(57)【要約】  重鎖可変ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、免疫抑制疾患の処置に好都合な性質を有することを特徴とする、ＣＣＲ５に結合する抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変ドメインが、配列番号１
【表６】
2010504739.tif 000007
（配列中、Ｘ０１はＬｙｓまたはＧｌｎであり、Ｘ０２はＧｌｎまたはＧｌｕであり、Ｘ０３はＡｒｇまたはＬｙｓであり、Ｘ０４はＬｅｕまたはＰｒｏであり、Ｘ０５はＭｅｔまたはＬｙｓであり、Ｘ０６はＩｌｅまたはＴｈｒであり、Ｘ０７はＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘ０８はＩｌｅまたはＴｈｒである）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＣＣＲ５に結合する抗体。
【請求項２】
軽鎖可変ドメインが、配列番号２
【表７】
2010504739.tif 000008
（配列中、Ｘ１０はＩｌｅまたはＡｌａであり、Ｘ１１はＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｘ１２はＧｌｎまたはＰｒｏであり、Ｘ１３はＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ１４はＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘ１５はＶａｌまたはＩｌｅであり、Ｘ１６はＧｌｎまたはＡｓｐであり、Ｘ１７はＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘ１８はＬｅｕまたはＡｌａであり、Ｘ１９はＬｙｓまたはＴｈｒであり、Ｘ２０はＡｓｎまたはＳｅｒであり、Ｘ２１はＬｅｕまたはＡｌａであり、Ｘ２２はＧｌｙまたはＡｌａであり、Ｘ２３はＡｓｎまたはＴｈｒであり、Ｘ２４はＬｅｕまたはＶａｌである）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のＣＣＲ５に結合する抗体。
【請求項３】
配列番号６、７、もしくは８、またはそのＣＣＲ５結合フラグメントの重鎖可変ドメインより選択される重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項記載のＣＣＲ５に結合する抗体。
【請求項４】
配列番号９もしくは１０、またはそのＣＣＲ５結合フラグメントの軽鎖可変ドメインより選択される軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載のＣＣＲ５に結合する抗体。
【請求項５】
抗体が、配列番号６、７、もしくは８、またはそのＣＣＲ５結合フラグメントより選択される重鎖可変ドメインを含むこと、および配列番号９もしくは１０、またはそのＣＣＲ５結合フラグメントより選択される軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とし、該重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが相互に独立して選択される、請求項３または４のいずれか一項記載のＣＣＲ５に結合する抗体。
【請求項６】
ヒト起源の定常領域を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載のＣＣＲ５に結合する抗体。
【請求項７】
重鎖定常領域が、ＣH１とＣH２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６〜２４０位で、かつ／またはＣH２とＣH３との間の第２ドメイン間領域のアミノ酸３２７〜３３１位で改変されているヒトＩｇＧ４アイソタイプまたはヒトＩｇＧ１アイソタイプのものであることを特徴とする、請求項６記載のＣＣＲ５に結合する抗体。
【請求項８】
配列番号３または４の重鎖定常領域を含み、かつ配列番号５の軽鎖定常領域を含むことを特徴とする、請求項６記載のＣＣＲ５に結合する抗体。
【請求項９】
ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものであり、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むこと、または突然変異Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４アイソタイプのものであることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項記載のＣＣＲ５に結合する抗体。
【請求項１０】
請求項１または２のいずれか一項記載の抗体を薬学的有効量で含む薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１または２のいずれか一項記載の抗体の薬学的有効量を含む薬学的組成物を製造するための方法。
【請求項１２】
薬学的組成物を製造するための、請求項１または２のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項１３】
薬として使用するための、請求項１または２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１４】
免疫抑制疾患の処置に使用するための、請求項１または２のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１５】
免疫抑制疾患を処置するための薬を製造するための、請求項１または２のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項１６】
請求項１または２のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を、免疫抑制疾患を患う患者に投与することを特徴とする、該患者を処置するための方法。
【請求項１７】
第２のポリペプチドと共に集合することができるポリペプチドをコードする核酸であって、該第２のポリペプチドが、配列番号２および５のポリペプチドの群より選択されるポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、配列番号１、６、７、または８のアミノ酸配列を含む核酸。
【請求項１８】
ＣＣＲ５に結合する抗体の鎖をコードする核酸であって、コードされる該鎖が、それぞれの他の抗体鎖と共に集合して、請求項１または２のいずれか一項記載のＣＣＲ５に結合する抗体分子を生じることができることを特徴とする核酸。
【請求項１９】
請求項１または２のいずれか一項記載のＣＣＲ５に結合する抗体をコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１９記載の核酸を含む真核細胞。
【請求項２１】
請求項１または２のいずれか一項記載のリコンビナントヒト抗体またはリコンビナントヒト化抗体を産生させるための方法であって、請求項１９記載の核酸が、原核または真核ホスト細胞に発現され、該リコンビナント抗体が、該細胞または該細胞の培養上清から回収されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＣＲ５に対する抗体、その産生方法、該抗体を含有する薬学的組成物、およびその使用に関するものである。
【０００２】
過去数年間にわたって、ＨＩＶ−１がターゲット細胞に侵入するために利用する特異的メカニズムの理解がますます深まった。これにより、この過程の別個の段階を攻撃する薬物を開発する努力が促進された。この侵入をターゲティングする最初の薬物が、臨床的使用について最近承認された（エンフュービルタイド（Ｔ２０）；Lazzarin, A., et al., N. Engl. J. Med. 348 (2003) 2186-2195）。エンフュービルタイドは、ケモカインレセプターの結合後の段階で融合を遮断するペプチド薬である。
【０００３】
ＨＩＶ−１の感染は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）と、ＣＤ４およびケモカインレセプターから構成される細胞レセプター複合体との間の相互作用によって開始する（Pierson, T.C. and Doms, R. W., Immuno. Lett. 85 (2003) 113-118；Kilby, J.M. and Eron, J.J., N. Engl. J. Med. 348 (2003) 2228-2238）。Ｅｎｖは二つのサブユニットを有する。細胞性ＣＤ４レセプターと相互作用し、ウイルス膜貫通サブユニットｇｐ４１と非共有結合的に会合する表面糖タンパク質ｇｐ１２０である。ｇｐ４１はウイルス膜にｇｐ１２０のアンカーを形成し、融合の原因ともなる。細胞上のＣＤ４へのｇｐ１２０の結合により、ｇｐ１２０が細胞表面のケモカインレセプターである「補助レセプター」と相互作用できるようにする結合部位を露出または創出するコンフォメーション変化がトリガーされる。ケモカインレセプターは、通常は走化機能、炎症機能、および他の機能を有する小型サイトカインであるケモカインに応答してシグナルを伝達する７回膜貫通Ｇタンパク質共役レセプター（７ＴＭ  ＧＰＣＲ）である。
【０００４】
臨床的に使用される大部分の薬物が他の７ＴＭ  ＧＰＣＲに対するものであることから、ウイルスの侵入を遮断するためにこれらの分子をターゲティングすることは、最も成功した種類の過去の薬物開発プログラムを延長したものである。ＨＩＶ−１単離株は、細胞に侵入し感染するためにＣＤ４および補助レセプターを必要とする。ヒトＣＣケモカインレセプターであるＣＣＲ５は、マクロファージ指向性（Ｒ５）株についての補助レセプターであり、ＨＩＶ−１の性伝染に重要な役割を果たす（Berger, E.A., AIDS 11 (Suppl. A) (1997) 3-16; Bieniasz, P.D. and Cullen, B. R., Frontiers in Bioscience 3 (1998) d44-d58; Littman, D.R., Cell 93 (1998) 677-680）。
【０００５】
ヒトＣＣＲ５（以後「ＣＣＲ５」と呼ぶ）は、大部分のＨＩＶ−１初代単離株に利用され、感染の樹立および維持に重要である。加えて、ＣＣＲ５の機能はヒトの健康に必須ではない。突然変異体ＣＣＲ５アレルである「ＣＣＲ５Δ３２」は、切断型非機能性タンパク質をコードする（Samson, M., et al., Nature 382 (1996) 722-725；Dean, M., et al., Science 273 (1996) 1856-1862）。この突然変異についてホモ接合性の個体はＣＣＲ５の発現を欠如し、ＨＩＶ−１感染から強く防御されている。この個体は、顕性の表現型事象を示さず、Ｍ指向性ＨＩＶ感染に高度に抵抗性である一方、ヘテロ接合性個体は疾患の進行遅延を示す（Schwarz, M. K. and Wells, T.N., Nat. Rev. Drug Discov. 1 (2002) 347-358）。ＣＣＲ５の欠如は、明白な有害事象を有さず、これは、おそらくＣＣＲ５が、αケモカインであるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳに対するレセプターとして高度に冗長なケモカインネットワークの一部であるからであり、これらのαケモカインは多数の重複する機能を共有し、その大部分は代替レセプターを有する（Rossi, D. and Zlotnik, A., Annu. Rev. Immunol. 18 (2000) 217-242）。ＨＩＶ−１の補助レセプターとしてのＣＣＲ５の同定は、そのリガンドであるＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳがＲ５Ｘ４単離株でもＸ４単離株でもなく、Ｒ５単離株による感染を遮断する能力に基づいた（Cocchi, F., et al., Science 270 (1995) 1811-1815）。
【０００６】
ＣＣＲ５は「クラスター」ケモカインのレセプターでもあり、クラスターケモカインは、主に炎症応答の間に産生され、好中球、マクロファージおよびＴ細胞サブセット（ＴヘルパーＴｈ１およびＴｈ２細胞）の動員をコントロールする。Ｔｈ１応答は、典型的には例えばウイルスおよび腫瘍に有効な細胞性免疫を伴う応答であるが、一方でＴｈ２応答はアレルギーに中心的であると考えられる。したがって、これらのケモカインレセプターの阻害剤は、免疫モデュレーター（immunomodulator）として有用なことがある。Ｔｈ１応答に関して、例えば慢性関節リウマチを含めた自己免疫における過剰活動性応答が減少し、Ｔｈ２応答に関して、喘息発作またはアトピー性皮膚炎を含めたアレルギー応答が軽減する（例えばSchols, D., Curr. Top. Med. Chem. 4 (2004) 883-893; Mueller, A. and Strange, P.G., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 (2004) 35-38; Kazmierski, W.M., et al., Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2 (2002) 265-278; Lehner, T., Trends Immunol. 23 (2002) 347-351を参照されたい）。
【０００７】
ＣＣＲ５に対する抗体は、例えば、ＰＲＯ１４０（Olson, W.C., et al., J. Virol. 73 (1999) 4145-4155）および２Ｄ７（Samson, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 24934-24941）である。さらなる抗体は、
【表１】
2010504739.tif 000002
に記載されている。
【０００８】
本発明の目的は、主にＡＩＤＳのための治療薬として使用される、新規なＣＣＲ５に対する抗体を提供することである。
【０００９】
発明の概要
本発明は、重鎖可変ドメインが、式
【表２】
2010504739.tif 000003
（配列中、
Ｘ０１はＬｙｓまたはＧｌｎであり、
Ｘ０２はＧｌｎまたはＧｌｕであり、
Ｘ０３はＡｒｇまたはＬｙｓであり、
Ｘ０４はＬｅｕまたはＰｒｏであり、
Ｘ０５はＭｅｔまたはＬｙｓであり、
Ｘ０６はＩｌｅまたはＴｈｒであり、
Ｘ０７はＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｘ０８はＩｌｅまたはＴｈｒである（配列番号１））
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ＣＣＲ５に結合する抗体を含む。
【００１０】
好ましくは、この抗体は、該抗体の軽鎖可変ドメインが、式
【表３】
2010504739.tif 000004
（配列中、
Ｘ１０はＩｌｅまたはＡｌａであり、
Ｘ１１はＰｈｅまたはＴｙｒであり、
Ｘ１２はＧｌｎまたはＰｒｏであり、
Ｘ１３はＳｅｒまたはＡｌａであり、
Ｘ１４はＧｌｎまたはＬｙｓであり、
Ｘ１５はＶａｌまたはＩｌｅであり、
Ｘ１６はＧｌｎまたはＡｓｐであり、
Ｘ１７はＳｅｒまたはＴｈｒであり、
Ｘ１８はＬｅｕまたはＡｌａであり、
Ｘ１９はＬｙｓまたはＴｈｒであり、
Ｘ２０はＡｓｎまたはＳｅｒであり、
Ｘ２１はＬｅｕまたはＡｌａであり、
Ｘ２２はＧｌｙまたはＡｌａであり、
Ｘ２３はＡｓｎまたはＴｈｒであり、
Ｘ２４はＬｅｕまたはＶａｌである（配列番号２））
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００１１】
好ましくは、この抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプまたはヒトＩｇＧ１アイソタイプであることを特徴とし、該ＩｇＧ１アイソタイプは、所望によりＣH１とＣH２との間のヒンジ領域のアミノ酸２１６〜２４０位で、および／またはＣH２とＣH３との間の第２ドメイン間領域のアミノ酸３２７〜３３１位で改変されている。
【００１２】
本発明の好ましい態様は、本発明に記載の抗体を含む薬学的組成物である。
【００１３】
本発明の好ましい態様は、薬学的組成物を製造するための本発明に記載の抗体の使用である。
【００１４】
本発明の好ましい態様は、本発明に記載の抗体を含む薬学的組成物を製造するための方法である。
【００１５】
本発明の好ましい態様は、第２のポリペプチドと共に集合することができるポリペプチドをコードする核酸であり、ここで、該第２のポリペプチドは、配列番号２および５のポリペプチドの群より選択されるポリペプチドを含み、一方で該ポリペプチドは、配列番号１、６、７、または８のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明の好ましい態様は、免疫抑制疾患を患う患者を処置するための方法であり、この方法は、治療有効量の本発明に記載の抗体をその患者に投与することを特徴とする。
【００１７】
本発明に記載の抗体は、好ましくは該抗体がＣＣＲ５に結合し、かつ配列番号６、７、もしくは８の重鎖可変ドメイン、配列番号９もしくは１０の軽鎖可変ドメイン、またはそのＣＣＲ５結合フラグメントの群より選択される可変重鎖または軽鎖ドメインを含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明に記載の抗体は、好ましくは配列番号６、７、もしくは８の重鎖可変ドメイン、またはそのＣＣＲ５結合フラグメントの群より選択される重鎖可変ドメインを重鎖可変ドメインとして有すること、および配列番号９もしくは１０の軽鎖可変ドメイン、またはそのＣＣＲ５結合フラグメントの群より選択される軽鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインとして有することを特徴とし、ここで、該重鎖および軽鎖可変ドメインは相互に独立して選択される。
【００１９】
本発明に記載の抗体は、好ましくは重鎖可変ドメインが、配列番号６、７、または８の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、さらに正確に言えば、この抗体が、配列番号６、７、もしくは８の重鎖可変ドメイン、またはそのＣＣＲ５結合フラグメントの重鎖可変ドメインより選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明に記載の抗体は、好ましくは軽鎖可変ドメインが、配列番号９または１０の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、さらに正確に言えば、この抗体が、配列番号９もしくは１０、またはそのＣＣＲ５結合フラグメントの軽鎖可変ドメインより選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明に記載の抗体は、好ましくは定常領域（軽鎖および重鎖）がヒト起源であることを特徴とする。このような定常領域（鎖）は、当技術分野の現状において周知であり、例えばKabatにより記載されている（例えばJohnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号３および４からなる群から独立して選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号５のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。この抗体がマウス起源であって、Kabatによるマウス抗体の抗体可変配列フレームを含むことがさらに好ましい（例えばJohnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。
【００２２】
この抗体は、ＣＣＲ５へのリガンドの結合およびシグナル伝達活性（例えば哺乳動物Ｇタンパク質の活性化、サイトソル遊離Ｃａ2+濃度の急速で一過性の増加の誘導、および／または細胞応答の刺激（例えば走化性、エキソサイトーシス、または白血球による炎症メディエーターの放出の刺激、インテグリンの活性化））などのヒトＣＣＲ５の一つまたは複数の機能を阻害する。この抗体は、ヒトＣＣＲ５へのＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、および／またはＨＩＶの結合を阻害し、白血球の輸送、細胞へのＨＩＶ侵入、Ｔ細胞活性化、炎症メディエーターの放出、および／または白血球の脱顆粒のような、ヒトＣＣＲ５により仲介される機能を阻害する。
【００２３】
本発明に記載の抗体は、ヒトＣＣＲ５に特異的に結合し、ウイルスの存在下で、４．０μg/ml以下のＩＣ50値でウイルスとターゲット細胞との間の膜融合を阻害するために有効な抗体濃度で該ターゲット細胞を抗体と接触させることを含むアッセイにおいて、該細胞とのＨＩＶの融合を阻害する。
【００２４】
本発明に記載の抗体は、ＣＣＲ５に特異的に結合し、１．５μg/ml以下、好ましくは０．３μg/ml以下のＩＣ50値でＣＣＲ５ポリペプチドおよびＣＤ４ポリペプチドを同時発現している第１の細胞と、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質を発現している第２の細胞との間の膜融合を阻害する。
【００２５】
本発明に記載の抗体は、ＣＣＲ５に特異的に結合し、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、および／またはＭＩＰ−１βの存在下で、１．５μg/ml以下のＩＣ50値でターゲット細胞を抗体と接触させることを含むアッセイにおいて、該ターゲット細胞における細胞応答の刺激を阻害し、好ましくは遊走を阻害する。
【００２６】
本発明に記載の抗体は、好ましくはＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、およびＣＸＣＲ４への結合アッセイにおいて、最大１００μg/mlの抗体濃度でケモカインの結合を阻害しない。
【００２７】
本発明に記載の抗体は、好ましくは最大５０μg/mlの抗体濃度で、ＣＣＲ５およびＧａｌｐｈａ１６を発現しているＣＨＯ細胞において検出された細胞内Ｃａ2+の増加を刺激しない。
【００２８】
本発明に記載の抗体は、好ましくはヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり、ここでＩｇＧ１またはＩｇＧ４が好ましい。
【００２９】
本発明に記載の抗体は、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプである。本発明に記載の抗体は、好ましくはＩｇＧ１アイソタイプである。本発明に記載の抗体は、好ましくは突然変異Ｓ２２８Ｐを有するＩｇＧ４アイソタイプである。本発明に記載の抗体、すなわち重鎖および軽鎖定常領域は、ＣH１とＣH２との間のヒンジ領域のアミノ酸約２１６〜２４０位で、好ましくはアミノ酸約２２０〜２４０位で（Angal, S., et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108）、および／またはＣH２とＣH３との間の第２のドメイン間領域のアミノ酸約３２７〜３３１位で改変されているＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプである（Kabatによる付番、例えばJohnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。このような改変は、エフェクター機能（ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ）を低下または回避する。ＩｇＧのクラススイッチは、抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常ドメインをＩｇＧ１突然変異体またはＩｇＧ４のような所望のクラスの抗体からのものにより交換することにより行うことができる。このような方法は、当技術分野の現状において周知である。
【００３０】
本発明に記載の抗体は、好ましくはＬ２３４（アミノ酸２３４位のロイシン）、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、および／またはＰ３２９（ＥＵインデックスによる付番）に少なくとも一つの突然変異を有するヒトサブクラスＩｇＧ１であることを特徴とする。好ましくは、この抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ（アミノ酸２３４位にロイシンの代わりにアラニン）およびＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１アイソタイプである。本発明に記載の抗体は、好ましくはＳ２２８位に突然変異を有するヒトＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする。
【００３１】
したがって本発明は、一局面では、抗体に関するものであり、この抗体は、該抗体がＣＣＲ５と結合し、ヒト起源のＦｃ部を有し、ヒト補体Ｃ１ｑ因子と結合せず、かつ／または補体Ｃ３因子を活性化することを特徴とする。好ましくは、この抗体は、ヒトＦｃγレセプターへの結合低下を示すか、またはヒトＦｃγレセプターに結合しない。
【００３２】
本発明は、さらに本発明に記載の抗体鎖、可変ドメイン、またはそのＣＤＲをコードする核酸分子を含む。コードされているポリペプチドは、それぞれの他の抗体鎖と共に集合して、本発明に記載のＣＣＲ５に対する抗体分子を生じることができる。
【００３３】
本発明は、さらに原核または真核ホスト細胞において該核酸を発現することができる、本発明に記載の該核酸を有する発現ベクター、およびそのような抗体をリコンビナント産生させるためにそのようなベクターを有するホスト細胞を提供する。
【００３４】
本発明は、さらに本発明に記載のベクターを含む原核または真核ホスト細胞を含む。
【００３５】
本発明は、さらに本発明に記載のリコンビナントヒト抗体またはヒト化抗体を産生させるための方法を含み、この方法は、原核または真核ホスト細胞に本発明に記載の核酸を発現させることおよび該細胞または細胞培養上清から該抗体を回収することを特徴とする。本発明は、さらにこのようなリコンビナント法により得ることができる抗体を含む。
【００３６】
本発明に記載の抗体は、ＣＣＲ５ターゲティング療法を必要とする患者に利益を生む。本発明に記載の抗体は、そのような疾患を患う、特に免疫抑制を患う、特にＨＩＶ感染を患う患者に利益をもたらす新しい発明的な性質を有する。
【００３７】
本発明は、さらに免疫抑制を患う患者、特にＨＩＶ感染を患う患者を処置するための方法を提供し、この方法は、そのような疾患を有する（したがって、そのような治療が必要である）と診断された患者に、本発明によるＣＣＲ５に結合する抗体の有効量を投与することを含む。この抗体は、好ましくは薬学的組成物に入れて投与される。
【００３８】
本発明は、さらに免疫抑制疾患の処置のため、好ましくはＨＩＶ感染の処置のため、免疫抑制を患う患者の処置のため、および本発明による薬学的組成物を製造するための薬として本発明に記載の抗体を使用することを含む。加えて、本発明は、本発明による薬学的組成物を製造するための方法を含む。
【００３９】
本発明は、さらに本発明に記載の抗体を含有する薬学的組成物を薬学的有効量で、所望により薬学的な目的のために抗体を製剤するために有用な緩衝剤および／または佐剤と共に含む。
【００４０】
本発明は、さらに薬学的に許容される担体中にそのような抗体を含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、製品またはキットに包含されていてもよい。
【００４１】
したがって、本発明の一局面は、薬として使用するための本発明に記載の抗体である。本発明の別の局面は、免疫抑制疾患の処置に使用するための本発明に記載の抗体である。また、一局面は、免疫抑制疾患の処置のための薬を製造するための本発明に記載の抗体の使用である。
【００４２】
発明の詳細な説明
用語「抗体」は、抗体全体および抗体フラグメントを含むが、それに限定されるわけではない抗体構造の様々な形態を包含する。本発明に記載の抗体は、好ましくはヒト化抗体、キメラ抗体、または本発明に記載の特徴的性質が保たれる限りにおいてさらに遺伝子操作された抗体である。
【００４３】
「抗体フラグメント」は、抗体全長の部分、好ましくはその可変ドメインまたは少なくともその抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例には、二重特異性抗体（diabody）、一本鎖抗体分子、免疫毒素、および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHuston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載されている。加えて、抗体フラグメントは、ＶHドメインの特徴を有する、すなわちＶLドメインと共に集合することができる一本鎖ポリペプチド、またはＣＣＲ５に結合するＶLドメインの特徴を有する、すなわちＶHドメインと共に機能性抗原結合部位に集合することができる一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、ターゲット細胞との膜融合またはＨＩＶの融合を阻害する性質を提供することができる。
【００４４】
本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を表す。用語「キメラ抗体」は、マウス由来の可変ドメイン、すなわち結合領域、および異なる供給源または種から得られた定常領域の少なくとも部分を含む、通常はリコンビナントＤＮＡ技法により調製されたモノクローナル抗体を表す。マウス可変ドメインおよびヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変ドメインをコードするＤＮＡセグメントおよびヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明により包含される他の形態の「キメラ抗体」は、本来の抗体からクラスまたはサブクラスが改変または変更された抗体である。そのような「キメラ」抗体は、「クラススイッチされた抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体を産生させるための方法は、当技術分野で周知の通常のリコンビナントＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション技法を伴う。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５，２０２，２３８号、および第５，２０４，２４４号を参照されたい。
【００４５】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク領域および／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのＣＤＲに比べて異なる種の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変された抗体を表す。好ましい態様では、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に接ぎ合わせて「ヒト化抗体」が調製される。例えば、Riechmann, L, et al., Nature 332 (1988) 323-327；およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体および二機能性抗体についての、上に言及された抗原を認識する配列を表すＣＤＲに相当する。
【００４６】
本明細書に使用する用語「ＣＣＲ５への結合」は、細胞に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＣＣＲ５発現細胞は、例えばトランスフォーメーションされたＣＨＯ細胞、Ｌ１．２細胞）におけるＣＣＲ５への抗体の結合を意味する。抗体濃度１００ng/mlでその抗体が５以上、好ましくは１０以上のＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を起こす場合に結合が見出される。
【００４７】
本明細書に使用する用語「７回膜貫通ケモカイン分子構造」は、ＣＣＲ５が細胞膜二重層中に位置する場合にＣＣＲ５が示す天然構造を表す（例えばOppermann, M., Cell. Sig. 16 (2004) 1201-1210を参照されたい）。他のＧタンパク質共役レセプター（例えばＧタンパク質共役レセプター１ｂ）のように、ＣＣＲ５は、細胞外Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質Ｃ末端ドメインから構成される。膜貫通ドメインは、３個の細胞質セグメントおよび３個の細胞外セグメントにより連結された７個の疎水性膜貫通セグメントからなる。本発明に記載の抗体は、ＣＣＲ５の７回膜貫通ケモカイン分子構造をとるＣＣＲ５に結合する。
【００４８】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常はアミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基（surface grouping）からなり、通常エピトープは特異的三次元構造特徴および特異的な電荷の特徴を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、後者ではなく前者への結合が、変性溶媒の存在下で失われることで区別される。好ましくは、本発明に記載の抗体は、変性したＣＣＲ５ではなく、ネイティブなＣＣＲ５に特異的に結合する。
【００４９】
用語「膜融合」は、ＣＣＲ５ポリペプチドおよびＣＤ４ポリペプチドを同時発現している第１の細胞と、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質を発現している第２の細胞との間の融合を表す。膜融合は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにより判定される。
【００５０】
用語「ターゲット細胞とのＨＩＶの融合を阻害する」は、該ウイルスの存在下で、ウイルスと該細胞との間の膜融合を阻害するために有効な抗体濃度で、ターゲット細胞を抗体と接触させること、およびルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定することを含むアッセイにおいて測定された、ターゲット細胞とのＨＩＶの融合を阻害することを表す。
【００５１】
本明細書に使用する「可変ドメイン」（軽鎖（ＶL）可変ドメイン、重鎖（ＶH）可変ドメイン）は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインの対のそれぞれを意味する。可変軽鎖および可変重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、３個の「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）により繋がった４個のフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、そのフレームワーク領域の配列は、広く保存されている。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採り、ＣＤＲはβシート構造を繋ぐループを形成することがある。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によりその三次元構造を保持し、もう一方の鎖由来のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に記載の抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たすことから、本発明のさらなる目的を提供する。
【００５２】
本発明に記載の抗体は、好ましくは該抗体が、
ａ）配列番号６のアミノ酸配列により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列により定義される軽鎖可変ドメイン；
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号１０のアミノ酸配列により定義される軽鎖可変ドメイン；
ｃ）配列番号７のアミノ酸配列により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列により定義される軽鎖可変ドメイン；
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号１０のアミノ酸配列により定義される軽鎖可変ドメイン；
ｅ）配列番号８のアミノ酸配列により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号９のアミノ酸配列により定義される軽鎖可変ドメイン；
ｆ）配列番号８のアミノ酸配列により定義される重鎖可変ドメインおよび配列番号１０のアミノ酸配列により定義される軽鎖可変ドメイン
からなる組合せの群より選択される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
【００５３】
本明細書に使用する場合の用語「抗体の抗原結合部分」は、抗原の結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を表す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書に定義される超可変領域の残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４というドメインを含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原の結合に最も寄与する領域であり、抗体の性質を定義する。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Publication No. 91-3242 (1991)の標準的な定義および／または「超可変ループ」由来の残基にしたがって決定される。
【００５４】
本明細書に使用する用語「核酸」または「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５５】
本出願の中で使用する用語「アミノ酸」は、アラニン（三文字表記：ａｌａ、一文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｄ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然カルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【００５６】
核酸は、別の核酸との機能的関係に置かれている場合に「作動可能に連結」している。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に、そのポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結しており、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合にコード配列に作動可能に連結しており、またリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合に、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結している」は、連結されているＤＮＡ配列が同一鎖上にあり、分泌リーダーの場合には隣接してリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、通常の慣例により合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００５７】
本明細書に使用する表現「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は、相互交換可能に使用され、そのような全ての名称には子孫が含まれる。したがって、「トランスフォーマント」および「トランスフォーメーションされた細胞」という語には、初代対象細胞、およびそれから得られた培養物が、継代回数を考慮せずに含まれる。全ての子孫は、計画的または偶発的な突然変異が原因で、ＤＮＡ含量が正確には同一ではない可能性があることもまた了解されている。当初トランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫が含まれる。
【００５８】
抗体の「Ｆｃ部」は、抗原への抗体の結合に直接関与するのではなく、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体すなわち免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのクラスに分類され、これらのうちいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に、例えばＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に、ＩｇＡはＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類されることがある。重鎖定常領域によると、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。本発明に記載の抗体は、好ましくはＩｇＧ型である。
【００５９】
本明細書に使用する用語「ヒト起源から得られるＦｃ部」は、サブクラスＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部、またはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ３のヒト抗体のＦｃ部のいずれかであるＦｃ部を、その突然変異形態を含めて意味する。好ましくは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３のヒト抗体のＦｃ部は、未改変Ｆｃ部に比べて、下に定義するＦｃγレセプター（ＦｃγＲ、すなわちＦｃγＲＩＩＩａ）の結合低下もしくは無結合、および／またはＣ１ｑの結合低下もしくは無結合を検出することができるように改変されている。「抗体のＦｃ部」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づき定義される。本発明に記載の抗体は、Ｆｃ部としてヒト起源から得られるＦｃ部、および好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を有する。好ましくは、Ｆｃ部はヒトＦｃ部であり、特に好ましくはヒトＩｇＧ４サブクラス、もしくはヒトＩｇＧ１サブクラス由来であるか、またはヒトＩｇＧ１サブクラス由来の突然変異Ｆｃ部であるかのいずれかである。配列番号３、配列番号４、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する配列番号３、または突然変異Ｓ２２８Ｐを有する配列番号４に示されるＦｃ部および重鎖定常領域が最も好ましい。
【００６０】
ＩｇＧ４は、Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲＩＩＩａ）との結合低下を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は、強い結合を示す。しかし、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃの糖質を欠如）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、およびＨｉｓ４３５は、変化した場合にＦｃレセプターの結合低下もまた提供する残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119；Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；EP0307434）。好ましくは、本発明に記載の抗体は、Ｆｃγレセプターの結合に関して、Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５、および／もしくはＤ２６５に突然変異をもち、かつ／またはＰＶＡ２３６突然変異を有するＩｇＧ４サブクラスまたはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２サブクラスである。好ましくは、突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、および／またはＰＶＡ２３６である（ＰＶＡ２３６は、ＩｇＧ１のアミノ酸２３３位から２３６位までのアミノ酸配列ＥＬＬＧ（一文字アミノ酸コードで表す）またはＩｇＧ４のＥＦＬＧがＰＶＡによって置き換えられていることを意味する）。ＩｇＧ４の突然変異Ｓ２２８Ｐ、ならびにＩｇＧ１のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａが特に好ましい。
【００６１】
抗体のＦｃ部は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部への補体Ｃ１ｑ因子の結合により開始する。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位で所定のタンパク質−タンパク質相互作用により起きる。そのようなＦｃ部の結合部位は、当技術分野の現状において公知であり、例えばLukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560；Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917；Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344；Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004；Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184；Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168；Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；およびEP0307434により記載されている。そのようなＦｃ部の結合部位は、例えばアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（KabatのＥＵインデックスに準じて付番）を特徴とする。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は、通常はＣ１ｑおよびＣ３の結合を含めた補体活性化を示し、一方でＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑおよびＣ３と結合しない。
【００６２】
すなわち、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣが必要な場合には、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃ部が好ましく、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの低下または不在が必要な場合には、ＩｇＧ４サブクラスまたは改変／突然変異ＩｇＧ１サブクラスのＦｃ部が好ましい。本発明は、一局面ではＣＣＲ５と結合する抗体を表し、Ｆｃγレセプターおよび／または補体Ｃ１ｑ因子との結合低下または無結合を示す。Ｆｃレセプターおよび／または補体Ｃ１ｑ因子と結合しない抗ＣＣＲ５抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しないが、一方で、Ｆｃレセプターおよび／または補体Ｃ１ｑ因子に対する結合低下を示す抗ＣＣＲ５抗体は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの低下を示す。好ましくは、そのような抗体は、ＣＣＲ５と結合し、ヒト起源から得られたＦｃ部を有し、Ｆｃレセプターおよび／または補体Ｃ１ｑ因子と結合しないか、またはその結合低下を示す。さらに好ましくは、この抗体は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはＴ細胞抗原を枯渇された抗体である。Ｃ１ｑの結合は、Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に準じて測定することができる。そのようなアッセイにおいて、８μg/mlの抗体濃度で被験抗体についての４９２〜４０５nmにおける吸光度（ＯＤ）が、未改変野生型抗体のＦｃ部のヒトＣ１ｑ結合についての値の１５％未満である場合には、「Ｃ１ｑの結合」は見出されない。「Ｃ１ｑの結合」低下は、同条件で未改変野生型抗体のＦｃ部のヒトＣ１ｑ結合についての値の１５％〜３０％の範囲にある。ＡＤＣＣは、ヒトＮＫ細胞上のヒトＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合として測定することができる。結合は、抗体濃度２０μg/mlで決定される。「Ｆｃγレセプターの無結合」または「ＡＤＣＣなし」は、２０μg/mlの抗体濃度で、ヒトＩｇＧ１（配列番号３）と同じ抗体の結合に比べて、ヒトＮＫ細胞上のヒトＦｃγＲＩＩＩａへの最大３０％の結合を意味する。「Ｆｃγレセプターの結合低下」または「ＡＤＣＣ低下」は、ヒトＩｇＧ１（配列番号３）と同じ抗体の結合に比べて、ヒトＮＫ細胞上のヒトＦｃγＲＩＩＩａに３０％〜最大６０％の結合を意味する。
【００６３】
本発明の別の局面は、ＣＣＲ５と結合し、かつＦｃγレセプターおよび／または補体Ｃ１ｑ因子ともまた実際に結合する抗体である。Ｆｃレセプターおよび／または補体Ｃ１ｑ因子と実際に結合する抗ＣＣＲ５抗体は、実際に抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発する。好ましくは、この抗体は、ＣＣＲ５と結合し、ヒト起源由来のＦｃ部を有し、実際にＦｃレセプターおよび／または補体Ｃ１ｑ因子ともまた結合することを特徴とする。さらに好ましくは、この抗体は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはＴ細胞抗原を枯渇された抗体である。Ｃ１ｑの結合は、Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184により測定することができる。ＡＤＣＣは、ヒトＮＫ細胞上のヒトＦｃγＲＩＩＩａへの抗体の結合として測定することができる。結合は、２０μg/mlの抗体濃度で決定される。
【００６４】
加えて、本発明に記載の抗体には、「保存的配列改変」（変異型抗体）、ヌクレオチド配列改変およびアミノ酸配列改変を有する抗体が含まれるが、これらの改変は、本発明に記載の抗体の上記特徴に影響せず、この特徴を変化させもしない。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発などの、当技術分野で公知の標準的な技法により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられているものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、ヒト抗ＣＣＲ５抗体における予測される可欠アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基によって置き換えることができる。したがって、「変異体」抗ＣＣＲ５抗体は、本明細書においてアミノ酸配列が、親抗体の一つまたは複数の可変領域における最大１０個、好ましくは約２〜約５個の付加、欠失および／または置換により「親」抗ＣＣＲ５抗体のアミノ酸配列と異なる分子を表す。アミノ酸置換は、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327およびQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033に記載されたような分子モデリングに基づく突然変異誘発により行うことができる。
【００６５】
本発明のさらなる態様は、Ｆｃγレセプターおよび／またはＣ１ｑに結合しないかまたは結合低下を示す、ＣＣＲ５に対する抗体を産生させるための方法であり、この方法は、ＣＣＲ５に結合するヒトＩｇＧ１型抗体の重鎖をコードする核酸配列が改変されていることにより、該改変された抗体がＣ１ｑおよび／またはＦｃγレセプターに結合しないか、または結合低下を示し、該改変された核酸および該抗体の軽鎖をコードする核酸が、発現ベクターに挿入され、該ベクターが真核ホスト細胞に挿入され、コードされるタンパク質が発現され、ホスト細胞または上清から回収されることを特徴とする。好ましくは、抗体は「クラススイッチ」、すなわち好ましくはＩｇＧ１ｖ１（ＰＶＡ−２３６；ＧＬＰＳＳ３３１）、ＩｇＧ１ｖ２（Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ）、ＩｇＧ１ｖ３（Ｓ２２８Ｐ；Ｌ２３５Ｅ）、ＩｇＧ１ｘ（Ｓ２２８Ｐ）、ＩｇＧ４ｖ１（ＰＶＡ−２３６）として定義されるＦｃ部の変更または突然変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４、および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４の突然変異）により改変されている。ＧＬＰＳＳ３３１は、突然変異Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓを意味する。
【００６６】
配列に関する同一性または相同性は、本明細書において最大の配列同一率を達成するために配列をアライメントし、必要ならばギャップを導入した後で親配列と同一な、候補配列におけるアミノ酸残基の率として定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部の伸長、欠失、または挿入のどれも、配列同一性または相同性に影響するとみなしてはならない。変異体は、ヒトＣＣＲ５と結合する能力を保持し、好ましくは親抗体よりも優れた性質を有する。例えば、変異体は、処置の間の副作用が軽減することがある。
【００６７】
本明細書における「親」抗体は、変異体の調製に使用されるアミノ酸配列によってコードされる抗体である。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、存在する場合には、ヒト抗体定常領域またはヒト抗体定常ドメインを有する。例えば、親抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。
【００６８】
本発明に記載の抗体は、リコンビナント手段により好ましくは産生される。そのような方法は、当技術分野の現状において広く公知であり、抗体ポリペプチドのその後の単離および通常は薬学的に許容される純度への精製を伴う、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質の発現を含む。タンパク質の発現のために、軽鎖および重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸は、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはイー・コリ（E. coli）細胞などの適切な原核または真核ホスト細胞において行われ、抗体は、その細胞から回収される(上清から、または細胞溶解後に)。
【００６９】
抗体のリコンビナント産生は、当技術分野の現状において周知であり、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202；Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282；Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160；Werner, R.G., Arzneimittelforschung-Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説に記載されている。
【００７０】
抗体は、細胞全体、細胞溶解物、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態の中に存在してもよい。精製は、他の細胞構成要素または他の混入物、例えば他の細胞の核酸またはタンパク質を除去するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により行われる。Ausubel, F., et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。
【００７１】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123；Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837；Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J.およびChristensen, K.（Cytotechnology 30 (1999) 71-83）により、そしてSchlaeger, E.-J.（J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199）により記載されている。
【００７２】
モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製手順により培養液から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、通常の手順を使用して容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡおよびＲＮＡの起源として役立つことができる。いったん単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いでそれをＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞などのホスト細胞にトランスフェクションして、このホスト細胞におけるリコンビナントモノクローナル抗体の合成を達成することができ、このホスト細胞は、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない。
【００７３】
ヒトＣＣＲ５抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするＤＮＡに適切なヌクレオチドの変更を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。しかし、そのような改変は、例えば上記のように非常に限られた範囲内でのみ行うことができる。例えば、改変は、ＩｇＧアイソタイプおよびエピトープの結合などの上記の抗体の特徴を変化させるのではなく、リコンビナント産生の収率またはタンパク質の安定性を改善することがあるし、精製を容易にすることもある。
【００７４】
抗ＣＣＲ５抗体の適正なコンフォメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を改善するために、そして異常な架橋を防止するために、一般にセリンに置換されることがある。逆に、抗体の安定性を改善するために（特にその抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合に）システイン結合をその抗体に付加してもよい。
【００７５】
抗体の別種のアミノ酸変異体は、その抗体の本来のグリコシル化パターンを変化させたものである。「変化させる」によって、抗体に見出された一つもしくは複数の糖質部分を除去すること、および／または抗体に存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合型である。用語「Ｎ−結合型」は、アスパラギン残基の側鎖への糖質部分の結合を表す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に結合させるための認識配列である。したがって、ポリペプチドにこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的グリコシル化部位が創出される。抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が（Ｎ−結合型グリコシル化部位について）一つまたは複数の上記トリペプチド配列を有するようにそのアミノ酸配列を変化させることによって好都合に実現される。
【００７６】
抗ＣＣＲ５抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の多様な方法により調製される。これらの方法には、天然起源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）、またはヒト化抗ＣＣＲ５抗体の初期調製された変異体もしくは非変異体版のオリゴヌクレオチド介在性（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００７７】
別種の共有結合性改変は、抗体にグリコシドを化学的または酵素的に共役させることを伴う。これらの手順は、Ｎ−またはＯ−結合型グリコシル化を行うことができるホスト細胞で抗体を産生させる必要がない点で有利である。使用するカップリング様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよび／もしくはヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）（システインなどの）遊離スルフヒドリル基、（ｄ）（セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンなどの）遊離ヒドロキシル基、（ｅ）（フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンなどの）芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は、WO87/05330およびAplin, J.D. and Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. 10 (1981) 259-306に記載されている。
【００７８】
抗体上に存在する任意の糖質部分の除去は、化学的または酵素的に成し遂げてもよい。化学的脱グリコシル化は、化合物であるトリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物に抗体を曝露する必要がある。この処置の結果として、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分または全ての糖の切断が生じるが、抗体はインタクトなまま残る。化学的脱グリコシル化は、Sojar, H.T. and Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57；Edge, A.S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137により記載されている。抗体上の糖質部分の酵素的切断は、Thotakura, N.R. and Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359により記載されているように多様なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。
【００７９】
抗体の別種の共有結合的改変は、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、第４，１７９，３３７号に示される方法で、多様な非タンパク質性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンに抗体を連結することを含む。
【００８０】
本発明に記載の重鎖および軽鎖可変ドメインは、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域の配列、３’非翻訳領域の配列、ポリアデニル化配列、および転写終結配列と組合されて、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖発現構築物を単一のベクターに組合せ、ホスト細胞に共トランスフェクション、連続トランスフェクション、または別々にトランスフェクションし、次いでそのホスト細胞を融合させて、両方の鎖を発現する単一のホスト細胞を形成させることができる。
【００８１】
本発明は、好ましくはヒト血漿試料の可溶性ＣＣＲ５（Tsimanis, T., Immunology Letters 96 (2005) 55-61）と本発明に記載の抗体との間の結合を測定する免疫学的アッセイによって、ＡＩＤＳの感受性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断するために本発明に記載の抗体を使用することをさらに含む。ＣＣＲ５の発現は、疾患の進行と相関を有するため、ＡＩＤＳの感受性について低リスクまたは高リスクな個体を同定するために使用することができる。診断目的のために、抗体または抗原結合性フラグメントは、ラベルされていることがあるし、ラベルされていないこともある。典型的には、診断アッセイは、ＣＣＲ５への抗体または抗体フラグメントの結合に起因する複合体の形成を検出することを伴う。
【００８２】
別の局面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体の一つもしくは組合せ、またはその抗原結合性部分が薬学的に許容される担体と共に製剤されたものを含有する組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【００８３】
本明細書に使用する「薬学的に許容され得る担体」には、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収／再吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性の類似物が挙げられる。好ましくは、担体は注射または点滴に適する。
【００８４】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の多様な方法により投与することができる。当業者により認識されているように、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変動するものである。
【００８５】
薬学的に許容され得る担体には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液を調製するための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためにそのような媒質および薬剤を使用することは、当技術分野において公知である。担体は、水に加えて例えば等張緩衝食塩水でありうる。
【００８６】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用することができる本発明の化合物および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の通常の方法により、薬学的に許容され得る剤形に製剤される。
【００８７】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、特定の患者に対して毒性を示さずに、その患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を実現するために有効な活性成分の量（有効量）を得るように変動させることができる。選択された投薬レベルは、採用された本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、採用される特定の化合物の投与経路、投与時間、および排泄速度、採用された特定の組成物と共に使用された他の薬剤、化合物、および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、および病歴、ならびに医学の分野で周知の類似の要因を含む多様な薬物動態学的要因に依存するものである。
【００８８】
本発明は、ＡＩＤＳなどの免疫不全症候群を有する患者、免疫抑制を起こす放射線療法、化学療法、自己免疫疾患のための治療法もしくは他の薬物療法（例えばコルチコステロイド療法）を受けている患者における免疫抑制などの免疫抑制を患う患者を処置するために、またはＧｖＨＤもしくはＨｖＧＤ（例えば移植後）を患う患者を処置するために、本発明に記載の抗体を使用することを含む。本発明は、そのような免疫抑制を患う患者を処置するための方法もまた含む。
【００８９】
本発明は、さらに本発明に記載の抗体の有効量を、薬学的に許容され得る担体と共に含む薬学的組成物を製造するための方法、およびそのような方法のために本発明に記載の抗体を使用することを提供する。本発明は、薬として使用するための本発明に記載の抗体もまた提供する。免疫抑制疾患を処置するための本発明に記載の抗体もまた提供する。
【００９０】
本発明は、さらに免疫抑制を患う患者を処置するための医薬品を製造するために、本発明に記載の抗体を有効量で、好ましくは薬学的に許容される担体と共に使用することを提供する。
【００９１】
本発明は、ＣＣＲ５により仲介される炎症メディエーターの放出を患う患者を処置するための医薬品を製造するために、本発明に記載の抗体を有効量で、好ましくは薬学的に許容され得る担体と共に使用することもまた提供する。
【００９２】
以下の実施例および配列リストは、本発明の理解を助けるために提供されるが、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなしに、示された手順に改変を加えることができることが了解されている。
【００９３】
配列の説明
配列番号１      式Ｉ、重鎖可変ドメイン
配列番号２      式ＩＩ、軽鎖可変ドメイン
配列番号３      γ１重鎖定常領域
配列番号４      γ４重鎖定常領域
配列番号５      κ軽鎖定常領域
配列番号６      重鎖可変ドメイン
配列番号７      重鎖可変ドメイン
配列番号８      重鎖可変ドメイン
配列番号９      軽鎖可変ドメイン
配列番号１０    軽鎖可変ドメイン
【００９４】
実施例１
抗体のリコンビナント産生
本発明に記載の抗体を発現させるためのベクターを、以下のように構築した。重鎖発現ベクターは、発現ベクターｐＳＶｇｐｔ中でヒトＩｇＧ１（配列番号３）定常領域に重鎖可変ドメインを連結することによって構築した。軽鎖発現ベクターは、発現ベクターｐＳＶｈｙｇ中でヒトκ軽鎖定常領域（配列番号５）に軽鎖可変ドメインを連結することによって構築した。リーダーシグナルペプチド、リーダーイントロンおよびマウス免疫グロブリンプロモーターを含めた５’フランキング配列ならびにスプライス部位およびイントロン配列を含めた３’フランキング配列を、テンプレートとしてベクターＶＨ−ＰＣＲ１およびＶＫ−ＰＣＲ１を使用して導入した。重鎖および軽鎖発現ベクターは、ＮＳ０細胞（ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３、免疫グロブリン無産生マウス骨髄腫）に共トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞クローンは、ヒトＩｇＧについてのＥＬＩＳＡによりヒト抗体の産生についてスクリーニングした。
【００９５】
実施例２
突然変異（変異）型抗ＣＣＲ５抗体のための発現プラスミドの構築
突然変異型抗ＣＣＲ５抗体の重鎖および軽鎖をコードする発現プラスミドは、QuickChange（商標）部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を使用した発現プラスミドの部位特異的突然変異誘発によって創出したが、これを表１に説明する。アミノ酸は、ＥＵ付番に準じて付番した（Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85；Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD, Publication No. 91-3242 (1991)）。
【００９６】
表１に定常鎖（Ｆｃ）の突然変異体を示す。
【００９７】
【表４】
2010504739.tif 000005
【００９８】
突然変異の説明：Ｌ２３４ＡはＫａｂａｔのアミノ酸２３４位のロイシンがアラニンに変更されていることを意味する。
【００９９】
実施例３
細胞−細胞融合アッセイ
１日目に、ｇｐ１６０を発現しているＨｅＬａ細胞（２×１０4個／５０μl／ウェル）を１０％(v/v)ＦＣＳおよび２μg/mlドキシサイクリンを補充したＤＭＥＭ培地に入れて白色９６マイクロタイタープレート中に蒔いた。２日目に、ウェル１個あたり１００μlの上清試料または抗体対照を透明の９６マイクロタイタープレートに加えた。次いで、培地に懸濁した８×１０4個のＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ細胞１００μlを添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。ＨｅＬａ細胞の培養液を９６ウェルプレートから吸引し、２００μlから１００μlの抗体／ＣＥＭ−ＮＫｒ−Ｌｕｃ混合液を添加し、３７℃で一晩インキュベーションした。３日目に１００μl/ウェルのBright-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（１，４−ジチオトレイトールおよび亜ジチオン酸ナトリウム；Promega Corp., USA）を添加し、室温で最低１５分間インキュベーションした後に発光を測定した。
【０１００】
材料：
ＨｅＬａ−Ｒ５−１６細胞（ドキシサイクリンの誘導に応答してＨＩＶのｇｐ１６０を発現する細胞系）は、栄養素および１０％(v/v)ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中で４００μg/mlのＧ４１８および２００μg/mlのハイグロマイシンＢと共に培養する。
【０１０１】
ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５−Ｌｕｃ（カタログ番号：５１９８）は、NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USAから入手することができるＴ細胞系である。細胞型：ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５（カタログ番号４３７６）をトランスフェクション（エレクトロポレーション）して、ＨＩＶ−２  ＬＴＲの転写コントロール下でルシフェラーゼ遺伝子を発現させ、１０％ウシ胎仔血清、４mMグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．８mg/ml硫酸ジェネテシン（Ｇ４１８）を含有するＲＰＭＩ１６８０中で増殖させた。成長の特徴：円形リンパ球、変化に乏しい形態。細胞は単細胞として懸濁状態で成長し、小さな凝集塊を形成することもある。１週間に２回、１：１０に分割する。特別な特徴：ＨＩＶ−２  ＬＴＲのトランス活性化後にルシフェラーゼ活性を発現する。中和アッセイおよび薬物感受性アッセイのために、初代ＨＩＶ単離株を感染させるために適する（Spenlehauer, C., et al., Virology 280 (2001) 292-300；Trkola, A., et al., J. Virol. 73 (1999) 8966-8974）。細胞系は、John MooreおよびCatherine Spenlehauer博士からNIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIHにより得た。
Bright-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液（Promega Corp., USA、品番Ｅ２２６４Ｂ）
Bright-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ基質（Promega Corp., USA、品番ＥＥ２６Ｂ）
【０１０２】
結果：
結果を表２に示す。ＩＣ50値は、４６〜３９９ng/mlの間である。抗体の定常領域は、突然変異ＩｇＧ１（ＩｇＧ１ｖ２）である。
【０１０３】
【表５】
2010504739.tif 000006
【０１０４】
実施例４
生きたウイルスを用いた抗ウイルスアッセイ
ＰＢＭＣは、Lymphoprep（商標）(Nycomed Pharma AG, Oslo, Norway）を使用した密度勾配遠心分離によって単離したバフィーコートから調製した。４人の異なるドナーからの細胞を混合し、ＰＨＡと１日間刺激した後、１％（w/v）ペニシリン／ストレプトマイシン、１％GlutaMAX（商標）（Invitrogen Corp., USA、カタログ番号３５０５０−０３８）、１％ピルビン酸ナトリウム、１％（w/v）可欠アミノ酸および１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で、５U/mlのＩＬ−２（インターロイキン２）の存在下で２日間培養した。
【０１０５】
５０μl中のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）１００，０００個を１００μlの抗体溶液（補充されたＲＰＭＩ培地に０．００６〜１７．５μg/mlの範囲で系列希釈）に添加し、２５０TCID50（組織培養感染量の中央値）のＮＬＢａｌ（ＢａＬのｅｎｖ（ｇｐ１２０）を有するＮＬ４．３株（Adachi, A., et al., J. Virol. 59 (1986) 284-291)）または体積５０μｌのＪＲＣＳＦ（O'Brien, W.A., et al., Nature 348 (1990) 69-73）に感染させた。この混合物を３７℃で６日間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベーションした。上清を採集した後で、５U/mlのＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ培地で１：５０に希釈した。
【０１０６】
ｐ２４の測定は、ＨＩＶ−１のｐ２４のＥＬＩＳＡ（Perkin-Elmer, USA）により行った。次いで、試料を中和し、ＨＩＶ−１  ｐ２４に高度に特異的なマウスモノクローナル抗体をコーティングしたマイクロプレートのウェルに移した。この固定化されたモノクローナル抗体はＨＩＶ−１  ｐ２４を捕捉する。細胞培養試料は破壊する必要がなく、モノクローナル抗体をコーティングしたマイクロプレートのウェルに試料を直接添加した。捕捉された抗原を、ＨＩＶ−１  ｐ２４に対するビオチン化ポリクローナル抗体に続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲートと共に複合体にした。結果として得られた複合体は、ｏ−フェニレンジアミンＨＣｌ（ＯＰＤ）と共にインキュベーションし、捕捉されたＨＩＶ−１  ｐ２４の量に直接比例する黄色を産生させることによって検出した。マイクロプレートの各ウェルの吸光度は、マイクロプレートリーダーを用いて測定し、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原標準の吸光度または標準曲線に対して較正した。
【０１０７】
結果：
ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶの成長阻害については、異なる組合せの重鎖可変ドメイン（配列番号６、７、８）および軽鎖可変ドメイン（配列番号９、１０）を含み、ＩｇＧ１アイソタイプである抗ＣＣＲ５抗体について２．２７ng/ml〜１４．２１ng/mlの範囲のＩＣ５０値が決定された。これらの組合せについて、ＩＣ９０値は、９．７７ng/ml〜７４．０６ng/mlである。
【０１０８】
突然変異ＩｇＧ１定常領域（ＩｇＧ１ｖ２）を含む抗ＣＣＲ５抗体について、異なる組合せの重鎖および軽鎖可変ドメインのＩＣ５０値が８．２２ng/ml〜４３．１１ng/mlの範囲に入ると決定されたが、ＩＣ９０値は、５１．９５ng/ml〜３１１．３８ng/mlの範囲に入ると決定された。
【０１０９】
実施例５
ＣＣＲ５の細胞ＥＬＩＳＡ
ＣＣＲ５を組換え発現しているＣＨＯ細胞２０，０００個を９６ウェルプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベーションした。その後、培地を吸引し、新鮮培地４０μlを添加した。培地で希釈した第１抗体１０μｌを添加し、４℃で２時間インキュベーションした。培地を吸引し、グルタルジアルデヒド（ｃ＝０．０５％、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液）１００μlを添加し、室温で１０分間インキュベーションした。２００μｌのＰＢＳで３回洗浄後に、検出用抗体５０μl（ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液に１：１０００〜１：２０００希釈）を添加し、室温で２時間インキュベーションした。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）５０μｌを添加し、反応を７分後に停止させる。吸光度を（６２０nmに対して）４５０nmで測定した。
【０１１０】
第１抗体：被験抗体
第２（検出）抗体：ペルオキシダーゼとコンジュゲーションした特異的ヒツジ抗ヒトＩｇＧγ抗体（The Binding siteカタログ番号ＡＰ００４）をブロッキング緩衝液１０％のＰＢＳに１：２０００（６μl/12ml）希釈したもの
培地：GlutaMAX（商標）、１０％ＦＣＳ、２００μg/mlハイグロマイシン（Roche Diagnostics GmbH, Germany）を加えたHAMのＦ−１２またはGIBCO
ＥＬＩＳＡ−ブロッキング：Roche Diagnostics GmbH, Germany, ＃１１１２５８９、１０％（v/v）水溶液、ＰＢＳで１：１０希釈
ＴＭＢ：Roche Diagnostics GmbH, Germany, #1432559、使用するための溶液
【０１１１】
結果：
ＣＣＲ５の細胞ＥＬＩＳＡの結果は、異なる組合せの重鎖可変ドメイン（配列番号６、７、８）および軽鎖可変ドメイン（配列番号９、１０）を含む抗ＣＣＲ５抗体のヒトＣＣＲ５に対する結合が濃度１０００ng/mlで２．７１〜３．１３（ＯＤ４５０／６２０）の範囲にあることを示す。
【０１１２】
実施例６
ＣＣＲ５ＭＡｂがＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａに結合する潜在性
本発明の抗体がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）に結合する能力を決定するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＦｃγＲＩＩＩａに対する２０μg/mlのマウスブロッキング抗体（抗ＣＤ１６抗体、クローン３Ｇ８、RDI, Flanders, NJ）の存在下または不在下で２０μg/mlの抗体および対照抗体と共にインキュベーションしてＦｃγＲＩＩＩａを介した結合を実証する。陰性対照として、ＦｃγＲＩＩＩａと結合しないヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４（The Binding Site）を使用する。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３（The Binding Site）を、ＦｃγＲＩＩＩａの結合についての陽性対照として含める。ＮＫ細胞上に結合した抗体は、ＰＥラベルしたマウス抗ヒトＣＤ５６（ＮＫ細胞表面マーカー）抗体（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA）を、ＦＩＴＣラベルしたヤギＦ（ａｂ）2抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Protos Immunoresearch, Burlingame, USA）と共に使用したＦＡＣＳ分析により検出する。最大結合（Ｂmax）は、抗体濃度２０μg/mlで決定する。ヒトＩｇＧ１についての１００％のＢmaxに比べて、対照抗体（ヒトＩｇＧ４）は最大３０％のＢmaxを示す。したがって、「ＦｃγＲＩＩＩａの無結合またはＡＤＣＣなし」は、抗体濃度２０μg/mlでヒトＩｇＧ１に比べて最大３０％のＢmax値を意味する。
【０１１３】
実施例７
ＣＣＲ５ケモタキシスアッセイ
Ｌ１．２ｈＣＣＲ５細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×グルタミン、１×ピルビン酸ナトリウム、１×β−メルカプトエタノール、および２５０μg/ml  Ｇ４１８を含有するＲＰＭＩ１６４０（全てInvitrogen Inc., USA製）中で培養した。ケモタキシスアッセイの設定直前に、細胞を沈降させ、走化性緩衝液（０．１％ＢＳＡおよび１０mM  ＨＥＰＥＳを含有するハンクス平衡塩類溶液ＨＢＳＳ（Invitrogen））に再懸濁した。走化性アッセイに使用した細胞は、終濃度５×１０6個/mlであった。ＣＣＲ５リガンドであるヒトＭＩＰ１α、ヒトＭＩＰ１βまたはヒトＲＡＮＴＥＳ（R&D Systems, USA）を走化性緩衝液に希釈し、終濃度２０nMで使用した。被験抗体または適切なアイソタイプ対照抗体をＨＢＳＳに希釈した。走化性アッセイは、口径０．５μmの９６ウェルChemoTx（登録商標）システム（Neuroprobe Inc., USA）で設定した。各抗体をＣＣＲ５リガンドの一つと混合し、この混合物の３０μlをChemoTx（登録商標）システムの下のウェルに入れた。フィルタースクリーンは下のウェルの上部に載せた。各抗体をＬ１．２ｈＣＣＲ５細胞と混合し、この混合物の２０μlをフィルターに載せた。次いで、プレートを加湿チャンバーに入れ、３７℃および５％ＣＯ2で３時間インキュベーションした。インキュベーション後に細胞をフィルターから剥がし、プレートを卓上型遠心分離器に入れ２０００rpmで１０分間回転させた。次いで、フィルターを除去し、下のウェルに移動した細胞の密度をCyQUANT（登録商標）細胞増殖アッセイキット（Invitrogen）およびSpectra MAX GeminiXSプレートリーダー（Molecular Devices, Wokingham, UK）を使用して製造業者の説明書に準じて検出した。Prism4（GraphPad Inc., USA）を使用してＩＣ50値を計算した。
【０１１４】
ＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を有する、異なる組合せの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインについてのヒトＭＩＰ−１α、ヒトＭＩＰ−１β、およびヒトＲＡＮＴＥＳに対するＩＣ50値は、それぞれ０．８０nM〜０．９１nM、０．７２nM〜１．０８ｎＭおよび０．８５nM〜２．６９nMである。
【０１１５】
突然変異ＩｇＧ１アイソタイプ（ＩｇＧ１ｖ２）の場合に、ヒトＭＩＰ−１α、ヒトＭＩＰ−１β、およびヒトＲＡＮＴＥＳに対するＩＣ50値は、それぞれ２．２１nM〜６．２８nM、２．１６nM〜６．８７nM、および３．５９nM〜５．０３nMの範囲である。
【配列表】
2010504739000001.app
【国際調査報告】
2010504739.tif 000009
2010504739.tif 000010
2010504739.tif 000011
2010504739.tif 000012
2010504739.tif 000013