(57)【要約】ＰＴＫ７タンパク質の機能阻害を通じる細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤に関するものであって、ＰＴＫ７タンパク質の機能を阻害することを特徴とし、これにより、ＶＥＧＦによる血管形成、細胞移動、細胞浸潤及び細胞付着を抑制し、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ）及びＡｋｔの活性化を抑制する。また、ＦＡＫ及びパキシリンの活性化も阻害することによって、生体内での血管新生、細胞移動及び細胞浸潤を効果的に抑制することができる。
2010522775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＴＫ７タンパク質の機能を阻害することを特徴とする細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤。
【請求項２】
前記抑制剤は、
ＰＴＫ７タンパク質の細胞外ドメインを有する可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤。
【請求項３】
前記可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片は、
配列番号２で表示されるアミノ酸配列または配列番号２で表示されるアミノ酸配列のうち１〜３０番目の配列を除いた残りの配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤。
【請求項４】
前記可溶性のＰＴＫ７タンパク質の最小活性断片は、
配列番号２の人間ＰＴＫ７タンパク質の３１番ないし４０９番アミノ酸配列または３２７番ないし４０９番アミノ酸配列であることを特徴とする請求項２に記載の細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤。
【請求項５】
前記抑制剤は、
前記ＰＴＫ７タンパク質を暗号化するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する小規模ＲＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤。
【請求項６】
前記小規模ＲＮＡ配列は、
ＰＴＫ７タンパク質を暗号化するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と相補的結合を形成して、前記ｍＲＮＡ配列の発現を抑制する小規模抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または前記小規模抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列を含む小規模ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であることを特徴とする請求項５に記載の細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤。
【請求項７】
前記抑制剤は、
ＰＴＫ７タンパク質と特異的に結合することによって、ＰＴＫ７タンパク質の活性を抑制するＰＴＫ７タンパク質中和抗体であることを特徴とする請求項１に記載の細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤。
【請求項８】
前記中和抗体は、
配列番号２で表示されるアミノ酸配列を認識することを特徴とする請求項７に記載の細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤。
【請求項９】
前記細胞は、
血管内皮細胞であることを特徴とする請求項１に記載の細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤に係り、より詳細には、ＰＴＫ７タンパク質の機能阻害を通じて生体内での血管新生、細胞移動及び細胞浸潤を効果的に抑制することができる細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間ＰＴＫ７（アミノ酸配列リスト番号ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＮ０４８６２．１；ｍＲＮＡ配列リスト番号ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４０２７１）は、細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）、膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）及びチロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）ドメインなどを含む非活性型受容体タイプのタンパク質燐酸化酵素（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ；ｄｅｆｅｃｔｉｖｅＲＰＴＫ）であって、そのポリペプチド構造に対する模式図が図１の上方に図示されている。具体的に、ＰＴＫ７ポリペプチドは、ＥＲ信号ペプチド、７個の兔疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態のループ（ｌｏｏｐ、以下、Ｉｇ  ｌｏｏｐ）を有する細胞外ドメイン、膜通過ドメイン、膜近接ドメイン（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）、酵素活性が欠けたチロシンキナーゼドメイン及びＣ−末端しっぽ部位からなっている。
【０００３】
本発明者は、人間ＰＴＫ７（Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１９：２３５−２３９）に引き続き、マウスのＰＴＫ７（Ｊｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３２８：７５−８４）を糾明したことがあり、それ以外にも、鶏のＫＬＧ（Ｃｈｏｕ，Ｙ．Ｈ．ａｎｄ  Ｈａｙｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：４８９７−４９０１）、ショウジョウ蝿のＤｔｒｋ／Ｏｆｆ−ｔｒａｃｋ（ＯＴＫ）（Ｐｕｌｉｄｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １１：３９１−４０４；Ｗｉｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３２：５３−６２）及びＨｙｄｒａのＬｅｍｏｎ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌｅ，Ｒ．Ｅ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２２４：２８６−２９８）がその同位体と見なされることがあるので、ＰＴＫ７は系統学上保存されていると言える。
【０００４】
一方、Ｈｙｄｒａ  Ｌｅｍｏｎ  ｍＲＮＡは、精子形成（ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）、卵子形成（ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び受精卵発生過程（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）で発現が増加すると報告されており、したがって、発生に重要な役割を担当することと考えられる（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌｅ，Ｒ．Ｅ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２２４：２８６−２９８）。ショウジョウ蝿Ｄｔｒｋ／ＯＴＫは、神経認知（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）と軸索誘導（ａｘｏｎ  ｇｕｉｄａｎｃｅ）を調節しながら、神経細胞付着（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）に関与すると報告されたことがあり（Ｐｕｌｉｄｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １１：３９１−４０４）、プレキシンＡ（Ｐｌｅｘｉｎ  Ａ）と共にセマフォリン（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）系の細胞表面リガンド（ｃｅｌｌ  ｕｒｆａｃｅ  ｌｉｇａｎｄ）のうち一つであるＳｅｍａ１Ａの受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として作用して、反発性軸索誘導（ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  ａｘｏｎｇｕｉｄａｎｃｅ）に関与するという報告があった（Ｗｉｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３２：５３−６２）。また、鶏ＫＬＧは、プレキシンＡ１（Ｐｌｅｘｉｎ−Ａ１）と共にＳｅｍａ  ６Ｄと結合し、プレキシンＡ１−ＫＬＧ−Ｓｅｍａ  ６Ｄ複合体は、鶏の心臓発生過程で心室形成に重要な役割をすると報告されたことがある（Ｔｏｙｏｆｕｋｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １８：４３５−４４７）。最近には、Ｎ−末端１１４個のアミノ酸のみで構成された不完全なＰＴＫ７を発現するマウスが中脳−後脳境界部位で脊髓の端部まで神経管（ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅ）が閉じず、立体纎毛束配向（ｓｔｅｒｅｏｃｉｌｉａｒｙ  ｂｕｎｄｌｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に異常を見せて出産前後に死亡し、このような特徴によってＰＴＫ７が平面細胞極性（Ｐｌａｎａｒ  ＣｅｌｌＰｏｌａｒｉｔｙ；ＰＣＰ）を調節すると報告されたことがある（Ｌｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３０：９３−９８）。
【０００５】
マウスＰＴＫ７  ｍＲＮＡは、発生初期にしっぽ、肋骨、体節、消化管、頭蓋骨及び顔面部分で高く発現される。これと同様に人間ＰＴＫ７  ｍＲＮＡは、胎児の結腸で高く増加し（Ｍｏｓｓｉｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：２１７９−２１８４）、正常な結腸に比べて転移性結腸癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）では増加しているが（Ｓａｈａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１３４３−１３４６）、転移性黒色腫（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ）では減少すると報告された（Ｅａｓｔｙ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７１：１０６１−１０６５）。したがって、以上の点を総合して見れば、腫瘍のような疾病状態でＰＴＫ７の発現程度が高いことから、これらの間に相関関係があるという程度は推定することができるが、具体的に、ＰＴＫ７が、腫瘍の発生または細胞の移動、浸潤、血管新生に如何なる影響を及ぼすか、または両者間に直接的な因果関係が成立するか否かは確認しにくかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、ＶＥＧＦによる血管形成、細胞移動、細胞浸潤及び細胞付着を抑制し、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ）及びＡｋｔの活性化を抑制し、またＦＡＫ及びパキシリンの活性化も阻害することによって、生体内での血管新生、細胞移動及び細胞浸潤を効果的に抑制することができる細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、前記課題を果たすために、ＰＴＫ７タンパク質の機能阻害を通じる細胞の移動、浸潤または血管新生抑制剤を提供する。
【０００８】
本発明の他の実施例によれば、前記抑制剤は、ＰＴＫ７タンパク質の細胞外ドメインを有する可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片を含みうる。
【０００９】
本発明の一実施例によれば、前記可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片は、配列番号２で表示されるアミノ酸配列または配列番号２で表示されるアミノ酸配列のうち１〜３０番目の配列を除いた残りの配列を含み、より望ましくは、前記可溶性のＰＴＫ７タンパク質の最小活性断片は、配列番号２の人間ＰＴＫ７タンパク質の３１番ないし４０９番アミノ酸配列、または３２７番ないし４０９番アミノ酸配列であり得る。
【００１０】
本発明のまた他の実施例によれば、前記抑制剤は、前記ＰＴＫ７タンパク質を暗号化するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する小規模ＲＮＡ配列を含み、より望ましくは、前記小規模ＲＮＡ配列は、ＰＴＫ７タンパク質を暗号化するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と相補的結合を形成して、前記ｍＲＮＡ配列の発現を抑制する小規模抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または前記小規模抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列を含む小規模ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。
【００１１】
本発明の他の実施例によれば、前記抑制剤は、ＰＴＫ７タンパク質と特異的に結合することによって、ＰＴＫ７タンパク質の活性を抑制するＰＴＫ７タンパク質中和抗体であり、前記中和抗体は、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を認識することができる。
【００１２】
本発明の他の実施例によれば、前記細胞は、血管内皮細胞であり得る。
【００１３】
以下、本明細書で使われた用語について簡略に説明する。
【００１４】
別途の説明がない限り、用語‘核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）’は、単一または二重螺線状でデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを示し、自然発生するヌクレオチドと類似している方式で核酸と結合する本来のヌクレオチドの知られた類似体を含み、特に言及のない限り、特定核酸配列は、それらの相補的配列を含む。
【００１５】
‘作動的に結合された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ）’は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／または解読過程を調節する。
【００１６】
細胞と関連して使われる用語‘組替え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）’は、細胞が異形の核酸を複製するか、異形の核酸によってコード化されるペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。また、組替え細胞は、細胞の本来の形態で発見される遺伝子を発現させることができるが、変形された遺伝子が人工的な方法によって細胞に再導入される。
‘プロモーター’は、所望のタンパク質の遺伝子が、前記プロモーターのダウンストリームに融合された時、植物細胞でタンパク質の発現を調節することができるプロモーターを意味する。また、本発明のプロモーターは、他の転写−翻訳活性配列に結合してさらに変形されうる。
【００１７】
‘中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）’は、中和反応に関与する免疫抗体としてウイルスなどの抗原が生体に対して毒性や感染力などの活性を有した時、その抗原に結合して活性を減退させるか、消失する抗体を意味する。
‘可溶性タンパク質断片’は、加水分解してアミノ酸のみを生成させる単純タンパク質の一種で水または塩類溶液に溶解することができるタンパク質を意味する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＶＥＧＦによる血管形成、細胞移動、細胞浸潤及び細胞部着を抑制し、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ）及びＡｋｔの活性化を抑制し、またＦＡＫ及びパキシリンの活性化も阻害することによって、生体内での血管新生、細胞移動及び細胞浸潤を効果的に抑制する抑制剤を提供することができる。本発明による血管新生、細胞移動及び細胞浸潤抑制剤は、可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片処理、ＰＴＫ７ノックダウン及びＰＴＫ７中和抗体処理などのような多様なＰＴＫ７機能阻害手段によって遂行される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＰＴＫ７ポリペプチド構造と、細胞から分泌させたＰＴＫ７の細胞外ドメインの全体または一部を示す模式図である。
【図２】ＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの血管形成に対するｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を示すグラフである。
【図３】ＨＵＶＥＣでＶＥＧＦによって誘導された細胞数の増加でｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を示すグラフである。
【図４】ＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの細胞移動及び浸潤に対するｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を示すグラフである。
【図５】ＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの細胞移動及び浸潤に対するｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を示すグラフである。
【図６】ＶＥＧＦによって誘導される生体内血管新生に対するｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を写真及びグラフで図示した図面である。
【図７】ＶＥＧＦによって誘導される生体内血管新生に対するｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を写真及びグラフで図示した図面である。
【図８】ＨＵＶＥＣでＶＥＧＦによって誘導された信号伝達物質の活性化でｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を表わす電気泳動結果及びグラフである。
【図９】ＨＵＶＥＣでＶＥＧＦによって誘導されたＦＡＫ、パキシリンの活性化、パキシリンの局所付着形成及びアクチンフィラメント（ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）形成でｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を表わす電気泳動結果及び共焦点蛍光顕微鏡写真である。
【図１０】ＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの細胞移動に対するｓＰＴＫ７の最小活動断片部位を決定するために分析した結果をグラフで図示した図面である。
【図１１】ＰＴＫ７ノックダウン分析に使われたｓｉＲＮＡの配列（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社のＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ）である。
【図１２】各ｓｉＲＮＡ及びこれらの混合物によるＰＴＫ７のノックダウン結果を表わす電気泳動写真である。
【図１３】ＰＴＫ７ノックダウン分析に使われたｓｈＲＮＡベクターの情報及び標的配列（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社のＭＩＳＳＩＯＮ  ＴＲＣ  ｓｈＲＮＡ）である。
【図１４】ｓｈＲＮＡベクターによるＰＴＫ７のノックダウン結果を表わす電気泳動写真である。
【図１５】ＨＵＶＥＣでＰＴＫ７のノックダウンが、ＶＥＧＦによって誘導された血管形成に及ぼす影響を分析した結果を表わすグラフである。
【図１６】ＨＵＶＥＣでＰＴＫ７の抗血清処理によってＶＥＧＦによって誘導されたＡｋｔの燐酸化に及ぼす影響を分析した結果を表わす電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２１】
前述したように、従来には、腫瘍のような疾病状態でＰＴＫ７タンパク質が過発現されるという程度のみ知られただけであり、ＰＴＫ７タンパク質が、腫瘍発生やこれと関連した過程と直接的な連関があるか否か、及びあるとすれば、如何なる発生機作に影響を及ぼしたかは知られていない。
【００２２】
これにより、本発明者は、人間ＰＴＫ７タンパク質の機能を抑制した時、細胞の移動、浸潤及び血管新生を阻むということを最初に確認した。したがって、人間ＰＴＫ７タンパク質の機能を抑制することによって、細胞の移動、浸潤及び血管新生を阻んで窮極的に癌転移を含めた細胞の移動、浸潤及び血管新生によって発生する各種の疾病を予防及び治療することができる。
【００２３】
以下では、人間ＰＴＫ７の活性を抑制することができるさまざまな抑制手段を提供しようとするが、発明の権利範囲が、これに限定されるものではない。
【００２４】
具体的に、本発明で提供されるＰＴＫ７タンパク質の具体的な機能阻害方法は、多様な手段によって具現可能であるが、例えば、ＰＴＫ７タンパク質と競争して、その機能を遮断することができる可溶性のＰＴＫ７（ｓＰＴＫ７）タンパク質断片またはその一部によっても具現可能である。前記可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片は、図１に図示されたようなＰＴＫ７の細胞外ドメインまたはその一部を有するように製作され、これは血管内皮細胞の血管形成と、細胞移動及び浸潤を阻害すると同時に、生体内血管新生を阻害し、ＰＩ３キナーゼとＡｋｔなどの信号伝逹タンパク質の活性化を抑制する機能も遂行すると確認された。また、ＰＴＫ７細胞外ドメインのうち一番目のＩｇ  ｌｏｏｐから四番目のＩｇｌｏｏｐまでのドメインを有するように製作されたＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ断片も、ｓＰＴＫ７と同様に血管内皮細胞の移動を阻害した。本発明による可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片は、まだ糾明されていないＰＴＫ７のリガンド（ｌｉｇａｎｄ）と結合して内生的ＰＴＫ７タンパク質と競争するおとり受容体（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として作用することによって、ＰＴＫ７の機能を阻害すると推定される。
【００２５】
具体的に、本発明に使われうる可溶性のＰＴＫ７（ｓＰＴＫ７）タンパク質断片は、人間ＰＴＫ７タンパク質の活性を阻害することができるものであれば、種類の制限がないが、望ましくは、配列番号２のアミノ酸配列で表示されるタンパク質や前記タンパク質の最小活性断片を使うことができる。前記配列番号２のアミノ酸配列を暗号化することができるものであれば、これをコーディングする遺伝子塩基配列は制限がないが、望ましくは、配列番号１で表示される遺伝子塩基配列を使うことができる。より望ましくは、配列リスト２で表示されるｓＰＴＫ７配列はＨｉｓ  ｔａｇを含んでおり、１番〜３０番に該当するＥＲ信号ペプチドであるので、これを除いたアミノ酸配列を含みうる。一方、最小活性断片は、実施例９から分かるように、配列リスト２で表示されるｓＰＴＫ７アミノ酸配列のうち３１番〜４０９番を含み、より望ましくは、３２７番〜４０９番を含みうる。
【００２６】
本発明の可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片の製造は、Ｈｉｓ−ｔａｇを有する人間ｓＰＴＫ７を発現するように作動的に結合されたベクター（ｐｃＤＮＡ３−ｈＰＴＫ７−Ｅｘｔ−Ｈｉｓ）またはその一部を発現するベクターを製作した後、このベクターをＨＥＫ２９３細胞に核酸伝達感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、ｓＰＴＫ７またはその一部を発現するＨＥＫ２９３細胞をそれぞれ分離して培養し、その細胞培養液でＮｉ２＋−ＮＴＡカラムクロマトグラフィーを使って可溶性のＰＴＫ７タンパク質を錠剤する方法によって遂行されうるが、これに限定されるものではなく、組替え発現ベクターから発現される組替えペプチドまたはタンパク質の錠剤を容易にするために、５´−または３´−末端の隣接した位置にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＦＬＡＧ、５〜７ｘ  Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、ＮｕｓＡ（Ｎｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ａ）またはＴｒｘ（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）をコーディングするヌクレオチド配列がさらに含まれうる。
【００２７】
一方、本発明の組替え発現ベクターは、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合位置及び転写／解読終了配列を含み、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター及びＨＳＶのｔｋプロモーター）が利用され、転写終了配列としてポリアデニル化配列を有しうる。
【００２８】
一方、本発明の組替え発現ベクターは選択標識として、当業界で通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン、テトラサイクリンに対する耐性遺伝子及びＧ４１８抵抗性遺伝子がある。
【００２９】
本発明の望ましい発現ベクターは、当業界で度々使われるプラスミド（例：ｐＳＣ１０１、ＣｏｌＥ１、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＨＣ７９、ｐＵＣ１９、ｐＥＴなど）、把持（例：λｇｔ４？λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）またはウイルス（例：ＳＶ４０など）を操作して製作されることがあるが、これに限定されない。
【００３０】
本発明の方法で、ベクターを安定しながら連続的にクローニング及び発現させることができる宿主細胞は、当業界に公知された如何なる宿主細胞も利用でき、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バシラスサブチリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバシラス属菌株、そして、サルモネラティフィリウム、セラチアマルセッセンス及び多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがある。
【００３１】
また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、イースト（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞及び人間細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８，ＢＨＫ，ＣＯＳ−７，２９３，ＨｅｐＧ２，３Ｔ３，ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株）などが利用されうる。
【００３２】
本発明のベクターを宿主細胞内に運搬する方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３））、ハナハン方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３）；及びＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７−５８０（１９８３））及び電気穿孔方法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：６１２７−６１４５（１９８８））などによって実施されうる。また、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，２２：４７９（１９８０））、燐酸カルシウム沈澱法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：８４１（１９８２））、リポソ−ム媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７（１９８０））、ＤＥＡＥデキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９５６８−９５７２（１９９０））などによってベクターを宿主細胞内に注入することができる。
【００３３】
本発明では、ｓＰＴＫ７が人間血管内皮細胞の血管形成、細胞移動及び浸潤を抑制するか否かを分析するために、血管内皮細胞としては、人間臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ；ＨＵＶＥＣ）を使い、血管内皮細胞の活性誘導物質としては、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）を使った。前記分析法では、多様な濃度の可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片をＨＵＶＥＣに処理した後、約３０分経過後にＶＥＧＦを処理し、ＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの血管形成に対する可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片の影響を分析した。分析結果、可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片のない状態でＶＥＧＦのみを処理したＨＵＶＥＣは、血管と類似した形態で網状の管を形成したが、可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片を前処理した場合には、濃度依存的にＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの管形成を抑制した（図２参照）。
【００３４】
また、血管内皮細胞の血管形成で可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片の細胞毒性が影響を及ぼしたか否かを分析して見るために、可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片を処理した後、ＨＵＶＥＣの細胞数変化をＭＴＴ法で分析し、その結果、可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片がＨＵＶＥＣの生存や繁殖には影響を及ぼさないということが分かった（図３参照）。したがって、可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片による血管内皮細胞の血管形成抑制作用は、細胞毒性によることでないという点を確認することができた。
【００３５】
一方、血管内皮細胞の血管形成には、細胞移動と浸潤とが重要な過程であるので、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムで化学走性移動性分析法（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）で細胞移動を測定し（図４参照）、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムで成長因子減少マトリゲル（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ）をコーティングした後、浸潤分析法（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）で細胞浸潤を測定した（図５参照）。それぞれで移動及び浸潤を示した細胞数を定量分析した結果、可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片は、濃度依存的にＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの移動及び浸潤を阻害するということを確認することができた。前記実験結果から可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片が生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で細胞毒性がなく、血管内皮細胞の血管形成、細胞移動及び浸潤を抑制するという事実を確認することができたので、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも同一の活性を有するか否かを確認しようとした。そのために、人間ｓＰＴＫ７と同一な方法でマウスｓＰＴＫ７を製造し、マトリゲル自体、ＶＥＧＦを含むマトリゲル、マウスｓＰＴＫ７とＶＥＧＦとを含むマトリゲルをマウスの腹部内皮と外皮との間に注射してｉｎ  ｖｉｖｏマトリゲルプラグ分析法を遂行した。実験結果、ＶＥＧＦは、プラグ（ｐｌｕｇ）に血管新生を誘導した一方、ｓＰＴＫ７をＶＥＧＦのように処理した実験群では、血管新生が著しく抑制されるということを確認することができた（図６及び図７参照）。
【００３６】
一方、ｓＰＴＫ７の最小活性断片部位を決定するために、Ｈｉｓ−ｔａｇを有するｓＰＴＫ７の各Ｉｇ  ｌｏｏｐドメインを発現、錠剤してｓＰＴＫ７のような方法で細胞移動を測定した。実験結果、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ−Ｈｉｓ、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓ及びＰＴＫ７−Ｉｇ１５−Ｈｉｓは、濃度依存的にＶＥＧＦによるＨＵＶＥＣの移動を阻害するということを確認することができた（図１及び図１０参照）。しかし、ＰＴＫ７−Ｉｇ１３−Ｈｉｓは、ｓＰＴＫ７に比べて非常に弱い細胞移動抑制能を示した。このような結果から、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ−Ｈｉｓが人間ＰＴＫ７細胞外ドメイン部分の最小活性断片を含み、特に、人間ＰＴＫ７細胞外ドメイン部分で損傷されていない四番目のＩｇ  ｌｏｏｐ部分（人間ＰＴＫ７タンパク質の３２７番から４０９番アミノ酸配列）がＰＴＫ７の機能に必須であるということを確認した。
【００３７】
本発明では、ＰＴＫ７タンパク質の機能阻害を通じて血管新生、細胞移動及び細胞浸潤を抑制することができる抑制剤を提供することに技術的特徴があり、したがって、このようなＰＴＫ７タンパク質の機能阻害は、可溶性のＰＴＫ７タンパク質断片を抑制剤として使う方法の以外にも、多様な抑制剤の使用を通じて達成されうる。例えば、ＰＴＫ７タンパク質を暗号化するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と相補的結合を形成することによって、前記ｍＲＮＡ配列の発現を抑制する小規模抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使ってＰＴＫ７タンパク質機能を阻害するか、このような小規模抑制ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列を含む小規模ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現ベクターを使ってＰＴＫ７タンパク質機能を阻害するか、またはＰＴＫ７タンパク質と特異的に結合することによって、ＰＴＫ７タンパク質の活性を抑制するＰＴＫ７タンパク質中和抗体を使ってＰＴＫ７タンパク質機能を阻害することもできる。
【００３８】
ＲＮＡｉを使うＰＴＫ７タンパク質機能阻害効果を確認するために、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡベクターを使ってＰＴＫ７の発現をノックダウンした後、血管内皮細胞の血管形成とＡｋｔ燐酸化に及ぼす影響とを分析した。ＰＴＫ７のノックダウン程度は、ＰＴＫ７抗−血清（ａｎｔｉ−ｓｅｒｕｍ）を使ってウェスタンブロットで分析し、分析結果、ＨＵＶＥＣにＰＴＫ７  ｓｉＲＮＡを核酸伝達感染させるか、ＨＥＫ２９３細胞にＰＴＫ７ｓｈＲＮＡベクターを核酸伝達感染させた後、ＰＴＫ７の発現が７０％以上減少したと観察されたので、ＰＴＫ７が効果的にノックダウンされたということを確認した（図１１〜図１５参照）。したがって、血管内皮細胞でＰＴＫ７ノックダウンがｓＰＴＫ７処理のような効果を示すので、ｓＰＴＫ７が内生的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＰＴＫ７の機能を遮断して血管内皮細胞の血管形成、移動、浸潤及び生体内血管新生を抑制するということを確認することができた。
【００３９】
一方、前記抑制剤の他の実施例として、ＰＴＫ７タンパク質と特異的に結合することによって、ＰＴＫ７タンパク質の活性を抑制するＰＴＫ７タンパク質中和抗体を利用することができ、この場合、望ましくは、前記中和抗体は、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を認識することができる（実施例１１参照）。
【００４０】
本発明の抑制剤は、薬学的組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含みうる。本発明のタンパク質またはこれを暗号化するＤＮＡを含む組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口形剤型、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤型化して使われうる。本発明の抽出物を含む組成物に含まれうる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デクストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、燐酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステア燐酸マグネシウム及び鉱物類が挙げられる。製剤化する場合には、普通使う充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記抽出液に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の以外にステア燐酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使われる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当されるが、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われうる。坐剤の基剤としては、ハードファット（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われうる。
【００４１】
本発明のタンパク質を暗号化するＤＮＡを患部に持続的に供給するために、前記ＤＮＡを挿入することができるベクターとしては、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクター、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）ベクター、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ベクター、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ベクター、単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）ベクターまたは動物細胞で発現されるプラスミドに含まれるということを特徴とする。
【００４２】
前記タンパク質またはこれを暗号化するＤＮＡを含有する組成物の投与形態は、注射剤で通常使われる如何なる器材でも使用可能である。例えば、器材は、蒸溜水、塩化ナトリウム塩溶液、塩化ナトリウム及び無機物塩の混合物またはそれと類似した混合物、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンのようなアミノ酸溶液、有機酸溶液または塩溶液及びグルコース溶液の混合及びこれと類似した溶液などを含む。また、注射剤は、通常の方法で浸透圧調節剤、ｐＨ調節剤、ごま油や豆油のような植物性油、またはレシチン、非イオン性表面活性剤のような表面活性剤を前記した器材に添加して溶液、懸濁液またはコロイド溶液などで製造することができる。このような注射剤は、粉末型、凍結乾燥型などで製造して、使用直前に溶解して使うこともできる。
【００４３】
本発明によるタンパク質またはこれを暗号化するＤＮＡを有効成分として含有する組成物は、固状である場合、遺伝子治療直前に必要であれば、あらかじめ滅菌した器材に溶解して使用し、液状である場合、別途の処理なしにそのまま使う。
【００４４】
本発明のタンパク質またはこれを暗号化するＤＮＡの望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって変わることができ、当業者によって適切に選択されうる。しかし、望ましい効果のために、血管新生によって誘発される疾患部位に局所的に０．０００１ないし１０００ｍｇ／ｋｇの量を１週に１回ないし数回投与するか、手術以後にカテーテル（ｃａｔｈｅｒｔｅｒ）のようなものを通じて一回投与して目標地点で吸収させうる。その投与量は、投与経路、疾患の程度、性別、体重、年齢などによって増減されうる。したがって、前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
本発明のタンパク質またはこれを暗号化するＤＮＡは、モルモット、マウス、家畜、人間などの哺乳動物に多様な経路で投与されうる。投与のすべての方式は、予想されることがあるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与されうる。
【００４６】
一方、本発明の組成物を含むことによって、必ず医薬品として許可されるもののみを意味せず、通常的な機能性食品または健康補助食品までも含む概念として理解されうる。
【００４７】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明の理解を助けるためのものであり、本発明の範囲を制限するものに解析されてはならない。
【実施例】
【００４８】
＜実施例１＞細胞培養
人間の臍帯静脈（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ）にコラーゲン分解酵素を処理して、人間臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ；ＨＵＶＥＣ）を分離した。ＨＵＶＥＣは、２０％（ｗ／ｖ）牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、３ｎｇ／ｍｌ基礎纎維母細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から購入）及び５ｕｎｉｔ／ｍｌヘパリンを含有したＭ１９９倍地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から購入）で培養した。一方、ＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレブトマイシンが含まれたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）で培養した。すべての細胞は、５％ＣＯ２及び９５％の空気が存在する３７℃で培養した。
【００４９】
＜実施例２＞Ｈｉｓ−ｔａｇが付着された人間ｓＰＴＫ７発現プラスミドの製造
先ず、人間ＰＴＫ７前腸ｃＤＮＡ（Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１９：２３５−２３９）で４．２−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を得て、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）のＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングすることで、人間ＰＴＫ７発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３−ｈＰＴＫ７を製作した。人間ＰＴＫ７タンパク質の細胞外ドメインのうちＣ−末端部分を暗号化している６４０−ｂｐのｃＤＮＡ断片にＨｉｓ−ｔａｇ暗号化配列と翻訳終了コドンとを含むように重合連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を通じて増幅させた。ＰＣＲに使われたプライマー対は、５´−ＡＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＣＡＣＣＡ−３´（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４０２７１の塩基配列１６４６−１６６５）と５´−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＣＴＴＧＴＡＧＧＧ−３´［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４０２７１の塩基配列２２３９−２２５６であるＨｉｓ−ｔａｇ暗号化配列（前記配列のうち下線部分）、終了コドン及びＸｂａＩサイト（前記配列のうちイタリック体の部分）］であった。
【００５０】
ｐｃＤＮＡ３−ｈＰＴＫ７は、ＸｈｏＩ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ４０２７１の塩基配列１８２９）とＸｂａＩ（ｐｃＤＮＡ３の多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ））とで切断して、１．６ｋｂの断片を除去した後、前記ＰＣＲ結果物をＸｈｏＩとＸｂａＩとで切断して、０．４５ｋｂの断片を分離して接合させることによって、人間ｓＰＴＫ７発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３−ｈＰＴＫ７−Ｅｘｔ−Ｈｉｓプラスミドを得た。製造されたプラスミドは、双方向配列確認を通じてＰＣＲ誤差がないということを確認した。ＰＴＫ７ポリペプチドの１番から３０番までのアミノ酸配列はＥＲシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）であるので、このプラスミドを真核細胞に導入すれば、アミノ酸配列３１番から７０３番までのＰＴＫ７細胞外部位全体とＨｉｓ  ｔａｇが発現された。
【００５１】
＜実施例３＞人間及びマウスｓＰＴＫ７の発現及び錠剤
実施例２で製作された人間ｓＰＴＫ７発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３−ｈＰＴＫ７−Ｅｘｔ−Ｈｉｓ）とマウスｓＰＴＫ７発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｍＰｔｋ７−Ｅｘｔ−Ｈｉｓ）（Ｊｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３２８：７５−８４）とをＨＥＫ２９３細胞に燐酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）方法でそれぞれ核酸伝達感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、１．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を処理して、Ｇ４１８抵抗性細胞クローンを選別した。該選別された細胞クローンを対象に抗−ペンタ−Ｈｉｓ単一抗体（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って人間ｓＰＴＫ７及びマウスｓＰＴＫ７を安定的に発現する細胞クローンを再選別した。該再選別されたクローンを７日間培養した無血清培養液を硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）で７０％まで飽和させてタンパク質を沈澱させた後、沈澱物を１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｍｅｔｈａｎｅ  Ｓｕｌｐｈｏｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ；ＰＭＳＦ）と１ｍＭエチレンジアミンテトラアセト酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｄｉａｍｉｎｅ  Ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）とが含まれた燐酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で溶解させてＰＢＳで透析した。透析を終えた試料をＮｉ２＋−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社から購入）にローディングしてイミダゾールで溶出した後、ＰＢＳで再透析して錠剤した人間ｓＰＴＫ７とマウスｓＰＴＫ７とを確保した。
【００５２】
＜実施例４＞ｓＰＴＫ７による血管内皮細胞の血管形成抑制分析
培養されたＨＵＶＥＣを１％ＦＢＳが含まれたＭ１９９倍地で６時間飢餓培養（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）した後、トリプシンで引き離して同じ倍地で分散した。０．２ｍｌ倍地に入っている２×１０５個のＨＵＶＥＣを多様な濃度のｓＰＴＫ７（０、０．５、１、２、４μｇ／ｍｌ）と３０分間あらかじめ反応させた。２４ウェルプレートの各ウェルに１０ｍｇ／ｍｌ成長因子減少ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）を０．２ｍｌずつ入れて重合させた後、各ウェルにｓＰＴＫ７を処理したＨＵＶＥＣを入れて、２０ｎｇ／ｍｌの血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）を加えた。２４ウェルプレートを１６時間３７℃で培養した後、形成された血管数を光学顕微鏡（６０倍）で分析した。本分析及び以下分析で各グループの比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓ  ｔ−テストを利用し、Ｐ値が０．０５未満である場合、有意レベルがないと見做した。すべての実験値は、最小限３回以上の独立実験を遂行して得たし、“平均値±標準偏差値”で表示した。
【００５３】
図２では、ＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの血管形成過程でｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を図示した。Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓ  ｔ−テストを通じる統計分析結果において、ＶＥＧＦを処理していない対照群に対しては、Ｐ値が０．０１未満である場合に††で、ＶＥＧＦを処理した対照群に対しては、Ｐ値が０．０１未満である場合に＊＊で、Ｐ値が０．００１未満である場合に＊＊＊で表示した。
【００５４】
図２の結果から分かるように、ｓＰＴＫ７がない状態でＶＥＧＦのみを処理したＨＵＶＥＣは、何も処理していないＨＵＶＥＣに比べて形成された管の数が４５％程度増加した。しかし、ｓＰＴＫ７を前処理した場合には、ｓＰＴＫ７濃度依存的にＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの血管形成を抑制した。
【００５５】
＜実施例５＞血管内皮細胞でｓＰＴＫ７による毒性影響分析
血管内皮細胞の血管形成でｓＰＴＫ７の細胞毒性が影響を及ぼしたか否かを分析して見るために、ＭＴＴ実験法を利用した。４８ウェルプレートの各ウェルに０．１％ゼラチン溶液２０μｌを加えた後、乾燥させた。各ウェルに２．０ｘ１０４個のＨＵＶＥＣを入れて２４時間培養した後、１％ＦＢＳが含まれたＭ１９９培養液で６時間飢餓培養させた。各ウェルに多様な濃度の人間ｓＰＴＫ７と１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦとを添加して３６時間培養した後、生きている細胞数をＭＴＴ実験法で分析した（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１２：１１９６−１２０１）。図３の結果から分かるように、ＶＥＧＦを処理していない試料に比べてＶＥＧＦのみ処理した場合には、細胞数が４０．５％増加したが、ＶＥＧＦのみ処理した試料とＶＥＧＦと共にｓＰＴＫ７を処理した試料とでは、細胞数に差がなかった。したがって、ｓＰＴＫ７は、ＨＵＶＥＣの生存や繁殖に影響を及ぼさないということが分かり、ｓＰＴＫ７による血管内皮細胞の血管形成抑制作用は、細胞毒性によるものではないということを確認することができた。
【００５６】
＜実施例６＞血管内皮細胞でｓＰＴＫ７による細胞移動及び浸潤抑制分析
血管内皮細胞の管形成には、細胞移動と浸潤とが重要な過程であるので、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムで化学走性運動分析法（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）で細胞移動を測定し（図４参照）、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムで成長因子減少マトリゲルをコーティングした後、浸潤分析法（ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）で細胞浸潤を測定した（図５参照）。細胞移動の定量的分析と、細胞浸潤の測定は、下記のように遂行した。
【００５７】
具体的に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの下面を１０μｌの０．１％ゼラチンでコーティングして乾燥した。ＨＵＶＥＣを１％ＦＢＳが含まれたＭ１９９培養液で６時間飢餓培養した後、トリプシンで引き離して同じ倍地で分散した。多様な濃度のｓＰＴＫ７を加えてＨＵＶＥＣが１Ｘ１０６個／ｍｌになるようにした後、３０分間反応させた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上のチャンバに反応させたＨＵＶＥＣを０．１ｍｌずつ入れて、下のチャンバには、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと１％ＦＢＳとが含まれたＭ１９９培養液を入れて３７℃で４時間培養した。フィルターの下面に移動した細胞は、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）とエオシン（ｅｏｓｉｎ）とで染色した。
【００５８】
一方、細胞浸潤を測定する方法は、細胞移動を測定する方法と同一であるが、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上面にも１０ｍｇ／ｍｌ成長因子減少ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ８０μｌをコーティングして乾燥したものと培養時間が２４時間である点で差があった。培養が終了した後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの下面に移動するか、浸潤した血管内皮細胞を光学顕微鏡（２００倍）で観察した。
【００５９】
図４及び図５は、ＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの細胞移動及び浸潤に対するｓＰＴＫ７の影響を分析した結果である。ＨＵＶＥＣの細胞移動（図４）と細胞浸潤（図５）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムでそれぞれ成長因子減少マトリゲルを使わない条件と使う条件とでＶＥＧＦを化学遊走因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）として使って決定した。Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓ  ｔ−テストで統計分析して、ＶＥＧＦを処理していない対照群に対してＰ値が０．００１未満である場合に†††で、ＶＥＧＦを処理した対照群に対してＰ値が０．００１未満である場合に＊＊＊で表示した。
【００６０】
図４及び図５を通じて分かるように、ＶＥＧＦは、ＨＵＶＥＣの移動を３．３倍、浸潤を５倍増加させたが、ｓＰＴＫ７は、濃度によって細胞移動と浸潤とを減少させた。したがって、ｓＰＴＫ７は、濃度依存的にＶＥＧＦによって誘導されたＨＵＶＥＣの移動と浸潤いずれもを阻害することを確認した。
【００６１】
＜実施例７＞ｓＰＴＫ７による生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）血管新生抑制分析
ｓＰＴＫ７は、血管内皮細胞に対する細胞毒性がなく、血管形成、細胞移動及び浸潤を抑制するということを確認したので、ｓＰＴＫ７が生体内で血管新生を抑制することを予想することができた。これを証明するために、何も含まないか、２００ｎｇのマウスＶＥＧＦを含むか、または２００ｎｇのマウスＶＥＧＦと２０μｇのマウスｓＰＴＫ７とを含む０．６ｍｌ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭに２０ｕｎｉｔのヘパリンを追加して、７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスに腹部内皮と外皮との間に注射した。７日後、プラグを回収して写真撮影し、血管新生程度を定量するために、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬キット５２５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから購入）で各プラグのヘモグロビン数値を測定した。
【００６２】
図６及び図７には、ＶＥＧＦによって誘導される生体内血管新生に対するｓＰＴＫ７の影響を分析した結果を図示した。各グループ当たり５匹のマウスにマトリゲル、マウスＶＥＧＦを含むマトリゲルまたはマウスｓＰＴＫ７とＶＥＧＦとを含むマトリゲルをそれぞれ注射した。図６は、マトリゲル注射後、７日後に各グループのマウスから取り出したマトリゲルプラグで血管新生の状態を示す結果であり、図４は、血管新生程度を定量化するために、各マトリゲルプラグのヘモグロビン量を測定したものである。Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓ  ｔ−テストで統計分析して、ＶＥＧＦを処理していない対照群に対してＰ値が０．００１未満である場合に†††、ＶＥＧＦを処理した対照群に対してＰ値が０．０１未満である場合に＊＊で表示した。
【００６３】
測定結果、ＶＥＧＦのみ含まれたプラグは、さび色である一方、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ自体あるいはｓＰＴＫ７とＶＥＧＦとが共に含有されたプラグは、薄い黄色を帯び（図６参照）、ＶＥＧＦのみ含んだプラグには、ほぼ７ｇ／ｄｌのヘモグロビンがあったが、ｓＰＴＫ７とＶＥＧＦとが共に含まれたプラグでは、１．５ｇ／ｄｌに数値が減少した（図７参照）。前記結果から、ｓＰＴＫ７は、生体内で血管新生を抑制することを確認することができた。
【００６４】
＜実施例８＞血管内皮細胞でｓＰＴＫ７による信号伝逹タンパク質の活性化抑制分析
ｓＰＴＫ７がＨＵＶＥＣの血管形成、細胞移動と浸潤とを抑制する時に如何なる信号伝逹過程を抑制するかを調査した。未混濁培養された（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ）ＨＵＶＥＣを１％ＦＢＳが含まれたＭ１９９倍地で６時間飢餓培養させた。飢餓培養終了３０分前に４μｇ／ｍｌのｓＰＴＫ７を入れて培養した後、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを入れて１０分間（ＫＤＲ燐酸化分析の場合には、５分間）培養した。該培養が終了した細胞はＰＢＳで拭いた後、１００ｍｍプレート当たり３５０μｌの放射免疫沈澱分析（ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ；ＲＩＰＡ）緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％トリトン  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、２５ｍＭ  β−グリセロリン酸二ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で２０分間溶解し（ｌｙｓｉｓ）、４℃、１２，０００ｇで５分間遠心分離して上澄み液を得た。免疫沈澱の場合には、上澄み液３５０μｌに１μｇの抗体を入れた後、４℃で１２時間反応させた。それぞれの反応物にプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（５０％スラリー）２０μｌを入れて４℃で１時間反応させた後、遠心分離して沈殿物を得た。ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）の場合には、免疫沈殿物または細胞分解物上澄み液にＳＤＳゲルサンプルバッファーを入れて沸して試料を準備した後、ＳＤＳ−ＰＡＧに電気泳動してニトロセルロース膜にブロッティングし、抗体を反応させた。ＰＩ３キナーゼ活性は、免疫沈殿物を用いて競争ＥＬＩＳＡキット（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ，ＵＳＡから購入）で測定した。
【００６５】
図８から分かるように、ｓＰＴＫ７は、ＨＵＶＥＣでＶＥＧＦによって誘導されたＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）燐酸化を抑制し、Ａｋｔ燐酸化も抑制しただけではなく、Ａｋｔを活性化するＰＩ３キナーゼの活性も抑制した。ＰＩ３キナーゼは、血管形成サイトカイン（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の発現を増加させるなどの役割で血管形成、細胞移動及び細胞浸潤と深い連関があると知られている（Ｂｒａｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄＥｃｃｌｅｓ，Ｓ．Ａ．，Ｔｕｍｏｒｉ  ９０：２−８）。また、Ａｋｔは、内皮細胞の生存、繁殖及び移動だけではなく、血管成熟及び透過性にも寄与して、血管形成で重要な役割をすると知られている（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１１：１１８８−１１９６；Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ  １２９：１２６１−１２７４）。このような結果を総合して見る時、ｓＰＴＫ７による内皮細胞の移動、浸潤及び血管形成阻害にＰＩ３キナーゼ及びＡｋｔ活性化阻害が重要な役割をするということを予想することができた。
【００６６】
さらに、ｓＰＴＫ７は、ＨＵＶＥＣでｂＦＧＦによって誘導されたＡｋｔの燐酸化も抑制した。したがって、ｓＰＴＫ７は、ＶＥＧＦやｂＦＧＦなどの多様な信号伝逹誘導子によって活性化されたＰＩ３キナーゼ及びＡｋｔなどの細胞内信号伝逹過程を遮断することによって、血管新生、細胞移動及び浸潤を阻害すると予想された。
【００６７】
内皮細胞にＶＥＧＦを処理すれば、局所付着キナーゼ（Ｆｏｃａｌ  ＡｄｈｅｓｉｏｎＫｉｎａｓｅ；ＦＡＫ）とパキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎ）のチロシン燐酸化が誘発されると知られている（Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２６９８８−２６９９５；Ａｂｅｄｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｚａｃｈａｒｙ，Ｉ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１５４４２−１５４５１）。また、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ信号機作は、ＶＥＧＦによって促進されたアクチン再構成（ａｃｔｉｎ  ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）と内皮細胞の移動とに関与すると報告されたことがある（Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｒｕｉｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８６：８９２−８９６；Ｒａｄｉｓａｖｌｊｅｖｉｃ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：２０７７０−２０７７４）。
【００６８】
ＦＡＫとパキシリンとの活性化でｓＰＴＫ７の影響を確認するために、前記の実施例のような方法でＨＵＶＥＣにｓＰＴＫ７とＶＥＧＦとを処理した後、ＦＡＫとパキシリンとをそれぞれの抗体で免疫沈澱した後、リン酸化チロシン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）抗体でウェスタンブロットを遂行して、ＦＡＫとパキシリンの燐酸化を分析した。具体的に、免疫蛍光顕微鏡（ｉｍｍｕｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）のために、飢餓培養したＨＵＶＥＣにｓＰＴＫ７を３０分間処理し、ＶＥＧＦを加えた後、１時間培養した。該培養した細胞を３．７％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を１０分間処理して細胞を固定して、０．５％トリトン  Ｘ−１００で５分間処理した後、３％ＢＳＡで１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。引き続き、パキシリンの抗体で２時間反応させ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ２次抗体とＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ−ＦＩＴＣとを入れて１時間反応させた後、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。その結、図９から分かるように、ｓＰＴＫ７が、ＦＡＫ及びパキシリンの活性化で及ぼす影響を観察したところ、ＨＵＶＥＣでｓＰＴＫ７は、ＶＥＧＦによって誘導されたＦＡＫ及びパキシリンのチロシン燐酸化を抑制すると観察された。
【００６９】
したがって、ｓＰＴＫ７は、局所付着形成とアクチン再構成とを阻害することによって、血管内皮細胞の付着及び移動を抑制すると予想することができた。このような結果から見る時、ＰＴＫ７機能阻害は、血管内皮細胞だけではなく、ＰＴＫ７を発現する他の類型の細胞でも、細胞移動、細胞浸潤、細胞付着などを抑制すると予想することができた。
【００７０】
＜実施例９：人間ＰＴＫ７の細胞外ドメイン部分の最小活動断片の結晶＞
人間ＰＴＫ７細胞外ドメインの最少活性部位を決定するために、ｓＰＴＫ７の欠失変異型（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ）を製作した。具体的に、図１に示すように、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１３−Ｈｉｓ［一番目のＩｇ  ｌｏｏｐから三番目のＩｇ  ｌｏｏｐ及び四番目のＩｇ  ｌｏｏｐ一部（配列番号２のアミノ酸配列３１番から３４４番）及びＨｉｓ  ｔａｇを発現］、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓ［一番目のＩｇ  ｌｏｏｐから四番目のＩｇ  ｌｏｏｐ及び五番目のＩｇ  ｌｏｏｐ一部（配列番号２のアミノ酸配列３１番から４３６番）及びＨｉｓ  ｔａｇを発現］及びｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１５−Ｈｉｓ［一番目のＩｇ  ｌｏｏｐから五番目のＩｇ  ｌｏｏｐ及び六番目のＩｇ  ｌｏｏｐ一部（配列番号２のアミノ酸配列３１番から５２８番）及びＨｉｓ  ｔａｇを発現］は、それぞれ最後のコドンの次にＨｉｓ  ｔａｇコドンと翻訳終了コドンとを有するように重合連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）方法で突然変異させた。
【００７１】
そのうち、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓの製作は、下記のように遂行した。先立って製造された人間ｓＰＴＫ７発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３−ｈＰＴＫ７−Ｅｘｔ−Ｈｉｓ）で人間ＰＴＫ７タンパク質の細胞外ドメインのうち五番目のＩｇ  ｌｏｏｐ初入の４３６番目のアミノ酸に連結されてＨｉｓ−ｔａｇ暗号化配列と翻訳終了コドンとを含むようにＰＣＲを通じて増幅させた。ＰＣＲに使われたプライマー対は、５´−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３´（ｐｃＤＮＡ３ベクターのＴ７プロモーター塩基配列８６３−８８２）と五番目のＩｇ  ｌｏｏｐ初入部分に対する５´−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＡＴＣＣＡＡ−３´［配列番号１の塩基配列１４５３−１４７０、Ｈｉｓ−ｔａｇ暗号化配列（前記配列のうち下線部分）、終了コドン及びＸｂａＩサイト（前記配列のうちイタリック体の部分）］であった。以後、実施例２でのように、前記ＰＣＲ結果物とｐｃＤＮＡ３．１ベクターとをＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで切断して断片を接合させることによって、人間ＰＴＫ７細胞外ドメインの一番目のＩｇ  ｌｏｏｐから四番目のＩｇ  ｌｏｏｐ及び五回目のＩｇ  ｌｏｏｐ一部（配列番号２のアミノ酸配列１番から４３６番）及びＨｉｓ  ｔａｇを発現するｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓプラスミドを得た。残りのプラスミドも、このような方法でそれぞれ得た。
【００７２】
ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ−Ｈｉｓ［五番目のＩｇ  ｌｏｏｐ初入部分を除いた、一番目のＩｇ  ｌｏｏｐから四番目のＩｇ  ｌｏｏｐまでの部分（配列番号２のアミノ酸配列３１番から４０９番）及びＨｉｓ  ｔａｇを発現］の場合には、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓで配列番号１の塩基配列１３９０番から１４７０番をＰＣＲで欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）した。ＰＣＲに使われたプライマー対は、５´−ＣＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣ−３´［配列番号１の塩基配列１３７７−１３８９、Ｈｉｓ−ｔａｇ暗号化配列（前記配列のうち下線部分）、終了コドン及びＸｂａＩサイト（前記配列のうちイタリック体の部分）とｐｃＤＮＡ３．１ベクターの塩基配列９９７−１００１（前記配列のうちゴシック体の部分）］と５´−ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣ−３´（Ｈｉｓ−ｔａｇ暗号化配列のうち一部（前記配列のうち下線部分）と配列番号１の塩基配列１３６２−１３８９）であった。前記ＰＣＲ結果物をＤｐｎＩを処理した後、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大膓菌にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎさせてコロリを選別、培養して欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）されたプラスミドを得た。製造されたプラスミドは、双方向配列確認を通じてＰＣＲ誤差がないということを確認した。
【００７３】
この実施例で製作した人間ＰＴＫ７細胞外ドメイン部分の発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１３−Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ−Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓ及びｐｃＤＮＡ３．１−ｈＰＴＫ７−Ｉｇ１５−Ｈｉｓ）を実施例３のように発現、錠剤して、図１のようにＰＴＫ７−Ｉｇ１３−Ｈｉｓ（人間ＰＴＫ７タンパク質のアミノ酸配列３１番から３４４番）、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ−Ｈｉｓ（人間ＰＴＫ７タンパク質のアミノ酸配列３１番から４０９番）、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓ（人間ＰＴＫ７タンパク質のアミノ酸配列３１番から４３６番）及びＰＴＫ７−Ｉｇ１５−Ｈｉｓ（人間ＰＴＫ７タンパク質のアミノ酸配列３１番から５２８番）を確保した。
【００７４】
該確保されたＰＴＫ７−Ｉｇ１３−Ｈｉｓ、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ−Ｈｉｓ、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓ及びＰＴＫ７−Ｉｇ１５−Ｈｉｓが、細胞移動に影響を及ぼすかを確認するために、実施例６のように細胞移動を測定した。図１０から分かるように、ＨＵＶＥＣの移動は、ＶＥＧＦとｓＰＴＫ７またはその断片を処理していない時に比べて、ＶＥＧＦのみ処理した時、３．３倍増加させた。
【００７５】
ＰＴＫ７−Ｉｇ１３−Ｈｉｓは、濃度によって細胞移動を減少させることができなかったが、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ−Ｈｉｓ、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓ、ＰＴＫ７−Ｉｇ１５−Ｈｉｓ及びｓＰＴＫ７は、濃度によって細胞移動を類似した程度に減少させた。Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓ  ｔ−テストで統計分析して、ＶＥＧＦを処理していない対照群に対してＰ値は０．００１未満であり、ＶＥＧＦを処理した対照群に対してＰＴＫ７−Ｉｇ１３−Ｈｉｓは、Ｐ値が０．０１未満であったが、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ−Ｈｉｓ、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４−Ｈｉｓ、ＰＴＫ７−Ｉｇ１５−Ｈｉｓ、ｓＰＴＫ７は、Ｐ値が０．００１未満であった。したがって、ＰＴＫ７−Ｉｇ１４ｓ−Ｈｉｓが、人間ＰＴＫ７細胞外ドメイン部分の最小活性断片を含み、人間ＰＴＫ７細胞外ドメイン部分で四番目のＩｇ  ｌｏｏｐ部分（人間ＰＴＫ７タンパク質の３２７番から４０９番アミノ酸配列）が完全な形態で存在するものがＰＴＫ７の機能に重要であるいうことを確認した。
【００７６】
＜実施例１０＞ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）方法によるＰＴＫ７ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）時に血管内皮細胞の血管形成及びＡｋｔ燐酸化阻害分析
ｓＰＴＫ７の以外にＰＴＫ７機能を遮断することができる他の方法として、ＲＮＡ干渉現象が活用されることがあるかを確認した。具体的に、ＰＴＫ７の小規模抑制ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）を処理するか、ＰＴＫ７  ｓｉＲＮＡを発現するＰＴＫ７のｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）ベクターを処理してＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘発させることによって、ＰＴＫ７の発現をノックダウンした後、血管内皮細胞の血管形成とＡｋｔ燐酸化とに及ぼす影響を分析した。ＨＵＶＥＣでＰＴＫ７  ｓｉＲＮＡを使ったＰＴＫ７のノックダウンは、下記の方法で遂行された。６ｃｍの培養皿で培養されたＨＵＶＥＣを血清減少倍地（ｓｅｒｕｍ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）で交換した後、１００ｎＭのｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社のＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ系のＪ−００３１６７−１３、Ｊ−００３１６７−１４、Ｊ−００３１６７−１５及びＪ−００３１６７−１６）、またはこれらの混合物（図１１参照）をリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を用いて４時間培養して核酸伝達感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。該核酸伝達感染されたＨＵＶＥＣを２０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ、３ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び５ｕｎｉｔ／ｍｌのヘパリンを含有したＭ１９９倍地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）に変えた後、４８時間培養した。ＨＵＶＥＣでＰＴＫ７のノックダウン程度を分析した結果、個別ＰＴＫ７−ｓｉＲＮＡであるＪ−００３１６７−１４、Ｊ−００３１６７−１５、Ｊ−００３１６７−１６及びＰＴＫ７  ｓｉＲＮＡ混合物が陰性コントロール（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べてＰＴＫ７の発現を７０％以上減少させ、これらのノックダウン効能が高いということを示した（図１２参照）。
【００７７】
一方、ＨＥＫ２９３でＰＴＫ７  ｓｈＲＮＡベクターを使ったＰＴＫ７のノックダウンは、下記の方法で遂行された。６ｃｍの培養皿で培養されたＨＥＫ２９３細胞に燐酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）方法で５μｇのＭｉｓｓｉｏｎ  ＴＲＣ  ｓｈＲＮＡベクター（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社のＭｉｓｓｉｏｎ  ＴＲＣ  ｓｈＲＮＡ系のＴＲＣＮ００００００６４３１、ＴＲＣＮ００００００６４３２、ＴＲＣＮ００００００６４３３、ＴＲＣＮ００００００６４３４及びＴＲＣＮ００００００６４３５、図１３参照）をそれぞれ核酸伝達感染させた。該核酸伝達感染されたＨＥＫ２９３細胞を１２時間後、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ倍地に変えた後、４８時間培養した。ＨＥＫ２９３でそれぞれのＰＴＫ７  ｓｈＲＮＡベクターによるＰＴＫ７のノックダウン程度を分析した結果、特に、ＴＲＣＮ００００００６４３３とＴＲＣＮ００００００６４３４とが陰性コントロールに比べてＰＴＫ７の発現を７０％以上減少させ、これらのＰＴＫ７ノックダウン効果が高いということを確認した（図１４参照）。
【００７８】
前記結果でのように、ＰＴＫ７のノックダウンが細胞機能に及ぼす影響を分析するために、ＰＴＫ７  ｓｉＲＮＡ混合物を使った。図１５は、ＨＵＶＥＣでＰＴＫ７のノックダウンがＶＥＧＦによって誘導された血管形成に及ぼす影響を分析した結果である。ＰＴＫ７ノックダウンＨＵＶＥＣを成長因子減少マトリゲル上に載せて１６時間培養した後、生成された血管数を測定し、Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓ  ｔ−テストで統計分析して、ＶＥＧＦを処理していない対照群（ｍｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）に対してＰ値が０．０１未満である場合に††、Ｐ値が０．００１未満である場合に†††、ＶＥＧＦを処理した対照群（ｍｏｃｋ＋ＶＥＧＦ）に対してＰ値が０．００１未満である場合に＊＊＊で表示した。図１５から分かるように、虚偽核酸伝達感染（ｍｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させたＨＵＶＥＣにＶＥＧＦを処理した時、血管形成が４５％程度増加し、対照群ｓｉＲＮＡを核酸伝達感染させたＨＵＶＥＣでも虚偽核酸伝達感染させたＨＵＶＥＣと類似したレベルでＶＥＧＦによる血管形成が観察されたが、ＰＴＫ７をノックダウンしたＨＵＶＥＣでは、ＶＥＧＦによって誘導された血管形成が抑制された。また、血管形成と同様にＡｋｔ燐酸化分析でも、虚偽核酸伝達感染させたＨＵＶＥＣにＶＥＧＦを処理した時、Ａｋｔの燐酸化が増加し、対照群ｓｉＲＮＡを核酸伝達感染させたＨＵＶＥＣでも虚偽核酸伝達感染させたＨＵＶＥＣと類似したレベルでＡｋｔ燐酸化が観察されたが、ＰＴＫ７をノックダウンしたＨＵＶＥＣでは、ＶＥＧＦによって誘導されたＡｋｔ燐酸化が抑制された。血管内皮細胞でＰＴＫ７ノックダウンがｓＰＴＫ７処理のような効果を示すので、ｓＰＴＫ７が内生的ＰＴＫ７の機能を遮断して、細胞の移動、浸潤及び血管新生を抑制するということを確認することができた。
【００７９】
＜実施例１１＞ＰＴＫ７抗体によるＰＴＫ７機能阻害時に血管内皮細胞のＡｋｔ燐酸化阻害分析
ｓＰＴＫ７の以外にＰＴＫ７機能を遮断することができる他の方法として、ＰＴＫ７の抗体が活用されることがあるかを分析した。以前実施例で、ｓＰＴＫ７処理によってＰＴＫ７の機能が阻害された時、細胞移動、浸潤、血管新生が減少するものとＡｋｔ燐酸化が減少するものとを示したことがある。したがって、ｓＰＴＫ７の抗体を処理した後、血管内皮細胞でＡｋｔ燐酸化に及ぼす影響を分析した。
【００８０】
ｓＰＴＫ７の抗体によってＨＵＶＥＣでＡｋｔ燐酸化に及ぼす影響を観察するために、飢餓培養終了３０分前に２μｇ／ｍｌのｓＰＴＫ７抗血清を入れて培養した後、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを入れて１０分間培養した。ＰＴＫ７抗−血清は、実施例１０で説明したように、錠剤したｓＰＴＫ７を兎に注射して製作し、ＰＴＫ７を特異的に認識することを確認した後に使った。培養が終了した細胞は、ＰＢＳで拭いた後、６０ｍｍプレート当たり１２０μｌの免疫沈澱分析緩衝溶液で実施例８のような方法で上澄み液を得た。引き続き、細胞分解物上澄み液を対象にウェスタンブロットを遂行した。
【００８１】
図１６は、ＨＵＶＥＣでＰＴＫ７の抗血清が、ＶＥＧＦによって誘導されたＡｋｔの燐酸化に及ぼす影響を分析した結果である。ｓＰＴＫ７の抗血清は、ＶＥＧＦによって誘導されたＡｋｔの燐酸化を抑制すると観察された。ｓＰＴＫ７の抗血清が、ｓＰＴＫ７処理と類似した効果を示すので、ｓＰＴＫ７の抗血清には、ＰＴＫ７中和ポリクローナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体を含んでいるので、ＰＴＫ７の機能を阻害することを表わす。したがって、ＰＴＫ７中和ポリクローナル抗体だけではなく、ＰＴＫ７中和モノクローナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体は、ＰＴＫ７の機能を阻害して細胞移動、浸潤、血管新生を抑制する方法になり得る。
【００８２】
結局、本発明の実施例を通じてｓＰＴＫ７処理、ＰＴＫ７ノックダウン、ＰＴＫ７中和抗体（ＰＴＫ７  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）処理の以外にも、ＰＴＫ７の機能を阻害するｓＰＴＫ７発現、ＰＴＫ７中和アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）処理などの方法も細胞の移動、浸潤を阻害し、血管内皮細胞の正常な機能を遮断して血管新生を抑制することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明による細胞移動、細胞浸潤及び血管新生の抑制剤は、細胞移動、浸潤及び血管新生と連関した転移癌腫（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含めた多様な疾病の治療に使われ、対象細胞も血管内皮細胞のみに限らず、ＰＴＫ７を発現する多種の細胞に適用されて細胞の移動、浸潤、付着を抑制するのに活用されうる。
【図１】
2010522775.tif 000003
【図２】
2010522775.tif 000004
【図３】
2010522775.tif 000005
【図４】
2010522775.tif 000006
【図５】
2010522775.tif 000007
【図６】
2010522775.tif 000008
【図７】
2010522775.tif 000009
【図８】
2010522775.tif 000010
【図９】
2010522775.tif 000011
【図１０】
2010522775.tif 000012
【図１１】
2010522775.tif 000013
【図１２】
2010522775.tif 000014
【図１３】
2010522775.tif 000015
【図１４】
2010522775.tif 000016
【図１５】
2010522775.tif 000017
【図１６】
2010522775.tif 000018
【配列表】
2010522775000001.app
【国際調査報告】
2010522775.tif 000019
2010522775.tif 000020
2010522775.tif 000021
2010522775.tif 000022
2010522775.tif 000023