(57)【要約】開示される技術（すなわち、本発明）は、滅菌インジケーターおよび生成するシグナルを濃縮する方法に関する。上記シグナルは、上記滅菌インジケーターを、容量を最小化し、そしてｐＨおよび増殖を緩衝化する作用もしくは媒介する作用を最小化した状態において、最小の表面積に制限することによって生成される。上記滅菌インジケーターは、第１の表面１４および第２の表面１６を有する基材１２；第１の部分２２および第２の部分２４を有する支持部２０；ならびに基材１２によって支持されている生物学的指示薬３０を備え得、基材１２は支持部２０の第１の部分１２を被覆し、基材１２の第２の表面１６は支持部２０の第１の部分２２に付着している。支持部２０の第２の部分は、生物学的指示薬３０を接触させることなく滅菌インジケーター１０を操作することを可能にするに十分な大きさであり得る。上記滅菌インジケーターを作製する方法が開示される。上記滅菌インジケーターを使用する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の表面および第２の表面を有する基材；
第１の部分および第２の部分を有する支持部；ならびに
上記基材によって支持されている生物学的指示薬
を備えている滅菌インジケーターであって、
上記基材は、上記支持部の第１の部分を被覆し、
上記基材の第２の表面は、上記支持部の第２の部分に付着しており、
上記支持部の第２の部分は、上記生物学的指示薬を接触させることなく上記滅菌インジケーターを操作することを可能にするに十分な大きさである
滅菌インジケーター。
【請求項２】
上記基材の第１の表面が、約１〜約８０ｍｍ２の範囲内の表面積を有する、請求項１に記載の滅菌インジケーター。
【請求項３】
上記基材が多孔材料または無孔材料を含む、請求項１または２に記載の滅菌インジケーター。
【請求項４】
上記基材が、紙、金属、ガラス、セラミック、プラスティック、膜、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項５】
上記基材が圧縮繊維を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項６】
上記基材が、焼結ガラス、ガラス繊維、セラミック、合成重合体、またはこれらの２つ以上の組み合わせから作られる多孔材料を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項７】
上記基材が紙を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項８】
上記基材がセルロースパッドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項９】
上記基材が、円、正方形、矩形、長円形、または多面の断面の形状を有する基板の形態である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１０】
上記基材が、金属、ガラス、セラミック、プラスティック、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む材料から作られている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１１】
上記基材がプラスティックから作られている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１２】
上記基材がポリスチレンから作られている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１３】
上記基材は、矩形の細片の形態であり、該基材の第１の部分が該基材の長さに関する副次的な部分を構成し、該基材の第２の部分が該基材の長さに関する主要な部分を構成している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１４】
上記基材が、超音波溶着、接着、熱封止または積層を用いて上記支持部に取り付けられている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１５】
上記生物学的指示薬が、１つ以上の試験生物、１つ以上の酵素、またはこれらの混合物を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１６】
上記生物学的指示薬が細菌を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１７】
上記生物学的指示薬が細菌胞子を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１８】
上記生物学的指示薬が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の細菌を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１９】
上記生物学的指示薬が、ゲオバチルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス  アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス  プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス  コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、クロストリジウム  スポロジェネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、バチルス  サブチリス  グロビギイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、バチルス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス  チルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２０】
上記生物学的指示薬が、菌類、放線菌、原虫、無性細菌、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２１】
上記生物学的指示薬が、アスペルギルス  ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、カンディダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、トゥリコフィトン  メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、ワンジエラ  デルマティティス（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、ミコバクテリウム  チェロナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ミコバクテリウム  ゴルダナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄａｎａｅ）、ミコバクテリウム  スメグマンティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｎｔｉｓ）、ミコバクテリウム  テッラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ）、ギアルディア  ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、クリプトスポリディウム  パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、アエロモナス  ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エンテロコッカス  ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス  ファエキウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス  ピロジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（ニューモニアエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ  ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｌａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス  アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ  コレラエスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス  エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ステノトゥロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｐｈｉｌｌｉａ）、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２２】
上記生物学的指示薬が、ゲオバチルス  ステアロテルモフィルスを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２３】
上記生物学的指示薬が、無性細菌、無性細胞および／またはこれら構成要素部分を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２４】
上記生物学的指示薬が、１つ以上の微生物を含み、かつ１つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２５】
上記賦形剤が１つ以上の含水炭素を含む、請求項２４に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２６】
上記賦形剤がトレハロースである、請求項２４または２５に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２７】
上記賦形剤が、スクロース、グルコース、マルトース、デキストラン、スターチ、アガロース、セルロース、タンパク質、ホスホン酸塩、緩衝化剤、蜜蝋、脂質、油、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２８】
上記生物学的指示薬が、バンコマイシン耐性の腸球菌、メチシリン耐性のスタフィロコッカス  アウレウス、ミコバクテリウム  チェロナエ、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項２９】
上記生物学的指示薬が１つ以上のプリオンを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項３０】
上記基材によって支持される胞子の濃度は、基材の平方ミリメートルあたり約１０４〜約１０７ｃｆｕである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項３１】
上記生物学的指示薬が、１つ以上の酵素を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項３２】
上記生物学的指示薬が、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ミリステートリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、バリンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン、ホスホヒドロラーゼ、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−セロビオシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ、脂肪酸エステラーゼ、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項３３】
上記生物学的指示薬が、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン、ホスホフィドロラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、脂肪酸エステラーゼ、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−ベータ−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−セロビオシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項３４】
上記基材が紙を含み、上記生物学的指示薬がゲオバチルス  ステアロテルモフィルスを含み、かつ支持部がポリスチレンを含み、上記基材が超音波溶着を用いて上記支持部に付着されている、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項３５】
第１の表面および第２の表面を有する基材；
第１の部分および第２の部分を有する支持部；ならびに
上記基材によって支持されている生物学的指示薬
を備えている滅菌インジケーターであって、
第１の表面は、約１〜約８０ｍｍ２の範囲内の面積を有し、
上記基材は、上記支持部の第１の部分を被覆し、
上記基材の第２の表面は、上記支持部の第２の部分に付着しており、
上記支持部の第２の部分は、上記生物学的指示薬を接触させることなく上記滅菌インジケーターを操作することを可能にするに十分な大きさである
滅菌インジケーター。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の上記滅菌インジケーターを収容し、上記滅菌インジケーターが滅菌の間に滅菌媒体との接触をもたらされるように適合されている第１の区画；ならびに
滅菌の間に上記滅菌インジケーターからのインキュベーション媒体の分離を維持するために適合され、かつ上記滅菌インジケーターが滅菌媒体にさらされた後に、上記滅菌媒体が上記滅菌インジケーターと接触することを許容するように適合されている、インキュベーション媒体を収容する第２の区画を備える、滅菌インジケーターキット。
【請求項３７】
上記基材に対して上記生物学的指示薬を塗布すること；および
上記支持部に対して上記基材を付着すること
を包含する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の滅菌インジケーターを製造する方法。
【請求項３８】
上記基材が、超音波溶着または接着を用いて上記支持部に対して付着される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
滅菌される物品および請求項１〜３５のいずれか１項に記載の滅菌インジケーターを、滅菌媒体に対してさらすこと
を包含する、滅菌方法。
【請求項４０】
上記滅菌媒体が少なくとも１つの液体の滅菌剤を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記滅菌媒体が少なくとも１つの気体の滅菌剤を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
滅菌される少なくとも１つの物品、および上記生物学的指示薬が少なくとも１つの試験生物を含む請求項１〜３５のいずれか１項に記載の滅菌インジケーターを、滅菌媒体に対してさらすこと；ならびに
滅菌が有効であるか否かを決定するための滅菌の後に、インキュベーション媒体と上記基材を接触させること
を包含する、滅菌の有効性を決定する方法。
【請求項４３】
上記インキュベーション媒体が、１つ以上の栄養源および１つ以上の微生物の増殖指示薬を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
上記インキュベーション媒体が、１つ以上のｐＨ緩衝液、浸透圧平衡を維持する１つ以上の薬剤、１つ以上の中和剤、またはこれらの２つ以上の組み合わせをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
上記インキュベーション媒体が、約−０．００１〜約−０．０７０ｍｏｌのＨ＋の範囲内における緩衝化能を有する緩衝化溶液を含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
滅菌される少なくとも１つの物品、および上記生物学的指示薬が少なくとも１つの試験生物を含む請求項１〜３５のいずれか１項に記載の滅菌インジケーターを、滅菌媒体に対してさらすこと；ならびに
滅菌が有効であるか否かを決定するために少なくとも１つの酵素基質と上記基材を接触させること
を包含する、滅菌の有効性を決定する方法。
【請求項４７】
上記酵素基質が、蛍光を発する１つ以上の４−メチルアンベリフェリル誘導体；７−アミド−４−メチル−クマリンの１つ以上の誘導体；１つ以上のジアセチルフルオレセイン誘導体；フルオレサミン；またはこれらの２つ以上の混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェリル−２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−ベータ−Ｄ−ルコピラノシド；４−メチルアンベリフェリル  アセテート；４−メチルアンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−ガラクトサミニド；４−メチルアンベリフェリル−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニド；４−メチルアンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；２’−（４−メチルアンベリフェリル）−アルファ−Ｄ−Ｎ−アセチル  ノイラミン酸；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルアンベリフェリル  アルファ−Ｌ−アラビノシド；４−メチルアンベリフェリル  エライデート；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−フコシド；４−メチルアンベリフェリル  ブチレート；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−セロビオシド；メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−Ｎ、Ｎ’−ジアセチル  チトビオシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｌ−フコシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｌ−フコシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルクロニド；４−メチルアンベリフェリル  ｐ−グアニジノベンゾエート；４−メチルアンベリフェリル  ヘプタノエート；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルアンベリフェリル  オレアート；４−メチルアンベリフェリル  パルミテート；４−メチルアンベリフェリル  ホスフェート；４−メチルアンベリフェリル  プロピオネート；４−メチルアンベリフェリル  ステアレート；４−メチルアンベリフェリル  サルフェート；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’Ｎ’’−トリアセチルキトトリオース；４’−メチルアンベリフェリル  ２，３，５−トリ−ベータ−ベンゾイル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−トリメチルアンモニウム  シンナメート  クロライド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−キシロシド；またはこれらの２つ以上の混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
上記酵素基質が、Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−プロリン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−チロシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；７−グルタリル−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；またはこれらの２つ以上の混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
上記酵素基質が、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−グルタリル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；またはこれらの２つ以上の混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
上記酵素基質が、フルオレセイン  ジアセテート、フルオレセイン  ジ（ベータ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド）、フルオレセイン  ジラウレート、またはこれらの２つ以上の混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
上記酵素が、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、キモトリプシン、または脂肪酸エステラーゼを含み、上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド、７−グルタリルフェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、または４−メチルアンベリフェリル  ヘプタノエートを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
上記酵素が、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを含み；かつ上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
上記酵素が、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼを含み；かつ上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
上記酵素基質が、１つ以上の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル誘導体；１つ以上のニトロフェニル誘導体；１つ以上のインドキシル誘導体；１つ以上のおよびフェノールフタレイン誘導体；またはこれらの２つ以上の混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
上記酵素基質が、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル  アセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  アセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−１，３−ジアセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  サルフェート、またはこれらの２つ以上の混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
上記酵素基質が、１つ以上のｐ−ニトロフェノール誘導体；１つ以上のｏ−ニトロフェノール誘導体；またはこれらの２つ以上の混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
上記酵素基質が、ジエチル−ｐ−ニトロフェノール  ホスフェート；ジ−ｐ−ニトロフェニル  ホスフェート；ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−ベータ−ガラクトピラノシル−ベータ−グルコ  ピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−ベータ−グルコピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−アセテート；ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；ｐ−ニトロフェニルベータ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオシド；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−グルコピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−マルトシド；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−マルトシド；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−マンノピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−マンノピラノシド；ｐ−ニトロフェニル  ミリステート；ｐ−ニトロフェニル  パルミテート；ｐ−ニトロフェニル  ホスフェート；ビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート；トリス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−グルコピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−グルクロニド；アルファ−ｐ−ニトロフェニルグリセリン；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−ラムノピラノシド；ｐ−ニトロフェニル  ステアレート；ｐ−ニトロフェニル  サルフェート；ｐ−ニトロフェニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−グルコサミニド；ｐ−ニトロフェニル  チミジン  モノホスフェート；ｐ−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−ベータ−グルクロン酸メチルエステル；ｐ−ニトロフェニル  バレレート；またはこれらの２つ以上の混合物を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
上記酵素基質が、ｏ−ニトロフェニル  アセテート；ｏ−ニトロフェニル−ベータ−グルコシド；ｏ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；ニトロフェニル−アルファ−ガラクトピラノシド；ニトロフェニル−ベータ−ガラクトピラノシド；ニトロフェニル  ブチレート；ニトロフェニル  カプレート；ニトロフェニル  カプロエート；ニトロフェニル  カプリレート；ニトロフェニル  ラウレート；ニトロフェニル  プロピオネート；インドキシル−アセテート；インドキシル  ベータ−Ｄ−グルコシド；３−インドキシル  サルフェート；３−インドキシル  ホスフェート；フェノールフタレイン  ジブチレート；フェノールフタレイン  ジホスフェート；フェノールフタレイン  ジスルフェート；フェノールフタレイン  グルクロン酸；フェノールフタレイン  モノ−ベータ−グルクロン酸；フェノールフタレイン  モノ−ベータ−グルクロン酸；およびフェノールフタレイン  モノ−ホスフェート；１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２；５−ジエトキシベンゼン；１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２；５−ジエトキシベンゼン；ｐ−ジアゾ−２，５−ジエトキシ−Ｎ−ベンゾイルアラニン；４−クロロ−２−メチルベンゼン  ジアゾニウム  クロライド；ｏ−アミノアゾトルエン  ジアゾニウム塩；１−ナフチル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；２−ナフチルホスフェート；２−ナフチル−ブチレート；２−ナフチル−カプリレート；２−ナフチル−ミリステート；Ｌ−ロイシル−２−ナフチルアミド；Ｌ−バリル−２−ナフチルアミド；Ｌ−シスチル−２−ナフチルアミド；Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド；Ｎ−グルタリル−フェニルアラニン  ２−ナフチル−アミン；２−ナフチル−ホスフェート；６−Ｂｒ−２−ナフチル−アルファ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド；２−ナフチル−ベータ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド；２−ナフチル−２−Ｄ−グルコピラノシド；６−ブロモ−２−ナフトール−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；６−ブロモ−２−ナフチル−２−Ｄ−マンノピラノシド；２−ナフチル−アルファ−Ｌ−フコピラノシド；ナフチル−ＡＳ−ＢＩ−ホスフェート；ナフチル−ＡＳ−ＢＩ−ベータ−Ｄ−グルクロニド；またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
上記酵素が、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−グルコピラノシドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
上記酵素が、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６２】
上記酵素が、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６３】
上記酵素が、β−ガラクトシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
上記酵素が、β−ガラクトシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示される方法は、滅菌インジケーター、および滅菌インジケーターを製造する方法に関する。開示される技術は、滅菌の有効性を確かめるための滅菌インジケーターを用いた滅菌方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
基本的には保健医療産業において、しかし、他の多くの商業的および産業的適用においてもまた、医療用および非医療用の装置、器具ならびに他の物品および物質といった備品を滅菌するために使用される工程の有効性を測定することが、しばしば必要とされている。滅菌されるひとまとまりの物品に滅菌インジケーターを含めることは、これらの滅菌工程においてしばしば標準的な手法である。これは、直接的な手法によって滅菌工程の致死率を評価することを可能にする。
【０００３】
従来の滅菌インジケーターは、生物学的指示薬を典型的に含む。生物学的指示薬は、滅菌によって破壊される生物よりも滅菌工程に対して耐性であるように設計されている、１つ以上の試験生物を備え得る。これらの試験生物はたいてい細菌胞子である。従来の滅菌インジケーターは、２つの形態において利用可能であり得る。
【０００４】
これらの形態の１つ目は基板の利用に関する。当該基板上には、細菌胞子が直接に塗布されるか、または播種されている。基板は胞子を用いて完全に被われ得る。ユーザによるあらゆる物理的な操作の結果として、基板から失われる胞子、ユーザに運ばれる胞子、または潜在的に汚染している胞子もしくは周囲によって汚染される胞子を生じ得る。ユーザが基板を扱うことを可能にする特別なクリップを提供することが提案されている。しかし、これらのクリップは、滅菌工程をしばしば妨げ、かつ不完全な試験結果を生じ得る。また、これらの基板とって最小の大きさの制限がきっかけとなって、相対的に大きな容積（例えば、約５〜約１０ミリリットル（ｍｌ））のインキュベーション媒体、および相対的に長い（例えば、約２〜約７日の）インキュベーション期間を典型的に要求する。
【０００５】
これらの形態の２つ目は、内蔵型の滅菌インジケーターを含む。これらの滅菌インジケーターは、別々の容器ではなくて単一の容器に、細菌胞子およびインキュベーション媒体を典型的に収納している。胞子は滅菌工程に供される。滅菌の後に、容器は、滅菌の有効性を決定するためにインキュベーション媒体との接触を生じるように、動かされる。これらの滅菌インジケーターは、気体の滅菌工程にとって有用であり得るが、液体の滅菌工程にとって典型的に好適ではない。
【０００６】
これらの滅菌インジケーターのそれぞれに伴う主な欠点は、滅菌試験に関する結果の取得における、時間の遅れに関する。これらの滅菌インジケーターは、生存するあらゆる胞子の適切な検出を保証するために、細菌胞子が少なくとも２日間、およびしばしば最大で約７日間、培養されることを必要とする。この期間中に、滅菌工程を受けた物品であって、評価中である物品は、胞子の生存試験の結果が決定されるまで、使用されるべきではない。しかし、多くの保健医療設備は、限られた蓄積を有し、かつ２４−４８時間以内およびしばしば即座に、それらの“滅菌された”器具を再利用しなければならない。このような背景において、滅菌確認にとって２〜７日の控えの期間は、非現実的であり得、費用がかかり得、かつ非能率的であり得る。
【０００７】
従って、当該技術によって提示される課題は、生物学的指示薬の取り扱いを最小限に抑えるかまたは排除し、かつ相対的に短い期間内に滅菌工程の有効性を正確に検出する、滅菌インジケーターを提供することである。この滅菌インジケーターが、気体の滅菌工程だけでなく液体の滅菌工程に対して適用可能であり得る場合に、滅菌インジケーターは好適である。少なくとも１つの実施形態において開示される技術は、この課題に対する解決を与え得る。
【発明の概要】
【０００８】
開示される技術は、第１の表面および第２の表面を有する基材；第１の部分および第２の部分を有する支持部；ならびに上記基材によって支持されている生物学的指示薬を備えている滅菌インジケーターであって、上記基材は、上記支持部の第１の部分を被覆し、上記基材の第２の表面は、上記支持部の第２の部分に付着しており、上記支持部の第２の部分は、上記生物学的指示薬を接触させることなく上記滅菌インジケーターを操作することを可能にするに十分な大きさである、滅菌インジケーターに関する。
【０００９】
開示される技術は、上述の滅菌インジケーターを収容し、上記滅菌インジケーターが滅菌の間に滅菌媒体と接触させられるように適合されている第１の区画；ならびに滅菌の間に上記滅菌インジケーターからのインキュベーション媒体の分離を維持するように適合され、かつ上記滅菌インジケーターが滅菌媒体にさらされた後に、上記滅菌媒体が上記滅菌インジケーター接触するように適合されている、インキュベーション媒体を収容する第２の区画を備える、滅菌インジケーターキットに関し得る。
【００１０】
開示される技術は、上記基材に対して上記生物学的指示薬を塗布すること；および上記支持部に対して上記基材を付着することを包含する、上述の滅菌インジケーターを製造する方法に関し得る。
【００１１】
開示される技術は、滅菌される物品および上述の滅菌インジケーターを、滅菌媒体に対してさらすことを包含する、滅菌方法に関し得る。
【００１２】
開示される技術は、滅菌される少なくとも１つの物品、および上記生物学的指示薬が少なくとも１つの試験生物を含む上述の滅菌インジケーターを、滅菌媒体に対してさらすこと；ならびに滅菌が有効であるか否かを決定するための滅菌の後に、インキュベーション媒体を上記基材を接触させることを包含する、滅菌の有効性を決定する方法に関する。
【００１３】
開示される技術は、滅菌される少なくとも１つの物品、および上記生物学的指示薬が少なくとも１つの試験生物を含む上述の滅菌インジケーターを、滅菌媒体に対してさらすこと；ならびに滅菌が有効であるか否かを決定するために少なくとも１つの酵素基質と上記基材を接触させることを包含する、滅菌の有効性を決定する方法に関する。
【００１４】
添付の図面において、同様の部材および特徴点は、同様の参照番号を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】開示される滅菌インジケーターの１つの実施形態を模式的に説明する平面図である。
【図２】図１に示される滅菌インジケーターの側面の模式図である。
【図３】２つの区画を収納し、１つの区画に上述の滅菌インジケーターが配置され、かつ他の区画にインキュベーション媒体が配置される、滅菌の有効性を決定する装置の模式的な展開図である。
【図４】実施例１における開示される滅菌インジケーターの試料にとっての、回復可能な胞子のプロットであり、超音波処理前と比較して、超音波処理に続く生存可能な胞子の数に有意差がないことを示している。
【図５】実施例２に示されるような、異なる容積および緩衝化能のインキュベーション媒体に対してさらされたゲオバチルス  ステアロテルモフィルスの胞子の増殖に応じた、ｐＨのプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
“滅菌”という用語は、複製、代謝および／または増殖が不可能な内容を表現することを指し得る。滅菌”という用語は、生物の完全な非存在を意味するとしばしば解釈される一方において、当該用語は、許容範囲内にあると予め承認される程度にまで、生存する生物がいないという内容を指すために、本明細書において使用され得る。特に断りがなければ、滅菌という用語は、滅菌よりも厳密ではない方法および行為（例えば、消毒および衛生化など）をも指すために、本明細書において使用され得る。本明細書に記載される、滅菌インジケーターおよび滅菌工程および滅菌装置は、保健医療分野および科学的分野などにおいて使用され得る。これらは、滅菌、消毒、衛生化などが所望され得る、商業用途および産業用途（例えば、食品加工、および製薬など）において使用され得る。
【００１７】
開示される滅菌インジケーターが使用され得る滅菌工程は、あらゆる滅菌工程であり得る。これらは、滅菌媒体または滅菌剤が、蒸気、乾熱、放射線、これらの他にも１つ以上の液体の滅菌剤および１つ以上の気体などの滅菌剤であり得る場合の、滅菌工程を包含する。放射線は、イオン化照射、パルス状の白色光もしくは紫外光およびマイクロ波などを含む、電子ビームまたは電磁スペクトルを包含し得る。放射線は、ガンマ線またはベータ線を包含し得る。気体の滅菌剤は、エチレンオキシド、および気体の過酸化水素を包含し得る。液体の滅菌剤は、ホルマリン（水に溶解され、かつ任意に毒性物質の形成を阻害するためにメタノールを含有するホルムアルデヒドガス）、グルタルアルデヒド、過酢酸、および液体の過酸化水素などを包含し得る。
【００１８】
滅菌インジケーターは、微生物に対する滅菌剤の致死率を調べるために使用され得る。当該微生物は、滅菌インジケーターとともに使用される生物学的指示薬よりも滅菌工程に対する耐性が低いあらゆる微生物である。これらの微生物は、細菌（例えば、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、レジオネラ種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、および他の腸内細菌、これら以外にもスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種および他のヒト病原性微生物（例えば、クリプトスポリディウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ））を含み得る。
【００１９】
滅菌インジケーターは、図１および２を参照して説明され得る。これらの図面を参照すると、滅菌インジケーター１０は、第１の表面１４および第２の表面１６を有する基材１２；第１の部分２２および第２の部分２４を有する支持部２０；ならびに上記基材１２によって支持されている生物学的指示薬３０を備えている滅菌インジケーターであって、上記基材１２は、上記支持部２０の第１の部分２２を被覆し、上記基材１２の第２の表面１６は、上記支持部２０の第２の部分に付着し得る。上記支持部２０の第２の部分２４は、上記生物学的指示薬３０を接触させることなく上記滅菌インジケーター１０を操作することを可能にするに十分な大きさであり得る。すなわち、第２の部分２４は、これらによって操作に応じた十分な面積であり得る。その結果として、滅菌インジケーター１０の容易な無菌操作を可能にする。
【００２０】
基材１２は、円形の形態として図面に描写される、相対的に平坦な基板の形態であり得る。しかし、基材１２が所望の形状または形態（例えば、正方形、矩形、および長円形など）であり得ることは、理解されるべきである。基材１２は多面的な断面を有する。基材１２は、相対的に小さい厚さを有する。基材１２は、例えば、約０．００１〜約３ｍｍの厚さを有し、かつ１つの実施形態において約０．０１〜約２ｍｍの厚さを有し、かつ１つの実施形態において約０．１〜約１ｍｍの厚さを有する。生物学的指示薬３０に対する支持を提供する基材１２の第１の表面１４の面積は、相対的に小さくあり得る。例えば、第１の表面１４の面積は、約１〜約８０ｍｍ２の範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約２〜約７０ｍｍ２の範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約３〜約６０ｍｍ２の範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約５〜約５０ｍｍ２の範囲内にあり得る。当該小さな面積の利点は、生物学的指示薬３０の大きさが相対的に小さくあり得ること、およびその結果として、生物学的指示薬をインキュベートするために必要とされるインキュベーション媒体の量が、相対的に少量であり得ること、およびインキュベーションに要求される時間が、相対的に短くなり得ることである。
【００２１】
基材１２は多孔材料または無孔材料を含み得る。基材は堅い基材を含み得る。基材は、滅菌工程またはインキュベーション工程の間に分解されないか、または劣化しない、あらゆる材料を含み得る。基材１２は、紙、金属、ガラス、セラミック、プラスティック、膜、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含み得る。金属はアルミニウムまたは鋼鉄を含み得る。プラスティックは、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリイミド、およびポリエステルなどを含み得る。基材１２は薄膜を含み得る。基材は紡いだ布または不織布の形態であり得る。基材は圧縮繊維のマットを含み得る。基材は、焼結ガラス、ガラス繊維、セラミック、合成重合体、またはこれら２つ以上の組み合わせから作られた、多孔材料を含み得る。基材はろ紙または吸収紙を含み得る。基材はセルロースパッドを含み得る。
【００２２】
支持部２０は、滅菌工程またはインキュベーション工程の間に溶解しないか、または劣化しない、あらゆる材料を含み得る。支持部はアルミニウムまたはステンレス鋼を含み得る。支持部は、ポリスチレン、およびポリオレフィン（例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン）などを含み得る。支持部２０は、柔軟であり得るか、または剛性であり得る。支持部２０は、折りたたみ可能であり得る。図面に描写される支持部２０は矩形形状であるが、しかし、支持部があらゆる所望の形状または形態（例えば、正方形、円形および長円形など）を有し得ることは、理解されるべきである。支持部２０の長さは、約０．２〜約１２ｃｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約０．２〜約１０ｃｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約０．５〜約７ｃｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約１〜約５ｃｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約１．５〜約３．５ｃｍの範囲内にあり得る。支持部２０の幅は、約０．２〜約２ｃｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約０．２〜約１．５ｃｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約０．２５〜約１ｃｍの範囲内にあり得る。支持部２０の厚さは、約０．０２〜約３ｍｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約０．１〜約２ｍｍの範囲内であり得る。第２の部分２４の長さは、約０．２〜約１２ｃｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約０．３〜約１１ｃｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約１〜約７ｃｍの範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約１．５〜約４．５ｃｍの範囲内にあり得る。
【００２３】
支持部２０は、矩形のシートまたは細片の形態であり得る。矩形のシートまたは細片の形態の支持部２０において、支持部２０の第１の部分２２が基材１２の長さの副次的な部分を構成し、支持部２０の第２の部分２４が支持部２０の長さの主要な構成する。第１の部分２２の長さに対する第２の部分２４の長さの割合は、約２：１〜約１２：１の範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約４：１〜約８：１の範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約５：１〜約６．５：１の範囲内にあり得る。
【００２４】
基材１２は、超音波溶着、熱封止、接着、または積層を用いて、支持部２０に対して付着され得る。基材１２は、基材１２に対する生物学的指示薬３０の塗布の前に、または当該塗布に続いて、支持部２０に対して付着され得る。基材１２は、超音波溶着または接着を用いた支持部２０に対する生物学的指示薬３０の塗布に続いて、支持部２０に対して付着され得る。超音波溶着は、基材に対する支持部の摩擦による結合に関し得る。接着は、基材１２および支持部２０に対して適合可能であり、かつ滅菌工程またはインキュベーション工程の間に分解されないか、または劣化しない、あらゆる接着であり得る。接着は、所定の生物に対して致死性または抑制性であるべきではない。接着は粘着であり得る。
【００２５】
滅菌インジケーター１０は、あらゆる工程において使用され得る。当該工程において、生物学的指示薬３０が滅菌工程の間に滅菌媒体にさらされ、かつそれから滅菌が有効であったか否かを決定するために、インキュベーション媒体に対してさらされる。滅菌インジケーター１０は、あらゆる滅菌工程（例えば、気体または液体の滅菌剤を採用する滅菌工程）とともに使用され得る。滅菌インジケーター１０は、滅菌工程の間に滅菌媒体に対して、滅菌される物品と共にさらされ得る。それから、生物学的指示薬３０は、所望の期間に渡ってインキュベートされ得、かつそれから滅菌工程が有効であったか否かを決定するために試験され得る。
【００２６】
滅菌インジケーター１０は、２つの別々の区画を有する容器を備える内蔵型の滅菌インジケーターキットに使用され得る。上記区画の１つは滅菌インジケーター１０を収納し得る。他の区画は滅菌媒体を収納し得る。上記キットおよび滅菌される物品は、使用中に滅菌媒体にさらされ得る。滅菌に続いてそれから、生物学的指示薬３０が、滅菌が有効であったか否かを決定するために十分に、インキュベーション媒体と接触する状態になるように、上記キットは動かされ得る。これらのキットは、生物学的指示薬が滅菌媒体にさらされ得るあらゆる滅菌工程（例えば、気体の滅菌剤を採用する滅菌工程）と共に使用され得る。
【００２７】
内蔵型の滅菌インジケーターキットは、図３に描写される形態にあり得る。図３を参照すると、キット４０は、先細の管４２、内部区画４４、および閉鎖キャップ４６を備える。閉鎖キャップ４６は突起４８を含む。環状空間４３は、先細の管４２の内面と内部区画４４との間に形成される。環状空間４３は他の内部区画を形成する。滅菌インジケーター１０は環状空間４３に配置される。インキュベーション媒体は内部区画４４に収納される。先細の管４２および閉鎖キャップ４６は、滅菌工程に使用される条件および化学的性質と適合性である、あらゆる材料から作られ得る。これらの材料は、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリメタクリレート、ポリメチルペンテン、およびポリエステルなどを含み得る。内部区画４４は、ガラスまたはもろいガラスアンプルの形態にあり得る。先細の管４２、内部区画４４および閉鎖キャップ４６に関するさらなる詳細は、米国特許第４，３０４，８６９号明細書に見出され得る。米国特許第４，３０４，８６９号明細書は、参照によって本明細書に組み込まれる。滅菌の間に、キット４０は、滅菌される物品とともに滅菌媒体にさらされる。滅菌が完了すると、閉鎖キャップ４６は、先細の管４２の中に下方に押される。突起４８は、内部区画４４を押圧し、かつ内部区画４４の破裂を引き起こす。これが、インキュベーション媒体を生物学的指示薬３０と接触を可能にする。所定の時間のインキュベーション後に、滅菌インジケーター１０が取り出され、かつ滅菌の程度が生物学的指示薬３０の変化を検出することによって決定され得る。
【００２８】
生物学的指示薬３０は１つ以上の試験生物を含み得る。代替可能に、生物学的指示薬３０は１つ以上の酵素を含み得る。１つ以上の酵素は、１つ以上の試験生物から取得され得るか、および／または単離され得る。生物学的指示薬３０は、１つ以上の酵素と組み合わせて１つ以上の試験生物を含み得る。
【００２９】
試験生物は、あらゆる生物を含み得る。当該生物は、意図される滅菌工程に対する耐性が、滅菌工程によって破壊されるべきである他の生物の耐性を越えている。生物学的指示薬３０として使用される試験生物の種類は、これに限定されないが、使用される滅菌工程の種類によって裏付けられた、種々の要素に依存し得る。試験生物は、微生物であり得る。使用され得る株は、滅菌に使用される工程に対して最も耐性のある株であり得る。試験生物は細菌を含み得る。細菌微生物は、内生胞子（すなわち、細菌胞子）を形成する微生物であり得る。試験生物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはクロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）属の細菌を含み得る。これらは、ゲオバチルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス  アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス  プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス  コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、クロストリジウム  スポロジェネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、バチルス  サブチリス  グロビギイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、バチルス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、およびバチルス  チルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）などを含み得る。細菌は、菌類、放線菌、原虫、および無性細菌などを含み得る。使用され得る菌類の例としては、アスペルギルス  ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、カンディダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、トゥリコフィトン  メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、およびワンジエラ  デルマティティス（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）などが挙げられ得る。使用され得る放線菌の例としては、ミコバクテリウム  チェロナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ミコバクテリウム  ゴルダナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄａｎａｅ）、ミコバクテリウム  スメグマンティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｎｔｉｓ）、およびミコバクテリウム  テッラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ）などが挙げられ得る。使用され得る原虫の例としては、ギアルディア  ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、およびクリプトスポリディウム  パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などが挙げられ得る。使用され得る無性細菌の例としては、アエロモナス  ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エンテロコッカス  ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス  ファエキウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス  ピロジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（���ューモニアエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ  ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス  アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ  コレラエスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス  エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、およびステノトゥロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｐｈｉｌｌｉａ）などが挙げられ得る。ゲオバチルス  ステアロテルモフィルス、バチルス  アトロファエウス、バチルス  サブチリス、バチルス  コアギュランス、およびクロストリジウム  スポロジェネスなどといった生物は、湿性の熱滅菌（加圧滅菌）の有効性の決定に使用され得、特にゲオバチルス  ステアロテルモフィルスが有用である。
【００３０】
試験微生物として使用され得る無性細菌、無性細胞および／またはこれらの構成要素部分といった微生物は、基材１２上に堆積され得、かつ１つ以上の賦形剤の存在下において堆積される場合に乾燥して生存し得、かつ保存し得る。賦形剤は、不安定な構成要素を安定化するために使用され得る、一般的に不活性な化合物の広範な種類と定義され得る。使用され得る賦形剤の下位の種類としては、含水炭素（例えば、オリゴマーの糖類および重合体の糖類）が挙げられる。当該化合物の例は、２糖類であるトレハロースであり得る。ある生物の組織における高濃度のトレハロースは、生物が水の欠乏状態において生存することを可能にし得る。トレハロースは、脱水後における機能的な細胞性構成要素を回復させるために使用され得る。トレハロースは、膜、および極端な環境条件（例えば凍結乾燥）下において細胞の生存に必須な他の巨大分子構造に、安定性を与え得る。他の安定化賦形剤化合物としては、単糖（例えば、スクロース、グルコース、およびマルトースなど）および長鎖重合体（例えば、デキストラン、スターチ、アガロース、およびセルロースなど）が挙げられ得る。他の非含水炭素から作られる賦形剤としては、タンパク質、ホスフェート、緩衝化剤、蜜蝋、脂質、油、および他の含水炭素から作られる材料が挙げられ得る。
【００３１】
生物学的指示薬３０は、最も耐性のある生物（例えば、ゲオバチルス  ステアロテルモフィルス）を表すような、それらの受け容れの基準に基づいて選択された刺激性の生物を含み得る。これらに加えて、生物学的指示薬３０は、非自己増殖性作用物質および／または細胞の亜細胞性構成要素もしくは産物を、さらに含み得る。これらは、それらの臨床的重要性を理由にしてか、または生物テロの作用物質として使用されることから、使用され得る。これらの生物は、天然の修飾または人の手による修飾に起因して、抗生物質処理または化学殺菌の通常の手段に対して現在耐性を有し得る株を含む。過去の種類の例としては、ＶＲＥ（バンコマイシン耐性のエンテロコッカス）、ＭＳＲＡ（メチシリン耐性のスタフィロコッカス  アウレウス）、およびミコバクテリウム  チェロナエなどが挙げられ得る。ＶＲＥおよびＭＲＳＡが治療手段に対する発達した耐性（例えば、抗生物質耐性）を有し、かつＭ．  チェロナエが殺菌のある様式に対する発達した耐性（例えば、グルタルアルデヒド耐性）を有する。このために、これらが使用され得る。
【００３２】
生物学的指示薬３０は、模倣的な代替物が未だない、１つ以上の新興の生物を含み得る。これらは、処置または殺菌の治療的経過に対して、特別な危険性または課題を代表し得る。これらの生物の例としては、プリオンが挙げられ得る。プリオンは本質的に生物ではない。しかし、疾患が起こる作用物質としてのプリオンの機能は、それらの構造と関連し得る。そして、プリオンの構造／機能の関連は、それらの相対的な感染性を決定するために採用され得る。他の非自立的な作用物質（例えば、ウイルス）ならびに亜細胞性の構成要素およびタンパク質性のプリオンが、生物学的指示薬３０として使用され得る。
【００３３】
基材１２は、試験生物を包含する水性の懸濁物または分散物を調製することによって、試験生物を用いて播種され得る。水性の懸濁物または分散物は、所定の濃度において、例えば、細菌胞子を含み得る。水性の懸濁物または分散物における細菌胞子の所定の濃度は、例えば、１ミリリットルにつき約１０５〜約１０１０のコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）の範囲内にあり、かつ１つの実施形態において１ミリリットルにつき約１０７〜約１０９ｃｆｕの範囲内にある。一定分量の懸濁物または分散物が、基材１２の上に載せられ得る。例えば、水におけるＢ．  サブチリスの懸濁物または分散物は、基材１２に播種する一定分量について所望の数の胞子をもたらすために、調製され得る。胞子は、基材上において乾燥するために放置され得る。気流が、例えば、乾燥工程を早めるための層流フードに基材を配置するといった様式によって、支持部上の胞子を乾燥するために使用され得る。基材上の胞子を乾燥させる方法としては、それらを立てたままにしておくこと、塩化カルシウムといった乾燥剤を収納する乾燥器に胞子を置くこと、および層流フードに胞子を置くことなどによって胞子を空気乾燥させることが挙げられ得る。基材１２によって支持されるコロニー形成ユニット数は、約１０４〜約１０７ｃｆｕ／ｍｍ２（基材の平方ミリメートルについてのｃｆｕ）の範囲内にあり得、かつ１つの実施形態において約１０５〜約１０６ｃｆｕ／ｍｍ２の範囲内にあり得る。
【００３４】
滅菌インジケーター１０は、滅菌条件が求められ得る物品と同じ滅菌媒体および滅菌処理に滅菌インジケーター１０を供することによって、使用され得る。生物学的指示薬３０が配置される領域内に、熱が使用され得るか、および／または気体の作用物、液体の作用物、蒸気の作用物、または化学的および／または物理的な作用物が通過し得る。これによって滅菌される物品と同じ滅菌工程または滅菌作用物に生物学的指示薬３０をさらし得る。滅菌に続いて、インキュベーション媒体は、生物学的指示薬３０との接触をもたらされ得る。インキュベーション媒体は、固体または液体の形態にあり得る。インキュベーション媒体は、緩衝化水性溶液を含み得る。しかし、開示される技術において、生物学的指示薬がｐＨの変化、酸化還元電位、および酵素活性などに対してより感度よくなり得るように、インキュベーション媒体の緩衝化能が低減され得ることが好ましい。生物学的指示薬が試験生物の増殖を許容する条件において、インキュベーション媒体との接触をもらすあらゆる手法は、試験生物が存在する場合に使用され得る。インキュベーション媒体は、粉末または錠剤の形態において滅菌容器に存在し得る。そして滅菌後に、生物学的指示薬が水性のインキュベーション媒体と接触する状態になるように、滅菌水が加えられ得る。
【００３５】
インキュベーション媒体は１つ以上の栄養源を含み得る。栄養源は、滅菌工程を生き延び得るあらゆる試験生物の増殖にとってのエネルギーを供給するために、使用され得る。栄養源の例としては、カゼインの膵液消化物、大豆ミールの酵素消化物、スクロース、デキストロース、酵母抽出物、Ｌ−システイン、およびこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられ得る。生存する試験生物の存在下において色または本来の状態を変える微生物の増殖指示薬が、インキュベーション媒体とともに使用され得る。増殖指示薬は、インキュベーション媒体に分散され得るか、または溶解され得、かつインキュベーション媒体に最初の色をつけ得る。また、増殖指示薬は、微生物の増殖に関してインキュベーション媒体における色の変化を与え得る。採用され得る増殖指示薬としては、ｐＨ感受性色素指示薬（例えば、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールパープル、フェノールレッドなど、またはこれらの組み合わせ）、酸化還元色素指示薬（例えば、メチレンブルーなど）、酵素基質、またはこれらの２つ以上の組み合わせが挙げら得る。酵素基質は、その活性が試験生物に存在し得る１つ以上の酵素との関連性を示す、酵素基質を含み得る。使用され得る酵素基質としては、以下に明確にされる酵素基質が挙げられ得る。これらの微生物の増殖指示薬の利用は、微生物の増殖という現象（例えば、ｐＨ、酸化還元電位、酵素活性、および他の増殖の指標の変化）に応じた色の変化を生じ得る。インキュベーション媒体は、１つ以上のｐＨ緩衝液、１つ以上の中和剤、浸透圧平衡を維持する１つ以上の薬剤、またはこれらの２つ以上の組み合わせをさらに含み得る。ｐＨ緩衝液としては、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２’’−ニトリロチエタノール（ビス  トリス）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（ビス−トリス  プロパン）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（トリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）、トリスベース）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ））、ジグリシン（Ｇｌｙ―Ｇｌｙ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ））、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ２酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（アセス（ａｃｅｓ））、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、β−ヒドロキシ−４−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＢＳ）、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸水和物（ＰＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）２水和物（ＰＯＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸（ＴＡＢＳ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸水和物（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、およびこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられ得る。中和剤の例としては、これらに限定されないが、チオグリコール酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、カタラーゼ、硫酸酸ナトリウム、２亜硫酸ナトリウムレシチン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、２炭酸カルシウム、およびこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられ得る。浸透圧平衡を維持する薬剤の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、カルシウム塩、金属塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化鉄、およびこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられ得る。インキュベーション媒体は、水；約０．０１〜約１００ｇ／ｌ（水１リットルについてのグラム）の、かつ１つの実施形態において約０．１〜約５０ｇ／ｌの、１つ以上の栄養源；約１．０×１０−５〜約１０ｇ／ｌの、かつ１つの実施形態において約１．０×１０−４〜約１．０ｇ／ｌの、１つ以上の微生物の増殖指示薬；約５０００ｇ／ｌの、かつ１つの実施形態において約０．００１〜約５０００ｇ／ｌの、かつ１つの実施形態において約０．１〜約１０００ｇ／ｌの、かつ１つ以上のｐＨ緩衝液；約１００ｇ／ｌの、かつ１つの実施形態において約０．１〜約５０ｇ／ｌの、１つ以上の中和剤；約５０ｇ／ｌの、かつ１つの実施形態において約０．１〜約２５ｇ／ｌの、浸透圧平衡を維持する１つ以上の薬剤を含む、水性組成物を包含する。
【００３６】
インキュベーション媒体は、相対的に低い緩衝化能を有する。インキュベーション媒体が有する緩衝化能は、約−０．００１〜約−０．０７０ｍｏｌのＨ＋範囲内にあり、かつ１つの実施形態において約−０．０１〜約−０．０７０ｍｏｌのＨ＋範囲内にあり、かつ１つの実施形態において約−０．０１〜約−０．０１４ｍｏｌのＨ＋の範囲内にある。この緩衝化能は、望ましく低い緩衝化能を有するインキュベーション媒体の調合によってか、またはより高い緩衝化能を有する前調合したインキュベーション媒体の水もしくは他の液体を用いた希釈によって、提供され得る。従来技術において、インキュベーション媒体は、生物の増殖を促進するために典型的に調合されている。これは、生物に増殖および分裂により多くのエネルギーを費やさせ得、かつ蓄積する酸性排泄物および代謝によって産生される副生成物の排出に、より少ないエネルギーを費やさせ得る。インキュベーション媒体内の緩衝液は、媒体を十分に中性またはアルカリ性に保つために使用されて、細胞膜を通過する酸性副生成物（プロトン）の輸送を容易にし得る。開示される滅菌インジケーターと共に使用されるインキュベーション媒体は、増殖がどれだけ速く検出され得るかに主眼を置き得る。約−０．００１〜約−０．０１０ｍｏｌのＨ＋の範囲内に低減された緩衝化能、および１つの実施形態において約−０．００５〜約−０．００７ｍｏｌのＨ＋の範囲内に低減された緩衝化能を採用することによって、インキュベーション媒体は、ｐＨ、酸化還元電位および／または酵素活性に関する小さな変位に対してより感度がよくなり得る。
【００３７】
インキュベーション媒体は、栄養ブロス、Ｄ／Ｅ中和ブロス、デイビス最小培地、滅菌性試験ブロス、および大豆−カゼイン消化物または牛肉エキスから作られた培地を含み得る。大豆−カゼイン消化物ブロス、液体チオグリコレートおよびデキストローストリプトン（ディフコ  ラボラトリー社（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ）の水性溶液を含み得る。グルコースなしの修飾トリプシン大豆ブロスベースが、使用され得る。酵素活性が測定される場合に、インキュベーション媒体は、水、酵素基質、および任意にｐＨ緩衝液を含み得る。
【００３８】
使用され得るインキュベーション媒体の例としては、カゼインの膵液消化物を含有するバクト（商標）  トリプティック  ソイ  ブロス（１７．０ｇ／ｌ）、大豆ミールの酵素消化物（３．０ｇ／ｌ）、塩化ナトリウム（５．０ｇ／ｌ）、リン酸２カリウム（２．５ｇ／ｌ）、およびデキストロース（２．５ｇ／ｌ）が使用され得る。これらの成分は、水に分散され得るか、または溶解され得る。ｇ／ｌという標記を用いて表される濃度は、１リットルの水についての成分のグラム数を指す。カゼインの膵液消化物、大豆ミールの酵素消化物、およびデキストロースは、微生物の増殖にとってエネルギー源を供給する。これらは、栄養源として言及され得る。塩化ナトリウムは、液体培地における浸透圧平衡を維持するために使用され得る。リン酸２カリウムは、ｐＨ緩衝液としての役割を果たし得る。ｐＨ−感受性色素であるフェノールレッド（１８ｍｇ／ｌ）は、例えば、バクト（商標）  ソイ  ブロス調合物に対して加えられ得る。色素は、微生物増殖から生じるインキュベーション媒体におけるｐＨ変位の指示薬として有用であり得る。
【００３９】
使用され得るインキュベーションの他の例は、ＢＢＬ（商標）  フルイッド  チオグリコレート培地である。このインキュベーション媒体は、カゼインの膵液消化物（１５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（５．０ｇ／ｌ）、デキストロース（５．５ｇ／ｌ）、塩化ナトリウム（２．５ｇ／ｌ）、Ｌ−システイン（０．５ｇ／ｌ）、チオグリコール酸ナトリウム（０．５ｇ／ｌ）、およびレザズリン（１．０ｇ／ｌ）を含有する。これらの成分は、水に分散され得るか、または溶解され得る。カゼインの膵液消化物、酵母抽出物、デキストロース、およびＬ−システインは、微生物にエネルギーを供給し得る栄養源である。塩化ナトリウムは、インキュベーション媒体において浸透圧平衡を維持するために使用され得る。チグリコール酸ナトリウムは、中和剤として使用され得る。レザズリンは、酸化／還元色素指示薬として使用され得る。他の栄養源、浸透圧調節剤および当業者に公知の一般的な成分は、記載された成分と交換され得る。
【００４０】
開示される技術の利点は、生物学的指示薬３０の大きさが、相対的に小さくあり得、かつ従ってあらゆる生存する試験生物の基材１２上におけるインキュベーションに必要とされる、インキュベーション媒体の容積が、相対的に少なくなり得ることである。これは、相対的に短くなり得るインキュベーション期間を結果として生じ得る。従って、１つの実施形態において、生物学的指示薬３０は、基材１２が約１〜約８０ｍｍ２、かつ１つの実施形態において約５〜約５０ｍｍ２の範囲内における表面積を有するという、相対的に小さい基材１２によって支持され得る。滅菌前に基材１２によって支持される胞子の数は、約１０４〜約１０７ｃｆｕ／ｍｍ２の範囲内に、および１つの実施形態において約１０５〜約１０６ｃｆｕ／ｍｍ２の範囲内にあり得る。滅菌後における生物学的指示薬３０をインキュベーションするために必要とされる、インキュベーション媒体の容積は、約０．１〜約５ｍｌ、かつ１つの実施形態において約０．１〜約４ｍｌ、かつ１つの実施形態において約０．１〜約３ｍｌ、かつ１つの実施形態において約０．１〜約２ｍｌ、かつ１つの実施形態において約０．１〜約１．５ｍｌ、かつ１つの実施形態において約０．３〜約１ｍｌの範囲内にあり得る。滅菌後における生物学的指示薬３０をインキュベーションするために要求される期間は、約０．１〜約４８時間、かつ１つの実施形態において約０．１〜約３６時間、および１つの実施形態において約０．１〜約２４時間、および１つの実施形態において約０．１〜約１５時間、および１つの実施形態において約０．１〜約１２時間、および１つの実施形態において約０．１〜約１０時間、および１つの実施形態において約０．１〜約８時間、および１つの実施形態において約０．１〜約６時間、および１つの実施形態において約０．１〜約５時間、および１つの実施形態において約０．１〜約４時間の範囲内にあり得る。
【００４１】
生物学的指示薬３０として使用され得る酵素は、あらゆる酵素（活性が少なくとも１つの試験生物の生存能力と関連する、細胞外酵素または細胞内酵素が挙げられる）を含み得る。“関連する”によって、バックグラウンドを越える酵素活性が試験生物の将来の増殖を予測するために使用され得ることが意図される。酵素は、滅菌サイクルに従い、試験生物に対して亜致死性であり、十分な活性を残して時間の所望の期間内（例えば、約４〜約１６４時間、および１つの実施形態において約４〜約８４時間）に酵素基質と反応し、試験生物にとって致死性である滅菌の後においてすでに不活性化されるか、または活性を明らかに低減される、酵素である。
【００４２】
以下の試験は、生物学的指示薬３０として有用であるために必要な特性を有するこれらの酵素の同定において有用であり得る。約１×１０６の試験生物の個体数を約ログ６だけ（すなわち、試験生物の増殖の欠如によって測定されるような約０の個体数にまで）減少させるためにまったく十分である滅菌条件に供される場合の酵素は、酵素基質との反応によって測定されるような“バックグラウンド”に等しい残りの酵素活性を有し得る。しかし、約１×１０６の試験生物の個体数を少なくとも約ログ１であるが、約ログ６よりも少なく減少させるためにまったく十分である滅菌条件に供される場合の酵素は、酵素基質との反応によって測定されるような“バックグラウンド”よりも高い、酵素活性を有し得る。酵素基質は、酵素によって作用される場合に検出可能な（例えば、蛍光または有色の）酵素修飾産物を生成する物質、または物質の混合物であり得る。酵      素は、約ログ６だけ試験生物の個体数を減少させるために不十分な滅菌条件の後に十分な活性を有して、酵素基質と反応し、かつ期間内に（約０．１〜約４８時間の範囲内、および１つの実施形態において約０．１〜約１２時間の範囲内、および１つの実施形態において約０．１〜約４時間の範囲内に）検出可能な量の酵素修飾産物を生成する、酵素であり得る。
【００４３】
約ログ６だけ試験生物の個体数を減少させるために不十分である、滅菌条件の後における生物学的指示薬３０の活性は、バックグラウンドよりも少なくとも約２パーセント高くあり得、かつ１つの実施形態においてバックグラウンドよりも少なくとも約５パーセント高くあり得、かつ１つの実施形態においてバックグラウンドよりも少なくとも約１０パーセント高くあり得る。“バックグラウンド”と規定される残りの酵素活性の水準は、酵素基質の自然発生の転換によって達成されて、酵素が不活性化された後に生成されるよりも多くあり得る。
【００４４】
生物学的指示薬３０において使用され得る酵素としては、これらに限定されないが、胞子形成微生物から得られる加水分解酵素が挙げら得る。これらの酵素としては、微生物のカンディダ、バチルスまたはクロストリジウムの種といった胞子形成微生物から得られるベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ミリステートリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、バリンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン、ホスホヒドロラーゼ、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−セロビオシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ、および脂肪酸エステラーゼが挙げられ得る。
【００４５】
使用され得るゲオバチルス  ステアロテルモフィルスから得られる酵素としては、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン、ホスホフィドロラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、および脂肪酸エステラーゼが挙げられ得る。使用され得るバチルス  サブチリスから得られる酵素としては、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−ベータ−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−セロビオシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、およびフェニルアラニンアミノペプチダーゼが挙げられ得る。
【００４６】
バチルス  サブチリスから得られるベータ−Ｄ−グルコシダーゼおよびアルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼは、エチレンオキシド滅菌の観察において使用され得る。ゲオバチルス  ステアロテルモフィルスから得られるアルファ−Ｄ−グルコシダーゼは、蒸気滅菌条件を観察するために使用され得る。
【００４７】
酵素基質は、酵素によって作用される場合に酵素修飾産物に転換される、物質または物質の混合物であり得る。一般的に、酵素修飾産物は、発光性、蛍光性、有色または放射性の物質であり得る。しかし、酵素基質は、酵素によって作用される場合に、発光性、蛍光性、有色または放射性の物質を生じるための付加的な化合物または組成物と反応する産物を生じる、１つ以上の化合物を包含し得る。酵素基質が滅菌の間に生物学的指示薬３０に含まれる場合に、酵素基質は、滅菌またはインキュベーションの間に自発的に分解されるか、または検出可能な産物に転換されるべきではない。例えば、蒸気滅菌および乾熱滅菌を観察するために使用される滅菌インジケーターにおいて、酵素基質は、約２０℃〜約１８０℃の間の温度において安定であるべきである。酵素基質が、従来のインキュベーション媒体とともに含められる場合に、インキュベーションにおいて安定である（例えば、インキュベーション媒体において自己蛍光性ではない）べきである。
【００４８】
特定の酵素の検出に使用され得る酵素基質は２種類ある。酵素基質の１種類目は、蛍光発生体または発色体のいずれかであり得、かつＡＢといった化学式を与えられ得る。酵素によって作用される場合に、ＡＢはＡ＋Ｂに分解され得る。Ｂは、例えば、蛍光性であり得るか、または有色であり得る。この種の蛍光発生基質の特定の例は、４−メチルアンベリフェリル  ホスフェートであり得る。酵素ホスファターゼの存在下において、基質は４−メチルアンベリフェロンおよびホスフェートに分解され得る。この種の他の蛍光発生基質としては、４−メチルアンベリフェリル、レソルフィンおよびフルオレセインの誘導体が挙げられる。この種の発色性基質の例は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  ホスフェートであり得る。ホスファターゼの存在下において、基質はインディゴブルーおよびホスフェートに分解され得る。この種の他の発色性基質としては、インドキシル、ニトロフェノールおよびフェノールフタレインの誘導体が挙げられ得、ここで、発色性インドリル基質が分解され得、かつ比色分析応答が以下の化学反応、ＡＢによって生成され得る。適切な酵素によって作用された後に、ＡＢはＡ＋Ｂに分解され得る。それから、この色はＢＢが生じる場合に得られ得る。
【００４９】
酵素基質の２種類目は、特定の酵素によってＣ＋Ｄに転換され得る、化学式ＣＤを与えられ得る。しかし、ＣもＤも蛍光発生性ではないか、または有色性ではないが、Ｄは、化合物Ｚとさらに反応して蛍光発生化合物または有色化合物を生じさせることが可能であり得、従って酵素活性を示す。この種の特定の蛍光発生体の例は、アミノ酸リジンであり得る。リジンカルボキシル基分解酵素の存在下において、リジンはＣＯ２の分子を失い得る。リジンの残余部は、それから強く塩基性を示すかカダベリンと呼ばれ得る。４−メチルアンベリフェロンといった塩基性指示薬は、取り込まれ得、かつ強塩基の存在下において蛍光を発し得る。この種の有色性基質は、２−ナフチル  ホスフェートであり得る。酵素ホスファターゼは、酵素基質と反応して、ベータ−ナフトールを生じる。遊離したベータ−ナフトールは、１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジエトキシベンゼンを含有する有色性試薬と反応して、すみれ色を生じ得る。
【００５０】
酵素基質は、本明細書において、例えば明らかに修飾されたか、または増強された蛍光を有する誘導体蛍光団を与えるための加水分解によって、酵素的に修飾可能な化合物と定義される、蛍光発生化合物であり得る。
【００５１】
蛍光発生化合物は、それ自身において非蛍光性であり得るか、またはメタ蛍光性（すなわち、例えば色または強度によって、対応する酵素修飾産物と比べて明確に異なる様式において蛍光性である）であり得、かつ励起および検出の適切な波長が、存在し得るあらゆる他の蛍光から酵素修飾によって発せられる蛍光シグナルを分離するために、使用され得る。
【００５２】
起源に関して天然に生じるか、または合成的である多様な起源の酵素に関する多くの酵素基質が、使用され得る。これらとしては、蛍光発生性の４−メチルアンベリフェリル誘導体（４−メチルアンベリフェロンに加水分解可能な）；７−アミノ−４−メチル−クマリンの誘導体；ジアセチルフルオレセイン誘導体；およびフルオレサミンが挙げられ得る。
【００５３】
酵素基質として使用され得る４−メチルアンベリフェリルの誘導体としては、４−メチルアンベリフェリル−２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−ベータ−Ｄ−ルコピラノシド；４−メチルアンベリフェリル  アセテート；４−メチルアンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−ガラクトサミニド；４−メチルアンベリフェリル−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニド；４−メチルアンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；２’−（４−メチルアンベリフェリル）−アルファ−Ｄ−Ｎ−アセチル  ノイラミン酸；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルアンベリフェリル  アルファ−Ｌ−アラビノシド；４−メチルアンベリフェリル  エライデート；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−フコシド；４−メチルアンベリフェリル  ブチレート；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−セロビオシド；メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−Ｎ、Ｎ’−ジアセチル  チトビオシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｌ−フコシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｌ−フコシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルクロニド；４−メチルアンベリフェリル  ｐ−グアニジノベンゾエート；４−メチルアンベリフェリル  ヘプタノエート；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルアンベリフェリル  オレアート；４−メチルアンベリフェリル  パルミテート；４−メチルアンベリフェリル  ホスフェート；４−メチルアンベリフェリル  プロピオネート；４−メチルアンベリフェリル  ステアレート；４−メチルアンベリフェリル  サルフェート；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’Ｎ’’−トリアセチルキトトリオース；４’−メチルアンベリフェリル  ２，３，５−トリ−ベータ−ベンゾイル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−トリメチルアンモニウム  シンナメート  クロライド；および４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−キシロシドが挙げられ得る。
【００５４】
酵素基質として使用され得る７−アミド−４−メチルクマリンとしては、Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−プロリン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−チロシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；および７−グルタリル−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリンが挙げられ得る。
【００５５】
酵素基質として使用され得る７−アミド−４−メチルクマリンのペプチド誘導体としては、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；およびＮ−グルタリル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリンが挙げられ得る。
【００５６】
酵素基質として使用され得るジアセチルフルオレセインの誘導体としては、フルオレセイン  ジアセテート、フルオレセイン  ジ（ベータ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド）、およびフルオレセイン  ジラウレートが挙げられ得る。
【００５７】
活性が検出されるべきである酵素が、例えばゲオバチルス  ステアロテルモフィルスから得られるアルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、キモトリプシン、または脂肪酸エステルである場合に、使用され得る蛍光発生酵素基質は、４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド、７−グルタリルフェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、または４−メチルアンベリフェリル  ヘプタノエートのそれぞれであり得る。活性化が検出されるべき酵素が、例えばバチルス  サブチリスから得られるアルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼである場合に、使用され得る蛍光発生酵素基質は、４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシドであり得る。活性が検出されるべき酵素が、例えばバチルス  サブチリスから得られるベータ−Ｄ−グルコシダーゼである場合に、使用され得る蛍光発生酵素基質は、４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシドであり得る。
【００５８】
使用され得る酵素基質は、誘導体発色団を生じるために酵素的に修飾可能な発色性化合物であり得るか、または異なる色もしくはより強い色を有する誘導体発色団を生じるために、同種または異種の他の化合物と反応する産物であり得る。発色性化合物は、対応する酵素修飾産物と比べて異なる様式（例えば色または強度に基づいて）において、無色または有色であり得る。これらの変化は、肉眼によって識別可能であり得るか、または色検出機器の利用を必要とし得る。比色分析機器のユーザに公知の方法において励起および検出の適切な波長は、存在し得るあらゆる他の色から酵素修飾によって発生される色シグナルを分けるために使用され得る。
【００５９】
酵素基質として使用され得る発色性化合物としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル誘導体；ニトロフェニル誘導体；インドキシル誘導体；およびフェノールフタレイン誘導体が挙げられ得る。
【００６０】
使用され得る５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル誘導体としては、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル  アセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  アセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−１，３−ジアセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  ホスフェート、および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  サルフェートが挙げられ得る。
【００６１】
使用され得るニトロフェニルの誘導体としては、ｐ−ニトリロフェノール誘導体およびｏ−ニトロフェノール誘導体が挙げられ得る。これらとしては、ジエチル−ｐ−ニトロフェノール  ホスフェート；ジ−ｐ−ニトロフェニル  ホスフェート；ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−ベータ−ガラクトピラノシル−ベータ−グルコ  ピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−ベータ−グルコピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−アセテート；ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；ｐ−ニトロフェニルベータ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオシド；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−グルコピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−マルトシド；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−マルトシド；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−マンノピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−マンノピラノシド；ｐ−ニトロフェニル  ミリステート；ｐ−ニトロフェニル  パルミテート；ｐ−ニトロフェニル  ホスフェート；ビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート；トリス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−グルコピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−グルクロニド；アルファ−ｐ−ニトロフェニルグリセリン；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−ラムノピラノシド；ｐ−ニトロフェニル  ステアレート；ｐ−ニトロフェニル  サルフェート；ｐ−ニトロフェニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−グルコサミニド；ｐ−ニトロフェニル  チミジン  モノホスフェート；ｐ−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−ベータ−グルクロン酸メチルエステル；およびｐ−ニトロフェニル  バレレートが挙げられ得る。
【００６２】
有用なｏ−ニトロフェノールとしては、ｏ−ニトロフェニル−ベータ−グルコシドおよびｏ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドが挙げられ得る。他の有用なニトロフェノール誘導体としては、ニトロフェニル−ベータ−フコピラノシド；ニトロフェニル−アルファ−ガラクトピラノシド；ニトロフェニル−ベータ−ガラクトピラノシド；ニトロフェニル  ブチレート；ニトロフェニル  カプレート；ニトロフェニル  カプロエート；ニトロフェニル  カプリレート；ニトロフェニル  ラウレート；およびニトロフェニル  プロピオネートが挙げられ得る。
【００６３】
使用され得るインドキシル誘導体としては、インドキシルーアセテート；インドキシル  ベータ−Ｄ−グルコシド；３−インドキシル  サルフェート；および３−インドキシル  プロピオネートが挙げられ得る。
【００６４】
使用され得るフェノールフタレイン誘導体の例としては、フェノールフタレイン  ジブチレート；フェノールフタレイン  ジホスフェート；フェノールフタレイン  ジスルフェート；フェノールフタレイン  グルクロン酸；フェノールフタレイン  モノ−ベータ−グルクロン酸；フェノールフタレイン  モノ−ベータ−グルクロン酸；およびフェノールフタレイン  モノ−ホスフェートが挙げられ得る。
【００６５】
上述の発色性酵素基質は、適切な酵素と反応して、発色団を生成し得る。
【００６６】
１−ナフチル誘導体、２−ナフチル誘導体およびナフチル−ＡＳ−ＢＩ誘導体を含有する付加的な酵素基質は、誘導体酵素修飾産物がジアゾ化色素といった発色性試薬とさらに反応されて発色団を生成する場合に、採用され得る。上記ジアゾ化色素は、例えば、１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジエトキシベンゼン、１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジエトキシベンゼン、ｐ−ジアゾ−２，５−ジエトキシ−Ｎ−ベンゾイルアラニン、４−クロロ−２−メチルベンゼン  ジアゾニウム  クロライド、およびｏ−アミノアゾトルエン  ジアゾニウム塩である。
【００６７】
使用され得る１−ナフチルの誘導体としては、１−ナフチル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニドが挙げられ得る。
【００６８】
使用され得る２−ナフチルの誘導体としては、１−ナフチル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；２−ナフチルホスフェート；２−ナフチル−ブチレート；２−ナフチル−カプリレート；２−ナフチル−ミリステート；Ｌ−ロイシル−２−ナフチルアミド；Ｌ−バリル−２−ナフチルアミド；Ｌ−シスチル−２−ナフチルアミド；Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド；Ｎ−グルタリル−フェニルアラニン  ２−ナフチル−アミン；２−ナフチル−ホスフェート；６−Ｂｒ−２−ナフチル−アルファ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド；２−ナフチル−ベータ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド；２−ナフチル−２−Ｄ−グルコピラノシド；６−ブロモ−２−ナフトール−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；６−ブロモ−２−ナフチル−２−Ｄ−マンノピラノシド；および２−ナフチル−アルファ−Ｌ−フコピラノシドが挙げられ得る。
【００６９】
ナフチル−ＡＳ−ＢＩの誘導体としては、ナフチル−ＡＳ−ＢＩ−ホスフェート；およびナフチル−ＡＳ−ＢＩ−ベータ−Ｄ−グルクロニドが挙げられ得る。
【００７０】
活性が検出されるべき酵素が、例えばゲオバチルス  ステアロテルモフィルスから得られるアルファ−Ｄ−グルコシダーゼである場合に、酵素基質は、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−グルコピラノシドであり得る。活性が検出されるべき酵素が、例えばバチルス  サブチリスから得られるアルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼである場合に、酵素基質は、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシドであり得る。活性が検出されるべき酵素が、例えばバチルス  サブチリスから得られるベータ−Ｄ−グルコシダーゼである場合に、酵素基質は、ｐ−ニトロフェニル−ベータ−であり得る。活性が検出されるべき酵素が、β−ガラクトシダーゼである場合に、酵素基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであり得る。活性が検出されるべき酵素が、β−ガラクトシダーゼである場合に、酵素基質は、４−メチルアンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであり得る。
【００７１】
使用され得る酵素基質は、活性が研究中である酵素の独自性に依存し得る。以下は、多くの酵素基質、および基質と反応して明らかに修飾されたか、または増強された蛍光または色を有する産物を生成し得る対応する酵素のリストである。
【００７２】
【表１】
2010504101.tif 000002
【００７３】
【表２】
2010504101.tif 000003
【００７４】
滅菌工程が完了した後に、基材１２において滅菌工程を乗り越え得るあらゆる酵素を有する基材１２は、適切な酵素基質を含有する水性媒体もしくは水性溶液または半固体もしくは固体と接触され得るか、または適切な酵素基質を含有する水性媒体もしくは水性溶液または半固体もしくは固体に配置され得る。水性媒体または水性溶液は緩衝化され得る。開示される技術の利点は、基材１２上に配置される酵素の量が相対的に少いこと、および従って滅菌を乗り越え得ているあらゆる酵素を検出するために必要とされる酵素基質の容積が、相対的に少なくなり得ることである。これは、検出期間が相対的に短くなるという結果を生じ得る。基材１２は、約１〜約８０ｍｍ２の範囲内、および１つの実施形態において約５〜約５０ｍｍ２の範囲内の表面積を有し得る。滅菌前に基材１２によって支持される酵素のユニットは、約１０−７〜約１０６ユニット／ｍｍ２の範囲内、および１つの実施形態において約１０−４〜約１０３ユニット／ｍｍ２の範囲内であり得る。酵素およびその適切な酵素基質は、水性媒体または水性溶液において互いに接触し得る。等張性緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ溶液、または酢酸緩衝液）が、使用され得る。緩衝液の選択における他の検討事項は、酵素活性に対する緩衝液の影響である。例えば、リン酸緩衝生理食塩水は、アルカリホスファターゼの強力な阻害剤である高濃度の無機リン酸塩を含有している。この酵素に関しては、トリス−ＨＣｌ緩衝液が使用され得る。
【００７５】
緩衝化水性溶液における酵素基質の濃度は、酵素基質および酵素の独自性、視覚的にかまたは装置によって検出されるために生成される必要がある酵素修飾産物の量、ならびに活性な酵素が反応混合物に存在するか否かを決定するために要求される、時間の長さに依存し得る。十分であり得る酵素基質の量は、少なくとも１×１０−８モーラーのモル濃度の酵素修飾産物が、約４時間またはそれより短い期間内に産生され得るような、滅菌が完了した後に存在し得るあらゆる活性な酵素と反応するために必要とされる量であり得る。酵素基質が４−メチルアンベリフェリル誘導体である場合に、緩衝化水溶液におけるその濃度は、約１×１０−５〜約１×１０−３モーラーの範囲内にあり得る。
【００７６】
酵素基質を含有する緩衝化水性溶液のｐＨは、約５〜約９．５の範囲内におけるｐＨ、および１つの実施形態においていくつかの塩基性蛍光発生基質に関する自己蛍光を防ぐために、約７．５のｐＨに調節され得る。
【００７７】
水性緩衝化溶液における酵素基質は、酵素が滅菌サイクルに供された後に活性が検出される酵素とともに、インキュベーションされ得る。インキュベーションは、酵素のあらゆるものが活性を維持していると想定して、検出可能な酵素修飾産物を作用させるために十分である時間の期間に渡って、かつ条件の下に継続され得る。一般的に、検出可能であり得る産物の量は、約１×１０−８モーラーほどにも低くあり得る。インキュベーション条件は、酵素修飾産物の少なくとも約１×１０−８モーラーにおいて、かつ１つの実施形態において酵素修飾産物の約１×１０−６〜約１×１０−５モーラーにおいて、生成するために十分であるべきである。検出可能な量の酵素修飾産物を生成するために必要とされる、インキュベーション時間およびインキュベーション温度は、酵素および酵素基質の独自性、ならびに緩衝化水性溶液に存在するそれぞれの濃度に依存し得る。一般的に、要求されるインキュベーション時間は、約４８時間以内、かつ１つの実施形態において約３６時間以内であり得、かつインキュベーション温度は、約２０℃〜約７０℃の範囲内にあり得る。インキュベーション時間は、約０．１〜約４８時間の範囲内、および１つの実施形態において約０．１〜約３６時間の範囲内、および１つの実施形態において約０．１〜約２４時間の範囲内、および１つの実施形態において約０．１〜約１２時間の範囲内、および１つの実施形態において約０．１〜約６時間の範囲内、および１つの実施形態において約０．１〜約４時間の範囲内、および１つの実施形態において約０．１〜約３時間の範囲内にあり得る。バチルス  サブチリスまたはゲオバチルス  ステアロテルモフィルスが、酵素の起源である場合に、インキュベーション時間は、約０．１〜約３時間の範囲内にあり得、かつインキュベーション温度は、約３０℃〜約４０℃の範囲内、および約５０℃〜約６５℃の範囲内のそれぞれにあり得る。
【００７８】
一般的に、使用され得る酵素修飾産物を検出する適切な方法としては、比色分析技術、電位差測定技術、重量測定技術、熱量測定技術、熱伝導測定技術、または分光光度技術が挙げられ得る。１つの実施形態において、蛍光測定技術または分光光度技術が使用され得る。例えば、特定の酵素基質は、酵素との相互作用が蛍光測定的に測定され得るアンベリフェロンを生じる、４−メチルアンベリフェリル誘導体を含み得るか、または当該基質は、酵素との相互作用が比色分析的に測定され得る産物を生じる、ニトロフェノールもしくは同種の誘導体を含み得る。
【００７９】
生物学的指示薬３０は、本明細書において単一の酵素および／または試験生物に関して主に記載されているが、複数の酵素および／または試験生物か、またはこれらの組み合わせかを含み得る。例えば、生物学的指示薬３０は、（３種の微生物に由来し得る）４種の酵素（１つの酵素が熱に耐性であり、第２が気体の滅菌媒体に耐性であり、第３が放射線（例えば、ガンマ線照射またはベータ線照射）に耐性であり、かつ第４が液体を基にした媒体（例えば、過酢酸、安定化過酸化水素、クロラミン、４級アミン、フェノール、オゾン水、またはグルタルアルデヒドなど）に耐性である）を含有し得る。同様に、生物学的指示薬３０は、３種の試験生物（１つの種が熱に耐性であり、第２の種が気体の滅菌媒体に耐性であり、第３の種が放射線に耐性であり、かつ第４が液体を基にした媒体に耐性である）を含有し得る。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）
アールストロム（Ａｈｌｓｔｒｏｍ）２３８紙のシート（アールストロムによって提供される紙製品）は、６ｍｍの直径を有する６つの円形の支持板（２３．８ｍｍ２の表面積）のそれぞれに切られる。３つの板は、１ミリリットルにつき１０８ｃｆｕ以上の個体数を有する７マイクロリットルのゲオバチルス  ステアロテルモフィルスを用いて、一方の面に播種される。３つの板は、播種されない。板のそれぞれは、２５ｍｍ×６ｍｍ×０．２５ｍｍの容積を有するポリスチレンの支持細片に対して、超音波溶着される。板のそれぞれについて、溶着ホーン（ｈｏｒｎ）が基材細片の一方の面との接触をもたらされると同時に、板は基材細片の他方の面と接触して配置される。播種されている板に関して、胞子と接触していない面は、支持細片と接触して配置される。超音波溶着の後に、播種していない３つの板は、上記と同じ方法において播種される。図４はこれらの試験の結果を示す。これらの試験は、超音波溶着の結果として有意な微生物の損失がないことを証明している。
【００８１】
（実施例２）
実施例１に記載した種類の滅菌インジケーター試料は、１０６ｃｆｕ／ｍｌのゲオバチルス  ステアロテルモフィルスを用いて播種され、かつ異なる容積および緩衝化能のインキュベーション媒体にさらされる。試料は、微生物の増殖に応じたｐＨ変化について観察される。インキュベーション媒体試料は、以下の通りである。
試料Ａ：完全な緩衝化能を有する、フェノールレッドを伴った１．０ｍｌのトリプティック  ソイ  ブロス（ＴＳＢ）。
試料Ｂ：完全な緩衝化能の５０％を有する、フェノールレッドおよび０．５ｍｌの無菌の脱イオン（ＤＩ）水を伴った０．５ｍｌのＴＳＢ。
試料Ｃ：完全な緩衝化能の８０％を有する、フェノールレッドおよび０．１ｍｌの無菌のＤＩ水を伴った０．４ｍｌのＴＳＢ。
試料Ｄ：完全な緩衝化能の６０％を有する、フェノールレッドおよび０．２ｍｌの無菌のＤＩ水を伴った０．３ｍｌのＴＳＢ。
試料Ｅ：完全な緩衝化能の４０％を有する、フェノールレッドおよび０．３ｍｌの無菌のＤＩ水を伴った０．２ｍｌのＴＳＢ。
結果は図５に示されている。これらの結果は、より少ないインキュベーション媒体の容積および低減された緩衝化能が、より多いインキュベーション媒体の容積と比べて、より速い微生物の増殖を示すことを示唆している。
【００８２】
開示されている技術は特定の実施形態に関して説明されているが、これらの種々の変形が本明細書を読んだ当業者にとって明らかになることは理解されるべきである。従って、本明細書に開示されている発明が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるような当該変形を網羅することを意図していることは、理解されるべきである。
【図１】
2010504101.tif 000004
【図２】
2010504101.tif 000005
【図３】
2010504101.tif 000006
【図４】
2010504101.tif 000007
【図５】
2010504101.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月13日(2009.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の表面および第２の表面を有する基材；
第１の部分および第２の部分を有する支持部；ならびに
上記基材によって支持されている生物学的指示薬
を備えている滅菌インジケーターであって、
上記基材は、上記支持部の第１の部分を被覆し、
上記基材の第２の表面は、上記支持部の第２の部分に付着しており、
上記支持部の第２の部分は、上記生物学的指示薬を接触させることなく上記滅菌インジケーターを操作することを可能にするに十分な大きさである
滅菌インジケーター。
【請求項２】
上記基材の第１の表面が、約１〜約８０ｍｍ２の範囲内の表面積を有するか；
上記基材が、円、正方形、矩形、長円形、もしくは多面の断面の形状を有する基板の形態であるか；
上記基材は、矩形の細片の形態であり、該基材の第１の部分が該基材の長さに関する副次的な部分を構成し、該基材の第２の部分が該基材の長さに関する主要な部分を構成しているか；
上記基材が、超音波溶着、接着、熱封止または積層を用いて上記支持部に取り付けられているか；または
上記基材によって支持される胞子の濃度は、基材の平方ミリメートルあたり約１０４〜約１０７ｃｆｕである、
請求項１に記載の滅菌インジケーター。
【請求項３】
上記基材が多孔材料または無孔材料を含むか；
上記基材が、紙、金属、ガラス、セラミック、プラスティック、膜、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせを含むか；
上記基材が圧縮繊維を含むか；
上記基材が、焼結ガラス、ガラス繊維、セラミック、合成重合体、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせから作られる多孔材料を含むか；
上記基材が紙を含むか；または
上記基材がセルロースパッドを含むか；
上記基材が、金属、ガラス、セラミック、プラスティック、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせを含む材料から作られているか；
上記基材がプラスティックから作られているか；または
上記基材がポリスチレンから作られている、
請求項１または２に記載の滅菌インジケーター。
【請求項４】
上記生物学的指示薬が、１つ以上の試験生物、１つ以上の酵素、またはこれらの混合物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項５】
上記生物学的指示薬が細菌胞子を含むか；
上記生物学的指示薬が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）もしくはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）の細菌を含むか；
上記生物学的指示薬が、ゲオバチルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス  アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス  プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス  コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、クロストリジウム  スポロジェネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、バチルス  サブチリス  グロビギイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、バチルス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス  チルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせを含むか；
上記生物学的指示薬が、菌類、放線菌、原虫、無性細菌、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせを含むか；
上記生物学的指示薬が、アスペルギルス  ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、カンディダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、トゥリコフィトン  メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、ワンジエラ  デルマティティス（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、ミコバクテリウム  チェロナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ミコバクテリウム  ゴルダナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄａｎａｅ）、ミコバクテリウム  スメグマンティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｎｔｉｓ）、ミコバクテリウム  テッラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ）、ギアルディア  ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、クリプトスポリディウム  パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、アエロモナス  ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エンテロコッカス  ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス  ファエキウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス  ピロジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（ニューモニアエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レジオネラ  ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｌａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス  アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ  コレラエスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｏｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス  エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ステノトゥロフォモナス  マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｐｈｉｌｌｉａ）、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせを含むか；または
上記生物学的指示薬が、無性細菌、無性細胞および／またはこれら構成要素部分を含む、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項６】
上記生物学的指示薬が、１つ以上の微生物を含み、かつ１つ以上の賦形剤をさらに含むか；
上記賦形剤が１つ以上の含水炭素を含むか；
上記賦形剤がトレハロースであるか；または
上記賦形剤が、スクロース、グルコース、マルトース、デキストラン、スターチ、アガロース、セルロース、タンパク質、ホスホン酸塩、緩衝化剤、蜜蝋、脂質、油、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項７】
上記生物学的指示薬が、バンコマイシン耐性の腸球菌、メチシリン耐性のスタフィロコッカス  アウレウス、ミコバクテリウム  チェロナエ、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせを含むか；または
上記生物学的指示薬が１つ以上のプリオンを含む、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項８】
上記生物学的指示薬が、１つ以上の酵素を含むか；
上記生物学的指示薬が、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ミリステートリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、バリンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン、ホスホヒドロラーゼ、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−セロビオシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ、脂肪酸エステラーゼ、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせを含むか；または
上記生物学的指示薬が、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン、ホスホフィドロラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、脂肪酸エステラーゼ、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−ベータ−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−セロビオシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、もしくはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項９】
上記基材が紙を含み、上記生物学的指示薬がゲオバチルス  ステアロテルモフィルスを含み、かつ支持部がポリスチレンを含み、上記基材が超音波溶着を用いて上記支持部に付着されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の滅菌インジケーター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の上記滅菌インジケーターを収容し、上記滅菌インジケーターが滅菌の間に滅菌媒体との接触をもたらされるように適合されている第１の区画；ならびに
滅菌の間に上記滅菌インジケーターからのインキュベーション媒体の分離を維持するために適合され、かつ上記滅菌インジケーターが滅菌媒体にさらされた後に、上記滅菌媒体が上記滅菌インジケーターと接触することを許容するように適合されている、インキュベーション媒体を収容する第２の区画を備える、滅菌インジケーターキット。
【請求項１１】
滅菌される少なくとも１つの物品、および上記生物学的指示薬が少なくとも１つの試験生物もしくは少なくとも１つの酵素を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の滅菌インジケーターを、滅菌媒体に対してさらすこと；ならびに
滅菌が有効であるか否かを決定するための滅菌の後に、インキュベーション媒体と上記基材を接触させること、または滅菌が有効であるか否かを決定するために少なくとも１つの酵素基質と上記基材を接触させることを包含する、滅菌の有効性を決定する方法。
【請求項１２】
上記インキュベーション媒体が、１つ以上の栄養源および１つ以上の微生物の増殖指示薬を含むか；
上記インキュベーション媒体が、１つ以上のｐＨ緩衝液、浸透圧平衡を維持する１つ以上の薬剤、１つ以上の中和剤、またはこれらの２つ以上の組み合わせをさらに含むか；
上記インキュベーション媒体が、約−０．００１〜約−０．０７０ｍｏｌのＨ＋の範囲内における緩衝化能を有する緩衝化溶液を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記酵素基質が、蛍光を発する１つ以上の４−メチルアンベリフェリル誘導体；７−アミド−４−メチル−クマリンの１つ以上の誘導体；１つ以上のジアセチルフルオレセイン誘導体；フルオレサミン；もしくはこれらの２つ以上の混合物を含むか；
上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェリル−２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−ベータ−Ｄ−ルコピラノシド；４−メチルアンベリフェリル  アセテート；４−メチルアンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−ガラクトサミニド；４−メチルアンベリフェリル−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニド；４−メチルアンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；２’−（４−メチルアンベリフェリル）−アルファ−Ｄ−Ｎ−アセチル  ノイラミン酸；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルアンベリフェリル  アルファ−Ｌ−アラビノシド；４−メチルアンベリフェリル  エライデート；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−フコシド；４−メチルアンベリフェリル  ブチレート；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−セロビオシド；メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−Ｎ、Ｎ’−ジアセチル  チトビオシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｌ−フコシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｌ−フコシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルクロニド；４−メチルアンベリフェリル  ｐ−グアニジノベンゾエート；４−メチルアンベリフェリル  ヘプタノエート；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルアンベリフェリル  オレアート；４−メチルアンベリフェリル  パルミテート；４−メチルアンベリフェリル
ホスフェート；４−メチルアンベリフェリル  プロピオネート；４−メチルアンベリフェリル  ステアレート；４−メチルアンベリフェリル  サルフェート；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’Ｎ’’−トリアセチルキトトリオース；４’−メチルアンベリフェリル  ２，３，５−トリ−ベータ−ベンゾイル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−トリメチルアンモニウム  シンナメート  クロライド；４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−キシロシド；もしくはこれらの２つ以上の混合物を含むか；
上記酵素基質が、Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−プロリン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−チロシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；７−グルタリル−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；もしくはこれらの２つ以上の混合物を含むか；
上記酵素基質が、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−グルタリル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  ７−アミド−４−メチルクマリン；もしくはこれらの２つ以上の混合物を含むか；
上記酵素基質が、フルオレセイン  ジアセテート、フルオレセイン  ジ（ベータ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド）、フルオレセイン  ジラウレート、もしくはこれらの２つ以上の混合物を含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
上記酵素が、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、キモトリプシン、または脂肪酸エステラーゼを含み、上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド、７−グルタリルフェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、もしくは４−メチルアンベリフェリル  ヘプタノエートを含むか；
上記酵素が、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを含み；かつ上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシドを含むか；
上記酵素が、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼを含み；かつ上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシドを含むか；
上記酵素が、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−グルコピラノシドを含むか；
上記酵素が、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシドを含むか；
上記酵素が、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、ｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドを含むか；
上記酵素が、β−ガラクトシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むか；または
上記酵素が、β−ガラクトシダーゼを含み、かつ上記酵素基質が、４−メチルアンベリフェロン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
上記酵素基質が、１つ以上の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル誘導体；１つ以上のニトロフェニル誘導体；１つ以上のインドキシル誘導体；１つ以上のおよびフェノールフタレイン誘導体；もしくはこれらの２つ以上の混合物を含むか；
上記酵素基質が、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル  アセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  アセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−１，３−ジアセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  サルフェート、もしくはこれらの２つ以上の混合物を含むか；
上記酵素基質が、１つ以上のｐ−ニトロフェノール誘導体；１つ以上のｏ−ニトロフェノール誘導体；もしくはこれらの２つ以上の混合物を含むか；
上記酵素基質が、ジエチル−ｐ−ニトロフェノール  ホスフェート；ジ−ｐ−ニトロフェニル  ホスフェート；ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−ベータ−ガラクトピラノシル−ベータ−グルコ  ピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−ベータ−グルコピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−アセテート；ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；ｐ−ニトロフェニルベータ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオシド；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−グルコピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−マルトシド；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−マルトシド；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−マンノピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−マンノピラノシド；ｐ−ニトロフェニル  ミリステート；ｐ−ニトロフェニル  パルミテート；ｐ−ニトロフェニル  ホスフェート；ビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート；トリス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェート；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−グルコピラノシド；ｐ−ニトロフェニル−ベータ−グルクロニド；アルファ−ｐ−ニトロフェニルグリセリン；ｐ−ニトロフェニル−アルファ−ラムノピラノシド；ｐ−ニトロフェニル  ステアレート；ｐ−ニトロフェニル  サルフェート；ｐ−ニトロフェニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−グルコサミニド；ｐ−ニトロフェニル  チミジン  モノホスフェート；ｐ−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−ベータ−グルクロン酸メチルエステル；ｐ−ニトロフェニル  バレレート；もしくはこれらの２つ以上の混合物を含むか；または
上記酵素基質が、ｏ−ニトロフェニル  アセテート；ｏ−ニトロフェニル−ベータ−グルコシド；ｏ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；ニトロフェニル−アルファ−ガラクトピラノシド；ニトロフェニル−ベータ−ガラクトピラノシド；ニトロフェニル  ブチレート；ニトロフェニル  カプレート；ニトロフェニル  カプロエート；ニトロフェニル  カプリレート；ニトロフェニル  ラウレート；ニトロフェニル  プロピオネート；インドキシル−アセテート；インドキシル  ベータ−Ｄ−グルコシド；３−インドキシル  サルフェート；３−インドキシル  ホスフェート；フェノールフタレイン  ジブチレート；フェノールフタレイン  ジホスフェート；フェノールフタレイン  ジスルフェート；フェノールフタレイン  グルクロン酸；フェノールフタレイン  モノ−ベータ−グルクロン酸；フェノールフタレイン  モノ−ベータ−グルクロン酸；およびフェノールフタレイン  モノ−ホスフェート；１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２；５−ジエトキシベンゼン；１−ジアゾ−４−ベンゾイルアミノ−２；５−ジエトキシベンゼン；ｐ−ジアゾ−２，５−ジエトキシ−Ｎ−ベンゾイルアラニン；４−クロロ−２−メチルベンゼン  ジアゾニウム  クロライド；ｏ−アミノアゾトルエン  ジアゾニウム塩；１−ナフチル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；２−ナフチルホスフェート；２−ナフチル−ブチレート；２−ナフチル−カプリレート；２−ナフチル−ミリステート；Ｌ−ロイシル−２−ナフチルアミド；Ｌ−バリル−２−ナフチルアミド；Ｌ−シスチル−２−ナフチルアミド；Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド；Ｎ−グルタリル−フェニルアラニン  ２−ナフチル−アミン；２−ナフチル−ホスフェート；６−Ｂｒ−２−ナフチル−アルファ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド；２−ナフチル−ベータ−Ｄ−ガラクト−ピラノシド；２−ナフチル−２−Ｄ−グルコピラノシド；６−ブロモ−２−ナフトール−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；６−ブロモ−２−ナフチル−２−Ｄ−マンノピラノシド；２−ナフチル−アルファ−Ｌ−フコピラノシド；ナフチル−ＡＳ−ＢＩ−ホスフェート；ナフチル−ＡＳ−ＢＩ−ベータ−Ｄ−グルクロニド；またはこれらの２つ以上の組み合わせを含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
上記基材に対して上記生物学的指示薬を塗布すること；および
上記支持部に対して上記基材を付着すること
を包含する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の滅菌インジケーターを製造する方法。
【国際調査報告】
2010504101.tif 000009