(57)【要約】  グリコシル化されたタンパク質（具体的には、高マンノース型グリコシル化を有するタンパク質）を植物培養で産生させ、一方で、そのようなタンパク質をＥＲシグナルにより標的化する、および／または、タンパク質がゴルジ体を迂回するためのデバイス、システムまたは方法。本発明はさらに、トランスジェニック植物の根（具体的には、ニンジン細胞）を使用する酵素活性な高マンノース型リソソーム酵素の発現および産生のためのベクターおよび方法に関連する。より具体的には、本発明は、生物学的に活性な高マンノース型グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）の高収率の発現および産生のための宿主細胞（具体的には、遺伝子導入されている懸濁されたニンジン細胞）、ベクターおよび方法に関連する。本発明はさらに、リソソーム蓄積症を処置するための組成物および方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ末端の液胞標的化シグナルおよびＮ末端の小胞体シグナルペプチドに連続して連結されるヒトリソソームタンパク質をコードする単離された核酸配列であって、前記ヒトリソソームタンパク質はヒトα−ガラクトシダーゼである、単離された核酸配列。
【請求項２】
Ｃ末端の小胞体保持シグナルおよびＮ末端の小胞体シグナルペプチドに連続して連結されるヒトリソソームタンパク質をコードする単離された核酸配列であって、前記ヒトリソソームタンパク質はヒトα−ガラクトシダーゼである、単離された核酸配列。
【請求項３】
前記ヒトα−ガラクトシダーゼは、配列番号２４に記載されるものである、請求項１または２に記載の単離された核酸配列。
【請求項４】
前記液胞標的化シグナルは、配列番号４に記載されるものである、請求項１に記載の単離された核酸配列。
【請求項５】
前記小胞体保持シグナルは、配列番号２３（ＫＤＥＬ）に記載されるものである、請求項２に記載の単離された核酸配列。
【請求項６】
配列番号１９に記載されるものである、請求項２の記載の単離された核酸配列。
【請求項７】
配列番号１７に記載されるものである、請求項１に記載の単離された核酸配列。
【請求項８】
前記ヒトリソソームタンパク質は、ヒトα−ガラクトシダーゼである、請求項１に記載の単離された核酸配列。
【請求項９】
前記ヒトリソソームタンパク質は、配列番号２４に記載されるものである、請求項１に記載の単離された核酸配列。
【請求項１０】
請求項１に記載の単離された核酸を含む、植物細胞において発現することができる核酸構築物。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸を含む、植物細胞において発現することができる核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸構築物を含む細胞。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸構築物を含む細胞。
【請求項１４】
前記ヒトリソソームタンパク質を組換え産生する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記ヒトリソソームタンパク質が、少なくとも１つのキシロース残基および少なくとも１つの露出したマンノース残基を有するように組換え産生される、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】
前記ヒトリソソームタンパク質が、少なくとも１つのコアα−（１，２）キシロース残基および少なくとも１つのコアα−（１，３）フコース残基を有するように組換え産生される、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞は植物細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１８】
前記植物細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスにより形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記植物細胞は、タバコ細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項２１】
前記ヒトリソソームタンパク質は、少なくとも１つのコアα−（１，２）キシロースおよび少なくとも１つのコアα−（１，３）フコースを有する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項２２】
少なくとも１つの露出したマンノース残基およびα（１−３）グリコシド結合を有する少なくとも１つのフコース残基を含む、ヒトリソソームタンパク質。
【請求項２３】
少なくとも１つのキシロース残基をさらに含む、請求項２２に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項２４】
前記キシロース残基は、コアα−（１，２）キシロース残基である、請求項２３に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項２５】
前記ヒトリソソームタンパク質は、グルコセレブロシダーゼである、請求項２２に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項２６】
前記ヒトリソソームタンパク質は、α−ガラクトシダーゼである、請求項２２に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項２７】
前記ヒトリソソームタンパク質は、Ｃ末端の液胞標的化シグナルに連続して連結される、請求項２２に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項２８】
前記ヒトリソソームタンパク質は、Ｃ末端の液胞標的化シグナルおよびＮ末端の小胞体シグナルペプチドに連続して連結される、請求項２２に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項２９】
前記ヒトリソソームタンパク質は、Ｃ末端の小胞体保持シグナルおよびＮ末端の小胞体シグナルペプチドに連続して連結される、請求項２２に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３０】
前記液胞標的化シグナルは、塩基性タバコキチナーゼＡ遺伝子の液胞標的化シグナルである、請求項２７に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３１】
前記液胞標的化シグナルは、配列番号２に記載されるものである、請求項３０に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３２】
前記小胞体シグナルペプチドは、配列番号１または配列番号１６に記載されるものである、請求項２８に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３３】
前記ヒトグルコセレブロシダーゼは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３４】
前記ヒトリソソームタンパク質は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３５】
前記ヒトグルコセレブロシダーゼは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３６】
前記ヒトリソソームタンパク質は、配列番号１８または配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３７】
前記ヒトリソソームタンパク質は、生物学的活性を有する、請求項２２に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３８】
前記生物学的活性は、マクロファージへの取り込みである、請求項３７に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項３９】
前記生物学的活性は、線維芽細胞への取り込みである、請求項３７に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項４０】
前記生物学的活性は、酵素活性である、請求項３７に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項４１】
前記マクロファージに対する天然に存在するリソソームタンパク質の対応する親和性との比較において、前記マクロファージに対する増大した親和性を有する、請求項３７に記載のヒトリソソームタンパク質。
【請求項４２】
請求項２２に記載のヒトリソソームタンパク質および医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つの露出されたマンノース残基およびα（１−３）グリコシド結合を有する少なくとも１つのフコース残基を含むヒトリソソームタンパク質を含む植物細胞調製物。
【請求項４４】
少なくとも１つのキシロース残基をさらに含む、請求項４３に記載の植物細胞調製物。
【請求項４５】
前記キシロースはコアα−（１，２）キシロースである、請求項４４に記載の植物細胞調製物。
【請求項４６】
前記ヒトリソソームタンパク質は、ヒトグルコセレブロシダーゼである、請求項４５に記載の植物細胞調製物。
【請求項４７】
前記ヒトリソソームタンパク質は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の植物細胞調製物。
【請求項４８】
前記ヒトリソソームタンパク質は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の植物細胞調製物。
【請求項４９】
前記ヒトリソソームタンパク質は、ヒトα−ガラクトシダーゼである、請求項４５に記載の植物細胞調製物。
【請求項５０】
前記ヒトグルコセレブロシダーゼは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の植物細胞調製物。
【請求項５１】
前記ヒトリソソームタンパク質は、配列番号１８または配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の植物細胞調製物。
【請求項５２】
前記ヒトリソソームタンパク質は、Ｃ末端の液胞標的化シグナルに連続的に連結される、請求項４３に記載の植物細胞調製物。
【請求項５３】
前記ヒトリソソームタンパク質は、Ｃ末端の液胞標的化シグナルおよびＮ末端の小胞体保持シグナルペプチドに連続的に連結される、請求項４３に記載の植物細胞調製物。
【請求項５４】
前記ヒトリソソームタンパク質は、Ｃ末端の小胞体保持シグナルおよびＮ末端の小胞体シグナルペプチドに連続的に連結される、請求項４３に記載の植物細胞調製物。
【請求項５５】
前記液胞標的化シグナルは、塩基性タバコキチナーゼＡ遺伝子の液胞標的化シグナルである、請求項５４に記載の植物細胞調製物。
【請求項５６】
前記液胞標的化シグナルは、配列番号２に記載されるものである、請求項５５に記載の植物細胞調製物。
【請求項５７】
前記小胞体シグナルペプチドは、配列番号１または配列番号１６に記載されるものである、請求項５５に記載の植物細胞調製物。
【請求項５８】
少なくとも１つの露出されたマンノース残基を有する前記ヒトリソソームタンパク質は、連鎖分析によって測定すると、前記ヒトリソソームタンパク質の主要な分画物を含む、請求項４３に記載の植物細胞調製物。
【請求項５９】
請求項４３に記載の植物細胞調製物および医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項６０】
リソソーム蓄積症を処置するための医薬の製造のための、請求項３７に記載の生物学的に活性なヒトリソソームタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高マンノース型タンパク質を産生させるための形質転換された宿主細胞、ならびに、これらのタンパク質を特に植物培養で産生させるための方法およびシステムに関連する。
【背景技術】
【０００２】
ゴーシェ病は、最も一般的なリソソーム蓄積症である。ゴーシェ病は、グリコスフィンゴリピドのグルコセレブロシド（グルコシルセラミド、ＧｌｃＣｅｒ）をグルコースおよびセラミドに加水分解することを触媒する膜結合型リソソーム酵素であるグルコセレブロシダーゼ（これはまた、グリコシルセラミダーゼとして知られている）の欠乏を生じさせる劣性の遺伝子障害（第１染色体のｑ２１〜ｑ３１）によって引き起こされる。ゴーシェ病は、マクロファージのリソソームにおけるＧｌｃＣｅｒの蓄積をもたらす、ｈＧＣＤ（ヒトグルコセレブロシダーゼ）遺伝子（ＧＢＡ）における点変異によって引き起こされる。ゴーシェ細胞と呼ばれる特徴的な貯蔵細胞が、肝臓、脾臓および骨髄に見出される。付随する臨床的症状には、重度の肝脾腫大症、貧血、血小板減少症および骨格衰退が含まれる。
【０００３】
ヒトＧＣＤをコードする遺伝子が１９８５年に初めて配列決定された（６）。そのタンパク質は、５３６量体のプロペプチドに由来する４９７個のアミノ酸からなる。成熟ｈＧＣＤは５つのＮ−グリコシル化アミノ酸コンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含有する。これらの部位のうちの４つが正常にグリコシル化される。第１の部位のグリコシル化が、活性なタンパク質を産生させるために不可欠である。高マンノース型オリゴ糖鎖および複合型オリゴ糖鎖の両方が特定されている（７）。胎盤由来のｈＧＣＤは７％の炭水化物を含有し、そのうちの２０％が高マンノース型である（８）。生化学的研究および部位特異的変異誘発研究により、折り畳み、活性化因子相互作用および活性部位存在位置にとって重要な領域および残基の最初のマップが提供されている（９）。
【０００４】
ノイラミニダーゼによる胎盤ｈＧＣＤの処理（これはアシアロ酵素をもたらす）は、ラット肝臓細胞による増大したクリアランス速度および取り込み速度をもたらし、同時に、肝臓の酵素活性における増大をもたらす（Ｆｕｒｂｉｓｈ他、１９８１、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、６７３：４２５〜４３４）。このグリカン修飾された胎盤ｈＧＣは現在、ゴーシェ病の処置において治療剤として使用される。生化学的研究および部位特異的変異誘発研究により、折り畳み、活性化因子相互作用および活性部位存在位置にとって重要な領域および残基の最初のマップが提供されている［Ｇｒａｃｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２８３〜２２９１（１９９４）］。
【０００５】
３つの異なるタイプのゴーシェ病が存在しており、それぞれがｈＧＣ活性のレベルによって決定される。この疾患によって冒される主要な細胞がマクロファージであり、この場合、マクロファージはＧｌｃＣｅｒの蓄積のために非常に肥大し、従って、「ゴーシェ細胞」として示される。
【０００６】
ゴーシェ病の根本原因としてのＧＣＤにおける欠陥の特定は、この障害のための治療的戦略としての酵素代償療法の開発につながった。
【０００７】
もう１つの十分に特徴づけられているリソソーム蓄積症がファブリー病である。ファブリー病は、リソソーム酵素のα−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧａｌＡ）の不十分な活性によって引き起こされるＸ連鎖のリソソーム蓄積症である。古典的ファブリー病の患者は、１％未満のα−ＧａｌＡ活性を典型的には有しており、また、多くの場合、四肢における重度の痛み（先端異常感覚）、発汗減少、角膜および水晶体の変化、皮膚病変（角化血管腫）、腎不全、心臓血管疾患、肺不全、神経学的症状ならびに発作を含めて、多様な様々な症状を明らかにする。非定型性ファブリー病では、残された酵素活性を有する個体が様々な症状を中年期以降に明らかにし、それらの症状は通常、１つの器官または少数の器官に限定される。女性保因者における臨床での症状発現は、ランダムなＸ染色体不活性化のために大きく変化する。保因者は一般に、生涯を通して無症候性のままであるが、多くが、罹患男性の臨床的症状と同じくらい変わりやすく、かつ、重症である臨床的症状を明らかにする。
【０００８】
Ｄｅ  Ｄｕｖｅが最初に、失われたリソソーム酵素を外因性の生物学的に活性な酵素により置き換えることが、リソソーム蓄積症の処置に対する実用的な方法であるかもしれないことを提案した［Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ．２３：１０４５（１９６４）］。
【０００９】
それ以降、様々な研究により、酵素代償療法が、様々なリソソーム蓄積症を処置するために有益であり得ることが示唆されている。最も優れた成功が、外因性酵素（β−グルコセレブロシダーゼ）の、胎盤から調製された酵素（Ｃｅｒｅｄａｓｅ（商標））、または、より近年では、組換えにより調製された酵素（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標））により処置されたＩ型ゴーシェ病の個体に関して示されている。
【００１０】
天然の供給源に由来する非修飾のグルコセレブロシダーゼは、４つの炭水化物鎖を有する糖タンパク質である。このタンパク質は体内では食作用細胞を標的とせず、従って、治療的価値が限られている。ゴーシェ病のための現在の治療を開発することにおいて、グルコセレブロシダーゼの炭水化物鎖における末端の糖が、３つの異なるグリコシダーゼによる処理によって逐次的に除かれる。このグリコシダーゼ処理は、その末端の糖がマンノース残基からなる糖タンパク質をもたらす。食細胞は、マンノース残基で終わるオリゴ糖鎖を有する糖タンパク質および糖ペプチドを認識するマンノース受容体を有するので、グルコセレブロシダーゼの炭水化物再構成により、これらの細胞に対するこの酵素の標的化が改善されている［Ｆｕｒｂｉｓｈ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６７３：４２５（１９８１）］。
【００１１】
本明細書で示されるように、グリコシル化はｈＧＣＤ活性において非常に重要な役割を果たしており、従って、ツニカマイシン（Ｓｆ９細胞）、または、すべてのグリコシル化部位を無効にする点変異（Ｓｆ９細胞およびＣＯＳ−１細胞の両方）のどちらかを使用する、細胞株で発現されるｈＧＣＤの脱グリコシル化は、酵素活性の完全な喪失をもたらす。加えて、大腸菌で発現されるｈＧＣＤは、不活性であることが見出された。さらなる研究では、タンパク質活性のための様々なグリコシル化部位の重要性が示された。実際のタンパク質活性におけるグリコシル化の役割に加えて、商業的に製造される酵素は、特異的な薬物送達を容易にするグリカン配列修飾を含有する。グリコシル化タンパク質は、マンノース含有グリカン配列のみを含むように、抽出後、再構成される。
【００１２】
ヒトＧＣＤ酵素は４つのグリコシル化部位および２２個のリシンを含有する。組換え産生された酵素（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標））は、胎盤酵素（Ｃｅｒｅｄａｓｅ（商標））とは、アルギニンがヒスチジンにより置換されている４９５位において異なる。さらに、オリゴ糖組成が、組換えＧＣＤと胎盤ＧＣＤとの間において、前者はより多くのフコース残基およびＮ−アセチル−グルコサミン残基を有し、一方、後者は１つの高マンノース鎖を保持するように異なる。上記で述べられたように、両方のタイプのＧＣＤが、末端のマンノースを露出させるために、３つの異なるグリコシダーゼ（ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼおよびＰ−Ｎアセチルグルコサミニダーゼ）により処理され、このことが食作用細胞の標的化を可能にしている。組換え産生された酵素を含む医薬調製物が米国特許第５５４９８９２号に記載される。言及されるすべての参考文献は、全体が本明細書に示されるかのように、本明細書により参照によって組み込まれることに留意しなければならない。
【００１３】
酵素代償療法のための組換えα−ガラクトシダーゼＡが、昆虫細胞（ｓｆ９細胞）（米国特許第７０１１８３１号を参照のこと）、ヒト線維芽細胞（米国特許第６３９５８８４号を参照のこと）、および、植物細胞（米国特許第６８４６９６８号を参照のこと）で産生されている。組換えａ−ＧａｌＡ（アガルシダーゼβ［Ｆａｂｒａｚｙｍｅ］：Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ；アガルシダーゼα［Ｒｅｐｌａｇａｌ］：ＴＫＴ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ）を用いた臨床試験が行われており、両方の薬物が臨床使用のために承認されている。
【００１４】
既存のリソソーム酵素代償療法処置に伴う１つの欠点が、例えば、低い取り込み、基質が蓄積する特定の細胞のリソソームに対する低下した標的化、および、リソソームにおける短い機能的インビボ半減期のために、酵素のインビボ生物活性が望ましくないほど低いことである。
【００１５】
既存のＧＣＤ組換え酵素のもう１つの大きな欠点がその費用であり、このことは保健医療システムへの重い経済的負担となり得る。これらの組換え酵素の費用が大きいことは、複雑な精製プロトコル、および、比較的多量の治療剤が既存の処置のために要求されることから生じている。従って、ＧＣＤの費用を下げ、その結果、この救命治療が、これを必要とするすべての人々に、より手軽に提供され得るようにすることが緊急に求められている。
【００１６】
医薬品使用のためのタンパク質は従来、哺乳動物または細菌の発現システムで産生されている。この１０年間で、新しい発現システムが植物において開発されている。この方法論では、アグロバクテリウム（一本鎖ＤＮＡ分子（Ｔ−ＤＮＡ）を植物のゲノムに挿入することができる細菌）が利用される。遺伝子をタンパク質およびペプチドの大量製造のために導入することが比較的簡便であるために、この方法論が、代替のタンパク質発現システムとしてますます広まっている（１）。
【００１７】
様々な翻訳後修飾が細菌の発現システムには存在しない一方で、植物由来の発現システムは実際に、タンパク質の発現および活性のために非常に重要であることが知られているこれらの修飾を容易にする。哺乳動物のタンパク質発現システムと植物のタンパク質発現システムとの間における大きな違いの１つが、生合成経路における違いによって引き起こされるタンパク質糖側鎖の変化である。グリコシル化は、タンパク質の活性、折り畳み、安定性、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、血中クリアランス速度、および、抗原としての可能性に対する大きな影響を有することが示された。従って、植物におけるタンパク質製造はどれも、植物のグリコシル化の潜在的な派生問題を考慮に入れなければならない。
【００１８】
タンパク質のグリコシル化は、Ｎ結合型修飾およびＯ結合型修飾の２つのカテゴリーに分けられる（２）。これら２つのタイプは、グリカン成分が結合するアミノ酸が異なり、Ｎ結合型はＡｓｎ残基に結合し、一方、Ｏ結合型はＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基に結合する。加えて、それぞれのタイプのグリカン配列が特有の特徴的な特徴を有する。これら２つのタイプのうち、Ｎ結合型グリコシル化の方が多く存在し、タンパク質機能に対するその影響が広範囲に研究されている。他方で、Ｏ結合型グリカンは比較的希であり、情報が、タンパク質に対するその影響に関してあまり得られていない。
【発明の概要】
【００１９】
背景技術では、グリコシル化タンパク質を植物培養で選択的に産生させるためのデバイス、システムまたは方法が教示または示唆されていない。背景技術ではまた、高マンノース型タンパク質を植物培養で産生させるためのそのようなデバイス、システムまたは方法が教示または示唆されていない。背景技術ではまた、タンパク質を、小胞体（ＥＲ）を介して植物培養で産生させるためのデバイス、システムまたは方法が教示または示唆されていない。背景技術ではまた、タンパク質を、ゴルジ体を迂回しながら、小胞体（ＥＲ）を介して植物培養で産生させるためのそのようなデバイス、システムまたは方法が教示または示唆されていない。背景技術ではまた、タンパク質を、ゴルジ体を迂回するためにＥＲシグナルを使用することによって植物培養で産生させるためのそのようなデバイス、システムまたは方法が教示または示唆されていない。
【００２０】
本発明者らは、グリコシル化されたタンパク質（具体的には、高マンノース型グリコシル化を有するタンパク質）を植物培養で産生させ、一方で、場合により、また、好ましくは、そのようなタンパク質をＥＲシグナルにより標的化する（および／または、他の場合には、そのようなタンパク質のプロセシングを操作する）ためのデバイス、システムまたは方法を提供することによって背景技術のこれらの欠点を克服する。１つだけの仮説によって限定されることを望まないが、そのような標的化は、タンパク質がゴルジ体を迂回し、それにより、所望されるグリコシル化（具体的には、高マンノース型グリコシル化）を保持することをもたらすと考えられる。本明細書で使用される用語「植物培養」は、培養で成長する任意のタイプのトランスジェニック植物細胞、および／または、他の場合には遺伝子操作された植物細胞を包含することに留意しなければならない。遺伝子操作することは場合により、永続的または一過性であり得る。好ましくは、培養は、完全な植物を形成するようには組み立てられない細胞であって、植物の少なくとも１つの生物学的構造体が存在しないような細胞を特徴とする。場合により、また、好ましくは、培養は、複数の異なるタイプの植物細胞を特徴とする場合があり、しかし、好ましくは、培養は特定のタイプの植物細胞を特徴とする。場合により、特定のタイプの植物細胞を特徴とする植物培養は、元々は、そのような植物細胞の複数の異なるタイプに由来し得ることに留意しなければならない。
【００２１】
植物細胞を、固体表面（例えば、プラスチックの培養容器または培養プレートなど）または懸濁状態での培養（これらに限定されない）を含めて、何らかのタイプの好適な培養方法に従って成長させることができる。
【００２２】
本発明はさらに、トランスジェニック植物の根（具体的には、ニンジン細胞）を使用する酵素活性な高マンノース型リソソーム酵素の発現および産生のためのベクターおよび方法に関連する。より具体的には、本発明は、生物学的に活性な高マンノース型グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）および高マンノース型α−ガラクトシダーゼＡの高収率の発現および産生のための宿主細胞（具体的には、遺伝子導入されている懸濁されたニンジン細胞）、ベクターおよび方法に関連する。本発明はさらに、リソソーム蓄積症を処置するための組成物および方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、十分な量の生物学的に活性なリソソーム酵素（具体的には、ヒトＧＣＤおよびヒトα−ガラクトシダーゼＡ）を欠乏細胞に提供するためのデバイス、システムおよび方法に関する。本発明はまた、リソソーム酵素（例えば、ＧＣＤおよびα−ガラクトシダーゼＡ）をコードする遺伝子の効率的な産生を可能にする新しいベクター組成物を含む宿主細胞に関する。
【００２４】
従って、本発明は、特定のグリコシル化要求を有するタンパク質、例えば、リソソーム酵素の高マンノース型グリコシル化を有するタンパク質（例えば、ＧＣＤおよびα−ガラクトシダーゼＡ）などを産生させるための経済的に実行可能な技術に対する長年にわたる切実な要求を解決する。本発明は、この長年にわたる切実な要求を、植物細胞培養を使用することによって解決することができる。
【００２５】
本発明をさらに説明するために、高マンノース型タンパク質の生合成経路の簡単な説明が次に提供される。高マンノース型および複合型のＮ結合型グリカンの基本的な生合成経路がすべての真核生物の間では高度に保存されている。生合成が、グリカン前駆体をオリゴサッカリルトランスフェラーゼによってドリコール脂質キャリアからタンパク質表面の特定のＡｓｎ残基に転移することで小胞体（ＥＲ）において始まる。前駆体は続いて、哺乳動物に存在するプロセスと同様に、高マンノース型構造を生じさせるために、グリコシダーゼＩ、グリコシダーゼＩＩおよび仮想的なマンノシダーゼによってＥＲにおいて修飾される。
【００２６】
複雑かつ混成型の構造へのグリカン配列のさらなる修飾がゴルジ体において生じる。そのような修飾には、４つマンノース残基のうちの１つがα−マンノシダーゼＩによって除かれること、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の付加、α−マンノシダーゼＩＩによる２つのさらなるマンノース残基の除去、Ｎ−アセチルグルコサミンの付加が含まれ、また、場合により、この段階で、キシロース残基およびフコース残基が、植物特異的なＮ結合型グリカンを生じさせるために付加されることがある。コアへのキシロースおよびフコースの転移の後、複合型タイプのＮ−グリカンがさらに、末端フコースおよび末端ガラクトースの付加によりプロセシングされ得る。さらなる修飾が糖タンパク質輸送の期間中に行われることがある。
【００２７】
いくつかの取り組みが現在、植物におけるタンパク質のグリコシル化を制御および調節するために背景技術では使用されるが、それらのすべてが、特に本発明との比較において、著しい不備を有する。大雑把な修飾、例えば、グリコシル化の完全な阻害、または、ペプチド鎖からのグリコシル化部位の除去が１つの方策である。しかしながら、この取り組みは構造的な欠陥を生じさせ得る。さらなる取り組みでは、特定の炭水化物プロセシング酵素のノックアウトおよび導入が伴う。再度ではあるが、この取り組みは困難であり、この取り組みもまた、植物細胞自体に対する有害な影響を有する場合がある。
【００２８】
本発明は、ＥＲシグナルを使用することによって、および／または、ＥＲからゴルジ体への分泌を阻止することによって背景技術の様々な取り組みのこれらの不備を克服する。１つだけの仮説によって限定されることを望まないが、リソソーム酵素の高マンノース型構造が好ましいので、分泌を阻止することができ、タンパク質をＥＲにおいて維持することができるならば、天然に存在する高マンノース型構造が、再構成を必要とすることなく得られる。
【００２９】
上記で示されたように、内膜系を介して輸送されるタンパク質は最初に小胞体に入る。この工程のための必要な輸送シグナルが、分子のＮ末端におけるシグナル配列（いわゆるシグナルペプチド）によって表される。このシグナルペプチドが、シグナルペプチドに結合した前駆体タンパク質を小胞体の中に入れることであるその機能を果たすとすぐに、シグナルペプチドは前駆体タンパク質からタンパク質分解的に切断される。その特異的な機能のおかげで、このタイプのシグナルペプチド配列は、細胞が、細菌、酵母、真菌、動物または植物であるかどうかにかかわらず、すべての生細胞において、進化の間、大きな程度に保存されている。
【００３０】
多くの植物タンパク質がシグナルペプチドによって小胞体に入るが、それらはＥＲに留まるのではなく、小胞体からゴルジ体に輸送され、そして、ゴルジ体から液胞への輸送を続ける。この輸送残基についてのそのような選別シグナルの１つのクラスが、前駆体タンパク質のＣ末端部分に存在するシグナルである［ＮｅｕｈａｕｓおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９８）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１２７〜１４４］。小胞体に入るためのＮ末端のシグナルペプチドと、Ｃ末端の液胞標的化シグナルとの両方を含有するタンパク質は、ゴルジ体においてタンパク質に結合する複合型グリカンを含有することが予想される［Ｌｅｒｏｕｇｅ他（１９９８）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：３１〜４８］。そのようなＣ末端の選別シグナルの性質は非常に広範囲に変化し得る。米国特許第６０５４６３７号は、液胞標的化ペプチドとして作用する液胞タンパク質であるタバコ塩基性キチナーゼの領域から得られるペプチドフラグメントを記載する。Ｃ末端の標的化シグナルと、複合型グリカンとを含有する液胞タンパク質についての一例が、インゲンマメの種子から得られるファゼオリン貯蔵タンパク質である［Ｆｒｉｇｅｒｉｏ他（１９９８）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０：１０３１〜１０４２；Ｆｒｉｇｅｒｉｏ他（２００１）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３：１１０９〜１１２６］。
【００３１】
理論的枠組みは、真核生物細胞において、液胞タンパク質は、その最終的な行き先としての液胞において捕捉される前に、ＥＲおよびゴルジ体を経由するということである。驚くべきことに、本発明の形質転換された植物根細胞は、予想されなかった高マンノース型のＧＣＤおよびα−ガラクトシダーゼＡを産生させた。好都合なことに、この高マンノース型産物は、生物学的に活性であることが見出され、従って、さらなる工程がその活性化のために必要とされなかった。１つだけの仮説によって限定されることを望まないが、ＥＲシグナルの使用により、組換えタンパク質が植物細胞培養で産生される場合、ゴルジ体への輸送を抑えることができ、従って、所望される高マンノース型グリコシル化を保持することができたようである。場合により、ゴルジ体を迂回するためのいかなるタイプの機構も含めて、高マンノース型グリコシル化をもたらすことができるどのようなタイプの機構も本発明に従って使用することができる。
【００３２】
第１の態様において、本発明は、目的とする高マンノース型組換えタンパク質を産生する宿主細胞に関連する。この細胞は、目的とするタンパク質をコードする組換え核酸分子により、または、この核酸分子を含む発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションすることができる。そのような核酸分子は、目的とするタンパク質をコードする第１の核酸配列を、液胞標的化シグナルペプチドをコードする第２の核酸配列に機能的に連結されて含む。第１の核酸配列は場合によりさらに、ＥＲ（小胞体）標的化シグナルペプチドをコードする第３の核酸配列に機能的に連結することができる。本発明の宿主細胞は、目的とするタンパク質が、高度にマンノシル化された形態で細胞によって産生されるという点で特徴づけられる。
【００３３】
本発明の宿主細胞は真核生物細胞または原核生物細胞であり得る。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は原核生物細胞であり、好ましくは細菌細胞であり、最も好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞である。これらの細胞は、下記の好ましい植物宿主細胞に感染させるために使用される。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は真核生物細胞である場合があり、好ましくは植物細胞である場合があり、最も好ましくは、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｉｈｚｏｇｅｎｅｓ）により形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞である場合がある。
【００３６】
１つの好ましい実施形態において、植物根細胞はニンジン細胞である。本発明の形質転換されたニンジン細胞は懸濁状態で成長することに留意しなければならない。上記で述べられたように、また、実施例において記載されるように、これらの細胞はアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞により形質転換された。
【００３７】
別の実施形態において、本発明の宿主細胞に含まれる組換え核酸分子は、塩基性タバコキチナーゼＡの遺伝子に由来する液胞標的化シグナルペプチドをコードする第２の核酸配列との機能的な連結にある、リソソーム酵素をコードする第１の核酸配列を含む。この液胞シグナルペプチドは、配列番号２によって示されるようなアミノ酸配列を有する。第１の核酸配列は場合によりさらに、配列番号１によって示されるようなＥＲ（小胞体）標的化シグナルペプチドをコードする第３の核酸配列と機能的な連結で連結することができる。１つの実施形態において、本発明の宿主細胞内に含まれる組換え核酸分子はさらに、植物細胞において機能的であるプロモーターを含む。このプロモーターは本発明の組換え分子に機能的に連結されなければならない。
【００３８】
別の実施形態において、この組換え核酸分子は場合によりさらに、植物細胞において好ましくは機能的である機能的に連結されたターミネーターを含むことができる。本発明の組換え核酸分子は場合によりさらに、さらなる制御エレメント、促進エレメントおよび調節エレメント、ならびに／または、選択マーカーを含むことができる。これらの調節エレメントは組換え分子に機能的に連結されることに留意しなければならない。
【００３９】
１つの好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞によって産生される目的とする高マンノース型タンパク質は、露出したマンノース末端残基を有する高マンノース型糖タンパク質であり得る。
【００４０】
そのような高マンノース型タンパク質は、別の好ましい実施形態によれば、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択されるリソソーム酵素であり得る。好ましい実施形態において、リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）またはヒトα−ガラクトシダーゼＡであり得る。以降、組換えＧＣＤ、ｒＧＣＤ、ｒｈＧＣＤはすべてが、別途示される場合を除き、組換えヒトＧＣＤの様々な形態を示す。以降、Ａ−ｇａｌ、Ａ−ｇａｌ  Ａ、組換えＡ−ｇａｌ、ｒＡ−ｇａｌ、ｒｈＡ−ｇａｌはすべてが、別途示される場合を除き、組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡの様々な形態を示す［Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ０００１６９（コード配列）および同ＣＡＡ２９２３２（アミノ酸配列）］。
【００４１】
前記のように、ゴーシェ病（最も一般的なリソソーム蓄積症）が、マクロファージのリソソームにおけるＧｌｃＣｅｒの蓄積をもたらすｈＧＣＤ（ヒトグルコセレブロシダーゼ）遺伝子（ＧＢＡ）における点変異によって引き起こされる。ゴーシェ病の根本原因としてのＧＣＤ欠乏の特定は、この障害のための治療的戦略としての酵素代償療法の開発につながった。しかしながら、グリコシル化は非常に重要な役割をｈＧＣＤ活性および標的細胞へのｈＧＣＤ取り込みにおいて果たす。
【００４２】
従って、本発明の他の好ましい実施形態によれば、好適にグリコシル化されたｈＧＣＤまたはα−ガラクトシダーゼＡが、好ましくは、植物細胞培養におけるｈＧＣＤまたはｈα−ガラクトシダーゼＡの発現を制御することによって、場合により、また、より好ましくは、ＥＲシグナルを提供することによって、および／または、他の場合には、場合により、また、より好ましくは、ゴルジ体への輸送を阻止することによって提供される。
【００４３】
場合により、また、好ましくは、ｈＧＣＤまたはα−ガラクトシダーゼＡは、ゴーシェ病の処置または防止のために、露出したマンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有する。
【００４４】
なおさらに、１つの具体的な実施形態において、この好ましい宿主細胞は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターと、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼターミネーターと、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）のΩ翻訳エンハンサーエレメントとをさらに含む組換え核酸分子により形質転換またはトランスフェクションされる。１つの好ましい実施形態によれば、この組換え核酸分子は、実質的には配列番号１３によって示されるような核酸配列を含み、実質的には配列番号１４または１５によって示されるようなアミノ酸配列を有する高マンノース型ＧＣＤをコードする。
【００４５】
本発明はさらに、生物学的に活性なリソソーム酵素をコードする核酸分子を含む発現ベクターを提供することを理解しなければならない。
【００４６】
１つの好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターは、生物学的に活性な高マンノース型のヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）またはヒトα−ガラクトシダーゼＡをコードする核酸分子を含む。好ましくは、この好ましい発現ベクターは、実質的には配列番号１３、１７または１９によって示されるような核酸配列を有する組換え核酸分子を含む。
【００４７】
第２の態様において、本発明は、本発明の宿主細胞によって産生される組換え高マンノース型タンパク質に関連する。
【００４８】
１つの好ましい実施形態において、この高マンノース型タンパク質は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択される生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素であり得る。最も好ましくは、このリソソーム酵素はヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）であり得る。
【００４９】
なおさらに、本発明は、露出したマンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有する組換えの生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素を提供する。
【００５０】
１つの好ましい実施形態によれば、本発明の組換えリソソーム酵素は標的部位において標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる。好ましくは、この部位は、リソソーム蓄積症に罹患する対象の体内であり得る。
【００５１】
組換えリソソーム酵素は、標的細胞に対する天然に存在するリソソーム酵素の対応する親和性との比較において、標的細胞に対する増大した親和性を有することに留意しなければならない。１つの具体的な実施形態において、標的部位における標的細胞は対象の肝臓におけるクップファー細胞であり得る。
【００５２】
１つの好ましい実施形態において、組換えリソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼまたはシアリダーゼからなる群から選択され得る。
【００５３】
最も好ましくは、この組換えリソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【００５４】
第３の態様において、本発明は、高マンノース型タンパク質を産生させる方法に関連する。それによれば、本発明のこの方法は下記：（ａ）目的とする組換えタンパク質をコードする組換え核酸分子により、または、この組換え核酸分子を含む発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた組換え宿主細胞の培養物を調製する工程；（ｂ）工程（ａ）によって調製されるこれらの宿主細胞の培養物を、タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程（この場合、宿主細胞により、タンパク質が、高度にマンノシル化された形態で産生される）；（ｃ）タンパク質を細胞から回収し、細胞を（ａ）において提供される培養物から集める工程；および（ｄ）工程（ｃ）のタンパク質を好適なタンパク質精製方法によって精製する工程を含む。
【００５５】
１つの好ましい実施形態によれば、この方法によって使用される宿主細胞は本発明の宿主細胞である。
【００５６】
別の好ましい実施形態において、本発明のこの方法によって産生される高マンノース型タンパク質は、露出したマンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有する生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素であり得る。
【００５７】
この組換え酵素は標的部位において標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる。より具体的には、本発明の方法によって産生される組換え酵素は、標的細胞に対する天然に存在するリソソーム酵素の対応する親和性との比較において、標的細胞に対する増大した親和性を有する。それによれば、標的部位における標的細胞は対象の肝臓におけるクップファー細胞であり得る。
【００５８】
１つの具体的な実施形態において、このリソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択され得る。最も好ましくは、このリソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）またはα−ガラクトシダーゼＡであり得る。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、本発明のこの方法によって使用される宿主細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスにより形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞であり得る。最も好ましくは、植物根細胞はニンジン細胞である。本発明のこの方法において、形質転換された宿主ニンジン細胞は懸濁状態で成長することに特に留意しなければならない。
【００６０】
１つのさらなる態様において、本発明は、下記の（ａ）および（ｂ）を含む、リソソーム蓄積症を有する対象を、外因性の組換えリソソーム酵素を使用して処置するための方法に関連する：（ａ）形質転換された植物根細胞から精製され、かつ、リソソーム酵素が異常に不足している細胞を効率的に標的化することができる、組換えの生物学的に活性な形態のリソソーム酵素を提供すること。この組換えの生物学的に活性な酵素は、露出する末端マンノース残基を、結合するオリゴ糖において有する。（ｂ）治療効果的な量のそのような組換えの生物学的に活性なリソソーム酵素を対象に投与すること。１つの好ましい実施形態において、本発明の方法によって使用される組換えの高マンノース型リソソーム酵素は本発明の宿主細胞によって産生させることができる。好ましくは、この宿主細胞はニンジン細胞である。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、本発明のこの方法によって使用されるリソソーム酵素は、露出したマンノース残基を有する少なくとも１つのオリゴ糖鎖を含む高マンノース型酵素であり得る。この組換え酵素は、対象の体内で、標的部位において標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる。より好ましくは、この組換えリソソーム酵素は、標的細胞に対する天然に存在するリソソーム酵素の対応する親和性との比較において、これらの標的細胞に対する増大した親和性を有する。
【００６２】
より具体的には、本発明のこの方法によって使用されるリソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼまたはシアリダーゼからなる群から選択され得る。好ましくは、このリソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【００６３】
従って、１つの好ましい実施形態によれば、本発明のこの方法は、リソソーム蓄積症を処置するために意図され、具体的には、ゴーシェ病を処置するために意図される。
【００６４】
そのような場合において、標的部位における標的細胞は対象の肝臓におけるクップファー細胞であり得る。
【００６５】
本発明はさらに、本発明によって規定されるような組換えの生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素を有効成分として含む、リソソーム蓄積症を処置するための医薬組成物を提供する。本発明の組成物は場合によりさらに、医薬的に許容される希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含むことができる。
【００６６】
１つの具体的な実施形態において、本発明の組成物は、ゴーシェ病を処置するために意図される。そのような組成物は好ましくは、効果的な成分として、本発明によって規定されるように、生物学的に活性な高マンノース型のヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）を含むことができる。
【００６７】
本発明はさらに、リソソーム蓄積症を処置または防止するための医薬品の製造における、本発明の組換えの生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素の使用に関連する。より具体的には、そのような疾患はゴーシェ病であり得る。
【００６８】
それによれば、この生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素は、本発明によって規定されるように、生物学的に活性な高マンノース型のヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【００６９】
本発明によれば、組換えタンパク質と、組換えタンパク質が高マンノース型タンパク質として産生されることを生じさせるためのシグナルとをコードするポリヌクレオチドを含む、高マンノース型組換えタンパク質を産生する宿主細胞が提供される。好ましくは、このポリヌクレオチドは、目的とするタンパク質をコードする第１の核酸配列を、シグナルペプチドをコードする第２の核酸配列に機能的に連結されて含む。場合により、シグナルペプチドはＥＲ（小胞体）標的化シグナルペプチドを含む。好ましくは、このポリヌクレオチドはさらに、液胞標的化シグナルペプチドをコードするための第３の核酸配列を含む。
【００７０】
好ましくは、シグナルは、組換えタンパク質がＥＲに標的化されることを生じさせる。より好ましくは、シグナルは、組換えタンパク質がＥＲに標的化されることを生じさせるためのシグナルペプチドを含む。最も好ましくは、ポリヌクレオチドは、そのようなシグナルペプチドをコードするための核酸セグメントを含む。
【００７１】
場合により、また、好ましくは、シグナルは、組換えタンパク質がゴルジ体を迂回することを生じさせる。好ましくは、シグナルは、組換えタンパク質がゴルジ体に標的化されないことを生じさせるためのシグナルペプチドを含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、そのようなシグナルペプチドをコードするための核酸セグメントを含む。
【００７２】
場合により、また、好ましくは、宿主細胞は真核生物細胞および原核生物細胞のいずれかの細胞である。場合により、原核生物細胞は細菌細胞であり、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞である。好ましくは、真核生物細胞は植物細胞である。より好ましくは、植物細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスにより形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞である。最も好ましくは、植物根細胞はニンジン細胞である。
【００７３】
好ましくは、組換えポリヌクレオチドは、塩基性タバコキチナーゼＡの遺伝子に由来する液胞標的化シグナルペプチドをコードする第２の核酸配列との機能的な連結にある、目的とするタンパク質をコードする第１の核酸配列を含み、そのような液胞シグナルペプチドは、配列番号２によって示されるようなアミノ酸配列を有し、また、第１の核酸配列は場合によりさらに、配列番号１によって示されるようなＥＲ（小胞体）標的化シグナルペプチドをコードする第３の核酸配列に機能的に連結される。
【００７４】
より好ましくは、組換えポリヌクレオチドはさらに、植物細胞において機能的であるプロモーターを含み、プロモーターは組換え分子に機能的に連結される。
【００７５】
最も好ましくは、組換えポリヌクレオチドはさらに、植物細胞において機能的であるターミネーターを含み、ターミネーターは組換え分子に機能的に連結される。
【００７６】
同様に最も好ましくは、組換えポリヌクレオチドは場合によりさらに、さらなる制御エレメント、促進エレメントおよび調節エレメント、ならびに／または、選択マーカーを含み、調節エレメントは組換え分子に機能的に連結される。
【００７７】
好ましくは、高マンノース型タンパク質は、少なくとも１つの露出したマンノース残基を伴うグリコシル化を有する高マンノース型糖タンパク質である。より好ましくは、高マンノース型タンパク質は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択される生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素である。
【００７８】
最も好ましくは、リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【００７９】
好ましくは、ＧＣＤは、配列番号７によって示されるような核酸配列によってコードされる、実質的には配列番号８によって示されるようなアミノ酸配列を含む。
【００８０】
より好ましくは、細胞は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターと、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼターミネーターと、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）のΩ翻訳エンハンサーエレメントである調節エレメントとをさらに含み、かつ、実質的には配列番号１４または１５によって示されるようなアミノ酸配列を有するＧＣＤをコードする、実質的には配列番号１３によって示されるような核酸配列を有する組換えポリヌクレオチドにより、または、そのような分子を含む発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされる。
【００８１】
好ましい実施形態によれば、上記の宿主細胞によって産生される組換えの高マンノース型タンパク質が提供される。
【００８２】
好ましくは、高マンノース型タンパク質は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択される生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素である。
【００８３】
より好ましくは、リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【００８４】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、露出したマンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有する組換えの生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素が提供される。
【００８５】
さらに他の好ましい実施形態によれば、シグナルペプチド活性を有する第１の部分と、リソソーム酵素活性を有する第２の部分とを含み、第１の部分により、第２の部分が、露出したマンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴ糖鎖を伴って植物細胞においてプロセシングされることが引き起こされる組換えタンパク質が提供される。
【００８６】
好ましくは、リソソーム酵素は、ゴーシェ病を処置または防止するためのタンパク質を含む。
【００８７】
より好ましくは、そのようなタンパク質はｈＧＣＤを含む。
【００８８】
別の実施形態において、リソソーム酵素は、ファブリー病を処置または防止するためのタンパク質を含む。
【００８９】
より好ましくは、そのようなタンパク質はα−ガラクトシダーゼＡを含む。
【００９０】
好ましくは、第１の部分は植物細胞のＥＲ標的化シグナルペプチドを含む。より好ましくは、組換え酵素は、リソソーム蓄積症に罹患する対象の体内で、標的部位において標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる。最も好ましくは、組換えリソソーム酵素は、標的細胞に対する天然に存在するリソソーム酵素の対応する親和性との比較において、標的細胞に対する増大した親和性を有する。標的細胞は、マンノース受容体を有する線維芽細胞およびマクロファージなどが可能である。
【００９１】
同様に最も好ましくは、組換えリソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼまたはシアリダーゼからなる群から選択される。
【００９２】
好ましくは、組換えリソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【００９３】
同様に好ましくは、標的部位における標的細胞は対象の肝臓におけるクップファー細胞である。
【００９４】
なおさらに他の好ましい実施形態によれば、植物細胞培養で産生される組換え高マンノース型タンパク質が提供される。好ましくは、このタンパク質は、タンパク質をＥＲに標的化するための植物シグナルペプチドを特徴とする。
【００９５】
より好ましくは、植物シグナルペプチドは、タンパク質を根の植物細胞培養でＥＲに標的化するためのペプチドを含む。最も好ましくは、根の植物細胞培養はニンジン細胞を含む。
【００９６】
さらに他の好ましい実施形態によれば、植物細胞培養で産生される組換え高マンノース型のｈＧＣＤタンパク質またはα−ガラクトシダーゼＡタンパク質が提供される。
【００９７】
なおさらに他の好ましい実施形態によれば、高マンノース型タンパク質を産生させるための植物細胞培養の使用が提供される。
【００９８】
他の好ましい実施形態によれば、組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドにより形質転換またはトランスフェクションされた組換え宿主細胞の培養物を調製すること；宿主細胞培養物を、組換えタンパク質の発現を可能にする条件（ただし、宿主細胞により、組換えタンパク質が、高度にマンノシル化された形態で産生される）下で培養することを含む、高マンノース型タンパク質を産生させる方法が提供される。
【００９９】
好ましくは、宿主細胞培養物は懸濁状態で培養される。より好ましくは、この方法はさらに、タンパク質を精製することを含む。
【０１００】
他の好ましい実施形態によれば、この方法は、前記のような宿主細胞を用いて行われる。好ましくは、高マンノース型タンパク質は、露出したマンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有する生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素である。より好ましくは、組換え酵素は標的部位において標的細胞上のマンノース受容体に結合する。最も好ましくは、組換え酵素は、標的細胞に対する天然に存在するリソソーム酵素の対応する親和性との比較において、標的細胞に対する増大した親和性を有する。
【０１０１】
好ましくは、リソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択される。
【０１０２】
より好ましくは、リソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）またはα−ガラクトシダーゼＡである。最も好ましくは、標的部位における標的細胞は対象の肝臓における線維芽細胞またはクップファー細胞である。
【０１０３】
好ましくは、宿主細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスにより形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞である。別の実施形態において、宿主細胞はタバコ細胞である。
【０１０４】
より好ましくは、植物根細胞はニンジン細胞である。
【０１０５】
最も好ましくは、形質転換された宿主ニンジン細胞は懸濁状態で成長する。
【０１０６】
なおさらに他の好ましい実施形態によれば、リソソーム蓄積症を有する対象を、外因性の組換えリソソーム酵素を使用して処置するための方法が提供され、この方法は、形質転換された植物根細胞から精製され、かつ、リソソーム酵素が異常に不足している細胞を効率的に標的化することができる組換えの生物学的に活性な形態のリソソーム酵素を提供すること（組換えの生物学的に活性な酵素は、結合するオリゴ糖において、露出する末端マンノース残基を有する）、および、治療効果的な量のそのような組換えの生物学的に活性なリソソーム酵素を対象に投与することを含む。この方法は場合により、前記のようないずれかの宿主細胞および／またはタンパク質を用いて行うことができる。
【０１０７】
好ましくは、組換え酵素は、対象の体内で、標的部位において標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる。より好ましくは、組換えリソソーム酵素は、標的細胞に対する天然に存在するリソソーム酵素の対応する親和性との比較において、標的細胞に対する増大した親和性を有する。最も好ましくは、リソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼまたはシアリダーゼからなる群から選択される。同様に最も好ましくは、リソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【０１０８】
同様に最も好ましくは、リソソーム蓄積症はゴーシェ病である。同様に最も好ましくは、標的部位における標的細胞は対象の肝臓におけるクップファー細胞である。
【０１０９】
別の実施形態において、蓄積症はファブリー病であり、リソソーム酵素はα−ガラクトシダーゼＡであり、標的細胞は線維芽細胞である。
【０１１０】
なおさらに他の好ましい実施形態によれば、上記のような組換えの生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素を有効成分として含む、リソソーム蓄積症を処置するための医薬組成物が提供され、そのような組成物は場合によりさらに、医薬的に許容される希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む。好ましくは、リソソーム蓄積症はゴーシェ病である。より好ましくは、組換えリソソーム酵素は、生物学的に活性な高マンノース型のヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【０１１１】
なおさらに他の好ましい実施形態によれば、リソソーム蓄積症を処置または防止するための医薬品の製造における、上記のような組換えの生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素の使用が提供される。好ましくは、疾患はゴーシェ病である。より好ましくは、生物学的に活性なリソソーム酵素は、生物学的に活性な高マンノース型のヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【０１１２】
別の実施形態において、疾患はファブリー病であり、生物学的に活性なリソソーム酵素はα−ガラクトシダーゼＡである。
【０１１３】
本発明が下記の図によってさらに記載され、しかし、下記の図は例示にすぎず、本発明の範囲を限定しない。本発明の範囲はまた、添付された請求項によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
本発明が、本明細書において、例としてのみであるが、添付されている図面を参照して記載される。
【図１Ａ】図１Ａは、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）のΩ翻訳エンハンサーエレメント、ＥＲ標的化シグナル、ヒトＧＣＤ配列（これはまた、配列番号７によって示される）、液胞シグナル、および、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のオクトピンシンターゼターミネーター配列を含む得られる発現カセットを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐＧｒｅｅｎＩＩプラスミド骨格の概略マップを示す。
【図２】図２は、抗ｈＧＣＤ特異的抗体を使用する、ｈＧＣＤ形質転換細胞の抽出物のウエスタンブロット分析を示す。標準物のＣｅｒｅｚｙｍｅ（レーン１）が陽性コントロールとして使用され、非形質転換のカルスが陰性コントロールとして使用され（レーン２）、様々な選択されたカルスの抽出物がレーン３〜８に示される。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、ＸＫカラム（２．６×２０ｃｍ）に充填された強カチオン交換樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でのｒｈＧＣＤの最初の精製工程を示す。カラムを、電気伝導率モニタリング、ｐＨおよび２８０ｎｍでの吸光度を可能にするＡＫＴＡプライムシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一体化した。ｒｈ−ＧＣＤの溶出を、６００ｍＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液により得た。図３Ａはこの精製工程の標準的操作を表す。操作期間中に集められる分画物が、図３Ｂによって示されるように酵素活性アッセイによってモニターされ、酵素活性を（溶出ピークにおいて）示すチューブをプールした。図３Ｃは、活性についてアッセイされた溶出分画物のクーマシーブルー染色を示す。
【図３Ｂ−Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、ＸＫカラム（２．６×２０ｃｍ）に充填された強カチオン交換樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でのｒｈＧＣＤの最初の精製工程を示す。カラムを、電気伝導率モニタリング、ｐＨおよび２８０ｎｍでの吸光度を可能にするＡＫＴＡプライムシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一体化した。ｒｈ−ＧＣＤの溶出を、６００ｍＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液により得た。図３Ａはこの精製工程の標準的操作を表す。操作期間中に集められる分画物が、図３Ｂによって示されるように酵素活性アッセイによってモニターされ、酵素活性を（溶出ピークにおいて）示すチューブをプールした。図３Ｃは、活性についてアッセイされた溶出分画物のクーマシーブルー染色を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、図３Ａの場合と同様ではあるが、第２のカラムについての対応するグラフを示す。
【図３Ｅ−Ｆ】図３Ｅ〜３Ｆは、図３Ｂ〜図３Ｃの場合と同様ではあるが、第２のカラムについての対応するグラフを示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、ＸＫカラム（２．６×２０ｃｍ）に充填された疎水性相互作用樹脂（ＴＳＫゲル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｃ、Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐ．）での組換えｈＧＣＤの最終精製工程を示す。カラムを、電気伝導率モニタリング、ｐＨおよび２８０ｎｍでの吸光度を可能にするＡＫＴＡプライムシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一体化した。前段カラムからのＧＣＤ溶出プールを６ｍｌ／分で負荷し、その後、ＵＶ吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液により洗浄した。純粋なＧＣＤを、５０％のエタノールを含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液によって溶出した。図４Ａは、この精製工程の標準的操作を表す。図４Ｂは、酵素活性アッセイによってモニターされた操作期間中に集められた分画物を示す。図４Ｃは、活性についてアッセイされた溶出分画物のクーマシーブルー染色を示す。
【図４Ｂ−Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ＸＫカラム（２．６×２０ｃｍ）に充填された疎水性相互作用樹脂（ＴＳＫゲル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｃ、Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐ．）での組換えｈＧＣＤの最終精製工程を示す。カラムを、電気伝導率モニタリング、ｐＨおよび２８０ｎｍでの吸光度を可能にするＡＫＴＡプライムシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一体化した。前段カラムからのＧＣＤ溶出プールを６ｍｌ／分で負荷し、その後、ＵＶ吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液により洗浄した。純粋なＧＣＤを、５０％のエタノールを含有する１０ｍＭクエン酸緩衝液によって溶出した。図４Ａは、この精製工程の標準的操作を表す。図４Ｂは、酵素活性アッセイによってモニターされた操作期間中に集められた分画物を示す。図４Ｃは、活性についてアッセイされた溶出分画物のクーマシーブルー染色を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、腹腔マクロファージによる取り込みの後における組換えｈＧＣＤの活性を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、腹腔マクロファージによる取り込みの後における組換えｈＧＣＤの活性を示す。
【図５Ｃ−Ｄ】図５Ｃは、腹腔マクロファージによる取り込みの後における組換えｈＧＣＤの活性を示し、一方、図５Ｄは、本発明による組換えＧＣＤのウエスタンブロットを示す。
【図６】図６は、本発明によるｒＧＣＤについてのグリコシル化構造およびＣｅｒｅｚｙｍｅ（商標）のグリコシル化構造の比較を示す。
【図７】図７は、本発明によるｒＧＣＤについてのグリコシル化構造を示す。
【図８Ａ】図８ａは、本発明によるｒＧＣＤについてのさらなるＮ−グリカングリコシル化構造を示す。
【図８Ｂ】図８ｂは、本発明によるｒＧＣＤについてのさらなるＮ−グリカングリコシル化構造を示す。
【図８Ｃ】図８ｃは、本発明によるｒＧＣＤについてのさらなるＮ−グリカングリコシル化構造を示す。
【図８Ｄ】図８ｄは、本発明によるｒＧＣＤについてのさらなるＮ−グリカングリコシル化構造を示す。
【図９】図９ａおよび９ｂは、本発明の精製された組換えヒトＧＣＤと、哺乳動物ＣＨＯ細胞で組換え産生される市販のヒトＧＣＤ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））との抗原的同一性および電気泳動的同一性を示す。図９ａは、本発明の植物産生によるｈＧＣＤ（レーン１および２、それぞれ、５μｇおよび１０μｇのタンパク質）、および、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（レーン３および４、それぞれ、５μｇおよび１０μｇのタンパク質）のクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。図９ｂは、市販のＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）酵素と比較される、ＰＡＧＥ分離された本発明の組換えヒトＧＣＤ（レーン１および２、それぞれ、５０ｎｇおよび１０ｎｇ）のウエスタンブロット分析である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離されたタンパク質をニトロセルロースにブロットし（レーン３および４、それぞれ、５０ｎｇおよび１００ｎｇの抗原）、ポリクローナル抗ＧＣＤ抗体およびペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＨＲＰ二次抗体を使用して免疫検出した。サイズおよび免疫反応性が、本発明の植物組換えＧＣＤと、哺乳動物細胞（ＣＨＯ）により調製される酵素（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））との間で一致していることに留意すること。ＭＷ＝分子量標準物マーカー。
【図１０】図１０ａおよび１０ｂは、本発明の組換えヒトＧＣＤのグリカン構造の概略図である。図１０ａはＧＣＤの主グリカン構造分析の結果を示し、ＨＰＬＣ、酵素アレイ消化およびＭＡＬＤＩに基づくすべての構造およびそれらの相対的な量が示される。個々のグリカンの保持時間が、グルコースユニット（ＧＵ）のラダーを与えるデキストランの標準物部分加水分解の保持時間に対して比較される。図１０ｂは、哺乳動物細胞（ＣＨＯ）により調製される酵素（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））のグリカン構造をインビトロ修飾プロセスの前後において示す。キシロースグリコシドおよび露出したマンノースグリコシドが本発明の組換えヒトＧＣＤでは優勢であることに留意すること。
【図１１】図１１は、バッチ間における組換えヒトＧＣＤの一貫した、再現性のあるグリカン構造を示す、本発明の組換えヒトＧＣＤのグリカンプロファイルのＨＰアニオン交換クロマトグラフィー分析である。
【図１２】図１２は、本発明の組換えヒトＧＣＤ（白三角）、および、哺乳動物細胞（ＣＨＯ）により調製される酵素（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））（黒四角）の両方の触媒作用の速度論的特徴が同一であることを示す速度論的分析である。本発明の組換えヒトＧＣＤと、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（０．２μｇ）とを、Ｃ６−ＮＢＤＧｌｃＣｅｒをＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．５）において使用してアッセイした（５分、３７℃）。ミカエリス−メンテン速度論を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して分析した。データは２回の独立した実験の平均である。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、タバコ植物で発現させたヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡの分子量分析の結果のプロットである。図１３Ａは、本明細書に記載されるようなゲルろ過によって求められたときの分子量を示す。図１３Ｂは、質量分析法（ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ）によって求められたときの分子量を示す。天然型α−ガラクトシダーゼＡのＭＷに対応する４８．６ｋＤａにおける（ＭＳでの）主ピークに留意すること。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、タバコ植物で発現させたヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡのＰＡＧＥ分析およびアミノ酸配列である。図１４Ａは、ＰＡＧＥで分けられたとき、６２ｋＤａおよび４７．６ｋＤａに対応するヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡの２つの異なったバンドを示す。図１４Ｂは、（「上側バンド」および「下側バンド」と標示される）これら２つのバンドのそれぞれに由来するアミノ酸配列を示す。それぞれのバンドにおける配列決定のために利用可能なポリペプチドの部分が赤色で示される。配列データをもたらすことができない領域（これらはおそらくはグリカン構造によって隠されている）が黒色で示される。配列決定された領域が、上側バンドと、下側バンドとの間において完全に一致することに留意すること。このことは、グリカン構造における区別が可能である同一のポリペプチドを示している。
【図１５】図１５は、タバコ植物で発現させたヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡの免疫反応性を示すウエスタンブロットの写真である。液胞に標的化されるヒトα−ガラクトシダーゼＡ（α−ｇａｌ−ｖａｃ、レーン「ｖａｃ」）、または、ＥＲ保持シグナルを有するヒトα−ガラクトシダーゼ（α−ｇａｌ−ＫＤＥＬ、レーン「ＫＤＥＬ」）のいずれかを発現するタバコ植物から抽出されたタンパク質をＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースにブロットし、（ヒトα−ガラクトシダーゼのアミノ酸３２６〜４２９に対する）抗α−ガラクトシダーゼＡ抗体と反応させ、ＨＲＰ二次抗体により可視化した。強い特異的な反応がα−ｇａｌ−ｖａｃおよびα−ｇａｌ−ＫＤＥＬの両方の発現タンパク質には存在し、一方、トランスジェニックコントロール植物から抽出されたタンパク質（ＧＦＰ）は非反応性であったことに留意すること。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、植物で発現させたヒト組換えα−ガラクトシダーゼの触媒的性質の速度論的分析を表すグラフである。図１６Ａは、植物発現によるヒト組換えα−ガラクトシダーゼＡと、市販されている組換えα−ガラクトシダーゼＡ調製物とを比較するミカエリス−メンテンプロットである。図１６Ｂは、ＫｍおよびＶｍａｘ（挿入された表に詳しく示される）を示す、図１６Ａから導かれる酵素速度論のラインウィーバー−バークプロットである。緑色は、植物発現によるヒト組換えα−ガラクトシダーゼを示し、黒色はＦａｂｒａｚｙｍｅを示し、青色はＲｅｐｌａｇａｌを示す。植物発現によるヒト組換えα−ガラクトシダーゼと、市販されている調製物との間での、酵素速度論における非常に近い対応に留意すること。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、植物で発現させたヒト組換えα−ガラクトシダーゼの様々な温度における安定性を示すＡＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。植物で発現させたヒト組換えα−ガラクトシダーゼ（植物ａ−Ｇａｌ）と、市販のヒト組換えα−ガラクトシダーゼ（Ｒｅｐｌａｇａｌ）とを、示された温度で２時間、活性緩衝液（図１７Ａ）または細胞培地（図１７Ｂ）においてインキュベーションし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、本明細書に記載されるように可視化した。
【図１８】図１８は、植物発現によるヒト組換えα−ガラクトシダーゼのＦａｂｒｙ線維芽細胞における取り込みおよび保持を示す、線維芽細胞の細胞溶解物のウエスタンブロット分析の写真である。レーン「植物αＧａｌＡ」は、植物発現によるヒト組換えα−ガラクトシダーゼと２時間インキュベーションされ、洗浄され、溶解されたヒトＦａｂｒｙ（α−ガラクトシダーゼ欠損）線維芽細胞からの線維芽細胞溶解物である。右端のレーンはＦａｂｒａｚｙｅｍｅ（登録商標）であり、その間には分子量ラダーが存在する。
【図１９】図１９は、特徴的なグリカン構造のピークを示すＮＰ−ＨＰＬＣプロファイルのプロット、および、グリカン自体の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
医薬品使用のためのタンパク質は従来、哺乳動物または細菌の発現システムで製造されている。この数年間で、有望な新しい発現システムが植物において見出された。新しい遺伝子を導入することが比較的簡便であること、また、タンパク質およびペプチドの大量製造のための潜在的可能性のために、「分子ファーミング（ｐｈａｒｍｉｎｇ）」がタンパク質発現システムとしてますます広まっている。
【０１１６】
哺乳動物のタンパク質発現システムと植物のタンパク質発現システムとの間における大きな違いの１つが、生合成経路における違いによって引き起こされるタンパク質グリコシル化配列の変化である。グリコシル化は、タンパク質の活性、折り畳み、安定性、溶解性、プロテアーゼに対する感受性、血中クリアランス速度、および、抗原としての可能性に対する大きな影響を有することが示された。従って、植物におけるタンパク質製造はどれも、植物のグリコシル化の潜在的な派生問題を考慮に入れなければならない。
【０１１７】
このことが、生物学的に活性な哺乳動物タンパク質を植物において産生させるための以前の試みにおいて遭遇する様々な困難によって十分に例示される。例えば、米国特許第５９２９３０４号（Ｒａｄｉｎ他（Ｃｒｏｐ  Ｔｅｃｈ、Ｉｎｃ））は、タバコ植物において、ヒトα−Ｌ−イズロナーゼ（ＩＤＵＡ）およびグルコセレブロシダーゼ（ｈＧＣ）を、その適切なヒトリソソーム酵素コード配列をタバコ植物のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介による形質転換のためのバイナリープラスミド用の発現カセットに挿入することによって産生させることを開示する。トランスジェニック植物における組換えヒトリソソームタンパク質の産生が明らかにされ、また、組換えタンパク質における触媒活性が検出されたにもかかわらず、標的細胞への結合または標的細胞内への取り込みは何ら開示されておらず、また、リソソーム酵素組成物は、おそらくは、タンパク質の正確なグリコシル化がないこと、および、その後では、このようなポリペプチドは特異的な受容体を介してその標的細胞／組織と効率的に相互作用することができないことのために、治療的適用には適さないままであった。
【０１１８】
炭水化物成分はタンパク質の最も一般的な翻訳後修飾の１つである。タンパク質のグリコシル化は、Ｎ結合型およびＯ結合型の２つのカテゴリーに分けられる。これら２つのタイプは、グリカン成分がタンパク質の表面において結合するアミノ酸が異なり、Ｎ結合型はＡｓｎ残基に結合し、一方、Ｏ結合型はＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基に結合する。加えて、それぞれのタイプのグリカン配列が特有の特徴的な特徴を有する。これら２つのタイプのうち、Ｎ結合型グリコシル化の方が多く存在し、タンパク質に対するその影響が広範囲に研究されている。他方で、Ｏ結合型グリカンは比較的希であり、情報が、タンパク質に対するその影響に関してあまり得られていない。植物におけるタンパク質のグリコシル化に関して得られるデータの大部分が、Ｏ結合型グリカンではなく、むしろ、Ｎ結合型グリカンに集中している。
【０１１９】
本発明は、本明細書において、場合により、また、好ましくは、懸濁状態で成長するトランスジェニック植物細胞（好ましくは根細胞である）に基づく植物発現システムを記載する。この発現システムは、目的とする高マンノース型タンパク質を効率的に産生させるために特に設計される。用語「高マンノース型」は、少なくとも１つの露出したマンノース残基を有するグリコシル化を包含する。
【０１２０】
従って、第１の態様において、本発明は、目的とする高マンノース型組換えタンパク質を産生する宿主細胞に関する。好ましくは、組換えタンパク質はＥＲ（小胞体）シグナルペプチドを特徴とし、より好ましくは、ＥＲ標的化シグナルペプチドを特徴とする。代替として、または、加えて、組換えタンパク質は、タンパク質がゴルジ体を迂回すること生じさせるシグナルを特徴とする。このシグナルは、好ましくは、組換えタンパク質が高マンノース型グリコシル化を特徴とすることを可能にし、より好ましくは、そのようなグリコシル化を保持することによって、また、最も好ましくは、ＥＲを標的化することによって、および／または、ゴルジ体を迂回することによって、組換えタンパク質が高マンノース型グリコシル化を特徴とすることを可能にする。本明細書においてより詳細に記載されるように、そのようなシグナルは、好ましくは、シグナルペプチドとして実行され、より好ましくは、タンパク質配列の一部を形成するシグナルペプチドとして実行され、場合により、また、より好ましくは、シグナルペプチドをタンパク質の一部として同様に特徴とするようにタンパク質を操作することによって実行される。シグナルは、場合により、標的化シグナル、保持シグナル、回避（迂回）シグナル、または、それらの任意の組合せ、あるいは、所望される高マンノース型グリコシル化構造をもたらすことができる任意の他のタイプのシグナルであり得ることに留意しなければならない。
【０１２１】
１つだけの仮説によって限定されることを望まないが、ＥＲ標的化シグナルの使用により、組換えタンパク質が植物細胞培養で産生される場合、ゴルジ体への輸送を抑えることができ、従って、所望される高マンノース型グリコシル化を保持することができたと思われる。場合により、ゴルジ体を迂回するためのいかなるタイプの機構も含めて、高マンノース型グリコシル化をもたらすことができるどのようなタイプの機構も本発明に従って使用することができる。様々なＥＲ標的化シグナルペプチドがこの技術分野では広く知られており、それらはＮ末端のシグナルペプチドである。場合により、何らかの好適なＥＲ標的化シグナルペプチドを本発明とともに使用することができる。
【０１２２】
本発明による宿主細胞は場合により、目的とするタンパク質をコードする組換え核酸分子により、または、この核酸分子を含む発現ベクターにより（永続的および／または一過性に）形質転換またはトランスフェクションすることができる。そのような核酸分子は、目的とするタンパク質をコードする第１の核酸配列を、場合により、また、好ましくは、液胞標的化シグナルペプチドをコードする第２の核酸分子に機能的に連結されて含む。本明細書で使用される用語「機能的に」連結された（連結される）は、物理的な連結を必ずしも示さないことに留意しなければならない。第１の核酸配列はさらに、場合により、また、好ましくは、ＥＲ（小胞体）標的化シグナルペプチドをコードする第３の核酸配列に機能的に連結することができる。１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、目的とするタンパク質が、少なくとも１つの露出されたマンノース残基を含む形態で細胞によって産生されるが、好ましくは、高度にマンノシル化された形態である形態で細胞によって産生されるという点で特徴づけられる。１つのより好ましい実施形態において、目的とするタンパク質が、露出したマンノースおよび少なくとも１つのキシロース残基を含む形態で細胞によって産生され、それにもかかわらず、１つのより好ましい実施形態では、露出したマンノースおよび少なくとも１つのフコース残基をさらに含む形態で細胞によって産生される。１つの非常に好ましい実施形態において、タンパク質が、露出したマンノース、コアα（１，２）キシロース残基およびコアα−（１，３）フコース残基を含む形態で細胞によって産生される。
【０１２３】
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書では交換可能に使用される用語である。そのような用語は、対象とする特定の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫もまた示すことが理解される。いくつかの変化が変異または環境的影響のいずれかのためにその後の世代において生じ得るので、そのような子孫は実際、親細胞と同一でないことがあるが、本明細書で使用される用語の範囲には依然として含まれる。本明細書で使用される「細胞」または「宿主細胞」は、ネイクドＤＮＡにより、または、組換えＤＮＡ技術を使用して構築される発現ベクターにより形質転換することができる細胞を示す。本明細書で使用される用語「トランスフェクション」は、核酸（例えば、ネイクドＤＮＡまたは発現ベクター）をレシピエント細胞に核酸媒介遺伝子移入によって導入することを意味する。本明細書で使用される「形質転換」は、細胞の遺伝子型が外因性ＤＮＡまたは外因性ＲＮＡの細胞取り込みの結果として変化するプロセスを示し、例えば、形質転換された細胞は、所望されるタンパク質の組換え形態を発現する。
【０１２４】
薬物抵抗性マーカーまたは他の選択マーカーが、一部には形質転換体の選択を容易にするために意図されることを理解しなければならない。加えて、選択マーカー（例えば、薬物抵抗性マーカー）の存在は、混入微生物を培養培地において増殖させないことにおいて有用である場合がある。形質転換された宿主細胞のそのような純粋培養が、誘導された表現型の生存のために要求される条件下で細胞を培養することによって得られる。
【０１２５】
上記で示されたように、本発明の宿主細胞は核酸分子によりトランスフェクションまたは形質転換することができる。本明細書で使用される用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、適する場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを示す。これらの用語はまた、均等物として、ヌクレオチドアナログから作製される、ＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかのアナログ、ならびに、実施形態に対して適用可能であるとして記載される場合には、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを包含することを理解しなければならない。
【０１２６】
さらに別の実施形態において、本発明の細胞は、組換え核酸分子を含む発現ベクターによりトランスフェクションまたは形質転換することができる。本明細書で使用される「発現ベクター」は、宿主のゲノムへのＤＮＡフラグメントの組込みを可能にする様々なベクター（例えば、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメントおよび他のビヒクル）を包含する。発現ベクターは、典型的には、所望される遺伝子またはそのフラグメントと、好適な宿主細胞において認識され、所望される遺伝子の発現をもたらす機能的に連結された遺伝子制御エレメントとを含有する自己複製性のＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物である。これらの制御エレメントは、好適な宿主における発現をもたらすことができる。一般に、遺伝子制御エレメントは原核生物プロモーターシステムまたは真核生物プロモーター発現制御システムを含むことができる。そのようなシステムは典型的には、転写プロモーター、転写の開始を制御するための必要に応じて使用されるオペレーター、ＲＮＡ発現のレベルを高めるための転写エンハンサー、好適なリボソーム結合部位をコードする配列、ＲＮＡスプライス接合部、転写および翻訳を終結させる配列などを含む。発現ベクターは通常、ベクターが宿主細胞とは無関係に複製することを可能にする複製起点を含有する。
【０１２７】
プラスミドはベクターの最も一般に使用される形態であるが、同等の機能を果たし、かつ、この技術分野で知られているか、または、知られるようになる他の形態のベクターが本明細書における使用のために好適である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ他、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８５年および増刊）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、および、Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ他（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ（１９８８）を参照のこと（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２８】
一般に、そのようなベクターはさらに、形質転換された細胞における表現型選択をもたらすことができる特定の遺伝子を含有する。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を発現させるための原核生物ウイルス発現ベクターおよび真核生物ウイルス発現ベクターの使用もまた意図される。
【０１２９】
場合により、ベクターは、（下記の実施例に関して記載されるように）一般的な植物ベクターである場合がある。代替として、ベクターは、場合により、根細胞に対して特異的である場合がある。
【０１３０】
１つの好ましい実施形態において、本発明の細胞は真核生物細胞または原核生物細胞であり得る。
【０１３１】
１つの具体的な実施形態において、本発明の細胞は原核生物細胞であり、好ましくは細菌細胞であり、最も好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞である。これらの細胞は、下記の好ましい植物宿主細胞に感染させるために使用される。
【０１３２】
別の好ましい実施形態において、本発明の細胞は真核生物細胞、好ましくは植物細胞、最も好ましくは、アグロバクテリウム・リゾゲネスにより形質転換された植物根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞である場合がある。
【０１３３】
１つの好ましい実施形態において、植物根細胞はニンジン細胞である。本発明の形質転換されたニンジン細胞は懸濁状態で成長することに留意しなければならない。上記で述べられたように、また、実施例において記載されるように、これらの細胞は本発明のアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞により形質転換された。
【０１３４】
本発明の宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するために使用される発現ベクターまたは組換え核酸分子はさらに、ペプチドシグナル配列を付加して、または、除いて、または、他の場合には、改変して、シグナルペプチドの切断を変化させるために、あるいは、発現したリソソーム酵素の、植物内膜系を介する標的化を増大または変化させるために、当業者に知られている様々な方法に従って改変することができる。例えば、しかし、限定としてではないが、発現構築物を、分泌のために、または、液胞での局在化のために、または、小胞体（ＥＲ）における保持のためにリソソーム酵素を標的化するように特に操作することができる。
【０１３５】
１つの実施形態において、発現ベクターまたは組換え核酸分子は、リソソーム酵素を植物液胞に標的化するシグナルをコードするヌクレオチド配列を取り込むように操作することができる。例えば、また、限定としてではないが、本発明の宿主細胞に含まれる組換え核酸分子は、塩基性タバコキチナーゼＡ遺伝子に由来する液胞標的化シグナルペプチドをコードする第２の核酸配列との機能的な連結にある、リソソーム酵素をコードする第１の核酸配列を含む。この液胞シグナルペプチドは、配列番号２によって示されるようなアミノ酸配列を有する。第１の核酸配列は場合によりさらに、配列番号１によって示されるようなＥＲ（小胞体）標的化シグナルペプチドをコードする第３の核酸配列と機能的な連結で連結することができる。１つの実施形態において、本発明の宿主細胞に含まれる組換え核酸分子はさらに、植物細胞において機能的であるプロモーターを含む。このプロモーターは本発明の組換え分子に機能的に連結されなければならない。
【０１３６】
用語「機能的に連結された（される）」は、第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能的な関係で置かれるとき、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に連結されることを示すために本明細書で使用される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターはコード配列に機能的に連結される。場合により、また、好ましくは、機能的に連結されたＤＮＡ配列は連続しており（例えば、物理的に連結され）、また、２つのタンパク質コード領域をつなぐ必要がある場合には、同じリーディングフレームにある。従って、ＤＮＡ配列および調節配列（１つまたは複数）は、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が調節配列（１つまたは複数）に結合したとき、遺伝子発現を可能にするような様式でつながれる。
【０１３７】
別の実施形態において、このような組換え核酸分子は場合によりさらに、植物細胞において好ましくは機能的である機能的に連結されたターミネーターを含むことができる。本発明の組換え核酸分子は場合によりさらに、さらなる制御エレメント、促進エレメントおよび調節エレメント、ならびに／または、選択マーカーを含むことができる。これらの調節エレメントは組換え分子に機能的に連結されることに留意しなければならない。
【０１３８】
発現構築物において使用することができる調節エレメントには、植物細胞にとって異種または同族的のどちらかであり得るプロモーターが含まれる。プロモーターは、連結された配列の高レベルの転写を植物細胞および植物において行わせることができる植物プロモーターまたは非植物プロモーターであり得る。本発明を実施することにおいて効果的に使用することができる植物プロモーターの限定されない例には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ、ｒｂｃＳ、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質に対するプロモーター、ＡｄｈＩ、ＮＯＳおよびＨＭＧ２、あるいは、それらの改変体または誘導体が含まれる。プロモーターは構成的または誘導可能のどちらかであり得る。例えば、また、限定としてではないが、誘導可能なプロモーターとして、植物、植物組織または植物細胞の機構的遺伝子活性化（ＭＧＡ）の後、リソソーム酵素ヌクレオチド配列の発現または増大した発現を促進させるプロモーターが可能である。
【０１３９】
本発明の宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するために使用される発現ベクターはさらに、植物および植物細胞における異種遺伝子の発現を増強または最適化するために、当業者に知られている様々な方法に従って改変することができる。そのような改変には、プロモーターの強さを増大させるためにＤＮＡ調節エレメントを変異すること、または、目的とするタンパク質を変化させることが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
１つの好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞によって産生される目的とする高マンノース型タンパク質は、少なくとも１つの露出したマンノース残基（少なくとも１つの末端マンノース残基）を有する、マンノースが多い糖タンパク質であり得る。別の実施形態では、本発明の糖タンパク質において、マンノース残基のほとんど（７５％超）が末端の露出したマンノース残基である。
【０１４１】
そのような高マンノース型タンパク質は、別の好ましい実施形態によれば、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択されるリソソーム酵素であり得る。
【０１４２】
用語「リソソーム酵素」は、本発明によって記載される植物発現システムで産生される何らかのそのような酵素および産物に関して本明細書で使用される場合、ヒトまたは動物のリソソーム酵素、ヒトまたは動物の改変されたリソソーム酵素、あるいは、そのような酵素のフラグメント、誘導体または改変体をコードするヌクレオチド配列からトランスジェニック植物細胞で発現される組換えペプチドを示す。ヒトまたは動物の有用な改変されたリソソーム酵素には、天然に存在するか、または、人為的に導入された１つまたはいくつかのアミノ酸付加、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸置換を有する、ヒトまたは動物のリソソーム酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
可溶性のリソソーム酵素は生合成の初期段階を分泌タンパク質と共有する：すなわち、リボソーム上での合成、粗面小胞体（ＥＲ）の表面に対するＮ末端シグナルペプチドの結合、シグナルペプチドが切断されるＥＲの内腔への輸送、および、特定のアスパラギン残基へのオリゴ糖の付加（Ｎ結合型）、それに続く、ゴルジ装置における新生タンパク質のさらなる修飾［ｖｏｎ  ＦｉｇｕｒａおよびＨａｓｉｌｉｋ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１６７〜１９３（１９８６）］。Ｎ結合型オリゴ糖は、複雑で、多様で、かつ、不均一であり得るし、また、高マンノース型残基を含有する場合がある。タンパク質は、ＥＲ後のプレ−ゴルジ区画において、また、シス−ゴルジにおいてさらなるプロセシングを受けて、リソソーム局在化酵素に対するＮ結合型マンノース６−リン酸（Ｍ−６−Ｐ）オリゴ糖依存性認識シグナルまたはＮ結合型Ｍ−６−Ｐオリゴ糖非依存性認識シグナルのどちらかを形成する［Ｋｏｒｎｆｅｌｄ＆Ｍｅｌｌｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５：４８３〜５２５（１９８９）；Ｋａｐｌａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：２０２６（１９７７）］。Ｍ−６−Ｐ認識シグナルの存在は、酵素がＭ−６−Ｐ受容体（ＭＰＲ）に結合することをもたらす。これらの結合した酵素は細胞内に留まり、最終的にはリソソームにパッケージングされ、従って、分泌のために標的化されるタンパク質、または、原形質膜に対して標的化されるタンパク質から隔離される。
【０１４４】
１つの好ましい実施形態において、リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）またはヒトα−ガラクトシダーゼＡであり得る。
【０１４５】
なおさらに、１つの具体的な実施形態において、この好ましい宿主細胞は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター、好ましくは、配列番号９によって示されるような核酸配列を有するカリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーターと、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼターミネーター、好ましくは、配列番号１２によって示されるような核酸配列を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼターミネーターと、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）のΩ翻訳エンハンサーエレメントとをさらに含む組換え核酸分子によって形質転換またはトランスフェクションされる。１つの好ましい実施形態によれば、この組換え核酸分子は、実質的には配列番号１３によって示されるような核酸配列を含み、実質的には配列番号１４または１５によって示されるようなアミノ酸配列を有する高マンノース型ＧＣＤをコードする。
【０１４６】
本発明はさらに、生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素をコードする核酸分子を含む発現ベクターを提供することを理解しなければならない。
【０１４７】
この態様の１つの好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターは、生物学的に活性な高マンノース型のヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）をコードする核酸分子を含む。好ましくは、この好ましい発現ベクターは、実質的には配列番号１３によって示されるような核酸配列を有する組換え核酸分子を含む。１つの具体的な実施形態によれば、好ましい発現ベクターでは、下記の実施例１によって記載されるようなｐＧＲＥＥＮＩＩプラスミドが利用される。本発明の別の実施形態において、発現ベクターは、生物学的に活性な高マンノース型のヒトα―ガラクトシダーゼ（α−ｇａｌ−Ａ）をコードする核酸分子を含む。好ましくは、この好ましい発現ベクターは、実質的には配列番号１７または１９によって示されるような核酸配列を有する組換え核酸分子を含む。１つの具体的な実施形態によれば、好ましい発現ベクターでは、下記の実施例５ａによって記載されるようなｐＩＣＨ１９１７０プラスミドが利用される。
【０１４８】
本発明は、上記で記載される発現ベクターに含まれる発現カセットを提供することにさらに留意しなければならない。
【０１４９】
第２の態様において、本発明は、本発明の宿主細胞によって産生される組換え高マンノース型タンパク質に関連する。
【０１５０】
１つの好ましい実施形態において、この高マンノース型タンパク質は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択される生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素であり得る。最も好ましくは、このリソソーム酵素はヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）であり得る。
【０１５１】
用語「生物学的に活性な」は、組換えリソソーム酵素が、ヒトまたは動物の対応するリソソーム酵素の天然基質あるいはアナログ基質または合成基質のどれかを検出可能なレベルで加水分解することができることを意味するために、植物発現システムで産生されるいずれかの組換えリソソーム酵素に関して本明細書では使用される。
【０１５２】
なおさらに、本発明は、露出したマンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有する組換えの生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素を提供する。
【０１５３】
１つの好ましい実施形態によれば、本発明の組換えリソソーム酵素は標的部位において標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる。好ましくは、この部位は、リソソーム蓄積症に罹患する対象の体内であり得る。
【０１５４】
場合により、また、より好ましくは、組換えリソソーム酵素は、標的細胞に対する天然に存在するリソソーム酵素の親和性との比較において、標的細胞に対する増大した親和性を有する。１つの具体的な実施形態において、標的部位における標的細胞は対象の肝臓におけるクップファー細胞であり得る。
【０１５５】
１つの好ましい実施形態において、組換えリソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼまたはシアリダーゼからなる群から選択され得る。
【０１５６】
最も好ましくは、この組換えリソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）またはα−ガラクトシダーゼＡである。
【０１５７】
第３の態様において、本発明は、高マンノース型タンパク質を産生させる方法に関連する。それによれば、本発明のこの方法は、（ａ）目的とする組換えタンパク質をコードする組換え核酸分子により、または、この組換え核酸分子を含む発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた組換え宿主細胞の培養物を調製する工程；（ｂ）工程（ａ）によって調製される宿主細胞の培養物を、高マンノース型タンパク質の発現を可能にする条件下で懸濁状態で培養する工程（この場合、宿主細胞により、タンパク質が、高度にマンノシル化された形態で産生される）；（ｃ）細胞を（ａ）において提供された培養物から集め、タンパク質を細胞から回収する工程；および（ｄ）工程（ｃ）のタンパク質を好適なタンパク質精製方法によって精製する工程を含む。
【０１５８】
場合により、また、好ましくは、組換えタンパク質を、米国特許第６３９１６３８号（２００２年５月２１日発行、これは、全体が本明細書に示されるかのように本明細書により参照によって組み込まれる）に関して記載されるデバイスで培養することによって、本発明による植物細胞によって産生させることができる。植物細胞をこのデバイスにより懸濁状態で培養するための条件が、「ＣＥＬＬ／ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ  ＤＥＶＩＣＥ，ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ」と題される米国特許出願（これは、本発明者らの１人によるものであり、本出願と共有である）に関して記載される（この米国特許出願は、全体が本明細書に示されるかのように本明細書により参照によって組み込まれ、また、本出願と同じ日に出願された）。
【０１５９】
本発明の１つの実施形態のさらなる態様によれば、組換えタンパク質を植物全体またはその一部において発現させることができる。それによれば、本発明のこの方法は、（ａ）植物または植物細胞を、目的とする組換えタンパク質をコードする組換え核酸分子により、または、この組換え核酸分子を含む発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションする工程；（ｂ）工程（ａ）によって調製される形質転換またはトランスフェクションされた植物または細胞を、高マンノース型タンパク質の発現を可能にする条件下で成長させる工程（この場合、植物細胞により、タンパク質が、露出した末端マンノース残基を有するマンノシル化された形態で産生される）；（ｃ）植物または組織を（ａ）において提供された植物または植物組織から集め、タンパク質を細胞から回収する工程；および（ｄ）工程（ｃ）のタンパク質を好適なタンパク質精製方法によって精製する工程を含む。本発明の別の実施形態において、ベクターによる植物の形質転換は安定的な形質転換であり、工程（ｂ）の後には、目的とする組換えタンパク質を発現する植物を選抜すること、および、選抜されたトランスジェニック植物を増殖させることが、組換えタンパク質を集め、回収する前に行われる。植物または植物組織（これには、植物体（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）と同様に、培養でのカルス、未成熟胚、花粉、種子、茎頂部が含まれるが、これらに限定されない）を、所望される哺乳動物ポリペプチドの構成的発現または条件的発現のために組換え発現ベクターにより形質転換することが、例えば、バイナリープラスミドを（米国特許第５７６３７４８号に記載されるように）タバコ植物のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介による形質転換のために使用して、または、共組み込み型ベクターを使用して、または、可動化ベクターを使用して、この技術分野では広く知られている。
【０１６０】
本発明の方法によって産生される目的とする高マンノース型タンパク質を回収および精製するための具体的かつ限定されない一例が、下記の実施例において見出され得る。実施例では、本発明によって産生される組換えｈ−ＧＣＤが、予想外にも、本発明の形質転換されたニンジン細胞の内膜に結合し、培地に分泌されなかったことが示される。可溶性ｒｈ−ＧＣＤは、この技術分野において知られている様々な手段（例えば、ろ過または沈殿）に従って、細胞破片および他の不溶性成分から分離することができる。例えば、凍結解凍サイクルの後、細胞は、破壊、および、細胞内可溶性タンパク質の放出を受け、これに対して、ｈ−ＧＣＤは不溶性の膜破片に結合したままである。このような可溶物および不溶性膜破片の混合物は次に遠心分離され、可溶性画分が除かれ、従って、このことにより、精製が簡略化された。膜に結合したｈ−ＧＣＤは、その後、穏和な界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤および酸化中和試薬の存在下での機械的な破壊によって溶解することができる。可溶性酵素はさらに、様々なクロマトグラフィー技術を使用して、例えば、カチオン交換クロマトグラフィーカラムおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを使用して精製することができる。バイオリアクターにおけるｒｈ−ＧＣＤ産生期間中および精製プロセス期間中において、ｈ−ＧＣＤの同一性、収量、純度および酵素活性を１つまたは複数の生化学的アッセイによって求めることができる。そのようなアッセイには、酵素の基質または基質アナログの加水分解を検出すること、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析および免疫学的分析（例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
植物全体および植物組織で発現させた組換えタンパク質の収量、純度、酵素活性、抗原特性、生物学的活性およびグリカンプロファイルを、下記の実施例において記載されるように、１つまたは複数の生化学的アッセイによって評価することができ、そのようなアッセイには、酵素の基質または基質アナログの加水分解を検出すること、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析、免疫学的分析（例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）、グリコシダーゼ酵素によるグリカン分析、および、クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
１つの好ましい実施形態によれば、この方法によって使用される宿主細胞は本発明の宿主細胞を含む。
【０１６３】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法によって産生される高マンノース型タンパク質は、露出したマンノース残基を含む少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有する生物学的に活性な高マンノース型リソソーム酵素であり得る。
【０１６４】
この組換え酵素は標的部位において標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる。より詳しくは、本発明の方法によって産生される組換え酵素は、標的細胞に対する天然に存在するリソソーム酵素の対応する親和性との比較において、標的細胞に対する増大した親和性を有する。それによれば、標的部位における標的細胞は対象の肝臓におけるクップファー細胞であり得る。
【０１６５】
１つの具体的な実施形態において、このリソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択され得る。最も好ましくは、このリソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）であり得る。
【０１６６】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法によって使用される宿主細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスにより形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞であり得る。最も好ましくは、植物根細胞はニンジン細胞である。形質転換された宿主ニンジン細胞は懸濁状態で成長することに特に留意しなければならない。
【０１６７】
さらなる態様において、本発明は、外因性の組換えリソソーム酵素を使用することによって、リソソーム蓄積症を有する対象（好ましくは、哺乳動物対象）を処置するための方法に関連する。
【０１６８】
本発明を開示し、記載したが、本発明は本明細書に開示される特定の実施例、方法工程、および材料に限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、そのような方法工程および材料は多少変化しうるからである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためにのみ使用され、特定の実施形態に限定されることを意図しないことも理解されるべきである。
【０１６９】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈が他のことを要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または変化形（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓまたはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇなど）は、言及された完全体または工程、あるいは、完全体または工程の群を包含することを意味し、任意の他の完全体または工程、あるいは、完全体または工程の群を除外することを意味しないことが理解される。
【０１７０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容がそうでないことを明確に示さない限り、複数形態を包含することに注意されるべきである。
【０１７１】
以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らによって利用される技術の代表例である。これらの技術が本発明の実施のための好ましい実施形態の例示であり、本開示に照らして、当業者が、本発明の精神および意図される範囲から逸脱することなく多数の変更がなされうることを理解することは理解されるべきである。
【実施例】
【０１７２】
実験手順：
プラスミドベクター
＊ＣＥ−Ｔ：これを、Ｇａｌｉｌｉ教授から得られたプラスミドＣＥから構築した［米国特許第５３６７１１０号、１９９４年１１月２２日］。
【０１７３】
プラスミドＣＥをＳａｌＩにより消化した。
【０１７４】
ＳａｌＩの付着末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメントを使用して平滑末端にした。その後、プラスミドをＰｓｔＩにより消化し、ＳｍａＩおよびＰｓｔＩにより消化された塩基性エンドキチナーゼ遺伝子［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ］由来のＥＲ標的化シグナル（ＡＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＡＡＴＴＣ）およびタバコキチナーゼＡ由来の液胞標的化シグナル（ＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧ）をコードするＤＮＡフラグメントに連結した。
【０１７５】
＊ｐＧＲＥＥＮＩＩ：これをＰ．Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ博士から得た［Ｒｏｇｅｒ  Ｐ．Ｈｅｌｌｅｎｓ他（２０００）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．  ４２：８１９〜８３２］。ｐＧＲＥＥＮＩＩベクターからの発現は、カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）のΩ翻訳エンハンサーエレメント、および、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のオクトピンシンターゼターミネーター配列によって制御される。
【０１７６】
ｃＤＮＡ
ｈＧＣＤ：これをＡＴＣＣ（アクセション番号６５６９６）から得た。グルコシダーゼβ（酸性）［グルコセレブロシダーゼ］を含有するＧＣ−２．２［ＧＣＳ−２ｋｂ；λ−ＥＺＺ−γ３ホモサピエンス］。インサート長さ（ｋｂ）：２．２０；組織：繊維芽細胞ＷＩ−３８細胞。
【０１７７】
発現プラスミドの構築
ｈＧＣＤをコードするｃＤＮＡ（ＡＴＴＣクローン番号６５６９６）を、フォワードプライマー（５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＡ３’）およびリバースプライマー（５’ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＡ３’）を使用して増幅した。精製されたＰＣＲ  ＤＮＡ産物をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩのエンドヌクレアーゼにより消化し（プライマー内の下線部の認識配列を参照のこと）、同じ酵素により消化された、発現カセットＥ−Ｔを有する中間ベクターに連結した。発現カセットを、ＳｍａＩおよびＸｂａＩの制限酵素を使用して切断し、中間ベクターから取り出し、その後、バイナリーベクターｐＧＲＥＥＮＩＩに連結し、これにより、最終的な発現ベクターを形成した。カナマイシン抵抗性が、ｐＧＲＥＥＮＩＩベクターと一緒に得られるｎｏｓプロモーターにより駆動されるＮＰＴＩＩ遺伝子によって付与される（図１Ｂ）。得られる発現カセットが図１Ａによって示される。
【０１７８】
得られたプラスミドを、下記の配列決定用プライマーを使用して、シグナルの正しいインフレーム融合を保証するために配列決定した：５’側３５Ｓプロモーター：５’ＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＣ３’、および、３’側ターミネーター：５’ＣＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣ３’。
【０１７９】
ニンジンカルスの確立および細胞懸濁培養
本発明者らが行ったニンジンカルスの確立および細胞懸濁培養は、Ｔｏｒｒｅｓ  Ｋ．Ｃ．によって以前に記載された通りであった（Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｈｏｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｒｏｐｓ、１１１頁、１６９）。
【０１８０】
ニンジン細胞の形質転換および形質転換細胞の単離
ニンジン細胞の形質転換を、以前に記載された方法［Ｗｕｒｔｅｌｅ，Ｅ．Ｓ．およびＢｕｌｋａ，Ｋ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、６１：２５３〜２６２（１９８９）］の適合化によるアグロバクテリウム形質転換を使用して行った。液体培地で成長する細胞を、カルスの代わりに、プロセスを通して使用した。インキュベーション時間および成長時間を、液体培養されている細胞の形質転換のために適合化した。簡単に記載すると、アグロバクテリウム細菌をエレクトロポレーションによってｐＧＲＥＥＮＩＩベクターにより形質転換し［ｄｅｎ  Ｄｕｌｋ−Ｒａ，Ａ．およびＨｏｏｙｋａａｓ、Ｐ．Ｊ．（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：６３〜７２］、その後、３０ｍｇ／ｍｌのパロモマイシン抗生物質を使用して選抜した。ニンジン細胞をアグロバクテリウム細菌により形質転換し、液体培地において６０ｍｇ／ｍｌのパロモマイシン抗生物質を使用して選抜した。
【０１８１】
高レベルのＧＣＤを発現するカルスを単離するための形質転換されたニンジン細胞のスクリーニング
形質転換後１４日で、培養から得られる細胞を、個々の細胞クラスターからカルスを形成させるために３％充填細胞体積の希釈度で固体培地に置床した。個々のカルスが１ｃｍ〜２ｃｍの直径に達したとき、細胞をＳＤＳサンプル緩衝液においてホモジネートし、得られたタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ［Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｕ．（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０〜６８５］で分離し、ニトロセルロースメンブラン（ｈｙｂｏｎｄＣニトロセルロース、０．４５ミクロン、カタログ番号：ＲＰＮ２０３Ｃ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅから得られる）に転写した。ＧＣＤを検出するためのウエスタンブロットを、ポリクローナル抗ｈＧＣＤ抗体（本明細書中下記に記載される）を使用して行った。著しいレベルのＧＣＤを発現するカルスを拡大して、スケールアップ、タンパク質精製および分析のために液体培地における成長に移した。
【０１８２】
ポリクローナル抗体の調製
７５マイクログラムの組換えＧＣＤ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標））を３ｍｌの完全フロイントアジュバントに懸濁し、２羽のウサギのそれぞれに注射した。それぞれのウサギに追加免疫注射を２週間後に与えた。ウサギを追加免疫注射後の約１０日で採血し、抗体力価が低下し始めるまで１週間の間隔で再び採血した。凝血塊を除いた後、血清を小分けし、−２０℃で保存した。
【０１８３】
バイオリアクターにおけるアップスケール培養での成長
ｒｈ−ＧＣＤ遺伝子を含有する遺伝子改変されたニンジン細胞の約１ｃｍ（直径）のカルスを、４．４ｇｒ／ｌのＭＳＤ培地（Ｄｕｃｈｅｆａ）、９．９ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ（Ｄｕｃｈｅｆａ）、０．５ｍｇの葉酸（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｌのビオチン（Ｄｕｃｈｅｆａ）、０．８ｇ／ｌのカゼイン加水分解物（Ｄｕｃｉｆａ）、３０ｇ／ｌの糖、および、ホルモンの２−４Ｄ（Ｓｉｇｍａ）を含有する直径９ｃｍのムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）寒天培地平板に置床した。カルスを２５℃で１４日間成長させた。
【０１８４】
懸濁細胞培養を、この技術分野では広く知られているように、形質転換されたカルスをＭＳＤ液体培地（０．２ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロ酢酸を含有するムラシゲ・スクーグ（１９６２））で継代培養することによって調製した。懸濁細胞を、２５０ｍｌの三角フラスコにおいて、２５℃で、６０ｒｐｍの振とう速度により培養した（作業体積を２５ｍｌで開始し、７日後に５０ｍｌに増大させる）。続いて、細胞培養体積を、作業体積を同じ条件下で３００ｍｌにまで増やすことによって１Ｌの三角フラスコに増大させた。４ＬのＭＳＤ培地を含有する小型バイオリアクター（１０Ｌ）［国際特許出願公開ＷＯ９８／１３４６９を参照のこと］の接種物を、７日間培養された２つの１Ｌの三角フラスコに由来する４００ｍｌの懸濁細胞を加えることによって得た。１Ｌｐｍの空気流とともに２５℃での１週間の培養の後、ＭＤＳ培地を１０Ｌにまで加え、培養を同じ条件下で続けた。さらに５日間の培養の後、細胞のほとんどを、細胞培地を８０μの網に通すことによって集め、回収した。余分な培地を絞り出し、押し固めた細胞ケークを−７０℃で保存した。
【０１８５】
バイオリアクターデバイスのさらなる詳細を米国特許第６３９１６３８号（２００２年５月２１日発行、これは以前に参照により組み込まれる）に関して見出すことができる。
【０１８６】
タンパク質精製
培地を不溶性ＧＣＤから分離するために、約１００ｇの湿重量の細胞を含有する凍結細胞ケークを解凍し、その後、解凍された細胞を、１７０００ｘｇで２０分間、４℃で遠心分離した。不溶物および無傷の細胞を１００ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、２０ｍＭのＥＤＴＡ）における再懸濁によって洗浄し、その後、１７０００ｇにおける２０分間の４℃での遠心分離によって沈殿させた。ｒｈ−ＧＣＤ（組換えヒトＧＣＤ）を、ペレットを２００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２０ｍＭのアスコルビン酸、３．８ｇのポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、１ｍＭのＤＴＴおよび１％のＴｒｉｔｏｎ−ｘ−１００）においてホモジネートすることによって抽出および可溶化した。その後、ホモジネートを室温で３０分間振とうし、１７０００ｘｇにおける２０分間の４℃での遠心分離によって清澄化した。ペレットを捨て、上清のｐＨを濃クエン酸の添加によってｐＨ５．５に調節した。ｐＨ調節後に生じた濁りを、上記と同じ条件下での遠心分離によって清澄化した。
【０１８７】
さらなる精製を下記のようなクロマトグラフィーカラム手順によって行った：２００ｍｌの清澄化された培地を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化され、ＸＫカラム（２．６×２０ｃｍ）に充填された２０ｍｌの強カチオン交換樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に負荷した。カラムを、電気伝導率、ｐＨおよび２８０ｎｍでの吸光度をモニターすることを可能にするＡＫＴＡプライムシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一体化した。サンプルを２０ｍｌ／分で負荷し、その後、カラムを、ＵＶ吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液（２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）により１２ｍｌ／分の流速で洗浄した。ｒｈ−ＧＣＤのプレ溶出を、２００ｍＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液により行い、溶出を、６００ｍＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液により得た。処理期間中に集められる分画物を酵素活性アッセイによってモニターし、酵素活性を（溶出ピークにおいて）示すチューブをプールした。プールされたサンプルを、５％のエタノールを含有する水で希釈（１：５）し、ＮａＯＨにより６．０にｐＨ調節した。ｒｈ−ＧＣＤを含有するサンプルを、前段カラムの場合と同じ樹脂の１０ｍｌが充填された第２のＸＫカラム（１．６×２０ｃｍ）に加えた。このカラムにおける樹脂は、５％のエタノールを含有する２０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡化された。サンプル負荷の後、カラムを平衡化緩衝液により洗浄し、ＧＣＤを溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）、５％のエタノールおよび１ＭのＮａＣｌ）によってカラムから溶出した。溶出工程における吸収ピークの分画物をプールし、第３のカラムに加えた。
【０１８８】
最終精製工程を、８ｍｌの疎水性相互作用樹脂（ＴＳＫゲル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｃ、Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐ．）が充填されたＸＫカラム（１．６×２０ｃｍ）で行った。樹脂は、５％のエタノールを含有する１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）において平衡化された。前段カラムからのＧＣＤ溶出プールを６ｍｌ／分で負荷し、その後、ＵＶ吸収がベースラインに達するまで平衡化緩衝液により洗浄した。純粋なＧＣＤが、５０％のエタノールを含有する１０ｍＭクエン酸塩緩衝液によって溶出され、これをプールし、−２０℃で保存した。
【０１８９】
タンパク質濃度の測定
細胞抽出物および分画物におけるタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンの標準物（第Ｖ画分、Ｓｉｇｍａ）を使用してＬｏｗｒｙ／Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｉｏ  Ｒａｄタンパク質アッセイ）［Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６）、７２：２４８］によってアッセイした。代替として、均一タンパク質サンプルの濃度を２８０ｎｍにおける吸収によって求めた（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４Ｏ．Ｄ２８０）。純度を２８０／２６０ｎｍの比によって求めた。
【０１９０】
ＧＣＤ酵素活性アッセイ
ＧＣＤの酵素活性を、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ）を基質として使用して求めた。アッセイ緩衝液は、６０ｍＭリン酸塩−クエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝６）、４ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１．３ｍＭのＥＤＴＡ、０．１５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１２５％のタウロコール酸ナトリウムを含有した。アッセイを９６ウエルＥＬＩＳＡプレートにおいて行った。０〜５０マイクロリットルのサンプルを２５０マイクロリットルのアッセイ緩衝液とインキュベーションし、基質を４ｍＭの最終濃度に添加した。反応液を３７℃で６０分間インキュベーションした。生成物（ｐ−ニトロフェニル；ｐＮＰ）の形成を４０５ｎｍにおける吸光度によって検出した。４０５ｎｍにおける吸光度をｔ＝０および終点でモニターした。６０分後、６マイクロリットルの５Ｎ  ＮａＯＨをそれぞれのウエルに加え、４０５ｎｍにおける吸光度を再びモニターした。並行してアッセイされた参照標準曲線を使用して、試験されたサンプルにおけるＧＣＤの濃度を定量した［Ｆｒｉｅｄｍａｎ他（１９９９）、Ｂｌｏｏｄ、９３（９）：２８０７〜１６］。
【０１９１】
速度論的研究：
速度論的研究のために、ＧＣＤ活性を、グルコシルセラミドの蛍光性の短アシル鎖アナログであるＮ−［６−［（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノイル］−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−グルコシルスフィンゴシン（Ｃ６−ＮＢＤ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ＧｌｃＣｅｒ）を使用して、いくつかの改変とともに本明細書中上記に記載されるようにアッセイした。Ｃ６−ＮＢＤ−ＧｌｃＣｅｒを、ＳｃｈｗａｒｚｍａｎｎおよびＳａｎｄｈｏｆｆ（１９８７）によって記載されるように、スクシンイミジル６−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノヘキサノアートを使用するグルコシルスフィンゴシンのＮ−アシル化によって合成した。アッセイを、２００μｌのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．５）の最終体積において、０．２μｇのＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）または本発明の植物ＧＣＤのどちらかを使用して行った。Ｃ６−ＮＢＤ−ＧｌｃＣｅｒの濃度は０．２５μＭから１００μＭにまで及んだ。反応を３７℃で５分間進行させ、蛍光性脂質の抽出および分析の前に１．５ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２、ｖ／ｖ）を加えることによって停止させた。
【０１９２】
生化学的分析：
ゲル内タンパク質分解および質量分析法による分析
ゲルにおける染色されたタンパク質バンドを清浄なカミソリ刃により切り出し、ゲル内のタンパク質を１０ｍＭのＤＴＴにより還元し、１０ｍＭ重炭酸アンモニウムにおける１００ｍＭのヨードアセトアミドにより修飾した。ゲル片を１０ｍＭ重炭酸アンモニウムにおける５０％アセトニトリルにより処理して、染色剤をタンパク質から除き、その後、ゲル片を乾燥した。乾燥ゲル片を、サンプルあたり約０．１μｇのトリプシンを含有する１０ｍＭ重炭酸アンモニウムにおける１０％アセトニトリルにより再水和した。ゲル片を３７℃で一晩インキュベーションし、得られたペプチドを、０．１％トリフルオロアセタートを含む６０％アセトニトリルにより回収した。
【０１９３】
トリプシン消化ペプチドを、多孔性Ｒ２（Ｐｅｒｓｅｐｅｃｔｉｖｅ）が均一充填された０．１Ｘ３００ｍｍの溶融シリカキャピラリー（Ｊ＆Ｗ、内径：１００マイクロメートル）での逆相クロマトグラフィーによって分離した。ペプチドを、約１μｌ／分の流速で、水における０．１％酢酸を含む５％〜９５％のアセトニトリルの８０分間の直線グラジエントを使用して溶出した。カラムからの液体をイオントラップ質量分析計（ＬＣＱ、Ｆｉｎｎｅｇａｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）にエレクトロスプレーした。質量分析を、全域ＭＳ走査を繰り返し使用し、その後、最初のＭＳ走査から選択された最も優勢なイオンの衝突誘導解離（ＣＩＤ）を使用して陽イオンモードで行った。質量分析データを、Ｓｅｑｕｅｓｔソフトウエア［Ｊ．ＥｎｇおよびＪ．Ｙａｔｅｓ、ワシントン大学およびＦｉｎｎｅｇａｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）］を使用して、ＮＲ−ＮＣＢＩデータベースにおけるタンパク質のシミュレートされたタンパク質分解およびＣＩＤと比較した。
【０１９４】
タンパク質のアミノ末端を、製造者の説明書に従って、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ４９４Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で配列決定した。
【０１９５】
腹腔マクロファージのＧＣＤ取り込み
マクロファージに対するＧＣＤの標的化および取り込みが、マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン受容体によって媒介されることが知られており、これは、Ｓｔａｈｌ  Ｐ．およびＧｏｒｄｏｎ  Ｓ．［Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８２）、９３（１）：４９〜５６］によって記載されるように、マウスから得られるチオグリコラート誘発された腹腔マクロファージを使用して求めることができる。簡単に記載すると、マウス（メス、Ｃ５７−Ｂ６系統）に２．４％のデキストロース非含有Ｂａｃｔｏ−チオグリコラート培地（Ｄｉｆｃｏカタログ番号０３６３−１７−２）の２．５ｍｌを腹腔内注射した。４〜５日後、処置されたマウスを頸部脱臼によって屠殺し、腹膜腔をリン酸塩緩衝化生理的食塩水により洗浄した。細胞を遠心分離（１０００ｘｇ、１０分間）によってペレット化し、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）に再懸濁した。その後、細胞を１〜２×１０５細胞／ウエルで９６ウエル組織培養プレートに置床し、３７℃でインキュベーションした。９０分後、非接着性の細胞を、ＰＢＳを使用して３回洗浄して除き、接着性のマクロファージを、酵母マンナン（２−１０、５ｍｇ／ｍｌ）の非存在下および存在下、２００マイクロリットルの最終体積において０から４０マイクログラムにまで及ぶ指定量のｒｈＧＣＤを含有する培養培地において３７℃で９０分間インキュベーションした。インキュベーション後、過剰なｒＧＣＤを含有する培地を除き、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、その後、溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ＝７．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５％のＮＰ−４０およびプロテアーゼ阻害剤）により溶解した。細胞によって取り込まれたｒＧＣＤの活性を、細胞溶解物を上記で記載されるようなインビトロでのグリコシダーゼアッセイに供することによって求めた。
【０１９６】
実施例１
発現プラスミドの構築
本実施例は、下記の実施例に関して使用される例示的な発現プラスミドの構築をより詳しく記載する。
【０１９７】
ｈＧＣＤをコードするｃＤＮＡ（ＡＴＴＣクローン番号６５６９６）を、フォワードプライマーの５’ＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＡ３’（これはまた配列番号１によって示される）およびリバースプライマーの５’ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＡ３’（これはまた配列番号２によって示される）を使用して増幅した。
【０１９８】
精製されたＰＣＲ  ＤＮＡ産物をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩのエンドヌクレアーゼにより消化し（プライマー内の下線部の認識配列を参照のこと）、同じ酵素により消化された、発現カセットＣＥ−Ｔを有する中間ベクターに連結した。ＣＥ−Ｔは、塩基性エンドキチナーゼ遺伝子［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ］由来のＥＲ標的化シグナルＭＫＴＮＬＦＬＦＬＩＦＳＬＬＬＳＬＳＳＡＥＡ（これはまた配列番号３によって示される）と、タバコキチナーゼＡ由来の液胞標的化シグナルＤＬＬＶＤＴＭ＊（これはまた配列番号４によって示される）とを含む。
【０１９９】
発現カセットを、ＳｍａＩおよびＸｂａＩの制限酵素を使用して切断し、中間ベクターから取り出し、バイナリーベクターｐＧＲＥＥＮＩＩに連結し、これにより、最終的な発現ベクターを形成した。カナマイシン抵抗性が、ｐＧＲＥＥＮＩＩベクターと一緒にｎｏｓプロモーターにより駆動されるＮＰＴＩＩ遺伝子によって付与される（図１Ｂ）。得られる発現カセットが図１Ａによって示される。
【０２００】
得られたプラスミドを、下記の配列決定用プライマーを使用して、シグナルの正しいインフレーム融合を保証するために配列決定した。
【０２０１】
５’側３５Ｓプロモーターに由来するプライマー：５’ＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＣ３’（これはまた配列番号５によって示される）、および、３’側ターミネーター：５’ＣＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣ３’（これはまた配列番号６によって示される）。確認されたクローン化ｈＧＣＤのコード配列が配列番号７によって示される。
【０２０２】
実施例２
ニンジン細胞の形質転換、および、ｒｈＧＣＤを発現する形質転換細胞についてのスクリーニング
本実施例は、下記の実施例において使用されるような、ニンジン細胞を本発明に従って形質転換するための例示的な方法を記載する。
【０２０３】
ニンジン細胞の形質転換を、［ＷｕｒｔｅｌｅおよびＢｕｌｋａ（１９８９）、同上］によって以前に記載されたようなアグロバクテリウム形質転換によって行った。遺伝子改変されたニンジン細胞を、形質転換体を選抜するための抗生物質を含むムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）寒天培地に置床した。図２によって示されるように、生じつつあるカルスから調製された抽出物を、抗ｈＧＣＤ抗体を使用するウエスタンブロット分析によってＧＣＤの発現について調べ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ標準物（陽性コントロール）および非形質転換細胞の抽出物（陰性コントロール）と比較した。調べられた様々なカルスの中で、１つのカルス（Ｎｏ．２２）をスケールアップ成長およびタンパク質精製のために選択した。
【０２０４】
ウエスタンブロットを下記のように行った。
【０２０５】
このアッセイのために、得られたサンプルに由来するタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースに転写した。この目的のために、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを下記のように調製した。ＳＤＳゲルは、（Ｌａｅｍｍｌｉ、ＵＫ（１９７０）、Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｐｈａｇｅ  Ｔ４、Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０〜６８５に従って）濃縮ゲルおよび分離ゲルからなる。分離ゲルの組成は下記の通りであった：１２％のアクリルアミド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、１０ｍｌのゲル溶液あたり４マイクロリットルのＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ９２８１）、０．１％のＳＤＳ、３７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）および０．１％の過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）。ＴＥＭＥＤおよび過硫酸アンモニウムを重合のためのフリーラジカル開始剤としてこの状況では使用した。重合開始後約２０分で、濃縮ゲル（３％のアクリルアミド、０．１％のＳＤＳ、１２６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．１％のＡＰＳおよび５ｍｌの濃縮ゲル溶液あたり５マイクロリットルのＴＥＭＥＤ）を分離ゲルの上に注ぎ、１２または１８間隔のコームを挿入して、サンプルのためのウエルを作製した。
【０２０６】
陽極チャンバーおよび陰極チャンバーを同一の緩衝剤溶液（ＳＤＳを含有するＴｒｉｓグリシン緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６１−０７７２）、ｐＨ８．３）で満たした。抗原含有物を０．５体積のサンプル負荷緩衝液（３０ｍｌのグリセロール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９０１２）、９％のＳＤＳ、１５ｍｌのメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）、１８７．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５００マイクロリットルのブロモフェノールブルー、すべての体積が１００ｍｌのサンプル緩衝液あたりである）により処理した。その後、混合物を１００℃で５分間加熱し、濃縮ゲルに負荷した。
【０２０７】
電気泳動を、好適な時間、室温で行った（例えば、サイズが１３×９ｃｍのゲルについては、５０〜７０ボルトの定電流強度を使用して４５〜６０分間、その後、１８０〜２００ボルトで４５〜６０分間）。その後、抗原をニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ）に転写した。
【０２０８】
タンパク質の転写を、実質的には本明細書に記載される通りに行った。ゲルを、Ｗｈａｔｍａｎｎ３ＭＭろ紙、導電性の厚さ０．５ｃｍの発泡物、および、白金電極により電流を通すワイヤ電極の間に、隣接するニトロセルロースと一緒に配置した。ろ紙、発泡物およびニトロセルロースは転写緩衝液（Ｂｉｏｒａｄから得られるＴＧ緩衝液（カタログ番号１６１−０７７１）；これはメタノールおよび水の緩衝液（２０％メタノール）により１０倍希釈された）に十分に浸された。転写を１００ボルトにおいて４℃で９０分間行った。
【０２０９】
転写後、ニトロセルロース上の未結合の結合部位を、リン酸塩緩衝液（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅＨａｅｎ、カタログ番号３０４３５）により希釈された、１％ドライミルク（Ｄａｉｒｙ  Ａｍｅｒｉｃａ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログＰ１３７９）を含有するブロッキング緩衝液により４℃で一晩飽和させた。ブロット細片を抗体（希釈度、上記のように１％ドライミルクおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）において１：６５００）と３７℃で１時間インキュベーションした。
【０２１０】
抗体とインキュベーションした後、ブロットを、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝化リン酸ナトリウム緩衝液（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅＨａｅｎ、カタログ番号３０４３５））により３回、それぞれの場合において１０分間、洗浄した。その後、ブロット細片を、室温で１時間、好適な二次抗体（ヤギ抗ウサギ（完全分子）ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ａ−４９１４）、リン酸塩緩衝液（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅＨａｅｎ、カタログ番号３０４３５）により希釈された、１％ドライミルク（Ｄａｉｒｙ  Ａｍｅｒｉｃａ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログＰ１３７９）を含有する緩衝液での１：３０００の希釈物）とインキュベーションした。ＰＢＳにより数回洗浄した後、ブロット細片をＥＣＬ発色剤試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＲＰＮ２２０９）により染色した。
【０２１１】
ブロットをＥＣＬ試薬に浸けた後、ブロットをＸ線フィルム（ＦＵＪＩ  Ｓｕｐｅｒ  ＲＸ  １８ｘ２４）にさらし、ＦＵＪＩ−ＡＮＡＴＯＭＩＸ現像液および定着液（ＦＵＪＩ−Ｘ定着、カタログ＃ＦＩＸＲＴＵ１／２）により現像した。抗体が結合したタンパク質を特徴づけるバンドが、この処理の後で視認された。
【０２１２】
バイオリアクターにおけるアップスケール培養での成長
カルス２２の懸濁培養物を、形質転換されたカルスを液体培地で継代培養することによって得た。細胞を、（実験手順において記載されるように）、総体積がバイオリアクターへの接種のために十分になるまで振とう三角フラスコで培養した。遺伝子改変されたトラスジェニックニンジン細胞は数ヶ月を超えて培養することができ、細胞採取を５日〜７日のサイクルで得ることができる（データは示されず）。ニンジン細胞におけるｒｈ−ＧＣＤ産生量がピークである培養７日目に、細胞を、培養物を１００メッシュの網に通すことによって集めた。細胞は、この技術分野において知られている手段（例えば、ろ過または遠心分離）によって集めることができることに留意しなければならない。押し固めた細胞ケークは、ｈ−ＧＣＤを均一に精製するための材料を提供するものであり、冷凍温度で保存することができる。
【０２１３】
実施例３
形質転換されたニンジン細胞からの組換えによる活性なｈＧＣＤタンパク質の精製
形質転換されたニンジン細胞で発現させた組換えｈ−ＧＣＤは、細胞の内膜に結合し、培地に分泌されないことが見出された。機械的な細胞破壊はｒＧＣＤを不溶性の膜破片に結合させたままである（データは示されず）。その後、ｒＧＣＤを、穏和な界面活性剤を使用して溶解し、細胞破片および他の不溶成分から分離した。可溶性酵素をさらに、実験手順において記載されるように、カチオン交換クロマトグラフィーカラムおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを含むクロマトグラフィー技術を使用して精製した。
【０２１４】
培地を不溶性ＧＣＤから分離するために、約１００ｇの湿重量の細胞を含有する凍結細胞ケークを解凍し、その後、１７０００ｘｇで２０分間、４℃で遠心分離した。不溶物および無傷の細胞を１００ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、２０ｍＭのＥＤＴＡ）における再懸濁によって洗浄し、１７０００ｇにおける２０分間の４℃での遠心分離によって沈殿させた。ｒＧＣＤを、ペレットを２００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２０ｍＭのアスコルビン酸、３．８ｇのポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、１ｍＭのＤＴＴおよび１％のＴｒｉｔｏｎ−ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））においてホモジネートすることによって抽出および可溶化した。ホモジネートを室温で３０分間振とうし、１７０００ｇにおける２０分間の４℃での遠心分離によって清澄化した。ペレットを捨て、上清のｐＨを濃クエン酸の添加によってｐＨ５．５に調節した。ｐＨ調節後に生じた濁りを、上記で記載と同じ条件下の遠心分離によって清澄化した。
【０２１５】
さらなる精製を下記のようにクロマトグラフィーカラムによって行った：最初の段階では、２００ｍｌの清澄化された抽出物を、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化され、ＸＫカラム（２．６×２０ｃｍ）に充填された２０ｍｌの強カチオン交換樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｈｉｇｈ−Ｓ担体、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に負荷した。カラムを、電気伝導率、ｐＨおよび２８０ｎｍでの吸光度をモニターすることを可能にするＡＫＴＡプライムシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一体化した。サンプルを２０ｍｌ／分で負荷し、その後、カラムを、ＵＶ吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液（２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）により１２ｍｌ／分の流速で洗浄した。ｒｈ−ＧＣＤのプレ溶出を、２００ｍＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液により行い、溶出を、６００ｍＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液により得た。操作期間中に集められる分画物を酵素活性アッセイによってモニターし、酵素活性を（溶出ピークにおいて）示すチューブをプールした。プールされたサンプルを、５％のエタノールを含有する水で希釈（１：５）し、ＮａＯＨによりｐＨ６．０にｐＨ調節した。
【０２１６】
図３Ａはこの精製段階の標準的な操作を表す。操作期間中に集められる分画物は、図３Ｂによって示されるように、酵素活性アッセイによってモニターされた。図３Ｃは、活性についてアッセイされた溶出分画物のクーマシーブルー染色を示す。
【０２１７】
ｒＧＣＤを含有する溶出分画物を、第２の精製段階のために、前段カラムの場合と同じ樹脂の１０ｍｌが充填された第２のＸＫカラム（１．６×２０ｃｍ）に加えた。このカラムにおける樹脂は、５％のエタノールを含有する２０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）により平衡化された。サンプルを負荷した後、カラムを平衡化緩衝液により洗浄し、ｒＧＣＤを溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）、５％のエタノールおよび１ＭのＮａＣｌ）によってカラムから溶出した。図３Ｄはこの精製段階の標準的な操作を表す。操作期間中に集められる分画物は、図３Ｅによって示されるように、酵素活性アッセイによってモニターされた。図３Ｆは、活性についてアッセイされた溶出分画物のクーマシーブルー染色を示す。
【０２１８】
溶出工程における吸収ピークの分画物を、第３の精製段階のために、プールし、第３のカラムに加えた。第３の精製段階を、８ｍｌの疎水性相互作用樹脂（ＴＳＫゲル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｃ、Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐ．）が充填されたＸＫカラム（１．６×２０ｃｍ）で行った。樹脂は、５％のエタノールを含有する１０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）において平衡化された。前段カラムからのＧＣＤ溶出プールを６ｍｌ／分で負荷し、その後、ＵＶ吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液により洗浄した。純粋なＧＣＤが、５０％のエタノールを含有する１０ｍＭクエン酸塩緩衝液によって溶出され、これをプールし、−２０℃で保存した。
【０２１９】
図４はこの精製段階の標準的な操作を表す。操作期間中に集められる分画物は酵素活性アッセイによってモニターされた（図４Ｂ）。図４Ｃは、活性についてアッセイされた溶出分画物のクーマシーブルー染色を示す。
【０２２０】
処理された細胞の回分精製において、ｒＧＣＤタンパク質が、９５％を超えるレベルに精製された。第１段階および第３段階だけが行われるならば、純度が約８０％のレベルで達成される（結果は示されず）。
【０２２１】
生化学的分析
精製されたｒｈＧＣＤの同一性を確認するために、Ｍａｓｓ−Ｓｐｅｃ  Ｍａｓｓ−Ｓｐｅｃ（ＭＳＭＳ）分析を行った。得られた結果は、リーダーペプチド配列および標的化配列を含めて、発現カセットのＤＮＡに基づく予測されたアミノ酸配列と一致したタンパク質配列のカバー範囲が４９％であることを示した。
【０２２２】
ｐｒＧＣＤの特徴づけおよび配列決定：本発明の植物産生によるヒト組換えＧＣＤをさらに特徴づけるために、ｒｈＧＣＤを、酸化防止剤の存在下、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して可溶化し、カチオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーによって均一に精製した（図９ａ）。本発明の植物産生によるヒト組換えＧＣＤのアミノ酸配列決定では、ｒｈＧＣＤの配列（配列番号１５）がヒトＧＣＤの配列（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ０４０６２、タンパク質ＩＤ  ＡＡＡ３５８７３）に対応し、また、シグナルペプチドの融合のために使用されたリンカーに由来するＮ末端における２つのさらなるアミノ酸（ＥＦ）（これらは、それに従えば、−２および−１と呼ばれる）と、液胞標的化シグナルに由来するＣ末端におけるさらなる７個のアミノ酸（これらは４９７〜５０３と呼ばれる）とを含むことが明らかにされた。
【０２２３】
精製された本発明の植物産生によるヒト組換えＧＣＤの、抗ＧＣＤポリクローナル抗体による免疫検出を、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）タンパク質と一緒にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離タンパク質のウエスタンブロッティングによって行った（図９ｂ）。これにより、植物産生のタンパク質と、ＣＨＯ産生のタンパク質とが、抗原的に同一であることが確認された。
【０２２４】
組換えｈＧＣＤの酵素活性：
本発明の植物産生によるヒト組換えＧＣＤの活性を、蛍光性のＧｌｃＣｅｒアナログを使用してＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の活性と比較した。図１２は、類似する比活性が得られたこと（Ｖｍａｘ値がｐｒＧＣＤについては０．４７±０．０８ＫｍｏｌのＣ６−ＮＢＤ−セラミド形成／分／ｍｇタンパク質であり、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）については０．４３±０．０６ＫｍｏｌのＣ６−ＮＢＤ−セラミド形成／分／ｍｇタンパク質である）、および、類似するＫｍ値が得られたこと（本発明のＧＣＤについては２０．７±０．７ＫＭであり、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）については１５．２±４．８ＫＭである）を示す。従って、これらの速度論的研究は、本発明の植物産生によるヒト組換えＧＣＤの活性がＣＨＯ発現による酵素の活性と類似することを示す。
【０２２５】
腹腔マクロファージにおける組換えｈＧＣＤの取り込みおよび活性
ニンジンで産生されたｒｈＧＣＤが正しくグリコシル化されているか、また、標的細胞による取り込みを受け得るか、従って、ゴーシェ病を処置するために有用であり得るかを明らかにするために、次に、ｒｈＧＣＤがマクロファージに結合し、マクロファージによって取り込まれることができるかをアッセイした。マクロファージに対するｒｈＧＣＤの標的化がマンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｍａｎ／ＧｌｃＮＡｃ）受容体によって媒介され、これを、チオグリコラート誘発された腹腔マクロファージを使用して求めることができる。図５によって示されるように、ｒＧＣＤは、細胞による取り込みを高いレベルで受ける。図５Ａは、本発明によるｒＧＣＤの細胞による取り込みをマンナン濃度に関して示す。
【０２２６】
図５Ａは、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標）と匹敵するレベルでの取り込みを示す（この調製物は、上記で記載される精製プロセスの第１段階および第３段階だけにより８０％の純度に調製された）。
【０２２７】
図５Ｂおよび図５Ｃは、この調製物が、上記で記載された精製プロセスの３つの段階のすべてにより、９５％を超える純度に調製されたので、ｒＧＣＤの取り込みが、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標）よりも高いレベルであることを示す。
【０２２８】
図５Ｃに関して、明らかに、４ｍｇ／ｍｌのマンナンによって阻害される、総活性からの特異的活性の割合が、下記のように、本発明のＧＣＤ（ｒＧＣＤ、すなわち、組換えヒトＧＣＤ）については、市場における現在入手可能な製造物よりも大きい：ＧＣＤ（ＣＢ−ｍｉｘ１、これは本発明のｒＧＣＤである）−７５％、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ−６５％。さらに、図によって示されるように、マンナンの添加は、細胞によるｒＧＣＤの結合を明らかに阻害した。２ｍｇ／ｍｌのマンナンの濃度において、ｒＧＣＤの結合が５０％阻害された。
【０２２９】
これらの結果は、グリカン構造の再構成がない場合でさえ、形質転換されたニンジン細胞から発現および精製されるｒｈＧＣＤは、Ｍａｎ／ＧｌｃＮＡｃ受容体を介して特異的にマクロファージ細胞を標的化するために取り込みを受けることができることを示す。そのうえ、この組換えｒｈＧＣＤは酵素的に活性である。
【０２３０】
図５Ｄは、ｒｈＧＣＤがまた、ウエスタンブロットにおいて抗ＧＣＤ抗体によって認識されることを示す：ｒＧＣＤは本発明によるタンパク質を示し、一方、ＧＣＤ標準物（レーンあたり５ｎｇ、１０ｎｇおよび２５ｎｇで示される）は、購入された市販のＧＣＤ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））である。
【０２３１】
実施例４
毒物学試験
上記の精製手順に従って得られる物質を、標準的な毒物学試験プロトコル（医薬品のための単回用量急性毒性試験に関する業界指針、薬物評価研究センター（ＣＤＥＲ）ＰＴ１（６１ＦＲ４３９３４、１９９６年８月２６日）に従って、また、ＩＣＨ  Ｍ３（Ｍ）、医薬品のためのヒト臨床試験を実施するための非臨床的安全性研究、ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／２８６／９５変更、２０００年１１月１６日）によって試験した。
【０２３２】
マウスに下記のように注射した：１．８ｍｇ／ｋｇ（臨床的用量）の初回用量の後、９および１８ｍｇ／ｋｇの用量が続いた。試験群には、６匹のマウス（ＩＣＲ  ＣＤ−１；３匹のオスおよび３匹のメス）が、本発明によるｒＧＣＤ（２５ｍＭクエン酸塩緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０、５％のエタノールを特徴とする液体キャリアにおいて）を受けるために含まれ、別の６匹のマウスが、コントロール群としてキャリアだけにより処置されるために含まれた。その後、マウスを１４日間観察し、安楽死させた。
【０２３３】
別の研究では、ビヒクル溶液だけ、あるいは、標準的な臨床的用量（６０ユニット／ｋｇ）の１倍、５倍または１０倍の倍量でのｐｒＧＣＤの用量がＩＣＲ（ＣＤ−１（登録商標））マウスに与えられた。動物（６匹／群、３匹のオスおよび３匹のメス）は薬物を１０ｍｌ／ｋｇの体積で静脈内に受けた。
【０２３４】
両方の毒性研究では、処置に関連づけられる明白な有害反応がないこと、甚だしい病理学的知見がないこと、体重変化がないこと、および、死亡発生がないことが、投与された最大用量でさえ認められたことが明らかにされた。さらに、臨床的用量の１０倍が投与された高用量群における動物から採取された血液サンプルを血液学および臨床化学について試験した。血液学および臨床化学のすべての値が正常な範囲内であった。加えて、そのような高用量で処置された動物は、肝臓、脾臓および腎臓の組織病理学的検査に供された。巨視的または微視的な組織病理学的知見が何ら認められなかった。
【０２３５】
実施例５
グリコシル化分析
前記の実施例に関して記載されるように産生されたｒＧＣＤの表面に存在するグリカン構造の分析を行った。下記においてより詳細に記載されるように、結果は、グリカンの大部分が、高マンノース型構造だけでなく、末端のマンノース残基を含有することを示している。好都合なことに、この高マンノース型産物は、生物学的に活性であることが見出され、従って、さらなる工程がその活性化のために必要とされなかった。
【０２３６】
下記の方法を使用して、上記で示される実施例に従って産生された組換えｈＧＣＤのグリコシル化構造を決定した。簡単に記載すると、Ｎ−グリカンおよびＯ−グリカンの両方についての単糖結合を、加水分解およびＧＣ−ＭＳによる戦略を使用することによって決定した。この方法では、ペプチドに対する炭水化物の結合タイプ、および、糖タンパク質の全体的な単糖組成が推定される。以前の知識、および、同様に、様々な単糖の間における比率に基づいて、この方法により、糖タンパク質表面のグリカンのタイプが示唆され得る。この情報は、タンパク質表面に存在する、可能性のあるグリカン構造を推定するために重要である。
【０２３７】
別の方法はＮ−グリカン集団のオリゴ糖分析を特徴とした。ＦＡＢ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを、サンプルのアリコートをトリプシンおよびペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）により消化し、グリカンの完全メチル化を行った後で行った。この方法は、Ｎ結合型炭水化物を酵素消化された糖タンパク質から分離および単離するために使用される。単離されたグリカン混合物におけるグリカン集団の質量が決定され、データベースから得られる既知構造の質量と比較され、また、単糖組成分析に照らして比較される。提案された構造はまた、供給源生物のグリコシル化パターンにも基づく。
【０２３８】
別の方法では、Ｏ−グリカン集団を、トリプシンおよびＰＮＧａｓｅＦにより処理された糖ペプチドの還元的脱離、脱塩、ならびに、完全メチル化の後で分析することが含まれた。Ｏ−グリカンはＰＮＧａｓｅＦによって遊離されず、従って、ペプチドに結合したままであるグリカンは、Ｏ結合型グリカンである可能性が最も高い。その後、これらのグリカンを還元的脱離によって遊離させ、それらの質量が分析される。
【０２３９】
単糖組成分析（下記で要約される）では、植物でのグリコシル化に特徴的なヘキソース、ヘキソサミンおよびペントースの特徴的な分布が明らかにされた。ＧｌｃＮａｃとマンノースとの間における比率により、特徴的なＮ結合型構造が、優勢なグリカン集団であることが示唆される。
【０２４０】
上記で記載されるように産生されたｈＧＣＤに由来するＮ−グリカンの質量分光分析では、優勢なＮ−グリカン集団がＰｅｎｔ．ｄｅｏｘｙＨｅｘ．Ｈｅｘ３．ＨｅｘＮＡｃ２の単糖組成を有することが示される。
【０２４１】
材料および方法
分析を、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）および遅延抽出−マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（ＤＥ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）の組合せを使用して行った。
【０２４２】
オリゴ糖分析のために、Ｎ−グリカン集団を、サンプルのアリコートをトリプシンおよびペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）により消化し、グリカンの完全メチル化を行った後、ＦＡＢ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。Ｏ−グリカン集団を、トリプシンおよびＰＮＧａｓｅＦにより処理された糖ペプチドの還元的脱離、脱塩、ならびに、完全メチル化の後で分析した。
【０２４３】
Ｎ−グリカンおよびＯ−グリカンの両方についての単糖結合を、加水分解、誘導体化およびＧＣ−ＭＳによる戦略を使用して決定した。
【０２４４】
実験の記載
サンプル
サンプルバイアルには下記（表１）のように特有のサンプル番号を付けた：
【０２４５】
2010525806.tif 000002
【０２４６】
サンプルは、必要とされるまで−１０〜−３０℃の間で保存された。
【０２４７】
タンパク質化学
無傷サンプルの透析
１個のバイアル（０．８ｍｇ／ｍｌの規定された濃度で１ｍｌのタンパク質を含有する）をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（１０ｋＤａの分子量排除）に注入し、水に対して４℃で２４時間にわたって透析し、その間、水を３回交換した。透析後、サンプルをカセットから取り出し、凍結乾燥した。
【０２４８】
オリゴ糖スクリーニングのための無傷サンプルのトリプシン消化
透析後の凍結乾燥サンプルを、１０％アンモニア水によりｐＨ８．４に調節された５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液に再懸濁し、ＳＯＰ  Ｂ００１およびＳＯＰ  Ｂ００３に従って３７℃で４時間、ＴＰＣＫ処理トリプシンにより消化した。反応を、９５℃の加熱ブロックに２分間入れることによって停止させ、その後、凍結乾燥した。
【０２４９】
炭水化物化学
ペプチドＮ−グリコシダーゼＡによる消化
糖タンパク質サンプルから得られるトリプシン切断されたペプチド／糖ペプチド混合物を、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）において３７℃で１５時間、ペプチドＮ−グリコシダーゼＡ（ＰＮＧａｓｅＡ）酵素により処理した。反応を凍結乾燥によって停止させた。得られた生成物を、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを使用して精製した。
【０２５０】
還元的脱離
可能性のあるＯ結合型糖ペプチドを含有するＳｅｐ−Ｐａｋ分画物を、０．０５Ｍ水酸化ナトリウムにおける１０ｍｇ／ｍｌのホウ水素化ナトリウムの溶液に溶解し、４５℃で１６時間インキュベーションした。反応を氷酢酸の添加によって停止させた。
【０２５１】
還元的脱離物質の脱塩
Ｄｏｗｅｘビーズを使用する脱塩を、ＳＯＰ  Ｂ０２２に従って行った。サンプルをカラムに負荷し、４ｍｌの５％酢酸水溶液を使用して溶出した。回収された画分を凍結乾燥した。
【０２５２】
遊離炭水化物の完全メチル化
５％酢酸水溶液のＳｅｐ−Ｐａｋ分画物において溶出するＮ結合型炭水化物、および、還元的脱離によって遊離する、可能性のあるＯ結合型グリカンを、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）／ヨウ化メチル（ＭｅＩ）手法（ＳＯＰ  Ｂ０１８）を使用して完全メチル化した。完全メチル化されたＮ結合型グリカン混合物の一部をＦＡＢ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析し、残りを結合分析に供した。
【０２５３】
Ｎ結合型炭水化物の結合分析
誘導体化
トリプシンおよびＰＮＧａｓｅＡによる消化または還元的脱離の後で得られる完全メチル化グリカンサンプル混合物を加水分解し（２Ｍ  ＴＦＡ、１２０℃で２時間）、還元した（２Ｍ  ＮＨ４ＯＨにおけるホウ重水素化ナトリウム（ＮａＢＤ４）、室温で２時間、ＳＯＰ  Ｂ０２５）。ホウ重水素化物が分解したときに生じるホウ酸塩を、メタノール／氷酢酸（９０：１０）の混合物の添加、それに続く凍結乾燥を３回行うことによって除いた。その後、サンプルを、無水酢酸を使用してアセチル化した（１００℃で１時間）。アセチル化サンプルをクロロホルムへの抽出によって精製した。その後、部分的にメチル化されたアルジトールアセテートをガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によって調べた。部分的にメチル化されたアルジトールアセテートの標準物混合物、および、ブランクもまた、同じ条件下で処理した。
【０２５４】
気液クロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）
ヘキサンに溶解された誘導体化炭水化物サンプルのアリコート（１μｌ）を、Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＸＬガスクロマトグラフおよびＤｅｌｌデータシステムを伴うＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｔｕｒｂｏｍａｓｓ  Ｇｏｌｄ質量分析計を使用するＧＣ／ＭＳによって下記の条件下で分析した：
ガスクロマトグラフィー
カラム：ＤＢ５
注入：オンカラム
インジェクター温度：４０℃
プログラム：４０℃で１分間、その後、７０℃／分で１００℃に、１００℃で１分間保持し、その後、８℃／分で２９０℃に、最後に２９０℃で５分間保持する。
キャリアガス：ヘリウム
質量分析
イオン化電圧：７０ｅＶ
取得モード：スキャニング
質量範囲：３５〜４５０ダルトン
ＭＳ分解能：ユニット
【０２５５】
無傷グルコセレブロシダーゼの糖分析
誘導体化
５００μｇのグルコセレブロシダーゼに等しいアリコートを内部標準物としての１０μｇのアラビトールとともに凍結乾燥した。その後、これを８０℃での一晩のメタノリシスに供し、窒素下で乾燥した。遊離した単糖を、メタノール、ピリジンおよび無水酢酸の溶液を使用して再度Ｎ−アセチル化し、再び窒素下で乾燥し、ＳＯＰ  Ｂ０２３に従ってそれらのトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体に変換した。ＴＭＳ誘導体を窒素下で濃縮し、２ｍｌのヘキサンに溶解し、３分間超音波処理した。その後、サンプルを４℃で一晩平衡化させた。１０μｇのアラビトールを含有するブランクと、それぞれ１０μｇのフコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸およびアラビトールを含有する標準物単糖混合物とを並行して調製した。その後、これらのＴＭＳ誘導体をガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によって調べた。
【０２５６】
気液クロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）
ヘキサンに溶解された誘導体化炭水化物サンプルのアリコート（１μｌ）を、Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ  ＸＬガスクロマトグラフおよびＤｅｌｌデータシステムを伴うＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｔｕｒｂｏｍａｓｓ  Ｇｏｌｄ質量分析計を使用するＧＣ／ＭＳによって下記の条件下で分析した：
ガスクロマトグラフィー
カラム：ＤＢ５
注入：オンカラム
インジェクター温度：４０℃
プログラム：９０℃で１分間、その後、２５℃／分で１４０℃に、５℃／分で２２０℃に、最後に１０℃／分で３００℃にして、３００℃で５分間保持する。
キャリアガス：ヘリウム
質量分析
イオン化電圧：７０ｅＶ
取得モード：スキャニング
質量範囲：５０〜６２０ダルトン
ＭＳ分解能：ユニット
【０２５７】
遅延抽出−マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＤＥ−ＭＡＬＤＩ  ＭＳ）および高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を、遅延抽出（ＤＥ）と結合させたＶｏｙａｇｅｒ  ＳＴＲ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎレーザー脱離質量分析計を使用して行った。
【０２５８】
乾燥した完全メチル化グリカンをメタノール：水（８０：２０）に再溶解し、２，５−ジヒドロ安息香酸のマトリックスを使用して分析した。ブラジキニン、アンジオテンシンおよびＡＣＴＨを外部校正物質として使用した。
【０２５９】
陽イオン高速原子衝撃質量分析による分析を、Ｖａｃｃ＝８ｋＶで作動するＭ−Ｓｃａｎ’ｓ  ＶＧ  ＡｕｔｏＳｐｅｃＥ質量分析計で、分解能がおよそ２５００である最大感度において４５００の質量範囲について行った。セシウムイオンガンを、３０ｋＶで作動するスペクトルを作製するために使用した。スペクトルを、Ｏｐｕｓソフトウエアを使用するＶＡＸデータシステム３１００Ｍ７６で記録した。
【０２６０】
乾燥した完全メチル化グリカンをメタノールに溶解し、供給源への挿入の前に、２〜４μｌのチオグリセロールがマトリックスとして事前に塗られた標的に負荷した。
【０２６１】
別の一組のグリコシル化分析では、類似する方法が、グリコシル化パターンを決定するために、また、本発明のニンジン細胞懸濁培養によって産生される主要なグリコシル化産物を特定するために使用された。
【０２６２】
グリコシル化パターンを、様々なエキソグリコシダーゼによる逐次消化を使用して、グリカン構造および相対的な量を求めるために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｅｎ  Ｇｕｒｉｏｎ大学、Ｂｅｅｒ  Ｓｈｅｂａ、イスラエル）によって分析した。本発明の植物ＧＣＤサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、６１ｋＤａのバンドを切り出し、その後、ＰＮＧａｓｅＡとのインキュベーション、または、トリプシンとのインキュベーション、それに続くＰＮＧａｓｅＡとのインキュベーションのどちらかに供して、Ｎ結合型グリカンを遊離させた。グリカンをアントラニルアミド（２ＡＢ）により蛍光標識し、順相ＨＰＬＣで処理した。
【０２６３】
標識グリカンプールの配列決定を、様々なエキソグリコシダーゼによる逐次消化、その後でのＨＰＬＣ分析によって達成した。個々のグリカンの保持時間を、グルコースユニット（ＧＵ）のラダーを与えるデキストランの標準的な部分加水分解物の保持時間と比較した。非標識のグリカンをさらに精製し、ＭＡＬＤＩ質量分析によって分析した。使用されたエキソグリコシダーゼ：ウシ腎臓のα−フコシダーゼ（これはα１−６およびα１−３のコアフコースを消化する；Ｐｒｏｚｙｍｅ）、タチナタマメのマンノシダーゼ（これは、α１−２，６＞３マンノースを除く；Ｐｒｏｚｙｍｅ）、キサントモナスのβ１，２−キシロシダーゼ（これは、α−結合したマンノースが除かれた後でのみ、α１−２キシロースを除く；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。
【０２６４】
ウシ精巣のα−ガラクトシダーゼ（これは、非還元末端ガラクトースのα１−３結合およびα１−４結合を加水分解する；Ｐｒｏｚｙｍｅ）、肺炎連鎖球菌のヘキソサミニダーゼ（これは、α１−２，３，４，６のＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃを消化する；Ｐｒｏｚｙｍｅ）。グリコシル化をさらに、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）および遅延抽出−マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＤＥ−ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ）を使用してＭ−Ｓｃａｎ（Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、英国）によって分析した。オリゴ糖決定のために、Ｎ−グリカン集団を、トリプシンおよびＰＮＧａｓｅＡによるサンプルの消化、そして、グリカンの完全メチル化の後、ＦＡＢ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。Ｏ−グリカンを、トリプシンおよびＰＮＧａｓｅＡにより処理された糖ペプチドの還元的脱離、脱塩、ならびに、完全メチル化の後で分析した。
【０２６５】
ｐｒＧＣＤの異なるバッチにおけるＮ−グリカンの類似性を、ｐｒＧＣＤのバッチ間の一貫性を明らかにするという目的のために、糖タンパク質から遊離するオリゴ糖についてのクロマトグラフィープロファイルを得るために、トリプシンおよびＰＮＧａｓｅＡによる消化の後、パルスアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ、Ｄｉｏｎｅｘ法）による高性能アニオン交換クロマトグラフィーによって分析した。この手法は、定性的かつ定量的な様式でのオリゴ糖パターンのクロマトグラフィー比較を可能にする。
【０２６６】
結果および考察
グルコセレブロシダーゼのＴＭＳ糖分析
Ｎ結合型オリゴ糖スクリーニング
無傷の糖タンパク質を透析に供し、その後、トリプシン消化した。凍結乾燥した生成物を、ＰＮＧａｓｅＡを使用して消化し、その後、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋを使用して精製した。５％酢酸水溶液（Ｎ結合型オリゴ糖含有）画分を完全メチル化し、ＦＡＢ質量スペクトルを、誘導体化されたオリゴ糖の一部を使用して、フラグメントイオンについての低質量範囲で得た。ＤＥ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、誘導体化されたオリゴ糖の一部を使用して、分子イオンについての高質量範囲で得た。
【０２６７】
グルコセレブロシダーゼ由来のＮ−グリカンの分析
表１は、ＦＡＢスペクトルに存在する優勢なフラグメントイオン、および、ＭＡＬＤＩスペクトルに存在する分子イオンを列挙する。分子イオン領域（付録ＩＩＩに示される）には、優勢なシグナルが１５０５．８のｍ／ｚ（これは、Ｐｅｎｔ．ｄｅｏｘｙＨｅｘ．Ｈｅｘ３．ＨｅｘＮＡｃ２の組成を有する構造についての［Ｍ＋Ｎａ］＋擬分子イオンと一致する）において含有される。強度がそれほど大きくない一連の擬分子イオンもまた、複合型構造および高マンノース型構造と一致して検出された。検出された高マンノース型構造は、サイズにおいて、１５７９．８のｍ／ｚにおけるＨｅｘ５．ＨｅｘＮＡｃ２から、２１９３．０のｍ／ｚにおけるＨｅｘ８．ＨｅｘＮＡｃ２にまで及ぶ。複雑なシグナルが、１３３１．７のｍ／ｚ（これは、Ｐｅｎｔ．Ｈｅｘ３．ＨｅｘＮＡｃ２の組成を有する構造についての［Ｍ＋Ｎａ］＋擬分子イオンと一致する）などのそれほど広範囲にプロセシングされていないＮ−グリカンから生じているか、または、例えば、１７５１．０のｍ／ｚ（これは、Ｐｅｎｔ．ｄｅｏｘｙＨｅｘ．Ｈｅｘ３．ＨｅｘＮＡｃ３の組成を有する構造についての［Ｍ＋Ｎａ］＋擬分子イオンと一致する）、２３７５．４のｍ／ｚ（これは、Ｐｅｎｔ．ｄｅｏｘｙＨｅｘ２．Ｈｅｘ４．ＨｅｘＮＡｃ４の組成を有する構造についての［Ｍ＋Ｎａ］＋擬分子イオンと一致する）、および、２７５３．６のｍ／ｚ（これは、Ｐｅｎｔ．ｄｅｏｘｙＨｅｘ３．Ｈｅｘ５．ＨｅｘＮＡｃ４の組成を有する構造についての［Ｍ＋Ｎａ］＋擬分子イオンと一致する）のより大きいＮ−グリカンから生じている。
【０２６８】
ＦＡＢ質量スペクトルは、スペクトルの低質量領域におけるフラグメントイオンに基づいてアンテナ構造に関する情報をもたらす（データは示されず）。様々なシグナルが検出され、これらにより、ヘキソース（２１９のｍ／ｚにおいて）およびＨｅｘＮＡｃ（２６０のｍ／ｚにおいて）がＮ−グリカンにおける非還元末端の単糖として特定された。
【０２６９】
2010525806.tif 000003
【０２７０】
第１欄におけるすべての質量が、別途言及される場合を除き、モノアイソトピックである。ソフトウエアは、多くの場合、特に１７００Ｄａを超える質量については、質量数を１３Ｃの同位体ピークに帰属するので、これらの質量数は生データに直接に関連しない場合がある。
【０２７１】
グルコセレブロシダーゼ由来のＮ−グリカンの結合分析
結合分析を、ＰＮＧａｓｅＡ消化、Ｓｅｐ−Ｐａｋ精製および完全メチル化の後、遊離したＮ結合型炭水化物について行った。
【０２７２】
複雑なクロマトグラムが、誘導体化試薬に起因するいくつかの不純物ピークとともに得られた。保持時間およびスペクトルを標準物混合物と比較することにより、表３に列挙される糖含有ピークの暫定的な帰属が可能であった。
【０２７３】
2010525806.tif 000004
【０２７４】
４．３  Ｏ結合型オリゴ糖スクリーニング
還元的脱離を、トリプシン消化およびＰＮＧａｓｅＡ消化の後のグルコセレブロシダーゼのＳｅｐ−Ｐａｋ精製から得られる６０％２−プロパノール画分（可能性のあるＯ結合型糖ペプチド画分）に対して行った。サンプルを反応停止後に脱塩し、ホウ酸塩を除去した後、完全メチル化した。ＦＡＢ質量スペクトルを、誘導体化されたオリゴ糖の一部を使用して、フラグメントイオンについての低質量範囲で得た。ＤＥ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、誘導体化されたオリゴ糖の一部を使用して、分子イオンについての高質量範囲で得た。Ｏ結合型グリカンの存在と一致するシグナルが観測されなかった（データは示されず）。
【０２７５】
グルコセレブロシダーゼ由来のＯ−グリカンの結合分析
結合分析を、完全メチル化の後、還元的脱離の生成物に対して行った。典型的なＯ結合型グリカンの存在と一致するシグナルが観測されなかった（データは示されず）。
【０２７６】
図６は、哺乳動物細胞であるＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞から得られるＧＣＤ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標））と、ニンジン細胞から得られる本発明のＧＣＤとの間における比較としてのいくつかの例示的なグリカン構造を示す。示されるように、これらの構造の再構成が、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（商標）については、露出したマンノース残基を得るために必要である。それに反して、そのような露出したマンノース残基が、本発明に従って植物細胞から得られるＧＣＤについては、さらなる操作、例えば、グリコシラーゼによるさらなる操作を必要とすることなく、直接に得られる。
【０２７７】
図７は、ｒＧＣＤに見出される主要なグリカン構造を表す。図７は、ａ）ニンジン細胞の懸濁で発現させたｈＧＣの表面に見出される優勢なオリゴ糖集団（１５０５．７のｍ／ｚ）；ｂ）典型的なＮ結合型コア；ｃ）フコシル化された植物Ｎ結合型コアからなる提案される構造を示す。Ｎ結合型グリカンが、アスパラギンを介して、かつ、図の右側におけるＧｌｃＮａｃ（ＧＮ）残基の還元性末端を介してタンパク質に結合する。植物のグリコシル化パターンでは、フコース残基が、α（１−３）グリコシド結合を使用して最初のＧｌｃＮａｃに結合するコア構造の一部である場合があり、一方、哺乳動物の構造では、α（１−６）グリコシド結合が典型的に使用される。
【０２７８】
図８Ａ〜図８Ｄは、本発明によるｒＧＣＤタンパク質において検出されるＮ−グリカンについて、すべての可能な構造を示す。
【０２７９】
特定された優勢なグリカン構造は、エンドウマメ、イネ、トウモロコシおよび他の食用植物から得られるほとんどの植物糖タンパク質において見出されるコアグリカン構造である。この構造は、コアのα−（１，３）−フコースだけでなく、コアのキシロース残基を含有する。Ｂａｒｄｏｒ他（３３）によって行われた研究では、非アレルギー性供血者の５０％がコアキシロースについての特異的な抗体をその血清に有し、また、２５％が、コアのα−（１，３）−フコースに対する特異的な抗体を有することが示される。しかしながら、そのような抗体が植物由来の生物医薬用糖タンパク質の使用に対する制限をもたらし得るかどうかはまだ研究されていない。
【０２８０】
上記で記載されるように産生されたｈＧＣＤの優勢でないグリカン集団は主に、Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ２からＨｅｘ８ＨｅｘＮＡｃ２までの高マンノース型構造であった。複雑な構造のなかには、Ｐｅｎｔ．ｄｅｏｘｙＨｅｘ２．Ｈｅｘ４．ＨｅｘＮＡｃ３およびＰｅｎｔ．ｄｅｏｘｙＨｅｘ３．Ｈｅｘ５．ＨｅｘＮＡｃ３などの構造を示したものがあった。Ｐｅｎｔ．Ｈｅｘ３．ＨｅｘＮＡｃ２がより小さい割合で検出された。
【０２８１】
主要な末端単糖はヘキソース（マンノースまたはガラクトース）およびＮ−アセチルヘキソサミンであり、このことは、高マンノース型構造および部分的にプロセシングされた複合型構造の存在と一致している。
【０２８２】
Ｏ結合型オリゴ糖スクリーニングに関しては、典型的なＯ結合型グリカンと一致するシグナルが観測されなかった。これらの結果は、哺乳動物培養システムにおいて産生される天然型ＧＣＤおよび組換えＧＣＤを含めて、他の細胞システムから得られるＧＣＤの知られているグリコシル化と一致しているように、ＧＣＤは、Ｏ結合型オリゴ糖を有しないことがこの技術分野では知られている。しかしながら、単糖組成において、アラビノースと一致するシグナルが検出された。
【０２８３】
本発明に関して重要な点は、ｈＧＣＤタンパク質のＮ−グリカン組成分析により、Ｎ−グリカンの大部分がマンノース残基で終わることが示されたことである。このことは、マクロファージのマンノース受容体による治療的ｈＧＣＤの取り込みを助けるマンノース末端Ｎ−グリカンのための必要条件と一致する。しかしながら、哺乳動物細胞で産生される天然型ＧＣＤまたは組換えＧＣＤのどちらも高マンノース型ではない。従って、本発明では、商業的に製造されているｈＧＣＤタンパク質の顕著な欠点、すなわち、これらのタンパク質が、上記で記載されるように産生されるタンパク質とは異なり、マンノース糖で終わるように改変されるという欠点が克服される。
【０２８４】
さらなるグルコシル化分析を、植物細胞で調製される精製されたヒト組換えグルコセレブロシダーゼに対して行った。グリコシル化を、様々なエキソグリコシダーゼによる逐次消化を使用して、グリカン構造およびグリカンの量比を求めるために分析した（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｅｎ  Ｇｕｒｉｏｎ大学、Ｂｅｅｒ  Ｓｈｅｂａ、イスラエル））（上記の方法を参照のこと）。この分析では、Ｎ結合型グリカンが、２つのさらなるマンノース残基にα１−３結合およびα１−６結合で結合する、２つのＧｌｃＮＡｃ残基および１−４結合したマンノースからなる主要なコアを有することが見出された。見出されたさらなる残基が、ＨＰＬＣ、酵素アレイ消化およびＭＡＬＤＩに基づくすべての構造およびそれらの相対的な量を示す図１０ａに示される。図１０ｂはＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）のグリカン構造をインビトロ酵素プロセシングの前後において示す。注目すべきことに、本発明のＧＣＤのグリカン構造の分析では、グリカンの９０％超がマンノースを多く含み、露出した末端マンノース残基を有したことが明らかにされた（図１０ａ）。これに対して、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の場合、マンノース残基は、複雑なインビトロ手順の後でのみ、露出するだけである（図１０ｂ）。本発明のＧＣＤにおける優勢なグリカンは、エンドウマメ、イネ、トウモロコシおよび他の食用植物から精製されたほとんどの糖タンパク質において見出されるコア構造である。この構造は、コアα−（１，３）−フコースだけでなく、コアα−（１，２）−キシロース残基を含有する（図１０ａ）。ＤＥ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳのデータは、典型的なＯ結合型グリカンと一致するシグナルを全く含有しなかった。異なる製造バッチから得られる本発明のＧＣＤについてのグルカンプロファイルのさらなる分析を、ニンジン細胞システムにおいて産生されるＧＣＤのバッチ間の再現性を評価するために行った。図１１に示されるように、本発明の植物ＧＣＤの表面におけるグリカンの集団はバッチ間において非常に再現性がある。
【０２８５】
実施例５ａ
生物学的に活性なα−ガラクトシダーゼの植物細胞における発現
ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（Ｘ連鎖型リソソーム蓄積症のファブリー病における病変）が配列決定およびクローン化されている。治療的使用のために好適なα−ガラクトシダーゼＡが植物細胞で産生され得るかどうかを調べるために、植物の小胞体に対して標的化されるヒトα−ガラクトシダーゼＡのコード配列を含むベクターを植物細胞で発現させ、植物由来の組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡのポリペプチド配列、生物学的活性およびグリカン構造を評価した。
【０２８６】
ヒトα−ガラクトシダーゼＡの発現ベクター：ヒトα−ガラクトシダーゼＡのコード配列と、翻訳されたタンパク質を植物の小胞体（ＥＲ）分泌系に標的化するためのＮ末端のリンゴペプチナーゼのリーダーペプチド（配列番号１６、ＭＡＬＫＴＱＬＬＷＳＦＶＶＶＦＶＶＳＦＳＴＴＳＣＳＧ）とを含有するベクターを構築した。２つの異なる構築物をクローン化した。この場合、異なるＣ末端配列が、翻訳されたタンパク質を特定の細胞区画において持続させるために設計された。一方の構築物（α−ｇａｌ−ｖａｃ、配列番号１７）は、ＥＲから植物液胞へのタンパク質の輸送のために設計されたＣ末端の液胞標的化シグナル（ＤＬＬＶＤＴＭ、配列番号４）を含有した。第２の構築物（α−ｇａｌ−ＫＤＥＬ、配列番号１９）はそのようなＣ末端の液胞標的化シグナルを有さず、ｃｉｓ−ゴルジからＥＲに戻る逆行輸送を可能にするために設計されたＣ末端のＥＲ保持配列（ＫＤＥＬ、配列番号２３）を含有した（Ｒａｙｏｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ、第４９巻、第３２６号、１４６３頁〜１４７２頁、１９９８；および、Ｅｖｒｏｎ他、２００７、ＦＡＳＥＢ  Ｊを参照のこと）。
【０２８７】
α−ｇａｌ−ｖａｃクローン：
ヒトα−ｇａｌのコード配列が、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって人工合成された（配列番号１７）。α−ｇａｌ−ｖａｃ配列は、リンゴペクチナーゼのリーダー（配列番号１６）（ＭＡＬＫＴＱＬＬＷＳＦＶＶＶＦＶＶＳＦＳＴＴＳＣＳＧ）、成熟型α−ガラクトシダーゼ配列（配列番号２４）、および、液胞保持シグナル（配列番号４）を含む。合成遺伝子は、サブクローニングを容易にするための制限部位によって囲まれる。
【０２８８】
遺伝子を、ニコチアナ・ベンタミアマ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｍａ）植物における一過性発現のためにＩＣＯＮ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈａｌｌｅ、ドイツ）によって開発されたベクターに、ＮＣＯＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用してクローン化した。
【０２８９】
α−ｇａｌ−ＫＤＥＬクローン：
Ｃ末端のＥＲ保持シグナルを有するクローンを構築するために、液胞シグナルを、ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを置換するためにリン酸化リンカー（配列番号２１および２２）を付加することによってＥＲ保持シグナルにより置換した。リン酸化リンカーはＥＲ保持シグナルをコードし、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの酵素によって生じる末端と適合し得る付着末端を有する：
2010525806.tif 000005
【０２９０】
α−ｇａｌ−ＫＤＥＬ構築物を作製するために、α−ｇａｌ−ｖａｃ構築物（配列番号１７）をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、上記リンカーと連結した。リンカーの挿入をＳａｃＩによる制限によって確認した。得られた構築物を、その後、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｍａにおける一過性発現のために、本明細書に記載されるようにＩＣＯＮベクターにクローン化した。
【０２９１】
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｍａにおける一過性発現システム
植物ウイルスベクターの使用が、植物体におけるタンパク質の迅速かつ高レベルの一過性発現を可能にする、トランスジェニック植物の代替として、この場合には選ばれた。
【０２９２】
目的とするタンパク質が、強力な重複させたウイルスプロモーター（例えば、コートタンパク質サブゲノムプロモーター）から発現される。このシステムは、アグロバクテリウムによって植物に送達されるウイルスベクターの一時的増幅（アグロ感染）に頼る。アグロ感染では、植物において機能的なプロモーターおよびＲＮＡウイルスのｃＤＮＡがアグロバクテリウムから植物細胞の中にＴ−ＤＮＡとして移される。Ｔ−ＤＮＡが植物において転写されて、自己複製を開始することができる生物学的に活性なウイルスＲＮＡを生じさせる。
【０２９３】
この方法は多数のタンパク質変化体の迅速な組み立ておよび発現を可能にする。この方法は非常に万能的であるだけでなく、ミリグラム量のタンパク質もまたほんの数日でもたらす。
【０２９４】
植物体のトランスフェクション：
Ｎ．Ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を発芽させ、長日（１６時間照明／８時間消灯）の光条件（５０μＥ）下、２４℃〜２５℃で、顆粒状の徐放性肥料（Ｓｃｏｔｔ  Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ、ＯＨ）が補充された市販の混合土壌（Ｇｉｖａａｔ  Ａｄａ、ＩＬ）において成長させる。
【０２９５】
一過性発現のために、ＩＣＯＮ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｗｅｇ、ドイツ）によって開発された３ベクター組換えシステムを記載される通りに使用した（Ｇｌｅｂａ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、２３：２０４２〜２０４８、２００５）。ベクターの１つには、α−ガラクトシダーゼのｃＤＮＡが挿入され、他の２つのベクターは、完全なウイルスレプリコンを構築するための遺伝子（ＲｄＲｐおよびインテグラーゼ）を含有し、従って、自己複製を開始することができる生物学的に活性なウイルスＲＮＡを生じさせる。
【０２９６】
アグロバクテリアを、エレクトロポレーション（２５００Ｖ、５ｍｓｅｃ）を使用してα−ガラクトシダーゼベクター含有プラスミドにより形質転換した［ｄｅｎ  Ｄｕｌｋ−Ｒａ，Ａ．およびＨｏｏｙｋａａｓ，Ｐ．Ｊ．（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：６３〜７２］。植物に、３つのＩＣＯＮプラスミドを含有するアグロバクテリウムを、この技術分野において知られている標準的な方法による真空浸潤によって浸潤させた。簡単に記載すると、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物（５〜６週齢）を、すべての地上部の植物器官を細菌懸濁物に浸すことによる浸潤に供し、真空チャンバーに置いた。約０．８ｂａｒの真空を１分間加え、その後、大気圧に素早く戻した。植物を、同じ条件下でさらに５日間〜７日間、温室に戻した。
【０２９７】
タンパク質精製：
タバコの葉を冷凍し、その後、乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。粉砕された葉を、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのアスコルビン酸、１ｍＭのＭＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦを含有する抽出緩衝液（ｐＨ７．２）に１：１の体積対重量の比率で再懸濁した。その後、細胞を破砕し、ホモジネートした。懸濁物をさらに、ナイフホモジナイザーを使用してホモジネートした。細胞懸濁物をマイクロ流体細胞破砕機に通し、得られた調製物を遠心分離した。ペレットを捨て、上清を硫酸アンモニウムにより処理し、遠心分離した。その後、ペレットをクエン酸塩緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６）に溶解し、溶液をｐＨ５．５にさらに酸性化し、遠心分離し、ろ過した（０．４５μＭ）。ろ液を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに負荷し、溶出された分画物をプールし、カチオン交換クロマトグラフィーカラムに負荷した。溶出された分画物をプールし、触媒活性について分析した。
【０２９８】
ウエスタンブロティング：
ウエスタンブロットを、ポリクローナルのウサギ抗α−ｇａｌＡ抗体を使用することによって、形質転換されたタバコ植物から得られるα−ガラクトシダーゼ分子を特定するために行った。
【０２９９】
タンパク質の転写を、実質的には本明細書に記載されるように行った。簡単に記載すると、ゲルからニトロセルロースへの転写を１００ボルトにおいて４℃で９０分間行った。転写後、ブロットをブロッキング緩衝液（１％ドライミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログＰ１３７９）、リン酸塩緩衝液において）によりブロッキング処理した。その後、ブロットを抗体とのインキュベーションによって免疫検出し、洗浄し、好適な二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｌａｂｓ  ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＡｂ）と反応させた。その後、ブロットをＥＣＬ発色剤試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＲＰＮ２２０９）により発色させ、オートラジオグラフィーを可視化のために使用した。
【０３００】
活性なα−ガラクトシダーゼ酵素の測定：
活性な植物α−ガラクトシダーゼＡのレベルを、２００〜１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲についてプロットされた市販α−ガラクトシダーゼのＦａｂｒａｚｙｍｅ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ）の活性の校正曲線に対して求めた。活性を、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ）を加水分解基質として使用して求めた。アッセイ緩衝液は、ｐＨ４．６で、２０ｍＭのクエン酸、３０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＢＳＡおよび０．６７％のエタノールを含有した。アッセイを９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０６１、９６Ｗ）において行い、５０マイクロリットルのサンプルを１５０マイクロリットルのアッセイ緩衝液とインキュベーションし、３０マイクロリットルの基質を８ｍＭの最終濃度に加えた。反応混合物を３７℃で９０分間インキュベーションし、結果を校正結果に対してプロットした。生成物（ｐ−ニトロフェニル；ｐＮＰ）の形成を４０５ｎｍにおける吸光度によって検出した。４０５ｎｍにおける吸光度をｔ＝０および終点においてモニターした。９０分後、１００マイクロリットルの１．９８Ｍ炭酸ナトリウムをそれぞれのウエルに加え、４０５ｎｍにおける吸光度を再びモニターした。
【０３０１】
速度論的研究：
Ｋｍを求めるために、ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）（Ｓｉｇｍａ）の濃度を１０００μＭ〜４５０００μＭの範囲で変化させた。２５ｎｇ／ｍＬのα−ガラクトシダーゼおよび様々な濃度の基質を含有する反応混合物を、３７℃で、８５分から１０５分にまで及ぶ時間にわたって反応させた。反応サンプルを飽和炭酸ナトリウムにより反応停止させ、ｐ−ニトロフェニル生成物の吸光度を４３０ｎｍにおいて検出した。
【０３０２】
生化学的分析
ＰＡＧＥから得られるタンパク質バンドのトリプシン消化が、Ｓｍｏｌｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ、Ｈａｉｆａ、ＩＬ）によって行われた。簡単に記載すると、ゲルにおける染色されたタンパク質バンドを清浄なカミソリ刃により切り出し、ゲル内のタンパク質を１０ｍＭのＤＴＴにより還元し、１０ｍＭ重炭酸アンモニウムにおける１００ｍＭのヨードアセトアミドにより修飾した。ゲル片を１０ｍＭ重炭酸アンモニウムにおける５０％アセトニトリルにより処理して、染色剤をタンパク質から除き、その後、ゲル片を乾燥した。乾燥したゲル片を、サンプルあたり約０．１μｇのトリプシンを含有する１０ｍＭ重炭酸アンモニウムにおける１０％アセトニトリルにより再水和した。ゲル片を３７℃で一晩インキュベーションし、得られたペプチドを、０．１％トリフルオロアセタートを伴う６０％アセトニトリルにより回収した。
【０３０３】
トリプシン消化ペプチドを、多孔性Ｒ２（Ｐｅｒｓｅｐｅｃｔｉｖｅ）が均一充填された０．１Ｘ３００ｍｍの溶融シリカキャピラリー（Ｊ＆Ｗ、１００マイクロメートルのＩＤ）での逆相クロマトグラフィーにより分離した。ペプチドを、約１μｌ／分の流速で、水における０．１％酢酸を含む５％〜９５％のアセトニトリルの８０分間の直線グラジエントを使用して溶出した。カラムからの液体をイオントラップ質量分析計（ＬＴＱ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にエレクトロスプレーした。質量分析を、全域ＭＳ走査を繰り返し使用し、その後、最初のＭＳ走査から選択された最も優勢なイオンの衝突誘導解離（ＣＩＤ）を使用して陽イオンモードで行った。質量分析データを、Ｓｅｑｕｅｓｔソフトウエア［Ｊ．ＥｎｇおよびＪ．Ｙａｔｅｓ、ワシントン大学およびＦｉｎｎｅｇａｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）］を使用して、ＮＲ−ＮＣＢＩデータベースにおけるタンパク質のシミュレートされたタンパク質分解およびＣＩＤと比較した。
【０３０４】
タンパク質のアミノ末端を、製造者の説明書に従って、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ４９４Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で配列決定した。
【０３０５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が、Ｓｍｏｌｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ、Ｈａｉｆａ、ＩＬ）において、この技術分野において知られている方法に従って、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＴＯＦ４７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われた。
【０３０６】
ゲルろ過：
ゲルろ過クロマトグラフィーでは、タンパク質がサイズに基づいて分離される。分子が多孔性ビーズの中を通って移動し、これにより、ビーズ内に拡散する。このとき、より小さい分子はビーズの細孔の中にさらに拡散し、従って、すき間の中をより遅く移動し、一方、より大きい分子はあまり進入しないか、または、全く進入せず、従って、すき間の中をより速く移動する。分子量および三次元形状の両方が保持の程度に寄与する。植物α−ガラクトシダーゼサンプルを分析緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６．０）に再懸濁し、流速が０．５ｍｌ／分であり、１００μｇのサンプルをカラム（−ＴＳＫ  Ｇｅｌ−２０００、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）に負荷した。
【０３０７】
線維芽細胞におけるα−ガラクトシダーゼ取り込み：
α−ガラクトシダーゼの標的化および取り込みを、ファブリー病患者に由来するヒト線維芽細胞（カタログＩＤ  ＧＭ０２７７５、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に対して試験した。線維芽細胞を、１２％のＦＢＳ、５ｍＭのＬ−グルタミン、５ｍｌのＭＥＭ  Ｅａｇｌｅビタミン溶液、１０ｍｌのＭＥＭアミノ酸溶液、５ｍｌのＭＥＭ  Ｅａｇｌｅ非必須アミノ酸溶液および５ｍｌのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ溶液が補充されたＤＭＥＭ培地（カタログＤ５５４６、Ｓｉｇｍａ）において培養した（すべての補充物がＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、ＩＬ）から得られた）。細胞を、１２％のＦＢＳが補充されたＰＢＳにおいて３００ｕｇ／ｍｌの植物α−ガラクトシダーゼＡと４時間インキュベーションし、その後、洗浄し、溶解した（２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ＋プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−２７１４）、２サイクルの凍結・解凍によって）。２０ｕｌのサンプルを１２％ＳＤＳゲルに負荷し、ウエスタンブロッティングによって分析した（上記参照）。
【０３０８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）では、タンパク質が主にその分子量によって分離される。加えて、この技術は、タンパク質の純度および組成に関する多くの情報をもたらす。タバコ植物から産生されたα−ガラクトシダーゼの分子量同一性およびタンパク質不純物パターンを、標準的なゲル分離プロトコルに従って、クーマシーブリリアントブルー染色を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって調べた。簡単に記載すると、ＳＤＳゲルは濃縮ゲル（３％）および分離ゲル（１２％）からなる。泳動緩衝液がＴｒｉｓ／ＳＤＳ（ｐＨ８．３）であり、負荷緩衝液がグリセロール−Ｔｒｉｓ−メルカプトエタノール（ｐＨ６．８）であった。
【０３０９】
結果：
図１３Ａおよび図１３Ｂは、本発明の方法によってタバコ植物で発現および産生された植物由来の組換えα−ガラクトシダーゼの分子量の、ゲルろ過（図１３Ａ）および質量分析（図１３Ｂ）による特徴づけを示す。質量分析プロファイルは、植物発現によるα−ガラクトシダーゼの分子量の推定値が４８ｋＤａ〜５２ｋＤａの範囲でいくつかの集団からなることを示す。αＧａｌは非共有結合による二量体であるので、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのエネルギーは、二量体から単量体への解離を生じさせる。この分子量は、４６．３ｋＤａを与える４０７個のアミノ酸と、残る分子量についてのグリカン構造の付加とを反映する。質量分析では、タンパク質が４８．６ｋＤａであることが確認され、これらの結果は十分に、天然型ヒトα−ガラクトシダーゼの分子量（約５１ｋＤａ）の範囲内である。ゲルろ過校正曲線は、植物α−ガラクトシダーゼの主ピークの保持時間（１８．４１分）に対応する分子量が７６．５６ｋＤａであることを示し、このことは二量体を示唆する。２０．４０３分における非常に小さいピークは、校正曲線によれば、単量体（４３．２７ｋＤａ）に対応する。ゲルろ過分析は穏和な条件で行われるので、ゲルろ過分析では、タンパク質をその二量体形態で観測することができる。
【０３１０】
ＰＡＧＥ分析による組換えα−ガラクトシダーゼの分離では、２つの主要なバンドが明らかにされた（図１４Ａ）。このことは、成熟型組換え酵素のグリコシル化における違いを示唆する。ＰＡＧＥから得られる単離されたバンドの配列決定は、配列決定のために利用可能なポリペプチドの領域（すなわち、グリカンによって覆われていない領域）が、２つのバンドにおいて全く同じ位置に突き止められないとはいえ、重なる場合には１００％の同一性を示したので、このことが実際に当てはまったことを示していた（図１４Ｂを参照のこと、赤色での配列決定された部分）。図１４Ｂ（下側バンド）は、脱グリコシル化されたα−ガラクトシダーゼの完全な配列特定を示す［脱グリコシル化が、ＰＮＧａｓｅＦ（Ｓｉｇｍａ）を使用して行われた］。赤色での配列は、以前に特定された配列を示す。緑色の配列は、グリカン除去後の配列決定に利用可能な配列を示す。黒色の配列は、今までのところ特定されない配列を示す。本来のグリコシル化部位が黄色の強調で示される。Ｃ末端のＫＤＥＬが、抗ＫＤＥＬ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を使用して確認された。まとめると、これらの結果は、本発明の方法によって発現されたα−ガラクトシダーゼタンパク質が、予想されたクローン化配列と同一であることを示す。
【０３１１】
植物発現によるヒト組換えα−ガラクトシダーゼは天然型組換えα−ガラクトシダーゼと抗原的に同一である：
本発明の構築物が植物組換えシステムにおけるヒトリソソーム酵素の正確な発現のために好適であることのさらなる確認が、植物発現によるα−ガラクトシダーゼのウエスタンブロットでの免疫検出によってもたらされた。図１５は、α−ｇａｌ−ｖａｃ構築物（レーン「ｖａｃ」）およびα−ｇａｌ−ＫＤＥＬ構築物（レーン「ＫＤＥＬ」）の両方からタバコ植物で発現させたポリペプチドが、天然型ヒトα−ガラクトシダーゼのアミノ酸３２６〜４２９の間で示されるようなポリペプチドセグメントに対して惹起されたウサギポリクローナル抗体によって検出される画分を含んでいたことを示す。ＧＦＰにより形質転換されたコントロール植物（レーン「ＧＦＰ」）は何らかの免疫反応性のバンドをもたらさなかった。
【０３１２】
組換えα−ガラクトシダーゼの速度論的分析：
植物発現によるヒト組換えα−ガラクトシダーゼの好適性を評価するために、タバコ植物由来の精製された組換えα−ガラクトシダーゼを速度論的分析に供し、ＫｍおよびＶｍａｘの値を求めた。図１６Ａおよび図１６Ｂでは、組換えα−ガラクトシダーゼの速度論（赤色の記号）が、市販されている組換えヒトα−ガラクトシダーゼのＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）の速度論（黒色の記号）およびＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）の速度論（青色の記号）と比較して示される。ＫｍおよびＶｍａｘの計算により、本発明の組換えα−ガラクトシダーゼ（これはＥＲに標的化され、ＥＲにおいて発現される）が、これらの市販の酵素と非常に類似するＫｍおよびＶｍａｘのパラメーターを有すること、すなわち、Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）よりも大きいＶｍａｘおよび低いＫｍを有し、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）よりも大きいＶｍａｘおよびわずかに大きいＫｍを有することが示される。このことは、植物におけるポリペプチドの発現およびプロセシングが正確であること、また、触媒活性が臨床適用のために好適であることを示している。
【０３１３】
組換えの植物発現によるヒトα−ガラクトシダーゼは広範囲の温度で安定である：
本発明の１つの実施形態に従って植物から発現および精製された組換えヒトα−ガラクトシダーゼをさらに評価するために、様々な温度（４℃〜３７℃）におけるポリペプチドの安定性を試験した。図１７Ａおよび図１７Ｂは、植物発現による組換えヒトα−ガラクトシダーゼ（植物ａ−Ｇａｌ）が、試験されたすべての温度において、電気泳動移動度における変化を何ら受けず、また、哺乳動物細胞由来の市販されている組換えα−ガラクトシダーゼ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標））よりも安定でないとしても、それと同程度に安定であったことを示す。組換えα−ガラクトシダーゼの安定性は、活性緩衝液（図１７Ａ）においてインキュベーションされたか、または、細胞培地緩衝液（図１７Ｂ）においてインキュベーションされたかにかかわらず、明白であった。
【０３１４】
組換えの植物発現によるヒトα−ガラクトシダーゼはヒト線維芽細胞において能動的に取り込まれる：
タバコで産生された組換えα−ガラクトシダーゼが標的細胞による取り込みを受け得るか、従って、ファブリー病の処置のために有用であり得るかを明らかにするために、組換えヒトα−ガラクトシダーゼが線維芽細胞に結合し、かつ、線維芽細胞によって取り込まれ得るかを次にアッセイした。図１８に示されるように、組換えα−ガラクトシダーゼは細胞による取り込みを受ける（レーン「植物αＧａｌ」は、標準物として泳動された２０ｎｇの市販の組換えαＧａｌ（Ｒｅｐｌａｇａｌ、右から最初のレーン、）と一緒に泳動された、線維芽細胞溶解物から採取された２０ｕｌのサンプルにおけるαＧａｌの免疫検出を示す）。間には、分子量マーカーラダーがある。
【０３１５】
これらの結果は、グリカン構造の再構成がない場合でさえ、形質転換されたタバコ植物から発現および精製された組換えα−ガラクトシダーゼは、α−ガラクトシダーゼが欠乏している線維芽細胞を標的化するために取り込みを受けることができることを示す。そのうえ、この組換えα−ガラクトシダーゼは酵素活性である。
【０３１６】
植物発現による組換えヒトα−ガラクトシダーゼのグリカンプロファイル：
前記実施例に関して記載されるように産生されたヒトα−ガラクトシダーゼの表面に存在するグリカン構造の分析を行った。下記においてより詳しく記載されるように、結果は、グリカンの大部分が、高マンノース型構造だけでなく、末端のマンノース残基を含有することを示している。好都合なことに、この高マンノース型構造は、生物学的に活性であることが見出された。従って、さらなる工程がその活性化のために必要とされなかった。
【０３１７】
ヒトα−ガラクトシダーゼとして特定されるＰＡＧＥ分離されたバンドを、トリプシン消化、グリカンの蛍光標識化、および、エキソグリコシダーゼ（ＢＫＦ、ＪＢＭ、ＸＹＬおよびＪＢＨ）による逐次消化、その後でのＨＰＬＣの後で配列決定したとき、グリコシル化の特徴的なパターンが認められる（図１９、８７分）。露出するマンノースを有するグリカン構造が優勢である。
【０３１８】
単糖組成分析（図１９を参照のこと）では、植物でのグリコシル化に特徴的なヘキソース、ヘキソサミンおよびペントースの分布が明らかにされた。ＧｌｃＮａｃおよびマンノースの間における比率により、特徴的なＮ結合型構造が、優勢なグリカン集団であることが示唆される。
【０３１９】
実施例６
本発明による処置
本発明に従って産生される組換えタンパク質は好ましくは、植物細胞培養物によって産生される好適にグリコシル化されたタンパク質（これは、好ましくは、例えば、リソソーム酵素であり、かつ／または、高マンノース型のグリコシル化されたタンパク質である）を含む。
【０３２０】
本明細書における好ましい実施形態によれば、本発明に従って産生されるタンパク質は、リソソーム関連疾患（例えば、リソソーム蓄積症など）の処置のために好適である。
【０３２１】
処置方法は、場合により、また、好ましくは、（ａ）形質転換された植物根細胞から精製され、かつ、リソソーム酵素が異常に不足している細胞を効率的に標的化することができる組換えの生物学的に活性な形態のリソソーム酵素を提供すること（この組換えの生物学的に活性な酵素は、露出した末端マンノース残基を、付属するオリゴ糖に有する）；および（ｂ）そのような組換えの生物学的に活性なリソソーム酵素の治療効果的な量、または、そのような組換えの生物学的に活性なリソソーム酵素を含む組成物の治療効果的な量を対象に投与することを含む。１つの好ましい実施形態において、本発明の方法によって使用される組換え高マンノース型リソソーム酵素を本発明の宿主細胞によって産生させることができる。好ましくは、この宿主細胞はニンジン細胞である。
【０３２２】
「ほ乳動物対象」または「哺乳動物患者」によって、ヒト、ウシ、ウマ、イヌおよびネコの対象を含めて、遺伝子治療が所望されるいずれかの哺乳動物が意味され、最も好ましくは、ヒト対象が意味される。
【０３２３】
用語「処置」はまた、病理学的状態および／またはその１つもしくは複数の症状を改善または緩和すること、あるいは、そのような状態を治療すること、あるいは、そのような状態の発生を防止することを包含することに留意しなければならない。
【０３２４】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法によって使用されるリソソーム酵素は、露出したマンノース残基を有する少なくとも１つのオリゴ糖鎖を含む高マンノース型酵素であり得る。この組換え酵素は対象の体内で標的部位において標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる。より好ましくは、この組換えリソソーム酵素は、標的細胞に対する天然に存在するリソソーム酵素の対応する親和性との比較において、これらの標的細胞に対する増大した親和性を有する。従って、それぞれの用量が、ＧＣＤが異常に不足している細胞を効果的に標的化することに依存しており、また、そのような形態のＧＣＤのそれぞれの用量は、治療的効果を達成するために類似する様式で他の場合において投与される天然に存在するＧＣＤの用量よりも実質的に少ない。
【０３２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のタンパク質は、リソソーム蓄積症を処置するために好適であり、その結果、本発明はまた、そのような疾患を処置するための方法を含む。リソソーム蓄積症は、糖脂質または多糖の老廃物を細胞のリソソームにおいて分解する酵素をコードする遺伝子における欠陥の結果である、４０を超える障害からなる一群である。酵素反応生成物（例えば、糖および脂質）は、その後、新しい生成物に再利用される。これらの障害のそれぞれが、リソソームにおける酵素のレベルに影響を及ぼす遺伝性の常染色体劣性形質またはＸ連鎖劣性形質から生じる。一般に、影響を受けた酵素の生物学的または機能的な活性が罹患者の細胞および組織において認められない。そのような疾患において、酵素機能における欠如は、体内で、細胞におけるリソソームでの脂質基質または炭水化物基質の進行性の全身的沈着を生じさせ、最終的には器官機能の喪失および死を引き起こす。リソソーム蓄積症の遺伝的病因、臨床的症状発現、分子生物学および可能性が、Ｓｃｒｉｖｅｒ他［Ｓｃｒｉｖｅｒ他編、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第７版、第ＩＩ巻、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ（１９９５）］に詳しく記載される。
【０３２６】
リソソーム蓄積症（およびその関連した欠損酵素）の例には、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ）、ファーバー病（セラミダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、Ｇｍｌガングリオシド症（β−ガラクトシダーゼ）、テイ・サックス病（β−ヘキソサミニダーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、シンドラー病（α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ）、ハンター症候群（イズロン酸−２−スルファターゼ）、スライ症候群（β−グルクロニダーゼ）、ハーラー症候群およびハーラー・シャイエ症候群（イズロニダーゼ）、ならびに、Ｉ細胞／サン・フィリポ症候群（マンノース−６−リン酸輸送因子）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２７】
ゴーシェ病はヒトにおける最も一般的なリソソーム蓄積症であり、最も高頻度にはアシュケナージ系ユダヤ人集団において発生する。合衆国では約５０００人〜１００００人の人々がこの疾患に苦しむ［Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ、Ａｄｖ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２１：３７７〜４４１（１９９３）］。ゴーシェ病はグルコセレブロシダーゼ（ｈＧＣＤ；グルコシルセラミダーゼ）の欠如から生じる。この欠如は、骨髄、脾臓および肝臓の細網内皮細胞における酵素基質（グルコセレブロシド）の蓄積を引き起こし、その結果、著しい骨格合併症（例えば、骨髄膨張および骨衰退）を生じさせ、また、脾機能亢進症、肝腫大、血小板減少症、貧血および肺合併症もまた生じさせる［Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ（１９９３）、同上；Ｌｅｅ、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．９５：１７７〜２１７（１９８２）］。
【０３２８】
より具体的には、本発明の方法によって使用されるリソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、α−マンノシダーゼまたはシアリダーゼからなる群から選択され得る。好ましくは、処置される疾患がゴーシェ病である場合、本発明の方法によって使用されるリソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）である。
【０３２９】
本発明のタンパク質は、医薬組成物を製造するために使用することができる。従って、本発明の別の態様によれば、その有効成分として、タンパク質を含み、かつ、医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物が提供される。本明細書で使用される「医薬組成物」は、本明細書に記載される有効成分の１つまたは複数（例えば、組換えタンパク質）を他の化学的成分（例えば、従来の薬物、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）とともに有する調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対するタンパク質または細胞の投与を容易にすることである。本発明の医薬組成物は、この技術分野において広く知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０３３０】
１つの好ましい実施形態において、用語「医薬的に許容される」は、動物（より具体的にはヒト）における使用について、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、あるいは、米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。以降、表現「生理学的に好適なキャリア」および表現「医薬的に許容されるキャリア」は交換可能に使用され、著しい刺激を生物に対してもたらさず、かつ、投与されたコンジュゲートの生物学的な活性および性質を阻害しない承認されたキャリアまたは希釈剤を示す。
【０３３１】
用語「キャリア」は、治療剤が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルを示す。そのような医薬用キャリアは無菌の液体が可能であり、例えば、水およびオイル（石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のものを含む）など、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが可能である。水は、医薬組成物が静脈内投与されるときの好ましいキャリアである。生理的食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液もまた、液体キャリアとして用いることができ、具体的には、注射用溶液のための液体キャリアとして用いることができる。好適な医薬用賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水およびエタノールなどが含まれる。組成物はまた、所望されるならば、微量の湿潤化剤もしくは乳化剤、または、ｐＨ緩衝化剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルション、錠剤、ピル、カプセル、粉末剤および持続放出配合物などの形態を取ることができる。組成物は、従来のバインダーおよびキャリア（例えば、トリグリセリド）を用いて、坐薬として配合することができる。経口用配合物は標準的なキャリア（例えば、医薬規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含むことができる。好適な医薬用キャリアの様々な例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。そのような組成物は、患者に対する適正な投与のための形態を提供するように、治療効果的な量のタンパク質（好ましくは、精製された形態でのタンパク質）を好適な量のキャリアと一緒に含有する。配合は投与様式のために好適でなければならない。
【０３３２】
本明細書において、用語「賦形剤」は、有効成分の加工および投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０３３３】
有効成分の配合および投与のためのさらなる技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０３３４】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、好適な固相キャリアまたはゲル相キャリア、あるいは賦形剤を含むことができる。このようなキャリアまたは賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられる。
【０３３５】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、経皮送達、腸管送達または非経口送達（筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、くも膜下注射、直接的な心室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む）が含まれ得る。
【０３３６】
従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬的に使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つ以上の医薬的に許容されるキャリアを使用して、従来の様式で配合することができる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０３３７】
注射の場合、本発明の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的な生理的食塩水緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０３３８】
経口投与の場合、有効成分は、場合により、例えばＧＣＤまたはα−ガラクトシダーゼのような本発明によるタンパク質を産生する細胞全体の投与によって処方され得る。有効成分はまた、有効成分および／または細胞を、この分野で広く知られている医薬的に許容されるキャリアと組み合わせることによって処方され得る。そのようなキャリアは、本発明の有効成分が、患者により経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして処方されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０３３９】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、有効成分の量を明らかにするために、または有効成分の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０３４０】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０３４１】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０３４２】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用される有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器において使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、有効成分および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【０３４３】
本明細書中に記載される有効成分は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために処方することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、そして、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０３４４】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性な調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油性の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０３４５】
好ましい実施形態において、組成物は、ヒトに対する静脈内投与のために適合化された医薬組成物として、日常的な手法に従って配合される。典型的には、静脈内投与される医薬組成物は、無菌の等張性の水性緩衝液における溶液である。一般に、成分は別々に提供されるか、または、単位投薬形態で一緒に混合されて、例えば、活性な薬剤の量を示す気密容器（例えば、アンプルまたは小袋など）における乾燥した凍結乾燥粉末または無水高濃度物として提供される。組成物が注入によって投与されることになる場合、組成物は、無菌の医薬規格の水または生理的食塩水を含有する注入ボトルとともに分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用無菌水または生理的食塩水のアンプルが提供される。
【０３４６】
本発明の医薬組成物は中性形態または塩形態として配合することができる。医薬的に許容される塩には、アニオンを伴って形成される塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩など、および、カチオンを伴って形成される塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩などが含まれる。
【０３４７】
本発明の有効成分はまた、例えば、従来の坐薬基剤（例えば、カカオバターまたは他のグリセリド）を使用して直腸用組成物（例えば、坐薬または停留浣腸剤）に配合することができる。
【０３４８】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、ゲル相キャリアまたはゲル相賦形剤の好適な固体を含むことができる。そのようなキャリアまたは賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３４９】
局所的経路が場合により行われ、局所用キャリアによって支援される。局所用キャリアは、局所的な有効成分投与のために一般に好適であるキャリアであり、これには、この技術分野において知られている任意のそのような物質が含まれる。局所用キャリアは、組成物を所望される形態で提供するように、例えば、組成物を、液体キャリアまたは非液体キャリア、ローション、クリーム、ペースト、ゲル、粉末、軟膏、溶媒、液体希釈剤および滴剤などとして提供するように選択され、局所用キャリアは、天然に存在する起源または合成起源のどちらかの物質から構成され得る。明らかなことではあるが、選択されたキャリアは、局所用配合物の活性な薬剤または他の成分に悪影響を及ぼさないこと、また、局所用配合物のすべての成分に関して安定であることが不可欠である。本明細書における使用のための好適な局所用キャリアの例には、水、アルコールおよび他の非毒性の有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン類およびワックスなどが含まれる。本明細書における好ましい配合物は、無色無臭の軟膏、液体、ローション、クリームおよびゲルである。
【０３５０】
軟膏は、典型的にはペトラタムまたは他の石油誘導体に基づく半固体の調製物である。使用される具体的な軟膏基剤は、当業者によって理解されるように、最適な有効成分送達を提供し、かつ、好ましくは、他の所望される特徴（例えば、皮膚軟化性など）もまた提供するものである。他のキャリアまたはビヒクルの場合と同様に、軟膏基剤は、不活性で、安定で、非刺激性で、かつ、非感作性でなければならない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９９５）において１３９９頁〜１４０４頁で説明されるように、軟膏基剤は、油性基剤、乳化可能な基剤、エマルション基剤および水溶性基剤の４つのクラスに類別することができる。油性の軟膏基剤には、例えば、植物油、動物から得られる脂肪、および、石油から得られる半固体の炭化水素が含まれる。乳化可能な軟膏基剤は、吸収軟膏基剤としてもまた知られており、水をほとんど含有しないか、または、水を全く含有せず、これには、例えば、ヒドロキシステアリンスルファート、無水ラノリンおよび親水性ペトラタムが含まれる。エマルション軟膏基剤は油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルションまたは水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションのどちらかであり、これには、例えば、セチルアルコール、グリセリルモノステアラート、ラノリンおよびステアリン酸が含まれる。好ましい水溶性軟膏基剤が様々な分子量のエチレングリコールから調製される。再度ではあるが、さらなる情報については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙを参照することができる。
【０３５１】
ローションは、摩擦を伴うことなく皮膚表面に塗布されるための調製物であり、典型的には、固体粒子（活性な薬剤を含む）が水またはアルコールの基剤に存在する液体または半液体の調製物である。ローションは、通常、固体の懸濁物であり、水中油型タイプの液体油性エマルションを含むことができる。ローションは、より多くの流体組成物を塗布することが容易であるので、大きな身体面積を処置するための本明細書における好ましい配合物である。ローションにおける不溶物は細かく分割されることが一般に必要である。ローションは、典型的には、より良好な分散を生じさせるための懸濁化剤を、活性な薬剤を皮膚との接触状態で局在化し、かつ、保つために有用な有効成分（例えば、メチルセルロースまたはナトリウムカルボキシメチルセルロースなど）と同様に含有する。
【０３５２】
選択された有効成分を含有するクリームは、この技術分野では知られているように、水中油型または油中水型のどちらかであっても、粘性の液体エマルションまたは半固体エマルションである。クリーム基剤は水洗性であり、油相、乳化剤および水相を含有する。油相は、時には「内部」相とも呼ばれることがあるが、一般には、ペトラタムおよび脂肪アルコール（例えば、セチルアルコールまたはステアリルアルコール）から構成される；水相は、通常の場合、必ずではないが、体積において油相を超え、また、一般には保湿剤を含有する。クリーム配合物における乳化剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（上掲）において説明されるように、一般には、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤または両性界面活性剤である。
【０３５３】
ゲル配合物は、頭皮への適用のために好ましい。局所用有効成分配合物の分野に従事する当業者によって理解されるように、ゲルは半固体の懸濁物タイプのシステムである。単一相ゲルは、キャリア液体全体に実質的に一様に分布される有機高分子を含有し、この場合、キャリア液体は典型的には水性であり、しかし、同様に、好ましくは、アルコールおよび場合によりオイルを含有する。
【０３５４】
様々な添加剤が当業者に知られているが、これらを本発明の局所用配合物に含めることができる。例えば、溶媒を、ある種の有効成分物質を可溶化するために使用することができる。必要に応じて使用される他の添加剤には、皮膚浸透増強剤、乳白剤、酸化防止剤、ゲル化剤、増粘剤および安定剤などが含まれる。
【０３５５】
本発明の局所用組成物はまた、従来の皮膚型のパッチまたは物品を使用して皮膚に送達することができ、この場合、有効成分組成物は、皮膚に貼り付けられるための薬物送達デバイスとして役立つ積層化された構造体の中に含有される。そのような構造体において、有効成分組成物は、上部支持層の下に存在する層、すなわち、「リザーバー」に含有される。積層化された構造体は、１つだけのリザーバーを含有することができるか、または、多数のリザーバーを含有することができる。１つの実施形態において、リザーバーは、有効成分送達期間中にシステムを皮膚に貼り付けるために役立つ医薬的に許容される接触接着性物質のポリマーマトリックスを含む。好適な皮膚接触接着性物質の例には、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレートおよびポリウレタンなどが含まれるが、これらに限定されない。選択される具体的なポリマー接着剤は、具体的な有効成分、ビヒクルなどに依存する。すなわち、接着剤は、有効成分含有組成物のすべての成分との適合性を有しなければならない。代替では、有効成分含有リザーバーおよび皮膚接触接着剤が別個の異なる層として存在し、この場合、接着剤はリザーバーの下に位置し、リザーバーは、この場合には、上記で記載されるようなポリマーマトリックスであり得るか、あるいは、リザーバーは液体またはヒドロゲルのリザーバーであり得るか、または、何らかの他の形態を取り得る。
【０３５６】
これらの積層体における支持層は、デバイスの上部表面として役立つものであり、積層化された構造体の主要な構造的要素として機能し、また、デバイスにその柔軟性の多くをもたらす。支持材のために選択される材料は、有効成分含有組成物の有効成分およびいずれかの他の成分に対して実質的に不浸透性であるように、従って、デバイスの上部表面からの何らかの成分の喪失を防止するように選択されなければならない。支持層は、皮膚が有効成分送達期間中に水和されることが所望されるかどうかに依存して、閉鎖性または非閉鎖性のどちらかであり得る。支持材は、好ましくは柔軟性のエラストマー材料からなるシートまたはフィルムから好ましくは作製される。支持層のために好適であるポリマーの例には、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエステルが含まれる。
【０３５７】
貯蔵期間中および使用前において、積層化された構造体は剥離ライナーを含む。使用直前に、この層が、その基層表面（有効成分リザーバーまたは別個の接触接着剤層のどちらか）を露出させるためにデバイスから除かれ、その結果、このシステムを皮膚に貼り付けることができるようにされる。剥離ライナーは、有効成分／ビヒクル不浸透性の材料から作製されなければならない。
【０３５８】
そのようなデバイスは、この技術分野において知られている様々な従来的技術を使用して製造することができ、例えば、接着剤、有効成分およびビヒクルの液状混合物を支持層に注ぎ、その後、剥離ライナーを積層化することによって製造することができる。同様に、接着剤混合物を剥離ライナーに注ぎ、その後、支持層を積層化することができる。代替として、有効成分リザーバーを有効成分または賦形剤の非存在下で調製することができ、その後、有効成分／ビヒクルの混合物に「浸す」ことによって負荷することができる。
【０３５９】
本発明の局所用配合物の場合のように、これらの積層化されたシステムの有効成分リザーバーに含有される有効成分組成物は数多くの成分を含有することができる。いくつかの場合において、有効成分は、「何も加えない状態」で、すなわち、さらなる液体の非存在下で送達することができる。しかしながら、ほとんどの場合において、有効成分は、好適な医薬的に許容されるビヒクル（典型的には、溶媒またはゲル）に溶解または分散または懸濁される。存在することができる他の成分には、保存剤、安定剤および界面活性剤などが含まれる。
【０３６０】
本発明のタンパク質（例えば、高マンノース型リソソーム酵素）は好ましくは、必要としている患者に、効果的な量で投与されることに留意しなければならない。本明細書で使用される「効果的な量」は、選択された結果を達成するために必要である量を意味する。例えば、本発明の組成物の効果的な量を、リソソーム蓄積症の処置のために有用であることのために選択することができる。
【０３６１】
本発明に関連して使用される好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、処置されている対象の疾患の症状を予防または緩和または改善するために効果的であるか、あるいは、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分の量を意味する。
【０３６２】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３６３】
本発明の方法において使用される任意の有効成分について、治療効果的な量または用量は、動物における活性アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量を、活性アッセイによって決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定めることができる。
【０３６４】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば、対象とする有効成分についてＩＣ５０およびＬＤ５０（処置された動物の５０％において死を生じさせる致死量）を決定することによって明らかにすることができる。これらの活性アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量範囲を定める際に使用することができる。例えば、遺伝傷害の処置のために好適な治療有効量は、これらの疾患の動物モデルによる実験から決定されることができる。
【０３６５】
投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１章、１頁を参照のこと）。
【０３６６】
投薬量および投薬間隔は、調節作用を維持するために十分な、活性成分の血漿レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）をもたらすために個々に調節することができる。ＭＥＣは、それぞれの調製物について変化するが、場合により、動物データ全体から推定することができる。
【０３６７】
投薬間隔はまた、ＭＥＣ値を使用して決定することができる。調製物は、場合により、期間の１０％〜９０％について、好ましくは３０％〜９０％の間、最も好ましくは５０％〜９０％の間、ＭＥＣを超えて血漿レベルを維持する治療方法を使用して投与することができる。
【０３６８】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬はまた、本明細書中上記で記載された徐放性組成物の単回投与であり得る。この場合、処置の経過は、数日から数週間まで、または、治癒が達成されるまで、もしくは、疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０３６９】
本発明の組成物は、所望される場合には、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーデバイスにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物に対する米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の有効成分を含む組成物はまた、適応状態を処置するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。
【０３７０】
本明細書で使用される用語「調節する」は、疾患の進行を実質的に阻害すること、または、遅くすること、または、逆戻りさせること、あるいは、疾患または状態の臨床的症状を実質的に改善すること、あるいは、疾患または状態の臨床的症状の出現を実質的に防止することを包含する。従って、「調節剤」には、疾患または状態を調節することができる薬剤が含まれる。
【０３７１】
他の実施形態
本発明はその詳細な記述と関連して説明されているが、前述の説明は添付の特許請求の範囲によって規定される発明の範囲を説明するためであって制限することを意図していないことは理解されるべきである。他の態様、利点、および変形例は特許請求の範囲内にある。
【０３７２】
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【配列表フリーテキスト】
【０３７３】
配列番号１は、ＥＲシグナルペプチドの配列を示す。
配列番号２は、タバコキチナーゼＡからの液胞標的化シグナルの配列を示す。
配列番号３〜６および２１〜２２は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号１０は、ＥＲシグナルペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列番号１１は、液胞標的化配列をコードする核酸配列を示す。
配列番号１２は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのターミネーターの核酸配列を示す。
配列番号１３は、高マンノースヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）をコードする核酸配列を示す。
配列番号１４は、高マンノースヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＤ）の配列を示す。
配列番号１５は、処理された植物産生によるヒト組換えＧＣＤタンパク質の配列を示す。
配列番号１６は、リンゴペプチナーゼのリーダーペプチドの配列を示す。
配列番号１７は、α−ｇａｌ−ｖａｃ発現構築物の配列を示す。
配列番号１８は、α−ｇａｌ−ｖａｃポリペプチドの配列を示す。
配列番号１９は、α−ｇａｌ−ＫＤＥＬ発現構築物の配列を示す。
配列番号２０は、α−ｇａｌ−ＫＤＥＬポリペプチドの配列を示す。
配列番号２３は、ＥＲ保持シグナルペプチドの配列を示す。
配列番号２４は、成熟型α−ガラクトシダーゼの配列を示す。
【図１Ａ】
2010525806.tif 000008
【図１Ｂ】
2010525806.tif 000009
【図３Ａ】
2010525806.tif 000010
【図３Ｄ】
2010525806.tif 000011
【図４Ａ】
2010525806.tif 000012
【図５Ａ】
2010525806.tif 000013
【図５Ｂ】
2010525806.tif 000014
【図６】
2010525806.tif 000015
【図７】
2010525806.tif 000016
【図８Ａ】
2010525806.tif 000017
【図８Ｂ】
2010525806.tif 000018
【図８Ｃ】
2010525806.tif 000019
【図８Ｄ】
2010525806.tif 000020
【図１０】
2010525806.tif 000021
【図１１】
2010525806.tif 000022
【図１２】
2010525806.tif 000023
【図１３】
2010525806.tif 000024
【図１６】
2010525806.tif 000025
【図１９】
2010525806.tif 000026
【図２】
2010525806.tif 000027
【図３Ｂ−Ｃ】
2010525806.tif 000028
【図３Ｅ−Ｆ】
2010525806.tif 000029
【図４Ｂ−Ｃ】
2010525806.tif 000030
【図５Ｃ−Ｄ】
2010525806.tif 000031
【図９】
2010525806.tif 000032
【図１４】
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【図１５】
2010525806.tif 000034
【図１７】
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【図１８】
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