(57)【要約】  本発明は、例えば、１つ又は複数のリン脂質又はコレステロール結合核酸を含んでいる、単分子層を形成するための方法及びデバイスを開示する。単分子層は、例えば、疎水性物質を含有している表面上に存在するか、又は表面と結合している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の配向結合又は配向付着及び／又は配向拡散に適合している疎水性表面を有する基板を含んでいる、デバイス。
【請求項２】
疎水性表面が、チェンバ、カラム、二次元表面、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）結晶、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、チップ、顕微鏡カバーガラス、マイクロ流体チップ、サンドイッチ細胞、又はチャネルの全部もしくは一部を含むか、又は全部もしくは一部を形成する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
疎水性表面が、ＳＵ−８、硬化焼成ＳＵ−８、疎水性ポリマー、ガラス、セラミック、金属、又は液晶の1つ又はそれ以上を含んでいる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
疎水性表面がサブ構造体のパターンを含んでいる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
サブ構造体が、層内の穿孔、層内の穴、層上の柱又は他の物質、パッチ、又は固定化された粒子、フィルム、化学物質、又は分子の1つ又はそれ以上を含んでいる、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
層内の穿孔、層内の穴、層上の柱又は他の物質、パッチ、又は固定化された粒子、フィルム、化学物質、又は分子が、薄膜、周囲の溶液及び／又は周囲の空気、ガスもしくは真空中に存在する物質又は化合物への、触媒の、結合の、化学吸着の、物理吸着の、又は調節の効果を含んでいる、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
サブ構造体が、秩序づけられた（例えば、配列された）又は無秩序な方式の1つ又はそれ以上に配置されていて、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の拡散フィルムによって完全にもしくは部分的に覆われるか又は囲まれるように適合されている、請求項４に記載のデバイス。
【請求項８】
疎水性表面が、化学反応、表面支援性合成手順、触媒プロセス、超分子自己集合、又は親和性に基づく分離を含むプロセスに適合している、請求項４に記載のデバイス。
【請求項９】
少なくとも１つの疎水性部分を有する分子が、リン脂質、両親媒性分子、界面活性剤、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、疎水性部分で修飾された分子の1つ又はそれ以上を含んでいる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
少なくとも１つの疎水性部分を有する分子がフィルムを含んでいる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
フィルムが、液体、固体、液晶又はゲルの1つ又はそれ以上を含んでいる、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
温度制御装置をさらに含んでいる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
温度制御装置が、少なくとも１つの疎水性部分を有する、薄膜を含む分子又は分子集合体の相転移及び拡散挙動に対する制御を可能にする、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
疎水性表面が、エンボス加工されたか又は刻み込まれた幾何パターンの1つ又はそれ以上を含んでいる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
疎水性表面、疎水性がより低い表面、及び疎水性表面を少なくとも部分的に覆い、疎水性表面に限局される少なくとも１つの疎水性部分を有する分子のフィルムを含有している基板を含んでいる、デバイス。
【請求項１６】
結合している極性環境において形成される薄膜単分子層表面を有する疎水性表面を含有している基板を含むデバイスであって、薄膜単分子層表面が疎水性表面上にリン脂質リポソームを配置することによって形成され、リン脂質リポソームが、疎水性表面上に配置されたとき拡散して薄膜単分子層表面を形成する、デバイス。
【請求項１７】
薄膜単分子層が、1つ又はそれ以上の付加的な成分をさらに含んでいる、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
さらなる成分が、他の脂質、膜タンパク質、膜に分配するように適合された分子もしくは粒子、又は膜に分配するように適合された別の分子に結合している分子及び粒子の1つ又はそれ以上を含んでいる、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
1つ又はそれ以上の付加的な成分が、疎水性部分と結合したオリゴヌクレオチドを含んでいる、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項２０】
混合領域と連通している第一及び第二の注入容器を含有するミキサーを含んでいる基板を含むデバイスであって、注入容器、第一及び第二連通領域ならびに混合領域が、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の配向結合又は配向付着及び／又は配向拡散に適合している疎水性表面を含んでいる、デバイス。
【請求項２１】
基板が、混合領域と連通している1つ又はそれ以上の付加的な注入容器をさらに含んでいる、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
基板が、疎水性表面を取り囲むより疎水性の低い表面をさらに含んでいる、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２３】
基板が、パターン化されたＳＵ−８及びＴｉ／Ａｕ表面を有する金被覆ガラスを含んでいる、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
1つ又はそれ以上の付加的なミキサーをさらに含んでいる、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２５】
混合領域に連通する流入及び廃棄物チャネル、ならびに反応器へのチャネルをさらに含んでいる、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２６】
注入口が、円形、正方形、五角形、六角形、三角形、長方形又は他の何れかの幾何学的形状である、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２７】
混合領域が、菱形、三角形、長方形、六角形、五角形、円形、又は他の何れかの幾何学的形状である、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２８】
デバイスが、薬剤スクリーニング、センサ適用、ＱＣＭ適用、ＳＰＲ適用、エバネセント波蛍光適用、触媒作用、分子の組織化、又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子で作られる分子的に薄い層もしくはフィルムの形成のために使用される、請求項１、１５又は１６に記載のデバイス。
【請求項２９】
デバイスが試料注入口をさらに含んでいる、請求項１、１５又は１６に記載のデバイス。
【請求項３０】
デバイスが検出器をさらに含んでいる、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
検出器が、質量分析法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）；蛍光検出器、蛍光相関検出器、化学発光検出器又は電気化学的検出器の1つ又はそれ以上を含んでいる、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
使用する質量分析法が、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ）又はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ  ＭＳ−ＭＳ）の1つ又はそれ以上から選択される、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３３】
試料分離装置、分画器又はマニピュレータの1つ又はそれ以上をさらに含んでいる、請求項１、１５又は１６に記載のデバイス。
【請求項３４】
分離装置が、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、ゲルクロマトグラフィ及びゲル電気泳動分離装置の1つ又はそれ以上から選択される、請求項１、１５又は１６に記載のデバイス。
【請求項３５】
方法が、
疎水性表面上に第一リポソームを配置し、そして
疎水性表面上に異なる組成の第二リポソームを配置して、
第一リポソームと第二リポソームが疎水性表面上で拡散し、生じた脂質フィルムが混合することを包含している、表面上でリポソームを混合する方法。
【請求項３６】
第一リポソームと第二リポソームから供与される物質の量が、第一リポソームと第二リポソームの大きさの1つ又はそれ以上によって、又はタイミングによって制御される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、第一リポソームと第二リポソームの一方又は両方の少なくとも一部を回収することをさらに包含している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
リポソームが、マイクロピペット、光ピンセット又はマイクロ流体デバイスの1つ又はそれ以上によって疎水性表面に配置される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
第一リポソームと第二リポソームから形成されるフィルムの化学量論的制御が得られる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
第一リポソームと第二リポソームの混合によって機能性表面が作製される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
機能性表面が、二次元又は三次元デバイスの1つ又はそれ以上を含有している、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
二次元又は三次元デバイスが、巨視的又は顕微鏡的次元のチェンバ、毛管、カラム又は他の何れかのデバイスを含有している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
機能性表面が、触媒表面、結合表面、又は物理的もしくは化学的操作を支援する表面の1つ又はそれ以上を含んでいる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
疎水性表面が、疎水性表面とより疎水性の低い表面のアレイを含有している、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
方法が、巨視的次元又は顕微鏡的次元の表面のアレイを作製する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第一リポソームが拡散して第一フィルムを形成し、そしてフィルムと結合するか又は反応する他の分子を添加することによって第一フィルムを機能化する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
リポソームが、超分子構造体、ナノ構造体、核酸アレイ、タンパク質アレイ、他の分子実体のアレイ、粒子アレイを形成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
第一リポソーム又は第二リポソームの1つ又はそれ以上が、オリゴヌクレオチド、疎水性部分と結合したオリゴヌクレオチド、膜タンパク質、膜に分配するように適合された分子もしくは粒子、又は膜に分配するように適合された別の分子に結合している分子及び粒子を含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
検出しようとする試料と基板を接触させることをさらに包含している、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
試料が、核酸もしくは他の部位特異的な分子認識分子、酵素、阻害剤、結合パートナー又は基質を含有している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
フィルムを化学的又は物理的に修飾することの1つ又はそれ以上をさらに包含している、請求項３５又は４８に記載の方法。
【請求項５２】
化学的もしくは物理的調節もしくは操作の異なる工程又は検出の異なる工程が、同じ試料に関して並行して実施される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
化学的もしくは物理的調節もしくは操作の異なる工程又は検出の異なる工程が、異なる試料に関して並行して実施される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
第一リポソームと第二リポソームから形成されたフィルムを乾燥させることをさらに包含している、請求項３５に記載の方法。
【請求項５５】
フィルムが、核酸フィルム又はタンパク質フィルムの1つ又はそれ以上を含有している、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
核酸フィルムを基板の表面上で乾燥させることをさらに包含している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
核酸フィルムを乾燥状態で保存することをさらに包含している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
フィルムを再水和することをさらに包含している、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
フィルムと試料の間の相互作用を検出することをさらに包含している、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
方法が、
多重膜小胞を緩衝液に懸濁し、そして
疎水性表面を含有している基板上に小胞を配置して、それにより小胞が表面上に単分子層として拡散することを包含している、動的液膜形成の方法。
【請求項６１】
第二多重膜小胞を基板上に配置し、それにより小胞と第二小胞が拡散して混合することをさらに包含している、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
第三多重膜小胞を基板上に配置し、それにより小胞、第二小胞及び第三小胞が拡散して混合することをさらに包含している、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
基板が請求項２０に記載のデバイスを含んでいる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
拡散係数が約０．０１〜約５００μｍ２／秒を包含している、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
方法が、修飾核酸分子を基板の疎水性表面に配置し、修飾核酸分子が表面と結合して、それにより核酸フィルムを形成することを包含している、核酸フィルムを形成する方法。
【請求項６６】
修飾核酸分子がコレステリル−テトラエチレングリコール修飾オリゴヌクレオチドを含んでいる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
第二修飾核酸分子を基板の疎水性表面上に配置することをさらに包含している、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
修飾核酸分子が同じ配列又は異なる配列の核酸を含んでいる、請求項６５又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
第二修飾核酸分子が基板の第二疎水性表面上に配置される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
３つ又はそれ以上の修飾核酸分子試料を基板上に配置することをさらに含んでいる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
試料が、隣接疎水性表面上又は各々がより疎水性の低い表面に囲まれた個別の疎水性表面上に配置される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
個別の疎水性表面が約１ｎｍ〜約５ｃｍの寸法特性を包含している、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
修飾核酸分子が約１０〜約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面被覆率を包含している、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
修飾核酸分子が約２０〜約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面被覆率を包含している、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
修飾核酸分子が、約１０１２〜約１０１３分子／ｃｍ２のフィルム密度を包含している、請求項６５に記載の方法。
【請求項７６】
相補的核酸を核酸フィルムにハイブリダイズすることをさらに包含している、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年３月２６日出願の米国特許仮出願第６０／９０８，８７２号の優先権を主張して、その内容全体は参照により本明細書に明確に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
ポリマー、バイオマテリアル及び他のソフトマテリアルは、基礎と応用の両方の見地から、ますます重要性が高まりつつある。材料の適用範囲は、ナノスケール（例えば、生体分子材料及びコポリマの中間相）から顕微鏡的（マイクロエレクトロニクス）、さらには巨視的（高性能構造複合材料）までに及ぶ。材料の開発と密接に関連しているのは、適用の小型化であり、これは、例えば、非侵襲的インビボ診断、ならびに化学的及び電気化学的治療のための分子レベルの化学センシングを伴う生物医学用マイクロマシン、のような超微細デバイスをもたらす。この小型化を達成するため、ナノスケール構造体及び成分を産出する高度に制御された方法をもたらす、自己集合(self-assembly)方法が活用され、開発されている。現時点では、マイクロ及びナノ構造体表面上での自己集合生体分子（例えば、脂質、ポリペプチド、ＤＮＡ及び生体高分子）に使用するためのマイクロチャネル及びパターン化表面を開発する試みはまだ成功を収めていない。高度配向性で可変次元の自己集合体は、例えば、ナノワイヤ及びナノ導管のような、ナノ及びマイクロスケールの無機／有機構造体の加工処理用の鋳型として使用されている。例えば、医療移植片及びインビボでの薬剤送達システムにおいて、生体適合性材料への需要が急速に増大しつつある。
【０００３】
さらに、生体膜の機能的及び生理的局面への洞察を得るには、サポートする脂質単分子層、二分子層及び多分子層の化学的及び動的性質を検討する必要があり、既存の手法では不十分である。固体表面結合平面膜の利点を生かしたシステム及び方法が得られることは、エバネセント場分光法(Watts,T., H.Gaub, and H.McConnell, 1986. Nature, 320:179−181)のような表面感受性技術が適用可能であるから、有用である。今までのところ、リン脂質膜に関する入手可能な検討の大部分は、集合体及び分子組織化工程にわたる制御を欠いている、ラングミュア・ブロジェット（Langmuir-Blodgett）法又は小胞融合によって製造された静的脂質層を使用して実施されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在の固定化手法の大半は、長いインキュベーション期間、複数回の洗浄工程及び強い化学処理工程を含み、それらは固定化システムの適用性を複雑で面倒なものにしている。従って、生体分子を表面に固定化するための方法と技能が当該技術分野において求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書は、固体基板上の単分子層フィルムを形成するための方法及びデバイスを開示する。より詳細には、本発明は、ナノテクノロジー及びナノバイオテクノロジー及び固体−ソフトマター界面に関する。
【０００６】
両親媒性分子又は一般に少なくとも１つの疎水性部分を含む分子の自己集合体を制御して、主として疎水性特性を有する固体表面と定義された組成の自己集合した又は吸着した分子の単分子層との間に定義された界面を作製するための方法及び技術が本明細書に開示される。例えば、単分子層は、１つ又はそれ以上のリン脂質、ＤＮＡ、ペプチド、膜タンパク質を含むタンパク質、液晶、又はそれらの混合物を含んでいてよい。
【０００７】
本明細書において提供される方法及びシステムは、自己集合又は自己会合に依存する方法を利用する多くの領域及び分野において、例えば、生体膜研究において、またＳＰＲ及びＱＣＭを含む薬剤スクリーニング、生体高分子分離及びバイオセンシングにおいても適用可能である。したがって、デバイスの形状は、例えば、薄膜における分離、反応及び混合現象に対して活用できる特異的機能性を促進するために設計され、カスタマイズされてもよい。さらなる例として、本明細書に提供される方法及びシステムは、表面支援（二次元）超分子及び高分子集合及び合成のため、ならびにナノスケール構造体及びデバイスの生産のために使用できる。一般にそれは、二次元マイクロ流体学又は薄膜流体学のプラットフォームについての基礎を形成する。
【０００８】
本明細書は、一態様により、疎水性表面を有する基板を含んでいるデバイスを開示していて、その疎水性表面は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の配向結合又は配向付着及び／又は配向拡散に適合する。
【０００９】
一実施態様では、疎水性表面は、チェンバ、カラム、二次元表面（例えば、９６、３８４又は１５３６ウェルマイクロタイタプレート）、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）結晶、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、チップ、顕微鏡カバーガラス、マイクロ流体チップ、サンドイッチ細胞、又はチャネル（例えば、及び／又はナノメートル〜メートル次元の他の何れかの幾何学的形状）の全部もしくは一部を含む、又は全部もしくは一部を形成する。
【００１０】
別の実施態様では、疎水性表面は、ＳＵ−８、硬化焼成ＳＵ−８、疎水性ポリマー、ガラス、セラミック、金属、又は液晶（ＳＵ−８様特性を有する他の物質、又は水との高接触角を有する物質）の１つ又はそれ以上を含む。
【００１１】
一実施態様では、疎水性表面はサブ構造体のパターンを含む。
別の実施態様では、サブ構造体は、層内の穿孔、層内の穴、層上の柱又は他の物質、パッチ、又は固定化された粒子、フィルム、化学物質、又は分子の１つ又はそれ以上を含む。
【００１２】
一実施態様では、層内の穿孔、層内の穴、層上の柱又は他の物質、パッチ、又は固定化された粒子、フィルム、化学物質、又は分子は、薄膜、周囲の溶液及び／又は周囲の空気、ガスもしくは真空中に存在する物質又は化合物への触媒の、結合の、化学吸着の、物理吸着の、（若しくは反応性）、又は調節の効果を含む。
【００１３】
別の実施態様では、サブ構造体は、１つ又はそれ以上の秩序づけられた（例えば、配列された）又は無秩序な方式に配置されていて、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の拡散フィルムによって完全にもしくは部分的に覆われるように又は囲まれるように適合されている。
【００１４】
別の実施態様では、疎水性表面は、化学反応、表面支援性合成手順、触媒プロセス、超分子自己集合、又は親和性に基づく分離（例えば、サブ構造体上又はサブ構造体内に固定化された物質又は反応物と拡散フィルムの活性成分との間で実施することができる）を含むプロセスに適合している。
【００１５】
一実施態様では、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子は、リン脂質、両親媒性分子（例えば、洗浄剤）界面活性剤、タンパク質（例えば、膜タンパク質、疎水性部分で修飾されたタンパク質）、ペプチド（例えば、長ペプチド又は短ペプチド、疎水性部分で修飾されたペプチド）、核酸、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）、疎水性部分で修飾された分子（例えば、疎水性表面と強力な疎水性相互作用を形成する能力を有する上記すべての脂質尾部）の１つ又はそれ以上を含む。
【００１６】
一実施態様では、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子はフィルムを含む。
別の実施態様では、フィルムは、液体、固体、液晶又はゲルの１つ又はそれ以上を含む。
【００１７】
一実施態様では、デバイスは温度制御装置をさらに含む。
一実施態様では、温度制御装置は、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の相転移及び拡散挙動が制御可能であるような制御を可能にする。
【００１８】
一実施態様では、疎水性表面は、エンボス加工された又は刻み込まれた幾何パターン（例えば、２Ｄ及び３Ｄ）の１つ又はそれ以上を含む。
１つの態様によれば、疎水性表面、疎水性がより低い表面、及び疎水性表面を少なくとも部分的に覆いそして疎水性表面に限局される少なくとも１つの疎水性部分を有する分子のフィルムを含む基板を含むデバイスが、本明細書に開示される。
【００１９】
１つの態様によれば、結合している極性（例えば、水性）環境において形成される薄膜単分子層表面を有する疎水性表面を含有する基板を含むデバイスであって、薄膜単分子層表面が疎水性表面上にリン脂質リポソームを配置することによって形成され、リン脂質リポソームが、疎水性表面上に配置されたとき拡散して薄膜単分子層表面を形成する、デバイスが本明細書に開示される。
【００２０】
別の実施態様では、薄膜単分子層は、１つ又はそれ以上の付加的な成分をさらに含む。
一実施態様では、さらなる成分は、他の脂質、膜タンパク質、膜に分配するように適合された分子もしくは粒子（例えば、薬剤及び染料）、又は膜に分配するように適合された別の分子に結合している分子及び粒子の1つ又はそれ以上を含む。
【００２１】
別の実施態様では、１つ又はそれ以上の付加的な成分は、疎水性部分（例えば、コレステロール）と結合したオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を含む。
【００２２】
１つの態様によれば、混合領域と連通している第一及び第二注入容器を含んでいるミキサーを含有する基板を含むデバイスであって、ここで、注入容器、第一及び第二連通領域ならびに混合領域が、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の配向結合又は配向付着及び／又は配向拡散に適合している疎水性表面を含んでいる、デバイスが本明細書に開示される。
【００２３】
一実施態様では、基板は、混合領域と連通している１つ又はそれ以上の付加的な注入容器をさらに含む。
一実施態様では、基板は、疎水性表面を取り囲むより疎水性の低い表面をさらに含む。
別の実施態様では、基板は、パターン化されたＳＵ−８（疎水性表面）及びＴｉ／Ａｕ（より疎水性の低い）表面を有する金被覆ガラスを含む。
【００２４】
一実施態様では、デバイスは１つ又はそれ以上の付加的なミキサーをさらに含む。
一実施態様では、デバイスは、混合領域に連通する流入及び廃棄チャネル、ならびに反応器（例えば、触媒反応器及び検出器）、（例えば、蛍光又は電気化学的検出器）へのチャネルをさらに含む。
【００２５】
別の実施態様では、注入口は、円形、正方形、五角形、六角形、三角形、長方形又は他の何れかの幾何学的形状である。
別の実施態様では、混合領域は、菱形、三角形、長方形、六角形、五角形、円形、又は他の何れかの幾何学的形状である。
【００２６】
一実施態様では、デバイスは、薬剤スクリーニング、センサへの適用、ＱＣＭへの適用、ＳＰＲへの適用、エバネセント波蛍光への適用、触媒作用、分子の組織化（例えば、分子合成又はデバイス合成）、又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子で作られる分子的に薄い層もしくはフィルムの形成のために使用される。
【００２７】
別の実施態様では、デバイスは試料注入口をさらに含む。
一実施態様では、デバイスは検出器をさらに含む。
一実施態様では、検出器は、質量分析法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）、蛍光検出器、蛍光相関検出器、化学発光検出器又は電気化学的検出器の１つ又はそれ以上を含む。
【００２８】
一実施態様では、使用する質量分析法は、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ）又はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ  ＭＳ−ＭＳ）の１つ又はそれ以上から選択される。
一実施態様では、デバイスは、試料分離装置、分画器又はマニピュレータの1つ又はそれ以上をさらに含む。
別の実施態様では、分離装置は、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、ゲルクロマトグラフィ及びゲル電気泳動分離装置の1つ又はそれ以上から選択される。
【００２９】
１つの態様によれば、疎水性表面上に（特定の組成の）第一リポソームを配置し、そして疎水性表面上に異なる組成物の第二リポソームを配置して、第一リポソームと第二リポソームが疎水性表面上で拡散して混合することを含む、表面上でリポソームを混合する方法が、本明細書に開示される。
【００３０】
一実施態様では、第一リポソームと第二リポソームから供与される物質の量は、第一リポソームと第二リポソームの大きさの1つ又はそれ以上によって、又はタイミングによって制御される。
一実施態様では、前記方法は、第一リポソームと第二リポソームの一方又は両方の少なくとも一部を回収する（例えば、それらが所望量の脂質を表面に供与した後）ことをさらに含む。
【００３１】
一実施態様では、リポソームは、マイクロピペット、光ピンセット又はマイクロ流体デバイスの1つ又はそれ以上によって、疎水性表面に配置される。
別の実施態様では、第一リポソームと第二リポソームから形成されるフィルムの化学量論的制御が得られる。
【００３２】
別の実施態様では、第一リポソームと第二リポソームの拡散した単分子層の混合によって機能性表面が作製される。
一実施態様では、機能性表面は、二次元又は三次元デバイスの1つ又はそれ以上を含む。
【００３３】
別の実施態様では、二次元又は三次元デバイスは、巨視的又は顕微鏡的次元のチェンバ、毛管、カラム又は他の何れかのデバイスを含む。
別の実施態様では、機能性表面は、触媒表面、結合表面、又は物理的もしくは化学的操作を支援する表面の1つ又はそれ以上を含む。
【００３４】
別の実施態様では、疎水性表面は、疎水性表面とより疎水性の低い表面のアレイを含む。
別の実施態様では、方法は、巨視的次元又は顕微鏡的次元の表面のアレイを作製することを含む。
【００３５】
一実施態様では、第一リポソームは拡散して第一フィルムを形成し、フィルムと結合するか又は反応する（例えば、フィルムがその性質を変化させるように）他の分子を添加することによって、第一フィルムを機能化する（又は変化させる）。
別の実施態様では、リポソームは、超分子構造体、ナノ構造体、核酸アレイ、タンパク質アレイ、他の分子実体のアレイ、粒子アレイを形成する。
【００３６】
一実施態様では、1つ又はそれ以上の第一リポソーム又は第二リポソームは、オリゴヌクレオチド、疎水性部分と結合したオリゴヌクレオチド、膜タンパク質、膜に分配するように適合された分子もしくは粒子、又は膜に分配するように適合された別の分子に結合している分子及び粒子を含む。
【００３７】
一実施態様では、方法は、検出しようとする試料と基板を接触させることをさらに含む。
一実施態様では、試料は、核酸もしくは他の部位特異的な分子認識分子（例えば、タンパク質、抗体もしくはそのフラグメント、又はレクチン）、酵素、阻害剤、結合パートナー又は基質を含む。
【００３８】
一実施態様では、方法は、フィルムを化学的又は物理的に修飾することの1つ又はそれ以上をさらに含む。
別の実施態様では、化学的若しくは物理的調節又は操作の異なる工程、或いは検出の異なる工程が、同じ試料に関して並行して実施される。
【００３９】
一実施態様では、化学的若しくは物理的調節又は操作の異なる工程、或いは検出の異なる工程が、異なる試料に関して並行して実施される。
一実施態様では、方法は、第一リポソームと第二リポソームから形成されたフィルムを乾燥させることをさらに含む。
【００４０】
別の実施態様では、フィルムは、核酸フィルム又はタンパク質フィルムの1つ又はそれ以上を含む。
一実施態様では、方法は、核酸フィルムを基板の表面上で乾燥させることをさらに含む。
【００４１】
一実施態様では、方法は、核酸フィルムを乾燥状態で保存することをさらに含む。
一実施態様では、方法は、フィルムを再水和することをさらに含む。
【００４２】
一実施態様では、方法は、フィルムと試料の間の相互作用を検出することをさらに含む。
１つの態様によれば、多重膜小胞を緩衝液に懸濁し、そして疎水性表面を含有している基板上に小胞を配置して、それにより小胞が表面上に単分子層として拡散することを含む、動的液膜形成の方法が本明細書に開示される。
【００４３】
一実施態様では、方法は、第二多重膜小胞を基板上に配置し、それにより小胞と第二小胞が拡散して混合することをさらに含む。
一実施態様では、方法は、第三多重膜小胞を基板上に配置し、それにより小胞、第二小胞及び第三小胞が拡散して混合することをさらに含む。
【００４４】
一実施態様では、基板は請求項１７に記載のデバイスを含む。
別の実施態様では、拡散係数は約０．０１〜約５００μｍ２／秒を含んでいる。
【００４５】
１つの態様によれば、修飾核酸分子を基板の疎水性表面に配置して、修飾核酸分子が表面と結合することを含む、核酸フィルムを形成する方法が本明細書に開示される。
一実施態様では、修飾核酸分子は、コレステリル−テトラエチレングリコール修飾オリゴヌクレオチド（ヘキサエチレングリコール／ポリエチレングリコール）を含む。
【００４６】
一実施態様では、方法は、第二修飾核酸分子を基板の疎水性表面上に配置することをさらに含む。
別の実施態様では、修飾核酸分子は、同じ配列又は異なる配列の核酸を含む。
【００４７】
一実施態様では、第二修飾核酸分子は基板の第二疎水性構造上に配置される。
一実施態様では、方法は、３つ又はそれ以上の修飾核酸分子試料を基板上に配置することをさらに含む。
一実施態様では、試料は、隣接疎水性表面上又は、各々がより疎水性の低い表面に囲まれた個別の疎水性表面上に配置される。
【００４８】
別の実施態様では、個別の疎水性表面は、約１ｎｍ〜約５ｃｍの寸法特性を包含する。
一実施態様では、修飾核酸分子は、約１０〜約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面被覆率を包含する。
【００４９】
一実施態様では、修飾核酸分子は、約２０〜約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面被覆率を包含する。
別の実施態様では、修飾核酸分子は、約１０１２〜約１０１３分子／ｃｍ２のフィルム密度を包含する。
【００５０】
一実施態様では、方法は、相補的核酸を核酸フィルムにハイブリダイズすることをさらに含む。
他の実施態様を以下に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１Ａは、Ｔｉの接着層、金の基層及び疎水性物質（ＳＵ−８ポリマー）の最上層で被覆された担体基板（例えば、ガラス）である、１つの実施態様の概略図を示す。  図１Ｂは、パターン化された表面デバイスの概略図を示す。Ｔｉの接着層、金の基層及び疎水性物質（ＳＵ−８ポリマー）のマイクロ構造化最上層で被覆された担体基板（例えば、ガラス）が示されている。  図１Ｃは、２つ（上の列）、３つ（中央の列）又は４つ（下の列）の別個の注入領域（φ２５μｍ）、レーン（幅５μｍ）及び中心混合領域を有する３つの異なる最上部構造体を含有している、図１Ｂに示すものと同じ一般的構造のパターン化された表面デバイスの明視野顕微鏡写真を示す。  図１Ｄは、拡散レーン上に固定点を有するパターン化表面の概略図を示す。固定点はエンボス加工されているか又は包埋されており、拡散脂質フィルム中の成分との化学的又は物理的相互作用のための官能基を担持する。
【図２Ａ】視覚化と制御のための倒立顕微鏡；注入針の位置づけのためのマイクロマニピュレータ；注入針；可溶性又懸濁物質の沈着のためのポンプ；及びデバイス上の脂質などの化学物質、及び温度制御のための抵抗加熱装置を含む、構成要素の中に置かれたパターン化デバイスを描画した、実験の設定を示す。
【図２Ｂ】フィルム拡散の視覚化のための蛇行レーンの明視野顕微鏡画像を示す。リン脂質沈着物（多重膜小胞、φ５μｍ）は中心注入領域に位置する。円形ＳＵ−８構造体の直径：２５μｍ。
【図２Ｃ】疎水性の平面デバイス表面上に疎水性尾部基（例えば、リン脂質）を有する両親媒性種を含有している、分子フィルムの円形拡散の概略図を示す。高くなった中心構造は、多重膜小胞を含む脂質沈着物を示す。矢印は拡散の等方性配向を示す。
【図２Ｄ】図２Ｂに示す平面構造のＳＵ−８デバイス上でのリン脂質フィルムの拡散を示す時系列蛍光顕微鏡写真である。パネル（ｉ）：沈着の１９分後、パネル（ｉｉ）：沈着の３０分後、パネル（ｉｉｉ）：沈着の２０８分後、パネル（ｉｖ）：沈着の４９９分後。円形ＳＵ−８構造体の直径は２５μｍである。
【図３Ａ】図１Ａと同様のＳＵ−８で被覆されたデバイス上の２つの成分の脂質混合を示す時系列蛍光顕微鏡写真である。パネル（ｉ）：４分後、パネル（ｉｉ）：６分後の経過、パネル（ｉｉｉ）：９分後、パネル（ｉｖ）：２７分後。２つの脂質画分の１つは蛍光標識されており（より明るく見える）、他方は標識されていない（暗く見える）。混合は、標識成分の蛍光の減少として認められる。円形構造体の直径は２５μｍである。
【図３Ｂ】図１Ｃに示すような、３つのレーン混合表面を有するデバイス上での３つの成分の脂質混合を示す時系列顕微鏡写真である。パネル（ｉ）：リン脂質の沈着直後の明視野顕微鏡写真；パネル（ｉｉ）〜（ｖｉ）：蛍光顕微鏡写真；パネル（ｉｉ）：リン脂質の沈着直後の、０分時点、パネル（ｉｉｉ）：２０分後の経過；パネル（ｉｖ）：９０分後；パネル（ｖ）：２１０分後；（ｖｉ）２４０分後。３つの注入領域に沈着した３つの脂質画分は、それらの拡散を同時に追跡するため３つの異なる蛍光を発する染料で標識されている。円形ＳＵ−８構造体の直径は２５μｍであり、画像はコントラストをより良好にするため反転色になっている。
【図３Ｃ】機能性フィルム成分の存在下での単一レーン表面を有するデバイス上の脂質拡散と混合の概略図を示す。拡散する脂質フィルムは、各注入領域の中心部の多重膜小胞から生じる。パネル（ｉ）：各々が２つの活性成分の１つを担持している、２つの脂質成分を有する単一レーン拡散及び混合デバイスの図。脂質拡散は、単一レーンで相互に連結された２つの注入領域に位置する２つの多重膜小胞から生じる。付加成分は拡散脂質と共に移動し、レーンの中心領域（挿入図）で混合したとき互いに反応する。パネル（ｉｉ）：単一レーン表面での脂質拡散に基づく分離デバイスの概略図を示す。フィルムを形成する脂質は、１つの注入領域内の単一多重膜小胞から生じる。注入領域に接続された単一レーンは、丸で囲まれたドットとして示されている、活性な機能化された表面サブ構造体を含む。この実施態様では、２つの相互に非反応性の成分が拡散脂質物質と混合され、２つのうちの一方は活性な表面領域と反応性であり、他方の成分は非反応性である。レーンを経て拡散したとき、２つの物質はレーンの中央部分（挿入図）の活性化表面領域に達する。反応性成分は保持され、非反応性成分は移動を続けて、この二次元ナノ流体フィルムデバイス内の２つの成分を有効に分離する。
【図４】ドープした極性ダイズ脂質試料のモル分率Фに対して蛍光強度Ｉをプロットすることにより、２つのリン脂質沈着物（１つは標識され、１つは標識されていない）の混合の数量化を示す。Ф＝０を除き、●及びＸは同一構造体に関する独立した測定値を表す。測定は、構造体全体にわたる脂質の等しい分布を達成するため脂質適用の約１６時間後に実施した。データ点の各々の対は、表面上の脂質フィルム組成物の記号表示を伴う。
【図５Ａ】パターン化表面デバイス上でのＤＮＡ固定化及びハイブリダイゼーション手順の概略図を示す。パネル（ｉ）：コレステロール−ＴＥＧ−ｓｓＤＮＡを含む溶液を、手操作によりパターン化ＳＵ−８／金基板上にピペットで分注する。パネル（ｉｉ）：インキュベーション期間後、カバーガラス（例えば、表面又は基板）を洗浄し、乾燥させて、再水和し、疎水性ＳＵ−８領域だけに吸着されたｓｓＤＮＡを残す。パネル（ｉｉｉ）：ｃＤＮＡを含む溶液をピペットで基板上に分注する。ハイブリダイゼーションを生じさせるためのインキュベーション期間後、カバーガラス（例えば、表面又は基板）を洗浄し、乾燥させて、再水和する。パネル（ｉｖ）：ＤＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖が疎水性ＳＵ−８領域で選択的に構築される。
【図５Ｂ】分子レベルでのデバイス上のＤＮＡ固定化及びハイブリダイゼーションの概略図を示す。パネル（ｉ）、（ｉｉ）：蛍光標識した（標識１，５００〜６００ｎｍ発光）コレステロール−ｓｓＤＮＡコンジュゲートをデバイス上の疎水性ＳＵ−８構造体に固定化する。パネル（ｉｉｉ）、（ｉｖ）：蛍光標識した（標識２，５５０〜７００ｎｍ発光）相補的ｓｓＤＮＡを溶液に添加し、表面に固定化されたｓｓＤＮＡとハイブリダイズさせる。構造化された表面の疎水性ＳＵ−８領域でのみ二本鎖標識ｄｓＤＮＡが得られる。
【図５Ｃ】蛍光標識したコレステロール−ＴＥＧ−ＤＮＡコンジュゲートの固定化検出を示す蛍光顕微鏡写真である。パネル（ｉ）：インキュベーションの１５分後に緩衝液中のＳＵ−８に固定化されたＤＮＡ１の蛍光（λｅｘｃ＝６３３ｎｍ、λｅｍ＝６６０〜７５０ｎｍ）。パネル（ｉｉ）：インキュベーションの２５分後に緩衝液中のＳＵ−８に固定化されたＤＮＡ３の蛍光（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５００〜５４０ｎｍ）。画像は人工色で示されている。
【図６】ＤＮＡ３＋ｃ−ＤＮＡ３／４プローブ対を使用したＦＲＥＴによるハイブリダイゼーション検出を示す。左側の欄は、ＤＮＡ３の蛍光（５００−５４０ｎｍの発光チャネル、４８８ｎｍの励起波長での検出）を示す。右側の欄は、ｃ−ＤＮＡ３／４の蛍光（５５０−６２０ｎｍの発光チャネル、４８８ｎｍの励起波長での検出）を示す。パネル（ｉ）、（ｉｉ）：沈着及びＤＮＡ３溶液の洗浄後の、乾燥及び緩衝液による再水和。パネル（ｉｉｉ）、（ｉｖ）：緩衝液の洗浄とｃ−ＤＮＡ３／４溶液の添加。パネル（ｖ）、（ｖｉ）：ｃ−ＤＮＡ３／４溶液の洗浄、乾燥及び緩衝液による再水和。欄の下のグラフは、各々のパネルｉ〜ｖｉについての強度データを数量化している。
【図７】光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）を時系列で示す。蛍光顕微鏡写真は、緩衝液中５５０−６２０ｎｍの発光チャネルを使用して５４３ｎｍの励起波長で撮影している。パネル（ｉ）：ＤＮＡ１＋ｃ−ＤＮＡ１／２プローブ対。退色前、ｔ＝０秒、ｔ＝３００秒、ｔ＝６００秒。パネル（ｉｉ）：ＤＮＡ３＋ｃ−ＤＮＡ３／４プローブ対。退色前、ｔ＝０秒、ｔ＝３００秒、ｔ＝６００秒。パネル（ｉｉｉ）：２つのシリーズについての時間に対する退色領域の蛍光回復。蛍光強度値は１００に正規化されている。
【図８】ＤＥＰＥ脂質拡散のサーモトロピックスイッチングを示す。（ａ）左側及び右側円形パッドに適用されたＳＰＥ脂質小胞を有するＳＵ−８構造体の透過型顕微鏡写真。ローダミンホスファチジルエタノールアミンでドープしたＤＥＰＥ粒子を中央の円形パッド上に置いた。（ｂ）直流電流を流して、それによってデバイスを加熱した、コイル状の薄いＴｉ／Ａｕフィルムに配列されたＳＵ−８構造体。（ｃ〜ｆ）（ａ）に対応する蛍光顕微鏡写真の重ね合わせ。ＤＥＰＥ（中央）は、温度がＴｍを超えて上昇したとき単分子層内に拡散する（ｃ〜ｄ）。Ｔｍ未満で拡散が停止することを示すため、カルボフルオレセインホスファチジルエタノールアミンでドープしたＳＰＥ脂質（励起４８８ｎｍ、発光５００〜５６０ｎｍ）及びＡｌｅｘａ  ６３３ホスファチジルエタノールアミンでドープしたＳＰＥ（励起６３３ｎｍ、発光６４０〜８００ｎｍ）を、それぞれ左側と右側のパッドに沈着させた。ＳＰＥ脂質単分子層フィルムはＳＵ−８構造体上に拡散するが、ＤＥＰＥの拡散はその大きさを維持する（励起５４３ｎｍ、発光５５０〜６５０ｎｍ）（ｅ〜ｆ）。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
明確に定義付けされた表面上の分子単分子層の形成が、様々な化学反応デバイス、センサ又はスクリーニング装置を構築するためならびに他の適用に対して、極めて望ましい。特定の疎水性修飾又は表面処理を必要としない、疎水性表面を備えたデバイスが本明細書に提供される。本明細書に記載のデバイスは、疎水性表面を覆う物質の少なくとも１つの分子的に薄い層を更に含有していて、そしてそのような分子的に薄い層を形成するための方法をさらに含む。本明細書に使用される、「分子的に薄い」とは、約０．１ｎｍ〜約１０００μｍ；約１０ｎｍ〜約２００μｍ；又は約１００ｎｍ〜約１００μｍ；約５００ｎｍ〜約１００μｍ；又はそれらの間の何れかの単一値又は部分的範囲の厚さを含む。
【００５３】
脂質−表面界面からの脂質二分子層の自発的集合と成長については、比較的欠陥のない脂質膜の調製のためのその簡単で広く適用できる方法に起因して、ますます関心を集めている(Goennenwein S. et al., Biophys.J.85:646-655(2003); Salafsky J. et al., Biochemistry 35(47):14773-14781(1996)）。本明細書に開示する方法は、例えば、水性媒質中の堆積脂質貯蔵容器から開始される、固体基板上での単一脂質二分子層の自発的成長を含んでいる。実験的に観察された挙動を説明するための物理的モデルが提案されている(Czolkos I. et al., Nano Letters 7:1980-1984(2007))。本明細書に提示される方法とシステムは、マイクロ及びナノ流体系、バイオセンサ及び他の分析手法内で、タンパク質及びＤＮＡなどの、それらの擬似天然環境(quasi-native environment)における生体高分子の直接操作を可能にする。
【００５４】
本明細書に記載の方法及びシステムの使用の一例は、表面結合膜への機能的膜タンパク質の組込みである。これまでに、膜の自己拡散への脂質−基板界面特性は検討されている(S.Goennenwein et al.,(2003)Biophys.J.85,646-655)。雲母、ガラス及びポリマー被覆ガラスなどの種々の基板材料の適合性に関して報告されていて、これらの材料がある程度まで二分子層の自己拡散を誘導できることが示された。シリコンは、特に、電子装置に接続することを通して分子センシング又は検出技術を含む多様な適用のための潜在的可能性を示す。脂質層の形成とナノ力学を支配するいくつかの他の因子、例えば、電解質濃度、温度及び電場が検討されてきた。しかしながら、これまで、脂質単分子層の制御された拡散を可能にする適切なインターフェースは報告されていない。そこで、本明細書において、脂質単分子層の拡散を制御するための適切なインターフェースを提供する方法とシステムが提示される。
【００５５】
本明細書で提示する方法及びシステムの使用の別の例は、検出に適用するためのＤＮＡの開発である。生物工学における多くの適用では、ＤＮＡの位置決定能力(addressability）と分子認識に基づいている。従って、これに関して、種々の基板上で高い表面被覆率及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の機能的アクセス可能性をもたらす効率的な固定化手順が、非常に重要になる。ＤＮＡマイクロアレイは、ラボ・オン・チップ合成によって又はあらかじめ合成されたＤＮＡの固体支持体への固定化によって作成することができる。前者の方法は複雑であり、種々のシステムをモデリングするためにあまり柔軟性があるとは言えないが、後者の方法はより安価であり、研究への適用においてより好ましい。これに関して、固定化用の固体支持体は、固相生化学反応の効率を決定するのを助け、したがってマイクロアレイの利用に役立つ。これまでに、ＤＮＡは、基板及び／又はオリゴヌクレオチドのいずれかが化学修飾された多種多様な基板に結合されている。
【００５６】
疎水性表面での制御された組成の可変次元の分子単分子層フィルムの形成のための方法及びデバイスが本明細書にさらに提示されていて、ここでデバイスは、表面がそのままの状態で疎水性であるので、特定の疎水性修飾又は表面の処理を必要としない。デバイスは、一実施態様では、例えば、親水性支持体上で、マイクロ構造体としてパターン化することができる疎水性基板を含む。修飾ＤＮＡ（例えば、コレステリル結合ＤＮＡ）、脂質、膜タンパク質を含むタンパク質、液晶ならびに他の両親媒性分子を含む薄い分子フィルムが疎水性表面上に形成される。フィルムの化学量論及び組成は制御することができる。例えば、フィルムの化学量論及び組成は、そこからフィルムが成長するリポソームに含まれる物質の量を制御することによって、規定された領域の表面で種々の物質でドープした種々のフィルムを混合することによって、種々の幅のレーンからのフィルムを混合することによって、種々のフィルムが表面に導入される時間を制御することによって、又は例えば、温度でフィルムの相状態を制御することによって、制御することができる。さらに、リポソームなどの前駆体集合物を表面に配置するためのマイクロディスペンシング技術も開示する。本明細書で開示する方法及びデバイスは、高度に定義された分子相互作用による自己集合又は自己会合に基づく方法を用いる多くの領域及び分野において適用可能である。そのような分野の例は、例えば、生体膜研究、薬剤スクリーニング、分離、分別、精製、生体高分子分離、単分子研究、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法及び水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）技術などのバイオセンシングを含む。
【００５７】
生物工学及び生体分析学における多くの適用では、表面支援ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づいている。従って、種々の基板上で高い表面被覆率及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の機能的アクセス可能性をもたらす効率的な固定化手順が、非常に重要になる。ＤＮＡは、ガラス、シリコン、溶融シリカ、Ｓｉ３Ｎ４、金、ＳＵ−８、ＰＤＭＳ、ＰＶＡ及びＰＭＭＡに共有結合されてきた。これらすべての場合に、基板及び／又はオリゴヌクレオチドのいずれかが化学修飾される必要がある。ＤＮＡは、オンチップ合成によって又はあらかじめ合成されたＤＮＡの固定化によって、固体支持体上のあらかじめ定められた場所に位置づけられる。オンチップ合成は高密度のアレイを提供するが、ＤＮＡ配列の長さ、合成の信頼度及び価格的な面で実質的制約がある。これに対し、ＤＮＡの固定化に基づく方法は、一般により簡単で、安価であり、用途が広い。大部分の固定化技術は、数時間のインキュベーション時間、複数回の洗浄工程、及び強い化学物質処理を含む。ＤＮＡの非共有結合表面吸着は、面倒で費用と時間のかかる基板の活性化／修飾及びその後の固定化手順を自動化するための最も簡単で容易な方法である。
【００５８】
本明細書で使用する「アレイ」とは、例えば、（ａ）その表面の別個の場所に配置された1つ又はそれ以上の構成要素を有する固体支持体、又は（ｂ）各々がその表面の別個の場所に配置された１つ又は複数の構成要素を有する、複数の固体支持体を含む。アレイは、本発明のパラメータ内で構成要素のすべての可能な順列置換を含むことができる。例えば、アレイは、すべての脂質のマイクロアレイ、複数の化合物を有するマイクロアレイ、脂質小胞を含む複数の化合物を有するマイクロアレイ等であってよい。
【００５９】
本発明の方法及びデバイスにおいて有用な脂質の例を以下に示す。当業者が本開示を利用して確認できるような他の脂質も使用できる。天然脂質は、例えば、リピドＡ（解毒リピドＡ）、コレステロール、スフィンゴ脂質（スフィンゴシン及びＤ−エリスロ−スフィンゴシン、スフィンゴミエリン、セラミド、セレブロシド、脳スルファチドなどの誘導体）、ガングリオシド、スフィンゴシン誘導体（グルコシルセラミド）、フィトスフィンゴシン及び誘導体（フィトスフィンゴシン、Ｄ−リボ−フィトスフィンゴシン−１−ホスフェート、Ｎ−アシルフィトスフィンゴシンＣ２、Ｎ−アシルフィトスフィンゴシンＣ８、Ｎ−アシルフィトスフィンゴシンＣ１８）、コリン（ホスファチジルコリン、血小板活性化因子）、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン）、グリセロール（ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール）、イノシトール（ホスファチジルイノシトール）、ホスファチジルイノシトール、セリン（ホスファチジルセリン（ナトリウム塩））、カルジオリピン、ホスファチジン酸、卵由来物質（卵誘導体）、リゾ（モノアシル）誘導体（リゾホスファチド）、水素化リン脂質、脂肪組織抽出物（脳＆卵、大腸菌＆心臓、肝＆ダイズ）、及び組織由来リン脂質の脂肪酸内容物（ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン）を含む。
【００６０】
スフィンゴ脂質は、例えば、スフィンゴシン（Ｄ−エリスロスフィンゴシン、スフィンゴシン−１−ホスフェート、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシン、スフィンゴシルホスホリルコリン、スフィンゴミエリン、グリコシル化スフィンゴシン）、セラミド誘導体（セラミド、Ｄ−エリスロセラミド−１−ホスフェート、グリコシル化セラミド）、スフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）（スフィンガニン−１−ホスフェート、スフィンガニン（Ｃ２０）、Ｄ−エリスロスフィンガニン、Ｎ−アシル−スフィンガニンＣ２、Ｎ−アシル−スフィンガニンＣ８、Ｎ−アシル−スフィンガニンＣ１６、Ｎ−アシル−スフィンガニンＣ１８、Ｎ−アシル−スフィンガニンＣ２４、Ｎ−アシル−スフィンガニンＣ２４：１、グリコシル化（Ｃ１８）スフィンゴシン及びリン脂質誘導体（グリコシル化スフィンゴシン）（スフィンゴシン、β−Ｄ−グルコシル、スフィンゴシン、β−Ｄ−ガラクトシル、スフィンゴシン、β−Ｄ−ラクトシル）、グリコシル化セラミド（Ｄ−グルコシル−β１−１’セラミド（Ｃ８）、Ｄ−ガラクトシル−β１−１’セラミド（Ｃ８）、Ｄ−ラクトシル−β１−１’セラミド（Ｃ８）、Ｄ−グルコシル−β１−１’セラミド（Ｃ１２）、Ｄ−ガラクトシル−β１−１’セラミド（Ｃ１２）、Ｄ−ラクトシル−β１−１’セラミド（Ｃ１２））、グリコシル化ホスファチジルエタノールアミン（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ラクトース）、Ｄ−エリスロ（Ｃ１７）誘導体（Ｄ−エリスロスフィンゴシン、Ｄ−エリスロスフィンゴシン−１−ホスフェート）、Ｄ−エリスロ（Ｃ２０）誘導体（Ｄ−エリスロスフィンゴシン）、及びＬ−トレオ（Ｃ１８）誘導体（Ｌ−トレオスフィンゴシン、サフィンゴール（Ｌ−トレオジヒドロスフィンゴシン））を含む。
【００６１】
合成グリセロールベースの脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルグリセリド、コレステロール、ＰＥＧ脂質、共役のために官能基化された脂質、様々な頭部を有するリン脂質、ｐＨ感受性リポソームのための脂質、金属キレート化脂質、抗原性リン脂質、ドキシル脂質、蛍光脂質、リゾリン脂質、アルキルホスホコリン、酸化脂質、ビオチニル化脂質、エーテル脂質、プラスモロゲン脂質、ジフィタノイルリン脂質、重合可能脂質、臭素化リン脂質、フッ素化リン脂質、重水素化脂質、ドキシル脂質、蛍光脂質、酵素活性化剤（ＤＧ、ＰＳ）、酵素阻害剤（ｖ−ＣＡＭ、ＰＫＣの阻害剤）、生物活性グリセロールベースの脂質（血小板活性化因子脂質、セカンドメッセンジャー脂質）、脂質代謝中間体（アシル補酵素Ａ、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、及びＶＰＣ−Ｇタンパク質共役受容体（ＬＰＡ１／ＬＰＡ３受容体アンタゴニスト、ＬＰＡ受容体アゴニスト、Ｓ１Ｐ１／Ｓ１Ｐ３受容体アンタゴニスト、Ｓ１Ｐ１／Ｓ１Ｐ３受容体アゴニスト）を含む。
【００６２】
エーテル脂質は、例えば、ジエーテル脂質（ジアルキルホスファチジルコリン、ジフィタニルエーテル脂質）、アルキルホスホコリン（ドデシルホスホコリン）、Ｏ−アルキルジアシルホスファチジルコリン（１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び誘導体）、ならびに合成ＰＡＦ及び誘導体（１−アルキル−２−アシル−グリセロール−３−ホスホコリン及び誘導体）を含む。
【００６３】
ポリマー及び重合可能な脂質は、例えば、ジアセチレンリン脂質、ｍＰＥＧリン脂質及びｍＰＥＧセラミド（ポリ（エチレングリコール）−脂質コンジュゲート、ｍＰｅｇ  ３５０ＰＥ、ｍＰＥＧ  ５５０ＰＥ、ｍＰＥＧ  ７５０ＰＥ、ｍＰＥＧ  １０００ＰＥ、ｍＰＥＧ  ２０００ＰＥ、ｍＰＥＧ  ３０００ＰＥ、ｍＰＥＧ  ５０００ＰＥ、ｍＰＥＧ  ７５０セラミド、ｍＰＥＧ  ２０００セラミド、ｍＰＥＧ  ５０００セラミド）、及び官能基化されたＰＥＧ脂質を含む。
【００６４】
蛍光脂質は、例えば、グリセロールベース（ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン）及びスフィンゴシンベース（スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−ホスフェート、セラミド、スフィンゴミエリン、フィトスフィンゴシン、ガラクトシルセレブロシド）の脂肪酸標識脂質、頭部標識脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルセリン）、及び２５−ＮＢＤコレステロールを含む。
【００６５】
酸化脂質は、例えば、１−パルミトイル−２−アゼラオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン、１−Ｏ−ヘキサデシル−２−アゼオラオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−（９’−オキソ−ノナノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、及び１−パルミトイル−２−（５’−オキソ−バレロイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む。
【００６６】
脂質はまた、例えば、ＤＥＰＥ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＡ−Ｎａ、ＤＰＰＡ−Ｎａ、ＤＯＰＡ−Ｎａ、ＤＭＰＧ−Ｎａ、ＤＰＰＧ−Ｎａ、ＤＯＰＧ−Ｎａ、ＤＭＰＳ−Ｎａ、ＤＰＰＳ−Ｎａ、ＤＯＰＳ−Ｎａ、ＤＯＰＥ−グルタリル−Ｎａ、テトラミリストイルカルジオリピン（Ｎａ）２、ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ−２０００−Ｎａ、ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ−５０００−Ｎａ、ＤＰＰＥカルボキシＰＥＧ  ２０００−Ｎａ及びＤＯＴＡＰ−Ｃｌを含む。
【００６７】
デバイス
１つの態様では、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の配向結合又は配向付着及び／又は配向拡散に適合している疎水性表面を有する基板を含むデバイスが、本明細書に開示される。
【００６８】
疎水性表面は、本明細書で使用するとき、水との高接触角を有する表面又は物質を示す。具体的には、接触角は、例えば、約８８〜約１７９°、約９０〜約１５０°、約１１０〜約１３０°又はそれらの間の何れかの範囲又は単一値に及んでいてよい。例示的な疎水性表面は、例えば、ＳＵ−８、硬化焼成ＳＵ−８、疎水性ポリマー、ガラス、セラミック、金属、又は液晶を含む。
【００６９】
デバイスの疎水性表面は、パターン化されてよく、そして／又は疎水性表面のサブ構造体を有していてよい。例えば、疎水性表面は、より疎水性の低い表面によって囲まれた疎水性表面のアレイを形成できる。本明細書で使用する、より疎水性の低い表面とは、例えば、疎水性表面よりも疎水性が低く、脂質拡散を支援しない表面を示す。より疎水性の低い表面についての接触角は、例えば、約２０〜約８７°、約２５〜約８０°、約３０〜約７０°、約４０〜約６０°又はそれらの間の何れかの部分範囲又は単一値に及んでいてよい。疎水性表面のパターンは何れの形状であってもよく、機能的設計（例えば、脂質単分子層の混合を促進するための本明細書に記載のミキサー設計）であってもよい。
【００７０】
疎水性表面は、例えば、分子の適用又は位置づけのため及び分子の混合のための部位を提供するように、例えば、機能的にパターン化することができる。例えば、基板は、混合領域と連通している第一及び第二の注入パッドを含有しているミキサーを含んでいてもよく、注入領域、第一及び第二の連通領域ならびに混合領域は、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の配向結合又は配向付着及び／又は配向拡散に適合する疎水性表面を含んでいる。基板は、混合領域と連通している1つ又はそれ以上の付加的な注入領域をさらに含んでいてよい。他の実施態様では、基板は、1つ又はそれ以上の付加的なミキサーをさらに含でいてよい。ミキサーは、アレイ形式にパターン化されていてもよく又は基板の表面上でランダムに配列されていてもよい。基板の注入口は、例えば、円形、正方形、五角形、六角形、三角形、長方形又は他の何れかの幾何学的形状であってもよい。混合領域は、例えば、菱形、三角形、長方形、六角形、五角形、円形又は他の何れかの幾何学的形状であってもよい。注入パッドと混合領域の間の通路、例えば、チャネルは、例えば、約数ｎｍ〜約数ｃｍの長さで約数ｎｍ〜約数ｃｍの幅；約０．１ｎｍ〜約２０ｃｍの長さで約０．１ｎｍ〜約２０ｃｍの幅；約１０ｎｍ〜約１０ｃｍの長さで約１０ｎｍ〜約１０ｃｍの幅；約１００ｎｍ〜約５ｃｍの長さで約１００ｎｍ〜約５ｃｍの幅又はそれらの間の何れかの部分範囲もしくは単一値、又は長さと幅の寸法の何れかの組合せであってよい。連絡通路の経路は、直線状、曲線状、蛇行、又は特定の目的のために当業者に適切と判定された何れかの他の形状であってよい。
【００７１】
一実施態様では、基板は、疎水性表面を取り囲むより疎水性の低い表面を有する。少なくとも１つの疎水性部分を有する分子は、例えば、疎水性表面上でのみ拡散し、より疎水性の低い表面では拡散しない。基板は、混合領域（１つ又は複数）に連通する流入及び廃棄物チャネル、ならびに反応器、例えば、触媒反応器及び検出器、例えば、蛍光又は電気化学的検出器へのチャネルを含んでいてよい。
【００７２】
基板は、一般に閉じたマイクロ流体ネットワークを形成するように相互に接続された通路の1つ又はそれ以上のセットを含むことができる。そのようなマイクロ流体ネットワークは、ネットワークの末端又はネットワークの中間部に外界に通じる１つ、２つ又はそれ以上の開口部を含んでいてよい。そのような開口部は液体を受け入れ、貯蔵し、及び／又は分配する。分配された液体は、マイクロ流体ネットワーク又はマイクロ流体システムの外側部位に直接流入する。そのような開口部は、一般に流入及び／又は排出機構において機能し、貯蔵容器（reservoir）を含むことができる。
【００７３】
基板はまた、液体、試薬及び／又はフィルムの操作又は分析に寄与する他の何れかの適切な特性又は機構を含むことができる。例えば、基板は、液体又はフィルムの流速及び／又は通路の態様を決定する調節又は制御機構を含むことができる。そのような調節機構には、弁及び／又はポンプが含まれていてもよい。あるいは、又は加えて、基板は、液体又はフィルムの温度、圧力、流速、光への暴露、電場への暴露、磁場強度等を測定する、調節する及び／又は感知する機構を含むことができる。従って、基板は、加熱器、冷却器、電極、レンズ、回折格子、光源、圧力センサ、圧力変換器、マイクロプロセッサ、マイクロエレクトロニクス等を含むことができる。さらに、各々のデバイス又はシステムは、所定のデバイス又はシステムを特定するための符号として働く1つ又はそれ以上の特性を含んでいてよい。特性は、区別的な位置、固有性及び／又は他の性質（光学特性など）を有する、白黒又は着色バーコード、単語、数等のような、何れかの検出可能な形状もしくは記号、又は形状もしくは記号のセットを含むことができる。
【００７４】
基板は、何れかの適切な物質又は適切な物質の組合せで形成されていてよい。適切な物質は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのエラストマー；ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート等のようなプラスチック；ガラス；セラミック；ゾル−ゲル；シリコン及び／又は他の半金属；金属又は金属酸化物；タンパク質（ゼラチン、ポリリシン、血清アルブミン、コラーゲン等）、核酸、微生物等のような生体高分子、混合物及び／又は粒子等を含むことができる。
【００７５】
チップとも称される基板は、何れかの適切な構造を有していてよい。そのようなデバイスは、単一成分からの単一構造体として、又は２つもしくはそれ以上の成分の多成分構造体として製造できる。２つ又はそれ以上の成分は、何れかの適切な相対的空間関係を有し、何れかの適切な結合機構によって互いに結合できる。
【００７６】
幾つかの実施態様では、成分の２つ又はそれ以上は、対面して配置されてもよく、比較的薄い層として製造されてもよい。比較的薄い層は、機能に基づき、異なる厚さを有することができる。例えば、幾つかの層の厚さは、とりわけ、約１０〜２５０μｍ、約２０〜２００μｍ、又は約５０〜１５０μｍであってよい。他の層は実質的により厚くてもよく、幾つかの場合にはシステムに機械的強度を与える。そのような他の層の厚さは、とりわけ、約０．２５〜２ｃｍ、０．４〜１．５ｃｍ、又は０．５〜１ｃｍであってよい。1つ又はそれ以上の付加的な層は、基板層として機能する実質的に平らな層であってよく、幾つかの場合には、一部又は全部のマイクロ流体通路に床部分を与える。
【００７７】
本明細書に記載のデバイスの成分は、システムについての所望の適用及び製造に使用する物質に基づき、何れかの適切な機構によって製造することができる。例えば、1つ又はそれ以上の成分は、適切な鋳型を使用して成形することができ、刻み込まれる及び／又はエンボス加工することができる。そのような鋳型は、とりわけ、マイクロマシニング、エッチング、ソフトリソグラフィ、材料堆積、裁断及び／又は打ち抜きによって何れかの適切な材料で形成することができる。あるいは、又は加えて、マイクロ流体システムの成分は、エッチング、マイクロマシニング、裁断、打ち抜き及び／又は材料堆積によって鋳型なしで製造することができる。
【００７８】
デバイス及びデバイスの部品は、別々に製造され、接合され、適宜にさらに改変することができる。例えば、異なる層として製造されるとき、成分は、一般に対面で結合させることができる。これらの別々の成分は、例えば、表面化学を改変する反応性化学物質、粒子結合剤、分析を容易にするための試薬等で表面処理されてもよい。そのような表面処理は、表面の別個の部分に限局されてもよく、又は比較的限局されなくてもよい。一部の実施態様では、別々の層を製造し、次に打ち抜いて及び／又は裁断して付加的な構造体を産出することができる。そのような打ち抜き及び／又は裁断は、異なる成分を接合する前及び／又は後に実施することができる。製造の方法は当業者に周知である。
【００７９】
通路は一般に、物質（例えば、液体、粒子及び／又は試薬）がそれを通って、それを越えて又はそれに沿ってデバイスシステム内を通過できる何れかの適切な経路、チャネル又は導管を含む。一般にはチャネル形態の、流体的に連絡する通路のセットは、まとめてマイクロ流体ネットワークと称することができる。幾つかの場合には、通路は、床、天井及び壁を形成する表面を有すると記述されていてもよい。通路は、とりわけ、幅、高さ、長さ及び／又は断面プロフィールを含む、何れかの適切な寸法及び形状を有していてもよく、またとりわけ、直線、円形及び／又は曲線を含む、何れかの適切な経路をたどることができる。通路はまた、陥凹、突起及び／又はアパーチャを含む、何れかの適切な表面輪郭を有していてもよく、またチャネル内の何れかの適切な位置に何れかの適切な表面化学又は透過性を有することができる。適切な表面化学は、通路形成の前、形成の間及び／又は形成後に、化学物質及び／又は試薬の添加及び／又は処理による表面修飾を含むことができる。
【００８０】
幾つかの場合、通路、特にチャネルと混合領域は、機能により記述されていてもよい。例えば、通路は、特定の適用における物質の流れの方向、特定標準構造に対する関係、及び／又は担持される物質の種類に従って記述されていてもよい。したがって、通路は、一般に物質を部位に運ぶ注入口通路（又はチャネル）、及び一般に部位から物質を運ぶ出口通路（又はチャネル）であってよい。加えて、通路は、粒子通路（又はチャネル）、試薬通路（又はチャネル）、収束通路（又はチャネル）、灌流通路（又はチャネル）、廃棄物通路（又はチャネル）等に言及されてもよい。
【００８１】
通路は、何れかの適切なマイクロ流体ネットワークを形成するために枝分かれしていてもよく、交わっていてもよく、及び／又は行き止まりになっていてもよい。従って、通路は、とりわけ、粒子の位置づけ、選別、保持、処理、検出、伝播、保存、混合及び／又は放出において機能することができる。
【００８２】
貯蔵容器は一般に、加工操作（例えば、測定、処理及び／又は流れ）の前、操作中、操作と操作の間、及び／又は操作後に、物質（例えば、液体、粒子及び／又は試薬）を貯蔵するための何れかの適切な容器又はチェンバを含む。ウェルとも称される貯蔵容器は、流入、中間及び／又は排出貯蔵容器を含有することができる。流入貯蔵容器は、物質を基板の一部分に投入する前に物質（例えば、液体、粒子、小胞及び／又は試薬）を貯蔵することができる。これに対し、中間貯蔵容器は、加工操作中及び／又は操作と操作の間、物質を貯蔵することができる。最終的に、排出貯蔵容器は、チップから、例えば、外部処理装置又は廃棄物へと排出する前、又はチップの処分の前に物質を貯蔵することができる。
【００８３】
調節装置は一般に、物質（例えば、液体、粒子及び／又は試薬）の運動を生み出す及び／又は調節するための何れかの適切な機構を含む。適切な調節装置は、とりわけ、弁、ポンプ及び／又は電極を含むことができる。調節装置は、積極的に流れを促進することによって及び／又は能動的又は受動的な流れを制限することによって機能してもよい。調節装置によって仲介される適切な機能は、流体ネットワークの混合、選別、連結（又は隔離）等を含んでいてもよい。
【００８４】
粒子は小胞であってよい。小胞は一般に、脂質エンベロープによって規定される何れかの非細胞由来粒子を含む。小胞は、それらのエンベロープ内又は内部に何れかの適切な成分を含むことができる。適切な成分は、とりわけ、化合物、ポリマー、複合体、混合物、集合体及び／又は粒子を含んでいてよい。例示的な成分は、タンパク質、ペプチド、低分子化合物、薬剤候補物質、受容体、核酸、リガンド等を含んでいてよい。
【００８５】
適切な基板は、例えば、パターン化されたＳＵ−８（疎水性表面）及びＴｉ／Ａｕ（より疎水性の低い）表面を有する金被覆ガラス、ガラス上のＳＵ−８、ＴｉＯ２又はＳｉＯ２上のＳＵ−８、親水性ＳＵ−８上の疎水性ＳＵ−８、プラスチック上のＳＵ−８、セラミック上のＳＵ−８、ゴム上のＳＵ−８、ならびに上記に示す組合せでの他のＳＵ−８様物質（ポリマー、エポキシ、ガラス、セラミック、ゴム、ゲルを含む）を含む。
【００８６】
疎水性表面は、固体表面であるか、又はもう１つ別の表面上の層であってよい。例えば、疎水性表面は、別の表面上の微細加工されたフォトレジスト層であってもよい。その他の表面は、固体材料であるか又は層状構造体であってよい。例えば、基板は、例えば、スパッタリングによって適用される、Ｔｉ／Ａｕ層を有するガラスであってよい。この開示を利用して、当業者は、疎水性表面を有する基板をどのようにして作製するかを理解するであろう。疎水性表面のパターンは、マイクロチップ製造の当業者に公知の技術によって作製することができる。
【００８７】
疎水性物質又はより疎水性の低い物質のサブ構造体は、例えば、層内の穿孔、層内の穴、層の柱又は層上の他の物質、パッチ、チャネル、チャネルを通して連絡しているウェル、固定化された粒子、固定化された分子、又はそれらの組合せであってもよい。サブ構造体は、例えば、秩序づけられた（例えば、配列された）パターン又は無秩序なパターン、又はそれらの組合せで配置されていてもよい。サブ構造体は、単分子層によって完全にもしくは部分的に覆われる、又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の拡散フィルムによって囲まれるように適合されている。疎水性表面は、サブ構造体に加えて又はサブ構造体の一部として、エンボス加工された又は刻み込まれた幾何パターン（例えば、２Ｄ及び３Ｄ）の1つ又はそれ以上を含むことができる。疎水性表面のサブ構造体は、より疎水性の低い表面によって囲まれていてもよい。サブ構造体はまた、巨視的又は顕微鏡的次元であってもよい。
【００８８】
基板の疎水性表面は、プロセスに適合されるか又はプロセスを実施するために適合される。そのようなプロセスは、例えば、化学反応、表面支援性合成手順、触媒プロセス、超分子自己集合、又は親和性に基づく分離（例えば、サブ構造体上もしくはサブ構造体内に固定化された物質もしくは反応物と拡散フィルムの活性成分との間、又はその後もしくは同時に混合される、基板上に配置された1つ又はそれ以上の小胞と結合した物質又は反応物の間）を含む。
【００８９】
疎水性表面上で配向結合又は配向付着及び／又は配向拡散させることができ、そして少なくとも１つの疎水性部分を有する分子は、例えば、リン脂質、両親媒性分子（例えば、洗浄剤）、界面活性剤、タンパク質（例えば、膜タンパク質、疎水性部分で修飾されたタンパク質）、ペプチド（例えば、長ペプチド又は短ペプチド、疎水性部分で修飾されたペプチド）、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）、疎水性部分で修飾された分子（例えば、疎水性表面と強力な疎水性相互作用を形成する能力を有する上記すべての脂質尾部）を含む。分子は、当業者に公知の何れかの組合せで互いに結合することができる。例えば、（モノ−、ジ−、トリ−）コレステリル結合ＤＮＡ、フェロセン結合ＤＮＡ、ピレン結合ＤＮＡ、芳香族と結合したＤＮＡ、脂質と結合したＤＮＡ、ナフタレンなどの芳香族化合物、及びＦＭＯＣ誘導体、ならびに脂質、及びアルカン、アルケン及びアルキンと結合したペプチド及びタンパク質。分子は、例えば、疎水性部分（例えば、コレステロール）と結合したオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を含む、1つ又はそれ以上の付加的な成分を含むことができる。薄膜単分子層も、したがって、1つ又はそれ以上の付加的な成分を含むことができる。付加的な成分はまた、他の脂質、膜タンパク質、膜に分配するように適合された分子もしくは粒子（例えば、薬剤及び染料）、又は膜に分配するように適合された別の分子に結合している分子及び粒子の1つ又はそれ以上を含むことができる。
【００９０】
一実施態様では、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子はフィルムを含む。例えば、分子の疎水性表面への配置もしくは適用の前、配置もしくは適用の間、又は配置もしくは適用後に、分子はフィルムであるか又はフィルムを形成する。フィルムは分子的に薄いフィルムであってよい。フィルムは、液体、固体、液晶又はゲル、又はそれらの組合せであってよい。フィルムはまた、ＤＮＡフィルム及び／又はタンパク質フィルムを含むことができる。
【００９１】
一実施態様では、本明細書に記載のデバイスは温度制御装置をさらに含むことができる。温度制御装置は、例えば、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の相転移及び拡散挙動に対する制御を可能にする。相転移温度未満では、フィルムは固体として挙動し、全く拡散しないか又は非常に緩慢に拡散し、そして全く混合しないか又はほとんど混合しない。相転移温度を超えると、フィルムは液体として挙動し、拡散して混合する。温度制御はまた、薄膜内で起こる反応の速度を制御するためにも使用できる（アレニウスの関係）。
【００９２】
１つの態様では、疎水性表面、疎水性がより低い表面、及び疎水性表面を少なくとも部分的に覆って、疎水性表面に限局される少なくとも１つの疎水性部分を有する分子のフィルムを含有している基板を含むデバイスが、本明細書に提示される。少なくとも１つの疎水性部分を有する分子はまた、疎水性部分を完全に覆ってもよい。分子は、例えば、表面を部分的に又は完全に覆うために表面上に単分子層フィルムを形成する。
【００９３】
１つの態様では、結合している極性（例えば、水性）環境において形成される薄膜単分子層表面を有する疎水性表面を含有している基板を含むデバイスが本明細書に提示され、前記薄膜単分子層表面は疎水性表面上にリン脂質リポソームを配置することによって形成され、リン脂質リポソームは、疎水性表面上に配置されたとき拡散して薄膜単分子層表面を形成する。
【００９４】
本明細書で開示するデバイスは、例えば、二次元マイクロ流体工学、薄膜マイクロ流体工学、分離、分別、単分子研究、薬剤スクリーニング、センサ適用、ＱＣＭ適用、ＳＰＲ適用、エバネセント波蛍光適用、触媒作用、分子の構築（例えば、分子合成又はデバイス合成）、又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子で作られる分子的に薄い層もしくはフィルムの形成のために使用することができる。
【００９５】
一実施態様では、被覆する薄膜は、完全に疎水性であるか又は少なくとも分子内に１つの疎水性部分を含む（例えば、両親媒性物質）。適切な疎水性表面の例は、例えば、ＳＵ−８、特に硬化焼成ＳＵ−８及び他の疎水性ポリマー、エポキシ、ガラス、セラミック、金属、液晶、及び水との高接触角を有する、例えば、約８８〜約１７９°、約９０〜約１５０°、約１１０〜約１３０°又はそれらの間の何れかの部分範囲又は単一値の接触角を有する他の物質を含む。単分子層は、例えば、疎水性表面への拡散又は吸着（又は他の原理による結合）によって、例えば、表面上での自己集合によって形成される。形成されたフィルムは、結晶、固体もしくは固体様であるか、又は液体、液晶又は液体様物質、例えば、ＰＯＰＣのようなリン脂質であってよい。そのような単分子層を形成するのに適したデバイスは、部分的に被覆された疎水性表面を含むことができて、その他の部分は、疎水性表面で形成される疎水性フィルムが疎水性部分に限局されるように、より疎水性が低い。したがって、パターン化表面（例えば、Ａｕ上のＳＵ−８）は、一次元、二次元又は三次元で作製することができる。デバイスは、分子を疎水性表面に適用して組織化するためのマイクロインジェクション及び自己集合技術などの顕微操作の使用を可能にする。また、光トラップ又は光ピンセット及び磁気トラップならびにマイクロ流体法などの物質移動及び試料適用のための他の技術と組み合わせることも可能である。さらに、デバイス（疎水性／親水性の二重特徴を有する、設計された構造化表面）は、制御された組成を有するフィルムの形成を支援するように作製することができる。これらのタイプの化学量論的に制御されたフィルムは、特に、疎水性表面上で移動性又は拡散性であるフィルムを実現するのに適する。そのようなフィルムの例は、リン脂質で作られる。
【００９６】
一実施態様では、デバイスは、ＳＵ−８又は硬化焼成ＳＵ−８などの疎水性コーティングで被覆された（例えば、完全に被覆された）チップ表面を含むことができる。図１Ａに概略的に示されるように、そのようなデバイスは、例えば、層状構造体であってもよい。本明細書では、エポキシベースのネガ型フォトレジストＳＵ−８を、Ｔｉ／Ａｕでスパッタした顕微鏡カバーガラスにスピンコーティングした。図１Ｂは、特定パターン内に疎水性特性を有する親水性チップ表面を示す概略図である。ＳＵ−８のトポグラフィ構造を、Ｔｉ／Ａｕ層でスパッタした顕微鏡カバーガラスにスピンコーティングした。図１Ｃは、Ｔｉ／Ａｕ層でスパッタした顕微鏡カバーガラスにスピンコーティングしたＳＵ−８によって作られた３つの異なるタイプの構造化デバイスの明視野顕微鏡画像である。最初のタイプは、２つのフィルム成分のための混合デバイスであり、２番目は３つのフィルム成分のための混合デバイスであり、３番目は４つのフィルム成分のための混合デバイスである。デバイスは、部分的に、疎水性基層としての金の薄膜及び疎水性エポキシフォトレジストＭｉｃｈｒｏｃｈｅｍ  ＳＵ−８の薄い平面構造体で被覆された、顕微鏡検査に使用されるホウケイ酸対物カバーガラスなどのガラス担体基板から成る。示されているデバイスでは、平面構造体は、金被覆カバーガラスの表面の８×１２ｍｍの面積を被覆する。デバイスのこの特定実施態様は顕微鏡観察に適しており、十分な光透過性が維持される。図１Ｃに示す構造体は、マイクロメートル範囲（例えば、約１〜約２５μｍ、約５〜約２０μｍ、約１０〜約１５μｍ、約１２〜約１４μｍ、又はその中に含まれる何れかの部分範囲又は単一値）の寸法特性、及び＞２０ｎｍ（又は約０．０１〜約２μｍ、約０．１〜約１μｍ、約０．５〜約０．９μｍ、又はその中に含まれる何れかの部分範囲又は単一値）の厚さを有する。デバイスは、例えば、クリーンルーム条件下で実施する必要のないエポキシ樹脂の架橋を完了させるための硬化焼成の最終工程を除き、クリーンルーム条件下で製造される。しかし、より簡単なデバイスは、様々な表面へのＳＵ−８の堆積によって作製することができる。
【００９７】
本明細書で述べるチップデバイスは、例えば、画像化及び操作のために倒立顕微鏡に取り付けることができる。図２Ａは、ロボット成分によって自動化することもできる、試料注入とデバイスの周囲の操作ワークステーションの一例を提示する。マイクロポジショナによって又は手動で制御されるマイクロピペットは、材料を直接チップ表面に送達するため、例えば、注入パッドへの局所注入のため、あるいはデバイスを覆う溶液中に直接送達するために使用できる。実験は、例えば、液相（例えば、水溶液）中で実施することができるが、デバイスは気相実験にも適合させやすい。
【００９８】
種々の構造の脂質、修飾ＤＮＡ（例えば、コレステリル結合ＤＮＡ）、膜タンパク質を含むタンパク質などの物質の複雑なセットが、単分子層フィルムを形成するため又は混合もしくは化学反応を開始させるために疎水性表面と共に使用できる。少なくとも２つの異なる成分を同じ疎水性表面上の空間的に離れた領域に配置するとき、フィルムの移動度が十分に大きい場合、例えば、表面上で約０．０１μｍ／秒より大きい場合は、拡散と混合を生じさせることができる。これは、例えば、リン脂質と他の脂質に関して可能である。同じ構造、密接に関連する構造又は異なる構造の物質は、このようにして接触範囲内に近接され、混合して、化学反応（例えば、電子移動反応、酸化、還元、及び考えられる他のすべての種類の反応）を受け、他の成分の化学反応（例えば、酵素反応など）を触媒又は阻害し、フィルムから物質を放出する（例えば、二本鎖からのｓｓＤＮＡの遊離）、又は新たな物質の付着、例えば、ＤＮＡの場合はハイブリダイゼーションを可能にするように、表面を修飾することができる。したがって、デバイスの形状は、例えば、薄膜における分離、反応及び混合現象に利用できる特定の機能性を促進するために最適化することができる。さらなる例として、この技術は、表面支援（二次元）超分子及び高分子集合及び合成のため、ならびにナノスケール構造体及びデバイスの生産のために使用できる。一般に、この技術は二次元マイクロ流体プラットフォームの基礎を形成する。
【００９９】
図２Ｂは、円形注入パッドから放射状に広がる蛇行パターンとして金表面にパターン化されたＳＵ−８を有するデバイスの一部を示す。動的接触角測定は、ＳＵ−８（実施例１に示す手順に従って作製された）上の水接触角が、疎水性であることを示す９１．４°±１．５°であり、一方、金（実施例１に示す手順に従って作製された）上の接触角は７７．９°±３．２°、すなわち親水性であることを示した。円形注入パッド上に、図２Ａに示すように試料適用のために圧力を用いるマイクロマニピュレータ及びマイクロインジェクタによって制御されるホールピペットを使用して、多重膜小胞を配置した。多重層リポソームは、疎水性尾部と親水性頭部を特徴とする、両親媒性リン脂質分子から成る。リポソームがデバイスの疎水性ＳＵ−８表面に適用されたとき、図２Ｃに概略的に示すように単分子層フィルムが形成し始める。脂質はＳＵ−８表面だけを湿らせ、周囲の金は脂質から離れたままである。リン脂質の疎水性部分はＳＵ−８と接触し、親水性頭部は水相へと配向する。拡散は、疎水性表面が完全に覆われるまで、又は脂質貯蔵容器が枯渇するまで、例えば、矢印で示すようにすべての方向に環状に起こる。拡散の先端部の張力は、脂質／ＳＵ−８の接着エネルギーに等しい。特定の学術理論に縛られるのを望むものではないが、沈着した脂質フィルムの検討は、脂質単分子層が存在するという結論を導いた。脂質フィルムの運動性を評価するために光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）実験を用いた。見出した拡散定数は単分子層の存在と一致した。その値は、浮遊リン脂質二分子層についての拡散定数よりもおよそ一桁低い。脂質分子の疎水性尾部とＳＵ−８表面との間の摩擦が拡散定数のこの低い値を説明し、脂質は、実際に、ＳＵ−８へと向かう疎水性尾部と水性緩衝液へと向かう親水性頭部を有する脂質単分子層として拡散すると結論付けられる。図２Ｄは、リン脂質単分子層フィルムが、蛍光標識したダイズ脂質抽出物から作られた多重膜小胞の沈着後の拡散によってＳＵ−８レーン上に形成されることの一例を示す。脂質は疎水性表面上でのみ拡散し、親水性表面では拡散しないので、この技術は、制御された二次元マイクロ流体工学を実施する可能性を提供するものである。固体チャネルにおける水様溶媒のマイクロ流体工学と比較してこの技術の興味深い局面は、拡散する脂質フィルムに関して固定された滑りなし境界条件が存在しないことである。
【０１００】
前記技術はまた、脂質供給源をＳＵ−８表面に適用し、共焦点顕微鏡で拡散を観測して、所望の被覆率に達した後マイクロピペットで脂質供給源を取り除くことにより、脂質沈着を制御する機会を提供するものである。したがって、試料注入を定量的に正確に制御することができる。これらの手法は、したがって、本発明者らが表面上にて二次元で混合及び化学的変換を実施することを可能にする。ほぼ平方マイクロメートル程度（ならびにより小さい及びより大きい）、例えば、約０．０１μｍ〜約数百マイクロメートルの所望サイズの構造体が製造でき、種々の化合物でドープすることができる脂質供給源を添加すること及び除去することによって、化学反応物の量に対する直接の制御が達成される。これは、従来の化学反応器における種々の化合物の体積分率に相当する。
【０１０１】
さらに、脂質拡散と混合により、デバイス上に異なる脂質又は反応性種及び成分を含む、あらかじめ定義された化学量論のリン脂質単分子層フィルムを生産する方法が実施可能である。最初に、異なる組成の２つのリポソームがＳＵ−８上に拡散し、それらの最先端が接触した場合、それらが拡散によって内容物を混合する。これは図３Ａに示されており、ダイズ極性抽出物（ＳＰＥ）脂質と合成脂質（ＤＯＴＡＰ）のフィルムが形成され、混合される。混合後、形成されたフィルムは、２つのそれぞれのパッチからの物質の量に比例する２つの成分を含有する。脂質を化学量論的に混合することの原理をさらに示すため、１つの実施態様は、ｎ成分系（ｎは１より大きい何れかの整数であってよい）における混合を促進する公知の大きさと特定形状のＳＵ−８構造体を含む。図３Ｂに示す３成分混合デバイスを使用して、異なる脂質画分を３つの異なる注入部位に連続的に適用し、それらが表面の中心部の三角形領域でどのように混合するかを観測することができる。
【０１０２】
二次元マイクロ流体プラットフォームは、したがって、化学分析及び合成における様々な適用に適する。例えば、表面上で分子を形成するために必要なそれぞれの成分（反応物）を含有する脂質を混合することにより、フィルム内で高分子を構築することができる。超分子集合体も、最初は別々の脂質画分に含まれる、超分子構築の種々の成分を混合することによって形成することができる。例えば、相補的一本鎖ＤＮＡ分子を、個々の脂質フィルム中で２つの異なる鎖を供給することによって表面上でハイブリダイズさせることができる。この種の表面化学を実施可能にするためには、当該技術分野で公知の方法により、分子、例えば、ＤＮＡを、拡散脂質フィルム中で脂質として挙動する脂質と化学的に結合することが有利である。
【０１０３】
デバイスは、２つ又はそれ以上の付加的な成分の反応性混合（例えば、相補的ＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーション、例えば、ペプチド、ＤＮＡ、芳香族化合物、脂質、アルカン、アルケン、アルキンならびに他の化合物の二量体化、オリゴマー化及び重合、共有結合を導く反応、二次元結晶の形成を導く混合、個々の構築ブロックの集合／会合からの超分子合成、自己集合反応、構築ブロックを一緒にすることによる自己組織化反応、構築ブロックを一緒にすることによるナノデバイス及びナノ構造体の製造）のために利用でき、それらは、注入領域への脂質の沈着の前に拡散脂質材料に添加されて、形成する脂質フィルムと共に拡散するか、又は完全に広がったフィルムの形成後に拡散脂質材料に添加される。各々の沈着スポットは、1つ又はそれ以上のそのような添加成分を含有することができる。図３Ｃ、パネル（ｉ）は、拡散レーンによって相互に連結された２つの沈着領域を含むデバイスを示す。各々の沈着領域に、1つ又はそれ以上の活性添加物と共に、脂質材料を多重膜小胞として沈着させる。２つの脂質沈着物は、各々が活性物質を担持しながら、レーンを越えて互いの方へと拡散する。接触したとき、機能性物質が、自己集合又は他の会合プロセス、触媒プロセス又は結合機構を含む化学反応において又は他の相互作用によって、相互作用するか又は結合する。図３Ｃ、パネル（ｉ）には、２つの活性物質の結合が描画されている。この方法は、活性添加物の正確な比率の確立を可能にし、したがって会合又は反応プロセスに対する制御を可能にする。このプロセスは２つの活性物質又は２つの脂質沈着物に限定されず、物質の何れの組合せも可能である。例えば、ＤＮＡの六角形構造体は、六角形の６本又は６本未満の異なる鎖が、各々が個々の鎖を担持する６つの異なる拡散脂質フィルムによって提供される、クリック化学に基づいて作製できる。
【０１０４】
図４は、２つの異なる混合物の積分蛍光強度が２成分ミキサーでの混合比Фにどのように依存するかをグラフに示す。この方法により、いずれの時点でも２つの材料の混合比を正確に判定することが可能である。これは、何れの組成の表面もそのようなデバイス上でin-situで合成できることを示している。
【０１０５】
加えて、脂質材料の拡散は、表面の温度などのパラメータを含む外部パラメータによって影響させることができる。一実施態様では、これは、温度制御要素をパターン化表面に組み込むことによって、又は赤外光もしくはレーザ光を含む放射法によって達成される。温度制御は、したがって、広範囲にわたって、例えば、ほぼ室温から約９５℃まで可能である。一実施態様では、そのような制御要素は、表面プリント抵抗加熱ストリップ（surface-printed resistive heating strip）、加熱ブロック、加熱コイル、赤外光又は、加熱要素が浴溶液に挿入される技術（図２Ａ）を含む何れかの他の方法である。表面加工又は他の加熱法に関連して、相変態などの脂質の温度応答特性は適用の基準である：高温で相転移点を上回ると、脂質は無秩序な液相状態となり、疎水性表面上に拡散することができ、一方相転移温度未満では、脂質は、拡散の可逆的停止を導く、非可動性の結晶相である。一実施態様では、相転移温度は、適用される脂質の化学構造によって、又は異なる化学構造の脂質を混合することによって好都合に制御できる。そこで、温度は、例えば、脂質拡散に基づく二次元マイクロ流体工学において脂質の流れを制御する１つの手段である（図８）。
【０１０６】
上記で、リン脂質が疎水性ＳＵ−８支持体上で吸着し、拡散することが示された。しかし、この方法は、例えば、様々な種類の分子の接着に対しても、それらが表面と相互作用することができる疎水性部分（例えば、疎水性芳香族、アルカン、アルケン又はアルキン結合を有するｃｈｏｌ−ＤＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド）を有することを条件として適用できる。ここで本発明者らは、疎水性部分（コレステロール）による天然ＤＮＡの修飾後のＤＮＡに関するそのような例を示す。具体的には、コレステリル修飾オリゴヌクレオチドがＳＵ−８上に効率的に吸着し、一方修飾していない天然状態のオリゴヌクレオチドは溶液中にとどまることを示している。ＳＵ−８へのｃｈｏｌ−ＤＮＡの結合は強い疎水性相互作用を含む。提示する固定化経路は、表面活性化の必要性を排除することにより、機能化された表面を含むＤＮＡ固定化のための他の方法に比べて利点を提供している。さらに本発明者らは、固定化されたｃｈｏｌ−ＤＮＡへの相補的鎖の高く且つ再現可能なハイブリダイゼーション収率を得た。
【０１０７】
コレステロールに結合され、蛍光染料で標識された一本鎖ＤＮＡの、金表面に疎水性パターン化ＳＵ−８構造体を有するデバイスへの固定化を、図５Ａ及び５Ｂに概略的に示す。溶液中のｃｈｏｌ−ＤＮＡをパターン化されたデバイス（Ａｕ上のＳＵ−８）に添加し、ｃｈｏｌ−ＤＮＡは、ＳＵ−８へと向かうコレステロール部分によりＳＵ−８表面にのみ付着する。ＳＵ−８表面へのｃｈｏｌ−ＤＮＡの結合は即時であり、例えば、共焦点顕微鏡検査によって視覚化できる。ＤＮＡに結合した染料分子に依存して、試料は種々の波長で励起される。
【０１０８】
さらに、形成されたＤＮＡフィルムは熱安定であり、清浄化し、乾燥させて、長期間保存することができる。基板（例えば、カバーガラス）は、例えば、水で洗浄し、その後窒素流下で穏やかに乾燥させることができる。吸着されたＤＮＡを有する基板は、乾燥状態で長期間保存することができる。図５Ｃは、表面に吸着した２つの異なる蛍光標識ｃｈｏｌ−ＤＮＡを有するＳＵ−８構造体を示す。
【０１０９】
最初のＤＮＡ鎖の吸着後、２番目の相補的鎖を溶液に添加することができる。次に相補的鎖を表面結合ＤＮＡとハイブリダイズさせる。本発明者らは、ハイブリダイゼーションを確認するために２つの異なる手法を使用した。最初のハイブリダイゼーションは、蛍光標識ＤＮＡ３とその相補的ｃ−ＤＮＡ３／４の間でのＦＲＥＴによって示された（配列及び標識情報に関しては表１参照）。図６において、右側のパネル（ｉｉ、ｉｖ、ｖｉ）は受容体の発光を示し、左側のパネル（ｉ、ｉｉｉ、ｖ）は供与体の発光を示しており、どちらも供与体の励起波長で励起した。相補的ｃ−ＤＮＡ３／４を添加する前に、撮影した蛍光顕微鏡写真は、カバーガラスを６時間乾燥状態に保持した後もＳＵ−８上にとどまる固定化されたＤＮＡ３を示している（図６、パネル（ｉ））。ｃ−ＤＮＡ３／４の添加は、Ｃｙ３の蛍光シグナルを有意に上昇させ（図６、パネル（ｉｉ）及び（ｉｖ））、ＦＡＭのシグナルを低下させる（図６、パネル（ｉ）及び（ｉｉｉ））。カバーガラスを洗浄し、乾燥させて、緩衝液で再水和した後、固定化してハイブリダイズさせたｃｈｏｌ−ＤＮＡ＋ｃ−ＤＮＡの対は、依然としてＳＵ−８上に存在した（図６、パネル（ｖ）及び（ｖｉ）参照）。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
ハイブリダイゼーションを、また非蛍光固定化プローブに結合した蛍光標識相補的ＤＮＡ分子によって検出した（図７参照）。ここで本発明者らは、ＤＮＡ４＋ｃ−ＤＮＡ３／４及びＤＮＡ２＋ｃ−ＤＮＡ１／２の対を使用し、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）を観測した。どちらの場合も固定化ＤＮＡ（ＤＮＡ４及びＤＮＡ２）は蛍光標識せず、ハイブリダイゼーションの証拠は相補的鎖（ｃ−ＤＮＡ３／４及びｃ−ＤＮＡ１／２）中のＣｙ３からの蛍光の検出によって得られる。どちらのハイブリダイゼーション実験の結果も、コレステロール修飾オリゴヌクレオチドは、固定化ＤＮＡを数時間乾燥状態に保持した後も、それらの相補的鎖にアクセス可能であることを証明している。
【０１１２】
加えて、このプラットフォームは膜タンパク質の固定化を可能にすると考えられる。膜タンパク質は一般に、高度に疎水性である膜貫通αらせんを含む。したがって、非修飾膜タンパク質は、ＳＵ−８を含む本明細書に提示される表面に自発的に吸着すると考えられる。
【０１１３】
一実施態様では、デバイスは、ＳＵ−８などの疎水性コーティングで被覆されたチップ表面を含んでもよく、チップ表面は、層内の穿孔、層内の穴、層の柱又は層上の他の物質、パッチ、又は固定化された粒子、及び分子などのサブ構造体のパターンを含む（図１Ｄ）。構造体は、秩序づけられた（配列された）又は無秩序な方式で配置され、拡散フィルムによって完全にもしくは部分的に覆われるか又は囲まれるように（例えば、表面の疎水性パターン化に基づいて）設計される。そのような構造化表面上で、化学反応又は他の表面支援性合成手順、触媒プロセス、超分子自己集合、又はサブ構造体上もしくはサブ構造体内に固定化された材料もしくは反応物と拡散フィルムの活性成分との間での親和性に基づく分離原理を含むプロセスが実施できる（図３Ｃ、パネル（ｉｉ））。一実施態様では、反応物又は活性成分はサブ構造体を横切る脂質の流れによって運ばれ、二次元マイクロ流体デバイスを生成することができる。
【０１１４】
別の実施態様では、反応物又は活性成分を構造化表面の注入領域に添加し、あらかじめ形成された脂質フィルム内でサブ構造体化レーン又は領域に達するまで拡散させる。別の実施態様では、そのような反応は、表面プリント加熱器を使用することによる温度勾配、レーザ又はフラッシュランプ照射を用いることによる光、粒子エミッタを用いた放射、又はバルクｐＨ変化もしくはマイクロ流体チャネルを通しての酸性又は塩基性溶液の供給を用いることによるｐＨ勾配などの刺激を含む、外部刺激によって開始させることができる。別の実施態様では、サブ構造体化表面領域は、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）結晶表面又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）基板表面などのデバイスを含む、分析又は合成機械装置とのインターフェースに配置することができる。
【０１１５】
特に、ＳＵ−８は非常に薄いフィルムとして金上に沈着させることができるので、ＱＣＭ及びＳＰＲのための広範囲の適用に利用できると考えられる。
【０１１６】
方法
少なくとも１つの疎水性部分を有する分子、リポソーム及び／又はそれと会合したもしくはそれに結合した分子を混合する方法を、本明細書に記述する。また、本明細書に記載のデバイスを使用する方法を説明する。
【０１１７】
１つの態様では、リポソームから抽出される脂質フィルムを表面上で混合する方法を説明する。その方法は、疎水性表面上に第一リポソーム（ある特定の組成の）を配置し、そして異なる組成の第二リポソームを疎水性表面上に配置して、第一リポソームと第二リポソームが疎水性表面上で拡散し、混合することを含む。
【０１１８】
少なくとも１つの疎水性部分を有するリポソーム又は分子は、例えば、マイクロピペット、光ピンセット又はマイクロ流体デバイスの1つ又はそれ以上によって疎水性表面に配置される。例えば、リポソームは、マイクロ流体デバイスを通ってマイクロ流体デバイス上又はデバイス内の疎水性表面へと移動することができる。デバイスは、巨視的又は顕微鏡的次元のチェンバ、毛管、カラム又は他の何れかのデバイスの1つ又はそれ以上をさらに含むことができる。
【０１１９】
本明細書で述べる方法は、指定量の物質の正確な混合を可能にする。例えば、第一リポソームと第二リポソームから供与される物質の量（又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の量）は、第一リポソームと第二リポソームの大きさの1つ又はそれ以上によって又はタイミングによって制御される。例えば、リポソームの物質量は既知であり、したがって物質の量は、リポソーム又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の測定量を使用することによって制御できる。また、拡散速度が本明細書で検討するように測定でき、この既知の因子を、例えば、固定された大きさの混合領域で、どれぐらいの時間で特定の所望量の物質を拡散させて混合することができるかを決定するための計算において使用できるので、タイミングを用いて混合を制御することができる。一定期間後に、例えば、リポソーム又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の1つ又はそれ以上の一定量を回収する又は取り出すことができる。
【０１２０】
ある実施態様では、方法は、第一リポソームと第二リポソームの一方又は両方の少なくとも一部を回収する（例えば、それらが所望量の脂質を表面に供与した後に）ことをさらに含む。これは、第一リポソームと第二リポソームから、又は何れかの数のリポソーム又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の集団から形成されるフィルムの化学量論的制御を得ることを可能にする。
【０１２１】
方法は、１つの実施態様によれば、第一リポソームと第二リポソームの混合によって、又はリポソームの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれ以上の集団、又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の集団の混合によって、機能性表面の作製を可能にする。
【０１２２】
一実施態様では、機能性表面は、二次元又は三次元表面特性の1つ又はそれ以上を含む。機能性表面は、同時に又は選択的に、金属触媒又は酵素を含む表面などの触媒表面、チオールに対して親和性を有する金スポット又はペプチド／タンパク質のＨｉｓ基に対して親和性を有するＮｉスポットを含む表面などの結合表面、又は固定化クラウンエーテル、キレート化剤又はある特定の官能基などの物理的又は化学的操作を支援する表面の1つ又はそれ以上を含む。
【０１２３】
方法はまた、リポソームから又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子からフィルムが形成された後、フィルムを機能化するか又は変化させることを可能にする。これは、例えば、フィルムに結合するか又はフィルムと反応する（例えば、フィルムがその性質を変化させるように）他の分子を添加することによって実施できる。
【０１２４】
ひとたび本明細書で述べる基板の疎水性表面に適用されると、リポソーム（例えば、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子で作られた）は、例えば、超分子構造体、ナノ構造体、ＤＮＡアレイ、タンパク質アレイ、他の分子実体のアレイ、粒子アレイを形成する。
【０１２５】
本明細書で述べる方法は、部位特異的な分子認識形態（例えば、核酸、例えば、ＤＮＡ）を、リポソームから又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子から形成されたフィルムにハイブリダイズすることをさらに含むことができる。上述したように、少なくとも１つの疎水性部分を有する分子は、核酸、タンパク質、レクチン及び結合パートナーによって認識可能な他の分子を自らに結合させることができる。フィルムは、ひとたび形成されれば、当業者に公知の分子認識アッセイにおいて使用することができる。
【０１２６】
本発明の方法はまた、第一リポソームと第二リポソームから形成されたフィルム、又はリポソームの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれ以上の集団又は少なくとも１つの疎水性部分を有する分子の集団で作られたフィルムを乾燥させることをさらに含んでいてもよい。
【０１２７】
一実施態様では、前記方法は、乾燥させたフィルムを再水和することを含む。コレステリル結合ＤＮＡフィルムなどのフィルムは、乾燥及び再水和したとき安定である。
【０１２８】
１つの態様では、多重膜小胞を緩衝液に懸濁し、疎水性表面を含む基板上に小胞を配置して、それにより小胞が表面上に単分子層として拡散することを含む、動的液膜形成の方法が本明細書に提示される。この方法は、第二多重膜小胞を基板上に配置し、それにより小胞と第二小胞が拡散して混合することをさらに含んでいてもよい。前記方法は、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目又はそれ以上の多重膜小胞を基板上に配置し、それにより小胞が拡散して、生じた脂質フィルムが混合することをさらに含んでいてもよい。
【０１２９】
方法はまた、本明細書において開示する方法により、各々のリポソーム又は分子混合物の拡散係数を決定することを含んでいてよい。リポソーム及び／又は分子は、約０．０１〜約数百μｍ２／秒；約０．５〜約５００μｍ２／秒；約１〜約１００μｍ２／秒；約５０〜約７５μｍ２／秒、又はその中に含まれる何れかの部分範囲又は単一値の拡散係数を含むことができる。
【０１３０】
本明細書で開示する方法はまた、マイクロ流体チャネルもしくはマイクロカナルの表面、又はサンドイッチ型層流セルを修飾するためにも使用することができる。
【０１３１】
リポソームは、本明細書で述べる方法によって、及び当業者に公知の何れかの方法によって、例えば、米国特許出願公開第２００７００５９７６５号に記載の方法によって作製することができる。
【０１３２】
本明細書で述べるデバイスは様々な測定のために使用することができる。測定機構は、試料を定性的及び／又は定量的に分析するために何れかの適切な検出方法を使用してもよい。適切な検出方法は、とりわけ、分光法、電気的方法、流体力学的方法、画像化法、及び／又は生物学的方法、特に粒子の分析に適合された又は適合可能な方法を含むことができる。これらの方法は、とりわけ、単一値又は複数値、時間依存的又は時間非依存的（例えば、定常状態又は終点）値、及び／又は平均値もしくは（時間的及び／又は空間的）分布値の検出を含んでいてもよい。これらの方法は、アナログ値及び／又はデジタル値を測定及び／又は出力することができる。
【０１３３】
分光法は一般に、光（又は波様粒子）の何れかの性質、特に試料との相互作用によって変化する性質の検出を含むことができる。適切な分光法は、とりわけ、吸収、ルミネセンス（光ルミネセンス、化学発光及び電気化学発光を含む）、磁気共鳴（核共鳴及び電子スピン共鳴を含む）、散乱（光散乱、電子散乱及び中性子散乱を含む）、回折、円偏光二色性、及び旋光を含むことができる。適切な光ルミネセンス法は、とりわけ、蛍光強度（ＦＬＩＮＴ）、蛍光偏光法（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、蛍光寿命（ＦＬＴ）、全内部反射蛍光法（ＴＩＲＦ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、及びそれらのリン光及び他の類似体を含むことができる。
【０１３４】
電気的方法は一般に、何れかの電気的パラメータの検出を含むことができる。適切な電気的パラメータは、とりわけ、電流、電圧、抵抗、静電容量、及び／又は電力を含んでいてよい。
【０１３５】
流体力学的方法は一般に、とりわけ、粒子（又はその成分もしくは誘導体）とその隣接物質（例えば、他の粒子）、溶媒（何れかのマトリックスを含む）及び／又はマイクロ流体系との間の相互作用の検出を含むことができ、分子の大きさ及び／又は形状を特徴づけるため、又は試料をその成分に分離するために使用することができる。適切な流体力学的方法は、とりわけ、クロマトグラフィ、沈降法、粘度測定及び電気泳動を含むことができる。
【０１３６】
画像化法は一般に、典型的には試料又はその成分を視覚化するために、とりわけ光学顕微鏡検査及び電子顕微鏡検査を含む、空間的に分布したシグナルの検出を含むことができる。
【０１３７】
生物学的方法は一般に、典型的には上述したように、別の方法を使用して、粒子によって伝導される、媒介される及び／又は影響される何れかの生物活性の検出を含むことができる。適切な生物学的方法は当業者に周知である。
【０１３８】
測定方法は、粒子の何れかの適切な特徴を直接及び／又は間接的に（例えば、レポーター分子を通して）検出及び／又は観測することができる。適切な特徴は、とりわけ、粒子の識別、数、濃度、位置（絶対的又は相対的）、組成、構造、配列及び／又は活性を含んでいてよい。検出される特徴は、とりわけ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、酵素、脂質、炭水化物、イオン、代謝産物、細胞小器官、添加試薬（の結合）、及び／又はそれらの複合体の存在／不在、濃度、局在、構造／修飾、立体配座、形態、活性、数、及び／又は運動などの、分子又は超分子特徴を含んでいてもよい。検出される特徴はまた、とりわけ、形態、成長、アポトーシス、壊死、溶解、生存／死、細胞周期の位置、シグナル伝達経路の活性、分化、転写活性、基質接着、細胞間相互作用、翻訳活性、複製活性、形質転換、熱ショック応答、運動性、拡大、膜の完全性、及び／又は神経突起伸長を含む、何れかの適切な細胞の遺伝子型又は表現型などの細胞特徴を含んでいてもよい。
【０１３９】
基板は、何れかの適切なウイルス、細胞小器官、ビーズ及び／又は小胞に基づくアッセイ及び／又は方法のために使用することができる。これらのアッセイは、調節剤（化合物、混合物、ポリマー、生体分子、細胞等）の、これらの他の分子のいずれかの中／上に存在する又はいずれかに結合する1つ又はそれ以上の物質（化合物、ポリマー、混合物、細胞等）への結合（又は影響）を測定することができる。あるいは又は加えて、これらのアッセイは、相互作用によって誘導される、活性（例えば、酵素活性）の変化、光学特性（例えば、とりわけ化学発光、蛍光又は吸光度）の変化、及び／又は立体配座の変化を測定することができる。
【０１４０】
幾つかの実施態様では、フィルムは検出可能な符号を含んでいてよい。そのような符号は、光学特性（例えば、スペクトル、蛍光励起／発光の強度及び／又は程度、吸光度、反射率、屈折率等）などの検出可能な性質を有する1つ又はそれ以上の物質によって付与することができる。1つ又はそれ以上の物質は、非空間的情報を提供するか、又は各々の符号の符号化態様に寄与する別個の空間位置を有していてもよい。符号は、細胞、化合物、タンパク質等のような異なる試料を、異なる符号を有するビーズに結合することを可能にできる。次に、異なる試料を合わせて、一緒に検定し、各々のビーズ上の符号を読み取ることによって同定することができる。細胞結合ビーズのための適切なアッセイは、上述した細胞アッセイのいずれかを含んでいてもよい。
【０１４１】
この欄に記載のアッセイの一部を実施するための適切な手順は、参照により本明細書に組み込まれている、Joe Sambrook and David Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual(3rd ed. 2000)に含まれる。
【実施例１】
【０１４２】
デバイスの製造
Menzel Glaser社の顕微鏡カバーガラスＮｏ．１を清浄にし、３０００ｒｐｍでＳＵ−８  ２０００型フォトレジスト（Microchem）を用いて１分間スピンコーティングし、続いて６５℃及び９５℃でソフト焼成した。次にカバーガラスをKarl Suss MJB3-UV 400マスクアライナにおいて４００ｎｍ（５ｍＷ／ｃｍ２）のＵＶ光に１５秒間露出した。ＳＵ−８被覆したカバーガラスを、６５℃及び９５℃での露出後焼成工程に供した後、ＳＵ−８現像液（Microresist Technology GmbH）に浸した。最終工程では、ＳＵ−８を水で洗浄し、窒素でブロー乾燥させて、Venticell drying（MMM Medcenter Einrichtungen GmbH）を用いて２００℃で３０分間硬化焼成した。構造化ＳＵ−８表面のために、チタンと金の層を、ＳＵ−８適用の前にMS 150 Sputter system（FHR Anlagenbau GmbH）を用いてホウケイ酸カバーガラスにスパッタした。チタン接着層（厚さ２ｎｍ）と金層（厚さ８ｎｍ）を、それぞれ５Å／秒及び２０Å／秒の堆積速度でＤＣマグネトロンスパッタリングによりカバーガラス上に堆積させた。
【０１４３】
ＳＵ−８プロセスのための暗視野フォトマスクをJEOL JBX-9300FS電子線リソグラフィシステムで作製した。ＵＶ−５／０．６レジスト（Shipley Co.）被覆したＣｒ／ソーダ石灰マスクを、マイクロメートル分解能についての一般的なプロセスを使用して（Zhang, J. et al., Micromech. Microeng. 11:20-26(2001)）露光し、現像して、エッチング処理した。
【０１４４】
パターンファイルをCADopia IntelliCADプラットフォームバージョン３．３（IntelliCAD Technology Consortium）で作製した。硬化焼成工程を除き、すべての製造手順はクリーンルーム大気下（ＩＳＯ  １４６４４−１によるクラス３−６）で実施した。
【０１４５】
接触角測定
動的接触角測定を、Drop Shape Analysing System 10Mk2(Kruss GmbH）においてＭｉｌｌｉ−Ｑ水で実施した。得られたデータをＤＳＡバージョン１．８０ソフトウエアで解析した。
【実施例２】
【０１４６】
脂質拡散及び混合
実施例２は、マイクロ加工した疎水性基板（実施例１のデバイス）上での、液膜の制御された動的形成及びいくつかの異なる脂質フィルムの混合を記述する。これまでの製造方法と異なり、この方法は、フィルムに含まれる種々の成分の化学量論的制御を可能にする。緩衝液の液滴に懸濁された多重膜脂質小胞を基板上に配置したとき、脂質は単分子層として速やかに表面上に拡散する。形成される脂質パッチは、図２Ｃに例示するような円形である。多重膜小胞は最終的に枯渇し、脂質単分子層へと変換される。
【０１４７】
種々の組成の脂質フィルムの混合は、例えば、多重膜小胞ＳＰＥ（全体として負に荷電した、ダイズ極性抽出物）脂質とＤＯＴＡＰ（正に荷電した合成脂質）多重膜小胞の混合物を、デバイス表面上の隣接領域に連続的に適用することによって達成される。２つの脂質単分子層の混合の時系列画像を図３Ａに示す。実験では、ＳＰＥ脂質を蛍光染料ＦＭ１−４３で標識し、ＤＯＴＡＰは修飾しなかった。混合が進むと共に、ＤＯＴＡＰにおける濃度上昇が染料の置換を導くので、ＳＰＥ脂質パッチ中の蛍光強度は低下する。脂質フィルムが混合しない場合は、２つのフィルムの間に蛍光強度の静止した不連続な境界が得られる。
【０１４８】
単分子層フィルムは、デバイス表面へと向かう脂質分子の疎水性尾部と、緩衝液に暴露される親水性頭部で形成される（図２Ｃ参照）。脂質分子の移動性を確認し、定量化するため、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）実験を実施し、拡散定数Ｄは２．３×１０−１μｍ２／秒であると算定した。混合実験では、マイクロ転写技術を用いて多重膜小胞をデバイス表面に沈着させた。これは、疎水性領域（例えば、ＳＵ−８を含む、実施例１参照）での制御された組成を有する脂質フィルムの形成を可能にする。このデバイスでは、ＳＵ−８と異なって親水性であり、脂質拡散を促進しないＡｕ上では脂質フィルムは形成しない。それぞれ多重膜小胞のための２つ及び３つの注入領域を有し、１つが混合領域の中心に配置されている、２成分及び３成分混合構造を使用した。図２Ａは、注入領域における脂質の沈着を制御し、拡散と混合を観測して、必要に応じてマイクロピペットで脂質源を除去することを可能にする、実験の設定の概略図を示す。脂質は、図１Ｃ（上段）に示すタイプの構造体上の２つの注入領域に既知量の異なる脂質フィルムを適用することによって化学量論的に混合することができる。脂質画分の１つが蛍光性であり、他の１つが蛍光性でないことにより、互いの画分への２つの脂質フィルムの希釈を観測することができ、異なるフィルム混合比Фでの蛍光強度が測定された（図４）。その関係は線形であり（Ｒ２＝０．９４４）、この系が検定可能であることを示す。
【０１４９】
図３Ｂは、３つの異なる染色を施した多重膜小胞が配置された３成分混合デバイスを示す。拡散脂質単分子層が構造の中心部で混合している。適用される脂質画分の混合比は、適用のタイミングと脂質源の除去によって制御することができる。
【０１５０】
レーン上の脂質フラックスの拡散係数βは、ラインの幅ｗとは無関係に、１〜５μｍ２／秒の範囲内である。レーン上の脂質の総流量はレーン幅ｗに比例する。これは、混合デバイスの中心混合領域へと導く２つのレーンの幅の比ｗＡ／ｗＢが、これらのレーン上で拡散する脂質画分ＡとＢの混合比Фに等しいことを意味する。これは、構造体のトポグラフィ設計により、混合される単分子層中の脂質混合比を制御することが原則として可能であることを示している。
【０１５１】
脂質拡散手順
裸のカバーガラスを顕微鏡載物台に載せ、再水和した脂質の溶液をそれに塗付した。マイクロ転写技術により、所望量の脂質を多重膜小胞の形態でピペットに吸引することが可能であった。その後このマイクロピペットを液滴から慎重に取り出した。次に、その代わりに、スパッタしたＴｉ／Ａｕ及びＳＵ−８構造体を有するカバーガラスを載物台に載せ、ＰＢＳ緩衝液の液滴を塗付した。マイクロピペットを液滴中まで下げて、吸引した脂質をマイクロ加工したパターン内の所望部位に塗付した。別の脂質画分、例えば、異なる発蛍光団で標識した脂質画分を、ＳＵ−８パターンを有するＴｉ／Ａｕカバーガラス上に移すために、この手順を反復した。図２Ａは共焦点顕微鏡での実験の設定を例示する。
【０１５２】
化学物質
ダイズ極性抽出物（ＳＰＥ）脂質をAvanti Polar Lipids, Alabaster(AL), USAより購入した。ＫＣｌ、ＤＯＴＡＰ、ＴＲＩＺＭＡ塩基、Ｋ２−ＥＤＴＡ、Ｋ３ＰＯ４、ＫＯＨ及びグリセロール（９９％）はSigma(Steinheim, Germany)より入手した。脱イオン水は、Millipore(Bedford(MA), USA)のＭｉｌｌｉ−Ｑシステムから生成した。ＦＭ１−４３及びローダミンホスファチジルエタノールアミン(Rhodamine PE)は、Molecular Probes(Eugene(OR), USA)から入手した。クロロホルムはVWR International AB(Stockholm, Sweden)より購入した。ＭｇＳＯ４及びＫＨ２ＰＯ４はMerck(Darmstadt, GEermany)から入手した。使用したリン酸緩衝液(PBS)は、脱イオン水中にＴＲＩＺＭＡ塩基（５ｍＭ）、Ｋ３ＰＯ４（３０ｍＭ）、ＫＨ２ＰＯ４（３０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）及びＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含有していて、ＫＯＨでｐＨ７．８に調整した。蛍光Ａｌｅｘａ  ６３３  Ｆｌｕｏｒ−ホスファチジルエタノールアミンは、Ａｌｅｘａ  ６３３  Ｆｌｕｏｒ  スクシンイミジルエステル（Molecular Probes）を、Ｎ２雰囲気下で２５時間、無水塩化メチレン（Aldrich）中のホスファチジルエタノールアミン（Sigma）と１：５の比率で撹拌することによって合成した。脂質は、Karlsson et al. (Karlsson M. et al., Anal. Chem. 726:5857-5862(2000))に記載のように調製した。
【０１５３】
簡単に述べると、脂質溶液（ｌ％（ｗ／ｗ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（カルボキシフルオレセイン）でドープしたＤＯＴＡＰ（Sigma）又はダイズ極性抽出物（ＳＰＥ）脂質（どちらもAvanti Polar Lipids）、ｌ％（ｗ／ｗ）ローダミンホスファチジルエタノールアミン、ＦＭ１−４３（どちらもMolecular Probes）、又は蛍光Ａｌｅｘａ  ６３３  Ｆｌｕｏｒ−ホスファチジルエタノールアミン）を減圧下で少なくとも４０分間乾燥させ、ＰＢＳ緩衝液（ＴＲＩＺＭＡ塩基（５ｍＭ）、Ｋ３ＰＯ４（３０ｍＭ）、Ｋ２−ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）（すべてSigma）、ＫＨ２ＰＯ４（３０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）（どちらもMerck）、ＫＯＨ（Sigma）でｐＨ７．８に調整）で約１０分間再水和した。
【０１５４】
巨大多重膜小胞の作製
例えば、約１〜約１００μｍ；約５〜約７５μｍ；約２５〜約５０μｍ、又はその中に含まれる何れかの部分範囲又は単一値のＧＭＶの形成を、２工程手順；脂質分散の脱水と、それに続く再水和で実施した。脱水のために、少量（２μｌ）の脂質懸濁液を慎重にホウケイ酸カバーガラス上に置き、減圧デシケータに入れた。試料が完全に乾燥したとき、脱水を終了し、試料を室温にもどした。乾燥試料を最初に緩衝液５μｌで再水和した。３〜５分後、試料中の乱流を最小限に抑えながら、試料を緩衝液で慎重に希釈した。すべての再水和液体を使用前に室温に温めた。
【０１５５】
注入チップの作製
キャピラリホルダに入れやすくするため後端を注意深く炎鍛造した（flame-forged）毛管（長さ：１０ｃｍ、光学密度：１ｍｍ、内径：０．７８ｍｍ；Clark Electromedical Instruments, Reading, UK）を担持する注入チップを、ホウケイ酸フィラメントから作製した。塵埃粒子を除去するため使用前に圧縮空気流で毛管をフラッシュした。チップをＣＯ２レーザ・プラー装置（Ｐ−２０００型、Sutter instrument Co., Novato, CA）で延伸した。注入チップの外径は０．２５〜２．５μｍにわたった。汚染を回避するため、チップは使用の直前に延伸した。
【０１５６】
顕微操作と微量注入
すべての顕微操作及び材料注入実験は、Leica PL Fluotar  ４０×対物レンズ及び水圧式顕微操作システム（高い目盛精度のマニピュレータ：Narishige MWH-3,Tokyo、粗マニピュレータ：Narishige MC-35A,Tokyo）を備えた倒立顕微鏡（Leica DM IRB,Wetzlar, Germany）で実施した。
【０１５７】
画像化
共焦点画像化実験を、Leica TCS SP2共焦点スキャナを備えたLeica IRE2共焦点顕微鏡で実施した。データをMatlabバージョン７．１（Ｒ１４）及びLeica Confocal Softwareバージョン２．６１で処理し、解析した。
【０１５８】
光退色後蛍光回復
光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）を、１％（ｗ／ｗ）のモル分率の蛍光ローダミンホスファチジルエタノールアミンでドープしたＳＰＥ脂質パッチ上で実施した。多重膜小胞からの正味の脂質の流れを回避するため、脂質源をパッチから取り除いた。脂質パッチの一部を強いレーザ照射によって５秒間退色させ、回復を記録した。次に回復を変形ベッセル関数に適合させ、「特徴的」拡散時間を評価した。データをMatlabバージョン７．１（Ｒ１４）及びLeica Confocal Softwareバージョン２．６１で処理し、解析した。
【０１５９】
脂質拡散適用
ＳＵ−８基板上に置いた緩衝液の液滴中に懸濁した多重膜脂質小胞は、単分子層として表面上に迅速に拡散する。形成される脂質パッチは、図２Ｃ及び３Ａに示すように円形である。多重膜小胞は最終的に枯渇し、脂質単分子層に変換される。ＳＵ−８によって誘発される張力は多重膜小胞の構造を破壊するのに十分である。したがって、ＳＵ−８上の脂質の表面接着エネルギーΣは、二分子層の溶解張力σＬ≒２〜９ｍＮ／ｍより大きい。吸着された脂質は、疎水性表面エネルギーをＳＵ−８と水との間に分け、脂質吸着に関連する表面エネルギーの増加、Σは、ＳＵ−８と水との間の表面張力におおよそ等しいと予想される。ＳＵ−８はエポキシであり、したがってＳＵ−８／水の表面張力はσｅｐｏｘｙ≒４７ｍＮ／ｍの高さであり得ると推測するのが妥当である。脂質拡散プロセスの動力学を数量化し、経時的な湿潤領域Ａは、拡散プロセスの開始時にはほぼ線形であることを見出した。脂質フィルムのマランゴーニ応力∇σを、脂質フィルムと表面の間の滑り摩擦力（単位面積当たり）と平衡させることによって、拡散の動力学をモデル化した：∇σ−ζｖ＝０。ＳＵ−８のレーン上での脂質フィルム拡散に関して、拡散速度はν＝√βｔ(式中、β＝Ｓ／２ζは拡散係数であり、拡散力Ｓは、表面上の脂質と貯蔵容器内の脂質との間の自由エネルギーの差（単位面積当たり）)である。レーン上での脂質フィルム速度はフィルム全体にわたって均一であるが、円形拡散に関しては速度の勾配が存在する。円形拡散する単分子層に関して、本発明者らは、拡散するフィルムの半径がＲｌｏｇ（Ｒ／Ｒ０）ｄＲ／ｄｔ＝２βによって与えられることを見出した。Ｒ０が拡散する多重膜小胞の平均半径に等しいとしてこの等式を数値的に解くと、実験データとの良好な一致が得られる。推定拡散係数は、β＝１〜３μｍ２／秒の範囲内である。
【０１６０】
拡散端の張力は脂質／ＳＵ−８の接着エネルギーに等しい：σ（Ｒ）＝Σ。多重膜小胞において、張力は二分子層の溶解張力に等しいと予想され：σ（Ｒ０）＝σＬ、拡散力はＳ＝Σ−σＬである。Σ〜σＬ〜６ｍＮ／ｍ及びβ≒３μｍ２／秒とすると、単分子層とＳＵ−８の間の滑り摩擦は、およそζ〜１０９Ｐａｓ／ｍであると推定され、これは、脂質二分子層内の２枚のシートの間の滑り摩擦、ｂｍ＝０．５×１０９Ｐａｓ／ｍと同程度の大きさである。これは、疎水性ＳＵ−８上の脂質単分子層が、脂質二分子層内のシート間の相互作用と非常に類似した相互作用を有するという概念を強く支持するものである。
【０１６１】
種々の組成を有する脂質フィルムの混合を明らかにするため、本発明者らは、ダイズ極性抽出物（ＳＰＥ）脂質の多重膜小胞とＤＯＴＡＰ多重膜小胞の混合物をＳＵ−８表面に適用した。ＤＯＴＡＰは、合成の、正に荷電した脂質であり、一方ＳＰＥは、全体として負に荷電している脂質の混合物である。２つの脂質単分子層の混合の画像を図３Ａに示す。ＳＰＥ脂質を蛍光染料ＦＭ１−４３で染色し、ＤＯＴＡＰは染色しなかった。混合が進むと共に、ＤＯＴＡＰにおける濃度上昇が染料の置換を導くので、染色されたＳＰＥ脂質パッチ中の蛍光強度は低下する。脂質フィルムが混合しない場合は、２つのフィルムの間に蛍光強度の静止した不連続な境界が得られる。
【０１６２】
本発明者らは次に、異なる疎水性を有するパターン化基板への多重膜小胞の沈着のためのマイクロ転写技術に基づくプラットフォームを開発した。このプラットフォームは、制御された組成を有する脂質フィルムの形成を可能にする。本発明者らは、ＳＵ−８と異なって親水性であり、脂質拡散を促進しないＡｕ上でＳＵ−８パターンを作製した。ＳＵ−８はフォトレジストであるので、これは、本発明者らが脂質フィルム形成と制御された化学量論的混合を支援するように設計した形状の、マイクロメートルスケールの構造体を生成する機会をもたらす。本発明者らは、それぞれ多重膜小胞のための２つ及び３つの注入容器を有し、１つが混合領域の中心に配置されている、２成分及び３成分ミキサーを作製した。図２ａは実験設定の概略図である。この設定により、注入容器への脂質の注入を制御し、拡散と混合を観測して、マイクロピペットで再び脂質源を取り除くことができる。本発明者らは、図２Ａに示すタイプの構造体上の２つの注入容器に既知量の異なる脂質フィルムを適用することによって、脂質を化学量論的に混合することができた。脂質画分の１つは蛍光性であり、他方の１つは蛍光性ではなかった。本発明者らは、互いの画分への２つの脂質フィルムの希釈を観測し、図４に示す、異なるフィルム混合比Фでの蛍光強度を測定した。その関係は線形である（Ｒ２＝０．９４４）ことが認められ、この系が検定可能であることを示している。
【０１６３】
さらに、脂質単分子層混合の動力学を追跡することができる。明らかに、広範囲の脂質混合比が表面上で認められる。蛍光強度の有意の変化が起こるためには数分を要することがわかる。まず第一に、比較的低い拡散定数の脂質がこの種の検討には好都合である。第二に、脂質の間に限られた連結サイズを有する菱形が存在する、ＳＵ−８構造体の意図的な設計は、末端注入容器の間が単純な直線である場合に比べて混合の減速に寄与する。
【０１６４】
図３Ｂは、３つの異なる染色を施した多重膜小胞が配置された３成分混合デバイスを示す。拡散脂質単分子層が構造の中心部で混合している。本発明者らはさらに、４つ又はそれ以上の異なる脂質フィルムを混合するためのより高次の構造体を作製することができる。適用される脂質画分の混合比は、適用のタイミングと脂質源の除去によって制御することができる。本発明者らは、レーン上の脂質フラックスの拡散係数βは、ラインの幅ｗとは無関係に、１〜５μｍ２／秒の範囲内であると測定した。レーンがレーン幅に比べて長いとき、脂質注入容器上の界面活性剤流れによる散逸は、レーン上の散逸と比較して無視できる程度であり、νｌａｎｅ＝√β／ｔ(式中、ｔ＝０は脂質が注入容器からレーンに入る時点である)である。レーン上の脂質の総流量は、したがって、レーン幅ｗに比例する。これは、混合デバイスの中心混合領域へとつながる２つのレーンの幅の比ｗＡ／ｗＢが、これらのレーン上で拡散する脂質画分ＡとＢの混合比Фに等しいことを意味する。これは、本発明者らが、原則的に、混合される単分子層中の脂質混合比を構造体のトポグラフィ設計によって制御できることを示している。
【実施例３】
【０１６５】
オリゴヌクレオチドの固定化
実施例３は、金表面上にマイクロ加工されたＳＵ−８部位を含む、実施例１で述べたデバイスの疎水性領域へのコレステリル−テトラエチレングリコール修飾オリゴヌクレオチド（ｃｈｏｌ−ＤＮＡ）の高収率固定化のための、迅速で簡単な１工程手順である（図１参照）。
【０１６６】
プロセスは、おそらくデバイス特性の疎水性とオリゴヌクレオチドの５’又は３’位置におけるコレステリル−ＴＥＧ修飾に基づく、基板とＤＮＡの間の相互作用を用いる、単純なものである。ＳＵ−８上の固定化ＤＮＡは、強固で効率的な結合、高い表面被覆率を示し、相補的鎖によるハイブリダイゼーションにアクセス可能である。共有結合によるＤＮＡ固定化についての表面被覆率値は１０１２〜１０１３分子／ｃｍ２（２０〜９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）の範囲内である。固定化されたｃｈｏｌ−ＤＮＡは、様々な期間（数時間まで）乾燥状態に保持された後も依然として機能性であり、貯蔵寿命を示す。ｃｈｏｌ−ＤＮＡ（表１参照）の固定化とハイブリダイゼーションの観測は、レーザ走査型共焦点顕微鏡検査（ＬＳＣＭ）による蛍光検出によって実施した。
【０１６７】
ＤＮＡの固定化
ｃｈｏｌ−ＤＮＡを含む溶液をピペットで分注し、デバイス上でインキュベートした（図５Ａ参照）。液滴の適用後、ｃｈｏｌ−ＤＮＡは数秒以内にＳＵ−８表面に吸着した。カバーガラスチップを洗浄し、乾燥させて、緩衝液で再水和した後、蛍光画像を記録した。図５Ｃのパネル（ｉ）及び（ｉｉ）は、それぞれ１５分及び２５分のインキュベーション時間後の固定化ＤＮＡ１及びＤＮＡ３を示す。コレステロール不含のｃ−ＤＮＡ３／４を使用して実施した対照実験は、コレステロールがＳＵ−８表面へのＤＮＡの吸着に決定的な役割を果たすという事実のゆえに、ＳＵ−８表面が実質的にＤＮＡ不含であることを明らかに示している（データは示していない）。
【０１６８】
固定化ｃｈｏｌ−ＴＥＧ−５’−ＧＣＧＡＧＴＴＴＣＧ−３’−Ｃｙ５及びｃｈｏｌ−ＴＥＧ−５’−ＧＣＧＡＧＴＴＴＣＧ−３’の表面被覆率を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて測定し、吸着されたｃｈｏｌ−ＤＮＡの量を算定した。ｃｈｏｌ−ＤＮＡの表面密度は、１０１２〜１０１３分子／ｃｍ２に相当する２０〜９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２の範囲内であり、ｓｓＤＮＡの単分子層の最大固定化密度、１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２に比較できる。１個のｓｓＤＮＡ分子によって被覆される面積は、したがって、３３３Å２〜１２５０Å２であると測定された。高い表面被覆率と固定化効率の高い収率は、吸着層が緻密であり、欠陥がないことが認められる共焦点顕微鏡写真と強く関連している。ＳＵ−８コレステロール相互作用の安定性を確認するため、固定化ｃｈｏｌ−ＤＮＡを有するデバイスを周囲空気中、室温で６時間乾燥状態に保持し、その後緩衝液で再水和した。蛍光強度データから、空気中での保存後に固定化ｃｈｏｌ−ＤＮＡの〜４０％だけが失われたと算定された。
【０１６９】
ＳＵ−８に結合したｓｓＤＮＡへの相補的ＤＮＡのハイブリダイゼーション蛍光標識ｃｈｏｌ−ＤＮＡを含む溶液をピペットで分注し、デバイス上でインキュベートした（図５Ｂ、パネル（ｉ）及び（ｉｉ））。インキュベーション後、デバイスを洗浄し、蛍光標識した相補的ｓｓＤＮＡを含む溶液を添加する。適用後、相補的ｓｓＤＮＡを固定化したｃｈｏｌ−ＤＮＡにハイブリダイズさせる（図５Ｂ、パネル（ｉｉｉ）及び（ｉｖ））。ＤＮＡ３をデバイス上に固定化し、６時間乾燥状態に保持したとき、どちらもＦＡＭ標識励起波長下で、図６、パネル（ｉ）はＦＡＭ標識発光を示し、図６、パネル（ｉｉ）はＣｙ３標識発光を示す。次にｃ−ＤＮＡ３／４を添加し、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によってハイブリダイゼーションを観測する。供与体であるＦＡＭ標識を励起して、供与体と受容体の発光を記録し、後者はハイブリダイゼーションが起こったことを示す。ＦＡＭ標識の蛍光シグナルは減少し（図６、パネル（ｉｉｉ）参照）、一方Ｃｙ３標識についてのシグナルは有意に増加する（図６、パネル（ｉｖ）参照）。どちらもＦＡＭ標識励起波長下で、図６、パネル（ｖ）はＦＡＭ標識発光を示し、図６、パネル（ｖｉ）はＣｙ３標識発光を示しており、デバイスを洗浄し、緩衝液で再水和した後も、固定化してハイブリダイズさせたＤＮＡが依然としてＳＵ−８表面上に存在することを示す。蛍光シグナル強度の変化が図６、パネル（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）に示されており、固定化及びハイブリダイゼーション工程、すなわち蛍光強度の上昇と低下を明らかにしている。さらに、ハイブリダイゼーションはまた、ＤＮＡ２＋Ｃ−ＤＮＡ１／２（図７、パネル（ｉ）参照）及びＤＮＡ４＋ｃ−ＤＮＡ３／４（図７、パネル（ｉｉ）参照）の対を使用して、固定化非蛍光ｓｓＤＮＡに結合した相補的一本鎖におけるＣｙ３標識からの蛍光の検出によっても示される。より高いレーザ強度を使用して対象とする領域を退色させ、退色スポットの蛍光回復（図７Ｃ参照）をＣｙ３標識励起波長下で観測した。結論として、ハイブリダイゼーション実験の結果は、コレステロール修飾オリゴヌクレオチドが、固定化ＤＮＡを数時間乾燥状態に保持した後も、それらの相補的鎖に対してアクセス可能であることを証明している。
【０１７０】
化学物質及びＤＮＡプローブ
すべての実験は、脱イオン水中にＴＲＩＺＭＡ塩基（５ｍＭ）、Ｋ３ＰＯ４（３０ｍＭ）、ＫＨ２ＰＯ４（３０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）及びＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（ＫＯＨでｐＨ７．８に調整）中で実施した。１０量体及び２０量体のオリゴヌクレオチドは、それぞれATDbio（Southampton, UK）及びMedprobe(Lund, Sweden)より購入した。実験を実施する前に、Varian(Victoria,Australia)から入手したＣＡＲＹ  ４０００紫外線可視分光光度計での吸光度測定によってＤＮＡ濃度を分析した。
【０１７１】
基板の作製
Menzel Glaser(Braunschweig, Germany)から入手した顕微鏡カバーガラス（２５ｍｍ×５０ｍｍ）を基板として使用した。カバーガラスを、脱イオン水中での５分間の超音波処理、及びそれに続いて、AMO GmbH(Aachen, Germany)のマイクロ波プラズマシステム、Tepla Plasma Batch System 300における２５０Ｗの酸素プラズマで２分間のプラズマ洗浄工程によって、十分に清浄化した。ＳＵ−８フォトレジストを適用する前に、主チェンバにおける基本圧力５×１０−７ｍｂａｒを有するFHR Anlagenbau GmbH(Ottendorf-Okrilla, Germany)のＭＳ  １５０スパッタシステムを、清浄なカバーガラスへのＴｉ／Ａｕフィルムの沈着のために使用する。チタン接着層（２ｎｍ）及び金層（８ｎｍ）を、５×１０−３ｍｂａｒのプロセス圧、それぞれ５Å／秒及び２０Å／秒の堆積速度でＤＣマグネトロンスパッタリングによりカバーガラスに沈着させた。ＳＵ−８プロセスのための暗視野フォトマスクは、JEOL JBX-9300FS電子線リソグラフィシステムで作製した。ＵＶ−５／０．６レジスト（Shipley Co., 455 Forest St., Marlborough, USA）被覆したＣｒ／ソーダ石灰マスクブランク（３インチサイズ）を、μｍ分解能についての一般的なプロセスを使用して露光し、現像して、エッチング処理した。パターンファイルはCADopia IntelliCADプラットフォームで作製した。レジストを適用する前に、金被覆カバーガラスを脱イオン水で洗浄し、窒素でブロー乾燥させた。次に、MicroChem(Newton, USA)から市販されているＳＵ−８  ２００２を、スパッタしたＴｉ／Ａｕフィルム上に３０００ｒｐｍでスピンコーティングした。フォトレジストの適用後に、６５℃及び９５℃で６分間ソフト焼成し、Karl Suss MJB3-UV 400マスクアライナにおいてマスクを通して４００ｎｍ、６ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に１５秒間露出して、６５℃及び９５℃で１分間の露出後焼成、及びMicroresist Technology GmbH(Berlin, Germany) から入手したＳＵ−８現像液浴中での現像を実施した。最後に
、カバーガラスを脱イオン水で十分に洗浄し、窒素でブロー乾燥させて、MMM Medcenter Einrichtungen GmbH(Grafelfing,Germany) から入手したVenticellオーブンにおいて２００℃で３０分間硬化焼成した。
【０１７２】
接触角測定
ＳＵ−８及び金表面での動的接触角測定を、Kruss GmbH(Hamburg,Germany)のDrop Shape Analysing System 10Mk2においてＭｉｌｌｉ−Ｑ水で実施した。
【０１７３】
ＤＮＡ吸光度測定
１、２、３及び４μＭのＤＮＡ１及びＤＮＡ２の溶液を、ＰＢＳ緩衝液を用いて調製した。保存溶液の濃度をＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で測定した。その後、保存溶液の液滴を規定された領域のＳＵ−８表面に塗布した。室温で１５分間のインキュベーション後、上清を取り、その吸光度スペクトルを記録した。保存溶液と上清の間の濃度の差はＳＵ−８表面に吸着されたＤＮＡ分子の量を示し、そこから固定化ＤＮＡ密度を算定した。
【０１７４】
固定化及びハイブリダイゼーションの検出
蛍光標識オリゴヌクレオチドを、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２スキャナ（Wetzlar,Germany）を備えたＬｅｉｃａ  ＩＲＥ２共焦点顕微鏡で走査した。固定化及びハイブリダイゼーション実験は、開放大気中、室温で実施した。固定化実験のために、ＳＵ−８構造化カバーガラスを共焦点顕微鏡の載物台に置き、ｃｈｏｌ−ＤＮＡ分子を含む２μＭ、２５０μＬ溶液を手操作によりカバーガラス上にピペットで分注した。規定のインキュベーション期間後、すなわちＤＮＡ１とＤＮＡ２については１５分後、ＤＮＡ３とＤＮＡ４については２５分後に、カバーガラスをＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、窒素流下で穏やかに乾燥させた。次に、カバーガラスを緩衝液で再水和し、蛍光標識ｃｈｏｌ−ＤＮＡ分子に関して蛍光顕微鏡写真を記録した。同じ手順をハイブリダイゼーション実験についても反復したが、再水和工程だけが異なった。緩衝液で再水和する代わりに、固定化ｃｈｏｌ−ＤＮＡを含むカバーガラスを、相補的ＤＮＡを含む２μＭ、２５０μＬ溶液で再水和した。規定のインキュベーション期間後、すなわちｃ−ＤＮＡ１／２については１５分後、ｃ−ＤＮＡ３／４については２５分後に、カバーガラスをＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、窒素流下で穏やかに乾燥させた。次にカバーガラスを緩衝液で再水和し、蛍光顕微鏡写真を記録した。ＤＮＡ４＋ｃ−ＤＮＡ３／４及びＤＮＡ２＋ｃ−ＤＮＡ１／２プローブ対に関して、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）実験を実施した。高強度レーザを用いて対象領域を退色させた。その後蛍光回復を観測した。
【０１７５】
チップの製造
マイクロチップの製造のために、Ｔｉ／Ａｕ層を最初に顕微鏡カバーガラスの上にスパッタし、次にＳＵ−８スピンコーティングを実施した。マイクロメートルサイズのＳＵ−８構造体を、マスクを通してのＵＶ光露出を用いてパターン化した。チップを、最後に、２００℃で３０分間硬化焼成した。最終的なマイクロ加工されたチップは、したがって、明確に区別できる表面特性を備える２つの層を含んでいた。金表面は親水性であり（水との接触角：７７．９°±３．２°）、ＳＵ−８構造体は疎水性である（水との接触角：９１．４°±１．５°）。
【０１７６】
ＳＵ−８の自己蛍光とｓｓＤＮＡの表面被覆率
ＳＵ−８の自己蛍光からＤＮＡプローブの蛍光を識別することができるように、パターン化ＳＵ−８表面を種々の励起波長で走査した。ＳＵ−８層の厚さを減じると、自己蛍光の減少を導く（Marie, E. et al. Biosensors and Bioelectronics 21, 1327-1332(2006)）。しかし、本発明者らのＳＵ−８層は厚さ約２μｍであり、その自己蛍光は、４８８ｎｍの励起波長を使用したときしか考慮に入れる必要がない。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて固定化Ｃｈｏｌ−ＴＥＧ−５’−ＧＣＧＡＧＴＴＴＣＧ−３’−Ｃｙ５及びＣｈｏｌ−ＴＥＧ−５’−ＧＣＧＡＧＴＴＴＣＧ−３’の表面被覆率を測定した。ｃｈｏｌ−ＤＮＡを含む保存溶液、及びチップに適用した液滴から収集した試料の吸光度測定を記録した。濃度差から吸着されたｃｈｏｌ−ＤＮＡの量を算定した。ｃｈｏｌ−ＤＮＡの表面密度は、１０１２〜１０１３分子／ｃｍ２に相当する２０〜９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２の範囲内であった。この結果は、ｓｓＤＮＡの単分子層の最大固定化密度である１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２と比較できる（この範囲では分子は直径２０Åの円筒状であり、表面の平面に対して垂直に配向すると考えられる）。１個のｓｓＤＮＡ分子によって被覆される面積は、したがって、本発明者らの実験では１２５０Å２〜３３３Å２であった。比較として、ｓｓＤＮＡの緊密に充填した完全単分子層（コレステリル−ＴＥＧ修飾なし）における１個のｓｓＤＮＡ分子の理論的面積被覆率は１１１Å２である。
【０１７７】
固定化の検出及びｓｓＤＮＡチップの安定性
ｃｈｏｌ−ＤＮＡ（表１参照）の固定化とハイブリダイゼーションの観測を、レーザ走査型共焦点顕微鏡検査（ＬＳＣＭ）による蛍光検出によって実施した。ｃｈｏｌ−ＤＮＡを含む溶液をピペットで分注し、チップ上でインキュベートした（図５Ａ参照）。液滴の適用後、ｃｈｏｌ−ＤＮＡは数秒以内にＳＵ−８表面に吸着した。チップを洗浄し、乾燥させて、緩衝液で再水和した後、蛍光画像を記録した。図５Ｃのパネル（ｉ）及び（ｉｉ）は、それぞれ１５分及び２５分のインキュベーション時間後の固定化ＤＮＡ１及びＤＮＡ３を示す。コレステロール不含のｃ−ＤＮＡ３／４を使用して実施した対照実験は、ＳＵ−８表面が実質的にＤＮＡ不含であることを明らかに示す（データは示していない）。これらの結果は、コレステロールがＳＵ−８表面へのＤＮＡの吸着に決定的な役割を果たすことを強く示唆する。インキュベーション時間及び濃度の上昇は、ＤＮＡの１０量体及び２０量体のいずれに関しても、蛍光強度を有意に変化させない（データは示していない）。これは、ＳＵ−８表面がｃｈｏｌ−ＤＮＡで容易に飽和することを示唆している。ＳＵ−８コレステロール相互作用の安定性を検討するため、固定化ｃｈｏｌ−ＤＮＡを有するチップを棚の上で６時間乾燥状態に保持し、その後緩衝液で再水和した。図６のパネルｉ及びｉｉｉの蛍光強度データから、空気中での保存後に固定化ｃｈｏｌ−ＤＮＡの〜４０％だけが失われたと算定された。
【０１７８】
ＳＵ−８に結合したｓｓＤＮＡへの相補的ＤＮＡのハイブリダイゼーション
本発明者らは、ハイブリダイゼーションを確認するために２つの異なる手法を使用した。最初のハイブリダイゼーションは、蛍光標識ＤＮＡ３とその相補的ｃ−ＤＮＡ３／４の間での蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）画像化（図６参照）によって示された。図６において、右側のパネルは受容体の発光を示し、左側のパネルは供与体の発光を示しており、どちらも供与体の励起波長で励起した。相補的ｃ−ＤＮＡ３／４を添加する前に、蛍光顕微鏡写真は、チップを６時間乾燥状態に保持した後のＳＵ−８上の固定化ＤＮＡ３を示す（図６ｉ）。図６ｉｉと６ｉｖを比較すると、ｃ−ＤＮＡ３／４の添加はＣｙ３標識の蛍光シグナルを有意に上昇させ、ＦＡＭ標識のシグナルを低下させる（図６ｉ及び６ｉｉｉを比較）。これは、標識対の間のＦＲＥＴ、及びそれゆえＤＮＡハイブリダイゼーションを証明している。チップを洗浄し、乾燥させて、緩衝液で再水和した後、固定化してハイブリダイズしたＤＮＡ３＋ｃ−ＤＮＡ３／４の対は依然としてＳＵ−８表面に存在した（図６ｖ及び６ｖｉ参照）。ハイブリダイゼーションはまた、標識していない固定化ｃｈｏｌ−ＤＮＡに結合した蛍光標識相補的ＤＮＡ鎖の検出によっても確認された（図７参照）。上述したように、コレステリル部分を欠くオリゴヌクレオチドはＳＵ−８表面に吸着しない。本発明者らは、ＤＮＡ４＋ｃ−ＤＮＡ３／４ならびにＤＮＡ２＋ｃ−ＤＮＡ１／２の対を使用し、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）を観測した。固定化ＤＮＡ（ＤＮＡ４及びＤＮＡ２）は標識せず、ハイブリダイゼーションの証拠は相補的鎖（ｃ−ＤＮＡ３／４及びｃ−ＤＮＡ１／２）中のＣｙ３からの蛍光の検出によって得られる。高いレーザ光強度を使用して、対象とする規定領域を退色させ、退色スポットの蛍光回復を観測した。溶液から基板への退色及び非退色二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）の交換の動力学はまだ確認されていないが、ｄｓＤＮＡ−チップシステムが平衡するとき、より短いオリゴヌクレオチドは、より長いオリゴヌクレオチドと比較してより速い脱離／吸着挙動を示す。しかし、退色スポットは、実験時間枠内では完全には回復しなかった。結論として、ハイブリダイゼーション実験からの結果は、コレステリル−ＴＥＧ修飾オリゴヌクレオチドが、固定化ＤＮＡを数時間乾燥状態に保持した後も、それらの相補的鎖に対してアクセス可能であることを証明している。
【０１７９】
硬化焼成したＳＵ−８表面にコレステリル修飾オリゴヌクレオチドを固定化するための直接的な１工程プロセスが、本明細書に提示される。基板とＤＮＡの間の結合は、おそらくＳＵ−８の疎水性とオリゴヌクレオチドの５’又は３’位置におけるコレステリル−ＴＥＧ−修飾に基づいている。ＳＵ−８上に固定化されたＤＮＡは強固で効率的な結合、高い表面被覆率を示し、相補的鎖によるハイブリダイゼーションにアクセス可能である。共有結合によるＤＮＡ固定化についてのこれまでの表面被覆率値は１０１１〜１０１２分子／ｃｍ２の範囲内である。本明細書において、本発明者らは、簡単な１工程固定化手順において１０倍高い表面被覆率を達成している。さらに、固定化されたｃｈｏｌ−ＤＮＡは、数時間乾燥状態に保持された後も依然として機能性である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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