(57)【要約】内皮細胞を用いた腫瘍ワクチンの調製方法に従って、生きた内皮細胞を緩やかな（細胞にとって非致死的な）条件下でプロテアーゼ処理し、分離した表面抗原を回収し、生きた内皮細胞の処理を、細胞による表面抗原の回復に必要な間隔をおいて繰り返し、必要な量に達するまで表面抗原を蓄積し、その後、ワクチンの質を管理する。本発明の使用によって得られる技術的成果は、腫瘍血管の内皮細胞（ＥＣ）に対する生体の免疫寛容を克服して腫瘍血管に損傷を与えることにより、腫瘍学的な疾患の治療の効率を強化することである。本発明の意義は、活性化内皮細胞に対する免疫寛容を克服することであり、免疫系により、主に腫瘍血管を損傷することが可能になる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍ワクチンの調製方法であって、
プロテアーゼにより、生きた内皮細胞を緩やかな（前記細胞にとって非致死的な）条件下で処理すること、
放出された細胞の表面抗原を回収すること、
前記細胞による表面抗原の回復に必要な間隔をおいて前記生細胞のプロテアーゼによる処理を繰り返すこと、
必要な量の抗原が得られるまで、放出される抗原を蓄積すること、及び
前記ワクチンの質を管理することから成る方法。
【請求項２】
活性化内皮細胞を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍組織血管から新たに単離した内皮細胞を使用する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
内皮細胞を培養して増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
トリプシンを前記プロテアーゼとして使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
活性化内皮細胞を腫瘍血管から単離し、その活性化状態を維持する条件下で培養する、請求項１、２、４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
培養中の内皮細胞の活性化状態を、腫瘍細胞との共培養によりサポートする、請求項１、２、４、６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
培養中の内皮細胞の活性化状態を、腫瘍組織のフラグメントとの共培養によりサポートする、請求項１、２、４、６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
患者自身の腫瘍血管から得た活性化内皮細胞を使用する、請求項１、２、４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
その他の患者の腫瘍血管から得た活性化内皮細胞を使用する、請求項１、２、４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍細胞とのインビトロでの共培養により活性化させた内皮細胞の培養物を使用する、請求項１、２、４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
内皮細胞を、患者自身の腫瘍細胞により活性化させる、請求項１、２、４、１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
内皮細胞を、その他の患者の腫瘍細胞により活性化させる、請求項１、２、４、１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
内皮細胞を、腫瘍細胞株によって活性化させる、請求項１、２、４、１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
成長培地への活性化物質の添加によりインビトロで活性化させた内皮細胞の培養物を使用する、請求項１、２、４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
内皮細胞を、少なくとも１種の活性化因子により活性化させる、請求項１、２、４、１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
内皮細胞を、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を用いて活性化させる、請求項１、２、４、１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍細胞培養物からの馴化成長培地の添加によりインビトロで活性化させた内皮細胞の培養物を使用する、請求項１、２、４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記表面抗原にアジュバントを添加する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医療技術、すなわち腫瘍を患った患者に対する免疫療法に関し、腫瘍学的な疾患の治療及びその再発防止を目的として、医療分野において用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
外科的な方法及び化学療法には限界があることから、腫瘍を患っている患者のための新しい治療方法の更なる開発が早急に求められている。昨今では、抗血管新生療法が特に注目されており、その作用機序は腫瘍血管の増殖抑制を基礎としている。
【０００３】
腫瘍の発現には２つの主要な段階がある。前血管的段階と血管的段階である。第１の段階の間に、腫瘍は、患者の血管からの拡散により栄養素及び酸素を受け取って増殖するが、これでは腫瘍が数ｍｍ３の体積を超えて増殖することができない。続く腫瘍増殖では、腫瘍の血管新生を特徴とする第２段階への移行が必要となる（非特許文献１）。血管の新生により腫瘍の栄養状態が大きく向上して増殖が強化され、転移の確率が高くなる（非特許文献２）。抗血管新生体質の使用により、腫瘍血管の増殖が防止され、増殖の第２段階が抑制される。
【０００４】
腫瘍の増殖を防止する周知の方法の１つが、血管内膜を覆う内皮細胞（ＥＣ）に関しての免疫寛容を克服することを目的とした患者へのワクチン接種である。細胞及び液性の細胞毒性により内皮細胞が死に、これが腫瘍血管の形成を妨げ、この結果、悪性細胞の破壊を引き起こす。このようなワクチン用の抗原を調製するための様々な方法が知られており、我々の発明に最も近いのは、正常な内皮細胞抗原を基礎としたワクチンである。
【０００５】
文献は、異種の内皮細胞の使用、すなわち生体学的に異なる種の内皮細胞を使用してワクチンを得る方法を示唆している（例えば、非特許文献３）。これらのワクチンの欠点は、異種の及び実際にその他雑多な抗原が存在することであり、これによりその他雑多な抗原と内皮細胞に特異的な反応をする抗原との間での免疫応答の分離が起こる。
【０００６】
別の文献により、同種からの抗原を基礎としたワクチンが知られており、同種に属する別の生体の細胞を用いて製造したワクチンである（例えば、非特許文献４、この文献の著者は、内皮細胞ワクチンの様々な変形を比較している）。ワクチン中の同種の抗原の存在もまた、ワクチン強度及び内皮細胞に特異的な抗原に対する免疫応答の特異性の低下につながる。
【０００７】
最も似たものが、Ｏｋａｊｉ  Ｙらの論文に記載されている（非特許文献５）。後者の方法には、内皮細胞の使用が含まれる。上記の方法においては、自己の内皮細胞、すなわち、ワクチン接種した生体から単離した細胞又は遺伝学的に同一の生体からの細胞（例えば、同じ系統のマウスからの細胞）を用いる。このようなワクチンからは、治癒効果を決定する、最も強力で特異的な免疫応答が得られる。しかしながら、全細胞から得られたワクチンは全て大量の雑多な物質、すなわちサイトゾルタンパク質、炭水化物、脂質を含有している。雑多な物質により、ワクチン中の、免疫系の作用対象候補である抗原の一部が著しく弱体化される（細胞内抗原は、免疫系の効果に関係ない）。既に知られているワクチン調製方法では、腫瘍血管の内皮細胞に特異的な免疫応答を誘発しないことに留意すべきである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Folkman  J., "What is evidence that tumors are angiogenesisdependent?" J. Natl. Cancer Inst., 1990, v.82, 4-6
【非特許文献２】Hanahan  D., Folkman J. "Patterns and emerging mechanisms of theangiogenic switch during tumorigenesis". Cell, 1996, v. 86, 353-364
【非特許文献３】Wei  Y., ''Immunotherapy of tumors with xenogeneic endothelial cells as avaccine", Nature Medicine, 2000, v. 6, 1160-1166
【非特許文献４】Scappaticci  F.A., Nolan G.Р., "Induction of anti-tumor immunity in miceusing a syngeneic endothelial cell vaccine", Anticancer Res., 2003, v. 23,1165-1672
【非特許文献５】“Vaccination  with autologous endothelium inhibits angiogenesis and metastasis ofcolon cancer through autoimmunity”, Cancer Sci., 2004, v. 95, 1, 85-90
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、腫瘍血管の内皮細胞に対する生体の免疫寛容を克服することを意図した、内皮細胞抗原を基礎とした腫瘍ワクチンの調製方法を開発することである。本発明の基礎は、生理学的条件下では休止状態にある正常な組織血管の内皮細胞と、活性化された、すなわち活発に増殖し、遊走している腫瘍の内皮細胞との間の周知の違いにある。活性化内皮細胞は、正常な組織血管の内皮細胞と比較すると、ανβ（Gladson C.L. et  al., Am. J. Pathol., 1996, v. 148, 1423-1434)、Ｅ−セレクチン（Volm M. et al., Clin. Cancer Res., 2000, v. 6, 3236-3240）、エンドグリン（Burrows  F. et al., Clin. Cancer Res.,  1995, v.  1, 1623-1634）、エンドシアリン（Takahashi  K. et al., J. Clin.  Invest., 1994, v. 93, 2357-64）、ＶＥＧＦ受容体（Boocock  C. et al., J. Natl. Cancer Inst., 1995, v. 87, 506-516）等の多くの特異性タンパク質の発現率が高いことが知られている。一部のタンパク質の発現プロフィールの違いは、米国特許US2006210975、US2005142138、US2006127902及び国際出願WO 2004091383から既知である。本発明にとって最も重要な点は、腫瘍血管の内皮細胞に特異的な抗原を得ることを可能にする内皮細胞表面、特にニュートロフィリン（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｌｉｎ）、インテグリン、受容体等の違いである（国際出願WO 2004001004）。
【発明の効果】
【００１０】
本願に記載の発明の使用によって得られる技術的成果は、腫瘍血管の内皮細胞に対する生体の免疫寛容を克服して腫瘍血管に損傷を与えることにより、腫瘍学的な疾患の治療の効率を強化することである。本発明の意義は、活性化内皮細胞に対する免疫寛容を克服することであり、これにより特に腫瘍血管への損傷を引き起こすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の技術的成果は、内皮細胞を用いた腫瘍ワクチンの調製方法の実現を通して得られる。本発明では、生きた内皮細胞をプロテアーゼによる細胞を殺すことのない処理に供し、分離した抗原を回収し、生細胞の処理を、その表面抗原の回復に必要な時間が過ぎた後に繰り返し、ワクチン接種に必要な用量が得られるまで表面抗原を蓄積し、調製するワクチンの質を管理する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
更に、本発明を、特定の実現例及び以下の対応する図面により説明する。
【図１】ワクチン調製の実現態様の図である。
【図２】第１及び第２実験群並びに対照群におけるＢＡＬＢ／ｃマウスでの肝細胞癌Ｈ２２の増殖についての曲線である（腫瘍の平均寸法を±標準偏差と共に示す）。
【図３】第１（Ａ）、第２（Ｂ）及び対照（Ｃ）のマウス群の腫瘍組織の組織切片及びその対応する血管新生指数（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ：ＡＩ）を示し、腫瘍血管の壁は暗い色に着色されている（カラー写真では茶色となる）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
好ましい実現態様には、活性化内皮細胞の使用が含まれる。
【００１４】
腫瘍血管から新しく単離した活性化内皮細胞を用いることができる。
【００１５】
腫瘍血管内皮細胞から単離した量が不十分な場合、本方法は、培養によるこの内皮細胞の増殖も想定している。
【００１６】
好ましい実現態様において、トリプシンをプロテアーゼとして使用する。
【００１７】
活性化内皮細胞は、腫瘍血管から単離することができる及びその活性化状態を維持する条件下で培養することができる。
【００１８】
内皮細胞の活性化状態は、腫瘍細胞との共培養によってサポートすることができる。
【００１９】
その他の実現態様により、腫瘍組織フラグメントの存在下での培養による、内皮細胞の活性化状態の維持が可能になる。
【００２０】
好ましい実現態様において、活性内皮細胞は、患者自身の腫瘍血管から得られる。
【００２１】
その他の態様において、様々な患者の腫瘍血管から得た活性化内皮細胞を用いることができる。
【００２２】
腫瘍細胞とのインビトロでの共培養によって活性化させた内皮細胞培養物も用いることができる。
【００２３】
患者自身の腫瘍細胞により、内皮細胞を活性化させることができる。
【００２４】
別の考えられ得る態様には、別の患者の腫瘍細胞による内皮細胞の活性化が含まれる。内皮細胞は、適切な腫瘍細胞株によって活性化させることができる。
【００２５】
その他の実現態様では、活性化因子の添加によりインビトロで活性化させた内皮細胞培養物の使用を想定している。この場合、内皮細胞を、少なくとも１種の活性化因子により活性化させることができる。特に、内皮細胞は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の使用により活性化される。
【００２６】
別の態様は、腫瘍細胞培養物からの馴化培地の添加によりインビトロで活性化させた内皮細胞の使用である。
【００２７】
アジュバントを表面抗原に添加すると、免疫応答が強化される。
【００２８】
図１において、本発明の実現態様について説明する。生きた内皮細胞を、生検又は手術により得た腫瘍組織から単離する。生きた内皮細胞を、活性化内皮細胞の初代培養の開始に使用する。必要に応じて、必要な量が得られるまで細胞を培養する。
【００２９】
最初から活性化状態にある腫瘍血管内皮細胞だけでなく、休止状態にある正常な血管からの内皮細胞及び様々な手段によって活性化させた内皮細胞を、本願に記載の方法の実現に用いることができる。
【００３０】
本発明の次の重要な工程は、プロテアーゼによる、緩やかな（細胞にとって非致死的な）条件下での生細胞の処理である。
【００３１】
ワクチン接種に必要な用量の抗原を得るために、表面抗原の回復に必要な数時間〜数日にわたる時間を置きながら、細胞のトリプシン処理の手順を何度か繰り返す。このようにして蓄積した抗原を、特定のワクチンの調製技術に従って処理する。すなわち、これらの抗原を精製し、濃縮し、その組成について分析し、免疫原性を強化するために変性する又はアジュバントと混合することができる。
【００３２】
本発明によるワクチン接種用の抗原の調製は、以下の利点を有する。
・自家ワクチンの利点全て。すなわち、特定の患者に対するその特異性。
・多価ワクチンの利点全て。すなわち、抗原の多重度。
・内皮細胞の表面抗原によるワクチンの富化（活性化内皮細胞を使用したほうが良い）。これにより免疫付与後に腫瘍血管内皮細胞に対する免疫寛容が克服される。
・内皮細胞の増殖ではなくその蓄積により、ワクチン接種に必要な用量の抗原を得ることができる。初代細胞培養物はインビトロでの増殖中に少しずつその抗原構造を変え、ワクチン接種には使えなくなることから、このことは重要である。
【００３３】
本明細書に従って得られる表面抗原の実用的な使用は、（腫瘍を含む）血管の内皮細胞の表面上に存在するタンパク質フラグメントの種類、すなわちアミノ酸配列及びその変異（例えば、グリコシル化）の種類によって決まる。本発明に従って得られる活性化内皮細胞の表面抗原の使用は、腫瘍血管の内皮細胞表面上に存在するタンパク質フラグメントの種類によって調整する。
【００３４】
腫瘍の血管新生がなくては腫瘍の増殖が不可能であることが知られている。免疫応答を強化するアジュバントと混合した、蓄積、精製した内皮細胞表面抗原（好みに応じて活性化）を、ヒト又は動物に注射する。注射した抗原を不活性化する細胞及び液性免疫応答の結果、腫瘍血管中に既に存在する内皮細胞又は新しく出現する内皮細胞が互いに破壊され、これにより免疫付与の治癒及び予防効果が得られる。完全な免疫応答を得るために、表面抗原を繰り返し注射する。
【００３５】
以下は、ヒト肝細胞癌Ｈ２２に対して自己の活性化内皮細胞を基礎としてマウスに接種する腫瘍ワクチンの調製方法の第１の実現例である。
【実施例１】
【００３６】
自己内皮細胞の培養物は、Ｂｅｌｌｏｎｉら（Microvasc. Res., 1992, vol. 43, 20-45）に従ってＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓の血管から得る。内皮細胞の活性化を、Ｈ２２細胞からの馴化成長培地を内皮細胞成長培地に１：３の比率で添加することで行う。活性化から５〜７日目に、内皮細胞を用いて、以下のプロトコルに従って表面抗原を得る。
【００３７】
１．活性化内皮細胞の培養物が入ったフラスコから成長培地を除去し、細胞の単層を３回以上、（成長培地の体積の半分の量の）滅菌生理溶液で洗浄する。この洗浄は、残留している成長培地を除去するために行われる。
【００３８】
次の重要な工程は、細胞を、これらの細胞が死なない濃度のプロテアーゼで処理することであり、プロテアーゼとしてはトリプシンを選択する（活性〜３０００Ｕ／ｍｇ）。
【００３９】
２．トリプシンの０．０００１％溶液を、フラスコ表面２５ｃｍ２あたり１ｍｌの割合で細胞の単層に添加する。
【００４０】
３．フラスコを３７℃でインキュベートする。５〜７分のインキュベートの後に、分離した表面抗原を含有するトリプシン溶液を除去する。
【００４１】
４．血清を含有する（通常、１０％）、新たに調製した新鮮な成長培地を添加し、培養を行う。
【００４２】
５．ワクチン接種に必要な用量を製造するために、表面抗原を蓄積する。工程１〜４を２４時間間隔で繰り返し、腫瘍血管に特異的な抗原を得るために、活性化内皮細胞の培養物の適性をチェックすることによりワクチンの質を管理する。
【００４３】
プロテアーゼでの細胞の処理の条件は、例えば、数分〜何十分と大幅に異なり、トリプシン濃度は、０．００００１％〜０．５％に異なり得る。処理条件は、内皮細胞の初代培養物毎に個別に採用される。トリプシンの活性が本明細書に記載のものとは異なる場合、その活性の正しい割合に合わせて濃度を計算する。
【００４４】
トリプシンでの処理直前に、細胞を、例えば生理溶液で洗浄して残留している成長培地を除去すべきである。トリプシン処理により放出された抗原は表面タンパク質のフラグメントであり、適切な手順、例えばピペットでのデカンテーションにより回収する。
【００４５】
培養過程において、他の培養細胞と同様に内皮細胞の抗原組成は変化し、これが細胞培養物の抗原と、患者の腫瘍血管の内皮細胞表面から得た抗原との違いにつながる。不適当なワクチンの製造を防止するために、抗原を蓄積するための内皮細胞培養物の適性を、ユーラシア特許No. 009326 “Method for testing a cell culture quality”に記載の細胞培養物評価方法に従って試験する。
【００４６】
（細胞にとって）非致死的な濃度のプロテアーゼで細胞を処理することにより、細胞の表面抗原が分離することが知られている（例えば、ユーラシア特許No. 009325 “Tumor vaccine, a method for producing a tumor vaccine  and a method for carrying out anti-tumor immunotherapy”を参照のこと）。従って、本発明により、その他のプロテアーゼの場合と同じく、トリプシンの作用は、内皮細胞の表面抗原溶液中への放出につながる。トリプシンの作用により放出された内皮細胞表面抗原（表面タンパク質のフラグメント）は、その殆どが免疫付与に適したものであり、腫瘍を患った患者へのワクチン接種に使用される。
【００４７】
細胞表面タンパク質から分離した抗原を含有するトリプシン溶液の回収は、フラスコの表面から細胞が剥がれる前に行うほうが良いことに留意しなくてはならず、これは抗原溶液中への細胞の混入防止とそれに伴う不要な精製工程の回避に役立つ。
【００４８】
細胞を死なせることのない適当な濃度でプロテアーゼ処理をすると細胞が死なず、ワクチン接種に必要な用量の抗原を蓄積するための、初代内皮細胞培養物のトリプシンでの処理の繰り返しが可能になる。
【００４９】
次のトリプシン処理までの間に、細胞を培養のプロトコルに従ってインキュベートする（すなわち、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃でインキュベートする。活性化状態の維持に必要な血清を含んだ成長培地を添加）。
【００５０】
蓄積した表面抗原を、ワクチン製造技術に沿って処理する。すなわち、精製、濃縮、組成分析、免疫原性を強化するための変性又はアジュバントとの混合を行うことができる。
【００５１】
本発明のその他の実現態様においては、プロテアーゼでの細胞の処理の工程を、細胞の継代培養工程と組み合わせることができる（プロテアーゼでの細胞処理、細胞の回収及び分割）。
【００５２】
トリプシン溶液は、滅菌生理溶液を用いて、またいずれの適当な生理食塩水又は緩衝液を用いて調製することができる。
【００５３】
本発明のその他の実現態様においては、トリプシンの代わりに様々なプロテアーゼ、例えばキモトリプシン、プロテアーゼＫ等を用いることができる。
【００５４】
腫瘍ワクチンを調製するためのこの（応用を意図した）方法は、どんなタイプの内皮細胞培養物、特にマトリックス又は基質上での培養物にも適用することができ、新たに単離した内皮細胞と同じく、様々な組み合わせの共培養の使用が可能である。
【００５５】
更に、本発明を、ヒト結腸癌の血管から単離した活性化内皮細胞の初代培養物を用いて、腫瘍ワクチンの調製方法の第２例により説明する。
【実施例２】
【００５６】
１．腫瘍を外科的に切除する際に得られた結腸腫瘍の組織片を、抗生体質を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を入れた滅菌試験管内に入れ、ラボに運んだ。
２．滅菌環境下にて、腫瘍組織をペトリ皿に移し、壊死、凝血した部位、残留脂肪分及び結合組織を機械的に除去した。
３．腫瘍組織をハサミで小切片に切断する。
４．腫瘍組織のフラグメントを、腫瘍フラグメントを覆うに十分な量のコラゲナーゼ０．２％溶液中にて３７℃でインキュベートする。
５．コラゲナーゼ溶液を捨て、腫瘍組織フラグメントをＰＢＳ溶液で優しく洗浄する。
６．ＲＰＭＩ１６４０培地３ｍｌを添加し、腫瘍組織フラグメントを、ピペット先端での徹底的な吸い込みと噴出により小さな細胞凝集塊に縮小する。
７．大きい細胞凝集塊を底に沈殿させ、残った細胞を新しい試験管に移し、室温にて１７０ｇで遠心分離する。
８．細胞ペレットをＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させる。
９．細胞懸濁液１ｍｌを、２０分の間、６７０ｇ、室温にてパーコール密度勾配で遠心分離する。
１０．パーコール密度勾配１．０３３〜１．０４７に対応する細胞分画（内皮細胞に対応する）を回収し、１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を添加し、混合物を再懸濁させ、１７０ｇでの５分の遠心分離により細胞を回収する。
１１．内皮細胞を成長培地（ＲＰＭＩ１６４０、ヘパリン、内皮成長因子、腫瘍細胞の馴化培地、１０％ウシ胎仔血清）に再懸濁させ、培養フラスコ内で培養する。
１２．成長培地をフラスコから取り除き、細胞を、培養培地の体積の半分の生理溶液又はＰＢＳ溶液で３回洗浄する。この結果、成長培地に由来する微量の血清が除去される。
１３．トリプシンの０．０００１％溶液（活性〜３０００Ｕ／ｍｇ）を、フラスコ表面２５ｃｍ２あたり溶液１ｍｌの割合で細胞に添加する。
１４．フラスコを３７℃でインキュベートする。５〜７分のインキュベーションの後、放出された表面抗原を含有する溶液を回収する。フラスコから溶液を除去する間、内皮細胞はフラスコ底部に付着したままであるべきである。トリプシンの影響により一部の細胞がフラスコ表面から剥がれて液体中に浮遊した場合は、５分の間、４００ｇで溶液を遠心分離しなくてはならず、細胞を含有していない上清を用いる。
１５．内皮細胞が入ったフラスコ中の残留トリプシンを不活性化するため、ウシ血清を含有する新しい成長培地を添加し、インキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２で継続することが必要である。
１６．工程１４に従って得られた溶液を真空濃縮装置（ｖａｃｕｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を４５℃で使用して濃縮する。事前に、溶液を適切なやり方、例えば逆相クロマトグラフィ、ゲル濾過等により脱塩すべきである。
１７．必要な量の抗原を蓄積するために、工程１２〜１６を、数時間〜数日の間隔で繰り返し、この間に調製中のワクチンの質を、患者の腫瘍血管に特異的な抗原を得るにあたっての適性に関して内皮細胞を評価することにより管理する。
【００５７】
本発明の好ましい実現態様においては、内皮細胞を、その内皮細胞を単離したものと同じ腫瘍に由来する腫瘍細胞と共培養する。
【００５８】
本発明の別の実現態様においては、内皮細胞を、別の患者の腫瘍に由来する腫瘍細胞と共培養する又は特定の株の腫瘍細胞と共培養する。
【００５９】
本発明の別の実現態様においては、内皮細胞を、その内皮細胞の単離に用いた腫瘍のフラグメントと共培養する又は別の患者の腫瘍フラグメントと共培養する。
【００６０】
本発明の別の実現態様においては、活性化内皮細胞は、その他の患者に由来する（同種の内皮細胞）。
【００６１】
本発明に従って得た培養内皮細胞の表面抗原は、ドナー腫瘍の内皮細胞に特異的でなくてはならない。しかしながら、患者の生体内で腫瘍細胞が成長する場合と同じ環境をインビトロで作り出すのは不可能であることから、培養により細胞の表現型に歪みが生じる。従って、ワクチン接種用の抗原を蓄積するための内皮細胞培養物の適性を、強制的に管理すべきであり、また前述のユーラシア特許”Method for testing a cell culture quality”に記載の方法に従って管理を行うべきである。
【００６２】
本方法により得られたワクチンの抗腫瘍活性を裏付けるために、マウスのモデル実験を行った。同じ歳、同じ体重の３群のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり６匹のオス）を用いた。
【００６３】
自己活性化及び非活性化内皮細胞の培養物を用いて、本発明の第１の実現態様に従って抗原を調製した。単離した抗原をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０でのゲル濾過により脱塩し、更に真空濃縮装置により濃縮した。
【００６４】
マウスに１００万個の肝細胞癌Ｈ２２細胞を皮下注射した。注射後７日目に、事前に完全フロイントアジュバントと１：１（ｖ／ｖ）の比で混合した１５０μｇの抗原を皮下注射することにより、マウスにワクチン接種を行った。４週間の間に不完全フロイントアジュバントを１週間に１回使用して、続く免疫付与を行った。第１実験群のマウスに本発明の第１の実現態様に沿って（すなわち自己活性化内皮細胞を用いた）調製したワクチンを接種した。第２群のマウスに、活性化させていない自己内皮細胞を用いて本発明の第１の実現態様に従って調製したワクチンを接種した。対照群に、同じやり方でフロイントアジュバントと混合したＰＢＳを注射した。
【００６５】
腫瘍接種後の３ヶ月の間に、腫瘍細胞の増殖を対照群及び実験群において観察した。測定結果（図２を参照のこと）は、実験群のマウスにおける腫瘍の縮小及び消失を実証しており、これは内皮細胞表面抗原を含有するワクチンの際立った抗腫瘍効果を証明しており、活性化内皮細胞の表面抗原を基礎として生成したワクチンでは、より顕著な効果が観察される。
【００６６】
ワクチンの抗血管作用機序を裏付けるため、血管新生指数（腫瘍細胞１０００個あたりの血管の量）を、組織片及び腫瘍血管の壁を染色する免疫酵素法を用いて、対照群及び実験群の腫瘍で測定した。
【００６７】
腫瘍接種後３０日目に採取した腫瘍組織の新たに単離したフラグメントを、ＰＢＳ（ｐＨ７．０〜７．２）中の１０％ホルムアルデヒト溶液中で固定し、パラフィンに包埋した。免疫組織化学的に調査するために、厚さ４μｍの切片を準備した。血管を見るために、切片を、標準的なアビジン・ビオチンペルオキシダーゼプロトコルを用いて、ヒトＣＤ３１に対するマウス抗体で染色した。パラフィンをエタノールで除去した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％過酸化水素で阻害した。抗体の非特異的な結合を、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ溶液で防止した。その結果、切片をＣＤ３１に対する１次抗体、マウスＩｇＧに対するビオチン化抗体及びストレプトアビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼ錯体と共にインキュベートした。切片を、新しく調製したジアミノベンジジン溶液で染色し、ヘマトキシリンで後染色した。各工程後、切片をＰＢＳで洗浄した。陰性対照として、１次抗体をマウスＩｇＧで置き換え、上記の方法に従って染色した切片を用いた。
【００６８】
図３は、第１（Ａ）及び第２（Ｂ）実験群並びに対照群（Ｃ）の腫瘍の組織片を示し、これらの群には血管新生指数（ＡＩ）１６、３２、８０が対応する。この事実は、内皮細胞の表面抗原によるワクチン接種の結果、血管新生が阻害されることを裏付けており、活性化内皮細胞を基礎としたワクチンではより強力に阻害されることを特徴づけている。
【００６９】
免疫応答の機序はヒトでも動物でも同じであるため、モデル実験の結果は動物への使用に限定されないことを強く主張する。
【００７０】
抗原投与方法及び体重１ｋｇあたりで計算した用量は、ヒトでの免疫付与の場合においてその意味が同じであるが、免疫付与の概要（用量、注射を繰り返す回数、使用アジュバント）を、疾患発現の重篤度、腫瘍学的な疾患の段階、腫瘍の血管新生の程度、化学療法と併用した場合に生体が抗原に対して際立った免疫応答を示す力を考慮して、各特定の患者に合わせて個別化することができる。
【００７１】
以下に、内皮細胞表面抗原を基礎とした腫瘍ワクチンをどのようにして得るかの例を挙げる。ワクチンを、男性に抗腫瘍ワクチン接種するために、本発明の第２の実現態様に従って調製した。
【実施例３】
【００７２】
ワクチンは、０．５ｍｌのＰＢＳ中に溶解させ、１ｍｌのアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、水・油エマルションを基礎として開発された、スクアレン、Ｐｌｕｎｏｒｉｃ  Ｌ１２１、Ｔｗｅｅｎ８０を含有するＳｙｎｔｅｘ社のアジュバントである）と混合した１ｍｇの抗原混合物（本発明の第２の実現態様に従って調製）から成る。
【００７３】
１用量のワクチンを３週間にわたって毎週及び５ヶ月にわたって毎月１回、患者に皮下注射する。
【００７４】
ワクチン接種の効率を、注射した表面抗原に対する免疫の強度によりチェックする。注射から２〜３日目に、注射した抗原に対する過敏性反応を、注射部位の紅斑の寸法を考慮して評価する。基準指数として、初回の注射部位上での寸法を採用する。ワクチン接種を繰り返した後の過敏性反応の明らかな増進は、免疫応答の発現を示している。
【００７５】
ワクチンの静脈内又は筋肉内注射も可能であり、アジュバントなしのワクチン注射も同じく可能である。
【００７６】
本願の方法に従って調製したワクチン使用後の免疫応答の発現は、ワクチン中の内皮細胞表面抗原の存在に負うものである。複数の抗原、すなわちワクチン中に存在する複数の表面タンパク質フラグメントにより、その表面に同じアミノ酸配列のタンパク質を有する細胞全てに対する免疫応答が可能になる。
【００７７】
本方法に従った腫瘍ワクチン調製は、患者自身の活性化内皮細胞だけでなく、別の患者の内皮細胞を用いても可能である。
【００７８】
どちらの場合においても治癒効果を得ることができるが、これは同じアミノ酸配列を有する抗原が、別の患者から得た腫瘍血管の内皮細胞表面上に存在しているからである。更に、本方法に沿って調製した自家ワクチンを用いる場合、効果はより顕著であるが、これはこの場合、このワクチンが、その特定の患者の腫瘍血管の内皮細胞に個別の抗原を含有しているからである。
【００７９】
治癒効果は、休止又は様々な方法により活性化された両方の状態の正常な組織の内皮細胞を使用しても得られる。この効果は、全ての内皮細胞に共通する表面抗原の存在及び様々な方法でのその活性化に続く内皮細胞の抗原組成における変化に一部共通する特徴によって説明される。
【００８０】
応用例として提案の、本方法に従って得たワクチンの使用により、単味ワクチンの使用と比較すると、治療の有効性を何倍も上昇させることが可能になることに留意すべきである。
【００８１】
本願の方法に従って調製したワクチンの使用により、腫瘍血管の内皮細胞に対する生体の免疫寛容を克服することが可能になるが、これはこのワクチンが、腫瘍血管内皮細胞に特異的な抗原で富化されているからである。
【００８２】
これは細胞を殺さない（非致死的な）濃度のプロテアーゼでの細胞のプロテアーゼ処理により生じる。細胞を殺さない濃度のプロテアーゼの使用により、内皮細胞の表面抗原だけを切断し、細胞膜の破壊に続く細胞死（細胞質内容物、特にワクチン接種に無用な細胞内タンパク質塊によるワクチン汚染につながる）を回避することができる。この方法は、既知のワクチン中の特定の腫瘍血管抗原の一部を減少させることが知られており、これはターゲットとしていない免疫応答の誘発と、その結果としての表面抗原に対するその特異性の弱体化につながる。
【００８３】
このため、本発明に従って調製した、表面抗原で富化したワクチンを使用することにより、抗腫瘍治療の効率を上昇させることが可能になる。
【００８４】
加えて、免疫療法の効率は、同じ内皮細胞から得た抗原を蓄積することによって調製した表面抗原の使用により上昇する。このような腫瘍ワクチン調製方法では、プロテアーゼの毎回の使用により、実質的に変わらない組成の抗原を得て、ワクチン接種に必要な量の抗原を蓄積することが可能になる。ワクチンの質を管理することにより、特定の腫瘍血管に特異的な抗原だけをワクチンに含ませることができる。
【００８５】
従って、本発明により、内皮細胞の表面抗原を得ることができ、またこの表面抗原を基礎として、腫瘍学的な疾患の免疫治療、すなわちワクチン接種の実施が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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