(57)【要約】  アミロイドβペプチド42のオリゴマー形態を検出するためのラクダ科動物単一ドメイン抗体の使用及びそれらの治療及び診断的応用。【選択図】なし
2010531992.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切な生物学的サンプルにおいてインビトロで配列番号：２のアミノ酸配列を有するアミロイドβペプチド42のオリゴマー形態を検出するための、アミロイドβペプチド42のＣ末端部に位置するエピトープに結合するラクダ科動物のVHH抗体の使用。
【請求項２】
前記エピトープが、配列番号：９のアミノ酸配列を有するペプチドAβ29-40、配列番号：10のアミノ酸配列を有するペプチドAβ33-42及び配列番号：11のアミノ酸配列を有するペプチドAβ35-42からなる群より選択されるペプチドからなることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記VHH抗体が配列番号：１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記アミロイドβペプチド42のオリゴマー形態が、２-マー、３-マー、４-マー、５-マー、６-マー、７-マー、８-マー、９-マー、10-マー、11-マー、12-マー、13-マー、14-マー、15-マー、16-マー、17-マー、18-マー、19-マー、20-マー、21-マー、22-マー、23-マー、24-マーからなる群より選択され、より好ましくはダイマー、トリマー、テトラマー又はドデカマーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記生物学的サンプルにおけるアミロイドβペプチド42のオリゴマー形態の存在が、アミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患の出現の予後マーカーであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記疾患がアルツハイマー病又はダウン症候群であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
適切な生物学的サンプル又は組織を請求項１〜３のいずれか１項に規定のVHH抗体と接触させることにより被験体におけるアミロイドβペプチド42のオリゴマー形態を検出する工程を含んでなることを特徴とする、アミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患の早期ステージを決定するためのインビトロ方法。
【請求項８】
前記疾患がアルツハイマー病又はダウン症候群であることを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。
【請求項９】
ａ)インビトロ又はエキソビボで適切な生物学的サンプルを請求項１〜３のいずれか１項に規定のVHH抗体と接触させる工程、及び
ｂ)前記生物学的サンプルへの前記抗体の結合を検出する工程
を含んでなり、結合がアミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患の存在のマーカーを構成する、被験体におけるアミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患の診断方法。
【請求項１０】
前記疾患がアルツハイマー病又はダウン症候群であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ)インビトロ又はエキソビボで適切な生物学的サンプルを請求項１〜３のいずれか１項に規定のVHH抗体と接触させる工程、
ｂ)前記生物学的サンプルにおけるアミロイドβペプチド42オリゴマーの量を決定する工程、及び
ｃ)工程(ｂ)で決定した量を標準と比較する工程
を含んでなり、量の差がアミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患の存在のマーカーを構成する、被験体におけるアミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患の診断方法。
【請求項１２】
前記疾患がアルツハイマー病又はダウン症候群であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミロイドβペプチド42のオリゴマー形態が、２-マー、３-マー、４-マー、５-マー、６-マー、７-マー、８-マー、９-マー、10-マー、11-マー、12-マー、13-マー、14-マー、15-マー、16-マー、17-マー、18-マー、19-マー、20-マー、21-マー、22-マー、23-マー、24-マーからなる群より選択され、より好ましくはダイマー、トリマー、テトラマー又はドデカマーであることを特徴とする請求項７、９又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
アミロイドβペプチドオリゴマー、好ましくはアミロイドβペプチド42オリゴマーにより媒介される疾患の治療用又は予防用の医薬の製造のための、請求項１〜３のいずれか１項に規定のVHH抗体の使用。
【請求項１５】
前記医薬がアミロイドβペプチドフィブリルの形成を阻害するために被験体に投与されることを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が前記疾患の進行を減速させるために被験体に投与されることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記疾患が神経変性疾患であることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病又はダウン症候群であることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ａ)インビトロ又はエキソビボで適切な生物学的サンプルをアミロイドフィブリルのようなβ-シートアミロイド構造に結合する化合物と接触させる工程
ｂ)β-シートアミロイド構造の量を決定する工程、
ｃ)こうして決定した量を被験体について以前に得た量と比較する工程
を含んでなり、量の減少がアミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患の後退のマーカーを構成する、被験体におけるアミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患の後退に対する請求項１〜３のいずれか１項に規定のVHH抗体の治療効果をモニターする方法。
【請求項２０】
前記疾患がアルツハイマー病又はダウン症候群であることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴマー形態のアミロイドβペプチド42を検出するためのラクダ科動物(camelid)の単一ドメイン抗体の使用及びその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病(AD)は、原因も治療法も知られていない進行性で不可逆性の脳疾患である。細胞外原線維沈着及び老人斑は、顕著で普遍的なADの特徴である。これら凝集物の主要成分は、アミロイドβ(Aβ)と呼ばれる水溶性の40又は42アミノ酸ポリペプチドである。しかし、AD病理における中心構造としての水不溶性原線維アミロイドへの当初の集中は、最近10年間の間に進展した。これは顕著な幾つかの発見に、例えばヒト脳においてオリゴマーAβの水溶性画分が見出されたこと(Kuoら，1996)に起因した。これら単離された可溶性オリゴマーは培養中のニューロンに対して毒性であった。次いで、オリゴマーAβの存在及び毒性が確証され、その構造のためにADDL(Aβ-由来拡散性リガンド)の名称が提案された(Lambertら，1998)。条件に依存して、ADDL組成物はトリマー〜ヘキサマーを優勢に含むことがあり、24-マーまでのより大きな構造を有することもある。ADDLは、重要な領域選択性神経毒性(小脳のニューロンには寛容である一方、海馬CA1領域及び嗅皮質中のニューロンを選択的に殺傷する)を示す(Kleinら，2001)。更に、オリゴマーは、ラットにおいてインビボで(Walshら，2002)及び海馬スライスで(Wangら，2002；Wangら，2004)、海馬長期増強(LTP)を抑制することができる。最近、認知障害はアミロイドβの低量の可溶性オリゴマー形態に直接帰すことができることが示されている；トリマー並びにより少ない程度でダイマー及びテトラマーが特に活性である(Clearyら，2005；Townsendら，2006)。
【０００３】
Aβフィブリルの形成について種々のモデルが提案されている。Bitanら(2003)により提案された単純モデルは、Aβ42がどのように組み立てられ得るかを説明している。モノマーは迅速にオリゴマー化してパラヌクレインになり、次にこのパラヌクレインが会合して大きなオリゴマー及びプロトフィブリルを形成する。モノマー、パラヌクレイン(ペンタマー、ヘキサマー)及びオリゴマーは、優勢には未組織化(unstructured)であるが、幾らかのβ-ストランド及びα-ヘリックスエレメントを含有する。プロトフィブリル形成は、実質的なコンホメーション再配置(rearrangement)が関与し、この間に、未組織化α-ヘリックス及びβ-ストランドエレメントが優勢なβシート/β-ターン構造に変換する。この経路における最終段階は、フィブリルへのプロトフィブリルの成熟(少なくとも動力学的には不可逆的であるように見えるプロセス)である(Lomakinら，1997)。
【０００４】
アミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患(例えば、AD又はダウン症候群)の正確な診断の必要性は、幾つかの症例では治療薬が利用可能になっているので、重要性が増している。したがって、Aβオリゴマーの信頼できるアッセイは極めて役立つであろう。しかし、これらアッセイは、Aβオリゴマーでの免疫化により生成され、オリゴマーに対して惹起されたモノクローナル及びポリクローナル抗体がフィブリルも認識するので、十分に機能を果たさない(Lacorら，2004；Lambertら，2001；Lambertら，2007)。これら抗体は、AD脳切片において、期待されるADタイプの免疫反応性に加えて、細胞周囲の免疫反応性も示す(Lambertら，2007；Lacorら，2004；Gongら，2003)。オリゴマーに対して惹起されたモノクローナル抗体は、Leeら(2006)によっても得られた。この抗体は、AD脳切片上で、オリゴマー、フィブリル及び成熟老人斑を認識する。Kayedら(2003)は、可溶性モノマー、低-MWオリゴマー及びフィブリルのものとは異なるAβ高-MWオリゴマーに特異的なコンホメーションを特異的に認識するポリクローナルウサギ抗体を調製した。Aβの異なるコンホメーション間を識別する方法は、従来のものではないエピトープを認識し得る代替の「結合体(binder)」を使用することである。
【０００５】
ラクダ科動物抗体の相当な割合は単一ドメイン抗体であり、これは、軽鎖を欠く単一重鎖結合性ドメインを介して抗原と相互作用する。このドメインは「VHH」又は「VHH抗体」と呼ばれる。組換えVHHは、最小サイズのインタクトな抗原-結合性ドメインである。VLドメインの不在により、VHHは、VLと結合しているVHドメインのものより高い構造的可撓性を達成することができる。更に、VHHの相補性決定領域(CDR)、特にCDR3は、従来のVH-VL抗体のものより統計学的に長い(Muyldermansら，2001)。小さなサイズ及び増大した可塑性は、VHHに独特な潜在能力を授けているようである：例えば、幾つかのVHHは、酵素(例えば、α-アミラーゼ、炭酸脱水酵素及び鶏卵リゾチーム)の活性部位腔と相互作用することにより、酵素活性を阻害し得る(Desmyterら，1996；Desmyterら，2002；Transueら，1998；Lauwereysら，1998)。これら特徴により、ラクダ科動物のVHHは、従来の抗体に対して免疫原性が貧弱である他の独特なエピトープを認識することが可能となり得る。
【０００６】
国際出願第WO 2004/044204号は、アミロイドβペプチド42に特異的に結合し得るラクダ科動物単鎖抗体の可変フラグメント(VHH抗体)を記載している。これらVHH抗体の中でも、VHH V31-1と呼ばれる１つの特定の抗体は、原線維形態のAβ42ペプチド(Aβ42)のカルボキシ末端部及びニューロン内Aβ42沈着を特異的に認識することが示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ここで、本発明者らは、前記国際出願第WO 2004/044204号に記載されていることに反して、VHH V31-1抗体が水不溶性原線維形態のAβ42を認識しないが、Aβ42の水溶性低分子オリゴマーを特異的に認識することを見出した。
【０００８】
更に、本発明者らはまた、前記VHH V31-1抗体がAβ42のＣ末端に特異的に結合するという事実にもかかわらず、該抗体が予想外にもフィブリル生成、すなわちAβフィブリルの形成を阻害することを見出した。実際、以前の研究により、Aβ42の領域１〜６(Solomon，2002；Legleiterら，2004)及び領域17〜20(Liuら，2004；Legleiterら，2004)に特異的な抗体はAβのインビトロ凝集及び細胞毒性を阻害したが、Ｃ末端に特異的な抗体は凝集を阻害しなかった(Bardら，2000；Liuら，2004)ことが示されている。領域17〜20及びＣ末端は、凝集で重要な役割を演じている(Ma及びNussinov，2002；Balbachら，2000；Halversonら，1990；Jarrettら，1993、及びHilbichら，1991)。このことは、Aβの中央領域に特異的な抗体が凝集を阻害した理由を説明し得る。しかし、以前に報告されたＣ末端特異的抗体がAβの凝集に対して効果を有さなかった理由の明確な説明は存在しない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】SDS PAGE電気泳動並びにV31-1及びmAb 6F/3Dによる免疫ブロットを示す。
【図２】DLSによるAβ42サイズの分析を示す。
【図３】Aβ42画分についてのVHH V31-1の結合を示す。
【図４】VHH V31-1及びmAb 6F/3DによるAβ42のドットブロット免疫アッセイを示す。
【図５】インビトロ血液脳関門(BBB)を横切るVHH抗体の移行を示す。
【図６】種々のVHHによるAD患者のニューロン内Aβ42ペプチド免疫反応性を示す
【図７】コントロール及びAD患者のギ酸画分のドットブロット免疫アッセイによるAβ42免疫反応性を示す。
【図８】ヒト皮質脳ギ酸画分中のAβ42トリマー及びテトラマーのVHH V31-1での免疫検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
したがって、第１の観点では、本発明は、アミロイドβペプチド42のＣ末端部に位置するエピトープに結合するラクダ科動物のVHH抗体の、適切な生物学的サンプル若しくは組織におけるインビトロでの、又は器官(例えば脳)におけるインビボでのアミロイドβペプチド42のオリゴマー形態の検出のための使用に関する。
【００１１】
ラクダ科動物(ラクダ(camel)、ヒトコブラクダ(dromedary)、ラマ(llama)、アルパカ(alpaca)、...)のVHH抗体とは、通常、ラクダ科動物の単鎖抗体の可変フラグメントをいい(Nguyenら，2001；Muyldermans，2001を参照)、本発明によれば、以下のものも含んでなる：
−  ラクダ科動物の単離VHH抗体、
−  ラクダ科動物の組換えVHH抗体、又は
−  ラクダ科動物の合成VHH抗体。
【００１２】
好ましい実施形態では、本発明のVHH抗体は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するラクダ科動物単鎖抗体の可変フラグメントである。このVHH抗体は国際出願第WO 2004/044204号に記載されている。VHH V31-1を発現する宿主細胞は、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM；28 rue du Dr. Roux，75724 Paris Cedex 15，France)から、番号I-2936で入手可能である。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、「アミロイドβペプチド」とは、アミロイド前駆体タンパク質(APP)からβ-及びγ-セクレターゼ媒介切断により生成されるペプチドをいう。好ましくは、アミロイドβペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するアミロイドβペプチド42(Aβ42)である。
【００１４】
本明細書中で使用する場合、用語「オリゴマー」とは、代表的には、アミロイド形成反応において最初に形成される準安定なマルチマーをいう(Kodaliら，2007)。幾つかのプロトフィブリルはオリゴマーとも考えることができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、前記アミロイドβペプチド42のオリゴマー形態(オリゴマー)は、２-マー、３-マー、４-マー、５-マー、６-マー、７-マー、８-マー、９-マー、10-マー、11-マー、12-マー、13-マー、14-マー、15-マー、16-マー、17-マー、18-マー、19-マー、20-マー、21-マー、22-マー、23-マー、24-マーからなる群より、好ましくはダイマー、トリマー、テトラマー又はドデカマー(12-マー)からなる群より、より好ましくはトリマー及びテトラマーからなる群より選択される。
【００１６】
アミロイドβペプチド42のＣ末端部に位置するエピトープへの本発明によるラクダ科動物VHH抗体の結合の特徴付けは、下記実施例２に記載のように、ELISA-ベースの結合アッセイにより実施することができる。有利には、前記VHH抗体の解離定数は、約２.10-8Ｍ又はそれ未満である。解離定数の測定は、当業者に公知の方法(Friguetら(1985)に記載の方法を使用することを含む)を用いてなされ得る。
【００１７】
用語「アミロイドβペプチド42のＣ末端部」とは、本明細書中で使用する場合、配列番号：２のアミロイドβペプチドのアミノ酸25〜42、特にアミノ酸29〜42をいう。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、エピトープは、添付の配列表の配列番号：９のアミノ酸配列を有するペプチドAβ29-40、配列番号：10のアミノ酸配列を有するペプチドAβ33-42及び配列番号：11のアミノ酸配列を有するペプチドAβ35-42からなる群より選択されるペプチドからなる。
【００１９】
用語「検出(する)」は、(例えば、脳の生検により得られる)適切な生物学的サンプル若しくは組織においてインビトロ若しくはエキソビボで、又は器官(例えば脳)においてインビボで上記のようなアミロイドβペプチド42のオリゴマー形態の存否を評価することを意味する。このプロセスには、(配列番号：１の)前記VHH抗体がアミロイドβペプチド42のオリゴマー形態に結合する能力が関与する。
【００２０】
検出は、適切な生物学的サンプル若しくは組織においてインビトロで、又は器官(例えば脳)においてインビボで、当該分野において公知の任意の方法により実施することができる。これら方法としては、下記のような適切な免疫化学的技法が挙げられる：
−  ELISA、EIA、RIA、免疫蛍光、免疫細胞化学的、免疫組織化学的、
−  被験体からの生物学的サンプル又は組織(例えば、血液、血清、尿、脳脊髄液)において実施される免疫ブロット分析、及び
−脳イメージング。
【００２１】
例として、これは、可視化できるか若しくは測定できる検出可能な標識を前記VHH抗体に連結することによって達成してもよいし、又は前記VHH抗体に特異的に結合するリガンド(例えば、検出可能な標識に連結した抗体)を使用することによって達成してもよい。
【００２２】
結合のレベルは、好ましくは、定量的に検出される。
有利には、上記のようなアミロイドβペプチド42のオリゴマー形態の存在の検出は、アミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患、好ましくは神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病又はダウン症候群)の出現の予後マーカーである。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、検出可能な標識は、以下からなる群より選択される：
−  酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース-６-ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ；
−  蛍光体、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、紫外(UV)部のスペクトル中の波長で励起される青色蛍光染料(例えば、AMCA(７-アミノ-４-メチルクマリン-３-酢酸)；Alexa Fluor 350)、青色光により励起される緑色蛍光染料(例えば、FITC、Cy2、Alexa Fluor 488)、緑色光により励起される赤色蛍光染料(例えば、ローダミン、Texas Red、Cy3、Alexa Fluor 546、564及び594)、又は近赤外光で励起され、電子検出器(CCDカメラ、光電子倍増管)で可視化される染料(例えばCy5)；
【００２４】
−  重金属キレート、例えば、ユーロピウム、ランタン又はイットリウム；
−  放射性同位体、例えば、[18Ｆ]フルオロデオキシグルコース又は11Ｃ-、125Ｉ-、131Ｉ-、3Ｈ-、14Ｃ-、99Tc-及び35Ｓ-標識化合物。
−  標識アビジンを用いて検出することができるビオチン。
【００２５】
第２の観点において、本発明は、適切な生物学的サンプル若しくは組織においてインビトロで、又は器官(例えば脳)においてインビボで、アミロイドβペプチドオリゴマー(好ましくは、Aβ42オリゴマー)により媒介される疾患(例えば、アルツハイマー病又はダウン症候群のような神経変性疾患)の早期ステージを決定する方法を提供する。ここで、該方法は、前記適切な生物学的サンプル、組織又は器官を、(好ましくは、上記のような検出可能な標識で標識された)上記のVHH抗体(好ましくは、配列番号：１のVHH抗体)と接触させることによって、被験体(哺乳動物、好ましくはヒト)において上記のようなアミロイドβペプチド42のオリゴマー形態を検出する工程を含んでなる。
【００２６】
別の観点によれば、本発明は、被験体(哺乳動物、好ましくはヒト)における、上記のようなアミロイドβペプチドオリゴマー(好ましくは、Aβ42オリゴマー)により媒介される疾患の診断方法であって、以下の工程：
ａ)適切な生物学的サンプル、組織又は器官を、上記のようなアミロイドβペプチド42のＣ末端部に位置するエピトープに結合するラクダ科動物のVHH抗体(好ましくは、配列番号：１のアミノ酸配列を有するVHH抗体)と接触させる工程、及び
ｂ)前記VHH抗体の前記生物学的サンプル、組織又は器官への結合を検出する工程であって、結合が前記疾患(例えばアルツハイマー病又はダウン症候群)の存在のマーカーを構成する工程
を含んでなる方法に関する。
【００２７】
本発明によれば、前記接触工程は、インビトロ、エキソビボ又はインビボで実施され得る。
接触工程がインビボで実施される場合、器官は好ましくは脳である。
【００２８】
本発明はまた、被験体(哺乳動物、好ましくはヒト)における、アミロイドβペプチドオリゴマー(好ましくは、Aβ42オリゴマー)により媒介される疾患の診断方法であって、以下の工程：
ａ)適切な生物学的サンプル若しくは組織をインビトロ若しくはエキソビボで、又はインビボで(例えば脳)、上記のようなアミロイドβペプチド42のＣ末端部に位置するエピトープに結合するラクダ科動物のVHH抗体(好ましくは、配列番号：１のアミノ酸配列を有するVHH抗体)と接触させる工程、
ｂ)前記生物学的サンプル、組織又は脳におけるアミロイドβペプチド42オリゴマーの量を決定する工程、及び
ｃ)工程(ｂ)で決定した量を標準と比較する工程であって、量の差が前記疾患(例えばアルツハイマー病又はダウン症候群)の存在のマーカーを構成する工程
を含んでなる方法に関する。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、用語「標準」とは、アミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患に罹患していない被験体の大集団で決定された、前記適切な生物学的サンプル又は脳におけるアミロイドβペプチド42オリゴマーの量をいう。
【００３０】
別の観点において、本発明は、上記のようなアミロイドβペプチド42のＣ末端部に位置するエピトープに結合するラクダ科動物のVHH抗体(好ましくは、配列番号：１のアミノ酸配列を有するラクダ科動物のVHH抗体)の、アミロイドβペプチドオリゴマー(好ましくは、アミロイドβペプチド42オリゴマー)により媒介される疾患を治療又は予防する医薬の製造のための使用に関する。
【００３１】
用語「治療(する)」には、前記疾患、前記疾患の徴候又は前記疾患への素因を治癒(cure，heal)、緩和、軽減、改変、修復、寛解、改善するか又はこれらに影響を与える目的での、該疾患、該疾患の徴候又は該疾患への素因を有する患者への前記VHH抗体の投与が含まれる。
【００３２】
用語「予防(する)」は、前記疾患の進行を低減及び/若しくは排除すること、又は前記疾患の発症を遅延若しくは排除することを意味する。
【００３３】
好ましい実施形態では、前記医薬は、アミロイドβペプチドフィブリル(好ましくはAβ42フィブリル)の形成を阻害し、及び/又は前記疾患の進行を減速させるように、被験体に投与される。
【００３４】
本発明の特定の実施形態では、医薬は、被験体(哺乳動物又はヒト)に、脳に直接か、又は注射(好ましくは、静脈内、腹腔内、筋肉内又は皮下注射)によるかのいずれかで投与することができる。事実、本発明者らは、前記VHH抗体が血液脳関門モデルを横切って移行(transmigrate)できることを示した。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、前記疾患は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病又はダウン症候群である。
【００３６】
全てのアミロイドフィブリルは、古典的<<クロス-β>>パターンのβ-シートの高含量、電子顕微鏡でのフィブリル形態、及び異質染色性染料Congo red及びチオフラビンＴに結合しその分光学的特性を改変する能力を含む共通の特徴を有する(Sumner Makin and Serpell，2005；Westermark，2005)。
【００３７】
次いで、本発明はまた、被験体におけるアミロイドβペプチドオリゴマーにより媒介される疾患の後退に対する、上記のようなアミロイドβペプチド42のＣ末端部に位置するエピトープに結合するラクダ科動物のVHH抗体(好ましくは、配列番号：１のアミノ酸配列を有するラクダ科動物のVHH抗体)の治療効果をモニターする方法であって、以下の工程：
ａ)インビトロ又はエキソビボで適切な生物学的サンプルをβ-シートアミロイド構造(例えば、アミロイドフィブリル)に結合する化合物(好ましくは、Congo Red(ベンジジンジアゾ-ビス-１-ナフチルアミン-４-スルホン酸のナトリウム塩)又はチオフラビンＴ(ThT))と接触させる工程、
ｂ)β-シートアミロイド構造の量を決定する工程、
ｃ)そのように決定した量を該被験体について以前に得た量と比較する工程であって、量の減少が前記疾患の後退のマーカーを構成する工程
を含んでなる方法に関する。
【００３８】
前記の特徴に加えて、本発明は、本発明を例示する実施例に言及する下記の記載及び添付の図面から明らかになる他の特徴を更に含んでなる。
【００３９】
図１は、SDS PAGE電気泳動並びにV31-1及びmAb 6F/3Dによる免疫ブロットを示す。Aβ42を37℃にて数日間インキュベートし、０日目、１日目、３日目及び７日目にアリコートを取り出した。この異なる画分を４〜12％ゲル上で分離し、タンパク質をニトロセルロースメンブレン上に移した。ゲル-排除したAβ反応性材料(矢印)についてはV31-1の免疫反応性がないことに注目すべきである。分子量は、クーマシー染色と免疫ブロットとの間にkDaで示されている。
【００４０】
図２は、DLSによるAβ42サイズの分析を示す。Aβ42を水に再懸濁し(0.20μM)、37℃にて数日間インキュベートした。各RH分布を100％強度に対して規格化した。ポリマー状及び凝集したAβ42からの散乱強度が優勢になった。大きな粒子(＞1000nm)は測定ウィンドウに含ませなかった。データは、少なくとも３つの独立した実験の各々において得られたものの代表である。
【００４１】
図３はAβ42画分についてのVHH V31-1の結合を示す。Aβ42を37℃にて数日間インキュベートし、ｔ=１時間、１日目、10日日目及び16日目にアリコートを取り出し、更なる使用まで−20℃にて保存した。画分のコーティングを４℃にて一晩行い、VHH V31-1の結合を４℃にて20分間行った。各VHH抗体希釈物について２つのウェルを使用した。結果は平均及び標準偏差で表す。この実験は独立した３つの実験の代表である。
【００４２】
図４は、VHH V31-1及びmAb 6F/3DによるAβ42のドットブロット免疫アッセイを示す。２μlのAβ42系列希釈物(１μg、0.5μg、0.25μg、0.125μg、0.062μg)をドット-ブロットした。
【００４３】
図５はインビトロ血液脳関門(BBB)を横切るVHH抗体の移行を示す。輸送研究は、10〜20μg/mlのVHH V31-1又はL1-3抗体を頂部区画(apical compartment)(上部チャンバ)に添加することによって開始し、10分、30分及び60分にて下部チャンバにおけるVHH抗体の量を決定した。
【００４４】
図６は、種々のVHHによるAD患者のニューロン内Aβ42ペプチド免疫反応性を示す。VHH V31-1(Ａ及びＢ)、VHH L1-3(Ｃ)及びVHH 61-3(Ｄ)で染色した脳組織の代表的顕微鏡写真。VHH V31-1を使用前にAβ42とプレインキュベートすると、かすかなニューロン染色のみが見出される(Ｅ)。顕微鏡写真Ｆは、VHH V31-1によるニューロン内Aβ42免疫反応性と、ニューロン外拡散プラーク染色の欠如との両方を証明している(プラークは矢印で示されている)。シナプスはVHH V31-1により標識されている(Ｇ)。
【００４５】
図７は、コントロール及びAD患者のギ酸画分のドットブロット免疫アッセイによるAβ42免疫反応性を示す。２μlの系列希釈物(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)をドット-ブロットした。VHH V31-1(Ａ)及びmAb 6F/3Dを使用した。Aβ42免疫反応性を全ての希釈物について濃度測定により決定した。相対吸光単位(R.A.U.)でのAβ42量(AD患者とコントロール患者との間のシグナルの差に対応)は、サンプル希釈率の関数として表している(Ｂ)。
【００４６】
図８は、ヒト皮質脳ギ酸画分中のAβ42トリマー及びテトラマーのVHH V31-1での免疫検出を示す。
【００４７】
以下の実施例は、本発明を説明するものであって、如何なる様式によっても本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１：材料及び方法
材料
使用したAβ42(配列番号：2)及び種々のAβ42フラグメント(配列番号：２の１〜11、10〜20、15〜25、22〜35、29〜40及び33〜42フラグメント；それぞれ配列番号：５、６、７、８、９及び10)はBachemから購入した。モノクローナル抗体(mAb)6F/3D抗-Ab 8-17(Dako)は、ドットブロッティング及びウェスタンブロッティングにより合成アミロイドペプチドを認識する。この抗体はまた、AD脳中の全てのタイプのアミロイド沈着を特異的に染色する。
【００４９】
被験体
ヒト皮質脳組織は、Hopital Pitie-La Salpetriere(Paris，France)から入手した。代表的な神経学的に正常なコントロール及び(Braak及びBraak(1991)に従ってステージBraak-VIと判定された)AD患者からの死後脳組織を検査した。
【００５０】
VHH抗体及びpETシステムにおけるその発現
VHH V31-1(配列番号：１)；VHH V31-1を発現する宿主細胞は、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM；28 rue du Dr. Roux，75724 Paris Cedex 15，France)において番号I-2936で入手可能である；これは2002年９月20日に寄託した；
VHH L1-3(配列番号：3)；VHH L1-3を発現する宿主細胞は、CNCM(28 rue du Dr. Roux，75724 Paris Cedex 15，France)において番号I-2934で入手可能である；これは2002年９月20日に寄託した；
VHH L35(配列番号：４)；VHH L35を発現する宿主細胞は、CNCM(28 rue du Dr. Roux，75724 Paris Cedex 15，France)において番号I-2935で入手可能である；これは2002年９月20日に寄託した；
VHH 61-3(配列番号：12)；VHH 61-3を発現する宿主細胞は、CNCM(28 rue du Dr. Roux，75724 Paris Cedex 15，France)において番号I-2933で入手可能である；これは2002年９月20日に寄託した。
【００５１】
ベクターpHEN1(国際出願第WO 2004/044204号に記載)に挿入されたVHH V31-1、VHH L1-3、VHH L35及びVHH 61-3抗体のコーディング配列をベクターpET22に、製造業者の指示(Novagen，Darmstadt，Germany)に従い、NcoI及びNotI制限部位を用いてサブクローニングした。形質転換E. coli BL 21(DE3)細胞は、20℃にて３時間のIPTG １mMによる誘導後に、周縁質でVHH抗体を発現した。周縁質抽出物は、20％スクロース及び１mM EDTAを含有する50mM硫酸ナトリウム緩衝剤(pH８)中に懸濁した細胞をスフェロプラスト化し(spheroplasting)、ペプチドグリカンをプロテアーゼインヒビター(CompleteTM，Boehringer Mannheim，Germany)の存在下に５mg/mlリゾチームで４℃にて20分間加水分解することにより得た。次いで、懸濁物を10,000rpmで２分間遠心分離した。周縁質抽出物に対応する上清を４℃に維持した。精製VHH抗体は、Ni2+で荷電されたキレート性アガロースカラム(Superflow Ni-NTA，Qiagen Ltd，UK)を製造業者の指示に従って用いて、IMACにより得た。タンパク質含量は、Bradford試薬を使用して測定した。最終調製物の純度は、クーマシー染色を用いるSDS-PAGE及びウェスタンブロットにより評価した。
【００５２】
ELISA
標準ELISAの変法を使用して培養上清中のVHH抗体の存在について試験した。マイクロタイタープレート(Nunc，Denmark)を、PBS中に希釈した１μg/mlの抗原で、４℃にて一晩のインキュベーションによりコーティングした。プレートを緩衝剤Ａ(PBS中0.1％ Tween 20)で４回洗浄し、VHHを緩衝剤Ｂ(緩衝剤Ａ中0.5％ゼラチン)に希釈した。プレートを37℃にて２時間インキュベートし、再度洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-標識ウサギ抗-c-myc(A14)(Santa Cruz，Ca，USA)又はウサギ抗-Hisタグ抗体(Santa Cruz，Ca，USA)を添加した。次いで、プレートを緩衝剤Ａで洗浄し、新たに調製した0.2％オルトフェニレンジアミン(Dakopatts A/S，Glostrup，Denmark)、0.1Ｍクエン酸緩衝剤(pH5.2)中0.03％ H2O2を各ウェルに加えた。ペルオキシダーゼ反応を、３Ｍ HClを添加して停止させ、光学密度を490nmで測定した。
【００５３】
ELISAによる解離定数の決定
VHH抗体の結合親和性をFriguetら(1985)に記載のように決定した。種々の濃度のAβペプチドを溶液で既知量のVHH抗体と、平衡に達するまで４℃にて一晩インキュベートした。使用したVHH抗体濃度は、予備的なELISAキャリブレーションにより決定した。各混合物(100μl)を、抗体を予めコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルに移し、４℃にて20分間インキュベートした。プレートを緩衝剤Ａで洗浄し、β-ガラクトシダーゼ-接合ヤギ抗-ウサギIg(Biosys，Compiegne，France)及び４-メチルウンベリフェリル β-Dガラクトシド(Sigma)を添加して遊離VHH抗体を検出した。蛍光は、355nmでの励起後に、460nmで読み取った(Fluoroskan，Labsystem，Finland)。KDは、結合抗体の割合の逆数 対 抗原のモル濃度の逆数をプロットすることによって得られる回帰曲線の傾きから推定した。
【００５４】
ウェスタンブロット
AβペプチドをPBS中に懸濁した。アリコート(５μl)に、等量のゲルローディング緩衝剤を添加し、次いで100℃にて５分間処理した。NuPAGE Novex 4-12％ Bis-trisゲル(Invitrogen)を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による分離後、半乾燥のままでHybond-C(Amersham)に移し、Xcell II blot module(Invitrogen)を使用してウェスタンブロッティングを行った。免疫化学反応の前に、メンブレンを４％脱脂乳溶液中でブロックした。メンブレンの免疫ブロッティングは、VHH抗体又はmAbのいずれかで達成し、それぞれペルオキシダーゼ-標識ウサギ抗-c-myc(A14)抗体(Santa Cruz，Ca，USA)によるか、又はウサギ抗-Hisタグ(Santa Cruz，Ca，USA)とその後のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗-ウサギ免疫グロブリンにより顕現した。最後に、化学発光キット(Amersham)を用いてペルオキシダーゼ活性を可視化した。
【００５５】
ドット-ブロット
0,25％(W/v)ジチオトレイトール(DTT)を含有するLaemmliサンプル緩衝剤中で凍結脳サンプルをホモジナイズし(1：10(w/v))、10分間熱処理した。次いで、各サンプルを100,000ｇにて60分間遠心分離した。得られたペレットを500μlの100％ギ酸中に再懸濁し、撹拌下に室温にて３時間放置した。次いで、画分を14000×ｇにて１時間遠心分離した(Permanneら，1995)。上清を取り出し、Hybond-Cニトロセルロースメンブレン(Amersham)上に２μlの系列希釈物(1/2〜1/164)をドット-ブロッティングした。メンブレンをブロックし、ウェスタンブロットについて記載したように免疫顕現化のために加工処理した。Gel-doc(Biorad)上でドット-ブロットを72ドット/インチの解像度でデジタル化し、８-ビットグレースケールPICTファイル(256段階のグレー)に保存した。免疫反応性の強度は、Quantity one software(Biorad)で各ドットについて算出した。
【００５６】
Aβ42モノマー及びプロトフィブリルの調製
Aβ42パウダーの１mgサンプルを500μlのヘキサフルオロイソプロパノール(Sigma)中に溶解し、４℃にて７日間穏やかに撹拌し、Branson超音波バスソニケータを用いて10分間超音波処理し、次いで16000×ｇにて10分間遠心分離した。50μgのペプチドを含有するアリコートを各々凍結乾燥し、−20℃で保存した。アリコートを二回蒸留水又はPBS(pH=7.4)中に溶解し、使用まで37℃にてインキュベートした。
【００５７】
動的光散乱(DLS)
DLS(準弾性光散乱とも呼ばれる)を使用して、Aβ粒子の粒子平均拡散係数分布を測定した。サンプル中に存在する各粒子は、その水力学的半径(RH)(これは、測定値と等しい拡散係数を有する球の半径に対応する)により特徴付けられる。RH測定は、ガリウムアルミニウムヒ素825nmレーザを備えたDynaPro MS800装置(Protein solution-Wyatt)で25℃にて行った。Aβ42ペプチドのアリコートを二回蒸留水中0.20μMに希釈し、37℃にてインキュベートした。サンプル(110μl)を光路長３mmの石英キュベット(Hellma)中に直接配置し、10秒間の平均取得時間で角度90°での総光散乱強度を収集した。自己相関化光強度データ(通常、30〜40点)から粒子並進拡散係数(DT)を算出し、Stokes-Einstein等式を用いてRHに変換した。Sedfit 9.3分析ソフトウェア(www.analyticalultracentrifugation.com)を用いて、強度 対 RHの分布プロットを算出し、各サブピークから強度-加重平均RH値を得た。
【００５８】
チオフラビンＴ(ThT)蛍光アッセイ
ThTの蛍光発光は、β-シート凝集体構造(例えば、アミロイドフィブリル)に結合するとシフトする(LeVine，1993)。Aβ42ペプチドのアリコートを二回蒸留水又はPBS(pH7.4)中20μMに希釈し、37℃にてインキュベートした。インキュベーションサンプルから30μlアリコートを周期的に取り出し、２mlの５μM ThT溶液(50mMリン酸緩衝剤、pH=6.5)に添加することによって、Aβ42凝集を測定した。蛍光強度は、光路１cmの石英キュベットを用いて分光蛍光光度計で励起波長450nm及び発光波長482nmにてモニターした。励起波長幅及び発光波長幅は共に５nmであった。読取値は、遊離ThTの蛍光寄与を減算後の３値の平均の結果であった。各実験は二連で行った。
【００５９】
統計分析
抗体フラグメントの存在下又は非存在下でAβ42の原線維発生を比較するために両側スチューデントのｔ検定を使用した。Ｐ値 < 0.05を統計学的に異なるとみなした。
【００６０】
免疫細胞化学
7μm厚のパラフィン切片上で脳組織の免疫染色を行った。切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノール(100％、96％及び90％)で再水和させ、最終的には水に移した。それらを90％ギ酸中でインキュベートし、水中で再度洗浄し、３％過酸化水素及び20％メタノールを用いて内因性ペルオキシダーゼについてクエンチし、最後に水中で洗浄した。TBS中２％ウシ血清アルブミン＋0,5％ Tween中で切片を10分間インキュベートすることにより非特異結合をブロックした。次いで、一次抗体の適切な希釈物を室温の湿潤化チャンバ内で一晩適用した(代表的には、VHHについては１μg/ml、6F/3D mAbについては1：200)。スライドをTBS-Tweenで洗浄し、TBS-Tween中、二次抗体(ウサギ抗-Hisタグ又はビオチン化抗-マウス免疫グロブリン)と室温にて２時間インキュベートした。次いで、スライドをペルオキシダーゼヤギ抗-ウサギ免疫グロブリン又はストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ融合体のいずれかとインキュベートし、ジアミノベンジジン(DAB)で２分間発現させた。TBS-Tweenで洗浄後、スライドをヘマトキシリン及びエオシンで対比染色した。
【００６１】
アミロイド抽出
ヒト皮質脳組織は、Hopital de la Pitie- Salpetriere(Paris，France)のGIE Neuro-CEBから入手した。Delacourteら(2002)に従ってアミロイド抽出を行った。簡潔には、合計50mgの脳組織を500μlの純粋なギ酸中でホモジネートした。窒素下で100μlを蒸発させ、２％ β-メルカプトエタノールを含有する100μlのLDSサンプル緩衝剤(NuPage，Invitrogen)中に可溶化し、10分間煮沸した後に電気泳動に供した。
【００６２】
実施例２：VHH V31-1によるAβ42のオリゴマー形態の認識の証明
１．VHH V31-1により認識されるエピトープの特徴付け
国際出願第WO 2004/044204号は、VHH V31-1がAβ42のカルボキシ末端部を認識することを開示している。VHH V31-1により認識されるエピトープを更に特徴付けるために、異なるAβフラグメント(1-11、10-20、15-25、22-35、29-40及び33-42)に対応するペプチドについてKDを決定した。VHH V31-1は、フラグメント1-10、10-20、15-25及び22-35を認識しなかった。Aβ29-40及びAβ33-42についてのVHH V31-1のKDは、同程度のオーダーであり、Aβ29-40については２(±0.8).10-8Ｍ、Aβ33-42については２.10-8Ｍであった。このことは、VHH V31-1がAβ42のＣ末端部に位置するエピトープを認識することを示唆している。
【００６３】
２．VHH V31-1はAβ42のオリゴマー形態を優先的に認識する
VHH V31-1を更に特徴付けるために、その結合をAβについて免疫ブロットすることにより試験した。Aβ42を37℃にて数日間インキュベートし、０日目、１日目、３日目及び７日目にアリコートを取り出した。Aβ42標準調製物(すなわち、高濃度のAβ42の37℃にて数日間のインキュベーションにより<<熟成(aging)>>)は、混合画分に導かれる。SDS変性後、この調製物は、ゲル-排除したAβ-反応性材料(すなわち、SDS-不溶性フィブリル)だけでなく、Aβ42モノマー及びオリゴマーも示さなかった(Hartleyら，1999)。VHH V31-1は、モノマーに対応する４kDaバンド、ダイマー、トリマー及びテトラマーに対応する８〜16kDaバンド、及び12-マーに対応する50〜80KDaバンドを標識したが、ゲルのまさに頂上部では更なるバンドを標識しなかった。このことは、V31-1がAβ42のオリゴマー形態を特異的に認識し、原線維形態は認識しないことを示唆している(図１)。対照的に、mAb 6F/3Dは、ゲル-排除した画分を含む種々のバンドを全て標識した。
【００６４】
次いで、DLSを使用して、オリゴマー化プロセスに沿ったAβ42粒子のサイズ分布の進展を調べた。Aβ42ペプチドをヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)に溶解し、超音波処理し、次いで遠心分離して会合したペプチドを完全に除去した。凍結乾燥アリコートを20℃に維持し、二回蒸留水に再懸濁し、異なるインキュベーション時間でDLSにより分析した。Ｔ=１時間で、Aβ42のサイズ分布は、約40nmの加重平均水力学的半径(RH)を有する単一ピークを示した(図２)。１日目には、約80nmに中心を有する単一ピークが観察された。10日目には、２つのピークが観察された：一方は約40nmに中心を有し、他方は約400〜500nmに中心を有していた。20日目にも、２つのピークが観察された：一方は約150nmに中心を有し、２番目は約600〜800nmに中心を有していた。粒子光散乱強度は分子により充填された体積に比例する(ID = f(RH3,Ｃ,１/λ4))ので、実際の大きな粒子の豊富さは、強度分布より示唆されるものより有意に低いことに留意することが重要である。Bitanらは、以前に、DLSによってAβ42のオリゴマーサイズ分布を分析した(Bitanら，2003)。２つのピークが観察され、一方はペンタマー/ヘキサマー単位に対応する約10〜20nmであり、他方は、これらオリゴマーの更なる自己会合によって形成されるプロトフィブリルに対応する約60nmであった。観察された40nmピークは、10〜20nm及び60nmで報告された２つのピークの加重平均であり得る。
【００６５】
ThTアッセイを用いてフィブリル形成の動力学をモニターした(下記表Ｉ)。ThTは、原線維構造に特異的に結合する蛍光染料である。Aβ42を水に再懸濁し、アリコートを周期的に取り出し、ThT溶液に加えた。時間依存性の増加が観察された。このことは、アミロイドフィブリルの進行性の形成が起こっていたことを示唆している。
【００６６】
【表１】
2010531992.tif 000003
【００６７】
Aβ42の異なる画分へのV31-1の結合をELISAで分析した(図３)。Aβ42へのVHH V31-1の結合は、１時間画分について16日目画分より有意に高かった。
【００６８】
37℃にて20日間より長くインキュベートした(ほとんどがフィブリルから構成される)Aβ42に対してドットブロット免疫アッセイを行った。強いAβ42免疫反応性がmAb 6F/3Dで得られた。対照的に、VHH V31-1とのAβ42免疫反応性は弱かった(図４)。このことは、VHH V31-1がAβのオリゴマー形態に優先的に結合し、原線維構造には優先的に結合しないことを確証している。
【００６９】
３．VHH V31-1はニューロン内Aβ42オリゴマーを認識するが、アミロイドプラークを認識しない
ヒトAD脳におけるVHH-特異的免疫反応性の分布を検査した。染色したAD脳組織スライスにより、VHH V31-1について顕著なニューロン内免疫反応性が明らかにされた一方、VHH 61-3のニューロン内免疫反応性は非常に微かであり、VHH L1-3のニューロン内免疫反応性は検出できなかった(図6A〜D)。正常脳組織はVHHで標識されなかった。顆粒は細胞体の核周辺領域に局在していた。顆粒を含有する細胞は、その形状からニューロン性と同定された。内皮細胞は顆粒を決して含有していなかった。この標識の特異性は、Aβ42オリゴマーとVHH V31-1をプレインキュベートすることにより確証された(図6E)。VHHは、アミロイドプラークを検出しなかったが、該プラーク周囲のニューロンの細胞内顆粒を検出した(図6G)。シナプスもまたV31-1で標識された(図6F)。
【００７０】
脳組織におけるVHH V31-1の免疫反応性を確証するために、AD患者及びコントロールから得られたギ酸画分に対してドットブロット免疫アッセイを行った。強いAβ42免疫反応性がAD患者画分で得られた。対照的に、コントロール患者に対するAβ42免疫反応性は弱かった(図7A)。VHH V31-1及びmAb 6F/3Dについて得られた結果を比較するために、全ての希釈物についてAβ42免疫反応性を濃度測定により決定した。AD患者とコントロール患者との間のシグナルの差に対応するAβ42の量は、サンプル希釈率の関数として表した。VHH V31-1及びmAb 6F/3Dで得られた結果は同様であった(図7B)。よって、本アッセイにより、VHH V31-1は脳組織においてAβ42オリゴマーを検出することが可能であることが確証された。
【００７１】
４．VHH V31-1はフィブリルの形成を阻害する
フィブリル形成に対するVHH抗体の効果を調べるために、Aβ42がインビトロで凝集することができ、VHH抗体がAβ42に強固に結合することができる条件を選択した(凍結乾燥Aβ42を水に再懸濁し、次いで作用濃度にPBSで希釈し、超音波処理した)。ネガティブコントロールとして、無関係のVHH抗体(L35；配列番号：４；国際出願第WO 2004/044204号に記載のもの)を用いて同様な実験を行った。VHH抗体の顕著な特徴は、37℃での長時間のインキュベーションに耐える能力である(Arbabi Ghahroudiら，1997)。
【００７２】
VHH V31-1の非存在下で、DLSデータは、Aβ42が容易に凝集し、１日目に一方が約30nmで他方が約100〜150nmである２つのピークを形成したことを示した。その後、２日目には早くも、約300nmに中心を有する新たなピークが検出された。これは７日目には600〜700nmに発達した(表II)。
【００７３】
【表２】
2010531992.tif 000004
【００７４】
したがって、Aβ42の凝集は、水(図２)又はPBS(表II)に希釈したとき同様であるように見える。Aβ42を等モル濃度のVHH L35と共にインキュベートすると、２つの主要ピーク約100〜150nm及び600〜700nmが形成される同様な凝集パターンが観察された。興味深いことに、フィブリル形成の動力学は、Aβ42をVHH L35とインキュベートしたとき、Aβ42が単独のときより速いように見えた。なぜなら、600〜800nmのピークが、早くも４日目に現れたからである。Aβ42を等モル濃度のVHH V31-1と共にインキュベートすると、１つが約10〜25nmであり、１つが約150〜200nmに中心を有する２つのピークが観察された。顕著なことに、600〜800nmピークは、この複合体に関しては検出することができなかった。このことにより、高分子量の凝集体は、VHH V31-1の存在下で形成することができなかったことが示唆される。VHH抗体単独の平均光散乱強度は、Aβ42とインキュベートしたVHH抗体の強度より遥かに低い。フィブリル形成がないことは、ThTアッセイによっても確証された：実際、蛍光は、Aβ42を等モル濃度のVHH V31-1と共にインキュベートすると顕著に減少した一方、Aβ42単独のときには増加した(表III)。
【００７５】
【表３】
2010531992.tif 000005
【００７６】
Aβ42を等モル濃度のVHH L35と共にインキュベートしたとき、蛍光の有意な減少は観察されなかった。
【００７７】
Yan及びWang(2006)は、最近、Aβ42のＣ末端がAβ40のものより剛性であり、フィブリル及びオリゴマーにおけるβ-コンホメーション用に予め用意されている可能性が高く、したがって凝集用の内部種子(internal seed)として作用する可能性が高いことを示した。この概念は、Aβ42のＣ末端の６残基がフィブリルの結晶構造中のNNQQNYコンホメーションに最適に適合していることを示す最近のAβ42のバイオインフォマティック研究により支持されている(Thompsonら，2006；Nelsonら，2005)。VHH V31-1はオリゴマー中のこの種子を認識し、凝集体の形成を防止している可能性との仮説を立てることができる。
【００７８】
５．VHH V31-1は、ヒト皮質脳組織中のAβ42トリマー及びテトラマーを認識する
ヒト皮質脳組織におけるVHH-特異的免疫反応性の分布を調べた。Aβ42トリマー及びテトラマーに対応する16及び20KDaの２つの主要なバンドが、皮質脳ギ酸画分中にVHH V31-1で免疫検出された(図８)。
【００７９】
実施例３：hCMEC/D3を横切るインビトロVHH抗体の移行
方法
不死化ヒト脳内皮細胞hCMEC/D3は、以前にWekslerら(2005)に詳細に記載されている。VHH抗体(VHH V31-1及びL1-3)の存在下での細胞生存能を、Wekslerら(2005)に記載されるMTTアッセイにより評価した。
【００８０】
Wekslerら(2005)に記載されるように、transwellポリカーボネートインサートフィルター(孔サイズ３μm、Corning，Brumath，France)でVHH抗体に対するhCMEC/D3細胞単層の透過性を測定した。hCMEC/D3細胞をEGM-2培地中該フィルター上に２×105細胞/cm2のコンフルーエント密度で播種した。
【００８１】
播種の３日後に、Wekslerら(2005)に記載されるように輸送研究を行った。hCMEC/D3細胞を含まないか又は種々の薬理学的モジュレータに30分間予め曝露したhCMEC/D3細胞を含むコラーゲンでコーティングされたインサートのいずれかを含有する上方チャンバにVHH抗体を加えることにより、実験を開始した。輸送研究は37℃で行った。種々の時間間隔(10、30及び60分)で下方チャンバをサンプリングし、VHH抗体の存在をELISA及びウェスタンブロットにより決定した(結果を参照)。
【００８２】
結果
図５は、機能的VHH V31-1のトランスサイトーシスが存在する一方、VHH L1-3はhCMEC/D3を通過しないことを示す。この通過は、時間依存性であり、30分間で最大に達した。60分の時点で、VHH V31-1抗体の約１％が下方チャンバに存在した。この結果は、VHH V31-1が血液脳関門を横切って移行することができることを示す。
【００８３】
参考文献
−  Arbabi Ghahroudi M.ら，FEBS Letters, 1997, 414, 521-6.
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−  Bard F.ら，Nature Medicine, 2000, 6, 916-9.
−  Bitan G.ら，Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100, 330-5.
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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