(57)【要約】本発明は、抗体の安定化のための処方物および方法を提供する。一実施形態では、本発明は、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合するＩｇＧ１抗体の安定な溶液処方物を提供する。別の実施形態では、本発明は、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合するＩｇＧ１抗体の安定化方法であって、その抗体の水系処方物を凍結乾燥する工程を含む方法を提供する。この処方物は、加工および保存中に抗体を安定化するために凍結乾燥することができ、その後にこの処方物は、薬理学的投与のために再構成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体処方物であって、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合するＩｇＧ１抗体と、ｐＨ約６．０〜約７．０の範囲の薬理学的に許容できる緩衝液と、薬理学的に許容できる塩と、薬理学的に許容できる安定剤と、薬理学的に許容できる界面活性剤とを含む、液体処方物。
【請求項２】
前記ＩｇＧ１抗体濃度が約５ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌの範囲にある、請求項２に記載の液体処方物。
【請求項３】
前記ＩｇＧ１がＩＭＣ−Ａ１２またはＩＭＣ−２Ｆ８である、請求項１に記載の液体処方物。
【請求項４】
前記緩衝液が、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の範囲にある、ヒスチジン、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、および酢酸塩の緩衝液からなる群から選択される有機緩衝液である、請求項１に記載の液体処方物。
【請求項５】
前記緩衝液が約１０ｍＭの濃度である、請求項４に記載の液体処方物。
【請求項６】
前記安定剤が、アスパラギン酸、ラクトビオン酸、グリシン、トレハロース、マンニトールおよびスクロースからなる群から選択される、請求項１に記載の液体処方物。
【請求項７】
前記安定剤が約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度の範囲にある、請求項６に記載の液体処方物。
【請求項８】
前記安定剤の濃度が約１００ｍＭである、請求項７に記載の液体処方物。
【請求項９】
前記安定剤が、トレハロースである、請求項６に記載の液体処方物。
【請求項１０】
前記安定剤がヒスチジンである、請求項６に記載の液体処方物。
【請求項１１】
前記塩が、約７５〜約１５０ｍＭの濃度の範囲にあるＮａＣｌである、請求項１に記載の液体処方物。
【請求項１２】
前記ＮａＣｌが約１００ｍＭの濃度である、請求項１１に記載の液体処方物。
【請求項１３】
前記界面活性剤が、約０．００１％〜約１．０％（重量／体積）の濃度の範囲にある、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレン−ポリプロピレングルコールおよび胆汁酸塩からなる群から選択される、請求項１に記載の液体処方物。
【請求項１４】
前記界面活性剤が、約０．０１％（重量／体積）の濃度である、請求項１３に記載の液体処方物。
【請求項１５】
ｐＨが約６．０〜約６．５の範囲にある、請求項１に記載の液体処方物。
【請求項１６】
ｐＨが約６．５である、請求項１３に記載の液体処方物。
【請求項１７】
約５ｍｇ／ｍｌのＩＭＣ−Ａ１２抗体、約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、約１００ｍＭのグリシン安定剤、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．０１％のポリソルベート８０を含み、ｐＨが約６．５である、請求項１に記載の液体処方物。
【請求項１８】
凍結乾燥されて凍結乾燥処方物を形成している、請求項１に記載の液体処方物。
【請求項１９】
さらに増量剤を含む、請求項１８に記載の凍結乾燥処方物。
【請求項２０】
前記増量剤がマンニトールまたはグリシンである、請求項１９に記載の凍結乾燥処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本願は、２００７年３月２２出願の米国仮特許出願第６０／９１９７４４号の利益を主張する。この仮特許出願の内容は本明細書の一部を構成する。
【０００２】
本発明は、インスリン様増殖因子１受容体に結合する抗体の安定化のための方法および処方物に関する。
【背景技術】
【０００３】
液体処方物中の抗体は、ヒンジ領域における加水分解、凝集、酸化、脱アミド化、および断片化を含めて、種々の化学プロセスおよび物理的プロセスを受けやすい。これらのプロセスは、機能抗体の利用可能性を低下させ、抗原結合の特徴を低下または除去することによって、治療抗体の臨床的効力を変更または排除することがある。本発明は、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）に対するＩｇＧ１サブクラスのモノクローナル抗体の安定な処方物に対するニーズに対応し、これらの抗体についての安定な溶液処方物および安定な凍結乾燥処方物を提供する。
【０００４】
ＩＧＦ−ＩＲは、正常な胎児成長および出生後の成長および発育にとって必須である偏在的な膜貫通型チロシンキナーゼ受容体である。ＩＧＦ−ＩＲは、細胞増殖、細胞分化、細胞の大きさの変化を刺激することができ、かつアポトーシスから細胞を保護することができる。それはまた、細胞形質転換のために準必須（ｑｕａｓｉ−ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ）であると考えられてきた（非特許文献１；非特許文献２に概説されている）。ＩＧＦ−ＩＲは、ほとんどの細胞型の表面に存在し、増殖因子ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ（以後、集合的にＩＧＦと呼ぶ）のためにシグナル伝達分子としての役割を果たす。ＩＧＦ−ＩＲはまた、インスリンに結合するが、それがＩＧＦに結合する親和性よりも３桁低い親和性で結合するに過ぎない。ＩＧＦ−ＩＲは、ジスルフィド結合によって共有結合的に結合している２つのα鎖および２つのβ鎖を含有する、予め形成されたヘテロ四量体である。この受容体サブユニットは、１８０ｋｄの１本のポリペプチド鎖の一部として合成され、このポリペプチド鎖は、次いでα（１３０ｋｄ）サブユニットおよびβ（９５ｋｄ）サブユニットへとタンパク質分解的に処理される。α鎖全体は細胞外にあり、リガンド結合のための部位を含有する。β鎖は、膜貫通型ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、ならびに細胞分化および形質転換のためには必要であるが、マイトジェンシグナル伝達およびアポトーシスからの保護のためには無くてもよいＣ末端伸張部を保有する。
【０００５】
ＩＧＦ−ＩＲは、インスリン受容体（ＩＲ）に非常に類似している。β鎖配列の内部では特にそうである（７０％相同性）。この相同性に起因して、最近の研究は、これらの受容体が１つのＩＲ二量体および１つのＩＧＦ−ＩＲ二量体を含有するハイブリッドを形成できることを明らかにした（非特許文献３）。ハイブリッドの形成は、正常細胞および形質転換細胞の両方において起こり、ハイブリッド含有量は、その細胞内のこの２つのホモ二量体受容体（ＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲ）の濃度に依存する。３９個の乳癌の検体の一研究において、ＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲはともにすべての腫瘍試料において過剰発現されていたが、ハイブリッド受容体含有量は、常に、両方のホモ受容体のレベルを、およそ３倍超えていた（非特許文献４）。ハイブリッド受容体はＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲの対から構成されているが、このハイブリッドは、ＩＧＦ−ＩＲの親和性と同様の親和性でＩＧＦに選択的に結合し、インスリンとは弱く結合するだけである（非特許文献５）。それゆえ、これらのハイブリッドは、ＩＧＦに結合して、正常細胞および形質転換細胞の両方において、シグナルを伝達することができる。
【０００６】
第２のＩＧＦ受容体、ＩＧＦ−ＩＩＲ、またはマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体もまた、高い親和性でＩＧＦ−ＩＩリガンドに結合するが、チロシンキナーゼ活性を欠く（非特許文献６）。それはＩＧＦ−ＩＩの分解を生じるため、ＩＧＦ−ＩＩについてのシンク（ｓｉｎｋ）であると考えられ、このリガンドの増殖促進効果に拮抗する。腫瘍細胞におけるＩＧＦ−ＩＩＲの損失は、ＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦ−ＩＲとの結合に対するその拮抗作用の解放によって、増殖の可能性を高め得る（非特許文献７）。
【０００７】
ＩＧＦ−Ｉの内分泌性発現は、主に成長ホルモンによって調節され、肝臓で産生されるが、最近の証拠は、多くの他の組織型もまたＩＧＦ−Ｉを発現することができることを示唆している。それゆえこのリガンドは、内分泌調節およびパラクリン調節を受けやすく、加えて、多くの種類の腫瘍細胞の場合には自己分泌調節を受けやすい（非特許文献８）。
【０００８】
ＩＧＦに対して特異的結合親和性を有する６つのＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）が血清中で同定された（非特許文献８）。ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦの作用を高めるかまたは阻害するかのいずれかをなすことができ、これは、翻訳後の改変の結果として生じる結合タンパク質の分子構造によって決定される。それらの一次的役割は、ＩＧＦの輸送、タンパク質的分解からのＩＧＦの保護、およびＩＧＦとＩＧＦ−ＩＲとの相互作用の調節である。血清ＩＧＦ−Ｉの約１％のみが遊離リガンドとして存在し、残りはＩＧＦＢＰと会合している（非特許文献８）。
【０００９】
リガンド（ＩＧＦ）の結合の際に、このＩＧＦ−ＩＲは、β鎖の触媒ドメイン内の保存されたチロシン残基で自己リン酸化を受ける。そのβ鎖内のさらなるチロシン残基の引き続くリン酸化は、シグナル伝達カスケードにとって非常に重要な下流分子の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）のためのドッキング部位を提供する。ＩＧＦシグナルの伝達のための原則的な経路は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）およびホスファチジルイノシトール  ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）である（非特許文献９に概説されている）。このＭＡＰＫ経路は、ＩＧＦ刺激後に顕在化されるマイトジェニックシグナルに主に関与し、ＰＩ３Ｋは、抗アポトーシスプロセスまたは生存プロセスのＩＧＦ依存性誘発に関与する。
【００１０】
ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の非常に重要な役割は、その抗アポトーシス機能または生存機能である。活性化されたＩＧＦ−ＩＲは、ＰＩ３Ｋおよび下流のＡｋｔ、またはタンパク質キナーゼＢのリン酸化にシグナル伝達する。Ａｋｔは、リン酸化を介して、プログラムされた細胞死の開始のために必須であるＢＡＤなどの分子を効果的に遮断することができ、そしてアポトーシスの開始を阻害することができる（非特許文献１０）。アポトーシスは、正常な発育プロセスにとって非常に重要な細胞機構である（非特許文献１１）。それは、重篤な損傷を受けた細胞の排除を行い、腫瘍形成を促し得る突然変異誘発性損傷の残存の可能性を低下させるための非常に重要な機構である。この目的のために、ＩＧＦシグナル伝達の活性化が、マウスのトランスジェニックモデルにおいて自然発症的な腫瘍の形成を促すことができることが明らかになった（非特許文献１２）。さらに、ＩＧＦ過剰発現は、化学療法によって誘発される細胞死から細胞を救うことができ、腫瘍細胞の薬物耐性における重要な要因であり得る（非特許文献１３）。結果として、ＩＧＦシグナル伝達経路の調節は、化学療法薬に対する腫瘍細胞の感受性を高めることが示された（非特許文献１４）。
【００１１】
非常に多くの研究および臨床研究が、癌の発生、維持および進行におけるＩＧＦ−ＩＲおよびそのリガンド（ＩＧＦ）の関与を示している。腫瘍細胞では、受容体の過剰発現は、ＩＧＦリガンドの過剰発現と呼応することが多いが、これらのシグナルの増強、およびその結果として、細胞増殖および生存の増大につながる。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、前立腺癌（非特許文献１５；非特許文献１６）、乳癌（非特許文献１３）、肺癌、結腸癌（非特許文献１７）、胃癌、白血病、膵臓癌、脳癌、ミエローマ（非特許文献１８）、メラノーマ（非特許文献１９）、および卵巣癌（非特許文献２０に概説されている）を含めた実に様々な癌細胞株についての強力なマイトジェンであることが示されており、この作用は、ＩＧＦ−ＩＲによって媒介される。血清中の高濃度のＩＧＦ−Ｉは、乳癌、前立腺癌、および結腸癌の危険性の上昇と関連づけられてきた（非特許文献２１）。結腸癌のマウスモデルにおいて、生体内での血中ＩＧＦ−Ｉ濃度の上昇は、腫瘍増殖および転移の発生率の顕著な上昇につながる（非特許文献２２）。トランスジェニックマウスの上皮基底細胞におけるＩＧＦ−Ｉの構成的発現が自然発症的な腫瘍形成を促すことが示されている（非特許文献１２；非特許文献２３）。細胞株および腫瘍におけるＩＧＦ−ＩＩの過剰発現は高い頻度で発生し、それはＩＧＦ−ＩＩ遺伝子のゲノム刷り込みの損失から生じ得る（非特許文献２４）。受容体の過剰発現は、肺腫瘍（非特許文献２５）、乳房の腫瘍（非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）、肉腫（非特許文献２９；非特許文献３０）、前立腺腫瘍（非特許文献１５）、および結腸腫瘍（非特許文献１７）を含めた多くの多様なヒトの腫瘍型で明らかにされている。加えて、非常に転移性が高い癌細胞は、転移する傾向が低い腫瘍細胞よりも、高いＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＲの発現を保有することが示されている（非特許文献３１）。細胞増殖および形質転換におけるＩＧＦ−ＩＲの非常に重大な役割が、ＩＧＦ−ＩＲノックアウト由来のマウスの胚線維芽細胞の実験において明らかにされた。これらの初代細胞は、１０％血清を含む培養培地中で顕著に低下した速度で増殖し、ＳＶ４０ラージＴを含めた種々の癌遺伝子によって形質転換することができない（非特許文献３２）。最近、いくつかの形態の乳癌における薬物ハーセプチンへの耐性は、それらの癌におけるＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の活性化に起因する可能性があることが明らかにされた（非特許文献３３）。ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現または活性化は、それゆえ、腫瘍形成能においてだけでなく、腫瘍細胞の薬物耐性においても主要な決定因子である可能性がある。
【００１２】
ＩＧＦ系の活性化はまた、先端巨大症（非特許文献３４）、網膜血管新生（非特許文献３５）、および乾癬（非特許文献３６）を含めた、癌とは別のいくつかの病態にも関係しているとされてきた。後者の研究では、ＩＧＦ−ＩＲを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド調製物が、マウスモデルにおけるヒト乾癬性皮膚移植片中での上皮細胞の過剰増殖を顕著に阻害することにおいて有効であった。これは、抗ＩＧＦ−ＩＲ療法がこの慢性障害の効果的な治療法である可能性があることを示唆する。
【００１３】
種々の戦略が、細胞におけるＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達経路を阻害するために開発されてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、乾癬について上で示したように、生体外、および実験的マウスモデルにおいて有効であった。加えて、生体外および生体内で抗増殖活性を保有する、ＩＧＦ−ＩＲを標的とする阻害性ペプチドが生成された（非特許文献３７；非特許文献３８）。ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端由来の合成ペプチド配列がアポトーシスを誘発し、腫瘍増殖を顕著に阻害することが示された（非特許文献３９）。腫瘍細胞株における過剰発現の際にリガンドについて野生型ＩＧＦ−ＩＲと競合し、生体外および生体内で腫瘍細胞増殖を効果的に阻害する、ＩＧＦ−ＩＲのいくつかのドミナントネガティブな変異体もまた、生成された（非特許文献４０；非特許文献４１）。加えて、ＩＧＦ−ＩＲの可溶形態も、生体内で腫瘍増殖を阻害することが明らかにされた（非特許文献４２）。ヒトＩＧＦ−ＩＲに対する抗体もまた、乳癌（非特許文献４３）、ユーイング骨肉腫（非特許文献４４）、およびメラノーマ（非特許文献４５）由来の細胞株を含めた、生体内での腫瘍細胞増殖および生体内での腫瘍形成を阻害することが示された。抗体は、魅力的な治療薬である。その主な理由は、それらが、１）特定のタンパク質抗原に対する高い選択性を保有することができ、２）その抗原への高い親和性結合を示すことができ、３）生体内で長い半減期を有し、そして、それらが天然の免疫産物であるため、４）低い生体内毒性を示すはずだからである（非特許文献４６）。しかしながら、非ヒト源、例えばマウス由来の抗体は、反復的な適用後に治療抗体に対して免疫応答をもたらすことがあり、それによって抗体の有効性を無力化することがある。完全ヒト抗体は、天然に存在する免疫応答性抗体と同様に、ヒトにおいてマウス抗体またはキメラ抗体ほどには免疫原性ではないようであるため、ヒトの治療薬として最大の成功の可能性を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ａｄａｍｓら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５７：１０５０−９３（２０００）
【非特許文献２】Ｂａｓｅｒｇａ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：５５７４−８１（２０００）
【非特許文献３】Ｐａｎｄｉｎｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５：１９３５−１９（１９９９）
【非特許文献４】Ｐａｎｄｉｎｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５：１９３５−４４（１９９９）
【非特許文献５】ＳｉｄｄｌｅおよびＳｏｏｓ、Ｔｈｅ  ＩＧＦ  Ｓｙｓｔｅｍ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．１９９−２２５頁、１９９９
【非特許文献６】Ｏａｔｅｓら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．４７：２６９−８１（１９９８）
【非特許文献７】Ｂｙｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４４０８−１６（１９９９）
【非特許文献８】Ｙｕ，Ｈ．およびＲｏｈａｎ，Ｊ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２：１４７２−８９（２０００）
【非特許文献９】Ｂｌａｋｅｓｌｅｙら、Ｔｈｅ  ＩＧＦ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．１４３−１６３（１９９９）
【非特許文献１０】Ｄａｔｔａら、Ｃｅｌｌ  ９１：２３１−４１（１９９７）
【非特許文献１１】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：４５３−５０１（１９９１）
【非特許文献１２】ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：１５６１−７０（２０００）
【非特許文献１３】Ｇｏｏｃｈら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．５６：１−１０（１９９９）
【非特許文献１４】Ｂｅｎｉｎｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：１７９０−９７（２００１）
【非特許文献１５】Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：６２７６−８０（２００１）
【非特許文献１６】Ｈｅｌｌａｗｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：２９４２−５０（２００２）
【非特許文献１７】ＨａｓｓａｎおよびＭａｃａｕｌａｙ、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：３４９−５６（２００２）
【非特許文献１８】ＧｅおよびＲｕｄｉｋｏｆｆ、Ｂｌｏｏｄ  ９６：２８５６−６１（２０００）
【非特許文献１９】Ａｌｌ−Ｅｒｉｃｓｓｏｎら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３：１−８（２００２）
【非特許文献２０】Ｍａｃａｕｌａｙ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５：３１１−２０（１９９０）
【非特許文献２１】Ｐｏｌｌａｋ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３６：１２２４−２８（２０００）
【非特許文献２２】Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：１０３０−３５（２００２））
【非特許文献２３】Ｂｏｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：１７２５−１７３４（１９９７）
【非特許文献２４】Ｙａｇｉｎｕｍａら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５４：５０２−７（１９９７）
【非特許文献２５】Ｑｕｉｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１４７７−８３（１９９６）
【非特許文献２６】Ｃｕｌｌｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：４８−５３（１９９０）
【非特許文献２７】ＰｅｙｒａｔおよびＢｏｎｎｅｔｅｒｒｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２：５９−６７（１９９２）
【非特許文献２８】ＬｅｅおよびＹｅｅ、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．４９：４１５−２１（１９９５）
【非特許文献２９】ｖａｎ  Ｖａｌｅｎら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１８：２６９−７５（１９９２）
【非特許文献３０】Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４５７０−７４（１９９６）
【非特許文献３１】Ｇｕｅｒｒａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６５：８１２−２０（１９９６）
【非特許文献３２】Ｓｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３６０４−１２（１９９４）
【非特許文献３３】Ｌｕら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：１８５２−５７（２００１）
【非特許文献３４】ＤｒａｎｇｅおよびＭｅｌｍｅｄ．Ｔｈｅ  ＩＧＦ  Ｓｙｓｔｅｍ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．６９９−７２０（１９９９）
【非特許文献３５】Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１２：１３９０−９５（１９９９）
【非特許文献３６】Ｗｒａｉｇｈｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：５２１−２６（２０００）
【非特許文献３７】Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６４４７−５１（１９９２）
【非特許文献３８】Ｈａｙｌｏｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１１：２０２７−３５（２０００）
【非特許文献３９】Ｒｅｉｓｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．１８１：１２４−３５（１９９９）
【非特許文献４０】Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０１：１１−６（２００２）
【非特許文献４１】Ｓｅｅｌｙら、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：１５（２００２）
【非特許文献４２】Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４０１３−２０（１９９６）
【非特許文献４３】ＡｒｔｅｇａおよびＯｓｂｏｒｎｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：６２３７−４１（１９８９）
【非特許文献４４】Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４１２７−３１（１９９８）
【非特許文献４５】Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５２２−２６（１９９３）
【非特許文献４６】ＰａｒｋおよびＳｍｏｌｅｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、３６０−４２１頁（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
この目的のために、治療用途として、高親和性のヒト抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体の安定な処方物を開発するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、抗体調製物の安定化のための処方物および方法に関する。一実施形態では、本発明は、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合するＩｇＧ１抗体と、緩衝液とを含む、安定な溶液（または液体）処方物を提供する。さらなる実施形態では、その液体処方物中の抗体濃度は約５ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌの範囲にある。好ましくは、その抗体は、ＩＭＣ−Ａ１２またはＩＭＣ−２Ｆ８である。より好ましくは、その抗体はＩＭＣ−Ａ１２である。
【００１７】
一実施形態では、この安定な抗体溶液処方物は、クエン酸塩緩衝液を含有する。さらなる実施形態では、このクエン酸塩緩衝液は、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの間の濃度である。さらなる実施形態では、このクエン酸塩緩衝液は、約１０ｍＭの濃度である。
【００１８】
一実施形態では、上記安定な抗体溶液処方物はグリシンを含有する。さらなる実施形態では、グリシン濃度は約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭである。さらなる実施形態では、このグリシン濃度は約１００ｍＭである。
【００１９】
一実施形態では、上記安定な抗体溶液処方物はＮａＣｌを含有する。さらなる実施形態では、このＮａＣｌは、約７５〜約１５０ｍＭの濃度である。さらなる実施形態では、このＮａＣｌは約１００ｍＭの濃度である。
【００２０】
一実施形態では、上記安定な抗体溶液処方物は界面活性剤を含有する。さらなる実施形態では、この界面活性剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベート（ツイーン（ＴＷＥＥＮ）、ポリエチレン−ポリプロピレングルコールとしても公知）である。さらなる実施形態では、この界面活性剤は、約０．００１％〜約１．０％（重量／体積）の濃度であるポリソルベート８０（ツイーン８０）である。さらなる実施形態では、ツイーン８０は約０．０１％（重量／体積）の濃度である。
【００２１】
一実施形態では、上記安定な抗体溶液処方物は、約６．０〜約７．０のｐＨを有する。さらなる実施形態では、そのｐＨは約６．０〜約６．５である。さらなる実施形態では、そのｐＨは約６．５である。
【００２２】
一実施形態では、上記安定な抗体溶液処方物は、約５ｍｇ／ｍｌ  ＩＭＣ−Ａ１２、約１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、約１００ｍＭ  グリシン、約１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および約０．０１％  ツイーン８０を含み、前記処方物は約６．５のｐＨである。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合するＩｇＧ１抗体を含み、かつ凍結乾燥されている、安定な、凍結乾燥抗体処方物を提供する。一実施形態では、この抗体はＩＭＣ−Ａ１２である。さらなる実施形態では、このＩＭＣ−Ａ１２濃度は、凍結乾燥の前は３０ｍｇ／ｍｌである。
【００２４】
一実施形態では、上記安定な、凍結乾燥した抗体処方物はヒスチジン緩衝液を含有する。さらなる実施形態では、ヒスチジン濃度は、凍結乾燥前は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。さらなる実施形態では、このヒスチジン濃度は、凍結乾燥の前は、約１０ｍＭである。さらなる実施形態では、この緩衝液は、凍結乾燥の前は、約ｐＨ６．５である。
【００２５】
一実施形態では、上記安定な、凍結乾燥した抗体処方物は凍結保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含有する。さらなる実施形態では、この凍結保護剤は糖類である。さらなる実施形態では、この凍結保護剤はトレハロースである。さらなる実施形態では、このトレハロース濃度は、凍結乾燥の前は、約４．６％である。一実施形態では、抗体濃度に対するトレハロース濃度の比は、凍結乾燥の前は、約２００〜約１０００の間である。さらなる実施形態では、抗体濃度に対するトレハロース濃度の比は、凍結乾燥の前は、約６００である。
【００２６】
一実施形態では、上記安定な、凍結乾燥した抗体処方物は増量剤を含有する。さらなる実施形態では、この増量剤はマンニトールまたはグリシンである。
【００２７】
一実施形態では、上記安定な、凍結乾燥した抗体処方物は、約３０ｍｇ／ｍｌ  ＩＭＣ−Ａ１２、約１０ｍＭ  ヒスチジン、および約４．６％  トレハロース（重量／体積）を含み、かつ前記処方物は、約ｐＨ６．５である（濃度およびｐＨは凍結乾燥前のものである）。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物のｐＨの関数として、融解温度（Ｔｍ１）の変化を示す図である。試験条件におけるＩＭＣ−Ａ１２についての転移温度（Ｔｍ）を評価するために、（表２からの）実験的な処方物中のＩＭＣ−Ａ１２についての熱融解曲線が、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によってアッセイされた。
【図２】ＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物中のｐＨの関数として、不溶性凝集体の形成に起因する損失（％）の変化を示す図である。２７．５ｍＬのガラスバイアル中に５ｍｇ／ｍＬで５ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を含む表２に記載される試料は、毎分３００回転で、室温で７２時間撹拌された。損失（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図３】ＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物中のｐＨの関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。２７．５ｍＬのガラスバイアル中に５ｍｇ／ｍＬで５ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を含む表２に記載される試料は、毎分３００回転で、室温で７２時間撹拌された。単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図４】ＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物中の４０℃でのｐＨの関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。（表２に列挙された）種々のｐＨ緩衝液中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２が、４０℃で３週間インキュベートされた。単量体の割合（％）に対するｐＨの効果は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図５】ＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物中の５０℃でのｐＨの関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。種々のｐＨ緩衝液（表２）中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２が、５０℃で１週間インキュベートされた。単量体の割合（％）に対するｐＨの効果は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図６】ＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物中の−２０℃および−７０℃でのｐＨの関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。（表２に列挙された）種々のｐＨ緩衝液中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２が、−２０℃および−７０℃で３週間インキュベートされた。単量体の割合（％）に対するｐＨの効果は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図７】ＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物のＤＳＣ試験について予測プロファイラを示す図である。転移温度に及ぼす緩衝液の種類、ｐＨ、ツイーン８０の濃度、ＮａＣｌ濃度、およびグリシン濃度の影響について予測プロファイラを試験した。タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、温度変化は、１．５℃／分の走査速度で５℃〜９５℃であった。メインの転移ピークに対応する融解温度は線形回帰モデルにフィッティングされ、試験された変数の効果が評価された。
【図８】ＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物の撹拌試験について予測プロファイラを示す図である。２７．５ｍＬのガラスバイアル中に５ｍｇ／ｍＬで５ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を有する表３に記載された試料は、プラットフォームシェーカー上で毎分３００回転で撹拌された。この試験は、室温で７２時間まで実施された。溶液濁度および単量体の割合（％）は、撹拌時間の関数として測定された。濁度および単量体の割合（％）に及ぼす試験された変数の影響は、ＪＭＰソフトウェアを用いて、応答を線形回帰モデルにフィッティングすることにより、評価された。
【図９】４０℃での４週間のインキュベーション後にＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物中に残っている単量体の割合（％）を示す図である。表３の処方物中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２は、４０℃で４週間インキュベートされた。出発物質および４０℃で４週間のインキュベーション後の試験された処方物の単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図１０】５０℃で２週間のインキュベーション後にＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物中に残っている単量体の割合（％）を示す図である。表３の処方物中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２は、５０℃で２週間インキュベートされた。出発物質および５０℃で２週間のインキュベーション後の試験された処方物の単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図１１】ＩＭＣ−Ａ１２の溶液処方物のリアルタイム加速温度安定性について予測プロファイラを示す図である。単量体の割合（％）、凝集体の割合（％）、および分解生成物の割合（％）に及ぼすｐＨ、ＮａＣｌ濃度、グリシン濃度、時、および温度の影響について予測プロファイラを試験した。
【図１２】撹拌時間の関数として、ＩＭＣ−Ａ１２のクエン酸塩処方物およびＰＢＳ処方物の溶液濁度の比較を示す図である。２７．５ｍＬのガラスバイアル中に５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を含有する試料は、プラットフォームシェーカー上で、毎分３００回転で撹拌された。この試験は、室温で７２時間まで実施された。濁度は、Ｓｈｉｍａｔｚｕ  １６０１  ｂｉｏｓｐｅｃ分光光度計を用いて、３５０ｎｍでの吸光度によってアッセイされた。
【図１３】撹拌時間の関数として、クエン酸塩処方物およびＰＢＳ処方物のＩＭＣ−Ａ１２の損失の割合（％）の比較を示す図である。２７．５ｍＬのガラスバイアル中に５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を含有する試料は、プラットフォームシェーカー上で、毎分３００回転で撹拌された。この試験は、室温で７２時間まで実施された。（不溶性凝集体の形成に起因する）物質損失の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定された。
【図１４】撹拌時間の関数として、クエン酸塩処方物およびＰＢＳ処方物中のＩＭＣ−Ａ１２単量体の割合（％）の比較を示す図である。２７．５ｍＬのガラスバイアル中に５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を含有する試料は、プラットフォームシェーカー上で、毎分３００回転で撹拌された。この試験は、室温で７２時間まで実施された。単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図１５】４０℃でのインキュベーション時間の関数として、ＰＢＳ処方物およびクエン酸塩処方物中のＩＭＣ−Ａ１２について単量体の割合（％）の比較を示す図である。単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図１６】４０℃でのインキュベーション時間の関数として、ＰＢＳ溶液処方物およびクエン酸塩溶液処方物中のＩＭＣ−Ａ１２について凝集体の割合（％）の比較を示す図である。凝集体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図１７】４０℃でのインキュベーション時間の関数として、ＰＢＳ溶液処方物およびクエン酸塩溶液処方物中のＩＭＣ−Ａ１２について分解生成物の割合（％）の比較を示す図である。分解生成物の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定された。
【図１８】４０℃で３ヶ月間のインキュベーション後の、ＰＢＳ溶液処方物およびクエン酸塩溶液処方物中のＩＭＣ−Ａ１２についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）を示す図である。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４−２０％トリス−グリシン勾配ゲル上で流された。１レーンあたり１０μｇの試料が、１０μｌの体積で充填された。このゲルは、クーマシーブルーで染色された。レーン４の「クエン酸塩」は、５ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−Ａ１２、１０ｍＭ  クエン酸塩、１００ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  ツイーン８０、ｐＨ６．５］である。レーン２およびレーン３の「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝食塩水である［以下の表３および表４を参照］。
【図１９】４０℃で３ヶ月間のインキュベーション後の、ＰＢＳ溶液処方物およびクエン酸塩溶液処方物中のＩＭＣ−Ａ１２についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）を示す図である。非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４−２０％  トリス−グリシン勾配ゲルを用いて流された。１０μｇの試料が、１０μｌの体積で充填された。このゲルは、クーマシーブルーで染色された。レーン４の「クエン酸塩」は、５ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−Ａ１２、１０ｍＭ  クエン酸塩、１００ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  ツイーン８０、ｐＨ６．５］である。レーン２およびレーン３の「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝食塩水である［以下の表３および表４を参照］。
【図２０】４０℃で３ヶ月間のインキュベーション後の、ＰＢＳ溶液処方物およびクエン酸塩溶液処方物中のＩＭＣ−Ａ１２について等電点電気泳動法（ＩＥＦ）ゲルを示す図である。ＩＥＦは、６．０〜１０．５の範囲のｐＨでアイソゲル（ＩｓｏＧｅｌ）（登録商標）アガロース  ＩＥＦプレートを用いて実施された。試験試料は、０．５％  ツイーン８０を含有するｍｉｌｌｉＱ水へと緩衝液交換された。１０μｇの試料が、１０μｌの体積で充填された。このゲルは、クーマシーブルーで染色された。レーン４の「クエン酸塩」は、５ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−Ａ１２、１０ｍＭ  クエン酸塩、１００ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  ツイーン８０、ｐＨ６．５］である。レーン２およびレーン３の「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝食塩水である［以下の表３および表４を参照］。
【図２１】−２０℃での時間の関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。ＰＢＳ溶液処方物またはクエン酸塩溶液処方物中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２は、−２０℃で３ヶ月までインキュベートされた。インキュベーション後、単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図２２】−７０℃でのインキュベーション時間の関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。ＰＢＳ溶液処方物またはクエン酸塩溶液処方物中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２は、−７０℃で３ヶ月間までインキュベートされた。インキュベーション後、単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図２３】−２０℃での凍結−解凍サイクル数の関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。ＩＭＣ−Ａ１２の凍結−解凍安定性は、試験試料を凍結乾燥機中で−２０℃まで、１℃／分の温度変化率で凍結させることによって評価された。この試料は、１時間インキュベートされ、１℃／分の温度変化率で４℃で解凍された。この凍結−解凍プロセスは１５回まで繰り返され、単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図２４】−７０℃での凍結−解凍サイクル数の関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。ＩＭＣ−Ａ１２の凍結−解凍安定性は、試験試料を凍結乾燥機中で−７０℃まで、１℃／分の温度変化率で凍結させることによって評価された。この試料は、１時間インキュベートされ、１℃／分の温度変化率で４℃で解凍された。凍結−解凍プロセスは１５回まで繰り返され、単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図２５】緩衝液の種類、冷却および凍結保護剤、増量剤、時間、ならびに温度の関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。
【図２６】緩衝液の種類、冷却および凍結保護剤、増量剤、時間、ならびに温度の関数として、凝集体の割合（％）の変化を示す図である。
【図２７】緩衝液の種類、冷却および凍結保護剤、増量剤、時間、ならびに温度の関数として、分解生成物の割合（％）の変化を示す図である。
【図２８】緩衝液の種類、冷却および凍結保護剤、増量剤、時間、ならびに温度の関数として、溶液濁度の変化を示す図である。
【図２９】ＩＭＣ−Ａ１２の凍結乾燥した処方物について単量体の割合（％）の変化を示す図である。表６の凍結乾燥した処方物５、６、９および１０中の単量体の割合（％）に及ぼす４０℃および５０℃での３ヶ月間のインキュベーションの効果が、検討された。単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図３０】ＩＭＣ−Ａ１２の凍結乾燥した処方物について凝集体の割合（％）の変化を示す図である。表６の凍結乾燥した処方物５、６、９および１０中の凝集体の割合（％）に及ぼす４０℃および５０℃での３ヶ月間のインキュベーションの効果が、分析された。凝集体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された
【図３１】ＩＭＣ−Ａ１２の凍結乾燥した処方物について分解生成物の割合（％）の変化を示す図である。表６の凍結乾燥した処方物５、６、９および１０中の分解生成物の割合（％）に及ぼす４０℃および５０℃での３ヶ月間のインキュベーションの効果が、分析された。分解生成物の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図３２】ＩＭＣ−Ａ１２の凍結乾燥した処方物について溶液濁度の変化を示す図である。表６の凍結乾燥した処方物５、６、９および１０中の濁度に及ぼす４０℃および５０℃での３ヶ月間のインキュベーションの効果が、Ｍｉｌｉ−Ｑ水を用いて５ｍｇ／ｍＬへと再構成した後に、分析された。濁度は、Ｓｈｉｍａｔｚｕ  １６０１  ｂｉｏｓｐｅｃ分光光度計を用いて、３５０ｎｍでの吸光度によってアッセイされた。
【図３３】４ヶ月間のインキュベーション後に残っている単量体の割合（％）の変化を示す図である。表７からの凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２処方物は、４℃、４０℃および５０℃で４ヶ月までインキュベートされた。この凍結乾燥した試料は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて５ｍｇ／ｍＬまで再構成され、残っている単量体の割合（％）を測定するためにＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図３４】凍結乾燥前（点線）および凍結乾燥後（実線）のＩＭＣ−Ａ１２の円二色性スペクトルを示す図である。この凍結乾燥プロセスがＡ１２の二次構造を変化させないことを確認するために、凍結乾燥前後のＩＭＣ−Ａ１２の二次構造を円二色性によって検討した。ＩＭＣ−Ａ１２は、ｍｉｌｉＱ水中に０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈または再構成され、円二色性スペクトルは、Ｊａｓｃｏ  ８１０円二色性分光光度計を用いて収集された。
【図３５】４０℃での時間の関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。ＰＢＳおよびクエン酸塩緩衝液中のＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物、ならびに好ましい凍結乾燥した処方物中のＩＭＣ−Ａ１２は、４０℃で４ヶ月間インキュベートされた。この凍結乾燥した試料は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で再構成され、単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図３６】５０℃での時間の関数として、単量体の割合（％）の変化を示す図である。ＰＢＳおよびクエン酸塩緩衝液中のＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物、ならびに好ましい凍結乾燥した処方物中のＩＭＣ−Ａ１２は、５０℃で４ヶ月間インキュベートされた。この凍結乾燥した試料は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で再構成され、単量体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図３７】４０℃での時間の関数として、凝集体の割合（％）の変化を示す図である。ＰＢＳおよびクエン酸塩緩衝液中のＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物、ならびに好ましい凍結乾燥した処方物中のＩＭＣ−Ａ１２は、４０℃で４ヶ月間インキュベートされた。この凍結乾燥した試料は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で再構成され、凝集体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図３８】５０℃での時間の関数として、凝集体の割合（％）の変化を示す図である。ＰＢＳおよびクエン酸塩緩衝液中のＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物、ならびに好ましい凍結乾燥した処方物中のＩＭＣ−Ａ１２は、５０℃で４ヶ月間インキュベートされた。この凍結乾燥した試料は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で再構成され、凝集体の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図３９】４０℃での時間の関数として、分解生成物の割合（％）の変化を示す図である。ＰＢＳおよびクエン酸塩緩衝液中のＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物、ならびに好ましい凍結乾燥した処方物中のＩＭＣ−Ａ１２は、４０℃で４ヶ月間インキュベートされた。この凍結乾燥した試料は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で再構成され、分解生成物の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図４０】５０℃での時間の関数として、分解生成物の割合（％）の変化を示す図である。ＰＢＳおよびクエン酸塩緩衝液中のＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物、ならびに好ましい凍結乾燥した処方物中のＩＭＣ−Ａ１２は、４０℃および５０℃で４ヶ月間インキュベートされた。この凍結乾燥した試料は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で再構成され、分解生成物の割合（％）は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
【図４１】４ヶ月間インキュベートされた試料のＳＤＳ−ｐａｇｅ（還元）分析を示す図である。ＰＢＳおよびクエン酸塩緩衝液中のＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物、ならびに好ましい凍結乾燥した処方物中のＩＭＣ−Ａ１２は、４℃、４０℃および５０℃で４ヶ月間インキュベートされた。この凍結乾燥した試料は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で再構成され、１０μｇが４−２０％  トリス−グリシンゲルへと充填された。ゲルはクーマシーブルーで染色された。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
液体処方物中の抗体は、ヒンジ領域における加水分解、凝集、酸化、脱アミド化、および断片化を含めて、種々の化学プロセスおよび物理的プロセスを受けやすい。これらのプロセスは、機能抗体の利用可能性を低下させ、抗原結合の特徴を低下または除去することによって、治療抗体の臨床的効力を変化または排除することがある。本発明は、モノクローナル抗体の安定な処方物に対するニーズに対処し、これらの抗体を凍結乾燥するための方法および処方物を提供する。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、インスリン様増殖因子Ｉ受容体に特異的に結合するＩｇＧ１抗体と、緩衝液とを含む安定な溶液処方物（本願明細書において「液体処方物」とも呼ばれる）を提供する。さらなる実施形態では、この抗体はＩＭＣ−Ａ１２である。別の実施形態では、この抗体はＩＭＣ−２Ｆ８である。
【００３１】
ＩＭＣ−Ａ１２は、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対するＩｇＧ１サブクラスの完全ヒトモノクローナル抗体である。このＩＭＣ−Ａ１２抗体は、本明細書の一部を構成する国際公開第２００５／０１６９７０号に開示されている。ＩＭＣ−Ａ１２についての重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に表されている。ＩＭＣ−Ａ１２についての軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４に表されている。ＩＭＣ−Ａ１２を用いた骨癌の治療方法は、本明細書の一部を構成する国際公開第２００６／１３８７２９号に開示されている。
【００３２】
ＩＭＣ−２Ｆ８は、同様にインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対するＩｇＧ１サブクラスの完全ヒトモノクローナル抗体である。ＩＭＣ−Ａ１２抗体は、本明細書の一部を構成する国際公開第２００５／０１６９７０号に開示されている。ＩＭＣ−２Ｆ８についての重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に表されている。ＩＭＣ−２Ｆ８についての軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および配列番号６に表されている。
【００３３】
初期処方物、ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の構造安定性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を測定するために、処方物スクリーニングが実施された。スクリーニング試験から、ＰＢＳ中のＩＭＣ−Ａ１２は凝集、沈殿、分解、加水分解および光に対して感受性を有することが決定的となった。これに加えて、それは、少量の注射液に関する微粒子の問題の試験に合格することができなかった。ｐＨ６．５の、５ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−Ａ１２、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０１％  ツイーン８０からなる改良された溶液処方物が開発された。このクエン酸塩処方物は、ＰＢＳ処方物とは異なり、微粒子を含まず、改善された安定性を有する。
【００３４】
ヒンジ領域で起こる加水分解を最少にするさらなる改良品では、凍結乾燥された処方物は、３０ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−Ａ１２、１０ｍＭ  ヒスチジン  ｐＨ６．５、および４．６％  トレハロースを含有する。加水分解は、凍結乾燥された処方物中のＩＭＣ−Ａ１２では停止した。
【００３５】
本発明は、上記抗体の分解を減少または排除する溶液処方物を提供する。この処方物は、以下のものの１種以上を含むことができる：特定のｐＨの緩衝液、塩、界面活性剤、安定剤、保存料、還元剤、およびキレート剤。
【００３６】
本発明は、非酵素的切断を受けやすい抗体（その機能的断片を含む）の凍結乾燥のための処方物を提供する。この処方物は、安定剤、界面活性剤、還元剤、担体、保存料、アミノ酸、およびキレート剤などのさらなる要素を含んでいてよい。本発明はまた、抗体組成物を安定化する方法であって、凍結保護剤の存在下で抗体の水系処方物を凍結乾燥する工程を含む方法をも提供する。この処方物は、加工および保存中に抗体を安定化するために凍結乾燥され、次いで薬理学的投与に先立って再構成されてもよい。好ましくは、この抗体は、製造から投与までその物理的および化学的安定性、ならびに完全性を実質的に保持する。本発明に従って安定性を高めるために、緩衝液、界面活性剤、糖類、糖アルコール、糖誘導体、およびアミノ酸を含めた種々の処方物成分が適切であり得る。本発明に従って安定性を高めるために、ｐＨおよび処方物成分の濃度を含めた種々の処方物特性が適切であり得る。
【００３７】
本発明によれば、上記処方物のｐＨを維持するために、緩衝液が用いられてもよい。この緩衝液は、外的な変化に起因するｐＨの変動を最少にする。本発明の処方物は、適切なｐＨ、好ましくは約６．０〜約７．０、より好ましくは約６．０〜約６．５、最も好ましくは約６．５の処方物を提供するための１種以上の緩衝液を含有する。例示的な緩衝液としては、ヒスチジン、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、および酢酸塩などの有機緩衝液一般が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、緩衝液濃度は約５ｍＭ〜約５０ｍＭである。さらなる実施形態では、緩衝液濃度は約１０ｍＭである。
【００３８】
本発明の処方物は、抗体の凝集および分解を防止するのを助け得る１種以上の安定剤を含有してよい。適切な安定剤としては、多価糖類、糖アルコール、糖誘導体、およびアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい安定剤としては、アスパラギン酸、ラクトビオン酸、グリシン、トレハロース、マンニトール、およびスクロースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の処方物は、１種以上の界面活性剤を含んでいてよい。抗体溶液は、空気−水界面において高表面張力を有する。この表面張力を低下させるために、抗体は空気−水界面に凝集する傾向がある。界面活性剤は、空気−水界面での抗体の凝集を最少にし、それによって溶液中での抗体の生物活性を維持するのを助ける。例えば、０．０１％のツイーン８０を加えると、溶液中での抗体の凝集を低下させることができる。この処方物が凍結乾燥された場合、この界面活性剤はまた、再構成された処方物における微粒子の形成を減少させ得る。本発明の凍結乾燥した処方物では、この界面活性剤は、凍結乾燥前の処方物、凍結乾燥した処方物、および再構成された処方物の１種以上に加えることができるが、凍結乾燥前の処方物に加えることが好ましい。例えば、０．０１％のツイーン８０は、凍結乾燥前に抗体溶液に加えることができる。界面活性剤としては、ポリソルベート２０（ツイーン２０）、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、ポリエチレン−ポリプロピレングルコール（プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）Ｆ−６８、ＣＡＳ番号９００３−１１−６）、および胆汁酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、界面活性剤濃度は約０．００１％〜約１．０％である。
【００４０】
凍結乾燥プロセスは、タンパク質またはポリペプチドを変性し得る種々のストレスを発生し得る。これらのストレスとしては、温度低下、氷の結晶の形成、イオン強度の上昇、ｐＨ変化、相分離、水和殻（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｓｈｅｌｌ）の除去、および濃度変化が挙げられる。凍結および／または乾燥プロセスのストレスに対して感受性を有する抗体は、１種以上の凍結保護剤を添加することによって、安定化できる。凍結保護剤は、凍結乾燥に伴うストレスから保護する化合物である。それゆえ、凍結保護剤は、１つの種類として、凍結プロセスから保護する冷却保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む。１種以上の凍結保護剤が、凍結乾燥に伴うストレスから保護するために使用されてもよく、それらは、例えば、スクロースまたはトレハロースなどの糖類；グルタミン酸一ナトリウムまたはヒスチジンなどのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどの離液性塩（ｌｙｏｔｒｏｐｉｃ  ｓａｌｔ）；三価またはより多価の糖アルコールなどのポリオール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール；プロピレングルコール；ポリエチレングルコール；プルロニック；ならびにこれらの組み合わせであってよい。好ましい凍結保護剤の例としては、上記の安定剤および界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明は、凍結乾燥のプロセスによって調製できる安定化された処方物を提供する。凍結乾燥は、物質がまず凍結され、次いで、まず昇華（一次乾燥プロセス）によって、次いで脱着（二次乾燥プロセス）によって、生物活性または化学反応をもはや支えない値まで溶媒の量が減らされる、安定化プロセスである。凍結乾燥した処方物では、溶液に関連した加水分解、脱アミド化、酸化および断片化反応は、回避または顕著に緩慢化できる。凍結乾燥した処方物はまた、運搬中の短期の温度変動に起因する損傷を回避することができ、そして室温での保存を可能にする。本発明の処方物は、噴霧乾燥および気泡乾燥（ｂｕｂｂｌｅ  ｄｒｙｉｎｇ）などの当該技術分野で公知の他の方法によって乾燥されてもよい。特記しない限り、本発明の処方物は、凍結乾燥前の処方物中で測定された成分濃度によって記載される。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、ヒンジ領域で起こり得る非酵素的分解を受けやすい抗体を安定化するための方法および処方物を提供する。抗体を非酵素的に切断される要因としては、アミノ酸配列、コンホメーションおよび翻訳後の処理が挙げられる。
【００４３】
抗体がヒンジ領域で加水分解、凝集、酸化、脱アミド化、沈殿、および／または断片化されるのは、水系溶液中での抗体のインキュベーションによって測定できる。典型的には、このインキュベーションは、試験の継続時間を短くするために、高温で実施される。例えば、４０℃または５０℃で３ヶ月間のインキュベーション。インキュベーション後、分解生成物は、サイズ排除クロマトグラフィ−高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を用いて分析することができる。
【００４４】
加えて、機械的ストレスによって誘発される抗体の分解、凝集、および沈殿に対する処方物成分の保護効果を検討するため、抗体処方物は撹拌してもよい。
【００４５】
当該技術分野で公知の種々の分析手法によって、溶液処方物の抗体安定性または再構成された凍結乾燥処方物の抗体安定性を測定することができる。かかる手法としては、例えば、（ｉ）メインの融解温度（Ｔｍ）を測定するための示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて熱安定性を；（ｉｉ）室温での制御された撹拌を用いて機械的安定性を；（ｉｉｉ）約−２０℃、約４℃、室温（約２３℃−２７℃）、約４０℃、および約５０℃の温度でのリアルタイム等温加速温度安定性（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を；（ｉｖ）約３５０ｎｍで吸光度をモニターすることにより溶液濁度を、ならびに（ｖ）ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて単量体、凝集体および分解生成物の量を、測定することが挙げられる。安定性は、選択された温度で選択された時間の間測定することができる。
【００４６】
一実施形態では、上記凍結乾燥した処方物は、再構成の際に、高濃度の抗体を提供する。さらなる実施形態では、安定な凍結乾燥した処方物は、液体を用いて再構成可能であり、凍結乾燥前の処方物の抗体濃度よりも約１−１０倍高い抗体濃度を有する溶液を形成できる。例えば、一実施形態では、この凍結乾燥した処方物は、１ｍＬ以下の水を用いて再構成され、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの抗体濃度を有する粒子を含まない再構成された処方物が得られる。
【００４７】
天然に存在する抗体は、典型的には、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を有し、各軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって重鎖に共有結合されている。多数のジスルフィド結合がさらに、２つの重鎖を互いに結合している。個々の鎖は、類似の大きさ（１１０−１２５個のアミノ酸）および構造を有するが異なる機能を有するドメインへと折り重なることができる。軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および／または１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含むことができる。重鎖もまた、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および／または、抗体の種類またはアイソタイプに依存して、３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含むことができる。ヒトでは、このアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、ＩｇＡおよびＩｇＧはさらにサブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ１−２およびＩｇＧ１−４）に細分される。
【００４８】
一般に、可変ドメインは、抗体ごとにかなりのアミノ酸配列の変動性を示し、特に抗原結合部位の場所ではそうである。高頻度可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの領域が、ＶＬおよびＶＨの各々において見出され、これらの領域は、フレームワーク可変領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる、さほど可変的でない領域によって支持されている。
【００４９】
ＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる抗体の一部分は、Ｆｖ（可変断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ））と表され、抗原−結合部位を構成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、１本のポリペプチド鎖上にＶＬドメインおよびＶＨドメインを含有する抗体断片であり、一方のドメインのＮ末端および他方のドメインのＣ末端は、柔軟性のあるリンカーによって繋がれている（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）；国際公開第８８／０９３４４号（Ｈｕｓｔｏｎら）を参照）。国際公開第９２／０１０４７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）は、バクテリオファージなどの可溶性組換え型遺伝子ディスプレイパッケージ（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐａｃｋａｇｅ）の表面上のｓｃＦｖ断片のディスプレイを記載している。
【００５０】
単鎖抗体は、それらが由来する全抗体の定常ドメインの一部またはすべてを欠く。それゆえ、それらは全抗体の使用に伴う問題のいくつかを克服することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常部と他の生体分子との間の特定の所望されない相互作用を有しない傾向がある。加えて、単鎖抗体は、全抗体よりもかなり小さく、全抗体よりも大きい透過性を有することができ、このため、単鎖抗体は標的抗原結合部位により効率よく局在化し結合することができる。さらに、単鎖抗体は、比較的小さいサイズのゆえに、全抗体よりも、レシピエントにおいて望まれない免疫応答を引き起こす可能性が少なくなる。
【００５１】
各単鎖が、第１のペプチドリンカーによって共有結合されている１つのＶＨドメインおよび１つのＶＬドメインを有する多数の単鎖抗体は、少なくとも１種以上のペプチドリンカーによって共有結合され、単一特異的、または多重特異的である多価の単鎖抗体を形成できる。多価の単鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖断片および可変重鎖断片を含み、ペプチドリンカーによって少なくとも１つの他の鎖に結合されている。このペプチドリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸残基から構成される。アミノ酸残基の最大数は、約１００である。
【００５２】
２つの単鎖抗体は、組み合わさって、二価の二量体として公知の二重抗体を形成することができる。二重抗体は、２本の鎖および２つの結合部位を有し、単一特異的または二重特異的となることができる。この二重抗体の各鎖は、ＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含む。これらのドメインは同一鎖上のドメイン間の対合を妨げるのに十分短いリンカーで連結され、従って、異なる鎖上の相補的ドメイン間の対合を促して、２つの抗原結合部位を作り直す。
【００５３】
３つの単鎖抗体は組み合わさって、三価の三量体としても公知の三重抗体を形成できる。三重抗体は、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸末端がＶＬドメインまたはＶＨドメインのカルボキシル末端に直接融合することにより、すなわち、何らのリンカー配列を有さずに、構築される。この三重抗体は、ポリペプチドが環状の、頭−尾様式で配列した、３つのＦｖ頭部を有する。この三重抗体の可能なコンホメーションは平面状であり、３つの結合部位が、互いから１２０°の角度で１つの平面上に存在する。三重抗体は単一特異的、二重特異的または三重特異的となることができる。
【００５４】
Ｆａｂ（断片、抗原結合）は、ＶＬＣＬＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる抗体の断片を指す。パパイン消化後に生成されるものは、単にＦａｂと呼ばれ、重鎖ヒンジ領域を保持しない。ペプシン消化後、重鎖ヒンジを保持する種々のＦａｂが生成される。鎖間ジスルフィド結合が無傷のままであるそれらの二価の断片は、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれるが、ジスルフィド結合が保持されない場合は、一価のＦａｂ’が生じる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、一価のＦａｂ断片よりも、抗原に対して高い結合活性を有する。
【００５５】
Ｆｃ（結晶性断片）は、対合した重鎖定常ドメインを含む抗体の一部分または断片についての記号表示である。ＩｇＧ抗体では、例えば、Ｆｃは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体のＦｃはさらに、ＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、補体媒介性細胞傷害性の活性化、および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関連する。多数のＩｇＧ様タンパク質の複合体であるＩｇＡおよびＩｇＭなどの抗体については、複合体形成は、Ｆｃ定常ドメインを必要とする。
【００５６】
最後に、ヒンジ領域は、その抗体のＦａｂ部分とＦｃ部分とを分離し、Ｆａｂ同士の可動性、およびＦｃに対するＦａｂの可動性を提供し、加えて２つの重鎖の共有結合のための多数のジスルフィド結合を含む。
【００５７】
従って、本発明の抗体としては、抗原と特異的に結合する、天然に存在する抗体、（Ｆａｂ’）２などの二価の断片、Ｆａｂなどの一価の断片、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価の単鎖抗体、二重抗体、三重抗体などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明の抗体、またはその断片は、例えば、単一特異的または二重特異的であってよい。二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である。抗体が複数の特異性を有する場合、認識されたエピトープは、単一の抗原と会合するものであってもよいし、複数の抗原と会合するものであってもよい。従って、本発明は、２つの異なる抗原に結合する二重特異的抗体またはその断片を提供する。
【００５９】
抗体またはその断片の特異性は、親和性および／または結合活性に基づいて決定することができる。抗体からの抗原の解離についての平衡定数（Ｋｄ）によって表される親和性は、抗原の決定基と抗体結合部位との間の結合の強さの尺度となる。結合活性は、抗体とその抗原との間の結合の強さの尺度である。結合活性は、エピトープと抗体上のその抗原結合部位との間の親和性、および抗体の価数（特定のエピトープの抗原結合部位の数を指す）の両方に関連する。抗体は、典型的には、１０−５〜１０−１１リットル／ｍｏｌの解離定数（Ｋｄ）で結合する。１０−４リットル／ｍｏｌ未満のあらゆるＫｄは、一般に非特異的結合を示すとみなされる。Ｋｄの値が小さいほど、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合の強さは強い。
【００６０】
本願明細書で使用する場合、「抗体」および「抗体断片」は、特異的抗原への特異性を保持する改変を含む。かかる改変としては、化学療法薬（例えば、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン）などのエフェクター分子、または細胞毒（例えば、タンパク質もしくは非タンパク質の有機化学療法薬）への接合が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、検出できるレポーター部分への接合によって改変することができる。半減期などの非結合的特徴に影響を及ぼす変更（例えば、ペグ化）を有する抗体もまた含まれる。
【００６１】
タンパク質剤および非タンパク質剤は、当該技術分野で公知の方法によって上記抗体に接合してよい。接合方法としては、直接結合、共有結合されたリンカーを介する結合、および特異的結合対のメンバーを介する結合（例えば、アビジン−ビオチン）が挙げられる。かかる方法としては、例えば、ドキソルビシンの接合についてＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０，６６００−６６０７（１９９０）に記載される方法、ならびに白金化合物の接合についてＡｒｎｏｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３０３，７９−９０（１９９１）およびＫｉｓｅｌｅｖａら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ＵＳＳＲ）２５，５０８−５１４（１９９１）によって記載される方法が挙げられる。
【００６２】
本発明の抗体はさらに、結合の特徴が直接的な変異、親和性成熟の方法、ファージディスプレイ、またはチェーンシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって改良されたものを含む。親和性および特異性は、ＣＤＲを変異させて、所望の特徴を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることにより、改変または改良することができる（例えば、Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３（１９９５）を参照）。ＣＤＲは種々の方法で変異される。１つの方法は、個々の残基または残基の組合せをランダム化して、本来は同一である抗原結合部位の集団において、２０個のアミノ酸すべてが特定の位置で見出されるようにすることである。あるいは、変異は、エラープローンＰＣＲ法によってある範囲のＣＤＲ残基にわたって誘導される（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）を参照）。例えば、重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を含有するファージディスプレイベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異誘発株（ｍｕｔａｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）で増殖させることができる（例えば、Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５９−３６８（１９９６）を参照）。これらの変異原性法は、当業者に公知の多くの方法の一例である。
【００６３】
抗体はまた、Ｆｃ受容体への結合を変え、従って抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性および補体依存性細胞傷害性などのエフェクター機能を高めるかまたは低下させることになる、Ｆｃ領域の１種以上のアミノ酸置換を含むように改変してもよい。
【００６４】
本発明の抗体の各ドメインは、完全免疫グロブリンドメイン（例えば、重鎖もしくは軽鎖の可変または定常ドメイン）であってよいし、あるいはそれは、天然に存在するドメインの機能的等価体もしくは変異体もしくは誘導体、または例えば、国際公開第９３／１１２３６号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら）に記載されている手法などを用いて生体外で構築された合成ドメインであってもよい。例えば、少なくとも１つのアミノ酸を欠いている抗体可変ドメインに対応するドメインを一緒に繋ぐことが可能である。この抗体の重要な特徴は、抗原結合部位の存在である。可変の重鎖断片および軽鎖断片という用語は、特異性に対して重要な効果を有しない変種を排除すると解釈されるべきではない。
【００６５】
本発明の抗体および抗体断片は、例えば、天然に存在する抗体、またはＦａｂもしくはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリから得ることができる。ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗体から単一ドメインの抗体を作製するため、ＣＤＲの外部の特定のアミノ酸置換を所望し、結合、発現または溶解性を高めてもよいことは理解されている。例えば、本来ＶＨ−ＶＬ界面に埋もれているアミノ酸残基を改変するのが望ましい場合がある。
【００６６】
さらに、本発明の抗体および抗体断片は、ヒト免疫グロブリンγ重鎖およびκ軽鎖を産生するトランスジェニックマウス（例えば、カリフォルニア州、サンノゼのメダレックス社（Ｍｅｄａｒｅｘ）より入手のＫＭマウス）を使用して、標準的なハイブリドーマ技術（本明細書の一部を構成する、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、２１１−２１３（１９９８））によって得ることができる。好ましい実施形態では、ゲノムを産生するヒト抗体の実質的な部分がマウスのゲノムに挿入され、内因性マウス抗体の産生が欠失するようにする。かかるマウスは、完全フロイントアジュバント中の標的分子の一部またはすべてを用いて、皮下的に（ｓ．ｃ．）免疫化してもよい。
【００６７】
本発明はまた、再構成された処方物を投与することを含む、治療方法をも提供する。この再構成された処方物は、本発明の凍結乾燥した処方物を、例えば１ｍＬの水を用いて再構成することにより調製される。再構成時間は、好ましくは１分未満である。濃い再構成された処方物は、投与の際に融通性を与える。例えば、再構成された処方物は、希釈した形で静脈内投与することができ、またはより濃縮された形で注射投与することもできる。本発明の濃い再構成された処方物は、特定の被験者および／または特定の投与経路に適合する濃度へと希釈することができる。従って、本発明は、治療有効量の抗体を、それを必要とする哺乳動物、特にヒトに投与することを含む、治療方法を提供する。本願明細書で使用する場合、投与という用語は、求められる結果を成就することができる任意の方法によって、本発明の抗体組成物を哺乳動物に送達することを意味する。再構成された処方物は、例えば、静脈内または筋肉内に投与することができる。一実施形態では、濃い再構成された処方物は、注射によって投与される。
【００６８】
本発明の処方物における抗体は、好ましくはヒト用である。一実施形態では、本発明の組成物は、固形腫瘍および非固形腫瘍を含めた腫瘍性疾患を治療するため、過剰増殖性障害を治療するため、肥満症を治療するために、使用することができる。
【００６９】
治療有効量とは、哺乳動物に投与されたときに、ＩＧＦ−ＩＲ活性を低下させるかまたは無力化する、腫瘍増殖の阻害、非癌性の過剰増殖性疾患を治療する、肥満症を治療するなどの、所望の治療効果を生み出すのに有効である本発明の抗体の量を意味する。上記のような抗体の投与は、他の抗体または任意の従来の治療薬（例えば、抗悪性腫瘍薬）の投与と組合わせることができる。
【００７０】
本発明の一実施形態では、上記組成物は、１種以上の抗悪性腫瘍薬と組合せて投与することができる。化学療法薬、放射線およびこれらの組合せなどの任意の適切な抗悪性腫瘍薬が使用できる。抗悪性腫瘍薬は、アルキル化剤または代謝拮抗薬であってもよい。アルキル化剤の例としては、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、およびダカルバジンが挙げられるが、これらに限定されない。代謝拮抗薬の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、およびトポテカンが挙げられるが、これらに限定されない。抗悪性腫瘍薬が放射線である場合、放射線源は、治療されている患者にとって外部（外照射療法−ＥＢＲＴ）または内部（近接照射療法−ＢＴ）のいずれかであってよい。投与される抗悪性腫瘍薬の用量は、例えば、薬剤の種類、治療されている腫瘍の種類および重症度、ならびにその薬剤の投与経路を含めた多くの要因に依存する。しかしながら、本発明はいずれかの特定の用量に限定されないということを強調しておきたい。
【００７１】
本発明の抗体、またはその断片の等価体はまた、本発明で提供される全長ＩＭＣ−Ａ１２抗体の可変領域または高頻度可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをも含む。実質的に同じアミノ酸配列は、本願明細書においては、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎによるＦＡＳＴＡ検索法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４−８（１９８８））によって決定した場合に、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有する配列として定義される。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は本発明をさらに例証するが、本発明の範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない。タンパク質の分析において用いられるものなどの従来の方法の詳細な説明は、本明細書の一部を構成するＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ））などの多くの刊行物から得ることができる。
【００７３】
すべての液体処方物スクリーニング試験について、タンパク質濃度を５ｍｇ／ｍＬに固定した。１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンおよび１２５ｍＭ  塩化ナトリウムからなる多成分緩衝液を、最適のｐＨについてスクリーニングするために使用した。緩衝液の種類、ツイーン８０、グリシン濃度、およびＮａＣｌ濃度についての必要条件を、実験計画法のアプローチ（ＤＯＥ、ＪＭＰソフトウェア）を用いて検討した。線形回帰分析を実施して、試験された変数の有意性を決定した。予測した処方物を、慣用的な一時一事法（ｏｎｅ−ｆａｃｔｏｒ−ａｔ−ａ−ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を用いて確認した。熱安定性に及ぼす試験された変数の効果を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）およびリアルタイム等温試験（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔｕｄｙ）を用いて検討した。室温での毎分３００回転の制御された撹拌を、機械的安定性についての試験として用いた。液体処方物の光安定性を、ＩＣＨ指針に基づき検討した。凍結−解凍安定性を、試験試料を−２０℃および−７０℃に冷却して４℃で解凍することにより決定した。
【００７４】
凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２処方物について、緩衝液の種類、安定剤、および増量剤を、２０ｍｇ／ｍＬのＡ１２濃度での実験計画法の一部実施モデル（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｍｏｄｅｌ）を用いて検討した。ＩＭＣ−Ａ１２の濃度、ＩＭＣ−Ａ１２濃度に対するトレハロース濃度の比、およびツイーン８０の濃度を、混合計画モデル（ｍｉｘｔｕｒｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｍｏｄｅｌ）を用いて最適化した。予測した最適の凍結乾燥処方物を、一時一事法を用いて、ＰＢＳおよびクエン酸塩溶液処方物と比較した。熱安定性に及ぼす変数の効果を、リアルタイム等温試験によって検討した。凍結乾燥した処方物の光安定性を、ＩＣＨ指針に基づき検討した。
【００７５】
【表１】
2010522208.tif 000002
【００７６】
スクリーニング試験において使用するためのＩＭＣ−Ａ１２を、５０Ｋカットオフ（ＹＭ  ５０）ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心濾過装置およびＡｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１２Ｒ遠心分離機（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））を用いて、実験的緩衝液に緩衝液交換することによって、調製した。タンパク質濃度を、１．５０の吸光係数および適切な緩衝液で５ｍｇ／ｍＬに調製した濃度を用いて２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。ツイーン８０を、タンパク質濃度調整後に、１０％（重量／体積）原液から加えた。ＰＢＳ処方物中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を対照として使用した。すべての試料を、シリンジフィルター（Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦ膜）を通して０．２２μｍで濾過した。
【００７７】
凍結乾燥プロセスを、Ｌｙｏｓｔａｒ  ＩＩ凍結乾燥機を用いて実施した。生成物を室温で凍結乾燥機に充填した。棚温度を、０．５℃／分の冷却速度で−５０℃まで冷却した。−５０℃での保持時間は２時間であった。一次乾燥および二次乾燥を、−３０℃および２０℃で各々１２時間実施した。温度を０．５℃／分で変化させた。一次乾燥中および二次乾燥中のチャンバ圧は５０ｍＴ（約６．７Ｐａ）であった。凍結乾燥が完了した後、凍結乾燥機のチャンバを、Ｎ２を用いて大気圧の半分まで戻し、蓋をした。
【００７８】
（実施例１：ｐＨ最適化試験）
１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジンおよび１２５ｍＭ  塩化ナトリウムからなる多成分緩衝液（ＭＣＢ）を使用して、最適ｐＨを決定した。この緩衝系は、ｐＨのみより大きい影響を及ぼし得る対イオン（塩効果）の最少化を意図していた。このｐＨスクリーニング計画マトリクスを表２に示す。ＩＭＣ−Ａ１２濃度を５ｍｇ／ｍＬに保った。検討したｐＨ範囲は、０．５ｐＨ単位の間隔で５．０−８．０であった。熱安定性および機械的安定性に及ぼすｐＨの影響を試験した。結果を以下に提示する。
【表２】
2010522208.tif 000003
【００７９】
（示差走査熱量測定（ＤＳＣ）試験）
試験条件下におけるＩＭＣ−Ａ１２についての転移温度（Ｔｍ）を評価するため、（表２に示す）実験的処方物中のＩＭＣ−Ａ１２についての熱融解曲線を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によってアッセイした。タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、温度変化は、１．５℃／分の走査速度で、５℃〜９５℃であった。融解曲線を、３つのＴｍの合計にフィッティングした。ｐＨの関数として最初の転移ピークに対応する融解温度であるＴｍ１を図１に示す。Ｔｍ１は、ｐＨ６．５−８．０の間ではほとんど同じであった。
【００８０】
（撹拌試験）
試料に、プラットフォームシェーカー上での撹拌によってストレスを加えた。２７．５ｍＬのガラスバイアル中に５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２の５ｍＬを含む表２に記載した試料を、ヘッドスペースを８１．８％であるように設定して、毎分３００回転で撹拌した。この試験を、室温で７２時間実施した。ｐＨの関数として、不溶性凝集体の形成に起因する損失の割合（％）および残っている単量体の割合（％）を、それぞれ図２および図３に示す。ｐＨ６．０−７．０の間で、損失の割合（％）は最少であり、単量体の割合（％）は最も高かった。
【００８１】
（４０℃および５０℃でのリアルタイム加速温度安定性）
種々のｐＨ緩衝液（表２）中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を、４０℃で３週間、および５０℃で１週間インキュベートした。単量体の割合（％）に及ぼすｐＨの影響を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。４０℃で３週間のインキュベーション後（図４）、および５０℃で１週間のインキュベーション後（図５）の残存した単量体の割合（％）の変化が、ｐＨの関数として示されている。ｐＨ６．０−６．５の間で、残っている単量体の割合（％）は最も大きかった。
【００８２】
（−２０℃および−７０℃でのリアルタイム凍結温度安定性）
（表２に列挙した）種々のｐＨ緩衝液中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を、−２０℃および−７０℃で３週間インキュベートした。単量体の割合（％）に対するｐＨの効果を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。３週間のインキュベーション後の単量体の割合（％）の変化をｐＨの関数として図６に示す。−２０℃または−７０℃のいずれにおいても、ｐＨは、単量体の割合（％）に有意な影響は及ぼさなかった。
【００８３】
（ｐＨ最適化の総括）
５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２の最適のｐＨは、６．０〜６．５の間であることが判明した。
【００８４】
（実施例２：溶液処方物についての賦形剤スクリーニング試験）
実施例１でのｐＨ最適化試験は、ＩＭＣ−Ａ１２が、ｐＨ６．０〜６．５の間で最も大きい安定性を有することを明らかにした。この実施例では、本発明者らは、ｐＨ６．０および６．５でのＩＭＣ−Ａ１２の安定性に対する緩衝液の種類、クエン酸塩およびヒスチジンの影響を試験した。ツイーン８０およびＮａＣｌおよびグリシンの濃度の必要条件もまた検討した。タンパク質濃度を、５ｍｇ／ｍＬに一定に保った。賦形剤スクリーニングの計画マトリクスを表３に示す。
【表３】
2010522208.tif 000004
【００８５】
（浸透圧測定）
表３の処方物の浸透圧を、Ｗｅｓｃｏｒ蒸気圧浸透圧計を用いて測定した。結果を表４に示す。試験した処方物の浸透圧は、２６０−３２０ｍＯｓｍ／Ｋｇという所望の範囲内であった。
【表４】
2010522208.tif 000005
【００８６】
（示差走査熱量測定による試験）
（表３に列挙した）実験的処方物中のＩＭＣ−Ａ１２についての熱融解曲線を、試験条件下におけるＩＭＣ−Ａ１２についての転移温度（Ｔｍ）を評価するため、ＤＳＣを用いてアッセイした。タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、温度変化は、１．５℃／分の走査速度で、５℃〜９５℃であった。メインの転移ピークに対応する融解温度を線形回帰モデルにフィッティングし、試験された変数の効果を評価した。このフィッティングについてのｐおよびＲｓｑは、それぞれ０．００３および０．９９であった。転移温度に及ぼす緩衝液の種類、ｐＨ、ツイーン８０濃度、ＮａＣｌ濃度、グリシン濃度の影響について、予測プロファイラ（ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｒ）を図７に示す。最適緩衝液は、ｐＨ６．５のクエン酸塩緩衝液であると決定した。グリシンは、融解温度を上昇させ、ツイーン８０は融解温度をわずかに低下させた。ＮａＣｌは、融解温度に対して有意な効果を与えなかった。
【００８７】
（撹拌試験）
試料に、プラットフォームシェーカー上での撹拌によってストレスを加えた。表３に記載した試料を、２７．５ｍＬのガラスバイアル中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２の５ｍＬとともに、毎分３００回転で撹拌した。この試験を、室温で７２時間まで実施した。溶液濁度および単量体の割合（％）を、撹拌時間の関数として測定した。濁度および単量体の割合（％）に及ぼす試験された変数の影響を、応答をＪＭＰソフトウェアを用いて線形回帰モデルにフィッティングすることによって評価した。濁度および単量体の割合（％）の両方に及ぼす実測対予測プロットのｐ値は、＜０．００１であった。統計的に有意な変数は、緩衝液、ツイーンおよび時間であった。濁度および単量体の割合（％）に及ぼす緩衝液、ツイーン８０、および時間の影響についての予測プロファイラを、図８に示す。０．０１％  ツイーンを含むクエン酸塩緩衝液は、最少の濁度および最高の単量体含有量を有していた。
【００８８】
（４０℃および５０℃におけるリアルタイム加速温度安定性）
表３の処方物中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を、４０℃で４週間、および５０℃で２週間インキュベートした。出発物質ならびに４０℃で４週間のインキュベーション後および５０℃で２週間のインキュベーション後の試験処方物の単量体の割合（％）を、それぞれ図９および図１０に示す。温度ストレスを加えた試料のＤＯＥ分析も、図１１に示した。４０℃では、試験した処方物のほとんどで、単量体の割合（％）は、ほとんど同じであったが、ＰＢＳよりは良好であった。５０℃では、クエン酸塩緩衝液中の処方物（処方物６−１０）は、ヒスチジン緩衝液（処方物１−５）よりも優れていた。図１１のＤＯＥ分析は、ＩＭＣ−Ａ１２がｐＨ６．０−６．５の間でほとんど同じ安定性を有し、ＮａＣｌが不安定化作用を有するが、他方、グリシンは比較的小さい影響を及ぼすことを示す。処方物９および１０は、ほとんど同じであることが判明した。しかしながら、処方物１０はより低いグリシン濃度（生理的条件により近い）を有するため、処方物１０の方が好ましい。
【００８９】
（賦形剤スクリーニング試験の総括）
ＤＳＣ試験は、クエン酸塩緩衝液、グリシンおよびｐＨ６．５がＩＭＣ−Ａ１２の熱安定性を高めることを示した。ツイーン８０はわずかに安定性を低下させたが、ＮａＣｌは大きな影響を及ぼさなかった。ＩＭＣ−Ａ１２は、機械的ストレスに対して感受性を有する。従って、ツイーン８０は、機械的ストレスに対する安定化に必要である。ＩＭＣ−Ａ１２は、加速された温度で、クエン酸塩処方物中では、ヒスチジン中よりも良好な安定性を有する。ヒスチジンおよびクエン酸塩緩衝液はともに、ＰＢＳ処方物よりも優れている。５ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−Ａ１２、１０ｍＭ  クエン酸塩、１００ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  ツイーン８０、ｐＨ６．５（クエン酸塩）を含有する処方物１０を、最適の処方物として選択した。
【００９０】
（実施例３：ＰＢＳ溶液処方物とクエン酸塩溶液処方物との間の比較）
上で考察したとおり、本発明者らは、ｐＨ６．５（クエン酸塩）で５ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−Ａ１２、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  ツイーン８０を含有するＩＭＣ−Ａ１２についての新しい溶液処方物を開発した。この実施例では、本発明者らは、クエン酸塩処方物中のＩＭＣ−Ａ１２の安定性をＰＢＳ処方物と比較した。
【００９１】
（撹拌試験）
試料に、プラットフォームシェーカー上での撹拌によってストレスを加えた。２７．５ｍＬのガラスバイアル中に５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を含む試料を、毎分３００回転で撹拌した。この試験を、室温で７２時間まで実施した。濃度および濁度測定を、Ｓｈｉｍａｔｚｕ  １６０１  ｂｉｏｓｐｅｃ分光光度計を用いて実施した。ＩＭＣ−Ａ１２溶液の濃度は、吸光係数１．５を用いて、２８０ｎｍでの吸光度から算出した。溶液濁度は、３５０ｎｍでの吸光度によって測定した。撹拌時間の関数として、溶液濁度、（不溶性凝集体の形成に起因する）物質損失の割合（％）、および残っている単量体の割合（％）を、それぞれ図１２、図１３および図１４に示す。ＩＭＣ−Ａ１２のＰＢＳ処方物については、溶液濁度および損失の割合（％）は撹拌時間とともに上昇したが、単量体の割合（％）は減少した。濁度、損失の割合（％）および単量体の割合（％）のすべてが、クエン酸塩処方物では変化しないままであった。
【００９２】
（４０℃でのリアルタイム加速温度安定性）
ＰＢＳまたはクエン酸塩処方物中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を、４０℃で３ヶ月までインキュベートした。インキュベーション後、試料をＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦによって分析した。結果を以下に示す。
【００９３】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析：サイズ排除クロマトグラフィは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ  ＬＣ  クロマトグラフおよびＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用いて実施した。移動相は、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＣｓＣｌ、ｐＨ７．０であった。５０μｇの試料を、１０μＬの体積で注入した。インキュベーション時間の変化の関数として、単量体、凝集体、および分解生成物の割合（％）の変化を、それぞれ図１５、図１６、および図１７に示す。両方の処方物で、単量体の割合（％）は減少し、凝集体および分解生成物の割合（％）は上昇したが、速度は、クエン酸塩処方物ではＰＢＳ処方物と比べて緩やかであった。
【００９４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：４０℃で３ヶ月間のインキュベーション後のＰＢＳおよびクエン酸塩処方物中のＩＭＣ−Ａ１２を、４−２０％  トリス−グリシン勾配ゲル上で還元および非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。１０μｇの試料を１０μｌの体積で充填した。ゲルをクーマシーブルーで染色した。結果を、それぞれ図１８および図１９に示す。比較すると、クエン酸塩処方物中よりもＰＢＳ処方物中のほうが、より強い不純物バンドが検出された。
【００９５】
ＩＥＦ分析：等電点電気泳動法（ＩＥＦ）は、６．０〜１０．５のｐＨ範囲でアイソゲル（登録商標）アガロースＩＥＦプレートを用いて実施した。試験試料を、０．５％  ツイーン８０を含有するｍｉｌｉＱ水へと緩衝液交換した。１０μｇの試料を１０μｌの体積で充填した。ゲルをクーマシーブルーで染色した。４０℃で３ヶ月間のインキュベーション後のＰＢＳおよびクエン酸塩処方物中のＩＭＣ−Ａ１２を、ＩＥＦによって分析した。結果を図２０に示す。比較すると、クエン酸塩処方物中よりもＰＢＳ処方物で、より拡散したより明確でないバンドが検出された。
【００９６】
（−２０℃および−７０℃でのＩＭＣ−Ａ１２の凍結温度安定性）
ＰＢＳおよびクエン酸塩処方物中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を、−２０℃および−７０℃で３ヶ月までインキュベートした。インキュベーション後の単量体の割合（％）を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。−２０℃および−７０℃での時間の関数として、単量体の割合（％）の変化を、それぞれ図２１および図２２に示す。単量体の割合（％）は、いずれの処方物においても、時間とともに変化しなかった。
【００９７】
（−２０℃および−７０℃でのＩＭＣ−Ａ１２の凍結−解凍安定性）
ＩＭＣ−Ａ１２の凍結−解凍安定性を、試験試料を、凍結乾燥機（ＦＴＳによって製造されたＬｙｏ−ｓｔａｒ  ＩＩ）中で、１℃／分の温度変化率で−２０℃または−７０℃のいずれかまで凍結させることによって評価した。この試料を、１時間インキュベートし、１℃／分の温度変化率で、４℃で解凍した。この凍結−解凍プロセスを１５回まで繰り返した。−２０℃および−７０℃での凍結−解凍サイクルの数の関数として、単量体の割合（％）の変化を、それぞれ図２３および図２４に示す。図示するように、クエン酸塩処方物中のＩＭＣ−Ａ１２は、ＰＢＳ処方物中よりも良好な凍結−解凍安定性を有する。ＰＢＳ処方物での単量体の割合（％）の減少は、主に凝集体の割合（％）の減少に起因するものであった。
【００９８】
（ＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物の光安定性）
ＩＭＣ−Ａ１２の光安定性試験を、ＩＣＨ指針に基づき実施した。ＰＢＳおよびクエン酸塩処方物中の５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２を室温で光に曝露した。総露光量は、２００ワット時／ｍ２の近紫外＋１２０万ルクス時の蛍光であった。対照試料は、光を遮断するために、黒い紙で包んだ。対照試料および試験試料を、光安定性チャンバ（Ｃａｒｏｎ  ６５００シリーズ、Ｃａｒｏｎ、オハイオ州、マリエッタ）の内部に置いた。光への曝露後、対照試料および試験試料の両方をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。対照および光に曝露した試料について、単量体、凝集体、および分解生成物の割合（％）を、表５に示す。ＩＭＣ−Ａ１２は、両方の処方物において光に敏感であることが見出された。しかしながら、光安定性は、ＰＢＳ処方物よりも、クエン酸塩処方物において有意に改善された。
【表５】
2010522208.tif 000006
【００９９】
（ＰＢＳとクエン酸塩処方物との間の比較の総括）
ＩＭＣ−Ａ１２は、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  ツイーン８０、ｐＨ６．５（クエン酸塩）の処方物中では、ＰＢＳ処方物中よりも有意に良好な安定性を示した。クエン酸塩は、粒子を含まず、機械的に誘発される凝集または沈殿に対して安定であり、温度によって誘発される凝集および分解が最少であり、凍結−解凍不安定性に対して安定化されており、かつ高められた光安定性を有する等張性処方物である。
【０１００】
（実施例４：凍結乾燥した処方物についての緩衝液、冷却保護剤および凍結保護剤ならびに増量剤のスクリーニング）
凍結乾燥した処方物について、緩衝液の種類、安定剤および増量剤を、２０ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２濃度で検討した。計画マトリクスを表６に示す。一部実施要因計画モデルを使用した。ＩＭＣ−Ａ１２の濃度最適化、ＩＭＣ−Ａ１２濃度に対するトレハロース濃度の比、およびツイーン８０濃度についての計画マトリクスを、表７に示す。混合計画モデルを使用した。
【表６】
2010522208.tif 000007
【表７】
2010522208.tif 000008
【０１０１】
凍結乾燥のために、ＩＭＣ−Ａ１２を、実験室スケールのＴＦＦおよびペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）（登録商標）ＸＬフィルター、５０Ｋカットオフフィルター（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いて、無希釈のｐＨ６．５の１０ｍＭ  ヒスチジン、またはｐＨ６．５の１０ｍＭ  クエン酸塩のいずれかへと緩衝液交換した。緩衝液交換を行った後に、凍結保護剤および冷却保護剤を濃厚な原液から加えた。タンパク質濃度を、吸光係数１．５０を用いて、２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。タンパク質濃度調整後に、ツイーン８０を１０％（重量／体積、ＤＩ水中）原液から加えた。すべての試料を、０．２２μｍカットオフ（Ｄｕｒａｐｏｓｅ  ＰＶＤＦ膜）シリンジフィルターを通して濾過した。
【０１０２】
緩衝液の種類、冷却保護剤および凍結保護剤ならびに増量剤を、表６に示した処方物中の２０ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２の単量体、凝集体、分解生成物および濁度に及ぼす影響について、スクリーニングした。凍結乾燥した薬物生成物を、４０℃および５０℃で３ヶ月間インキュベートした。インキュベーション後、凍結乾燥した薬物生成物をｍｉｌｉＱ水に５ｍｇ／ｍＬまで再構成した。再構成した生成物を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよび濁度分析によって分析した。結果を、統計ソフトウェアＪＭＰを用いてフィッティングした。結果を以下にまとめる。
【０１０３】
（予測した単量体、凝集体、分解生成物および濁度に及ぼす変数の効果）
再構成した薬物生成物を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよび濁度分析によって分析した。緩衝液の種類、冷却保護剤および凍結保護剤、ならびに増量剤の関数として、単量体、凝集体、分解生成物の割合（％）および濁度の変化を、それぞれ図２５、図２６、図２７、および図２８に示す。結果は、以下のことを明らかにした。（１）ヒスチジン緩衝液は、クエン酸塩緩衝液よりも多くの単量体およびより少ない凝集体をもたらす。（２）トレハロースおよびスクロースは、単量体含有量を上昇させ、凝集を低下させる。（３）増量剤、マンニトールおよびグリシンは、単量体または凝集体の割合（％）に対して有意な効果は示さなかった。試験した変数のうちで、分解生成物に対して有意な効果を示すものはなかった。
【０１０４】
（一時一事法のアプローチによる予測した結果の確認）
統計的な予測結果を確認するために、表６の処方物５、６、９および１０を、一時一事法のアプローチを用いて分析した。単量体、凝集体、分解生成物の割合（％）および濁度に及ぼす４０℃および５０℃での３ヶ月までのインキュベーションの効果を、それぞれ図２９、図３０、図３１、および図３２に示す。結果は、（１）ヒスチジンはクエン酸塩よりも優れた緩衝液であり、（２）トレハロースはスクロースよりも良好な安定剤であることを確認した。
【０１０５】
（緩衝液の種類、冷却保護剤および凍結保護剤、および増量剤スクリーニングの総括）
凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２処方物は、ヒスチジン緩衝液中でクエン酸塩緩衝液よりもより大きい安定性を有する。トレハロースは、スクロースよりも良好な安定化効果を有する。増量剤、マンニトールおよびグリシンが存在しても、有意に安定性はもたらさない。
【０１０６】
（実施例５：最適の凍結乾燥した処方物のためのＩＭＣ−Ａ１２、トレハロースおよびツイーン８０濃度の最適化）
混合計画モデルを用いて、最適処方物のために、ＩＭＣ−Ａ１２濃度、トレハロース：ＩＭＣ−Ａ１２の比、およびツイーン８０の濃度を最適化した。実験計画マトリクスを表７に示す。凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２を、４℃、４０℃および５０℃で４ヶ月までインキュベートした。結果を以下で考察する。
【０１０７】
（処方物の関数としての単量体の割合（％）の変化）
表７からの凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２処方物を、４℃、４０℃および５０℃で４ヶ月までインキュベートした。凍結乾燥した試料を、ＭｉｌｉＱ水を用いて５ｍｇ／ｍＬまで再構成した。再構成した試料を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析し、残っている単量体の割合（％）を測定した。結果を図３３に示す。
【０１０８】
（単量体変化の速度に及ぼすＩＭＣ−Ａ１２濃度、トレハロース：Ａ１２の比およびツイーン８０の濃度の効果）
単量体変化の速度を、時間の関数としての単量体変化の傾きとして定義する。エクセルソフトウェアを用いて、その傾きを算出した。単量体変化の速度は、最も低いＩＭＣ−Ａ１２濃度および最も高いトレハロース：ＩＭＣ−Ａ１２比で最小であった。ツイーン８０は、有意な効果を示さなかった。
【０１０９】
（最適化試験の総括）
予測した単量体含有量は、ＩＭＣ−Ａ１２濃度の減少およびトレハロース：ＩＭＣ−Ａ１２比の増加とともに増加した。一定のＩＭＣ−Ａ１２濃度では、単量体含有量は、トレハロース：ＩＭＣ−Ａ１２比を大きくすることによって増加した。ツイーン８０は、単量体の割合（％）に対して最小の効果しか示さなかった。３０ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２および６００のトレハロース：ＩＭＣ−Ａ１２比を有する処方物４を、好ましい処方物として選択した。
【０１１０】
（実施例６：凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２の特性解析）
カールフィッシャー分析により測定した場合の凍結乾燥した生成物の水分含量は、約１．０％であることが判明した。凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２を、ｍｉｌｉＱ水を用いて５ｍｇ／ｍＬまで再構成した。再構成時間は約１−２分であった。
【０１１１】
（ＩＭＣ−Ａ１２の安定性に及ぼす凍結乾燥の影響）
凍結乾燥プロセスがＩＭＣ−Ａ１２の安定性を変化させていないことを確認するために、ＩＭＣ−Ａ１２を、凍結乾燥の前後でＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析に先立って再構成した。凍結乾燥前および凍結乾燥後のＡ１２についての単量体、凝集体および分解生成物の割合（％）を表８に示す。
【表８】
2010522208.tif 000009
【０１１２】
（ＩＭＣ−Ａ１２のコンホメーション安定性に及ぼす凍結乾燥の影響）
凍結乾燥プロセスがＡ１２の二次構造を変えていないことを確認するために、凍結乾燥前および凍結乾燥後のＩＭＣ−Ａ１２の二次構造を円二色性によって検討した。このＣＤスペクトルはＪａｓｃｏ  ８１０円二色性分光光度計を用いて収集し、ＩＭＣ−Ａ１２濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬであった。凍結乾燥前ならびに凍結乾燥および再構成後のＣＤスペクトルを図３４に示す。ＩＭＣ−Ａ１２の二次構造は、凍結乾燥によっては変わらなかった。
【０１１３】
（ＩＭＣ−Ａ１２についての微粒子総数に及ぼす凍結乾燥の影響）
ＩＭＣ−Ａ１２の微粒子総数に対する凍結乾燥の効果を、ハイアック・ロイコモデル（ＨＩＡＣ  ＲＯＹＣＯ  ＭＯＤＥＬ）９７０３液中微粒子システムを用いて測定した。凍結乾燥前後のＩＭＣ−Ａ１２を５ｍｇ／ｍＬまで希釈／再構成した。結果を表９に示す。微粒子総数は、有意には変化しなかった。
【表９】
2010522208.tif 000010
【０１１４】
（実施例７：溶液ＩＭＣ−Ａ１２処方物と凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２処方物との間の比較）
以下の処方物を比較した。
（１）ＰＢＳ溶液処方物、ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬのＩＭＣ−Ａ１２。
（２）クエン酸塩溶液処方物、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  グリシン、０．０１％  ツイーン８０（重量／体積）、ｐＨ６．５中の５ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−Ａ１２。
（３）凍結乾燥した処方物、３０ｍｇ／ｍＬ  ＩＭＣ−Ａ１２、１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、４．６％トレハロース、ｐＨ６．５。
【０１１５】
（リアルタイム加速温度安定性）
ＰＢＳおよびクエン酸塩溶液処方物、ならびに凍結乾燥した処方物を、４℃、４０℃、５０℃でインキュベートした。凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２を、分析に先立って、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて５ｍｇ／ｍＬまで再構成した。この溶液処方物および再構成した凍結乾燥した処方物を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１１６】
ＰＢＳおよびクエン酸塩緩衝液中のＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物、ならびに好ましい凍結乾燥した処方物中のＩＭＣ−Ａ１２を、４０℃および５０℃で４ヶ月間インキュベートした。凍結乾燥した試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中で再構成し、単量体の割合（％）をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。４０℃および５０℃で４ヶ月インキュベーション後の単量体の割合（％）を、それぞれ図３５および図３６に示す。４０℃および５０℃で４ヶ月インキュベーション後の凝集体の割合（％）をそれぞれ図３７および図３８に示す。４０℃および５０℃で４ヶ月インキュベーション後の分解生成物の割合（％）を、それぞれ図３９および図４０に示す。
【０１１７】
４℃、４０℃および５０℃で４ヶ月インキュベーション後の試料のＳＤＳ−ｐａｇｅ（還元）分析を図４１に示す。ＰＢＳおよびクエン酸塩緩衝液中のＩＭＣ−Ａ１２溶液処方物、ならびに好ましい凍結乾燥した処方物中のＩＭＣ−Ａ１２を、４℃、４０℃および５０℃で４ヶ月間インキュベートした。凍結乾燥した試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中で再構成し、１０μｇを４−２０％  トリス−グリシンゲルに充填した。このゲルをクーマシーブルーで染色した。
【０１１８】
（凍結乾燥した処方物の光安定性）
光安定性を上に記載したようにして実施した。凍結乾燥したＩＭＣ−Ａ１２ならびに溶液処方物ＰＢＳおよびクエン酸塩を室温で光に曝露した。総露光量は２００ワット時／ｍ２の近紫外＋１２０万ルクス時の蛍光であった。対照の試料は、光を遮断するために、黒い紙で包んだ。対照試料および試験試料を、光安定性チャンバ（Ｃａｒｏｎ  ６５００シリーズ、Ｃａｒｏｎ、オハイオ州、マリエッタ）の内部に置いた。光への曝露後、対照試料および試験試料の両方をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。対照および光に曝露した試料について、単量体、凝集体、および分解生成物の割合（％）を、表１０に示す。ＩＭＣ−Ａ１２は、両方の処方物において光に敏感であることが見出された。しかしながら、光安定性は、ＰＢＳ処方物よりも、クエン酸塩処方物において有意に良好であった。
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月18日(2009.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010522208000001.app
【国際調査報告】
2010522208.tif 000063
2010522208.tif 000064