(57)【要約】創傷治癒が良好であれば、新しく形成された皮膚は、コラーゲンの蓄積を介して引張強度を生じるはずである。肉芽形成中の創傷床のコラーゲンの測定は、良好な創傷治癒を予測することができる。コラーゲン測定の既存の方法は、特別な装置を必要とするか、又は潜在的な妨害分子を識別できない。本書記載のものは、高圧液体クロマトグラフィを利用した、組織からコラーゲンを抽出、定量する正確で、特異的で、信頼性のある方法である。この方法は十分に鋭敏であり、新生治癒創傷で見られる少量のコラーゲン測定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治癒の進行を評価する方法において：
（ａ）対象の創傷部位から組織サンプルを得るステップと；
（ｂ）前記組織サンプルを処理するステップと；
（ｃ）前記処理した組織サンプル中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンを高圧液体クロマトグラフィにより分離して、検体ピーク面積を得るステップと；
（ｄ）前記組織中の前記グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの濃度を決定するステップと；
（ｅ）前記組織中の前記グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの前記濃度を前記組織中の全コラーゲン濃度と相関させるステップと；
（ｆ）前記創傷部位での前記全コラーゲン量を、非創傷組織中のコラーゲンの前記量と比較して、創傷治癒進行を評価するステップと；
を具える方法。
【請求項２】
前記組織が、皮膚である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織が、肉芽を形成したものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）から（ｆ）が、少なくとも１度反復され、各反復について、前記組織サンプルが同一対象の同一創傷部位から得たものである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ａ）から（ｆ）が、約第３日乃至約第２年間の期間中で少なくとも一度反復される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
最初の反復における組織中の前記全コラーゲンの量を、１又はそれ以上の続く反復における前記組織中の前記全コラーゲンの量と比較するステップを更に具える請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、ほ乳類である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ほ乳類が、ヒトである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
処理が：
（ａ）前記組織サンプルからの脂肪除去ステップと；
（ｂ）前記組織サンプルの脱水ステップと；
（ｃ）前記サンプルをアミノ酸に加水分解するステップと；
（ｄ）前記サンプルを誘導体化するステップと；
を具える請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記高圧液体クロマトグラフィが、Ｃ１８カラムで実行される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃ１８カラムが、約１から約１２のｐＨ領域である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記高圧液体クロマトグラフィ中の前記グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの溶出が、光ダイオードアレイ検出器により４３６ｎｍで測定される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記高圧液体クロマトグラフィが、逆相高圧液体クロマトグラフィである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記高圧液体クロマトグラフィは、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ１１．０の緩衝液７０％とアセトニトリル３０％とからなる移動相である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記組織中の前記グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの濃度を決定するステップが：
（ａ）グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの既知の濃度のサンプルを得るステップと；
（ｂ）高圧液体クロマトグラフィにより、前記サンプル中の前記グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンを分離するステップと；
（ｃ）グラフｘ軸上にグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの前記既知の濃度を、当該グラフｙ軸上に検体ピーク面積を表示して、直線性の標準曲線を作成するステップと；
（ｄ）前記処理した組織サンプル中の前記グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの各前記濃度を、式：
2010504533.tif 000010
ここで、ｂは、前記ｙ軸切片、ｍは前記直線性標準曲線の前記勾配である、
を用いて、計算するステップと；
（ｅ）前記組織中の前記グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの各前記濃度を、式：
2010504533.tif 000011
を用いて計算するステップと；
を具える請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織中の前記グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの前記濃度と前記組織中の前記全コラーゲンの量を相関させるステップが、式：
2010504533.tif 000012
ここで、Ｃは、コラーゲン中のグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの成分の百分率の総和を１００で割ったものである、
を用いるステップを具える請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｃが、０．５５に等しい請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年９月２１日に出願され、その全内容が本明細書に取り込まれている米国仮特許出願第６０／８４６，２５０号の優先権の利益を請求する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、組織中のコラーゲン含量を測定する方法に関する。特に、ＨＰＬＣ技術を用いたコラーゲン含量の測定に関する。特定の態様では、本発明は、創傷治癒におけるコラーゲン含量の測定に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の記載
コラーゲン蛋白質は、主としてヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、及びプロリン（Ｐｒｏ）からなる繰り返しのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖から構成される。コラーゲンは、人体から見出されている最も主要なタンパク質の１つであり、正常な（非創傷）皮膚組織の皮層中の細胞外マトリックスの約８０〜８５％を含む。コラーゲンのユニークな特性が、正常な皮膚組織に、引張強度、完全性（統合性）、及び構造を提供していることを示す証拠がある〔非特許文献１〕。引張強度の生成は、良好な創傷治療の重要な要素であり、コラーゲンが引張強度の生成に関与する主要なタンパク質であるため、正確なコラーゲン測定によって、良好な創傷治療の予測し得る。
【０００４】
分光光度法やガスクロマトグラフィなどの生化学及び分析化学で共通に用いられる様々な分析方法が、コラーゲンの定量に適している〔非特許文献２〕。現在利用できるほとんどのヒドロキシプロリンの測定用の分光光度比色法は、１９５０ノイマン（Ｎｅｕｍａｎ）とローガン（Ｌｏｇａｎ）又はステグマン（Ｓｔｅｇｍａｎｎ）法の改良であるが、その方法は、感度が高く正確であるが、扱いにくく、解決し難い問題がある〔非特許文献３〕。
【０００５】
別の一般的な分析方法は、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である。ＨＰＬＣは、サンプルを添加した液体をポンプ注入して特別に充填したカラムを通して、そのカラムを通して高圧で、サンプルを圧送することにより稼働する。カラム内に充填された物質は、固定相又は吸着相と呼ばれ、通常は、微細に粉砕された粉末又はゲルである。移動相と呼ばれている液体は、通常、有機及び／又は緩衝液である。試験用にクロマトグラフィ中に分離されるサンプル中の物質は、通常、検体と呼ばれる。クロマトグラフィの視覚的なアウトプットであるクロマトグラムは、分離した混合物中の様々な成分（検体など）に対応した様々なピークやパターンを表示する。ＨＰＬＣにより生じたデータによっては、分析者は妨害があるか否か、同時溶出ピークがあるか否か及び、これらのピークがどこで生じるのかを正確に決定できる。ＨＰＬＣにより生じたピークは、分離用に分析することができるが、分光光度計により得られた結果は、混入物質に起因するものであるかどうかを決めることはできない。
【０００６】
コラーゲンを測定するＨＰＬＣを用いた公知の方法は、蛍光検出装置や、分析の費用及び／又は複雑さを増す高度に特殊化したカラムなどの特殊化した装具が必要であり、潜在的にはこの方法を使用できないとされている〔非特許文献４〜６〕。イノウエ（Ｉｎｏｕｅ）らは、コラーゲン代謝が関与する疾患の標識として、ＨＰＬＣを用いてプロリルジペプチド、プロリン、及びヒドロキシプロリンのヒト血清中濃度を測定するための方法を記載している。この方法は、縦に連結したＨＰＬＣと、２つの異なる発光波長でモニタすることが必要である。マルチネツ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）らは、アミノ酸分析用に特別に充填した専用カラムである、ウォータズピコ−タッグ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ（登録商標））カラムを用いて逆相ＨＰＬＣ法でヒドロキシプロリンを分析した。ヒドロキシプロリンとヒドロキシリシルピリジノリン（ｈｙｄｒｏｘｙｌｓｙｌｐｙｒｉｄｉｎｏｌｉｎｅ）の架橋を定量することにより、マルチネツ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）らは、ブタ左心室中のコラーゲン含量の指標を得たが、コラーゲン含量の定量はできなかった。Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｏｒｔｉｚらは、ボローニャなどの肉製品中のコラーゲン濃度を測定する方法を記載している。この方法は、逆相ＨＰＬＣとフルオリッチロム（ｆｌｕｏｒｉｃｈｒｏｍ）検出装置を用いたヒドロキシプロリンの含量の測定に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，１６２，５０６号
【特許文献２】米国特許第４，５９７，７６２号
【特許文献３】米国特許第５，８１４，３２８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇ．Ｓ．Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ：ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｗｏｕｎｄｓ，Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｏｕｎｄｓ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２００５）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｏｕｎｄｓ．ｃｏｍ  ２００５／ａｕｇｕｓｔ／Ｓｃｈｕｌｔｚ／Ｅｘｔｒａｃｅ−Ｍａｔｒｉｃ−Ａｃｕｔｅ−Ｃｈｒｏｎｉｃ−Ｗｏｕｎｄｓ．ｈｔｍｌ
【非特許文献２】Ｈ．Ｉｎｏｕｅら、Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７２４：２２１−２３０（１９９９）
【非特許文献３】Ｈ．Ｓｔｅｇｅｍａｎｎ及びＫ．Ｓｔａｌｄｅｒ，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｃｔａ、１８：２６７−２７３（１９６７）； Ｂ．Ｒ．Ｓｗｉｔｚｅｒ及びＧ．Ｋ．Ｓｕｍｍｅｒ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：４８７−４９１（１９７１）
【非特許文献４】Ｈ．Ｉｎｏｕｅら；Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７５７：３６９−３７３（２００１）
【非特許文献５】Ｄ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．及びＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９  １−９（２００３）
【非特許文献６】Ｆ．Ａ．Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｏｒｔｉｚら、Ｊ．ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ＆  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈ．，２７，１７  ２７７１−２７８０（２００４）
【非特許文献７】Ｒ．Ｆ．Ｄｉｅｇｅｌｍａｎｎ及びＭ．Ｃ．Ｅｖｅｎｓ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ、バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）９：２８３−２８９（２００４）
【非特許文献８】Ａ．Ｊ．Ｍｅｓｚａｒｏｓら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６５：４３５−４４１（２０００）
【非特許文献９】Ｃ．Ｔ．Ｈｅｓｓ及びＲ．Ｓ．Ｋｉｒｓｎｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｋｉｎ  ＆  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ，１６，５：２４６−２５７（２００３）
【非特許文献１０】連邦食品・医薬品・化粧品法第５０１条  ＜１２２５＞  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｎ：（２００４）  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ２７／Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ２２，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２００４，ｐｐ．２６２２−２６２５
【非特許文献１１】Ｔ．Ｍ．Ｄｅｖｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉ：Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｉｎ：Ｔ．Ｍ．Ｄｅｖｌｉｎ（Ｅｄ）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ２００６，ｐｐ．１０１
【発明の概要】
【０００９】
１つの態様では、本発明は、組織中の全コラーゲンを測定する方法を提供しており、この方法は、（ａ）組織サンプルを得るステップと；（ｂ）組織サンプルを処理するステップと；（ｃ）処理した組織サンプル中の、グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの少なくとも１つを高圧液体クロマトグラフィにより分離して、検体のピークと面積を得るステップと；（ｄ）組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの少なくとも１つの濃度を決定するステップと；（ｅ）組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの少なくとも１つの濃度を組織中の全コラーゲン量と相互に関連付けるステップ、を具える。
【００１０】
別の態様では、本発明は組織中の全コラーゲンを測定する方法を提供しており、この方法は、（ａ）組織サンプルを得るステップと；（ｂ）組織を処理するステップと；（ｃ）処理した組織サンプル中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンを高圧液体クロマトグラフィにより分離して、検体のピーク面積を得るステップと；（ｄ）組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリン濃度を測定するステップと；（ｅ）組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリン濃度を組織中の全コラーゲン量と相互に関連付けるステップ、を具える。
【００１１】
ある態様では、この組織は創傷部位からのものである。本発明の１つの態様では、この組織が、肉芽組織である。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、創傷治癒の進行を評価又はモニタする方法を提供しており、この方法は、（ａ）対象の創傷部位から組織を得るステップと；（ｂ）この組織サンプルを処理するステップと；（ｃ）処理した組織サンプル中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの少なくとも１つを高圧液体クロマトグラフィにより分離して、検体のピーク面積を得るステップと；（ｄ）組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの少なくとも１つの濃度を決定するステップと；（ｅ）組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの少なくとも１つの濃度を組織中の全コラーゲン量と相互に関係付けるステップと、（ｆ）創傷部位の組織中の全コラーゲン量を非創傷組織中のコラーゲン量と比較して、創傷治癒の進行を評価するステップと、を具える。
【００１３】
本発明の別の態様では、創傷治癒の進行を評価する方法が提供されており、その方法は：（ａ）対象の創傷部位から組織サンプルを得るステップと；（ｂ）この組織サンプルを処理するステップと；（ｃ）処理した組織サンプル中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンを、高圧液体クロマトグラフィにより分離して、試料のピーク面積を得るステップと；（ｄ）組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリン濃度を決定するステップと；（ｅ）組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリン濃度を組織中の全コラーゲン量と相互に関連付けるステップと；（ｆ）創傷部位の組織中の全コラーゲン量を非創傷組織中のコラーゲン量と比較して、創傷治癒の進行を評価するステップを具える。ある態様では、この方法は、少なくとも１度繰り返され、各反復において、同一の対象の同一の創傷部位から組織サンプルを得る。反復は、定められた期間中、少なくとも１度くり返される。ある態様では、その期間は、日、週、半月、月、四半期、半年、１年、２年、３年、４年又は５年である。ある態様では、この方法は、１日おき、３日おき、４日おき、５日おき、６日おき、毎週、１週おき、３週おき、４週おき、５週おき、６週おき、に繰り返えしてもよい。その他の態様は、最初の反復における組織中の全コラーゲン量を、続く反復における組織中全コラーゲン量と比較するステップを具える。創傷部位における組織中の全コラーゲン量を比較することで、創傷治癒の進行をモニタ及び／又は評価が可能となる。
【００１４】
組織サンプルは、ヒト源、又は、両生類、は虫類、魚類、鳥類などの様々な動物源から得ることができる。限定されないほ乳類の例としては、マウス、ラット、ラビット、イヌ、ウシ、及びヒトをあげることができる。組織は、例えば、切断、解体、剥離、又は切開などの様々な手段で源から取出すことができる。取出しは、例えば、ナイフ、メス、レーザ、又は刃物などの道具の使用が役立つ。
【００１５】
本発明は、コラーゲンを含むどのような組織にも適用することができる。コラーゲンは、大部分の組織を支持する細胞外マトリックスの主要成分である。加えて、コラーゲンは、一定の細胞の内部にも見いだされる。コラーゲンは、皮膚、筋膜、軟骨、靱帯、及び腱、などの柔組織中の主要成分である。コラーゲンは、骨及び歯にも見いだされる。本発明のある態様では、この組織は、皮膚である。皮膚は、３つの主要な層から構成されている：最外層である表皮；多くの神経末端と結合組織が集中している真皮；及び下皮又は皮下脂肪層である。
【００１６】
ヒト及び動物に、多くの様々なタイプのコラーゲンがある。既知のタイプが異なる２８の源がの報告がされている。人体で見いだされているコラーゲンのほぼ８０〜９０％が、タイプＩ（皮膚、腱、骨、靱帯、象牙質、及び間質性の組織）、タイプＩＩ（軟骨、及び硝子体液）、及び、タイプＩＩＩ（細胞培養、及び胎児組織）の組み合わせである。本発明は、コラーゲンのどのタイプにも、または、どのような組合わせにも適用できる。
【００１７】
ここで用いたように、「処理した組織サンプル」は、ＨＰＬＣによる成分の分離に適した状態に処理された組織サンプルを意味する。ＨＰＬＣを含めて分析用に組織を処理する方法は、この分野で公知である。本発明の方法は、組織サンプルを処理するステップを具えており、特別な態様で、この処理は、（ａ）組織サンプルからの脂肪除去；（ｂ）組織サンプルの脱水；（ｃ）サンプルをアミノ酸へ加水分解；及び／又は（ｄ）サンプルの誘導体化、の１又はそれ以上を含む組織サンプルの処理を含む。これらの処理は全てこの技術分野で公知であり、一般に行われている方法が含まれる。脂肪の除去は、物理的、及び化学的な方法を含む様々な方法で行うことができる。ある態様では、化学的な脱脂は、溶媒又は界面活性剤での洗浄を含む。このような溶媒の限定されない例には、エチルアルコール、アセトニトリル、ヘキサン、ペンタン、及び／又はアセトンが含まれる。脱水は、凍結乾燥、乾燥、制御された加熱処理、及び／又は真空の利用により達成できる。特定の、限定されない態様では、このサンプルは、塩酸にさらして加熱することにより加水分解され、アセトン中で４−ジメチルアミノアゾベンゼン４’−スルホニルクロライド溶液中で誘導体化される。
【００１８】
１つの態様では、組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの濃度を決定するステップは：（ａ）既知の濃度のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンのサンプルを入手するステップと；（ｂ）高圧液体クロマトグラフィによりサンプル中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンを分離するステップと；（ｃ）グラフｘ軸上にグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの既知の濃度を、ｙ軸上に検体ピーク面積をプロットして、リニア標準曲線を作成するステップと；（ｄ）処理した組織サンプル中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの各濃度を計算するステップと、を具える。グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの各濃度は、式：
2010504533.tif 000002
を用いて、計算し、（ここで、ｂはｙ切片であり、ｍは標準直線の勾配である）；（ｅ）組織中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの各濃度を式：      
2010504533.tif 000003
を用いて計算する。
【００１９】
別の態様では、組織中グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリン濃度を組織中全コラーゲン量と式：
2010504533.tif 000004
を用いて、相互に関連付ける。ここで、Ｃは、コラーゲン中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの百分率（％）の和である。「Ｃ」の値は、この技術分野で報告されており、コラーゲンタイプで変化することがある。限定されない例では、「Ｃ」は、０．５５である。
【００２０】
標準曲線を作成する方法は、この技術分野ではよく知られており、標準曲線は、手書きで又は用具又はコンピュタの補助で作成することができる。コンピュータ、計算機及びその他の用具用の曲線適合ソフトウエアプログラムを用いて、標準曲線を作成することができる。
【００２１】
本発明の１つの態様では、高圧液体クロマトグラフィは、逆相液体クロマトグラフィである。別の態様では、高圧液体クロマトグラフィは、Ｃ１８カラムで行われ、更に、別の態様では、約１〜約１２の範囲のｐＨで行われる。高圧液体クロマトグラフィを行う間の検体（グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリン）の溶出は、例えば、光ダイオードアレイ検出器により測定することもできる。本発明の１つの態様では、溶出は４３６ナノメータで測定することができる。本発明の１つの態様では、高圧液体クロマトグラフィ中の検体（プロリン、及びヒドロキシプロリン）の溶出は、蛍光検出装置では測定されない。
【００２２】
本発明の別の態様では、高圧液体クロマトグラフィは、約７０％の２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ１１．０の緩衝液、及び約３０％のアセトニトリルの移動相である。移動相は、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％緩衝液からなる。限定されない緩衝液の例には、リン酸カリウム、リン酸クエン酸、トリス、へペス、ＭＥＳ又はＭＯＰＳ緩衝液を挙げることができる。緩衝相（ｂｕｆｆｅｒ  ｐｈａｓｅ）は、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％アセトニトリルを含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の方法は、創傷治癒の初期段階で見られる低レベルのコラーゲンの検出に非常に適している。本発明のある態様では、この方法は、１．０μｇ／ｍｌ又はそれより低い濃度で組織サンプル中に存在するヒドロキシプロリンの検出に用いられる。本発明のある態様では、この方法は、０．９μｇ／ｍｌより低い、０．８μｇ／ｍｌより低い、０．７μｇ／ｍｌより低い、０．６μｇ／ｍｌより低い、０．５μｇ／ｍｌより低い、０．４μｇ／ｍｌより低い、０．３μｇ／ｍｌより低い、あるいは、０．２μｇ／ｍｌより低い濃度で組織サンプル中に存在するヒドロキシプロリンの検出に用いられる。ある態様では、この方法は、０．１２〜１．０μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．９μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．８μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．７μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．６μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．５μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．４μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．３μｇ／ｍｌの間、又は０．１２〜０．２μｇ／ｍｌの間の濃度で組織サンプル中に存在するヒドロキシプロリンの検出に用いられる。本発明のある態様では、この方法は、１．０μｇ／ｍｌ又はそれより低い濃度で組織サンプル中に存在するグリシンの検出に用いられる。本発明のある態様では、この方法は、０．９μｇ／ｍｌより低い、０．８μｇ／ｍｌより低い、０．７μｇ／ｍｌより低い、０．６μｇ／ｍｌより低い、０．５μｇ／ｍｌより低い、０．４μｇ／ｍｌより低い、０．３μｇ／ｍｌより低い、０．２μｇ／ｍｌより低い、又は０．１μｇ／ｍｌより低い濃度で組織サンプル中に存在するグリシンの検出に用いられる。ある態様では、この方法は、０．０６〜１．０μｇ／ｍｌの間、０．０６〜０．９μｇ／ｍｌの間、０．０６〜０．８μｇ／ｍｌの間、０．０６〜０．７μｇ／ｍｌの間、０．０６〜０．６μｇ／ｍｌの間、０．０６〜０．５μｇ／ｍｌの間、０．０６〜０．４μｇ／ｍｌの間、０．０６〜０．３μｇ／ｍｌの間、０．０６〜０．２μｇ／ｍｌの間、又は０．０６〜０．１μｇ／ｍｌの間の濃度で組織サンプル中に存在するグリシンの検出に用いられる。本発明のある態様では、この方法は、１．０μｇ／ｍｌ又はそれより低い濃度で組織サンプル中に存在するプロリンの検出に用いられる。本発明のある態様では、この方法は、０．９μｇ／ｍｌより低い、０．８μｇ／ｍｌより低い、０．７μｇ／ｍｌより低い、０．６μｇ／ｍｌより低い、０．５μｇ／ｍｌより低い、０．４μｇ／ｍｌより低い、０．３μｇ／ｍｌより低い、又は０．２μｇ／ｍｌより低いより低い、濃度での組織サンプル中に存在するプロリンの検出に用いられる。ある態様では、この方法は、０．１２〜１．０μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．９μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．８μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．７μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．６μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．５μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．４μｇ／ｍｌの間、０．１２〜０．３μｇ／ｍｌの間、又は０．１２〜０．２μｇ／ｍｌの間、の濃度で組織サンプル中に存在するプロリンの検出に用いられる。
【００２４】
上述の如く、本発明の方法は、創傷治癒の初期段階で見られるような低レベルのコラーゲンの検出に非常に適している。したがって、本発明のある態様では、創傷が生じて、９日以内、８日以内、７日以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内での創傷治癒の進展を評価する方法を提供する。ある態様では、創傷治癒の進展は、創傷の発生から約２〜９日、２〜８日、２〜７日、２〜６日、２〜５日、２〜４日、２〜３日、３〜９日、３〜８日、３〜７日、３〜６日、３〜５日、３〜４日、の間に評価される。
【００２５】
本発明の方法は、また、広いダイナミックレンジに渡るコラーゲンレベルの検出に適している。この広いダイナミックレンジは、治癒の経過を通して創傷組織でコラーゲンレベルのモニタに有用である。ある態様では、本発明は、組織サンプル中のグリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリンの各濃度が０．０６μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ、０．１２μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ〜２４μｇ／ｍｌ、である範囲にわたって検出する方法を提供する。
【００２６】
本明細書に記載されるいずれの方法又は組成物も、本明細書に記載されるその他のいずれの方法又は組成物に対しても提供し得ることが予想される。
【００２７】
特許請求の範囲の「又は」という用語の使用は、明細書の開示は、選択されたもののみ及び「及び／又は」を指す定義を支持しているにもかかわらず、選択されたもののみを指すか、又は選択されたものが相互に排除されることが明快に指摘されないかぎり「及び／又は」を意味するために用いられる。  
【００２８】
本出願の全体を通して、「約」という用語は、ある値が前記値を決定するために用いられたデバイス又は方法による誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
【００２９】
長年にわたる特許法を受けて、用語「１」及び「１つ」は、特許請求の範囲又は明細書中で「含む」という単語と一緒に用いられるときは、特段の規定がなければ１又は２つ以上を示す。
【００３０】
本発明のその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。詳細な説明と特定の実施例は、一方、本発明の特別の態様を示しており、この詳細な説明から当業者にとって自明になるため、本発明の精神と範囲内に含まれる様々な変更や改良は、例示のみの方法で示している。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある態様を示す。本発明は、本明細書に表した特別な態様の詳細な説明と共に、１又はそれ以上のこれらの図面を参照することにより、更により良く理解されるであろう。  
【００３２】
【図１】図１は、０．７５μｇ／ｍｌ〜２４μｇ／ｍｌのヒドロキシプロリン、グリシン、プロリンでなるアミノ酸の標準混液を注入した１例の代表的なヒドロキシプロリン、グリシン、プロリンの直線性のプロットを示す。各標準濃度の面積は、各アミノ酸ピークに基づいて計算した値を表す。各アミノ酸傾向線の相関係数を挙げており、全てのアミノ酸の標準曲線は、０．７５μｇ／ｍｌ〜２４μｇ／ｍｌの間で直線性を示している。
【図２】図２は、正常で無傷のブタ皮膚からの典型的な皮膚クロマトグラムを示す。
【図３】図３は、ヒドロキシプロリン、グリシン、プロリンのスパイキングスタディプロットを示す。正常で無傷の皮膚からのブタ組織サンプルは、６．０μｇ／ｍｌアミノ酸標準混液（標的標準）の８０％、１００％、及び１２０％でデュプリケイトでスパイクした。傾向線は、全ての３種のアミノ酸の回収の代表的なものである。その結果は、線が重なる程に似ている。各アミノ酸の相関係数は、０．９９５（ヒドロキシプロリン）、０．９８８（グリシン）、及び０．９９５（プロリン）である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
Ａ．創傷治癒経過
例えば、外科手術によって、正常皮膚の完全性がくずれた場合、順調な急性創傷の治癒は、４つの公知の相を通して系統的な進行に従っている。これらの相は、うっ血、炎症、増殖、及び再構築又は化膿である。うっ血及び初期の炎症相の間、血管収縮因子が放出され、毛細血管の収縮をもたらし、血小板と炎症性細胞を創傷床へ移動させる。炎症相の間は、創傷を安定化させる好中球が放出される〔非特許文献７〕。２、３日以内にマクロファージが創傷に入り込む。これらのマクロファージは、好中球と損傷されたマトリックスの除去に関与する〔非特許文献８〕。創傷は、次に、線維芽細胞及びケラチノサイトの創傷への移動を伴う増殖相に入る。肉芽組織形成に必要なコラーゲンやその他の細胞外−細胞マトリックスタンパク質を生産するのは、線維芽細胞である。肉芽組織は、典型的には、創傷ベースから成長する分散した線維性結合組織である。創傷治癒の経過中、コラーゲン分子は、創傷部位へ細胞遊走を促進するコラーゲン−フィブリンマトリックスを形成する。
【００３４】
増殖相の間、線維芽細胞の浸潤は、創傷治癒経過にとって非常に重要である。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）や形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）などの特定のサイトカインが、線維芽細胞調節因子であり、それらは肉芽差組織の形成に関与する。さらに、ＴＧＦ−βは、創傷床で最も多く見られる線維芽細胞の増殖を激しく刺激する。創傷を再構築する最終相の間は、コラーゲンの沈着が続く。再構築の２年後には、創傷の引張強度は、正常皮膚組織の最大値のおおよそ８０％に達するであろう〔非特許文献９〕。
【００３５】
ある場合には、創傷は、期待する時期内に予測通りの段階に順調な治癒をし損なう。このような創傷は、慢性的であると考えられ、慢性的な創傷の患者は、創傷治癒をし損なったために、さらなる感情的、身体的ストレスをもつ。典型的には、何かが炎症相又は増殖相の崩壊をもたらした場合、慢性創傷へ進展する。崩壊の共通する原因は、感染、組織低酸素、反復性外傷、残骸及び／又は壊死組織の存在、糖尿病などのある種の疾患が含まれる。慢性創傷の患者は、感染のリスクが高く、しばしばかなりの痛みがあることが報告されている。慢性創傷からの合併症を防ぐために、ある種の創傷は評価し、モニタするべきである。本発明は、創傷組織のコラーゲンの定量によって創傷を評価しモニタする正確で特異的で信頼性のある方法を提供する。これらの方法は、十分に感度が高く、新しい回復期の創傷に見られる少量のコラーゲンを測定できる。
【００３６】
Ｂ．コラーゲンの構造
コラーゲン分子、又は「トロポコラーゲン」サブユニットは、約３００ｎｍ長で、１．５ｎｍの径をもつ棒状である。それらは、３つのポリペプチド鎖でつくられており、それらの各々は左巻らせんであり、一緒にねじれて右巻らせんのコイルドコイル構造になっている。トロポコラーゲンサブユニットは、自然発生的に自己集合し、らせん内及びらせん間には、共有結合架橋が存在する。コラーゲン原線維（膠原線維）はコラーゲン分子を束ねており、コラーゲン線維は原線維の束である。コラーゲンサブユニットのアミノ酸配列は、全く独特である。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｐｒｏ又はＧｌｙ−Ｘ−Ｈｙｐのパターンが一般的であり、ここで、Ｘが様々なその他のアミノ酸残基をとり得、特異的な配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐがたびたび生じる。
【００３７】
本発明は、コラーゲン中で見いだされる３つの最も豊富なアミノ酸（ヒドロキシプロリン、グリシン、プロリン）の分析により全コラーゲン量を計算する方法を提供する。１つの態様では、全コラーゲン量は、各標準曲線に基づき、これら３つのアミノ酸濃度（μｇ／ｍｌ）を先ず算出することにより計算する。したがって、各サンプル中のヒドロキシプロリン、グリシン、プロリンの濃度（μｇ／ｍｌ）は、式：
2010504533.tif 000005
ここで、ｂはｙ切片であり、ｍはリニア曲線に基づく勾配である、により決定することができる。次に、湿組織（μｇ／ｍｇ）のサンプル当たりの濃度をサンプル重量、希釈係数、及び最終サンプル容量（ｍＬ）を考慮して、各アミノ酸毎に計算する。  
2010504533.tif 000006
【００３８】
全コラーゲンは、ヒドロキシプロリン、グリシン及びプロリンの濃度（μｇ／ｍｇ）を取り出し、この３つの値の総和を計算し、次いで特定のタイプのコラーゲンのヒドロキシプロリン、グリシン及びプロリンの既知の百分率（％）の総和で割り、０．０１を乗じることにより計算する。これは、「Ｃ」として下記に表しているが、ここでＣは、画分としてあらわされたコラーゲン中のヒドロキシプロリン、グリシン及びプロリンの成分百分率の総和である。したがって、
2010504533.tif 000007
である。
【００３９】
Ｃの値は、文献上で見ることができ、報告されている値は、コラーゲンのタイプで変動することがある。例えば、Ｔ．Ｍ．Ｄｅｖｉｎ〔非特許文献１１〕により報告されたコラーゲンのヒドロキシプロリン、グリシン及びプロリンの既知百分率の総和は、５５％であり、全コラーゲンの全量５５％については、コラーゲンは、約９．１％のヒドロキシプロリン、３３％のグリシン、１３％のプロリンから構成されることが報告されている。
【００４０】
コラーゲンは、対象から取り出したサンプルから単離されなければならず、分析試験の前に化学的に調製することがある。このような手順は、凍結、粉砕化、凍結乾燥（脱水）、加水分解、及び誘導体化などのいくつかのステップを含むことがある。その他のステップは、非コラーゲン分子の消化、ろ過、沈殿、透析、希釈、溶媒化又は反復洗浄を含むことがある。この分野の公知のコラーゲン製造技術の例は、特許文献１〜３に見られる。
【００４１】
Ｃ．高圧液体クロマトグラフィ
順相（通常）、逆相、イオン交換、及びバイオアフィニティなどの相の材質に基づいて多くの特異性あるタイプのＨＰＬＣがある。例えば、逆相ＨＰＬＣは、非極性の固定相と水性で適度な極性の移動相から構成され、極性溶離液、相対的に非極性の検体、及び非極性の固定相の間で、斥力から生じる疎水性相互作用の原理に基づき作用する。相対的には、イオン交換クロマトグラフィは、溶質イオンと固定相に結合した電荷部位との間の誘引力に頼っている。同一の荷電のイオンは、排除される。アジレントテクノロジ社（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、日立（Ｈｉｔａｃｈｉ）、及びウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）などの数社が、商業上市販されているＨＰＬＣ機器とその装備品を製造している。
【００４２】
ＨＰＬＣ機器は、例えば、光ダイオードアレイ検出器などの様々なタイプの検出器を装備することができる。光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）は、例えば、集積回路チップ、又はマルチプレクサなど、複数の独立した光ダイオード素子が相互に並んだ、リニアアレイである。分光法では、分光計の画面を配置して、ある範囲の波長を同時検出できるようにする。ＨＰＬＣ検出器などのような、アレイ検出器は、サンプルのフローセルを急速に通り抜けるサンプルのＵＶ−可視全域の吸収スペクトルの記録に特に有用である。
【００４３】
Ｄ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すものである。実施例に開示した技術は、本発明者によって発見された技術を表わし、本発明の実施をうまく機能させており、したがって、その好ましい実施形態を構成するものと考慮できることが当業者に理解されよう。しかし、当業者は、本開示を鑑みて、本発明の思想および範囲を逸脱することなく、開示された具体的な実施態様に多くの変更を加え、なおも、同様な成果を得ることができることは自明である。
【００４４】
１．サンプルの採取と調製
２０匹の家畜ブタ（学名  Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）に、全層、直径５ｃｍの切除創傷を背部に作った。創傷形成中にメダル状に取離した円形の皮膚を、−８０℃の液体窒素中に突然入れて、コラーゲン分析に用いるまで凍結させた。これらのメダル状の皮膚を、正常で、無傷の皮膚サンプルとした。創傷は、デュオデルム（Ｄｕｏｄｅｒｍ）（商標）（親水コロイド被覆材）を付け、ドレッシング（包帯）は週３度交換した。傷つけてから９日後、動物を安楽死させ、メダル状の肉芽組織を取り出し、コラーゲン分析まで、−８０℃で凍結した。これらのメダル状のものを、初期の治癒組織のサンプルとした。
【００４５】
採取した後、凍結した皮膚組織サンプルを、マルチサンプル生物粉砕器（マルチサンプル  バイオパルビライザ、Ｂｉｏｓｐｅｃ）で粉砕した。次に、サンプルを一晩凍結乾燥させて、余分な水分を除いた。粉砕は、皮膚組織を崩してバラバラにし、より多くの表面積を露出させて、組織を脱脂する助けとした。凍結乾燥後、サンプルを５回の、７０％エチルアルコール、１００％エチルアルコール、１００％アセトニトリル、及び１００％アセトンの１５分間洗で、連続的に脱脂した。サンプルは、次いで室温で乾燥させた。乾燥後、サンプルは、６Ｎ塩酸を添加して、１１０℃で一晩、アミノ酸に加水分解した。凍結乾燥に続いて、サンプルを一晩、真空下で乾燥させて、残りの塩酸を除き、次いでサンプルを１３ｍｇ／ｍＬの最終濃度に水で再構築した。
【００４６】
すべての標本結果は、０．７５〜２４μｇ／ｍＬのリニア曲線の範囲に基づいていた。約１．３ｘ１０−１ｍｇ／ｍＬの皮膚組織を含む１０μｌサンプルを、アセトン中４−ジメチルアミノアゾベンゼン４’−スルホニルクロライドの１．３ｍｇ／ｍＬ溶液の１ｍｌで誘導体化した。誘導体化したサンプルは、ｐＨ９．０の５０ｍＭの重炭酸ナトリウムの５００μｌで希釈し、サンプル溶液のｐＨの中和を助けた。誘導体化したサンプルは、７０℃で１０から１５分間インキュベイトし、次いで一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥に続いて、サンプルを７０％エチルアルコール２ｍＬで再構築し、ウォットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）２５ｍｍＧＤ／ＸＰＳＵろ過膜でろ化し、ＨＰＬＣ用バイアルに入れた。
【００４７】
２．ＨＰＬＣ  分析及び検証
全ての濾過したサンプルは、２９９６光ダイオ−ドアレイ検出器とデータプロセス用Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウエアを装備したウォーターズアライアンス（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｉａｎｃｅ）（登録商標）２６９５ＨＰＬＣシステムで分析した。全コラーゲンの測定のために、ヒドロキシプロリン、グリシン、及びプロリンを、４３６ｎｍで測定した。この逆相ＨＰＬＣ法は、調整済みのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｇｅｍｉｎｉ（商標）Ｃｌ８  １５Ｏ  ｘ４．６ｍｍ及び３ミクロン粒子サイズカラムを用いた。全てのサンプルは、予め混合し予めろ過した７０％の２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ１１．０緩衝液及び３０％のアセトニトリルの移動相を均一濃度の状態で流した。各注入は、室温で、０．５ｍｌ／分の流速で４５分間続けた。ヒドロキシプロリン、グリシン、及びプロリンのピーク全てが、２５．０分で溶出した。２６分から４５分の間の時間に、次の使用前にカラムを洗浄して、平衡化した。
【００４８】
ＨＰＬＣ法は、直線性、正確性、精度、正確性／再現性、検出限界及び定量性の限界が実証されている。直線性は、０．７５〜２４μｇ／ｍＬの範囲で、ヒドロキシプロリン、グリシン、及びプロリンの既知の濃度で調整された５種の標準液を試験することにより決定した。各標準液濃度をプロットし、既知の標準液濃度に対する面積を示した、また、各々についての相関係数を計算した。用いた各直線性は、０．９９６より大きい相関係数であった。正確性は、同日に６サンプルを試験して、平均回復相対標準偏差（ＲＳＤ）が１５％以下であることを保証することにより決定した。２つの別々の場合における精度は、６．０μｇ／ｍＬ標準液の６回注入の分析により試験し、各場合でカラムロットを変えて、ＲＳＤが３％以下であることの保証をした。正確性／再現性（安定性）は、３種の異なる場合について別々の分析者により調製された６種の異なるサンプル標本を評価する試験を行い、各場合でＲＳＤが１５％以下であり、全ての３種の場合の平均で２０％以下であることの保証がされた。最後に、検出限界と定量性限界を、最低の直線性標準濃度以下に希釈した連続希釈標準液の試験により決定した。各希釈液の３とおりの連続注入を行い、次いで、このクロマトグラフィを分析して、ヒドロキシプロリン、グリシン及びプロリンの検出限界／定量限界を求めた。平均値と％ＲＳＤを、各連続希釈濃度について計算し、ピークノイズ比に対するピークシグナルを計算し、各希釈について記録した。検出濃度限界は、３：１の信号対ノイズ比をもつ濃度であった。定量限界は、１５％と同等かそれより少ないＲＳＤをもつ最低限度であった。
【００４９】
３．結果
検証は完全であり、この方法が正確で特異的で信頼性のあることを示した。この方法を試験し、外部標準液が、ヒドロキシプロリン、グリシン及びプロリンの０．７５〜２４μｇ／ｍＬの範囲で直線性を示すことを実証した（図１）。ヒドロキシプロリン、グリシン及びプロリンの直線性相関係数（ｒ２値）は、各々、０．９９９±０．００１、０．９９９±０．００２、０．９９９±０．００１であった。この方法がヒドロキシプロリン、グリシン、及びプロリンを検出できる最低濃度は、順に、０．１２、０．０６及び０．１２μｇ／ｍＬであり、３：１の信号対ノイズ比で、これらの値を計算した。この方法で各標準液を定量することができる最低濃度は、ヒドロキシプロリンの０．２４μｇ／ｍＬ、グリシンの０．１２μｇ／ｍＬ、及びプロリンの０．２４μｇ／ｍＬである。これらの値は、信号対ノイズ比４：１の平均ピーク比、及び、７．１３の平均百分率相対標準偏差（％ＲＳＤ）を用いて計算した。
【００５０】
正確性／再現性の試験は、この方法の適格性の複雑な部分であり、非創傷ブタ組織に対して行った。代表的な皮膚組織クロマトグラムを図２に示す。ヒドロキシプロリン、グリシン、及びプロリンの保持時間は、各々１１．３分、１８．６分及び２４．９分であった。６個の個別のサンプルを処理し、日を変え及び／又は分析者を変えて、３つの別々の場合について分析した。次に平均及び相対標準偏差を、その場合毎に計算した。全体の平均値と全体の相対標準偏差を、全ての３つの場合の結果を用いて計算した。１つの場合の平均値は、５．２０％ＲＳＤで、全コラーゲン値２６８．２７μｇ／ｍｇであった。全平均値（全ての場合について）は、全体の相対標準偏差１０．７％で、全コラーゲン量２４０．８２μｇ／ｍｇであった。各場合の正確性／再現性の結果、及び全体平均値を表１に示した。この方法が皮膚組織サンプル中のコラーゲンを分析するのに正確であることを、この結果は示している。
2010504533.tif 000008
【００５１】
スパイキングスタディが、この方法の検定に含まれており、方法が正確であることを確認し、この方法が、正常で無傷の皮膚組織マトリックスからのバイアスを分析することなく、関心のあるピークに妨害が存在しないことを示す。１つの無傷の皮膚サンプルを用い、３種のアミノ酸全ての混液を含む０％、８０％、１００％、及び１２０％の６μｇ／ｍＬ濃度の標準液でデュプリケイトにてスパイクした。次いで、平均値と相対標準偏差を用いて各濃度について回収百分率を計算した。ヒドロキシプロリンの回収は、５．９３％ＲＳＤで１０１．０９％であった。グリシンの回収は、９．５２の％ＲＳＤで１１０．５０％であり、プロリンの回収の平均は、５．８９の％ＲＳＤで１０１．２３であった。各成分について理論上の濃度に対する実際の濃度の間の関係を示すプロットを作成した。相関係数、ｙ軸切片、及び勾配を各プロットについて計算した。各プロットの相関係数は、ヒドロキシプロリンについては０．９９５であり、グリシンについては０．９９８であり、プロリンについては０．９９５であった（図３）。１に近い相関係数は、実際の濃度が理論値に等しいことを示す。スパイクスタディの結果は、皮膚組織マトリックスからの妨害ピークがないことを確認した。
【００５２】
この方法が、新生の創傷治癒で見られる少量のコラーゲンを正確に測定することを確認するため、創傷から９日のブタ肉芽組織を分析し、そのデータを表２に示す。全てのサンプルは、標準曲線の直線部分内に入った。したがって、全サンプル中の全てのコラーゲン濃度を計算することができた。ブタ肉芽組織でみられた平均コラーゲン量は、５６．８４６μｇ／ｍｇであり、一方、正常無傷の皮膚で見られた平均コラーゲン量は２４０．８２３μｇ／ｍｇであった。
2010504533.tif 000009
【００５３】
４．考察
このＨＰＬＣ法は、ヒドロキシプロリンとその誘導体の溶出時間が接近しているため、注意深く最適化する必要がある。この処理中にさまざまなカラムで試験し、広いｐＨレンジをもつＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラムを用いて最良の結果が得られた。この方法は、非特許文献１０に記載のＵＳＰガイドラインに基づいて立証された。直線性の検討からの相関係数値（ｒ２）は、全ての分析試験が０．７５及び２４μｇ／ｍＬの間で直線性であったことを示す。スパイキングスタディからの回収が、この方法が正確であり、混乱させるバイアスが見つからないことを示した。方法の精度は、この試験の各場合にＲＳＤが３％以下という精度の結果をもたらしたことにより示された。この方法の正確性／再現性は、３つの異なる場合で１５％以下のＲＳＤをもたらし、全体で２０％以下であることにより示された。
【００５４】
初期の時点で創傷中に生じる少量のコラーゲンを定量するために用いる方法は、感度が高くなければならない。本発明は、正常、無傷のブタ皮膚を用いて立証され、一旦、立証されると、この方法は、ブタ肉芽組織中のコラーゲンを定量に用い、この組織でのコラーゲンの定量が本方法で設定した直線性の範囲に含まれることを保証した。本方法は、少なくとも０．７５から２４μｇ／ｍＬの範囲で、感度が高く、正確で、精度がよいことが証明された。この方法は、正常ブタ皮膚（〜２４１μｇ／ｍｇ生重量）で、ブタの肉芽創第９日（〜５７μｇ／ｍｇ）中のコラーゲン量の測定が可能であった。
【００５５】
本書で開示され請求の範囲に記載した組成物及び方法の全てを、本開示を考慮に入れて必要以上の実験なしに構成及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好適な実施例に関して説明する一方、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本書に記載の組成物及び方法及び方法のステップ又はステップの手順の様々な変更を適用してもよいことは、当業者にとって明らかである。さらに、同一又は類似する結果を得ながら本書に記載の薬剤を化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤に置き換えてもよいことに留意されたい。このような当業者に明らかに似たような置換及び変更全ては、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると考えられる。
【００５６】
参考文献
以下の参考文献が、本書の説明を補助する典型的な手続に関する又は他の詳細を与える限りにおいて、参照することにより本書に明確に取り込まれている。
【００５７】
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Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８１４，３２８
Ｓｅｃｔｉｏｎ  ５０１  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ，＜１２２５＞  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｎ：（２００４）Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ２７／  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ２２，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２００４，ｐｐ．２６２２−２６２５．
Ｔ．Ｍ．Ｄｅｖｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉ：Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｉｎ：Ｔ．Ｍ．Ｄｅｖｌｉｎ（Ｅｄ）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，２００６，ｐｐ．１０１
【図１】
2010504533.tif 000013
【図２】
2010504533.tif 000014
【図３】
2010504533.tif 000015
【国際調査報告】
2010504533.tif 000016