(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0006270823.tif 000032
［式中、
−Ａは、
−（Ｒ１）ｎ−基を表し、ここで、Ｒ１は、そのＣ末端により結合しているアミノ酸残基であり、ｎ＝１または２であり、各Ｒ１は同一または異なり、前記アミノ酸のＮ末端はアリールアルコキシカルボニル基で置換され得るか；または
−Ｃ（Ｏ）−Ｒ６基を表し、ここで、Ｒ６は、１または２個のヘテロ原子を含む５から１４員の飽和ヘテロ環であって、該ヘテロ環は、未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキルで置換されており；
−Ｂは、
−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７基を表し、ここで、Ｒ７は、水素；直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２アルキル；であるか、または、Ｒ７はＯＲ８を表し、該Ｒ８が直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２アルキルである］
の７β−ヒドロキシコレステロール基本構造を有する化合物。
【請求項２】
下記式（Ｉ）
0006270823.tif 000033
の化合物であって、
以下の条件：
−Ａは、−（Ｒ１）ｎ−基を表し、ここで、Ｒ１はアミノ酸残基であり、ｎ＝１または２である；
−Ａは、−（Ｒ１）ｎ−基を表し、ここで、Ｒ１はアミノ酸残基であり、ｎ＝１または２であり、前記アミノ酸のＮ末端はアリールアルコキシカルボニル基で置換されている；
−Ａは、場合によりそのＮ末端にアリールアルコキシカルボニル基が置換しているグリシニル基に連結しているアラニル基を表す；
−Ａは、場合によりそのＮ末端にアリールアルコキシカルボニル基が置換しているグリシニル基に連結しているメチオニル基を表す；
の少なくとも１つを満たし、及び
−Ｂは、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７基を表し、ここで、Ｒ７は、水素；直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２アルキル；であるか、または、Ｒ７はＯＲ８を表し、該Ｒ８が直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２アルキルである；
式（Ｉ）のβ−ヒドロキシコレステロール基本構造を有する化合物。
【請求項３】
Ａは、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ６基を表し、ここで、Ｒ６は、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン基であって、未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキルで置換されている、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項４】
Ｂは、アルキル基がＣ１−Ｃ６であるアシル基、または、アルキル基がＣ１−Ｃ６であるアルコキシカルボニル基を表す請求項１〜３のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項５】
下記式（Ｉ）
0006270823.tif 000034
で表される７β−ヒドロキシコレステロール基本構造を有する化合物であって、
７−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２−（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−アセトアミド）プロパノエート（分子１．ａ）；
７−アセトキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２−（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−アセトアミド）プロパノエート（分子１．ｂ）；
７−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレート（分子２．ａ）；
７−アセトキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］−フェナントレン−３−イル２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレート（分子２．ｂ）；
から選択される式（Ｉ）の化合物。
【請求項６】
−コレステロールの３位のヒドロキシル官能基を保護基で保護する段階、
−７位にケトン官能基を導入する段階、
−ケトン官能基をヒドロキシル官能基に還元する段階、
−７位のヒドロキシル官能基にＢ基に対応する保護基を導入する段階、及び
−３位のヒドロキシル官能基を脱保護する段階
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【請求項７】
脱保護後、３位のヒドロキシル官能基を所望のＡ基で置換し得る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物及び医薬として許容され得るビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を単独で、または別の活性成分と一緒に含むリポソームから構成されている、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を単独で、または別の活性成分と一緒に含むアルコール溶液から構成されている、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
経口ルートにより投与するのに適している、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、エマルジョン剤、経口懸濁液剤、滴剤、シロップ剤、式（Ｉ）の化合物と胆汁酸塩の複合体、及びリポソームまたは非リポソーム形態の式（Ｉ）の化合物とリン脂質の組合せから選択される、経口ルートにより投与するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記式（Ｉ）の化合物は唯一の活性成分として、または抗癌剤と一緒に使用されている、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
形質転換した星状膠細胞に関係する疾患の治療のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１５】
多形膠芽細胞腫の治療のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１６】
多形膠芽細胞腫の治療のための式（Ｉ）の化合物であって、前記治療が式（Ｉ）の第１化合物を投与する少なくとも１つの段階、及び第１化合物とは異なる式（Ｉ）の第２化合物を投与する少なくとも１つの段階を含む逐次治療である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１７】
悪性血液疾患の治療のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１８】
悪性血液疾患が骨髄タイプである、請求項１７に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１９】
悪性血液疾患がリンパ腫である、請求項１７に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２０】
神経芽細胞腫の治療のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２１】
黒色腫の治療のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２２】
Ｂが、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７基を表し、ここで、Ｒ７は、直鎖または分岐状のＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または、Ｒ７はＯＲ８を表し、該Ｒ８が直鎖または分岐状のＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２３】
−Ａが、−（Ｒ１）ｎ−基を表し、ここで、Ｒ１はアミノ酸残基であり、ｎ＝１または２であり、前記アミノ酸のＮ末端はベンジルオキシカルボニル基で置換されている；または、
−Ａが、場合によりそのＮ末端にベンジルオキシカルボニル基が置換しているグリシニル基に連結しているアラニル基を表す；または、
−Ａが、場合によりそのＮ−末端にベンジルオキシカルボニル基が置換しているグリシニル基に結合しているメチオニル基を表す；
請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２４】
Ｂが、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７基を表し、ここで、Ｒ７は、直鎖または分岐状のＣ１−Ｃ６アルキルであるか、または、Ｒ７はＯＲ８を表し、該Ｒ８が直鎖または分岐状のＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項２５】
Ｂが、アセチル基またはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を表す、請求項４に記載の式（Ｉ）の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ステロール誘導体、その製造方法、それを含む医薬組成物、及び癌細胞に形質転換した星状膠細胞に関係する疾患を治療するため、特に多形膠芽細胞腫を治療するため、または特に形質転換した骨髄細胞に関係する悪性血液疾患を治療するため、またはリンパ腫を治療するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞形質転換は正常な真核細胞の不死化細胞及び／または癌性真核細胞への転移に相当する。用語「形質転換した細胞」または「癌細胞」は以後同義語として使用される。
【０００３】
グレードＩＶの星状細胞腫としても公知の多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）は、星状膠細胞が特にグレードＩ、グレードＩＩ及びグレードＩＩＩの神経膠腫を経て癌細胞に形質転換することを特徴とする脳腫瘍である。
【０００４】
腫瘍学の分野で実質的な科学的及び治療的進歩があるにもかかわらず、ＧＢＭは今でも不治の癌である。うまく行っても、研究者及び医師は患者の平均寿命が数ヶ月、最長でも１５ヶ月延長できると満足している。
【０００５】
ＧＢＭの治療において経験した問題の１つは幹細胞により生ずる再発である。実際、現状の治療が腫瘍の大部分の根絶に成功したときでも、幹細胞はしばしば新しい腫瘍を発生させる（１，２）。
【０００６】
現在の治療は通常、腫瘍の場所が切除可能ならば腫瘍を切除後、必要に応じて放射線治療及び／または化学療法を行っている。化学療法において最も有力な治療の１つは、アバスチン（ＶＥＧＦのその受容体への結合を抑制する）及びイリノテカン（トポイソメラーゼＩの阻害剤）の投与からなる二剤治療である。現在、プロカルバジン（ＤＮＡアルキル化剤）、ロムスチン（ＣＣＮＵ；非特異的アルキル化剤）及びビンクリスチン（微小管重合の抑制）の組合せであるＰＣＶタイプの三剤治療が議論の的になっている。グアニンアルキル化剤であるテモゾロミドと放射線治療との組合せは、特に高度メチル化ＤＮＡを有する患者のメディアン生存の増加を示す。シレンジタイド（幾つかのインテグリン受容体の抑制）及びタランパネル（ＡＭＰＡタイプのグルタメートチャネルのブロッキング）を試験する臨床試験（フェーズＩＩＩ）が進行中である。
【０００７】
免疫療法研究及び臨床試験には、２つのタイプ：
−インビトロで活性化されている細胞、例えば頭蓋内に注入されるリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ；フェーズＩＩ臨床試験）または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ；フェーズＩ臨床試験）を患者に注入する養子免疫療法。現在、殆ど最低限に近い２０ヶ月の生存が観察されている；
−ワクチン（フェーズＩ）及び樹状細胞（フェーズＩＩ）を使用することからなる能動免疫療法。これは患者生存に有意な改善を示さない。これらの試験は中止している；
がある。
【０００８】
抗癌ボテンシャルを有する分子のベクターとしてアデノウイルス、レトロウイルスまたは麻疹ウイルスを使用することからなる遺伝子治療は、たった６〜１１ヶ月しか生存の改善を示さない。ＧＢＭにおいて薬剤のトランスポータとしてニューロン幹細胞の使用を提案している細胞治療は今でも基本的研究の実証段階にある。
【０００９】
最近数十年ではやや軽視されており、再び考察されているアプローチは、解糖及び酸化的リン酸化のレベルで作用させることからなる。癌細胞は、たとえ酸素供給が制限要因でなくてもその代謝を嫌気性代謝の方向に変化させる傾向があるので、グルコースの消費を増加させる。Ｗａｒｂｕｒｇ（３）が知見したこの現象はＨＩＦ（低酸素誘導因子）及びＭｙｃプロ癌遺伝子の過剰発現に起因する。ＨＩＦは、酸素呼吸における主要酵素であるピルビン酸デヒドロゲナーゼを不活性化することによるピルベートのラクテートへの変換を嫌気的に増加させる。Ｍｙｃは無酸素呼吸に関与するグルタミンの生合成を刺激する（４）。
【００１０】
これに関連して、エネルギー代謝に作用する臨床試験は進行中である。例として（４）、
−メトホルミン：ミトコンドリア呼吸複合体Ｉのインヒビターであり、細胞増殖を減速させるＡＭＰＫを誘導する；
−フロレチン：グルコースの取り込みを減らすための物質；
−フェニルアセテート：グルタミンレベルを低下させるための物質；
−ジクロロアセテート：ピルビン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤；
が挙げられ得る。
【００１１】
ジクロロアセテートを除いて、これら全ての分子は試験中であり（フェーズＩＩ臨床試験）、現在知見はまだ得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＰＮＡＳ，２００４，１０１：７８１−７８６
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，２８６：３２８４３−３２８５３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ，１９２３，１４２：３１７−３３３
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｎａｃｅｒ，２０１０，１０：２６７−２７７
【発明の概要】
【００１３】
今回、ＧＢＭの起源での細胞型である星状膠細胞のエネルギー代謝の特定面を標的とするステロール誘導体が多形膠芽細胞腫を治療するために使用できるだろうと知見された。
【００１４】
本発明の独特の態様は、その形質転換が最終的にＧＢＭの形成をもたらす（膠細胞起源の）星状膠細胞の特定エネルギー代謝を使用することからなる。
【００１５】
実際、星状膠細胞は同時に、酸化的リン酸化（ミトコンドリアにおける電子伝達にカップリングしたクレブス回路）及び解糖を介してＡＴＰの形態でのエネルギー供給を使用している。後者では、ピルベートはクレブス回路に入らないが、タイプ５の酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によりラクテートに還元される。ＡＴＰ供給に加えて、星状膠細胞は、隣接細胞のニューロンに神経伝達物質（グルタメート）を供給するためにラクテートの生成を介して解糖を使用している。
【００１６】
下表には、正常または癌性の星状膠細胞のエネルギー代謝が他の細胞と模式的に比較されている。
【００１７】
【表１】
0006270823.tif 000002
【００１８】
星状膠細胞のエネルギー代謝は特殊である。実際、ミトコンドリア呼吸及び解糖が共同して働いている。
【００１９】
正常な星状膠細胞の特殊な代謝二元性、すなわちミトコンドリア呼吸及び解糖が本発明のステロール誘導体を製造する戦略の基本をなしている。
【００２０】
実際、本発明者らは作業仮説を提案し、この作業仮説に従って本発明のステロール誘導体は癌性星状膠細胞のエネルギー代謝を死に至るであろう過程である解糖からミトコンドリア呼吸へ向け得る。
【００２１】
高い抗癌ポテンシャルを有する分子である７β−ヒドロキシコレステロール（７β−ＯＨＯＨ）（５，６）は、インビトロで不死化した（自然に形質転換した）ラット星状膠細胞株（７，８）及びＧＢＭ（ラット株Ｃ６）に対して著しい細胞毒性を示す（９）。研究は、Ｃ３−ＯＨでの細胞内脂肪酸による７β−ＯＨＯＨのエステル化（７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルの形成）は親分子である７β−ＯＨＯＨの中毒作用に強く関与したことを示している（７，８，１０）。
【００２２】
しかしながら、Ｃ３−ＯＨでエステル化されているかいない７β−ＯＨＯＨのインビトロでのＧＢＭに対する作用メカニズムは全く解明されていなかった。最近、Ｃ６株に対して実施した研究から、７β−ＯＨＯＨが細胞エネルギー代謝における主要酵素であるタンパク質キナーゼＡｋｔを含めたある細胞メッセンジャーの開始部位の血漿膜中のミクロドメインのラフトのアーキテクチャー及びダイミナックスをモジュレートすることが分かった（１１）。実際、オキシステロールは、ラフトのアーキテクチャーを妨害することによりＡｋｔの活性に、特に正常細胞の癌細胞への形質転換中に影響を与える：Ａｋｔはこれらの細胞におけるグルコースの捕捉及び解糖活性を調節する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】７β−アセチルコレステロール（化合物１．４）の製造のための反応ダイアグラムを示す。
【図２】β−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルコレステロール（化合物１．６）の製造のための反応ダイアグラムを示す。
【図３】セクションＩＩ，Ａの操作条件下で分子１．ａ（実施例３）の存在下、または分子１．ａ、次いで分子２．ａ（実施例５）を用いて、１９日及び３５日逐次処理した後のＣ６細胞の培養物の外観を示している。
【図４】培養物の特徴である光学像（１０×１０）を示す。細胞層（ＣＬ）が見られ得、この上に半球形状の細胞凝集物（ＣＡ）が固定されるようになる。
【図５】免疫標識によりヒトＧＢＭ中に示されているＣＤ１３３＋細胞（幹細胞）が細胞凝集物中に存在し、細胞層（ＣＬ）中に存在していないことを示している。
【図６】免疫蛍光標識は、細胞層（ＣＬ）中の正常星状膠細胞のマーカーであるＧＦＡＰの存在（２６）、及びＣＬ中のニューロフィラメントの存在を示している。
【図７】免疫蛍光標識は、細胞凝集物（ＣＡ）中の正常星状膠細胞のマーカーであるＧＦＡＰの存在（２６）、及びＣＡ中のニューロフィラメントの存在を示している。
【図８】ＧＢＭの細胞死の前のＭＴＴ染色の増加と共にＬＤＨ  ＧＢＭの酵素活性の分子２．ｂによる阻害の可能性により（表２）、ＣＤ１３３＋細胞の免疫標識は、細胞が２２日の処理後に消失することを明らかに示している。
【図９】ＧＢＭの細胞死の前のＭＴＴ染色の増加と共にＬＤＨ  ＧＢＭの酵素活性の分子２．ｂによる阻害の可能性により（表３）、ＣＤ１３３＋細胞の免疫標識は、細胞が２２日の処理後に消失することを明らかに示している。
【図１０】ＣＤ１３３＋細胞の免疫標識において、ＣＤ１３３＋細胞の５０％が残留細胞中になお存在している。
【図１１】星状膠細胞型を正常星状膠細胞の標準マーカーであるＧＦＡＰの存在により確認した図である。
【図１２】慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を患っている患者から白血球を集めた血液サンプルから単離する。フィード層（１７）に接種することにより培養から２４時間後、細胞を１０μＭの改良リポソーム形態の分子２．ｂで１回処理した結果を示す。
【図１３】培養を開始してから２４時間後に、神経芽細胞腫を未封入リポソーム（対照）または分子１．ｂまたは２．ｂを含有しているリポソームで処理した。細胞を２２μＭの分子１．ｂまたは２２μＭの分子２．ｂで１回処理する。リポソーム形態を濃縮した結果を示す。
【図１４】ｐＨｉ  ６．２でのＬＤＨ  ＬＬ、ｐＨｉ  ６．４でのＬＤＨ  ＧＢＭのＬＤＨ活性を示す。結果は、水性形態のオキサメート（１８ｍＭ）またはエタノール形態の分子２．ｂ（３６ｍＭ）を添加するとＬＤＨ  ＬＬの酵素活性がほぼ完全に阻害され、ＬＤＨ  ＧＢＭ（Ｂ）の酵素活性が部分的に阻害されることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
驚くことに、３位に置換基及び７位に保護基を有する７β−ヒドロキシコレステロール基本構造を有している本発明のステロール誘導体は高グレード癌性星状膠細胞のエネルギー供給に必須の解糖を抑制し、同時にこの細胞にとって「致命的」でもあるミトコンドリア呼吸を回復させることができるであろうことが今回知見された。
【００２５】
実際、この２つの作用により、癌細胞の「過熱」が生じ、これによりその死が生ずる。
【００２６】
更に、本発明のステロール誘導体は幹細胞に対しても活性を有し、よって膠芽細胞腫細胞を全体的に破壊することができる。
【００２７】
本発明のステロール誘導体の膠芽細胞腫に対する活性とは、骨髄細胞の細胞代謝が星状膠細胞の細胞代謝が類似しているために該ステロール誘導体が骨髄タイプの悪性血液疾患の治療に使用されることが予想され得ることを意味する；以下に説明するように、ニューロンが星状膠細胞と同一の発生学的及び細胞起源を有しているので神経芽細胞腫の治療において、及びメラニン細胞が星状膠細胞と同一の発生学的起源を有しているので黒色腫の治療において使用される。
【００２８】
更に、骨髄細胞株及びリンパ球細胞株が共通の起源、すなわち多能性造血幹細胞を有しているという事実は、本発明のステロール誘導体をリンパ腫を治療するために使用することも考えられ得ることを意味する。
【００２９】
従って、本発明は、式（Ｉ）
【００３０】
【化１】
0006270823.tif 000003
（式中、
−Ａは
（Ｒ１）ｎ−基、ここでＲ１はそのＣ末端により結合しているアミノ酸残基であり、ｎ＝１または２であり、各Ｒ１は同一または異なり、前記アミノ酸のＮ末端は−Ｃ−（Ｏ）−Ｒ２基、Ｒ３−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−またはＲ３−Ｃ（Ｏ）−基で置換され得、ここでＲ２は単環式または多環式Ｃ６−Ｃ１４アリールアルキル基であり；Ｒ３は未置換であるかまたはＲが水素、直鎖状Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたは未置換Ｃ６−Ｃ１４アリールを表すＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ１−Ｃ６アルキルであり；またはＲ３は未置換であるか少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル、または上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ６−Ｃ１４アリールまたはＣ５−Ｃ１４ヘテロアリール基である；または
同一または異なり得る１個以上のヘテロ原子を含み得、未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ４アルキル基で置換されている単環式または多環式Ｃ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキル基；同一または異なり得る１個以上のヘテロ原子を含み得、未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ４アルキル基で置換されている単環式または多環式Ｃ６−Ｃ１４アリールアルキルオキシ基、または単環式または多環式Ｃ５−Ｃ１４ヘテロアリールアルキルオキシ基；または
−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ４または−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ４基、ここでＲ４は水素；未置換であるかまたは上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されている直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２アルキル基；未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル、または上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ６−Ｃ１４アリール基；アシル基；ホルミル基；スルホニル基；スルフィニル基；またはＲ４はアリル基または糖残基を表す；
−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ５基、ここでＲ５は未置換であるかまたは上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されている直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２アルキルである；
−Ｃ（Ｏ）−Ｒ６基、ここでＲ６は未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル、または上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されている１または２個のヘテロ原子を含む飽和Ｃ５−Ｃ１４ヘテロ環であり；またはＲ６は未置換であるかまたは上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される基で置換されている直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２アルキル基；未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル、または上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ６−Ｃ１４アリール基またはＣ５−Ｃ１４ヘテロアリール基；または糖残基を表す；
を表し、
−Ｂは−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７基を表し、ここでＲ７は水素；未置換であるかまたは上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されている直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル；未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル、または上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ６−Ｃ１４アリール基であり；またはＲ７はＲ８が直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキルであるＯＲ８を表す）
の化合物に関する。
【００３１】
アルキル基は、直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ１２基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシルまたはドデシル基を指し、直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル基が好ましい。
【００３２】
アリール基は、不飽和の単環式または多環式、炭素環式Ｃ６−Ｃ１４基、例えばフェニル、ナフチル、インデニル、アントラセニル基、より特にフェニル基を指す。
【００３３】
ヘテロアリール基は、同一でも異なっていてもよい１個以上のヘテロ原子を含む不飽和の単環式または多環式Ｃ５−Ｃ１４基、より特にプリンまたはピリミジン塩基を指す。
【００３４】
「ヘテロ原子」は酸素、窒素または硫黄原子を意味する。
【００３５】
「糖残基」は、例えばグルコース、リボースまたはアラビノースタイプの単位を意味する。
【００３６】
有利なアミノ酸残基は、例えばメチオニル、グリシニルまたはアラニル単位である。
【００３７】
好ましい式（Ｉ）の化合物は、以下の条件：
−Ａは−（Ｒ１）ｎ−基を表し、ここでＲ１はアミノ酸残基であり、ｎ＝１または２である；
−Ａは−（Ｒ１）ｎ−基を表し、ここでＲ１はアミノ酸残基であり、ｎ＝１または２であり、前記アミノ酸のＮ末端はアリールアルコキシカルボニル基、特にベンジルオキシカルボニル；またはＲ３−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−またはＲ３−Ｃ（Ｏ）−基で置換されており、ここでＲ３は未置換であるかまたは上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ１−Ｃ６アルキルであり；またはＲ３は未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル、または上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ６−Ｃ１４アリールまたはＣ５−Ｃ１４ヘテロアリール基である；
−Ａは場合によりそのＮ末端でアリールアルコキシカルボニル基、特にベンジルオキシカルボニルで置換されているグリシニル基に連結されているアラニル基を表す；
−Ａは場合によりそのＮ末端でアリールアルコキシカルボニル基、特にベンジルオキシカルボニルで置換されているグリシニル基に連結されているメチオニル基を表す；
Ａは−Ｃ（Ｏ）−Ｒ６基を表し、ここでＲ６は２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン基であるか；未置換であるかまたは上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されている直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル基；未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル、または上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ６−Ｃ１４アリール基またはＣ５−Ｃ１４ヘテロアリール基；または糖残基である；の少なくとも１つを満たしているものである。
【００３８】
有利には、Ｂはアルキル基がＣ１−Ｃ６であるアシル基、特にアセチル、またはアルキル基がＣ１−Ｃ６であるアルコキシカルボニル基、特にｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を表す。
【００３９】
Ｂは、特に未置換であるかまたは上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ１−Ｃ６アルキル基；または未置換であるかまたは直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキルの少なくとも１つ、または上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ６−Ｃ１４アリール基をも表し得る。
【００４０】
式（Ｉ）の好ましい化合物は、
７−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２−（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−アセトアミド）プロパノエート（分子１．ａ）；
７−アセトキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２−（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−アセトアミド）プロパノエート（分子１．ｂ）；
７−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレート（分子２．ａ）；
７−アセトキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレート（分子２．ｂ）；
である。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物は、以下の段階： 
−コレステロールの３位のヒドロキシル官能基を保護基、例えばＲ９基が置換または未置換のＣ１−Ｃ６アルキル、または置換または未置換のアリール基であるアシルオキシＲ９−Ｃ（Ｏ）−基、特にアリールアルコキシカルボニル基で保護する段階、
−７位にケトン官能基を導入する段階、
−ケトン官能基をヒドロキシル官能基に還元する段階、
−７位のヒドロキシル官能基にＢ基に相当する保護基、例えばアシル、アリールまたはアルコキシカルボニル基、或いはＲ１０が置換または未置換のＣ１−Ｃ６アルキル、未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキルで置換されているアリール、または未置換であるかまたは少なくとも１つの直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ６アルキル、または上に規定したＯＲ、ＮＨＲ及びＳＲから選択される少なくとも１つの基で置換されているＣ５−Ｃ１４ヘテロアリールであるアシルオキシＲ１０−Ｃ（Ｏ）基を導入する段階、
−３位のヒドロキシル官能基を脱保護する段階
を含む方法によりコレステロールから得ることができる。
【００４２】
３位のヒドロキシル官能基を脱保護した後、ヒドロキシル官能基を所望のＡ基で置換することができる。
【００４３】
７位のケトン官能基の導入は通常の酸化方法により実施することができる。
【００４４】
選択的にβ位でのケトン官能基のヒドロキシル官能基への還元は、例えば塩化セリウム六水和物の存在下でＮａＢＨ４を用いるルーチェ方法により実施することができる（１２）。
【００４５】
本発明は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物及び医薬として許容され得るビヒクルを含む医薬組成物または薬剤にも関する。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を含むリポソーム製剤から構成され得る。リポソームは当業者に公知の各種技術により作成することができる。リポソームを構成する各種脂質が使用され得る［Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（１９８６），Ｋｕｎｉｏ  Ｙａｇｉ編，Ｊａｐａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｋａｒｇｅｒ］。
【００４７】
或いは、リポソームは、主に４０〜８０ｎｍの粒度分布を有し、経時的に安定な組成を有している所謂「改良」リポソーム、または「改良」リポソームと同一の粒度分布を有しているが、「改良」リポソームよりも高濃度、特に５０％以上の活性分子を含む所謂「濃厚」リポソームから構成され得る。
【００４８】
「改良」リポソームは、以下の段階：
−リポソーム中に含めようとする活性分子及びリン脂質を有機溶媒中で接触させる段階、
−前記溶媒を窒素流下で蒸発させて脂質フィルムを得る段階、
−前記脂質フィルムを有機溶媒中に溶解させる段階、
−前記溶媒を窒素流下で蒸発させ、前記脂質フィルムを水性緩衝液中に取る段階、
−超音波浴を用いて音波処理する段階、
−押し出しにより小胞を得る段階
を含む製造方法により得ることができる。
【００４９】
好ましくは、音波処理は約２０℃の温度で１分間の１０パルスで実施する。押し出しは２００ｎｍの孔径を有するＰＶＤＦタイプ膜を用いて実施することができる。
【００５０】
「濃厚」リポソームは、
−リポソーム中に含めようとする活性分子、及び通常技術で使用されている量よりも多い量、特に通常量の２倍の量のリン脂質を有機溶媒中で接触させる段階、
−前記溶媒を減圧下で蒸発させて脂質フィルムを得る段階、
−前記脂質フィルムを有機溶媒中に溶解させる段階、
−前記溶媒を減圧下で蒸発させ、前記脂質フィルムを水性緩衝液中に取る段階、
−超音波浴を用いて音波処理する段階、
−押し出しにより小胞を得る段階
を含む製造方法により得ることができる。
【００５１】
好ましくは、音波処理は約２０℃の温度で１分間に２０パルスで実施する。押し出しは２００ｎｍの孔径を有するＰＶＤＦタイプ膜を用いて実施することができる。
【００５２】
好ましくは、蒸発は約３ｋＰａ（３０ｍｂａｒ）以下の圧力及び２５℃の浴温で実施する。好ましくは、ロータリーエバポレータを使用する。
【００５３】
リン脂質に対する活性分子の量は、重量％で表示して、例えば約１５％であってもよい。
【００５４】
本発明の好ましい薬剤は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物が充填されているリポソームから構成されている。
【００５５】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、本発明の医薬組成物中に、特に医薬組成物がリポソームであるときには唯一の活性成分を構成する。少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を含むリポソームは例えば経口ルートまたは非経口ルートにより投与することができる。
【００５６】
或いは、式（Ｉ）の化合物を別の活性成分、例えば抗癌剤、特に特にアバスチン、イリノテカン、テモゾロミドまたはタキソール誘導体と一緒に使用することができる。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の、経口投与または非経口投与、特に注射、注入または吸入に適した形態であってもよい。
【００５８】
特に、前記医薬組成物は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を単独で、または別の活性成分と一緒に含む医薬として許容できる溶液、特にアルコール溶液であり得、これは患者に対して輸注または注入により投与することができる。
【００５９】
前記医薬組成物は、特に経口ルートまたは舌下ルートにより投与するのに適している。例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、エマルジョン剤、経口懸濁液剤、滴剤、シロップ剤等のような通常の医薬形態の他に、本発明の経口医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物と胆汁酸塩の複合体、または例えばリポソームまたは非リポソーム形態の式（Ｉ）の化合物とリン脂質、例えばホスファチジルコリンの組合せを含むことができる。
【００６０】
形質転換した星状膠細胞に関係する疾患の治療、特に多形膠芽細胞腫またはグレードＩＶの星状細胞腫（ＧＢＭ）の治療において使用するための式（Ｉ）の化合物も本発明の主題である。特に、式（Ｉ）の化合物を大脳皮質の治療部位に直接注射することができる。
【００６１】
本発明は、有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を投与することによる形質転換した星状膠細胞に関係する疾患の治療、特に多形膠芽細胞腫またはグレードＩＶの星状細胞腫（ＧＢＭ）の治療にも関する。
【００６２】
本発明は、他の癌、すなわち骨髄タイプの悪性血液疾患、並びにリンパ腫、神経芽細胞腫及び黒色腫の治療にも関する。
【００６３】
骨髄タイプの悪性血液疾患の治療において使用するための式（Ｉ）の化合物も本発明の主題である。
【００６４】
本発明は、有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を投与することによる骨髄タイプの悪性血液疾患の治療にも関する。
【００６５】
骨髄タイプの悪性疾患は正常の骨髄細胞から発生する。正常状態のこの細胞型は星状膠細胞にかなり類似のエネルギー代謝を有している。この細胞型はミトコンドリア呼吸及び解糖（乳酸経路；ＬＤＨ）からそのエネルギーを生成する（１３）。骨髄起源の癌の場合、癌細胞は解糖からそのエネルギーを生成する。ＧＢＭに関して、式（Ｉ）の化合物の抗癌活性はＬＤＨ（解糖）の抑制、従ってミトコンドリア呼吸の高バーストに起因する細胞の過熱によるであろう。
【００６６】
リンパ腫の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物も本発明の主題である。
【００６７】
本発明は、有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を投与することによるリンパ腫の治療にも関する。
【００６８】
実際、骨髄細胞株及びリンパ系細胞株は多能性造血幹細胞である共通の起源を有しているので、式（Ｉ）の化合物の骨髄タイプの悪性血液疾患に対する活性は、リンパ腫を治療するために該化合物を使用することも予測され得ることを意味する。
【００６９】
神経芽細胞腫の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物も本発明の主題である。
【００７０】
本発明は、有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を投与することによる神経芽細胞腫の治療にも関する。
【００７１】
主に頭蓋外交感神経系を冒す神経芽細胞腫に関して、星状膠細胞と同様にニューロンが一方では同じ発生学的起源、すなわち外胚葉、他方では細胞起源、すなわち神経上皮細胞を有しているので（１４）、式（Ｉ）の化合物は抗腫瘍活性を示す。要するに、星状膠細胞及びニューロンは共に神経細胞であり、式（Ｉ）の化合物に対して等しく感受性である。
【００７２】
黒色腫の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物も本発明の主題である。
【００７３】
本発明は、有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を投与することによる黒色腫の治療にも関する。
【００７４】
実際、黒色腫の起源であるメラノサイトは、それ自体外胚葉に由来する神経堤に由来している（１４）。星状膠細胞もニューロンも外胚葉に由来しており、式（Ｉ）の化合物は抗ＧＢＭ及び抗神経芽細胞腫活性を示すので、これらの化合物は多分黒色腫に対しても抗癌特性を有している。
【００７５】
代替手段によれば、前記治療は、式（Ｉ）の第１化合物を投与する少なくとも１つの段階、及び第１化合物とは異なる式（Ｉ）の第２化合物を投与する少なくとも１つの段階を含む逐次治療である。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は本発明を例示するが、本発明を限定しない。
【００７７】
セクションＩは化学合成に関する。
【００７８】
実施例１及び２は式（Ｉ）の化合物を製造するために使用される合成中間体の製造に関する。実施例３〜６は式（Ｉ）の化合物の製造に関する。
【００７９】
セクションＩＩは式（Ｉ）の化合物の生物学的活性に関する。
【００８０】
Ｉ／化学合成
[実施例１]：７β−アセチルコレステロール（化合物１．４）の製造
反応ダイアグラムを図１に示す。
【００８１】
１）化合物１．１の製造
【００８２】
【化２】
0006270823.tif 000004
【００８３】
以下の試薬を使用した。
【００８４】
【表２】
0006270823.tif 000005
【００８５】
コンデンサーを備えた１Ｌの３首フラスコにコレステリルベンゾエート、ジオキサン／水混合物、亜塩素酸ナトリウム及びＮ−ヒドロキシフタルイミドをその順番で入れる。この混合物を５０℃で６時間加熱する。反応の進行をヘキサン／Ｅｔ２Ｏ  ８／２を用いるシリカプレートＴＬＣ（ＴＬＣシリカゲル６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ）によりモニターする。
【００８６】
形成速度が許容される値に達したら、粗な反応混合物を１０％  亜硫酸ナトリウム溶液（５００ｍｌ）に注いだ後、エーテルで抽出する。得られた有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、次いで水、最後にブラインで洗浄する。次いで、この有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧下で蒸発させる。
【００８７】
次いで、得られた着色油状残渣をエタノールから再結晶化することにより精製する。得られた白色固体は十分な純度を有していないので、再びシリカゲルクロマトグラフィー（シリカＳＤＳ  ６０Ａ，３５〜７０μｍ）により精製する。この油状物をジクロロメタン中に取ることにより固体沈着物が得られる。精製を９８／２〜９０／１０の範囲のヘキサン／酢酸エチル溶離液を用いて実施する。生成物が白色固体の形態で得られる。
【００８８】
収率：２３％
分析：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＢＲＵＫＥＲ  ４００ＭＨｚ）による分析。ＨＰＬＣカラム順相ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  Ｏ−ＤＨ（ＯＤＨ０ＣＥ−ＣＥ０２６カラム），溶離液９／１ヘキサン／ｉＰｒＯＨ，２０分間，波長１９０ｎｍ。  保持時間  ６．６８２分、ＨＰＬＣ  純度９９．２％。
【００８９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．７１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８９（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．９４（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），１．０２−２．７８（ｍ，２６Ｈ），１．２７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），４．９９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），５．７６（ｄ，１Ｈ，ＣＨ），７．４４−８．０５（ｍ，５Ｈ，ＣＨＡｒ）。
【００９０】
２）化合物１．２の製造
【００９１】
【化３】
0006270823.tif 000006
【００９２】
以下の試薬を使用した。
【００９３】
【表３】
0006270823.tif 000007
【００９４】
ケトコレステリルベンゾエート、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ溶媒混合物及び塩化セリウム水和物を５００ｍｌのフラスコに入れる。ホウ水素化ナトリウムをゆっくり添加する前に、氷浴を用いて粗な反応混合物を０℃に冷却する。ガスの発生が観察され、氷浴を１時間維持した後、周囲温度で１８時間撹拌する。進行を８０／２０  ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いるＴＬＣ（ＴＬＣシリカゲル  ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ）によりモニターする。形成速度が十分でないならば、０．５当量のホウ水素化ナトリウムを添加する。
【００９５】
粗な反応混合物に水（５０ｍｌ）及びジクロロメタン（２００ｍｌ）を添加する。分液漏斗に移した後、有機相を回収する。水性相を再びＤＣＭで抽出する。有機相を合わせ、１Ｎ  塩酸溶液で洗浄した後、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄する。
【００９６】
次いで、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させて、僅かに着色した油状物が得られる。これは自然に結晶化する。
【００９７】
残渣をＤＣＭ中に取ることにより固体沈着物を得る。この粗な生成物をシリカゲルカラム（シリカＳＤＳ  ６０Ａ，３５〜７０μｍ）で９／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いて精製する。生成物が白色固体の形態で得られる。
【００９８】
収率：８９％
分析：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＢＲＵＫＥＲ  ４００ＭＨｚ）による分析。ＨＰＬＣカラム順相ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  Ｏ−ＤＨ（ＯＤＨ０ＣＥ−ＣＥ０２６カラム），溶離液９／１ヘキサン／ｉＰｒＯＨ，２０分間，波長１９０ｎｍ。  保持時間  ７．０７６分、ＨＰＬＣ  純度９８．８％。
【００９９】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．６３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７９（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．８５（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８９−２．４３（ｍ，２７Ｈ），１．０４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），３．８１（ｄ，１Ｈ，ＣＨ），４．８１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），５．２９（ｄ，１Ｈ，ＣＨ），７．３４−７．９９（ｍ，５Ｈ，ＣＨＡｒ）。
【０１００】
３）化合物１．３の製造
【０１０１】
【化４】
0006270823.tif 000008
【０１０２】
以下の試薬を使用した。
【０１０３】
【表４】
0006270823.tif 000009
【０１０４】
７β−ヒドロキシコレステリルベンゾエート、ピリジン及び無水酢酸を順次１００ｍｌのフラスコ中に入れる。この混合物を周囲温度で１６時間撹拌する。進行を９／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いるＴＬＣ（ＴＬＣシリカゲル  ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ）によりモニターする。
【０１０５】
粗な反応混合物を減圧下で蒸発させる。酢酸エチルとの共蒸発を２回実施する。得られた残渣を酢酸エチル中に取る。こうして得た有機相を１Ｎ塩酸で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で蒸発させる。
【０１０６】
得られた白色固体を追加精製することなく、直接次の段階において使用する。
【０１０７】
収率：１００％
分析：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＢＲＵＫＥＲ  ４００ＭＨｚ）による分析。ＨＰＬＣカラム順相ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  Ｏ−ＤＨ（ＯＤＨ０ＣＥ−ＣＥ０２６カラム），溶離液９／１ヘキサン／ｉＰｒＯＨ，２０分間，波長１９０ｎｍ。  保持時間  ４．９７２分、ＨＰＬＣ  純度９９．６％。
【０１０８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．６３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７９（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．８４（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），０．９１−２．４１（ｍ，２６Ｈ），１．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  アセチル），４．７８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．９９（ｄ，１Ｈ，ＣＨ），５．２１（ｓ，１Ｈ，ＣＨ），７．３３−７．９８（ｍ，５Ｈ，ＣＨＡｒ）。
【０１０９】
４）化合物１．４の製造
【０１１０】
【化５】
0006270823.tif 000010
【０１１１】
以下の試薬を使用した。
【０１１２】
【表５】
0006270823.tif 000011
【０１１３】
７β−アセチルコレステリルベンゾエート及びメタノール中１％  水酸化ナトリウム溶液を１００ｍｌのフラスコに入れる。完全に溶解するまでこの混合物を周囲温度で撹拌する。進行を７／３ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いるＴＬＣ（ＴＬＣシリカゲル  ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ）によりモニターする。
【０１１４】
反応を完了させるために、ＴＬＣによるモニタリングを２０分毎に実施しながら粗な混合物を４０℃に加熱してもよい。
【０１１５】
酢酸エチル（２００ｍｌ）及び水（５０ｍｌ）を添加した後、分液漏斗に移し、相を分離する。水性相を再び酢酸エチルで抽出する。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧下で蒸発させて、油状残渣を得る。
【０１１６】
固体沈着物を生成するために、残渣を酢酸エチル中に取る。精製をシリカゲルカラム（シリカＳＤＳ  ６０Ａ，３５〜７０μｍ）で９／１〜７／３の範囲のヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いて実施する。予想される生成物が無色油状物として得られ、これは自然に結晶化して、白色固体が生ずる。形成された７β−ヒドロキシコレステロールを回収するために、カラムを１００％酢酸エチルで洗浄する。
【０１１７】
収率：３８％
分析：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＢＲＵＫＥＲ  ４００ＭＨｚ）による分析。ＨＰＬＣカラム順相ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  Ｏ−ＤＨ（ＯＤＨ０ＣＥ−ＣＥ０２６カラム）、溶離液９／１ヘキサン／ｉＰｒＯＨ，２０分間，波長１９０ｎｍ。  保持時間  ６．１８６分、ＨＰＬＣ  純度９１．７％。
【０１１８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．６２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７８（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．８５（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８６−２．２８（ｍ，２７Ｈ），１．０３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．９６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  アセチル），３．４７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．９４（ｔｄ，１Ｈ，ＣＨ），５．１３（ｔ，１Ｈ，ＣＨ）。
【０１１９】
[実施例２]：７β−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルコレステロール（化合物１．６）の製造
反応ダイアグラムを図２に示す。
【０１２０】
化合物１．６を実施例１の化合物１．２から製造する。
【０１２１】
１）化合物１．５の製造
【０１２２】
【化６】
0006270823.tif 000012
【０１２３】
以下の試薬を使用した。
【０１２４】
【表６】
0006270823.tif 000013
【０１２５】
７β−ヒドロキシコレステリルベンゾエート、溶媒、２，６−ジメチルアミノピリジン及び無水ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを順次１００ｍｌの一首フラスコ中に入れる。完全に溶解するまでこの混合物を周囲温度で撹拌する。進行を８／２ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いるＴＬＣによりモニターする。
【０１２６】
ＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）及び水（１０ｍｌ）を添加する。こうして得られた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧下で蒸発させて、油状残渣を得る。
【０１２７】
固体沈着物を生成するために、残渣をＥｔＯＡｃ中に取る。精製をシリカゲルカラムで９５／５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いて実施する。
【０１２８】
分析：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）による分析
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．５９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７７（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．８４（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），０．８６−１．９８（ｍ，２４Ｈ），１．０９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４１（ｓ，９Ｈ，３ＣＨ３，ｔ−Ｂｏｃ），２．４２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），４．８０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．９１（ｄ，１Ｈ，ＣＨ），５．１８（ｓ，１Ｈ，ＣＨ），７．３４−７．９７（ｍ，５Ｈ，ＣＨＡｒ）。
【０１２９】
２）化合物１．６の製造
【０１３０】
【化７】
0006270823.tif 000014
【０１３１】
以下の試薬を使用した。
【０１３２】
【表７】
0006270823.tif 000015
【０１３３】
７β−ｔ−ブチルオキシカルボニルコレステリルベンゾエート及びメタノール中１％  水酸化ナトリウム溶液を５０ｍｌの一首フラスコに入れる。完全に溶解するまでこの混合物を周囲温度で撹拌する。進行を７／３ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いるＴＬＣによりモニターする。反応を完了させるために、粗な混合物を４０℃に加熱してもよい。
【０１３４】
ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）及び水（２０ｍｌ）を添加する。水性相を再びＥｔＯＡｃで抽出する。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧下で蒸発させて、油状残渣を得る。
【０１３５】
固体沈着物を生成するために、残渣をＥｔＯＡｃ中に取る。精製をシリカゲルカラムで９／１〜７／３の範囲のヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いて実施する。形成された７β−ヒドロキシコレステロールを回収するために、カラムを１００％ＥｔＯＡｃで洗浄する。
【０１３６】
分析：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）による分析
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．６０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７８（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．８４（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），０．９１−２．２９（ｍ，２７Ｈ），０．９７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４１（ｓ，９Ｈ，３ＣＨ３，ｔ−Ｂｏｃ），３．４７（ｍ，１Ｈ，ＣＨＢ），４．７７（ｔｄ，１Ｈ，ＣＨＣ），５．１７（ｔ，１Ｈ，ＣＨＡ）。
【０１３７】
[実施例３]：７−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２−（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）プロパノエート（分子１．ａ）の製造
簡易名：３−ベンジルオキシカルボニル−グリシニル−アラニル−７β−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−コレステロール
【０１３８】
【化８】
0006270823.tif 000016
【０１３９】
分子１．ａを中間体化合物１．６から製造する。
【０１４０】
以下の試薬を使用した。
【０１４１】
【表８】
0006270823.tif 000017
【０１４２】
７β−ｔ−ブチルオキシカルボニルコレステロール（８０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）、ジペプチド（６８ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ，１．５当量）、溶媒混合物（ＴＨＦ／ＤＣＥ  １：１）（６ｍｌ）、ＤＣＣ（５０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ，１．５当量）及びＤＭＡＰ（３０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ，１．５当量）を１０ｍｌのウィトンボトルに入れる。粗な反応混合物を周囲温度で２４時間撹拌する。進行を７／３ヘキサン／酢酸エチル溶離液を用いるＴＬＣによりモニターする。
【０１４３】
粗な反応生成物に酢酸エチル（３０ｍｌ）及び水（１０ｍｌ）を添加する。有機相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧下で蒸発させる。固体沈着物を生成するために、得られた油性残渣を酢酸エチル中に取る。
【０１４４】
精製をシリカゲルカラムで７／３、次いで６／４ヘキサン／酢酸エチル溶離液を用いて実施する。
【０１４５】
分析：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）による分析
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．６０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７９（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．８３（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），０．９４−１．８８（ｍ，２４Ｈ），０．９８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．１９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  Ａｌａ），１．４０（ｓ，９Ｈ，３ＣＨ３，ｔ−Ｂｏｃ），２．２７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．８３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），４．４７（ｔｄ，Ｈ，ＣＨ  Ａｌａ），４．４７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．７８（ｔｄ，１Ｈ，ＣＨ），５．０７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２  Ｇｌｙ），５．２２（ｔ，１Ｈ，ＣＨ），５．２３（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），６．４１（ｓｌ，１Ｈ，ＮＨ），７．２９（ｍ，５Ｈ，ＣＨＡｒ）。
【０１４６】
[実施例４]：７−アセトキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２−（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−アセトアミド）プロパノエート（分子１．ｂ）の製造
簡易名：３−ベンジルオキシカルボニル−グリシニル−アラニル−７β−Ｏ−アセチル−コレステロール
【０１４７】
【化９】
0006270823.tif 000018
【０１４８】
分子１．ｂを中間体化合物１．４から製造する。
【０１４９】
以下の試薬を使用した。
【０１５０】
【表９】
0006270823.tif 000019
【０１５１】
７β−アセチルコレステロール（６０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、ジペプチド（７０ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ，１．５当量）、溶媒混合物（ＴＨＦ／ＤＣＥ  １：１）（６ｍｌ）、ＤＣＣ（４２ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ，１．５当量）及びＤＭＡＰ（２５ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ，１．５当量）を１０ｍｌのウィトンボトルに入れる。粗な反応混合物を周囲温度で２４時間撹拌する。
【０１５２】
進行を７／３ヘキサン／酢酸エチル溶離液を用いるＴＬＣによりモニターする。
【０１５３】
粗な反応生成物に酢酸エチル（３０ｍｌ）及び水（１０ｍｌ）を添加する。有機相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧下で蒸発させる。固体沈着物を生成するために、得られた油性残渣を酢酸エチル中に取る。
【０１５４】
精製をシリカゲルカラムで７／３、次いで６／４ヘキサン／酢酸エチル溶離液を用いて実施する。
【０１５５】
分析：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）による分析
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．６２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７８（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．８４（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），０．９１−１．８３（ｍ，２５Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．１７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  Ａｌａ），１．９４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  アセチル），２．２７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．８２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．４７（ｔｄ，１Ｈ，ＣＨ  Ａｌａ），４．５６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．９５（ｔｄ，１Ｈ，ＣＨ），５．０６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２  Ｇｌｙ），５．１７（ｓｌ，１Ｈ，ＣＨ），５．３７（ｔ，１Ｈ，ＣＨ），６．４９（ｄｌ，１Ｈ，ＮＨ），７．２４（ｍ，５Ｈ，ＣＨＡｒ）。
【０１５６】
[実施例５]：７−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレート（分子２．ａ）の製造
簡易名：３−（Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシル−７β−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−コレステロール
１）ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレート基の製造
【０１５７】
【化１０】
0006270823.tif 000020
【０１５８】
以下の試薬を使用した。
【０１５９】
【表１０】
0006270823.tif 000021
【０１６０】
アセタール、メタノール及び水酸化リチウムを順次５０ｍｌのフラスコに入れる。この混合物を周囲温度で１６時間撹拌する。
【０１６１】
粗な反応混合物を減圧下で蒸発させる。得られた残渣を水（７５ｍｌ）中に取る。次いで、この相を０℃で１Ｎ塩酸でｐＨ１に酸性化した後、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出する。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧下で蒸発させて、僅かに着色している油性残渣を得る。
【０１６２】
残渣を追加の精製することなく直接カップリングの段階において使用する。
【０１６３】
分析：ＤＭＳＯ中１Ｈ  ＮＭＲ，ＢＲＵＫＥＲ  ４００ＭＨによる分析
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  １．３２（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），１．４２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），４．１４（ＡＢ，２Ｈ，ＣＨ２），４．５５（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ），１０．３０（ｓｌ，１Ｈ，ＯＨ），７．２４（ｍ，５Ｈ，ＣＨＡｒ）。
【０１６４】
収率：９４％
【０１６５】
２）分子２．ａの製造
【０１６６】
【化１１】
0006270823.tif 000022
【０１６７】
分子２．ａを中間体化合物１．４から製造する。
【０１６８】
以下の試薬を使用した。
【０１６９】
【表１１】
0006270823.tif 000023
【０１７０】
７β−ｔ−ブチルオキシカルボニルコレステロール（５０ｍｇ，９．９ｍｍｏｌ）、溶媒混合物（ＴＨＦ／ＤＣＥ  １：１）（６ｍｌ）及び３−（Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボン酸（１６ｍｇ，１１．９ｍｍｏｌ，１．２当量）を１０ｍｌのウィトンボトルに入れる。
【０１７１】
粗な反応混合物を周囲温度で２４時間撹拌する前に、ＤＣＣ（２４．５ｍｇ，１１．９ｍｍｏｌ，１．２当量）及びＤＭＡＰ（１４．５ｍｇ，１１．９ｍｍｏｌ，１．２当量）を添加する。進行を８／２ヘキサン／酢酸エチル溶離液を用いるＴＬＣによりモニターする。反応を完了させるために５０℃で２時間加熱する。
【０１７２】
粗な反応生成物に酢酸エチル（３０ｍｌ）及び水（１０ｍｌ）を添加する。有機相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧下で蒸発させる。固体沈着物を生成するために、得られた油性残渣を酢酸エチル中に取る。
【０１７３】
精製をシリカゲルカラムで９５／５、次いで９／１ヘキサン／酢酸エチル溶離液を用いて実施する。
【０１７４】
分析：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）による分析
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．６０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７９（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．８３（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７４−１．９７（ｍ，２５Ｈ），０．９８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．３３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  アセタール），１．４０（ｓ，９Ｈ，３ＣＨ３，ｔ−Ｂｏｃ），１．４２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  アセタール），２．２９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），４．０８（ＡＢ，２Ｈ，ＣＨ２  アセタール），４．４８（ｄｄｄ，Ｈ，ＣＨ  アセタール），４．６３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．７８（ｔｄ，１Ｈ，ＣＨ），５．２２（ｄ，１Ｈ，ＣＨ）。
【０１７５】
[実施例６]：７−アセトキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシレート（分子２．ｂ）の製造
簡易名：３−（Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルボキシル−７β−Ｏ−アセチル−コレステロール
【０１７６】
【化１２】
0006270823.tif 000024
【０１７７】
分子２．ｂを中間体化合物１．４から製造する。
【０１７８】
以下の試薬を使用した。
【０１７９】
【表１２】
0006270823.tif 000025
【０１８０】
コレステロール、溶媒混合物及び酸を１００ｍｌのフラスコに入れる。粗な反応生成物を周囲温度で２４時間撹拌する前に、ＤＣＣ及びＤＭＡＰを添加する。進行を８／２ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いるＴＬＣ（ＴＬＣシリカゲル  ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ）によりモニターする。
粗な反応混合物に酢酸エチル（１００ｍｌ）及び水（５０ｍｌ）を添加する。有機相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧下で蒸発させる。
【０１８１】
固体沈着物を生成するために、得られた油性残渣を酢酸エチル中に取る。シリカゲルカラム（シリカＳＤＳ  ６０Ａ，３５−７０ｐｍ）で９５／５、次いで９／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶離液を用いる。
【０１８２】
収率：６８％
分析：１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＢＲＵＫＥＲ  ４００ＭＨｚ）による分析。ＨＰＬＣカラム順相ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  Ｏ−ＤＨ（ＯＤＨ０ＣＥ−ＣＥ０２６カラム），溶離液９／１ヘキサン／ｉＰｒＯＨ，２０分間，波長１９０ｎｍ。  保持時間  ５．２９１分、ＨＰＬＣ  純度９８．７％。
【０１８３】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００．１３ＭＨｚ）：δ  ０．６２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），０．７９（ｄｄ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．８４（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３），０．９１−２．３０（ｍ，２７Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．３３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  アセタール），１．４２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  アセタール），１．９３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３  アセチル），４．０９（ＡＢ，２Ｈ，ＣＨ２  アセタール），４．４８（ｄｄ，１Ｈ，ＣＨ  アセタール），４．６２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．９６（ｔｄ，１Ｈ，ＣＨ），５．１８（ｄ，１Ｈ，ＣＨ）。
【０１８４】
ＩＩ／生物学的活性
Ａ／プロトコル
以下のプロトコルをすべての実験に対して使用した。
【０１８５】
１）細胞培養
細胞培養（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｒｅｆ．１１４７５４）のために処理したプラスチック製平底９６ウェル培養プレート（ＮＵＮＣ，米国）を使用する。１ウェルあたり１５００個の細胞を２００μｌの培地に接種する。処理後、１ウェルあたり１００μｌの純粋培地、１００μｌのエタノールまたはリポソームを含有している培地、または１００μｌの活性成分を含有している培地を添加する；従って、処理後の培地の最終容量は全てのウェルで３００μｌである。
【０１８６】
培養物をサンヨーインキュベータ（日本，モデルＭＣＯ−１９ＡＩＣ−ＵＶ）において３７℃、５％  ＣＯ２及び飽和湿度の雰囲気中でインキュベートする。細胞を倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００，日本）を用いて観察し、写真をカメラ（ｃマウント付きデジタルカメラ；ＬＡＢＯＶＥＲ，フランス国）で撮る。培養フードは微生物学的安全フードＭＳＣ（ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，モデルＨＥＲＡ  ＳＡＦＥ  ＫＳ１２，フランス国）である。
【０１８７】
細胞倍加時間を式：
倍加時間＝（ｔｂ−ｔａ）ｌｏｇ（２）／（ｌｏｇ（ｂ）−ｌｏｇ（ａ））
を用いて計算する。ここで、（ａ）及び（ｂ）は時間ｔａ及びｔｂ（ｔｂ＞ｔａ）の細胞の数を表す（１５）。
トリプシン（ウシ膵臓タイプ３，Ｓｉｇｍａ，フランス国）を用いて解離することにより転移を実施する。細胞解離を周囲温度で０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシンを含有している０．０４％（ｗ／ｖ）タイロードＫＣｌ溶液を用いて３０分間実施する。
【０１８８】
解離後、細胞に適した培地中に細胞を懸濁し、トーマ細胞を用いてカウントし、１ウェルあたり１５００個の細胞となるように同一培地で希釈する。
【０１８９】
ａ）細胞株
以下の膠芽細胞腫細胞を使用した：
・Ｃ６株
Ｃ６型細胞株は、Ｎ−メチルニトロソウレアにより誘導したラット脳腫瘍からＢｅｎｄａら（１６）により得た。抗ＧＢＭポテンシャルを評価するために「インビトロ」及び「インビボ」モデルとしてこの細胞型を使用する。これらの株は作製者Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｕ４４  ＩＮＳＥＲＭ及びＵＰＲ  ４１６  ＣＮＲＳ）に由来している。
【０１９０】
培地は７０％最少必須培地（ＭＥＭ；（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ，ｒｅｆ．６１１００）及び３０％ハンクス溶液（ＳＩＧＭＡ，ｒｅｆ．Ｈ９２６９）から構成する。培地に５％（ｖ／ｖ）の最終濃度のウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ，ｒｅｆ．１０１０８１６５）、５μｇ／ｍＬのシプロフロキサシン塩酸塩の抗生物質溶液（ＥＵＲＯＭＥＤＥＸ，ｒｅｆ．ＵＣ５０７４）及び２．５μｇ／ｍＬのフンギゾン溶液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，ｒｅｆ．１５２９０−０２６）を添加する。この細胞型の倍加時間は１７時間である。
・ヒト起源のＧＢＭ株
ヒト膠芽細胞腫株（ＧＢＭ，株Ｕ−８７ＭＧ）及びその培地（イーグル最少必須培地、すなわちＥＭＥＭ）はＡＴＣＣ（米国，ｒｅｆ．ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−１４）から入手した。細胞の培養をＡＴＣＣの推奨に従って開始し、維持する。通常抗ＧＢＭポテンシャルを試験するために「インビトロ」及び「インビボ」でこれらの株を使用する。これらの株の倍加時間は１６時間である。
【０１９１】
ヒト細胞の以下の初代培養物も使用した：
・星状膠細胞
使用したヒト起源の星状膠細胞（ｒｅｆ．１８００）、及び２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ血清（ｒｅｆ．００１０）、星状膠細胞増殖タンパク質（ＡＧＳ，ｒｅｆ．１８５２）及びペニシリン／ストレプトマイシンの溶液（ｒｅｆ．０５０３）を含有している基本培地から構成したその培地はＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国から入手した。これらのヒト星状膠細胞の倍加時間は９６時間である。
・肝細胞
ヒト起源の肝細胞（ｒｅｆ．５０２００）、及び１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有している培地（ｒｅｆ．５２０１）はＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国から入手した。これらの倍加時間は２４時間である。
・腎細胞
ヒト起源の腎細胞（ｒｅｆ．４１２０）、及び１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有している培地（ｒｅｆ．４１０１）はＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国から入手した。倍加時間は９６時間である。
・心細胞
ヒト起源の心細胞（ｒｅｆ．６３００）、及び１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有している培地はＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国から入手した。倍加時間は７２時間である。
・骨格筋細胞
ヒト起源の骨格筋細胞（ｒｅｆ．３５００）、及び１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含有している培地（ｒｅｆ．３５０１）はＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国から入手した。これらの細胞の倍加時間は７２時間である。
【０１９２】
ヒト起源の癌細胞の以下の培養物も使用した。
・肝癌細胞
肝癌細胞（ｒｅｆ．ＡＴＣＣ−ＨＢ−８０６５）はＡＴＣＣから入手した。培地はＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，米国；ｒｅｆ．５１２００）及び１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳから構成されている。倍加時間は６０時間である。
・前立腺癌細胞
前立腺癌細胞（ｒｅｆ．ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−８１）はＡＴＣＣから入手した。培地は肝癌株に対して使用したものと同一である。倍加時間は６０時間である。
・乳癌細胞
乳癌細胞（ｒｅｆ．ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−１９）はＡＴＣＣから入手した。培地は肝癌株に対して使用したものと同一である。倍加時間は２０時間である。
・結腸癌（株ＨＴ２９／２１９）
結腸癌（Ｒｅｆ．ＥＣＡＣＣ−８５０６１１０９）はＥＣＡＣＣコレクションから入手した。培養条件はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ情報リーフレット中の推奨に基づいている。
・神経芽細胞腫（株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）
神経芽細胞腫（Ｒｅｆ．ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−２２６６）はＡＴＣＣコレクションから入手した。培養条件はＡＴＣＣ情報リーフレット中の推奨に基づいている。
・慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）
慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を患っている患者の血液サンプルから精製した細胞はＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｒｅ及びＢｉｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｅｌｏｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＣＨＵ  ｄｅ  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ）から入手した。フィード層に接種する技術により培養を実施した。細胞を、当該細胞に対して意図されている処理により影響されず、当該細胞の生理を大きく変化させないフィード層に対して接種する。ＣＭＭＬ細胞をヒト胚脊髄を起源とする細胞株で培養した（１７）。
【０１９３】
これら全ての培養物に関して、培養を供給業者の推奨に従って開始し、維持した。
【０１９４】
ｂ）培養物の処理
活性成分は無水エタノール（ＡｎａｌａＲ，ＮＯＲＭＡＰＵＲ，ＶＷＲ，フランス国）中に溶解させるかまたはリポソーム溶液、例えば９９０μｌで希釈したストック溶液（１０μｌ）の形態であり、その後３０．０、１５．０、７．５及び３．３μΜの濃度を与えるように培養ウェル（２００μｌの培地）に添加する（１ウェルＢＩ−ＧＢＭあたりの培地の最終容量：３００μｌ）。
【０１９５】
活性成分がエタノール溶液中にある場合、培地は３．３％  エタノール（ｖ／ｖ）を含有している。
【０１９６】
２）リポソームの作成
ａ）基本的方法はＷｅｒｔｈｌｅら（１０）に記載されている。
【０１９７】
簡単に説明すると、試験しようとする化合物、すなわち本発明の化合物（活性成分）または７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステル（３位をオレエート基でエステル化した７β−ヒドロキシステロールの誘導体，その合成はＲａｋｏｔｏａｒｉｖｅｌｏら（１８）に記載されており、対照として使用する）、大豆ホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ）及びコレステリル−３−スルフェート（Ｓｉｇｍａ）をそのストック溶液から得る。前記ストック溶液は活性成分及び７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルの場合にはジクロロエタンから、ホスファチジルコリンの場合にはクロロホルム：メタノール混合物（９：１，ｖ／ｖ）から、コレステリル−３−スルフェートの場合にはクロロホルムから調製した。モル比はホスファチジルコリン、コレステリル−３−スルフェート、及び７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステル及び活性成分それぞれについて１Ｍ／０．１Ｍ／０．２５Ｍである。
【０１９８】
蒸発させた後、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＰＢＳ生理食塩液の溶液，ｐＨ７．２（ＢｉｏＲａｄ）を乾燥化合物に添加する。９０μｌの培地に添加した２０または１０μｌのリポソームが所望の最終濃度を与えるように緩衝液の容量及び生成物の質量を調節する。リポソームはリポソファスト（Ｓｏｄｅｘｉｍ，ＳＡ  Ｍｕｉｚｏｎ，フランス国）を用いて押し出し技術により形成する。溶液をポリカーボネート濾過膜（１００ｎｍ）に４１回通す。２２μｍミリポア膜を用いてリポソームを濾過することにより滅菌する。
【０１９９】
インビトロで他のヒト細胞型に対する分子の活性を試験するために、リポソームの製造を上記した２つの異なる方法で、すなわち一方では均質粒度分布に関して、他方では活性分子の濃度に関して最適化した。
【０２００】
ｂ）同一の粒度分布及び経時的に安定な組成を有するリポソーム（「改良リポソーム」）を得る
溶媒を蒸発させた後、脂質フィルムを再びジクロロエタン：エタノール（３．３：１．５；ｖ：ｖ）中に溶解し、溶液を窒素流下で再び蒸発させる。激しく撹拌しながら、ＰＢＳ（１ｍｌ）を添加し、脂質残渣が再び溶解するように残渣をこすり落とし、５分間激しく撹拌した後、２０℃を超えない温度で１分に１０パルスの超音波処理を加える（Ｅｌｍａ，Ｓ  ６０Ｈ，Ｅｌｍａｓｏｎｉｃ）。得られた小胞を押し出し、溶液を濾過膜に２回通した以外は上記したように滅菌する。
【０２０１】
これらのリポソームは４０〜８０ｎｍの粒度分布を有しており、０．０８６ｍｇ／ｍｌの分子２．ｂを含有している。
【０２０２】
ｃ）より高濃度の分子２．ｂを有するリポソーム（「濃厚リポソーム」）を得る
脂質フィルムを作成するために、ホスファチジルコリンの濃度を２倍とする；他の化合物の濃度は改良リポソームについて上記した濃度と同一のままである。
【０２０３】
これらのリポソームを作成するための手順は、（１）超音波処理は１分に２０パルスであり、（２）溶媒をロータリーエバポレータ（Ｂｕｃｈｉ，モデルＶ  ８５０及びＲ  ２１５）を用いて減圧（約３ｋＰａ；３０ｍｂａｒ）下で蒸発させる以外は改良リポソームについて上記した手順と同一である。
【０２０４】
これらのリポソームは４０〜８０ｎｍの粒度分布を有しており、０．１３３ｍｇ／ｍｌの分子２．ｂを含有している。
【０２０５】
抽出前に５００μｌのリポソームの溶液を１０μｌの２％（ｖ：ｖ）トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）と４０℃で１８時間インキュベートする以外は、脂質化合物を抽出した後、リポソームを構成する分子の特性評価、リポソームの安定性及び組成の評価をＦｏｌｃｈら（１９）の方法に従って実施する。
【０２０６】
ルーチンの技術に従ってメチル化した後、ホスファチジルコリンを構成する脂肪酸の分析を、ガスクロマトグラフを連結した質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により実施する。
【０２０７】
ホスファチジルコリンのコリン基の特性評価をＲｅｉｎｅｃｋａｔｅ（２０）の方法に従って実施する。
【０２０８】
分子２．ｂを上記（化合物の製造）したＨＰＬＣにより、または以下のポイント５）に記載するシリカ薄層クロマトグラフィーにより定量する。
【０２０９】
リポソームの粒度分布は蛍光リポソームに対して測定し、形態分析は落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｖｅｒｔ，Ｚｅｉｓｓ）を用いて像を得た後Ｓｅｒｔプログラムにより実施する。
【０２１０】
使用するホスファチジルコリンが改良リポソームの場合には５．０％、濃厚リポソームの場合には２．５％の蛍光ホスファチジルコリン（ＮＢＤ−ＰＣ−オレイル；Ａｖａｎｔｉ；励起／発光＝４６０ｎｍ／５３４ｎｍ）を含有している以外は、改良または濃厚リポソームについて記載したのと同一量のホスファチジルコリンを用いて蛍光リポソームを作成する。
【０２１１】
まずポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ，水中１％  ｗ：ｖ）で被覆した後、ラミニン（Ｓｉｇｍａ，水中０．６％）で被覆したガラス培養スライドにリポソームを沈降させる。画像を得る前に、リポソームをグルタルアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）（リポソーム：グルタルアルデヒド：ＰＢＳ；１５：３７．５：９７．５，ｖ．ｖ．ｖ）で固定する。
【０２１２】
３）活性及び毒性の測定
同一方法を両ケースに対して使用する。活性の場合、試験化合物の抗ＧＢＭポテンシャルを使用し、毒性をインビトロで維持したヒト起源の正常細胞に対して試験する。
【０２１３】
以下の測定方法を使用する：
ａ）細胞計数
写真での細胞計数方法を使用する。
【０２１４】
例えば、９６ウェルプレート中の培養物の場合、使用した顕微鏡の倍率（対物×１０または×２０，接眼×１０）の関数として、撮った写真はウェルの直径の１／５に等しい直径を有する視野を表す。従って、ウェル中の細胞の総数は１写真あたりの細胞数の５倍に等しい。Ｃ６細胞の場合、この技術を標準技術（細胞層のトリプシン処理、細胞の遠心、細胞の生理的塩類液中への懸濁、及びトーマ細胞を用いる計数）と比較した。得られた結果は両方法で同一である。
【０２１５】
ｂ）タンパク質アッセイ
培地を各ウェルから取り出し、５０μｌ／ウェルのレムリ緩衝液（０．１ｍｌのトリス，０．８ｍｌのグリセロール，１．６ｍＬの１０％  ＳＤＳ，８ｍｌのｑ．ｓ．ｆ超純水）を添加する。
【０２１６】
対照ウェルでは、１０μｌのウシ血清アルブミン範囲（結晶化ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）の溶液を添加する；範囲は０〜２０μｇ／ウェルである。次いで、ウェルに４０μｌのレムリ緩衝液を補充する。最後に、２００μｌのＢＣＡ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，米国；ＢＣＡタンパク質アッセイキット；ＴｈｅｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，フランス国）の溶液を添加する。
【０２１７】
培養プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。各ウェルの光学密度をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ，米国，ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー１２２２２）により５７０ｎｍで測定し、定量化する。
【０２１８】
ｃ）細胞生存性（ＭＴＴ試験）
この試験により、細胞呼吸、特にミトコンドリア呼吸を検出することができる。テトラゾリウム塩ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，米国，ｒｅｆ．Ｍ５６５５）のストック溶液を１０ｍｇのＭＴＴ／ｍｌ−ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水，ＳＩＧＭＡ，ｒｅｆ．Ｄ  １４０８）を用いて調製する。この溶液を各ウェル中の培地に直接添加する；ＭＴＴの最終濃度は２５μｇ／ｍｌである。次いで、プレートを３７℃で少なくとも１時間インキュベートする。
【０２１９】
主にミトコンドリア電子伝達により生成される青色ホルマザン粒が現れたら、高密度ホルマザン粒を有する細胞を計数するために写真を撮った；Ｕ８７−ＭＧ株の場合にこの技術を使用する。次いで、この株及び他の培養物の場合、培地を除去し、ホルマザン沈降物を溶解させるために１００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，ＳＤＳ  ＣＡＲＬＯ  ＥＲＢＡ，イタリー国）を添加する。
【０２２０】
光学密度をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ，ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー）を用いて４９０ｎｍで測定し、定量する。
【０２２１】
生存性は時にはトリパンブルー排除技術によっても試験される。
【０２２２】
４）細胞の免疫標識及び像の獲得
抗ＣＤ１３３（ポリ，Ａｂｎｏｖａ）、抗ＧＦＡＰ（ポリ，Ｓｉｇｍａ）、抗ＮＦＬ（モノ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及び抗線維芽細胞（ＥＲＴＲ７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）一次抗体を、最初の３つの抗体の場合には１／１００に、最後の抗体の場合には１／５０に希釈する。
【０２２３】
ＩＤＨ−Ｒ１３２Ｈ（低グレード神経膠腫のマーカー（２１））及びＣＤ３１（内皮細胞のマーカー（２２））を検出するために、使用した一次抗体はそれぞれＣｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ（マウス，１／２０希釈）及びＳｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（家兔，１／２５０希釈）から入手した。
【０２２４】
一次抗体の認識に対応する二次抗体は、ペルオキシダーゼ（ヤギ，Ｓｉｇｍａ）にカップリングした抗家兔抗体、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８（ヤギ，Ｓｉｇｍａ）にカップリングした抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８（ヤギ、Ｓｉｇｍａ）にカップリングした抗マウス、及びＦＩＴＣ（家兔，Ｓｉｇｍａ）にカップリングした抗ラットである。希釈はそれぞれ１／４０００、１／１０００、１／４０００及び１／４００である。
【０２２５】
ペルオキシターゼをカップリングした二次抗体を用いてＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ及びＣＤ３１を検出する。これらはそれぞれＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（抗マウス，１／１０００希釈）及びＳｉｇｍａ（抗家兔，１／５００希釈）から入手する。
【０２２６】
細胞をＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中０．１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を用いて５分間透過処理する。非特異的部位をＰＢＳ中２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロックする。抗ＣＤ１３３、抗ＧＦＡＰ、抗ＮＦＬ及び抗線維芽細胞抗体に対してそれぞれ周囲温度で１時間、４℃で４８時間、４℃で２４時間及び周囲温度で１時間インキュベーションを実施する。二次抗体とのインキュベーションは周囲温度で１時間実施する。ＣＤ１３３ポジティブ細胞をＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２システム（Ｓｉｇｍａ）により検出し、光学顕微鏡を用いて観察する。
【０２２７】
マーカーＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ及びＣＤ３１の比色検出を、基質ＮＯＶＡＲＥＤベクター（Ｅｕｒｏｂｉｏ）を用いて実施する。また、光学顕微鏡を用いて着色した細胞を検出する。蛍光を検出し、落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ，Ｚｅｉｓｓ，ドイツ国）を用いて画像を得る。
【０２２８】
５）脂質の抽出及びオキシステロールの同定
細胞を０．９％ＮａＣｌで洗浄し、機械的に収集し、トリス−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ；ｐＨ７．４）中に懸濁し、ポッター（１０００ｒ．ｐ．ｍ．及び１３往復）を用いて均質化する。均質化は氷中で実施する。１容量の細胞懸濁液に対して１９容量のクロロホルム：メタノール（２：１，ｖ／ｖ）を添加した後、抽出をＦｏｌｃｈら（１９）に従って４℃で実施する。０．２容量の０．７４％ＫＣｌ（ｗ／ｖ）を添加することにより有機相及び水性相を分離する。
【０２２９】
有機相をロータリーエバポレータ（Ｂｕｃｈｉ，Ｒ−２１５，スイス国）を用いて蒸発させた後、脂質残渣をクロロホルム中に取る。ＴＬＣ層をクロロホルム：メタノール（１：１，ｖ／ｖ）で予め洗浄し、１００℃で１時間活性化する。脂質を石油エーテル（沸点：６０〜７０℃）：エーテル：酢酸（８０：２０：１．３，ｖ／ｖ／ｖ）で溶離させる。沈降した標準物質はコレステロール、７−ケト−コレステロール、７β−ＯＨＣＨ、７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステル及び分子２．ｂである。脂質及び標準物質をＭａｃｃａｌａ試薬で検出する。Ｒｆ値はコレステロール、７−ケト−コレステロール、７β−ＯＨＣＨ、７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステル及び分子２．ｂの場合それぞれ０．２１、０．０９、０．０８、０．２７及び０．２３である。各標準物質について０．５〜２μｇの較正範囲を別々に実施する。シリカの展開させた薄層をスキャンした後、当該スポットの強度を標準物質に対して計算する。
【０２３０】
使用した溶媒はＡｎａｌＡＲまたはＨＰＬＣグレードを有している。
【０２３１】
６）ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ：ＥＣ  １．１．１．２７）の活性及び阻害の分析
ＬＤＨの活性及びルーチンの阻害剤であるオキサメート（２３）によるその阻害の測定を標準物質としてライヒマン乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）（ＬＬ）の精製ＬＤＨ（Ｓｉｇｍａ）を用いて分光分析法（２４）により確認した。
【０２３２】
次いで、ＬＤＨ活性及びその阻害を「インゲルアッセイ」技術（２５）により検出した。使用した活性のソースはヒトＧＢＭ株Ｕ８７−ＭＧ（ＬＤＨ  ＧＢＭ）から部分精製したＬＤＨ  ＬＬ及びＬＤＨであった。ＬＤＨ  ＬＬ及びＬＤＨ  ＧＢＭサンプルの電気泳動ゲルに対して等電点電気泳動（ＩＥＦ）を実施した後に、「インゲルアッセイ」検出を実施した。
【０２３３】
ａ）ＬＤＨ  ＧＢＭの部分精製
リン酸緩衝液（５０ｍＭ，Ｐｈ７．２．Ｐｉ）中に収集した細胞を数回の凍結（−２０℃）／融解サイクルにかけ、細胞材料を均質化する。４℃で１０，０００ｇを４５分間遠心した後、上清を集め、１０％  グリセロール（ｖ：ｖ）を含有しているアリコートを−８０℃で凍結する。所望のときに、融解後アリコートをＰｉで作成した濾過カラム（Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ−６０，ＢｉｏＲａｄ）を用いてクロマトグラフにかける。ゲル容量は９ｍｌであり、カラムの内径は０．４ｃｍである。溶離を大気圧下で実施する。１．４ｍｌの第１分画を除去し、次の２ｍｌ中のＬＤＨ活性を集める。この分画（ＬＤＨ  ＧＢＭ）のタンパク質成分をＳＤＳ  ＰＡＧＥ技術後硝酸銀染色により、またはウェスタンブロットにより特性評価した。ＬＤＨの分子量を求める（サブユニットの場合３１ｋＤａ、またはダイマー中のその会合物の場合６２ｋＤａ）。
【０２３４】
ｂ）ＩＥＦ
冷チャンバでプレフォーカスした後、７．５（Ｔ％）及び２．６（Ｃ％）のミニゲルをアンフォライン（ＢｉｏＲａｄ）と一緒にＰｉに注ぎ、７〜５の範囲のｐＨ勾配を形成することができる。使用した容器はミニプロティアン３タイプ（ＢｉｏＲａｄ）のものである。アノード緩衝液は２．０のｐＨを有しており、カソード緩衝液は１０．０のｐＨを有している。変性させることなくＬＤＨ  ＬＬ及びＬＤＨ  ＧＢＭサンプルを沈着させ、電気泳動を冷チャンバにおいて電圧を１００Ｖから３００Ｖに増加させながら２１０分間実施する。
【０２３５】
ｃ）ＬＤＨ活性
ＬＤＨ活性をラクテート／ＮＡＤ／ＭＴＴ／フェナジンメトスルフェート系（ＩＥＦゲル中でのホルマジンタイプの沈殿の形成）により検出する；この系は参考文献（２５）に記載されている。
【０２３６】
オキサメート（１８ｍＭ）またはエタノール形態の分子２．ｂ（３６ｍＭ）を添加すると、ＬＤＨ  ＬＬ及びＬＤＨ  ＧＢＭ活性の阻害の程度を測定することができる。
【０２３７】
Ｂ／インビトロでの抗ＧＢＭ活性
Ｂ．１．動物モデル
Ｃ６細胞（ラット）の培養物を上述（セクションＩＩ，Ａ）した操作条件下で使用した。
【０２３８】
[実施例７]：Ｃ６細胞（ラット）の培養物に対するインビトロでの抗ＧＢＭ活性
得られた結果を下表１及び図３に要約する。
【０２３９】
【表１３】
0006270823.tif 000026
【０２４０】
図３（倍率２０×１０）は、上述（セクションＩＩ，Ａ）した操作条件下で分子１．ａ（実施例３）の存在下、または分子１．ａ、次いで分子２．ａ（実施例５）を用いて１９日及び３５日逐次処理した後のＣ６細胞の培養物の外観を示している。
【０２４１】
結果（表１）は、エタノール形態の分子１．ａが１９日処理後細胞毒性であることを示している。１５μΜの１．ａでは、１４日処理後細胞数、タンパク質レベル及びＭＴＴアッセイは３０％低下し、少なくとも１９日で９７％の低下に達する。１９日の処理で７．５及び３．３μΜのｌａに対して用量依存性も観察され、１５μΜでは対照培養物に比して２０％のＭＴＴ／細胞比の増加が観察される。
【０２４２】
残留する細胞を除去するために、逐次処理を使用した。細胞をまず１５μΜの分子１．ａで処理し、処理の１９日目に分子２．ａを７．５μΜの濃度で添加する。
【０２４３】
生存細胞は観察されない；図３に示すように、細胞「死体」のみが細胞培養物の固体基質（ウェルの底）に接着している。
【０２４４】
要約すると、分子１．ａ、次いで分子２．ａを用いる逐次処理はこの細胞型に対して完全な有効性を示す。この知見は破壊前の細胞の全呼吸の増加を示している。
【０２４５】
Ｂ．２．ヒトモデル：ヒト細胞（株Ｕ−８７ＧＭ）の培養物に対するインビトロでの抗ＧＢＭ活性
Ｂ．２．１  インビトロモデル及び結果の表示の定義
ａ）各種細胞型の特性評価
Ｕ−８７ＧＭ細胞を上記（セクションＩ，Ａ）した操作条件下で培養した。
【０２４６】
培養物は２つの細胞成分、すなわち正常（非癌性）細胞として挙動する細胞及びＧＢＭ型細胞から構成される細胞凝集物から構成されている。
【０２４７】
図４は、培養物の特徴である光学像（１０×１０）を示す。細胞層（ＣＬ）が見られ得、この上に半球形状の細胞凝集物（ＣＡ）が固定されるようになる。図５（２０×１０）は、免疫標識によりヒトＧＢＭ中に示されているＣＤ１３３＋細胞（幹細胞）が細胞凝集物中に存在し、ＣＬ中に存在していないことを示している。免疫蛍光標識は、ＣＬ及びＣＡ（図６及び７；２０×１０）中の正常星状膠細胞のマーカーであるＧＦＡＰの存在（図６及び７；２０×１０）（２６）、及びＣＬ及びＣＡ中のニューロフィラメントの存在を示している。しかしながら、増殖に対して高いポテンシャルを有する細胞である線維芽細胞の特異的標識がＣＡの場合にのみ見られる。非常に少数のＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈポジティブ細胞がＣＬ及びＣＡにおいて観察される。逆に、ＣＤ３１ポジティブ細胞がＣＬ及びＣＡ中に存在している。
【０２４８】
光学顕微鏡による観察は、ＣＡの細胞は非常に迅速に分裂する（最大１６時間の倍加時間）のに対して、ＣＬを構成する細胞は９６時間の倍加時間を有していることを明らかに示している。
【０２４９】
これらの所見は、開発されている細胞計数方法（フォルマザン粒で標識されているかまたは標識されていない細胞）を正当化する；実際、トリプシン処理後の計数はＣＬ及びＣＡの細胞を区別することができない。像は、ＣＡのみがＧＢＭ特性（短い倍加時間、幹細胞及び線維芽細胞の存在）を有していることも示している。従って、得られた結果はＣＡに対して試験した分子の効果の結果である。
【０２５０】
ｂ）結果の表示
結果を以下のパラメーターに従って表示する：
（ｉ）本発明の分子の有効性
−残留細胞、特に幹細胞の定量、
−本発明の分子の経時的有効性。
【０２５１】
本発明の分子を含有している培地を新鮮培地で置換し、「デノボ」細胞増殖を調べる：「デノボ」増殖がないことは幹細胞を含めたＧＢＭ細胞の全破壊を表す。
【０２５２】
（ｉｉ）分子のＧＢＭ細胞の全呼吸に対する効果
（ｉｉｉ）本発明の分子で得た結果と７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステル（対照）で得た
結果との比較
Ｂ．２．２  結果
Ｕ８７−ＭＧ（ヒト）細胞の培養物を上述（セクションＩＩ，Ａ）した操作条件下で使用した。７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルを対照として使用した。
【０２５３】
[実施例８]：リポソーム形態の分子２．ａ（実施例５）のインビトロでの抗ＧＢＭ活性の研究
得られた結果を下表２に示す。
【０２５４】
【表１４】
0006270823.tif 000027
【０２５５】
これらの結果は３回実施した３つの独立した実験の平均値である。結果を対照に対する％として表示する。
【０２５６】
所見は、１５μΜのリポソーム形態の分子２．ａが１５日の処理後ＧＢＭ細胞（ＣＡ）の存在をゼロに減らすことを示している。
【０２５７】
分裂の遅い細胞（ＣＬ）のみが残る。効果は用量依存的でない。エタノール形態の７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルはＧＢＭ（ＣＡ）に対して作用せず（実施例９も参照されたい）、リポソーム形態の分子のみが８０μＭで作用する。その有効性はリポソーム形態の７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルの用量を増加させても向上せず、低下することさえある。
【０２５８】
しかしながら、処理の１３日目に７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルを含有している培地を除去し、この薬物を含有していない新鮮な培地で置換すると、細胞増殖が観察され、平行してＭＴＴ試験では２日後に増加が観察される；この増加は４０％である。これは分子２．ａには当てはまらない：この分子の非存在下では細胞増殖は観察されない。
【０２５９】
表２は、殆どの細胞が消えたときに（８日の処理）ＭＴＴ／細胞が大きく増加する（対照に比して１４０％）ことも示している。これはリポソームの７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルには当てはまらない：８０μＭでも、ＭＴＴ／細胞比は変わらない。
【０２６０】
この所見は２つの分子間の異なる作用を示している：細胞の大量死の前に全細胞呼吸が増加する。これは７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルには当てはまらない。
【０２６１】
[実施例９]：エタノール形態の分子２．ｂ（実施例６）のインビトロでの抗ＧＢＭ活性の研究
得られた結果を下表３に示す。
【０２６２】
【表１５】
0006270823.tif 000028
【０２６３】
これらの結果は各々３回実施した３つの独立した実験の平均値である。結果を対照に対する％として表示する。３０μＭを超えると、７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルはもはやエタノールに溶解し得ない。
【０２６４】
所見は、エタノール形態の分子２．ｂが３０μＭで完全に有効であることを示している：活性成分を除去した後でもＧＢＭ細胞が残っていない。リポソーム形態の分子２．ａのように、細胞死の前に細胞呼吸が増加する。これはエタノール性７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルには当てはまらず、抗腫瘍活性は観察されない。
【０２６５】
更に、２２日目に培地を化合物２．ｂを含有していない新鮮培地で置換しても細胞増殖は生じない。
【０２６６】
[実施例１０]：ＣＤ１３３＋幹細胞のＡ／Ｂペルオキシダーゼ系での免疫標識
免疫標識を上記（セクションＩＩ，Ａ）したように実施する。
【０２６７】
得られた結果を下表４に示す。
【０２６８】
【表１６】
0006270823.tif 000029
【０２６９】
これらの結果は各々３回実施した２つの独立した実験の平均値である。結果を対照に対するＣＤ１３３＋細胞の％として表示する。これらの実験は実施例８及び９に記載されている実験と独立している。
【０２７０】
表２及び３に記載されている所見のように、リポソーム形態の７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステル及びエタノール形態の分子２．ｂはタンパク質のレベルを未処理の対照細胞に比して８５％及び１００％低下させる。
【０２７１】
結果は、幹細胞が分子２．ｂにより完全に破壊されることを示している。これは、リポソーム形態で投与しても７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルには当てはまらない。
【０２７２】
図９（ＣＤ１３３＋細胞の免疫標識）は、細胞が２２日の処理後に消失することを明らかに示している。これはリポソーム形態の７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルには当てはまらない（図１０，ＣＤ１３３＋細胞の免疫標識）；この場合、ＣＤ１３３＋細胞の５０％が残留細胞中になお存在している。２２日目に培地を化合物２．ｂを含有していない新鮮培地で置換してもＣＤ１３３＋幹細胞は出現しない。
【０２７３】
[実施例１１]：ヒト起源のＧＢＭにおけるインビトロでのエタノール形態の分子２．ｂ（実施例６）の運命の研究
３０μＭのエタノール形態の分子２．ｂで処理したＧＢＭ由来の脂質の抽出及び分析は２４時間または１０日の処理後に７β−ＯＨＣＨ−Ｃ３−エステルの存在を示さない。後者の時間は細胞死が始まるときである。しかしながら、７β−ＯＨＣＨに形質転換した分子２．ｂの０．１２％及び０．１８％がそれぞれ１日及び１０日の処理後に観察される。対照実験はこうした非常に低レベルの７β−ＯＨＣＨはＧＢＭの死を誘導しないことを示している。
【０２７４】
[実施例１２]：毒性の研究
毒性をインビトロでヒト起源の各種正常細胞に対して試験した。
【０２７５】
ａ）星状膠細胞に対して
使用した細胞は上記（セクションＩＩ，Ａ）したヒト起源の細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国，ｒｅｆ．１８００）である。
【０２７６】
星状膠細胞型を正常星状膠細胞の標準マーカーであるＧＦＡＰの存在により確認する（図１１；倍率×２００）。
【０２７７】
分子２．ａ（リポソーム形態）及び２．ｂ（エタノール形態）は、３０μＭで３０日の処理後正常な（非癌性）ヒト星状膠細胞の一次培養物に対して毒性でない。
【０２７８】
ｂ）他の細胞に対して
使用した細胞は、上述（セクションＩＩ，Ａ）したヒト起源の肝細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国，ｒｅｆ．５０２００）、腎細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国，ｒｅｆ．４１２０）、骨格筋細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国，ｒｅｆ．３５００）及び心細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，米国，ｒｅｆ．６３００）である。
【０２７９】
分子２．ａ（リポソーム形態）及び２．ｂ（エタノール形態）は、３０μＭで少なくとも３０日の処理後ヒト起源の肝細胞、腎細胞、骨格筋細胞及び心細胞の一次培養物に対して毒性でない。
【０２８０】
[実施例１３]：他の癌に対するインビトロでの分子２．ｂ（実施例６）の活性の研究
使用した癌細胞は、上述したヒト起源の肝癌（ｒｅｆ．ＡＴＣＣ−ＨＢ−８０６５）、前立腺癌（ｒｅｆ．ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−８１）、乳癌（ｒｅｆ．ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−１９）癌細胞及び結腸癌細胞（ＥＣＡＣＣ−ＨＴ２９／２１９）由来である。
【０２８１】
３０μＭでエタノール形態の分子２．ｂはヒト起源の肝癌、前立腺癌または乳癌細胞の細胞分裂及び呼吸に対して効果を示さない。
【０２８２】
１５μＭで、改良リポソーム形態の分子２．ｂは結腸癌細胞に対して毒性でない。
【０２８３】
[実施例１４]：慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）に対するインビトロでの改良リポソーム形態の分子２．ｂの活性の研究
ＣＭＭＬを患っている患者から白血球を集めた血液サンプルから単離する。フィード層（１７）に接種することにより培養から２４時間後、細胞を１０μＭの改良リポソーム形態の分子２．ｂで１回処理する。
【０２８４】
結果を図１２の写真（倍率２０×１０）に示す。
【０２８５】
対照は未封入リポソームで処理した細胞である：文字Ａを付けた左上の写真は４８時間の処理後に撮ったものであり、文字Ｂを付けた左下の写真は７２時間の処理後に撮ったものである。
【０２８６】
２．ｂで処理した細胞の場合、文字Ｃを付けた右上の写真は４８時間の処理後に撮ったものであり、文字Ｄを付けた右下の写真は７２時間の処理後に撮ったものである。
【０２８７】
結果は、７２時間の処理後の分子２．ｂの著しい効果を示している。細胞増殖は対照に比してかなり遅くなり、壊死性外観を有する多くの細胞が観察される。
【０２８８】
[実施例１５]：ヒト神経芽細胞腫（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−２２６６）に対するインビトロでの分子１．ｂ及び２．ｂの活性の研究
培養を開始してから２４時間後に、神経芽細胞腫を未封入リポソーム（対照）または分子１．ｂまたは２．ｂを含有しているリポソームで処理した。細胞を２２μＭの分子１．ｂまたは２２μＭの分子２．ｂで１回処理する。リポソーム形態を濃縮する。
【０２８９】
結果を図１３の写真（倍率１０×１０）に示す。
【０２９０】
対照細胞の場合、文字Ａを付けた左上の写真は７日の処理後に撮ったものであり、文字Ｂを付けた左下の写真は２８日の処理後に撮ったものである。
【０２９１】
濃厚リポソーム分子１．ｂで処理した細胞の場合、文字Ｃを付けた写真（中間、上）は７日の処理後に撮ったものであり、文字Ｄを付けた写真（中間、下）は２８日の処理後に撮ったものである。濃厚リポソーム分子２．ｂで処理した細胞の場合、文字Ｅを付けた写真は７日の処理後に撮ったものである。
【０２９２】
結果は、分子１．ｂに比して分子２．ｂの著しい活性を示している。２８日の処理後、分子ｌｂは対照細胞に比して殆ど全ての細胞に対して毒性である。分子２．ｂの場合、ラジカル毒性作用が７日の処理後にすでに観察される；生存細胞は観察されない。
【０２９３】
[実施例１６]：ヒトＧＢＨ（Ｕ８７−ＭＧ株）から抽出したＬＤＨの活性のインビトロでの分子２．ｂによる阻害の研究
これらの実験の目的は、シリーズ２分子のＬＤＨの酵素活性の阻害のポテンシャルを立証することであった。研究は分子２．ｂを用いて実施し、その阻害ポテンシャルをライヒマン乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）（ＬＬ）由来のＬＤＨ及びセクション“Ａ／プロトコル６）”に上記したヒトＧＢＭ株（Ｕ８７−ＭＧ）由来の部分精製したＬＤＨに対して試験した。
【０２９４】
ＬＤＨの活性を、セクション“Ａ／プロトコル６）”に記載したＩＥＦ電気泳動ゲルを用いる「インゲルアッセイ」技術により検出する（２５）：この技術の精度は０．２単位のｐＨである。ＬＤＨの活性を、ＬＤＨ活性が見られる部位であるホルマザンタイプの暗青色沈殿により検出される。
【０２９５】
図１４（Ａ）は、ｐＨｉ  ６．２でのＬＤＨ  ＬＬ、ｐＨｉ  ６．４でのＬＤＨ  ＧＢＭのＬＤＨ活性を示す。
【０２９６】
結果は、水性形態のオキサメート（１８ｍＭ）またはエタノール形態の分子２．ｂ（３６ｍＭ）を添加するとＬＤＨ  ＬＬの酵素活性がほぼ完全に阻害され、ＬＤＨ  ＧＢＭ（Ｂ）の酵素活性が部分的に阻害されることを示している。
【０２９７】
ＧＢＭの細胞死の前のＭＴＴ染色の増加と共にＬＤＨ  ＧＢＭの酵素活性の分子２．ｂによる阻害の可能性により（表２及び３；図８及び９）、式（Ｉ）の化合物の作用メカニズムの仮説が確認される：本発明の分子はＬＤＨの活性を阻害し、その結果ミトコンドリア呼吸のバーストが引き起こされる。
【０２９８】
【表１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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