(57)【要約】  本発明は、高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）及びフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、並び、にそれらに関連する疾患、障害及び状態を予防及び／又は治療するための、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）酵素に対する安定化活性を有する薬理学的シャペロンとして作用する特異的タイプの化合物の使用に関する。さらに、本発明は、本発明による化合物を含有する医薬組成物、並びに、ＨＰＡ、特に、ＰＫＵ並びにそれに関連する疾患、障害及び状態を治療する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）、特に、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、並びにそれに起因する疾患、障害及び状態を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）酵素に対する安定化活性を有する薬理学的シャペロン並びにそれらの生理学的に適合できる付加塩及び溶媒和物の使用であって、前記薬理学的シャペロンが、
ａ）一般式Ｉを有する化合物
【化１】
2010531321.tif 000024
｛式中、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＣＲＡ又はＮＲＢであり、
ＲＡは、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式の群から選択され、
ＲＢは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシの群から選択され、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、及び、特に、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化２】
2010531321.tif 000025
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ３アルコキシル、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、又はＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）から選択される｝、
ｂ）一般式ＩＩを有する化合物
【化３】
2010531321.tif 000026
｛式中、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、又はＣＯＲＡ（ＲＡは、上記のように定義される）から選択され、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は、置換ヘテロ環式、及び、特に、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化４】
2010531321.tif 000027
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）から選択される｝、
ｃ）一般式ＩＩＩを有する化合物
【化５】
2010531321.tif 000028
｛式中、Ｘ２は、Ｏ、又はＳの群から選択され、
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡは、上記のように定義される）、アルカリル基、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式、及び、特に、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化６】
2010531321.tif 000029
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ＮＨ２、アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ１１は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、及びＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）から選択される｝、
ｄ）一般式ＩＶを有する化合物
【化７】
2010531321.tif 000030
｛式中、Ｘ３及びＸ５は、独立して、Ｏ、及びＳの群から選択され、Ｘ４は、Ｏ、Ｓ又はＮＲＢ（ＲＢは、上記のように定義される）であり、
Ｒ１２は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、及び置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ１３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ１４及びＲ１５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式、好ましくは、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化８】
2010531321.tif 000031
（式中、Ａ、Ｂ及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｎ（ＲＢ）２、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式から選択される）、特に、Ｏ、Ｓ、及びＮＲＢ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）からなる群から選択される１又は２個のヘテロ原子をその骨格内に含有し、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、及びＣ１〜Ｃ３アミノアルキルからなる群から選択される１又は２個の独立した置換基を含有する６員ヘテロ環式環から選択される｝
からなる群から選択される使用。
【請求項２】
化合物が、Ｘ３及びＸ５がＳであり、Ｘ４がＯであり、Ｒ１４が、Ｏ、Ｓ、ＮＲＢ（ＲＢは、上記のように定義される）からなる群から選択される１又は２個のヘテロ原子をその骨格内に含有し、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、及びＣ１〜Ｃ３アミノアルキルからなる群から選択される１又は２個の独立した置換基を含有する６員ヘテロ環式環である一般式ＩＶを有する化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
一般式ＩＶの化合物が、Ｘ３及びＸ５がＳであり、Ｘ４がＯであり、Ｒ１２及びＲ１３がメチルであり、Ｒ１４が水素であり、Ｒ１５がメチルフェニルである化合物である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
化合物が、Ｘ２がＯであり、Ｒ９が、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有する置換ベンゼン環
【化９】
2010531321.tif 000032
（式中、Ａ、Ｂ及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、又は置換アリールからなる群から選択される）である一般式ＩＩＩを有する化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
Ｘ２がＯであり、Ｒ８がニトロ基であり、Ｒ９がメチルフェニル基であり、Ｒ１０がアミノ基であり、Ｒ１１が水素である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
化合物が、Ｒ５及びＲ６が、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ、及びＣを含有する置換ベンゼン環
【化１０】
2010531321.tif 000033
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、又は置換アリールからなる群から選択される）であり、Ｒ７が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、Ｒ４が、ニトロ基又はハロゲンである一般式ＩＩの化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ７がメチルであり、Ｒ４がニトロであり、Ｒ５及びＲ６が、置換されていてもよいフェニルである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
化合物が、Ｘ１がＯであり、Ｒ１が、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ、及びＣを含有する置換ベンゼン環
【化１１】
2010531321.tif 000034
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、又は置換アリールからなる群から選択される）である一般式Ｉによる化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
Ｘ１がＯであり、Ｒ１がフェニルであり、Ｒ２がアミノ基であり、Ｒ３がシアノ基である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＰＫＵを予防及び／又は治療するための医薬品の調製における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
場合により薬学的に許容できる担体と一緒に請求項１〜９のいずれか一項に記載の一般構造Ｉの化合物及び／又は一般式ＩＩの化合物及び／又は一般式ＩＩＩの化合物及び／又は一般式ＩＶの化合物又はその生理学的に許容できる酸付加塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物。
【請求項１２】
制御放出医薬調製物である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
カプセル剤、錠剤、丸薬、マトリクス又はゲルとしてさらに定義される、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
活性成分が、使用中に６時間を超える期間にわたって放出される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
デポー製剤としてさらに定義される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
ＨＰＡ、特に、ＰＫＵの個体を治療する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の一般式Ｉによる化合物、及び／又は一般式ＩＩによる化合物、及び／又は一般式ＩＩＩによる化合物、及び／又は一般式ＩＶによる化合物又はその生理学的に許容できる酸付加塩若しくは溶媒和物を活性成分として含む組成物を、個体に投与することを含む方法。
【請求項１７】
活性成分を含む組成物が、制御放出医薬調製物である、請求項１６に記載の患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）及びフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、並びに、それらに関連する疾患、障害及び状態を治療するための、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）酵素に対する安定化活性を有する薬理学的シャペロンとして作用する特異的タイプの化合物の使用に関する。さらに、本発明は、本発明による化合物を含有する医薬組成物、並びに、ＨＰＡ、特に、ＰＫＵ並びにそれに関連する疾患、障害及び状態を治療する方法に関する。
【０００２】
［背景技術］
ＰＫＵは、身体が、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）を代謝してＬ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）にするのに必要なＰＡＨ酵素を含有していないか、又は、より少ない量か若しくはあまり安定でない形態でＰＡＨ酵素を含有しているが、代わりにアミノ基転移によってフェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換するヒト遺伝性障害であり、しかしながら、Ｌ−Ｐｈｅの脱炭酸が起きることもある。即ち、前記疾患に罹患している個体の身体は、必須アミノ酸であるフェニルアラニンを利用することができない。アミノ酸は、個体が、通常、必須アミノ酸を作らないことから、食物の構成成分である。「古典的フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）」において、フェニルアラニンを分解する酵素であるＰＡＨは、完全に又はほぼ完全に欠乏しているため、チロシンへの変換は起きない。この酵素がないと、フェニルアラニン及び他の酵素経路からのその分解化学物質は、血液及び身体組織中に蓄積する（Ｓｃｒｉｖｅｒ  ＣＲ、Ｋａｕｆｍａｎ  Ｓ．Ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉａ：ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．（Ｓｃｒｉｖｅｒ  ＣＲ、Ｂｅａｕｄｅｔ  ＡＬ、Ｖａｌｌｅ  Ｄ、Ｓｌｙ  ＷＳ編、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ。第８版  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００１）１６６７〜１７２４）。
【０００３】
さらに、「高フェニルアラニン血症」（ＨＰＡ）と呼ばれる疾患は、上昇した血液フェニルアラニンを有する現象について記載するために使用され、通常、特異的形態のＰＫＵを包含する。ＨＰＡを示す患者の約９８％が、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ｐａｈ）遺伝子の変異を持っており、一方、残りの２％は、主に、ＰＡＨ補因子であるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の合成又は再生に関与する酵素に悪影響がある（Ｓｃｒｉｖｅｒ  ＣＲ、Ｋａｕｆｍａｎ  Ｓ．前掲書）。以下において、ＨＰＡは、上昇したフェニルアラニンレベルを有することを特徴とするすべてのタイプの疾患又は障害又は状態を包含するために使用される。ＰＫＵは、ＨＰＡがｐａｈ遺伝子の変異に起因する、ＨＰＡの一般用語に分類される特殊な形態の障害を表す。
【０００４】
前に述べたように、ＰＫＵとＨＰＡは共に、ｐａｈ遺伝子の変異により引き起こされる。ＰＫＵに関係する変異の６０％以上は、ミスセンス変異（タンパク質上の単一アミノ酸置換につながる）であり、ＰＡＨ機能に対するそれらの主な効果は、タンパク質に関係しているように思われ、ＰＡＨ機能に対するそれらの主な効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質ミスフォールディング及び代謝回転増加に関係しているように思われる。アミノ酸Ｌ−ＰｈｅをＬ−Ｔｙｒに変換する際の欠陥によって、Ｌ−Ｐｈｅは、血液中に蓄積し、主に、尿中に未変化で排泄され、一部は、アミノ基転移を受けてフェニルピルビン酸となり、フェニル酢酸、フェニル乳酸及びｏ−ヒドロキシフェニル酢酸へさらに代謝されることがあり、すべてが尿中に排泄される（Ｓｃｒｉｖｅｒ  ＣＲ、Ｋａｕｆｍａｎ  Ｓ．前掲書）、Ｗａｔｅｒｓ  ＰＪ、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２００３；２１（４）：３５７〜６９；Ｓｃｒｉｖｅｒ  ＣＲ．Ｔｈｅ  ＰＡＨ  ｇｅｎｅ，ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ，ａｎｄ  ａ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｓｈｉｆｔ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２００７。
【０００５】
ＰＫＵ、及びＨＰＡの大部分の他の原因は、劣性様式で遺伝される（Ｓｃｒｉｖｅｒ  ＣＲ、Ｋａｕｆｍａｎ  Ｓ．前掲書）。このことは、患者が、この障害に関して２つの形質を受け継いだことを意味する。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子に１つだけ変異を持っている者は、ＰＫＵのキャリアと呼ばれ、キャリアは、この障害の症状を有していない。古典的ＰＫＵ及びＨＰＡの他の原因は、白人又は東洋人１０，０００〜２０，０００人につき約１人に影響を及ぼす。アフリカ系アメリカ人における発生率はずっと少ない。これらの障害は、男性と女性で等しい頻度である。
【０００６】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ、フェニルアラニン４−モノオキシゲナーゼ；ＥＣ１．１４．１６．１）は、補基質としてのテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）及び分子二酸素の存在下でＬ−ＰｈｅのＬ−Ｔｙｒへの水酸化を触媒する非ヘム鉄依存性酵素である、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ＰＦ、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０００；７４：２３５〜２９４。ヒトにおいて、ＰＡＨ活性は、主に、肝臓に存在し、肝臓におけるタンパク質及び神経伝達物質の生合成のためにＬ−Ｔｙｒを提供するのに不可欠であり、タンパク質及び神経伝達物質の生合成のためにＬ−Ｔｙｒを提供するのに不可欠であり、そのうえ、エネルギー代謝に関与している。変異を引き起こす約５００の疾患がＰＡＨ遺伝子について記載されている。例えば、ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｐａｈｄｂ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃｓにてフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子座知識ベース（ＰＡＨｄｂ）を参照されたい。ＰＡＨの機能喪失に関与する分子機構は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びおそらくはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＡＨ酵素の立体配座安定性低下及び、一部の場合に、速度論的異常に向けられてきた（Ｗａｔｅｒｓ  ＰＪ．、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２００３；２１（４）：３５７〜６９；Ｓｃｒｉｖｅｒ  ＣＲ．、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２００７；Ｅｒｌａｎｄｓｅｎ  Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００４；１０１（４８）：１６９０３〜８）。
【０００７】
人工食製剤及び新生児スクリーニングテストによる早期診断を使用することによるＬ−Ｐｈｅ摂取の制限は、精神遅滞を包含する疾患の主要症状を予防する際の著しい成功につながった。しかしながら、食事療法は、「生涯にわたって」維持しなければならず、相対的に費用がかかり社会的負担があり、続けられない場合、妊娠中の胎児発達に影響を及ぼすことがある。
【０００８】
典型的には、ＨＰＡは、精神遅滞に関係している。さらに、古典的ＰＫＵの未治療小児は、出生時には正常であるが、早期の発達指標に達することができず、小頭症を発症し、脳機能の進行性障害を示す。多動、発作、及び重度精神遅滞は、後年になっての主要な臨床的問題である。脳波異常；皮膚、毛髪及び尿の「ネズミのような」臭い（フェニル酢酸蓄積に起因する）；並びに色素脱失及び湿疹の傾向は、悲惨な臨床像を完成させている。妊婦のＰＫＵについては、小児の健康のために、妊娠前及び妊娠中に低いフェニルアラニンレベルを維持することが、ＰＫＵの女性にとって、不可欠である。さもないと、結果として、小児は、先天性心疾患、成長遅延、小頭症及び精神遅滞を発症することがある（Ｇａｍｂｏｌ  ＰＪ．、Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｕｒｓ  ２００７；２２（２）：１２９〜３８）。
【０００９】
現在、低Ｐｈｅ食を部分的又は全体的に代用してＰＫＵを治療するためのいくつかの異なる戦略が検討されている。ＢＨ４補充は、中等度及び重度のＰＫＵ表現型において短期及び長期にＬ−Ｐｈｅレベルを低下させＬ−Ｐｈｅ耐性を高め、おそらく分解／不活性化に対するＰＡＨ変異体タンパク質の安定化が関わる多因子機構（Ｅｒｌａｎｄｓｅｎ  Ｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００４；１０１（４８）：１６９０３〜８）によって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＬ−Ｐｈｅ酸化を増加させる（Ｂｌａｕ  Ｎ、Ｅｒｌａｎｄｓｅｎ  Ｈ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｄ  ２００４；８２（２）：１０１〜１１）ことが証明されている。大型中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）補充は、Ｌ型アミノ酸キャリアによる血液脳関門を通過するＬＮＡＡ輸送のＬ−Ｐｈｅ誘発性阻害の改善に基づいている、Ｍａｔａｌｏｎ  Ｒら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ２００３；１１２（６Ｐｔ２）：１５７０〜１５７４。上記のアプローチは、制限的Ｌ−Ｐｈｅ食を容易にすることができる。遺伝子療法及び酵素補充療法のような追加のアプローチは、Ｌ−Ｐｈｅ食事制限を完全に取り除くことを目的にしており、現在、熱心な研究の対象である（Ｇａｍｅｚ  Ａら、Ｍｏｌ  ｔｈｅｒ  ２００５；１１（６）：９８６〜９  Ｗａｎｇ  Ｌら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  ２００５；８６（１〜２）：１３４〜４０；Ｈａｒｄｉｎｇ  ＣＯら、Ｔｈｅｒ  ２００６；１３（５）：４５７〜６２；Ｄｉｎｇ  Ｚら、Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒ  ２００６；１３（７）：５８７〜９３。
【００１０】
本発明の目的は、ＰＫＵ及びＨＰＡを治療するための新たなアプローチを提供すること及びそのために有用な新たな化合物を提供することである。
【００１１】
［本発明の概要］
本発明者らは、ＨＰＡ及びＰＫＵを予防及び／又は治療するための新たな化合物を見いだした。上記化合物は、通常はＨＰＡ又はＰＫＵの原因である変異体ＰＡＨ酵素を安定化する。これらのいわゆる薬理学的シャペロンは、ＰＡＨ変異体タンパク質を安定化し、したがって、Ｌ−ＰｈｅをＬ−ｔｙｒに処理する上記酵素の体内における酵素活性を増加させる。本発明による上記化合物は、リガンド結合によってＰＡＨ活性を有意に阻害することなく酵素を安定化する。
【００１２】
したがって、本発明は、ＨＰＡ、特に、ＰＫＵ並びにそれに起因する疾患、障害及び状態を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における、ＰＡＨに対する安定化効果を有する薬理学的シャペロン並びにその生理学的に適合できる酸及び塩基付加塩並びに溶媒和物の使用に関する。上記薬理学的シャペロンは、
ａ）一般式Ｉを有する化合物
【化１】
2010531321.tif 000002
｛式中、Ｘ１は、Ｏ１Ｓ１ＣＲＡ又はＮＲＢであり、
ＲＡは、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式の群から選択され、
ＲＢは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシの群から選択され、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ１、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、及び、特に、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化２】
2010531321.tif 000003
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル  アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、又はＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）から選択される｝、
ｂ）一般式ＩＩを有する化合物
【化３】
2010531321.tif 000004
｛式中、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、又はＣＯＲＡ（ＲＡは、上記のように定義される）から選択され、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、アリール  置換アリール、ヘテロ環式、又は、置換ヘテロ環式、及び、特に、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換基ベンゼン環
【化４】
2010531321.tif 000005
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ  ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）から選択される｝、
ｃ）一般式ＩＩＩを有する化合物
【化５】
2010531321.tif 000006
｛式中、Ｘ２は、Ｏ、又はＳの群から選択され、
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル  Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡは、上記のように定義される）、アルカリル基、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式、及び、特に、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化６】
2010531321.tif 000007
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ＮＨ２、アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ５アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ１１は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、及びＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）から選択される｝、
ｄ）一般式ＩＶを有する化合物
【化７】
2010531321.tif 000008
｛式中、Ｘ３及びＸ５は、独立して、Ｏ、及びＳの群から選択され、Ｘ４は、Ｏ、Ｓ又はＮＲＢ（ＲＢは、上記のように定義される）であり、
Ｒ１２は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２  ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ  ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、及び置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ１３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２  アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、Ｒ１４及びＲ１５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡは、上記のように定義される）アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式、好ましくは、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化８】
2010531321.tif 000009
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｎ（ＲＢ）２、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式から選択される）、特に、Ｏ、Ｓ、及びＮＲＢ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）からなる群から選択される１又は２個のヘテロ原子をその骨格内に含有し、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、及びＣ１〜Ｃ３アミノアルキルからなる群から選択される１又は２個の独立した置換基を含有する６員ヘテロ環式環から選択される｝
の群から選択される。
【００１３】
化合物は、一般式ＩＶ若しくはＩＩＩの化合物、又は薬学的に許容できるその塩及び溶媒和物、特に、生理学的に適合できる酸及び塩基付加塩であることが好ましい。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明による化合物を含有する医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明の他の態様は、ＨＰＡ、特に、ＰＫＵを有する個体を治療する方法であって、前記個体に、上記で定義されているような一般式Ｉによる化合物及び／又は一般式ＩＩによる化合物及び／又は一般式ＩＩＩによる化合物、及び／又は一般式ＩＶによる化合物又はその薬学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を活性成分として含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）においてＰＡＨを安定化することが見いだされた４つの化合物。Ａ）ＡＮＳ蛍光によってモニターするＨＴＳ手法から得られる、ヒット化合物５（△）、６（◇）、１１（▽）及び１３（□）の非存在下（○）又は１００μＭ存在下でのｗｔ−ＰＡＨの代表的熱変性プロファイル。Ｂ）ヒット化合物５  （５−アミノ−３−（５−メチル−３−フェニル−４−イソオキサゾリル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル）、６  （１−ベンズヒドリル−４−（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）ピペラジン）、１１  （３−アミノ−２−ベンジル−７−ニトロ−４−（２−キノリル）−１，２−ジヒドロイソキノリン−１−オン）及び１３  （５，６−ジメチル−３−（４−メチル−２−ピリジニル）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（１Ｈ）−オン）の化学構造。
【図２】異なる濃度のヒット化合物５（Ａ）、６（Ｂ）、１１（Ｃ）及び１３（Ｄ）の非存在下又は存在下でのｗｔ−ＰＡＨの代表的熱変性プロファイルを示す図である。実験は、ヒット化合物０（□）、２５（○）、５０（△）、１００（▽）μＭを使用して行った。プロットは、少なくとも３つの独立した実験を表している。
【図３】推定上の阻害を検討するための、標準条件における組換えＰＡＨの活性に対するヒット化合物の効果を示す図である。実験は、１００μＭ  Ｌ−Ｐｈｅ及び１０μＭ  ＢＨ４（Ａ）又は１ｍＭ  Ｌ−Ｐｈｅ及び２００μＭ  ＢＨ４（Ｂ）と共に、各化合物１００μＭにて行った。サンプルは、活性測定に先立ってＬ−Ｐｈｅとプレインキュベートするか（黒）又はプレインキュベートしなかった（白）。データは、三回の重複実験の平均値±ＳＤである。
【図４】Ａ２９３細胞において一過性に発現されたｗｔ−ＰＡＨ及びＰＫＵ変異体に対するヒット化合物１１（黒）及び１３（白）の効果を示す図である。化合物の濃度は、４０μＭとした。Ａ）ＰＡＨ活性レベルに対する効果。Ｂ）ウェスタンブロット分析により測定される免疫反応性タンパク質レベルに対する効果。活性及び免疫反応性タンパク質レベルは、各ＰＡＨタンパク質についてＤＭＳＯ１％の存在下での対照と比較した比として表される。データは、少なくとも３つの独立した発現実験の平均値±ＳＤである。比活性は、ｗｔ−ＰＡＨ：７．１±２．３；Ｉ６５Ｔ−ＰＡＨ：１．７±０．６；Ｒ６８Ｓ−ＰＡＨ：３．３±０．４；Ｒ２６１Ｑ−ＰＡＨ：４．９±１．９ｎｍｏｌ  Ｌ−Ｔｙｒ／ｍｉｎ・ｍｇであった。Ｒ２５２Ｗ−ＰＡＨについての活性は、アッセイの検出限界（＜０．０１ｎｍｏｌ  Ｌ−Ｔｙｒ／ｍｉｎ・ｍｇタンパク質）よりも低かったため、信頼できるとは見なされなかった。
【００１７】
［本発明の詳細な説明］
本発明は、ＰＡＨ酵素に対する安定化活性を有し、したがって、個体の身体におけるフェニルアラニンのチロシンへの変換率を増加させる化合物の使用に関する。上記化合物は、ＨＰＡ、特に、ＰＫＵ、又はそれに関連する疾患、障害若しくは状態を予防及び／又は治療するための医薬品を調製するのに有用である。
【００１８】
即ち、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質にとっての薬理学的シャペロンに相当する比較的低い濃度の本発明による化合物は、ＰＡＨ残留活性及び変異したＰＡＨタンパク質のタンパク質レベルに対する安定性を有意に増加させることができる。
【００１９】
これに関して、「薬理学的シャペロン」という用語は、化学シャペロン又は多くはタンパク質骨格の優先的脱水によりコンパクトな天然状態を非特異的に安定化し、したがって、正確なフォールディングの効率を増加させるグリセロール若しくはＴＭＡＯのようなオスモライト（Ａｒａｗａｋａ  Ｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００６；１７６４（１１）：１６７７〜８７を参照）と対照的に、タンパク質の天然状態を安定化する小分子（例えば、Ａｒａｗａｋａ  Ｔら、前掲書）を指す。
【００２０】
「療法」又は「治療」という用語は、哺乳類、例えば、患者と呼ばれることが多いヒト、又は動物のような個体の状態に有益な変化を生み出すことが意図されているプロセスを指す。有益な変化は、例えば、機能回復、症状低減、疾患、障害、若しくは状態の進行の制限若しくは遅延、患者の状態、疾患若しくは障害の悪化の予防、制限若しくは遅延のうちの１つ又は複数を包含することがある。そのような療法は、通常、とりわけ、薬物の投与を包含する。
【００２１】
本明細書において使用されるように、それらに起因するか又はそれらに関連する「疾患、障害及び状態」という用語は、精神遅滞のようなＨＰＡ及びＰＫＵに起因する疾患、障害及び状態を指す。さらに、ＰＡＨ機能が、白斑のように、ＨＰＡに至るＰＡＨの阻害又は不活性化によって影響を受ける障害が包含される（Ｐｅｙ  ＡＬら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ  ２００６；２０（１２）：２１３０〜２）。
【００２２】
本明細書において使用されるように、本明細書において互換的に使用される「個体」又は「対象」という用語は、療法又は予防を必要としている個体又は対象を指す。対象又は個体は、脊椎動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましく、ヒトであることが特に好ましい。
【００２３】
一態様において、本発明は、ＨＰＡ、特に、ＰＫＵ、並びにそれに起因する疾患、障害及び状態を予防及び／又は治療するための、一般式Ｉを有する化合物、一般式ＩＩを有する化合物、一般式ＩＩＩを有する化合物及び／又は一般式ＩＶを有する化合物並びにその生理学的に適合できるそれらの塩及び溶媒和物の使用に関する。
【００２４】
一般式Ｉを有する化合物を以下に示す
【化９】
2010531321.tif 000010
｛式中、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＣＲＡ又はＮＲＢであり、
ＲＡは、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式の群から選択され、
ＲＢは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシの群から選択され、
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、及び、特に、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ、及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化１０】
2010531321.tif 000011
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、又はＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）から選択される｝。
【００２５】
特に好ましい実施形態において、一般式Ｉは、Ｘ１がＯであり、Ｒ１が、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有する置換ベンゼン環
【化１１】
2010531321.tif 000012
（式中、Ａ、Ｂ及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）である化合物である。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、Ｒ３はシアノ基であり、及び／又はＲ２はアミノ基である。
【００２７】
一般式Ｉの化合物は、Ｒ１がフェニルであり、Ｒ２がアミノ基であり、Ｒ３がシアノ基であり、Ｘ１がＯである化合物であることが特に好ましい。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、本発明による化合物は、一般式ＩＩを有する化合物である
【化１２】
2010531321.tif 000013
｛式中、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、又はＣＯＲＡ（ＲＡは、上記のように定義される）から選択され、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は、置換ヘテロ環式、及び、特に、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化１３】
2010531321.tif 000014
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）から選択される｝。
【００２９】
一般式ＩＩを有する化合物は、Ｒ５及びＲ６が、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ、及びＣを含有する置換ベンゼン環
【化１４】
2010531321.tif 000015
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、又は置換アリールからなる群から選択される）である化合物であることが好ましい。
別の実施形態において、Ｒ７は、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基である。
さらに、Ｒ４は、ニトロ基又はハロゲンであることが好ましい。
【００３０】
一般式ＩＩの化合物は、Ｒ７がメチルであり、Ｒ４がニトロであり、Ｒ５及びＲ６が、置換されていてもよいフェニルである化合物であることが特に好ましい。
【００３１】
別の好ましい実施形態は、一般式ＩＩＩを有する化合物の使用に関する
【化１５】
2010531321.tif 000016
｛式中、Ｘ２は、Ｏ、又はＳの群から選択され、
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡは、上記のように定義される）、アルカリル基、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式、及び、特に、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ、及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化１６】
2010531321.tif 000017
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ＮＨ２、アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式からなる群から選択される）から選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ１１は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｎ（ＲＢ）２、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式、及びＣＯＲＡ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）から選択される｝。
【００３２】
Ｘ２がＯであり、Ｒ９が、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ、及びＣを含有する置換ベンゼン環
【化１７】
2010531321.tif 000018
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ３アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、又は置換アリールからなる群から選択される）である一般式ＩＩＩの化合物が特に好ましい。
【００３３】
Ｒ１０がアミノ基であり、及び／又はＲ９が水素であり、及び／又はＲ８がＮＯ２である化合物がさらに好ましい。
【００３４】
Ｒ８がニトロ基であり、Ｒ９がベンジル基であり、Ｒ１０がアミノ基であり、Ｒ１１が水素である一般式ＩＩＩの化合物が特に好ましい。
【００３５】
さらに、別の実施形態は、一般式ＩＶを有する化合物の使用に関する
【化１８】
2010531321.tif 000019
｛式中、Ｘ３及びＸ５は、独立して、Ｏ、及びＳの群から選択され、Ｘ４は、Ｏ、Ｓ又はＮＲＢ（ＲＢは、上記のように定義される）であり、
Ｒ１２は、Ｈ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、及び置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ１３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式から選択され、
Ｒ１４及びＲ１５は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６アルケニル、ＣＯＲＡ（ＲＡは、上記のように定義される）、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、又は置換ヘテロ環式、好ましくは、以下に示すように置換基Ａ、Ｂ、及びＣを含有し、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を含有していてもよい置換ベンゼン環
【化１９】
2010531321.tif 000020
（式中、Ａ、Ｂ、及びＣは、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｎ（ＲＢ）２、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、ＮＯ２、アリール、置換アリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式から選択される）、特に、Ｏ、Ｓ、及びＮＲＢ（ＲＡ及びＲＢは、上記のように定義される）からなる群から選択される１又は２個のヘテロ原子をその骨格内に含有し、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、及びＣ１〜Ｃ３アミノアルキルからなる群から選択される１又は２個の独立した置換基を含有する６員ヘテロ環式環から選択される｝。
【００３６】
特に、化合物は、Ｘ３及びＸ５がＳであり、Ｘ４がＯであり、Ｒ１４が、Ｏ、Ｓ、ＮＲＢ（ＲＢは、上記のように定義される）からなる群から選択される１又は２個のヘテロ原子をその骨格内に含有し、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、及びＣ１〜Ｃ３アミノアルキルからなる群から選択される１又は２個の独立した置換基を含有する６員ヘテロ環式環である一般式ＩＶの化合物である。
【００３７】
さらなる好ましい実施形態において、Ｒ１２及びＲ１３がメチルであり、Ｘ３がＳであり、Ｒ１４がメチルピリジニルであり、Ｘ４がＯであり、Ｘ５がＳであり、Ｒ１５が水素である一般式ＩＶの化合物が使用される。
【００３８】
「アルキル」という用語は、本明細書において、別途指示されていない限り、１〜６個の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖両方の飽和脂肪族炭化水素を指すために使用され、「アルケニル」は、別途指示されていない限り、１又は２個の炭素−炭素二重結合を含み、２〜８個の炭素原子を含有する直鎖と分岐鎖両方のアルキル基を包含することが意図されている。
【００３９】
「置換アルキル」、及び「置換アルケニル」という用語は、ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ、ＮＯ２、アミノ、カルボニル、ケト、アリール、ヘテロ環式、置換アリール、置換アリール、置換ヘテロ環式、アルコキシ、アリールオキシ、置換アルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボキシ、アルキルアミノ、アリールチオを包含する群からの１つ又は複数の置換基を有する上述のアルキル、及びアルケニルを指す。これらの置換基は、アルキル、又はアルケニル基のいずれの炭素に接続していてもよいが、但し、接続は、安定な化学的部分を構築するものとする。
【００４０】
「アリール」という用語は、本明細書において、単環又は、縮合若しくは連結した環の少なくとも一部が共役芳香族系を形成するように一緒に縮合若しくは連結された複数の芳香族環であってもよい芳香族系を指すために使用される。アリール基は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、テトロヒドロナフチル（ｔｅｔｒｏｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈｙｌ）、フェナントリルを包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
「ヘテロ環式」という用語は、本明細書において、飽和、部分不飽和、又は不飽和であり、炭素原子並びにＮ、Ｏ及びＳ原子を包含する群から選択される１〜４個のヘテロ原子からなる安定な４〜１１員の単環式又は安定な多環式ヘテロ環式環について記載するために使用される。Ｎ及びＳ原子は酸化されていてもよい。ヘテロ環式環は、上記で定義したヘテロ環式環のうちのいずれかがアリール環と縮合しているいずれの多環式環も包含する。ヘテロ環式環は、得られる構造が化学的に安定であるならば、いずれのヘテロ原子又は炭素原子においても結合することができる。そのようなヘテロ環式基は、テトラヒドロフラン、ピペリジニル、ピペラジニル、２−オキソピペリジニル、アゼピニル、ピロリジニル、イミダゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル、インドリル、キノリニル、チエニル、フリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、及びイソキノリニルを包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
「置換ヘテロ環式」という用語は、本明細書において、ハロゲン、ＣＮ、ＯＨ  ＮＯ２、アミノ、アルキル、置換アルキル、循環的に（ｃｙｃｌｉｃａｌｌｙ）、アルケニル、アルコキシ、アリールオキシ、置換アルキルオキシ、アルキルカルボニルを包含する群から選択される１〜４個の置換基を有する定義したばかりのヘテロ環式について記載するために使用される。
【００４３】
「アルコキシ」という用語は、本明細書において、ＯＲ基を指すために使用され、Ｒは、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル又は置換アルキルである。
【００４４】
「アミノアルキル」という用語は、同じか又は異なっていてもよい１〜６個の炭素原子を含有するアルキル又は置換アルキル基であり、その結合点が窒素原子上にある二級と三級両方のアミンを指す。
【００４５】
「ハロゲン」という用語は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｒ又はＩを指す。
【００４６】
さらなる態様において、本発明は、場合により薬学的に許容できる担体と一緒に、本明細書において定義されているような一般構造Ｉの化合物及び／又は一般式ＩＶの化合物又はその生理学的に許容できる塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物に関する。
【００４７】
本明細書において使用されているように、「担体」という用語は、希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。
【００４８】
したがって、更なる態様において、本発明は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）若しくは（ＩＶ）による化合物又はそれらの塩若しくは溶媒和物、及び、場合により、薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。そのような医薬組成物は、治療有効量の化合物及び、場合により、薬学的に許容できる担体を含む。医薬組成物は、本明細書に記載されているように、患者に生理学的に許容できる担体と一緒に投与することができる。具体的実施形態において、「薬学的に許容できる」という用語は、動物、より詳細にはヒトにおいて使用することが規制当局又は他の一般的に認められた薬局方により承認されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水、及びラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物又は合成起源のものを包含する油などの無菌液体であってもよい。水は、医薬組成物が静脈内に投与される場合に好ましい担体である。食塩溶液並びに水性のブドウ糖及びグリセロール溶液も、特に、注射用液剤のための液体担体として用いることができる。適当な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース  ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを包含する。組成物は、望ましい場合、微量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。組成物は、伝統的な結合剤及びトリグリセリドなどの担体と一緒に、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、マグネシウム、カーボネートなどの標準的担体を包含することができる。適当な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０））に記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、適当量の担体と一緒に、好ましくは、精製形態で、式（Ｉ）及び（ＩＩ）による化合物、それらの塩又は溶媒和物を含有する治療有効量の前述の化合物を含有するであろう。製剤は、投与の様式に適合するべきである。
【００４９】
典型的には、薬学的に又は治療的に許容できる担体は、活性成分の生物学的活性の有効性を阻害せず、宿主又は患者に対して毒性でない担体媒体である。
【００５０】
別の好ましい実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物としてルーチンな手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張性水性緩衝液中の液剤である。必要な場合、組成物は、可溶化剤及び注射部位における痛みを軽減するためのリドカインなどの局所麻酔薬も包含することがある。一般的に、成分は、例えば、活性剤の量を表示したアンプル又はサシェット（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密閉された容器中の乾燥した凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、単位剤形で別々に又は混ぜ合わせられて供給される。組成物が点滴により投与される場合、無菌の医薬品等級の水又は食塩水を含有する点滴ボトルで投薬することができる。組成物が注射により投与される場合、投与に先立って成分を混ぜることができるように、注射用の滅菌水又は食塩水のアンプルを提供することができる。
【００５１】
本発明と関連して使用するための医薬組成物は、中性又は塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容できる塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンで形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンで形成されるものを包含する。
【００５２】
本発明の組成物に適用されるような「治療的又は薬学的に有効な量」は、望ましい生物学的結果を誘導するのに十分な組成物の量を指す。その結果は、徴候、症状、又は原因若しくは疾患の軽減、又は生物学的システムのいずれか他の望ましい変化であってもよい。本発明において、結果は、典型的には、感染に対する免疫学的応答の増加又は炎症プロセスに対する応答の抑制が関わるであろう。
【００５３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、場合により、最適な用量範囲を特定するのに役立てるために用いられることがある。製剤において用いられる正確な投与量は、投与の経路、及び疾患又は障害の重症度によっても異なり、開業医の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効な投与量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデルテキストシステム（ｔｅｘｔ  ｓｙｓｔｅｍ）から得られる用量反応曲線から外挿することができる。医薬組成物は、直接又は補助剤との組合せで投与されることが好ましい。
【００５４】
「投与された」という用語は、本明細書において定義されているような式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）による化合物を含有する化合物、それらの塩及び溶媒和物を含む上述の医薬組成物の、個体への、治療有効投与量の投与を意味する。「治療有効量」とは、効果を引き起こすための投与量を意味する。正確な投与量は、治療の目的によって異なり、既知の技法を使用して当業者によって突き止められるであろう。当技術分野において知られており上記に記載されているように、全身対局所的輸送、年齢  体重、全体的な健康、性別、食事、投与の時間  薬物相互作用及び状態の重症度についての調整が必要であることがあり、当業者によりルーチンな実験で突き止められるであろう。
【００５５】
さらに別の実施形態において、本発明は、高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）、特に、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）並びにそれに関連する疾患、障害及び状態に苦しんでいる個体を予防及び治療する方法であって、前記個体に、活性成分としての式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）による化合物又はそれらの塩若しくは溶媒和物、及び、場合により、薬学的に許容できる担体を含む医薬品を有効量投与するステップを含み、特に、ＨＰＡ及びＰＫＵを予防又は治療するのに有用な方法に関する。
【００５６】
上記方法は、ヒト療法と獣医学的応用例の両方に適用可能である。望ましい治療活性を有する本明細書に記載されている化合物は、本明細書に記載されているように、患者に対して生理学的に許容できる担体中で投与することができる。導入の方法に応じて、化合物は、以下で議論されるような様々な方法で製剤化することができる。治療効果のある化合物の製剤中の濃度は、約０．１〜１００ｗｔ％と変わることがある。薬剤は、単独又は他の治療との組合せで投与することができる。
【００５７】
医薬組成物の投与は、これらに限定されないが、経口的に、皮下に、静脈内に、動脈内、結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）、髄内の、髄腔内の、イントラベントリキュラー（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）に、鼻腔内に、結膜の、気管支内の、経皮的に、直腸内に、腹腔内に、筋肉内に、肺内の、膣に、直腸に、又は眼内に投与することを含む、上記で議論されているような様々な方法で行うことができる。一部の場合において、例えば、創傷及び炎症の治療において、薬学的に有効な薬剤を、溶液ドライスプレーとして直接塗布することができる。
【００５８】
主治医及び臨床因子は、用量レジメンを決定するであろう。典型的投与量は、例えば、０．００１〜１０００ｐｇのような、０．００１〜１０００ｍｇの範囲であってもよく、しかしながら、この例示的範囲に満たないか又は超える投与量は、特に前述の因子を考慮して想定されている。
【００５９】
本発明による医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、マトリクス又はゲル剤の形態で存在する、制御放出医薬調製物であることが好ましい。
【００６０】
本発明による制御放出医薬調製物は、長期間にわたって本発明による化合物の放出を達成し、それによって、従来の送達により達成されるものを上回る治療作用及び／又は有効性の持続時間を延長する調製物である。長期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８時間又はそれ以上であってもよく、典型的には、対象に投与されてから数分の間にすべてではないが大部分の治療剤を供給する即時放出製剤と対照的である。時間放出における変動及び対象から対象への本発明の組成物の投与に関係する他の特徴が存在することがあるため、時間放出プロファイル、用量、及び他の物理的特徴は近似していることがある。「制御放出医薬調製物」は、本明細書において使用されるように、持続放出製剤並びに時間放出製剤を包含することを意味する。
【００６１】
特定の実施形態において、組成物は、カプセル、錠剤、丸薬、マトリクス、デポー、又はゲルなどの様々な調製物又は製剤で提供することができる。本発明による化合物の量は、本明細書におけるいずれの介在値又は範囲をも包含する、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００ｍｇ又はそれ以上の概算量で提供することができる。本発明による化合物は、少なくとも又は多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８時間又はそれ以上の概算期間にわたって放出されることがある。組成物は、経口、注射用、デポー又は他の経路により投与することができる。
【００６２】
一部の実施形態において、組成物は、異なる速度で本発明による化合物を放出する、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個又はそれ以上の領域を意味する多くの領域を包含することができる。そのような組成物は、第２の領域と比較すると、胃腸、血管、又は他の身体環境への暴露でその領域に含有される治療剤の大部分を放出する即時放出領域などのより高速度で上記化合物又は化合物の１タイプを放出する１つの領域を有することができる。さらに、第２の領域は、上記に記載されているように、適切な期間にわたって同じ化合物又は異なる化合物を放出する制御放出領域であってもよい。本発明は、本明細書に記載されている組成物を投与することによりＨＰＡ患者を治療する方法を包含する。特定の実施形態において、患者は、体重１ｋｇ当たり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｇの概算範囲である用量の本発明による化合物を投与されることがある。
【００６３】
本発明の特定の実施形態において、本発明による化合物の持続放出、時間放出、さもなければ制御放出製剤は、ＨＰＡ、特に、ＰＫＵを治療するために単独又は他の活性成分との組合せで使用することができる。単独又は他の活性成分との組合せの本発明による化合物は、そのような治療用ビヒクル（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９８０、Ａ，Ｏｓｏｌ編及びＴａｉｌｏｒｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．７０９、ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ及びＳｈａｌａｂｙ編に記載されているような）の製造業者により決定及び製造されることがある制御放出、持続放出、又は時間放出動態を有する単一の製剤又は複数の製剤として投与されることがある。
【００６４】
本発明の他の実施形態において、持続放出、時間放出、さもなければ制御放出製剤は、制御放出、持続放出又は時間放出領域と組み合わされた即時放出領域などの、異なる速度で１つ又は複数の治療剤を放出する送達ビヒクル中の複数の領域即ち「コンパートメント」を包含することがある。異なる放出速度は、単一の薬物送達ビヒクル又は複数の薬物送達ビヒクル中に組み込まれることがある。薬物送達ビヒクルは、本発明による化合物及び保護化合物（例えば、抗酸化剤）などの他の成分を含有することができる。持続放出、時間放出、さもなければ制御放出薬物送達ビヒクル又は製剤を使用するＨＰＡ及びＰＫＵを治療するための方法は企図されている。
【００６５】
したがって、他の実施形態において、本発明は、ＨＰＡ、特に、ＰＫＵの個体を治療する方法であって、本明細書において定義されているような一般式Ｉによる化合物、及び／又は一般式ＩＩによる化合物、及び／又は一般式ＩＩＩによる化合物、及び／又は一般式ＩＶによる化合物又はその生理学的に許容できる酸付加塩若しくは溶媒和物を活性成分として含む組成物を、個体に、投与することを含む方法に関する。
【００６６】
提供される組成物は、本発明による医薬組成物であることが好ましい。
【００６７】
本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに理解することができる。
【実施例】
【００６８】
［材料］
クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの部位特異的変異誘発法によって、ｐｃＤＮＡ３−ＰＡＨ発現ベクター（Ｋｎａｐｐｓｋｏｇ  ＰＭら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９９６；８：２３６〜２４６）上にあるヒトＰＡＨ  ｃＤＮＡに、変異Ｉ６５Ｔ、Ｒ６８Ｓ、Ｒ２５２Ｗ及びＲ２６１Ｑを導入した。変異誘発に使用したプライマーは、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）より提供された。変異誘発の信頼性は、ＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【００６９】
［大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＰＡＨの組換え発現］
四量体完全長野生型（ｗｔ）−ＰＡＨ、Ｒ６８Ｓ−ＰＡＨ変異体及び二重欠損型（ｄｏｕｂｌｅ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）ＰＡＨ１０３〜４２８（酵素の触媒ドメインに対応する残基１０３〜４２８を含む）を、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質として大腸菌において組換え発現させ、さらに切断し、基本的にＭａｒｔｉｎｅｚ  Ａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９５；３０６：５８９〜５９７に記載されているように均一にＭＢＰ融合パートナーなしに単離した。
【００７０】
［ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）］
リガンド誘発性ＰＡＨ安定化に関するＨＴＳは、外因性蛍光プローブ８−アニリノ１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ；Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で組換え純ＰＡＨタンパク質の熱変性をモニターすることにより行った。ＨＴＳ実験は、ＦｌｕｏＤｉａ  Ｔ７０  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で行った。タンパク質−リガンド溶液（２００ｕＬ）を９６ウェルのマイクロプレート（Ａｂｇｅｎｅ製のサーモファスト（ＴｈｅｒｍｏＦａｓｔ）（登録商標）９６  Ｓｋｉｒｔｅｄ）中に分注し、鉱油で重層した。タンパク質溶液は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ２００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０中に０．１ｍｇ／ｍｌのＰＡＨ（ＰＡＨサブユニットで２μＭ）及び１００μＭのＡＮＳを含有していた。リガンドは、それぞれ１００μＭ及び２．５％最終濃度にてＤＭＳＯ中に添加した。ＤＭＳＯ及び／又はリガンドの非存在下での対照実験を、各マイクロプレートにおいて定期的に行った。リガンド（メイブリッジヒットファインダー（ＭａｙＢｒｉｄｇｅ  ＨｉｔＦｉｎｄｅｒ）（商標）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅから）を、タンパク質溶液を含有するマイクロプレートに手動で添加し、３０分にわたって２５℃にてインキュベートした後、それらをマイクロプレートリーダー上に搭載した。熱変性は、タンパク質アンフォールディングによるＡＮＳ蛍光強度λｅｘｃ＝３９５及びλｅｍ＝５００ｎｍの増加を追うことによってモニターした；フィルター（Ｍａｔｕｌｉｓ  Ｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５、４４（１３）：５２５８〜６６）。蛍光を、１℃／分の走査速度にて２５〜７５℃の範囲で記録し、１分間にわたって各温度において、システムを平衡にさせた後、蛍光発光を取得した。実験は、製造者により提供されるソフトウェアを使用してリアルタイムモニターした。実験データを平準化及び規格化した後に、リガンド誘発性安定化を、Ｃ＋＋で書かれた手製のソフトウェア及び以下の式（等式１）を使用し、アンフォールド（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）蛍光シグナル（ｆｕ）の半分が実験的に観察される温度として定義される転移の中点温度としてのＴ０．５を推定することによりスクリーニングした。
【００７１】
【数１】
2010531321.tif 000021
【００７２】
ここで、Ｆは、実験から得られた蛍光値であり、ｍｎ及びｍｕは、転移前及び転移後の勾配であり、Ｙｎ及びＹｕは、切片であり、ｎ及びｕは、変性曲線における天然状態及びアンフォールド状態であり、これらを、ある温度（Ｔ）に対して転移前及び転移後の直線ベースラインを使用して正規化した。陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）は、自動分析手順中に発生する偽陽性を除外するために等式１に各陽性ヒットを手動でフィッティングさせることによって確認した。安定化リガンドについての陽性ヒットは、２倍のＳ．．Ｄを超えて（Ｔ０．５（ヒット）＞Ｔ０．５（対照）＋（２ｓ．ｄ．））熱安定性を増加させた化合物と見なし、Ｔ０．５（対照）は、リガンドの非存在下で対照を使用して各実験（マイクロプレート）について実験的に決定され、Ｓ．Ｄ．は、各実行（各マイクロプレートにおける４〜８回の実験）における対照実験の標準偏差とした。
【００７３】
［蛍光によりモニターされる熱変性］
追加の熱変性実験を、温度制御されたＰｅｌｔｉｅｒマルチセルホルダーを備えたＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）で行った。ＰＡＨ（２μＭサブユニット）、２０ｍＭ  ＮａＨｅｐｅｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１００μＭ  ＡＮＳ、２．５％ＤＭＳＯ及び０〜１００μＭ  リガンドを含有するサンプルを、３０分にわたって室温にてインキュベートし、平衡にした後に、測定した。熱変性は、２０〜８０℃の範囲で１Ｋ／分にてＡＮＳ蛍光発光（３９５ｎｍにおける励起及び５００ｎｍにおける発光；スリット１０ｎｍ）の変化を追うことによりモニターした。各実行は、リガンド非存在下での対照を含む４つの異なるサンプルを含有していた。データ分析は、等式１に実験的に得られた蛍光値をフィッティングさせることによって行った。
【００７４】
ＰＡＨ安定化リガンド（薬理学的シャペロン）についてのＨＴＳ探索は、タンパク質変性によるＡＮＳ蛍光の増加を測定することによりｗｔ−ＰＡＨの熱安定性に対するリガンド結合の効果をモニターすることにより行った、Ｍａｔｕｌｉｓ  Ｄら、前掲書。ＡＮＳ及びＤＭＳＯ濃度を、ＰＡＨ熱安定性に対する影響がほとんど又はまったくなく、良好な信号対雑音比を示すように最適化した。最適条件の下で、ｗｔ−ＰＡＨの熱変性は、約４７℃に中点転移温度を示した。この熱転移は、おそらく、ＨＴＳ法において使用される低いタンパク質濃度において明瞭には可視化されない円偏光二色性分光法及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（Ｔｈｏｒｏｌｆｓｓｏｎ  Ｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２；４１（２４）：７５７３〜７５８５）による調節（Ｔｍ＝４５℃）及び触媒（Ｔｍ＝５４℃）ドメインアンフォールディングに対応する２つの重なり合ったアンフォールディングアンフォールディング転移の結果である。この方法の他の検証は、濃度依存的にＰＡＨ熱安定性に対する天然基質（Ｌ−Ｐｈｅ）の安定化効果を試験することにより行い（図示せず）、ＰＡＨ熱変性に関する以前の試験と一致する結果を示した。
【００７５】
ＨＴＳは、市販の化合物ライブラリー（メイブリッジヒットファインダー（商標）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）から無作為に選択された１０００個の化合物を使用して行った。この化学ライブラリーは、ワールドドラッグインデックス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｙｂｒｉｄｇｅ．ｃｏｍ／）中の約４００．０００のファルマコフォアのうちの約８７％を代表する１６．０００のリード化合物を含む。リガンドの非存在下又は存在下での実験によって得られるＴ０．５値を比較し、ＰＡＨタンパク質を有意に安定化するリガンドを選別することができた。この選択基準は、１４個の化合物を潜在的ヒット化合物として明らかにした。
【００７６】
他の実験をＨＴＳと同一条件の下に標準セル蛍光計中で行い、それらの１４化合物のうちの４つについて有意で再現性のある安定化効果を確認することができた（図１）。しかしながら、それらは、異なるｗｔ−ＰＡＨ安定化能力を示した（表１）。
【００７７】
【表１】
2010531321.tif 000022
【００７８】
予想されたように、安定化効果は、それらの４つすべてについて濃度依存的であり、化合物１１及び１３については２５μＭにて有意であった（図２）。リガンドによるタンパク質安定化の大きさは、いくつかある要因の中で特に、結合親和性及びリガンド濃度に依存し、それらの４化合物については以下の親和性ランキング：１１＞１３＞５≒６を示唆している。これらの４リガンドに関するｗｔ−ＰＡＨの見掛けの親和性を、ＰＡＨ  Ｔｒｐ−発光蛍光に対するこれらのリガンドのクエンチング効果をモニターすることによりさらに試験した（図示せず）。リガンド１１及び１３は、有意な蛍光クエンチングを誘発し、それぞれリガンド１１及び１３について約３０及び約３μＭにおけるＴｒｐ−蛍光の５０％減少を誘発した。
【００７９】
類似のリガンド誘発性安定化実験を、ｉ）調節Ｎ−末端ドメインと四量体化モチーフの両方を欠き、機能性二量体として存在する触媒ドメイン（ＰＡＨ１０３〜４２８）と等価な二重欠損型のＰＡＨ、並びに、ｉｉ）安定な四量体として精製されるのに十分な安定性を示す中等度ＰＫＵ及びわずかなＰＫＵ変異体のうちの１つと関係するＲ６８Ｓ−ＰＡＨ変異体を使用して行った。リガンドの１００μＭ濃度にて、ヒット化合物６及び１１は、ＰＡＨ１０３〜４２８とＲ６８Ｓ−ＰＡＨの両方を有意に安定化した（表１）。興味深いことに、これらの酵素形態は、化合物１３によりわずかに安定化されたに過ぎず、調節ドメインが、ＰＡＨとの結合に重要な役割を果たしていることを示唆した。
【００８０】
［酵素反応速度論的解析］
ＰＡＨ活性を、基本的に（Ｂｊφｒｇｏ  Ｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８；２５７（１）：１〜１０）に記載されているように１分にわたって２５℃にて測定した。四量体ｈＰＡＨ（１〜２μｇ）を、カタラーゼ（０．０４ｍｇ／ｍｌ）、０．１〜１ｍＭ  Ｌ−Ｐｈｅ、ＤＭＳＯ２．５％及び各化合物０〜１００μＭを含有する２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ０．２Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０中でインキュベートした。２５℃にて４分のインキュベーション後、硫酸第一鉄アンモニウム（１００μＭ）を添加し、反応を、５ｍＭ  ＤＴＴの存在下でＢＨ４（１０〜２００μＭ）を添加することにより１分後に誘発させた。一部の実験において、Ｌ−Ｐｈｅとのプレインキュベーションステップを省略し、Ｌ−ＰｈｅをＢＨ４と一緒に添加し、酵素のＬ−Ｐｈｅ誘発性活性化を分析した。ＢＨ４及びＬ−Ｐｈｅについて反応速度論的パラメーターを決定するため、ＢＨ４を、０〜２００μＭ（Ｌ−Ｐｈｅは、１ｍＭで一定にした）にて使用し、Ｌ−Ｐｈｅを、０〜１ｍＭ（ＢＨ４は７５μＭで一定にした）にて使用した。生成したＬ−Ｔｙｒは、ＨＰＬＣ及び蛍光検出により定量化した（Ｄφｓｋｅｌａｎｄ  ＡＰら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４；２５９：１１２４２〜１１２４８）。飽和曲線を、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  ｖ．９．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ）を使用することにより、双曲線（ＢＨ４について）又はシグモイド（Ｌ−Ｐｈｅについて）速度論的モデルにフィットさせた。
【００８１】
ＰＡＨ酵素反応速度は、リガンド結合がＰＡＨ触媒活性を阻害するかどうかを知るために４つのヒット化合物の存在下で分析した。活性測定は、活性アッセイに先立ってＰＡＨ酵素をＬ−Ｐｈｅとプレインキュベートするか又はプレインキュベートすることなく、高濃度（１００μＭ）のリガンドの存在下で行った。ヒトＰＡＨのＬ−Ｐｈｅプレインキュベーションは、酵素の活性化及び基質による正の協同性の発現につながり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＡＨ活性に対する重要な調節的役割を果たすと考えられる（Ｐｅｙ  ＡＬら、（Ｂｌａｕ  Ｎ．編  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ＰＫＵ  ａｎｄ  ＢＨ４、２００６））。低いＬ−Ｐｈｅ及びＢＨ４濃度（生理学的濃度；Ｐｅｙ  ＡＬら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  ２００５；８６  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ４３〜５３を参照）を使用することにより、中程度から弱い阻害が観察され（図３Ａ）、化合物５及び１３については特に有意であった。これらの条件下で、リガンド濃度が、Ｌ−Ｐｈｅ濃度（１００μＭ）と等しく、ＢＨ４濃度（１０μＭ）の１０倍超であることは注目に値する。化合物１３を除いて、この阻害は、Ｌ−Ｐｈｅ（１００μＭ）とのプレインキュベーションステップを省略した場合に劇的に弱まった。さらに、Ｌ−Ｐｈｅ及びＢＨ４を飽和濃度で使用した場合、阻害は消滅し（図３Ｂ）、これらのリガンドによるかなり弱く可逆的な阻害効果を示した。
【００８２】
他の反応速度論的解析を行い、弱い阻害が、基質及び／又は補因子の結合部位についての競合に起因するかどうかを決定した。ＢＨ４及びＬ−Ｐｈｅ濃度に対する活性依存性を、１００μＭ化合物濃度の存在下で測定し、実験データを、双曲線（ＢＨ４）又はシグモイド（Ｌ−Ｐｈｅ）反応速度論的モデルにフィットさせた。これらの実験から得られるフィッティングパラメーターを表２にまとめる。ＢＨ４濃度に対する活性依存性（飽和Ｌ−Ｐｈｅ濃度、１ｍＭでのプレインキュベーションによる）は、Ｖｍａｘにおいてはこれらのリガンドのいずれについてもほとんど又はまったく効果を示さなかったが（１５％よりも低い）、化合物５及び１３は、ＢＨ４によってＫｍを増加させ（それぞれ、約２０％及び５０％）、ＢＨ４に対する弱い競合的挙動を示唆した（競合的阻害についての標準的等式を使用してＫｌは、それぞれ、約５００μＭ及び２００μＭであった）。これらの値は、７Ｓ−ＢＨ４及びＢＨ２（それぞれ、Ｋｌは、約２〜５μＭ及び約１７μＭ）などの、ＰＡＨの適当な生理学的阻害剤について得られるものよりも実質的に高い。一方、Ｌ−Ｐｈｅ濃度に対する活性依存性を分析した場合（高いが飽和でないＢＨ４濃度、７５μＭにて）、Ｓ０．５又はヒル係数（ｈ）に対する顕著な効果は観察されず、Ｖｍａｘにおける一部の減少のみが化合物５及び１３（約１３％及び３０％）について観察され、おそらくＢＨ４結合に対する一次競合効果に起因する弱い非競合的阻害を示している。
【００８３】
【表２】
2010531321.tif 000023
【００８４】
［真核細胞におけるｗｔ−ＰＡＨ及び変異体の発現分析］
ヒト胎児腎臓細胞（Ａ２９３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を、４．５ｇ／ｌグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ｉ．ｕ．／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び０．２５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で生育させた。Ａ２９３を、製造者により記載されているようにリポフェクタミンシステム（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ｐｃＤＮＡ３−ＰＡＨ発現ベクター（ｗｔ又は変異体ＰＡＨ構築物）１μｇを一過性にトランスフェクトした。薬理学的シャペロンを、トランスフェクションしてから５時間後に添加し（ＤＭＳＯ１％中のリガンド最終濃度４０μＭ）、２４時間にわたってインキュベートし、次いで、細胞を採取し、−８０℃にて保存した。ＤＭＳＯの非存在下での対照実験によって、１％ＤＭＳＯの条件は、ＰＡＨ活性及び免疫反応性タンパク質に対しても、細胞の生育及び生存に対しても、有意な影響はないことが明らかになった（データ省略）。
【００８５】
細胞抽出物は、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのキモスタチン、ロイペプチン、アンチパイン及びペプスタチン存在下で５０ｍＭスクロースを含有するＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中に細胞ペレットを再懸濁することによって調製した。細胞を、細針に２０回通すことでホモジナイズした。次いで、スクロース濃度を０．２５Ｍまで上げ、抽出物を、４℃にて３０分にわたって１７０．０００ｇにて遠心分離により清浄化した。細胞抽出物中のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して正規化し、続いて、ＰＡＨ免疫検出及び酵素活性測定のために使用した。
【００８６】
ウェスタンブロット分析を、一次抗体としてモノクローナルマウス抗ヒトＰＡＨ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）及び二次抗体としてヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）後に行った。検出は、化学発光法（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行い、Ｑｕａｎｔｉｆｙ  ｏｎｅ  ｖ．４．５．２．ソフトウェアを使用してフルオール−Ｓ（Ｆｌｕｏｒ−Ｓ）（商標）ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳ）で定量化した。活性測定は、ゼブラ（Ｚｅｂｒａ）（商標）Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することにより遊離アミノ酸及び低分子量の汚染物質の除去後に細胞抽出物に対して行った。総タンパク質５〜２０μｇを、１ｍＭ  Ｌ−Ｐｈｅ及び２００μＭ  ＢＨ４並びに３０分の反応を使用して、基本的に上記に記載されているように行われる活性測定のために使用した。これらの条件下で、ＰＡＨ免疫反応性及び活性は、細胞抽出物中に存在するＰＡＨタンパク質の量に対して直線的であった。
【００８７】
ｗｔ−ＰＡＨ及びＰＫＵ変異体ｃＤＮＡを持つ構築物をＡ２９３細胞にトランスフェクションした後、細胞を、ヒット化合物１１及び１３  ４０μＭの存在下又は非存在下で２４時間にわたってインキュベートした。細胞を採取し、免疫反応性ＰＡＨタンパク質及びＰＡＨ活性を、可溶性細胞抽出物中で測定した。得られた結果を図４にまとめる。テストされた４つのＰＫＵ変異体、即ち、Ｉ６５Ｔ−、Ｒ６８Ｓ−、Ｒ２５２Ｗ−及びＲ２６１Ｑ−ＰＡＨは、ｗｔ−ＰＡＨと比較して低い残留活性及び定常状態タンパク質レベルを示し、異なる程度までのフォールディング欠陥を反映した。Ｉ６５Ｔ−、Ｒ６８Ｓ−、及びＲ２６１Ｑ−ＰＡＨは、ｗｔ対照と比較して相対的に高いＰＡＨ活性（ＤＭＳＯ１％の存在下で）、即ち、それぞれｗｔ活性の２３％、４６％及び６９％を示した。Ｒ２５２Ｗ−ＰＡＨの場合、活性は、化合物１１及び１３の有無にかかわらずｗｔ−ＰＡＨのアッセイの検出限界＜０．２％未満であったため、酵素活性に対する薬理学的シャペロンの効果の分析を検討しなかった。これらの結果は、以前に指摘されているように（Ｗａｔｅｒｓ  ＰＪ．（Ｂｌａｕ  Ｎ編、ＰＫＵ  ａｎｄ  ＢＨ４．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｉｏｐｔｅｒｉｎ．Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ：ＳＰＳ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ＭＢＨ、２００６）２７７．３１０）、異なる報告間で観察される実験的散乱を説明することができる実験差異の範囲内で真核生物系における以前の発現アッセイ（Ｒ６８Ｓ＝５７±３６％；Ｉ６５Ｔ：４１±３３％；Ｒ２６１Ｑ：５１±２６％；Ｒ２５２Ｗ：０％；及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＰＡＨＤＢ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃａ／のＰＡＨｄｂ）と一致している。これら４つの変異体は、ＰＫＵ患者における異なる表現型のグループと関係する異なる変異体フォールディング挙動を表していると考えることができ、Ｒ６８Ｓは、軽度の変異であり、Ｉ６５Ｔは、軽度〜中等度であり、Ｒ２６１Ｑは、高度に変動し（軽度〜中等度〜重度）、Ｒ２５２Ｗは、重度の変異である。
【００８８】
低濃度（４０μＭ）のヒット化合物１１及び１３は、使用されるヒット化合物及び発現されるＰＡＨタンパク質に応じて、異なる程度までＡ２９３細胞におけるＰＡＨ発現を亢進することができる（図４）。ＰＡＨ活性は、ｗｔ並びにＩ６５Ｔ及びＲ６８Ｓ変異体において、化合物１１により６０〜１００％及び化合物１３により４０〜５０％亢進された（図４Ａ）。ＰＡＨ免疫反応性タンパク質の増加と良く相関しているＰＡＨ活性の亢進は、化合物１１の存在下で観察され、一方、活性は、おそらくＰＡＨタンパク質のフォールディングと触媒効率の両方に対するこの変異の混合効果によって、正確に決定するのには低すぎた。これらの効果は、化合物１１については大部分の場合に統計的に有意であったが、化合物１３についてはわずかな場合に過ぎなかった（図４）。
【００８９】
これらの結果は、ＰＡＨと有意な親和性で結合するリガンドが（蛍光分光法により観察されるＰＡＨ安定化から推測されるように）、タンパク質レベル及び活性を増加させ、おそらくユビキチン仲介性タンパク質分解から守ることができることを示している。さらに、熱変性に対するリガンド誘発性安定化（図２及び表１）とＰＡＨ活性及びタンパク質レベルの亢進（図４）の間の類似の相関は、両方の化合物並びにｗｔ及び変異体ＰＡＨタンパク質について見いだされる。
【００９０】
［マウスによる実験］
この動物実験は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｂｅａｔ  Ｔｈｏｎｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｚｕｒｉｃｈ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌに関する許可書０７−２００８（請求に応じて入手可能）で承認された。
化合物１１及び化合物１３の溶液は、１０％ＤＭＳＯ及び１０％グルコース中で５ｍｇ／ｍｌ（１４ｍＭ）の濃度にて調製した。そのために、１００％ＤＭＳＯ中の各化合物５０ｍｇ／ｍｌ（１４０ｍＭ）のストックを、１０％グルコース溶液で１：１０に希釈した。化合物１１及び１３のストックと最終溶液は共に、化合物がこれらの条件で不溶であることから実際は懸濁液である。
【００９１】
動物実験は、Ｂｅａｔ  Ｔｏｎｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｚｕｒｉｃｈ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）により行われた。１０％ＤＭＳＯ（グループ１、対照）又は化合物１１（グループ２）若しくは化合物１３（グループ１３）の溶液２５μｌ／日を、正確に１２週齢で１９〜２３ｇの体重の若年成体Ｃ５７ＢＩ／６マウス（すべて雌）に１０日にわたって経口的に投与した。各グループにおいて、即ち、グループ２及び３において、動物に、約５．９ｍｇ／ｋｇ／日で投与した。５匹の動物を各グループで処置し、処置による体重変化は認められず、即ち、開始と終了の間に５％未満の変化であった。動物を、処置の１０日目に屠殺し、それらの肝臓を２つに切り分け、直ちに液体窒素中で冷凍し、次いで、冷凍した半分の肝臓を、ドライアイス中でＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｇｅｎに送った。肝臓ホモジネートは、Ｅｌｚａｏｕｋ  Ｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３；２７８（３０）：２８３０３〜１１に記載されているように、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びプロテアーゼ阻害剤フッ化フェニルメチルスルホニル、ロイペプチン、及びペプスタチンの存在下で４℃にて調製した。均質化後、抽出物を、４℃にて３０分にわたって１７０．０００ｇにて遠心分離により清浄化した。
【００９２】
可溶性タンパク質の濃度は、各グループで類似し、肝臓抽出物１ｍｌ当たり約３５ｍｇであった。ＤＭＳＯ及び１０％ＤＭＳＯ中の化合物１１、１３の経口補充に対する肝臓ＰＡＨ応答は、
ｉ）上述したような、ゼブラ（商標）Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することによる遊離アミノ酸及び低分子量の汚染物質の除去後のＰＡＨ活性や、
ｉｉ）報告されているように行われる定量的リアルタイムＰＣＲ分析によるＰａｈ−ｍＲＮＡ発現を決定することによって分析した。
【００９３】
ＰＡＨ活性の１．６５倍の増加が、化合物１１による処置後に測定された。化合物１３による増加は、有意ではなかった（即ち、測定された活性は、対照グループについて１．２７±０．６３、グループ２（化合物１１）について２．２±０．７８、グループ３について１．４１±０．５４であった）。
【００９４】
対照と比較して、処置マウスにおける定量的リアルタイムＰＣＲ分析によるＰａｈ−ｍＲＮＡ発現に変化はなく、化合物１１が遺伝子発現にもＰａｈ−ｍＲＮＡ安定性にも影響を及ぼさないことを支持しており、したがって、増加した肝臓ＰＡＨ活性は、酵素に対する化合物１１の安定化化学シャペロン効果の結果であろう。
【００９５】
［動物実験からの初期結論］
これらの結果は、化合物１１の効果についての原理の証明を構成する。活性の増加は、１回の腹腔内注射による５０ｍｇ／ｋｇ（１．６倍の活性増加）での、又は５週間の５０ｍｇ／ｋｇ／日での経口処置（１．７倍の活性増加）により酵素の天然補因子であるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）による野生型マウスの処置により得られるものと類似している。
【００９６】
我々は、現在、ＰＡＨタンパク質レベルに対する化合物の効果を測定するために、これらのサンプルにおいてウェスタンブロット分析を行っている。さらに、我々は、５週にわたる長い処置を計画している。例えば、以前の動物実験は、１０日間の５０ｍｇ／ｋｇ／日の経口処置について効果は観察されないが、５週後には効果が測定できることを明らかにした。さらに、我々は、肝臓中に蓄積されている化合物の凝集に大きな変動をもたらしているそれらの不溶性によって、化合物の吸収が、疎外されると予想している。長期の処置は、より明確な結果をもたらすだろう。さらに、我々は、これらの化合物が、ＰＡＨに対するより高い効果を達成するには溶解性が改善されなければならないと考えている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2010531321.tif 000041
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