(57)【要約】  本発明は、コリネバクテリアを利用し、グリセロールを含む多様な炭素源から発酵産物を生産する方法に関する。より具体的には、発酵産物を高収率及び高生産性で生産できる、炭素源の全部または一部をグリセロールとし、外来のグリセロール利用関連ｇｌｐＤＦＫ遺伝子が導入されたコリネバクテリアを利用して発酵を行うことにより、商業的に有用なアミノ酸を培地上に蓄積して生産できる方法に関する。【代表図】図１
2010516274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネバクテリウム ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)ＮＣＴＣ１３１２９由来の配列番号９の塩基配列を有する、グリセロールを利用可能にする遺伝子組み合わせのｇｌｐＤＦＫで形質転換されたことを特徴とするコリネバクテリア。
【請求項２】
コリネバクテリウム ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)ＮＣＴＣ１３１２９由来の配列番号３の塩基配列を有する、グリセロールを利用可能にする遺伝子組み合わせのｇｌｐＤＦＫで形質転換されたことを特徴とするコリネバクテリア。
【請求項３】
前記コリネバクテリアがコリネバクテリウム グルタミカム (Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム グルタミカムＳＭ５(KFCC-11112)及びコリネバクテリウム グルタミカムＣＦ９０５(KFCC-10881)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のコリネバクテリア。
【請求項４】
グリセロールを利用可能にする遺伝子組み合わせのｇｌｐＤＦＫで形質転換されたコリネバクテリアを、炭素源としてグリセロールが一部あるいは全部含まれた培養培地に接種して培養する段階と、前記培養物から発酵産物を分離する段階とを含むことを特徴とする、グリセロールを利用して発酵産物を生産する方法。
【請求項５】
前記ｇｌｐＤＦＫがコリネバクテリウム ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)ＮＣＴＣ１３１２９由来の配列番号９の塩基配列を有することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｇｌｐＤＦＫがコリネバクテリウム ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)ＮＣＴＣ１３１２９由来の配列番号３の塩基配列を有することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記形質転換が、前記ｇｌｐＤＦＫ遺伝子を含むベクターにより行われることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記形質転換が、前記ｇｌｐＤＦＫ遺伝子を含むベクターで宿主細胞を形質転換した後、得られたプラスミドを電気パルス法でコリネバクテリアに導入して行われることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が大腸菌ＣＯ０２−００１４(受託番号：KCCM 10834P)であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記コリネバクテリアがコリネバクテリウム グルタミカム (Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム グルタミカム ＳＭ５(KFCC-11112)及びコリネバクテリウム グルタミカム ＣＦ ９０５(KFCC-10881)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵産物がグルタミン酸またはリシンであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネバクテリアを利用し、グリセロール(glycerol)を含む多様な炭素源から発酵産物を生産する方法に関する。より具体的には、本発明は油類産業及びバイオディーゼル(BioDiesel)を生産する際に形成される副産物のグリセロールを炭素源として含む培養培地を利用し、商業的に有用なアミノ酸であるアスパラギン酸(Aspartate)、スレオニン(Threonine)、リシン(lysine)、メチオニン(methionine)、イソロイシン(isoleucine)、アスパラギン(Asparagine)、グルタミン酸(Glutamic acid)、グルタミン(Glutamine)、プロリン(Proline)、アラニン(Alanine)、バリン(Valine)、ロイシン(Leucine)、トリプトファン(Tryptophan)、チロシン(Tyrosine)、フェニルアラニン(Phenylalanine)及び前記物質の代謝上の中間物質をそれぞれ蓄積可能な、外来のグリセロール利用関連遺伝子が導入された、コリネバクテリアを利用して発酵を行うことにより、前記アミノ酸のような発酵産物を高収率及び高生産性で生産できる、グリセロールを利用した発酵産物の生産方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
上記のアミノ酸は、非常に有用なものであって、アスパラギン酸は、アスパルテーム(aspartame)の原料物質として利用されており、リシンとスレオニン、メチオニン、トリプトファンは、飼料用及び食品用アミノ酸、医薬用アミノ酸として広く利用されている。アスパラギン、イソロイシン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンなどは、食品用及び医薬用アミノ酸として広く利用されている。また、ホモセリン、Ｏ−スクシニルホモセリンは、これらのアミノ酸生産の前駆物質として利用可能である。
【０００３】
高油価が続いていることから、自然界の再生物質を利用した代替エネルギーの開発が注目を浴びている。この中で最も注目を浴びているのが、発酵を通じて得られるエタノール(Bioethanol)及び植物由来オイルから得られるバイオディーゼル(BioDiesel)である。バイオディーゼルは、主に植物由来のオイルを基質として生産されたメタノール(methanol)及び触媒を利用してエステル形成反応(esterification)を通じて合成された脂肪酸メチルエステルあるいは脂肪酸エチルエステルを意味する。この過程で必然的に全体重量の１０％程度の比率でグリセロールが副産物として形成されるようになる。
【０００４】
グリセロールはＣ３Ｈ８Ｏ３で、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６のグルコース(glucose)に比べ１段階還元された物質であって、微生物の代謝過程においてより向上された還元力を提供することができる。発酵を通じて生産される数々の物質が、その代謝過程上で還元力を要求する場合が多いため、グリセロールを基質として効果的に利用できれば、所望の発酵産物の収率及び生産性の向上をもたらすことができる。しかしながら、このような特性にもかかわらず、現在までグリセロールを利用した研究は、ロイテリン(reuterin, 参照：非特許文献１)、２，３−ブタンジオール(2,3-butanediol,参照：非特許文献２)、１，３−プロパンジオール(1,3-propanediol, 参照：非特許文献３)、コハク酸(特許文献１)、イタコン酸(Itaconic acid, 参照：特許文献２)、３−ヒドロキシプロパンアルデヒド(3-hydroxypropanaldehyde, 参照：非特許文献４)、プロピオン酸(propionic acid, 参照:非特許文献５)に限定されていた。その理由は、既存の発酵産業で効果的に利用されていた炭素源に比べ、グリセロールが高価であったからである。したがって、発酵を通じてグリセロールを生産する研究が進行された(非特許文献６)。
【０００５】
しかし、現在はバイオディーゼルの生産量が増え、それによりグリセロールの生産量も増えているため、その値段が急激に落ちている実情である。このような点に根拠し、最近グリセロールを含むバイオディーゼルの副産物を利用して、１，３−プロパノール(非特許文献７)、水素及びエタノールを生産すること(非特許文献８)が報告されたが、代表的な発酵産物であるアミノ酸及び主要な代謝産物の場合は、まだその例を見つけ出すことができない。
【０００６】
今までグリセロールは、石鹸製造業、脂肪酸製造業、ワックス及び界面活性剤生産製造業などで生産されたが、上記のようにバイオディーゼルの生産量が急増することにより、副産物のグリセロールの生産も増え、グリセロールを含んでいる副産物を効果的に処理する問題が発生している。また、精製されたグリセロールの場合も、その値段が急落すると予想される。したがって、グリセロールを利用し、効果的に発酵により有用な発酵産物を生産することができれば、数多い付加効果をもたらすことができる。
【０００７】
微生物のグリセロール利用は、大腸菌(Escherichia coli)とクレブシエラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)でよく知られている。大腸菌において、細胞外部のグリセロールは、エネルギーの消耗無しに、水分だけではなくグリセロールと尿素に対する透過性を有するアクアグリセロポリン(aquaglyceroporin)の一つであるＧｌｐＦを利用して細胞中に入るようになる(非特許文献９)。入ったグリセロールは、グリセロールキナーゼ(glycerol kinase)によりグリセロール-３-リン酸に転換された後、グリセロール-３-リン酸ジヒドロゲナーゼ(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase)によりジヒドロキシアセトンリン酸(dihydroxyacetone phosphate, DHAP)に転換されて、トリオースリン酸イソメラーゼ(Triosephosphate isomerase, TpiA)によりグリセロアルデヒド-３-リン酸(glyceroaldehyde-3-phosphate,G-3-P)に転換されて、解糖過程を経て代謝されるようになる(非特許文献１０)。グリセロールキナーゼの活性がない場合は、グリセロールジヒドロゲナーゼ(glycerol dehydrogenase, Gdh)によりジヒドロキシアセトン(dihydroxyacetone, DHA)に転換された後、グリセロールキナーゼまたはジヒドロキシアセトンキナーゼ(dihydroxyacetone kianse, DHA kinase)によりジヒドロキシアセトンホスフェート(dihydroxyacetone phosphate: DHAP)に転換された後、グリセルアルデヒド-３-リン酸(glyceraldehydes-3-phosphate:G-3-P)に転換されて代謝される(非特許文献１１)。このようなグリセロールの代謝過程は、多様な形態に調節される。特に、グリセロールとグルコースとが共に存在する場合、野生型の大腸菌は、排他的にブドウ糖のみを利用した後、グリセロールを利用する(非特許文献１２)。
【０００８】
コリネバクテリウム属に属する微生物は、産業的に広く利用される微生物であって、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)は、リシン、グルタミン酸ナトリウムのようなアミノ酸の生産に、コリネバクテリウム アンモニアゲネス(C. ammoniagenes)は、核酸などの発酵生産に産業的に広く利用される菌株である。コリネバクテリアの場合、発酵時に炭素源としてブドウ糖、原糖などの多様な炭素源を利用できることが知られており、ｘｙｌＡＢのような遺伝子導入を通じてキシロース(xylose)利用性を付与した場合も知られている(非特許文献１３)。しかしながら、コリネバクテリアの場合、炭素源としてグリセロールの利用に関して知られた場合は少なく、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においても、その利用性が極めて低いことが分かる(特許文献３)。
【０００９】
コリネバクテリウム属に属する微生物の中、４種の微生物に対する全体ゲノム配列がよく知られている。これらの中、唯一にコリネバクテリウム ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)からのみ、完結されたグリセロール利用遺伝子を見つけ出すことができて、他の３種のコリネバクテリウム属のコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)では、グリセロールを利用するに関与するＧｌｐＦなどが欠乏していることが分かった。このような遺伝子の欠損が、コリネバクテリアがグリセロールを効果的に利用するのに障害となるのが分かる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】大韓民国登録番号10-0313134
【特許文献２】米国特許登録番号5,457,040
【特許文献３】大韓民国特許出願2006-057633
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Talarico et. al., Antimicrob.Agents Chemother., 32:1854-1858 (1988)
【非特許文献２】Biebl, et al., Appl Microbiol. Biotechnol. 50:24-29(1998)
【非特許文献３】Menzel, et. al., Enzyme Microb. Technol., 20:82-86 (1997)
【非特許文献４】Doleyres etal. Appl. Micribiol.Biotechnol. 68(4):467-474 (2005)
【非特許文献５】Himmi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53: 435-440 (2000)
【非特許文献６】Wang et al., Biotechnol. Adv., 19(3):201-223 (2001)
【非特許文献７】Gonzalez-Pajuelo et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31: 442-446, (2004)
【非特許文献８】Ito et al., J. Biosci.Bioeng., 100(3): 260-265 (2005)
【非特許文献９】Helleret al., J. Bacteriol. 144:274-278, (1980)
【非特許文献１０】Lin EC, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578, (1976)
【非特許文献１１】Paulsen et al., Microbiology,146:2343-2344, (2000)
【非特許文献１２】Lin, Annu. Rev. Microbiol. 30:535-578,(1976)
【非特許文献１３】Kawaguchi et al.,Appl. Envion. Microbiol. 72(5): 3418-3428 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のように、バイオディーゼルの副産物として得られるグリセロールを炭素源として効果的に利用する場合、相当な付加価値を得ることができる。本発明者らはこのような事実に基づき、産業的に効用価値の高いコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム アンモニアゲネスなどのコリネバクテリアのグリセロール利用可能性について鋭意研究した結果、コリネバクテリアに外来のグリセロール利用遺伝子を導入することにより、コリネバクテリアのグリセロール利用性を画期的に改善することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
したがって、本発明の主要な目的は、コリネバクテリアにおいてグリセロール資化性を画期的に改善できるようにするグリセロール利用関連遺伝子を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、グリセロールを単独または他の炭素源と共に効果的に利用するコリネバクテリア由来の変異体を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、コリネバクテリアがグリセロールを単独または他の炭素源と共に含んだ炭素源を利用し、発酵を通じて発酵産物を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記のような目的を達成するために、本発明は、コリネバクテリアにおいてグリセロール資化性を画期的に改善できるようにするグリセロール利用関連遺伝子を提供する。
【００１７】
本発明において、グリセロール利用関連遺伝子は、コリネバクテリウム ジフテリア由来のグリセロール流入促進タンパク質(Glycerol uptake facilitator protein)をコーディングする遺伝子(以下、glpFという)、ＡＴＰを利用してリン酸化することにより、グリセロール-３-リン酸を生産する酵素であるグリセロールキナーゼ(glycerol kinase)をコーディングする遺伝子(以下、glpKという)、及びグリセロール-３-リン酸を酸化してジヒドロキシアセトン-３-リン酸を生産する酵素であるグリセロール-３-リン酸ジヒドロゲナーゼ(glycerol-3-phospho dihydrogenase)をコーディングする遺伝子(以下、glpDという)を意味する。
【００１８】
前記遺伝子は、微生物外部のグリセロールを微生物内部に入るようにして、これをリン酸化してグリセロール−３−リン酸に転換した後、これをジヒドロキシアセトン−３−リン酸に転換して、最終的に解糖過程の中間物質であるグリセルアルデヒド−３−リン酸に転換して代謝できるようにするポリペプチドをコーディングする遺伝子であって、コリネバクテリアにおいて作動できるものであればいずれも使用可能である。
【００１９】
上記の遺伝子の例は、動物、植物、微生物由来の遺伝子を含む。より好ましい例として、微生物由来の遺伝子が含まれて、さらに好ましくは、コリネバクテリウム ジフテリア NCTC13129(Corynebacterium diphtheriae NCTC13129, ジーンバンク許可番号NC_002935)から得られる遺伝子が含まれる。
【００２０】
また、本発明は、グリセロールを単独または他の炭素源と共に効果的に利用するコリネバクテリア由来の変異体を提供する。
【００２１】
本発明で使用される菌株は、グリセロールを効果的に利用するために、ブドウ糖とグリセロールを同時に消耗して成長することができる。上記のように、ブドウ糖とグリセロールを炭素源として同時に利用する場合、野生型の大腸菌などは排他的にブドウ糖のみを利用して、ブドウ糖を全て利用した後、グリセロールを利用するディオーキシー（diauxy）現象を示す。したがって、グリセロールを含む複合炭素源が供給される時、発酵効率が減少するようになる。
【００２２】
これを克服するために、本発明者らは前記菌株に対してグリセロールとブドウ糖の同時利用可能性を探索し、コリネバクテリア由来のグリセロール利用関連遺伝子を前記菌株に導入することにより、グリセロール及び他の炭素源を共に効果的に使用可能であることが分かった。
【００２３】
一つの様態として、本発明はコリネバクテリウム ジフテリアから得られたグリセロール利用関連タンパク質であるＧｌｐＦ(ジーンバンク許可番号NC_940539.1)、ＧｌｐＫ(ジーンバンク許可番号 NC_940538.1)、ＧｌｐＤ(ジーンバンク許可番号 NC_040540.1)をコーディングする遺伝子を含む微生物を提供する。前記遺伝子は、当業界に通常的に知られた方法を利用してコリネバクテリアを形質転換することができて、グリセロールが単独または他の炭素源と共に含まれた炭素源を効果的に利用してアミノ酸を生産するコリネバクテリウム変異体を提供する。
【００２４】
本発明で使用可能なベクターは、特に制限されず、公知の発現ベクターを使用することができる。好ましくは、大腸菌−コリネバクテリウムシャトルベクターであるpECCG117ベクター(Biotechnology letters vol 13,No.10, p.721-726(1991)を使用することができる。
【００２５】
本明細書において、‘形質転換’という用語は、遺伝子を宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で発現できるようにすることを意味する。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内に発現できるものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されたものでも、染色体の外に位置しているものでもよい。また、前記遺伝子は、ポリペプチドをコーディングすることができるポリヌクレオチドであって、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。また、前記遺伝子は、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いかなる形態で導入されてもよい。例えば、前記遺伝子は、自己的に発現されるに必要なあらゆる要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自己複製の可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記遺伝子は、それ自体またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
【００２６】
本発明の好ましい様態において、形質転換は、ｇｌｐＤＦＫ遺伝子を含むベクターで宿主細胞を形質転換した後、得られたプラスミドを電気パルス法で導入して行われる。前記形質転換された宿主細胞は、大腸菌ＣＯ０２−００１４(受託番号：KCCM  10834P)である。
【００２７】
本発明において、グリセロールを利用してアミノ酸を効果的に生産するためにグリセロール利用関連遺伝子で形質転換された微生物は、コリネバクテリア科(Corynebacteriaceae)に含まれる微生物であって、好ましくはコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物である。さらに好ましくは、コリネバクテリウム グルタミカム(例えば、ATCC13032)、コリネバクテリウム アンモニアゲネス(例えば、ATCC 6872)、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)(例えば、ATCC13869)、ブレビバクテリウム フラバム(Brevibacterium flavum)(例えば、ATCC14067)、コリネバクテリウム テルモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)(例えば、FERM-BP1539)、コリネバクテリウム エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)(例えば、C.efficiens str. YS-314)などからなる種の群から選択される微生物であるが、これらに限定されるものではない。また、上記の種からアミノ酸や核酸のような有用な物質を生産する微生物、例えば、グルタミン酸を生産するコリネバクテリウム グルタミカム ＳＭ５、リシンを生産するコリネバクテリウム グルタミカム ＣＦ ９０５(KFCC-10881)などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
また、本発明はコリネバクテリアがグリセロールが単独または他の炭素源と共に含まれた炭素源を利用し、発酵を通じて発酵産物を生産する方法を提供する。より具体的には、グリセロールを利用可能にする遺伝子組み合わせのｇｌｐＤＦＫを含むベクターで宿主細胞を形質転換する段階；形質転換された宿主細胞から得られたプラスミドをコリネバクテリアに電気パルス法を通じて形質転換させる段階；前記形質転換されたコリネバクテリアを、炭素源としてグリセロールが単独または他の炭素源と共に含まれた培養培地に接種して培養する段階；及び前記培養物から発酵産物を分離する段階を含むことを特徴とする、グリセロールを利用して発酵産物を生産する方法に関する。
【００２９】
本発明の発酵産物を生産する方法において、前記微生物の培養過程は、当業界に知られた適切な培地と培養条件によってなされる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株によって容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例には、回分式、連続式、及び流加式培養が含まれるが、これに限定されるものではない。このような多様な培養方法は、例えば、"Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-HallInternational Editions, pp 138-176に開示されている。
【００３０】
培養に使用される培地は、特定菌株の要求条件を適宜満足しなければならない。本発明で使用される培地は、炭素源としてグリセロールが単独または他の炭素源と共に含み、好ましくは、グリセロールは、培養培地１リットル当たり１ｇ乃至３００ｇが含まれる。その他の適量の炭素源は、多様に利用可能である。特に好ましい炭素源は、ブドウ糖である。使用できる窒素源の例としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、及び大豆ミールのような有機窒素源、及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源が含まれる。これらの窒素源は、単独または組み合わせて使用できる。前記培地には、りん源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応されるナトリウム含有塩を含むことができる。また、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。その他、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などを含むことができる。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式で添加できる。
【００３１】
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加し、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して、気泡生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入するか、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入無しにあるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入する。培養物の温度は、２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養期間は、所望のアミノ酸の生成量になるまで続けることができ、好ましくは１０〜１６０時間である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、コリネバクテリウム グルタミカムATCC13032/ pECCG117-cdi glpDFK-1、コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2を、炭素源としてブドウ糖１００％条件の最小培地下で培養した時、時間当たり成長率を吸光度で示したものである。
【図２】上記のような微生物を、炭素源としてブドウ糖：グリセロール＝５０：５０％条件の最小培地下で培養した時、時間当たり成長率を吸光度で示したものである。
【図３】上記のような微生物を、炭素源としてグリセロール１００％条件の最小培地下で培養した時、時間当たり成長率を吸光度で示したものである。                ATCC13032 : Corynebacterium glutamicum ATCC13032                            DFK-1 : Corynebacterium glutamicum ATCC13032/ pECCG117-cdi glpDFK-1         DFK-2 : Corynebacterium glutamicum ATCC13032/ pECCG117-cdi glpDFK-2
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、 実施例を通じて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
コリネバクテリアにおいて作動できるグリセロール利用関連遺伝子の探索及びクローニング
コリネバクテリウム ジフテリアのグリセロール利用関連遺伝子の塩基配列は、既に明白に明かされて公開されている。米国国立衛生研究所ジーンバンク(NIH GeneBank)からコリネバクテリウム ジフテリアのグリセロール利用関連タンパク質であるGlpF、GlpK、GlpDをコーディングする遺伝子(glpF, glpK及びglpD)及び周辺塩基配列に対する情報を入手した。コリネバクテリウム ジフテリアのGlpFジーンバンク許可番号は、NC_940539.1、GlpKのジーンバンク許可番号は、NC_940538.1、GlpDのジーンバンク許可番号は、NC_940540.1であった。それぞれの遺伝子は、ゲノム上で連続的に存在して、これを利用し、一回のＰＣＲ法を通じて、３種の遺伝子の全部を単一ポリヌクレオチドに増幅した。コリネバクテリウム ジフテリアのグリセロール利用関連遺伝子のＰＣＲ法による増幅には、配列番号１と２のプライマーが使用された。
配列番号1 : 5' GATGCGGCCGCGCTGTGTGGCGTATGTCG3'
配列番号2 : 5'GATGCGGCCGCAATCATCAAACCCAACCCCA 3'
【００３５】
コリネバクテリウム ジフテリアのグリセロール利用関連遺伝子増幅のために、コリネバクテリウム ジフテリア NCTC13129の染色体を生物資源センター(American Type Culture Collection; ATCC)から購入した(ATCC認証番号700971D-5)。コリネバクテリウム ジフテリア NCTC13129の染色体を鋳型として、ＰＣＲ法によりグリセロール利用関連遺伝子を増幅した。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で３分間変性後、９４℃で３０秒間変性、５６℃で３０秒間アニーリング、７２℃４分３０秒間重合を２５回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、4281bpのポリヌクレオチドが得られた。得られたポリヌクレオチドをTOPO TAクローニングキット(Invitrogen社)を利用してpCR2.1にクローニングした。
【実施例２】
【００３６】
得られたｇｌｐＤＦＫ遺伝子の塩基配列決定及びアミノ酸変異復元
得られたプラスミドを制限酵素のNotIで切って、グリセロール利用関連遺伝子が含まれているDNA切片を得た後、これを大腸菌−コリネバクテリウムシャトルベクターのpECCG117でクローニングして、大腸菌TOP10に形質転換した。製作された菌株を大腸菌CO02-0014と命名し、これをＫＣＣＭに受託番号KCCM 10834Pとして寄託した(KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms) of KFCC (Korean Federation of Culture Collection), the International Depository Authority located at 361-221, Hongje-1-Dong, Seodaemungu-Gu,Seoul, Korea, on January 8, 2007)。
【００３７】
通常の知られたプラスミドminiprep法を利用して得られたプラスミドをpECCG117-cdi glpDFK-1と命名した。pECCG117-cdi glpDFK-1のDNA塩基配列を決定した時、171番目から1904番目塩基配列はglpD遺伝子(配列番号4)、1904番目から2644番目塩基配列はglpF遺伝子(配列番号5)、2663番目から4181番目塩基配列はglpK遺伝子(配列番号6)をそれぞれコーディングし、既存のゲノムシーケンシング結果と異なる五つの塩基配列変化があることを確認した(配列番号3)。それぞれの塩基配列の変化は、54番目のチミンがシチジンに、1598番目のアデニンがグアニンに、2608番目のアデニンがグアニンに、2829番目のアデニンがグアニンに、3037番目のアデニンがグアニンに変化した。この中、2829番目の塩基配列の変化のみがアミノ酸の変異を誘発して、他の四つの塩基配列の変異は非表現突然変異(silent mutation)と判明された。変形されたアミノ酸は、glpK領域の56番目アスパラギンがセリンに変化したものであった。変異されたアミノ酸を含むglpKのアミノ酸配列を配列番号６に示した。
【００３８】
変形されたアミノ酸を本来のアスパラギンに変化させるために、位置特異的突然変異法(site-directed mutagenesis)を利用した。glpK領域の56番目アミノ酸である変形されたセリンをアスパラギンに特異的に変異させるためのプライマーを製作して、これを配列番号7及び配列番号8に示した。
配列番号7: 5' GGAAATCTGGGCCAACACGCGCCAAGCC 3'’
配列番号8: 5' GGCTTGGCGCGTGTTGGCCCAGATTTCC 3'
【００３９】
前記プライマーを利用して位置特異的変異を行った。そのために、Stratagene社のQuickChange(登録商標)II XL特定位置突然変異キット(Site-Directed Mutagenesis kit)を利用した。その方法は、製造社の提供した方法に従った。得られたコロニーからプラスミドを公知の方法により抽出し、これを利用し塩基配列を決定して、2829番目アデニンがグアニンに変異されるにつれて、pECCG117-cdi glpDFK-1のglpK領域の56番目セリンがアスパラギンに変化され、既に知られたコリネバクテリウム ジフテリアのGlpKと同一のタンパク質を生産することができることが分かった(配列番号9; 配列番号10)。このように得られたglpDFKプラスミドをpECCG117-cdi glpDFK-2と命名した。
【実施例３】
【００４０】
コリネバクテリウム グルタミカムATCC13032への導入
pECCG117-cdi glpDFK-1とpECCG117-cdi glpDFK-2をそれぞれコリネバクテリウム グルタミカムATCC13032に電気パルス法を利用して導入した後、バクトペプトン10g/L、イースト抽出液10g/L、ビーフ抽出液5g/L、NaCl 2.5g/L、カナマイシン25μg/mLの含まれたプレートで培養した。得られたコロニーに対し、PCRクローニング法を通じて、グリセロール利用関連遺伝子が含まれるプラスミドを有しているコロニーを獲得した。これをそれぞれコリネバクテリウム グルタミカムATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1、コリネバクテリウム グルタミカムATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2と命名した。
【実施例４】
【００４１】
コリネバクテリウム グルタミカムATCC13032のグリセロール利用性確認
コリネバクテリウム グルタミカム/pECCG117-cdi glpDFK-1及びコリネバクテリウム グルタミカム/pECCG117-cdi glpDFK-2のグリセロール利用性を確認するために、まず固体状の最小培地でそれぞれの前記プラスミドを含むコリネバクテリウム グルタミカムATCC13032と、含まないコリネバクテリウム グルタミカムATCC13032を培養した。そのための最小培地の組成は、下記のようである。
コリネバクテリウム グルタミカムの最小培地組成(pH 7.2):グリセロール10g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4・H2O 0.4g/L、尿素 2g/L、(NH4)2SO4 5g/L、NaCl 0.5g/L、ニコチン酸アミド5mg/L、パントテン酸カルシウム1mg/L、チアミン3mg/L、ビオチン200μg/L、微量元素1mL、寒天(Agar)20g/L
【００４２】
接種された菌株を30℃の培養器で48時間培養した。その結果、pECCG117-cdi glpDFK-1及びpECCG117-cdi glpDFK-2が導入されたコリネバクテリウム グルタミカムは、最小培地で成長することを確認することができたが、前記プラスミドが導入されなかった菌株の場合は、成長が微弱であることを確認することができた。
【００４３】
二つの菌株に対して、液状の最小培地における成長性を確認するために、二つの菌株を種培地に接種して24時間培養した後、遠心分離を通じて残りの培地を除去した。pH7.0のリン酸バッファーで2回分散させて、残っている培地を完全に除去した後、40mLの最小培地に接種して30℃で36時間培養した後、成長性を比較した。最小培地の炭素源を比較するために、ブドウ糖12g/Lを含む場合、グリセロール12g/Lを含む場合、ブドウ糖とグリセロールをそれぞれ6g/Lずつ含む場合を比較して、その結果を図１に示した。
【００４４】
上記の結果から分かるように、グリセロール利用遺伝子が導入されていないコリネバクテリウム グルタミカムATCC13032の場合は、グリセロールを効果的に利用することができないため成長が難しいが、グリセロール利用関連遺伝子が導入された菌株の場合、グリセロール炭素源として利用して成長できることが分かる。また、グリセロールが単独で含まれた場合は、コリネバクテリウム グルタミカムATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2がより有利であったが、ブドウ糖単独及びブドウ糖とグリセロールとが混ざっている場合の成長性は、コリネバクテリウム グルタミカムATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1の場合が有利であって、これを利用して実験を進行した。
【実施例５】
【００４５】
グルタミン酸生産菌株のグリセロール利用性の確認
グリセロールを利用し、コリネバクテリアの成長だけではなく、実際有用物質の生産も可能であるかを調べるために、発現ベクターのpECCG117-cdi glpDFK-1をグルタミン酸生産菌株であるコリネバクテリウム グルタミカムSM5(KFCC-11112)に、実施例３と同様な方法により導入した。コリネバクテリウム グルタミカム SM5及びコリネバクテリウム SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1に対し、ブドウ糖のみを炭素源として使用する場合、グリセロールのみを炭素源として使用する場合、それぞれを必要とされる比率で混ぜて使用した場合について、グルタミン酸の生産性を比較した。上記のSM5及び発現ベクターを含むSM5を一白金耳量種培地に接種した後、30℃で18時間培養した。種培地の構成成分は、ペプトン1g/L、酵母エキス0.5g/L、肉汁0.5g/L、グルコース1g/L、塩化ナトリウム0.25g/L、尿素0.13g/Lであり、液相のpHは、7.2である。発酵を行うために、種培養液1mLを培養培地に接種して、30℃で24時間培養した。培養培地の成分は、HSM 3mL、ビオチン1μg/L、廃糖蜜0.05g/L、硫酸アンモニウム0.1g/L、硫酸鉄0.002g/L、硫酸マンガン0.002g/L、硫酸マグネシウム0.05g/L、チアミン塩酸500μg/L、リン酸第一カリウム0.2g/L、尿素0.95g/Lであり、炭素源を培養条件にしたがって添加した。培地のpHは、7.2であった。その結果、L-グルタミン酸の生成を確認することができ、これを比較して表１に示した。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
前記結果において、グリセロールを単独使用する場合、コリネバクテリウム グルタミカム SM5は、成長性が極めて不良で、グルタミン酸の生産量が微量であった。その反面、コリネバクテリウム グルタミカム SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1の場合は、たとえ生産性は減少しても、グリセロールを単独利用して成長することができ、ほぼ等しい収率でグルタミン酸を生産することができた。また、グリセロールをブドウ糖と混ぜて利用した場合において、全体炭素源の50％前後のグリセロールを利用して、その残りをブドウ糖を利用する場合、生産性及び収率の減少無しにグルタミン酸を生産することができることが分かった。その反面、SM5単独の場合は、却ってグルタミン酸の生産が減少することが分かる。
【実施例６】
【００４８】
リシン生産菌株へのグリセロール利用遺伝子導入及びこれを利用したリシン生産
グリセロールを利用したコリネバクテリアの成長だけではなく、実際有用物質の生産も可能であるかを調べるために、発現ベクターのpECCG117-cdi glpDFK-1をリシン生産菌株であるコリネバクテリウム グルタミカム CF 905(KFCC-10881)に、実施例３と同様な方法により導入した。
【００４９】
種培地25mlを含有する250ml corner-baffledフラスコにコリネバクテリウム グルタミカム 親株KFCC10881と本発明の菌株KFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1をそれぞれ接種し、30℃で20時間振とう培養(200rpm)した。生産培地24mlを含有する250ml corner-baffledフラスコ に1mlの種培養液をそれぞれ接種し、30℃で72時間振とう培養(200rpm)した。培養終了後、アミノ酸分析器によりL-リシンの生産量を測定した。コリネバクテリウム グルタミカムKFCC10881とKFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1に対する培養物中のL-リシンに対する結果は、下記表２の通りである。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
上記結果から分かるように、リシン生産菌株にグリセロール利用性遺伝子のpECCG117-cdi glpDFK-1を導入した場合、親株と異なって、グリセロールに対する利用性を示して、リシン生産も増加したことを確認した。
【００５２】
種培地(pH 7.0):
原糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩 1000μg、カルシウム-パントテン酸2000μg、ニコチンアミド2000μg(工程水1リットル基準)。
生産培地(pH 7.0):
ブドウ糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質(Soy protein) 2.5g、Corn Steep Solids 5g、尿素 3g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン 100μg、チアミン塩酸塩 1000μg、カルシウム-パントテン酸 2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g(工程水1リットル基準)
【００５３】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変形することなく、他の具体的な形態で実施され得ることが分かるだろう。これと関連し、以上記述した実施例は全ての面で例示的なものであって、限定的ではないことを理解すべきである。本発明の範囲は、上記詳細な説明よりは、添付の特許請求の範囲の意味及び範囲、そして等価概念から導出される全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上説明したように、本発明は油類産業及びバイオディーゼルの副産物であるグリセロールを利用して、効果的に発酵物質を高い効率で生産する方法を提供する。また、本発明の微生物は、グリセロールの含まれた複合炭素源を含んだ培地及びグリセロールを単独で含んだ培地で効果的に発酵物質を生産することができる。したがって、本発明の微生物に基づいた他の発酵物質を生産する微生物は、効果的にグリセロールを炭素源として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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