(57)【要約】アジュバントは、例えば抗原の免疫原性を増大させることによって免疫応答を刺激する化合物又は材料である。本明細書においては、アジュバント効果を増大させる組成物及び方法が提供される。前記方法は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して、ＡＰＣの細胞表面マーカーに結合する化合物を使用してアジュバントを標的化させることを含む。かかる方法は、動物（例えばヒト）の免疫応答を刺激するのに有用である。また、抗原とアジュバントとをＡＰＣに標的化させる組成物も提供される。
2010504970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバントの効果を増大するための方法であって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面マーカーに結合する化合物に結合するアジュバントを含む薬剤を動物に投与することと、それによって抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対してアジュバントを標的化させることと、該化合物または該アジュバント以外の抗原に対する免疫応答を刺激することによって該アジュバントの効果を増大させることとを含む、方法。
【請求項２】
該アジュバントが該化合物に共有結合により結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該化合物がＡＰＣの細胞表面マーカーに結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該抗体が抗体の抗原結合フラグメントである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該抗体が内部移行抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該抗体がヒト化抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
該細胞表面マーカーが内部移行受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該ＡＰＣが樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該細胞表面マーカーがＣ−型レクチンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該細胞表面マーカーがＤＣ−ＳＩＧＮである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する該化合物が、マンノース炭水化物、フコース炭水化物、植物レクチン、抗生物質、糖、タンパク質又は抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する該化合物が抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該アジュバントが、ミネラル塩、小分子、サポニン、多糖類、脂質、核酸、タンパク質又はペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該アジュバントがタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該アジュバントが脂質でない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
該タンパク質がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
該動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該アジュバントが自然免疫応答を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
該動物が予め該アジュバントを接種されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
該薬剤が医薬組成物に製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該医薬組成物が更に抗原を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該薬剤が該化合物に結合する抗原を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該抗原が該化合物に共有結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該薬剤が医薬組成物に製剤化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該医薬組成物が、更に、該化合物に結合しない抗原を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物に結合する前記抗原及び前記化合物に結合しない前記抗原は同じものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該抗原が核酸ワクチンでない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
該抗原がタンパク質又はペプチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
免疫応答を刺激することを必要とする動物において免疫応答を刺激するための方法であって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面マーカーに結合する化合物に結合するアジュバントを含む薬剤を該動物に投与することを含み、該薬剤が前記化合物または前記アジュバント以外の抗原に対する免疫応答を刺激する、方法。
【請求項３１】
該アジュバントが共有結合によって該化合物に結合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該化合物がＡＰＣの細胞表面マーカーと結合する抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
該抗体が抗体の抗原結合フラグメントである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該抗体が内部移行抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
該抗体がヒト化抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
該細胞表面マーカーが内部移行受容体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
該ＡＰＣが樹状細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
該細胞表面マーカーがＣ−型レクチンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該細胞表面マーカーがＤＣ−ＳＩＧＮである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する該化合物が、マンノース炭水化物、フコース炭水化物、植物レクチン、抗生物質、糖、タンパク質又は抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する該化合物が抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
該アジュバントが、ミネラル塩、小分子、サポニン、多糖類、脂質、核酸、タンパク質又はペプチドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
該アジュバントがタンパク質である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
該アジュバントが脂質でない、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
該タンパク質がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
該薬剤が腫瘍関連抗原に対する免疫応答を刺激する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４８】
該薬剤が病原体感染と関連した抗原に対する免疫応答を刺激する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４９】
該動物がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項５０】
該薬剤が自然免疫応答を刺激する請求項３０に記載の方法。
【請求項５１】
該動物が予め該アジュバントを接種されない、請求項３０に記載の方法。
【請求項５２】
該薬剤が医薬組成物に製剤化される、請求項３０に記載の方法。
【請求項５３】
該医薬組成物が更に抗原を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該薬剤が該化合物に結合する抗原を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５５】
該抗原が該化合物に共有結合する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
該薬剤が医薬組成物に製剤化される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
該医薬組成物が、更に、該化合物に結合しない抗原を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記化合物に結合する前記抗原及び前記化合物に結合しない前記抗原は同じものである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
該抗原が核酸ワクチンでない、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
該抗原がタンパク質又はペプチドである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
動物において免疫応答を刺激するための方法であって、アジュバントに共有結合するＤＣ−ＳＩＧＮ特異抗体を含むＡＰＣ標的化剤を該動物に投与することを含み、該ＡＰＣ標的化剤が前記ＤＣ−ＳＩＧＮ特異抗体又は前記アジュバント以外の抗原に対する免疫応答を刺激し、該動物が予め該アジュバントを接種されない、方法。
【請求項６２】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面マーカーに結合する化合物と、アジュバントと、抗原とを含む免疫刺激剤であって、前記化合物、アジュバント及び抗原が結合している免疫刺激剤。
【請求項６３】
該化合物、該抗原及び該アジュバントが共有結合する、請求項６０に記載の免疫刺激剤。
【請求項６４】
該化合物及び該抗原が該アジュバントに結合する、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項６５】
該化合物及び該アジュバントが該抗原に結合する、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項６６】
該アジュバント及び該抗原が該化合物に結合する、請求項６３に記載の免疫刺激剤。
【請求項６７】
該抗原が腫瘍関連抗原である、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項６８】
該抗原が病原体に由来する抗原である、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項６９】
該抗原が核酸ワクチンでない、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項７０】
該抗原がタンパク質又はペプチドである、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項７１】
該アジュバントが、ミネラル塩、小分子、サポニン、多糖類、脂質、核酸、タンパク質又はペプチドである、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項７２】
該アジュバントがタンパク質である、請求項６６に記載の免疫刺激剤。
【請求項７３】
該アジュバントが脂質でない、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項７４】
該タンパク質がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）である、請求項７０に記載の免疫刺激剤。
【請求項７５】
該化合物が、ＡＰＣの細胞表面マーカーと結合する抗体である、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項７６】
該抗体がヒト化抗体である、請求項７５に記載の免疫刺激剤。
【請求項７７】
該抗体が抗体の抗原結合フラグメントである、請求項７５に記載の免疫刺激剤。
【請求項７８】
該抗体が内部移行抗体である、請求項７５に記載の免疫刺激剤。
【請求項７９】
該抗原が重鎖定常領域のＣ末端に結合する、請求項７５に記載の免疫刺激剤。
【請求項８０】
該抗原が、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は前記抗体の定常領域に組み込まれる、請求項７５に記載の免疫刺激剤。
【請求項８１】
該化合物が、内部移行受容体である細胞表面マーカーと結合する、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項８２】
該化合物が樹状細胞の細胞表面マーカーと結合する、請求項６２に記載の免疫刺激剤。
【請求項８３】
該細胞表面マーカーがＣ−型レクチンである、請求項８２に記載の免疫刺激剤。
【請求項８４】
該細胞表面マーカーがＤＣ−ＳＩＧＮである、請求項８２に記載の免疫刺激剤。
【請求項８５】
ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する該化合物が、マンノース炭水化物、フコース炭水化物、植物レクチン、抗生物質、糖、タンパク質又は抗体である、請求項８４に記載の免疫刺激剤。
【請求項８６】
ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する該化合物が抗体である、請求項８５に記載の免疫刺激剤。
【請求項８７】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項８６に記載の免疫刺激剤。
【請求項８８】
請求項６２に記載の免疫刺激剤と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項８９】
該化合物に結合しない抗原を更に含む請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記化合物に結合する前記抗原及び該化合物に結合しない前記抗原は同じものである、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９１】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面マーカーに結合する化合物と、アジュバントと、抗原とを含む免疫刺激組成物であって、前記アジュバント又は前記抗原の内の少なくとも１つが該化合物に結合する、免疫刺激組成物。
【請求項９２】
前記アジュバント又は前記抗原の内の少なくとも１つが該化合物に共有結合する、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項９３】
該アジュバントが該化合物に結合する、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項９４】
該抗原が該アジュバントに結合する、請求項９３に記載の免疫刺激組成物。
【請求項９５】
該抗原が該化合物に結合する、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項９６】
該アジュバントが該抗原に結合する、請求項９５に記載の免疫刺激組成物。
【請求項９７】
該アジュバント及び該抗原が該化合物に結合する、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項９８】
該抗原が腫瘍関連抗原である、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項９９】
該抗原が病原体に由来する抗原である、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１００】
該抗原が核酸ワクチンでない、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１０１】
該抗原がタンパク質又はペプチドである、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１０２】
該アジュバントが、ミネラル塩、小分子、サポニン、多糖類、脂質、核酸、タンパク質又はペプチドである、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１０３】
該アジュバントがタンパク質である、請求項１０２に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１０４】
該アジュバントが脂質でない、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１０５】
該タンパク質がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）である、請求項１０３に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１０６】
該化合物が、ＡＰＣの細胞表面マーカーと結合する抗体である、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１０７】
該抗体がヒト化抗体である、請求項１０６に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１０８】
該抗体が抗体の抗原結合フラグメントである、請求項１０６に記載の免疫刺激剤。
【請求項１０９】
該抗体が内部移行抗体である、請求項１０６に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１１０】
該化合物が、内部移行受容体である細胞表面マーカーと結合する、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１１１】
該化合物が樹状細胞の細胞表面マーカーと結合する、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１１２】
該細胞表面マーカーがＣ−型レクチンである、請求項１１１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１１３】
該細胞表面マーカーがＤＣ−ＳＩＧＮである、請求項１１１に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１１４】
ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する該化合物が、マンノース炭水化物、フコース炭水化物、植物レクチン、抗生物質、糖、タンパク質又は抗体である、請求項１１３に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１１５】
ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する該化合物が抗体である、請求項１１４に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１１６】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１５に記載の免疫刺激組成物。
【請求項１１７】
薬学的に許容される担体を更に含む、請求項９１に記載の免疫刺激組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２００６年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／８４７，４０７号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／８４７，４０７号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の免疫系は、腫瘍細胞、他の病原性細胞、及び侵入した異種病原体の認識及び除去のための手段を提供する。免疫系は、通常強力な防御線を提供するが、癌細胞や、他の病原性細胞、感染因子が宿主の免疫応答をすり抜けて増殖するか、若しくは随伴する宿主病原性と共に持続する例が依然として多くある。化学療法剤及び放射線療法は、自己複製する新生物を除去するために開発されてきた。しかしながら、現在利用可能な化学療法剤及び放射線治療方式の全てではないにしてもほとんどは、癌細胞を破壊するだけでなく正常な宿主細胞（例えば造血系の細胞）に影響を及ぼすように働くため、有害副作用を有する。更に、宿主の薬剤耐性が発現する場合、化学療法剤の有効性は限定される。
【０００３】
また、異種病原体は、適格な免疫応答をすり抜けることによって、若しくは宿主の免疫系が薬物療法や他の健康問題によって支障を来す場合に宿主内で増殖することがある。多くの治療用化合物が開発されてきたものの、かかる治療に耐性のある病原体や耐性を獲得した病原体は多い。治療剤に対する耐性を発現する癌細胞及び感染微生物の能力並びに現在利用可能な抗癌薬の有害副作用によって、病原性細胞集団に特異的で且つ宿主毒性が低下した新規な療法を開発することの必要性が際立っている。
【０００４】
免疫系は、特異性抗原の受容体を表面に発現するＢリンパ球及びＴリンパ球によって媒介される特異免疫を含む特異免疫及び非特異免疫の両方を示し得る。特異的な免疫応答は、体液性免疫（即ち、抗体作成によるＢ細胞活性化）及び細胞媒介性免疫（即ち、細胞傷害性Ｔリンパ球や、ヘルパーＴリンパ球（ＴＨ１細胞やＴＨ２細胞等）、抗原提供細胞等のＴ細胞の活性化）を伴う。ＴＨ１応答は、補体結合抗体、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、及び強い遅延型過敏性反応を誘発し、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ、リンホトキシン及びγ−インターフェロンの産生と関連する。ＴＨ２応答は、ＩｇＥ並びにＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１０の産生と関連する。特異的免疫応答は、ある抗原に既に曝露された免疫細胞がその後その抗原に曝露されると同じ抗原に速やかに応答可能であるように、特異性だけでなく記憶を伴う。
【０００５】
アジュバントは、例えば抗原の免疫原性を増大させることによって免疫応答を刺激する化合物又は材料である。アジュバントは、非特異的（多種多様な抗原に対する免疫応答の刺激）にか、特異的（即ち抗原特異的な免疫応答の刺激）にかのいずれかで作用し得る。特異免疫を増大させるアジュバントは、細胞性免疫応答又は体液性応答或いはその両方を刺激することによって作用し得る。細胞性免疫応答を刺激するアジュバントは、ＴＨ１応答又はＴＨ２応答の方へ免疫応答を片寄らせる可能性がある。体液性免疫応答を刺激するアジュバントは、使用するアジュバントに応じて異なる抗体アイソタイププロファイルの産生を誘導する可能性がある。この点に関しては、異なるアジュバントによって、異なる抗体アイソタイプ、各アイソタイプの異なる量の抗体、及び親和性が異なる抗体の産生が刺激される可能があり、その結果、使用するアジュバント次第で非常に異なる抗体集団となる。
【０００６】
免疫応答を刺激する安全且つ有効な組成物及び方法を開発することは、非常に重要なことである。特に、腫瘍関連抗原及び病原体関連抗原に対する免疫応答を、かかる抗原を最初に同定する必要なしに、又は、特異性抗原に対する処置を個別に扱う必要なしに刺激する方法の必要が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書においては、アジュバント効果を増大させる組成物及び方法が提供される。また、免疫刺激を必要とするヒト等の動物の治療方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面マーカーに結合する化合物に結合するアジュバントを含む薬剤を動物に投与することと、それによって抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対してアジュバントを標的化させることと、該化合物や該アジュバント以外の抗原に対する免疫応答を刺激することによって該アジュバントの効果を増大させることとを含むアジュバント効果増大方法を提供するものである。該アジュバントは、ＡＰＣ細胞表面マーカーに結合する化合物に共有結合してよい。
【０００９】
ある実施形態において、該化合物は、ＡＰＣの細胞表面マーカーに結合する抗体であってよい。かかる抗体は、抗体フラグメント、内部移行抗体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。
【００１０】
ある実施形態において、ＡＰＣは樹状細胞であってよい。ＡＰＣが樹状細胞である場合、細胞表面マーカーは、例えばＤＣ−ＳＩＧＮ等のＣ型レクチンであってよい。そのような場合において、該ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する化合物は、例えば、マンノース炭水化物、フコース炭水化物、植物レクチン、抗生物質、糖、タンパク質又は抗体であってよい。例示的な一実施形態において、該ＤＣ−ＳＩＧＮと結合する化合物は、例えばモノクローナル抗体等の抗体である。
【００１１】
ある実施形態において、該アジュバントは、例えば、ミネラル塩、小分子、サポニン、多糖類、脂質、核酸、タンパク質又はペプチドであってよい。例示的な一実施形態において、アジュバントは、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）やカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）等のタンパク質である。
【００１２】
ある実施形態において、該動物はヒトである。
【００１３】
ある実施形態において、該アジュバントは自然免疫応答を刺激する。
【００１４】
ある実施形態において、該動物は、予め該アジュバントを接種されない。
【００１５】
ある実施形態において、該薬剤は、該化合物に共有結合する抗原を更に含む。
【００１６】
別の一態様において、本発明は、免疫応答の刺激を、それを必要とする動物において行う方法であって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面マーカーに結合する化合物に結合するアジュバントを含む薬剤を該動物に投与することを含み、該薬剤が該化合物や該アジュバント以外の抗原に対する免疫応答を刺激する（尤も、該化合物及び／又は該アジュバントに対する応答も発現することがある）方法を提供するものである。該アジュバントは、ＡＰＣの細胞表面マーカーに結合する化合物に共有結合してよい。
【００１７】
ある実施形態において、該薬剤は、腫瘍関連抗原又は病原体感染に関連する抗原に対する免疫応答を刺激する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、アジュバントに共有結合するＤＣ−ＳＩＧＮ特異抗体を含むＡＰＣ標的化剤を該動物に投与することを含む動物の免疫応答を刺激する方法であって、該ＡＰＣ標的化剤が該ＤＣ−ＳＩＧＮ特異抗体や該アジュバント以外の抗原に対する免疫応答を刺激し、該動物が予め該アジュバントを接種されない方法を提供するものである。なお、該抗原に対する免疫応答の他に、該抗体及び／又はアジュバントに対する免疫応答もまた発現する可能性がある。
【００１９】
別の一態様において、本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面マーカーに結合する化合物と、アジュバントと、抗原とを含む免疫刺激剤であって、該化合物、アジュバント及び抗原が結合している免疫刺激剤を提供するものである。ある実施形態において、該アジュバント、抗原及び化合物は、共有結合してよい。各種実施形態において、該アジュバント、抗原及び化合物は、いかなる順序で結合してもよい。
【００２０】
ある実施形態において、該抗原は、例えば腫瘍関連抗原や病原体由来抗原あってよい。
【００２１】
ある実施形態において、該アジュバントは、例えばミネラル塩や、小分子、サポニン、多糖類、脂質、核酸、タンパク質、ペプチドであってよい。例示的な一実施形態において、該アジュバントは、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）やカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）等のタンパク質である。
【００２２】
ある実施形態において、該化合物は、ＡＰＣの細胞表面マーカーに結合する抗体である。かかる抗体は、例えば抗体フラグメントや、内部移行抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体であってよい。該化合物が抗体である場合、該抗原は、重鎖定常領域のＣ末端に結合する可能性がある。或いは、該抗原は、該抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は該抗体の定常領域に取り込まれ得る。
【００２３】
ある実施形態においては、該化合物は、樹状細胞の細胞表面マーカーと結合する。例示的な樹状細胞の表面マーカーはＣ型レクチン（例えばＤＣ−ＳＩＧＮ）である。ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する化合物の例としては、例えばマンノース炭水化物や、フコース炭水化物、植物レクチン、抗生物質、糖、タンパク質、抗体が含まれる。例示的な一実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合する化合物は、抗体（例えばモノクローナル抗体）である。
【００２４】
別の一態様において、本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面マーカーに結合する化合物と、アジュバントと、抗原とを含む免疫刺激組成物を提供するものであって、該アジュバントと該抗原の内の少なくとも１種が該化合物に結合するものである。
【００２５】
本発明の実施においては、特に明記しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を用いることが可能であり、これらは当該技術分野の範囲内である。かかる技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｊ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ  ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌａｃｙ，Ｅ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照。
【００２６】
本発明の他の特徴及び効果は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２７】
添付の特許請求の範囲は、参考として本セクションで援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の前述及び他の特徴及び効果は、添付の図面に関連してなされる以下の例示の実施例の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄ。臍帯血移植されたマウスは、ＴｉｔｅｒｍａｘにおけるＫＬＨによる免疫化又はＤ１Ｖ１−ＫＬＨによるＤＣ−ＳＩＧＮ標的免疫化の後、ＫＬＨに対する増殖応答を引き起こす可能性がある。図１Ａ：１５週齢の４匹の移植マウスに、Ｔｉｔｅｒｍａｘと共に５０μｇのＫＬＨ（半分量を皮下、残り半分を腹腔内）を注射した。２匹の免疫マウス（平均値で示される）及び１匹の非接種マウスをＤａｙ１２に屠殺し、脾臓細胞を単離した。ＫＬＨに応答する増殖を、培養５日後に３Ｈ−チミジンの取り込みを決定することによってテストした。図１Ｂ：２匹のマウスに対して、１回目の免疫化の３週間後に第２免疫化を行った。１２日後に脾臓を摘出した。ＫＬＨに対する脾細胞の増殖を、３Ｈ−チミジンの取り込みによって評価した。図１Ｃ：６匹の移植マウスを、１００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ又は１００μｇの５Ｇ１．１−ＫＬＨによって静脈内で免疫化した。更に２匹の移植マウスにも、１００μｇのＫＬＨとＴｉｔｅｒｍａｘとを皮下注射した。９日後（図１Ｃ）又は、図１Ｄにおける１４日後（図１Ｄ）に脾臓を収集し、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによってＫＬＨに対する増殖応答を評価した。データは、３〜６回の繰り返した平均±標準偏差を表す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄ。臍帯血移植されたマウスは、ＴｉｔｅｒｍａｘにおけるＫＬＨによる免疫化又はＤ１Ｖ１−ＫＬＨによるＤＣ−ＳＩＧＮ標的免疫化の後、ＫＬＨに対する増殖応答を引き起こす可能性がある。図１Ａ：１５週齢の４匹の移植マウスに、Ｔｉｔｅｒｍａｘと共に５０μｇのＫＬＨ（半分量を皮下、残り半分を腹腔内）を注射した。２匹の免疫マウス（平均値で示される）及び１匹の非接種マウスをＤａｙ１２に屠殺し、脾臓細胞を単離した。ＫＬＨに応答する増殖を、培養５日後に３Ｈ−チミジンの取り込みを決定することによってテストした。図１Ｂ：２匹のマウスに対して、１回目の免疫化の３週間後に第２免疫化を行った。１２日後に脾臓を摘出した。ＫＬＨに対する脾細胞の増殖を、３Ｈ−チミジンの取り込みによって評価した。図１Ｃ：６匹の移植マウスを、１００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ又は１００μｇの５Ｇ１．１−ＫＬＨによって静脈内で免疫化した。更に２匹の移植マウスにも、１００μｇのＫＬＨとＴｉｔｅｒｍａｘとを皮下注射した。９日後（図１Ｃ）又は、図１Ｄにおける１４日後（図１Ｄ）に脾臓を収集し、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによってＫＬＨに対する増殖応答を評価した。データは、３〜６回の繰り返した平均±標準偏差を表す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄ。臍帯血移植されたマウスは、ＴｉｔｅｒｍａｘにおけるＫＬＨによる免疫化又はＤ１Ｖ１−ＫＬＨによるＤＣ−ＳＩＧＮ標的免疫化の後、ＫＬＨに対する増殖応答を引き起こす可能性がある。図１Ａ：１５週齢の４匹の移植マウスに、Ｔｉｔｅｒｍａｘと共に５０μｇのＫＬＨ（半分量を皮下、残り半分を腹腔内）を注射した。２匹の免疫マウス（平均値で示される）及び１匹の非接種マウスをＤａｙ１２に屠殺し、脾臓細胞を単離した。ＫＬＨに応答する増殖を、培養５日後に３Ｈ−チミジンの取り込みを決定することによってテストした。図１Ｂ：２匹のマウスに対して、１回目の免疫化の３週間後に第２免疫化を行った。１２日後に脾臓を摘出した。ＫＬＨに対する脾細胞の増殖を、３Ｈ−チミジンの取り込みによって評価した。図１Ｃ：６匹の移植マウスを、１００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ又は１００μｇの５Ｇ１．１−ＫＬＨによって静脈内で免疫化した。更に２匹の移植マウスにも、１００μｇのＫＬＨとＴｉｔｅｒｍａｘとを皮下注射した。９日後（図１Ｃ）又は、図１Ｄにおける１４日後（図１Ｄ）に脾臓を収集し、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによってＫＬＨに対する増殖応答を評価した。データは、３〜６回の繰り返した平均±標準偏差を表す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄ。臍帯血移植されたマウスは、ＴｉｔｅｒｍａｘにおけるＫＬＨによる免疫化又はＤ１Ｖ１−ＫＬＨによるＤＣ−ＳＩＧＮ標的免疫化の後、ＫＬＨに対する増殖応答を引き起こす可能性がある。図１Ａ：１５週齢の４匹の移植マウスに、Ｔｉｔｅｒｍａｘと共に５０μｇのＫＬＨ（半分量を皮下、残り半分を腹腔内）を注射した。２匹の免疫マウス（平均値で示される）及び１匹の非接種マウスをＤａｙ１２に屠殺し、脾臓細胞を単離した。ＫＬＨに応答する増殖を、培養５日後に３Ｈ−チミジンの取り込みを決定することによってテストした。図１Ｂ：２匹のマウスに対して、１回目の免疫化の３週間後に第２免疫化を行った。１２日後に脾臓を摘出した。ＫＬＨに対する脾細胞の増殖を、３Ｈ−チミジンの取り込みによって評価した。図１Ｃ：６匹の移植マウスを、１００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ又は１００μｇの５Ｇ１．１−ＫＬＨによって静脈内で免疫化した。更に２匹の移植マウスにも、１００μｇのＫＬＨとＴｉｔｅｒｍａｘとを皮下注射した。９日後（図１Ｃ）又は、図１Ｄにおける１４日後（図１Ｄ）に脾臓を収集し、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによってＫＬＨに対する増殖応答を評価した。データは、３〜６回の繰り返した平均±標準偏差を表す。
【図２】ＣＤ４０抗体によって、ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を介してＤＣを標的とする抗原に対する免疫応答は変化しない。臍帯血移植Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスに、１００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨを、９０μｇの抗ヒトＣＤ４０と共に、又はそれを伴わずに静脈内注射した。免疫化の９日後に脾臓を摘出し、各種濃度のＫＬＨで脾細胞を５日間刺激した。脾細胞の増殖を、３Ｈ−チミジンの取り込みによって評価した。データは、３〜６回の繰り返した平均±標準偏差を表す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃ。種々のＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（Ｅ１０−ＴＴ）による破傷風トキソイドペプチドの送達も免疫応答を誘発する。図３Ａ：１５週齢の臍帯血移植マウスを、Ｔｉｔｅｒｍａｘと共に５０μｇの破傷風トキソイド（ＴＴ）（半分量を皮下、残り半分を腹腔内）で免疫化した。幾匹かのマウスを屠殺し、免疫化の９日後に脾臓を単離するか（図３Ａ）、或いは幾匹かのマウスを２回目の免疫化の後に屠殺し、免疫化の９日後に脾臓を単離した（図３Ｂ）。ＴＴに応答する増殖を、培養５日後に３Ｈ−チミジンの取り込みによって決定した。図３Ｃ：５匹のＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスの各々に、３ｎｍｏｌのＴＴと混合した３ｎｍｏｌのＥ１０−ＴＴ又は３ｎｍｏｌのＥ１０を皮下注射した。９日後、脾臓を摘出し、Ｅ１０又はＴＴで脾細胞を刺激した。４日後、各ウェル内に１μＣｉ３Ｈ−チミジンを加えた。前記細胞を２４時間収集した。値は、３〜６ウェルの平均±標準偏差を表す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃ。種々のＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（Ｅ１０−ＴＴ）による破傷風トキソイドペプチドの送達も免疫応答を誘発する。図３Ａ：１５週齢の臍帯血移植マウスを、Ｔｉｔｅｒｍａｘと共に５０μｇの破傷風トキソイド（ＴＴ）（半分量を皮下、残り半分を腹腔内）で免疫化した。幾匹かのマウスを屠殺し、免疫化の９日後に脾臓を単離するか（図３Ａ）、或いは幾匹かのマウスを２回目の免疫化の後に屠殺し、免疫化の９日後に脾臓を単離した（図３Ｂ）。ＴＴに応答する増殖を、培養５日後に３Ｈ−チミジンの取り込みによって決定した。図３Ｃ：５匹のＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスの各々に、３ｎｍｏｌのＴＴと混合した３ｎｍｏｌのＥ１０−ＴＴ又は３ｎｍｏｌのＥ１０を皮下注射した。９日後、脾臓を摘出し、Ｅ１０又はＴＴで脾細胞を刺激した。４日後、各ウェル内に１μＣｉ３Ｈ−チミジンを加えた。前記細胞を２４時間収集した。値は、３〜６ウェルの平均±標準偏差を表す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃ。種々のＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（Ｅ１０−ＴＴ）による破傷風トキソイドペプチドの送達も免疫応答を誘発する。図３Ａ：１５週齢の臍帯血移植マウスを、Ｔｉｔｅｒｍａｘと共に５０μｇの破傷風トキソイド（ＴＴ）（半分量を皮下、残り半分を腹腔内）で免疫化した。幾匹かのマウスを屠殺し、免疫化の９日後に脾臓を単離するか（図３Ａ）、或いは幾匹かのマウスを２回目の免疫化の後に屠殺し、免疫化の９日後に脾臓を単離した（図３Ｂ）。ＴＴに応答する増殖を、培養５日後に３Ｈ−チミジンの取り込みによって決定した。図３Ｃ：５匹のＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスの各々に、３ｎｍｏｌのＴＴと混合した３ｎｍｏｌのＥ１０−ＴＴ又は３ｎｍｏｌのＥ１０を皮下注射した。９日後、脾臓を摘出し、Ｅ１０又はＴＴで脾細胞を刺激した。４日後、各ウェル内に１μＣｉ３Ｈ−チミジンを加えた。前記細胞を２４時間収集した。値は、３〜６ウェルの平均±標準偏差を表す。
【図４】ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体によってＤＣを標的とする抗原は、刺激性免疫応答を誘発するための二量体化を必要としない。ＴＴジペプチドと混合した３．３ｎｍｏｌのｓｃＦｖ−ＲＲ−ＴＴ又はＤ１Ｖ１ｓｃＦｖのいずれかを、３匹の移植マウスに各々静脈内注射した。１匹のマウスを、Ｔｉｔｅｒｍａｘと共にジペプチドによって皮下で免疫化した。脾臓を９日後に収集し、ＰＨＡ、ジペプチド又は培地単独で細胞を刺激した。４日後に３Ｈ−チミジンを加え、翌日細胞を収集して数を決定した。値は、３〜６ウェルの平均±標準偏差を表す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄ。ＲＡＪＩ／フルダラビン処理ＲＡＪＩ／ｉＤＣ／ｈＰＢＬモデルにおけるＤ１Ｖ−ＫＬＨのアジュバント効果。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、４百万個のＲＡＪＩ細胞（図５Ａ、図５Ｃ）或いは３百万個のＲＡＪＩ細胞及び２百万個のフルダラビン処理ＲＡＪＩ細胞（ｆｄＲＡＪＩ）（図５Ｂ、図５Ｄ）、３００００個の未熟ＤＣ、及び３百万個のｈＰＢＬを注射した。等モル量のＤ１Ｖ１−ＫＬＨ（４０μｇ）、対照抗体５Ｇ１．１−Ｇ２／Ｇ４（４０μｇ）又はＫＬＨ（１０μｇ）に細胞混合物を皮下注射した。その後、２００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ、又は２００μｇの対照抗体、又は５０μｇのＫＬＨを使用して、抗体又はＫＬＨを１週間間隔で更に２回投与した。データは、各群の１０匹のマウスからの腫瘍容積の平均±標準誤差を表す。＊スチューデントのｔ検定によって算出された対照抗体投与群と比較した有意水準（ｐ＜０．０１）。＊＊対照抗体投与群と比較した高有意水準（ｐ＜０．００５）。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄ。ＲＡＪＩ／フルダラビン処理ＲＡＪＩ／ｉＤＣ／ｈＰＢＬモデルにおけるＤ１Ｖ−ＫＬＨのアジュバント効果。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、４百万個のＲＡＪＩ細胞（図５Ａ、図５Ｃ）或いは３百万個のＲＡＪＩ細胞及び２百万個のフルダラビン処理ＲＡＪＩ細胞（ｆｄＲＡＪＩ）（図５Ｂ、図５Ｄ）、３００００個の未熟ＤＣ、及び３百万個のｈＰＢＬを注射した。等モル量のＤ１Ｖ１−ＫＬＨ（４０μｇ）、対照抗体５Ｇ１．１−Ｇ２／Ｇ４（４０μｇ）又はＫＬＨ（１０μｇ）に細胞混合物を皮下注射した。その後、２００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ、又は２００μｇの対照抗体、又は５０μｇのＫＬＨを使用して、抗体又はＫＬＨを１週間間隔で更に２回投与した。データは、各群の１０匹のマウスからの腫瘍容積の平均±標準誤差を表す。＊スチューデントのｔ検定によって算出された対照抗体投与群と比較した有意水準（ｐ＜０．０１）。＊＊対照抗体投与群と比較した高有意水準（ｐ＜０．００５）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄ。ＲＡＪＩ／フルダラビン処理ＲＡＪＩ／ｉＤＣ／ｈＰＢＬモデルにおけるＤ１Ｖ−ＫＬＨのアジュバント効果。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、４百万個のＲＡＪＩ細胞（図５Ａ、図５Ｃ）或いは３百万個のＲＡＪＩ細胞及び２百万個のフルダラビン処理ＲＡＪＩ細胞（ｆｄＲＡＪＩ）（図５Ｂ、図５Ｄ）、３００００個の未熟ＤＣ、及び３百万個のｈＰＢＬを注射した。等モル量のＤ１Ｖ１−ＫＬＨ（４０μｇ）、対照抗体５Ｇ１．１−Ｇ２／Ｇ４（４０μｇ）又はＫＬＨ（１０μｇ）に細胞混合物を皮下注射した。その後、２００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ、又は２００μｇの対照抗体、又は５０μｇのＫＬＨを使用して、抗体又はＫＬＨを１週間間隔で更に２回投与した。データは、各群の１０匹のマウスからの腫瘍容積の平均±標準誤差を表す。＊スチューデントのｔ検定によって算出された対照抗体投与群と比較した有意水準（ｐ＜０．０１）。＊＊対照抗体投与群と比較した高有意水準（ｐ＜０．００５）。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄ。ＲＡＪＩ／フルダラビン処理ＲＡＪＩ／ｉＤＣ／ｈＰＢＬモデルにおけるＤ１Ｖ−ＫＬＨのアジュバント効果。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、４百万個のＲＡＪＩ細胞（図５Ａ、図５Ｃ）或いは３百万個のＲＡＪＩ細胞及び２百万個のフルダラビン処理ＲＡＪＩ細胞（ｆｄＲＡＪＩ）（図５Ｂ、図５Ｄ）、３００００個の未熟ＤＣ、及び３百万個のｈＰＢＬを注射した。等モル量のＤ１Ｖ１−ＫＬＨ（４０μｇ）、対照抗体５Ｇ１．１−Ｇ２／Ｇ４（４０μｇ）又はＫＬＨ（１０μｇ）に細胞混合物を皮下注射した。その後、２００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ、又は２００μｇの対照抗体、又は５０μｇのＫＬＨを使用して、抗体又はＫＬＨを１週間間隔で更に２回投与した。データは、各群の１０匹のマウスからの腫瘍容積の平均±標準誤差を表す。＊スチューデントのｔ検定によって算出された対照抗体投与群と比較した有意水準（ｐ＜０．０１）。＊＊対照抗体投与群と比較した高有意水準（ｐ＜０．００５）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
１．定義
本明細書で使用される場合、以下の用語及び成句は、以下に記載される意味を有するものとする。特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、一般的に当業者に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３０】
単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に状況が明確に示されない限り、複数の言及を含む。
【００３１】
「含む」及び「含まれる」という用語は、包括的で開かれた意味、即ち更なる要素が含まれ得るという意味で使用される。
【００３２】
「含まれる」という用語は、「含まれるが限定されない」という意味で用いられる。「含まれる」と「含まれるが限定されない」は区別なく使用される。
【００３３】
「免疫グロブリン」は四量体分子である。天然の免疫グロブリンにおいて、各四量体は同じ２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１個の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１個の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒトの軽鎖は、κ軽鎖とλ軽鎖とに分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、εに分類され、それぞれ抗体アイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥに規定する。軽鎖及び重鎖中の可変領域及び定常領域には、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域が結合し、重鎖も約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプは、免疫グロブリン分子に柔軟性を与える約１０〜６０のアミノ酸のアミノ酸配列である「ヒンジ領域」を有する。各軽鎖／重鎖の対の可変領域は、完全型免疫グロブリンが２個の結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。免疫グロブリンは高次構造に組織され得る。ＩｇＡは、一般的に２つの四量体の二量体である。ＩｇＭは、一般的に５つの四量体の五量体である。
【００３４】
免疫グロブリン鎖は、３つの超可変領域（相補性決定領域又はＣＤＲとも呼称する）によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域により整列させられ、特異的エピトープに対する結合を可能にしている。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖の両方は、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲＳ及びＦＲ４を含む。各領域に対するアミノ酸の割当は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【００３５】
「抗体」とは、完全型免疫グロブリン又は特異的結合のための完全抗体と競合するその抗原結合部位を意味する。抗原結合部位は、組換えＤＮＡ法或いは完全抗体の酵素的開裂又は化学開裂によって生じる。抗原結合部位としては、なかでも、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一領域抗体、キメラ抗体、ミニボディー、二重体、三重体、四重体及びポリペプチドに結合する特異性抗原を与えるのに十分な少なくとも一部の免疫グロブリンを含有するポリペプチドが含まれる。
【００３６】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなる一価のフラグメントであり；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであり；Ｆｄフラグメントは、ＶＨ領域とＣＨ１領域とからなり；Ｆｖフラグメントが、抗体の１本のアームのＶＬ領域及びＶＨ領域からなり；ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）はＶＨ領域からなる。
【００３７】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対になって、それらを単一タンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーを介して一価の分子を形成する抗体である（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。二重体は、ＶＨ領域及びＶＬ領域が単一のポリペプチド鎖に発現する二価抗体又は二重特異性抗体であるが、それは、短すぎて同じ鎖上の２つの領域間に対が形成され得ないリンカーを使用するものであり、それによって前記領域を別の鎖の相補性領域と対になるようにし、２個の抗原結合部位を生成するものである（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３及びＰｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，１９９４を参照）。１つ以上のＣＤＲは、共有結合又は非共有結合のいずれかで分子内に組み込まれ得る。ミニボディーは、２個のｓｃＦｖモノマーに２つの定常領域が結合する二価抗体又は二重特異性抗体である（例えば、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｏｕｒｉｓｕ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：１２９−１３４（２００３）参照）。
【００３８】
抗体は１つ以上の結合部位を有し得る。２個以上の結合部位が存在する場合、前記結合部位は互いに同じであるか、若しくは異なっていてよい。例えば、天然の免疫グロブリンは２個の同じ結合部位（例えば二価）を有し、一本鎖抗体又はＦａｂフラグメントは１個又は２個の結合部位を有し得るが、一方で「二重特異性」抗体又は「二官能性」抗体は２個の異なる結合部位を有する。
【００３９】
「ヒト抗体」という用語には、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１個以上の可変領域及び定常領域を有する全ての抗体が包含される。好ましい実施形態において、可変領域及び定常領域の全ては、ヒト免疫グロブリン配列（完全ヒト抗体）に由来する。これらの抗体は、下記の通り様々な方法で調製され得る。
【００４０】
本明細書で用いられる「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」という用語は、アミノ酸残基２２４〜２５１（Ｋａｂａｔ番号付けスキーム）を含む重鎖の領域を意味する。この領域は、遺伝子ヒンジ（例えばＫａｂａｔ番号付けスキームを用いた場合のアミノ酸残基２２４〜２４３）並びに構造的に柔軟なアミノ酸残基Ｃ末端〜前記遺伝子ヒンジを包含する（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，Ｃａｌａｂｉ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．（１９８７）参照）。
【００４１】
「キメラ抗体」という用語は、１個の抗体に由来する１個以上の領域と、１個以上の他の抗体に由来する１個以上の領域とを含む抗体をいう。
【００４２】
「腫瘍関連抗原」という用語は、好ましくは腫瘍細胞によって提示され、よって腫瘍細胞と非腫瘍細胞との区別を可能にするポリペプチドを意味する。腫瘍関連抗原は、免疫応答の推定標的である腫瘍細胞の内面又は表面上に発現するタンパク質である。それらは、多くの場合変異、欠失、異なる発現量、二次修飾の変化、又は他の発育段階における発現による通常の細胞性対応物とは異なる。前記タンパク質は、好ましくは細胞表面上に発現し、更にＭＨＣクラスＩ分子によって、腫瘍細胞表面上で処理されたペプチドとして提示される。腫瘍関連抗原の例としては、例えば、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、Ｄ９７、ｇｐ１００、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦ受容体、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＭＳＡ、ＣＤＣＰ１、ＣＤ２６、ヘプシン、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、Ｍｅｔ、ＣＡＩＸ（Ｇ２５０）、ＥｐｈｈＢ４（エフリン・タイプＢ受容体４）、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＤＰＰ６、シンデカン１、ＩＧＦＢＰ２
（ヒトインスリン様増殖因子結合タンパク質２）、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬ４、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ受容体、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ、ＢＡＧＥ、ＴＲＰ−１、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＭＵＣ１、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＳＣ（扁平上皮癌抗原）、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ｈＣＧが含まれる。
【００４３】
「治療上有効量」という用語は、治療を必要とする被験体への投与の際、かかる治療を行うのに十分なＡＰＣ標的化剤、薬物又は他の分子の量を意味する。治療上有効量は、治療される被験体及び病状、被験体の体重及び年齢、病状の重症度、投与方法等に応じて変化するものであって、当業者によって直ちに決定され得る。
【００４４】
２．アジュバント効果を増大させるための組成物
例えば本明細書に記載される方法に従って使用され得るアジュバント効果を増大させるためのＡＰＣ標的化剤が、本明細書において提供される。かかる薬剤は、ＡＰＣ上の細胞表面タンパク質に結合する化合物に共有結合するアジュバントを含む。かかる薬剤は、更なる成分（例えば抗原）を任意に含んでよい。また、ＡＰＣ標的化剤と薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。
【００４５】
本明細書に記載されるＡＰＣ標的化剤は、ＡＰＣの細胞表面タンパク質に対してアジュバントを標的化させる化合物を含む。例示的な一実施形態において、前記化合物は、ＡＰＣ上の内部移行受容体に対してアジュバントを標的化させる。種々の細胞がＡＰＣとして機能し得る。これらの細胞の際立った特色は、クラスＩＩＭＨＣ分子を発現し、共刺激信号を送達する能力を有することである。３種の細胞型が専門的なＡＰＣとして分類される：樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球。例示的な一実施形態において、ＡＰＣ細胞表面タンパク質に特異的に結合する化合物としては、抗体（例えば抗ＭＨＣＩＩ抗体）や以下に記載される細胞表面マーカーに対する抗体がある。
【００４６】
樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーとしては、例えば、ＣＤ８３、ＣＤ２０５／ＤＥＣ−２０５、ＣＤ１９７／ＣＣＲ７、ＣＤ２０９／ＤＣ−ＳＩＧＮが含まれる。かかるＤＣ細胞表面特異的マーカーに特異的に結合する化合物を使用して、ＤＣに対してアジュバントを標的化させることができる。例示的な一実施形態においては、化合物を使用して、ＤＣ表面上の内部移行受容体（例えば、ＤＥＣ−２０５、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＣＲ７受容体）にアジュバントを標的化させることができる。ＤＣ細胞表面マーカーに結合し得る化合物としては、例えば炭水化物や、レクチン、抗生物質、糖、タンパク質、ペプチド、抗体がある。
【００４７】
ある実施形態においては、化合物をＤＣ−ＳＩＧＮに標的化してよい。ＤＣ−ＳＩＧＮは、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ受容体に結合し、樹状細胞へのＨＩＶの付着を容易にするＣ型レクチンである（例えば、米国特許公開第２００５／０１１８１６８号参照）。ＤＣ−ＳＩＧＮと結合し得る化合物としては、例えば、マンノース炭水化物（例えばマンナン及びＤ−マンノース；フコース炭水化物（例えばＬ−フコース）；植物レクチン（例えばコンカナバリンＡ）；抗生物質（例えばプラディマイシンＡ）；糖（例えばＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びガラクトース）；並びに適切なペプチド模倣化合物や薬物小分子が挙げられ、それらは例えばファージディスプレイ法を用いて同定され得る。更に、ＤＣ−ＳＩＧＮ結合活性を保持するタンパク質（例えばｇｐ１２０）及びそれらの類似体又はフラグメントは、ＤＣ−ＳＩＧＮ結合部分及びそのフラグメントを含む単離ＩＣＡＭ受容体やその類似体等と同様に使用され得る。
【００４８】
特定の実施形態において、化合物は、ＤＣ特異的細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ２０５／ＤＥＣ−２０５、ＣＤ１９７／ＣＣＲ７、ＣＤ２０９／ＤＣ−ＳＩＧＮ）に対して標的化される抗体であってよい。更に本明細書で概説されるように、かかる抗体は、商業的に購入され得るか、若しくは標準的技法を用いて作製され得る。例示的な一実施形態において、ＡＰＣに対してアジュバントを標的化させる化合物は、例えばＡＺＮ−Ｄ１やＡＺＮ−Ｄ２等の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体である（例えば、米国特許公開第２００５／０１１８１６８号参照）。例示的な一実施形態において、化合物は、ＤＣの表面上の内部移行受容体に対して標的化される抗体（例えば、ＤＥＣ−２０５や、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＣＲ７に結合する抗体）であってよい。
【００４９】
Ｂリンパ球に特異的な細胞表面マーカーとしては、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３２、ＣＤ７９α，β、ＣＤ８３、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１７９ａ，ｂ、ＣＤ１８０が含まれる。かかるＢリンパ球特異的細胞表面マーカーに特異的に結合する化合物を使用して、Ｂリンパ球に対してアジュバントを標的化させることができる。Ｂリンパ球細胞表面マーカーに結合し得る化合物は、例えばタンパク質や、ペプチド、抗体であってよい。例示的な一実施形態において、化合物は、例えばＣｄ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３２又はＣＤ７９に結合するタンパク質、ペプチド又は抗体等、Ｂリンパ球の表面上の内部移行受容体に対して標的化される抗体であってよい。
【００５０】
マクロファージに特異的な細胞表面マーカーとしては、例えばＣＤ６４や、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ２０６が含まれる。かかるマクロファージ特異的細胞表面マーカーに特異的に結合する化合物を使用して、マクロファージに対してアジュバントを標的化させることができる。マクロファージ細胞表面マーカーに結合し得る化合物は、例えばタンパク質や、ペプチド、抗体であってよい。例示的な実施形態において、化合物は、例えば、ＣＤ６４又はＣＤ２０６に結合するタンパク質、ペプチド、抗体等、マクロファージの表面上の内部移行受容体を標的とする抗体であってよい。
【００５１】
ＡＰＣに対するアジュバントの標的化に使用される抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤ分子であってよい。かかる抗体は、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等）や、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等の任意のタイプの抗体アイソタイプに由来する定常領域又はその一部、又はＧ２／Ｇ４ハイブリッド定常領域等のハイブリッド定常領域又はその一部を含むことが可能である（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ  ａｎｄ  Ｗｏｏｆ  ＪＭ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎ．５１：１−１８（１９９２）；Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ＳＭ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１（１９９１）；Ｍｕｅｌｌｅｒ  ＪＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４（６）：４４１−４５２（１９９７）参照）。
【００５２】
ある実施形態において、キメラ抗体、ヒト化抗体又は霊長類化（ＣＤＲ移植）抗体、抗体フラグメント並びにキメラ抗体フラグメント又はＣＤＲ移植抗体フラグメントは、異なる種に由来する部位を含んでおり、ＡＰＣに対してアジュバントを標的化させるために使用され得る。例示的な抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディー、又は重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域の少なくとも一部と融合したＦｖ、ｓｃＦｖ、二重体、三重体が含まれる。これらの抗体の各種部分は、従来の技法によって互いに化学的に結合され得るか、若しくは遺伝子工学法を使用して連続したタンパク質として調製され得る。例えば、キメラ鎖又はヒト化鎖をコードする核酸は、連続したタンパク質を作製するために発現させ得る。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０，１２５，０２３号；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０，１２０，６９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；及びＷｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号を参照。また、霊長類化抗体に関してはＮｅｗｍａｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）を参照。一本鎖抗体に関しては、例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，９４６，７７８号；及びＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）を参照。
【００５３】
更に、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体又は一本鎖抗体のフラグメント等の抗体の機能性フラグメントを使用して、ＡＰＣに対してアジュバントを標的化させることができる。機能性抗体フラグメントとは、それらが誘導される完全長抗体の少なくとも１つの結合機能及び／又は調節機能を保持するフラグメントをいう。好ましい機能性フラグメントは、相当する完全長抗体の抗原結合機能を保持する。
【００５４】
ヒト化抗体は、重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域及び定常領域内の特定のアミノ酸が、ヒトにおける免疫応答を回避する又は無効にするように変異したヒト以外の種に由来する抗体である。或いは、ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する定常領域をヒト以外の種の可変領域に融合させることによって作製され得る。ヒト化抗体作製法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号及び同第５，８７７，２９３号に見出され得る。ヒト化抗体は、場合により少なくとも１つの部分がヒト由来である異なる由来の免疫グロブリン部分を含んでよい。従って、所望のエピトープに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリン（非ヒト由来（例えば齧歯類）の抗原結合領域及びヒト由来の免疫グロブリンの少なくとも一部（例えば、ヒトフレームワーク領域、ヒト定常領域又はその一部）を含む前記免疫グロブリン）は、ＡＰＣに対してアジュバントを標的化させるために使用され得る。例えば、ヒト化抗体は、マウス等の必要な特異性を有する非ヒト由来の免疫グロブリンに由来する部分と、ヒト由来の免疫グロブリン配列（例えばキメラ免疫グロブリン）に由来する部分とを含むことが可能であり、それらは従来の技法によって化学的に結合（例えば合成）され、又は遺伝子工学法を用いて連続したポリペプチドとして調製される（例えば、キメラ抗体のタンパク質部位をコードするＤＮＡが発現して、連続したポリペプチド鎖を産生し得る）。
【００５５】
ある実施形態において、ＡＰＣ標的化化合物として有用な抗体は、内部移行抗体（例えば、その抗体が結合した細胞が取り込む抗体）であってよい。
【００５６】
また、本明細書に記載されるＡＰＣ標的化剤はアジュバントをも含む。前記アジュバントは、ＡＰＣ細胞表面分子に特異的に結合する化合物に結合（例えば共有結合）し、それによってＡＰＣに対してアジュバントを標的化させ、アジュバント効果を増大させる。多種多様なアジュバントが、本明細書に記載される薬剤に応じて使用され得る。例示的な実施形態においては、ヒトへの投与に適切なアジュバントを選択してよい。本明細書に記載される前記方法及び組成物に応じて使用され得るアジュバントの例としては、ミネラル塩、サポニン、多糖類、脂質、リポ多糖類（エンドトキシン）、核酸、タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
ある実施形態において、アジュバントはミネラル塩であってよい。ミネラル塩のアジュバントの例としては、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム（例えば、ＨＣＩ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ｅｌｓｅｎｂａｋｋｅｎ  ２３，ＤＫ−３６００  Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｕｎｄ（デンマーク））、リン酸カルシウム（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａｌｓ  Ｆｒｙｄｅｎｌｕｎｄｓｖｅｊ  ３０，２９５０  Ｖｅｄｂａｃｋ、デンマーク）、水酸化アルミニウム（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）、γインスリンと結合する水酸化アルミニウム（Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェート（Ａｄｊｕ―Ｐｈｏｓ）、デオキシコール酸−水酸化アルミニウム錯体（ＤＯＣ／Ａｌｕｍ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
別の実施形態において、アジュバントは、イミキモド等の合成イミダゾキノリン（Ｓ−２６３０８，Ｒ−８３７）（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１８２０−１８２６（２００１））又はレジキモド（Ｓ−２８４６３，Ｒ−８４８）（Ｖａｓｉｌａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０４：６４−７４（２０００））であってよい。
【００５９】
ある実施形態において、アジュバントはサポニンであってよい。サポニンは、天然及び合成のグリコシドトリテルペノイド化合物並びにその薬学的に許容される塩、誘導体、模倣体（例えばイソツカレソール及びその誘導体）及び／又はその生物学的に活性なフラグメントを包含し、それらはアジュバント活性を有する。例示的なサポニンとしては、例えば、キラヤサポニン、ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１、Ｑｕｉｌ−Ａ（例えば米国特許第５，０５７，５４０号参照）、ＧＳＫ−１（高麗人参サポニン）が含まれる。
【００６０】
ある実施形態において、アジュバントは核酸であってよい。核酸のアジュバントの例としては、ＣｐＧ、ポリアデニル酸／ポリウリジル酸及びロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）（例えば、米国特許第６，４０６，７０５号参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
他の実施形態において、アジュバントは、タンパク質又はタンパク質フラグメントであってよい。タンパク質のアジュバントの例としては、ヘモシアニン、ヘモエリトリン、血清タンパク質、サイトカイン、マクロファージ炎症タンパク質、細菌性抗原、酵母抗原、哺乳動物ポリペプチド、超抗原が含まれる。
【００６２】
一例示的実施形態において、アジュバントは、ヘモシアニン及びヘモエリトリンであってよい。例示的なヘモシアニンは、他の軟体動物及び節足動物のヘモシアニン及びヘモエリトリンを用いてもよいが、キーホールリンペット（ＫＬＨ）に由来する。
【００６３】
別の一例示的実施形態において、タンパク質のアジュバントは、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）であってよい。
【００６４】
別の一実施形態において、タンパク質のアジュバントは、血清タンパク質（例えば補体因子Ｃ３ｄ）であってよい。Ｃ３ｄは、１６個のアミノ酸のペプチド（例えば、Ｆｅａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３５５−６１；Ｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ；２８０（５３６７）：１２７７−８１，Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１（２）参照）であり、これは市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｃａｔ．Ｃ１５４７）。
【００６５】
他の実施形態において、タンパク質のアジュバントはサイトカインであってよい。本発明の組成物において使用され得るサイトカインの例としては、インターフェロン（例えばインターフェロン−γ）、インターロイキン（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５））、コロニー刺激因子（例えばマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ））；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−１及びＭＩＰ−３ａが含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
ある実施形態において、タンパク質のアジュバントは、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）又はそのフラグメントであってよい。ＭＩＰは、刺激（例えばグラム陰性菌、リポ多糖類及びコンカナバリンＡ）に応答して、特定の哺乳類細胞（例えばマクロファージやリンパ球）によって産生するタンパク質である。例示的なＭＩＰとしては、マクロファージ炎症タンパク質３（ＭＩＰ−３）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ５５７７３）がある。
【００６７】
別の実施形態において、タンパク質のアジュバントは、細菌性抗原や酵母抗原であってよい。適切な細菌性抗原又は酵母抗原の例としては、例えば、ムラミルペプチド（例えば、Ｉｍｍｔｈｅｒ（登録商標）、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（ＭＤＰ誘導体）、ＤＴＰ−Ｎ−ＧＤＰ、ＧＭＤＰ（ＧＥＲＢＵアジュバント）、ＭＰＣ−０２６、ＭＴＰ−ＰＥ、ムラメチド及びムラパルミチン）；ＭＰＬ誘導体（例えば、ＭＰＬＡ、ＭＰＬ−ＳＥ、３Ｄ−ＭＬＡ、ＳＢＡＳ−２）；マンナン、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる。かかる薬剤は市販されており、例えば、ＭＰＬ−ＡはＩＣＮ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｃａｔ＃１５００１２）から、Ｉｍｍｔｈｅｒ（登録商標）はＤｏｒ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．から入手され得る。
【００６８】
他の実施形態において、タンパク質のアジュバントは哺乳類ペプチドであってよい。アジュバントとして使用され得る哺乳類ペプチドの例としては、例えば、黒色腫ペプチド９４６、好中球化学誘引ペプチド、エラスチン反復ペプチドが含まれる。
【００６９】
ある実施形態において、アジュバントは超抗原であってよい。超抗原は、細胞内腫瘍抗原等の細胞内抗原に対する免疫応答を生じさせる又は増強させるために特に有用であり得る。超抗原は、抗原処理の必要なしに、ペプチド抗原よりも大きな割合のＴリンパ球を刺激する細菌性産物である（Ｍｏｏｎｅｙ  ｅｔ．  ａｌ．，（１９９４），Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：６７５−６８１）。超抗原としては、ブドウ球菌エキソタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌由来のα、β、γ及びδエンテロトキシン）、α、β、γ及びδ大腸菌エキソトキシン、細菌（例えばウェルシュ菌や化膿連鎖球菌）由来の他の膜タンパク質及び毒素が含まれる。
【００７０】
他の実施形態において、アジュバントは多糖類であってよい。例えば肺炎球菌多糖類アジュバント等の各種多糖類アジュバントも使用され得る（例えば、Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ８：１９０−２０５参照）。また、多糖類のポリアミンの変種（例えば、キチン及びキトサン並びに、脱アセチル化キチン）も使用され得る。
【００７１】
他の実施形態において、アジュバントはリポ多糖類（エンドトキシン）であってよい。この種類のアジュバントは、動物において使用され得るリピドＡや、動物及びヒトにおいて使用され得る無毒化エンドトキシンによって例示される。無毒化及び精製されたエンドトキシン並びにそれらの組み合わせは、米国特許第４，８６６，０３４号；同第４，４３５，３８６号；同第４，５０５，８９９号；同第４，４３６，７２７号；同第４，４３６，７２８号；同第４，５０５，９００号に記載されている。
【００７２】
別の一実施形態において、アジュバントは、グラム陰性細胞に由来するテイコ酸であってよい。これらには、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、リビトールテイコ酸（ＲＴＡ）、グリセロールテイコ酸（ＧＴＡ）が含まれる。また、それらの合成対応物の活性型も使用され得る（Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６３：５７−６５）。
【００７３】
トレハロースジミコレートの有無にかかわらず、ＢＣＧ及びＢＣＧ細胞壁骨格（ＣＷＳ）もまたアジュバントとして使用され得る。トレハロースジミコレート酸自体を使用してよい。トレハロースジミコレートは、米国特許第４，５７９，９４５号に記載のように調製され得る。
【００７４】
本明細書において記載されるアジュバントは、市販されている、又は当該技術分野において周知の従来の方法を用いて得られる。
【００７５】
当業者に既知の種々の方法によって、ＡＰＣ細胞表面分子に結合する化合物にアジュバントを共有結合させることができる。例えば、化学的リンカー、ペプチドリンカー又はオリゴマーリンカーを使用して、ＡＰＣ標的化化合物にアジュバントを結合させることができる。例示的な一実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、ＡＰＣ細胞表面分子に向けられる抗体とアジュバントとを含む。かかる実施形態において、好ましくは、抗体の抗原結合活性に影響を及ぼさない方法で抗体にアジュバントを結合させる。例えば、化学的リンカー、ペプチドリンカー、オリゴマーリンカー又は組換え法を使用して、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域のＣ末端にアジュバントを結合させることができる。例示的な実施形態において、抗体に結合させるアジュバントはタンパク質アジュバントであってよい。かかる実施形態においては、ペプチドリンカー又は化学的リンカーによって、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域のＣ末端にアジュバントを結合させることができる。また、組換え法を使用して、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常領域のＣ末端にタンパク質アジュバントを結合させることができ、例えば、アジュバントをコードする核酸を、抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸及び融合物として発現するアジュバント／抗体分子と適切に結合させることができる。
【００７６】
特定の実施形態においては、切断可能なペプチドリンカーによって、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域のＣ末端にアジュバントを結合させることができる。ペプチドリンカーは、例えば２、３、４、５個以上の小さなアミノ酸残基（例えばグリシンやセリン）を含んでよい。更に、リンカーは、ポリペプチドのＮ末端の近く又は直接隣接して位置するプロテアソーム切断を引き起こす１個以上のアミノ酸（典型的にはリジンやアルギニン）を含んでよい。例示的なリンカーとしては、例えば、配列ＧＧＸｎ（配列番号１）、ＧＧＧＸｎ（配列番号２）、ＧＧＧＧＸｎ（配列番号３）、ＧＧＧＳＸｎ（配列番号４）又はＧＧＧＳＧＧＧＳＸｎ（配列番号５）を有するペプチドが挙げられ、ここでＸはリジン又はアルギニンであり、ｎは１〜５である。
【００７７】
ある実施形態において、ＡＰＣ標的化化合物に対してアジュバントを結合させるためにアジュバントをリポソーム担体内にカプセル化することは望ましい可能性がある。例えば、アジュバントがミネラル塩等の小分子である場合、かかる技法は望ましい可能性がある。
【００７８】
特定の実施形態においては、ＡＰＣ標的化化合物に２種類以上の異なるアジュバントを共有結合してよい。２つ以上のアジュバントの組み合わせを使用する場合、アジュバントの種類は同じであっても異なってもよい。例えば、２種の異なるタンパク質アジュバント、２種の異なるオリゴヌクレオチドアジュバント、２種の異なる多糖類アジュバント、タンパク質アジュバント及びオリゴヌクレオチドアジュバント、タンパク質アジュバント及び多糖類アジュバント等を使用することは望ましい可能性がある。
【００７９】
特定の実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、更なる成分を更に含むことができる。例示的な一実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、ＡＰＣ標的化化合物に共有結合するアジュバントと抗原とを含む。前記アジュバントはＡＰＣ標的化化合物に共有結合し、前記抗原は、ＡＰＣ標的化化合物又はアジュバントのいずれかに共有結合してよい。例示的な一実施形態において、前記抗原は前記アジュバントと異なる。
【００８０】
抗原は、化学的リンカー、ペプチドリンカー、オリゴマーリンカー又はアジュバントをＡＰＣ標的化担体に結合するための上記の組換え法を使用して、ＡＰＣ標的化化合物に（例えば、ＡＰＣ標的化化合物又はアジュバントに直接）結合させることができる。更に、ペプチド抗原は、抗体ＡＰＣ標的化化合物内に、前記抗体の領域（例えばＣＤＲ領域や定常領域）内に前記抗原のアミノ酸配列を導入することによって組み込まれ得る（例えば、米国特許公開第２００４／０２５３２４２号参照）。例示的な一実施形態において、ペプチド抗原は、抗体のヒンジ領域の中又は近くに組み込まれる。抗原配列は、ヒンジ領域のＮ末端と重鎖の上流領域との間の結合部、又はヒンジ領域のＣ末端と重鎖の下流領域との間の結合部で、ヒンジ領域自体に組み込まれ得る。抗原配列には、プロテアソーム切断部位が場合により側面に位置してよい。抗原配列は、抗体内にペプチドを挿入することによって抗体分子に組み込まれ得る（例えば、アミノ酸配列が抗体の配列に付加される）。或いは、抗原配列は、前記導入配列と抗体配列の一部を置換することによって抗体内に組み込まれ得る。置換によってアミノ酸配列を組み込む場合、導入されるアミノ酸配列の長さは、置換される抗体配列と同じサイズ、より大きい又はより小さくてよい（例えば、組み込まれる１０個のアミノ酸の配列によって、長さが５、１０又は１５個のアミノ酸である抗体分子上の配列の領域を置換することができる）。例示的な一実施形態において、アミノ酸配列は、抗体分子の全体のサイズが維持されるように、置換される抗体配列の領域と同じ長さである。抗原配列は、組み込まれる配列と高いアミノ酸配列同一性を有する領域で抗体内に組み込まれ得る。
【００８１】
ＡＰＣ標的化剤に含まれる抗原は、免疫応答を刺激することが望まれる任意の抗原であってよい。例えば抗原は、被験体に対してＡＰＣ標的化剤の投与を行うことで前記抗原に対する免疫応答を生じさせるように、病原体又は腫瘍細胞に由来するものであってよい。例示的な一実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原又は病原体関連抗原であってよい。
【００８２】
例示的な腫瘍関連抗原としては、以下のものが含まれる：黒色腫と関連するｇｐ１００、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ、ＢＡＧＥ、ＴＲＰ−１；胃癌と関連するＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４；大腸癌と関連するＣＥＡ、ＣＡ１９−９、Ｍｕｃ−１；膵臓癌と関連するＣＡ１９−９、Ｃａ−５０、ＣＥＡ；小細胞肺癌と関連するＣＥＡ、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＥＧＦ受容体；肺癌と関連するＣＥＡ；肝臓癌と関連するα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）；前立腺癌と関連するＰＳＡ、ＰＭＳＡ、ＣＤＣＰ１、ＣＤ２６、ヘプシン、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、Ｍｅｔ、ＣＡＩＸ（Ｇ２５０）、ＥｐｈｈＢ４（エフリン・タイプＢ受容体４）、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＤＰＰ６、シンデカン１、ＩＧＦＢＰ２（ヒトインスリン様増殖因子結合タンパク質２）、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬ４、ＶＥＧＦ；胆嚢癌と関連するＣＡ１９−９；扁平上皮癌と関連するＳＳＣ（扁平上皮癌抗原）；乳癌と関連するＣＥＡ  ＣＡ１５−３、ＣＥＡ、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、Ｍｕｃ−１及びＨｅｒ２／Ｎｅｕ受容体；精巣癌と関連するＡＦＰ、ｈＣＧ；卵巣癌と関連するＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＡＦＰ及びＴＡＧ−７２；Ｂ細胞リンパ腫と関連するＣＤ２０、ＣＤ２１。
【００８３】
腫瘍関連抗原は実験的に同定され得る又はデータベースから選択され得る。癌細胞によって発現又はアップレギュレートされる分子を同定するデータベースとしては、例えば、ＮＣＩ６０マイクロアレイプロジェクト（例えば、Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４：２２７−３４（２０００）；ワールドワイドウェブ（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｎｃｉ６０／）参照）、癌分類法（例えば、Ａ．Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：７３８８−７３９３（２００１）；ワールドワイドウェブ（ｇｎｆ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｅｐｉｃａｎ）参照）、リンパ腫／白血病分子プロファイリングプロジェクト（例えば、Ａｌｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３−１１（２０００）；ワールドワイドウェブ（ｌｌｍｐｐ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｌｙｍｐｈｏｍａ／）参照）が含まれる。癌細胞によって発現する又はアップレギュレートされる分子の同定に有用な実験方法としては、例えば、マイクロアレイ実験、定量的ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、ノーザン分析が含まれる。
【００８４】
ある実施形態において、本発明は、ＡＰＣ標的化剤と遊離抗原とを含む組成物を提供するものである。例えば、組成物は、ＡＰＣ標的化化合物に結合しない抗原と共に混合されるＡＰＣ標的化化合物に共有結合するアジュバント及び抗原を有するＡＰＣ標的化剤を含んでよい。例示的な一実施形態において、ＡＰＣ標的化化合物に結合する抗原と遊離抗原とは同じものである。前記抗原は、単一の抗原或いは抗原の混合物であってよく、例えば、同じタンパク質に由来する種々のペプチド、異なるタンパク質に由来するペプチド、他の抗原分子の混合物が含まれる。
【００８５】
他の実施形態において、抗原は、例えば植物や、バクテリア、原生動物、寄生虫又はウィルス等、病原体と関連した抗原であってよい。かかる抗原は、ペプチド、糖タンパク質又は多糖類であり得る。多種多様な適切な病原体抗原の具体例は、例えば米国特許公開第２００６／０１７１９１７号に見出され得る。
【００８６】
ある実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、ＫＬＨと錯体を形成する抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を含む２種成分剤ではない。ある実施形態において、ＡＰＣ標的化剤はマンナンコーティングリポソームではない。ある実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、脂質でもリポソームでもないアジュバントを含む。ある実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、核酸でも核酸ワクチンでもない抗原を含む。ある実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、ＡＰＣ細胞表面分子に結合する抗体を含むものであって、前記抗体が、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は定常領域に組み込まれた抗原やアジュバントを含まないものである。
【００８７】
また、本発明の範囲内には、タンパク質系ＡＰＣ標的化剤をコードする核酸、ＡＰＣ標的化剤をコードする核酸を含む発現ベクター、及びＡＰＣ標的化剤を作製するための発現ベクターを含む宿主細胞が包含される。
【００８８】
３．アジュバント効果を増強させる方法
本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対してアジュバントを標的化させることによってアジュバントの効果を増強させる方法及び組成物を提供するものである。前記方法は、ＡＰＣ上の細胞表面タンパク質と結合する化合物に結合するアジュバントを含む薬剤を利用する。ある実施形態において、前記方法は、ＡＰＣ標的化化合物に結合するアジュバントと抗原とを含むＡＰＣ標的化剤を利用することができる。
【００８９】
前記方法は、研究目的並びに治療目的を含むアジュバント効果が望まれるいずれの状況においてもアジュバントの効果を増強させるために使用され得る。例えば、アジュバントは、一般的に、前記アジュバントと共に投与される所望の抗原に対する免疫応答を増強させるために抗体産生と共に使用される。アジュバントは、一般的に、ワクチンの抗原成分に対する免疫応答を刺激するためにワクチンと共に使用される。
【００９０】
例示的な実施形態において、本発明は、免疫応答の刺激及び／又は増強が望まれる被験体（例えば、病原体感染、癌又は他の病状に罹患している個体）を治療する方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載される治療上有効量の１種以上のＡＰＣ標的化剤を前記個体に投与することを含む。これらの方法は、特に動物の、より詳しくはヒトの治療的処置及び予防的処置を目的とする。
【００９１】
ある実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、例えば抗感染剤等（例えば、抗生物質化合物、抗ウィルス性化合物及び／又は抗真菌性化合物等）の１種以上の他の治療剤との併用療法の一部として投与され得る。例えば、例示的な抗生物質としては、サルファ剤（例えばサルファニルアミド）、葉酸類似体（例えばトリメトプリム）、β−ラクタム（例えばペニシリン、セファロスポリン）、アミノグリコシド（例えばストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン）、テトラサイクリン（例えばクロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン）、マクロライド（例えばエリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン）、リンコサミド（例えばクリンダマイシン）、ストレプトグラミン（例えばキヌプリスチン及びダルフォプリスチン）、フルオロキノロン（例えばシプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン）、ポリペプチド（例えばポリミキシン）、リファンピン、ムピロシン、シクロセリン、アミノサイクリトール（例えばスペクチノマイシン）、糖ペプチド（例えばバンコマイシン）、オキサゾリジノン（例えばリネゾリド）が含まれる。例示的な抗ウィルス剤として、例えば、ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ヌクレオシド−類似体逆転写酵素阻害剤（例えばＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、Ｄ４Ｔ、３ＴＣ）、非核酸系逆転写酵素阻害剤（例えばネビラピン、デラビルジン）、プロテアーゼ阻害剤（例えばサキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル）、リバビリン、アマンタジン、リマンタジン、リレンザ、タミフル、プレコナリル及びインターフェロンが含まれる。例示的な抗真菌薬としては、例えば、ポリエン抗真菌薬（例えばアンフォテリシン及びナイスタチン）、イミダゾール抗真菌薬（ケトコナゾール及びミコナゾール）、トリアゾール抗真菌薬（例えばフルコナゾール及びイトラコナゾール）、フルシトシン、グリセオフルビン、テルビナフィンが含まれる。
【００９２】
例示的な一実施形態において、本発明は、被験体のインフルエンザの治療又は予防のため若しくはインフルエンザと関連した症状の治療又は軽減のための免疫応答を刺激する方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載のように治療上有効量のＡＰＣ標的化剤を投与することを含んでよい。本明細書において提供される方法に従って治療され得る例示的なインフルエンザ感染としては、例えば、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザが含まれる。例示的な一実施形態において、前記インフルエンザとしては、Ａ型インフルエンザ（例えば、Ａ／ＰＲ７８／３４又はＡ／ＨＫ／８／６８、若しくはＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ４Ｎ６、Ｈ６Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ３Ｎ８、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ７Ｎ７、Ｈ２Ｎ３，Ｈ６Ｎ１、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ７Ｎ１，Ｈ１１Ｎ１、Ｈ７Ｎ２及びＨ５Ｎ３等）がある。各種実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、被験体の感染と実質的に同時に又はその後に投与され得る（即ち治療上の処置）。他の実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、治療上の有益性（例えば、インフルエンザ感染の１つ以上の症状又は合併症、ウィルス力価、ウィルス複製、又は１種以上のインフルエンザ菌株のウィルスタンパク質量の減少又は低下）を提供するものである。低減又は緩解させ得るインフルエンザ感染の症状又は合併症としては、例えば、悪寒、発熱、咳嗽、咽頭痛、鼻閉、副鼻腔うっ血、鼻の感染症、副鼻腔感染症、体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳部感染、耳痛又は死亡が含まれる。更に別の実施形態において、治療上の有益性としては、インフルエンザ感染からの被験体の回復の促進がある。更に他の実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、抗ウィルス剤或いはインフルエンザ感染と関連した１種以上の症状又は合併症（例えば、悪寒、発熱、咳嗽、咽頭痛、鼻閉、体の痛み、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、副鼻腔感染症又は耳部感染）を阻害する１種以上の薬剤との併用療法の一部として投与され得る。一実施形態において、インフルエンザの治療又は予防に有用なＡＰＣ標的化剤は、ＡＰＣ標的化化合物に共有結合するアジュバントを含む。別の一実施形態において、インフルエンザの治療に有用なＡＰＣ標的化剤は、アジュバントとそれに共有結合したインフルエンザ抗原とを有するＡＰＣ標的化化合物を含む。
【００９３】
ある実施形態においては、腫瘍増殖の阻害又は抑制方法及び癌を罹患する個体の治療方法が提供される。前記方法は、本明細書に記載のような治療上有効量の１種以上のＡＰＣ標的化剤を前記個体に投与することを含む。ある実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、ＡＰＣ標的化化合物に共有結合するアジュバントを含んでよい。他の実施形態において、ＡＰＣ標的化剤は、アジュバントとそれに共有結合する腫瘍関連抗原とのＡＰＣ標的化錯体を含んでよい。これらの方法は、特に動物、より詳しくはヒトの治療的処置及び予防的処置を目的とする。
【００９４】
ＡＰＣ標的化剤は、癌（腫瘍）（大腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌、膀胱癌、頭頸部の扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、カポシ肉腫、神経膠芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、リンパ腫、肺癌、黒色腫、腎癌、白血病等が含まれるがこれらに限定されない）の治療又は予防に有用である可能性がある。
【００９５】
ある実施形態において、１種以上のＡＰＣ標的化剤は、一緒に（同時に）又は異なる時点で（逐次的に）投与することが可能である。ＡＰＣ標的化剤は、単独で、或いは増殖性疾患（例えば腫瘍）の治療又は予防のための他の従来の抗癌治療法と併用して使用され得る。例えば、かかる方法は、予防的な癌予防、術後の癌の再発及び転移の予防に、及び他の従来の癌療法のアジュバントとして用いられ得る。本発明は、本発明の１種以上のＡＰＣ標的化剤を用いることによって、従来の癌療法（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法、手術）の有効性を増大させ得ることを認めるものである。
【００９６】
多様な従来の化合物は、抗腫瘍活性を有することが示されている。これらの化合物は、充実性腫瘍の縮小、転移及び更なる成長の予防、若しくは白血病又は骨髄悪性腫瘍における悪性細胞の数の減少のための化学療法における医薬品として使用されてきた。化学療法は、様々な種類の悪性腫瘍の治療に効果的であるが、多くの抗腫瘍性化合物は、望ましくない副作用を誘起する。二種以上の異なる治療を併用する場合、その治療は相乗作用的に働き、その治療の各々薬剤の投与量の減少を可能にし、それによってより高投与量の各化合物によって生じる有害な副作用を減少させることが明らかである。他の例において、治療が無効な悪性腫瘍は、２種以上の異なる治療の併用療法に応答することができる。
【００９７】
抗腫瘍療法と併用され得る医薬品化合物としては、単なる例示として、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトセシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エクセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンが含まれる。
【００９８】
これらの化学療法的抗腫瘍化合物は、それらの作用機序によって、例えば以下のものを含む群に分類され得る：抗代謝薬／抗癌剤（例えば、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン）及びプリン類似体）、葉酸拮抗剤及び関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖／抗有糸分裂剤（天然産物（例えばビンカアルカロイド類（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン））、微小管撹乱物質（例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポシロン、ナベルビン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ傷害剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトセシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド及びエトポシド（ＶＰ１６）等）；抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身で代謝し、それ自身のアスパラギンを合成する能力を有さない細胞を奪取するＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン及びメチルメラミン（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、スルホン酸アルキル−ブスルファン、ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）及び類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジニン（ＤＴＩＣ））；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗剤（例えば葉酸類似体（メトトレキサート））；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン類、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）、アロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩、及び他のトロンビンの阻害剤）；フィブリン溶解薬（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤（ブレベルジン）；免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；免疫調節性剤（レナリドマイド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ、ＣＣ−５０１３）及びＣＣ−４０４７（アクチミド））等のサリドマイド及びその類似体）、シクロホスファミド；抗血管新生化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）及び成長因子阻害剤（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンギオテンシン受容体遮断薬；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤及び分化誘導物質（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトセシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、テニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレニソロン）；成長因子信号伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導物質及びカスパーゼ活性化剤；及びクロマチン撹乱物質。
【００９９】
ある実施形態において、抗血管新生療法に併用され得る医薬品化合物としては、（１）ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）等の「血管新生促進分子」放出阻害剤；（２）抗βｂＦＧＦ抗体等の血管新生促進分子中和剤；（３）血管新生刺激に対する内皮細胞応答阻害剤（コラゲナーゼ阻害剤、基底膜代謝回転阻害剤、血管新生抑制ステロイド、真菌由来血管新生阻害剤、血小板第４因子、トロンボスポンジン、関節炎薬物（例えばＤ−ペニシラミン及び金チオマレート酸塩）、ビタミンＤ３類似体、α−インターフェロン等）が含まれる。更に提唱された血管新生阻害剤については、Ｂｌｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１０３２：８９−１１８（１９９０），Ｍｏｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０），Ｉｎｇｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５９：４４−５１（１９８８）及び米国特許第５，０９２，８８５号、同第５，１１２，９４６号、同第５，１９２，７４４号、同第５，２０２，３５２号並びに同第６，５７３，２５６号を参照。更に、血管新生を阻害するために使用され得る多種多様な化合物（例えば、ＶＥＧＦ媒介血管新生経路を遮断するペプチド又は薬剤、エンドスタチンタンパク質又は誘導体、アンギオスタチンのリジン結合フラグメント、メラニン又はメラニン活性化化合物、プラスミノーゲンフラグメント（例えばプラスミノーゲンのクリングル１〜３）、トロポニンサブユニット、ビトロネクチンαｖβ３の拮抗剤、サポシンＢに由来するペプチド、抗生物質又は類似体（例えばテトラサイクリン又はネオマイシン）、ジエノゲスト含有組成物、ペプチドと連結するＭｅｔＡＰ−２阻害コアを含む化合物、化合物ＥＭ−１３８、カルコン及びその類似体及びｎａａｌａｄａｓｅ阻害剤）がある。例えば、米国特許第６，３９５，７１８号、同第６，４６２，０７５号、同第６，４６５，４３１号、同第６，４７５，７８４号、同第６，４８２，８０２号、同第６，４８２，８１０号、同第６，５００，４３１号、同第６，５００，９２４号、同第６，５１８，２９８号、同第６，５２１，４３９号、同第６，５２５，０１９号、同第６，５３８，１０３号、同第６，５４４，７５８号、同第６，５４４，９４７号、同第６，５４８，４７７号、同第６，５５９，１２６号、及び同第６，５６９，８４５号を参照。
【０１００】
本発明のＡＰＣ標的化剤の投与は、併用療法の性質に応じて、他の療法が施されている間及び／又はその後で継続させ得る。ＡＰＣ標的化剤の投与は、単回投与又は多回投与で行うことができる。場合により、ＡＰＣ標的化剤の投与は、従来の療法の少なくとも数日前に開始されるが、一方で他の例においては、従来の療法を施す直前又はその時に開始される。
【０１０１】
例示的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＡＰＣ標的化化合物に結合するアジュバントを予め接種されていない被験体のアジュバント効果を増強させること又は免疫応答を刺激することを含む。
【０１０２】
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、自然免疫応答、リコールの免疫応答、又はその両方を刺激することができる。
【０１０３】
例示的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、アジュバント又はＡＰＣ標的化化合物以外の抗原に対する免疫応答を刺激する。ある実施形態において、前記方法は、未知の抗原に対する免疫応答を刺激することを含んでよい。ある実施形態において、前記方法は、既に被験体内に存在する抗原（例えば腫瘍抗原や病原体抗原）に対する免疫応答を刺激することを含んでよい。
【０１０４】
ある実施形態において、例えば抗原、アジュバント及びＡＰＣ標的化化合物を含む３種の成分のＡＰＣ標的化剤を利用する場合、前記方法は、（アジュバント及び／又はＡＰＣ標的化化合物に対する免疫応答を刺激することを除外しないにもかかわらず）アジュバント又はＡＰＣ標的化化合物に対する免疫応答ではなく、関連抗原に対する免疫応答を刺激することを含む。前記被験体の前記抗原への曝露又は接種は、予め行っても行わなくてもよい。
【０１０５】
４．抗体産生
本明細書に記載されるあるＡＰＣ標的化剤の産生に有用な抗体は、所望のエピトープと結合するように設計されてよく、或いは公的に入手可能な既知の抗体のソースから選択されてよい。例えば、抗体配列のデータベースは、ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒのワールドワイドウェブ上に見出され得る。抗体をコードする核酸配列は、標準的組換えＤＮＡ法を使用して、タンパク質アジュバントやペプチド抗原等の１個以上の配列を付加するためにマニピュレートされ得る。タンパク質系ＡＰＣ標的化剤をコードする核酸配列は、更に後述するように、発現ベクター内及びＡＰＣ標的化剤の発現に適切な宿主細胞内に導入され得る。
【０１０６】
免疫抗原の調製並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製は、本明細書に記載されるように又は他の適切な技法を使用して実施され得る。種々の方法が記載されている。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）  ａｎｄ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５５２（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，１７２，１２４；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２７，Ｓｕｍｍｅｒ’９４），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），Ｃｈａｐｔｅｒ  １１，（１９９１）を参照。一般的に、ハイブリドーマは、適切な不死化細胞株（例えばＳＰ２／０等の骨髄腫細胞株）を抗体産生細胞と融合することによって作製され得る。抗体産生細胞は、好ましくは脾臓又はリンパ腺のものであって、対象の抗原によって免疫化される動物から得られる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択培養条件を使用して単離され得、限界希釈によってクローニングされ得る。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によって選択され得る。
【０１０７】
必要な特異性の抗体を産生する又は単離する他の適切な方法としては、例えば、組換え抗体をライブラリーから選択する方法や、ヒト抗体の完全なレパートリを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）の免疫化に基づく方法が含まれる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５４５，８０６；Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５４５，８０７を参照。
【０１０８】
例示のために、ＡＰＣ細胞表面タンパク質に由来するイムノゲンは、哺乳類（例えばマウス、ハムスター、ウサギ）を免疫化するために使用され得る。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｅｄ．  ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照。タンパク質又はペプチドに免疫原性を与えるための技法としては、担体との共役又は当該技術分野で周知の他の技法が含まれる。ポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫化の過程は、血漿又は血清中の抗体価の検出で観察できる。標準的なＥＬＩＳＡ又は他のイムノアッセイは、抗体のレベルを評価するための抗原としてのイムノゲンと共に使用され得る。
【０１０９】
ポリペプチドの抗原製剤により動物を免疫化後、抗血清を得ることができ、所望により、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を産生するため、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から収集することが可能であり、ハイブリドーマ細胞等を得るため、標準体細胞融合法により骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させることができる。かかる技法は当該技術分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ法（最初にＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７で開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）、ヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ハイブリドーマ細胞は、所望のポリペプチドと特異的に反応する抗体とかかるハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されるモノクローナル抗体とを産生するために免疫化学的にスクリーニングされ得る。
【０１１０】
ある実施形態において、抗体は、従来の技法と、全抗体について上記と同様の有用性についてスクリーニングされたフラグメントとを使用して断片化され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって生成できる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを処理してジスルフィド架橋を減少させてＦａｂ’フラグメントを産生することができる。Ｆａｂフラグメントは、抗体をパパインで処理することによって生成できる。
【０１１１】
ある実施形態において、本明細書に記載される抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域により与えられる対象のポリペプチドとの親和性を有する二重特異性分子、一本鎖分子、並びにキメラ及びヒト化分子を含むことが更に意図される。軽鎖又は重鎖二量体や、Ｆｖや一本鎖（ｓｃＦｖ）構築体等のその任意の最小限のフラグメントの産生のための技法は、例えば米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。また、トランスジェニックマウス又は他の哺乳類を含む他の生物体を用いてヒト化抗体を発現させることができる。これらの抗体を生成する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０，１２５，０２３号；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０，４５１，２１６号；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０，１２０，６９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０，１９４，２７６号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００号；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許出願第０，５１９，５９６Ａ１を参照。また、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｈｕｓｔｏｎ、米国特許第５，４７６，７８６号；及びＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）を参照。
【０１１２】
かかるヒト化免疫グロブリンは、所望のヒト化鎖をコードする遺伝子（例えばｃＤＮＡ）を調製するために合成及び／又は組換え核酸を使用して産生することが可能である。例えば、ヒト化可変領域についてコードする核酸（例えばＤＮＡ）配列は、ヒト鎖又はヒト化鎖をコードするＤＮＡ配列（例えば既にヒト化された可変領域からのＤＮＡ鋳型）を改変するためにＰＣＲ突然変異誘発方法を使用して構築され得る（例えば、Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：５４０４（１９８９））；Ｓａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；及びＬｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１）参照）。これら又は他の適切な方法を使用して、直ちに変異体を作製することも可能である。一実施形態においては、クローニングされた可変領域に突然変異が起きる可能性があり、所望の特異性を有する変異体をコードする配列を選択することができる（例えばファージライブラリーから；例えば、Ｋｒｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５１４，５４８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９３／０６２１３，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ（１９９３年４月１日公開）、を参照）。
【０１１３】
所望のポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法は、検出可能な免疫応答の刺激に有効的な量のポリペプチドを含む免疫原性組成物の量をマウスに投与することと、マウスから抗体産生細胞（例えば脾臓由来の細胞）を得て、抗体産生ハイブリドーマを得るために前記抗体産生細胞に骨髄腫細胞を融合させることと、ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために前記抗体産生ハイブリドーマをテストすることとを含む。一旦得られると、場合により、細胞培養物中でハイブリドーマを増殖させることができ、ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体をハイブリドーマ由来細胞が産生するという培養条件で増殖させることができる。モノクローナル抗体は、前記細胞培養物から精製され得る。
【０１１４】
更に、ハイブリドーマ細胞株は、免疫グロブリン鎖をコードする核酸のソースとして使用することが可能であり、それは単離及び発現が可能である（例えば、任意の適切な技法を使用して他の細胞に移す際（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号参照））。例えば、再配列された軽鎖又は重鎖を含むクローンを（例えばＰＣＲによって）単離することが可能であるか、或いはｃＤＮＡライブラリーを前記細胞株から単離されるｍＲＮＡから調製することが可能であり、及び所望の免疫グロブリン鎖をコードするｃＤＮＡクローンを単離することが可能である。このように、前記抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸又はその一部は、種々の宿主細胞内又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系内の特異的免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそれらの変異体（例えばヒト化免疫グロブリン）の産生のための組換えＤＮＡ法に従って得られ、使用され得る。例えば、ヒト化された免疫グロブリンや免疫グロブリン鎖等の変異体をコードする核酸（ｃＤＮＡ等）又はその誘導体は、前記核酸が１つ以上の発現調節要素（例えばベクター内の、又は宿主細胞ゲノム内に組込まれたもの）に機能的に連結されるように、適切な原核生物ベクター又は真核生物ベクター（例えば発現ベクター）内に配置され、適切な方法（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）よって適切な宿主細胞内に導入される。産生のために、宿主細胞は、発現に適切な条件下（例えば、誘導物質、適切な塩類が補充される適切な培地、成長因子、抗生物質、栄養補給剤等の存在下）で維持することが可能であり、それによって、コードされたポリペプチドが産生される。所望により、コードされたタンパク質は、（例えば宿主細胞や培地から）回収及び／又は単離され得る。前記作製方法がトランスジェニック動物の宿主細胞の発現を包含することはいうまでもない（例えば、ＷＯ９２／０３９１８、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９２年３月１９日公開）を参照）。
【０１１５】
抗体はまた、当該技術分野で既知の各種ファージディスプレイ法を用いて作製することも可能である。ファージディスプレイ法において、機能的抗体領域はファージ粒子の表面上にディスプレイされ、ファージ粒子はそれらをコードするポリヌクレオチド配列を保有する。特定の一実施形態において、かかるファージは、レパートリ又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトやネズミ）から発現するＦａｂ及びＦｖ或いはジスルフィド結合安定化Ｆｖ等、抗原結合領域をディスプレイするために利用することが可能である。対象の抗原に結合する抗原結合領域を発現するファージは、例えば標識抗原又は固体表面又はビーズに結合した又は捕捉された抗原を用いて、抗原により選択又は同定され得る。これらの方法で使用されるファージは、典型的にはｆｄやＭ１３等の繊維状ファージである。抗原結合領域は、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかとのリコンビナント融合タンパク質として発現する。本発明の免疫グロブリン又はそのフラグメントを作製するために使用され得るファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８号に開示されているものが含まれる。
【０１１６】
上記の参考文献に記載のように、ファージ選択後、前記ファージから抗体コード領域を単離及び使用され得、全抗体（ヒト抗体などを含む）又は任意の他の所望のフラグメント等を作製できる。例えば下記で詳述のように、任意の所望の宿主（哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、細菌等）において発現させることが可能である。例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え産生する技法はまた、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２（６）：８６４−８６９，１９９２；及びＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：２６−３４，１９９５；及びＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−１０４３，１９８８（各々はその開示内容全体を参考として援用される）に開示されているもの等、当該技術分野で既知の方法を用いて使用することもできる。一本鎖Ｆｖｓ及び抗体を産生するために使用され得る技法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３：４６−８８，１９９１；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７９９５−７９９９，１９９３；及びＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８−１０４０，１９８８に記載されているものが含まれる。
【０１１７】
所望の結合特異性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。所望の抗原に対して免疫特異的な抗体のヌクレオチド配列は、例えば上記のように、文献から又はデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）から得ることが可能である。抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されるオリゴヌクレオチドから構築され（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：２４２（１９９４）に記載の通り）、それは、簡潔には、抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、次いでＰＣＲによる連結オリゴヌクレオチドの増幅を伴う。或いは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の発現のために選択されるハイブリドーマ細胞株等、抗体を発現する組織又は細胞から得られるｃＤＮＡライブラリーから作製され得る。所望の抗体遺伝子は、配列の３’末端及び５’末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅によってライブラリーから単離され得る。次いで、ＰＣＲによって作製された増幅核酸は、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクター内にクローニングされ得る。
【０１１８】
ＡＰＣ標的化剤をコードする核酸配列が得られた時点で、ＡＰＣ標的化剤の作成のためのベクターは、当該技術分野で周知の技法を使用する組換えＤＮＡ法によって作製され得る。当業者に周知の方法は、ＡＰＣ標的化剤コード配列及び適切な転写及び翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法としては、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ法、合成法、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技法を参照）。
【０１１９】
ＡＰＣ標的化剤（又はその成分（例えば抗体、タンパク質アジュバント、抗原ペプチド等））のヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、従来の技法（例えばエレクトロポレーション、リポソーム型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿）によって宿主細胞に移すことが可能であり、次いで従来の技法によってトランスフェクト細胞を培養して抗体を産生することができる。特定の実施形態において、ＡＰＣ標的化剤の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって調節される。
【０１２０】
組換えＡＰＣ標的化剤を発現するために使用される宿主細胞は、細菌細胞（例えば大腸菌）又は真核細胞のいずれであってもよい。真核細胞は、特に全組換え免疫グロブリン分子を含むＡＰＣ標的化剤の発現に有用であり得る。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳類細胞は、ヒトサイトメガロウィルスに由来する主要中間初期遺伝子プロモーター要素等のベクターと共に、免疫グロブリンに有効的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。
【０１２１】
種々の宿主−発現ベクター系は、本明細書に記載されるＡＰＣ標的化剤を発現するために利用され得る。かかる宿主―発現系は、ＡＰＣ標的化剤のコード配列が産生され、その後精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又はトランスフェクトされる場合にｉｎ  ｓｉｔｕでＡＰＣ標的化剤を発現し得る細胞も表す。これらとしては、免疫グロブリンコード配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクター又は組換えコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌や枯草菌）等の微生物；免疫グロブリンコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセスやピキア）；免疫グロブリンコード配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウィルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）やタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ））を感染させた又は免疫グロブリンコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）又は哺乳類のウィルスに由来するプロモーター（例えばアデノウィルス後期プロモーター；ワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を宿す哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、３Ｔ３細胞、リンパ細胞（米国特許第５，８０７，７１５号参照）、Ｐｅｒ  Ｃ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌによって開発されたラット網膜細胞））が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるＡＰＣ標的化剤の作製に適用可能な植物、酵母又は真菌／藻類の抗体を作製する方法は、例えば、米国特許第６，０４６，０３７号と、同第５，９５９，１７７号と、米国特許公開第２００５／００３７４２０号と同第２００５／０１３８６９２号とに記載されている。
【０１２２】
細菌系において、多くの発現ベクターは、有利には、発現するＡＰＣ標的化剤について意図された使用に応じて選択され得る。例えば、ＡＰＣ標的化剤の医薬組成物の生成のためにかかる大量のタンパク質を産生する場合、直ちに精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターは望ましい可能性がある。かかるベクターとしては、融合タンパク質が産生されるようにＡＰＣ標的化剤コード配列がｌａｃＺコード領域を有するフレーム内のベクター内に個別に連結され得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１）；ＰＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）等が含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、かかるＡＰＣ標的化剤は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズに対する吸着及び結合によって溶解細胞から容易に精製することが可能であり、その後遊離グルタチオンの存在下で溶出する。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビン又はＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１２３】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）が、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。前記ウィルスは、スポドプテラ・フルギペルダ細胞内で増殖する。ＡＰＣ標的化剤コード配列は、前記ウィルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングすることが可能であり、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。
【０１２４】
哺乳動物の宿主細胞においては、多くのウィルスベースの発現系を利用することが可能である。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合、対象のＡＰＣ標的化剤コード配列は、アデノウィルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター及び三部リーダー配列に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによりアデノウィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスゲノムの非必須領域（例えばＥ１又はＥ３領域）における挿入は、生存可能であり、感染宿主において免疫グロブリン分子を発現可能である組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）参照）。特異的開始シグナルはまた、挿入されたＡＰＣ標的化剤コード配列の効果的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンや隣接配列が含まれる。更に、開始コドンは、インサート全体の翻訳を保証するために所望のコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成性の両方の種々の由来のものであり得る。発現の有効性は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写終結因子等の包含により増大され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）参照）。
【０１２５】
更に、宿主細胞株が選択され得るが、これは挿入された配列の発現を調節するか、又は所望される特異的な様式での遺伝子産物を修飾及びプロセッシングする。タンパク質産物のかかる修飾（例えばグリコシル化）及びプロセッシング（例えば切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセッシング及び修飾について特徴的で特異的な機序を有する。適切な細胞株又は宿主系が選択されて、発現する異種タンパク質の正確な修飾及びプロセッシングを確実にすることができる。このために、転写一次産物の適切なプロセッシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。かかる哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
長期にわたる高収率の組換えタンパク質（例えば、ＡＰＣ標的化剤、抗体、タンパク質アジュバント、ペプチド抗原等）の産生のためには、安定的な発現が好ましい。例えば、ＡＰＣ標的化剤を安定して発現する細胞株が設計され得る。ウィルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）及び選択可能なマーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換され得る。異種ＤＮＡの導入後、設計された細胞は、栄養強化培地中で１〜２日間増殖させることが可能であり、次いで選択培地に置き換えられる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がプラスミドをその細胞の染色体に安定に組込み、そして病巣（これは、次にクローニングすることが可能であり、そして細胞株にまで拡大され得る）を形成するまで増殖することを可能にする。この方法は、本明細書に記載されるＡＰＣ標的化剤を発現する細胞株を設計するために有利に利用され得る。
【０１２７】
多数の選択系が使用することが可能であるが、これらとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））の遺伝子が含まれるが、これらには限定されず、これらはそれぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞又はａｐｒｔ−細胞において使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性が、ｄｈｆｒ遺伝子（これは、メトトレキサートに対する耐性を与える）（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ遺伝子（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を与える）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ遺伝子（これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える）（Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１：１５５−２１５（１９９３））；並びにｈｙｇｒｏ遺伝子（これは、ヒグロマイシンに対する耐性を与える）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））について選択の基礎として使用され得る。使用可能な組換えＤＮＡ法の技術分野で一般的に既知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ａｎｄ  ｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ．；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されている。
【０１２８】
ＡＰＣ標的化剤（又はその成分）の発現レベルは、ベクター増幅によって増加され得る（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）参照）。ＡＰＣ標的化剤を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅した領域がＡＰＣ標的化剤のヌクレオチド配列と関連しているため、ＡＰＣ標的化剤の産生もまた増加される（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７）。
【０１２９】
宿主細胞は、２種の発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター及び軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクター）でコトランスフェクトされ得る。前記２種のベクターは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含み得る。或いは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターが使用され得る。かかる状況下において、軽鎖は、過剰な毒性遊離重鎖を回避するように重鎖の前に配置されなければならない（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２；Ｋｏｈｌｅｒ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７）。重鎖及び軽鎖についてのコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含み得る。
【０１３０】
本発明のＡＰＣ標的化剤（又はその成分）が組換え発現されると、それは抗体の精製のための当該技術分野で周知の任意の方法（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特にプロテインＡの後の特異性抗原に対する親和性による親和性クロマトグラフィー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的な溶解性、又はタンパク質の精製についての任意の他の標準的な技法）によって精製され得る。
【０１３１】
５．医薬組成物
本発明は、方法と、１種以上のＡＰＣ標的化剤を含む医薬組成物とを提供する。本発明はまた、被験体に有効量のＡＰＣ標的化剤又はＡＰＣ標的化剤を含む医薬組成物を投与することによって、疾患、障害又は感染症と関連した１種以上の症状の治療、予防及び改善法を提供する。一実施形態においては、ＡＰＣ標的化剤が実質的に精製される（即ち、実質的にその効果を限定又は望ましくない副作用を生じる物質を含まない）。本明細書に記載されるＡＰＣ標的化剤を投与することができる被験体としては、例えば、非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）及び霊長類（例えばカニクイザル等のサルやヒト）を包含する哺乳類等の動物が含まれる。例示的な一実施形態において、前記被験体はヒトである。
【０１３２】
ある実施形態において、記載されるＡＰＣ標的化剤は、薬学的に許容される担体と製剤化され得る。かかるＡＰＣ標的化剤は、単独又は医薬製剤（組成物）の成分として投与され得る。ＡＰＣ標的化剤は、ヒト又は獣医学に使用するための任意の簡便な方法における投与のために製剤化され得る。また、湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムやステアリン酸マグネシウム）並びに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味料、着香剤及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤は、前記組成物中に存在し得る。
【０１３３】
標題のＡＰＣ標的化剤の製剤としては、経口投与、飼料投与、局所投与、非経口投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射）、吸入（例えば、気管支内吸入、鼻腔内吸入又は経口吸入、鼻腔内滴下）、直腸投与及び／又は腟内投与に適切なものが含まれる。また、他の適切な投与方法としては、再充填可能な装置又は生分解性装置及び徐放性ポリマー装置が含まれる。また、本明細書に記載される医薬組成物は、他の治療薬とのコンビナトリアル療法の一部として、（同じ製剤又は別々の製剤で）投与され得る。
【０１３４】
製剤は、単位用量形態で簡便に提示することが可能であり、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単一の剤形を作製するための担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、被処理宿主と特定の投与様式とに応じて変化し得る。一般的に、単一の剤形を作製するための担体材料と組み合わせることが可能な活性成分の量は、治療効果を生じるＡＰＣ標的化剤の量である。
【０１３５】
ある実施形態において、これらの製剤又は組成物を調製する方法は、ＡＰＣ標的化剤及び担体並びに、場合により、１種以上の副成分とを組み合わせることを含む。一般的に、製剤は、液体担体又は微粉固体担体或いはその両方と調製することが可能であり、次いで必要に応じてその生成物を成形することができる。
【０１３６】
経口投与のための製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、口内錠（風味付けした基礎原料、通常スクロース及びアカシア又はトラガカントゴムを使用）、散剤、顆粒の形態で、或いは水性液体又は非水液体の液剤又は懸濁剤として、或いは水中油液型液状エマルジョン又は油中水型液状エマルジョンとして、或いはエリキシル剤又はシロップ剤として、或いは（ゼラチン及びグリセリン等の不活性基剤、或いはスクロース及びアカシアを使用する）香錠として、及び／又は口内洗剤等としてあり得、各々は活性成分として所定量の１種以上の標題のＡＰＣ標的化剤を含む。
【０１３７】
経口投与のための固体投与形態（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、散剤、顆粒剤等）において、本発明の１種以上のＡＰＣ標的化剤は、１種以上の薬学的に許容される担体（例えばクエン酸ナトリウムやリン酸二カルシウム）及び／又は以下のいずれかと混合され得る：（１）充填剤又は増量剤（例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び／又は珪酸）；（２）結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシア）；（３）保湿剤（例えばグリセロール）；（４）崩壊剤（例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカ澱粉、アルギン酸、あるケイ酸塩、炭酸ナトリウム）；（５）溶液硬化遅延剤（例えばパラフィン）；（６）吸収促進剤（例えば第四級アンモニウム化合物）；（７）湿潤剤（例えばセチルアルコールやグリセロールモノステアレート）；（８）吸収剤（例えばカオリン及びベントナイト粘土）；（９）潤滑剤（例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物）；及び（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合、前記医薬組成物は緩衝剤を含んでもよい。また、類似のタイプの固体組成物は、ラクトースや乳糖等の賦形剤並びに高分子量ポリエチレングリコール等を使用した軟充填ゼラチンカプセル及び硬充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として使用され得る。
【０１３８】
経口投与のため液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、ミクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤が含まれる。活性成分に加え、液体剤形は、当該技術分野において一般的に用いられる不活性希釈剤（例えば水や他の溶媒）、可溶化剤及び乳化剤（例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコール及び脂肪酸エステル、及びそれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤の他に、経口組成物としてはまた、湿潤剤、乳化及び懸濁化剤、甘味剤、着香剤、着色剤、賦香剤、保存剤が含まれる。
【０１３９】
前記活性化合物に加え、懸濁剤は、懸濁化剤（例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル）、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント及びそれらの混合物を含むことができる。
【０１４０】
本発明の方法は、皮膚或いは粘膜（例えば子宮頚部や膣上のもの）のいずれかに対する局所投与を利用することができる。これによって、副作用の誘発を回避しつつ腫瘍への直接的な送達が行われ得る。局所製剤は、皮膚又は角質層透過増強剤として有効的であることが既知の多種多様な薬剤の内の１種以上を更に含むことができる。これらの例としては、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチル又はイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド及びアゾンが含まれる。更なる薬剤が、前記製剤を化粧学的に許容されるように更に含まれ得る。これらの例としては、脂肪、ワックス、油、染料、芳香剤、保存剤、安定化剤、界面活性剤がある。また、当該技術分野で既知のもの等の角質溶解剤が含まれ得る。例としては、サリチル酸や硫黄がある。
【０１４１】
局所又は経皮投与のための剤形としては、散剤、噴霧剤、軟膏剤、糊剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、貼付剤、吸入剤が含まれる。標題のＡＰＣ標的化剤は、薬学的に許容される担体、並びに必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤又は噴射剤と、無菌条件下で混合され得る。前記軟膏剤、糊剤、クリーム剤及びゲル剤は、ＡＰＣ標的化剤に加え、賦形剤（例えば動物性脂肪及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルク、酸化亜鉛や、それらの混合物）を含有することができる。
【０１４２】
散剤及び噴霧剤は、薬剤の他に、賦形剤（例えば、ラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム、ポリアミド粉末や、これらの物質の混合物）を含有することができる。噴霧剤は、通例の噴射剤（例えばクロロフルオロハイドロカーボン）及び揮発性非置換炭化水素（例えばブタンやプロパン）を更に含有することができる。
【０１４３】
非経口投与に適切な医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容される無菌の等張性の水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又は乳液、或いは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を指定のレシピエントの血液と等張にする溶質、懸濁化剤又は増粘剤を含有し得る使用時に無菌注射液剤又は分散液に再構成され得る無菌の散剤と組み合わせて１種以上のＡＰＣ標的化剤を含むことができる。本明細書に記載される医薬組成物に使用され得る適切な水性担体及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）及び適切なそれらの混合物、植物油（例えばオリーブ油）、注射可能有機エステル（例えばオレイン酸エチル）が含まれる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料（例えばレシチン）を用いて、分散剤の場合には必要粒径を維持することによって、及び界面活性剤を用いて、維持され得る。
【０１４４】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有してよい。微生物の活動の防止は、各種の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等）を含めることによって確実にされ得る。前記組成物中に等張性剤（例えば、糖類、塩化ナトリウム等）を含めることは望ましくあり得る。更に、注射可能剤型の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。
【０１４５】
注射可能蓄積物は、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマーにおける１種以上のＡＰＣ標的化剤のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の割合、並びに特定のポリマーの性質に応じて薬物放出速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）やポリ（無水物）が含まれる。また、蓄積注射可能製剤は、体組織に適合したリポソーム又はミクロエマルジョンの薬物を封入することによって調製される。
【０１４６】
腟内又は直腸投与のための製剤は坐剤として提示され得、その坐剤は、本発明の１種以上の薬剤を、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、座薬ワックス又はサリチル酸塩を含む１種以上の適切な非刺激性賦形剤又は担体と混合することによって調製され得るものであり、且つ、室温で固体であるが体温で液体となり、そのため直腸内又は膣腔内で溶解して活性化合物を放出するものである。
【実施例】
【０１４７】
本発明を今や一般的に記載したので、本発明は、以下の実施例を参照することによってより直ちに理解されるであろう。実施例は、本発明の特定の態様及び実施形態の例示の目的のみで含まれ、そしていかなる形であれ本発明を限定することを意図しない。
【０１４８】
実施例１：ＤＣ−ＳＩＧＮによる樹状細胞に対するアジュバントのｉｎ  ｖｉｖｏ標的化
ＤＣは、末梢血液中及び組織中の抗原を取り込んで処理し、そして免疫応答の活性化のための流入領域リンパ節内のリンパ球にそれらを提示する固有の能力を有する抗原提供細胞である。しかしながら、生産的Ｔ細胞応答が生じるには活性化刺激が必要であり、そうしないと忍容性が誘起される（Ｈａｗｉｇｅｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：７６９−７７９）。癌ワクチンの開発は、主に自己由来ＤＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの負荷に焦点を当ててきた（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：２９６−３０６）。近年、ＤＣ上の抗原取り込み受容体に対してｉｎ  ｖｉｖｏで抗原を標的化する、より直接的な方法が、前臨床試験において探索されてきた。対象の候補物質の可能性としては、Ｆｃ受容体（Ｒｅｇｎａｕｌｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９：３７１−３８０；Ｋａｌｅｒｇｉｓ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９５：１６５３−１６５９）、ケモカイン受容体（Ｂｉｒａｇｙｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｂｌｏｏｄ  １０４：１９６１−１９６９）、及びＣ−型レクチン（Ｂｏｎｉｆａｚ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．  ２００２．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９６：１６２７−１６３８；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：２８４５−２８５２）がある。Ｆｃ及びケモカイン受容体発現がＤＣに限定されない場合、Ｃ−型レクチンファミリーの幾つかのメンバーは、よりＤＣ特異的な発現パターンを示す。Ｉ型Ｃ−型
レクチン、例えばマンノース受容体及びＤＥＣ−２０５は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体標的化試験に使用されてきた。両受容体に対する抗体は、抗原をＤＣに特異的に送達することが可能であり、その抗原は適切に処理され、Ｔ細胞に提示される。しかしながら、そのＴ細胞応答を観察したところ、免疫寛容を生じることが分かった（Ｂｏｎｉｆａｚ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９６：１６２７−１６３８；Ｃｈｉｅｐｐａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：４５５２−４５６０）。ＤＥＣ２０５抗体を介して抗原を送達する際、十分な刺激性応答を誘発するには更なる共刺激信号が必要であった。
【０１４９】
それに対して、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ヒトＤＣサブセット上のＤＥＣ２０５とは異なる発現パターンを有するＩＩ型Ｃ−型レクチンである。また、ＤＣ−ＳＩＧＮは、種々の病原ウィルス上のエンベロープタンパク質に直接結合するその能力によって示される効率的に抗原を取り込むことが可能なエンドサイトーシス受容体である（Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０５：１１５−１２３；Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃｅｌｌ  １００：５８７−５９７；Ｃａｍｂｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７：４８１−４８８）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験によって、ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体−ＫＬＨ複合体がＤＣに内部移行し、ＤＣの表面上にＫＬＨエピトープを提示することに成功し、それによって抗−ＫＬＨ  Ｔ細胞応答が誘起されたことが示された（Ｔａｃｋｅｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｂｌｏｏｄ  １０６：１２７８−１２８５）。本明細書に示される試験は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＣ−ＳＩＧＮを介して抗原を標的化することによって未感作のヒト免疫細胞の刺激性免疫応答が高まるのかどうかを評価するものである。ヒトにおいては、ＤＣ−ＳＩＧＮが専門の抗原提示細胞上に発現するだけであるが、一方でマウスにおいては、ＤＣ−ＳＩＧＮ生物が多数のファミリーメンバー及び種々の発現パターンとより一層複合する（Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：１２８３−１２９０；Ｔａｋａｈａｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６：８１９−８２９）。したがって、厳密にマウスのモデルにおけるＤＣ−ＳＩＧＮの抗体媒介標的化は、ヒトの設定に移すことができない可能性がある。この試験は、ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を使用してＤＣに対する抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ標的化を評価するモデルとしてのヒト免疫系（Ｔｒａｇｇｉａｉ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１０４−１０７）の必須細胞と再構成される免疫不全Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスを使用したものである。抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ｈＤ１Ｖ１及びＥ１０は、いずれのマウスＤＣ−ＳＩＧＮファミリーメンバーとも交差反応しないため、再構成されたＲａｇ２−／−γｃ−／−における標的化は、完全にヒトＤＣ−ＳＩＧＮを介する。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及び破傷風トキソイド（ＴＴ）をモデル抗原として使用し、抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体に化学的又は遺伝子的にかのいずれかで連結した。ＤＣに対するいずれの抗原の標的化された送達によっても、任意の更なる共刺激信号の非存在下で増殖性ヒト免疫応答が生じた。更に、抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体に連結したＫＬＨの投与が他の腫瘍モデル及びヒト臨床試験においてＫＬＨによって観察されるアジュバント効果を増大させるのかどうかを評価するために、ヒト末梢血リンパ球（ｈＰＢＬ）で再構成される腫瘍異種移植モデルを用いた（Ｒａｇｕｐａｔｈｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：５２１４−５２２０；Ｋｒｕｇ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：６０９４−６１００；Ｓｌｏｖｉｎ，Ｓ．Ｆ．２００���．Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ４：１１８−１２３）。腫瘍成長の阻害は、ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体に連結したＫＬＨによって異種移植腫瘍モデルにおいて有意に増大した。故に、ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を介してＤＣに対して抗原を標的化することは、癌及び感染症に対する強い且つ持続性の抗原特異性Ｔ細胞応答を高める強力な方法である可能性があった。
【０１５０】
材料及び方法
抗体構築体。Ｔａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ  １０６：１２７８−１２８５（２００５））に記載されるように、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ；Ｐｉｅｒｃｅ、米国イリノイ州ロックフォード）を使用して、化学的共役によって、Ｇ２Ｇ４融合定常領域を含むヒトＤＣ−ＳＩＧＮに特異的なヒト化抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ｈＤ１Ｖ１に、ＫＬＨを共役させた。また、同様に、対照抗体５Ｇ１．１（Ｃ５ａを認識するヒト化ＩｇＧ２／Ｇ４抗体）にＫＬＨを共役させた。
【０１５１】
ｓｃＦｖ−ＲＲ−ＴＴは、ｈＤ１Ｖ１の一本鎖変異体である。最初にＡＰＥＸ３Ｐ内にｓｃＦｖＤ１Ｖ１をクローニングした後、プロテアソーム切断用アルギニン「ＲＲ」リンカーとタンデムなＣ末端で一般的なＴＴヘルパーエピトープアミノ酸８２９−８４４の２つのコピーを連結する。Ｄ１Ｖ１  Ｖｋリーダー配列及びＶｋ配列並びにヒト化抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ  Ｄ１Ｖ１遺伝子のＶｈを増幅した。精製用６ＸＨｉｓ、終止コドン及びＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ酵素クローニング部位を導入した。重なりＰＣＲの後、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号６）リンカーをコードする配列を、ＶｋとＶｈとの間に導入した。ＰＣＲフラグメントは、ｐＣＲ２．１ベクター内にクローニングされたＴＡであり、正確な配列を確認した。次いで、ｐＣＲ２．１−ｓｃＦｖ−Ｄ１Ｖ１をＢａｍＨＩ／ＸｂａＩによって消化し、Ａｌｅｘｉｏｎの哺乳類細胞発現ベクターＡｐｅｘ３Ｐ（Ａｐｅｘ３Ｐ−ｓｃＦｖ  Ｄ１Ｖ１ＨＩＳ）内にフラグメントをクローニングした。配列決定によって最終構築体を確認した。
【０１５２】
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）によってＡｐｅｘ３Ｐ−ｓｃＦｖＤ１Ｖ１−ＲＲ−ＴＴでトランスフェクトした２９３ＥＢＮＡヒト胚腎臓細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２で、１０％熱不活性ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、活性２５０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８  Ｓｕｌｆａｔｅを有する２ｍＭグルタミン、及び１ｎｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ＃１０−０１３−ＣＶ）中で増殖させた。細胞の９０〜９５％のコンフルエントＴ−１７５フラスコを、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充した３０ｍＬのＩＳ  Ｐｒｏ無血清培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州サンタアナ、Ｃａｔａｌｏｇ＃９１１０３）を各フラスコに加える前に、血清タンパク質を除去するために、１５ｍＬハンクス液（ＨＢＳＳ）（又はＣａ／Ｍｇを含むＰＢＳ）で洗浄した。上清を濃縮し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｃｏｌｕｍｎによって精製した。
【０１５３】
最終的に２５の全体のアミノ酸（ＲＲＩＤＫＩＳＤＶＳＴＩＶＰＹＩＧＰＡＬＮＩＲＲＲ）（配列番号７）を挿入するために、エピトープの上流側及び３下流側で、２個の更なるアルギニンを有するグリシン２４９及び２５０間のＣＨ２領域内に、重なりＰＣＲによってＴＴエピトープ６３０ＤＲを挿入することによって、ＴＴエピトープを固定したヒトＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮ交差反応性キメラ抗体Ｅ１０−ＴＴ（アイソタイプ、ＩｇＧ１）を、前述（Ｄａｋａｐｐａｇａｒｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：４２６−４４０）のように構築した。前記試験において使用された全ての抗体は、ＱＣＬ−１０００カブトガニ血球抽出成分アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、米国メリーランド州ウォーカーズヴィル）を使用して決定されたように、エンドトキシンに対して陰性を示した。機能的グレードの抗ＣＤ４０抗体を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。
【０１５４】
臍帯血試料及び前駆細胞の単離。親へのインフォームドコンセントの後、新しい臍帯血を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州アラメダ）から入手した。前記血液は、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎及びサイトメガロウィルスについて陰性を示した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、臍帯血単核細胞を単離した。次いで、血液前駆細胞を、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（加国バンクーバー）から入手されたＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒ濃縮キットを使用して単離した。前記前駆細胞を分注し、使用するまで液体窒素中に保存した。
【０１５５】
マウス。Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ（日本国神奈川県）から、ＢＡＬＢ／ｃ背景のＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスの雌雄を購入した。Ｐｅｒｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）において、特定病原体感染防止条件で前記マウスを飼育し、収容した。４〜６週齢のＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国メイン州バーハーバー）から入手し、特定病原体感染防止条件下で維持した。動物についての研究は、全てＰｅｒｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ’ｓ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【０１５６】
新生児Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスの移植。Ｔｒａｇｇｉａｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１０４−１０７（２００４））に記載の方法に変更を幾つか行い、それに基づいて新生児マウスに臍帯血細胞を移植した。全ての手法は、Ｐｅｒｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ’ｓ  ＩＡＣＵＣ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得た。新生児のマウスに、１Ｇｙ／分で１Ｇｙを照射した（カリフォルニア大学，サンディエゴ）。照射後１〜２時間目に、３０ゲージ１／２インチ針（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）を使用して、マウスの肝臓に３０μＬ  ＲＰＭＩにおけるＣＤ３４＋臍帯血細胞を注入した。臍帯血細胞を移植した新生児マウスを３〜４週間目に離乳した。
【０１５７】
細胞単離。眼窩後穿刺により各マウスから末梢血液を採取した。密度勾配遠心分離によって、ヘパリン化全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。大腿骨及び脛骨を、無菌的に摘出した。骨髄を、いずれかの端部から完全なＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって洗浄した。細胞懸濁液を、セルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって濾過し、８分間の４００×ｇでペレット細胞に遠心分離した。標準手順で、脾臓、リンパ節（浅頸、腋窩、鼠径、腸間膜）から単個細胞浮遊液を調製した。脾臓の赤血球、ＰＢＭＣ及び、骨髄を、塩化アンモニウム（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、加国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）によって溶解した。前記細胞を、追加実験に使用する前にＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。
【０１５８】
臍帯血移植マウスの免疫化。マウスに、ＴｉｔｅｒｍａｘアジュバントにおけるＫＬＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）又はＴＴ抗原（Ｓｙｎｐｅｐ，米国カリフォルニア州ダブリン）を皮下又は腹腔内かのいずれかで投与し、２００μＬのＰＢＳにおけるＤＣ−ＳＩＧＮ抗体Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨ、５Ｇ１．１−ＫＬＨ又はＤ１Ｖ１−ＫＬＨ、及びＣＤ４０抗体を静脈内投与した。
【０１５９】
増殖アッセイ。脾臓を摘出し、単個細胞浮遊液を無菌的に調製した。遠心分離後、赤血球を塩化アンモニウム（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、加国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）によって溶解した。１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム溶液、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．０７５％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム、及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０におけるＫＬＨ又はＴＴの９６ウェルプレートで、２×１０５の脾臓細胞を５日間培養した。４日間の共培養後、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を細胞培養物に添加し、１６〜１８時間後にマイクロプレートシンチレーションカウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国コネチカット州シェルトン）でチミジン取り込みを測定した。増殖指数を、（ＫＬＨ又はＴＴ投与のｃｐｍ）／（培地投与のｃｐｍ）として決定した。
【０１６０】
フローサイトメトリー分析。移植マウスから単離した免疫細胞を１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳにおいて再懸濁し、以下のもの：ＰＥ共役抗ヒトＣＤ１９、ＡＰＣ共役抗ヒトＣＤ４、ＰＥ共役抗ヒトＣＤ８、又はＦＩＴＣ共役抗ヒトＣＤ２０９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）、の内の１種と２０分間培養し、同じ緩衝液で２回洗浄した。前記細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータで分析し、ＢＤ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用してデータを分析した。実験データを、所与のマーカーに陽性の染色したゲート化細胞のパーセンテージで表す。
【０１６１】
ＲＡＪＩ−ＰＢＬモデル。インフォームドコンセント及びＩＲＢ承認の後、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋで、健康なヒトドナーから末梢血液を採取した。１５分間４００×ｇでヒストパック勾配（Ｓｉｇｍａ）で血液の遠心分離によってＰＢＭＣを単離した。ＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞を２回洗浄した。同じドナーから、単球単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）による磁気分離を用いてＣＤ１４＋単球を単離することによって、未成熟ＤＣを調製した。次いで、８００Ｕ／ｍＬヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５００Ｕ／ｍＬヒト組換えＩＬ−４（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で、前記細胞を５日間培養した。Ｄａｙ３に、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を再度加えた。
【０１６２】
ＲＡＪＩ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中で培養した。フルダラビン（Ｓｉｇｍａ）投与ＲＡＪＩ細胞について、ＲＡＪＩ細胞を２４時間５μｇ／ｍＬでフルダラビンで培養し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。４百万個のＲＡＪＩ細胞、３万個の未成熟ＤＣ、及び３百万個のヒトＰＢＭＣを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍成長を、試験デザインに対して盲検化した人員によるマイクロキャリパ測定法によって決定した。腫瘍容積を、式：（長さ）×（幅）×（幅）／２に従って算出した。実験データは、各群１０匹のマウスからの腫瘍容積の平均を表す。抗体投与は、腫瘍日に開始し、指示用量の１／１０で皮下注射によってＰＢＭＣ注射を行い、その後２週間に亘って腫瘍付近に毎週皮下注射を行った。
【０１６３】
統計分析。群間差を、両側の対応のないスチューデントｔ検定によって分析した。有意性は、ｐ＜０．０５で認められた。
【０１６４】
結果
臍帯血移植マウスにおけるＤＣ−ＳＩＧＮ抗体ｈＤ１Ｖ１によるＫＬＨのｉｎ  ｖｉｖｏ標的化は、刺激性免疫応答を誘起する。Ｔａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ  １０６：１２７８−１２８５（２００５））は、ＫＬＨに共役したヒト化抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（ｈＤ１Ｖ１−Ｇ２Ｇ４）を有するＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションが、構築体の内部移行を生じさせ、ＫＬＨで免疫化した患者に由来するＴ細胞に対してＫＬＨエピトープの提示を成功させることを示した。得られた増殖性Ｔ細胞応答は、非共役型ＫＬＨによる刺激によって観察されるものより１００倍強かった。現在の試験は、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨがｉｎ  ｖｉｖｏでＤＣを標的化することに成功してヒトの未感作免疫細胞応答を刺激することができたのかどうかについて取り組むものである。ｈＤ１Ｖ１−Ｇ２Ｇ４抗体は齧歯類ＤＣ−ＳＩＧＮと交差反応しないことから、マウスのＤＣ−ＳＩＧＮ生物はヒトとは実質的に異なると思われ（Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：１２８３−１２９０；Ｔａｋａｈａｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６：８１９−８２９）、ヒト免疫細胞を移植したマウスは、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨのｉｎ  ｖｉｖｏ標的化を評価するのに最もよい選択であると思われた。
【０１６５】
Ｔｒａｇｇｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１０４−１０７（２００４））に記載のヒト臍帯血移植マウスは完全な範囲の機能性ヒト免疫細胞を発育したことが報告された。免疫不全新生児マウスの肝臓内へのヒト造血幹細胞及び造血前駆細胞の移植がヒト免疫系の移植、拡大、全体的再構成を生じさせることを確認するために、多くの移植マウスにおいて、各種免疫器官に由来するヒトＤＣ、ヒトＢ細胞、ヒトＣＤ８  Ｔ細胞及びＣＤ４  Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。細胞注射の３ヵ月後、脾臓及びリンパ節において約１２％〜２５％のＣＤ１９陽性細胞、２０〜３１％のＣＤ８＋細胞、及び１１〜１５％のＣＤ４＋細胞が発現した（表Ｉ）。Ｂ細胞及びＤＣの割合はヒトと同等であると思われるが、ＣＤ４／ＣＤ８比はヒトにおいて期待されるものと比較して逆であった。これらのデータは、既に報告されているように（Ｔｒａｇｇｉａｉ，  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１０４−１０７）、再構成Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスにおけるヒト幹細胞及び前駆細胞が３ヵ月間に亘ってＴ細胞及びＢ細胞に発育したことを示している。
【０１６６】
表Ｉ．臍帯血移植の後の細胞頻度（％）。Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスへのヒト臍帯血細胞の注射の３ヵ月後、骨髄、リンパ節、脾臓を摘出し、ヒトＣＤ抗原に対する抗体を使用してフローサイトメトリーによって細胞表現型を評価した。
【０１６７】
【表１】
2010504970.tif 000003
ＤＣへのＫＬＨの標的化送達をテストする前に、アジュバントにおける免疫化後のＫＬＨに対して検出可能な増殖性免疫応答を生じる能力について、移植マウスのヒトＴ細胞を評価した。非接種マウスに由来する脾細胞とは対照的に、接種９日後のＫＬＨ接種マウスから単離した脾細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＫＬＨで刺激された場合に増殖した（図１Ａ）。ＫＬＨによる第２の免疫化は、増殖応答を更に増加させなかった（図１Ｂ）。全体として増殖指数はかなり低く、これはヒトＴ細胞数がかなり少ないことを示していると推定される。しかしながら、前記応答は一貫性があって再現可能であり、このことは、ヒト臍帯血移植マウスがＤＣ−ＳＩＧＮによるＫＬＨの標的化送達をテストするための適切なモデルであることを示している。
【０１６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤＣへの抗原の特異的標的化をテストするために、補体タンパク質Ｃ５ａ（５Ｇ１．１−ＫＬＨ）を認識する対照抗体に共役するＤ１Ｖ１−ＫＬＨかＫＬＨのいずれかでＲａｇ２−／−γｃ−／−移植マウスを免疫化して、ＫＬＨ抗体複合体に対するいかなる応答もＤＣ−ＳＩＧＮによって媒介されることを確実にした。９日後に脾臓を単離し、ＫＬＨに対する増殖応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨの投与を受けたマウスは、５μＭで約７倍、５０μＭで６倍のＫＬＨに対する強い増殖応答を示したが、５Ｇ１．１−ＫＬＨ対照抗体の投与を受けたマウスは、強い増殖応答を示さなかった（図１Ｃ）。免疫化の１４日後においても、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨによって免疫化した３匹のマウスの内の２匹は、対照抗体５Ｇ１．１−ＫＬＨと比較して５μＭ  ＫＬＨで２〜４倍の、５０μＭ  ＫＬＨで３〜５倍の、ＫＬＨに応答して良好なＴ細胞増殖を示した（図１Ｄ）。Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨ免疫化によって誘起したＫＬＨに対する応答は、ＰＨＡによって誘起した増殖と同等だったが、これはＫＬＨに対する強い応答が生じたことを示している。２匹の５Ｇ１．１−ＫＬＨ免疫マウスのいずれも、ＫＬＨに対するＴ細胞応答を示さなかったが、これは、ＤＣ−ＳＩＧＮによる標的化がＫＬＨに対する免疫応答の増大に重要であることを示している。それに対して、ＴｉｔｅｒｍａｘにおけるＫＬＨによって免疫化したマウスの応答は弱かったが、有意だった。
【０１６９】
詳細に分析したところ、ヒト免疫細胞は、全ての移植マウスにおいて検出可能であることが分かった。その数はマウスの中で２倍まで変化し、ヒト細胞数の増加は、ＫＬＨに対する免疫応答の強さの増加と相関しなかった（表ＩＩ）。これらの実験は、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨがヒト臍帯血移植マウスへの投与の際に更なるアジュバントを要求することなく刺激性免疫応答を誘起し得ることを示しているが、このことは、ＤＣ−ＳＩＧＮによる標的化が、産生的免疫応答を誘起するために十分にＤＣを刺激することを示唆しており、そして、リコール応答だけでなく未感作応答がＤＣ−ＳＩＧＮによる標的化によって生じることを示している。
【０１７０】
表ＩＩ．Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨによって免疫化された移植マウスから回収したＤＣ及びＴ細胞の数。臍帯血移植マウスを、１００μｇのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ又は１００μｇの５Ｇ１．１−ＫＬＨのいずれかによって静脈内で免疫化した。更に２匹のマウスに、１００μｇのＫＬＨ及びＴｉｔｅｒｍａｘを皮下注射した。脾臓及びリンパ節を９日後又は１４日後に摘出し、Ｔ細胞及びＤＣの頻度をフローサイトメトリーによって評価した。
【０１７１】
【表２】
2010504970.tif 000004
Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨで免疫化したヒト臍帯血移植マウスにおいて誘起したＫＬＨに対する全体的増殖応答に影響を及ぼさない抗ＣＤ４０同時刺激。Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨ免疫化後のＫＬＨに対するＴ細胞増殖の大きさは、既に更なるアジュバントの必要がないことが示唆されているＰＨＡ刺激後のＴ細胞増殖の大きさと同等だったが、ＫＬＨ応答を増加させる能力について、抗ＣＤ４０及びＤ１Ｖ１−ＫＬＨの同時投与を評価した。ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）によるＣＤ４０のライゲーションは、ＡＰＣとＴ細胞との間の相互作用において重要な手順である（Ｈｏｗｌａｎｄ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４４６５−４４７０）。Ｂｏｎｉｆａｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９６：１６２７−１６３８（２００２））は、ＣＤ４０を介したＤＣ成熟刺激の同時送達が、抗−ＤＥＣ−２０５：ＯＶＡ構築体との刺激性免疫応答の誘発に必要であることを示した。同時刺激が存在しない場合、抗−ＤＥＣ−２０５：ＯＶＡの投与は忍容性を誘起した。図２は、ＤＥＣ−２０５による標的化とは対照的に、ＤＣ−ＳＩＧＮによる抗原標的化が抗−ＣＤ４０ライゲーションによって実質的に増大しないことを示している。Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨ単独によって生じるＫＬＨに対するＴ細胞応答は、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨとＣＤ４０抗体との併用によって達成されるものと同様であった。
【０１７２】
ＤＣ−ＳＩＧＮによるｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原標的化による増殖応答の誘起は、特定の抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体に特異的でもなく限定もされない。ＫＬＨの他に、別のモデル抗原（破傷風トキソイド（ＴＴ））に対する免疫応答が増大するかどうかについて評価した。更に、Ｄ１Ｖ１に加えて、他のＤＣ−ＳＩＧＮ抗体構築体が免疫応答を誘起することができるかどうかについて取り組んだ。ＫＬＨ実験と同様に、最初に、移植マウスにおけるアジュバントにおいて非共役型ＴＴに対してヒト免疫応答が増大し得るのかどうかについて評価した。１回の免疫化を受けたマウスに由来する脾細胞はＴＴに応答して激しく増殖したが、未接種のマウスはそうではなかった（図３Ａ）。ＴＴに対する増殖応答の大きさは、ＰＨＡに対する増殖応答と同等であったが、このことはＴＴによって最大応答が得られたことを示している。第２の免疫化後、ＴＴに応答するＴ細胞の増殖能力は、単回免疫化の後よりも２〜５倍高かった。（図３Ｂ）。しかしながら、Ｔ細胞応答とは対照的に、抗原特異性免疫グロブリン応答は検出され得なかった。抗体応答を増大させるためには、更なる免疫化が必要であったかもしれず、Ｂ細胞による取り込みには遊離抗原が提供されなければならない可能性が最も高い。まとめると、臍帯血移植マウスがＴＴに対するヒトＴ細胞応答を起こすことがこれらの実験によって示される。
【０１７３】
追加実験において、ＤＣ−ＳＩＧＮにＴＴを標的化させる２種の異なる抗体複合体をテストした。ＫＬＨ抗体複合体とは対照的に、ＴＴ構築体を、全タンパク質を抗体に化学結合させる代わりに、ＴＴエピトープを含むように遺伝子操作した。ＴＴエピトープ６３２ＤＲがＤＣ−ＳＩＧＮ反応性Ｅ１０抗体（Ｅ１０−ＴＴ）のヒンジ領域内に発現した（Ｄａｋａｐｐａｇａｒｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：４２６−４４０）。Ｅ１０−ＴＴ抗原複合体（Ｅ１０−６３２ＤＲ）はｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＤＣによってプロセッシング及び提示でき、それによって、ＴＴ接種ドナーから得られたＴ細胞における有意な増殖応答が誘発されることがあらかじめ示された。Ｒａｇ２−／−γｃ−／−再構成マウスにおけるＥ１０−ＴＴ複合体によるｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＤＣの標的化がＴＴに対して未感作Ｔ細胞応答を生じさせることが可能であるのかについて評価するために、移植マウスを、Ｅ１０−ＴＴ複合体によってか、Ｅ１０とＴＴとの混合物によってかのいずれかで免疫化した。免疫化の９日後、Ｅ１０−ＴＴ複合体によって免疫化した５匹のマウスの内の３匹は、混合物としてＥ１０とＴＴとによって免疫化した５匹のマウスよりも、ＴＴに対して２倍強い免疫応答を引き起こした（図３Ｃ）。しかしながら、全体的な増殖指数は、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨによって観察されたものよりも小さかった。また、同じ実験において、前記抗体自体に対する応答が生じたかどうかについても評価した。一般的に、これは、Ｅ１０及びＴＴの混合物の投与を受けたマウス３１６８を除いた場合ではなかった。全体として、この実験は、ＤＣ−ＳＩＧＮによる抗原標的化が未感作Ｔ細胞の活性化を生じさせ得ることを確認するが、特異抗体又は特異抗原に限定されない。
【０１７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＣ−ＳＩＧＮによる抗原標的化による増殖性Ｔ細胞応答の誘起は二量体化を必要としない。実験の次にセットにおいて、増殖性Ｔ細胞応答の誘起がＤＣ−ＳＩＧＮ分子の二量体化を必要とするのかどうかについて探索した。応答が二量体化なしで引き起こされ得るのかどうかを評価するために、ｈＤ１Ｖ１−Ｇ２Ｇ４を、タンデムでＴＴエピトープの２つのコピーを含む１５アミノ酸リンカーによって分離されたＶ領域を有する一本鎖抗体に変換した（Ｄ１Ｖ１ｓｃＦｖ−ＲＲ−ＴＴと称する）。アジュバントにおけるＴＴジペプチドによる免疫化後にＴＴに応答するＴ細胞の増殖（ＴＴジペプチドを混合したＤ１Ｖ１ｓｃＦｖ−ＲＲ−ＴＴ又はＤ１Ｖ１ｓｃＦｖ）を比較した。Ｄ１Ｖ１ｓｃＦｖ−ＲＲ−ＴＴを注射した３匹全てのマウスに由来する脾細胞は、ペプチドに対する強い増殖応答を示したが、それはＰＨＡ刺激細胞と同等であった。未刺激細胞は、少し増殖しか示さなかった（図４）。ｓｃＦｖ及び遊離ジペプチドを注射したマウスのいずれもＴＴに対する応答を示さかったが、ＰＨＡに対する細胞増殖によって、ヒトＴ細胞の移植の成功が示された。また、ＴｉｔｅｒｍａｘにおけるＴＴジペプチドの投与を受けたマウスは、意外にもＰＨＡに対してではなく、ＴＴに対して増殖応答を示した。これらのデータは、主に単量体型となるべきＤＣ−ＳＩＧＮに対する一本鎖抗体による抗原標的化でも刺激性免疫応答を誘起することを示しており、ＤＣ−ＳＩＧＮ分子の二量体化が必要であるとは思われない。
【０１７５】
癌療法のポテンシャルアジュバントとしてのＤ１Ｖ１−ＫＬＨ。ＤＣ−ＳＩＧＮによる抗原標的化の最大の目的は、例えば癌抗原又は感染症抗原に対して免疫系を導くことであり、これによって癌細胞又は感染因子の消失が生じる。臍帯血移植マウスを使用した実験の全てにおいて、Ｔ細胞の増殖とは、刺激性免疫応答についての読み出し値であった。次に、ＤＣ−ＳＩＧＮによる抗原標的化によって腫瘍成長の阻害が生じるのかどうかについて取り組んだ。再度、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨをモデル系として使用した。ペプチド又は腫瘍溶解物を負荷したＤＣを含む癌ワクチンにＫＬＨを加えることによって、臨床試験においてワクチン有効性が増加したことが報告された（Ｒａｇｕｐａｔｈｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：５２１４−５２２０；Ｋｒｕｇ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：６０９４−６１００；Ｓｌｏｖｉｎ，Ｓ．Ｆ．２００５．Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ４：１１８−１２３）。故に、ｈＤ１Ｖ１（Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨ）へのＫＬＨの結合によってアジュバントの性質が向上させることができ、それによって免疫系による腫瘍細胞死滅が増加するのかどうかについて取り組んだ。免疫欠損マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）におけるヒト腫瘍成長に対するヒト免疫細胞の効果を評価するのに適切なモデルを事前に確立した。このモデルにおいて、０〜５×１０６のｈＰＢＬ及び３０，０００個のＤＣと共にバーキット−リンパ種細胞株ＲＡＪＩの皮下注射は腫瘍成長を阻害しないが、５×１０６超のｈＰＢＬの投与は、有意に腫瘍成長を阻害する。このモデルにおいて、３０，０００個のＤＣ及び３×１０６のｈＰＢＬを有するＤ１Ｖ１−ＫＬＨの投与によって腫瘍成長阻害が生じるかどうかについて評価した。Ｄ１Ｖ１―ＫＬＨ投与群の腫瘍成長を、対照抗体構築体５Ｇ１．１−ＫＬＨ又はＫＬＨ単独を投与した群の腫瘍成長と比較した。期待された通り、３０，０００個の未成熟ヒトＤＣを有する３百万個のｈＰＢＬはＲＡＪＩ細胞の腫瘍成長を有意に阻害しなかったが（図５Ａ）、３０，０００個の未成熟ＤＣを有する１千万個のｈＰＢＬは、腫瘍成長を９０％阻害する。Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨの投与は、５０％腫瘍成長を阻害したが、対照抗体５Ｇ１．１−ＫＬＨ又はＫＬＨ単独は、この実験の腫瘍成長に影響を及ぼさなかった。
【０１７６】
アポトーシス細胞の存在が、場合によってはＲＡＪＩ由来抗原の提示を増加でき、それによってこの腫瘍モデルにおいてＤ１Ｖ１−ＫＬＨの存在下でより強い腫瘍成長阻害が生じるのかどうかを更に評価した。実際、マウスにフルダラビン投与ＲＡＪＩ細胞とフルダラビン未投与ＲＡＪＩ細胞との混合物を注射した場合、腫瘍成長は、５Ｇ１．１−ＫＬＨ及びＫＬＨ投与群で５０％阻害され、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨ投与群で７５％阻害された（図５Ｂ）。ＫＬＨ−ｈＤ１Ｖ１Ｇ２／Ｇ４による腫瘍成長阻害は、細胞注射後Ｄａｙ３１から試験終了まで有意であることが認められた（ｐ＜０．０５）。この実験を同一のドナーによって反復したところ、テストした投与のいずれかを伴ってＲＡＪＩ細胞単独を注射したマウスにおいては、有意な腫瘍成長阻害は認められなかったが（図５Ｃ）、フルダラビン及び未投与細胞の混合物の投与を受けたマウスにおいては、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨの投与によって約８０％の腫瘍成長阻害が生じた（図５Ｄ）。
【０１７７】
これらの実験によって、Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨの投与は、ＫＬＨ又はＫＬＨ−５Ｇ１．１の投与よりも免疫刺激を高め、それは腫瘍細胞死滅の増加を媒介することが示唆される。Ｄ１Ｖ１−ＫＬＨは、腫瘍ペプチド又は他の型の腫瘍抗原又は腫瘍細胞溶解を生じさせる任意の療法（例えば放射線療法や化学療法）と併用したアジュバントとして治療的に有用である可能性があった。更に、これらの実験は、腫瘍又は感染症抗原を含むように設計されたＤＣ−ＳＩＧＮ抗体が、場合によっては、非標的化免疫化方法と比較して免疫応答の増大を高める可能性があるという原理の証明を提供する。
【０１７８】
均等物
本発明は、とりわけアジュバント効果を増大させる組成物及び方法を提供するものである。本発明の特定の実施形態が考察されたが、上記の明細書は例示的なものであり、限定的ではない。本発明の多くの変更は、本明細書の概要に基づいて当業者には明らかとなるであろう。本発明の全範囲は、均等物の全範囲と共に特許請求の範囲を参照することによって、及びかかる変更と共に明細書を参照することによって決定されなければならない。
【０１７９】
参照による引用
本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、下記で一覧が示されるものを含めて、あたかも個々の刊行物又は特許が具体的且つ個別に示され、参考として援用されているかのように、開示内容全体が本明細書で援用される。矛盾する場合、本明細書における全ての定義を含む本出願が支配する。
【０１８０】
また、Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）及び／又はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によって維持されているもの等、公的なデータベース内の項目と相互に関連する受入番号を参照するいかなるポリヌクレオチド及びポリペプチド配列も、その全体が参考として援用される。
【０１８１】
また、参考として援用されるものは、以下のものである：
【０１８２】
【化１】
2010504970.tif 000005
【図１Ａ】
2010504970.tif 000006
【図１Ｂ】
2010504970.tif 000007
【図１Ｃ】
2010504970.tif 000008
【図１Ｄ】
2010504970.tif 000009
【図２】
2010504970.tif 000010
【図３Ａ】
2010504970.tif 000011
【図３Ｂ】
2010504970.tif 000012
【図３Ｃ】
2010504970.tif 000013
【図４】
2010504970.tif 000014
【図５Ａ】
2010504970.tif 000015
【図５Ｂ】
2010504970.tif 000016
【図５Ｃ】
2010504970.tif 000017
【図５Ｄ】
2010504970.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月7日(2009.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010504970000001.app
【国際調査報告】
2010504970.tif 000019
2010504970.tif 000020
2010504970.tif 000021
2010504970.tif 000022
2010504970.tif 000023