(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
Ｒ１−Ｚ−Ｒ２
｛式中、
Ｒ1が水素、Ｃ1-4アルキル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり；
Ｒ2がＮＨ2又はＯＨであり；及び
Ｚが以下の：
Ｈ−Ａｉｂ−ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ；
ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＭＮＴＩＬＤＳＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＧＱＡＶＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＳＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＴＩＬＥＮＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＥＧＳＦＳＳＤＬＳＴＩＬＥＮＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
Ｈ−Ａｉｂ−ＤＧＳＦＳＤＥＬＮＴＩＬＤＧＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ；
ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ；及び
ＨＧＥＧＳＦＳＳＤＬＳＴＩＬＥＧＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；、
から選ばれる｝
を有するＧＬＰ−２アナログ、又はその医薬的に許容され得るその塩又は溶媒和物。
【請求項２】
以下の：
Ｈｙ-Ｈ-Ａｉｂ-ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
Ｈｙ-ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
Ｈｙ-ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ-ＮＨ2；
Ｈｙ-ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＭＮＴＩＬＤＳＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
Ｈｙ-ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＧＱＡＶＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
Ｈｙ-ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＳＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
Ｈｙ-ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
Ｈｙ-ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＴＩＬＥＮＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
Ｈｙ-ＨＧＥＧＳＦＳＳＤＬＳＴＩＬＥＮＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
Ｈｙ-Ｈ-Ａｉｂ-ＤＧＳＦＳＤＥＬＮＴＩＬＤＧＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ-ＮＨ2；
Ｈｙ-ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
Ｈｙ-ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ-ＮＨ2；及び
Ｈｙ-ＨＧＥＧＳＦＳＳＤＬＳＴＩＬＥＧＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ-ＯＨ；
から選ばれる、請求項１に記載のＧＬＰ-２アナログ又はその医薬的に許容され得るその塩又は溶媒和物。
【請求項３】
治療法に使用される、請求項１又は２に記載のＧＬＰ−２アナログ。
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載のGLP-2アナログ、又はその塩を、担体との混合物として含む、医薬組成物。
【請求項５】
前記ＧＬＰ−２アナログが医薬的に許容され得る酸付加塩である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＧＬＰ−２類似体が注射又は点滴による投与に好適な液体として処方されるか、又は緩慢に放出されるように処方される、請求項４又は請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
軽度炎症の治療及び／又は予防向けの薬剤の調製のための、請求項１又は請求項２に記載のＧＬＰ−２アナログの使用。
【請求項８】
糖尿病に関連する軽度炎症の治療及び／又は予防向けの薬剤の調製のための、請求項１又は２に記載のＧＬＰ−２アナログの使用。
【請求項９】
前記糖尿病に関連する軽度炎症が：メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、心血管疾患、胃腸の炎症、鬱病、アルツハイマー、関節炎、高血圧、脂質異常症、脳卒中；食道、胃、十二指腸から成る上部胃腸管、小腸、結腸及び直腸における胃腸障害、あらゆる病因の潰瘍、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、カル−デ−サク症候群、炎症性腸疾患、セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、並びに化学療法及び／又は放射線血液療法誘発性粘膜炎及び下痢に関連している、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１又は請求項２に記載のＧＬＰ−２アナログをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸配列を、その発現を導く制御配列と組み合せて含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
前記ＧＬＰ−２アナログの発現に適した条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を培養すること、及びそれにより産生されたＧＬＰ−２類似体を精製することを含む、請求項１又は２に記載のＧＬＰ−２アナログの製造方法。
【請求項１４】
治療において使用するための、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載の発現ベクター又は請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
肥満、糖尿病、心血管疾患、胃腸の炎症、鬱病、アルツハイマー、関節炎、高血圧、脂質異常症、脳卒中、あらゆる病因の潰瘍を含めた食道、胃、十二指腸から成る上部胃腸管、小腸、結腸及び直腸における胃腸障害、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、カル−デ−サク症候群、炎症性腸疾患、セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、並びに化学療法及び／又は放射線血液療法誘発性粘膜炎及び下痢に関連している軽度炎症の治療及び／又は予防向けの医薬の製造における、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載の発現ベクター又は請求項１２に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１６】
有効量の請求項１又は２に記載のＧＬＰ−２アナログ、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載の発現ベクター、又は請求項１２に記載の宿主細胞を含む、患者の必要性に応じて胃及び腸関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
前記胃腸関連障害が、メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、心血管疾患、胃腸の炎症、鬱病、アルツハイマー、関節炎、高血圧、脂質異常症、脳卒中；あらゆる病因の潰瘍を含めた食道、胃、十二指腸から成る上部胃腸管、小腸、結腸及び直腸における胃腸障害、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、カル−デ−サク症候群、炎症性腸疾患、セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、並びに化学療法及び／又は放射線血液療法誘発性粘膜炎及び下痢に関連している軽度炎症である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
癌化学療法薬剤及び請求項１又は２に記載のＧＬＰ−２アナログ、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載の発現ベクター、又は請求項１２に記載の宿主細胞それぞれを任意に医薬的に許容される担体と組み合わせて含む治療キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変更されたＧＬＰ−１活性を有するグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）類似体、並びに、例えば代謝性エンドトキシン血症、糖尿病、肥満、及びメタボリックシンドロームなどの疾患及び身体状態の予防、処置又は寛解におけるそれらの医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
軽度の炎症は、心臓病、脳卒中、糖尿病及び死亡に関する独立した危険因子である。調査結果は、それらがともに炎症性疾患であるので、アテローム性動脈硬化症（動脈における脂肪性沈着物（プラーク）の形成、及びフリーラジカルや伝染性物質の作用を伴う）が骨や関節の関節炎になぞらえ得ることを示唆している。炎症は、インスリン抵抗性の検出に先行するので、そのため糖尿病の優れた予測因子となり得る。
【０００３】
さらに、肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂ）に粘膜バリア機能の乱れと全身性炎症の増強があることが実証された（Brun et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 292: G518-G525, 2007. 5 October 2006）。これらの観察はさらに、高脂肪食摂取で飼養されたＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（Cani et al., DlABETES, VOL. 57, JUNE 2008, p 1470-1481）や非肥満糖尿病マウス（Hadjiyanni et al., 2009）にまで拡大された。Ｃａｎｉと同僚ら（gut.bmj.com, 2009）は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、腸内微生物叢を変更することで、腸透過性及びＧＬＰ−２駆動経路を介した炎症を低減したことを報告した。さらに、現在では、肥満及び糖尿病の患者で観察された透過性の増大が、以前に予期されたよりも疾病進行においてより重大な役割を担っている可能性が高い。増大した腸透過性は、腸管腔の向こう側への細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）移行の増加につながる。この増加したＬＰＳは、多くの疾患の発症機序に関与する軽度慢性炎症を引き起こす体内の循環している及び臓器に存在するマクロファージなどの免疫細胞を活性化する。この現象は、代謝性エンドトキシン血症（ＭＥ）と呼ばれ、慢性疾患病理学の新しい概念と見なすことができる。
【０００４】
本願発明の範囲の中にＭＥと関連疾患を標的化することがある。II型糖尿病、アテローム性動脈硬化、パーキンソン病及び癌転移を含めた疾患が、軽度慢性炎症との関連で生じ、そしてそれの起源は明確に定義されていない。興味深いことに、いくつかの最近の調査では、疾患進行と血漿エンドトキシン濃度との有意な相関関係が実証された（Chang 2011, J Med Sci 2011 ;31(5):191-209）。
【０００５】
それによって肥満糖尿病状況において二重ＧＬＰ２−ＧＬＰ１アゴニストが機能する仮定された機構が、図１に示されている。そのＧＬＰ２成分が、炎症及び代謝性エンドトキシン血症を低減する一方で、ＧＬＰ１成分が古典的なＧＬＰ１依存機構を通じたグルコース制御及び体重減少を提供した。
【０００６】
ヒトＧＬＰ−２は、腸の腸管内分泌Ｌ細胞及び脳幹の特定領域におけるプログルカゴンの特定の翻訳後プロセシングに由来する３３アミノ酸のペプチドであり、栄養素の摂取に反応して、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、オキシントモジュリン、及びグリセンチンと共に分泌される。
【０００７】
ＧＬＰ−２は陰窩における幹細胞増殖刺激及び絨毛のアポトーシスの阻害を通じ、小腸粘膜上皮の有意な増殖を誘導する（Drucker et al., Proc Natl Acad Sci US A 93:7911-7916 (1996)）。ＧＬＰ−２はまた、結腸に対する増殖効果も有する。さらに、ＧＬＰ−２は、胃排出及び胃酸分泌を阻害し（Wojdemann et aL, J Clin Endocrinol Metab. 84:2513-2517 (1999)）、腸のバリア機能を増強し（Benjamin et aL, Gut47: 112-9 (2000)）、グルコース輸送体の発現増加を通じた腸ヘキソース輸送を刺激し（Cheeseman, Am J Physiol. R1965-71 (1997)）、且つ腸血流を増大させる（Guan et al., Gastroenterology125:136147 (2003)）。
【０００８】
ＧＬＰ−２は、クラスＩＩグルカゴンセクレチンファミリーに属する単一のＧタンパク質共役型受容体に結合する。ＧＬＰ−２受容体は小腸、結腸及び胃において発現され、そしてそこはまた、ＧＬＰ−２に反応することが知られている部位でもある（Yusta et al., Gastroenterology 119:744-755 (2000)）。しかしながら、胃腸管内におけるＧＬＰ−２受容体からの刺激に対する標的細胞型は良く分かっておらず、そして、ＧＬＰ−２受容体に共役する下流の細胞内メディエーターは良く理解されていない。
【０００９】
小腸におけるＧＬＰ−２の実証された特異的且つ有益な効果は、腸疾患又は傷害の処置にＧＬＰ−２を使用することへの大きな関心を引き起こした（Sinclair and Drucker, Physiology 2005: 357-65）。さらに、化学療法誘導性腸炎、虚血再灌流障害、デキストラン硫酸誘導性結腸炎、及び炎症性腸疾患の遺伝的モデルを含む腸傷害の多数の前臨床モデルにおいて、ＧＬＰ−２が粘膜上皮損傷を防止又は減少させることが示されてきた（Sindair and Drucker Physiology 2005: 357-65）。
【００１０】
さらに、胃におけるＧＬＰ−２ＲのｍＲＮＡ発現（Yusta et al., 2000）、及びＧＬＰ−２が腸の運動性及び胃酸分泌を低下させるという観察（Meier et al., GASTROENTEROLOGY 2006; 130: 44-54）の両者は共に、胃が直接的又は間接的にＧＬＰ−２に反応するということの十分な証拠を提供している。それにもかかわらず、ＧＬＰ−２又はＧＬＰ−２類似体の、胃内面の損傷を特徴とする状態における使用についてはまだ探求されていない。
【００１１】
ＧＬＰ−２は、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１）の配列を有する３３アミノ酸ペプチドとして分泌される。酵素ＤＰＰ ＩＶによりＮ末端に対して２位のアラニン（Ａｌａ）において迅速に切断されて、不活性型のヒトＧＬＰ−２ペプチド（３−３３）となる。腎クリアランスに加え、この迅速なＧＬＰ−２（１−３３）の分解によってペプチドの半減期は７分間となる（Tavares et aL, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 278:E134-E139 (2000)）。
【００１２】
代表的なＧＬＰ−２類似体は、例えば米国特許第５，７８９，３７９号；同第５，９９４，５００号；同第６，１８４，２０１号；同第６，１８４，２０８号；国際特許出願公開第ＷＯ９７／３９０３１号；同第ＷＯ０１／４１７７９号；同第ＷＯ０２／０６６５１１号及びＤａＣａｍｂｒａら（Biochemistry 2000, 39, 8888-8894）に記載されている。本明細書中に引用したすべての文献は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
広義には、本発明は、野生型ＧＬＰ−２に比較して１若しくは複数の置換を含み、且つ、例えば試験管内における効力アッセイで評価されるような、特性の変更、好ましくは増強されたＧＬＰ−１活性を有し得るＧＬＰ−２類似体に関係する。例えばＧＬＰ−１活性は、天然ＧＬＰ−２よりも低いＧＬＰ−１受容体におけるＥＣ50値を測定することによって評価され得る。いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、１７位のＧｌｎ、Ｌｙｓ又はＧｌｕと組み合わせて、野生型ＧＬＰ−２配列の２、３、５、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９、２０、２１、２４、２７及び／又は２８位のうちの１若しくは複数に相当するアミノ酸位置に１若しくは複数の置換を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、１７位のＧｌｎ、Ｌｙｓ又はＧｌｕと組み合わせて、野生型ＧＬＰ−２配列の２、３、５、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１６、２０、２１、２４、２７及び／又は２８位の１若しくは複数に相当するアミノ酸位置に１若しくは複数の置換を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、２位に保存的又は非保存的置換を含む、及び／又は野生型ＧＬＰ−２配列の２８〜３３位のアミノ酸に相当する１若しくは複数のアミノ酸の置換又は欠失を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、１２、１４、１６、１７、１９、２０、２４、２７、２８及び３２位の１若しくは複数に結合された親油性置換基を任意に含む。いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、１２、１６、１７、２０、２４、２７、２８及び３２位の１若しくは複数に結合された親油性置換基を任意に含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−２類似体は、一般式Ｉ：
Ｒ1−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ａｌａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｒ2（Ｉ）（配列番号２）
｛式中、
Ｒ1は水素、Ｃ1-4アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり；
Ｘ２はＧｌｙ、Ａｌａ又はＡｉｂであり；
Ｘ３はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐであり；
Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ８はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであり；
Ｘ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｓｎ、Ｓｅｒ又はＡｌａであり；
Ｘ１２はＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＬｙｓであり；
Ｘ１３はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又はＧｌｎであり；
Ｘ１４はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘ１５はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
Ｘ１６はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ１７はＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＧｌｕであり；
Ｘ１９はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘ２０はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓであり；
Ｘ２１はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２８はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ２９はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３０はＬｙｓ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３１はＩｌｅ、Ｐｒｏ又は不在であり；
Ｘ３２はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｙ１又は不在であり；
Ｙ１はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、又はＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであり；且つ
Ｒ2はＮＨ2又はＯＨである｝によって表されるか、あるいは医薬的に許容され得るその塩又は溶媒和物であるが；
但し、式ＩのＧＬＰ−２類似体は、
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号３）
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号４）又は
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＳＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ；（配列番号５）
ではない。
【００１５】
この式で、Ｘ３１はまた、Ｙ１であってもよい。Ｘ２８はまた、Ｇｌｙであってもよい。Ｘ２９はまた、Ａｌａであってもよい。
【００１６】
さらに、Ｙ１はＸ３３とＲ2の間に存在していてもよい。これにより、Ｘ３４位が想定されてもよく、ここで、Ｘ３４はＹ１又は不在である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−２類似体は、式ＩによるＧＬＰ−２類似体、あるいは医薬的に許容され得るその塩又は溶媒和物であって、式中、
Ｒ1は水素であり；
Ｘ２はＧｌｙ、Ａｌａ又はＡｉｂであり；
Ｘ３はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐであり；
Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ８はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであり；
Ｘ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｓｎ、Ｓｅｒ、又はＡｌａであり；
Ｘ１２はＴｈｒ又はＬｙｓであり；
Ｘ１４はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘ１５はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
Ｘ１６はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ１７はＧｌｎ又はＬｙｓであり；
Ｘ１９はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘ２０はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓであり；
Ｘ２１はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＬｙｓであり；
Ｘ２８はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ２９はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３０はＬｙｓ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３１はＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３２はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｙ１又は不在であり；
Ｙ１はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであり；そして
Ｒ2はＮＨ2又はＯＨであるが、
但し、式ＩのＧＬＰ−２類似体は
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；又は
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＳＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ、
ではない。
【００１８】
この式で、Ｘ１３はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又はＧｌｎであってもよい。
【００１９】
Ｘ２８はまた、Ｇｌｙであってもよい。Ｘ２９はまた、Ａｌａであってもよい。Ｙ１はＸ３３とＲ2の間に存在していてもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１４はＬｅｕである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１４はＭｅｔである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１７はＧｌｎである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１７はＬｙｓである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１７はＧｌｕである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１９はＡｌａである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１９はＶａｌである。
【００２７】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１６はＧｌｙであり且つ式ＩのＸ１７はＧｌｎである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１６はＧｌｙであり且つ式ＩのＸ１７はＬｙｓである。
【００２９】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ１６はＧｌｙであり且つ式ＩのＸ１７はＧｌｕである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ２はＡｉｂであり、式ＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩのＸ１７はＧｌｎである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ２はＡｉｂであり、式ＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩのＸ１７はＬｙｓである。
【００３２】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ２はＡｉｂであり、式ＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩのＸ１７はＧｌｕである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ２はＧｌｙであり、式ＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩのＸ１７はＧｌｎである。
【００３４】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ２はＧｌｙであり、式ＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩのＸ１７はＬｙｓである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、式ＩのＸ２はＧｌｙであり、式ＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩのＸ１７はＧｌｕである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−２類似体は、一般式Ｉａ：
Ｒ1−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｒ2（Ｉａ）（配列番号６）
｛式中、
Ｒ1は水素、Ｃ1-4アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり；
Ｘ２はＧｌｙ、Ａｌａ又はＡｉｂであり；
Ｘ３はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐであり；
Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ８はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであり；
Ｘ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｓｎ又はＳｅｒであり；
Ｘ１２はＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＬｙｓであり；
Ｘ１３はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又はＧｌｎであり；
Ｘ１５はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
Ｘ１６はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ１７はＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＧｌｕであり；
Ｘ２０はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓであり；
Ｘ２１はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２８はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ２９はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３０はＬｙｓ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３１はＩｌｅ、Ｐｒｏ又は不在であり；
Ｘ３２はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｙ１又は不在であり；
Ｙ１はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、又はＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであり；且つ
Ｒ2はＮＨ2又はＯＨである｝によって表されるか、あるいは医薬的に許容され得るその塩又は溶媒和物であるが；
但し、式ＩａのＧＬＰ−２類似体は
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；又は
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＳＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ、
ではない。
【００３７】
この式で、Ｘ３１はまた、Ｙ１であってもよい。
【００３８】
さらに、Ｙ１はＸ３３とＲ2の間に存在していてもよい。これにより、Ｘ３４位が想定されてもよく、ここで、Ｘ３４はＹ１であるか又は不在である。Ｘ２８はまた、Ｇｌｙであってもよい。Ｘ２９はまた、Ａｌａであってもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−２類似体は、式ＩａによるＧＬＰ−２類似体、あるいは医薬的に許容され得るその塩又は溶媒和物であって、
式中、
Ｒ1は水素であり；
Ｘ２はＧｌｙ、Ａｌａ又はＡｉｂであり；
Ｘ３はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐであり；
Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ８はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＳｅｒであり；
Ｘ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｘ１０はＭｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＴｙｒであり；
Ｘ１１はＡｓｎ又はＳｅｒであり；
Ｘ１２はＴｈｒ又はＬｙｓであり；
Ｘ１５はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
Ｘ１６はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ１７はＧｌｎ又はＬｙｓであり；
Ｘ２０はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓであり；
Ｘ２１はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＬｙｓであり；
Ｘ２８はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ２９はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３０はＬｙｓ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３１はＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３２はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｙ１又は不在であり；
Ｙ１はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであり；そして
Ｒ2はＮＨ2又はＯＨであるが、
但し、式Ｉａの類似体は、
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；又は
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＳＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ、
ではない。
【００４０】
この式で、Ｘ１３はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又はＧｌｎであってもよい。
【００４１】
Ｘ２８はまた、Ｇｌｙであってもよい。Ｘ２９はまた、Ａｌａであってもよい。
【００４２】
Ｙ１はＸ３３とＲ2の間に存在していてもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ１７はＧｌｎである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ１７はＬｙｓである。
【００４５】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ１７はＧｌｕである。
【００４６】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩａのＸ１７はＧｌｎである。
【００４７】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩａのＸ１７はＬｙｓである。
【００４８】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩａのＸ１７はＧｌｕである。
【００４９】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ２はＡｉｂであり、式ＩａのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩａのＸ１７はＧｌｎである。
【００５０】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ２はＡｉｂであり、式ＩａのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩａのＸ１７はＬｙｓである。
【００５１】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ２はＡｉｂであり、式ＩａのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩａのＸ１７はＧｌｕである。
【００５２】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ２はＧｌｙであり、式ＩａのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩａのＸ１７はＧｌｎである。
【００５３】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ２はＧｌｙであり、式ＩａのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩａのＸ１７はＬｙｓである。
【００５４】
いくつかの実施形態において、式ＩａのＸ２はＧｌｙであり、式ＩａのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩａのＸ１７はＧｌｕである。
【００５５】
先の実施形態のいずれかにおいて、又は独立に、Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１はＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａであってもよい。
【００５６】
先に記載した一般式において、Ｘ２８〜Ｘ３３位は特定のアミノ酸残基から選択されても、Ｙ１であっても、又は不在であってもよい。ＧＬＰ−２類似体が１以下のＹ１部分を含んでおり、そして、存在している場合には、Ｙ１が分子のＣ末端部分を形成することを意図する。これにより、Ｘ２８〜Ｘ３３位のいずれかがＹ１である場合、すべての下流位置が不在である；すなわち、そのＹ１の下流のＸ２９〜Ｘ３３（又はＸ３４）位は不在である。このような関係においては、所定の位置の「下流」という場所は、その位置のＣ末端に位置している場所である。
【００５７】
さらに、Ｘ２８〜Ｘ３３位のいずれかが不在である場合、（Ｙ１が存在し得ることを除いて）その位置の下流の全ての位置も不在である。これにより、不在であり得るこれらの位置の唯一の組み合わせは、Ｘ３３；Ｘ３２−Ｘ３３；Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３；Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３；Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３；及びＸ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３である。言い換えれば、ＸＮ位（ここで、Ｎは２８〜３３の整数である）が存在している場合には、Ｘ（Ｎ−１）位もまた存在している。
【００５８】
ＧＬＰ−２類似体は、一般式ＩＩ：
Ｒ1−Ｈｉｓ−Ｘ２−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ａｌａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｒ2（ＩＩ）（配列番号７）
｛式中、
Ｒ1は水素、Ｃ1-4アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり；
Ｘ２はＧｌｙ、Ａｌａ又はＡｉｂであり；
Ｘ３はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐであり；
Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ１２はＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＬｙｓであり；
Ｘ１３はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又はＧｌｎであり；
Ｘ１４はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘ１５はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
Ｘ１６はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ１７はＧｌｎ又はＬｙｓであり；
Ｘ１９はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘ２０はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓであり；
Ｘ２１はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２８はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ２９はＴｈｒ、Ａｌａ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３０はＬｙｓ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３１はＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３２はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３４はＹ１又は不在であり；
Ｙ１はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、又はＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであり；且つ
Ｒ2はＮＨ2又はＯＨであり；
ここで、
ＧＬＰ−２類似体は１以下のＹ１しか含んでおらず；
Ｘ２８〜Ｘ３３のいずれかがＹ１である場合には、そのＹ１の下流のＸ２９〜Ｘ３４位は不在であり；
Ｘ２８〜Ｘ３３のいずれかが不在である場合には、その位置の下流のＸ２９〜Ｘ３３位もまた不在である｝によって表され得るか、あるいは医薬的に許容され得るその塩又は溶媒和物である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、式ＩＩのＸ１６はＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＡｌａである。そのような実施形態において、式ＩＩのＸ１７はＬｙｓであってもよく、又は式ＩＩのＸ１７はＧｌｎであってもよい。
【００６０】
さらに加えて又はその代わりに、式ＩＩのＸ２はＧｌｙ又はＡｌａであってもよい。
【００６１】
これにより、いくつかの実施形態において、式ＩＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩＩのＸ１７はＧｌｎである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、式ＩＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩＩのＸ１７はＬｙｓである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、式ＩＩのＸ２はＧｌｙであり、式ＩＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩＩのＸ１７はＧｌｎである。
【００６４】
いくつかの実施形態において、式ＩＩのＸ２はＧｌｙであり、式ＩＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩＩのＸ１７はＬｙｓである。
【００６５】
いくつかの実施形態において、式ＩＩのＸ２はＡｉｂであり、式ＩＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩＩのＸ１７はＧｌｎである。
【００６６】
いくつかの実施形態において、式ＩＩのＸ２はＡｉｂであり、式ＩＩのＸ１６はＧｌｙであり、且つ式ＩＩのＸ１７はＬｙｓである。
【００６７】
これにより、式ＩＩのいくつかの実施形態において、
Ｒ1は水素、Ｃ1-4アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり；
Ｘ２はＧｌｙ又はＡｉｂであり；
Ｘ３はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ１２はＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＬｙｓであり；
Ｘ１３はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又はＧｌｎであり；
Ｘ１４はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘ１５はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
Ｘ１６はＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＡｌａであり；
Ｘ１７はＧｌｎ又はＬｙｓであり；
Ｘ１９はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘ２０はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓであり；
Ｘ２１はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２８はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ２９はＴｈｒ、Ａｌａ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３０はＬｙｓ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３１はＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３２はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３４はＹ１又は不在であり；
Ｙ１はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、又はＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであり；且つ
Ｒ2はＮＨ2又はＯＨであり；
ここで、
ＧＬＰ−２類似体は１以下のＹ１しか含んでおらず；
Ｘ２８〜Ｘ３３のいずれかがＹ１である場合には、そのＹ１の下流のＸ２９〜Ｘ３４位は不在であり；
Ｘ２８〜Ｘ３３のいずれかが不在である場合には、その位置の下流のＸ２９〜Ｘ３３位もまた不在である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、Ｘ１６はＧｌｙであり、且つＸ１７はＧｌｎである。
【００６９】
いくつかの実施形態において、Ｘ１６はＧｌｙであり、且つＸ１７はＬｙｓである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、Ｘ２はＧｌｙであり、Ｘ１６はＧｌｙであり、且つＸ１７はＧｌｎである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、Ｘ２はＧｌｙであり、Ｘ１６はＧｌｙであり、且つＸ１７はＬｙｓである。
【００７２】
いくつかの実施形態において、Ｘ２はＡｉｂであり、Ｘ１６はＧｌｙであり、且つＸ１７はＧｌｎである。
【００７３】
いくつかの実施形態において、Ｘ２はＡｉｂであり、Ｘ１６はＧｌｙであり、且つＸ１７はＬｙｓである。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＧＬＰ−２類似体は、一般式ＩＩＩ：
Ｒ1−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｘ３−Ｇｌｙ−Ｘ５−Ｐｈｅ−Ｘ７−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｌｅｕ−Ｘ１５−Ｇｌｙ−Ｘ１７−Ａｌａ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２７−Ｘ２８−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｒ2（ＩＩＩ）（配列番号２１）
｛式中、
Ｒ1は水素、Ｃ1-4アルキル（例えばメチル）、アセチル、ホルミル、ベンゾイル又はトリフルオロアセチルであり；
Ｘ３はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｘ５はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ７はＳｅｒ又はＴｈｒであり；
Ｘ１２はＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＬｙｓであり；
Ｘ１３はＩｌｅ、Ｔｙｒ、又はＧｌｎであり；
Ｘ１５はＡｓｐ又はＧｌｕであり；
Ｘ１７はＧｌｎ又はＬｙｓであり；
Ｘ１９はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘ２０はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓであり；
Ｘ２１はＡｓｐ、Ｇｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘ２４はＡｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕであり；
Ｘ２７はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり；
Ｘ２８はＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ２９はＴｈｒ、Ａｌａ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３０はＬｙｓ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３１はＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３２はＴｈｒ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３３はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｙ１又は不在であり；
Ｘ３４はＹ１又は不在であり；
Ｙ１はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、又はＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであり；且つ
Ｒ2はＮＨ2又はＯＨであり；
ここで、
ＧＬＰ−２類似体は１以下のＹ１しか含んでおらず；
Ｘ２８〜Ｘ３３のいずれかがＹ１である場合には、そのＹ１の下流のＸ２９〜Ｘ３４位は不在であり；
Ｘ２８〜Ｘ３３のいずれかが不在である場合には、その位置の下流のＸ２９〜Ｘ３３位もまた不在である｝によって表されるか、あるいは医薬的に許容され得るその塩又は溶媒和物である。
【００７５】
本発明の上記の実施形態のいずれかにおいて、ＧＬＰ−２類似体のアミノ酸配列には、アミノ酸配列ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ又はＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＩＴＤから５以下のアミノ変更、例えば４以下、３以下、２以下又は１以下の変更しかないことが望まれ得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、次の配列のうちのいずれか１つ：
Ｈ−Ａｉｂ−ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号８）
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号９）
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ；（配列番号１０）
ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＭＮＴＩＬＤＳＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号１１）
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＧＱＡＶＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号１２）
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＳＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号１３）
ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号１４）
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＴＩＬＥＮＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号１５）
ＨＧＥＧＳＦＳＳＤＬＳＴＩＬＥＮＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号１６）
Ｈ−Ａｉｂ−ＤＧＳＦＳＤＥＬＮＴＩＬＤＧＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ；（配列番号１７）
ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号１８）
ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ；（配列番号１９）及び
ＨＧＥＧＳＦＳＳＤＬＳＴＩＬＥＧＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ；（配列番号２０）、
によって表されるか、あるいは医薬的に許容され得るその塩又は溶媒和物である。
【００７７】
これにより、本発明のＧＬＰ−２類似体は、化合物Ｒ1−Ｚ−Ｒ2であってもよく、式中、Ｒ1及びＲ2は前記一般式で定義されるとおりのものであり、そしてＺは先に列挙したものから選択されるペプチド配列である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、天然ＧＬＰ−２の１２、１４、１６、１７、１９、２０、２４、２７、２８及び３２位の１若しくは複数に相当する位置でアミノ酸に結合された親油性置換基を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、天然ＧＬＰ−２の１２、１６、１７、２０、２４、２７、２８及び３２位の１若しくは複数に相当する位置でアミノ酸に結合された親油性置換基を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、治療法で使用されてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本発明は、担体との混合物の状態で本発明のＧＬＰ−２類似体、あるいはその塩又は誘導体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、医薬的に許容され得る酸付加塩であるＧＬＰ−２類似体を含み得る。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、注射又は点滴による投与に好適な液体として処方されるか、又はそれは本発明のＧＬＰ−２類似体の緩やかな放出をもたらすように処方される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明は、軽度炎症の治療及び／又は予防向けの薬剤の調製のための本発明のＧＬＰ−２類似体の使用を提供する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本発明は、糖尿病（Ｉ型糖尿病であってもＩＩ型糖尿病であってもよいが、特にＩＩ型）に関連する軽度炎症の治療及び／又は予防向けの薬剤の調製のための本発明のＧＬＰ−２類似体の使用を提供する。いくつかの実施形態において、軽度炎症は、局所性又は全身性軽度炎症である。いくつかの実施形態において、軽度炎症としては、メタボリックシンドローム、肥満（例えば腹部肥満）、糖尿病、心血管疾患、胃腸の炎症、鬱病、アルツハイマー、関節炎、高血圧、脂質異常症及び脳卒中、あらゆる病因の潰瘍（例えば消化性潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群、薬物性潰瘍、感染又は他の病原菌に関連する潰瘍）を含めた食道、胃、十二指腸から成る上部胃腸管、小腸、結腸及び直腸における胃腸障害、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、カル−デ−サク症候群、炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎）、（例えばグルテン誘発性腸疾患又はセリアック病から生じる）セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、並びに化学療法及び／又は放射線血液療法誘発性粘膜炎及び下痢が挙げられる。上記疾患、身体状態及び障害の一部が軽度炎症に関連していると特徴付けられ得る。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＧＬＰ−２類似体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＧＬＰ−２類似体の発現を誘導するための制御配列と組み合わせて、本発明のＧＬＰ−２類似体をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＧＬＰ２類似体を製造する方法を提供するが、その方法は、ＧＬＰ−２類似体を発現する宿主細胞を発現に好適な条件下で培養し、ＧＬＰ−２類似体を精製し、これにより製造することを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸分子、本発明の発現ベクター、又は本発明の宿主細胞は、治療法で使用されてもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本発明は、軽度炎症の治療及び／又は予防向けの薬剤の調製における本発明の核酸分子、本発明の発現ベクター、又は本発明の宿主細胞の使用を提供する。いくつかの実施形態において、軽度炎症は、局所性であっても全身性であってもよく、例えばメタボリックシンドローム（最も広い定義）、肥満（例えば腹部肥満）、糖尿病、心血管疾患、胃腸の炎症、鬱病、アルツハイマー病、関節炎、高血圧、脂質異常症及び脳卒中、あらゆる病因の潰瘍（例えば消化性潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群、薬物性潰瘍、感染又は他の病原菌に関連する潰瘍）を含めた食道、胃、十二指腸から成る上部胃腸管、小腸、結腸及び直腸における胃腸障害、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、カル−デ−サク症候群、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、（例えばグルテン誘発性腸疾患又はセリアック病から生じる）セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、並びに化学療法及び／又は放射線血液療法誘発性粘膜炎及び下痢が挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本発明は、有効量の本発明のＧＬＰ−２類似体、本発明の核酸分子、本発明の発現ベクター、又は本発明の宿主細胞を投与することによってそれを必要としている患者の胃腸関連障害（例えば胃又は腸管）を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、胃腸関連障害は軽度炎症である。軽度炎症は、局所性であっても全身性であってもよい。軽度炎症としては、例えばメタボリックシンドローム、肥満（例えば腹部肥満）、糖尿病、心血管疾患、胃腸の炎症、鬱病、アルツハイマー、関節炎、高血圧、脂質異常症及び脳卒中、あらゆる病因の潰瘍（例えば消化性潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群、薬物性潰瘍、感染又は他の病原菌に関連する潰瘍）を含めた食道、胃、十二指腸から成る上部胃腸管、小腸、結腸又は直腸における胃腸障害、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、カル−デ−サク症候群、炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎）、（例えばグルテン誘発性腸疾患又はセリアック病から生じる）セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、並びに化学療法及び／又は放射線血液療法誘発性粘膜炎及び下痢が挙げられる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本発明は、癌の化学療法剤と本発明のＧＬＰ−２類似体、本発明の核酸分子、本発明の発現ベクター又は本発明の宿主細胞を、それぞれ任意に医薬的に許容し得る担体と組み合わせて含む処置用キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】生理学的経路に対するＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２の効果を示す（出典Cani et al., Pharmacology and Therapeutics 130 (2011) 202-212.）。
【図２】経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）に対する化合物１２又はビヒクル投与の効果を示す。グルコース負荷の一時間前に、ベースライン測定値を採取し、そして化合物１２／ビヒクルを投与した。（Ａ）実験期間中の血糖レベル。（Ｂ）血糖測定値のＡＵＣ。
【図３】腸の湿重量に対する化合物７又はビヒクル投与の効果を示す。動物を、化合物７又はビヒクルで１日１回、４日間処置し、そして、５日目に、小腸を取り出し、計量した。
【図４】腸の重量に対する２週間の試験化合物７投与又はビヒクル投与の効果を示す。（Ａ）小腸の湿重量。（Ｂ）大腸の湿重量。
【図５】グルコース恒常性に対する２週間の試験化合物７投与又はビヒクル投与の効果を示す。動物を一晩断食させ、そして、（Ａ）空腹時血糖、（Ｂ）空腹時血漿インスリン及び（Ｃ）恒常性モデル評価−インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）の分析のために採血した。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
発明の詳細な説明
本明細書中に別段の定義がない限り、本出願で使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載した化学、分子生物学、細胞及び癌生物学、免疫学、微生物学、薬理学、並びにタンパク質及び核酸化学と関係して使用される用語体系及びそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、且つ一般的に使用されるものである。
【００９３】
本出願で言及されたすべての刊行物、特許、及び公開特許出願は、言及によって具体的に本明細書中に援用される。矛盾する場合には、その具体的な定義を含んでいる本明細書が統制する。
【００９４】
本明細書中に記載した発明の各実施形態は、単独で、又は１若しくは複数の本発明の他の実施形態と組み合わせて利用され得る。
定義
【００９５】
別段の指定がない限り、以下の定義が特定の用語に与えられ、そしてそれが、先に記載された明細に使用される。
【００９６】
この明細書を通じて、「comprise」という語又は「comprises」若しくは「comprising」などのバリエーションは、述べられた整数（若しくは成分）又は整数（若しくは成分）の群の包含を含意すると理解されるが、その他の整数（若しくは成分）又は整数（若しくは成分）の群を除外するものではない。
【００９７】
単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別段の命令がない限り、複数形を含んでいる。
【００９８】
用語「含む」は、「これだけに限定されるものではないが、含む」を意味するように使用される。「含む」及び「これだけに限定されるものではないが、含む」は互換的に使用される。
【００９９】
「患者」、「対象」及び「個体」という用語は、互換的に使用されてもよく、ヒト又はヒト以外の動物のどちらかを指す。これらの用語は、ヒト、霊長類、家畜動物（例えばウシ、ブタ）、コンパニオン・アニマル（例えばイヌ、ネコ）及び齧歯類（例えばマウスやラット）などの哺乳類を含んでいる。
【０１００】
本発明との関連において「溶媒和物」という用語は、溶質（ｉｎ ｃａｓｕ、本発明によるペプチドコンジュゲート又は医薬的に許容し得るその塩）と溶媒との間で形成されると化学量論的に定義される複合体を指す。この文脈では、溶媒は、例えば水であっても、エタノールであっても、別の医薬的に許容され得る、典型的に小分子有機種、例えばこれだけに限定されるものではないが、酢酸又は乳酸などであってもよい。問題の溶媒が水であるときに、通常、そのような溶媒和物は水和物と呼ばれる。
【０１０１】
本発明との関連において用いられる「アゴニスト」という用語は、問題の受容体型を活性化する物質（リガンド）を指す。
【０１０２】
明細書及び特許請求の範囲を通じて、天然アミノ酸に関して従来の一字コード及び三文字コードが使用され、そして、サルコシン（Ｓａｒ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）及びα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）などの他のアミノ酸に関して一般に認められている三文字コードが使用される。本発明のペプチド内のすべてのアミノ酸残基は、好ましくはＬ−立体配置のものである。しかしながら、Ｄ−立体配置アミノ酸もまた存在し得る。
【０１０３】
本明細書中に開示されている配列は共通して、配列のアミノ末端（Ｎ末端）に「Ｈｙ−」部分、及び「配列のカルボキシ末端（Ｃ末端）に「−ＯＨ」部分又は「−ＮＨ2」部分のどちらかを組み込んだ配列である。そのような場合、そして、別段の指示がない限り、問題の配列のＮ末端における「Ｈｙ−」部分は水素原子を示し［例えば式Ｉ及びＩａではＲ1＝Ｈｙ−；Ｎ末端における遊離の一級又は二級アミノ基の存在に相当する］、それに対して、配列のＣ末端における「−ＯＨ」又は「−ＮＨ2」部分は、それぞれヒドロキシ基［例えば式Ｉ及びＩａではＲ2＝ＯＨ；Ｃ末端におけるカルボキシ（ＣＯＯＨ）基の存在に相当する］又はアミノ基［としては、式Ｉ及びＩａではＲ2＝ＮＨ2；Ｃ末端におけるアミド（ＣＯＮＨ2）基の存在に相当する］を示す。本発明の各配列では、Ｃ末端の「−ＯＨ」部分はＣ末端の「−ＮＨ」部分と置換されてもよいし、逆もまた同様である。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、「保存的置換」は、天然ヒトＧＬＰ−２ペプチド配列の特定の位置に入っているアミノ酸残基が、以下の表で定義されるのと同じ群（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、１、２、３）に属しているアミノ酸残基で交換されたことを意味する。
【表１】
0006298044.tif 000002
【０１０５】
手段本明細書中で使用される場合、「非保存的」置換は、天然ヒトＧＬＰ−２配列のアミノ酸残基の保存的置換以外のあらゆる置換、例えば非タンパク質性非天然型アミノ酸（Ｓａｒ、Ｎｌｅ、Ａｉｂ）での置換又は同じ群に属していないアミノ酸での置換を意味する。
【０１０６】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の化合物は少なくとも１つのＧＬＰ−２及び１つのＧＬＰ−１生物学的活性を有する。代表的な活性としては、腸の透過性を低減すること及び腸の炎症を変化させることが挙げられる。これは、例えば実施例に記載の生体内アッセイで評価でき、そしてそのアッセイでは、試験動物をＧＬＰ−２類似体で処置したか又は晒した後に、腸又はその一部の質量と透過性が測定される。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有する野生型ＧＬＰ−２（１−３３）に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する。例えば、本発明のＧＬＰ−２類似体は、約５０％〜８８％の配列同一性、例えば約６０％〜８０％、そして特定の実施形態において、少なくとも６３％、６６％、又は６９％の配列同一性を有し得る。
【０１０８】
ＧＬＰ−２ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列を整列し、且つ必要であればギャップを導入し、そして、いずれの保存された置換も配列同一性の一部として考慮しなかった後の、野生型ＧＬＰ−２配列のアミノ酸残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列の整列は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２又は整列ソフトウェアのような公表されているソフトウェアを用いた公知の方法を用いることにより、熟練者によって行なうことができる。例えばAltschui et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996), Pearson et al., Genomics-46: 24-36, 1997、及びmolbiol.soton.ac.uk/ compute/alignのウェブサイト上の整列プログラムを参照のこと。
【０１０９】
本明細書中で用いられる及び本発明によるパーセンテージ配列同一性はこれらのプログラムを初期設定で用いることにより決定され得る。さらに一般的には、熟練者は比較される配列の完全長を超えた最大の整列を達成するために必要ないずれのアルゴリズムをも含む、整列決定のための適切なパラメーターを容易に決定することができる。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２４、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３１、Ｘ３２及びＸ３３位において２以上の置換（すなわち、先の所定の野性型ＧＬＰ−２配列に対して２以上の置換）を含む。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体は、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２４、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３１、Ｘ３２及びＸ３３位において２以上の置換（すなわち、先の所定の野性型ＧＬＰ−２配列に対して２以上の置換）を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３１、Ｘ３２及びＸ３３位のアミノ酸残基は任意に欠失している。
【０１１３】
理論に縛られることなく、天然ＧＬＰ−２ペプチド配列の１７位に相当する位置における極性又は荷電残基（例えばＧｌｎ、Ｌｙｓ又はＧｌｕ）が、天然ＧＬＰ２ペプチド配列に見られるＬｅｕの代わりに、相互作用し、そして、ＧＬＰ−１受容体を活性化し得ると我々は考えている。これにより、１７位の極性及び荷電アミノ酸は、ＧＬＰ２ペプチド又はその類似体の受容体選択性を変更し、そして、ＧＬＰ−１受容体とＧＬＰ−２受容体の両方を活性化する二重作動性ペプチドをもたらし得る。
【０１１４】
理論に縛られることなく、１６位のおける小アミノ酸残基（例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＡｌａ）が、ＧＬＰ−２ペプチド類似体のＧＬＰ−１受容体活性の導入又は促進に望ましいことであり得ると我々は考える。しかしながら、１７位のアミノ酸が極性又は荷電アミノ酸である限り、他のアミノ酸置換で高いＧＬＰ−１受容体活性を得ることも可能であり得る。
【０１１５】
本発明のいくつかの実施形態において、先に記載したＧＬＰ−２類似体には、１２、１４、１６、１７、１９、２０、２４、２７、２８及び３２位の１若しくは複数に結合された親油性置換基が含まれる。
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態において、先に記載したＧＬＰ−２類似体には、１２、１６、１７、２０、２４、２７、２８及び３２位の１若しくは複数に結合された親油性置換基が含まれる。
【０１１７】
本発明の好ましい実施形態において、先に記載したＧＬＰ−２類似体には、１６、１７、２０及び２４位の１若しくは複数に結合された親油性置換基が含まれる。
【０１１８】
（式Ｉ、式Ｉａ又は式ＩＩに由来する）本発明の代表的な化合物が以下に記載されており、ここで、前記化合物は、Ｒ1及びＲ2で記載されるＮ末端及びＣ末端で修飾されていてもよく、且つ医薬的に許容され得るその塩又は誘導体が含まれる：
Ｈｙ−Ｈ−Ａｉｂ−ＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物１）
Ｈｙ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＮＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物２）
Ｈｙ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；（化合物３）
Ｈｙ−ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＭＮＴＩＬＤＳＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物４）
Ｈｙ−ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＧＱＡＶＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物５）
Ｈｙ−ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＳＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物６）
Ｈｙ−ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物７）
Ｈｙ−ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＴＩＬＥＮＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物８）
Ｈｙ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＤＬＳＴＩＬＥＮＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物９）
Ｈｙ−Ｈ−Ａｉｂ−ＤＧＳＦＳＤＥＬＮＴＩＬＤＧＫＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；（化合物１０）
Ｈｙ−ＨＧＤＧＳＦＳＳＥＬＡＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＡＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物１１）
Ｈｙ−ＨＧＤＧＳＦＳＤＥＭＮＴＩＬＤＧＱＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫ−ＮＨ2；（化合物１２）
Ｈｙ−ＨＧＥＧＳＦＳＳＤＬＳＴＩＬＥＧＫＡＡＲＤＦＩＥＷＬＩＱＴＫＩＴＤ−ＯＨ；（化合物１３）。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、胃腸の炎症、例えば糖尿病に関連する軽度の胃腸の炎症の治療及び／又は予防向けの薬剤の調製における本発明のＧＬＰ−２類似体の使用を提供する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、本発明は本明細書中に定義されるＧＬＰ−２誘導体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明はその発現を誘導する配列と任意に組み合わされた上記の核酸配列を含む発現ベクター、及びこの発現ベクターにより形質転換されたホスト細胞を提供する。このホスト細胞は好ましくはＧＬＰ−２類似体を発現及び分泌することができる。尚、さらなる態様において、本発明はＧＬＰ−２類似体の発現に適切な状態の下でホスト細胞を培養すること、及びそれにより産生されたＧＬＰ−２類似体を精製することを含む、ＧＬＰ−２類似体の産生方法を提供する。
【０１２２】
本発明はさらに、処置における使用のための本発明の核酸、本発明の発現ベクター、又はＧＬＰ−２類似体を発現及び分泌できる本発明のホスト細胞を提供する。この核酸、発現ベクター及びホスト細胞は、ＧＬＰ−２類似体それ自体により処置され得るここに記述されたいずれの疾患の処置にも使用され得ることが理解され得る。従って本発明のＧＬＰ−２類似体を含む処置組成物、又は本発明のＧＬＰ−２類似体の投与についての参考文献は、文脈がそれ以外のものを要求していない限り、本発明の核酸、発現ベクター、又はホスト細胞の投与を包含するものとして解釈されなければならない。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本発明は、胃腸の炎症の治療及び／又は予防向けの薬剤の調製における、本明細書中に定義される核酸分子、発現ベクター、又は宿主細胞の使用を提供する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、糖尿病に関連する軽度の胃腸の炎症を処置する方法を提供する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本発明は、それを必要としている患者の、糖尿病と関連した軽度の胃腸の炎症を処置又は予防する方法を提供するが、その方法は、有効量の本発明の核酸、発現ベクター又は宿主細胞を投与することを含んでいる。
【０１２６】
先に記載したように、本発明のＧＬＰ−２類似体は、天然ＧＬＰ−２に比較して１以上のアミノ酸置換、欠失、反転、又は付加を有する。この定義はまた、同義語であるＧＬＰ−２ミメティクス及び／又はＧＬＰ−２アゴニストも含む。さらに、本発明の類似体はそのアミノ酸側基、α−炭素原子、末端アミノ基、又は末端カルボン酸基の１つ以上にさらなる化学修飾を有し得る。化学修飾は、化学成分の付加、新しい結合の創造、及び化学成分の除去を含むがこれらに限定されない。アミノ酸側基の修飾は、リジンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、又はリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸の、又はアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、及びグルタミン又はアスパラギンの脱アミドを含むがこれらに限定されない。Ｎ末端のアミノ基の修飾は、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ低級アルキル、及びＮ−アシル修飾を含むがこれらに限定されない。Ｃ末端のカルボキシ基の修飾は、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、及び低級アルキルエステル修飾を含むがこれらに限定されない。低級アルキルは好ましくはＣ1−Ｃ4アルキルである。さらに、側鎖の１つ以上の官能基、又は末端基は、熟練作業者に公知の保護基によって保護され得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸のα−炭素はモノ−又はジ−メチル化され得る。
【０１２７】
存在するとき、酸化的に安定なＭｅｔ−置換アミノ酸は、Ｍｅｔ（Ｏ）（メチオニンスルホキシド）、Ｍｅｔ（Ｏ）2（メチオニンスルホン）、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、そして好ましくはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ又はＳｅｒからなる群から選択されるものを意味する。
親油性置換基
【０１２８】
本発明との関連で用いられる化合物中のアミノ酸側鎖の１若しくは複数は、親油性置換基Ｚ1に結合され得る。いかなる理論に拘束されることを望むものではないが、親油性置換基は、血流でアルブミンに結合し、従って、本発明との関連で用いられる化合物の半減期を増強することができる酵素分解から化合物を遮蔽すると我々は考える。親油性置換基はまた、例えば、ＧＬＰ−２受容体及び／又はＧＬＰ−１受容体に関して化合物の効力を調整し得る。
【０１２９】
特定の実施形態において、たった１つのアミノ酸側鎖だけが、親油性置換基に結合される。他の実施形態において、２つのアミノ酸側鎖は互いに親油性置換基に結合される。さらなる実施形態において、３つ又はそれ以上アミノ酸側鎖がそれぞれ親油性置換基に結合される。化合物が２つ又はそれ以上の親油性置換基を含む場合、それらは同一又は異なる置換基とすることができる。
【０１３０】
親油性置換基Ｚ1は、アミノ酸側鎖において原子に共有結合で結合される、あるいは１若しくは複数のスペーサーＺ2によってアミノ酸側鎖に結合され得る。
【０１３１】
用語「結合される」とは、１つの同定可能な化学部分の他の部分への共有結合、及びこのような部分間の構造的関係を記載するために本明細書中で使用される。特定の合成方法を意味すると受け取るべきではない。１若しくは複数のスペーサーＺ2が存在する場合、これは化合物と親油性部分との間のスペーシングを供するために使用される。
【０１３２】
親油性置換基は、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド又はスルホンアミドを介してアミノ酸側鎖又はスペーサーに結合され得る。従って、親油性置換基がエステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド又はスルホンアミドの部分を形成するアシル基、スルホニル基、Ｎ原子、Ｏ原子又はＳ原子を含み得ると理解することができるであろう。好ましくは、親油性置換基におけるアシル基はアミノ酸の側鎖又はスペーサーを有するアミド又はエステルの一部を形成する。親油性置換基は、１０〜２４個の炭素（Ｃ）原子、例えば、１０〜２２個のＣ原子、例えば、１０〜２０個のＣ原子を有する炭化水素鎖を含むことができる。好ましくは、少なくとも１１個のＣ原子、さらに好ましくは１８個又はそれ以下のＣ原子を有する。例えば、炭化水素鎖は１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個の炭素原子を含むことができる。炭化水素鎖は、直鎖状又は分岐状とすることができ、飽和又は不飽和とすることができる。上記の考察から、炭化水素鎖は好ましくは、アミノ酸側鎖又はスペーサーへ結合する一部を形成する部分、例えばアシル基、スルホニル基、Ｎ原子、Ｏ原子又はＳ原子での置換と理解することができるであろう。最も好ましくは、炭化水素鎖は、アシル基での置換であり、従って、炭化水素鎖は、アルカノイル基、例えばドデカノイル、２−ブチルオクタノイル、テトラデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル又はエイコサノイル基の一部とすることができる。
【０１３３】
上述の通り、親油性置換基Ｚ1は、１若しくは複数のスペーサーＺ2によってアミノ酸側鎖に結合され得る。存在する場合、スペーサーは親油性置換基及びアミノ酸側鎖に結合される。スペーサーは、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド又はスルホンアミドによって独立して親油性置換基及びアミノ酸側鎖に結合することができる。従ってそれは、アシル、スルホニル、Ｎ原子、Ｏ原子又はＳ原子から独立して選択される２つの部分を含むことができる。スペーサーは、直鎖状のＣ1-10炭化水素鎖又はより好ましくは直鎖状のＣ1-5炭化水素鎖から成る。さらに、スペーサーは、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルキルアミン、Ｃ1-6アルキルヒドロキシ及びＣ1-6アルキルカルボキシから選択される１若しくは複数の置換基で置換されることができる。
【０１３４】
スペーサーは、例えば、天然に存在する又は天然でない任意のアミノ酸の残基とすることができる。例えば、スペーサーは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩＩｅ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、α−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ、ε−Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇａｂａ、Ａｉｂ、β−Ａｌａ（すなわち３−アミノプロパノイル）、４−アミノブタノイル、５−アミノペンタノイル、６−アミノヘキサノイル、７−アミノヘプタノイル、８−アミノオクタノイル、９−アミノノナノイル、１０−アミノデカノイル又は８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイルの残基とすることができる。特定の実施形態において、スペーサーは、Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ、ε−Ｌｙｓ、β−Ａｌａ（すなわち３−アミノプロパノイル）、４−アミノブタノイル、８−アミノオクタノイル又は８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイルの残基である。本発明において、γ−Ｇｌｕ及びイソＧｌｕは互換的に使用される。親油性置換基が結合されるアミノ酸側鎖は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｄｂｕ、Ｄｐｒ又はＯｒｎ残基の側鎖であり得る。例えば、それは、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＣｙｓ残基の側鎖である。２つ又はそれ以上の側鎖が親油性置換基を有する場合、それらはこれらの残基から独立して選択することができる。従って、アミノ酸側鎖は、スペーサー又は親油性置換基とエステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド又はスルホンアミドを形成するための、カルボキシ、ヒドロキシル、チオール、アミド又はアミン基を含む。
【０１３５】
親油性部分Ｚ1及びスペーサーＺ2含む親油性置換基の例は、以下の式：
【化１】
0006298044.tif 000003
に示される。ここで、式中、Ｌｙｓ残基の側鎖は、アミド結合を介してγ−Ｇｌｕスペーサー（Ｚ2）に共有結合で結合される。ヘキサデカノイル基（Ｚ1）は、アミド結合を介してγ−Ｇｌｕスペーサーに共有結合で結合される。Ｌｙｓ残基に結合される親油性部分及びスペーサーのこの組合せは、例えば、特定の化合物の式中で示す場合、略語Ｋ（ヘキサデカノイル−γ−Ｇｌｕ）で言及する。γ−Ｇｌｕは、イソＧｌｕ、及びパルミトイル基としてのヘキサデカノイル基と呼ぶこともまたできる。従って、表記（ヘキサデカノイル−γ−Ｇｌｕ）は、例えばＰＣＴ／ＧＢ２００８／００４１２１において使用されるように、表記（イソＧｌｕ（Ｐａｌｍ））又は（イソＧｌｕ（パルミトイル））と同等であることは明らかであろう。
【０１３６】
当業者であれば、本発明と関連して用いられる化合物の調製に適した技術を十分把握しているであろう。適した化学技術の例としては、ＷＯ９８／０８８７１、ＷＯ００／５５１８４、ＷＯ００／５５１１９、Madsen et al., J. Med. Chem. 50:6126-32 (2007)、及びKnudsen et al., J. Med Chem. 43:1664-1669 (2000)を参照のこと。そして、これらを参照により本明細書中に援用する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体には、天然ＧＬＰ−２の１２、１４、１６、１７、１９、２０、２４、２７、２８及び３２位に相当する位置の１若しくは複数においてアミノ酸に結合された、先に記載した親油性置換基がある。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−２類似体には、天然ＧＬＰ−２の１２、１６、１７、２０、２４、２７、２８及び３２位に相当する位置の１若しくは複数においてアミノ酸に結合された、先に記載した親油性置換基がある。
【０１３９】
本発明のペプチドはまた、塩又はその他の誘導体の形で提供され得ることが理解されなければならない。塩は、酸付加塩及び塩基性塩のような医薬的に許容される塩を含む。酸付加塩の例は、塩酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、及び酢酸塩を含む。塩基性塩の例は、Ｒ3及びＲ4が独立して任意にＣ1-6−アルキルに置換されるか、任意にＣ２−６−アルケニルに置換されるか、任意にアリールに置換されるか、又は任意にヘテロアリールに置換される際に、陽イオンがナトリウム及びカリウムのようなアルカリ金属、カルシウムのようなアルカリ土類金属、及びアンモニウムイオン+Ｎ（Ｒ3）３（Ｒ4）から選択される塩を含む。その他の医薬的に許容される塩の例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition. Ed. Alfonso R Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A. 1985及びより最近の版、並びにEncyclopaedia of Pharmaceutical Technologyに記載されている。
【０１４０】
本発明のＧＬＰ−２類似体のその他の誘導体は、Ｍｎ2+及びＺｎ2+のような金属イオンとの配位化合物、生体内での加水分解性エステルのようなエステル、遊離酸又は塩基、水和物、プロドラッグ、又は脂質を含む。エステルは化合物中に存在する水酸基又はカルボン酸基と適切なカルボン酸又はアルコール反応パートナーとの間で、公知の方法を用いて形成される。化合物のプロドラッグとしての誘導体は、生体内又は試験管内において親化合物の１つへ変換できる。一般的には、化合物のプロドラッグの形においては、少なくとも１つの生物活性が減少され得て、これは化合物又はその代謝産物の放出のためのプロドラッグの変換により活性化される。プロドラッグの例は、ｉｎ ｓｉｔｕでの放出活性化合物では除去され得るか、又は生体内での薬剤のクリアランスを阻害するために役立つ保護基の使用を含む。
【０１４１】
１ｎＭ以下、そして好ましくは１ｎＭ未満のＥＣ50を有するＧＬＰ−２類似体が、ＧＬＰ−２アゴニストと定義される。
【０１４２】
本発明は以下の実験部分においてさらに記述されるペプチドを含む。
ＧＬＰ−２類似体の合成
【０１４３】
本発明の類似体は固相又は液相のペプチド合成により合成されることが好ましい。これに関連して、熟練者は、ＰＣＴ公報ＷＯ９８／１１１２５及びSynthetic Peptides (2nd Edition)の中のFields, GB et al., 2002, "Principles and practice of solid-phase peptide synthesis"、及び本明細書中の実施例を模倣してもよい。
【０１４４】
従って、ＧＬＰ−２類似体は、例えば：
（ａ）ペプチドを固相又は液相ペプチド合成により合成し、その合成ペプチドを回収して、それにより入手すること；
（ｂ）ペプチドが天然アミノ酸から成る場合、そのペプチドをコードする核酸構築物を宿主細胞内で発現させ、宿主細胞培養から発現産物を回収すること；
（ｃ）ペプチドが天然アミノ酸から成る場合、そのペプチドをコードする核酸構築物の無細胞試験管内での発現を達成し、発現産物を回収すること；又は
（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の方法を組み合わせてペプチドの断片を得、続いてペプチドを得るため断片を結合（例えば連結）し、ペプチドを回収すること、
を含む方法を含めた多数の方法により合成され得る。
【０１４５】
従って、本発明の幾つかの類似体にとっては、遺伝子工学技術の活用が有利であり得る。これはペプチドが十分に大きく（又は融合コンストラクトとして産生され）、且つそのペプチドが生体中でＲＮＡから翻訳される天然アミノ酸のみを含む際に事例となり得る。
【０１４６】
組み換え遺伝子技術の目的のためには、本発明のペプチドをコードする核酸断片は重要な化学産物である。従って、本発明のさらなる態様は、ペプチドが好ましくは天然アミノ酸から構成される本発明のＧＬＰ−２誘導体をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。本発明の核酸断片はＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片のいずれかであり得る。
【０１４７】
本発明の核酸断片は通常クローニング又は発現ベクターを形成するため適切なベクターに挿入され得る。このような新規のベクターもまた本発明の一部である。本発明のこれらのベクターの構築に関する詳細は、以下、細胞及び微生物の形質転換に関連して考察される。ベクターは目的及び応用のタイプに応じ、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体、又はウィルスであることができるが、ある細胞に一過性にのみ発現されるネイキッドＤＮＡもまた重要なベクターである。本発明の好ましいクローニングベクター及び発現ベクター（プラスミドベクター）は自律複製でき、それにより高レベル発現、又は後のクローニングのための高レベル複製を目的とした高コピー数を可能にする。
【０１４８】
本発明のベクターの一般的な概要は５’から３’への方向における機能的結合において以下の特徴、即ち本発明の核酸断片の発現を駆動するためのプロモーター、任意に分泌を可能にする（細胞外相へ、又はそれが適用される際には周辺質内へ）リーダーペプチド又は複数の用途、例えば混合性の分泌のためのリーダーペプチドをコードする核酸配列、精製タグ及びペプチドの補正又はポリペプチド断片の膜への融合を目的とした酵素による整形、本発明のペプチドをコードする核酸断片、及び任意に、転写終結区をコードする核酸配列を含む。産生菌種又は細胞株中で発現ベクターを操作する際には形質転換細胞の遺伝的安定の目的のため、宿主細胞中に導入されたベクターは宿主細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい。
【０１４９】
本発明のベクターは、宿主細胞を形質転換して本発明のＧＬＰ−２類似体を産生するために使用されてもよい。本発明の一部でもあるこのような形質転換細胞は、本発明の核酸断片及びベクターの増殖のために使用されるか、又は組み換え型の本発明のペプチドの産生のために使用される培養細胞又は細胞株であることができる。
【０１５０】
本発明の好ましい形質転換細胞は、例えばエシェリキア属（Escherichia）（例えばＥ．コリ（E. coli））、バチルス属（Bacillus）（例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis））、サルモネラ属（Salmonella）又はマイコバクテリウム属（Mycobacterium）（好ましくはＭ．ボビスＢＣＧ（M. bovis BCG）のような非病原性のもの）からの細菌、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）など）、及び原生動物を含めた微生物である。あるいは、形質転換細胞は多細胞生物、例えば真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は哺乳類細胞（例えばヒト由来の細胞）由来であり得る。クローニング及び／又は最適化された発現の目的のために、形質転換細胞は本発明の核酸断片を複製する能力のあることが好ましい。本発明の核酸断片を発現する細胞は本発明の有用な実施形態として好ましい。それらは本発明のペプチドをスモールスケール又はラージスケールで調整するために使用できる。
【０１５１】
形質転換細胞によって本発明のペプチドを産生する際、発現産物が培養液中に排出されるか又は形質転換細胞の表面に発現産物が輸送されることは必須ではないが好都合である。
【０１５２】
効果的な産生細胞が同定された際、それ自体に基づいた、本発明のベクターを有し且つペプチドをコードする核酸断片を発現する安定化細胞株を樹立することが好ましい。
【０１５３】
一般に、宿主細胞に適合する種由来のレプリコン及び制御配列を含むプラスミドベクターは、宿主細胞との関連において使用される。通常、ベクターは複製部位を有し、同様に形質転換細胞における表現型の選択を可能にする標識配列を有する。例えばＥ．コリは一般にＥ．コリ種由来の（例えばBolivar et al., 1977を参照のこと）ｐＢＲ３２２（しかし、その他にも多数の有用なプラスミドが存在する）を用いて形質転換され得る。ｐＢＲ３２２プラスミドはアンピシリン及びテトラサイクリンの耐性遺伝子を含んでおり、そのために形質転換細胞の同定を容易にする。ｐＢＲプラスミド、又はその他の微生物プラスミド又はファージは、発現のために原核微生物により使用することのできるプロモーターを含むか、あるいはプロモーターを含むように改変されていなければならない。
【０１５４】
これらの原核生物組み換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーターシステム（Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979）、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Goeddel et al., 1979；ＥＰ００３６７７６Ａ）を含む。これらは最も一般的に使用されるが、その他の微生物プロモーターも発見され且つ利用されており、当業者がそれらをプラスミドベクターに機能的に連結することを可能にするヌクレオチド配列に関する詳細は公表されている（Siebwenlist et al., 1980）。
【０１５５】
原核生物に加え、酵母培養のような真核微生物もまた使用され得る。これらの実施形態において、そのプロモーターもまた発現を駆動することができなければならない。真核微生物の多数の種が利用可能であるが、中でもサッカロミセス・セレビシエ、又は一般のパン酵母が最も一般的に使用される。例えばピキア・スティプティス（Pichia stiptis）及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）も使用され得る。サッカロミセス・セレビシエ内での発現には、例えばＹＲｐ７プラスミドが一般的に使用される（Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980）。このプラスミドは予め、トリプトファン中で増殖できない変異酵母種、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１（Jones, 1977）に対して選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特徴である破壊されたｔｒｐ１は、トリプトファン非存在下での増殖により形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【０１５６】
酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列は３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzman et al., 1980）、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、及びグルコキナーゼのようなその他の糖分解酵素（Hess et al., 1968; Holland et al., 1978）のためのプロモーターを含む。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子に付随する終止配列もまた、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び終止を提供するための発現が望まれるベクターの３’配列に連結される。
【０１５７】
増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有するその他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に付随する分解酵素、及び前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、及びマルトース及びガラクトース利用原因酵素のためのプロモーター領域である。酵母適合性のプロモーター、複製開始点及び終結配列を含むいずれのプラスミドベクターも適切である。
【０１５８】
微生物に加え、多細胞生物由来細胞の培養もまた宿主として試用され得る。原理的にはこのような細胞培養のいずれもが、脊椎動物培養又は無脊椎動物培養由来にかかわらず機能する。しかしながら脊椎動物細胞への関心は最も高く、近年脊椎動物の培養における増殖（組織培養）は日常的な方法となりつつある（Tissue Culture, 1973）。このように有用な宿主細胞株の例として、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、及びＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７ ２９３、ヨトウガ（ＳＦ）細胞（完全な発現システムとして、i.a. Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. and from lnvitrogenから市販されている）、Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningenから市販されているキイロショウジョウバエ細胞株Ｓ２、及びＭＤＣＫ細胞株が挙げられる。
【０１５９】
このような細胞のための発現ベクターは通常（必要であれば）複製開始点、発現されるべき遺伝子の前に位置するプロモーター、必要ないずれかのリボゾーム結合部位に加え、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列を含む。
【０１６０】
哺乳類細胞での使用において、発現ベクターの制御機能はしばしばウィルス性の材料により提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターはポリオーマウィルス、アデノウィルス２、及び最も頻繁にはシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、両者共に断片としてＳＶ４０ウィルス性複製開始点を含むウィルスより容易に得られることから特に有用である（Fiers et al., 1978）。比較的小さな、又は大きなＳＶ４０断片もまた使用され得て、ここに提供されたものはウィルス性複製開始点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に及ぶ約２５０ｂｐの配列に含まれる。さらに、プロモーター及び望まれる遺伝子配列に通常付随する制御配列を利用することも可能且つしばしば望まれることであり、提供されたこのような制御配列は宿主細胞システムに適合する。
【０１６１】
複製開始点は、ＳＶ４０又はその他のウィルス（例えばポリオーマウィルス、アデノウィルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ）から由来し得るような、外部からの開始点を含むベクターの構築又は宿主細胞の染色体複製メカニズムにより提供され得る。ベクターが宿主細胞染色体に取り込まれるのであれば、しばしば後者が十分である。
【０１６２】
組み換え体産生の過程において十分な収量を得るためには、ペプチドとアフィニティータグ（精製を容易にするための）として役立つ融合パートナーとの融合及び／又はペプチドの複数反復を有することにより、この類似体を融合タンパク質として調整することが有利であり得る。これらの方法はペプチダーゼのための適切な切断部位の存在を必要とする。熟練者は基礎となる遺伝的構築物をどのように作製するかを知り得る。
【０１６３】
組み換え調整の後、本発明のペプチドは多段階クロマトグラフィー（例えばイオン交換、サイズ排除、及びアフィニティークロマトグラフィー法）を含む公知の方法により精製できる。
【０１６４】
また、天然アミノ酸を含むペプチドは試験管内の無細胞システムにより調整できる。これは、ペプチドが想定された宿主細胞に有毒であり得る場合に特に好都合である。従って、本発明は本発明のペプチドを調整するための、試験管内無細胞翻訳／発現の利用もまた企図する。これに関連して、例えばAmbion Inc., 2130 Woodward, Austin, TX 78744-1832, USAからの市販の試験管内翻訳キット、材料、及び技術文書が参考となる。
【０１６５】
最後に、利用可能な方法は言うまでもなく、例えば半合成の類似体を調整するために組み合わせることができる。このようなセットアップにおいて、ペプチド断片は少なくとも２つの異なった工程又は方法の使用により調整され、最終ペプチド産物を得るための断片の結合（例えば連結）がそれに続く。
生物学的活性
【０１６６】
典型的には、本発明のＧＬＰ−２類似体はＧＬＰ−１受容体及びＧＬＰ−２受容体の両方に活性を有する。
【０１６７】
ＥＣ50値は、所定の受容体におけるアゴニスト効力の数字尺度として使用できる。ＥＣ50値は、特定のアッセイにおいてその化合物の最大活性の半分を達成するのに必要とされる化合物の濃度の尺度である。同じアッセイで基準化合物のＥＣ50より低い、特定の受容体におけるＥＣ50を有する化合物は、基準化合物に比べてその受容体に対してより高い効力を有すると見なされ得る。
【０１６８】
本発明のＧＬＰ−２類似体は、典型的に野性型ヒトＧＬＰ−２（ｈＧＬＰ２）に比べてＧＬＰ−１受容体（例えばヒトＧＬＰ−１受容体）により高い活性を有する。これにより、ＧＬＰ−１活性に関するいずれの所定のアッセイにおいても、ＧＬＰ−２類似体は野性型ヒトＧＬＰ−２又は［Ｇｌｙ２］−ｈＧＬＰ−２（すなわち、テズグルチド（teduglutide）としても知られている、２位にグリシンを有するヒトＧＬＰ−２）に比べてより低いＥＣ50を有する。同じＧＬＰ−１活性アッセイで評価されるとき、ＧＬＰ−２類似体のＥＣ50対ｈＧＬＰ−２又は［Ｇｌｙ２］−ｈＧＬＰ−２のＥＣ50の比は、そのため典型的に１未満である。例えばそれは、０．５未満、０．１未満、又は０．０１未満であってもよい。
【０１６９】
ＧＬＰ−１受容体のＥＣ50は、例えば実施例１に記載のＧＬＰ−１受容体効力アッセイを使用することで評価されるとき、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又はより好ましくは１．０ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０９ｎＭ未満、０．０８ｎＭ未満、０．０７ｎＭ未満、０．０６ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．０４ｎＭ未満、０．０３ｎＭ未満、０．０２ｎＭ未満、０．０１ｎＭ未満、０．００９ｎＭ未満、０．００８ｎＭ未満、０．００７ｎＭ未満、０．００６ｎＭ未満、又は０．００５ｎＭ未満であり得る。
【０１７０】
本発明のＧＬＰ−２類似体はＧＬＰ−２活性を保持しているが、ＧＬＰ−２受容体におけるそれらの効力はｈＧＬＰ−２又は［Ｇｌｙ２］−ｈＧＬＰ−２の効力と同じである必要はない。ＧＬＰ−２活性の適当なレベルが保持されている限り、それらにはより低い効力しかなくてもよい。ＧＬＰ−２活性に関するいずれのアッセイにおいても、ＧＬＰ−２類似体は野性型ヒトＧＬＰ−２又は［Ｇｌｙ２］−ｈＧＬＰ−２より低い又は高いＥＣ50を有していてもよい。同じＧＬＰ−２活性アッセイで評価されるとき、ＧＬＰ−２類似体のＥＣ50対ｈＧＬＰ−２又は［Ｇｌｙ２］−ｈＧＬＰ−２のＥＣ50の比は、同じアッセイにおいて、例えば２００未満、１００未満、１０未満、５未満、１未満、０．１未満、０．５未満又は０．１未満になり得る。
【０１７１】
本発明の類似体及びｈＧＬＰ−２又は［Ｇｌｙ２］−ｈＧＬＰ−２についてＧＬＰ−２受容体及びＧＬＰ−１受容体におけるＥＣ50値の比を比較することもまた望まれ得る。好ましくは、ＧＬＰ−２アッセイとＧＬＰ−１アッセイのあらゆる所定の組に関して、本発明の類似体は、同じアッセイにおけるｈＧＬＰ−２又は［Ｇｌｙ２］−ｈＧＬＰ−２の当量比より高いＥＣ５０［ＧＬＰ−２］／ＥＣ５０［Ｇｌｙ−１］を有する。例えば本発明の類似体の比は、ｈＧＬＰ−２又は［Ｇｌｙ２］−ｈＧＬＰ−２の比より少なくとも２倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍大きい。
医薬組成物及び投与
【０１７２】
本発明のＧＬＰ−２類似体又はその塩又は誘導体は、保存又は投与のために調整された医薬組成物として処方され得て、これは処置上効果的な量の本発明のＧＬＰ−２類似体ペプチド又はその塩又は誘導体を医薬的に許容される担体中に含む。
【０１７３】
本発明の化合物の処置上効果的な量は、投与経路、処置される哺乳類の型、及び検討中の特定の哺乳類の身体的特徴に依存し得る。この量を決定するための、これらの要素及びその関連性は医学当業者に周知である。この量及び投与方法は、ペプチドの大腸への送達に最適な効率を達成するため調整できるが、医学当業者に周知の要素である体重、食餌、併用される薬剤、及びその他の要素に依存し得る。
【０１７４】
胃及び腸関連疾患を処置又は予防するために効果的な量の本発明のＧＬＰ−２類似体又はその塩が存在する医薬組成物の提供は、本発明の範囲内である。
【０１７５】
本発明の化合物の酸性成分を有する医薬的に許容される塩は、有機又は無機塩基を用いて形成できる。塩基により形成される適切な塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩のような金属塩、例えばナトリウム、カリウム、又はマグネシウム塩；モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−、又はトリ−低級アルキルアミン（例えば、エチル−ｔｅｒｔ−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−、又はジメチルプロピルアミン）、又はモノ−、ジ−、又はトリヒドロキシ低級アルキルアミン（例えば、モノ−、ジ−、又はトリエタノールアミン）により形成されるようなアンモニア塩及び有機アミン塩を含む。内部塩もまた形成され得る。同様に、本発明の化合物が塩基成分を含む際、塩は有機及び無機酸を用いて形成できる。例えば、塩は下記の酸、即ち酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、及びカンファースルホン酸、同様にその他の公知の医薬的に許容される酸から形成できる。アミノ酸付加塩もまた、リジン、グリシン、及びフェニルアラニンのようなアミノ酸により形成できる。
【０１７６】
当業者にとって明らかであるように、本発明のペプチド又は医薬組成物の「処置上効果的な量」とは、年齢、体重、及び処置される哺乳類の種、使用される特定の化合物、特定の投与方法、及び望まれる効果、及び処置上の指示に依存して変化し得る。この量を決定するための、これらの要素及びそれらの関連性は周知であるため、処置上有効な量のレベル、ここに述べられた腸及び胃関連疾患の予防及び／又は処置において望まれる結果を達成するために必要な量の決定、同様にここに開示されたその他の医学的指示は、熟練者の領域であり得る。
【０１７７】
本明細書中で用いられる「処置上有効な量」とは、所定の状態又は病態による症状を減少させる量、及び好ましくはその状態又は病態を有する個体の生理反応を正常化させる量である。症状の減少又は生理反応の正常化は当業における日常的方法を用いて決定でき、所定の状態又は病態により変化し得る。一態様において、１若しくは複数の本発明のＧＬＰ−２類似体又は１若しくは複数の本発明のＧＬＰ−２類似体を含む医薬組成物の処置上効果的な量は、測定できる生理的パラメーターを、その状態又は病態を持たない個体のパラメーターに対し実質的に同じ値（好ましくはその値の３０％以内、さらに好ましくは２０％以内まで、及びさらに尚好ましくは１０％以内まで）に回復させる量である。
【０１７８】
本発明の一実施形態において、本発明の化合物又は医薬組成物の投与は低用量レベルから開始され、腸及び胃関連疾患のような関連する医学的徴候の予防／処置に望まれる効果が達成されるまで増大される。これが処置上効果的な量として定義され得る。本発明のペプチドに関しては単独又は医薬組成物の一部として、この量は体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇのような、体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ、例えば体重当たり１０〜１００マイクログラム／ｋｇであり得る。
【０１７９】
処置に使用するために、本発明のＧＬＰ−２類似体は、医薬的に許容され且つ選択された投与経路によるペプチドの送達に適切な担体と共に処方される。本発明の目的のための末梢の非経口投与は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の投与経路を含む。本発明で使用される特定の化合物は、経口、経直腸、経鼻、又は経下気道経路による投与も許容され得る。これらはいわゆる非−非経口経路（non-parenteral route）である。本医薬組成物は、本発明のＧＬＰ−２類似体又はその塩又は誘導体、及び医薬的に許容される担体を含む。医薬的に許容される適切な担体は希釈剤、賦形剤等のような、ペプチドを基礎とする薬剤に従来から用いられているものである。処置に使用するための医薬的に許容される担体は医薬分野において公知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A. R Gennaro edit. 1985）に記載されている。例えば、わずかに酸性、又は生理的なｐＨの滅菌生理食塩水及びリン酸緩衝食塩水が使用され得る。ｐＨ緩衝剤はリン酸、クエン酸、酢酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、重炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、好ましい緩衝液としてのヒスチジン、アルギニン、リジン、又は酢酸塩又はそれらの混合物であり得る。好ましい緩衝液の範囲は、特定の実施形態において、ｐＨ４〜８、ｐＨ６．５〜８、そしてさらに好ましくはｐＨ７〜７．５である。パラ、メタ、及びオルトクレゾール、メチル−及びプロピルパラベン、フェノール、ベンジルアルコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸、安息香酸ベンジル、ソルビン酸、プロパン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような保存料がこの医薬組成物中に提供され得る。アスコルビン酸、メチオニン、トリプトファン、ＥＤＴＡ、アスパラギン、リジン、アルギニン、グルタミン及びグリシンのような、酸化、脱アミド、異性化、ラセミ化、環化、ペプチドの加水分解を防ぐ安定剤がこの医薬組成物中に提供され得る。ドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリンのような、凝集、繊維形成及び沈殿を防ぐ安定剤もまたこの医薬組成物中に提供され得る。エタノール、酢酸又は酢酸塩及びそれらの塩のような可溶化のための、又は凝集を防ぐための有機修飾剤がこの医薬組成物中に提供され得る。塩、例えば塩化ナトリウム、又は最も好ましい炭水化物、例えばデキストロース、マンニトール、乳糖、トレハロース、ショ糖又はそれらの混合物のような等張性供給物（isotonicity makers）がこの医薬組成物中に提供され得る。
【０１８０】
Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ＳＤＳ、ポロクサマー、例えばプルロニックＦ−６８、プルロニックＦ−１２７のような界面活性剤がこの医薬組成物中に提供され得る。色素及び香味料もまたこの医薬組成物中に提供され得る。他の実施形態において、ＧＬＰ−２ペプチド類似体の医薬的に許容される酸付加塩が提供される。
【０１８１】
懸濁剤が使用され得る。エタノール、第３級ブタノール、２−プロパノール、エタノール、グリセロール、及びポリエチレングリコールのような有機修飾剤が、凍結乾燥製品の凍結乾燥のための薬理的処方において提供され得る。増量剤、及び塩、例えば塩化ナトリウム、炭水化物、例えばデキストロース、マンニトール、乳糖、トレハロース、ショ糖又はそれらの混合物、アミノ酸（例えばグリシン及びグルタミン酸塩）のような等張性供給物、又はシステイン、レシチン又はヒト血清アルブミン、又はそれらの混合物のような賦形剤が、凍結乾燥のためにこの医薬組成物中に提供され得る。
【０１８２】
本発明の医薬組成物は経口投与のための錠剤、カプセル剤又はエリキシル剤、直腸投与のための坐薬、注射投与のための好ましくは無菌溶液、無菌粉末又は懸濁液等として処方され且つ使用され得る。投与の用量及び方法は最適な効率を達成するため調整できるが、例えば体重、食餌、併用される薬剤などの要素に依存し、それらの要素は当業者に認識されている。
【０１８３】
投与が静脈内投与及び皮下投与などの非経口であるべきときには、注射用医薬組成物は従来の形、水溶液又は懸濁液のいずれか；凍結乾燥剤、使用直前の再構成又は注射に先立つ液体への懸濁に適切な固形剤、又は乳剤として調整できる。
【０１８４】
凍結乾燥製品の再構成のための希釈液は先に列挙した緩衝液から選択されるか、又は水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、乳糖、トレハロース、ショ糖、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩、又はＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポロクサマー（例えばプルロニックＦ−６８又はプルロニックＦ−１２７）のような界面活性剤、ポリエチレングリコール、及び／又はパラ、メタ、及びオルトクレゾール、メチル−及びプロピルパラベン、フェノール、ベンジルアルコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸、安息香酸ベンジル、ソルビン酸、プロパン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような保存料、及び／又はエタノール、酢酸、クエン酸、乳酸又はそれらの塩のような有機修飾剤を加えた注射用の水であり得る。
【０１８５】
さらに、所望されれば、この注射用医薬組成物は湿潤剤、又はｐＨ緩衝剤のような無毒の補助物質を微量含み得る。吸収促進製剤（例えば、リポソーム、界面活性剤及び有機酸）もまた利用され得る。
【０１８６】
本発明の一実施形態において、この化合物は、例えば完全非経口栄養を受けている患者（例えば新生児、又は悪液質又は食欲不振を患う患者）に液体栄養補助剤として使用する際の点滴による投与のため、又は例えば皮下、腹腔内、又は静脈内への注射による投与のために処方され、従って無菌で発熱物質を含まない形の、且つ生理的に許容されるｐＨ、例えばわずかに酸性又は生理的ｐＨに適宜緩衝された水溶液として利用される。筋肉内投与のための処方は溶液、又は植物油、例えばキャノーラ油、コーン油、又は大豆油への懸濁液に基づき得る。これらの油を基礎とした処方は、抗酸化物質例えばＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）及びＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）により安定化され得る。
【０１８７】
従って、本発明のＧＬＰ−２類似体は蒸留水又は生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、５％デキストロース溶液又は油のようなビヒクルにおいて投与され得る。本発明のＧＬＰ−２類似体の溶解度は、所望されれば界面活性剤及び／又は乳化剤のような溶解度賦活薬の取り込みにより増強され得る。
【０１８８】
ＧＬＰ−２類似体の作用が望まれる場における緩慢な放出を提供するように、注射液に水性担体又はビヒクルを、ＧＬＰ−２類似体を注射部位又はそれに近い部位に蓄えるために役立つ量のゼラチンと共に補うことができる。ヒアルロン酸のような別のゲル化剤も持続性薬剤として有用であり得る。
【０１８９】
本発明のペプチド化合物は単独、又は抗炎症作用を有する化合物と組み合わせて使用され得る。理論に縛られることなく、このような組み合わせの処置は本発明のペプチド類似体の有益な処置効果を強化し得る。
【０１９０】
言うまでもなく、患者を処置するための最も適切な投与量及び投与計画は、処置されるべき疾患及び状態、及び患者の体重及びその他のパラメーターにより異なる。特定の理論による制約を意図せず、マイクログラム／ｋｇ又はｍｇ／ｋｇ範囲における投与量、及び比較的短いか長い期間又は処置頻度は、特に小腸質量の統計的に有意な増大のように処置上有用な結果を生み出し得ることが期待される。幾つかの例において、処置上の投与計画は最初の処置の休止に続いて起こる組織退縮を防ぐための維持量の投与を含み得る。本発明により得られる結果によりヒトへの使用における最も適切な投与量の規模及び投与計画が導かれ得て、且つ適切に計画された治験により確認され得る。
【０１９１】
効果的な量及び処置プロトコルは、実験動物において低用量から開始し、その効果をモニターしながら用量を増やしていき、同様に投与計画も系統的に変化させるという従来の方法により決定され得る。所定の患者に対する最適な投与量を決定する際には医師により多数の要素が考慮され得る。このような考慮は熟練者に公知である。
【０１９２】
本発明によるＧＬＰ−２ペプチドのヒトに対する量は、一実施形態において約１０マイクログラム／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約５０マイクログラム／ｋｇ／日から約５ｍｇ／ｋｇ／日、及び最も好ましくは約１００マイクログラム／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
医学的状態
【０１９３】
本発明のＧＬＰ−２類似体は、軽度炎症、例えば局所性又は全身性軽度炎症に罹患している個体を予防するか又は処置するための医薬品として有効である。軽度炎症としては、これだけに限定されるものではないが：メタボリックシンドローム、肥満（例えば腹部肥満）、糖尿病、心血管疾患、胃腸の炎症、鬱病、アルツハイマー、関節炎、高血圧、脂質異常症及び脳卒中が挙げられる。胃腸障害としては、食道から成る上部胃腸管の障害が挙げられ、本明細書中に記載した本発明のＧＬＰ−２類似体又はその塩の有効量を投与することによって処置され得る。胃及び腸関連疾患としては、あらゆる病因の潰瘍（例えば消化性潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群、薬物性潰瘍、感染又は他の病原菌に関連する潰瘍）、消化障害、吸収不良症候群、短腸症候群、カル−デ−サク症候群、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、（例えばグルテン誘発性腸疾患又はセリアック病から生じる）セリアックスプルー、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、並びに化学療法及び／又は放射線血液療法誘発性粘膜炎及び下痢が挙げられる。
【０１９４】
胃腸粘膜新生物、又は胃腸粘膜新生物の増大したリスクを有する患者にとって、胃腸粘膜新生物の刺激又は悪化のような副作用のリスクを減少又は抑止するための化合物の選択が望まれ得る。
【０１９５】
本発明のＧＬＰ−２類似体により処置され得る特定の状態は、熱からアルファグリアジンへの有毒反応に起因し、グルテン誘導性腸疾患又はセリアック病の結果となり得て、且つ小腸絨毛の有意な減少により特徴付けられるセリアックスプルー、感染に起因し、絨毛の部分的な平坦化により特徴付けられる熱帯性スプルー、一般的な可変性の免疫不全又は低ガンマグロブリン血症の患者に一般的に見られ、絨毛の高さの有意な減少により特徴付けられる低ガンマグロブリン血症スプルーを含む様々な形のスプルーを含む。ＧＬＰ−２類似体による処置の処置的有効性は、絨毛の形態を調べるための腸内生検、栄養吸収の生化学的評価、腸透過性の非侵襲的な決定、患者の体重増加、又はこれらの状態に付随する症状の寛解によりモニターされ得る。
【０１９６】
本発明のＧＬＰ−２類似体は、いずれの病因にもよる潰瘍（例えば、消化性潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、薬物性潰瘍、感染又はその他の病原菌に関連する潰瘍）を含む胃関連疾患の予防又は処置のための薬剤として有用であり得る。
【０１９７】
それに加えて本発明のＧＬＰ−２類似体により処置され得るその他の状態、又はＧＬＰ−２類似体が予防的に有用である状態は、前記の放射線性腸炎、感染性又は後感染性腸炎、及び癌化学療法剤又は有毒剤による小腸損傷を含む。
【０１９８】
ＧＬＰ−２類似体はまた、栄養障害、例えば悪液質及び食欲不振の処置に使用され得る。
【０１９９】
本発明の特定の実施形態は、本ペプチドを腸損傷及び機能不全の予防及び／又は処置のために使用することに関わる。小腸粘膜の幹細胞はその増殖の割合が速いため、化学療法による細胞傷害性効果に影響されやすい（Keefe et al., Gut 2000; 47: 632-7）。本ＧＬＰ−２ペプチドアゴニストの投与は小腸陰窩における栄養効果を増強し、且つ化学療法及び／又は放射線療法により損傷された腸上皮と置き換えるための新しい細胞を迅速に供給する。本発明のＧＬＰ−２類似体を投与することにより達成されるべき目標は、化学療法を受けている患者の胃腸損傷に関わる罹患率を減少させ、より侵襲的な化学療法、放射線及び化学療法と放射線療法の組み合わせへの耐性を増大させることである。本発明に従い、併用される予防的又は処置的処置が、放射線療法を受けているか、又は受けようとしている患者に提供され得る。
【０２００】
抗癌化学療法の後に起こる胃腸粘膜炎は次第に寛解するものの、一旦起こると基本的には処置できないことからますます問題となっている。一般に使用されている細胞増殖抑制性の癌処置剤５−ＦＵ及びイリノテカンを用いて行われた研究により、これらの薬剤による効果的な化学療法は主に小腸の完全な構造及び機能に影響を与えるが、結腸への影響は少なく、主に粘液形成の増大として反応することが示された（Gibson et al., J Gastroenterol Hepatol. 18(9):1095-1100, 2003; Tamaki et al., J Int Med Res. 31 (1):6-16, 2003）。
【０２０１】
別の実施形態において、本発明は患者の必要に応じた効果的な量のＧＬＰ−２類似体又はその塩を投与することにより、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態を処置する方法について述べる。このような疾患はＤＰＰ−ＩＶ酵素が過剰発現された状態を含む。
【０２０２】
先に述べたように一実施形態において、この医薬組成物は前記のＧＬＰ−２類似体又はその塩又はその誘導体が徐放されるように処方され得る。
【０２０３】
本ペプチドは、効果的な量の本発明のＧＬＰ−２類似体又はその塩の投与により新生児を処置するための方法に使用され得ることが想定される。未発達な腸のために、摂食により起こる新生児の合併症は本発明のペプチドアゴニストの使用により克服され得る。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、本発明は患者の必要に応じた効果的な量のＧＬＰ−２類似体又はその塩を投与することにより、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）により媒介される状態を処置する方法について述べる。このような疾患はＤＰＰ−ＩＶ酵素が過剰発現された状態を含む。
【実施例】
【０２０５】
以下の実施例は本発明の好ましい態様を例証するために提供され、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０２０６】
一般的なペプチド合成
装置及び合成ストラテジー
ペプチドは、側鎖官能性のためのＮ−α−アミノ保護基としての９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）及び適切な一般保護基を用いた濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中でバッチ式に合成された。
【０２０７】
固相ペプチド合成を、標準的なＦｍｏｃ化学反応を使用して、CEM Liberty Peptide Synthesizerによりおこなった。使用の前に、TentaGel S Ram 樹脂（１ｇ；０．２５ｍｍｏｌ／ｇ）をＮＭＰ（１０ｍｌ）中で膨潤させ、ＤＣＭ及びＮＭＰを使用してチューブ及び反応槽との間を移動させた。
【０２０８】
カップリング
ＮＭＰ／ＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１：１；０．２Ｍ；５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−アミノ酸をCEM Discoverマイクロ波装置の樹脂に、ＨＡＴＵ／ＮＭＰ（０．５Ｍ；２ｍｌ）及びＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．０Ｍ；１ｍｌ）と共に添加した。窒素をその混合物に通してバブリングしながら、カップリング混合物を７５℃まで５分間加熱した。続いて樹脂をＮＭＰで洗浄した（４×１０ｍｌ）。
【０２０９】
あるいは、ＤＭＦ／ＤＣＭ（２：１；０．２Ｍ；５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−アミノ酸を、加える。ＣＯＭＵ／ＤＭＦ（０．５Ｍ；２ｍｌ）及びＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ（２．０Ｍ；１ｍｌ）と一緒にCEM Discoverマイクロ波装置内で樹脂に加えた。窒素をその混合物に通してバブリングしながら、カップリング混合物を７５℃まで５分間加熱した。続いて樹脂をＮＭＰで洗浄した（４×１０ｍｌ）。
【０２１０】
脱保護
最初の脱保護のためにピペリジン／ＮＭＰ（２０％；１０ｍｌ）を樹脂に添加し、混合物を電子レンジで加熱した（３０秒；４０℃）。反応槽を排出し、ピペリジン／ＮＭＰ（２０％；１０ｍｌ）の２回目の量を添加し、再度加熱した（７５℃；３分）。続いて樹脂をＮＭＰで洗浄した（６×１０ｍｌ）。
【０２１１】
あるいは、最初の脱保護のためにピペリジン／ＤＭＦ（２０％；１０ｍｌ）を樹脂に添加し、混合物を電子レンジで加熱した（３０秒；４０℃）。反応槽を排出し、ピペリジン／ＤＭＦ（２０％；１０ｍｌ）の２回目の量を添加し、再度加熱した（７５℃；３分）。続いて樹脂をＤＭＦで洗浄した（６×１０ｍｌ）。
【０２１２】
側鎖アシル化（任意）
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ又は直交性側鎖保護基を有する他のアミノ酸をアシル化の位置に導入する。続いて、最終カップリングにおいて、Ｂｏｃ２Ｏを使用して又はＢｏｃ保護アミノ酸を使用することによって、ペプチド主鎖のＮ末端をＢｏｃ保護する。ペプチドがまだ樹脂に結合された状態で、フレッシュに調製したＮＭＰ中のヒドラジン水和物（２−４％）を２×１５分間使用して直交性側鎖保護基を選択的に切断する。上記のペプチドカップリング方法を使用して、無保護のリジン側鎖をまずＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ又は他のスペーサーアミノ酸と結合させ、ピペリジンで脱保護しそして親油性部分でアシル化する。採用した略語は次の通りである：
ｉｖＤｄｅ：１−（４，４−ジメチル２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）３−メチル−ブチル
Ｄｄｅ：１−（４，４−ジメチル２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−エチル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＥｔＯＨ：エタノール
Ｅｔ２Ｏ：ジエチルエーテル
ＨＡＴＵ：Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロリン酸Ｎ−オキシド
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
【０２１３】
切断
樹脂をＥｔＯＨ（３×１０ｍｌ）及びＥｔ２Ｏ（３×１０ｍｌ）で洗浄し、一定の重量まで室温（ｒ．ｔ．）で乾燥させた。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５／２．５／２．５；４０ｍｌ、２ｈ；ｒ．ｔ．）又はＴＦＡ／ＤＯＤＴ（９５／５；４０ｍｌ、２ｈ；ｒ．ｔ．）での処置によって、未精製のペプチドを樹脂から切断した。ＴＦＡの大半を減圧で除去し、未精製のペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで３回洗浄し、室温で一定の重量まで乾燥した。
【０２１４】
未精製のペプチドのＨＰＬＣ精製
Ｃ−１８カラム（５ｃｍ；１０μｍ）及びフラクションコレクターを備えたPerSeptive Biosystem VISION Workstationを使用して、未精製のペプチドを調製用逆相ＨＰＬＣによって約９０％又はそれ以上まで精製し、緩衝液Ａ（０．１％のＴＦＡ，ａｑ．）及び緩衝液Ｂ（０．１％のＴＦＡ、９０％のＭｅＣＮ，ａｑ．）との勾配で３５ｍｌ／分で実行した。分析用ＨＰＬＣ及びＭＳによって画分を分析し、関連画分をプールし、そして凍結乾燥した。最終生成物をＨＰＬＣ及びＭＳによって特徴を明らかにした。
【０２１５】
Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸は側鎖が保護された適切な形でAdvanced ChemTech 30 (ACT)より購入した。
【０２１６】
カップリング試薬
カップリング試薬のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＧ）は、Riedel de-Haen, Germanyから購入した。
【０２１７】
固体支持体
ペプチドは０．２２−０．３１ｍｍｏｌ／ｇのTentaGel S樹脂上で合成した。TentaGel S-Ram、TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc（Rapp polymere, Germany）はＣ−末端がアミド化されたペプチドが好ましい場合に使用したが、TentaGel S PHB、例えばTentaGel S PHB Lys(Boc)FmocはＣ−末端が遊離カルボン酸であることが好ましい場合に使用した。
【０２１８】
（例えば１５位の）Ａｓｐの脱保護基は、次の位置（例えば１６位）のアミノ酸がＧｌｙであるとき、３０％のピペリジン／ＮＭＰ中の０．１Ｍのギ酸を使用し、且つ合成又は脱保護中に加熱することなくおこなった。
【０２１９】
触媒及びその他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）はAldrich, Germanyから、ピペリジン及びピリジンはRiedel-de Haen, Frankfurt, Germanyから、エタンジチオールはRiedel-de Haen, Frankfurt, Germanyから購入した。３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（ＨＯＡｔ）はFluka, Switzerlandから入手した。
【０２２０】
カップリング方法
アミノ酸は、ｉｎ ｓｉｔｕで産生されたＨＯＢｔ又はＨＯＡｔエステルとしてカップリングされ、ＤＭＦ中でＤＩＣを用い、適切なＮ−α−保護アミノ酸及びＨＯＢｔ又はＨＯＡｔから作られた。アシル化は、試験中のＦｍｏｃ脱保護を予防するために８０℃で行われたニンヒドリン試験によって確認した（Larsen, B. D. and Holm, A., Int J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 1-9）。
【０２２１】
Ｎ−α−アミノ保護基（Ｆｍｏｃ）の脱保護
未精製ペプチドのＨＰＬＣ精製
未精製のペプチド産物はPerSeptive Biosystems VISION Workstationにて精製した。機器の制御及びデータの取得には、ＶＩＳＩＯＮ ３．０ソフトウェアを使用した。以下のカラム及びＨＰＬＣバッファーシステムを使用した：
カラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ ＫＲ １００Å、１０ｍｍ Ｃ−８、２５０×５０．８ｍｍ
バッファーシステム：緩衝液：Ａ：ＭＱＶ中の０．１％ＴＦＡ；Ｂ：０．０８５％ＴＦＡ、１０％ＭＱＶ、９０％ＭｅＣＮ
勾配：０−３７分 ０−４０％Ｂ
流速：３５ｍｌ／分、ＵＶ検出：Ｉ＝２１５ｎｍ及び２８０ｎｍ
【０２２２】
質量分析法
ペプチドは、１ないし１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、super gradientメタノール（Labscan, Dublin, Ireland）、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Millipore, Bedford, MA）、及びギ酸（Merck, Damstadt, Germany）（５０：５０：０．１ｖ／ｖ／ｖ）に溶解した。ペプチド溶液（２０ｍｌ）はＬＣＴ質量分析計（Micromass, Manchester, UK）を用いたＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる陽極性モードで、＋／−０．１ｍ／ｚの精度にて分析した。
【０２２３】
先に述べたように、調製用ＨＰＬＣを用いた精製の後ペプチド産物を回収し、ペプチドの同一性をＥＳ−ＭＳにより確認した。この方法は、以下においてさらに例証される全てのペプチドの合成に使用した。
【０２２４】
合成された化合物
表１の化合物を、上記の技術を使用して合成した。
表１：合成した化合物
【表２】
0006298044.tif 000004
【０２２５】
実施例１：化合物１２の合成
固相ペプチド合成を、標準的なＦｍｏｃ化学反応を使用して、CEM Liberty Peptide Synthesizerによりおこなった。使用の前に、TentaGel S Ram S樹脂（１．３３ｇ；０．２５ｍｍｏｌ／ｇ）をＮＭＰ（１０ｍｌ）中で膨潤させ、ＤＣＭ及びＤＭＦを使用してチューブ及び反応槽との間を移動させた。
【０２２６】
カップリング
ＤＭＦ／ＤＣＭ（２：１；０．２Ｍ；５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−アミノ酸を、加える。ＣＯＭＵ／ＤＭＦ（０．５Ｍ；２ｍｌ）及びＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ（２．０Ｍ；１ｍｌ）と一緒にCEM Discoverマイクロ波装置内で樹脂に加えた。窒素をその混合物に通してバブリングしながら、カップリング混合物を７５℃まで５分間加熱した。続いて樹脂をＤＭＦで洗浄した（４×１０ｍｌ）。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ Ｍｅ、Ｍｅ、Ｐｒｏ）−ＯＨ偽プロリンを第６及び第７アミノ酸に使用した。
【０２２７】
脱保護
最初の脱保護のためにピペリジン／ＤＭＦ（２０％；１０ｍｌ）を樹脂に添加し、混合物を電子レンジで加熱した（３０秒；４０℃）。反応槽を排出し、ピペリジン／ＤＭＦ（２０％；１０ｍｌ）の２回目の量を添加し、再度加熱した（７５℃；３分）。続いて樹脂をＤＭＦで洗浄した（６×１０ｍｌ）。
【０２２８】
樹脂をＥｔＯＨ（３×１０ｍｌ）及びＥｔ２Ｏ（３×１０ｍｌ）で洗浄し、一定の重量まで室温（ｒ．ｔ．）で乾燥させた。ＴＦＡ／ＤＯＤＴ（９５／５；８０ｍｌ、２ｈ；ｒ．ｔ．）での処置によって、未精製のペプチドを樹脂から切断した。ＴＦＡの大半を減圧で除去し、未精製のペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで３回洗浄し、室温で一定の重量まで乾燥した。
【０２２９】
未精製のペプチドのＨＰＬＣ精製
Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ５μ Ｃ−１８ １１０Ａ、１０×２５０ｍｍカラム及びフラクションコレクターを備えたPerSeptive Biosystem VISION Workstationを使用して、未精製のペプチドを調製用逆相ＨＰＬＣによって４５％までまず精製し、緩衝液Ａ（０．１％のＴＦＡ，ａｑ．）及び緩衝液Ｂ（０．１％のＴＦＡ、９０％のＭｅＣＮ，ａｑ．）との勾配で３５ｍｌ／分で実行した。分析用ＨＰＬＣ及びＭＳによって画分を分析し、関連画分をプールし、そして凍結乾燥した。生成物（１４３ｍｇ）を、Ｃ４ Ｊｕｐｉｔｅｒ２、１２×２５ｃｍカラムを用いて２回目の精製をおこなって、ＨＰＬＣ及びＭＳによって特徴を明らかにしたとき８９％の純度を有する２７ｍｇを得た。予測モノアイソトピックＭＷ＝３３７７．６１、実測値３３７７．５７。
【０２３０】
実施例２．ＧＬＰ−２−受容体効力アッセイ
Perkin Elmer製のｃＡＭＰ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを、ＧＬＰ−２類似体に対するｃＡＭＰ応答を定量するために使用した。テズグルチドはこのアッセイの基準化合物であり、約０．０１ｎＭのＥＣ50を有している。ｃＡＭＰの細胞内レベルの増大を引き起こす試験化合物をこのアッセイで試験し、そして、その応答を、濃度反応曲線からＥＣ50と最大反応を計算するために正の対照及び負の対照に対して標準化した。結果を表２に列挙する。
【０２３１】
ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する細胞株の作出
ヒトグルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）（初期受入番号Ｐ４３２２０）をコードしているｃＤＮＡを、ｃＤＮＡＢＣ１１２１２６（ＭＧＣ：１３８３３１／ＩＭＡＧＥ：８３２７５９４）からクローニングした。サブクローニングのための末端制限酵素部位をコードしているプライマーを使用して、ＧＬＰ−１ＲをコードしているＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。５’末端プライマーは、効率的な翻訳を保証するための近接コザック共通配列をさらにコードした。ＧＬＰ−１ＲをコードしているＤＮＡの忠実度を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ＧＬＰ−１ＲをコードしているＰＣＲ産物を、ネオマイシン（Ｇ４１８）抵抗性マーカーを含む哺乳類の発現ベクター中にサブクローニングした。ＧＬＰ−１Ｒをコードしている哺乳類の発現ベクターを、標準的なリン酸カルシウム形質導入方法によってＨＥＫ２９３細胞中に形質導入した。形質導入の４８時間後に、制限希釈クローニングのために細胞を播種し、培地中で１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８で選択した。３週間後に、ＧＬＰ−１Ｒ発現細胞の１２個の生存コロニーを採取し増殖させ、下記の通りＧＬＰ−１受容体効果アッセイ中で試験した。１つのＧＬＰ−１−Ｒ発現クローンを、化合物プロファイリングのために選択した。
【０２３２】
ヒトＧＬＰ−２受容体を発現する細胞株の作出
ｈＧＬＰ２−ＲをＩｍａｇｅクローン：５３６３４１５（１１９２４−ｌ１７）としてMRC-geneservice, Babraham, Cambridgeから購入した。哺乳類発現ベクターへのサブクローニングのために、サブクローニング用のプライマーをDNA Technology, Risskov, Denmarkから得た。ＰＣＲ反応に使用した５’及び３’プライマーはクローニングのための端末制限部位を含んでおり、さらに５’プライマーの内容はＯＲＦによってコードされる産物の配列を変更させずにコザックコンセンサスに修飾されている。標準的なＰＣＲ反応を、５０μｌの総量中に先に触れたプライマーと共に鋳型としてＩｍａｇｅクローン５３６３４１５（１１９２４−１１７）及びPolymerase Herculase II Fusionを使用して実施した。作り出したＰＣＲ産物を、ＧＦＸ ＰＣＲ及びＧｅｌバンド精製キットを使用して精製し、制限酵素によって消化し、そして、Rapid DNA ligation Kitを使用して哺乳類発現ベクター内にクローニングした。連結反応物をXL10Gold Ultracompetent細胞に形質転換し、そしてコロニーをEndofree Plasmidを使用してＤＮＡ製造のために釣り出した。続く配列決定をMWG Eurofins, Germanyによって実施した。クローンがｈＧＬＰ−２受容体、スプライスバリアントｒｓ１７６８１６８４であることを確認した。
【０２３３】
ＨＥＫ２９３細胞を、Upofectamine PLUSトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション前日に、ＨＥＫ２９３細胞を抗生物質不含細胞培養培地中に２×１０6細胞／Ｔ７５フラスコの密度で２個のＴ７５フラスコに播種した。トランスフェクションの日に、細胞を１×ＤＰＢＳで洗浄し、培地をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−プラスミド複合体の添加前に５ｍｌ／Ｔ７５フラスコの体積までＯｐｔｉｍｅｍで置き換え、Ｔ７５フラスコ内の細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−プラスミド複合体を緩やかに滴下して加え、そして、３時間後に成長培地で置き換え、２４時間後に５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補った成長培地で再び置き換えた。Ｇ４１８選択の状態で４週間後に、コロニーを釣り出し、そして、機能検定で試験した。１つのコロニーを化合物プロファイリングで使用するために選択した。
【０２３４】
ＧＬＰ−１−受容体効力アッセイ
Perkin Elmer製のcAMP AlphaScreen（登録商標）アッセイを、それぞれＧＬＰ１受容体及びＧＬＰ２受容体の活性化に対するｃＡＭＰ応答を定量するために使用した。エキセンジン−４（ＺＰ２４）をＧＬＰ１受容体の活性化に関する基準化合物として使用し、テズグルチド（ＺＰ１５５９）をＧＬＰ２受容体の活性化に関する基準化合物として使用した。ｃＡＭＰの細胞内レベルの増大を発揮する試験化合物からのデータは、濃度反応曲線からＥＣ50及び最大反応を計算するために、正の対照及び負の対照（ビヒクル）に対して標準化した。結果を表２に挙げた。
表２：ＧＬＰ−１Ｒ及びＧＬＰ−２ＲのＥＣ50測定値
【表３】
0006298044.tif 000005
【０２３５】
実施例３：正常マウスにおける耐糖能に対する効果
通常食を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを使用した。マウスを標準的な居住条件で飼育し（明るさ、温度、及び湿度が管理された部屋（０６．００〜１８．００時に点灯する１２：１２時間の明暗サイクル；２４℃；５０％の相対湿度））、それぞれの投薬群は１０匹の動物から成った。
【０２３６】
経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の前に、動物に５時間断食させた。グルコース負荷の１時間前に（時間ｔ＝−６０分）、ベースライン血糖を計測した。血液サンプリング直後に、動物に指示された量の化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）を１回皮下投与した。ｔ＝０分である１時間後に、２ｇ／ｋｇの強制経口グルコース（グルコースＳＡＤ ０．４５６ｇ／ｌから希釈した水中、０．４ｇ／ｍｌ；投与体積５ｍｌ／ｋｇ）を動物に与えた。グルコース投与後に、ｔ＝１５、３０、６０、１２０分でのグルコース測定のために、尾静脈血を採血した。
【０２３７】
結果
ビヒクル処置マウスは、最初の３０分で血糖値が増大し、それに続いて１２０分後にベースラインレベルに戻る、グルコース負荷に対する典型的な反応を示した。試験化合物は有意に血糖応答を低減した（図２）。
【０２３８】
実施例４：正常ラットの腸重量に対する効果
通常食を与えたウィスター系雄ラットを使用した。ラットを標準的な居住条件で飼育し（明るさ、温度、及び湿度が管理された部屋（０６．００〜１８．００時に点灯する１２：１２時間の明暗サイクル；２４℃；５０％の相対湿度））、それぞれの投薬群は６匹の動物から成った。ラットには、指示された量の化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）を４日間にわたり皮下経路を介して１日１回投与した。５日目に、ラットを屠殺し、そして、小腸湿重量を計測した。
【０２３９】
結果
試験化合物は、用量依存的に腸重量を高めた（図３）。
実施例５：食餌誘発性肥満マウスにおける化合物７の効果
【０２４０】
食餌誘発性肥満を、高脂肪食（Research Diet 60%脂肪(012492) Research Diet Inc., New Brunswick, USA）をＣ５７８Ｌ／６Ｊ雄マウスに与えることによって作り出した。マウスを標準的な居住条件で飼育した（明るさ、温度、及び湿度が管理された部屋（０６．００〜１８．００時に点灯する１２：１２時間の明暗サイクル；２４℃；５０％の相対湿度））。
【０２４１】
ビヒクル処置投与群には８匹の動物が含まれ、化合物７処置群は１２匹の動物／群から成った。すべての動物を、取り扱いや注射に対する動物の順応のために７日間模擬処置し（１日１回、ＳＣ、１００μＩのビヒクル）、それに続いて１４日間（１日２回、ＳＣ、５ｍｌ／ｋｇ）処置した（ビヒクル又は化合物７）。動物に一晩断食させ（１１〜１２日目）、血液はグルコース及びインスリンの分析のために採血した。１４日目に、動物を屠殺し、そして小腸及び大腸を採取し、洗浄し、そして、計量した。
【０２４２】
結果
１４日間１日２回投与した化合物７は、ビヒクル処置対照と比較して、小腸及び大腸の質量を有意に増加させた（図４）。
【０２４３】
１４日間１日２回投与した化合物７は、ビヒクル処置対照に比べて、空腹時血糖と血漿インスリンレベルを低減するので、より低いＨＯＭＡ−ＩＲ指数をもたらした（図５）。
【０２４４】
本発明は上に述べた典型的な実施形態と共に記述されているが、多数の同等な改変及び変化はそれが開示された際当業者には明らかであり得る。従って、説明された本発明の典型的な実施形態は例示的であり限定的ではないとみなされる。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、記述された実施形態には様々な変更が成され得る。ここに引用された全ての文献は明白に参照により組み入れられたものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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