(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)細胞増殖用培地を用いて、培地のｐＨが０．１以上上昇するまで大腸菌細胞を回分式で培養する段階：
(ii)細胞培養培地のｐＨが上昇するとき一次注入培地を添加し大腸菌細胞をｐＨスタット流加式で培養する段階：及び
(iii)細胞培養培地の６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ600）が１２０〜１８０に上昇するときから二次注入培地を添加し大腸菌細胞を流加式で培養する段階であって、培養中に培地のｐＨが二次注入培地の注入率及び撹拌速度を減少させることによって上昇する、段階を含み、
ステップ(iii)の間、組換えタンパク質の発現を誘導し、組換えタンパク質の発現は、細胞培養培地のＯＤ600が１５０以上となった時にのみステップ(iii)においてのみ誘導される、大腸菌細胞の培養方法。
【請求項２】
前記大腸菌は、組換えタンパク質を発現する形質変換された菌株である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形質転換大腸菌株は、ＨＭ１１２０１（ＫＣＣＭ-１０６６０Ｐ）である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記大腸菌が、免疫グロブリンＦｃフラグメントの組換えタンパク質を発現する形質転換された菌株である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記形質転換大腸菌株は、Ｌａｃオペレーターが導入された発現ベクターを含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
イソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシド(Isopropylβ-Ｄ-1-thiogalactopyranoside、IPTG)を添加して組換えタンパク質の発現を誘導する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記イソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドの添加量は、０．１〜０．５ｍＭである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記イソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドは、培地の吸光度（ＯＤ600）が１５０以上を示す時だけ添加する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ii）は、一次注入培地の注入率は２００〜４００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜８００ｒｐｍである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記注入率及び攪拌速度は、段階的に増加させる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ii）は、一次注入培地の注入率及び攪拌速度を３ステップにかけて増加させることで行い、ここで、まず、一次注入培地の注入率は２００〜３００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜６００ｒｐｍで、それから、注入率は２５０〜３５０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は５００〜７００ｒｐｍで、最後に、注入率は３００〜４００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は６００〜８００ｒｐｍである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（iii）において、二次注入培地の注入率は２００〜４００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜８００ｒｐｍである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記注入率及び攪拌速度は、段階的に減少させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（iii）は、二次注入培地の注入率及び攪拌速度を３ステップにかけて減少させることで行い、ここで、まず、二次注入培地の注入率は３００〜４００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は６００〜８００ｒｐｍで、それから、注入率は２５０〜３５０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は５００〜７００ｒｐｍで、最後に、注入率は２００〜３００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜６００ｒｐｍである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
細胞増殖用培地は、トリプトン、酵母抽出物、ＮａＣｌ、ＫＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4を含む初代増殖培地に、クエン酸、ＦｅＣｌ2、Ｈ3ＢＯ3、ＭｎＣｌ2、ＣｕＣｌ2、Ｎａ2ＭｏＯ4、ＣｏＣｌ2、ＺｎＣｌ2、ＥＤＴＡを含むトレースメタル溶液（Trace metal solution）が添加された請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
一次注入培地は、２００〜４００ｇ/ｌの酵母抽出物及び７００〜８００ｇ/ｌのブドウ糖を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
二次注入培地は、２００〜４００ｇ/ｌの酵母抽出物及び５００〜７００ｇ/ｌのブドウ糖を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞培地の最終吸光度（ＯＤ600）が、２００以上示す請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌細胞の高濃度培養方法に関するものであり、より具体的に、本発明は細胞量と組換タンパク質の量を最大化するために、大腸菌細胞を増殖する段階と組換えタンパク質の発現を誘導する段階を含む、大腸菌細胞の増殖を最大化するための培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（E.coli）は、大腸菌の培養及び遺伝工学に利用可能であり、その増殖速度の速さと、発酵分野及び遺伝工学技術の進歩により、様々な有用タンパク質の大量生産のために、最も広く用いられている宿主細胞である。組換えタンパク質を高収率で生産するためには、形質転換大腸菌細胞を高濃度で培養することが必要である。その目的のために、複合培地(complex medium)、合成培地(synthetic medium)、半合成培地(semi-synthetic medium)などの様々なタイプの培地と、定速注入(constant-rate feeding)、注入率の階段的増加(stepwise increase)、指数的増加(exponential feeding)又は比増殖速度調節(specific growth rate control)、ｐＨスタット（pH-stat）と溶存酸素による調節(Do-stat control)、そして、ブドウ糖と酢酸濃度による調節などの様々な培地注入方法が開発され、高濃度の大腸菌細胞を得るために用いられた。しかし、実際には、それぞれの形質転換された菌株の培養には、特異的な方法と最適条件が存在する。従って、高収率でタンパク質を生産するためには、培地の注入と細胞の培養において最も最適な条件を選択することが重要である。
【０００３】
一般に、組換え大腸菌による組換えタンパク質の生産において、該当プロモーターと発現タンパク質の特徴が、細胞増殖率と単位細胞当たりの生産性に影響を与える。例えば、タンパク質の発現が強力なプロモーターによって調節されるシステムでは、組換えタンパク質の迅速な発現が、宿主細胞のエネルギー代謝のバランスを崩し、それによって、細胞増殖を阻害することがある。特に、発現タンパク質が宿主細胞に直接悪影響を与える場合は、宿主細胞の増殖は大いに阻害される。
【０００４】
これらの理由により、強力な誘導性プロモーターによるタンパク質の発現は、宿主細胞にかなりの負担になるため、その負担を最小化できるほど組換えタンパク質の大量生産はより容易に達成できる。上記条件を考慮した最適発現時期は、タンパク質の発現のために、同じタイプの発現ベクターや宿主細胞を用いる場合でも、発現タンパク質の特徴に依存して異なることがある。さらに、細胞増殖と発現率における発現時期の影響の重要性が異なることがある。また、細胞増殖率と細胞量はタンパク質の生産に影響を与える。細胞当たり同じ生産性を持つ場合は、多い量の細胞を使用することで、タンパク質の生産収率を増加させることができる。従って、最適培養条件を確立することが、組換え微生物から組換えタンパク質を生産し高濃度の細胞量を生産するために重要である。
【０００５】
形質転換大腸菌におけるタンパク質の発現は、増殖環境と関連した細胞内の様々な生理的/生態学的な要因（プラスミドコピーの数及び安定性、転写及び解読効率、発現タンパク質の溶解度、タンパク質分解、膜保全）などと密接に関係するので、生産収率と生産性を最大化するためには、最適培養条件を確立することが重要である。従って、組換えタンパク質を高収率で発現させるためには、イソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドのような適した誘導物質を添加する必要がある。また、タンパク質を生産するために適した組成の培地を高濃度の組換え大腸菌を培養するための培地に適切な方法に従い注入することが必要である。必要によって、組換えタンパク質の生産のために、培地の組成物とそれを注入する注入方法を変えなければならない（非特許文献１）。
【０００６】
大腸菌により組換えタンパク質を発現させる方法は、３つの代表的なタイプに分けることができる。１つ目は、大腸菌細胞の細胞質内で、可溶型として組換えタンパク質を発現させる方法である。２つ目は、シグナル配列を用いて大腸菌細胞のペリプラズムで、組換えタンパク質を発現させる方法である。３つ目は、封入体(inclusion body、IB)の形態として組換えタンパク質を発現させる方法であり、この方法は、高収率でタンパク質を発現させるために最も一般的に用いられている。
【０００７】
タンパク質を封入体の形態として発現させる場合には、大腸菌細胞を高濃度で培養する必要がある。具体的には、各細胞当たりのタンパク質の発現率が類似である場合、大腸菌細胞を高濃度で増殖するほど、高収率のタンパク質を得ることができる。そのため、大腸菌細胞を高濃度で増殖する方法を調べる研究が多くなされてきた。韓国特許第１０−０２３５３１５号公報では、ヒト成長ホルモンを過剰発現させるために、融合タンパク質（fusion protein）の使用を記述しているが、細胞量はリッタ当たりおよそ９０〜１００ｇであることが確認された（特許文献１）。さらに、２ステップ発酵条件における組換えタンパク質の生産工程においても、最終吸光度（ＯＤ600）が１５０を超えないことが観察された（非特許文献２）。同様に、salmosinのようなタンパク質を生産するための高濃度培養条件でも、リッター当たり只の６５．７０ｇの封入体しか得ることができなかった（非特許文献３）。さらに、IFNγを生産するための培養条件でも、細胞培養のリッター当たりわずか１００gの細胞量しか得ることができなかった（非特許文献４）。その結果、依然として大腸菌細胞におけるより高濃度の培養方法の開発は必要とされている。
【０００８】
これらの背景を基に、本発明者は、組換えタンパク質を高収率で生産する方法を開発しようと努力し、形質転換大腸菌細胞を培養する段階と組換えタンパク質の発現を誘導する段階を区別し異なるタイプの培地で宿主細胞を培養した場合、形質転換大腸菌による組換えタンパク質を大量に生産できることを見出し、発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許公告第１０−０２３５３１５号公報
【特許文献２】韓国特許公告第 ８２４５０５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bio Technol., 10: 1550-1556, 1992
【非特許文献２】Microb Cell Fact., 7; 7:26, 2008
【非特許文献３】J Microbiol Biotechnol., 21; (10): 1053-6, 2011
【非特許文献４】J Ind Microbiol Biotechnol., 31(2): 63-9, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明は、高濃度で大腸菌細胞を培養する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的を達成するための1つの実施様態として、本発明は、高濃度で大腸菌細胞を培養する方法を提供する。
【００１３】
具体的に、本発明は、(i)細胞増殖培地のｐＨが０．１以上まで上昇するまで大腸菌を回分培養式で培養する段階；(ii)細胞培養液のｐＨが上昇するとき、一次注入培地を添加し大腸菌細胞を流加培養式で培養する段階；及び(iii)細胞培養の吸光度（ＯＤ600）が１５０以上増加するとき、二次注入培地を添加し大腸菌細胞を流加培養式で培養する段階を含む、大腸菌細胞の培養方法を提供する。
【００１４】
本研究の目的のために、大腸菌は、組換えタンパク質を発現する形質転換された大腸菌でもよい。
【００１５】
本発明で用いられる用語「細胞増殖培地」とは、大腸菌細胞を増殖させるために用いる培地を意味する。本発明の目的のために、細胞増殖培地は、大腸菌に増殖環境を提供する初代培養培地と、ｐＨを調節し大腸菌の増殖を促進するトレースメタル溶液（trace metal solution）を含むことができるが、それらに限定されるものではない。初代培養培地のタイプは限定されるものではないが、トリプトン、酵母抽出物、ＮａＣｌ、ＫＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4を含むことが好ましい。そして、トレースメタル溶液は限定されるものではないが、好ましくは、クエン酸、ＦｅＣｌ2、Ｈ3ＢＯ3、ＭｎＣｌ2、ＣｕＣｌ2、Ｎａ2ＭｏＯ4、ＣｏＣｌ2、ＺｎＣｌ2、及びＥＤＴＡを含むことができる。さらに、細胞増殖培地は、好ましくは、２０ｇ/ｌのトリプトン、１０ｇ/ｌの酵母抽出物、１０ｇ/ｌのＮａＣｌ、２０７．５ｇ/ｌのＫＨ2ＰＯ4 、５０ｇ/ｌの(ＮＨ4)2ＨＰＯ4、２６８ｇ/ｌのクエン酸、２７０ｇ/ｌのＦｅＣｌ2、３０ｇ/ｌのＨ3ＢＯ3、１００ｇ/ｌのＭｎＣｌ2、１５ｇ/ｌのＣｕＣｌ2、２５ｇ/ｌのＮａ2ＭｏＯ4、２５ｇ/ｌのＣｏＣｌ2、２０ｇ/ｌのＺｎＣｌ2、０．５Ｍ ＥＤＴＡを含むことができる。必要によって、細胞増殖培地は当業者の選択によって追加成分を含むことができる。
【００１６】
本発明の方法は、ステップ（iii）を実行している間又は後に、組換えタンパク質の発現を誘導する段階をさらに含むことができる。好ましくは、大腸菌はステップ（iii）の実行と同時に組換えタンパク質の発現を誘導することができる。より好ましくは、タンパク質発現のための誘導物質を二次注入培地に添加することである。つまり、組換えタンパク質の発現は、イソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドの添加により誘導することができる。最も好ましくは、イソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドの濃度は、０．１〜０．５ｍＭになるように添加することである。イソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドは、細胞培養の吸光度（ＯＤ600）が１２０以上増加したときに添加することが好ましい。
【００１７】
他の実施例によると、免疫グロブリンＦｃフラグメントを発現させるための形質転換大腸菌株、ＨＭ１１２０１（ＫＣＣＭ-１０６６０Ｐ）は、組換えタンパク質の発現を誘導するために、ステップ（iii）でイソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドを含んでいる二次注入培地で培養した。
【００１８】
本発明で用いられる用語「形質転換大腸菌」とは、目的の組換えタンパク質を発現及び生産するために、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現ベクターの形又は染色体ＤＮＡに挿入される形で導入された大腸菌株を意味する。本研究の目的のために、大腸菌に導入されたポリヌクレオチドと発現ベクター、大腸菌から生産できる組換えタンパク質は、特に限定されるものではない。より容易な発現システムとして、Ｌａｃオペレーター(Lac operator)を含む発現ベクターを用いることができる。この場合は、イソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドを目的の組換えタンパク質の発現誘導物質として用いることができる。本発明の一つの実施例として、形質転換大腸菌は、免疫グロブリンＦｃフラグメントを発現できる大腸菌、ＨＭ１１２０１（ＫＣＣＭ-１０６６-Ｐ）を用いた（特許文献２）。
【００１９】
本発明で用いられる用語「回分培養」とは、初期供給原料及び栄養分を含む培養液で細胞を培養する培養工程を意味する。この培養方法は、栄養分を補充できないという短所があるが、培養条件の調節が不可能な培養と汚染しやすい培養の場合には、成功率が高いという長所がある。従って、回分培養は、主に開発段階や実験室レベルで主に用いられる。本発明の目的のために、回分培養は、形質転換大腸菌が実質的な増殖段階に突入し培地のｐＨが上昇する時点まで行う。すなわち、回分培養は、細胞培養のｐＨが初期培地のｐＨから０．１までに上昇する時点まで続ける。
【００２０】
本発明で用いられる用語「一次注入培地」とは、大腸菌の増殖を促進するために、回分培養及びｐＨの上昇後に大腸菌が増殖し始めるたら流加式法によって添加する培地を意味する。本発明の目的のために、一次注入培地は、酵母抽出物とグルコースを含み、細胞増殖培地に添加することができる。一次注入培地における酵母抽出物とグルコースの量は特に限定されるものではないが、当業者によって適切に決定することができる。好ましくは、一次注入培地は、２００〜４００ｇ/ｌの量の酵母抽出物と７００〜８００ｇ/ｌの量のグルコースを含むのがよい。
【００２１】
本発明で用いられる用語「二次注入培地」とは、目的の組換えタンパク質の発現及び生産において一定のレベルまで増殖した大腸菌を誘導するために、流加式培養として用いる培地を意味する。本発明の目的のために、二次注入培地には、酵母抽出物とグルコースを含み、細胞増殖培地に添加することができる。必要によって、二次注入培地にはイソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドのような組換えタンパク質の発現誘導物質を含むことができる。二次注入培地において、酵母抽出物の量、グルコースの量、イソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドの量は特に制限されるものではないが、当業者によって決定することができる。好ましくは、二次注入培地は、２００〜４００ｇ/ｌの量の酵母抽出物、５００〜７００ｇ/ｌの量のグルコース、必要によってイソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドは０．１〜０．５ｍＭを含むのがよい。
【００２２】
本発明で用いられる用語「流加培養」とは、細胞培養と同時に、発酵における全ての発酵工程の開始から修了まで発酵槽から培養液を抽出することなく、制御された方法で栄養培地を注入する培養工程を意味する。流加式培養においては、特定の栄養分の添加率を微生物の消費速度と比例するようにして、培地内の栄養分の濃度を所定の値に制御することができる。このような長所から、流加式培養は、基質阻害、生成物阻害、又は増殖阻害を引き起こす発酵研究に用いられる。また、パン酵母、アミノ酸、抗生物質などと関連した発酵産業に適用される。本発明の目的のために、流加培養は、一定のレベルまで増殖した大腸菌により目的の組換えタンパク質を生産するために適用することができる。
【００２３】
好ましくは、本発明の培養条件は、回分培養と流加培養に分離することなく、一つの工程として実行したことを言及する。
【００２４】
本発明における形質転換大腸菌細胞の培養方法は、組換え大腸菌を回分培養する間に、ｐＨの上昇に伴い一次注入培地と二次注入培地を順次に添加するｐＨ-スタット工程である。これに関連して、一次注入培地の添加量は徐々に増加させ、一方、二次注入培地の添加量は徐々に減少させる方法で行う。このような、ｐＨ-スタット発酵は栄養枯渇によりｐＨが上昇する際に栄養分を添加する流加式工程で、溶存酸素(Dissolved Oxygen)の濃度は考慮しない。ＤＯ-ｓｔａｔによると、基質の枯渇によりＤＯの濃度が増加する際に栄養分を添加する。しかし、大腸菌の場合、嫌気性と好気性の両方の条件でも菌株が増殖できるため、ＤＯ-ｓｔａｔ発酵を用いるのは不適切である。本発明では、栄養分の枯渇を示すｐＨの上昇だけを細胞増殖の指標として用いた。すなわち、本発明では、より正確な基準に基づいた高濃度培養法を提供する。
【００２５】
本発明における大腸菌培養方法によると、好ましくはステップ（ii）で一次注入培地の注入率は２００〜４００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜８００ｒｐｍであり、ステップ（iii）で二次注入培地の注入率は２００〜４００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜８００ｒｐｍである。より好ましくは、ステップ（ii）で一次注入培地の注入率と攪拌速度は、菌株の特殊増殖速度に伴いそれぞれ２００〜４００ｍｌ/ｈｒ範囲に、４００〜８００ｒｐｍ範囲に段階的に上げることである。例えば、注入率と攪拌速度の増加は全部で３、４又は５ステップを含むことができるが、３ステップであることが好ましい。より具体的に、上記の方法は３ステップにおいて、一次注入培地の注入率と攪拌速度を増加させることにより行うことができる。まずは、一次注入培地の注入率は２００〜３００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜６００ｒｐｍで、それから、注入率は２５０〜３５０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は５００〜７００ｒｐｍで、最後に、注入率は３００〜４００ｍL/ｈｒで攪拌速度は６００〜８００ｒｐｍで行うことができる。特に、ステップ１で一次注入培地の注入率は２００〜３００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜６００ｒｐｍで、ステップ２で一次注入培地の注入率は２５０〜３５０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は５００〜７００ｒｐｍで、ステップ３で一次注入培地の注入率は３００〜４００ｍｌ/ｈｒで、攪拌速度は６００〜８００ｒｐｍである。さらに好ましくは、ステップ１で一次注入培地の注入率は２００〜２７０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜５５０ｒｐｍで、ステップ２で注入率は２７０〜３００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度５５０〜６５０ｒｐｍで、ステップ３で注入率は３００〜３５０ｍｌ/ｈｒで、攪拌速度は６５０〜８００ｒｐｍである。
【００２６】
より好ましくは、本発明の大腸菌細胞の培養方法は、以下のように行うことができる。栄養培地の枯渇によるタンパク質の発現を誘導するステップ（iii）において、二次注入培地の注入率及び攪拌速度をｐＨの変化に伴って２００〜４００ｍｌ/ｈｒの範囲内に、攪拌速度は４００〜８００ｒｐｍの範囲内に段階的に減少させる。例えば、注入率と攪拌速度の減少は、全部で３、４又は５ステップを含むことができるが、３ステップであることが好まししい。具体的に、３ステップにおける、一次注入培地の注入率と攪拌速度の減少により、上記の方法を行うことができる。まずは、一次注入培地の注入率は３００〜４００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は６００〜８００ｒｐｍで、それから、注入率は２５０〜３５０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は５００〜７００ｒｐｍで、最後に、注入率は２００〜３００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜６００ｒｐｍである。特に、ステップ１で二次注入培地の注入率は３００〜４００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は６００〜８００ｒｐｍで、ステップ２で注入率は２５０〜３５０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は５００〜７００ｒｐｍで、ステップ３で注入率は２００〜３００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜６００ｒｐｍである。より好ましいのは、ステップ１で二次注入培地の注入率は３００〜３５０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は６５０〜８００ｒｐｍで、ステップ２で注入率は２７０〜３００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は５５０〜６５０ｒｐｍで、ステップ３で注入率は２００〜２７０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜５５０ｒｐｍである。
【００２７】
本発明の一つの実施様態によると、形質転換大腸菌、ＨＭ１１２０１をトレースメタル補充増殖培地を用いて、３７℃及び空気供給速度１ｖｖｍの条件で回分式で培養し、ｐＨが上昇すると一次注入培地を添加し２５〜３０時間流加式で培養し、吸光度（ＯＤ600）が１２０〜１８０に達するまで培養した（実験例１−１）。吸光度（ＯＤ600）が１２０〜１８０の時点で、目的の組換えタンパク質を生産するために、様々な条件による二次注入培地を添加した（実験例１−２）。特に、１５０以上の吸光度（ＯＤ600）を示した組換えタンパク質の発現誘導においては、最終的に吸光度が２００以上を示し、２００ｇ/ｌ以上の濃度を示す大腸菌細胞を得ることができた。
【発明の効果】
【００２８】
上述したように、本発明の培養方法を用いることにより、目的の組換えタンパク質を生産するための形質転換大腸菌を高濃度で増殖させることができた。従って、本発明の方法は、細胞の生産性を高めるだけでなく、組換えタンパク質の生産収率を上げ、組換えタンパク質を効果的に生産するために広く活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ】形質転換大腸菌、ＨＭ１１２０１（ＫＣＣＭ-１０６６０P）の培養プロファイルを示す図である。灰色線は温度を意味し、太い線はｐＨを意味し、点線は攪拌速度を意味し、細い線は空気供給速度を意味する。
【図１ｂ】電気泳動により測定したタンパク質の発現レベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、実施例を通じて本発明をよりよく理解できる。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：ＨＭ１１２０１の発酵
免疫グロブリンＦｃフラグメントを発現させる形質変換大腸菌、ＨＭ１１２０１（ＫＣＣＭ-１０６６０P）を代表菌株として選別し高濃度培養及び高収率の発現を達成するためにｐＨ-スタット流加発酵に従う段階的方式で、注入培地方法を最適化した。
【００３２】
実施例１−１：形質転換大腸菌の高濃度細胞培養条件の確立
形質転換大腸菌を初代培養培地(２０ｇ/ｌのトリプトン 、１０ｇ/ｌの酵母抽出物、１０ｇ/ｌのＮａＣｌ、２０７．５ｇ/ｌのＫＨ2ＰＯ4 、５０ｇ/ｌの（ＮＨ4）2ＨＰＯ4、ｐＨ６．７)に３７℃で空気供給速度1ｖｖｍの条件により回分式で培養した。次に、一次注入培地(３００〜４００ｇ/ｌの酵母抽出物及び７００〜８００ｇ/ｌのブドウ糖)とトレースメタル溶液(２６８ｇ/ｌのクエン酸、２７０ｇ/ｌのＦｅＣｌ2 、３０ｇ/ｌのＨ3ＢＯ3 、１００ｇ/ｌのＭｎＣｌ2、１５ｇ/ｌのＣｕＣｌ2、２５ｇ/ｌのＮａ2ＭｏＯ4 、２０ｇ/ｌのＺｎＣｌ2 及び０．５ｍＭ ＥＤＴＡ)を添加し、流加式で培養した。
【００３３】
細胞が一定のレベルまで増殖し細胞培養のｐＨがＰＩＤ[P(proportional),I(integral),D(differential)] コントロール数値より上昇した場合、特に培地内の炭素源のような栄養成分の枯渇により、大腸菌の代謝及び成長の変化、そして長期間の放置による細胞溶解が生じる。その解決策として、菌株の比増殖速度(Specific growth rate)に比例して、流加式により段階的に注入培養を添加した。注入培地の注入率が菌株の増殖速度を超える場合には、酢酸が蓄積して大腸菌の代謝及び増殖が阻害される。従って、注入率の段階的増加により攪拌速度も段階的に増加された。具体的には、ステップ１において５０Ｌの発酵機を使用する場合、細胞の濃度が７×１０9ｃｅｌｌ/ｍｌ以上である段階では一次注入培地の注入率は２００〜３００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は４００〜６００ｒｐｍである。一方、細胞の濃度が２×１０10〜３×１０10ｃｅｌｌ/ｍｌである段階では、一次注入培地の注入率は２５０〜３５０ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は５００〜７００ｒｐｍである。また、細胞の濃度が３×１０10〜４．５×１０10ｃｅｌｌ/ｍｌである段階では、一次注入培地の注入率は３００〜４００ｍｌ/ｈｒで攪拌速度は６００〜８００ｒｐｍである。それから、細胞の濃度が４．５×１０10ｃｅｌｌ/ｍｌ以上である場合には、一次注入培地の注入率と攪拌速度は細胞増殖を阻害しない範囲内で、最大に設定し一定に維持した。
【００３４】
上記の条件のように２５〜３０時間培養した結果、吸光度（ＯＤ600）が１２０〜１８０の形質転換大腸菌を得ることができた。
【００３５】
実施例１−２：組換えタンパク質を高収率で生産するための培養条件の確立
上記の実施例１−１で培養した形質転換大腸菌、ＨＭ１１２０１によるタンパク質発現の最適条件を確立するために、多様な組成物を二次注入培地として用い、多様な速度で注入した。
【００３６】
その結果、２００〜４００ｇ/ｌの濃度の酵母抽出物及び５００〜７００ｇ/ｌの濃度のブドウ糖を含む組成物を二次注入培地として使用した場合、組換えタンパク質を高収率で発現させるために有用であることを見出した。
【００３７】
また、流加培養において、培地の栄養分の枯渇と攪拌条件の調節を通じて、菌株の増殖段階から組換えタンパク質の生産段階への転換するために、培地の注入率と攪拌速度を段階的に減少させた。具体的に、注入率及び攪拌速度の段階的調節は、アルカリ性(Alkaline)溶液の投入量及びｐＨ上昇に比例して調節した。ステップ１で注入率と攪拌速度をそれぞれ３００〜４００ｍｌ/ｈｒ及び６００〜８００ｒｐｍにし、ステップ２で２５０〜３５０ｍｌ/ｈｒ及び５００〜７００ｒｐｍにし、ステップ３で２００〜３００ｍｌ/ｈｒ及び４００〜６００ｒｐｍにそれぞれ設定した。タンパク質の発現を誘導するために０．１〜０．５ｍＭのイソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドを添加した。
【００３８】
組換えタンパク質の発現を促進するための培養工程の後半には、大腸菌の活性が低下する。この際、過度に培地を添加すると大腸菌の希釈と酢酸の蓄積を引き起こし、大腸菌の増殖が低下するだけでなく、組み換えタンパク質の発現が抑制される。この問題を解決するために、培養工程の後半に注入培地の注入率を下げることで、大腸菌に添加する栄養分を減少させた。栄養分の供給が減少し大腸菌の物質代謝が変換されると、アンモニウムイオンが培地に放出され、その結果、培地のｐＨが上昇する。従って、一貫したｐＨ範囲のために追加的に調節しなくても、細胞培養の培養終了までのｐＨは６．８〜７．５に維持されることを確認した(図.１)。図１は、形質転換大腸菌、ＨＭ１１２０１（ＫＣＣＭ-１０６６０Ｐ）の培養増殖プロファイル及び電気泳動による組み換えタンパク質の発現レベルの分析を示す。図１に示すように、時間の経過に比例して大腸菌による目的の組換えタンパク質の生産は増加した。
【００３９】
一方、注入培地の組成及びイソプロピルβ-Ｄ-1-チオガラクトピラノシドの添加時期を変えながら、形質転換大腸菌を培養した。その結果、大腸菌を増殖させるための培養の前半の時間を延ばし最大限に大腸菌を高濃度に増殖させた後に、目的の組み換えタンパク質の発現を誘導する培養後半に進行させる場合、大腸菌の増殖を最大化でき菌株の生産量を増加させることができた(表１)。培養４５時間後に、最終ＯＤ600と菌株の生産量及びタンパク質の量を測定した。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
表１から理解されるように、注入培地の組成及び発現誘導時期に伴い、最終吸光度（ＯＤ600）が２００以上を示し、２００ｇ以上の細胞量を得ることができた。
【００４２】
図１に示すように、免疫グロブリンＦｃは、高いレベルで発現し細胞量を１．５倍増加させることができた。すなわち、本発明は生産性を向上させるために効果的な培養条件であり、本発明は、タンパク質発現の高収率に効果的であることを報告する。
【００４３】
本発明の実施様態は、例示的目的として説明したが、当業者らは添付された特許請求範囲に記述された発明の範囲と趣旨から外れずに、多様な変更、追加、代用が可能であることを認識できることである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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