(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリキア属微生物を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するための組成物であって、該微生物中のグルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼ活性が、その内在的活性より弱化されるか、あるいは除去され、かつＯ−スクシニルホモセリンの生産性が野生株微生物に対して増加した、前記組成物。
【請求項２】
前記グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼは、配列番号２３のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記微生物は、追加してシスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼのうち１以上の活性が、その内在的活性に比べて弱化されるか、あるいは除去されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記シスタチオンガンマシンターゼは、配列番号２４のアミノ酸配列を有し、前記ホモセリンキナーゼは、配列番号２５のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記微生物は、追加してホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性が、その内在的活性より強化されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記微生物は、大腸菌であることであることを特徴とする、請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼ活性が、その内在的活性より弱化されるか、あるいは除去され、かつＯ−スクシニルホモセリンの生産性が野生株微生物に対して増加した、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培養する段階と、
得られた微生物の培養液から、Ｏ−スクシニルホモセリンを得る段階と、
を含む、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産する方法。
【請求項９】
前記微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項８に記載のＯ−スクシニルホモセリンを生産する方法。
【請求項１０】
ＫＣＣＭ１１４８７Ｐである、エシェリキア属微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−スクシニルホモセリン生産微生物、及びそれを利用して、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｏ−スクシニルホモセリン（Ｏ−succinyl homoserine）は、生合成経路において、ホモセリン（homoserine）と、スクシニル−ＣｏＡ（succinyl−ＣｏＡ）のスクシニル基（succinyl group）との結合によって生成される。従って、高収率のＯ−スクシニルホモセリン生産菌株開発において、ホモセリンとスクシニルＣｏＡとの生成が重要である。そのうち、スクシニルＣｏＡは、ＴＣＡ回路（ＴＣＡ cycle）で生成されるので、スクシニルＣｏＡを高濃度で生成しようとすれば、ＴＣＡ回路強化が要求される。
【０００３】
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ：pentose phosphate pathway）は、ＮＡＤＰＨの主供給源として周知されており、アミノ酸の生合成経路において、補助因子（cofactor）であるＮＡＤＰＨが要求される。従って、アミノ酸生産菌株の開発において、ペントースリン酸経路を強化するために、その経路の最初の段階に関与するグルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼ（glucose ６−phosphate−１−dehydrogenase）をコーディングするｚｗｆ遺伝子を強化させることが一般的であり、大韓民国公開特許公報第２００８−００３６６０８号及び同第２００６−０１２９３５２号は、かような菌株を開示する。
【０００４】
ｚｗｆ遺伝子の発現や、それによってコーディングされた酵素の活性を弱化させれば、ペントースリン酸経路が弱化され、ＮＡＤＰＨ供給が不足する。かような場合、ＮＡＤＰＨが、ＴＣＡ回路のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ：isocirate dehydrogenase）及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｅ：malate dehydrogenase）の過発現によって、一部補充されるという研究が報告された（Appl Microbiol Biotechnol. 2004 64(1); 91-8, Metab Eng. 2004 6(2); 164-74, FEBS Letters 581 2007 3771-6）。
【０００５】
本発明者らは、Ｏ−スクシニルホモセリンを、高収率、高効率で製造することができる菌株を開発するための研究を行い、Ｏ−スクシニルホモセリン生産能を有する大腸菌において、Ｏ−スクシニルホモセリンの前駆体であるスクシニル−ＣｏＡを高濃度で生産するための目的で、ｚｗｆ遺伝子を弱化及び欠損させた菌株を開発し、培養の結果、Ｏ−スクシニルホモセリン濃度が上昇されたことを確認することにより、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｏ−スクシニルホモセリン生産微生物を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明は、またＯ−スクシニルホモセリン生産微生物を培養する段階を含むＯ−スクシニルホモセリンを生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一様態で、本発明は、Ｏ−スクシニルホモセリン生産微生物を提供する。
【０００９】
本発明の一具体例において、Ｏ−スクシニルホモセリン生産微生物は、グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼ（glucose ６−phosphate−１−dehydrogenase）活性が、その内在的活性より弱化されるか、あるいは除去された、Ｏ−スクシニルホモセリン生産能を有する微生物でもある。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼ活性が、その内在的活性より弱化されるか、あるいは除去された、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
（２）前記グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼは、配列番号２３のアミノ酸配列を有することを特徴とする、（１）に記載のエシェリキア属微生物。
（３）前記微生物は、追加してシスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼのうち１以上の活性が、その内在的活性に比べて弱化されるか、あるいは除去されたものであることを特徴とする、（１）に記載のエシェリキア属微生物。
（４）前記シスタチオンガンマシンターゼは、配列番号２４のアミノ酸配列を有し、前記ホモセリンキナーゼは、配列番号２５のアミノ酸配列を有することを特徴とする、（３）に記載のエシェリキア属微生物。
（５）前記微生物は、追加してホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性が、その内在的活性より強化されたものであることを特徴とする、（１）に記載のエシェリキア属微生物。
（６）前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、配列番号２６のアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする、（５）に記載のエシェリキア属微生物。
（７）前記微生物は、大腸菌であることであることを特徴とする、（１）ないし（６）のうちいずれか１に記載のエシェリキア属微生物。
（８）グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼ活性が、その内在的活性より弱化されるか、あるいは除去された、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培養する段階と、得られた微生物の培養液から、Ｏ−スクシニルホモセリンを得る段階とを含む、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産する方法。
（９）前記微生物は、大腸菌であることを特徴とする、（８）に記載のＯ−スクシニルホモセリンを生産する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＯ−スクシニルホモセリン生産菌株は、Ｏ−スクシニルホモセリンを効率的に生産し、Ｌ−メチオニンの生産に利用することができ、それによって生産されたＬ−メチオニンは、動物飼料または動物飼料添加剤だけではなく、人間の食品または食品添加剤の生産に汎用される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一様態で、本発明は、Ｏ−スクシニルホモセリン生産微生物を提供する。
【００１２】
本発明の一具体例において、Ｏ−スクシニルホモセリン生産微生物は、グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼ（glucose ６−phosphate−１−dehydrogenase）活性がその内在的活性より弱化されるか、あるいは除去された、Ｏ−スクシニルホモセリン生産能を有する微生物でもある。
【００１３】
本明細書において使用された用語「Ｏ−スクシニルホモセリン生産微生物」は、Ｏ−スクシニルホモセリンを生物体内で生産し、Ｏ−スクシニルホモセリンを蓄積することができる、原核微生物または真核微生物を意味する。例えば、Ｏ−スクシニルホモセリン生産微生物は、エシェリキア属（Escherichia ｓｐ．）、エルウィニア属（Erwinia ｓｐ．）、セラチア属（Serratia ｓｐ．）、プロビデンシア属（Providencia ｓｐ．）、コリネバクテリウム属（Corynebacteria ｓｐ．）、シュードモナス属（Pseudomonas ｓｐ．）、レプトスピラ属（Leptospira ｓｐ．）、サルモネラ属（Salmonellar ｓｐ．）、ブレビバクテリア属（Brevibacteria ｓｐ．）、ヒフォモナス属（Hyphomononas ｓｐ．）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium ｓｐ．）、ノカルディア属（Norcardia ｓｐ．）、かび（fungi）、または酵母（yeast）に属する微生物でもある。具体的には、エシェリキア属微生物であり、さらに具体的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でもある。
【００１４】
グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨのレベルを維持させることによって、細胞に還元力を供給する代謝経路であるペントースホスフェート経路として作用する。該酵素は、ペントースホスフェート経路の最初の段階において、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元させながら、グルコース６−ホスフェートを、６−ホスホノグルコラクトンに酸化させる反応を触媒する。該酵素をコーディングする遺伝子は、ｚｗｆと総称され、該酵素の活性が弱化されたり除去されたりすれば、相対的に、ＴＣＡ方向に流れ、ＴＣＡ回路が強化される。
【００１５】
前記グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼは、配列番号２３のアミノ酸配列を有するものでもある。また、前記グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼは、配列番号２３と、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。
【００１６】
本明細書において、配列と係わって使用された用語「相同性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、百分率で表示される。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一であるか、あるいは類似した活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表示される。例えば、配列番号２３と、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列は、グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼの活性を有する配列を示す。
【００１７】
本明細書において使用された用語「内在的」酵素及び活性は、微生物または細胞に本来存在する天然状態の酵素及びその活性を意味する。すなわち、当該酵素及び活性が変異される前の酵素及びその活性を意味するのである。
【００１８】
本発明の一具体例において、前記微生物は、追加してシスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼのうち１以上の活性がそれぞれその内在的活性に比べて弱化されるか、あるいは除去され、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産能を有する微生物でもある。具体的には、前記微生物は、シスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼいずれもの活性がその内在的活性に比べて弱化されるか、あるいは除去され、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産能を有する微生物でもある。
【００１９】
シスタチオンガンマシンターゼは、Ｏ−スクシニルホモセリンをシスタチオンに転換させる活性を有する。シスタチオンガンマシンターゼは、ｍｅｔＢ遺伝子によってコーディングされ、該酵素の活性を弱化させたり除去したりすれば、Ｏ−スクシニルホモセリンがシスタチオンに転換されずに蓄積される。
【００２０】
ホモセリンキナーゼは、ホモセリンからＯ−ホスホホモセリンの合成を触媒し、ｔｈｒＢ遺伝子によってコーディングされる。従って、該酵素の活性を弱化させたり除去したりすれば、ホモセリンがＯ−ホスホホモセリンに転換されずに、Ｏ−スクシニルホモセリンの生成に利用されることになる。
【００２１】
本発明の一具体例において、前記シスタチオンガンマシンターゼは、配列番号２４のアミノ酸配列を有し、前記ホモセリンキナーゼは、配列番号２５のアミノ酸配列を有することができる。また、前記シスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼは、それぞれ配列番号２４及び２５と、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。
【００２２】
本明細書において使用された用語、酵素活性の「弱化」または「除去」は、当該酵素をコーディングする遺伝子の発現やその酵素の活性が内在的活性より低下するか、あるいは全く存在しないということを意味するものであり、当該酵素をコーディングする遺伝子の塩基配列全体またはその一部、あるいはその発現調節配列の全体または一部を欠失、置換または挿入によって変異させるか、あるいはそれらの組み合わせによるものでもある。
【００２３】
本明細書において使用された用語「発現調節配列」は、遺伝子の発現を調節する塩基配列であり、個体内において、特定遺伝子の発現を増加させたり減少させたりすることができるセグメントを意味し、プローモーター、転写調節因子結合部位などを含むが、それらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の一具体例において、前記微生物は、追加してホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性がその内在的活性より強化され、Ｏ−スクシニルホモセリンの生産能を有する微生物でもある。
【００２５】
ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、スクシニル−ＣｏＡ及びホモセリンから０−スクシニルホモセリンを生成する反応を触媒する酵素であり、メチオニン生合成経路の第１段階に関与する。該酵素をコーディングする遺伝子は、ｍｅｔＡと総称され、メチオニンによるフィードバック調節によって、その発現が抑制される。従って、メチオニンによるフィードバック調節を除去し、高レベルに発現されるようにするための変異体が利用される。
【００２６】
本発明の一具体例において、前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、配列番号２６のアミノ酸配列を有することができる。また、前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、配列番号２６と、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。一方、メチオニンによるフィードバック調節が解除されたホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、配列番号２７（ｍｅｔＡ１１：大韓民国特許公開第２００９−０１０６３６５号）と、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。
【００２７】
本明細書において使用された用語、酵素活性の「強化」は、当該酵素の活性が変異前に比べて向上したということを意味する。具体的には、当該酵素をコーディングする遺伝子の過発現によって、内在的活性に比べて酵素の活性が高くなるか、あるいはその遺伝子において、変異によって、コーディングされた酵素の活性が内在的活性より高くなったことであり、コーディングする遺伝子のコピー数を増加させるか、あるいは前記遺伝子のプローモーターを、内在したプローモーターより強いプローモーターに置換するか、あるいは前記酵素の活性が上昇するように、染色体上の前記遺伝子の塩基配列全体またはその一部、あるいは発現調節配列の全体または一部を欠失、置換または挿入によって変異させるか、あるいはそれらの組み合わせによるものでもある。
【００２８】
本発明の一具体例において、前記ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、それをコーディングする遺伝子のプローモーターを、内在的プローモーターより強い活性のプローモーターに交替された遺伝子によってコーディングされる。例えば、前記プローモーターは、活性が強いプローモーターと知られたＰｔａｃ、Ｐｔｒｃ、Ｐｐｒｏ、ＰＲ、ＰＬ、Ｐｒｍｆ、ＰｃｙｓＫなどを含むが、それらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の一具体例において、前記微生物は、大腸菌でもある。前記微生物は、グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼ活性が、内在的グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼ活性より弱化されるか、あるいは除去され、またシスタチオンガンマシンターゼ及びホモセリンキナーゼのうち１以上の活性がそれぞれの内在的活性に比べて弱化されるか、あるいは除去され、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼの活性が内在的活性に比べて強化された大腸菌でもある。
【００３０】
本発明の一具体例において、前記微生物は、大腸菌の染色体上のｍｅｔＡが、メチオニンによるフィードバック調節が除去された変異体であるｍｅｔＡ１１（配列番号２７）に交替され、染色体上のｔｈｒＢ及びｍｅｔＢが欠損され、ｚｗｆが弱化または除去された大腸菌でもある。
【００３１】
本発明の一具体例において、前記微生物は、２０１３年１１月２２日付けで、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に、寄託番号ＫＣＣＭ１１４８７Ｐで寄託された大腸菌ＣＣ０３−０１５６でもある。
【００３２】
また、本発明の一具体例において、前記微生物は、スクロース資化性が付与された微生物でもある。スクロース資化性は、スクロースを炭素源として、または代謝源として代謝することができる能力を意味し、スクロース代謝酵素、例えば、フラクトキナーゼ（fructokinase）、スクロースＰＴＳパーミアーゼ（sucrose ＰＴＳ permease）、スクロースヒドロラーゼ（sucrose hydrolase）、インベルターゼ（invertase）の導入によって付与される。例えば、大韓民国公開特許第２０１０−００９９５７２号に開示されたストレプトコッカス・ミュータンス由来のＳｃｒ−ＰＴＳ酵素をコーディングする遺伝子を含む組換えベクター（ｐＡｓｃｒＳＭ、配列番号２８）によって形質転換させてスクロース資化性を付与することができる。
【００３３】
本発明の一具体例において、前記微生物は、大腸菌の染色体上のｍｅｔＡがメチオニンによるフィードバック調節が除去された変異体であるｍｅｔＡ１１（配列番号２７）に交替され、染色体上のｔｈｒＢ及びｍｅｔＢが欠損され、ｚｗｆが除去され、スクロース資化性ストレプトコッカス・ミュータンスに由来したフラクトキナーゼ、スクロースＰＴＳパーミアーゼ、スクロース、ヒドロラーゼ、及びスクロース転写調節子をコーディングするｓｃｒＫＹＡＢＲを含む組換えベクターによって形質転換されて原糖を利用することができる大腸菌でもある。
【００３４】
本発明の一様態において、Ｏ−スクシニルホモセリンを生産する方法として、グルコース６−ホスフェート−１−デヒドロゲナーゼの活性が、その内在した活性に比べ、弱化または除去されたエシェリキア属微生物を培養する段階、及び得られた微生物の培養液からＯ−スクシニルホモセリンを得る段階を含む方法が提供される。
【００３５】
本発明の一具体例によるＯ−スクシニルホモセリンを生産する方法において、Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株の培養は、当業界に知られた適切な培地及び培養条件によってなされる。かような培養過程は、当業者であるならば、選択される菌株によって、容易に調整して使用することができるであろう。培養方法の例として、回分式、連続式及び流加式の培養が含まれるが、それらに限定されるものではない。かような多様な培養方法は、例えば、文献（「Biochemical Engineering」, James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp. 138-176）に記載されている。
【００３６】
培養に使用される培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。多様な微生物培養培地は、例えば、文献（「Manual of Methods for General Bacteriology」, the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981）に記載されている。それら培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。該炭素源は、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、果糖、麦芽糖、澱粉及び纎維素のような炭水化物；大豆油、ひまわりオイル、ひまし油（castor oil）及びココナッツオイル（coconut oil）のような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸（stearic acid）及びリノール酸（linoleic acid）のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸を含む。それら炭素源は、単独で、または組み合わされて使用される。窒素源としては、ペプトン（peptone）、酵母抽出液（yeast extract）、肉汁（gravy）、麦芽抽出液（malt extract）、とうもろこし浸出液（ＣＳＬ：corn steep liquor）及び豆粉（bean flour）のような有機窒素源、並びに尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含む。それら窒素源は、単独で、または組み合わされて使用される。前記培地には、リン酸源として、追加してリン酸二水素カリウム（potassium dihydrogen phosphate）、リン酸水素二カリウム（dipotassium hydrogen phosphate）、及び相応するナトリウム包含塩（sodium-containing salts）を含んでもよい。また、培地は、硫酸マグネシウム（magnesium sulfate）または硫酸鉄（ironsulfate）のような金属を含んでもよい。また、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが添加される。
【００３７】
また、培養液の好気性条件を維持するために、培養液内に、酸素または酸素を含んだガス（例えば、空気）が培養液に注入されてもよい。培養物の温度は、一般的に、２０ないし４５℃、望ましくは、２５ないし４０℃である。培養期間は、Ｌ−メチオニン前駆体の生産が、所望のレベルに逹するまで続められ、望ましい培養時間は、１０ないし１６０時間である。
【００３８】
以下、本発明について、実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限られるものではない。
【実施例】
【００３９】
参考例１．Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株の作製
１−１．ｍｅｔＢ遺伝子の欠損
Ｏ−スクシニルホモセリンの蓄積を増大させるために、その分解に関与する、シスタチオンガンマシンターゼをコーディングするｍｅｔＢ遺伝子を欠損させた菌株を製造した。
野生型Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株において、シスタチオンガンマシンターゼをコーディングするｍｅｔＢ遺伝子を欠損させた。シスタチオンガンマシンターゼは、細胞で多様なメチオニン前駆体と結合し、それによって、多様な副産物を生成することができると知られている。従って、シスタチオンシンターゼの過発現は、付随反応の増加によって、細胞内反応効率性を低下させる。ｍｅｔＢ遺伝子欠損のために、ＦＲＴ−one−step−ＰＣＲ欠損方法を遂行した（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）。まず、配列番号１及び２のプリマーを利用して、ｐＫＤ３ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）をテンプレートにしたＰＣＲ反応を遂行し、欠損カセット（deletion cassette）を作製した。
【００４０】
配列番号１：
5'-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
配列番号２：
5'-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
【００４１】
ＰＣＲ条件は、変性（denaturation）９５℃３０秒、アニーリング（annealing）５５℃３０秒、伸張（extension）７２℃１分からなるサイクルを３０回反復遂行した。得られたＰＣＲ産物を、１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂサイズのバンドを溶離して精製した。回収されたＤＮＡ切片を、ｐＫＤ４６ベクター（PNAS (2000) Vol. 97, pp. 6640-6645）をあらかじめ形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株に電気穿孔（electroporation）した。電気穿孔のために、ｐＫＤ４６に形質転換されたＷ３１１０菌株を、２００μｇ／Ｌアンピシリン（ampicilin）と、５ｍＭアラビノース（Ｌ−arabinose）とが含まれたＬＢ培地を利用して、３０℃でＯＤ６００＝０．５まで培養させた後、１０％グリセロールで３回洗浄して使用した。電気穿孔は、２，５００Ｖで行った。回収された菌株を、３０μｇ／Ｌクロラムフェニコール（chloramphenichol）を含んだＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で１日ないし２日培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００４２】
選別された菌株は、その菌株をテンプレートにして、配列番号３及び４のプリマーを利用して、前述の条件でＰＣＲを行った後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが１．５ｋｂと観察されることを確認し、ｍｅｔＢ遺伝子の欠損を確認した。
【００４３】
配列番号３：5'-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3'
配列番号４：5'-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3'
【００４４】
ｍｅｔＢ遺伝子の欠損が確認された菌株を、ｐＣＰ２０ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）に形質転換させ、１００μｇ／Ｌアンピシリンを含んだＬＢ培地で培養し、また同一条件のＰＣＲを行い、１．０％アガロースゲル上で小さくなったＰＣＲ産物を介して、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認し、最終ｍｅｔＢ遺伝子欠損菌株を作製した。得られたメチオニン要求性菌株をＣＣ０３−０１３２と命名した。
【００４５】
１−２．ｔｈｒＢ遺伝子の欠損
ホモセリンからのＯ−スクシニルホモセリンの生成量を増加させるために、ホモセリンキナーゼをコーディングする遺伝子であるｔｈｒＢ遺伝子を欠損させた。特に、スレオニン生産菌株を利用する場合、ホモセリンの利用活性が非常に大きいために、該遺伝子の欠損が必ず必要である。１−１で作製されたＣＣ０３−０１３２菌株におけるｔｈｒＢ遺伝子欠損のために、ＦＲＴ−one−step−ＰＣＲ欠損方法を遂行した（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）。ｔｈｒＢ遺伝子の欠損のために、配列番号５及び６のプリマーを利用して、ｐＫＤ３ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）をテンプレートにしてＰＣＲ反応を行い、欠損カセットを作製した。
【００４６】
配列番号５：
5'-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
配列番号６：
5'-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCCTCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
【００４７】
ＰＣＲ条件は、変性９５℃３０秒、アニーリング５５℃３０秒、伸張７２℃１分からなるサイクルを３０回反復遂行した。得られたＰＣＲ生成物を、１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂサイズのバンドを溶離して精製した。回収されたＤＮＡ切片を、ｐＫＤ４６ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）であらかじめ形質転換させたＣＣ０３−０１３２菌株に、電気穿孔によって注入した。電気穿孔のために、ｐＫＤ４６に形質転換されたＣＣ０３−０１３２菌株は、２００μｇ／Ｌアンピシリン及び５ｍＭアラビノースが含まれたＬＢ培地を利用して、３０℃でＯＤ６００＝０．５まで培養させた後、１０％グリセロールで３回洗浄して使用した。電気穿孔は、２，５００Ｖで行った。回収された菌株を、３０μｇ／Ｌクロラムフェニコールを含んだＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で１日ないし２日培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
選別された菌株は、菌株をテンプレートにして、配列番号７及び８のプリマーを利用して前述の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で、遺伝子サイズが１．５ｋｂに観察されることを確認し、ｔｈｒＢ遺伝子の欠損を確認した。
【００４８】
配列番号７：5'-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3'
配列番号８：5'-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3'
【００４９】
確認された菌株は、ｐＣＰ２０ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）で形質転換させ、１００μｇ／Ｌアンピシリンを含んだＬＢ培地で培養し、さらに同一条件のＰＣＲを行い、１．０％アガロースゲル上で小さくなったＰＣＲ産物を介して、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認し、最終ｔｈｒＢ遺伝子の欠損菌株を作製した。作製された菌株をＣＣ０３−０１３３と命名した。
【００５０】
１−３．ｍｅｔＡ遺伝子の欠損
染色体に、フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子を導入するために、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２）Ｗ３１１０菌株に、ｍｅｔＢ遺伝子及びｔｈｒＢ遺伝子を欠損させたＣＣ０３−０１３３菌株を基に、染色体上の本来ｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた。ｍｅｔＡ遺伝子の欠損のために、ＦＲＴ−one−step−ＰＣＲｄｅｌｅｔｉｏｎ方法を遂行した（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）。ｍｅｔＡ遺伝子の欠損のためには、配列番号９，１０のプリマーを利用して、ｐＫＤ３ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）をテンプレートにして、ＰＣＲ反応で欠損カセットを作製した。
【００５１】
配列番号９：
5'-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
配列番号１０：
5'-CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATGCATCCCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
【００５２】
ＰＣＲ条件は、変性９５℃３０秒、アニーリング５５℃３０秒、伸張７２℃１分からなるサイクルを３０回反復遂行した。得られたＰＣＲ生成物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂサイズのバンドを溶離して精製した。回収されたＤＮＡ切片は、ｐＫＤ４６ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）をあらかじめ形質転換させたＣＣ０３−０１３３菌株に電気穿孔した。電気穿孔のために、ｐＫＤ４６に形質転換されたＣＣ０３−０１３３菌株は、２００μｇ／Ｌアンピシリン及び５ｍＭアラビノースが含まれたＬＢ培地を利用して、３０℃でＯＤ６００＝０．５まで培養させた後、１０％グリセロールで３回洗浄して使用した。電気穿孔は、２，５００Ｖで行った。回収された菌株を、３０μｇ／Ｌクロラムフェニコールを含んだＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で１日ないし２日培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
【００５３】
選別された菌株は、菌株をテンプレートにして、配列番号１１及び１２のプリマーを利用して、前述の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で、遺伝子サイズが１．５ｋｂに観察されることを確認し、ｍｅｔＡ遺伝子の欠損を確認した。
【００５４】
配列番号１１：5'-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3'
配列番号１２：5'-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3'
【００５５】
確認された菌株は、ｐＣＰ２０ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）で形質転換させ、１００μｇ／Ｌアンピシリンを含んだＬＢ培地で培養し、さらに同一条件のＰＣＲを行い、１．０％アガロースゲル上で小さくなったＰＣＲ産物を介して、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認し、最終ｍｅｔＡ遺伝子の欠損菌株を作製した。作製された菌株をＣＣ０３−０１３４と命名した。
【００５６】
１．４．ｍｅｔＡ１１遺伝子の挿入
−ｍｅｔＡ１１挿入用ｐＳＧベクター作製
ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼは、培地に添加される微量のメチオニンによってフィードバック調節を受け、ほとんどの活性が抑制される特性を示すので、Ｌ−メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリン生産増加のために、メチオニンによるフィードバック調節が除去された変異型に交替させた。大腸菌のホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコーディングする、染色体上にある野生型ｍｅｔＡ遺伝子を、メチオニンによるフィードバック調節が除去された変異型をコーディングするｍｅｔＡ１１（配列番号２７）に交替するために、挿入用ベクターであるｐＳＧ−ｍｅｔＡ１１を作製した。大韓民国特許出願公開第２００９−０１０６３６５号に開示された内容によって、ｍｅｔＡ１１遺伝子の塩基配列情報を確保し、それに基づいて、ｍｅｔＡ１１遺伝子のＡＴＧ部分から、ＯＲＦを含み、制限酵素ＥｃｏＲＩ認知部位及びＳａｃＩ認知部位を含んでいるプライマー（配列番号１３及び１４）を合成した。ｍｅｔＡ１１遺伝子をｐＣＬ１９２０ベクターにライゲーションさせて製造されたｐＭｅｔＡ１１−ＣＬプラスミド（大韓民国特許出願公開第２００９−０１０６３６５号）をテンプレートにして、下記配列番号を有したプライマーを利用してＰＣＲを行った。
【００５７】
配列番号１３：5'-ggccgaattcatgccgattcgtgtgccgga-3'
配列番号１４：5'-ggccgagctcgttaatccagcgttggattca-3'
【００５８】
ＰＣＲは、ｐｆｕ−Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ソルジェント：ＳＰＸ１６−Ｒ２５０）を利用して行い、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び伸張７２℃、２分からなるサイクルを３０回反復した。その結果、両側に制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＳａｃＩの認識部位を含むｍｅｔＡ１１ＯＲＦが増幅されたＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲを介して得られたｍｅｔＡ１１遺伝子に対して、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩを処理し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで処理されたｐＳＧ７６−Ｃベクター（Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22): 4409-15）に、ライゲーションを介して前記遺伝子をクローニングし、最終的にｍｅｔＡ１１遺伝子がクローニングされたｐＳＧ−ｍｅｔＡ１１組換えベクターを作製した。
【００５９】
−ｍｅｔＡ１１遺伝子の挿入菌株作製
前述のところで作製したｍｅｔＡ１１遺伝子の挿入用ベクターであるｐＳＧ−ｍｅｔＡ１１を、参考例１−３で得られた菌株ＣＣ０３−０１３４に形質転換し、ＬＢＣｍ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／Ｌ）培地で培養した後、クロラムフェニコール耐性を有するコロニーを選別した。選抜された形質転換体は、ｐＳＧ−ｍｅｔＡ１１ベクターが染色体内のｍｅｔＡ部分に一次挿入された菌株である。ｍｅｔＡ１１遺伝子が挿入された菌株に、ｐＳＧベクター内に存在するＩ−ＳｃｅＩ部分を切断する制限酵素であるＩ−ＳｃｅＩを発現するベクターであるｐＳＴ７６−ＡＳｃｅＰベクター（Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27 (22): 4409-15）を形質転換させ、ＬＢ−Ａｍｐ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール１００μｇ／Ｌ）で生長する菌株を選別した。かように選別された菌株は、野生型ｍｅｔＡがｍｅｔＡ１１に交替され、挿入されたｐＳＧ７６−Ｃベクターが除去された菌株である。該菌株を大腸菌ＣＣ０３−００３８と命名した。
【００６０】
実施例１．ｚｗｆ遺伝子の弱化及び欠損
１−１．ｚｗｆ遺伝子の弱化
−ｚｗｆ遺伝子開始コドン置換用ｐＳＧベクターの作製
参考例１−４で作製されたＣＣ０３−００３８菌株において、ｚｗｆ遺伝子を弱化させるために、ｚｗｆ遺伝子ＯＲＦ部分の開始コドンＡＴＧをＧＴＧに変更する方法を適用した。配列番号１５，１６及び配列番号１７，１８のプライマーを利用して、大腸菌Ｗ３１１０の誘電体をテンプレートにしてＰＣＲを行った。
【００６１】
配列番号１５：5'-ggccgaattcctgaaagaaatcgaaatgcag-3'
配列番号１６：5'-cacgtcattctccttaagaattc-3'
配列番号１７：5'-gaattcttaaggagaatgacgtg-3'
配列番号１８：5'-ggccgagctcgggcatggcaaagtagttaatg-3'
【００６２】
ＰＣＲは、ｐｆｕ−Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ソルジェント：ＳＰＸ１６−Ｒ２５０）を使用して行い、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；及び伸張７２℃、１分からなるサイクルを３０回反復した。獲得した２つの断片をテンプレートにして、ＳＯＥｉｎｇ（splicing by overlap extension）ＰＣＲを行った。その結果、両末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＳａｃＩ認識部位を有し、開始コドンとしてＧＴＧを含むｚｗｆ部分を得て、得られた断片末端にその認識部位が存在する、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩを処理し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩが処理されたｐＳＧ７６−Ｃベクター（Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27 (22): 4409-15）ベクターに、ライゲーションを介してクローニングし、最終的にｐＳＧ−ｚｗｆ（ＧＴＧ）組換えベクターを作製した。
【００６３】
−ｚｗｆ遺伝子開始コドン置換菌株の作製
前述のように、ｚｗｆ遺伝子開始コドン置換用に作製されたｐＳＧ−ｚｗｆ（ＧＴＧ）を、参考例１−４で作製したＣＣ０３−００３８菌株に形質転換し、ＬＢ＿Ｃｍ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／Ｌ）培地で培養した後、クロラムフェニコール耐性を有するコロニーを選別した。選別された形質転換体は、ｐＳＧ−ｚｗｆ（ＧＴＧ）ベクターが、染色体内のｚｗｆ部分に一次挿入された菌株である。選別された菌株に、ｐＳＧベクター内に存在するＩ−ＳｃｅＩ部分を切断する制限酵素であるＩ−ＳｃｅＩを発現するベクターであるｐＳＴ７６−ＡＳｃｅＰ（Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15; 27(22): 4409-15）を形質転換し、ＬＢ−Ａｍｐ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール１００μｇ／Ｌ）で生長する菌株を選別した。かように選別された菌株は、ｚｗｆ遺伝子の開始コドンがＡＴＧでＧＴＧに変更され、ｚｗｆ遺伝子が弱化された菌株と確認した後、挿入されたｐＳＧ７６−Ｃベクターを除去した形態である。該菌株をＣＣ０３−００３８ｚｗｆＧＴＧと命名した。
【００６４】
１−２．ｚｗｆ遺伝子の欠損
参考例１−４で作製されたＣＣ０３−００３８菌株において、ｚｗｆ遺伝子の欠損のために、ＦＲＴ−one−step−ＰＣＲ欠失方法を遂行した（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）。ｚｗｆ遺伝子の欠損のためには、配列番号１９及び２０のプライマーを利用して、ｐＫＤ３ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）をテンプレートにしてＰＣＲ反応を行い、欠損カセットを作製した。
【００６５】
配列番号１９：
5'-CAAGTATACCCTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
配列番号２０：
5'-CTGCGCAAGATCATGTTACCGGTAAAATAACCATAAAGGATAAGCGCAGATACATATGAATATCCTCCTTAG-3'
【００６６】
ＰＣＲ条件は、変性９５℃３０秒、アニーリング５５℃３０秒、伸張７２℃１分からなるサイクルを３０回反復遂行した。得られたＰＣＲ生成物を、１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂサイズのバンドを溶離して精製した。回収されたＤＮＡ切片を、ｐＫＤ４６ベクター（PNAS (2000), Vol. 97, pp. 6640-6645）であらかじめ形質転換させたＣＣ０３−００３８菌株に、電気穿孔によって注入した。電気穿孔のために、ｐＫＤ４６に形質転換されたＣＣ０３−００３８菌株は、２００μｇ／Ｌアンピシリン及び５ｍＭアラビノースが含まれたＬＢ培地を利用して、３０℃でＯＤ６００＝０．５まで培養させた後、１０％グリセロールで３回洗浄して使用した。電気穿孔は、２，５００Ｖで行った。回収された菌株を、３０μｇ／Ｌクロラムフェニコールを含んだＬＢ平板培地に塗抹し、３７℃で１日ないし２日培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
選別された菌株は、菌株をテンプレートにして、配列番号２１及び２２のプライマーを利用して、前述の条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で、遺伝子サイズが２ｋｂに観察されることを確認し、ｚｗｆ遺伝子の欠損を確認した。
【００６７】
配列番号２１：5'-CATAACATGATCAGTGTCAGAT-3'
配列番号２２：5'-CGCGTAACAATTGTGGATTCAT-3'
【００６８】
確認された菌株は、ＣＣ０３−０１５６と命名した。
【００６９】
１−３．スレオニン生産菌株基盤Ｏ−スクシニルホモセリン生産菌株の作製
国際特許ＷＯ２００５／０７５６２５に開示されたスレオニン生産菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１Ｐを利用して、参考例１に記載された方法と同一方法により、ｍｅｔＢ，ｔｈｒＢ及びｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた後、フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ１１遺伝子を導入し、Ｏ−スクシニルホモセリン生産能を有する菌株を作製し、ＣＪＭ２−Ａ１１と命名し、追加して、実施例１−２に記載された方法と同一方法で、ｚｗｆ遺伝子を欠損させた菌株を作製し、ＣＪＭ２−Ａ１１Ｚと命名した。
【００７０】
実施例２．Ｏ−スクシニルホモセリン生産のための発酵
実施例１で作製された菌株において、ｚｗｆ遺伝子の欠損効果を確認するために、三角フラスコ培養を実施した。フラスコ培地組成は、下記表１の通りである。
また、大韓民国特許出願公開第２００９−００１８１２８号に記載されたｓｃｒＫＹＡＢＲ（以下、「ｓｃｒＯ」と記載）塩基配列を有するｐＡｓｃｒＳＭプラスミド（配列番号２８）を導入し、原糖を摂取することができる菌株を作製し、フラスコ培養を実施した。フラスコ培地組成は、下記表２の通りである。前記方法に作製された菌株は、それぞれＣＣ０３−００３８／ｐＡｓｃｒＳＭ、ＣＣ０３−００３８ｚｗｆＧＴＧ／ｐＡｓｃｒＳＭ、ＣＣ０３−０１５６／ｐＡｓｃｒＳＭ、ＣＪＭ２−Ａ１１／ｐＡｓｃｒＳＭ及びＣＪＭ２−Ａ１１Ｚ／ｐＡｓｃｒＳＭと命名した。
【００７１】
表１．フラスコ培地組成
【表１】
0006360563.tif 000002
【００７２】
表２．フラスコ培地組成
【表２】
0006360563.tif 000003
【００７３】
平板ＬＢ培地にＣＣ０３−００３８、ＣＣ０３−００３８ｚｗｆＧＴＧ、ＣＣ０３−０１５６、ＣＪＭ２−Ａ１１、ＣＪＭ２−Ａ１１Ｚ、ＣＣ０３−００３８／ｐＡｓｃｒＳＭ、ＣＣ０３−００３８ｚｗｆＧＴＧ／ｐＡｓｃｒＳＭ、ＣＣ０３−０１５６／ｐＡｓｃｒＳＭ、ＣＪＭ２−Ａ１１／ｐＡｓｃｒＳＭ及びＣＪＭ２−Ａ１１Ｚ／ｐＡｓｃｒＳＭを接種し、３３℃で一晩培養した後、単一コロニーを２ｍｌＬＢ培地に接種した後、３３℃で２時間培養し、さらに２５ｍｌフラスコ培地を含んだ２５０ｍｌ三角フラスコに、ＯＤ６００＝０．５に接種し、３３℃２００ｒｐｍで４８時間培養し、ＨＰＬＣ分析を介して、Ｏ−スクシニルホモセリン生産量を比較した。その結果を下記表３に表示する。
【００７４】
表３．フラスコ培養を介したＯ−スクシニルホモセリンの生産
【表３】
0006360563.tif 000004
【００７５】
フラスコ培養結果、ｚｗｆ遺伝子を弱化または欠損させたＣＣ０３−００３８ｚｗｆＧＴＧ，ＣＣ０３−０１５６，ＣＪＭ２−Ａ１１Ｚ，ＣＣ０３−００３８ｚｗｆＧＴＧ／ｐＡｓｃｒＳＭ，ＣＣ０３−０１５６／ｐＡｓｃｒＳＭ及びＣＪＭ２−Ａ１１Ｚ／ｐＡｓｃｒＳＭ菌株が、それぞれの対照群菌株対比で、８．９％ないし４０．０％さらに高いＯ−スクシニルホモセリン生産量を示した。また、ホモセリン生産量が減少する結果が確認され、ＴＣＡ回路が強化され、スクシニル−ＣｏＡの生産が増加したと判断することができる。
【００７６】
本発明者は、ＣＣ０３−００３８菌株及びＣＪＭ２−Ａ１１菌株において、ｚｗｆ遺伝子を弱化または欠損させるとき、高収率でＯ−スクシニルホモセリンを生産することができるということを確認し、菌株ＣＣ０３−０１５６を、ブダペスト条約下で、２０１３年１１月２２日付けで韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１１４８７Ｐを受けた。
【００７７】
ｚｗｆ遺伝子をＴＣＡ回路強化に適用するという側面で、ｚｗｆ遺伝子の弱化または欠損は、大腸菌に限定されずに、エシェリキア属（Escherichia ｓｐ．）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium ｓｐ．）、及び酵母などを含み、ＴＣＡ回路を有する微生物において、Ｏ−スクシニルホモセリンの高収率生産のために、同一に適用することができると判断される。
【００７８】
[配列リストフリーテキスト]
本明細書に記載された配列番号１ないし配列番号２８の配列が添付された配列リストに表示される。
【受託番号】
【００７９】
受託番号：ＫＣＣＭ１１４８７Ｐ
0006360563.tif 000005
0006360563.tif 000006
【配列表】
0006360563000001.app