(57)【要約】  α−ガラクトシルセラミド（α−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）又はｉＧｂ３のような、少なくとも１つのＮＫＴアクチベータ、ＣＤ４０アゴニスト、及び任意選択的に抗原を含んでなるアジュバント組合せを開示する。癌のような様々な慢性疾患の治療へのこれら免疫アジュバントの使用についても提供する。【選択図】図１
2010525065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＤ４０の少なくとも１つのアゴニスト；
（ｉｉ）少なくとも１つのＮＫＴアクチベータ；及び
（ｉｉｉ）任意選択的に、少なくとも１つの所望抗原を含んでなる、
Ｔ細胞免疫に対して相乗効果を誘発するアジュバント組合せ。
【請求項２】
ＮＫＴアクチベータがα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）又はｉＧｂ３である、請求項１のアジュバント組合せ。
【請求項３】
ＣＤ４０アゴニストが、抗ＣＤ４０抗体又は抗体断片、又はＣＤ４０Ｌタンパク質、その誘導体、断片、又はマルチマー、又はＣＤ４０Ｌを含有するコンジュゲートである、請求項１のアジュバント組合せ。
【請求項４】
前記免疫グロブリンがキメラ免疫グロブリンである、請求項３のアジュバント組合せ。
【請求項５】
前記免疫グロブリンがヒト化免疫グロブリンである、請求項３のアジュバント組合せ核酸構築体。
【請求項６】
前期免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンである、請求項３のアジュバント組合せ。
【請求項７】
前記免疫グロブリンが単鎖免疫グロブリンである、請求項３のアジュバント組合せ。
【請求項８】
前記免疫グロブリンがヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含む、請求項３のアジュバント組合せ。
【請求項９】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群より選択される、請求項３のアジュバント組合せ。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンが、同じプロモーターへ機能可能的に連結されている免疫グロブリン軽鎖コーディング核酸配列及び免疫グロブリン重鎖コーディング核酸配列によってコードされる、請求項３のアジュバント組合せ。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン軽鎖配列及び免疫グロブリン重鎖配列は、ＩＲＥＳによって介在される、請求項１０のアジュバント組合せ。
【請求項１２】
前記抗原が、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫の抗原である、請求項１のアジュバント組合せ。
【請求項１３】
前記抗原がヒト抗原である、請求項１のアジュバント組合せ。
【請求項１４】
前記ヒト抗原が、その発現が慢性ヒト疾患に相関するか又は関与する、癌抗原、自己抗原、又は他のヒト抗原である、請求項１３のアジュバント組合せ。
【請求項１５】
前記ウイルス抗原が、ＨＩＶ、ヘルペス、パピローマウイルス、エボラ、ピコルナ、エンテロウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ＶＳＶ、デングウイルス、肝炎ウイルス、リノウイルス、黄熱病ウイルス、ブンヤウイルス、ポリオーマウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス、エコーウイルス、ポックスウイルス、帯状疱疹、アフリカ豚コレラウイルス、インフルエンザウイルス、及びパラインフルエンザウイルスからなる群より選択されるウイルスに特異的である、請求項１２のアジュバント組合せ。
【請求項１６】
前記細菌抗原が、サルモネラ、エッシェリヒア、シュードモナス、バチルス、ビブリオ、カンピロバクター、ヘリコバクター、エルウィニア、ボレリア、ペロバクター、クロストリジウム、セラチア、キサントモナス、エルシニア、バークホルデリア、リステリア、シゲラ、パスツレラ、エンテロバクター、コリネバクテリウム、及びストレプトコッカスからなる群より選択される細菌に由来する、請求項１２のアジュバント組合せ。
【請求項１７】
前記寄生虫抗原が、バベシア、エントアメーバ、リーシュマニア、プラスモジウム、トリパノソーマ、トキソプラズマ、ジアルジア、扁形動物、及び回虫より選択される寄生虫に由来する、請求項１２のアジュバント組合せ。
【請求項１８】
前記真菌抗原が、アスペルギルス、コクシジオイデス、クリプトコッカス、カンジダ、ノカルジア、ニューモシスティス、及びクラミジアからなる群より選択される真菌に由来する、請求項１２のアジュバント組合せ。
【請求項１９】
抗原が、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌（小細胞又は大細胞）、骨癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、卵巣癌、精巣癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結腸癌、甲状腺癌、子宮頚部癌、頭頚部癌、肉腫、グリア細胞腫、及び胆嚢癌からなる群より選択されるヒト癌により発現される癌抗原である、請求項１のアジュバント組合せ。
【請求項２０】
抗原が、その発現が自己免疫疾患に相関する自己抗原である、請求項１のアジュバント組合せ。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のアジュバント組合せを含有する組換え微生物。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のアジュバント組合せ又は前記アジュバント組合せを含有する組成物を投与することによって、抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するための方法。
【請求項２３】
前記投与することが、以下：
（ｉ）ＣＤ４０アゴニスト又はＮＫＴアクチベータだけの投与に比べてより高い頻度の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導すること；
（ｉｉ）ＣＤ４０アゴニスト又はＮＫＴアクチベータだけの投与に比べてより多い量の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導すること；及び
（ｉｉｉ）ＣＤ４０アゴニスト又はＮＫＴアクチベータだけの投与に比べて腫瘍免疫を増強することの少なくとも１つをもたらす、請求項２２の方法。
【請求項２４】
抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、自己抗原、アレルゲン、及び癌抗原より選択される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
抗原がＨＩＶ抗原である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
ＨＩＶ抗原がｇａｇ又はｅｎｖである、請求項２５の方法。
【請求項２７】
抗原がヒト腫瘍によって発現される抗原である、請求項２４の方法。
【請求項２８】
抗原がメラノーマによって発現される抗原である、請求項２４の方法。
【請求項２９】
治療される疾患が、癌、アレルギー、炎症性疾患、感染症、及び自己免疫疾患より選択される、請求項２３の方法。
【請求項３０】
治療される疾患がメラノーマである、請求項２９の方法。
【請求項３１】
感染症が、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫によって引き起こされる、請求項２３の方法。
【請求項３２】
ウイルスがＨＩＶである、請求項３１の方法。
【請求項３３】
前記投与が、以下：
（ｉ）ＣＤ４０アゴニスト又はＮＫＴアクチベータ若しくはアゴニスト単独の投与に比べて実質的に増強された一次及び記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発すること；
（ｉｉ）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の指数的増大を誘導すること；及び
（ｉｉｉ）ＣＤ４欠損宿主において、正常（非ＣＤ４欠損）宿主に匹敵する防御免疫応答を産生することの少なくとも１つをもたらす、請求項３０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞上でのＣＤ７０発現をアップレギュレートして抗原特異的な細胞性免疫を促進する、相乗的なアジュバント組合せに概して関する。より特別には、本発明は、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）アクチベータ（例えば、α−ガラクトシルセラミド（α−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）又はｉＧｂ３）とＣＤ４０アゴニスト（例えば、アゴニストの抗ＣＤ４０抗体、又はＣＤ４０Ｌポリペプチド又はコンジュゲート）を含んでなり、そして任意選択的に標的抗原がさらに含まれる特異的な相乗的組合せに関する。なおさらに、本発明は、抗原特異的な細胞性免疫（即ち、ＣＤ８＋免疫）を増強する、そのような相乗的なアジュバント組合せ又はタンパク質コンジュゲートの投与を含んでなる新規の免疫療法を提供する。具体的には、これらのアジュバント組合せ及び／又はポリペプチドコンジュゲートを免疫アジュバントとして含んでなる組成物の、癌、感染症、自己免疫疾患、アレルギー及び炎症性疾患が含まれる様々な慢性疾患を治療するための使用についても教示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
微生物に対する身体の防御系、並びに細胞増殖に影響を及ぼす疾患のような他の慢性疾患に対する身体の防御は、自然免疫系の初期反応と獲得免疫系の後期応答によって媒介される。自然免疫には、例えば、微生物の病原体に特徴的であり、哺乳動物細胞上には存在しない構造を認識する機序が関与する。そのような構造の例には、細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ウイルスの二本鎖ＤＮＡ、及び非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡヌクレオチドが含まれる。自然免疫応答系のエフェクタ細胞は、好中球、マクロファージ、及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含む。自然免疫に加えて、哺乳動物が含まれる脊椎動物は、感染作用体への曝露により刺激されて、特別な抗原へのそれぞれの継続的な曝露に伴って強度及び有効性が増加する免疫防御系を進化させてきた。特異的な感染又は抗原攻撃（insult）へ適応するその能力により、この免疫防御機序は、獲得免疫として記載されている。Ｂリンパ球によって産生される抗体が関与する体液性免疫と、Ｔリンパ球が媒介する細胞媒介性免疫と呼ばれる２種類の獲得免疫応答がある。
【０００３】
２種類の主要なＴリンパ球、ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）とＣＤ４ヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）が記載されてきた。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、ウイルス又は細菌に感染された細胞の上に、クラスＩ  ＭＨＣ分子によって提示される外来抗原を、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して認識するエフェクタ細胞である。外来抗原の認識時に、ＣＤ８＋細胞は、活性化、成熟化、及び増殖のプロセスを受ける。この分化プロセスは、外来抗原を表示する標的細胞を破壊する能力のあるＣＴＬクローンをもたらす。一方、Ｔヘルパー細胞は、エフェクタ免疫応答の体液性と細胞媒介性の両方の形態に関与する。体液性、又は抗体免疫の応答に関しては、Ｂリンパ球によって、Ｔｈ細胞との相互作用を介して抗体が産生される。具体的には、循環する微生物のような細胞外の抗原が特殊化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれ、処理されて、クラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に付随してＣＤ４＋Ｔｈ細胞へ提示される。次いで、これらのＴｈ細胞がＢリンパ球を活性化して、抗体産生をもたらす。対照的に、細胞媒介性、又は細胞性の免疫応答は、標的細胞への成功した感染後のように、細胞内の部位に存在する微生物を中和するように機能する。例えば、微生物抗原のような外来抗原は、被感染細胞内で合成されて、そのような細胞の表面上で、クラスＩ  ＭＨＣ分子に付随して提示される。そのようなエピトープの提示は、上記に記載のＣＤ８＋ＣＴＬの刺激をもたらすが、これもＣＤ４＋Ｔｈ細胞によって刺激されるプロセスである。Ｔｈ細胞は、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞と呼ばれる、少なくとも２種の明確な亜集団からなる。Ｔｈ１及びＴｈ２のサブタイプは、抗原への曝露の後で共通の前駆体より分化する、Ｔｈ細胞の偏向した集団を表す。
【０００４】
それぞれのＴヘルパー細胞サブタイプは、互いに異なり、それぞれ他の増大及び機能を交差調節する明確な免疫学的効果を促すサイトカインを分泌する。Ｔｈ１細胞は、インターフェロン（ＩＦＮ）γ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、及びＩＬ−１２のようなサイトカインの多量と少量のＩＬ−４を分泌する。Ｔｈ１関連サイトカインは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性を促進して、最も頻繁には、細胞内病原体に対する細胞媒介性免疫応答に関連する。対照的に、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１０のようなサイトカインの多量を分泌するが、ＩＦＮ−γはわずかに分泌して、抗体応答を促進する。Ｔｈ２応答は、炭疽菌からの保護や寄生虫感染症の消失といった体液性応答に特に関連している。
【０００５】
生じる免疫応答がＴｈ１又はＴｈ２のいずれに推進されるかは、関与する病原体とサイトカインのような細胞環境中の因子に主に依存する。Ｔヘルパー応答、又は正確なＴヘルパー亜集合を活性化し得ないと、特別な病原体と戦うのに十分な応答を開始し得ないことだけでなく、再感染に抗する弱い免疫の産生をもたらす可能性がある。多くの感染作用体は、Ｔｈ１免疫によって具現化されるような細胞媒介性応答が保護及び／又は療法に重要な役割を担うことが期待される、細胞内の病原体である。さらに、これら感染症の多くでは、不適正なＴｈ２応答の誘導が疾患アウトカムに負の影響を及ぼすことが示されている。例には、M tuberculosis（結核）、S. mansoni（マンソン住血吸虫症）、及びまた、逆効果のＴｈ２様優勢免疫応答が含まれる。らい腫性らいも、蔓延しているが不適正なＴｈ２様応答を特徴とするらしい。ＨＩＶ感染は、別の例を代表する。ここでは、Ｔｈ１様細胞の他のＴｈ細胞集団に対する比の低下が、疾患症状へ向かう進行に不可欠な役割を果たすことが示唆されている。
【０００６】
感染作用体に対する保護手段として、いくつかの微生物からの保護のための予防接種プロトコールが開発されてきた。感染病原体に対する予防接種プロトコールは、乏しいワクチン免疫原性、不適正な種類の応答（「抗体」対「細胞」媒介性免疫）、長期の免疫記憶を誘導する能力の不足、及び／又は所与の病原体の異なる血清型に対する免疫を産生し得ないことによってしばしば妨げられる。現行の予防接種戦略は、所与の血清型と多くの一般病原体、例えば、ウイルスの血清型又は病原体に特異的な抗体の誘導を目標にする。どの血清型が世界中で蔓延しているかを監視するための努力が反復的なベースで行われなければならない。この例は、主要な感染株となることが予期される新生のインフルエンザＡ血清型を毎年監視することである。
【０００７】
予防接種プロトコールを支援するために、特定の感染症に対する免疫応答の産生を支援するアジュバントがさらに開発されてきた。例えば、アルミニウム塩は、ある種の病原体に対する抗体応答を増強するのに比較的安全で有効なワクチンアジュバントとして使用されてきた。そのようなアジュバントの欠点の１つは、それらが細胞媒介性免疫応答を刺激するのに相対的に無効であり、主にＴｈ２に偏った免疫応答を産生することである。
【０００８】
保護的な免疫の産生が、抗原への曝露だけでなく、その抗原が遭遇する状況（context）にも依存することは、今日広く認められている。新規の抗原を非炎症状況の宿主へ導入すると、長期の免疫ではなく免疫寛容を産生するのに対し、炎症剤（アジュバント）の存在時に抗原へ曝露すると免疫が引き起こされるという数多くの例が存在する（Mondino et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:2245 (1996); Pulendran et al., J. Exp. Med. 188:2075 (1998); Jenkins et al., Immunity 1 :443 (1994); 及び Kearney et al., Immunity 1 :327 (1994)).
獲得免疫を調節することが知られている天然に存在する分子は、ＣＤ４０である。ＣＤ４０は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一員であり、数多くの細胞媒介性免疫応答に必須で、Ｔ細胞依存性体液性免疫の発現に必要とされる（Aruffo et al., Cell 72:291 (1993); Farrington et al., Proc Natl Acad Sci., USA 91:1099 (1994); Renshaw et al., J Exp Med 180:1889 (1994)）。その本来の役割において、ＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ４０−リガンドは、ＤＣ又はＢ細胞上で発現されるＣＤ４０と相互作用し、ＡＰＣの活性化の増加と、同時にＴ細胞のさらなる活性化を促進する（Liu et al Semin Immunol 9:235 (1994); Bishop et al., Cytokine Growth Factor Rev 14:297 (2003)）。ＤＣでは、ＣＤ４０連結により、典型的には、活性化マーカーのアップレギュレーションと炎症性サイトカインの産生といった、ＴＬＲを介した刺激に似た応答がもたらされる（Quezada et al. Annu Rev Immunol 22:307 (2004); O'Sullivan B and Thomas R Crit Rev Immunol 22:83 (2003)）。ＣＤ８応答におけるその重要性は、ＣＤ４０を介したＡＰＣの刺激により、ＣＤ４細胞の非存在時でのＣＤ４依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答がレスキューされることを示す諸研究によって実証された（Lefrancois et al., J Immunol. 164:725 (2000); Bennett et al., Nature 393:478 (1998); Ridge et al., Nature 393:474 (1998); Schoenberger et al., Nature 393:474 (1998)）。この知見は、ＣＤ４０アゴニストが単独で、ある種の疾患状態で欠落しているＣＤ８＋Ｔ細胞応答を潜在的にレスキューする可能性があるという多くの思索の口火となった。
【０００９】
しかしながら、他の研究は、ＣＤ４０刺激単独では、長期免疫を産生するのに不十分であることを実証した。いくつかのモデル系において、抗ＣＤ４０治療単独では、長期免疫を不十分に産生した。いくつかのモデル系において、抗ＣＤ４０治療単独では、無効な炎症性サイトカイン産生、抗原特異的Ｔ細胞の欠失（Mauri et al. Nat Med 6:673 (2001); Kedl et al. Proc Natl Acad Sci., USA 98:10811 (2001)）、そしてＢ細胞応答の停止（Erickson et al., J Clin Invest 109:613 (2002)）をもたらし得る。また、可溶性のトリマー化ＣＤ４０リガンドが臨床においてＣＤ４０経路のアゴニストとして使用されたことがあるが、わずかに報告されたことは、ＣＤ４０の刺激単独では、長期のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫に必要なすべてのシグナルを再構成し得ないという結論に一致している（Vonderheide et al., J Clin Oncol 19:3280 (2001)）。
【００１０】
様々なアゴニスト抗体が異なるグループによって報告されている。例えば、あるｍＡｂ  ＣＤ４０．４（５ｃ３）（PharMingen，カリフォルニア州サンディエゴ）は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの間の活性化をほぼ３０〜４０％高めると報告されている（Schlossman et al., Leukocyte Typing, 1995, 1 :547-556）。また、Seattle Genetics は、米国特許第６，８４３，９８９号において、アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体を使用してヒトの癌を治療する方法を提供すると主張している。彼らの抗体は、刺激性のシグナルを送達して、それがＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用を少なくとも４５％増強してＣＤ４０Ｌ媒介性の刺激を増強して、in vivo 抗新生物活性を保有すると主張されている。彼らは、この抗体をＳ２Ｃ６（Ｂリンパ球に対して強い増殖促進シグナルを伝達することがかつて示されたアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体）より入手している（Paulie et al., 1989, J. Immunol. 142:590-595）。
【００１１】
自然免疫応答と獲得免疫応答におけるＣＤ４０の活性の故に、様々なＣＤ４０アゴニストについて、ワクチンアジュバントとして、そして増強された細胞性免疫が所望される療法における使用法が探究されてきた。最近、あるＴＬＲアゴニスト及び抗ＣＤ４０治療と組み合わせた抗原での免疫化（組合せＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫化）が、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞増大を誘導し、いずれかのアゴニスト単独での免疫化より１０〜２０倍高い応答を誘発することが実証された（Ahonen et al., J Exp Med 199:775 (2004)）。これは、ウイルス又は微生物の病原体による感染の非存在下で、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を産生し得ることを初めて実証したものである。組合せＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫化により誘発される抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、溶解機能、γ−インターフェロン産生、及び抗原チャレンジへの二次応答の増強を実証する。ＣＤ８＋Ｔ細胞増大の誘導における、抗ＣＤ４０との相乗的な活性は、ＴＬＲ１／６、２／６、３、４、５、７、及び９のアゴニストで示された。このことは、組合せＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫化により、重大な細胞媒介性獲得免疫を誘発するのに必要とされるすべてのシグナルを再構成し得ることを示唆する。
【００１２】
ＮＫＴ細胞は、非多形性ＣＤ１ｄ抗原提示分子によって制限されるＴ細胞受容体を発現する、免疫調節性Ｔリンパ球であることが知られている。ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄにより提示される糖脂質、α−ガラクトシルセラミド（α−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）を認識する。α−Ｇａｌ−Ｃｅｒの認識時に、ＮＫＴ細胞は、活性化されて、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及びＩＦＮ−γが含まれるサイトカインを産生して、それ自体は、免疫調節サイトカインの分泌を促進することによって免疫応答をアップレギュレートすることもダウンレギュレートすることもできる。ＮＫＴ細胞を欠いているマウスは、細菌感染症とある種の腫瘍に対する抵抗性をより受け易くて、宿主防御におけるＮＫＴ細胞の重要な役割を実証する。また、単独療法としてのα−Ｇａｌ−Ｃｅｒのマウスへの投与によるＮＫＴ細胞の活性化は、腫瘍に対する免疫を限られた成功で増強し得ることも示された（Matsuyoshi, H., S. Hirata, Y. Yoshitake, Y. Motomura, D. Fukuma, A. Kurisaki, T. Nakatsura, Y. Nishimura, and S. Senju. 2005「Therapeutic effect of α-galactosylceramide-loaded dendritic cells genetically engineered to express SLC/CCL21 along with tumor antigen against peritoneally disseminated tumor cells（腹腔内播種された腫瘍細胞に対する腫瘍抗原と、ＳＬＣ／ＣＣＬ２１を発現するように遺伝子工学処理したα−ガラクトシルセラミド負荷樹状細胞の治療効果）」Cancer Sci. 96:889-896; Crowe, N.Y., J.M. Coquet, S.P. Berzins, K. Kyparissoudis, R. Keating, D.G. Pellicci, Y. Hayakawa, D.I. Godfrey, and M.J. Smyth. 2005「Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo（ＮＫＴ細胞サブセットにより in vivo で媒介されるディファレンシャルな抗腫瘍免疫）」J. Exp. Med. 202:1279-1288; Smyth, M.J., N. Y. Crowe, Y. Hayakawa, K. Takeda, H. Yagita, and D.I. Godfrey. 2002「NKT cells - conductors of tumor immunity?（ＮＫＴ細胞−腫瘍免疫のコンダクター？）」Curr. Opin. Immunol. 14:165-171）。
【００１３】
故に、予防接種プロトコールにおいて、又は微生物感染症の間などにおける、獲得免疫応答の有効性を高めるには、新規のより有効なワクチンアジュバントを開発することが重要である。本発明は、このニーズを満足させる上に、他の利点も提供する。かつて、本発明者は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストとＣＤ４０アゴニストの組合せを含んでなる新規の相乗的なアジュバントについて報告したことがある。これらのアゴニストは、組合せにおいて、細胞性免疫に対して相乗的な効果を誘発する。これらの相乗的なアジュバントとその予防及び治療上の応用については、ＵＳ公開特許出願ＵＳ２００４０１４１９５０（２００４年７月２２日公開）に開示され、その特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、別の相乗的なアジュバント組合せの発見と、治療的又は予防的に免疫を強化する組合せとしてのその使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は、（ｉ）少なくとも１つのＮＫＴアクチベータ、例えば、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）又はｉＧｂ３；及び（ｉｉ）ＣＤ４０アゴニスト抗体又はその断片、又はモノマー又はマルチマー（トリマー）ＣＤ４０Ｌタンパク質のようなＣＤ４０Ｌポリペプチド、ＣＤ４０Ｌタンパク断片、又はＣＤ４０Ｌを含有するコンジュゲートといった、少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト；及び（ｉｉｉ）任意選択的に、それに対する細胞性免疫応答が望ましくは誘発される抗原の組合せを含んでなる、相乗的な免疫アジュバントに関する。さらに本発明は、そのような組合せの免疫アジュバントとして、そしてＴ細胞免疫が望ましくは増強される状態を治療することへの使用に関する。
【００１５】
以下に詳しく記載するように、これらの免疫組合せは、そのような治療の必要な宿主へ：
（ｉ）ＣＤ４０アゴニスト又はＮＫＴアクチベータだけの投与に比べて、より高い頻度の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発すること；
（ｉｉ）ＣＤ４０アゴニスト又はＮＫＴアクチベータだけの投与に比べて、より多い量の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発すること；及び
（ｉｉｉ）ＣＤ４０アゴニスト又はＮＫＴアクチベータだけの投与に比べて、腫瘍免疫を増強することの手段として投与してよい。
【００１６】
さらに抗原が含まれてもよい上記の免疫アジュバント組合せは、上記に特定した細胞性免疫応答の増強が療法上望まれるあらゆる疾患又は状態、具体的には、感染症、癌のような増殖性障害、アレルギー、自己免疫障害、炎症障害、及び、細胞性免疫の増強が所望される治療アウトカムである他の慢性疾患を治療するのに使用してよい。本発明の好ましい応用には、具体的には、癌のような慢性疾患の治療が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、抗ＣＤ４０及びα−ＧａｌＣｅｒの組合せ投与の効果と、そのような投与が抗原特異的なＴ細胞の in vivo 増大を相乗的に増強することを示す実験を含有する。
【図２】図２は、組み合わせた抗ＣＤ４０及びα−ＧａｌＣｅｒでの免疫化の結果としての免疫応答を定量する実験を含有する。
【図３】図３は、ＣＤ４０／ＴＬＲ＊予防接種が全身性メラノーマにおいて治療的に介入することを示す、メラノーマ細胞で免疫化したマウスでの実験を含有する。
【図４】図４は、抗ＣＤ４０及びα−ＧａｌＣｅｒの投与がＤＣ上でのＣＤ７０発現を in vivo で誘導することを示す実験を含有する（この実験では、マウスに以下の組合せを注射した：２μｇ  α−ＧａｌＣｅｒ、５０μｇポリＩＣ、及び／又は５０μｇ抗ＣＤ４０（ｉ．ｐ．）。注射後１８〜２０時間で脾臓を採取した）。
【図５】図５は、α−ＧａｌＣｅｒ／ＣＤ４０免疫化が、ＳＴＡＴ４、ＩＦＮγ、及びＩＦＮａｂ非依存性であるがＳＴＡＴ１及びＴ−ｂｅｔ依存性である、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することを示す実験を含有する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、相乗的に有効な量の（ｉ）α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）又は別のＮＫＴ細胞活性化剤のような、少なくとも１つのナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）活性化剤；（ｉｉ）少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、及び（ｉｉｉ）任意選択的に、少なくとも１つの抗原を含んでなる、相乗的な免疫アジュバント組合せの使用に関する。これらのアジュバントは、（ｉ）抗原特異的なエフェクタＣＤ８Ｔ細胞を増大させる、及び／又は（ｉｉ）免疫応答を増強するために使用してよい。それに基づいて、これらの相乗的なアジュバントは、細胞性免疫の増強が所望される、癌や他の増殖性障害、ウイルス及び他の感染症、自己免疫、炎症性疾患、及びアレルギー障害のような状態を有する被検者を治療するために、予防的及び治療的に使用することができる。特に、本主題の相乗的なアジュバントは、ワクチンアジュバントとして使用してよい。故に、このようなワクチンアジュバントの基本成分は、ＮＫＴ細胞アクチベータ、ＣＤ４０アゴニスト、及び、保証されるならば、腫瘍又は感染症の抗原の追加であろう。このような発明は、癌又は感染症のように、免疫応答を増強すること、又は自己免疫におけるように免疫応答を改善することが望まれるいかなる状況でも有用であろう。
【００１９】
より具体的には、本発明は、ＮＫＴアクチベータ、例えば、α−ガラクトシルセラミド（α−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）又はｉＧｂ３と、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＤ４０Ｌタンパク質、又はその断片又は誘導体又はマルチマー、又はＣＤ４０、好ましくはヒトＣＤ４０へ結合するアゴニスト抗体又は抗体断片）、及び任意選択的に抗原を含んでなる新規の相乗的なアゴニスト組合せを提供する。これらのアジュバント組合せは、宿主、好ましくはヒトへ投与されるとき、増強された抗原特異的な細胞性免疫応答を産生するために使用してよい。
【００２０】
好ましい態様において、ＮＫＴアクチベータは、α−ガラクトシルセラミド（α−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）、イソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉＧｂ３）、又は、例えば、ＣＤ１ｄ抗原提示分子によって提示される他の糖脂質のような、ＮＫＴを刺激することができる他のあらゆる分子である。
【００２１】
また、本発明は、前記相乗的なアジュバント組合せ、それを含有する担体を抗原特異的な免疫応答が望ましくは誘導される宿主、例えば、癌又は感染又はアレルギー障害のような慢性疾患を有する人へ使用する方法、及び前記組成物を産生する方法を提供する。
【００２２】
なおさらに、本発明は、増強された抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するための宿主への投与に適している前記新規の相乗的なＮＫＴアクチベータ／ＣＤ４０アゴニスト組合せを含んでなる組成物を提供する。
【００２３】
特に、本発明は、前記新規の相乗的なアジュバント組合せをそのような治療の必要な宿主へ投与して増強された抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発することを含んでなる、免疫療法の新規な方法を提供する。好ましい態様において、これらの組成物及びコンジュゲートは、癌、感染症、特に慢性感染症（例えば、ウイルス、細菌、又は寄生虫が関与するもの）；又は自己免疫、炎症性、又はアレルギー状態を有しているか又はそれらを発症するリスク状態にある被検者へ投与される。特に、好ましい態様において、本発明は、メラノーマに対する抗原特異的な細胞性免疫応答を誘発するために使用してよい。
【００２４】
このように、本発明は、癌や自己免疫疾患、アレルギー障害、及び炎症性疾患のような他の増殖性疾患、並びに、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫が関与する慢性感染症に対する強力なワクチンの開発を提供し、ここで有効な治療には、組み合わせたＮＫＴアクチベータ／ＣＤ４０アゴニスト免疫化により産生することが可能である細胞性免疫の量と質が求められる。
【００２５】
本発明の応用
本発明は、少なくとも１つのＮＫＴアクチベータ、少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、及び任意選択的に抗原を含んでなる、新規のアジュバント組合せを提供する。本発明には、主題のＮＫＴアクチベータ及びＣＤ４０アゴニストと組み合わせた、それに対する増強された細胞性免疫応答が治療的に望まれる、あらゆる抗原の使用が含まれる。いくつかの態様において、抗原は、ＮＫＴアクチベータと別に投与してよく、あるいは、宿主は、抗原に自然に曝露されていてもよい。いくつかの態様では、３つの部分、即ち、抗ＣＤ４０抗体のようなＣＤ４０アゴニスト、ＮＫＴアクチベータ、及び抗原のすべてを同時に投与してよい。追加的に、いくつかの態様では、３つの部分、即ち、抗ＣＤ４０抗体のようなＣＤ４０アゴニスト、ＮＫＴアクチベータ、及び抗原のすべてを別個の独立した実体として同時投与してよい。好ましくは、所望の相乗的な増強を細胞性免疫において達成するために、これら部分のすべてを実質的に同時に投与する。これらの部分は、いずれの順序で投与してもよい。
【００２６】
例示の抗原には、限定されないが、細菌、ウイルス、寄生虫の抗原、アレルゲン、自己抗原、及び腫瘍関連抗原が含まれる。特に、抗原には、タンパク抗原、ペプチド、不活性化生物全体、等を含めることができる。
【００２７】
本発明に使用し得る抗原の具体例には、Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤ型肝炎、インフルエンザウイルス、リステリア、ボツリヌス菌、結核、野兎病、大痘瘡（天然痘）、ウイルス性出血熱、ペスト菌（ペスト）、ＨＩＶ、ヘルペス、乳頭腫ウイルス由来の抗原と、感染作用体と関連した他の抗原が含まれる。他の抗原には、腫瘍細胞に関連した抗原、自己免疫状態、アレルギー、及び喘息に関連した抗原が含まれる。本主題のアゴニスト組合せ、フラジェリン及び抗ＣＤ４０抗体と併用したそのような抗原の投与は、そのような疾患状態に対する免疫を付与するための治療用又は予防用ワクチンに使用することができる。
【００２８】
いくつかの態様において、本方法及び組成物は、感染作用体からの抗原を含めることによって、感染症を有するリスク状態にあるか又は感染症を有する個体を治療するために使用することができる。感染症は、外来生物又は宿主の内部で生殖する作用体の宿主中での存在に起因する疾患又は状態を意味する。感染症を有するリスク状態にある被検者は、感染症を発症する素因がある被検者である。そのような個体には、例えば、感染性の生物又は作用体への曝露が知られているか又は疑われる被検者を含めることができる。感染症を有するリスク状態にある被検者には、感染性の作用体又は生物への免疫応答を開始する能力が損なわれたことに関連する状態の被検者、例えば、先天性又は獲得性免疫不全の被検者、放射線又は化学療法を受けている被検者、熱傷のある被検者、外傷性損傷のある被検者、手術、又は他の侵襲性の医科又は歯科手技を受けている被検者、又は、類似の免疫不全状態の個体も含めてよい。
【００２９】
本発明のワクチン組成物で治療又は予防し得る感染症には、細菌、ウイルス、真菌、及び寄生虫の感染症が含まれる。他のさほど一般的ではない種類の感染症には、リケッチア、マイコプラズマ、及びスクラピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、及びプリオン病（例えば、クールー病及びクロイツフェルト−ヤコブ病）を引き起こす作用体も含まれる。ヒトに感染する細菌、ウイルス、真菌、及び寄生虫の例は、よく知られている。感染症は、急性、亜急性、慢性、又は潜在性であってよく、そしてそれは、局在性又は全身性であってよい。さらに、感染は、主に細胞内であり得るか、又は感染性生物体の宿主中の生活環の少なくとも１つの相の間は細胞外であり得る。
【００３０】
本主題のワクチン及び方法をそれに対して使用し得る細菌感染症には、グラム陰性菌とグラム陽性菌がともに含まれる。グラム陽性菌の例には、限定されないが、パスツレラ種、ブドウ球菌種、及び連鎖球菌種が含まれる。グラム陰性菌の例には、限定されないが、大腸菌、シュードモナス種、及びサルモネラ種が含まれる。感染菌の具体例には、限定されないが、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・バーグドフェリ、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリウム種（例えば、結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイ、マイコバクテリウム・ゴルドネ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、化膿性連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス群）、糞便連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボービス、連鎖球菌（アネロビウス種）、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム種、エリジペロトリックス・リュージオパチエ、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、破傷風菌、エンテロバクター・エロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルトシダ、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム、ストレプトバチルス・モリニホルミス、トレポネーマ・パリダム、トレポネーマ・ペルテヌエ、レプトスピラ、リケッチア、及びアクチノミセス・イスラエリイが含まれる。
【００３１】
ヒトにおいて感染症を引き起こすウイルスの例には、限定されないが、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−Ｉ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）、ＨＩＶ−ＩＩ、ＬＡＣ又はＩＤＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ又はＨＩＶ−ＩＩＩのようなヒト免疫不全ウイルスとＨＩＶ−ＬＰのような他の分離株）、ピコナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、リノウイルス、エコーウイルス）、カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を誘発する株）、トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、ブンヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス）、アレナウイルス科（出血熱ウイルス）、レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス）、ビマウイルス科、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（パルボウイルス）、パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（アデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ及びＩＩ、帯状疱疹ウイルス、ポックスウイルス）、及びイリドウイルス科（例えば、アフリカブタ発熱性ウイルス）、及び未分類ウイルス（例えば、海綿様脳症の起因体、デルタ型肝炎の病原体、非Ａ非Ｂ型肝炎（腸伝播されるクラス１；Ｃ型肝炎のように非経口伝播されるクラス２）の病原体；ノルウォークウイルスと関連ウイルス、及びアストロウイルスが含まれる。
【００３２】
真菌の例には、アスペルギルス種、コクシジオイデス・イミジス、クリプトコックス・ネオホルマンス、カンジダ・アルビカンスと他のカンジダ種、ブラストミセス・デルマチチジス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、クラミジア・トラコマティス、ノカルジア種、及びニューモシスティス・カリニが含まれる。
【００３３】
寄生虫には、限定されないが、バベシア・ミクロティ、バベシア・ダイバージェンス、エントメーバ・ヒストリチカ（Entomoeba histolytica）、ランブル鞭毛虫、熱帯リーシュマニア、リーシュマニア種、ブラジルリーシュマニア、リーシュマニアドノバニ、熱帯熱マラリア、四日熱マラリア、卵型マラリア、三日熱マラリア、ゴンディ・トキソプラズマ、ガンビア・トリパノソーマ、及びトリパノソーマ・ローデシェンセ（アフリカ眠り病）、クルーズ・トリパノソーマ（シャーガス病）、及びゴンディ・トキソプラズマ、扁形動物、及び回虫のような、血行性及び／又は組織寄生虫が含まれる。
【００３４】
述べたように、本発明には、癌のような増殖性疾患を治療することにおける、そして好ましい態様では、メラノーマを治療することにおける、本主題のコンジュゲートの使用がさらに含まれる。癌は、身体の臓器及び系の正常な機能に干渉する、細胞の非制御増殖の状態である。癌を有する被検者は、その被検者の身体に存在する客観的に測定可能な癌細胞を有する被検者である。癌を発症するリスク状態にある被検者は、例えば、家族歴、遺伝素因、放射線又は他の発癌剤への被検者曝露に基づいて、癌を発症する素因のある被検者である。その元の部位より遊走して生きた臓器へ播種する癌は、最終的には、罹患した臓器の機能悪化を介して被検者の死をもたらし得る。白血病のような造血系の癌は、被検者の正常な造血コンパートメントを打ち負かして、それにより造血系の破綻をもたらし（貧血、血小板減少症、及び好中球減少症の形態で）、最終的には死を引き起こすことができる。
【００３５】
転移は、原発腫瘍から身体の他の部分への癌細胞の播種より生じる、原発腫瘍部位とは異なる、癌細胞の領域である。原発腫瘍量の診断時には、被検者について、転移の存在をモニタリングする場合がある。転移は、しばしば、特定症状のモニタリングに加えて、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、スキャン、血球及び血小板カウント、肝機能試験、胸部Ｘ線撮影、及び骨スキャンの単独又は組合せの使用により検出される。
【００３６】
本発明に従って含有するアジュバント組合せ及び組成物は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又はＤＮＡコード化の包含によって、多様な癌又は癌を発症するリスク状態の被検者を治療するために使用することができる。これは、腫瘍細胞において発現される抗原である。そのような癌の例には、乳癌、前立腺癌、結腸癌、白血病、慢性リンパ球性白血病のような血液癌、等が含まれる。本発明の予防接種方法を使用して、腫瘍の増殖を阻害するか又は遅延させること、又は腫瘍の大きさを減少させることによって、腫瘍を治療するための免疫応答を刺激することができる。腫瘍関連抗原も、腫瘍細胞において専ら発現される抗原であり得るが、腫瘍細胞に限られるわけではない。
【００３７】
追加の癌には、限定されないが、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系（ＣＮＳ）の癌、頚部癌、絨毛癌、結直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頚部癌、胃癌、上皮内新生物、腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌（小細胞、大細胞）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるリンパ腫；神経芽腫；口腔癌（例えば、唇、舌、口、及び咽頭の癌）；卵巣癌；膵臓癌；網膜芽腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；肉腫；皮膚癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌；泌尿器系の癌；並びに、他の癌腫及び肉腫が含まれる。
【００３８】
本発明に従って含有するアジュバント組合せ及び組成物はまた、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬、又は他の自己免疫障害のような自己免疫疾患を治療するために使用することができる。本発明のワクチン及び免疫アジュバントで潜在的に治療し得る他の自己免疫疾患には、クローン病と潰瘍性大腸炎のような他の炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、自己免疫脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、グレイブス病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症、混合結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、三日月形糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、乾癬性関節炎、インスリン抵抗性、自己免疫糖尿病（１型糖尿病；インスリン依存性糖尿病）、自己免疫肝炎、自己免疫血友病、自己免疫リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫肝炎、自己免疫血友病、自己免疫リンパ増殖症候群、自己免疫ぶどう膜網膜炎、及びギラン・バレー症候群が含まれる。最近、動脈硬化症とアルツハイマー病は、自己免疫疾患として認識されてきた。このように、本発明のこの態様では、抗原は、組織破壊や正常組織の傷害に貢献する望ましくない免疫応答をそれに対して宿主が誘発する、自己抗原であろう。
【００３９】
本発明に従って含有するアジュバント組合せ及び組成物はまた、喘息とアレルギー性及び炎症性疾患を治療するために使用することができる。喘息は、気道の炎症及び狭窄と吸入抗原に対する気道の増加反応性を特徴とする呼吸器系の障害である。喘息には、必ずではないが頻繁に、アトピー又はアレルギー症状が伴う。アレルギーは、ある物質（アレルゲン）に対して獲得される過敏症である。アレルギー状態には、湿疹、アレルギー性鼻炎又はコリーザ、枯草熱、気管支喘息、蕁麻疹、及び食物アレルギーと他のアトピー状態が含まれる。アレルゲンは、感受性のある被検者においてアレルギー又は喘息性の応答を誘発し得る物質である。花粉、昆虫毒、動物鱗屑、埃、カビ胞子、及び薬物を含めて、多数のアレルゲンがある。
【００４０】
天然及び植物アレルゲンの例には、以下の属に特有なタンパク質が含まれる：イヌ、ヒョウヒダニ、ネコ、ブタクサ、ロチウム（Lotium）、スギ、アルテルナリア、ハンノキ、Alinus、カバノキ、コナラ、オリーブ、ヨモギ、オオバコ、ヒカゲミズ、ブラテラ、ミツバチ、イトスギ、ビャクシン、ツヤ、ヒノキ、ゴキブリ（Periplanet）、アゴピロン（Agopyron）、ライムギ、コムギ、カモガヤ、ウシノケグサ、イチゴツナギ、カラスムギ、シラゲガヤ、ハルガヤ、オオカニツリ、ヌカボ、アワガエリ、クサヨシ、ススメノヒエ、モロコシ、及びブロミス（Bromis）。
【００４１】
本発明に従って含有するアジュバント組合せ及び組成物は、特定の状態、例えば、感染症、癌、又は自己免疫状態を治療するための他の療法と組み合わせることができると理解される。例えば、癌の場合、本発明の方法は、化学療法又は放射線療法と組み合わせてよい。
【００４２】
ワクチンとしての組成物を作製する方法は、当業者によく知られている。ＮＫＴアクチベータ、ＣＤ４０アゴニスト、及び任意選択的な抗原の有効量は、経験的に決定することができるが、動物モデルにおいて免疫学的に有効な量に基づくことができる。考慮すべき因子には、抗原性、製剤、投与の経路、投与すべき免疫用量の回数、個体の身体状態、体重、及び年齢、等が含まれる。そのような因子は、当業者によりよく知られていて、当業者が決定することができる（例えば、Paoletti and McInnes 編「Vaccines, from Concept to Clinic: A Guide to the Development and Clinical Testing of Vaccines for Human Use（ワクチン、概念から臨床へ：ヒト使用ワクチンの開発及び臨床試験の手引き）」ＣＲＣプレス（1999）を参照のこと）。本明細書に開示するように、主題のＤＮＡ又はタンパク質コンジュゲートは、単独で、又は他のアジュバントと併用して投与することができると理解される。
【００４３】
本発明のアジュバントは、限定されないが、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、鼻腔内、経口、又は他の粘膜の経路が含まれる、当該技術分野で知られたいずれの方法によっても、局所的又は全身的に投与することができる。追加の経路には、頭蓋内（例えば、槽内、又は脳室内）、眼窩内、眼、嚢内、髄腔内、及び局所の投与が含まれる。本発明のアジュバント及びワクチン組成物は、好適な無毒の医薬担体において投与し得るか、又はマイクロカプセル剤又は持続放出インプラントにおいて製剤化することができる。本発明の免疫原性組成物は、所望されるならば、所望の細胞性免疫応答を持続させるために、複数回投与することができる。適正な経路、製剤、及び免疫化スケジュールは、当業者によって決定され得る。
【００４４】
本発明の方法において、いくつかの例では、抗原とＮＫＴアクチベータ／ＣＤ４０アゴニストコンジュゲートを別々に投与しても、同じ製剤に組み合わせてもよい。いくつかの例では、数種の抗原を含めることが有益であり得る。細胞性免疫の所望される相乗的な増強を達成するために、これらの組成物は、別々に、又は組み合わせて、いずれの順序で投与してもよい。典型的には、これらの組成物は、互いに短い時間の間で、即ち、互いに約数時間以内に、より好ましくは、約半時間以内に投与する。いくつかの態様において、それらは、互いに約２４〜４８時間以内に同時投与してよい。
【００４５】
いくつかの事例では、アフィニティー精製を促進する部分をアジュバントに含めることが有益であるかもしれない。そのような部分には、アジュバント組合せの機能に干渉しない、比較的小さな分子が含まれる。あるいは、タグは、切断により除去可能であってよい。そのようなタグの例には、ポリヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、マルターゼ結合タンパク質、レクチン、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ、アビジン、等が含まれる。他の好適なアフィニティータグには、ＦＬＡＧ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｙｃ、等が含まれる。
【００４６】
本主題のアジュバント組合せは、生理食塩水のような生理学的に許容される担体とともに投与することができる。本組成物には、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、及び重炭酸塩のような緩衝剤、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、血清アルブミンのようなタンパク質、エチレンジアミン四酢酸、塩化ナトリウム又は他の塩、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、等のような別の担体又は賦形剤も含めてよい。本発明のアジュバントは、対応する投与経路に従って、様々なやり方で製剤化することができる。例えば、摂取又は注射用に液体製剤を作製することができて、ゲル剤又は種々の製剤（procedures）を摂取、吸入、又は局所適用のために作製することができる。そのような製剤を作製するための方法はよく知られていて、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences（レミントン製薬科学）」第１８版、マック・パブリッシング・カンパニー、ペンシルヴェニア州イーストンに見出すことができる。
【００４７】
本発明には、ＤＮＡベースのワクチンも含まれる。所望の抗原及び／又はＣＤ４０アジュバントをコード化し得るこれらのＤＮＡは、裸のＤＮＡとして投与しても、発現ベクターに含まれてもよい。さらに、本主題の核酸配列は、移植片の移植に先立って移植片の細胞へ導入してよい。このＤＮＡは、好ましくは、ヒト被検者における発現を促進するためにヒト化されるものである。
【００４８】
本主題のアジュバント組合せには、「マーカー」又は「レポーター」がさらに含まれてよい。マーカー又はレポーター分子の例には、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ｌａｃＺ、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、等が含まれる。
【００４９】
本主題のアジュバント又は抗原の発現を促進するために使用し得る原核及び真核細胞には、例えば、微生物、植物、及び動物の細胞（例、大腸菌、枯草菌、等のような原核生物、Ｓｆ２１細胞のような昆虫細胞、サッカロミセス、カンジダ、クリヴェロミセス、シゾサッカロミセス、及びピキアのような酵母細胞、並びに、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨｅＬａ、等のような哺乳動物細胞）が含まれる。当業者は、所望の細胞又は生物に適した発現ベクター、プロモーター、選択可能マーカー、等が含まれる、特別な発現系に適した成分を容易に選択することができる。様々な発現系の選択及び使用については、例えば、Ausubel et al．「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の現行プロトコール）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（1993）；及び、Pouwels et al．「Cloning Vectors: A Laboratory Manual（クローニングベクター：実験マニュアル）」：1985 補遺（1987）に見出すことができる。また提供されるのは、本主題のＤＮＡ構築体を含有して発現する真核細胞である。
【００５０】
細胞移植の場合、細胞は、移植手順によって投与しても、血管壁を介したカテーテル媒介注射手技で投与してもよい。いくつかの事例において、細胞は、血管への放出により投与してよく、そこから細胞は、引き続き、血流によって分布する、及び／又は周囲組織へ遊走する。
【００５１】
本発明に有用な「ＮＫＴアクチベータ又はアゴニスト」には、当該技術分野で一般的に知られている、ＮＫＴ細胞のすべてのアクチベータ又はアゴニストが含まれる。ＮＫＴアクチベータ又はアゴニストの例には、例えば、ＵＳ２００６０２１１８５６とＵＳ２００６００５２３１６（このいずれの公開特許出願も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される、セラミドと他の糖脂質化合物が含まれる。例えば、これには、引用特許においてＮＫＴアクチベータとして開示されて当該技術分野で知られている、α−ガラクトシルセラミド、α−グルコシルセラミド、ホスファチジルイノシトール及びグリコシルホスファチジルイノシトール、並びに、他の様々な糖脂質化合物及び誘導体が含まれる。Parekh et al., Crit. Rev. Immunol. 25(3): 183-213 (2005); 及び、Parekh et al., J Immunol. 173(l): 3693-706 (2006) も参照のこと。この参考文献のいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
述べたように、本発明に有用な「ＣＤ４０アゴニスト」は、好ましくは、ＣＤ４０へ特異的に結合するアゴニスト抗ＣＤ４０抗体又はその断片、好ましくはマウス又はヒトのＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌタンパク質、誘導体、三量体ＣＤ４０Ｌコンジュゲートのような多量体を含む。本明細書に使用するように、用語「抗体」は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにその抗原結合断片が含まれる、その最も広い意味で使用される。これには、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖ断片が含まれる。
【００５３】
さらに、用語「抗体」には、天然抗体だけでなく、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体、及びヒト化抗体のような、非天然に存在する抗体が含まれる。本発明での使用に好ましいのは、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒト抗体である。キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、単鎖、及び二機能性の抗体の合成の方法は、当業者によく知られている。さらに、ＣＤ４０に特異的な抗体は広く知られていて入手可能であり、好適な宿主をＣＤ４０抗原、好ましくはヒトＣＤ４０で免疫化することによって作製することができる。
【００５４】
本発明の様々な態様の活性に実質的には影響を及ぼさない修飾も、本明細書に提供する本発明の定義内で提供されると理解される。
【実施例】
【００５５】
抗原特異的なＣＤ８応答を誘導することにおける、ＣＤ４０アゴニストのα−ＧａｌＣｅｒとのシナジー
以下の実験は、ＴＬＲアゴニストでかつて観測されたことに類似して、溶解機能のあるＣＤ８細胞を増大させることにおいて、ＮＫＴα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）が抗ＣＤ４０抗体とともにシナジーを与えることを明らかにする。ＣＤ４０アゴニストとα−ＧａｌＣｅｒの組合せ投与は、高レベルの細胞媒介性免疫を誘導した。
【００５６】
実施例１：
抗ＣＤ４０とα−ＧａｌＣｅｒの組合せ投与は、抗原特異的Ｔ細胞の in vivo での増大を相乗的に増強する。
【００５７】
本実施例は、図１に含まれる実験に関する。ここでは、５００μｇオバルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、１００μｇ抗ＣＤ４０、１００μｇ  Ｓ−２７６０９（ＴＬＲ７アゴニスト）、４μｇ  α−ＧａｌＣｅｒ（ｉ．ｖ．）を図に注記の組合せでマウスに投与した。５日後、先に記載のように、Ｓｉｉｎｆｅｋｌパルス標的を用いた標準ＣＴＬアッセイを実施した。注記した試薬の投与後６日目に、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、in vitro での再刺激後にＩＦＮγを産生する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数と同様に、先に記載のようにテトラマー染色によって定量した。
【００５８】
図１の結果は、驚くべきことに、ＣＤ４０アゴニスト（抗ＣＤ４０）とＴＬＲアゴニスト（Ｓ−２７６０９）、又は抗ＣＤ４０とα−ＧａｌＣｅｒと組み合わせた新抗原（ＯＶＡ）の投与が高レベルのＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＶＡ−Ｈ−２ｂテトラマーを使用するテトラマー染色によって定量される）とＩＦＮ−αを産生するＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のリコール（recall）応答を誘発することを実証する。
【００５９】
実施例２：
組み合わせた抗ＣＤ４０及びα−ＧａｌＣｅｒでの免疫化の結果としての免疫応答を定量すること（図１のデータに基づく）と、保護性抗腫瘍免疫を誘導することにおけるＣＤ４０アゴニストのα−ＧａｌＣｅｒとのシナジーの実証
抗ＣＤ４０／α−ＧａｌＣｅｒ／ＯＶＡ又は抗ＣＤ４０／６０９／ＯＶＡの投与は、この薬剤だけの単独療法としての使用に比較して、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数を増強するのにずっとより有効であるので、組合せ療法について、メラノーマのマウスモデルにおいて治療性免疫を誘導するのに有効な手段として試験した。抗ＣＤ４０及びＴＬＲ＊又はα−ＧａｌＣｅｒを使用する初期試験は、ペプチド又はタンパク質全体と一緒にこのアクチベータの組合せを投与すると、きわめて高い（ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち５％より高いテトラマー＋Ｔ細胞）頻度の抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が誘発されることを明示した。次いで、我々は、高頻度の「自己反応性又は腫瘍反応性」Ｔ細胞が同系腫瘍に対して保護するように誘発され得るかどうかを探究することにした。チロシナーゼ関連タンパク質−２（ＴＲＰ−２）は、メラニン合成に関与するタンパク質であり、メラノーマ関連抗原として免疫療法に使用されてきた。ＴＲＰ−２は、正常メラニン細胞とメラノーマにおいて発現されて、ＣＴＬにより認識されるヒト腫瘍抗原として同定されて、引き続き、Ｂ１６メラノーマの腫瘍拒絶抗原として同定された。ＣＤ８＋Ｔ細胞ペプチドエピトープは、ヒトとマウスの両方で記載されている。このＣＤ４０／ＴＬＲプラットフォームを使用して、抗自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導され得るかどうかを検証するために、Ｂ１６メラノーマを（４日前に）与えたマウスを、５０μｇのＴＲＰ−２（ΔＶペプチド；ＴＲＰ−２（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ））の複素環バージョン、抗ＣＤ４０及びＴＬＲ７＊、又は抗ＣＤ４０及びα−ＧａｌＣｅｒ（並びに、それぞれの単独療法）で腹腔内に免疫化した。
【００６０】
図２の結果は、腫瘍の投与後２１日での肺転移の数によって判定されるように、抗ＣＤ４０／ＴＬＲ／ΔＶ又は抗ＣＤ４０／α−ＧａｌＣｅｒ／ΔＶの組合せ使用によって、最も有効な治療的保護がもたらされたことを示す。α−ＧａｌＣｅｒとΔＶでは、いくらかの予防的保護がもたらされる。しかしながら、他の療法での我々の経験に基づけば、抗ＣＤ４０／α−ＧａｌＣｅｒ／ΔＶの使用は、α−ＧａｌＣｅｒ／ΔＶ療法を受けるマウスに比較して、これらマウスの増強された生存をもたらすものである。
【００６１】
この in vivo 殺傷アッセイはまた、組合せ療法（ＯＶＡ／抗ＣＤ４０／α−ＧａｌＣｅｒ）が試験したいずれの単独療法（抗ＣＤ４０／ＯＶＡ又はα−ＧａｌＣｅｒ／ＯＶＡ又はＴＬＲ／ＯＶＡ）よりも有効であることを示唆する（図２参照）。
【００６２】
実施例３：
ＣＤ４０／ＴＬＲ＊予防接種は、全身性メラノーマに治療的に介入する。
【００６３】
本実施例は、図３に含まれる実験に関する。図３に含まれるこの実験では、Ｂ６マウス（４匹／群）を１００Ｋ  Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞の静脈内注射後４日目に免疫化した。特に、注記する薬剤：抗ＣＤ４０（１００μｇ／マウス、腹腔内）、Ｓ２７６０９（ＴＬＲ７＊，１００μｇ）、ΔＶ−ペプチド（１００μｇ）、又はα−ＧａｌＣｅｒ（４μｇ，静脈内）の組合せでマウスを免疫化した。腫瘍の投与後２０日目に（４日目介入スキームを使用して）肺を取り出して（代表的な写真；図３上を参照のこと）、肺転移の数を目視計数によって定量した（図３の下パネルを参照のこと）。
【００６４】
実施例４：
抗ＣＤ４０抗体とα−ＧａｌＣｅｒは、ＤＣ上でのＣＤ７０発現を in vivo で誘導する。
【００６５】
図４に含まれる実験では、マウスに以下の組合せを注射した：２μｇ  α−ＧａｌＣｅｒ、５０μｇポリＩＣ、及び／又は５０μｇ抗ＣＤ４０（腹腔内）。その後、注射後１８〜２０時間で脾臓を取り出した。脾臓をコラゲナーゼ消化し、ＣＤ１１ｃ＋について染色して、ＣＤ８＋及びＣＤ８−（ＣＤ１１ｂ＋）ＤＣによって分析した。
【００６６】
この図の結果は、意外にも、ＣＤ４０アゴニスト及びα−ＧａｌＣｅｒの組合せを投与したマウスより入手される樹状細胞上でのみ、ＣＤ７０の発現が誘導されることを明らかにする。
【００６７】
本発明者は、抗ＣＤ４０とＴＬＲアゴニストをともに組み合わせて投与するときにのみ、in vivo の樹状細胞の表面上でＣＤ７０発現の増加があることをかつて報告した。さらに、我々は、ＣＤ７０の発現が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の後続の増大に必須であることを示した。
【００６８】
全く予期しなかったが、本主題の新規な相乗的アジュバント組合せの投与では、同様の結果が観測される。特に、そしてＴＬＲ及びＣＤ４０アゴニストで見られたシナジーに類似して、抗ＣＤ４０及びα−ＧａｌＣｅｒの組合せ投与では、ＣＤ７０のＤＣ上でのアップレギュレーションも見られる。図４に示すように、ＣＤ７０のＣＤ８＋及びＣＤ８−，ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ上での有意に増加した発現が観測されるのは、抗ＣＤ４０及びＴＬＲアゴニスト（ポリＩＣ）又は抗ＣＤ４０及びα−ＧａｌＣｅｒを投与するときだけである。
【００６９】
実施例５：
α−ＧａｌＣｅｒ／ＣＤ４０免疫化は、ＳＴＡＴ４、ＩＦＮγ、及びＩＦＮａｂ非依存性であるがＳＴＡＴ１及びＴｂｅｔ依存性である、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する。
【００７０】
シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）タンパク質は、細胞増殖の多くの側面を調節する。ＳＴＡＴ１は、Ｉ型又はＩＩ型インターフェロンのいずれかによるシグナルにより遺伝子をアップレギュレートすることに関与している。ＩＦＮ−γ刺激への応答時に、ＳＴＡＴ１は、ＧＡＳ（インターフェロン−γ活性化配列）プロモーター要素へ結合する、ＳＴＡＴ３とのホモ二量体又はヘテロ二量体を形成し；ＩＦＮ−α又はＩＦＮ−βいずれかの刺激への応答時に、ＳＴＡＴ１は、ＩＳＲＥ（インターフェロン刺激応答要素）プロモーター要素へ結合し得る、ＳＴＡＴ２とのヘテロ二量体を形成する。細胞性免疫におけるＩＬ−１２の役割は、ＳＴＡＴ−４転写因子によって主に媒介される。ＳＴＡＴ−４は、ＩＬ−１２活性に必須である。Ｔ−ｂｅｔは、ＣＤ４（ＴＨ）リンパ球における細胞系譜の決定を調節する、転写因子のＴ−ボックスファミリーのメンバーである。これは、ＩＦＮ−γを活性化することによって一部なされる。Ｔ−ｂｅｔは、ＣＤ４及びＮＫ細胞におけるＩＦＮ産生の制御に必要とされるが、ＣＤ８細胞におけるそれには必要とされない。
【００７１】
図５に含まれる実験では、マウス（ｗｔＢ６又はｗｔＢ６／１２９Ｆ１及びＫＯ）を５０μｇ抗ＣＤ４０（ＦＧＫ４５）、２μｇ  α−ＧａｌＣｅｒ、及び２００μｇの全オバルブミンで静脈内免疫化した。７日後、このマウスを犠牲にして、先に記載のように（Sanchez et al. 2007 Journal of Immunology）、ＰＢＬと脾臓細胞を単離し、Ｋｂ／ｏｖａ  ＭＨＣテトラマーで染色して、ｏｖａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定した。示すドットプロットを完全に生きているＣＤ８＋Ｂ２２０−細胞上で制御（gated）して、テトラマー＋及び−細胞の表現型を表面マーカーのＫＬＲＧ１に関して示す。示す数字は、ＣＤ８＋Ｔ細胞全体のうちのテトラマー（＋）の百分率を表す。示すドットプロットは、ＰＢＬについてのものであるが、脾臓も同様の傾向を反映する。この実験は、α−ＧａｌＣｅｒ／ＣＤ４０免疫化が、ＳＴＡＴ４、ＩＦＮγ、及びＩＦＮａｂ非依存性であるがＳＴＡＴ１及びＴｂｅｔ依存性である、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することを示す。
【００７２】
結論
図１〜５の実験に含まれる結果に少なくとも基づけば、抗原とＮＫ−Ｔ細胞を誘導するアゴニスト（α−ＧａｌＣｅｒ）と一緒のＣＤ４０アゴニストの組合せ投与は、これらアゴニストのいずれか単独より高まった免疫を誘導する（免疫に対して相乗的な効果を誘発する）。ＣＤ４０アゴニスト及びα−ＧａｌＣｅｒの組合せは、抗原の有無でのあらゆるアゴニスト単独と比較するとき、より高い頻度の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、より多い数の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をもたらして、抗腫瘍免疫を増強する。
【００７３】
故に、ＣＤ４０アゴニストとα−ＧａｌＣｅｒのようなＮＫ−Ｔ細胞アクチベータとの組合せ使用は、腫瘍及び感染症への保護的な細胞媒介性免疫応答を誘発するのに強力なワクチン基盤として役立つことだろう。
【００７４】
本明細書に引用する雑誌、特許、及び他の出版物への様々な言及は、現在の到達水準を含み、完全に説明されるかのように、参照により組み込まれる。
【００７５】
本発明は、以下に続く特許請求項によってさらに明確にされる。
【図１】
2010525065.tif 000003
【図２】
2010525065.tif 000004
【図３】
2010525065.tif 000005
【図４】
2010525065.tif 000006
【図５】
2010525065.tif 000007
【国際調査報告】
2010525065.tif 000008