(57)【要約】  本発明は、スクリーニングの新規パラダイムを使用する癌性疾患修飾性抗体の製造方法に関する。評価項目として、癌細胞への細胞障害性を用いて抗癌抗体を分離することによって、当該方法は治療および診断目的のための抗癌抗体の製造を可能とする。当該抗体は、癌の病期判断および診断を助けるために使用されることができ、そして原発腫瘍および腫瘍転移を治療するために使用され得る。抗癌抗体は、毒素、酵素、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部位および造血系細胞と複合化され得る。
2010516630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された、単離モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１記載の単離モノクローナル抗体の抗体−リガンド。
【請求項３】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体のヒト化バージョン、または前記ヒト化抗体から産生された抗原結合断片。
【請求項４】
請求項３記載のヒト化抗体の抗体−リガンド。
【請求項５】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体のキメラバージョン、または前記キメラ抗体から産生された抗原結合断片。
【請求項６】
請求項５記載のキメラ抗体の抗体−リガンド。
【請求項７】
細胞障害性部位、酵素、放射活性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部位、および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーと結合された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の前記単離抗体、またはその抗体−リガンド。
【請求項８】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された、単離ハイブリドーマ細胞株。
【請求項９】
ヒト腫瘍から選択された組織試料中における癌性細胞の抗体誘導細胞障害を開始する方法であって；
前記ヒト腫瘍由来の組織試料を提供すること；
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体の前記ヒト化抗体、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体の前記キメラ抗体、または、標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗体−リガンドを提供すること；および、
前記単離モノクローナル抗体、前記ヒト化抗体、前記キメラ抗体またはその前記抗体−リガンドを前記組織試料と接触させること
を含み；
ここで、前記単離モノクローナル抗体、前記ヒト化抗体、前記キメラ抗体またはその前記抗体−リガンドと前記組織との結合が細胞障害性を誘導する、前記方法。
【請求項１０】
哺乳動物において抗体誘導細胞障害に対して感受性のあるヒト腫瘍を治療する方法であって、前記ヒト腫瘍が、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、または、標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗体−リガンドと特異的に結合する、抗原の少なくとも一つのエピトープを発現し、前記哺乳動物へ前記モノクローナル抗体またはその前記抗体−リガンドを前記哺乳動物の腫瘍量を減少させるために有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
前記単離モノクローナル抗体が、細胞障害性部位と複合化されている、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞障害性部位が放射性同位体である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが補体を活性化する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが、抗体依存性細胞障害を仲介する、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のヒト化バージョンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のキメラバージョンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体と同一のエピトープまたはエピトープ（複数）と特異的に結合することができるモノクローナル抗体。
【請求項１８】
哺乳動物におけるヒト腫瘍を治療する方法であって、前記ヒト腫瘍が、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、または、標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗体−リガンドと特異的に結合する、抗原の少なくとも一つのエピトープを発現し、前記哺乳動物へ、前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドを、前記哺乳動物の腫瘍量を減少させるために有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記単離モノクローナル抗体が細胞障害性部位と複合化されている、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞障害性部位が放射性同位体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが補体を活性化する、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが抗体依存性細胞障害を仲介する、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のヒト化バージョンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のキメラバージョンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物においてヒト腫瘍を治療する方法であって、前記ヒト腫瘍が、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、または、標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗体−リガンドと特異的に結合する抗原の少なくとも一つのエピトープを発現し、前記哺乳動物へ前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドを前記哺乳動物の腫瘍量を減少させるために有効な量で、少なくとも一つの化学療法剤と共に投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
前記単離モノクローナル抗体が細胞障害性部位と複合化されている、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞障害性部位が放射性同位体である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが補体を活性化する、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが、抗体依存性細胞障害を仲介する、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のヒト化バージョンである、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のキメラバージョンである、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
ＩＤＡＣ受入番号０５１２０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ９０Ａ５６．１１によって産生される単離モノクローナル抗体、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体の前記ヒト化抗体、または受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体の前記キメラ抗体によって特異的に結合される、ヒト腫瘍から選択された組織試料中における癌性細胞の存在を決定するための結合アッセイであって：
前記ヒト腫瘍由来の組織試料を提供すること；
ＩＤＡＣ受入番号０５１２０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ９０Ａ５６．１１によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されるものと同一のエピトープまたはエピトープ（複数）を認識する、少なくとも一つの前記単離モノクローナル抗体、前記ヒト化抗体、前記キメラ抗体またはその抗体−リガンドを提供すること；
少なくとも一つの前記提供された抗体またはその抗体−リガンドを、前記組織試料へ接触させること；および
前記の少なくとも一つの提供された抗体またはその抗体−リガンドと前記組織試料との結合を決定すること
を含み；
それにより、前記組織試料中の前記癌性細胞の存在が示される、前記結合アッセイ。
【請求項３３】
ヒト腫瘍量の減少のためのモノクローナル抗体の使用であって、前記ヒト腫瘍が、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、または標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗体−リガンドと特異的に結合する抗原の少なくとも一つのエピトープを発現し、前記哺乳動物へ前記モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドを前記哺乳動物の腫瘍量を減少させるために有効な量で投与することを含む、前記使用。
【請求項３４】
前記単離モノクローナル抗体が細胞障害性部位と複合化されている、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞障害性部位が放射性同位体である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが補体を活性化する、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが、抗体依存性細胞障害を仲介する、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のヒト化バージョンである、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のキメラバージョンである、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
ヒト腫瘍量の減少のためのモノクローナル抗体の使用であって、前記ヒト腫瘍が、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、または標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗体−リガンドと特異的に結合する抗原の少なくとも一つのエピトープを発現し、前記哺乳動物へ前記モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドを；前記哺乳動物のヒト腫瘍量を減少させるために有効な量で、少なくも一つの化学療法剤と共に投与することを含む、前記使用。
【請求項４１】
前記単離モノクローナル抗体が細胞障害性部位と複合化されている、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞障害性部位が放射性同位体である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが補体を活性化する、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが、抗体依存性細胞障害を仲介する、請求項４０記載の方法。
【請求項４５】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のヒト化バージョンである、請求項４０記載の方法。
【請求項４６】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のキメラバージョンである、請求項４０記載の方法。
【請求項４７】
請求項１、２、３、６、７、８または１７のいずれか一項に記載の抗体または抗体−リガンド；
前記抗体またはその抗原結合断片と、細胞障害性部位、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部位および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーとの複合体；ならびに
必要量の薬学的に許容される担体；
を組み合わせて含む、ヒト癌性腫瘍を治療するために有効な組成物であって、
前記ヒト癌性腫瘍を治療するために有効である、前記組成物。
【請求項４８】
ヒト癌性腫瘍の存在を検出するためのアッセイキットであって、前記ヒト癌性腫瘍が受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、または標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗体−リガンドと特異的に結合する抗原の少なくとも一つのエピトープを発現し、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、またはその抗体−リガンド、および前記単離モノクローナル抗体またはその抗体−リガンドが、その存在が特定のカットオフレベルにおいて前記ヒト癌性腫瘍の前記存在を診断するポリペプチドと結合されているか否かを検出するための手段を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、癌性疾患修飾性抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離および製造に関し、ならびに治療および診断方法における、これらのＣＤＭＡＢ単独での使用、または一もしくはそれ以上のＣＤＭＡＢ／化学療法剤との併用での使用に関する。本発明は、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイにさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌治療法としてのモノクローナル抗体：癌を罹患している個人の各々は、唯一の存在であり、その人の身元と同様、他人の癌とは異なる癌を有している。これにもかかわらず、現行の治療法は、同じ段階で、同じ方法で、同じ種類の癌を罹患している全ての患者を治療する。これらの患者の少なくとも３０％は、一次治療を失敗し、その結果治療をさらに行い、そして治療の失敗、転移および最終的に死亡の可能性の増加につながる。治療法における優れた取り組みは、特定の個人のための、治療法のカスタマイズ化であろう。カスタマイズ化に適した、現在において唯一の治療法が外科手術である。化学療法および放射線治療は、患者に合わせて行なわれることができず、そして外科手術自体は、大部分の場合において治癒をもたらすほど十分ではない。
【０００３】
モノクローナル抗体の出現で、抗体それぞれが単一のエピトープを対象とすることができるため、カスタマイズ化された治療方法を開発する可能性がより現実的となった。さらに、特定の個人の腫瘍を独自に特徴付けるエピトープの集団を対象とする、抗体の併用を実現することが可能となった。
【０００４】
癌性細胞と正常細胞との間における著しい違いは、癌性細胞が、形質転換細胞に特異的な抗原を含むことであると認識されたので、科学界は長い間、モノクローナル抗体が、これらの癌抗原に特異的に結合することによって、形質転換細胞を特異的に標的とするように設計され得ると考え；その後モノクローナル抗体は、癌細胞を排除するための「魔法の弾丸」として働き得ると信じられるようになった。しかし現在、単一のモノクローナル抗体は、全ての癌の事例において役割を果たすことができず、そしてモノクローナル抗体は、標的化癌治療法の一種として展開され得ることが広く認識されている。開示された本発明の教示に従って単離されたモノクローナル抗体は、例えば、腫瘍量を減少させることによって、患者に利益のある方法で、癌性疾患の進行を変更することが示されており、そして本明細書において、癌性疾患修飾性抗体（ＣＤＭＡＢ）または「抗癌」抗体と様々に呼ばれるだろう。
【０００５】
現時点において、癌患者は通常、治療にほとんど選択肢がない。癌治療に対する厳格に管理された手法によって、全生存率および罹患率の改善がなされた。しかし、特定の個人においては、改善されたこれらの統計は、彼ら個人の症状改善とは必ずしも相関がない。
【０００６】
したがって、施術者が、各々の腫瘍を同一の集団中における他の患者とは独立して治療することができる方法論が提案された場合、これはちょうど一個人に合わせた独自の治療手法を可能とするだろう。かかる治療法は、理想的に、治癒率を増加させ、そしてより良い結果を生み、それにより長年にわたる必要性を満足するだろう。
【０００７】
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用は、ヒトの癌の治療において大した成果もなく使用された。リンパ腫および白血病は、ヒト血漿を用いて治療されたが、長期にわたる寛解または応答はほとんどなかった。さらに、再現性が欠如しており、そして化学療法と比較して追加の利益がなかった。乳癌、黒色腫および腎細胞癌のような固形腫瘍はまた、ヒトの血液、チンパンジーの血清、ヒト血漿およびウマ血清を用いて治療されたが、予期できない、および効果のない結果となった。
【０００８】
固形腫瘍に対する、モノクローナル抗体の多くの臨床試験が行なわれた。１９８０年代において、特定の抗原に対する、または組織選択性に基づいた抗体を使用して、少なくとも４７人の患者からただ一人の応答者が生じた、ヒト乳癌に関する少なくとも４件の臨床試験があった。１９９８年になってはじめて、シスプラチンとの併用で、ヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））を使用した、成功した臨床試験があった。この試験において３７人の患者は応答を評価され、そのうち約４分の１が部分的な応答率を有し、そしてさらに４分の１が軽微な、または不変の疾患進行を有した。応答者の間における進行の平均期間は８．４ヶ月であり、平均応答継続期間は５．３ヶ月であった。
【０００９】
ハーセプチン（登録商標）は、タキソール（登録商標）との併用で、第一選択の使用のために１９９８年に承認された。臨床試験の結果は、タキソール（登録商標）単剤による治療を受けた患者と比較して（３．０ヶ月）、タキソール（登録商標）との併用で抗体治療を受けた患者における平均疾患進行期間の増加を示した（６．９ヶ月）。平均生存期間もまた；ヘパリン（登録商標）とタキソール（登録商標）との併用療法の医療群対タキソール（登録商標）単剤での治療の医療群が、２２ヶ月対１８ヶ月と、かすかに増加した。さらに、タキソール（登録商標）単剤のものと比較して、抗体とタキソール（登録商標）との併用群において、完全応答者の数（８パーセント対２パーセント）および部分的応答者の数（３４パーセント対１５パーセント）の両方において増加があった。しかし、ハーセプチン（登録商標）およびタキソール（登録商標）を用いた治療は、タキソール（登録商標）単剤での治療と比較して、心毒性発生率がより高くなった（それぞれ１３パーセント対１パーセント）。また、ハーセプチン（登録商標）治療は、現在において機能が知られていないか、または生物学的に重要なリガンドが知られていない受容体であるヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）を、（免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を通じて決定されるように）過剰に発現している患者にのみ；そして転移性の乳癌を有する患者の約２５％にのみ有効であった。したがって、乳癌患者にとって大きな、満たされていない必要性が未だにある。ハーセプチン（登録商標）治療から利益を受けることができる者でさえ、まだ化学療法を必要としており、そして結果的に、少なくともある程度この種の治療の副作用に対応しなければならないだろう。
【００１０】
結腸直腸癌を調査する臨床試験は、糖タンパク質標的および糖脂質標的の両方に対する抗体に関連する。腺癌に幾らか特異性を有する１７−１Ａのような抗体に対して、第２相臨床試験が進められ、６０人以上の患者中１患者にのみ部分的な応答があった。他の試験において、１７−１Ａの使用は、シクロホスファミドをさらに使用する方法において、５２人の患者中１人のみが完全応答を、そして２人が軽微な応答を示した。現在までに、１７−１Ａの第３相臨床試験は、病期III 期の結腸癌に対する補助的治療法として、有効性の改善を実証しなかった。画像化のために最初に承認されたヒト化マウスモノクローナル抗体の使用はまた、腫瘍の退縮を実現しなかった。
【００１１】
モノクローナル抗体を使用した結腸癌の臨床試験において、幾つかの良好な結果があったのは、ごく最近のことである。２００４年に、アービタックス（登録商標）は、イリノテカンを基盤とした化学療法が無効であって、ＥＧＦＲを発現している転移性結腸直腸癌の患者に対する第二選択の治療法として承認された。二群第II相臨床試験および単群試験の両方の結果は、イリノテカンと併用したアービタックス（登録商標）は、それぞれ２３パーセントおよび１５パーセントの応答率を有し、それぞれ４．１ヶ月および６．５ヶ月の疾患進行の平均期間を有した。同じ二群第II相臨床試験および別の単群試験の結果は、アービタックス（登録商標）単剤での治療が、それぞれ１１パーセントおよび９パーセントの応答率となり、それぞれ１．５ヶ月および４．２ヶ月の疾患進行の平均期間となった。
【００１２】
結果として、スイスおよび米国の両方において、イリノテカンとの併用によるアービタックス（登録商標）の治療が、そして米国においてアービタックス（登録商標）単剤での治療が、第一選択のイリノテカン治療に失敗した結腸癌患者の第二選択の治療法として承認された。したがってハーセプチン（登録商標）のように、スイスでの治療は、モノクローナル抗体と化学療法との併用としてのみ承認されている。さらに、スイスおよび米国の両方における治療は、第二選択の治療法としての患者に対してのみ承認されている。同様に、２００４年にアバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ）（登録商標）が、転移性結腸直腸癌の第一選択の治療法として、５−フルオロウラシルを基盤とした静脈内化学療法との併用での使用が承認された。第III 相臨床試験結果は、５−フルオロウラシルを単剤で用いて治療された患者と比較して、５−フルオロウラシルとの併用で、アバスチン（登録商標）を用いて治療された患者の平均生存期間の延長を実証した（それぞれ１６ヶ月対２０ヶ月）。しかし、ハーセプチン（登録商標）およびアービテックス（登録商標）と同様に、モノクローナル抗体と化学療法の併用としてのみ承認されている。
【００１３】
肺、脳、卵巣、膵臓、前立腺および胃癌に対してはまた、思わしくない結果が続いている。非小細胞肺癌に対する最も期待のできる最近の結果は、化学療法剤であるタキソテール（登録商標）との併用で、殺細胞性薬剤であるドキソルビシンと複合化されたモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗シアリル−ＬｅＸ）を含む治療である、第II相臨床試験からもたらされた。タキソテール（登録商標）は、肺癌の第二選択の治療法としてＦＤＡに唯一承認された化学療法である。初期データは、タキソテール単剤と比較して改善された全生存率を示す。当該試験のために募集された６２人の患者のうち、３分の２はタキソテール（登録商標）との併用でＳＧＮ−１５を投与され、一方残りの３分の１はタキソテール（登録商標）を単剤で投与された。タキソテール（登録商標）を単剤で投与された患者において平均全生存率が５．９ヶ月であったことと比較して、タキソテール（登録商標）との併用による、ＳＧＮ−１５を投与された患者において平均全生存率は７．３ヶ月であった。１年および１８ヶ月における全生存率は、タキソテールを単剤で投与された患者において、それぞれ２４パーセントおよび８パーセントであったのと比較して、タキソテール（登録商標）との併用による、ＳＮＧ−１５を投与された患者において、それぞれ２９パーセントおよび１８パーセントであった。さらなる臨床試験が計画されている。
【００１４】
前臨床において、黒色腫に対するモノクローナル抗体の使用において、幾つかの限定的な成功があった。これらの抗体は、ほとんど臨床試験に到達せず、そして今のところ承認されておらず、また第III 相臨床試験において好ましい結果を実証されなかった。
【００１５】
疾患を治療する新規薬剤の発見は、疾患病因に寄与し得る３０，０００の既知の遺伝子産物から、関連のある標的の同定ができないために妨げられている。癌研究において、潜在的薬剤標的は、それらが癌細胞中で過剰に発現されているという事実によって、通常単純に選択される。したがって同定されるべき標的は、その後多くの化合物との相互作用でスクリーニングされる。潜在的な抗体治療の場合において、これらの候補化合物は通常、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって定められた基本原則（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）に従って、モノクローナル抗体産生の伝統的手法から得られる。脾臓細胞が、抗原（例えば細胞全体、細胞分画、精製抗原）に免疫を持つマウスから回収され、そして不死化ハイブリドーマの相手と融合される。得られたハイブリドーマは、スクリーニングされ、そして最も強く標的へ結合する抗体の分泌物が選択される。ハーセプチンおよびリツキシマブを含む、癌細胞に対する多くの治療的および診断的抗体がこれらの方法を使用して産生され、そしてそれらの親和性に基づいて選択された。この方法における欠点は、２つある。第一に、治療用または診断用抗体の結合に好適な標的の選択が、組織特異的な発癌性過程に関する知識不足、および過剰発現による選択のような、これらの標的が同定される単純な方法によって制限される。第二に、最も強い親和性で受容体と結合する薬剤分子は通常、シグナルを惹起または阻害する可能性が最も高いという仮定は、必ずしも事実ではないかもしれない。
【００１６】
乳癌および結腸癌の治療における幾らかの進展にもかかわらず、単剤、または併用治療のいずれかにおいて、有効な抗体治療の同定および発展は、全ての種の癌において不十分である。
【００１７】
先行特許：
米国特許第５，７５０，１０２号明細書は、患者の腫瘍由来の細胞が、患者由来の細胞または組織からクローン化されてもよいＭＨＣ遺伝子を用いて形質移入される方法を開示している。これらの形質移入された細胞はその後、患者に予防接種するために使用される。
【００１８】
米国特許第４，８６１，５８１号明細書は、哺乳動物の腫瘍細胞および正常細胞の細胞内成分に特異的であるが、外部成分には特異的ではないモノクローナル抗体を得るステップ、モノクローナル抗体を標識化するステップ、当該標識化された抗体が、腫瘍細胞を破壊する治療を受けた哺乳動物の組織と接触するステップ、ならびに変性した腫瘍細胞の細胞内成分への、標識化された抗体の結合を測定することによって、治療の有効性を決定するステップを含む方法を開示している。ヒト細胞内抗原に対する抗体を調製するとき、悪性細胞がかかる抗原の簡便な供給源であることを特許権者は認識している。
【００１９】
米国特許第５，１７１，６６５号明細書は、新規抗体およびその製造方法を提供する。特に、当該特許は、例えば結腸腫瘍および肺腫瘍のような、ヒト腫瘍に関連するタンパク質抗原と強く結合し、一方正常細胞とは、非常により低い程度で結合する特性を有するモノクローナル抗体の形態を教示する。
【００２０】
米国特許第５，４８４，５９６号明細書は、ヒト癌患者から外科的に腫瘍組織を除去すること、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処置すること、生存できるが、腫瘍形成をしないように、腫瘍細胞に放射線を照射すること、および、原発腫瘍の再発を阻害することができ、一方で同時に転移を阻害することのできる、患者のためのワクチンを調製するために、これらの細胞を使用することを含む、癌治療の方法を提供する。当該特許は、腫瘍細胞の表面の抗原に対して反応する、モノクローナル抗体の開発を教示する。第４列第４５行以下に記載されているように、特許権者は、ヒト腫瘍において活性のある特定の免疫療法を発現するモノクローナル抗体の開発において、自然発症腫瘍細胞を利用する。
【００２１】
米国特許第５，６９３，７６３号明細書は、ヒト細胞腫に特有であり、そして源泉である上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示する。
【００２２】
米国特許第５，７８３，１８６号明細書は、Ｈｅｒ２発現細胞におけるアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２抗体、当該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、抗体および前記抗体を含む医薬組成物を使用する癌の治療方法について記載されている。
【００２３】
米国特許第５，８４９，８７６号明細書は、腫瘍および非腫瘍組織源から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体の産生のための、新規ハイブリドーマ細胞株について記載してある。
【００２４】
米国特許第５，８６９，２６８号明細書は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を製造する方法、モノクローナル抗体を産生する方法、および当該方法により産生されたモノクローナル抗体について記載されている。当該特許は、癌の診断および治療に有用である抗ＨＤヒトモノクローナル抗体の産生について特に記載されている。
【００２５】
米国特許第５，８６９，０４５号明細書は、ヒト細胞腫細胞と反応する抗体、抗体断片、抗体複合体および一本鎖免疫毒素に関する。これらの抗体分子が、ヒト細胞腫の表面上に存在する細胞膜抗原と反応するという観点において、そしてさらに、当該抗体が細胞腫細胞中に取り込まれ、その後結合する能力を有し、その結果それらを抗体−薬剤および抗体−毒素複合体を形成するために特に有用なものとするという観点において、これらの抗体が機能する機構は、二通り存在する。それらの未修飾の形態において、当該抗体はまた、特定の濃度において細胞障害性作用を顕在化させる。
【００２６】
米国特許第５，７８０，０３３号明細書は、腫瘍治療および予防のための自己抗体の使用を開示している。しかしこの抗体は、高齢の哺乳動物由来の抗核自己抗体である。この場合において、当該自己抗体は、免疫系において見られる天然型抗体の一種であると考えられる。当該自己抗体が「高齢の哺乳動物」由来であるため、当該自己抗体が実際に治療されるべき患者由来である必要はない。さらに当該特許は、高齢の哺乳動物由来の天然型およびモノクローナル抗核自己抗体、ならびにモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株について開示している。
【発明の概要】
【００２７】
発明の概要
本願は、癌性疾患修飾性抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するために、米国特許第６，１８０，３５７号明細書に教示されている、患者特異的抗癌抗体を産生するための方法論を利用する。これらの抗体は、一の腫瘍に対して特異的に製造されることができ、したがって癌治療のカスタマイズ化を可能とする。本願の内容中において、殺細胞特性（細胞障害性）または細胞増殖阻害特性（細胞増殖抑制性）のいずれかを有する抗癌抗体は、以後、細胞障害性がある、と言われるだろう。これらの抗体は、癌の病期分類および診断を助けるために使用されることができ、そして腫瘍の転移を治療するために使用され得る。これらの抗体はまた、予防的治療の目的で、癌の防止のために使用され得る。伝統的な創薬規範に従って産生された抗体とは異なり、本方法において産生された抗体は、悪性組織の発達および／または残存に不可欠であることがこれまでに示されていない分子および経路を標的としてもよい。さらに、これらの抗体の結合親和性は、より強い親和性相互作用の影響を受けないかもしれない、細胞障害性事象を引き起こすための要件を満たす。同様に、例えば放射性核種のような標準的な化学療法モダリティを本発明のＣＤＭＡＢと複合化し、それにより前記化学療法剤の使用を集中させることは、本発明の範囲内である。ＣＤＭＡＢはまた、毒素、細胞障害性部位、例えばビオチン複合化酵素のような酵素、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部位または造血系細胞と複合化され、それにより抗体複合体を形成することができる。ＣＤＭＡＢは単剤で、または一またはそれ以上のＣＤＭＡＢ／化学療法剤との併用で使用され得る。
【００２８】
個別的な抗癌治療の可能性は、患者を治療する方法に変化をもたらすだろう。可能性のある臨床のシナリオは、腫瘍試料が診察時に得られ、そして保存されることである。この試料から、腫瘍は、以前から存在する癌性疾患修飾性抗体の一群から分類され得る。患者は通常、病期分類されるが、利用可能な抗体は患者をさらに病期分類するときに使用され得る。当該患者は既に存在する抗体を用いて速やかに治療されることができ、そして当該腫瘍に特異的な抗体の一団は、本明細書に記載されている方法の使用、または本明細書において開示されているスクリーニング法と併せたファージディスプレイライブラリーの使用を通じてのいずれかで産生され得る。他の腫瘍が、治療されている腫瘍と同一の幾つかエピトープを有する可能性があるため、産生された全ての抗体は、抗癌抗体のライブラリーに加えられる。本方法に従って製造された抗体は、これらの抗体と結合する癌を有する多くの患者において、癌性疾患を治療するために有用であるかもしれない。
【００２９】
抗癌抗体に加えて、患者は、多様な治療計画の一部として現在推奨される治療を受けることを選択することができる。本方法論によって単離された抗体は、非癌性細胞に対して比較的無毒であるという事実により、単剤または従来の治療法を併用するかのいずれかで使用される、高用量での抗体の組み合わせが可能となる。高い治療指数によって、治療抵抗性細胞の発生可能性を減少させるはずである、短期間尺度における再治療が同様に可能となるだろう。
【００３０】
患者が初期の治療手順において抵抗性があるか、または転移が進行しているのならば、当該腫瘍に特異的な抗体を産生する方法は、再治療のために繰り返され得る。さらに、抗癌抗体は、患者から得られる赤血球と複合化され、そして転移の治療のために再注入され得る。転移性癌に対する有効な治療法はあまりなく、そして転移は通常、死に至る不良転帰の前兆である。しかし、転移性癌は通常十分に血管新生化され、そして赤血球による抗癌抗体の送達は、腫瘍部位に抗体を集中させる効果を有し得る。転移に十分先立って、大部分の癌細胞は、それらの生存のために宿主の血液供給に依存しており、そして赤血球と複合化された抗癌抗体は、上皮内腫瘍に対して同様に有効であり得る。または、当該抗体は、他の造血系細胞、例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞などと複合化されてもよい。
【００３１】
５つの抗体の分類があり、そしてそれぞれは、その重鎖によって与えられる機能と関連している。一般的に、裸の抗体による癌細胞の死滅化は、抗体依存性細胞障害、または補体依存性細胞障害のいずれかを通じて仲介されると考えられる。例えば、マウスのＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は、ヒト補体を活性化することができる。補体系のＣ−１成分と結合し、それにより、腫瘍の溶解につながり得る補体活性化の古典経路を活性化する。ヒト抗体にとって、最も有効な補体活性化抗体は、一般的にＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球および特定のリンパ球による細胞の死滅へと導くだろう、Ｆｃ受容体を有する細胞障害性細胞を補充するために有効である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプの両方のヒト抗体は、ＡＤＣＣを仲介する。
【００３２】
Ｆｃ領域を通じて仲介された細胞障害性は、エフェクター細胞およびそれらに対応する受容体の存在を、または例えばＮＫ細胞、補体およびＴ細胞のようなタンパク質のそれぞれの存在を必要とする。これらのエフェクター機構の非存在下において、抗体のＦｃ部位は不活性である。抗体のＦｃ部位は、インビボにおいて抗体の薬物動態に影響を与える特性を付与するかもしれないが、インビトロにおいてこれは効力がない。
【００３３】
我々が抗体を試験する細胞障害性アッセイは、既存のエフェクター機構を全く有しておらず、そしてインビトロで行なわれる。これらのアッセイは、エフェクター細胞（ＮＫ、マクロファージまたはＴ細胞）あるいは既存の補体を有していない。これらのアッセイは共に添加されるものによって完全に規定されるので、それぞれの成分は特徴付けられ得る。本明細書中で使用されるアッセイは、標的細胞、培地および血清のみを含む。標的細胞は、それらは癌細胞または線維芽細胞であるので、エフェクター機能を有さない。エフェクター機能特性を有する外因性細胞なしで、この機能を有する細胞成分はない。培地は、補体または任意の細胞を含まない。標的細胞の増殖を補助するために使用される血清は、供給業者によって開示されているような補体活性を有さない。さらに、我々自身の研究室において、我々は、使用される血清中の補体活性の欠如を確認した。したがって、我々の研究は、抗体の効果が、Ｆａｂを通じて仲介される抗原への結合の効果に完全によるものであるという事実を証明する。標的細胞は、Ｆｃに対する受容体を有さないため、効果的に、それらはＦａｂのみを認識し、および相互作用している。ハイブリドーマは、標的細胞ともに試験された完全免疫グロブリンを分泌しているが、細胞と相互作用する免疫グロブリンの唯一の部分はＦａｂであり、そしてそれは抗原結合断片として作用する。
【００３４】
本願においてクレームされた抗体および抗原結合断片に関して、本願は、表１におけるデータによって証明されるように細胞障害性を実証した。上で指摘されたように、そして本明細書において物的証拠により確認されたように、この効果は、腫瘍細胞へのＦａｂによる結合に完全によるものであった。
【００３５】
Ｆｃによって補充されるエフェクター機能とは無関係に、標的抗原への抗体の直接的結合による細胞障害性を仲介する抗体の能力について、十分な証拠が存在する。このための最も良い証拠は、（形式的に細胞または補体の機構を排除するために）追加の細胞または補体を有さないインビトロの実験である。これらの種の実験は、完全免疫グロブリンを用いて、またはＦ（ａｂ）’２断片のような抗原結合断片を用いて行なわれた。これらの種の実験において、抗体または抗原結合断片は、いずれも米国ＦＤＡによって、癌治療における市販のために承認されている抗体である抗Ｈｅｒ２および抗ＥＧＦＲ抗体の場合のように、直接的に標的細胞のアポトーシスを誘発し得る。
【００３６】
抗体が仲介する癌死滅の、別の可能な機構は、細胞膜およびそれと関連のある糖タンパク質または糖脂質中の、様々な化学結合の加水分解を触媒するように機能する抗体、いわゆる触媒抗体の使用を通じてであるかもしれない。
【００３７】
抗体により仲介される癌細胞死滅の、３つのさらなる機構がある。第一は、癌細胞上に存在する推定抗原に対して免疫応答を引き起こすために、ワクチンとして身体へ導入される抗体の使用である。第二は、成長受容体を標的として、そしてそれらの機能を阻害する抗体の使用か、またはその機能が有効に失われるように、その受容体を下方制御する抗体の使用である。第三は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１またはＴＲＡＩＬ  Ｒ２のような細胞死受容体との連結反応、あるいはアルファＶベータ３ならびにそれと同様のもののようなインテグリン分子との連結反応のような、直接細胞死へと導くかもしれない細胞表面部位の直接的連結反応における、かかる抗体の効果である。
【００３８】
抗癌剤の臨床的有用性は、患者が許容することのできるリスク因子下での薬剤の利益に基づくものである。癌治療において、生存は一般的に利益の後に最も追求されたが、しかし、延命に加えて十分に認識された多くの他の利益がある。治療が生存に不利な影響を与えないこれらの他の利益は、症状の緩和、有害事象に対する防御、再発期間または無病生存期間の延長、および進行期間の延長を含む。これらの判断基準は一般的に認められており、そして米国食品医薬品局（Ｆ．Ｄ．Ａ）のような取締機関は、これらの利益を生む薬剤を承認する（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ  ４２：１３７−１４３  ２００２）。これらの判断基準に加えて、これらの種の利益を予感させる、他の評価項目があることは十分に認識されている。部分的に、米国Ｆ．Ｄ．Ａ．によって許可されている加速された承認手順は、患者の利益を予想し得る代用があると認めている。２００３年末現在、この手順の下で１６個の薬剤が承認され、そしてこれらのうち４つは完全に承認されており、すなわち追跡調査は、代用評価項目によって予想されたように、直接的な患者の利益を実証した。固形腫瘍における薬剤の効果を決定するための一つの重要な評価項目は、治療に対する応答を測定することによる、腫瘍量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９２（３）：２０５−２１６  ２０００）。かかる評価における臨床的基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、癌における国際的な専門家の集団である、固形腫瘍ワーキンググループにおける応答評価基準によって公表された。ＲＥＣＩＳＴ基準に従った客観的反応によって示されるように、腫瘍量において実証された効果を有する薬剤は、好適な対照群と比較して、最終的に直接的な患者の利益を生む。前臨床における設定において、腫瘍量は一般的に、評価および実証することがより容易である。前臨床試験が臨床の設定に変換され得るという観点において、前臨床モデルにおける延長された生存期間を実現する薬剤は、最も良い、予想された臨床的有用性を有する。臨床的治療に対して肯定的な応答を生じることに似て、前臨床における設定において腫瘍量を減少させる薬剤はまた、疾患に対して著しい、直接的な影響を有する。生存期間の延長は、抗癌剤治療による臨床成績の後に最も探求されるが、臨床的有用性を有する他の利益があり、そして、疾患の進行の遅延、延長された生存期間、またはそれらの両方と関連があるかもしれない腫瘍量の減少はまた、直接的な利益につながり、そして臨床的な影響を有するかもしれない（Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．発展的な治療学：標的とされた化合物の臨床試験設計の成功および失敗；ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ，第３９回  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００３，２０９−２１９ページ）。
【００３９】
本発明は、細胞障害性アッセイおよびヒト癌の動物モデルにおけるその効果によって同定された、ＡＲ９０Ａ５６．１１の開発および使用について説明する。本発明は、標的分子上に存在する一つエピトープまたはエピトープ（複数）に特異的に結合し、そして裸抗体として、インビトロにおいて悪性腫瘍細胞に対して細胞障害性特性を有するが、正常細胞に対しては有さない、ならびに裸抗体として腫瘍成長の阻害を直接的に仲介する試薬について記載する。さらなる利点は、腫瘍の成長阻害および癌治療の他の肯定的な評価項目を達成するために、同族抗原のマーカーを発現している標的腫瘍に対して、このような抗癌抗体を使用することである。
【００４０】
全てにおいて、本発明は、投与された時に、哺乳動物中において抗原を発現する癌の腫瘍量を減少させることができる治療剤の標的として、ＡＲ９０Ａ５６．１１抗原の使用を教示する。本発明はまた、哺乳動物中において抗原を発現する癌の腫瘍量を減少させるために、それらを標的とするＣＤＭＡＢ（ＡＲ９０Ａ５６．１１）およびそれらの誘導体、ならびにその抗原結合断片の使用を教示し、そしてそのリガンドを誘導する細胞障害性を教示する。さらに、本発明はまた、ＡＲ９０Ａ５６．１１抗原を発現する腫瘍を有する哺乳動物の診断、治療の予測および予後にとって有用であり得る、癌性細胞におけるＡＲ９０Ａ５６．１１抗原検出法の使用を教示する。
【００４１】
したがって、ハイブリドーマ細胞株、ならびに前記ハイブリドーマ細胞株がコードしている、対応する単離モノクローナル抗体およびその抗原結合断片を単離するために、特定の個人由来の癌性細胞、または一もしくはそれ以上の特定の癌細胞株に対する癌性疾患修飾性抗体（ＣＤＭＡＢ）を産生する方法を利用することが本発明の目的であり、ここでＣＤＭＡＢは癌細胞に対して細胞障害性を有すると同時に、非癌性細胞に対しては比較的無毒である。
【００４２】
癌性疾患修飾性抗体、リガンドおよびその抗原結合断片を教示することが、本発明の追加の目的である。
【００４３】
細胞障害性が抗体依存性細胞障害を通じて仲介される、癌性疾患修飾性抗体を製造することが、本発明のさらなる目的である。
【００４４】
細胞障害性が補体依存性細胞障害性を通じて仲介される、癌性疾患修飾性抗体を製造することが、本発明のさらに追加の目的である。
【００４５】
細胞障害性が細胞の化学結合の加水分解を触媒することができる機能である、癌性疾患修飾性抗体を製造することが、本発明のもう一つのさらなる目的である。
【００４６】
本発明のもう一つのさらなる目的は、癌の診断、予後および監視のための結合アッセイにおいて有用である、癌性疾患修飾性抗体を製造することである。
【００４７】
本発明の他の目的および利点は、図および実施例により、本発明の特定の実施形態を示す以下の記載から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｓ８８８．Ｌｕに対するハイブリドーマ上清のパ−センテージ細胞障害性、および結合レベルの対比である。
【図２】図２は、癌および正常細胞株へのＡＲ９０Ａ５６．１１の結合を示す。当該データは、平均蛍光強度を、アイソタイプ対照を越える倍増加として示すために表にされている。
【図３】図３は、ＡＲ９０Ａ５６．１１ならびに幾つかの癌および非癌細胞株に対する抗ＥＧＦＲ抗体の典型的なＦＡＣＳヒストグラムを含む。
【図４】図４は、予防的ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデル中の腫瘍成長に対するＡＲ９０Ａ５６．１１の効果を示す。縦の点線は、抗体が投与された期間を示す。データ点は、平均±ＳＥＭを示す。
【図５】図５は、予防的ＢｘＰＣ−３膵臓癌モデル中の体重に対するＡＲ９０Ａ５６．１１の効果を示す。データ点は、平均±ＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
発明の詳細な説明
一般的に、以下の語または句は、要約、明細書本文、実施例および特許請求の範囲において使用される時、指示された定義を有する。
【００５０】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして例えば、（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体、脱免疫化されたマウス、キメラ、またはヒト化抗体を含む）一本鎖モノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、免疫複合体および抗体断片を特に含む（以下参照）。
【００５１】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」とは、潜在的に同種の抗体群から得られる抗体、すなわち、少量存在するかもしれない天然で産生され得る変異体を除いて、当該個体群が同一であることを含む、単一の抗体のことである。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは反対に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体によって汚染されずに合成されるかもしれないという点において有利である。修飾語「モノクローナル」は、潜在的に同種の抗体群から得られるような抗体の特性を示し、そして幾つかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ他，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載された、ハイブリドーマ（マウスまたはヒト）法によって製造されてもよく、または組み換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）によって製造されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ他，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、およびＭａｒｋｓ他，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を使用する、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００５２】
「抗体断片」は、好ましくは抗原結合領域またはその可変領域を含む、無傷抗体の一部を含む。抗体断片の例は、完全長未満の抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；リニアー抗体；一本鎖抗体分子；一本鎖抗体、単一領域抗体分子、融合タンパク質、組み換えタンパク質ならびに抗体断片（複数）から形成される多特異的抗体を含む。
【００５３】
「無傷」抗体は、抗体結合可変領域ならびに軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域ＣＨ1、ＣＨ2、およびＣＨ3を含むものである。定常領域は、天然型配列定常領域（例えば、ヒト天然型配列定常領域）またはそのアミノ酸配列変形体であってもよい。好ましくは、無傷抗体は一またはそれ以上のエフェクター機能を有する。
【００５４】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、無傷抗体は異なる「クラス」として割り当てられ得る。無傷抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、そしてこれらの幾つかは「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分けられても良い。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構造は、周知である。
【００５５】
抗体「エフェクター機能」とは、生物学的活性が抗体のＦｃ領域（天然型配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変形体Ｆｃ領域）に起因するものである。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞仲介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などを含む。
【００５６】
「抗体依存性細胞仲介性細胞障害」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞障害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞上における結合抗体を認識し、そして続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞仲介性反応のことである。ＡＤＣＣを仲介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲIII のみを発現するが、一方で単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIII を発現する。造血系細胞中におけるＦｃＲの発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３において要約される。興味のある分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第 ５，５００，３６２号または５，８２１，３３７号明細書に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが行なわれてもよい。かかるアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代わりに、または追加的に、興味のある分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えばＣｌｙｎｅｓ他  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価されてもよい。
【００５７】
「エフェクター細胞」は、一またはそれ以上のＦｃＲを発現する白血球であり、そしてエフェクター機能を行なう。好ましくは、当該細胞は、ＦｃγＲIII を少なくとも発現し、そしてＡＤＣＣエフェクター機能を行なう。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞および好中球を含み；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然源、例えば本明細書において記載されている血液またはＰＢＭＣから単離されてもよい。
【００５８】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を記載するために使用される。好ましいＦｃＲは、天然型配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体と結合するもの（ガンマ受容体）であり、そしてＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII、およびＦｃγＲIII サブクラスの受容体を含み、そしてこれらの受容体の対立遺伝子変異体ならびに、かわりにこれらの受容体のスプライスされた形態を含む。ＦｃγＲII受容体は、ＦｃγＲIIＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲIIＢ（「阻害性受容体」）を含み、そしてそれは、その細胞質ドメインとは主として異なる、同一のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体活性化チロシン型モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体阻害性チロシン型モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｍ．ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）の概説を参照）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ他，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；ならびにｄｅ  Ｈａａｓ他，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。将来的に同定されるものを含めて、他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」に含められる。当該用語はまた、胎児性受容体ＦｃＲｎを含み、そしてそれは母親由来のＩｇＧの胎児への伝達に関与する（Ｇｕｙｅｒ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）および、Ｋｉｍ他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４２９（１９９４））。
【００５９】
「補体依存性細胞障害性」または「ＣＤＣ」とは、補体存在下において標的を溶解する分子の能力のことである。補体活性化経路は、同種抗原と複合化した分子（例えば抗体）への、補体系の補体第一成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイが行なわれてもよい。
【００６０】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体中の配列において広範囲に異なり、そしてその特定の抗原のための各々の特定の抗体の結合および特異性において使用される事実のことを言う。しかし可変性は、抗体の可変領域を通じて均一に分布されていない。それは、軽鎖および重鎖可変領域の両方において超過変領域と呼ばれる３つの断片に集中される。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれは広くβシート構造を採用している４つのＦＲを含み、それらはループ連結を形成する３つの超過変領域によって結合されており、そして幾つかの場合においてβシート構造の一部を形成している。それぞれの鎖中の超過変領域は、ＦＲによって非常に接近してつながっており、そして他方の鎖からの超過変領域を用いて、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ他、免疫学的に関心のあるタンパク質の配列、第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常領域は、抗原への抗体の結合に直接的に関与していないが、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与のような、様々なエフェクター機能を示す。
【００６１】
本明細書において使用される場合において、用語「超可変領域」とは、抗原への結合に関与する抗体のアミノ酸残基のことである。超過変領域は、遺伝的に、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域における２４〜３４残基（Ｌ１）、５０〜５６残基（Ｌ２）、および８９〜９７残基（Ｌ３）、ならびに重鎖可変領域における３１〜３５残基（Ｈ１）、５０〜６５残基（Ｈ２）および９５〜１０２残基（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ他、免疫学的に関心のあるタンパク質の配列、第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））および／または「超過変ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変領域における２６３２残基（Ｌ１）、５０〜５２残基（Ｌ２）、および９１〜９６残基（Ｌ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２残基（Ｈ１）、５３〜５５残基（Ｈ２）および９６〜１０１残基（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義された超可変領域残基以外の残基である。抗体のパパイン消化は、単一の抗原結合部位をそれぞれ有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、および、その名前が速やかに結晶化する能力を反映している残余の「Ｆｃ」フラグメントを産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、そして抗原とまだ架橋結合することができるＦ（ａｂ’）2断片を産生する。
【００６２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む、最小の抗体断片である。この領域は、一の重鎖可変領域および一の軽鎖可変領域が非共有結合性の接合により、強く結びついた二量体からなる。この構造中において、それぞれの可変領域の３つの超可変領域は、ＶH−ＶL二量体の表面上における抗原結合部位を定義するために相互作用する。合計で６つの超過変領域が、抗体への抗原結合特異性を与える。しかし、完全な結合部位よりも低い親和性であるが、一の可変領域（または抗原特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、そして結合する能力を有する。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常領域および重鎖の第一定常領域（ＣＨＩ）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一またはそれ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨＩ領域のカルボキシ末端における幾つかの残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常領域のシステイン残基（複数）が、少なくとも一つの遊離のチオール基を有するＦａｂ’のことを意味する。Ｆ（ａｂ’）2抗体断片は本来、それらの間に存在するヒンジの、システインを有する対のＦａｂ’断片として産生された。抗体断片の他の化学的結合が、同様に知られている。
【００６３】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、明らかに異なる二つの種類のうちの一つとして割り当てられ得る。
【００６４】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶHおよびＶL領域を含み、そしてこれらの領域は、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ＶH領域とＶL領域の間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、モノクローナル抗体の薬理学，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６９−３１５ページ（１９９４）を参照。
【００６５】
用語「二重特異性抗体」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片のことであり、当該断片は同一のポリペプチド鎖（ＶH−ＶL）中において、軽鎖可変領域（ＶL）と結合された重鎖可変領域（ＶH）を含む。短すぎて同一の鎖上において２つの領域の間で対形成をすることができないリンカーを使用することによって、当該領域は別の鎖の相補的領域と対形成され、そして２つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より完全に記載されている。
【００６６】
用語「三重特異性抗体」または「三価三量体」とは、３つの一本鎖抗体の組み合わせのことである。三重特異性抗体は、ＶLまたはＶH領域のアミノ酸末端を用いて、すなわち任意のリンカー配列を有することなく構築される。三重特異性抗体は、環状に、ヘッド・トゥー・テイルで配置されたポリペプチドを持った３つのＦｖ頭部を有する。三重特異性抗体の可能な構造は、互いに１２０度の角度で面上に位置された３つの結合部位を有する平面形である。三重特異性抗体は、単一特異的、二重特異的、または三重特異的であり得る。
【００６７】
「単離」抗体とは、その天然環境の成分から同定された、ならびに分離された、および／または回収されたものである。天然環境由来の混入成分は、診断または治療的使用の妨げとなるだろう物質であり、そして酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性のまたは非タンパク質性の溶質を含むかもしれない。単離抗体は、抗体の天然環境の少なくとも一成分が存在しないだろうために、組み換え細胞中に、インサイチュで当該抗体を含む。しかし通常、単離された抗体は少なくとも一つの精製段階によって調製されるだろう。
【００６８】
関心のある抗原と「結合する」抗体とは、抗原を発現する細胞を標的とするとき、抗体が治療剤または診断剤として有用であるために、十分な親和性を有しながらその抗原と結合することができるものである。抗体が抗原部位と結合するものである場合、それは通常、他の受容体とは対照的に当該抗原部位と優先的に結合し、そして非特異的なＦｃの接触または他の抗原と共通する翻訳後修飾体との結合のような偶発的な結合を含まず、そして他のタンパク質と著しく交差反応をしないものであってもよい。関心のある抗原と結合する抗体の検出方法は、当技術分野において周知であり、そしてＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットのようなアッセイを含み得るが、それらに限定されない。
【００６９】
本明細書において使用されている表現「細胞」「細胞株」および「細胞培養」は、代替可能に使用され、全てのかかる意味は、子孫を含む。全ての子孫は、意図的な、または意図的ではない変異によって、ＤＮＡの内容において厳密に同一でなくてもよいこともまた、理解されている。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同一の機能または生物学的活性を有する変異の子孫が含まれる。それは、別個の意味が意図されている文脈から明らかだろう。
【００７０】
「治療または処置」とは、臨床的治療および予防的または防止的手段の両方のことであり、その目的は、標的とされた病態または疾患を予防すること、または進行を遅らせる（軽減する）ことである。治療の必要がある者は、既に疾患に罹患している者および疾患を罹患する傾向にある者、または疾患が予防されている者を含む。したがって、本明細書において治療される哺乳動物は、疾患を有するとして診断されてもよく、または疾患にかかりやすく、もしくは疾患の疑いがあってもよい。
【００７１】
用語「癌」および「癌性」は、無制御の細胞増殖または細胞死によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的条件のことであり、またはそのことを説明する。癌の例は、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性腫瘍を含むが、それらに限定されない。かかる癌のより特別な例は、扁平上皮癌（例えば上皮性有棘細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌もしくは肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）もしくは胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）もしくは腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌、肛門癌、陰茎癌、または頭頸部癌を含む。
【００７２】
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化合物である。化学療法剤の例は、チオテパもしくはシクロホスファミド（シトキサン（ＣＹＴＯＸＡＮ）（商標））；ブスルファン、インプロスルファン、もしくはピポスルファンのようなアルキル化剤；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパのようなアジリジン；エチレンイミンもしくはアルトレタミンを含むメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵのようなピリミジン類縁体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸のような葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−ヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバシン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（タキソール（ＴＡＸＯＬ）（登録商標）、ブリストール−マイヤーズ  スクイブ  オンコロジー、プリンストン、ＮＪ．）およびドセタキセル（タキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）（登録商標）、アベンティス、ローヌ−プーラン  ローラー、アントニー、フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンのようなプラチナ類縁体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上の任意の薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。この定義中には、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、４（５）−イミダゾールを阻害するアロマターゼ、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ））を含む抗エストロゲンのような、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように働く抗ホルモン剤；およびフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンのような、抗アンドロゲン；ならびに上記の任意の薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
【００７３】
治療目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、マウス、ＳＣＩＤもしくはヌードマウス、またはマウス種、家畜および農業用家畜、ならびに羊、犬、馬、猫、牛などのような、動物園の動物、運動用動物またはペット動物を含めて、哺乳動物として分類される全ての動物のことである。好ましくは、本明細書における当該哺乳動物はヒトである。
【００７４】
「オリゴヌクレオチド」は、短い長さの、一本鎖または二本鎖の、（１９８８年５月４日に刊行された欧州特許第２６６，０３２号明細書に記載されているような固相技術を使用した、ホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホロアミダイトの化学のような既知の手法により、またはＦｒｏｅｈｌｅｒ他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７，１９８６、に記載されているようなデオキシヌクレオシド  Ｈ−ホスホネート中間体を経由して、化学的に合成されるポリデオキシリボヌクレオチドである。それらはその後、ポリアクリルアミドゲル上において精製される。
【００７５】
本発明に従って、非ヒト（例えばマウス）免疫グロブリンの「ヒト化」および／または「キメラ」形態とは、元の抗体と比較して、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）またはヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）の応答の減少をもたらす特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2もしくは抗体の他の抗原結合サブシークエンスのような）その断片を含み、そして前記非ヒト免疫グロブリン由来の必須の部分（例えばＣＤＲ（複数）、抗原結合領域（複数）、可変領域（複数）など）であって、所望の効果を再度産生するために必要であるが、同時に前記非ヒト免疫グロブリンと同程度の結合特性を保持しているものを含む、抗体のことである。大部分において、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換されている。幾つかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトＦＲ残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中、および移入されたＣＤＲまたはＦＲ配列のいずれにも見られない残基を含む。これらの修飾は、抗体の能力をさらに洗練化および最適化する。一般的にヒト化抗体は、実質的に少なくとも一つの、典型的に二つの可変領域の全てを含み、そしてその中において、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてＦＲ残基の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、好ましくは免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを少なくとも含むだろう。
【００７６】
「脱免疫化」抗体は、特定の種に対して非免疫原性である、または免疫原性をあまり有さない免疫グロブリンである。脱免疫化は、抗体の構造改変を通じて達成され得る。当業者にとって既知の、任意の脱免疫化技術が使用され得る。脱免疫化抗体のための一の好適な技術が、例えば２０００年６月１５日に刊行された国際公開第００／３４３１７号に記述されている。
【００７７】
「アポトーシス」を誘導する抗体は、アネキシンＶの結合、カスパーゼ活性、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞の断片化および／または（アポトーシス小体とよばれる）膜小胞の形成によって説明されるが、それらに限定されないプログラム細胞死を、任意の手段によって誘導するものである。
【００７８】
本明細書において使用される「抗体誘導細胞障害」は、ハイブリドーマ上清、または受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体由来の細胞障害性効果であって、その効果が結合の程度とは必ずしも関連のないものを意味すると理解される。
【００７９】
本明細書を通じて、ハイブリドーマ細胞株、およびそれから産生された単離モノクローナル抗体は、実質名称のＡＲ９０Ａ５６．１１と、または寄託名称（Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）のＩＤＡＣ０５１２０６−０３と、代替的に呼ばれる。
【００８０】
本明細書において使用される「抗体−リガンド」は、標的抗原の少なくとも一つのエピトープに対して結合特異性を示す部分を含み、そしてそれは、無傷抗体分子、抗体断片および抗原結合領域またはその一部（すなわち、抗体分子の可変部位）を少なくとも有する任意の分子であってもよく、例えばＦｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）2分子、二重特異性抗体、融合タンパク質、またはＩＤＡＣ０５１２０６−０３（ＩＤＡＣ０５１２０６−０３抗原）と名付けられたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離モノクローナル抗体によって結合される、抗原の少なくとも１つのエピトープを特異的に認識し、かつ結合する任意の遺伝子改変された分子であってよい。
【００８１】
本明細書において使用される「癌性疾患修飾性抗体」（ＣＤＭＡＢ）とは、例えば腫瘍量を減少させることによって、または腫瘍を有する個人の生存を延長させることによって患者に利益のあるように、癌性疾患過程を修飾するモノクローナル抗体およびその抗体−リガンドのことである。
【００８２】
最も広い意味における「ＣＤＭＡＢ関連結合剤」は、少なくとも一つのＣＤＭＡＢ標的エピトープと競合的に結合する、任意の形態のヒトもしくは非ヒト抗体、抗体断片、抗体−リガンド、または同種のものを含むが、それらに限定されないものと理解される。
【００８３】
「競合性結合剤」は、少なくとも一つのＣＤＭＡＢ標的エピトープに対して結合親和性を有する任意の形態のヒトもしくは非ヒト抗体、抗体断片、抗体−リガンド、または同種のものを含むが、それらに限定されないものと理解される。
【００８４】
治療されるべき腫瘍は、原発腫瘍および転移性腫瘍ならびに難治性腫瘍を含む。難治性腫瘍は、化学療法剤を単剤で、抗体単体で、放射線のみで、またはそれらの組み合わせを用いる治療に対して応答することができない、または抵抗性がある腫瘍を含む。難治性腫瘍はまた、かかる薬剤を用いた治療によって抑制されるが、治療中止後５年以内、場合によっては１０年以内、またはそれ以上の期間内に再発すると思われる腫瘍を含む。
【００８５】
治療され得る腫瘍は、血管新生されていない、または実質的に未だ血管新生されていない腫瘍、および血管新生された腫瘍を含む。適宜に治療され得る固形腫瘍の例は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、神経膠腫、およびリンパ腫を含む。かかる腫瘍の幾つかの例は、類上皮腫、頭頸部腫瘍のような扁平上皮腫瘍、大腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳腺腫瘍、小細胞性および非小細胞性肺腫瘍を含む肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍ならびに肝臓腫瘍を含む。他の例は、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、消化管および腎臓癌ならびに肉腫、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫、好ましくは多形性膠芽腫、および平滑筋肉腫を含む。
【００８６】
本明細書において使用される「抗原結合領域」は、標的抗原を認識する分子の一部分を意味する。
【００８７】
本明細書において使用される「競合的に阻害する」とは、従来型の相互抗体競合アッセイを用いて、ＩＤＡＣ０５１２０６−０３と名付けられたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体（ＩＤＡＣ０５１２０６−０３抗体）が標的とする決定部位を認識し、そして結合することができることを意味する（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ．，Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  Ｃ．およびＤｕｆｏｕｒ  Ｄ．（１９７３），競合的およびサンドイッチ手法による、アルファ  フェトプロテインに対する酵素結合型免疫測定法  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４８，１５）。
【００８８】
本明細書において使用される「標的抗原」は、ＩＤＡＣ０５１２０６−０３抗原またはその一部である。
【００８９】
本明細書において使用される「免疫複合体」は、細胞毒素、放射活性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部位、酵素、毒素、抗腫瘍薬剤また治療剤と化学的または生物学的に連結された抗体のような任意の分子またはＣＤＭＡＢを意味する。抗体またはＣＤＭＡＢは、その標的と結合することができる限り、当該分子の任意の場所において細胞毒素、放射活性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部位、酵素、毒素、抗腫瘍、または治療剤と連結されていてもよい。免疫複合体の例は、抗体毒素化学的複合体および抗体−毒素融合タンパク質を含む。
【００９０】
抗腫瘍剤としての使用のために好適である放射活性薬剤は、当業者とって既知である。例えば、１３１Ｉまたは２１１Ａｔが使用される。これらのアイソトープは、従来の技術を使用する抗体に付属している（例えばＰｅｄｌｅｙ他，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６８，６９−７３（１９９３））。または、当該抗体に付属している当該抗腫瘍剤は、プロドラッグを活性化する酵素である。腫瘍部位へ到達するまで不活性形態の状態のままであるプロドラッグが投与され、そして一旦抗体複合体が投与されると、そこでプロドラッグがその細胞毒素形態へ変換される。実際抗体−酵素複合体は、患者へ投与され、そして治療されるべき組織の領域へ局在化される。その後プロドラッグが患者へ投与され、細胞毒性薬剤への変換が、治療されるべき組織の領域中で起こる。あるいは、抗体と複合化した抗腫瘍薬剤は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）のようなサイトカインである。当該抗体は、サイトカインを腫瘍へ向かわせ、その結果当該サイトカインが他の組織に影響を与えることなく腫瘍への損傷または腫瘍の破壊を仲介する。サイトカインは、従来型の組み換えＤＮＡ技術を使用して、抗体とＤＮＡレベルで融合する。インターフェロンもまた、使用されてもよい。
【００９１】
本明細書において使用される「融合タンパク質」は、抗原結合領域が生物学的に活性な分子、例えば毒素、酵素、蛍光タンパク質、発光性マーカー、ポリペプチドタグ、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部位またはタンパク薬剤と結合している任意のキメラタンパク質を意味する。
【００９２】
本発明は、標的部位またはレポーター部位が連結された、本発明のＣＤＭＡＢをさらに意図する。標的部位は、結合対の第一メンバーである。例えば、抗腫瘍剤は、かかる対の第二メンバーと複合化され、そしてそれにより抗原結合タンパク質が結合されている部位へと向けられる。かかる結合対の共通の例は、アビジンおよびビオチンである。好ましい実施形態において、ビオチンは、本発明のＣＤＭＡＢの標的抗原と複合化され、そしてそれにより、抗腫瘍剤、またはアビジンもしくはストレプトアビジンと複合化されている他の部位に対する標的を提供する。または、ビオチンもしくは別のかかる部位は、本発明のＣＤＭＡＢの標的抗原と連結され、そしてレポーターとして、例えば検出可能なシグナル産生剤がアビジンまたはストレプトアビジンと複合化されている診断系において、使用される。
【００９３】
検出可能なシグナル産生剤は、インビボおよびインビトロにおいて、診断目的のために有用である。シグナル産生剤は、外的手段、通常は電磁放射の測定によって検出可能である測定可能なシグナルを産生する。大部分において、シグナル産生剤は、酵素または発色団であり、あるいは蛍光、リン光、または化学発光によって光を放出する。発色団は、紫外線または可視領域における光を吸収する染料を含み、そして酵素が触媒する反応の基質または分解産物であり得る。
【００９４】
さらに、当技術分野において周知である調査法または診断法のための、インビボおよびインビトロにおける本発明のＣＤＭＡＢの使用は、本発明の範囲内に含まれる。本明細書において意図される診断法を実行するために、本発明は、本発明のＣＤＭＡＢを含むキットをさらに含んでもよい。かかるキットは、かかる個人の細胞上に存在するＣＤＭＡＢの標的抗原の過剰発現を検出することによって、ある種の癌に対する危険性を有する個人を同定するために有用であるだろう。
【００９５】
診断アッセイキット
本発明のＣＤＭＡＢを、腫瘍の存在を決定するための診断アッセイキットの形態で利用することが意図されている。腫瘍は、一またはそれ以上の腫瘍特異的抗原の存在に基づいて、例えば、血液、血清、尿および／または腫瘍生検のような、患者から得られるだろう生体試料中のタンパク質、および／または、かかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて、一般的に患者において検出されるだろう。
【００９６】
前記タンパク質は、特定の腫瘍、例えば結腸腫瘍、乳腺腫瘍、または前立腺腫瘍の存在もしくは不在を示すマーカーとして機能する。前記抗原が、他の癌性腫瘍の検出において有用であろうことがさらに意図されている。本発明のＣＤＭＡＢ、またはＣＤＭＡＢ関連性結合剤を含む、結合剤の診断アッセイキットの含有により、生体試料中における薬剤と結合する抗原レベルの検出が可能となる。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用されてもよく、そしてそれはまた、癌の存在または不在を示す。結合アッセイを診断に役立たせるために、結合認識に明確に癌性腫瘍の存在についての診断を与えるように、正常組織中に存在するものに関連して、統計的に有意なレベルの抗原と相関するデータが得られるだろう。試料中におけるポリペプチドマーカーを検出する結合剤を使用するために、当業者にとって既知である複数の形式が、本発明の診断アッセイにとって有用であろうことが意図されている。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，アンチボディーズ：ア  ラボラトリー  マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，９〜１４章，１９８８に記述されている通りである。上述の診断アッセイ形式の任意の、および全ての組み合わせ、置換、または修飾がさらに意図される。
【００９７】
患者における癌の存在または不在は、典型的に、（ａ）患者から得られた生体試料を結合剤と接触させることによって；（ｂ）結合剤と結合するポリペプチドのレベルを試料中において検出することによって；そして（ｃ）ポリペプチドのレベルをあらかじめ決められたカットオフ値と比較することによって決定されるだろう。
【００９８】
例示的実施形態において、アッセイは、試料残渣からポリペプチドと結合し、および除去するための、固相担体上に固定化されたＣＤＭＡＢ型結合剤の使用に関連するだろうことが意図される。結合されたポリペプチドはその後、レポーター基を含み、そして結合剤／ポリペプチド複合体と特異的に結合する検出試薬を使用して検出されてもよい。具体的な検出試薬は、ポリペプチドまたは抗体と特異的に結合するＣＤＭＡＢ型結合剤、あるいは抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンのような、結合剤と特異的に結合する他の薬剤を含んでもよい。別の実施形態において、競合的アッセイが利用されてもよいことが意図されており、そしてその中において、ポリペプチドはレポーター基で標識されており、そして試料と共に結合剤をインキュベートした後、固定化された結合剤と結合することができる。試料の構成成分がラベル化されたポリペプチドと結合剤との結合を阻害する程度は、固定化された結合剤と試料との反応性を示唆する。かかるアッセイにおける使用のために好適なポリペプチドは、結合剤が結合親和性を有する完全長腫瘍特異的タンパク質および／またはその一部を含む。
【００９９】
診断キットは、当業者にとって既知である任意の物質の形態であってもよく、タンパク質が付着されてもよい固相担体と共に提供されるだろう。好適な例は、マイクロタイタープレートまたはニトロセルロースもしくは他の好適な膜中に試験用ウェルを含んでもよい。または当該担体は、ガラス、繊維ガラス、ラテックスまたはポリスチレンもしくはポリビニルクロリドのようなプラスチック物質のような、ビーズまたはディスクであってもよい。当該担体はまた、例えば米国特許第５，３５９，６８１号明細書に開示されたもののような、磁性粒子または光ファイバーセンサーであってもよい。
【０１００】
結合剤は、特許文献および科学文献中に十分に記載されている、当業者にとって既知の種々の技術を使用して、固相担体上において固定化されるだろうことが意図されている。用語「固定化」とは、吸着のような非共有結合性結合、および本明細書において薬剤と担体上の官能基との間の直接的連結であってもよく、または架橋剤による連結であってもよい共有結合性結合の両方のことをいう。非限定だが好ましい実施形態において、マイクロタイタープレート中のウェルへの、または膜への吸着による固定化が好ましい。吸着は、好適な緩衝液中で、好適な時間をかけて、固相担体を用いて結合剤と接触させることによって達成されてもよい。接触時間は、温度に応じて変化してもよく、そして通常は約１時間〜約１日の間の範囲内になるだろう。
【０１０１】
固相担体への結合剤の共有結合性結合は、担体を、担体およびヒドロキシルまたはアミノ基のような結合剤上の官能基の両方と反応するだろう二官能性試薬と最初に反応させることによって従来は達成されるだろう。例えば結合剤は、ベンゾキノンを使用して、または担体上のアルデヒド基と結合相手上のアミンおよび活性水素との縮合によって、好適な重合体被覆を有する担体と共有結合的に結合してもよい。
【０１０２】
診断アッセイキットが、二抗体サンドイッチアッセイの形態をとるだろうことがさらに意図される。このアッセイは、固相担体、一般にはマイクロタイタープレートのウェル上に固定化された抗体、例えば本明細書中に開示されたＣＤＭＡＢを、試料と最初に接触させ、当該試料中のポリペプチドを固定化された抗体と結合させることによって達成されてもよい。結合されていない試料はその後、固定化されたポリペプチド−抗体複合体から取り除かれ、そしてレポーター基を含む検出試薬（好ましくはポリペプチド上の異なる部位へ結合することができる二次抗体）が添加される。固相担体に結合したままである検出試薬の量はその後、特定のレポーター基に好適な方法を使用することによって決定される。
【０１０３】
特定の実施形態において、一旦抗体が上記の通り担体上に固定化されると、ウシ血清アルブミンまたはツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（商標）（シグマ  ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）Ｃｏ．，セントルイス，Ｍｏ．）のような、当業者にとって既知の、好適なブロッキング剤の使用により、担体上の残存するタンパク質結合部位がブロッキングされるだろうことが意図される。固定化された抗体はその後、試料と共にインキュベートされ、そしてポリペプチドは抗体と結合することができるだろう。インキュベーションに先立って、試料は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような好適な希釈剤を用いて希釈され得る。一般的に、好適な接触時間（すなわちインキュベーション時間）は、特異的に選択された腫瘍を有する個人から得た試料中のポリペプチドの存在を検出するために十分な期間の時間と一致するように選択されるだろう。好ましくは、接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとが平衡状態にある結合レベルの、少なくとも約９５％である結合レベルを達成するために十分な時間である。当業者は、平衡を達成するために必要な時間が、ある期間に渡って起こる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定されるかもしれないことを認識するだろう。
【０１０４】
結合していない試料はその後、好適な緩衝液を用いて固相担体を洗浄することによって除去されるだろうことが、さらに意図される。レポーター基を含む二次抗体は、その後固相担体へ添加されるだろう。検出試薬と、固定化された抗体−ポリペプチド複合体とのインキュベーションがその後、結合したポリペプチドを検出するために十分な時間をかけて行なわれる。その後、未結合の検出試薬は取り除かれ、そして結合した検出試薬がレポーター基を使用して検出されるだろう。レポーター基を検出するために用いられる方法は、必然的に選択されたレポーター基の型に特異的であり、例えば放射活性基に対しては、シンチレーション測定またはオートラジオグラフィー法が好適である。分光法は、染料、発光基および蛍光基を検出するために使用されてもよい。ビオチンは異なるレポーター基（一般的には放射活性基もしくは蛍光基または酵素）と結合したアビジンを使用して検出されてもよい。酵素レポーター基は、一般的には、基質を（通常は特定の時間をかけて）添加後に、反応産物の分光的または他の分析法によって検出されてもよい。
【０１０５】
前立腺癌のような癌の存在または不在を決定するための、本発明の診断アッセイキットを利用するために、固相担体に結合されたままであるレポーター基から検出されるシグナルは通常、あらかじめ決定されたカットオフ値に相当するシグナルと比較されるだろう。例えば、癌の検出のための例示的なカットオフ値は、固定化された抗体が、癌ではない患者由来の試料とインキュベートされるときに検出される平均シグナルであってもよい。一般的に、所定のカットオフ値を超えて約３標準偏差であるシグナルを生じる試料は、癌に対して陽性であると考えられるだろう。別の実施形態において、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔ他，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７ページの方法に従って、受信者動作曲線を使用することによって決定されてもよい。かかる実施形態において、カットオフ値は、診断試験結果に対するそれぞれの可能なカットオフ値に相当する、真陽性率（すなわち感受性）および偽陽性率（１００％特異性）の複数組のプロットから決定され得る。左上隅に最も近いプロット上のカットオフ値（すなわち、最も広い領域を囲む値）は、最も正確なカットオフ値であり、そして、この方法によりカットオフ値よりも高いシグナルを生じる試料は、陽性と考えられてもよい。または、カットオフ値は、偽陽性率を最小化するために、プロットに沿って左へシフトされてもよく、または偽陰性を最小化するために右へシフトされてもよい。一般的に、この方法により決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを生じる試料は、癌に対して陽性であると考えられる。
【０１０６】
キットによって可能となる診断アッセイは、結合剤がニトロセルロースのような膜上に固定化されている、流水式試験形態または試験紙形態のいずれかで行なわれるだろうことが意図されている。流水式試験において、試料中のポリペプチドは、当該試料が当該膜を通過するときに固定化された結合剤と結合する。第二に、標識化された結合剤はその後、二次結合剤を含む溶液が膜へ流入するときに、結合剤−ポリペプチド複合体と結合する。結合した二次結合剤の検出はその後、上述のように行なわれてもよい。試験紙形態において、結合剤が結合される膜の一端は、試料を含む溶液中に浸されるだろう。当該試料は、二次結合剤を含む領域を通じて、そして固定化された結合剤の領域へと膜に沿って移動する。固定化抗体の領域に存在する二次結合剤の濃度は、癌の存在を示唆する。結合部位における、視覚的に読むことができる線のようなパターンの生成は、陽性試験を示唆するだろう。かかるパターンの不在は、陰性の結果を示す。生体試料が、上で議論された形態において、二抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じさせるために十分であるだろうポリペプチドのレベルを含むとき、一般的に、膜上に固定化された結合剤の量は、視覚的に識別できるパターンを生じさせるために選択される。本診断用アッセイにおける使用のために好ましい結合剤は、本明細書中に開示された抗体、その抗原結合断片、および本明細書に記載されている任意のＣＤＭＡＢ関連結合剤である。膜上に固定化される抗体の量は、診断アッセイを行なうために有効な任意の量であり、そして約２５ナノグラムから約１マイクログラムの範囲であってもよい。典型的には、かかる試験は非常に少量の生体試料を用いて行われてもよい。
【０１０７】
さらに、本発明のＣＤＭＡＢは、その標的抗原を同定する能力を有するため、実験室内で研究のために使用されてもよい。
【０１０８】
本明細書に記載された発明がより十分に理解されるために、以下の記述がなされる。
【０１０９】
本発明は、ＩＤＡＣ  ０５１２０６−０３抗原を特異的に認識し、かつ結合するＣＤＭＡＢ（すなわち、ＩＤＡＣ  ０５１２０６−０３  ＣＤＭＡＢ）を提供する。
【０１１０】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される単離モノクローナル抗体のＣＤＭＡＢは、それがハイブリドーマＩＤＡＣ  ０５１２０６−０３によって産生された単離モノクローナル抗体の、標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合領域を有する限り、任意の形態であってもよい。したがって、ＩＤＡＣ  ０５１２０６−０３抗体と同一の結合特異性を有する任意の組み換えタンパク質（例えば抗体が、リンホカインまたは腫瘍増殖阻害因子のような第二のタンパク質と結合されている融合タンパク質）は、本発明の範囲内である。
【０１１１】
本発明の一の実施形態において、ＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ  ０５１２０６−０３抗体である。
【０１１２】
他の実施形態において、ＣＤＭＡＢは、（一本鎖Ｆｖ分子のような）Ｆｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、融合タンパク質、二重特異性抗体、異種抗体、またはＩＤＡＣ  ０５１２０６−０３抗体の抗原結合領域を有する任意の組み換え分子であってもよい抗原結合断片である。本発明のＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ  ０５１２０６−０３モノクローナル抗体が対象とするエピトープに向けられる。
【０１１３】
すなわち本発明のＣＤＭＡＢは、誘導体分子を産生するために、分子中のアミノ酸修飾によって修飾されてもよい。化学的修飾もまた可能である。直接的変異、親和性成熟法、ファージディスプレイまたはチェ−ン・シャッフリングによる修飾もまた可能であるかもしれない。
【０１１４】
親和性および特異性は、ＣＤＲおよび／またはフェニルアラニン、トリプトファン（ＦＷ）残基を変異させることによって、ならびに所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることによって、修飾または改善され得る（例えば、Ｙａｎｇ他，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，（１９９５）２５４：３９２−４０３）。一の方法は、他の同一の抗原結合部位を有する固体群において、２〜２０個のアミノ酸のサブセットが特定の部位に見られるように、個々の残基または残基の組み合わせをランダム化することである。または変異が、エラープローンＰＣＲ法によって、残基の範囲を超えて誘発され得る（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９２）２２６：８８９−９６）。別の例において、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異株中において増殖され得る（例えば、Ｌｏｗ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９６）２５０：３５９−６８）。これらの変異の方法は、当業者にとって既知の多くの方法を例示する。
【０１１５】
本発明の抗体の親和性を増加させるための別の方法は、チェイン・シャッフリングを行うことであり、より高い親和性を有する抗体を調製するために、重鎖または軽鎖はランダムに他の重鎖または軽鎖と組み合わされる。抗体の種々のＣＤＲはまた、他の抗体における対応するＣＤＲとシャッフルされてもよい。
【０１１６】
誘導体分子は、ポリペプチドの機能的特性を保持し、すなわち、かかる置換を有する分子は、ＩＤＡＣ０５１２０６−０３抗原またはその一部へのポリペプチドの結合を十分に可能とするだろう。
【０１１７】
これらのアミノ酸置換は、「保存的」として当技術分野において既知のアミノ酸置換を含むが、それに必ずしも限定されない。
【０１１８】
例えば「保存的アミノ酸置換」と呼ばれる特定のアミノ酸置換が、タンパク質の構造または機能のいずれも改変させることなく、タンパク質中において頻繁になされ得ることは、タンパク質化学の確立した原理である。
【０１１９】
かかる変化は、任意のイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）の、他のこれらの疎水性アミノ酸への置換；アスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換、およびその逆の置換；グルタミン（Ｑ）のアスパラギン（Ｎ）への置換、およびその逆の置換；ならびにセリン（Ｓ）のトレオニン（Ｔ）への置換、およびその逆の置換を含む。他の置換はまた、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して保存的と考えられ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は頻繁に交換可能であり、同様にアラニンおよびバリン（Ｖ）が交換可能である。相対的に疎水的であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシンおよびイソロイシンと頻繁に交換可能であり、そして時折バリンとも交換可能である。リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、当該アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であって、そしてこれらの２つのアミノ酸残基のｐＫａの違いは重要ではない位置において頻繁に交換可能である。さらに他の変化は、特定の環境において「保存的」と考えられ得る。
【実施例】
【０１２０】
実施例１
ハイブリドーマの産生−ハイブリドーマ細胞株ＡＲ９０Ａ５６．１１
ハイブリドーマ細胞株ＡＲ９０Ａ５６．１１を、ブダペスト条約に従って、カナダ国際寄託当局（ＩＤＡＣ）、微生物局、カナダ保険省、１０１５アーリントン（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ）・ストリート、ウィニペグ、マニトバ、カナダ、Ｒ３Ｅ３Ｒ２に、２００６年１２月５日に、受入番号０５１２０６−０３で寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８に従って、寄託者は、寄託された物質の公衆への利用に課される全ての制限は、特許の付与において変更不可に取り除かれるだろうことを保証する。当該寄託は、保管者が生存試料を分配することができないならば、置き換えられるだろう。
【０１２１】
抗癌抗体ＡＲ９０Ａ５６．１１を産生するハイブリドーマを産生するために、冷凍された肺腺癌腫瘍組織（ゲノミクス・コラボレイティブ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ）、ケンブリッジ、ＭＡ）の単一の細胞上清をＰＢＳ中で調製した。イミューンイージー（ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ）（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｌｎｏ，オランダ）アジュバントを、軽く攪拌することによって、使用のために調製した。５〜７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０マイクロリットルの抗原−アジュバント中の２００万個の細胞を皮下注射することによって免疫した。近年製造された抗原−アジュバントを、腹腔内で免疫化したマウスを追加免疫するために、最初の免疫化から２〜５週後に、５０マイクロリットル中の２００万個の細胞を使用した。最後の免疫化から３日後に、融合のために脾臓を使用した。ハイブリドーマを、単離された脾臓細胞をＮＳＯ−Ｉ骨髄腫パートナーと融合することによって調製した。融合体由来の上清は、ハイブリドーマのサブクローンから試験された。
【０１２２】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体がＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであるかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行なった。コーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．２〜９．６）中、２．４マイクログラム／ｍＬの濃度である、１００マイクロリットル／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を、４℃でＥＬＩＳＡプレートへ一晩添加した。当該プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５パーセント  ツィーン）で三度洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのブロッキングバッファー（洗浄バッファー中５パーセントミルク）をプレートへ１時間、室温で添加し、その後洗浄バッファーで三度洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのハイブリドーマ上清を添加し、そして当該プレートを１時間、室温でインキュベートした。当該プレートを洗浄バッファーにて三度洗浄し、そして（１パーセントミルクを含有するＰＢＳで希釈された）ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体のいずれかの１／１００，０００希釈液を、１００マイクロリットル／ウェルで添加した。当該プレートを一時間、室温にてインキュベートした後、当該プレートを三度、洗浄バッファーで洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ溶液を１〜３分間、室温にてインキュベートした。呈色反応を、５０マイクロリットル／ウェルの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を添加することによって終結させ、そして当該プレートをパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読んだ。図１に示すように、ＡＲ９０Ａ５６．１１ハイブリドーマは、ＩｇＧアイソタイプの抗体を主に分泌した。
【０１２３】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体のサブクラスを決定するために、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｒｏｎｔｓｔｒａａｔ、オランダ）を使用して、アイソタイピング実験を行なった。ラット抗マウスサブクラス特異的抗体を含む検査片に、５００マイクロリットルの緩衝溶液を添加した。５００マイクロリットルのハイブリドーマ上清を試験管に添加し、そして穏やかに攪拌させながら浸した。捕獲されたマウス免疫グロブリンを、コロイド粒子と結合した二次ラットモノクローナル抗体によって直接検出した。これらの二つのタンパク質の結合は、アイソタイプを分析するために使用される視覚シグナルを生み出す。抗癌抗体ＡＲ９０Ａ５６．１１は、ＩｇＧ２ａカッパアイソタイプである。
【０１２４】
限界希釈を１ラウンド行なった後、細胞ＥＬＩＳＡアッセイにおいて標的細胞と結合する抗体のために、ハイブリドーマ上清を試験した。３つのヒト肺癌細胞株、１つのヒト乳癌細胞株および１つのヒト非癌肺細胞株：Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＨｓ８８８．Ｌｕ、をそれぞれ試験した。全ての細胞株を、アメリカン・タイプ・ティシュー・コレクション（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から得た。プレートに入れられた細胞を、使用前に固定化した。当該プレートを、ＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2を含むＰＢＳを用いて三度、室温で洗浄した。ＰＢＳで希釈された、１００マイクロリットルの２パーセントパラホルムアルデヒドをそれぞれのウェルへ１０分間、室温で添加し、その後廃棄した。当該プレートを、ＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2を含むＰＢＳを用いて三度、室温で再び洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルの、５パーセントミルクの洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５パーセントツィーン）溶液を用いて、ブロッキングを１時間、室温で行なった。当該プレートを、洗浄バッファーで三度洗浄し、そしてハイブリドーマ上清を、１００マイクロリットル／ウェルで１時間、室温で添加した。当該プレートを洗浄バッファーで３度洗浄し、そして１００マイクロリットル／ウェルの、（１パーセントミルクを含有するＰＢＳで希釈された）西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の１／２５，０００希釈液を添加した。室温で１時間インキュベート後、当該プレートを三度、洗浄バッファーで洗浄し、そして１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ基質を１〜３分間、室温でインキュベートした。当該反応を、５０マイクロリットル／ウェルの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で終結させ、そして当該プレートをパーキン−エルマーＨＴＳ７０００プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読んだ。図１において表にされた結果は、試験された細胞株と結合しないことが以前示された、社内のＩｇＧアイソタイプ対照と比較した、バックグラウンドに対する倍値として表現された。ハイブリドーマＡＲ９０Ａ５６．１１由来の抗体は、ＮＣＩ−Ｈ２３肺癌細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株に対して強い結合を示し、他の癌細胞株または非癌肺細胞株とは検出可能な程度に結合できないことを示した。
【０１２５】
抗体結合の試験と併せて、ハイブリドーマ上清の細胞障害性効果（抗体誘導細胞障害）を、細胞系：Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｓ８８８．Ｌｕ、で試験した。カルセインＡＭを、モルキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から得て、そして当該アッセイを以下の記述に従って行なった。細胞を、あらかじめ決定した好適な密度で、アッセイ前にプレートに蒔いた。２日後、１００マイクロリットルの、ハイブリドーママイクロタイタープレート由来の上清を、細胞プレートへ移し、そして５パーセントＣＯ2インキュベーター中で５日間インキュベートした。陽性対照として使用されるウェルを空になるまで吸引し、そして培養培地中に溶解された１００マイクロリットルのアジ化ナトリウム（ＮａＮ3、  ．０１パーセント、シグマ、オークビル、ＯＮ）またはシクロヘキシミド（ＣＨＸ、０．５マイクロモーラー、シグマ、オークビル、ＯＮ）を添加した。５日の処置の後、当該プレートをひっくり返し、そして拭って乾燥させることによって空にした。室温にて、ＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2を含有するＤＰＢＳ（ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）リン酸緩衝生理食塩水）を、多チャンネルスクイーズボトルからそれぞれのウェル中へ分注し、３度たたき、ひっくり返し、そして拭って乾燥させることによって空にした。ＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2を含有するＤＰＢＳで希釈された５０マイクロリットルの蛍光性カルセイン色素をそれぞれのウェルへ添加し、そして３７℃で、５パーセントＣＯ2インキュベーター中で３０分間インキュベートした。当該プレートをパーキン−エルマーＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーで読み、そして当該データをマイクロソフト・エクセルにて分析した。結果を図１において表にした。ＡＲ９０Ａ５６．１１ハイブリドーマ由来の上清は、ＮＣＩ−Ｈ２３肺癌細胞の２３％において特定の細胞障害性を起こした。これは、陽性対照であるアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドを用いて得られる細胞障害性のそれぞれ２６および７４パーセントであった。
【０１２６】
図１の結果は、ＡＲ９０Ａ５６．１１の細胞障害性効果が、癌細胞の種類における結合レベルと直接的に相関がないことを実証した。ＮＣＩ−Ｈ２３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への同程度の結合があったが、細胞障害性はＮＣＩ−Ｈ２３細胞においてのみ検出可能であった。図１において表で示されるように、ＡＲ９０Ａ５６．１１はＨｓ８８８．Ｌｕ非癌ヒト肺細胞株において細胞障害性を引き起こさなかった。既知の非特異的細胞障害性剤であるシクロヘキシミドおよびＮａＮ3は通常、予想通りの細胞障害性を引き起こした。
【０１２７】
実施例２
インビトロにおける結合
ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤバイオサイエンス、オークビル、ＯＮ）中で、ハイブリドーマを一週間に二度回収および再播種しながら培養することによって、ＡＲ９０Ａ５６．１１モノクローナル抗体を産生した。プロテインＧセファロース４ファストフロー（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ）を用いた標準的な抗体精製法をその後行なった。脱免疫化され、ヒト化された、黒色腫またはマウスのモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。
【０１２８】
ＡＲ９０Ａ５６．１１の、肺癌（Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、およびＮＣＩ−Ｈ５２０）、結腸癌（Ｌｏｖｏ）、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、脾臓癌（ＢｘＰＣ−３）、前立腺癌（ＰＣ−３）および子宮癌（ＯＶＣＡＲ−３）、ならびに皮膚（ＣＣＤ−２７ｓｋ）および肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）由来の非癌細胞株への結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍを除く全ての細胞株を、アメリカン・タイプ・ティシュー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）から得た。ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍを、ＮＣＩ−フレデリック癌ＤＣＴＤ腫瘍／細胞株リポジトリー（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  ＤＣＴＤ  Ｔｕｍｏｒ／Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（フレデリック、ＭＤ）から得た。
【０１２９】
細胞を、最初に細胞単層を（Ｃａ++およびＭｇ++の無い）ＤＰＢＳを用いて洗浄することにより、ＦＡＣＳ用に調製した。その後、細胞解離バッファー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、バーリングトン、ＯＮ）を、細胞培養プレート由来の細胞を３７℃で遊離させるために使用した。遠心分離および回収の後、当該細胞をＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2および２パーセントウシ胎児血清を含むＤＰＢＳ（染色培地）中で、４℃で再懸濁し、そしてその細胞数を数え、好適な細胞密度に分配し、細胞をペレット状にするために遠沈し、そして試験抗体（ＡＲ９０Ａ５６．１１）または対照抗体（アイソタイプ対照、抗ＥＧＦＲ）の存在下、４℃で、染色培地中で再懸濁した。アイソタイプ対照および試験抗体を２０マイクログラム／ｍＬで、一方抗ＥＧＦＲを５マイクログラム／ｍＬで、氷上にて３０分間評価した。アレクサ・フロー（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）５４６結合型二次抗体の添加に先立って、当該細胞を一度、染色培地で洗浄した。染色培地中のアレクサ・フロー５４６結合型抗体をその後、３０分間、４℃で添加した。最後に当該細胞をその後洗浄し、そして固定培地（１．５パーセントパラホルムアルデヒドを含有する染色培地）中で再懸濁した。フローサイトメトリーによる細胞の捕捉を、ＦＡＣＳアレイ（ＦＡＣＳａｒｒａｙ）（商標）システムソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス、オークビル、ＯＮ）を使用して、ＦＡＣＳアレイ（商標）上に試料を流すことによって評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を、ＦＳＣおよびＳＳＣ検出器において電圧および振幅の増加を調節することによって設定した。蛍光（アレクサ−５４６）チャンネルの検出器を、細胞が約１〜５ユニットの平均蛍光強度の一定のピークを有するように、未染色の細胞を流すことによって調節した。それぞれの試料に対して、約１０，０００ゲート事象（染色され、固定化された細胞）を分析のために獲得し、そして当該結果を図２に示す。
【０１３０】
図２は、アイソタイプ対照に対する平均蛍光強度の倍増加を示す。ＡＲ９０Ａ５６．１１抗体の代表的ヒストグラムを図３にまとめた。ＡＲ９０Ａ５６．１１は、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２３（９．５倍）、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（３．５倍）、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３（３．９倍）、前立腺癌細胞株ＰＣ−３（１．５倍）、および子宮癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３（２．０倍）に対して検出可能な結合をすることを実証した。非癌皮膚細胞株ＣＣＤ−２７ｓｋおよび肺細胞株Ｈｓ８８８．Ｌｕを含む、試験された他の細胞株に対して、検出可能な結合をしなかった。ＦＡＣＳ結合データは、実施例１に示した細胞ＥＬＩＳＡ結合と一致している。これらのデータはまた、ＡＲ９０Ａ５６．１１が、さまざまレベルの抗原発現をしている幾つかの異なる癌細胞株と結合し、そして癌細胞株対正常細胞株において異なった結合を示したことを実証する。
【０１３１】
実施例３
ＢｘＰＣ−３細胞における、インビボの腫瘍実験
実施例１および２は、ＡＲ９０Ａ５６．１１がヒト癌細胞株に対して、幾つかの異なる癌指標にわたって検出可能な結合を有する、抗癌特性を有することを実証した。図４および５に関して、８〜１０週齢の雌ＳＣＩＤマウスは、１００マイクロリットルＰＢＳ溶液中の５００万個のヒト膵臓細胞（ＢｘＰＣ−３）を、首筋に皮下注射することによって移植された。当該マウスは、８匹を２つの治療グループにランダムに分けられた。移植後の日に、１０ｍｇ／ｋｇのＡＲ９０Ａ５６．１１試験抗体または緩衝液対照を、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4を含む希釈液を用いて、ストック濃縮液を希釈した後、３００マイクロリットル量をそれぞれのコホートへ腹腔内に投与した。抗体および対照試料をその後、試験期間中に同じ方法で週に三度投与した。腫瘍の成長を約７日に一度、ノギスを使用して測定した。当該試験を、抗体の２４回投与の後に終了した。当該動物の体重を当該試験の間、一週間に一回記録した。試験の終わりに、全ての動物をＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【０１３２】
ＡＲ９０Ａ５６．１１は、ヒト膵臓癌のインビボ予防モデルにおいて、ＢｘＰＣ−３における腫瘍の増殖を減少させた。ＡＲＩＵＳ抗体ＡＲ９０Ａ５６．１１を用いた治療は、最後の抗体投与から１日後の５６日目において、緩衝液で処置したグループと比較して、ＢｘＰＣ−３腫瘍の増殖を５７パーセント（ｐ＝０．００７６、Ｔ−テスト）減少させた（図４）。
【０１３３】
当該試験を通じて、毒性の臨床兆候はなかった。１週間間隔で測定された体重は、健康および発育障害に対する代用であった。平均体重は、試験期間中において全てのグループにおいてかすかに増加した（図５）。１日目〜５６日目における平均体重増加は、対照グループにおいて０．７５ｇ（３．３７パーセント）であり、ＡＲ９０Ａ５６．１１で処置したグループにおいて０．８８ｇ（３．９６パーセント）であった。処置期間の終わりにおいてグループ間に著しい違いはなかった。
【０１３４】
要約すると、ＡＲ９０Ａ５６．１１は良好な耐容性を示し、そしてこのヒト膵臓異種移植モデルにおいて腫瘍量を減少させた。
【０１３５】
実施例４
競合的結合剤の単離
抗体について鑑みると、当業者は、同一のエピトープを認識する、競合的に阻害するＣＤＭＡＢ、例えば競合抗体を作製することができる（Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｌ他  Ｃｌｉｎｉｃａ  ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ  ４８：１５−１８（１９７３））。一の方法は、抗体によって認識される抗原を発現する免疫原を用いて免疫化することを必要とする。試料は、組織、単離されたタンパク質（複数）または細胞株（複数）を含んでもよいが、それらに限定されない。ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳまたはウェスタンブロッティングのような、試験抗体の結合を阻害する抗体を同定するものである競合アッセイを用いて、得られるハイブリドーマをスクリーニングすることができる。別の方法は、前記抗原の少なくとも一つのエピトープを認識する抗体に対する、ファージディスプレイ抗体ライブラリーおよびパニングを利用することができる（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＪＬ他  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１４：２９４−３００（２００３））。いずれかの場合において抗体は、その標的抗原の少なくとも一つのエピトープへ、元のラベル化された抗体の結合と置き換えるそれらの能力に基づいて選択される。したがって、かかる抗体は、元の抗体と同じ、抗原の少なくとも一つのエピトープを認識する特性を有するだろう。
【０１３６】
実施例５
ＡＲ９０Ａ５６．１１モノクローナル抗体の可変領域のクローニング
ＡＲ９０Ａ５６．１１ハイブリドーマ細胞株によって産生された、モノクローナル抗体の重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）由来の可変領域の配列を決定することができる。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードするＲＮＡを、グアニジウム  イソチオシアネートを用いた細胞の可溶化に関する標準的な方法を使用して、対象となるハイブリドーマから抽出することができる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：５２９４−５２９９（１９７９））。ｍＲＮＡは、その後のＶHおよびＶL遺伝子の単離のために、当技術分野において既知のＰＣＲ法によってｃＤＮＡを調製するために使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，モルキュラー・クローニング、第１４章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））。重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列を、自動エドマン・シークエンシングによって独立して決定することができる。ＣＤＲおよびフランキングＦＲのさらなる伸張を同様に、ＶHおよびＶL断片のアミノ酸シークエンシングによって決定することができる。その後、合成プライマーをＡＲ９０Ａ５６．１１モノクローナル抗体由来のＶHおよびＶL遺伝子の単離のために設計することができ、そして単離された遺伝子を、シークエンシングのために、好適なベクター中へ連結することができる。キメラおよびヒト化ＩｇＧを製造するために、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を、発現のために好適なベクター中にサブクローン化することができる。
【０１３７】
別の実施形態において、ＡＲ９０Ａ５６．１１、またはその脱免疫化されたキメラもしくはヒト化バージョンは、抗体を発現し、そして回収することができるように、形質転換動物において抗体をコードする核酸を発現させることによって産生される。例えば、回収および精製を容易にする組織特異的な方法で、当該抗体を発現することができる。一のかかる実施形態において、本発明の抗体は、授乳期間中の分泌のために、乳腺において発現される。形質転換動物は、マウス、ヤギ、ウサギを含むが、それらに限定されない。
【０１３８】
ｉ）モノクローナル抗体
（実施例１に記載されているような）モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、そして従来の方法を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）シークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい源として役に立つ。一度単離されると、当該ＤＮＡを発現ベクター中へ導入してもよく、そしてその後、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成するために、それは、Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中へ形質移入される。当該ＤＮＡはまた、例えば、コーディング配列を、相同なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常領域に置換することによって改変されてもよい。キメラまたはハイブリッド抗体はまた、架橋剤に関するものを含めて、合成タンパク質化学における既知の手法を使用してインビトロで調製されてもよい。たとえば、免疫毒素はジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築されてもよい。この目的のための好適な試薬の例は、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートを含む。
【０１３９】
（ii）ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト源からそれに導入された、一またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は通常、「インポート」残基と呼ばれ、そしてそれは通常、「インポート」可変領域から持ち込まれる。げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列と置換することによる、Ｗｉｎｔｅｒおよびその共働者の方法でヒト化を行なうことができる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｃｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３９７−４０２（２０００））。
【０１４０】
親のヒト化配列の三次元モデルを使用して、親の配列および様々な概念のヒト化産物の分析の過程によって、ヒト化抗体を調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、そして当業者に周知である。選択された候補の免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を描き、および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の精査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における、当該残基の考え得る役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンが、その抗原と結合する能力に影響を与える残基の分析を可能とする。この方法において、標的抗原（複数）に対する増大した親和性のような所望の抗体特性を達成するために、ＦＲ残基を選択し、そしてコンセンサスおよびインポート配列と結合することができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接的にそして最も実質的に抗原結合への影響に関連する。
【０１４１】
（iii ）抗体断片
様々な技術が、抗体断片の産生のために発展した。これらの断片は、組み換え宿主細胞によって産生され得る（Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５４８−５５７（１９９９）；Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０（２０００）に総説されている）。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、直接的にＥ．コリから回収され、そしてＦ（ａｂ’）2断片を形成するように、化学的に結合され得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７（１９９２））。別の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）2は、Ｆ（ａｂ’）2分子の構築を促進するために、ロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成される。別の手法に従って、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2断片は、組み換え宿主細胞培養から直接に単離され得る。
【０１４２】
実施例６
本発明の抗体を含む組成物
本発明の抗体は、癌を予防／治療するための組成物として使用され得る。本発明の抗体を含む、癌を予防／治療するための組成物は、低毒性であり、そしてそれらは液体調製物の形態として、またはヒトもしくは哺乳動物（例えばラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）にとって好適な調製物の医薬組成物として、経口または非経口的に（例えば血管内に、腹腔内に、皮下に、など）投与され得る。本発明の抗体は、それ自体で投与されてもよく、または好適な組成物として投与されてもよい。投与のために使用される組成物は、本発明の抗体もしくはその塩を有する、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含んでもよい。かかる組成物は、経口または非経口投与に好適である医薬調製物の形態で提供される。
【０１４３】
非経口投与のための組成物の例は、注射用調製物、坐薬などである。注射用調製物は、静脈注射、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射、点滴、間接内注射などのような投薬形態を含んでもよい。これらの注射用調製物は、公然知られた方法によって調製されてもよい。例えば、注射用調製物は、注射のために従来使用される無菌の水性培地または油性培地中で本発明の抗体もしくはその塩を溶解、懸濁または乳化することによって調製されてもよい。注射のための水性培地として、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の助剤を含む等張液などがあり、それらはアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化キャスターオイルのポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加体））などのような、好適な可溶化剤と組み合わせて使用されてもよい。油性培地として、例えばごま油、大豆油などが使用され、そしてそれらは、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどのような可溶化剤と組み合わせて使用されてもよい。したがって、調製された当該注射剤は通常、好適なアンプル中に注入される。直腸投与のために使用される坐剤は、本発明の抗体またはその塩と、坐薬に対する従来の基材とを混ぜ合わせることによって調製されてもよい。経口投与のための組成物は、固体または液体調製物を含み、特に、（糖衣錠およびフィルムコート錠を含む）錠剤、丸剤、顆粒剤、粉末状調製物、（軟カプセルを含む）カプセル、シロップ、乳剤、懸濁液などを含む。かかる組成物は、公然知られた方法によって製造され、そして医薬組成物の分野において従来から使用されているビヒクル、希釈剤または賦形剤を含んでもよい。錠剤のためのビヒクルまたは賦形剤の例は、ラクトース、スターチ、スクロース、ステアリン酸マグネシウムなどである。
【０１４４】
好都合にも、上に記載した経口または非経口の使用のための組成物は、活性成分の投与量に合わせるために好適である単位投与量の医薬組成物へと調製される。かかる単位投与量調製物は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射剤（アンプル）、坐剤などを含む。含まれている前記化合物の量は通常、約５〜約５００ｍｇ／用量単位形態であり；上で記載した抗体が、特に注射剤の形態で約５〜約１００ｍｇ含まれることが好ましく、そして他の形態で１０〜２５０ｍｇ含まれることが好ましい。
【０１４５】
前記の予防／治療剤、または本発明の抗体を含む調整剤の投与量は、投与されるべき対象、標的となる疾患、健康状態、投与経路などに依存して変化してもよい。例えば、成人における乳癌の治療／予防の目的のために使用されるとき、本発明の抗体を約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、そしてより好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、約１〜５回／日で、好ましくは約１〜３回／日で静脈内に投与することは有効である。他の非経口および経口投与において、当該薬剤は、上で示した用量に相当する用量で投与され得る。健康状態が特に重症であるとき、投与量はその健康状態に従って増加されてもよい。
【０１４６】
本発明の抗体は、そのままで、または好適な組成物の形態で投与されてもよい。投与のために使用される組成物は、前記抗体もしくはその塩を含む薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含んでもよい。かかる組成物は、経口または非経口投与（例えば血管内注射、皮下注射など）に好適な医薬組成物の形態で提供される。上で記載したそれぞれの組成物は、他の活性成分をさらに含んでもよい。さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例えばシクロホスファミド、イホスファミドなど）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、５−フルオロウラシルなど）、抗腫瘍抗生物質（例えばマイトマイシン、アドリアマイシンなど）、植物由来抗腫瘍剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールなど）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカンなどと組み合わせて使用されてもよい。本発明の抗体および上で記載した薬剤は、患者に同時に、または交互に投与されてもよい。
【０１４７】
本明細書において記載されている、特に癌に対する治療方法はまた、他の抗体または化学療法剤の投与と共に行なわれてもよい。例えば、アービタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）（登録商標）（セツキシマブ）のようなＥＧＦＲに対する抗体はまた、特に結腸癌を治療するときに投与されてもよい。アービタックス（登録商標）はまた、乾癬の治療に対して有効であることが示された。併用使用のための他の抗体は、特に乳癌を治療するときにおいてハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）を、特に結腸癌を治療するときにおいてアバスチン（登録商標）を、そして特に非小細胞肺癌を治療するときにおいてＳＧＮ−１５を含む。本発明の抗体の、他の抗体／化学療法剤との投与は同時に、または別々に、同じ経路で、または異なる経路で行なわれてもよい。
【０１４８】
化学療法剤／他の抗体の、利用される投与計画は、患者の疾患の治療にとって非常に好適であると考えられる全ての投与計画を含む。異なる悪性腫瘍は、特定の抗腫瘍抗体および特定の化学療法剤の使用を必要とすることができ、そしてそれは、患者を基準として患者に基づいて決定されるだろう。本発明の好ましい実施形態において、化学療法は、抗体治療と同時に、またはより好ましくは抗体治療の後で行なわれる。しかし、本発明は任意の特定の方法または投与経路に限定されないことは、強調されるべきである。
【０１４９】
証拠の優越は、ＡＲ９０Ａ５６．１１が、癌細胞株に存在するエピトープの連結を通じて、抗癌効果を仲介することを示す。さらに、ＡＲ９０Ａ５６．１１抗体が；ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、またはＩＨＣによって示されるが、それらに限定されない技術を利用することにより、エピトープを発現し、当該抗体と特異的に結合する細胞の検出に使用され得ることが示され得る。
【０１５０】
本明細書中において言及された全ての特許および刊行物は、本発明が関連する技術分野における当業者のレベルを示唆している。全ての特許および刊行物は、それぞれの個々の刊行物が、あたかも明確に、および個々に参照により組み込まれるように示唆されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
本発明の特定の形態が記載されているが、それは、本明細書において記載され、および示された特定の形態または一部の構成に限定されないことが理解されるだろう。様々な変更が、本発明の範囲から離れることなくなされてもよいことが、ならびに本発明が本明細書中に示され、および記載されたものに限定されるとは考えられないことが、当業者にとって明らかであるだろう。
【０１５２】
当業者は、本発明が、目的を実行し、そして本明細書中に記載された結果および効果、ならびにそこに記載されているに等しいものを得るために十分に適応されることを容易に理解するだろう。本明細書に記載された全てのオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連のある化合物、方法、手法および技術は、本明細書中の好ましい実施形態の代表例であり、例となるように意図されており、そして当該範囲を限定ものとして意図されていない。本発明の趣旨に含まれ、そして添付の特許請求の範囲によって定義されている変化ならびに他の使用を、当業者は気づくだろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されたが、クレームされた本発明が、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者にとって明らかである、本発明を実施するために記載された形式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図１】
2010516630.tif 000003
【図２】
2010516630.tif 000004
【図３】
2010516630.tif 000005
【図４】
2010516630.tif 000006
【図５】
2010516630.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月5日(2009.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された、単離モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１記載の単離モノクローナル抗体の抗原結合断片。
【請求項３】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体のヒト化バージョン、または前記ヒト化抗体から産生された抗原結合断片。
【請求項４】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体のキメラバージョン、または前記キメラ抗体から産生された抗原結合断片。
【請求項５】
細胞障害性部位、酵素、放射活性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部位、および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーと結合された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記単離抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項６】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された、単離ハイブリドーマ細胞株。
【請求項７】
受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体と同一のエピトープまたはエピトープ（複数）と特異的に結合することができるモノクローナル抗体。
【請求項８】
哺乳動物において抗体誘導細胞障害に対して感受性のあるヒト腫瘍を治療する方法であって、前記ヒト腫瘍が、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、または、標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗原結合断片と特異的に結合する、抗原の少なくとも一つのエピトープを発現し、前記哺乳動物へ前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を前記哺乳動物の腫瘍量を減少させるために有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
前記単離モノクローナル抗体が、細胞障害活性部位と複合化されている、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞障害活性部位が放射性同位体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のヒト化バージョンである、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のキメラバージョンである、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物におけるヒト腫瘍を治療する方法であって、前記ヒト腫瘍が、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、または、標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗原結合断片と特異的に結合する、抗原の少なくとも一つのエピトープを発現し、前記哺乳動物へ、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を、前記哺乳動物の腫瘍量を減少させるために有効な量で、少なくとも一つの化学療法剤と共に投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記単離モノクローナル抗体が細胞障害性部位と複合化されている、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞障害性部位が放射性同位体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のヒト化バージョンである、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記単離モノクローナル抗体が、前記単離モノクローナル抗体のキメラバージョンである、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
ＩＤＡＣ受入番号０５１２０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ９０Ａ５６．１１によって産生される単離モノクローナル抗体、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体の前記ヒト化抗体、または受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体の前記キメラ抗体によって特異的に結合される、ヒト腫瘍から選択された組織試料中における癌性細胞の存在を決定するための結合アッセイであって：
前記ヒト腫瘍由来の組織試料を提供すること；
ＩＤＡＣ受入番号０５１２０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ９０Ａ５６．１１によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されるものと同一のエピトープまたはエピトープ（複数）を認識する、少なくとも一つの前記単離モノクローナル抗体、前記ヒト化抗体、前記キメラ抗体またはその抗原結合断片を提供すること；
少なくとも一つの前記提供された抗体またはその抗原結合断片を、前記組織試料へ接触させること；および
前記の少なくとも一つの提供された抗体またはその抗原結合断片と前記組織試料との結合を決定すること
を含み；
それにより、前記組織試料中の前記癌性細胞の存在が示される、前記結合アッセイ。
【請求項１９】
請求項１〜５および７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片；
前記抗体またはその抗原結合断片と、細胞障害性部位、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部位および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーとの複合体；ならびに
必要量の薬学的に許容される担体；
を組み合わせて含む、ヒト癌性腫瘍を治療するために有効な組成物であって、
前記ヒト癌性腫瘍を治療するために有効である、前記組成物。
【請求項２０】
ヒト癌性腫瘍の存在を検出するためのアッセイキットであって、前記ヒト癌性腫瘍が受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、または標的抗原への前記単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、その抗原結合断片と特異的に結合する抗原の少なくとも一つのエピトープを発現し、受入番号０５１２０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された前記ハイブリドーマによって産生された前記単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、および前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、その存在が特定のカットオフレベルにおいて前記ヒト癌性腫瘍の前記存在を診断するポリペプチドと結合されているか否かを検出するための手段を含む、前記キット。
【国際調査報告】
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