(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
0006401713.tif 000019
の構造を有する化合物を得るための方法であって、
ａ）有機溶媒、窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物、式ＩＩ
【化２】
0006401713.tif 000020
の構造を有する化合物及び式ＩＩＩ
【化３】
0006401713.tif 000021
の構造を有する化合物を反応混合物として混ぜ合わせるステップと、
ｂ）前記反応混合物を２５℃から５５℃の温度に維持するステップと、
ｃ）前記反応混合物から式Ｉの構造を有する化合物を分離するステップと
を含み、それにより、式Ｉの構造を有する化合物を得る方法であり、
式中、
Ｒ１が（ＣＨ２）ｅ−Ｏ−（ＣＨ２）ｆ−Ｈであり、ｅが１〜５から選択される整数であり、ｆが１〜５から選択される整数であり、及び
Ｒ２が水素である、上記方法。
【請求項２】
式Ｉの構造を有する前記化合物が、
【化４】
0006401713.tif 000022
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式ＩＩの構造を有する前記化合物がラパマイシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１がＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｅとｆの合計が７以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
窒素ヘテロ原子を有する前記有機塩基化合物が、式ＩＶ
【化５】
0006401713.tif 000023
（式中、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、及びＲｇは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜５アルキル、ＯＨ及びＮＨ２からなる群から選択される）
の構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
窒素ヘテロ原子を有する前記有機塩基化合物が、２，６−ルチジン及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
窒素ヘテロ原子を有する前記有機塩基化合物が、２，６−ルチジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）の前記維持するステップが、２〜１０時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）の維持温度が２５から４０℃である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒が、トルエン又は塩化メチレンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
式ＩＩＩの構造を有する前記化合物対式ＩＩの構造を有する前記化合物のモル比が、３０対１から６０対１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
窒素ヘテロ原子を有する前記有機塩基化合物対式ＩＩの構造を有する前記化合物のモル比が、８０対１から１２０対１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記比が１０４対１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
窒素ヘテロ原子を有する前記有機塩基化合物が、２回の別々の部分で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
式Ｉの構造を有する前記化合物を分離するステップが、クロマトグラフィーを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記クロマトグラフィーが、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー及び薄層クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記クロマトグラフィーが、シリカゲルカラムクロマトグラフィーであり、前記クロマトグラフィーが、酢酸エチル、ヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される１種又は複数の溶媒を含む移動相を使用して行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
式Ｉの構造を有する前記化合物を固体化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
式Ｉの構造を有する前記化合物を固体化するステップが、
ａ）式Ｉの構造を有する前記化合物をメタノール中で可溶化するサブステップと
ｂ）式Ｉの構造を有する前記化合物を水から析出させるサブステップと
を含み、それにより、式Ｉの構造を有する前記化合物を固体化する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年１月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／７５５，３８８号の優先権を主張するものであり、この出願の全体を参照によって本明細書に組み込む。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発のもとで行われた発明に対する権利に関する声明
適用なし
【０００３】
コンパクトディスクにより提出される「配列表」、表又はコンピュータプログラムリストの付属の参照
適用なし
【背景技術】
【０００４】
バイオリムスＡ９（登録商標）（ＢＡ９としても知られている）は、平滑筋細胞の増殖及び再狭窄を予防するために冠動脈ステントの薬物コーティングとして開発された活性医薬成分である。ＢＡ９は、ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）によって合成される市販のマクロライド天然物であるラパマイシン（シロリムスとしても知られている、ＣＡＳ［５３１２３−８８−９］）に構造的に関連する。「リムス」ファミリーのその他のメンバーとしては、エベロリムス（ＣＡＳ［１５９３５１−６９−６］）、ゾタロリムス（ＣＡＳ［２２１８７７−５４−９］）及びテムシロリムス（ＣＡＳ［１６２６３５−０４−０３］）が挙げられる。このファミリーのメンバーは、インビボにおいて免疫抑制、抗真菌、抗腫瘍及び／又は抗炎症作用があることが知られおり、移植拒絶反応、感染症、自己免疫疾患及び過度の細胞増殖によって特徴づけられる症状の治療に有用である。ＢＡ９の化学構造は、３１員環トリエンマクロライドラクトンからなり、これは、根幹を成すラパマイシン環状構造を保ち、ラパマイシンのヒドロキシル基がエトキシエチル基によりアルキル化された４０位の側鎖の付加物のみが異なる。
【０００５】
シロリムス及びその他のシロリムス誘導体と比較したＢＡ９の化学構造を図１に提供する。この構造は、４０位がエトキシエチル化されたラパマイシンの３１員環マクロライドトリエンラクトン環からなる。ＢＡ９は、シロリムスのように、細胞内のイムノフィリンタンパク質ＦＫＢＰ１２と結合する。結果として生じたマクロライド／ＦＫＢＰ−１２複合体は、その後、シロリムスと同様の様式で細胞周期の進行に重要なタンパク質であるｍＴＯＲと結合すると考えられている。ｍＴＯＲの不活性化により、いくつかの特定のシグナル伝達経路が抑制され、細胞周期がＧ１からＳ期で停止させられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＢＡ９及びその他のラパマイシン誘導体の治療上の価値を考慮すると、このファミリーの活性剤を調製するための改善された方法が必要とされている。本発明は、この需要及びその他の需要に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、式Ｉ
【化１】
0006401713.tif 000002
の構造を有する化合物を得るための方法を提供する。
本方法は、
ａ）有機溶媒、窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物、式ＩＩ
【化２】
0006401713.tif 000003
の構造を有する化合物及び式ＩＩＩ
【化３】
0006401713.tif 000004
の構造を有する化合物を反応混合物として混ぜ合わせるステップと、
ｂ）反応混合物を約２５℃から約５５℃の温度に維持するステップと、
ｃ）反応混合物から式Ｉの構造を有する化合物を分離するステップと、
を含み、それにより式Ｉの構造を有する化合物を得る、方法であって、
式中、
Ｒ１は、Ｒａ−（Ｏ）ｄ−Ｒｂからなる群から選択され、
Ｒａは、Ｃ１〜５アルキレンであり、Ｒｂは、Ｃ１〜５アルキル；Ｃ１〜５アルキレン−ＯＨ；Ｃ６〜１０アリールＣ１〜５アルキル；Ｃ６〜１０アリールＣ１〜５アルコキシ；Ｃ１〜５アルコキシＣ１〜５アルキル；アシル；アシルＣ１〜５アルキル；アミノＣ１〜５アルキル；Ｃ１〜５アルキルアミノＣ１〜５アルキル；アシルアミノＣ１〜５アルキル；Ｃ１〜５アルコキシカルボニルアミノＣ１〜５アルキル；及びＣ６〜１０アリール；
であり、
Ｒ２は水素であり、
下付文字ｄは、０〜１から選択される整数である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】シロリムス、バイオリムスＡ９及び関連する誘導体の化学構造を示す図である。
【０００９】
【図２】本発明の方法によるラパマイシン誘導体の調製のための合成スキームを示す図である。
【００１０】
【図３】図３Ａは、５０〜５５℃で合成された粗製ＢＡ９のＨＰＬＣ分析を示すグラフである。  図３Ｂは、４０℃で合成された粗製ＢＡ９のＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Ｉ．全般
本発明は、バイオリムスＡ９（ＢＡ９）を含むラパマイシン誘導体を得るための改善された方法を提供する。式Ｉの化合物を得るためのラパマイシンの誘導体化についての一般スキームを図２に示す。本方法は、制御された温度における適したトリフラートとのラパマイシンの反応、それに続く後処理及び生成物の単離を含む。方法の各種ステップは、本明細書に記載されている。
【００１２】
ラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体を合成する前述の方法は、反応性のヒドロキシル基に修飾を有する望ましくない副生成物を生成することが確認された。所望の誘導体と同様に非極性の特性をもつこれらの副生成物は、収率を著しく低下させ、精製を複雑にする。驚くべきことに、合成の温度を制御することによって、副生成物の生成を劇的に減少させることができることがわかった。反応条件の小さな変更が、生成物の収率及び純度の驚くほど大きな改善につながる。これらの予想外の利点については、下に詳細に記載する。
【００１３】
ＩＩ．定義
「反応混合物として混ぜ合わせること」とは、少なくとも２つの別個の化学種が一緒に混ざり、最初の反応体のうちの１種を修飾するか又は第３の別個の化学種である生成物を形成するかのいずれかの反応をすることができるように、少なくとも２つの別個の化学種を接触させるプロセスを指す。しかしながら、得られる反応生成物は、添加された試薬間の反応或いは１種又は複数の添加された試薬から反応混合物中に生成され得る中間体から直接生成することができることが認識されるべきである。
【００１４】
「有機溶媒」とは、周囲温度及び圧力において液体であり、実質的に水を含まない炭素含有物質を指す。有機溶媒の例としては、これらに限定されるものではないが、トルエン、塩化メチレン、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド及び石油エーテルが挙げられる。
【００１５】
「有機塩基化合物」とは、プロトン（すなわち、水素陽イオン）を受け取ることができ、塩基の共役酸を形成する炭素ベースの分子を指す。一般に、本発明の方法に使用される有機塩基化合物は、少なくとも１つの窒素ヘテロ原子を含む。有機塩基化合物の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒューニッヒ塩基（すなわち、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）、２，６−ルチジン（すなわち、２，６−ジメチルピリジン）などのルチジン、トリエチルアミン及びピリジンが挙げられる。
【００１６】
「分離すること」とは、化合物及び少なくとも１種の他の物質を含む混合物から化合物の少なくとも一部を単離するプロセスを指す。単離された化合物は、混合物中に存在する少なくとも１種の他の物質を実質的に含まない。
【００１７】
「アルキル」とは、示された数の炭素原子を有する直鎖又は分岐の飽和脂肪族ラジカルを指す。アルキルは、Ｃ１〜２、Ｃ１〜３、Ｃ１〜４、Ｃ１〜５、Ｃ１〜６、Ｃ１〜７、Ｃ１〜８、Ｃ１〜９、Ｃ１〜１０、Ｃ２〜３、Ｃ２〜４、Ｃ２〜５、Ｃ２〜６、Ｃ３〜４、Ｃ３〜５、Ｃ３〜６、Ｃ４〜５、Ｃ４〜６及びＣ５〜６などの任意の数の炭素を含んでもよい。例えば、Ｃ１〜６アルキルとしては、以下に限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。アルキルは、以下に限定されるものではないが、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどの最大２０個の炭素原子を有するアルキル基を指す場合もある。
【００１８】
「アルキレン」とは、示された数の炭素原子を有し、少なくとも２つの他の基と結合している直鎖又は分岐の飽和脂肪族ラジカル、すなわち、二価の炭化水素ラジカルを指す。アルキレンと結合する２つの部分は、アルキレン基の同じ原子又は異なる原子と結合してもよい。例えば、直鎖アルキレンは、−（ＣＨ２）ｎ−の２価のラジカルであってもよい、この場合、ｎは１、２、３、４、５又は６である。代表的なアルキレン基としては、これらに限定されるものではないが、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンチレン及びヘキシレンが挙げられる。
【００１９】
「アルケニル」とは、少なくとも２個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する直鎖又は分岐の炭化水素を指す。アルケニルは、Ｃ２、Ｃ２〜３、Ｃ２〜４、Ｃ２〜５、Ｃ２〜６、Ｃ２〜７、Ｃ２〜８、Ｃ２〜９、Ｃ２〜１０、Ｃ３、Ｃ３〜４、Ｃ３〜５、Ｃ３〜６、Ｃ４、Ｃ４〜５、Ｃ４〜６、Ｃ５、Ｃ５〜６及びＣ６などの任意の数の炭素を含んでもよい。アルケニル基は、以下に限定されるものではないが、１、２、３、４、５個以上を含む任意の適した数の二重結合を有してもよい。アルケニル基の例としては、これらに限定されるものではないが、ビニル（エテニル）、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、イソペンテニル、１，３−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，５−ヘキサジエニル、２，４−ヘキサジエニル、及び１，３，５−ヘキサトリエニルが挙げられる。
【００２０】
「アルキニル」とは、少なくとも２個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する直鎖又は分岐のいずれかの炭化水素を指す。アルキニルは、Ｃ２、Ｃ２〜３、Ｃ２〜４、Ｃ２〜５、Ｃ２〜６、Ｃ２〜７、Ｃ２〜８、Ｃ２〜９、Ｃ２〜１０、Ｃ３、Ｃ３〜４、Ｃ３〜５、Ｃ３〜６、Ｃ４、Ｃ４〜５、Ｃ４〜６、Ｃ５、Ｃ５〜６及びＣ６などの任意の数の炭素を含んでもよい。アルキニル基の例としては、これらに限定されるものではないが、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、ブタジイニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、イソペンチニル、１，３−ペンタジイニル、１，４−ペンタジイニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジイニル、１，４−ヘキサジイニル、１，５−ヘキサジイニル、２，４−ヘキサジイニル、及び１，３，５−ヘキサトリイニルが挙げられる。
【００２１】
「アリール」とは、任意の適した数の環原子及び任意の適した数の環を有する芳香族環系を指す。アリール基は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６環原子などの任意の適した数の環原子、並びに６から１０、６から１２又は６から１４環員を含んでもよい。アリール基は、単環式でもよく、融合されて二環式若しくは三環式基を形成してもよく、又は結合によって連結されてビアリール基を形成してもよい。代表的なアリール基としては、フェニル、ナフチル及びビフェニルが挙げられる。その他のアリール基としては、メチレン連結基を有するベンジルが挙げられる。一部のアリール基は、６から１２環員を有し、例えば、フェニル、ナフチル又はビフェニルである。
【００２２】
「アルコキシ」とは、アルキル基を結合点とつなぐ酸素原子を有するアルキル基：アルキル−Ｏ−を指す。アルキル基に関しては、アルコキシ基は、Ｃ１〜６などの任意の適した数の炭素原子を有してもよい。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、２−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが挙げられる。
【００２３】
「カルボニル」とは、炭素−酸素二重結合（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−）からなる部分を指す。
【００２４】
「アシル」とは、本明細書に記載されるとおりのアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に結合された本明細書に記載されるとおりのカルボニル基を含む部分を指す。
【００２５】
「モル比」とは、第２の化学種又はあらゆる他の追加の化学種のモル数に対する第１の化学種のモル数の比を指す。
【００２６】
「クロマトグラフィー」とは、混合物を固定相に接触させ、移動相を使用して固定相から化合物を溶出することによって、混合物中の１種又は複数の他の化合物からある化合物を分離するプロセスを指す。クロマトグラフィーの例としては、ガスクロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。クロマトグラフィーは、例えば、化学反応の進行を分析するため又は化学合成後の物質を純化するために行われてもよい。マイクログラムからキログラムにおよぶ材料の量がクロマトグラフィー分離に一般に使用されるが、その他の量が使用されてもよい。
【００２７】
「固体化すること」とは、溶液中の化合物を合体させて固形物の物質にさせるプロセスを指す。溶液中の化合物の全体又はその任意の部分を固体化してもよい。固形物は、アモルファス又は結晶の物質であってもよい。「析出させること」とは、物質をアモルファスの形態に固体化することを指す。
【００２８】
「可溶化すること」とは、固形物の物質を溶媒に溶解させて溶液を形成するプロセスを指す。固形物質の全体又はその任意の部分を溶解させてもよい。溶けていない材料が、溶媒中に懸濁の形態で存在してもよい。
【００２９】
「約」という用語は、本明細書中で数値を修飾するために使用される場合、その明確な値の前後の近い範囲を意味する。「Ｘ」が値である場合、「約Ｘ」は、０．９Ｘから１．１Ｘの値、より好ましくは、０．９５Ｘから１．０５Ｘの値を意味するであろう。「約Ｘ」のいかなる言及も、少なくとも値Ｘ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１．０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ及び１．０５Ｘを具体的に示す。それにより、「約Ｘ」は、例えば、「０．９８Ｘ」の請求項の限定に明細書の裏付けを教示及び提供することが意図される。
【００３０】
ＩＩＩ．本発明の実施形態
本発明の方法は、多数のマクロライド誘導体を調製するために使用することができる。式Ｉ及びＩＩに従った構造を有するものを含むマクロライドは、大環状ラクトン環によって特徴づけられるポリケチド天然物及び合成類似体である。本発明の方法は、ラパマイシン誘導体であるバイオリムスＡ９（ＢＡ９）、エベロリムス、ゾタロリムス及びテムシロリムスの調製に特に有用である。その他のマクロライド誘導体も、本発明の方法を使用して調製することができる。
【００３１】
したがって、本発明の一部の実施形態は、式Ｉ
【化４】
0006401713.tif 000005
の構造を有する化合物を得るための方法を提供する。
本方法は、
ａ）有機溶媒、窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物、式ＩＩ
【化５】
0006401713.tif 000006
の構造を有する化合物及び式ＩＩＩ
【化６】
0006401713.tif 000007
の構造を有する化合物を反応混合物として混ぜ合わせるステップと、
ｂ）反応混合物を約２５℃から約５５℃の温度に維持するステップと、
ｃ）反応混合物から式Ｉの構造を有する化合物を分離するステップと、
を含み、それにより、式Ｉの構造を有する化合物を得る、方法であって、
式中、
Ｒ１は、Ｒａ−（Ｏ）ｄ−Ｒｂからなる群から選択され、
Ｒａは、Ｃ１〜５アルキレンであり、Ｒｂは、Ｃ１〜５アルキル；Ｃ１〜５アルキレン−ＯＨ；Ｃ６〜１０アリールＣ１〜５アルキル；Ｃ６〜１０アリールＣ１〜５アルコキシ；Ｃ１〜５アルコキシＣ１〜５アルキル；アシル；アシルＣ１〜５アルキル；アミノＣ１〜５アルキル；Ｃ１〜５アルキルアミノＣ１〜５アルキル；アシルアミノＣ１〜５アルキル；Ｃ１〜５アルコキシカルボニルアミノＣ１〜５アルキル；及びＣ６〜１０アリール；
であり、
Ｒ２は水素であり、
下付文字ｄは、０〜１から選択される整数である。
【００３２】
一部の実施形態において、反応混合物は無色である。一部の実施形態において、反応の生成物は無色である。一部の実施形態において、本発明は、式Ｉ
【化７】
0006401713.tif 000008
の構造を有する化合物を得るための方法であって、
ａ）有機溶媒、窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物、式ＩＩ
【化８】
0006401713.tif 000009
の構造を有する化合物及び式ＩＩＩ
【化９】
0006401713.tif 000010
の構造を有する化合物を反応混合物として混ぜ合わせるステップと、
ｂ）無色の反応混合物を得るために反応混合物を約２５℃から約５５℃の温度に維持するステップと、
ｃ）無色の反応混合物から式Ｉの構造を有する化合物を分離するステップと、
を含み、これにより、式Ｉの構造を有する化合物を得る方法であり、
式中、
Ｒ１が、Ｒａ−（Ｏ）ｄ−Ｒｂからなる群から選択され、
Ｒａが、Ｃ１〜５アルキレンであり、Ｒｂは、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ１〜５アルキレン−ＯＨ、
Ｃ６〜１０アリールＣ１〜５アルキル；Ｃ６〜１０アリールＣ１〜５アルコキシ；Ｃ１〜５アルコキシＣ１〜５アルキル；アシル；アシルＣ１〜５アルキル；アミノＣ１〜５アルキル；Ｃ１〜５アルキルアミノＣ１〜５アルキル；アシルアミノＣ１〜５アルキル；Ｃ１〜５アルコキシカルボニルアミノＣ１〜５アルキル；及びＣ６〜１０アリール；
であり、
Ｒ２が水素であり、
下付文字ｄが、０〜１から選択される整数である、方法を提供する。
【００３３】
一部の実施形態において、式Ｉの構造を有する化合物は、以下のものである。
【化１０】
0006401713.tif 000011
【００３４】
一部の実施形態において、式ＩＩの構造を有する化合物はラパマイシンである。一部の実施形態において、Ｒ１はＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨである。一部の実施形態において、Ｒ１は（ＣＨ２）ｅ−Ｏ−（ＣＨ２）ｆ−Ｈであり、ｅは１〜５から選択される整数であり、ｆは１〜５から選択される整数である。一部の実施形態において、Ｒ１はＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３（すなわち、２−エトキシエチル）である。一部の実施形態において、ｅとｆの合計が７を超えない。
【００３５】
一部の実施形態において、式Ｉの化合物は、ＢＡ９、Ａ９としても知られているバイオリムスＡ９；４０−Ｏ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシン；４２−Ｏ−（２−エトキシエチル）−ラパマイシン；ウミロリムス；（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ、２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘキサデカヒドロ−９，２７−ジヒドロキシ−３−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−エトキシエトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−２３，２７−エポキシ−３Ｈピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペンタオン；及び（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ、１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１２−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−エトキシエトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペンタオンである。バイオリムスＡ９は、ＣＡＳ番号８５１５３６−７５−９によっても知られている。
【００３６】
式Ｉの化合物を形成するのに適した任意のトリフラート化合物が本発明の方法に使用されてもよい。一般に、本発明の方法に使用されるトリフラートは、式ＩＩＩに従った構造を有する。構造Ｒ１ＯＳＯ２ＣＦ３（すなわち、式ＩＩＩ）を有するトリフラートは、対応するアルコール（Ｒ１ＯＨ）とトリフルオロメタンスルホン酸、塩化トリフルオロメタンスルホニル、トリフルオロメタンスルホン酸無水物及び同種のものとの反応により調製されてもよい。トリフラートは、式Ｉの化合物を調製するのに特に有用であるが、アルコールＲ１ＯＨのその他の誘導体（トシラート、メシラート、及びブロシラートを含む）も、本発明の方法に使用することができる。
【００３７】
任意の適した有機塩基が本発明の方法に使用されてもよい。一般に、窒素ヘテロ原子を有する塩基が使用される。適した塩基の例としては、ヒューニッヒ塩基（すなわち、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）、２，６−ルチジン（すなわち、２，６−ジメチルピリジン）を含むルチジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルピリジン、１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１，５，７−トリアザビシクロ（４．４．０）デカ−５−エン（ＴＢＤ）、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ（４．４．０）デカ−５−エン（ＭＴＢＤ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン（ＴＭＰ）、ペンピジン（ＰＭＰ）、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＴＥＤ）、キヌクリジン及びコリジンが挙げられる。２種の以上の塩基の組合せが使用されてもよい。その他の塩基も、本発明の方法に適している場合がある。
【００３８】
一部の実施形態において、窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物は、式ＩＶ
【化１１】
0006401713.tif 000012
（式中、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ及びＲｇは、それぞれ独立してＨ、Ｃ１〜５アルキル、ＯＨ及びＮＨ２からなる群から選択される）
に従った構造を有する。一部の実施形態において、窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物は、２，６−ルチジン及びヒューニッヒ塩基から選択される。一部の実施形態において、窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物は２，６−ルチジンである。
【００３９】
式ＩＩの化合物、式ＩＩＩの化合物及び有機塩基を含む反応混合物は、約２５℃から約５５℃の温度に式Ｉの化合物を形成するために十分な任意の長さの時間維持されてもよい。一般に、反応混合物は、約２５℃から約５５℃の温度に数分から２４時間の間のいずれかの時間維持される。反応混合物を維持するステップは、例えば、約１分から約２４時間又は約３０分から約１８時間又は約１時間から約１２時間又は約２時間から約１０時間又は約４時間から約６時間であってもよい。反応混合物を維持するステップは、約２、３、４、５、６、７、８、９又は１０時間であってもよい。一部の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の維持するステップが約２〜１０時間である、上記のとおりの式Ｉの構造を有する化合物を得るための方法を提供する。
【００４０】
式ＩＩの化合物、式ＩＩＩの化合物及び有機塩基を含む反応混合物は、式Ｉの化合物を形成するのに十分な任意の温度に維持されてもよい。一般に、反応混合物は、約２５℃から約５５℃の温度に維持される。反応混合物は、約２５℃から約５５℃の温度、又は約３０℃から約５５℃、約３５℃から約５５℃、又は約４０℃から約５５℃、又は約４５℃から約５５℃、又は約５０℃から約５５℃、又は約３０℃から約５０℃、又は約３５℃から約４５℃に維持されてもよい。反応混合物は、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４又は５５℃に維持されてもよい。一部の実施形態において、本発明は、ステップ（ｂ）の維持温度が約２５から約４０℃である、上記のとおりの式Ｉの構造を有する化合物を得るための方法を提供する。後ろに詳細を記載するとおり、反応温度の小さな変更が、望ましくない副生成物の形成の驚くべき減少につながることを発見した。
【００４１】
一部の実施形態において、本発明の反応混合物は無色である。一部の実施形態において、反応の生成物は無色である。「無色の反応混合物」とは、５６０〜６００ｎｍの間の波長における反応混合物の光学濃度が０．５未満であることを意味する。光学濃度は、例えば、０．５未満又は０．４未満又は０．３未満又は０．２未満又は０．１未満又は０．０５未満であってもよい。光学濃度は、以下の式
Ａλ＝ｌｏｇ１０（Ｉ０／Ｉ１）、
（式中、Ａλは、光の特定の波長（λ）における吸光度であり、Ｉ１は、材料を通過した照射線（光）（透過線）の強度であり、Ｉ０は、材料を通過する前の照射線（入射線）の強度である）
によって定義される。光学濃度は、希釈されていない反応混合物又はトルエン及び同種のものなどの適した溶媒により希釈された反応混合物のサンプルを使用して測定されてもよい。「無色の生成物」は、生成物のトルエン及び同種のものなどの適した溶媒の溶液の５６０〜６００ｎｍの間の波長における光学濃度が０．５未満であること意味する。
【００４２】
任意の適した有機溶媒が、本発明の方法に使用されてもよい。適した溶媒としては、これらに限定されるものではないが、トルエン、塩化メチレン、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、石油エーテル及びそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態において、有機溶媒は、トルエン又は塩化メチレンである。式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換するために十分であれば、溶媒の量は重要ではない。一般に、溶媒と式ＩＩの化合物の比は、重量に基づいて約１：１から約１０００：１である。溶媒と式ＩＩについての化合物の比は、例えば、重量に基づいて約１００：１又は約１０：１であってもよい。
【００４３】
式Ｉの化合物を形成するために十分な式ＩＩＩの化合物の任意の量が本発明の方法に使用されてもよい。一般に、本発明の方法において形成される反応混合物は、式ＩＩの化合物の１当量に対して最大約６０モル当量の式ＩＩＩの化合物を含む。式ＩＩＩの構造を有する化合物対式ＩＩの構造を有する化合物のモル比は、例えば、約３０対１から約６０対１であってもよい。式ＩＩＩの構造を有する化合物対式ＩＩの構造を有する化合物のモル比は、約３０対１、又は約３５対１、又は約４０対１、又は約４５対１、又は約５０対１、又は約５５対１、又は約６０対１であってもよい。一部の実施形態において、式ＩＩＩの構造を有する化合物対式ＩＩの構造を有する化合物のモル比は、約３０対１から約６０対１である。その他のモル比が本発明の方法に適している場合もある。
【００４４】
式Ｉの化合物を形成するのに十分な有機塩基の任意の量が、本発明の方法に使用されてもよい。一般に、本発明の方法において形成される反応混合物は、式ＩＩの化合物の１当量に対して最大約１２０モル当量の有機塩基を含む。窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物対式ＩＩの構造を有する化合物のモル比は、例えば、約８０対１から約１２０対１であってもよい。窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物対式ＩＩの構造を有する化合物のモル比は、約８０対１、又は約８５対１、又は約９０対１、又は約９５対１、又は約１００対１、又は約１０５対１、又は約１１０対１、又は約１１５対１、又は約１２０対１であってもよい。一部の実施形態において、窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物対式ＩＩの構造を有する化合物のモル比は約８０〜１２０対１である。一部の実施形態において、比は、１０４対１である。その他のモル比が本発明の方法に適している場合もある。窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物は、１回の部分又は２回以上の別々の部分で添加されてもよい。一部の実施形態において、窒素ヘテロ原子を有する有機塩基化合物は、２回の別々の部分で添加される。
【００４５】
本発明の方法は、一般に式Ｉの化合物を反応混合物から分離するステップを含む。式Ｉの化合物は、溶媒などの１種又は複数の化合物、有機塩基化合物、式ＩＩの化合物又は式ＩＩＩの化合物から分離されてもよい。式Ｉの化合物を分離するために、任意の適した分離技術が使用されてもよい。適した分離技術としては、これらに限定されるものではないが、式Ｉの固形化合物の濾過、式Ｉの固形化合物の遠心分離、蒸留、液体抽出、昇華及びクロマトグラフィー技術が挙げられる。クロマトグラフィー技術の例としては、これらに限定されるものではないが、順相カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー及び薄層クロマトグラフィーが挙げられる。式Ｉの化合物を分離させるために、２つの以上の分離技術を組み合わせて実施してもよい。一部の実施形態において、式Ｉの構造を有する化合物を分離するステップは、式Ｉの構造を有する化合物を分離させるためにクロマトグラフィーを使用することを含む。一部の実施形態において、クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー及び薄層クロマトグラフィーからなる群から選択される。一部の実施形態において、クロマトグラフィーは、シリカゲルカラムクロマトグラフィーであり、クロマトグラフィーは、酢酸エチル、ヘキサン及びヘプタンからなる群から選択される１種又は複数の溶媒を含む移動相を使用して行われる。一部の実施形態において、クロマトグラフィーは、ヘキサン及び酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィーである。
【００４６】
一部の実施形態において、本方法は、任意に式Ｉの構造を有する化合物を固体化するステップを含む。一部の実施形態において、式Ｉの構造を有する化合物を固体化するステップは、ａ）式Ｉの構造を有する化合物をメタノール中で可溶化するサブステップと、ｂ）式Ｉの構造を有する化合物を水から析出させるサブステップとを含み、これにより、式Ｉの構造を有する化合物を固体化する。水からの析出に先立って式Ｉの構造を有する化合物を可溶化するためにその他の溶媒が使用されてもよい。
【実施例】
【００４７】
例１：２−エトキシエチルトリフラートの調製
米国特許第７，８１２，１５５号の方法に従って、２−エトキシエチルトリフラートを合成した。塩化メチレン（５５８ｇ）を、予め窒素パージした乾燥した丸底フラスコに移した。これに続いて、２−エトキシエタノール（７５．０ｇ）及び２，６−ルチジン（８９．９ｇ）を添加した。その反応混合物を、０〜−１０℃の間に冷却しながら２０分間撹拌した。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（２８２．４ｇ）を滴下ロートにより反応混合物に滴加した。その後、撹拌した反応混合物に水を添加し、得られた二相の混合物をさらに５分間撹拌した。ジクロロメタン層を洗浄し、分離し、回収した。塩化メチレン溶液を硫酸ナトリウムにより乾燥し、硫酸ナトリウムを濾過によって除去し、溶媒を減圧下、３０℃で除去した。
【００４８】
出発２−エトキシエタノールの５０５ｇスケールでも合成を行った。合成に続くこのバッチの減圧蒸留による精製により、１０６０ｇ（収率８６％）の２−エトキシエチルトリフラートが生成された。トリフラートは、米国特許第７，２２０，７５５号及び米国特許第７，１９３，０７８号に記載されている方法により調製してもよい。
【００４９】
例２：５５℃におけるバイオリムスＡ９の調製。
２，６−ルチジン（４９．１当量）を含むトルエン中で２−エトキシエチルトリフラート（４４．３当量）とラパマイシン（１．０当量）のカップリングを、５５℃（水浴の外部温度）で９０分間行った。このプロセスでは（ラパマイシンの２．０ｇスケール）、２−エトキシエチルトリフラートを、予め加熱した反応混合物（５５℃）に１回の部分を添加した。９０分間の加熱後、外部加熱のスイッチを切り、続いて第２の部分の２，６−ルチジン（５４．９当量）を添加した。第２のルチジン部分の添加後、反応混合物を周囲温度でさらに９０分間撹拌し、その後、粗製ＢＡ９を単離するための後処理をした。後処理は、以下を含むものとした：１．酢酸エチルによる反応混合物の希釈；２．冷えた１ＮのＨＣｌによる反応混合物の急冷；及び３．３回分の２０％の塩化ナトリウム水溶液による有機層の洗浄。塩化ナトリウムによる最後の洗浄後の水層のｐＨは約６であった。その粗製材料を、その後、１つの溶媒混合物（比が４：６（体積／体積）のｎ−ヘキサン／酢酸エチル）のみを使用したアイソクラティックシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００５０】
このプロセスを２．０ｇスケールで行った。反応混合物の内部温度が５０℃に達した後（ｔｂａｔｈ＝５１〜５２℃）、２−エトキシエチルトリフラートを反応混合物に複数の部分で添加した。添加の際、５８℃までの内部温度の上昇が観察された。反応の進行をＨＰＬＣによって観察した。ＨＰＬＣ分析によって得られたラパマイシン、ＢＡ９及びＲＲＴ＝１．２の主な副生成物の相対量の概要を表１に示す。表の相対量は、ＡＵＣ％（曲線下面積）、すなわち、得られたクロマトグラムの１つのピーク（ひいては、１つの化学種又は類似／同一の保持時間を有する２つの以上の化学種に対応する）に対応する合計シグナルのうちの割合として表わされている。ＲＲＴは、所与の化学種の保持時間対ＢＡ９の保持時間の比を指す（例えば、化学種Ｘなら、ＲＲＴ＝ＲＴＸ／ＲＴＢＡ９）。反応混合物は、トルエン及びルチジンを含むため、ＡＵＣ％値は概算である。
【表１】
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【００５１】
表１に示されるデータにより明らかにされるとおり、ＢＡ９のＡＵＣ％は、加熱の４５分の時点でその最大に達した。この時間の後も、ラパマイシンは依然として消費されるが、ＲＲＴが１．２の副生成物の増加も伴う。第２の部分の２，６−ルチジンの添加に続く周囲温度における９０分間の撹拌は、反応混合物の組成に有意な影響を与えなかった。
【００５２】
ＨＰＬＣ分析は、本プロセスが粗製ＢＡ９をもたらすことを示した（５８．６％ＡＵＣ含有率）。未反応のラパマイシンに加えて（ＲＲＴ約０．５２〜０．５８）、粗製生成物は、ＨＰＬＣ保持時間＝１１．０分（ＲＲＴ＝１．２）に９．６％ＡＵＣの主要な不純物／副生成物を含み、１３．２分（ＲＲＴ＝１．４２）及び１３．６分（ＲＲＴ＝１．４７）の間に最大１．８％ＡＵＣの１組の不純物を含んでいた。
【００５３】
例３：低温におけるバイオリムスＡ９の調製。
本プロセスを室温に近い温度で、以下の手順によって行った。２−エトキシエチルトリフラートの添加（１時間以内で少しずつ行った）が最初の反応混合物の内部温度を２２．６℃から２６．３℃に上昇させた。トリフラートの添加の完了後、反応混合物を約２６℃において４０分間撹拌し、その後、ＨＰＬＣによって分析した（表２の０時間についての項目を参照）。反応混合物の内部温度を、その後、２、３分以内に３０℃まで上昇させ、その混合物を、次に、この温度において最大１９．５時間撹拌した。１９．５時間撹拌すると、反応は平衡点に達した。
【表２】
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【００５４】
表２のデータに関して、「ＢＡ９ ＡＵＣ％」とは、ＢＡ９、ラパマイシン及びＲＲＴ＝１．２のピークの合計と比較した積分されたＢＡ９のピークを指す。「絶対ＡＵＣ％」とは、ＨＰＬＣクロマトグラムのすべての積分されたピークと比較した積分されたＢＡ９のピークを指す。表２のデータは、以下ことを明らかにしている：ａ）２−エトキシエチルトリフラートの添加の間、バッチの温度を３０℃以下に制御することが、ＲＲＴ＝１．２の副生成物の形成を著しく減少させる；ｂ）３０℃での５時間後でも、反応混合物中に依然として３２％の未反応のラパマイシンが存在する；ｃ）ラパマイシンの量を２７ＡＵＣ％に低下させるためには合計で最大２０時間の加熱が必要であろう；及びｄ）長時間の加熱は、ＲＲＴ＝１．２の副生成物を３．２％ＡＵＣに増加させている。
【００５５】
本プロセスを、４０℃の最高温度で行った。この試験では、２−エトキシエチルトリフラートの添加（１時間以内で少しずつ行った）が、内部温度を２４．２℃から２７．６まで上昇させた。トリフラートの添加の完了後、反応混合物を約２７℃で３０分間撹拌した、その後、ＨＰＬＣによって分析した（表３の０時間についての項目を参照）。反応混合物の内部温度を、その後、４０℃まで上昇させ、この温度で最大４時間撹拌した。表３から明白なとおり、４０℃における３〜４時間の撹拌後に反応混合物のＢＡ９の収率が最大に達した。
【００５６】
異なる反応温度に関するデータを比較すると、４０℃におけるＨＰＬＣ／ＲＲＴ＝１．２の副生成物の形成が３０℃における類似の項目（１〜２％ＡＵＣ）よりも高いレベル（７〜１０％ＡＵＣ）であったことが示されている。また、２−エトキシエチルトリフラートの添加の間、バッチ温度を３０℃以下に制御することが、ＲＲＴ＝１．２の副生成物の形成を著しく減少させることも確認された（約１ＡＵＣ％含有率）。
【００５７】
粗製ＢＡ９を生成する反応混合物の完全なワークアップを含む、４０℃以下の温度における粗製ＢＡ９の合成を、ラパマイシンの２．０ｇスケールで試験した。少しずつ３０分以内で２−エトキシエチルトリフラートを添加すると、内部温度が２０．０℃から２４．０℃に上昇し、さらに撹拌すると（依然として外部加熱なし）、２５．５℃に上昇した（トリフラートの添加開始から１時間後）。反応混合物を、その後、４０℃に外部から加熱し（２５分以内）、この温度で３時間撹拌した。最初の反応の後、１２．９ｇの２，６−ルチジンを反応混合物に添加した。新しい反応混合物を、３０℃で９０分間撹拌した。
【表３】
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【００５８】
生成物の後処理は、以下を含むものとした：１．１６０ｍＬの酢酸エチルによる反応混合物の希釈；２．１６０ｍＬの冷えた１ＮのＨＣｌによる３℃から９℃の間の温度範囲への反応混合物の急冷；及び３．３回分の２０％の塩化ナトリウム水溶液（それぞれ、３２０ｍＬ、２００ｍＬ及び２００ｍＬ）による有機層の洗浄。塩化ナトリウムによる最後の洗浄後の水層のｐＨは６であった。粗製生成物の油状生成物のＨＰＬＣの記録は、さらに高いＢＡ９の含有率を明らかにした（６６．３ＡＵＣ％）。ＨＰＬＣ分析は、５０〜５５℃で生成された類似の粗製生成物中のＢＡ９の含有率が５８．６％だけであったことを示した。さらに、（４０℃及び５０〜５５℃で生成された）粗製ＢＡ９の２つのロットの比較により、低い温度で生成されたロットの方が副生成物の量が少ないことが明らかになった。最も顕著なのは、２つのロットのＨＰＬＣ／ＲＲＴ＝１．２の副生成物の含有率の差である。高い温度で合成されたロットの不純物の含有率は９．６ＡＵＣ％であるが（図３Ａ参照）、４０℃で生成された粗製生成物の含有率は３．６ＡＵＣ％だけである（図３Ｂ参照）。
【００５９】
例４：反応スケールアップ。
生成物及び副生成物の分布が反応混合物の温度に依存することがわかったため、ラパマイシンの誘導体化プロセスの温度プロフィールをさまざまなスケールについて調査した。本プロセスを、開始ラパマイシンに関して３０．０ｇスケールで行った。少しずつ３０分以内で２−エトキシエチルトリフラートを添加すると、内部温度が２０℃から２７℃に上昇し、さらに撹拌すると（依然として外部加熱なし）３２℃に上昇した（トリフラートの添加開始から１時間後）。反応混合物を、その後、外部から４０℃に加熱し、この温度で３時間撹拌した。最初の反応の後、２，６−ルチジンを、反応混合物に添加し、３０℃で９０分間撹拌した。反応混合物の後処理により、油状生成物がもたらされた。ＨＰＬＣ分析に基づいて、大きなスケールでの合成によって最初に生成された粗製生成物は、６４．２ＡＵＣ％のＢＡ９及び４．９％のＲＲＴ＝１．２の副生成物を含んでいた。
【００６０】
上の段落に記載されているプロセスによるスケールアップしたＢＡ９の合成を、ともに開始ラパマイシン５２．０ｇスケールでさらに２回繰り返した。合成スケールをさらに拡大すると、２−エトキシエチルトリフラートの添加の際に、バッチのさらに大きな発熱が起こった（第１の場合２０から３６℃及び第２の場合１８から３３℃）。５２ｇスケールで合成された粗製バイオリムスＡ９のＨＰＬＣから明白なとおり、粗製生成物は、６２．９及び６５．０ＡＵＣ％のバイオリムスＡ９並びに１０．２及び８．５ＡＵＣ％のＲＲＴが１．２０の副生成物を含んでいる。
【００６１】
異なるスケールの合成における２−エトキシエチルトリフラートの反応混合物への添加の間に観察された最初の発熱の比較は、この発熱の影響の程度が合成スケールに比例することを示している（前述の合成の発熱プロセスによる温度上昇の表４の比較を参照）。
【００６２】
２ｇスケールの第１の例における粗製バイオリムスＡ９と３０〜５２ｇスケールで合成された粗製バイオリムスＡ９のロットとの不純物プロフィールの比較により、合成手順をスケールアップすると、多量のＲＲＴ＝１．２の副生成物が形成されることが明らかにされている。この不純物の量は、２ｇの合成の生成物については３．６％に過ぎなかったが、大きなスケールで合成した生成物については４．９〜１０．２ＡＵＣ％であったことがわかった。いかなる特定の理論に縛れることを望むものではないが、この差異は、熱的に制御されていない２−エトキシエチルトリフラートの添加の間に起こるバッチ温度の上昇が、小さなスケールの方が小さいことによるものと考えられる（２５．５℃まで温度が引き上げられたが、大きなスケールの合成では最大３６℃まで温度が引き上げられた；表４を参照）。そのようなものとして、反応温度を制御するための対策は、反応のスケールに応じて調整されるべきである。
【表４】
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【００６３】
例５：バイオリムスＡ９の後処理。
３５℃の最大反応温度のみを用いてラパマイシンの２．０ｇスケールの合成を繰り返した。この差は、反応混合物の２５℃から３５℃への温度上昇の上昇が遅いことだけであった（約５分間のかわりに３０分以内、副生成物の量をさらに最小限にする）。この合成により、再び高いＨＰＬＣ／ＡＵＣ含有率（６６．８％）のＡＰＩ及び低い含有率のＲＲＴ＝１．２の副生成物（ＲＴ＝１０．７分、２．７％）を含む粗製バイオリムスＡ９が生成された。
【００６４】
粗製生成物を、濃度勾配のあるｎ−ヘキサン及び酢酸エチルの溶媒混合物を用いたシリカゲルクロマトグラフィーを使用して精製した。クロマトグラフィー画分を、ＨＰＬＣによって分析した。ＢＡ９のＨＰＬＣ／ＡＵＣ％が９５．０％以下である画分と既知及び不明の不純物の有無の同時に通過する基準を組み合わせた。これにより、ＨＰＬＣ／ＡＵＣ純度＝９６．２％の精製されたＢＡ９の４０％の収率がもたらされた。
【００６５】
精製されたＢＡ９の主要な部分の他に、その他の有意な２つの部分の精製されたＢＡ９を、シリカゲルクロマトグラフィー精製から得た：ａ）収率１２％のＨＰＬＣ／ＡＵＣ純度が９１．８％の部分及びｂ）収率８％のＨＰＬＣ／ＡＵＣ純度が９１．８％の部分。
【００６６】
ヘキサン／酢酸エチルによる緩い濃度勾配及び長時間の溶出を使用すると、大きなスケール（ラパマイシンの５２ｇスケール）ではカラムクロマトグラフィーの間の不純物の分離が不十分になる。ｎ−ヘキサン／酢酸エチルの混合物を用いた急勾配のグラジエント法を使用した。５２ｇのラパマイシンから開始した急勾配のグラジエントシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる未処理のバイオリムスＡ９の精製により、２３．５ｇの精製された生成物がもたらされた（ＨＰＬＣ／ＡＵＣ％純度が９６．０％）。さらに１０．０ｇの生成物（ＨＰＬＣ／ＡＵＣ純度が９４．９％）を得た。
【００６７】
例６：反応温度の小さな変更が生成物分布の驚くべき増加につながる。
小さな温度の変更が生成物／副生成物分布に驚くべき変化をもたらすことがわかった。表５及び表６に示したとおり、６０℃と５５℃における合成についての反応混合物のサンプリングの比較により、反応温度のわずかな低下が副生成物の形成を劇的に減少させることが示されている。これは、二置換不純物である保持時間１１．５分間で溶出する化合物について最も明らかであった（６０℃で反応したＲＴ１１．５が１２．５％に対して５５℃で反応したＲＴ１１．５が５．９％）。
【表５】
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【００６８】
同様に、５℃だけ低い温度で同じ時間、反応を行うことにより、ラパマイシン出発材料のＢＡ９への変換が改善されている（６０℃で反応したＢＡ９が３９．８％に対して５５℃で反応したＢＡ９が７０．２％）。副生成物は、生成混合物から除去するのが特に難しいため、副生成物の形成を抑制すること特に有利である。対照的に、未反応の出発材料は、除去するのが容易である。そのように、本明細書に記載される方法は、精製された生成物の収率を著しく増加させ、コストを節減し、以前より知られている方法に関連する厄介な問題を低減する。
【表６】
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【００６９】
前述の記載は、わかりやすく、理解しやすくするために、説明及び例によってある程度詳細に行ったが、当業者は、添付の特許請求の範囲内で特定の変更及び修正を実施できることを理解するであろう。さらに、本明細書中に示した各文献は、各文献が個々に参照により組み込まれたように、その全体を同程度まで参照により組み込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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