(57)【要約】本発明は、骨および軟骨障害、軟部組織障害および心血管疾患のような骨格筋障害を含む治療適用のためのｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出のためのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）を含有するフィブリンシーラントに関する。本発明はまた、シーラントを配合するために用いられるフィブリノーゲン複合体成分の含有量を調整することによりフィブリンシーラントからのＴＧＦ−βタンパク質の放出を調整する方法を提供する。病状または障害の処置のため、ＴＧＦ−βは、ひとたびフィブリンシーラントから放出されると、ＴＧＦ−βがｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてその予想される生物学的活性を仲介できるように、その生物活性を保持することが企図される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリンシーラントからのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の放出を調整するための方法であって、該タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該フィブリンシーラントは、フィブリノーゲン複合体成分、トロンビン成分およびＴＧＦ−β成分の混合により製造され、該方法は：
ａ）ＴＧＦ−βの既知の初期量およびフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＴＧＦ−βの量を決定するステップと、
ｂ）第２のフィブリンシーラントを製造するためにステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラントにおいて用いられたフィブリノーゲン複合体の該既知の最終濃度を調整するステップと、を含み、該第１のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の該既知の最終濃度と比較して該第２のシーラント中の該フィブリノーゲン複合体の濃度を増大させることにより、ステップ（ａ）の第１のシーラントからのＴＧＦ−βの放出と比較して、該第２のシーラントからのＴＧＦ−β放出の速度が減少し、該第２のシーラントが、ステップ（ａ）における第１のシーラントと同じＴＧＦ−βの初期量を有する、
方法。
【請求項２】
フィブリンシーラントからのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の放出を調整するための方法であって、該タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該フィブリンシーラントは、フィブリノーゲン複合体成分、トロンビン成分およびＴＧＦ−β成分の混合により製造され、該方法は：
ａ）ＴＧＦ−βの既知の初期量およびフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＴＧＦ−βの量を決定するステップと、
ｂ）第２のフィブリンシーラントを製造するためにステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラントにおいて用いられたフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を調整するステップと、を含み、該第１のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の該既知の最終濃度と比較して該第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の濃度を減少させることにより、ステップ（ａ）の第１のシーラントからのＴＧＦ−βの放出と比較して、該第２のシーラントからのＴＧＦ−β放出の速度が増大し、該第２のシーラントが、ステップ（ａ）における第１のシーラントと同じＴＧＦ−βの初期量を有する、
方法。
【請求項３】
前記第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が約５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が、前記第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度と約１ｍｇ／ｍｌ〜約１４９ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が、前記第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体濃度と約５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が、前記第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体濃度と約１０ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記第１または第２のシーラント中のトロンビン成分の最終濃度が、約１ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ＴＧＦ−βの最終濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の、それを必要としている患者における、制御放出のための方法であって、該タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該方法は、ＴＧＦ−βを含むフィブリンシーラントを該患者に投与するステップを含み、該ＴＧＦ−βの少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、方法。
【請求項１１】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を混合物中で組み合わせることにより製造される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＧＦ−βが、前記ＦＣ成分と前記トロンビン成分との混合前に、該ＦＣ成分に添加される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも３５％〜９０％が少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜７５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１６】
放出された前記ＴＧＦ−βが生物学的に活性である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１７】
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の、それを必要としている患者における、制御放出のための方法であって、該タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該方法は、ＴＧＦ−βを含むフィブリンシーラントを該患者に投与するステップを含み、該ＴＧＦ−βの少なくとも２０％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、方法。
【請求項１８】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を混合物中で組み合わせることにより製造される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＧＦ−βが、前記ＦＣ成分と前記トロンビン成分との混合前に、該ＦＣ成分に添加される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも２５％〜７５％が少なくとも１０日間保持される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜５５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２２】
放出された前記ＴＧＦ−βが生物学的に活性である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記シーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項１１または１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記シーラント中の最終トロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌ〜２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にある、請求項１１または１８に記載の方法。
【請求項２５】
最終フィブリノーゲン複合体濃度が４０ｍｇ／ｍｌであり、最終トロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、請求項１１または１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記シーラント中の最終ＴＧＦ−β濃度が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である、請求項１０または１７に記載方法。
【請求項２８】
前記ＴＧＦ−β１の少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、該ＴＧＦ−β１の少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２である、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＧＦ−β２の少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＴＧＦ−β３の少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、該ＴＧＦ−β３の少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者が、筋骨格疾患または障害、軟部組織疾患または障害および心血管疾患からなる群より選択される疾患を患っている、請求項１０または１７に記載の方法。
【請求項３４】
前記骨格筋障害が骨疾患または骨障害である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記骨格筋障害が軟骨疾患または軟骨障害である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記患者が心血管疾患を患っている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出の恩恵を受けるであろう障害または疾患を患っている患者を処置するための方法であって、該タンパク質が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該方法が、該ＴＧＦ−βタンパク質を含むフィブリンシーラントを該患者に投与するステップを含み、
該フィブリンシーラントが、該ＴＧＦ−βの制御放出を提供し、該ＴＧＦ−βの少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、あるいは該ＴＧＦ−βの少なくとも２０％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持され、該ＴＧＦ−βが、該障害または疾患を処置するのに有効な速度で放出される、
方法。
【請求項３８】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を混合物中で組み合わせることにより製造される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＴＧＦ−βが、前記ＦＣ成分と前記トロンビン成分との混合前に、該ＦＣ成分に添加される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも３５％〜９０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜７５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも２０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも２５％〜７５％が少なくとも１０日間保持される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜５５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４６】
放出された前記ＴＧＦ−βが生物学的に活性である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記シーラント中の最終ＦＣ濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記シーラント中の最終トロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌ〜２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
最終フィブリノーゲン複合体濃度が約４０ｍｇ／ｍｌであり、最終トロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記シーラント中の最終ＴＧＦ−β濃度が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである、請求項３７に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＴＧＦ−β１の少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、該ＴＧＦ−β１の少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＴＧＦ−β２の少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＴＧＦ−β３の少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、該ＴＧＦ−β３の少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記患者が、筋骨格疾患または障害、軟部組織疾患または障害および心血管疾患からなる群より選択される疾患を患っている、請求項３７に記載の方法。
【請求項５８】
前記骨格筋障害が骨疾患または骨障害である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記骨格筋障害が軟骨疾患または軟骨障害である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記患者が心血管疾患を患っている、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質を含むフィブリンシーラントを調製するためのキットであって、該タンパク質が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該フィブリンシーラントが、所望のＴＧＦ−β放出速度を有し、該キットは：
ａ）フィブリノーゲン複合体成分を含有し、ＴＧＦ−β成分を任意に含む第１のバイアルまたは第１の保存容器と、
ｂ）トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器と、を含み、該キットが、該第１のバイアルまたは第１の保存容器がＴＧＦ−β成分を含有しない場合にＴＧＦ−β成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を任意に含み、該キットがさらに、その使用説明書を含む、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／８８１，４５２号および２００７年６月１３日に出願された仮特許出願第６０／９３４，４５７号（これらは、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、筋骨格疾患および心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含む治療適用のためのｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）のためのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）を含有するフィブリンシーラントに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
フィブリンシーラントは、ヒト血液凝固タンパク質から作られ、出血を制御するために手術中に一般に用いられる外科的「接着剤」の一種である。これらのシーラント中の成分は、適用中に相互作用して血液タンパク質フィブリンで構成された安定な血餅を形成する。フィブリンシーラントは現在、いくつかの異なる目的のために、すなわち、外科医が手術している領域における出血を制御するために、創傷治癒を早めるために、中空の身体器官を封止するためまたは標準的な縫合により作られた孔を覆うために、手術中に露出される組織への薬剤の徐放的送達を提供するために、手術中に用いられる。
【０００４】
フィブリンシーラントは一般に、２種類のヒト血漿由来成分：（ａ）フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンで主に構成された高濃縮フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）に加えて触媒量の因子ＸＩＩＩおよびプラスミノゲンと、（ｂ）高効力トロンビンとから成る。フィブリンシーラントはまた、アプロチニンも含有し得る。トロンビンの作用により、（可溶性）フィブリノーゲンは最初、自然に凝集していわゆるフィブリン血餅を形成するフィブリンモノマーに変換される。同時に、溶液中に存在する因子ＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩ）が、カルシウムイオンの存在下でトロンビンにより因子ＸＩＩＩａに活性化される。凝集フィブリンモノマーおよびことによると存在するいずれかの残留フィブロネクチンが架橋されて、新しいペプチド結合形成により高重合体を形成する。この架橋反応により、形成された血餅の強度が実質的に増大される。一般に、血餅は、創傷および組織表面にうまく付着し、これにより接着および止血効果がもたらされる（特許文献１）。従って、フィブリン接着剤は、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分を、カルシウムイオンを付加的に含有するトロンビン成分と共に含む２成分接着剤として頻繁に用いられる。
【０００５】
フィブリンシーラントの特別な利点は、接着剤／ゲルが、その適用部位において異物として残るのではなく、まさに自然な創傷治癒におけるように完全に再吸収され、新たに形成された組織により置き換えられることである。様々な細胞、例えば、マクロファージ、続いて繊維芽細胞がゲル中に移行し、ゲル物質を溶解および再吸収し、新しい組織を形成する。フィブリンシーラントは、フィブリンゲルをｉｎ  ｓｉｔｕで形成するために用いられてきており、これらのフィブリンゲルは、細胞および成長因子の送達のために用いられてきた（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
組織修復のためには、成長因子および細胞をフィブリンゲルのようなマトリックス中に局在化することが望ましい。例えば、フィブリンマトリックスは、ウシ胎児血清、サンゴ粒、およびリポソームを含有する様々な複合混合物中でのＴＧＦ−βの送達のために用いられてきた（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。成長因子をフィブリンゲルから送達するための別の手段は、トランスグルタミナーゼ基質、抗体、および成長因子と結合されたＶＥＧＦフラグメントを含む接合体を伴う（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献２；特許文献３および特許文献４参照）。加えて、フィブリンゲルは、細胞成長（例えば、ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ））および増殖、ならびに、マトリックス中のＦＣおよびトロンビンの濃度に応じて、ある程度、骨形成分化を引き起こすことが示されている（非特許文献７）。
【０００７】
成長因子を体内の特定部位に送達するフィブリンシーラントの能力は有用であるが、組織の適切な再成長は、適切な処置が保証されるように特定の速度でその部位に送達される成長因子またはサイトカインの連続的／安定な供給を必要とすることがよくある。このことは、治療タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで短い半減期を有するのであれば、特に当てはまる。現在使用されているフィブリンシーラントは、導入された薬物または薬剤のある程度の遅延放出に備えるが、シーラント中の薬剤の寿命を延長する能力は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長期組織修復を改善するであろう。
【０００８】
従って、様々な病状および障害の処置のためにｉｎ  ｖｉｖｏで成長因子を送達するための効果的な手段を開発し、フィブリンゲルからの成長因子の制御放出のための改善された方法を開発する必要性が当該技術分野において依然としてある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７，２４１，６０３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５０６，３６５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，７１３，４５３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／００１２８１８号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｏｘら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ（２００４）１０（５−６）：９４２−９５４
【非特許文献２】Ｗｏｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ（２００３）８９：５７３−５８２
【非特許文献３】Ｆｏｒｔｉｅｒら、Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ（１９９７）５８（１）：６６−７０
【非特許文献４】Ａｒｎａｕｄら、Ｃｈｉｒｕｒｇｉｅ  Ｐｌａｓｔｉｑｕｅ  Ｅｓｔｈｅｔｉｑｕｅ（１９９４）３９（４）：４９１−４９８
【非特許文献５】Ａｒｎａｕｄら、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ（１９９４）５４：４９３−４９８
【非特許文献６】Ｇｉａｎｎｏｎｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００３）８３（１）：１２１−１２３
【非特許文献７】Ｃａｔｅｌａｓら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ（２００６）１２（８）：２３８５−２３９６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの成長因子の制御放出のためのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）を含むフィブリンシーラントの組成物を提供する。本発明はまた、シーラントを配合するために用いられるフィブリノーゲン複合体成分の含有量を調整することによりフィブリンシーラントからのＴＧＦ−βタンパク質の放出を調整する方法を提供する。病状または障害の処置のため、ＴＧＦ−βは、ひとたびフィブリンシーラントから放出されると、ＴＧＦ−βがｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてその予想される生物学的活性を仲介できるように、その生物活性を保持することが企図される。
【００１２】
１つの態様において、本発明は、フィブリンシーラントからのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の放出を調整するための方法を提供し、前記タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、フィブリンシーラントは、フィブリノーゲン複合体成分、トロンビン成分およびＴＧＦ−β成分の混合により製造され、この方法は、ａ）ＴＧＦ−βの既知の初期量およびフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＴＧＦ−βの量を決定するステップと、ｂ）第２のフィブリンシーラントを製造するためにステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラントにおいて用いられたフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を調整するステップと、を含み、第１のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度と比較して第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の濃度を増大させることにより、ステップ（ａ）の第１のシーラントからのＴＧＦ−βの放出と比較して、第２のシーラントからのＴＧＦ−β放出の速度が減少させられ、第２のシーラントが、ステップ（ａ）における第１のシーラントと同じＴＧＦ−βの初期量を有する。
【００１３】
関連した態様において、本発明は、フィブリンシーラントからのＴＧＦ−βタンパク質の放出を調整するための方法を提供し、前記タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、フィブリンシーラントは、フィブリノーゲン複合体成分、トロンビン成分およびＴＧＦ−β成分の混合により製造され、この方法は、ａ）ＴＧＦ−βの既知の初期量およびフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＴＧＦ−βの量を決定するステップと、ｂ）第２のフィブリンシーラントを製造するためにステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラントにおいて用いられたフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を調整するステップと、を含み、第１のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度と比較して第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の濃度を減少させることにより、ステップ（ａ）の第１のシーラントからのＴＧＦ−βの放出と比較して、第２のシーラントからのＴＧＦ−β放出の速度が増大し、第２のシーラントが、ステップ（ａ）における第１のシーラントと同じＴＧＦ−βの初期量を有する。
【００１４】
１つの実施形態において、第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある。関連した実施形態において、第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度は、約５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌの範囲内にある。
【００１５】
別の実施形態において、第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度は、第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度と約１ｍｇ／ｍｌ〜約１４９ｍｇ／ｍｌ異なることが企図される。さらなる実施形態において、第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度は、第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体濃度と約５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ異なる。さらに別の実施形態において、第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度は、第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体濃度と約１０ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌ異なる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、第１または第２のシーラント中のトロンビン成分の最終濃度は、約１ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にあることが企図される。別の実施形態において、第１または第２のシーラント中のＴＧＦ−βの最終濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲内にある。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ＴＧＦ−βタンパク質の、それを必要としている患者における、制御放出のための方法を提供し、前記タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、この方法は、ＴＧＦ−βを含むフィブリンシーラントを前記患者に投与するステップを含み、ＴＧＦ−βの少なくとも２５％がフィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される。
【００１８】
関連した態様において、本発明は、ＴＧＦ−βタンパク質の、それを必要としている患者における、制御放出のための方法を提供し、前記タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、この方法は、ＴＧＦ−βを含むフィブリンシーラントを前記患者に投与するステップを含み、ＴＧＦ−βの少なくとも２０％がフィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される。
【００１９】
フィブリンシーラントから放出されたＴＧＦ−βが生物学的に活性であることが企図される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βの少なくとも３５％〜９０％が少なくとも３日間保持される。関連した実施形態において、ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜７５％がフィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される。さらなる実施形態において、ＴＧＦ−βの少なくとも６０％がフィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される。
【００２１】
別の実施形態において、ＴＧＦ−βの少なくとも２５％〜７５％がフィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される。関連した実施形態において、前記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜５５％がフィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される。
【００２２】
関連した実施形態において、フィブリンシーラントが、３日間または１０日間のいずれか一方あるいはその両方について上記の範囲の放出動態を有し得ることが企図される。
【００２３】
１つの実施形態において、フィブリンシーラントは、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分とトロンビン成分とを混入物中で組み合わせることによって製造される。別の実施形態において、ＴＧＦ−βは、ＦＣ成分とトロンビン成分との混合の前にＦＣ成分に添加される。さらなる実施形態において、ＴＧＦ−βは、トロンビン成分に添加される。さらなる実施形態において、ＴＧＦ−βは、成分がフィブリンゲルを形成できる前に、ＦＣとトロンビンとの混合物に添加される。
【００２４】
関連した実施形態において、ＴＧＦ−β放出が日々規則的な量だけ減少し得ることが企図される。例えば、フィブリンシーラント中のＴＧＦ−β量は、１日あたり約１％、１日あたり約２％、１日あたり約３％、１日あたり約４％、１日あたり約５％、１日あたり約６％、１日あたり約７％、１日あたり約８％、１日あたり約９％または１日あたり約１０％減少してもよく、あるいは所望の放出量を、フィブリンシーラントを配合するために用いられるフィブリノーゲン複合体濃度またはトロンビン濃度に基づいて調節することができる。
【００２５】
本発明は、シーラント中のフィブリノーゲン複合体成分の最終濃度が、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にあることを企図する。いくつかの実施形態において、シーラント中のトロンビン成分の最終濃度が、約１ＩＵ／ｍｌ〜２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にあることも企図される。１つの実施形態において、最終フィブリノーゲン複合体濃度は、約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌまたは約４０ｍｇ／ｍｌであり、最終トロンビン濃度は約２ＩＵ／ｍｌである。
【００２６】
１つの実施形態において、シーラント中の最終ＴＧＦ−βの濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである。
【００２７】
さらなる実施形態において、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１であることが企図される。１つの実施形態において、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である場合、前記ＴＧＦ−β１の少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、前記ＴＧＦ−β１の少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される。
【００２８】
関連した実施形態において、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２であることが企図される。１つの実施形態において、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２である場合、前記ＴＧＦ−β２の少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される。
【００２９】
別の実施形態において、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３であることが企図される。１つの実施形態において、ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である場合、前記ＴＧＦ−β３の少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３間日保持され、前記ＴＧＦ−β３の少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出の恩恵を受けるであろう障害または疾患を患っている患者を処置するための方法を企図し、前記タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、前記方法は、ＴＧＦ−βタンパク質を含むフィブリンシーラントを前記患者に投与するステップを含み、フィブリンシーラントは、ＴＧＦ−βの制御放出をもたらし、ＴＧＦ−βの少なくとも２５％は、フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、前記ＴＧＦ−βは、前記障害または疾患を処置するのに有効な速度で放出される。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、生物活性トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出の恩恵を受けるであろう障害または疾患を患っている患者を処置するための方法を企図し、前記タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、前記方法は、ＴＧＦ−βタンパク質を含むフィブリンシーラントを前記患者に投与するステップを含み、フィブリンシーラントは、ＴＧＦ−βの制御放出をもたらし、ＴＧＦ−βの少なくとも２０％は、フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持され、前記ＴＧＦ−βは、前記障害または疾患を処置するのに有効な速度で放出される。
【００３２】
本発明はまた、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出の恩恵を受けるであろう障害または疾患を患っている患者を処置するための薬剤の製造における、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択されるＴＧＦ−βタンパク質を含むフィブリンシーラントの使用を提供し、フィブリンシーラントは、上記のようにＴＧＦ−βの制御放出をもたらす。
【００３３】
本発明は、ＴＧＦ−βタンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出の恩恵を受けるであろう患者を処置するための方法、または前記患者を処置する薬剤の製造におけるフィブリンシーラントの使用に上述の放出動態が適用可能であることを企図する。
【００３４】
１つの態様において、患者は、当業者にとって明白であろうｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−βの制御放出から恩恵を受けるであろう疾患を患っている。１つの実施形態において、疾患または障害は、筋骨格疾患または障害、軟部組織疾患または障害および心血管疾患からなる群より選択される。１つの実施形態において、骨格筋障害は、骨疾患または骨障害である。関連した実施形態において、骨格筋障害は、軟骨疾患または軟骨障害である。
【００３５】
１つの実施形態において、フィブリンシーラントは、注射、噴霧、内視鏡投与もしくは予備成形ゲルのような当該技術分野においてよく知られた方法を用いてそれ単独で、または当業者に知られた他の材料および他の方法と組み合わせて患者に投与される。
【００３６】
本発明はまた、生物活性トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質を含むフィブリンシーラントを調製するためのキットを提供し、前記タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、前記フィブリンシーラントは、所望のＴＧＦ−β放出速度を有し、キットは、ａ）フィブリノーゲン複合体成分を含有し、ＴＧＦ−β成分を任意に含む第１のバイアルまたは第１の保存容器と、ｂ）トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器と、を含み、前記キットは、前記第１のバイアルまたは第１の保存容器がＴＧＦ−β成分を含有しない場合にＴＧＦ−β成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を含み、前記キットはさらに、その使用説明書を含む。キットはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのフィブリンシーラントの使用または投与のための器具も含み得る。
【００３７】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例が、本発明の特定の実施形態を示すと同時に、単なる例示として与えられることが理解されるべきである。なぜならば、本発明の趣旨および範囲に入る様々な変更および修正は、この詳細な記載から当業者にとって明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られたフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１の日々の放出に対するＴＧＦ−β１の量の効果を示す（［ＦＣ］＝２５ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）
【図２】ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られたフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１の累積放出に対するＴＧＦ−β１の量の効果を示す（［ＦＣ］＝２５ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）
【図３】ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られたフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１の日々の放出に対するＦＣ濃度の効果を示す（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）
【図４】ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られたフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１累積放出に対するＦＣ濃度の効果を示す（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図５】ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）で作られたフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１の日々の放出に対するＦＣ濃度の効果を示す（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図６】ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）で作られたフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１累積放出に対するＦＣ濃度の効果を示す（［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図７】ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られたフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１の日々の放出に対するトロンビン濃度の効果を示す（［ＦＣ］＝２５ｍｇ／ｍｌ）。
【図８】ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られたフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１累積放出に対するトロンビン濃度の効果を示す（［ＦＣ］＝２５ｍｇ／ｍｌ）。
【図９】フィブリンゲルからのＴＧＦ−β１累積放出に対するＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）ロット番号の効果を示す（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図１０】フィブリンゲルからのＴＧＦ−β１累積放出に対するＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨＳ／Ｄ（商標）ロット番号の効果を示す（［ＦＣ］＝２０ｍｇ／ｍｌ、［トロンビン］＝２ＩＵ／ｍｌ）。
【図１１】図１１（放出されたＴＧＦ−βの生物活性）は、３日目にＴＧＦ−β１を添加したまたは添加していないＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）フィブリンゲルからの培地上清を用いて、または付加的な２ｎｇ（１ｎｇ／ｍｌ）のＴＧＦ−β１により新たに調製した培地（陽性対照）を用いて単層で培養したヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）の増殖を示す。結果を、１日目に正規化した。
【図１２】図１２（放出されたＴＧＦ−βの生物活性）は、ＴＧＦ−β１を添加したＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）フィブリンゲルからの培地上清中で（すなわち、放出されたＴＧＦ−β１を含有する培地中で）培養したＨＭＳＣにおけるアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を、ＴＧＦ−β１を全く添加していないフィブリンゲルからの培地上清中で培養したＨＭＳＣにおけるＡＬＰ活性、および新たに添加されたＴＧＦ−β１を含有する培地中で培養したＨＭＳＣにおけるＡＬＰ活性（陽性対照）と比較して示す。結果（最初にＩＵ／ｍｌで計算される）は、増殖に関して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、骨および軟骨障害のような筋骨格疾患、軟部組織障害、ならびに心血管疾患の処置を含む治療適用におけるｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出のためのＴＧＦ−βを含有するフィブリンゲルを提供する。本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフィブリンシーラントからの放出が所望の生物活性を調整するように、ゲルから放出されたＴＧＦ−βがその生物活性を保持することを企図する。本発明はまた、所望のＴＧＦ−β放出動態を達成するためにフィブリンシーラントを配合する際に有用なＦＣ成分またはトロンビン成分の濃度を決定するための方法を提供する。
【００４０】
特にことわらない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（２ｄ  ｅｄ．１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ  ．，１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，５ＴＨ  ＥＤ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００４１】
本明細書中で引用された各刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらが本開示と整合性がなくならない程度に、参照によりその全体が組み込まれる。
【００４２】
本明細書および特許請求の範囲において用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明確に要求されない限り、複数の言及を含む。
【００４３】
本明細書中で用いられるように、以下の用語は、特段の規定のない限り、それらに帰される意味を有する。
【００４４】
本明細書中で用いられるように、用語「フィブリンシーラント」、「フィブリンゲル」、「フィブリン接着剤」、「フィブリン血餅」または「フィブリンマトリックス」は、区別なく用いられ、時間の経過につれて細胞成長または生物活性物質の放出の足場として働くことができる、少なくともフィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を含む３次元ネットワークを指す。
【００４５】
本明細書中で用いられるように、用語「制御放出」、「遅延放出」は、同じ意味を有し、フィブリンゲル中の薬剤（例えば、成長因子）の保持を指す。制御放出は、結合された成長因子の拡散または解離およびその後のゲルからの拡散による成長因子のゆっくりとした安定な分泌／放出だけでなく、マトリックスの壊変および酵素開裂にも起因する。
【００４６】
本明細書中で用いられるように、「ｉｎ  ｓｉｔｕ形成」は、生理学的温度および体内での注入部位における形成か、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件におけるフィブリンシーラントの形成を指す。この用語は一般に、投与に先だっておよび投与の時点で実質的に架橋されていないフィブリンシーラント中の前駆体分子間の共有結合の形成を記述するために用いられる。
【００４７】
本明細書中で用いられるように、「フィブリノーゲン複合体成分」は、トロンビンと混合されて血餅様フィブリンシーラントという結果になるフィブリン／フィブリノーゲン溶液を指す。フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）は主に、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンにより構成されており、触媒量のＦＸＩＩＩおよびプラスミノゲンも含有し得る。フィブリノーゲン複合体成分はまた、シーラータンパク質と呼ばれることもある。
【００４８】
本明細書中で用いられるように、「トロンビン成分」は、フィブリノーゲン複合体成分と混合されて血餅様フィブリンシーラントという結果になるトロンビン溶液を指す。
【００４９】
本明細書中で用いられるように、「トランスフォーミング増殖因子−ベータ成分」または「ＴＧＦ−β成分」は、液体形状のフィブリンシーラントへの溶液中の成長因子の添加を指す。ＴＧＦ−β成分、ＦＣ複合体成分およびトロンビン成分の各々は、別個に添加してフィブリンシーラントを含むＴＧＦ−βを形成してもよい。任意に、ＴＧＦ−β成分は、トロンビン成分との混合前に、液状のＦＣ複合体成分に添加される。
【００５０】
本明細書中で用いられるように、「組み換えヒトＴＧＦ−β」は、組み換えＤＮＡ技術によって得られた組み換えヒトトランスフォーミング増殖因子−β（ｒｈＴＧＦ−β）を指す。これは、当該技術分野において知られた任意の方法によって製造され得る。
【００５１】
本明細書中で用いられるように、用語「生物活性な」または「生物学的に活性な」は、溶液中またはフィブリンシーラント中のタンパク質、例えば、ＴＧＦ−βタンパク質が、自然に発現される（すなわち、組み換え的に、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてのどちらかで発現される場合）タンパク質と比較して、同じまたは同様な生物学的活性を示す生物学的特性を指す。
【００５２】
本明細書中で用いられるように、「検出可能部分」、「検出可能標識」または「標識」は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的な手段で検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に用いられるような）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテンおよび抗血清またはモノクロナール抗体が利用可能なタンパク質、あるいは標的に対し相補的な配列を有する核酸分子が含まれる。検出可能な部分は、試料中の結合された検出可能部分の量を定量することができる、放射性、色素原性、または蛍光性のシグナルのような測定可能なシグナルをしばしば生成する。
【００５３】
フィブリンシーラント
多くの形態のフィブリンが、フィブリンシーラントとして使用するために利用可能である。フィブリンゲルは、自己血漿、低温沈殿血漿（例えば、商業的に利用可能なフィブリン接着剤キット）、血漿から精製したフィブリノーゲン、および組み換えフィブリノーゲンならびに因子ＸＩＩＩａから合成され得る。これらの材料の各々は、生化学的組成において若干の変動はあるが、基本的に同様なマトリックスを提供する。Ｓｉｅｒｒａ  ＤＨ，Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ａｐｐｌ，７，３０９−３５２（１９９３）。これらの材料間の類似性は、特定の酵素生物活性および一般的な治癒応答の両方に存在する。
【００５４】
本発明において有用なフィブリンゲルは、フィブリンシーラントから形成され、このフィブリンシーラントは、２つの主要成分：フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）およびトロンビンから成る。ＦＣは、主にフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンで構成され、触媒量のＦＸＩＩＩおよびプラスミノゲンも含有できる。ＦＣ成分およびトロンビン成分は一般に、ヒト血漿から得られるが、組み換え／遺伝子工学手法によっても製造され得る。フィブリンシーラントの例は、米国特許第５，７１６，６４５号；同第５，９６２，４０５号：同第６，５７９，５３７号に記載されており、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）、およびＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨＳ／Ｄ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を含む。
【００５５】
フィブリンゲルを形成するため、ＦＣは最初に、パッケージの取扱説明に従って還元、解凍または別の方法で調製され、必要に応じ希釈バッファを用いて希釈され、治療薬剤が液状ＦＣに添加される。ほとんどの商業的に利用可能なフィブリンシーラントは、アプロチニンのようなゲル溶解の阻害剤を含んでおり、これは使用者の自由裁量でＦＣに添加することができる。アプロチニンおよび他のゲル溶解阻害剤の説明は、国際公開第９９／１１３０１号において提供されている。トロンビン成分はまた、ＣａＣｌ２溶液を用いて液体形状に還元され、必要に応じ希釈バッファを用いてさらに希釈される。トロンビン成分を、ＴＧＦ−βをさらに含むＦＣ成分と混合して、フィブリンゲルを形成することが企図される。アプロチニン成分を欠くフィブリンシーラントも設計されている（ＥＶＩＣＥＬ（商標），Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。
【００５６】
組織接着剤として使用できるフィブリノーゲン含有製剤を製造するための付加的な方法としては、さらなる洗浄およびエタノール、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、グリシンまたはベータ−アラニンによる沈降を任意に伴う低温沈降物からの製造、および既知の血漿分画方法の範囲内の血漿からの製造が含まれる（例えば、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ”，１９８０，ｅｄ．：Ｃｕｒｌｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ。３−１５，３３−３６および５７−７４、またはＢｌｏｍｂ  ｃｋ  Ｂ．ａｎｄ  Ｍ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ”，Ａｒｋｉｖ  Ｋｅｍｉ  １０，１９５９，ｐ．４１５ｆ．参照）。フィブリンシーラントはまた、患者自身の血漿を用いて作られ得る。例えば、ＣＲＹＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｒａｎｃｈｏ  Ｃｏｒｄｏｖａ，ＣＡ）またはＶＩＶＯＳＴＡＴ（登録商標）（Ｖｉｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）フィブリンシーラントシステムは、患者の血漿からの自己フィブリンシーラント成分の製造を可能にする。フィブリンシーラントの成分は、凍結乾燥された急速冷凍液体、または液体形状で利用可能である。
【００５７】
フィブリンゲルの成分は、所望の制御放出のタイプをもたらすために、適切な濃度で添加される。ＦＣ成分は、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、最高１５０ｍｇ／ｍｌ（ゲル中の最高濃度）を含むがこれらに限定されない濃度で、または必要に応じて中間濃度で添加され得る。さらに、ＦＣ成分の濃度は、１ＩＵ／ｍｌ、２ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ、７ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、１５ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ、３０ＩＵ／ｍｌ、３５ＩＵ／ｍｌ、４０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、６０ＩＵ／ｍｌ、７０ＩＵ／ｍｌ、８０ＩＵ／ｍｌ、９０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１２０ＩＵ／ｍｌ、１４０ＩＵ／ｍｌ、１５０ＩＵ／ｍｌ、１７５ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌ、２２５ＩＵ／ｍｌおよび２５０ＩＵ／ｍｌを含むがこれらに限定されないトロンビンの任意の適切な濃度と組み合わせてもよい。
【００５８】
治療薬剤のための制御放出系を作るために、ＴＧＦ−βのような第２の薬剤をフィブリンシーラント組成物に添加することが企図される。ＴＧＦ−βｔは、１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−βの範囲内で、適正な遅延放出処方をもたらす任意の濃度で添加することができる。フィブリンシーラント中のＴＧＦ−βの典型的な濃度としては、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
フィブリンシーラント中で用いられるＦＣまたはトロンビンの濃度は、フィブリンゲル中に添加されたＴＧＦ−βが、数日間〜数週間の間に、治療上有効な量放出されるようなものであることが企図される。１つの態様において、ＴＧＦ−βは、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間  １８日間、１９日間、２０日間、またはそれ以上の期間の間に、フィブリンゲルから放出される。
【００６０】
ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−βが長期間にわたりｉｎ  ｓｉｔｕで利用可能なように、制御されたまたは遅延された放出様式でフィブリンシーラントから放出される。ＴＧＦ−β放出が日々規則的な量だけ減少され得ることが企図され、例えば、ＴＧＦ−βレベルは、１日につき約１％、１日につき約２％、１日につき約３％、１日につき約４％、１日につき１日につき約５％、１日につき約６％、１日につき約７％、１日につき約８％、１日につき約９％または１日につき約１０％あるいはそれ以上減少され得る。関連した実施形態において、少なくとも２５％のＴＧＦ−βが少なくとも３日間フィブリンゲル中に保持されることが企図される。さらなる実施形態において、少なくとも３５％〜９０％、少なくとも４５％〜７５％、または少なくとも６０％のＴＧＦ−βが、少なくとも３日間フィブリンゲル中に保持される。少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％のＴＧＦ−βが、フィブリンゲル中に少なくとも３日間保持されることがさらに企図される。
【００６１】
別の実施形態において、少なくとも２０％のＴＧＦ−βが、少なくとも１０日間フィブリンゲル中に保持される。さらなる実施形態において、少なくとも２５％〜７５％または４５％〜５５％のＴＧＦ−βが、少なくとも１０日間保持される。少なくとも２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％または７５％のＴＧＦ−βが、フィブリンゲル中に少なくとも１０日間保持されることがさらに企図される。
【００６２】
本発明は、フィブリンシーラントの成分の濃度を調整することにより所望の放出動態を有するフィブリンシーラントを配合する方法を提供する。１つの態様において、この方法は、ＴＧＦ−βの既知の初期量およびフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＴＧＦ−βの量を決定するステップと、第２のフィブリンシーラントを製造するためにステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラントにおいて用いられたフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を調整するステップと、を企図し、第１のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度と比較して第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の濃度を増減することにより、ステップの第１のシーラントからのＴＧＦ−βの放出と比較して、第２のシーラントからのＴＧＦ−β放出の速度が調節され、第２のシーラントが、ステップにおける第１のシーラントと同じＴＧＦ−βの初期量を有する。
【００６３】
１つの実施形態において、第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある。第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が上記で述べられた通りである請求項１または２の方法。関連した実施形態において、第１のフィブリンシーラントのＦＣ濃度は、第２のシーラント中の最終ＦＣ濃度と、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１４９ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、または約１０ｍｇ／ｍｌ〜約ｌ６０ｍｇ／ｍｌ異なる。さらなる実施形態において、第１のフィブリンシーラントのＦＣ濃度ＦＣ濃度は、第２のフィブリンシーラント中の最終ＦＣ濃度と、約２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ  ４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、または最高約１４９ｍｇ／ｍｌまで、これらの濃度の間の任意の量だけ異なる。
【００６４】
本発明において有用なフィブリンシーラントは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの使用を目的とする付加的な材料または薬剤と組み合わされ得ることが企図される。そのような薬剤としては、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血液凝結因子、酵素、ケモカイン、可溶性細胞表面受容体、細胞接着分子、抗体、ホルモン、細胞骨格タンパク質、マトリックスタンパク質、シャペロンタンパク質、構造タンパク質、代謝タンパク質、および当該技術分野で知られている他のものを含む付加的な治療薬剤を含まれるが、それらに限定されない。例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，６２版，２００８，Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪを参照されたい。
【００６５】
フィブリンシーラントにおいて有用な付加的な材料としては、ポリマー、サンゴ、セラミックス、ガラス、金属、骨由来材料、ヒドロキシアパタイト、合成スカフォールド材料、これらの材料の組み合わせ、および当該技術分野で知られている他の材料を含むがそれらに限定されない耐力材料で有り得る、骨または軟骨疾患のためのシーラントと組み合わせることができるであろう材料が含まれる。例えば、Ｇｕｅｈｅｎｎｅｃら（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，８：１−１１，２００４）、米国特許第７，１２２，０５７号および米国特許第６，６９６，０７３号を参照されたい。
【００６６】
１つの実施形態において、フィブリンゲルは、生物学的に活性なＴＧＦ−βを逆結合後に、ＦＣおよびトロンビンの濃度を調節することにより制御された方法で送達するためのキャリア系として使用できる。
【００６７】
本発明の１つの実施形態において、フィブリンゲルが２５ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビンを用いてＴＩＳＳＥＥＬ  Ｖａｐｏｒ  Ｈｅａｔｅｄ（ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標））から作られる場合、添加されたＴＧＦ−β１の少なくとも８０％が３日後にゲル中に保持され、添加されたＴＧＦ−β１の少なくとも４８％が１０日後にゲル中に保持される。ＴＧＦ−β放出量は、ゲル中に添加された成長因子の量に比例する。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、フィブリンゲルが５ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌ（ゲル中の最終濃度）のトロンビンを用いてＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）から作られる場合、添加されたＴＧＦ−β１の少なくとも６０％が３日後にゲル中に保持され、添加されたＴＧＦ−β１の少なくとも２５％が１０日後にゲル中に保持される。本発明の別の実施形態において、フィブリンゲルが５ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌ（ゲル中の最終濃度）のトロンビンを用いてＴＩＳＳＥＥＬ  Ｖａｐｏｒ  Ｈｅａｔｅｄ  Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ（ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標））から作られる場合、添加されたＴＧＦ−β１の少なくとも３５％が３日後にゲル中に保持され、７％未満が１０日後にゲル中に保持される（すなわち、ほとんど完全に放出される）。従って、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）かＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）から作られたフィブリンゲルを用いた場合、保持率はＦＣ濃度が高くなるにつれて増大する。
【００６９】
本発明の別の実施形態において、２、１０および５０ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中で２５ｍｇ／ｍｌのＦＣ最終濃度で）によりＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られたフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１放出は同様であり、トロンビン濃度は、ＴＧＦ−β１放出に対してＦＣ濃度の効果よりも小さい効果を有することを示唆している。ＴＧＦ−β１放出は、最も高いトロンビン濃度（２５０ＩＵ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）を用いた場合に有意に高いのみであり、より外来性の構造を有するゲル構造の効果を示唆している。
【００７０】
本発明の別の実施形態において、フィブリンゲルが、２０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を用いて異なるロット番号のＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られる場合、１０日後に１つのロットのゲル中では少なくとも６７％のＴＧＦ−β１が保持され、別のロットでは３９％保持され、第３のロットでは全く保持されなかった。これらのロット間の１つの違いは、因子ＸＩＩＩ含有量である（それぞれ、４２．２Ｕ／ｍｌ、３３．９Ｕ／ｍｌおよび＜１Ｕ／ｍｌ）。本発明の別の実施形態において、フィブリンゲルが、２０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を用いて異なるロット番号のＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）で作られる場合、１０日後に１つのロットのゲル中では少なくとも２０％のＴＧＦ−β１が保持され、他の２つのロットでは全く保持されなかった。これらのロットの因子ＸＩＩＩ含有量は、すべて３Ｕ／ｍｌより低かった。
【００７１】
本発明の別の実施形態において、５ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を用いてＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られたフィブリンゲルにＴＧＦ−β２が添加される場合、３日後、添加されたＴＧＦ−β２の少なくとも約２５％がゲル中で保持される。保持率は、ＦＣ濃度と共に増大する。５ｍｇ／ｍｌのトロンビンおよび２ＩＵ／ｍｌのＦＣ（ゲル中の最終濃度）を用いてＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られたフィブリンゲルにＴＧＦ−β３が添加される場合、３日後、添加されたＴＧＦ−β３の少なくとも５５％がゲル中に保持され、１０日後、２５％保持される。
【００７２】
上記で述べられた実施形態が、商業的に利用可能なフィブリンシーラントからのＴＧＦ−β放出の典型的な実施形態であり、本発明をどのようにも限定することを意図するものではないことが当業者に理解されるであろう。
【００７３】
ＴＧＦ−βタンパク質
ＴＧＦ−ベータは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５として知られている少なくとも５つのアイソフォームで存在する。それらのアミノ酸配列は、ほぼ７０〜８０％の相同性を示す。ＴＧＦ−ベータ−ｌは、優勢なフォームであり、他のアイソフォームがより限定された範囲の細胞および組織において発現されるのに対し、ほとんどいたるところで見出される。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３は、骨形態形成において明確な機能を有すると思われる（Ｆａｇｅｎｈｏｌｚら、Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｓｕｒｇ．１２：１８３−１９０，２００１）。ＴＧＦ−β１の３次元構造は、Ｈｉｎｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：８５１７−８５３４，１９９６に記載される。ＴＧＦ−β２の３次元構造は、Ｄａｏｐｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：３６９−３７３，１９９２に記載される。ＴＧＦ−β３の３次元構造は、Ｍｉｔｔｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ５：１２６１−１２７１，１９９６に記載される。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、フィブリンゲルからの放出ＴＧＦ−β１の生物学的活性を試験した。ＴＧＦ−β１を添加したゲルの培地上清中（すなわち、放出されたＴＧＦ−β１を含有する培地中）での単層培養後のヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）のより方形ないし多角形の形状への形態学的変化は、ＴＧＦ−β１を添加していないゲルの培地上清中で培養された細胞と比較して、より低い増殖を呈する傾向を同時に有する細胞分化を示す。ＴＧＦ−β１を添加したゲルの培地上清中（すなわち、放出されたＴＧＦ−β１を含有する培地中）で培養した細胞のアルシアンブルー陽性染色は、ＨＭＳＣが軟骨形成を受け始めることを示す。初期および後期骨形成分化のマーカー、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性およびアリザリンレッド染色は、それぞれ陰性のままである。細胞形態学、増殖および骨形成分化におけるこれらの変化は、ＴＧＦ−β１が、ゲルからの放出後も依然として生物学的に活性であることを実証している。
【００７５】
本発明にとり有用なＴＧＦ−β分子としては、全長タンパク質、タンパク質の前駆体、タンパク質のサブユニットまたはフラグメント、およびそれらの機能的誘導体が含まれる。ＴＧＦ−βへの参照は、天然由来タンパク質調剤を含むそのようなタンパク質のすべてのあり得る形態を含むものとする。
【００７６】
本発明によれば、用語「組み換えＴＧＦ−β」は、特定の限定の根拠をなすものではなく、異種または天然ＴＧＦ−β、組み換えＤＮＡ技術を介して得られたＴＧＦ−β、あるいはその生物学的に活性な誘導体を問わない任意のＴＧＦ−βを含む。特定の実施形態において、この用語は、タンパク質および核酸、例えば、遺伝子、前−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびポリペプチド、多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、ならびに種間相同体を包含し、これらは、（１）参照された核酸または本明細書中で記載されるアミノ酸配列によりコードされたＴＧＦ−β１、−β２または−β３ポリペプチドと、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、またはそれ以上のアミノ酸の範囲にわたって、約６０％より大きいアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有し；（２）抗体、例えば、本明細書中で記載されるような参照されたアミノ酸配列、それらの免疫原性フラグメント、および保存的に修正されたそれらの変異体を含む免疫原に対して生成されたポリクロナール抗体に特異的に結合し；（３）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件のもとで、本明細書中で記載されるような参照されたアミノ酸配列、および保存的に修正されたそれらの変異体をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、（４）本明細書中で記載されるような参照核酸と、少なくとも約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００、またはそれ以上のヌクレオチド（成熟タンパク質の１２１８のヌクレオチドの全長配列まで）の範囲にわたって、約９５％以上、約９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の核酸配列同一性を有する。
【００７７】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は一般に、霊長類、例えば、ヒト；齧歯類、例えば、ラット、マウス、ハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または何か他の哺乳動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物に由来する。本発明の核酸およびタンパク質は、組み換え分子であってもよい（例えば、異種かつ野生型配列またはその変異体をコードする、あるいは非天然）。ヒトＴＧＦ−βの構造については、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により維持されるＧｅｎｂａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅを参照されたい：Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦβ−１，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００６５１，Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦβ−２，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２９，ＴＧＦβ−３Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００３２３０。
【００７８】
ＴＧＦ−βの産生は、（ｉ）遺伝子工学による、例えば、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅による、組み換えＤＮＡの生産、（ｉｉ）例えば、エレクトロポレーションまたは顕微注射を用いた形質移入により原核細胞または真核細胞へ組み換えＤＮＡを導入し、（ｉｉｉ）前記形質転換された細胞を、例えば、連続式またはバッチ式で培養し、（ｉｖ）ＴＧＦ−βを、例えば、連続的にまたは導入時に発現させ、（ｖ）陰イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーを介して精製ＴＧＦ−βを得るために、前記ＴＧＦ−βを、例えば、培地からまたは形質転換された細胞を収集することにより単離するための、当該技術分野において知られている任意の方法を含むことができる。
【００７９】
ＴＧＦ−βは、薬理学的に許容されるＴＧＦ−β分子を産生することを特徴とする適切な原核または真核ホスト系における発現により産生され得る。一般に用いられるホスト細胞はとしては、グラム陰性またはグラム陽性細菌のような原核細胞、すなわちＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ等の任意の菌株が含まれる。真核細胞の例は、Ｄ．Ｍｅｌ−２、Ｓｆ４、Ｓｆ５、Ｓｆ９、およびＳｆ２１ならびにＨｉｇｈ５のような昆虫細胞；植物細胞ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａのような酵母細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞のような哺乳動物細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；ヒト腎臓２９３細胞；ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ２９３、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２、ならびに当該技術分野において知られているその他のものである。本発明に従ってＴＧＦ−βを産生または分離するために用いられる試薬または条件に対する制約は皆無であり、当該技術分野において知られているまたは商業的に利用可能な任意のシステムを使用できる。本発明の好ましい実施形態において、ＴＧＦ−βは、従来技術の説明に記載されるような方法により得られる。
【００８０】
多種多様なベクターをＴＧＦ−βの調製に用いることができ、当該技術分野においてよく知られた真核細胞および原核細胞発現ベクターから選ぶことができる。原核細胞発現のためのベクターの例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤ等のプラスミドが含まれるがそれらに限定されず、ここで、原核細胞発現ベクターにおいて用いられるプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ等が含まれる。真核細胞発現のためのベクターの例として、以下のものが含まれるが、それらに限定されない：（ｉ）酵母中での発現については、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴのようなベクターであり、ＡＯＸｌ、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧｌ等のプロモーターを用い、（ｉｉ）昆虫細胞中での発現については、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣ等のベクターであり、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈ等のプロモーターを用い、（ｉｉｉ）哺乳動物細胞中での発現については、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶ等のベクター、ならびにワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス等のウイルス系由来のベクターであり、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−Ｉ、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチンのようなプロモーターを用いる。
【００８１】
ポリペプチドコード化ＤＮＡまたはＲＮＡを含むホスト細胞が、細胞の成長およびＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適した条件のもとで培養される。ポリペプチドを発現するそれらの細胞は、既知の方法を用いて同定することができ、組み換えタンパク質は、ポリペプチド産生の増幅ありまたはなしの既知の方法を用いて、分離および精製される。同定は、例えば、ＰＣＲスクリーニング、サザンブロットスクリーニング分析、またはタンパク質発現についてのスクリーニングのような、タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示す表現型を表示する遺伝子改変された哺乳動物細胞のスクリーニングによって実行される。タンパク質コード化ＤＮＡが組み込まれた細胞の選択は、選択可能なマーカーをＤＮＡコンストラクトに組み込み、選択可能なマーカー遺伝子を含有する形質移入されたまたは感染させられた細胞を、選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞のみの生存に適した条件の下で培養することにより達成され得る。導入されたＤＮＡコンストラクトのさらなる増幅は、遺伝的改変細胞を増幅に適した条件の下で培養する（例えば、増幅可能なマーカー遺伝子を含有する遺伝子改変された細胞を、増幅可能なマーカー遺伝子の多重コピーを含む細胞のみが生存できる濃度の薬物の存在下で培養する）ことによって影響され得る。
【００８２】
試料中のタンパク質濃度を決定する方法
治療的タンパク質は、内生的に産生された天然タンパク質との類似性により、血清試料中で検出することが困難なことがよくある。しかしながら、治療的タンパク質が、より大きい可溶性または安定性、酵素消化抵抗性、改善された生物学的半減期、および当業者に知られた他の特徴のような所望の特性を有するかどうかを評価するために投与された、治療的ポリペプチド、フラメント、それらの変異体または類似体の量を決定することは有用なことがよくある。この方法は、知的所有権によって保護され得る治療的タンパク質の認可された使用の検出も考慮する。
【００８３】
本発明は、ＴＧＦ−βを含有するフィブリンゲルからのＴＧＦ−βの放出を検出し、タンパク質の放出動態を決定する方法を規定する。フィブリノーゲン複合体成分の濃度を変えて作られたフィブリンシーラントからのこれらの放出動態の比較は、治療目的のための所望の放出レートを決定するのに役立つ。ある期間にわたってフィブリンシーラントから放出されたタンパク質の量を特定する能力は、半減期、吸収、安定性等に基づいて最適な治療の決定に役立つ。検出アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）、または当該技術分野において知られている他の結合アッセイであり得る。
【００８４】
一般に、試料中のＴＧＦ−βの存在を検出するために、ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−βと結合する抗体、可溶性受容体または他のタンパク質もしくは薬剤のような、ＴＧＦ−β結合薬剤に結合される。
【００８５】
検出ステップについては、ＴＧＦ−βタンパク質は、検出可能部分または検出可能標識に結合され得る。検出可能部分または標識は、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段により検出可能な組成物を指す。検出可能部分は、試料中の結合された検出可能部分の定量に用いることができる放射性、色素原性、蛍光性シグナルのような測定可能なシグナルをしばしば生成する。検出可能部分は、共有結合的にか、あるいはイオン結合、ファンデルワールス結合、または水素結合、例えば、放射性ヌクレオチド、もしくはストレプトアビヒンにより認識されるビオチニル化ヌクレオチドの組み込みを介して、タンパク質に組み込まれるかタンパク質に結合され得る。検出可能部分は直接的または間接的に検出可能である。間接検出は、検出可能部分への第２の直接的または間接的検出可能部分を結合させることを伴うことがある。例えば、検出可能部分は、ストレプトアビヒンにとっての結合パートナーであるビオチンのような結合パートナーのリガンドであり得る。結合パートナーはそれ自体、直接的に検出可能であり、例えば、抗体は蛍光性分子によってラベリングされ得る。シグナルの定量方法の選択は、例えば、シンチレーション計数、デンシトメトリー、またはフローサイトメトリーにより達成される。
【００８６】
本発明のアッセイ方法における使用に適した標識の例としては、放射性標識、発蛍光団、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に用いられるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに、例えば、放射標識をハプテンまたはペプチドに組み込むことにより検出可能にされ得る、またはハプテンもしくはペプチドと特的に反応する抗体を検出するために用いられ得るタンパク質が含まれる。また、抗血清またはモノクロナール抗体が利用可能なタンパク質、ならびに標的に対し相補的な配列を持つ核酸分子、分子質量ビーズ、磁性薬剤、蛍光染料を含有するナノ−もしくはマイクロ−ビーズ、量子ドット、量子ビーズ、蛍光タンパク質、蛍光標識を持つデンドリマー、マイクロ−トランスポンダー、電子ドナー分子もしくは分子構造、または光反射粒子も企図される。
【００８７】
本発明と共に使用するために企図される付加的な標識としては、蛍光染料（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン等）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般に用いられる他の酵素）、ならびに、コロイド金、着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）、および発光または化学発光標識（例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、ＭＳＤスルホ−タグ）が含まれるがそれらに限定されない。
【００８８】
標識は、当該技術分野においてよく知られている方法に従って、アッセイの所望の成分に直接的または間接的に結合できる。特定の実施形態において、標識は、本発明による活性薬剤の接合のためのイソシアネートまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル試薬を用いて成分に共有結合的に結合される。本発明の１つの態様において、標識を生体高分子に接合して、活性薬剤が結合されていない標識生体高分子接合体を形成するために二官能イソシアネート試薬が用いられる。標識生体高分子接合体は、本発明による標識された接合体の合成のための中間体として用いたり、または生体高分子接合体を検出するために用いたりできる。上記で示されたように、必要とされる感度、アッセイの所望の成分との接合の容易さ、安定性要件、利用可能な計測器、および廃棄規定に応じた標識の選択により、多種多様な標識が使用され得る。非放射性標識は、間接的手段によりしばしば結合される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、共有結合により分子に結合される。リガンドは次に、別の分子（例えば、ストレプトアビヒン）に結合され、この別の分子は、本来的に検出可能であるか、あるいは検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物のようなシグナル系に共有結合により結合される。
【００８９】
本発明の方法において有用な化合物はまた、例えば、酵素または発蛍光団との接合によって、シグナル生成化合物に直接接合され得る。標識としての使用に適した酵素としては、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはｏｘｉｄｏｔａｓｅ、特にペルオキシダーゼが含まれいるが、それらに限定されない。標識としての使用に適した蛍光化合物としては、上記列挙されたもの、ならびに、フルオロセイン誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロライドｅｒｙｔｈｒｏｓｃｅｉｎ、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、ユーロピウム、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド等が含まれるがそれらに限定されない。標識としての使用に適しいた化学発光化合物としては、ＭＳＤスルファ−ＴＡＧ、ユーロピウム（Ｅｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが含まれるがそれらに限定されない。本発明の方法において用い得る様々な標識化またはシグナル生成系の概要については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照されたい。
【００９０】
標識を検出するための方法は、当業者によく知られており、検出される標識のタイプにより要求される。従って、例えば、標識が放射性である場合、検出のための手段としては、シンチレーションカウンター（例えば、放射免疫アッセイ、シンチレーション近接アッセイ）（Ｐｉｔａｓら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ．３４：９０６−１２，２００６）またはオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、標識は、適切な波長の光で蛍光色素を励起させ、結果として生じる蛍光を検出することによりて検出できる（例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または当該技術分野において知られている他の方法）。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管等の電子検出器の使用により視覚的に検出できる。同様に、酵素標識は、適切な基質を酵素に提供し、結果として生じる反応産生物を検出することによって検出できる。比色または化学発光標識は、単に標識と関連した色を観察することによって検出できる。本発明の方法における使用に適した他の標識化および検出システムは、当業者に即座に明白になるであろう。そのような標識化されたモジュレーターおよびリガンドは、疾患または健康状態の診断において用いられ得る。
【００９１】
この方法は、少なくとも１つ以上の洗浄ステップを任意に含み、その場合、結合されたＴＧＦ−β組成物は、結合されていないポリペプチドにより引き起こされるバックグラウンド測定を低減するために、タンパク質結合を測定する前に洗浄される。ポリペプチド組成物のインキュベーション後およびＴＧＦ−βの検出前のＴＧＦ−βの洗浄は、適切なバッファに界面活性剤を加えたものの中で実行される。適切な界面活性剤としては、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルグルコシド、アルキルマルトシド、アルキル硫酸塩（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）、ＮＰ−４０、アルキルチオグルコシド、ベタイン、胆汁酸、ＣＨＡＰシリーズ、ジギトニン、グルカミド、レシチン／リゾレシチン、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０のようなポリソルベート、ＢＲＩＪ（登録商標）、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）ならびにＴＨＥＳＩＴ（登録商標）を含む非イオン系ポリオキシエチレンベースの界面活性剤、第四アンモニウム化合物等が含まれるがそれらに限定されない。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｂ，Ｓｕｐｐｌ．１１，１９９８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪも参照されたい。適切な界面活性剤は、定常的な実験法を用いて決定できる（Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｊ．，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．、１９８８参照）。
【００９２】
フィブリンシーラントを投与する方法
本発明において有用なフィブリンシーラントを、当該技術分野においてよく知られた手法を用いて、例えば、所望の部位での注射または噴霧により、スポンジ様の担体、予備形成したシーラントまたは当該技術分野において知られた他の方法を用いて内視鏡的に、対象に投与される。１つの実施形態において、シーラントを注射または噴霧して、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲルを形成させる。
【００９３】
これらのフィブリンシーラントは、以下で述べられる症状を含むがそれらに限定されない、当業者には明らかなように、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−βの徐放／制御放出から恩恵を受けるであろう対象への投与のために企図される。１つの実施形態において、患者は、筋肉、関連した靭帯、他の結合組織、ならびに他の骨および軟骨の疾患を含むがそれらに限定されない筋骨格疾患；筋肉、繊維状組織、脂肪、血管、および滑膜組織に影響する障害を含むがそれらに限定されない軟部組織の疾患または障害；あるいは心血管疾患を患っている。
【００９４】
１つの実施形態において、フィブリンシーラントは、骨移植片の代替品の役割を果たし、従って、脊椎固定ケージ、偽関節欠陥の治癒、骨造成、骨折修復加速、骨組織再構築、および歯再生を含むがそれらに限定されない同じ適応症の多くにおいて適用され得る。加えて、別の実施形態において、シーラントは、インプラント組み込みにおいて用いられ得る。インプラント組み込みにおいて、インプラントをフィブリンシーラントでコーティングし、インプラントの表面内への近隣骨領域の成長を誘発し、弛緩および他の関連した問題を防止することができる。別の実施形態において、成長因子−強化マトリックスを、皮膚の慢性創傷を治癒するために用いることができる。
【００９５】
付加的な骨または軟骨の障害または症状としては、変形性関節症、骨粗鬆症、骨形成異常症、くる病、骨軟化症、マクキューン−オルブライト症候群、アルバース−シェーンベルグ疾、ページェット疾、リウマチ様関節炎、骨関節炎、軟骨損傷、前立腺周囲骨溶解、骨形成不全症、転移性骨疾患、骨軟骨腫、骨形成、骨髄炎、オステオパシー、骨化石症、骨硬化症、多発性軟骨炎、関節軟骨創傷、軟骨石灰化症、軟骨形成不全症、膝蓋軟骨軟化症、軟骨肉腫、肋軟骨炎、内軟骨腫、強直母趾、半月板創傷、股関節唇裂傷、離断性骨軟骨炎（ｏｃｄ）、再発性多発性軟骨炎あるいは骨または軟骨形成の刺激の恩恵を受ける任意の症状が含まれるがそれらに限定されない。
【００９６】
付加的な結合組織障害としては、エーラー−ダンロス症候群、マルファン症候群、強皮症、弛緩性皮膚、デュピュイトラン病、限局型全身性強皮症、混合性結組織疾患、スティックラー症候群および他の結合組織疾患が含まれるがそれらに限定されない。
【００９７】
ＴＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラントはまた、腱炎、滑液嚢炎、筋筋膜症候群、軟部組織に影響を与えるリウマチ病、ティーツェ症候群、肋軟骨炎、肋膜炎、付着部炎、構造障害、肉腫および軟部組織に影響を与える他の症状が含まれるがそれらに限定されない軟部組織疾患または症状の処置に有用である。
【００９８】
ＴＧＦタンパク質を含むフィブリンシーラントはまた、虚血／再灌流、心筋硬塞、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、再狭窄、動脈炎、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、発作、血管または心臓石灰化、血栓症、末梢血管疾患、血管壁リモデリング、心室リモデリング、急速心室ペーシング、冠動脈微小塞栓、頻脈、徐脈、圧過負荷、大動脈屈曲、冠動脈結紮、血管性心疾患、石灰化、リウマチ性心疾患、心内膜炎、または人工弁の複雑化により引き起こされた弁劣化を含むがそれらに限定されない弁疾患；心房性細動、ＱＴ延長症候群、洞結節機能不全、アンギナ、心不全、高血圧症、心房性細動、心房性粗動、心膜滲出および心膜炎を含むがそれらに限定されない心膜疾患；心筋症心肥大または心血管発達的障害が含まれるがそれらに限定されない心血管疾患または症状の処置に有用である。
【００９９】
キット
キットも、本発明の範囲内で企図される。典型的なキットは、ＦＣおよびトロンビン成分を含むフィブリンシーラントを含み得る。１つの実施形態において、キットは、フィブリンシーラントに組み込むためのＴＧＦ−βタンパク質をさらに含む。１つの態様において、各成分は、それ自体の別個の貯蔵容器、バイアルまたは容器に入れることができる。関連した態様において、ＴＧＦ−βは、ＦＣ成分と混合されてもよく、トロンビン成分は、別個の貯蔵容器中に入れてもよい。関連した実施形態において、貯蔵容器は、バイアル、ボトル、バッグ、リザーバ、チューブ、ブリスター、パウチ、パッチ等である。処方の成分のうちの１つ以上が、凍結乾燥、冷凍乾燥、スプレー冷凍乾燥、または任意の他の還元可能な形態であってもよい。もし要望されれば、様々な還元媒体がさらに提供され得る。
【０１００】
キットの成分は、凍結形態、液状形態または凍結乾燥形態のいずれかであり得る。キットが、フィブリンゲルを対象に投与するのに適した装置を含むことがさらに企図される。さらなる実施形態において、キットは、フィブリンシーラントを調製および投与するための指示も含む。
【０１０１】
本発明の付加的な態様および詳細は、限定するのではなく例示的であることを意図する以下の実施例から明らかになるであろう。
【実施例】
【０１０２】
（実施例１）
材料および方法
フィブリンゲル（ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）またはＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標））（Ｓ／Ｄは、いっそうの安全性をもたらすために付加されたウイルス不活化ステップである）の８つの異なる処方を、それぞれ５〜４０ｍｇ／ｍｌおよび２〜２５０ＩＵ／ｍｌの濃度（ゲル中の最終濃度）のＦＣおよびトロンビンを用いて調製した。フィブリンゲル（全０．３ｍｌ）を、２４−ウェル培養プレート中で調製した。ＦＣ成分は、フィブリン溶解阻害剤であるアプロチニンを３０００ＫＩＵ／ｍｌ含有していた。
【０１０３】
５〜４０ｎｇ／０．３ｍｌゲルの組み換えヒト（ｒｈ）ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、または１５ｎｇ／０．３ｍｌゲルのｒｈＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、もしくは１５ｎｇ／０．３ｍｌゲルのｒｈＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ゲル調製時にＦＣ成分に添加した。すべてのゲルを、３７℃にて５％ＣＯ２中で最高１０日間、標準ＨＭＳＣ成長培地（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ、以前はＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中でインキュベートした。培地は毎日交換した。培地試料を、ＴＧＦ−βの量について酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により試験するまで凍結した。最初に添加されたＴＧＦ−β１の完全な回復を検証するために、いくつかのゲルを、１０日間のインキュベーション後にウロキナーゼを用いて溶解し、上清もＥＬＩＳＡにより試験した。
【０１０４】
種々の放出動態を実施した：
１．  放出動態に対するＴＧＦ−β１量の効果を、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られた単一フィブリンゲル処方物（２５ｍｇ／ｍｌのＦＣ濃度および２ＩＵ／ｍｌのトロンビン濃度、ゲル中の最終濃度）を用いて分析した。
【０１０５】
２．  固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）を用いた場合のＴＧＦ−β１放出動態に対するＦＣ濃度の効果を、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）の４つの異なるＦＣ濃度を用いて分析した。
【０１０６】
３．  固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）を用いた場合のＴＧＦ−β１放出動態に対するＦＣ濃度の効果を、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）の４つの異なるＦＣ濃度を用いて分析した。
【０１０７】
４．  固定ＦＣ濃度（２５ｍｇ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）を用いた場合のＴＧＦ−β１放出動態に対するトロンビン濃度の効果を、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）の４つの異なるトロンビン濃度を用いて分析した。
【０１０８】
５．  ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）またはＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）のロット番号を変えた場合のＴＧＦ−β１の放出動態に対する効果を、単一のフィブリンゲル処方（２０ｍｇ／ｍｌのＦＣ濃度および２ＩＵ／ｍｌのトロンビン濃度、ゲル中の最終濃度）を用いて分析した。
【０１０９】
６．  固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）でのＴＧＦ−β２放出動態に対するＦＣ濃度の効果を、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）の４つの異なるＦＣ濃度を用いて分析した。
【０１１０】
７．  固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）でのＴＧＦ−β３放出動態に対するＦＣ濃度の効果を、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）の４つの異なるＦＣ濃度を用いて分析した。
【０１１１】
ゲル表面に接種したＨＭＳＣに対する、フィブリンゲル中に添加したＴＧＦ−β１（１５ｎｇ／０．３ｍｌゲル）の効果を、蛍光顕微鏡検査により分析した。ＦＣ中にＴＧＦ−β１が添加されていないゲルを対照として用いた。約１０，０００ＨＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．）を、２４ウェルプレート中で、５〜４０ｍｇ／ｍｌのＦＣ濃度および２〜２５０ＩＵ／ｍｌのトロンビン濃度（ゲル中の最終濃度）で調製したゲル上に接種した。ゲル中にＴＧＦ−β１が添加された場合またはされない場合の細胞の形態学および遊走を観察するために、細胞を伴うゲルを、１日目、４日目、７日目および１０日目にカルセイン／臭化エチジウム色素で染色した。
【０１１２】
放出されたＴＧＦ−β１の生物活性を試験するために、３日目のゲル（当初、添加されたＴＧＦ−β１を全く含有していない（対照）または添加された１５ｎｇのＴＧＦ−β１／０．３ｍｌゲルを含有しており、２０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）で調製された）からの培地上清を、ＨＭＳＣ単層のための培地として用いた。新たに添加されたＴＧＦ−β１を含有する培地中の細胞が陽性対照の役割を果たした。最高７日目までの細胞形態学の変化を、カルセインで染色した後、光学および蛍光顕微鏡検査により分析した。細胞増殖も、カルセインで染色した後、細胞単層の全体的蛍光強度（光学密度により測定される）を測定して分析した。結果を、１日目に正規化した。細胞分化は、グリコアミノグリカンの存在（軟骨形成について）を示すために用いられるアルシアンブルー染色、およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性ならびにアリザリンレッド染色（骨形成について）により分析した。ＡＬＰ活性結果（最初、ＩＵ／ｍｌで計算される）を、増殖に関して正規化した。ＴＧＦ−β１ゲルを添加したゲルからの培地上清で観察されたどのような変化も、放出されたＴＧＦ−β１により実際に誘発されたものであって、ゲルそれ自体から放出されたかもしれない何か他の生物活性成分によって誘発されたものではないことを確実なものにするために、ゲルのいくつかは、対照試料としてＴＧＦ−β１を全く添加することなく調製してあった。
【０１１３】
最後に、フィブリンゲル内に接種したＨＭＳＣおよびゲル表面に接種したヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ，Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．）の挙動に対するＴＧＦ−β１の効果を分析するために、１０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を含有するゲルを、単一培養細胞（ＨＭＳＣまたはＨＵＶＥＣ）またはＨＭＳＣ：ＨＵＶＥＣ比が４：１の共培養細胞で調製した。組み換えヒトＴＧＦ−β１（５ｎｇ／０．３ｍｌゲル、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｔｅｍｓ）を、ゲル調製時に共培養ゲルの半分の中のＦＣに添加した。ゲルを、３７℃にて５％ＣＯ２中で最高２１日間、血清サプリメントを加えた標準内皮細胞培地（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．）を用いてインキュベートした。細胞形態学および増殖、ならびに骨形成分化の分析を、１日目、７日目、１４日目および２１日目に実行した。相互接続された細胞−細胞ネットワーク（血管形成分化の初期事象）へのＨＵＶＥＣの再編成を含む細胞形態学を、カルセイン色素で染色した後、蛍光顕微鏡検査により観察した。細胞増殖は、フィブリンゲルを精製濃縮ウシトリプシン溶液に溶解させた後、細胞懸濁液の蛍光強度により測定した。最後に、ＡＬＰ活性を、骨形成分化の初期マーカーとして測定した。統計分析は、有意水準を５％としてＡＮＯＶＡ検定を用いて実行した。
【０１１４】
（実施例２）
フィブリンゲルに種々の量で添加したＴＧＦ−β１の放出動態
フィブリンゲルからのＴＧＦ−β１の放出動態に対するＴＧＦ−β１量の効果を、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）で作られた単一フィブリンゲル処方物（２５ｍｇ／ｍｌのＦＣ濃度およびＩＵ／２ｍｌのトロンビン濃度、ゲル中の最終濃度）を用いて分析した。ゲルからの日々のＴＧＦ−β１放出（図１）および累積ＴＧＦ−β１放出（図２）に対するＴＧＦ−β１量の効果の分析は、ＴＧＦ−β１放出のレベルが、ＦＣ成分に当初添加した成長因子の量と比例することを示している。概して、このフィブリンゲル処方物を用いた結果は、当初添加したＴＧＦ−β１の約４５％〜５２％しか１０日後に放出されないことを示した（図２）。言い換えれば、当初添加したＴＧＦ−β１の約４８％〜５５％が、１０日後にフィブリンゲル中に保持された。３日後のみのＴＧＦ−β１の累積放出を考慮すると、最小保持率は約８０％であった。
【０１１５】
（実施例３）
ＦＣまたはトロンビンの濃度を変化させた場合のフィブリンゲルからのＴＧＦ−β１の放出動態
固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ）（ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ）を用いた場合のＴＧＦ−β１放出動態に対するＦＣ濃度の効果：ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）フィブリンシーラントを用いた場合のＴＧＦ−β１放出動態に対するＦＣ濃度の効果を決定するため、固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ）を有するゲルを用いてＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨの４つの異なるＦＣ濃度（５、１０、２０および４０ｍｇ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）において放出を分析した。
【０１１６】
ＥＬＩＳＡによる日々のＴＧＦ−β１放出の分析は、分析したすべてのＦＣ濃度について、１日目のスパイク放出および１０日目までの放出の減少を示した（図３）。より低いＦＣ濃度を含有するゲルの場合に放出は有意により高く、放出動態に対するＦＣ濃度の効果、およびフィブリンゲルのＦＣ成分タンパク質とのＴＧＦ−β１の潜在的な結合親和性を示唆している。１０日目までのＴＧＦ−β１の累積放出もまた、成長因子の初期添加量（１５ｎｇ）よりも低く、最大で累積放出の約７５％（５ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）、および最小で約２５％（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）であった（図４）。従って、これらの結果は、１０日後の約２５％（５ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）の最小保持率、および約７５％（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）の最大保持率を示した。３日後のみのＴＧＦ−β１の累積放出を考慮すると、最小保持率は約６０％（５ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）および最大保持率は約９０％（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）であった。
【０１１７】
固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ）（ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標））を用いた場合のＴＧＦ−β１放出動態に対するＦＣ濃度の効果：ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）フィブリンシーラントを用いた場合のＴＧＦ−β１放出動態に対するＦＣ濃度の効果を決定するため、固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ）を有するゲルを用いてＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）の４つの異なるＦＣ濃度（５、１０、２０および４０ｍｇ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）において放出を分析した。
【０１１８】
ＥＬＩＳＡによる日々のＴＧＦ−β１放出の分析は、分析したすべてのＦＣ濃度について、１日目のスパイク放出および１０日目までの放出の減少を示した（図５）。より低いＦＣ濃度を含有するゲルの場合に放出は有意により高く、放出動態に対するＦＣ濃度の効果、およびフィブリンゲルのＦＣ成分タンパク質とのＴＧＦ−β１の潜在的な結合親和性を示唆している。１０日目までのＴＧＦ−β１の累積放出は、約７０％（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）から２つの最も低いＦＣ濃度（５ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）を用いた場合のほぼ１００％に達した（図６）。従って、１０日後の最大保持率は約３０％であった。３日後のみのＴＧＦ−β１の累積放出を考慮すると、最小保持率は約３５％（５ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）および最大保持率は約７５％（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）であった。
【０１１９】
固定ＦＣ濃度（２５ｍｇ／ｍｌ）を用いた場合のＴＧＦ−β１放出（ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標））に対するトロンビン濃度の効果：ＴＧＦ−β１放出動態に対するトロンビン濃度の効果を決定するため、固定ＦＣ濃度（２５ｍｇ／ｍｌ）を有するゲルを用いてＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨの４つの異なるトロンビン濃度（２、１０、５０、２５０ＩＵ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）において放出を分析した。
【０１２０】
ＥＬＩＳＡによる日々のＴＧＦ−β１放出の分析は、分析したすべてのＦＣ濃度について、１日目のスパイク放出および１０日目までの放出の減少を示した（図７）。放出は、２、１０および５０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを用いた場合に同様であり（３日後に約１５％放出（すなわち、８５％保持率）、１０％後に約３５％放出（すなわち、６５％保持率））、ＴＧＦ−β１放出に対するトロンビン濃度の効果は、ＦＣ濃度の効果よりも引くことを示唆している。ＴＧＦ−β１放出は、最も高いトロンビン濃度（２５０ＩＵ／ｍｌ）を用いた場合にのみ有意により高く、これは十中八九、そのような高いトロンビン濃度を用いた場合のゲルのより不均質な構造のせいである。ＦＣの効果と同様に、１０日目までのＴＧＦ−β１の累積放出は、成長因子の初期添加量よりも低かった（図８）。
【０１２１】
ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）またはＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）のロット番号を変えた場合のＴＧＦ−β１放出に対する効果：ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）またはＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）のロット番号を変えた場合のＴＧＦ−β１の放出動態に対する効果を、単一フィブリンゲル処方物（２０ｍｇ／ｍｌのＦＣ濃度および２ＩＵ／ｍｌのトロンビン濃度、ゲル中の最終濃度）を用いて分析した。
【０１２２】
ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）のＦＣロット番号を変えた場合の効果の分析は、ロット番号に応じて、１０日後に約３２％から完全放出までの累積放出を示した（図９）。言い換えれば、結果は、ロット番号に応じて、１０日後に無視できる保持率から６８％の最大保持率を示した。これらの結果は、これらの種々のロットにおける因子ＸＩＩＩ含有量によって実証され、最も低い放出％（すなわち、最も高い保持率）は、最も高い量の因子ＸＩＩＩを含有するロット番号によって達成される（ロット１は、＜１Ｕ／ｍｌの因子ＸＩＩＩを含有し、ロット２は、３３．９Ｕ／ｍｌを含有し、ロット３は、４２．２Ｕ／ｍｌを含有していた）。３日後のみのＴＧＦ−β１の累積放出を考慮すると、最小保持率は約４３％であり（ロット１を用いた場合）、最大保持率は約８５％であった（ロット３を用いた場合）。
【０１２３】
ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  Ｓ／Ｄ（商標）のＦＣロット番号を変えた場合の効果の分析は、ロット番号に応じて、１０日後に約８０％から完全放出までの累積放出を示した（図１０）。従って、結果は、ロット番号に応じて、１０日後に無視できる保持率から２０％の最大保持率を示した。これらのロット中の因子ＸＩＩＩ含有量は、３Ｕ／ｍｌより低かった。３日後のみのＴＧＦ−β１の累積放出を考慮すると、最小保持率は約５７％であり（ロット１を用いた場合）、最大保持率は約６７％であった（ロット３を用いた場合）。
【０１２４】
（実施例４）
ＴＧＦ−βの他のアイソフォーム（ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）の放出動態
ＴＧＦ−β２の放出動態：ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）フィブリンシーラントからのＴＧＦ−β２の放出動態に対する効果を、固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ）を有するゲルを用いてＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）の４つの異なるＦＣ濃度（５、１０、２０および４０ｍｇ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）について分析した。
【０１２５】
ＥＬＩＳＡ結果は、より低いＦＣ濃度を含有するゲルを用いた場合、少なくとも早い時点において、累積ＴＧＦ−β２放出が有意により高いことを示し、フィブリンゲルのＦＣ成分タンパク質との潜在的な結合親和性を示している。１０日目までに、より低いＦＣ濃度を含有する他の処方物を用いた場合、放出は８５％（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）〜１００％に達した。言い換えれば、これらの結果は、１０日後に約１５％の最大保持率を示した（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）。３日後のみのＴＧＦ−β２の累積放出を考慮すると、最小保持率は約２５％（５ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）であり、最大保持率は約７０％（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）であった。
【０１２６】
ＴＧＦ−β３の放出動態：ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）フィブリンシーラントからのＴＧＦ−β３放出動態に対するＦＣ濃度の効果を、固定トロンビン濃度（２ＩＵ／ｍｌ）を有するゲルを用いてＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ（商標）の４つの異なるＦＣ濃度（５、１０、２０および４０ｍｇ／ｍｌ、ゲル中の最終濃度）を分析した。
【０１２７】
ＥＬＩＳＡ結果は、より低いＦＣ濃度を含有するゲルを用いた場合、累積ＴＧＦ−β３放出が有意により高いことを示し、ＴＧＦ−β３放出動態に対するＦＣ濃度の効果、およびフィブリンゲルのＦＣ成分タンパク質とのＴＧＦ−βの潜在的な結合親和性を示している。１０日目までのＴＧＦ−β３の累積放出も、成長因子の初期添加量よりも低く、累積放出の最大百分率が約７５％（５ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）、最小が約３０％（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）であった。言い換えれば、これらの結果は、１０日後に約２５％の最小保持率（５ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）および約７０％の最大保持率（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）を示した。３日後のみのＴＧＦ−β３の累積放出を考慮すると、最小保持率は約５５％（５ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）であり、最大保持率は約９０％（４０ｍｇ／ｍｌのＦＣを用いた場合）であった。
【０１２８】
（実施例５）
フィブリンゲルの表面に接種したＨＭＳＣに対するＴＧＦ−β１の効果：
ヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）は、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞および筋細胞を含む種々の特殊組織細胞型に分化することができる多能性細胞である（Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ，Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ９：６４１−６５０，１９９１）。これらの細胞の関与および分化は、細胞相互作用だけでなく特定の成長因子を含む各種の因子により変調される。成長因子のＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、ＭＳＣ成熟のレギュレーターであるとされてきた。特に、ＴＧＦ−β１は十中八九、軟骨形成または骨形成系統へのＭＳＣの分化を引き起こすことにより、軟骨および骨の発達に関与している（Ｃｅｎｔｒｅｌｌａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ，１５：２７−３９，１９９４）。加えて、ＴＧＦ−β１は、骨成長の間の決定的なプロセスである血管形成の様々な局面に関与する重要な血管形成因子である。血管形成および血管リモデリングにおけるＴＧＦ−βシグナリング経路の重要性に関する多くの研究が報告されている（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｏら、Ｃｈｅｓｔ  １２８：６，２００５）。最後に、ＴＧＦ−βは、毛細血管形態形成および血管壁完全性の維持において重要な役割を果たすことが明らかにされている（Ｐｅｐｐｅｒ  ＭＳ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  ＦａｃｔｏｒＲｅｖｉｅｗｓ  （１）：２１−４３，１９９７）。
【０１２９】
ゲル表面に接種したＨＭＳＣに対する、フィブリンゲル中に添加したＴＧＦ−β１（１５ｎｇ／０．３ｍｌゲル）の効果を、蛍光顕微鏡検査により分析した。ＦＣ中にＴＧＦ−β１が添加されていないゲルを対照として用いた。約１０，０００ＨＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．）を、２４ウェルプレート中で、５〜４０ｍｇ／ｍｌのＦＣ濃度および２〜２５０ＩＵ／ｍｌのトロンビン濃度（ゲル中の最終濃度）で調製したゲル上に接種した。ゲル中にＴＧＦ−β１が添加された場合またはされない場合の細胞の形態学および遊走を観察するために、細胞を伴うゲルを、１日目、４日目、７日目および１０日目にカルセイン／臭化エチジウム色素で染色した。
【０１３０】
ゲル表面にＨＭＳＣを接種したゲルの蛍光顕微鏡検査分析は、ゲル中にＴＧＦ−β１を添加したままたはしてない、分析した全てのゲル消泡物について、付ＨＭＳＣがうまく増殖し、早くも７日目に単層を形成したことを示した。結果は、フィブリンゲル中に添加したＴＧＦ−β１が、ゲル表面で培養された場合に、ＨＭＳＣ形態学およびゲル中への遊走に影響することも明らかにした。事実、細胞は、ＴＧＦ−β１を全く添加せずに調製したゲル上では細長い形状を示したが、ＴＧＦ−β１を添加して調製したゲル表面に接種した場合には、より方形ないし多角形の形状を有した。ゲル中に添加されたＴＧＦ−β１の存在下におけるＭＳＣのより方形ないし多角形の形状は、骨形成および／または軟骨形成表現型へのそれらの分化を示す。また、いくつかの細胞が、ＴＧＦ−β１を全く添加せずに調製したゲル内部へ遊走したのに対し、細胞は大半が、ＴＧＦ−β１を添加して調製したゲルの表面に留まった。
【０１３１】
ＴＧＦ−β１を添加して調製したゲル内部への細胞遊走がないことは、フィブリンゲルが、ゲル上に接種した細胞にＴＧＦ−β１を送達できることを示す。本発明のフィブリンゲルにより、ＴＧＦ−β１は、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況において周囲領域の細胞に送達され得る。
【０１３２】
（実施例６）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＭＳＣ単層に対する放出ＴＧＦ−β１の生物活性
放出されたＴＧＦ−β１の生物活性を試験するために、３日目のゲル（当初、ＴＧＦ−β１を全く添加しないもの（対照）または１５ｎｇＴＧＦ−β１／０．３ｍゲル添加したもの、ゲルは２０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビンで調製、ゲル中の最終濃度）からの培地上清をＨＭＳＣ単層のための培地として用いた。新たに添加したＴＧＦ−β１を含有する培地中で培養された細胞は、陽性対照の役割を果たした。７日目までの細胞形態学の変化を、カルセインで染色した後、光学および蛍光顕微鏡検査により分析した。細胞増殖も、カルセインで染色した後、細胞単層の全体的蛍光強度（光学密度により測定される）を測定して分析した。結果は、１日目に正規化した。細胞分化は、グリコアミノグリカンの存在（軟骨形成について）を示すために用いられるアルシアンブルー染色、およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性ならびにアリザリンレッド染色（骨形成について）により分析した。ＡＬＰ活性結果（最初、ＩＵ／ｍｌで計算される）を、増殖に関して正規化した。ＴＧＦ−β１ゲルを添加したゲルからの培地上清で観察されたどのような変化も、放出されたＴＧＦ−β１により実際に誘発されたものであって、ゲルそれ自体から放出されたかもしれない何か他の生物活性成分によって誘発されたものではないことを確実なものにするために、ゲルのいくつかは、対照試料としてＴＧＦ−β１を全く添加することなく調製してあった。
【０１３３】
ＴＧＦ−β１を添加した３日目のゲルからの培地上清中（すなわち、放出されたＴＧＦ−β１を含有する培地中）で培養したＨＭＳＣ単層は、早くも４日目に形態学変化を示し、７日目にはいっそう顕著であった。ＨＭＳＣ単層は、ＴＧＦ−β１を全く添加していないゲルからの培地上清中で培養されたものよりも、より方形ないし多角形の形状、および新たに添加されたＴＧＦ−β１を含有する培地中で培養されたもの（陽性対照）と同様な形状を有していた。
【０１３４】
４日目および７日目における細胞増殖を１日目の増殖（ベースライン）に正規化した。ＴＧＦ−β１を添加したゲルからの培地上清中で（すなわち、放出されたＴＧＦ−β１を含有する培地中で）培養した細胞の増殖は、ＴＧＦ−β１を全く添加していないゲルからの培地上清中で培養した細胞よりも低くなり、ＴＧＦ−β１を新たに添加した培地中で培養した細胞増殖に類似する傾向がある（図１１）。
【０１３５】
ＴＧＦ−β１を添加したゲルからの培地上清中での（すなわち、放出されたＴＧＦ−β１を含有する培地中での）単層培養後の、より方形ないし多角形の形状へのＨＭＳＣ形態学の変化は、ＴＧＦ−β１を全く添加していないゲルからの培地上清中で培養した細胞と比較してより低い増殖を呈する傾向と平行して、細胞分化を示す。
【０１３６】
軟骨形成または骨形成発現型への細胞分化を、アルシアンブルー（軟骨形成について）およびＡＬＰ活性ならびにアリザリンレッド（骨形成について）による染色によってアクセスした。アルシアンブルー染色は、ＴＧＦ−β１を添加したゲルからの培地上清中で（すなわち、放出されたＴＧＦ−β１を含有する培地中で）培養したＨＭＳＣにおいて時間と共に増加し、７日目までに、染色量は、ＴＧＦ−β１を全く添加していないゲルからの培地上清中で培養したＨＭＳＣよりも有意に高く、ＴＧＦ−β１を新たに添加した培地中で培養したＨＭＳＣにおける染色量と同様であった。アリザリンレッド染色は、すべての試料において陰性のままであった。ＡＬＰ活性は、ＴＧＦ−β１を添加したゲルからの培地上清中で培養したＨＭＳＣにおいて４日目および７日目の間で減少した（図１２）。ＡＬＰ活性は、早くも４日目に、ＴＧＦ−β１を全く添加していないゲルからの培地上清中で培養したＨＭＳＣにおいて検出されたレベルよりも有意に低く（４日目でｐ＝０．００５、７日目でｐ＝３Ｅ−０６）、ＴＧＦ−β１を新たに添加した培地中で培養したＨＭＳＣにおけるものと同様のレベルあった。
【０１３７】
細胞形態学、増殖および軟骨形成分化の変化は、ＧＦ−βｌが、ゲルからのＧＦ−βｌの放出後も依然として生物学的に活性であることを実証している。
【０１３８】
（実施例７）
フィブリンゲル内に接種したＨＭＳＣおよびフィブリンゲル表面に接種したＨＵＶＥＣに対するＴＧＦ−β１の効果
フィブリンゲル内に接種したＨＭＳＣおよびゲル表面に接種したヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ，Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．）の挙動に対するＴＧＦ−β１の効果を分析するために、１０ｍｇ／ｍｌのＦＣおよび２ＩＵ／ｍｌのトロンビン（ゲル中の最終濃度）を含有するゲルを、単一培養細胞（ＨＭＳＣまたはＨＵＶＥＣ）またはＨＭＳＣ：ＨＵＶＥＣ比が４：１の共培養細胞で調製した。組み換えＴＧＦ−β１（５ｎｇ／０．３ｍｌゲル）を、ゲル調製時に共培養ゲルの半分の中のＦＣに添加した。ゲルを、３７℃にて５％ＣＯ２中で最高２１日間、血清サプリメントを加えた標準内皮細胞培地（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．）を用いてインキュベートした。細胞形態学および増殖、ならびに骨形成分化の分析を、１日目、７日目、１４日目および２１日目に実行した。相互接続された細胞−細胞ネットワーク（血管形成分化の初期事象）へのＨＵＶＥＣの再編成を含む細胞形態学を、カルセイン色素で染色した後、蛍光顕微鏡検査により観察した。細胞増殖は、フィブリンゲルを精製濃縮ウシトリプシン溶液に溶解させた後、細胞懸濁液の蛍光強度により測定した。最後に、標準アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイを、骨形成分化の初期マーカーとして実行した。
【０１３９】
蛍光顕微鏡検査分析は、ＴＧＦ−βを添加した単一培養ゲルまたは共培養ゲルに接種された場合、ＨＭＳＣがより均等に分散され、より細長い形状を有することを示した。ＨＳＭＣはより小さく、ＴＧＦ−β１を添加していない共培養ゲルの底部に向かって遊走する傾向があった。相互接続された細胞−細胞ネットワーク（血管形成分化の初期事象）へのＨＵＶＥＣ再編成は、より早く開始し、ＴＧＦ−β１を添加していない共培養ゲルと比較してＴＧＦ−β１を含有する単一培養ゲルおよび共培養ゲルにおけるよりも大きい程度まで生じた
細胞増殖は、時間と共に増大した。ＴＧＦ−β１を添加したゲルと添加しなかったゲルとの間に、有意差は全く観察されなかった。すべてのＨＭＳＣ含有条件についてのＡＬＰ活性は、時間と共に増大した。ＡＬＰ活性のレベルは、７日目を除き、ＴＧＦ−β１を添加していないゲルのレベルと比較して、ＴＧＦ−β１を添加したゲルにおいてより高くなる傾向があった。このことは、ＴＧＦ−β１を添加したゲルにおいて１４日後に初期骨形成分化の増大を示したが、このことはまた、ＴＧＦ−β１の存在下における、考え得るより多くの数のＨＭＳＣを反映していたのかもしれない。実行された増殖アッセイが２つの細胞型間で差異を認めなかったので、ＡＬＰ活性レベルは、ＨＭＳＣの総数とは直接関連していなかったかもしれない。
【０１４０】
上記の例示的実施例において示されたように、本発明の多くの修正および変更が当業者の心に思い浮かぶことが予想される。従って、特許請求の範囲に見られる限定のみが、本発明に課されるべきである。
【図１】
2010516703.tif 000002
【図２】
2010516703.tif 000003
【図３】
2010516703.tif 000004
【図４】
2010516703.tif 000005
【図５】
2010516703.tif 000006
【図６】
2010516703.tif 000007
【図７】
2010516703.tif 000008
【図８】
2010516703.tif 000009
【図９】
2010516703.tif 000010
【図１０】
2010516703.tif 000011
【図１１】
2010516703.tif 000012
【図１２】
2010516703.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月22日(2010.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本発明はまた、生物活性トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質を含むフィブリンシーラントを調製するためのキットを提供し、前記タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、前記フィブリンシーラントは、所望のＴＧＦ−β放出速度を有し、キットは、ａ）フィブリノーゲン複合体成分を含有し、ＴＧＦ−β成分を任意に含む第１のバイアルまたは第１の保存容器と、ｂ）トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器と、を含み、前記キットは、前記第１のバイアルまたは第１の保存容器がＴＧＦ−β成分を含有しない場合にＴＧＦ−β成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を含み、前記キットはさらに、その使用説明書を含む。キットはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのフィブリンシーラントの使用または投与のための器具も含み得る。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
フィブリンシーラントからのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の放出を調整するための方法であって、このタンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、このフィブリンシーラントは、フィブリノーゲン複合体成分、トロンビン成分およびＴＧＦ−β成分の混合により製造され、この方法は：
ａ）ＴＧＦ−βの既知の初期量およびフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＴＧＦ−βの量を決定するステップと、
ｂ）第２のフィブリンシーラントを製造するためにステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラントにおいて用いられたフィブリノーゲン複合体のこの既知の最終濃度を調整するステップと、を含み、この第１のシーラント中のフィブリノーゲン複合体のこの既知の最終濃度と比較してこの第２のシーラント中のこのフィブリノーゲン複合体の濃度を増大させることにより、ステップ（ａ）の第１のシーラントからのＴＧＦ−βの放出と比較して、この第２のシーラントからのＴＧＦ−β放出の速度が減少し、この第２のシーラントが、ステップ（ａ）における第１のシーラントと同じＴＧＦ−βの初期量を有する、
方法。
（項目２）
フィブリンシーラントからのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の放出を調整するための方法であって、このタンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、このフィブリンシーラントは、フィブリノーゲン複合体成分、トロンビン成分およびＴＧＦ−β成分の混合により製造され、この方法は：
ａ）ＴＧＦ−βの既知の初期量およびフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＴＧＦ−βの量を決定するステップと、
ｂ）第２のフィブリンシーラントを製造するためにステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラントにおいて用いられたフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を調整するステップと、を含み、この第１のシーラント中のフィブリノーゲン複合体のこの既知の最終濃度と比較してこの第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の濃度を減少させることにより、ステップ（ａ）の第１のシーラントからのＴＧＦ−βの放出と比較して、この第２のシーラントからのＴＧＦ−β放出の速度が増大し、この第２のシーラントが、ステップ（ａ）における第１のシーラントと同じＴＧＦ−βの初期量を有する、
方法。
（項目３）
上記第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が約５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が、上記第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度と約１ｍｇ／ｍｌ〜約１４９ｍｇ／ｍｌ異なる、項目１または２に記載の方法。
（項目６）
上記第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が、上記第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体濃度と約５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ異なる、項目１または２に記載の方法。
（項目７）
上記第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が、上記第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体濃度と約１０ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌ異なる、項目１または２に記載の方法。
（項目８）
上記第１または第２のシーラント中のトロンビン成分の最終濃度が、約１ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にある、項目１または２に記載の方法。
（項目９）
ＴＧＦ−βの最終濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、項目１または２に記載の方法。
（項目１０）
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の、それを必要としている患者における、制御放出のための方法であって、このタンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、この方法は、ＴＧＦ−βを含むフィブリンシーラントをこの患者に投与するステップを含み、このＴＧＦ−βの少なくとも２５％がこのフィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、方法。
（項目１１）
上記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を混合物中で組み合わせることにより製造される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記ＴＧＦ−βが、上記ＦＣ成分と上記トロンビン成分との混合前に、このＦＣ成分に添加される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも３５％〜９０％が少なくとも３日間保持される、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１４）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜７５％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１５）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも６０％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１６）
放出された上記ＴＧＦ−βが生物学的に活性である、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１７）
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の、それを必要としている患者における、制御放出のための方法であって、このタンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、この方法は、ＴＧＦ−βを含むフィブリンシーラントをこの患者に投与するステップを含み、このＴＧＦ−βの少なくとも２０％がこのフィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、方法。
（項目１８）
上記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を混合物中で組み合わせることにより製造される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記ＴＧＦ−βが、上記ＦＣ成分と上記トロンビン成分との混合前に、このＦＣ成分に添加される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも２５％〜７５％が少なくとも１０日間保持される、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２１）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜５５％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２２）
放出された上記ＴＧＦ−βが生物学的に活性である、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２３）
上記シーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、項目１１または１８に記載の方法。
（項目２４）
上記シーラント中の最終トロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌ〜２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にある、項目１１または１８に記載の方法。
（項目２５）
最終フィブリノーゲン複合体濃度が４０ｍｇ／ｍｌであり、最終トロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、項目１１または１８に記載の方法。
（項目２６）
上記シーラント中の最終ＴＧＦ−β濃度が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである、項目１０または１７に記載の方法。
（項目２７）
上記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である、項目１０または１７に記載方法。
（項目２８）
上記ＴＧＦ−β１の少なくとも６０％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、このＴＧＦ−β１の少なくとも２５％がこのフィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２である、項目１０または１７に記載の方法。
（項目３０）
上記ＴＧＦ−β２の少なくとも２５％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
上記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、項目１０または１７に記載の方法。
（項目３２）
上記ＴＧＦ−β３の少なくとも５５％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、このＴＧＦ−β３の少なくとも２５％がこのフィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
上記患者が、筋骨格疾患または障害、軟部組織疾患または障害および心血管疾患からなる群より選択される疾患を患っている、項目１０または１７に記載の方法。
（項目３４）
上記骨格筋障害が骨疾患または骨障害である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上記骨格筋障害が軟骨疾患または軟骨障害である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
上記患者が心血管疾患を患っている、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出の恩恵を受けるであろう障害または疾患を患っている患者を処置するための方法であって、このタンパク質が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、この方法が、このＴＧＦ−βタンパク質を含むフィブリンシーラントをこの患者に投与するステップを含み、
このフィブリンシーラントが、このＴＧＦ−βの制御放出を提供し、このＴＧＦ−βの少なくとも２５％がこのフィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、あるいはこのＴＧＦ−βの少なくとも２０％がこのフィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持され、このＴＧＦ−βが、この障害または疾患を処置するのに有効な速度で放出される、方法。
（項目３８）
上記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を混合物中で組み合わせることにより製造される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記ＴＧＦ−βが、上記ＦＣ成分と上記トロンビン成分との混合前に、このＦＣ成分に添加される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも３５％〜９０％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４１）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜７５％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４２）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも６０％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４３）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも２０％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４４）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも２５％〜７５％が少なくとも１０日間保持される、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４５）
上記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜５５％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４６）
放出された上記ＴＧＦ−βが生物学的に活性である、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４７）
上記シーラント中の最終ＦＣ濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、項目３８に記載の方法。
（項目４８）
上記シーラント中の最終トロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌ〜２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にある、項目３８に記載の方法。
（項目４９）
最終フィブリノーゲン複合体濃度が約４０ｍｇ／ｍｌであり、最終トロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、項目３８に記載の方法。
（項目５０）
上記シーラント中の最終ＴＧＦ−β濃度が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである、項目３７に記載の方法。
（項目５１）
上記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である、項目３７に記載の方法。
（項目５２）
上記ＴＧＦ−β１の少なくとも６０％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、このＴＧＦ−β１の少なくとも２５％がこのフィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２である、項目３７に記載の方法。
（項目５４）
上記ＴＧＦ−β２の少なくとも２５％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
上記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、項目３７に記載の方法。
（項目５６）
上記ＴＧＦ−β３の少なくとも５５％が上記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、このＴＧＦ−β３の少なくとも２５％がこのフィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
上記患者が、筋骨格疾患または障害、軟部組織疾患または障害および心血管疾患からなる群より選択される疾患を患っている、項目３７に記載の方法。
（項目５８）
上記骨格筋障害が骨疾患または骨障害である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
上記骨格筋障害が軟骨疾患または軟骨障害である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
上記患者が心血管疾患を患っている、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質を含むフィブリンシーラントを調製するためのキットであって、このタンパク質が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、このフィブリンシーラントが、所望のＴＧＦ−β放出速度を有し、このキットは：
ａ）フィブリノーゲン複合体成分を含有し、ＴＧＦ−β成分を任意に含む第１のバイアルまたは第１の保存容器と、
ｂ）トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器と、を含み、このキットが、この第１のバイアルまたは第１の保存容器がＴＧＦ−β成分を含有しない場合にＴＧＦ−β成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を任意に含み、このキットがさらに、その使用説明書を含む、
キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリンシーラントからのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の放出を調整するための方法であって、該タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該フィブリンシーラントは、フィブリノーゲン複合体成分、トロンビン成分およびＴＧＦ−β成分の混合により製造され、該方法は：
ａ）ＴＧＦ−βの既知の初期量およびフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＴＧＦ−βの量を決定するステップと、
ｂ）第２のフィブリンシーラントを製造するためにステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラントにおいて用いられたフィブリノーゲン複合体の該既知の最終濃度を調整するステップと、を含み、該第１のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の該既知の最終濃度と比較して該第２のシーラント中の該フィブリノーゲン複合体の濃度を増大させることにより、ステップ（ａ）の第１のシーラントからのＴＧＦ−βの放出と比較して、該第２のシーラントからのＴＧＦ−β放出の速度が減少し、該第２のシーラントが、ステップ（ａ）における第１のシーラントと同じＴＧＦ−βの初期量を有する、
方法。
【請求項２】
フィブリンシーラントからのトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の放出を調整するための方法であって、該タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該フィブリンシーラントは、フィブリノーゲン複合体成分、トロンビン成分およびＴＧＦ−β成分の混合により製造され、該方法は：
ａ）ＴＧＦ−βの既知の初期量およびフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を有する第１のフィブリンシーラントから放出されるＴＧＦ−βの量を決定するステップと、
ｂ）第２のフィブリンシーラントを製造するためにステップ（ａ）の第１のフィブリンシーラントにおいて用いられたフィブリノーゲン複合体の既知の最終濃度を調整するステップと、を含み、該第１のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の該既知の最終濃度と比較して該第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体の濃度を減少させることにより、ステップ（ａ）の第１のシーラントからのＴＧＦ−βの放出と比較して、該第２のシーラントからのＴＧＦ−β放出の速度が増大し、該第２のシーラントが、ステップ（ａ）における第１のシーラントと同じＴＧＦ−βの初期量を有する、
方法。
【請求項３】
前記第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１または第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が約５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が、前記第２のシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度と約１ｍｇ／ｍｌ〜約１４９ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が、前記第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体濃度と約５ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のフィブリンシーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が、前記第２のシーラント中のフィブリノーゲン複合体濃度と約１０ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌ異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記第１または第２のシーラント中のトロンビン成分の最終濃度が、約１ＩＵ／ｍｌ〜約２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ＴＧＦ−βの最終濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の制御放出のための医薬の製造におけるフィブリンシーラントの使用であって、該タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該ＴＧＦ−βの少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、使用。
【請求項１１】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を混合物中で組み合わせることにより製造される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＴＧＦ−βが、前記ＦＣ成分と前記トロンビン成分との混合前に、該ＦＣ成分に添加される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも３５％〜９０％が少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも４０％〜７５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１６】
放出された前記ＴＧＦ−βが生物学的に活性である、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１７】
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質の制御放出のための医薬の製造におけるフィブリンシーラントの使用であって、該タンパク質は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該ＴＧＦ−βの少なくとも２０％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、使用。
【請求項１８】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を混合物中で組み合わせることにより製造される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＴＧＦ−βが、前記ＦＣ成分と前記トロンビン成分との混合前に、該ＦＣ成分に添加される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも２５％〜７５％が少なくとも１０日間保持される、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜５５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２２】
放出された前記ＴＧＦ−βが生物学的に活性である、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２３】
前記シーラント中の最終フィブリノーゲン複合体濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項１１または１８に記載の使用。
【請求項２４】
前記シーラント中の最終トロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌ〜２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にある、請求項１１または１８に記載の使用。
【請求項２５】
最終フィブリノーゲン複合体濃度が４０ｍｇ／ｍｌであり、最終トロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、請求項１１または１８に記載の使用。
【請求項２６】
前記シーラント中の最終ＴＧＦ−β濃度が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである、請求項１０または１７に記載の使用。
【請求項２７】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である、請求項１０または１７に記載使用。
【請求項２８】
前記ＴＧＦ−β１の少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、該ＴＧＦ−β１の少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２である、請求項１０または１７に記載の使用。
【請求項３０】
前記ＴＧＦ−β２の少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、請求項１０または１７に記載の使用。
【請求項３２】
前記ＴＧＦ−β３の少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、該ＴＧＦ−β３の少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記患者が、筋骨格疾患または障害、軟部組織疾患または障害および心血管疾患からなる群より選択される疾患を患っている、請求項１０または１７に記載の使用。
【請求項３４】
前記骨格筋障害が骨疾患または骨障害である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記骨格筋障害が軟骨疾患または軟骨障害である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
前記患者が心血管疾患を患っている、請求項３３に記載の使用。
【請求項３７】
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの制御放出の恩恵を受けるであろう障害または疾患を処置するための医薬の製造におけるフィブリンシーラントの使用であって、該タンパク質が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該フィブリンシーラントが、該ＴＧＦ−βの制御放出を提供し、該ＴＧＦ−βの少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、あるいは該ＴＧＦ−βの少なくとも２０％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持され、該ＴＧＦ−βが、該障害または疾患を処置するのに有効な速度で放出される、使用。
【請求項３８】
前記フィブリンシーラントが、フィブリノーゲン複合体（ＦＣ）成分およびトロンビン成分を混合物中で組み合わせることにより製造される、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記ＴＧＦ−βが、前記ＦＣ成分と前記トロンビン成分との混合前に、該ＦＣ成分に添加される、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも２５％〜９０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４１】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも４０％〜７５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４２】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４３】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４４】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも２５％〜７５％が少なくとも１０日間保持される、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４５】
前記ＴＧＦ−βの少なくとも４５％〜５５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４６】
放出された前記ＴＧＦ−βが生物学的に活性である、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４７】
前記シーラント中の最終ＦＣ濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内にある、請求項３８に記載の使用。
【請求項４８】
前記シーラント中の最終トロンビン濃度が約１ＩＵ／ｍｌ〜２５０ＩＵ／ｍｌの範囲内にある、請求項３８に記載の使用。
【請求項４９】
最終フィブリノーゲン複合体濃度が約４０ｍｇ／ｍｌであり、最終トロンビン濃度が約２ＩＵ／ｍｌである、請求項３８に記載の使用。
【請求項５０】
前記シーラント中の最終ＴＧＦ−β濃度が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである、請求項３７に記載の使用。
【請求項５１】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である、請求項３７に記載の使用。
【請求項５２】
前記ＴＧＦ−β１の少なくとも６０％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、該ＴＧＦ−β１の少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β２である、請求項３７に記載の使用。
【請求項５４】
前記ＴＧＦ−β２の少なくとも２５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持される、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β３である、請求項３７に記載の使用。
【請求項５６】
前記ＴＧＦ−β３の少なくとも５５％が前記フィブリンシーラント中に少なくとも３日間保持され、該ＴＧＦ−β３の少なくとも２５％が該フィブリンシーラント中に少なくとも１０日間保持される、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
前記患者が、筋骨格疾患または障害、軟部組織疾患または障害および心血管疾患からなる群より選択される疾患を患っている、請求項３７に記載の使用。
【請求項５８】
前記骨格筋障害が骨疾患または骨障害である、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
前記骨格筋障害が軟骨疾患または軟骨障害である、請求項５７に記載の使用。
【請求項６０】
前記患者が心血管疾患を患っている、請求項５７に記載の使用。
【請求項６１】
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）タンパク質を含むフィブリンシーラントを調製するためのキットであって、該タンパク質が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３からなる群より選択され、該フィブリンシーラントが、所望のＴＧＦ−β放出速度を有し、該キットは：
ａ）フィブリノーゲン複合体成分を含有し、ＴＧＦ−β成分を任意に含む第１のバイアルまたは第１の保存容器と、
ｂ）トロンビン成分を有する第２のバイアルまたは第２の保存容器と、を含み、該キットが、該第１のバイアルまたは第１の保存容器がＴＧＦ−β成分を含有しない場合にＴＧＦ−β成分を有する第３のバイアルまたは第３の保存容器を任意に含み、該キットがさらに、その使用説明書を含む、
キット。
【国際調査報告】
2010516703.tif 000014
2010516703.tif 000015
2010516703.tif 000016