(57)【要約】  本明細書では、多数の同時化学反応を実施するための装置、システム、チップおよび方法が得られる。本発明のチップは、実施される反応の温度に応じてアドレス指定することができる、アドレス指定可能なユニットを含む。本発明の装置、システムおよびチップは、最大で対象とする生物体のゲノム全体の配列を含む数千もの核酸配列でポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに特に適している。
2010516281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板とナノウェルのアレイとを含むチップと熱的に接触して構成された少なくとも１つの加熱素子を含み、前記少なくとも１つの加熱素子が前記チップに対して相対的に移動するよう構成されている、装置。
【請求項２】
前記少なくとも１つの加熱素子が前記チップの上下から前記チップと熱的に接触し、前記チップの下から熱的に接触している前記加熱素子が、前記チップの上から熱的に接触している前記加熱素子の温度未満の温度に設定される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記チップが、上面と下面とを含み、第１のナノウェル群が前記上面の一方位に沿って配置され、第２のナノウェル群が前記第１のナノウェル群に直交する向きに配置されている、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記加熱素子が、ナノウェルのアレイを含む固定のチップの上または下に位置決めされる、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記加熱素子が、加熱冷却が可能なものである、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
複数の温度ゾーンに対応する複数の加熱素子を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記複数の温度ゾーンが、約５２℃から約９５℃の範囲内である、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記複数の温度ゾーンによって温度勾配が得られる、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記温度ゾーンのうちの少なくとも１つが約５２℃から約６５℃の範囲の温度に設定され、少なくとも１つの他の温度ゾーンが約９０℃から約９５℃の温度に設定される、請求項６に記載の装置。
【請求項１０】
約６８℃から約７２℃の範囲の温度に設定された少なくとも１つの他の温度ゾーンをさらに含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
少なくとも１つの加熱素子が、温度の経時的なスパイク波形を含む出力を提供するよう構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記アレイの個々のナノウェルの寸法が、長さ約２５０μｍ、幅約２５０μｍ、深さ約５２５μｍまたはそれ未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記チップが光信号を検出する光学系に作動的に接続されている、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記光学系が複数の光検出器を含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
ナノウェルの数が約３０，０００を超える、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記ナノウェルが約１００ｎｌを入れられるように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
反応試料を入れられるように構成されたチップを提供するステップと、
少なくとも１つの加熱素子と前記チップとの間を熱接触させるために、前記チップに対して位置変更が可能な少なくとも１つの加熱素子を提供するステップと、
前記チップの温度を変更することによって前記反応試料で化学反応を実施するステップとを含み、前記加熱素子が前記チップと熱的に接触するように前記少なくとも１つの加熱素子を前記チップに対して動かすことによって前記温度の変更が実現される、化学反応を実施する方法。
【請求項１８】
前記化学反応が核酸増幅反応である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの加熱素子の移動が、前記チップに作動的に接続された温度センサから生成される信号によって制御される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記反応試料が光信号を生成可能であり、前記チップが、前記反応試料から発せられる光信号を検出するよう構成された光学系に作動的に接続されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記光信号が、前記化学反応による生成物の量に比例する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記温度の変更が、各々異なる温度に設定された複数の加熱素子を動かすことによって実現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの加熱素子が約５２℃から約６５℃の範囲の温度に設定され、少なくとも１つの他の加熱素子が約９０℃から約９５℃の範囲の温度に設定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
各々が化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含み、前記アドレス指定可能なユニットのアレイが、所定の温度ゾーンに対応するように構成され、前記アレイの個々のユニットが、約１μｌ未満の化学反応混合物を保持するような寸法に形成される、反応を実施するためのチップ。
【請求項２５】
複数のアレイを含む、請求項２４に記載のチップ。
【請求項２６】
複数のアレイを含み、その各々が異なる温度ゾーンに対応している、請求項２４に記載のチップ。
【請求項２７】
複数のアレイを含み、前記アレイのうちの少なくとも１つが、核酸増幅反応を支持するためのアニーリング温度に設定され、少なくとも１つの他のアレイが、核酸増幅反応を支持するための変性温度に設定される、請求項２４に記載のチップ。
【請求項２８】
前記ゾーンをアドレス指定して所定の温度ゾーンを示す、請求項２４に記載のチップ。
【請求項２９】
前記アドレス指定可能なユニットのアレイが、６つ以上の所定の温度ゾーンに対応するよう構成される、請求項２４に記載のチップ。
【請求項３０】
前記チップが加熱素子と熱的に接触している、請求項２４に記載のチップ。
【請求項３１】
（ａ）各々が化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含み、前記アドレス指定可能なユニットのアレイが、所定の温度ゾーンに対応するように構成され、前記アレイの個々のユニットが、約１μｌ未満の化学反応混合物を保持するような寸法に形成される、反応を実施するためのチップと、
（ｂ）前記チップと熱的に接触している加熱素子と、を含む、少なくとも２段階の温度レベルを循環させる必要のある化学反応を実施するための装置。
【請求項３２】
前記アドレス指定可能なユニットのアレイが約３０，０００よりも大きい、請求項２４または３１に記載の装置。
【請求項３３】
（ｃ）前記チップと作動的に接続された光学系をさらに含み、前記光学系が、アドレス指定された温度による制御が可能なユニットからの光信号を検出する、請求項３１に記載の装置。
【請求項３４】
前記光学系が複数の光検出器を含む、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
複数の加熱素子をさらに含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３６】
前記複数の加熱素子が６つ以上の加熱素子を含む、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記アレイ内の個々のユニットが、試料を受け入れて限局するためのナノウェルを含み、前記ウェルが試料充填時に封止される、請求項２４または３１に記載の装置。
【請求項３８】
前記化学反応が核酸増幅反応である、請求項２４または３１に記載の装置。
【請求項３９】
ユニットの所定の温度が、均質な生成物の少なくとも９０％が前記化学反応から得られるように構成されている、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
（ａ）各々が化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含み、前記アドレス指定可能なユニットのアレイが、所定の温度ゾーンに対応するように構成され、前記アレイの個々のユニットが、約１μｌ未満の化学反応混合物を保持するような寸法に形成される、反応を実施するためのチップを提供するステップと、
（ｂ）所定の一組の温度に基づいて複数の反応試料を前記チップのユニットに配置するステップと、
（ｃ）加熱素子を制御して少なくとも２段階の温度レベルを循環させるステップとを含む、複数の反応試料を伴い、かつ少なくとも２段階の温度レベルの循環を必要とする、反応を実施する方法。
【請求項４１】
前記チップのアレイ内の個々のユニットが、前記試料を受け入れて限局するためのナノウェルを含み、前記ウェルが試料充填時に封止される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記化学反応が核酸増幅反応である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ユニットの所定の温度が、均質な生成物の少なくとも９０％が前記化学反応から得られるように構成されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
（ａ）化学反応を含むための複数のナノウェルを含むチップを収容するよう構成された本体と、
（ｂ）第１の温度を提供する第１の加熱器および第２の温度を提供する第２の加熱器と、を含み、
前記第１の加熱器および前記第２の加熱器が、第１の方位と第２の方位との間で移動可能なように構成され、前記第１の方位が前記加熱器を試料ホルダと熱的に接触させ、前記第２の方位が前記加熱器を前記試料ホルダと熱的に接触させない、少なくとも２段階の温度レベルの循環を必要とする化学反応を実施するための装置。
【請求項４５】
前記複数のナノウェルがアドレス指定可能であり、前記ナノウェルのうちの少なくとも１つがアドレス指定されて、前記ナノウェル内で化学反応を実施するための所定の温度を示すように、前記ナノウェルが所定の一組の温度に基づいて配置される、請求項４４に記載の装置。
【請求項４６】
前記複数のナノウェルが約３０，０００を超えるナノウェルを含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項４７】
前記第１の加熱器が複数の温度ゾーンを含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項４８】
前記温度ゾーンが６つ以上の温度ゾーンを含む、請求項４７に記載の装置。
【請求項４９】
前記複数の温度ゾーンが所定の一組の温度に対応し、これに基づいて温度による制御が可能なユニットがアレイ化されている、請求項４８に記載の装置。
【請求項５０】
前記第１の加熱器および第２の加熱器が、プロトコールに従って第１の方位と第２の方位との間を移動する、請求項４４に記載の装置。
【請求項５１】
前記第１の方位と第２の方位との間で前記第１の加熱器および第２の加熱器を移動させるためのモータをさらに含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項５２】
前記第１の加熱器によって温度勾配が得られる、請求項４４に記載の装置。
【請求項５３】
前記第１の加熱器と熱的に接触しているヒートシンクをさらに含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項５４】
前記第２の加熱器と熱的に接触しているヒートシンクをさらに含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項５５】
前記ヒートシンクから熱を取り除くためのファンをさらに含む、請求項５３または５４に記載の装置。
【請求項５６】
前記チップに作動的に接続された複数の温度センサをさらに含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項５７】
前記複数の温度センサが、各温度ゾーンの温度を測定するよう割り当てられた少なくとも１つの温度センサを有する、請求項５６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２００７年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／８８６，０６７号ならびに、２００７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／０１６，３７７号の利益を主張するものであり、これらの出願全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
１９８３年にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が誕生し開発がはじまって以来、ＤＮＡを同定、操作、複製する上での将来性が大幅に広がり、分子生物学の世界に革新的な変化がもたらされた。そして、科学研究、臨床検査、法鑑定、環境についての研究など、ＰＣＲを利用するための多数の異なる用途が開発されている。
【０００３】
ヒトゲノムの配列決定を受けて、推定で３０，０００におよぶヒト遺伝子のゲノム解析が、生化学および薬学分野における基礎・応用研究の主な焦点となっている。遺伝子を解析して操作することで、多岐にわたる機能障害のための診断、医薬品、治療法を開発できる可能性がある。診断装置では患者から得た小さな試料を利用することが多いが、診断目的で採取した患者の試料は一般に数や量にかぎりがあるため、１つの試料で実施できる試験の回数がわずかしかない。したがって、小さな試料１つから多数の遺伝子または核酸配列を解析できる小型装置に対する需要がある。
【０００４】
遺伝子治療の開発も研究者と製薬関係者（pharmaceuticals）の両方にとって主な関心の的となっている。新規な治療法を開発して新たな治療標的を認識するには、ある生物体のゲノム全体のすべてではないにしても大半を利用する、高スループットのスクリーニングが望ましいであろう。また、個体から採取した試料のゲノム全体を配列決定して増幅する機能によって、患者に合わせた医薬品の開発への道が開ける可能性もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現時点で入手可能なＰＣＲマイクロプレートおよびサーモサイクラーの多くが、手頃な費用で大量のＰＣＲを実施することには対応していない。多くの反応で、個体の配列それぞれの分析に必要な試料の容積がマイクロリットル台になる。数千もの遺伝子を配列決定または増幅する場合、個体または個体群から得る必要のある試料の量が非実用的であることも珍しくない。また、多数の配列を扱うのであれば、反応の感度や特異性もＰＣＲ実施時の大きな問題となる。さらに、配列のＰＣＲ増幅に必要なアニーリング温度が配列によって１５℃ほど変動することがある。比較的小さな試料の数千の遺伝子を配列決定するには、サーマルサイクリング装置を異なる温度範囲に適応させる必要がある。
【０００６】
近年、ナノファブリケーション技術が進歩したことで、電気素子、光学素子、化学的素子または機械的素子と一体化された小型装置を生産できるようになった。この技術によって、低圧蒸着、フォトリソグラフィ、エッチングをはじめとするさまざまな製造技法が具体化されている。これらの技法に基づいて、ナノ加熱器に接続されたシリコンチャネルを含む小型装置が提案されている（たとえば、米国特許第６，９６２，８２１号、同第６，０５４，２６３号、同第５，７７９，９８１号、同第５，５２５，３００号を参照のこと）。こうしたチャネルまたはチャンバを利用する設計は、原理的には熱質量と反応容積を小さくするものであるが、依然として他に実用上の欠点がある。特に、設計によるチャネルまたはチャンバには、温度と蒸発を制御する点で制限がある。
【０００７】
このような装置またはシステムは、診断試験、製薬開発、患者に合わせた医薬品に大幅に役立つであろう。本発明は、こうした需要を満たすと同時に、関連の利点も提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
一般に、一態様では、基板とナノウェルのアレイとを含むチップと熱的に接触して構成された少なくとも１つの加熱素子を含み、少なくとも１つの加熱素子がチップに対して相対的に移動するよう構成されている装置が得られる。
【０００９】
一実施形態では、加熱素子がチップの上下からチップと熱的に接触し、チップの下から熱的に接触している加熱素子が、チップの上から熱的に接触している加熱素子の温度未満の温度に設定される。別の実施形態では、チップが、上面と下面とを含み、第１のナノウェル群が上面の一方位に沿って配置され、第２のナノウェル群が第１のナノウェル群に直交する向きに配置されている。加熱素子は、ナノウェルのアレイを含む固定のチップの上または下に位置決め可能であり、なおかつ加熱冷却が可能なものである。
【００１０】
一実施形態では、この装置が、複数の温度ゾーンに対応する複数の加熱素子を含む。複数の温度ゾーンは、約５２℃から約９５℃の範囲内であり得る。別の実施形態では、複数の温度ゾーンによって温度勾配が得られる。温度ゾーンのうちの少なくとも１つを、約５２℃から約６５℃の範囲の温度に設定可能であり、他の温度ゾーンの少なくとも１つを、約９０℃から約９５℃の温度に設定可能である。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの他の温度ゾーン約６８℃から約７２℃の範囲の延伸温度に設定可能である。
【００１１】
特定の実施形態では、少なくとも１つの加熱素子が、温度の経時的なスパイク波形を含む出力を提供するよう構成される。
【００１２】
一実施形態では、前記アレイの個々のナノウェルの寸法が、長さ約２５０μｍ、幅約２５０μｍ、深さ約５２５μｍまたはそれ未満である。
【００１３】
別の実施形態では、チップが光信号を検出する光学系に作動的に接続されている。この光学系は、複数の光検出器を含むものであってもよい。
【００１４】
一実施形態では、ナノウェルの数が約３０，０００を超える。別の実施形態では、ナノウェルが約１００ｎｌを入れられるように構成される。
【００１５】
一般に、別の態様では、反応試料を入れられるように構成されたチップを提供するステップと、少なくとも１つの加熱素子とチップとの間を熱接触させるために、チップに対して位置変更が可能な少なくとも１つの加熱素子を提供するステップと、チップの温度を変更することによって反応試料で化学反応を実施するステップとを含み、加熱素子がチップと熱的に接触するように少なくとも１つの加熱素子をチップに対して動かすことによって前記温度の変更が実現される、化学反応を実施する方法が得られる。
【００１６】
一実施形態では、化学反応が核酸増幅反応である。
【００１７】
別の実施形態では、少なくとも１つの加熱素子の移動が、チップに作動的に接続された温度センサから生成される信号によって制御される。
【００１８】
さらに別の実施形態では、反応試料が光信号を生成可能であり、チップが、反応試料から発せられる光信号を検出するよう構成された光学系に作動的に接続されている。光信号は、化学反応による生成物の量に比例するものであってもよい。
【００１９】
一実施形態では、各々異なる温度に設定された複数の加熱素子を動かすことによって温度の変更が実現される。別の実施形態では、少なくとも１つの加熱素子を約５２℃から約６５℃の範囲の温度に設定し、少なくとも１つの他の加熱素子を約９０℃から約９５℃の範囲の温度に設定する。
【００２０】
一般に、別の態様では、各々が化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含み、アドレス指定可能なユニットのアレイが、所定の温度ゾーンに対応するように構成され、前記アレイの個々のユニットが、約１μｌ未満の化学反応混合物を保持するような寸法に形成される、反応を実施するためのチップが得られる。一実施形態では、この装置は、複数のアレイを含んでいる。別の実施形態では、この装置が複数のアレイを含み、その各々が異なる温度ゾーンに対応している。一実施形態では、アレイのうちの少なくとも１つを、核酸増幅反応を支持するためのアニーリング温度に設定し、少なくとも１つの他のアレイを、核酸増幅反応を支持するための変性温度に設定する。
【００２１】
特定の実施形態では、ゾーンをアドレス指定して所定の温度ゾーンを示す。別の実施形態では、アドレス指定可能なユニットのアレイが、６つ以上の所定の温度ゾーンに対応するよう構成される。
【００２２】
一実施形態では、チップが加熱素子と熱的に接触している。
【００２３】
一般に、別の態様では、（ａ）各々が化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含み、アドレス指定可能なユニットのアレイが、所定の温度ゾーンに対応するように構成され、前記アレイの個々のユニットが、約１μｌ未満の化学反応混合物を保持するような寸法に形成される、反応を実施するためのチップと、（ｂ）チップと熱的に接触している加熱素子と、を含む、少なくとも２段階の温度レベルを循環させる必要のある化学反応を実施するための装置が得られる。
【００２４】
一実施形態では、アドレス指定可能なユニットのアレイが約３０，０００よりも大きい。
【００２５】
特定の実施形態では、この装置が、（ｃ）チップと作動的に接続された光学系をさらに含み、光学系が、アドレス指定された温度による制御が可能なユニットからの光信号を検出する。一実施形態では、光学系が複数の光検出器を含む。
【００２６】
一実施形態では、この装置は複数の加熱素子をさらに含んでいる。特定の実施形態では、複数の加熱素子が６つ以上の加熱素子を含む。一実施形態では、アレイ内の個々のユニットが、試料を受け入れて限局するためのナノウェルを含み、前記ウェルが試料充填時に封止される。別の実施形態では、化学反応が核酸増幅反応である。一実施形態では、ユニットの所定の温度が、均質な生成物の少なくとも９０％が化学反応から得られるように構成されている。
【００２７】
一般に、別の態様では、（ａ）各々が化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含み、アドレス指定可能なユニットのアレイが、所定の温度ゾーンに対応するように構成され、前記アレイの個々のユニットが、約１μｌ未満の化学反応混合物を保持するような寸法に形成される、反応を実施するためのチップを提供するステップと、（ｂ）所定の一組の温度に基づいて複数の反応試料をチップのユニットに配置するステップと、（ｃ）加熱素子を制御して少なくとも２段階の温度レベルを循環させるステップとを含む、複数の反応試料を伴い、かつ少なくとも２段階の温度レベルの循環を必要とする、反応を実施する方法が得られる。
【００２８】
一実施形態では、チップのアレイ内の個々のユニットが、試料を受け入れて限局するためのナノウェルを含み、前記ウェルが試料充填時に封止される。別の実施形態では、化学反応が核酸増幅反応である。さらに別の実施形態では、ユニットの所定の温度が、均質な生成物の少なくとも９０％が化学反応から得られるように構成されている。
【００２９】
一般に、さらに別の態様では、（ａ）化学反応を含むための複数のナノウェルを含むチップを収容するよう構成された本体と、（ｂ）第１の温度を提供する第１の加熱器および第２の温度を提供する第２の加熱器と、を含み、第１の加熱器および第２の加熱器が、第１の方位と第２の方位との間で移動可能なように構成され、第１の方位が加熱器を試料ホルダと熱的に接触させ、第２の方位が加熱器を試料ホルダと熱的に接触させない、少なくとも２段階の温度レベルの循環を必要とする化学反応を実施するための装置が得られる。
【００３０】
一実施形態では、複数のナノウェルがアドレス指定可能であり、ナノウェルのうちの少なくとも１つがアドレス指定されて、前記ナノウェル内で化学反応を実施するための所定の温度を示すように、ナノウェルが所定の一組の温度に基づいて配置される。特定の実施形態では、複数のナノウェルが約３０，０００を超えるナノウェルを含む。
【００３１】
一実施形態では、第１の加熱器が複数の温度ゾーンを含む。別の実施形態では、温度ゾーンが６つ以上の温度ゾーンを含む。さらに別の実施形態では、複数の温度ゾーンが所定の一組の温度に対応し、これに基づいて温度による制御が可能なユニットがアレイ化されている。一実施形態では、第１の加熱器および第２の加熱器が、プロトコールに従って第１の方位と第２の方位との間を移動する。
【００３２】
さらに別の実施形態では、この装置が、第１の方位と第２の方位との間で第１の加熱器および第２の加熱器を移動させるためのモータを含んでいる。
【００３３】
一実施形態では、第１の加熱器によって温度勾配が得られる。別の実施形態では、この装置が、第１の加熱器と熱的に接触しているヒートシンクをさらに含んでいる。異なる実施形態では、この装置が、第２の加熱器と熱的に接触しているヒートシンクをさらに含んでいる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、この装置が、ヒートシンクから熱を取り除くためのファンをさらに含んでいる。他の実施形態では、この装置が、チップに作動的に接続された複数の温度センサをさらに含んでいる。一実施形態では、複数の温度センサが、各温度ゾーンの温度を測定するよう割り当てられた少なくとも１つの温度センサを有する。
【００３５】
援用
本明細書で言及した刊行物および特許出願をすべて、個々の刊行物または特許出願を具体的かつ個別に援用した場合と同程度に、ここに援用する。
【００３６】
本発明の新規な特徴については、添付の特許請求の範囲に明記されている。例示を目的とした実施形態を記載した以下の詳細な説明を参照することで、本発明の特徴および利点をより一層理解することができる。かかる実施形態では、本発明の原理ならびに添付の図面が用いられている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
図面の簡単な説明
【図１】６つの小さなチップすなわち、アドレス指定された所定の異なる温度を示す、アドレス指定可能なユニットからなる６つのアレイを含む本発明のチップの一例としての実施形態を示す。
【図２】円形基板上の一例としてのチップレイアウトの上面図である。
【図３】チップ上のナノウェルを示す一例としてのチップレイアウトの上面図である。
【図４】一例としてのナノウェルチップの側面図の長手方向断面である。
【図５】各々が異なる温度ゾーンを示す一組の小さなチップを含む一例としての本発明の一例としてのチップを示す。
【図６】ナノウェルチップと一緒に少なくとも１つの加熱素子を有する、例示を目的とした一装置設計である。
【図７】温度ゾーンが２つ以上ある、本発明の一実施形態による装置の例示を目的とした図である。
【図８】頂部に実装された加熱素子と光学スキャナとを含む、本発明の一実施形態による装置の一実施形態の側面図である。
【図９】さまざまな時刻（ｘ軸）での装置の温度（ｙ軸）の変化をプロットしたグラフである。
【図１０】アーク灯で発生させることのできる一連の熱温度プロファイルを示す。各温度プロファイルは、加熱素子に対するチップ応答を示す。グラフの上の行（ａ）は経時的（ｘ軸）な温度変化（ｙ軸）を示す。グラフの下の行（ｂ）はチップの深さ（ｘ軸）に対するチップ温度（ｙ軸）を示す。
【図１１】サーマルサイクリング装置の加熱素子構成の例を示す。
【図１２】第１の方位と第２の方位との間で２つの加熱器が移動可能であり、第１の方位が試料ホルダと熱的に接触する、サーマルサイクリング装置の一例としての実施形態を示す。
【図１３】加熱器が、アドレス指定可能なユニットのあるチップと熱的に接触する第１の方位にあるときの図１２の例における第１の加熱器の側面図を示す。
【図１４】加熱器が異なる温度ゾーンに分けられた状態の本発明のサーマルサイクリング装置によって得られる温度プロファイルを示す。
【図１５】装置が、トップカバースライドと、チップまたは化学反応をトップカバースライドと光学的および／または熱的に接触させる力を供給できる加熱器とを含む、本発明の一例としての装置またはシステムを示す。
【図１６】本発明のサーモサイクリングシステムの一実施形態の概略図である。
【図１７】チップと、加熱装置と、反応結果を分析するための光学系とを含む本発明の一例としてのシステムを示す。
【図１８】光学系と、加熱装置と、化学反応を実施するためのチップとを含む本発明の一例のシステムである。
【図１９】本発明の具体的な実施形態によるシステムと連通する代表的な論理装置例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明は、チップ、サーマルサイクリング装置、複数の化学反応の実施ならびに個々の分子の多重分析のためのシステムおよび方法を提供するものである。また、本発明は、反応物質、条件および温度の厳密な制御の操作を可能にする小型の高度自動化装置および方法を提供するものである。
【００３９】
本発明は、生物体の全ゲノムを同時に分析するための方法、チップ、装置に関するものであってもよい。この方法の多くが、極めて小さな反応容積で実施するポリメラーゼ連鎖反応または同様の増幅方法を利用する、ヌクレオチドのゲノム混合物の定性分析および／または定量分析に関するものである。
【００４０】
推定で３０，０００におよぶヒト遺伝子を解析することで、薬学分野の応用研究ならびに、多岐にわたる機能障害のための診断、医薬品、治療法の開発のための方法が得られるかもしれない。たとえば、健常な個体と疾患のある個体との間の遺伝的な差を理解すれば、細胞および組織の生化学的構造と機能の差異を判断し、適切な治療介入を識別することが可能である。
【００４１】
一実施形態では、ゲノムが、ヒト、哺乳動物、マウス、シロイヌナズナ（Arabidopsis）または他の植物、バクテリア、真菌または動物種由来のものであってもよい。また、本発明を、特定の個体、動物または植物の診断と創薬に利用してもよい。
【００４２】
多くの場合、ある生物体のすべての遺伝子を試験して遺伝子発現プロファイルを判断すると望ましいことがある。このような試験は、単一の個体から得たＤＮＡまたはＲＮＡを、同一または異なる遺伝子の異なる変異に関連する配列変異体（単一ヌクレオチド多型すなわち「ＳＮＰ」など）あるいは、親からの異なる染色体セグメントの遺伝のマーカーとして機能する配列変異体の観点からスクリーニングする上でも有用な場合がある。このような試験は、たとえば、疾患の羅患性を予測、個体が遺伝子変異のキャリアであるか否かを判断、個体が副作用を生じやすいか否かまたは特定の薬剤に対して耐性であるか否かの判断をする、あるいは、他の診断、治療または研究目的で有用な場合もある。
【００４３】
チップ
本発明のチップの全体での大きさは可変であり、厚さ数ミクロンから数センチメートル、幅または長さ数ミリメートルから５０センチメートルの範囲であり得る。一般に、チップ全体の大きさは幅および／または長さ約１０ｍｍから約２００ｍｍ、厚さ約１ｍｍから約１０ｍｍの範囲である。いくつかの実施形態では、チップが幅約４０ｍｍ×長さ４０ｍｍ×厚さ３ｍｍである。
【００４４】
このチップは、それよりも小さな一組のチップであってもよい。たとえば、チップが６つの小さなチップを含み（アドレス指定可能なユニットのアレイが６つなど）、小さなチップ同士の間に熱緩衝材を設けた形にすることができる。一組の小さなチップとしてのチップを、本明細書ではプレートとも呼ぶ。例の実施形態では、６つの小さなチップ各々が、チップ全体のユニットのアレイがアドレス指定される対象となる、所定の異なる温度に対応する。
【００４５】
チップ上のユニットの総数は、本発明のチップを利用する予定の特定の用途に応じて変わってくる。チップ表面でのユニットの密度も特定の用途ごとに変わる場合がある。ユニットの密度（たとえば、基板の１ユニット表面積あたりのチャンバ数）、ユニットの大きさと容積についても、所望の用途ならびに、本発明の方法を利用する予定の生物体の種などの要因によって変わる場合がある。
【００４６】
本発明のチップには、多数のユニットを組み込むことができる。さまざまな実施形態において、チップ上のユニットの総数は約１０００から約２００，０００、より好ましくは５０００から約１００，０００である。他の実施形態では、チップが小さなチップを含み、その各々が約５，０００から約２０，０００のユニットを含む。したがって、大きいほうのチップが約３から約２０の小さなチップを含む場合、そこには約１５，０００から約４００，０００のユニットが含まれる。特定の実施形態では、チップが約１００，０００のユニットを含む。
【００４７】
たとえば、正方形のチップであれば、直径０．１ｍｍで１２５×１２５のナノウェルを含み得る。表Ｉに、本発明による一例としての特定のチップについて、ウェルレイアウト形式のいくつかの例を示す。上述したように、プレートは小さなチップを複数含むチップと等価である。表Ｉの例では、プレート１つに６つの小さなチップを含む。
【００４８】
【表１】
2010516281.tif 000003
【００４９】
表Ｉにおいて、ｍは水平軸方向のウェルの概算数であり、ｎは垂直軸方向のウェルの概算数であり、深さをｍｍ単位で示し、ウェル／チップ数とウェル／プレート数も概算である。
【００５０】
チップは、どのような大きさのものであってもよく、ユニットをいくつ含むものであってもよい。一実施形態では、本発明のチップを受け取るユーザまたは顧客が、大きさ、ユニット、ユニットにナノウェルを含むかどうかを選択する。好ましい実施形態では、本発明のチップ上のユニットで核酸増幅化学反応を実施する場合、ユーザは、ある種のゲノム全体の配列決定に必要な遺伝子数に応じてユニット数を選択することが可能である。
【００５１】
６つの小さなチップ１１０を含む実施形態の一例のチップ１００を図１に示す。小さなチップ１１０は、面積が３８ｍｍ×３９．５ｍｍであり、６つの小さなチップ１１０を含むチップ１００全体としての大きさは面積が約８５ｍｍ×１２９ｍｍである。この例では、小さなチップ１１０のウェルサイズが約４００μｍと大きい（図は正確な縮尺で示したものではない）。表Ｉに示したように、小さなチップ１１０は、ｍ×ｎ個の一連のナノウェル１２０を含み得る。この実施形態では、ｔ−ｍｍの壁厚１２２によってチップ上のナノウェル数を決めることができる。小さなチップ１１０の各々でチップ１００全体の所定の温度を表すことができるため、各ナノウェル１２０での反応温度に応じて小さなチップ１１０各々をアドレス指定することが可能である。また、全体としての大きいほうのチップ１００で複数の小さなチップ１１０を使用する場合、熱絶縁性のフレーム１３０を用いることで、アドレス指定可能な所定の各々の温度領域を互いに熱的に分離することが可能である。この例では、熱絶縁性フレーム１３０が厚さ３ｍｍであり、当業者であれば自明であろうように、雲母、ポリエチレンまたは他の任意の絶縁材料で作製可能なものである。
【００５２】
一実施形態では、全ゲノム高スループット遺伝子発現リアルタイムＰＣＲチップで３３，７５０のアッセイを実施できる。
【００５３】
ナノウェルについては、都合のよい大きさ、形状または容積で製造してもよい。ウェルは、長さ約１００μｍから約１ｍｍ、幅約１００μｍから約１ｍｍ、深さ約１００μｍから約１ｍｍにすることができる。さまざまな実施形態では、各ナノウェルのアスペクト比（幅に対する深さの比）が約１から約４である。一実施形態では、各ナノウェルのアスペクト比が約２である。横切断面は、円形、楕円形、卵形、円錐形、矩形、三角形、多面体または他の任意の形状であってもよい。ウェルの特定の深さ部分での横断面も大きさと形状を変えることができる。
【００５４】
一実施形態では、ナノウェルの容積を約１ｎｌから約１ｕｌとすることができる。ナノウェルは一般に、容積が１ｕｌ未満、好ましくは５００ｎｌ未満である。この容積は、２００ｎｌ未満または１００ｎｌ未満ですらあってもよい。一実施形態では、ナノウェルの容積が約１００ｎｌである。必要であれば、容積に対する表面積の比を大きくすることで、ユニットでの伝熱を容易にする（これによって、熱サイクルの傾斜時間を短縮できることがある）ようにナノウェルを製造することが可能である。
【００５５】
各ナノウェルのキャビティは多種多様な構成を取り得るものである。たとえば、ナノウェル内のキャビティを直線状または曲線状の壁で仕切り、独立しているが隣接するコンパートメントを形成してもよいし、円形の壁で仕切って内側と外側の環状コンパートメントを形成してもよい。
【００５６】
内面対容積比が大きいナノウェルには、そこに含まれる反応物がウェルの内面と相互作用する可能性を低くするための材料をコーティングしてもよい。試薬が望ましくない状態で内面と相互作用しやすいか内面に付着しやすい場合に、コーティングが特に有用である。反応物の特性に応じて、疎水性または親水性のコーティングを選択してもよい。多種多様な適切なコーティング材料が当該技術分野において入手可能である。こうした材料の中には、表面に共有結合できるものもあれば、非共有結合的な相互作用で表面と結合するものもある。コーティング材料の非限定的な例としては、ジメチクロロシラン（dimethychlorosilane）、ジメチジクロロシラン（dimethydichlorosilane）、ヘキサメチルジシラザンまたはトリメチルクロロシランなどのシラン化試薬、ポリマレイミド、酸化ケイ素、Aquasil(商標）、Surfasil(商標）などのシリコン処理試薬があげられる。別の好適なコーティング材料に、アミノ酸などのブロック剤あるいは、ポリビニルピロリドン、ポリアデニル酸およびポリマレイミドを含むがこれに限定されるものではないポリマーがあげられる。
【００５７】
特定のコーティング材料を、強く加熱するか放射線を当てる、あるいは化学反応によって、表面に架橋させることが可能である。当業者であれば、チップのナノウェルをコーティングするための他の好適な手段が分かるであろうし、必要以上に実験をすることなくこれを確かめることができよう。
【００５８】
一実施形態では、チップの個々のユニットが、試料を受け入れて限局するためのナノウェルを含み、前記ウェルが試料充填時に封止される。
【００５９】
液体を通さない物理的な障害物を使って、アレイ内の個々のユニットを互いに分離することが可能である。一態様では、これらのユニットは、ナノウェルと呼ばれる、くぼんだ部分を含むものであってもよい。ナノウェルは上部が開口していてもよいが、液体の通過を制限するために物理的に他のウェルとは隔てられている。よって、このナノウェルには、反応試料を受け入れて限局するのに適した少なくとも１つのキャビティがある。１つのナノウェルを周囲の環境から分離して液体の通過を制限するには、ナノウェルを封止してもよい。好ましい実施形態では、ナノウェルを封止する方法が、ウェル内の試料の上に鉱物油を堆積させて試料を限局することである。鉱物油であればナノ分注が可能である。ナノウェルの封止は、当業者間で明らかであろうどのような方法で行ってもよい。
【００６０】
多くの用途では、ナノウェルを封止して液体の蒸発を防止すると望ましいため、サーマルサイクリングの最初から最後まで好ましい反応濃度を維持する。よって、ナノウェルのアレイを封止するための手法を採用できる。有用な封止法では、いくつかの要因を考慮に入れている。第１に、この方法は大量のナノウェルの処理時に最初から最後まで高い。第２に、この方法は、個々のナノウェルの選択的封止を可能にするものでなければならない。この方法自体、封止したナノウェル間に所望のパターンまたは形式で散在する、開放状態のナノウェルを含むチップを生成できるものである。開放状態および／または未充填のウェルは、熱の受動的な散逸を可能にするだけでなく、隣り合ったナノウェル間の伝熱も低減可能なものである。
【００６１】
別の封止方法を用いると、少なくとも１つの開放状態のウェルを含むナノウェルのアレイが得られる。この方法は、（ａ）少なくとも１つの開放状態のナノウェルの開放面を画定する周囲に沿って放射線硬化型接着剤を塗布するステップと、（ｂ）封止対象となる少なくとも１つの開放状態のナノウェルの開放面を画定する周囲を包囲するためのカバーを配置するステップと、（ｃ）アレイを放射線ビームに曝露して封止を実施するステップと、を含み得る。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「放射線硬化型接着剤」とは、放射線ビームへの曝露時に強く加熱しなくても硬化して接着面に結合する組成物を示す。「放射線ビーム」とは、周波数の低い順に、赤外線、可視光、紫外（ＵＶ）光、Ｘ線、γ線をはじめとするエネルギ電磁波を示す。膨大な数の放射線硬化型接着剤が市販されている（たとえば、ThomasNet（登録商標）のＷＷＷサイトにある放射線硬化型接着剤および放射線システムを販売している企業の一覧を参照のこと）。このような材料としては、さまざまな周波数の放射線ビームで硬化可能な多様なアクリル、アクリレート、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリエステル、ビニル、ビニルエステル、膨大な数のエポキシがあげられる。上記の放射線硬化型材料ならびに他の放射線硬化型材料は、ペースト、粉末、樹脂、テープなどの液体または固体の状態で商業提供されている。
【００６３】
放射線硬化型接着剤に何を選択するかは、接着対象となる表面の材料構成に左右される。上述したクラスの接着剤は、広範囲にわたる材料で作製可能なカバーにチップ基板を接着するのに適している。たとえば、ガラス、セラミック、半金属、半導体（たとえば、ケイ素、シリケート、窒化ケイ素、二酸化ケイ素、石英、ガリウムアルセナイド）、プラスチック、他の有機ポリマー材料から選択される任意の材料で作製される２つの表面を放射線封止するのに、アクリルおよびエポキシが適用可能である。使用温度が低く硬化時間が短いという特性を持つ放射線硬化型材料が、本発明のチップの封止に望ましいものとなり得る。これらの材料を用いると、短時間での封止が可能であり、チップ内の化学試薬または生物試薬に対して放射線の悪影響がおよぶのを回避できる。
【００６４】
放射線硬化型接着剤は、ナノウェルの開放面を画定する周囲に沿ってどのような機械的手段でも塗布可能なものである。「周囲」は、チップ基板またはカバーの境界であってもよい。いずれの場合も、接着剤の硬化時に周囲がそれぞれの接着面である基板またはカバーに結合される。放射線硬化型接着剤は、好適な任意の道具を使って周囲に塗布、印刷、分注または噴霧可能なものである。機械的な手段であれば、周囲に接着剤の均一な層を形成できる。均一な分布を得るための１つの方法に、メッシュのスクリーンマスクとスキージを使って開放状態のウェルの周囲に接着剤を直接塗布することがある。あるいは、メッシュのスクリーンマスクを使用して、周囲のマークを付けておいたカバーに放射線硬化型接着剤を直接塗布してもよい。マスクを取り除けば、接着剤の均一な層が得られる。
【００６５】
放射線硬化型接着剤を塗布したら、ナノウェルにカバーをのせて、ウェルの開放面を画定する周囲を包囲する。好適なカバーは一般に、放射線ビームを透過できる材料で作られる。好ましいカバーは、ガラス、石英、プラスチック、当業者間で公知の好適な有機ポリマー材料またはこれらの組み合わせなどの透明材料で製造される。
【００６６】
カバーで覆ったナノウェルの封止は、ウェルを放射線ビームに曝露して行うことが可能である。選択した接着剤のタイプに応じて、放射線ビームは、従来の白熱光源、レーザ、レーザダイオード、ＵＶ電球、Ｘ線装置またはγ線装置などを光源とするものであり得る。必要であれば、選択した特定のウェルだけが封止されるよう、放射線源からの放射線ビームがナノウェルアレイの選択した場所だけに到達できるようにする。選択的封止は、ナノウェルの場所にパターン形成したフォトマスクを使ってなされることが多い。フォトマスクに、透明な場所と不透明な場所を作り、これがそれぞれ封止対象となるナノウェルと開放状態のままにしておくナノウェルに対応する。放射線ビームは透明領域を難なく通過するが、不透明の領域では反射するか吸収される。したがって、選択したナノウェルだけが光に曝露され、接着剤が硬化して封止されることになる。フォトマスクには、隣接する２つの開放状態のナノウェルが封止されないようにパターンを形成することが可能である。フォトマスクには、得られるナノウェルアレイで封止されたウェルと封止されていないウェルが交互になるようにパターンを形成すればよい。当業者であれば、どのようなパターンでも無制限の数のフォトマスクを作り、任意の形式で開放状態のナノウェルと封止されたナノウェルのあるチップを形成できる。このようなフォトマスクを製造するための方法は、当該技術分野において十分に確立されているため、ここでは詳細な説明を割愛する。
【００６７】
図２は、シリコンウェハ２００で作られた別のチップ３００を示す代表的な概略図である。好ましいシリコンチップは全体の大きさが厚さ約５００ミクロンであり、幅または長さについては望ましいナノウェル数によってどのような値であってもよい。このようなシリコンウェハ２００は、直径６インチ（１５０ｍｍ）、厚さ６２６μｍである。チップ３００は、このようなウェハ２００から製造可能であり、当該チップは、一辺２１０に沿って約８５．４８ｍｍ、他辺２２０に沿って１２７．７６ｍｍ、チップの対角線２５０に沿って１５０ｍｍである。製造時、チップはＳＢＳ基準に準拠したｑＰＣＲチップである。チップ上に製造されるナノウェルの総数は、本発明のチップを利用する特定の用途によって違ってくる。膨大な数の反応の同時実施という需要に対応するために、本発明のチップは一般に、少なくとも１００のナノウェル、より一般には３０，０００を超えるナノウェルを有する。チップ表面でのナノウェル密度は特定の用途ごとに変わる場合がある。たとえば、チップ表面でのナノウェルの密度は、１ｍｍ２あたりのナノウェル数で約１から約１０００の範囲であり得る。別の例では、チップでのナノウェル密度は１ｍｍ２あたりのナノウェル数で約１０から約１００の範囲であり得る。
【００６８】
図３は、代表的なナノウェル３０２を含むチップ３００の表側の説明図である。一例としての一実施形態では、チップ３００のナノウェル３０２は長さ０．２５ｍｍ、幅０．２５ｍｍ、ナノウェル３０２の中心から中心までの間隔が０．３４８ｍｍである。ナノウェル３０２の中心から中心までの間隔は必要に応じて決めればよく、たとえば２ｍｍから０．０１ｍｍの間隔を想定している。本発明のチップのナノウェルは、図３に示すような特定のパターンで格子を形成するような行と列など、チップの表面上または表面の端から端までどのような形式にアレイ化してもよいものである。好ましい実施形態では、市販の流体処理装置の設計が必要ないように、試薬の分注および／またはアッセイの読み取り用の既存の機器類に合った形式でナノウェルをアレイ化する。図３の例のように、チップは少なくとも２４６のナノウェル、より好ましくは少なくとも３６７のナノウェル、より好ましくは少なくとも４５，１４１のナノウェル、さらにより好ましくは少なくとも９０，２８２のナノウェルを含むものであってもよい。チップのナノウェル数は９０，２８２またはそれよりも多い数であってもよいが、ナノウェル数は通常、約１，４４４，５１２ナノウェルを超えられないことが想定される。チップの好ましい実施形態のナノウェル数は、各列に８２の遺伝子をトリプリケートで、すべての行に３０，０９４の遺伝子をトリプリケートで持たせられるだけの数である。このような好ましい一実施形態として、ウェル数はヒトゲノム全体をトリプリケートでスクリーニングできるだけの数である。チップのナノウェル数に、他の生物体のゲノムでも発現された遺伝子の組全体を増幅するための適切な反応ウェルを含み得ることが想定される。
【００６９】
図４は、図３に示すような一例としてのチップ３００の第２の層の横断面側面図である。図４は、厚さ０．６２５ｍｍのチップ３００の非限定的な例を示す。図４はまた、長さと幅が０．２５ｍｍ（２５０μｍ）の寸法のウェル３０２各々も示す。図示のように、ウェルの下にチップを０．１ｍｍ残してナノウェルの深さを０．５２５ｍｍ（５２５μｍ）とすることができる。ナノウェルの開口が、丸、正方形、矩形または他の所望の幾何学的形状からなる形状を含み得ることが想定される。一例として、ナノウェルは、直径または幅約１００μｍから約１ｍｍ、ピッチまたは長さ約１５０μｍから約１ｍｍ、深さ約１０μｍから約１ｍｍを含み得る。各ナノウェルのキャビティは、多種多様な構成を取り得る。たとえば、ナノウェル内のキャビティを直線状または曲線状の壁で仕切り、独立しているが隣接するコンパートメントを形成してもよい。
【００７０】
チップのナノウェルは、一般に知られているフォトリソグラフィ法で形成できるものである。湿式ＫＯＨエッチング法または異方性ドライエッチング法でナノウェルを形成できる。
【００７１】
内面対容積（ration）比が大きいナノウェルには、そこに含まれる反応物がナノウェルの内面と相互作用する可能性を低くするための材料をコーティングしてもよい。また、抵抗加熱材料でチップを作製することも可能である。材料の非限定的な例としては、アルミニウム基板およびステンレス鋼基板（ＳＳ−３１６など）といった金属板があげられる。使用する基板が金属である場合、通常は表面に絶縁層をコーティングして、流体試料を用いる動作時の試料成分の腐蝕および／または電気泳動を防止すると好ましい。非金属加熱材料の場合には通常、コーティングは必要ない。ＳｉＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、テフロン（登録商標）などで作られたものをはじめとして、多種多様な保護コーティングが入手可能である。図４には、個々のウェル３０２がＫＯＨでエッチングされ、ＳｉＯ２で層状に構成されたチップ３００を示す。
【００７２】
また、図４は、ナノウェルの少なくとも２つの対向するアレイを含む例示を目的としたチップも示す。この図では、チップ３００には上３６０と底３６２の面がある。アレイのうちの１つを上面３６４に沿って配置し、他を対向するアレイで下面３６８に沿って配置する。各ユニットの開放面がチップの対向するユニットの開放面とは逆を向くように、底側のアレイのナノウェルは逆向きに位置決めされている。対向する２つのアレイを、各ナノウェルの基部が対向するアレイの基部と直接向き合うように配置してもよい。
【００７３】
図４には具体的に明示していないが、上３６４および／または底３６８側のアレイのナノウェルはいずれも、封止されていても未封止であってもよい。また、上側のアレイのナノウェルを充填または未充填とし、反応試料がある状態にしてもよいし、ない状態でもよい。次に、チップを外部の加熱素子と接触させることで、本発明のチップを加熱素子と熱的に接触させる。
【００７４】
本発明のチップのナノウェルの表面をさらに変化させて、反応試薬用の吸着部位を作製することも可能である。これらの部位は、有機または無機の単純分子または複合分子、ペプチド、タンパク質（たとえば抗体）またはポリヌクレオチドなど、生物学的または化学的な化合物を結合するためのリンカー部分を含むものであってもよい。化学的または生物学的反応物を固定化するための吸着部位の作製には多くの方法があることは、当業者であれば理解できよう。たとえば、共有結合または非共有結合のいずれかで、核酸およびアミノ酸をチップに直接固定化し、これらをリンカー部分にアンカーし、あるいはこれらを固定化部分につなぐための豊富な技法を利用できる（たとえば、Methods Mol. Biol. Vol. 20(1993)、Beier et al.,Nucleic Acids Res. 27:1970-1-977(1999)、Joos et al.,Anal. Chem. 247:96-101(1997)、Guschin et al.,Anal. Biochem. 250:203-211(1997)を参照のこと）。ナノウェルの表面をプラズマエッチ処理し、プローブまたはプライマーを固定化できるようにしてもよい。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「化学反応」という用語は、物質の化学的な特性の変化を伴うプロセスを示す。このようなプロセスは、タンパク質、糖タンパク質、核酸、脂質、無機化学物質またはこれらの組み合わせなどの生体分子を伴う極めて多岐にわたる反応を含む。本発明のチップには、異なる温度が望ましい化学的用途および生物学的用途にさまざまな使用がある。化学反応でも、核酸分子間、タンパク質間、核酸とタンパク質との間、タンパク質と小分子との間の相互作用を伴うことがある。プロセスが酵素で触媒される場合は、これは「酵素反応」とも呼ばれる。
【００７６】
ほとんどの酵素は特定の温度下でしか機能しないため、本発明のチップおよび他の装置は酵素反応を実施する上で特に有用である。特に温度依存性の高い代表的な酵素反応としては、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）などの核酸増幅、核酸配列決定、逆転写、核酸ライゲーションがあげられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、本発明のチップで実施される核酸増幅反応がリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応である。別の実施形態では、核酸増幅反応が逆転写共役ポリメラーゼ連鎖反応である。
【００７７】
本発明のチップは、核酸を増幅するためのコスト効率のよい手段を提供するものである。従来のマイクロタイタープレートとサーマルサイクラーを用いる場合とは違って、本発明のチップは超小型であり、独立した熱プロトコールのもと、小さな容積で膨大な数の標的核酸を短時間で増幅できる。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「核酸増幅」とは、標的核酸のコピー数を増加させる酵素反応を示す。このような増加は、線形の場合もあるし指数関数的な場合もある。Taqポリメラーゼ、Pfuポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、E.coliＤＮＡポリメラーゼのKlenowフラグメントおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素など）といった天然または組換えのＤＮＡポリメラーゼで増幅を実施することができる。
【００７９】
通常、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の目的は、最初に供給された小さな容積の標的または種子ＤＮＡと同一のＤＮＡを大量に製造することである。反応には、ＤＮＡの鎖をコピーし、以後のサイクルでこのコピーを使って他のコピーを生成することを含む。各サイクルで、存在するＤＮＡの量が倍になるため、反応混合物中に存在する標的ＤＮＡ鎖のコピーの容積が幾何学的に大きくなっていく。
【００８０】
ＰＣＲの基本手順については、米国特許第４，６８３１９５号（Mullis）および同第４，６８３，２０２号（Mullisら）に教示されている。簡単に説明すると、ＰＣＲによる核酸の増幅には、ＤＮＡを熱変性させ、増幅対象となる標的核酸セグメントに隣接する配列に２つのプライマーをアニーリングし、アニール後のプライマーをポリメラーゼで伸長させることからなるサイクルの繰り返しが必要である。プライマーは標的核酸の対向する鎖にハイブリダイズされ、ポリメラーゼによる合成がプライマー間のセグメントで進行して標的セグメントの量が効果的に倍になっていくような配向となる。さらに、伸長生成物も相補的であってプライマーを結合できるため、連続したサイクル各々が前のサイクルで合成された標的核酸の量を実質的に倍にするものとなる。これによって、特定の標的核酸が約２ｎの比率で指数関数的に累積していく。ここで、ｎはサイクル数である。
【００８１】
一般的な従来のＰＣＲサーマルサイクリングプロトコールは、（ａ）９０℃から９５℃の範囲での変性、（ｂ）５０℃から６８℃の範囲の温度でのアニーリング、（ｃ）６８℃から７５℃で伸長というサイクルを３０サイクル含む。本発明のチップでは、反応容積が小さく、加熱質量が小さく、熱を散逸させる効果的な特徴の設計を採用していることも一部の理由となって、サーマルサイクリング時間を劇的に短縮することができる。
【００８２】
本発明のチップを逆転写ＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に採用することも可能である。ＲＴ−ＰＣＲは、従来のＰＣＲに対する別の変形例であり、まずは逆転写酵素がＲＮＡ分子を二本鎖ｃＤＮＡ分子に変換し（covert）、続いてこれをポリメラーゼ連鎖反応の以後の増幅でのテンプレートとして利用する。ＲＴ−ＰＣＲを実施するにあたって、逆転写酵素は一般に、標的核酸を熱で変性させた後で反応試料に添加される。その上で十分な長さの時間（たとえば５〜６０分間）反応を好適な温度（たとえば３０〜４５℃）に維持し、予定した増幅サイクルを開始する前にｃＤＮＡテンプレートを生成する。この反応は、遺伝情報がＲＮＡ分子に記憶されている生物学的実体を検出するのに特に有用である。このカテゴリの生物学的実体の非限定的な例として、ＨＩＶウイルスおよび肝炎ウイルスなどのＲＮＡウイルスがあげられる。本発明で具体化されるＲＴ−ＰＣＲの別の重要な用途に、被検試料で検出されたｍＲＮＡレベルに基づく生物学的実体の同時定量化がある。定量結果が望ましいのであれば、増幅された核酸の相対コピーを維持または制御する方法を用いるよう注意を払わなければならないことは、当業者であれば理解できよう。
【００８３】
核酸の「定量的」増幅の方法は当業者間で公知である。たとえば、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、同じプライマーを使って公知の量の制御配列を同時に共増幅することを要する場合がある。これによって、ＰＣＲ反応の較正に使用できる内部標準が得られる。他のｑＰＣＲ実施方法も当該技術分野において利用可能である。
【００８４】
核酸増幅は一般に、増幅試薬を用いて実施される。増幅試薬は一般に、酵素、水性緩衝液、塩、プライマー、標的核酸、ヌクレオシド三リン酸を含む。文脈に応じて、増幅試薬は、完全な増幅反応混合物または不完全な増幅反応混合物のいずれかである。
【００８５】
本発明のチップに含まれる試薬は、実施される反応によって決まる。一実施形態では、アドレス指定可能なユニットのアレイのユニットのうちの少なくとも１つが、核酸増幅反応を実施するための試薬を含む。試薬は、イムノアッセイ、核酸増幅を含むがこれに限定されるものではない核酸検出アッセイのための試薬であってもよい。試薬は、チップのユニットで乾燥状態であっても液体状態であってもよい。
【００８６】
一実施形態では、核酸増幅反応を実施できるチップのアドレス指定可能なユニットのアレイのユニットの少なくとも１つが、プローブ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰのうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、チップのナノウェルが、プローブ、プライマー、ポリメラーゼを含む溶液を含む。さまざまな実施形態では、各チャンバが、（１）前記標準ゲノム内のポリヌクレオチド標的用のプライマー、（２）プライマーが前記標的に結合すると濃度依存性信号を発する前記プライマーに関連したプローブを含む。
【００８７】
さまざまな実施形態では、各ユニットが、ゲノム内のポリヌクレオチド標的用のプライマーと、プライマーが標的と結合したときに濃度依存性信号を発する、このプライマーに関連したプローブを含む。
【００８８】
別の実施形態では、チップの少なくとも１つのユニットが、フォワードＰＣＲプライマー、リバースＰＣＲプライマー、少なくとも１つのFAM標識ＭＧＢ消光ＰＣＲプローブを含む溶液を含む。
【００８９】
一実施形態では、プライマー対をユニットに分注した後に、凍結などの方法で乾燥させる。このようにしておくと、ユーザは、試料、プローブおよび／またはポリメラーゼなどを選択的に分注（ナノ分注）することが可能である。
【００９０】
本発明の他の実施形態では、上記の溶液のいずれかを乾燥状態でナノウェルに含むようにしてもよい。この実施形態では、乾燥した状態のものをウェルにコーティングする、あるいはウェルの底に送るようにしてもよい。ユーザは、解析前に水と試料との混合物を各ウェルに加えることができる。
【００９１】
この実施形態では、乾燥させた反応混合物を含むチップを、別の場所に保管または出荷されたライナで封止してもよい。ライナは、接着剤の均一性を損なうことなく無事に剥離可能なものである。ライナは、識別する上で役に立ち、なおかつ取り扱い易くするために、カバーとは見た目が異なっている。ライナの材料は、接着剤から剥がす際に静電荷の生成を最小限に抑えるよう選択される。ユーザがチップを使える状態になったら、封止を破ってライナを取り除き、試料をチップのユニットに入れる。その上で、チップを封止して加熱素子と接触させることができる。
【００９２】
多くの用途で、ユニット（たとえば、ナノウェル）を封止して液体の蒸発を防止すると望ましいため、サーマルサイクリングの最初から最後まで好ましい反応濃度を維持する。
【００９３】
また、遺伝子型決定、遺伝子発現あるいは、ＰＣＲで実施される他のＤＮＡアッセイのためにチップを利用してもよい。プレートで実施されるアッセイは、Taqman、Invader、Taqman Gold、SYBR gold、SYBR greenなどのＤＮＡアッセイに限定されるものではなく、レセプター結合、酵素、他の高スループットスクリーニングアッセイなどの他のアッセイも含む。いくつかの実施形態では、ＲＯＸ標識プローブを内部標準として利用する。
【００９４】
また、本発明は、試料をナノウェルに入れて反応混合物を生成し、チップのナノウェルを鉱物油または別の封止機構で封止し、チップをサーマルサイクリングシステムに入れ、システムを循環させ、結果を分析することを含む、最初から組み込まれている複数のナノウェルを含むチップを使用してＰＣＲ解析を実施するための方法を提供するものでもある。
【００９５】
本発明によれば、チップのユニットは、マルチプレックスＰＣＲの実施に使用可能な溶液を含む。好ましい実施形態では、このユニットは、溶液に含まれる化学物質とプローブに基づいて、個々のユニットそれぞれで複数のＰＣＲ反応を行うことができる。「マルチプレックスＰＣＲ」とは、同じ１つのユニットで２以上のプライマー対を使用することである。この方法は、一方のプライマー対が標的を増幅し、他方のプライマー対が内因性基準を増幅する相対定量に使用可能である。マルチプレックス反応は、Standard Curve MethodまたはComparative Ct Methodをはじめとする多種多様な方法で実施可能である。
【００９６】
励起波長が約４８５ｎｍから、発光波長が約５１０〜５２０ｎｍのカルボキシ−フルオレセインであるFAM；ＲＴ−ＰＣＲで普通に用いられ、励起波長が約４８８ナノメートル、発光波長が約５１０ナノメートルのSYBR Green 1；発光波長が約５１７ナノメートルから約５３８ナノメートルのTET；発光波長が５２５〜５３５ｎｍから約５４６〜５５６ｎｍである、HEX、JOEおよびVIC群のプローブ；カルボキシ−テトラメチルローダミンであり、発光波長が約５５６ナノメートルから約５８０ナノメートルのTAMRA；カルボキシ−ｘ−ローダミンであり、発光波長が約５７５〜５８５ｎｍから約６０５〜６１０ｎｍのROX；発光範囲が約３５０ナノメートルから約４４０ナノメートルのALEXA；発光波長が約５８０〜５８５ｎｍから約６００〜６１０ｎｍのTEXAS RED；発光波長が約５４５ナノメートルから約５６８ナノメートルのCy3；発光波長が約６３５〜６５５ｎｍから約６６５〜６７５ｎｍのCy5；発光波長が約７１５ナノメートルから約７８７ナノメートルのCy7など、さまざまなプローブを使用できる。最適化した干渉フィルタは、スペクトル的に隣接したフルオロフォアからの不必要なクロストークをブロックアウトするために、各フルオロフォアについて励起波長と発光波長を厳密に一致させる。
【００９７】
核酸増幅に用いるプライマーとして何を選択するかは、標的核酸配列に左右される。本発明で用いられるプライマーは一般に、ポリメラーゼ連鎖反応によってテンプレート特異的に伸長可能な、通常は数ヌクレオチド長のデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドである。標的核酸を増幅するのに適したプライマーの設計は、当業者が判断可能なものである。
【００９８】
ＰＣＲあるいは、当該技術分野において公知または上述した他の任意の核酸増幅反応によって得られる増幅後の核酸を都合よく検出するために、プライマーを検出可能な標識にコンジュゲートしてもよい。本発明で使用するのに適した検出可能な標識としては、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段による検出可能な組成物があげられる。検出可能な標識については当該技術分野において適切なものが多種多様に知られているが、これには、ルミネッセント標識、酵素または他のリガンドが含まれる。好ましい実施形態では、ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン錯体などの蛍光標識または酵素タグを利用したいことが多い。
【００９９】
標識は、当業者間で公知の多数ある手段のうちのどれで取り込んでもよい。一態様では、増幅ステップで標識を同時に取り込む。よって、たとえば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを使うＰＣＲでは、標識された増幅生成物が得られる。別の態様では、ＲＮＡをＤＮＡに変換する転写反応で、標識ヌクレオチド（たとえばフルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）または標識プライマーを使用して、検出可能な標識を転写後の核酸に取り込む。
【０１００】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド増幅方法を実施するのに適した試薬およびキットを提供するものである。このような試薬およびキットは、従来のＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、他の増幅反応を実施するのに適した試薬およびキットからモデル化できる。このようなキットは、本発明のチップと、増幅試薬、検出試薬、これらの組み合わせからなる群から選択される試薬とを含む。このキットは、マルチプレックス増幅産物の下流または以後の解析のためにパッケージされた試薬を含むものであってもよい。個々のユニットに含まれるプライマーは、互いに独立して、複数のマルチプレックス増幅プライマーを含む、異なるプライマーの組であっても同一であってもよい。
【０１０１】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野において公知のように、単一ヌクレオチド多型を検出するのに適している。このようなプローブの具体例として、１つのヌクレオチド位置について配列保存（sequence save）が同一である４つのオリゴヌクレオチドプローブからなる組があげられる。
【０１０２】
４つのプローブ各々が、この位置で異なるヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ／Ｕ）を含む。プローブは、スペクトル分解可能な異なる波長で光を発することのできる、異なるフルオロフォア（たとえば、４通りの色のフルオロフォア）など、互いに区別可能な異なる検出可能な信号を生成できる標識を使って標識できるものである。
【０１０３】
本発明で使用するプライマー対は、化学合成、組換えクローニングまたはこれらの組み合わせによって得られる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は当該技術分野において公知であり、ここではその詳細な説明を割愛する。当業者であれば、標的配列を使用して、ＤＮＡ合成器を利用するか外注サービスに出して所望のプライマー対を得ることができる。
【０１０４】
核酸増幅には、標的を増幅するのに用いられる酵素と相溶の緩衝液で標的核酸が必要である。本発明に用いられる標的核酸は、標的配列を含有する疑いのある反応試料を包含する。反応試料のソースまたはこれを生成する方法に関しては、何ら限定することを意図したものではない。一般に、被検試料は生物学的試料および／または環境試料であり得る。生物学的試料は、ヒト、他の動物または植物、体液、固体組織試料、これらに由来する組織培養あるいは細胞およびその子孫、これらのソースのいずれかから調製された切片またはスミアあるいは、標的核酸を含有する疑いのある他の任意の試料に由来するものであってもよい。好ましい生物学的試料は、血液、尿、髄液、脳脊髄液、滑液（sinovial fluid）、アンモニア液（ammoniac fluid）、精液、唾液を含むがこれに限定されるものではない体液である。他のタイプの生物学的試料としては、野菜、乳製品、肉類、食肉の肉以外の有用物および廃棄物などの食品および成分があげられる。環境試料は、土、水、汚水、化粧品、農業および工業試料を含むがこれに限定されるものではない、環境材料由来のものである。
【０１０５】
被検試料に含まれる核酸の調製は、当該技術分野において標準的な方法または上述の手法で実施可能である。簡単に説明すると、ＤＮＡおよびＲＮＡを、さまざまな溶菌酵素または化学溶液を使用してSambrookら（「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」）に記載された手法で単離するか、あるいは製造業者による取り扱い説明書で提供される添付の指示に従って核酸結合樹脂によって抽出することができる。
【０１０６】
反応試料の核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはウイルスＤＮＡであり得る。しかしながら、本発明は、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどの他の核酸でも実施可能なものである。これらの核酸は、多種多様な形態で存在することがある。たとえば核酸は、一本鎖、二本鎖、円形、線形またはコンカテマーの形であり得る。核酸がどのような性質のものであっても、使用する方法に対して適切かつ十分に認知された改変をほどこすだけで増幅可能であることは、当業者であれば理解できよう。
【０１０７】
本発明の一態様では、反応を実施するためのチップが、各々化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含む。チップのアドレス指定可能なユニットは、ユニットの化学反応を実施するための所定の一組の温度に基づいて配置される。ユニットのうちの少なくとも１つをアドレス指定し、ユニット内で化学反応を実施するための所定の温度を示す。
【０１０８】
一実施形態では、複数のユニットをアドレス指定して、化学反応を実施するための所定の温度を示す。別の実施形態では、ユニットの各々を個別にアドレス指定して、前記ユニット内で化学反応を実施するための所定の温度を示す。
【０１０９】
本発明のチップのユニットの所定の温度は、均質な生成物の少なくとも９０％が化学反応から得られるように構成可能なものである。アニーリング温度を最適化すれば、所定の反応温度に基づいてアドレス指定可能なチップの構成によって、反応生成物の収率と品質とを有意に改善することができる。これは、ユーザが本発明のチップおよび装置で生物体の全ゲノムなどの多数の核酸を分析しようとしている場合に、重要となる可能性がある。一実施形態では、医療診断機器として用いられる場合の本発明のチップ、装置またはシステムの使用時に、反応収率が改善されていることが重要な役割を果たす。
【０１１０】
図５は、一組の小さなチップ５１０を含む本発明のチップ５００の一例を示す。プレート５００とも呼ばれる一組の小さなチップ５１０は、熱絶縁性フレーム５３０と接触して配置される。図５に明記したように、小さなチップ５１０各々が、この例ではゾーン１、２、３、４、５、６である異なる温度ゾーンを示す。一実施形態では、温度ゾーンが、チップ５００のナノウェル５２０内でポリメラーゼ連鎖反応を実施するための所定の一組のアニーリング温度に対応する。チップ５００全体を異なる温度ゾーンに分けることで、ユーザはナノウェル５２０内での反応の特異性を高めることができる。たとえば、ある種のゲノム全体を分析する場合、複数の温度ゾーンを持つことでゲノムを一層正確に判定することが可能になる。
【０１１１】
本発明のチップは、チップの底側にエッチングで形成された１つまたは複数の溝を含むものであってもよい。通常、溝は空気の流れを可能にするアンダートレンチ、オープンチャネルまたは経路である。この溝はチップの熱質量を下げ、表面積を増し、よってチップの熱的性能を高める。溝については、円形、楕円形、卵形、円錐形、矩形、三角形、多角形を含むがこれに限定されるものではない、どのような形状に製造してもよい。溝をさらに直線状または曲線状の壁で仕切り、独立しているが隣接するチャネルを形成してもよいし、円形の壁で仕切って内側と外側の環状チャネルを形成してもよい。溝の寸法は、チップの全体の大きさと深さに左右される。溝の深さは、チップの深さの約１０分の１から約１０分の９の範囲であり得る。他の寸法すなわち、幅と長さは、チップの対応する寸法よりも短いか長くてもよいし、同等であってもよい。特に、Ｌ字溝がユニットの基部を包囲する。いずれかの溝で形成された通路を空気が流れる際に、熱の受動的な散逸によってユニットの表面から熱を奪うため、サーマルサイクリングの速度が上昇する。
【０１１２】
好適なチップ基板の選択には、いくつかの要因が適用される。基板は良好な熱導体であることが多い。良好な熱導体は一般に、熱伝導率の値が１Ｗ／ｍ−１Ｋ−１よりも大きく、好ましくは１００Ｗ／ｍ−１Ｋ−１よりも大きく、より好ましくは１４０Ｗ／ｍ−１Ｋ−１よりも大きい。材料の熱伝導率については２５０Ｗ／ｍ−１Ｋ−１以上にしてもよいが、通常は５００Ｗ／ｍ−１Ｋ−１を超えることがない。第２に、基板は比較的不活性かつ化学的に安定でなければならない。このような基板は一般に、意図した用途に採用される反応試料に対する反応しやすさのレベルが低い。さらに、熱制御素子を材料の上または材料と隣接して一体化する機能または実現可能性に基づいて、材料を選択すべきでもある。多種多様な材料がこれらの基準を満たす。一例としての材料には、シリコン、シリケート、窒化ケイ素、二酸化ケイ素、リン化ガリウム、ガリウムアルセナイドまたはこれらの任意の組み合わせなどの半金属または半導体があげられるが、これに限定されるものではない。考えられる他の材料に、ガラス、セラミック（結晶性シリケートおよび非結晶性シリケートならびに、非シリケートベースのセラミックを含む）、金属または合金、ドーパントを含有する複合ポリマー（たとえば、熱伝導率を上げるための酸化アルミニウム）あるいは、当該技術分野において入手可能なさまざまなプラスチックおよび有機ポリマー材料のいずれかがある。一実施形態では、ＡｌまたはＳＳ−３１６ならびに同様の他のものを含む基板でナノウェルを製造する。
【０１１３】
一実施形態では、熱伝導性ポリマーを用いてチップを製造する。たとえば、ポリカーボネート、ポリプロピレンまたは当該技術分野における当業者間で公知の他の伝導性ポリマーを用いて、チップを製造することが可能である。
【０１１４】
チップは、当業者には自明であろうどのような方法でも製造可能である。本発明のチップを作製する方法の例としては、マイクロドリル加工、放電方法、熱エンボス加工、水を導光手段として用いる工具での熱エンボスがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０１１５】
あるいは、集積回路（ＩＣ）およびMicro-Electro-Mechanical System（ＭＥＭＳ）産業で十分に確立された技法を用いて本発明のチップを製造することも可能である。この製造プロセスは一般に、チップ基板を選択することから始まって、続いて適当なＩＣ処理方法および／またはＭＥＭＳマイクロマシン技法を利用して、さまざまな成分を構成および統合する。
【０１１６】
本発明のチップの製造は、ＩＣ−プロセシングおよび／またはＭＥＭＳマイクロマシン加工の標準的な技法で実施可能である。本発明のチップは、多層構造として製造可能である。このプロセスは一般に、底層を構成するところから始まる。続いて、フォトリソグラフィ、化学蒸着または物理的気相成長法、乾式または湿式エッチングを含むがこれに限定されるものではない技法の組み合わせを利用して、その上に位置するかそれに埋設された構造を形成する。蒸着を用いれば、たとえば他の材料の上に極めて薄く均一なコーティングを製造できるが、エッチングはより大きなチップ構造の大量生産を可能にするものである。イオン注入、プラズマアッシング、ボンディング、電気メッキなどの他の有用な技法を利用して、チップの表面特性を改善するか、あるいはチップのさまざまな成分を一体化することも可能である。以下、図示した一例としてのチップ設計を参照して、製造方法を詳細に示す。同一の一般的なプロセスと、その明白な変形例を、本明細書に記載の本発明のチップの製造に適用可能である。
【０１１７】
図４は、一例としてのチップ設計の一部の断面図である。この実施形態では、ナノウェルが、基板の第１および第２の（または底および上の）それぞれの層からなる本体内に埋設されている。このプロセスは一般に、ガラス、Pyrexウェハまたは本明細書に記載したまたは当該技術分野において公知の他の好適な材料などの耐熱性材料である基板の第１の層を提供するところから開始される。次のステップは、ユニットの基礎をなすナノウェルを作製することである。ナノウェルは一般に、一般にシリコンウェハである第２の層内に配置される（たとえば図４を参照のこと）。シリコンウェハは、第１の層に結合される前にいくつかの処理ステップを経る。たとえば、シリコンウェハをフォトレジストの層に結合させ、フォトリソグラフィの過程でのＵＶ光の曝露後の化学エッチングに対する表面の感受性を高めてもよい。フォトレジストの層は、フォトマスクの厳密なアライメントによって、続くエッチングステップで形成されることになるナノウェルの大きさと場所を画定する。次に、当該技術分野において公知の多種多様な手段でシリコンウェハをエッチングし、ウェルのキャビティを形成する。一般に行われているエッチング手法では、シリコンウェハを除去して所望の形状を作る水酸化カリウム（ＫＯＨ）などの化学物質を使用する必要がある。
【０１１８】
本発明のチップのナノウェルを形成したら、その表面特性を改善して特定の用途に合うようにすることができる。表面積が大きいほうが望ましい場合、プラズマエッチャーなどでナノウェルの壁をさらにエッチングし、一般に「ブラックシリコン」と呼ばれるケイ素の極めて細かいデンドライトを得るようにしてもよい。ブラックシリコンが存在すると、有効伝熱面積を劇的に大きくすることが可能である。ナノウェルの基部に形成されたブラックシリコンは、フォトン検知装置、温度センサおよび他の制御素子のアンカーとしても機能することがある。
【０１１９】
本明細書で論じたように、内面対容積比が大きいナノウェルには、そこに含まれる反応物がウェルの内面と相互作用する可能性を低くするための材料をコーティングしてもよい。コーティング材料の塗布にどの方法を選ぶかは、使用するコーティング材料のタイプに左右されることになる。通常、コーティングをほどこすには、ナノウェルに材料を直接塗布した後、余分な未結合のコーティング材料を洗い流す。また、特定のコーティング材料を、強く加熱するか放射線を当てる、あるいは化学反応によって、表面に架橋させることが可能である。当業者であれば、チップ上に形成されたナノウェルをコーティングするための他の好適な手段が分かるであろうし、必要以上に実験をすることなくこれを確かめることができよう。
【０１２０】
次に、試料の調製には、ＰＣＲ反応試料混合物、標識プライマー、試料と、蒸発を防ぐ目的で個々にナノ分注可能な油滴とを組み合わせることを含む。続いて圧電ディスペンサと露点分注法とを用いて個々のナノウェルに試料を分注する。
【０１２１】
水性の反応試料の蒸発を防ぐために、試料を露点またはその前後でナノウェルに適用することが可能である。本明細書で使用する場合、「露点」とは、滴の大きさが大きく変化しない温度範囲のことである。露点では、試料滴からの水の蒸発率と、チップを覆っている、湿った空気からの水が凝縮されて滴になる率とが平衡に達する。この平衡に達したら、チップの平面に対して空気が飽和すると言われている。１気圧では、露点は約１４℃である。このため、水性の反応試料の分注は、好ましくは露点よりも約１℃から約５℃以下の範囲で高い温度で実施する。当業者であれば明らかなように、外圧が高くなれば露点の温度も高くなる。したがって、必要があれば、反応試料を加圧環境で分注して蒸発を防止してもよい。
【０１２２】
本発明のチップに存在する増幅された核酸は、（ａ）増幅産物を検出可能な標識と結合させることなどによって、検出可能な複合体を形成し、（ｂ）増幅反応の反応物および他の成分からの増幅産物を電気泳動的に分解することを含むが、これに限定されるものではない、さまざまな方法で検出できるものである。
【０１２３】
特定の実施形態では、蛍光ＤＮＡ結合染料などの検出可能な標識で増幅産物を直接的に可視化する。二本鎖ＤＮＡ分子にインターカレートされる染料の量は一般に、増幅されたＤＮＡ産物の量に比例し、増幅産物の量については、本発明の光学系または当該技術分野において公知の他の好適な機器を用いて、インターカレートした染料の蛍光を定量化することで、適宜判断することができる。この用途に適したＤＮＡ結合染料としては、SYBR green、SYBR blue、DAPI、ヨウ化プロピジウム、Hoeste、SYBR gold、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオルクマニン（fluorcoumanin）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどがあげられる。
【０１２４】
さまざまな種類の蛍光ＤＮＡ結合染料に加えて、配列特異的プローブなどの他のルミネッセント標識を増幅反応に利用して、増幅産物の検出および定量化を容易にすることが可能である。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的検出に依存している。染料ベースの定量方法とは違って、特異性および感受性の増加につながる標的特異的発光プローブ（TaqMan（登録商標）プローブなど）を使用する。プローブベースの定量的増幅を行うための方法は当該技術分野において十分に確立され、米国特許第５，２１０，０１５号に教示されている。
【０１２５】
さまざまな実施形態では、チップがさらに、カバーをチップに対して整列配置または取り付けるあるいは、チップを加熱素子に対して整列配置または取り付けるよう動作可能なアライメントの特徴を含む。さまざまな実施形態では、このような特徴は、凹形または凸形の特徴を含む。当該特徴は、ピン、リッジ、スナップ、ネジ、これらの組み合わせを含む。
【０１２６】
さまざまな実施形態では、チップアセンブリが、反応チャンバ温度の監視または制御を容易にする温度制御素子を含む。このような温度制御素子としては、アセンブリを介しての加熱または冷却気体の流れを容易にするチャネルまたは他の構造があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１２７】
本発明の別の態様では、複数の反応試料を伴い、少なくとも２段階の温度レベルを循環させる必要のある反応を行うための方法が開示され、この方法は、各々化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含むチップを提供することを含み、ユニットは、ユニットの化学反応を実施するための所定の一組の温度に基づいて配置され、ユニットのうちの少なくとも１つがアドレス指定されて、前記ユニット内で化学反応を実施するための所定の温度を示し、所定の一組の温度に基づいて、複数の反応試料をチップのユニットに配置し、加熱素子を制御して少なくとも２段階の温度レベルを循環させる。一態様では、化学反応を実施する方法が、本明細書で説明したようなチップを提供することを含むものであってもよく、この場合は反応試料を受けるようにチップを構成する。チップに対して位置変更可能な加熱素子を提供し、少なくとも１つの加熱素子とチップとを熱的に接触させることが可能である。チップの温度を変えれば、反応試料で化学反応を実施することができる。チップでの温度を変えるには、たとえば、加熱素子がチップと熱的に接触するように少なくとも１つの加熱素子をチップに対して移動させてもよい。
【０１２８】
この方法では、本発明のチップとサーマルサイクリング本発明の装置を使用する。一般に、生物体のゲノム全体の解析では、異なる遺伝子または核酸配列の増幅が異なるアニーリング温度で最適化される。これらの異なるアニーリング温度をまとめて大まかなゾーンにし、アッセイの感受性および特異性を改善することができよう。したがって、本発明のチップは、アニーリング温度ゾーンのうちの１つに基づいてアドレス指定可能である。
【０１２９】
アニーリング温度の選択は、ＰＣＲ反応の特異性を最適化する上で必須の成分である場合がある。核酸増幅のための異なる配列のアニーリング温度を、多種多様な方法で求めることができる。１つの方法に、核酸配列の融解温度（Ｔｍ）を求めるものがある。融解温度とは、ＤＮＡ二本鎖の半分が解離して一本鎖になる温度である。核酸増幅を設計する場合、成功する増幅のパラメータの設計にあたってプライマー長と配列とが重要である。たとえば、ＤＮＡの融解温度は、その長さと、グアニンおよびシトシン含有量の増加との両方にともなって上昇するが、これは単純な式で概算可能なものである。
【０１３０】
ＰＣＲ反応で選択するアニーリング温度は、プライマーの長さと組成に直接左右される。アニーリング温度（Ｔａ）を、使用する一対のプライマーの最低Ｔｍよりも約５℃低くなるように選択可能である（Innis and Gelfand, 1990）。別の例としてのアニーリング温度算出方法として、
ＴａＯｐｔ＝０．３×（プライマーのＴｍ）＋０．７×（産物のＴｍ）−２５
があるが、式中、プライマーのＴｍは安定性の低いプライマー−テンプレート対の融解温度であり、産物のＴｍはＰＣＲ産物の融解温度である（Rychlik,et al.,1990）。
【０１３１】
ＰＣＲ反応のアニーリング温度が低すぎると、プライマーが本来の標的以外の配列にアニールできるため、非特異的増幅、さらには結果として所望の産物の収率低下につながる可能性がある。アニーリング温度が高すぎると、プライマーアニーリングの温度が低下するため、生成される産物が少なすぎる結果になる。別の考慮点として、アニーリング温度が極めて異なる一対のプライマーでは、ユニークな産物を相当な収率で得られることがなく、最も効率よくプライムされる産物鎖が不用意にも非対称または一本鎖で増幅する結果につながることがある。
【０１３２】
ＰＣＲサーマルサイクリングでは、異なるプライマー対ごとの最適Ｔａおよび最大Taには範囲があり、遺伝子ごとに連続的に変わる場合がある。一般に、特定のプライマー対で高品質のアニールを得るためのアニール温度は１〜３℃の範囲である。アニール温度がこれよりも高くなると、ＰＣＲアニールステップが減速する可能性がある。アニール温度が低くなると、所望の部位以外の部位でプライマーがＤＮＡと結合または他の種と結合しかねない。
【０１３３】
１つの方法に、遺伝子アッセイを「破棄する（bin）」ことがある。その特定の遺伝子アッセイのＴａの温度に最も近い温度で、特定のアッセイの温度をチップのアドレス指定可能な部分に割り当てる。たとえば、装置またはチップが６０℃、６２．５℃、６５℃の３つの温度ゾーンを有する場合、最適な挙動を有するアッセイＴａ＝６４℃を６５℃のゾーンに割り当てる。
【０１３４】
ＰＣＲ反応のアニーリングステップは一般に、４０秒以下で起こるが、これには増幅対象となる配列の長さに左右される側面がある。
【０１３５】
ＰＣＲは通常、プライマー融点（Ｔｍ）の計算で求めた温度よりも５℃低い温度から開始されるが、最適な温度は計算した温度よりもかなり高くなることが多い。いくつかの実施形態では、アニーリング温度を経験によって試験しなければならない。たとえば、最適なアニーリング温度が求められるまでは温度を徐々に上昇させる複数のＰＣＲ反応を行うことができる。
【０１３６】
ゲノムの多くの遺伝子配列が、温度ゾーンにまとめることが可能である。一実施形態では、本発明のチップのユニットが異なるアニーリング温度ゾーンを表し、たとえば、５４から６８℃の範囲にわたってゾーンが２℃ずつ上昇する。次に、所定の温度に応じてこのユニットをアドレス指定し、その温度でＰＣＲ反応のアニーリングステップを行う。
【０１３７】
所定の温度に応じてユニットをアドレス指定した後、試料をチップに分散させることが可能である。試料については、本明細書に開示する多種多様な方法でチップに加えることができる。
【０１３８】
さまざまな実施形態では、システムまたはチップがさらに、チップのアドレス指定可能なユニットへの増幅試薬または試料の充填を容易にするよう動作可能な充填装置を含むことが可能である。本明細書にて有用な充填装置としては、アドレス指定可能なユニットへの試薬または試料の充填を指示し、導き、経路設定し、あるいは実施する物理的および化学的なモダリティがあげられる。
【０１３９】
さまざまな実施形態では、チップが、たとえば、チップ表面で液体を分配および流動させる助けとなるための障壁やトレンチといった特徴など、隆起または陥没した領域を含むものであってもよい。一実施形態では、充填システムが、毛細管チャネルを含む。これらの特徴の寸法は、組立時の気泡の回避や機械的な便利さおよび実現可能性などの要因に応じて柔軟である。
【０１４０】
充填システムは、好ましくはアドレス指定可能なユニットでこのような試薬または試料を配置する、チップ表面での増幅試薬または試料の配置を容易にする装置を含む。本明細書において有用なこのような装置は、実質的に表面全体を覆うよう試薬または試料を表面に注ぐための装置を含む。一実施形態では、充填システムは、特定の反応チャンバに対して（たとえば圧電ポンプを使って）反応物をピペット採取し、スポット注入し、または噴霧する装置を含む。充填システムはナノディスペンサであってもよい。別の実施形態では、充填装置がチップの反応チャンバを充填するよう動作可能な真空ポンプを含む。充填システムはまた、チップに遠心力を印可する装置を含むものであってもよい。一実施形態では、充填システムは、チップの充填装置と近接しているか、流体連通状態にある。充填システムは、自動またはコンピュータからのプロトコールに従って動作可能である。
【０１４１】
装置
本発明の一態様は、個々の分子の多重分析および／または膨大な数の化学反応の同時実施用に設計された小型のチップを収容するよう構成される装置の設計である。一実施形態では、本発明は、マルチプレックス状に温度、蒸発、小容積の試薬送達および／または産物検出を厳密に制御しての操作を可能にする高度自動化、小型かつ分析的な機器を提供するものである。
【０１４２】
本発明の一態様の装置は、チップの加熱または冷却に有用な少なくとも１つの加熱素子を含む。チップの温度を下げるよう加熱素子を構成する場合、構成要素は本質的に冷却素子として機能する点を理解されたい。
【０１４３】
一実施形態では、この装置は少なくとも１つの加熱素子が位置決めされた状態の基部を含む。加熱素子は、さまざまな有用な温度を提供できるものであり、たとえば、加熱素子は、必要に応じて約−２０℃から約１２０℃の範囲の温度を提供するよう構成可能である。
【０１４４】
加熱素子は、チップを収容するよう構成可能である。さまざまな実施形態では、チップの下またはチップの上に加熱素子を位置決め可能である。特定の実施形態では、加熱素子が１つしかない場合に、チップに対して加熱素子を移動させることが可能である。必要であれば、チップを固定することが可能である。
【０１４５】
図６は、この装置の一実施形態を示す概略図の非限定的な例である。図６は、少なくとも１つの加熱素子６０２が配置された状態の基部６００を示す。加熱素子６０２は、チップ６５０を収容でき、このようなチップは、チップ６５０のナノウェル６５２のうちの１つに反応試料を収容して限局できるものである。装置の加熱素子６０２は、チップ６５０に対して２つの位置に移動可能である。
【０１４６】
図６に示す加熱素子６０２は、図７に示すように異なる温度ゾーンに分割可能である。図７は、チップの温度を制御および／または変更するのに用いられるチップ７００の下に配置された加熱素子の例示を目的とした図である。一実施形態では、加熱素子の温度範囲が、変性温度で９０℃から９５℃の範囲、プライマーアニーリングステージで５２℃から６５℃、プライマー依存性伸長ステージで６８℃から７５℃にあり得る。加熱素子７００の非限定的な例を図７に示す。この例の加熱素子７００は、ＰＣＲの変性、プライマーアニーリングステージおよびプライマー依存性伸長ステージに、前から順に９５℃（７０２）、５２℃（７０４）、７２℃（７０６）の温度ゾーンのあるものである。加熱素子７００の各温度ゾーンの寸法は、大きさを変えることが可能である。図７に示す一実施形態では、一例のチップの下にある加熱素子が長さ約９インチ×幅９インチである。
【０１４７】
反応試料を収容および限局するよう構成されたチップを、チップを受け入れるよう構成された装置の加熱素子７００の上に配置する。図７の７００チップの下に位置決めされた加熱素子を使用して、チップが９５℃のブロックと接触した後、５２℃のブロック、続いて７２℃のブロックと接触するよう加熱素子を物理的に移動する。チップに対して加熱素子を移動することで、加熱素子の表面積が大きくなって重要なランプダウン速度がかなり速くなる。また、表面積が大きくなることで、温度ごとにチップが移動するためチップの裏側からの冷却も可能になる。さらに、この手法では、サイクル間でチップを冷却するだけの従来の方法よりもかなり高速にチップを加熱冷却することができる。
【０１４８】
チップ８００の温度を制御および／または変更するための別の方法を図８に示す。図８は、チップ８００の上に位置決めされた加熱素子８５０の非限定的な例である。図８に示すように、加熱素子は、チップ８００の上に位置決めされた一連のオン／オフアークハロゲンランプ８５２である。各ハロゲンランプ８５２の周囲には、ヒートランプ８５２からの均一な熱源を保証するための熱反射器８５４が配置される。アーク灯８５２の高出力と、シリコンへの出力のスペクトルマッチによって、アーク灯８５２の極めて高速な「ランプアップ」速度が得られる。ランプがアーク灯であるという事実は、アーク灯８５２のスイッチオフが事実上瞬時であることを意味する。また、図８は放射線硬化型接着剤８０２でチップ８００を封止して、反応試料の蒸発を防止しやすくできることも示す。反応サイクルの後、非限定的な一例では、ハイパースペクトルスキャナまたはＣＣＤスキャナなどのスキャナ８６０でチップを走査する。特定の態様では、このような光学的に結合されたシステムが、増幅時に複数回にわたって反応試料の入ったウェルに励起光線を送り、複数回それぞれのサイクル間にナノウェルからの光信号を監視する。
【０１４９】
図９は、オン／オフアーク灯の摂氏での温度変化（ｙ軸）と秒単位での時間（ｘ軸）をグラフ表示したものである。図９に示されるように、アーク灯のハロゲンランプのランプアップ速度は、９５＋／−０．５℃の温度にて２０℃から１００℃／秒で約２秒未満、６５＋／−０．５℃への２０℃から１００℃のランプダウン速度も約２秒未満である。アーク灯の温度は、ＰＣＲ反応プロセスの際に約６５℃から約９５℃にシフトする。
【０１５０】
必要があれば、別のチップでアルミニウム／ケイ素から製造されるナノウェルへの断続的な熱の移動を最小限にするよう本発明の装置を設計する。断続的な熱の量を最小限にするための１つの方法に、Ａｌ／Ｓｉが最高温度にある時間を短くすることで、「サーマルバジェット」を減らすことがある。よって、「ランプアップ」および「冷却」速度を上げ、加熱から冷却への可能なかぎり最速の遷移を実現することすなわち、「ターンアラウンド」が重要である。チップを加熱冷却するこの方法も、チップの加熱時に均一性を保証する。こうした均一性は、ナノウェル性能のばらつきにつながりかねない数度の温度差による応力を防止するものである。
【０１５１】
図１０に示されるように、アーク灯が送達できるいくつかの温度出力プロファイルがある。行（ａ）に沿ったグラフは温度変化（ｙ軸）と時間の変化（ｘ軸）を示す。これに対応して、行（ｂ）に沿ったグラフは、行（ａ）に示す高速熱処理（ＲＴＰ）プロファイルに対するチップ応答を示す。スパイクまたはインパルス光学加熱器プロファイルなど、経時的にみた温度のゆっくりした変化に応答して、チップ温度はチップの深さ全体で一定に保たれる。レーザまたはフラッシュアシスト加熱器プロファイルなど、経時的にみて温度がより短時間で変化するのに応答して、チップの温度は熱源に対するチップの深さに応じて変化する。
【０１５２】
特定の理論に限定されることなく、図１０は、本発明に対応する多数の温度出力プロファイルを示す。図１０（ａ）（１）に示すようなスパイク加熱器プロファイルは、曲線的な熱プロファイルを特徴とするものであり、図１０（ｂ）（１）に示すような熱源温度に近いチップ応答温度を生成する。ピークのある熱プロファイルを特徴とするインパルス加熱器プロファイル（図１０（ａ）（２））では、熱源の温度が熱源に応答するチップの温度よりも速いが、熱源からの距離に対してチップの深さ全体にわたってチップの温度が依然として比較的均一に保たれる（図１０（ｂ）（２））。鋭利なピークのあるプロファイルを特徴とする図１０（ａ）（３）に示すようなレーザ加熱器プロファイルでは、熱源がチップよりもかなり速く作用する。したがって、チップの表面層だけが加熱される（図１０（ｂ）（３））。チップの深さが増すにつれて、温度プロファイルが冷たくなる。最後に、表面アニーリングのためのフラッシュに続く初期バルク加熱を特徴とするフラッシュアシストプロファイル（図１０（ａ）（４））では、チップ応答が、レーザプロファイル（図１０（ｂ）（４））でのチップ応答に近くなる。
【０１５３】
本発明の別の態様では、各々化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含む、反応を行うためのチップであって、これらのユニットが、当該ユニットのうちの少なくとも１つがアドレス指定され、前記ユニット内で化学反応を実施するための所定の温度を示すように、ユニットの化学反応を実施するための所定の一組の温度に基づいて配置されたチップと、チップと熱的に接触している加熱素子とを含む、少なくとも２段階の温度レベルを循環する必要のある化学反応を実施するための装置が記載される。
【０１５４】
好ましい実施形態では、チップのアドレス指定可能なユニットが、リアルタイムＰＣＲを含むがこれに限定されるものではない、核酸増幅反応を実施するよう構成される。このユニットは、試薬、プローブ、プライマー、ｄＮＴＰまたはこれらの組み合わせを含むナノウェルであってもよい。所定の温度は、ＰＣＲ反応を実施するための異なるアニーリング温度であってもよい。
【０１５５】
加熱素子は、抵抗加熱器または熱電加熱器を含むプレートなどの単純な加熱器であってもよいし、精巧なサーマルサイクリング装置であってもよい。いくつかの例では、チップが加熱素子と熱的に接触しているときに、加熱素子がヒートシンクと熱的に接触して、チップの高速な温度変化を可能にする。ファンを加熱素子に接続して、高速サーマルサイクリングでの制御性を高めてもよい。加熱素子の他の例としては、伝熱によって短時間で加熱可能あるいは、膜内に電磁加熱器を有する薄膜加熱器があげられる。薄膜加熱器の製造に特に適した材料の１つが酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）である。ＩＴＯは、電気伝導度が極めて高い、透明なセラミック材料である。ＩＴＯはバルク状または薄層の形で調製可能であるが、一体型または外部の加熱素子として特に有用である。
【０１５６】
別の実施形態では、加熱素子が、大きさおよび構成の点でチップに適合する。一実施形態では、装置がさらに複数の加熱素子を含む。加熱素子は、チップに隣接、チップの基部および／またはチップの上の着脱自在のユニットとして配置可能なものである。好ましい実施形態では、加熱素子の縁の部分でのエッジ効果を最小限に抑えるために、加熱素子の面積がチップの面積よりもかなり大きくなっている。
【０１５７】
加熱素子構成とセットアップのいくつかの例を図１１ａ〜ｃに示す。これらの例では、加熱素子１１００をヒートシンク１１１０およびファン１１２０に接続して、サーマルサイクリングのランプアップ時間と温度変化に対する制御を改善する。加熱素子１１００と試料（またはチップ）１１４０との間に、素子１１００およびチップ１１４０に熱的に密着する金属製の熱ブロック１１３０を使用することができる。ブロック１１３０は、再現可能な温度変化を生み出すようチップ１１４０が熱伝導率の高いものでなくても熱伝導率を高くできるものである。複数の加熱素子を使用して温度ゾーンまたは複数の温度ゾーンを規定する場合は、加熱の小さな乱れ（エアブリーズなど）が原因で温度に大きな変化が生じることがある。熱ブロックを使って抵抗を小さくすれば、ゾーン間での熱の移動をスムーズにすることができる。また、金属製の熱ブロックは、上面に温度センサを保持することができる。温度センサは、各ゾーンに対応していてもよいし、あるいはチップ自体の一部であってもよい。熱ブロックはまた、真空によってブロックおよび／または加熱素子と熱的に密着した状態にチップを保持するための真空チャネルも提供できる。図１１ａ〜ｃに示されるように、加熱素子１１００は、１つまたは複数の熱電１１５０または抵抗１１６０加熱素子あるいはこれらの組み合わせを含むものであってもよい。
【０１５８】
加熱素子によって温度勾配を得ることができる。ここでの温度勾配は、単一の加熱素子のある部分で別の部分よりも高い温度であってもよい。たとえば、抵抗加熱器または熱電加熱器を構成して、加熱素子で熱勾配を得ることができる。熱勾配はまた、チップのある部分で別の部分よりも高い温度としても規定できる。たとえば複数の加熱素子を使用する場合、１つの加熱素子がチップの一方の側または端に高めの温度を送ることができ、第２の加熱素子がチップの一方の側または端に異なる温度を送ることができ、これによって熱勾配が得られる。
【０１５９】
装置はさらに、チップと作動的に接続された光学系を含むものであってもよく、この場合の光学系は、ユニットからの光信号を検出する。一例としての実施形態では、チップ、加熱素子、光学系が本発明のシステムを構成する。
【０１６０】
一態様では、本発明の開示は、化学反応を実施するための試料ホルダを収容するよう構成された本体と、複数の温度ゾーンを含む第１の加熱器と、均一な温度を与える第２の加熱器と、を含み、第１の加熱器および第２の加熱器が、第１の方位と第２の方位との間で移動可能なように構成され、第１の方位が加熱器を試料ホルダと熱的に接触させ、第２の方位が加熱器を試料ホルダと熱的に接触させない、少なくとも２段階の温度レベルを循環させる必要のある化学反応を実施するための装置を含む。
【０１６１】
試料ホルダは、各々化学反応用に構成されたアドレス指定可能なユニットのアレイを含む、反応を実施するためのチップであってもよく、ユニットは、当該ユニットのうちの少なくとも１つがアドレス指定され、ユニット内で化学反応を実施するための所定の温度を示すように、前記ユニットの化学反応を実施するための所定の一組の温度に従って配置される。一実施形態では、複数の温度ゾーンが所定の一組の温度に対応し、これに基づいてユニットを配置する。
【０１６２】
装置および試料ホルダがＰＣＲ反応を実施するよう構成される一実施形態では、所定の温度ゾーンが異なるアニーリング温度に対応し、これらの温度で複数のＰＣＲ反応を実施できる。さらに別の実施形態では、ゲノムの全部ではないにしても大半を増幅するために、装置および試料ホルダが一連のＰＣＲ反応を実施できるものである。この例では、ゲノム全体が、所望の反応の特異性を実現するのにさまざまなアニーリング温度を必要とする。たとえば、異なるヌクレオチド配列のアニーリング温度に基づいて、これらの温度を２℃の温度ゾーンにグループ化することができる。試料ホルダのユニットを、ユニット内の反応が実施される温度ゾーンに基づいてアドレス指定することが可能である。一実施形態では、装置は、装置の第１の加熱器での６つの異なる温度ゾーンに対応する６つの異なるアニーリング温度ゾーンに基づいてユニットがアドレス指定されたチップを含む試料ホルダを収容する。
【０１６３】
好ましい実施形態では、第１の加熱器および第２の加熱器が、プロトコールに沿って第１の方位と第２の方位との間で移動する。装置はさらに、第１の加熱器および第２の加熱器を第１の方位と第２の方位との間で移動させるためのモータを含むものであってもよい。加熱器は、当業者間にて公知であろう任意の方法で移動可能である。
【０１６４】
第１の方位は、加熱器を試料ホルダと熱的に接触させる。一実施形態では、試料ホルダを使用してＰＣＲ反応を実施する。第１の加熱器は、複数の温度ゾーンを有し、第１の加熱器が試料ホルダに熱的に接触したときにＰＣＲ反応のアニーリングステップで必要な温度を得るのに使用可能である。一実施形態では、第２の加熱器は、第２の加熱器が第１の方位にあって試料ホルダと熱的に接触したときに、ＰＣＲ反応で核酸の伸長または変性に必要な温度を提供するものである。
【０１６５】
本発明の装置および方法の一例では、ＰＣＲ反応のために試料ホルダと熱的に接触する第１の方位に第２の加熱器を移動させる。第２の加熱器は、試料ホルダに収容された試料の核酸を変性させるために約９５℃の温度を提供する。変性ステップ後、第２の加熱器を第２の方位に移動させ、第１の加熱器を試料ホルダと熱的に接触する第１の方位に移動させる。第１の加熱器は、プライマーを試料の核酸配列にアニーリングするために試料ホルダに温度を与える。変性ステップを実施するプロセスに続いて、所望の増幅産物が得られるまでアニーリングステップを繰り返すまたは循環させることができる。
【０１６６】
図１２は、本発明のサーマルサイクリング装置１２００の一例の実施形態を示す。この例では、装置１２００は、チップ１２５０のアドレス指定可能な所定の６つの異なる温度に対応する６つの異なる温度ゾーンを有する第１の加熱器１２１０を含む。第１の加熱器１２１０は、図１２の上面図に示すようにチップ１２５０と熱的に接触したり離れたりして移動可能である。第２の加熱器１２２０は、チップ１２５０のアドレス指定可能な所定の６つの異なる温度領域の各々を同一温度まで加熱するために加熱器全体に均一な温度を提供するものである。たとえば、第２の加熱器１２２０は、本発明のチップでＰＣＲを実施する変性および伸長ステップのために均一な温度を提供でき、第１の加熱器１２１０は、多数の反応を実施する特異性を増すためのさまざまなアニーリング温度を提供できる。多くの反応を分析するためのイメージングソース１２６０を、チップの加熱器の第１の方位とは反対側に配置してもよい。
【０１６７】
図１３は、図１２の例における第１の加熱器１２１０の側面図を、加熱器１２１０がアドレス指定可能なユニット１２５０のあるチップと熱的に接触する第１の方位にある状態で示す。たとえば、異なる熱電加熱素子１２１６、１２１８によって加熱器の各温度ゾーン１２１２、１２１４を提供することができ、一例の仕様をいくつか図１３に示す。
【０１６８】
一実施形態では、第１の加熱器によって温度勾配が得られる。第１の加熱器および第２の加熱器の加熱器のタイプの例としては、抵抗加熱器および熱電加熱器があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１６９】
さらに別の実施形態では、装置が、第１の加熱器、第２の加熱器またはその両方と熱的に接触したヒートシンクを含む。
【０１７０】
温度を監視するために、装置はまた、複数の温度センサを含むものであってもよい。一実施形態では、複数の温度センサが、装置の各温度ゾーンの温度測定用として割り当てられた少なくとも１つの温度センサを有する。温度センサは、熱電対であってもよいし、当該技術分野において利用可能な他の任意のセンサであってもよい。
【０１７１】
加熱素子は、素子に電圧を供給する電源に導線で接続可能であって、以後ユニットを加熱するものである。加熱素子は、ユニットの温度を監視および調節する温度センサに接続されていてもよい。温度センサは、温度を制御できるため、よってユニットのアレイの熱プロファイルを制御できる。チップおよび／または第１の加熱器をさまざまな温度ゾーンに分けることで、異なるサーマルサイクリングプロファイルを必要とする化学反応を並行実施する柔軟性がさらに高まる。あるいは、個々のユニットまたはゾーンに温度センサを接続することが可能であるため、各ユニットまたはゾーンの温度を独立に制御することができる。温度センサは、ユニットの基部に隣接するかまたはユニットの基部にある着脱自在のユニットとして配置できるものである。また、ユニットの内面または外面と一体化することも可能である。さらに、温度センサを加熱素子と一体の部品として製造することも可能である。
【０１７２】
本発明のサーマルサイクリング装置によって得られる温度プロファイルを図１４に示す。この例では、第１の加熱器の６つの異なる温度ゾーンを、第２の加熱器によって得られる９５℃という均一な温度よりもそれぞれ別個に低い温度で示す。たとえば、本発明のチップ、システムおよび装置でヒトゲノム全体を増幅する場合、ゲノムの各遺伝子（約３０，０００）を増幅するために約１５分未満、１０分未満または５分未満でさえ、４０サイクルを実施することができる。
【０１７３】
少なくとも２段階の温度レベルを循環するための装置の本体が、試料ホルダを収容するよう構成される。試料ホルダは、真空による力をはじめとする多種多様な手段で本体内の適所に保持可能なものである。一実施形態では、加熱器が試料ホルダと熱的に接触できるように、本体は試料ホルダを適所にしっかりと保持するための真空チャックを含む。当業者であれば自明であるように、試料ホルダを収容するよう構成するときに、クランプ、ピン、接着剤、細溝または他の任意の固定方法本体に取り入れることが可能である。
【０１７４】
この装置は、試料ホルダに対する加熱素子の第１の方位と第２の方位の位置を判断するためのセンサをさらに含むものであってもよい。
【０１７５】
本発明の別の態様では、少なくとも２段階の温度レベルの循環を必要とする化学反応を実施するための装置が、化学反応を含む複数のナノウェルを含むチップを収容するよう構成された本体と、第１の温度を提供する第１の加熱器と、第２の温度を提供する第２の加熱器と、を含み、第１の加熱器および第２の加熱器が、第１の方位と第２の方位との間で移動可能なように構成され、第１の方位が加熱器を試料ホルダと熱的に接触させ、第２の方位が加熱器を試料ホルダと熱的に接触させない。
【０１７６】
一実施形態では、複数のナノウェルがアドレス指定可能であり、ナノウェルのうちの少なくとも１つがアドレス指定されて、前記ナノウェル内で化学反応を実施するための所定の温度を示すように、ナノウェルが所定の一組の温度に基づいて配置される。
【０１７７】
別の実施形態では、第１の加熱器が複数の温度ゾーンを含む。複数の温度ゾーンは、所定の一組の温度に対応するものであってもよく、これに基づいてユニットをアレイ化する。
【０１７８】
第１の加熱器および第２の加熱器は、プロトコールに従って第１の方位と第２の方位との間で移動可能である。一実施形態では、装置はさらに、第１の加熱器および第２の加熱器を第１の方位と第２の方位との間で移動させるためのモータを含むものであってもよい。
【０１７９】
一実施形態では、第１の加熱器によって温度勾配が得られる。第１の加熱器および第２の加熱器の加熱器のタイプの例としては、抵抗加熱器および熱電加熱器があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１８０】
さらに別の実施形態では、装置が、第１の加熱器、第２の加熱器またはその両方と熱的に接触したヒートシンクを含む。
【０１８１】
温度を監視するために、装置はまた、複数の温度センサを含むものであってもよい。一実施形態では、複数の温度センサが、装置の各温度ゾーンの温度測定用として割り当てられた少なくとも１つの温度センサを有する。
【０１８２】
本発明の一例としての装置およびシステム１５００を図１５に示す。チップ１５１０は、少なくとも２段階の温度レベルの循環を必要とする化学反応を実施するための装置に実装可能なものである。チップ１５１０は、真空またはクリップなどのこれを適所に保持できる任意の方法で適所に設定可能なものである。チップはまた、当該チップを適切な位置に整列配置させるストップまたは壁に対してチップを摺動させることで、装置内に配置可能である。チップは、上下移動可能な試料ホルダ１５２０に配置可能なものである。試料ホルダについては、装置１５００の加熱器１５３０に接続されるよう構成可能である。
【０１８３】
一実施形態では、チップ１５１０および／またはチップのウェルを、チップまたはナノウェルプレートをカバーするための標準的なＰＣＲテープなどの薄いプラスチックカバー１５１２で封止する。ＰＣＲテープは、ポリエチレンなどの透明な材料で作られたものであってもよく、再移動可能であり、ときには交換が可能なこともある。透明な油を使ってウェルおよび／またはチップ１５１０の表面を覆うようにしてもよい。一実施形態では、チップ１５１０および／またはウェルを油とカバーで覆っている。
【０１８４】
一実施形態では、チップを本発明のサーマルサイクリング装置に配置するまではチップ１５１０を覆うカバー１５１２を取り除かない。チップを装置内の適所に配置したら、加熱器１５３０によって、チップ１５１０をトップカバースライド１５４０と光学的または熱的に接触させる力をチップ１５１０に印可することができる。トップカバースライド１５４０は、透明な材料または光学機器でチップの反応を観察できる任意の材料で作製可能なものである。トップカバースライドに利用可能な材料としては、当業者であれば自明であるように、ガラス、シリカ、シリコン、ポリマーまたはプラスチックがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０１８５】
トップカバースライド１５４０は、チップ１５１０の頂部またはチップのカバー１５１２および／またはウェルを加熱できる酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）加熱器などの加熱器１５４２を含むものであってもよい。トップカバースライドの加熱器１５４２を利用して、チップのユニットの表面あるいは開口部で凝縮が起こらないように、チップ表面で温度のバランスを取ることができる。たとえば、ＰＣＲ反応の実施時、試薬および／または試料の液体成分が、反応ユニットまたは反応ウェルの表面またはカバーで凝縮する点まで加熱されることがある。凝縮が生じると、ユニット内の反応を監視するのに使っている光学系の邪魔になることがある。本発明の一実施形態では、図１５に示されるように、装置の加熱器１５３０によって、加熱器１５４２を含むトップカバースライド１５４０とチップ１５１０を熱的に接触させる力を与えることができるが、これによってチップ１５１０の表面温度のバランスを取って凝縮を防止することができる。図１５に示されるように、トップカバースライド１５４０を一対のばねまたは圧縮装置１５５２によって装置のブリッジ１５５０に接続してもよい。ばねまたは他の装置１５５２は、加熱器１５３０がチップ１５１０に印可する力によって生じるトップカバースライド１５４０への圧力の一部を緩和することができ、これによって装置およびシステムが一層堅牢なものとなる。トップカバースライドと装置のブリッジとの接続には、圧力ダンピングのためのどのような方法または装置を利用してもよい。
【０１８６】
図１５に示す一例としてのシステムおよび装置では、サーマルサイクリング装置１５００の側面を介してチップ１５１０をロードまたはアンロードすることができる。次に、装置の加熱器１５３０をチップ１５１０と熱的に接触する方位に動かし、チップをトップカバースライド１５４０と熱的に接触させる力を与えることができる。図１５では、チップがウェルを覆うプラスチックカバー１５１２を有する。同じく図１５では、トップカバースライド１５４０が溶融ＳｉＯ２／石英材料を含み、ＩＴＯ加熱器１５４２も含む。ＩＴＯ加熱器１５４２は、図１５に示すようにＩＴＯ加熱器に接続された導線１５４４によって動作する。次に、システム内の応力を緩和する圧縮ばね１５５２でトップカバースライド１５４０を装置のブリッジ１５５０に接続する。ばね１５５２は、装置の加熱器１５３０およびトップカバースライド１５４０の加熱器の両方とチップ１５１０との熱的な接触も改善する機能を果たすことができる。
【０１８７】
実用上、加熱素子と作動的に接続されたコンピュータ読み取り可能な媒体に格納された所定のアルゴリズムを処理することで、加熱素子を制御して反応試料の温度を制御することが可能である。加熱素子の移動も、コンピュータで提供またはコンピュータ読み取り可能な媒体に格納可能なプロトコールまたはアルゴリズムで制御可能である。他の態様では、制御ステップが、コンピュータ読み取り可能な媒体に格納されたプロトコールに基づいて、試料ホルダのユニットまたはチップに作動的に接続された温度センサ素子から出力される温度または移動センサ信号の処理を必要とするものであってもよい。これは、アナログ信号またはデジタル信号を処理する温度制御のための従来のエレクトロニクス構成部品を利用して実現可能である。好ましくは、エレクトロニクス構成部品はフィードバック制御回路で稼働される。これらは一ユニットの温度を制御できるが、まとめて１つの温度ゾーンを構成する複数のユニットの温度またはゾーン自体の温度を制御できることも多い。特定の実施形態では、異なるゾーンの温度を別々に制御する。サーマルサイクリングのプロファイルおよび期間は、本発明のチップを利用する特定の用途に左右される。
【０１８８】
システム
本発明のチップに、当該チップでの化学反応の結果または過程を検出および／または監視できる光学系を設けることが可能である。このような光学系は、第１に反応物を光学的に励起させた後、チップの反応物からの光信号を集めて分析して機能を実現する。本発明に適用可能な光学系は、３つの素子すなわち、光学励起素子、光伝送素子、フォトン検知素子を含む。光学系はまた、任意に光学的選択素子を含んでもよい。
【０１８９】
図１６は、実験セットアップでの機器の代表例を示す代表的なブロック図である。図１６は、光学励起素子の代表例としてレーザ１６１０に接続されたコンピュータシステム（またはデジタル装置）１６００を示す。光学励起素子は、ナノウェルに含まれる反応物を光学的に励起させるのに用いられる励起光線のソースとして作用する。この素子は、異なる波長、強度および／またはコヒーレント特性の光線を生成する広範囲にわたる光源を包含する。このような光学的励起源の代表例としては、レーザ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、紫外線電球および／または白色光源があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１９０】
本発明で用いられる光伝送素子は、２つの機能を果たす。第１に、チップのナノウェル内部の反応物に光学的励起源を集めるおよび／または向ける機能である。第２に、チップのナノウェル内部の反応物から発せられる光信号をフォトン検知素子に伝送および／または送る機能である。本発明で使用するのに適した光伝送素子は、１箇所から別の箇所に光をチャネル伝送する多種多様な光学的装置を包含する。このような光伝送装置の非限定的な例としては、光ファイバ、光学的マルチプレクサ（ＭＵＸ）およびデマルチプレクサ（ＤＥ−ＭＵＸ）、回折格子、アレイ導波路格子（ＡＷＧ）、光スイッチ、ミラー、レンズ、コリメータ、適切な屈折率および幾何学的形状での光の伝送を案内する他の任意の装置があげられる。
【０１９１】
フォトン検知素子は、ナノウェル内部の反応物からの光信号のスペクトルを分析する。好適なフォトン検知素子は、特定の波長で光信号の強度を検出可能であり、好ましくは同時に一定範囲の波長での光信号の強度も測定できる。好ましくは、素子は、スペクトルピーク波長、スペクトルピーク幅、バックグラウンドスペクトルノイズ測定値を示すスペクトルデータ分析結果を提供するものである。本発明に適したフォトン検知素子の代表例として、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、電子倍増式電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）、光倍増管（ＰＭＴ）、光倍増アレイ、ゲートセンシティブＦＥＴ、ナノチューブＦＥＴおよびＰ−Ｉ−Ｎダイオードがあげられる。本明細書で使用する場合、ＣＣＤは、従来のＣＣＤ、電子倍増式電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）および他の形態の増感ＣＣＤを含む。
【０１９２】
さまざまな素子の多くの組み合わせを用いて本発明の光学系を組み立てることが可能であるが、励起反応物のスペクトルを分析するための有用なアセンブリは、光伝送素子とフォトン検知素子とを含む。このようなアセンブリを本明細書では「スペクトルアナライザ」とも呼ぶ。
【０１９３】
必要があれば、本発明の光学系は、光学的選択素子を含むものであってもよい。この素子は、ナノウェルに収容された反応物に届く前に励起光線の光学特性を選択および／または精錬する。また、信号がフォトン検知素子に届く前にナノウェル内の反応物からの光信号を選択および／または精錬するために光学的選択素子を利用してもよい。好適な光学的選択素子は、偏光、光強度、波長、複数の光ビーム間の位相差、複数の光ビーム間の時間遅延を含むがこれに限定されるものではない、広範囲にわたる光学特性を選択および調節可能である。このような光学的選択素子の代表例として、偏光フィルタ、光減衰器、波長フィルタ（低域通過、帯域通過または高域通過）、波長板および遅延線がある。
【０１９４】
上述した光学的素子は多種多様な構成を取ることができる。本発明のチップの一体部分をなしてもよいし、別のユニットのままにしておいてもよい。これらの素子はいずれも、商業入手可能である。よって、一実施形態において、本発明は、光伝送素子およびフォトン検知素子がチップ基板に製造されるチップを提供するものである。一態様では、フォトン検知素子が、監視対象となるチップ上の各ナノウェルと一体化される。別の態様では、２以上のタイプのフォトン検知素子がナノウェルと一体化され、検出能または検出効率が高められる。別の態様では、フォトン検知素子をナノウェルの側面に沿ってまたはナノウェルの基部に製造してもよいし、ナノウェルのカバーの一部として製造してもよい。このような構成に適したフォトン検知素子としては、アバランシェフォトダイオード、電荷結合装置（従来のＣＣＤ、電子倍増式電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）および他の形態の増感ＣＣＤを含む）、ゲートセンシティブＦＥＴ、ナノチューブＦＥＴ、Ｐ−Ｉ−Ｎダイオードがあげられるが、これに限定されるものではない。電子移動のアバランシェプロセスで信号を増幅することによって単一のフォトンを検出できるため、アバランシェフォトダイオードが特に好ましい。本明細書に記載または当該技術分野において公知の標準的なＩＣプロセシング技術を用いて、これらの素子と支持回路とを一緒にして、本発明のチップの一部として製造することも可能である。
【０１９５】
別の実施形態では、本発明は、チップおよび光学系が別のユニットのままとなっている装置を提供するものである。この実施形態の一態様は、複数のサイクル時間にわたって少なくとも２段階の温度レベルを循環させる必要のある化学的または生物学的反応を実施するための装置を包含する。この装置は、本発明のチップと、チップに作動的に接続され、なおかつナノウェルからの光信号を検出する光学系と、を含む。好ましくは、検出される光信号が、ナノウェルで起こる化学反応による生成物の量に関連している。
【０１９６】
図１６は、この態様の一例としての光学系を示す。一例としての実施形態では、このシステムが、コンピュータまたは他のデジタルセットアップ１６００によって制御された波長可変レーザ１６１０またはゼノンランプなどの光伝送素子を含む。レーザは、Powellレンズ１６２０、テレスコープ１６３０および／または線焦点レーザ１６４０を使ってすべてのナノウェルに均一な分布を提供できるような焦点とされる。チップ上のナノウェルからの光信号は、鏡筒などのレンズ１６９０で平行化され、低域通過フィルタ、高域通過フィルタまたはノッチフィルタのいずれかである同調フィルタ１６９０を通って、スペクトル解析のために電荷結合素子（ＣＣＤ）１６１５に送られる。この特定の実施形態では、チップ上に製造されたナノウェルでの化学反応の過程および／または結果を監視するための低コストの解決策が得られる。
【０１９７】
さらに別の実施形態では、図１６のオプション１に示すように、Ｘ−Ｙステージに配置される光伝送素子が可動である。別の実施形態では、図１６のオプション２に示すように、チップをＸ−Ｙステージに配置する。
【０１９８】
さらに別の実施形態では、基板の特定のナノウェルで最適な化学反応を実現するためのフィードバック制御または自己学習が得られる。たとえば、可動の光伝送素子およびフォトン検知素子との関連でナノウェルのアレイを含む定位置の基板を使用して、１つまたは複数の光伝送ユニットでの加熱後（または一連の加熱および／または冷却ステップの提供後）に、特定のナノウェルでの所望の化学反応の成果をフォトン検知素子で検出することができる。検出ステップに基づいて特定のナノウェルで各化学反応を分析する際、加熱および／または冷却のための以後のサイクルラウンドに好適な補正（反応温度または反応サイクルの期間を上下させるなど）を取り入れて、必要に応じて化学反応を最適化することが可能である。各ナノウェルでの化学反応で所望の成果が検出されるまで、さまざまなナノウェル場所で伝送素子と検知素子を繰り返し通れば、このプロセスを繰り返すことができる。このようにして、特定のナノウェル化学反応を連続的に監視し、操作して特定のナノウェルに合った最適な化学反応を得ることができる。異なるナノウェル場所では、個々の反応のユニークな特性に応じて異なる条件が必要になることもある（ＰＣＲ反応で異なるプライマーおよびテンプレートを用いる場合など）。よって、各ナノウェル場所に向けたフィードバックループプロセスで本発明の装置を利用して、基板上のそれぞれの場所での化学反応を最適化することができる。
【０１９９】
一例としての実施形態では、ChungaraシリーズのＣＣＤカメラを利用することができる。ChungaraＣＣＤカメラは、天文学および分光学などの分野での低ノイズかつ長時間曝露による画像形成の厳しい用途の大半で使用可能である。ChungaraＣＣＤコントローラでは、モジュール方式と一般的なハードウェアアーキテクチャに基づいているため、広範囲にわたるＣＣＤを読み取ることができる。たとえば、使用可能な一例のＣＣＤは、１５３６×１０２４のKodak KAF-1602ＣＣＤから４０９６×４０９６のKodak KAF-16801ＣＣＤにおよぶ。カメラをイーサネット（登録商標）リンクまたはワイヤレス接続でホストコンピュータに接続して、コンピュータとＣＣＤカメラとの間の距離が長くてもよいようにすることも可能である。
【０２００】
別の実施形態では、本発明は、チップ、装置および光学系が別々のユニットであるシステムを提供するものである。一実施形態では、本発明の装置、システム、チップ、本発明のサーマルサイクリング装置または加熱素子、チップに作動的に接続され、かつチップのアドレス指定可能なユニットからの光信号を検出する光学系を提供するものである。好ましくは、検出される光信号が、ユニットで起こる化学反応による生成物の量に関連している。
【０２０１】
別の好ましい実施形態では、チップに作動的に接続された本発明の光学系によって、本発明のチップで増幅された核酸を検出する。この光学系は、増幅反応時に適当な励起光線を反応物に伝送し、反応物からの光信号を集めて分析できるものである。好ましくは、検出される光信号が、複数のサイクル時間にわたって増幅反応で増幅された核酸の量を示す。特定の態様では、光学系は、増幅時に複数回にわたって反応試料の入ったウェルに励起光線を送り、複数回それぞれにナノウェルからの光信号を監視する。光信号の相対強度を、好ましくは複数のサイクル時間にわたって分析することで、増幅反応の進行を定量的に監視することができる。一般に、監視対象となる光信号はルミネッセント信号である。増幅が開始されたらナノウェルの開口なしでも増幅生成物の検出および／または監視を実施可能である。
【０２０２】
図１７は、第１の方位と第２の方位との間で移動可能な第１の加熱器１７１２および第２の加熱器１７１２のあるサーマルサイクリング装置１７１０と、所定の温度に基づいてアドレス指定可能なユニットのアレイのあるチップ１７２０とを有する本発明の一例のシステム１７００を示す。この例では、チップ１７２０および装置１７１０に作動的に接続された光学系１７３０がChungaraＣＣＤカメラ１７３２である。図１７の側面図に示すように、加熱器１７１２、１７１４は、独立して移動し、本発明のチップ１７２０と熱的に接触して、ゲノム全体のＰＣＲ増幅反応などの多数の化学反応の高速サーマルサイクリングを提供可能なものである。
【０２０３】
図１８は、光学系１８１０と、加熱装置１８２０と、化学反応を実施するためのチップ１８３０とを含む本発明の一例のシステム１８００を示す。システムの加熱装置１８２０は、ＰＣＲ反応用のサーマルサイクリング装置であってもよい。図１８に示すように、加熱装置は、ＰＣＲ用の変性ブロック１８２２およびアニールブロック１８２４を含むものであってもよい。加熱装置１８２０はまた、図１８にて矢印で示すように、水平方向と垂直方向の両方に移動可能である。垂直方向に移動可能な試料ホルダ１８４０にはチップ１８３０が挿入される。チップ１８３０および／またはチップのナノウェルは、プラスチックカバー１８３２で覆われていてもよいし覆われていなくてもよい。加熱器１８２０は、薄膜ＩＴＯ加熱器１８５２を含むトップカバースライド１８５０と試料ホルダ１８４０を強制的に熱的に接触させる。トップカバースライド１８５０は、システムの試料ホルダ１８４０と加熱器１８２０、１８５２との熱的な接触性を高めるための圧縮ばね１８５４によってシステム１８００に接続される。システム１８００は、トップカバースライド１８５０が光学系１８１０に対して圧縮されるのを防ぐためのデッドストップ１８５６を含むものであってもよい。
【０２０４】
図１８では、光学系１８１０が、ＣＣＤカメラ１８１２と、励起光源１８１４と、光学機器１８１６と、光学フィルタ１８１８とを含む。このシステムは、複数の光学系を含むものであってもよい。別の実施形態では、システムは、複数のＣＣＤカメラ、励起光源、光学機器または光学フィルタを含む。光学系１８１０は、チップ１８３０が加熱装置１８２０と熱的に接触したときにチップ１８３０で発生する化学反応からの情報を受け取るように機能できるものである。
【０２０５】
図１９は、代表例の論理装置を示すブロック図であり、これによって本発明に関するデータを吟味または分析することができる。このようなデータは、個体の遺伝子型、遺伝子構成または疾患、機能障害または症状に関連したものであってもよい。図１９は、たとえば、結果を得るための装置１９２４と一緒に用いられる装置１９２０に接続されたコンピュータシステム（またはデジタル装置）１９００を含む。コンピュータシステム１９００を、固定メディア１９１２を有するサーバ１９０９に対して任意に接続可能な媒体１９１１および／またはネットワークポート１９０５からの指示を読み取ることのできる論理装置として理解してもよい。図１９に示すシステムは、ＣＰＵ１９０１と、ディスクドライブ１９０３と、キーボード１９１５および／またはマウス１９１６などの任意の入力装置と、任意のモニタ１９０７とを含む。ローカルな場所または遠隔地で、図示のように通信媒体によってサーバ１９０９とのデータ通信を実現することが可能である。通信媒体は、データを送信および／または受信するどのような手段を含むものであってもよい。たとえば、通信媒体は、ネットワーク接続、ワイヤレス接続またはインターネット接続であってもよい。このような接続によって、ＷＷＷでの通信ができる。本発明に関するデータを、第三者１９２２が受信および／または吟味するために、このようなネットワークまたは接続経由で送信することが想定される。受領者またはユーザ１９２２は、患者、医療関係者またはヘルスケアマネージャであってもよい。一実施形態では、コンピュータ読み取り可能な媒体として、生物学的試料の解析結果の送信に適した媒体があげられる。この媒体には、被検体の遺伝子型、遺伝子構成または疾患症状または状態に関する結果を含むことができ、このような結果は本明細書に記載の方法で得られるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２０６】
本発明の使用
サーマルサイクリングのための本発明のチップおよび装置には、制御可能な温度が望ましい化学的用途および生物学的用途で多岐にわたる使用がある。本発明の方法、チップおよび装置は、好ましくは、チップの取り扱い、サーマルサイクリング、画像形成をはじめとするプロセスの１つまたは複数のステップの組み合わせに役立つ設備で実施する。よって、本発明は、ある種の個々のメンバから得た生物学的試料の遺伝子発現プロファイルを前記種の標準ゲノムに対して同時に判断するシステムを提供するものである。
【０２０７】
一実施形態では、本発明を使用して、反応試料の温度を変更および／または維持することが可能である。反応試料の温度を変更および／または維持することは、タンパク質間の相互作用を見極める、ＤＮＡまたはＲＮＡハイブリダイゼーションについて検討する、酵素反応を実施することを含むがこれに限定されるものではない、広範囲にわたる状況で必要とされる。この方法は、加熱素子と熱的に接触しているチップに製造されたナノウェルに反応試料を配置し、加熱素子に電圧を印加することを要するものである。
【０２０８】
別の実施形態では、サーマルサイクリング用の本発明のチップ装置を、複数の反応試料が関与し、少なくとも２段階の温度レベルを循環させる必要のある化学反応の実施に利用する。このプロセスは、（ａ）本明細書に記載したようなユニットのアレイを含むチップを提供し、（ｂ）複数の反応試料をチップのユニットに配置し、（ｃ）加熱素子を制御して少なくとも２段階の温度レベルを循環させることを必要とする。
【０２０９】
本発明の方法の実施は一般に、加熱素子と熱的に接触した本発明のチップのナノウェルに反応試料を配置するところから始まる。必要があれば、本発明のチップに作動的に接続された分注システムによって反応試料を適用してもよい。手動のピペットから自動のロボットシステムまで多種多様な分注機器が当該技術分野において利用可能である。好ましい分注機器としては、圧電ナノディスペンサがあげられる。
【０２１０】
本発明のチップおよび装置は、定量的核酸増幅の実施に特に適している。したがって、本発明は、核酸増幅反応生成物の形成を、好ましくはリアルタイムで監視するための方法を提供するものである。特定の好ましい実施形態では、そこに含まれている増幅後の核酸を、チップに一体化されたフォトン検知素子で直接監視する。フォトン検知素子は、増幅反応時の任意の検討時刻における増幅された核酸の量を反映したものである光信号の強度を記録する。光信号は、標識反応物を適当な入射光線で励起する際に放出されるどのような種類のルミネッセント信号であってもよい。
【０２１１】
本発明の標的核酸の増幅・検出方法には、薬剤スクリーニング、疾患の診断、系統発生的分類、個体の遺伝子型決定、親の同定および法医学的同定など、広範囲にわたる用途がある。
【０２１２】
一実施形態では、本発明のシステム、チップ、装置または方法を利用して、治療的に関連するバイオマーカーを発見することができよう。たとえば、本発明を利用して、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肺癌のバイオマーカーを同定することができよう。
【０２１３】
より一層基本的なレベルで、標的核酸の増幅および検出を、疾患のある組織と正常な組織との間、異なるタイプの組織および細胞間、異なる発達段階または異なる細胞周期点にある細胞間、さまざまな環境刺激または鉛薬剤（lead drug）を受けている細胞間の差次的遺伝子発現の同定および定量化に利用してもよい。
【０２１４】
本発明のさまざまな構成では、１つまたは複数の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の有無などの構造的ゲノム情報ならびに、１つまたは複数の遺伝子の発現または発現量などの機能的ゲノム情報を得る上で有用な利用者側でのアッセイを提供するための方法が開示される。それ自体、アッセイは生物学的試料における遺伝物質の存在または発現を検出するよう構成可能なものである。この方法は、ストックアッセイの注文を受けるよう構成されたユーザインタフェースを提供し、カスタムアッセイの設計と前記アッセイの注文のリクエストを受けるよう構成されたユーザインタフェースを提供し、消費者からの１つのカスタムアッセイまたはストックアッセイの注文に応じて、消費者に少なくとも１つのカスタムアッセイまたはストックアッセイを納品することを含む。特定の他の態様では、本発明は、システム、装置、チップならびに、遺伝物質の存在または発現を検出するよう構成されたアッセイを消費者に提供するためのシステムを構成するための方法を含む。一実施形態では、ユーザの需要に合わせてチップをカスタマイズすることが可能である。
【０２１５】
本発明は、ポリヌクレオチドを含有する液体試料で増幅反応を行うための方法および装置をはじめとして、少量の液体を収容して取り扱うための装置および方法を提供するものである。本発明の実施形態は、液体試料でのポリヌクレオチドのサーモサイクルによる増幅反応をはじめとして、化学反応を実施するためのチップを含む。
【０２１６】
本発明のチップおよび他の装置には、制御可能な温度が望ましい他の多くの化学的用途および生物学的用途での使用がある。このような用途としては、レドックス反応、加水分解、リン酸化、重合などの多種多様な反応があげられる。別の用途に、タンパク質、糖タンパク質、核酸、脂質ならびに、無機化学物質またはこれらの任意の組み合わせなどの生体分子が関与する相互作用を見極めることがある。化学反応にも、核酸分子間、核酸とタンパク質との間、タンパク質と小分子との間の相互作用が関与することがある。化学反応は、本発明のチップのナノウェルに導入される細胞の外で起こるものであってもよいし、細胞内で起こるものであってもよい。
【０２１７】
特に重要なのが、特定のタンパク質間相互作用の存在を検出する用途である。このような用途では一般に、タンパク質性のプローブと標的タンパク質とを本発明のチップのユニットに配置して利用する。
【０２１８】
この実施形態の一態様では、タンパク質間相互作用が標的タンパク質（抗原など）とその標的に特異的な抗体との間の相互作用である。別の態様では、タンパク質間相互作用が、細胞表面レセプターとその対応するリガンドとの間の相互作用である。さらに別の態様では、タンパク質間相互作用に、細胞表面レセプターと免疫リポゾームまたは免疫毒素とが関与する。他の態様では、タンパク質間相互作用が、サイトゾルタンパク質、核タンパク質、シャペロンタンパク質または他の細胞内膜構造に固定されたタンパク質が関与するものであってもよい。
【０２１９】
「膜」「サイトゾル」「核」「分泌」という用語は、細胞タンパク質に適用される場合、細胞タンパク質がほとんど、優先的に、あるいは好んで局在する細胞外および／または細胞内の場所を示す。
【０２２０】
「細胞表面レセプター」とは、それぞれのリガンドに結合できる膜タンパク質のサブセットを示す。細胞表面レセプターは、細胞の細胞膜に固定または挿入された分子である。これらは、タンパク質、糖タンパク質、多糖および脂質の大きなファミリを構成し、細胞膜の構造的な構成要素としてだけでなく、多種多様な生物学的機能を担う調節要素としても機能する。
【０２２１】
反応は一般に、プローブと標的との間に複合体が形成される条件下で、タンパク質性のプローブを標的タンパク質と接触させることで実施される。反応温度、反応時間、緩衝液の状態などの条件は、調査対象となる個々の相互作用に左右されることになる。通常、生理学的に関連する温度と緩衝液の状態で反応を実施すると好ましい。生理学的に関連する温度とは、ほぼ室温から約３７℃の範囲である。これは、本発明のチップの加熱素子を調節することで実現可能である。一般に、生理緩衝液には生理学的濃度の塩が含有され、約６．５から約７．８、好ましくは約７．０から約７．５の中性のｐＨに調節される。上掲のSambrook et al.(1989)に多種多様な生理緩衝液が列挙されているため、本明細書では詳細を割愛する。
【０２２２】
当該技術分野における標準的な手法または本明細書に記載する方法で、複合体の形成を直接または間接的に検出することができる。直接的な検出方法では、プローブに検出可能な標識を与え、複合体が形成されたら、未反応のプローブとは区別できる光信号がプローブから発せられる。望ましい標識は一般に、標的結合または得られる標的−プローブ複合体の安定性に干渉しない。上述したように、このような用途に適した広範囲にわたる標識が当該技術分野において公知であり、その大半がルミネッセントプローブである。結合反応で形成されるプローブ−標的複合体の量については、標準的な定量アッセイまたは上述した光学系を用いる定量方法で定量化可能である。
【０２２３】
本明細書に記載した例および他の実施形態は一例にすぎず、本発明の装置、システム、組成物、材料および方法の完全な範囲を説明するにあたってこれを限定することを意図したものではない。具体的な実施形態、装置、システム、組成物、材料および方法における等価な変更、改変、変動を本発明の範囲内で実施し、実質的に類似の結果を得ることができよう。このような変更、改変または変動は、本発明の趣旨および範囲を逸脱するものとはみなされない。
【図１】
2010516281.tif 000004
【図２】
2010516281.tif 000005
【図３】
2010516281.tif 000006
【図４】
2010516281.tif 000007
【図５】
2010516281.tif 000008
【図６】
2010516281.tif 000009
【図７】
2010516281.tif 000010
【図８】
2010516281.tif 000011
【図９】
2010516281.tif 000012
【図１０】
2010516281.tif 000013
【図１１】
2010516281.tif 000014
【図１２】
2010516281.tif 000015
【図１３】
2010516281.tif 000016
【図１４】
2010516281.tif 000017
【図１５】
2010516281.tif 000018
【図１６】
2010516281.tif 000019
【図１７】
2010516281.tif 000020
【図１８】
2010516281.tif 000021
【図１９】
2010516281.tif 000022
【国際調査報告】
2010516281.tif 000023