(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］を含む第１のポリペプチドと、式ＩＩ：ａ３−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む第２のポリペプチドと、を含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質であって、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、融合されるか、またはヘテロ二量体として存在し、
式中、ａ）Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり、ｂ）Ａ２は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり、ｃ）［Ｂ］は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン、その断片であるか、または欠失されており、ｄ）Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり、ｅ）Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり、ｆ）ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域であり、
異種性ポリペプチド部分が、Ａ１−２領域、Ａ２−２領域、または両方に挿入され、
前記Ａ１−２領域は、配列番号１のアミノ酸２１８〜アミノ酸２２９の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応し、
前記Ａ２−２領域は、配列番号１のアミノ酸５７７〜アミノ酸６３５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応し、
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す、組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項２】
式Ｉ：（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］を含む第１のポリペプチドと、式ＩＩ：ａ３−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む第２のポリペプチドと、を含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質であって、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、融合されるか、またはヘテロ二量体として存在し、
式中、ａ）Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり、ｂ）Ａ２は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり、ｃ）［Ｂ］は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン、その断片であるか、または欠失されており、ｄ）Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり、ｅ）Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり、ｆ）ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域であり、
異種性ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２１、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３３６、配列番号１のアミノ酸３３９、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸４１６、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入され、
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す、組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、前記式（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］−［ａ３］−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む１本のポリペプチド鎖を形成する、請求項１または２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項４】
前記第２のポリペプチドは、前記式［ａ３］−（Ａ３）−（Ｃ１）−（Ｃ２）を含み、（Ｃ２）は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項５】
前記Ａ２−２領域は、配列番号１のアミノ酸５９５〜アミノ酸６０７の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項６】
前記異種性ポリペプチド部分が、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２１、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入される、請求項１および３〜５のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドが、第２の異種性部分を含み、前記第２の異種性部分は、許容ループ内、ａ３領域内、もしくは前記Ｂドメイン内、またはそれらの断片内に挿入される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項８】
前記第２の異種性部分が、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２１、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３３６、配列番号１のアミノ酸３３９、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸４１６、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入される、請求項７に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項９】
前記第２の異種性部分がａ３に挿入される、請求項７に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１０】
前記第２の異種性部分が、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流のａ３に挿入される、請求項９に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１１】
前記第２の異種性部分がＢドメインまたはその断片内に挿入される、請求項７に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１２】
前記第２の異種性部分が、配列番号１のアミノ酸７４５に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入される、請求項７または１１に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１３】
３つ、４つ、５つ、または６つの異種性部分を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１４】
少なくとも１つの異種性部分が、前記ＦＶＩＩＩ配列に挿入される１つ以上のアミノ酸の配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１５】
少なくとも１つの異種性部分が、前記タンパク質のインビボ半減期を増加させる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１６】
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質の前記インビボ半減期を増加させる前記異種性部分は、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、Ｆｃ、プロリン−アラニン−セリンアミノ酸カセット配列（ＰＡＳ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１７】
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質の前記インビボ半減期を増加させる前記異種性部分は、クリアランス受容体、またはその断片を含み、前記クリアランス受容体は、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体への前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質の結合を遮断し、前記クリアランス受容体は、低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）またはそのＦＶＩＩＩ結合断片である、請求項１５に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１８】
少なくとも１つの異種性部分は、前記タンパク質の安定性を増加させる要素を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項１９】
前記組換えタンパク質は、天然ＦＶＩＩＩの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の前記凝血促進活性を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項２０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが互いに融合し、それにより１本鎖ポリペプチドを形成する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項２１】
配列番号１に対応する残基１６４５、残基１６４８、または残基１６４５と１６４８の両方におけるアミノ酸残基が、アルギニンではない、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２４】
前記ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、またはそれらの誘導体である、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ＳＶ４０型ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、エプスタイン・バールウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびポリオウイルスベクターから選択される、請求項２４に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
前記レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター、およびラウス肉腫ウイルスベクターから選択される、請求項２５に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
前記単離された核酸は、プロモーターまたは制御配列に作動可能に連結している、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２２に記載の単離された核酸または請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２９】
組換えＦＶＩＩＩタンパク質を産生する方法であって、請求項２８に記載の宿主細胞を、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質が発現される条件下で培養することを含む、方法。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質、請求項２２に記載の単離された核酸、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の発現ベクター、または請求項２８に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項３１】
必要性のある患者において凝血疾患または病態を予防する、治療する、寛解させる、または管理するための、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質を作製する方法であって、異種性部分を、特定された許容箇所に挿入することを含み、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す、方法。
【請求項３３】
前記凝血疾患または病態は、血友病である、請求項３１に記載の用途のための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
血友病は、血液凝固がある特定の血漿中凝血因子の欠如によって妨げられる、出血障害である。血友病Ａおよび血友病Ｂは、それぞれ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）および第ＩＸ因子の欠損によって引き起こされる、２つの異なる種類の血友病である。
【０００２】
血友病Ａは、突発性出血および外傷後の過剰な出血によって特徴付けられる。やがて、筋肉および関節への反復的な出血（幼少期に始まることが多い）が、血友病性関節症および不可逆的な関節損傷をもたらす。この損傷は進行性であり、関節の非常に限定された可動性、筋萎縮症、および慢性痛に至る可能性がある（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍｅｒｃｈａｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２９：８７−９６（２００３）、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０００３】
血友病Ｂ（クリスマス病としても知られる）は、世界中で最も一般的な遺伝性出血障害のうちの１つである。それは、減少したインビボおよびインビトロ血液凝血活性をもたらし、侵された個人の生涯全体を通じて広範な医療監視を必要とする。介入の不在下では、罹患した個人は、関節における突発性出血を患うことになり、それは重度の疼痛および消耗性の不動状態をもたし、筋肉中への出血は、筋肉組織内での血液の蓄積をもたらし、咽喉および頚部における突発性出血は、即座に処置されない場合、窒息を引き起こし得、腎出血、ならびに外科手術、ささいな偶発性損傷、または抜歯後の重度の出血もまたよく見られる。
血友病の治療は、ＦＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子活性の回復を目的とする補充療法によるものである。血友病Ａの治療は、ＦＶＩＩＩ活性を正常レベルの１〜５％まで回復させて、突発性出血を予防することを目的とする補充療法による（Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７７３−１７７９（２００１）、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。出血エピソードをオンデマンドで治療する、または予防的に治療することによって出血エピソードが起こることを予防するために利用可能な、血漿由来および組換えＦＶＩＩＩ製剤がある。これらの製剤の半減期に基づいて、治療レジメンは、頻繁な静脈内投与を必要とする。かかる頻繁な投与は、痛みを伴い、かつ不都合である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍｅｒｃｈａｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２９：８７−９６（２００３）
【非特許文献２】Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７７３−１７７９（２００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、式Ｉ：（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］を含む第１のポリペプチドと、式ＩＩ：ａ３−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む第２のポリペプチドとを含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質を提供し、この第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、融合されるか、またはヘテロ二量体として存在し、式中、ａ）Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり、ｂ）Ａ２は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり、ｃ）［Ｂ］は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン、その断片であるか、または欠失されているか、もしくは任意に不在であり、ｄ）Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり、ｅ）Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり、ｆ）ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域であり、このＡ１ドメインは、許容ループ−１（Ａ１−１）領域および許容ループ−２（Ａ１−２）領域を含み、このＡ２ドメインは、許容ループ−１（Ａ２−１）領域および許容ループ−２（Ａ２−２）領域を含み、このＡ３ドメインは、許容ループ−１（Ａ３−１）領域および許容ループ−２（Ａ３−２）領域を含み、この領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも１つは、異種性部分を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す。
【０００６】
本開示はさらに、式Ｉ：（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］を含む第１のポリペプチドと、式ＩＩ：ａ３−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む第２のポリペプチドとを含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質を提供し、この第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、融合されるか、またはヘテロ二量体として存在し、式中、ａ）Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり、ｂ）Ａ２は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり、ｃ）［Ｂ］は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン、その断片であるか、または欠失されているか、もしくは任意に不在であり、ｄ）Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり、ｅ）Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり、ｆ）ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域であり、ａ３は、異種性部分を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す。
【０００７】
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、式（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］−［ａ３］−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む１本のポリペプチド鎖を形成する、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質がさらに提供される。第２のポリペプチドが式［ａ３］−（Ａ３）−（Ｃ１）−（Ｃ２）を含み、式中、（Ｃ２）がＦＶＩＩＩのＣ２ドメインである）、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質がさらに提供される。
【０００８】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質の許容ループは、表面が露出した柔軟なループ構造内に含有される。例えば、ＤＳＳＰデータベースの受入番号２Ｒ７Ｅとして保管される成熟ＦＶＩＩＩの二次構造によると、Ａ１−１は、βストランド１とβストランド２との間に位置し、Ａ１−２は、βストランド１１とβストランド１２との間に位置し、Ａ２−１は、βストランド２２とβストランド２３との間に位置し、Ａ２−２は、βストランド３２とβストランド３３との間に位置し、Ａ３−１は、βストランド３８とβストランド３９との間に位置し、Ａ３−２は、βストランド４５とβストランド４６との間に位置する。ある特定の態様において、Ａ１−１を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１５〜アミノ酸約４５、例えば、配列番号１のアミノ酸約１８〜アミノ酸約４１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ１−２を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約２０１〜アミノ酸約２３２、例えば、配列番号１のアミノ酸約２１８〜アミノ酸約２２９の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ２−１を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約３９５〜アミノ酸約４２１、例えば、配列番号１のアミノ酸約３９７〜アミノ酸約４１８の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ２−２を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約５７７〜アミノ酸約６３５、例えば、配列番号１のアミノ酸約５９５〜アミノ酸約６０７の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ３−１を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１７０５〜アミノ酸約１７３２、例えば、配列番号１のアミノ酸約１７１１〜アミノ酸約１７２５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ３−２を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１８８４〜アミノ酸約１９１７、例えば、配列番号１のアミノ酸約１８９９〜アミノ酸約１９１１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。いくつかの実施形態において、ａ３は、配列番号１のアミノ酸約１６４９〜アミノ酸１６８９の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。
【０００９】
ある特定の態様において、領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも２つは、異種性部分を含む。
【００１０】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応する挿入部位において異種性部分を含む。
【００１１】
ある特定の態様において、少なくとも１つの許容ループが異種性部分を含む、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ａ３においてさらなる異種性部分をさらに含む。例えば、ａ３領域は、配列番号１のアミノ酸約１６４９〜アミノ酸約１６８９である。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質のａ３は、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位においてさらなる異種性部分を含む。
【００１２】
ある特定の態様において、ａ３が異種性部分を含む、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、上述の領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも１つにおいてさらなる異種性部分をさらに含む。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ａ３において異種性部分、および上述の領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも１つにおいて２つのさらなる異種性部分を含む。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ａ３において異種性部分、および上述の領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも１つにおいて３つのさらなる異種性部分を含む。
【００１３】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上のアミノ酸の配列を含む、少なくとも１つの異種性部分を含む。
【００１４】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、タンパク質の半減期、例えば、インビボ半減期を増加させる、少なくとも１つの異種性部分を含む。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を増加させる異種性部分は、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ）、ＸＴＥＮ、Ｆｃ、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を増加させる異種性部分は、クリアランス受容体、またはその断片を含み、このクリアランス受容体は、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体への組換えＦＶＩＩＩタンパク質の結合を遮断する。ある特定の態様において、クリアランス受容体は、低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）またはそのＦＶＩＩＩ結合断片である。
【００１５】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の可視化または位置特定を可能にするペプチドまたはポリペプチドを含む、少なくとも１つの異種性部分を含む。可視化または位置特定は、インビトロ、インビボ、エクスビボ、またはそれらの任意の組み合わせで可能にされ得る。ある特定の態様において、可視化または位置特定を可能にするペプチドまたはポリペプチドは、ビオチンアクセプターペプチド、リポ酸アクセプターペプチド、蛍光タンパク質、二ヒ素色素のライゲーションのためまたは準安定テクネチウム複合体化のためのシステイン含有ペプチド、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの近接アッセイのためのユウロピウムクラスレート複合体化のためのペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の態様において、蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、またはＥＹＦＰである。ある特定の態様において、二ヒ素色素は、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン（ｄｉｔｈｉｏａｒｓｏｌａｎ）−２−イル）フルオレセイン（ＦｌＡｓＨ）である。ある特定の態様において、ビオチンアクセプターペプチドは、アビジンベースおよびストレプトアビジンベースの試薬の複合体化を容易にする。ある特定の態様において、リポ酸アクセプターペプチドは、結合されたリポ酸へのチオール反応性プローブの複合体化または蛍光リポ酸類似体の直接のライゲーションを容易にする。
【００１６】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、タンパク質の安定性を増加させる、少なくとも１つの異種性部分を含む。
【００１７】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、天然ＦＶＩＩＩの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の凝血促進活性を有する。凝血促進活性は、例えば、発色基質アッセイ、一段式凝血アッセイ、または両方によって、測定することができる。
【００１８】
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードする配列を含む単離された核酸、または単離された核酸分子を含むベクター、例えば、発現ベクター、もしくは宿主細胞がさらに提供される。ある特定の態様において、宿主細胞は、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現し、この発現は、インビボまたはインビトロであり得る。本発明の宿主細胞を、組換えＦＶＩＩＩタンパク質が発現される条件下で培養することを含む、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質を産生する方法がさらに提供される。
【００１９】
本発明はさらに、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質、本発明の単離された核酸、本発明の発現ベクター、または本発明の宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物を提供する。
【００２０】
有効量の本発明の組成物を投与することによって、必要性のある患者において凝血疾患または病態を予防する、治療する、寛解させる、または管理する方法がさらに提供される。本発明の組成物を用いて、患者において凝血疾患または病態を診断するまたは画像診断するための方法がさらに提供される。
【００２１】
異種性部分を、特定される許容箇所に挿入することを含む、本発明の組換えＦＶＩＩＩポリペプチドを作製する方法がさらに提供され、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す。ある特定の態様において、特定される許容箇所は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２である。ある特定の態様において、本方法は、異種性部分を、領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも２つに挿入することを含む。ある特定の態様において、本方法は、異種性部分を、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入することを含む。ある特定の態様において、本方法は、異種性部分を、配列番号１のアミノ酸１８８、配列番号１のアミノ酸２２１、配列番号１のアミノ酸３３３、配列番号１のアミノ酸３３６、配列番号１のアミノ酸３３９、配列番号１のアミノ酸４１６、配列番号１のアミノ酸４４２、配列番号１のアミノ酸４９０、配列番号１のアミノ酸７１３、配列番号１のアミノ酸１７９６、配列番号１のアミノ酸１８０２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸のアミノ酸の直ぐ下流に挿入することを含む。ある特定の態様において、本方法は、さらなる異種性部分を、ａ３に、例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に、挿入すること含む。
【００２２】
ある特定の態様において、本方法は、ＦＶＩＩＩ配列に挿入された１つ以上のアミノ酸の配列を含む、異種性部分を挿入することを含む。ある特定の態様において、本方法は、タンパク質の半減期、例えば、インビボ半減期を増加させる、異種性部分を挿入することを含む。ある特定の態様において、本方法は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の可視化または位置特定を可能にするペプチドまたはポリペプチドを含む、異種性部分を挿入することを含む。
【００２３】
他の態様において、本発明は、本明細書に記載される組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを設計することを含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質を構築する方法を含む。
【００２４】
本開示はまた、少なくとも１つの異種性部分を、組換えＦＶＩＩＩタンパク質のａ３酸性スペーサー領域に挿入することを含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加させる方法も提供し、このａ３領域への少なくとも１つの異種性部分の挿入は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含まない対応する組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の増加した発現をもたらす。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの１つに挿入された、１つのさらなる異種性部分をさらに含み、このａ３領域への少なくとも１つの異種性部分の挿入は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含まない対応する組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の増加した発現をもたらす。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの１つ以上に挿入された、２つのさらなる異種性部分をさらに含み、このａ３領域への少なくとも１つの異種性部分の挿入は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含まない対応する組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の増加した発現をもたらす。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、３つのさらなる異種性部分をさらに含み、このａ３領域への少なくとも１つのさらなる異種性部分の挿入は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含まない対応する組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の増加した発現をもたらす。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、４つのさらなる異種性部分をさらに含み、このａ３領域への少なくとも１つのさらなる異種性部分の挿入は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含まない対応する組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の増加した発現をもたらす。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、５つのさらなる異種性部分をさらに含み、このａ３領域への少なくとも１つのさらなる異種性部分の挿入は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含まない対応する組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の増加した発現をもたらす。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、６つのさらなる異種性部分をさらに含み、このａ３領域への少なくとも１つのさらなる異種性部分の挿入は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含まない対応する組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の増加した発現をもたらす。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
式Ｉ：（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］を含む第１のポリペプチドと、式ＩＩ：ａ３−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む第２のポリペプチドと、を含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質であって、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、融合されるか、またはヘテロ二量体として存在し、
式中、ａ）Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり、ｂ）Ａ２は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり、ｃ）［Ｂ］は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン、その断片であるか、または欠失されており、ｄ）Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり、ｅ）Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり、ｆ）ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域であり、
前記Ａ１ドメインは、許容ループ−１（Ａ１−１）領域および許容ループ−２（Ａ１−２）領域を含み、
前記Ａ２ドメインは、許容ループ−１（Ａ２−１）領域および許容ループ−２（Ａ２−２）領域を含み、
前記Ａ３ドメインは、許容ループ−１（Ａ３−１）領域および許容ループ−２（Ａ３−２）領域を含み、
異種性部分が、前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも１つに挿入され、
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す、組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２）
式Ｉ：（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］を含む第１のポリペプチドと、式ＩＩ：ａ３−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む第２のポリペプチドと、を含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質であって、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、融合されるか、またはヘテロ二量体として存在し、
式中、ａ）Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり、ｂ）Ａ２は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり、ｃ）［Ｂ］は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン、その断片であるか、または欠失されているか、もしくは任意に不在であり、ｄ）Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり、ｅ）Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり、ｆ）ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域であり、
異種性部分が、ａ３に挿入され、
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す、組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３）
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、前記式（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］−［ａ３］−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む１本のポリペプチド鎖を形成する、項目１または項目２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目４）
前記第２のポリペプチドは、前記式［ａ３］−（Ａ３）−（Ｃ１）−（Ｃ２）を含み、（Ｃ２）は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインである、項目１〜３のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目５）
前記許容ループは、表面が露出した柔軟なループ構造内に含有され、ＤＳＳＰデータベースの受入番号２Ｒ７Ｅとして保管される成熟第ＶＩＩＩ因子の二次構造に従って、Ａ１−１は、βストランド１とβストランド２との間に位置し、Ａ１−２は、βストランド１１とβストランド１２との間に位置し、Ａ２−１は、βストランド２２とβストランド２３との間に位置し、Ａ２−２は、βストランド３２とβストランド３３との間に位置し、
Ａ３−１は、βストランド３８とβストランド３９との間に位置し、Ａ３−２は、βストランド４５とβストランド４６との間に位置する、項目１、３、または４のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目６）
Ａ１−１を含む、前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１５〜アミノ酸約４５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目７）
Ａ１−１は、配列番号１のアミノ酸約１８〜アミノ酸約４１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目６に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８）
Ａ１−２を含む、前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約２０１〜アミノ酸約２３２の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９）
Ａ１−２は、配列番号１のアミノ酸約２１８〜アミノ酸約２２９の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目８に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１０）
Ａ２−１を含む、前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約３９５〜アミノ酸約４２１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１１）
Ａ２−１は、配列番号１のアミノ酸約３９７〜アミノ酸約４１８の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目１０に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１２）
Ａ２−２を含む、前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約５７７〜アミノ酸約６３５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１３）
Ａ２−２は、配列番号１のアミノ酸約５９５〜アミノ酸約６０７天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目１２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１４）
Ａ３−１を含む、前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１７０５〜アミノ酸約１７３２の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１５）
Ａ３−１は、配列番号１のアミノ酸約１７１１〜アミノ酸約１７２５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目１４に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１６）
Ａ３−２を含む、前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１８８４〜アミノ酸約１９１７の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１７）
Ａ３−２は、配列番号１のアミノ酸約１８９９〜アミノ酸約１９１１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目１６に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１８）
異種性部分が、前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも２つに挿入される、項目１または３〜１７のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１９）
異種性部分が、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入される、項目１または３〜１８のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２０）
さらなる異種性部分が、ａ３に挿入される、項目１または３〜１９のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２１）
前記さらなる異種性部分が、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流のａ３に挿入される、項目２０に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２２）
２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのさらなる異種性部分をさらに含む、項目１または３〜２１のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２３）
前記Ａ１ドメインは、許容ループ−１（Ａ１−１）領域および許容ループ−２（Ａ１−２）領域を含み、
前記Ａ２ドメインは、許容ループ−１（Ａ２−１）領域および許容ループ−２（Ａ２−２）領域を含み、
前記Ａ３ドメインは、許容ループ−１（Ａ３−１）領域および許容ループ−２（Ａ３−２）領域を含み、
さらなる異種性部分が、前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも１つに挿入される、項目２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２４）
さらなる異種性部分が、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入される、項目２または項目２３に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２５）
少なくとも１つの異種性部分が、前記ＦＶＩＩＩ配列に挿入される１つ以上のアミノ酸の配列を含む、項目１〜２４のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２６）
少なくとも１つの異種性部分が、前記タンパク質のインビボ半減期を増加させる要素を含む、項目１〜２５のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２７）
記組換えＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ半減期を増加させる前記要素は、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、Ｆｃ、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの組み合わせを含む、項目２６に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２８）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ半減期を増加させる前記要素は、クリアランス受容体、またはその断片を含み、前記クリアランス受容体は、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体への前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質の結合を遮断する、項目２６に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目２９）
前記クリアランス受容体は、低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）またはそのＦＶＩＩＩ結合断片である、項目２８に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３０）
少なくとも１つの異種性部分が、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質の可視化または位置特定を可能にするペプチドまたはポリペプチドを含む、項目１〜２９のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３１）
可視化または位置特定は、インビトロ、インビボ、エクスビボ、またはそれらの任意の組み合わせで可能にされる、項目３０に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３２）
視化または位置特定を可能にする前記ペプチドまたはポリペプチドは、ビオチンアクセプターペプチド、リポ酸アクセプターペプチド、蛍光タンパク質、二ヒ素色素のライゲーションのためまたは準安定テクネチウム複合体化のためのシステイン含有ペプチド、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの近接アッセイのためのユウロピウムクラスレート複合体化のためのペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目３０または項目３１に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３３）
前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、またはＥＹＦＰである、項目３２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３４）
前記二ヒ素色素は、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン（ｄｉｔｈｉｏａｒｓｏｌａｎ）−２−イル）フルオレセイン（ＦｌＡｓＨ）である、項目３２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３５）
前記ビオチンアクセプターペプチドは、アビジンベースおよびストレプトアビジンベースの試薬の複合体化を容易にする、項目３２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３６）
前記リポ酸アクセプターペプチドは、結合されたリポ酸へのチオール反応性プローブの複合体化または蛍光リポ酸類似体の直接のライゲーションを容易にする、項目３２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３７）
少なくとも１つの異種性部分が、前記タンパク質の安定性を増加させる要素を含む、項目１〜３６のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３８）
前記組換えタンパク質は、天然ＦＶＩＩＩの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の前記凝血促進活性を有する、項目１〜３７のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目３９）
凝血促進活性は、発色基質アッセイ、一段式凝血アッセイ、または両方によって測定される、項目１〜３８のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目４０）
項目１〜３９のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードする配列を含む、単離された核酸。
（項目４１）
項目４０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目４２）
項目４０に記載の単離された核酸または項目３９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目４３）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、インビボで発現される、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４４）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、インビトロで発現される、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４５）
組換えＦＶＩＩＩタンパク質を産生する方法であって、項目４２に記載の宿主細胞を、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質が発現される条件下で培養することを含む、方法。
（項目４６）
項目１〜３９のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質、項目４０に記載の単離された核酸、項目４１に記載の発現ベクター、または項目４２〜４４のいずれか１項に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、組成物。
（項目４７）
有効量の項目４６に記載の組成物を投与することによって、必要性のある患者において凝血疾患または病態を予防する、治療する、寛解させる、または管理する方法。
（項目４８）
項目４６に記載の組成物を用いて、患者において凝血疾患または病態を診断するまたは画像診断するための方法。
（項目４９）
組換えＦＶＩＩＩタンパク質を作製する方法であって、異種性部分を、特定された許容箇所に挿入することを含み、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す、方法。
（項目５０）
前記特定された許容箇所は、許容ループである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記許容ループ領域は、前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２からなる群から選択される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
異種性部分が、前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも２つに挿入される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記異種性部分は、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入される、項目４９または５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
異種性部分が、配列番号１のアミノ酸１８８、配列番号１のアミノ酸２２１、配列番号１のアミノ酸３３３、配列番号１のアミノ酸３３６、配列番号１のアミノ酸３３９、配列番号１のアミノ酸４１６、配列番号１のアミノ酸４４２、配列番号１のアミノ酸４９０、配列番号１のアミノ酸７１３、配列番号１のアミノ酸１７９６、配列番号１のアミノ酸１８０２、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入される、項目４９に記載の方法。
（項目５５）
さらなる異種性部分が、ａ３に挿入される、項目４９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記さらなる異種性部分は、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流のａ３に挿入される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
少なくとも１つの異種性部分が、前記ＦＶＩＩＩ配列を含む１つ以上のアミノ酸の配列に挿入される、項目４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
少なくとも１つの異種性部分が、前記タンパク質のインビボ半減期を増加させる、項目４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
少なくとも１つの異種性部分が、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質の可視化または位置特定を可能にするペプチドまたはポリペプチドを含む、項目４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加させる方法であって、少なくとも１つの異種性部分を、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質のａ３酸性スペーサー領域に挿入することを含み、前記ａ３領域への少なくとも１つの異種性部分の前記挿入は、前記ａ３領域に挿入される前記少なくとも１つの異種性部分を含まない対応する前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質の増加した発現をもたらす、方法。
（項目６１）
前記異種性部分は、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流のａ３に挿入される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ領域に挿入された少なくとも１つのさらなる異種性部分を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ領域に挿入された２つのさらなる異種性部分を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ領域に挿入された３つのさらなる異種性部分を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ領域に挿入された４つのさらなる異種性部分を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６６）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ領域に挿入された５つのさらなる異種性部分を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６７）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ領域に挿入された６つのさらなる異種性部分を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６８）
前記許容ループ領域は、前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２からなる群から選択される、項目６２〜６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
前記異種性部分は、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入される、項目６２〜６７のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、相互に融合され、それによって１本鎖ポリペプチドを形成する、項目１〜３８のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質、項目４０に記載の核酸、項目４１に記載のベクター、項目の４２〜４４いずれか１項に記載の宿主細胞、または項目４５〜６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記本鎖ポリペプチドは、成熟完全長ＦＶＩＩＩ配列に対応する残基１６４５、残基１６４８、または残基１６４５および１６４８の両方において１つ以上の置換、欠失、または突然変異を含有する、項目７０に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、または方法。
（項目７２）
残基１６４５、残基１６４８、または残基１６４５および１６４８の両方における前記アミノ酸残基は、アルギニンでない、項目７１に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、または方法。
（項目７３）
前記１本鎖ポリペプチドは、プロセシングされていない、項目７０に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、または方法。
（項目７４）
前記ＦＶＩＩＩタンパク質の凝血促進活性を排除するまたは低減することなくＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を増加させる方法であって、異種性部分を、特定された許容箇所に挿入することを含み、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性および前記異種性部分を含まない前記ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して増加した半減期を示す、方法。
（項目７５）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性および前記異種性部分を含まない前記ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して増加した半減期を有する、項目４９〜６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７６）
式Ｉ：（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］を含む第１のポリペプチドと、式ＩＩ：ａ３−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む第２のポリペプチドと、を含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質であって、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、融合されるか、またはヘテロ二量体として存在し、
式中、ａ）Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり、ｂ）Ａ２は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり、ｃ）［Ｂ］は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン、その断片であるか、または欠失されており、ｄ）Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり、ｅ）Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり、ｆ）ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域であり、
前記Ａ１ドメインは、許容ループ−１（Ａ１−１）領域および許容ループ−２（Ａ１−２）領域を含み、
前記Ａ２ドメインは、許容ループ−１（Ａ２−１）領域および許容ループ−２（Ａ２−２）領域を含み、
前記Ａ３ドメインは、許容ループ−１（Ａ３−１）領域および許容ループ−２（Ａ３−２）領域を含み、
前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、またはａ３のうちの少なくとも１つは、異種性部分を含み、
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す、組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目７７）
前記許容ループは、表面が露出した柔軟なループ構造内に含有され、ＤＳＳＰデータベースの受入番号２Ｒ７Ｅとして保管される成熟第ＶＩＩＩ因子の二次構造に従って、Ａ１−１は、βストランド１とβストランド２との間に位置し、Ａ１−２は、βストランド１１とβストランド１２との間に位置し、Ａ２−１は、βストランド２２とβストランド２３との間に位置し、Ａ２−２は、βストランド３２とβストランド３３との間に位置し、Ａ３−１は、βストランド３８とβストランド３９との間に位置し、Ａ３−２は、βストランド４５とβストランド４６との間に位置する、項目１、３、４、または７６のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目７８）
Ａ１−１を含む、前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１５〜アミノ酸約４５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５または７７に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目７９）
Ａ１−１は、配列番号１のアミノ酸約１８〜アミノ酸約４１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目７８に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８０）
Ａ１−２を含む前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約２０１〜アミノ酸約２３２の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５〜８および７７〜７９のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８１）
Ａ１−２は、配列番号１のアミノ酸約２１８〜アミノ酸約２２９の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目８０に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８２）
Ａ２−１を含む前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約３９５〜アミノ酸約４２１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５〜９および７７〜８１のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８３）
Ａ２−１は、配列番号１のアミノ酸約３９７〜アミノ酸約４１８の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目８２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８４）
Ａ２−２を含む前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約５７７〜アミノ酸約６３５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５〜１１および７７〜８３のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８５）
Ａ２−２は、配列番号１のアミノ酸約５９５〜アミノ酸約６０７天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目８４に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８６）
Ａ３−１を含む前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１７０５〜アミノ酸約１７３２の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５〜１３および７７〜８５のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８７）
Ａ３−１は、配列番号１のアミノ酸約１７１１〜アミノ酸約１７２５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目８６に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８８）
Ａ３−２を含む前記表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１８８４〜アミノ酸約１９１７の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目５〜１５および７７〜８７のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目８９）
Ａ３−２は、配列番号１のアミノ酸約１８９９〜アミノ酸約１９１１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目８８に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９０）
前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、またはａ３のうちの少なくとも２つの各々は、異種性部分を含む、項目１〜１７および７６〜８９のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９１）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応する挿入部位において異種性部分を含む、項目１、３〜１８、または７６〜９０のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９２）
ａ３は、さらなる異種性部分を含む、項目１、３〜１９、または７６〜９１のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９３）
ａ３は、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位において前記さらなる異種性部分を含む、項目９２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９４）
前記Ａ１ドメインは、許容ループ−１（Ａ１−１）領域および許容ループ−２（Ａ１−２）領域を含み、
前記Ａ２ドメインは、許容ループ−１（Ａ２−１）領域および許容ループ−２（Ａ２−２）領域を含み、
前記Ａ３ドメインは、許容ループ−１（Ａ３−１）領域および許容ループ−２（Ａ３−２）領域を含み、
前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも１つは、さらなる異種性部分を含む、項目２に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９５）
Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２は、項目５〜１７のいずれか１項に記載されるように定義される、項目９４に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９６）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応する挿入部位においてさらなる異種性部分を含む、項目２、２３、９３、または９４に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９７）
前記異種性部分のうちの少なくとも１つは、前記タンパク質の半減期を増加させる、項目１〜２５または７６〜９６のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９８）
前記異種性部分のうちの少なくとも１つは、前記タンパク質の安定性を増加させる、項目１〜３６または７６〜９７のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目９９）
ａ３は、配列番号１のアミノ酸約１６４９〜アミノ酸約１６８９の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する、項目２〜４、２０、２１、２３、２４〜３９、７０〜７３、または７６〜９８のいずれか１項に記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質。
（項目１００）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、インビトロまたはインビボで発現される、項目４５に記載の方法。
（項目１０１）
前記凝血疾患または病態は、血友病である、項目４７または４８に記載の方法。
（項目１０２）
Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２は、項目５〜１７のいずれか１項に記載されるように定義される、項目５１に記載の方法。
（項目１０３）
前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも２つの各々は、異種性部分を含む、項目５０、１０１、または１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応する挿入部位において前記異種性部分を含む、項目４９〜５２、１０２、または１０３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０５）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１のアミノ酸１８８、配列番号１のアミノ酸２２１、配列番号１のアミノ酸３３３、配列番号１のアミノ酸３３６、配列番号１のアミノ酸３３９、配列番号１のアミノ酸４１６、配列番号１のアミノ酸４４２、配列番号１のアミノ酸４９０、配列番号１のアミノ酸７１３、配列番号１のアミノ酸１７９６、配列番号１のアミノ酸１８０２、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応する挿入部位において前記異種性部分を含む、項目４９〜５２、１０２、または１０３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０６）
ａ３は、さらなる異種性部分を含む、項目４９〜５４または１０２〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０７）
ａ３は、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位において前記さらなる異種性部分を含む、項目５５または１０６に記載の方法。
（項目１０８）
組換えＦＶＩＩＩタンパク質を構築する方法であって、前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を設計することを含み、
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、式Ｉ：（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］を含む第１のポリペプチドと、式ＩＩ：ａ３−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む第２のポリペプチドと、を含み、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドは、融合されるか、またはヘテロ二量体として存在し、
式中、ａ）Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり、ｂ）Ａ２は、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり、ｃ）［Ｂ］は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン、その断片であるか、または欠失されており、ｄ）Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり、ｅ）Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり、ｆ）ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域であり、
前記Ａ１ドメインは、許容ループ−１（Ａ１−１）領域および許容ループ−２（Ａ１−２）領域を含み、
前記Ａ２ドメインは、許容ループ−１（Ａ２−１）領域および許容ループ−２（Ａ２−２）領域を含み、
前記Ａ３ドメインは、許容ループ−１（Ａ３−１）領域および許容ループ−２（Ａ３−２）領域を含み、
前記領域Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、またはａ３のうちの少なくとも１つは、異種性部分を含み、
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す、方法。
（項目１０９）
前記組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、項目３〜３９、７０〜７３、または７７〜９８のいずれか１項に記載されるように定義される、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、またはａ３は、項目５〜１７または２１のいずれか１項に記載されるように定義される、項目１０８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】（パネル１Ａ〜１Ｇ）配列番号２として提示される、成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ヒトＦＶＩＩＩ構築物の一次配列およびドメイン構造を描写する。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限部位の箇所が示される。アミノ酸付番は、成熟ＦＶＩＩＩの一次配列（配列番号１）におけるアミノ酸位置に対応することに留意されたい。個々のドメインが、灰色の線／ボックスによって境界を付けられており、灰色の文字でドメイン識別が与えられる。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、破線のボックスにより示される。中実のくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの活性化の際のトロンビン切断の部位を示す。塗りつぶされていないくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩの２本鎖型への細胞内タンパク質分解プロセシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを容易にするためにｃＤＮＡに導入された、固有の非天然制限部位（ＮｈｅＩ、ｇｃｔａｇｃ；ＣｌａＩ、ａｔｃｇａｔ）が、二重下線と共に灰色でハイライトされる。
【図１Ｂ】（パネル１Ａ〜１Ｇ）配列番号２として提示される、成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ヒトＦＶＩＩＩ構築物の一次配列およびドメイン構造を描写する。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限部位の箇所が示される。アミノ酸付番は、成熟ＦＶＩＩＩの一次配列（配列番号１）におけるアミノ酸位置に対応することに留意されたい。個々のドメインが、灰色の線／ボックスによって境界を付けられており、灰色の文字でドメイン識別が与えられる。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、破線のボックスにより示される。中実のくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの活性化の際のトロンビン切断の部位を示す。塗りつぶされていないくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩの２本鎖型への細胞内タンパク質分解プロセシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを容易にするためにｃＤＮＡに導入された、固有の非天然制限部位（ＮｈｅＩ、ｇｃｔａｇｃ；ＣｌａＩ、ａｔｃｇａｔ）が、二重下線と共に灰色でハイライトされる。
【図１Ｃ】（パネル１Ａ〜１Ｇ）配列番号２として提示される、成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ヒトＦＶＩＩＩ構築物の一次配列およびドメイン構造を描写する。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限部位の箇所が示される。アミノ酸付番は、成熟ＦＶＩＩＩの一次配列（配列番号１）におけるアミノ酸位置に対応することに留意されたい。個々のドメインが、灰色の線／ボックスによって境界を付けられており、灰色の文字でドメイン識別が与えられる。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、破線のボックスにより示される。中実のくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの活性化の際のトロンビン切断の部位を示す。塗りつぶされていないくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩの２本鎖型への細胞内タンパク質分解プロセシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを容易にするためにｃＤＮＡに導入された、固有の非天然制限部位（ＮｈｅＩ、ｇｃｔａｇｃ；ＣｌａＩ、ａｔｃｇａｔ）が、二重下線と共に灰色でハイライトされる。
【図１Ｄ】（パネル１Ａ〜１Ｇ）配列番号２として提示される、成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ヒトＦＶＩＩＩ構築物の一次配列およびドメイン構造を描写する。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限部位の箇所が示される。アミノ酸付番は、成熟ＦＶＩＩＩの一次配列（配列番号１）におけるアミノ酸位置に対応することに留意されたい。個々のドメインが、灰色の線／ボックスによって境界を付けられており、灰色の文字でドメイン識別が与えられる。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、破線のボックスにより示される。中実のくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの活性化の際のトロンビン切断の部位を示す。塗りつぶされていないくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩの２本鎖型への細胞内タンパク質分解プロセシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを容易にするためにｃＤＮＡに導入された、固有の非天然制限部位（ＮｈｅＩ、ｇｃｔａｇｃ；ＣｌａＩ、ａｔｃｇａｔ）が、二重下線と共に灰色でハイライトされる。
【図１Ｅ】（パネル１Ａ〜１Ｇ）配列番号２として提示される、成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ヒトＦＶＩＩＩ構築物の一次配列およびドメイン構造を描写する。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限部位の箇所が示される。アミノ酸付番は、成熟ＦＶＩＩＩの一次配列（配列番号１）におけるアミノ酸位置に対応することに留意されたい。個々のドメインが、灰色の線／ボックスによって境界を付けられており、灰色の文字でドメイン識別が与えられる。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、破線のボックスにより示される。中実のくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの活性化の際のトロンビン切断の部位を示す。塗りつぶされていないくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩの２本鎖型への細胞内タンパク質分解プロセシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを容易にするためにｃＤＮＡに導入された、固有の非天然制限部位（ＮｈｅＩ、ｇｃｔａｇｃ；ＣｌａＩ、ａｔｃｇａｔ）が、二重下線と共に灰色でハイライトされる。
【図１Ｆ】（パネル１Ａ〜１Ｇ）配列番号２として提示される、成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ヒトＦＶＩＩＩ構築物の一次配列およびドメイン構造を描写する。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限部位の箇所が示される。アミノ酸付番は、成熟ＦＶＩＩＩの一次配列（配列番号１）におけるアミノ酸位置に対応することに留意されたい。個々のドメインが、灰色の線／ボックスによって境界を付けられており、灰色の文字でドメイン識別が与えられる。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、破線のボックスにより示される。中実のくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの活性化の際のトロンビン切断の部位を示す。塗りつぶされていないくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩの２本鎖型への細胞内タンパク質分解プロセシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを容易にするためにｃＤＮＡに導入された、固有の非天然制限部位（ＮｈｅＩ、ｇｃｔａｇｃ；ＣｌａＩ、ａｔｃｇａｔ）が、二重下線と共に灰色でハイライトされる。
【図１Ｇ】（パネル１Ａ〜１Ｇ）配列番号２として提示される、成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ヒトＦＶＩＩＩ構築物の一次配列およびドメイン構造を描写する。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限部位の箇所が示される。アミノ酸付番は、成熟ＦＶＩＩＩの一次配列（配列番号１）におけるアミノ酸位置に対応することに留意されたい。個々のドメインが、灰色の線／ボックスによって境界を付けられており、灰色の文字でドメイン識別が与えられる。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、破線のボックスにより示される。中実のくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの活性化の際のトロンビン切断の部位を示す。塗りつぶされていないくさび／三角形は、ＦＶＩＩＩの２本鎖型への細胞内タンパク質分解プロセシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを容易にするためにｃＤＮＡに導入された、固有の非天然制限部位（ＮｈｅＩ、ｇｃｔａｇｃ；ＣｌａＩ、ａｔｃｇａｔ）が、二重下線と共に灰色でハイライトされる。
【図２】ドメイン構成ならびに天然および非天然制限部位の箇所を示す、図１に記載されるＦＶＩＩＩ構築物の図式表示を提供する。
【図３】構造データセット２Ｒ７Ｅ、３ＣＤＺ、およびＰＭ００７６１０６についての図式ＡＳＡＶｉｅｗ出力を示す。ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２におけるアミノ酸についての溶媒露出面積（ＡＳＡ）が示される。
【図４】ＸＴＥＮ  ＡＥ４２挿入部位の箇所の構造表示を示す。ＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）の結晶構造に対応する中央の図面は、ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２の詳細図によって囲まれる。βストランドおよびαへリックスは、リボン表示として示される。ループは、αカーボンパイプとして示される。挿入部位におけるアミノ酸は、ＣＰＫ球表示として示される。各図式における数字は、図１における付番による挿入部位の箇所を示す。
【図５】結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質がＦＶＩＩＩ活性を表示する、図４に示される挿入部位の箇所の構造表示を示す。
【図６】ＸＴＥＮ  １４４挿入部位の箇所の構造表示を示す。
【図７】結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質がＦＶＩＩＩ活性を表示する、図６に示される挿入部位の箇所の構造表示を示す。
【図８】ＦＶＩＩＩ活性を表示する（黒色のボックス、白色の文字列）またはＦＶＩＩＩ活性を何ら表示しない（灰色のボックス、太字の文字列）組換えＦＶＩＩＩタンパク質をもたらす、ＸＴＥＮ  ＡＥ４２挿入の箇所を示す、ＦＶＩＩＩのドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２のＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントを示す。
【図９Ａ】（パネル９Ａおよび９Ｂ）蛋白質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）にて識別子２Ｒ７Ｅの下に寄託された天然活性ヒトＦＶＩＩＩ結晶構造における、２本のポリペプチド鎖の二次構造のＤＳＳＰ図式表示を示す。アミノ酸配列付番は、図１のタンパク質配列におけるもの、および配列番号１におけるものと同じである。βシート領域は、塗りつぶされた矢印として示され、１〜６６と表記される。許容ループの箇所は、網目状のボックスによって表される。ドメインＡ１許容ループは、ループＡ１−１およびループＡ１−２と表記される。ドメインＡ２許容ループは、ループＡ２−１およびループＡ２−２と表記される。ドメインＡ３許容ループは、ループＡ３−１およびループＡ３−２と表記される。
【図９Ｂ】（パネル９Ａおよび９Ｂ）蛋白質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）にて識別子２Ｒ７Ｅの下に寄託された天然活性ヒトＦＶＩＩＩ結晶構造における、２本のポリペプチド鎖の二次構造のＤＳＳＰ図式表示を示す。アミノ酸配列付番は、図１のタンパク質配列におけるもの、および配列番号１におけるものと同じである。βシート領域は、塗りつぶされた矢印として示され、１〜６６と表記される。許容ループの箇所は、網目状のボックスによって表される。ドメインＡ１許容ループは、ループＡ１−１およびループＡ１−２と表記される。ドメインＡ２許容ループは、ループＡ２−１およびループＡ２−２と表記される。ドメインＡ３許容ループは、ループＡ３−１およびループＡ３−２と表記される。
【図１０】ＦＶＩＩＩ活性を表示する（黒色のボックス、白色の文字列）またはＦＶＩＩＩ活性を何ら表示しない（灰色のボックス、太字の文字列）組換えＦＶＩＩＩタンパク質をもたらす、ＸＴＥＮ  １４４挿入の箇所を示す、ＦＶＩＩＩのドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２のＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントを示す。許容ループの箇所は、波線の長方形によって示される。
【図１１】図１１Ａは、ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２の箇所（波線により丸く囲まれる）、ならびにＣＰＫ球表示としてハイライトされる許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２の箇所を示す、ヒトＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）の正面図の構造表示を提示する。図１１Ｂは、ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２の箇所（波線により丸く囲まれる）、ならびにＣＰＫ球表示としてハイライトされる許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２の箇所を示す、ヒトＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）の側面図の構造表示を提示する。
【図１２】（１２Ａ、１２Ｃ、および１２Ｅ）ＣＰＫ球表示としてハイライトされる許容ループの箇所を示す、単離されたヒトＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）Ａドメインの上面図の構造表示を示す。１２Ｂ、１２Ｄ、および１２Ｆは、ＣＰＫ球表示としてハイライトされる許容ループの箇所を示す、単離されたヒトＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）Ａドメインの側面図の構造表示を示す。
【図１３】ＨｅｍＡマウス（図１３、パネル  Ａ）およびＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウス（図１３、パネル  Ｂ）における細胞培養ＰＫアッセイを使用した、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）−ＦＶＩＩＩと比較した、ドメイン内挿入を有する２つのＦＶＩＩＩ変異体（ｐＳＤ００５０およびｐＳＤ００６２、表ＩＩＩを参照されたい）のＰＫプロフィールを示す。５分間の回収率、および半減期（ｔ１／２）が示される。
【図１４】単一のＸＴＥＮ挿入を有する、種々のＦＶＩＩＩ変異体の発色およびａＰＴＴアッセイ活性データの棒グラフ。提示されるデータは、許容ループＡ１−１（配列番号１に対応するアミノ酸１８、２６、または４０）、許容ループＡ２−１（配列番号１に対応するアミノ酸４０３または３９９）、ａ３領域（配列番号１に対応するアミノ酸１６５６）、許容ループＡ３−１（配列番号１に対応するアミノ酸１７２０または１７２５）、許容ループＡ３−２（配列番号１に対応するアミノ酸１９００、１９０５、または１９１０）、またはカルボキシ末端（ＣＴ、配列番号１に対応するアミノ酸２３３２）における、ＸＴＥＮ、例えば、ＡＥ１４４、ＡＧ１４４、もしくはＡＥ２８８の単一挿入に対応する。また、ＢＤＤ−ＦＶＩＩ対照についてのａＰＴＴおよび発色活性アッセイ活性データも示される。また、図面において、発色アッセイによって決定した活性およびａＰＴＴアッセイによって検出した活性との間の比率または比率の範囲（例えば、ａ３について１．１またはＡ１−１挿入について１．４〜１．６範囲）としても示される（発色／ａＰＴＴ比）。
【図１５】２つのＸＴＥＮ挿入を有する、種々のＦＶＩＩＩ変異体の発色およびａＰＴＴアッセイ活性データの棒グラフ。提示されるデータは、それぞれ、許容ループＡ１−１およびａ３領域、許容ループＡ２−１およびａ３領域、許容ループＡ３−１およびａ３領域、許容ループＡ３−２およびａ３領域、許容ループＡ１−１およびＡ２−１、許容ループＡ１−１およびＡ３−１、許容ループＡ１−１およびＡ３−２、ならびに許容ループＡ２−１およびＡ３−２における、ＸＴＥＮの二重挿入に対応する。
【図１６Ａ】（１６Ａおよび１６Ｂ）２つまたは３つのＸＴＥＮ挿入を有する、種々のＦＶＩＩＩ変異体の発色およびａＰＴＴアッセイ活性データの棒グラフ。図１６Ａは、許容ループＡ１−１（配列番号１に対応するアミノ酸１８または２６）、許容ループＡ２−１（配列番号１に対応するアミノ酸４０３）、ａ３領域（配列番号１に対応するアミノ酸１６５６）、許容ループＡ３−１（配列番号１に対応するアミノ酸１７２０）、許容ループＡ３−２（配列番号１に対応するアミノ酸１９００）、またはカルボキシ末端（ＣＴ、配列番号１に対応するアミノ酸２３３２）における、ＸＴＥＮの二重または三重挿入に対応するデータを提示する。図式はまた、ＸＴＥＮが１９００位、Ｂドメイン、およびＣＴにおいて挿入された構築物に対応するデータも示す。また、図面において、発色アッセイによって決定した活性およびａＰＴＴアッセイによって検出した活性との間の比率または比率の範囲（例えば、３つのＸＴＥＮ挿入について３．２〜４．２）としても示される（発色／ａＰＴＴ比）。図１６Ｂは、許容ループにおけるＸＴＥＮの三重挿入に対応するデータを提示する。左パネルグラフに示される構築物（左から右）は、それぞれ配列番号１に対応する、アミノ酸２６、４０３、および１６５６；２６、１６５６、および１７２０；２６、１６５６、および１９００；４０３、１６５６、および１７２０；４０３、１６５６、および１９００；ならびに１６５６、１７２０、および１９００における挿入に対応する。右パネルグラフに示される構築物は、１つのＸＴＥＮが許容ループＡ１−１、許容ループＡ２−１、許容ループＡ３−１、または許容ループＡ３−２に挿入され、２つのＸＴＥＮが非許容ループに挿入された、つまり第２のＸＴＥＮがＢドメインに挿入され、第３のＸＴＥＮがカルボキシ末端（ＣＴ）に挿入された、３つのＸＴＥＮ挿入構築物に対応する。また、ＢＤＤ−ＦＶＩＩ対照についてのａＰＴＴおよび発色活性アッセイデータも示される。
【図１６Ｂ】（１６Ａおよび１６Ｂ）２つまたは３つのＸＴＥＮ挿入を有する、種々のＦＶＩＩＩ変異体の発色およびａＰＴＴアッセイ活性データの棒グラフ。図１６Ａは、許容ループＡ１−１（配列番号１に対応するアミノ酸１８または２６）、許容ループＡ２−１（配列番号１に対応するアミノ酸４０３）、ａ３領域（配列番号１に対応するアミノ酸１６５６）、許容ループＡ３−１（配列番号１に対応するアミノ酸１７２０）、許容ループＡ３−２（配列番号１に対応するアミノ酸１９００）、またはカルボキシ末端（ＣＴ、配列番号１に対応するアミノ酸２３３２）における、ＸＴＥＮの二重または三重挿入に対応するデータを提示する。図式はまた、ＸＴＥＮが１９００位、Ｂドメイン、およびＣＴにおいて挿入された構築物に対応するデータも示す。また、図面において、発色アッセイによって決定した活性およびａＰＴＴアッセイによって検出した活性との間の比率または比率の範囲（例えば、３つのＸＴＥＮ挿入について３．２〜４．２）としても示される（発色／ａＰＴＴ比）。図１６Ｂは、許容ループにおけるＸＴＥＮの三重挿入に対応するデータを提示する。左パネルグラフに示される構築物（左から右）は、それぞれ配列番号１に対応する、アミノ酸２６、４０３、および１６５６；２６、１６５６、および１７２０；２６、１６５６、および１９００；４０３、１６５６、および１７２０；４０３、１６５６、および１９００；ならびに１６５６、１７２０、および１９００における挿入に対応する。右パネルグラフに示される構築物は、１つのＸＴＥＮが許容ループＡ１−１、許容ループＡ２−１、許容ループＡ３−１、または許容ループＡ３−２に挿入され、２つのＸＴＥＮが非許容ループに挿入された、つまり第２のＸＴＥＮがＢドメインに挿入され、第３のＸＴＥＮがカルボキシ末端（ＣＴ）に挿入された、３つのＸＴＥＮ挿入構築物に対応する。また、ＢＤＤ−ＦＶＩＩ対照についてのａＰＴＴおよび発色活性アッセイデータも示される。
【図１７】ＤＫＯマウスにおける、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ対照と比較した、単一のＸＴＥＮ挿入を有する、種々の投与されたＦＶＩＩＩ変異体の血漿中レベルを示す。ＸＴＥＮを、配列番号１に対応するアミノ酸２６、４０３、１５６５、１７２０、１９００、またはカルボキシ末端（ＣＴ）において挿入した。
【図１８】ＤＫＯマウスにおける、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ対照（ｒＦＶＩＩＩ）と比較した、１つの挿入（ＢドメインにおけるＸＴＥＮ１４４）、２つの挿入（配列番号１に対応するアミノ酸１９００のＡ３−２許容ループにおけるＸＴＥＮ１４４、およびカルボキシ末端におけるＸＴＥＮ２８８；またはＢドメインにおけるＸＴＥＮ１４４およびカルボキシ末端におけるＸＴＥＮ２８８）および３つのＸＴＥＮ挿入（ＢドメインにおけるＸＴＥＮ１４４、カルボキシ末端におけるＸＴＥＮ２８８、および配列番号１に対応するアミノ酸１９００のＡ３−２許容ループにおけるＸＴＥＮ１４４）を有する、種々の投与されたＦＶＩＩＩ変異体の血漿中レベルを示す。
【図１９】単一のＣＴＰ１挿入を有する、種々のＦＶＩＩＩ変異体の発色活性データの棒グラフを示す。提示されるデータは、ＦＶＩＩＩにおける異なる箇所での、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端に由来する２９アミノ酸長ペプチドを包含する４５アミノ酸長ペプチド（ＣＴＰ１、配列番号８１）の単一挿入に対応する。ｘ軸に示される構築物表記における数字は、直後にペプチドが挿入されるアミノ酸位置に対応する。挿入の許容ループ（およびａ３領域）箇所は、棒の上に示される。また、ＦＶＩＩＩ対照についての発色活性アッセイデータも示される。
【図２０】単一のＣＴＰ１挿入を有する、種々のＦＶＩＩＩ変異体の発色活性データの棒グラフを示す。提示されるデータは、ＦＶＩＩＩにおける異なる箇所での、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端に由来する２９アミノ酸長ペプチドを包含する４５アミノ酸長ペプチド（ＣＴＰ１、配列番号８１）の単一挿入に対応する。ｘ軸に示される構築物表記における数字は、直後にペプチドが挿入されるアミノ酸位置に対応する。挿入の許容ループ（およびａ３領域）箇所が、棒の上に示される。また、ＦＶＩＩＩ対照についての発色活性アッセイデータも示される。
【図２１】単一のアルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ１、配列番号８３）挿入を有する、種々のＦＶＩＩＩ変異体の発色活性データの棒グラフを示す。提示されるデータは、ＦＶＩＩＩにおける異なる箇所での、１８アミノ酸長ＡＢＰ１、配列番号８３を包含する４４アミノ酸長ペプチドの単一挿入に対応する。ｘ軸に示される構築物表記における数字は、後にペプチドが挿入されるアミノ酸位置に対応する。挿入の許容ループ（およびａ３領域）箇所は、棒の上に示される。また、ＦＶＩＩＩ対照についての発色活性アッセイデータも示される。
【図２２】単一のＧｌｙ−Ｓｅｒ反復（ＨＡＰ１、配列番号８５）挿入を有する、種々のＦＶＩＩＩ変異体の発色活性データの棒グラフを示す。提示されるデータは、ＦＶＩＩＩにおける異なる箇所での、３５アミノ酸ＨＡＰ１を包含する４１アミノ酸長ペプチドの単一挿入に対応する。ｘ軸に示される構築物表記における数字は、後にペプチドが挿入されるアミノ酸位置に対応する。挿入の許容ループ（およびａ３領域）箇所は、棒の上に示される。また、ＦＶＩＩＩ対照についての発色活性アッセイ活性データも示される。
【図２３】単一の高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ１、配列番号８７）挿入を有する、種々のＦＶＩＩＩ変異体の発色活性データの棒グラフを示す。提示されるデータは、ＦＶＩＩＩにおける異なる箇所での、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１９１）の２つの縦列反復に隣接した、ＥＧＦＰ１の２３９アミノ酸残基配列を包含する２６５アミノ酸長ポリペプチドの単一挿入に対応する。ｘ軸に示される構築物表記における数字は、後にペプチドが挿入されるアミノ酸位置に対応する。挿入の許容ループ（およびａ３領域）箇所は、棒の上に示される。また、ＦＶＩＩＩ対照についての発色活性アッセイデータも示される。
【図２４】化学的ＰＥＧ化の前および後の、ならびにトロンビン処理を伴うおよび伴わない、精製ＦＶＩＩＩ変異体ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのタンパク質特異的染色（左パネル）およびＰＥＧ特異的染色（右パネル）を示す。ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１は、システイン含有ペプチド（ＣＣＰ１、配列番号９０）が残基２６の直後に挿入される変異体である。
【図２５】２１４ｎｍでのＵＶ監視を用いたＴｏｓｏｈ  Ｇ３０００  ＳＷｘｌカラムによるサイズ排除クロマトグラフィーによって分解された、ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１（黒色の実線）およびＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１（黒色の破線）の重ね合わされたクロマトグラムを示す。分子量標準の溶離プロフィール（灰色の線）は、キロダルトン（ｋＤａ）の単位で示される構成成分の分子量と重ね合わされる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
「ａ」または「ａｎ」主体という用語は、その主体の１つ以上を指すことに留意されたく、例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すように理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され得る。
【００２７】
本発明は、ＦＶＩＩＩの凝血促進活性を有し、宿主細胞中で発現され得る、改善された特性、例えば、改善された半減期または改善された安定性を有する、ある特定の組換えＦＶＩＩＩタンパク質に向けられる。かかる組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、例えば、血友病に対する治療的処置として、使用することができる。
【００２８】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、単数形の核酸ならびに複数形の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるもの等のアミド結合）を含む。
【００２９】
「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然環境から除去された、核酸分子ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ベクターに含有されるＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために、単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種性宿主細胞中で維持される、または溶液中で他のポリヌクレオチドから（部分的にまたは実質的に）精製される、組換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に産生されるかかる分子がさらに含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、または転写終結シグナル等の調節要素を含むことができる。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸へと翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部分である。「停止コドン」（ｔａｇ、ｔｇａ、またはｔａａ）は、典型的にアミノ酸へと翻訳されなくとも、コード領域の一部と見なされ得るが、任意の隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等は、コード領域の一部でない。コード領域の境界は、典型的に、結果としてもたらされるポリペプチドのアミノ末端をコードする、５’末端にある開始コドン、および結果として生じるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする、３’末端にある翻訳停止コドンによって決定される。本発明の２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物において、例えば、単一のベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築物において、例えば、別個の（異なる）ベクター上に、存在し得る。したがって、単一のベクターは、ほんの単一のコード領域を含有し得るか、または２つ以上のコード領域を含み得、例えば、単一のベクターは、下に記載されるように結合ドメイン−Ａおよび結合ドメイン−Ｂを別個にコードし得ることになる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明の結合ドメインをコードする核酸に融合された、または融合されていない、いずれの異種性コード領域もコードすることができる。異種性コード領域には、限定なしに、分泌シグナルペプチドまたは異種性機能的ドメイン等の、特化された要素またはモチーフが含まれる。
【００３１】
哺乳類細胞によって分泌されるある特定のタンパク質は、一旦、成長しているタンパク質鎖の粗面小胞体を渡る搬出が開始されると、成熟タンパク質から切断される、分泌シグナルペプチドに関連する。当業者は、シグナルペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合され、完全なまたは「完全長」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型を産生することを承知している。ある特定の実施形態において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチド、またはそれと作動可能に関連付けられているポリペプチドの分泌を導く能力を保持する、その配列の機能的誘導体が使用される。代替的に、異種性哺乳類シグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）もしくはマウスβ−グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用することができる。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」ならびに複数形の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状で連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指し、産物の具体的な長さを指しているわけではない。故に、２つ以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために使用される、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「アミノ酸鎖」、または任意の他の用語が「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれの代わりにも、またはこれらの用語のいずれとも交換可能に、使用することができる。本明細書で使用されるとき、「タンパク質」という用語は、いくつかの事例においてアミド結合以外の結合によって関連付けられ得る、１つ以上のポリペプチドからなる分子を包含することが意図される。例えば、天然活性ＦＶＩＩＩタンパク質等のヘテロ二量体は、ジスルフィド結合によって関連付けられる重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドのヘテロ二量体である。他方で、タンパク質はまた、１本のポリペプチド鎖でもあり得る。この後者の事例において、１本のポリペプチド鎖は、いくつかの事例において、一緒に融合されてタンパク質を形成する２つ以上のポリペプチドサブユニットを含むことができる。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はまた、限定なしに、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非自然発生のアミノ酸による修飾を含む、発現後修飾の産物を指すことも意図される。ポリペプチドまたはタンパク質は、天然の生物学的源に由来するか、または組換え技術によって産生され得るが、指定される核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。それは、化学合成によるものを含む、任意の様態で生成することができる。
【００３３】
「単離された」ポリペプチド、タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、その自然環境にないポリペプチドまたはタンパク質を指す。特定のレベルの精製は何ら必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドまたはタンパク質は、単純にその天然または自然環境から除去されたものであり得る。「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を介して産生されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。宿主細胞中で発現される、組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的のために、単離されていると見なされ、同様に、任意の好適な技法によって分離され、分画され、または部分的にもしくは実質的に精製された、天然または組換えポリペプチドも単離されていると見なされる。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」という用語は、組換え核酸を内部に持つまたは内部に持つことができる、細胞または細胞の集団を指す。宿主細胞は、原核性細胞（例えば、大腸菌）であり得、または代替的に、宿主細胞は、真核性細胞、例えば、真菌細胞（例えば、出芽酵母、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または分裂酵母等の酵母細胞）、および昆虫細胞（例えば、Ｓｆ−９）または哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＣＯＳ−  ７、ＮＩＨ−３Ｔ３）等の種々の動物細胞であり得る。
【００３５】
また、ポリペプチドの断片、変異体、または誘導体、およびそれらの任意の組み合わせも本発明に含まれる。本発明のポリペプチドおよびタンパク質を指すときの「断片」または「変異体」という用語には、参照ポリペプチドまたはタンパク質の特性（例えば、凝血促進活性）の少なくともいくらかを保持する、いずれのポリペプチドまたはタンパク質も含まれる。ポリペプチドの断片には、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片が含まれる。本発明のポリペプチドまたはタンパク質の変異体には、上述の断片、およびまた、アミノ酸置換、欠失、または挿入に起因して改変アミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。変異体は、自然または非自然発生であり得る。非自然発生の変異体は、当該技術分野で既知の突然変異生成技法を使用して産生することができる。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。本発明のポリペプチドまたはタンパク質の「誘導体」は、天然ポリペプチドまたはタンパク質上では見出されないさらなる特長を示すように改変されており、かつ凝血促進活性を有する、ポリペプチドまたはタンパク質である。「誘導体」の例としては、Ｆｃ融合タンパク質がある。
【００３６】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐状側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。故に、ポリペプチドにおけるアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸と置き換えられる場合、その置換は、保存的であると見なされる。別の実施形態において、一連のアミノ酸は、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる、構造的に同様の連なりと保存的に置き換えることができる。
【００３７】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の「配列同一性パーセント」という用語は、２つの配列を最適にアライメントするために導入する必要がある付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮に入れて、比較のウィンドウにわたってそれらの配列によって共有される、同一の合致した位置の数を指す。合致した位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的配列および参照配列の両方において提示される、任意の位置である。ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸ではないので、標的配列内で提示されるギャップは計数されない。同様に、参照配列からのヌクレオチドまたはアミノ酸ではなく、標的配列ヌクレオチドまたはアミノ酸が計数されるので、参照配列内で提示されるギャップは計数されない。
【００３８】
配列同一性の百分率は、両方の配列内で同一のアミノ酸残基または核酸塩基が生じる位置の数を決定して合致した位置の数を得、合致した位置の数を、比較のウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出される。２つの配列間の配列の比較および配列同一性パーセントの決定は、オンライン使用のためおよびダウンロードのための両方で、直ぐに利用可能なソフトウェアを使用して遂行され得る。好適なソフトウェアプログラムは、種々の情報源から、タンパク質およびヌクレオチド配列の両方のアライメントのために入手可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府の国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能な、ＢＬＡＳＴプログラムの一式の一部である、ｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方で、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラムの一式の一部である、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、それらもまた、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ．にて入手可能である。
【００３９】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と揃う、単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は各々、それらの独自の配列同一性パーセントを有することができる。配列同一性パーセント値は、小数第２位で四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は、８０．１に四捨五入される一方で、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は、８０．２に四捨五入される。また、長さの値は、常に整数となることにも留意されたい。
【００４０】
当業者であれば、配列同一性パーセントの算出のための配列アライメントの生成が、一次配列データによって排他的に主導される双対の配列−配列比較に限定されないことを理解するであろう。配列アライメントは、多重配列アライメントに由来し得る。多重配列アライメントを生成するための１つの好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ．から利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から利用可能なＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２およびＭＵＳＣＬＥは、代替的に、例えば、ＥＢＩから利用可能である。
【００４１】
配列アライメントが、配列データを、構造的データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、突然変異の箇所）、または系統発生学的データ等からの異種情報源からのデータと統合することによって、生成され得ることもまた理解されるであろう。異種情報のデータを統合して多重配列アライメントを生成する、好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇにて利用可能な、および代替的に、例えば、ＥＢＩから利用可能な、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一性パーセントを算出するために使用される最終的なアライメントは、自動でまたは手動でのいずれで監督され（ｃｕｒａｔｅｄ）てもよいこともまた理解されるであろう。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応するアミノ酸」は、任意のＦＶＩＩＩ断片、変異体、または誘導体におけるアミノ酸であり、それは、天然ヒトＦＶＩＩＩにおける対応するアミノ酸と同じ位置に該当する。例えば、キメラまたはハイブリッドＦＶＩＩＩタンパク質またはそれらの断片、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０１１／０６９１６４  Ａ２号、同第ＷＯ  ２０１２／００６６２３  Ａ２号、同第ＷＯ  ２０１２／００６６３５  Ａ２号、または同第ＷＯ  ２０１２／００６６３３  Ａ２号に開示されるものは、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１）と揃えることができ、配列番号１の領域と揃うキメラまたはハイブリッドタンパク質の領域におけるアミノ酸は、それが配列番号１と揃うアミノ酸番号に「対応する」。同様に、ＦＶＩＩＩの任意の断片、例えば、ＦＶＩＩＩヘテロ二量体の軽鎖（例えば、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメイン）を、配列番号１と揃えて、配列番号１の対応する領域を決定することができ、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおけるアミノ酸に対応する断片におけるアミノ酸は、それらが配列番号１と揃うアミノ酸に基づいて付番されるであろう。揃えられたＦＶＩＩＩ領域は、領域間の類似性が当業者によって容易に特定され得る限り、配列番号１の対応する領域に対して１００％同一である必要はない。故に、ＦＶＩＩＩ断片、変異体、誘導体または類似体において揃えられた領域は、配列番号１における対応する領域に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「挿入部位」という用語は、異種性部分が挿入され得る位置の直ぐ上流である、ＦＶＩＩＩポリペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体における位置を指す。「挿入部位」は、番号として明記され、その番号は、挿入の位置に対して直ぐＮ末端側である、挿入部位が対応する成熟天然  ＦＶＩＩＩ（配列番号１）におけるアミノ酸の番号である。例えば、「ａ３は、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位において異種性部分を含む」という表現は、異種性部分が、配列番号１のアミノ酸１６５６およびアミノ酸１６５７に対応する２つのアミノ酸の間に位置することを示す。
【００４４】
本明細書で使用される「アミノ酸の直ぐ下流」という表現は、アミノ酸の末端カルボキシル基の直ぐ隣の位置を指す。同様に、「アミノ酸の直ぐ上流」という表現は、アミノ酸の末端アミン基の直ぐ隣の位置を指す。
【００４５】
本明細書で使用される「挿入され」、「挿入される」、「に挿入され」という用語、または文法的に関連する用語は、天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける類似の位置と比べた、組換えＦＶＩＩＩポリペプチドにおける異種性部分の位置を指す。本明細書で使用されるとき、それらの用語は、天然成熟ヒトＦＶＩＩＩと比べた、組換えＦＶＩＩＩポリペプチドの特性を指し、組換えＦＩＩＩポリペプチドが作製されたいずれの方法またはプロセスも示す、暗示する、または推論することはない。例えば、本明細書に提供される組換えＦＶＩＩＩポリペプチドを参照して、「異種性部分がＡ１−２に挿入される」という表現は、組換えＦＶＩＩＩポリペプチドが、天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおけるＡ１−２領域（天然成熟ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸約２１８〜アミノ酸約２２９）に対応する、例えば、天然成熟ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸２１８および２１９、アミノ酸２１９および２２０、アミノ酸２２０および２２１、アミノ酸２２１および２２２、アミノ酸２２２および２２３、アミノ酸２２３および２２４、アミノ酸２２４および２２５、アミノ酸２２５および２２６、アミノ酸２２６および２２７、アミノ酸２２７および２２８、またはアミノ酸２２８および２２９に対応するアミノ酸によって境界を付けられる領域において、異種性部分を含むことを意味する。
【００４６】
「融合」タンパク質は、アミド結合を介して第２のポリペプチドに連結される第１のポリペプチドを含み、例えば、この第２のポリペプチドは、本来は第１のポリペプチドに自然に連結されない。通常は別個のタンパク質において存在するポリペプチドを、融合ポリペプチドにおいて一緒にすることができるか、または通常は同じタンパク質において存在するポリペプチドを、融合ポリペプチドにおいて新たな配列で配置することができる（例えば、免疫グロブリンＦｃドメインとの本発明のＦＶＩＩＩドメインの融合、またはＢドメインの欠失を通じた、ＦＶＩＩＩのＡ３領域への直接のＦＶＩＩＩのＡ１およびＡ２領域の融合）。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作成し、翻訳することによって、作成される。
【００４７】
「異種性」および「異種性部分」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分が、それが比較されている実体のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分とは明確に異なる実体に由来することを意味する。例えば、異種性ポリペプチドは合成であるか、あるいは異なる種、個体の異なる細胞型、または明確に異なる個体の同じもしくは異なる細胞の型に由来し得る。一態様において、異種性部分は、別のポリペプチドに融合されて、融合ポリペプチドまたはタンパク質をもたらす、ポリペプチドであり得る。別の態様において、異種性部分は、ポリペプチドまたはタンパク質に複合体化させられたＰＥＧ等の、非ポリペプチドであり得る。
【００４８】
ポリペプチドにおいて存在し得るリンカーは、本明細書で「切断可能なリンカー」と称され、それは、ポリペプチドにおいて自然に発生しない１つ以上の異種性プロテアーゼ切断部位（例えば、第ＸＩａ因子またはトロンビン切断部位）を含み、また切断部位のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両側上のさらなるリンカーが含まれてもよい。かかる部位についての例となる箇所は、添付の図面に示され、例えば、ＦＶＩＩＩの重鎖とＦＶＩＩＩの軽鎖との間の配置を含む。    
【００４９】
１．第ＶＩＩＩ因子
本明細書で使用される「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」または「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、別途明記されない限り、その正常な役割が凝固である、機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質を意味する。故に、ＦＶＩＩＩという用語には、機能的である変異体タンパク質が含まれる。一実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスＦＶＩＩＩタンパク質である。機能的ＦＶＩＩＩタンパク質は、完全もしくは部分的Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、例えば、Ｆｃドメイン、または両方を含む、融合タンパク質等であるが、これらに限定されない、融合タンパク質であり得る。無数の機能的ＦＶＩＩＩ変異体が構築されてきており、それらを本明細書に記載される組換えＦＶＩＩＩタンパク質として使用することができる。ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０１１／０６９１６４  Ａ２号、同第ＷＯ  ２０１２／００６６２３  Ａ２号、同第ＷＯ  ２０１２／００６６３５  Ａ２号、または同第ＷＯ  ２０１２／００６６３３  Ａ２号を参照されたく、それらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００５０】
非常に多くの機能的ＦＶＩＩＩ変異体が知られている。加えて、ＦＶＩＩＩにおける数百個の非機能的突然変異が、血友病患者において特定されている。例えば、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９：２７４−８（２００２）を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、ヒトおよび他の種由来のＦＶＩＩＩ間の比較は、機能に必要とされる可能性の高い、保存された残基を特定している。例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７−２２（１９９８）および米国公開特許第６，２５１，６３２号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００５１】
ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，９６５，１９９号に示されるように、ｃＤＮＡから推定した。ｃＤＮＡ配列に由来する天然成熟ヒトＦＶＩＩＩ（すなわち、分泌シグナルペプチドを含まないが、他の翻訳後プロセシングの前である）は、配列番号１として提示される。部分的または完全Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、機能的であり、市販のＦＶＩＩＩ治療薬において使用されている。例えば、欧州特許第５０６７５７Ｂ２号を参照されたく、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５２】
「天然成熟ＦＶＩＩＩ」は、機能的ドメインを含み、それは凝血促進活性に必要であることもないこともある。天然成熟ヒトＦＶＩＩＩの配列は、配列番号１として提示される。天然ＦＶＩＩＩタンパク質は、次の式：Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有し、式中、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、構造的に関連する「Ａドメイン」であり、Ｂは、「Ｂドメイン」であり、Ｃ１およびＣ２は、構造に関連する「Ｃドメイン」であり、ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域である。配列番号１における一次アミノ酸配列位置を参照して、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１ドメインは、Ａｌａ１〜約Ａｒｇ３３６に及び、ａ１スペーサー領域は、約Ｍｅｔ３３７〜約Ａｒｇ３７２に及び、Ａ２ドメインは、約Ｓｅｒ３７３〜約Ｔｙｒ７１９に及び、ａ２スペーサー領域は、約Ｇｌｕ７２０〜約Ａｒｇ７４０に及び、Ｂドメインは、約Ｓｅｒ７４１〜約Ａｒｇ１６４８に及び、ａ３スペーサー領域は、約Ｇｌｕ１６４９〜約Ａｒｇ１６８９に及び、Ａ３ドメインは、約Ｓｅｒ１６９０〜約Ａｓｎ２０１９に及び、Ｃ１ドメインは、約Ｌｙｓ２０２０〜約Ａｓｎ２１７２に及び、Ｃ２ドメインは、約Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２に及ぶ（Ｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １：９２２−９３０（２００５））。特定のタンパク質分解切断部位以外で、ＦＶＩＩＩのドメインと領域との間の境界の箇所の表記は、異なる参考文献において異なり得る。本明細書に注記される境界は、したがって、「約」という用語の使用によって近似値として表記される。
【００５３】
ａ３、Ａ３、Ｃ１、およびＣ２ドメイン、すなわち、約Ｓｅｒ１６９０〜Ｔｙｒ２３３２を含む、ポリペプチドは、正常なＦＶＩＩＩプロセシング中に、Ａ１、ａ１、Ａ２、ａ２、およびＢドメインを含むポリペプチドから切断されて、重鎖および軽鎖をもたらす。Ｂドメインは凝血促進活性に必要とされず、市販の治療的組成物を含む、ある特定の態様において、ＦＶＩＩＩのＢドメインの一部または全てが欠失している（「Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子」または「ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの例としては、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）またはＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（組換えＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）が挙げられ、それは、配列番号１のアミノ酸１６３８〜２３３２に対応する第２のポリペプチドに融合された、配列番号１のアミノ酸１〜７４３に対応する第１のポリペプチドを含む。本発明の組換えタンパク質を産生するために使用され得る、例となるＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ構築物には、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１）のアミノ酸７４７〜１６３８に対応するアミノ酸の欠失を伴うＦＶＩＩＩ（Ｈｏｅｂｅｎ  Ｒ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８−７３２３（１９９０）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、および成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１）のアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸８６８〜１５６２に対応するアミノ酸の欠失を伴うＦＶＩＩＩ（Ｍｅｕｌｉｅｎ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２（４）：３０１−６（１９８８）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
ある特定の態様において、タンパク質が、式Ｉ：（Ａ１）−ａ１−（Ａ２）−ａ２−［Ｂ］を含む第１のポリペプチド、すなわち、アミノ酸鎖、および式ＩＩ：ａ３−（Ａ３）−（Ｃ１）を含む第２のポリペプチド、すなわち、アミノ酸鎖を含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質が提供される。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、単一のアミノ酸鎖として存在することができ、つまり、アミド結合を通じて融合されるか、またはヘテロ二量体として存在することができる。一実施形態において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１本鎖ポリペプチドにおいてＦＶＩＩＩ重鎖およびＦＶＩＩＩ軽鎖を含む。１本鎖ポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ重鎖とＦＶＩＩＩ軽鎖との間の切断部位に１つ以上の置換、欠失、または突然変異を含有することができる。例えば、１本鎖ＦＶＩＩＩポリペプチドは、成熟完全長ＦＶＩＩＩタンパク質の残基１６４５、残基１６４８、または両方の残基に対応するアルギニン残基に１つ以上の置換、欠失、または突然変異を含有することができ、その置換、欠失、または突然変異は、ＦＶＩＩＩ重鎖およびＦＶＩＩＩ軽鎖がヘテロ二量体へと切断されるのを防止する。置換または突然変異は、任意の既知のアミノ酸、例えば、アラニンであり得る。別の実施形態において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１本鎖ポリペプチドにおいてＦＶＩＩＩ重鎖およびＦＶＩＩＩ軽鎖を含み、そのＦＶＩＩＩ重鎖およびＦＶＩＩＩ軽鎖は、プロセシングされない（本明細書で「プロセシングされていない」または「非プロセス型」とも称される）。例えば、組換えＦＶＩＩＩタンパク質における１本鎖ポリペプチドは、依然として、成熟完全長ＦＶＩＩＩタンパク質の残基１６４５、残基１６４８、または両方の残基に対応するアルギニン残基を保持することができるが、組換えＦＶＩＩＩタンパク質における１本鎖ポリペプチドは、ＦＶＩＩＩ重鎖およびＦＶＩＩＩ軽鎖へと切断されない。他の実施形態において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質組成物は、ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩおよびプロセシングされていないＦＶＩＩＩの混合物を含む。他の実施形態において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質組成物は、１本鎖ＦＶＩＩＩ、プロセシングされていないＦＶＩＩＩ、およびヘテロ二量体ＦＶＩＩＩの混合物を含む。
【００５５】
この態様によれば、Ａ１は、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり、Ａ２は、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり、［Ｂ］は、ＦＶＩＩＩの任意のＢドメインまたはその断片であり（すなわち、Ｂドメインは、タンパク質の一部であることもないこともあり、部分的に存在するのみであってもよい）、Ａ３は、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり、Ｃ１は、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり、ａ１、ａ２、およびａ３は、酸性スペーサー領域である。ある特定の態様において、第２のポリペプチドは、（Ｃ１）に対してＣ末端側に位置する（Ｃ２）をさらに含み、ここでＣ２は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインである。本発明の組換えポリペプチドの種々のＦＶＩＩＩドメインは、天然成熟ＦＶＩＩＩ、例えば、天然成熟ヒトＦＶＩＩＩの、対応する領域と一次配列類似性を共有するが、その領域は、組換えポリペプチドが凝血促進活性を有していれば、同一である必要はない。
【００５６】
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも１つの許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つの異種性部分を含み、凝血促進活性を有し、また宿主細胞中で発現され得る。「異種性部分」は、異種性のポリペプチド、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ポリペプチド実体、または両方であり得る。例となる異種性部分が下に記載される。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも１つの許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分は、ＸＴＥＮ配列ではない。他の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも１つの許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分は、タンパク質の半減期、例えば、インビボ半減期を増加させ、異種性部分は、ＸＴＥＮ配列ではない。異種性部分（例えば、タンパク質の半減期を増加させる異種性部分）を含む構築物は、実施例に記載される。許容ループに適用される「挿入する」または「に挿入する」という用語は、異種性部分をＦＶＩＩＩポリペプチド鎖内に統合し、それを天然アミノ酸または異種性の天然もしくは非天然アミノ酸の側鎖に結合することによる（例えば、分子生物学法を使用して誘導体化可能な側鎖を有するシステインまたは別のアミノ酸をＦＶＩＩＩ配列に導入）、ＦＶＩＩＩポリペプチドへの、またはＦＶＩＩＩポリペプチドに共有もしくは非共有結合されたリンカーもしくは他の分子への、異種性部分の共有または非共有結合を指す。ポリペプチド配列の関連において使用されるとき、「挿入」という用語は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのアミノ酸配列における２つの隣接するアミノ酸の間の異種性配列（例えば、ポリペプチドまたはシステイン等の誘導体化可能なアミノ酸）の導入、またはＦＶＩＩＩポリペプチドへの異種性部分の融合、複合体化、もしくは化学結合を指す。
【００５７】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、キメラである。本明細書で使用される「キメラタンパク質」または「キメラポリペプチド」は、異なる源からのアミノ酸の少なくとも２つの広がりを中に含む、タンパク質またはポリペプチド、例えば、下により詳細に記載されるように、異種性ポリペプチドを、例えば、ＦＶＩＩＩの許容ループ内にまたはａ３領域内に含む、ＦＶＩＩＩタンパク質を意味する。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、異なる遺伝子、異なるｃＤＮＡ、または異なる種等の異なる源からの、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれを超えるアミノ酸鎖を含むことができる。本発明の組換えポリペプチドにおいて使用するための、例となる異種性ポリペプチドには、ＦＶＩＩＩ半減期または安定性を増加させるポリペプチド、例えば、免疫グロブリンＦｃ領域が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組換えポリペプチドに含めることができる、具体的な異種性ポリペプチドは、本明細書の他の箇所に記載される。
【００５８】
キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、異なる部分配列を連結する１つ以上のリンカーを含むことができる。故に、部分配列は、単一のキメラタンパク質またはキメラポリペプチド内で、直接的に、もしくはリンカーを介して間接的に、または両方により連結することができる。本明細書に記載されるキメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、シグナル配列ならびにタンパク質精製または検出を補助する６ＨｉｓおよびＦＬＡＧ等の配列等の、さらなるポリペプチドを含むことができる。加えて、キメラポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端にアミノ酸またはペプチド付加を有することができる。
【００５９】
ある特定の実施形態において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、例えば、非ポリペプチド異種性部分を含むように、複合体化される。複合体化は、許容ループへの、もしくはａ３領域、または両方への、アクセプターアミノ酸（例えば、システイン）、ペプチド、またはポリペプチドの挿入を通じてもよい。本明細書で使用されるとき、複合体は、疎水性相互作用、共有性相互作用、水素結合相互作用、イオン性相互作用、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、任意の物理化学的手段によって互いに結合された任意の２つ以上の実体を指す。故に、ある特定の態様において、本発明の複合体化された組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の実体が共有または非共有性相互作用によってそれに結合された、凝血促進活性を有する、組換えＦＶＩＩＩタンパク質を指す。
【００６０】
「凝血促進活性」とは、天然ＦＶＩＩＩの代用となる、血液中の凝血カスケードに関与する本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質の能力を意味する。例えば、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、例えば、発色アッセイにおいて試験するとき、それがＦＩＸを補因子として活性化して、第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化された第Ｘ因子（ＦＸａ）に変換し得る場合、凝血促進活性を有する。
【００６１】
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、天然成熟ヒトＦＶＩＩＩの１００％の凝血促進活性を示す必要はない。実際、ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された異種性部分は、より低い活性でも完全に容認できるるように、タンパク質の半減期または安定性を有意に増加させることができる。故に、ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、天然ＦＶＩＩＩの少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％の凝血促進活性を有する。
【００６２】
凝血促進活性は、任意の好適なインビトロまたはインビボアッセイによって測定することができる。ＦＶＩＩＩの活性は、凝血の生成を監視することによって凝血カスケードの下流で（凝血アッセイ）、またはＦＶＩＩＩ−ＦＩＸ複合体による活性化に次ぐＦＸの酵素活性を直接測定することによって上流で（発色アッセイ）のいずれかで、測定することができる（例えば、Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２８：２４７−５６（２００２）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：１６４４−４７（１９９９）、Ｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４５：２−１２（２００７）、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４：３７７−８４（２００６）を参照されたい）。故に、凝血促進活性は、発色基質アッセイ、凝血アッセイ（例えば、一段式または二段式凝血アッセイ）、または両方を使用して測定することができる。発色アッセイ機構は、活性化されたＦＶＩＩＩが、活性化されたＦＩＸ、リン脂質、およびカルシウムイオンの存在下でＦＸのＦＸａへの変換を加速するという、血液凝血カスケードの原則に基づく。ＦＸａ活性は、ＦＸａに特異的なｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解によって評価される。４０５ｎＭで測定されるｐ−ニトロアニリドの初期の放出率は、ＦＸａ活性に直接比例し、故に、試料中のＦＶＩＩＩ活性に直接比例する。発色アッセイは、国際血栓止血学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）（ＩＳＴＨ）の学術標準化委員会（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＳＳＣ）の第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子小委員会によって推奨される。１９９４年以来、発色アッセイはまた、ＦＶＩＩＩ濃縮物の効力の決定のための、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の参照方法となっている（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．５４，８１８−８２３（１９８５）、Ｌｅｔｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．３７、４４８−４５３（１９８６））。
【００６３】
凝血促進活性を決定するのに有用な他の好適なアッセイには、例えば、ＳｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒおよびＤｏｃｋａｌに対する米国出願公開第２０１０／００２２４４５号に開示されるものが含まれ、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６４】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質の凝血促進活性は、天然成熟ＦＶＩＩＩと比較され、ある特定の態様において、それは国際標準と比較される。
【００６５】
本明細書で使用される「当量」は、国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｔ）で表されるものと同じＦＶＩＩＩ活性の量を意味し、それは問題のポリペプチドの分子量とは無関係である。ＦＶＩＩＩ活性の１つの国際単位（ＩＵ）は、１ミリリットルの正常なヒト血漿中のＦＶＩＩＩの量におよそ対応する。上述のように、欧州薬局方の発色基質アッセイおよび一段式凝血アッセイを含む、いくつかのアッセイが、ＦＶＩＩＩ活性を測定するために利用可能である。
【００６６】
２．第ＶＩＩＩ因子許容ループ
本明細書の他の箇所に詳述されるように、発明者らは、各ＦＶＩＩＩ「Ａ」ドメインが、組換えタンパク質の凝血促進活性、または組換えタンパク質が宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現される能力を排除することなく、異種性部分が挿入され得る、少なくとも２つの「許容ループ」を含むことを認識した。発明者らは、許容ループを、他の属性の中でもとりわけ、高い表面または溶媒表面が露出したおよび高い立体配座柔軟性を有する領域として特定した。「許容部位」は、許容ループにおいて密集する傾向があるが、発明者らはまた、組換えタンパク質の凝血促進活性、または組換えタンパク質が宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現される能力を排除することなく、異種性部分が挿入され得る、許容ループの外側の他の許容部位を特定した。「許容箇所」という用語は、許容ループおよび許容部位の両方を指す。Ａ１ドメインは、許容ループ−１（Ａ１−１）領域および許容ループ−２（Ａ１−２）領域を含み、Ａ２ドメインは、許容ループ−１（Ａ２−１）領域および許容ループ−２（Ａ２−２）領域を含み、Ａ３ドメインは、許容ループ−１（Ａ３−１）領域および許容ループ−２（Ａ３−２）領域を含む。
【００６７】
ある特定の態様において、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２のうちの少なくとも１つに挿入された、少なくとも１つの異種性部分を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ある特定の態様において、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された、少なくとも２つの異種性部分を含み、この２つの異種性部分のうちの少なくとも１つは、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つに、またはａ３領域に挿入され、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ある特定の態様において、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された少なくとも３つの異種性部分を含み、この３つの異種性部分のうちの少なくとも１つは、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つに、またはａ３領域に挿入され、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ある特定の態様において、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された少なくとも４つの異種性部分を含み、この４つの異種性部分のうちの少なくとも１つは、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つに、またはａ３領域に挿入され、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ある特定の態様において、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された少なくとも５つの異種性部分を含み、この５つの異種性部分のうちの少なくとも１つは、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つに、またはａ３領域に挿入され、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ある特定の態様において、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質に挿入された少なくとも６つの異種性部分を含み、この６つの異種性部分のうちの少なくとも１つは、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つに、またはａ３領域に挿入され、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。
【００６８】
ある特定の態様において、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩに、例えば、２つの異なる許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、少なくとも２つの異種性部分を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。代替的に、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、他の許容ループに挿入された異種性部分を含んでも含まなくても、単一の許容ループに挿入された２つ以上の異種性部分を含むことができ、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ある特定の態様において、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、上述の許容ループのうちの少なくとも１つに挿入された少なくとも１つの異種性部分を含むことができ、またａ３に挿入された１つ以上の異種性部分をさらに含むことができ、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループにまたはａ３に挿入された、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える異種性部分を含むことができ、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。
【００６９】
ある特定の態様において、上述の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ａ３に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ａ３に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、また上述の１つ以上の許容ループに挿入された１つ以上の異種性部分をさらに含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。
【００７０】
発明者らは、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質が、ＦＶＩＩＩ  Ａドメイン領域の各々において、凝血促進活性を有し、依然として宿主細胞によってインビボまたはインビトロで発現されることが可能でありながら異種性部分の挿入を可能にする、少なくとも２つの許容ループを含むことを認識した。様々な程度の分解能の、ＦＶＩＩＩの種々の結晶構造が、決定されてきた。Ｘ線結晶解析および分子動力学シミュレーションによって決定される、ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩａのこれらの構造を使用して、ＦＶＩＩＩについての接触可能表面積および立体配座柔軟性のモデルを生成した。例えば、ヒトＦＶＩＩＩの結晶構造は、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１１：１２４０−１２４７（２００８）およびＮｇｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １６：５９７−６０６（２００８）によって決定された。これらの構造についてのデータは、蛋白質構造データバンク（ｐｄｂ．ｏｒｇ）から、それぞれ受入番号２Ｒ７Ｅおよび３ＣＤＺの下で入手可能である。
【００７１】
Ｓｈｅｎらの結晶構造による、ヒトＦＶＩＩＩの重鎖および軽鎖の予測される二次構造が、図９Ａおよび９Ｂに再生されている。Ｓｈｅｎらの結晶構造から予測される種々のβストランドは、図９Ａおよび９Ｂにおいて連続的に付番される。ある特定の実施形態において、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２は、ＦＶＩＩＩのＡドメインにおける表面が露出した柔軟なループ構造内に含有される。ＰＤＢデータベースの受入番号２Ｒ７Ｅ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）として保管される成熟ＦＶＩＩＩの二次構造により、ならびに図９Ａおよび９Ｂに示されるように、Ａ１−１は、βストランド１とβストランド２との間に位置し、Ａ１−２は、βストランド１１とβストランド１２との間に位置し、Ａ２−１は、βストランド２２とβストランド２３との間に位置し、Ａ２−２は、βストランド３２とβストランド３３との間に位置し、Ａ３−１は、βストランド３８とβストランド３９との間に位置し、Ａ３−２は、βストランド４５とβストランド４６との間に位置する。図９Ａおよび９Ｂに示されるＰＤＢ受入番号２Ｒ７Ｅの二次構造は、ＤＳＳＰプログラムによる標準化された二次構造帰属に対応する（Ｋａｂｓｃｈ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：２５７７−２６３７（１９８３））。ＰＤＢ受入番号２Ｒ７Ｅとして保管される成熟ＦＶＩＩＩのＤＳＳＰ二次構造は、ｓｗｉｆｔ．ｃｍｂｉ．ｒｕ．ｎｌ／ｇｖ／ｄｓｓｐ／にて利用可能なＤＳＳＰデータベースで評価することができる（Ｊｏｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，３９（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｄ４１１−Ｄ４１９（２０１０））。
【００７２】
ある特定の態様において、Ａ１−１を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１５〜アミノ酸約４５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ１−１は、配列番号１のアミノ酸約１８〜アミノ酸約４１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ１−２を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約２０１〜アミノ酸約２３２の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ１−２は、配列番号１のアミノ酸約２１８〜アミノ酸約２２９の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ２−１を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約３９５〜アミノ酸約４２１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ２−１は、配列番号１のアミノ酸約３９７〜アミノ酸約４１８の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ２−２を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約５７７〜アミノ酸約６３５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ２−２は、配列番号１のアミノ酸約５９５〜アミノ酸約６０７天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ３−１を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１７０５〜アミノ酸約１７３２の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ３−１は、配列番号１のアミノ酸約１７１１〜アミノ酸約１７２５の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ３−２を含む表面が露出した柔軟なループ構造は、配列番号１のアミノ酸約１８８４〜アミノ酸約１９１７の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある特定の態様において、Ａ３−２は、配列番号１のアミノ酸約１８９９〜アミノ酸約１９１１の天然成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。
【００７３】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩの１つ以上の許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、１つ以上の異種性部分を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。挿入対象の異種性部分には、（ｉ）ＦＶＩＩＩの半減期またはインビボもしくはインビトロ安定性を増加させるもの、（ｉｉ）クリアランス受容体、あるいは（ｉｉｉ）組換えＦＶＩＩＩタンパク質の可視化または位置特定を補助する部分が含まれるが、これらに限定されない。異種性部分は、下により詳細に考察される。
【００７４】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける１つ以上のアミノ酸に対応する１つ以上のアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、異種性部分を含む。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１のアミノ酸１８８、配列番号１のアミノ酸２２１、配列番号１のアミノ酸３３３、配列番号１のアミノ酸３３６、配列番号１のアミノ酸３３９、配列番号１のアミノ酸４１６、配列番号１のアミノ酸４４２、配列番号１のアミノ酸４９０、配列番号１のアミノ酸７１３、配列番号１のアミノ酸１７９６、配列番号１のアミノ酸１８０２、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける１つ以上のアミノ酸に対応する１つ以上のアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、異種性部分を含む。
【００７５】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ある特定の態様において、少なくとも１つの異種性部分が、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流のａ３領域に挿入される。いくつかの態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、記載されるａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流）に挿入された異種性部分を含み、またＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された１つ以上の異種性部分をさらに含む。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、記載されるａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流）に挿入された異種性部分を含み、また配列番号１のアミノ酸１８、配列番号１のアミノ酸２２、配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける１つ以上のアミノ酸に対応する１つ以上のアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、１つ以上の異種性部分をさらに含む。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、記載されるａ３領域に挿入された異種性部分を含み、また配列番号１のアミノ酸１８８、アミノ酸２２１配列番号１の、配列番号１のアミノ酸３３３、配列番号１のアミノ酸３３６、配列番号１のアミノ酸３３９、配列番号１のアミノ酸４１６、配列番号１のアミノ酸４４２、配列番号１のアミノ酸４９０、配列番号１のアミノ酸７１３、配列番号１のアミノ酸１７９６、配列番号１のアミノ酸１８０２、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける１つ以上のアミノ酸に対応する１つ以上のアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、１つ以上の異種性部分をさらに含む。
【００７６】
他の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された第１の異種性部分、およびＢドメインに挿入された第２の異種性部分を含む。一実施形態において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１）に対応するアミノ酸１８の直ぐ下流、配列番号１に対応するアミノ酸２２、配列番号１に対応するアミノ酸２６、配列番号１に対応するアミノ酸４０、配列番号１のアミノ酸２１６、配列番号１のアミノ酸２２０、配列番号１のアミノ酸２２４、配列番号１のアミノ酸３９９、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸４０９、配列番号１のアミノ酸５９９、配列番号１のアミノ酸６０３、配列番号１のアミノ酸１７１１、配列番号１のアミノ酸１７２０、配列番号１のアミノ酸１７２５、配列番号１のアミノ酸１９００、配列番号１のアミノ酸１９０５、配列番号１のアミノ酸１９１０に挿入された、第１の異種性部分、およびＢドメイン、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸７４５の直ぐ下流に挿入された、第２の異種性部分を含む。
【００７７】
いくつかの態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１のアミノ酸４０３の直ぐ下流に挿入された第１の異種性部分、および配列番号１のアミノ酸７４５の直ぐ下流に挿入された第２の異種性部分を含む。他の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩ配列（すなわち、配列番号１）に対応するアミノ酸１９００の直ぐ下流に挿入された第１の異種性部分、および配列番号１に対応するアミノ酸７４５の直ぐ下流に挿入された第２の異種性部分を含む。依然として他の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１に対応するアミノ酸１８の直ぐ下流に挿入された第１の異種性部分、および配列番号１に対応するアミノ酸７４５の直ぐ下流に挿入された第２の異種性部分を含む。
【００７８】
なおも他の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１に対応するアミノ酸１６５６の直ぐ下流に挿入された第１の異種性部分、および配列番号１に対応するアミノ酸１９００の直ぐ下流に挿入された第２の異種性部分を含む。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１に対応するアミノ酸２６の直ぐ下流に挿入された第１の異種性部分、配列番号１に対応するアミノ酸１６５６の直ぐ下流に挿入された第２の異種性部分、および配列番号１に対応するアミノ酸１９００の直ぐ下流に挿入された第３の異種性部分を含む。いくつかの態様において、第１および第２の異種性部分は、同一である。他の態様において、第１の異種性部分は、異なる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ重鎖（ＨＣ）およびＦＶＩＩＩ軽鎖を含む２本鎖ＦＶＩＩＩ、または１本鎖ＦＶＩＩＩであり得る。
【００８０】
いくつかの態様において、Ａドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含む、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質のａ３領域への少なくとも１つのさらなる異種性部分は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つのさらなる異種性部分を含まない組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現レベルと比較したとき、発現レベルの増加をもたらす。いくつかの態様において、さらなる異種性部分は、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流のａ３領域に挿入される。いくつかの態様において、発現レベルの増加は、活性アッセイによって決定される。ある特定の態様において、活性アッセイは、発色アッセイまたはａＰＴＴアッセイである。いくつかの態様において、少なくとも１つのさらなる異種性部分がａ３領域に挿入される、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）のうちの１つ以上に挿入された１つの異種性部分を含む。
【００８１】
いくつかの態様において、少なくとも１つのさらなる異種性部分がａ３領域に挿入される、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）のうちの１つ以上に挿入された２つの異種性部分を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのさらなる異種性部分がａ３領域に挿入される、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）のうちの１つ以上に挿入された３つの異種性部分を含む。他の態様において、少なくとも１つのさらなる異種性部分がａ３領域に挿入される、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）のうちの１つ以上に挿入された３つを超える異種性部分を含む。特定の実施形態において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１に対応するアミノ酸１６５６の直ぐ下流に異種性部分を含み、配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６５６が、欠失している。
【００８２】
いくつかの態様において、Ａドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含む、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質のａ３領域への少なくとも１つのさらなる異種性部分の挿入によって引き起こされる、発現レベルの増加は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つのさらなる異種性部分を含まない組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現レベルと比較したときの、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％の増加である。いくつかの態様において、Ａドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含む、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質のａ３領域への少なくとも１つのさらなる異種性部分の挿入によって引き起こされる、発現レベルの増加は、ａ３領域に挿入されたさらなる異種性部分を含まない組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現レベルと比較したときの、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍の増加である。
【００８３】
本開示はまた、少なくとも１つの異種性部分を組換えＦＶＩＩＩタンパク質のａ３領域に挿入することを含む、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加させる方法も提供し、このａ３領域に挿入された少なくとも１つのさらなる異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つのさらなる異種性部分を含まない組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、増加した発現を示す。
【００８４】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質のａ３酸性スペーサー領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含む。一例において、ａ３領域への少なくとも１つの異種性部分の挿入は、ａ３領域に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含まない対応する組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現と比較して、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の増加した発現をもたらす。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、１つのさらなる異種性部分をさらに含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、２つのさらなる異種性部分をさらに含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、３つのさらなる異種性部分をさらに含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質、例えば、１つ以上の許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、４つのさらなる異種性部分をさらに含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質、例えば、１つ以上の許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２に挿入された、５つのさらなる異種性部分をさらに含む。
【００８５】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、複数の異種性挿入、例えば、２個を超える、３個を超える、４個を超える、５個を超える、６個を超える、７個を超える、８個を超える、９個を超える、または１０個を超える挿入を含み、この挿入部位は、表Ｘ〜ＸＶＩＩＩに列挙される部位またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されず、この挿入部位のうちの少なくとも１個は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２に、またはａ３領域に位置する。
【００８６】
一態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、２つの異種性部分を含み、この２つの異種性部分のうちの少なくとも１つは、許容ループ内に、もしくはａ３領域、または２つの異種性部分の両方に挿入される。第１および第２の異種性部分は、同じであるか、または異なる可能性がある。２つの異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質の非限定的な例が、表ＸＩに列挙される。一例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、ループＡ２−１に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−２に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−２に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入される。別の実施形態において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、２つの異種性部分、すなわち、配列番号１に対応するアミノ酸１６５６の直ぐ下流に挿入された第１の異種性部分、および配列番号１の（ＣＴ）アミノ酸２３３２の直ぐ下流に挿入された第２の異種性部分を含み、ここで配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６５６は、欠失している。いくつかの実施形態において、２つの異種性部分を含むＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６８５もしくは配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６５６からの欠失、またはアミノ酸１６４８（例えば、Ｒ１６４８Ａ）、１６８０（Ｙ１６８０Ｆ）、もしくは両方における突然変異もしくは置換を含有する。
【００８７】
別の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、３つの異種性部分を含み、この３つの異種性部分のうちの少なくとも１つが、許容ループにまたはａ３領域に挿入されるか、３つの異種性部分のうちの少なくとも２つが、２つの許容ループに、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、あるいは３つの異種性部分が、３つの許容ループに、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入される。第１、第２、または第３の異種性部分は、相互に同じであるか、または異なる可能性がある。第１、第２、第３の異種性部分は、同じであるか、または異なる。３つの異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質の非限定的な例が、表ＸＩＩまたはＸＩＩＩにある。一例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、ａ３領域に挿入される。別の例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入される。別の例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入される。別の例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第３の異種性部分は、カルボキシ末端位置（ＣＴ）において挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第３の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第２の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第３の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第２の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第３の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。いくつかの実施形態において、３つの異種性部分を含むＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６８５もしくは配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６５６の欠失、またはアミノ酸１６４８（例えば、Ｒ１６４８Ａ）、１６８０（Ｙ１６８０Ｆ）、もしくは両方における突然変異もしくは置換を含有する。
【００８８】
別の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、４つの異種性部分を含み、この４つの異種性部分のうちの少なくとも１つが、許容ループ内にまたはａ３領域に挿入されるか、４つの異種性部分のうちの少なくとも２つが、２つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、４つの異種性部分のうちの少なくとも３つが、３つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、あるいは４つの異種性部分の全てが、４つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入される。４つの異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質の非限定的な例が、表ＸＩＶまたはＸＶに列挙される。第１、第２、第３、または第４の異種性部分は、同じであるか、または異なる。一例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入される。別の例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第４の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。いくつかの実施形態において、４つの異種性部分を含むＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６８５もしくは配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６５６の欠失、またはアミノ酸１６４８（例えば、Ｒ１６４８Ａ）、１６８０（Ｙ１６８０Ｆ）、もしくは両方における突然変異もしくは置換を含有する。
【００８９】
別の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、５つの異種性部分を含み、この５つの異種性部分のうちの少なくとも１つが、許容ループ内にまたはａ３領域に挿入されるか、５つの異種性部分のうちの少なくとも２つが、２つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、５つの異種性部分のうちの少なくとも３つが、３つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、５つの異種性部分のうちの少なくとも４つが、４つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、あるいは５つの異種性部分の全てが、５つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入される。第１、第２、第３、第４、および第５の異種性部分は、同じであるか、または異なる。５つの異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質の非限定的な例が、表ＸＶＩにある。一例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第５の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第５の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第５の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第５の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第５の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第５の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第５の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第５の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第２の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第３の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第５の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。いくつかの実施形態において、５つの異種性部分を含むＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６８５もしくは配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６５６の欠失、またはアミノ酸１６４８（例えば、Ｒ１６４８Ａ）、１６８０（Ｙ１６８０Ｆ）、もしくは両方における突然変異もしくは置換を含有する。
【００９０】
別の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、６つの異種性部分を含み、この６つの異種性部分のうちの少なくとも１つが、許容ループ内にまたはａ３領域に挿入されるか、６つの異種性部分のうちの少なくとも２つが、２つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、６つの異種性部分のうちの少なくとも３つが、３つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、６つの異種性部分のうちの少なくとも４つが、４つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、６つの異種性部分のうちの少なくとも５つが、５つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入されるか、または６つの異種性部分の全てが、６つの許容ループ内に、ａ３領域に、またはそれらの任意の組み合わせに挿入される。第１、第２、第３、第４、第５、および第６の異種性部分は、同じであるか、または異なる。６つの異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質の例としては、表ＸＶＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。一例において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、ａ３領域に挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第５の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第６の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。別の態様において、第１の異種性部分は、許容ループＡ１−１に挿入され、第２の異種性部分は、許容ループＡ２−１に挿入され、第３の異種性部分は、Ｂドメインに挿入され、第４の異種性部分は、許容ループＡ３−１に挿入され、第５の異種性部分は、許容ループＡ３−２に挿入され、第６の異種性部分は、ＣＴにおいて挿入される。いくつかの実施形態において、６つの異種性部分を含むＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６８５もしくは配列番号１に対応するアミノ酸７４５〜アミノ酸１６５６の欠失、またはアミノ酸１６４８（例えば、Ｒ１６４８Ａ）、１６８０（Ｙ１６８０Ｆ）、もしくは両方における突然変異もしくは置換を含有する。
【００９１】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘにおけるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、１つの異種性部分を含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、２つのアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、２つの異種性部分を含み、この２つのアミノ酸の各々は、表Ｘにおけるアミノ酸からなる群から選択される。特定の実施形態において、２つの異種性部分は、表ＸＩにおける挿入部位からなる群から選択される、２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、３つのアミノ酸の直ぐ下流に挿入された３つの異種性部分を含み、この３つのアミノ酸の各々は、表Ｘにおけるアミノ酸からなる群から選択される。具体的な実施形態において、３つの異種性部分は、表ＸＩＩおよびＸＩＩＩにおける挿入部位からなる群から選択される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、４つのアミノ酸の直ぐ下流に挿入された４つの異種性部分を含み、この４つのアミノ酸の各々は、表Ｘにおけるアミノ酸からなる群から選択される。特定の実施形態において、４つの異種性部分は、表ＸＩＶおよびＸＶにおける挿入部位からなる群から選択される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、５つのアミノ酸の直ぐ下流に挿入された５つの異種性部分を含み、この５つのアミノ酸の各々は、表Ｘにおけるアミノ酸からなる群から選択される。特定の実施形態において、５つの異種性部分は、表ＸＶＩにおける挿入部位からなる群から選択される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、６つのアミノ酸の直ぐ下流に挿入された６つの異種性部分を含み、この６つのアミノ酸の各々は、表Ｘにおけるアミノ酸からなる群から選択される。特定の実施形態において、６つの異種性部分は、表ＸＶＩＩにおける挿入部位からなる群から選択される、６つの挿入部位に挿入される。
【００９２】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、１つの異種性部分、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなる異種性部分を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、２つの異種性部分、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなる異種性部分を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された３つの異種性部分、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなる異種性部分を含む。
【００９３】
３．異種性部分
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つの異種性部分を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。「異種性部分」は、異種性ポリペプチド、もしくは非ポリペプチド部分、または両方を含むことができる。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分は、ＸＴＥＮ配列ではない。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分は、半減期延長部分（例えば、インビボ半減期延長部分）であるが、ＸＴＥＮ配列ではない。
【００９４】
ＦＶＩＩＩがその凝血促進活性の少なくとも一部分を保持する挿入部位の発見はまた、それらの同じ部位のうちの１つ以上においてＦＶＩＩＩタンパク質に融合されたときの半減期の長期化に関連する、不定形のまたは定形のいずれかの特性を有する他のペプチドおよびポリペプチドの挿入も可能にするであろうと考えられている。異種性部分（例えば、半減期延長部分）の非限定的な例としては、アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、米国特許出願第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカーが挙げられ、５０％未満〜５０％超の様々な程度の二次構造を有する、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される２種類のアミノ酸の、６〜４０アミノ酸のペプチドおよび短鎖ポリペプチドが、とりわけ、ＦＶＩＩＩの特定される活性挿入部位における挿入に好適であろう。
【００９５】
ある特定の態様において、異種性部分は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質のインビボまたはインビトロ半減期を増加させる。他の態様において、異種性部分は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の可視化または位置特定を容易にする。組換えＦＶＩＩＩタンパク質の可視化および／または箇所は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、またはそれらの組み合わせであり得る。他の態様において、異種性部分は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の安定性を増加させる。本明細書で使用されるとき、「安定性」という用語は、環境条件（例えば、温度上昇または低下）に反応した組換えＦＶＩＩＩタンパク質の１つ以上の物理的特性の維持を測る、当該技術分野で承認されている尺度を指す。ある特定の態様において、物理的特性は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の共有構造（例えば、タンパク質分解切断、所望されない酸化、または脱アミドの不在）の維持であり得る。他の態様において、物理的特性はまた、適正に折り畳まれた状態（例えば、可溶性または不溶性凝集体または沈殿物の不在）での組換えＦＶＩＩＩタンパク質の存在であり得る。一態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の安定性は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の生物物理学的特性、例えば、熱安定性、ｐＨアンフォールディングプロフィール、グリカンの安定な除去、溶解度、生化学的機能（例えば、別のタンパク質に結合する能力）等、および／またはそれらの組み合わせをアッセイすることによって測定される。別の態様において、生化学的機能は、相互作用の結合親和性によって実証される。一態様において、タンパク質安定性の尺度は、熱安定性、すなわち、熱的攻撃への抵抗性である。安定性は、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱法）等の、当該技術分野で既知の方法を使用して測定することができる。熱安定性を測定する方法には、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、円偏光二色性（ＣＤ）、および熱的攻撃アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
具体的な態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質における１つ以上の許容ループ、ａ３領域、または両方に挿入された異種性部分は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の生化学的活性を保持する。一実施形態において、生化学的活性は、ＦＶＩＩＩ活性であり、それは発色アッセイによって測定することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、異種性部分は、異種性部分のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に位置するリンカーを介して、挿入部位に間接的に挿入することができる。異種性部分のＮ末端およびＣ末端におけるリンカーは、同じであるか、または異なり得る。いくつかの実施形態において、数個のリンカーが、異種性部分の一方または両方の末端に縦列で隣接し得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー」である。「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。
【００９８】
例となるＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号６０）を含み、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１００と同じまたはそれよりも高い整数である。一実施形態において、ｎ＝１、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号１９１）である。一実施形態において、ｎ＝２、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１９２）である。別の実施形態において、ｎ＝３、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１９３）である。別の実施形態において、ｎ＝４、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１９４）である。別の実施形態において、ｎ＝５、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１９５）である。なおも別の実施形態において、ｎ＝６、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号１９６）である。別の実施形態において、ｎ＝７、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号１９７）である。なおも別の実施形態において、ｎ＝８、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号１９８）である。別の実施形態において、ｎ＝９、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号１９９）である。なおも別の実施形態において、ｎ＝１０、すなわち、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号２００）である。
【００９９】
別の例となるＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２０１）を含み、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１００と同じまたはそれよりも高い整数である。一実施形態において、ｎ＝１、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号２０２）である。一実施形態において、ｎ＝２、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号２０３）である。別の実施形態において、ｎ＝３、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２０４）である。別の実施形態において、ｎ＝４、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２０５）である。別の実施形態において、ｎ＝５、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号２０６）である。なおも別の実施形態において、ｎ＝６、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号２０７）である。なおも別の実施形態において、ｎ＝７、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号２０８）である。なおも別の実施形態において、ｎ＝８、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号２０９）である。なおも別の実施形態において、ｎ＝９、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号２１０）である。なおも別の実施形態において、ｎ＝１０、すなわち、リンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号２１１）である。
【０１００】
３．１  半減期延長
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、タンパク質の半減期、例えば、タンパク質のインビボ半減期を増加させる、少なくとも１つの異種性部分を含む。組換えＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、当業者に既知の任意の方法、例えば、血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルを検出するためのＦＶＩＩＩ活性アッセイ（発色アッセイまたは一段式凝血ａＰＴＴアッセイ）、または血漿ＦＶＩＩＩ抗原レベルを検出するためのＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡによって、決定することができる。特定の実施形態において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の凝血活性の半減期は、一段式凝血アッセイによって決定される。より特定の実施形態において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の凝血活性の半減期は、ＨｅｍＡマウス、またはＦＶＩＩＩおよびフォンヴィルブランド因子二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウスのいずれかのマウスにおいて決定される。
【０１０１】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を増加させる異種性部分は、限定なしに、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ＸＴＥＮ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、アルブミン結合部分等の異種性ポリペプチド、またはこれらのポリペプチドの任意の断片、誘導体、変異体、もしくは組み合わせを含むことができる。ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、半減期を増加させる異種性ポリペプチドを含み、この異種性ポリペプチドは、ＸＴＥＮ配列ではない。他の関連する態様において、異種性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸等の非ポリペプチド部分のための結合部位、またはこれらの部分の任意の誘導体、変異体、もしくは組み合わせを含むことができる。
【０１０２】
他の実施形態において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の重合体に複合体化される。重合体は、水溶性または非水溶性であり得る。重合体は、ＦＶＩＩＩにまたはＦＶＩＩＩに複合体化された他の部分に、共有結合または非共有結合することができる。重合体の非限定的な例としては、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、またはポリ（アクリロイルモルホリン）が挙げられ得る。さらなる種類の重合体−複合体化ＦＶＩＩＩは、米国特許第７，１９９，２２３号に開示され、それは参照によりその全体が開示される。
【０１０３】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える異種性部分を含むことができ、それらは各々、同じであるか、または異なる分子であり得る。
【０１０４】
３．１．１．Ｆｃ領域
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループに、またはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つＦｃ領域を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、別途明記されない限り、Ｆｃドメイン、変異体、またはその断片を含む、機能的新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合パートナーを意味する。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ受容体によって特異的に結合され得、結果的に、ＦｃＲｎ結合パートナーのＦｃＲｎ受容体による活性な輸送を有する、任意の分子である。故に、Ｆｃという用語は、機能的であるＩｇＧ  Ｆｃの任意の変異体を含む。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶解析に基づいて記載されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９（１９９４）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＦｃＲｎとのＦｃの主な接触域は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの接合部の近くにある。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触部は全て、１本のＩｇ重鎖内にある。ＦｃＲｎ結合パートナーには、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、およびＦｃＲｎの完全な結合領域を含むＩｇＧの他の断片が含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃは、免疫グロブリンのヒンジ領域を含んでも含まなくても、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むことができる。また、キメラタンパク質におけるＦｃ領域の望ましい特性、例えば、半減期、例えば、インビボ半減期の増加を維持する、Ｆｃ断片、変異体、または誘導体も含まれる。無数の突然変異体、断片、変異体、および誘導体が、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０１１／０６９１６４  Ａ２号、第ＷＯ  ２０１２／００６６２３  Ａ２号、第ＷＯ  ２０１２／００６６３５  Ａ２号、または第ＷＯ  ２０１２／００６６３３  Ａ２号に記載され、それらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
３．１．２  アルブミン
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つのアルブミンポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。完全長型において６０９アミノ酸のタンパク質である、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、またはＨＡ）は、かなりの割合の血清浸透圧に関与し、また、内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書で使用される「アルブミン」という用語は、完全長アルブミンまたはその機能的断片、変異体、誘導体、もしくは類似体を含む。アルブミンまたはその断片もしくは変異体の例は、米国特許公開第２００８／０１９４４８１Ａ１号、同第２００８／０００４２０６  Ａ１号、同第２００８／０１６１２４３  Ａ１号、同第２００８／０２６１８７７  Ａ１号、もしくは同第２００８／０１５３７５１  Ａ１号、またはＰＣＴ出願公開第２００８／０３３４１３  Ａ２号、同第２００９／０５８３２２  Ａ１号、もしくは同第２００７／０２１４９４  Ａ２号に開示され、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ）は、限定なしに、アルブミンに結合することができる、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合抗体断片を損ない得る。Ｋｒａｕｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７８：１９０−１９４（１９９６）およびＬｉｎｈｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１１：２０６−２１３（２００２）によって開示される、レンサ球菌プロテインＧからのドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの例である。アルブミン結合ペプチドの例としては、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号４５）を有する一連のペプチドが挙げられる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）を参照されたい。アルブミン結合抗体断片の例は、Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９−３２６（２００７）、Ｒｏｏｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３−３１７（２００７）、およびＨｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｃｉ．，２１：２８３−２８８（２００８）に開示され、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩポリペプチドは、許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入されたそのアルブミンに結合することができる、非ポリペプチド小分子、変異体、または誘導体のための少なくとも１つの結合部位を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。例えば、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループにおいてまたはａ３領域において結合された、１つ以上の有機アルブミン結合部分を含むことができ、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。かかるアルブミン結合部分の例は、Ｔｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０：２２８６−２２９２（２００９）によって開示される、２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、アルブミン結合ポリペプチド配列は、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列に隣接する。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１９１）である。他の実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１９２）である。
【０１０９】
３．１．３  ＸＴＥＮ
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つのＸＴＥＮポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、この組換えタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。本明細書で使用されるとき、「ＸＴＥＮ配列」は、小さい親水性アミノ酸から主に構成される非自然発生の実質的に非反復性の配列を有する、延長された長さのポリペプチドを指し、この配列は、低度の二次または三次構造を有するか、何の二次または三次構造も有しない。キメラタンパク質パートナーとして、ＸＴＥＮは、例えば、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質の許容ループまたはａ３領域に挿入されるとき、ある特定の望ましい薬物動態学的、物理化学的、および薬学的特性を付与する、担体としての役目を果たすことができる。かかる望ましい特性には、向上した薬物動態学的パラメータおよび溶解度特性が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質に挿入されたＸＴＥＮ配列は、組換えタンパク質に、次の有利な特性のうちの１つ以上を付与することができる：立体配座柔軟性、向上した水溶解度、高度なプロテアーゼ抵抗性、低い免疫原性、哺乳類受容体への低い結合、または増加した流体力学（またはストークス）半径。ある特定の態様において、ＸＴＥＮ配列は、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質が体内に留まり、天然ＦＶＩＩＩと比較して増加した一定期間にわたって凝血促進活性を有するように、より長い半減期（例えば、インビボ半減期）または増加した曲線下面積（ＡＵＣ）等の、薬物動態学的特性を増加させることができる。
【０１１１】
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質に挿入され得るＸＴＥＮ配列の例は、例えば、米国特許公開第２０１０／０２３９５５４  Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６  Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０  Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１  Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９  Ａ１号、もしくは同第２０１１／０１７２１４６  Ａ１、または国際特許公開第ＷＯ  ２０１００９１１２２  Ａ１号、同第ＷＯ  ２０１０１４４５０２  Ａ２号、同第ＷＯ  ２０１０１４４５０８  Ａ１号、同第ＷＯ  ２０１１０２８２２８  Ａ１号、同第ＷＯ  ２０１１０２８２２９  Ａ１号、もしくは同第ＷＯ  ２０１１０２８３４４  Ａ２号に開示され、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質に挿入され得る、例となるＸＴＥＮ配列には、ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４（配列番号１３）、ＸＴＥＮ  １４４−２Ａ（配列番号１５）、ＸＴＥＮ  Ａ１４４−３Ｂ（配列番号１７）、ＸＴＥＮ  ＡＥ１４４−４Ａ（配列番号１９）、ＸＴＥＮ  ＡＥ１４４−５Ａ（配列番号２１）、ＸＴＥＮ  ＡＥ１４４−６Ｂ（配列番号２３）、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−１（配列番号２５）、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ａ（配列番号２７）、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｂ（配列番号２９）、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｃ（配列番号３１）、およびＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｆ（配列番号３３）が含まれる。
【０１１３】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分のうちの少なくとも１つは、ＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの２つが、ＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの３つが、ＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの４つが、ＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの５つが、ＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの６つ以上が、ＸＴＥＮ配列である。
【０１１４】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、ａ３、またはそれらの任意の組み合わせの内の挿入部位において、１つ以上のＸＴＥＮ配列を含む。一実施形態において、１つ以上のＸＴＥＮ配列は、Ａ１−１内に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のＸＴＥＮ配列は、Ａ１−２内に挿入される。他の実施形態において、１つ以上のＸＴＥＮ配列は、Ａ２−１内に挿入される。依然として他の実施形態において、１つ以上のＸＴＥＮ配列は、Ａ２−２内に挿入される。なおも他の実施形態において、１つ以上のＸＴＥＮ配列は、Ａ３−１内に挿入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＸＴＥＮ配列は、Ａ３−２内に挿入される。ある特定の実施形態において、１つ以上のＸＴＥＮ配列は、ａ３領域内に挿入される。
【０１１５】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される挿入部位で挿入された、１つのＸＴＥＮ配列を含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される２つの挿入部位に挿入された、２つのＸＴＥＮ配列を含む。特定の実施形態において、２つのＸＴＥＮ配列は、表ＸＩに列挙される２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される３つの挿入部位に挿入された、３つのＸＴＥＮ配列を含む。具体的な態様において、３つのＸＴＥＮ配列は、表ＸＩＩ、表ＸＩＩＩ、または両方の表に列挙される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される４つの挿入部位に挿入された、４つのＸＴＥＮ配列を含む。特定の態様において、４つのＸＴＥＮ配列は、表ＸＩＶ、表ＸＶ、または両方に列挙される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される５つの挿入部位に挿入された、５つのＸＴＥＮ配列を含む。特定の態様において、５つのＸＴＥＮ配列は、表ＸＶＩに列挙される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される６つの挿入部位に挿入された、６つのＸＴＥＮ配列を含む。特定の実施形態において、６つのＸＴＥＮ配列は、表ＸＶＩＩに列挙される、６つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、全ての挿入されたＸＴＥＮ配列は、同一である。他の態様において、挿入されたＸＴＥＮ配列のうちの少なくとも１つは、残りの挿入されたＸＴＥＮ配列とは異なる。
【０１１６】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、１つのＸＴＥＮ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＸＴＥＮ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、２つのＸＴＥＮ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＸＴＥＮ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、３つのＸＴＥＮ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＸＴＥＮ配列を含む。
【０１１７】
３．１．４  ＣＴＰ
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットの少なくとも１つのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。組換えタンパク質に挿入された１つ以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質の半減期を増加させることが知られている。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７１２，１２２号を参照されたい。例となるＣＴＰペプチドは、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号３５）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号３６）を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ  ２００９／００８７４１１  Ａ１号を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＣＴＰ配列は、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列に隣接する。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１９１）である。他の実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１９２）である。
【０１１８】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分のうちの少なくとも１つは、ＣＴＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの２つが、ＣＴＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの３つが、ＣＴＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの４つが、ＣＴＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの５つが、ＣＴＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの６つ以上が、ＣＴＰ配列である。
【０１１９】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、ａ３、またはそれらの任意の組み合わせの内の挿入部位において、１つ以上のＣＴＰ配列を含む。一実施形態において、１つ以上のＣＴＰ配列は、Ａ１−１内に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のＣＴＰ配列は、Ａ１−２内に挿入される。他の実施形態において、１つ以上のＣＴＰ配列は、Ａ２−１内に挿入される。依然として他の実施形態において、１つ以上のＣＴＰ配列は、Ａ２−２内に挿入される。なおも他の実施形態において、１つ以上のＣＴＰ配列は、Ａ３−１内に挿入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＣＴＰ配列は、Ａ３−２内に挿入される。ある特定の実施形態において、１つ以上のＣＴＰ配列は、ａ３領域内に挿入される。
【０１２０】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される挿入部位で挿入された、１つのＣＴＰ配列を含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される２つの挿入部位に挿入された、２つのＣＴＰ配列を含む。特定の実施形態において、２つのＣＴＰ配列は、表ＸＩに列挙される２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される３つの挿入部位に挿入された、３つのＣＴＰ配列を含む。具体的な態様において、３つのＣＴＰ配列は、表ＸＩＩ、表ＸＩＩＩ、または両方の表に列挙される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される４つの挿入部位に挿入された、４つのＣＴＰ配列を含む。特定の態様において、４つのＣＴＰ配列は、表ＸＩＶ、表ＸＶ、または両方に列挙される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される５つの挿入部位に挿入された、５つのＣＴＰ配列を含む。特定の態様において、５つのＣＴＰ配列は、表ＸＶＩに列挙される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される６つの挿入部位に挿入された、６つのＣＴＰ配列を含む。特定の実施形態において、６つのＣＴＰ配列は、表ＸＶＩＩに列挙される、６つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、全ての挿入されたＣＴＰ配列は、同一である。他の態様において、挿入されたＣＴＰ配列のうちの少なくとも１つは、残りの挿入されたＣＴＰ配列とは異なる。
【０１２１】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、１つのＣＴＰ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＣＴＰ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、２つのＣＴＰ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＣＴＰ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、３つのＣＴＰ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＣＴＰ配列を含む。
【０１２２】
３．１．５  ＰＡＳ
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つのＰＡＳペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。本明細書で使用されるＰＡＳペプチドまたはＰＡＳ配列は、主にアラニンおよびセリン残基を含む、または主にアラニン、セリン、およびプロリン残基を含む、アミノ酸配列を意味し、このアミノ酸配列は、生理的条件下でランダムコイル立体配座を形成する。したがって、ＰＡＳ配列は、キメラタンパク質において異種性部分の一部として使用され得る、アラニン、セリン、およびプロリンを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる、ビルディングブロック、アミノ酸重合体、または配列カセットである。アミノ酸重合体はまた、アラニン、セリン、およびプロリン以外の残基が副成分としてＰＡＳ配列において付加されるときにも、ランダムコイル立体配座を形成することができる。「副成分」とは、アラニン、セリン、およびプロリン以外のそのアミノ酸が、ＰＡＳ配列においてある程度、例えば、アミノ酸の最大約１２％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１２個、最大約１０％、最大約９％、最大約８％、約６％、約５％、約４％、約３％、すなわち約２％、または約１％付加され得ることを意味する。アラニン、セリン、およびプロリンとは異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択され得る。生理的条件下で、ＰＡＳペプチドは、ランダムコイル立体配座を形成し、それによって、本発明の組換えタンパク質に対して増加したインビボおよび／またはインビトロ安定性を媒介することができ、また凝血促進活性を有する。
【０１２３】
ＰＡＳペプチドの非限定的な例としては、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号３７）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号３８）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号３９）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号４０）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号４１）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号４２）、ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号４３）、またはそれらの任意の変異体、誘導体、断片、もしくは組み合わせが挙げられる。ＰＡＳ配列のさらなる例は、例えば、米国特許公開第２０１０／０２９２１３０  Ａ１号およびＰＣＴ出願公開第ＷＯ  ２００８／１５５１３４  Ａ１号から知られている。欧州発行特許第ＥＰ２１７３８９０号。
いくつかの実施形態において、ＰＡＳ配列は、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列に隣接する。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１９１）である。他の実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１９２）である。
【０１２４】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分のうちの少なくとも１つは、ＰＡＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの２つが、ＰＡＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの３つが、ＰＡＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの４つが、ＰＡＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの５つが、ＰＡＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの６つ以上が、ＰＡＳ配列である。
【０１２５】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、ａ３、またはそれらの任意の組み合わせの内の挿入部位において、１つ以上のＰＡＳ配列を含む。一実施形態において、１つ以上のＰＡＳ配列は、Ａ１−１内に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のＰＡＳ配列は、Ａ１−２内に挿入される。他の実施形態において、１つ以上のＰＡＳ配列は、Ａ２−１内に挿入される。依然として他の実施形態において、１つ以上のＰＡＳ配列は、Ａ２−２内に挿入される。なおも他の実施形態において、１つ以上のＰＡＳ配列は、Ａ３−１内に挿入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＰＡＳ配列は、Ａ３−２内に挿入される。ある特定の実施形態において、１つ以上のＰＡＳ配列は、ａ３領域内に挿入される。
【０１２６】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される挿入部位で挿入された、１つのＰＡＳ配列を含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される２つの挿入部位に挿入された、２つのＰＡＳ配列を含む。特定の実施形態において、２つのＰＡＳ配列は、表ＸＩに列挙される２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される３つの挿入部位に挿入された、３つのＰＡＳ配列を含む。具体的な態様において、３つのＰＡＳ配列は、表ＸＩＩ、表ＸＩＩＩ、または両方の表に列挙される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される４つの挿入部位に挿入された、４つのＰＡＳ配列を含む。特定の態様において、４つのＰＡＳ配列は、表ＸＩＶ、表ＸＶ、または両方に列挙される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される５つの挿入部位に挿入された、５つのＰＡＳ配列を含む。特定の態様において、５つのＰＡＳ配列は、表ＸＶＩに列挙される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される６つの挿入部位に挿入された、６つのＰＡＳ配列を含む。特定の実施形態において、６つのＰＡＳ配列は、表ＸＶＩＩに列挙される、６つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、全ての挿入されたＰＡＳ配列は、同一である。他の態様において、挿入されたＰＡＳ配列のうちの少なくとも１つは、残りの挿入されたＰＡＳ配列とは異なる。
【０１２７】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、１つのＰＡＳ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＰＡＳ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、２つのＰＡＳ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＰＡＳ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、３つのＰＡＳ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＰＡＳ配列を含む。
【０１２８】
３．１．６  ＨＡＰ
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つのホモアミノ酸重合体（ＨＡＰ）ペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ＨＡＰペプチドは、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、１２０アミノ酸、１４０アミノ酸、１６０アミノ酸、１８０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸、３５０アミノ酸、４００アミノ酸、４５０アミノ酸、または５００アミノ酸長を有する、グリシンの反復配列を含むことができる。ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合されたまたは連結された部分の半減期を延長することが可能である。ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられるが、これらに限定されず、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。一実施形態において、ｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態において、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２０：２７３−２８４（２００７）を参照されたい。
【０１２９】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分のうちの少なくとも１つは、ＨＡＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの２つが、ＨＡＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの３つが、ＨＡＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの４つが、ＨＡＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの５つが、ＨＡＰ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの６つ以上が、ＨＡＰ配列である。
【０１３０】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、ａ３、またはそれらの任意の組み合わせの内の挿入部位において、１つ以上のＨＡＰ配列を含む。一実施形態において、１つ以上のＨＡＰ配列は、Ａ１−１内に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のＨＡＰ配列は、Ａ１−２内に挿入される。他の実施形態において、１つ以上のＨＡＰ配列は、Ａ２−１内に挿入される。依然として他の実施形態において、１つ以上のＨＡＰ配列は、Ａ２−２内に挿入される。なおも他の実施形態において、１つ以上のＨＡＰ配列は、Ａ３−１内に挿入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＨＡＰ配列は、Ａ３−２内に挿入される。ある特定の実施形態において、１つ以上のＨＡＰ配列は、ａ３領域内に挿入される。
【０１３１】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される挿入部位で挿入された、１つのＨＡＰ配列を含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される２つの挿入部位に挿入された、２つのＨＡＰ配列を含む。特定の実施形態において、２つのＨＡＰ配列は、表ＸＩに列挙される２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される３つの挿入部位に挿入された、３つのＨＡＰ配列を含む。具体的な態様において、３つのＨＡＰ配列は、表ＸＩＩ、表ＸＩＩＩ、または両方の表に列挙される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される４つの挿入部位に挿入された、４つのＨＡＰ配列を含む。特定の態様において、４つのＨＡＰ配列は、表ＸＩＶ、表ＸＶ、または両方に列挙される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される５つの挿入部位に挿入された、５つのＨＡＰ配列を含む。特定の態様において、５つのＨＡＰ配列は、表ＸＶＩに列挙される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される６つの挿入部位に挿入された、６つのＨＡＰ配列を含む。特定の実施形態において、６つのＨＡＰ配列は、表ＸＶＩＩに列挙される、６つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、全ての挿入されたＨＡＰ配列は、同一である。他の態様において、挿入されたＨＡＰ配列のうちの少なくとも１つは、残りの挿入されたＨＡＰ配列とは異なる。
【０１３２】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、１つのＨＡＰ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＨＡＰ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、２つのＨＡＰ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＨＡＰ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、３つのＨＡＰ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＨＡＰ配列を含む。
【０１３３】
３．１．７  トランスフェリン
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、少なくとも１つのトランスフェリンペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。任意のトランスフェリンが、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質に入れられ得る。例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、遺伝子重複に由来するように思われる、２つの主要なドメインＮ（約３３０アミノ酸）およびＣ（約３４０アミノ酸）を有する、およそ７５ｋＤａ（グリコシル化を考慮せずに）の６７９アミノ酸のタンパク質である。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ  ０３９８４７、およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照されたく、それらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
トランスフェリンは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）媒介性エンドサイトーシスを通じて鉄を輸送する。鉄がエンドソーム区画中に放出され、Ｔｆ−ＴｆＲ複合体が細胞表面上に再循環された後、Ｔｆは、次の鉄輸送周期のために細胞外空間に再び放出される。Ｔｆは、１４〜１７日間を超過する、長い半減期を有する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，傾向ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２３：２０６−２０９（２００２）。トランスフェリン融合タンパク質は、半減期延長、癌療法のための標的化された送達、経口送達、およびプロインスリンの持続的活性化について、研究されてきている（Ｂｒａｎｄｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２９：２３０−２３８（２０１１）、Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：７２９２−７２９６（２００５）、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３３４：６８２−６９２（２０１０）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １５５：３８６−３９２（２０１１））。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、トランスフェリン配列は、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列に隣接する。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１９１）である。他の実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１９２）である。
【０１３６】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分のうちの少なくとも１つは、トランスフェリン配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの２つが、トランスフェリン配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの３つが、トランスフェリン配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの４つが、トランスフェリン配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの５つが、トランスフェリン配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの６つ以上が、トランスフェリン配列である。
【０１３７】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、ａ３、またはそれらの任意の組み合わせの内の挿入部位において、１つ以上のトランスフェリン配列を含む。一実施形態において、１つ以上のトランスフェリン配列は、Ａ１−１内に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のトランスフェリン配列は、Ａ１−２内に挿入される。他の実施形態において、１つ以上のトランスフェリン配列は、Ａ２−１内に挿入される。依然として他の実施形態において、１つ以上のトランスフェリン配列は、Ａ２−２内に挿入される。なおも他の実施形態において、１つ以上のトランスフェリン配列は、Ａ３−１内に挿入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のトランスフェリン配列は、Ａ３−２内に挿入される。ある特定の実施形態において、１つ以上のトランスフェリン配列は、ａ３領域内に挿入される。
【０１３８】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される挿入部位で挿入された、１つのトランスフェリン配列を含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される２つの挿入部位に挿入された、２つのトランスフェリン配列を含む。特定の実施形態において、２つのトランスフェリン配列は、表ＸＩに列挙される２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される３つの挿入部位に挿入された、３つのトランスフェリン配列を含む。具体的な態様において、３つのトランスフェリン配列は、表ＸＩＩ、表ＸＩＩＩ、または両方の表に列挙される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される４つの挿入部位に挿入された、４つのトランスフェリン配列を含む。特定の態様において、４つのトランスフェリン配列は、表ＸＩＶ、表ＸＶ、または両方に列挙される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される５つの挿入部位に挿入された、５つのトランスフェリン配列を含む。特定の態様において、５つのトランスフェリン配列は、表ＸＶＩに列挙される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される６つの挿入部位に挿入された、６つのトランスフェリン配列を含む。特定の実施形態において、６つのトランスフェリン配列は、表ＸＶＩＩに列挙される、６つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、全ての挿入されたトランスフェリン配列は、同一である。他の態様において、挿入されたトランスフェリン配列のうちの少なくとも１つは、残りの挿入されたトランスフェリン配列とは異なる。
【０１３９】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、１つのトランスフェリン配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるトランスフェリン配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、２つのトランスフェリン配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるトランスフェリン配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、３つのトランスフェリン配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるトランスフェリン配列を含む。
【０１４０】
３．１．８  ＰＥＧ
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、非ポリペプチド異種性部分またはその断片、変異体、もしくは誘導体のための少なくとも１つの結合部位を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。例えば、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループにおいてまたはａ３領域において結合された、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含むことができ、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。
【０１４１】
ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩと少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子との間に形成された複合体を指し得る。ＰＥＧは、多岐にわたる分子量および平均分子量の範囲で市販されている。ＰＥＧの平均分子量の範囲の典型的な例としては、約２００、約３００、約４００、約６００、約１０００、約１３００〜１６００、約１４５０、約２０００、約３０００、約３０００〜３７５０、約３３５０、約３０００〜７０００、約３５００〜４５００、約５０００〜７０００、約７０００〜９０００、約８０００、約１００００、約８５００〜１１５００、約１６０００〜２４０００、約３５０００、約４００００、約６００００、および約８００００ダルトンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの平均分子量は、単に例として提供されるものであり、決して限定するようには意図されない。
【０１４２】
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質を、ＰＥＧ化して、モノまたはポリ（例えば、２〜４個の）ＰＥＧ部分を含めることができる。ＰＥＧ化は、当該技術分野で既知のＰＥＧ化反応のいずれによっても実施され得る。ＰＥＧ化タンパク質産物を調製するための方法は、一般に、（ｉ）ポリペプチドを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体等）と、本発明のペプチドが１個以上のＰＥＧ基に結合する条件下で反応させることと、（ｉｉ）反応産物（複数可）を得ることとを含む。一般に、反応のための最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて個別に決定される。
【０１４３】
例えば、Ｍａｌｉｋ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−３５（１９９２）、Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３（２）：４−１０（１９９２）、欧州特許公開第ＥＰ０４０１３８４号、同第ＥＰ０１５４３１６号、および同第ＥＰ０４０１３８４号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ９２／１６２２１号および同第ＷＯ９５／３４３２６号等の、当業者に利用可能ないくつかのＰＥＧ結合方法がある。非限定な例として、ＦＶＩＩＩ変異体は、本明細書に記載される１つ以上の許容ループにシステイン置換基を含有することができ、そのシステインは、ＰＥＧ重合体にさらに複合体化され得る。Ｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１６：２７０−２７９（２０１０）および米国特許第７，６３２，９２１号を参照されたく、それらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分のうちの少なくとも１つは、ＰＥＧ分子である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの２つが、ＰＥＧである。いくつかの態様において、異種性部分のうちの３つが、ＰＥＧである。いくつかの態様において、異種性部分のうちの４つが、ＰＥＧである。いくつかの態様において、異種性部分のうちの５つが、ＰＥＧである。いくつかの態様において、異種性部分のうちの６つ以上が、ＰＥＧである。
【０１４５】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、ａ３、またはそれらの任意の組み合わせの内の挿入部位において、１つ以上のＰＥＧを含む。一実施形態において、１つ以上のＰＥＧは、Ａ１−１内に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のＰＥＧは、Ａ１−２内に挿入される。他の実施形態において、１つ以上のＰＥＧは、Ａ２−１内に挿入される。依然として他の実施形態において、１つ以上のＰＥＧは、Ａ２−２内に挿入される。なおも他の実施形態において、１つ以上のＰＥＧは、Ａ３−１内に挿入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＰＥＧは、Ａ３−２内に挿入される。ある特定の実施形態において、１つ以上のＰＥＧは、ａ３領域内に挿入される。
【０１４６】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される挿入部位で挿入された、１つのＰＥＧを含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される２つの挿入部位に挿入された、２つのＰＥＧを含む。特定の実施形態において、２つのＰＥＧは、表ＸＩに列挙される２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される３つの挿入部位に挿入された、３つのＰＥＧを含む。具体的な態様において、３つのＰＥＧは、表ＸＩＩ、表ＸＩＩＩ、または両方の表に列挙される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される４つの挿入部位に挿入された、４つのＰＥＧを含む。特定の態様において、４つのＰＥＧは、表ＸＩＶ、表ＸＶ、または両方に列挙される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される５つの挿入部位に挿入された、５つのＰＥＧを含む。特定の態様において、５つのＰＥＧは、表ＸＶＩに列挙される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される６つの挿入部位に挿入された、６つのＰＥＧを含む。特定の実施形態において、６つのＰＥＧは、表ＸＶＩＩに列挙される、６つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、全ての挿入されたＰＥＧは、同一である。他の態様において、挿入されたＰＥＧのうちの少なくとも１つは、残りの挿入されたＰＥＧとは異なる。
【０１４７】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、１つのＰＥＧ、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＰＥＧを含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、２つのＰＥＧ、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＰＥＧを含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、３つのＰＥＧ、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＰＥＧを含む。
【０１４８】
３．１．９  ＨＥＳ
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループにおいてまたはａ３領域において複合体化された、少なくとも１つのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）重合体を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ＨＥＳは、自然発生のアミロペクチンの誘導体であり、体内のα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、有利な生物学的特性を示し、血液量補充剤として、および血液希釈療法において診療所で使用される。例えば、Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ  ８：２７１−２７８（１９８７）、およびＷｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．４１：４９４−４９８（１９９１）を参照されたい。
【０１４９】
ＨＥＳは、分子量分布および置換度によって主に特徴付けられる。ＨＥＳは、１〜３００ｋＤ、２〜２００ｋＤ、３〜１００ｋＤ、または４〜７０ｋＤの平均分子量（重量平均）を有する。ヒドロキシエチルデンプンは、ヒドロキシエチル基に関して、０．１〜３、０．１〜２、０．１〜０．９、または０．１〜０．８のモル置換度、および２〜２０の範囲のＣ２：Ｃ６置換比をさらに示し得る。約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳは、ＦｒｅｓｅｎｉｕｓからのＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）である。ＶＯＬＵＶＥＮ（登録商標）は、例えば、血液量減少の治療法および予防法のための治療的適応において使用される容量補充に用いられる、人工コロイドである。例えば、上述の同じＰＥＧ結合方法等の、当業者に利用可能ないくつかのＨＥＳ結合方法がある。
【０１５０】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分のうちの少なくとも１つは、ＨＥＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの２つが、ＨＥＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの３つが、ＨＥＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの４つが、ＨＥＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの５つが、ＨＥＳ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの６つ以上が、ＨＥＳ配列である。
【０１５１】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、ａ３、またはそれらの任意の組み合わせの内の挿入部位において、１つ以上のＨＥＳ配列を含む。一実施形態において、１つ以上のＨＥＳ配列は、Ａ１−１内に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のＨＥＳ配列は、Ａ１−２内に挿入される。他の実施形態において、１つ以上のＨＥＳ配列は、Ａ２−１内に挿入される。依然として他の実施形態において、１つ以上のＨＥＳ配列は、Ａ２−２内に挿入される。なおも他の実施形態において、１つ以上のＨＥＳ配列は、Ａ３−１内に挿入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＨＥＳ配列は、Ａ３−２内に挿入される。ある特定の実施形態において、１つ以上のＨＥＳ配列は、ａ３領域内に挿入される。
【０１５２】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される挿入部位で挿入された、１つのＨＥＳ配列を含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される２つの挿入部位に挿入された、２つのＨＥＳ配列を含む。特定の実施形態において、２つのＨＥＳ配列は、表ＸＩに列挙される２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される３つの挿入部位に挿入された、３つのＨＥＳ配列を含む。具体的な態様において、３つのＨＥＳ配列は、表ＸＩＩ、表ＸＩＩＩ、または両方の表に列挙される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される４つの挿入部位に挿入された、４つのＨＥＳ配列を含む。特定の態様において、４つのＨＥＳ配列は、表ＸＩＶ、表ＸＶ、または両方に列挙される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される５つの挿入部位に挿入された、５つのＨＥＳ配列を含む。特定の態様において、５つのＨＥＳ配列は、表ＸＶＩに列挙される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される６つの挿入部位に挿入された、６つのＨＥＳ配列を含む。特定の実施形態において、６つのＨＥＳ配列は、表ＸＶＩＩに列挙される、６つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、全ての挿入されたＨＥＳ配列は、同一である。他の態様において、挿入されたＨＥＳ配列のうちの少なくとも１つは、残りの挿入されたＨＥＳ配列とは異なる。
【０１５３】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、１つのＨＥＳ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＨＥＳ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、２つのＨＥＳ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＨＥＳ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、３つのＨＥＳ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＨＥＳ配列を含む。
【０１５４】
３．１．１０  ＰＳＡ
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上の許容ループにおいてまたはａ３領域において複合体化された、少なくとも１つのポリシアル酸（ＰＳＡ）重合体を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。ＰＳＡは、ある特定の細菌株によって、および哺乳動物においてある特定の細胞中で産生される、シアル酸の自然発生の非分岐状重合体である。例えば、Ｒｏｔｈ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ｉｎ  Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ：Ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｔｏ  Ｍａｎ，ｅｄｓ．Ｒｏｔｈ  Ｊ．，Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ  Ｕ．，Ｔｒｏｙ  Ｆ．Ａ．（ＢｉｒｋｈaｕｓｅｒＶｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），ｐｐ．３３５−３４８を参照されたい。ＰＳＡは、限定された酸加水分解によってもしくはノイラミニダーゼでの消化によって、または天然の細菌由来の重合体型の分画によって、ｎ＝約８０以上のシアル酸残基から最小ｎ＝２までの種々の重合度で産生することができる。例えば、上述の同じＰＥＧ結合方法等の、当業者に利用可能ないくつかのＰＳＡ結合方法がある。ある特定の態様において、活性化ＰＳＡはまた、ＦＶＩＩＩ上のシステインアミノ酸残基に結合することができる。例えば、米国特許第５８４６９５１号を参照されたい。
【０１５５】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分のうちの少なくとも１つは、ＰＳＡ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの２つが、ＰＳＡ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの３つが、ＰＳＡ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの４つが、ＰＳＡ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの５つが、ＰＳＡ配列である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの６つ以上が、ＰＳＡ配列である。
【０１５６】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、ａ３、またはそれらの任意の組み合わせの内の挿入部位において、１つ以上のＰＳＡ配列を含む。一実施形態において、１つ以上のＰＳＡ配列は、Ａ１−１内に挿入される。別の実施形態において、１つ以上のＰＳＡ配列は、Ａ１−２内に挿入される。他の実施形態において、１つ以上のＰＳＡ配列は、Ａ２−１内に挿入される。依然として他の実施形態において、１つ以上のＰＳＡ配列は、Ａ２−２内に挿入される。なおも他の実施形態において、１つ以上のＰＳＡ配列は、Ａ３−１内に挿入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＰＳＡ配列は、Ａ３−２内に挿入される。ある特定の実施形態において、１つ以上のＰＳＡ配列は、ａ３内に挿入される。
【０１５７】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される挿入部位で挿入された、１つのＰＳＡ配列を含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される２つの挿入部位に挿入された、２つのＰＳＡ配列を含む。特定の実施形態において、２つのＰＳＡ配列は、表ＸＩに列挙される２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される３つの挿入部位に挿入された、３つのＰＳＡ配列を含む。具体的な態様において、３つのＰＳＡ配列は、表ＸＩＩ、表ＸＩＩＩ、または両方の表に列挙される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される４つの挿入部位に挿入された、４つのＰＳＡ配列を含む。特定の態様において、４つのＰＳＡ配列は、表ＸＩＶ、表ＸＶ、または両方に列挙される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される５つの挿入部位に挿入された、５つのＰＳＡ配列を含む。特定の態様において、５つのＰＳＡ配列は、表ＸＶＩに列挙される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される６つの挿入部位に挿入された、６つのＰＳＡ配列を含む。特定の実施形態において、６つのＰＳＡ配列は、表ＸＶＩＩに列挙される、６つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、全ての挿入されたＰＳＡ配列は、同一である。他の態様において、挿入されたＰＳＡ配列のうちの少なくとも１つは、残りの挿入されたＰＳＡ配列とは異なる。
【０１５８】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、１つのＰＳＡ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＰＳＡ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、２つのＰＳＡ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＰＳＡ配列を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、３つのＰＳＡ配列、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、さらなるＰＳＡ配列を含む。
【０１５９】
３．１．１１  クリアランス受容体
ある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質が、許容ループに、もしくはａ３領域に、または両方に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の少なくとも１つの断片、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む場合、延長され得、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を有し、宿主細胞中でインビボまたはインビトロで発現され得る。低比重リポタンパク質関連タンパク質受容体ＬＲＰ１、またはその断片等の、クリアランス受容体の可溶型の挿入は、クリアランス受容体へのＦＶＩＩＩの結合を遮断し、それによってその半減期、例えば、インビボ半減期を延長することができる。ＬＲＰ１は、ＦＶＩＩＩを含む多様なタンパク質の受容体媒介性クリアランスに関連付けられる、６００ｋＤａの内在性膜タンパク質である。例えば、Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １６：６−１６（２０１０）を参照されたい。他の好適なＦＶＩＩＩクリアランス受容体は、例えば、ＬＤＬＲ（低比重リポタンパク質受容体）、ＶＬＤＬＲ（超低比重リポタンパク質受容体）、およびメガリン（ＬＲＰ−２）、またはそれらの断片である。例えば、Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０６：９０６−９１２（２００５）；Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  １１６：５４３９−５４４０（２０１０）、Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１６：５６８８−５６９７（２０１０）を参照されたい。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、クリアランス受容体配列は、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列に隣接する。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１９１）である。他の実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１９２）である。
【０１６１】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単独でまたはＡドメインの許容ループ（例えば、上述のＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２）に挿入されている１つ以上の異種性部分と組み合わせてのいずれかで、ＦＶＩＩＩのａ３領域（例えば、配列番号１のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位）に挿入された少なくとも１つの異種性部分を含み、この異種性部分のうちの少なくとも１つは、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の断片、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの２つが、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの３つが、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの４つが、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの５つが、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体である。いくつかの態様において、異種性部分のうちの６つ以上が、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体である。
【０１６２】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、許容ループ、例えば、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、Ａ３−２、ａ３、またはそれらの任意の組み合わせの内の挿入部位において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つ以上の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。一実施形態において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つ以上の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、Ａ１−１内に挿入される。別の実施形態において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つ以上の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、Ａ１−２内に挿入される。他の実施形態において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つ以上の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、Ａ２−１内に挿入される。依然として他の実施形態において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つ以上の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、Ａ２−２内に挿入される。なおも他の実施形態において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つ以上の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、Ａ３−１内に挿入される。いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つ以上の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、Ａ３−２内に挿入される。ある特定の実施形態において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つ以上の断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ａ３領域内に挿入される。
【０１６３】
ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される挿入部位で挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つの断片、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される２つの挿入部位に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の２つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。特定の実施形態において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の２つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、表ＸＩに列挙される２つの挿入部位に挿入される。依然として他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される３つの挿入部位に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の３つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。具体的な態様において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の３つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、表ＸＩＩ、表ＸＩＩＩ、または両方の表に列挙される、３つの挿入部位に挿入される。なおも他の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される４つの挿入部位に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の４つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。特定の態様において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の４つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、表ＸＩＶ、表ＸＶ、または両方に列挙される、４つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される５つの挿入部位に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の５つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。特定の態様において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の５つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、表ＸＶＩに列挙される、５つの挿入部位に挿入される。ある特定の態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、表Ｘに列挙される６つの挿入部位に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の６つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。特定の実施形態において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の６つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、表ＸＶＩＩに列挙される、６つの挿入部位に挿入される。いくつかの態様において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の全ての挿入された断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、同一である。他の態様において、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の挿入された断片のうちの少なくとも１つ、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体は、残りのＦＶＩＩＩクリアランス受容体の挿入された断片、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体とは異なる。
【０１６４】
いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応するアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の１つの断片、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体のさらなる断片、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する２つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の２つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体のさらなる断片、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。いくつかの態様において、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩにおける配列番号１のアミノ酸２６、配列番号１のアミノ酸４０３、配列番号１のアミノ酸１７２０、または配列番号１のアミノ酸１９００に対応する３つのアミノ酸位置の直ぐ下流に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体の３つの断片、またはそれらのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体、ならびに配列番号１のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸の直ぐ下流に挿入された、ＦＶＩＩＩクリアランス受容体のさらなる断片、またはそのＦＶＩＩＩ結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。
【０１６５】
３．２  可視化および箇所
ある特定の態様において、異種性部分は、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質の可視化または位置特定を容易にする。可視化または位置特定を容易にする、組換えタンパク質への挿入または複合体化のための無数のペプチドおよび他の部分が、当該技術分野で知られている。かかる部分を使用して、インビトロ、インビボ、エクスビボ、またはそれらの任意の組み合わせで、可視化または位置特定を容易にすることができる。
【０１６６】
可視化または位置特定を可能にするペプチドまたはポリペプチドの非限定的な例としては、アビジンベースおよびストレプトアビジンベースの試薬の複合体化を容易にし得るビオチンアクセプターペプチド、結合されたリポ酸へのチオール反応性プローブの複合体化またはリポ酸または蛍光リポ酸類似体の直接のライゲーションを容易にし得るリポ酸アクセプターペプチド、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその変異体（例えば、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ等のＹＦＰ、ｍＶｅｎｕｓ、ＹＰｅｔもしくはＣｉｔｒｉｎｅ、またはＣｅｒｕｌｅａｎもしくはＥＣＦＰ等のＣＦＰ）もしくは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン（ＦｌＡｓＨ）等の二ヒ素色素のライゲーションのためまたは準安定テクネチウム複合体化のためのシステイン含有ペプチド、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの近接アッセイのためのユウロピウムクラスレート複合体化のためのペプチド、それらの任意の変異体、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、可視化を可能にするペプチドまたはポリペプチド（例えば、ＥＧＦＰ等のＧＦＰ）は、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方の末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列に隣接する。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１９１）である。他の実施形態において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１９２）である。
【０１６８】
これらの技法によって標識される組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、例えば、病理学的血栓形成および溶解の３−Ｄ画像診断、凝血促進悪性腫瘍における腫瘍の画像診断、血液および血漿中の凝血促進微粒子のフローサイトメトリー定量および特性評価、生体内顕微鏡検査による血栓形成の監視のために、使用することができる。
【０１６９】
４．薬学的組成物および治療方法
本発明はさらに、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質を含む薬学的組成物を使用して、ヒト対象において出血病態を治療するための方法を提供する。例となる方法は、必要性のある対象に、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質を含む、治療上有効量の薬学的組成物／製剤を投与することを含む。他の態様において、本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡを含む組成物を、必要性のある対象に投与することができる。本発明のある特定の態様において、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現する細胞を、必要性のある対象に投与することができる。本発明のある特定の態様において、薬学的組成物は、（ｉ）組換えＦＶＩＩＩタンパク質、（ｉｉ）組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードする単離された核酸、（ｉｉｉ）核酸コードを含むベクター、（ｉｖ）組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードする単離された核酸および／もしくは組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）を含むベクターを含む、細胞、または（ｖ）それらの組み合わせを含み、また薬学的組成物は、許容される賦形剤または担体をさらに含む。
【０１７０】
出血性病態は、血液凝固障害によって引き起こされ得る。血液凝固障害はまた、凝血障害とも称され得る。一例において、本開示の薬学的組成物で治療することができる血液凝固障害は、血友病またはフォンウィルブランド病（ｖＷＤ）である。別の例において、本開示の薬学的組成物で治療することができる血液凝固障害は、血友病Ａである。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、出血性病態に関連する出血の種類は、関節血症、筋肉出血、口腔出血（ｏｒａｌ  ｂｌｅｅｄ）、出血、筋肉への出血、口腔出血（ｏｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、外傷、頭部外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系の出血、咽頭後隙の出血、後腹膜腔内出血、または腸腰筋鞘内の出血から選択される。
【０１７２】
他の実施形態において、出血性病態を患う対象は、例えば、外科的予防または周術期管理を含む、外科手術のための処置を必要とする。一例において、外科手術は、小手術および大手術から選択される。例となる外科的手技には、抜歯、扁桃摘出術、鼠径部ヘルニア切開術、滑膜切除術、開頭術、骨接合術、外傷外科手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、または関節置換手術（例えば、人工膝関節全置換術、人工股関節置換手術等）、心臓手術、および帝王切開術が含まれる。
【０１７３】
別の例において、対象は、第ＩＸ因子を用いて同時に治療される。本発明の化合物は、ＦＩＸａを活性化することができるので、対象へのＦＩＸａの投与前に、ＦＩＸａポリペプチドを予め活性化させるために使用され得る。
【０１７４】
本発明の方法は、予防的処置またはオンデマンド処置を必要とする対象に対して実施されてもよい。
【０１７５】
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質を含む薬学的組成物は、例えば、局所（例えば、経皮もしくは眼球）、経口、頬側、経鼻、膣内、直腸、または非経口投与を含む、いずれの適切な投与様態のためにも製剤化され得る。
【０１７６】
本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、皮内、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、鞘内、眼球内、眼周囲、眼窩内、滑液嚢内、および腹腔内注射、ならびに任意の同様の注射または注入法を含む。組成物はまた、例えば、懸濁液、エマルション、徐放性製剤、クリーム、ゲル、または粉末であり得る。組成物は、トリグリセリド等の従来の結合剤および担体と共に坐剤として製剤化することができる。
【０１７７】
一例において、薬学的製剤は、液体製剤、例えば、緩衝等張水溶液である。別の例において、薬学的組成物は、生理的または生理的に近いｐＨを有する。他の例において、水性製剤は、生理的または生理的に近いオスモル濃度および塩分を有する。それは、塩化ナトリウムおよび／または酢酸ナトリウムを含有し得る。いくつかの例において、本発明の組成物は、凍結乾燥される。
【０１７８】
５．ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および作製方法
本発明は、本明細書に記載される組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードする単離された核酸、その核酸を含む発現ベクター、その核酸もしくはベクターを含む宿主細胞、または組換えＦＶＩＩＩタンパク質を作製する方法をさらに提供する。
【０１７９】
一実施形態において、本発明は、異種性部分を、本明細書に記載される特定される許容箇所、ａ３領域、または両方に挿入することを含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質を作製する方法を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す。
【０１８０】
別の実施形態において、本発明は、異種性部分を、本明細書に記載される特定される許容箇所、ａ３領域、または両方に挿入することを含む、ＦＶＩＩＩタンパク質の凝血促進活性を排除するまたは低減することなくＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を増加させる方法を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、異種性部分を含まないＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、凝血促進活性および増加した半減期を示す。
【０１８１】
他の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される許容ループ、ａ３領域、または両方に少なくとも１つの異種性部分を含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を設計することを含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質を構築する方法を提供する。
【０１８２】
ある特定の実施形態において、本発明は、異種性部分を、本明細書に記載される特定される許容箇所、ａ３領域、または両方に挿入することを含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の発現を増加させる方法を含み、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す。
【０１８３】
依然として他の実施形態において、本発明は、異種性部分を、本明細書に記載される特定される許容箇所、ａ３領域、または両方に挿入することを含む、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の凝血促進活性を保持する方法を提供し、この組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、凝血促進活性を示す。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、核酸、ベクター、または宿主細胞は、タンパク質転換酵素をコードするさらなるヌクレオチドをさらに含む。タンパク質転換酵素は、プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン５型（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン７型（ＰＣＳＫ７またはＰＣ５）、酵母Ｋｅｘ  ２、プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン３型（ＰＡＣＥまたはＰＣＳＫ３）、およびそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質転換酵素は、ＰＡＣＥ、ＰＣ５、またはＰＣ７である。具体的な実施形態において、タンパク質転換酵素は、ＰＣ５またはＰＣ７である。国際出願公開第ＷＯ  ２０１２／００６６２３号を参照されたく、それは参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態において、タンパク質転換酵素は、ＰＡＣＥ／フーリンである。
【０１８５】
本明細書で使用されるとき、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入されるときに、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製および翻訳に必要な要素を含有する、任意の核酸構築物を指す。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、およびそれらの誘導体を含むことができる。
【０１８６】
本明細書で使用される遺伝子発現制御配列は、それが作動可能に連結されるコード核酸の効率的な転写および翻訳を容易にする、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサーの組み合わせ等の、任意の調節ヌクレオチド配列である。遺伝子発現制御配列は、構成的または誘導性プロモーター等の、例えば、哺乳類またはウイルスプロモーターであってもよい。構成的哺乳類プロモーターには、次の遺伝子のためのプロモーターが含まれるが、これらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチンプロモーター、および他の構成的プロモーター。真核性細胞中で構成的に機能する、例となるウイルスプロモーターには、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルスからのプロモーター、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。他の構成的プロモーターは、当業者に知られている。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターにはまた、誘導性プロモーターが含まれる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に知られている。
【０１８７】
ウイルスベクターの例としては、次のウイルス由来の核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス等のレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ関連ウイルス；ＳＶ４０−型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バールウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；ならびにレトロウイルス等のＲＮＡウイルス。当該技術分野で周知の他のベクターを容易に用いることができる。ある特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子と置き換えられた、非細胞変性の真核性ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスには、レトロウイルスが含まれ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、その後の宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みを伴う。レトロウイルスは、人間の遺伝子療法治験に対して認可されている。最も有用なのは、複製欠損性である（すなわち、所望のタンパク質の合成を導くことが可能であるが、感染粒子を製作することはできない）、レトロウイルスである。かかる遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率形質導入に対する一般的な実用性を有する。複製欠損性レトロウイルスを産生するための標準プロトコル（プラスミドへの外因性遺伝物質の組み込み、プラスミドでのパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、およびウイルス粒子での標的細胞の感染のステップを含む）が、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）に提供される。
【０１８８】
発現ベクター（単数または複数）は次いで、好適な標的細胞中にトランスフェクトされるか、または共トランスフェクトされ、それがポリペプチドを発現するであろう。当該技術分野で既知のトランスフェクション技法には、リン酸カルシウム沈殿（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｃｅｌｌ  １４：７２５）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ  １：８４１）、およびリポソームベースの試薬が含まれるが、これらに限定されない。原核性細胞および真核性細胞の両方を含む、多様な宿主−発現ベクター系を利用して、本明細書に記載されるタンパク質を発現させてもよい。これらには、適切なコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された、細菌（例えば、大腸菌）等の微生物；適切なコード配列を含有する組換え酵母もしくは真菌発現ベクターで形質転換された、酵母もしくは糸状菌；適切なコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクターで感染させられた、昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスまたはタバコモザイクウイルス）で感染させられた、もしくは適切なコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞系；または哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ、ＨＫＢ１１、およびＢＨＫ細胞）を含む動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８９】
一実施形態において、宿主細胞は、真核性細胞である。本明細書で使用されるとき、真核性細胞は、決定的な核を有する任意の動物または植物細胞を指す。動物の真核性細胞には、脊椎動物、例えば、哺乳動物の細胞、および無脊椎動物、例えば、昆虫の細胞が含まれる。植物の真核性細胞には具体的に、限定なしに、酵母細胞が含まれ得る。真核性細胞は、原核性細胞、例えば、細菌とは明確に異なる。
【０１９０】
ある特定の実施形態において、真核性細胞は、哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、哺乳動物に由来する任意の細胞である。哺乳類細胞は具体的に、哺乳類細胞株を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、ヒト胚性腎臓細胞株である、ＨＥＫ  ２９３細胞である。ＨＥＫ  ２９３細胞は、ＣＲＬ−１５３３としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから、およびカタログ番号１１６３１−０１７の２９３−Ｈ細胞またはカタログ番号１１６２５−０１９の２９３−Ｆ細胞としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）から、入手可能である。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、網膜に由来するヒト細胞株である、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、Ｃｒｕｃｅｌｌ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能である。他の実施形態において、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．から入手可能である（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＣＣＬ−６１）。依然として他の実施形態において、哺乳類細胞は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。ＢＨＫ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．から入手可能である（例えば、ＣＲＬ−１６３２）。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞およびヒトＢ細胞株のハイブリッド細胞株である、ＨＫＢ１１細胞である。Ｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（２）：１６５−７８（２００６））。
【０１９１】
依然として他の実施形態において、トランスフェクトされた細胞は、安定にトランスフェクトされている。これらの細胞は、当業者に既知の従来の技法を使用して、安定細胞株として選択し、維持することができる。
【０１９２】
タンパク質のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞は、適切な成長培地中で成長させられる。本明細書で使用されるとき、「適切な成長培地」という用語は、細胞の成長に必要とされる栄養分を含有する培地を意味する。細胞成長に必要とされる栄養分は、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、および成長因子を含んでもよい。任意に、培地は、１つ以上の選択因子を含有することができる。任意に、培地は、仔ウシ血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有することができる。一実施形態において、培地は、実質的に何のＩｇＧも含有しない。成長培地は、一般に、ＤＮＡ構築物を含有する細胞のために、例えば、薬物選択または必須栄養分を欠損させることによって、選択することになり、それがＤＮＡ構築物上の選択可能マーカーによって補完されるか、またはＤＮＡ構築物で共トランスフェクトされる。培養された哺乳類細胞は、一般に、市販の血清含有または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で成長させられる。一実施形態において、培地は、ＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）である。別の実施形態において、培地は、ＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）である。使用される特定の細胞株に適切な培地の選択は、当業者のレベル内にある。
【０１９３】
ある特定の態様において、本発明は、本明細書に記載される方法によって産生される組換えＦＶＩＩＩタンパク質に関する。
【０１９４】
インビトロ産生は、大量の本発明の改変ポリペプチドを得るための規模の拡大を可能にする。組織培養条件下での哺乳類細胞培養のための技法は、当該技術分野で知られており、例えば、エアリフト反応器中もしくは連続攪拌反応器中での、均質懸濁培養、または例えば、中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ、もしくはセラミックカートリッジ上での、固定化もしくは包括固定化細胞培養を含む。必要であるかつ／または所望される場合、ポリペプチドの溶液は、慣習的なクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーによって、精製することができる。
【０１９５】
本発明の実施は、別途指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を用いることになり、それらは当業者の技能の範囲内にある。かかる技法は、文献に完全に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，（１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照されたい。
【０１９６】
免疫学の一般原則を記載している標準の参考文献には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）、Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）、Ａｂｂａｓ  Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）、およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）が含まれる。
【０１９７】
本発明をこれまで詳細に説明してきたが、それは次の実施例を参照することによって、より明確に理解されることになり、これらの実施例は、例示説明の目的のみで本明細書と共に含まれるものであり、本発明を限定するようには意図されない。本明細書で参照される全ての特許および刊行物は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
（実施例）
（実施例１）
【０１９８】
第ＶＩＩＩ因子ベースベクターの構築および操作、クローニング、トランスフェクション、ならびに発現
一般に、本発明の実施は、別途指示されない限り、従来の化学的技法、生物物理学的技法、分子生物学的技法、組換えＤＮＡ技術、および電気泳動における標準技法を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。天然シグナル配列を含む、ヒト第ＶＩＩＩ因子のコード配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００１３２）を、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってヒト肝臓ポリＡ  ＲＮＡから得た。ＦＶＩＩＩが大きいため、コード配列をいくつかに分けて別々のＲＴ−ＰＣＲ反応から得て、一連のＰＣＲ反応、制限消化、およびセリン  ７４３（Ｓ７４３）がグルタミン１６３８（Ｑ１６３８）に融合されて２６８２ｂｐが完全長ＦＶＩＩＩのＢドメイン（配列番号３）から排除された、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩコード領域を含有する中間クローニングベクター中へのライゲーションによって組み立てた。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩポリペプチドコード配列を、Ｋｏｚａｋ翻訳開始配列（開始Ｍｅｔ残基をコードするＡＴＧコドンに対して直ぐ５’側のＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）の導入に次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｈｏＩ部位との間の発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にライゲートした。ポリペプチドをコードする配列のベースベクターへの挿入を容易にするために、２つの固有の制限部位（ＮｈｅＩおよびＣｌａＩ）を、結果として生じたＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのタンパク質配列が不変のままであるように、標準のＰＣＲベースの突然変異生成法によって導入した。ＮｈｅＩ部位（Ａｌａ−Ｓｅｒをコードする）をヌクレオチド位置８５０〜８５５に導入し、ＣｌａＩ部位（Ｉｌｅ−Ａｓｐをコードする）をヌクレオチド位置４９８４〜４９８９に導入した。図１（パネルＡ〜Ｇ）は、第ＶＩＩＩ因子構築物のドメイン構造および導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ部位の箇所を示す（タンパク質配列：配列番号２、ＤＮＡ配列：配列番号３）。
【０１９９】
結果として生じたプラスミドをｐＢＣ０１０２と命名した。その後、第ＶＩＩＩ因子配列のＣ末端とＭｙｃエピトープタグ（−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−）との間、およびＭｙｃエピトープタグとＣ末端ヘキサヒスチジンタグとの間にＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒ残基を含むリンカーペプチドをコードする配列を導入することによって、プラスミドｐＢＣ１０２を修飾してプラスミドｐＢＣ０１１４を生成した。図２は、ベースベクターｐＢＣ０１１４のトポロジーを示す。
【０２００】
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）またはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、プラスミドｐＢＣ０１１４でトランスフェクトした。一過性でトランスフェクトされた細胞を、２９３フリースタイル培地または２９３フリースタイル培地とＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の混合物中で成長させた。
【０２０１】
トランスフェクションの３〜５日後に細胞培養培地を回収し、ＦＶＩＩＩ発現について発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイおよびＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡによって分析した。組換えＦＶＩＩＩを含有する濃縮馴化培地を最初の薬物動態研究に使用した。
（実施例２Ａ）
【０２０２】
可能性のある許容ループ部位選択−方法１
バイオコンピュータ法（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、異種性部分の挿入が凝血促進活性の喪失をもたらさないであろう、第ＶＩＩＩ因子における特定の部位の箇所を予測した。構造分析を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ；ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）が管理する蛋白質構造データバンクに寄託されたＸ線結晶学的座標３ＣＤＺ（Ｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １６：５９７−６０６（２００８））および２Ｒ７Ｅ（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１１：１２４０−１２４７（２００８））、ならびにＣｏｎｓｏｒｚｉｏ  Ｉｎｔｅｒｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ  ｐｅｒ  ｌｅ  Ａｐｐｌｉｃａｚｉｏｎｉ  ｄｉ  Ｓｕｐｅｒｃａｌｃｏｌｏ  ｐｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔa  ｅ  Ｒｉｓｅｒｃａ（ＣＡＳＰＵＲ）およびＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｍｅが管理するタンパク質モデルデータベース（ｍｉ．ｃａｓｐｕｒ．ｉｔ／ＰＭＤＢ／ｍａｉｎ．ｐｈｐ）に寄託された分子動力学シミュレーション研究（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ，ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：７（２０１０））から得られた予測される精密なＦＶＩＩＩ構造の原子座標ＰＭ００７６１０６上で行った。
【０２０３】
各個々のアミノ酸残基の接触可能表面積（ＡＳＡ）を、２Ｒ７Ｅ、３ＣＤＺ、およびＰＭ００７６１０６データセットにはＡＳＡＶｉｅｗアルゴリズム（Ａｈｍａｄ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５：５１（２００４））を使用することによって、また、２Ｒ７Ｅおよび３ＣＤＺデータセットにはＧＥＴＡＲＥＡアルゴリズム（Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚ  Ｒ．＆Ｂｒａｕｎ  Ｗ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，１９，３１９−３３３（１９９８）を使用することによって、算出した。構造データセット２Ｒ７Ｅ、３ＣＤＺ、およびＰＭ００７６１０６の図式ＡＳＡＶｉｅｗ出力が、図３に示される。
【０２０４】
同じ構造データセットに対して、ＧＥＴＡＲＥＡアルゴリズムは、実質的に同等の結果をもたらした。中程度から高度の予測されるＡＳＡ（０．５〜１）の領域をＶｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ  ｅｔ  ａｌ．に提示される原子位置変動（ＡＰＦ）データを比較することによってさらに評価した。０．５以上のＡＳＡ値および４０Å２のＡＰＦ値を有する位置に対応する配列位置には、さらなる分析を考慮した。
【０２０５】
次いで、この結果として生じたサブセットを含む残基の表面露出を、ＰＹＭＯＬ（登録商標）分子可視化ソフトウェア（Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ）を使用して２Ｒ７Ｅ、３ＣＤＺ、およびＰＭ００７６１０６の三次元構造描写を手動で検査することによって評価した。表面露出され、かつ−シートまたは−ヘリックス等の定義された二次構造要素に位置しない残基には、さらなる評価を考慮した。
【０２０６】
結果として生じた残基のサブセットを、突然変異が血友病Ａの原因となることが知られている残基への直鎖状アミノ酸配列における近接度に基づいてさらに評価した（ＨＡＭＳＴｅＲＳデータベース；ｈａｄｂ．ｏｒｇ．ｕｋ）。既知の血友病Ａ突然変異部位の５つの残基内の部位をさらなる考慮から排除した。
【０２０７】
この分析に基づいて、異種性部分の挿入のための部位を選択し、この部位群をバッチ１と命名した。
（実施例２Ｂ）
【０２０８】
可能性のある許容ループ部位選択−方法２
コンピュータ法を使用して、異種性部分の挿入が凝血促進活性の喪失をもたらさないであろう、第ＶＩＩＩ因子における特定の部位の箇所を予測した。最初に、異なる種にわたる第ＶＩＩＩ因子の配列分析を、基本的な局所的アライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ；ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して行った。１０種の異なる脊椎動物種由来の総計１８個のＦＶＩＩＩポリペプチド配列を差異分析のために選択した。使用された種は、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（ｇｉ：３１４９９、ｅｍｂ：ＣＡＡ２５６１９．１、配列番号６３；ｇｉ：１８２８０３、ｇｂ：ＡＡＡ５２４８４．１、配列番号６４；ｇｉ：１８２３８３、ｇｂ：ＡＡＡ５２４２０．１、配列番号６５；ｇｉ：１１９５９３０５３、ｇｂ：ＥＡＷ７２６４７．１、配列番号７８）、チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）（チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ））（ｇｉ：３３２８６２０３６、ｒｅｆ：ＸＰ＿００３３１７８３７．１、配列番号６５）、テナガザル（ホオジロテナガザル）（ｇｉ：３３２２６０６１４、ｒｅｆ：ＸＰ＿００３２７９３７９．１、配列番号６６）、ウサギ（アナウサギ）（ｇｉ：２８４００５２３４、ｒｅｆ：ＮＰ＿００１１６４７４２．１、配列番号６９）、イヌ（タイリクオオカミ族）（ｇｉ：５０９７８９７８、ｒｅｆ：ＮＰ＿００１００３２１２．１、配列番号７０）、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）（ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ））（ｇｉ：２９６４７１１２６、ｇｂ：ＤＡＡ１３２４１．１、配列番号７１；ｇｉ：２２４４５８３９８、ｒｅｆ：ＮＰ＿００１１３８９８０．１、配列番号７２）、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）（ヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ））（ｇｉ：２８９１９１３５８、ｒｅｆ：ＮＰ＿００１１６６０２１．１、配列番号７５）、マウス（ハツカネズミ）（ｇｉ：２３８６２４１８２、ｒｅｆ：ＮＰ＿００１１５４８４５．１、配列番号７３；ｇｉ：２３８６２４１８０、ｒｅｆ：ＮＰ＿０３２００３．２、配列番号７４；ｇｉ：２３８６２４１８４、ｒｅｆ：ＮＰ＿００１１５４８４６．１、配列番号７６）、ブタ（イノシシ）（ｇｉ：４７５２３４２２、ｒｅｆ：ＮＰ＿９９９３３２．１、配列番号７７）、ラット（ドブネズミ）（ｇｉ：３４３２８５３４、ｒｅｆ：ＮＰ＿８９９１６０．１、配列番号７８；ｇｉ：３１６９９５３１５、ｇｂ：ＡＤＵ７９１１３．１、配列番号７９；ｇｉ：３１６９９５３１３、ｇｂ：ＡＤＵ７９１１２．１、配列番号８０）であった。３つを超える（４つ以上の）異なるアミノ酸を有する部位を超可変と見なした。
【０２０９】
分子動力学（ＭＤ）分析を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ；ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）が管理する蛋白質構造データバンクに寄託されたＸ線結晶学的構造２Ｒ７Ｅ（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１１：１２４０−１２４７（２００８）を使用して行った。ＭＤシミュレーションを、ＮＡＭＤ（ｗｗｗ．ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｎａｍｄ／）を用いて４３７１７個の明確な水分子の存在下で行い、１ナノ秒シミュレーション中に１０００個のスナップ写真を収集した。各残基のＣの二乗平均平方根距離（ＲＭＳＤ）を、ＶＭＤ（ｗｗｗ．ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／）において収集したスナップ写真を使用して算出して残基の柔軟性を推定し、４Åよりも大きいＲＭＳＤ値を有する残基を高度に柔軟であると指定した。
【０２１０】
これらの２つの方法を合わせることによって、超可変であり、高度に柔軟でもあると指定される表面部位には、さらなる評価を考慮した。これらの可能性のある部位のうち、方法１（上の実施例２Ａ）によって特定された部位の直鎖状ポリペプチド配列の５つの残基内に存在する部位をさらなる評価から排除した。結果として生じた残基のサブセットを、突然変異が血友病Ａの原因となることが知られている残基への直鎖状配列における近接度に基づいてさらに評価した（ＨＡＭＳＴＥＲＳデータベース；ｈａｄｂ．ｏｒｇ．ｕｋ／）。既知の血友病Ａ突然変異部位の５つの残基内の部位をさらなる考慮から排除した。
【０２１１】
この分析に基づいて、異種性部分の挿入のための部位を選択し、この部位群をバッチ２と命名した。
（実施例３）
【０２１２】
ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４挿入
ＦＶＩＩＩが、補因子機能を喪失することなく、個々の構造ドメイン内での可変の長さおよび組成のペプチドの挿入に耐え得るということを実証するために、４２アミノ酸長のＸＴＥＮペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号１３）を、最初に標準の組換えＤＮＡ技法によって挿入した。ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４  ＤＮＡ配列（配列番号１４）は、アミノ酸Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、およびＧｌｕ（Ｅ）をコードし、いずれもベースベクターｐＢＣ０１１４の配列に存在しない５’ＡｓｃＩ制限部位（ｇｇｃｇｃｇｃｃ）および３’ＸｈｏＩ部位（ｃｔｃｇａｇ）に隣接する。
【０２１３】
ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４  ＤＮＡ配列を化学合成し、結果として生じたＤＮＡ構築物が、ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４タンパク質配列が部位選択において示される残基の直後に挿入されるＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードするように挿入した。
【０２１４】
故に、天然ＦＶＩＩＩポリペプチド配列において残基Ｘが挿入の部位を指定し、残基Ｚが隣の残基を指定する場合、ＸＴＥＮ  ＡＥ４２の挿入からもたらされるポリペプチドは、以下の配列を含有するであろう：
【化１】
0006383666.tif 000002
【０２１５】
加えて、この位置での対応するＤＮＡ配列の挿入は、ＸＴＥＮコード配列に隣接するＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位も導入し、これらの制限部位は、ベースベクターにおいて固有であり、これらを後に使用して介在配列を切り取り、より長いＸＴＥＮ配列、異なる組成および配列のＸＴＥＮ配列、または非関連異種性配列を導入することができる。
【０２１６】
ＦＶＩＩＩ配列における総計１６個の異なる部位を上の実施例２Ａに記載の方法に基づいてＸＴＥＮ  ＡＥ４２挿入のために選択し、これらをバッチ１と命名した。さらに２１個の部位を上の実施例２Ｂに記載の方法に基づいてＸＴＥＮ  ＡＥ４２挿入のために選択し、これらをバッチ２と命名した。これらのバッチ１およびバッチ２挿入部位の箇所は、表Ｉに要約される。
【０２１７】
集合的に、バッチ１およびバッチ２部位は、Ａ１ドメイン中の１２個の部位、Ａ２ドメイン中の７個の部位、Ａ３ドメイン中の１０個の部位、Ｃ１ドメイン中の４個の部位、およびＣ２ドメイン中の３個の部位を表す。ＦＶＩＩＩの三次元構造におけるバッチ１および２部位の箇所が図４に示される。
【表１】
0006383666.tif 000003
【０２１８】
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体の発現
ＡＥ４２−４  ＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）またはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してトランスフェクトした。一過性でトランスフェクトされた細胞を、２９３フリースタイル培地または２９３フリースタイル培地とＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の混合物中で成長させ、ＦＶＩＩＩ活性には発色アッセイを、ＦＶＩＩＩ発現にはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）を使用することによって、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を分析した。
【０２１９】
インビトロアッセイ
ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性を評価するために、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析した。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０２２０】
発色アッセイによるＦＶＩＩＩ活性測定
ＦＶＩＩＩ活性を、ＤｉａＰｈａｒｍａのＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）ＳＰ  ＦＶＩＩＩキット（ロット番号Ｎ０８９０１９）を使用して測定し、全てのインキュベーションを、振盪しながら３７℃のプレートヒーター上で行った。６ウェルプレート由来のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４変異体の一過性トランスフェクション培地からの細胞培養回収物を、１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液を使用して所望のＦＶＩＩＩ活性範囲まで希釈した。ＦＶＩＩＩ標準物を、偽トランスフェクション培地を含有する１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液中で、試験試料と一致した培養培地濃度で調製した。組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）標準物の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＩＵ／ｍＬであった。標準物、希釈した細胞培養試料、およびプールされた正常ヒト血漿アッセイ対照をＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに二重に添加した（２５μＬ／ウェル）。
【０２２１】
新たに調製したＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５０μＬのＦＸａ基質を各ウェルに順次添加し、添加毎に５分間インキュベートした。基質とインキュベートした後、２５μＬの２０％酢酸を添加して呈色反応を終了させ、４０５ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）プラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）計器で測定した。
【０２２２】
データ分析を、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２）を使用して行った。定量の最低レベル（ＬＬＯＱ）は３９ｍＩＵ／ｍＬであった。
【０２２３】
ＦＶＩＩＩ−ＨＣおよびＦＶＩＩＩ−ＬＣ  ＥＬＩＳＡによる発現測定
変異体の発現を、ＥＬＩＳＡを使用して定量した。ＦＶＩＩＩのＡ１およびＡ２ドメインにおけるＸＴＥＮ挿入に対応するＤＮＡ構築物のＦＶＩＩＩ抗原発現レベルを、ＦＶＩＩＩ−ＬＣ  ＥＬＩＳＡによって分析した。ＦＶＩＩＩのＡ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインにおけるＸＴＥＮ挿入に対応するＤＮＡ構築物のＦＶＩＩＩ抗原発現レベルを、ＦＶＩＩＩ−ＨＣ  ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０２２４】
回収後の細胞培養培地中のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ抗原を、ＦＶＩＩＩ−ＬＣ  ＥＬＩＳＡではＧＭＡ０１１抗体（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）によって、またはＦＶＩＩＩ−ＨＣ  ＥＬＩＳＡではＧＭＡ０１６抗体（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）によって、捕捉した。ＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートを、４℃で一晩インキュベートすることによって１００μＬ／ウェルの抗ＦＶＩＩＩ抗体（２μｇ／ｍＬ）でコーティングした。プレートを次いで、ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、ブロッキング緩衝液（１０％の熱失活したウマ血清を含むＰＢＳＴ）で室温で１時間ブロッキングした。
【０２２５】
６ウェルプレートからのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体の一過性トランスフェクション培地由来の細胞培養回収物を、１倍ブロッキング緩衝液を使用して所望のＦＶＩＩＩ抗原範囲まで希釈した。ＦＶＩＩＩ標準物を、偽トランスフェクション培地を含有する１倍ＦＶＩＩＩブロッキング緩衝液中で、試験試料と一致した培地濃度で調製した。ｒＦＶＩＩＩ標準物の範囲は、５０ｎｇ／ｍＬ〜０．３９ｎｇ／ｍＬであった。
【０２２６】
標準物、希釈した細胞培養試料、およびプールされた正常ヒト血漿アッセイ対照をＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに二重に添加し（１００μＬ／ウェル）、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μＬのＨＲＰヒツジ抗ｈＦＶＩＩＩ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｆ８Ｃ−ＥＩＣ−Ｄ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでさらに４回洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ超高感度基質（ＢｉｏＦＸ）を各ウェルに添加し、続いて５〜１０分発色現像した。呈色反応を終了させるために、５０μＬのＨ２ＳＯ４を各ウェルに添加し、４５０ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）プラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）計器で測定した。
【０２２７】
データ分析を、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．４）を使用して行った。定量の最低レベル（ＬＬＯＱ）は０．００３９μｇ／ｍＬであった。結果が表ＩＩに示される。
【表２】
0006383666.tif 000004
【０２２８】
組換えタンパク質の凝血促進活性、または宿主細胞中で発現される組換えタンパク質の能力を排除することなく異種性部分を挿入した許容部位を、ＦＶＩＩＩの３つのＡドメインの各々におけるループ内に密集させた。図８は、ドメインＡ１、Ａ２、およびＡ３でＦＶＩＩＩ活性を示した組換えＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位の箇所を示す。図５は、ＦＶＩＩＩ活性を示した組換えＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位の箇所を描写する構造表示を示す。
【０２２９】
溶媒中に密集させた許容部位は、高度に柔軟な表面ループ（許容ループ）を露出した。Ａ１ドメインループは、それぞれ、成熟ヒトＦＶＩＩＩの配列（配列番号１）のアミノ酸１５〜４５位および２０１〜２３２位にほぼ対応する領域に位置した。Ａ２ドメインループは、それぞれ、成熟ヒトＦＶＩＩＩの配列（配列番号１）のアミノ酸３９５〜４２１位および５７７〜６３５位にほぼ対応する領域に位置した。Ａ３ドメインループは、それぞれ、成熟ヒトＦＶＩＩＩの配列（配列番号１）のアミノ酸１７０５〜１７３２位および１８８４〜１９１７位にほぼ対応する領域に位置した。図９Ａおよび９Ｂは、ＦＶＩＩＩの三次元構造における二次構造要素に対する許容ループの箇所を示す。
（実施例４）
【０２３０】
ＸＴＥＮ  １４４挿入
上に提示される予備データ（実施例３Ｂ）の分析は、異種性ポリペプチド配列の挿入を受け入れ得る直鎖状ポリペプチド配列内の定義された領域およびＦＶＩＩＩ  Ａドメインの三次元構造の存在を示唆した。この仮説を試験し、ＦＶＩＩＩ活性を喪失することなく異種性ポリペプチドの挿入を受け入れ得る推定領域の境界をさらに定義するために、バッチ１にもバッチ２にも存在しないさらなる２３個の挿入部位を選定し、バッチ３と命名した。
【０２３１】
バッチ３構築物を、アミノ酸残基Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、およびＧｌｕ（Ｅ）を含む１４４残基ＸＴＥＮ  ＡＥポリペプチド、またはアミノ酸残基Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＴｈｒ（Ｔ）を含む１４４残基ＸＴＥＮ  ＡＧポリペプチドの挿入によって生成した。５つの異なるバージョンの１４４残基ＡＥポリペプチドを生成し、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−２Ａ（配列番号１５）、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−３Ｂ（配列番号１７）、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−４Ａ（配列番号１９）、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−５Ａ（配列番号２１）、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−６Ｂ（配列番号２３）とした。５つの異なるバージョンの１４４残基ポリペプチドを生成し、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−１（配列番号２５）、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ａ（配列番号２７）、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ｂ（配列番号２９）、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ｃ（配列番号３１）、およびＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ｆ（配列番号３３）と命名した。
【０２３２】
ＤＮＡ配列をコードする１４４残基ＸＴＥＮを、挿入部位のいずれかの側のベースベクター内の最も近い固有の制限部位にわたる、ＤＮＡセグメントの化学合成（ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって導入した。
【０２３３】
ＸＴＥＮ  １４４ペプチドに対応するＤＮＡ配列を、結果として生じたＤＮＡ構築物が、ＸＴＥＮ  １４４タンパク質配列が部位選択において示される残基の直後に挿入され、かつＡｓｃＩ部位およびＸｈｏＩ部位に隣接した、ＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードするように挿入した。
【０２３４】
これらの部位に加えて、ＸＴＥＮ  ＡＥ４２ポリペプチドの挿入がＦＶＩＩＩ凝血促進活性を無効にしなかったバッチ１および２からの部位を、制限酵素ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩでのＡＥ４２ポリペプチドコードＤＮＡセグメントの切り取り、ならびに同じ部位でのＸＴＥＮ  ＡＥ１４４およびＸＴＥＮ  ＡＧ１４４コード配列の導入によって修飾した。これらのバッチ１、バッチ２、およびバッチ挿入部位の箇所は、表ＩＩＩに要約される。図６は、ＸＴＥＮ  １４４挿入部位の箇所を示すＦＶＩＩＩの構造表示を提示する。
【表３】
0006383666.tif 000005
【０２３５】
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  １４４変異体の発現
ＸＴＥＮ  １４４挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）またはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してトランスフェクトした。一過性でトランスフェクトされた細胞を、２９３フリースタイル培地または２９３フリースタイル培地とＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の混合物中で成長させた。トランスフェクションの３〜５日後に細胞培養培地を回収し、実施例３で論じられたように、発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイおよびＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡによってＦＶＩＩＩ発現について分析した。
【０２３６】
一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮した。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管した。
【０２３７】
インビトロアッセイ
挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性を評価するために、細胞培養由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析した。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡ（実施例３を参照されたい）によって分析した。
【０２３８】
発色アッセイによるＦＶＩＩＩ活性測定ならびにＦＶＩＩＩ−ＨＣおよびＦＶＩＩＩ−ＬＣ  ＥＬＩＳＡによる発現測定
発色およびＥＬＩＳＡアッセイを実施例３に記載されるように行った。得られた結果が表ＩＶに要約される。
【表４】
0006383666.tif 000006
＊ＤＮＡ構築物ｐＳＤ００４６、ｐＳＤ００４７、およびｐＳＤ００４７でのトランスフェクションからもたらされた細胞培養上清は、検出可能な活性または抗原レベルを示さなかった。その後、この結果の原因は、分解に起因してこれらの調製物中にＤＮＡが欠如したことにあると見なした。
【０２３９】
組換えタンパク質の凝血促進活性、または宿主細胞で発現される組換えタンパク質の能力を排除することなく異種性部分を挿入した許容部位を、ＦＶＩＩＩの３つのＡドメインの各々におけるループに密集させた。より短い異種性部分の挿入に耐えた同一の許容ループ領域は、より長い異種性配列の挿入にも耐えることが見出された。図１０は、結果として生じた組換えＦＶＩＩＩタンパク質においてＦＶＩＩＩ活性を示したドメインＡ１、Ａ２、およびＡ３内のＸＴＥＮ  １４４挿入部位の箇所を示す。図７は、ＦＶＩＩＩ活性を示した組換えＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位の箇所を描写する構造表示を示す。
【０２４０】
これらの観察は、ＦＶＩＩＩのＡドメインの各々における２つの領域がＦＶＩＩＩ補因子活性を喪失することなく異種性ポリペプチドの挿入を受け入れ得ることを示す。これらのいわゆる許容ループ（図１１および１２）構造描写は、それらがＡドメインの各々に構造的に類似した位置を占有し、かつＦＶＩＩＩ分子の一面から突出することを示す。特定された許容ループは、図９Ａおよび９Ｂに示されるように、Ａ１、Ａ２、およびＡ３ドメインの三次元構造におけるβストランドの間に位置する高度に柔軟なループに対応する。
【０２４１】
ＦＶＩＩＩ半減期延長についてのＸＴＥＮ  １４４挿入のインビボ評価
ＨｅｍＡマウスにおける細胞培養培地ＰＫ
ＨｅｍＡマウス（８〜１２週齢）に細胞培養物を１００〜３００ＩＵ／ｋｇの濃度で投与した（ｎ＝３／群）。同じ組のマウスからの眼窩後方採血によって、血漿試料を投与後５分、２４時間、および４８時間時点で収集した。血漿試料および細胞培養濃縮物のＦＶＩＩＩ活性を上述のＦＶＩＩＩ発色アッセイによって分析した。ＦＶＩＩＩ  ＸＴＥＮ  １４４変異体のＰＫプロフィールを、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して分析した。
【０２４２】
ＸＴＥＮ  １４４ドメイン内挿入を有する２つのＦＶＩＩＩ変異体のＰＫプロフィール（ｐＳＤ００５０およびｐＳＤ００６２、表ＩＩＩを参照されたい）を、ＨｅｍＡマウスにおける細胞培養ＰＫによって、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩと比較した（図１３のパネルＡおよび表Ｖを参照されたい）。図１３のパネルＡに示されるように、３つの試験したＦＶＩＩＩ分子の同等の初期回収率が観察された。両方のＦＶＩＩＩ  ＸＴＥＮ  １４４変異体は、野生型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較したとき２倍長い半減期を示した。
【０２４３】
ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける細胞培養培地ＰＫ
雄のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウス（８〜１２週齢）を、組換えＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｐＳＤ００５０またはｐＳＤ０６２のいずれかを１００〜３００ＩＵ／ｋｇで含有する細胞培養濃縮物の単回静脈内投与によって処置した（ｎ＝３／群）。注入後５分、８時間、および１６時間時点で、血液試料を眼窩後方出血によって同じ組のマウスから収集した。血漿試料および細胞培養濃縮物のＦＶＩＩＩ活性をＦＶＩＩＩ発色アッセイによって分析し、ｒＢＤＤ  ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ  ＸＴＥＮ  １４４変異体のＰＫプロフィールを、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）プログラムを使用して分析した。
【０２４４】
ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける２つのＦＶＩＩＩ  ＸＴＥＮ  １４４ドメイン内挿入変異体ｐＳＤ００５０およびｐＳＤ００６２ならびにｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのＰＫプロフィールが、図１３のパネルＢおよび表Ｖに示される。ＶＷＦ保護を喪失したため、ｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの血漿半減期はわずか１５分間であった。しかしながら、２つのＸＴＥＮ挿入変異体の場合、半減期は、それぞれ、３．１５時間および３．８３時間にまで延長された。本実験の条件下で、試験結果は、これらの許容ループ領域における１４４個のアミノ酸残基を有するＸＴＥＮのドメイン内挿入がＦＶＩＩＩ活性を保存しただけでなく、ＦＶＩＩＩの半減期の延長も提供したことを実証する。
【表５】
0006383666.tif 000007
（実施例５）
【０２４５】
複数のＸＴＥＮ挿入
ＦＶＩＩＩが、補因子機能を喪失することなく、許容部位における４２および１４４アミノ酸長のＸＴＥＮ配列の挿入に耐え得ることを実証した後、２つのＸＴＥＮペプチドを含有する変異体を設計した。これらのＦＶＩＩＩ変異体は、２つのＸＴＥＮ  １４４挿入、２つのＸＴＥＮ  ２８８挿入、または１つのＸＴＥＮ  １４４および１つのＸＴＥＮ  ２８８挿入を含有した。次の１０個の１４４アミノ酸残基長のＸＴＥＮ配列を、ＦＶＩＩＩの複数の箇所で挿入するために選択した：ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−２Ａ（配列番号１５）、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−３Ｂ（配列番号１７）、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−４Ａ（配列番号１９）、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−５Ａ（配列番号２１）、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−６Ｂ（配列番号２３）、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−１（配列番号２５）、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ａ（配列番号２７）、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ｂ（配列番号２９）、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ｃ（配列番号３１）、およびＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ｆ（配列番号３３）。次の３つの異なる２８８アミノ酸残基長のＸＴＥＮ配列を、ＦＶＩＩＩの複数の箇所で挿入するために選択した：ＸＴＥＮ−ＡＥ２８８＿１（配列番号４５）、ＸＴＥＮ−ＡＧ２２８−２（配列番号４６）、およびＸＴＥＮ−ＡＧ２２８−１（配列番号４７）。挿入部位を上の実施例２Ａおよび３Ｂに記載されるように選択した。挿入部位の箇所、挿入したＸＴＥＮ、およびＦＶＩＩＩ変異体に導入したさらなる突然変異が表ＩＶに要約される。
【０２４６】
ＸＴＥＮ  １４４および２８８ペプチドに対応するＤＮＡ配列を、結果として生じたＤＮＡ構築物が、ＸＴＥＮ１４４タンパク質配列が部位選択において示される残基の直後に挿入されるＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードするように挿入した。
【０２４７】
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ二重変異体の発現
ＸＴＥＮ  １４４およびＸＴＥＮ  ２８８挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）またはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してトランスフェクトした。一過性でトランスフェクトされた細胞を、２９３フリースタイル培地または２９３フリースタイル培地とＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の混合物中で成長させた。トランスフェクションの３〜５日後に細胞培養培地を回収し、ＦＶＩＩＩ発現について発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイおよびＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０２４８】
一過性トランスフェクション由来のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ二重変異体細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮した。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管した。
【０２４９】
インビトロアッセイ
ＸＴＥＮ  １４４挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性を評価するために、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、上述のＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析した。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０２５０】
発色アッセイによるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体活性測定
発色アッセイを実施例３に記載されるように行った。得られた結果が表ＶＩに要約される。
【表６−１】
0006383666.tif 000008
【表６−２】
0006383666.tif 000009
【表６−３】
0006383666.tif 000010
【０２５１】
「ＸＴＥＮ挿入１」および「ＸＴＥＮ挿入２」欄は、挿入の箇所および種類を示し、例えば、「１９１０＿ＡＧ１４４＿Ｃ」は、成熟ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸１９１０位におけるＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｃの挿入に対応する。「さらなる修飾」欄は、さらなる突然変異の箇所および種類を示し、例えば、「Ｒ１６４８Ａ」は、成熟ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸１６４８位におけるアルギニンのアラニンへの突然変異を示した。
【０２５２】
ＦＶＩＩＩ−ＨＣおよびＦＶＩＩＩ−ＬＣ  ＥＬＩＳＡによるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体発現測定
ＥＬＩＳＡアッセイを実施例３に記載されるように行った。
【０２５３】
ＦＶＩＩＩ半減期延長についての複数のＸＴＥＮ挿入のインビボ評価
ＨｅｍＡマウスにおける細胞培養培地ＰＫ
ＨｅｍＡマウス（８〜１２週齢）に細胞培養物を１００〜３００ＩＵ／ｋｇの濃度で投与する（ｎ＝３／群）。同じ組のマウスからの眼窩後方採血によって、血漿試料を投与後５分、２４時間、および４８時間時点で収集する。血漿試料および細胞培養濃縮物のＦＶＩＩＩ活を上述のＦＶＩＩＩ発色アッセイによって分析する。２つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体のＰＫプロフィールを、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して分析する。
【０２５４】
２つのＸＴＥＮドメイン内挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体のＰＫプロフィールを、ＨｅｍＡマウスにおける細胞培養ＰＫによって、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩと比較する。
【０２５５】
ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける細胞培養培地ＰＫ
ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウス（８〜１２週齢）に細胞培養物を約１００ＩＵ／ｋｇの濃度で投与する（ｎ＝３／群）。血液試料を投与後５分時点で収集して初期回収率を評価し、半減期を評価するために同じ組のマウスからさらに２回の採血を行う（投与後最大９６時間）。血漿試料および細胞培養濃縮物のＦＶＩＩＩ活性を上述のＦＶＩＩＩ発色アッセイによって分析する。２つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体のＰＫプロフィールを、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して分析する。２つのＸＴＥＮドメイン内挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体のＰＫプロフィールを、ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける細胞培養ＰＫによって、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩと比較する。
（実施例６）
【０２５６】
ＧＦＰ挿入
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、本質的な蛍光特性ならびにＮ末端およびＣ末端が近接近したコンパクトな三次元構造を有する約３０ｋＤａのタンパク質である（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５９：２２３−３９（１９６２）；Ｏｒｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：１３９２−９５（１９９６）、ＧＦＰの結晶構造は、蛋白質構造データバンクにおいてＰＤＢ  ＩＤ：１ＥＭＡという識別名で入手可能である）。ＧＦＰ（例えば、配列番号４８を参照されたい）、または明確に異なるスペクトル特性および安定性プロフィールを示すその変異体（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：７１３−７１７（２００９）、Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ｅｄ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｄ．Ｌ．ａｎｄ  Ｓｗｅｄｌｏｗ，Ｊ．Ｒ．），ｐｐ．３−３４．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を、５’ＡｓｃＩ制限部位、ＧＦＰまたはその変異体のコード配列、および３’ＸｈｏＩ制限部位を含むＤＮＡセグメントを用いた標準の分子生物学的技法によって、ＦＶＩＩＩ分子の許容ループおよびａ３セグメント内に導入して、挿入を可能にする。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性について試験し、これを用いて当該技術分野で既知の方法によって組換えＦＶＩＩＩタンパク質の箇所を可視化することができる。
【０２５７】
ＧＦＰを、表ＩまたはＩＩＩに開示される少なくとも１つの箇所に、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つにおける他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。ＧＦＰ挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。ＧＦＰを含むＦＶＩＩＩ変異体を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。ＧＦＰを含むＦＶＩＩＩ変異体のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２５８】
結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を試験してその蛍光特性も特徴付け、それを用いて当該技術分野で既知の方法、例えば、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡法等の顕微鏡法によって、組換えＦＶＩＩＩタンパク質の箇所を可視化する。
（実施例７）
【０２５９】
半減期を増加させる異種性部分の挿入
実施例７．１−ＩｇＧのＦｃ領域の挿入
ＩｇＧのＦｃ領域の融合は、Ｆｃ領域がいずれかのタンパク質のＣ末端に融合されると、凝固第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子の両方に循環半減期の増加を付与する（Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１２）（印刷前にオンライン出版された）ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１１−０８−３６７８１３、Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１５：２０５６−６４（２０１０）、Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９：６６６−７２（２０１２））。代替のアプローチとして、柔軟なグリシンおよびセリン含有リンカーによって分離された同一のＦｃポリペプチド配列（例えば、配列番号４９を参照されたい）を含む一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）領域を、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩ分子の許容ループ内に導入する。このｓｃＦｃ領域は、ＦＶＩＩＩ分子の構造的歪みを伴うことなく許容ループへの挿入を可能にするために、末端の柔軟なリンカー配列をさらに含み得る。挿入されるＤＮＡセグメントは、許容ループ部位への容易な挿入を可能にするために、５’ＡｓｃＩ制限部位、ｓｃＦｃのコード配列、および３’ＸｈｏＩ制限部位を含む。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２６０】
Ｆｃ配列を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つにおける他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。Ｆｃ挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。Ｆｃ異種性部分を含むＦＶＩＩＩ変異体を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。Ｆｃ異種性部分を含むＦＶＩＩＩ変異体のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２６１】
実施例７．２−アルブミンまたはアルブミン結合部分の挿入
実施例７．２．１−アルブミン挿入
組換え凝固因子の循環半減期をアルブミンポリペプチドのタンパク質末端への組換え融合によって延長させることができる。Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２８（Ｓｕｐｐｌ．１）：２９−Ｓ１２（２０１１）。このアプローチの代替手段として、柔軟なリンカー断片をその末端に付加したアルブミンポリペプチドまたは付加しないアルブミンポリペプチドのいずれかを、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩ分子の許容ループ内およびａ３セグメント内に導入することができる。挿入されるＤＮＡセグメントは、許容ループ部位への挿入を可能にするために、５’ＡｓｃＩ制限部位、アルブミンのタンパク質コード配列（配列番号５０）、アルブミン変異体またはアルブミン断片、および３’ＸｈｏＩ制限部位を含む。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２６２】
アルブミン配列を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つにおける他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。アルブミン挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。アルブミン異種性部分を含むＦＶＩＩＩ変異体を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。アルブミン異種性部分を含むＦＶＩＩＩ変異体のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２６３】
実施例７．２．２：ペプチドアルブミン結合部分の挿入
ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ（配列番号５２）、ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号５３）、ＱＧＬＩＧＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＧＤＳＶＫ（配列番号５４）またはＧＥＷＷＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＥＥＤ（配列番号５５）等の１つ以上のポリペプチドアルブミン結合部分を、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩの許容ループもしくはａ３領域に、または両方に挿入する。１つのアプローチは、アルブミン結合ペプチドの変性ヌクレオチド配列を合成し、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位を作成し、次いで制限酵素消化およびプラスミドＤＮＡライゲーションによってアルブミン結合部分を挿入することである。Ａリンカー配列（ＧＧＧＳ）ｎ（Ｄｅｎｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２））（式中、ｎは、０、１、２、３、４、またはそれを超え得る）（配列番号５１）を、これをＦＶＩＩＩに挿入する前に、アルブミン結合ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加することができる。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２６４】
ポリペプチドアルブミン結合部分の配列を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。挿入されたペプチドアルブミン結合部分を有するＦＶＩＩＩ変異体を上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（１００ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。挿入されたペプチドアルブミン結合部分を有するＦＶＩＩＩ変異体を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。挿入されたペプチドアルブミン結合部分を有するＦＶＩＩＩ変異体のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２６５】
実施例７．２．３−小分子アルブミン結合部分の挿入
ペプチドアルブミン結合部分に加えて、アルブミン結合能力を有する１つ以上の小分子をＦＶＩＩＩの許容ループのうちの１つ以上またはａ３領域内に結合させることもできる。ＦＶＩＩＩが結晶構造に基づくと、その表面に遊離システインを有しないため（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ，Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１１：１２４０（２００８）、ＰＤＢ：３ＣＤＺ，Ｎｇｏ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１６：５９７−６０６（２００８））、１つのアプローチは、システイン含有ペプチド（例えば、ＧＧＧＳＧＣＧＧＧＳ）（配列番号５６）をＦＶＩＩＩの許容ループまたはａ３領域に挿入することである。次いで、アルブミン結合２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサン酸塩を、ＦＶＩＩＩに導入されたシステインに特異的に複合体化することができる。簡潔に述べると、Ｃｙｓ挿入を含有するＦＶＩＩＩを標準の分子技術によって構築することができ、哺乳類発現系（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ２１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＡＰ細胞）において発現されるＦＶＩＩＩを、親和性およびイオン交換クロマトグラフィーを介して精製することができる。
【０２６６】
精製された組換えＦＶＩＩＩタンパク質をトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって還元して、導入されたシステインのチオール基を露出させ、次いで、２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサン酸塩と反応させる。複合体化された組換えＦＶＩＩＩタンパク質がＨＡＳ親和性樹脂に結合するため、複合体化されていない組換えＦＶＩＩＩタンパク質をＨＳＡ親和性クロマトグラフィーによって除去することができる。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２６７】
小分子アルブミン結合部分配列は、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に結合する。小分子アルブミン結合部分を有するＦＶＩＩＩ変異体のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。小分子アルブミン結合部分を有するＦＶＩＩＩ変異体のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２６８】
実施例７．３  ＰＥＧ化
１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子をＦＶＩＩＩの許容ループのうちの１つ以上またはａ３領域内に結合させることができる。ＦＶＩＩＩが結晶構造に基づくと、その表面に遊離システインを有しないため（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ，Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１１：１２４０（２００８）、ＰＤＢ：３ＣＤＺ，Ｎｇｏ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１６：５９７−６０６（２００８））、１つのアプローチは、システイン含有ペプチド（例えば、ＧＧＧＳＧＣＧＧＧＳ）（配列番号５６）をＦＶＩＩＩの許容ループまたはａ３領域内に挿入することである。次いで、マレイミドを含有するＰＥＧ分子を、組換えＦＶＩＩＩタンパク質に導入されたシステインに特異的に複合体化することができる。簡潔に述べると、Ｃｙｓ挿入を含有する組換えＦＶＩＩＩタンパク質を標準の分子技術によって構築することができ、哺乳類発現系（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ２１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＡＰ細胞）において発現される組換えＦＶＩＩＩタンパク質を、親和性およびイオン交換クロマトグラフィーを介して精製することができる。精製された組換えＦＶＩＩＩタンパク質をトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって還元して、導入されたシステインのチオール基を露出させ、次いで、マレイミドＰＥＧと反応させる。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２６９】
ＰＥＧは、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に結合する。ＰＥＧ化組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。ＰＥＧ化組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２７０】
実施例７．４−ヒト絨毛性ゴナドトロピン−サブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）の挿入
ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットの２９残基Ｃ末端ペプチドの融合が、組換えタンパク質の薬物動態特性を向上させることが実証されている（Ｆａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４３０４−７（１９９２）。ＣＴＰ（ＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ）（配列番号６２）またはその連結バージョンを、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩ分子の許容ループおよびａ３セグメント内に導入することができる。挿入されるＤＮＡセグメントは、許容ループ部位への挿入を可能にするために、５’ＡｓｃＩ制限部位、タンパク質コード配列ＣＴＰ、および３’ＸｈｏＩ制限部位を含む。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２７１】
ＣＴＰ配列を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。ＣＴＰ挿入を有するＦＶＩＩＩを上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。ＣＴＰ異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。ＣＴＰ異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２７２】
実施例７．５−クリアランス受容体ＬＲＰ１への融合
リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ１）は、ＦＶＩＩＩを含む多様なタンパク質の受容体媒介性クリアランスに関連付けられる、６００ｋＤａの内在性膜タンパク質である（Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １６：６−１５（２０１０））。配列番号５７（シグナルペプチドを含むヒトＬＲＰ１配列）を参照されたい。
【０２７３】
ＬＲＰ１のＦＶＩＩＩへの融合は、ＦＶＩＩＩの分子内遮蔽をもたらし、それによってＦＶＩＩＩをＬＲＰ１による正常なクリアランスから保護し、その循環半減期を増加させ得る。ＬＲＰ１の４４０４アミノ酸細胞外領域、またはそれらの個別的なドメインもしくは断片を、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩ分子の許容ループまたはａ３セグメント内に導入することができる。挿入されるＤＮＡセグメントは、許容ループ部位への挿入を可能にするために、５’ＡｓｃＩ制限部位、ＬＲＰ１のタンパク質コード配列（またはそれらの個別的なドメインもしくは断片）、および３’ＸｈｏＩ制限部位を含む。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２７４】
ＬＲＰ１配列（またはそれらの個別的なドメインもしくは断片）を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。ＬＲＰ１挿入を有するＦＶＩＩＩを上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。ＬＲＰ１異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。ＬＲＰ１異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２７５】
実施例７．６−ＰＡＳ化
ＦＶＩＩＩ  ＰＡＳ化とは、主に３つのアミノ酸：アラニン、セリン、およびプロリンからなる１つ以上のポリペプチドとのＦＶＩＩＩの組換え融合を指す（欧州特許公開第ＥＰ２１７３８９０号を参照されたい）。
【０２７６】
例となるＰＡＳポリペプチドは、配列ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号３７）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号３８）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号３９）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号４０）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号４１）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号４２）、またはＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号４３）のうちの１つまたは多数の反復を含有し得る。１つ以上のＰＡＳポリペプチドを、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩの許容ループもしくはａ３領域に、または両方に挿入することができる。１つのアプローチは、ＰＡＳポリペプチドの変性ヌクレオチド配列を合成し、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位を作成し、制限酵素消化およびプラスミドＤＮＡライゲーションによってＰＡＳポリペプチドを挿入することである。（ＧＧＧＳ）ｎ等のリンカー配列（式中、ｎは、０、１、２、３、４、またはそれを超え得る）を、これをＦＶＩＩＩに挿入する前に、ＰＡＳポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加することができる。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２７７】
ＰＡＳ配列を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。ＰＡＳポリペプチド挿入を有するＦＶＩＩＩを上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。ＰＡＳポリペプチド異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。ＰＡＳポリペプチド異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２７８】
実施例７．７−ＨＡＰ化
ＦＶＩＩＩ  ＨＡＰ化とは、ＦＶＩＩＩへの、主にグリシン豊富なホモアミノ酸重合体（ＨＡＰ）からなる１つ以上のポリペプチドの組換え融合を指す。ＨＡＰポリペプチドの例には、１つの（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎモジュールが含まれ得、式中、ｎは、１、２、および最大４００であり得る（配列番号６０）。１つ以上のＨＡＰポリペプチドを、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩの許容ループもしくはａ３領域に、または両方に挿入することができる。１つのアプローチは、ＨＡＰポリペプチドの変性ヌクレオチド配列を合成し、適切な制限酵素部位を作成し、制限酵素消化およびプラスミドＤＮＡライゲーションによってＨＡＰポリペプチドを挿入することである。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２７９】
ＨＡＰ配列を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。ＨＡＰポリペプチド挿入を有するＦＶＩＩＩを上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。ＨＡＰポリペプチド異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。ＨＡＰポリペプチド異種性部分を含むＦＶＩＩＩ変異体のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２８０】
実施例７．８−ＨＥＳ化
１つ以上のヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）分子をＦＶＩＩＩの許容ループのうちの１つ以上またはａ３領域内に結合させることができる。ＦＶＩＩＩがその結晶構造に基づくと、その表面に遊離システインを有しないため（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ，Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１１：１２４０（２００８）、ＰＤＢ：３ＣＤＺ，Ｎｇｏ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１６：５９７−６０６（２００８））、１つのアプローチは、システイン含有ペプチド（例えば、ＧＧＧＳＧＣＧＧＧＳ）（配列番号５６）をＦＶＩＩＩの許容ループまたはａ３領域に挿入することであり、次いで、マレイミドを含有するＨＥＳ分子を、ＦＶＩＩＩに導入されたシステインに特異的に複合体化することができる。簡潔に述べると、Ｃｙｓ挿入を含有する組換えＦＶＩＩＩタンパク質を標準の分子技術によって構築し、組換えＦＶＩＩＩタンパク質を哺乳類発現系（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ２１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＡＰ細胞）において発現させ、次いで、親和性およびイオン交換クロマトグラフィーを介して精製する。精製された組換えＦＶＩＩＩタンパク質をトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって還元して、導入されたシステインのチオール基を露出させ、次いで、マレイミド  ＨＥＳと反応させる。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２８１】
ＨＥＳ分子は、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に結合する。ＨＥＳ異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。ＨＥＳ異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２８２】
実施例７．９−トランスフェリン融合
１つ以上のトランスフェリン分子またはその断片もしくは変異体を、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩの許容ループもしくはａ３領域に、または両方に挿入することができる。１つのアプローチは、トランスフェリンペプチドの変性ヌクレオチド配列を合成し、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位を作成し、制限酵素消化およびプラスミドＤＮＡライゲーションによってトランスフェリンを挿入することである。リンカー配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５１）（式中、ｎは、０、１、２、３、４、またはそれを超え得る）を、これをＦＶＩＩＩに挿入する前に、トランスフェリンペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加することができる。ＧＧＧＳリンカーの代わりにＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号６１）等の代替のリンカーを用いることもできる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２０１０，３４，６８２−６９２）。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を凝血促進活性および半減期の延長について試験する。
【０２８３】
トランスフェリン配列を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。トランスフェリン挿入を有するＦＶＩＩＩを上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。トランスフェリン異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。トランスフェリン異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
（実施例８）
【０２８４】
可視化のための異種性部分の挿入
実施例８．１−ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）
ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）は、大腸菌ビオチンリガーゼの基質として機能するランダムペプチドディスプレイ法によって特定される、１３残基ペプチド（ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨ）（配列番号５８）である。大腸菌ビオチンリガーゼは、ペプチド内の単一のリジン残基のアミノ基へのビオチンの共有結合を触媒する（Ｓｃｈａｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１１３８−４３（１９９３））。このように、ＢＡＰが付加した融合タンパク質をビオチンで共有結合的に標識し、それによって精製、二次標識、および（ストレプト）アビジンベースの試薬での固定化を容易にし得る。加えて、ＢＡＰ配列を有する組換え標的タンパク質の部位特異的酵素的ビオチン化を可能にする哺乳類細胞ベースの発現系が開発されている（Ｍｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５７６：２８０−８９（２００８）、Ｋｕｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５２：３２０−２８（２００７）。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を可視化または位置特定（ｌｏｃａｔｉｏｎ）に用いることができる。
【０２８５】
５’ＡｓｃＩ制限部位および３’ＸｈｏＩ制限部位に隣接したＢＡＰをコードする配列を、許容ループ挿入部位またはａ３領域において、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩ分子の許容ループまたはａ３領域内に導入する。
【０２８６】
ＢＡＰ配列を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。ＢＡＰ挿入を有する組換えＦＶＩＩＩタンパク質を上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を液体窒素で急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。ＢＡＰ異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。ＢＡＰ異種性部分を含むＦＶＩＩＩ変異体のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
【０２８７】
実施例８．２−リポ酸アクセプターペプチド（ＬＡＰ）
１３残基のリポ酸アクセプターペプチド２（ＬＡＰ２；ＧＦＥＩＤＫＶＷＹＤＬＤＡ）（配列番号５９）は、大腸菌リポ酸リガーゼの基質として機能し得る酵母ペプチドディスプレイ法によって特定されるペプチジル基質のクラスのうちの１つである（Ｐｕｔｈｅｎｖｅｅｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１：１６４３０−３８（２００９）。トリプトファン３７がアラニンで置換されるＬｐｌＡの変異体（Ｗ３７ＡＬｐｌＡ）は、これが、インビトロまたは生細胞のいずれかで、リポ酸ではなく、蛍光７−ヒドロキシクマリン誘導体のＬＡＰ２への共有結合性の複合体化（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を触媒するように、改変された基質特異性を有する（Ｕｔｔａｍａｐｉｎａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７：１０９１４−１９（２０１０））。
【０２８８】
５’ＡｓｃＩ制限部位および３’ＸｈｏＩ制限部位に隣接したＬＡＰ２配列を、許容ループに位置する部位で、標準の分子生物学的技法によってＦＶＩＩＩ分子の許容ループおよびａ３セグメント内に導入し、それによって組換えＦＶＩＩＩタンパク質の直接かつ共有結合的な部位特異的蛍光標識を可能にする。結果として生じる組換えＦＶＩＩＩタンパク質を可視化に使用することができる。
【０２８９】
ＬＡＰ配列を、表ＩもしくはＩＩＩに開示される箇所のうちの少なくとも１つに、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、もしくはＡ３−２のうちの少なくとも１つの他の好適な挿入部位に、またはａ３領域に、あるいは両方に挿入する。ＬＡＰ挿入を有するＦＶＩＩＩを上述のＨＥＫ２９３Ｆ細胞中にトランスフェクトし、一過性で発現させる。一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地をＣＥＮＴＲＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）中で１０倍に濃縮する。次いで、濃縮した物質を急速冷凍し、今後のインビトロ分析およびインビボＰＫ試験のために−８０℃で保管する。ＬＡＰ異種性部分を含む組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現する細胞培養物由来の培養培地試料中でのＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して分析する。抗原発現レベルをＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡによって分析する。ＬＡＰ異種性部分を含むＦＶＩＩＩ変異体のＰＫを上述のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて分析する。
（実施例９）
【０２９０】
ＦＶＩＩＩのａ３酸性ペプチド領域内のＸＴＥＮ配列の挿入によるＦＶＩＩＩ発現のレスキューまたは増強
接着ＨＥＫ２９３細胞を、実施例５に記載されるように、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩのコード配列が各々１４４アミノ酸残基の２〜４つのＸＴＥＮ挿入を含有した、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ＤＮＡ構築物でトランスフェクトした。構築物の組成および挿入箇所は、以下の表ＶＩＩに示される。トランスフェクション後５日目に、細胞培養上清を、実施例３に記載される発色アッセイによってＦＶＩＩＩ活性についてアッセイした。結果が表ＶＩＩに示される。
【表７】
0006383666.tif 000011
【０２９１】
比較するために、全てのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物は、Ａ３ドメイン内の１７２０位（成熟天然  ＦＶＩＩＩに対して付番）にＡＧ１４４  ＸＴＥＮ挿入を有した。発現レベルを発色アッセイによって決定し、ｍＩＵ／ｍＬ単位で表した。単一のさらなるＸＴＥＮ挿入をＡ１ドメイン内の２６位（ＬＳＤ００４０．００２）またはＡ２ドメイン内の４０３位（ＬＳＤ００４１．００８）のいずれかに有する構築物は、それぞれ、１７５ｍＩＵ／ｍＬおよび２７９ｍＩＵ／ｍＬの発現レベルをもたらした。対照的に、単一のさらなるＸＴＥＮ挿入をａ３酸性ペプチド内の１６５６位に有する構築物は、２５９８ｍＩＵ／ｍＬの発現レベルをもたらし、Ａ１およびＡ２挿入構築物と比べたａ３  ＸＴＥＮ挿入構築物の発現レベルの増強を実証した。
【０２９２】
加えて、ＸＴＥＮ挿入をＡ１ドメイン内の２６位およびＡ３ドメイン内の１７２０位に有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物（ＬＳＤ００４０．００２）と比較して、さらなるＸＴＥＮ挿入をａ３酸性ペプチド領域内の１６５６位に有する構築物（ｐＳＤ０８０．００２）は、有意により高い発現（それぞれ１７５および１０８１ｍＩＵ／ｍＬ）をもたらした。これらの知見と一致して、ＸＴＥＮ挿入をＡ２ドメイン内の４０３位およびＡ３ドメイン内の１７２０位に有する構築物（ＬＳＤ００４１．００８）は、２７９ｍＩＵ／ｍＬの発現レベルをもたらしたが、一方でａ３酸性ペプチド領域内の１６５６位におけるさらなるＸＴＥＮ挿入（ＰＳＤ０８３．００１）は、７８９ｍＩＵ／ｍＬまでの発現レベルの増加をもたらした。
【０２９３】
最後に、ＸＴＥＮ挿入をＡ１ドメイン内の２６位に、ならびに２つのＸＴＥＮ挿入をＡ３ドメイン内の１７２０および１９００位に有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物（ＰＳＤ０８２．００１）は、定量下限を上回る活性をもたらさなかった。しかしながら、さらなるＸＴＥＮ挿入をａ３酸性ペプチド領域内に有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物（ＰＳＤ０９０．００３）は、検出可能な活性をもたらし、ａ３領域内のＸＴＥＮ配列の組み込みが、さもなければ定量下限（ＬＬＯＱ）を下回るレベルで発現されるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物における発現（活性によって測定される）の回復をもたらし得ることを実証した。本実験の条件下で、結果は、１６５６位での、および拡張して、ａ３領域内でのＸＴＥＮの挿入が、凝血促進ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ組成物の増強された発現をもたらすという結論を支持する。
（実施例１０）
【０２９４】
ａＰＴＴによって測定されるＦＶＩＩＩ活性に対するＸＴＥＮ挿入の効果
発色アッセイ（実施例３に記載される）に加えて、一段式活性化部分プロトロンビン（ａＰＴＴ）凝血アッセイを用いて、種々のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質のＦＶＩＩＩ活性を決定した。
【０２９５】
方法：ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ａＰＴＴ活性を、ＳＹＳＭＥＸ（登録商標）ＣＡ−１５００計器（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を使用して測定した。アッセイのための標準曲線を作成するために、ＷＨＯ第ＶＩＩＩ因子標準を、２％偽トランスフェクション培地により１００ｍＵ／ｍＬまで希釈し、２倍階段希釈系列を次いで行ない、最終的な標準物は０．７８ｍＵ／ｍＬであった。ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ細胞培養試料を、ａＰＴＴアッセイ緩衝液により最初に１：５０で希釈し、必要な場合、さらなる希釈を２％偽トランスフェクション培地により行った。
【０２９６】
希釈後、ａＰＴＴアッセイを、ＳＹＳＭＥＸ（登録商標）計器を使用して次のように行った：５０μＬの希釈された標準および試料を５０μＬのヒトＦＶＩＩＩ欠損血漿、次いで５０μＬのａＰＴＴ試薬と混合した。混合物を３７℃で４分間インキュベートし、インキュベーションに次いで、５０μＬのＣａＣｌ２を混合物に添加し、凝血時間を即座に測定した。
【０２９７】
試験試料のＦＶＩＩＩ活性を決定するために、標準物の凝血時間を、片対数目盛（凝血時間：線形；標準濃度：Ｌｏｇ）を使用してプロットして、凝血時間とＦＶＩＩＩ活性との間の方程式を外挿し、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ活性を次いで標準曲線に対して算出した。アッセイの感度は、４０ｍＵ／ｍＬ第ＶＩＩＩ因子であった。
【０２９８】
結果：結果が図１４〜１６に要約される。単一のＸＴＥＮ  １４４または２８８アミノ酸長をＦＶＩＩＩに挿入したとき、発色アッセイにおいて活性を示すＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質の全てはまた、ａＰＴＴアッセイにおいても活性であった。ａＰＴＴ活性は、発色アッセイにおいて観察された傾向に従い、例えば、発色アッセイにおいて低いＦＶＩＩＩ活性を示したそれらの分子はまた、低いａＰＴＴ値をも有した。
【０２９９】
一般に、融合タンパク質に対するａＰＴＴ結果は、発色アッセイによって得られた結果よりも低く、発色対ａＰＴＴ比が、単一のＸＴＥＮ挿入について、図１４に例示されるように、１．１から最大２．２であった。複数のＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質は、一般に、発色アッセイを介して観察された活性と比較して、ａＰＴＴ活性のさらなる低減を示した。２つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮのアッセイは、全ての構築物で活性を示したが、いくつかの事例においては発色／ａＰＴＴ比が４に達した（図１５）。３つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮのアッセイもまた、両方のアッセイにおいて活性を示し、いくつかの事例においては発色／ａＰＴＴ比が５に達したが（図１６）、一方でＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ対照についての比率は、より同等であった（図１６の右側）。
【０３００】
さらに、ＸＴＥＮ挿入の部位は、ａＰＴＴ活性および発色活性との間で見られた差異に寄与するように思われた。例えば、２つのＸＴＥＮ挿入を有するいくつかの分子は、発色値よりも最大で４倍低いａＰＴＴ活性をもたらした一方で、２つのＸＴＥＮ挿入を有する他のＦＶＩＩＩ分子についてのそのａＰＴＴ活性値は、発色活性とほぼ同等であった（図１５）。３つのＸＴＥＮ挿入を有するいくつかの分子は、発色活性よりも最大で５倍低いａＰＴＴ活性を示したが、一方で３つのＸＴＥＮを有する他のＦＶＩＩＩ分子は、それらの対応する発色活性よりも２倍未満低いａＰＴＴ活性を有した（図１５）。
【０３０１】
本実験の条件下で、結果は、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質構築物が凝血促進活性を実際保持するが、発色アッセイが一般に、本研究に用いられたａＰＴＴアッセイ系において観察されたものよりも高い活性レベルを提供するという結論を支持する。
（実施例１１）
【０３０２】
ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＸＴＥＮ挿入部位の効果の評価
方法：規定の箇所における単一のＸＴＥＮ  ＡＧ−１４４挿入を有する６つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて試験して（実施例４に一般に記載されるように）、ＦＶＩＩＩ半減期に対するＸＴＥＮ挿入部位の効果を評価した。Ａ１−１、Ａ２−１、ａ３、Ａ３−１、Ａ３−２内、またはＣ末端のいずれかにおけるＸＴＥＮ挿入を有する、６つの代表的ＦＶＩＩＩ変異体（表ＩＶに列挙されるｐＳＤ−００５０、ｐＳＤ−０００３、ｐＳＤ−００３９、ｐＳＤ−００１０、およびｐＳＤ−００６３  ；ならびに２３３２位、すなわちカルボキシ末端における、単一のＡＧ−１４４挿入を含む、ｐＳＤ−００１４）を本研究のために選択し、ベースベクターから生成されたＢＤＤ  ＦＶＩＩＩを対照として使用した。
【０３０３】
ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスを、１００〜２００ＩＵ／ｋｇでの６つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物（または陽性対照培地）からの一過性トランスフェクション細胞培養培地濃縮物の単回静脈内投与で処置し、血漿試料をその後、投薬後５分、７時間、および１６時間時点で収集した。血漿中ＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色アッセイを使用して試験し、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ半減期を、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）プログラムを使用して推定した。研究データが表ＶＩＩＩおよび図１７に要約される。
【０３０４】
結果：ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ対照と比較して、有意により低い半減期が、試験された全てのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体について観察されたが、半減期増加の程度は様々であり、４０３挿入部位にＸＴＥＮを有する変異体が１０倍で最も少ない半減期延長を付与したが（対照と比較して）、一方で１９００挿入変異体は、１８倍で最も大きい半減期延長を付与した。ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＸＴＥＮ挿入部位の差異は、インビボのＦＶＩＩＩクリアランスにおける異なるＦＶＩＩＩドメインの役割を反映し得る。
【表８】
0006383666.tif 000012
（実施例１２）
【０３０５】
ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＸＴＥＮ挿入の相加的効果の評価
方法：ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質の半減期に対する複数のＸＴＥＮ挿入の効果を評価するために、１〜３つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体の半減期を、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ＤＫＯマウスにおいて、５つの構築物からの細胞培養濃縮物を使用して決定した（実施例４に一般に記載されるように）。次の５つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体を研究において試験した：１９００位（完全長第ＶＩＩＩ因子に対して付番）にＡＥ１４４挿入を有する、ｐＳＤ−００６２；ＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン（Ｂドメインアミノ酸７４５位）にＡＥ１４４を有する、ｐＳＤ−０００５；ＦＶＩＩＩ  Ｃ末端（ＣＴ）にＡＥ２８８を有する、ｐＳＤ−００１９；Ｂドメインに挿入されたＡＥ１４４およびＣ末端で挿入されたＡＥ２８８を有する、ＬＳＤ−０００３．００６、ならびに１９００位で、Ｂドメインにより、およびＣ末端で挿入された、ＡＥ１４４、ＡＥ１４４、およびＡＥ２８８の３つのＸＴＥＮを有する、ＬＳＤ−００５５．０２１。ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ半減期値を、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）プログラムを使用して推定した。
【０３０６】
結果：研究結果が表ＩＸに要約され、ＰＫ曲線が図１８に示される。研究結果は、ＦＶＩＩＩ半減期延長に対する複数のＸＴＥＮ挿入の相加的効果を実証した。単一のＸＴＥＮ挿入では、ＦＶＩＩＩの半減期は、０．２５時間から３．２〜４．０時間まで延長し、すなわち、１３〜１６倍の増加であった。ＢおよびＣＴへのＸＴＥＮ挿入を一緒に組み合わせたとき、ＦＶＩＩＩ半減期は、１０．６時間までさらに延長し、すなわち、４２倍の長期化であった。最後に、Ｂ／ＣＴ構築物に対して１９００位に付加された第３のＸＴＥＮ挿入の場合、半減期は、ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて１６時間に到達し、すなわち、６４倍の増加であった。
【表９】
0006383666.tif 000013
（実施例１３）
【０３０７】
ＸＴＥＮ挿入を含有するさらなるＦＶＩＩＩ変異体
表Ｘ〜ＸＶＩＩＩに提示されるデータは、１〜６つのＸＴＥＮ挿入を含有した、さらなるＦＶＩＩＩ変異体発現構築物に対応する。構築物を生成するために使用された方法、ＥＬＩＳＡを使用して発現レベルを決定するための方法、および発色アッセイを使用して凝血促進活性を決定するための方法は、上に詳述される。
【０３０８】
表Ｘに提示される結果は、本明細書に記載される基準に基づいて選択された単一の部位に挿入されたＸＴＥＮを有する、ＦＶＩＩＩ変異体を使用して得た。ｐＢＣ００１１４  ＦＶＩＩＩ陽性対照は、良好な発現およびＦＶＩＩＩ活性を示した。
【表１０−１】
0006383666.tif 000014
【表１０−２】
0006383666.tif 000015
【０３０９】
単一挿入部位データの結果は、２つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体構築物の作成を導き、その結果が表ＸＩに提示される。
【表１１−１】
0006383666.tif 000016
【表１１−２】
0006383666.tif 000017
【０３１０】
上述のデータの結果は、３つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体構築物の作成を導き、その結果が表ＸＩＩに提示される。３つのＸＴＥＮ挿入を含むさらなるＦＶＩＩＩ変異体が表ＸＩＩＩに示される。
【表１２】
0006383666.tif 000018
【表１３】
0006383666.tif 000019
【０３１１】
４つのＸＴＥＮ挿入を有するいくつかの構築物を作成し、アッセイし、これらの分子のうちのほとんどが、ＦＶＩＩＩ活性を示したことから（表ＸＩＶおよび表ＸＶ）、複数のＸＴＥＮの挿入を有するＦＶＩＩＩがＦＶＩＩＩ活性を依然として保持し得ることが示唆される。
【表１４】
0006383666.tif 000020
【表１５−１】
0006383666.tif 000021
【表１５−２】
0006383666.tif 000022
【表１５−３】
0006383666.tif 000023
【０３１２】
Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３ドメイン、およびＣ末端に挿入された４つのＸＴＥＮを有する、限定された数のＦＶＩＩＩ変異体構築物を作成し、アッセイし、９つの分子のうちの６つが、ＦＶＩＩＩ活性を示した（表ＸＶＩ）。その一方で、各々６つのＸＴＥＮ挿入を有する２つのＦＶＩＩＩ変異体もまた作成し、それらは、この発色アッセイにおいてＦＶＩＩＩ活性を示さなかったことから（表ＸＶＩＩ）、ＸＴＥＮ挿入の数および部位がＦＶＩＩＩ活性を保持するために重要であることが示唆される。
【表１６】
0006383666.tif 000024
【表１７】
0006383666.tif 000025
【０３１３】
提示された結果は、本実験の条件下で、ＸＴＥＮ挿入部位を選択するために使用された基準が有効であり、ＦＶＩＩＩの選択部位への１つ以上のＸＴＥＮの挿入が５割を超える確率で、結果として生じたＸＴＥＮ分子の凝血促進活性の保持をもたらし、３つのＸＴＥＮの挿入が、単一または二重ＸＴＥＮ挿入構築物と比較して、高いレベルのＦＶＩＩＩ凝血促進活性を保持するより高い割合の融合タンパク質をもたらすように思われたという概念を支持した。
（実施例１４）
【０３１４】
許容ループ内の代表的部位におけるＣＴＰ１の挿入
ＦＶＩＩＩが、補因子機能を喪失することなく、個々の構造ドメイン内での可変の長さおよび組成のペプチドの挿入に耐え得るということを実証するために、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端に由来する２９アミノ酸長ペプチドを包含する４５アミノ酸長ペプチド（ＣＴＰ１、配列番号８１）を、標準の組換えＤＮＡ技法によって挿入した。ＣＴＰ−１  ＤＮＡ配列（配列番号８２）は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１９１）に隣接し、いずれもベースベクターｐＢＣ０１１４の配列に存在しない５’ＡｓｃＩ制限部位（ｇｇｃｇｃｇｃｃ）および３’ＸｈｏＩ部位（ｃｔｃｇａｇ）に末端が隣接した、ヒト絨毛性ゴナドトロピン由来ペプチド（配列番号６２）を含むポリペプチドをコードする。
【０３１５】
ＣＴＰ−１  ＤＮＡ配列を化学合成し、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、固有のＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位が指定される挿入部位の直ぐ下流に挿入された適切なＦＶＩＩＩ発現プラスミドに挿入して、結果として生じたＤＮＡ構築物が、ＣＴＰ１タンパク質配列が部位選択において示される残基の直後に挿入されたＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードするようにした。
【０３１６】
故に、天然ＦＶＩＩＩポリペプチド配列において残基Ｘが挿入の部位を指定し、残基Ｚが隣の残基を指定する場合、ＣＴＰ１の挿入からもたらされるポリペプチドは、以下の配列を含有した：
【化２】
0006383666.tif 000026
【０３１７】
加えて、この位置での対応するＤＮＡ配列の挿入は、ＣＴＰ１コード配列に隣接するＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位を保持したが、これらの制限部位は、ベースベクターに固有であり、これらを後に使用して介在ＣＴＰ１配列を切り取り、組成、長さ、および一次配列が異なる配列を導入することができる。
【０３１８】
ＦＶＩＩＩ配列における総計１２個の異なる挿入部位をＣＴＰ１挿入のために選択した。ＦＶＩＩＩの各Ａドメインにつき、許容ループの各々において（すなわち、ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２において）１つの部位、ならびにａ３酸性ペプチド領域内で１つの部位を選択した。これらのＣＴＰ１挿入部位の箇所が表ＸＶＩＩＩに要約される（表ＸＸＩＶもまた参照されたい）。
【表１８】
0006383666.tif 000027
【０３１９】
ＣＴＰ１挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を使用して、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用してトランスフェクトした。一過性でトランスフェクトされた細胞を、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（登録商標）Ｆ１７培地およびＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物中で成長させた。トランスフェクションの５日後に、培養培地中の組換えＦＶＩＩＩ−ＣＴＰ１変異体の活性を発色ＦＶＩＩＩアッセイによって分析して、これらの部位におけるＣＴＰ１挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性を評価した。
【０３２０】
ＦＶＩＩＩ活性を、ＤｉａＰｈａｒｍａのＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）ＳＰ  ＦＶＩＩＩキットを使用して測定し、全てのインキュベーションを、振盪しながら３７℃のプレートヒーター上で行った。ＦＶＩＩＩ−ＣＴＰ１変異体の一過性トランスフェクションからの回収物細胞培養培地を、１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液を使用して所望のＦＶＩＩＩ活性範囲まで希釈した。ＦＶＩＩＩ標準物を、偽トランスフェクトされた細胞からの培地を含有する１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液中で、試験試料の濃度と一致した濃度で調製した。組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）標準物の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＩＵ／ｍＬであった。標準物、希釈した細胞培養試料、およびプールされた正常ヒト血漿アッセイ対照をＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに、２５μＬ／ウェルにより二重に添加した。新たに調製したＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５０μＬのＦＸａ基質を各ウェルに順次添加し、添加毎に５分間インキュベートした。基質とのインキュベーション後、２５μＬの２０％酢酸を添加して発色現像を終了させ、４０５ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）プラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）計器で測定した。データ分析を、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２）を使用して行った。定量の最低レベル（ＬＬＯＱ）は３９ｍＩＵ／ｍＬであった。発色ＦＶＩＩＩアッセイの結果が１９図に示される。
【０３２１】
図１９に描写される結果は、ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩの補因子活性を抑止することなく、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２内、ならびにａ３領域内の代表的部位におけるＣＴＰ１ペプチドの挿入を受け入れ可能であることを示す。Ａ２ドメイン内の５１８位、Ａ３ドメイン内の１８６１位、Ｃ１ドメイン内の２１１１位、およびＣ２ドメイン内の２１８８位におけるＣＴＰ１ペプチドの挿入は、定量限界未満（ＢＬＯＱ）であるＦＶＩＩＩ活性レベルをもたらした。Ａ１ドメイン内の１１６位におけるＣＴＰ１ペプチドの挿入は、許容ループ内またはａ３領域内の代表的部位におけるＣＴＰ１挿入について観察されたものと比べて、低いが検出可能なＦＶＩＩＩ活性をもたらした。これらの結果は、これらの許容部位におけるペプチジル挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性が、挿入された要素の組成に厳密に依存しない、ＦＶＩＩＩの本質的な特性であるという結論を支持する。
（実施例１５）
【０３２２】
許容ループ内のさらなる部位におけるＣＴＰ１の挿入
ＦＶＩＩＩが、補因子機能を喪失することなく、許容ループ内の種々の部位における外因性ペプチジル要素の個々の挿入に耐え得るということを実証するために、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＣＴＰ１、配列番号８１）のカルボキシ末端に由来する２９アミノ酸長ペプチドを包含する４５アミノ酸長ペプチドを、標準の組換えＤＮＡ技法によって挿入した。ＣＴＰ１  ＤＮＡ配列（配列番号８２）は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１９１）に隣接し、いずれもベースベクターｐＢＣ０１１４の配列に存在しない５’ＡｓｃＩ制限部位（ｇｇｃｇｃｇｃｃ）および３’ＸｈｏＩ部位（ｃｔｃｇａｇ）に末端が隣接した、ヒト絨毛性ゴナドトロピン由来ペプチド（配列番号６２）を含むポリペプチドをコードする。
【０３２３】
ＣＴＰ１  ＤＮＡ配列を化学合成し、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、固有のＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位が指定される挿入部位の直ぐ下流に挿入された適切なＦＶＩＩＩ発現プラスミドに挿入して、結果として生じたＤＮＡ構築物が、ＣＴＰ１タンパク質配列が部位選択において示される残基の直後に挿入されたＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードするようにした。
【０３２４】
故に、天然ＦＶＩＩＩポリペプチド配列において残基Ｘが挿入の部位を指定し、残基Ｚが隣の残基を指定する場合、ＣＴＰ１の挿入からもたらされるポリペプチドは、以下の配列を含有した：
【化３】
0006383666.tif 000028
【０３２５】
加えて、この位置での対応するＤＮＡ配列の挿入は、ＣＴＰ１コード配列に隣接するＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位を保持したが、これらの制限部位は、ベースベクターに固有であり、これらを後に使用して介在ＣＴＰ１配列を切り取り、組成、長さ、および一次配列が異なる配列を導入した。
【０３２６】
ＦＶＩＩＩ配列における総計１４個の挿入部位をＣＴＰ１挿入のために選択した。ＦＶＩＩＩの各Ａドメインにつき、許容ループの各々において（すなわち、ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２において）１つの部位、ならびにａ３酸性ペプチド領域内で１つの部位を選択した。これらのＣＴＰ１挿入部位の箇所が表ＸＩＸに要約される（表ＸＸＩＶもまた参照されたい）。
【表１９】
0006383666.tif 000029
【０３２７】
ＣＴＰ１挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を使用して、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用してトランスフェクトした。一過性でトランスフェクトされた細胞を、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（登録商標）Ｆ１７培地およびＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物中で成長させた。トランスフェクションの５日後に、培養培地中の組換えＦＶＩＩＩ−ＣＴＰ１変異体の活性を発色ＦＶＩＩＩアッセイによって分析して、ＣＴＰ１挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性を評価した。
【０３２８】
ＦＶＩＩＩ活性を、ＤｉａＰｈａｒｍａのＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）ＳＰ  ＦＶＩＩＩキットを使用して測定し、全てのインキュベーションを、振盪しながら３７℃のプレートヒーター上で行った。ＦＶＩＩＩ−ＣＴＰ１変異体の一過性トランスフェクションからの回収物細胞培養培地を、１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液を使用して所望のＦＶＩＩＩ活性範囲まで希釈した。ＦＶＩＩＩ標準物を、偽トランスフェクトされた細胞からの培地を含有する１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液中で、試験試料の濃度と一致した濃度で調製した。組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）標準物の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＩＵ／ｍＬであった。標準物、希釈した細胞培養試料、およびプールされた正常ヒト血漿アッセイ対照をＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに、２５μＬ／ウェルにより二重に添加した。新たに調製したＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５０μＬのＦＸａ基質を各ウェルに順次添加し、添加毎に５分間インキュベートした。基質とのインキュベーション後、２５μＬの２０％酢酸を添加して発色現像を終了させ、４０５ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）プラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）計器で測定した。データ分析を、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２）を使用して行った。定量の最低レベル（ＬＬＯＱ）は３９ｍＩＵ／ｍＬであった。発色ＦＶＩＩＩアッセイの結果が図２０に示される。
【０３２９】
図２０に描写される結果は、ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩの補因子活性を抑止することなく、図１９に描写される各許容ループの単一の代表的部位に加えて、許容ループＡ１−１、Ａ２−１、Ａ３−１、およびＡ３−２内の他の部位におけるＣＴＰ１ペプチドの挿入を受け入れ可能であることを示す。これらの結果は、これらの許容部位におけるペプチジル挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性が、各許容ループの一般の特性であり、表面ループ内の具体的な位置に制限されないという結論を支持する。
（実施例１６）
【０３３０】
許容ループ内の代表的部位におけるアルブミン結合ペプチドＡＢＰ１の挿入
ＦＶＩＩＩが、補因子機能を喪失することなく、許容ループ内の種々の部位における外因性ペプチジル要素の個々の挿入に耐え得るということを実証するために、１８アミノ酸長アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ１、配列番号８３）を包含する４４アミノ酸長ペプチドを、標準の組換えＤＮＡ技法によって挿入した。ＡＢＰ１  ＤＮＡ配列（配列番号８４）は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１９１）の２つの反復に隣接し、いずれもベースベクターｐＢＣ０１１４の配列に存在しない５’ＡｓｃＩ制限部位（ｇｇｃｇｃｇｃｃ）および３’ＸｈｏＩ部位（ｃｔｃｇａｇ）に末端が隣接した、アルブミン結合ペプチド（配列番号５２）を含むポリペプチドをコードする。
【０３３１】
ＡＢＰ１  ＤＮＡ配列を化学合成し、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、固有のＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位が指定される挿入部位の直ぐ下流に挿入された適切なＦＶＩＩＩ発現プラスミドに挿入して、結果として生じたＤＮＡ構築物が、ＡＢＰ１タンパク質配列が部位選択において示される残基の直後に挿入されたＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードするようにした。
【０３３２】
故に、天然ＦＶＩＩＩポリペプチド配列において残基Ｘが挿入の部位を指定し、残基Ｚが隣の残基を指定する場合、ＡＢＰ１の挿入からもたらされるポリペプチドは、以下の配列を含有した：
【化４】
0006383666.tif 000030
【０３３３】
加えて、この位置での対応するＤＮＡ配列の挿入は、ＡＢＰ１コード配列に隣接するＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位を保持したが、これらの制限部位は、ベースベクターに固有であり、これらを後に使用して介在ＡＢＰ１配列を切り取り、組成、長さ、および一次配列が異なる配列を導入する。
【０３３４】
ＦＶＩＩＩの各Ａドメインにつき、許容ループの各々において（すなわち、ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２において）１つのＡＢＰ１挿入部位、ならびにａ３酸性ペプチド領域内で１つの部位を選択した。これらのＡＢＰ１挿入部位の箇所が表ＸＸに要約される（表ＸＸＩＶもまた参照されたい）。
【表２０】
0006383666.tif 000031
【０３３５】
ＡＢＰ１挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を使用して、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用してトランスフェクトした。一過性でトランスフェクトされた細胞を、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（登録商標）Ｆ１７培地およびＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物中で成長させた。トランスフェクションの５日後に、培養培地中の組換えＦＶＩＩＩ−ＡＢＰ１変異体の活性を発色ＦＶＩＩＩアッセイによって分析して、ＡＢＰ１挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性を評価した。
【０３３６】
ＦＶＩＩＩ活性を、ＤｉａＰｈａｒｍａのＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）ＳＰ  ＦＶＩＩＩキットを使用して測定し、全てのインキュベーションを、振盪しながら３７℃のプレートヒーター上で行った。ＦＶＩＩＩ−ＡＢＰ１変異体の一過性トランスフェクションからの回収物細胞培養培地を、１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液を使用して所望のＦＶＩＩＩ活性範囲まで希釈した。ＦＶＩＩＩ標準物を、偽トランスフェクトされた細胞からの培地を含有する１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液中で、試験試料の濃度と一致した濃度で調製した。組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）標準物の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＩＵ／ｍＬであった。標準物、希釈した細胞培養試料、およびプールされた正常ヒト血漿アッセイ対照をＩＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに、２５μＬ／ウェルにより二重に添加した。新たに調製したＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５０μＬのＦＸａ基質を各ウェルに順次添加し、添加毎に５分間インキュベートした。基質とのインキュベーション後、２５μＬの２０％酢酸を添加して発色現像を終了させ、４０５ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）プラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）計器で測定した。データ分析を、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２）を使用して行った。定量の最低レベル（ＬＬＯＱ）は３９ｍＩＵ／ｍＬであった。発色ＦＶＩＩＩアッセイの結果が図２１に示される。
【０３３７】
図２１に描写される結果は、ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩの補因子活性を抑止することなく、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２内、ならびにａ３領域内の代表的部位におけるＡＢＰ１ペプチドの挿入を受け入れ可能であることを示す。Ａ１ドメイン内の１１６位、Ａ２ドメイン内の５１８位、Ａ３ドメイン内の１８６１位、Ｃ１ドメイン内の２１１１位、およびＣ２ドメイン内の２１８８位におけるＡＢＰ１ペプチドの挿入は、定量限界未満（ＢＬＯＱ）であるＦＶＩＩＩ活性レベルをもたらした。一般に、個々のＡＰＢ１挿入は、対応するＣＴＰ１挿入がもたらしたものよりも低いＦＶＩＩＩ活性をもたらし、挿入されたペプチジル要素の組成が結果として生じた構築物の活性を調節し得ることを示している。しかしながら、これらの結果は、これらの許容部位におけるペプチジル挿入に対するＦＶＩＩＩの全体的な耐性が、挿入された要素の組成に厳密に依存しない、ＦＶＩＩＩの本質的な特性であるという結論を支持する。
（実施例１７）
【０３３８】
許容ループ内の代表的部位におけるＧｌｙ−Ｓｅｒ反復の挿入
ＦＶＩＩＩが、補因子機能を喪失することなく、許容ループ内の種々の部位における外因性ペプチジル要素の個々の挿入に耐え得るということを実証するために、３５残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復（ＨＡＰ１、配列番号８５）を包含する４１アミノ酸長ペプチドを、標準の組換えＤＮＡ技法によって挿入した。ＨＡＰ１  ＤＮＡ配列（配列番号８６）は、いずれもベースベクターｐＢＣ０１１４の配列に存在しない５’ＡｓｃＩ制限部位（ｇｇｃｇｃｇｃｃ）および３’ＸｈｏＩ部位（ｃｔｃｇａｇ）に末端が隣接した、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１９１）の７つの縦列反復を含むポリペプチドをコードする。
【０３３９】
ＨＡＰ１  ＤＮＡ配列を化学合成し、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、固有のＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位が指定される挿入部位の直ぐ下流に挿入された適切なＦＶＩＩＩ発現プラスミドに挿入して、結果として生じたＤＮＡ構築物が、ＨＡＰ１タンパク質配列が部位選択において示される残基の直後に挿入されたＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードするようにした。
【０３４０】
故に、天然ＦＶＩＩＩポリペプチド配列において残基Ｘが挿入の部位を指定し、残基Ｚが隣の残基を指定する場合、ＨＡＰ１の挿入からもたらされるポリペプチドは、以下の配列を含有した：
【化５】
0006383666.tif 000032
【０３４１】
加えて、この位置での対応するＤＮＡ配列の挿入は、ＨＡＰ１コード配列に隣接するＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位を保持したが、これらの制限部位は、ベースベクターに固有であり、これらを後に使用して介在ＨＡＰ１配列を切り取り、組成、長さ、および一次配列が異なる配列を導入した。
【０３４２】
ＦＶＩＩＩの各Ａドメインにつき、許容ループの各々において（すなわち、ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２において）１つのＨＡＰ１挿入部位、ならびにａ３酸性ペプチド領域内で１つの部位を選択した。これらのＨＡＰ１挿入部位の箇所が表ＸＸＩに要約される（表ＸＸＩＶもまた参照されたい）。
【表２１】
0006383666.tif 000033
【０３４３】
ＨＡＰ１挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を使用して、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用してトランスフェクトした。一過性でトランスフェクトされた細胞を、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（登録商標）Ｆ１７培地およびＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物中で成長させた。トランスフェクションの５日後に、培養培地中の組換えＦＶＩＩＩ−ＨＡＰ１変異体の活性を発色ＦＶＩＩＩアッセイによって分析して、ＨＡＰ１挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性を評価した。
【０３４４】
ＦＶＩＩＩ活性を、ＤｉａＰｈａｒｍａのＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）ＳＰ  ＦＶＩＩＩキットを使用して測定し、全てのインキュベーションを、振盪しながら３７℃のプレートヒーター上で行った。ＦＶＩＩＩ−ＨＡＰ１変異体の一過性トランスフェクションからの回収物細胞培養培地を、１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液を使用して所望のＦＶＩＩＩ活性範囲まで希釈した。ＦＶＩＩＩ標準物を、偽トランスフェクトされた細胞からの培地を含有する１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液中で、試験試料の濃度と一致した濃度で調製した。組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）標準物の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＩＵ／ｍＬであった。標準物、希釈した細胞培養試料、およびプールされた正常ヒト血漿アッセイ対照をＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに、２５μＬ／ウェルにより二重に添加した。新たに調製したＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５０μＬのＦＸａ基質を各ウェルに順次添加し、添加毎に５分間インキュベートした。基質とのインキュベーション後、２５μＬの２０％酢酸を添加して発色現像を終了させ、４０５ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）プラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）計器で測定した。データ分析を、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２）を使用して行った。定量の最低レベル（ＬＬＯＱ）は３９ｍＩＵ／ｍＬであった。発色ＦＶＩＩＩアッセイの結果が図２２に示される。
【０３４５】
図２２に描写される結果は、ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩの補因子活性を抑止することなく、許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、およびＡ３−２内、ならびにａ３領域内の代表的部位におけるＨＡＰ１ペプチドの挿入を受け入れ可能であることを示す。Ａ２ドメイン内の５１８位、Ｃ１ドメイン内の２１１１位、およびＣ２ドメイン内の２１８８位におけるＨＡＰ１ペプチドの挿入は、定量限界未満（ＢＬＯＱ）であるＦＶＩＩＩ活性レベルをもたらした。Ａ１ドメイン内の１１６位およびＡ３ドメイン内の１８６１位におけるＨＡＰ１ペプチドの挿入は、許容ループ内またはａ３領域内の代表的部位におけるＨＡＰ１挿入について観察されたものと比べて、低いが検出可能なＦＶＩＩＩ活性をもたらした。これらの結果は、これらの許容部位におけるペプチジル挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性が、挿入された要素の組成に厳密に依存しない、ＦＶＩＩＩの本質的な特性であるという結論を支持する。
（実施例１８）
【０３４６】
選択された許容ループ内の代表的部位における緑色蛍光タンパク質の挿入
ＦＶＩＩＩが、補因子機能を喪失することなく、定義された３次元構造を採用することが知られているタンパク質の挿入に耐え得るということを実証するために、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ１、配列番号８７）の２３９アミノ酸残基配列を包含する２６５アミノ酸長ポリペプチドを、標準の組換えＤＮＡ技法によって挿入した。ＥＧＦＰ１  ＤＮＡ配列（配列番号８９）は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１９１）の２つの縦列反復に隣接し、いずれもベースベクターｐＢＣ０１１４の配列に存在しない５’ＡｓｃＩ制限部位（ｇｇｃｇｃｇｃｃ）および３’ＸｈｏＩ部位（ｃｔｃｇａｇ）に末端が隣接した、ＥＧＦＰポリペプチド（配列番号８８）をコードする。
【０３４７】
ＥＧＦＰ１  ＤＮＡ配列を化学合成し、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、固有のＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位が指定される挿入部位の直ぐ下流に挿入された適切なＦＶＩＩＩ発現プラスミドに挿入して、結果として生じたＤＮＡ構築物が、ＥＧＦＰ１タンパク質配列が部位選択において示される残基の直後に挿入されたＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードするようにした。
【０３４８】
故に、天然ＦＶＩＩＩポリペプチド配列において残基Ｘが挿入の部位を指定し、残基Ｚが隣の残基を指定する場合、ＥＧＦＰ１の挿入からもたらされるポリペプチドは、以下の配列を含有した：
【化６】
0006383666.tif 000034
【０３４９】
加えて、この位置での対応するＤＮＡ配列の挿入は、ＥＧＦＰ１コード配列に隣接するＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位を保持したが、これらの制限部位は、ベースベクターに固有であり、これらを後に使用して介在ＥＧＦＰ１配列を切り取り、組成、長さ、および一次配列が異なる配列を導入することができる。
【０３５０】
ＥＧＦＰ１挿入部位を、許容ループＡ１−１、Ａ２−１、Ａ３−１、およびＡ３−２の各々の内で、ならびにａ３酸性ペプチド領域内で選択した。これらのＥＧＦＰ１挿入部位の箇所が表ＸＸＩＩに要約される（表ＸＸＩＶもまた参照されたい）。
【表２２】
0006383666.tif 000035
【０３５１】
ＥＧＦＰ１挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を使用して、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用してトランスフェクトした。一過性でトランスフェクトされた細胞を、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（登録商標）Ｆ１７培地およびＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物中で成長させた。トランスフェクションの５日後に、培養培地中の組換えＦＶＩＩＩ−ＥＧＦＰ１変異体の活性を発色ＦＶＩＩＩアッセイによって分析して、ＥＧＦＰ１挿入に対するＦＶＩＩＩの耐性を評価した。
【０３５２】
ＦＶＩＩＩ活性を、ＤｉａＰｈａｒｍａのＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）ＳＰ  ＦＶＩＩＩキットを使用して測定し、全てのインキュベーションを、振盪しながら３７℃のプレートヒーター上で行った。ＦＶＩＩＩ−ＥＧＦＰ１変異体の一過性トランスフェクションからの回収物細胞培養培地を、１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液を使用して所望のＦＶＩＩＩ活性範囲まで希釈した。ＦＶＩＩＩ標準物を、偽トランスフェクトされた細胞からの培地を含有する１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液中で、試験試料の濃度と一致した濃度で調製した。組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）標準物の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＩＵ／ｍＬであった。標準物、希釈した細胞培養試料、およびプールされた正常ヒト血漿アッセイ対照をＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに、２５μＬ／ウェルにより二重に添加した。新たに調製したＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５０μＬのＦＸａ基質を各ウェルに順次添加し、添加毎に５分間インキュベートした。基質とのインキュベーション後、２５μＬの２０％酢酸を添加して発色現像を終了させ、４０５ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）プラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）計器で測定した。データ分析を、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２）を使用して行った。定量の最低レベル（ＬＬＯＱ）は３９ｍＩＵ／ｍＬであった。発色ＦＶＩＩＩアッセイの結果が図２３に示される。
【０３５３】
図２３に描写される結果は、ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩの補因子活性を抑止することなく、許容ループＡ１−１、Ａ２−１、Ａ３−１、およびＡ３−２内、ならびにａ３領域内の選択された代表的部位におけるＥＧＦＰ１の挿入を受け入れ可能であることを示す。これらの部位の各々におけるＥＧＦＰ１挿入は、検出可能なＦＶＩＩＩ活性をもたらしたが、観察された活性の程度は、挿入の部位に依存しており、ａ３領域内のＥＧＦＰ１挿入が非修飾ベースベクターからの活性と同等の活性をもたらし、Ａ２−１およびＡ３−１許容ループ内のＥＧＦＰ１挿入が中程度のＦＶＩＩＩ活性をもたらし、許容ループＡ１−１およびＡ３−２内のＥＧＦＰ１挿入が低いＦＶＩＩＩ活性をもたらした。故に、ＦＶＩＩＩは、定義された３次元構造を採用することが知られているタンパク質であるＥＧＦＰの挿入に対するその耐性の程度において、挿入の部位の関数として有意な変動性を示す。
（実施例１９）
【０３５４】
Ｃｙｓ含有ペプチドの挿入および化学ＰＥＧ修飾
ＦＶＩＩＩが、ＦＶＩＩＩ補因子機能を喪失することなく、許容ループ内の外因性ペプチジル要素の挿入、およびその要素内に含有されるシステイン残基へのその後の共有結合性の複合体化に耐え得るということを実証するために、単一のＣｙｓ残基（ＣＣＰ１、配列番号９０）を含有する３５残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復配列を包含する４１アミノ酸長ペプチドを、標準の組換えＤＮＡ技法によって挿入した。ＣＣＰ１  ＤＮＡ配列（配列番号９１）は、いずれもベースベクターｐＢＣ０１１４の配列に存在しない５’ＡｓｃＩ制限部位（ｇｇｃｇｃｇｃｃ）および３’ＸｈｏＩ部位（ｃｔｃｇａｇ）に末端が隣接した、Ｃｙｓ残基が２１位で置換されたアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１９１）の７つの縦列反復を含むポリペプチドをコードする。
【０３５５】
ＣＣＰ１  ＤＮＡ配列を化学合成し、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＢＣ０１８４のＡｓｃＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入し、結果として生じたＤＮＡ構築物ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１が、ＣＣＰ１タンパク質配列が残基２６の直後に挿入されているＦＶＩＩＩ融合タンパク質をコードするようにした。
【化７】
0006383666.tif 000036
【０３５６】
加えて、この位置での対応するＤＮＡ配列の挿入は、ＣＣＰＰ１コード配列に隣接するＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位を保持したが、これらの制限部位は、ベースベクターに固有であり、これらを後に使用して介在ＣＣＰ１配列を切り取り、組成、長さ、および一次配列が異なる配列を導入することができる。
【０３５７】
プラスミドＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１を使用して、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の大規模な一過性トランスフェクションを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）を使用して行った。一過性でトランスフェクトされた細胞を、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（登録商標）Ｆ１７培地およびＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物中で成長させた。
【０３５８】
馴化細胞培養培地をトランスフェクションの５日後に回収し、ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１タンパク質を、免疫親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーの順次のステップによって高度に精製した。
【０３５９】
ＰＥＧのＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１への共有結合性の複合体化をトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によるＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１の穏やかな還元によって、還元された産物の精製をイオン交換クロマトグラフィーによって、および精製された還元ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１のインキュベーションを６０ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミドによって、達成した。ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１をイオン交換クロマトグラフィーによって分解した。
【０３６０】
ＰＥＧ複合体化がＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１のＡ１ドメイン上で特異的に生じたことを確認するために、ＰＥＧ化種および非ＰＥＧ化種の両方をトロンビンで消化し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、それらの非トロンビン処置対応物と共に分析した。ＦＶＩＩＩのトロンビン消化は、産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解するときに明確に識別可能である、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、および残存のＦＶＩＩＩ軽鎖に対応するバンドを生成することがよく知られている。未処理であるまたは化学的ＰＥＧ化に供されたＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１試料への本方法の適用はしたがって、ＰＥＧ部分がＡ１ドメインに付加されたことの検証を可能にする。
【０３６１】
ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１が定量的にＰＥＧ化されたことを確認するために、非修飾ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１およびＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１をＴｏｓｏｈ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラムによるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析し、時間の関数として溶離液の吸光度を２１４ｎｍで監視した。結果として生じたクロマトグラムを、１７、４４、１５８、および６７０ｋＤａのタンパク質分子量標準物により生成された参照クロマトグラムと重ね合わせて、非修飾ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１およびＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１の両方の見かけの分子量の決定ならびにＰＥＧ化反応の効率の評価を可能にした。
【０３６２】
非修飾ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１およびＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１のＦＶＩＩＩ活性を、ＤｉａＰｈａｒｍａのＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）ＳＰ  ＦＶＩＩＩキットを使用して測定し、全てのインキュベーションを、振盪しながら３７℃のプレートヒーター上で行った。精製ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１およびモノ−ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１の試料を、１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液を使用して所望のＦＶＩＩＩ活性範囲まで希釈した。ＦＶＩＩＩ標準物を１倍ＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液中で調製した。組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）標準物の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＩＵ／ｍＬであった。標準物およびプールされた正常ヒト血漿アッセイ対照をＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに、２５μＬ／ウェルにより二重に添加した。新たに調製したＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および５０μＬのＦＸａ基質を各ウェルに順次添加し、添加毎に５分間インキュベートした。基質とのインキュベーション後、２５μＬの２０％酢酸を添加して発色現像を終了させ、４０５ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）プラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）計器で測定した。データ分析を、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２）を使用して行った。定量の最低レベル（ＬＬＯＱ）は３９ｍＩＵ／ｍＬであった。非ＰＥＧ化およびＰＥＧ化構築物についての活性データが表ＸＸＩＩＩに示される：
【表２３】
0006383666.tif 000037
【０３６３】
図２４に提示される結果は、精製ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１調製物が、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む１本鎖種（ＳＣ  ＦＶＩＩＩ）および２本鎖種を含有したことを示す。非修飾ＳＣ  ＦＶＩＩＩおよびＨＣに対応するタンパク質バンド（列１）は、ＰＥＧ化の結果として、減少した電気泳動移動度に起因して上方にシフトした（列２）。ＰＥＧ化ＳＣ  ＦＶＩＩＩおよびＨＣに対応するが、ＬＣには対応しないバンドが、ＰＥＧ染色によって観察された（列７）。非修飾ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１のトロンビン処理は、バンドがａ３欠失軽鎖（ＬＣ  ａ３）、Ａ１ドメイン、およびＡ２ドメインに対応する、切断産物の予測されたパターンをもたらした（列４）。これらのうち、Ａ１ドメインに対応するバンドのみが、ＰＥＧ化されると上方にシフトして（列３）、ＰＥＧ染色によって検出された、低減された電気泳動移動度を有する単一のバンドを生じた（列８）。これらの結果は、ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１がＡ１ドメイン上で特異的にかつＰＥＧ化されることを実証する。
【０３６４】
図２５に例示されるように、ＰＥＧ化および非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに分析した。非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１に対応する主要なピークは１５８ｋＤａ分子量標準物の保持時間と同様の保持時間で溶離したが、一方でＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１に対応する主要なピークは、６７０ｋＤａ分子量標準物の保持時間よりも若干少ない保持時間で溶離し、ＰＥＧ化がＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１の流体力学半径を有意に増加させたことを示している。非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１およびＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１の両方についてのクロマトグラムは、両方のタンパク質種が９０％超純粋であることを示す。結果的に、表ＸＸＩＩＩに提示されるＦＶＩＩＩ活性データは、ＦＶＩＩＩの残基２６の後に挿入されたシステイン含有ＣＣＰ１ペプチドへのＰＥＧの化学的複合体化が、結果として生じた分子の特異的活性を非修飾ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１と比べて有意に改変しないと結論付けるように解釈することができる。加えて、ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１およびＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ−００２６−ＣＣＰ１の両方の観察された特異的活性は、非修飾Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩについて観察された特異的活性と同様であり、ＦＶＩＩＩの許容ループＡ１−１内の残基２６におけるＣＣＰ１ペプチドの挿入が、挿入されたＣＣＰ１ペプチドがＰＥＧ化されようとされなかろうと、それ自体では、ＦＶＩＩＩの特異的活性の低減に寄与しないことを示している。
【表２４】
0006383666.tif 000038
（実施例２０）
【０３６５】
ＦＶＩＩＩ変異体を生成するためのコンビナトリアルライブラリアプローチ
ＸＴＥＮは、いくつかのタンパク質の循環半減期を増加させることが示されている、不定形の反復を含むポリペプチドである。ペイロード分子のクリアランスおよび機能に及ぼすＸＴＥＮの影響は、ＸＴＥＮ挿入の箇所、組成、長さ、および数を変動させることによって最適化することができ、それらの全ては、組換え技術によって達成することができる。ＸＴＥＮのドメイン内挿入を受け入れ得る、ＦＶＩＩＩにおける許容ループの特定と共に、現在の臨床候補で観察される２倍を超える半減期延長を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体を開発するために、ＦＶＩＩＩのＸＴＥＮ修飾に対する多変量のアプローチを探索した。したがって、ＦＶＩＩＩの活性および薬物動態に対する複数のＸＴＥＮ挿入の効果を評価した。
【０３６６】
方法：Ａドメインの許容ループ内に、Ｂドメイン接合部において、およびＣ末端において２〜６つのＸＴＥＮ挿入を有する４００個を超えるＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ変異体を含む、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮコンビナトリアルライブラリを構築した。変異体をＨＥＫ２９３細胞中で、小規模な一過性トランスフェクションによって発現させ、馴化培地中のＦＶＩＩＩ活性をＦＶＩＩＩ発色アッセイによって測定した。培養培地中で０．３ＩＵ／ｍＬ以上のＦＶＩＩＩ活性を有する変異体の薬物動態学的（ＰＫ）特性を、ＦＶＩＩＩノックアウト（ＨｅｍＡ）およびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ二重ノックアウト（ＤＫＯ）マウスにおいて、経時的な血漿中ＦＶＩＩＩ活性を監視することによって評価した。ＤＫＯマウスを最初のランク付け目的のために使用して、半減期に及ぼす内因性ＶＷＦの影響を排除した。濃縮馴化培地または部分精製ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ調製物をＰＫ研究において使用して、ＰＫスクリーニングの処理量を増加させた。馴化培地または精製タンパク質のいずれを用いても、同様のＰＫプロフィールが観察された。
【０３６７】
結果：ＦＶＩＩＩ変異体は、最大５つのＸＴＥＮ挿入で活性を保持した。ＶＷＦの保護効果を欠いているＤＫＯマウスにおいて、ＸＴＥＮによって付与される半減期改善は、挿入部位依存的であり、非修飾ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩについての０．２５時間に対して、Ａ３ドメイン内の単一のＸＴＥＮ挿入が半減期を最大４．５時間、Ａ２ドメイン内のそれらが最大２．５時間延長させた。ドメイン内挿入については、１４４残基のＸＴＥＮ長が細胞培養中の活性および半減期延長に関して最適であり、ＰＫに対する複数のＸＴＥＮ挿入の効果は、挿入部位が異なるドメインにあるときに相加的であった。３つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩは、ＤＫＯマウスにおいて１６時間の半減期を達成して、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと比べて６４倍の増加を表したが、さらなるＸＴＥＮの導入は、１８時間までのほんのわずかな増加しかもたらさず、ＸＴＥＮによる半減期延長が相加的だが飽和性であることを示している。ＤＫＯマウスにおいて３〜１８時間の半減期を示した選択されたＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体は全て、ＨｅｍＡマウスにおいて同様の半減期（約１４時間）を有した。
【０３６８】
本発明は、明記される機能およびそれらの関係の実現を例示する、機能的ビルディングブロックを用いて上述された。これらの機能的ビルディングブロックの境界は、記載の便宜上、本明細書で恣意的に画定されている。明記される機能およびそれらの関係が適切に行われる限り、代替的な境界が画定され得る。
【０３６９】
具体的な実施形態の上述の説明は、他の者が当業者の技能の範囲内で知識を適用することによって、過度の実験を用いずに、本発明の一般の概念から逸脱することなく、かかる具体的な実施形態の種々の適用のために、容易に修正および／または適合させることができる本発明の一般の性質を十分に明らかにするであろう。したがって、かかる適合および修正は、本明細書に提示される教示および手引きに基づいて、開示される実施形態の均等物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書における表現法または用語法は、本明細書の用語法または表現法が教示および手引きを考慮して当業者によって解釈されるものであるように、限定目的ではなく説明目的のためのものであることを理解されたい。
【０３７０】
本発明の幅および範囲は、上述の例となる実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、次の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにおいて規定されるべきである。本発明の他の実施形態は、本明細書に開示される本発明の明細および実施を考慮することから、当業者に明らかとなろう。
【図１Ａ】
0006383666.tif 000039
【図１Ｂ】
0006383666.tif 000040
【図１Ｃ】
0006383666.tif 000041
【図１Ｄ】
0006383666.tif 000042
【図１Ｅ】
0006383666.tif 000043
【図１Ｆ】
0006383666.tif 000044
【図１Ｇ】
0006383666.tif 000045
【図２】
0006383666.tif 000046
【図３】
0006383666.tif 000047
【図４】
0006383666.tif 000048
【図５】
0006383666.tif 000049
【図６】
0006383666.tif 000050
【図７】
0006383666.tif 000051
【図８】
0006383666.tif 000052
【図９Ａ】
0006383666.tif 000053
【図９Ｂ】
0006383666.tif 000054
【図１０】
0006383666.tif 000055
【図１１】
0006383666.tif 000056
【図１２】
0006383666.tif 000057
【図１３】
0006383666.tif 000058
【図１４】
0006383666.tif 000059
【図１５】
0006383666.tif 000060
【図１６Ａ】
0006383666.tif 000061
【図１６Ｂ】
0006383666.tif 000062
【図１７】
0006383666.tif 000063
【図１８】
0006383666.tif 000064
【図１９】
0006383666.tif 000065
【図２０】
0006383666.tif 000066
【図２１】
0006383666.tif 000067
【図２２】
0006383666.tif 000068
【図２３】
0006383666.tif 000069
【図２４】
0006383666.tif 000070
【図２５】
0006383666.tif 000071
【配列表】
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