(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの構造単位：
【化１】
0006298818.tif 000049
および任意選択で、少なくとも１つの構造単位：
【化２】
0006298818.tif 000050
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、存在する場合、水素、Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−
およびＣ１〜５アルキルからなる群からそれぞれ独立して選択され；
【化３】
0006298818.tif 000051
は、各場合において、単結合または二重結合であって、
式中、二重結合である各場合において、二重結合−Ｏに結合するＲ１、Ｒ２、Ｒ３また
はＲ４は不在であり；Ｒ１が不在の場合、Ｒ５は水素、ヒドロキシル、Ｃ１〜５アルキル
またはＣ１〜５アルコキシであり；Ｒ３が不在の場合、Ｒ６は水素、ヒドロキシル、Ｃ１
〜５アルキルまたはＣ１〜５アルコキシであり；
式中、単結合である各場合において、二重結合−Ｏに結合するＲ１、Ｒ２、Ｒ３または
Ｒ４が存在し；Ｒ１が存在する場合、Ｒ５は水素であり；Ｒ３が存在する場合、Ｒ６は水
素であり；
Ｑは−（ＣＲｃＲｄ）ｖ−であって；
式中、ＲｃおよびＲｄは、各場合において、独立して、水素またはＣ１〜５アルキル
であり；ｖは２〜６の整数であり；
ｐは１〜１０の整数であり；
Ａは、
【化４】
0006298818.tif 000052
であって、
式中、ＬはＳ、ＯまたはＮであり；
Ｇは、各場合において、独立して、水素である、またはＬと一緒に一酸化窒素ドナー
を形成する、または不在であり；
Ｘは水素、Ｃ１〜５アルキルである、またはＮと一緒に一酸化窒素ドナーを形成し；
Ｂは存在しないか、水素、ヒドロキシル、Ｃ１〜５アルキル、または−Ｙ−Ｚであって
、式中、Ｙは、構造
【化５】
0006298818.tif 000053
（式中、Ｒｐ、Ｒｑ、ＲｓおよびＲｔは、各場合において、独立して、水素またはヒドロ
キシルであり；ｋは１〜２０の整数である）を有し、
Ｚは、構造
【化６】
0006298818.tif 000054
（式中、ｊは、各場合において、１〜１００の整数である）を有し；
Ｄは−ＮＲａＲｂであって、式中、ＲａおよびＲｂは、水素、ホルミル、Ｃ１〜５アル
キル（Ｃ＝Ｏ）−、Ｃ１〜５アルキルおよびＣ１〜５アルキルエステルからなる群から独
立して選択される；
またはＤは、
【化７】
0006298818.tif 000055
である）
を含むポリグルコサミンであって、
前記ポリグルコサミンが、ジアゼニウムジオレート、ニトロソチオール、ニトロソアミ
ン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシウレアおよびこれら
の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの一酸化窒素ドナーを含み、
ＧがＬと一緒に前記少なくとも１つの一酸化窒素ドナーを形成するか、ＸがＮと一緒に
前記少なくとも１つの一酸化窒素ドナーを形成する、ポリグルコサミン。
【請求項２】
構造単位：
【化８】
0006298818.tif 000056
（式中、
ｍは１〜１０，０００の整数である）
を含む、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項３】
前記一酸化窒素ドナーがジアゼニウムジオレートである、請求項１に記載のポリグルコ
サミン。
【請求項４】
ｍが１〜５０の整数である、請求項３に記載のポリグルコサミン。
【請求項５】
ｍが１〜１０の整数である、請求項３に記載のポリグルコサミン。
【請求項６】
少なくとも１つの構造単位：
【化９】
0006298818.tif 000057
（式中、
Ｄは−ＮＲａＲｂであって、式中、ＲａおよびＲｂは、水素、ホルミル、Ｃ１〜５アル
キル（Ｃ＝Ｏ）−、Ｃ１〜５アルキルおよびＣ１〜５アルキルエステルからなる群から独
立して選択される）
を含む、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項７】
【化１０】
0006298818.tif 000058
が、各場合において、単結合であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ水素であり、
Ｒ５およびＲ６がそれぞれ水素である、請求項６に記載のポリグルコサミン。
【請求項８】
少なくとも１つの構造単位：
【化１１】
0006298818.tif 000059
を含む、請求項７に記載のポリグルコサミン。
【請求項９】
Ｂが水素である、請求項８に記載のポリグルコサミン。
【請求項１０】
Ｂが−Ｙ−Ｚである、請求項９に記載のポリグルコサミン。
【請求項１１】
Ｚは構造：
【化１２】
0006298818.tif 000060
を有する、請求項１０に記載のポリグルコサミン。
【請求項１２】
Ｙが構造：
【化１３】
0006298818.tif 000061
を有する、請求項１０に記載のポリグルコサミン。
【請求項１３】
構造単位：
【化１４】
0006298818.tif 000062
（式中、
Ｄは、
【化１５】
0006298818.tif 000063
である）
を含む、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項１４】
【化１６】
0006298818.tif 000064
が、各場合において、単結合であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ水素である、請求項１３に記載のポリグルコサミ
ン。
【請求項１５】
Ｂが−Ｙ−Ｚであって、式中、Ｚは構造：
【化１７】
0006298818.tif 000065
を有する、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項１６】
ｊが１〜５０の整数である、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項１７】
ｊが１〜１５の整数である、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項１８】
Ａが、
【化１８】
0006298818.tif 000066
（式中、Ｇは水素である、またはＮと一緒に一酸化窒素ドナーを形成する、または不在
であり；
Ｂは水素である）
である、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項１９】
構造単位：
【化１９】
0006298818.tif 000067
（式中、
ｍは１〜１，０００の整数であり、
ｎは１〜１，０００の整数である）
を含む、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項２０】
ｍおよびｎが、１〜５０の整数からそれぞれ独立して選択される、請求項１９に記載の
ポリグルコサミン。
【請求項２１】
構造単位：
【化２０】
0006298818.tif 000068
を含む、請求項１９に記載のポリグルコサミン。
【請求項２２】
Ｘが水素である、またはＮと一緒にジアゼニウムジオレートを形成し；
Ａが、
【化２１】
0006298818.tif 000069
（式中、Ｇは水素である、またはＮと一緒にジアゼニウムジオレートを形成する）
である、請求項２１に記載のポリグルコサミン。
【請求項２３】
Ｂが、−Ｙ−Ｚであって、式中、Ｚは構造：
【化２２】
0006298818.tif 000070
を有する、請求項２１に記載のポリグルコサミン。
【請求項２４】
Ｙが構造：
【化２３】
0006298818.tif 000071
を有する、請求項２３に記載のポリグルコサミン。
【請求項２５】
ＡがＮである、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項２６】
ＡがＳである、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項２７】
ＲｃおよびＲｄが、各場合において、独立して、水素またはメチルであり；
ｖが２である、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリグルコサミンの有効量を含む、対象に一酸
化窒素を送達するための組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリグルコサミンの有効量を含む、疾患状態を
処置するための組成物であって、前記疾患状態が、癌、心血管疾患、微生物感染；医療機
器への血液の曝露によって引き起こされる血小板凝集および血小板粘着；異常な細胞増殖
に起因する病態；移植拒絶、自己免疫疾患、炎症、血管疾患；瘢痕組織；創傷収縮、再狭
窄、疼痛、発熱、胃腸障害、呼吸器障害、性的機能不全および性感染症からなる群から選
択される組成物。
【請求項３０】
前記疾患状態が嚢胞性線維症である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ｉｉｉ．請求項１〜２７のいずれか１項に記載ののポリグルコサミン；および
ｉｖ．薬学的に許容される担体
を含む、医薬製剤。
【請求項３２】
前記ポリグルコサミンが水溶性である、請求項３１に記載の医薬製剤。
【請求項３３】
前記ポリグルコサミンが水溶性である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリグ
ルコサミン。
【請求項３４】
前記ポリグルコサミンが、１００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、請求項
１〜２７のいずれか１項に記載のポリグルコサミン。
【請求項３５】
ＧがＬと一緒に前記少なくとも１つの一酸化窒素ドナーを形成する、請求項１に記載の
ポリグルコサミン。
【請求項３６】
ＸがＮと一緒に前記少なくとも１つの一酸化窒素ドナーを形成する、請求項１に記載の
ポリグルコサミン。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの一酸化窒素ドナーがジアゼニウムジオレートである、請求項３６
に記載のポリグルコサミン。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの一酸化窒素ドナーがニトロソチオールである、請求項３６に記載
のポリグルコサミン。
【請求項３９】
構造単位：
【化２４】
0006298818.tif 000072
（式中、ｘ＝２であり、
ｍは１〜１，０００の整数であり、
ｎは１〜１，０００の整数である）
を含む、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項４０】
構造単位：
【化２５】
0006298818.tif 000073
（式中、
ｍは１〜１，０００の整数であり、
ｎは１〜１，０００の整数である）
を含む、請求項１に記載のポリグルコサミン。
【請求項４１】
少なくとも１つの構造単位：
【化２６】
0006298818.tif 000074
（式中、
ｍは１〜１，０００の整数であり、
ｎは１〜１，０００の整数である）
を含む、ポリグルコサミン。  
【請求項４２】
ｍ及びｎが、それぞれ独立して、１〜５０の整数から選択される、請求項４１に記載の
ポリグルコサミン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［政府の権利］
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＥＢ０００７０８の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
［発明の分野］
本開示の主題は、一酸化窒素放出多糖およびオリゴ糖、特にポリグルコサミン、ならびに生物医学的および薬学的用途におけるそれらの使用を提供する。より詳細には、いくつかの実施形態において、本開示の主題は、制御および標的化された方法で一酸化窒素を放出し、それによって一酸化窒素の治療効果を延長し、標的細胞および／または組織への一酸化窒素の送達の特異性を改善する一酸化窒素放出オリゴ糖を提供する。
【背景技術】
【０００３】
生物学、生理学、病態生理学における一酸化窒素（ＮＯ）の多面的な役割の発見（Ｍａｒｉｅｔｔａ，Ｍ．Ａ．ら、ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ、２、２１９〜２２５（１９９０年）を参照のこと）は、一酸化窒素放出を制御することができる一酸化窒素ドナーの探求をもたらした。Ｋｅｅｆｅｒ，Ｌ．Ｋ．，Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、２８、３０〜３５（１９９８年）を参照のこと。現在までに、研究者は、ＮＯが、心血管、胃腸、泌尿生殖器、呼吸器ならびに中枢および末梢神経系における様々な生物学的プロセスを調節することを発見した。Ｉｇｎａｒｒｏ，Ｌ．Ｊ．，Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、２０００年；およびＩｇｎａｒｒｏ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８４、９２６５〜９２６９（１９８７年）を参照のこと。さらに、ＮＯが血管拡張剤として発見され、抗生物質と殺腫瘍因子の両方として同定されたことにより、ＮＯは魅力的な医薬品候補となった。例えば、Ｒａｄｏｍｓｋｉ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，９２、６３９〜６４６（１９８７年）；Ａｌｂｉｎａ，Ｊ．Ｅ．およびＲｅｉｃｈｎｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｃａｎｃ．Ｍｅｔａｓ．Ｒｅｖ．，１７、１９〜５３（１９９８年）；Ｎａｂｌｏ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３、９７１２〜９７１３（２００１年）；Ｃｏｂｂｓ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５、７２７〜７３０（１９９５年）；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，９２、４３９２〜４３９６（１９９５年）；ならびにＴｈｏｍｓｅｎ，Ｌ．Ｌ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，７２、４１〜４４（１９９５年）を参照のこと。いくつかの一酸化窒素ドナーが報告されており、最も注目すべきはＮ−ジアゼニウムジオレートであると報告されている。一般に、Ｎ−ジアゼニウムジオレートＮＯドナーは、高圧でのアミンとＮＯとの反応によって合成された小分子であり、例えば、水溶液中でＮＯを自発的に生成するために使用されている。Ｈｒａｂｉｅ，Ｊ．Ａ．およびＫｅｅｆｅｒ，Ｌ．Ｋ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１０２、１１３５〜１１５４（２００２年）を参照のこと。
【０００４】
例えば、腫瘍細胞を死滅させるために一酸化窒素ドナーの活性を調べるという治療方針は、部分的に問題がある。なぜなら、当技術分野で公知の一酸化窒素送達システムが一酸化窒素を無差別に放出または供与するからである。したがって、生理学におけるＮＯ機能の理解の向上を容易にし、ＮＯに関連する治療法の開発をもたらすために、制御および／または標的化された方法で一酸化窒素を放出または供与する一酸化窒素送達システムが当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
実施形態において、本明細書に開示された主題は、共有結合性の一酸化窒素放出部分、すなわちＮＯドナーを含有するポリグルコサミンを対象とする。ポリグルコサミン骨格中の少なくとも１つの構造単位は、式Ｉの構造単位を含有する。任意選択で、ポリグルコサミンの少なくとも１つの構造単位は、式ＩＩの構造単位をさらに含む。有利には、本明細書に記載のポリグルコサミンは水溶性であり、標的にＮＯを送達することができる。
【０００６】
実施形態において、本明細書に開示された主題は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位を含み、任意選択で、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位をさらに含むポリグルコサミンを投与することを含む、対象にＮＯを送達または放出する方法を対象とする。
【０００７】
実施形態において、本明細書に開示された主題は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位を含み、任意選択で、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位をさらに含むポリグルコサミンを投与することを含む、対象における疾患状態を処置する方法を対象とする。
【０００８】
実施形態において、本明細書に開示された主題は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位を含有し、任意選択で、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位および薬学的に許容される担体、添加剤または賦形剤をさらに含むポリグルコサミンを含む医薬組成物を対象とする。
【０００９】
実施形態において、本明細書に開示された主題は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位を含み、任意選択で、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位をさらに含むポリグルコサミンを調製する方法を対象とする。
【００１０】
別の実施形態において、本明細書に開示された主題は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位を含み、任意選択で、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位をさらに含むポリグルコサミンを用いることによりバイオフィルムを破壊、根絶または予防する方法を対象とする。
【００１１】
主題は、本明細書の図面および以下に述べる明細書において十分に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本開示の官能化ポリグルコサミンの有利な特性を説明する表である。
【図２】特定の実施形態において見つかったＣ、ＨおよびＮの割合を示す表である。
【図３】特定の実施形態の１Ｈ  ＮＭＲである。
【図４】図４Ａは、異なるＮＯ抱合溶媒中の特定のキトサンオリゴ糖ＣＳＯ２−ＮＯの放出プロフィールを示すグラフである。メタノール：Ｈ２Ｏ  ７：３は、０．８７μｍｏｌ／ｍｇの総ＮＯ貯蔵をもたらした。図４Ｂは、メタノール中のキトサン２／ＮＯ−５ｋ（黒四角）、メタノール／水  ９：１（黒丸）、８：２（白三角）、７：３（黒三角）および６：４ｖ／ｖ（白四角）の一酸化窒素放出プロフィールに特異的なデータ点を示すグラフである。
【図５】（Ａ）特定のＮＯ放出キトサンオリゴ糖のリアルタイムＮＯ放出プロフィール；および（Ｂ）特定のＮＯ放出キトサンオリゴ糖のｔ［ＮＯ］対時間のプロットを示すグラフである。
【図６】特定の実施形態のｔ［ＮＯ］、［ＮＯ］ｍａｘおよびｔ１／２を示す表である。
【図７】緑膿菌細菌とバイオフィルムの５対数減少をもたらしたＮＯ放出ＣＳＯを示すデータを示すグラフである。確立した緑膿菌バイオフィルムに対するＮＯ放出（黒塗り記号）および対照（白抜き記号）キトサンオリゴ糖（キトサン１−５ｋ；ＣＳＯ１−ＮＯ（球）、キトサン２−５ｋ；ＣＳＯ２−ＮＯ（四角）およびキトサン３−５ｋ；ＣＳＯ３−ＮＯ（三角））の抗バイオフィルム効力。対照キトサンオリゴ糖は、細菌生存率の有意な減少をもたらさなかった。
【図８】Ｌ９２９マウス線維芽細胞における細胞毒性を示すグラフである。緑膿菌バイオフィルムに対して細菌生存率を５対数減少させる濃度（ＭＢＣ）の対照およびＮＯ放出キトサンオリゴ糖に曝露されたＬ９２９マウス線維芽細胞の生存率。各パラメータは、複数の反復試験区で分析した（ｎ＝３）。
【図９】バイオフィルム中の緑膿菌と会合するＲＩＴＣ標識キトサンオリゴ糖（Ａ．キトサン２／ＮＯ−５ｋ、Ｂ．キトサン３／ＮＯ−５ｋ、Ｃ．キトサン２−１０ｋ）の共焦点蛍光画像、ならびにＤ）キトサン２／ＮＯ−５ｋ、Ｅ）キトサン３／ＮＯ−５ｋおよびＦ）キトサン２／ＮＯ−１０ｋと共にインキュベートしたｓｙｔｏ９標識バイオフィルムの画像である。ｓｙｔｏ９の緑色蛍光は、バイオフィルム中に埋め込まれている緑膿菌細菌を示している。ＲＩＴＣの赤色蛍光は、ＲＩＴＣ標識キトサンオリゴ糖とバイオフィルム中の緑膿菌の会合を示している。スケールバー：４０μｍ。
【図１０】緑膿菌と会合するＡ）２４、Ｂ）２８、Ｃ）４２分でのＲＩＴＣ改変キトサン２／ＮＯ−５ｋおよびＤ）８２、Ｅ）８６、Ｆ）１１０、Ｈ）１２０分でのキトサン３／ＮＯ−５ｋ（１５０μｇ  ｍＬ−１）の明視野ならびに蛍光画像である。Ｇ）キトサン２／ＮＯ−５ｋは４４分での、Ｈ）キトサン２／ＮＯ−５ｋは１２０分での、それらと共にインキュベートした緑膿菌のオーバーレイ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
実施形態においてＮＯ放出キトサンオリゴ糖とも呼ばれる、本開示の一酸化窒素（ＮＯ）放出ポリグルコサミンは、有利には、水溶性で調整可能である。これらの特性は、水溶性の治療薬が有利である治療および疾患状態、例えば、嚢胞性線維症の処置において、本開示のポリグルコサミンの有用性に寄与する。本開示の官能化ＮＯ放出ポリグルコサミンが有する公知のＮＯ放出粒子に勝る他の利点は以下を含む。１．キトサンオリゴ糖上に二級アミン含有オリゴマー鎖をグラフトすることによる異なる合成経路および化学組成；２．ＮＯ貯蔵およびＮＯ放出動態が調整可能であることが利点である。アジリジンオリゴマー側鎖上の二級アミンの数を調整することによって、ＮＯ貯蔵を制御することができる。異なる疎水性／親水性の化合物により得られる物質上のアミンをさらに官能化することにより、ＮＯ放出動態を制御することができる。実際、本開示の官能化ポリグルコサミンによってはるかに多くのＮＯ貯蔵を得た。ならびに３．粒子とは対照的に、本明細書に記載の官能化ポリグルコサミンは水溶性であり、水溶性が望まれる生物医学的用途を含むより広い範囲の用途を容易にする。以前に開示されたＮＯ放出キトサン（ＵＳ６，４５１，３３７）は、水溶性ではない。これは、本開示の水溶性の官能化は容易にバイオフィルムに浸透し根絶することができるという別の利点を強調している。
【００１４】
本発明は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に述べられた実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろこれらの実施形態は、本開示が詳細で完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して例示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例示された特徴は、その実施形態から削除することができる。加えて、本明細書において示唆された実施形態への多数の変形および追加は、本開示に照らせば当業者には明らかであろうし、これらは本発明から逸脱するものではない。
【００１５】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で本発明の説明において使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００１６】
本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００１７】
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１または２以上を意味することができる。例えば、ＮＯ放出部分（"a" NO releasing moiety）は、単一または多数を意味することができる。
【００１８】
本明細書で使用される「および／または」は、任意および関連した記載項目の１つもしくは複数のすべての可能な組合せを意味または包含し、選択肢（「または」）で解釈される場合、組み合わせないことを意味または包含する。
【００１９】
さらに、本明細書で使用される「約」という用語は、本発明の化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能な値に言及する場合、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％または±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００２０】
「本質的に〜からなる」という用語（およびその文法的変形）は、本発明の組成物に適用される場合、追加成分が組成物を実質的に変化させない限り、組成物は追加成分を含有し得ることを意味する。
【００２１】
本明細書で使用される「治療有効量」または「有効量」という用語は、障害、疾患または疾病に苦しんでいる対象に、当技術分野において周知なものである、対象の状態（例えば、１つまたは複数の症状）の改善、状態の進行の遅延または軽減、障害の発症の予防または遅延、および／または臨床パラメータ、疾患もしくは疾病等の変化を含む、例えば、有益な効果であり得る調節効果を付与する官能化ポリグルコサミンの量を意味する。例えば、治療有効量または有効量は、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％，少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％対象の状態を改善する組成物、化合物または薬剤の量を意味することができる。
【００２２】
「処置する」または「処置すること」または「処置」は、障害、疾患または疾病に苦しんでいる対象に、当技術分野において周知なものである、対象の状態（例えば、１つまたは複数の症状）の改善、状態の進行の遅延または軽減、障害の発症の予防または遅延、および／または臨床パラメータ、疾患もしくは疾病等の変化を含む、例えば、有益な効果であり得る調節作用を付与する任意のタイプの動作を意味する。
【００２３】
「破壊」および「根絶」という用語は、バイオフィルムに対抗するための本開示の官能化ポリグルコサミンの能力を意味する。バイオフィルムは、部分的に根絶または破壊することができ、細胞がもはや互いにまたは表面に付着しないことを意味する。バイオフィルムは完全に根絶することができ、バイオフィルムがもはや実質的な程度に相互接続した、凝集性または連続した細胞のネットワークではないことを意味する。
【００２４】
本明細書で使用される「水溶性」という用語は、官能化ポリグルコサミンが、官能化前のポリグルコサミンよりも室温で水に可溶性であることを意味する。好ましくは、本明細書に開示された水溶性官能化ポリグルコサミンは、水１ｍＬ当たり５０ｍｇを超える官能化ポリグルコサミンが溶解するように可溶性である。より好ましくは、本明細書に開示された水溶性官能化ポリグルコサミンは、水１ｍＬ当たり７５ｍｇを超える官能化ポリグルコサミンが溶解するように可溶性である。最も好ましくは、本明細書に開示された水溶性の官能化ポリグルコサミンは、水１ｍＬ当たり１００ｍｇを超える官能化ポリグルコサミンが溶解するように可溶性である。
【００２５】
「一酸化窒素ドナー」または「ＮＯドナー」という用語は、一酸化窒素種の生物活性が意図された作用部位において発現されるように、一酸化窒素種を供与、放出、および／または直接もしくは間接的に輸送する、および／またはインビボでの一酸化窒素の内因性の産生を刺激する、および／またはインビボでの一酸化窒素の内因性レベルを上昇させる種を意味する。
【００２６】
「一酸化窒素放出」または「一酸化窒素供与」という用語は、一酸化窒素の３つの酸化還元型（ＮＯ＋、ＮＯ−、ＮＯ）のいずれかを供与、放出、および／または直接もしくは間接的に輸送する方法を意味する。いくつかの場合において、一酸化窒素放出または供与は、一酸化窒素種の生物活性が、意図された作用部位において発現されるように実行される。
【００２７】
本明細書で使用される「微生物感染」という用語は、細菌、真菌、ウイルスおよび酵母感染を意味する。
【００２８】
本明細書に開示された多くの実施形態において、処置される「患者」または「対象」は、望ましくはヒト患者であるが、本開示の主題の原理は、「対象」および「患者」という用語に含まれることが意図されている哺乳動物を含むすべての脊椎動物種に対して本開示の主題が有効であることを示していることが理解されるべきである。適切な対象は、一般に哺乳動物対象である。本発明は、研究に加えて、獣医学的および医療用途においても使用される。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語には、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）等が含まれるが、これらに限定されない。ヒト対象には、新生児、乳幼児、未成年者、成人および老人の対象が含まれる。
【００２９】
本明細書で開示された方法を、「必要とする」対象であり得る対象は、疾患状態を経験している、および／または疾患状態を経験することが予想される対象であることができ、本発明の方法および組成物は、治療および／または予防処置のために使用される。
【００３０】
本明細書に記載のオリゴ糖はポリグルコサミン（polyglucosamines）である。ポリグルコサミンおよびその誘導体は、当技術分野においてキトサンおよびその誘導体として公知である。特に有用なポリグルコサミンは、サイズが１００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であることができるポリマーである。分子量１００ｇ／ｍｏｌ未満のより小さいポリグルコサミンおよび分子量２０，０００ｇ／ｍｏｌ超のより大きいものも考えられる。分子量２０，０００ｇ／ｍｏｌ超のキトサンは、水溶性であるように、さらに官能化されることが必要な場合がある。有用なポリグルコサミンの重要な特徴は、ＮＯ放出ポリグルコサミンを形成するために、本明細書に記載の方法に従って誘導体化された炭水化物骨格上の利用可能な窒素である。有利には、本明細書に開示されたポリグルコサミンは水溶性である。
【００３１】
キトサンは、ランダムに分布したβ−（１−４）結合したＤ−グルコサミン（脱アセチル化単位）とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化単位）からなる直鎖状多糖である。それはポリグルコサミンである。キトサンは、エビ、ロブスターおよび／またはカニなどの甲殻類の外骨格に見られる多糖であるキチンから誘導される。それは以下の構造を有する。
【化１】
0006298818.tif 000002
キトサンは、生分解性および生体適合性である。キトサン自体は、酸性条件下でのみ可溶性である。キトサン多糖は、生理的条件下で不溶性である。さらに、それらのＮＯ貯蔵はむしろ小さく（約０．２μｍｏｌ／ｍｇ）、これは、ＮＯドナー形成に必要な塩基性溶液における多糖の溶解性が低いためであると考えられる。Ｖａｌｍｉｋｉｎａｔｈａｎ，Ｃ．Ｍ．；Ｍｕｋｈａｔｙａｒ，Ｖ．Ｊ．；Ｊａｉｎ，Ａ．；Ｋａｒｕｍｂａｉａｈ，Ｌ．；Ｄａｓａｒｉ，Ｍ．；Ｂｅｌｌａｍｋｏｎｄａ，Ｒ．Ｖ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋａｂｌｅ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｂａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ２０１２年、８、１９６４〜１９７６；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｌ．；Ｘｉａ，Ｗ．Ｓ．；Ｌｉｕ，Ｐ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｑ．Ｙ．；Ｔａｈｉｒｏｕ，Ｔ．；Ｇｕ，Ｗ．Ｘ．；Ｌｉ，Ｂ．Ｃｈｉｔｏｓａｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ／Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ  ２０１０年、８、１９６２〜１９８７；Ｗａｎ，Ａ．；Ｇａｏ，Ｑ．；Ｌｉ，Ｈ．Ｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｄｄｕｃｔｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２０１０年、１１７、２１８３〜２１８８。改善されたＮＯ貯蔵を有するＮ−ジアゼニウムジオレート官能化キトサン誘導体を合成するために、我々は、過酸化水素中でキトサン多糖を分解することによって水溶性キトサンオリゴ糖を調製した。本明細書に記載のキトサンオリゴ糖の利点は、１００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌ、特に、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ以下、または約８０００ｇ／ｍｏｌ以下、または約５０００ｇ／ｍｏｌ以下、または約２，５００ｇ／ｍｏｌ以下の比較的低い分子量および容易にバイオフィルムに浸透する能力である。Ｍａｇｈａｍｉ，Ｇ．Ｇ．；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｇ．Ａ．Ｆ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８年、１８９、１９５〜２００；Ｐｏｒｐｏｒａｔｔｏ，Ｃ．；Ｂｉａｎｃｏ，Ｉ．Ｄ．；Ｒｉｅｒａ，Ｃ．Ｍ．；Ｃｏｒｒｅａ，Ｓ．Ｇ．，Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００３年、３０４、２６６〜２７２。本明細書に記載のキトサンオリゴ糖は、約８．７μｍｏｌ／ｍｇまでのより多くのＮＯ貯蔵を有し、中性および塩基性条件下でも可溶性である。
【００３２】
キトサン骨格上の一級アミノ基は、本明細書に開示されたＮＯ放出オリゴ糖の調製のためのケミカルハンドルである。以下のスキームに示すように、二級アミノ基は、一級アミノ基から調製される。
【００３３】
二級アミノ基を形成するために有用な薬剤は、アジリジン、特に２−メチルアジリジン、およびチイランなどからなる群から選択される。
【００３４】
一実施形態において、本明細書に開示された主題は、ポリグルコサミン、例えば、式Ｉの少なくとも１つの構造単位：
【化２】
0006298818.tif 000003
および任意選択で、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位：
【化３】
0006298818.tif 000004
を含むキトサンオリゴ糖を対象とする。
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、存在する場合、水素；Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−（Ｃ１〜５アルキルがメチルである場合、Ｍｅ（Ｃ＝Ｏ）−はアシル、Ａｃである）；およびＣ１〜５アルキルからなる群からそれぞれ独立して選択され；
【化４】
0006298818.tif 000005
は、各場合において、単結合または二重結合であって、
式中、二重結合である各場合において、二重結合−Ｏに結合するＲ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４は不在であり；Ｒ１が不在の場合、Ｒ５は水素、ヒドロキシル、Ｃ１〜５アルキルまたはＣ１〜５アルコキシであり；Ｒ３が不在の場合、Ｒ６は水素、ヒドロキシル、Ｃ１〜５アルキルまたはＣ１〜５アルコキシであり；
式中、単結合である各場合において、二重結合−Ｏに結合するＲ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４が存在し；Ｒ１が存在する場合、Ｒ５は水素であり；Ｒ３が存在する場合、Ｒ６は水素であり；
Ｑは−（ＣＲｃＲｄ）ｖ−であって；
式中、ＲｃおよびＲｄは、独立して、水素、またはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびペンチルなどのＣ１〜５アルキルである。好ましくは、ＲｃおよびＲｄは、独立して、水素、メチルまたはエチルであり；ｖは２〜６の整数であり；好ましくは、ｖは２であり；
ｐは１〜１００、好ましくは１〜５０、より好ましくは１〜２５、最も好ましくは１〜１０の整数であり；
Ａは、
【化５】
0006298818.tif 000006
であって、
式中、ＬはＳ、ＯまたはＮであり；
Ｇは、各場合において、独立して、水素である、またはＬと一緒に一酸化窒素ドナーを形成し；
Ｘは水素、Ｃ１〜５アルキルである、またはＮと一緒に一酸化窒素ドナーを形成し；
Ｂは水素または−Ｙ−Ｚであって、式中、Ｙはスペーサーであり、Ｚはポリマーまたは末端基である；またはＢは不在であり；
Ｄは−ＮＲａＲｂであって、式中、ＲａおよびＲｂは、水素、ホルミル、Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−（Ｃ１〜５アルキルがメチルである場合、Ｍｅ（Ｃ＝Ｏ）−はアシル、Ａｃである）、Ｃ１〜５アルキルおよびＣ１〜５アルキルエステルからなる群から独立して選択される；
またはＤは、
【化６】
0006298818.tif 000007
である。
【００３５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の有用な値は、存在する場合、水素およびＣ１〜５アルキルからなる群からそれぞれ独立して選択される。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の１つまたは複数がＣ１〜５アルキルである場合、それはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびペンチルから選択される。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、存在する場合、水素またはメチルである。最も好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、存在する場合、水素である。
【００３６】
すべての実施形態において、
【化７】
0006298818.tif 000008
は、各場合において、単結合または二重結合である。好ましくは、それはすべての場合において単結合である。
【００３７】
Ｑは−（ＣＲｃＲｄ）ｖであって；式中、ＲｃおよびＲｄは、独立して、水素、またはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびペンチルなどのＣ１〜５アルキルである。好ましくは、ＲｃおよびＲｄは、独立して、水素、メチルまたはエチルである。ｖの有用な値は２〜６の整数である。好ましくは、ｖは２である。
【００３８】
ｐの有用な値には、１〜１００の任意の整数が含まれる。好ましくは、ｐは１〜５０の整数である。より好ましくは、ｐは１〜２５の整数である。最も好ましくは、ｐは１〜１０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０である。
【００３９】
Ｌの有用な値は、Ｎ、ＳおよびＯである。好ましくは、ＬはＮまたはＳである。Ｇが存在する各場合において、それは、独立して、水素または一酸化窒素ドナーである。一酸化窒素ドナーは、ポリグルコサミン上の利用可能なＮＯ量に寄与するので、Ｇは一酸化窒素ドナーであることが好ましい。好ましい実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するＧの少なくとも３０％が一酸化窒素ドナーである。より好ましくは、ポリグルコサミン上に存在するＧの少なくとも５０％が一酸化窒素ドナーである。さらにより好ましくは、ポリグルコサミン上に存在するＧの少なくとも９０％が一酸化窒素ドナーである。最も好ましくは、ポリグルコサミン上に存在するＧの少なくとも９５％が一酸化窒素ドナーである。
【００４０】
Ｘの有用な値は、水素、Ｃ１〜５アルキルまたは一酸化窒素ドナーである。一酸化窒素ドナーは、ポリグルコサミン上の利用可能なＮＯ量に寄与するので、Ｘは一酸化窒素ドナーであることが好ましい。好ましい実施形態では、ポリグルコサミン上に存在するＸの少なくとも３０％が一酸化窒素ドナーである。より好ましくは、ポリグルコサミン上に存在するＸの少なくとも５０％が一酸化窒素ドナーである。さらにより好ましくは、ポリグルコサミン上に存在するＸの少なくとも９０％が一酸化窒素ドナーである。最も好ましくは、ポリグルコサミン上に存在するＸの少なくとも９５％が一酸化窒素ドナーである。
【００４１】
Ｂの有用な値は、水素、−Ｙ−Ｚであって、式中、Ｙはスペーサーであり、Ｚはモノマーまたはポリマーである、またはＢは末端基である。また、Ｂは、ＬがＯまたはＳである場合、不在であってもよい。本明細書で使用される場合、末端基は、ポリマーまたはモノマーの末端の任意の末端キャッピング基である。これらの基は、当技術分野において公知である。好ましくは、Ｂが末端基である場合、それは水素、ヒドロキシルまたはＣ１〜５アルキルである。
【００４２】
Ｚの有用な値には、当技術分野において公知のモノマーおよびポリマー、特に、活性医薬成分中で使用されるものが含まれる。特に有用なポリマーまたはモノマーは以下：
【化８】
0006298818.tif 000009
を含み、式中、ｊは、各場合において、１〜１００の整数である。
【００４３】
本明細書に開示された式中の有用なスペーサー、Ｙには、当技術分野において公知のスペーサーまたはリンカー、特に活性医薬成分において使用されるものが含まれる。特に有用なスペーサーには、以下のもの：
【化９】
0006298818.tif 000010
を含み、式中、Ｒｐ、Ｒｑ、ＲｓおよびＲｔは、各場合において、独立して、水素またはヒドロキシルであり；ｋは１〜２０の整数である。
【００４４】
本明細書に開示された戦略を使用して、オリゴ糖上に存在する任意の二級アミノ基を本明細書に記載されているように改変して、ＮＯ放出オリゴ糖を形成することができる。糖骨格部分に直接結合した二級アミノ基または骨格の糖部分にペンダント状になっている二級アミノ基は、ＮＯ放出部分で官能化することができる。合成経路で本明細書に完全に開示されているように、一級アミンは二級アミンに改変される。この改変はアジリジン、チイランなどによって容易にすることができる。
【００４５】
有用なＮＯ放出部分には、当技術分野において公知の任意のＮＯ放出基が含まれる。特に有用なのは、ポリグルコサミン上のＮ、ＳまたはＯに共有結合しているＮＯ放出基の残基、すなわちＮＯドナーである。ＮＯドナーは、それが結合しているポリグルコサミン上の原子と一緒に、ジアゼニウムジオレート、ニトロソチオールの一部としての−ＮＯ、例えば、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシウレアおよびこれらの組合せからなる群から選択される部分を形成する。好ましくは、ＮＯ放出部分はジアゼニウムジオレートである。これらの基は塩の形態で存在していてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＮＯドナーは、Ｎ−ジアゼニウムジオレート（すなわち、１−アミノ置換ジアゼン−１−イウム−１，２−ジオレート）であり、Ｎ−ジアゼニウムジオレートは、生物学的条件下で自発的にＮＯを生成する能力があるためにＮＯドナーとして特に魅力的である。Ｈｒａｂｉｅ，Ｊ．Ａ．およびＫｅｅｆｅｒ，Ｌ．Ｋ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１０２、１１３５〜１１５４（２００２年）；ならびにＮａｐｏｌｉ，Ｃ．およびｌａｎａｒｒｏ，Ｌ．Ｊ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３、９７〜１２３（２００３年）を参照のこと。いくつかのＮ−ジアゼニウムジオレート化合物は、一級および二級アミン、ポリアミン、ならびに二級アミノ酸を包含する様々な求核残基を使用して合成されている。Ｈｒａｂｉｅ，Ｊ．Ａ．およびＫｅｅｆｅｒ  Ｌ．Ｋ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１０２、１１３５〜１１５４（２００２年）を参照のこと。Ｎ−ジアゼニウムジオレートの形成において、アミン１当量は、高圧下で一酸化窒素２当量と反応する。塩基（例えば、メトキシドのようなアルコキシド）はアミン窒素からプロトンを除去して、アニオン性の安定化した［Ｎ（Ｏ）ＮＯ］基を作り出す。周囲条件下で安定している間、Ｎ−ジアゼニウムジオレートは水性媒体中で自発的に分解して、ｐＨ、温度および／またはアミン部分の構造に依存した速度でＮＯを生成する。例えば、Ｎ−ジアゼニウムジオレート改変プロリン（ＰＲＯＬＩ／ＮＯ）、２−（ジメチルアミノ）−エチルプトレアニン（ＤＭＡＥＰ／ＮＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサンジアミン（ＤＭＨＤ／ＮＯ）およびジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ／ＮＯ）が、ｐＨ７．４および３７℃で２秒から２０時間の範囲の多様なＮＯ放出半減期を有する小分子ＮＯドナーとして開発されている。Ｈｒａｂｉｅ，Ｊ．Ａ．およびＫｅｅｆｅｒ，Ｌ．Ｋ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１０２、１１３５〜１１５４（２００２年）；ならびにＫｅｅｆｅｒ，Ｌ．Ｋ．，Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４３、５８５〜６０７（２００３年）を参照のこと。
【００４７】
ポリグルコサミンの二級アミン官能基は、強塩基および気体一酸化窒素の存在下で、一酸化窒素ドナーに高収率で変換される。本明細書で提供されるように、溶媒系は、ＮＯを有するポリグルコサミンの充填に影響を与えることができる。
【００４８】
一実施形態において、本明細書に記載されているように、ポリグルコサミンが特にアジリジンで官能化される場合、官能化ポリグルコサミンは式Ｉａの少なくとも１つの構造単位：
【化１０】
0006298818.tif 000011
および任意選択で、式ＩＩａの少なくとも１つの構造単位：
【化１１】
0006298818.tif 000012
を含み、式中、変数の定義は、Ｄを除いて、上記で定義した通りである。この実施形態では、Ｄは−ＮＲａＲｂであって、式中、ＲａおよびＲｂは、水素、ホルミル、Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−、Ｃ１〜５アルキルおよびＣ１〜５アルキルエステルからなる群から独立して選択される、またはＤは、構造：
【化１２】
0006298818.tif 000013
を有し、式中、Ｘ、Ｑ、ｐおよびＢは上記の通りである。
【００４９】
本実施形態の一態様では、本明細書に記載されているように、ポリグルコサミンが特にアジリジンで官能化される場合、官能化ポリグルコサミンは式ＶＩＩＩの少なくとも１つの構造単位：
【化１３】
0006298818.tif 000014
を含み、式中、変数は本実施形態のために上記に記載した通りである。
【００５０】
「アミノ」および「アミン」という用語は、ＮＲ３、ＮＨ３、ＮＨＲ２およびＮＨ２Ｒ（式中、Ｒは本明細書の他の箇所に記載された通りであり得る）などの窒素含有基を意味する。したがって、本明細書で使用される「アミノ」は、一級アミン、二級アミンまたは三級アミンを意味することができる。いくつかの実施形態において、アミノ基の１つのＲはジアゼニウムジオレート（すなわち、ＮＯＮＯ）であり得る。
【００５１】
「カチオン性アミン」および「四級アミン」という用語は、追加の（すなわち、第四の）基、例えば、窒素に結合している水素またはアルキル基を有するアミノ基を意味する。したがって、カチオン性または四級アミンは正の電荷を有する。
【００５２】
「アルキル」という用語は、１〜２４個の炭素原子、例えば、１〜１２個の炭素原子を含有する直鎖または分枝炭化水素鎖を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどが挙げられる。
【００５３】
本明細書で使用される「アルコキシ」という用語は、鎖長がこれに限定されない限り、酸素原子に結合した、上記で定義された直鎖または分枝鎖アルキルラジカルを意味し、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アルコキシ鎖は、１〜５個の炭素原子の長さであり、より好ましくは１〜３個の炭素原子の長さである
【００５４】
以下の特定の実施形態が開示される。
１．少なくとも１つの構造単位：
【化１４】
0006298818.tif 000015
および任意選択で、少なくとも１つの構造単位：
【化１５】
0006298818.tif 000016
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、存在する場合、水素、Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−およびＣ１〜５アルキルからなる群からそれぞれ独立して選択され；
【化１６】
0006298818.tif 000017
は、各場合において、単結合または二重結合であって、
式中、二重結合である各場合において、二重結合−Ｏに結合するＲ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４は不在であり；Ｒ１が不在の場合、Ｒ５は水素、ヒドロキシル、Ｃ１〜５アルキルまたはＣ１〜５アルコキシであり；Ｒ３が不在の場合、Ｒ６は水素、ヒドロキシル、Ｃ１〜５アルキルまたはＣ１〜５アルコキシであり；
式中、単結合である各場合において、二重結合−Ｏに結合するＲ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４が存在し；Ｒ１が存在する場合、Ｒ５は水素であり；Ｒ３が存在する場合、Ｒ６は水素であり；
Ｑは−（ＣＲｃＲｄ）ｖ−であって；
式中、ＲｃおよびＲｄは、独立して、水素またはＣ１〜５アルキルであり；ｖは２〜６の整数であり；
ｐは１〜１０の整数であり；
Ａは、
【化１７】
0006298818.tif 000018
であって、
式中、ＬはＳ、ＯまたはＮであり；
Ｇは、各場合において、独立して、水素である、またはＬと一緒に一酸化窒素ドナーを形成する、または不在であり；
Ｘは水素、Ｃ１〜５アルキルである、またはＮと一緒に一酸化窒素ドナーを形成し；
Ｂは１つの水素または−Ｙ−Ｚであって、式中、Ｙはスペーサーであり、Ｚはポリマーまたは末端基であり；
Ｄは−ＮＲａＲｂであって、式中、ＲａおよびＲｂは、水素、ホルミル、Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−、Ｃ１〜５アルキルおよびＣ１〜５アルキルエステルからなる群から独立して選択される；
またはＤは、
【化１８】
0006298818.tif 000019
である）
を含むポリグルコサミン（キトサンオリゴ糖）。
２．ＸおよびＧの少なくとも１つが、それが結合しているポリグルコサミン上の原子と一緒に一酸化窒素ドナーを形成する、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
３．４．構造単位：を含む、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
【化１９】
0006298818.tif 000020
（式中、
ｍは１〜１０，０００の整数である。）
５．一酸化窒素ドナーが、それが結合しているポリグルコサミン上の原子と一緒に、ジアゼニウムジオレート、ニトロソチオール、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシウレアおよびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
５．一酸化窒素ドナーがジアゼニウムジオレートである、実施形態４に記載のポリグルコサミン。
６．ｍが１〜５０の整数である、実施形態３に記載のポリグルコサミン。
７．ｍが１〜１０の整数である、実施形態３に記載のポリグルコサミン。
８．少なくとも１つの構造単位：
【化２０】
0006298818.tif 000021
（式中、
Ｄは−ＮＲａＲｂであって、式中、ＲａおよびＲｂは、水素、ホルミル、Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−、Ｃ１〜５アルキルおよびＣ１〜５アルキルエステルからなる群から独立して選択される）
を含む、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
９．
【化２１】
0006298818.tif 000022
が、各場合において、単結合であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ水素であり、
Ｒ５およびＲ６がそれぞれ水素である、実施形態８に記載のポリグルコサミン。
１０．少なくとも１つの構造単位：
【化２２】
0006298818.tif 000023
を含む、実施形態９に記載のポリグルコサミン。
１１．Ｂが水素である、実施形態１０に記載のポリグルコサミン。
１２．Ｂが−Ｙ−Ｚである、実施形態１１に記載のポリグルコサミン。
１３．Ｂが−Ｙ−Ｚであって、式中、Ｚは構造：
【化２３】
0006298818.tif 000024
（式中、ｊは、各場合において、１〜１００の整数である）
を有する、実施形態１２に記載のポリグルコサミン。
１４．Ｙが構造：
【化２４】
0006298818.tif 000025
（式中、
Ｒｐ、Ｒｑ、ＲｓおよびＲｔは、各場合において、独立して、水素またはヒドロキシルであり；
ｋは１〜２０の整数である）
を有する、実施形態１２に記載のポリグルコサミン。
１５．構造単位：
【化２５】
0006298818.tif 000026
（式中、
Ｄは、
【化２６】
0006298818.tif 000027
である）
を含む、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
１６．
【化２７】
0006298818.tif 000028
が、各場合において、単結合であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ水素である、実施形態１５に記載のポリグルコサミン。
１７．Ｂが−Ｙ−Ｚであって、式中、Ｚは構造：
【化２８】
0006298818.tif 000029
（式中、ｊは、各場合において、１〜１００の整数である）
を有する、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
１８．ｊが１〜５０の整数である、実施形態１７に記載のポリグルコサミン。
１９．ｊが１〜１５の整数である、実施形態１７に記載のポリグルコサミン。
２０．Ａが、
【化２９】
0006298818.tif 000030
（式中、Ｇは水素である、またはＮと一緒に一酸化窒素ドナーを形成する、または不在であり；
Ｂは水素である）
である、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
２１．構造単位：
【化３０】
0006298818.tif 000031
（式中、
ｍは１〜１，０００の整数であり、
ｎは１〜１，０００の整数である）
を含む、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
２２．ｍおよびｎが１〜５０の整数からそれぞれ独立して選択される、実施形態２１に記載のポリグルコサミン。
２３．２４．構造単位：を含む、実施形態２１に記載のポリグルコサミン。
【化３１】
0006298818.tif 000032
２５．Ｘが水素である、またはＮと一緒にジアゼニウムジオレートを形成し；
Ａが、
【化３２】
0006298818.tif 000033
（式中、Ｇは水素である、またはＮと一緒にジアゼニウムジオレートを形成する）
である、実施形態２０に記載のポリグルコサミン。
２６．Ｂが−Ｙ−Ｚであって、式中、Ｚは構造：
【化３３】
0006298818.tif 000034
（式中、ｊは、各場合において、１〜１００の整数である）
を有する、実施形態２１に記載のポリグルコサミン。
２７．２８．Ｙが構造：
【化３４】
0006298818.tif 000035
（式中、
Ｒｐ、Ｒｑ、ＲｓおよびＲｔは、各場合において、独立して、水素またはヒドロキシルであり；
ｋは１〜２０の整数である）
を有する、実施形態２２に記載のポリグルコサミン。
２９．ＡがＮである、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
３０．ＡがＳである、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
３１．ＲｃおよびＲｄが、独立して、水素またはメチルであり；
ｖが２である、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
３２．対象に請求項１のポリグルコサミンの有効量を投与することを含む、対象に一酸化窒素を送達する方法。
３３．それを必要とする対象に実施形態１のポリグルコサミンの有効量を投与することを含む、疾患状態を処置する方法であって、疾患状態が、癌、心血管疾患、微生物感染；医療機器への血液の曝露によって引き起こされる血小板凝集および血小板粘着；異常な細胞増殖に起因する病態；移植拒絶、自己免疫疾患、炎症、血管疾患；瘢痕組織；創傷収縮、再狭窄、疼痛、発熱、胃腸障害、呼吸器障害、性的機能不全および性感染症からなる群から選択される方法。
３４．前記疾患状態が嚢胞性線維症である、実施形態３１に記載の方法。
３５．ｉ．請求項１のポリグルコサミン；および
ｉｉ．薬学的に許容される担体
を含む、医薬製剤。
３６．ポリグルコサミンが水溶性である、実施形態３３に記載の医薬製剤。
３５．ポリグルコサミンが水溶性である、実施形態１に記載のポリグルコサミン。
【００５５】
すべての実施形態において、置換基および／または変数の組合せは、そのような組合せが各原子の既知の原子価に従う化合物をもたらす場合にのみ許容される。
【００５６】
特定の官能化ポリグルコサミンには、以下が含まれる。
【化３５】
0006298818.tif 000036
上記の式Ｉの構造およびその中の実施形態（すなわち、式ＩＩＩ、ＶＩおよびＶＩＩ）のそれぞれにおいて、存在する場合、ｍは、１〜１０，０００、好ましくは１〜１０００または１〜５００；より好ましくは１〜２００または１〜１００；最も好ましくは１〜５０；１〜２０または１〜１０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；ｎは、１〜１０，０００、好ましくは１〜１０００または１〜５００；より好ましくは１〜２００または１〜１００；最も好ましくは１〜５０；１〜２０または１〜１０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；Ｉは、１〜１０，０００、好ましくは１〜１０００または１〜５００；より好ましくは１〜２００または１〜１００；最も好ましくは１〜５０；１〜２０または１〜１０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。
【００５７】
一実施形態において、本明細書に開示された主題は、対象に一酸化窒素を送達する方法を対象とし、対象に官能化ポリグルコサミンの有効量を投与することを含む。
【００５８】
別の実施形態において、本明細書に開示された主題は、疾患状態を処置する方法を対象とし、請求項１の該ポリグルコサミンの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、該疾患状態は、癌、心血管疾患、微生物感染；医療器具への血液の曝露によって引き起こされる血小板凝集および血小板粘着；異常な細胞増殖に起因する病態；移植拒絶、自己免疫疾患、炎症、血管疾患；瘢痕組織；創傷収縮、再狭窄、疼痛、発熱、胃腸障害、呼吸器障害、性的機能不全および性感染症からなる群から選択される。好ましくは、疾患状態は嚢胞性線維症である。
【００５９】
別の実施形態において、本明細書に開示された主題は、バイオフィルムを破壊、根絶または予防する方法を対象とする。この方法は、バイオフィルムを含有するもしくは表面もしくは領域の一部もしくはすべてを形成もしくは占有するバイオフィルムの影響を受けやすい表面または領域を本明細書に記載の官能化ポリグルコサミンと接触させることを含む。「バイオフィルム」という用語は、通常表面に細胞が互いに接着した１つまたは複数の微生物の凝集体を意味することを意図する。ほとんどの浮遊性の微生物は、バイオフィルムを形成し、かつ／または表面に付着し得る。微生物は、ファンデルワールス力を介した弱い可逆的接着を通じて表面または互いに接着することができる。微生物は、細胞接着または線毛などの構造を用いてより恒久的にとどまることができる。
【００６０】
さらに別の実施形態において、本明細書に開示された主題は、官能化ポリグルコサミンおよび薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を対象とする。本開示を通して記載されているように、好ましくは、官能化ポリグルコサミンは水溶性である。
【００６１】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」は、生物学的またはその他の点で望ましくないわけではない材料を意味する。すなわち、材料は、実質的な有害な生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、本発明の組成物と共に個体に投与することができる。当業者に周知であるように、材料は、当然、活性成分の任意の分解を最小にし、対象における任意の有害な副作用を最小にするように選択される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；２０  ｅｄ．２００５年を参照のこと）。本発明の組成物のための例示的な薬学的に許容される担体としては、滅菌の発熱物質を含まない水および滅菌の発熱物質を含まない生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本開示の治療用組成物は、いくつかの実施形態において、本開示の一酸化窒素放出ポリグルコサミンおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。適切な組成物は、製剤を意図されるレシピエントの体液と等張にする抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質および溶質を含有し得る水性および非水性の滅菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。
【００６３】
本開示の方法において使用される組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用薬剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば、滅菌の発熱物質を含まない水で構成するための粉末形態であり得る。
【００６４】
治療用組成物は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結またはフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。
【００６５】
経口投与の場合、組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される添加剤と共に従来の技術によって調製された、例えば、錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当技術分野で公知の方法によってコーティングすることができる。例えば、治療剤は、ヒドロクロロチアジドと組み合わせて、治療剤が標的器官に達するまでそれを保護する腸溶性または遅延放出コーティングを施したｐＨ安定化コアとして製剤化することができる。
【００６６】
経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態をとることができ、またはそれらは使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提供することができる。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加物と共に従来の技術によって調製することができる。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含有することができる。経口投与用調製物は、活性化合物を制御放出するように適切に製剤化され得る。口腔内投与の場合、組成物は従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。
【００６７】
化合物はまた、移植または注射用調製物として製剤化され得る。したがって、例えば、化合物は、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化することができる。化合物はまた、直腸組成物（例えば、カカオバターもしくは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸剤）、クリームもしくはローション、または経皮パッチに製剤化することができる。
【００６８】
エアゾールとして、吸入により投与するのに適した医薬製剤も提供される。好ましくは、本明細書に記載の官能化ポリグルコサミンは、溶液および／またはエアロゾル形態に製剤化される。これらの製剤は、本明細書に記載のＮＯ放出ポリグルコサミンの溶液または懸濁液を含む。所望の製剤を小さいチャンバーに入れて噴霧することができる。噴霧は、ＮＯ放出ポリグルコサミンを含む複数の液滴または固体粒子を形成するために、圧縮空気または超音波エネルギーによって達成することができる。例えば、本開示のＮＯ放出ポリグルコサミンは、嚢胞性線維症に関連する細菌感染を処置するために吸入によって投与することができる。嚢胞性線維症に関連する細菌感染としては、ステノトロホモナス、マイコバクテリウムアビウムイントラセルラーレおよびマイコバクテリウムアブセサス、バークホルデリアセパシアならびにシュードモナスアエルギノーサ（緑膿菌）感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、測定可能な生物学的応答を生成するのに十分な治療用組成物（例えば、一酸化窒素放出ポリグルコサミンを含む組成物）の量を意味する。本開示の主題の活性組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象および／または用途に対して所望の応答を達成するのに有効な活性化合物の量を投与するように変化させることができる。選択される投与量レベルは、組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物または処置との組合せ、処置される状態の重症度、ならびに健康状態および処置される対象の以前の病歴を含む、様々な因子に依存するであろう。好ましくは、最小用量が投与され、用量制限毒性がない限り、用量は最小有効量まで増大させる。有効用量の決定および調整、ならびにそのような調整をいつどのように実施するかの評価は、医療分野の当業者に公知である。
【００７０】
本明細書に開示された組成物の投与の場合、マウス用量をヒト用量に変換するための変換係数：１ｋｇ当たりのヒト用量＝１ｋｇ当たりのマウス用量×１２を用いて、マウス動物モデルに投与される用量に基づいてヒト用量を推定する従来の方法を行うことができる。Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ．５０、２１９〜２４４（１９６６年）を参照のこと。薬物用量はまた、体表面積１平方メートル当たりのミリグラムで与えることができる。なぜなら、体重よりむしろこの方法は、特定の代謝および排泄機能と良好な相関を達成するからである。さらに、体表面積は、成人および小児ならびに異なる動物種における薬物投与量のための共通分母として使用することができる。Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ．５０、２１９〜２４４（１９６６年）を参照のこと。簡単に述べると、任意の所与の種におけるｍｇ／ｋｇ用量を等価のｍｇ／平方メートル用量として表現するために、用量に適切なｋｍ係数を掛ける。ヒト成人では、１００ｍｇ／ｋｇは１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／平方メートル＝３７００ｍｇ／ｍ２と等価である。
【００７１】
製剤および用量に関するさらなるガイダンスについては、米国特許第５，３２６，９０２号；５，２３４，９３３号；ＰＣＴ国際公開第９３／２５５２１号パンフレット；Ｂｅｒｋｏｗら、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｈｏｍｅ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎ．Ｊ．（１９９７年）；Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、９ｔｈ  ｅｄ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６年）；Ｅｂａｄｉ，ＣＲＣ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９９８年）；Ｋａｔｚｕｎｑ，Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、８ｔｈ  ｅｄ．Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋｓ／ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５ｔｈ  ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．：Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９７５年）；およびＳｐｅｉｇｈｔら、Ａｖｅｒｙ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｃｈｏｉｃｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｖａｌｕｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ、４ｔｈ  ｅｄ．Ａｄｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：Ａｕｃｋｌａｎｄ／Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９７年）；Ｄｕｔｃｈら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｕ．，１００〜１０１、２５５〜２６３（１９９８年）を参照のこと。
【００７２】
対象に本開示の主題の組成物を投与する適切な方法としては、全身投与、非経口投与（血管内、筋肉内、動脈内投与を含む）、経口送達、口腔内送達、皮下投与、吸入、気管内投与、外科移植、経皮送達、局所注射および超速度注入／照射が挙げられるが、これらに限定されない。適用可能な場合、持続注入が標的部位での薬物の蓄積を向上させることができる（例えば、米国特許第６，１８０，０８２号を参照のこと）。
【００７３】
本開示の主題の方法に従って使用される薬物投与の特定の様式は、用いられる薬剤および／または担体、処置されるべき状態の重症度ならびに代謝または投与後の活性剤の除去のメカニズムを含む様々な因子に依存するが、これらに限定されない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の追加の治療剤を官能化ポリグルコサミンと組み合わせて使用することができる。このような追加の薬剤は、官能化ポリグルコサミンを含む製剤の一部とする、または官能化ポリグルコサミンを含む製剤とは別の製剤として前後もしくは一緒に（同時に）投与することができる。このような追加の治療剤としては、特に、抗癌治療剤、抗菌剤、鎮痛剤、抗炎症剤、血管拡張剤および免疫抑制剤、ならびに処置される疾患または状態の緩和を増強し得る任意の他の公知の治療剤が挙げられる。「同時に」とは、併用効果をもたらすために時間的に十分に接近していることを意味する（すなわち、同時は、一斉である、または互いの前もしくは後の短い時間内に発生する２つ以上のイベントであることができる）。いくつかの実施形態において、２つ以上の化合物を「同時に」投与することとは、２つの化合物が時間的に十分に接近して投与されて、一方の存在が他方の生物学的効果を変化させることを意味する。２つの化合物は、同じもしくは異なる製剤でまたは経時的に投与することができる。同時投与は、投与前に化合物を混合することによって、または例えば、同じ時点であるが、異なる解剖学的部位でもしくは異なる投与経路を用いて、２つの異なる製剤で化合物を投与することによって行うことができる。
【００７５】
ＮＯ放出ポリグルコサミンと組み合わせて使用される追加の治療剤の選択は、疾患の種類、対象の年齢および全身の健康状態、疾患の進行の攻撃性ならびに組合せを含む薬剤を許容する対象の能力を含む様々な因子に依存するが、これらに限定されない。
【００７６】
「抗悪性腫瘍」剤または「化学療法剤」とも記載される様々な化学物質は、癌の処置に使用される本開示のＮＯ放出ポリグルコサミンと組み合わせて使用することができる。このような化学療法化合物としては、アルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、タンパク質合成阻害剤、ＤＮＡもしくはＲＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ塩基類似体、トポイソメラーゼ阻害剤、抗血管新生剤およびテロメラーゼ阻害剤またはテロメアＤＮＡ結合化合物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、適切なアルキル化剤としては、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾジゼパ（ｂｅｎｚｏｄｉｚｅｐａ）、カルボコン、メツレデパおよびウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンなどのエチレンイミンならびにメチルメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎｅ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミドおよびウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチンなどのニトロソウレアが挙げられる。
【００７７】
癌の処置に使用される抗生物質としては、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、硫酸ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシンおよびストレプトゾシンが挙げられる。化学療法代謝拮抗剤としては、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン、シタラビン、ペントスタチン、メトトレキサートおよびアザチオプリン、アシクロビル、アデニンβ−１−Ｄ−アラビノシド、アメトプテリン、アミノプテリン、２−アミノプリン、アフィディコリン、８−アザグアニン、アザセリン、６−アザウラシル、２’−アジド−２’−デオキシヌクレオシド、５−ブロモデオキシシチジン、シトシンβ−１−Ｄ−アラビノシド、ジアゾオキソノルロイシン、ジデオキシヌクレオシド、５−フルオロデオキシシチジン、５−フルオロデオキシウリジンおよびヒドロキシウレアが挙げられる。
【００７８】
化学療法タンパク質合成阻害剤としては、アブリン、アウリントリカルボン酸、クロラムフェニコール、コリシンＥ３、シクロヘキシミド、ジフテリア毒素、エデインA、エメチン、エリスロマイシン、エチオニン、フッ化物、５−フルオロトリプトファン、フシジン酸、グアニリルメチレンジホスホネートおよびグアニリルイミドジホスフェート、カナマイシン、カスガマイシン、キロマイシンならびにＯ−メチルスレオニンが挙げられる。追加のタンパク質合成阻害剤としては、モデシン、ネオマイシン、ノルバリン、パクタマイシン、パロモマイシン、ピューロマイシン、リシン、志賀毒素、ショードマイシン、スパルソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チオストレプトンおよびトリメトプリムが挙げられる。硫酸ジメチル、マイトマイシンＣ、窒素および硫黄マスタードなどのアルキル化剤、アクリジン色素、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アントラセン、ベンゾピレン、臭化エチジウム、プロピジウムジヨージド絡み合いなどのインターカレート剤、ならびにジスタマイシンおよびネトロプシンなどの薬剤を含むＤＮＡ合成阻害剤は、本開示の癌の処置の一部として使用することができる。クメルマイシン、ナリジクス酸、ノボビオシンおよびオキソリン酸などのトポイソメラーゼ阻害剤、コルセミド、コルヒチン、ビンブラスチンおよびビンクリスチンを含む細胞分裂阻害剤；ならびにアクチノマイシンＤ、α−アマニチンおよび他の真菌アマトキシンを含むＲＮＡ合成阻害剤、コルジセピン（３’−デオキシアデノシン）、ジクロロリボフラノシルベンズイミダゾール、リファンピシン、ストレプトバリシンならびにストレプトリジギンもまた、適切な癌の処置を提供するために官能化ポリグルコサミンと組み合わせることができる。
【００７９】
したがって、本明細書に記載のＮＯ放出官能化ポリグルコサミンと組み合わせて使用することができる現在の化学療法剤としては、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシン、シスプラチン、過酸化水素、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチヌム、ビンブラスチンおよびメトトレキサートなどが挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用される「抗菌剤」という用語は、細菌、真菌、酵母またはウイルスを殺す、それらの増殖を阻害するまたは増殖を予防する任意の薬剤を意味する。微生物感染の処置または予防を補助するために本開示のＮＯ放出官能化ポリグルコサミンに組み込むことができる適切な抗菌剤としては、バンコマイシン、ブレオマイシン、ペントスタチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシンおよびアミカシンなどの抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗菌剤としては、２−ｐ−スルファニリルアニリノエタノール、４，４’−スルフィニルジアニリン、４−スルファニルアミドサリチル酸、アセジアスルホン、アセトスルホン、アミカシン、アモキシシリン、アンホテリシンＢ、アンピシリン、アパルシリン、アピサイクリン、アプラマイシン、アルベカシン、アスポキシシリン、アジダムフェニコール、アジスロマイシン、アズトレオナム、バシトラシン、バンベルマイシン、ビアペネム、ブロジモプリム、ブチロシン、カプレオマイシン、カルベニシリン、カルボマイシン、カルモナム、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セフブペラゾン、セフクリジン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、フェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフィニノクス（ｃｅｆｉｎｉｎｏｘ）、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォテタン、セフォチアム、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフプロジル、セフロキサジン、セフタジジム、セフテラム、セフチブテン、セフトリアキソン、セフゾナム、セファレキシン、セファログリシン、セファロスポリンＣ、セフラジン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、クリンダマイシン、リン酸クリンダマイシン、クロモサイクリン、コリスチン、シクラシリン、ダプソン、デメクロサイクリン、ジアチモスルホン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、エノキサシン、エンビオマイシン、エピシリン、エリスロマイシン、フロモキセフ、フォーチミシン、ゲンタマイシン、グルコスルホン、ソラスルホン、グラミシジンＳ、グラミシジン、グレパフロキサシン、グアメシクリン、ヘタシリン、イミペネム、イセパマイシン、ジョサマイシン、カナマイシン、ロイコマイシン、リンコマイシン、ロメフロキサシン、ルセンソマイシン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メロペネム、メタサイクリン、ミクロノマイシン、ミデカマイシン、ミノサイクリン、モキサラクタム、ムピロシン、ナジフロキサシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ノルフロキサシン、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、ｐ−スルファニリルベンジルアミン、パニペネム、パロモマイシン、パズフロキサシン、ペニシリンＮ、ピパサイクリン、ピペミド酸、ポリミキシン、プリマイシン、キナシリン、リボスタマイシン、リファミド、リファンピン、リファマイシンＳＶ、リファペンチン、リファキシミン、リストセチン、リチペネム（ｒｉｔｉｐｅｎｅｍ）、ロキタマイシン、ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、サラゾスルファジミジン、サンサイクリン、シソマイシン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スクシスルホン、スルファクリソイジン、スルファロクス酸、スルファミドクリソイジン、スルファニル酸、スルホキソン、テイコプラニン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、テトロキソプリム、チアンフェニコール、チアゾールスルホン、チオストレプトン、チカルシリン、チゲモナム、トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、トロスペクトマイシン、トロバフロキサシン、ツベラクチノマイシンおよびバンコマイシンなどの抗菌剤が挙げられる。また、抗菌剤には、アムホテリシンＢ、アザセリン、カンジシジン、クロルフェネシン、デルモスタチン、フィリピン、フンギクロミン、メパルトリシン、ニスタチン、オリゴマイシン、ペリマイシンＡ、ツベルシジン、イミダゾール、トリアゾールおよびグリセオフルビンなどの抗真菌剤が含まれ得る。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ＮＯ放出ポリグルコサミンは、ポリマーフィルムに組み込むことができる。このような組み込みは、ポリマー表面へのポリグルコサミンの静電会合を介して、ポリマー表面にポリグルコサミンを物理的に埋め込むことを通して、またはポリマー表面の反応性基上への官能化ポリグルコサミンの共有結合によるものであることができる。あるいは、官能化ポリグルコサミンは、液体ポリマー前駆体の溶液中に混合されて、ポリマーが硬化されるときにポリマーマトリックス中に捕捉され得る。重合性基はまた、官能化ポリグルコサミンをさらに官能化するために使用することができ、そうすると、重合プロセス中にポリグルコサミンをポリマーに共重合させることができる。ＮＯ放出ポリグルコサミンを組み込むのに適したポリマーとしては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリビニリデンなどのポリオレフィン、ならびにポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタンなどが挙げられる。特に、ポリウレタンには、医療用セグメント化ポリウレタンが含まれ得る。医療用セグメント化ポリウレタンはまた、ポリマーにさらなる長さまたは重さを加える、アルキレン鎖などの１つまたは複数の拡張部分を含むことができる。このようなポリウレタンはまた、一般に非毒性である。医療用セグメント化ポリウレタンの一例は、ＴＥＣＯＦＬＥＸ（登録商標）である。
【００８２】
ＮＯ放出ポリグルコサミンを含有するポリマーフィルムは、血小板の粘着を予防し、細菌感染を予防し、血管拡張剤として作用するために、様々な物品、特に外科用器具、生物学的センサーおよび医療用インプラントをコーティングするために使用することができる。これらの物品は、血管医療器具、泌尿器医療器具、胆管医療器具、胃腸医療器具、外科手術部位に配置するために適合された医療器具および皮膚創傷または開口部上に配置するために適合された医療器具において有用であり得る。したがって、ポリマーは、動脈ステント、ガイドワイヤー、カテーテル、トロカール針、骨アンカー、骨ネジ、保護めっき、股関節および関節置換、電気リード、バイオセンサー、プローブ、縫合糸、外科用ドレープ、創傷被覆材および包帯をコーティングするために使用することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態において、コーティングされたデバイスは、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、チタン、アルミニウム、銅、金、銀、白金およびこれらの組合せなどの金属表面を有し得る。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出グルコサミンを含有するフィルムまたはポリマーは、ガラスまたは繊維（例えば、布または紙）などの非金属表面をコーティングするために使用することができる。
【００８４】
さらに、ＮＯ放出グルコサミンを含有するポリマーは、デバイス自体を形成するために使用することができる。例えば、ポリマーは、血液もしくは組織用の保存袋または創傷被覆材を形成することができる。
【００８５】
バイオフィルムを予防または破壊するために官能化ポリグルコサミンと接触させることができる表面としては、医療器具、給排水栓、コンデンサーコイル、光学表面、艇体および航空機からなる群から選択されるものが挙げられる。他の非限定的な例としては、カウンタートップ、窓、電化製品、ハードフロア、敷物、浴槽、シャワー、鏡、トイレ、ビデ、バスルームの備品、シンク、冷蔵庫、電子レンジ、小さなキッチン用品、テーブル、椅子、キャビネット、引き出し、ソファ、ラブシート、ベンチ、ベッド、スツール、戸棚、チェスト、ドレッサー、ディスプレイキャビネット、時計、ビュッフェ、シェード、シャッター、エンターテイメントセンター、アームレール、ランプ、手すり、図書館、キャビネット、机、ドア、棚、カウチ、カート、ピアノ、彫像および他の芸術、ラック、ファン、照明器具、ビリヤードテーブル、ピンポンテーブル、サッカーテーブル、カードテーブル、ツール（例えば、ハンドパワーおよび／または手持ち工具、電動工具、空気動力工具等）、電話、ラジオ、テレビ、ステレオ装置、ＣＤおよびＤＶＤプレーヤー、アナログおよびデジタルサウンドデバイス、パームコンピュータ、ラップトップコンピュータ、デスクトップおよびタワーコンピュータ、コンピュータモニタ、ｍｐ３プレーヤー、メモリストレージデバイス、カメラ、ビデオカメラ、車両表面（例えば、フロントガラス；タイヤ；金属、繊維ガラス、複合材料および／またはプラスチックの外側表面；布地および／またはビニールの外側表面；布地、ビニールおよび／または皮革の内部表面；金属、プラスチック、木材および／または複合材料の内部表面、ガラスの内部表面等）、自転車、スノーモービル、オートバイ、オフロード車両、庭用機器、農機具、洗浄装置（例えば、パワーワッシャー等）、塗装機器（例えば、電気および空気動力の塗装機器等）、医療および／もしくは歯科用機器、舶用機器（例えば、セールボート、パワーボート、いかだ、セールボード、カヌー、手漕ぎボート等）、おもちゃ、筆記具、腕時計、額入り写真および絵画、書籍ならびに／または同様のものが挙げられる。１つまたは複数の種類の液体が表面から流れ落ち、表面に吸収されないおよび／または表面を汚さないことが望ましい任意の表面を基板とすることができる。例えば、環境条件に曝露される表面。また、表面が、身体組織または体液に接触する医療器具などの微生物が付着する場所となり得る場合が特に好ましい。
【００８６】
血管または他の体管腔を通る動きに適合されたカテーテルなどの医療器具は、典型的には、低摩擦の外表面を有している。医療器具の表面が低摩擦表面でない場合、デバイスの体管腔内への挿入および体管腔内からの除去がより困難になり、身体組織の損傷または炎症が生じ得る。低摩擦表面は、特定の長期デバイス（例えば、長期カテーテル）とそれを取り巻く組織の間での動きの結果として、例えば、患者の活動の結果として生じ得る不快感および損傷を低減するためにも有益である。医療器具には、様々なインプラント型および挿入型医療器具（本明細書では「体内医療器具」とも呼ばれる）が含まれる。このような医療器具の例としては、流体（例えば、薬物含有流体、拡張用流体などの加圧流体、体液、造影剤、加熱または冷却溶媒等）の送達または除去に関与するデバイス、ならびに広い範囲にわたる体管腔内へ挿入かつ／または体管腔内を通して挿入するためのデバイスが挙げられ、体管腔には、心臓、動脈（例えば、冠状、大腿、大動脈、腸骨、頚動脈および椎骨脳底動脈）および静脈などの心血管系の管腔、尿道（尿道前立腺部を含む）、膀胱、尿管、膣、子宮、精管および卵管などの泌尿生殖器系の管腔、鼻涙管、耳管、気管、気管支、鼻腔および副鼻腔などの気道の管腔、食道、腸、十二指腸、小腸、大腸、直腸、胆管系および膵管系などの胃腸管の管腔、リンパ系の管腔、主要体腔（腹膜、胸膜、心膜）その他が含まれる。体内医療器具の非制限的な具体例としては、バルーンとバルーン用の拡張用チューブを含む血管カテーテル（例えば、バルーンカテーテル）などの血管用デバイス、ハイドロライザカテーテル、ガイドワイヤー、プルバックシース、フィルター（例えば、大静脈フィルター）、左心室補助循環装置、完全人工心臓、注射針、薬物送達チューブ、ドレナージ管、胃腸および大腸内視鏡チューブ、内視鏡器具、気管チューブなどの気管内器具、尿路カテーテルおよび尿管ステントなどの尿路用器具、カテーテルおよびワイヤーなどの神経領域用器具、トロカール針、骨アンカー、骨ネジ、保護めっき、関節置換、電気リード、バイオセンサー、プローブ、縫合糸、外科用ドレープ、創傷被覆材ならびに包帯が挙げられる。本発明による多くのデバイスは、中実と中空両方の円筒形状を含む、１つまたは複数の円筒形部分を有する。
【００８７】
固体基板材料には、ポリマー材料などの有機材料（例えば、５０重量％以上の有機種を含有する材料）ならびに金属材料（例えば、金属および金属合金）および非金属材料（例えば、とりわけ、様々な金属および非金属酸化物、様々な金属および非金属窒化物、様々な金属および非金属炭化物、様々な金属および非金属ホウ化物、様々な金属および非金属ホスフェートならびに様々な金属および非金属硫化物を含有し得る、炭素、半導体、ガラスならびにセラミックを含む）などの無機材料（例えば、５０重量％以上の無機種を含有する材料）が含まれ得る。非金属無機材料の具体例は、１つまたは複数の以下のものを含有する材料：酸化アルミニウムおよび遷移金属酸化物（例えば、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、モリブデン、タングステン、レニウムおよびイリジウムの酸化物）を含む金属酸化物；シリコン；シリコン窒化物、シリコン炭化物およびシリコン酸化物を含有するものなどのシリコンベースのセラミック（ガラスセラミックと呼ばれることもある）；リン酸カルシウムセラミック（例えば、ヒドロキシアパタイト）；炭素；ならびに炭素窒化物などの炭素ベースのセラミックのような材料であり得る。
【００８８】
さらに、ＮＯ放出ポリグルコサミンは、抗菌石鹸などに限定されず、洗剤に組み込むことができる。例えば、石鹸バーに埋め込まれた官能化ポリグルコサミンからのＮＯ放出は、使用時の水との接触および／またはｐＨの低下によって誘発することができる。バーの外表面が侵食または溶解されるにつれて、バー表面内の官能化ポリグルコサミンは、その後のバーの使用のためにさらに露出する。ＮＯ放出ポリグルコサミンは、液体石鹸中にも懸濁することができる。このような石鹸および洗剤は、個人の衛生のために、または繊維の抗微生物処理を提供するために使用することができる。このような石鹸および洗剤は、細菌、真菌またはウイルスなどの微生物に曝露され得る、家庭での表面または病院もしくは他の医療環境における任意の表面を処理するためにも使用することができる。
【００８９】
本明細書において「生体適合性」という用語は、特定の量で患者に投与された場合に毒性または望ましくない副作用を誘発しない有機溶媒を意味する。
【００９０】
製剤は、それらのすべての薬学的に許容される塩の形態を含む。このような塩の例には、薬学的に許容される無機および有機の酸ならびに塩基から誘導されるものが含まれる。適切な酸性塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、ヒドロキシナプトエート（ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｔｈｏａｔｅ）、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。シュウ酸などの他の酸は、それ自体は薬学的に許容されるものではないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製において用いることができる。
【００９１】
適切な塩基から誘導される塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウムおよびカルシウム）、アンモニウムおよびＮ−（アルキル）４＋塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
官能化ポリグルコサミンには、その中の任意の塩基性窒素含有基の四級化を有するものも含まれる。
【００９３】
簡単にするために、本明細書での議論は、立体異性について言及せずに提供される。当業者は、本明細書に記載のポリグルコサミンが、１つまたは複数の不斉中心を含有し、したがって、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一の光学異性体、個々のジアステレオマーならびにジアステレオマー混合物として存在し得ることを理解するであろう。これらの化合物のこのような異性体形態はすべて、本発明に明示的に含まれる。
【００９４】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。
【実施例】
【００９５】
１．ＮＯ放出キトサンオリゴ糖の合成
キトサンオリゴ糖は、酸化（過酸化水素）（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋ．；Ｒａｊａｐａｋｓｅ，Ｎ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＣＯＳ）：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．２００５年、６２、３５７〜３６８）またはキトサン多糖の酵素分解により合成した。得られた水溶性キトサンオリゴ糖をアジリジン化合物（アジリジンおよび２−メチルアジリジンを含むが、これらに限定されない）のカチオン開環によって改変して二級アミン部分を付与し、続いて塩基性条件（「帯電」）下で高圧ＮＯと反応させて、水溶性ＮＯ放出キトサンオリゴ糖を得た。
【００９６】
［材料および方法］
中間分子量のキトサン、２−メチルアジリジン（ＭＡｚ）、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルアクリレート（平均Ｍｎ＝４８０）（ＰＥＧ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム分子内塩（ＭＴＳ）、トリプシン、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入した。緑膿菌（ＡＴＣＣ番号１９１４３）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）およびＴｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ａｇａｒ（ＴＳＡ）は、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）から購入する。Ｌ９２９マウス線維芽細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ、ＮＣ）から得た。蒸留水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ａ−１０水浄化システム（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて精製した。Ｓｙｔｏ９緑色蛍光核酸染色液は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。一般的な実験用塩および溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入した。すべての材料は、特に断りのない限り、さらに精製せずに入手したままの状態で使用した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、４００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ機器で記録した。元素（炭素、水素および窒素またはＣＨＮ）分析は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２４００機器（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて実施した。
【００９７】
キトサンオリゴ糖は、過酸化水素を用いて、酸化分解することによって調製した。中間分子量キトサン（２．５ｇ）を６５〜８５℃で１時間撹拌しながら、過酸化水素溶液（１５または３０重量％）中に懸濁させた。溶解していないキトサンを濾過により除去した後、アセトンを濾液に添加することによって、溶液からキトサンオリゴ糖を沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって収集し、エタノールで２回洗浄し、室温にて真空下で乾燥させた。キトサンオリゴ糖の粘度は、Ｕｂｂｌｅｏｈｄｅ毛細管粘度計を用いて、２５℃にてＮａＣｌ（０．２０Ｍ）およびＣＨ３ＣＯＯＨ（０．１０Ｍ）の溶液中で測定した。オリゴ糖の分子量は、古典的なマルク−ホウインクの式（すなわち、［η］＝１．８１×１０−３Ｍ０．９３）を用いて決定した。Ｍａｇｈａｍｉ（１９８８年）。
【００９８】
分子量（Ｍｗ）の制御は、過酸化水素の濃度および分解温度を変化させることによって達成した。キトサンオリゴ糖の粘度は、Ｕｂｂｌｅｏｈｄｅ毛細管粘度計を用いて、塩化ナトリウム（０．２０Ｍ）および酢酸（０．１０Ｍ）の溶液中で決定した。Ｄｕ，Ｊ．；Ｈｓｉｅｈ，Ｙ．Ｌ．Ｎａｎｏｆｉｂｒｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８年、１９、１２５７０７。分子量は、マルク−ホウインクの式（すなわち、［η］＝１．８１×１０−３Ｍ０．９３）と組み合わせて、処理条件の関数として決定した。まとめると、より高い濃度の過酸化水素およびより高い分解温度はより低分子量のキトサンをもたらした。表１に示すように、約１０ｋＤ分子量のキトサンオリゴ糖を１時間、６５℃にて１５重量％の過酸化水素中で調製した。分解温度を８５℃に上昇させると、有意に小さいサイズ（Ｍｗ約５ｋＤ）をもたらした。
【００９９】
【表１】
0006298818.tif 000037
【０１００】
より高い濃度の過酸化水素（すなわち、３０重量％）と高温（すなわち、８５℃）の両方を採用した場合、キトサンオリゴ糖の分子量はさらに減少した（約２．５ｋＤ）。表２に示すように、オリゴ糖のＣＨＮ元素分析によると、窒素の全体含有量は６．３重量％であった。
【０１０１】
【表２】
0006298818.tif 000038
【０１０２】
二級アミン官能化およびＮＯ貯蔵を変更するために、２−メチルアジリジン（ＭＡｚ）を異なる供給比（すなわち、２：１および１：１）でキトサンオリゴ糖上にグラフトした。一級アミンへの２−メチルアジリジンの供給比を１：１（ＣＳＯ１；キトサン１−５ｋ）から２：１（ＣＳＯ２；キトサン２−５ｋ）に大きくすると、より多くのＮＯ貯蔵（例えば、それぞれ約０．３０から０．８７μｍｏｌ／ｍｇ）をもたらした。図５ＡおよびＢに示すように、ＮＯフラックスおよびキトサン１／ＮＯ−５ｋの貯蔵はキトサン２／ＮＯ−５ｋよりも低く、その結果は、キトサン１−５ｋ（約８．９重量％）のアミン濃度がキトサン２−５ｋ（約１０．８重量％）と比較してより低いことに起因し得る。
【０１０３】
スキームＡおよびＢは、本明細書に記載のＮＯ放出キトサンオリゴ糖を調製するための経路を示す。
【化３６】
0006298818.tif 000039
【０１０４】
スキームＡにおいて、ＣＳＯ１（ｘ＝１）；ＣＳＯ２（ｘ＝２）；ＣＳＯ１−ＮＯ（ｘ＝１）；ＣＳＯ２−ＮＯ（ｘ＝２）。スキームＢにおいて、ＣＳＯ３（ｘ＝２）；ＣＳＯ３−ＮＯ（ｘ＝２）。上記スキームＡは、キトサンオリゴ糖の一級アミン上への２−メチルアジリジンのグラフト（ＣＳＯ１、２）および得られた物質のジアゼニウムジオレート化（ＣＳＯ１、２−ＮＯ）を含む、二級アミンおよびジアゼニウムジオレート官能化キトサンオリゴ糖誘導体を調製するための合成経路である。上記スキームＢは、２−メチルアジリジングラフト化キトサンオリゴ糖のＰＥＧ化（ＣＳＯ３）および得られた物質のジアゼニウムジオレート化（ＣＳＯ３−ＮＯ）を含む、二級アミンおよびジアゼニウムジオレート官能化キトサンオリゴ糖誘導体を調製するための合成経路である。
【０１０５】
スキームＡ’およびＢ’は、本明細書に開示されたキトサンオリゴ糖の合成経路を示す。
【化３７】
0006298818.tif 000040
【化３８】
0006298818.tif 000041
【０１０６】
二級アミン官能化キトサンオリゴ糖（キトサン１、キトサン２およびキトサン３）とＮＯ（塩基性条件下で１０気圧）の反応により、Ｎ−ジアゼニウムジオレートＮＯドナー官能化キトサンオリゴ糖（キトサン１／ＮＯ、キトサン２／ＮＯおよびキトサン３／ＮＯ）を得た。ＮＯ抱合（「帯電」）溶媒は、帯電効率および潜在的な総ＮＯ貯蔵に影響を与える。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ａ．Ｗ．；Ｓｌｏｍｂｅｒｇ，Ｄ．Ｌ．；Ｒａｏ，Ｋ．Ｓ．；Ｓｃｈｏｅｎｆｉｓｃｈ，Ｍ．Ｈ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｓｉｚｅ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１２年、５、７２３５〜７２４４。キトサンオリゴ糖を適切に溶解するために水溶液が必要であった。Ｎ−ジアゼニウムジオレート変換効率に対する水濃度の影響を調べるために、メタノール（一般的な帯電溶媒）（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ（２０１２年）；Ｓｔａｓｋｏ，Ｎ．Ａ．；Ｓｃｈｏｅｎｆｉｓｃｈ、Ｍ．Ｈ．Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６年、１２８、８２６５〜８２７１）と水の混合物を調製し（１０：０、９：１、８：２、７：３および６：４ｖ／ｖ）、ナトリウムメトキシドを添加することによりｐＨを１０超に調整した。
【０１０７】
スキームＣは、本明細書に記載のニトロソチオールＮＯ放出キトサンオリゴ糖を調製するための経路を示す。
【化３９】
0006298818.tif 000042
【０１０８】
スキームＤは、ジアゼニウムジオレート共役および共役ジアゼニウムジオレートからの２ＮＯの放出を示す。
【化４０】
0006298818.tif 000043
【０１０９】
二級アミン官能化キトサンオリゴ糖：２−メチルアジリジン（ＭＡｚ）グラフト化キトサンオリゴ糖を以下の以前に報告された手順に従って合成した。Ｗｏｎｇ，Ｋ．；Ｓｕｎ，Ｇ．Ｂ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｑ．；Ｄａｉ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｙ．；Ｈｅ，Ｃ．Ｂ．；Ｌｅｏｎｇ，Ｋ．Ｗ．ＰＥＩ−ｇ−ｃｈｉｔｏｓａｎ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｔｏ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  ｌｉｖｅｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００６年、１７、１５２〜１５８。簡単に述べると、濃縮ＨＣｌ（１１μＬ）、水（１００μＬ）とキトサンオリゴ糖上の一級アミンに対して１：１（ＣＳＯ１；Ｃｈｉｔｏｓａｎ１）または２：１（ＣＳＯ２；Ｃｈｉｔｏｓａｎ２）モル比のＭＡｚとの混合物をキトサンオリゴ糖（１００ｍｇ）の脱イオン水（５ｍＬ）中溶液に滴下した。得られた溶液を室温で５日間撹拌した後、７５℃で２４時間撹拌した。生成物を透析により精製し、凍結乾燥によって収集した。生成物中の任意の高分子量のポリ（２−メチルアジリジン）をメタノールで洗浄することにより除去し、得られた物質を室温にて真空下で乾燥させた。次いで、キトサン２をｐＨ１０．０で水に溶解した。ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルアクリレートを添加することによってキトサンオリゴ糖上の一級アミンを官能化し、キトサン３を生成した。得られたＰＥＧ官能化キトサンオリゴ糖誘導体を透析により精製し、凍結乾燥によって収集した。キトサン１およびキトサン２の１Ｈ  ＮＭＲデータ (400 MHz, CD3OD, δ): 0.8-1.1 (NH2CH(CH3)CH2NH), 1.9 (C7: CHNHCOCH3), 2.3-2.7 (NH2CH(CH3)CH2NHCH, C2: NH2CH(CH3)CH2NHCH), 3.3-4.0 (C3, C4, C5, C6: OHCH, OCHCH(OH)CH(NH2)CH, OHCH2CH, OHCH2CH), 4.4 (C1: OCH(CHNH2)O). キトサン３の１Ｈ  ＮＭＲデータ (400 MHz, CD3OD, δ): 0.8-1.1 (NH2CH(CH3)CH2NH), 1.9 (C7: CHNHCOCH3), 2.3-2.7 (NH2CH(CH3)CH2NHCH, C2: NH2CH(CH3)CH2NHCH), 3.2 (OCH2CH2OCH3), 3.3-4.0 (OCH2CH2OおよびC3, C4, C5, C6: OHCH, OCHCH(OH)CH(NH2)CH, OHCH2CH, OHCH2CH), 4.4 (C1: OCH(CHNH2)O).
【０１１０】
Ｎ−ジアゼニウムジオレート官能化キトサンオリゴ糖：二級アミン官能化キトサンオリゴ糖（ＣＳＯ１、キトサン１、ＣＳＯ２、キトサン２、キトサン３およびＣＳＯ３）および５．４ｍＭナトリウムメトキシド（７５μＬ）を異なるｖ／ｖ比（例えば、１０：０、９：１、８：２、７：３、６：４）のメタノール／水混合物（２ｍＬ）に添加した。懸濁液をＰａｒｒ水素化容器内のバイアルに添加し、それをアルゴンで３回迅速に（５〜１０秒）パージし、次に３回の長いアルゴンパージサイクル（１０分）でパージして、溶液から残留酸素を除去した。次いで、Ｐａｒｒ水素化容器を（ＮＯ分解生成物を除去するために）ＫＯＨペレット上で精製したＮＯガスで１０気圧に加圧し、３日間１０気圧に維持した。同じアルゴンパージプロトコルを実施して、容器からバイアルを除去する前に、溶液から未反応のＮＯおよび分解生成物を除去した。
【０１１１】
蛍光標識キトサンオリゴ糖：これらのキトサンオリゴ糖を以下の以前に報告された手順に従って調製した。Ｔｏｋｕｒａ，Ｓ．；Ｕｅｎｏ，Ｋ．；Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｓ．；Ｎｉｓｈｉ，Ｎ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１９９７年、１２０、１〜９。簡単に述べると、キトサンオリゴ糖（５０ｍｇ）をｐＨ９．０で水（２ｍＬ）に溶解した。２−メチルアジリジンをグラフトする前に、キトサンオリゴ糖の一級アミンに対して１：１００モル比の溶液にローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）を添加した。溶液を暗所で室温にて３日間撹拌した。その後の透析および凍結乾燥により、ＲＩＴＣ標識キトサンオリゴ糖を得た。
【０１１２】
ＭＡｚと一級アミンの比を調整することによって（例えば、１：１  ＣＳＯ１およびキトサン１、２：１  ＣＳＯ２およびキトサン２）、キトサンオリゴ糖上にグラフトしたＭＡｚ繰り返し単位の数は調整可能であり（ＮＭＲデータを裏付ける）、様々な二級アミン濃度およびＮＯ貯蔵をもたらした。アクリレート官能化ＰＥＧ鎖をマイケル付加反応によりＣＳＯ２およびキトサン２上の一級アミンに結合させ、ＰＥＧ改変足場（例えば、ＣＳＯ３およびキトサン３、スキームＢおよびＢ’を参照のこと）。オリゴ糖への２−メチルアジリジンのグラフトは、ＣＳＯ１およびキトサン１とＣＳＯ２およびキトサン２の対応する窒素含有量を６．３からそれぞれ８．９と１０．８重量％に増加させた。ＣＳＯ２およびキトサン２のＰＥＧ化は、窒素含有量の対応する減少をもたらした（３．１重量％）（ＣＳＯ３およびキトサン３）。
【０１１３】
２．官能化ポリグルコサミンにおける一酸化窒素の帯電、貯蔵および放出
本明細書に開示された主題は、二級アミン官能化キトサンオリゴ糖（例えば、ＣＳＯ１、２、３）の帯電状態の最適化について説明している。メタノールと水の混合物を帯電溶媒として使用した。図４は、異なる溶媒中の帯電したＣＳＯ２−ＮＯのＮＯ放出プロフィールを示している。７：３メタノール／水を使用した場合、最大総ＮＯ貯蔵（例えば、約０．８７μｍｏｌ／ｍｇ）を得た。
【０１１４】
【表３】
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【０１１５】
本明細書に開示された主題は、キトサンオリゴ糖上の一級アミンに対するアジリジン化合物の比を調整することによる総ＮＯ貯蔵の制御について説明している。アジリジン化合物の使用を増加させることによって、より多くの二級アミン含有量、したがってより多くの総ＮＯ貯蔵を得ることができる。例えば、図５ＡおよびＢならびに表４ＡおよびＢに示すように、２−メチルアジリジン／一級アミン２：１比での合成により、約０．８７μｍｏｌ／ｍｇの総貯蔵を得たが、１：１の比は、０．３０μｍｏｌ／ｍｇのＮＯ貯蔵をもたらした。したがって、アジリジン化合物の使用をさらに増加させることにより、ＮＯ貯蔵はおそらくより増大するであろう。（７：３メタノール／水帯電溶媒比を用いた）最大ＮＯ貯蔵は０．８７μｍｏｌ／ｍｇで、これは、以前に報告されたキトサン多糖（約０．２  μｍｏｌ／ｍｇ）のものよりもおよそ４倍多かった。Ｄｕ，Ｊ．；Ｈｓｉｅｈ，Ｙ．Ｌ．Ｎａｎｏｆｉｂｒｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８年、１９、１２５７０７；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋ．；Ｒａｊａｐａｋｓｅ，Ｎ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＣＯＳ）：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．２００５年、６２、３５７〜３６８；Ｍａｇｈａｍｉ（１９８８年）。
【０１１６】
本明細書に開示された主題は、二級アミン官能化キトサンオリゴ糖（ＣＳＯ１、２）のアミン部分を官能化することによるＮＯ放出動態の制御について説明している。図５ＡおよびＢならびに表４Ａおよび４Ｂに示すように、親水性ＰＥＧで改変されたキトサンオリゴ糖（ＣＳＯ３−ＮＯ）は、ＰＥＧ官能化前の対応物（ＣＳＯ２−ＮＯ）と比較して、より多くの初期ＮＯフラックスおよびより短い半減期を示した。
【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
したがって、オリゴ糖単位は、ＮＯ放出特性に反映されるモル比で存在する。実施形態において、ｍは約０．４〜約０．９、例えば、約０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９であり；ｎは約０．１〜約０．６、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５または０．６であり；式中、ｍおよびｎは各単位のモル分率を表し、ｍおよびｎの和は１である。
【０１１９】
【表５】
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【０１２０】
水／メタノール混合物中のＮ−ジアゼニウムジオレート官能化キトサンオリゴ糖（１ｍｇ）（ＣＳＯ１−ＮＯ、キトサン１／ＮＯ、ＣＳＯ２−ＮＯ、キトサン２／ＮＯ、ＣＳＯ３−ＮＯ、キトサン３／ＮＯ）を３７℃の脱酸素化リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）３０ｍＬを含有する試料容器に添加し、それがＮＯ放出を惹起した。放出されたＮＯを定量化するために、溶液を流速７０ｍＬ／分で窒素パージし、遊離したＮＯを分析器に運んだ。機器の回収率（２００ｍＬ／分）に一致するように追加の窒素流を容器に供給した。ＮＯ放出レベルが１０ｐｐｂＮＯ／ｍｇキトサンオリゴ糖未満に低下したときにＮＯの分析を終了した。ＮＯ放出キトサンオリゴ糖の化学発光データは、１）ＮＯ放出の総量（ｔ［ＮＯ］、μｍｏｌＮＯ／ｍｇ二級アミン官能化キトサンオリゴ糖）；２）ＮＯ放出の最大フラックス（［ＮＯ］max、ｐｐｂ／ｍｇ二級アミン官能化キトサンオリゴ糖）；および３）ＮＯ放出の半減期（ｔ１／２）として表した。
【０１２１】
３．マウス線維芽細胞生存率アッセイ
Ｌ９２９マウス線維芽細胞は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１重量％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で増殖させ、加湿条件下、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２中にて３７℃でインキュベートした。８０％の密集度に達した後、細胞をトリプシン処理し、３×１０４細胞／ｍＬの密度で組織培養処理ポリスチレン９６ウェルプレート上に播種し、３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、新しいＤＭＥＭ２００μＬおよびＮＯ放出キトサンオリゴ糖のＰＢＳ中溶液５０μＬを各ウェルに添加する前に、上清を吸引した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、上清を吸引し、ＤＭＥＭ／ＭＴＳ／ＰＭＳ（１０５／２０／１、ｖ／ｖ／ｖ）の混合物１２０μＬを各ウェルに添加した。３７℃で１．５時間インキュベーションした後に得られた着色溶液の吸光度は、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで定量化した。ＤＭＥＭ／ＭＴＳ／ＰＭＳの混合物および未処理の細胞をそれぞれブランクおよび対照として使用した。細胞生存率を式１により算出した。
【数１】
0006298818.tif 000047
【０１２２】
４．上述した緑膿菌バイオフィルムに対してＭＢＣのオリゴ糖にマウス線維芽細胞を曝露することによって、対照とＮＯ放出キトサンオリゴ糖の細胞毒性を比較した。２４時間のインキュベーション後の対照およびＮＯ放出キトサンオリゴ糖の正規化された細胞生存率の結果を図８ＡおよびＢに示す。サイズ（すなわち、分子量）に関係なく、対照およびＮＯ放出キトサンオリゴ糖は、ＮＯ放出足場のためのＭＢＣでマウス線維芽細胞に対して非毒性であり、これらの材料の抗バイオフィルム剤としての他の抗菌剤と比較した利点を示した。ＮＯ放出キトサンオリゴ糖は、キトサン対照群よりも低い細胞毒性を示した。
【０１２３】
５．静的条件下での殺菌アッセイ
緑膿菌細菌培養物をＴＳＢ中で３７℃にて一晩凍結（−８０℃）ストックから増殖させた。得られた懸濁液のアリコート５００μＬを新しいＴＳＢ５０ｍＬに添加し、濃度が、栄養寒天上でのＯＤ６００、複製プレーティングおよび数え上げることにより確認して約１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに達するまで３７℃で約２時間インキュベートした。ＴＳＡ上に細菌懸濁液をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートすることにより作業細菌ストックを生成した。ＴＳＡ細菌ストックを毎週調製し、４℃で保存した。殺菌アッセイのために、緑膿菌のコロニーをＴＳＡプレートから採取し、ＴＳＢ３ｍＬ中に分散させ、３７℃で一晩インキュベートした。培養液のアリコート５００μＬを新しいＴＳＢ５０ｍＬに添加し、約１×１０８ＣＦＵ／ｍＬの濃度にインキュベートした。細菌を遠心分離により収集し、ＰＢＳ中に再懸濁し、約１×１０６ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。緑膿菌に対するＮＯ放出キトサンオリゴ糖の殺菌効力は、細菌懸濁液をＮＯ放出キトサンオリゴ糖と共に３７℃でインキュベートすることによって評価した。４時間後、細菌懸濁液のアリコート１００μＬを除去し、ＰＢＳで１０倍に希釈し、ＴＳＡ上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。細菌生存率の３対数減少をもたらすＮＯ放出キトサンオリゴ糖の最小濃度を最小殺菌濃度（ＭＢＣ）と定義した。
【０１２４】
細菌生存率アッセイを静的条件下で実施して、細菌生存率を３対数減少（すなわち、９９．９％の死滅）させるのに必要なキトサンの濃度を決定した。それは以下、最小殺菌濃度またはＭＢＣと呼ぶ。９９．９％の細菌死滅に必要なＮＯ用量を定量的に評価するために、アッセイ（４時間）の時間にわたるＮＯ放出キトサンオリゴ糖から送達されるＮＯ量（表４）も調べた。キトサンオリゴ糖に必要なＭＢＣと殺菌ＮＯ用量の両方を表５で提供する。
【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
サイズ（すなわち、約２．５、５または１０ｋＤａの分子量）に関係なく、各ＮＯ放出キトサンオリゴ糖（キトサン２／ＮＯ−２．５ｋ、キトサン２／ＮＯ−５ｋ、キトサン２／ＮＯ−１０ｋ）は、３対数の死滅について同様の殺菌ＮＯ濃度（すなわち、約１０μｍｏｌＮＯ／ｍＬ）を示した（表５）。検討した各ＮＯ放出キトサンオリゴ糖（ＣＳＯ２−ＮＯ−５ｋを含む）は、緑膿菌を９９．９％以上死滅させた。同等の濃度で、対照（非ＮＯ放出）キトサンは細菌生存率の有意な減少をもたらさず、殺菌剤としてのＮＯを示した（データは示さず）。
【０１２７】
６．ＮＯ放出キトサンオリゴ糖での緑膿菌バイオフィルムの処理
ＣＤＣバイオリアクター（Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｚｅｍａｎ、ＭＴ）を使用して緑膿菌バイオフィルムを４８時間にわたって成長させた。簡単に述べると、リアクターを組み立てる前に、医療グレードのシリコーンゴム基材をクーポンホルダーに取り付けた。次いで、組み立てたリアクターをオートクレーブした。リアクターの流出物ラインをクランプし、１％（v／v）の滅菌ＴＳＢ（５００ｍＬ）を無菌的に添加した。次いで、緑膿菌をＴＳＢ中で１０８ＣＦＵ／ｍＬまで培養した。リアクターに最終濃度約２×１０５ＣＦＵ／ｍＬでこの細菌懸濁液のアリコート（１ｍＬ）を接種した。リアクターをゆっくり撹拌しながら（１５０ｒｐｍ）３７℃で２４時間インキュベートした。この「バッチ相」増殖に続いて、リアクター培地は、さらに２４時間、０．３３％（ｖ／ｖ）のＴＳＢで６ｍＬ／分にて流出物ラインを介して連続的に交換した。
【０１２８】
シリコーンゴム基板上に成長させた緑膿菌バイオフィルムをわずかに撹拌しながらＰＢＳ中のキトサンオリゴ糖に曝露して（３７℃、２４時間）、生存率において５対数減少を誘発するのに必要な最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を決定した。２４時間後、試料を超音波処理し、ボルテックスして、バイオフィルムを破壊した。細菌／キトサン懸濁液のアリコート（１００μＬ）を希釈しＴＳＡ上にプレートした。ＴＳＡプレートを３７℃で一晩インキュベートした後、観察されたコロニーを計数することによって細菌生存率を決定した。注目すべきは、選択されたこのプレート計数法の検出限界が２．５×１０３ＣＦＵ／ｍＬであることである。したがって、バイオフィルムの生存率の５対数減少を正確に表すためにバイオフィルムの成長条件を選択した。
【０１２９】
ＮＯ放出キトサンオリゴ糖（例えば、キトサン１／ＮＯ−５ｋ、キトサン２／ＮＯ−５ｋ、キトサン３／ＮＯ−５ｋ）の抗バイオフィルム活性を評価するために、緑膿菌バイオフィルムは、０．２〜１．３ｍｇ／ｍＬのＮＯ放出キトサンオリゴ糖（約０．１７〜０．４６μｍｏｌＮＯ／ｍＬに対応する）に２４時間曝露した。処理後、生存率の定量化を可能にするために、バイオフィルムをボルテックスおよび超音波処理することによりシリコーンゴム基材から除去した。Ｓａｌｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．；Ｔｏｒｒｅｓ  ｄｅ  Ｈｏｌｄｉｎｇ，Ｃ．Ｌ．；Ｔｈｏｍａｓ，Ｌ．；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｖ．；Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｇ．Ｐ．；Ｓａａｖｅｄｒａ，Ｊ．Ｅ．；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ａ．；Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｍ．；Ｋｅｅｆｅｒ，Ｌ．Ｋ．；Ｍｉｒａｎｄａ，Ｋ．Ｍ．ＨＮＯ  ａｎｄ  ＮＯ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｍｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｉａｚｅｎｉｕｍｄｉｏｌａｔｅ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＨ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０、３２６２〜７０。対照実験は、選択したプロトコルを用いて、緑膿菌バイオフィルムの成長を確認するために実施した。図７に示すように、ＰＢＳにのみ曝露された場合、バイオフィルム中の緑膿菌の生存率は約２×１０８ＣＦＵであった。バイオフィルム細菌生存率を５対数減少させるためのキトサン濃度（ＭＢＣ）は、キトサン２／ＮＯ−５ｋ、キトサン１／ＮＯ−５ｋおよびキトサン３／ＮＯ−５ｋについて、それぞれ４００、７００および１０００μ／ｍＬであった。キトサン２／ＮＯ−５ｋは、最も高い抗バイオフィルム効力を示したが、おそらくＮＯ貯蔵／放出の増加および負に荷電した細菌との迅速な会合の両方による結果であると思われる。キトサン１／ＮＯ−５ｋおよびキトサン３／ＮＯ−５ｋは、同様なレベルのＮＯ（約０．３μｍｏｌ／ｍｇ）を貯蔵したが、キトサン１／ＮＯ−５ｋ（ＭＢＣ７００μｇ／ｍＬ）は、キトサン３／ＮＯ−５ｋ（ＭＢＣ１０００μｇ／ｍＬ）と比較して、バイオフィルム細菌を根絶するのにより効果的であった。キトサン２／ＮＯ−５ｋおよびキトサン３／ＮＯ−５ｋと緑膿菌バイオフィルムの会合は、共焦点顕微鏡を用いて評価した。図９Ａ〜Ｆに示すように、キトサン２／ＮＯ−５ｋに曝露されたバイオフィルムは、キトサン３／ＮＯ−５ｋと比較して、より強い赤色蛍光を示し、正に荷電したキトサン２／ＮＯ−５ｋと細菌の会合の増大を再度確認した。
【０１３０】
７．共焦点顕微鏡法
緑膿菌をＴＳＢ中で濃度約１×１０８ＣＦＵ／ｍＬに培養し、遠心分離（１０分間に３６４５×ｇ）を介して収集し、滅菌ＰＢＳ中に再懸濁し、約１×１０６ＣＦＵ／ｍＬに調整した。細菌溶液のアリコートを３７℃で１．５時間、共焦点ガラスボトムディッシュ中でインキュベートした。５４３ｎｍＨｅＮｅ励起レーザーおよびＬＰ５８５ｎｍフィルターを備えたＺｅｉｓｓ５１０Ｍｅｔａ倒立型共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）改変キトサンオリゴ糖の蛍光画像を得た。明視野および蛍光画像を４０倍の対物Ｎ．Ａ．１．２Ｃアポクロマート水浸レンズによって収集した。ＲＩＴＣ標識ＮＯ放出キトサンオリゴ糖のＰＢＳ（１．５ｍＬ）中溶液を共焦点ガラスディッシュ中の細菌溶液（１．５ｍＬ）に添加し、１５０μｇ／ｍＬの最終濃度を達成した。画像を２分毎に収集し、もしあれば、キトサンオリゴ糖と緑膿菌の会合を時間的に特徴付けた。バイオフィルム内のキトサンオリゴ糖と細菌の会合を観察するために、ｓｙｔｏ９（１０μＭ）で染色された確立したバイオフィルムをＲＩＴＣ標識ＮＯ放出キトサンオリゴ糖（ＰＢＳ中１５０μｇ／ｍＬ）と共に２．５時間インキュベートした。画像化の前に、試料をＰＢＳ（３倍）で洗い流した。４８８ｎｍＡｒおよび５４３ｎｍＨｅＮｅ励起レーザーならびにＢＰ５０５〜５３０ｎｍおよびＬＰ５８５ｎｍフィルターを備えたＺｅｉｓｓ５１０Ｍｅｔａ倒立型共焦点レーザー走査型顕微鏡それぞれを用いて、すべての共焦点画像を得た。蛍光画像を２０倍の対物レンズで収集した。
【０１３１】
共焦点顕微鏡法を利用して、キトサン３／ＮＯ−５ｋおよびキトサン２／ＮＯ−５ｋと細菌の会合動態を比較した。ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）標識キトサン２／ＮＯ−５ｋおよびキトサン３／ＮＯ−５ｋを合成した。Ｍａｇｈａｍｉ（１９８８年）。キトサン−細菌会合へのＲＩＴＣの潜在的な影響は、低いＲＩＴＣ濃度（すなわち、総一級アミンに対して１：１００のモル比）を用いることによって最小化された。次いで、ＮＯ放出キトサンオリゴ糖と細菌の会合の程度を細菌の周囲の赤色蛍光を測定することによって追跡した。キトサン２／ＮＯ−５ｋ（２４分以内）は、キトサン３／ＮＯ−５ｋ（８６分）より迅速に細菌と会合した（図１０）。４２分でのキトサン２／ＮＯ−５ｋからの蛍光は、１１０分でのキトサン３／ＮＯ−５ｋのものよりも有意に大きく、キトサン３／ＮＯ−５ｋが、ＰＥＧ（中性）改変のためにはるかに遅い速度で細菌と会合することをさらに実証した。キトサン２／ＮＯ−５ｋおよびキトサン３／ＮＯ−５ｋと緑膿菌の会合をさらに検査すると、キトサン２／ＮＯ−５と細菌の会合の増大が明らかになった（図１０Ｇ、Ｈ）。
【０１３２】
キトサン分子量がプランクトン死滅において重要な役割を果たすことは観察されなかったが、バイオフィルムに対して最大のキトサンオリゴ糖（キトサン２／ＮＯ−１０ｋおよびキトサン２／ＮＯ−２．５ｋについて、６００μｇ／ｍＬ対４００μｇ／ｍＬ）であるキトサン２／ＮＯ−１０ｋを用いた場合、あまり効果的でない細菌死滅が観察された。バイオフィルムにおけるキトサンオリゴ糖と細菌の効率的な会合は、以前に報告された生理的条件下で不溶性であるＮＯ放出多糖の観点において有利である。文書を引用した本出願において引用または参照されたすべての文書、および本明細書において引用または参照されたすべての文書（「本明細書で引用された文書」）、および本明細書で引用された文書において引用または参照されたすべての文書は、本明細書において言及された、または参照として本明細書に組み込まれる任意の文書における任意の製品のための任意の製造者の指示、説明、製品仕様および製品シートと共に、参照として本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。
【０１３３】
以上、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、上記の段落により規定される本発明は、上記説明において示した特定の詳細に限定されるものでなく、本発明の精神または範囲を逸脱することなく多くの明らかな変更が可能であることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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