(57)【要約】【課題】同種異系幹細胞移植はハイリスクの白血病の多くの患者のオプションではないので、これらの白血病のバイオロジーに関する我々の理解を改善すること及び改善された治療方法を開発することの必須の要求が存在する。【解決手段】本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の診断、予後、及び治療のための新規な方法及び組成物を提供する。発明は、抗−ＡＭＬ剤を同定する方法も提供する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が急性骨髄性白血病を有するか又は発症するリスクにあるか否かを診断する方法であって、被験者由来の試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、その際、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した、試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が、ＡＭＬを有するか又は発症するリスクを有する被験者であることの指標である、方法。
【請求項２】
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、図５−６、８−１８及び２１の何れかに示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２０，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−１９１，ｍｉＲ−１９９ａ及びｍｉＲ−１９９ｂ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料中の相当するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い、請求項１記載の方法。
【請求項５】
試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料中の相当するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い、請求項１記載の方法。
【請求項６】
急性骨髄性白血病の被験者の予後を決定する方法であって、被験者からの試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含むが、ｍｉＲ遺伝子産物がＡＭＬの予後不良に関連し；そして対照試料中の相当するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が予後不良の指標である、方法。
【請求項７】
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、図５−６、８−１８及び２１の何れかに示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
被験者が急性骨髄性白血病を有するか又は発症するリスクにあるか否かを診断する方法であって、
（１）被験者から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写することにより、標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを用意し；
（２）標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを用意し；そして
（３）試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生じさせたハイブリダイゼーションプロファイルと比較するが、その際、少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化が、ＡＭＬを有するか又は発症するリスクを有する被験者であることの指標である、方法。
【請求項９】
対照試料から生じさせたシグナルに比較した少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルがダウン制御されている、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
対照試料から生じさせたシグナルに比較した少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルがアップ制御されている、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、図５−６、８−１８及び２１の何れかに示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
被験者が急性骨髄性白血病を有するか又は発症するリスクにあるか否かを診断する方法であって、
（１）被験者から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写することにより、標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを用意し；
（２）標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを用意し；そして
（３）試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生じさせたハイブリダイゼーションプロファイルと比較するが、その際、シグナルの変化が、予後不良のＡＭＬを有するか又は発症するリスクを有する被験者であることの指標である、方法。
【請求項１３】
表５−６、８−１８及び２１の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のシグナルの変化が、予後不良のＡＭＬを有するか又は発症するリスクを有する被験者であることの指標である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
マイクロアレイが、ｍｉＲ−２０，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−１９１，ｍｉＲ−１９９ａ及びｍｉＲ−１９９ｂ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるｍｉＲＮＡに関する少なくとも一つのｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が被験者の癌細胞においてダウン制御されているか又はアップ制御されているようなＡＭＬを有する被験者においてＡＭＬを治療する方法であって、
（１）少なくとも被験者のｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてダウン制御されている場合に、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物又は単離されたそのバリアント又は生物学上活性なその断片を有効な量にて被験者に投与することにより癌細胞の増殖を阻害するが、但し、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ―１６−１ではなく；又は
（２）少なくとも被験者のｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてアップ制御されている場合に、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する少なくとも一つの化合物を有効な量にて被験者に投与することにより癌細胞の増殖を阻害する
ことを含む方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）における少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が図５−６、８−１８及び２１の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２０，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−１９１，ｍｉＲ−１９９ａ及びｍｉＲ−１９９ｂ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
被験者のＡＭＬを治療する方法であって、
（１）対照細胞に比較したＡＭＬ細胞中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の量を測定し；そして
（２）（ｉ）癌細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞中において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量よりも低いならば、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物又は単離されたそのバリアント又は生物学上活性なその断片を有効な量にて被験者に投与することによりＡＭＬ細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量を変更するが、但し、ｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ―１６−１ではなく、又は（ｉｉ）癌細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞中に置いて発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量よりも高いならば、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害するために有効な量の少なくとも一つの化合物を被験者に投与することによりＡＭＬ細胞において発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量を変更する
ことを含む方法。
【請求項１９】
工程（ｉ）における少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が図５−６、８−１８及び２１の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｉｉ）における少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２０，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−１９１，ｍｉＲ−１９９ａ及びｍｉＲ−１９９ｂ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又は単離されたそのバリアント、又は生物学上活性なその断片、及び薬学上受容可能な担体を含む、ＡＭＬを治療するための薬学組成物。
【請求項２２】
少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、対照細胞に比較してＡＭＬ細胞においてダウン制御されているｍｉＲ遺伝子産物に相当する、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が図５−６、８−１８及び２１の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子発現阻害剤化合物及び薬学上受容可能な担体を含む、ＡＭＬを治療するための薬学組成物。
【請求項２５】
少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、対照細胞に比較してＡＭＬ細胞においてアップ制御されているｍｉＲ遺伝子産物に相当する、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が図５−６、８−１８及び２１の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４記載の組成物。
【請求項２７】
抗−ＡＭＬ剤を同定する方法であって、試験薬剤を細胞に提供し、そしてＡＭＬ細胞における低下した発現レベルに関連した少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含むが、その際、上記細胞中の対照細胞に比較した上記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加が試験薬剤が抗−ＡＭＬ剤であることの指標である、方法。
【請求項２８】
ｍｉＲ遺伝子産物が図５−６、８−１８及び２１の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
抗−ＡＭＬ剤を同定する方法であって、試験薬剤を細胞に提供し、そしてＡＭＬ細胞における増加した発現レベルに関連した少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含むが、その際、上記細胞中の対照細胞に比較した上記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの低下が試験薬剤が抗−ＡＭＬ剤であることの指標である、方法。
【請求項３０】
ｍｉＲ遺伝子産物が図５−６、８−１８及び２１の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ＦＡＢ分類及び細胞遺伝学に関連したマイクロＲＮＡを測定する方法であって、図５に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項３２】
ＡＭＬの１２２人の患者において全生存に関連したマイクロＲＮＡを測定する方法であって、図６（表３）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項３３】
ＣＤ３４＋細胞とＡＭＬの１２２人の患者の間において差異発現されるｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図８（表５）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項３４】
他のＡＭＬ  ＦＡＢ亜種との比較においてＡＭＬ  ＦＡＢ  Ｍ０−Ｍ１において差異発現されるｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図９（表６）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項３５】
ＡＭＬ  ＦＡＢ  Ｍ３［ｔ（１５：１７）］において差異発現されるｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図１０（表７）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項３６】
他のＡＭＬ  ＦＡＢ亜種との比較においてＡＭＬ  ＦＡＢ  Ｍ４及びＭ５において差異発現されるｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図１１（表８）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項３７】
他のＡＭＬ  ＦＡＢ亜種との比較においてＡＭＬ  ＦＡＢ  Ｍ６及びＭ７において差異発現されるｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図１２、表９に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項３８】
高ＷＢＣ，及び末梢血（ＰＢ）及び骨髄（ＢＭ）芽細胞に関連したｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図１３（表１０）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項３９】
他のＡＭＬ  ＦＡＢ亜種との比較において正常巨核ＡＭＬにおいて差異発現されるｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図１４（表１１）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項４０】
１１ｑ２３再編成に関連したｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図１５（表１２）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項４１】
非複合又は正常核型との比較において複合核型の患者において差異発現されるｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図１６（表１３）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項４２】
第７染色体に関連したｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図１７（表１４）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項４３】
第８トリソミーに関連したｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図１８（表１５）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【請求項４４】
イダルビシン及びシタラビンに対する応答に関連したｍｉＲＮＡを測定する方法であって、図２１（表１８）に示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物を選択することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001] 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、多様な遺伝子異常と臨床上の特徴を伴う多数の実体を含む外因性疾患である１。病因は、相対的にわずかな種類の白血病として知られる２。中程度のリスク（intermediate risk）及び不良なリスク（poor risk）の細胞遺伝学の（cytogenetics）患者がＡＭＬの大多数を代表する；化学療法に基づく養生法はこれらの患者のほとんどを治癒できないし、幹細胞移植は、しばしば治療の選択枝である３、４。同種異系幹細胞移植はハイリスクの白血病の多くの患者のオプションではないので、これらの白血病のバイオロジーに関する我々の理解を改善すること及び改善された治療方法を開発することの必須の要求が存在する。
【０００２】
[0002] ＡＭＬにおけるｍＲＮＡ発現レベルの系統的なハイスループット分析は、ＡＭＬの新規な分子のサブグループを記載する；これらのうちのいくつかは顕在化を予測すると示唆された５−６。この進展にも拘わらず、公知の遺伝子への集中化は、ＡＭＬの分子パズルをはだかにするのに十分ではない可能性がある。非コードＲＮＡを含む全ゲノムアプローチの完成は、ＡＭＬバイオロジーの改善された理解を導くかもしれない。
【０００３】
[0003] マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、部分的又は完全に相補な部位への塩基対合を通して翻訳阻害又はそれらの標的ｍＲＮＡの分断を誘導することにより遺伝子発現を制御する、１９−２５ヌクレオチドの長さの非コードＲＮＡである７。ｍｉＲＮＡは、重大な生物学上のプロセスに関与するが、発生、細胞分割、アポトーシス及び増殖を含む８。最近、ｍｉＲＮＡ発現が造血及び癌に関連付けられている９−１１。Calinらは、全身性リンパ性白血病におけるｍｉＲ−１５ａとｍｉＲ−１６−１の欠失とダウン制御を示した１２。いくつかのグループは、大きな細胞リンパ腫１３及び小児性バーキットリンパ腫１４におけるｍｉＲＮＡ発現の変化を報告している。より最近では、トランスジェニックマウスのＢ細胞ｍｉＲ−１５５の過剰発現がポリクローナルなＢ細胞の増殖及びＢ細胞腫瘍形成をもたらすことが示された１５。これらの観察が示すのは、ｍｉＲＮＡがヒトの癌の開始及び進行に関与することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Lowenberg B, Downing J.R., Burnett A. Acute Myeloid leukemia. NEnglJMed 1999; 341 : 1051 -1062.
【非特許文献２】Grim wade D, Haferlach T. Gene expression profiling in acute myeloid leukemia. NEnglJMed 200A; 350:1676 -7.
【非特許文献３】Burnett AK. Current controversies: which patients with acute myeloid leukemia should receive bone marrow transplantation? An adult theater's view. Br. J Haematol 2002; 1 18:357 -64.
【非特許文献４】Drobyski WR. The role of allogeneic transplantation in high -risk acute myeloid leukemia. Leukemia 2004; 10: 1565 -8.
【非特許文献５】Bullinger L. Dohner K, Bair E. et al. Use of gene -expression profiling to identify prognostic subclasses in adult acute myeloid leukemia. NEngJMed 2004; 350:1605-1 61 6.
【非特許文献６】VaIk PJM, Verhaak GW, Beijen MA. Prognostically useful gene -expression profiles in acute myeloid leukemia. NEngJMed 2004 ; 350: 1617 -1628.
【非特許文献７】Pasquinelli AE, Hunter S, Bracht J. MicroRNAs: a developing story. Curr O, Genet Dev 2005; 15: 200 -5.
【非特許文献８】Bartel D. MicroRNAs: genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell 2004; 116:281 -297.
【非特許文献９】Chen CZ , Li L. Lodish H, Bartel D. MicroRNAs Modulate Hematopoietic lineage Differentiation . Science 2004; 303:83 -86.
【非特許文献１０】Volinia S, Calin G, Liu CG, et al. A microRNA expression signature in human solid tumors defines cancer targets. Proc Nad Acad Sci USA 2006; 103: 2257 -61.
【非特許文献１１】Lu J, Getz G, Miska EA, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 2005; Jun 9; 435: 834 -8.
【非特許文献１２】Calin GA, Liu CG, Sevignani C, et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B-CeIl Chronic Lymphocytic leukemias. Proc Nad Acad Sci USA 2004; 101 : 1175560.
【非特許文献１３】Eis PS, Tarn W, Sun, L. Accumulation of m iR- 155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. Proc Nad Acad Sci USA 2005; 102: 3627 -32.
【非特許文献１４】Metzler M, Wilda M, Busch K, et al. High expression of miR -155 /BIC RNA in children with Burkitt lymphoma. Genes Chomosomes and Cancer 2004; 39:167 -9.
【非特許文献１５】Costinean, S. et al. Pre B cell proliferation and lymphoblastic leukemia/high grade lymphoma in Eμ miR155 transgenic mice. Proc Nad Acad Sci USA 2006; 103: 7024 - 9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[0004] 本明細書にて議論されるとおり、ｍｉＲＮＡマイクロアレイを用いて、予後中程度及び予後不良が支配的な多くのセットのＡＭＬ患者をプロファイルすることにより、細胞遺伝学上のグループ及び臨床的特徴と、ｍｉＲＮＡプロファイルの関係を調査する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[0005] 急性骨髄性白血病癌細胞において差異発現されたマイクロＲＮＡの同定は、白血病の診断、予後及び治療の助けとなるはずである。さらに、これらのｍｉＲＮＡの仮想標的の同定は、それらの病理上の役割を解明する助けとなるはずである。一つの広い側面において、本明細書においては、急性骨髄性白血病の診断、予後及び治療のための方法及び組成物が提供される。
【０００７】
[0006] 本発明は、一部、正常の対照細胞に比較して胸部癌細胞において差異発現されるｍｉＲＮＡの急性骨髄性白血病癌−特異的特性の同定に基づく。
[0007] 従って、本発明は、被験者が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有するか又は発症するリスクにあるか否かを診断する方法を包含し、被験者由来の試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、その際、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した、試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が、ＡＭＬを有するか又は発症するリスクを有する被験者であることの指標である。
【０００８】
[0008] 特定の態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２９又はｍｉＲ−１８１である。特定の態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２９ｂ及び／又はｍｉＲ−１８１ｂである。
【０００９】
[0009] 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、当業者によく知られた様々な技術を用いて測定することができる。一つの態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、ノーザンブロット分析を用いて測定される。別の態様において、試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。また、別の態様においては、試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高いことがあり得る。
【００１０】
[0010] 発明は、被験者内の一つ又はそれより多い予後（prognostic）マーカーに関連するＡＭＬを診断する方法も提供し、被験者由来のＡＭＬ試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、その際、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した、試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が、一つ又はそれより多い予後マーカーに関連したＡＭＬを被験者が有する指標である。一つの態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、被験者から得られた試験試料由来のＲＮＡを逆転写することにより標的とオリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し；当該標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；そして、試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生じさせたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより、測定される。少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化は、被験者がＡＭＬを有するか又は発症するリスクにあるかの何れかの指標である。
【００１１】
[0011] 発明は、対照試料から生じさせたシグナルに比較した、少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルが脱制御された（例えば、ダウン制御されたか、又はアップ制御された）、被験者内のＣＬＬを治療する方法も包含する。
【００１２】
[0012] 特定の態様において、マイクロアレイは、ｍｉＲ−２９又はｍｉＲ−１８１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される一つ又はそれより多いｍｉＲＮＡに関するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００１３】
[0013] 発明は、被験者において一つ又はそれより多い予後不良（adverse prognostic）マーカーに関連したＡＭＬを被験者が有するか又は発症するリスクにあるか否かを診断する方法も包含し、被験者から得られた試験試料由来のＲＮＡを逆転写することにより標的とオリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し；当該標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；そして、試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生じさせたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することによる。シグナルの変化は、被験者がＡＭＬを有するか又は発症するリスクにあるかの何れかの指標である。
【００１４】
[0014] 発明は、被験者の癌細胞において少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が対照細胞に比してアップ制御されるか又はダウン制御されている、ＡＭＬを有する被験者を治療する方法も包含する。少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞中でダウン制御される場合、上記方法は、被験者の癌細胞の増殖が阻害されるように、被験者に対して有効な量の少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を投与することを含む。少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞中でアップ制御される場合、上記方法は、被験者の癌細胞の増殖が阻害されるように、当該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する少なくとも一つの化合物を有効な量、被験者に対して投与することを含む。特定の態様において、上記少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、選択されたｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１及びそれらの組み合わせである。
【００１５】
[0015] 関連する態様において、発明は、被験者のＡＭＬを治療する方法を提供するが、ＡＭＬ細胞中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の対照細胞に対する量を測定し；そして癌細胞中において発現されているｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞内で発現されているｍｉＲ遺伝子産物の量より少ないなら、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物を有効な量、被験者に投与するか、又は癌細胞中において発現されているｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞内で発現されているｍｉＲ遺伝子産物の量より多いなら、被験者の癌細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する少なくとも一つの化合物を有効な量被験者に投与することにより、ＡＭＬ細胞において発現されているｍｉＲ遺伝子産物の量を変更することを含む。特定の態様において、上記少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１６】
[0016] 発明は、さらに、ＡＭＬを治療するための薬学組成物を提供するが、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物及び薬学上受容可能な担体を含む。特定の態様において、当該薬学組成物は、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、適当な対照細胞に比較してＡＭＬ細胞中でダウン制御されているｍｉＲ遺伝子産物である。特定の態様において、上記少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−１８１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の特定の態様において、上記薬学組成物は、少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害剤化合物と薬学上受容可能な担体を含む。また、特定の態様において、上記薬学組成物は、適当な対照細胞に比較してＡＭＬ細胞中でアップ制御されているｍｉＲ遺伝子産物に特異的な少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害剤化合物を含む。
【００１７】
[0017] 別の態様において、本発明は、抗−ＡＭＬ剤を同定するための方法を提供するが、試験薬剤を細胞に提供し、そしてＡＭＬ細胞内の発現レベルの低下に関連した少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、適当な対照細胞に比したＡＭＬ細胞内でのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は試験薬剤が抗−ＡＭＬ剤であることの指標である。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、図５−６、８−１８及び２１（表１−２、５−１５及び１８）の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物からなる群から選択される。特定の態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２０，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−１９９ａ及びｍｉＲ−１９９ｂ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
[0018] 本発明は、試験薬剤を細胞に提供し、そしてＡＭＬ細胞内の発現レベルの増加に関連した少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、適当な対照細胞に比したＡＭＬ細胞内でのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの低下は試験薬剤が抗−ＡＭＬ剤であることの指標である、抗−ＡＭＬ剤を同定する方法も提供する。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２９，ｍｉＲ−１８１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１９】
[0019] 発明のさらなる利点、目的及び特徴は、以下の記載に一部示されており、そして以下の試験に際して当業者には一部明らかになり、あるいは発明の実施により学習されるかもしれない。発明の目的及び利点は、請求の範囲において特別に指摘されたように現実化され且つ達成されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】[0020] 図１Ａ−Ｆは、ｑＲＴ−ＰＣＲによる成熟ｍｉＲＮＡの定量によるマイクロアレイデータの有効性に関する。[0021] 図１Ａは、ＣＤ３４＋前駆細胞に関する６人のＡＭＬ患者のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現に関する。結果は、ｌｅｔ−７ｉ及び ２ΔＣｔ 変換による標準化（Ｃｔ）後の、ＣＤ３４＋発現値に関するＡＭＬ試料中のｍｉＲＮＡ発現の倍率変化として表される１８（薄いバーは標準偏差を表す）。[0022] 図１Ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いたマイクロアレイデータの有効性に関する。スキャターブロットは、各試料に関して、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ発現値（２  ｌｏｇ）と標準化されたｑＲＴ−ＰＣＲ  ＯＣｔ値（ｌｏｇスケール）の間の負の相関を示す（ピアソン相関係数  Ｒ＝０．０８  ｐ＜０．００１）。濃いピンクの線は予測されたＹを表す。ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｃｔ値）が低ければ低いほど、ｍｉＲＮＡの発現レベルは高い。例えば、右下の点は低いΔCtを有し（高発現）、そして高いマイクロアレイ（チップ）値に相関する。
【図１−２】[0023] 図１Ｃは、ＣＤ３４＋幹細胞に関する、成熟して造血に方向付けされた前駆細胞内のｍｉＲＮＡ発現に関する。結果は、１８Ｓ 及び ２ΔC１ 変換による標準化（Ｃｔ）後の、ＣＤ３４＋細胞に関する、別々の成熟及び方向付けされた前駆細胞の平均ｍｉＲＮＡ発現の倍数変化として表される。[0024] 図１Ｄは、ＦＡＢ分類に準じてグループ分けされたＡＭＬ試料中のｍｉＲ−１８１ｂの平均ｑＲＴ−ＰＣＲ発現に関する：各カテゴリーの患者試料の数は以下のとおりである；Ｍ０−Ｍ１（６），Ｍ２（８）及びＭ６Ｍ７（５）。
【図１−３】[0025] 図１Ｅは、正常な核型（１０）対他の異常な核型（２６）のＡＭＬ患者における平均ｍｉＲ−１０  ｑＲＴ−ＰＣＲ発現に関する。[0026] 図１Ｆは、複雑な核型の患者（６）と他の細胞質の異常性を有する患者（２２）におけるｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲ−１２６の平均発現に関する。異なる群の間のｍｉＲＮＡ発現をｔ−検定（ＳＰＳＳ）を用いて比較した。
【図２−１】[0027] 図２Ａ−Ｄは、新たに診断されたＡＭＬの患者における全生存に関連したマイクロＲＮＡに関する。マイクロアレイにより検出されたｍｉＲ−２０（図２Ａ）とｍｉＲ−２５（図２Ｂ）の高いか又は低い発現の１２２人のＡＭＬ患者に関する全生存のカプラン−マイヤー評価。ログランク検定を用いることにより、生存曲線の間の違いを比較した。類似の臨床的特徴を有する３６人のＡＭＬ患者の独立したセットを用いて、異なる技術を用いて（ｍｉＲＮＡ  ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ｍｉＲ−２０とｍｉＲ−２５の出力予測パワーを確認した。
【図２−２】ｑＲＴ−ＰＣＲにより検出されたｍｉＲ−２０（図２Ｃ）とｍｉＲ−２５（図２Ｄ）の高いか又は低い発現の３６人のＡＭＬ患者に関する全生存のカプラン−マイヤー評価。９５％信頼区間（ＣＩ  ９５％）の危険率をカプラン−マイヤー法により得た。
【図３】[0028] 図３Ａは、４人の異なる健康なドナーから得られた、骨髄赤血球／巨核前駆細胞及び末梢血成熟顆粒球／単球におけるｍｉＲ−１８１ｂとｍｉＲ−１３５ａの発現の平均ｑＲＴ−ＰＣＲ。結果は、４つのＣＤ３４＋細胞中のｍｉＲ−１８１ｂとｍｉＲ−１３５ｂのｍｉＲＮＡ発現に関しての異なる系列内のｍｉＲＮＡ発現の倍数変化として示される。[0029] 図３Ｂは、正常な核型の１０人の患者と異常な核型の２２人の患者におけるｍｉＲ−３０ｃの平均ｑＲＴ−ＰＣＲ発現値に関する。２つの群（正常対異常核型）からのｍｉＲＮＡ発現値をｔ−検定（ＳＰＳＳ）を用いて比較した。[0030] 図３Ｃは、完全寛解を経験した（６）か又は誘導化学療法の経験が失敗に終わった（６）新たにＡＭＬと診断されたＡＭＬ患者の１２人の別個の患者においての、イダルビシン及びシタラビンによる誘導化学療法を経験したＡＭＬ患者における、ｑＲＴ−ＰＣＲによる平均ｍｉＲ−２９ｂ発現に関する。２つの群（ＣＲ対失敗）からのｍｉＲＮＡ発現値をｔ−検定（ＳＰＳＳ）を用いて比較した。
【図４−１】[0031] 図４。表１。ＡＭＬとして新たに診断された１５８人の患者の臨床的及び細胞遺伝学的特徴付け。
【図４−２】図４続き。表１。ＡＭＬとして新たに診断された１５８人の患者の臨床的及び細胞遺伝学的特徴付け。
【図５】[0032] 図５。表２。ＦＡＢ分類及び細胞遺伝学に関連したマイクロＲＮＡ。
【図６】[0033] 図６。表３。１２２人のＡＭＬ患者の全生存に関連したマイクロＲＮＡ。
【図７】[0034] 図７。表４。マイクロアレイの標準化において使用されたハウスキーピング遺伝子プローブ。
【図８】[0035] 図８。表５。ＣＤ３４＋細胞と１２２人のＡＭＬ患者の間で差異発現されたｍｉＲＮＡ。
【図９】[0036] 図９（表６）。他のＡＭＬ  ＦＡＢサブタイプと比較したＡＭＬ  ＦＡＢ  Ｍ０−Ｍ１において差異発現されたｍｉＲＮＡ。
【図１０】[0037] 図１０。表７。ＡＭＬ  ＦＡＢ  Ｍ３［ｔ（１５；１７）］において差異発現されたｍｉＲＮＡ。
【図１１】[0038] 図１１。表８。他のＡＭＬと比較したＡＭＬ  ＦＡＢ  Ｍ４及びＭ５において差異発現されたｍｉＲＮＡ。
【図１２】[0039] 図１２。表９。他のＡＭＬと比較したＡＭＬ  ＦＡＢ  Ｍ６及びＭ７において差異発現されたｍｉＲＮＡ。
【図１３−１】[0040] 図１３。表１０。高ＷＢＣ，及び末梢血（ＰＢ）及び骨髄（ＢＭ）芽細胞に関連したｍｉＲＮＡ。
【図１３−２】[0040] 図１３。表１０。高ＷＢＣ，及び末梢血（ＰＢ）及び骨髄（ＢＭ）芽細胞に関連したｍｉＲＮＡ。
【図１４】[0041] 図１４。表１１。他のＡＭＬに比較した正常核型ＡＭＬにおいて差異発現されたｍｉＲＮＡ。
【図１５】[0042] 図１５。表１２。１１ｑ２３再編成に関連するｍｉＲＮＡ。
【図１６】[0043] 図１６。表１３。非複合又は正常の核型と比較した、複合核型（complex karyotype）の患者において差異発現されるｍｉＲＮＡ。
【図１７】[0044] 図１７。表１４。第７染色体に関連するｍｉＲＮＡ。
【図１８−１】[0045] 図１８。表１５。第８染色体トリソミーに関連するｍｉＲＮＡ。
【図１８−２】図１８続き。表１５。第８染色体トリソミーに関連するｍｉＲＮＡ。
【図１８−３】図１８続き。表１５。第８染色体トリソミーに関連するｍｉＲＮＡ。
【図１９】[0046] 図１９。表１６。初期誘導化学治療又は初期難治性疾患後の最初の再発における２４人の患者の臨床的特徴。
【図２０】[0047] 図２０。表１７。イダルビシン及びシタラビンにより処置された２４人の患者に関連するｍｉＲＮＡ。
【図２１】[0048] 図２１。表１８。イダルビシン及びシタラビンに対する応答に関連するｍｉＲＮＡ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
[0049] 本発明は、正常な対照細胞に比較しての急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における発現の変化を有する特定のマイクロＲＮＡの同定、及び、それらマイクロＲＮＡと特定の診断、予後及び治療上の特徴との関連に一部基づく。
【００２２】
[0050] 本明細書において使用される「ｍｉＲ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」、又は「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲ遺伝子からの未加工又は加工されたＲＮＡ転写物を意味する。ｍｉＲ遺伝子は蛋白質に翻訳されないため、用語「ｍｉＲ遺伝子産物」は、蛋白質を含まない。未加工のｍｉＲ遺伝子転写物は、「ｍｉＲ前駆体」とも呼ばれ、典型的には、約７０−１００ヌクレオチドの長さのＲＮＡ転写物を含む。ｍｉＲ前駆体は、ＲＮＡｓｅ（例えば、ダイサー、アルゴナウト、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ））による活性な１９−２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子への消化により加工され得る。この活性な１９−２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は、「加工された」ｍｉＲ遺伝子転写物又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも呼ばれる。
【００２３】
[0051] 当該活性１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、天然の加工経路（例えば、完全細胞又は細胞溶解物を用いて）を通してか又は合成加工経路（例えば、単離された加工酵素、単離されたダイサー、アルゴナウト、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩを用いて）により、ｍｉＲＮＡ前駆体から得ることができる。本明細書においてマイクロＲＮＡを名称で呼ぶ場合、名称は特に示されない限り、前駆体及び成熟形態の両者に対応する。
【００２４】
[0052] 本発明は、被験者が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有するか又は発症するリスクにあるか否かを診断する方法を包含し、被験者由来の試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定し、そして試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することを含む。本明細書において使用される「被験者」は、ＡＭＬを有するか又は疑いのある如何なる動物でもあり得る。好ましい態様において、被験者はＡＭＬを有するか又は有する疑いのあるヒトである。
【００２５】
[0053] 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、被験者から得られた生物学的試料の細胞内で測定することができる。例えば、慣用の生検技術により、組織試料をＡＭＬを有する疑いのある被験者から取り出すことができる。別の態様において、血液試料を被験者から取り出すことができ、そして、白血球細胞を標準技術によりＤＮＡ抽出のために単離することができる。血液又は組織の試料は、好ましくは、放射線治療、化学治療又は他の治療処置の前に被験者から得る。対応する対照の組織又は血液試料、又は対照の参照試料を、被験者の罹患していない組織から、正常なヒト又は正常な個体の集団から、又は、被験者試料中の大多数の細胞に対応する培養細胞から、得ることができる。対照の組織又は血液の試料は、次に、被験者の試料と共に加工されて、被験者試料からの細胞内の所定のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料の細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物レベルと比較され得る。あるいは、参照試料を得て試験試料とは別に（例えば、異なる時間）加工することで、被験者試料からの細胞内の所定のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルが参照試料からの対応するｍｉＲ遺伝子産物レベルと比較され得る。
【００２６】
[0054] 一つの態様において、試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現がアップ制御されている）。本明細書においては、被験者からの細胞又は組織試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞又は参照試料中の同じ遺伝子産物の量よりも高い場合に、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「アップ制御される」と用いる。別の態様において、試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現がダウン制御されている）。本明細書においては、被験者からの細胞又は組織試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の量が対照細胞又は参照試料中の同じ遺伝子産物の量よりも低い場合に、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「ダウン制御される」と用いる。対照及び正常試料中の相対的なｍｉＲ遺伝子発現は、一つ又はそれより多いＲＮＡ発現標準に関して測定することができる。標準は、例えば、ゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準細胞系中のｍｉＲ遺伝子発現レベル、被験者の非罹患組織中のｍｉＲ遺伝子発現レベル、又は正常なヒト対照の集団に関して以前に得られたｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含み得る。
【００２７】
[0055] 対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較しての、被験者から得られた試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（即ち、増加又は低下）は、被験者におけるＡＭＬ癌の存在の指標である。一つの態様において、試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様において、試験試料中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。
【００２８】
[0056] 特定の態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、本明細書中の図面及び表に示される群から選択される。
[0057] 試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生物学試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適した何れかの技術を用いて測定することができる。生物学試料（例えば、細胞又は組織）中のＲＮＡ発現レベルを測定するための適当な技術（例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ，インサイチュハイブリダイゼーション）は、当業者には周知である。特定の態様において、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、ノーザンブロット分析を用いて検出される。例えば、全細胞ＲＮＡを核酸抽出バッファーの存在下でホモジェナイズし、そして遠心分離することにより細胞から精製され得る。核酸を沈殿させ、そしてＤＮａｓｅと沈殿による処理でＤＮＡが除去される。ＲＮＡ分子は、次に標準の技術に従いアガロースゲル上の電気泳動により分離され、そしてニトロセルロースフィルターに転写される。次に、ＲＮＡを加熱によりフィルターに固定化する。特定のＲＮＡの検出及び定量は、問題のＲＮＡに相補な適切に標識されたＤＮＡ又はＲＮＡプローブを用いて達成される。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第７章を参照されたく、全開示は引用により本明細書に編入される。
【００２９】
[0058] 所定のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンハイブリダイゼーションのための適切なプローブ（例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ）は、本明細書の表に提供される核酸配列から生成することができ、限定ではないが、目的のｍｉＲ遺伝子産物に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％相補性を有するプローブ並びに目的のｍｉＲ遺伝子産物に対して完全相補性を有するプローブを含む。標識されたＤＮＡ又はＲＮＡプローブの製造方法及びその標的核酸配列へのハイブリダイゼーションの条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第１０及び１１章を参照されたく、その開示は引用により本明細書に編入される。
【００３０】
[0059] 例えば、核酸プローブは、例えば、放射性核種、例えば、３Ｈ，３２Ｐ，３３Ｐ，１４Ｃ，又は３５Ｓ；重金属；標識リガンドのための特異的結合対メンバーとして機能し得るリガンド（例えば、ビオチン、アビジン、又は抗体）；蛍光分子；化学発光分子；酵素等）により標識され得る。
【００３１】
[0060] プローブは、Rigby et al. (1977), J. MoI. Biol. 113:237-251のニックトランスレーション法又はFienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132:6-13のランダムプライミング法の何れかにより高い比活性まで標識することができ、それらの全開示は引用により本明細書に編入される。後者は一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型から高い比活性の３２Ｐ−標識プローブを合成するために選択される方法である。例えば、前から存在するヌクレオチドを高い放射活性のヌクレオチドにニックトランスレーション法に従い置換することにより、１０ｃｐｍ／マイクログラムの十分過剰な比活性の３２Ｐ−標識核酸プローブを製造することができる。ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフによる検出を次にハイブリダイズしたフィルターを写真フィルムに暴露することにより実施できる。ハイブリダイズしたフィルターにより暴露された写真フィルムの濃度スキャンはｍｉＲ遺伝子転写レベルの正確な測定を提供する。別のアプローチを用いるなら、ｍｉＲ遺伝子転写物レベルをコンピューターイメージ化システム、例えば、Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager、アマシャムバイオサイエンス、ピスカタウエイ、ＮＪから市販により定量化することができる。
【００３２】
[0061] ＤＮＡ又はＲＮＡの放射性核種の標識が実用的でない場合、ランダムプライマー方法を用いることにより、アナログ、例えば、ｄＴＴＰアナログである５−（Ｍ−（Ｎ−ビオチニル−イプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン３リン酸をプローブ分子に取り込むことができる。ビオチン化プローブオリゴヌクレオチドは、ビオチン結合蛋白質、例えばアビジン、ストレプトアビジン及び抗体（例えば、抗−ビオチン抗体）を蛍光染料又は発色反応を生じる酵素にカップリングさせたものを用いる反応により検出することができる。
【００３３】
[0062] ノーザン及び他のＲＮＡハイブリダイゼーション技術に加え、ＲＮＡ転写物のレベルの測定は、インサイチュハイブリダイゼーションの技術を用いて達成できる。この技術は、ノーザンブロット技術よりもわずかな細胞しか必要とせず、そして全細胞を顕微鏡カバースリップ上へ被覆して放射線活性又は他の標識核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）プローブを含む溶液により細胞の核酸含有物を釣ることを含む。この技術は、被験者からの組織生検試料を分析するのに特によく適している。インサイチュハイブリダイゼーション技術の実行は、詳細には、米国特許番号5,427,916に記載されており、その全開示を引用により本明細書に編入する。所定のｍｉＲ遺伝子産物のインサイチュハイブリダイゼーションに適したプローブは、本明細書に提供された核酸配列から生成することができ、そして限定ではないが、目的のｍｉＲ遺伝子産物に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％相補性を有するプローブ並びに目的のｍｉＲ遺伝子産物に対して完全相補性を有するプローブを含む。
【００３４】
[0063] 細胞内のｍｉＲ遺伝子転写物の相対数は、ｍｉＲ遺伝子転写物の逆転写、次にポリメラーゼチェインリアクションによる転写物の逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）によっても検出することができる。ｍｉＲ遺伝子転写物のレベルは、内部標準、例えば、同じ試料の中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子からのｍＲＮＡのレベルとの比較において定量することができる。内部標準としての使用のための適切な「ハウスキーピング」遺伝子は、例えば、ミオシン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）を含む。定量性及び半定量性ＲＴ−ＰＣＲを実施するための方法及びその変法は当業者に周知である。
【００３５】
[0064] いくつかの例として、試料中の多数の異なるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に測定することは、望ましいかもしれない。他の例としては、癌に相関するすべての公知のｍｉＲ遺伝子の転写物の発現レベルを測定することが望ましいかもしれない。数百ものｍｉＲ遺伝子又は遺伝子産物の癌特異的発現レベルを評価することは時間を浪費して、大量の全ＲＮＡ（例えば、ノーザンブロット各々のために少なくとも２０μｇ）及び放射性同位元素を必要とするオートラジオグラフ技術を必要とする。
【００３６】
[0065] これらの制限を克服するためには、マイクロチップフォーマット（即ち、マイクロアレイ）中のオリゴライブラリーを、ｍｉＲ遺伝子のセットに特異的なオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド）プローブのセットを含むように構築してよい。そのようなマイクロアレイを用いる際、ＲＮＡの逆転写により標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを用意し、そしてそれらをハイブリダイズさせてマイクロアレイ上の当該オリゴヌクレオチドを釣り上げてハイブリダイゼーション又は発現のプロファイルを生成することにより、生物学試料中の複数のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定することができる。試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルは、次に、対照試料のそれと比較されることにより、どのマイクロＲＮＡがＡＭＬ癌細胞中で発現レベルが変更されるかを決定することができる。本明細書において使用される「プローブオリゴヌクレオチド」又は「プローブオリゴデオキシヌクレオチド」は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味する。「標的オリゴヌクレオチド」または「標的オリゴデオキシヌクレオチド」は、検出される分子（例えば、ハイブリダイゼーションにより）を意味する。「ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド」又は「ｍｉＲに特異的なプローブヌクレオチド」は、特定のｍｉＲ遺伝子産物に対して又は特定のｍｉＲ遺伝子産物の逆転写物に対してハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３７】
[0066] 特定の試料の「発現プロファイル」又は「ハイブリダイゼーションプロファイル」は、本質的には、試料の状態のフィンガープリントである；２つの状態が類似に発現される何れかの特定の遺伝子であるが、多数の遺伝子の評価は同時に細胞の状態に独特の遺伝子発現プロファイルを生じさせることを可能にする。即ち、正常な組織がＡＭＬ細胞から識別されるかもしれず、そしてＡＭＬ細胞内では異なる予後状態（例えば、幸福な（good）あるいは不幸な（poor）長期間生存の見込み）が決定されるかもしれない。異なる状態のＡＭＬ細胞の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子のアップ制御及びダウン制御の両者）が得られる。ＡＭＬ細胞又は正常細胞において差異発現される配列の同定、並びに異なる予後の結果をもたらす差異発現は、多くの様式におけるこの情報の使用を可能にさせる。例えば、特定の処置療法を評価してよい（例えば、化学治療薬剤が特定の患者において長期の予後を改善するように作用するか否かを決定するため）。同様に、患者の試料を公知の発現プロファイルと比較することにより、診断を実施するか又は確認してよい。さらに、これらの遺伝子の発現プロファイル（又は個々の遺伝子）は、ＡＭＬ発現プロファイルを抑圧するか又は不良な予後プロファイルを良好な予後プロファイルに変換する薬剤候補のスクリーニングを可能にさせる。
【００３８】
[0067] 従って、発明は、被験者がＡＭＬを有するか又はＡＭＬを発症するリスクにあるか否かを診断する方法を提供するが、被験者から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写することにより標的オリゴヌクレオチドのセットを用意し、当該標的オリゴヌクレオチドをｍｉＲＮＡ―特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生じさせたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することを含み、その際、少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化が、ＡＭＬを有するか又はＡＭＬを発症するリスクにある被験者である指標である。一つの態様において、上記マイクロアレイは、すべての公知のヒトｍｉＲＮＡの実質的部分のｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００３９】
[0068] 特定の態様において、上記マイクロアレイは、図５−６、８−２８及び２１（表１−２、５−１５及び１８）の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される一つ又はそれより多いｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。一つの態様において、すべての一つのｍｉＲＮＡ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２０，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−１９１，ｍｉＲ−１９９ａ及びｍｉＲ−１９９ｂ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００４０】
[0069] 上記マイクロアレイは、公知のｍｉＲＮＡ配列から生じさせた遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから製造することできる。当該アレイは、各ｍｉＲＮＡに関して２つの異なるオリゴヌクレオチドを含んでよく、一方は活性な成熟配列を含み、そして他方はｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である。アレイは、対照、例えば、ヒトオルソログとたった１塩基しか違わない一つ又はそれより多いマウス配列を含んでもよく、ハイブリダイゼーションストリンジェント条件に関する対照としても機能し得る。両種由来のｔＲＮＡ及び他のＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ及びｍＲＮＡ）もマイクロチップ上にプリントして、特異的ハイブリダイゼーションのための内部の相対的に安定な陽性対照を用意してもよい。非特異的ハイブリダイゼーションのための一つ又はそれより多い適切な対照をマイクロチップ上に含ませてもよい。このためには、あらゆる公知のｍｉＲＮＡと何の相同性もないことに基づいて配列が選択される。
【００４１】
[0070] マイクロアレイは、当業界公知の技術を用いて製作してよい。例えば、適当な長さ、例えば、４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドを、Ｃ６位において５’−アミン修飾して、市販のマイクロアレイシステム、例えば、GeneMachine OmniGrid（登録商標） 100 Microarrayer 及びAmersham CodeLink（登録商標）活性化スライドを用いてプリントする。標的ＲＮＡに相当する標識ｃＤＮＡオリゴマーは、標的ＲＮＡを標識プライマーで転写することにより製造する。第１鎖合成後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させてＲＮＡ鋳型を分解する。そうして製造された標識標的ｃＤＮＡを次にハイブリダイズ条件下、例えば、６Ｘ  ＳＳＰＥ／３０％フォルムアミド、２５℃にて１８時間にてマイクロアレイにハイブリダイズさせ、０．７５Ｘ  ＴＮＴ中で３７℃において４０分間洗浄する。固定化されたプローブＤＮＡが試料中の相補性の標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置においてハイブリダイゼーションが起こる。標識された標的ｃＤＮＡは、結合が起きるアレイ上の正確な位置を示し、自動的な検出と定量を可能にする。結果はハイブリダイゼーション事象のリストからなり、特定のｃＤＮＡ配列の相対的富裕性を示し、よって、患者の試料中の対応する相補性のｍｉＲの相対的富裕性を示す。一つの態様によれば、標識されたＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識プライマーから製造されたビオチン標識ｃＤＮＡである。マイクロアレイは、次に、例えば、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを用いてビオチン含有転写物の直接検出により加工されて、慣用のスキャニング法によりスキャンされる。アレイ上の各点のイメージ強度は患者試料中の対応するｍｉＲの富裕性に比例する。
【００４２】
[0071] アレイの使用はｍｉＲＮＡ発現検出に関していくつかの利点を有する。第１に、数百の遺伝子の全世界的発現が同じ試料において同じ時間点にて同定できる。第２に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深いデザインにより、成熟分子と前駆体分子の両方の発現が同定できる。第３に、ノーザンブロット分析との比較において、チップは少量のＲＮＡしか必要とせず、２．５μｇの全ＲＮＡを用いて再現性のある結果を提供する。相対的に限定された数のｍｉＲＮＡ（種あたり数百）が、各々に関して別個のオリゴヌクレオチドプローブの、いくつかの種に関する共通のマイクロアレイの構築を可能にする。そのようなツールは、様々な条件下における各公知のｍｉＲのトランス種発現の分析を可能にする。
【００４３】
[0072] 特定のｍｉＲの定量発現レベルアッセイのための用途に加えて、ｍｉＲＮオームの実質的な部分、好ましくは全ｍｉＲＮオームに相当するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロチップを用いることにより、ｍｉＲ発現パターンの分析のためのｍｉＲ発現プロファイリングを実施してよい。別個のｍｉＲのサインは、確立された疾患マーカーに関連し得るか、又は疾患状態に直接関連し得る。
[0073] 本明細書に記載される発現プロファイリング方法によれば、癌（例えば、ＡＭＬ）を有する疑いのある患者の試料からの全ＲＮＡを定量性逆転写することにより、試料中のＲＮＡに相補性の標識標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供する。標的オリゴデオキシヌクレオチドは、次に、ｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより、試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。結果は、試料中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表す、試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルである。ハイブリダイゼーションプロファイルは、試料からの標的オリゴデオキシヌクレオチドの、マイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ−特異的オリゴヌクレオチドへ結合することに関するシグナルを含む。当該プロファイルは、結合の存在又は不在として記録してよい（シグナル対ゼロシグナル）。より好ましくは、記録されたプロファイルが各ハイブリダイゼーションからのシグナルの強度を含む。プロファイルは、正常、例えば癌ではない対照試料から生じさせたハイブリダイゼーションプロファイルと比較される。シグナルの変化は被験者における癌の存在又は癌を発症する性質の指標である。
【００４４】
[0074] ｍｉＲ遺伝子発現を測定する他の技術も、当業者の範囲内であり、ＲＮＡ転写の率及び分解の率を測定するための様々な技術を含む。
[0075] 発明は、ＡＭＬ癌の被験者の予後を決定する方法も含むが、ＡＭＬの特定の予後に関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の被験者試験試料中のレベルを測定することを含む（例えば、良好又は陽性の予後、不良な予後又は予後不良）。これらの方法によれば、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比較した、試験試料中の特定の予後に関連するｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、特定の予後を伴うＡＭＬを有する被験者の指標である。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は予後不良（即ち、不良な予後）に関連する。予後不良の例は、限定ではないが、低生存率及び急速な疾患進行を含む。
【００４５】
[0076] 特定の態様において、被験者から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写することにより標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生じさせたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する。
【００４６】
[0077] 如何なる理論にも拘束されることを意図しないが、細胞中の一つ又はそれより多いｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、これらｍｉＲの一つ又はそれより多くの意図された標的の分解をもたらし得て、ＡＭＬの形成を導き得る。よって、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを変更することは（例えば、ＡＭＬ癌細胞内でアップ制御されるｍｉＲのレベルを低下させることによるか、ＡＭＬ癌細胞内でダウン制御されるｍｉＲのレベルを増加させることによる）、ＡＭＬ癌の治療に成功するかもしれない。
【００４７】
[0078] 従って、本発明は、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が被験者の細胞（例えば、ＡＭＬ癌細胞）中で脱制御される（例えば、ダウン制御、アップ制御）被験者においてＡＭＬを治療する方法を包含する。一つの態様においては、試験試料（例えば、ＡＭＬ癌試料）中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様においては、試験試料（例えば、ＡＭＬ癌試料）中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。当該少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物がＡＭＬ癌細胞中でダウン制御されている場合、上記方法は、被験者において癌細胞の増殖が阻害されるように、当該少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又はその単離されたバリアント又は生物学上活性な断片を有効量にて投与することを含む。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物が被験者の癌細胞においてダウン制御されている場合、被験者への有効量の単離ｍｉＲ遺伝子産物の投与は、癌細胞の増殖を阻害することができる。被験者に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、癌細胞においてダウン制御される内生の野生型ｍｉＲ遺伝子産物（例えば、本明細書中の表に示されるｍｉＲ遺伝子産物）と同一であり得、あるいはそれは、そのバリアント又は生物学上活性な断片であり得る。
【００４８】
[0079] 本明細書において定義される、ｍｉＲ遺伝子産物の「バリアント」は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して１００％未満の同一性を有し、かつ対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の一つ又はそれより多い生物活性を所有するｍｉＲＮＡを意味する。そのような生物活性の例は、限定ではないが、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害（例えば、標的ＲＮＡ分子の翻訳を阻害すること、標的ＲＮＡ分子の安定性を変調すること、標的ＲＮＡ分子のプロセシングを阻害すること）及びＡＭＬに関連した細胞プロセス（例えば、細胞分化、細胞成長、細胞死）の阻害を含む。これらのバリアントは、種のバリアント及びｍｉＲ遺伝子中の一つ又はそれより多い変異（例えば、置換、欠失、挿入）の結果のバリアントである。特定の態様において、バリアントは、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一である。
【００４９】
[0080] 本明細書で定義される、ｍｉＲ遺伝子産物の「生物学上活性な断片」は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の一つ又はそれより多い生物活性を所有するｍｉＲＮＡ遺伝子産物のＲＮＡ断片を意味する。上記のとおり、そのような生物活性の例は、限定ではないが、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害及びＡＭＬに関連した細胞プロセスの阻害を含む。特定の態様において、生物学上活性な断片は、少なくとも約５、７、１０、１２、１５、又は１７ヌクレオチドの長さである。特定の態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、一つ又はそれより多い追加の抗癌処置と組み合わされて被験者に投与され得る。適切な抗癌処置は、限定ではないが、化学治療、放射線治療及びそれの組み合わせ（例えば、放射線化学治療）を含む。
【００５０】
[0081] 上記少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてアップ制御される場合、上記方法は、ＡＭＬ癌細胞の増殖が阻害されるように、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する化合物を治療上有効な量で被験者に投与することを含む。そのような化合物は、本明細書においては、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物と呼ぶ。適切なｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の例は、限定ではないが、本明細書において記載されたものを含む（例えば、二重鎖ＲＮＡ，アンチセンス核酸及び酵素ＲＮＡ分子）。特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、一つ又はそれより多い追加の抗癌処置と組み合わされて被験者に投与され得る。適切な抗癌処置は、限定ではないが、化学治療、放射線治療及びそれの組み合わせ（例えば、放射線化学治療）を含む。
【００５１】
[0082] 特定の態様において、ＡＭＬ癌細胞においてダウン制御される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、図５−６、８−１８及び２１（表１−２、５−１５及び１８）の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡからなる群から選択される。
【００５２】
[0083] 特定の態様において、当該少なくとも一つのｍｉＲＮＡ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２０，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−１９１，ｍｉＲ−１９９ａ及びｍｉＲ−１９９ｂおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５３】
[0084] 本明細書において使用される用語「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」、「処置（treatment）」は、疾患又は症状、例えばＡＭＬ癌に関連した兆候を改善することを意味し、疾患の兆候の開始を阻止するか又は遅延させること、及び／又は疾患又は症状の兆候の重度又は頻度を減らすことを含む。用語「被験者」及び「個体」は、本明細書においては、動物、例えば哺乳類を含むよう定義され、限定ではないが、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハツカネズミ、ラット、マウス及びその他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類、又はマウス種を含む。好ましい態様において、動物はヒトである。
【００５４】
[0085] 本明細書において使用される、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の「有効量」は、ＡＭＬ癌を患う被験者の癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。当業者は、因子、例えば、被験者のサイズ及び体重；疾患侵入の範囲；被験者の齢、健康及び性別；投与経路；及び投与が局所か全身の何れかを考慮することにより、与えられた被験者に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量を容易に決定することができる。
【００５５】
[0086] 例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、処置される腫瘍塊のおおよその質量に基づいて決定することができる。腫瘍塊のおおよその質量は、塊のおおよその体積を計算することにより決定することができ、その際、１立法センチメートルの体積は大まかに１グラムと均等である。腫瘍塊の質量に基づいた、有効な量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、約１０−５００マイクログラム／腫瘍塊の質量グラムの範囲であり得る。特定の態様において、腫瘍塊は、少なくとも約１０マイクログラム／腫瘍塊質量、少なくとも約６０マイクログラム／腫瘍塊質量又は少なくとも約１００マイクログラム／腫瘍塊質量であり得る。
【００５６】
[0087]単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効な量は、処置される被験者のおおよその体重又は見積もられた体重に基づいても決定できる。好ましくは、そのような有効量は、本明細書において記載されるとおり、非経口又は腸に投与される。例えば、被験者に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効な量は、約５−３０００マイクログラム／体重ｋｇ、約７００−１０００マイクログラム／体重ｋｇ、又は、約１０００マイクログラム／体重ｋｇより高い範囲であり得る。
【００５７】
[0088] 当業者は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の与えられた被験者への投与のための適切な用量管理も容易に決定することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物を被験者に１回投与することができる（例えば、単一の注射又は沈着（deposition））。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は日に１回又は２回約３日から２８日の期間にわたり、より特定すれば約７日から約１０日の期間にわたり投与することができる。特定の用量管理においては、ｍｉＲ遺伝子産物を１日に１回７日間投与する。用量管理が複数投与を含む場合、被験者に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効な量は、全用量管理を通して投与される遺伝子産物の全部の量を含み得ることが理解される。
【００５８】
[0089] 本明細書において使用される「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物は、合成されたか、変更されたか、又はヒトの介入を通して天然状態から取り出されたものである。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物、又はその天然状態の共存物質から部分的又は完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離された」と考えられる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、実質上精製された形態にて存在することができるか、又はｍｉＲ遺伝子産物が送達された細胞内に存在することができる。即ち、細胞へ意図的に送達されるか又は細胞内で発現されるｍｉＲ遺伝子産物は、「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物であると考えられる。ｍｉＲ前駆体分子から細胞内部で生産されたｍｉＲ遺伝子産物も、「単離された」分子であると考えられる。発明によれば、本明細書において記載される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、被験者（例えば、ヒト）においてＡＭＬ癌を治療するための医薬の製造に使用することができる。
【００５９】
[0090] 単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、多数の標準技術を用いて得ることができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は、当業界公知の方法を用いて化学合成するか又は組換え生産することができる。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイト及び慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の商業上の供給者は、例えば、プロリゴ (ハンブルグ、ドイツ)、ダーマコンリサーチ(ラファイエット、コロラド、 アメリカ合衆国)、ピアスケミカル(ペルビオサイエンス、ロックフォード、イリノイ、アメリカ合衆国の一部)、グレンリサーチ(スターリング、バージニア、アメリカ合衆国)、ケムジーンズ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）(アシュランド、マサチューセッツ、アメリカ合衆国) 及びクルアケム (グラスゴー、英国)を含む。
【００６０】
[0091] あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は、何れかの適切なプロモーターを用いて組換え環状又は直鎖状ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。プラスミドからＲＮＡを発現させるのに適したプロモーターは、例えば、Ｕ６又はＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列又はサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業界の範囲内である。発明の組換えプラスミドは、癌細胞中のｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能か又は制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【００６１】
[0092] 組換えプラスミドから発現されるｍｉＲ遺伝子産物は、標準技術を用いて培養細胞系から単離することができる。組換えプラスミドから発現されるｍｉＲ遺伝子産物は、癌細胞に送達するか又は癌細胞内で直接に発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物を癌細胞に送達するための組換えプラスミドの使用は、以下において詳細に論じられる。
【００６２】
[0093] ｍｉＲ遺伝子産物は別の組換えプラスミドから発現することができ、あるいは、同じ組換えプラスミドから発現させることができる。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、単一のプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現されるか、又は前駆体分子を、限定ではないが癌細胞内のプロセシングシステム実在物（extant）を含む適切なプロセシングシステムにより機能性ｍｉＲ遺伝子産物にプロセシングされる。他の適切なプロセシングシステムは、限定ではないが、インビトロドロソフィラ細胞溶解物システム（例えば、Tuschlらに対する米国公開特許出願番号2002/0086356に記載されるとおりであり、その全開示は引用により本明細書に編入される）及びエシェリヒアコリＲＮＡｓｅ  ＩＩＩシステム（Yangらに対する米国公開特許出願番号2004/0014113に記載されるとおりであり、その全開示は引用により本明細書に編入される）を含む。
【００６３】
[0094] ｍｉＲ遺伝子産物を発現するのに適したプラスミドの選択、核酸配列をプラスミドに挿入して当該遺伝子産物を発現させる方法、及び当該組換えプラスミドを目的の細胞に送達する方法は、当業界の範囲内である。例えば、Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505; and Paul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505- 508を参照されたく、それらの全開示は引用により本明細書に編入される。
【００６４】
[0095] 一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ中期−初期プロモーターの制御下でｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書において使用される、プロモーターの「制御下で」は、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列がプロモーターの３’に位置し、その結果当該プロモーターがｍｉＲ遺伝子産物コーディング配列の転写を開始できることを意味する。
【００６５】
[0096] ｍｉＲ遺伝子産物は、組換えウイルスベクターから発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物は２つの別々の組換えウイルスベクターから、又は同じウイルスベクターから発現させることができる。組換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、標準技術により培養細胞発現系から単離することができるか、又は癌細胞内で直接に発現させることができる。ｍｉＲ遺伝子産物を癌細胞へ送達するための組換えウイルスベクターの使用は、以下において詳細に論じられる。
【００６６】
[0097] 発明の組換えウイルスベクターは、ｍｉＲ遺伝子細胞及びＲＮＡ配列を発現するための適切なプロモーターをコードする配列を含む。適切なプロモーターは、限定ではないが、Ｕ６又はＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列又はサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は、当業界の範囲内である。発明の組換えウイルスベクターは、癌細胞中のｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能か又は制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【００６７】
[0098] ｍｉＲ遺伝子産物のためのコーディング配列を受容できる何れかのウイルスベクターを用いることができ、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクターである。ウイルスベクターの親和性は、ベクターを他のウイルスからのエンベロープ蛋白質又は他の表面抗原によりシュードタイピングする（pseudotyping）か、又は別のウイルスキャプシッド蛋白質を置き換えることにより、適宜修飾することができる。
【００６８】
[0099] 例えば、発明のレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ（Mokola）等からの表面蛋白質によりシュードタイピングすることができる。発明のＡＡＶベクターは、ベクターを工作して異なるキャプシッド蛋白質血清型を発現することにより、異なる細胞を標的化するように作成することができる。例えば、血清型２のゲノム上で血清型２のキャプシッドを発現するＡＡＶベクターをＡＡＶ  ２／２と呼ぶ。ＡＡＶ  ２／２ベクターの中のこの血清型２キャプシッド遺伝子を、血清型５キャプシッド遺伝子により置き換えて、ＡＡＶ  ２／５ベクターを生産することができる。異なるキャプシッド蛋白質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、当業界の範囲内である；例えば、Rabinowitz, J. E., et al. (2002), J. Virol. 76:791-801に開示されており、その全開示は引用により編入される。
【００６９】
[00100] 発明における使用のために適した組換えウイルスベクターの選択、ＲＮＡを発現するための核酸配列のベクターへの挿入方法、ウイルスベクターの目的の細胞への送達方法、及び発現されたＲＮＡ産物の回収は、当業界の範囲内である。例えば、Dornburg (1995), Gene Therap. 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therap. 1 :5- 14; 及びAnderson (1998), Nature 392:25-30に開示されており、それらの全開示は引用により編入される。
【００７０】
[00101] 特に適切なウイルスベクターは、ＡＶ及びＡＡＶに由来するものである。ｍｉＲ遺伝子産物を発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、及び当該ベクターを細胞に送達するための方法は、Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010に記載されており、その全開示は引用により編入される。ｍｉＲ遺伝子産物を発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構築する方法、及び当該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Samulski et al. (1987), J Virol. 61 :3096-3101 ; Fisher et al. (1996), J Virol, 70:520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826;米国特許番号5,252,479;米国特許番号5,139,941;国際特許出願番号WO 94/13788;及び国際特許出願番号WO 93/24641に記載されており、それらの全開示は引用により編入される。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ＣＭＶ中期初期プロモーターを含む単一の組換えＡＡＶベクターから発現される。
【００７１】
[00102] 特定の態様において、発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ポリＴ停止配列と作動可能に連結したｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列をヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの制御下に含む。本明細書において使用される「ポリＴ停止配列に作動可能に連結」は、センス又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列が５’方向でポリＴ停止シグナルにすぐ隣接することを意味する。ベクターからのｍｉＲ配列の転写の間、ポリＴ停止シグナルは転写を停止させるように機能する。
【００７２】
[00103] 発明の治療方法の別の態様において、ｍｉＲ発現を阻害する少なくとも一つの有効な量の化合物が被験者に投与され得る。本明細書において使用される「ｍｉＲ発現を阻害する」は、治療後にｍｉＲ遺伝子産物の前駆体及び／又は活性な成熟形態の生産が治療前に生産される量より低くなることを意味する。当業者は、例えば、本明細書において論じられるｍｉＲ転写物レベルを測定するための技術を用いて、癌細胞中でｍｉＲ発現が阻害されるか否かを容易に決定することができる。阻害は、遺伝子発現のレベルにおいて（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を阻害することにより）、又はプロセシングのレベルにおいて（ｍｉＲ前駆体を活性な成熟ｍｉＲにプロセシングすることを阻害することにより）、生じ得る。
【００７３】
[00104] 本明細書において使用されるｍｉＲ発現を阻害する化合物の「有効な量」は、癌（例えば、ＡＭＬ癌）を患う被験者において癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。当業者は、因子、例えば被験者のサイズ及び体重；疾患浸透の程度；被験者の齢、健康、及び性別；投与の経路；及び投与が局所であるか又は全身か否かを考慮することにより、所定の被験者に対して投与されるｍｉＲ発現阻害化合物の有効量を容易に決定することができる。
【００７４】
[00105] 例えば、発現阻害化合物の有効な量は、本明細書において記載されるとおり、治療される腫瘍塊のおおよその質量に基づき得る。ｍｉＲ発現を阻害する化合物の有効な量は、治療される被験者の近似の体重又は見積もられた体重に基づくこともできる。
【００７５】
[00106] 当業者は、本明細書において記載されるとおり、ｍｉＲ発現を阻害する化合物を所定の被験者に送達するための適切な用量管理を容易に決定することができる。
[00107] ｍｉＲ遺伝子発現を阻害するのに適した化合物は、二重鎖ＲＮＡ（例えば、短いか又は小さい干渉ＲＮＡ又は「ｓｉＲＮＡ」）、アンチセンス核酸、及び酵素的ＲＮＡ分子、例えばリボザイムを含む。これらの化合物の各々は、所定のｍｉＲ遺伝子産物を標的化して、そして標的化されたｍｉＲ遺伝子産物の発現を干渉することができる（例えば、翻訳を阻害することにより、分断及び／又は分解を誘導することにより）。
【００７６】
[00108] 例えば、所定のｍｉＲ遺伝子の発現は、ｍｉＲ遺伝子産物の少なくとも一部に対して少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相同性を有する単離された二重鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によるｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することにより阻害することができる。特定の態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、「短いか又は小さい干渉ＲＮＡ」であるか又は「ｓｉＲＮＡ」である。
【００７７】
[00109] 本方法において有用なｓｉＲＮＡは、約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチドの長さ、好ましくは約１９から約２５ヌクレオチドの長さの短い二重鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、標準のワトソンクリック塩基対合相互作用（以後、「塩基対合」）により共にアニールされた、センスＲＮＡ鎖と相補性のアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は標的ｍｉＲ遺伝子産物内に含まれる核酸配列と実質上同一の核酸配列を含む。
【００７８】
[00110] 本明細書において使用される標的ｍｉＲ内に含まれる標的核酸に対して「実質上同一の」ｓｉＲＮＡ内の核酸配列は、標的配列と同一である核酸配列であるか又は標的配列と１あるいは２ヌクレオチドが異なる核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２つの相補性の一本鎖ＲＮＡ分子であり得るか、又は２つの相補性の部分が塩基対合していて一本鎖の「ヘアピン」エリアにより共有結合している単一の分子であり得る。
【００７９】
[00111] 当該ｓｉＲＮＡは、一つ又はそれより多いヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更により、天然に生じるＲＮＡとは異なる、変更されたＲＮＡでもあり得る。そのような変更は、非ヌクレオチド物質の、例えばｓｉＲＮＡの末端又はｓｉＲＮＡの一つ又はそれより多い内部ヌクレオチドへの付加、又はヌクレアーゼ消化に対してｓｉＲＮＡを耐性にする修飾、又はｓｉＲＮＡ内の一つ又はそれより多いヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドによる置換を含み得る。
【００８０】
[00112] ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖は、３’突出を含むこともできる。本明細書において使用される「３’突出」は、二重鎖ＲＮＡ鎖の３’−末端から伸張した少なくとも一つの未対合のヌクレオチドを意味する。即ち、特定の態様において、ｓｉＲＮＡは、１から約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む）の長さ、１から約５ヌクレオチドの長さ、１から約４ヌクレオチドの長さ、約２から約４ヌクレオチドの長さ、の少なくとも一つの３’突出を含む。特定の態様において、３’突出は、ｓｉＲＮＡの一方の鎖又は両方の鎖上に存在し、そして２ヌクレオチドの長さである。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’突出を含み得る。
【００８１】
[00113] ｓｉＲＮＡは、化学的又は生物学的に生産することができ、又は組換えプラスミドあるいはウイルスベクターから発現させることができ、単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関しては上記のとおりである。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子の生産及び試験方法の例は、Gewirtzに対する米国公開特許出願番号2002/0173478及びReichに対する米国公開特許出願番号2004/0018176に記載されており、それらの全開示は引用により編入される。
【００８２】
[00114] 所定のｍｉＲ遺伝子の発現は、アンチセンス核酸により阻害することもできる。本明細書において使用される「アンチセンス核酸」は、標的ＲＮＡの活性を変更する、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ペプチド核酸相互作用により標的ＲＮＡに結合する核酸分子を意味する。本方法において使用するために適したアンチセンス核酸は、一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ，ＤＮＡ，ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ペプチド核酸（ＰＮＡ））であり、一般的には、ｍｉＲ遺伝子産物中の連続する核酸配列に対して相補性の核酸配列を含む。当該アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物中の連続する核酸配列に対して５０−１００％相補性、７５−１００％相補性、又は９５−１００％相補性の核酸配列を含む。特定のヒトｍｉＲ遺伝子産物の核酸配列が本明細書中の表に提供される。理論に拘束される意図はないが、上記アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物／アンチセンス核酸二重鎖を消化するＲＮａｓｅ  Ｈ又は別の細胞性ヌクレアーゼを活性化すると信じられる。
【００８３】
[00115] アンチセンス核酸は、核酸バックボーン又は糖部分又は塩基部分（又はそれらの均等物）に対して修飾を含むことにより標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達又は分子の効果に関する他の特性を増強することもできる。そのような修飾は、コレステロール部分、二重鎖インターカレーター、例えばアクリジン、又は一つ又はそれより多いヌクレアーゼ耐性群を含む。
【００８４】
[00116] アンチセンス核酸は、化学的又は生物学的に生産することができ、又は組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現させることができ、単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関しては上記の通りである。生産及び試験のための方法の例は、当業界の範囲内である；例えば、Stein and Cheng (1993), Science 261 : 1004 及びWoolfに対する米国特許番号5,849,902を参照されたく、それらの全開示は引用により本明細書に編入される。
【００８５】
[00117] 所定のｍｉＲ遺伝子の発現は、酵素的核酸により阻害することもできる。本明細書において使用される「酵素的核酸」は、ｍｉＲ遺伝子産物の連続する核酸配列に相補性を有する基質結合部位を含む核酸であって、そしてｍｉＲ遺伝子産物を特異的に分断することができる核酸である。酵素的核酸基質結合領域は、例えば、ｍｉＲ遺伝子産物中の連続する核酸配列に対して５０−１００％相補性、７５−１００％相補性、又は９５−１００％相補性であり得る。酵素的核酸は、塩基、糖及び／又はリン酸基においても修飾を含み得る。本方法における使用のための例示の酵素的核酸は、リボザイムである。
【００８６】
[00118] 酵素的核酸は、化学的又は生物学的に生産することができるか、又は組換えプラスミド又はウイルスベクターから発現することができ、単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関しては上記の通りである。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を生産及び試験するための例示の方法は、Werner and Uhlenbeck (1995), Nucl. Acids Res. 23:2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31；及びCechらに対する米国特許番号4,987,071に記載されており、それらの全開示は引用により本明細書に編入される。
【００８７】
[00119] 少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ発現を阻害する少なくとも一つの化合物の投与は、癌（例えば、ＡＭＬ）を有する被験者の癌細胞の増殖を阻害する。本明細書において使用される「癌細胞の増殖を阻害する」は、細胞を殺すか、又は細胞の成長を永久又は一時的に阻止するか又は遅延させることを意味する。被験者中のそのような細胞の数がｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の投与の後に一定であるか低下した場合は、癌細胞の増殖の阻害が推論され得る。そのような細胞の絶対数が増加するが、腫瘍の成長の速度が低下する場合にも、癌細胞増殖の阻害が推論され得る。
【００８８】
[00120] 被験者の体内の癌細胞の数は、直接の測定によるか、又は初期又は転移癌の塊のサイズからの見積もりにより、決定することができる。例えば、被験者の癌細胞の数は、免役組織学の方法、フローサイトメトリー又は癌細胞の特徴的な表面マーカーを検出するためにデザインされた他の技術により、測定することができる。
【００８９】
[00121] ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、これらの化合物を被験者の癌細胞に送達するために適した何れかの手段により被験者に投与することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、被験者の細胞にこれらの化合物又はこれらの化合物をコードする配列を含む核酸をトランスフェクトするのに適した方法により投与することができる。一つの態様において、当該細胞に、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含むプラスミド又はウイルスベクターをトランスフェクトする。
【００９０】
[00122] トランスフェクションの方法は、当業界においてよく知られており、例えば、核酸の細胞の核又は前核への直接の注射；エレクトロポレーション；リポソーム輸送又は脂肪親和性物質により媒介される輸送；受容体媒介性核酸送達；バイオバリスティック又は粒子加速；リン酸カルシウム沈殿、及びウイルスベクターにより媒介されるトランスフェクションを含む。
【００９１】
[00123] 例えば、リポソーム輸送化合物、例えばＤＯＴＡＰ（N-[l-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート、ベーリンガー−マンハイム）又は均等物、例えばリポフェクチンを細胞にトランスフェクトすることができる。用いられる核酸の量は、発明の実施にあたり決定的ではない；受容可能な結果は０．１−１００マイクログラムの核酸／１０３細胞により達成されるかもしれない。例えば、１０５細胞あたり、３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中約０．５マイクログラムのプラスミドベクターの比率を用いることができる。
【００９２】
[00124] ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、何れかの適切な腸溶性又は非経口投与経路により被験者に投与することもできる。本方法のための適切な腸溶性投与経路は、例えば、経口、直腸内又は鼻内送達を含む。適切な非経口投与経路は、例えば、血管内投与（例えば、静脈内巨丸剤注射、静脈内点滴、動脈内巨丸剤注射、動脈内点滴及び脈管構造へのカテーテル点滴注入）；組織周囲又は組織内注射（例えば、腫瘍周囲及び瘍内注射、網膜周囲又は注射網膜下（subretinal）注射）；皮下注射又は沈着（deposition）を含み、皮下点滴（浸透性ポンプによる）；目的の組織への直接の適用、例えばカテーテル又は他の配置（placement）装置（例えば、網膜沈殿又は座薬又は孔性、非孔性あるいはゼラチン様材料を含む移植物）；及び吸入を含む。特に適した投与経路は、注射、点滴及び腫瘍への直接の注射である。
【００９３】
[00125] 本方法において、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、はだかのＲＮＡとして送達剤と共に、あるいはｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸（例えば、組換えプラスミドまたウイルスベクター）として、被験者に投与することができる。適切な送達剤は、例えば、Ｍｉｎｉｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂肪親和性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えば、ポリリジン）及びリポソームを含む。
【００９４】
[00126] ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を発現する配列を含む組換えプラスミド及びウイルスベクター、及びそのようなプラスミド及びウイルスベクターを癌細胞に送達するための技術は、本明細書で論じられて折、及び／又は当業界においてよく知られている。
【００９５】
[00127] 特定の態様においては、リポソームを用いることにより、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はそれらをコードする配列を含む核酸）を被験者に送達する。リポソームは、遺伝子産物又は核酸の血液半減期を増加させ得る。発明における使用のための適切なリポソームは、標準の小胞形成脂質から形成することができ、一般的には中性か又は陰性荷電リン脂質及びステロール、例えばコレステロールを含む。脂質の選択は、一般的には、因子、例えば、所望のリポソームサイズ及び血流におけるリポソームの半減期を考慮することにより導かれる。リポソーム製造のための様々な方法が公知であり、例えば、Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; 及び米国特許番号4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, 及び5,019,369に記載されており、それらの全開示は引用により本明細書に編入される。
【００９６】
[00128] 本方法における使用のためのリポソームは、リポソームを癌細胞に標的化するためのリガンド分子を含むことができる。癌細胞において優勢な受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体は好ましい。
【００９７】
[00129] 本方法における使用のためのリポソームは、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）及び網内系（「ＲＥＳ」）による浄化を回避するために修飾することもできる。そのような修飾されたリポソームは、表面上にオプソニン作用阻害部分を有するか又はリポソーム構造に組み込まれる。特に好ましい態様において、発明のリポソームは、オプソニン作用阻害部分及びリガンドの両方を含むことができる。
【００９８】
[00130] 発明のリポソームを製造することにおける使用のためのオプソニン作用阻害部分は、典型的には、リポソーム膜に結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書において使用されるとおり、オプソニン作用阻害部分が、例えば脂溶性アンカーの膜自体へのインターカレートによるか、又は膜脂質の活性基に直接結合することにより化学的又は物理的に膜自体に結合するとき、オプソニン作用阻害部分はリポソーム膜に「結合する」。これらのオプソニン作用阻害親水性ポリマーは、ＭＭＳ及びＲＥＳによるリポソームの取り込みを有意に低下させる保護表面層を形成する；例えば、米国特許番号4,920,016に記載されており、その全開示は引用により本明細書に編入される。
【００９９】
[00131] リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用阻害部分は、好ましくは、水溶性のポリマーであり、数平均分子量が約５００から約４０，０００ドルトンであり、好ましくは約２，０００から約２０，０００ドルトンである。そのようなポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）又はそれらの誘導体；例えば、メトキシＰＥＧ又はＰＰＧ，及びステアリン酸ＰＥＧ又はＰＰＧ；合成ポリマー、例えば、ポリアクリルアミド、又はポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖状、又は分枝状又は樹木状ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えば、カルボキシル基又はアミノ基が化学的に結合したポリビニルアルコール及びポリキシリトール、並びにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１である。ＰＥＧのコポリマー、メトキシＰＥＧ、又はメトキシＰＰＧ、またはそれらの誘導体も適している。さらに、オプソニン作用阻害ポリマーは、ＰＥＧのブロックコポリマーであることができ、ポリアミノ酸、ポリサッカライド、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、又はポリヌクレアーゼの何れかである。オプソニン作用阻害ポリマーは、アミノ酸又はカルボキシル酸、例えば、ガラクツロン酸グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルウロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナンを含む天然ポリサッカライド；アミン化ポリサッカライド又はオリゴサッカライド（直鎖状又は分枝）；又はカルボキシル化ポリサッカライド又はオリゴサッカライドでもあり得、例えば、カルボン酸のカルボキシル基の結果生じる結合による誘導体により反応させる。好ましくは、オプソニン作用阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ又はその誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体により修飾されたリポソームは、ときに、「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ぶ。
【０１００】
[00132] オプソニン作用阻害部分は、非常に多くの周知技術の何れか一つによりリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシサクシニミドエステルをホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合させて、次に、膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３と溶剤混合物、例えば、テトラヒドロフランと水を３０：１２の比率で６０℃において用いる還元アミン化により、ステアリルアミン脂溶性アンカーにより誘導することができる。
【０１０１】
[00133] オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは、未修飾のリポソームよりも長い間血流に残る。このため、そのようなリポソームは、ときに「ステルス」リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、孔性又は「リーキー」な微小血管系により栄養供給される組織内に蓄積することが知られている。即ち、そのような微小血管系の欠陥、例えば固形腫瘍（例えば、ＡＭＬ）により特徴付けされる組織は、有効にこれらのリポソームを蓄積する；Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる低下した取り込みは、肝臓及び脾臓内のリポソームの有意な蓄積を阻止することにより、ステルスリポソームの毒性を減少させる。即ち、オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はそれらをコードする配列を含む核酸）を腫瘍細胞に送達するのに、特にふさわしい。
【０１０２】
[00134] ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子配列を阻害化合物は、それらを被験者に投与する前に、当業界公知の技術に従い、ときに「医薬（medicaments）」と呼ばれる薬学組成物として製剤化することができる。従って、発明は、ＡＭＬ癌を治療するための薬学組成物を包含する。一つの態様において、当該薬学組成物は、少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又はその単離されたバリアント又は生物学上活性なその断片、及び薬学上受容可能な担体を含む。特定の態様において、上記少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、適切な対照細胞に比べて、ＡＭＬ癌細胞における発現のレベルが低下したｍｉＲ遺伝子細胞に相当する。
【０１０３】
[00135] 他の態様において、発明の薬学組成物は、少なくとも一つのｍｉＲ発現阻害化合物を含む。特定の態様において、当該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子発現化合物は、その発現が対照細胞に比べてＡＭＬ癌細胞において大きいｍｉＲ遺伝子に特異的である。
【０１０４】
[00136] 本発明の薬学組成物は、少なくとも滅菌状態であり、発熱源フリーとして特徴付けされる。本明細書において使用される「薬学組成物」は、ヒト及び獣医学の用途のための製剤を含む。発明の薬学組成物を製造するための方法は、当業界の範囲内であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA. (1985)に記載されているとおりであり、その全開示は引用により本明細書に編入される。
【０１０５】
[00137] 本薬学組成物は、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は当該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）（０．１から９０％の重量）、又はその生理学上受容可能な塩を、薬学上受容可能な担体と混合されて含む。特定の態様において、発明の薬学組成物は、さらに、一つ又はそれより多い抗癌剤（例えば、化学治療剤）を含む。発明の薬学組成物は、リポソームにより封入された少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は当該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）及び薬学上受容可能な担体を含むこともできる。一つの態様において、上記薬学組成物は、ｍｉＲ−１５，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−１４３及び／又はｍｉＲ−１４５ではないｍｉＲ遺伝子又は遺伝子産物を含む。
【０１０６】
[00138] 特に適した薬学上受容可能な担体は、水、緩衝化された水、通常の塩水、０．４％塩水、０．３％グリシン、ヒアルウロン酸等である。
[00139] 特定の態様において、発明の薬学組成物は、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は当該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）であって、ヌクレアーゼによる消化に耐性のものを含む。当業者は、例えば、一つ又はそれより多い２’−位が修飾されたリボヌクレオチドをｍｉＲ遺伝子産物に取り込むことにより、ヌクレアーゼ耐性の核酸を容易に合成することができる。適切な２’−位が修飾されたリボヌクレオチドは、Ｔ−位を、フッ素、アミノ、アルキル、アルコキシ及びＯ−アリルで修飾したものを含む。
【０１０７】
[00140] 発明の薬学組成物は、慣用の薬学賦形剤及び／又は添加物を含むこともできる。適切な薬学上の賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、バッファー及びｐＨ調節剤を含む。適切な添加物は、例えば、生理学上生物適合性のバッファー（例えば、塩酸トロメタミン）、キレートの添加物（例えば、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミド）又はカルシウムキレート複合体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ，ＣａＮａＤＴＯ  Ａ−ビスアミド）、又は、任意にカルシウム又はナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、又は乳酸カルシウム）を含む。発明の薬学組成物は、液体での使用のためにパッケージ化されるか、又は凍結乾燥することができる。
【０１０８】
[00141] 発明の固形の薬学組成物に関しては、慣用の非毒性の固形の薬学上受容可能な単体を用いることができ、例えば、薬学グレードのマニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、カルボン酸マグネシウム等である。
【０１０９】
[00142] 例えば、経口投与のための固形薬学組成物は、上にリストされた担体及び賦形剤の何れか及び１０−９５％、好ましくは２５％−７５％の上記少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又はそれらをコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）を含むことができる。エアロゾル（吸入）投与のための薬学組成物は、上記のとおりリポソームに封入された、０．０１−２０重量％、好ましくは１％−１０重量％の、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は当該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）及び推薬を含むことができる。担体は所望に応じて含むこともでき；例えば、鼻内送達のためのレシチンを含むこともできる。
【０１１０】
[00143] 発明の薬学組成物は、一つ又はそれより多い抗癌剤をさらに含むことができる。特定の態様において、該組成物は、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は当該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）及び少なくとも一つの化学治療剤を含む。発明の方法に適した化学治療剤は、限定ではないが、ＤＮＡ−アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、抗代謝剤、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、ホルモンアンタゴニスト剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイクリン阻害剤、カスパーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アンチセンス核酸、三重鎖ＤＮＡ、核酸アプタマー、及び分子上修飾されたウイルス、細菌、菌体外毒素剤を含む。本発明の組成物のための適切な薬剤の例は、限定ではないが、シチジン、アラビノシド、メトトレキセート、ビンクリスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、デキサメタゾン、アルグラビンシクロホスファミド、サルコリシン、メチルニトロソウレア、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ビンブラスチン、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、過酸化水素、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ＣＰＴ−１１，タキソール、タノキシフェン、ダカルバジン、リツキシマブ、ダウノルビシン、1-β-D-アラビノフラノシルシトシン、イマニチブ、フルダラビン、ドセタキセル及びＦＯＬＦＯＸ４を含む。
【０１１１】
[00144] 発明は、抗−ＡＭＬ癌剤を同定する方法も包含し、試験薬剤を細胞に供給し、そして細胞内の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。一つの態様において、当該方法は、試験薬剤を細胞に供給し、そしてＡＭＬ癌細胞内の低下した発現レベルに関連した少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適切な対照（例えば、対照細胞内のｍｉＲ遺伝子産物のレベル）に比較した上記細胞内でのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は、試験薬剤が抗ＡＭＬ癌薬剤であることの指標である。
【０１１２】
[00145] 特定の態様において、ＡＭＬ癌細胞の発現レベルの低下に関連した上記少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、図５−６、８−１８及び２１（表１−２、５−１５及び１８）の何れか一つに示されるｍｉＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物からなる群から選択される。
【０１１３】
[00146] 他の態様において、上記方法は、試験薬剤を細胞に供給して、ＡＭＬ癌細胞内の増加した発現レベルに関連した少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適切な対照（例えば、対照細胞内のｍｉＲ遺伝子産物のレベル）に比較した上記細胞内でのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの低下は、試験薬剤が抗ＡＭＬ癌薬剤であることの指標である。
【０１１４】
[00147] 特定の態様において、ＡＭＬ癌細胞内の増加した発現レベルに関連した少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ−２０，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−１９１，ｍｉＲ−１９９ａ，及びｍｉＲ−１９９ｂ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１１５】
[00148] 適切な薬剤は、限定ではないが、薬物（例えば、小分子、ペプチド）、及び生物学上のマクロ分子（例えば、蛋白質、核酸）を含む。薬剤は、組換えによるか、合成により生産することができ、あるいは、天然源から単離（即ち、精製）してよい。そのような薬剤を細胞に提供するための様々な方法（例えば、トランスフェクション）が当業界においてよく知られており、そのような方法のいくつかは上で記載された。少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を検出するための方法（例えば、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ，発現プロファイリング）も、当業界においてよく知られている。これらの方法のいくつかも本明細書に記載される。
【０１１６】
[00149] 発明は、以下の非限定実施例により今例示される。
【実施例】
【０１１７】
[00150] 例示
[00151] 方法
[00152] 患者と細胞試料。新たにＡＭＬと診断された１５８人の患者からの白血病試料及び再発のＡＭＬ（３４）又は難治性疾患（２０）の患者からの５４の試料を、研究所ガイドラインに従いインフォームドコンセントにサインしたのち、ＭＤアンダーソン癌センターの細胞組織バンク（ｎ＝２０２）及びトーマスジェファーソン大学（ｎ＝１０）から得た（図４（表１））。
【０１１８】
[00153] 骨髄及び末梢血試料を回収し、フィコール−ハイパック（ニガルド（Nygaard））勾配遠心分離により調製し、そして冷凍保存した。試料の細胞遺伝学的分析は以前に記載されたとおりに提示のときに実施した１６。細胞遺伝学クローンと核型を記載するのに使用された基準は、ヒト細胞遺伝学用語集に関するインターナショナルシステムの推奨にしたがった１７。ＡＭＬの３６人の患者の独立したセットを用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いることによるマイクロアレイサイン（signature）内でｍｉＲＮＡを確認した。完全寛解（ＣＲ）は骨髄吸引物中の＜５％の芽細胞（blast）の存在、絶対末梢好中球カウント＞１ｘ１０９／ｌ及び血小板＞１００ｘ１０９／ｌにより定義された。
【０１１９】
[00154] 末梢血の成熟顆粒球及び単球、骨髄ＣＤ７１＋選択された赤血球前駆体及びＣＤ３４＋細胞は４人の健常なドナーから、但しＣＤ３４＋（１０人のドナー）はオールセル（Allcells）から購入したことを除く。インビトロにて分化した巨核球は前に記載されたとおりに得た１８。
【０１２０】
[00155] ＲＮＡ抽出とｍｉＲＮＡマイクロアレイ実験。
[00156] ＲＮＡ抽出とｍｉＲＮＡマイクロチップは、ほかの場所で詳細に記載されたとおりに実施した１９。簡単に言うと、１７６人のＡＭｌ患者からの全ＲＮＡを５μｇ、４通りにて、２５０のヒト成熟ｍｉＲＮＡ及び前駆体ｍｉＲＮＡに相当するプローブとハイブリダイズさせた（２００５年１１月にmiRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/)において記載されたとおり）２０。
【０１２１】
[00157] マイクロＲＮＡのリアルタイム定量。
[00158] 前に記載されたとおり２１、ＰＣＲ  ９７００温度循環器ＡＢＩプリズム７９００ＨＴ及び配列検出システム（アプライドバイオシステムズ）を用いて単一のチューブのＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡを選択したが、マイクロアレイ患者データセットにおいて最小の発現可変性をそれが有したからである。リアルタイムＰＣＲの比較を３通りにて実施したが、鋳型を含まない対照を含んだ。比較Ｃｔ法を用いて相対的発現を計算した。
【０１２２】
[00159] データ分析。
[00160] ＧＥＮＥＰＩＸ  ＰＲＯを用いてマイクロアレイイメージを分析した。各ｍｉＲＮＡの複製スポットの平均値について、バックグラウンドを差し引きし、ｌｏｇ２変換し、標準化し、そして試料の少なくとも１０％において存在すると測定された場合は、発現テーブルに確保した。ｍｉＲＮＡプローブを通して（through）散在させたチップ上にプリントされたハウスキープ遺伝子のセット（図７（表４））に(over)、標準化を実施した。２つのクラスの比較において（即ち、ＣＤ３４対ＡＭＬ）、差異発現されたｍｉＲＮＡを、マイクロアレイの有意分析（ＳＡＭ）内の試験手法を用いて同定した２２。ＳＡＭは、すべての測定値の標準偏差に比較した発現の変化に基づいて、各遺伝子に関するスコアを計算する。これは複数の試験であるから、偽陽性率（ＦＤＲ）又はｑ−値を計算するために交換（permutations）を実施する。５％未満のＦＤＲと２を超えない倍率変化のｍｉＲＮＡを、さらに分析すべきであると考えた。すべてのデータは、ＭＩＡＭＥｘｐｒｅｓｓ（アクセス番号係属中）を用いてアレイエクスプレスデータベースに提出した。
【０１２３】
[00161 ] 統計分析。
[00162] フィッシャーの精密試験、ｔ−検定及びカイ二乗検定を用いて患者群の間のベースライン特性及び平均ｍｉＲＮＡ発現を比較した。すべての報告されたＰ値は、２つの面を有し、ＳＰＳＳソフトウエアパッケージ（ＳＰＳＳ  １０．０）を用いて得た。全生存数を最後の追跡の日までの診断時間及び再発又は死亡までの診断時間から計算した。最後の追跡の日まで生きた患者からのデータを検閲した（censored）。生存を実行して（perform the survival）、そしてカプラン−マイヤー（ＫＭ）プロットを生じさせるために、試料を２つのクラスに分配して（高発現及び低発現、試料のフルセットにおける中度の発現に従う）、チップ上で且つＰＣＲにより測定されたｍｉＲＮＡレベルを２つの異なる変数に変換した。生存曲線を各群に関して得て、ログランク検定を用いることにより比較した。ＫＭ法により得られたそれらの９５％信頼度の間隔を有するハザード比も記録した。
【０１２４】
[00163] 標的予測及びマイクロアレイ確認
[00164] データ確認。マイクロアレイのデータを確認するため、我々は、１０人の患者の４２のｍｉＲＮＡ測定値を用いたピアソン相関と直線回帰分析（ＳＰＳＳソフトウエア）を使用した。これらの函数は、測定値の各対を調査し（一方はチップから、他方はＲＴ−ＰＣＲから）、２つの変数が共に動くか否かを決定するものであり、即ち、チップからの大きなｒ値（高発現）がｑＲＴ−ＰＣＲ（デルタＣｔ）からの低発現と関連するか否かを決定する。負の相関が予測されるが、ｑＲＴ−ＰＣＲ値（デルタＣｔ）はｍｉＲＮＡの発現レベルに対して逆関数だからである。チップのｍｉＲＮＡ測定値とｑＲＴ−ＰＣＴのｍｉＲＮＡ測定値の両方のｌｏｇ値を用いた。
【０１２５】
[00165] 標的予測。マイクロＲＮＡ標的をインシリコにてＴＡＲＧＥＴＳＣＡＮ３２(www.genes.mit.edu/targetscan) 及びＰＩＣＴＡＲ３３ (www.pictar.bio.nvu.edu)を用いて予測した；両データベースは３’ＵＴＲ  ｍｉＲＮＡ標的を予測する。
【０１２６】
[00166] 結果
[00167] ＡＭＬ患者は、正常なＣＤ３４＋前駆細胞についてのｍｉＲＮＡ発現の異なるスペクトルを明らかにする。
【０１２７】
[00168] ＡＭＬの病理におけるｍｉＲＮＡの可能な関与を理解することに対する第１の工程として、我々は、１２２人の新たにＡＭＬと診断されたＡＭＬ患者の試料からのｍｉＲＮＡ発現と、１０人の異なるドナーからのＣＤ３４＋細胞をｍｉＲＮＡマイクロアレイプラットフォームを用いて分析した１９（図４（表１）の臨床データ）。ＳＡＭは、ＣＤ３４＋細胞に比較した、ＡＭＬ試料中のダウン制御されたｍｉＲＮＡのみを同定した（表Ｓ２，サポート情報）。我々は、ＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、これらの多くが差異発現されたｍｉＲＮＡであることを確認した（図１Ａ）。さらに、マイクロアレイプラットフォームを確認するため、我々は、チップ上で高発現されたか、中程度に発現されたか、そして低発現されたｍｉＲＮＡに関してｑＲＴ−ＰＣＴを実施した。図１Ｂに示されるとおり、マイクロアレイ又はｑＲＴ−ＰＣＲの何れかにより測定されたｍｉＲＮＡレベルは極めて一致しており、２つのプラットフォームの測定値の間で高度に有意な相関が存在した（ｒ＝０．８８，ｐ＜０．００１）。
【０１２８】
[00169] ｍｉＲＮＡサインは造血分化とＦＡＢ分類に相関する。
[00170] ｍｉＲＮＡ発現は、腫瘍の造血発生系列と分化ステージの知識を与えることが示された１１。異なるプロファイルがＡＭＬ患者における正常対悪性腫瘍細胞を特徴付けするので、我々は、成熟顆粒球及び単球並びに赤血球及び巨核球前駆体を含むヒト造血細胞のパネル間で、ＡＭＬ試料とＣＤ３４＋細胞の間においてもっとも差異発現されるｍｉＲＮＡの発現パターンをｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。ＡＭＬにおいてダウン制御される多くのｍｉＲＮＡは、成熟及び前駆体造血細胞においてもダウン制御された（図１Ｃ及び３Ａ）。２つの最近の研究は、ＣＤ３４＋細胞のインビトロ分化の間のｍｉＲＮＡダウン制御のいくつかの系列への広がりを記載した。これらの結果は、白血病のｍｉＲＮＡのサブセットが正常な造血においてｍｉＲＮＡ発現の分化パターンを密接にフォローすることを示唆する。ｍｉＲＮＡが白血病の患者において細胞分化のステージを反映するなら、それらは、共に白血病の分化ステージに密接に関連する細胞形態学及び免役表現形に基づいたＡＭＬのフランス−アメリカ及びイギリス（ＦＡＢ）分類にも相関するはずである２４。事実、我々は、ＦＡＢ分類に関連するサインを同定した。（図９−１２、表６−９）。ＦＡＢ  Ｍ０−Ｍ１サインの範囲内で、我々は、いくつかのｍｉＲ−１８１ファミリーのメンバー並びにＣＤ３４＋細胞において高発現された他のｍｉＲＮＡを同定したことから、幹細胞のそれに近い発現プロファイルを示唆する（図９（表６））。ｍｉＲ−１８１の発現は、事実、すべての系列からの成熟及びコミットされた前駆体造血細胞においてダウン制御され（図３Ａ）、そして類似の結果がＦＡＢ  Ｍ６−Ｍ７のようなほとんどの分化した白血病において観察された（図１Ｄ）。
【０１２９】
[00171] ｍｉＲＮＡは白血球細胞と芽細胞に正に相関した。
[00172] 我々は、次に、ｍｉＲＮＡが治療前の患者の特性、例えば年齢、性別、白血球（ＷＢＣ）カウント、骨髄又は末梢血の芽細胞のパーセンテージに関連するか否かを調査した。我々は、ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−３０ｂ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−２５及びｍｉＲ−１８１ｂを含むいくつかのｍｉＲＮＡと、ＷＢＣカウント、末梢血及び骨髄の芽細胞のパーセンテージの間の正の相関を検出した（図１３（表１０））。
【０１３０】
[00173] 定義された細胞遺伝学上のサブグループに関連するマイクロＲＮＡのサイン。
[00174] ＡＭＬにおける公知の遺伝子異常（cytogenetic abnormalities）に関連したｍｉＲＮＡを同定するため、我々は、ＳＡＭ内で交換調整されたｔ−検定を用いることにより、慣用の核型により分析された少なくとも２０の中期の１１６人のＡＭＬ試料を研究した。これらのデータは図５（表２））に要約される。
【０１３１】
[00175] 正常な核型のＡＭＬ。
[00176] 我々は、正常な核型のＡＭＬケースを異常な核型のＡＭＬの他のケースと識別するサインを同定した（図１４（表１１）、図３Ｂ）。アップ制御された遺伝子の間で、ｍｉＲは、正常核型６を有するＡＭＬにおいて過剰発現されることが示されたＨＯＸ遺伝子のクラスター内に位置している（図１Ｅ，図５（表２））。特に、我々及びその他は、ｍｉＲ−１０ａ及びｍｉＲ−１９６ｂのようなＨｏｘに取り囲まれたｍｉＲＮＡがいくつかのＨｏｘ遺伝子を標的とすることを示したことから、転写因子のこのファミリーに関する制御の複合層を明らかにした１８、２５。
【０１３２】
[00177] 以前の２つの研究が、正常な核型のＡＭＬ試料におけるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＭＴ３Ａと３Ｂの高レベルの発現を同定しており、この亜種における病理の異常なメチル化に関する潜在的役割を示唆する５−６。興味を引くのは、正常な核型群においてダウン制御されるｍｉＲＮＡの間で、２つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２００ｃ及びｍｉＲ−１８２）が存在することであり、ＤＮＭＴ３ＡとｍｉＲ−を標的にすることが予測され、ＤＮＭＴ３Ｂを標的とすることが提案されている。即ち、これらのｍｉＲＮＡのダウン制御は、正常な核型のＡＭＬ細胞においてＤＮＭＴ３の両方の遺伝子の過剰発現に寄与するのかもしれない。
【０１３３】
[00178] １１ｑ２３異常性
[00179] ｔ（９；ｌ  １）［５］及びｔ（６；ｌ  １）［４］の患者においてダウン制御される遺伝子の間で（図１５（表１２））、多くのものが、この群の患者において過剰発現されて予後不良に関連すると記載されてきたＨｏｘ遺伝子、即ち、ＨＯＸＡ９（ｌｅｔ７ｆ），ＨＯＳＡ１０（ｉＲ−１５ａ），ＰＢＸ３（ｌｅｔ０７ｆ，ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１９６ｂ）及びＭＥＩＳＩ（ｍｉＲ−３３１）６  を標的とすることが予測される（図１５（表１２））。同様に、この群においてダウン制御されるｍｉＲ−１２９ファミリーのメンバーも、抗−アポトーシスＭＣＬＩ遺伝子を標的とすることが予測される。
【０１３４】
[00180] 複合核型
[00181] ３より多くの遺伝子異常を有する試料は、ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−２６ａ，ｍｉＲ−３４ｂ，ｍｉＲ−３０ｃ及びｍｉＲ−３０１をこの群のもっとも識別可能な遺伝子として含む共通のサインを共有する。（図１６（表１３））。同様に、第７染色体の単離された損失（isolated loss）の患者においては、ｍｉＲ−１２６がアップ制御された（表Ｓ１１）。興味を引くのは、このｍｉＲＮＡがＣＤ３４＋幹細胞において高度に発現されており、そして複合核型のものを除く他のＡＭＬにおいてはダウン制御されていたことである。これらの結果は、複合（Ｎ＝６）及び非複合遺伝子異常（Ｎ＝２２）のＡＭＬ患者の別個のセットにおいて、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて確認された（図１Ｆ）。
【０１３５】
[00182] 第８トリソミー
[00183] ＳＡＭを用いて得られたサインは、単離された第８トリソミーの患者試料において多数のアップ制御されたｍｉＲＮＡを同定した（図１８（表１５））。アップ制御されたｍｉＲＮＡの間で、ｍｉＲ−１２４ａ及びｍｉＲ−３０ｄがそれぞれ８ｐ２１及び８ｑ２３において局在したことから、遺伝子用量効果がこれらのｍｉＲＮＡのアップ制御において役割を担うかもしれないことを示唆する。
【０１３６】
[00184] 再発したＡＭＬ患者におけるマイクロＲＮＡの発現
[00185] 我々は、さらに、我々のｍｉＲＮＡプラットフォームを用いることにより再発した急性骨髄性白血病の５４人の患者のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを調査した（図１９（表１６））。我々は、有意ではない統計学上のスコア及び倍数変化ｓが２より低いことにより反映されるとおり、新たな患者と治療された患者の間の大きな違いを見いだせなかった（データは示さず）。しかしながら、我々は、これらの患者において新規の患者のものと類似のＦＡＢと細胞遺伝学上の（cytogenetics）サインを観察したことから（図８−１７；表５−１４）、即ち、以前に記載された発見を確認した。これらのデータは、白血病及び細胞遺伝学上の分化ステージによりｍｉＲＮＡ発現が大きく推進されることを示唆する。
【０１３７】
[00186] 結果と関連するマイクロＲＮＡ
[00187] 我々は、新たに診断された１２２人のＡＭＬ患者において、全部の生存に関連した、１％より低い偽陽性（false discovery）の少量のｍｉＲＮＡ及び２より高いＳＡＭ生存スコア（Ｃｏｘ回帰）を同定した。同定された遺伝子：ｍｉＲ−１７−５ｐ，ＭＩＲ−２０，ｍｉＲ−ｍｉＲ−１８２，ｍｉＲ−１９１，ｍｉＲ−１９９ａ及びｍｉＲ−１９９ｂのすべてが、過剰発現されたとき、逆に、全生存に影響した（図６（表３））。我々は、次に、生存曲線の比較のためにカプラン−マイヤー法及びログランク検定を用いることにより、上記ｍｉＲＮＡの高発現又は低い発現の１２２人のＡＭＬ患者の生存確率を評価した。我々は、ｍｉＲ−１７−５ｐ及びｍｉＲ−１８２を除く（ｐ＝０．０６）、ｍｉＲ−２０（図２Ａ），ｍｉＲ−２５（図２Ｂ），ｍｉＲ−１９１，ｍｉＲ−１９９ａ，及びｍｉＲ−１９９ｂに関して、ＳＡＭの結果を確認した［データは示さず］。ＡＭＬの３６人の患者の別個の試料においてｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価するために、我々は、ＡＭＬの３６人の患者の別個の試料においてｑＲＴ−ＰＣＲを用いてｍｉＲ−２０及びｍｉＲ−２５を測定した。
【０１３８】
[00188] ｍｉＲ−２０とｍｉＲ−２５の高発現の患者は、低発現のＡＭＬ患者よりも、有意に短い生存（ＯＳ）（図２Ａ及び２Ｂ）及び事象に無関係の生存（ｍｉＲ−２０  ｐ＝０．０１２，ＨＲ＝２．３９  ＣＩ  ９５％：１．３−５．２及びｍｉＲ−２５  ｐ＝０．０１８，ＨＲ＝２．２３  ＣＩ  ９５％：１．７−４．９）を有することがわかった。性別、年齢、好ましくない細胞遺伝学、白血球細胞及び末梢芽細胞カウントを含む他の臨床上の特徴は、３６人のＡＭＬ患者のこの独立したセットにおける生存と、有意には関連しなかった（データは示さず）。
【０１３９】
[00189] 誘導処置により寛解を達成することの失敗に関連するｍｉＲＮＡ
[00190] 我々は別のｍｉＲＮＡの発現に相関したＡＭＬ患者における生物学上及び遺伝学上の発見を示したことから、我々は、次に、処置の応答とｍｉＲＮＡ発現の関係をさらに調査した。誘導処置の応答に関連したｍｉＲＮＡを同定するため、我々は、診断中の２４人のＡＭＬ患者の群においてｍｉＲＮＡ発現を分析し、全員をイダルビシン１２ｍｇ／ｍ．２にて、毎日、１から３日目まで、及びシタラビン１５００ｍｇ／ｍ２を４日連続注入により処置した（図２０（表１７））。ＳＡＭは、処置が失敗に終わった患者において診断中にダウン制御された２５のｍｉＲＮＡを同定した（図２１（表１８））。とりわけ、ｍｉＲ−２９ｂとｍｉＲ−２９ｃは、様々な化学治療剤に対する耐性に関連する遺伝子であるＭＣＬＩを標的にするものと予測される２６。これらの結果を確認するため、我々は、類似のベースライン特性を有するが様々な化学治療プロトコルを処置されたＡＭＬ患者の独立したセットにおいてｑＲＴ−ＰＣＲによりｍｉＲ−２９を測定した。我々は、ｍｉＲ−２９ｂが、完全寛解を達成した患者に比べて誘導処置を失敗した患者においてダウン制御されることを発見した（図３Ｃ）。
【０１４０】
[00191] 考察
[00192] この研究において、我々は、ＡＭＬ試料とそれらの前駆体ＣＤ３４＋細胞のゲノムワイドなｍｉＲＮオーム分析を実施するためにマイクロアレイプラットフォームを用いた。いくつかのｍｉＲＮＡがＣＤ３４＋細胞に比較してＡＭＬ患者においてアップ制御された事実があるにも拘わらず、ほとんどのｍｉＲＮＡはダウン制御された。ダウン制御されたｍｉＲＮＡのいくつかは、ＡＭＬのＦＡＢ分類とうまく相関する白血病の分化ステージに関するマーカーを含む。Luらは、腫瘍の発生系列と分化ステージをｍｉＲＮＡが反映することを報告した１１。本明細書において同定されたｍｉＲＮＡサブセットが分化ステージの単なるマーカーであるのか、それとも、これらのｍｉＲＮＡのいくつかが病理上の役割を有するのか否かは、明確にされないままである。
【０１４１】
[00193] ＳＡＭ用いて、我々は、いくつかの細胞遺伝学上のグループに関連する分子上のサインを同定した。１１ｑ２３再編成、正常核型及び第８トリソミーに関連するものがとりわけもっとも強いサインであった。
【０１４２】
[00194] ｍｉＲＮＡのサブセットは癌原性ｍｉＲＮＡとして機能する。
[00195] ｍｉＲ−１７及びｍｉＲ−２０にわたるアップ制御されるクラスターはＥ２１ＦＩ２１を標的化することから、即ち、細胞周期の制御全体に衝撃を与える。対称的に、ＡＭＬにおいてダウン変調されてしかも寛解を達成しそこなうことに関連するｍｉＲ−２９ファミリーのメンバーは、必須のアポトーシス制御因子であって、様々な化学治療剤に耐性の細胞においてアップ制御されるＭＣＬＩを標的化すると予測される２６。さらに、このファミリーの他のメンバーは、ＣＬＬ患者２８人及びＡＭＬ癌２９人において短い事象とは独立の生存と関連するサインにおいて同定されたことから、このｍｉＲＮＡが腫瘍抑圧性の非コード遺伝子である可能性を示す。
【０１４３】
[00196] 我々は、全生存及び事象とは独立した生存（ＯＳ）に関連する分子上のサインを記載する。いくつかの観察は、我々の結果を強化する。第１に、我々は、結果の違いを証明するのが困難な調査された患者の全部の予後不良と短い生存にも拘わらず、生存に関連するｍｉＲＮＡを同定した。第２に、生存に関連するｍｉＲＮＡの２つ（ｍｉＲ−２０及びｍｉＲ−２５）も、高いＷＢＣ及び芽細胞のカウントに相関し、すべての特徴は生存と密接に関連していた。第３に、我々は、６種の固形癌に共有されるサインに共通したいくつかのアップ制御されたｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−２０及びｍｉＲ−１９１）を同定したが１０、そのうちのいくつか（ｍｉＲ−１７及びｍｉＲ−２０）は癌発生においてよく特性決定された役割を有する２７−３０。
【０１４４】
[00197] 要約すると、我々は、ｍｉＲのサブセットが白血病の分化ステージのマーカーであり、そしてＦＡＢ分類に相関するが、一方その他は細胞遺伝学上のグループ及び結果に関連してＡＭＬにおいて明確に脱制御されることを証明した。最後に、我々は、ｍｉＲＮＡが癌遺伝子及び腫瘍の抑圧因子として作用して白血病発生に関与するかもしれないことを示す。
【０１４５】
[00198] 前記の態様及び利点は、本発明を限定するものとして意図されるべきではない。本教示は、他の種類の装置に容易に適用可能である。本発明の記載は、例示を意図するものであって、特許請求の範囲を限定することを意図しない。多くの変更、修飾及びバリエーションが当業者には明らかである。特許請求の範囲において、ミーンズファンクションの節は、列挙された機能を実施するものとして本明細書に記載された構造及び構造上の均等物のみならず均等な構造もカバーすることを意図する。
【０１４６】
[00199] 本明細書において引用されたすべての科学刊行物及び特許刊行物は引用により編入される。書かれた記載及び実施例により今記載された発明は、様々な態様において実施可能であることを当業者は認識するし、また、前記記載及び実施例が例示のためであり、特許請求の範囲を制限するためのものではないことを認識する。
【０１４７】
[00200] 特に引用により編入されなかった本明細書で引用されたすべての刊行物の関連記載は、それらのすべてを引用により本明細書に編入する。この発明はその好ましい態様に関連して特に示されて記載されてきたが、当業者は、特許請求の範囲により包含される発明の範囲を逸脱しないように、フォームと詳細においての様々な変化がなされうることを理解する。
【０１４８】
[00201] 文献
1. Lowenberg B, Downing J.R., Burnett A. Acute Myeloid leukemia. NEnglJMed 1999; 341 : 1051 -1062.
2. Grim wade D, Haferlach T. Gene expression profiling in acute myeloid leukemia. NEnglJMed 200A; 350:1676 -7.
3. Burnett AK. Current controversies: which patients with acute myeloid 
leukemia should receive bone marrow transplantation? An adult theater's view. Br. J Haematol 2002; 1 18:357 -64.
4. Drobyski WR. The role of allogeneic transplantation in high -risk acute myeloid leukemia. Leukemia 2004; 10: 1565 -8.
5. Bullinger L. Dohner K, Bair E. et al. Use of gene -expression profiling to identify prognostic subclasses in adult acute myeloid leukemia. NEngJMed 2004; 350:1605-1 61 6.
6. VaIk PJM, Verhaak GW, Beijen MA. Prognostically useful gene -expression profiles in acute myeloid leukemia. NEngJMed 2004 ; 350: 1617 -1628.
7. Pasquinelli AE, Hunter S, Bracht J. MicroRNAs: a developing story. Curr O, Genet Dev 2005; 15: 200 -5.
8. Bartel D. MicroRNAs: genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell 2004; 116:281 -297.
9. Chen CZ , Li L. Lodish H, Bartel D. MicroRNAs Modulate Hematopoietic lineage Differentiation . Science 2004; 303:83 -86.
10. Volinia S, Calin G, Liu CG, et al. A microRNA expression signature in human solid tumors defines cancer targets. Proc Nad Acad Sci USA 2006; 103: 2257 -61.
11. Lu J, Getz G, Miska EA, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 2005; Jun 9; 435: 834 -8.
12. Calin GA, Liu CG, Sevignani C, et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B-CeIl Chronic Lymphocytic leukemias. Proc Nad Acad Sci USA 2004; 101 : 1175560.
13. Eis PS, Tarn W, Sun, L. Accumulation of m iR- 155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. Proc Nad Acad Sci USA 2005; 102: 3627 -32.
14. Metzler M, Wilda M, Busch K, et al. High expression of miR -155 /BIC RNA in children with Burkitt lymphoma. Genes Chomosomes and Cancer 2004; 39:167 -9.
15. Costinean, S. et al. Pre B cell proliferation and lymphoblastic leukemia/high grade lymphoma in Eμ miR155 transgenic mice. Proc Nad Acad Sci USA 2006; 103: 7024 - 9.
16. Bloomfield CD. Prognostic factors for selecting curative therapy for adult acute myeloid leukemia. Leukemia 1992; 6:65 -67. 21.
17. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (1985) ISCN 1985. Report of the Standing Committee on Human Cytogenetic Nomenclature. Bi Orig Artie Ser 1985 ; 21 : 1-117. 
18. Garzon R, Pichiorri F, Palumbo T, et al. MicroRNAs fmgeφrints during human megakaryocytopoiesis. Proc Nad Acad Sci USA 2006; 103: 5078 -83.
19. Liu CG, Calin GA. Meloon B, et al. An oligonucleotide microchip for genomic -wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc Nad Acad Sci USA 2004; 101 : 11755 -60.
20. Griffiths -Jones S. The microRNA registry. Nucleic Acids Res 2004; 32, Database issue D 109 -Dl 11.
21. Chen C, Ridzon DA. Broomer AJ, et al. Real -Time quantification of microRNAs by stem-loop RT -PCR. Nucleic Acids Res 2005:33:el79.
22. Tusher VG, Tibshirani R, Chu G. Significant analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:5116:21.
23. Felli N, Pelosi E. Beta R5 et al. Lineage -Specific Expression and functional Relevance of MicroRNA genes in Normal Hematopoiesis. Blood (ASH national meetings abstract) 2006; 106: 2263.
24. French -American -British (FAB) Cooperative Group. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. Ann Intern Med. 1985; 103:620 - 685.
25. Yekta S, Shih IH, Bartel DP. Micro -RNA direct cleavage of HOXB8 mRNA. Science 2004; 304:594 -6.
26. Zhou P, Qian L, Kozopas KM, Craig RW: McI -1 , a BcI -2 family member, delays the death of hematopoietic cells under a variety of apoptosis-inducing conditions. Blood 1997; 89:630.
27. O'Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, Dang CV, Mendell JT. C -myc regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature 2005; 435:839 -43.
28. Calin GA, Terracing M, Camino A, et al. A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. NEnglJMed.2005; 353:1793 -801.
29. Yanaihara N, Caplen N, Bowman, E, et al. Unique microRNA molecular profiles in AML cancer diagnosis and prognosis. Cancer Cell 2006; 9:189 -98.
30. He L, Thomson JM, Hemann MT. A microRNA polycistron as a potential oncogene, re 2005; 435: 828 -33.
31. Lewis BP, Shih IH, Jones -Rhoades MW, Bartel P, Burge CB. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell 2003; 115:787 -798.32. Krek A, Griin D, Poy M, et al. Combinatorial microRNA target Nature G 37: 495 -500. 
32. Lewis BP. Burge CB, Bartel D. Conserved seed pairing often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell 2005; 120: 15 -20.
33. Krek A, Grun D, Poy MN, et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat . Genet. 2005; 37: 495 -500. 
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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