(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
ｂ．少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’ＵＴＲエレメント）と、
ヒストンステムループと、
を含み、
前記３’ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含み、
前記変異体が、前記アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲと少なくとも９５％同一であり、
前記３’ＵＴＲエレメントが、前記アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じるものではないことを特徴とする人工核酸分子。
【請求項２】
オープンリーディングフレームが、３’ＵＴＲエレメントがラットアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する場合、ベータ−グロビンをコードしておらず、
オープンリーディングフレームが、３’ＵＴＲエレメントがヒトアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する場合、ヒト第ＩＸ因子をコードしていない請求項１に記載の人工核酸分子。
【請求項３】
前記３’ＵＴＲエレメントが、脊椎動物のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含む請求項１から２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項４】
前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５に係る核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなる、或いは、前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５に係る核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列の断片を含むか又はからなり、かつ、前記配列番号１、配列番号２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５に比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じるものではない請求項１から３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項５】
ｃ．ポリ（Ａ）配列及びポリアデニル化シグナルの少なくともいずれか
を更に含む請求項１から４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項６】
ポリアデニル化シグナルが、３’ＵＴＲエレメント内に位置する請求項５に記載の人工核酸分子。
【請求項７】
ポリアデニル化シグナルが、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎは、Ａ又はＵである）を含む請求項５から６のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項８】
ポリアデニル化シグナルが、３’ＵＴＲの３’末端の５０ヌクレオチド未満上流に位置する請求項５から７のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項９】
ポリ（Ａ）配列が、２０アデニンヌクレオチド〜３００アデニンヌクレオチドの長さを有する請求項５から８のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１０】
オープンリーディングフレームが、アルブミンをコードしていない請求項１から９のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１１】
５’−キャップ構造、ポリ（Ｃ）配列、及びＩＲＥＳモチーフの少なくともいずれかを更に含む請求項１から１０のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１２】
核酸が、更なる５’−エレメント、プロモーター、又は５’ＵＴＲとプロモーター含有配列とを含む請求項１から１１のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１３】
人工核酸分子が、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されている請求項１から１２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１４】
前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量が、野生型オープンリーディングフレームに比べて増加している請求項１から１３のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１５】
オープンリーディングフレームが、コドンが最適化されている領域を含む請求項１から１４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１６】
ＲＮＡ分子である請求項１から１５のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１７】
ａ．オープンリーディングフレーム及びクローニングサイトの少なくともいずれかと、
ｂ．少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’ＵＴＲエレメント）と、
ヒストンステムループと、
を含み、
前記３’ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含み、
前記変異体が、前記アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲと少なくとも９５％同一であり、
前記３’ＵＴＲエレメントが、前記アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じるものではないことを特徴とするベクター。
【請求項１８】
オープンリーディングフレームが、３’ＵＴＲエレメントがラットアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する場合、ベータ−グロビンをコードしておらず、
オープンリーディングフレームが、３’ＵＴＲエレメントがヒトアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する場合、ヒト第ＩＸ因子をコードしていない請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
ＤＮＡベクターである請求項１７から１８のいずれかに記載のベクター。
【請求項２０】
プラスミドベクター又はウイルスベクターである請求項１７から１９のいずれかに記載のベクター。
【請求項２１】
請求項１から１６のいずれかに記載の人工核酸分子を含む請求項１７から２０のいずれかに記載のベクター。
【請求項２２】
環状分子である請求項１７から２１のいずれかに記載のベクター。
【請求項２３】
５’→３’方向において、コード鎖のポリ（Ａ）配列又は３’ＵＴＲエレメントに続いて、環状ベクター分子を線形化するための制限酵素部位が配置されている請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１から１６のいずれかに記載の人工核酸分子又は請求項１７から２３のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項２５】
哺乳類細胞である請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項１から１６のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項１７から２３のいずれかに記載のベクター、又は請求項２４から２５のいずれかに記載の細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２７】
１以上の薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤、及び１以上のアジュバントの少なくともいずれかを更に含む請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
医薬として使用するための請求項１から１６のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項１７から２３のいずれかに記載のベクター、請求項２４から２５のいずれかに記載の細胞、又は請求項２６から２７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ワクチンとして又は遺伝子治療において使用するための請求項１から１６のいずれかに記載の人工核酸分子、請求項１７から２３のいずれかに記載のベクター、請求項２４から２５のいずれかに記載の細胞、又は請求項２６から２７のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オープンリーディングフレームと、３’ＵＴＲエレメントと、任意で、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子に関する。本発明は、更に、好ましくは遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種の分野で使用するための、３’ＵＴＲエレメントを含むベクター、人工核酸分子を含む医薬組成物、並びに人工核酸分子、ベクター、及び／又は人工核酸分子を含む医薬組成物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種は、現代医学の最も有望且つ急速に発展している方法に属する。これらは、非常に広範囲に亘る疾患を治療するための非常に特異的且つ個人的な選択肢を提供することができる。具体的には、遺伝性の遺伝子疾患だけでなく、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患に加えて、炎症性疾患も、かかる治療アプローチの対象となり得る。また、これらアプローチによってかかる疾患の発症を（早期に）予防することも考えられる。
【０００３】
遺伝子治療の背後にある主な概念的理論は、特定の疾患の病態に関連している遺伝子発現の欠陥を適切に調節することである。遺伝子発現の病理学的変化は、重要な遺伝子産物、例えば、ホルモン等のシグナル伝達因子、ハウスキーピング因子、代謝酵素、構造タンパク質等の欠失又は過剰産生を引き起こす場合がある。遺伝子発現の変化は、転写及び／又は翻訳の誤制御によるだけではなく、特定のタンパク質をコードしているＯＲＦ内部の突然変異による場合もある。病理学的突然変異は、例えば、染色体の異常によって、又は点突然変異若しくはフレームシフト突然変異等のより特異的な突然変異によって引き起こされる場合があり、これらは全て、遺伝子産物の機能を限定したり、場合によっては、機能全てを失わせたりする。しかし、細胞の転写又は翻訳機構に関与しているタンパク質をコードしている遺伝子が突然変異によって影響を受ける場合、転写又は翻訳の誤制御が生じる場合もある。かかる突然変異は、制御機能を有する遺伝子の病理学的なアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを導く場合がある。かかる制御機能を発揮する遺伝子産物をコードしている遺伝子は、例えば、転写因子、シグナル受容体、メッセンジャータンパク質等であり得る。しかし、かかる制御タンパク質をコードしている遺伝子の機能が失われても、特定の状況下では、欠陥のある遺伝子産物の更に下流で作用する他の因子を人工的に導入することによって復帰させることができる。また、異常のある遺伝子自体を置換することを介して、遺伝子治療によってかかる遺伝子の欠陥を補償することもできる。
【０００４】
遺伝子ワクチン接種は、選択された抗原（例えば、細菌表面、ウイルス粒子、腫瘍抗原等の特徴的な成分）に対する所望の免疫応答を誘起する。一般的に、ワクチン接種は、現代医学の重要な偉業のうちの１つである。しかし、現在有効なワクチンを利用できる疾患は非常に少数でしかない。したがって、未だ毎年数百万の人々が、ワクチン接種によって予防することができない感染症に冒されている。
【０００５】
一般的に、ワクチンは、「第１」世代、「第２」世代、及び「第３」世代のワクチンに更に分類することができる。「第１世代」のワクチンは、典型的に、全生物ワクチンである。これは、ウイルス、細菌等の生病原体及び弱毒化病原体又は殺病原体に基づく。生病原体及び弱毒化病原体のワクチンの主な問題点は、生命に危険を及ぼすような変異体に戻ってしまうリスクがあることである。したがって、かかる病原体は、たとえ弱毒化されていても、本質的に予測不可能なリスクを有している場合がある。死病原体は、特異的免疫応答を発生させるのに望ましいほど有効ではない場合がある。これらリスクを最小限に抑えるために、「第２世代」のワクチンが開発された。これは、典型的に、病原体に由来する所定の抗原又は組み換えタンパク質成分からなるサブユニットワクチンである。
【０００６】
遺伝子ワクチン、即ち、遺伝子ワクチン接種用ワクチンは、通常、「第３世代」のワクチンとして理解される。これは、典型的に、インビボで病原体又は腫瘍抗原に特徴的なペプチド又はタンパク質（抗原）の断片を発現させる遺伝的に改変された核酸分子で構成される。遺伝子ワクチンは、患者に投与され、被感染能力を有する菌によって取り込まれたときに発現する。投与された核酸が発現することにより、コードされているタンパク質が産生される。これらタンパク質が患者の免疫系によって外来タンパク質であると認識された場合、免疫応答が誘発される。
【０００７】
上記から分かる通り、遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の両方法は、本質的に、核酸分子を患者に投与し、次いで、コードされている遺伝情報を転写及び／又は翻訳させることに基づいている。或いは、遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療は、治療を受ける患者から特定の身体細胞を単離し、次いで、かかる細胞をインビトロでトランスフェクトし、処理された細胞を前記患者に再投与することを含む方法を含んでいてもよい。
【０００８】
ＤＮＡ及びＲＮＡは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種を行う際に、投与するための核酸分子として用いることができる。ＤＮＡは、比較的安定で取り扱いが容易であることが知られている。しかし、ＤＮＡの使用には、投与されたＤＮＡ断片が患者のゲノムに不所望に挿入されて、欠陥の生じた遺伝子の機能が失われてしまう可能性があるというリスクがある。更なるリスクとして、抗ＤＮＡ抗体の不所望な産生が生じたことがある。別の問題点は、ＤＮＡを投与し、転写／翻訳させる際に得ることができる、コードされているペプチド又はタンパク質の発現レベルが限定的である点である。数ある理由の中でも、投与されるＤＮＡの発現レベルは、ＤＮＡ転写を制御する特定の転写因子の存在に依存する。かかる因子が存在しない場合、ＤＮＡ転写によって満足のいく量のＲＮＡが得られない。その結果、翻訳されるペプチド又はタンパク質のレベルが限定される。
【０００９】
遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のためにＤＮＡの代わりにＲＮＡを用いることによって、不所望のゲノムへの組み込み及び抗ＤＮＡ抗体の産生のリスクが最小限に抑えられるか又はなくなる。しかし、ＲＮＡは、遍在するＲＮＡｓｅによって容易に分解され得る比較的不安定な分子種であると考えられている。
【００１０】
インビボでは、ＲＮＡの分解は、ＲＮＡの半減期の制御に寄与している。この効果により真核生物の遺伝子発現の制御が微調整されていると考えられ、立証されている（非特許文献１）。したがって、各自然界に存在するｍＲＮＡは、前記ｍＲＮＡが由来する遺伝子に依存する個々の半減期を有している。このことは、前記遺伝子の発現レベルの制御に寄与している。不安定なＲＮＡは、異なる時点で一過的に遺伝子を発現させるために重要である。しかし、寿命の長いＲＮＡは、別個のタンパク質の蓄積又は遺伝子の連続的発現に関連している場合がある。インビボでは、ｍＲＮＡの半減期は、例えば、インスリン様成長因子Ｉ、アクチン、及びアルブミンのｍＲＮＡについて示されている通り、ホルモン処理等の環境要因にも依存している場合がある（非特許文献２）。
【００１１】
遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種の場合、通常、安定なＲＮＡが望ましい。これは、ＲＮＡ配列によってコードされている産物がインビボで蓄積されることになっているという事実によるものである。他方、ＲＮＡは、好適な剤形に調製されたとき、保存の過程で、及び投与したときに、構造的且つ機能的に一体性を維持しなければならない。したがって、早期に分解又は崩壊するのを防ぐために、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の安定なＲＮＡ分子の提供がかなりの注目を集めた。
【００１２】
核酸分子のＧ／Ｃ含量がその安定性に影響を及ぼす場合があることが報告されている。したがって、多量のグアニン（Ｇ）及び／又はシトシン（Ｃ）残基を含む核酸は、多量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有する核酸よりも機能的に安定であり得る。これに関連して、特許文献１は、翻訳領域の配列を改変することによって安定化したｍＲＮＡを含有する医薬組成物を提供している。かかる配列改変は、遺伝子コードの縮重を利用する。したがって、あまり好ましくない（ＲＮＡの安定性の観点であまり好ましくない）組み合わせのヌクレオチドを含有するコドンを、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに別のコドンに置換してよい。このＲＮＡの安定化方法は、所望のアミノ酸配列の余地を残してはならない各単一のＲＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列の提供によって限定される。また、このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に制限される。
【００１３】
ｍＲＮＡを安定化するための別の選択肢として、自然界に存在する真核生物のｍＲＮＡ分子は、特徴的な安定化エレメントを含有することが見出されている。例えば、真核生物のｍＲＮＡ分子は、５’末端（５’ＵＴＲ）及び／又は３’末端（３’ＵＴＲ）に所謂非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、更に５’−キャップ構造又は３’−ポリ（Ａ）テール等の他の構造的特徴を含む。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、典型的に、ゲノムＤＮＡから転写されるので、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。５’−キャップ及び３’−ポリ（Ａ）テール（ポリ（Ａ）テール又はポリ（Ａ）配列とも呼ばれる）等の成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造的特徴は、通常、ｍＲＮＡのプロセシング中に転写（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。
【００１４】
３’−ポリ（Ａ）テールは、典型的に、転写ｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデニンヌクレオチドの単調な一続きの配列である。これは、最高約４００個のアデニンヌクレオチドを含み得る。かかる３’−ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性にとって重要な要素である可能性があることが見出されている。
【００１５】
また、α−グロビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、α−グロビンｍＲＮＡの周知の安定性にとって重要な因子であり得ることが示されている（非特許文献３）。α−グロビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、その存在がインビトロにおけるｍＲＮＡの安定性と相関している特定のリボ核タンパク質複合体（α−複合体）の形成に関与していることが明らかである（非特許文献４）。
【００１６】
ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす因子にかかわらず、投与された核酸分子が標的細胞又は組織によって有効に翻訳されることは、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種用の核酸分子を用いる任意のアプローチにとって非常に重要である。安定性の制御とともに、大部分のｍＲＮＡの翻訳も、ＵＴＲ、５’−キャップ、及び３’−ポリ（Ａ）テール等の構造的特徴によって制御されている。これに関連して、ポリ（Ａ）テールの長さも同様に翻訳効率にとって重要な役割を果たしている可能性があることが報告されている。しかし、３’−エレメントの安定化は、翻訳を減少させる効果を有している可能性もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第０２／０９８４４３号パンフレット
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，１−１２
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ：Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ，ａｃｔｉｎ，ａｎｄ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．５２８７−５２９１，１９９１
【非特許文献３】Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  α−ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ  ｉｓ  ａ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｖｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ３’−ｔｏ−５’  ｅｘｏｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｃａｐｐｉｎｇ，ＲＮＡ，８，ｐｐ．１５２６−１５３７，２００２
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｍＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １９，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ  １９９９，ｐ．４５５２−４５６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種に応用するのに好適であり得る核酸分子を提供することにある。具体的には、本発明の目的は、翻訳効率において著しい機能喪失を示すことなしに、早期の分解又は崩壊に対して安定化されているｍＲＮＡ種を提供することにある。本発明の別の目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用することができる優れたｍＲＮＡ種をコードする核酸分子を提供することにある。本発明の更なる目的は、遺伝子治療及び／又は遺伝子ワクチン接種において使用するための医薬組成物を提供することにある。要約すると、本発明の目的は、コスト効率が高く且つ簡単なアプローチによって関連技術の上記問題点を克服する改善された核酸種を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の根底にある目的は、請求する発明主題によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
以下の図、配列、及び実施例は、本発明を更に説明することを意図する。これらは、本発明の発明主題を限定することを意図するものではない。
【図１】図１は、人工ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒトα−グロビン３’ＵＴＲ、ヒトアルブミン３’ＵＴＲ、及びヒトβ−グルクロニダーゼ３’ＵＴＲの効果を示す。ここでは、ヒトアルブミン３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡは、本発明に係るｍＲＮＡである。それは、キタアメリカホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼをコードしているオープンリーディングフレームと、それに続いて、５’から３’方向に、配列番号２に係る３’ＵＴＲエレメントと、６４アデニン長のポリ（Ａ）配列とを含む。配列番号２に対応するヒトアルブミン３’ＵＴＲを含有する人工ｍＲＮＡからのタンパク質発現が著しく延長されることが観察できる。  ３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現と比べて、ヒトα−グロビン３’ＵＴＲ、ヒトアルブミン３’ＵＴＲ、又はヒトβ−グルクロニダーゼ３’ＵＴＲの効果を調べた。したがって、様々なｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、及び４８時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から４８時間後にかけて低下し、４８時間後には６時間後のシグナルの１０％しか残っていなかった。α−グロビン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を中等度安定化させる。しかし、驚くべきことに、本発明のヒトアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を更に著しく延長する。対照的に、安定なβ−グルクロニダーゼｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、アルブミン３’ＵＴＲでみられた程度まではルシフェラーゼ発現を延長せず、これは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現の延長においてアルブミン３’ＵＴＲが特に効率的であることを確認するものである。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準偏差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．１に要約する。
【図２】図２は、ヒトα−グロビン３’ＵＴＲ又は幾つかの異なる安定なｍＲＮＡのいずれかの３’ＵＴＲを含有するｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現と比べた、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒトアルブミン３’ＵＴＲの効果を示す。したがって、様々なｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、及び４８時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から４８時間後にかけて低下し、４８時間後には６時間後のシグナルの１４％しか残っていなかった。α−グロビン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を中等度安定化させる。しかし、驚くべきことに、本発明のヒトアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を更に著しく延長する。アルブミン３’ＵＴＲと比べて、幾つかの異なる安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、遥かに低い程度しかｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に影響を与えない。ａｔｐ５ｏ及びａｔｐ５ｌの３’ＵＴＲは、ルシフェラーゼ発現を安定させる程度がアルブミン３’ＵＴＲよりも遥かに低い。更に、ａｔｐ５ｏ及びａｔｐ５ｌの３’ＵＴＲは、アルブミン３’ＵＴＲに比べてルシフェラーゼレベルを実質的に低下させる。安定なｎｄｕｆａ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、ルシフェラーゼ発現を著しく安定化させる。しかし、ｎｄｕｆａ１の３’ＵＴＲも、ルシフェラーゼレベルを実質的に低下させる。アルブミン３’ＵＴＲは、全タンパク質発現を維持しながらタンパク質発現を延長させる点で独特である。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準偏差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．２に要約する。
【図３】図３は、ヒトアルブミン３’ＵＴＲを含有するｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する、ヒトアルブミン３’ＵＴＲからＨｉｄＩＩＩ制限酵素部位及び／又はＸＢａＩ制限酵素部位及び／又はＴ７終結シグナルを除去する点突然変異の効果を示す。したがって、様々なｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。コトランスフェクトしたＲｒＬｕｃのシグナルによって、ＰｐＬｕｃシグナルをトランスフェクション効率について補正した。α−グロビン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を非常に僅かにしか安定化しない。対照的に、アルブミン３’ＵＴＲの全ての変異体は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長する。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準偏差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．４に要約する。
【図４】図４は、３’ＵＴＲを有しないＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。
【図５】図５は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。ヒトアルブミンの３’ＵＴＲをＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。配列は、Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８２；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．Ｊａｎ；７９（１）：７１−５から得た。
【図６】図６は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン２−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。一点突然変異によってＴ７終結シグナルが除去されているヒトアルブミンの３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図７】図７は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン３−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。一点突然変異によってＴ７終結シグナルが除去されているヒトアルブミンの３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図８】図８は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン４−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。一点突然変異によってＴ７終結シグナルが除去されているヒトアルブミンの３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図９】図９は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン５−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。２つの連続する点突然変異によってＴ７終結シグナルが除去されているヒトアルブミンの３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図１０】図１０は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン６−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。２つの一点突然変異によってＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位が除去されているヒトアルブミンの３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図１１】図１１は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。３つの一点突然変異によってＴ７終結シグナルに加えてＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位が除去されているヒトアルブミンの３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図１２】図１２は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。ヒトα−グロビンの３’ＵＴＲの中央のα複合体結合部分を、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図１３】図１３は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｇｕｓｂ−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。ヒトβ−グルクロニダーゼの３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図１４】図１４は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｔｐ５ｏ−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。ヒトＡＴＰシンターゼサブユニットＯの３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図１５】図１５は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｎｄｕｆａ１−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１αサブ複合体サブユニット１の３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図１６】図１６は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｔｐ５ｌ−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。ヒトＡＴＰシンターゼサブユニットｇの３’ＵＴＲを、ＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。
【図１７】図１７は、本発明に係る３’ＵＴＲエレメントのタンパク質産生安定化及び／又はタンパク質産生延長効果を例示的に示す。曲線は、経時的に測定した、（例えば、哺乳類細胞において）核酸分子から産生されたタンパク質の量を表す。実線は、本発明に係る人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からのタンパク質産生を表す。破線は、例えば、３’ＵＴＲを有しないか、又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、レポータータンパク質をコードしているＯＲＦと自然界において併存している３’ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子からのタンパク質産生を表す。太い横線は、閾値を表す。これは、例えば、核酸分子の発現開始（例えば、トランスフェクション）の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後に測定されたタンパク質量であってよい。レファレンス核酸分子から産生されたタンパク質量は、発現開始（例えば、トランスフェクション）の約３２時間後に閾値を下回るが、一方、本発明に係る人工核酸分子から産生されたタンパク質量は、発現開始（例えば、トランスフェクション）の約６８時間後に閾値を下回ることが分かる。産生されたタンパク質の合計量は、曲線下面積（ＡＵＣ）に等しい。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子から産生されたタンパク質の合計量は、少なくとも、３’ＵＴＲを有しないレファレンス核酸分子から産生されたタンパク質の合計量である。
【図１８】図１８は、３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現と比べた、人工ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する霊長類由来の様々なアルブミン３’ＵＴＲの効果を示す。ここでは、ヒトアルブミン３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ（アルブミン）及びアヌビスヒヒ由来のアルブミンの３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ（アルブミン８）が、本発明に係るｍＲＮＡである。これらは、キタアメリカホタルのルシフェラーゼをコードしているオープンリーディングフレームと、それに続いて、５’から３’方向に、配列番号２又は配列番号３３に係る３’ＵＴＲエレメントと、６４アデニン長のポリ（Ａ）配列とを含む。配列番号２又は配列番号３３に対応するアルブミン３’ＵＴＲを含有する人工ｍＲＮＡからのタンパク質発現が著しく延長されることが観察できる。  ３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現と比べた、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対するヒトアルブミン３’ＵＴＲ及びアヌビスヒヒ由来のアルブミンの３’ＵＴＲの効果を調べた。ルシフェラーゼ発現を調べるために、様々なｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞にエレクトロポレーションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から７２時間後にかけて低下し、７２時間後には６時間後のシグナルの５％しか残っていなかった。本発明のヒトアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長する。アヌビスヒヒ由来のアルブミン３’ＵＴＲ（アルブミン８）は、ヒトアルブミン３’ＵＴＲ配列と同程度ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を延長する。したがって、霊長類由来のアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長するのに特に好適である。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準偏差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．４、表７に要約する。
【図１９】図１９は、様々なトランスフェクション方法を用いて、３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現と比べて、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する様々な霊長類由来のアルブミン３’ＵＴＲの効果を示す。したがって、様々なｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞にリポフェクションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から４８時間後にかけて低下し、６時間後のシグナルの８２％になった。また、ヒトアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長し、４８時間後のシグナルは、６時間後のシグナルよりも高かった。アヌビスヒヒ由来のアルブミン３’ＵＴＲ（アルブミン８）は、ヒトアルブミン３’ＵＴＲ配列と同程度ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を延長する。したがって、霊長類由来のアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長するのに特に好適である。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準偏差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．４、表９に要約する。
【図２０】図２０は、３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現と比べた、マウス細胞におけるｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する様々な霊長類由来のアルブミン３’ＵＴＲの効果を示す。したがって、様々なｍＲＮＡをマウス線維芽細胞株であるＬ−９２９細胞にリポフェクションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から４８時間後にかけて低下し、４８時間後には６時間後のシグナルの２３％しか残っていなかった。マウス細胞においてさえも、ヒトアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長する。アヌビスヒヒ由来のアルブミン３’ＵＴＲ（アルブミン８）も同様にｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を延長する。したがって、霊長類由来のアルブミン３’ＵＴＲは、哺乳類細胞種におけるｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長するのに特に好適である。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準偏差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．５、表１１に要約する。
【図２１】図２１は、３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現と比べた、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に対する様々な哺乳類由来のアルブミン３’ＵＴＲの効果を示す。したがって、様々なｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にリポフェクションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から４８時間後にかけて低下し、４８時間後には６時間後のシグナルの４９％しか残っていなかった。ヒトアルブミン３’ＵＴＲ及びアヌビスヒヒ由来のアルブミン３’ＵＴＲ（アルブミン８）は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長し、４８時間後のシグナルは、６時間後のシグナルよりも高かった。重要なことに、マウス由来のアルブミン３’ＵＴＲ（アルブミン９）も同様にｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を延長する。したがって、哺乳類由来のアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長するのに特に好適である。トリプリケートのトランスフェクションについて、平均ＲＬＵ±ＳＤ（相対光単位±標準偏差）としてデータをグラフ化する。ＲＬＵを実施例５．６、表１３に要約する。
【図２２】図２２は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン８−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。アヌビスヒヒのアルブミンの３’ＵＴＲをＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。配列は、ＮＣＢＩレファレンス配列ＸＭ＿００３８９８７８３．１から得た。
【図２３】図２３は、ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン９−Ａ６４のｍＲＮＡ配列を示す。マウスのアルブミンの３’ＵＴＲをＯＲＦとポリ（Ａ）との間に挿入した。配列は、ＮＣＢＩレファレンス配列ＮＭ＿００９６５４．３から得た。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
明確に且つ読みやすくするために、以下の定義を提供する。これら定義について言及される任意の技術的特徴は、本発明の各実施形態及び全実施形態において読み取ることができる。これら実施形態に関連して更なる定義及び説明を具体的に提供する場合がある。
【００２３】
適応免疫応答：適応免疫応答は、典型的に、免疫系の抗原特異的応答であると理解される。抗原特異性により、特定の病原体又は病原体に感染している細胞に合わせた応答を生じさせることができる。これら病原体又は細胞に合わせた応答を開始させる能力は、通常、「記憶細胞」によって体内に維持されている。身体がある病原体に１回超感染した場合、これら特異的記憶細胞を用いて、前記病原体を速やかに除去する。これに関連して、適応免疫応答の第１の工程は、抗原提示細胞による抗原特異的免疫応答を誘導することができる抗原特異的なナイーブＴ細胞又は様々な免疫細胞の活性化である。これは、ナイーブＴ細胞が常に通過しているリンパ組織及び器官で生じる。抗原提示細胞として機能し得る３種の細胞は、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞である。これら細胞は、それぞれ、免疫応答の誘発において異なる機能を有する。樹状細胞は、食作用及びマクロピノサイトーシスによって抗原を取り込むことができ、また、例えば外来抗原と接触することによって刺激されて、樹状細胞が成熟樹状細胞に分化する局所リンパ組織に遊走することができる。マクロファージは、細菌等の特定の抗原を摂取し、感染因子又は他の適切な刺激によって誘導されてＭＨＣ分子を発現させる。また、受容体を介して可溶性タンパク質抗原に結合し、内部に取り込むＢ細胞の独自の能力は、Ｔ細胞の誘導にとって重要であり得る。ＭＨＣ分子は、典型的に、抗原のＴ細胞への提示を担当する。ＭＨＣ分子における抗原の提示により、Ｔ細胞が活性化されて、前記Ｔ細胞の増殖及びアームドエフェクターＴ細胞への分化が誘導される。エフェクターＴ細胞の最も重要な機能は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞によって感染細胞を殺傷し、共に細胞媒介免疫を構成するＴｈ１細胞によってマクロファージを活性化させ、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１細胞の両方によってＢ細胞を活性化させて様々な分類の抗体を産生させ、それによって体液性免疫応答を駆動することである。Ｔ細胞は、抗原を直接認識したり結合したりはしないが、その代わり、例えば、他の細胞の表面上のＭＨＣ分子に結合している病原体由来のタンパク質抗原の短いペプチド断片（例えば、所謂エピトープ）を認識するＴ細胞受容体によって抗原を認識する。
【００２４】
適応免疫系：適応免疫系は、本質的に、病原体の成長を停止させる又は妨げることに専念している。適応免疫系は、典型的に、特定の病原体を認識及び記憶し（免疫を生じさせ）、前記病原体に遭遇したときにより強い攻撃を開始する能力を脊椎動物の免疫系に付与することによって適応免疫応答を制御する。前記系は、体細胞超変異（体細胞の突然変異が加速されるプロセス）及びＶ（Ｄ）Ｊ組み換え（抗原受容体遺伝子セグメントの不可逆的な遺伝子組み替え）により、高度に適応可能である。この機序により、少数の遺伝子が膨大な数の様々な抗原受容体を産生することができ、前記抗原受容体は、後に、個々のリンパ球で一意的に発現する。遺伝子の再配置により各細胞のＤＮＡが不可逆的に変化するので、かかる細胞の後代（子孫）は全て、長命特異的免疫にとって重要であるメモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞を含む、同じ受容体特異性をコードしている遺伝子を受け継ぐ。
【００２５】
アジュバント／アジュバント成分：アジュバント又はアジュバント成分は、最も広い意味では、典型的に、薬物又はワクチン等の他の剤の効果を変化させ得る、例えば、強化し得る薬理学的及び／又は免疫学的剤である。アジュバント又はアジュバント成分は、広義で解釈すべきであり、広範囲に亘る物質を指す。典型的に、これら物質は、抗原の免疫原性を高めることができる。例えば、アジュバントは、自然免疫系によって認識され得、例えば、自然免疫応答を誘発することができる。「アジュバント」は、典型的に、適応免疫応答を誘発しない。したがって、「アジュバント」は、抗原として適切ではない。アジュバントの作用機序は、適応免疫応答を生じさせる抗原によって誘発される効果とは異なる。
【００２６】
抗原：本発明において、「抗原」は、典型的に、免疫系によって、好ましくは適応免疫系によって認識され得る物質を指し、例えば、適応免疫応答の一部として抗体及び／又は抗原特異的Ｔ細胞を形成することによって抗原特異的免疫応答を誘発することができる。典型的に、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチド又はタンパク質であってもよく、前記ペプチド又はタンパク質を含んでいてもよい。
【００２７】
人工核酸分子：人工核酸分子は、典型的に、自然界には存在しない核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であると理解してよい。言い換えれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子として理解してよい。かかる核酸分子は、その個々の配列（自然界には存在しない）及び／又は他の修飾（例えば、自然界には存在しないヌクレオチドの構造的修飾）から非天然であり得る。人工核酸分子は、ＤＮＡ分子であってもよく、ＲＮＡ分子であってもよく、ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを含むハイブリッド分子であってもよい。典型的に、人工核酸分子は、所望の人工ヌクレオチド配列（異種配列）に相当するように遺伝子改変方法によって設計及び／又は作製することができる。これに関連して、人工配列は、通常、自然界には存在し得ない配列である、即ち、少なくとも１つのヌクレオチドが野生型配列とは異なる。用語「野生型」とは、自然界に存在する配列であると理解してよい。更に、用語「人工核酸分子」の意味は、「１つの単一分子」には限定されず、典型的に、同一分子の集合体を含むと理解される。したがって、アリコートに含有される複数の同一分子を指す場合がある。
【００２８】
２シストロン性ＲＮＡ、多シストロン性ＲＮＡ：２シストロン性又は多シストロン性のＲＮＡは、典型的に２つ（２シストロン性）又はそれ以上（多シストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し得るＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである。これに関連して、オープンリーディングフレームは、ペプチド又はタンパク質に翻訳可能なコドンの配列である。
【００２９】
担体／高分子担体：本発明における担体は、典型的に、別の化合物（カーゴ）の輸送及び／又は複合体化を促進する化合物であってよい。高分子担体は、典型的に、高分子で形成される担体である。担体は、共有相互作用又は非共有相互作用によってカーゴに結合し得る。担体は、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を標的細胞に輸送することができる。担体は、幾つかの実施形態では、カチオン性成分であってよい。
【００３０】
カチオン性成分：用語「カチオン性成分」は、典型的に、典型的に１〜９のｐＨ値、好ましくは９以下（例えば、５〜９）、８以下（例えば、５〜８）、７以下（例えば、５〜７）のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ（例えば、７．３〜７．４）を有する正に帯電している帯電分子（カチオン）を指す。したがって、カチオン性成分は、任意の正に帯電している化合物又はポリマーであってよく、好ましくは、生理学的条件下で、特にインビボにおける生理学的条件下で正に帯電しているカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。「カチオン性のペプチド又はタンパク質」は、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＯｒｎから選択される、少なくとも１つの正に帯電しているアミノ酸、又は１超の正に帯電しているアミノ酸を含有していてよい。したがって、所与の条件下で１超の正電荷を呈する「ポリカチオン性」成分も、カチオン性成分の範囲内である。
【００３１】
５’−キャップ：５’−キャップは、一般的に成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する実体、典型的に修飾ヌクレオチド実体である。５’−キャップは、典型的に、修飾ヌクレオチド、特に、グアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−三リン酸結合を介して５’末端に結合する。５’−キャップは、メチル化されていてもよく、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ（式中、Ｎは、５’−キャップを有する核酸の５’末端のヌクレオチド、典型的に、ＲＮＡの５’末端である）である。５’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、逆転デオキシ非塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆転ヌクレオチド部分、３’−３’−逆転非塩基部分、３’−２’−逆転ヌクレオチド部分、３’−２’−逆転非塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。
【００３２】
細胞免疫／細胞免疫応答：細胞免疫は、典型的に、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、及び抗原に応答する様々なサイトカインの放出を指す。より一般的な用語では、細胞免疫は、抗体に基づくのではなく、免疫系の細胞の活性化に基づく。典型的に、細胞免疫応答は、細胞（例えば、樹状細胞又は他の細胞等の特定の免疫細胞）においてアポトーシスを誘導することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化し、その表面上に外来抗原のエピトープを提示することを特徴とし得る。かかる細胞は、ウイルスに感染していてもよく、細胞内細菌に感染していてもよく、腫瘍抗原を提示する癌細胞であってもよい。更なる特徴は、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞を活性化して病原体を破壊させたり、細胞を刺激して適応免疫応答及び自然免疫応答に関与している他の細胞の機能に影響を及ぼす様々なサイトカインを分泌させたりすることであり得る。
【００３３】
ＤＮＡ：ＤＮＡは、デオキシリボ核酸の一般的な略称である。ＤＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸のモノマーであり、これらは、単独で、糖部分（デオキシリボース）、塩基部分、及びリン酸部分で構成され、特徴的な骨格構造により重合する。前記骨格構造は、典型的に、第１のヌクレオチドの糖部分（即ち、デオキシリボース）と、隣接する第２のモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の順序、即ち、糖／リン酸骨格に結合している塩基の順序が、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖形態では、第１の鎖のヌクレオチドは、典型的に、例えばＡ／Ｔ塩基対合及びＧ／Ｃ塩基対合によって第２の鎖のヌクレオチドとハイブリダイズする。
【００３４】
エピトープ：（「抗原決定基」とも呼ばれる）は、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープとに分けることができる。本発明におけるＴ細胞エピトープ又はタンパク質の一部は、好ましくは約６アミノ酸長〜約２０アミノ酸長又はそれ以上のアミノ酸長を有する断片、例えば、好ましくは約８アミノ酸長〜約１０アミノ酸長、例えば、８アミノ酸長、９アミノ酸長、又は１０アミノ酸長（又は更には１１アミノ酸長又は１２アミノ酸長）を有するＭＨＣクラスＩ分子によって処理及び提示される断片、或いは、好ましくは約１３アミノ酸長以上、例えば、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、又はそれ以上のアミノ酸長を有するＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理及び提示される断片を含んでよく、これら断片は、アミノ酸配列の任意の部分から選択してよい。これら断片は、典型的に、ペプチド断片及びＭＨＣ分子からなる複合体の形態でＴ細胞によって認識される。即ち、前記断片は、典型的に、そのネイティブな形態では認識されない。Ｂ細胞エピトープは、典型的に、好ましくは５アミノ酸〜１５アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸〜１２アミノ酸、更により好ましくは６アミノ酸〜９アミノ酸を有する、本明細書に定義する（ネイティブな）タンパク質又はペプチド抗原の外表面上に位置する断片であり、これは、即ちそのネイティブな形態で抗体によって認識され得る。
【００３５】
更に、タンパク質又はペプチドのかかるエピトープは、かかるタンパク質又はペプチドの本明細書に記載する変異体のいずれかから選択してよい。これに関連して、抗原決定基は、本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列において不連続であるが、三次元構造では結合する本明細書に定義するタンパク質又はペプチドのセグメントで構成される高次構造エピトープ又は不連続エピトープであってもよく、単一ポリペプチド鎖で構成される連続エピトープ又は線状エピトープであってもよい。
【００３６】
配列の断片：配列の断片は、典型的に、例えば、核酸分子又はアミノ酸の配列の完全長配列のより短い部分であってよい。したがって、断片は、典型的に、完全長配列内の相当する一続きと同一である配列からなる。本発明における好ましい配列の断片は、前記断片が由来する分子における連続する一続きの実体に相当するヌクレオチド又はアミノ酸等の連続する一続きの実体からなり、前記断片が由来する分子全体（即ち、完全長分子）の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。
【００３７】
Ｇ／Ｃ改変：Ｇ／Ｃ改変核酸は、典型的に、好ましくは野生型配列よりも多数のグアノシン／シトシンヌクレオチドを含む改変野生型配列に基づく核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子であってよい。グアノシン又はシトシンヌクレオチドを含有するコドンでアデノシン又はチミジンヌクレオチドを含有するコドンを置換することによって、このように数を増加させることができる。ＤＮＡ又はＲＮＡのコード領域におけるＧ／Ｃ含量を増加させる場合、遺伝コードの縮重を利用する。したがって、コドン置換は、コードされているアミノ酸残基は変化させず、核酸分子のＧ／Ｃ含量のみを増加させることが好ましい。
【００３８】
遺伝子治療：遺伝子治療は、典型的に、ペプチド又はタンパク質をコードしている核酸による患者の身体又は患者の身体の単離要素（例えば、単離組織／細胞）の治療を意味すると理解してよい。遺伝子治療は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を任意の投与経路によって患者に直接投与するか、又はインビトロで前記患者の単離細胞／組織に投与して、インビボ／エキソビボ又はインビトロで前記患者の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意でｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を前記患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含んでよい。
【００３９】
遺伝子ワクチン接種：遺伝子ワクチン接種は、典型的に、抗原若しくは免疫原をコードしている核酸分子又はその断片を投与することによるワクチン接種であると理解してよい。前記核酸分子は、被験体の身体又は被験体の単離細胞に投与してよい。身体の特定の細胞をトランスフェクトした際又は単離細胞をトランスフェクトした際、これら細胞は、前記抗原又は免疫原を発現し、次いで、免疫系に提示して、適応免疫応答、即ち、抗原特異的免疫応答を誘発し得る。したがって、遺伝子ワクチン接種は、典型的に、ａ）核酸、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子を被験体、好ましくは患者、又は被験体、好ましくは患者の単離細胞に投与して、通常、インビボ又はインビトロで前記被験体の細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）導入された前記核酸分子を転写及び／又は翻訳させる工程；及び任意で、ｃ）前記核酸を前記患者に直接投与しなかった場合、トランスフェクトされた単離細胞を被験体、好ましくは患者に再投与する工程のうちの少なくとも１つを含む。
【００４０】
異種配列：２つの配列は、典型的に、同一の遺伝子に由来していない場合、「異種」であると理解される。即ち、異種配列は、同一の生物に由来し得たとしても、天然で（自然界で）同一の核酸分子（例えば、同一のｍＲＮＡ等）中に存在することはない。
【００４１】
体液性免疫／体液性免疫応答：体液性免疫は、典型的に、抗体産生と、任意で抗体産生に付随する付属プロセスとを指す。体液性免疫応答は、典型的に、例えば、Ｔｈ２活性化及びサイトカイン産生、胚中心の形成及びアイソタイプの切り換え、親和性成熟及び記憶細胞の産生を特徴とし得る。また、体液性免疫は、典型的に、病原体及び毒素の中和、古典的補体活性化、並びに食作用及び病原体排除のオプソニンによる促進を含む抗体のエフェクター機能を指す場合もある。
【００４２】
免疫原：本発明において、免疫原は、典型的に、免疫応答を刺激することができる化合物であると理解してよい。好ましくは、免疫原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。特に好ましい実施形態では、本発明の意味における免疫原は、提供される核酸分子、好ましくは本明細書に定義する人工核酸分子の翻訳産物である。典型的に、免疫原は、少なくとも適応免疫応答を誘発する。
【００４３】
免疫賦活組成物：本発明において、免疫賦活組成物は、典型的に、免疫応答を誘導することができるか、又は免疫応答を誘導することができる成分が由来する少なくとも１つの成分を含有する組成物であると理解してよい。かかる免疫応答は、好ましくは、自然免疫応答又は適応免疫応答と自然免疫応答との組み合わせであってよい。本発明における免疫賦活組成物は、好ましくは、少なくとも１つの人工核酸分子、より好ましくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ分子）を含有する。ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分は、好適な担体と複合体化し得る。したがって、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ／担体複合体を含んでいてよい。更に、免疫賦活組成物は、ｍＲＮＡ等の免疫賦活成分のアジュバント及び／又は好適なビヒクルを含んでいてよい。
【００４４】
免疫応答：免疫応答は、典型的に、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的反応（所謂、特異的又は適応免疫応答）、自然免疫系の非特異的反応（所謂、非特異的又は自然免疫応答）、又はこれらの組み合わせであってよい。
【００４５】
免疫系：免疫系は、生物を感染から保護することができる。病原体が、生物の物理的障壁の通過に成功し、この生物に侵入した場合、自然免疫系が、即座にではあるが非特異的に応答する。病原体がこの自然応答から逃れた場合、脊椎動物は、第２の保護層である適応免疫系を有している。ここで、免疫系は、感染中の応答に適応してその病原体認識を向上させる。その後、この向上した応答は、病原体が排除された後も免疫記憶の形態で保持され、この病原体に遭遇したときにはいつも適応免疫系がより速やかに且つより強力な攻撃を行うことが可能になる。これによれば、免疫系は、自然免疫系及び適応免疫系を含む。これら２つの部分はそれぞれ、典型的に、所謂体液性成分及び細胞性成分を含有する。
【００４６】
免疫賦活ＲＮＡ：本発明における免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）は、典型的に、自然免疫応答を誘導することができるＲＮＡであってよい。これは、通常、オープンリーディングフレームを有しないので、ペプチド抗原又は免疫原を提供しないが、例えば、特定の種類のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）又は他の好適な受容体に結合することによって免疫応答を誘発する。しかし、無論、オープンリーディングフレームを有し且つペプチド／タンパク質をコードしているｍＲＮＡも自然免疫応答を誘導し得るので、免疫賦活ＲＮＡであり得る。
【００４７】
自然免疫系：非特異的免疫系としても知られている自然免疫系は、典型的に、非特異的に他の生物による感染からホストを守る細胞及び機構を含む。これは、自然免疫系の細胞は、包括的に病原体を認識し、応答することができるが、適応免疫系とは異なり、ホストに対して長期間免疫を付与することも、防御免疫を付与することもないことを意味する。自然免疫系は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド、リポ多糖類等の他の補助物質、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４０リガンド、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、成長因子及びｈＧＨ、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０のリガンド、マウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、又はＴＬＲ１３のリガンド、ＮＯＤ様受容体のリガンド、ＲＩＧ−Ｉ様受容体のリガンド、免疫賦活核酸、免疫賦活ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ、抗菌剤、又は抗ウイルス剤によって活性化され得る。本発明に係る医薬組成物は、１以上のかかる物質を含んでいてよい。典型的に、自然免疫系の応答は、サイトカインと呼ばれる特殊な化学メディエーターを含む化学因子の産生を介して感染部位に免疫細胞を動員し、補体カスケードを活性化し、特殊な白血球によって器官、組織、血液、及びリンパ中に存在する外来物質を同定及び除去し、適応免疫系を活性化し、及び／又は感染因子に対する物理的及び化学的な障壁として作用することを含む。
【００４８】
クローニングサイト：クローニングサイトは、典型的に、核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームを含む核酸配列の挿入に好適である核酸分子のセグメントであると理解される。挿入は、例えば、制限酵素処理及びライゲーションによって当業者に公知の任意の分子生物学的方法によって実施してよい。クローニングサイトは、典型的に、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含む。これら１以上の制限酵素部位は、これら部位においてＤＮＡを切断する制限酵素によって認識され得る。１超の制限酵素部位を含むクローニングサイトは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）又はポリリンカーと呼ばれる場合もある。
【００４９】
核酸分子：核酸分子は、核酸成分を含む、好ましくは核酸成分からなる分子である。核酸分子という用語は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子を指す。好ましくは、用語「ポリヌクレオチド」と同義的に用いられる。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含むか又はからなるポリマーである。また、用語「核酸分子」は、例えば、塩基が修飾されている、糖が修飾されている、又は骨格が修飾されているＤＮＡ又はＲＮＡの分子等の修飾核酸分子も含む。
【００５０】
オープンリーディングフレーム：本発明におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、典型的に、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得る幾つかのヌクレオチドトリプレットの配列であってよい。オープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン、即ち、その５’末端における通常アミノ酸メチオニンをコードしている３つの連続するヌクレオチドの組み合わせ（ＡＴＧ）と、その後に、通常３の倍数である長さのヌクレオチドを有する領域とを含む。ＯＲＦは、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって終結する。典型的に、これは、オープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。したがって、本発明におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）で始まり、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）で終結する、３で割り切れる多数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは、単離することができたり、例えば、ベクター又はｍＲＮＡにおけるより長い核酸配列に組み込むことができたりする。また、オープンリーディングフレームは、「タンパク質コード領域」と呼ばれる場合もある。
【００５１】
ペプチド：ペプチド又はポリペプチドは、典型的に、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸モノマーのポリマーである。典型的に、５０個未満のモノマーユニットを含む。しかし、ペプチドという用語は、５０個超のモノマーユニットを有する分子を除外するものではない。また、典型的に５０個〜６００個のモノマーユニットを有する長いペプチドは、ポリペプチドとも呼ばれる。
【００５２】
薬学的に有効な量：本発明において薬学的に有効な量は、典型的に、免疫応答等の薬学的効果を誘導して、ペプチド又はタンパク質の病的レベルの発現を変化させるか又は例えば、病理学的状況の場合、欠損している遺伝子産物を置換するのに十分な量であると理解される。
【００５３】
タンパク質：タンパク質は、典型的に、１以上のペプチド又はタンパク質を含む。タンパク質は、典型的に、３次元形態に折り畳まれており、これは、タンパク質がその生物学的機能を発揮するのに必要である場合がある。
【００５４】
ポリ（Ａ）配列：ポリ（Ａ）テール又は３’−ポリ（Ａ）テールとも呼ばれるポリ（Ａ）配列は、典型的に、アデノシンヌクレオチドの配列、例えば、約４００個以下のアデノシンヌクレオチドの配列、約２０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、好ましくは約５０個〜約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、より好ましくは約５０個〜約３００個のアデノシンヌクレオチドの配列、更により好ましくは約５０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列、最も好ましくは約６０個〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列であると理解される。ポリ（Ａ）配列は、典型的に、ｍＲＮＡの３’末端に位置する。本発明において、ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡ内に位置してもよく、又は例えば、ベクターの転写によってＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を作製するためのテンプレートとして機能するベクター等のベクターにおける任意の他の核酸分子内に位置してもよい。
【００５５】
ポリアデニル化：ポリアデニル化は、典型的に、ＲＮＡ分子等の核酸分子、例えば、未成熟ｍＲＮＡにポリ（Ａ）配列を付加することであると理解される。ポリアデニル化は、所謂ポリアデニル化シグナルによって誘導され得る。このシグナルは、好ましくは、ポリアデニル化される核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の３’末端における一続きのヌクレオチド内に位置している。ポリアデニル化シグナルは、典型的に、アデニン及びウラシル／チミンヌクレオチドからなるヘキサマー、好ましくは、ヘキサマー配列ＡＡＵＡＡＡを含む。他の配列、好ましくはヘキサマー配列も考えられる。ポリアデニル化は、典型的に、プレｍＲＮＡ（未成熟ｍＲＮＡとも呼ばれる）のプロセシング中に生じる。典型的に、ＲＮＡの成熟（プレｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへ）は、ポリアデニル化工程を含む。
【００５６】
制限酵素部位：「制限酵素認識部位」とも呼ばれる制限酵素部位は、制限酵素によって認識されるヌクレオチド配列である。制限酵素部位は、典型的に短く、好ましくは、回文構造のヌクレオチド配列、例えば、４個〜８個のヌクレオチドを含む配列である。制限酵素部位は、好ましくは、制限酵素によって特異的に認識される。制限酵素は、典型的に、この部位において制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を切断する。二本鎖ＤＮＡ配列等の二本鎖ヌクレオチド配列では、制限酵素は、典型的に、ヌクレオチド配列の両方の鎖を切断する。
【００５７】
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ：ＲＮＡは、リボ核酸の一般的な略称である。ＲＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、所謂骨格に沿って互いに結合しているアデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、グアノシン一リン酸、及びシチジン一リン酸のモノマーである。骨格は、第１のモノマーの糖（即ち、リボース）と第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。特定の連続するモノマーをＲＮＡ配列と呼ぶ。通常、ＲＮＡは、例えば、細胞内部のＤＮＡ配列の転写によって得ることができる。真核細胞では、転写は、通常、核又はミトコンドリア内部で実施される。インビボでは、ＤＮＡの転写により、通常、所謂未成熟ＲＮＡが得られ、これは、所謂メッセンジャーＲＮＡ（通常、ｍＲＮＡと略される）にプロセシングされなければならない。例えば、真核生物における未成熟ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’−キャッピング、ポリアデニル化、核又はミトコンドリアからのエクスポート等の様々な異なる転写後修飾を含む。これらプロセス全体をＲＮＡの成熟とも呼ぶ。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的に、成熟ｍＲＮＡは、５’−キャップ、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。メッセンジャーＲＮＡは別として、転写及び／又は翻訳の制御に関与し得る幾つかの非コード型のＲＮＡが存在する。
【００５８】
核酸分子の配列：核酸分子の配列は、典型的に、そのヌクレオチドの特定の及び個々の順序、即ち、連続物であると理解される。タンパク質又はペプチドの配列は、典型的に、そのアミノ酸の順序、即ち、連続物であると理解される。
【００５９】
配列同一性：同じ長さ及び順序のヌクレオチド又はアミノ酸を有する場合、２以上の配列は同一である。同一性の割合は、典型的に、２つの配列が同一である程度について説明する。即ち、典型的に、その配列位置においてレファレンス配列の同一ヌクレオチドと一致するヌクレオチドの割合について説明するものである。同一性の程度を決定する場合、比較する配列は、同じ長さ、即ち、比較する配列のうちの最長の配列の長さを有するとみなされる。これは、８ヌクレオチドからなる第１の配列が、前記第１の配列を含む１０ヌクレオチドからなる第２の配列と８０％同一であることを意味する。言い換えれば、本発明において、配列同一性は、好ましくは、同じ長さを有する２以上の配列において配列のうちの同一位置を有するヌクレオチドの割合に関する。ギャップは、アラインメントにおけるその実際の位置にかかわらず、通常、非同一位置であるとみなされる。
【００６０】
安定化核酸分子：安定化核酸分子は、例えば、環境因子又はエキソヌクレアーゼ若しくはエンドヌクレアーゼによる分解等の酵素分解によって、修飾されていない核酸分子よりも崩壊又は分解に対して安定であるように修飾されている核酸分子、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡの分子である。好ましくは、本発明における安定化核酸分子は、細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において安定化される。また、安定化効果は、例えば、安定化核酸分子を含む医薬組成物の製造過程において、細胞外、例えば、バッファ溶液中でも発揮され得る。
【００６１】
トランスフェクション：用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分子等の核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを指す。本発明において、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳類細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法を含む。かかる方法は、例えば、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクションを含む。好ましくは、導入は、非ウイルスである。
【００６２】
ワクチン：ワクチンは、典型的に、少なくとも１つの抗原、好ましくは免疫原を提供する予防的又は治療的材料であると理解される。抗原又は免疫原は、ワクチン接種に好適な任意の材料に由来してよい。例えば、抗原又は免疫原は、病原体（例えば、細菌若しくはウイルス粒子等）又は腫瘍若しくは癌性組織に由来してよい。抗原又は免疫原は、身体の適応免疫系を刺激して、適応免疫応答を提供する。
【００６３】
ベクター：用語「ベクター」は、核酸分子、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明におけるベクターは、オープンリーディングフレームを含む核酸配列等の所望の核酸配列を組み込む又は有するのに好適である。かかるベクターは、ストレージベクター、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクター等であってよい。ストレージベクターは、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を便利に保管することができるベクターである。したがって、このベクターは、例えば、所望のｍＲＮＡ配列又はその一部に相当する配列（例えば、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム及び３’ＵＴＲに相当する配列）を含んでいてよい。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質等の発現産物を産生するために用いることができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列（例えば、ＲＮＡプロモーター配列）等のベクターの一続きの配列の転写に必要な配列を含んでいてよい。クローニングベクターは、典型的に、核酸配列をベクターに組み込むために用いることができるクローニングサイトを含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってよい。トランスファーベクターは、細胞又は生物に核酸分子を移入するのに好適なベクター、例えば、ウイルスベクターであってよい。本発明におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクターであってもＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡ分子である。好ましくは、本発明におけるベクターは、クローニングサイト、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性因子）、及びベクターの増殖に好適な配列（例えば、複製起点）を含む。好ましくは、本願におけるベクターは、プラスミドベクターである。
【００６４】
ビヒクル：ビヒクルは、典型的に、化合物（例えば、薬学的に活性のある化合物）を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であると理解される。例えば、薬学的に活性のある化合物を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容可能な液体であってよい。
【００６５】
３’−非翻訳領域（３’ＵＴＲ）：３’ＵＴＲは、典型的に、ｍＲＮＡのタンパク質コード領域（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又はコード配列（ＣＤＳ））とポリ（Ａ）配列との間に位置するｍＲＮＡの部分である。ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、アミノ酸配列に翻訳されない。３’ＵＴＲ配列は、一般的に、遺伝子発現プロセス中にそれぞれのｍＲＮＡに翻訳される遺伝子によってコードされている。ゲノム配列は、先ず、任意のイントロンを含む未成熟ｍＲＮＡに転写される。次いで、前記未成熟ｍＲＮＡは、成熟プロセスにおいて成熟ｍＲＮＡに更にプロセシングされる。この成熟プロセスは、５’キャッピング工程、未成熟ｍＲＮＡをスプライシングして、任意のイントロン及び３’末端の修飾（例えば、未成熟ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化）を除去する工程、及び任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによる切断工程等を含む。本発明において、３’ＵＴＲは、タンパク質コード領域の終止コドンの３’側、好ましくはタンパク質コード領域の終止コドンの直ぐ３’側に位置し、且つポリ（Ａ）配列の５’側、好ましくはポリ（Ａ）配列の直ぐ５’側のヌクレオチドまで延在する成熟ｍＲＮＡの配列に相当する。用語「相当する」とは、３’ＵＴＲ配列が、３’ＵＴＲ配列を定義するために用いられるｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列であってもよく、かかるＲＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列であってもよいことを意味する。本発明において、用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」、例えば、「アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ」は、この遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相当する配列、即ち、遺伝子の転写及び未成熟ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡである。用語「遺伝子の３’ＵＴＲ」は、３’ＵＴＲのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列を含む。
【００６６】
第１の態様では、本発明は、
ａ．少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、
ｂ．アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’ＵＴＲエレメント）と
を含む人工核酸分子に関する。
【００６７】
用語「３’ＵＴＲエレメント」は、３’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる核酸配列を指す。「３’ＵＴＲエレメント」は、好ましくは、人工核酸配列（例えば、人工ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲを表すか、又は人工核酸分子の３’ＵＴＲをコードしている核酸配列を指す。したがって、本発明の意味において、好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ（好ましくは、人工ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲであってもよく、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの転写テンプレートであってもよい。したがって、３’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、好ましくは人工ｍＲＮＡ（例えば、遺伝的に改変されているベクターコンストラクトの転写によって得られるｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲに対応する核酸配列である。好ましくは、本発明の意味における３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲとして機能するか、又は３’ＵＴＲの機能を発揮するヌクレオチド配列をコードしている。
【００６８】
好ましくは、少なくとも１つのオープンリーディングフレームと少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントとは、異種である。これに関連して、用語「異種」は、自然界（天然）では、オープンリーディングフレームと３’ＵＴＲエレメントとがこの組み合わせで存在しないことを意味する。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、オープンリーディングフレームとは異なる遺伝子に由来する。例えば、ＯＲＦは、例えば、異なるタンパク質をコードしているか又は同じタンパク質であるが異なる種のタンパク質をコードしている、３’ＵＴＲエレメントとは異なる遺伝子に由来していてよい。好ましくは、オープンリーディングフレームは、ヒトアルブミンをコードしていない。好ましくは、オープンリーディングフレームは、アルブミンをコードしていない。オープンリーディングフレームは、例えば、グロビンタンパク質（特に、ベータ−グロビン）、ルシフェラーゼタンパク質、ＧＦＰタンパク質、又はこれらの変異体（例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、又はＧＦＰタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する変異体）からなる群より選択されるレポータータンパク質をコードしていないことが好ましい。具体的には、特定の実施形態では、特に３’ＵＴＲエレメントがラットアルブミン３’ＵＴＲ又はその変異体に由来している場合、オープンリーディングフレームは、ベータ−グロビン、より具体的にはウサギベータ−グロビン、又はこれらの変異体をコードしていないことが好ましい。更に、特定の実施形態では、本発明の人工核酸分子は、（同義的に局在化シグナル又はターゲティングシグナルとも呼ばれる）シグナル配列をコードしていない（したがって、かかるシグナル配列をコードしているセグメントを含有しない）。かかるシグナル配列は、典型的に、コードされているアミノ酸配列の５’末端に提供される。特に、本発明の人工核酸は、（人工的に又は自然界で）「シグナルアミノ酸配列」を含有するタンパク質をコードしておらず、特に、コードされているタンパク質を小胞体の膜に結合しているポリソームに導く及び／又は小胞体の膜を貫通して本発明の核酸によってコードされている対象タンパク質を移動させるシグナル配列をコードしていない。特に、本発明の核酸分子にコードされているタンパク質は、アルブミンシグナル配列、より具体的には、ラットアルブミンシグナル配列を含有しない。また、典型的に、本発明の人工核酸分子によってコードされているタンパク質は、特に、コード領域がグロビン、より具体的にはベータ−グロビン、更により具体的にはウサギベータ−グロビンをコードしている場合、乳タンパク質も成長ホルモンシグナル配列も含有しない。別の実施形態では、本発明の人工核酸配列は、特にコード領域が、グロビン配列、より具体的にはベータ−グロビン又はその変異体をコードしている場合、グロビン５’ＵＴＲ配列、具体的にはベータ−グロビン由来の５’ＵＴＲ配列、より具体的にはウサギグロビン５’ＵＴＲ配列を含有しない。人工核酸分子が５’ＵＴＲ配列を含有する場合、その５’ＵＴＲ配列は、アルブミン遺伝子、具体的にはラットアルブミン遺伝子に由来する５’ＵＴＲ配列ではないように選択してよい。本発明の人工核酸分子が１超の３’ＵＴＲを含有している場合、他の３’ＵＴＲは、好ましくは、グロビン３’ＵＴＲ及びｃ−ｍｙｃ３’ＵＴＲからなる群からは選択されない。別の実施形態では、本発明の核酸分子の３’ＵＴＲは、特に、コード領域がグロビン、より具体的にはベータ−グロビンをコードしている場合、ラットアルブミン３’ＵＴＲには対応しない。
【００６９】
更に、オープンリーディングフレームは、ヒト第ＩＸ因子又はその変異体（例えば、ヒト第ＩＸ因子に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する変異体）をコードしていないことが特に好ましい。核酸分子は、特に、本発明の核酸分子のコード領域が、上記ヒト第ＩＸ因子又はその変異体をコードしている場合、アルブミンプロモーター、具体的には、点変異を有するアルブミンプロモーター、より具体的には、Ｇ５２Ａ点変異を有するアルブミンプロモーターを含有しない。
【００７０】
別の実施形態では、本発明の人工核酸分子は、特に、コード領域が耐性遺伝子、特にネオマイシン耐性遺伝子をコードしている場合、トランスポゾンエレメント（例えば、トランスポゾンプラスミド）に対応しないか、又はトランスポゾンを含有しない（具体的には、Ｔｎ５トランスポゾンに対応しないか、又はＴＮ５モザイクエレメントを含有しない）。本発明の核酸分子は、かかる状況下で、トランスポザーゼ、具体的にはＴｎ５トランスポザーゼと機能的に相互作用することはできない。機能的に言えば、本発明の核酸分子は、典型的に、核酸（本発明の核酸分子がトランスポゾンを含有しないとき）といずれのトランスポゾンに対しても特異的であるトランスポザーゼとの間で複合体を形成してはならない。本発明の核酸分子のコード領域（ＯＲＦ）は、特に、本発明の核酸分子がトランスポザーゼと機能的に相互作用する場合、ｓｉＲＮＡをコードしていない。
【００７１】
これに関連して、特定の実施形態では、特に、オープンリーディングフレームがヒト第ＩＸ因子又はその変異体をコードしている場合、オープンリーディングフレームは、イントロンを含有しないことが特に好ましい。
【００７２】
更に、これに関連して、特定の実施形態では、特に、３’ＵＴＲエレメントがヒトアルブミン３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する場合、オープンリーディングフレームは、ヒト第ＩＸ因子又はその変異体をコードしないことが好ましい。
【００７３】
本発明の人工核酸分子は、本発明の特定の実施形態として、発現カセットではない。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、３’プロモーターもプロモーターの３’末端も含有しない。その実施形態の観点では、本発明の核酸分子は、「分泌カセット」ではないが、その理由は、シグナル配列を含有しない、好ましくは、３’プロモーターを含有しないためである。具体的には、本発明の核酸分子は、ＯＲＦと、３’ＵＴＲ領域と、任意で５’ＵＴＲ領域とを含む１つの単一核酸分子で構成される。したがって、本発明の核酸分子は、１超の別個の遺伝要素で構成される分泌カセットには対応せず、特に、コード領域（ＯＲＦ）の上流の領域を表す第１の遺伝要素及びＯＲＦの下流の領域を表す別個の第２の遺伝要素（これらは、例えば、キットの一部として独立に提供される）には対応しない。
【００７４】
好ましくは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、ＯＲＦに機能的に連結している。これは、好ましくは、例えば、ＯＲＦの発現に対する安定化機能又は人工核酸分子に対する安定化機能等の機能を発揮することができるように、３’ＵＴＲエレメントがＯＲＦに連結していることを意味する。好ましくは、ＯＲＦと３’ＵＴＲエレメントとは、５’→３’方向に連結する。したがって、好ましくは、人工核酸分子は、以下の構造：５’−ＯＲＦ−（任意の）リンカー−３’ＵＴＲエレメント−３’（リンカーは、存在していても存在していなくてもよい）を含む。例えば、リンカーは、例えば、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むか又はからなる一続きの１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド又は１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド等、１以上のヌクレオチドであってよい。
【００７５】
好ましくは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、脊椎動物のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体、好ましくは、哺乳類のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ（例えば、マウスアルブミン遺伝子、アヌビスヒヒのアルブミン遺伝子、又はヒトアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ）又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。より好ましくは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、霊長類のアルブミン遺伝子、特にヒトアルブミン遺伝子又はアヌビスヒヒのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はこれらの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなり、更により好ましくは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５に係るヒトアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はその変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる。好ましい実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、アフリカツメガエルのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲには由来しない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、アフリカツメガエルのアルブミン遺伝子由来の３’ＵＴＲのポリ（Ａ）制限要素Ｂ（ＰＬＥＢ）を含まない。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、アフリカツメガエルのアルブミン遺伝子由来の３’ＵＴＲのＰＬＥＢからなるものではない。
【００７６】
用語「［．．．］アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列」とは、好ましくは、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ配列、又はその断片若しくは一部に基づく核酸配列を指す。この用語は、アルブミン遺伝子の全３’ＵＴＲ配列に対応する配列（即ち、完全長３’ＵＴＲ配列）、及びアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。好ましくは、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの断片は、アルブミン遺伝子の完全長３’ＵＴＲの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、アルブミン遺伝子の完全長３’ＵＴＲにおける連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる断片は、本発明の意味において、好ましくは本明細書に記載する機能的断片である。用語「アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ」は、好ましくは、自然界に存在するアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲを指す。
【００７７】
用語「アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体」及び「その変異体」は、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに関連して、自然界に存在するアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体、好ましくは、脊椎動物のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体、より好ましくは、哺乳類のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ（例えば、マウスアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ）の変異体、更により好ましくは、霊長類のアルブミン遺伝子（具体的には、上記ヒトアルブミン遺伝子又はアヌビスヒヒのアルブミン遺伝子）の３’ＵＴＲの変異体を指す。かかる変異体は、アルブミン遺伝子の改変３’ＵＴＲであってよい。例えば、変異体３’ＵＴＲは、その変異体が由来する自然界に存在する３’ＵＴＲに比べて、１以上のヌクレオチドの欠失、挿入、付加、及び／又は置換を示してよい。好ましくは、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体は、その変異体が由来する自然界に存在する３’ＵＴＲと少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。好ましくは、変異体は、本明細書に記載する機能的変異体である。
【００７８】
用語「アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列」は、好ましくは、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ配列の変異体、又は上記その断片若しくは一部に基づく核酸配列を指す。この用語は、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の全配列（即ち、アルブミン遺伝子の完全長変異体３’ＵＴＲ配列）に対応する配列、及びアルブミン遺伝子の変異体３’ＵＴＲ配列の断片に対応する配列を含む。好ましくは、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の断片は、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの完全長変異体の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を表す、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの完全長変異体における連続する一続きのヌクレオチドに対応する連続する一続きのヌクレオチドからなる。かかる変異体の断片は、本発明の意味において、好ましくは、本明細書に記載する変異体の機能的断片である。
【００７９】
本発明において、用語「機能的変異体」、「機能的断片」、及び「変異体の機能的断片」（「機能的変異体断片」とも呼ばれる）は、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの断片、３’ＵＴＲの変異体、又は３’ＵＴＲの変異体の断片が、前記変異体、前記断片、又は前記変異体の断片が由来するアルブミン遺伝子の自然界に存在する３’ＵＴＲの少なくとも１つの機能、好ましくは１超の機能を発揮することを意味する。かかる機能は、例えば、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）における、ｍＲＮＡの安定化、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の安定化、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質産生の延長、及び／又はｍＲＮＡからのタンパク質発現若しくは全タンパク質産生の増加であってよい。本発明における変異体、断片、及び変異体の断片は、以下のうちの少なくともいずれかの機能を発揮することが特に好ましい：好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス３’ＵＴＲを含むか又は３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡを安定化させる機能；好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス３’ＵＴＲを含むか又は３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を安定化及び／又は延長する機能；並びに好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において、レファレンス３’ＵＴＲを含むか又は３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡに比べてｍＲＮＡからのタンパク質産生を増加させる機能。レファレンス３’ＵＴＲは、例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲであってよい。更に、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片は、その変異体、断片、又は変異体断片が由来する野生型の３’ＵＴＲに比べて、かかる３’ＵＴＲの変異体、断片、又は変異体断片を含むｍＲＮＡの翻訳効率を実質的に減じる効果を有しないことが好ましい。本発明において、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」又は「変異体の機能的断片」の特に好ましい機能は、上記機能的断片、機能的変異体、又は変異体の機能的断片を有するｍＲＮＡの発現によるタンパク質産生の安定化及び／又は延長である。
【００８０】
好ましくは、機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片によって発揮される１以上の機能の効率、例えば、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生安定化効率及び／又はタンパク質の産生増加効率は、前記変異体、前記断片、又は前記変異体断片が由来するアルブミン遺伝子の自然界に存在する３’ＵＴＲによって発揮されるｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生安定化効率及び／又はタンパク質の産生増加効率の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
【００８１】
本発明に関連して、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの断片又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体は、好ましくは、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの断片又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の断片は、上記機能的断片である。
【００８２】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの「機能的断片」、「機能的変異体」、又は「変異体の機能的断片」を含むか又はからなる。
【００８３】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡ（レファレンスｍＲＮＡ）と比べて人工核酸分子の安定性を上昇させる、例えば、本発明に係るｍＲＮＡの安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生の安定性を上昇させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質産生を延長する。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡと比べて、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからのタンパク質発現及び／又は全タンパク質産生を増加させる。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含むそれぞれのｍＲＮＡの翻訳効率と比べて、ｍＲＮＡの翻訳効率に悪影響を与えない。これに関連して、用語「それぞれのｍＲＮＡ」は、異なる３’ＵＴＲは別にして、レファレンスｍＲＮＡが、３’ＵＴＲエレメントを含むｍＲＮＡと類似している、好ましくは同一であることを意味する。
【００８４】
人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からの「タンパク質産生を安定化及び／又は延長する」という用語は、好ましくは、哺乳類発現系（例えば、ＨｅＬａ又はＨＤＦ細胞）において（例えば、レファレンス３’ＵＴＲを含むか又は３’ＵＴＲを有しない）レファレンス人工核酸分子（例えば、レファレンスｍＲＮＡ）からのタンパク質産生と比べて、人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からのタンパク質産生が安定化及び／又は延長されることを意味する。したがって、人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質は、レファレンス核酸分子から産生されるタンパク質についてみられ得る期間よりも長い期間観察可能である。言い換えれば、経時的に測定される人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質の量は、経時的に測定されるレファレンス核酸分子（例えば、レファレンスｍＲＮＡ）から産生されるタンパク質の量よりも遅い時点で閾値を下回る。かかる閾値は、例えば、核酸分子の発現開始（例えば、トランスフェクション）の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後等、発現の初期相において測定されるタンパク質の量であってよい（図１７）。
【００８５】
例えば、人工核酸分子（例えば、人工ｍＲＮＡ）からのタンパク質産生は、哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞等の哺乳類細胞）において、レファレンス核酸分子（例えば、レファレンスｍＲＮＡ）からのタンパク質産生と比べて、少なくとも核酸分子の発現開始（例えば、トランスフェクション）の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後、発現の初期相において観察される量である量において、少なくとも約５時間、好ましくは少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも約２４時間延長される。したがって、本発明に係る人工核酸分子は、好ましくは、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子と比べて、少なくとも発現開始（例えば、トランスフェクション）の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後等、発現の初期相において観察される量である量において、タンパク質産生を少なくとも約５時間、好ましくは少なくとも約１０時間、より好ましくは少なくとも約２４時間延長することができる。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質産生は、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子からのタンパク質産生と比べて、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも２．５倍延長される。
【００８７】
このタンパク質産生を延長する効果は、（ｉ）好ましくは哺乳類発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞）において、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）をコードしているＯＲＦの発現によって得られるタンパク質量を経時的に測定し、（ｉｉ）タンパク質量が、人工核酸分子の発現開始の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後（例えば、トランスフェクションの１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後）等に観察されるタンパク質量を下回る時点を求め、（ｉｉｉ）前記タンパク質量が発現開始の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、又は６時間後に観察されたタンパク質量を下回る時点を、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲを含む核酸分子について求めた前記時点と比較することによって求めることができる（図１７）。
【００８８】
好ましくは、タンパク質産生に対するこの安定化及び／又は延長効果が得られると同時に、例えば、４８時間又は７２時間の期間内に本発明に係る人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量は、少なくとも、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、自然界において人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から産生されるタンパク質の量である。したがって、本発明は、上記の通り、哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞等の哺乳類細胞）においてタンパク質産生を延長及び／又は安定化させる人工核酸分子であって、例えば、４８時間又は７２時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、自然界において人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から前記期間内に産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。
【００８９】
したがって、「安定したタンパク質発現」とは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、レファレンス３’ＵＴＲを含むか又は３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡ）と比べたとき、所定の期間、例えば、２４時間、より好ましくは４８時間、更により好ましくは７２時間に亘って本発明に係る人工核酸分子からより均一にタンパク質が産生されることを意味する。したがって、本発明に係る３’ＵＴＲエレメントを含む人工核酸分子、例えば、本発明に係るｍＲＮＡからの（例えば、哺乳類系における）タンパク質産生のレベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、上記レファレンスｍＲＮＡ）について観察される程度まで低下することはない。例えば、発現開始の６時間後、例えば、本発明に係る人工核酸分子を細胞（例えば、哺乳類細胞）にトランスフェクトした６時間後に観察される（ＯＲＦによってコードされている）タンパク質の量は、発現開始の４８時間後、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質の量と同等であってよい。したがって、発現開始の４８時間後、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察される、例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）等のＯＲＦによってコードされているタンパク質の量の、発現開始の６時間後、例えば、トランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質の量に対する比は、本発明に係る核酸分子の場合、好ましくは少なくとも約０．４、より好ましくは少なくとも約０．５、より好ましくは少なくとも約０．６、更により好ましくは少なくとも約０．７である。好ましくは、前記比は、約０．４〜約４、好ましくは約０．６５〜約３、より好ましくは約０．７〜約２である。それぞれのレファレンス核酸分子（例えば、レファレンス３’ＵＴＲを含むか又は３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡ）の場合、前記比は、例えば、約０．０５〜約０．３であってよい。
【００９０】
したがって、本発明は、ＯＲＦと上記３’ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子であって、発現開始の４８時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量（例えば、ルシフェラーゼの量）の、発現開始の６時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量に対する比が、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞）において、好ましくは約０．４超、より好ましくは約０．５超、より好ましくは約０．６超、更により好ましくは約０．７超（例えば、約０．４〜約４、好ましくは約０．６５〜約３、より好ましくは約０．７〜約２）であり、好ましくは、例えば４８時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、自然界において前記人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から前記期間内に産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ＯＲＦと上記３’ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子であって、例えば、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞等の哺乳類細胞）において、発現開始の７２時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量（例えば、ルシフェラーゼの量）の、発現開始の６時間後に観察される（レポーター）タンパク質の量に対する比が、好ましくは、約０．４超、より好ましくは約０．５超、より好ましくは約０．６超、更により好ましくは約０．７超、例えば、約０．４〜約１．５、好ましくは約０．６５〜約１．１５、より好ましくは約０．７〜約１．０であり、好ましくは、例えば７２時間の期間内に前記人工核酸分子から産生されるタンパク質の合計量が、少なくとも、３’ＵＴＲを有しないか又はレファレンス３’ＵＴＲ（例えば、自然界において前記人工核酸分子のＯＲＦと併存している３’ＵＴＲ）を含むレファレンス核酸分子から前記期間内に産生されるタンパク質の合計量である人工核酸分子を提供する。
【００９１】
本発明において、「タンパク質発現の増加」とは、好ましくは、レファレンス分子と比べて発現開始後のある時点におけるタンパク質発現が増加することを意味する。したがって、本発明に係る人工核酸分子の発現開始後（例えば、トランスフェクション後）、例えば、本発明に係るｍＲＮＡのトランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの４８時間後、又は７２時間後において観察されるタンパク質レベルは、好ましくは、レファレンス核酸分子（例えば、レファレンス３’ＵＴＲを含むか又は３’ＵＴＲを有しないレファレンスｍＲＮＡ）の発現開始後（例えば、トランスフェクション後）の同時点で観察されるタンパク質レベルよりも高い。
【００９２】
人工核酸分子からの「合計タンパク質産生量の増加」とは、好ましくは哺乳類の発現系（例えば、ＨｅＬａ細胞又はＨＤＦ細胞等の哺乳類細胞）において、人工核酸分子からタンパク質が産生される期間に亘って、タンパク質産生量が増加することを指す。したがって、「合計タンパク質産生量」は、好ましくは、経時的なタンパク質産生量を表す曲線下面積（ＡＵＣ）を指す。
【００９３】
人工核酸分子の安定性上昇、タンパク質産生の安定性上昇、タンパク質産生の延長、並びに／又はタンパク質発現及び／若しくは全タンパク質産生の増加は、好ましくは、３’ＵＴＲを有しないそれぞれのレファレンス核酸分子（例えば、３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡ）、又はレファレンス３’ＵＴＲを含むレファレンス核酸分子（例えば、上記の通り自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）と比較することによって求められる。
【００９４】
アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体、断片、及び／又は変異体断片のｍＲＮＡ及びタンパク質の少なくともいずれかの産生安定化効果及び効率、並びに／又はタンパク質産生増加効果及び効率に加えて、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントの産生安定化効果及び効率、並びに／又はタンパク質産生増加効果及び効率は、当業者に公知であるこの目的に適した任意の方法によって求めることができる。例えば、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）のコード配列を含み、３’ＵＴＲを含まない人工ｍＲＮＡ分子；自然界に存在するアルブミン遺伝子由来の３’ＵＴＲを含む人工ｍＲＮＡ分子；レファレンス遺伝子由来の３’ＵＴＲ（即ち、レファレンス３’ＵＴＲ、例えば、自然界においてＯＲＦと併存する３’ＵＴＲ）を含む人工ｍＲＮＡ分子；３’ＵＴＲとして、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体を含む人工ｍＲＮＡ分子：３’ＵＴＲとして、自然界に存在するアルブミン遺伝子の断片を含む人工ｍＲＮＡ分子；又は３’ＵＴＲとして、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体の断片を含む人工ｍＲＮＡ分子を作製してよい。かかるｍＲＮＡは、例えば、Ｔ７プロモーターとそれぞれのｍＲＮＡ配列をコードしている配列とを含むプラスミドベクター等、それぞれのベクターのインビトロ転写によって作製することができる。作製されるｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡをトランスフェクトするのに適した任意のトランスフェクション法によって細胞にトランスフェクトしてよい。例えば、ＨＥＬＡ細胞等の哺乳類細胞にエレクトロポレーションし、トランスフェクション後の特定の時点、例えば、トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にサンプルを分析してよい。前記サンプルは、当業者に周知の方法によってｍＲＮＡ量及び／又はタンパク質量について分析してよい。例えば、サンプリング時点で細胞中に存在するレポーターｍＲＮＡの量は、定量ＰＣＲ法によって求めることができる。それぞれのｍＲＮＡによってコードされているレポータータンパク質の量は、例えば、用いられるレポータータンパク質に依存して、ＥＬＩＳＡアッセイ又はレポーターアッセイ（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）によって求めることができる。タンパク質発現の安定化及び／又はタンパク質発現の延長の効果は、例えば、トランスフェクションの４８時間後に観察されるタンパク質レベルのトランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質レベルに対する比を求めることによって分析することができる。前記値が１に近付くにつれて、この期間内のタンパク質発現がより安定である。かかる測定は、無論、７２時間以上の時点で実施してもよく、タンパク質発現の安定性を求めるために、トランスフェクションの７２時間後に観察されるタンパク質レベルとトランスフェクションの６時間後に観察されるタンパク質レベルとの比を求めてもよい。
【００９５】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、以下に示す配列番号１、配列番号２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５に係る核酸配列等のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列を含むか又はからなり、前記配列の変異体（例えば、少なくとも４０％同一）は、好ましくは、上記機能的変異体である。
【表１】
0006298039.tif 000002
【表２】
0006298039.tif 000003
【００９６】
また、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５に係る核酸配列等のアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの核酸配列に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する核酸配列の断片を含んでいてもよく又はからなっていてもよく、前記断片は、好ましくは、上記の機能的断片又は機能的変異体断片である。かかる断片は、好ましくは、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する。
【００９７】
例えば、かかる断片は、配列番号１８〜３０に係る核酸配列、例えば、
【表３】
0006298039.tif 000004
【表４】
0006298039.tif 000005
又は対応するＲＮＡ配列、又は前記核酸配列若しくは対応するＲＮＡ配列と少なくとも４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％同一である核酸配列を有し得る。したがって、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、上記核酸断片を含んでいてもよく又はからなっていてもよい。明らかなことであるが、配列番号１８〜３０に係る断片に含まれるチミジンヌクレオチドは、ウリジンヌクレオチドによって置換されてもよい。
【００９８】
好ましくは、前記変異体、断片、又は変異体断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５に係る核酸配列の少なくとも１つの機能（例えば、本発明に係る人工核酸分子の安定化、本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現の安定化及び／又は延長、タンパク質産生の増加の少なくともいずれか）を、配列番号１、配列番号２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５に係る核酸配列によって示される安定化効率及び／又はタンパク質産生増加効率の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の効率で示す上記機能的変異体、機能的断片、又は機能的変異体断片である。
【００９９】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約１２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３’ＵＴＲエレメントは、約５０ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、好ましくは約１００ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドの長さを有し得る。
【０１００】
更に、本発明に係る人工核酸分子は、１超の上記３’ＵＴＲエレメントを含んでいてよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、１、２、３、４、又はそれ以上の３’ＵＴＲエレメントを含んでいてよく、個々の３’ＵＴＲエレメントは、同一であっても異なっていてもよい。例えば、本発明に係る人工核酸分子は、２つの本質的に同一の上記３’ＵＴＲエレメント（例えば、配列番号１、２、３２、３３、３４、又は３５に係る核酸配列等、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ、又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる２つの３’ＵＴＲエレメント）、その機能的変異体、その機能的断片、又はその機能的変異体断片を含んでいてよい。
【０１０１】
驚くべきことに、本発明者らは、上記３’ＵＴＲを含む人工核酸分子が、タンパク質産生を延長及び／又は安定化できるｍＲＮＡ分子を表し得るか又は提供し得ることを見出した。したがって、本明細書に記載する３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡ分子からのタンパク質発現の安定性を改善する及び／又は翻訳効率を改善することができる。
【０１０２】
本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡベクター）であってよく、改変ＲＮＡ分子又は改変ＤＮＡ分子であってもよい。それは、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖分子として、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するＤＮＡ分子として提供され得る。
【０１０３】
本発明に係る人工核酸は、更に、任意で５’ＵＴＲ及び／又は５’−キャップを含んでいてよい。任意の５’−キャップ及び／又は５’ＵＴＲは、好ましくは、本発明に係る人工核酸分子内のＯＲＦの５’側に位置する。
【０１０４】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルを更に含む。好ましくは、任意のポリ（Ａ）配列は、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントの３’側に位置し、好ましくは、３’ＵＴＲエレメントの３’末端に連結されている。直接連結されていてもよく、又は（例えば、１以上の制限酵素部位を含むか又はからなる１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド、好ましくは１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドのリンカーを介する等、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等のヌクレオチドを介して）間接的に連結されていてもよい。
【０１０５】
１つの実施形態では、任意のポリアデニル化シグナルは、３’ＵＴＲエレメント内に位置する。好ましくは、ポリアデニル化シグナルは、コンセンサス配列ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ（Ｎは、Ａ又はＵである）、好ましくはＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡを含む。かかるコンセンサス配列は、大部分の動物及び細菌の細胞系によって、例えば、ＣｓｔＦ、ＰＡＰ、ＰＡＢ２、ＣＦＩ及び／又はＣＦＩＩと協働する切断／ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）等のポリアデニル化因子によって認識され得る。ポリアデニル化シグナルは、好ましくは、３’ＵＴＲエレメントの３’末端の約５０ヌクレオチド未満上流、より好ましくは約３０塩基未満上流、最も好ましくは約２５塩基未満上流、例えば、２１塩基上流に位置することが好ましい。
【０１０６】
例えば、３’ＵＴＲエレメント内にポリアデニル化シグナルを含む本発明に係る人工核酸分子（例えば、人工ＤＮＡ分子）の転写により、その３’ＵＴＲエレメントにポリアデニル化シグナルを含有する未成熟ＲＮＡが得られる。例えば、配列番号１に係る３’ＵＴＲエレメントを含むＤＮＡ分子の転写により、
【表５】
0006298039.tif 000006
以下の配列に係る３’ＵＴＲエレメントを有するＲＮＡが得られる：
【表６】
0006298039.tif 000007
。
【０１０７】
次いで、適切な転写系を用いることにより、ポリ（Ａ）配列を未成熟ＲＮＡに結合させる。例えば、本発明の人工核酸分子は、上記３’ＵＴＲエレメントとポリアデニル化シグナルとを含むＤＮＡ分子であってよく、このことにより、前記ＤＮＡ分子の転写時にＲＮＡがポリアデニル化され得る。したがって、得られるＲＮＡは、本発明の３’ＵＴＲエレメントとそれに続くポリ（Ａ）配列との組み合わせを含んでいてよい。
【０１０８】
潜在的な転写系は、インビトロ転写系又は細胞転写系等である。したがって、本発明に係る人工核酸分子の転写、例えば、オープンリーディングフレームと、３’ＵＴＲエレメントと、ポリアデニル化シグナルとを含む人工核酸分子の転写により、オープンリーディングフレームと、３’ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子を得ることができる。
【０１０９】
したがって、本発明は、また、オープンリーディングフレームと、上記３’ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むｍＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。
【０１１０】
１つの実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号１に係る配列、又は配列番号１に対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又は上記これらの断片とを含む人工ＤＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。更に、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号２に係る配列、又は配列番号２に対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又は上記これらの断片とを含む人工ＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。
【０１１１】
１つの更なる実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号３２に係る配列、又は配列番号３２に対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又は上記これらの断片とを含む人工ＤＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。更に、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号３３に係る配列、又は配列番号３３に対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又は上記これらの断片とを含む人工ＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。
【０１１２】
更に、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号３４に係る配列、又は配列番号３４に対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又は上記これらの断片とを含む人工ＤＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。更に、本発明は、オープンリーディングフレームと、配列番号３５に係る配列、又は配列番号３５に対して少なくとも約４０％以上の同一性を有する配列、又は上記これらの断片とを含む人工ＲＮＡ分子である人工核酸分子を提供する。
【０１１３】
したがって、本発明は、翻訳効率に関して安定化及び最適化されているＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子のテンプレートとなり得る人工核酸分子を提供する。言い換えれば、人工核酸分子は、ｍＲＮＡの産生に用いることができるＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。得ることができるｍＲＮＡは、次いで、オープンリーディングフレームによってコードされている所望のペプチド又はタンパク質を産生するために翻訳され得る。人工核酸分子がＤＮＡである場合、例えば、インビトロ又はインビボでｍＲＮＡを継続して繰り返し産生するための二本鎖保管形態として用いてよい。
【０１１４】
１つの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、ポリ（Ａ）配列を更に含む。ポリ（Ａ）配列の長さは、変動してよい。例えば、ポリ（Ａ）配列は、約２０アデニンヌクレオチド〜約３００アデニンヌクレオチド、好ましくは約４０アデニンヌクレオチド〜約２００アデニンヌクレオチド、より好ましくは約５０アデニンヌクレオチド〜約１００アデニンヌクレオチド、例えば、約６０アデニンヌクレオチド、約７０アデニンヌクレオチド、約８０アデニンヌクレオチド、約９０アデニンヌクレオチド、又は約１００アデニンヌクレオチドの長さを有していてよい。
【０１１５】
例えば、本発明に係る人工核酸分子は、以下のＤＮＡ配列に対応する核酸配列を含んでいてよい。
【表７】
0006298039.tif 000008
【０１１６】
かかる配列の転写により、以下の配列を含む人工核酸分子を得ることができる：
【表８】
0006298039.tif 000009
【０１１７】
また、かかる人工ＲＮＡ分子、即ち、配列番号４、３７、又は３９に係る配列を含む人工核酸分子は、必ずしもＤＮＡ親から転写されることなしに一般的な化学合成法によってインビトロで得ることもできる。
【０１１８】
特に好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、５’から３’方向に、オープンリーディングフレームと、上記３’ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列とを含むＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子である。
【０１１９】
好ましい実施形態では、オープンリーディングフレームは、アルブミン、特にヒトアルブミン、マウスアルブミン、又はアヌビスヒヒ由来のアルブミンをコードしないが、但し、３’ＵＴＲエレメントは、それぞれ、ヒトアルブミン、マウスアルブミン、又はアヌビスヒヒ由来のアルブミンの３’ＵＴＲと同一である。幾つかの更なる実施形態では、オープンリーディングフレームは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．５に係るヒトアルブミンをコードしないが、但し、３’ＵＴＲエレメントは、ヒトアルブミンの３’ＵＴＲと同一であることが好ましい場合がある。幾つかの更なる実施形態では、オープンリーディングフレームは、アルブミン又はその変異体をコードしないが、但し、３’ＵＴＲエレメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、又は配列番号３５と同一の配列であることが好ましい場合がある。更に、幾つかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、ヒト第ＩＸ因子、又はグロビンタンパク質（特に、ベータ−グロビン）、ルシフェラーゼタンパク質、ＧＦＰタンパク質、又はこれらの変異体（例えば、グロビンタンパク質、ルシフェラーゼタンパク質、又はＧＦＰタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する変異体）からなる群より選択されるレポータータンパク質をコードしないことが好ましい。更に、特定の実施形態では、特に、オープンリーディングフレームがヒト第ＩＸ因子をコードしている場合、オープンリーディングフレームは、イントロンを含有しないことが好ましい。
【０１２０】
１つの実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、アルブミン以外のペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと；配列番号１、３２、又は３４に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメントと；ポリアデニル化シグナル及び／又はポリ（Ａ）配列とを含む人工ＤＮＡ分子を提供する。更に、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、アルブミン以外の任意のペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと；配列番号３、３６、又は３８に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメントとを含む人工ＤＮＡ分子を提供する。
【０１２１】
更に、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、アルブミン以外のペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと；配列番号２、３３、又は３５に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメントと；ポリアデニル化シグナル及び／又はポリ（Ａ）配列とを含む人工ＲＮＡ分子（好ましくは、人工ｍＲＮＡ分子又は人工ウイルスＲＮＡ分子）を提供する。更に、本発明は、オープンリーディングフレーム、好ましくは、アルブミン以外のペプチド又はタンパク質をコードしているオープンリーディングフレームと；配列番号４、３７、又は３９に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、更により好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメントとを含む人工ＲＮＡ分子（好ましくは、人工ｍＲＮＡ分子又は人工ウイルスＲＮＡ分子）を提供する。
【０１２２】
本発明は、コードされているペプチド又はタンパク質発現の安定性を強化し、延長することを特徴とし得る人工核酸分子（好ましくは、人工ｍＲＮＡ）を提供する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、タンパク質発現の安定性の強化、延いてはタンパク質発現の延長は、人工核酸分子（例えば、本発明に係る人工ｍＲＮＡ分子）の分解減少に起因している可能性がある。したがって、本発明の３’ＵＴＲエレメントは、人工核酸が分解及び崩壊するのを防ぐことができる。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、３’ＵＴＲエレメントは、ヒストンステムループからなるものではないことが好ましく、好ましくは、ヒストンステムループを含まない。１つの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、ヒストンステムループを含まない。しかし、幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列に加えて、ヒストンステムループを含んでいてよい。本発明に係る人工核酸分子は、例えば、５’から３’方向に、ＯＲＦと、本発明の３’ＵＴＲエレメントとを含んでいてよく、好ましくは、ポリアデニル化シグナル、任意のヒストンステムループ、及び任意のポリ（Ａ）配列を含む。また、前記人工核酸分子は、５’から３’方向に、ＯＲＦと、本発明の３’ＵＴＲエレメントとを含んでいてよく、例えば、ポリアデニル化シグナル、ポリ（Ａ）配列、及び任意のヒストンステムループを含む。
【０１２４】
本発明において、かかるヒストンステムループは、典型的に、ヒストン遺伝子に由来し、２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列の分子内塩基対合を含み、それによってステムループを形成する。ステムループは、一本鎖ＤＮＡ、又はより一般的にはＲＮＡにおいて形成され得る。また、その構造は、ヘアピン又はヘアピンループとして知られており、通常、連続配列内のステム及び（末端）ループからなり、前記ステムは、ステムループ構造のループを構築する一種のスペーサーとしての短い配列によって分断されている２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列によって形成される。前記２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列は、例えば、ステムループエレメント、ステム１及びステム２として定義することができる。ステムループは、これら２つの隣接する全体的に又は部分的に逆相補的な配列（例えば、ステムループエレメント、ステム１及びステム２）が互いに塩基対を形成するときに形成されて、連続配列におけるステムループエレメント、ステム１とステム２との間に位置する短い配列によって形成される不対ループを末端に含む二本鎖核酸配列を生じさせる。したがって、不対ループは、典型的に、これらステムループエレメントのいずれとも塩基対合することができない核酸の領域を表す。得られるロリポップ形構造は、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素である。したがって、ステムループ構造の形成は、得られるステム及びループ領域の安定性に依存し、第１の必要条件は、典型的に、折り重ねられて対合二本鎖を形成することができる配列の存在である。対合ステムループエレメントの安定性は、対合領域の長さ、含まれているミスマッチ又はバルジの数（特に、長い二本鎖では、少数のミスマッチは典型的に許容可能である）、及び塩基組成によって決定される。本発明では、最適なループ長は、３塩基〜１０塩基、より好ましくは３塩基〜８塩基、３塩基〜７塩基、３塩基〜６塩基、又は更により好ましくは４塩基〜５塩基、最も好ましくは４塩基である。
【０１２５】
ヒストンステムループ配列の一例は、配列番号３１に係る配列（ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ）又は対応するＲＮＡ配列である。
【０１２６】
したがって、幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸分子は、（ａ．）少なくとも１つのオープンリーディングフレームと；（ｂ．）本明細書に記載する少なくとも１つの３’ＵＴＲと；（ｄ．）例えば、配列番号３１に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよく又はからなっていてもよい少なくとも１つのヒストンステムループであって、好ましくは、配列番号３１に係る配列又は対応するＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列の位置６、１３、及び２０が、保存されている、即ち、配列番号３１の位置６、１３、及び２０におけるヌクレオチドと同一であるヒストンステムループとを含む。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、人工核酸分子は、更なるエレメント（例えば、５’−キャップ、ポリ（Ｃ）配列、及び／又はＩＲＥＳモチーフ）を含む。５’−キャップは、転写後にＲＮＡの５’末端に付加してよい。更に、本発明の人工核酸分子は、特に核酸がｍＲＮＡの形態であるか又はｍＲＮＡをコードしている場合、少なくとも１０個のシチジン、好ましくは少なくとも２０個のシチジン、より好ましくは少なくとも３０個のシチジンの配列（所謂「ポリ（Ｃ）配列」）によって修飾されてよい。具体的には、本発明の核酸分子は、特に核酸が（ｍ）ＲＮＡの形態であるか又はｍＲＮＡをコードしている場合、典型的に約１０シチジンヌクレオチド〜約２００シチジンヌクレオチド、好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約１００シチジンヌクレオチド、より好ましくは約１０シチジンヌクレオチド〜約７０シチジンヌクレオチド、又は更により好ましくは約２０シチジンヌクレオチド〜約５０シチジンヌクレオチド、又は更には２０シチジンヌクレオチド〜３０シチジンヌクレオチドのポリ（Ｃ）配列を含有していてよい。したがって、好ましくは、本発明に係る人工核酸分子は、好ましくは５’から３’方向に、ＯＲＦと、上記少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントと、ポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルと、ポリ（Ｃ）配列とを含む。
【０１２８】
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列又はＩＲＥＳモチーフは、例えば、人工核酸分子が２以上のペプチド又はタンパク質をコードしている場合、幾つかのオープンリーディングフレームを分離することができる。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡが２シストロン性又は多シストロン性のＲＮＡである場合、特に有用であり得る。
【０１２９】
更に、人工核酸分子は、更なる５’エレメント、好ましくは５’ＵＴＲ、プロモーター、又は５’ＵＴＲ及びプロモーター含有配列を含んでいてよい。プロモーターは、本発明に係る人工核酸分子、例えば、本発明に係る人工ＤＮＡ分子の転写を駆動及び／又は制御することができる。更に、５’ＵＴＲは、本発明の３’ＵＴＲエレメントと相互作用し得、それによって、本発明の３’ＵＴＲエレメントの安定化効果を支持し得る。かかるエレメントは、更に、安定性及び翻訳効率を支持し得る。したがって、幾つかの実施形態では、本発明は、５’から３’方向に、以下の構造のうちの少なくとも１つを含む人工核酸分子、好ましくはｍＲＮＡ分子を提供する：
５’−キャップ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列
５’−キャップ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列
５’−キャップ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列
５’−キャップ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列−ヒストンステムループ
５’−キャップ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列
５’−キャップ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲエレメント−ポリ（Ａ）配列−ポリ（Ｃ）配列−ヒストンステムループ。
【０１３０】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはオープンリーディングフレームは、少なくとも部分的にＧ／Ｃ改変されている。したがって、本発明の人工核酸分子は、前記分子のＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量を改変することによって熱力学的に安定化させることができる。好ましくは遺伝コードの縮重を用いることによって、相当する野生型配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量と比べて本発明に係る人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させてよい。したがって、核酸分子のコードされているアミノ酸配列は、好ましくは、特定の野生型配列のコードされているアミノ酸配列と比べて、Ｇ／Ｃ改変によって改変されないことが好ましい。したがって、翻訳されるアミノ酸配列を維持しながら含まれるＧ／Ｃヌクレオチドの量が増えるように、野生型コード配列と比べてコード配列又は核酸分子全体（例えば、ｍＲＮＡ）のコドンを変化させてよい。幾つかのコドンが１つの同じアミノ酸をコードしている（所謂、遺伝コードの縮重）という事実に関連して、安定性のために最も好ましいコドンを決定することができる（所謂、代替コドンの利用）。
【０１３１】
本明細書に定義する本発明の核酸分子のコード領域によってコードされているアミノ酸によっては、その野生型コード領域に対して、核酸配列、例えばコード領域を様々に改変できる可能性がある。Ｇ又はＣヌクレオチドのみを含有するコドンによってコードされているアミノ酸の場合、コドンを改変する必要はない。したがって、Ｐｒｏ（ＣＣＣ又はＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ又はＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣ又はＧＣＧ）、及びＧｌｙ（ＧＧＣ又はＧＧＧ）のコドンは、ＡもＵ／Ｔも存在しないので、改変する必要がない。
【０１３２】
対照的に、Ａ及び／又はＵ／Ｔヌクレオチドを含有するコドンは、同じアミノ酸をコードしているがＡ及び／又はＵ／Ｔを含有していない他のコドンで置換することによって改変してよい。その例は、以下の通りである：
Ｐｒｏのコドンは、ＣＣ（Ｕ／Ｔ）又はＣＣＡからＣＣＣ又はＣＣＧに改変してよい；
Ａｒｇのコドンは、ＣＧ（Ｕ／Ｔ）又はＣＧＡ又はＡＧＡ又はＡＧＧからＣＧＣ又はＣＧＧに改変してよい；
Ａｌａのコドンは、ＧＣ（Ｕ／Ｔ）又はＧＣＡからＧＣＣ又はＧＣＧに改変してよい；
Ｇｌｙのコドンは、ＧＧ（Ｕ／Ｔ）又はＧＧＡからＧＧＣ又はＧＧＧに改変してよい。
【０１３３】
他の場合、Ａ又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドをコドンからなくすことはできないが、Ａ及び／又は（Ｕ／Ｔ）ヌクレオチドの含量が低いコドンを使用することによってＡ及び（Ｕ／Ｔ）含量を減少させることができる。その例は、以下の通りである：
Ｐｈｅのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｌｅｕのコドンは、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ａ、（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）Ｇ、Ｃ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＣ（Ｕ／Ｔ）ＡからＣ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＣ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ｓｅｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｃ（Ｕ／Ｔ）又は（Ｕ／Ｔ）ＣＡ又はＡＧ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＣＣ、（Ｕ／Ｔ）ＣＧ又はＡＧＣに改変してよい；
Ｔｙｒのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ａ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＡＣに改変してよい；
Ｃｙｓのコドンは、（Ｕ／Ｔ）Ｇ（Ｕ／Ｔ）から（Ｕ／Ｔ）ＧＣに改変してよい；
Ｈｉｓのコドンは、ＣＡ（Ｕ／Ｔ）からＣＡＣに改変してよい；
Ｇｌｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに改変してよい；
Ｉｌｅのコドンは、Ａ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＡ（Ｕ／Ｔ）ＡからＡ（Ｕ／Ｔ）Ｃに改変してよい；
Ｔｈｒのコドンは、ＡＣ（Ｕ／Ｔ）又はＡＣＡからＡＣＣ又はＡＣＧに改変してよい；
Ａｓｎのコドンは、ＡＡ（Ｕ／Ｔ）からＡＡＣに改変してよい；
Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに改変してよい；
Ｖａｌのコドンは、Ｇ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）又はＧ（Ｕ／Ｔ）ＡからＧ（Ｕ／Ｔ）Ｃ又はＧ（Ｕ／Ｔ）Ｇに改変してよい；
Ａｓｐのコドンは、ＧＡ（Ｕ／Ｔ）からＧＡＣに改変してよい；
Ｇｌｕのコドンは、ＧＡＡからＧＡＧに改変してよい；
終止コドン（Ｕ／Ｔ）ＡＡは、（Ｕ／Ｔ）ＡＧ又は（Ｕ／Ｔ）ＧＡに改変してよい。
【０１３４】
他方、Ｍｅｔ（Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）及びＴｒｐ（（Ｕ／Ｔ）ＧＧ）のコドンの場合、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに配列を改変することはできない。
【０１３５】
上記置換は、その特定の野生型オープンリーディングフレーム（即ち、オリジナル配列）と比べて、本明細書に定義する本発明の核酸配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させるために個々に又は全ての可能な組み合わせで用いることができる。したがって、例えば、野生型配列に存在するＴｈｒの全てのコドンをＡＣＣ（又はＡＣＧ）に改変してもよい。
【０１３６】
好ましくは、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量は、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに、即ち、遺伝子コードの縮重を用いて、野生型コード領域のＧ／Ｃ含量と比べて、少なくとも７％、好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％増加させる。特定の実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、又はその断片、変異体、若しくは誘導体のオープンリーディングフレームにおける置換可能なコドンのうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は更には１００％を置換して、前記オープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を増加させる。
【０１３７】
これに関連して、本明細書に定義する本発明の核酸配列のオープンリーディングフレームのＧ／Ｃ含量を、コードされているアミノ酸配列を変化させることなしに、野生型オープンリーディングフレームと比べて最大限（即ち、置換可能なコドンの１００％）増加させることが特に好ましい。
【０１３８】
更に、オープンリーディングフレームは、好ましくは、少なくとも部分的にコドンが最適化されている。コドンの最適化は、細胞内のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発生頻度が異なることによって翻訳効率が決定され得るという知見に基づいている。したがって、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のコード領域に所謂「レアコドン」が存在している場合、前記レアコドンに相当する改変核酸配列は、比較的「高頻度の」ｔＲＮＡをコードしているコドンが存在する場合よりも翻訳効率が低くなる確率が高い。
【０１３９】
したがって、本発明の核酸配列のオープンリーディングフレームは、好ましくは、細胞内で比較的レアなｔＲＮＡをコードしている野生型配列のうちの少なくとも１つのコドンが、細胞内で比較的高頻度で存在するｔＲＮＡをコードしており且つ前記比較的レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換されるように、相当する野生型コード領域に対して改変される。この改変により、本明細書に定義する本発明の人工核酸分子のオープンリーディングフレームは、高頻度で存在するｔＲＮＡを利用可能なコドンが、レアなｔＲＮＡに対応するコドンに置き換わることができるように改変される。言い換えれば、本発明によれば、この改変により、レアなｔＲＮＡをコードしている野生型オープンリーディングフレームの全てのコドンを、細胞内においてより高頻度で存在し且つ前記レアなｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するコドンと交換してよい。どのｔＲＮＡが細胞内で比較的高頻度で存在するか、及び対照的にどのｔＲＮＡが比較的低頻度で存在するかは、当業者に公知である。例えば、Ａｋａｓｈｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２００１，１１（６）：６６０−６６６を参照されたい。したがって、好ましくは、オープンリーディングフレームは、好ましくは本発明に係る核酸分子が発現する系に関して、好ましくは本発明に係る核酸分子が翻訳される系に関して、コドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームのコドン使用頻度は、哺乳類のコドン使用頻度、より好ましくはヒトのコドン使用頻度に従ってコドンが最適化されている。好ましくは、オープンリーディングフレームは、コドンが最適化されており且つＧ／Ｃ含量が改変されている。
【０１４０】
分解耐性、例えば、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによるインビボ分解に対する耐性を更に改善するために、及び／又は本発明に係る人工核酸分子からのタンパク質発現の安定性を更に改善するために、人工核酸分子は、骨格修飾、糖修飾、及び／又は塩基修飾、例えば、脂質修飾等の修飾を更に含んでいてよい。好ましくは、本発明に係る人工核酸分子の転写及び／又は翻訳は、前記修飾によって殆ど損なわれない。
【０１４１】
本発明において用いることができるヌクレオチドアナログ／修飾は、例えば、２−アミノ−６−クロロプリンリボサイド−５’−トリホスフェート、２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート、２−チオシチジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスフェート、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、５−メチルウリジン−５’−トリホスフェート、６−アザシチジン−５’−トリホスフェート、６−アザウリジン−５’−トリホスフェート、６−クロロプリンリボサイド−５’−トリホスフェート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、８−アザアデノシン−５’−トリホスフェート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスフェート、ベンズイミダゾール−リボサイド−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、プソイドウリジン−５’−トリホスフェート、又はピューロマイシン−５’−トリホスフェート、キサントシン−５’−トリホスフェートから選択してよい。特に好ましくは、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、及びプソイドウリジン−５’−トリホスフェートからなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドである。
【０１４２】
更に、脂質修飾人工核酸分子は、典型的に、人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つのリンカーと、このリンカーと共有結合している少なくとも１つの脂質とを含んでいてよい。或いは、脂質修飾人工核酸分子は、本明細書に定義する少なくとも１つの人工核酸分子と、好ましくはリンカーを介さずに前記人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つの好ましくは二官能性の脂質とを含んでいてよい。第３の選択肢によれば、脂質修飾人工核酸分子は、本明細書に定義する人工核酸分子と、前記人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つのリンカーと、このリンカーと共有結合している少なくとも１つの脂質と、更に、好ましくはリンカーを介さずに前記人工核酸分子と共有結合している少なくとも１つの好ましくは二官能性の脂質とを含んでいてよい。
【０１４３】
更なる態様では、本発明は、
ａ．オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又は例えば、オープンリーディングフレーム若しくはオープンリーディングフレームを含む配列を挿入するためのクローニングサイトと、
ｂ．アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含む少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’ＵＴＲエレメント）と
を含むベクターを提供する。
【０１４４】
少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント及びＯＲＦは、本発明に係る人工核酸分子について上記する通りである。クローニングサイトは、オープンリーディングフレームを導入するのに好適な任意の配列又はオープンリーディングフレームを含む配列、例えば、１以上の制限酵素部位等であってよい。
【０１４５】
したがって、クローニングサイトを含むベクターは、好ましくは、オープンリーディングフレームをベクターに挿入するのに好適である。好ましくは、オープンリーディングフレームを３’ＵＴＲエレメントの５’側に挿入するのに好適である。好ましくは、クローニングサイト又はＯＲＦは、好ましくは３’ＵＴＲエレメントの５’末端に近接して、３’ＵＴＲエレメントの５’側に位置する。例えば、クローニングサイト又はＯＲＦは、３’ＵＴＲエレメントの５’末端に直接連結していてもよく、本発明に係る人工核酸分子について上記した通り一続きのヌクレオチド（例えば、一続きの２ヌクレオチド、４ヌクレオチド、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド等）を介して連結していてもよい。
【０１４６】
好ましくは、本発明に係るベクターは、例えば、任意でオープンリーディングフレーム又はオープンリーディングフレームを含む配列をベクターに挿入し、前記ベクターを転写することによって、本発明に係る人工核酸分子を作製するのに、好ましくは、本発明に係る人工ｍＲＮＡを作製するのに好適である。したがって、好ましくは、ベクターは、プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）等の転写に必要なエレメントを含む。好ましくは、ベクターは、真核生物、原核生物、ウイルス若しくはファージの転写系（例えば、真核細胞、原核細胞等）、又は真核生物、原核生物、ウイルス、若しくはファージのインビトロ転写系を用いる転写に好適である。したがって、例えば、ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ（例えば、真核生物、原核生物、ウイルス、又はファージのＲＮＡポリメラーゼ）によって認識されるプロモーター配列を含んでいてよい。好ましい実施形態では、ベクターは、ＳＰ６又はＴ７等のファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、好ましくはＴ７プロモーターを含む。好ましくは、ベクターは、ファージに基づくインビトロ転写系（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに基づくインビトロ転写系等）を用いるインビトロ転写に好適である。
【０１４７】
ベクターは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りポリ（Ａ）配列及び／又はポリアデニル化シグナルを更に含んでいてよい。
【０１４８】
ベクターは、ＲＮＡベクターであってもよく、ＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡベクターである。ベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドベクター等の当業者に公知の任意のベクターであってよい。好ましくは、ベクターは、プラスミドベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドベクターである。
【０１４９】
好ましい実施形態では、本発明に係るベクターは、本発明に係る人工核酸分子を含む。
【０１５０】
好ましくは、本発明に係るＤＮＡベクターは、配列番号１、配列番号３、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、又は配列番号３８に係る配列、或いは配列番号１、配列番号３、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、又は配列番号３８に係る核酸配列、又は上記これらの断片、好ましくはこれらの機能的断片に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１５１】
好ましくは、本発明に係るＲＮＡベクターは、配列番号２、配列番号４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、又は配列番号３９に係る配列、或いは配列番号２、配列番号４、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、又は配列番号３９に係る核酸配列、又はこれらの断片、好ましくはこれらの機能的断片に対して少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１５２】
好ましくは、ベクターは、環状分子である。好ましくは、ベクターは、二本鎖ＤＮＡ分子等の二本鎖分子である。かかる環状の、好ましくは二本鎖のＤＮＡ分子は、本発明の人工核酸分子の保管形態として便利に用いることができる。更に、細胞、例えば培養細胞のトランスフェクションに用いることができる。また、本発明に係る人工ＲＮＡ分子を得るためのインビトロ転写に用いることができる。
【０１５３】
好ましくは、ベクター、好ましくは環状ベクターは、例えば、制限酵素で切断することによって線形にすることができる。好ましい実施形態では、ベクターは、３’ＵＴＲエレメントの直ぐ３’側、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列若しくはポリアデニル化シグナルの３’側、又は（存在する場合）ポリ（Ｃ）配列の３’側、又は（存在する場合）ヒストンステムループの３’側に位置する制限酵素部位等の切断部位、好ましくは唯一の切断部位を含む。したがって、好ましくは、ベクターの線形化によって得られる生成物は、３’末端において、３’ＵＴＲエレメントの３’末端、又は（存在する場合）ポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルの３’末端、又は（存在する場合）ポリ（Ｃ）配列の３’末端で終結する。本発明に係るベクターが、本発明に係る人工核酸分子を含む実施形態では、制限酵素部位、好ましくは唯一の制限酵素部位が、人工核酸分子の３’末端の直ぐ３’に位置することが好ましい。
【０１５４】
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターを含む細胞に関する。前記細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、脊椎動物細胞、例えば哺乳類細胞等の任意の細胞であってよい。前記細胞は、例えば、細菌細胞において本発明のベクターを複製するために用いることができる。更に、前記細胞は、本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターを転写するため、及び／又は本発明に係る人工核酸分子若しくはベクターのオープンリーディングフレームを翻訳するために用いることができる。例えば、前記細胞は、組み換えタンパク質を産生するために用いることができる。
【０１５５】
本発明に係る細胞は、例えば、標準的なトランスフェクション、形質移入、又は形質転換の方法等の標準的な核酸移入法によって得ることができる。例えば、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクション等によって細胞に移入してよい。
【０１５６】
好ましくは、前記細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト被験体、家畜、実験動物（例えば、マウス又はラット）の細胞等である。好ましくは、前記細胞は、ヒトの細胞である。前記細胞は、確立されている細胞株の細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、ＨＥＬＡ、ＨＥＫ等であってもよく、一次細胞、例えば、ＨＤＦ細胞等であってもよい。好ましくは、生物から単離された細胞である。好ましい実施形態では、前記細胞は、哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の単離細胞である。例えば、前記細胞は、好ましくは哺乳類の被験体、好ましくはヒトの被験体の免疫細胞（例えば、樹状細胞）、癌細胞若しくは腫瘍細胞、又は任意の体細胞等であってよい。
【０１５７】
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、又は本発明に係る細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子ワクチン接種用のワクチンとして用いてよい。したがって、ＯＲＦは、ワクチン接種のために患者に投与される抗原をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、ワクチンである。更に、本発明に係る医薬組成物は、例えば、遺伝子治療に用いることができる。
【０１５８】
好ましくは、医薬組成物は、更に、１以上の薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクル、充填剤、及び／又は希釈剤を含んでいてよい。本発明では、薬学的に許容できるビヒクルは、典型的に、本発明の医薬組成物用の液体又は非液体の基剤を含む。１つの実施形態では、医薬組成物は、液体形態で提供される。これに関連して、前記ビヒクルは、好ましくは、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸、クエン酸等のバッファ溶液等の水に基づく。バッファは、特定のレファレンス媒体に対して高張、等張、又は低張であってよい。即ち、前記バッファは、特定のレファレンス媒体に対してより高い、同一の、又はより低い塩含量を有してよく、好ましくは、浸透圧又は他の濃度効果により哺乳類細胞を損傷させない濃度の前述の塩を用いてよい。レファレンス媒体は、例えば、血液、リンパ液、サイトゾル液、又は他の体液等の「インビボ」法で用いられる液体であるか、或いは一般的なバッファ若しくは液体等の「インビトロ」法でレファレンス媒体として用いることができる液体である。かかる一般的なバッファ又は液体は、当業者に公知である。乳酸リンゲル液が、液体基剤として特に好ましい。
【０１５９】
本発明の医薬組成物のために、患者に投与するのに適している１以上の相溶性の固体又は液体の充填剤又は希釈剤、或いは封入化合物を同様に用いてもよい。用語「相溶性」とは、本明細書で使用するとき、好ましくは、典型的な使用条件下で本発明の医薬組成物の薬学的有効性を実質的に低減させる相互作用が生じないように、本発明の医薬組成物のこれら成分と本明細書に定義する本発明の核酸、ベクター、又は細胞とを混合できることを意味する。
【０１６０】
本発明に係る医薬組成物は、任意で、１以上の更なる医薬活性成分を更に含んでいてよい。これに関連して医薬活性成分とは、特定の適応症又は疾患を治癒させる、寛解させる、又は予防する治療効果を示す化合物である。前記化合物としては、限定するものではないが、ペプチド又はタンパク質、核酸、（治療的に活性のある）低分子量の有機化合物又は無機化合物（分子量：５，０００未満、好ましくは１，０００未満）、糖類、抗原又は抗体、関連技術において既に知られている治療剤、抗原細胞、抗原細胞断片、細胞画分、細胞壁成分（例えば、多糖類）、（例えば、化学的に又は放射線照射により）改変、弱毒化、又は不活化された病原体（ウイルス、細菌等）等が挙げられる。
【０１６１】
更に、本発明の医薬組成物は、人工核酸分子又はベクター用の担体を含んでいてよい。かかる担体は、医薬的に活性のある人工核酸分子又はベクターの生理学的に許容できる液体への溶解、輸送及び細胞内取り込みを媒介するのに好適であり得る。したがって、かかる担体は、本発明に係る人工核酸分子又はベクターのデポー製剤及び送達に好適であり得る成分であってよい。かかる成分は、例えば、トランスフェクション剤又は複合体化剤として機能し得るカチオン性又はポリカチオン性の担体又は化合物であってよい。
【０１６２】
これに関連して、特に好ましいトランスフェクション剤又は複合体化剤は、カチオン性又はポリカチオン性の化合物であり、例えば、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン若しくはスペルミジン、又は他のカチオン性のペプチド又はタンパク質（例えば、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチド又はアナログペプチドを含む）、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リシンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特にショウジョウバエのアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、又はヒストン）が挙げられる。
【０１６３】
更に、かかるカチオン性又はポリカチオン性の化合物又は担体は、好ましくは少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているカチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質であってよい。好ましくは、カチオン性又はポリカチオン性の担体は、以下の合計式（Ｉ）を有するカチオン性ペプチドから選択される：
｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝；式（Ｉ）
（式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘは、３〜１００であり、ｌ、ｍ、ｎ、又はｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、及び９１〜１００から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％であり；Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＯｒｎを除くネイティブ（即ち、自然界に存在する）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり；ｘは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ｘａａの総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の９０％を超えない）。アミノ酸Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、及びＸａａはいずれも、ペプチドの任意の位置に位置してよい。これに関連して、７アミノ酸〜３０アミノ酸のカチオン性ペプチド又はタンパク質が特に好ましい。
【０１６４】
更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質は、上に示す通り、式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝（式（Ｉ））に従って定義され、少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むか又は含むように更に改変されているとき、限定されるものではないが、部分式（Ｉａ）から選択してよい：
｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ’）ｘ（Ｃｙｓ）ｙ｝  部分式（Ｉａ）
（式中、（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；及びｘは、本明細書に定義する通りであり、Ｘａａ’は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、又はＣｙｓを除くネイティブ（即ち、自然界に存在する）又は非ネイティブなアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり、ｙは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｌｙｓ（リジン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）及びＯｒｎ（オルニチン）の総含量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも１０％である）。更に、カチオン性又はポリカチオン性のペプチドは、部分式（Ｉｂ）から選択してよい：
Ｃｙｓ１｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝Ｃｙｓ２  部分式（Ｉｂ）
（式中、経験式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝（式（ＩＩＩ））は、本明細書に定義する通りであり、（半経験）式（ＩＩＩ）に係るアミノ酸配列のコアを形成し、Ｃｙｓ１及びＣｙｓ２は、（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘに近接するか又は末端に存在するシステインである）。
【０１６５】
トランスフェクション剤又は複合体化剤として用いることができる更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性の化合物は、カチオン性多糖類（例えば、キトサン）、ポリブレン、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン、又はカチオン性若しくはポリカチオン性のポリマー（例えば、β−アミノ酸ポリマー又は逆ポリアミド等の修飾ポリアミノ酸；ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））等の修飾ポリエチレン；ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルメタクリレート））等の修飾アクリレート；ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等の修飾アミドアミン；ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）；ポリプロピルアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭ系デンドリマー等のデンドリマー；ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）等のポリイミン；ポリアリルアミン；シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサン等の糖骨格系ポリマー；ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー等のシラン骨格系ポリマー）、１以上のカチオン性ブロック（例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される）と１以上の親水性又は疎水性のブロックとの組み合わせからなるブロックポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）等を含んでいてよい。
【０１６６】
これに関連して、本発明の人工核酸分子又は本発明のベクターは、カチオン性又はポリカチオン性の化合物、好ましくはカチオン性のタンパク質又はペプチドと少なくとも部分的に複合体化することが特に好ましい。部分的にとは、本発明の人工核酸分子又は本発明のベクターの一部のみがカチオン性又はポリカチオン性の化合物と複合体化し、本発明の人工核酸分子又は本発明のベクターの残りは、複合体化していない（「遊離」）形態であることを意味する。好ましくは、複合体化核酸の遊離核酸に対する比は、約５：１（ｗ／ｗ）〜約１：１０（ｗ／ｗ）、より好ましくは約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：８（ｗ／ｗ）、更により好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：５（ｗ／ｗ）又は１：３（ｗ／ｗ）の範囲から選択され、最も好ましくは、複合体化核酸の遊離核酸に対する比は、約１：１（ｗ／ｗ）の比から選択される。
【０１６７】
本発明に係る医薬組成物は、任意で、１以上のアジュバント、例えば、自然免疫系を刺激するため又は人工核酸分子若しくはベクターの細胞内取り込みを強化するためのアジュバントを更に含んでいてよい。これに関連して、アジュバントは、自然免疫系の免疫応答、即ち、非特異的免疫応答を開始させたり増加させたりするのに好適な任意の化合物として理解してよい。言い換えれば、投与したとき、本発明の医薬組成物は、好ましくは、任意で前記医薬組成物に含有されるアジュバントにより、自然免疫応答を誘発する。好ましくは、かかるアジュバントは、哺乳類において自然免疫応答の誘導を補助するアジュバントであってよい。かかるアジュバントは、免疫賦活性核酸（即ち、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体等に結合し得る核酸）、好ましくは、免疫賦活性ＲＮＡであってよい。
【０１６８】
かかるアジュバント、好ましくはかかる免疫賦活性核酸は、医薬組成物の人工核酸分子、好ましくはワクチンによってコードされているペプチド又はタンパク質（即ち、抗原）に対する特異的免疫応答（即ち、適応免疫応答）を補助することができる自然免疫応答（即ち、非特異的免疫応答）を誘導することができる。
【０１６９】
また、本発明の医薬組成物は、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対する（リガンドとしての）結合親和性に起因して、又はマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２若しくはＴＬＲ１３に対する（リガンドとしての）結合親和性に起因して免疫賦活性であることが知られている任意の更なる化合物を更に含有していてもよい。
【０１７０】
本発明の医薬組成物に含まれ得る更なる添加剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）等の乳化剤；例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤；着色剤；風味付与剤；医薬担体；打錠剤；安定剤；酸化防止剤；保存剤である。
【０１７１】
本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、「安全且つ有効な量」の医薬組成物の成分、特に、本明細書に定義する本発明の核酸配列、ベクター、及び／又は細胞を含む。本明細書で使用するとき、「安全且つ有効な量」とは、本明細書に定義する疾患又は疾病の好ましい変化を著しく誘導するのに十分である量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、好ましくは、重篤な副作用を避け、且つ利益とリスクとの間の道理に適った関係を可能にする。これらの限度は、典型的に、道理に適った医学的判断の範囲内で決定される。
【０１７２】
更なる態様では、本発明は、医薬として、例えば（遺伝子ワクチン接種における）ワクチンとして、又は遺伝子治療において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。
【０１７３】
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の治療作用又は効果を利用するか或いは特定のペプチド又はタンパク質の追加が必要である任意の医学的用途に特に好適である。したがって、本発明は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の治療作用又は効果によって治療することができるか、或いは特定のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の追加によって治療することができる疾患又は疾病の治療又は予防において用いるための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。例えば、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば遺伝子ワクチン接種又は遺伝子治療によって、遺伝性疾患、自己免疫疾患、癌性又は腫瘍関連疾患、感染性疾患、慢性疾患等を治療又は予防するために用いることができる。
【０１７４】
特に、本発明の３’ＵＴＲエレメントは、本発明の核酸分子のＯＲＦを安定的に長期に亘って発現させるので、治療を受ける被験体において治療用のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が安定的に且つ長期に亘って存在することから利益を得るかかる治療的処置は、本発明に関連する医学的用途に特に好適である。したがって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物に特に好適な医学的用途は、ワクチン接種である。したがって、本発明は、被験体、好ましくは哺乳類の被験体、より好ましくはヒトの被験体のワクチン接種のための本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。好ましいワクチン接種処理は、細菌、原生動物、又はウイルスによる感染症等の感染性疾患に対するワクチン接種、及び抗腫瘍ワクチン接種である。かかるワクチン接種処理は、予防的であってもよく、治療的であってもよい。
【０１７５】
治療又は予防される疾患に応じてＯＲＦを選択してよい。例えば、オープンリーディングフレームは、遺伝性疾患に罹患している患者等、タンパク質が完全に欠失しているか又は機能が少なくとも部分的に喪失している患者に供給すべきタンパク質をコードしていてよい。更に、オープンリーディングフレームは、被験体の疾患又は症状に有益な影響を与えるペプチド又はタンパク質をコードしているＯＲＦから選択してよい。更に、オープンリーディングフレームは、天然のペプチド若しくはタンパク質の病的過剰産生をダウンレギュレートするか又は病的にタンパク質若しくはペプチドを発現する細胞を除去するペプチド又はタンパク質をコードしていてもよい。かかる欠失、機能喪失、又は過剰産生は、例えば、腫瘍及び新生物、自己免疫疾患、アレルギー、感染症、慢性疾患等に関連して生じる場合がある。更に、オープンリーディングフレームは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍抗原のエピトープ）をコードしていてよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸分子又はベクターは、抗原又は免疫原（例えば、病原体又は腫瘍関連抗原のエピトープ）と、上記３’ＵＴＲエレメント、及びポリ（Ａ）配列等の任意の更なる成分とを含むか又はからなるアミノ酸配列をコードしているＯＲＦを含む。
【０１７６】
医学的用途に関連して、特に、ワクチン接種に関連して、ＤＮＡは、抗ＤＮＡ免疫応答を誘発するリスクを有し且つゲノムＤＮＡに挿入される傾向を有するので、本発明に係る人工核酸分子は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであることが好ましい。しかし、幾つかの実施形態では、例えば、アデノウイルス送達ビヒクル等のウイルス送達ビヒクルを、例えば、遺伝子治療的処置において本発明に係る人工核酸分子又はベクターを送達するために用いる場合、人工核酸分子又はベクターがＤＮＡ分子であることが望ましい場合もある。
【０１７７】
本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、又は埋め込まれたレザーバを介して投与してよい。本明細書で使用するとき、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を含む。
【０１７８】
好ましくは、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、非経口的に、例えば非経口注射によって投与され、より好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病変内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下への注射又は注入技術を介して投与される。皮内及び筋肉内への注射が特に好ましい。本発明の医薬組成物の滅菌注射用形態は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これら懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤と懸濁化剤とを用いて当技術分野において公知の技術に従って製剤され得る。
【０１７９】
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない任意の経口的に許容できる剤形で経口投与してよい。
【０１８０】
また、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、例えば、皮膚又は任意の他のアクセス可能な上皮組織の疾患を含む、局所塗布によって容易にアクセス可能な領域又は器官が治療標的に含まれる場合は特に、局所投与してもよい。これら領域又は器官のそれぞれについて、好適な局所製剤は容易に調製される。局所塗布については、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を、１以上の担体に懸濁又は溶解している好適な軟膏に製剤してよい。
【０１８１】
１つの実施形態では、医薬としての使用は、哺乳類細胞のトランスフェクション、好ましくは哺乳類細胞のインビトロトランスフェクション、より好ましくは前記医薬により治療される被験体の単離細胞のインビトロトランスフェクションの工程を含む。前記使用が単離細胞のインビトロトランスフェクションを含む場合、医薬としての使用は、トランスフェクトされた細胞を患者に（再）投与することを更に含んでいてよい。医薬としての本発明の人工核酸分子又はベクターの使用は、トランスフェクションに成功した単離細胞を選択する工程を更に含んでいてよい。したがって、ベクターが選択マーカーを更に含むことが有益である場合がある。また、前記医薬としての使用は、単離細胞のインビトロトランスフェクションと、前記細胞からの発現産物（即ち、コードされているペプチド又はタンパク質）の精製とを含んでいてよい。この精製ペプチド又はタンパク質は、後に、それを必要としている被験体に投与してよい。
【０１８２】
また、本発明は、上記疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物をそれを必要としている被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０１８３】
更に、本発明は、疾患又は疾病を治療又は予防する方法であって、本発明に係る人工核酸分子又は本発明に係るベクターで細胞をトランスフェクトすることを含む方法を提供する。トランスフェクションは、インビトロで実施してもよく、インビボで実施してもよい。好ましい実施形態では、細胞のトランスフェクションは、インビボで実施され、トランスフェクトされた細胞は、それを必要としている被験体、好ましくはヒト被験体に投与される。好ましくは、インビトロでトランスフェクトされる細胞は、被験体、好ましくはヒト患者の単離細胞である。したがって、本発明は、被験体、好ましくはヒト患者から細胞を単離する工程と、本発明に係る人工核酸又は本発明に係るベクターで前記単離細胞をトランスフェクトする工程と、前記トランスフェクトされた細胞を前記被験体、好ましくは前記ヒト患者に投与する工程とを含む治療方法を提供する。
【０１８４】
本発明に係る疾患を治療又は予防する方法は、好ましくは、上記ワクチン接種方法及び／又は遺伝子治療方法である。
【０１８５】
上記の通り、本発明の３’ＵＴＲエレメントは、ｍＲＮＡ分子を安定化することができる並びに／又はｍＲＮＡ分子からのタンパク質産生を安定化及び／若しくは延長することができる。したがって、更なる態様では、本発明は、ＲＮＡ分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）を安定化させる方法であって、ＲＮＡ分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）又は前記ＲＮＡ分子をコードしているベクターと、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’ＵＴＲエレメント）とを結合させる工程を含む方法に関する。
【０１８６】
更に、本発明は、人工核酸分子若しくはベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）からのタンパク質産生を増加させる及び／又は人工核酸分子若しくはベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）からのタンパク質産生を延長する方法であって、前記人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）と、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる３’ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’ＵＴＲエレメント）とを結合させる工程を含む方法に関する。
【０１８７】
用語「人工核酸分子又はベクターと３’ＵＴＲエレメントとを結合させる」とは、本発明において、好ましくは、人工核酸分子又はベクターと３’ＵＴＲエレメントとを機能的に結合させるか又は機能的に組み合わせることを意味する。これは、人工核酸分子又はベクターと、３’ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’ＵＴＲエレメント）とが、３’ＵＴＲエレメントの機能（例えば、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生を安定化させる機能）が発揮されるように結合又はカップリングされることを意味する。典型的に、これは、３’ＵＴＲエレメントが、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）の、オープンリーディングフレームの３’側、好ましくはオープンリーディングフレームの直ぐ３’側、好ましくはオープンリーディングフレームとポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれることを意味する。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ）に３’ＵＴＲとして、即ち、前記３’ＵＴＲエレメントが、前記人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲになるように、即ち、任意で短いリンカー（例えば、１以上の制限酵素部位を含むか又はからなる配列）を介して連結されている、オープンリーディングフレームの３’側からポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナルの５’側まで延在するように組み込まれる。したがって、好ましくは、用語「人工核酸分子又はベクターと３’ＵＴＲエレメントとを結合させる」とは、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）内に位置するオープンリーディングフレームと３’ＵＴＲエレメントとを機能的に結合させることを意味する。３’ＵＴＲ及びＯＲＦは、本発明に係る人工核酸分子について上記した通りであり、例えば、好ましくは、ＯＲＦと３’ＵＴＲとは、異種であり、例えば、上記の通り異なる遺伝子に由来する。
【０１８８】
更なる態様では、本発明は、ＲＮＡ分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）の安定性を上昇させるための３’ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’ＵＴＲエレメント）の使用であって、前記３’ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる使用を提供する。
【０１８９】
更に、本発明は、人工核酸分子又はベクター（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）からのタンパク質産生を増加させるため、並びに／又は人工核酸分子又はベクター分子（好ましくは、ｍＲＮＡ分子）からのタンパク質産生を安定化及び／若しくは延長するための３’ＵＴＲエレメント（好ましくは、上記３’ＵＴＲエレメント）の使用であって、前記３’ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲ又はアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含むか又はからなる使用を提供する。
【０１９０】
本発明に係る使用は、好ましくは、人工核酸分子、ベクター、又はＲＮＡと上記３’ＵＴＲエレメントとを結合させることを含む。
【０１９１】
本発明の医薬組成物の化合物及び成分は、互いに独立して製造及び取引されてもよい。したがって、本発明は、更に、本発明に係る人工核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、及び／又は本発明に係る医薬組成物を含むキット又はキットオブパーツに関する。好ましくは、かかるキット又はキットオブパーツは、更に、使用説明書と、トランスフェクション用の細胞と、アジュバントと、医薬組成物の投与手段と、人工核酸分子、ベクター、細胞、又は医薬組成物を溶解又は希釈するための薬学的に許容できる担体及び／又は薬学的に許容できる溶液とを含んでいてよい。
【実施例】
【０１９２】
１．  ＤＮＡテンプレートの調製
Ｔ７プロモーターに続いて、キタアメリカホタルルシフェラーゼをコードしているＧＣリッチ配列（ｐｐＬｕｃ（ＧＣ））及びＡ６４ポリ（Ａ）配列を含むインビトロ転写用ベクターを構築した。Ａ６４ポリ（Ａ）配列で終結するｍＲＮＡを得るために、インビトロ転写前にベクターを線形化するために用いられる制限酵素部位をポリ（Ａ）配列の直後に配置した。インビトロ転写によって適宜このベクターから得られたｍＲＮＡを「ｐｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４」と命名する。
【０１９３】
このベクターを、オープンリーディングフレームの３’側に非翻訳配列（３’ＵＴＲ）を含むように改変した。以下のｍＲＮＡコード配列を含むベクターを作製した（図４〜１６及び２２〜２３）：
配列番号５（図４）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４
配列番号６（図５）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン−Ａ６４
配列番号７（図６）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン２−Ａ６４
配列番号８（図７）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン３−Ａ６４
配列番号９（図８）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン４−Ａ６４
配列番号１０（図９）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン５−Ａ６４
配列番号１１（図１０）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン６−Ａ６４
配列番号１２（図１１）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン７−Ａ６４
配列番号１３（図１２）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４
配列番号１４（図１３）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｇｕｓｂ−Ａ６４
配列番号１５（図１４）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｔｐ５ｏ−Ａ６４
配列番号１６（図１５）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｎｄｕｆａ１−Ａ６４
配列番号１７（図１６）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｔｐ５ｌ−Ａ６４
配列番号４０（図２２）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン８−Ａ６４
配列番号４１（図２３）：ＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン９−Ａ６４
【０１９４】
実施例で用いるｍＲＮＡは、前記ベクターのインビトロ転写によって得た。
【０１９５】
２．  インビトロ転写
実施例１に係るＤＮＡテンプレートを線形化し、Ｔ７−ポリメラーゼを用いてインビトロで転写させた。次いで、ＤＮＡテンプレートをＤＮａｓｅ処理によって分解した。過剰のＮ７−メチル−グアノシン−５’−トリホスフェートー５’−グアノシンを転写反応物に添加することによって、５’−キャップ構造を含むｍＲＮＡ転写産物を得た。このようにして得られたｍＲＮＡを精製し、水に再懸濁させた。
【０１９６】
３．  細胞のトランスフェクション
３．１  ｍＲＮＡのエレクトロポレーション
細胞をトリプシン処理し、ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄した。ｏｐｔｉ−ＭＥＭ２００μＬ中５×１０４個又は１×１０５個の細胞を、それぞれ、ＰｐＬｕｃをコードしているｍＲＮＡ０．３μｇ又は１μｇでエレクトロポレーションした。コントロールとして、ｐｐＬｕｃをコードしていないｍＲＮＡを別個にエレクトロポレーションした。幾つかの実験では、トランスフェクション効率を管理するために、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（ＲｒＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡをＰｐＬｕｃ  ｍＲＮＡと共にエレクトロポレーションした（ＲｒＬｕｃ  ｍＲＮＡ０．１μｇ）。エレクトロポレーションした細胞を、２４ウェルプレートの培地（１ｍＬ）に播種した。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、又は４８時間後（又は幾つかの実験では、７２時間後）、培地を吸引し、リシスバッファ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（ＨＣｌ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  グリセロール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）又はＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２００μＬに細胞を溶解させた。ルシフェラーゼ活性を測定するまで溶解物を−２０℃で保存した。
【０１９７】
３．２  ｍＲＮＡのリポフェクション
トランスフェクションの３日間前に、細胞を９６ウェルプレートに播種した（１ウェル当たり２，５００細胞又は５，０００細胞）。リポフェクション直前に、ｏｐｔｉ−ＭＥＭで細胞を洗浄した。リポフェクタミン２０００と複合体化しているＰｐＬｕｃコードｍＲＮＡ（１ウェル当たり２５ｎｇ）で細胞をリポフェクトした。トランスフェクション効率を管理するためにウミシイタケルシフェラーゼ（ＲｒＬｕｃ）をコードしているｍＲＮＡをＰｐＬｕｃ  ｍＲＮＡと共にコトランスフェクトした（１ウェル当たりＲｒＬｕｃ  ｍＲＮＡ２．５ｎｇ）。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、又は７２時間後に培地を吸引し、リシスバッファ（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬに細胞を溶解させた。ルシフェラーゼ活性を測定するまで溶解物を−８０℃で保存した。
【０１９８】
４．  ルシフェラーゼ測定
ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダーによって相対光単位（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を測定した。ＰｐＬｕｃ活性は、溶解物５０μＬ及びルシフェリンバッファ２００μＬ（７５μＭ  ルシフェリン、２５ｍＭ  グリシルグリシン、ｐＨ７．８（ＮａＯＨ）、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２ｍＭ  ＡＴＰ）を用いて、５秒間の測定時間で測定した。ＲｒＬｕｃ活性は、溶解物５０μＬ及びセレンテラジンバッファ２００μＬ（４０μＭセレンテラジン、２．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ５．０）、１．１Ｍ  ＮａＣｌ、１．３ｍＭ  ＮａＮ３、０．４４ｇ／Ｌ  ＢＳＡ）を用いて、５秒間の測定時間で測定した。
【０１９９】
或いは、Ｈｉｄｅｘ  Ｃｈａｍｅｌｅｏｎプレートリーダーによって相対光単位（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を測定した。ＰｐＬｕｃ活性は、溶解物２０μＬ及びルシフェリンバッファ１００μＬ（Ｂｅｅｔｌｅ−Ｊｕｉｃｅ，ＰＪＫ  ＧｍｂＨ）を用いて、２秒間の測定時間で測定した。ＲｒＬｕｃ活性は、溶解物２０μＬ及びセレンテラジンバッファ１００μＬ（Ｒｅｎｉｌｌａ−Ｊｕｉｃｅ，ＰＪＫ  ＧｍｂＨ）を用いて、２秒間の測定時間で測定した。
【０２００】
５．結果
５．１  アルブミン３’ＵＴＲは、周知のα−グロビン３’ＵＴＲよりもｍＲＮＡからのタンパク質発現を著しく延長する。
ｍＲＮＡからのタンパク質発現に対する３’非翻訳領域の効果について調べるために、実施例１−２に従って様々な３’ＵＴＲを有するｍＲＮＡを合成した。ヒトα−グロビンの３’ＵＴＲの中央のα複合体結合部分を含有しているｍＲＮＡ（配列番号１３に係るＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ａｇ−Ａ６４）。α−グロビン３’ＵＴＲを選択したのは、コード領域の配列に関係なくｍＲＮＡを安定化させることが報告されているためである（Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｎ．Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．＆Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ，Ｍ．，２００２．Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ  ｉｓ  ａ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｖｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ３’−ｔｏ−５’  ｅｘｏｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｃａｐｐｉｎｇ．ＲＮＡ，８（１２），Ｓ．１５２６−１５３７．）。或いは、ヒトアルブミンの３’ＵＴＲを含有するｍＲＮＡ（配列番号６に係るＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン−Ａ６４）。ヒトアルブミンｍＲＮＡは、安定であることが報告されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ：  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ，ａｃｔｉｎ，ａｎｄ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８８（１２），Ｓ．５２８７−５２９１）。最後に、ヒトβ−グルクロニダーゼの３’ＵＴＲを含有するｍＲＮＡ（配列番号１４に係るＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−ｇｕｓｂ−Ａ６４）を用いた。このヒトβ−グルクロニダーゼｍＲＮＡも、安定であることが報告されている（Ｗａｔｓｏｎ，Ｇ．＆Ｐａｉｇｅｎ，Ｋ．，１９８７．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｄｅｓｃｒｉｂｅ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｍＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７（３），Ｓ．１０８５−１０９０．）。比較のために、３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡも用いた（配列番号５に係るＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−Ａ６４）。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、及び４８時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表１及び図１を参照）。
【０２０１】
【表９】
0006298039.tif 000010
【０２０２】
３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から４８時間後にかけて低下し、４８時間後には６時間後のシグナルの１０％しか残っていなかった。α−グロビン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を中等度にしか安定化させなかった。しかし、驚くべきことに、ヒトアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を更に著しく延長した。対照的に、β−グルクロニダーゼの３’ＵＴＲは、アルブミン３’ＵＴＲでみられた程度まではルシフェラーゼ発現を延長しなかった。
【０２０３】
４８時間後のルシフェラーゼレベルの６時間後のルシフェラーゼレベルに対する比（数字が大きいほど、タンパク質発現の安定化を示す）を計算した。任意の３’ＵＴＲがタンパク質発現の経時変化をどれくらい安定化させたかを示すこれらデータを、表２に要約する。
【０２０４】
【表１０】
0006298039.tif 000011
【０２０５】
アルブミン３’ＵＴＲは、周知のα−グロビン３’ＵＴＲよりも遥かに、また安定なβ−グルクロニダーゼｍＲＮＡの３’ＵＴＲよりもタンパク質発現を安定化させた。この結果は、アルブミン３’ＵＴＲが、ｍＲＮＡからのタンパク質発現の延長において特に効率的であることを示す。
【０２０６】
５．２  アルブミン３’ＵＴＲは、全タンパク質発現を維持しながらタンパク質発現を延長する点で独特である。
アルブミン３’ＵＴＲによるタンパク質発現の延長は、安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲの遺伝的効果を明らかにし得る（たとえ、実施例５．１でみられたα−グロビン３’ＵＴＲの非常に限定的な効果が、この主張を証明するものではないとしても）。したがって、安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含有するｍＲＮＡを合成した（Ｆｒｉｅｄｅｌ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ｅｌ．，２００９．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３７（１７），Ｓ．ｅ１１５．）：ａｔｐ５ｏ又はｎｄｕｆａ１又はａｔｐ５ｌ（それぞれ、ヒトＡＴＰシンターゼサブユニットＯ、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１αサブ複合体サブユニット１、又はヒトＡＴＰシンターゼサブユニットｇ）。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、及び４８時間後にルシフェラーゼレベルを測定した（以下の表３及び図２を参照）。
【０２０７】
【表１１】
0006298039.tif 000012
【０２０８】
３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から４８時間後にかけて低下し、４８時間後には６時間後のシグナルの１４％しか残っていなかった。α−グロビン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を中等度安定化させた。しかし、驚くべきことに、ヒトアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を更に著しく延長した。アルブミン３’ＵＴＲと比べて、幾つかの異なる安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、遥かに低い程度しかｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現に影響を与えなかった。ａｔｐ５ｏ及びａｔｐ５ｌの３’ＵＴＲは、ルシフェラーゼ発現を安定させる程度がアルブミン３’ＵＴＲよりも遥かに低かった。更に、ａｔｐ５ｏ及びａｔｐ５ｌの３’ＵＴＲは、アルブミン３’ＵＴＲに比べてルシフェラーゼレベルを実質的に低下させた。安定なｎｄｕｆａ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、ルシフェラーゼ発現を著しく安定化させた。しかし、ｎｄｕｆａ１の３’ＵＴＲも、ルシフェラーゼ発現を実質的に低下させた。
【０２０９】
４８時間後のルシフェラーゼレベルの６時間後のルシフェラーゼレベルに対する比（数字が大きいほど、タンパク質発現の安定化を示す）を計算した。任意の３’ＵＴＲがタンパク質発現の経時変化をどれくらい安定化させたかを示すこれらデータを、表４に要約する。
【０２１０】
【表１２】
0006298039.tif 000013
【０２１１】
アルブミン３’ＵＴＲは、全タンパク質発現を維持しながらタンパク質発現を延長する点で独特であった。アルブミン３’ＵＴＲは、周知のα−グロビン３’ＵＴＲ及び幾つかの異なる安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲと比べて、最も遅い時点におけるタンパク質発現を実質的に上昇させた。この結果は、アルブミン３’ＵＴＲが、ｍＲＮＡからのタンパク質発現の延長に特に好適であることを示す。
【０２１２】
５．３  アルブミン３’ＵＴＲの様々な変異体は、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長する。
ヒトアルブミン３’ＵＴＲは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、ＸｂａＩ制限酵素部位、及びＴ７終結シグナルを含有する。したがって、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位及び／又はＸｂａＩ制限酵素部位及び／又はＴ７終結シグナルが点変異によって除去されている、ヒトアルブミン３’ＵＴＲの変異体を含有するｍＲＮＡを合成した（配列番号１７〜１２に係るＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン２〜７）。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ＰｐＬｕｃシグナルを、コトランスフェクトしたＲｒＬｕｃのシグナルによってトランスフェクション効率について補正した（以下の表５及び図３を参照）。
【０２１３】
【表１３】
0006298039.tif 000014
【０２１４】
７２時間後のルシフェラーゼレベルの６時間後のルシフェラーゼレベルに対する比（数字が大きいほど、タンパク質発現の安定化を示す）を計算した。任意の３’ＵＴＲがタンパク質発現の経時変化をどれくらい安定化させたかを示すこれらデータを、表６に要約する。
【０２１５】
【表１４】
0006298039.tif 000015
【０２１６】
３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から７２時間後にかけて低下し、７２時間後には６時間後のシグナルの５％しか残っていなかった。α−グロビン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を中等度にしか安定化しなかった。対照的に、アルブミン３’ＵＴＲの全ての変異体は、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長した。
【０２１７】
５．４  霊長類のアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長する。
アルブミン３’ＵＴＲによるタンパク質発現の延長は、種特異的である可能性がある。様々な霊長類に由来するアルブミン３’ＵＴＲを比較すると、ヒトアルブミン３’ＵＴＲに対する相同性が一番低いのは、アヌビスヒヒのアルブミン３’ＵＴＲであった（チンパンジー：同一性９９％、ボノボ：同一性９９％、スマトラオランウータン：同一性９９％、アヌビスヒヒ：同一性９６％）。したがって、アヌビスヒヒのアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲを含有するｍＲＮＡを合成した（配列番号４０に係るＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン８−Ａ６４）。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にエレクトロポレーションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ＰｐＬｕｃシグナルを、コトランスフェクトしたＲｒＬｕｃのシグナルによってトランスフェクション効率について補正した（以下の表７及び図１８を参照）。
【０２１８】
【表１５】
0006298039.tif 000016
【０２１９】
７２時間後のルシフェラーゼレベルの６時間後のルシフェラーゼレベルに対する比（数字が大きいほど、タンパク質発現の安定化を示す）を計算した。任意の３’ＵＴＲがタンパク質発現の経時変化をどれくらい安定化させたかを示すこれらデータを、表８に要約する。
【０２２０】
【表１６】
0006298039.tif 000017
【０２２１】
３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から７２時間後にかけて低下し、７２時間後には６時間後のシグナルの５％しか残っていなかった。ヒトアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長した。アヌビスヒヒ由来のアルブミン３’ＵＴＲは、ヒト配列と同程度ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を延長した。この結果は、霊長類由来のアルブミン３’ＵＴＲが、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長するのに特に好適であることを示す。
【０２２２】
ヒト及びアヌビスヒヒのアルブミン３’ＵＴＲによるタンパク質発現の延長は、ｍＲＮＡをエレクトロポレーションではなくリポフェクションした場合にもみられた。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをＨＤＦにリポフェクションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ＰｐＬｕｃシグナルを、コトランスフェクトしたＲｒＬｕｃのシグナルによってトランスフェクション効率について補正した（以下の表９及び図１９を参照）。
【０２２３】
【表１７】
0006298039.tif 000018
【０２２４】
４８時間後のルシフェラーゼレベルの６時間後のルシフェラーゼレベルに対する比（数字が大きいほど、タンパク質発現の安定化を示す）を計算した。任意の３’ＵＴＲがタンパク質発現の経時変化をどれくらい安定化させたかを示すこれらデータを、表１０に要約する。
【０２２５】
【表１８】
0006298039.tif 000019
【０２２６】
エレクトロポレーションではなくリポフェクションした際も、ヒトアルブミン３’ＵＴＲ及びアヌビスヒヒ由来のアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長した。この結果は、霊長類由来のアルブミン３’ＵＴＲが、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長するのに特に好適であることを確認するものである。
【０２２７】
５．５  霊長類のアルブミン３’ＵＴＲは、マウス細胞においてｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長する。
アルブミン３’ＵＴＲによるタンパク質発現の延長は、種特異的である可能性がある。したがって、ヒトアルブミン３’ＵＴＲ及びアヌビスヒヒ由来のアルブミン３’ＵＴＲが、マウス細胞においてｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を延長するかどうかについて試験した。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをマウス線維芽細胞株であるＬ−９２９細胞にリポフェクションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ｐＬｕｃシグナルを、コトランスフェクトしたＲｒＬｕｃのシグナルによってトランスフェクション効率について補正した（以下の表１１及び図２０を参照）。
【０２２８】
【表１９】
0006298039.tif 000020
【０２２９】
４８時間後のルシフェラーゼレベルの６時間後のルシフェラーゼレベルに対する比（数字が大きいほど、タンパク質発現の安定化を示す）を計算した。任意の３’ＵＴＲがタンパク質発現の経時変化をどれくらい安定化させたかを示すこれらデータを、表１２に要約する。
【０２３０】
【表２０】
0006298039.tif 000021
【０２３１】
３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から４８時間後にかけて低下し、４８時間後には６時間後のシグナルの２３％しか残っていなかった。ヒトアルブミン３’ＵＴＲは、マウス細胞株においてｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長した。また、アヌビスヒヒ由来のアルブミン３’ＵＴＲも、マウス細胞株においてｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を延長した。この結果は、霊長類由来のアルブミン３’ＵＴＲが、哺乳類細胞種におけるｍＲＮＡからのタンパク質発現の延長に特に好適であることを示す。
【０２３２】
５．６  哺乳類のアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を延長する。
アルブミン３’ＵＴＲによるタンパク質発現の延長は、種特異的である可能性がある。様々な哺乳類由来のアルブミン３’ＵＴＲを比較すると、ヒトアルブミン３’ＵＴＲに対する相同性が一番低いのは、マウスアルブミン３’ＵＴＲであった（ウマ：同一性８６％、イヌ：同一性８４％、ウシ：同一性７４％、ラット：同一性７３％、マウス：同一性７２％）。したがって、マウスアルブミン遺伝子の３’ＵＴＲを含有するｍＲＮＡを合成した（配列番号４１に係るＰｐＬｕｃ（ＧＣ）−アルブミン９−Ａ６４）。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にリポフェクションした。トランスフェクションの６時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後にルシフェラーゼレベルを測定した。ＰｐＬｕｃシグナルを、コトランスフェクトしたＲｒＬｕｃのシグナルによってトランスフェクション効率について補正した（以下の表１３及び図２１を参照）。
【０２３３】
【表２１】
0006298039.tif 000022
【０２３４】
４８時間後のルシフェラーゼレベルの６時間後のルシフェラーゼレベルに対する比（数字が大きいほど、タンパク質発現の安定化を示す）を計算した。任意の３’ＵＴＲがタンパク質発現の経時変化をどれくらい安定化させたかを示すこれらデータを、表１４に要約する。
【０２３５】
【表２２】
0006298039.tif 000023
【０２３６】
３’ＵＴＲを有しないｍＲＮＡからのルシフェラーゼレベルは、６時間後から４８時間後にかけて低下し、４８時間後には６時間後のシグナルの４９％しか残っていなかった。ヒトアルブミン３’ＵＴＲ及びアヌビスヒヒ由来のアルブミン３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を著しく延長した。重要なことに、マウス由来のアルブミン３’ＵＴＲも、ヒトＨｅＬａ細胞株においてｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を同様に延長した。この結果は、哺乳類由来のアルブミン３’ＵＴＲが、ｍＲＮＡからのタンパク質発現の延長に特に好適であることを示す。
【０２３７】
配列
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【図１】
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【図２】
0006298039.tif 000040
【図３】
0006298039.tif 000041
【図４】
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【図５】
0006298039.tif 000043
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006298039.tif 000047
【図１０】
0006298039.tif 000048
【図１１】
0006298039.tif 000049
【図１２】
0006298039.tif 000050
【図１３】
0006298039.tif 000051
【図１４】
0006298039.tif 000052
【図１５】
0006298039.tif 000053
【図１６】
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【図１７】
0006298039.tif 000055
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
0006298039.tif 000060
【図２３】
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【配列表】
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