(57)【要約】  本発明は、外因性ポリペプチド、例えば、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの発現を改善する組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、DNAワクチンのために有用な組成物及び方法において、発現及び安定性が高められたDNAプラスミドを提供する。
2010525812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カナマイシン耐性遺伝子を含むDNAプラスミドであって、
（a）前記カナマイシン耐性遺伝子が配列番号:1のプロモータ及び／又はTTG開始コドンを含むか、
（b）前記カナマイシン耐性遺伝子が配列番号:2のプロモータ、配列番号:3のプロモータ及び／又は転写終了シグナルを含まず、
前記カナマイシン耐性遺伝子の発現が、配列番号:2のプロモータ、配列番号:3のプロモータ及び／又は転写終了シグナルを含むカナマイシン耐性遺伝子と比較して低下する、前記カナマイシン耐性遺伝子を含むDNAプラスミド。
【請求項２】
カナマイシン耐性遺伝子の発現の低下が、配列番号:2のプロモータ、配列番号:3のプロモータ及び／又は転写終了シグナルを含むカナマイシン耐性遺伝子を含むDNAプラスミドと比較して、より高いプラスミド収量及びより高いプラスミド安定性をもたらす、請求項1に記載のDNAプラスミド。
【請求項３】
カナマイシン耐性遺伝子が配列番号:1のプロモータを含む、請求項1又は2に記載のDNAプラスミド。
【請求項４】
カナマイシン耐性遺伝子がTTG開始コドンを含む、請求項1から3のいずれかの項に記載のDNAプラスミド。
【請求項５】
DNAプラスミドがpLL10、pLL14、pLL16又はpLL18である、請求項1に記載のDNAプラスミド。
【請求項６】
トランスポゾンがカナマイシン耐性遺伝子プロモータと翻訳開始点との間に挿入されてあり、それによってカナマイシン耐性遺伝子の発現の低下がもたらされる、カナマイシン耐性遺伝子を含むDNAプラスミド。
【請求項７】
カナマイシン耐性遺伝子の発現の低下が、トランスポゾンがカナマイシン耐性遺伝子プロモータと翻訳開始との間に挿入されていないカナマイシン耐性遺伝子を含むDNAプラスミドと比較して、より高いプラスミド収量及びより高いプラスミド安定性をもたらす、請求項6に記載のDNAプラスミド。
【請求項８】
請求項1から7のいずれかの項に記載のプラスミド及び医薬的又は獣医学的に許容できる担体、ビヒクル若しくは賦形剤を含む、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドのデリバリー及び発現のための処方物。
【請求項９】
担体、ビヒクル又は賦形剤が、トランスフェクションを促進させる、及び／又は、ベクター又はタンパク質の保存を向上させる、請求項8に記載の処方物。
【請求項１０】
対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドが、トリ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ又はブタのウイルス若しくは病原体に由来する、請求項8又は9に記載の処方物。
【請求項１１】
動物で免疫応答を刺激する方法であって、請求項8から10のいずれかの項に記載の処方物の有効量を動物の細胞に投与し、さらに前記細胞で対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現させる工程を含む、前記免疫応答を刺激する方法。
【請求項１２】
動物で免疫応答を誘導する方法であって、請求項8から10のいずれかの項に記載の処方物の有効量を動物の細胞に投与し、さらに前記細胞で対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現させる工程を含む、前記免疫応答を誘導する方法。
【請求項１３】
動物がトリ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ又はブタである、請求項11又は13に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1から10のいずれかの項に記載のDNAプラスミド又は処方物及び請求項11から13のいずれかの１項記載の方法を実施するための指示書を含む、請求項11から13に記載の方法のいずれか1つを実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
参照による本明細書への包含
本発明は米国仮特許出願60/795,324（2006年4月27日出願）に関連する。本明細書で引用又は参照される全ての文書類（“本明細書引用文書類”）、及び本明細書引用文書類で引用又は参照される全ての文書類は、一切の製造業者の指示書、説明書、製品明細書、及び本明細書又は本明細書に参照により含まれる一切の文書類に記載された一切の製品に関する製品パンフレットと同様に参照により本明細書に含まれ、さらに本発明の実施に利用することができる。
本発明は一般的にDANワクチン及びDANワクチンを使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、DNAワクチンのために有用な、発現及び安定性が改善されたDNAプラスミドに関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAワクチン（遺伝子ワクチン、プラスミドワクチン又はポリヌクレオチドワクチンとも称される）は、抗原に対する免疫付与を目的とする遺伝子の移入に利用される比較的簡単で経済的な方法の代表である。DNAワクチンに付随する低い毒性はその更なる開発を有利にするが、臨床的環境にうまく組み入れられるためには、このアプローチの潜在能力を向上させるさらに新たな戦術が要求される（以下の論文で概説されている：Shaw & Strong, Front Biosci 2006 Jan 1, 11:1189-98）。DNAワクチン接種は通常のワクチン戦術における大半の不都合を克服することができ、将来のワクチンとしての潜在能力を有している。しかしながら、商品はなお市場に提供されるには至っていない。可能な1つの説明は、ヒトで効率的な免疫応答を誘発するには技術的に不十分であるということも言えようが、安全性もまた基本的な問題でありえる（以下の論文で概説されている：Glenting & Wessels, Microb Cell Fact 2005 Sep 6, 4:26）。
pVR1020又は1012プラスミド（VICAL Inc.; C. Luke et al. Journal Infectious Diseases 1997, 175:91-97；J. Hartikka et al. Human Gene Therapy 1996 7:1205-1217；例えば以下を参照されたい：米国特許5,846,946号、6,451,769号、6,586,409号及び6,875,748号）は、ポリヌクレオチド配列の挿入に利用されるDNAプラスミドベクターである。pVR1020プラスミドはpVR1012に由来し、ヒトtPAシグナル配列を含む。また別のDNAプラスミドが、例えば米国特許6,852,705号、6,818,628号、6,586,412号、6,576,243号、6,558,674号、6,464,984号、6,451,770号、6,376,473号及び6,221,362号で見出される。しかしながら、DNAワクチン接種用のpVR1012系プラスミドには不都合、例えばプラスミドの不安定性及びコピー数の不均一性が存在する。
したがって、特に、防御応答を誘導するために十分な量で、対象の標的抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現させることに関して有効なDNAワクチンが求められる。
本出願におけるいずれの文書の引用又は検証も、そのような文書が本発明に先行する技術として利用可能であることを容認するものではない。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、部分的には、カナマイシン耐性遺伝子プロモータと翻訳開始点との間のトランスポゾンの挿入が予想通りカナマイシン耐性を消滅させ、さらに予想に反して高速度のプラスミド複製を可能にするという実験的観察に基づいている。換言すれば、変異型（トランスポゾン含有型）プラスミドの収量は、親プラスミドの収量よりも3倍高かった。したがって、カナマイシン耐性（“KanaR”）遺伝子の発現効率は細菌におけるプラスミド複製に影響を有する、すなわちカナマイシン耐性の発現低下はプラスミド複製速度の増加をもたらすと仮説をたてた。特に高いKanaR発現率は強い代謝負荷となる可能性があり、これは最適なプラスミド複製速度を妨げ、及び／又はKanaR遺伝子の転写は複製起点（ORI）に干渉する。
本発明は、カナマイシン耐性（“KanaR”）遺伝子を含むことができるDNAプラスミドに関し、この場合、前記カナマイシン耐性遺伝子は、より効率の低いKanaR発現プロモータ及び／又はより効率の低い開始コドンを含む。有利な実施態様では、KanaRプロモータはP1プロモータである。得られたDNAプラスミドは、おそらくKanaR発現の低下のために、より高いプラスミド収量及びより高いプラスミド安定性をもたらす。有利には、DNAプラスミドはpLL10又はpLL14でありえる。
本発明はまた、カナマイシン耐性遺伝子を含むことができるDNAプラスミドに関し、この場合、トランスポゾンがKanaRプロモータと翻訳開始点との間に挿入されてあり、それによってKanaR発現の低下がもたらされる。得られたDNAプラスミドは、おそらくKanaR発現の低下のために、より高いプラスミド収量及びより高いプラスミド安定性をもたらす。
【０００４】
本発明はまた、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドのデリバリー及び発現のための処方物を包含し、この場合、前記処方物は、本明細書に開示したDNAプラスミドのいずれか及び医薬的又は獣医学的に許容できる担体、ビヒクル若しくは賦形剤を含むことができる。有利な実施態様では、前記担体、ビヒクル又は賦形剤はトランスフェクションを促進するか、及び／又はベクター又はタンパク質の保存を向上させることができる。有利には、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、トリ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ又はブタのウイルス若しくは病原体に由来することができる。
本発明はさらに動物で免疫応答を刺激する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示した処方物の有効量を動物の細胞に投与し、さらに前記細胞で対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現させる工程を含むことができる。本発明はまた動物で免疫応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示した処方物の有効量を動物の細胞に投与し、さらに前記細胞で対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現させる工程を含むことができる。有利には、動物は、トリ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ又はブタでありえる。
本発明はまた、上記に記載の方法のいずれか1つを実施するためのキットを含み、前記キットは、本明細書に開示したDNAプラスミド又は処方物とともに、動物で免疫応答を刺激又は誘導する方法を実施するための指示書を含むことができる。
特筆すれば、本開示において、及び特に特許請求項及び／又は項目で、“含む（comprises）”、“含まれる（comprised）”、“含んでいる（comprising）”などのような用語は、米国特許法において前記用語に属すると考えられる意味を有することができ、例えば、それらは、“含む（include）”、“含まれる（included）”、“含んでいる（including）”などを意味することができ、さらに“本質的に〜から成っている”及び“本質的に〜から成る”のような用語は、米国特許法においてそれらに帰された意味を有し、例えば、それらは、明確には列挙されていない成分を考慮するが、従来技術で見出される成分又は本発明の根本的若しくは新規な特徴に影響をあたえる成分は排除する。
上記及び他の実施態様は、以下の詳細な説明によって開示されるか又は詳細な説明から明瞭であり、かつそれら詳細な説明に含まれる。
以下の詳細な説明（前記は例示として提供され、記載した個々の実施態様に本発明をもっぱら限定しようとするものではない）は、添付の図面と併用すればもっともよく理解することができる。図面は以下のとおりである：
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】実施例１で認定したKanaR発現カセットの起こりえる3つのプロモータを示す：P1（配列番号:1）、P2（配列番号:2）及びP3（配列番号:3）。P2及びP3は部分的に重なり合う。
【図２】pVR1012の模式図を示し、KanaR転写の方向及び複製起点（ORI）の位置が表示されている。
【図３】実施例１でプラスミドpVR1012のKanaRカセットをどのように変異導入ベクターpALTER-1内でクローニングしたかを示す。
【図４】実施例1でどのようにしてPacI制限部位をKanaR ORFの下流に導入してプラスミドpLL2を作製し、SwaI制限部位を上流に導入し、RsrII制限部位を下流に導入してpLL4を作製し、さらに最終的に翻訳開始コドンATGをTTGに変異させてpLL6を作製したかを示す。
【図５】実施例１で変異させたKanaRカセットをどのようにプラスミドpVR1012内でクローニングし、pLL7を作製したかを示す。
【図６】実施例1で同定したrrnBターミネータ配列をどのようにpSB062からPCRによってプラスミドpLL7内でクローニングし、続いてPacI RsrII消化を実施してpLL9を作製したかを示す。
【図７】実施例1で同定したspeAターミネータ配列の合成オリゴヌクレオチドのアニーリング及びPacI RsrII消化によるプラスミドpLL7内でのクローニングと、それによるpLL11の作製を示す。
【図８】プラスミドpLL6の変異させた翻訳開始配列をMscI PacI消化によってpLL9内でクローニングしpLL10を作製した態様を示す。
【図９】プロモータ配列P2/P3（配列番号:2−3）（P1（配列番号:1）を含む）、P1（配列番号:1）、及びP2/P3（配列番号:2−3）（前記プロモータ配列は実施例1で認定された）を、どのようにそれぞれURS11-URS12 PCR、URS13-URS12 PCR及びYRS11-URS14 PCRによってクローニングしたかを示す。
【図１０】プロモータ配列P2/P3（配列番号:2−3）（P1（配列番号:1）を含む）をどのようにプラスミドpLL9内でクローニングし、pLL13を作製したかを示す。
【図１１】プロモータ配列P1（配列番号:1）をどのようにプラスミドpLL9内でクローニングし、pLL14を作製したかを示す。
【図１２】プロモータ配列P2/P3（配列番号:2−3）をどのようにプラスミドpLL9内でクローニングし、pLL15を作製したかを示す。
【図１３】プロモータ配列P1（配列番号:）をどのようにプラスミドpLL7内でクローニングし、pLL16を作製したかを示す。
【図１４】実施例1で同定した種々の適切なプロモータ及びターミネータを用いて作製したいくつかのpVR1012誘導体を示す。pLL13、pLL14、pLL15及びpLL16構築物は、CMVプロモータとKanaP1（配列番号:1）プロモータとの間に192塩基対の欠失を有する。
【図１５】pVR1012誘導体の模式図を表し、実施例1のpLL13からpLL16構築物で欠失している192塩基対領域を示す。
【図１６】実施例１にしたがい、カナマイシン濃度増加に抵抗する細菌コロニーの能力のそれぞれ50μL及び100μLの細菌懸濁希釈物における2つのグラフを示す。
【図１７】実験室の増殖条件下で得られたプラスミド収量のグラフを示す。実施例1の細菌コロニーをKana 100μg/mLを含む液体LB培地で増殖させた。
【図１８】pLL14プラスミド収量に対する比として表したプラスミド収量を示す（基線＝100）。実験1は各構築物につき8から15クローンを表し、実験2は、pVR1012については6クローン、pLL14については2クローン及びpLL16については25クローンを表し、実験3は、pVR1012、pPB662及びpLL14については25クローン、並びにpLL19については20クローンを表す。
【図１９】実験室の増殖条件下で得られたプラスミド収量のグラフを示す。細菌コロニーはEGLI培地で増殖させた。プラスミド収量は、pVR1012親プラスミドの収量に対する比として表されている（基線＝100）。
【図２０】個々のプラスミドの収量（pVR1012構築物の平均に対してインデックス化されている）を表すが、これはクローンの不均一性を示している（*：変異プラスミド）。さらに実施例1の3つの異なる構築物のEGLI馴化クローンにおけるプラスミド収量のグラフを示す。変動性はインデックスとして表され、この場合第一のクローンが100%対照とみなされる。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
本発明は、部分的には、カナマイシン耐性遺伝子プロモータと翻訳開始点との間のトランスポゾンの挿入は予想通りカナマイシン耐性を消滅させ、さらに予想に反して高速のプラスミド複製を可能にするという実験的観察に基づいている。換言すれば、変異型（トランスポゾン含有型）プラスミドの収量は、親プラスミドの収量よりも3倍高かった。したがって、カナマイシン耐性（“KanaR”）遺伝子の発現効率は細菌におけるプラスミド複製に影響を有する、すなわちカナマイシン耐性の発現低下はプラスミド複製速度の増加をもたらすと仮説をたてた。特に、栄養制限の状況では、高いKanaR発現速度は強い代謝負荷となる可能性があり、これは最適なプラスミド複製速度に干渉し、及び／又はKanaR遺伝子の転写は複製起点（ORI）に干渉する。
本発明は、KanaR発現が低下し、それによって、例えばpVR1012プラスミド又はKanaR発現が減少しないその誘導体と比較してプラスミド収量の増加及びより高いプラスミド安定性がもたらされる任意のDNAプラスミドを包含する。
本発明は、KanaRを含むことができるDNAプラスミドに関し、前記カナマイシン耐性遺伝子は、より効率の低いKanaR発現プロモータ及び／又はより効率の低い開始コドンを含む。有利な実施態様では、KanaRプロモータはP1プロモータであり、開始コドンはATGである。得られたDNAプラスミドは、おそらくKanaR発現の低下のために、より高いプラスミド収量及びより高いプラスミド安定性をもたらす。有利には、DNAプラスミドはpLL10又はpLL14でありえる。
本発明はまた、カナマイシン耐性遺伝子を含むことができるDNAプラスミドに関し、この場合、トランスポゾンがKanaRプロモータと翻訳開始点との間に挿入されてあり、それによってKanaR発現の低下がもたらされる。得られたDNAプラスミドは、おそらくKanaR発現の低下のために、より高いプラスミド収量及びより高いプラスミド安定性をもたらす。
【０００７】
発現ベクターは、プラスミドベクター又はDNAプラスミドベクター、特にin vivo発現ベクターである。具体的な非制限的な例では、DNAプラスミドベクターは、pVR1020又は1012プラスミド（VICAL Inc.；Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97；Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217；例えば米国特許5,846,946号、6,451,769号、6,586,409号及び6,875,748号を参照されたい）のエレメントを含む。pVR1020プラスミドはpVR1012から誘導され、ヒトtPAシグナル配列を含む。ある実施態様では、前記ヒトtPAはGenbankのアクセッション番号HUMTPA14のアミノ酸M（1）からアミノ酸S（23）を含む。別の具体的な非制限的な例では、ポリヌクレオチド配列挿入用ベクターとして利用されるプラスミドは、Genbankのアクセッション番号U28070のアミノ酸M（24）からアミノ酸A（48）のウマIGF1のシグナルペプチド配列を含む。実際に検討又は利用することができるDNAプラスミドに関するさらに別の情報は、例えば米国特許6,852,705号、6,818,628号、6,586,412号、6,576,243号、6,558,674号、6,464,984号、6,451,770号、6,376,473号及び6,221,362号で見出される。
別の実施態様では、前記プラスミドは、以下を含む（ただしこれらに限定されない）カナマイシン耐性遺伝子を有する任意のプラスミドでありえる：クロンテック社（Clontech）のベクター、Living Colors pAcGFP1、Living Colors pAcGFP1-C1、Living Colors pAcGFP1-N1、pAmCyan1-C1、pAmCyan1-N1、pAsRed2-C1、pAsRed2-N1、pCMV-DsRed-Express、pDsRed2-1、pDsRed2-C1、pDsRed2-N1、pDsRed-Express-1、pDsRed-Express-C1、pDsRed-Express-N1、pDsRed-Monomer-C1、pDsRed-Monomer-N1、pHcRed1-1、pHcRed1-C1、pHcRed1-N1/1、pIRES2-DsRed2、pIRES2-DsRed-Express、pLPS-AcGFP1-N Acceptor、Proteasome Sensor、pTimer、pZsGreen1-1、pZsGreen1-C1、pZsGreen1-N1、pZsYellow1-C1及びpZsYellow1-N1ベクター；インビトロゲン社（Invitrogen）のベクター、pCR3、pCR3.1-Uni、pCR1000及びpZErO-2.1；並びにストラタジーン社（Stratagene）のpCMV-3Tag、pBK-CMV Phagemid、ZAP Express、pCMV-Script、pCMV-Tag、PCR-Script pMC1neo及びpMC1neo Poly Aベクター。以下でもまた言及される：米国特許6,942,975号、6,887,702号、6,849,442号、6,846,970号、6,825,012号、6,806,399号、6,803,230号、6,790,607号、6,696,278号、6,667,150号、6,624,344号、6,620,990号、6,610,909号、6,585,976号、6,573,437号、6,570,067号、6,562,584号、6,528,703号、6,503,748号、6,475,731号、6,410,317号、6,410,314号、6,387,654号、6,376,744号、6,350,934号、6,303,383号、6,297,054号、6,284,541号、6,258,999号、6,255,560号、6,248,937号、6,235,518号、6,174,708号、6,127,171号、6,121,511号、6,117,651号、6,054,635号、6,037,524号、6,018,103号、5,994,625号、5,981,191号、5,981,182号、5,977,439号、5,925,544号、5,910,488号、5,866,404号、5,851,808号、5,851,804号、5,830,727号、5,824,877号、5,792,935号、5,783,394号、5,750,871号、5,733,753号、5,733,744号、5,731,179号、5,723,746号、5,716,803号、5,712,112号、5,705,361号、5,654,180号、5,599,670号、5,591,577号、5,589,623号、5,569,834号、5,567,599号、5,565,347号、5,504,005号、5,463,174号、5,460,952号、5,436,138号、5,416,250号、5,416,011号、5,378,618号、5,256,568号、5,169,755号、5,137,829号、5,053,335号、5,004,863号、4,935,340号、4,920,054号、4,795,855号、4,782,022号、4,771,002号、4,626,510号及び4,567,146号。
【０００８】
本発明はまた、カナマイシン耐性に加えて他の抗生物質耐性、例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン及びテトラサイクリン耐性（ただしこれらに限定されない）遺伝子を有するプラスミドもまた包含する。
ある実施態様では、プラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を有するいずれのプラスミドでもよい。前記には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：クロンテック社のベクター、Living Colors pAcGFP1、pAmCyan、pAsRed2、pbetagal-Basic、pbetagal-Control、pBI Tet、pBI-G Tet、pBI-L Tet、pCMVbeta、pCMV-Myc & pCMV-HA、pDsRed2、pDsRed-Express、pDsRed-Monomer Vector、pGFP、pGFPuv、pHcRed1、pIRES、pIRESbleo3、pIRESneo3、pIRESpuro3、pLP-IRESneo Acceptor、pLP-LNCX Acceptor、pLP-TRE2 Acceptor、pPUR、pRevTet-Off、pRevTet-Off-IN、pRevTet-On、pSEAP2-Basic、pSEAP2-Control、pTet-Off、pTet-On、pTet-tTS、pTimer、pTimer-1、pTK-Hyg、pTRE2、pTRE2hyg、pTRE2hyg2-6xHN、pTRE2hyg2-HA、pTRE2hyg2-Myc、pTRE2pur、pTRE2pur-6xHN、pTRE2pur-HA、pTRE2pur-Myc、pTRE-6xHN、pTRE-HA、pTRE-Myc、pTRE-Tight、pTRE-Tight-DsRed2、pZsGreen及びpZsYellow；インビトロゲン社のベクター、p2Bac、p2Bac/CAT/CAT、pAc5.1/V5-His、pAc5.1/V5-His/LacZ、pBAD-TOPO、pBlueBac、pBlueBac/His、pBlueBac/His/CAT、pBlueBac2、pBlueBac3、pBlueBac4、pBlueBac4/CAT、pcDNA1/Amp、pcDNA3/CAT、pcDNAII、pCMVSport1、pCMVSport2、pCMVSport2.2、pCMVSport4、pCR3、pCR3.1-Uni、pCRBac、pCRT7/CT-LacZ、pCRT7/CT-TOPO、pCRT7/NT-E3、pCRT7/NT-TOPO、pDW232、pFastBac1、pMEP4、pMT/LacZ、pMT/V5-His-TOPO、pPIC3、pPIC3K、pRBK、pSL301、pSPORT1-CAT、pYesTrp2-RalGDS及びpYesTrp2-RalGDS；並びにスタラタジーン社のPCR-Script、pBC Phagemid、pMC1neo及びpMC1neo Poly A、pBlueScript II Phagemid及びSuperCos Iベクター。以下でもまた言及される：米国特許6,987,006号、6,972,322号、6,916,611号、6,887,702号、6,803,230号、6,790,607号、6,706,524号、6,696,278号、6,667,150号、6,569,678号、6,562,584号、6,544,782号、6,521,449号、6,503,748号、6,486,134号、6,410,317号、6,410,314号、6,387,654号、6,376,192号、6,291,238号、6,255,071号、6,221,630号、6,140,087号、6,127,171号、6,025,193号、6,025,192号、6,010,875号、5,981,279号、5,981,182号、5,955,363号、5,925,544号、5,919,676号、5,912,153号、5,894,060号、5,877,400号、5,866,404号、5,851,808号、5,834,191号、5,830,727号、5,830,690号、5,786,162号、5,776,773号、5,773,697号、5,766,940号、5,733,753号、5,731,193号、5,716,803号、5,705,361号、5,691,155号、5,602,300号、5,527,691号、5,504,005号、5,470,729号、5,436,138号、5,434,065号、5,432,082号、5,378,618号、5,290,691号、5,264,354号、5,256,568号、5,256,546号、5,160,489号、5,151,364号、5,147,789号、5,143,836号、5,126,252号、5,093,251号、5,081,022号、 4,997,767号、4,988,622号、4,935,364号、4,920,054号、4,889,806号、4,879,230号、4,876,202号、4,845,031号、4,808,519号、4,766,072号、4,752,574号、4,703,012号、4,634,678号、4,487,835号、4,349,629号及び4,340,674号。
【０００９】
別の実施態様では、プラスミドはクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するいずれのプラスミドでもよい。前記には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：クロンテック社のベクター、pDNR-LacZ Donor Reporter、pDNR-SEAP Donor Reporter、pLP-AcGFP1-C Acceptor、pLP-BacPAK9 Acceptor、pLP-BacPAK9-6xHN Acceptor、pLP-CMV-HA Acceptor、pLP-CMV-Myc Acceptor、pLP-CMVneo Acceptor、pLP-GADT7 AD Acceptor、pLP-GBKT7 DNA-Acceptor、pLP-IRESneo Acceptor、pLP-LNCX Acceptor、pLP-PROTet-6xHN Acceptor、pLP-RevTRE Acceptor、pLPS-AcGFP1-N Acceptor及びpLP-TRE2 Acceptor；インビトロゲン社のベクター、pLysS及びpSPORT1-CAT；並びにストラタジーン社のpBC Phagemid及びPCR-Scriptベクター。以下でもまた言及される：米国特許6,916,611号、6,900,010号、6,887,702号、6,884,576号、6,846,671号、6,803,230号、6,696,278号、6,673,537号、6,667,150号、6,562,584号、6,548,246号、6,503,748号、6,436,694号、6,420,110号、6,410,317号、6,410,314号、6,391,640号、6,387,654号、6,376,192号、6,331,527号、6,309,883号、6,309,830号、6,291,211号、6,255,071号、6,252,140号、6,221,630号、6,146,871号、6,127,171号、6,107,093号、6,083,750号、6,031,151号、6,025,192号、6,001,564号、5,994,132号、5,994,066号、5,981,182号、5,955,363号、5,932,479号、5,928,891号、5,925,544号、5,925,523号、5,908,747号、5,866,404号、5,851,808号、5,821,093号、5,766,940号、5,733,753号、5,728,571号、5,716,803号、5,707,830号、5,639,644号、5,591,577号、5,470,729号、5,437,988号、5,434,065号、5,256,568号、5,256,546号、5,053,335号、5,004,863号、4,868,111号、4,839,284号、4,752,574号及び4,711,849号。
【００１０】
別の実施態様では、プラスミドはネオマイシン耐性遺伝子を有するいずれのプラスミドでもよい。前記には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：クロンテック社のベクター、pRevTet-Off Vector、pRevTet-Off-IN Vector、pIRES Vector、pIRESbleo3 Vector、pIREShyg3 Vector、pIRESneo3 Vector、pIRESpuro3 Vector、pLP-IRESneo Acceptor Vector、pTet-Off Vector、pTet-On Vector、pIRES2-DsRed-Express Vector、pLXIN Retroviral Vector、pIRES2-DsRed2 Vector、Proteasome Sensor Vector、pLXSN Retroviral Vector、pCMV-DsRed-Express Vector、Living Colors pAcGFP1-C1 Vector、pAmCyan1-C1 Vector、pAsRed2-C1 Vector、pDsRed2-C1 Vector、pDsRed-Express-C1 Vector、pDsRed-Monomer-C1 Vector、pHcRed1-C1 Vector、pZsGreen1-C1 Vector、pZsYellow1-C1 Vector、Living Colors pAcGFP1 Vector、pDsRed2-1 Vector、pDsRed-Express-1 Vector、pHcRed1-1 Vector、pTimer Vector、pZsGreen1-1 Vector、pQCXIX Retroviral Vector、LRCX Retroviral Vector Set、pLNCX2 Retroviral Vector、pLP-LNCX Acceptor Vector、pQCXIN Retroviral Vector、Living Colors pAcGFP1-N1 Vector、pAmCyan1-N1 Vector、pAsRed2-N1 Vector、pDsRed2-N1 Vector、pDsRed-Express-N1 Vector、pDsRed-Monomer-N1 Vector、pHcRed1-N1/1 Vector、pLPS-AcGFP1-N Acceptor Vector、pZsGreen1-N1 Vector、pZsYellow1-N1 Vector及びVP16 Minimal Domain Vector Set；インビトロゲン社のベクター、pcDNA1/Neo、pcDNA3/CAT（pcDNA3.1/CATで代替)、pCR3（pCR3.1で代替）、pCR3.1-Uni及びpRc/CMV；並びにストラタジーン社のpCMV-3Tag Vectors、pCMV-Script Vector、SuperCos I Vector、ZAP Express Vector、pCMV-Tag Vectors、pMC1neo及びpMC1neo Poly A Vectors、PCR-Script Cloning Kits、Vitality hrGFP Mammalian Expression Vectors、pBK-CMV Phagemid Vector及びLambda ZAP-CMV Vector。以下でもまた言及される：米国特許7,026,525号、6,942,995号、6,905,818号、6,815,185号、6,806,399号、6,787,687号、6,747,189号、6,673,602号、6,673,537号、6,667,150号、6,624,344号、6,620,990号、6,440,444号、6,429,357号、6,391,633号、6,376,192号、6,316,253号、6,294,187号、6,291,211号、6,255,560号、6,252,140号、6,248,937号、6,232,526号、6,221,630号、6,210,930号、6,207,879号、6,194,636号、6,114,146号、6,096,717号、6,071,512号、5,998,144号、5,985,560号、5,969,211号、5,955,363号、5,955,319号、5,939,288号、5,902,577号、5,894,060号、5,891,634号、5,830,698号、5,807,742号、5,750,871号、5,733,779号、5,665,565号、5,639,663号、5,614,381号、5,583,278号、5,470,726号、5,463,174号、5,416,011号、5,352,605号、5,278,056号、5,256,568号、5,149,636号、5,017,478号、4,957,865号、4,935,340号、4,839,284号、4,792,520号、4,766,066号、4,752,574号、4,740,463号、4,663,285号、4,536,475号、4,513,086号、4,513,085号、4,503,155号、4,468,462号、4,460,688号、4,430,434号及び4,416,994号。
【００１１】
別の実施態様では、プラスミドはテトラサイクリン耐性遺伝子を有するいずれのプラスミドでもよい。前記には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：クロンテック社のベクター、pRevTet-Off Vector、pRevTet-On Vector、pRevTet-Off-IN Vector、Creator-Compatible PROTet 6xHN Bacterial Expression System、PROTet 6xHN Bacterial Expression System、pTRE-Tight Vector、pTet-Off Vector、pTet-On Vector、Tet-Off Gene Expression System、Tet-On Gene Expression System、Adeno-X Tet-Off Expression System 1、Adeno-X Tet-On Expression System 1、Adeno-X Viral DNA （PI-Sce I/I-Ceu I消化）、Creator-Compatible RevTet-Off Retroviral Gene Expression System、Creator-Compatible RevTet-On Retroviral Gene Expression System、pLP-RevTRE Acceptor Vector、pRevTRE Vector、RevTet-Off System、RevTet-On System、pBI Tet Vector、pBI-G Tet Vector、pBI-L Tet Vector、pTet-tTS Vector、pLP-TRE2 Acceptor Vector、pTRE2 Vector、pTRE2hyg Vector、pTRE2pur Vector、Tet System Approved FBS、US-Sourced（ガンマ線照射）、pTRE-Tight-DsRed2 Vector及びVP16 Minimal Domain Vector Set；並びにインビトロゲン社のベクター、pTet-tTak及びpTet-Splice。以下でもまた言及される：米国特許6,924,101号、6,905,836号、6,777,229号、6,759,236号、6,699,702号、6,699,692号、6,696,278号、6,680,301号、6,673,537号、6,667,150号、6,642,052号、6,620,618号、6,613,528号、6,544,782号、6,541,003号、6,503,748号、6,482,636号、6,440,741号、6,436,694号、6,410,317号、6,392,121号、6,376,192号、6,309,883号、6,303,383号、6,265,562号、6,261,807号、6,221,630号、6,218,181号、6,136,536号、6,127,171号、6,080,575号、6,033,856号、6,022,731号、6,010,875号、5,958,680号、5,955,363号、5,891,718号、5,869,035号、5,866,410号、5,858,762号、5,851,796号、5,849,576号、5,840,521号、5,830,727号、5,830,690号5,786,162号、5,766,940号、5,637,503号、5,593,860号、5,585,254号、5,527,691、号、5,516,669号、5,508,176号、5,384,259号、5,378,618号、5,348,886号、5,290,691号、5,256,568号、5,256,546号、5,166,070号、5,158,891号、5,151,364号、5,147,789号、5,053,335号、4,983,522号、4,879,230号、4,876,202号、4,874,703号、4,778,761号、4,752,574号、4,703,012号、4,680,260号、4,663,285号、4,634,677号、4,631,259号、4,581,335号、4,374,200号及び4,349,629号。
【００１２】
プラスミドという用語は、本発明のポリヌクレオチド及び所望される宿主又は標的の細胞内でのそのin vivo発現のために必要なエレメントを含む一切のDNA転写ユニットをカバーし、これに関して、スーパーコイル又は非スーパーコイルプラスミド、環状プラスミドは、直鎖形とともに本発明の範囲内に包含されることが特記される。
各プラスミドは、抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチド（これらは場合によって異種ペプチド配列と融合されている）に加えて、変種、アナログ又はフラグメントを含み、又はこれらを収納し、又は本質的にこれらから成り、場合によってこれらはプロモータと機能的に連結されるか、又はプロモータの制御下にあるか、又はプロモータに依存する。一般的には、真核細胞で機能する強力なプロモータを利用するのが有利である。好ましい強力なプロモータは、ヒト又はネズミ起源（又は場合によって別の起源（例えばラット又はモルモット））の前初期サイトメガロウイルスプロモータ（CMV-IE）である。CMV-IEプロモータは実際のプロモータ部分（エンハンサー部分と結合していてもいなくてもよい）を含むことができる。以下を参照することができる：EP-A-260 148、EP-A-323 597、米国特許5,168,062号、5,385,839号及び4,968,615号、並びにPCT出願WO87/03905。前記CMV-IEプロモータは有利にはヒトCMV-IE（Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530）又はネズミCMV-IEである。
より一般的な用語として、プロモータはウイルス起源又は細胞起源である。本発明の実施で有利に用いることができるCMV-IE以外のウイルスプロモータはSV40ウイルスの初期／後期プロモータ又はラウス肉腫ウイルスのLTRプロモータである。本発明の実施で有利に用いることができる強力な細胞性プロモータは、細胞骨格遺伝子のプロモータ、例えばデスミンプロモータ（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344）又はアクチンプロモータ（Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277）である。
【００１３】
これらのプロモータの機能的な部分フラグメント（すなわち適切なプロモーション活性を維持するこれらのプローモータの部分）は本発明に含まれる。例えば、PCT出願WO98/00166又は米国特許6,156,567号の切端CMV-IEプロモータは、本発明の実施に用いることができる。本発明の実施に用いられるプロモータにはしたがって完全長プロモータの誘導体及び部分フラグメントが含まれ、適切なプロモーション活性、したがってプロモータとしての機能を維持し、前記プロモーション活性は好ましくは、前記誘導体又は部分フラグメントが誘導された実際のプロモータ又は完全長プロモータの機能と実質的に類似し、例えば米国特許6,156,567号の切端CMV-IEプロモータの活性と類似するか、完全長CMV-IEプロモータの活性と類似する。したがって、本発明の実施に用いられるCMV-IEプロモータは、完全長プロモータのプロモータ部分及び／又は完全長プロモータのエンハンサー部分、並びに誘導体及び部分フラグメントを含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成ることができる。
好ましくは、前記プラスミドは、他の発現制御エレメントを含むか又は本質的にそれらから成る。安定化配列、例えばイントロン、好ましくはhCMV-IEの第一のイントロン（PCT出願WO89/01036）、ウサギβグロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., Science, 1979, 206:337-334）を取り込むことが特に有益である。
プラスミド及びポックスウイルス以外のベクターのためのポリアデニル化シグナル（ポリA）に関しては、ウシ成長ホルモン（bGH）遺伝子のポリ(A)シグナル（米国特許5,122,458号）又はウサギβグロビン遺伝子のポリ(A)シグナル又はSV40ウイルスのポリ(A)シグナルがより有用でありえる。
【００１４】
本発明は、任意の標的ペプチド又はポリペプチド、有利には対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの発現を、本発明のDNAプラスミドによって提供する。本発明は、本明細書に開示するDNAプラスミド内の任意の対象抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの発現を意図する。本DNAプラスミドは対象となる1つ以上の抗原、エピトープ、免疫原を発現させることができる。
有利な実施態様では、前記抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、トリ、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ又はブタのウイルス若しくは病原体から誘導される。別の実施態様では、前記抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは西ナイルウイルスから誘導することができる。別の実施態様では、前記抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドは、ヒトのウイルス又は病原体から誘導することができる。
本発明のトリの抗原、エピトープ又は免疫原は、マレック病ウイルス（MDV）（例えば血清型1及び2、好ましくは1）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、グンボロ病（Gumboro disease）ウイルス若しくは伝染性嚢胞病（infectious bursal disease）ウイルス（IBDV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、伝染性貧血ウイルス若しくはトリ貧血ウイルス（CAV）、喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、脳脊髄炎ウイルス若しくはトリ脳脊髄炎ウイルス（AEV又はトリ白血病ウイルスALV）、シチメンチョウ出血性腸炎（HEV）のウイルス、肺炎ウイルス症（pneumovirosis）ウイルス（TRTV）、家禽ペストウイルス（トリインフルエンザ）、ニワトリ水心膜炎、トリレオウイルス、大腸菌、マイコプラズマ・ガリナルム（Mycoplasma gallinarum）、マイコプラズマ・ガリセプチクム（Mycoplasma gallisepticum）、ヘモフィルス・アビウム（Haemophilus avium）、パスツレラ・ガリナルム（Pasteurella gallinarum）、パスツレラ・ムルトシダ・ガリシダ（Pasteurella multocida gallicida）、及び前記の混合物から誘導することができる。好ましくは、MDVについては、免疫原は有利にはgB及び／又はgD、例えばgB及びgDであり；NDVについては、免疫原は有利にはHN及び／又はF、例えばHN及びFであり；IBDVについては、免疫原は有利にはVP2であり；IBVについては、免疫原は有利にはS（より有利にはS1）及び／又はM及び／又はN、例えばS（又はS1）及びM及び／又はNであり；CAVについては、免疫原は有利にはVP1及び／又はVP2であり；ILTVについては、免疫原は有利にはgＢ及び／又はgDであり；AEVについては、免疫原は有利にはenv及び／又はgag/pro、例えばenv及びgag/pro又はgag/proであり；HEVについては、免疫原は有利には100Kタンパク質及び／又はヘキソンであり；TRTVについては、免疫原は有利にはF及び／又はGであり；家禽ペストについては、免疫原は有利にはHA及び／又はN及び／又はNP、例えばHA及びN及び／又はNPである。
【００１５】
本発明のウシの抗原、エピトープ又は免疫原は、BHV-1、BRV、bPI-3及び／又はBCVウイルス、又はウシ呼吸器合胞体形成ウイルス及びウシウイルス性下痢症ウイルスを含む（ただしこれらに限定されない）群から選択されるウシの病原体から誘導することができる。BRSVの免疫原は、BRSV F又はG又はN、例えばBRSV F及び／又はG又はN及び／又はGでありえる。BHV-1の免疫原はgB及び／又はgC及び／又はgDでありえる。BVDVの免疫原はE0タンパク質（gp48）及び／又はE2タンパク質（gp53）でありえる。BVDVは1型及び／又は2型でもよい。bPI-3の免疫原はbPI-3 F及び／又はHNでありえる。ウシの病原他の免疫原及び前記をコードする核酸分子及び前記を発現する構築物に関しては、米国特許6,451,770号、6,376,473号、6,224,878号もまた参照されたい。
本発明のイヌの抗原、エピトープ又は免疫原は、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス（CDV）、イヌパラインフルエンザ2型ウイルス（CPI−2）、イヌヘルペスウイルス1型（CHV-1）、狂犬病ウイルス（ラブドウイルス）、イヌパルボウイルス（CPV）、イヌコロナウイルス（CCV）、イヌアデノウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、レプトスピラ及び前記の混合物から誘導することができる。好ましくは、CDVについては、免疫原は有利にはF及び／又はHAである（CDVの免疫原及び構築物に関しては米国特許6,309,647号、5,756,102号もまた参照されたい）；CPVについては、免疫原は有利にはVP2であり；CCVについては、免疫原は有利にはS及び／又はMであり；CHV-1については、免疫原は有利にはgB及び／又はgC及び／又はgDであり（CHVの免疫原及び構築物に関しては米国特許5,688,920号、5,529,780号もまた参照されたい）；狂犬病ウイルスについては、免疫原は有利にはGであり（狂犬病コンビネーション組成物に関しては米国特許5,843,456号もまた参照されたい）；ボレリア・ブルグドルフェリについては、免疫原は有利にはOspAである（OspAコンビネーション組成物に関しては米国特許6,368,603号もまた参照されたい）。
【００１６】
本発明のウマの抗原、エピトープ又は免疫原は、EHV-1及び／又はEHV-4ウイルス、又は以下を含む（ただしこれらに限定されない）群から選択される別のウマ病原体から誘導することができる：ウマインフルエンザウイルス（EIV）、東部脳脊髄炎ウイルス（EEV）、西部脳脊髄炎ウイルス（WEV）、ベネズエラ脳脊髄炎ウイルス（VEV）、ライム病病原体、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ウマ動脈炎ウイルス（EAV）及び狂犬病ウイルス。抗原、エピトープ又は免疫原は、EHVの糖タンパク質、例えばgB、gD、gB＋gD、gC及びgEであってもよい。EIVについては、免疫原は有利にはHA、NP及び／又はNであり；脳炎ウイルスについては、免疫原は有利にはC及び／又はE1及び／又はE2であり；破傷風菌については、免疫原は破傷風毒素のサブユニットCの全部又は部分である。ウマの病原体の免疫原、及び前記をコードする核酸分子、及び前記を発現する構築物については、米国特許6,395,283号、6,248,333号、5,338,683号、6,183,750号で言及される。
本発明のネコの抗原、エピトープ又は免疫原は、ネコヘルペスウイルス1型（FHV-1）、ネコカルシウイルス（FCV）、狂犬病ウイルス（ラブドウイルス）、ネコパルボウイルス（FPV）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV）、ネコ白血病ウイルス（FeLV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、クラミジア及び前記の混合物から誘導することができる。好ましくはFeLVについては、免疫原は有利にはenv及び／又はgag及び／又はpol、例えばgag/polであり；FPVについては、免疫原は有利にはVP2であり；FIPVについては、免疫原は有利にはS及び／又はM及び／又はN、例えばS及びM及び／又はNであり（免疫原及びその構築物については米国特許6,348,196号及び5,858,373号もまた参照されたい）；FHVについては、免疫原は有利にはgB及び／又はgC及び／又はgD、例えばgB及びgC及び／又はgDであり（ヘルペスウイルスの免疫原及び前記を発現する構築物については米国特許5,338,683号及び6,183,750号もまた参照されたい）；FCVについては、免疫原は有利にはCであり；FIVについては、免疫原は有利にはenv及び／又はgag及び／又はpro、例えばgag/pro、env、又はenv及びgag/proであり（米国特許出願08/746,668（Tartagliaら、1996年11月14日出願）で考察されている免疫原及び構築物もまた参照されたい）；狂犬病ウイルスについては、免疫原は有利にはGである。
【００１７】
本発明のブタの抗原、エピトープ又は免疫原は、PRRSウイルス及び／又は以下を含む（ただしこれらに限定されない）群から選択される病原体から誘導することができる：仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝播性胃腸炎ウイルス（コロナウイルス）、ブタシルコウイルス、例えばブタシルコウイルス2型、ロタウイルス、ブタアデノウイルス3型、大腸菌、エリシペロトリクス・リュシオパシアエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、クロストリジウムspp.、サルモネラspp.、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、マイコプラズマ・ヒオプニューモニアエ（Mycoplasma hyopneumoniae）及びアクチノバシルス・プリューロプニューモニアエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）。ブタ病原体の抗原、エピトープ又は免疫原には、仮性狂犬病ウイルスgB、仮性狂犬病ウイルスgC、仮性狂犬病ウイルスgD、ブタインフルエンザHA、ブタインフルエンザNA、ブタインフルエンザNP、ブタ生殖器及び呼吸器症候群ウイルスのORF4、ブタ生殖器及び呼吸器症候群ウイルスのORF7、PRRSVのORF4、PRRSV ORF3、PRRSV ORF6、PRRSVオープンリーディングフレーム5（ORF5）及び6（ORF6）、PRRSVオープンリーディングフレーム5（ORF5）及び3（ORF3）及び6（ORF6）、ブタコレラウイルスE1、ブタコレラウイルスE2遺伝子、パルボウイルスVP2、ブタシルコウイルス2型ORF1又はブタシルコウイルス2型ORF2が含まれえる。ブタ病原体の免疫原、前記をコードする核酸分子及び前記を発現する構築物については、米国特許6,517,843号、6,497,883号、6,391,314号、6,379,676号、6,217,883号、6,207,165並びに米国特許出願公開2003003112号及びWO99/53047、WO99/08706、WO01/83737及びWO00/47756で言及される。
【００１８】
本発明のDNAプラスミドは、西ナイルウイルス（“WNV”）のE、prM、M又は前記の組合せ若しくはポリプロテインをコードする前記ウイルスのポリヌクレオチドの1つ以上を発現することができる（例えばE、又はE及びprM、又はE及びM、又はE及びprM及びM、又はポリプロテインE-prM-M、又はポリプロテインprM-E、又はポリプロテインM-E、又は前記の少なくとも1つのエピトープ）。本発明の実施態様にしたがえば、調製物中の他のベクター（1つ又は複数のベクター）は、WNウイルスの1つ以上の他のタンパク質（例えばprM、M、prM-M、又はそれらのエピトープ）をコードするポリヌクレオチドを含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成り、適切な環境下で前記ベクターはそれらを発現することができる。
本明細書で用いられる、“抗原”又は“免疫原”という用語は、宿主動物で特異的な免疫応答を誘発する物質を意味する。抗原は、生物体全体（死滅、弱毒又は生きた生物）；生物のサブユニット又は部分；免疫原性特性を有する挿入物を含む組換えベクター；宿主動物に提示されたとき免疫応答を誘発することができるDNA片又はフラグメント；タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン又は前記の組合せを含むことができる。あるいは、免疫原又は抗原は毒素又は抗毒素を含むことができる。
【００１９】
本明細書で用いられる、“免疫原性タンパク質又はペプチド”という用語はまた、いったん宿主に投与されたら、当該タンパク質に対して誘導される液性及び／又は細胞性型の免疫応答を惹起することができるという意味で免疫学的に活性なペプチド及びポリペプチドを示す。好ましくは、タンパク質フラグメントとは、その総体タンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有するものである。したがって、本発明のタンパク質フラグメントは、少なくとも1つのエピトープ又は抗原決定基を含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成る。エピトープという用語は、液性型（B細胞）及び／又は細胞型（T細胞）の免疫反応を誘発することができるタンパク質部位に関する。
“免疫原性タンパク質又はペプチド”という用語は、当該ポリペプチドが機能して本明細書に規定する免疫学的応答を生じるかぎり、当該配列への欠失、付加及び置換もさらに意図される。これに関連して、特に好ましい置換は、概して性質が保存的、すなわちアミノ酸の1つのファミリー内で生じる置換であろう。例えば、アミノ酸は一般的に以下の4つのファミリーに分類される：（1）酸性−アスパルテート及びグルタメート；（2）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（4）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは時に芳香族アミノ酸として分類される。ロイシンとイソロイシン又はバリンとの（又はその逆）；アスパルテートとグルタメートとの（又はその逆）；スレオニンとセリンとの（又はその逆）単独置換；又はあるアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸との同様な保存的置換は、生物学的な活性について大きな影響を与えないであろうということは論理的に推測できる。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響を与えない小さなアミノ酸置換を有するタンパク質は、したがって参照ポリペプチドの規定内に入る。
【００２０】
“エピトープ”という用語は、特異的なB細胞及び／又はT細胞が応答する、抗原又はハプテン上の部位に該当する。前記用語はまた、“抗原決定基”又は“抗原性決定部位”と相互に用いられる。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が別の抗体と標的抗原との結合を阻止する能力を示す簡単な免疫アッセイで認定することができる。
組成物又はワクチンとの“免疫学的応答”は、対象の組成物又はワクチンに対する宿主の細胞性及び／又は抗体媒介性免疫応答の進行である。通常は、“免疫学的応答”には1つ以上の以下の作用が含まれる（ただしこれらに限定されない）：対象の組成物又はワクチンに含まれる1つ又は複数の抗原に対して特異的に誘導された抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、及び／又は細胞傷害性T細胞の生成。好ましくは、宿主は、新規感染に対する抵抗性が強化されるか、及び／又は疾患の重症度が低下するように治療的又は防御的な免疫学的応答を示すであろう。そのような防御は、感染によって通常示される症状の緩和又は欠如、より短い回復期間、及び／又は感染宿主におけるウイルス力価の低下によって示されるであろう。
本明細書で用いられる“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドはまた、上記に記載した免疫学的応答を誘導するアミノ酸配列に関連する。本明細書で用いられる、“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドには、タンパク質の完全長配列、そのアナログ又はその免疫学的フラグメントが含まれる。“免疫原性フラグメント”とは、1つ以上のエピトープを含み、したがって上記に記載した免疫学的応答を誘導するタンパク質フラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、当分野で周知の多数のエピトープマッピング技術を用いて認定することができる。例えば以下を参照されたい：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa NJ。例えば、直鎖状エピトープは、例えば固相で多数のペプチド（前記ペプチドは該当タンパク質分子の部分に対応する）を同時に合成し、固相に結合したままで前記ペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。そのような技術は当分野では公知であり、例えば以下に記載されている：米国特許4,708,871号；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715（前記文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に含まれる）。同様に、配座エピトープは、アミノ酸の空間配座を例えばX線結晶学及び2次元核磁気共鳴により決定することによって容易に認定される。例えば上掲書（Epitope Mapping Protocols）を参照されたい。特にT. parvaのタンパク質に応用することができる方法はPCT出願PCT/US2004/022605号に詳しく記載されている（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００２１】
合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ及び他の組換え抗原もまた本定義に含まれる。例えば以下を参照されたい：Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998。本発明の目的のためには、免疫原性フラグメントは、通常その分子の少なくとも約3アミノ酸、好ましくは少なくとも約5アミノ酸、より好ましくは少なくとも10−15アミノ酸、もっとも好ましくは25以上のアミノ酸を含むであろう。フラグメントの長さについては決定的な上限はなく、フラグメントには、該当タンパク質の完全長に近いもの、又は該当タンパク質の少なくとも1つを含む融合タンパク質すら含まれよう。
したがって、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小構造は、それが、対象のタンパク質又はポリプロテインの1つのエピトープ又は抗原決定基をコードするヌクレオチドを含むか、又は本質的に前記ヌクレオチドから成るか、又は前記ヌクレオチドから成るということである。タンパク質又はポリプロテイン全体のフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、より有利にはタンパク質又はポリプロテイン全体をコードする配列の最低限21ヌクレオチド、有利には少なくとも42ヌクレオチド、好ましくは少なくとも57、87、又は150の連続した（consecutive）切れ目のない（contiguous）ヌクレオチドを含むか、又は本質的にそれらから成るか、又はそれらから成る。エピトープ決定の方法、例えばオーバーラップペプチドライブラリーの作製（Hemmer B.  et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168）、Pepscan（Geysen et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002；Geysen et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 178-182；Van der Zee R. et al., (1989) Eur. J. Immunol., 19, 43-47；Geysen H.M., (1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 21, 523-533；Multipin.RTM.  Peptide Synthesis Kits de Chiron）及びアルゴリズム（De Groot A. et al., (1999) Nature Biotechnology, 17, 533-561及びPCT出願PCT/US2004/022605）（前記文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に含まれる）を、特段の実験を実施することなく本発明の実施に用いることができる。本明細書に引用及び取り込んだ他の文書類もまた、免疫原又は抗原のエピトープ、したがってそのようなエピトープをコードする核酸分子の決定方法に関して参考にすることができる。
【００２２】
“ポリヌクレオチド”は任意の長さを有するヌクレオチドの重合形であり、任意に組み合わされたデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びアナログを含む。ポリヌクレオチドは三次元構造を有することができ、任意の機能（公知であれ未知であれ）を果たすことができる。“ポリヌクレオチド”という用語には、二本鎖、一本鎖、及び三重ヘリックス分子が含まれる。特段に規定又は要求されなければ、本明細書に記載するポリヌクレオチドのいずれの実施態様も、二本鎖形及び、DNA、RNA又はハイブリッド分子のいずれかの二本鎖形を形成することが分かっているか又は予想される2つの相補形の各々を包含する。
以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ、ウラシル、他の糖類及び連結基（例えばフルオロリボース及びチオレート）、並びにヌクレオチド分枝を含むことができる。ヌクレオチドの配列は重合後に、例えば標識成分による結合によってさらに改変することができる。この定義に含まれる他のタイプの改変は、キャップ、天然に存在する1つ以上のヌクレオチドのアナログによる置換、ポリヌクレオチドをタンパク質、金属、標識成分、他のポリヌクレオチド又は固相に結合させるための手段の導入である。ポリヌクレオチドは化学的合成によって得るか、又は微生物によって誘導することができる。
【００２３】
本発明はさらに、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する相補鎖を含む。前記相補鎖は、ポリマーであり任意の長さを有し、任意に組み合わされたデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びアナログを含むことができる。
“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”及び“ポリペプチドフラグメント”という用語は、任意の長さのアミノ酸残基ポリマーを指すために本明細書では相互に用いられる。前記ポリマーは直鎖状でも分枝していてもよく、改変アミノ酸又はアミノ酸アナログを含むことができ、さらにアミノ酸以外の化学的成分によって中断されていてもよい。前記用語はまた、天然に、又は介入（例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化）、又は他の任意の操作若しくは改変（例えば標識又は生物的活性成分との結合）により改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。
“単離された”ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、天然の環境でそれらに付随している物質を実質的に含まないポリヌクレオチド又はポリペプチドである。実質的に含まないとは、これらの物質の少なくとも50%、有利には少なくとも70%、より有利には少なくとも80%、さらに有利には少なくとも90%を含まないことを意味する。
ハイブリダイゼーション反応は、種々の“ストリンジェンシー”の条件下で実施することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーが高くなる条件は周知である。例えば以下を参照されたい：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook et al. 1989)。関連する条件の例には以下が含まれる（順番はストリンジェンシーが低い方から高い方へ）：インキュベーション温度が25℃、37℃、50℃、及び68℃；緩衝液濃度が10ｘSSC、6ｘSSC、1ｘSSC、0.1ｘSSC（SSCは0.15MのNaCl及び15mMのクエン酸緩衝液）及び他の緩衝液系を用いた場合は前記濃度と等価のそれらの濃度；ホルムアミド濃度が0%、25%、50%及び75%；インキュベーション時間が5分から24時間；洗浄工程が1回、2回又はそれより多い回数；洗浄インキュベーション時間が1分、2分又は15分；及び洗浄溶液が6ｘSSC、1ｘSSC、0.1ｘSSC、又は脱イオン水。
【００２４】
本発明はさらに、対象のポリペプチドの機能的に等価な変種及び誘導体、及びその機能的に等価なフラグメントをコードするポリヌクレオチドを包含する。前記変種及び誘導体並びにそのフラグメントは、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性を強化することも低下させることも、又は顕著な影響を及ぼさないこともある。これらの機能的に等価な変種、誘導体及びフラグメントは生物学的な活性を保持する能力を示す。例えば、コードされるアミノ酸配列を変化させないDNA配列における変化は、アミノ酸残基の保存的置換、1つ若しくは数アミノ酸の欠失又は付加、及びアミノ酸残基のアミノ酸アナログによる置換を生じるものと同様に、コードされるポリペプチドの特性に顕著な影響を及ぼさないものである。保存的アミノ酸置換は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。ある実施態様では、変種は、対象のポリヌクレオチド又はポリペプチドと少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の相同性又は同一性を有する。
【００２５】
本発明の目的のためには、配列同一性又は相同性は、オーバーラップ及び同一性を最大にする一方で配列ギャップを最小にするようにアラインメントを実施したときに配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、多数の任意の数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。2つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの非限定的な例は、KarlinとAltschulのアルゴリズム（Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87: 2264-2268（以下の文献（Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 5873-5877）に記載されているように改変されてある））である。
配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムのまた別の例はMyersとMillerのアルゴリズムである（Myers & Miller, CABIOS 1988;4: 11-17）。そのようなアルゴリズムはALIGNプログラム（2.0バージョン）に取り込まれている（ALIGNプログラムはGCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である）。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを用いるときは、PAM120ウェート残基表、ギャップ長ペナルティー12.及びギャップペナルティー4を用いることができる。局所の配列類似性を有する領域の認定及びアラインメントのためのまた別の有用なアルゴリズムは、PearsonとLipmanが記載したFASTAアルゴリズムである（Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448）。
本発明での使用に有利なものはWU-BLAST（Washington University BLAST）のバージョン2.0ソフトである。いくつかのUNIX（登録商標）プラットフォームのためにプログラムを実行することができるWU-BLASTバージョン2.0は、ftp ://blast.wustl.edu/blast/executablesからダウンロードすることができる。このプログラムはWU-BLASTバージョン1.4を基にしており、前記は、さらにパブリックドメインのNCBI-BLASTバージョン1.4を基にしている（Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480；Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990, 215: 403-410；Gish & States, 1993, Nature Genetics 3: 266-272；Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる））。
【００２６】
一般的に、アミノ酸配列の比較は、既知構造のポリペプチドのアミノ酸配列と未知構造のポリペプチドのアミノ酸配列とのアラインメントによって実施される。続いて配列内のアミノ酸を比較し、相同なアミノ酸群をグループ化する。この方法によってポリペプチドの保存領域が検出され、アミノ酸挿入及び欠失が示される。アミノ酸配列間の相同性は、市販のアルゴリズムを用いることによって検出することができる（上記の相同性に関する記述もまた参照されたい）。本明細書に既に記載したアルゴリズムとは別に、プログラムBLAST、ギャップ付加BLAST、BLASTN、BLASTP、及びPSI-BLAST（National Center for Biotechnology Information提供）に関してもまた述べる。これらのプログラムはこの目的のために当分野で広く用いられ、2つのアミノ酸配列の相同領域のアラインメントを可能にする。
一そろいの検索プログラムのいずれにおいても、ギャップ付加アラインメントルーチンはデータ検索自体にとって必須である。ギャップ付加は所望の場合にはオフにすることができる。長さ1のギャップに対するデフォルトペナルティー（Q）は、タンパク質とBLASTPについてはQ＝9であり、BLASTNについてはQ＝10であるが、任意の整数に変えることができる。ギャプ伸張のための残基当たりのデフォルトペナルティー（R）は、タンパク質とBLASTPについてはR＝2であり、BLASTNについてはR＝10であるが、任意の整数に変えることができる。オーバーラップ及び同一性を最大にしながら配列ギャップを最少にする配列アラインメントのために、Q及びRの値の任意の組合せを用いることができる。デフォルトアミノ酸比較行列はBLOSUM62であるが、他のアミノ酸比較行列、例えばPAMも利用することができる。
【００２７】
あるいは別に、又は付け加えるに、例えば“相同性”又は“同一性”という用語は、ヌクレオチド又はアミノ酸配列に関しては、2つの配列間の相同性の定量的測定を表示することができる。パーセント配列相同性は、（Nref−Ndif）ｘ 100／Nrefとして算出することができる。式中、Ndifは、アラインメントを実施したとき2つの配列において同一でない残基の総数であり、Nrefは配列の一方の残基の数である。したがって、AGTCAGTCなるDNA配列は、AATCAATCなる配列と75%の配列同一性を有するであろう（Nref＝8；Ndif＝2）。
あるいは別に、又は付け加えるに、配列に関して“相同性”又は“同一性”は、同一のヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を2つの配列の短い方のヌクレオチド又はアミノ酸の数で割ったものを示すことができる。この場合、2つの配列のアラインメントは、Wilbur & Lipmanのアルゴリズム（Wilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80:726）（前記文献は参照により本明細書に含まれる）にしたがい、例えば20ヌクレオチドのウィンドウサイズ、4ヌクレオチドのワード長、及び4のギャップペナルティーを用いて決定することができ、さらにコンピュータ支援解析及びアラインメントを含む配列データの解釈は、市販のプログラム（例えばIntelligeneticsTM Suite（Intelligenetics Inc. CA））を用いて都合よく実施することができる。RNA配列がDNA配列と類似する、又はある程度の配列同一性若しくは相同性を有するというとき、DNA配列のチミジン（T）はRNA配列のウラシル（U）と同等であるとみなされる。したがって、DNA配列のチミジン（T）をRNA配列のウラシル（U）と同等とみなすことによって、RNA配列も本発明の範囲内に包含され、DNA配列から誘導することができる。
さらに、パーセント相同性を決定するために、当業者は、特段の実験を実施することなく、他の多くのプログラム又は参照文献を参考にすることができる。
【００２８】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクター内に収納され、プロモータエレメントと、さらに場合によってはエンハンサーと機能的に連結された対象のポリヌクレオチドを包含する。
“ベクター”とは、標的細胞にin vitro又はin vivoでデリバーされるべき異種ポリヌクレオチドを含む組換えDNA若しくはRNAプラスミド又はウイルスをいう。異種ポリヌクレオチドは、治療目的のために対象の配列を含むことができ、場合によって発現カセットの形態であってもよい。本明細書で用いられるように、ベクターは最終的な標的細胞又は対象において複製する能力を有する必要はない。前記用語はクローニングベクターを含み、ウイルスベクターもまた含まれる。
“組換え体”という用語は、天然には存在しないか、又は別のポリヌクレオチドと天然には見出されない配列に連結している、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
“異種”は、比較しようとするある存在物の残りの部分とは遺伝的に別個の存在物に由来することを意味する。例えば、あるポリヌクレオチドは遺伝子工学技術によって異なる供給源に由来するプラスミド又はベクターに配置することができ、前記は異種ポリヌクレオチドである。その天然のコード配列から取り出され、天然の配列以外のコード配列と機能的に連結されたプロモータは異種プロモータである。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、追加の配列、例えば同じ転写ユニット内のさらに別のコード配列、制御エレメント（例えばプロモータ）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、同じ又は異なるプロモータの制御下にある追加の転写ユニット、クローニング、発現、相同組換え及び宿主細胞の形質転換を可能にする配列、並びに本発明の実施態様の提供のために所望されえる任意の構築物を含むことができる。
対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの発現のためのエレメントが、有利には本発明のベクターに存在する。最低限、これは、開始コドン（ATG）、終止コドン及びプロモータ、並びに場合によってはまた、ある種のベクター（例えばプラスミド）及びある種のウイルスベクター（例えばポックスウイルス以外のウイルスベクター）のためのポリアデニル化配列を含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成る。有利にはベクター中でポリヌクレオチドがポリプロテインフラグメント（例えばペプチド）をコードするとき、ATGはリーディングフレームの5'に配置され、終止コドンは3'に配置される。発現を制御する他のエレメント、例えばエンハンサー配列、安定化配列（例えばイントロン）、及びタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列も存在しえる。
【００３０】
本発明の遺伝子の遺伝子生成物のin vivo又はin vitro発現のためのベクター又は組換え体又はプラスミドを作製及び／又は投与する方法は、所望されるいずれの方法でもよい。前記は、例えば以下で開示されているか、又は以下で引用されている文書類に開示された方法又はそれらに類似する方法である：米国特許4,603,112号、4,769,330号、4,394,448号、4,722,848号、4,745,051号、4,769,331号、4,945,050号、5,494,807号、5,514,375号、5,744,140号、5,744,141号、5,756,103号、5,762,938号、5,766,599号、5,990,091号、5,174,993号、5,505,941号、5,338,683号、5,494,807号、5,591,639号、5,589,466号、5,677,178号、5,591,439号、5,552,143号、5,580,859号、6,130,066号、6,004,777号、6,130,066号、6,497,883号、6,464,984号、6,451,770号、6,391,314号、6,387,376号、6,376,473号、6,368,603号、6,348,196号、6,306,400号、6,228,846号、6,221,362号、6,217,883号、6,207,166号、6,207,165号、6,159,477号、6,153,199号、6,090,393号、6,074,649号、6,045,803号、6,033,670号、6,485,729号、6,103,526号、6,224,882号、6,312,682号、6,348,450号及び6; 312,683号、米国特許出願920,197号（1986年10月16日出願）、WO 90/01543W091/11525、WO 94/16716、WO 96/39491、WO 98/33510、EP 265785、EP 0 370 573；Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11313-11318；Ballay et al., EMBO J. 1993, 4:3861-65；Felgner et al., J. Biol. Chem. 1994, 269:2550-2561；Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11371-11377；Graham, Tibtech 1990, 8:85-87; Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992, 3:237-52；Ju et al., Diabetologia 1998, 41:736-739；Kitson et al., J. Virol. 1991, 65:3068-3075；McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11414-11420；Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11341-11348；Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11349-11353；Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984, 4:399-406；Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995, 39, “Baculovirus Expression Protocols,” Humana Press Inc.；Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983, 3:2156-2165；Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11334-11340；Robinson et al., Sem. Immunol. 1997;9:271；及びRoizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:11307-11312。本発明の実施に有用なベクター例の提供に加え、本明細書への引用及び参考文献による本明細書への取り込みもまた、本発明の組成物中のベクター（1つ又は複数のベクター）によって発現されるべき、又は本発明の組成物に含まれるべきペプチド又はそのフラグメントのための供給源を提供する。
【００３１】
本発明はまたベクター（例えば発現ベクター）を含む調製物、例えば治療用組成物に関する。前記調製物は、1つ以上のベクター（例えば発現ベクター、例えばin vivo発現ベクター）を含むか、本質的に前記1つ以上のベクターから成るか、又は前記1つ以上のベクターから成ることができ、前記ベクターは1つ以上の対象の抗原、エピトープ又は免疫原を含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成る（さらに有利には前記を発現する）。有利には、前記ベクターは、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードする（さらに有利にはそれらを発現する）ポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記ポリヌクレオチドから成るか、又は前記ポリヌクレオチドから成るポリヌクレオチドを収納し、さらに前記ポリヌクレオチドを医薬的又は獣医学的に許容可能な担体、賦形剤又はビヒクル中で発現する。したがって、本発明の実施態様によれば、前記調製物中の他のベクター（1つ又は複数）は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチド、又はそれらのフラグメントを構成する1つ以上の他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記ポリヌクレオチドから成るか、又は前記ポリヌクレオチドから成り、さらに適切な環境下で前記ベクターは前記ポリヌクレオチドを発現する。
別の実施態様にしたがえば、調製物中の前記ベクター（1つ又は複数）は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド若しくはポリペプチドを構成する1つ以上のタンパク質又は前記のフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成り、前記ベクター（1つ又は複数）はポリヌクレオチドを発現する。本発明の調製物は有利には少なくとも2つのベクターを含むか、本質的にそれらから成るか、又はそれらから成り、前記ベクターは、同じタンパク質及び／又は異なるタンパク質（有利には同じタンパク質）をコードする別個の単離体に由来するポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成り、さらに有利にはベクターはまた前記を発現し、有利にはin vivoで固有の条件下で又は適切な条件下で又は適切な宿主細胞で前記を発現する。調製物は1つ以上のベクターを含み、前記ベクターは、対象の抗原若しくは融合タンパク質又はそのエピトープをコードするポリヌクレオチドを収納するか、本質的に前記ポリヌクレオチドから成るか、又は前記ポリヌクレオチドから成る1つ以上のベクターを含み、さらに有利には前記対象の抗原若しくは融合タンパク質又はそのエピトープを発現（有利にはin vivoで発現）する。本発明はまた、種々の抗原、エピトープ又は免疫原、例えば種々の種（例えばトリ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒト及びブタ（ただしこれらに限定されない））に由来する抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを収納するか、本質的に前記ポリヌクレオチドから成るか、又は前記ポリヌクレオチドから成り、さらにこれら抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現するベクターの混合物を目的とする。
【００３２】
本発明の別の実施態様にしたがえば、発現ベクターは、固有の細胞系でのタンパク質のin vitro発現に用いられる発現ベクターである。発現されたタンパク質は、分泌後に、又は分泌後とは限らず（分泌されない場合は、典型的には細胞が溶解するか又は細胞溶解が実施される）培養上清で又は培養上清から採集され、場合によって、例えば限外ろ過のような濃縮方法によって濃縮されるか、及び／又は、例えばアフィニティー型、イオン交換型又はゲルろ過型クロマトグラフィー方法のような精製手段によって精製することができる。
“宿主細胞”とは、外因性ポリヌクレオチド、例えば組換えプラスミド又はベクターの投与によって遺伝的に変化したか、又は遺伝的に変化させることができる原核細胞又は真核細胞をいう。遺伝的に変化した細胞というとき、この用語は、最初に変化した細胞及びその子孫の両方を示す。有利な宿主細胞には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ベビーハムスター腎（BHK）細胞、大腸癌（Caco-2）細胞、COS7細胞、MCF-7細胞、MCF-10A細胞、Madin-Darbyイヌ腎（MDCK）細胞。Madin-Darbyウシ腎細胞（MDBK）、ミンク肺（Mv1Lu）細胞、MRC-5細胞、U937細胞及びVERO細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）K1細胞。所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なクローニングベクター又は発現ベクターに挿入することができる。続いてこのベクターを複製と増幅のために適切な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは当分野で公知の任意の手段によって宿主細胞に導入することができる。対象のポリヌクレオチドを含むベクターは、以下を含む多数の適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入することができる：直接取り込み；エンドサイトーシス；トランスフェクション；ヌクレオフェクション；f-交配；エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン又は他の物質を利用するトランスフェクション；微粒子ボンバードメント；リポフェクション；及び感染（ベクターが感染性、例えばレトロウイルスベクターである場合）。導入ベクター又はポリヌクレオチドの選択はしばしば宿主細胞の特性に左右されるであろう。
【００３３】
有利な実施態様では、本発明は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドのデリバリー及び標的細胞での発現のために、治療的に有効な量の処方物の投与を提供する。治療的に有効な量の決定は、当業者にとって日常的な実験の範囲内である。ある実施態様では、処方物は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び医薬的若しくは獣医学的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤を含む。有利な実施態様では、医薬的又は獣医学的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤は、トランスフェクションを促進するか、及び／又はベクター又はタンパク質の保存を向上させる。
医薬的又は獣医学的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤は当業者には周知である。例えば、医薬的又は獣医学的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤は、0.9%NaCl（例えば食塩水）溶液又はリン酸緩衝液である。本発明の方法に用いることができる他の医薬的又は獣医学的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤には、ポリ-(L-グルタメート) 又はポリビニルピロリドンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。医薬的又は獣医学的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤は、ベクター（又はin vitroで本発明のベクターから発現されるタンパク質）の投与を促進する任意の化合物又は化合物の組合せでありえる。有利には、前記担体、ビヒクル又は賦形剤は、トランスフェクションを促進するか、及び／又はベクター（又はタンパク質）の保存を向上させることができる。用量及び用量体積は本明細書の一般的な記述で考察されるが、さらにまた当業者は、当分野の知識とともに本開示を熟読することにより特段の実験を実施することなく前記を決定することができる。
【００３４】
プラスミドにとって有益な（ただしこれだけが適切というわけではないが）第四アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質は、有利には以下の式を有するものである：
【００３５】
【化１】
2010525812.tif 000003
【００３６】
式中、R1は12から18の炭素原子を有する飽和又は不飽和の直鎖脂肪族基であり、R2は2又は3個の炭素原子を含むまた別の脂肪族基であり、Xはアミン又はヒドロキシル基であり、例えばDMRIEである。別の実施態様では、陽イオン性脂質は中性脂質、例えばDOPEと結合していてもよい。
これらの陽イオン性脂質の中で、好ましいものは、DMRIE（N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム；WO96/34109）であり、有利には中性脂肪、有利にはDOPE（ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン；J. P. Behr, 1994, Bioconjugate Chemistry, 5:382-389）と結合してDMRIE-DOPEを形成する。
有利には、アジュバントとのプラスミド混合物は、即席で、有利には調製物の投与と同時に又は調製物の投与の直前に形成される。例えば、投与前に間を置かずに又は投与に先立って、プラスミド-アジュバント混合物を形成し、有利には混合物が複合体を形成できるように投与に先立って十分な時間、例えば投与に先立って約10分から約60分、例えば投与に先立って約30分が提供される。
DOPEが存在するとき、DMRIE：DOPEのモル比は、有利には約95；約5から約5：約95、より有利には約1：約1、例えば1：1である。
DMRIE又はDMRIE-DOPEアジュバント：プラスミドの重量比は、約50：約1から約1：約10、例えば約10：約1から約1：約5、有利には約1：約1から約1：約2、例えば1：1から1：2でありえる。
【００３７】
本発明の免疫原性組成物及びワクチンは1つ以上のアジュバントを含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成る。本発明の実施に使用される適切なアジュバントは、（1）アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のポリマー、（2）免疫刺激配列（ISS）、例えば1つ以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al. 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:2879-2883；WO98/16247）、（3）水中油エマルジョン、例えばSPTエマルジョン（M. Powell, M. Newmann著、”Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”（Plenum Press 1995）の147ページに記載）及びMF59（同書の183ページに記載）、（4）第四アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質、例えばDDA、（5）サイトカイン、（6）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、（7）サポニン若しくは（8）本出願中に引用され及び参照により含まれる任意の文書類中で考察された他のアジュバント、又は（9）前記の任意の組合せ。
水中油エマルジョン（3）（ウイルスベクターにとって特に適切である）は以下を基剤にすることができる：軽い液状パラフィン油（ヨーロッパ薬局方タイプ）、イソプレノイド油（例えばスクァラン、スクァレン）、アルケンのオリゴマー化から得られた油（イソブテン又はデセン）、直鎖アルキル基を有する酸又はアルコールのエステル（例えば植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ(カプリレート／カプレート)、グリセロールトリ(カプリレート／カプレート) 及びプロピレングリコールジオレエート、又は分枝脂肪アルコール又は脂肪酸のエステル、特にイソステアリン酸エステル。前記油は乳化剤と一緒に用いられ、エマルジョンを生成する。乳化剤は非イオン性界面活性剤、例えば一方ではソルビタン、マンニド（例えばアンヒドロマンニトールオレエート）、グリセロール、ポリグリセロール又はプロピレングリコールのエステル、及び他方ではオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸のエステルであってもよく、前記エステルは場合によってエトキシル化されてあるか、又はポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、例えばプロニック（例えばL121）である。
【００３８】
タイプ（1）のアジュバントポリマーの中では、架橋アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー、特に糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されたものが好ましい。これらの化合物はカルボマー（Pharmeuropa, vol.8, no.2, June 1996）の名称で知られている。当業者はまた米国特許2,909,462号を参照することができる。前記特許文献は、少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくは8つを超えないそのような基）を有し、少なくとも3つのヒドロキシル基の水素原子が少なくとも2つの炭素原子をもつ不飽和脂肪族基によって置換されたポリヒドロキシ化合物によって架橋されたアクリル酸ポリマーを提供する。好ましい基は、2から4の炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリル及び他のエチレン系不飽和基である。不飽和基はまた他の置換基、例えばメチルを含むことができる。Carbopol（BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で販売されている製品が特に適切である。前記製品はアリルサッカロース又はアリルペンタエリトリトールによって架橋されている。それらの中でCarbopol 974P、934P及び971Pが考慮される。
無水マレイン酸-アルケニル誘導体コポリマーに関しては、EMA（Monsanto）が好ましい。前記は、直鎖又は架橋されたエチレン-無水マレイン酸コポリマーであり、例えばジビニルエーテルによって架橋されている。以下の文献でもまた言及されている：J. Fields et al. Nature 1960, 186:778-780。
構造に関しては、アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー及びEMAは好ましくは以下の式を有する基本ユニットによって構成される：
【００３９】
【化２】
2010525812.tif 000004
【００４０】
式中、
−R1及びR2（これらは同じでも異なっていてもよい）はH又はCH3を表し；
−ｘ＝0又は1、好ましくはｘ＝1であり；
−ｙ＝1又は2であり、ｘ＋ｙ＝2である。
EMAの場合、x = 0、y = 2であり、カルボマーの場合、x = y = 1である。
これらのポリマーは水または生理学的塩溶液(20 g/l NaCl)に花葉であり、pHを7.3〜7.4にたとえばソーダ(NaOH）によって調整して発現ベクターを取り込むアジュバント溶液を供給することができる。最終ワクチン組成物中のポリマー濃度は0.01〜1.5％(w/v)、有利には0.05〜１％ w/v、好ましくは0.1〜0.4％ w/vであり得る。
【００４１】
サイトカイン（5）は免疫原性組成物又はワクチン組成物中でタンパク質の形態であってもよいが、免疫原又はそのエピトープとともに宿主内で同時発現されてもよい。免疫原又はそのエピトープを発現するベクターと同じベクターによるサイトカインの同時発現、又は別個のベクターによるサイトカインの同時発現が好ましい。
本発明は、例えば複数の活性成分を、有利にはこれらをまとめて、さらにアジュバント、担体、サイトカイン及び／又は希釈剤と一緒に混合することによって、そのようなコンビネーション組成物を製造することを含む。
本発明で用いることができるサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFNα）、インターフェロンβ（IFNβ）、インターフェロンγ（IFNγ）、インターロイキン-1α（IL-1α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-11（IL-11）、インターロイキン-12（IL-12）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、腫瘍壊死因子β（IFNβ）及び形質転換増殖因子β（TGFβ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。サイトカインは、本発明の免疫原性組成物又はワクチン組成物と同時に投与するか、及び／又は連続的に投与してもよい。したがって、例えば本発明のワクチンはまた、適切なサイトカイン（例えばワクチン接種されるか、又は免疫学的応答が誘導されるべき宿主に適合するサイトカイン、例えばイヌに投与されるべき調製物についてはイヌサイトカイン）をin vivoで発現する外因性核酸分子を含むことができる。
【００４２】
有利には、本発明の医薬組成物及び／又は治療組成物及び／又は処方物は、本明細書で考察した1つ以上の発現ベクター及び／又はポリペプチドの治療的応答を誘導するために有効な量を含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成り、有効な量は、特段の実験を実施することなく、本開示（本明細書に取り込まれた文書類を含む）及び当分野の情報から決定することができる。
プラスミドベクターを基にした治療組成物及び／又は医薬組成物の場合、一般的には、用量は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドの約1μgから約2000μg、有利には約50μgから約1000μg、より有利には約100μgから約800μgを含むことができる。プラスミドベクターを基にした治療組成物及び／又は医薬組成物がエレクトロポレーションによって投与されるとき、プラスミドの用量は、一般的には、約0.1μgから1mg、有利には約1μgから100μg、有利には約2μgから50μgである。用量体積は約0.１から約2mL、有利には約0.2から約1mLでありえる。これらの用量及び用量体積は哺乳動物標的種に対して適切である。
有利な実施態様では、動物は、2用量を3から4週間隔で皮下ルートによりワクチン接種されるが、筋肉内ルートもまた意図される。血液サンプルを、1回目及び／又は2回目のワクチン接種の日、及び2回目のワクチン接種後約2から4週間で収集し、特異的抗体レベルを当業者に公知の方法（例えばウイルス中和、血球凝集阻害、ELISA又は一元放射溶血（SRH）試験）によって決定する。
【００４３】
本明細書の開示は例示のために提供され、本発明はそれらに限定されないことは当業者には理解されるところであろう。本明細書の開示及び当分野における情報から、当業者は様々な投与、投与ルート、及び各注射プロトコルに用いられるべき用量を、特段の実験を実施することなく決定することができる。
本発明は、本発明にしたがって作製した治療組成物の有効量を動物へ少なくとも1回投与することを意図する。動物は雄でも雌でも妊娠した雌でも新生獣でもよい。この投与は、筋肉内（IM）、皮内（ID）若しくは皮下（SC）注射又は鼻内若しくは経口投与を含む（ただしこれらに限定されない）多様なルートを介して実施することができる。本発明の治療組成物はまた針無し装置（例えばPigjet、Biojector又はVitajet装置（Bioject, Oregon, USA）による）によって投与することができる。プラスミド組成物を投与するまた別のアプローチはエレクトロポレーションの使用である（S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378；S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238；S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408；PCT Application No. WO99/01158）。別の実施態様では、治療組成物は遺伝子銃又は金粒子ボンバードメントによって動物にデリバーされる。有利な実施態様では、動物は脊椎動物である。
本発明のある実施態様は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドに対して動物で免疫応答を誘導する方法であり、前記方法は、組換えワクチンのデリバリー及び発現用処方物を、免疫応答を誘導するために有効な量で投与することを含む。本発明のさらに別の実施態様は、動物で免疫学的又は防御的応答を誘発する方法であり、前記方法は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドのデリバリー及び発現用処方物の有効量を動物に投与することを含み、この場合、前記処方物は組換えワクチン及び医薬的又は獣医学的に許容できる担体、ビヒクル又は賦形剤を含む。
本発明は、動物（有利には哺乳動物又は脊椎動物）の免疫応答を誘導、誘発又は刺激する方法に関する。
本発明の別の実施態様は、対象の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドに対して免疫学的又は防御的応答を動物で誘発する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、組換えワクチン及び免疫応答を動物で誘導するために有効な量でデリバリーを実施するための指示書を含む。
本発明を以下の非限定的な例によりこれからさらに説明する。
【実施例１】
【００４４】
細菌におけるプラスミド複製効率に対するカナマイシン耐性（“Kanar”）遺伝子発現効率の影響
以下の実施例は、細菌におけるプラスミド複製効率に対するカナマイシン耐性（“KanaR”）遺伝子発現効率の影響を示す。
第一に、KanaR発現カセットエレメント、特にプロモータ、翻訳開始及び転写終了を解析した。これらの発現エレメントを解析したなら、これらのエレメントを改変し、プラスミド生成収量に対する改変エレメントの影響を解析する。4つの潜在的プロモータを同定した。P3（配列番号:3）はデータベース及び文献検索から同定した。その構造はGenBank AN# X00928（配列番号:4）に記載されているが、これまでのソフトでは検出されなかった。P2（配列番号:2）はバイオインフォマティクス解析によって同定されたが、公表されたGenBank AN# V00359（配列番号:5）でもまた見出された。P1（配列番号:1）は、pVR1012骨格に付属する付加された潜在的プロモータであった。P0は、pVR1012骨格に付属するまた別の潜在的プロモータであった。図1は、P2（配列番号:2）及びP3がどのように部分的にオーバーラップしているかを示す。
pVR1012にはKanaRのための転写終了シグナル配列は存在しない。このことは多くの潜在的な結果を生じえよう。多くのKanaR転写物は異常に長く、さらに無用な代謝負荷となりえるので分解される可能性があろう。さらにまた、KanaRの発現はpVR1012では最適より低い可能性がある。図2に模式的に示すように、KanaR転写は複製起点（ORI）を通過して継続し、複製開始を妨げる可能性がある。したがって、以下の2つの適切な転写ターミネータを認定した：rrnBT1+T2（前記はGenBank AN# U13872（配列番号:6）で見出され、多くの市販の発現ベクターで用いられている）及びspeA（前記はACC.番号M31770（配列番号:7）を有する）。さらにまた、pVR1012のATG開始コドンをTTGに置換し、翻訳開始効率を低下させた。したがって、この目的は、各改変発現カセットのカナマイシン耐性性能及びプラスミド生成収量に対する影響を決定することであった。
【００４５】
したがって、プロモータ1（配列番号:1）、P2/P3（配列番号:2−3）、又はP2/P3（配列番号:2−3）付きP1（配列番号:1）、転写ターミネータrrnBT1+T2又はspeA、及び開始コドンTTGを用いて、pVR1012誘導体を作製した。そのようなDNA配列をKanaRのORFの上流又は下流に導入するために、単一制限部位が必要であった。そのような部位はpVR1012に見出されなかったので、それらを位置特異的変異導入によって導入した。第一に、図3に示すようにKanaRカセットを変異導入ベクターpALTER-1にてクローニングした。図4は、KanaR ORFの下流にPacI制限部位を導入し、それによってpLL2を生成し、上流にSwaI制限部位を導入し、さらにRsrII制限部位を下流に導入し、それによってpLL4を生成し、最後に翻訳開始コドンATGをTTGに変異させてpLL6を生成した手順を示している。続いて、図5に示すように、pLL4の変異KanaRカセットをpV1012にてクローニングしpLL7を形成した。続いて、図6に示すように、pSB062からPCRによってpLL7にてrrnBターミネータ配列をクローニングし、その後PacI RsrII消化を実施してpLL9を形成した。図7は、合成オリゴヌクレオチドのアニーリング及びPacI RsrII消化によるpLL7でのspeAターミネータ配列のクローニングとそれによるpLL11の形成を示す。次に、図8に示すように、pLL6の変異させた翻訳開始配列をMscI PacI消化によってpLL9にてクローニングし、pLL10を形成した。最後に、図9は、プロモータ配列P1（配列番号:1）付きP2/P3（配列番号:2−3）、P1（配列番号:1）、及びP2/P3（配列番号:2−3）を、それぞれURS11-URS12 PCR、URS13-URS12 PCR及びURS11-URS14 PCRによってクローニングした手順を示す。図10、11及び12は、これらをpLL9に取り込み、それぞれpLL13、14及び15を形成した手順を示す。同様に、図13は、P1（配列番号:1）をpLL7に取り込んでpLL16を形成した手順を示す。図14は、得られた構築物のいくつかを示す。pLL13、PLL14、pLL15及びpLL16構築物は、図15に示すように、CMVプロモータとKana P1（配列番号:1）プロモータとの間に192塩基対欠失を有していた。表1はこれらの構築物の要旨である。
【００４６】
表1
2010525812.tif 000005
* CMVプロモータとKana P1プロモータとの間に192bpの欠失を有する構築物
【００４７】
KanaR遺伝子転写物サイズに対する改変の影響はノザンブロット実験によって確認した。これらの実験によって、スメアで示されるとおりpVR1012 KanaR転写物の不均一性が確認された。これらによって、pLL9、pLL10及びpLL11の3つの活性な以下のプロモータの存在もまた確認された：P2/P3（配列番号:2−3）からの1つの主要な短い転写物とP0及びP1（配列番号:1）からの2つのより少ない転写物。予想されたとおり、pLL13は2つの転写物を生じ、pLL14及びpLL15はただ1つの転写物を生じた。
続いて、pVR1012誘導体についていくつかのパラメータを試験し、それらの新規な特徴を評価した。カナマイシン濃度増加に対する耐性能力は、先ず初めに各構築物（pVR1012からpLL15まで）を含む1個の細菌コロニーをLB培地に接種し、一晩200RPMで37℃にて増殖させることによって試験した。各懸濁物の細菌を分光光度計によって定量した（OD600 nm）。適切な希釈の細菌懸濁物、50又は100μLを濃度が増加していくカナマイシンを含むLB培地にプレートした。最後に、コロニーを数え、その結果は図16に示されている。これらの結果は、ほとんどのpVR1012誘導体を含む細菌は、カナマイ濃度の増加に対して順応させなくとも同じ耐性性能を有することを示した。なぜならば、増殖は0から800μg/mLの間では影響を受けず、3200μg/mLで阻害されたからである。pLL10及びpLL14を含む細菌は、増殖が800μg/mLで90%から100%阻害されたのでカナマイシン耐性能力が有意に低下していたが、200μg/mLでは阻害されなかった。したがって、P2/P3（配列番号:2−3）プロモータの欠如又は翻訳効率低下はKanaR酵素の生成に顕著な影響を与え、P2/P3（配列番号:2−3）プロモータはKanaR発現にもっとも有効であり、さらにTTGインヒビターはKanaR発現を低下させることを示していると結論した。しかしながら、これらの変異はなお細菌の耐性及び従来のカナマイ濃度の存在下での増殖を許容する。
EGLI培地順応能力を、先ず初めに各細菌内構築物及び104 CFUを含む細菌細胞懸濁物をLBで増殖させ、その後でEGLIプレートにプレートすることによって試験した。各構築物を含む25から50の単離コロニーを続いて新しいEGLIプレートにプレートした。増殖コロニーを数え、その結果は表2に示されている。pLL10、pLL14及びpLL16プラスミド骨格は、それらを含む細菌に栄養制限培地における明瞭な増殖利点を付与した。さらにまた、より低いカナマイシン生成能力は、100μg/mLのカナマイ存在下の低栄養培地でのより良好な順応能力を伴った。
【００４８】
2010525812.tif 000006
【００４９】
実験室の増殖条件下で得られるプラスミド収量を、先ず初めに各構築物を含む細菌の1つのコロニーを100μg/mLのカナマイを含むLB液体培地で一晩、37℃にて200RPMで増殖させることによって試験した。各懸濁物中の細菌の量を分光光度計（OD600 nm）によって判定した。エッペンドルフカラムを用いて各懸濁物のDNAを精製し、分光光度計（OD260 nm）によって定量した（各DNA溶液は2回定量した）。続いて、各懸濁物中のプラスミドコピー数を算出し、その結果は図17で知ることができる。カナマイ100μg/mL含有LB培地での増殖後、種々の構築物間で顕著な相違は認められなかった。さらに、プラスミド安定性を各構築物に由来する3つのプラスミド調製物を制限分析に付すことによって判定した。
実験室の増殖条件下で得られるプラスミド収量を、先ず初めに固形培地でEGLIに順応させることによって試験した。各構築物を含む15及び25コロニー（それぞれ実験A及びB）をEGLI液体培地で37℃及び200RPMで一晩増殖させた。各懸濁物中の細菌量を分光光度計によって判定した（OD600 nm）。Qiagenカラムを用いて各懸濁物のDNAを精製し、分光光度計（OD260 nm）によって定量した。続いて、各懸濁物中のプラスミドコピー数を推定した。その結果は図19で知ることができる。
結果は、構築物pLL14及びpLL16は、実験室の条件下のEGLI培地におけるプラスミド収量に関して最良の候補であることを示している。さらにまた、プラスミド収量は、構築物が転写ターミネータ及び効率的な翻訳開始（ATG）を含むとき顕著に低くなった。同時に、プラスミド収量は、構築物が翻訳ターミネータを含まないか、又は最適に達しないP1（配列番号:1）プロモータ又は最適に達しない翻訳開始（TTG）を含むときに最高であった。プラスミド収量は構築物pVR1012とpLL10では類似しており、低い翻訳効率が転写ターミネータの負の影響を代償したことを示している。これらの結果は、KanaR発現性能が低ければ低いほど、プラスミド収量が高いことを示唆している。この試験をさらに広げ、プラスミドの安定性を、各構築物に由来する各プラスミドを制限分析に付すことによってさらに評価した。表2はこの分析を示している。変異は、pLL10、pLL14、pLL16及びpLL19についてはEGLI順応後に検出されなかったが、一方、他の構築物については変異が9%を超えた。さらにまた、pLL14、pLL16及びpLL19のEGLI順応クローンではプラスミド収量の均質性の増加があることが観察された。図20は、構築物pVR1012によるプラスミド収量の高い不均一性と構築物pLL4又はpLL9によるプラスミド収量により低い不均一性の相違を示している。
【００５０】
発酵によって得られるプラスミド収量は、先ず初めに発酵のためにEGLI順応SCS1/pLL4の1つのクローンを任意に選択することによって試験した。発酵後に細菌を遠心分離し、プラスミドをアリコットから抽出し、PGEAによって現像する方法にしたがって2度定量した。結果は、SCS1/pLL14の増殖速度は、pVR1012誘導体（例えばpPB266及びpPB662）について通常認められる増殖速度より顕著に遅いことを示した。さらにまた、pLL14の個別のプラスミド収量は1gの細菌ペレット当たり3.1mgプラスミドであった。この結果は、カナマイ順応及びクローン選別後のpVR1012誘導体でこれまでに得られた最高の結果に該当する。続いて、各発酵クローン由来のプラスミド調製物を異なる3つの制限消化パターンによる制限分析に付すことによって、プラスミド安定性を判定した。表4は、全体的なプラスミド分析結果の要旨を提供する。結果は、KanaR発現レベルがプラスミド複製効率に対して影響を与えたことを示している。発現が低ければ低いほど、低栄養培地及びカナマイ100μg/mLでの複製速度は速くなった。より低いKanaR発現は、天然のプロモータ（P2/P3（配列番号:2−3））の欠失、転写終了シグナルの欠如を担保すること、及び翻訳開始に変異を導入することによって得ることができた。低いKanaR発現は、親プラスミド骨格pVR1012と比較したとき50%までのプラスミド収量の増加をもたらした。低KanaR発現はまた、プラスミド安定性の増加及びプラスミド生成収量における均質性をもたらした。したがって、このことによりおそらく限られたクローン選別が可能であった。
【００５１】
2010525812.tif 000007
【００５２】
プラスミドpLL16を、例えばカナマイ濃度増加に対する耐性及び発酵後のプラスミド収量について更なる分析に付す。pLL17及びpLL18の構築もまた完成させる。この場合pLL17はP1プロモータ、TTG開始コドン及びターミネータrrnBT1/2を有し、pLL18はP1プロモータ、TTG開始コドン及び有し、ターミネータはもたない。しかしながら、これらの構築物は低いKanaR性能のために得ることが困難かもしれない。これらの構築物を以前に記載した試験を用いて分析する。選択した構築物（例えばpLL14−18）についてカナマイ順応後にプラスミド収量試験を実施する。全ての構築物のKanaR遺伝子のRNA転写物分析を実施してこの推定モデルを確認する。pVR1012中のKanaRカセットをひっくり返すことにより、KanaRカセットが複製起点に影響を持たないことを確認することが可能である。
【実施例２】
【００５３】
配列
定義：プラスミドR1のトランスポゾンTm2350 Km(r) 遺伝子の5'領域
アクセッション：X00928（配列番号:4）
1 gaattcccgc agattaacgc gcataacaag cggtttactc gttttggcct gcaatgtaac
61 ataatataca ttatgcgcac taaggtagag gcagcaagat tatgcggttt tgatcagaac
121 tcagttaacc atcccgggat tctgctctgg cccattcagc gcagtttttt actttggatg
181 aagttaaccc atgttatatt gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt
241 ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt
301 gctcgaggga attc
【００５４】
定義：トランスポゾンTn903
アクセッション：V00359 J01839（配列番号:5）
1 ggctttgttg aataaatcag atttcgggta agtctccccc gtagcgggtt gtgttttcag
61 gcaatacgca cgctttcagg catacctgct ttcgtcattt tgttcagcgc tcgtaccagg
121 gccatagcct ccgcaacctg accatcgtag tcacgcagcg tcagtgaacc cccgaacagc
181 tgttttaccc ggtacatcgc cgtttccgct atcgagcgac ggttgtaatc tgttgtccat
241 ttccaccgcg cattactccc ggtcattcgc tgattagcca ctgcacggtt acggtctgca
301 tattcaccgg gccagtaacc cgcacctttt cggggaggga taagcgcgct gattttctta
361 cgccgcagtt catcgtgaca gagccgggtg tcgtaagcgc cgtctgccga tgctgccctg
421 atttttctgt gagtctgccg gataagaccc gggaaggctt ctgagtcggt cacattgttc
481 agcgacaggt cagcgcagat gatttcatgt gttttactgt caacggcgag atgcagctta
541 cgccagatac ggcggcgttc ctggccatgc tttttgactt tccattcgcc ttcaccaaag
601 accttcagcc cggtggaatc aatcaccaga tgcgcgattt caccccgggt gaacgttttg
661 aaactgatat taaccgactt tgcccgcctg ctgacacagc tgtaatccgg gcagcgcaac
721 ggaacattca tcagtgtaaa aatggaatca ataaagccct gcgcagcgcg cagggtcagc
781 ctgaatacgc gtttaatgac cagcacagtc gtgatggcaa ggtcagaata gcgctgaggt
841 ctgcctcgtg aagaaggtgt tgctgactca taccaggcct gaatcgcccc atcatccagc
901 cagaaagtga gggagccacg gttgatgaga gctttgttgt aggtggacca gttggtgatt
961 ttgaactttt gctttgccac ggaacggtct gcgttgtcgg gaagatgcgt gatctgatcc
1021 ttcaactcag caaaagttcg atttattcaa caaagccacg ttgtgtctca aaatctctga
1081 tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata
1141 aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg ctcgaggccg
1201 cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc
1261 gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt
1321 ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac
1381 tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat
1441 gcatggttac tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat
1501 cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg
1561 attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa
1621 tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg
1681 cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aagcttttgc cattctcacc ggattcagtc
1741 gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt
1801 tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg
1861 aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt
1921 gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca
1981 gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcggc
2041 tttgttgaat aaatcgaact tttgctgagt tgaaggatca gatcacgcat cttcccgaca
2101 acgcagaccg ttccgtggca aagcaaaagt tcaaaatcac caactggtcc acctacaaca
2161 aagctctcat caaccgtggc tccctcactt tctggctgga tgatggggcg attcaggcct
2221 ggtatgagtc agcaacacct tcttcacgag gcagacctca gcgctattct gaccttgcca
2281 tcacgactgt gctggtcatt aaacgcgtat tcaggctgac cctgcgcgct gcgcagggct
2341 ttattgattc catttttaca ctgatgaatg ttccgttgcg ctgcccggat tacagctgtg
2401 tcagcaggcg ggcaaagtcg gttaatatca gtttcaaaac gttcacccgg ggtgaaatcg
2461 cgcatctggt gattgattcc accgggctga aggtctttgg tgaaggcgaa tggaaagtca
2521 aaaagcatgg ccaggaacgc cgccgtatct ggcgtaagct gcatctcgcc gttgacagta
2581 aaacacatga aatcatctgc gctgacctgt cgctgaacaa tgtgaccgac tcagaagcct
2641 tcccgggtct tatccggcag actcacagaa aaatcagggc agcatcggca gacggcgctt
2701 acgacacccg gctctgtcac gatgaactgc ggcgtaagaa aatcagcgcg cttatccctc
2761 cccgaaaagg tgcgggttac tggcccggtg aatatgcaga ccgtaaccgt gcagtggcta
2821 atcagcgaat gaccgggagt aatgcgcggt ggaaatggac aacagattac aaccgtcgct
2881 cgatagcgga aacggcgatg taccgggtaa aacagctgtt cgggggttca ctgacgctgc
2941 gtgactacga tggtcaggtt gcggaggcta tggccctggt acgagcgctg aacaaaatga
3001 cgaaagcagg tatgcctgaa agcgtgcgta ttgcctgaaa acacaacccg ctacggggga
3061 gacttacccg aaatctgatt tattcaacaa agcc
【００５５】
定義：pTrc99aクローニングベクター、完全な配列
アクセッション：U13872（配列番号:6）
1 gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc
61 ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc
121 gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc
181 tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga
241 taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta
301 gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc
361 tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca
421 gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg
481 atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga
541 aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc
601 ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg
661 tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg
721 acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa
781 atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga
841 agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc
901 ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg
961 gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc
1021 gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat
1081 tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg
1141 acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag
1201 aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa
1261 cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc
1321 gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca
1381 cgatgcctac agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc
1441 tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc
1501 tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg
1561 ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta
1621 tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag
1681 gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga
1741 ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc
1801 tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa
1861 agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa
1921 aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc
1981 cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt
2041 agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc
2101 tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac
2161 gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca
2221 gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg
2281 ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag
2341 gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt
2401 ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat
2461 ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc
2521 acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt
2581 gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag
2641 cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca
2701 tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc
2761 gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc
2821 gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg
2881 gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa
2941 ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc
3001 tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa
3061 ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc
3121 gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg
3181 gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg
3241 ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg
3301 attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc
3361 ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg
3421 atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat
3481 gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc
3541 catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc
3601 gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat
3661 aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc
3721 atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg
3781 ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg
3841 cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat
3901 atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac
3961 cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca
4021 ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg
4081 gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg
4141 caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctg
【００５６】
定義：大腸菌のアルギニンデカルボキシラーゼ（speA）遺伝子、完全なcds、アグマチナーゼ（speB）及びメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（metK）遺伝子（5'末端）
アクセッション：M31770（配列番号:7）
1 tacccaaggt cgctggtggt gatttcgccg ccaactaaaa ccaatgccgg tttttacgta
61 ggtttcgcaa gcaacgcgtg ctttcggatc ctgttcgagg atcgcgtcta aaacggcatc
121 agaaatttgg tcagcaattt tgtcaggatg cccttcagag acggactcgg acgtaaaaag
181 gtgttttgcc atatttaata tcacctaaag agaatttggt tagctcaaac tgttgtgtgg
241 attttctgtg gtagcggatc ctaccacgac tctgcaggtt aaaaacactg gcagtctgag
301 tgttaatcgg tatggatgga ttaacatctg gatggctatt ttaggtcaat tcttcaccct
361 atttccactt ttttttgaat cgtgtctcat tctgttaaaa acgtggctgg aaatttttcc
421 tgacaatgcc ggcattctgc gtatttatct tttgcaattt tctgccattg tggggtataa
481 aacgcggcgc gcggcttaaa taaaaagcac acgacgtttc tttcgtgttg ccacttccag
541 ccgggttcaa atcagagttt tggcttgtgg gttcgtctta acaggcggcc gtggaggtga
601 tacgaaataa tgaaccgttg tctgctgctt aacctgtctc accgttctgg tgaagattcg
661 ttccccgcac tctgcatctc tgctttgcat acctgccgat gttataccca tctcggcgct
721 tctcaggatt caagagctgg ttacagttac tgaggactga acaagggcgc tcttgtaaaa
781 acaagagttt tctcgtggtt tcgccgaact ttcacactta cgttcggtta tgtgcttaat
841 aatgttatga aaaagaaacc ggttgcgcag ttggagcgtc agcattcact gctggaaaat
901 ccatgtgctt atgggttgtt atcgcagttc caggctgcga tagtcgttaa ctgttttaca
961 cttaataaaa taatttgagg ttcgctatgt ctgacgacat gtctatgggt ttgccttcgt
1021 cagcgggcga acacggtgta ctacgctcca tgcaggaggt tgcaatgagc tcccaggaag
1081 ccagcaagat gctgcgtact tacaatattg cctggtgggg caataactac tatgacgtta
1141 acgagctggg ccacattagc gtgtgcccgg acccggacgt cccggaagct cgcgtcgatc
1201 tcgcgcagtt agtgaaaact cgtgaagcac agggccagcg tctgcctgca ctgttctgtt
1261 tcccacagat cctgcagcac cgtttgcgtt ccattaacgc cgcgttcaaa cgtgcgaggg
1321 aatcctacgg ctataacggc gattacttcc ttgtttatcc gatcaaagtt aaccagcacc
1381 gccgcgtgat tgagtccctg attcattcgg gcgaaccgct gggtctggaa gccggttcca
1441 aagccgagtt gatggcagta ctggcacatg ctggcatgac ccgtagcgtc atcgtctgca
1501 acggttataa agaccgcgaa tatatccgcc tggcattaat tggcgagaag atggggcaca
1561 aggtctatct ggtcattgag aagatgtcag aaatcgccat tgtgctggat gaagcagaac
1621 gtctgaatgt cgttcctcgt ctgggcgtgc gtgcacgtct gcgttcgcag ggttcgggta
1681 aatggcagtc ctccggcggg gaaaaatcga agttcggcct ggctgcgact caggtactgc
1741 aactggttga aaccctgcgt gaagccgggc gtctcgacag cctgcaacta ctgcacttcc
1801 acctcggttc gcagatggcg aatattcgcg atatcgcgac aggcgttcgt gaatccgcgc
1861 gtttctatgt ggaactgcac aagctgggcg tcaatattca gtgcttcgac gtcggcggcg
1921 gtctgggcgt ggattatgaa ggtactcgtt cgcagtccga ctgttcggtg aactacggcc
1981 tcaatgaata cgccaacaac attatctggg cgattggcga tgcgtgtgaa gaaaacggtc
2041 tgccgcatcc gacggtaatc accgaatcgg gtcgtgcggt gactgcgcat cacaccgtgc
2101 tggtgtctaa tatcatcggc gtggaacgta acgaatacac ggtgccgacc gcgcctgcag
2161 aagatgcgcc gcgcgcgctg caaagcatgt gggaaacctg gcaggagatg cacgaaccgg
2221 gaactcgccg ttctctgcgt gaatggttac acgacagtca gatggatctg cacgacattc
2281 atatcggcta ctcttccggc atctttagcc tgcaagaacg tgcatgggct gagcagcttt
2341 atttgagcat gtgccatgaa gtgcaaaagc agctggatcc gcaaaaccgt gctcatcgtc
2401 cgattatcga cgagctgcag gaacgtatgg cggacaaaat gtacgtcaac ttctcgctgt
2461 tccagtcgat gccggacgca tgggggatcg accagttgtt cccggttctg ccgctggaag
2521 ggctggatca agtgccggaa cgtcgcgctg tgctgctgga tattacctgt gactctgacg
2581 gtgctatcga ccactatatt gatggtgacg gtattgccac gacaatgcca atgccggagt
2641 acgatccaga gaatccgccg atgctcggtt tctttatggt cggcgcatat caggagatcc
2701 tcggcaacat gcacaacctg ttcggtgata ccgaagcggt tgacgtgttc gtcttccctg
2761 acggtagcgt agaagtagaa ctgtctgacg aaggcgatac cgtggcggac atgctgcaat
2821 atgtacagct cgatccgaaa acgctgttaa cccagttccg cgatcaagtg aagaaaaccg
2881 atcttgatgc tgaactgcaa caacagttcc ttgaagagtt cgaggcaggt ttgtacggtt
2941 atacttatct tgaagatgag taagtcctgt gttacttgaa tccgcttaat ttagcggtga
3001 taatccgcca caatttattg tgacaaatcc aacccttcct cgtcgggcct aacgacgcgg
3061 aagggttttt ttatatcgac tttgtaatag gagtccatcc atgagcacct taggtcatca
3121 atacgataac tcactggttt ccaatgcctt tggtttttta cgcctgccga tgaacttcca
3181 gccgtatgac agcgatgcag actgggtgat tactggcgtg ccgttcgata tggcca
【００５７】
これまで詳細に本発明の好ましい実施態様を記載してきたが、上記パラグラフによって規定した本発明は、多くの明瞭な変型が本発明の範囲を逸脱することなく可能であるので、上記の記述で示した個々の記載に限定されないことは理解されよう。
【図１】
2010525812.tif 000008
【図２】
2010525812.tif 000009
【図３】
2010525812.tif 000010
【図４】
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【図５】
2010525812.tif 000012
【図６】
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【図７】
2010525812.tif 000014
【図８】
2010525812.tif 000015
【図９】
2010525812.tif 000016
【図１０】
2010525812.tif 000017
【図１１】
2010525812.tif 000018
【図１２】
2010525812.tif 000019
【図１３】
2010525812.tif 000020
【図１４】
2010525812.tif 000021
【図１５】
2010525812.tif 000022
【図１６】
2010525812.tif 000023
【図１７】
2010525812.tif 000024
【図１８】
2010525812.tif 000025
【図１９】
2010525812.tif 000026
【図２０】
2010525812.tif 000027
【図２１】
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【配列表】
2010525812000001.app
【国際調査報告】
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