(57)【要約】本発明は、以下の工程を含む、グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターから 2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシド(αGG; 図 1)を生産するための方法に関する:  スクロースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.7)を提供する工程、  該スクロースホスホリラーゼを、グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターとしてのグリセロールを含む混合物と共にインキュベートする工程、および  2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシドを単離および/または精製する工程。
2010504082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターから 2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシド(αGG)を生産する方法であって、
スクロースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.7)を提供する工程、
該スクロースホスホリラーゼを、グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターとしてのグリセロールを含む混合物と共にインキュベートする工程、および
2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシドを単離および/または精製する工程、
を含む方法。
【請求項２】
グルコシルドナーが、スクロース、およびフルクトシル部分が修飾されたまたは別のケトシル残基によって置換されたスクロースの類縁体、α-D-グルコース-1-リン酸、α-D-グルコース-1-フルオライド、さらに安定な活性化グルコシルドナー、例えばα-D-グルコース-1-アジド、およびそれらの混合物、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スクロースホスホリラーゼが微生物起源、好ましくは細菌起源のものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細菌のスクロースホスホリラーゼが、アグロバクテリウム・ヴィティス(NCBI P33910)、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Q84HQ2)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Q84BY1)、大腸菌(P76041)、大腸菌 O6 (Q8FHS2)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Q7WWP8、Q7WWQ5)、ラクトバチルス・デルブレッキイ 亜種 ラクティス(Q71I99)、ロイコノストック・メセンテロイデス (Q59495、Q9R5Q3)、リステリア・モノサイトゲネス(Q4ENE7、Q4EQR2、Q4ETN7、Q4EHA0、Q4EJW2、Q4ELY7)、シュードモナス・プトレファシエンス、シュードモナス・サッカロフィラ(AAD40317)、ロドピレルーラ・バルティカ(Q7UIS9)、シューワネラ・バルティカ(Q3Q4P1)、シューワネラ・フリギディマリナ(Q3NMD1)、ソリバクター・ウシタトゥス(Q43TL5)、ストレプトコッカス・ミュータンス(P10249)および/またはシネココッカスの一種(O68858、Q7U3J7)から得られることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
スクロースホスホリラーゼが、完全長タンパク質またはその触媒的に活性な断片、または融合タンパク質として組換えにより生産されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
スクロースホスホリラーゼが、インキュベーション工程よりも前に担体上に固定化されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該担体が固体支持体、好ましくはポリマー、より好ましくはアクリルポリマー、特にメタクリルアミド、N,N'-メチレン-ビス(アクリルアミド)およびオキシラン基を保有するモノマーのコポリマーであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
担体が、クロマトグラフィー樹脂、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、親和性クロマトグラフィー樹脂および疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
インキュベーションが、4 から 10 の、好ましくは 5 から 9 の、より好ましくは 6 から 8 の、特に 7 の pH 値において実施されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
インキュベーションが、少なくとも 15 分、好ましくは少なくとも 60 分、より好ましくは少なくとも 3 時間、よりいっそう好ましくは少なくとも 5 時間の間、実施されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
インキュベーションが、10 から 50℃の範囲、好ましくは 15 から 40℃の範囲、より好ましくは 30℃の温度で実施されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
混合物が、グルコシルドナーを 0.01 から 3 mol/l、好ましくは 0.05 から 2 mol/l、より好ましくは 0.1 から 1.5 mol/l の濃度で含むことを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
混合物が、グリセロールを 0.01 から 10 mol/l、好ましくは 0.05 から 5 mol/l、より好ましくは 0.1 から 3 mol/l、よりいっそう好ましくは 0.1 から 1.5 mol/l の濃度で含むことを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
混合物中におけるグリセロール対グルコシルドナーの比が、0.1:1 から 10:1、好ましくは 0.5:1 から 5:1、より好ましくは 1:1 から 3:1 の範囲であることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
α-D-グルコシルグリセロールが、活性炭上での溶出クロマトグラフィーによって、55%、好ましくは 70%、より好ましくは 85% の収率で単離されることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
スクロースホスホリラーゼが、ロイコノストック・メセンテロイデス(Q59495、Q9R5Q3)から得られ、かつ、アクリルポリマー、特にメタクリルアミド、N,N'-メチレン-ビス(アクリルアミド)およびオキシラン基を保有するポリマーのコポリマー上に固定化され、該固定化されたスクロースホスホリラーゼが、グルコシルドナーとしてのスクロースと共にインキュベートされることを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
α-D-グルコシルグリセロールおよびフルクトースを含有する混合物を生産する方法であって、
スクロースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.7)を提供する工程、
該スクロースホスホリラーゼを、スクロースおよびグルコシルアクセプターとしてのグリセロールを含む混合物と共にインキュベートする工程、および
α-D-グルコシルグリセロールおよびフルクトースの混合物を単離および/または精製する工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る、α-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物。
【請求項１９】
フルクトースを、好ましくはα-D-グルコシルグリセロールと等モルの量でさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載の産物。
【請求項２０】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物を含む化粧品調製物。
【請求項２１】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物を含む医薬調製物。
【請求項２２】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物を含む栄養補助食品。
【請求項２３】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物の、甘味料としての使用。
【請求項２４】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物の、加工処理中および保存中における生体分子、特にタンパク質またはタンパク質断片および脂質由来の構造の安定化剤としての使用。
【請求項２５】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物の、加工処理中および保存中における生存微生物の安定化剤としての使用。
【請求項２６】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物の、乾燥中、特に凍結乾燥中におけるタンパク質の安定化剤としての使用。
【請求項２７】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物の、封入体からのタンパク質の再フォールディングを助け、かつ、インビボでの、特に大腸菌におけるタンパク質のミスフォールディングおよび凝集を妨げる添加剤としての使用。
【請求項２８】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物の、特に大腸菌における組換えタンパク質の生産中の細胞生存率を改善する添加剤としての使用。
【請求項２９】
請求項１８に記載のα-D-グルコシルグリセロールまたはα-D-グルコシルグリセロールを含む産物の、反応条件下での酵素の安定性を改善する添加剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α-D-グルコシルグリセロール(2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシド)の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純および複雑な炭水化物（carbohydrates）は、エネルギー貯蔵、細胞壁構築、細胞-細胞間の相互作用およびシグナル伝達、宿主-病原体相互作用およびタンパク質グリコシル化を含む、多様な範囲の細胞機能を支配する。それらはまた、浸透圧調節物質および極端な寿命の低分子（small molecules of extreme lifestyles）としての機能を果たす。グリコシルトランスフェラーゼ(GT)が本来的にグリコシド合成の原因酵素である一方、グリコシルヒドロラーゼ(GH)はグリコシドを分解するよう進化してきた。GT および GH のクラスのうち、グリコシドホスホリラーゼ(GP)はいくつかの点において特殊である。GP は、二糖および様々な重合度のオリゴ糖または多糖を含むα-およびβ-D-グリコシド、主にはグルコシド(Glc-OR)の加リン酸分解を触媒する。リン酸は通常、α-D-グルコース 1-リン酸(Glc 1-P)よりも大過剰に存在するため、グルコシルのリン酸(Pi)への転移は、生体内で熱力学的に支持される。しかしながら、GP-触媒反応の熱力学的平衡定数(Keq)は、GT(Keq << 1) および GH (Keq >> 1)の反応の Keq 値の中間である。比較的有利な Keq 値、およびリン酸-活性化糖がヌクレオチド-活性化糖よりも安価であり、それらがほとんどの GT に必要とされる、という事実により、GP は立体-および位置特異的なグルコシド合成についての興味深い生体触媒となっている。
【０００３】
最近、新規なα-D-グルコシド、特に、現在いくつかの応用が発展しつつあるα-D-グルコシルグリセロール(2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシド; αGG)に対して、より大きな注意が向けられている。αGG は微生物において、高塩濃度、熱、および UV-放射によるストレスに対するいくつかの防御を提供する適合溶質として機能する。αGG は、スクロースと比較してのその齲蝕原性およびカロリー値の低さから、食料品における代替甘味料として有用であると言われている。さらに、αGG およびその誘導体は、タンパク質のミスフォールディングによって引き起こされる疾患および癌治療における治療法として研究される。化粧品においては、αGG は抗老化剤および保湿調節化合物として用いられ得る。
【０００４】
αGG は、化学的および酵素的方法によって生産され得る。化学的方法は、マルチトール、イソマルトース、トレハルロース（trehalulose）等の様々な出発化合物を包含し得る(例えば Takenaka F. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64:378-385 を参照)。αGG の合成を触媒する酵素は、α-グルコシダーゼ(Takenaka F. and Uchiyama H. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2000) 64:1821-1826)、シクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ(Nakano H. et al. J. Biosci. Bioeng. (2003) 95:583-588)、グルコシル-グリセロール-フォスフェート合成酵素(Marin K. et al. J. Bacteriol. (1998) 180:4843-4849)および植物グルコシダーゼII(Kaushal GP et al. Arch. Biochem. Biophys. (1989) 272:481-487)を包含し得る。現在の全ての αGG 合成方法は、１または複数の、以下の重大な不便さを示す: 多段階反応(活性化、保護および脱保護を含む); 労働集約的な合成および後処理（work-up）; 低い収量および生産性; 低い原子経済（atom economy）; 長い反応時間。その結果、αGG を生産するための工業的過程は全く発展せず、生成物を市場において入手することができない。
【０００５】
立体化学的に純粋な天然 αGG の化学的合成は、極度に労力を要する手順および低い収率のため、技術的に実現が難しい。αGG の微生物合成が示されたが、生産性に乏しい。α-グルコシダーゼによるグルコシル基転移を用いる αGG の酵素的合成は（これまでに）記載された一つの可能性であるが、該工程の主な欠点は、グリセロールの１位よりも２位のヒドロキシ基を好む、既知の酵素の誤った位置選択性である。α-グルコシダーゼによって合成された生成物の混合物は、正しい天然の αGG を 30% しか含有せず、生成物単離において相当の努力が要求される。
【０００６】
αGG の微生物合成は現在、大量の化学物質として αGG を生産することができないため、特に αGG の収量を考慮に入れる場合には、成熟した工程ではない。達成可能な生成物濃度は非常に低く(例えば 29 mg/l; Roder et al. FEMS Microbiol. Lett. (2005) 243: 219-226)、生産性 (≧3日の生産)も工業的生産にとって有利ではない。
【０００７】
JP 2001/245690 A は、グルコシダーゼ、特にβ-ガラクトシダーゼを用いることによってグリコシドおよびオリゴ糖を生産する方法に関する。
【発明の概要】
【０００８】
当該技術分野において公知の方法の欠点を克服し、立体化学的に純粋な αGG を高収量で生産するための酵素的方法を提供することが、本発明の目的である。さらに該方法は、好ましくは、経済的な基質の使用を可能にするであろう。
【０００９】
したがって、本発明は、以下の工程を含む、グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターから 2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシド(αGG; 図 1)を生産するための方法に関する:
− スクロースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.7)を提供する工程、
− 該スクロースホスホリラーゼを、グルコシルドナーおよびグルコシルアクセプターとしてのグリセロールを含む混合物と共にインキュベートする工程、および
− 2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシドを単離および/または精製する工程。
【００１０】
スクロースホスホリラーゼ(SPase; EC 2.4.1.7)は、スクロースおよびリン酸の、D-フルクトースおよび Glc 1-P への変換を触媒する。SPase は、多くの細菌性原料から単離されている。SPase をコードする遺伝子は、様々な細菌からクローン化され、異種性に発現されている(Kawasaki H et al.、Biosci. Biotech. Biochem. (1996) 60:322-324; Kitao S and Nakano E、J. Ferment. Bioeng. (1992) 73:179-184; van den Broek LAM et al.、Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004) 65:219-227)。グリコシルヒドロラーゼ(GH)およびグリコシルトランスフェラーゼ(GT)の配列に基づく体系的な分類によると、SPase は、しばしばα-アミラーゼファミリーと称される GH13 ファミリー(クラン GH-H)に属する(Coutinho PM et al. J. Mol. Biol. (2003) 328:307-317; Henrissat B. Biochem. J. (1999) 280:309-316)。ビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis) からの SPase の三次元構造が最近解析され、(β/α) 8 バレルフォールド、および２つのカルボキシル基がおそらく求核剤(Asp192)および一般的な酸/塩基(Glu232)の役割を果たす触媒部位が明らかになった。
【００１１】
SPase の反応は、アノマーの立体配置の正味の保持と共に進行し、立体配置的に反転させる２つの段階を含む、二重置換機構を通して起こる: グルコシルドナーの炭素-酸素結合の切断および共有結合性β-グルコシル-酵素(β-Glc-E)中間体の形成; および Glc 1-P を産生する、該中間体のリン酸との反応。副反応において、β-Glc-E 中間体は水によって妨害され得、加水分解に至り得る。スクロースの加水分解性変換は不可逆的であるが、加リン酸分解反応よりも２桁近く遅く進行する。SPase はまた、加水分解と競合して起こるグルコシル基転移反応をも触媒し、それによって β-Glc-E 中間体は外部の求核剤により攻撃され、新たなα-D-グルコシドが生成される。
【００１２】
生化学的研究により、SPase はグルコシル部分の転移に厳密に特異的であり、エピマー化および脱酸素化を含むグルコピラノシル環上の構造的変更を許容しない、ということが明らかにされている。SPase に対する既知のグルコシルドナーのリストはそれ故に短い: スクロース、Glc 1-P および α-D-グルコース 1-フルオライド。対照的に、グルコシルアクセプターに対する SPase の特異性は、比較的緩やかである。 
【００１３】
高い定量的収率(>95%)で天然 αGG のみを形成する SPase の選択性は、本発明による方法の重大な点である。本発明の方法は、(化学的合成においては必要とされる)いかなる化学的誘導体化をも伴わず、(大規模な工業的工程からも得られる)非常に安価な基質を利用することができ、かつ、変換される全ての基質が定量的に生成物になることから、極めて高い原子効率（atom efficiency）によって特徴付けられる。微生物の発酵中は、例えば、基質の大部分は増殖および維持のエネルギーのために使われ、αGG の生産には基質のほんの一部しか使われない。本発明の方法においては、たった１つの酵素だけが必要とされ、それは天然のものでも組換えによる調製のものでも良く、遊離状態でまたは固定化されて、単独の酵素としてまたは別の触媒形態(透過処理された細胞または休止細胞)で、用いられ得る。
【００１４】
本発明の方法は、好ましくは精製酵素または酵素抽出物を用いてインビトロで実行され、ここで、採用される SPase は少なくとも１つの源から得ることができ、これは１より多くの型(起源)の SPase も採用され得ることを意味する。
【００１５】
αGG の合成は、好ましくは 1,000 から 1,000,000 ユニット/リットルの間の活性を供給する、スクロースホスホリラーゼのタンパク質濃縮物(concentration)を用いて実行される(１ユニットは、文献に報告されている、通常は 30 ℃の、標準的な反応条件下で、分あたり 1 μmol の基質を変換する酵素活性として定義される)。
【００１６】
本明細書において用いる場合“スクロースホスホリラーゼ”とは、EC 2.4.1.7 クラスの酵素だけでなく、その基質および生成物に関して同じ性質を示す分子をもいう。かかる分子は、潜在的に酵素活性または結合活性をも示す、スクロースホスホリラーゼの、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合タンパク質をも含む。
【００１７】
本発明の好ましい態様によれば、グルコシルドナーは、スクロース、およびフルクトシル部分が修飾されまたは別のケトシル残基で置換されたスクロースの類縁体、Glc 1-P、α-D-グルコース-1-フルオライド、さらに安定な活性化グルコシルドナー、例えばα-D-グルコース-1-アジド、およびそれらの混合物、からなる群から選択される。
【００１８】
本発明の方法において採用されるグルコシルドナーは、SPase によって触媒されるグリコシル基転移反応の基質として働くいかなるものであっても良い。
【００１９】
本発明の方法におけるスクロース(グルコースおよびフルクトースからなる二糖)の使用は、αGG の形成だけでなくフルクトースの形成をももたらす。仮に Glc 1-P または α-D-グルコース-1-フルオライドなどの基質が採用される場合、リン酸またはフッ化物が αGG に加えて形成される生成物となる。達成可能な収率は、グルコシルドナーのエネルギー含量に依存し、30% よりも大きく、好ましくは 50% よりも大きく、特に 90% よりも大きい。
【００２０】
本発明による方法において使用されるスクロースホスホリラーゼは、好ましくは微生物起源のものであり、好ましくは細菌起源のものである。
【００２１】
微生物の SPase を使用することの利点は、これらの酵素の単純な生産および単離、および安定性である。それらの酵素は、天然にまたは組換えにより SPase を発現する微生物から得ることができる。
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、細菌のスクロースホスホリラーゼは、アグロバクテリウム・ヴィティス(Agrobacterium vitis)(NCBI P33910)、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis)(Q84HQ2)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)(Q84BY1)、大腸菌(Escherichia coli) (P76041)、大腸菌 O6 (Escherichia coli O6)(Q8FHS2)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)(Q7WWP8、Q7WWQ5)、ラクトバチルス・デルブレッキイ 亜種 ラクティス(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)(Q71I99)、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）(Q59495、Q9R5Q3)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)(Q4ENE7、Q4EQR2、Q4ETN7、Q4EHA0、Q4EJW2、Q4ELY7)、シュードモナス・プトレファシエンス(Pseudomonas putrefaciens)、シュードモナス・サッカロフィラ(Pseudomonas saccharophila)(AAD40317)、ロドピレルーラ・バルティカ(Rhodopirellula baltica)(Q7UIS9)、シューワネラ・バルティカ(Shewanella baltica)(Q3Q4P1)、シューワネラ・フリギディマリナ(Shewanella frigidimarina)(Q3NMD1)、ソリバクター・ウシタトゥス(Solibacter usitatus)(Q43TL5)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)(P10249) および/またはシネココッカスの一種(Synechococcus sp.)(O68858、Q7U3J7)から得られる。
【００２３】
少なくとも１の ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides） 由来の SPase を使用することが特に好ましい。
【００２４】
SPase は、好ましくは、完全長タンパク質またはその触媒的に活性な断片、または融合タンパク質として組換えにより生産される。しかし、該 SPase を天然に生産する生物から直接に SPase を用いることももちろん可能である。SPase を組換え生産する方法は、当業者に公知である(例えば、Sambrook J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6)。
【００２５】
本明細書において用いる場合、“完全長タンパク質”とは、生物、例えば上記のもの由来の遺伝子によってコードされる SPase をいう。該天然遺伝子、特に該遺伝子の SPase をコードする領域は、SPase の組換え生産のために直接採用される。
【００２６】
SPase の“触媒的に活性な断片”とは、ネイティブな SPase と同一または実質的に同一の活性および基質特異性を有する、SPase のタンパク質断片をいう。該断片が同一または同様の基質特異性を有し、かつ、ネイティブな SPase と同一の生成物の形成を触媒するならば、断片の長さは重要でない。
【００２７】
本明細書において用いる場合、“融合タンパク質”とは、少なくとも１のさらなるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと組換えにより融合している、SPase またはその触媒的に活性な断片をいう。該少なくとも１のさらなるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、いかなる種類のものであってもよい(例えば、酵素)。
【００２８】
これらのバリアントがネイティブな SPase と同一または実質的に同一の活性(例えば、増大した触媒活性)を有するならば、本発明の範囲内には SPase のバリアント(例えば、欠失、置換および挿入を含む変異)も集約されることに注意する。
【００２９】
本発明によると、SPase は、部分精製されていても良いがされる必要はない無細胞の酵素、細胞膜の透過性改善(透過処理)および機械的安定性改善のために物理的または化学的に前処理された全細胞システム、該遊離酵素または全細胞システムが好ましくはゲル様構造中に捕捉され、または担体上に固定化されているカプセル化触媒、のいずれかとしてインキュベーション工程中に採用され得る。細胞の透過処理を含む、酵素を固定化する方法の最近の包括的な要約は、Cao L.、Carrier-bound Immobilized Enzymes (2005) Wiley-VCH、Weinheim によって与えられる。
【００３０】
有利には SPase は、担体、好ましくは固体支持体上に固定化される。該 SPase に非共有結合で結合するあらゆる物質、好ましくは陰イオン交換特性を有する天然または非天然ポリマー、または共有結合で結合するあらゆる物質、好ましくはポリマー、より好ましくはアクリルポリマー、特にメタクリルアミド、N,N'-メチレン-ビス(アクリルアミド)およびオキシラン基を保有するモノマーのコポリマーが採用され得る。
【００３１】
担体は、好ましくはクロマトグラフィー樹脂、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂(例えば、固定化された SPase 特異的抗体を含む) および疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される。
【００３２】
本発明の SPase は、その基質特異性を変化させまたは低変換率へとその活性を減少させる方法において、該酵素の酵素活性が影響を受けないのであれば、あらゆる担体、好ましくは粒子(例えば、ビーズ)、特にクロマトグラフィー樹脂上に(一時的にまたは共有結合的に)固定化され得る。
【００３３】
担体は官能基を含み得、その官能基は、樹脂上で SPase に結合するために、酵素もまた対応する結合相手を保有していることを要求する(例えば、ストレプトアビジン-ビオチン、キレートされた金属イオン-His6-タグ)。
【００３４】
該官能基を欠く担体に対する酵素の親和性を改善するため、SPase は、結合ペプチド、好ましくはイオン交換特性を示す結合ペプチド、または結合ドメイン、好ましくは多糖結合ドメイン、特にセルロース結合ドメインを有する融合タンパク質として組換えにより生産され得る。
【００３５】
本発明の方法における、固定化された不溶性の酵素(担体に結合したもの、カプセル化されたもの、全細胞システム)の使用によって、いくつかの利点が提供される:
1.固定化された酵素は、反応の最後に、再使用のため、反応混合物から容易に回収されるが、一方で可溶性の酵素は困難と活性の喪失を伴ってしか回収されない;
2.固定化された酵素は、可溶性の酵素と対比して得られる酵素の代謝回転数、および反応の最後または水性緩衝液中での長期保存後における回収された酵素の活性、のいずれについても、可溶性の酵素より安定である。
【００３６】
ある特定の酵素について、固定化が成功するという見込みをもって選択され得る特定の固定化方法は無い。さらに、２以上の酵素の共固定化が成功する見込みは一層予測し難い。いかなる酵素の固定化の成功も、様々な方法をスクリーニングすることによって見出さなければならず、最適な結果は試行錯誤によって得られるということが、当業者によって一般的に認められている。担体上での SPase の固定化は、酵素活性を安定化する。酵素の包括（entrapment）も安定性を改善することが文献により示される(Soetaert W. et al.、Progress in Biotechnology Vol. 10 (Petersen S.B.、Svensson、B.、Pederesen、S.、Eds)、Elsevier、Amsterdam)。酵素の固定化は、以下を含む様々な技術を用いて実施され得る:(1) 共有結合、物理的吸着、静電気的結合、または親和性結合を介しての酵素の担体または支持体への結合、(2) 二官能性または多官能性試薬による架橋、(3) ゲルマトリックス、ポリマー、エマルション、またはいくつかの形態の膜中への包括（entrapment）、および (4) これらのあらゆる方法の組み合わせ。これらの酵素固定化方法の多くについての詳細な説明、および固定化方法の選択に影響を与える様々な要因は、Methods in Enzymology、K. Mosbach (ed.)、Academic Press、New York の以下の巻およびその中の引用文献中に集められる: Vol. 44 (1976)、Vol. 135 (1987)、Vol. 136 (1987)、Vol. 137 (1988)。
【００３７】
オキシランアクリルビーズ Eupergit C および Eupergit C-250L (Rohm Pharma)上での SPase の固定化は、反応条件に対し特に安定で、かつ、十分に高い特異的活性(酵素活性ユニット/触媒グラム)を有する触媒(酵素＋担体)をもたらした。しかし、本発明の方法において有用であるためには、遊離および固定化の両方の SPase 調製物が用いられ得る。
【００３８】
しかしながら、可溶性酵素の欠陥の多くは、固定化酵素触媒を採用することによって排除することができる。水性緩衝液中における固定化された SPase の安定性は、可溶性酵素よりもずっと大きい。固定化触媒の回収および再使用は、反応混合物から触媒を単純に濾過分離することおよびそれを新鮮な反応混合物へ再利用することによって容易に実施された; 固定化 SPase についてのこの様式において、高い代謝回転数(すなわち、触媒分子あたりの、酵素の不活化までに生成物分子へ変換される基質分子数)が達成され得る。
【００３９】
反応において用いられる固定化 SPase は、有効な濃度、通常は約 0.001 から 約 100.0 IU/ml の濃度、好ましくは 約 10 から 約 50 IU/ml で存在すべきである。IU(国際単位)は、分あたり１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量として定義される。
【００４０】
反応が完了した上で、担体に結合した SPase を濾過または遠心分離によって取り除くことができる。固定化 SPase がカラム(例えば、クロマトグラフィーカラム)中に充填される場合には、αGG の生成は、反応混合物から固定化 SPase を取り除く必要なく、連続的な方法で達成され得る。
【００４１】
本発明の好ましい態様によれば、基質との SPase のインキュベーションは、4 から 10 の、好ましくは 5 から 9 の、より好ましくは 6 から 8 の、特に 7 の pH 値で実施される。
【００４２】
本発明による方法における pH 値は、好ましくは上記の範囲から選択され、そのことは基質の αGG への効率的な変換を可能にする。
【００４３】
本発明の別の好ましい態様によれば、インキュベーションは、少なくとも 15 分、好ましくは少なくとも 60 分、より好ましくは少なくとも 3 時間、よりいっそう好ましくは少なくとも 5 時間の間、実施される。
【００４４】
固定化または非結合の SPase との基質のインキュベーションは、少なくとも 15 分間、実施され得る。しかしながら、1 および 48 時間の間または 5 および 24 時間の間のインキュベーション時間を選択することが特に好ましい。インキュベーション時間は、選択されるインキュベーション温度にも依存する。このことは、インキュベーション温度が酵素の至適温度よりも低い場合、インキュベーション時間が延長され得ることを意味する。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、インキュベーションは、10 から 50℃の範囲、好ましくは 15 から 40℃の範囲、より好ましくは 30℃ の温度で実施される。
【００４６】
本発明によって SPase と共にインキュベートされる混合物は、グルコシルドナー、特にスクロースを、0.01 から 3 mol/l、好ましくは 0.05 から 2 mol/l、より好ましくは 0.1 から 1.5 mol/l の濃度で含む。
【００４７】
SPase の活性および αGG をもたらすその基質代謝回転は、本明細書に開示されるグルコシルドナー濃度において最適であることが判明した。
【００４８】
本発明の好ましい態様によれば、基質混合物は、グリセロールを 0.01 から 10 mol/l、好ましくは 0.05 から 5 mol/l、より好ましくは 0.1 から 3 mol/l、よりいっそう好ましくは 0.1 から 1.5 mol/l の濃度で含む。
【００４９】
混合物中における、グリセロール対グルコシルドナーの比は、好ましくは 0.1:1 から 10:1、好ましくは 0.5:1 から 5:1、より好ましくは 1:1 から 3:1 の範囲である。
【００５０】
本発明による方法によって得られ得る αGG α-D-グルコシルグリセロールは、様々なクロマトグラフィー方法、好ましくは濾過助剤としてのセライト(celite)と併用される活性炭(activated charcoal)上での溶出クロマトグラフィーによって単離され得る。本発明による方法によって得られ得る生成物の混合物は、水で平衡化された上記材料のカラム上にロードされ、結合した αGG の溶出は 2% エタノールを用いて達成される。αGG を含有する画分は、残余のグリセロールおよびグルコシルドナーの切断に起因する生成物を含まない。αGG は、70%を超え、好ましくは 80%を超え、特に 90%を超える収率で得られる。クロマトグラフィー後の生成物の純度は、80%を超え、好ましくは 90%を超え、特に 95%を超える。減圧下での濃縮の後、固体の αGG は、好ましくは乾燥によって、好ましくは凍結乾燥によって得られる。
【００５１】
炭(Charcoal)は、好ましくは懸濁剤として用いられ得、またはより好ましくはカラム(例えば、クロマトグラフィーカラム)中に充填され得る。酵素または残余の酵素および基質を含む可能性のある反応混合物は、炭(charcoal)と接触させられ(例えば、炭(charcoal)カラム上に適用され)、引き続いて溶出される。この溶出物または反応混合物自身でさえ、例えば陰イオン交換樹脂を用いて(さらに)精製され得る。
【００５２】
本発明の別の好ましい態様によれば、スクロースホスホリラーゼは、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）(Q59495、Q9R5Q3)から得られ、遊離のまたは好ましくは固定化された酵素調製物、好ましくはアクリルポリマー、特にメタクリルアミド、N,N'-メチレン-ビス(アクリルアミド)およびオキシラン基を保有するポリマーのコポリマー上に固定化された酵素調製物として用いられ、ここで、固定化されたスクロースホスホリラーゼは、グルコシルドナーとしてのスクロースと共にインキュベートされる。
【００５３】
例えば、特に、オキシラン基を保有するポリマー粒子(またはゲル)上に固定化された、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来の SPase は、並外れて安定で、かつ、連続的な反応に良く適合した。
【００５４】
本発明の別の側面は、本発明による方法によって得られ得るα-D-グルコシルグリセロール(αGG)またはα-D-グルコシルグリセロール(αGG)を含む生成物に関する。
【００５５】
SPase は、グルコシル基転移に起因する副生成物の有意な形成を伴わずに該αGG の形成を特異的に触媒することができるため、本発明の方法によって得られ得る αGG または αGG を含む生成物は、天然 αGG (2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシド)を多量に含む。それゆえ、所望の 2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシドに加えて 1-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシドをも含む位置異性体の混合物が全く含まれないことは特に重要である。これら２つの生成物の分離は非常に困難である。本発明の方法の反応条件下において、変換されるドナーのグルコシル部分の 90%よりも多く、好ましくは 95%よりも多く、より好ましくは 98%よりも多くが、所望の生成物へ転移させられるほどに、加水分解生成物の形成が効率的に阻止されることも特に重要である。
【００５６】
例えば、スクロースがグルコシルドナーとして用いられる場合、天然 αGG およびフルクトースを含む生成物が得られる。Glc 1-P がグルコシルドナーとして用いられる場合、天然 αGG およびリン酸を含む生成物が得られる。
【００５７】
したがって、本発明の方法によって得られ得る生成物は、フルクトースを、好ましくは αGG α-D-グルコシルグリセロールと等モルの量で、さらに含み得る。
【００５８】
αGG は、様々な微生物において浸透圧保護(osmoprotective)物質および安定化剤の機能を果たす天然分子(グリコシド; 炭水化物誘導体)である。単離された αGG が、技術的応用に関して相当興味深い、様々な傑出した(outstanding)特性を有するということを、いくつかの刊行物が示している。αGG およびその誘導体の使用は、これらに限定されないが、医薬(癌治療)、化粧品(様々な製品に対する保湿および安定化添加剤)、および食品(抗糖尿病剤)の分野を包含する。さらに αGG は、成体分子(タンパク質、脂質)および微生物の、非常に効率的な安定化剤である。
【００５９】
本発明の別の側面は、本発明による αGG を含む化粧品調製物に関する。
【００６０】
本発明の化粧品は特に、本発明の化粧品のみが天然 αGG を含むという事実によって特徴付けられ、それは本発明の方法によって得られ得る。
【００６１】
本発明の別の側面は、本発明による αGG を含む医薬調製物に関する。
【００６２】
本発明の別の側面は、αGG、または本発明によるαGGを含む生成物、を含む栄養補助食品(food supplement)に関する。
【００６３】
本発明の別の側面は、αGG または本発明によるαGGを含む生成物の、甘味料としての使用に関する。ある特定の側面は、本発明の方法によって得られ得る、αGG およびフルクトースの混合物の、甘味料としての使用である。
【００６４】
本発明の別の側面は、保存中または加工処理(processing)中、特に乾燥中における、生体分子の調製物に対する安定化添加剤としての αGG の使用に関する。特に、αGG は、生存微生物、タンパク質および脂質由来の構造の安定化剤として働き得る。αGG は、タンパク質調製物、例えば、これらに限定されず、抗体、抗体断片、および酵素を、変性および生物学的活性の喪失に逆らって安定化し得る。
【００６５】
本発明の別の側面は、インビトロおよびインビボ条件下でのタンパク質のフォールディング、特に組換えタンパク質のフォールディングを促進することができる添加剤としての、αGG の使用に関する。
【００６６】
αGG は特に、皮膚クレンザー(JP 2004/331583)、水性(water-based)化粧品(JP 2004/331582)、中性脂肪の蓄積阻害剤(JP 2004/331580)、真皮マトリックスの生成促進剤(JP 2004/331579)、細胞活性化剤(JP 2004/331578)および抗菌剤(JP 2004/331577)として使用され得る。
【００６７】
本発明は、以下の図表および実施例によって、それらに制限されることなく、さらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図 1 は、αGG の化学構造を示す。
【００６９】
表 1 は、本発明の方法によって生産および精製された αGG についての NMR データを示し、化学構造を 図 1 に明解に示す。
表 1: D2O 中において、300 K で、アセトンでの外部較正(2.22 ppm 1H; 31.5 ppm 13C)を用いて、反応混合物から直接測定した、2-O-グリセリル-α-D-グルコピラノシド(αGG)における NMR シフト割当て。
【表１】
2010504082.tif 000003
Suhr, R.; Scheel, O.; Thiem, J. J. Carbohydr. Chem. (1998) 17: 937-968
【００７０】
【図２】図 2 は、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）からの遊離の SPase を用いての、スクロースおよびグリセロールからの αGG の生産を示す。酵素反応を撹拌バッチ方式（stirred batch system）で実施した。基質として 300 mM スクロース および 2 M グリセロールを含有する、50 mM MES バッファー(pH 7)を用いた。酵素濃度は 20 IU/ml であった。詳細には、50 mM MES バッファー(pH 7)中に 300 mM スクロース、2 M グリセロール および 20 IU/ml SPase を含有する反応混合物を、30℃ および 550 rpm で 7.5 時間インキュベートした。選択されたこれら最適条件下において、αGG の収率は 95%より高かった。生成物を明らかにするため、遊離されたフルクトースの量から遊離されたグルコースの量を減算した。
【図３】図 3 は、オキシラン基を保有するポリマー上に固定化された、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）からの SPase の操作上の安定性を示す。充填床酵素リアクターにおける、スクロースの連続的変換の結果が示される。基質溶液は、pH 7.0 の 20 mM MES バッファー中に各々 600 mM のスクロースおよびリン酸を含有した。反応を 30℃ および 6 ml・h-1 の一定流速で行い、平均滞留時間はそれぞれ 8.8 時間(53 ml、●) および 18.5 時間(111 ml、○)であった。
【図４】図 4 は、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）からの SPase を用いての、グリセロールの酵素的グルコシル化による、様々な pH 値での αGG の合成を示す。反応混合物は、それぞれ 40 mM MES バッファー(pH 6.0、6.5、7.0) および 40 mM TES バッファー(pH 7.5、8.0)中に、0.1 M Glc 1-P、3 M グリセロール および 3 IU/ml の SPase を含有した。変換を 30℃ および 550 rpm の撹拌速度で実施した。生産性を明らかにするため、遊離されたリン酸の量(cP)から遊離されたグルコースの量(cglc)を減算した。
【図５】図 5 は、新たな α-D-グルコシドの合成につながる、スクロースの加水分解における SPase による求核的競合（nucleophilic competition）を示す。
【実施例】
【００７１】
実施例 1: Spase の生産
SPase は、文献における報告に従って、ネイティブな酵素または(例えば、これらに限定されないが、大腸菌(Escherichia coli)において生産される)組換え酵素として得ることができる(Guibert A and Monsan P、Ann. N.Y. Acad. Sci. (1988) 504:307-311; Vandamme EJ et al.、Adv. Appl. Microbiol.(1987)32:163-201; Kawasaki H et al.、Biosci. Biotech. Biochem.(1996)60:322-324; Kitao S and Nakano E、J. Ferment. Bioeng.(1992)73:179-184; van den Broek LAM et al.、Appl. Microbiol. Biotechnol.(2004)65:219-227)。それは当然、適切な微生物の振盪フラスコ培養、およびバイオリアクター、好ましくは通気または非通気の撹拌槽リアクターまたはカラムリアクター、例えばバブルカラム(bubble column)またはエアリフトリアクター、に代表される様々なスケールで生産されうる。酵素の部分精製または単離は、SPase について記載された手順を用いて、または最新技術に従ってタンパク質精製の一般的プロトコルを採用することによって為される。固定化手順、例えば、これらに限定されないが、不溶性担体への共有および非共有結合、カプセル化、および全細胞システムは、SPase についての既に発達したプロトコルを用いて、または最新技術に従って一般的プロトコルを採用することによって実行される(Pimentel MCB and Ferreira MSS、Appl. Biochem. Biotechnol.(1991)27:37-43; Soetaert W. et al.、Progress in Biotechnology Vol.10 (Petersen S.B.、Svensson、B.、Pederesen、S.、Eds)、Elsevier、Amsterdam; Vandamme EJ et al.、Adv. Appl. Microbiol.(1987)32:163-201)。
【００７２】
実施例 2: 酵素アッセイ
連続的共役酵素アッセイを用い、30℃で SPase の活性を決定し、ここで、スクロースおよび無機リン酸からの Glc 1-P の生成は、ホスホグルコムターゼ(PGM)およびグルコース 6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6P-DH)の存在下における NAD+ の減少と共役する。標準的アッセイを、原則的には他で記載された通り、10 mM EDTA、10 mM MgCl2 および 10 μM α-D-グルコース 1,6-ビスリン酸を含有する pH 7.0 の 50 mM リン酸カリウムバッファー中で実施した。反応混合物は、250 mM スクロース、2.5 mM NAD+、3 U・ml-1 PGM、3.4 U・ml-1 NAD+-依存性 G6P-DH および適切な希釈の酵素溶液を含有した。経時的な NADH の形成を、分光測定により 340 nmでモニターした。１ユニットの SPase 活性は、上記の条件下で分あたり 1 μmol の NAD+ の減少を引き起こした酵素の量に相当する。タンパク質濃度を、標準としてのウシ血清アルブミンと共に BioRad の色素結合法を用いて決定した。リン酸を 850 nmで比色測定により決定し、Glc 1-P を、PGM および G6P-DH と共に、共役酵素系においてアッセイした。
【００７３】
実施例 3: オキシラン基を含有するポリマー上への LmSPase の固定化 
総量 700 U の、50 U・mg-1 の特異的 SPase 活性を有する粗精製 SPase 調製物を、pH 7.0 の 0.7 M リン酸カリウムバッファー中で、10 g の Eupergit C と共に、4℃で 14 時間インキュベートした。撹拌速度は、250 rpmであった。該固定化物（immobilisate）を、pH 7.0 の 20 mM MES バッファーで数回洗浄した。固定化後の上清において測定された残存活性と使用された全活性(U)の比によって与えられる結合効率は、0.5 であった。
【００７４】
実施例 4: 固定化 SPase の操作安定性 
SPase が付着した Eupergit C を、恒温ジャケットを備える GE Healthcare XK26/40 ガラスカラム中に充填した(2.6 cm; 53 ml または 111 ml、34 U・g-1 Eupergit C)。該カラムを、pH 7.0 の 20 mM MES バッファーで平衡化した。基質溶液は各々 600 mM のスクロースおよびリン酸を同じバッファー中に含有し、水浴中でのインキュベーションによって反応温度(30℃)へ導かれた。該溶液を、GE Healthcare ピストンポンプ(モデル P-500)から送られる 6 ml・h-1 の一定流速で、充填床(packed bed)を通して送り出した。リアクターの出口での温度を継続的にモニターした。一定の時点において 1-ml のサンプルを採取し、さらなる分析に用いた。
【００７５】
図 3 は、1.13 cm・h-1 の一定の軸方向流速で操作される連続的固定床リアクターにおける、Glc 1-P 生成の経時変化を示す。充填床の高さによって決定される 8.8 時間または 18.5 時間の平均滞留時間によって、スクロース(600 mM)の変換はそれぞれ 68% および 91% であった。生成物 g・l-1 x 滞留時間の逆数 として計算される、それぞれに対応する生産性は、15.4 g・(l・h)-1 および 10.9 g・(l・h)-1 であった。650 時間の延長された反応時間まで変換速度が一定のままであったことに注目されたく、このことは操業条件における固定化 SPase の優れた安定性を際立たせる。
【００７６】
実施例 5: ドナーとして Glc 1-P を用いる αGG の合成 
反応混合物は、40 mM MES バッファー(pH 6.0、6.5、7.0) または 40 mM TES バッファー(pH 7.5、8.0)中に、0.1 M Glc 1-P、3 M グリセロール および 3 IU・ml-1 LmSPase を含有した。30℃ および 550 rpmの撹拌速度において、酵素的変換を経時的に追跡した。遊離されたリン酸(cP)およびグルコース(cglc)の濃度を決定した。形成されたグルコシル基転移生成物の量は、cP - cglc に相当する。結果を図 4 に示す。
【００７７】
実施例 6: ドナーとしてスクロースを用いる αGG の合成 
50 mM MES バッファー(pH 7)中に 300 mM スクロース、2 M グリセロールおよび 20 U/ml SPaseを含有する反応混合物を、30℃ および 550 rpm で 7.5 時間インキュベートした。これらの選択された最適条件下において、αGG の収率は 95% よりも高かった(図 2)。BioRad HPX-87C カラムおよび示差屈折率(reflection index)検出を採用する HPLC を用いて、生成物の分析を行った。該カラムを 85℃に維持し、0.6 ml/分の流速で脱イオン水を溶出剤として用いた。遊離されたグルコースの量を、最新のグルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼアッセイを用いて測定した。表 1 に示される NMR 解析により、αGG の正確な構造および生成物の混合物の組成を確認した。実施例 10a および 10b で用いられる条件下では、加水分解(すなわちグルコースの形成)が効率的に妨げられることに注目されたい。
【００７８】
実施例 7: αGG の精製 
800 mM スクロースを用いた以外は実施例 6 の通りに得られた 約 90 ml の生成物を、活性炭(activated charcoal) Norit（登録商標）(Type Norit SX Ultra)と セライト(celite)（登録商標）501(か焼されたフィルターエイド(Filter Aid))との 1:1 の混合物 約 1 リットルを充填したカラム(XK 50/60、GE Healtcare)上にロードした。該カラムを水で平衡化した。該生成物溶液は、16.3 g の αGG、12.4 g のフルクトース、2.2 g のスクロース、13.1 g のグリセロールおよび 0.8 g のグルコースを含有した。水中におけるエタノールの段階的勾配を用い、まず 4 リットルの水、次いで 4 リットルの 2% エタノール、そして最後に 2 リットルの 15% エタノールを用いて溶出を行った。αGG は 2% エタノールで溶出し、未反応のスクロースおよびフルクトースから分離される。グリセロールは水画分中に存在する。回収された αGG の収率は 56% であり、HPLC によって評価される αGG の純度は 98% よりも大きい。
【００７９】
実施例 8: 凍結乾燥中のタンパク質の安定化 
pH 7.0 の 100 mM Tris/HCl バッファー中における 0、20、50、100、500、1000 または 1500 mM の αGG の存在下で、興味のあるタンパク質(例えば、マンニトールデヒドロゲナーゼ、MDH)を 0.8 mg/ml の濃度でインキュベートした。該サンプルを一晩凍結乾燥させて、同じバッファーに再度溶解した。他で記載された通りに(Slatner M. et al.、Biochemistry 38: 10489-10498)、対応する酵素についての適切なアッセイを用いて、凍結乾燥の前後で特異的酵素活性を決定した。いかなる安定化剤も添加しない状態では、MDH の酵素活性は凍結乾燥後に 2% まで低下したが、一方で αGG は、添加される αGG の濃度に関わらず酵素活性を 48% まで維持することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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