(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象におけるＣＤ３０＋白血病またはＣＤ３０＋リンパ腫を含むＣＤ３０＋癌の治療を目的とした養子細胞療法において使用するキメラ抗原受容体を有するＴ細胞であって、
前記キメラ抗原受容体は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
前記キメラ抗原受容体を有するＴ細胞は、
ＣＤ３０＋白血病細胞またはＣＤ３０＋リンパ腫細胞を含むＣＤ３０＋癌細胞には毒性であるが、
ＣＤ３０＋非癌細胞には非毒性であることを特徴とする、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞。
【請求項２】
前記ＣＤ３０＋癌は、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、皮膚リンパ腫、菌状息肉腫、リンパ増殖性疾患、全身性肥満細胞症、奇形癌、幹細胞由来悪性腫瘍、癌幹細胞のうちのいずれか１つであることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体を有するＴ細胞。
【請求項３】
前記ＣＤ３０＋癌は、ホジキンリンパ腫もしくは非ホジキンＢ細胞リンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫、または、菌状息肉腫もしくはセザリーリンパ腫を含むＴ細胞リンパ腫であることを特徴とする、請求項１または２に記載のキメラ抗原受容体を有するＴ細胞。
【請求項４】
Ｔ細胞でキメラ抗原受容体として発現された際にＣＤ３０＋癌細胞に対して毒性作用を示すが、ＣＤ３０＋非癌細胞に対しては非毒性であることを特徴とする、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５】
請求項４のポリペプチドをコードする配列番号４で示される塩基配列を含む核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の塩基配列を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターまたは請求項５に記載の核酸分子を含む、細胞、細胞株または宿主細胞。
【請求項８】
前記キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の作製において使用する、請求項６に記載のベクター、請求項７に記載の細胞、細胞株もしくは宿主細胞、請求項５に記載の核酸分子および／または請求項４に記載のポリペプチドを含む、キット。
【請求項９】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体であって、当該キメラ抗原受容体を発現する遺伝子操作リンパ球の存続および増幅の改善に使用するキメラ抗原受容体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
第１の態様において、本発明は、必要とする対象におけるＣＤ３０＋癌の治療を目的とした養子細胞療法において使用するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する遺伝子改変Ｔ細胞に関する。特に、本発明は、ＣＤ３０＋癌細胞には毒性であるがＣＤ３０＋非癌細胞には非毒性である特定のキメラ抗原受容体を含有および発現する遺伝子操作Ｔ細胞に関する。さらなる態様において、本発明は、特定のキメラ抗原受容体および前記受容体をコードする核酸分子ならびにそれを含有するベクターおよび細胞に関する。最後に、本発明は、キメラ抗原受容体を含有するリンパ球の存続および増幅の改善において使用するための前記キメラ抗原受容体の使用、および特定のペプチドを発現する遺伝子改変リンパ球の存続および増幅の改善のための前記ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
養子Ｔ細胞導入は悪性腫瘍の治療に有意な有効性を示しており、白血病を含む様々な疾患に治癒力を持ち得る。通常、患者由来のＴ細胞を組換えＴ細胞（ＴＣＲ）、あるいは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにｅｘ  ｖｉｖｏで操作する。
前記キメラ抗原受容体は一般に、抗体由来の細胞外抗原結合ドメインとシグナル伝達Ｔ細胞受容体エンドドメイン由来の細胞内Ｔ細胞活性化ドメインから構成される。生理学的なＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、細胞外成分を介して結合する抗原と細胞内シグナル伝達成分により提供されるＴ細胞活性化を組み合わせた１本の単鎖ポリペプチドから構成される。従って、抗体由来の結合ドメインのために、ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）には依存せずに、それらの標的、通常には、細胞表面抗原を認識し、抗原保持が低下または欠如した腫瘍細胞変異体（一般に見られる腫瘍免疫回避機構に当たる）によって損なわれることはない。
【０００３】
ＣＡＲは、近年、広範囲にわたる研究活動の焦点であった。特に、ＣＡＲ  Ｔ細胞溶解能は養子細胞療法の焦点である。癌治療のための最近の臨床試験は、ＣＡＲにより再指向されたＴ細胞による養子療法の可能性を強調した。
例えば、ＧＤ２ガングリオシド特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置された神経芽腫患者は、Ｔ細胞の持続はわずかな時間に過ぎなかったものの、ある程度強い抗腫瘍作用を示した。さらなる研究では、ＣＡＲにより操作されたＴ細胞は慢性および急性リンパ球性白血病に罹患している患者において利益をもたらす抗腫瘍応答を誘発し得るという概念が証明された。ＣＡＲ  Ｔ細胞アプローチは、単一の分子の代わりに操作細胞が使用される限り、例えば免疫毒素の使用によるなどの他の抗体媒介免疫療法と異なる。
【０００４】
近年、ＣＡＲの設計の至適化に努力がなされてきた、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｍａｎ  Ｊ．Ｓ．ら，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１０，１０，７７−９０参照。しかしながら、多くの試みは、特に、より効果的な抗腫瘍応答およびＴ細胞生存の延長による前記操作Ｔ細胞の体内での長期Ｔ細胞存続の実現の必要性を残している。加えて、臨床適用中のＴ細胞存続の維持および活性化に必要とされる共刺激シグナルはまだ同定されていない。従って、養子免疫療法を含む様々なアプローチのためのＣＡＲの至適化に関して進行中の研究がある。
【０００５】
すでに１９９９年に、Ｈｏｍｂａｃｈ  Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９９，２２（６），４７３−４８０は、ホジキンリンパ腫に関連するＣＤ３０抗原に特異性を有するキメラＴ細胞受容体を記載している。ここでは、キメラ受容体の特異的架橋がＣＤ３０＋標的細胞に対してＭＨＣ非拘束細胞毒性を誘導するが、ＣＤ３０−細胞に対しては誘導しないことが特定されている。
ＣＤ３０は腫瘍細胞によって発現されるだけでなく、正常な活性化されたＢ細胞によっても発現されるので、ＣＤ３０を標的として使用することは躊躇された。この仮説はＳａｖｏｌｄｏら，Ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（７），２６２０−２６３０に持ち越され、この筆者は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が良性Ｂ細胞種リンパ芽球細胞株（ＬＣＬ細胞株）の高い細胞溶解を呈することを示している。そこで使用されているＣＡＲは、細胞内ＣＤ２８ドメインを持たない「第一世代」ＣＡＲである。
【０００６】
Ｈｏｍｂａｃｈ  Ａ．ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１０，１７，１２０６−１２１３は、Ｆｃ受容体＋細胞による標的外活性化および先天性免疫応答の意図しない誘導を回避する、細胞外ＣＡＲ部分におけるＩｇＧ１  Ｆｃスペーサードメインの改変を記載している。
【０００７】
Ｋｏｆｌｅｒら，２０１１，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９，７６０−７６７では、ＣＡＲ分子は、ＣＤ３ζエンドドメインとＣＥＡに特異的な抗体由来ｓｃＦｖエクトドメインを組み合わせたＣＤ２８エンドドメインを有すると記載されている。そこには、ＣＤ２８  ＣＡＲエンドドメインにおけるｌｃｋ結合部分の欠失は、インターフェロン−γ分泌、増殖および細胞溶解の障害なく、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の存在下で、再指向された抗腫瘍活性を改善することが記載されている。
改変型のＣＤ２８エンドドメインを有するＣＡＲは、Ｔｒｅｇ細胞により重度の浸潤を受ける多様なタイプの癌を有する患者において養子Ｔ細胞療法の実施を促すものと思われる。
【０００８】
加えて、ＣＡＲにより再指向されたＴ細胞を有する癌の養子療法の概要は、Ｈｏｍｂａｃｈら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３，１３（１），１−１０に示されている。そこには、ＣＡＲ効果は、共刺激活性ならびに再指向された抗腫瘍Ｔ細胞応答の改善および延長を含むとの概要が示されている。さらに、この種の養子療法の悪影響は、「サイトカインストーム」および「Ｔ細胞抑制」を含むと記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
養子療法におけるＣＡＲ発現Ｔ細胞は、有益な効果の他、前述のような各療法の好ましい開発を現在妨げている有害な副作用が知られている。
参照文献に記載されているように、ＣＡＲの開発は、前記のことを克服することを試みる１または２つの共刺激シグナルドメインを担持する第二世代および第三世代のＣＡＲをもたらす。しかしながら、ＣＡＲに基づく養子療法の残る問題は、ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞が悪性癌細胞（腫瘍細胞）と健常な細胞（非腫瘍細胞）を区別しないということである。従って、癌特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の主要な課題は、健常な組織に対する副作用を最小とすることである。抗腫瘍効果はＣＡＲ  Ｔ細胞の長期間の存在を必要とすることから、さらにＣＡＲ  Ｔ細胞の存続、生存および増殖を改善することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の簡単な説明
第１の態様において、本発明は、必要とする対象におけるＣＤ３０＋白血病またはＣＤ３０＋リンパ腫を含むＣＤ３０＋癌の治療を目的とした養子細胞療法において使用するためのキメラ抗原受容体を有するＴ細胞に関し、前記キメラ抗原受容体はＮ末端から始まってＣ末端へと以下のドメイン：抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメイン、特に、配列番号２のＨＲＳ３−ｓｃＦｖまたはＣＤ３０と特異的に結合し配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するそのホモログと、スペーサードメインと、膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインを含み、前記キメラ抗原受容体を有するＴ細胞は、前記対象のＣＤ３０＋癌細胞、特に、ＣＤ３０＋白血病細胞またはＣＤ３０＋リンパ腫細胞には毒性であるが、ＣＤ３０＋非癌（健常）細胞には非毒性であることを特徴とするキメラ抗原受容体を有することを特徴とする。
【００１１】
特に、本発明は、配列番号４の核酸によりコードされた配列番号３のポリペプチドまたはそのホモログであるＣＡＲを発現するＴ細胞に関する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、必要とする対象においてＣＤ３０＋癌を治療するための、本発明による前記キメラ抗原受容体を有するＴ細胞の使用に関する。特に、ＣＤ３０＋癌は、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、皮膚リンパ腫、菌状息肉腫、セザリーリンパ腫、リンパ増殖性疾患、全身性肥満細胞症、奇形癌、幹細胞由来悪性腫瘍、癌幹細胞またはその他のうちのいずれか１つである。
【００１３】
さらに、本発明は、配列番号３のポリペプチドまたは配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するそのホモログに関し、Ｔ細胞で発現された際の前記ポリペプチドまたはそのホモログならびにキメラ抗原受容体はＣＤ３０＋癌細胞には毒性作用を示すが、ＣＤ３０＋非癌細胞には非毒性であることを特徴とする。
【００１４】
加えて、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに前記核酸配列、例えば、配列番号４を含むベクターに関する。さらに、前記核酸配列または前記ベクターを含む細胞、細胞株または宿主細胞、ならびに前記ベクター、前記ベクターもしくは前記核酸分子を含む細胞、細胞株もしくは宿主細胞を含むか、または前記核酸分子を含む、キットまたはシステムが提供される。
【００１５】
最後に、本発明は、前記ＣＡＲを発現する任意の遺伝子操作免疫細胞、特に、リンパ球の存続および増幅を改善するための本発明によるＣＡＲの使用に関する。
加えて、本発明は、ペプチドが遺伝子操作リンパ球により発現される他の任意の特異性のキメラ抗原受容体と融合されている場合に前記ペプチドを発現する任意の遺伝子操作リンパ球の存続および増幅を改善するＨＲＳ３  ｓｃＦｖペプチドまたはそれをコードする核酸の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】配列番号４の核酸によりコードされた配列番号３の分子ＣＡＲ＃１１３８のモジュラー組成。
【図２】操作したヒトＴ細胞はＣＡＲ＃１１３８を発現する。ヒト末梢Ｔ細胞は健常なドナーの血液から単離し、ベクター＃１１３８の形質導入によりレトロウイルスで操作した。１２時間後、細胞の＃１１３８  ＣＡＲ発現を、ＰＥ標識ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体およびＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＵＣＨＴ１を用い、ＳＯＰ＿ｔｕｍｏｒｇｅｎｅｔｉｃｓ＿ＦＡＣＳに従う２色ＦＡＣＳによって調べた。
【図３】操作したＴ細胞はＣＤ３０＋リンパ腫細胞を排除し、ＣＤ３４＋ＣＤ３０＋造血幹細胞の排除は少ない。ＣＡＲ＃１１３８を有するＴ細胞は、偽形質導入後のＣＡＲを持たないＴ細胞（Ｔ細胞＃１１３８陰性）および非改変Ｔ細胞（ｗ／ｏ）を２４時間、同種異系ＣＤ３４＋造血幹細胞とともに共培養してＣＤ３０の発現を誘導し、またＣＦＳＥ標識ＣＤ３０＋Ｍｙｌａ細胞ともに共培養した。細胞を抗ＣＤ３４−ＰＥモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＡＣ１３６（２０μｌ）で染色した。計数標準（５μｌ／試験）および７ＡＡＤ（５μｌ／試験）を加え、細胞を標準ビーズ１，０００イベントに対する計数を設定するＦＡＣＳによって分析した。試験は３反復で行い、標的細胞の総数を決定した。
【図４】＃１１３８  ＣＡＲを有するＴ細胞および＃１１３８  ＣＡＲを有さないＴ細胞をそれぞれ同種異系ＣＤ３４＋造血幹細胞およびＣＦＳＥ標識ＣＤ３０＋Ｍｙｌａ細胞と２４時間共培養した。細胞を抗ＣＤ３４−ＰＥ  ｍＡｂ  ＡＣ１３６（２０μｌ）で染色した。計数標準（５μｌ／試験）および７−ＡＡＤ（５μｌ／試験）を加え、細胞を、標準ビーズ１，０００イベントに対する総数を設定することによりＦＡＣＳによって分析した。各標的集団における死細胞（７−ＡＡＤ＋）の数を求め、下式：死滅標的細胞のパーセント＝（７−ＡＡＤ＋標的細胞数／総標的細胞数）＊１００を用いて総標的細胞に対する死細胞％として表した。試験は３反復で行った。
【図５】ＣＤ３０＋Ｔ細胞およびＢ細胞は、ヒト化ＳＣＩＤマウスの末梢血中、抗ＣＤ３０  ＣＡＲ  Ｔ細胞＃１１３８の存在下で存続する。ＳＣＩＤマウスにヒト造血系を移植してその末梢血にヒトＢ細胞およびＴ細胞を担持させた。０日目に、＃１１３８  ＣＡＲで操作した同じドナーのヒトＴ細胞をｉ．ｖ．注射により養子導入した。末梢血ＣＤ３０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ３０＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞（Ｂ）を、抗ＣＤ３０  ＣＡＲ  Ｔ細胞＃１１３８により処置前−５日および処置後＋５０日の時点でフローサイトメトリーにより記録した。
【図６】抗ＣＤ３０  ＣＡＲ＃１１３８を有するＴ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中に優先的に蓄積する。末梢血リンパ球に各ＣＡＲを植え付けた。形質導入後、細胞を１０％ＦＣＳおよびＩＬ−２（５００Ｕ／ｍｌ）を添加したＸｖｉｖｏ１５培地で培養した。培地は１週間に１回交換し、ＩＬ−２は２日置きに加えた。培養開始後の示された時点で、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスおよびＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ抗体を用い、ＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＡＲ発現を記録した。
【図７ａ】実験計画の流れ図を示す。
【図７ｂ】自己Ｂ細胞の、本発明によるＣＤ３０  ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的細胞溶解を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明者らはキメラ抗原受容体を含む遺伝子操作Ｔ細胞を提供することを目的とし、前記Ｔ細胞は、前記対象のＣＤ３０＋癌細胞には毒性活性を示すが、ＣＤ３０＋非癌細胞には非毒性である。
すなわち、第１の態様において、本発明は、必要とする対象におけるＣＤ３０＋癌、特に、ＣＤ３０＋リンパ腫またはＣＤ３０＋白血病細胞の治療を目的とした養子細胞療法において使用するためのキメラ抗原受容体を有するＴ細胞に関し、前記キメラ抗原受容体はＮ末端から始まってＣ末端へと以下のドメイン：抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメイン、特に、配列番号２のＨＲＳ３−ｓｃＦｖまたは配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有しＣＤ３０と特異的に結合するそのホモログと、任意選択によりスペーサードメインと、膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインを含有し、前記キメラ抗原受容体を有するＴ細胞は、前記対象のＣＤ３０＋癌細胞、特に、ＣＤ３０＋白血病細胞またはＣＤ３０＋リンパ腫細胞には毒性であるが、ＣＤ３０＋非癌細胞には非毒性であることを特徴とする。
【００１８】
これに関して、用語「ＣＤ３０＋癌細胞」は、ＣＤ３０分子を発現する悪性細胞または新生細胞を指す。
【００１９】
さらに、用語「ＣＤ３０＋非癌細胞」は、ＣＤ３０分子を発現する良性（健常）細胞、例えば、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞または幹細胞を指す。
【００２０】
用語「非腫瘍細胞」および「腫瘍細胞」ならびに「非癌細胞」および「癌細胞」は、特に断りのない限り、本明細書で互換的に使用される。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”  ｏｒ  “ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）」ならびに用語「含有する（“ｃｏｎｔａｉｎ”  ｏｒ  “ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”）」は、「からなる（“ｃｏｎｓｉｓｔ”  ｏｒ  “ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ”）」の具体例を指す。
【００２２】
用語「ホモログ」は、本明細書で使用する場合、特定の量、すなわち、それが参照される核酸配列またはアミノ酸配列の少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性を有する、ＤＮＡまたはポリペプチドのいずれかの分子を指す。相同性は、２つの配列間の同一性の大きさを指す。ホモログ配列は、特定されたものと同一または類似の特徴を有し、特に、その配列の同一または類似の特性を有する。例えば、配列番号２のＨＲＳ３  ｓｃＦｖ配列のホモログは、ＨＲＳ３  ｓｃＦｖ分子の場合と同様に、ＣＤ３０分子に対して同一または類似の結合特異性を有する。さらに、ホモログは、同一のペプチドをコードするが遺伝コードの縮重のためにその配列が異なり得る核酸分子を含む。さらに、同定とは、それが示す配列に関して記載されるような順序での同一のアミノ酸分子または核酸分子の存在を指す。すなわち、少なくとも９０％の同一性の場合、９０％以上のそれぞれ核酸分子およびアミノ酸分子が対応する位置で同一である。特に断りのない限り、用語「相同性」と「同一性」は本明細書で互換的に使用される。一実施形態では、ホモログは、配列番号２のＨＲＳ３  ｓｃＦｖペプチドの、配列番号２のＨＲＳ３  ｓｃＦｖペプチドにより認識される同じエピトープと特異的に結合するホモログである。
【００２３】
加えて、用語「遺伝子操作された」は、遺伝子工学により操作された細胞を指す。すなわち、これらの細胞は、前記細胞中に天然には存在しない異種配列を含有する。一般に、異種配列は、ベクター系、または核酸分子を細胞に導入するための他の手段（リポソームを含む）を介して導入される。異種核酸分子は前記細胞のゲノムに組み込まれてもよいし、または例えばプラスミドの形態で染色体外に存在してもよい。この用語にはまた、遺伝子操作され、単離されたＣＡＲポリペプチドを細胞に導入する実施形態も含まれる。
【００２４】
一般に、ＣＡＲは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質と融合された細胞外抗体型認識ドメインからなる融合タンパク質である。一般に、抗原認識領域を含有するエクトドメインは、シグナルペプチドと抗原認識単位を含む。本発明によれば、エクトドメインは、抗ＣＤ３０一本鎖ドメインを含む。前記一本鎖ドメインは配列番号２のＨＲＳ３  ｓｃＦｖまたは配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有し、ＣＤ３０と特異的に結合するそのホモログから選択される一本鎖ドメインであることが好ましい。さらに、この一本鎖ドメインはＨＲＳ４またはＫｉ−４などの他の抗ＣＤ３０抗体に由来してもよい。前記抗体はＣＤ３０に対して、ＨＲＳ３抗体に対するものと同じ結合特異性を有する、すなわち、ＣＤ３０の同じエピトープに結合する。
【００２５】
エクトドメインはスペーサードメインの存在により膜貫通ドメインから間隔をとることができる。前記任意選択のスペーサードメインは抗原結合ドメインと膜貫通ドメインを連結し、前記膜貫通ドメインは、抗原認識を助けるために抗原結合ドメインを様々な方向に向かせるように十分フレキシブルであることが好ましい。
【００２６】
膜貫通ドメインは一般に、膜を貫通する疎水性αヘリックスである。他の膜貫通ドメインも使用可能である。最後に、エンドドメインはＣＡＲの細胞質部分内のシグナル伝達ドメインに相当する。
【００２７】
記載のようなＣＡＲを含有する、すなわち、Ｎ末端から始まってＣ末端へと以下のドメイン：抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメイン、任意選択によりスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、ＣＤ３０＋癌細胞とＣＤ３０＋非癌細胞の間で示差的に毒性活性を示し得る細胞質ドメインを有するＣＡＲを含有するＴ細胞が認識されている。従って、本発明のＴ細胞は、例えば、当技術分野に記載されているような癌ＣＤ３０＋細胞と健常なＣＤ３０＋細胞の療法に対する細胞傷害作用という当技術分野で公知の問題を克服する。
【００２８】
本発明の実施形態において、ＣＡＲは、抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメインのＮ末端に位置するリーダー配列を含む。
【００２９】
加えて、別の実施形態では、抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメインは、特に、配列番号２のＨＲＳ３  ｓｃＦｖペプチドである。本明細書では、特にＨＲＳ３の可変領域の抗ＣＤ３０一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）が、ＣＤ３０＋癌細胞に毒性であるがＣＤ３０＋非癌細胞には非毒性である活性の提示を可能とすることが認識された。
【００３０】
別の実施形態では、ＣＡＲ分子のスペーサードメインは、配列番号５のＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２ＣＨ３ドメインまたはそれと少なくとも７０％の同一性を有するそのホモログであり、好ましくは、スペーサードメインは、配列番号５の変異型ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２ＣＨ３ドメインである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、スペーサードメインと膜貫通ドメインの間にはリンカーが位置してよい。例えば、配列番号３のＣＡＲでは、スペーサードメインと膜貫通ドメインの間にアミノ酸４個のリンカーが位置する。
【００３２】
さらに、別の実施形態は、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞に関し、この膜貫通ドメインはＣＤ２８分子に由来し、例えば、ＣＤ２８分子の膜貫通ドメインは配列番号６のｌｃｋドメインを欠いている。
【００３３】
本明細書において互換的に使用されるシグナル伝達ドメインまたはエンドドメインまたは細胞内ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃε受容体（ＩｇＥ受容体）γ鎖シグナル伝達鎖または共刺激ドメインを含有する。
例えば、細胞内ドメインは、配列番号７のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインまたは少なくとも７０％相同性を有するそのホモログである。別の実施形態では、細胞内ドメインは、配列番号８のＦｃε受容体γシグナル伝達ドメインまたは少なくとも７０％の同一性を有するそのホモログである。シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞における細胞傷害活性またはＴ細胞によるインターフェロン−γ分泌の活性化をそれぞれ担う。
【００３４】
ＣＡＲ分子は、いわゆる「第二世代」ＣＡＲ分子である。第二世代ＣＡＲ分子は、例えばＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に由来する第二のシグナル伝達ドメインをさらに含有する改変型のシグナル伝達ドメインである。「第三世代」ＣＡＲ分子は、共刺激シグナル伝達ドメインとの組合せ、例えばＣＤ２８とＣＤ１３７またはＣＤ１３４の組合せを含有する。
【００３５】
ＣＡＲ分子についての概要は例えば、Ｇｉｌｈａｍ  Ｄ．Ｅ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２，１８（７），３７７−３８４に示されている。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を有するＴ細胞であり、このキメラ抗原受容体は配列番号３のポリペプチドである。前記ＣＡＲはまた、本明細書で＃１１３８として示される。
【００３７】
抗ＣＤ３０  ＣＡＲ＃１１３８はＴ細胞の表面で発現され、可変領域抗ＣＤ３０一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体ＨＲＳ３の細胞外部分およびｓｃＦｖと膜貫通ドメインの間のスペーサーとしての改変型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３ドメインから構成される。ＩｇＧ１ドメインの改変は、野生型アミノ酸配列ＰＥＬＬＧＧＰ  Ｘ１３  ＭＩＳＲＴ（配列番号９）からＰＰＶＡ−ＧＰ  Ｘ１３  ＭＩＡＲＴ（配列番号１０）に変換するための点突然変異からなり、これにより先天免疫細胞のような他の細胞上のＦｃ受容体へのＣＡＲ  Ｆｃドメインの意図しない結合（この結合は前記の他細胞の活性化およびＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を意図せずに媒介する）が低減される。
ＣＡＲ＃１１３８の膜貫通および細胞膜内近位はヒトＣＤ２８に由来し、ヒトＣＤ３ζの細胞内部分に融合されている。ＣＤ２８配列は、Ｐ５６０＞Ａ５６０、Ｐ５６３＞Ａ５６３、Ｐ５６４＞Ａ５６４に変異を有する（Ｋｏｆｌｅｒら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９，７６０−７６７（２０１１））。それによりｌｃｋキナーゼに対するＣＤ２８結合部位は破壊され、その結果、ｌｃｋシグナル伝達経路の活性化がもたらされ、次いでＣＡＲにより媒介されるＩＬ−２分泌が妨げられる。前臨床モデルは、これらの条件下でＴｒｅｇ細胞により媒介されるＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の抑制が低減されることを暗示している。
【００３８】
例で示されるように、Ｔ細胞（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋いずれかのＴ細胞）はＣＤ３０＋細胞に異なった作用を示し、すなわち、＃１１３８  ＣＡＲを有するＴ細胞の存在下でＣＤ３０＋癌細胞は死滅化されるが、ＣＤ３０＋非癌細胞は生存して留まる。
【００３９】
例として、＃１１３８  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、健常なヒトＣＤ３０＋ＣＤ３４＋造血幹細胞に対しては非毒性であるが、ＣＤ３０＋リンパ腫細胞は排除される。
【００４０】
さらに、例に示されるように、本発明による＃１１３８  ＣＡＲを含有するＴ細胞は、マウスモデルにおいて健常なヒトＢ細胞およびＴ細胞に対して有毒活性を示さない。自己の健常な細胞に対しての有意な自己免疫活性および有害な副作用は見られない。加えて、病原体に対するリンパ球免疫応答に変化はなく、調べた病原体に対しての細胞性免疫防御が可能であった。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、必要とする対象においてＣＤ３０＋癌を治療するための養子細胞療法における本発明によるキメラ抗原受容体を有するＴ細胞の使用に関する。例えば、ＣＤ３０＋癌は、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、皮膚リンパ腫、菌状息肉腫、リンパ増殖性疾患、全身性肥満細胞症、奇形癌、幹細胞由来悪性腫瘍、または癌幹細胞またはその他であり得る。
【００４２】
すなわち、驚くことに、本発明によるキメラ抗原受容体を有するＴ細胞は、被処置対象に存在する非癌ＣＤ３０＋細胞を障害することなく、必要とする対象のＣＤ３０＋癌を治療することを可能とする。異なる抗原結合ドメインを有する極めて多様なＣＡＲを用いた場合のこれまでの所見とは対照的に、抗ＣＤ３０抗体ドメインは、悪性ＣＤ３０＋細胞の排除を可能とするが、良性ＣＤ３０＋細胞は影響を受けない。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において＃１１３８で示されるＣＡＲポリペプチドに相当する配列番号３のポリペプチド、または少なくとも９０％の同一性を有するそのホモログに関し、前記ポリペプチドまたはそのホモログは、Ｔ細胞で発現される場合、ＣＤ３０＋癌細胞に対して毒性作用を示すがＣＤ３０＋非癌細胞に対しては非毒性であるキメラ抗原受容体である。例えば、配列番号３のポリペプチドは、配列番号４の核酸配列によりコードされる。
【００４４】
ポリペプチドは、抗ＣＤ３０抗体のＨＲＳ３−ｓｃＦｖ一本鎖ドメイン、変異型のＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２ＣＨ３ドメインであるスペーサードメイン、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、特に、ｌｃｋドメインを欠いたＣＤ２８由来膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζの細胞内ドメインから構成される。
【００４５】
加えて、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。さらに、記載のようなポリペプチドをコードする本発明による核酸配列を含むベクターが提供される。当業者は、好適なベクター系およびベクター、特に、真核細胞、特に、Ｔ細胞のトランスフェクションおよび形質導入を可能とするベクターを熟知している。
【００４６】
さらに、本発明は、本発明によるベクターまたは本発明による核酸分子を含有する細胞、細胞株または宿主細胞を提供する。好ましくは、前記細胞、細胞株または宿主細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００４７】
さらに、本発明は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の作製において使用するための、本発明によるベクター、本発明による細胞、細胞株もしくは宿主細胞、または本発明によるポリペプチドもしくは本発明による核酸分子またはその混合物を含有するキットまたはシステムを提供する。
本発明によるキットまたはシステムは、ベクターまたは核酸分子上のポリペプチドを細胞に導入するための手段を含むさらなる成分を含有してもよい。当業者はこれを行うために好適な手段を熟知している。
【００４８】
さらに、本発明は、前記キメラ抗原受容体＃１１３８またはそのホモログを発現する任意の遺伝子操作リンパ球の存続および増殖の改善を目的として使用するための、本明細書で定義されるキメラ抗原受容体に関する。すなわち、本発明者らは、驚くことに、幅広い多様な他のキメラ抗原受容体とは対照的に、本発明によるキメラ抗原受容体＃１１３８は、例で示されるように遺伝子操作リンパ球の存続および増幅の改善を付与することを実現した。ゆえに、操作したＴ細胞の対象内での存続が短すぎ、操作したＴ細胞の数が急激に減るというこれまでに知られていたＣＡＲ  Ｔ細胞の臨床に関連する欠点は克服される。
【００４９】
最後に、本発明は、ＨＲＳ３  ｓｃＦｖペプチド、およびＨＲＳ３のｓｃＦｖにより同定されるエピトープに関して同じ特性を有するそのホモログを提供する。すなわち、例えば、抗体ＨＲＳ４およびＫｉ−４は同じエピトープに結合する。よって、ＨＲＳ４のｓｃＦｖとＫｉ−４のｓｃＦｖは、本発明に関しておそらく同じ活性を持ち得る。
加えて、前記ペプチドをコードする核酸配列が提供される。前記ペプチドおよび核酸は、前記ｓｃＦｖペプチドがキメラ受容体の一部であるか、または遺伝子操作リンパ球により発現される他の任意の特異性のキメラ抗原受容体と融合されている場合に、前記ペプチドを発現する任意の遺伝子操作リンパ球の存続および増幅を改善するための使用に好適である。すなわち、例えば配列番号１の配列によりコードされる配列番号２のＨＲＳ３  ｓｃＦｖペプチドなどのＨＲＳ３  ｓｃＦｖペプチドと異なる抗原結合特異性を付加的に有するＣＡＲ分子を組み合わせると、前記操作リンパ球の存続および増幅が改善される。
【００５０】
本発明を実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、本発明を限定することなくさらに例示する。
【実施例】
【００５１】
試験品の作製
＃１１３８  ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを、Ｇａｌｖ偽型エンベロープを用い、ＳＯＰ−ＧＬ−ＶｅｃｔＰｒｏｄに従って作製した。要約すると、ベクター粒子の作製は、２９３Ｔなどのヒト胎児腎臓細胞にて、ポリフェクト（登録商標）を介したＤＮＡトランスフェクション後に一過性としてなされた。ベクター粒子は、Ｇａｌｖを有する偽型であった。ベクター力価は測定しなかった。
【００５２】
ヒト血液リンパ球の形質導入は標準技術（Ｃｈｅａｄｌｅ，Ｅ．Ｊ．，ら，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ３６，ｉｎ：“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，第２版，Ｅｄ．Ｐ．Ｃｈａｍｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９０７，６４５−６６６（２０１２），ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−９７４−７＿３６）に従って行った。要約すると、トランスフェクト２９３Ｔ細胞からの２日目の上清を用いて２日間、ヒトリンパ球に形質導入を行った。ＣＡＲの細胞外ＩｇＧ１  ＣＨ２  ＣＨ３ドメインに対する抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定したところ、ＣＡＲ＃１１３８は２日目にヒトＴ細胞の２０〜３５％に発現された。比較として、ＣＡＲ＃１１７５（Ｈｏｍｂａｃｈ  Ａ，ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｏｃｔ；１７（１０）：１２０６−１３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１０．９１．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊｕｎ  １７参照）は、同じ手順によって測定したところヒトＴ細胞１７〜３０％に発現されていた。
【００５３】
細胞表面にＣＡＲ＃１１３８を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＲ  ＨＲＳ３  ｓｃＦｖドメインと特異的に結合する９Ｇ１０抗体の使用によって記録できる。＃１１３８  ＣＡＲで操作したＴ細胞はＣＤ３０発現細胞と特異的に結合して活性型となり、これはＣＤ３０＋標的細胞の増殖および細胞溶解の増加による、ＩＦＮ−γを含むサイトカインの分泌増加によって示される。注目すべきは、Ｔ細胞がＣＡＲ＃１１３８によって刺激された場合には、バックグラウンドレベルのＩＬ−２が分泌されるに過ぎないことである。しかしながら、ＩＬ−２は、Ｔ細胞がそれらの生理学的ＴＣＲとＣＤ２８によって刺激される場合には、生理学的な量で分泌される。ＣＤ３０−細胞はＴ細胞の活性化を誘発しないことから、Ｔ細胞＃１１３８の活性化は、ＣＡＲの特異性によって定義されるように抗原特異的である。
ＣＤ３０＋リンパ腫患者の血清中に蓄積する可溶性ＣＤ３０は、１０μｇ／ｍｌまでの濃度では、ＣＡＲを介したＴ細胞の活性化を遮断しない［Ｈｏｍｂａｃｈ  Ａ，ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｍａｒ  １５；５８（６）：１１１６−９］。これは、ＣＤ３０が標的細胞の表面に固定化されているかまたは表面で発現される場合にのみに起こり得るが、ＣＤ３０タンパク質が溶液中に存在する場合には起こらないＴ細胞の活性化を誘発するためには、ＣＡＲは多コピーの標的化抗原と結合させることによって架橋しなければならないという事実によるものである。
【００５４】
実施例１：ＣＡＲ＃１１３８で修飾したＴ細胞のＣＤ３０＋腫瘍細胞および健常細胞に対する活性
Ｔ細胞のＣＡＲ＃１１３８での操作
ヒト末梢Ｔ細胞への＃１１３８  ＣＡＲの植え付けは、形質導入１２後の２色フローサイトメトリーにより評価した。図２はＣＡＲ操作Ｔ細胞のドットブロット分析を示す。＃１１３８  ＣＡＲ発現を有するＴ細胞の数は全Ｔ細胞の１６．５％であった。
【００５５】
ＣＡＲ＃１１３８を有するＴ細胞および対照Ｔ細胞の精製
Ｔ細胞＃１１３８を６０時間培養し、ＣＡＲに結合する抗体としての抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＦＩＴＣおよびＴ細胞を特定する抗ＣＤ３−ＰＥ抗体で標識し、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩセルソーターを用いて選別した。ゲートはＣＤ３＋ＣＡＲ＃１１３８＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＡＲ＃１１３８−Ｔ細胞に設定した。選別した細胞のアリコートをＦＡＣＳにより再分析した。ＣＤ３＋＃１１３８＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋＃１１３８−Ｔ細胞の純度はそれぞれ９４．４％および９９．６％であった。
【００５６】
同種異系ＣＤ３４＋造血幹細胞の単離
ＣＤ３４＋細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ補充時のボランティアドナーの末梢血から密度遠心分離および磁気セルソーティング（ＭＡＣＳ）により単離した。細胞を抗ＣＤ３４  ＰＥコンジュゲートｍＡｂで標識し、分画細胞および非選別細胞のアリコートをＦＡＣＳにより分析した。単離されたＣＤ３４＋細胞の純度は９４．４％であった。
【００５７】
Ｍｙｌａ細胞のＣＦＳＥ標識
Ｍｙｌａ細胞を１．２５μＭ  ＣＦＳＥで標識し、単離したＣＤ３４＋造血幹細胞と混合した。抗ＣＤ３４−ＰＥ  ｍＡｂにより同定したＣＤ３４＋細胞およびＣＦＳＥ＋Ｍｙｌａ細胞は明確に識別可能であり、両集団を生存力に関して別個に分析できる。
【００５８】
＃１１３８  ＣＡＲを有するＴ細胞の、ＣＤ３０＋リンパ腫細胞とＣＤ３０＋ＣＤ３４＋造血幹細胞に対する再指向された毒性
ＣＤ３０＋ＭｙＬａリンパ腫細胞をＣＤ３０＋ＣＤ３４＋健常造血幹細胞とともに、抗ＣＤ３０  ＣＡＲ＃１１３８で操作したＴ細胞と共培養した。対照として一部のＣＤ３０＋細胞を、同じドナーおよび細胞調製物に由来するＣＡＲ不含Ｔ細胞（「Ｔ細胞＃１１３８陰性」）とともにインキュベートした。
【００５９】
標的細胞の総数をＦＡＣＳにより求め、カウント標準を用いて標準化した。ＣＤ３４＋ＣＤ３０＋造血幹細胞は、モノクローナル抗ＣＤ３４−ＰＥ抗体による染色およびＣＦＳＥ染色Ｍｙｌａ細胞とは異なるＣＳＦＥの欠如により同定した。試験は３反復で行い、データを図３にまとめる。
ＣＤ３４＋造血幹細胞数は、ＣＡＲ不含Ｔ細胞（ｗ／ｏ）、ＣＡＲ含有Ｔ細胞（Ｔ細胞＃１１３８）の存在下または形質導入手順後にＣＡＲを欠くＴ細胞（Ｔ細胞＃１１３８陰性）の存在下では減少しない。ＣＤ３４＋ＣＤ３０＋健常細胞とは対照的に、ＣＤ３０＋ＣＦＳＥ標識Ｍｙｌａ細胞の数は、予想されるＴ細胞のアロ反応性（Ｔ細胞＃１１３８陰性）に加えてＣＡＲ  Ｔ細胞媒介性死滅化（Ｔ細胞＃１１３８）のために実質的に低下した。
【００６０】
ＣＤ３０＋健常細胞および腫瘍細胞に対するＴ細胞ＣＡＲ＃１１３８の毒性を決定するために、死滅標的細胞の数をフローサイトメトリーの手段による直接的様式で求めた。ＣＤ３４＋ＣＤ３０＋健常細胞を抗ＣＤ３４−ＰＥ抗体により同定し、ＣＦＳＥ標識Ｍｙｌａリンパ腫細胞から識別した。生存標的細胞と死滅標的細胞を７−ＡＡＤ染色により決定した。データを図４にまとめる。
【００６１】
結論
健常ヒトＣＤ３０＋ＣＤ３４＋造血幹細胞に対する抗ＣＤ３０  ＣＡＲ＃１１３８を有するＴ細胞の毒性を、ＣＤ３０＋リンパ腫細胞の標的化と比較して試験した。健常ドナーからのＴ細胞を、＃１１３８  ＣＡＲを発現するように操作し、同じ形質導入バッチからＣＡＲを持たないＴ細胞をセルソーティングにより精製した。この手順を用いてＣＡＲ修飾特異的毒性と形質導入プロセス自体によって誘導された非特異的毒性を比較した。
本発明者らは、ＣＤ３４＋同種異系造血幹細胞に対する反応性に関する精製Ｔ細胞＃１１３８の毒性を記録した。さらに、本発明者らは、同じアッセイで異なる標識の標的細胞を混合することにより、ＣＤ３０＋ＣＤ３４＋造血幹細胞に対する毒性と同時にＣＤ３０＋リンパ腫細胞に対する毒性を記録した。この手順により同じアッセイで直接毒性バイスタンダー毒性の評価が可能となる。試験群と対照群の両方で観察時間は２４時間であった。
【００６２】
本発明者らは、ＣＦＳＥ標識ＣＤ３０＋Ｍｙｌａリンパ腫細胞の数は、Ｔ細胞＃１１３８とともにインキュベートした際に＃１１３８陰性Ｔ細胞とともにインキュベートした場合に比べて特異的に低下することを見出した。これと一致して、死滅Ｍｙｌａ標的細胞数は、Ｔ細胞＃１１３８とともにインキュベートした際に実質的に増加した。これに対し、ＣＤ３４＋健常造血幹細胞の絶対数の低下も死滅ＣＤ３４＋細胞数の増加も見られなかった。
本発明者らが、ＣＤ３４＋ＣＤ３０＋細胞の近傍でＴ細胞＃１１３８によるＣＤ３０＋腫瘍細胞の特異的死滅が見られるが、ＣＤ３４＋造血幹細胞に対しては直接的またはバイスタンダー毒性を見出したことは注目に値する。これらのことを考え合わせると、ＣＡＲ＃１１３８を有するＴ細胞は健常ＣＤ３０＋ＣＤ３４＋造血幹細胞に対しては毒性を示さなかったが、ＣＤ３０＋リンパ腫細胞に対しては特異的毒性を示した。
【００６３】
実施例２：マウスモデルにおける健常ヒトＢ細胞およびＴ細胞に対するＣＡＲ＃１１３８操作Ｔ細胞の非毒性活性
用量選択
ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を臍帯血から単離した。新生Ｒａｇ２−／−共通γ鎖−／−マウスに、ヒト造血系を植え付けるために３×１０５のＣＤ３４＋造血幹細胞を移植した。植え付けに成功したマウスにマウス当たり２．５×１０６のＴ細胞を尾静脈への単回注射により移植した。
【００６４】
動物／動物の維持
種：マウス
系統／ストック：Ｒａｇ２−／−ｃγ−／−
種の選抜：Ｔ細胞およびＢ細胞欠乏マウスモデルを用いてヒト造血系を植え付け、この再構成された造血系はヒトの状態を密接に模倣する。
【００６５】
動物の識別
【００６６】
【表１】
0006285553.tif 000002
表１：Ａ−Ｅ＝育種群；ｍ＝雄  ｗ＝雌；マウス１〜６個体
【００６７】
ヒト造血の移植
Ｒａｇ２−／−ｃγ−／−マウスに、臍帯血から単離したヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を植え付け（ＳＯＰ−ＲｅｐｏｐＣＤ３４、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ６）、末梢血中のヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー記録により、５週間後の成熟ヒトリンパ球の樹立の成否をモニタリングした。
【００６８】
試験群
マウスを試験計画に従って３つの試験群に配分した。以下の群を使用した。
【００６９】
マウスのヒト造血による養子細胞療法：自己ヒト造血が樹立されたＲａｇ２−／−ｃγ−／−レシピエントマウスへの＃１１３８  ＣＡＲを有するＣＤ３＋Ｔ細胞のｉ．ｖ．尾静脈注射；対照：＃１１７５  ＣＡＲを有するＣＤ３＋Ｔ細胞の移植
【００７０】
【表２】
0006285553.tif 000003
【００７１】
Ｒａｇ２−／−ｃγ−／−レシピエントマウスにおけるヒト造血細胞の植え付け
ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞移植物の植え付けおよびその後のマウスの末梢血におけるヒト造血の樹立を、移植５週間後のヒトＣＤ４＋細胞およびＣＤ４５＋細胞のフローサイトメトリー記録により評価した。
マウス２１個体中１２個体で植え付けられたヒト造血系が末梢血中のヒトＣＤ４＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞により示された。Ｍｏｃｋ植え付けマウスおよび非処置Ｒａｇ２−／−ｃγ−／−マウスはこれらの細胞を担持しない。同腹マウスＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥにそれぞれ同じドナーのＣＤ３４＋臍帯血細胞を植え付けた。植え付けに成功したマウスだけを養子細胞療法に使用した。
【００７２】
操作ヒトＴ細胞によるＣＡＲ＃１１３８の発現
ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（ＣＤ３４＋細胞と同じドナーに由来）を、ＣＤ３０特異的ＣＡＲ＃１１３８または対照としてＣＥＡ特異的ＣＡＲ＃１１７５を発現するようにｅｘ  ｖｉｖｏで操作した。ＣＡＲ＃１１７５は、ＣＡＲ＃１１３８のＣＤ３０特異的ｓｃＦｖ  ＨＲＳ３の代わりにＣＥＡ特異的ｓｃＦｖ  ＢＷ４３１／２６を担持し、試験を通じて対照として使用した。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞でのＣＡＲ発現は、ＣＡＲおよびヒトＣＤ３の両方の細胞外ヒトＩｇＧ「スペーサー」ドメインのフローサイトメトリー検出により記録した。
【００７３】
ＣＡＲ操作Ｔ細胞を、自己造血系を備えた対応するマウスにｉ．ｖ．注射により移植した（マウス当たり２．５×１０６のＣＡＲ含有Ｔ細胞）。
【００７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける＃１１３８  ＣＡＲを有するＴ細胞の毒性
１．末梢血総数および体重
観察期間中、試験群に明らかな異常は見られなかった。試験群の末梢血の細胞コンパートメントのリンパ球のパーセンテージ（およそ７０％）、単球のパーセンテージ（およそ１０％）および顆粒球のパーセンテージ（およそ２０〜２５％）は、Ｔ細胞を受容していない、または対照ＣＡＲ＃１１７５を有するＴ細胞を受容した対照動物で見られたものと違いはなかった。
【００７５】
抗ＣＤ３０  Ｔ細胞＃１１３８または対照としての抗ＣＥＡ  Ｔ細胞＃１１７５の存在下または不在下でのマウスの末梢血中のＣＤ３０＋Ｔ細胞およびＢ細胞の数を、Ｔ細胞療法前−５日とＴ細胞療法後７、１４、２２、２９、３６、４３、５０日の時点でフローサイトメトリーにより記録した。
【００７６】
７週間の観察期間中、Ｔ細胞療法前−５日に比べて養子細胞療法後に、Ｔ細胞＃１１３８の存在下でのＣＤ３０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ３０＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の数に変化は記録されなかった。ＣＤ３０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、対照としてのＣＥＡ特異的Ｔ細胞＃１１７５を受容したマウスと同等であった。
【００７７】
各マウスの体重を毎週測定した。本発明者らは、観察期間中、各マウスの体重における実質的変化を記録しなかった。さらに、試験群間の違いも記録されなかった。
【００７８】
２．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ＃１１３８刺激時の非毒性
本発明者らは、ＣＡＲ＃１１３８のＨＲＳ３  ｓｃＦｖドメインに対する抗イディオタイプ抗体９Ｇ１０を産生する照射済みの９Ｇ１０ハイブリドーマ細胞の投与により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗ＣＤ３０  ＣＡＲ  Ｔ細胞＃１１３８チャレンジを行った。抗体９Ｇ１０は抗体産生細胞の細胞表面に存在し、操作Ｔ細胞＃１１３８をＣＡＲ架橋により強く活性化する。これらの試験条件で、処置マウスの末梢血中のＣＤ３０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ３０＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞の数は変化しなかった（図５）。
【００７９】
３．試験病原体としてのＬＣＭＶ感染後の免疫応答の不変
病原体に対するリンパ球免疫応答がＴ細胞＃１１３８の存在下で変化するかどうかを調べるため、Ｔ細胞＃１１３８を用いた養子療法後７日目に、Ｒａｇ２−／−ｃγ−／−マウスにおいて植え付けられたヒト免疫系をリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染により抗原刺激した。
【００８０】
このアッセイは、免疫適格宿主における全身ＬＣＭＶ感染は、活性型となって感染部位において炎症性浸潤物を産生し、ＣＤ３０を高レベルで一時的に発現する特定のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞により制御されるという事実に基づく。Ｔ細胞およびＢ細胞免疫系が移植されていないＲａｇ２−／−ｃγ−／−マウスは、抗ＬＣＭＶＴ細胞応答を生成できない。ヒト免疫系が移植されたヒト化Ｒａｇ２−／−ｃγ−／−マウスは、それらがＬＣＭＶ感染後の炎症性浸潤物を生成するかどうかを問われる。
【００８１】
本発明者らは、フットパッドへの局部的ウイルス適用によりＬＣＭＶに対する免疫応答を刺激した。これは数日内に感染部位の腫脹により抗ウイルス免疫応答を示すための従来の感染検定である。
【００８２】
本発明者らは、ここで、完全免疫適格を有する野生型マウス、例えばｂａｌｂ／ｃマウスに関して知られているように、感染部位におけるフットパッドの腫脹を記録した。この感染経路により処置された試験マウスにおいて体重減少は記録されなかった。データは、抗ＣＤ３０  ＣＡＲ  Ｔ細胞＃１１３８による療法後に再構成されたＲａｇ２−／−ｃγ−／−マウスにおいて局部的ＬＣＭＶ感染が局部的に制御されることを示す。試験中に死亡したマウスはなかった。
【００８３】
しかしながら、約３０％の体重減少（１０日目と２７日目では平均１８ｇから１２ｇ）が見られた。抗ＣＤ３０  Ｔ細胞＃１１３８を刺激するために９Ｇ１０抗体細胞を受容したマウスは、劇的な体重減なくＬＣＭＶ感染を制御した。比較として、抗ＣＥＡ  Ｔ細胞＃１１７５による療法後のヒト化Ｒａｇ２−／−ｃγ−／−マウスは体重減少を示さなかった。
【００８４】
データは抗ＣＤ３０  Ｔ細胞＃１１３８を伴うヒト化マウスは全ての場合でフットパッドの腫脹により示されるＬＣＭＶ感染時の細胞性免疫応答を誘導できることを示す。しかしながら、抗ＣＤ３０  Ｔ細胞＃１１３８で処置されたマウスでは、ＬＣＭＶ感染に対する応答は、食物摂取の低下および体重減少をもたらす急激なＴ細胞＃１１３８活性化のために中等度のサイトカイン放出症候群に関連し得る。これは、それらのマウスにおいて標的をもたず活性型とならない抗ＣＥＡ  ＃１１７５  ＣＡＲを有する対照Ｔ細胞を受容したマウスとは対照的である。
【００８５】
４．血清病理学
各試験群のマウスにおいて、さらには全身性のＬＣＭＶ感染を受けた各群のうち１個体のマウスにおいて血清ＧＯＴ（グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ）を記録した。血清ＧＯＴおよびＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｕｎｉｋｌｉｎｉｋ  ＫｏｌｎによりそれらのＳＯＰを用いて測定された。Ｔ細胞療法から５７日後までの観察期間中、処置マウスの血清ＧＯＴレベルに有意な変化は見られなかった。
【００８６】
結論
健常自己ＣＤ３０＋リンパ球に対するＴ細胞＃１１３８の毒性を、ヒト造血系で感染に再構成されたＲａｇ２−／−ｃγ−／−マウスにおいて試験した。３名のドナーからのＴ細胞を抗ＣＤ３０  ＣＡＲ＃１１３８、対照として抗ＣＥＡ  ＣＡＲ＃１１７５で操作し、自己健常ＣＤ３０＋リンパ球に対する自己免疫反応性に関して、特に、ＣＤ３０＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ３０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の排除に関して試験した。試験群および対照群とも全観察時間は６０日であった。
【００８７】
処置マウスにおいて疾患の徴候は記録されなかった。末梢血中のＣＤ３０＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ３０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は変わらなかった。自己免疫毒性の徴候がない場合には、ＣＡＲの結合ドメインと結合してＣＡＲシグナル伝達およびＴ細胞の活性化を誘導する抗イディオタイプ抗体９Ｇ１０の適用による操作Ｔ細胞＃１１３８のｉｎ  ｖｉｖｏ刺激によって促した。末梢血中のＣＤ３０＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞とＣＤ３０＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度に変化は見られなかった。
【００８８】
抗ＣＤ３０Ｔ細胞＃１１３８で処置したヒト化マウスにおける病原体に対するリンパ球免疫応答は、Ｔ細胞＃１１３８の移入後７日目では、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の局部感染により示されるように変化はなかった。しかしながら、処置したマウスは約３０％（１０日目に対して２７日目）の体重減少を受けていた。
Ｔ細胞＃１１７５を移植したマウスはＬＣＭＶ感染後に体重減少を示さなかったことから、本発明者らは、Ｔ細胞＃１１３８を有するマウスにおける抗ＬＣＭＶ免疫応答は、食物摂取の低下をもたらすＣＤ３０＋標的細胞に対する急激な活性化のために中等度のサイトカイン放出症候群を生じたと結論づける。感染中に死亡したマウスはいなかった。
【００８９】
本検定条件下で、Ｔ細胞＃１１３８による養子療法は末梢血中のＢ細胞数およびＴ細胞数を保持し、試験病原体に対する細胞性免疫防御を可能とした。
【００９０】
実施例３：＃１１３８  ＣＡＲにより改変されたＴ細胞の特異的増殖
ＣＡＲ＃１１３８および＃９４６によるＴ細胞の操作
ＣＥＡ特異的ｓｃＦｖ結合ドメインＣＥＡを担持するヒト末梢Ｔ細胞への＃１１３８および比較として＃９４６  ＣＡＲの植え付け（Ｈｏｍｂａｃｈ  Ａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１０  Ｏｃｔ；１７（１０）：１２０６−１３  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１０．９１．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊｕｎ  １７参照）を形質導入の１２時間後に２色ＦＡＣＳにより評価した。初期効率はそれぞれ＃１１３８  ＣＡＲ  Ｔ細胞で２９％、＃９４６  ＣＡＲ  Ｔ細胞で２２％であった。
【００９１】
ＣＡＲ＃１１３８および＃９４６を有するＴ細胞のモニタリング
形質導入後、細胞を１０％ＦＣＳおよびＩＬ−２（５００Ｕ／ｍｌ）を添加したＸｖｉｖｏ１５培地で培養した。培地は１週間に１回交換し、ＩＬ−２を２日置きに加えた。種々の時点で細胞のサンプルを取り出し、ＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＡＲ発現を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ１  Ｆｃ抗体およびＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体を用いて分析した。データを図６にまとめる。
【００９２】
結論
＃１１３８  ＣＡＲ  Ｔ細胞の数は３００時間までの長期培養中に＃９４６  ＣＡＲ  Ｔ細胞に比べて実質的に増加し、＃１１３８  ＣＡＲを有するものは全Ｔ細胞の＞９０％であったのに対し、＃９４６  ＣＡＲを有するＴ細胞は５０％という結果となった。
【００９３】
実施例４：Ｂ細胞の特異的細胞溶解
図７ａに示されるように、Ｂ細胞は、ＰＢＭＣから標準的手順に従って単離した。加えて、Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離し、ＣＡＲ  ＃１１３８を移植し、ＣＦＳＥ標識し、ＣＡＲ＋集団とＣＡＲ−集団に分離した。自己Ｂ細胞を標準的手順に従ってｓＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−４により９６時間活性化し、ＰＫＨ２６で標識し、フローサイトメトリーに基づくセルソーティングによりＣＤ３０＋集団とＣＤ３０−集団に選別した。標識Ｔ細胞をＢ細胞とともに２４時間共培養し（２．５×１０４／ウェル）、回収し、７−ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、悪性Ｔ細胞に相当するＭｙｌａ細胞の標的細胞溶解をＸＴＴに基づく生存アッセイにより調べた。
図７Ｂに示されるように、ＣＡＲ＋またはＣＡＲ−Ｔ細胞によるＣＤ１９＋Ｂ細胞の有意な細胞溶解は見られないが、＃１１３８  ＣＡＲ  Ｔ細胞とともにインキュベートした際にはＣＤ３０＋  Ｍｙｌａ細胞の実質的な細胞溶解が起こった。さらに、ＣＡＲ不含Ｔ細胞と比較してＣＡＲ  ＃１１３８  Ｔ細胞によるＣＤ１９＋Ｂ細胞のＣＤ３０＋細胞およびＣＤ３０−細胞の細胞溶解には実質的な違いはない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【配列表】
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