(57)【要約】  本発明は、メガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子と、ラクチル−ＣｏＡを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の遺伝子とを同時に有し、ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する組換え微生物及びそれを用いたポリラクテートまたはその共重合体の製造方法に関する。本発明によれば、微生物にメガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼを導入することによってラクチル−ＣｏＡを円滑に供給することができるので、ポリラクテートまたはその共重合体を効率的に製造することができる。
2010525835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（me-pct）とラクチル−ＣｏＡを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート（PHA）合成酵素の遺伝子とを同時に有し、ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する組換え微生物。
【請求項２】
ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有しない微生物をメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換して得られるものであるポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有しない微生物は、大腸菌であるポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
上記ラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子は、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９であるポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
ｍｅ−ｐｃｔを含む組換えベクターで形質転換され、同時にｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９を含むベクターで形質転換されるか、又はｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９が染色体上に挿入されているポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する請求項４に記載の組換え微生物。
【請求項６】
ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物をメガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換して得られるポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項７】
上記ＰＨＡ合成酵素の遺伝子は、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９であるポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物は大腸菌なものであるポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート-ラクテート共重合体生成能を有する請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換え微生物をグルコース、ラクテート及びヒドロキシアルカノエートからなる群から選択される１種以上の炭素源を含有する培地で培養した後、上記培養された微生物からポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを特徴とするポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体［poly(hydroxyalkanoateco-lactate)］の製造方法。
【請求項１０】
上記ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を構成するヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレラート、４−ヒドロキシブチレート、炭素数が６〜１４の中鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、２−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシバレリアン酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシバレリアン酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３-ヒドロキシ−４−ペンテン酸、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、３−ヒドロキシ−９−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５，８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルバレリアン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシ酪酸、フェノキシ−３−ヒドロキシバレリアン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ酪酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシバレリアン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリアン酸、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸、３，１��−ジヒドロキシドデカン酸、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸、３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−２−メチル酪酸、３−ヒドロキシ−２−メチルバレリアン酸、及び３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸からなる群から選択される１以上である請求項９に記載のポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法。
【請求項１１】
上記ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体は、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレーレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）、及びポリ（３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）からなる群から選択される請求項９に記載のポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法。
【請求項１２】
メガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（me-pct）とラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子を含むポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体製造用組換えベクター。
【請求項１３】
上記ラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子はｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９である請求項１２に記載のポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体製造用組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とラクチル−ＣｏＡを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート（PHA）合成酵素の遺伝子を同時に有し、ポリラクテート（ＰＬＡ）またはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体（lactate copolymer）生成能を有する組換え微生物、及びそれを用いたポリラクテートまたはその共重合体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリラクテート（PLA，polylactate）は、ラクテート（lactate）由来の代表的な生分解性高分子であって、汎用の高分子または医療用の高分子への応用性が高い高分子である。現在、ＰＬＡは微生物の発酵によって生産されたラクテートを重合することにより製造されているが、ラクテートの直接重合によっては低分子量（１，０００〜５０００ダルトン）のＰＬＡのみが生成される。１００，０００ダルトン以上のＰＬＡを合成するためには、ラクテートの直接重合によって得られた低分子量のＰＬＡから、鎖結合剤（chain coupling agent）を利用してさらに高分子量のＰＬＡに重合する方法がある。しかし、上記方法は、有機溶剤（solvent）や鎖結合剤を添加することから、工程が複雑になり、また、それらを除去し難いという短所がある。
【０００３】
現在、商用化されている高分子量のＰＬＡ生産工程は、ラクテートをラクチド（lactide）に転換した後、ラクチド環の開環縮合反応を通じてＰＬＡを合成する方法が使用されている。
【０００４】
ラクテートの化学合成によってＰＬＡを合成する場合、ＰＬＡホモポリマーは容易に得られるが、様々なモノマー組成を含むＰＬＡ共重合体を合成することは難しく、商業的に利用できないという短所がある。
【０００５】
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）は、過度な炭素源が存在し、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の営養分が不足するとき、微生物がエネルギーや炭素源の保存物質としてその内部に蓄積するポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油由来の合成高分子と類似した物性を有し、且つ完全な生分解性を有するので、既存の合成プラスチックを代替する物質として認識されている。
【０００６】
微生物でＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡモノマーに転換する酵素と、ＰＨＡモノマーを用いてＰＨA高分子を合成するＰＨＡ合成酵素(synthase)が必須である。微生物を用いてＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成するときも、同じシステムが必要とされ、元来のＰＨＡ合成酵素の基質であるヒドロキシアシル−ＣｏＡを提供できる酵素に加えてラクチル−ＣｏＡを提供できる酵素が必要とされる。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼと、それを基質として用いるシュードモナス属６−１９（Pseudomonas sp.6-19）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用して、成功的にポリラクテート及びその共重合体を合成することができた（特許文献１）。
【０００８】
また、特許文献２には、クロストリジウム・プロピオニカム由来プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの変異体を使用して、クロストリジウム・プロピオニカム由来プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの細胞成長阻害及び大腸菌での非効率的な発現問題を解決することによって、ポリラクテート及びその共重合体を高効率で製造することができることが開示されている。
【０００９】
上記特許文献１、２から分かるように、微生物を用いて効率的にポリラクテートまたはその共重合体を生産するためには、細胞成長を大きく阻害しない活性化形態に高発現されたラクチル−ＣｏＡを円滑に供給しうる単量体供給酵素を導入することが非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国特許出願第１０−２００６−０１１６２３４号
【特許文献２】韓国特許出願第１０−２００７−００８１８５５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明者らは、既存システムで使われているクロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ以外の微生物由来のラクチル−ＣｏＡ転換酵素を見つけ出すために鋭意研究し、メガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼがラクチル−ＣｏＡ転換活性があることを確認した（国際公開番号ＷＯ０２／４２４１８  Ａ２）。その後、本発明者らはメガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼをクローニングすることによって、大腸菌を用いて、ポリラクテートまたはその共重合体を高効率で製造することができることを確認し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明の目的は、ラクチル−ＣｏＡの効率的供給酵素としてメガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼを用いて、ポリラクテートまたはその共重合体を高効率で生成することができる組換え微生物及び上記組換え微生物を用いてポリラクテートまたはその共重合体を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、メガスフェラ・エルスデニ由来プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子（me-pct）と、ラクチル−ＣｏＡを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート（PHA）合成酵素の遺伝子とを同時に有し、ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する組換え微生物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、上記組換え微生物をグルコース、ラクテート及びヒドロキシアルカノエートからなる群から選択される１種以上の炭素源を含有する培地で培養し；上記培養された微生物からポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収する；ことを特徴とするポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体［poly(hydroxyalkanoateco-lactate)］の製造方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、メガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子とを含むポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体製造用組換えベクターを提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係るメガスフェラ・エルスデニ由来プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子が導入された組換え微生物ではラクチル−ＣｏＡ供給を円滑に供給することができ、それによりポリラクテートまたはその共重合体を高効率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】グルコース、ラクテート及び３ＨＢを用いてポリラクテート共重合体Ｐ（3HB-co-lactate）を細胞内で合成する経路を示す概略図である。
【図２】本発明のシュードモナス属６−１９由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子とメガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とを含む組換え発現ベクターを作製する過程を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、メガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（me-pct）とラクチル−ＣｏＡを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート（PHA）合成酵素の遺伝子とを同時に有し、ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する組換え微生物を提供する。
【００１９】
本発明の一実施形態によると、上記ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する組換え微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有しない微生物を、メガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換して得ることができる。
【００２０】
上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有しない微生物は大腸菌であってもよい。
【００２１】
上記ラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子はｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９であってもよい。
【００２２】
上記組換え微生物は、ｍｅ−ｐｃｔを含む組換えベクターで形質転換され、同時にｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９を含むベクターで形質転換されるか、または、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９が染色体上に挿入されていてもよい。
【００２３】
本発明の別の実施形態によると、上記組換え微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物をメガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換して得ることができる。
【００２４】
上記ＰＨＡ合成酵素の遺伝子はｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９であってもよい。
【００２５】
上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物は大腸菌であってもよい。
【００２６】
また、本発明は、上記した組換え微生物をグルコース、ラクテート及びヒドロキシアルカノエートからなる群から選択される１種以上の炭素源を含有する培地で培養し；上記培養された微生物からポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収する；ことを特徴とするポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体［poly(hydroxyalkanoateco-lactate)］の製造方法を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は、メガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（me-pct）とラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子とを含むポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体製造用組換えベクターを提供する。
【００２８】
上記ラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子はｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９であってもよい。
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３０】
上記ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する微生物は、（ｉ）ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有しない微生物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子とラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換して得られるか、（ｉｉ）ラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する微生物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子で形質転換して得られるか、または、（ｉｉｉ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子を有する微生物をラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換して得られる、ことを特徴としているが、これに制限されない。
【００３１】
例えば、上記２つ遺伝子（ラクチル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素の遺伝子及びラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子）のいずれかを有する微生物で、その遺伝子を増幅し、且つ別の一つの遺伝子で形質転換させたものも本発明の範囲に属する。
【００３２】
本発明において、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子は、メガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号２４、ｍｅ−ｐｃｔ）であってもよい。
【００３３】
本発明に係る微生物は、ｍｅ−ｐｃｔ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換され、同時にシュードモナス属６−１９由来のＰＨＡ合成酵素の遺伝子であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９を含むベクターで形質転換されるか、またはｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９が染色体上に挿入されていてもよい。この場合、炭素源としてグルコース、ラクテート、及び様々なヒドロキシアルカノエートからなる群から選択された１つ以上を用いてポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を製造できる。
【００３４】
本発明によると、上記組換え微生物をグルコース、ラクテート及びヒドロキシアルカノエートからなる群から選択される１種以上の炭素源を含有する培地で培養し、上記培養された微生物からポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することができる。
【００３５】
上記培養は、ラクテート共重合体を製造するために、ヒドロキシアルカノエートを含有する環境で遂行され得る。このようなヒドロキシアルカノエートには、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレラート、４−ヒドロキシブチレート、炭素数が６〜１４の中鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、２−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシバレリアン酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシバレリアン酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、３−ヒドロキシ−９−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５，８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルバレリアン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシ酪酸、フェノキシ−３−ヒドロキシバレリアン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ酪酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシバレリアン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリアン酸、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸、３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−２−メチル酪酸、３−ヒドロキシ−２−メチルバレリアン酸、３−ヒドロキシ−２，６−ジメチル−５−ヘプテン酸などが挙げられるが、これに制限されない。
【００３６】
上記ヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、炭素数が６〜１４の中鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、３−ヒドロキシバレリアン酸、４−ヒドロキシバレリアン酸、５−ヒドロキシバレリアン酸などが好みしく、３−ヒドロキシブチレート（3-HB）がさらに好ましい（図１参照）。
【００３７】
本発明のラクテート重合体またはラクテート共重合体は、ポリラクテート、ポリ（ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−３−ラクテート）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ポリヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）などが挙げられるが、これに制限されない。
【００３８】
上記ラクテート共重合体の具体的な例は、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（中鎖長（MCL）３−ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレーレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）などであってもよいが、これに制限されない。
【００３９】
図１に示されるように、本発明の一実施例において、微生物は３−ヒドロキシブチレート（3-HB）を含有する環境で培養されていてもよく、上記共重合体はＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）であってもよい。
【００４０】
本発明において、ベクターとは適した宿主内でＤＮＡを発現させるのに適した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、または簡単に潜在的ゲノム挿入物であってもよい。ベクターが適当な宿主に形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムと関係なく自己複製または機能するか、または一部場合に、ゲノムそれ自体に統合され得る。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使われる形態であるので、用語「プラスミド」及び「ベクター」は以下では交互に用いられる。しかし、本発明は当業界に知らされているか、または従来のベクターと同等の機能を遂行するために考慮された、他種のベクターの形態も含む。
【００４１】
用語「発現調節配列」とは、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコード配列の発現に必須であるＤＮＡ配列を意味する。そのような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列はプロモーター、任意にオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサー（enhancer）が含まれる。プラスミドで遺伝子の発現量に影響を及ぼす因子はプロモーターである。高発現用のプロモーターとしてＳＲαプロモーターとサイトメガロウイルス （cytomegalovirus）由来のプロモーターなどが使用されていてもよい。
【００４２】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に様々な発現調節配列中のどのような１つでもベクターに適用できる。例えば、有用な発現調節配列はＳＶ４０またはアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター,ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセラートキナーゼまたは他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、上記ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α−交配システムのプロモーター及び原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節するものと知らされた構成と誘導のその他の配列及びこれらの様々な組合が含まれる。
【００４３】
核酸は他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、“作動可能に連結（operably linked）”される。これは適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）は、調節配列（ら）に結合される時、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列（ら）であってもよい。例えば、プレ配列（pre-sequence）または分泌リーダ（leader）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーは配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか;またはリボソーム結合部位は翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要がない。これらの配列の連結は便利な制限酵素部位でライゲーションによって遂行される。そのような部位が存在しない場合、常法によって合成オリゴヌクレオチド・アダプター（oligonucleotide adaptor）またはリンカー（linker）を使用する。
【００４４】
用語“発現ベクター”とは、通常異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア（recombinant carrier）として一般的に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは宿主細胞から天然的に見つからないＤＮＡであるヘテロタイプのＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一旦宿主細胞内に存在すれば、宿主染色体ＤＮＡと関係なく複製でき、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。
【００４５】
周知のように、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、当該遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製起点（replication origin）を共に含む一つの発現ベクター内に含まれる。発現宿主が真核細胞である場合には、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００４６】
本発明において、組換えベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（Yeast Artificial Chromosome）ベクターなどを使用できる。例えば、本発明の目的上、プラスミドベクターを利用することが好ましい。このような目的に使用され得る典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数百個のプラスミドベクターを含むように複製を効率的に行わせる複製起点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選抜させる抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片が挿入され得る制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在せずとも、常法による合成オリゴヌクレオチド・アダプター（oligonucleotide adaptor）またはリンカー(linker)を使用すれば、ベクター及び外来ＤＮＡを容易にライゲーションすることができる。
【００４７】
本発明に係る組換えベクターは、適切な宿主細胞で常法によって形質転換することができる。宿主細胞としては、バクテリア、酵母及び黴などが可能であるが、これに制限されない。本発明に選好される宿主細胞は、原核細胞であり、大腸菌が好ましい。適した原核宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２菌株２９４、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene）及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｂなどが含まれる。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ．ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種（speices）及び属（genera）などが使用され得る。
【００４８】
上述したＥ．ｃｏｌｉに加えて、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属の菌株、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）のようなバシリ（bacilli）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）またはセラチア・マルセセンス （Serratia marcescens）のような腸内細菌及び様々なシュードモナス（Pseudomonas）属の菌株が宿主細胞として使用できるが、これに制限されない。
【００４９】
また、原核細胞の形質転換はSambrook et al., supraの1.82セクションに記載されたカルシウムクロリド方法を使用して容易に達成することができる。選択的に、また、電気穿孔法（electroporation）（ Neumann et al., EMBO J., 1:841 (1982)）もこのような細胞を形質転換するのに使用することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業者には明らかである。
【００５１】
［製造例1：シュードモナス属６−１９由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング及び発現ベクターの作製］
本発明に使われたシュードモナス属６−１９ （ＫＣＴＣ  １１０２７ＢＰ）由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９）を分離するために、シュードモナス属６−１９ の全体ＤＮＡを抽出し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子配列（Ae-jin Song, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004）に基づいた配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを作製し、ＰＣＲを遂行してｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子を得た。
配列番号１：5'- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3’
配列番号２：5'- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3’
【００５２】
ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動した結果、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子に該当する１．７ｋｂｐサイズの遺伝子切片を確認した。ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素の発現のために、単量体（monomer）供給酵素と合成酵素とが共に発現されるオペンロン形態の常時的発現システムを導入した。
【００５３】
ｐＳＹＬ１０５ベクター（Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347）からラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha） Ｈ１６由来のＰＨＢ（poly(hydroxylbutyrate)）生産オペロンが含有されたＤＮＡ切片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Stratagene）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することによって、ｐＲｅＣＡＢ組換えベクターを製造した。
【００５４】
ｐＲｅＣＡＢベクターは、ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）と単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ及びｐｈａＢＲＥ）がＰＨＢオペロンプロモーターにより常時的に発現され、大腸菌でもよく作動することが知られている（Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347）。ｐＲｅＣＡＢベクターをＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩで切断し、Ｒ．ユートロファＨ１６ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）を除去した後、上記で得られたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子をＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターを製造した。
【００５５】
ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位がそれぞれ両端に一つのみ含まれたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素遺伝子切片を作るために、まず、内在しているＢｓｔＢＩ位置をＳＤＭ（site directed mutagenesis）方法でアミノ酸の変換無しに、除去しており、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位を添加するために、配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６、配列番号７及び配列番号８の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラップＰＣＲを遂行した。
配列番号３：5'- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3’
配列番号４：5' - CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3’
配列番号５：5' - GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3’
配列番号６：5' - CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC - 3’
配列番号７：5' - GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG - 3’
配列番号８：5'- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3’
【００５６】
上記作製したｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターのｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子の塩基配列は、シークエンシングを通して確認し、配列番号９で示し、これによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０で示した。
【００５７】
上記遺伝子塩基配列の類似性を分析した結果、シュードモナス属菌株（Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998）由来のｐｈａＣ１と８４．３％の相同性を有し、アミノ酸配列相同性は８８．９％と上記２合成酵素がだいぶ類似した酵素であることを確認した。その結果、 本発明で得られたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素はＴｙｐｅ  ＩＩ  ＰＨＡ合成酵素であることを確認した。
【００５８】
上記ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素によってＰＨＢの生産を確認するために、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene）に形質転換し、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ  ａｇａｒ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、ＰＨＢ生成が観察されなかった。
【００５９】
［製造例２：シュードモナス属６−１９由来のＰＨＡ合成酵素の基質特異性変異体の作製］
様々な種類のＰＨＡ合成酵素の中で、Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＰＨＡ合成酵素は比較的炭素数の長い基質を重合させるＭＣＬ−ＰＨＡ（medium-chain-length PHA）合成酵素として知られており、このＭＣＬ合成酵素はＰＬＡの共重合体生産に非常に有用であることが期待されている。本発明で獲得したｐｈａＣ１Ｐｓ６-１９合成酵素と非常に相同性の高いシュードモナス属６１−３由来のｐｈａＣ１合成酵素はＴｙｐｅ  ＩＩ合成酵素であるが、比較的広い範囲の基質特異性を有すると報告されている（Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998）。ＳＣＬ−ＰＨＡ（short-chain-length PHA）生産に適した突然変異体に関する研究結果が報告されている（Takase et al., Biomacromolecules, 5:480, 2004)。上記研究に基づいて、本発明ではＳＣＬ活性に影響を及ぼすアミノ酸位置３箇所をアミノ酸配列分析を通して見つけ出し、配列番号１１〜配列番号１６のプライマーを使用したＳＤＭ方法を利用して下記表１のように変異体を作った。
【００６０】
【表１】
2010525835.tif 000003
【００６１】
これらの組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅに形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ  ａｇａｒ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で生育させた結果、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１ＢｌｕｅとｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１ＢｌｕｅでいずれもＰＨＢ生成を確認することができた。即ち、単量体供給酵素であるｐｈａＡＲＥとｐｈａＢＲＥによりグルコースから３ＨＢ−ＣｏＡが生成され、これを基質としてｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９２００及びｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）がＰＨＢを合成したものである。定量的な分析のために、形質転換した組換え大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅをグルコース（２０ｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ培地で３７℃の温度で４日間培養した。培養した組換え大腸菌にスクロースショック（sucrose shock）を与えた後、ナイルレッド（Nile-Red）染色をし、これをＦＡＣＳ（Florescence Activated Cell Sorting）分析した。
【００６２】
野生型合成酵素を含むベクターであるｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢベクターで形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅはナイルレッドにより染色されない反面、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢで形質転換された大腸菌とｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢで形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅは細胞内に蓄積されたＰＨＢがナイルレッドにより染色され、高い蛍光度を示した。また、培養菌体を遠心分離を通して回収し、８０℃の乾燥器で４８時間乾燥した後、気体クロマトグラフィー分析を遂行して細胞内の合成されたＰＨＢ含量を測定した結果、ｐＰｓ６１９Ｃ１２００−ＲｅＡＢで形質転換させた大腸菌とｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢで形質転換させた大腸菌は、乾燥細胞重量に対して、それぞれ２９．７％（ｗ／ｗ）及び４３．１％（ｗ／ｗ）であり、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢの場合は、検出されなかった。
【００６３】
［製造例３：クロストリジウム・プロピオニカム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの発現が可能な組換えベクターの製造］
ＰＬＡまたはその共重合体合成時に必要な単量体であるラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（cp-pct）を用いた。ｃｐ−ｐｃｔの場合、微生物に毒性を示すと知られているが、一般的に組換えタンパク質発現に広く使われるｔａｃプロモーターやＴ７プロモーターを使用したＩＰＴＧによる発現誘導システムでは誘導剤添加と同時に、組換え微生物が全て死滅する。このために弱く発現されるが、微生物成長によって持続的に発現される常時的発現システムを使用することが適すると判断した。ｃｐ−ｐｃｔはクロストリジウム・プロピオニカムの染色体ＤＮＡを配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを利用してＰＣＲして得られた断片を使用した。このとき、元来野生型ｃｐ−ｐｃｔに存在するＮｄｅＩ部位をクローニングの容易性のためにＳＤＭ方法を利用して除去した。
配列番号１７：5' - ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA -3’
配列番号１８：5' - gc tctaga tta gga ctt cat ttc ctt cag acc cat taa gcc ttc tg -3'
【００６４】
また、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を添加するために、配列番号１９と配列番号２０の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラッピングＰＣＲを遂行した。
配列番号１９：5' - agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3’
配列番号２０：5' - gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3’
【００６５】
ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００を含有したｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、ラルストニア・ユートロファＨ１６由来の単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ及びｐｈａＢＲＥ）を除去した後、上記ＰＣＲクローニングしたｃｐ−ｐｃｔ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターを製造した。
【００６６】
［実施例１：メガスフェラ・エルスデニ（Megasphaera elsdenii）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング及び発現ベクターの作製］
本発明に使われたメガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（me-pct）を分離するために、メガスフェラ・エルスデニ（ＤＳＭ  ２０４６０）菌株をＰＹＧ液体培地３０ｍＬに１８時間、嫌気的に培養した後、遠心分離し、ペレットを１００ｍＬ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｅｒを利用して洗浄した後、 Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega, Catalog No. A 1120)を利用して菌株の全体ＤＮＡを抽出した。ＰＹＧ培地の組成と製造法は表２に示した。
【００６７】
【表２】
2010525835.tif 000004
【００６８】
ｍｅ−ｐｃｔ遺伝子配列（ＷＯ０２／４２４１８Ａ２）に基づいた配列番号２１及び配列番号２２の塩基配列を有するプライマーを作製し、ＰＣＲを遂行してｍｅ−ｐｃｔを得た。
配列番号２１：5' - act gaa ttc atg aga aaa gta gaa atc att aca gct g -3’
配列番号２２：5' - agt cat atg tct aga tta ttt ttt cag tcc cat ggg acc gtc -3’
【００６９】
ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動した結果、ｍｅ−ｐｃｔ遺伝子に該当する１．６ｋｂｐサイズの遺伝子切片を確認した。ｍｅ−ｐｃｔの発現のために、ＰＨＡ合成酵素と単量体供給酵素ｃｐ−ｐｃｔとが共に発現されるオペロン形態の常時的発現ベクターであるｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ（韓国特許出願第１０−２００６−０１１６２３４号）を利用した。ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、既存ｃｐ−ｐｃｔ遺伝子を除去した後、上記で得られたｍｅ−ｐｃｔ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＭＥＰＣＴ組換えベクターを製造した（図２参照）。ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位をそれぞれ両端に一つのみ含みながら、開始コドン前にＲＢＳ領域が含まれたｍｅ−ｐｃｔ遺伝子切片を作るために、上記作製したｍｅ−ｐｃｔ遺伝子ＰＣＲ反応物を鋳型とし、配列番号２２と配列番号２３の塩基配列を有するプライマーを利用してＰＣＲを遂行した。
配列番号２３：5' - agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gga aac aga att cat gag aaa agt ag -3’
【００７０】
上記作製したｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＭＥＰＣＴ組換えベクターのｍｅ−ｐｃｔ塩基配列は、シークエンシングを通して確認しており、これは既存ＷＯ０２／４２４１８Ａ２に報告された塩基配列と一致した。ｍｅ−ｐｃｔの正常な発現を確認するために、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＭＥＰＣＴ組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、これを３ＨＢが含まれたＰＨＢ検出培地（ＬＢ  ａｇａｒ、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ２ｇ／Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ)で生育させた結果、ＰＨＢ生成を確認することができた。即ち、培地内に含まれた３ＨＢをｍｅ−ｐｃｔが３ＨＢ−ＣｏＡに転換され、これをｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００合成酵素が重合して細胞内にＰＨＢを蓄積したものである。
【００７１】
［実施例２及び比較例：メガスフェラ・エルスデニ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼを用いたＰＬＡ共重合体製造］
実施例１で作製されたｍｅ−ｐｃｔの活性を定量的に分析するために、組換え発現ベクターｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＭＥＰＣＴ（図２参照）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９とｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９をブドウ糖（２０ｇ／Ｌ）と３ＨＢ（２ｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ培地で、３７℃で、４日間フラスコ培養した。培養菌体を遠心分離して回収し、１００℃の乾燥器で２４時間乾燥した後、気体クロマトグラフィー分析を通して細胞内の合成された高分子含量を測定した。その結果を表３に示した。
【００７２】
【表３】
2010525835.tif 000005
【００７３】
気体クロマトグラフィー分析結果、本発明で製造したｍｅ−ｐｃｔが含まれた組換え発現ベクターは、野生型ｃｐ−ｐｃｔ含有ベクターであるｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターに比べて、ＰＬＡ共重合体合成能が３倍程度優れており、ＰＬＡのモル含量は類似していることを確認した。
【図２】
2010525835.tif 000006
【図１】
2010525835.tif 000007
【配列表】
2010525835000001.app
【国際調査報告】
2010525835.tif 000008
2010525835.tif 000009
2010525835.tif 000010