または複数の生物活性部分を有するアミノ酸配列を提供する。本明細書で用いる「Ｕｂａ６タンパク質の生物活性部分」は、Ｕｂａ６分子と非Ｕｂａ６分子との相互作用に関与するＵｂａ６タンパク質断片を含む。本明細書で用いる「Ｅ２Ｚタンパク質の生物活性部分」は、Ｅ２Ｚ分子と非Ｅ２Ｚ分子との相互作用に関与するＥ２Ｚタンパク質断片を含む。Ｕｂａ６タンパク質の生物活性部分としては、例えば、配列番号５または配列番号７に示すアミノ酸配列などのＵｂａ６タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるか、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられ、それは、完全長Ｕｂａ６タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、Ｕｂａ６タンパク質の活性の少なくとも１つを示す。通常、生物活性部分は、Ｕｂａ６タンパク質の活性の少なくとも１つ（例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１または複数のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へのユビキチン転移；および／または１または複数の標的ポリペプチド（例えば、ユビキチン、Ｅ２、または標的ポリペプチドおよび／または標的タンパク質など）のユビキチン化）を有するドメインまたはモチーフ（例えば、１、２、またはそれ以上のＴｈｉＦドメイン、１つまたは複数の触媒性システインドメイン、１つまたは複数のアデニル化ドメイン、および／または１つまたは複数のＣ末端ユビキチン様（Ｕｂｌ）ドメイン）を含む。Ｕｂａ６タンパク質の生物活性部分は、例えば、１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０５０、１０５２、１０５３、またはそれを超えるアミノ酸長のポリペプチドであってもよい。Ｕｂａ６タンパク質の生物活性部分は、ＵＰＰ活性を調節する薬剤開発の標的として用いることができる。一実施形態では、Ｕｂａ６タンパク質の生物活性部分は、少なくとも１つのＴｈｉＦドメイン、触媒性システインドメイン、アデニル化ドメイン、および／またはＣ末端ユビキチン様ドメインを含む。
【００９７】
当然のことながら、ある実施形態においては、本発明のＵｂａ６タンパク質の生物活性部分は、前述の構造ドメインの少なくとも１個を含んでいてもよい。他の実施形態では、Ｕｂａ６タンパク質の生物活性部分は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの前述の構造ドメインを含んでもよい。さらに、タンパク質の他の領域が欠失したようなその他の生物活性部分は、組換え技術によって作製することができ、未変性Ｕｂａ６タンパク質の機能的活性の１つまたは複数について評価することができる。
【００９８】
例示的な実施形態では、Ｕｂａ６タンパク質は、配列番号５または配列番号７に示すアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、Ｕｂａ６タンパク質は、配列番号５または配列番号７と実質的に相同であって、配列番号５または配列番号７のタンパク質の機能的活性を保持しているが、上記で詳細に説明したような自然対立遺伝子変異または突然変異誘発のためにアミノ酸配列が異なっている。したがって、別の実施形態では、Ｕｂａ６タンパク質は、配列番号５または配列番号７に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００９９】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、最適な比較を行うことを目的として、配列のアラインメントが行われる（例えば、最適なアラインメントのために、第一および第二のアミノ酸配列もしくは核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較の目的のために非相同配列を無視することができる）。例示的な実施形態では、比較用にアラインメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、および少なくとも７０％、８０％、または９０％である（例えば、第二の配列をＵｂａ６アミノ酸配列に対してアラインメントする場合で、それぞれ１０５２アミノ酸残基および１０５３アミノ酸残基を有する場合、少なくとも３１５、少なくとも４２０、少なくとも５２６、少なくとも６３１、および少なくとも７３６、８４１、もしくは９４６のアミノ酸残基がアラインメントされる）。次に、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある位置が、第二の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、これらの分子はその位置において同一である（本明細書で用いるアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同義である）。二つの配列の間の同一性パーセントは、これらの配列によって共有される同一である位置の数の関数であり、二つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さが考慮に入れられる。
【０１００】
二つの配列間の配列比較、および同一性パーセントの決定は、数学的なアルゴリズムを用いて行うことができる。例示的な実施形態では、二つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍより入手可能）に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用いて、ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ：１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。さらに別の例示的な実施形態では、二つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｇｃｇ．ｃｏｍのウェブサイトより入手可能）を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａＣＭＰマトリックス、ならびにｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ：４０、５０、６０、７０、または８０、およびｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。別の実施形態では、二つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込
まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１（１９８９））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ：１２、およびｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ：４を用いて決定される。
【０１０１】
本発明の核酸およびタンパク質配列を「クエリー配列」として用いてさらに公のデータベースで検索を行い、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で行い、本発明のＵｂａ６核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で行い、本発明のＵｂａ６タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較用のギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９（１９９７）に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのウェブサイト）。
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の態様は、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質（もしくはその一部）をコードする核酸を含む、発現ベクターなどのベクターに関する。本明細書で用いる「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、その中に付加的なＤＮＡ断片を連結することができる環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡ断片をウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞内で自律増殖することができる（例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクター、および哺乳類のエピソームベクター）。その他のベクター（例えば、哺乳類の非エピソームベクター）は、宿主細胞へ導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、ホストゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、ベクターに作動的に連結された遺伝子の発現させることができる。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」という。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であることから、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に用いる場合がある。しかし、本発明には、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの同等の機能を果たす他の形態の発現ベクターを含むことを意図している。
【０１０２】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を宿主細胞内での核酸の発現に適した形態で含む。このことは、組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され、発現される核酸配列に作動的に連結された、１つまたは複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動的に連結される」とは、対象であるヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系、またはベクターが宿主細胞中へ導入される場合は宿主細胞において）そのヌクレオチド配列の発現が可能となるように制御配列に連結されることを意味することを意図している。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。そのような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。制御配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でのヌクレオチド配列の恒常的に発現させる配列、および特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列を発現させる配列（例えば、組織特異的制御配列）が挙げられる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因に依存し得ることを、当業者であれば理解するであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中へ導入し、それによって、融合タンパク質もしくはペプチドを含む、本明細書に記載する核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（例えば、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質、変異型のＵｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質、ならびに融合タンパク質など）を産生させることができる。
【０１０３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞中でＵｂａ６が発現されるように設計することができる。例えば、Ｕｂａ６、Ｕｂａ６断片、Ｅ２Ｚ、および／またはＥ２Ｚ断片を、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞、または哺乳類細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、でさらに議論されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳することができる。
【０１０４】
原核細胞中でのポリペプチドの発現は、融合タンパク質もしくは非融合タンパク質を発現させる恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、大腸菌内で行われることが最も多い。融合ベクターは、コードされるポリペプチドへ、通常はその組換えポリペプチドのアミノ末端へ、多くのアミノ酸を付加している。通常、そのような融合ベクターは、１）組換えポリペプチドの発現を増加させる、２）組換えポリペプチドの溶解度を増大させる、および３）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することによって、組換えポリペプチドの精製を補助する、という三つの目的を果たす。多くの場合、融合発現ベクターには、融合部分と組換えポリペプチドとの接続部にタンパク質切断部位が導入されて、融合ポリペプチドの精製に続いて、融合部分から組換えポリペプチドを分離することが可能となる。そのような酵素、およびその同族認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０（１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州、べバリー）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを標的組換えタンパク質と融合する。
【０１０５】
適切な誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ他、Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５（１９８８））、およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ６０−８９  （１９９０））が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現したウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）を介して行われる、Ｔ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にてＴ７ｇｎ１遺伝子を内部に有する常在性のプロファージから供給される。
【０１０６】
大腸菌中での組換えタンパク質の発現を最大化する１つの手法は、組換えタンパク質のタンパク質分解による切断能力が損なわれた宿主細菌内でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １１９−１２８（１９９０））。別の手法は、発現ベクター中へ挿入される核酸の核酸配列を変化させて、各アミノ酸に対する個々のコドンを大腸菌内で優先的に用いられるものとすることである（Ｗａｄａ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１（１９９２））。本発明のそのような核酸配列の変化は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
【０１０７】
別の実施形態では、Ｕｂａ６発現ベクターは、酵母発現ベクターである。出芽酵母内での発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ他、Ｅｍｂｏ  Ｊ．６：２２９（１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｃｅｌｌ  ３０：９３３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ他、Ｇｅｎｅ
５４：１１３（１９８７））、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、サンディエゴ）、およびｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、サンディエゴ）が含まれる。
【０１０８】
あるいは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、Ｕｂａ６ポリペプチドおよび／またはＥ２Ｚポリペプチドを昆虫細胞内で発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）内でのタンパク質の発現に使用可能であるバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６（１９８３））、およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１（１９８９））が挙げられる。
【０１０９】
さらに別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて、哺乳類細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０（１９８７））、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７（１９８７））が含まれる。哺乳類細胞内で用いる場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス制御因子によってもたらされる。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウィスル、およびサルウイルス４０に由来している。原核細胞および真核細胞の両方に適したその他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ，ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９の第１６章および第１７章を参照されたい。
【０１１０】
別の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定のタイプの細胞内で優先的に核酸を発現させることができる（例えば、組織特異的制御エレメントを用いて核酸を発現させる）。組織特異的制御エレメントは、当該技術分野で周知である。適切な組織特異的プロモーターの限定されない例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８（１９８７））、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５（１９８８））、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９（１９８９））および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ他、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３）；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｃｅｌｌ  ３３：７４１（１９８３））、ニューロン特異的プロモーター（例えば
、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：５４７３（１９８９）  ）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２（１９８５））、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、牛乳乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号、および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が含まれる。発生的に制御されたプロモーターも含まれ、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ
Ｇｒｕｓｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４  （１９９０））、およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７（１９８９））が含まれる。
【０１１１】
一実施形態では、本発明は、Ｕｂａ６核酸分子に対してアンチセンスである核酸分子を提供する。本明細書で用いる「アンチセンス」という用語は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの機能に干渉し、そのＲＮＡおよび／またはＤＮＡの発現を抑制し得る核酸を意味する。アンチセンス核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に対して相補的である。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合することができる。アンチセンス核酸は、Ｕｂａ６コード鎖全体に対して相補的であってもよく、またはその一部のみに対して相補的であってもよい。
【０１１２】
アンチセンス核酸分子を細胞へ送達して、内在性ヌクレオチド配列の発現を阻害、除去、増強、もしくは変化させるために外来性ヌクレオチド配列を発現させることができ、または天然にはその細胞と関連していない特定の生理的特性を発現させることができる。ある実施形態においては、アンチセンス核酸は、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖干渉ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）、短鎖干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）、またはリボザイムである。
【０１１３】
本明細書で用いる「ｓｉＲＮＡ」という用語は、長さが例えば２１〜２５塩基など、３０塩基未満である二本鎖ＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡは、当該技術分野で周知のいずれの方法で作製してもよい。ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡ干渉の総説については、Ｍａｃｒａｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１：１９５（２００６）；Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ他、ＲＮＡ  １１：６７４（２００５）；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ、Ｃｅｌｌ  １６：４１５（２００１）；Ｆｉｒｅ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６（１９９８）を参照されたい。一実施形態では、デオキシヌクレオチドの３’オーバーハングを有する、一本鎖の、遺伝子特異的センスおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマーを作製し、精製する。例えば、２本のオリゴマーを９４℃で２分間加熱し、９０℃で１分間冷却し、次に、１分あたり１℃の割合で２０℃まで冷却してアニールすることができる。次に、このｓｉＲＮＡを、動物へ注入するか、または、本明細書に記載する核酸送達の方法を用いて所望のタイプの細胞へ送達することができる。
【０１１４】
本発明の別の態様は、宿主細胞のゲノムの特定の位置へ相同的に組換え可能な配列を含む本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」、および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において交換可能に用いられる。これらの用語は、特定の対象細胞だけを意味するだけでなく、そのような細胞の子孫、または潜在的な子孫も意味することは理解されよう。突然変異または環境的な影響のために、後続の世代においてある種の変異が発生する可能性があるため、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でない場合があるが、それでも、本明細書で用いるこの用語の範囲内に含まれる。
【０１１５】
宿主細胞は、いずれの原核細胞であっても、または真核細胞であってもよい。例えば、宿主細胞は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ細胞）、酵母、ゼノパス細胞、ゼブラフィッシュ細胞、または哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、またはヒト胎児細胞（２９
３Ｔ）など）であってもよい。その他の適切な宿主細胞は、当業者に周知である。
【０１１６】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって、原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、外来性核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞へ導入するための当該技術分野において認められている種々の技術を意味し、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ，ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８９）、およびその他の実験用マニュアルを参考されたい。
【０１１７】
哺乳類細胞を安定にトランスフェクトする場合、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術にもよるが、極僅かの細胞のみが外来性ＤＮＡをそのゲノムに組み込みことができることが知られている。このような組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）を同定し、選別するためには、一般に、選別可能なマーカー（例えば、抗生物質への耐性）をコードする遺伝子を、対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。選別可能マーカーの例には、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが含まれる。選別可能マーカーをコードする核酸は、検出可能な翻訳産物をコードするベクターと同じベクターによって宿主細胞へ導入してもよく、または別のベクターによって導入してもよい。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択によって同定することができる（例えば、選別可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞が生存し、その他の細胞は死滅する）。
【０１１８】
例えば培養下の原核宿主細胞または真核宿主細胞など、本発明の宿主細胞を用いて、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質、またはその一部を産生（すなわち、発現）することができる。したがって、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いて、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質、またはその一部を産生する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、本発明の（検出可能な翻訳産物をコードする組換え発現ベクターが導入された）宿主細胞を適切な培地中で培養して、検出可能な翻訳産物を産生することを含む。別の実施形態では、この方法は、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質、またはその一部を、培地または宿主細胞から単離することをさらに含む。
【０１１９】
本発明の宿主細胞を用いて、非ヒトトランスジェニック動物を産生することもできる。例えば、一実施形態では、本発明の宿主細胞は、Ｕｂａ６をコードする配列が導入された受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次に、このような宿主細胞を用いて、外来性Ｕｂａ６配列がそのゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物を作出することができる。本明細書で用いる「トランスジェニック動物」とは、哺乳類（例えば、ラットまたはマウスなどのげっ歯類）などの非ヒト動物であって、その動物の１つまたは複数の細胞が導入遺伝子を含んでいる。トランスジェニック動物のその他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが含まれる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物を発生させるもととなる細胞のゲノム中に組み込まれ、成熟動物のゲノム中に残っている外来性ＤＮＡであり、トランスジェニック動物の１または複数のタイプの細胞または組織中で、コードされた遺伝子産物を発現させるものである。本明細書で用いる「相同組換え動物」とは、哺乳類など（例えば、マウス）の非ヒト動物であって、内在性遺伝子と、発生前にその動物の細胞内（例えばその動物の胚性細胞など）へ導入された外来性ＤＮＡ分子との間での相同組換えにより、内在性遺伝子が変化した動物のことである
。
【０１２０】
胚操作およびマイクロインジェクションによってトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作出する方法は、当該技術分野において通常の方法となっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、Ｗａｇｎｅｒらによる米国特許第４，８７３，１９１号、Ｈｏｇａｎ，Ｂ．、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）、ならびにＷｉｌｍｕｔ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０（１９９７）に記載されている。類似の方法が、その他のトランスジェニック動物の作出に用いられる。導入遺伝子の制御された発現を可能とする選択系を含むトランスジェニック非ヒト動物の作出方法が、Ｌａｋｓｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：６２３２（１９９２）；およびＯ’Ｇｏｒｍａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１（１９９１）に記載されている。
診断アッセイ
生物試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を検出する方法の例には、試験対象から生物試料を採取すること、およびその生物試料を、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性（例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１または複数のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へのユビキチン転移；１または複数のユビキチン−タンパク質リガーゼ（例えば、Ｅ３）へのユビキチン転移；および／または１または複数の標的ポリペプチドのユビキチン化）を検出することができる化合物もしくは薬剤と接触させることが含まれる。
【０１２１】
ある態様においては、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性（例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１または複数のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へのユビキチン転移；１または複数のユビキチン−タンパク質リガーゼ（例えば、Ｅ３）へのユビキチン転移；および／または１または複数の標的ポリペプチドのユビキチン化）を検出する薬剤は、Ｕｂａ６、ユビキチン、および／または抗体などの標的ポリペプチドもしくは標的タンパク質と結合することができる抗体である。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。完全な（ｉｎｔａｃｔ）抗体、またはその断片（例えば、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）2）を用いることができる。プローブまたは抗
体に関する「標識された」という用語は、検出可能である物質をプローブまたは抗体にカップリング（すなわち、物理的結合）によりプローブまたは抗体を直接標識すること、および直接標識された別の試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接標識することを含むことを意図している。間接標識の例には、蛍光標識した二次抗体を用いて一次抗体を検出すること、および蛍光標識したストレプトアビジンにより検出可能となるよう、ＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが含まれる。
【０１２２】
「生物試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、および生体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および体液を含むことを意図している。すなわち、本発明の検出方法を用いて、生物試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性をインビトロ、ならびにインビボで検出することができる。例えば、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚをインビトロで検出する技術としては、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、および免疫蛍光法が挙げられる。さらに、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性をインビボで検出する技術としては、標識抗Ｕｂａ６および／または抗Ｅ２Ｚ抗体、標識抗ユビキチン抗体、標識抗Ｅ２抗体、標識抗Ｅ３抗体、または標識抗標
的タンパク質などを対象へ導入する方法が挙げられる。例えば、標準的なイメージング技術によって対象中のその存在および位置を検出することができる放射性マーカーで抗体を標識することができる。
【０１２３】
一実施形態では、生物試料は、試験対象由来のタンパク質分子を含む。ある態様においては、生物試料は、対象から従来の手段によって単離された血清試料である。
【０１２４】
別の実施形態では、この方法は、コントロールの対象からコントロールの生物試料を得ること、そのコントロール試料を、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を検出することができる化合物もしくは薬剤と接触させ、その生物試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の存在を検出すること、ならびにコントロール試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６活性の存在を、試験試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の存在と比較することをさらに含む。
【０１２５】
本発明は、さらに、生物試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の存在を検出するためのキットも含む。例えば、このキットは、生物試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を検出することができる標識された化合物もしくは薬剤；試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の量を測定する手段；ならびに、試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の量を標準試料と比較する手段を含むことができる。この化合物または薬剤は、適切な容器内に収容することができる。このキットは、さらに、このキットを用いてＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を検出するための説明書を含むことができる。
予後アッセイ
さらに、本明細書に記載する診断の方法を用いて、Ｕｂａ６の発現もしくは活性の異常に伴う疾患もしくは障害（例えば、癌）を有するか、またはそれを発症するリスクを有する対象を同定することができる。例えば、前述の診断アッセイ、または以下に示すアッセイなどの本明細書に記載するアッセイを用いて、癌などのユビキチン関連障害、炎症性障害、および神経変性障害など、Ｕｂａ６の発現および／または活性の誤制御を伴う障害を有するか、またはそれを発症するリスクを有する対象を同定することができる。
【０１２６】
したがって、本発明は、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現または活性の異常を伴う疾患または障害を同定する方法を提供する。この方法では、対象から試験試料を採取し、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、および／またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を検出する。ここで、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、および／またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の存在が、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、および／またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の異常に伴う疾患もしくは障害を有するか、またはそれらを発症するリスクを有する対象の兆候となる。本明細書で用いる「試験試料」とは、対象から採取された生物試料を意味する。例えば、試験試料は、体液（例えば、血清）、細胞試料、または組織であってよい。
【０１２７】
さらに、本明細書に記載する予後アッセイを用いることで、対象に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣剤、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、またはその他の薬物候補）を投与して、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現または活性の異常に伴う疾患または障害を治療することが可能かどうかを判断することができる。例えば、そのような方法を用いて、癌に対する薬剤で、対象を効果的に治療できるかどうかを判
断することができる。したがって、本発明は、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現または活性の異常を伴う障害に対する薬剤で、対象を効果的に治療できるかどうかを判断するための方法を提供する。この方法では、試験試料を採取し、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、および／またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を検出する。
【０１２８】
本発明の方法を用いて、Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子の遺伝的変化を検出することもでき、それによって、変化した遺伝子を有する対象が、癌などのＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の誤制御を特徴とする障害に対するリスクを有するかどうかが判断される。ある実施形態においては、この方法には、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える変化；Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子の異所性発現；または、Ｕｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質の異常活性、のうちの少なくとも１つを特徴とする遺伝的変化の有無を、対象由来の細胞試料中で検出することが含まれる。例えば、そのような遺伝的変化は、１）Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子からの１つまたは複数のヌクレオチドの欠失；２）Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子への１つまたは複数のヌクレオチドの付加；３）Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、４）Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子の染色体再構築；５）Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルの変化；６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの改変など、Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子の異常な修飾；７）Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型スプライシングパターンの存在；８）非野生型レベルのＵｂａ６タンパク質および／またはＥ２Ｚタンパク質；９）Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子の対立遺伝子欠失；ならびに１０）Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの不適切な活性、のうちの少なくとも１つの存在を確認することによって検出することができる。本明細書に記載するように、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚ遺伝子の変化を検出するために用いることができる当該技術分野で周知の数多くのアッセイが存在する。
【０１２９】
ある実施形態においては、この変化の検出には、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ  ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）における（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号を参照）、またはライゲーション連鎖反応法（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７（１９８８）；およびＮａｋａｚａｗａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０（１９９４）を参照）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は、Ｕｂａ６遺伝子の点突然変異の検出に特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５（１９９５）を参照）。この方法は、対象から細胞試料を採取する工程、試料の細胞から核酸（例えば、ゲノム核酸、ｍＲＮＡ、またはその両方）を単離する工程、Ｕｂａ６遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生ずるような条件下にて、核酸試料を、Ｕｂａ６遺伝子へ特異的にハイブリダイズする１または複数のプライマーと接触させる工程、ならびに増幅産物の有無を検出するか、もしくは増幅産物のサイズを検出してその長さをコントロール試料と比較する工程を含むことができる。本明細書に記載する突然変異の検出に用いられる技術のいずれかと組み合わせて、ＰＣＲおよび／またはＬＣＲを予備的な増幅工程として用いることが望ましい場合があることが予想される。
【０１３０】
別の増幅法としては：自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４（１９９０））、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３（１９８９））、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７（１９８８））、またはその他のいずれかの核酸増幅法が挙げられ、それに続
いて、当業者に周知の技術を用いて増幅された分子を検出する。このような検出スキームは、核酸分子の検出において、そのような分子の存在数が非常に少ない場合に特に有用である。
【０１３１】
別の実施形態において、試料細胞由来のＵｂａ６遺伝子の突然変異は、制限酵素の切断パターンの変化によって同定することができる。例えば、試料ＤＮＡおよびコントロールＤＮＡを単離し、（任意に）増幅し、１または複数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片長さサイズをゲル電気泳動で決定して比較する。試料ＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間の断片長さサイズの違いは、試料ＤＮＡに変異が存在することを示している。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照）を用いて、リボザイム切断部位で発生または欠失した特定の変異の存在を評価することができる。
【０１３２】
他の実施形態では、Ｕｂａ６の遺伝子突然変異を、例えばＤＮＡまたはＲＮＡなどの試料核酸およびコントロール核酸を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．他、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４（１９９６）；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３（１９９６））。例えば、Ｕｂａ６の遺伝子突然変異は、前述のＣｒｏｎｉｎ他に記載のように、光で生成したＤＮＡプローブ（ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ）を含む二次元アレイ中で同定することができる。簡単に述べると、プローブの第一のハイブリダイゼーションアレイを用いて試料およびコントロール中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、配列重複プローブの直線状アレイを作製することにより、これらの配列間の塩基変化を同定することができる。この工程により、点突然変異を同定することが可能となる。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、ここでは、検出されたすべての変異または突然変異に相補的な、より小さな特定化プローブアレイを用いることで、特定の突然変異の特性決定が可能となる。各突然変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、もう一つは突然変異遺伝子に相補的である並列プローブセットから成る。
【０１３３】
さらに別の実施形態では、当該技術分野で周知の様々な配列決定反応のいずれも、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚ遺伝子の直接に配列決定すること、および試料Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの配列を対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって変異を検出することに用いることができる。配列決定反応の例には、Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０（１９７７））、またはＳａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３（１９７７））によって開発された技術に基づくものが含まれる。診断アッセイを行う場合は、質量分析による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開第９４／１６１０１号；Ｃｏｈｅｎ他、（１９９６）  Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎ他、（１９９３）  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７を参照）を含む、様々な自動配列決定方法のいずれも用いることができることが予測される（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８（１９９５））。
【０１３４】
Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子中の突然変異を検出するその他の方法としては、切断剤からの保護を利用して、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２（１９８５））。一般的に、当該技術分野の技術「ミスマッチ切断」では、最初に、野生型Ｕｂａ６配列および／または野生型Ｅ２Ｚ配列を含む（標識）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料から得られた突然変異の可能性のあるＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二本鎖を用意する。この二重鎖である二本鎖を、コントロール鎖および試料鎖の間の塩基対ミスマッチなどによって存在するこ
とになるような、二本鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖はＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド鎖はＳ１ヌクレアーゼで処理し、ミスマッチ領域を酵素で消化する。他の実施形態では、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかを、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理し、ピペリジンで処理してミスマッチ領域を消化する場合がある。ミスマッチ領域の消化後、次に、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲルにてサイズによって分離し、突然変異部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６（１９９２）を参照されたい。例示的な実施形態では、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識することができる。
【０１３５】
さらに別の実施形態において、ミスマッチ切断反応には、細胞試料から得られたＵｂａ６および／またはＥ２ＺのｃＤＮＡにおける点突然変異を検出し、マッピングするために、定義された系において二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１または複数のタンパク質（いわゆる、「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）が用いられる。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチのＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチのＴを切断する（Ｈｓｕ他、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７（１９９４））。例示的な実施形態によると、例えば、野生型Ｕｂａ６配列および／または野生型Ｅ２Ｚ配列などのＵｂａ６配列および／またはＥ２Ｚ配列に基づくプローブを、試験細胞由来のｃＤＮＡまたはその他のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。その二本鎖を、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、その切断産物を、存在する場合は、電気泳動プロトコルなどによって検出することができる。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照されたい。
【０１３６】
その他の実施形態では、電気泳動における移動度の変化を用いて、Ｕｂａ６遺伝子および／またはＥ２Ｚ遺伝子中の変異が同定されることがある。例えば、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ）を用いて、変異型核酸と野生型核酸との間の電気泳動における移動度の違いを検出することができる（Ｏｒｉｔａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９）：２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５  （１９９３）；および、Ｈａｙａｓｈｉ、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３  （１９９２）を参照されたい）。試料およびコントロールのＵｂａ６核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は、変性され、復元される。一本鎖核酸の二次構造は配列により異なっており、その結果生じる電気泳動における移動度の変化よって、１塩基の変化でさえも検出することができる。ＤＮＡ断片は、標識されていてもよく、または標識されたプローブで検出してもよい。アッセイの感度は、二次構造が配列の変化に対してより感受性の高い、ＲＮＡを用いることによって（ＤＮＡを使用するよりも）向上させることができる。例示的な実施形態においては、対象となる方法はヘテロ二本鎖分析を用いて、電気泳動における移動度の変化に基づいて二重鎖のヘテロ二本鎖分子を分離する（Ｋｅｅｎ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５（１９９１））。
【０１３７】
さらに別の実施形態では、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５（１９８５））を用いて、変性剤の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲル中での変異型断片または野生型断片の移動を分析する。分析方法としてＤＧＧＥを用いる場合は、例えば、約４０ｂｐの高融点のＧＣリッチＤＮＡから成るＧＣクランプをＰＣＲによって付加することによって、ＤＮＡが完全に変性することがないよう、ＤＮＡを修飾することがある。さらなる実施形態では、変性剤の濃度勾配の代わりに温度勾配を用いて、コントロールＤＮＡおよび試料ＤＮＡの移動度の違いを同定する（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｓｎｅｒ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３（１９８７））。
【０１３８】
点突然変異を検出するその他の技術の例には、これらに限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が含まれる。例えば、既知の突然変異を中心に配置したオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、次に、完全に一致する場合にのみハイブリダイズすることができる条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズさせることができる（Ｓａｉｋｉ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３２４（１９８６）：１６３；Ｓａｉｋｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０（１９８９））。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションメンブランに結合させ、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズさせる場合、ＰＣＲで増幅した標的ＤＮＡ、または多くの種々の変異型とハイブリダイズする。
【０１３９】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を、本発明と組み合わせて用いることができる。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、対象となる突然変異を、その分子の中心に有し（したがって、増幅はディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７（１９８９））、または、適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を防止または減少させることができる場合は、１つのプライマーの３’最末端に有することができる（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ、Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８（１９９３））。さらに、この突然変異領域中に新規な制限部位を導入して、切断に基づく検出を可能とすることが望ましい場合がある（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１（１９９２））。ある実施形態においては、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて増幅を実施する場合があることが予想される（Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１８９（１９９１））。この場合は、５’配列の３’末端において完全一致する場合にのみライゲーションが起こり、それにより、増幅の有無を調べることによって特定の部位での既知の突然変異の存在を検出することが可能となる。
【０１４０】
本明細書に記載する方法は、例えば、本明細書に記載する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージされた診断キットを用いることによって実施してもよく、例えば臨床の場で便利に用いて、Ｕｂａ６遺伝子が関与する疾患もしくは疾病の症状を示すか、またはそれらの家族歴がある患者の診断を行うことができる。さらに、本明細書に記載する予後アッセイには、Ｕｂａ６が発現するいずれのタイプの細胞または組織も用いることができる。
臨床試験中の効果のモニタリング
Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現、または１または複数の活性（例えば、ユビキチン活性化；ユビキチン−アデニル酸中間体の形成；ユビキチンのチオールエステル化；１または複数のユビキチン結合酵素（例えば、Ｅ２）へのユビキチン転移；１または複数のユビキチン−タンパク質リガーゼ（例えば、Ｅ３）へのビキチン転移；および／または１または複数の標的ポリペプチド（例えば、ユビキチン、Ｅ２、Ｅ３、または標的ポリペプチドおよび／または標的タンパク質など）のユビキチン化）に対する薬剤（例えば、薬物）の影響のモニタリングは、基本的な薬物スクリーニングにおいてだけでなく、臨床試験においても適用することができる。例えば、本明細書に記載するスクリーニングアッセイによって決定された薬剤が、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの遺伝子発現またはタンパク質レベルを上昇させる、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を上方制御する効果は、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの遺伝子発現、タンパク質レベルの低下、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の下方制御を示す対象の臨床試験においてモニターすることができる。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定された、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの遺伝子発現またはタンパク質レベルを低下させる、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性を下方制御するという薬剤の効果は、Ｕｂａ６および／またはＥ
２Ｚの遺伝子発現、タンパク質レベルの上昇、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性の上方制御を示す対象の臨床試験においてモニタリングすることができる。
【０１４１】
例示的な実施形態では、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣剤、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、もしくは本明細書に記載するスクリーニングアッセイによって同定されたその他の薬物候補）による対象の治療の効果をモニタリングする方法を提供し、その方法には、（ｉ）その薬剤の投与前に、対象から投与前試料を採取する工程；（ｉｉ）投与前試料中の、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベル、または、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）対象から１または複数の投与後試料を採取する工程；（ｉｖ）投与後試料中の、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルもしくは活性レベル、または、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性レベルを検出する工程；（ｖ）投与前試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルもしくは活性レベル、または、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性レベルを、１または複数の投与後試料中のＵｂａ６および／またはＥ２Ｚのタンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡ、またはＵｂａ６および／またはＥ２Ｚの活性と比較する工程；ならびに（ｖｉ）それに応じて対象への薬剤の投与量を変更する工程を含む。例えば、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現または活性を検出されたものよりも高いレベルに上昇させるため、すなわち、薬剤の効果を高めるためには、薬剤の投与量を増加させることが望ましい場合がある。あるいは、Ｕｂａ６の発現または活性を検出されたものよりも低いレベルに低下させるために、すなわち、薬剤の効果を下げるためには、薬剤の投与量を減少させることが望ましい場合がある。このような実施形態によると、Ｕｂａ６および／またはＥ２Ｚの発現または活性を、観測可能な表現型の応答がない場合でも、薬剤の効果の指標として用いることができる。
【０１４２】
本発明を、以下の例でさらに説明するが、これらは、限定するものとして解釈されるべきではない。本願に引用されるすべての参考文献、特許、および特許出願公開公報の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【０１４３】
実施例１
新規な脊椎動物Ｅ１タンパク質Ｕｂａ６は、インビトロでユビキチンの活性化を促進する
ユビキチンに対するＥ１は、細菌の古代の代謝酵素に見られる、タンパク質フォールドドメイン、ＴｈｉＦドメインを含むタンパク質ファミリーのメンバーである（Ｌａｋｅ他、Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：３２５（２００１））。このドメインを用いて関連するタンパク質をバイオインフォマティックスにより同定し、ユビキチンに対する標準Ｅ１活性化酵素（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＦＬＪ１０８０８）であるＵｂｅ１と類似性した、これまでは未同定であったタンパク質、Ｕｂａ６が同定された。Ｕｂａ６オルソログは、マウス、ラット、およびゼブラフィッシュ（Ｄｒ）に存在するが、脊椎動物でない後生動物、または酵母中には存在しない（図１Ａ）。系統学的には、Ｕｂａ６は、Ｕｂｅ１ＬよりもＵｂｅ１と関連性が低かった（図１Ｇ）。
【０１４４】
組換えＵｂａ６（昆虫細胞中で発現し、そこから精製、図１Ｂ）が、いくつかのユビキチン様タンパク質、およびユビキチン自体を活性化する能力について調べた。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析でのＵｂａ６〜Ｕｂチオールエステルの出現による測定によると、驚くべきことに、Ｕｂａ６はユビキチンを活性化することはできるが、試験したそれ以外のユビキチン様タンパク質はいずれも活性化できないことが分かった（図１Ｃ、レーン４）。予想通り、Ｕｂａ６〜Ｕｂの形成は、ＤＴＴの添加によって逆転させることができ、このことは、チオールエステルの存在を示唆している（図１Ｄ、レーン５および６）。Ｕｂａ
６よりもＵｂｅ１と関連性の高いＵｂｅ１Ｌ（図１Ａ）は、ユビキチンを活性化できなかったが、Ｕｂｅ１Ｌの既知の標的であるＩＳＧ１５を活性化できたため（図１Ｅ）、Ｕｂａ６のユビキチン活性を促進する能力は特異的であると考えられた。合わせて考えると、これらのデータは、Ｕｂａ６はユビキチンのチャージング（ｃｈａｒｇｉｎｇ；負荷）を促進できるが、その他の数多くのユビキチン様タンパク質のチャージングは促進できないということを示唆している。
【０１４５】
ユビキチン活性化酵素としてのＵｂａ６の同定は予想外であったので、この結論を確認するために以下に説明するいくつかの実験を行った。まず、Ｕｂｅ１の精製に使用するＨｅｒｓｈｋｏ（Ｈｅｒｓｈｋｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８２０６（１９８３））の古典的手法により、Ｕｂａ６も同様に精製することができるかどうかを調べた。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６を安定に発現する２９３Ｔ細胞から抽出物を作製し、ＡＴＰ存在下で、ユビキチン−アガロースと共にインキュベートした。続いて、ＤＴＴを含有しないバッファーでビーズを洗浄し、次に、Ｅ１とユビキチンもしくはユビキチン様タンパク質との間のチオールエステルを逆転させる、ＤＴＴを含有するバッファーでタンパク質を溶離した。次に、ロード、フロースルー、洗浄液、および溶離液、ならびにユビキチン−アガロースビーズに結合したままのタンパク質を用いてイムノブロッティングを行い、抗Ｕｂｅ１でＵｂｅ１を、抗ＨＡでＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６を検出した。Ｕｂａ６の溶離パターンは、Ｕｂｅ１の溶離パターンと非常に類似していた（図１Ｆ）。特に、Ｕｂａ６は、ＤＴＴによる処理で特異的に溶離された。これらのデータは、Ｕｂａ６が、Ｕｂｅ１と同様に、チオール依存的な様式でユビキチンと化学的に架橋できることを示唆している。
実施例２
インビボでユビキチンに結合したＵｂａ６の同定
インビボでのＵｂａ６とユビキチンとの結合を実証するために、３種類の形態のＵｂａ６：１）Ｎ末端Ｆｌａｇ−ＨＡタグを有する野生型タンパク質；２）触媒性システインがアラニンに変異し、Ｎ末端にＦｌａｇ−ＨＡが融合された、Ｃ６２５Ａ変異体；および３）触媒性システインがセリンに変異し、Ｎ末端にＦｌａｇ−ＨＡが融合された、Ｃ６２５Ｓ変異体を安定に発現する細胞株を作製した。活性部位のシステインをアラニンで置換することによって、タンパク質のユビキチン活性化を促進する能力が不活性化されると予想された。対照的に、システインのセリンへの変異体は、システインで形成されるチオールエステルよりも安定であるエステル結合ユビキチンまたはエステル結合ユビキチン様タンパク質の形成をサポートすると予想された。確かに、過去の研究（Ｋｏｍａｔｓｕ他、Ｅｍｂｏ  Ｊ．２３：１９７７（２００４））では、特定の場合では、チオールエステル結合よりもエステル結合の方がより安定な抱合体を形成することが可能であることが実証されている。
【０１４６】
還元剤の非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析においては、３種類のタンパク質はすべて同等のレベルで発現した（図２Ａ）。抗ＨＡ抗体によるイムノブロッティング、およびポンソー染料を用いたメンブランの染色の両方で観測されたように、野生型タンパク質およびＣ６２５Ａミュータントが同一の位置に移動したのに対し、Ｃ６２５Ｓミュータントタンパク質の大部分はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる移動度の低下を示した（図２Ａ）。これらのデータは、Ｕｂａ６が、ミュータントタンパク質のＳ６２５を介して、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質と安定なエステルを形成することを示唆している。Ｕｂａ６の移動度の遅い形態が、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質Ｎｅｄｄ８を有しているかどうかを調べるために、抗ユビキチン抗体または抗Ｎｅｄｄ８抗体を用いて、イムノブロット法を行った（図２Ａ）。Ｃ６２５をセリンで置換した場合、ユビキチンはＵｂａ６の移動度の遅い形態において検出されたが、野生型タンパク質またはＣ６２５Ａ変異タンパク質のいずれにもユビキチンは見いだされなかった。このことは、より移動度の遅
い形態のＵｂａ６C625Sタンパク質がユビキチンを含むことを示唆している。一方、ポジ
ティブコントロールとして用いたＳＣＦ複合体中でははっきりと検出されたが、Ｎｅｄｄ８は検出されなかった（図２Ａ）。
【０１４７】
次に、Ｕｂａ６C625Sがユビキチンと結合していることについてのさらなる確認を求め
た。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sの調製用試料を、ＣＭＶプロモーターの支配下でＦ
ｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sを安定に発現する２９３Ｔ細胞から精製した。単離された
タンパク質のおよそ３０％が、そのユビキチン様タンパク質による修飾物と一致する位置で移動することが分かった（図３Ｃ）。より移動度の遅いタンパク質の質量分析により、ユビキチン由来の３種類のペプチドが同定された（図３Ｃ）。このことは、Ｕｂａ６C625Sがユビキチンと抱合していることと一致する。一方、より移動度の速い形態のタンパク
質は、ユビキチンのペプチドを欠いていた。Ｕｂａ６C625Sのいずれの形態も、その他の
いずれのユビキチン様タンパク質のペプチドも含んでおらず、このことは、このような条件下ではＵｂａ６がその他のユビキチン様タンパク質を活性化することができないことを示唆している。
【０１４８】
これらの結果に対する過剰発現のいずれの影響をも排除するために、Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６、Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625A、およびＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６C625Sを、ＰＧＫプロモーターにより誘導したレンチウイルスベクターから内在レベルに近いレベルで発現させた。ここでも、Ｃ６２５Ｓミュータントが、ユビキチン化と一致するより移動度の遅いタンパク質を発現したが、ＷＴまたはＣ６２５Ａタンパク質は発現しなかった（図２Ｂ）。合わせて考えると、これらのデータは、Ｕｂａ６が、組織培養細胞中でユビキチンを活性化する機能を有することを示唆している。
実施例３
Ｕｂａ６は、Ｕｂｅ１とは異なる特異性でユビキチンのＥ２への転移を促進する
Ｕｂｅ１は、その活性部位システイン残基からＥ２ユビキチン結合酵素の活性部位システインへのユビキチンの転移を促進する。Ｅ２の一部はＵｂｅ１によって活性化されることが分かっているが、少数のＥ２は、ユビキチン様タンパク質への転移に特異的である（Ｅ２Ｍ／Ｕｂｃ１２はＮｅｄｄ８によってチャージされ、Ｅ２Ｉ／Ｕｂｃ９はＳＵＭＯによってチャージされ、Ｅ２Ｌ／Ｕｂｃ８はＩＳＧ１５によってチャージされる）。Ｕｂａ６が、１種または複数種のＥ２へユビキチンを転移する能力を有するかどうかを決定するために、ヒトゲノムに存在する２４種類を超えるＥ２をクローン化し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、インビトロでのチャージングアッセイ（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を実施した。このアッセイでは、チャージされたＥ２は、チャージされていないＥ２よりも移動度が遅かった。チャージングアッセイの例を図３Ａに示し、すべてのＥ２実験のデータを図３Ｂにまとめる。これらのＥ２に対するＵｂｅ１およびＵｂａ６の特異性は異なることが発見された。予想通り、Ｕｂｅ１およびＵｂａ６のいずれも、Ｅ２Ｍ、Ｅ２Ｍ３、ＨＳＰＣ、Ｅ２Ｌ６、Ｅ２Ｕ、またはＥ２Ｉのチャージングを促進しなかった。Ｕｂｅ１は、Ｅ２Ｊ１、Ｅ２Ｊ２、Ｅ２Ｋ、Ｅ２Ｑ２、Ｅ２Ｒ１／Ｃｄｃ３４、Ｅ２Ｒ２／Ｃｄｃ３４Ｂ、およびＥ２Ｗのチャージングを選択的に促進し、一方、Ｕｂｅ１およびＵｂａ６の両方が、Ｅ２Ｃ、Ｅ２Ｄ１、Ｅ２Ｄ２、Ｅ２Ｄ３、Ｅ２Ｄ４、Ｅ２Ｅ１、Ｅ２Ｇ、Ｅ２Ｓ、およびＥ２Ｔのチャージングを様々な程度に促進した。興味深いことに、Ｕｂｅ１ではなくＵｂａ６が、機能が未知でありこれまで性質が不明であったＥ２Ｚのチャージングを促進した。理論に束縛されるものではないが、これらのデータは、Ｕｂｅ１およびＵｂａ６が、これらがチャージングするＥ２に関して異なる基質特異性を有し、したがって、異なる経路で機能する可能性があることを示唆している。理論に束縛されるものではないが、Ｕｂａ６は、非標準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｅ２（すなわち、既知のＥ２との配列の関連性から同定することができないＥ２）と共に機能する可能性がある。そのようなタンパク質は、当該技術分野で周知の方法を用いて容易に同定されるであろう。
実施例４
Ｕｂｅ１およびＵｂａ６のＵｂｌドメインは基質特異性を制御する
Ｎｅｄｄ８に対するＥ１のサブユニットであるＵｂａ３についての過去の研究により、そのＣ末端ユビキチンフォールドが、特異的Ｅ２であるＵｂｃ１２の認識に関与していることが明らかとなっている（Ｈｕａｎｇ他、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：９２７（２００４））。Ｕｂｅ１およびＵｂａ６のＴｈｉＦドメインおよび触媒性ドメインは４３％の同一性を有するが、Ｃ末端ユビキチン様ドメインは、より関連性が低い（約３３％の同一性）（図４Ａ、Ｂ）。一方、Ｕｂａ６のＵｂｌドメインは、ゼブラフィッシュからヒトのＵｂａ６タンパク質において非常に保存度が高く（約７５％）（図１Ｇ）、このことは、Ｕｂａ６のＣ末端Ｕｂｌドメイン内の配列を維持するための選択圧の存在を示唆している。Ｕｂａ１に対するＵｂａ６の基質選択性がそのＵｂｌドメインを反映している可能性を調べるために、Ｕｂｌドメインの交換実験を行った（図４Ｃ）。Ｕｂｅ１のＵｂｌドメインを、Ｕｂａ６由来のＵｂｌドメインで置換し、またその逆も行った。Ｕｂｅ１はＣｄｃ３４／Ｅ２Ｒ１を活性化することができたのに対し、Ｕｂａ６は、この活性を欠いていた。しかし、Ｕｂｅ１のＵｂｌドメインを持つＵｂａ６は、Ｃｄｃ３４のチャージングに対して活性であった。このことと一致して、Ｕｂａ６由来のＵｂｌドメインを含むＵｂｅ１は、Ｃｄｃ３４のチャージングにおいて不完全であった。Ｕｂｌドメインを欠いたＵｂｅ１およびＵｂａ６はいずれもＣｄｃ３４をチャージングにおいて不完全であった。これらのデータは、Ｕｂｅ１およびＵｂａ６のＣ末端Ｕｂｌドメインが、ユビキチンチャージングの特異性にとって重要であること、およびＵｂａ６のＵｂｌドメインが、Ｕｂｅ１のＵｂｌドメインよりも識別性が高いことを示唆している。
実施例５
動物細胞中のＵｂａ６の存在量を低下させる方法
動物細胞中のＵｂａ６を検出するために、Ｃ末端Ｕｂｌドメインに対する抗体を作製した。この抗体は、２９３Ｔ細胞を含むいくつかの細胞株からの抽出物において、Ｕｂａ６の予想サイズであるおよそ１２５Ｋｄのタンパク質の二本線を認識した（図２Ｄ）。この抗体は、エピトープタグが存在するために内在性タンパク質よりもＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で僅かに遅く移動する、精製Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６とも反応した。Ｕｂａ６を標的とする３種類の異なるｓｉＲＮＡが、その定常状態のレベルを大きく低下させることができることが分かった（図２Ｄ）。これらのデータは、ＲＮＡｉを用いることによって、Ｕｂａ６の活性／機能が阻害されることを示唆している。
実施例６
Ｕｂｃ５のチャージング
Ｕｂｅ１およびＵｂａ６の両方によってチャージされるＵｂｃ５に対する、キメラタンパク質（Ｕｂａ１のＵｂｌドメインをＵｂｅ１のＵｂｌドメインで置換；Ｕｂｅ１由来のＵｂｌドメインをＵｂａ６のＵｂｌドメインで置換（図１１Ａおよび１１Ｂ））の活性分析を行った。Ｕｂｌドメインを欠くＵｂａ６およびＵｂｅ１は、Ｕｂｃ５に対する活性を欠くが、各々のキメラタンパク質は活性であることが分かった（図１１Ｃ）。これらのデータは、この共通するＥ２に関しては、Ｕｂｌドメインが交換可能であることを示唆している。さらに、Ｃｄｃ３４またはＥ２Ｚに対するキメラの活性が欠如していることは、タンパク質が全体的に非機能的であるからではないことも示唆している。重要なことには、Ｕｂａ６のＵｂｌドメインを含むＵｂｅ１タンパク質は、やはりＥ２Ｚに対して不活性であり、このことは、特異性にはＵｂｌドメイン外の付加的な構造的特徴が必要である可能性があることを示唆している。分子モデル化による研究も行い、Ｕｂａ６およびＵｂｅ１由来のいずれのＵｂｌドメインも、ユビキチン様フォールドに折りたたまれることが示された（図１１Ｄ）。
実施例７
インビボでのＥ２ＺのチャージにはＵｂａ６必要である
Ｕｂａ６またはＵｂｅ１のいずれかを除去するために、ＲＮＡｉと組み合わせたインビボでのチャージングアッセイを利用した。インビボでのチャージングアッセイにおいては、ｐＨ約４．５のバッファー（５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）、０．５％  ＮＰ４０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて細胞ライセートを作製し、直ちに非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。このような条件下にて、Ｅ２チオールエステルは比較的安定に維持され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離が可能であった。次に、チャージングされたＥ２およびチャージングされていないＥ２をイムノブロットにより検出した。Ｅ２Ｚに対する抗体は利用可能ではなかったため、Ｆｌａｇ−ＨＡ−タグを有するＥ２Ｚを安定に発現する細胞株を作製した。図１２Ａに示すように、Ｅ２Ｚの画分は、大部分のタンパク質よりも僅かに遅く移動した。このバンドは、活性部位システインがアラニンに変異してユビキチン化されない変異型Ｅ２Ｚを用いた場合、または野生型Ｅ２ＺにＤＴＴを添加した場合（チオールエステルを減少させることになる）には、存在しなかった。図１２Ｂに示すように、３種類の異なるｓｉＲＮＡを用いてＵｂａ６を除去することにより、Ｅ２Ｚのインビボでのチャージングが、完全にＵｂａ６に依存していることが分かった。一方、Ｕｂｅ１の除去は、Ｅ２Ｚのチャージングの程度に影響を与えなかった。しかし、Ｕｂｅ１の除去により、Ｕｂｅ１特異的Ｅ２  Ｃｄｃ３４のチャージングの程度は低下した。
実施例８
ユビキチンＥ１の構造的多様性および機能的多様性
ヒト、チンパンジー、旧世界ザル、およびゼブラフィッシュは、単一のＵＢＥ１遺伝子しか含んでおらず、ヒトの場合、これはＸ染色体に位置している。しかし、マウスの場合、Ｙ染色体上に第二の遺伝子が位置していることから、Ｘ連鎖ＵＢＥ１遺伝子の重複が発生したと考えられる（Ｌｅｖｙ他、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １１：１６４（２０００）；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：５２８（１９９２）；Ｏｄｏｒｉｓｉｏ他、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８０：３３６（１９９６））。マウスＵｂｅ１ｙタンパク質は、マウスＵｂｅ１ｘと約９０％の同一性を有し、これらのタンパク質は、Ｅ１樹状図の同じクレイド（ｃｌａｄ）に位置する（図２０）。実際、マウスＵｂｅ１ｙは、ゼブラフィッシュＵｂｅ１タンパク質よりも、マウスＵｂｅ１ｘおよび対応するヒトＵｂｅ１タンパク質と関連性が高い（図２０）。ラットＹ染色体にも、ＵＢＥ１関連配列が存在するが、これらの配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ２５２２５を参照）が完全なＵＢＥ１遺伝子を構成するとは考えられない。植物には複数のＵｂｅ１オルソログが存在する（例えば、シロイヌナズナには２つの遺伝子（Ｈａｔｆｉｅｌｄ他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：２１３（１９９７））、コムギには３つの遺伝子が存在する（図２０））。ここでも、各々の種内では、コードされたＥ１タンパク質は互いに関連性が高く（約９０％の同一性）、Ｅ１樹状図で単一のクレイド形成する（図２０）。過去の研究においては、Ｕｂｅ１関連Ｅ１の機能的特性の違いを同定することができておらず、このことは、これらの遺伝子が、同一の生化学的機能をもたらすであろうが、異なる種類の細胞、または異なる発生環境において機能するであろうことを示唆している。シロイヌナズナＵｂｅ１タンパク質は、試験したすべてのＥ２に対して同一の活性を有している（Ｈａｔｆｉｅｌｄ他、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：２１３（１９９７））。さらに、過去には、マウスＵｂｅ１ｙがもっぱら精巣内でのみ発現し、精子形成におけるＵｂｅ１ｙの誘発は、Ｕｂｅ１ｘタンパク質も発現するこの発生段階における通常のユビキチン活性化酵素の活性レベルの上昇の必要性を反映していると考えられると結論付けられた（Ｏｄｏｒｉｓｉｏ他、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８０：３３６（１９９６））。一方、ヒト、マウス、およびゼブラフィッシュのＵｂａ６遺伝子は、互いの関連性がより高く、Ｕｂｅ１クレイドとの関連性は低い（図２０）。実際、Ｕｂａ６タンパク質は、それ自体のクラッドを形成し、これは、ヒトＵｂａ６およびＵｂｅ１が、Ｅ２のインビボでのチャージングにおいて異なる役割を担っているという知見と一致する（図１５）。
【０１４９】
Ｕｂａ６オルソログを持たないと思われる、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、黄色ショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、および出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とは対照的に、ウニ（Ｓ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）においては、Ｕｂｅ１およびＵｂａ６オルソログのいずれも同定された（７０９残基に対して、それぞれ、ＸＰ＿７９５３０２、同一性６５％、およびＸＰ＿７８０７８２、同一性５６％）。
実施例９
Ｅ１Ufd−Ｅ２接触部分における特異性エレメント
本明細書で示す結果は、Ｕｂｅ１およびＵｂａ６が、異なるセットのＥ２結合酵素と相互作用しチャージングする能力を有することを示唆しており、欠失解析およびキメラタンパク質の解析に基づいている。本明細書で示す結果は、Ｕｂａ６およびＵｂｅ１のＣ末端ユビキチンフォールドドメイン（Ｕｆｄ）が、Ｅ２の動員および／またはトランスチオール化に寄与していることも示唆している（図１４）。現在、Ｕｂｅ１、Ｕｂａ６、Ｕｓｅ１、またはＣｄｃ３４に利用可能な構造は存在しない。これらのタンパク質のモデルを、関連するタンパク質：Ｕｂａ６およびＵｂｅ１に対してはＳＵＭＯ１（ｐｄｂコード：１Ｙ８Ｑ）由来のＵｆｄ、Ｃｄｃ３４Ａの場合はＵｂｃＨ１（１ＴＴＥ）由来のＵｆｄ、ならびにＵｓｅ１の場合はＵｂｃＨ５Ｂ（２ＥＳＱ）由来のＵｆｄの構造に基づいて構築した。ＵｆｄおよびＣｄｃ３４に対するモデルは、Ｍｏｄｅｌｌｅｒを用いて作製し、Ｕｓｅ１に対するモデルは、Ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌを用いて作製した。次に、これらのモデルを、Ｐｙｍｏｌにて、Ｕｂａ３Ufd−Ｕｃｂ１２複合体（１Ｙ８Ｘ）（Ｈｕａｎｇ他、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ  １７：３４１（２００５））の構造と比較した。
【０１５０】
Ｕｂｃ１２／Ｕｂａ３Ufdの構造において（図２１Ｂ）、Ｕｂｃ１２のＮ末端ヘリック
ス（ヘリックス１）は、主にＳ２、Ｓ３、およびＳ４から成るＵｆｄのβシートの表面と複数の箇所で接触している（図２１Ｂ）。Ｕｂｃ１２ヘリックスに面したＵｆｄのβシート表面は、主に、短鎖の側鎖および／または親水性の側鎖を有する残基（Ａ３８０、Ｔ３８２、Ｔ３８４、Ｔ３９１、Ａ４２４、Ａ４２６）から成る（図２１Ａおよび２１Ｂ）。これにより、Ｕｂｃ１２ヘリックスのＱ３１、Ｌ３２、Ｑ３５、およびＮ３９との相互作用が容易となる。Ｕｂａ３UfdのＲ３９０は、βシートの反対側から突出しており、Ｕｂ
ｃ１２のＬ２ループのＤ４２７と接触している（図２１Ｂ）。Ｕｂａ６およびＵｂｅ１のＳＵＭＯ１Ｕｆｄフォールドとの構造に基づいたアラインメント、ならびにＵｓｅ１およびＣｄｃ３４ＡのＵＢＣフォールドとの構造に基づいたアラインメントにより、Ｕｂａ６Ufd−Ｕｓｅ１複合体およびＵｂｅ１UfdＣｄｃ３４複合体のモデルが提供される（図２１Ｃおよび２１Ｄ）。特異性に対する構造的基盤をこれらのモデルから直接同定することはできないが、特異性に関与する可能性のある予測接触部分内におけるＵｆｄ配列とＵＢＣとの配列の違いを同定することは可能である。まず、３つのＵｆｄのβシート表面は、異なるチャージ分布を有する（図２１Ｄ）。Ｕｂａ３Ufdは、最も塩基性であり（青色）、
Ｕｂｅ１UfdおよびＵｂａ６Ufdがそれに続く。さらに、Ｕｂａ３Ufdは、Ｕｂａ６または
Ｕｂｅ１由来のＵｆｄには見られない酸性のパッチ（赤色）を有する。Ｕｂｃ１２のＨ１ヘリックスとは対照的に、Ｕｓｅ１のＨ１ヘリックスは、非常に高い疎水性の性質を持ち、これは、Ｕｂａ６Ufdの予測Ｓ２βシートおよびＳ３βシートの疎水性が、Ｕｂａ３Ufdと比べて、より高いことと一致している（図２１Ａおよび２１Ｃ）。Ｕｓｅ１のＬ２ループは、Ｕｂａ６UfdのＳ３およびＨ２と相互作用するであろうが、構造的予測が不確実で
あるために、これらの潜在的な相互作用を評価することは不可能である。Ｕｂｅ１Ufdの
予測構造は、Ｕｂａ３Ufd−Ｕｂｃ１２の構造に重ね合わせると、Ｃｄｃ３４のＨ１と衝
突するような、モデル化が不十分なセグメントを含んでいる（図２１Ｄ）。しかしながら、それぞれの接触部分で接触している可能性のある接触部分の残基における類似および相違のいずれをも同定することはできる。例えば、Ｕｂｅ１のＳ４末端部のＲ１０２９は、
Ｕｂａ６のＤ１０２３およびＵｂａ３のＡ４２６に対応している（図２１Ａ）。さらに、Ｕｂｅ１のＳ２のＬ９９７は、Ｕｂａ６のＶ９８６およびＵｂａ３のＴ３８４に対応している（図２１Ａ）。同様に、それぞれの特異的Ｅ２のＨ１の残基には、著しい相違が存在する（図２１Ａ）。
【０１５１】
本明細書において解析された複合体について、Ｅ２およびＵｆｄの接触部分に存在すると予測される残基の相違は明らかであるものの、理論に束縛されるものではないが、本明細書で示しデータに基づくと、この系の特異性は、Ｅ２とＵｆｄとの接触部分のアミノ酸の１つもしくは少数の変化を反映する可能性は低いと考えられる。第一に、Ｅ２配列の詳細な解析（特に、Ｕｆｄと結合するＮ末端ヘリックス）では、共に機能するＥ１と関連する個別のクラスへＥ２を分離するような残基のクラスを同定することができなかった（Ｗｉｎｎ他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １２：１５６３（２００４））。第二に、Ｕｂｃ１２／Ｕｂａ３−Ｕｆｄ相互作用に対する、大規模ばアラニン走査突然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、多くの残基が相互作用に寄与することが示唆されている。例えば、Ｕｂｃ１２の接触部分の９個の残基のうちの８個の変異により、Ｎｅｄｄ８によるそのチャージングが低下、または消滅した（Ｈｕａｎｇ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １７：３４１（２００５）；Ｈｕａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：３９４（２００７））。同様に、Ｕｂａ３のＵｆｄの相互作用表面上の５個の残基のうちの４個の変異により、Ｕｂｃ１２のチャージングが低下した（Ｈｕａｎｇ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １７：３４１（２００５））。したがって、この重要で興味深い問題を扱うには、構造解析が必要となるであろう。
実施例１０
材料と方法
プラスミド
Ｕｂｅ１、Ｕｂａ６、Ｅ２ユビキチン結合酵素およびユビキチン様タンパク質に対するオープンリーディングフレームは、ｃＤＮＡテンプレートまたはｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅し、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）にクローン化した。これらのオープンリーディングフレームは、次に、ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて組換えによるクローン化を利用して、図に示した目的のプラスミドに導入した。突然変異は、ＰＣＲに基づく突然変異誘発を用いて作成した。すべてのオープンリーディングフレームを、その全体について配列を決定した。ＧＳＴ−Ｕｂｅ１ＬおよびＧＳＴ−ＭＰ１を発現するバキュロウイルスは、Ｂｒｅｎｄａ  Ｓｃｈｕｌｍａｎ
氏（聖ユダヤ小児研究病院、テネシー州、ンフィス）の提供による。
【０１５２】
特に断りのない限り、オープンリーディングフレームは、ｐＥＮＴＲ／ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）にクローン化し、ＣＬＯＮＡＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたインビトロ組換えを利用して、適切な発現プラスミドに導入した。ｐＨＡＧＥ−Ｆｌａｇ−ＨＡベクター（ピューロマイシン耐性）では、オープンリーディングフレームはＰＧＫプロモーターの支配下に配置される。Ｅ２のオープンリーディングフレームは、Ｔ７プロモーター、およびＮ末端Ｈｉｓ−６タグを含むベクター内に配置した。細菌内でのＵｓｅ１発現のために、Ｕｓｅ１オープンリーディングフレーム（ＮＭ＿０２３０７９）を、オープンリーディングフレームの上流にＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含むｐＥＮＴＲ−２にクローン化し、ｐＤＥＳＴ−１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｎ末端ＧＳＴタグ）へ導入した。抗Ｕｓｅ１抗体を用いて検出した内在性タンパク質のサイズ、およびＤＮＡ配列解析によると、Ｕｓｅ１に対するアノテーションが付されたオープンリーディングフレーム（ＵＢＥ２Ｚという）（Ｇｕ，Ｘ．他、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｅ２Ｚ  （ＵＢＥ２Ｚ）．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．（２００６））は正しくない。実際のオープンリーディングフレームは、アノテーションが付された開始部位の前の１０９個のアミノ酸から開始する（図２０Ｂ）。調べたすべての遺伝子の配列を、図２２にまとめて示す。
ｍＲＮＡ発現
ノバルティス研究財団ゲノム研究所の転写プロファイリングリソース（Ｓｕ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：４４６５（２００２）；Ｓｕ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：６０６２（２００４））を用いて、Ｕｂａ６、Ｕｂｅ１およびＵｓｅ１に対するｍＲＮＡ発現の解析を行った。この解析では、ＧＮＦ１Ｈチップを、ＭＡＳ５転写プロファイリングアルゴリズム（Ｓｕ他、（２００４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：６０６２）と組み合わせて利用した。
系統樹
系統樹、およびアラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷをＴｒｅｅｖｉｅｗと組み合わせて用いて作成した。
抗体
Ｕｂａ６抗体およびＵｓｅ１抗体は、それぞれ、細菌内で作製されたＧＳＴ−Ｕｂａ６融合タンパク質（残基８６９−１０５２）、およびＧＳＴ−Ｕｓｅ１を用いて、ウサギで作製した。抗体は、使用前にアフィニティ精製を行った。抗体の特異性は、Ｕｂａ６、Ｕｓｅ１に対するＲＮＡｉによって決定した。
タンパク質の発現および精製
昆虫細胞内でのタンパク質の産生では、組換えバキュロウイルスを用いてＳｆ９細胞を感染させ（４０時間）、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中の清澄化した細胞抽出物を、抗Ｆｌａｇ−セファロースビーズまたはＧＳＨ−セファロースビーズに結合させた。洗浄したビーズをＦｌａｇペプチド（５００μｇ／ｍＬ）、またはグルタチオン（４０ｍＭ）で溶離し、タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％  グリセロールに対して透析した。細菌発現は、Ｒｏｓｅｔｔａ／ＤＥ３細胞中で、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導し、３７℃で３時間行った。溶解バッファー中で細胞を破壊した後、ＧＳＨ−セファロースを用いて精製した。質量分析により、ＧＳＴ−ＵＢＬタンパク質はすべて、適切なＣ末端を有することが分かった。
【０１５３】
特に断りのない限り、哺乳類細胞におけるタンパク質発現は、Ｇａｔｅｗａｙに適合したｐＨＡＧＥ（レンチウイルス）に基づくベクターを用いたウイルスの形質導入によって行った。ベクターを２９３Ｔ細胞にパッケージングし、これを用いて図に示した細胞株の形質導入を行い、その後、ピューロマイシンによる選別を行った。免疫沈降では、溶解バッファー中に抽出物を生成し、その後、図に示した抗体でインキュベートした。タンパク質は、４−１２％のトリス−グリシン勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）で分離した。Ｅ２のチャージングを調べるために、細胞を、５０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州、インディアナポリス）（図に示したように、ｐＨ３〜５）バッファー中に溶解し、遠心分離により清澄化した。１０μｇの抽出物を、非還元Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビス−トリスゲルで分離した後、イムノブロットを行った。ＲＮＡｉを用いた場合は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を用いて、図に示したｓｉＲＮＡ（３３ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。７２時間後、細胞を前述のように溶解し、Ｅ２のチ
ャージングを調べた。ｓｉＲＮＡの配列は本明細書にて提供されている。ユビキチンとＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６との間のチオエステルを調べるため、Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６（野生型またはＣ６２５Ａ変異体）を発現する細胞を、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、プロテアーゼ阻害剤中に溶解し、抽出物を使用して抗ＨＡアガロースを用いた免疫沈降を行った。免疫複合体を溶解バッファー（ｐＨ４．５）で洗浄し、ＨＡペプチドで溶離し、次に、還元剤の非存在下にて、４−１２％ビス−トリスゲルで電気泳動を行った。場合によっては、チオエステル結合を減少させるために、電気泳動の前に試料を２００ｍＭ  ＤＴＴで処理した。ゲルをＰＶＤＦへ転写して、図に示した抗体でプローブし、または、場合によっては、以下に示すように、バンドを切り出して、質量分析を行った。
インビトロでのユビキチン活性化アッセイおよびＥ２チャージングアッセイ
ユビキチン活性化については、図に示したＥ１（８ｎＭ）を、１００ｎＭ  ＧＳＴ−ＵＢＬおよび２ｍＭ  ＡＴＰと共に、反応バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中で、３０℃にて１５分間インキュベートし（全容量
１０μＬ）、還元剤を含まない２×Ｌａｅｍｌｉ試料バッファーを添加して反応を停止し、直ちに、非還元４−１２％トリス−グリシンゲル、およびイムノブロッティングを行った。ユビキチン活性化の動態を測定するために、８ｎＭ  Ｅ１および０．５μＭ  ユビキチンを、３０℃にて図に示した時間反応させ、化学発光をＣＣＤにより検出してイムノブロットを定量した。検出は、測定機器Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  ＦｌｏｕｒＣｈｅｍ  ８９００を用いて行った。ＧＳＴユビキチン濃度への依存性を測定する実験では、ＧＳＴ−ユビキチン濃度は、０、７．５、１５、３０、６０、１２０、２４０、および４８０ｎＭであり、反応時間は１０分であった。２回の独立した実験の平均反応速度を、標準偏差と共に示す。Ｅ２のチャージングを調べるために、35Ｓ−メチオニンの存在下、細菌Ｓ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、図に示したＥ２をインビトロで翻訳した。細菌Ｓ３０抽出物は、このアッセイに干渉する可能性のあるユビキチン活性化酵素およびユビキチン結合酵素を欠いている。放射標識したＥ２（１μＬ）を、反応バッファー中、４０ｎＭの図に示したＥ１、２５μＭのリジンを含まないユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、マサチューセッツ州、ウォルサム）、２ｍＭのＡＴＰと共にインキュベートした（１５分、３０℃）（全容量１０μＬ）。説明されているように、反応物をユビキチンの活性化について分析した。一部の実験では、細菌から精製したＵｓｅ１を用いた。Ｕｂｅ１は、ＴＥＶプロテアーゼを用いてＧＳＴ−ＴＥＶ−Ｕｓｅ１から切り離し、溶離したＵｓｅ１を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％  グリセロールに対して透析した。ユビキチン−セファロースを用いたＵｂａ６およびＵｂｅ１の捕捉は、過去に報告されたように（Ｐｉｃｋａｒｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１５７３（１９８５）；Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２５３７（１９８２））、安定にＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６を発現する細胞の抽出物を用いて行った。
質量分析
特に断りのない限り、質量分析は、ゲル内トリプシン処理で作製されたペプチドについて、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ＬＴＱ質量分析器を用いて行った。検索は、Ｓｅｑｕｅｓｔを用いて行った。ＧＳＴ−ＵＢＬ融合タンパク質のＣ末端を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから２μｇのタンパク質を切り出し、図に示したプロテアーゼで消化した。次に、消化したペプチドを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの一連の操作毎に３２５０を超えるＭＳ／ＭＳのスキャンが得られる条件下にて、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを分析した。予測Ｃ末端ペプチド、ならびに予測スペクトルと一致するスコアＸＣｏｒｒおよびｄＣｎを得た。哺乳類細胞から精製したＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６〜Ｕｂ由来のペプチドの分析については、トリプシン処理した試料を、測定機器ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐを用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析し、高い質量精度でペプチドを同定した。まず、Ｓｅｑｕｅｓｔを用いて、タ
ンデム質量スペクトルのヒトゲノムに対する検索を行い、ユビキチンおよびＵｂａ６に対するペプチドを同定されたが、その他のユビキチン様タンパク質に対しては同定されなかった。より効果的に付加的なＵＢＬの存在を除外するために、ヒトのユビキチン、Ｎｅｄｄ８、ＳＵＭＯ−１、ＳＵＭＯ−２、ＳＵＭＯ−３、Ｆｕｂ１、Ｆａｔ１０、Ｕｒｍ１、Ｕｆｍ１、Ｇｄｘ、Ｉｓｇ１５、およびＡｐｇ１２に対するタンパク質配列を含む範囲を絞ったデータベースの検索を、１００質量単位フィルター（１００  ｍａｓｓ  ｕｎｉｔ
ｆｉｌｔｅｒ）を用いて行った（軌道トラップ検出によって得られる高い質量精度のために容易に行われる）。ユビキチンにのみ対応するペプチドが得られ（図２参照）、このことから、Ｕｂａ６が、ユビキチンに加えてＵＢＬも効率的にチャージすることは極めて可能性が低いと考えられた。
【０１５４】
昆虫細胞内でのタンパク質の産生では、組換えバキュロウイルスを用いてＳｆ９細胞を感染させ（４０時間）、溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中の清澄化した細胞抽出物を、抗Ｆｌａｇ−セファロースビーズまたはＧＳＨ−セファロースビーズに結合させた。洗浄したビーズをＦｌａｇペプチド（５００μｇ／ｍＬ）、またはグルタチオン（４０ｍＭ）で溶離し、タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％  グリセロールに対して透析した。細菌発現は、Ｒｏｓｅｔｔａ／ＤＥ３細胞中で、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、３７℃にて３時間行った。溶解バッファー中で細胞を破壊した後、ＧＳＨ−セファロースを用いて精製した。質量分析により、ＧＳＴ−ＵＢＬタンパク質はすべて、適切なＣ末端を有することが分かった。
【０１５５】
特に断りのない限り、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現は、Ｇａｔｅｗａｙに適合したｐＨＡＧＥ（レンチウイルス）に基づくベクターを用いたウイルスの形質導入によって行った。ベクターを２９３Ｔ細胞にパッケージングし、これを用いて図に示した細胞株の形質導入を行い、その後、ピューロマイシンによる選別を行った。免疫沈降法では、溶解バッファー中に抽出物を生成し、その後、図に示した抗体でインキュベートした。タンパク質は、４−１２％のトリス−グリシン勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）で分離した。Ｅ２のチャージングを調べるために、細胞を、５０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州、インディアナポリス）（図に示したように、ｐＨ３〜５）バッファー中に溶解し、遠心分離により清澄化した。１０μｇの抽出物を、非還元Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビス−トリスゲルで分離した後、イムノブロットを行った。ＲＮＡｉを用いた場合は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を用いて、図に示したｓｉＲＮＡ（３３ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。７２時間後、細胞を前述のように溶解し、Ｅ２のチャージングを調べた。ｓｉＲＮＡの配列は本明細書にて提供されている。ユビキチンとＦｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６との間のチオエステルを調べるため、Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６（野生型、またはＣ６２５Ａ変異体）を発現する細胞を、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、プロテアーゼ阻害剤中に溶解し、抽出物を使用して抗ＨＡアガロースを用いた免疫沈降を行った。免疫複合体を溶解バッファー（ｐＨ４．５）で洗浄し、ＨＡペプチドで溶離し、次に、還元剤の非存在下にて、４−１２％ビス−トリスゲルで電気泳動を行った。場合によっては、チオエステル結合を減少させるために、電気泳動の前に試料を２００ｍＭ  ＤＴＴで処理した。ゲルをＰＶＤＦへ転写して、図に示した抗体でプローブし、または、場合によっては、以下に示すように、バンドを切り出して、質量分析を行った。
組織培養
組織培養細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地中で、５％ＣＯ2下、３７℃にて増殖さ
せた。Ｆｌａｇ−ＨＡ−Ｕｂａ６または関連する突然変異体を安定に発現する細胞株を作
製するために、Ｕｂａ６のＯＲＦを、ｐＨＡＧＥ−ＣＭＶ−Ｆｌａｇ−ＨＡ−ＧＡＷまたはｐＨＡＧＥ−ＰＧＫ−Ｆｌａｇ−ＨＡ−ＧＡＷのいずれかに組換え、ウイルスを、標準的なレンチウイルスパッケージングの手順を用いてパッケージングした。ウイルスの上清を用いて２９３Ｔ細胞を、およそ０．５の感染効率で感染させた。細胞は、ピューロマイシンを用いて、組込みについて選別された。
大腸菌でのタンパク質の発現
ＧＳＴ−ユビキチンおよびユビキチン様タンパク質の大腸菌での発現については、ＢＬ２１／ＤＥ３細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州、マディソン）を、適切な発現プラスミド（ｐＤＥＳＴ−２７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換し、プラスミドはカルバサイクリンを用いて選別した。細胞を０．８ＯＤまで増殖させ、０．４ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。３時間後、細胞を回収し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＮＰ４０中で溶解し、１２０００ｇにて遠心分離した。抽出物を、ＧＳＨ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）を用いて精製した。溶解バッファーでビーズを洗浄後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および４０ｍＭ  グルタチオンを用いてタンパク質を溶離した。Ｅ２をインビトロで翻訳するために、Ｔ７プロモーターを含むベクター中のコード配列を、大腸菌インビトロ翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、35Ｓ−メチオニンの存在下で、転写、および翻訳した。次に、タンパク質を、以下に説明するチオールエステルアッセイに用いた。
昆虫細胞でのタンパク質の発現
昆虫細胞での発現では、ＯＲＦクローンは、Ｓｆ９細胞の同時導入によって、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてバキュロウイルス配列と組換え、トランスフェクションの３日後にウイルス上清を単離した。ウイルスストックを、Ｓｆ９細胞中で増幅させた。タンパク質の産生については、Ｓｆ９細胞をウイルスストッに感染させ、４０時間後、プロテアソーム阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、スイス、バーゼル）の存在下で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．５％  ＮＰ４０を用いて細胞を溶解した。抽出物を遠心分離により清澄化し、ライセートを、抗Ｆｌａｇ樹脂（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）、またはＧＳＨ−セファロース樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）と共にインキュベートした。樹脂を溶解バッファーで洗浄し、その後、前述のように、Ｆｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ）またはグルタチオンで溶離した。タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および５０％  グリセロールに対して、４℃にて２時間透析し、−８０℃で保存した。
ユビキチン活性化反応および転移反応
ユビキチン活性化を調べるために、Ｕｂｅ１またはＵｂａ６（１００ｎｇ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および４ｍＭ  ＡＴＰ中にて、１０μｇのユビキチンまたはユビキチン様タンパク質の存在下、上記で示した時間インキュベートした（最終容量１０μＬ）。反応混合物を用いて、図に示した時間、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルは、クーマシーで染色するか、または上記で示した抗体でイムノブロッティングを行った。
【０１５６】
Ｕｂａ６からＥ２へのユビキチン転移を調べるために、チオールエステルアッセイを行った。反応は、２μＬのインビトロ翻訳、および35Ｓ−メチオニン標識されたＥ２を添加したこと以外は前述のようにして行った。図に示した時間の後、反応混合物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、乾燥ゲルはオートラジオグラフィーを行ってＥ２タンパク質およびそのチオールユビキチンの形態を視覚化した。一部の実験では、リジン残基を持たないユビキチン（ＵｂＫＯ）を用いた。
哺乳類細胞でのタンパク質の発現
哺乳類細胞におけるＵｂａ６に対するユビキチン抱合体を調べるために、Ｕｂａ６または変異体を安定的にもしくは一過的に発現する、図に示した細胞株を溶解した。清澄化したライセートを用いて、抗ＨＡ樹脂で免疫沈降を行った。樹脂を溶解バッファーで洗浄後、タンパク質を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、図に示した抗体でイムノブロッティングを行った。特定の場合では、ゲルをクーマシーで染色し、タンパク質を切り出した後、Ｔａｐｌｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）にて質量分析を行った。
全般的方法
ユビキチン活性化アッセイには、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中で８ｎＭ  Ｅ１、１００ｎＭ  ＧＳＴ−ＵＢＬ、および２ｍＭ  ＡＴＰ
を３０℃にて１５分間処理することを含めた（全容量１０μＬ）。還元剤を含まない２×Ｌａｅｍｌｉ試料バッファーで反応を停止し、非還元４−１２％トリス−グリシンゲルで分離し、イムノブロッティングを行った。Ｅ２のチャージングを調べるために、35Ｓ−メチオニンの存在下、細菌Ｓ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソン）を用いて、図に示したＥ２をインビトロで翻訳した。Ｅ２（１μＬ）を、４０ｎＭ  Ｅ１、２５μＭ  ＫＯユビキチン（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、マサチューセッツ州、ウォルサム）、２ｍＭ  ＡＴＰと共にインキュベートし（１５分間、３０℃）（全容量１０μＬ）、その後、４−１２％トリス−グリシンゲル分離／オートラジオグラフィーを行った。
【０１５７】
免疫沈降法については、細胞抽出物を、ｐＨ７．５の溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州、インディアナポリス））、またはｐＨ４．５の溶解バッファー（５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、プロテアーゼ阻害剤）中に作製した。タンパク質を、非還元４−１２％トリス−グリシン勾配ゲルまたは４−１２％ビス−トリス勾配ゲルで分離し、その後、ブロッティングまたは質量分析を行った。インビボでのＥ２のチャージングを調べるために、細胞を、５０ｍＭ  ＭＥＳ（図に示したように、ｐＨ３〜５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、プロテアーゼ阻害剤中に溶解し、遠心分離により清澄化した。抽出物（１０μｇ）を、非還元４−１２％ビス−トリスゲルで分離した後、イムノブロッティングを行なった。記載がある場合は、抽出物を２００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）とともに煮沸した（５分間）。ＲＮＡｉについては、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて細胞をトランスフェクトした。７２時間後、本明細書に記載のように細胞を溶解した。ｓｉＲＮＡの配列：ｓｉＵｂａ６−１、ＣＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＴＡＡＡ；ｓｉＵｂａ６−２、ＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＧ  ＴＡＣＣＧＣＡＴＴＴ；ｓｉＵｂａ６−３、ＧＧＧＡＴＣＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＡＣＡＴＧＧＡＡＡ；ｓｉＵｂｅ１−１、ＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡＴＴ；ｓｉＵｂｅ１−２、ＣＣＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＣＣＴＡＣＡＡＧＡＡＴ；ｓｉＵｂｅ１−３、ＴＣＣＴＣＡＡＣＴＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＴＴＣＴＴ。
実施例１１
参考文献
Ｇｕ，Ｘ．他、“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ
ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｅ２Ｚ（ＵＢＥ２Ｚ）”、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、３４：１８３−１８８（２００６）
Ｐｉｃｋａｒｔ，Ｃ．Ｍ．＆  Ｅｄｄｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．、“Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１６９５：５５−７２（２００４）
Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｔ．、Ｗａｌｄｅｎ，Ｈ．、Ｄｕｄａ，Ｄ．＆  Ｓｃｈｕｌｍａｎ，Ｂ．Ａ．、“Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：１９５８−１９７１（２００４）
Ｋｅｒｓｃｈｅｒ，Ｏ．、Ｆｅｌｂｅｒｂａｕｍ，Ｒ．＆  Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｍ．、“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ａｎｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ、２２：１５９−１８０（２００６）
Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．、Ｅｌｉａｓ，Ｓ．、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｈ．＆  Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．“‘Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｆｆｉｎｉｔｙ’  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：２５３７−２５４２（１９８２）
Ｈａａｓ，Ａ．Ｌ．、Ｗａｒｍｓ，Ｊ．Ｖ．、Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．＆  Ｒｏｓｅ，Ｉ．Ａ．、“Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：２５４３−２５４８（１９８２）
Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｈ．、Ｅｌｉａｓ，Ｓ．＆  Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．、“Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：８２０６−８２１４（１９８３）
Ｐｉｃｋａｒｔ，Ｃ．Ｍ．＆  Ｒｏｓｅ，Ｉ．Ａ．、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：１５７３−１５８１（１９８５）
Ｐｉｃｋａｒｔ，Ｃ．Ｍ．、“Ｂａｃｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ”、Ｃｅｌｌ、１１６：１８１−１９０（２００４）
Ｌａｋｅ，Ｍ．Ｗ．、Ｗｕｅｂｂｅｎｓ，Ｍ．Ｍ．、Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｋ．Ｖ．＆  Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｈ．、“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ
ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＭｏｅＢ−ＭｏａＤ  ｃｏｍｐｌｅｘ”、Ｎａｔｕｒｅ、４１４：３２５−３２９（２００１）
Ｄｕｄａ，Ｄ．Ｍ．、Ｗａｌｄｅｎ，Ｈ．、Ｓｆｏｎｄｏｕｒｉｓ，Ｊ．＆  Ｓｃｈｕｌｍａｎ，Ｂ．Ａ．、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴｈｉＦ”、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４９：７７４−７８６（２００５）
Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｃ，Ｂｅｇｌｅｙ，Ｔ．Ｐ．＆  Ｅａｌｉｃｋ，Ｓ．Ｅ．、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴｈｉＳ−ＴｈｉＦ
ｃｏｍｐｌｅｘ，  ａ  ｋｅｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｌｆｕｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｈｉａｍｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１１−１９（２００６）
Ｗａｌｄｅｎ，Ｈ．、Ｐｏｄｇｏｒｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．＆  Ｓｃｈｕｌｍａｎ，Ｂ．Ａ．、“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃａｓｃａｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  ＮＥＤＤ８”、Ｎａｔｕｒｅ、４２２：３３０−３３４（２００３）
Ｌｏｉｓ，Ｌ．Ｍ．＆  Ｌｉｍａ，Ｃ．Ｄ．、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ
ＳＵＭＯ  Ｅ１  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ＳＵＭＯ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅ２  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ
Ｅ１”、Ｅｍｂｏ．Ｊ．、２４：４３９−４５１（２００５）
Ｂｅｎｃｓａｔｈ，Ｋ．Ｐ．、Ｐｏｄｇｏｒｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．、Ｐａｇａｌａ，Ｖ．Ｒ．、Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ，Ｃ．Ａ．＆  Ｓｃｈｕｌｍａｎ，Ｂ．Ａ．、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  Ｕｂｃ９ｐ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｓｍｔ３ｐ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：４７９３８−４７９４５（２００２）
Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｔ．他、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｕｂｃ１２  ｂｙ  ａｎ  Ｅ２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ＮＥＤＤ８’ｓ  Ｅ１”、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．、１７：３４１−３５０（２００５）
Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｔ．他、“Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ  ｓｗｉｔｃｈ  ｔｏｇｇｌｉｎｇ  Ｅ１Ｅ２  ａｆｆｉｎｉｔｙ”、Ｎａｔｕｒｅ、４４５：３９４−３９８（２００７）
Ｆｉｎｌｅｙ，Ｄ．、Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．＆  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．、“Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｔｓ８５”、Ｃｅｌｌ、３７：４３−５５（１９８４）
Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．、Ｆｉｎｌｅｙ，Ｄ．＆  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．、“Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｔｓ８５”、Ｃｅｌｌ、３７：５７−６６（１９８４）
ＭｃＧｒａｔｈ，Ｊ．Ｐ．、Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｓ．＆  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．、“ＵＢＡ  １：  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ”、Ｅｍｂｏ．Ｊ．、１０：２２７−２３６（１９９１）
Ｏｄｏｒｉｓｉｏ，Ｔ．、Ｍａｈａｄｅｖａｉａｈ，Ｓ．Ｋ．、ＭｃＣａｒｒｅｙ，Ｊ．Ｒ．＆  Ｂｕｒｇｏｙｎｅ，Ｐ．Ｓ．、“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｇｅｎｅ  Ｕｂｅ１ｙ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｕｂｅ１ｘ  ｓｈｏｗｓ  ｔｈａｔ  ｔｈｅｙ  ａｒｅ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ  ａｎｄ  ｓｐｅｒｍａｔｉｄｓ  ｂｕｔ  ａｒｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐａｃｈｙｔｅｎｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅｓ”、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１８０：３３６−３４３（１９９６）
Ｈａａｓ，Ａ．Ｌ．＆  Ｂｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｍ．、“Ｔｈｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｚｙｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：１３２５８−１３２６７（１９８８）
Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｍ．他、“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｕｆｍ１，ａ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｆｏｌｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ”、Ｅｍｂｏ．Ｊ．、２３：１９７７−１９８６（２００４）
Ｗａｌｄｅｎ，Ｈ．他、“Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＰＢＰ１−ＵＢＡ３−ＮＥＤＤ８−ＡＴＰ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  Ｅ１”、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、１２：１４２７−１４３７（２００３）
Ｅｌｅｔｒ，Ｚ．Ｍ．、Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｔ．、Ｄｕｄａ，Ｄ．Ｍ．、Ｓｃｈｕｌｍａｎ，Ｂ．Ａ．＆  Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｂ．、“Ｅ２  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｍｕｓｔ  ｄｉｓｅｎｇａｇｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｉｒ  Ｅ１  ｅｎｚｙｍｅｓ  
ｂｅｆｏｒｅ  Ｅ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ａｎｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ”、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１２：９３３−９３４（２００５）
Ｂｏｏｔｈ，Ｊ．Ｗ．、Ｋｉｍ，Ｍ．Ｋ．、Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ，Ａ．、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ａ．Ｄ．＆  Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．、“Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ”、Ｅｍｂｏ．Ｊ．、２１  ：２５１−２５８（２００２）
Ｓｈｒｉｎｇａｒｐｕｒｅ，Ｒ．、Ｇｒｕｎｅ，Ｔ．、Ｍｅｈｌｈａｓｅ，Ｊ．＆  Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｊ．、“Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｎｏｔ
ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８，３１１−８（２００３）
Ｃｈｅｎ，Ｘ．他、 “Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−
ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ２１（Ｃｉｐ１）”、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、１６：８３９−８４７（２００４）
【図１Ａ】
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【図１３Ｅ】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ−１】
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【図１Ｈ−３】
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【図１Ｈ−４】
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【図１Ｈ−５】
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【図１Ｈ−６】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｃ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【国際調査報告】
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