(57)【要約】  濃度を高めたリポ酸を含む培養培地を使用する、体外受精のための組成物及び方法が提供される。より詳細には、本発明は、５μＭ〜４０μＭの濃度のリポ酸を有する発生細胞用の培養培地を提供する。確認された範囲内の濃度でリポ酸を含む培養培地は、対照培地で培養した胚盤胞と比較して、生存率が増大し、細胞数が増大し、内部細胞塊が増大し、及び／又は塊全体に対する内部細胞の占める割合が増大した胚盤胞を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水、
（ｂ）無機塩、
（ｃ）少なくとも１つのエネルギー源、及び
（ｄ）約５μＭ〜約４０μＭの濃度のリポ酸、リポ酸誘導体又はその組合せ、
を含む発生細胞培養培地。
【請求項２】
１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の培養培地。
【請求項３】
前記培養培地が、幹細胞、配偶子、受精卵又は胚のうち少なくとも１つの、或る発生段階から別の発生段階への発生をサポートする、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項４】
前記培養培地が胚の発生をサポートする、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項５】
前記培養培地がヒト胚の発生をサポートする、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項６】
前記培養培地が配偶子の発生をサポートする、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項７】
前記培養培地が幹細胞の発生をサポートする、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項８】
前記培地中における無機塩の濃度が約１１５ｍＭ〜約１４０ｍＭであり、前記培地中におけるエネルギー源の濃度が約５ｍＭ〜約３０ｍＭであり、前記培地中におけるアミノ酸の総濃度が約０．１ｍＭ〜１５ｍＭである、請求項２に記載の培養培地。
【請求項８】
キレート剤、抗生物質及びヒアルロン酸をさらに含む、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項９】
増殖因子、ホルモン、抗生物質及びビタミンから成る群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含む、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項１０】
エタノールをさらに含む、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項１１】
約５μＭ〜約２０μＭの濃度のリポ酸を有する、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項１２】
約５μＭ〜約１０μＭの濃度のリポ酸を有する、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項１３】
約８μＭ〜約１２μＭの濃度のリポ酸を有する、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項１４】
約１０μＭの濃度のリポ酸を有する、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項１５】
前記培養培地が４細胞期まで胚の発生をサポートする、請求項４に記載の培養培地。
【請求項１６】
前記培養培地が８細胞期まで胚の発生をサポートする、請求項４に記載の培養培地。
【請求項１７】
前記培養培地が胚盤胞期まで胚の発生をサポートする、請求項４に記載の培養培地。
【請求項１８】
前記培養培地が８細胞期から胚盤胞期まで胚の発生をサポートする、請求項４に記載の培養培地。
【請求項１９】
前記培地が、卵母細胞成熟培地、受精用培地、ＩＣＳＩ培地、精子培地又は凍結培地である、請求項１又は２に記載の培養培地。
【請求項２０】
発生細胞を培養する方法であって、該方法が、請求項１又は２に記載の培養培地中で幹細胞、配偶子、受精卵又は胚を培養することを含む、方法。
【請求項２１】
前記幹細胞、配偶子、受精卵又は胚が大気酸素条件下で培養される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記幹細胞、配偶子、受精卵又は胚が低減酸素条件下で培養される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
幹細胞、配偶子、受精卵又は胚を培養する前記工程が、ヒト胚を培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
幹細胞、配偶子、受精卵又は胚を培養する前記工程が、胚を４細胞期まで培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
幹細胞、配偶子、受精卵又は胚を培養する前記工程が、胚を８細胞期まで培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
幹細胞、配偶子、受精卵又は胚を培養する前記工程が、胚を胚盤胞期まで培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
幹細胞、配偶子、受精卵又は胚を培養する前記工程が、胚を８細胞期から胚盤胞期まで培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
幹細胞、配偶子、受精卵又は胚を培養する前記工程が、胚を３日目の段階まで培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
幹細胞、配偶子、受精卵又は胚を培養する前記工程が、胚を５日目の段階まで培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）水、
（ｂ）無機塩、
（ｃ）少なくとも１つのエネルギー源、及び
（ｄ）リポ酸、リポ酸誘導体又はその組合せ、
を含む発生細胞培養培地であって、該培養培地が哺乳動物の胚の胚盤胞期までの発生をサポートし、さらに該培養培地が、リポ酸及びリポ酸誘導体が存在しないことにおいてのみ該培養培地と異なる対照培地と比較して、５日目の胚盤胞総数について少なくとも１０％の増大をもたらす、培地。
【請求項３１】
１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む、請求項３０に記載の培地。
【請求項３２】
前記哺乳動物の胚がＣＦ１マウス胚である、請求項３０又は３１に記載の培地。
【請求項３３】
前記発生細胞培養培地が、５μＭ〜４０μＭのリポ酸、リポ酸誘導体又はその組合せを含む、請求項３０又は３１に記載の培地。
【請求項３４】
胚を培養する方法であって、請求項３０又は３１に記載の培養培地中で胚を胚盤胞期ま
で培養することを含む、方法。
【請求項３５】
（ａ）水、
（ｂ）無機塩、
（ｃ）少なくとも１つのエネルギー源、及び
（ｄ）リポ酸、リポ酸誘導体又はその組合せ、
を含む発生細胞培養培地であって、該培養培地が哺乳動物の胚の胚盤胞期までの発生をサポートし、さらに該培養培地が、リポ酸及びリポ酸誘導体が存在しないことにおいてのみ該培養培地と異なる対照培地と比較して、５日目の胚盤胞の細胞総数について少なくとも１０％の増大をもたらす、培地。
【請求項３６】
１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む、請求項３５に記載の培地。
【請求項３７】
前記哺乳動物の胚がＣＦ１マウス胚である、請求項３５に記載の培地。
【請求項３８】
前記発生細胞培養培地が、５μＭ〜４０μＭのリポ酸、リポ酸誘導体又はその組合せを含む、請求項３５に記載の培地。
【請求項３９】
胚を培養する方法であって、請求項３５に記載の培養培地中で胚を胚盤胞期まで培養することを含む、胚を培養する方法。
【請求項４０】
（ａ）水、
（ｂ）無機塩、
（ｃ）少なくとも１つのエネルギー源、及び
（ｄ）リポ酸、リポ酸誘導体又はその組合せ、
を含む発生細胞培養培地であって、該培養培地が哺乳動物の胚の胚盤胞期までの発生をサポートし、さらに該培養培地が、リポ酸及びリポ酸誘導体が存在しないことにおいてのみ該培養培地と異なる対照培地と比較して、５日目の胚盤胞の内部細胞塊について少なくとも１０％の増大をもたらす、培地。
【請求項４１】
１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む、請求項４０に記載の培地。
【請求項４２】
前記哺乳動物の胚がＣＦ１マウス胚である、請求項４０に記載の培地。
【請求項４３】
前記発生細胞培養培地が、５μＭ〜４０μＭのリポ酸、リポ酸誘導体又はその組合せを含む、請求項４０に記載の培地。
【請求項４４】
胚を培養する方法であって、請求項４０に記載の培養培地中で胚を胚盤胞期まで培養することを含む、胚を培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は包括的に、哺乳動物の体外受精（ＩＶＦ）、並びに、受精及び胚発生をおこなうのに、及び幹細胞増殖をおこなうのに有用な培地及び工程に関する。特に本発明は、胚を含む発生細胞の増殖及び発生をサポートし、且つＩＶＦにおける妊娠の成功の可能性を顕著に増大させる、リポ酸濃度を高めた培養培地を提供する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００７年５月１日付けで出願された米国仮特許出願第６０／９１５，１８０号明細書に基づく優先権を主張し、その開示の全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
以下の記載は、読者の理解を助けるために示される。示した情報又は引用した文献のいずれも、本発明に対する先行技術であると認められるものではない。
【０００４】
体外受精は、男性及び女性の様々な形態の不妊を克服するために使用される手法である。この工程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで卵母細胞を精子で受精させること、及び、その後、発生中の胚を女性の体内に移植することを含む。ＩＶＦによる最初の誕生（非特許文献１）から３０年近くが経ったが、この工程は、低着床率及び低妊娠率という継続的な課題に直面している。「試験管ベビー」が初めて誕生してから最初の１０年間では、報告されたＩＶＦの成功率は、８％〜１０％にすぎなかった。この低い成功率は、少なくとも部分的には、胚培養培地の粗悪な品質のためであった。不幸にも、最近の３０年間にわたるＩＶＦ培養培地を改善し特化させようとする絶え間ない努力にも関わらず、単一胚移植が採用された例（２００５年のフィンランド及びスウェーデンにおける国内ＩＶＦ登録者に基づく）では、成功率は約３０〜３５％に増加したにすぎない。この単一胚移植データは、１９７８年のデータに対し最も比較可能なデータである。ＩＶＦ成功率の改善におけるこの緩慢な進歩は、配偶子、受精卵及び胚等の発生細胞用の培養培地の代替及び増強における困難性及び予測不可能性を反映する。
【０００５】
ヒトＩＶＦのために現在使用されている培地の種類は、単純培地と複合培地という２つのカテゴリーに分類される。単純培地は、ピルビン酸塩、乳酸塩及びグルコース等の炭水化物エネルギー源を添加した平衡塩類溶液であるアール液及びヒト卵管液（ＨＴＦ）等のような培地である。複合培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０培地等）は、非必須アミノ酸及び必須アミノ酸と、ビタミン、抗生物質及び血清又はタンパク質等の他の添加物とをさらに含む。
【０００６】
ＩＶＦ培養培地によっては、単一培地中で８細胞期又はそれ以降まで胚発生をサポートすることを目的としているが、様々な発生段階における発生中の胚をサポートするように別々の培養培地を最適化することが趨勢となっている。このことは、ＩＶＦにおける逐次培養培地の広範な使用につながっている。例えば、逐次培養培地系は、発生の最初の４８時間での１細胞受精卵から８細胞胚までの胚の増殖のために１つの培養培地を、８細胞胚を胚盤胞期まで増殖させるために別の培養培地を使用することがある。女性の生殖器官は発生中の胚に対して環境の変化をもたらすので、逐次培養培地は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの胚増殖時の女性の生殖器官をより密に模倣するように構成される。培地の組成は典型的には、胚の増殖及び発生をサポートするために培地の最適化を改善するよう、アミノ酸及び糖質等の成分に関して異なる。
【０００７】
ＩＶＦにおいて採用される培養培地は、最近の３０年間の過程で、ある程度発展してき
た。しかし、いくつかの観点では培養培地は、全く変化してこなかった。胚培養培地の改善を目指すほとんどの研究の焦点は、培地の主要部分（core）または大半（bulk）を構成する成分、すなわち炭水化物エネルギー源、アミノ酸、血清及び塩／緩衝剤に向けられてきた。他の原料は、ほとんど注意を払われてこなかった。場合によっては、これらの原料は、胚培養培地が最初に考案される基礎となった初期の体細胞培養培地中に存在していたという理由だけで、胚培養培地中に含まれてきたようである。リポ酸（ＬＡ）は、かかる原料の１つである。
【０００８】
α−リポ酸又はチオクト酸としても知られるリポ酸は、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及び分枝鎖α−ケト酸の酸化的脱炭酸を触媒する多酵素複合体のＥ２（ジヒドロリポ酸アシルトランスフェラーゼ）サブユニットの補酵素としての役割で広く知られている。しかし過去約１０年間で、リポ酸が抗酸化剤でもあることが明らかとなった。リポ酸の性能は、リポ酸／ジヒドロリポ酸系の独特な抗酸化特性、その活性酸素種（ＲＯＳ）除去能、及び、最も強力な抗酸化剤の１つであるグルタチオンを含む他の抗酸化剤の還元型の組織濃度に対する顕著な効果に起因する。文献からのデータは、リポ酸及びジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）が、マウス白血病細胞及びジャーカット（jurkat）Ｔ細胞のような特定の細胞型に対する増殖促進効果を有する場合、又は有しない場合があることを示唆する。非特許文献２及び非特許文献３を参照されたい。
【０００９】
リポ酸は、２つの鏡像異性形態（Ｒ体及びＬ体）を作り出すキラル中心を有する両親媒性のジスルフィド化合物であり、最も生物学的に活性なものはＲ−鏡像異性体である。上記ジスルフィド成分は分子に金属キレート特性をもたらし、その一方で、化合物の両親媒特性によりその相対的に小さな分子（分子量＝２０６．３４ｇ／ｍｏｌ）は容易に細胞膜を拡散透過でき、リポ酸はα−ケト酸の脱炭酸（好気条件でのエネルギー代謝における重要な工程）に関与する複数の細胞性多酵素複合体によりそのジチオール、すなわち還元型であるＤＨＬＡに容易に変換される。加えて、ＤＨＬＡ／ＬＡ対は−０．２９Ｖの酸化還元電位を有すると報告され、それによりＤＨＬＡ／ＬＡ対は強力な電子受容体／酸素ラジカル除去ユニットとなる。この強力な酸化還元電位により、その分子は、ビタミンＣ、ビタミンＥ、グルタチオン、コエンザイムＱ１０及びユビキノン等の他の抗酸化剤の電位のリサイクル役として機能できる。リポ酸の還元は細胞内で起こると推定されるが、生じたＤＨＬＡは細胞から周囲の培地中へ漏出し、細胞内及び細胞外の抗酸化能の両方に影響すると考えられる。
【００１０】
リポ酸は、原核生物及び真核生物に広く存在する。脱プロトンした塩基であるリポ酸イオンは、生理的条件での最も一般的な形態であり、前駆体であるオクタン酸、及び、硫黄源（最もありうるのはシステイン残基）からリポ酸合成酵素により細胞内で合成されると考えられる。これにより当該分子は非必須栄養素となるが、関節炎、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、メタボリック症候群及びアルツハイマー病を含め、過度の酸化的ストレスに関連する疾患において、有益な栄養補助食品であることが報告されている。例えば非特許文献４、非特許文献５を参照されたい。
【００１１】
体内でのリポ酸の役割に関する知識体系の増大に関わらず、培養における発生細胞（胚等）の増殖に対するその効果についてはほとんど知られていない。リポ酸は胚培養培地中に低濃度で含まれることがあるものの、通常は存在しない。胚培養培地中におけるリポ酸の役割を体系的に調査した２つの研究は、胚培養培地からのリポ酸の除去は結果に対する効果を有しないという結論に至った。第１の研究は、ハムスター８細胞胚の、孵化直前の及び孵化後の胚盤胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発生に対する、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培地由来のリポ酸を含む１１種類の水溶性ビタミンの効果を調べた（非特許文献６）。この研究は、ハムスター８細胞胚の発生におけるリポ酸の除去は、いずれの培養段階においても発生に対する有意な効果をもたらさないという結論に至った。第２の研究により、拡張胚盤
胞へのウサギ桑実胚の培養における、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培地のリポ酸を含む１１種類の水溶性ビタミンの除去の効果を観察した（非特許文献７）。この研究も、リポ酸の除去による有意な効果はないという結論に至った。それにもかかわらず、リポ酸はいくつかの胚培養培地に含まれている。
【００１２】
公表された文献からは明らかでない理由により、リポ酸を含むこれらの胚培養培地は、その濃度を１μＭ以下に制限する。これは、初期の且つ今なお一般的な体細胞培養培地であり、たまたまリポ酸を１μＭの濃度で含んでいるＨａｍ’ｓ  Ｆ１０培地及びＦ１２培地から、多くの胚培養培地が最初に考案されたという事実のためでありうる。しかし、かかる培地においてリポ酸を含むことの必要性が、又は望ましさでさえもが、初期胚の培養培地の基礎としてのＨａｍ’ｓ  Ｆ１０培地及びＦ１２培地の初期の採用時には検討されなかったことは、上で引用した研究から明らかである。これは、現在の主要な市販の胚培養培地製品のいずれもリポ酸を全く含有しないようであるという事実によっても明らかに示される。実際、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培地及びＦ１２培地からの体細胞培養培地の発展の傾向は、それらの培地の希釈にも向かっており、結果としてさらに低濃度のリポ酸を有する培養培地に至った。例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地に続く一般的な培養培地は、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地の、リポ酸を含まない別の培養培地であるダルベッコ変法最小必須培地（ＤＭＥＭ）との１＋１希釈物である、ＤＭＥＭ／Ｆ１２である。ＲＤＦは、後ほど現れた、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づき構成された別の一般的な培養培地である。ＲＤＦは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の、リポ酸を含まない別の培養培地であるＲＰＭＩ１６４０との１＋１希釈物である。したがって、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培地及びＦ１２培地からの培養培地の発展の傾向は、培養培地におけるリポ酸の役割が見過ごされてきた、又は正しく評価されてこなかったことを示す。
【００１３】
リポ酸は、他の濃度で体細胞培養培地中にも含まれてきたが、かかる培地中において使用されるリポ酸の濃度は何オーダーにもわたって幅があり、「異なる細胞型の培養をｉｎ
ｖｉｔｒｏで成功させるには、異なる培地組成の使用が必要とされることが多い。」と認識されている（例えば、特許文献１を参照されたい）。このことは、体細胞とは非常に異なる必要条件を有する、発生細胞（胚等）のための培養培地について特に当てはまる。加えて、体細胞培養の分野内でさえ、培養培地においてリポ酸が有益であるかどうかに関しては意見の相違がある（例えば、「α−リポ酸（チオクト酸）を培養培地に添加することがあるが、それが実際に必要だという証拠はほとんどない。」と述べている特許文献２の４４頁を参照されたい）。そのように、体細胞培養培地におけるリポ酸の使用に関する文献は、培養培地におけるリポ酸の、配偶子、受精卵及び胚等の発生細胞に対する望ましさ又は効果を明らかにはしない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第９８／０８９３４号
【特許文献２】国際公開第９９／３５２４２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】シュテプトー及びエドワーズ(Steptoe, P.C. and Edwards, R.G.), ランセット(Lancet) 2(8085): 366 (1978)
【非特許文献２】ドヴィノヴァ(Dovinova)ら, ネオプラズマ(Neoplasma), Vol. 46, pp. 237-241 (1999)
【非特許文献３】ミズノ(Mizuno)ら, バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.), Vol. 200, pp. 1134-1136 (1994)
【非特許文献４】パーシャディン(Pershadsingh HA), エキスパート  オピニオン  イン  インベスティゲイティング  ドラッグス(Expert Opin Investig Drugs) 16:291-302 (2007)
【非特許文献５】ホルキスト(Holquist)ら, ファーマコロジー  アンド  セラピー(Pharmacol Ther.) 113: 154-64 (2007)
【非特許文献６】ケイン(Kane)ら, バイオロジー  オブ  リプロダクション(Biology of Reproduction), 39, 1137 (1988)
【非特許文献７】ケイン(Kane), ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  ズーロジー(J. of Expt. Zoology), 245, 220 (1988)
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、哺乳動物の発生細胞、特に胚及び哺乳動物の幹細胞のための改良された培養培地を提供する。本発明は、その培養培地中で哺乳動物の発生細胞を培養する方法をさらに提供する。その培養培地は、任意の他の既知の胚培養培地の少なくとも５倍、及びより望ましくは少なくとも１０倍の、リポ酸及び／又はリポ酸誘導体の境界明確な濃度範囲を特徴とする。本発明者らにより特定される範囲内の濃度でリポ酸又はリポ酸誘導体を含む培養培地は、対照培地で培養した胚盤胞と比較して、生存率が増大し、細胞数が増大し、内部細胞塊が増大し、及び／又は塊全体に対する内部細胞の占める割合が増大した胚盤胞を提供することができる。このことは、これらの因子が、胚が健康であるか、及び将来的に子宮内で胎児への発生が成功するか、を予測する判断材料とみなされるため、重要である。
【００１７】
特定の一実施形態では、培養培地は、水、無機塩、少なくとも１つのエネルギー源、及び５μＭ〜４０μＭの濃度のリポ酸を含む。一実施形態では、培地は、１つ又は複数のアミノ酸をさらに含む。これは、５μＭ〜２０μＭの濃度のリポ酸を有する培養培地を含み、５μＭ〜１５μＭの濃度のリポ酸を有する培養培地をさらに含み、８μＭ〜１２μＭの濃度のリポ酸を有する培養培地をさらに含み、約１０μＭの濃度のリポ酸を有する培養培地をまたさらに含む。培養培地は、増殖因子、ホルモン、ビタミン及び抗生物質等の他の原料を任意に含み得るが、これらに限定はされない。
【００１８】
培養培地は、第１の発生段階から第２の発生段階への発生細胞の増殖をサポートするように調整され得る。例えば培養培地は、哺乳動物の胚を、４細胞期まで、８細胞期まで、又は胚盤胞期までサポートするように構成され得る。したがって、本発明に包含される様々な培養培地は、様々な成分を様々な濃度で含み得る。
【００１９】
本発明のさらなる目的、特徴及び効果は、添付した図面と共に提供される以下の詳細な説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明による、２０％Ｏ2におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウス胚の胚盤胞の発生を示すデータを示す図である。
【図２】本発明による、５％Ｏ2におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウス胚の胚盤胞の発生を示すデータを示す図である。
【図３】リポ酸の存在下における活性酸素種（ＲＯＳ）の抑制を示すデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、移植前のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの配偶子、受精卵及び／又は胚の発生をサポートする、濃度を高めたリポ酸及び／又はリポ酸誘導体を含むＩＶＦ用及び幹細胞用の培養培地組成物を提供する。より具体的には、本発明のＩＶＦ培養培地は、リポ酸及び／又はリポ酸誘導体を５μＭ〜４０μＭの濃度で含む。この範囲内では、胚発生についての最大
の改善は約１０μＭで起こる。したがって本発明の培養培地は、例えば５μＭ〜２０μＭ、５μＭ〜１５μＭ及び８μＭ〜１２μＭ、好ましくは約１０μＭを含む、より明確な範囲内の濃度のリポ酸及び／又はリポ酸誘導体を有する培地も包含する。したがって本発明は、リポ酸を含む既知の胚培養培地と比較して、リポ酸濃度が少なくとも５倍、及び望ましくは少なくとも１０倍増大した、哺乳動物の胚のための培養培地を提供する。
【００２２】
本明細書に記載される培養培地とその使用とは、商業的及び工業的用途に加えて（又はその代替として）、重要な非商業的及び非工業的用途（例えば研究）を有する。本発明は、法により禁じられているヒト胚の商業的な使用を後押しすることを意図しない。
【００２３】
「培養培地」という用語は、幹細胞、配偶子、受精卵及び胚等の哺乳動物の発生細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養のために使用される、規定の浸透圧及びｐＨに調製された塩及び炭水化物を含有する水性媒体を表すために、本明細書を通じて使用される。かかる培地は、当業者により研究室で調製することができ、また市販されてもいる。以下の説明の多くは胚を発生させるための培養培地に集中するが、その培養培地は幹細胞、配偶子及び受精卵を発生させる及び培養するために使用され得ることを理解されたい。
【００２４】
「胚」という用語は、受精卵から最初の５日又は６日までの、全ての発生段階における細胞を表すために使用される。
【００２５】
「発生細胞」という用語は、幹細胞、配偶子、受精卵及び胚を表すために使用される。
【００２６】
本発明は、少なくとも部分的には、５μＭ〜４０μＭの範囲の濃度でリポ酸を含む培養培地が、リポ酸を除去した、又はこの範囲外の濃度でリポ酸を含む培養培地と比較して、ＩＶＦ処置の成功率を実質的に改善するという本発明者らの発見に基づく。理論に拘束されることを望むものでも又は意図するものでもないが、本発明者らは、発生細胞のための培養培地中においてリポ酸濃度を高めることによりもたらされる恩恵は、様々な効果の相互作用から得られると考える。リポ酸の抗酸化的効果は、培地中で重要な役割を果たす可能性がある。具体的には、培養へのリポ酸の添加は、フリーラジカル及び活性酸素種により引き起こされる酸化的損傷から発生中の細胞を保護する役割を果たすと考えられる。しかし、他の効果も、この恩恵に寄与し、配偶子、受精卵及び胚のための培養培地におけるリポ酸の狭い有効範囲を定めるのを助けている可能性がある。これらの効果は、ＧＳＨの細胞間レベルの増大の可能性とキレート効果とを含む。加えて、培養培地におけるリポ酸のレベルの増大による恩恵は、発生細胞内におけるリポ酸の代謝の様々な段階で存在する、リポ酸の様々な代謝産物の結果であり得る。例えば、その恩恵は、メチル化リポ酸又はＤＨＬＡ等のリポ酸の誘導体に由来することがある。
【００２７】
本発明の培地によりもたらされる改善は、いくつかのパラメータの内の１つ又は複数により測定され得る。これらには、４日段階又は5日段階までの胚盤胞の生存率が向上すること、胚盤胞の細胞数がより多いこと、胚盤胞の内部細胞塊がより大きいこと、及び胚盤胞の内部細胞塊が全体に対してより大きい割合を占めることを含む。本発明者らは、５μＭ〜４０μＭの範囲外の濃度のリポ酸を有する培養培地はこれらの有益な効果をもたらすことができず、胚発生に対して有害な効果を有することさえあり得ることを見出した。例えば本発明者らは、リポ酸を培養に５μＭ未満で添加しても、（ｉ）培養中の胚の胚盤胞期への進行、（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胚盤胞中の細胞数、又は（ｉｉｉ）胚盤胞の内部細胞塊に対して、たとえあるにせよ、ほとんど効果がないことを発見した。対照的に、少なくとも５μＭのリポ酸を含む培地中で培養した胚は、これらの有益な効果の全てを示す。同様に、約４０μＭを超える濃度でリポ酸を培養培地に添加すると、リポ酸の有益な効果は失われる。この濃度を超えると、４日目胚盤胞の発生低下と、細胞数減少との傾向がある。したがって、リポ酸は臨界範囲でのみ有効であるようである。
【００２８】
本発明の培養培地の使用によりもたらされる胚発生における改善は、高濃度（すなわち５μＭ〜４０μＭ）のリポ酸及び／又はその誘導体を含有する改善した培地中で培養した胚を、リポ酸又はその誘導体が対照中には存在しない点でのみ改善した培地と異なる対照培地中で培養した胚と比較することにより定量され得る。例えば、受精した哺乳動物の受精卵（例えばＣＦｌマウス受精卵等）を４日目又は５日目まで本発明の培地中で培養したとき、本発明の培養培地は、以下の（１）〜（４）の１つ又は複数において、少なくとも５％、少なくとも１０％、又はさらに少なくとも１５％の増大をもたらし得る：（１）３日目における緊密化（コンパクション）が起こる割合；（２）４日目における総胚盤胞発生の割合；（３）５日目における総胚盤胞発生の割合；及び（４）５日目における胚盤胞孵化の割合。加えて、本発明の培地は、総内部細胞数が、及び／又は該内部細胞による塊全体に対する割合の増大が、対照培地中で培養した胚盤胞の内部細胞よりも少なくとも１０％、又はさらに少なくとも１５％高い胚盤胞を提供しうる。
【００２９】
本発明の培養培地は、様々な段階の胚発生をサポートするように最適化され得る。例えばその培地は、４細胞期まで、８細胞期まで、４細胞期から８細胞期まで、胚盤胞期まで、又は４細胞期若しくは８細胞期から胚盤胞期まで、胚を培養するように最適化され得る。したがって、培養の必須原料及び非必須原料の性質及び濃度は変化することがあるが、リポ酸（又はその誘導体）を含む各々の培養培地中では、リポ酸の濃度は望ましくは５μＭ〜４０μＭである。発生細胞の逐次培養において、リポ酸又はリポ酸誘導体は、１つの培地中には存在し、他の培地中には存在しなくともよい。
【００３０】
本発明の培養培地によりもたらされる改善は、大気酸素条件（例えば約２０％）下及び低減酸素条件（例えば約５％）下で増殖及び発生した胚盤胞について達成され得る。このことは、低減酸素条件が子宮の環境をより良く模擬しより良い結果をもたらすという事実にも関わらず、ほとんどのＩＶＦプログラムが大気酸素条件下で配偶子及び胚を培養するため、重要である。Quinn, P., Harlow, G.M., 「移植前マウス胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発生における酸素の影響（The effect of oxygen on the development of preimplantation mouse embryos in vitro）」, J. Exp. Zool., Oct. 1978, 206(l):73-80.；Thompson, J.G., Simpson, A.C., Pugh, P.A., Donnelly, P. E., Tervit, H.R., 「移植前ヒツジ胚及びウシ胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発生における酸素濃度の影響（Effect of oxygen
concentration on in-vitro development of preimplantation sheep and cattle embryos）」, J. Reprod. Fertil, July 1990, 89(2):573-8。この理由は、低酸素条件下で培養するために必要とされる三重ガスインキュベータの費用のためであることが多い。したがって、本発明の培地組成物は、高い酸化的ストレス下で培養される胚を受け入れるのにより適した培養培地をもたらす。
【００３１】
発生細胞（胚等）を培養するための典型的な培養培地は、主要原料として、水と、無機塩と、１つ又は複数のエネルギー源と、１つ又は複数のアミノ酸（非必須アミノ酸及び任意に必須アミノ酸を含む）とを含む。胚培養培地における典型的なエネルギー源は、ピルビン酸塩、乳酸塩及びグルコース等の炭水化物エネルギー源を含む。適切な無機塩は、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ4、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びＫＨ2ＰＯ4を含む。非必須アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、システイン、グルタミン酸塩、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン及びチロシンを含む。必須アミノ酸は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン及びバリンを含む。リポ酸及び主要原料に加えて、培養培地は典型的には他の添加物を含む。これらは、ビオチン、パントテン酸塩、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン及びチアミン等のビタミンを含み、増殖因子、ホルモン、並びにペニシリンＧ及びストレプトマイシン硫酸塩等の抗生物質をさらに含
む。アルブミン（例えばヒト血清アルブミン又は組換えヒトアルブミン等）、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸、ＥＤＴＡ等のキレート剤、及びＨＥＰＥＳ緩衝液又はＭＯＰＳ緩衝液等の緩衝液を、培養培地に添加することもできる。培養培地中にも含まれ得る特定の様々な原料は、塩化コリン、ヒポキサンチン、イノシトール、チミジン、シアノコバラミン、システアミン、フェノールレッド及びグルタチオンを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
培養培地中における主要原料及び他の添加物の濃度は、培地を最適化する対象である胚発生段階に応じて変化し得る。培養培地中における無機塩の典型的な濃度は、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ又は約１１０ｍＭ〜約１４０ｍＭであり得る。培地中のエネルギー源の典型的な濃度は、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、又は約５ｍＭ〜約１５ｍＭであり得る。培養培地中におけるアミノ酸の総量の典型的な濃度は、約０．１ｍＭ〜約１５ｍＭ、又は約０．５ｍＭ〜約１２ｍＭ、又は約０．５ｍＭ〜約６ｍＭであり得る。アミノ酸の組成及びその濃度は、培養培地中における細胞の発生段階に応じて変化し得る。培養培地中におけるビタミンと、増殖因子と、ホルモンと、他の様々な原料とは、例えば１ｍＭ以下、０．５ｍＭ以下、又はさらに０．１ｍＭ以下の、かなり低い濃度で添加される傾向がある。
【００３３】
本発明の培養培地は、従来の胚培養培地に、５μＭ〜４０μＭのリポ酸又はリポ酸誘導体濃度となるのに十分なリポ酸又はリポ酸誘導体を添加することにより構築され得る。リポ酸誘導体は、培養中の発生細胞の生存又は発生を改善することに関して等価の、又は実質的に等価の生物学的効果を有するリポ酸から誘導された分子を含む。したがってリポ酸誘導体は、メチル化リポ酸及びＤＨＬＡを含むが、これらに限定されない。本出願の目的のために、誘導体は、本質的に等価の生理学的特性を有する他の生物学的に活性な両親媒性のジスルフィド／チオクト分子も表す。
【００３４】
リポ酸又はリポ酸誘導体は、鏡像異性形態の混合物として、又は単一の鏡像異性体として、添加され得る。後者の場合には、生物学的により活性であることから、Ｒ−鏡像異性体がより望ましいことがある。例えばリポ酸は、エネルギー源としてピルビン酸塩、グルコース及び乳酸塩が添加された、ヒト卵管液（ＨＴＦ）、ウィッティンガム（Whittingham's）Ｔ６培地及びアール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）（Irvine Scientificから入手可能）等の市販の単純培養培地に添加することができる。これらの単純培地は、卵母細胞の受精と２日目又は３日目の移植までの胚の培養とのための臨床ＩＶＦ設備（clinical IVF settings）において一般的に採用されてきた。リポ酸は、初期胚の増殖をサポートするように構成されるより複雑な胚培養培地にも添加され得る。かかる培地は、Vitrolifeから入手可能なＧ１（商標）培養培地を含む。この培地は、卵割期胚の８細胞期前後への発生をサポートするように構成される。培地は、初期胚をサポートするために、炭水化物、アミノ酸及びキレート剤を含む。Ｇ１培地の完全な構成を、表１に示す。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
代替的に、リポ酸又はリポ酸誘導体は、３日目（８細胞期）を越えて胚をサポートすることができる、市販のＩＶＦ培養培地に添加され得る。これらの培養培地は、移植に先立ち、胚を胚盤胞期に進ませるように構成されている。本発明によれば、リポ酸は、胚盤胞の発生をさらに増強するために、これらの培地に添加され得る。１つの例として、Desai et al, Human Reprod 12: 328-335 (1997)に記載されているα−変法必須培地（αＭＥＭ）が挙げられる。第２の例として、パントテン酸塩を加えたＨＥＣＭ−６培地が挙げられる。McKiernan SH and Bavister BD, Human Reprod 15: 157-164 (2000)。他の例として、Vitrolifeから入手可能なＧ２培地が挙げられる。Ｇ２は、８細胞期（３日目）前後から胚盤胞期への胚の発生をサポートするように構成される培地である。該培地（表２）は、後期胚をサポートするために、炭水化物、アミノ酸及びビタミンを含む。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
一実施形態では、８細胞期胚は、初期の増殖（すなわち８細胞期まで）をサポートするように最適化されたリポ酸添加胚培養培地から、後期の増殖（すなわち胚盤胞期まで）をサポートするように最適化された胚培養培地へ移される。リポ酸は、後者の培地には添加してもよく、又はしなくてもよい。
【００３９】
本発明の培養培地は、５μＭ〜４０μＭのリポ酸濃度となるのに十分なリポ酸又はリポ酸誘導体を、従来の配偶子（卵母細胞又は精子）培養培地又は凍結培地に添加することにより構築することもできる。以下の表３〜表５は、細胞の発生及び生存が改善するようリポ酸が含まれ得る、配偶子培養培地を示す。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
【表４】
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【００４２】
【表５】
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【実施例１】
【００４３】
実施例１−リポ酸は、培養胚の胚盤胞細胞数を増大させる
本発明に従い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウス胚の発生時に、リポ酸を含む培養培地組成物を使用した。５μＭ〜４０μＭの濃度のリポ酸が、胚盤胞細胞数及び細胞塊の有意な増大を含む、マウス胚発生に対する有意に有益な効果を有することがわかる。
【００４４】
以下の手順を実施した。リポ酸をエタノールに溶解した。１００％のＥｔＯＨでの１０
０ｍＭの希釈標準溶液（working solution）を調製し、その後適当に希釈を行い培養培地（最終濃度：１μＭ、１０μＭ及び１００μＭ）とした。最高濃度溶液の希釈に相当する（０．１％）溶媒対照（vehicle control）を全ての培養実験において使用した。受精卵を、４週齢のＣＦ１非近交系雌性マウスから回収した。卵丘細胞に包まれた受精卵をｈＣＧ後２１時間で回収し、５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを添加したＧ−ＭＯＰＳ中の１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼで剥皮した。培養を、５％Ｏ2又は２０％Ｏ2のいずれかでインキュベーションした。培養４日後に胚盤胞の発生を分析し、１処理当たり２００個の培養胚において細胞数を計数した。
【００４５】
結果を図１（２０％Ｏ2）及び図２（５％Ｏ2）に示す。データは、１研究当たり２００個の培養胚に基づく。培養中の非近交系（ＣＦ１）マウス胚に対して１μＭ〜１００μＭの濃度にわたりリポ酸を試験したところ、１０μＭに曝した場合に、得られた胚盤胞の細胞数は有意に高かった。１μＭのリポ酸濃度では、５％又は２０％の酸素濃度のいずれにおいても、細胞数の統計学的に有意な増加は観察されなかった。さらにリポ酸の有益な効果は、より高い濃度では失われた。事実として、１００μＭのリポ酸濃度では、対照培地で増殖した対応する胚よりも胚の細胞数は有意に低かった。図１及び図２についてのデータをそれぞれ表６及び表７に示し、これらの表は栄養外胚葉、内部細胞塊（ＩＣＭ）及びＩＣＭ率についての結果も示す。
【００４６】
【表６】
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【００４７】
【表７】
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【実施例２】
【００４８】
実施例２−マウス４日目胚の逐次ＩＶＦ培養におけるリポ酸
ＣＦ１マウス胚を、Ｇ１単独で、又は１０μＭのリポ酸を加えたＧ１でのいずれかで、増殖させた。４８時間後、両方の処理群由来の胚をＧ２に移した。全ての培養を、低Ｏ2においてインキュベーションした。緊密化率を評価し、胚盤胞発生率を７１時間及び７８時間において測定した。その後、胚盤胞を特異的に染色し計測した。結果を表８に示す。Ｇ１へのリポ酸の添加は、内部細胞塊の細胞数と全体に対する内部細胞塊の割合とを増大
させた。
【００４９】
【表８】
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【実施例３】
【００５０】
実施例３−マウス胚発生に対するリポ酸の有効濃度範囲
胚盤胞発生及び細胞数を増強するためのリポ酸濃度の有効範囲を、ＣＦ１マウス胚を使用して確定した。結果を表９に示す。データは、胚盤胞発生の促進と細胞数の増大とにおいてリポ酸が５μＭ〜４０μＭの間で有効であることを示す。これらの濃度を超えると、リポ酸は、対照と比較して、５日目までの胚盤胞発生の低下と、細胞数の減少とをもたらす。
【００５１】
【表９】
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【実施例４】
【００５２】
実施例４−活性酸素種に対するリポ酸の保護効果
リポ酸が抗酸化的効果を有するかどうかを決定するために、活性酸素種（ＲＯＳ）の中間体と反応する蛍光色素２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸（Ｈ２ＤＦＦＤＡ）を使用して一連の実験を行った。ＤＭＳＯ中の２００μＭのＨ２ＤＦＦＤＡを、ＧＭＯＰＳ−Ｐｌｕｓ（Vitrolifeから入手可能）に添加した。ＥｔＯＨ中にリポ酸を溶解し、培地内の最終濃度を０．１％のＥｔＯＨとした。その後、各液滴を、ＵＶ光を使用する２．５分間の曝露を連続的に４回行って光酸化し、ＲＯＳを発生させた。
【００５３】
図３は、培養培地内のＲＯＳの発生の低減におけるリポ酸の効果を示す。全ての結果は溶媒対照群（０．９５％  ＥｔＯＨ）との比較に基づいており、溶媒対照群は対照群との比較においては有意でなかった。リポ酸を含むことは、全ての濃度で、活性酸素の発生の濃度依存的な減少をもたらしたので、リポ酸が抗酸化的効果を有していることを示唆する。
【実施例５】
【００５４】
実施例５−ヒト胚発生に対するリポ酸Ｇ培地の効果
本発明に従い、リポ酸含有培養培地のヒト胚発生に対する効果を試験した。予後良好な患者について、その胚の半分は、リポ酸を含まないＧ１培養培地（すなわち対照）中で培養され、他の半分は１０μＭのリポ酸を含有するＧ１培地（すなわちリポ酸増加培地）中で培養された。
【００５５】
データは、マウスモデルで得られたデータに矛盾しない。胚は、リポ酸増加培地では、対照と比較してより急速に８細胞期及び胚盤胞期まで発生する。
【００５６】
本開示の目的のために、及び他に特に説明のない限り、「１つの（a）」又は「１つの（an）」は「１つ又は複数の」を意味する。本明細書で引用した全ての特許、出願、文献及び出版物は、それらが個々に引用により取り込まれたのと同じ程度で、その全体が本明細書に援用される。
【００５７】
本発明の原理は特定の実施形態と関連づけて記載されているが、これらの記載は一例としてのみなされており、本発明の範囲を限定することは意図されていないことははっきりと理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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