(57)【要約】  本発明は細胞とビリオンの脂質含量及び膜特性を調整するための組成物、方法及びシステムを提供する。特定量、クラス及び／又は組み合わせの脂質サプリメントを添加した培地で宿主細胞を増殖させると、細胞及び細胞で増殖されるウイルスの脂質含量を改変することができる。Ｃ１６：０．Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ｎ９及び／又はＣ１８：２ｎ６脂肪酸を含有するコレステロールエステル、スフィンゴミエリン、糖脂質等の脂質はウイルス感染に対する細胞許容性、ウイルス収率、ウイルス免疫原性及び／又は膜相転移温度を改変することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス脂質組成の改変方法であって、
ウイルスに適した型の宿主細胞の培養用培地におけるスフィンゴミエリン又はコレステロール濃度を調整する段階と；
宿主細胞にウイルスを感染させる段階を含み；
それにより、スフィンゴミエリン又はコレステロール濃度を調整しない培地で増殖させた宿主細胞型で培養した対照ウイルスとは異なる脂質組成をもつウイルスを提供する前記方法。
【請求項２】
ウイルスがレトロウイルス、パラミクソウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス、オルトミクソウイルス、インフルエンザウイルス、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス、フィロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ラブドウイルス、狂犬病、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、トガウイルス、アレナウイルス、及びブンヤウイルスから構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地中のスフィンゴミエリン又はコレステロール濃度を調整することによりウイルス膜相転移温度を変化させる段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ウイルスを液体防腐剤中に脂質膜の転移温度で保持する段階を更に含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
凍結乾燥、凍結発泡乾燥、発泡乾燥、噴霧凍結乾燥、噴霧乾燥、高圧噴霧乾燥、及び超臨界噴霧乾燥から構成される群から選択される方法によりウイルスを乾燥する段階を更に含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
培地中に２０ｍｇ／Ｌを上回る濃度又は０．０１ｍｇ／Ｌを下回る濃度にスフィンゴミエリンとコレステロールの総濃度を調整する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスの免疫原性が変化するまでスフィンゴミエリン又はコレステロール濃度を調整する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスに対する宿主細胞の許容性が増加するまで培地中のスフィンゴミエリン又はコレステロール濃度を調整する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記調整段階がスフィンゴミエリン濃度を増加する段階又は９−オクタデセン酸（Ｃ１８：１ｎ９）を含有するコレステロールを増加する段階を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞からのウイルス生産が増加する点まで培地中のスフィンゴミエリン又はコレステロール濃度を調整する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
スフィンゴミエリン又はコレステロールがパルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）及びオレイン酸（Ｃ１８：１）から構成される群から選択される脂肪酸を含有する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシトールを培地に添加することにより、子孫ビリオンの収率を増加する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
鶏卵尿嚢中で増殖させた対照インフルエンザビリオンに比較して膜コレステロール又はスフィンゴミエリンの比率を増加させたインフルエンザビリオン。
【請求項１４】
比率の増加が２０ｍｇ／Ｌ以上のスフィンゴミエリン又はコレステロールを含有する培地で増殖させた宿主細胞でビリオンを培養することにより得られる請求項１３に記載のビリオン。
【請求項１５】
スフィンゴミエリンパルミチン酸（Ｃ１６：０）エステルの膜中脂肪酸モル百分率を対照ビリオンよりも少なくとも１０％増加させるか又はコレステロールパルミチン酸（Ｃ１６：０）もしくはステアリン酸（Ｃ１８：０）エステルを対照ビリオンよりも少なくとも１０％増加させた請求項１３に記載のビリオン。
【請求項１６】
ウイルスの培養システムであって、
前記ウイルスに対して許容性の宿主細胞を含み；
前記細胞を増殖させるのに適した細胞培養培地に前記細胞を配置し；
更にコレステロール又はスフィンゴミエリンを含み；
コレステロール又はスフィンゴミエリンを培地に添加することにより、許容性を増加、細胞からのウイルスの収率を増加、ウイルスの保存安定性を増進又はウイルスの膜相転移温度を変化させる前記システム。
【請求項１７】
添加するコレステロール又はスフィンゴミエリンがコレステロール又はスフィンゴミエリンの添加による調整前の培地に対して２５モル％を上回るパルミチン酸（Ｃ１６：０）、２０モル％を上回るステアリン酸（Ｃ１８：０）又は４０モル％を上回るオレイン酸（Ｃ１８：１）を含有する請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
ビリオンがレトロウイルス、パラミクソウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス、オルトミクソウイルス、インフルエンザウイルス、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス、フィロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ラブドウイルス、狂犬病、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、トガウイルス、アレナウイルス、及びブンヤウイルスから構成される群から選択される請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
細胞がニワトリ尿嚢（ＣＡＳ）細胞、ニワトリ胎児腎（ＣＥＫ）細胞、イヌ腎細胞、ベロ細胞、リンパ球、ＭＤＣＫ腎細胞、ＭＡ−１０４細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬＡ細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、及びＵ９３７細胞から構成される群から選択される請求項１６に記載のシステム。
【請求項２０】
培地がホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシトールを含有する請求項１６に記載のシステム。
【請求項２１】
改変型膜脂質組成をもつインフルエンザウイルスを提供する方法であって、
コレステロール又はスフィンゴミエリン高含有飼料をニワトリに与える段階と；
ニワトリから１個以上の受精卵を採取する段階と；
１個以上の受精卵の尿嚢にインフルエンザウイルスを接種する段階と；
１個以上の尿嚢からインフルエンザウイルスを回収する段階を含む前記方法。
【請求項２２】
コレステロール又はスフィンゴミエリンが２５モル％を上回るパルミチン酸（Ｃ１６：０）、２０モル％を上回るステアリン酸（Ｃ１８：０）又は４０モル％を上回るオレイン酸（Ｃ１８：１）を含有する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
コレステロール又はスフィンゴミエリン高含有飼料がニワトリ１羽１日当たり少なくとも１グラムの総コレステロール又は総スフィンゴミエリンを含有する請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも提供されるウイルスがコレステロール又はスフィンゴミエリン高含有飼料を与えない対照ニワトリからの卵で培養したウイルスよりも高い力価、コレステロール又はスフィンゴミエリン高含有飼料を与えない対照ニワトリからの卵で培養したウイルスよりも長い保存寿命、コレステロール又はスフィンゴミエリン高含有飼料を与えない対照ニワトリからの卵で培養したウイルスよりも高い抗原性、及びコレステロール又はスフィンゴミエリン高含有飼料を与えない対照ニワトリからの卵で培養したウイルスからの膜に比較して改変された膜相転移から構成される群から選択される特性を示すまで飼料のコレステロール又はスフィンゴミエリンを調整する請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は先行米国仮出願第６０／８５２，５７１号（発明の名称「ウイルス脂質成分の改変（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  Ｖｉｒａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）」，発明者Ｖｕ  Ｔｒｕｏｎｇ−Ｌｅ，出願日２００６年１０月１７日）の優先権と特典を主張する。前記先行出願の全開示内容を本明細書に援用する。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は脂質成分を改変した培地組成物、細胞及びウイルスに関する。前記細胞及びウイルスを提供する方法は、ウイルス宿主細胞を培養するためにスフィンゴミエリン、コレステロール、ホスファチジルセリン及びホスファチジルコリン等の培地脂質を調節する段階を含む。改変型宿主細胞はウイルスの培養の許容性を増し、収率を上げることができる。得られた改変型ウイルスは安定性が高まり、より良好に処理条件に適合させることができる。
【背景技術】
【０００３】
細胞原形質膜は各種脂質（例えばリン脂質、コレステロール、スフィンゴ脂質、及び糖脂質）を含有しているが、これらの脂質は必ずしも均等に分布していない。例えば、膜二重層の内側層と外側層の脂質成分には有意差が認められる。更に、脂質と所定の膜蛋白質は例えば飽和度の高い脂肪酸を含む特定脂質の含量が多いために、膜一般よりも脂質を密に充填した「ラフト」ないし脂質ミクロドメインを形成する場合がある。膜の脂質組成は膜の特性に実質的に影響を与える場合がある。
【０００４】
培地は動物細胞膜の脂質組成に影響を与える可能性がある。例えば、Ｄ．Ｔｏｍｂａｃｃｉｎｉら，Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３，ＳＶ３Ｔ３，ａｎｄ  Ｃｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ  Ａ−Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｒｅｖｅｒｔａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  Ｍｅｄｉａ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｌｉｐｉｄ−Ｄｅｐｌｅｔｅｄ  Ｓｅｒｕｍ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，２２：５９０−５９７，（１９８１）では、細胞を無脂質培地でストレス下に増殖させた場合の膜脂質脂肪酸組成の種々の変化について言及している。これらの変化の多くは脂肪酸を添加しない飼料で飼育した動物の組織中に検出される変化と同様であった。しかし、通常の動物飼料又は細胞培養培地に補充した場合に通常の膜脂質組成が有意に変化するかどうかについては明らかになっていない。
【０００５】
エンベロープをもつウイルスの脂質組成を改変する試みが行われている。例えば、Ａ．Ｃ．Ｒｏｌａｎｄら，“Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｌｕｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”，ＰＮＡＳ  ９０：５１８１−５１８５（１９９３）はＨＴＶエンベロープと宿主細胞膜の間に相違があることを見出した。ＲｏｌａｎｄはＨＴＶ−Ｉをリン脂質リポソームと共にインキュベートすると、エンベロープ中のコレステロール量が低下し、感染性が有意に低下すると述べている。
【０００６】
しかし、宿主細胞とウイルスの脂質組成を改変するためのより選択的な方法が依然として必要とされている。通常の感染と複製に関連する特定脂質と成分脂肪酸が同定されるならば、培養と所定のウイルス特性の制御に有利に利用できると思われる。本発明はこれらの特徴に加え、以下の記載から自明となる他の特徴を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は細胞膜とウイルスエンベロープの脂質組成を調整するための組成物、方法及びシステムに関する。細胞膜に提供される脂質クラス及びサブクラスを改変するために補充される所定の脂質を含有する培地で宿主細胞を増殖させることができる。ウイルス宿主細胞を増殖させるために使用される培地はウイルスエンベロープ中の脂質の特性を改変し、ウイルス収率を改変し、ウイルスの物性を改変することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ウイルス脂質組成の改変方法は例えばウイルスに適した宿主細胞の培養用培地におけるスフィンゴミエリン又はコレステロール濃度を調整する段階と、宿主細胞にウイルスを感染させる段階を含むことができる。それにより、これらの培地脂質濃度を調整せずに同一宿主細胞で増殖させた同一（対照）ウイルスとは異なる脂質組成を子孫ビリオンに与えることができる。本発明の方法により調整する典型的なウイルスとしては、例えばレトロウイルス（例えばＨＴＶ）、パラミクソウイルス（例えば呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、パポバウイルス（例えばヒトパピローマウイルス）、フィロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ラブドウイルス（例えば狂犬病）、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ）、トガウイルス、アレナウイルス、及びブンヤウイルスが挙げられる。
【０００９】
培地の調整としては、本明細書に特定する脂質の標準培地濃度の増減が挙げられる。調整は規定又は不明の脂質含量の培地を調製する段階と、その後、（一般に、規定クラス及び／又はサブクラスの脂質を培地に添加することにより）培地の脂質含量を変えることにより培地脂質を調整する段階を含むことができる。未調整の細胞を未調整の出発培地で増殖させることができ、調整後の細胞を調整後の培地で増殖させることができる。調整後のビリオンを調整後の細胞で培養することができ、未調整のビリオンを未調整の細胞で増殖させる。例えば、出発培地と異なる濃度、例えば培地中に２０ｍｇ／Ｌを上回る濃度又は０．０１ｍｇ／Ｌを下回る濃度に培地中の脂質濃度を調整することができる。前記方法はスフィンゴミエリン、コレステロール、リン脂質及び糖脂質のクラスの脂質を調整する段階を含む。更に、脂質の調整としては、例えば９−オクタデセン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ６）及びオレイン酸（Ｃ１８：１）等の所定脂肪酸にエステル化した脂質のサブクラスの増減が挙げられる。
【００１０】
このようにウイルス脂質組成を調整すると、ウイルス膜相転移温度等のウイルスの所定の物性を変化させることができる。従って、ウイルス保存安定性を改変するため又は例えば防腐剤分子をウイルスに浸透し易くするように乾燥温度等の所望の製剤化工程パラメーターを補完するために、ウイルス膜相転移温度を調節することができる。例えば、調整後のウイルスを液体防腐剤中に転移温度で保持する場合にワクチン乾燥製剤の製造用乾燥工程前及び／又は同工程中に安定剤の膜貫通取込みを改変できるように、ウイルスの脂質の相転移温度を特定値にすることができる。典型的な乾燥方法としては凍結乾燥、凍結発泡乾燥、発泡乾燥、噴霧凍結乾燥、噴霧乾燥、高圧噴霧乾燥、及び超臨界噴霧乾燥が挙げられる。
【００１１】
ウイルスの免疫原性を改変するためにウイルスエンベロープ脂質含量の調整を使用することができる。従って、宿主生物免疫系に外部から添加されるウイルスエンベロープは免疫相互作用に重要である。エンベロープ上に「脂質ラフト」を形成する膜脂質と蛋白質の組み合わせは重要な免疫原となり得る。膜脂質組成に応じて、免疫原の全体的な蛋白質抗原構造と形態を改変することができる。例えば、鳥類で増殖させた哺乳動物用ウイルスワクチンについて、例えば、より典型的な哺乳動物脂質含量となるようにウイルスを改変することにより、より高い防御応答を誘発するように調節することができる。場合により、より強力で長時間の免疫応答、例えばアジュバント効果を誘発するようにウイルスの脂質含量を調節することができる。
【００１２】
別の側面では、増殖培地中の所定の脂質の濃度を調整することにより宿主細胞の感染許容性を改変することができる。例えば、許容性に相関した脂質を添加又は補充した培地で宿主細胞を増殖させることができる。インフルエンザウイルス等については、スフィンゴミエリン及び／又はコレステロール高含有培地で増殖させることにより宿主細胞の感染性を強化することができる。Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ｎ９及び／又はＣ１８：２ｎ６脂肪酸を含有する脂質サブクラスを培地に添加すると特に有益であると思われる。
【００１３】
本発明の更に別の側面では、例えばウイルスエンベロープに選択的に取り込まれる脂質を高濃度で含有する培地を準備することにより、ウイルスの収率を上げることができる。例えば、細胞増殖培地中のスフィンゴミエリン又はコレステロールの濃度を調整することにより細胞からのウイルス生産を増加することができる。場合により、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシトールを培地に添加することにより、ウイルス収率を上げることができる。Ｃ１６：０及び／又はＣ１８：２ｎ６脂肪酸を含有する脂質サブクラスを培地に添加すると特に有益であると思われる。
【００１４】
本発明は最適濃度未満の膜コレステロールもしくはスフィンゴミエリンを発現する鶏卵尿嚢又は培養細胞株で増殖させた対照インフルエンザビリオンに比較してこのような好ましい脂質の比率を増加させたインフルエンザビリオンの組成物を含む。場合により、比率の増加は２０ｍｇ／Ｌ以上のスフィンゴミエリン又はコレステロールを含有する培地で増殖させた宿主細胞でビリオンを培養することにより得られる。好ましい態様では、パルミチン酸（Ｃ１６：０）にエステル化したスフィンゴミエリンを培地に添加するか、及び／又はパルミチン酸（Ｃ１６：０）もしくはステアリン酸（Ｃ１８：０）にエステル化したコレステロールを培地に添加する。より好ましい態様では、スフィンゴミエリンパルミチン酸（Ｃ１６：０）エステルの培地中脂肪酸モル百分率を標準培地よりも少なくとも１０％増加させるか又はコレステロールパルミチン酸（Ｃ１６：０）もしくはステアリン酸（Ｃ１８：０）エステルを標準（例えば出発）培地よりも少なくとも１０％増加させる。より好ましい態様では、スフィンゴミエリンパルミチン酸（Ｃ１６：０）エステルの膜中脂肪酸モル百分率を対照ビリオンよりも少なくとも１０％増加させるか又はコレステロールパルミチン酸（Ｃ１６：０）もしくはステアリン酸（Ｃ１８：０）エステルを（例えば標準培地で増殖させた感染細胞からの）対照ビリオンよりも少なくとも１０％増加させる。
【００１５】
ウイルスの培養システムは例えば前記ウイルスに対して許容性の宿主細胞を含み、前記細胞を増殖させるのに適した培地に前記細胞を配置し、更にコレステロール又はスフィンゴミエリンを含むことができる。コレステロール又はスフィンゴミエリンの培地添加は、許容性の調整、細胞からのウイルスの収率の増加、ウイルスの保存安定性の増進又はウイルスの膜相転移温度の変化を目的とすることができる。好ましい態様において、添加するコレステロール又はスフィンゴミエリンは２５モル％を上回るパルミチン酸（Ｃ１６：０）、２０モル％を上回るステアリン酸（Ｃ１８：０）又は４０モル％を上回るオレイン酸（Ｃ１８：１）を含有する。好ましいシステムにおいて、ウイルスはレトロウイルス（例えばＨＩＶ）、パラミクソウイルス（例えば呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、パポバウイルス（例えばヒトパピローマウイルス）、フィロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ラブドウイルス（例えば狂犬病）、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ）、トガウイルス、アレナウイルス及びブンヤウイルスである。好ましい態様において、宿主細胞は鶏卵尿嚢細胞又はＭＤＣＫ腎細胞である。好ましい態様では、例えばウイルス生産を増加するために、培地に更にホスファチジルセリン及び／又はホスファチジルイノシトールを添加する。
【００１６】
本発明の所定方法では、宿主細胞を提供する動物の飼料を調節することによりウイルス宿主細胞の脂質含量を調整する。例えば、コレステロール又はスフィンゴミエリン（又は他の所望脂質クラス及び／又はサブクラス）高含有飼料をニワトリに与え、ニワトリから１個以上の受精卵を採取し、１個以上の受精卵の尿嚢にインフルエンザウイルスを接種し、１個以上の尿嚢からインフルエンザウイルスを回収することにより、改変型膜脂質組成をもつインフルエンザウイルスを提供することができる。好ましい態様では、尿膜腔液総コレステロール及び／又はスフィンゴミエリンが２５モル％を上回るパルミチン酸（Ｃ１６：０）、２０モル％を上回るステアリン酸（Ｃ１８：０）及び／又は４０モル％を上回るオレイン酸（Ｃ１８：１）を含有するまでニワトリ飼料の濃度を高める。好ましい態様において、コレステロール又はスフィンゴミエリン高含有飼料はニワトリ１羽１日当たり少なくとも０．５グラム、１グラム、２グラム、５グラム又は１０グラムの総コレステロール又は総スフィンゴミエリンを含有する。このように提供されるウイルスは例えば調整脂質濃度の比較的高い飼料を与えない対照ニワトリからの卵で培養したウイルスよりも高い力価、調整脂質高含有飼料を与えない対照ニワトリからの卵で培養したウイルスよりも長い保存寿命、調整脂質高含有飼料を与えない対照ニワトリからの卵で培養したウイルスよりも高い抗原性、及び調整脂質高含有飼料を与えない対照ニワトリからの卵で培養したウイルスからの膜に比較して改変した膜相転移等の所望特性をもつことができる。
【００１７】
（定義）
本欄又は明細書の以下の欄で特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。以下の定義は本願との関連で当分野における定義を補うものであり、関連又は非関連ケース、例えば同一名義の特許又は出願に適用するものではない。
【００１８】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定装置又はシステムに限定されず、当然のことながら種々に適用できると理解すべきである。また、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。
【００１９】
本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、場合により複数形も含む。従って、例えば「脂質」と言う場合には２種以上の脂質の組み合わせを含むことができ、複数形で「卵」と言う場合には１個の卵を含むことができ、他の用語についても同様である。
【００２０】
本発明の実施には過度の実験を必要とせずに本明細書に記載する方法及び材料に類似するもの、改変したもの又は等価の多数の方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載するものである。本発明の記載と特許請求の範囲において、以下の用語は以下の定義に従って使用される。
【００２１】
膜脂質のクラスは例えば脂質にエステル化される脂肪酸の種類に応じて所定のサブクラスとして存在することができる指定脂質分子種を含む。例えば、膜脂質のクラスとしては、コレステロール、スフィンゴミエリン、リン脂質、糖脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールアミン、セラミド、セレブロシド、ガングリオシド等が挙げられる。これらの脂質のサブクラスとしては、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタン酸及び／又は同等物等の各種脂肪酸にエステル化されたクラスメンバーが挙げられる。１種以上の脂質クラス又はサブクラスが他のウイルスと有意に異なる（例えば１０％差）量又は比率でウイルス中に存在する場合に、ウイルスは別のウイルスに対して「異なる脂質組成」をもつ。本発明は、例えば同一接種材料から出発するが、異なる脂質成分及び／又は異なる脂質比率の培地で増殖させた細胞で培養することにより、異なる脂質組成をもつウイルスを生産するための方法を提供する。
【００２２】
Ｃ１６：０、Ｃ１８：１ｎ９等の脂肪酸鎖略称は当分野で通常呼称されている通りとする。例えば、Ｃ１８：１とは鎖の不飽和位置に１個の二重結合をもつ１８炭素脂肪酸鎖を意味する。Ｃ１８：１ｎ９とは９位炭素に二重結合をもつ１８炭素脂肪酸鎖を意味する。一般に、脂肪酸は脂質分子中の高極性側の基にエステル化され、例えばリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質等を形成する。あるいは、脂肪酸はコレステロール等の比較的疎水性の基にエステル化される場合もある。
【００２３】
脂質に関して本明細書で使用する「調整」なる用語は脂質、脂質クラス及び／又は脂質サブクラスの量、濃度及び／又は比率を変化させることを意味する。多くの場合、例えば培地脂質の調整は出発培地への脂質の添加を伴う。しかし、調整は場合により培地、細胞膜又はウイルスからの脂質の低減又は除去を意味する場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】細胞膜脂質のＦＴＩＲデータのグラフを示す。対照ニワトリ胎児腎（ＣＥＫ）細胞は約７℃、３２℃及び５４℃で相転移を示す（グラフ１Ａ）。シクロデキストリンを使用してＣＥＫ細胞からコレステロールを除去すると、融点約４５℃の規則的脂質群（１Ｂ）が有意に増加し、インフルエンザ感染に対する許容性の高いＣＥＫ細胞の原形質膜は有意量のコレステロール及びコレステロールエステルを含有していることが分かった。膜をスフィンゴミエリナーゼで処理すると、低融点群が有意に減少し、より規則的な高融点膜脂質群が著しく増加する。この応答はＣＥＫ細胞が有意量のスフィンゴミエリンを含有していることを強く示唆するものである。総合すると、コレステロールとスフィンゴミエリンはＣＥＫ膜の有意成分であり、これらの脂質はインフルエンザ感染許容性に関与していることがデータから示唆された。
【００２５】
【図２】Ａ／シドニーウイルスエンベロープ脂質のＦＴＩＲデータのグラフを示す。コレステロール含量を減らすためにシクロデキストリンで処理するか、又はスフィンゴミエリンをセラミドに変換するためにスフィンゴミエリナーゼで処理すると、規則的な高融点膜脂質群が有意に増加する。データから明らかなように、ＣＥＫ細胞と同様に、Ａ／シドニー等のインフルエンザウイルスも有意量のコレステロールとスフィンゴ脂質を含有している。
【００２６】
【図３】ニワトリ尿嚢（ＣＡＳ）宿主細胞と鶏卵尿嚢を株化したＣＡＳ細胞から生産されたインフルエンザウイルスの膜における所定脂質クラスの発現を比較した棒グラフである。データによると、通常の哺乳動物細胞に由来する各種脂質クラスの典型的な分布に比較して、インフルエンザウイルスとインフルエンザ感染に対する許容性が高いとして知られるＣＥＫ細胞では、ホスファチジルセリンとスフィンゴミエリンが多い。
【００２７】
【図４】ＣＡＳ細胞とＣＡＳ細胞で増殖させたウイルスにおけるリン脂質サブクラスの発現を比較した棒グラフである。
【図５】ＣＡＳ細胞とＣＡＳ細胞で増殖させたウイルスにおけるリン脂質サブクラスの発現を比較した棒グラフである。
【００２８】
【図６】ＣＡＳ細胞とＣＡＳ細胞で増殖させたウイルスにおけるスフィンゴミエリンサブクラスの発現を比較した棒グラフである。
【００２９】
【図７】ＣＡＳ細胞とＣＡＳ細胞で増殖させたウイルスにおけるコレステロールエステルサブクラスの発現を比較した棒グラフである。この結果は、許容宿主と非許容宿主の間に有意な脂質組成差があることを示唆している。
【００３０】
【図８】ウイルス及びウイルスに対する許容性レベルの異なる細胞間の膜脂質クラスの相違を示す。この結果は、許容宿主と非許容宿主の間に有意な脂質組成差があることを示唆している。
【００３１】
【図９】ウイルス及びウイルスに対する許容性レベルの異なる細胞間の膜コレステロールエステルサブクラスの相違を示す。
【００３２】
【図１０】ウイルス及びウイルスに対する許容性レベルの異なる細胞間の膜スフィンゴミエリンサブクラスの相違を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は改変型脂質組成をもつウイルス及びウイルスとその宿主細胞の脂質構成を改変するための方法に関する。１側面では、例えば培地成分を調節することにより、ウイルス宿主細胞の細胞膜脂質を改変することができる。このような改変型宿主細胞は高い許容性で感染させることができ、ウイルス収率を上げることができる。改変型細胞で培養したウイルスは例えば未改変宿主細胞で増殖させた同一ウイルスに比較して安定性の増進、免疫原性の改変及び／又は膜相転移特性の変化を提供する改変型ウイルス膜脂質組成をもつことができる。
【００３４】
前記方法の特定態様では、宿主細胞膜（外膜又は内膜）の脂質組成及び／又は脂質（例えばウイルス膜）組成を改変する量のコレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン／イノシトール及び／又はホスファチジルコリンを含有する培地を準備することができる。得られる膜組成は培地で増殖させた細胞から培養したウイルスの培養、処理パラメーター、安定性及び抗原特性に利点を提供することができる。
【００３５】
許容宿主と非許容宿主の間、及びウイルスとその宿主細胞の間には有意脂質組成差が存在しており、例えばより高い力価、より強い免疫原性、より簡便な処理、及び／又はより長い保存寿命をもつワクチンを提供するために利用できることを本発明者らは見出した。例えば、（特に１８：０（ステアリン酸）脂肪酸鎖の比率が高い）膜スフィンゴミエリン及び／又は（特に１８：１ｎ９（オレイン酸）脂肪酸鎖の比率が高い）コレステロールエステルを増加するように改変した細胞は、例えばレトロウイルス（例えばＨＩＶ）、パラミクソウイルス（例えば呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、パポバウイルス（例えばヒトパピローマウイルス）、フィロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ラブドウイルス（例えば狂犬病）、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ）、トガウイルス、アレナウイルス、及びブンヤウイルス等のウイルスに対する許容性を増加することができる。場合により、Ｃ１６：０コレステロールエステル、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール及びＣ１６：０（パルミチン酸）スフィンゴ脂質及び１８：２ｎ６（リノール酸）コレステロール等のウイルスの好ましい脂質と脂肪酸の比率を高くするように、宿主細胞用培地の組成によりウイルスの脂質含量を改変することができる。
【００３６】
宿主細胞の脂質の改変
本明細書に記載する脂質含量と所定の宿主細胞特性の間の相関に鑑み、また、増殖培地の脂質含量により宿主細胞の脂質組成を改変できるという事実を考慮し、本発明ではウイルス宿主細胞の特性を改善するためのストラテジーを提供する。
【００３７】
１側面では、感染許容性を増加し、最終ウイルス培養収率を改善するようにウイルス宿主細胞の培養条件を調節することができる。例えばインフルエンザウイルスに対する宿主細胞の感染許容性は宿主細胞脂質膜中のＣ１８：１ｎ９コレステロール比率の増加に相関することが判明した。許容性の高い宿主細胞の膜脂質ではＣ１８：０スフィンゴミエリンが増加する傾向があることも発見した。本発明の方法では、Ｃ１８：１ｎ９コレステロールエステル及び／又はＣ１８：０スフィンゴミエリンを含有する培地でウイルス宿主細胞を増殖させる。本発明の方法では、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のＣ１８：１ｎ９コレステロールエステル及び／又はＣ１８：０スフィンゴミエリンを含有する培地でウイルス宿主細胞を増殖させる。
【００３８】
本発明の所定態様では、ウイルス宿主細胞の培地におけるＣ１８：１ｎ９コレステロールエステル及び／又はＣ１８：０スフィンゴミエリンの量を調整する。例えば、Ｃ１８：１ｎ９コレステロールエステル及び／又はＣ１８：０スフィンゴミエリンの存在を確保するため、これらの脂質の絶対量を増加するため、及び／又はこれらの脂質の比率を増加するために、種々の量のこれらの脂質を標準市販培地（又は他の任意出発培地）に添加することができる。場合により、Ｃ１８：１ｎ９コレステロールエステルよりもＣ１６：０及び／又はＣ１８：０コレステロールエステル等の他のコレステロールエステルの量又は比率を低くした培地を調製することができる。場合により、Ｃ１６：０及び／又はＣ１８：１ｎ９スフィンゴミエリン等の他のスフィンゴ脂質を加えないか又はＣ１８：０スフィンゴミエリンよりもその量もしくは比率を低くした宿主細胞培養培地を調製することができる。例えば、Ｃ１８：１ｎ９コレステロールエステルを他の個々のコレステロールエステル又は他のコレステロールエステルの合計よりも過剰に含有する培地でエンベロープをもつウイルスの培養用宿主細胞を増殖させることができる。場合により、Ｃ１８：０スフィンゴミエリンを他の個々のスフィンゴ脂質又は他のスフィンゴ脂質の合計よりも過剰に含有する培地でエンベロープをもつウイルスの培養用宿主細胞を増殖させることができる。１態様において、例えば、エンベロープをもつウイルス宿主細胞の培養用液体培地は少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のＣ１８：１ｎ９コレステロールエステルを含有する。この態様において、Ｃ１８：１ｎ９脂肪酸を含有しないコレステロールエステルは培地に存在しないか、個々の量がＣ１８：１ｎ９コレステロールエステルよりも少量で存在するか、又は総量がＣ１８：１ｎ９コレステロールエステルよりも少量で存在することが好ましい。所定態様において、エンベロープをもつウイルス宿主細胞の培養用液体培地は少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のＣ１８：０スフィンゴミエリンを含有する。これらの態様において、Ｃ１８：０脂肪酸を含有しないスフィンゴミエリンは本質的に培地に存在しないか、個々の量がＣ１８：０スフィンゴミエリンよりも少量で存在するか、又は総量がＣ１８：０スフィンゴミエリンよりも少量で存在することが好ましい。別の側面において、Ｃ１８：１ｎ９コレステロールエステルは培地の総成分コレステロールエステルの少なくとも３５モル％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又はそれ以上の量でエンベロープをもつウイルス宿主細胞用の培地に存在することが好ましい。更に、Ｃ１８：０スフィンゴミエリンは培地中のスフィンゴ脂質の少なくとも１５モル％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又はそれ以上の量でエンベロープをもつウイルス宿主細胞用の培地に存在することが好ましい。
【００３９】
本発明の組成物及び方法の他の側面において、本発明者らは細胞又は培地脂質がＣ１８：２ｎ６脂肪酸を含有する場合にエンベロープウイルスに対する宿主細胞の許容性が高くなることを発見した。これらの脂肪酸は遊離脂肪酸でもよいし、Ｃ１８：２ｎ６コレステロール、Ｃ１８：２ｎ６コレステロールエステル、及び／又はＣ１８：２ｎ６スフィンゴミエリン等のように膜脂質分子にエステル化したものでもよい。エンベロープをもつウイルス宿主細胞の好ましい培養用液体培地は少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のＣ１８：２ｎ６脂肪酸又はこれらの脂肪酸を含む脂質を含有する。別の側面において、Ｃ１８：２ｎ６コレステロールエステルは総成分コレステロールエステルの少なくとも５モル％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、又はそれ以上の量でエンベロープをもつウイルス宿主細胞用の培地に存在することが好ましい。場合により、Ｃ１８：２ｎ６スフィンゴミエリンは培地の総成分スフィンゴ脂質の少なくとも５モル％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、又はそれ以上の量でエンベロープをもつウイルス宿主細胞用の培地に有利に存在することができる。
【００４０】
最も好ましい１態様では、上記脂質の組み合わせを増殖培地に補充することにより、ウイルス感染に対する宿主細胞の許容性を調整する。例えば、好ましい１態様では、Ｃ１８：１ｎ９コレステロールエステル、Ｃ１８：０スフィンゴミエリン、Ｃ１８：２ｎ６スフィンゴミエリン及びＣ１８：２ｎ６コレステロールの２種以上を宿主細胞増殖培地に補充する。１側面では、Ｃ１８：１ｎ９エステルであるコレステロールエステル少なくとも３５モル％と、Ｃ１８：０脂肪酸であるスフィンゴ脂質脂肪酸少なくとも１５モル％を提供するように培地に補充する。別の側面では、Ｃ１８：１ｎ９エステルであるコレステロールエステル少なくとも３５モル％と、Ｃ１８：０脂肪酸であるスフィンゴ脂質脂肪酸少なくとも１５モル％と、Ｃ１８：２ｎ６脂肪酸であるスフィンゴ脂質脂肪酸少なくとも５モル％を提供するように培地に補充する。
【００４１】
ウイルス力価の改変
培養からのウイルス力価はウイルス回収物を調製及び処理する時間と費用に大きく影響する可能性がある。本発明の方法はウイルス感染に対する宿主細胞の許容性の増加に相関した脂質を提供すること及び／又は宿主よりもウイルスの脂質濃度が選択的に高い脂質を提供することにより、例えばエンベロープをもつウイルス培養の生産性を改善することができる。
【００４２】
本発明の方法を利用するウイルスとしては一般にエンベロープをもつウイルスが挙げられる。しかし、本発明はエンベロープをもたないウイルスに対する宿主細胞の許容性も本明細書に記載する培地脂質調節により調節できることを認める。更に、本発明者らは多くのエンベロープをもたないウイルスが例えば安定性及び／又は生産性の高いビリオン子孫を提供するために、本発明の培地改変を利用できる脂質及び／又はリポ蛋白質成分をもつことを認める。
【００４３】
本発明の組成物、方法及びシステムで利用するのに好ましいウイルスとしては、エンベロープをもつウイルスが挙げられる。特に、本発明の培地で増殖させた細胞で有利に培養することができるより好ましいウイルスは例えばバキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、及びブンヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーである。最も好ましいウイルスとしては、各種インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全（ＨＴＶ）ウイルス、パラミクソウイルス（例えば呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス）、及びパポバウイルス（例えばヒトパピローマウイルス）が挙げられる。
【００４４】
本発明の方法を使用してウイルス力価を増加するには、宿主細胞の許容性を増加する方法として上記に記載した方法により実施することができる。ウイルス感染に対する細胞の許容性は細胞がウイルスの複製を助長するために宿主として機能できるか否かとその程度の指標である。どのような理由にせよ、ウイルスに非許容性の細胞ではウイルスは複製できない。他方、ウイルスに対する許容性の高い細胞のほうが許容性の低い細胞よりも一般に細胞１個当たり多数のビリオンを複製する。許容性の高い細胞は、細胞１個当たりの子孫ビリオン数が多くない場合でも、少なくとも感染効率を高くすることができるという利点もある。即ち、許容性の高い細胞のほうが高い比率の接種材料ビリオンに感染できることが多いため、例えば低力価又は劣化した接種材料を感染させても効率的に増殖できる。従って、本発明の１側面は宿主細胞培養の感染から得られるウイルスの力価を増加させるために、宿主細胞の許容性を増加させる本発明の方法を使用できるという点にある。
【００４５】
本発明の別の側面では、宿主細胞脂質よりもウイルス中に比較的多量又はウイルス中に比較的高濃度で存在する脂質を提供することにより、宿主細胞の感染から生産されるウイルスの品質及び／又は量を改変することができる。例えば、本発明者らはウイルスによっては宿主細胞用培地及び／又は宿主細胞よりも所定脂質の脂質含量が比較的高いことを突き止めた。ウイルス中に選択的に高濃度で存在する脂質を提供すると、例えば許容性増加、感染性増加、高力価及び／又は高収率等のウイルス培養上の利点が得られると予想される。
【００４６】
本発明者らは所定のエンベロープをもつウイルス粒子ではＣ１６：０脂肪酸を含む脂質の濃度が高いことを見出した。１態様では、ウイルス用宿主細胞を培養するために使用する培地にＣ１６：０脂肪酸又はＣ１６：０脂肪酸を含む脂質を添加することによりウイルス培養の生産性を増加することができる。例えば、所定態様では、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のＣ１６：０脂肪酸（パルミチン酸）、その塩、又はＣ１６：０脂肪酸を含む脂質（例えばコレステロールエステル又はスフィンゴ脂質）を含有する液体培地で増殖させた宿主細胞でウイルスを培養することができる。これらの態様において、上記Ｃ１６：０脂質は個々の脂質種の他の脂肪酸又は総脂質よりも多量に存在することが好ましい。本発明の別の側面において、Ｃ１６：０コレステロールエステルは総培地コレステロールエステルの少なくとも１０モル％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又はそれ以上の量でエンベロープをもつウイルス宿主細胞用の培地に存在することが好ましい。更に、Ｃ１６：０スフィンゴミエリンは培地スフィンゴ脂質の少なくとも１０モル％，少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又はそれ以上の量でエンベロープをもつウイルス宿主細胞用の培地に存在することが好ましい。
【００４７】
本発明者らは所定のエンベロープをもつウイルス粒子ではＣ１８：２ｎ６脂肪酸を含む脂質の濃度が高いことを見出した。１態様では、ウイルス用宿主細胞を培養するために使用する培地にＣ１８：２ｎ６脂肪酸又はＣ１８：２ｎ６脂肪酸を含む脂質を添加することによりウイルス培養の生産性を増加することができる。例えば、所定態様では、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のＣ１８：２ｎ６脂肪酸（リノール酸）、その塩、又は１種以上のＣ１８：２ｎ６脂肪酸を含む脂質（例えばコレステロールエステル又はスフィンゴ脂質）を含有する液体培地で増殖させた宿主細胞でウイルスを培養することができる。これらの態様において、上記Ｃ１８：２ｎ６脂質は個々の脂質種の他の脂肪酸又は総脂質よりも多量に存在することが好ましい。本発明の別の側面において、Ｃ１８：２ｎ６コレステロールエステルは培地コレステロールエステルの少なくとも１０モル％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又はそれ以上の量でエンベロープをもつウイルス宿主細胞用の培地に存在することが好ましい。更に、Ｃ１８：２ｎ６スフィンゴミエリンは培地スフィンゴ脂質の少なくとも２モル％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又はそれ以上の量でエンベロープをもつウイルス宿主細胞用の培地に存在することが好ましい。
【００４８】
本発明の所定態様では、上記脂質の組み合わせを補充した培地でウイルス宿主細胞を増殖させることにより生産性（例えば感染性、複製、力価、宿主細胞当たりの感染単位）を増加することができる。例えば、好ましい１態様では、Ｃ１６：０コレステロールエステル、Ｃ１６：０スフィンゴミエリン、Ｃ１８：２ｎ６スフィンゴミエリン及びＣ１８：２ｎ６コレステロールエステルの２種以上をウイルス宿主細胞増殖培地に補充する。１側面では、Ｃ１８：２ｎ６脂肪酸を含むコレステロールエステル及び／又はスフィンゴ脂質脂肪酸少なくとも１５モル％を提供するように培地に補充する。別の側面では、Ｃ１６：０脂肪酸であるスフィンゴ脂質脂肪酸少なくとも１０モル％と、Ｃ１６：０脂肪酸を含むコレステロールエステル少なくとも１５モル％を提供するように培地に補充する。別の側面では、Ｃ１８：２ｎ６エステルであるコレステロールエステル少なくとも１０モル％と、Ｃ１８：２ｎ６脂肪酸であるスフィンゴ脂質脂肪酸少なくとも１０モル％と、Ｃ１６：０エステルであるコレステロールエステル少なくとも１０モル％と、Ｃ１６：０脂肪酸であるスフィンゴ脂質脂肪酸少なくとも５モル％を提供するように培地に補充する。
【００４９】
ウイルス安定性増進
ウイルスの物理的安定性の側面を改善するために、本発明の方法によるウイルス脂質成分の量及び／又は比率の調節を使用することができる。例えば、高融点脂質、ワクチン製造工程に適合性の高い脂質、又は酸化しにくい脂質を含有するように調節したウイルスは所定環境でより高い安定性（例えばワクチン製品及び／又は処理中間体の保存寿命安定性）を提供することができる。
【００５０】
脂質の融点は一般に長い脂肪酸鎖を含む脂質のほうが高く、また、飽和脂肪酸を含む脂質のほうが高い。また、膜の流動性はコレステロール比率の増加と共に低下するので、コレステロール含量の高い膜のほうが剛性であり、安定性を高くすることができる。更に、飽和脂肪酸鎖の酸化感受性（例えば保存時のラジカルによる連鎖反応）は不飽和脂肪酸よりも低い。本発明の１側面では、飽和脂肪酸濃度が高い及び／又はコレステロール濃度が低い脂質を含有する培地で増殖させた細胞で培養することにより、ウイルス、特にエンベロープをもつウイルスの安定性を増進することができる。例えば、安定性の高いビリオンを生産するための細胞培養用培地には、標準培地よりも高比率の飽和脂肪酸を含む補充量のスフィンゴミエリンとリン脂質を添加することができる。例えばＣ１６：０脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及び／又はＣ２０：０脂肪酸の比率が非常に高い脂質を例えば標準培地（例えば市販培地）に補充することができる。好ましい１態様において、ウイルス宿主細胞用増殖培地は１種以上の飽和脂肪酸（例えばＣ１６：０脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、及び／又はＣ２０：０脂肪酸）を含む脂質を少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上含有する。これらの態様において、飽和Ｃ１６−Ｃ２０脂肪酸は培地中の特定脂質（例えばリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質等）に含まれる他の脂肪酸又は総脂質よりも多量に存在することが好ましい。本発明の別の側面において、不飽和Ｃ１６−Ｃ２０脂肪酸は個々の培地脂質種又は総培地脂質の少なくとも１０モル％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又はそれ以上の量でエンベロープをもつウイルス宿主細胞用の培地に存在することが好ましい。
【００５１】
本発明者らは生体膜を膜の相転移温度に近い温度で液体防腐剤溶液に接触させることにより生物材料（例えば細菌、エンベロープをもつウイルス、動物細胞等）の安定性を改善できることを指摘した（本明細書に援用する出願番号第１０／４１２，６３０号参照）。相転移温度では、膜の透過性が実質的に増すため、防腐剤（例えば、標準生物製剤糖及びアミノ酸）が膜に浸透し易くなる。本発明の１側面は細胞及び／又はウイルスを製剤化及び防腐処理工程に適合し易くするために、培地脂質含量の調節により細胞又はウイルスの宿主の相転移温度を調整できるという点にある。例えば、膜の典型的な相転移温度は約１５℃とすることができる。しかし、処理中の生存率を上げるため及び／又は例えば噴霧乾燥、凍結乾燥もしくは凍結発泡乾燥中の潜熱の結果として生じる温度に適合させるために、より低温又は５〜１０℃でウイルス（例えばワクチン）を処理することが望ましい場合がある。他方、例えば元々相転移温度が低い膜（例えば好冷生物）や、高温での膜透過性が所望される工程（例えば遺伝子形質転換工程）では、細胞膜の相転移温度をより高温に調整することが望ましい場合もある。
【００５２】
一般に、膜の剛性と相転移温度は、例えば、１）コレステロール不含培地で細胞を増殖させること、２）スフィンゴミエリンを補充した培地で細胞を増殖させること、３）（膜コレステロールを低減するために）細胞をシクロデキストリンと接触させること、４）膜をスフィンゴミエリナーゼと接触させる（従って、膜スフィンゴミエリンをより剛性のセラミドに変換する）こと、及び／又は５）長鎖及び／又は飽和脂肪酸の比率の高い脂肪酸を含む脂質を補充した培地で細胞を増殖させることにより上昇させることができる。一般に、膜の相転移温度は、例えば、１）コレステロールを補充した培地で細胞を増殖させること、２）スフィンゴミエリン不含培地で細胞を増殖させること、及び／又は３）短鎖及び／又は不飽和脂肪酸の比率の高い脂肪酸を含む脂質を補充した培地で細胞を増殖させることにより低下させることができる。
【００５３】
細胞の相転移温度を低下させる好ましい態様では、コレステロールや比較的短鎖（Ｃ１２−Ｃ１６）でより好ましくは不飽和の脂肪酸を含む脂質等の補充脂質を含有する培地で細胞を増殖させる。例えば、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のコレステロール及び／又は１種以上のＣ１２−Ｃ１６不飽和脂肪酸を含む脂質を含有するように補充した細胞用標準培地で細胞を増殖させることができる。脂質の脂肪酸は他の脂肪酸（例えばＣ１８−Ｃ２２飽和脂肪酸）よりも多量に存在することが好ましい。場合により、膜相転移温度を上昇させるために、より小数種の異なるクラス及び／又はサブクラスの脂質を含有する培地で宿主細胞を増殖させることができる。細胞の膜相転移温度を低下させ易くするためには、不飽和Ｃ１２−Ｃ１６脂肪酸が個々の培地脂質種又は総培地脂質の少なくとも１０モル％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又はそれ以上の量で培地に存在することが好ましい。場合により、膜相転移温度を低下させるために、より多数種の異なるクラス及び／又はサブクラスの脂質を含有する培地で細胞を増殖させることができる。ウイルス膜の相転移温度を調節する好ましい１態様では、上記のような宿主細胞を使用してウイルスを培養する。
【００５４】
細胞の相転移温度を上昇させる好ましい態様では、スフィンゴ脂質や比較的長鎖（Ｃ１８−Ｃ２２）でより好ましくは飽和の脂肪酸を含み、更に好ましくは異なる脂質の数が制限された他の脂質等の補充脂質を含有する培地で細胞を増殖させる。例えば、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のスフィンゴミエリン及び／又は１種以上のＣ１８−Ｃ２２飽和脂肪酸を含む他の脂質を含有するように補充した細胞用標準培地で細胞を増殖させることができる。脂質の脂肪酸は他の脂肪酸（例えばＣ１２−Ｃ１６不飽和脂肪酸）よりも多量に存在することが好ましい。細胞の膜相転移温度を低下し易くするためには、不飽和Ｃ１８−Ｃ２２脂肪酸が個々の培地脂質種又は総培地脂質の少なくとも１０モル％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又はそれ以上の量で培地に存在することが好ましい。ウイルス膜の相転移温度を上昇させる好ましい１態様では、上記のような培地で増殖させた宿主細胞を使用してウイルスを培養する。場合により、スフィンゴミエリナーゼ及び／又はシクロデキストリンと接触させることにより細胞又はウイルス膜の相転移温度を上昇させることができる。
【００５５】
細胞又はウイルスの膜脂質の調整システム
本発明は細胞又はウイルスの膜における脂質成分の改変システムを含む。前記システムは一般に、例えば適切な増殖培地に１個以上の細胞を含み、前記培地にはリン脂質、コレステロール及び／又はスフィンゴミエリンを補充する。前記システムは更に細胞に感染することが可能なウイルスを含むことができる。
【００５６】
細胞及びウイルス脂質の操作システム及び方法は特定成分が不在又は欠損している培地に補充する段階を含む。補充は場合により公知又は未公開の成分を含む当分野で周知の標準培地に特定脂質を添加する操作を含むことができる。本発明は本明細書に教示する特定脂質を添加（又は除去するように再調製）することによって特定改変を行うことにより細胞及びウイルス脂質を改変しようとするものである。例えば、所定の標準培地は恐らく所定量の改変用脂質を含有しているが、細胞又はウイルスの脂質含量を改変するように特定脂質を調整することができる。例えば、宿主細胞及び／又はウイルス脂質組成を改変するために、以下の培地を本明細書に教示するように脂質について調整することができる：２９３細胞用培地、脂肪細胞／脂肪前駆細胞用培地、羊水細胞用培地、星状細胞用培地、イーグル基礎培地、血液及び骨髄細胞用培地、ＣＨＯ細胞用培地、軟骨細胞用培地、クリック培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｄ−ＭＥＭ  ｗ／ｏグルタミン、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｄ−ＭＥＭ  ｗ／グルタミン、内皮細胞用培地、線維芽細胞用培地、遺伝子治療用培地、Ｇ−ＭＥＭ培地、ハムＦ−１０培地、ハムＦ−１２培地、肝細胞用培地、ハイブリドーマ用培地、ＩＭＥＭリクター培地、イスコフ培地、ケラチノサイト用培地、リーボビッツＬ−１５培地、マッコイ５Ａ培地、ＭＣＤＢ  １３１培地、ＭＤＣＫ培地、１９９培地、ＭＥＭα培地、ＭＥＭスピナー培地、ＭＥＭ  ｗ／グルタミン、ＭＥＭ  ｗ／ｏグルタミン、ＮＣＴＣ−１０９培地、ニューロン細胞用培地、希突起膠細胞用培地、骨芽細胞用培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、平滑筋細胞用培地、トランスフェクト細胞選択・クローニング用培地、ベロ細胞用培地、ウィリアム培地、ムラシゲ・スクーグ基礎塩類溶液、チュー（Ｎ６）培地、ＤＫＷ／クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）混合基礎塩類、マッコーエン樹木植物用培地、ギヤール（Ｆ／２）海水強化基礎塩類等（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ等の製品参照）。
【００５７】
細胞、培地及びウイルスは発酵槽、Ｔ型フラスコ、ペトリ皿、フラスコ、撹拌装置付きフラスコ等の培養容器に収容することができる。システムは例えば約１０℃〜約４０℃又は約３７℃の安定したインキュベーション温度を提供するためのサブシステムコンポーネントを含むことができる。
【００５８】
上記システムの特定態様において、スフィンゴミエリンはＣ１６：０脂肪酸、Ｃ１８：０脂肪酸、Ｃ１８２ｎ６及び／又はＣ１８１ｎ９脂肪酸を含むことができる。例えば、培地スフィンゴミエリンは（エステル化した）２５モル％以上のパルミチン酸（Ｃ１６：０）、２０モル％以上のステアリン酸（Ｃ１８：０）及び／又は４０モル％以上のオレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）を含むことができる。
【００５９】
上記方法及びシステムの別の側面において、ウイルス宿主細胞培養用培地は（慣用又は標準培地量に対して）補充したホスファチジルセリン及び／又はホスファチジルイノシトールを含有する。例えば、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のホスファチジルセリン及び／又はホスファチジルイノシトールを含有するように補充した細胞用標準培地で細胞を増殖させることができる。これらのリン脂質の脂肪酸は主にＣ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８１ｎ９、及び／又はＣ１８：２ｎ６であることが好ましい。最も好ましいリン脂質サプリメントは１種以上のＣ１８：２ｎ６脂肪酸を含有する。ホスファチジルセリン及び／又はホスファチジルイノシトールは培地中のリン脂質又は総脂質の少なくとも１０モル％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又はそれ以上の量で培地に存在することが好ましい。
【００６０】
好ましい態様において、細胞は動物細胞である。細胞は鳥類細胞又は哺乳動物細胞が好ましい。細胞はヒト細胞、サル細胞、類人猿細胞、ニワトリ細胞がより好ましい。細胞はニワトリ尿嚢（ＣＡＳ）細胞、ニワトリ胎児腎（ＣＥＫ）細胞、イヌ腎細胞、ベロ細胞、リンパ球、ＭＤＣＫ細胞、ＭＡ−１０４細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、及びＵ９３７細胞が最も好ましい。
【００６１】
好ましい態様において、ウイルスはバキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、イリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、及びブンヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）のメンバー等のエンベロープをもつウイルスである。最も好ましいウイルスとしては、各種インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全（ＨＴＶ）ウイルス、パラミクソウイルス（例えば呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス）、及びパポバウイルス（例えばヒトパピローマウイルス）が挙げられる。
【００６２】
本発明のシステムでウイルスを培養すると、子孫ビリオンの所定の特性を制御することが可能になる。例えば、補充（改変）培地で宿主細胞を培養すると、未補充培地で増殖させた宿主細胞で培養したウイルスよりも高い力価が得られ、ウイルスの保存寿命を延ばし、ウイルスの免疫原性を増強し、及び／又はウイルスの膜Ｔｇを改変することができる。
【００６３】
上記システム及び方法の他の側面では、宿主細胞を提供する動物に本明細書に有利であるとして特定する脂質を高濃度で含有する飼料を与えることにより、宿主細胞（例えばＣＡＳ細胞）及び／又はビリオンの脂質含量を改変することができる。例えば、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８１ｎ９、及び／又はＣ１８：２ｎ６脂肪酸を含むスフィンゴミエリン、リン脂質、及び／又はコレステロールエステル等の脂質を高濃度で含有する飼料を動物に与えることができる。
【００６４】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により発明を限定するものではない。変更しても実質的に同様の結果となる種々のパラメーターが当業者に認識されよう。
【００６５】
インフルエンザウイルスエンベロープの相転移測定の結果、比較的剛性の膜構造が明らかになり、高融点脂質の濃度が高く、ウイルスエンベロープ上にコレステロールとスフィンゴ脂質が多量に存在することが裏付けられた。所定の脂質クラスがビリオンの増殖に用いる宿主細胞に比較してビリオンに優先的又は選択的に高濃度で存在するか否かという点について検討した。ウイルスに高濃度で存在する脂質の種類とサブクラス、許容性レベルの異なる宿主細胞の脂質組成の相違、及び細胞培養培地に「優先的」脂質成分を補充する効果について検討した。
【００６６】
本発明者らは宿主細胞とビリオンの間及び宿主細胞間及びビリオン間の脂質組成の相違が細胞及びウイルス産物の生産性と効力を改変するのに有用な特性と相関していることを見出した。例えば、脂質組成分析の結果、ウイルスエンベロープではウイルスの作製に使用した宿主細胞に比較して高レベルのスフィンゴミエリンとコレステロールが過剰に発現されることが分かった。本発明者らはスフィンゴミエリンサブタイプとコレステロールサブタイプに関してウイルスと細胞の間に有意差があることに着目した。スフィンゴミエリン１６：０はウイルスに高濃度で検出され、１８：０は許容細胞では高濃度であったが、ウイルスでは（恐らく優先的に）低濃度であった。１８：１ｎ９鎖長をもつコレステロールエステルは細胞で優先的に高濃度であり、１６：０はウイルスで高濃度であった。ベロ細胞（インフルエンザに対して低許容性）はインフルエンザ感染に対する許容性の高い尿嚢細胞よりもスフィンゴミエリン含量が低く、１８：１ｎ９コレステロールエステル含量が有意に低かった。
【実施例１】
【００６７】
膜相転移の顕微ＦＴＩＲ解析
図１Ａ〜１Ｃに示すように、膜の脂質移動度は膜のコレステロール及びスフィンゴミエリン含量により変化した。ＦＴＩＲは〜２８５０ｃｍ−１で−ＣＨ２伸縮振動を検出し、リン脂質テール基の脂肪アシル側鎖の振動をモニターした。温度に対する端数をプロットし、膜相変化を調べた。流体相−高脂質移動度相変化からゲル−結晶相変化までを検出可能であった。高波数側へシフトするほど、規則性の高い（ないし剛性度の高い）膜脂質環境を意味することが分かった。
【００６８】
シクロデキストリンの疎水性ポケットは膜からコレステロールを分離することができる。シクロデキストリン処理により図１Ａの対照に対してコレステロール含量を低下させると、図１Ｂに示すように、脂質移動度は低下し、検出される脂質は規則性が高くなった。図１Ｃに示すように、膜をスフィンゴミエリナーゼで処理して膜スフィンゴミエリンをセラミドに変換することにより膜融点と脂質規則性は更に増加した。更に、これらの実験の結果、インフルエンザ感染に対する許容性の高いＣＥＫ細胞は膜特性を変化させるために調整可能なコレステロールとスフィンゴ脂質を多量に含有していることが判明した。
【００６９】
１側面では、宿主細胞の許容性を予測するためにＦＴＩＲ分析を使用できると予想される。例えば、所定のＦＴＩＲプロフィル及び／又は処理応答は許容性に相関することができる。宿主細胞用培地の調整により膜脂質組成と膜特性を同様に変化させることができると予想される。
【実施例２】
【００７０】
処理後のビリオン膜のＦＴＩＲ分析
ウイルス膜の規則性と脂質移動度は脂質含量の変化により左右されることも判明した。例えば、図２に示すように、（例えばシクロデキストリン処理により）ウイルス膜のコレステロール含量を改変すると、移動度と相転移特性を変化させることができる。更に、ＦＴＩＲにより検出される通り、膜スフィンゴミエリンからセラミドへの変換も膜の特性を変化させることができる。これらの実験の結果、許容宿主細胞と同様に、ウイルスは比較的多量のコレステロールとスフィンゴミエリンを含有することが分かった。ウイルス膜は最も許容性の高い宿主細胞の膜よりも更に高濃度のコレステロールとスフィンゴミエリンを含有することが分かった。
【００７１】
１側面では、例えば保存に伴うウイルスの変化を検出するためにＦＴＩＲ分析を使用できると予想される。例えば、所定の膜脂質成分の分解又は消費をＦＴＩＲプロフィルの変化と相関させることができる。
【００７２】
これらの実験から、波数変化の大きさにより実証される通り、インフルエンザエンベロープは比較的剛性であることが分かった。インフルエンザは高濃度のコレステロールとスフィンゴ脂質を含有していると思われる。Ａ／シドニーでは〜１５℃で大きな相転移を検出可能であるが、Ｂ／ハルビンではさほどではない。例えばウイルスワクチンの製剤化乾燥工程における乾燥サイクルを設計するためにこのような相転移を使用することができる。ＨＩＶと同様に、インフルエンザエンベロープは平均的な宿主膜には一般的でない膜脂質ラフトないしミクロドメインに由来する。
【実施例３】
【００７３】
脂質サブタイプを含む膜組成分析
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法とガスクロマトグラフィー法を使用して１０種のクラスと４０種のサブクラスの膜脂質を同定した。これらのクラスはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン／イノシトール、スフィンゴミエリン、コレステロールエステル、遊離脂肪酸、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、カルジオリピン及びリゾホスファチジルコリンであった。これらのクラス内で、例えば脂質構造にエステル化される脂肪酸の種類に従って脂質を更に特性決定した。検出限界は一般に約１ｎｍｏｌであり、アッセイ変動は測定間で１０％未満であった。
【００７４】
図３に示すように、特に、ウイルスエンベロープ膜は宿主ＣＡＳ細胞膜に比較してスフィンゴミエリンと糖脂質（ホスファチジルセリン／イノシトール）が多い。
【００７５】
図４及び５に示すように、宿主細胞と子孫ウイルスの間には脂質含量サブタイプに有意差が認められる。例えば、ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルセリン／イノシトールはいずれも宿主よりもウイルスのほうが高濃度のＣ１８：１ｎ９脂肪酸を含有しているようである。
【００７６】
図６に示すように、Ｃ１８：０脂肪酸を含むスフィンゴミエリンサブタイプは宿主細胞濃度よりもウイルスに実質的に高濃度で存在する。
【００７７】
図７に示すように、許容性ＣＡＳ細胞はＣ１８：１ｎ９を含むコレステロールエステルの濃度が子孫ウイルスに比較して有意に高い。
【実施例４】
【００７８】
許容細胞と非許容細胞の膜組成
ウイルス感染許容性の異なる宿主細胞の選択について一連の分析を実施した。特定膜脂質とウイルス感染感受性の相関傾向が認められた。
【００７９】
例えば、ベロ細胞はインフルエンザウイルス感染に対する許容性が比較的低く、ＭＤＣＫ細胞は多少許容性が高く、ＣＡＳ細胞は最も許容性が高い。図８に示すように、スフィンゴミエリンは許容細胞で実質的に顕著である。
【００８０】
図９に示すように、コレステロールエステルについては、Ｃ１８：１ｎ９及びＣ１８２ｎ６脂肪酸は許容性の低い細胞よりも高い細胞のほうが有意に顕著である。
【００８１】
図１０に示すように、スフィンゴミエリンサブタイプについては、許容性とＣ１８：０含有スフィンゴミエリンの多寡の間に相関があると思われる。
【００８２】
以上をまとめると、細胞及びウイルス膜脂質の調節により宿主細胞の許容性とウイルス培養収率を改変できるものと期待される。相転移測定によると、インフルエンザウイルスエンベロープは非常に剛性であり、高融点脂質から構成されるようである。脂質組成分析の結果、ウイルスエンベロープではスフィンゴミエリンとコレステロールの濃度が高いことが確認された。スフィンゴミエリンサブタイプとコレステロールサブタイプについては、ウイルスと細胞の間に有意差が認められた。ベロ細胞は許容性の高い尿嚢細胞に比較してスフィンゴミエリン含量が低く、１８：１ｎ９コレステロールエステル含量が有意に低かった。
【００８３】
当然のことながら、本明細書に記載した実施例及び態様は例証のみを目的とし、その記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。本明細書に引用した全刊行物、特許、及び特許出願はその開示内容全体を全目的で本明細書に援用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００８４】
【特許文献１】米国仮出願第６０／８５２，５７１号
【非特許文献】
【００８５】
【非特許文献１】Ｄ．Ｔｏｍｂａｃｃｉｎｉら，Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３，ＳＶ３Ｔ３，ａｎｄ  Ｃｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ  Ａ−Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｒｅｖｅｒｔａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  Ｍｅｄｉａ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｌｉｐｉｄ−Ｄｅｐｌｅｔｅｄ  Ｓｅｒｕｍ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，２２：５９０−５９７，（１９８１）
【非特許文献２】Ａ．Ｃ．Ｒｏｌａｎｄら，“Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｌｕｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”，ＰＮＡＳ  ９０：５１８１−５１８５（１９９３）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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