(57)【要約】本発明は、遺伝子治療の改善した方法、特にＰＥＧ化アデノウイルスを用いた遺伝子治療に関連する。遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与には、投与量依存性の副作用が関連していた。他の型の治療と同様に、アデノウイルスに基づく遺伝子治療への要求は、治療効果を最大限にしながら、副作用を軽減することである。特に、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法であって、該方法は被験体にＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度はビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間である、方法。
【請求項２】
前記副作用が心血管系副作用である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記副作用がアナフィラキシー様反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記副作用が凝固障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記副作用が炎症である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記ＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率が非ＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率と同じか、またはそれより高い方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここでＰＥＧリンカーが、５ｋＤのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧ−ＳＰＡリンカーである方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記アデノウイルスビリオンのペグ化の程度が、ビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間である方法。
【請求項９】
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法であって、該方法は被験体にＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオン２あたり約１６００のＰＥＧ分子までである、方法。前記副作用が心血管系副作用である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記副作用がアナフィラキシー様反応である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記副作用が凝固障害である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記副作用が炎症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここでＰＥＧリンカーが、５ｋＤのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧ−ＳＰＡリンカーである方法。
【請求項１４】
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法であって、該方法は被験体にＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度はビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子の間である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００６年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／８４８，６１４号の米国特許法のもとでの優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８４８，６１４号の開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子治療の改善した方法、特にＰＥＧ化アデノウイルスを用いた遺伝子治療に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与には、投与量依存性の副作用が関連していた。他の型の治療と同様に、アデノウイルスに基づく遺伝子治療への要求は、治療効果を最大限にしながら、副作用を軽減することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子およびビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子の間である。
【０００５】
本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）である。
【０００６】
本発明はまた、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までである。
【０００７】
１つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する心血管系作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）である。
【０００８】
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する心血管系作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までである。
【０００９】
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する凝固障害を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）である。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する凝固障害を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までである。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスベクターの全身投与に関連するアナフィラキシー様反応を軽減する方法を提供し、当該方法は、ＰＥＧ化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）である。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスベクターの全身投与に関連するアナフィラキシー様反応を軽減する方法を提供し、当該方法は、ＰＥＧ化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までである。
【００１３】
さらに別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）であり、そしてここでＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率は、非ＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率と同じか、またはそれより高い。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する程度のＰＥＧ化を有する、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスを提供する。理論に拘束されるものではないが、アデノウイルスのカプシドタンパク質のＰＥＧ化が、それぞれの受容体とアデノウイルスタンパク質の立体障害によって、ヒスタミンおよびサイトカインのような即時炎症性メディエーターの放出を誘導し得る細胞受容体の結合を阻害すると考えられる。ＰＥＧ化は、患者において組換えアデノウイルスベクターによって誘導される汎発性凝固障害を誘導し得る血液成分との相互作用を阻害し得るとも考えられる。
【００１５】
本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子の間である。
【００１６】
１つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここでそのアデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）である。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までである。
【００１８】
１つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する心血管系作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）である。
【００１９】
１つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する心血管系作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までである。
【００２０】
１つの実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する凝固障害を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）である。
【００２１】
さらに別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する凝固障害を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までである。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、炎症性状態の素因のある、および／または炎症性状態を有する患者を含むがそれに限らない、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連するアナフィラキシー様反応を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）である。
【００２３】
別の実施態様において、本発明は、炎症性状態の素因のある、および／または炎症性状態を有する患者を含むがそれに限らない、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連するアナフィラキシー様反応を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までである。
【００２４】
さらに別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えば、ビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）であり、そしてここでＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率は、非ＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率と同じか、またはそれより高い。例として、そして制限せずに、中和抗体が血清中に存在する場合、形質導入効率は、非ＰＥＧ化組換えアデノウイルスよりも高くなり得る。
【００２５】
一般的に、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までの投与は、より低い形質導入効率と関連するが、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与と関連する副作用のより高い軽減と関連する。ＰＥＧ化組換えアデノウイルス（例えば治療タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＰＥＧ化複製欠損組換えアデノウイルス）の全身投与が有用であり得る患者の状態の例は、慢性炎症性状態を含むがこれに限らない。そのような状態の例は、ＣＯＰＤ、慢性関節リウマチおよび癌を含むがこれに限らない。
【００２６】
形質導入効率を測定する方法は、当該分野で公知である。
【００２７】
本発明はまた、ＰＥＧ化アデノウイルスを含む組成物を提供する。
【００２８】
一般
本発明によって、当該分野の技術の範囲内の、従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を採用し得る。そのような技術は、文献において説明される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中で「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
【００２９】
アデノウイルスのＰＥＧ化
アデノウイルスビリオンを、当該分野で公知のあらゆる方法によってＰＥＧ化し得る。ＰＥＧ修飾は、治療ペプチドおよびタンパク質の修飾のためによく確立された技術である。タンパク質およびペプチドのＰＥＧ化の主な利点は、抗原性および免疫原性の抑制を含む。ＰＥＧ−タンパク質結合物の調製は、一般的に、適当な試薬によるＰＥＧのヒドロキシル基の活性化を必要とし、それは結合反応の間に、タンパク質の求核性をもつ基（主にリシンε−アミノ基）によって完全に置換され得る（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１３４９−１３５８（１９９９））。活性化ＰＥＧリンカーを産生するために、広く様々な方法が開発された（Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．３：３２１−３４０（１９９６））。
【００３０】
同様に、様々なポリエチレングリコールを、アデノウイルスのカプシドタンパク質に結合させる多くの方法が利用可能である（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１３４９−１３５８（１９９９））。Ｃｒｏｙｌｅら（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：１７１３−１７２２（２０００））は、十分にウイルスカプシドを修飾する反応時間の短縮、および極端な保存条件下でのアデノウイルスの物理的安定性を有する３つの結合方法を記載する。他の方法が当該分野で利用可能である。例として、そして制限されるものではないが、ポリマーを共有結合で（例えば米国特許第５，７１１，９４４号明細書および同第５，９５１，９７４号明細書を参照のこと）、または非共有結合で（例えば国際公開第２００５／０１２４０７号パンフレットを参照のこと）結合し得る。
【００３１】
様々な活性化ポリエチレングリコールリンカーが、タンパク質およびｒＡｄのＰＥＧ化のために利用可能である。一端がＮ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）で活性化され、そして他方がメトキシ基でキャッピングされたポリエチレングリコールである、ＰＥＧ−ＳＰＡ（ＳＰＡ：ＰＥＧプロピオン酸のサクシニミジルエステル）を、アデノウイルスをＰＥＧ化するために選択し得る。
【００３２】
ＮＨＳエステルとは反対の末端でＰＥＧにフルオレセイン部分を有するＰＥＧ−ＳＰＡも利用可能である。このフルオレセイン標識ＰＥＧリンカー（ここでフルオロ−ＰＥＧ−ＳＰＡと省略する）の利点は、それがＰＥＧ−ＳＰＡと同じ反応性を有することである。好ましい実施態様において、５ｋＤａのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧ−ＳＰＡリンカーを使用する。
【００３３】
他のＰＥＧリンカーも使用し得る。例えば、トレシル−ＭＰＥＧ（ＴＭ−ＰＥＧ）を、アデノウイルスをうまくＰＥＧ化するために使用した（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１３４９−１３５８（１９９９）；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）；ＰｏｌｙＭＡＳＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ））。他の市販で入手可能なリンカーは、サクシニミジルコハク酸ＭＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）、ポリフタラミド（ＰＰＡ）、および塩化シアヌルＭＰＥＧ（ＣＣ−ＰＥＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））を含む。
【００３４】
例として、そして制限されるものではないが、一般的に約１％ｗ／ｖのＰＥＧから約４％ｗ／ｖのＰＥＧの間は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間を産生する。また例として、そして制限されるものではないが、一般的に約５％ｗ／ｖのＰＥＧから約８％ｗ／ｖのＰＥＧの間は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子より多くおよびビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子を産生する。（例えば国際公開第２００７／０６２２０７号パンフレットを参照のこと）
アデノウイルスのＰＥＧ化
アデノウイルスを、当該分野で公知のあらゆる方法によってＰＥＧ化し得る。例として、そして制限されるものではないが、ポリマーを共有結合で（例えば米国特許第５，７１１，９４４号明細書および同第５，９５１，９７４号明細書を参照のこと）、または非共有結合で（例えば国際公開第２００５／０１２４０７号パンフレットを参照のこと）結合し得る。(本明細書中にその全体が参考として援用される、２００６年１１月２３日に出願された、米国特許出願第６０／７３９，７３９号明細書も参照のこと。)本明細書中にその全体が参考として援用される、２００６年１１月２３日に出願された、米国特許出願第６０／７３９，７３９号明細書も参照のこと。
【００３５】
ＰＥＧ化の程度を決定する方法
ビリオンのＰＥＧ化の相対的な程度を決定するためにも、当該分野で公知のあらゆる方法を使用し得る。好ましい実施態様において、アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の平均的な程度を決定するために使用する方法は、ＣｓＣｌ勾配上の分析的超遠心（ＡＵＣ）を利用する（本明細書中にその全体が参考として援用される、２００６年１１月２３日に出願された、米国特許出願第６０／７３９，７３９号明細書、現在の国際公開第２００７／０６２２０７号パンフレットを参照のこと）。当該分野で公知の他の方法も、標準として使用するポリマー−粒子結合調製物のＰＥＧ化の相対的な程度を決定するために使用し得る。例えば、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼによるビオチン標識ＰＥＧ化ｒＡｄのＥＬＩＳＡ分析によってそのＤＰを決定する、ビオチン標識ＰＥＧリンカーを使用する先行技術の方法を（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１３４９−１３５８（１９９９））、標準として使用し得る。あるいは、標準的な調製物のＰＥＧ化の平均的な程度を決定するために、ＰＥＧ化ウイルス調製物を、フルオレサミンで処理して、非ＰＥＧ化コントロールと比較してリシン基の喪失を定量し得る（Ｃｒｏｙｌｅら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：１７１３−１７２２）。
【００３６】
組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）
組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）は、ワクチンまたは遺伝子治療のために、遺伝子を細胞に伝達するために広く使用される（Ａｌｅｍａｎｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１（１１）：２６０５−２６０９（２０００）；ＶｏｒｂｅｒｇｅｒおよびＨｕｎｔ、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ７（１）：４６−５９（２００２）；ＭｉｚｕｇｕｃｈｉおよびＨａｙａｋａｗａ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１５（１１）：１０３４−１０４４（２００４）；Ｂａｓａｋら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：１８２−９６（２００４））。「組換え体」という用語は、従来の組換えＤＮＡ技術によって修飾されたゲノムを指す。
【００３７】
「アデノウイルス」という用語は、「アデノウイルスベクター」という用語と同義であり、そしてアデノウイルス科のウイルスを指す。「組換えアデノウイルス」という用語は、「組換えアデノウイルスベクター」という用語と同義であり、そしてそのウイルスゲノムが従来の組換えＤＮＡ技術によって修飾された、細胞に感染し得るアデノウイルス科のウイルスを指す。組換えアデノウイルスという用語はまた、キメラ（またはさらに多量体の）ベクター、すなわち１つ以上のウイルスサブタイプからの相補的コード配列を用いて構築したベクターを含む。
【００３８】
アデノウイルス科という用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルアデノウイルス亜属を含むがこれに限らない、マストアデノウイルス属の動物アデノウイルスを集合的に指す。特に、ヒトアデノウイルスは、Ａ〜Ｆ亜属およびその個々の血清型を含む。例えば、アデノウイルス１、２、３、４、４ａ、５、６、７、７ａ、７ｄ、８、９、１０、１１（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４ａ、３５、３５ｐ、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、および９１型のいずれも、本発明の細胞培養において産生し得る。本発明の好ましい実施において、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型２または５であるか、またはそれ由来である。
【００３９】
組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスベクターであり、それは変異したゲノムを含む；例えば、変異したゲノムは、ある部分を欠き得るか、または１つまたはそれ以上のさらなる、異種性の遺伝子を含み得る。１つの実施態様において、組換えアデノウイルスベクターは、タンパク質ＩＸ遺伝子の欠失を有するアデノウイルスベクター伝達システムである（本明細書中に参考として援用される、国際特許出願国際公開第９５／１１９８４号パンフレットを参照のこと）。
【００４０】
別の実施態様において、アデノウイルスは選択的に複製する組換えアデノウイルス、または条件的に複製するアデノウイルス、すなわち正常細胞においては弱毒化されているが、腫瘍細胞においてはウイルス複製を維持するアデノウイルスである、例えばＫｉｍ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：７８１−７８７（２００１）；Ａｌｅｍａｎｙ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：７２３−７２７（２０００）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ，Ｍ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＳｙｓｔｅｍｓにおけるＲｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３２１−３４３頁（２００３）を参照のこと。
【００４１】
本発明の１つの実施態様において、選択的に複製する組換えアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、公開された国際出願番号、国際公開第００／２２１３６号パンフレットおよび同第００／２２１３７号パンフレット；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０３５−１０４１（２００１）；Ｈｏｗｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２（５）：４８５−９５（２０００）；およびＤｅｍｅｒｓ，Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：４００３−４００８（２００３）において記載されたようなものである。
【００４２】
選択的に複製する組換えアデノウイルスはまた、「腫瘍退縮アデノウイルス」、「腫瘍退縮複製アデノウイルス」、「複製アデノウイルスベクター」、「条件的に複製するアデノウイルスベクター」、または「ＣＲＡＶ」として記載され得るが、これに限らない。本発明の別の実施態様において、上記で記載したように、ＰＥＧ化を、他の型のウイルスベクターによって誘導された副反応を軽減するために使用し得る。例は、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびＳＶ４０ウイルスベクターを含むがこれに限らない。
【００４３】
１つの実施態様において、本発明の組換えアデノウイルスは、望ましい生物学的性質または活性を有する、部分、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のような、しかしそれに限らない、異種性のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
ある実施態様において、その異種性のヌクレオチド配列は、サイトカイン、サイトカイン受容体、ホルモン、成長因子、または成長因子受容体のような、生物学的反応修飾因子をコードする。そのような生物学的反応修飾因子の制限されるものではない例は、インターフェロン（ＩＦＮ）−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦＲおよびＴＮＦＲＳＦ１８およびＴＮＦＳＦ１８を含むＴＮＦＲリガンドスーパーファミリーメンバーを含む。好ましい実施態様において、そのヌクレオチド配列は、インターフェロンアルファ２ｂのようなインターフェロンをコードする（例えば本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第６，８３５，５５７号明細書を参照のこと）。
【００４５】
他の実施態様において、異種性のヌクレオチド配列は、抗体をコードする。さらに他の実施態様において、異種性のヌクレオチド配列は、キメラまたは融合タンパク質をコードする。
【００４６】
ある実施態様において、異種性のヌクレオチド配列は、組換えアデノウイルスベクターが由来する種、サブグループまたは変異体の他の、アデノウイルスの異なる種、サブグループ、または変異体に属するウイルスの抗原性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。ある実施態様において、その異種性のヌクレオチド配列は、病原性微生物から得られた、および／またはそれ由来の、抗原性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
【００４７】
本発明のさらに別の実施態様において、その異種性のヌクレオチド配列は、癌治療遺伝子である。そのような遺伝子は、リンパ球の抗腫瘍活性を増強する遺伝子、その発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を増強する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、自殺遺伝子、多剤耐性遺伝子、アンチセンス配列、等を含む。従って、例えば本発明のアデノウイルスベクターは、ｐ５３、Ｒｂ、またはマイトシンのような、細胞周期を調節する、または条件的自殺遺伝子チミジンキナーゼのような、細胞死を誘導するのに有効なタンパク質の発現のために、外来性遺伝子を含み得る。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「ｒＡｄ産生細胞」、「生産細胞」、および「パッケージング細胞」という用語は、効率的なウイルス増殖に必要な産物を供給することによって、組換えアデノウイルスを増殖させ得る細胞と同義であり、そしてそれを意味する。様々な哺乳動物細胞系統が、組換えアデノウイルスの培養のために公に利用可能である。例えば、２９３細胞系統（ＧｒａｈａｍおよびＳｍｉｌｅｙ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２（１９７７））を操作して、Ｅ１機能の欠損を補完した。
【００４９】
ｒＡｄ産生細胞または細胞系統を、標準的な細胞培養技術を用いて増殖させ得る（例えばＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８７を参照のこと）。
【００５０】
細胞を、血清を含む、または血清を含まない条件で増殖させ得る。懸濁培養を、振とう、揺らす、攪拌、回転または攪拌して懸濁液中の細胞を維持し得る。
【００５１】
「Ａ５４９」は、当該分野で一般に公知である肺癌細胞系統である。１つの実施態様において、Ａ５４９細胞は、ＡＴＣＣ株ＣＣＬ−１８５である。
【００５２】
組換えアデノウイルス産生細胞または産生細胞系統を、哺乳動物細胞培養に関して当該分野で公知のあらゆる方法によって増殖または成長させ得る。単一工程または複数工程の手順によって増殖させ得る。例えば、単一工程の増殖手順において、産生細胞を貯蔵から取り出し、そして培養容器に直接播種し、そこでウイルスの産生が起こる。複数工程の増殖手順において、産生細胞を貯蔵から取り出し、そして産生が起こる最終的な培養容器に達するまで、徐々にサイズが増加する多くの培養容器で増殖させる。増殖工程の間、細胞を、増殖のために最適化された条件下で増殖させる。温度、ｐＨ、溶解酸素レベル等のような培養条件は、特定の細胞系統に関して最適であることが公知であり、そして当該分野の当業者に明らかとなる（例えばＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第２版、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照のこと）。
【００５３】
ｒＡｄ産生細胞またはｒＡｄ産生細胞系統を増殖させ得、そしてｒＡｄ産生細胞またはｒＡｄ産生細胞産生ウイルスを、当該分野で公知のあらゆる適当な容器で培養し得る。例えば、細胞を増殖させ得、そして感染細胞をバイオジェネレーターまたはバイオリアクターで培養し得る。一般的に、「バイオジェネレーター」または「バイオリアクター」は、一般的にステンレススチールまたはガラスで作られた、０．５リットルまたはそれより大きい容量を有する、攪拌システム、ＣＯ２ガスを注入するための装置、および酸素添加装置を含む、培養タンクを意味する。典型的には、それはｐＨ、溶解酸素、温度、タンク圧または培養の特定の物理化学的なパラメーター（例えばグルコースまたはグルタミンの消費、または乳酸およびアンモニウムイオンの産生）のような、バイオジェネレーターの内部パラメーターを測定するプローブを備える。ｐＨ、酸素、および温度のプローブは、これらのパラメーターを不変に調節するバイオプロセッサーに連結している。別の実施態様において、その容器はＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒである（ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）。
【００５４】
培養中の細胞密度を、当該分野で公知のあらゆる方法によって決定し得る。例えば、細胞密度を、顕微鏡で（例えば血球計数器）、または電子細胞計測装置（例えばＣＯＵＬＴＥＲ  ＣＯＵＮＴＥＲ；ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ  ７８０／ＳＰＯＳ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｉｚｅｒ）によって決定し得る。
【００５５】
「感染する」という用語は、細胞の組換えアデノウイルスによる感染を促進するような条件下で、組換えアデノウイルスを、細胞または細胞系統に接触させることを意味する。所定のウイルスの複数のコピーによって感染した細胞において、ウイルス複製およびビリオンのパッケージングに必要な活性は協同的である。従って、細胞がウイルスで複合的に感染する有意な可能性が存在するように条件を調整することが好ましい。細胞におけるウイルスの産生を増強する条件の例は、感染期におけるウイルス濃度の増加である。しかし、細胞あたりのウイルス感染の全数が過度であり得る可能性があり、細胞に毒性効果を引き起こす。従って、ウイルス濃度における感染を１ｍｌあたり１０６から１０１０ビリオンの範囲に、好ましくは約１０９ビリオンに維持するよう努力しなければならない。細胞系統の感染性を増加させるために、化学的薬剤も採用し得る。例えば、本発明は、カルパイン阻害剤を含むことによって、ウイルス感染に関する細胞系統の感染性を増加させる方法を提供する。本発明の実施において有用なカルパイン阻害剤の例は、カルパイン阻害剤１（Ｎ−アセチル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシナールとしても知られる、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから市販で入手可能）を含む。カルパイン阻害剤１は、組換えアデノウイルスに対する、細胞系統の感染性を増加させることが観察された。
【００５６】
「ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する」という用語は、ウイルスがその細胞内で増殖することを可能にするような感染細胞の条件を維持することを意味する。各細胞によって産生されるウイルス粒子の数を最大限にするように条件を調節することが望ましい。従って、例えば温度、溶解酸素およびｐＨレベルのような反応条件をモニターおよび調節することが必要である。ＣｅｌｌｉＧｅｎ  Ｐｌｕｓ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．４４  Ｔａｌｍａｄｇｅ  Ｒｏａｄ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪから市販で入手可能）のような、市販で入手可能なバイオリアクターは、そのようなパラメーターをモニターおよび維持するための装置を有する。感染および培養条件の最適化はいくらか変動するが、効率的な複製およびウイルス産生のための条件が、産生細胞系統の公知の性質、ウイルスの性質、およびバイオリアクターの型を考慮して、当業者によって達成され得る。
【００５７】
アデノウイルスのようなウイルスを、細胞において産生し得る。細胞を培養すること；任意で新しい増殖培地を細胞に加えること；細胞にウイルスを播種すること；播種した細胞をインキュベートすること（あらゆる時間の間）；任意で新しい増殖培地を播種した細胞に加えること；および任意で細胞および培地からウイルスを回収することによって、ウイルスを産生し得る。典型的には、Ｓｈａｂｒａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４５３−４６５（１９９７）において記載されるような、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムを用いる高速液体クロマトグラフィーのような従来の方法で決定される、ウイルス粒子の濃度が、プラトーに達し始めた時に、回収を行う。
【００５８】
あらゆる時点において、新しい増殖培地を播種した細胞に提供し得る。例えば、新しい培地を、灌流によって加え得る。培地交換は、細胞におけるウイルス産生を有意に増加させ得る。本発明の１つの実施態様において、細胞の培地を、２回−感染時に１回、および感染後に１回、連続的に交換する。
【００５９】
ウイルスを産生するために使用する細胞は、血清を含まない培地条件下で凍結した細胞系統から、または血清を含む培地条件下で凍結した細胞系統から（例えば凍結細胞バンクから）得ることができる。
【００６０】
培養中のウイルスの存在を同定するために、すなわち培養中のウイルスタンパク質の存在を示すために適当な方法は、ウイルスタンパク質の１つに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用い得る免疫蛍光テスト（Ｖｏｎ  Ｂｕｌｏｗら、Ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ、第１０版、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはネステッドＰＣＲ（Ｓｏｉｎｅら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３７：４６７−４７６（１９９３））、ＥＬＩＳＡ（Ｖｏｎ  Ｂｕｌｏｗら、Ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ、第１０版、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、フローサイトメトリーによるヘキソン発現分析（Ｍｕｓｃｏら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３３：２９０−２９６（１９９８）、ウイルスの中和、または特異的ウイルスタンパク質を同定するための通常の組織化学的方法のいずれかを含む。
【００６１】
培養中のアデノウイルスの量の滴定を、当該分野で公知の技術によって行い得る。特定の実施態様において、ウイルス粒子の濃度を、Ｓｈａｂｒａｍら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４５３−４６５（１９９７）によって記載されたような、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑアッセイによって決定する。本明細書中で使用される場合、「溶解」という用語は、ウイルスを含む細胞の破裂を指す。溶解は、当該分野で周知の様々な手段によって達成し得る。例えば、哺乳動物細胞は、低圧（１００〜２００ｐｓｉ差圧）条件下で、ホモジナイゼーションによって、顕微溶液化によって、または従来の凍結−解凍法によって溶解し得る。外来性の遊離のＤＮＡ／ＲＮＡは、ＤＮＡ分解酵素／ＲＮＡ分解酵素による分解によって除去し得る。
【００６２】
アデノウイルスを含む細胞を、凍結し得る。アデノウイルスを、ウイルスを含む細胞および培地から回収し得る。１つの実施態様において、アデノウイルスを、ウイルスを含む細胞および培地の両方から同時に回収する。特定の実施態様において、アデノウイルス産生細胞および培地を、例えば米国特許第６，１４６，８９１号明細書において記載されたように、ウイルスを含む細胞を溶解し、そして同時にそうでなければウイルス精製を妨害する細胞の破片を培地から除去する条件下で、クロスフロー微量ろ過にかける。
【００６３】
「採取する」という用語は、培地からアデノウイルスを含む細胞を収集することを意味し、そして培地からのアデノウイルスの収集を含み得る。これは、分画遠心法またはクロマトグラフィー的手段のような、従来の精製方法によって達成し得る。この段階において、採取した細胞は、凍結保存し得る、またはウイルスを単離するために溶解および精製によってさらに処理し得る。エキソゲナーゼ（ｅｘｏｇｅｎａｓｅ）を含まないＤＮＡ／ＲＮＡを、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）のようなＤＮＡ分解酵素／ＲＮＡ分解酵素で分解することによって除去し得る。
【００６４】
ウイルス採取物は、米国特許第６，１４６，８９１号明細書および同第６，５４４，７６９号明細書において記載されたように、限外ろ過またはタンジェンシャルフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）ろ過のような方法によって、ウイルスを濃縮するためにさらに処理し得る。
【００６５】
「回収する」という用語は、溶解した産生細胞から、および任意で培地上清から、組換えウイルス粒子の実質的に純粋な集団を単離することを意味する。本発明の細胞培養において産生されたウイルス粒子を、当該分野で一般に公知であるあらゆる方法によって、単離および精製し得る。クロマトグラフィーまたは分画密度勾配遠心法のような、従来の精製技術を採用し得る。例えば、ウイルス粒子を、塩化セシウム勾配精製法、カラムまたはバッチクロマトグラフィー、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフィー（Ｈａｒｕｎａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３：２６４−２６７（１９６１）；Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９：５３６−５４５（１９５９）；Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０：４５９−４６５（１９６０））、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００２／００６４８６０号明細書）、およびソフトゲル（例えばアガロース）、多孔性ポリマー「ｔｈｒｏｕｇｈｐｏｒｅｓ」、タンパク質とのより速い相互作用のためにデザインされた触手を有する「触手様」溶媒（例えばフラクトゲル）、およびソフトゲルの高容量および複合性材料の硬性を利用する、硬いシェル中のソフトゲルに基づく材料（例えばＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）  Ｆ）（Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６５８：２０７（１９９４）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６９９：４７−６１（１９９７））を含む、均一な架橋多糖のような他の樹脂を用いるクロマトグラフィーによって精製し得る。本発明の好ましい実施において、その教示全体が本明細書中に参考として援用される、１９９８年１１月１７日に発行された、Ｓｈａｂｒａｍら、米国特許第５，８３７，５２０号明細書、および米国特許第６，２６１，８２３号明細書において記載されたように、実質的にＨｕｙｇｈｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１４０３−１４１６（１９９５）の工程によって、カラムクロマトグラフィーによってウイルスを精製する。
【実施例】
【００６６】
全般的に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００５  Ａｕｇ；１２（２）：２５４−６３において記載されたプロトコールに従って、本願発明者は、ＰＥＧ化または非ＰＥＧ化組換えアデノウイルスのいずれかを投与したマウスにおいて、心血管系の反応を評価した。ＥＫＧおよび心拍数の両方を評価した。組換えアデノウイルスを、ＳＰＡ−ＰＥＧ５ＫリンカーでＰＥＧ化した。その結果は、様々な実験における４および５のｎに基づく。
【００６７】
ｒＡｄベクターのＰＥＧ化は、３つの別々の実験において、治療したマウスの半分で、血行力学的反応を阻害することが観察された。正常マウスにおける血行力学的心血管系反応の阻害は、ビリオンあたり約６００〜８００のＰＥＧ分子を有するｒＡｄベクターを用いて達成し得る。
【００６８】
インビボにおける全身の形質導入に対するＰＥＧ化の効果を、静脈内経路で、１×１０１１粒子の未修飾またはＰＥＧ化ｒＡｄベクターを３日後に注入したマウスにおいて評価した。肝臓、脾臓、副腎、肺、小腸および大腸、腎臓および心臓組織における定量的リアルタイムＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲによって体内分布を評価して、様々な形式の相対的な形質導入能力を評価した。驚くべきことに、様々な臓器における形質導入効率は、未修飾およびＰＥＧ−ｒＡｄベクターに関して比較的同等であった。導入遺伝子特異的ＤＮＡの体内分布は、試験した全ての臓器において、およびハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子発現と比較して、実質的に同等であった。これらの結果は、ビリオンあたり６００〜８００のＰＥＧ分子を有するｒＡｄ−ＰＥＧを用いて、形質導入効率は、非ＰＥＧ化ｒＡｄベクターと同様であることを示した。
【００６９】
ｒＡｄベクターのＰＥＧ化の、アナフィラキシー様反応のモデルにおける副作用を軽減する能力も試験した。このモデルは、アナフィラキシー様反応の軽減を引き起こす、表面に様々な程度のＰＥＧ化を有するｒＡｄ−ＰＥＧベクターを試験し、そして慢性炎症に伴う反応の悪化を阻害するために必要なＰＥＧ化の程度（すなわちビリオン粒子あたりの共有結合したＰＥＧ分子の数）を関連付ける能力を我々に提供した。ビリオンあたり１２５０のＰＥＧ分子より多く、そして１６００までのＰＥＧ分子によるｒＡｄベクターのＰＥＧ化（ＰＥＧ化反応中８％のＳＰＡ−ＰＥＧ）は、アナフィラキシー様反応の阻害を引き起こした。
【００７０】
本発明は、本明細書中で記載された特定の実施態様によって範囲を制限されない。実際、本明細書中で記載されたものに加えて、本発明の様々な修飾が、前述の説明から当業者に明らかとなる。そのような修飾は、添付の請求の範囲内に入ることが意図される。
【００７１】
特許、特許申請、出版物、製品の説明、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号およびプロトコールが、本明細書中で引用され、その開示は、全ての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月15日(2009.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
さらに別の実施態様において、本発明は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法を提供し、該方法は、ＰＥＧ化アデノウイルスビリオンを患者に投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのＰＥＧ化の程度は、ビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間（例えばビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間）であり、そしてここでＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率は、非ＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率と同じか、またはそれより高い。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法であって、該方法は被験体にＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度はビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間である、方法。
（項目２）
前記副作用が心血管系副作用である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記副作用がアナフィラキシー様反応である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記副作用が凝固障害である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記副作用が炎症である、項目１に記載の方法。
（項目６）
項目１に記載の方法であって、ここで前記ＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率が非ＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率と同じか、またはそれより高い方法。
（項目７）
項目１に記載の方法であって、ここでＰＥＧリンカーが、５ｋＤのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧ−ＳＰＡリンカーである方法。
（項目８）
項目１に記載の方法であって、ここで前記アデノウイルスビリオンのペグ化の程度が、ビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間である方法。
（項目９）
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法であって、該方法は被験体にＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオン２あたり約１６００のＰＥＧ分子までである、方法。前記副作用が心血管系副作用である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記副作用がアナフィラキシー様反応である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記副作用が凝固障害である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記副作用が炎症である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
項目１に記載の方法であって、ここでＰＥＧリンカーが、５ｋＤのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧ−ＳＰＡリンカーである方法。
（項目１４）
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減する方法であって、該方法は被験体にＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを投与することを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度はビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子の間である、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減するための組成物であって、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度はビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子の間である、組成物。
【請求項２】
前記副作用が心血管系副作用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記副作用がアナフィラキシー様反応である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記副作用が凝固障害である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記副作用が炎症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、ここで前記ＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率が非ＰＥＧ化組換えアデノウイルスの形質導入効率と同じか、またはそれより高い組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、ここでＰＥＧリンカーが、５ｋＤのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧ−ＳＰＡリンカーである組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、ここで前記アデノウイルスビリオンのペグ化の程度が、ビリオンあたり約６００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１０００のＰＥＧ分子の間である組成物。
【請求項９】
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減するための組成物あって、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度は、ビリオンあたり約１２５０のＰＥＧ分子より高く、そしてビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子までである、組成物。
【請求項１０】
前記副作用が心血管系副作用である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記副作用がアナフィラキシー様反応である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記副作用が凝固障害である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記副作用が炎症である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法であって、ここでＰＥＧリンカーが、５ｋＤのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧ−ＳＰＡリンカーである組成物。
【請求項１５】
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの全身投与に関連する副作用を軽減するための組成物であって、ＰＥＧ化組換えアデノウイルスビリオンを含み、ここで該アデノウイルスビリオンのペグ化の程度はビリオンあたり約４００のＰＥＧ分子とビリオンあたり約１６００のＰＥＧ分子の間である、組成物。
【国際調査報告】
2010504979.tif 000002
2010504979.tif 000003
2010504979.tif 000004