(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸を安定化させるための方法であって、前記脂肪酸または前記脂肪酸を含むサンプルを、固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体に、適用することを含み、前記固体マトリックスが、２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含み、
前記汚染物質は、固体媒体に脂肪酸または脂肪酸を含むサンプルを適用する前の全脂質の割合として計算された脂肪酸の割合と比較して、全脂質の割合として計算された脂肪酸の割合を、固体マトリックス中の存在により増加または減少させる１種または複数種の化合物である、方法。
【請求項２】
脂肪酸を含むサンプルの脂肪酸組成を決定するための方法であって、
（ａ）２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体に、サンプルが固体マトリックスに収着されるように、サンプルを適用することと、
（ｂ）固体マトリックスに収着されたサンプルの脂肪酸組成を決定することと、
を含み、
前記汚染物質は、固体媒体に脂肪酸または脂肪酸を含むサンプルを適用する前の全脂質の割合として計算された脂肪酸の割合と比較して、全脂質の割合として計算された脂肪酸の割合を、固体マトリックス中の存在により増加または減少させる１種または複数種の化合物である、方法。
【請求項３】
（ｂ）が、
（ｉ）固体マトリックスに収着されたサンプルの少なくとも一部を抽出して、誘導体化された脂肪酸を含む抽出物を提供することと、
（ｉｉ）誘導体化された脂肪酸の量に基づいて、サンプルの脂肪酸組成を決定することと、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、血液、唾液、母乳、尿、精液、血漿および血清からなる群から選択される生物学的サンプルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む、脂肪酸を安定化させるための固体媒体を作製するための方法であって、固体マトリックスを含む固体媒体を提供することと、固体媒体に少なくとも１種のキレート化剤および少なくとも１種の抗酸化剤を適用することと、を含み、固体マトリックスは、２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含み、
前記汚染物質は、固体媒体に脂肪酸または脂肪酸を含むサンプルを適用する前の全脂質の割合として計算された脂肪酸の割合と比較して、全脂質の割合として計算された脂肪酸の割合を、固体マトリックス中の存在により増加または減少させる１種または複数種の化合物である、方法。
【請求項６】
前記汚染物質が飽和脂肪酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記固体マトリックスが、紙、ガラス系マトリックス、紙系マトリックス、セルロース系マトリックス、シリカゲル充填紙、ガラスマイクロファイバーフィルター、親水性ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ファイバーガラス、および多孔性セラミックスからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種のキレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸、アスコルビン酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１種の抗酸化剤が、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、またはｔ−ブチルヒドロキノンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の抗酸化剤および前記少なくとも１種のキレート化剤が、単一の溶液の形態で、または個別の溶液、すなわち、少なくとも１種の抗酸化剤を含む１つの溶液および少なくとも１種のキレート化剤を含む１つの溶液の形態で、固体媒体に適用される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記固体媒体がストリップの形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ストリップが１ｃｍ×３ｃｍの寸法を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗酸化剤（１種または複数種）および／または前記キレート化剤（１種または複数種）が０．０１ｍｇ〜１ｍｇの量で前記固体媒体上に存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記脂肪酸または前記脂肪酸を含む流体を、ガラスマイクロファイバーフィルターまたはシリカゲル充填紙と、エチレンジアミン四酢酸および／またはアスコルビン酸と、ブチル化ヒドロキシトルエンと、を含む固体媒体に、適用することを含む、請求項１に記載の脂肪酸を安定化させるための方法。
【請求項１５】
脂肪酸を安定化させるための固体媒体であって、前記媒体が固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含み、前記固体マトリックスが２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含み、
前記汚染物質は、固体媒体に脂肪酸または脂肪酸を含むサンプルを適用する前の全脂質の割合として計算された脂肪酸の割合と比較して、全脂質の割合として計算された脂肪酸の割合を、固体マトリックス中の存在により増加または減少させる１種または複数種の化合物である、固体媒体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の固体媒体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液などのサンプル中に存在する脂肪酸を安定化させるための方法に関する。本発明はさらに、適用された脂肪酸を安定化させることが可能な固体媒体およびそれを作製するための方法に関する。本発明はさらに、サンプルの脂肪酸組成を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ω−３脂肪酸、とくに、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の大量摂取は、成人において心血管疾患、神経変性疾患、糖尿病、および関節炎の低減、ならびに早産児において精神発達の改善に関連付けられてきた。結果として、世界中の保健当局は、現在、たとえば、魚を含む食事を１週間に２〜３回とることにより、ω−３脂肪酸の摂取量を増大させることを推奨している。
【０００３】
心臓保護のための食事性ω−３脂肪酸の推奨事項は、脂肪の多い魚の食事を１週間に２回とって魚の摂取量を増加させるかまたは男性および女性でそれぞれ６００または４００ｍｇ／日の長鎖ω−３脂肪酸を摂取することを含む。これらの推奨事項は、臨床試験では細胞内ω−３脂肪酸レベルを心臓保護の範囲内のレベルに増加させることが知られているが、これらの推奨事項が一般集団の脂肪酸の状態にどのような影響を及ぼしているかに関する知見は、ほとんど存在しない。血液中の脂肪酸の状態は、ヒト集団で心臓リスクを評価したり、食事性ω−３脂肪酸の補給が奏効すると思われる個体を同定したりするのに有用なマーカーであるので、脂肪酸の状態の評価は、重要である。
【０００４】
血中レベルは、生物学的作用を反映すると考えられ、かつ血液は、ヒト研究で採取に利用可能であるので、ヒト臓器内の脂肪酸の状態のマーカーとして使用されるヒト血液サンプルの脂肪酸プロファイリングは、食事性脂肪酸の摂取量と脂肪酸の状態との関係を理解するのに重要なツールになってきた。しかしながら、血液中の脂肪酸をアッセイする従来の方法は、静脈血採取と高価で時間のかかる多工程プロセスとを必要とするので、スクリーニングツールとしてのその有用性は、限定される。したがって、細胞内ω−３脂肪酸レベルを測定する迅速で安価でかつ信頼性のある手段が必要である。
【０００５】
最近まで、ヒト血液中に存在するω−３脂肪酸のレベル（ω３指数として知られる）のそのような迅速で信頼性のある試験は、利用可能でなかった。過去数年間、いくつかの会社は、血液スポット試験の広告を出してきた。この試験では、指に穿刺した後、血液スポットは、抗酸化剤を含む濾紙または含まない濾紙の小片上に配置される。乾燥後、濾紙は、分析のために中央実験室に送られる。血液スポット中の脂肪酸は、何週間にもわたり安定であり、かつω３指数の信頼性のある尺度を得ることが可能であると主張されてきた。本発明者らは、これらの試験の再現を試みたところ、経時的に脂肪酸の有意な劣化が起こることを見いだした。
【０００６】
そのような製品の１つは、血液スポット中のｎ−３およびｎ−６長鎖多価不飽和脂肪酸の直接評価のためにシグマ  アルドリッチにより開発されたＦｌｕｋａ血液採取キットである。Ｆｌｕｋａキット紙上に採取された血液スポットサンプルを室温で貯蔵して行われた唯一の長期安定性試験では、１ヶ月後、長鎖多価不飽和脂肪酸レベル（全脂肪酸基準のパーセントとして）の有意な低下を生じることが示された（Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，２０１１  ８４，１３−１８）。このため、結果を比較するのであれば、採取の一定時間後にすべてのサンプルを分析することが必要となるであろうから、この血液スポット方法は、長鎖多価不飽和脂肪酸の酸化により非実用的なものとなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、血液の貯蔵時の脂肪酸劣化が最小限に抑えられるかまたは回避される、血液中の脂肪酸含有率を決定するための簡単で迅速でかつ信頼性のある方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、乾燥血液スポット内の脂肪酸が周囲条件で何ヵ月間にもわたり安定化されうることを発見した。本発明者らはさらに、脂肪酸を安定化させることによりかつ固体媒体中の汚染物質を制御することにより、何ヵ月間にもわたり固体媒体上に貯蔵された血液の脂肪酸組成のきわめて正確な決定を達成しうることを発見した。
【０００９】
第１の態様では、本発明は、脂肪酸を安定化させるための方法を提供する。本方法は、脂肪酸または脂肪酸を含むサンプルを、固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体に、適用することを含む。ただし、固体マトリックスは、約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む。
【００１０】
サンプルは、生物学的サンプルでありうる。
【００１１】
生物学的サンプルは、体液、たとえば、血液、唾液、母乳、尿、精液、血漿、滑液、血清などでありうる。
【００１２】
体液は、哺乳動物の体液でありうる。
【００１３】
サンプルは、脂肪酸を含む流体、たとえば、体液でありうる。
【００１４】
脂肪酸は、不飽和脂肪酸でありうるかまたはそれを含みうる。
【００１５】
脂肪酸は、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）でありうるかまたはそれを含みうる。
【００１６】
脂肪酸は、ω−３脂肪酸、たとえば、ＥＰＡ、ＤＨＡなどでありうるかまたはそれらを含みうる。
【００１７】
第２の態様では、本発明は、脂肪酸を含むサンプルの脂肪酸組成を決定するための方法を提供する。本方法は、
（ａ）固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体にサンプルを適用することと、ただし、固体マトリックスは、サンプルが固体マトリックスに収着されるように、約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、
（ｂ）固体マトリックスに収着されたサンプルの脂肪酸組成を決定することと、
を含む。
【００１８】
サンプルは、生物学的サンプルでありうる。一実施形態では、生物学的サンプルは、体液、たとえば、血液、唾液、母乳、尿、精液、血漿、滑液、血清などである。
【００１９】
本方法は、サンプル中の全脂質基準の割合としてまたはサンプル中の全脂肪酸基準の割合としてサンプル中の１つ以上のクラスの脂肪酸の量を決定することを含みうる。
【００２０】
サンプルは、約１００μＬ未満または約５０μＬ未満または約２０μＬ未満の量で固体媒体に適用されうる。
【００２１】
工程（ｂ）は、工程（ａ）の何週間か後または何ヶ月か後に行われうる。
【００２２】
以下の記載は、第１および第２の態様に当てはまる。
【００２３】
固体マトリックスは、約１μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質または約０．５μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含みうる。
【００２４】
汚染物質は、飽和脂肪酸でありうる。
【００２５】
固体マトリックスは、紙、紙系マトリックス、またはガラス系マトリックスでありうる。
【００２６】
紙系マトリックスは、シリカゲル充填紙でありうる。
【００２７】
ガラス系マトリックスは、ガラスマイクロファイバーフィルターでありうる。
【００２８】
少なくとも１種のキレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、アスコルビン酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩でありうる。
【００２９】
少なくとも１種の抗酸化剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、またはｔ−ブチルヒドロキノンでありうる。
【００３０】
上述のキレート化剤および抗酸化剤の任意の組合せが考えられる。
【００３１】
一実施形態では、キレート化剤は、アスコルビン酸および／またはＥＤＴＡであり、かつ抗酸化剤は、ＢＨＴである。
【００３２】
固体媒体は、ストリップの形態をとりうる。
【００３３】
ストリップは、約１ｃｍ×３ｃｍの寸法を有しうる。
【００３４】
抗酸化剤は、約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約５ｍｇの量で、または約０．０１〜約１ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約０．５ｍｇの量で固体媒体上に存在しうる。一実施形態では、抗酸化剤は、約０．１ｍｇの量で存在する。
【００３５】
キレート化剤は、約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約５ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの量で、または約０．０５ｍｇ〜約０．５ｍｇの量で固体媒体上に存在しうる。一実施形態では、キレート化剤は、約０．２５ｍｇの量で存在する。他の実施形態では、キレート化剤は、約０．５ｍｇの量で存在する。
【００３６】
第１の態様の一実施形態では、本発明は、脂肪酸を安定化させるための方法を提供する。本方法は、脂肪酸または脂肪酸を含むサンプルを、シリカゲル充填紙とＥＤＴＡおよび／またはアスコルビン酸とＢＨＴとを含む固体媒体に、適用することを含む。
【００３７】
第１の態様の他の実施形態では、本発明は、脂肪酸を安定化させるための方法を提供する。本方法は、脂肪酸または脂肪酸を含むサンプルを、ガラスマイクロファイバーフィルターとＥＤＴＡおよび／またはアスコルビン酸とＢＨＴとを含む固体媒体に、適用することを含む。
【００３８】
第３の態様では、本発明は、固体媒体を提供する。前記媒体は、固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含み、固体マトリックスは、約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む。
【００３９】
固体媒体は、脂肪酸を安定化させるためのものおよび／またはサンプルの脂肪酸組成の決定に使用するためのものでありうる。
【００４０】
脂肪酸は、不飽和脂肪酸でありうるかまたはそれを含みうる。
【００４１】
脂肪酸は、ＬＣＰＵＦＡでありうるかまたはそれを含みうる。
【００４２】
脂肪酸は、ω−３脂肪酸、たとえば、ＥＰＡ、ＤＨＡなどでありうる。
【００４３】
固体マトリックスは、約１μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質または約０．５μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含みうる。
【００４４】
汚染物質は、飽和脂肪酸でありうる。
【００４５】
固体マトリックスは、紙、紙系マトリックス、またはガラス系マトリックスでありうる。
【００４６】
紙系マトリックスは、シリカゲル充填紙でありうる。
【００４７】
ガラス系マトリックスは、ガラスマイクロファイバーフィルターでありうる。
【００４８】
少なくとも１種のキレート化剤は、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩でありうる。
【００４９】
少なくとも１種の抗酸化剤は、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、またはｔ−ブチルヒドロキノンでありうる。
【００５０】
上述のキレート化剤および抗酸化剤の任意の組合せが考えられる。
【００５１】
一実施形態では、キレート化剤は、アスコルビン酸および／またはＥＤＴＡであり、かつ抗酸化剤は、ＢＨＴである。
【００５２】
固体媒体は、ストリップの形態をとりうる。
【００５３】
ストリップは、約１ｃｍ×３ｃｍの寸法を有しうる。
【００５４】
抗酸化剤は、約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約５ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約０．５ｍｇの量で固体媒体上に存在しうる。一実施形態では、抗酸化剤は、約０．１ｍｇの量で存在する。
【００５５】
キレート化剤は、約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約５ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの量で、または約０．０５ｍｇ〜約０．５ｍｇの量で固体媒体上に存在しうる。一実施形態では、キレート化剤は、約０．２５ｍｇの量で存在する。
【００５６】
第３の態様の一実施形態では、本発明は、固体媒体を提供する。前記媒体は、シリカゲル充填紙とＥＤＴＡおよび／またはアスコルビン酸とＢＨＴとを含む。
【００５７】
第３の態様の他の実施形態では、本発明は、固体媒体を提供する。前記媒体は、ガラスマイクロファイバーフィルターとＥＤＴＡおよび／またはアスコルビン酸とＢＨＴとを含む。
【００５８】
第４の態様では、本発明は、固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体を作製するための方法を提供する。前記方法は、固体マトリックスを含む固体媒体を提供することと、固体媒体に少なくとも１種のキレート化剤および少なくとも１種の抗酸化剤を適用することと、を含み、固体マトリックスは、約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む。
【００５９】
固体マトリックス、キレート化剤、および抗酸化剤は、以上の態様に定義されたとおりでありうる。
【００６０】
固体マトリックスは、約１μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質または約０．５μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含みうる。
【００６１】
少なくとも１種の抗酸化剤および少なくとも１種のキレート化剤は、単一の溶液の形態で、または個別の溶液、すなわち、少なくとも１種の抗酸化剤を含む１つの溶液および少なくとも１種のキレート化剤を含む１つの溶液の形態で、固体媒体に適用されうる。
【００６２】
溶液は、アルコールおよび水、たとえば、エタノールおよび水を含みうる。
【００６３】
溶液中の少なくとも１種の抗酸化剤の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬでありうる。
【００６４】
溶液中の少なくとも１種のキレート化剤の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬでありうる。
【００６５】
固体媒体は、ストリップの形態をとりうる。
【００６６】
ストリップに適用される溶液の量は、約１〜５００μＬ、または約１〜１００μＬでありうる。
【００６７】
ストリップは、約１ｃｍ×３ｃｍの寸法を有しうる。
【００６８】
汚染物質は、飽和脂肪酸でありうる。
【００６９】
第５の態様では、本発明は、第３の態様に係る固体媒体を含むキットを提供する。
【００７０】
キットは、脂肪酸の安定化に使用するためのものおよび／またはサンプルの脂肪酸組成の決定に使用するためのものでありうる。
【００７１】
キット、被験体から脂肪酸を含むサンプル、たとえば、血液などの体液を得るための先鋭な物体をさらに含みうる。
【００７２】
次に、単なる例にすぎないが、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】異なる単一の抗酸化剤または鉄キレート化剤で前処理された２つのタイプの紙上に採取された血液スポット中に保持されたＬＣＰＵＦＡの４週間貯蔵後のレベルを示している。
【図２】Ｆｌｕｋａ試験キット上の血液スポット中の脂肪酸組成の２ヶ月間貯蔵時の変化を示している。
【図３】ワットマンシリカゲル充填紙上の血液スポット中の脂肪酸組成の２ヶ月間貯蔵時の変化を示している。
【図４】キャピラリー乾燥血液スポット（ＤＢＳ）と全血抽出全脂質との間でのＥＰＡ＋ＤＨＡ含有率の相関を示している。ＤＢＳ中（ｘ軸）対全血抽出全脂質中（ｙ軸）のＥＰＡ＋ＤＨＡ含有率、全血（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）（％）＝ＤＢＳ（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）（％）×１．０６８−０．１３９（ｒ＝０．９９７１、Ｐ＜０．０００１）。
【図５】キャピラリー乾燥血液スポットと血漿全脂質との間でのＥＰＡ＋ＤＨＡ含有率の相関を示している。ＤＢＳ中（ｘ軸）対血漿全脂質中（ｙ軸）のＥＰＡ＋ＤＨＡ含有率、血漿全脂質（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）（％）＝ＤＢＳ（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）（％）×１．１０８−１．５５４（ｒ＝０．９８６９、Ｐ＜０．０００１）。
【図６】キャピラリー乾燥血液スポットと血漿リン脂質との間でのＥＰＡ＋ＤＨＡ含有率の相関を示している。ＤＢＳ中（ｘ軸）対血漿リン脂質中（ｙ軸）のＥＰＡ＋ＤＨＡ含有率、血漿リン脂質（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）（％）＝ＤＢＳ（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）（％）×１．１８６＋０．６８５（ｒ＝０．９８１４、Ｐ＜０．０００１）。
【図７】キャピラリー乾燥血液スポットとω−３指数（ＲＢＣ  ＥＰＡ＋ＤＨＡ）との間でのＥＰＡ＋ＤＨＡのレベルの相関を示している。ＤＢＳ中のＥＰＡ＋ＤＨＡ含有率（ｘ軸）対ω−３指数（ｙ軸）、ω−３指数（％）＝キャピラリーＤＢＳ（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）（％）×１．３４５＋１．３２（ｒ＝０．９４９２、Ｐ＜０．０００１）。
【図８】新たに作製された紙およびあらかじめ作製された紙上で４週間にわたり室温で貯蔵された血液スポットの脂肪酸組成を示している。値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を表しており、互いに有意差（ｐ＜０．０１）はない。「オリジナル」とは、５０μｌの新鮮血の直接メチル基転移から得られた脂肪酸組成を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
定義
以下は、本発明の説明の理解に役立ちうるいくつかの定義である。これらは、一般的な定義として意図されたものであり、本発明の範囲をこれらの用語のみになんら限定すべきものではなく、以下の説明をより良く理解するために提示されている。
【００７５】
本明細書全体を通じて、文脈上とくに必要とされないかぎり、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を含む）」という単語または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変化形は、明記された工程もしくは要素もしくは整数または一群の要素もしくは整数を包含し、任意の他の工程もしくは要素もしくは整数または一群の要素もしくは整数を排除しないことを意味すると理解されるものとする。したがって、本明細書との関連では、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という用語は、「必ずしも〜のみ含むというわけではなく、主に〜を含む」ということを意味する。
【００７６】
本明細書との関連では、「約」という用語は、同一の機能または結果を達成するという観点から当業者が挙げられた値と等価であると考えるであろう数値の範囲を意味するものと理解される。
【００７７】
本明細書との関連では、「ａ」および「ａｎ」という用語は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を意味する。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００７８】
本明細書との関連では、「体液」という用語は、分泌または排出される流体を含めて、人体内または動物体内に由来する任意の液体を含むものと理解される。体液の例としては、血液、精液、血漿、血清を含む漿液、唾液、汗、尿、母乳、胆汁、および腹水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
本明細書との関連では、「キレート化剤」という用語は、第ＩＩ族および第ＩＩＩ族の多価金属イオンおよび遷移金属イオンを含む多価イオンを錯体化可能な任意の化合物を包含するものと理解される。
【００８０】
本明細書との関連では、「収着する」および「収着される」という用語は、関連物質が固体マトリックス中または固体マトリックス上に吸収されるまたは吸着されるまたは他の形で組み込まれることを意味するものと理解される。
【００８１】
本明細書との関連では、「生物学的サンプル」という用語は、生物、たとえば、植物、動物（ヒトを含む）、菌類、細菌、藻類などから得られるサンプルを意味するものと理解される。
【００８２】
本明細書との関連では、「紙系マトリックス」という用語は、紙を含むまたは含有するマトリックスを意味するものと理解される。紙系マトリックスは、少なくとも５％（ｗ／ｗ）、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９９％（ｗ／ｗ）の紙を含みうる。
【００８３】
本明細書との関連では、「ガラス系マトリックス」という用語は、ガラスを含むまたは含有するマトリックスを意味するものと理解される。ガラス系マトリックスは、少なくとも５％（ｗ／ｗ）、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９９％（ｗ／ｗ）のガラスを含みうる。
【００８４】
本明細書との関連では、「セルロース系マトリックス」という用語は、セルロースを含むまたは含有するマトリックスを意味するものと理解される。セルロース系マトリックスは、少なくとも５％（ｗ／ｗ）、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９９％（ｗ／ｗ）のセルロースを含みうる。
【００８５】
本発明は、広くは、サンプル中に存在する脂肪酸を安定化させる方法と、脂肪酸の安定化に使用するためのおよびサンプルの脂肪酸組成の決定に使用するための固体媒体と、に関する。発明はまた、脂肪酸を含むサンプルの脂肪酸組成を決定するための方法に関する。本発明はさらに、脂肪酸の安定化に使用するためのおよびサンプルの脂肪酸組成の決定に使用するための固体媒体を作製するための方法に拡張される。
【００８６】
本発明の第１の態様に係る方法は、サンプル中に存在する脂肪酸を安定化させるための簡単で安全で便利でかつ信頼性のある手段を提供する。本発明者らは、本方法を用いることにより、血液、母乳、および血漿中に存在する脂肪酸が、劣化を最小限に抑えて９週間まで室温で安定化されうることを見いだした。
【００８７】
固体媒体は、少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とが収着された固体マトリックスを含む。本発明で使用するのに好適な固体マトリックスは、少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤と流体とを収着可能な任意の材料を含む。そのようなマトリックスの例としては、紙、ガラス系マトリックス、紙系マトリックス、セルロース系マトリックス、親水性ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ファイバーガラス、および多孔性セラミックスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、固体マトリックスは、紙系マトリックス、たとえば、シリカゲル被覆紙やシリカゲル含浸紙を含むシリカゲル充填紙である。好適なシリカゲル充填紙としては、３６６８−９１５の番号でワットマン社から入手可能なものが挙げられる。これらの紙は、セルロースと大細孔シリカとで構成され、約０．２７ｍｍの厚さと約１００ｍｍ／３０分（水）の流量とを有する。紙および紙系マトリックスの他の例としては、濾紙およびクロマトグラフィー紙が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
代替実施形態では、固体マトリックスは、ガラス系マトリックス、たとえば、ガラスウールまたはガラスマイクロファイバーフィルター、特定的には、ホウケイ酸ガラスを含むまたはそれらからなるガラスマイクロファイバーフィルターである。好適なガラスマイクロファイバーフィルターとしては、Ａ１８２０−０４７、Ｂ１８２１−０４７、Ｃ１８２２−０４７、およびＤ１８２３−０４７の番号でワットマン社から入手可能なものが挙げられる。
【００８９】
本発明者らは、驚くべきことに、紙系固体マトリックス中に存在する汚染物質が、とくに、固体マトリックスに適用される流体の体積が少ない場合（すなわち、約２０μＬ未満）、それぞれのクラスの脂肪酸の量を全脂質基準の割合として正確に決定するのを妨害することを発見した。これとの関連では、１種または複数種の「汚染物質」という用語は、固体マトリックスに適用する前のサンプル中の全脂質基準の割合として計算されたあるクラスの脂肪酸の割合と比較して、マトリックスに適用されたサンプル中の全脂質基準の割合として計算されたあるクラスの脂肪酸の割合を、固体マトリックス中の存在により増加または減少させる１種または複数種の化合物を意味するものと理解されうる。そのような汚染物質としては、たとえば、飽和脂肪酸（たとえば、１６：０および１８：０）、飽和脂肪酸のエステル、樹脂酸（たとえば、アビエチン酸、イソピマル酸、デキストロピマル酸、およびレボピマル酸）、および樹脂酸のエステルが挙げられる。これらは、製造時に紙中に混入する。脂肪酸の割合を計算する時に汚染物質を補正するために対照としてブランク固体マトリックスを使用することが可能であるが、こうすると、本方法に追加の工程が加わるので、効率が低減される。本発明者らは、固体マトリックス中の汚染物質が約２μｇ／ｃｍ２未満であることを保証することにより、それぞれのクラスの脂肪酸の量を流体中の全脂質基準の割合として正確に決定することを最適化可能であることを見いだした。したがって、第１、第２、第３、および第４の態様の実施形態では、固体マトリックスは、約２μｇ／ｃｍ２未満、または約１．９μｇ／ｃｍ２未満、または約１．８μｇ／ｃｍ２未満、または約１．７μｇ／ｃｍ２未満、または約１．６μｇ／ｃｍ２未満、または約１．５μｇ／ｃｍ２未満、または約１．４μｇ／ｃｍ２未満、または約１．３μｇ／ｃｍ２未満、または約１．２μｇ／ｃｍ２未満、または約１．１μｇ／ｃｍ２未満、または約１μｇ／ｃｍ２未満、または約０．９μｇ／ｃｍ２未満、または約０．８μｇ／ｃｍ２未満、または約０．７μｇ／ｃｍ２未満、または約０．６μｇ／ｃｍ２未満、または約０．５μｇ／ｃｍ２未満、または約０．４μｇ／ｃｍ２未満、または約０．３５μｇ／ｃｍ２未満、または約０．３μｇ／ｃｍ２未満、または約０．２５μｇ／ｃｍ２未満、または約０．２μｇ／ｃｍ２未満、または約０．１５μｇ／ｃｍ２未満、または約０．１μｇ／ｃｍ２未満、または約０．１５μｇ／ｃｍ２以下、または約０．１２μｇ／ｃｍ２以下の量で汚染物質を含む。他の選択肢として、固体マトリックスは、約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．５μｇ／ｃｍ２の量で、または約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．３μｇ／ｃｍ２の量で、または約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．１μｇ／ｃｍ２の量で、または約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．２μｇ／ｃｍ２の量で、または約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．１５μｇ／ｃｍ２の量で汚染物質を含みうる。第１、第２、第３、または第４の態様の代替実施形態では、脂肪酸または脂肪酸を含むサンプルを適用する前に、固体マトリックスは、約２μｇ／ｃｍ２未満、または約１．９μｇ／ｃｍ２未満、または約１．８μｇ／ｃｍ２未満、または約１．７μｇ��ｃｍ２未満、または約１．６μｇ／ｃｍ２未満、または約１．５μｇ／ｃｍ２未満、または約１．４μｇ／ｃｍ２未満、または約１．３μｇ／ｃｍ２未満、または約１．２μｇ／ｃｍ２未満、または約１．１μｇ／ｃｍ２未満、または約１μｇ／ｃｍ２未満、または約０．９μｇ／ｃｍ２未満、または約０．８μｇ／ｃｍ２未満、または約０．７μｇ／ｃｍ２未満、または約０．６μｇ／ｃｍ２未満、または約０．５μｇ／ｃｍ２未満、または約０．４μｇ／ｃｍ２未満、または約０．３μｇ／ｃｍ２未満、または約０．２５μｇ／ｃｍ２未満、または約０．２μｇ／ｃｍ２未満、または約０．１５μｇ／ｃｍ２未満、または約０．１μｇ／ｃｍ２未満、または約０．１５μｇ／ｃｍ２以下、または約０．１２μｇ／ｃｍ２以下の量で飽和脂肪酸および／または樹脂酸を含むか、あるいは脂肪酸または脂肪酸を含むサンプルを適用する前に、固体マトリックスは、約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．５μｇ／ｃｍ２の量で、または約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．３μｇ／ｃｍ２の量で、または約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．２μｇ／ｃｍ２の量で、または約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．１μｇ／ｃｍ２の量で、または約０．００５μｇ／ｃｍ２〜約０．１５μｇ／ｃｍ２の量で飽和脂肪酸および／または樹脂酸を含む。
【００９０】
本明細書の実施例に記載されるように、固体マトリックス中に存在する汚染物質の量を制御することにより、かつサンプル中に存在する脂肪酸を安定化させることにより、固体マトリックスへのサンプル適用の何週間か後さらには何ヶ月か後にサンプルの脂肪酸組成を非常に高い確度で決定することが可能である。したがって、たとえば、血液などのサンプルの脂肪酸含有率を正確に決定することが望まれる場合、単に個体の指に穿刺し、血液のスポットを固体媒体上に配置し、それを乾燥させ、次いで、分析のためにそれを中央実験室に郵送しうる。固体媒体上の長期脂肪酸安定性を考慮すれば、固体媒体を冷蔵する必要もなければ、サンプルを速達で郵送する必要もない。また、静脈穿刺の必要性が回避されるとともに、固体媒体中の汚染物質を補正するために対照としてブランク採取紙またはなにか他の手段を使用する必要性も回避される。したがって、他の態様では、本発明は、脂肪酸を含むサンプルの脂肪酸組成を決定するための方法に関する。本方法は、
（ａ）固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体にサンプルを適用することと、ただし、固体マトリックスは、サンプルが固体マトリックスに収着されるように、約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、
（ｂ）固体マトリックスに収着されたサンプルの脂肪酸組成を決定することと、
を含む。
【００９１】
工程（ｂ）は、当業者に周知の方法により、たとえば、乾燥収着サンプル中の脂肪酸を誘導体化し、得られた誘導体化化合物をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析することにより、行われうる。一実施形態では、乾燥収着サンプル中の脂肪酸は、たとえば、メタノール中の１％Ｈ２ＳＯ４溶液中、７０℃で３時間加熱することにより、直接メチル基転移により脂肪酸メチルエステルに変換される。次いで、脂肪酸メチルエステルは、有機溶媒（たとえばヘプタン）中に抽出され、そして脂肪酸メチルエステルを含有するヘプタンは、ガスクロマトグラフに注入される。脂肪酸メチルエステルの同定および定量は、ヒューレット  パッカード  ケミステーションデータシステムを用いて、未知サンプルの保持時間およびピーク面積値を市販の脂質標準のものと比較することにより、達成されうる（本明細書の実施例１を参照されたい）。
【００９２】
したがって、一実施形態では、工程（ｂ）は、
（ｉ）固体マトリックスに収着されたサンプルの少なくとも一部を抽出して、誘導体化たとえばエステル化された脂肪酸を含む抽出物を提供することと、
（ｉｉ）誘導体化された脂肪酸の量に基づいて、サンプルの脂肪酸組成を決定することと、
を含む。
【００９３】
エステル化脂肪酸は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルエステル、たとえば、メチルエステルでありうる。
【００９４】
本方法は、サンプル中に存在する全脂質基準の割合（たとえばパーセント）として、またはサンプル中に存在する全脂肪酸基準の割合として、サンプル中の１つ以上のクラスの脂肪酸（好ましくは不飽和脂肪酸）の量を決定することを含みうる。たとえば、本方法は、１種以上の次の不飽和脂肪酸、すなわち、１８：１ｎ−９、１８：２ｎ−６、２０：４ｎ−６、２０：５ｎ−３、２２：５ｎ−３、および２２：６ｎ−３の量を決定することを含みうる。工程（ｂ）は、工程（ａ）の何週間か後または何ヶ月か後に行われうる。たとえば、工程（ｂ）は、工程（ａ）の約１２ヶ月後まで、約９ヶ月後まで、約８ヶ月後まで、約７ヶ月後まで、約６ヶ月後まで、約５ヶ月後まで、約４ヶ月後まで、約３ヶ月後まで、約２ヶ月後まで、または約１ヶ月後まで行われうる。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、工程（ａ）の約１２週間後まで、約１１週間後まで、約１０週間後まで、約９週間後まで、約８週間後まで、約７週間後まで、約６週間後まで、約５週間後まで、約４週間後まで、約３週間後まで、約２週間後まで、または約１週間後まで行われる。
【００９５】
脂肪酸組成の決定で不正確さに寄与するおそれのある疎水性化合物による汚染の可能性をさらに最小化するために、工程（ａ）で得られたサンプルは、好ましくは、工程（ｂ）の実施前にセロハンバッグ内に貯蔵される。好ましくは、サンプルは、周囲温度の暗所でセロハンバッグ内に貯蔵される。
【００９６】
典型的には、サンプルは、生物学的サンプルであるが、劣化に対してとくに感受性のある脂肪酸、特定的には不飽和脂肪酸を含む任意のサンプルに本発明に係る方法および媒体を適用可能であることは、当業者であればわかるであろう。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、体液である。体液の例としては、血液、唾液、母乳、尿、精液、血漿、滑液、および血清が挙げられるが、これらに限定されるものではない。代替実施形態では、サンプルは、脂肪酸組成を決定することが望まれる不飽和脂肪酸を含む油、たとえば、海産油や植物油などの食用油でありうる。品質管理の目的でおよび／または貯蔵寿命を評価するために、そのような油の脂肪酸組成を決定することが望ましいこともありうる。他の実施形態では、油は、生成された全脂質基準の割合として増加した量の所定の脂肪酸たとえばω−３脂肪酸を生成するように開発されてきた遺伝子工学操作作物（たとえばキャノーラ）に由来する油でありうる。この場合、生成された全脂質基準の割合としてω−３脂肪酸の増加を定量するために、第２の態様に係る方法を使用することが可能である。
【００９７】
サンプルは、約１００μＬ未満、または約９０μＬ未満、または約８０μＬ未満、または約７０μＬ未満、または約６０μＬ未満、または約５０μＬ未満、または約４０μＬ未満、または約３０μＬ未満、または約２５μＬ未満、または約２０μＬ未満、または約２０μＬの量で固体媒体に適用されうる。
【００９８】
他の実施形態では、サンプルは、約１０μＬ〜約２５０μＬ、または約１０μＬ〜約１５０μＬ、または約１０μＬ〜約１００μＬ、または約１０μＬ〜約７５μＬ、または約１０μＬ〜約６０μＬ、または約３０μＬ〜約６０μＬ、または約１０μＬ〜約２０μＬ、または約１０μＬ〜約３０μＬ、または約５０μＬの量で固体媒体に適用されうる。
【００９９】
本発明で使用される固体マトリックスは、それに収着される少なくとも１種のキレート化剤を含む。キレート化剤は、当業者に周知である。本発明で使用するのに好適なキレート化剤としては、ＥＤＴＡ、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）トリエタノールアミン、サリシクリック酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−五酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−（ビス−（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−グリシン、ジエチレントリアミン五酢酸、［［（カルボキシメチル）イミノ］ビス（エチレンニトリロ）］−四酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、トリグリコラミン酸、トリロンＡ、α，α’，α’’−トリメチルアミントリカルボン酸、トリ（カルボキシメチル）アミン、アミノ三酢酸、ハンプシャーＮＴＡ酸、ニトリロ−２，２’，２’’−三酢酸、チトリプレックスＩ、ニトリロ三酢酸、およびデフェロキサミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
本発明で使用する固体マトリックスは、そこに収着された少なくとも１つの抗酸化剤をさらに含む。本発明で使用するのに好適な抗酸化剤としては、レスベラトロール、ｔ−ブチルヒドロキノン、ＢＨＴ、ＢＨＡ、クエン酸、シトレート、アスコルビン酸、アスコルベート、フラバノイドたとえばバカレイン、および抗酸化剤植物抽出物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
抗酸化剤は、約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約０．５ｍｇの量で固体媒体上に存在しうる。一実施形態では、抗酸化剤は、約０．１ｍｇの量で存在する。
【０１０２】
キレート化剤は、約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの量で、または約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの量で、または約０．０５ｍｇ〜約０．５ｍｇの量で固体媒体上に存在しうる。一実施形態では、キレート化剤は、約０．２５ｍｇの量で存在する。他の実施形態では、キレート化剤は、約０．５ｍｇの量で存在する。
【０１０３】
本発明はさらに、固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体を作製するための方法に関する。前記方法は、固体マトリックスを含む固体媒体を提供することと、固体媒体に少なくとも１種のキレート化剤および少なくとも１種の抗酸化剤を適用することと、を含み、固体マトリックスは、約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む。
【０１０４】
固体マトリックス、キレート化剤、および抗酸化剤は、本明細書に定義されるとおりでありうる。少なくとも１種の抗酸化剤および少なくとも１種のキレート化剤は、単一の溶液の形態で、または個別の溶液、すなわち、少なくとも１種の抗酸化剤を含む１つの溶液および少なくとも１種のキレート化剤を含む１つの溶液の形態で、固体媒体に適用されうる。他の選択肢として、少なくとも１種の抗酸化剤および／または少なくとも１種のキレート化剤が液体である場合、それぞれ固体媒体にニートで適用されうる。
【０１０５】
溶液は、有機溶媒および水、たとえば、アルコール（たとえば、メタノールまたはエタノール）および水を含みうる。
【０１０６】
溶液中の少なくとも１種の抗酸化剤の濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬでありうる。溶液中の少なくとも１種のキレート化剤の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬでありうる。ストリップに適用される溶液の量は、約１〜５００μＬ、または約１〜１００μＬ、または約５０μＬでありうる。典型的には、溶液は、滴下適用される。
【０１０７】
固体媒体は、任意の形状（たとえば、円形、長方形、正方形など）をとりうるが、典型的には、ストリップの形態である。ストリップは、約１ｃｍ×１ｃｍ〜約１ｃｍ×３ｃｍの寸法を有しうるが、代替サイズのストリップが考えられる。典型的には、固体媒体は、標準的な封筒に入れて中央実験室に安価にかつ容易に郵送できように薄い（すなわち、１〜２ｍｍ）。
【０１０８】
本発明はさらに、第３の態様に係る固体媒体を含むキットに関する。キットは、脂肪酸を含むサンプルたとえば体液を被験体から得るために先鋭な物体（たとえば、ピン、針など）をさらに含みうる。一実施形態では、体液は、血液である。好ましくは、先鋭な物体は、その使用後に被験体が感染するリスクを最小限に抑えるようにあらかじめ滅菌される。キットは、使用説明書をさらに含みうる。
【実施例】
【０１０９】
次に、例示を目的としたものにすぎないが、以下の実施例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。実施例は、本発明を例示する役割を果たすことが意図されたものであり、本明細書全体を通じて、説明の開示の一般性をなんら限定するものとみなされるべきではない。
【０１１０】
実施例１−ＢＨＴとアスコルビン酸／ＥＤＴＡとの組合せを用いたワットマンシリカゲルクロマトグラフィー紙上の血液スポットの安定化
材料および方法
血液採取紙
２つのタイプの紙、すなわち、Ｆｌｕｋａ血液採取キット紙（シグマ  アルドリッチ、ブックス、スイス国）およびワットマンシリカゲルクロマトグラフィー紙（４６×５７ｃｍ、ワットマン、バッキンガム、英国）を血液スポット採取に使用した。２種の市販のフェノール系酸化防止剤、すなわち、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび第三級ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）は、シグマ  アルドリッチ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。鉄キレート化剤、Ｌ−アスコルビン酸、およびＥＤＴＡは、Ｃｈｅｍ−ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ギルマン、南オーストラリア）から購入した。
【０１１１】
抗酸化剤／キレート化剤（保護剤）溶液
両方のタイプの採取紙上の血液スポット中の脂肪酸を安定化させるために、１４種の保護剤配合物を調製した（表１）。血液スポット中の脂質酸化を抑制する最適抗酸化剤濃度を決定するために、両方の種類の抗酸化剤（ＢＨＴおよびＴＢＨＱ）を３つの異なる濃度（０．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ）で試験した（表１）。Ｌ−アスコルビン酸およびＥＤＴＡを５ｍｇ／ｍｌのレベルで鉄キレート化剤として使用した。１滴の各保護剤配合物（約５０μｌ）を採取紙ストリップ上に一様に広げて、紙上に血液を採取する前に空気乾燥させた。
【０１１２】
【表１】
0006325985.tif 000002
【０１１３】
サンプル作製
魚油を規則的に摂取し血液中のＥＰＡおよびＤＨＡの含有率が非常に高い１名の健常志願者から前肘静脈を介して血液を採取した。新鮮血（約５０μｌ）を５ｍｌ密封バイアル内の無水メタノール（ウィートン、ミルビル、米国）中で２ｍｌの１％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４（１８Ｍ  ＡＲグレード、ＢＤＨ，サセックス、英国）と混合し、７０℃で３時間加熱することにより、全血中の脂肪酸の直接メチル基転移を達成した。得られた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をヘプタン中に抽出し、すでに確立された方法（１）に従って分析用ＧＣに注入した。保護剤配合物（表１）の不在下または存在下で両方のタイプの血液採取紙ストリップ（１×３ｃｍ）上で１滴の新鮮血（約５０μｌ）を吸収させることにより、血液スポットを取得し、そしてすべての血液スポットを周囲温度で６時間空気乾燥させた。血液スポットを乾燥させた後、それらを４つのグループに分割した。第１のグループは、新鮮血と同一の手順に従って直ちにエステル交換した。これらのサンプルから得られた結果を、新鮮血の脂肪酸組成を直接測定することにより得られたものと比較して、空気乾燥時に血液スポットサンプル中のＬＣＰＵＦＡの酸化損失があったかを決定し、血液スポット中の脂肪酸組成に対するベースライン尺度を提供した。残りの３つのグループの血液スポットを周囲温度の暗所でセロハンバッグ内に貯蔵し、そして血液採取時の２週間後、４週間後、または９週間後のいずれかでこれらのサンプル中の脂肪酸組成を測定した。すべてのサンプルをトリプリケート方式で処理した。
【０１１４】
ガスクロマトグラフィー分析
ＢＰＸ７０キャピラリーカラム５０ｍ×０．３２ｍｍ、フィルム厚０．２５μｍ（ＳＧＣ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．，ビクトリア、オーストラリア）、ＰＴＶ注入器、およびフレームイオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＧＣ（ヒューレット  パッカード  ６８９０；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，カリフォルニア、米国）を用いて、ＦＡＭＥを分離し定量した。注入器温度を２５０℃およびＦＩＤ温度を３００℃に設定し、プログラム温度ランプ（１４０〜２４０℃）を使用した。３５ｃｍ／秒のカラム内流量でヘリウムガスをキャリヤーとして利用し、入口スプリット比を２０：１に設定した。ヒューレット  パッカード  ケミステーションデータシステムを用いて、未知サンプルの保持時間およびピーク面積値を市販の脂質標準（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ  Ｉｎｃ．，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ，ＵＳＡ）のものと比較することにより、ＦＡＭＥの同定および定量を達成した。
【０１１５】
統計解析
ＰＡＳＷ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ１８を用いて、すべての統計解析を行った。値は、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表される。一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、空気乾燥後の全血中脂質中の脂肪酸のパーセント間の有意差を決定した。二元配置ＡＮＯＶＡを用いて、同一の血液サンプル内の脂肪酸パーセントの経時的変化に及ぼす紙のタイプおよび保護剤配合物の影響を試験した。紙のタイプと保護剤配合物との間で有意な相互作用がＡＮＯＶＡで決定された場合、脂肪酸の経時的変化を異なる紙のタイプで個別に決定し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキー事後検定でｐ＜０．０５を統計的に有意であるとした。
【０１１６】
結果
紙および抗酸化剤濃度の影響
抗酸化剤および鉄キレート化剤の不在下では、Ｆｌｕｋａ紙またはシリカゲル紙上に採取された血液スポットは、抗酸化剤で前処理された紙上に採取されたそれらの血液スポットと比較した場合、４週間の貯蔵期間にわたり測定されたＬＣＰＵＦＡ含有率の有意な低下を呈した（図１）。ＢＨＴで前処理された紙上に採取された血液スポットは、周囲温度で４週間貯蔵した後、３つの濃度すべてで、他の抗酸化剤または鉄キレート化剤で前処理された紙上に採取されたものよりも高いパーセントのＬＣＰＵＦＡを保持した（図１）。ＢＨＴにより与えられた最適保護は、２ｍｇ／ｍｌの濃度であるように思われた。Ｆｌｕｋａ紙上よりもシリカゲル被覆紙上のほうが血液スポット中のＬＣＰＵＦＡがより安定であるように思われたことは、注目すべきである。
【０１１７】
鉄キレート化剤の影響
両方のタイプの紙上に血液をスポットして６時間にわたりスポットを乾燥させたところ、酸性化メタノール中で直接エステル交換された等価量の血液と対比してＬＣＰＵＦＡの損失を生じた（表２および３）。直接エステル交換は、血中脂質の脂肪酸組成を決定する信頼性のある方法として実証されてきた。また、ＢＨＴ単独で処理された紙上に採取された血液スポットサンプルでは、全血中脂質中のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）のパーセントの有意な低下が検出された。しかしながら、ＢＨＴと鉄キレート化剤（Ｌ−アスコルビン酸またはＥＤＴＡ）のいずれかとの混合物で前処理された採取紙のいずれに吸収された血液スポット中で測定される脂肪酸組成も、新鮮血から得られた結果と有意差はなかった（表２および表３を参照されたい）。さらに、使用した保護剤配合物に関係なく、ワットマンシリカゲル紙上に採取された血液スポットは、Ｆｌｕｋａ血液採取キット紙上に採取された血液スポットと比較して、一貫して、新鮮血により類似した脂肪酸組成を呈した。
【０１１８】
【表２】
0006325985.tif 000003
【０１１９】
【表３】
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【０１２０】
血液スポット脂肪酸組成に及ぼす長期貯蔵の影響
Ｆｌｕｋａ試験キット紙上に採取され、９週間にわたり貯蔵された血液スポットは、６時間の空気乾燥直後に測定されたそれらの血液スポットに対して有意差のある脂肪酸組成を示した（図２、ｐ＜０．０１）。使用した保護剤配合物に関係なく、Ｆｌｕｋａ試験キット上に採取された血液スポット中で測定されたω−６脂肪酸（リノレイン酸、ＬＡ、１８：２ｎ−６、アラキドン酸、ＡＡ、２０：４ｎ−６）ならびにω−３ＥＰＡおよびＤＨＡのレベルは、貯蔵後２週間程度の早い時期にベースラインで測定された値よりも有意に低く、レベルは、９週間の貯蔵期間にわたり継続的に低下した。反対に、血液スポット中で測定された全飽和脂肪酸のパーセントは、貯蔵期間にわたり絶えず増加した（図２）。
【０１２１】
いかなる保護剤も用いずにワットマンシリカゲル紙上に血液スポットを採取した場合、２週間の貯蔵後、血液スポットの全脂質中のＥＰＡおよびＤＨＡのパーセントは、有意に低下したが（図３、ｐ＜０．０１）、損失は、同一の期間にわたりＦｌｕｋａ紙上で観察されたものよりも少ない。ＢＨＴでワットマンシリカゲル紙を処理することにより、ＥＰＡおよびＤＨＡのレベルの有意な低減は、貯蔵４週間後まで見られなかった。ワットマンシリカゲル紙にＢＨＴと鉄キレート化剤（Ｌ−アスコルビン酸またはＥＤＴＡ）のいずれかとの両方を添加した後、血液スポットサンプル中の全ＬＣＰＵＦＡのパーセントは、室温で９週間貯蔵した後でさえもベースライン値と有意に異ならなかった（図３）。
【０１２２】
考察
個体のＬＣＰＵＦＡ状態を評価するための血液スポット技術が汎用的に採用されるようになった場合、研究者は、本方法が経時的に正確かつ安定であることを保証する必要がある。濾紙上に血液をスポットすると当然ながら血液中のＬＣＰＵＦＡが空気に暴露されることを考慮して、研究者は、このようにして採取された血液スポットサンプル中のＬＣＰＵＦＡの安定性について関心を抱いてきた（２）。商業的には、血液スポット技術は、それらのω３指数（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）の評価を得るために、作製された紙上のサンプルを消費者が郵送するように広告されている。そのような試験は、血中の脂肪酸、最も注目すべきはＥＰＡおよびＤＨＡが、離れた実験室でサンプルが分析されるまでスポット時から安定であることを仮定している。明らかなように、Ｆｌｕｋａ試験キットを使用した場合、紙がＢＨＴで被覆されているかにかかわらず、これらのω−３脂肪酸の時間依存的酸化が起こるであろう。採取紙をＢＨＴ処理した場合でさえも、周囲温度で１ヶ月間貯蔵した後、サンプル中のｎ−３ＬＣＰＵＦＡ含有量の約６０％が保持されるにすぎないと報告されている（２）。
【０１２３】
血液スポット中の脂肪酸組成の最大の安定性は、抗酸化剤ＢＨＴと鉄キレート化剤（Ｌ−アスコルビン酸またはＥＤＴＡ）と採取紙としてのシリカゲル紙とを組み合わせることにより達成され、これにより、周囲温度で２ヶ月間貯蔵した後でさえも、血液スポット中の元のＥＰＡおよびＤＨＡレベルを維持することが可能であった。
【０１２４】
結論として、この試験の結果から、ＢＨＴとキレート化剤とシリカゲル紙との組合せで構成された保護システムは、周囲温度で貯蔵した場合、血液スポット中のＬＣＰＵＦＡの有意な酸化損失を少なくとも２ヶ月間にわたり防止可能であることが示唆される。この方法は、長期貯蔵後のキャピラリー血液サンプル中の脂肪酸の状態の正確な評価を可能にする能力を有するので、異なる期間で貯蔵されたサンプル間の比較を可能にする能力を有する。
【０１２５】
実施例２−ＢＨＴとＥＤＴＡとの組合せを用いたワットマンシリカゲルクロマトグラフィー紙上の血漿スポットの安定化
１日１カプセルの魚油を規則的に摂取した被験体から血液を採取した。血漿および赤血球を分離するために、血液サンプルを４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１滴の血漿（約５０μｌ）を直接エステル交換し、得られたＦＡＭＥをＧＣにより分析し、血漿全脂質中の脂肪酸組成のベースラインを提供した。血漿の残りを２つの部分に分割し、第１の部分を−２０℃で貯蔵し、そして１、２、および４週間で直接エステル交換により脂肪酸組成に関して試験した。第２の部分を、２ｍｇ／ｍｌのＢＨＴおよび５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡで含浸して５〜６時間空気中で乾燥させたワットマンシリカゲルクロマトグラフィー紙（４６×５７ｃｍ、ワットマン、バッキンガム、英国（紙１つあたり約５０μｌ））上にスポットした。次いで、血漿スポットを室温（１９〜２３℃）の暗所でセロハンバッグ内に貯蔵し、そしてこれらのサンプル中の脂肪酸組成を血液採取時の１、２、および４週間後に測定した。すべてのサンプルをトリプリケート方式で処理した。結果は表４に示される。
【０１２６】
【表４】
0006325985.tif 000005
【０１２７】
実施例３−ＢＨＴとＥＤＴＡとの組合せを用いたワットマンシリカゲルクロマトグラフィー紙上の母乳スポットの安定化
５ヶ月間泌乳しており魚油補給を行わなかった被験体から母乳を入手した。１滴の母乳（約５０μｌ）を直接エステル交換し、得られたＦＡＭＥをＧＣにより分析し、母乳全脂質中の脂肪酸組成のベースラインを提供した。母乳の残りを、２ｍｇ／ｍｌのＢＨＴおよび５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡで含浸して５〜６時間空気中で乾燥させたワットマンシリカゲルクロマトグラフィー紙（４６×５７ｃｍ、ワットマン、バッキンガム、英国（紙１つあたり約５０μｌ））上にスポットした。母乳スポットを乾燥させた後、それらを４つのグループに分割した。第１のグループは、新鮮母乳と同一のエステル交換手順に従って直ちにエステル交換した。これらのサンプルから得られた結果を、新鮮母乳の脂肪酸組成を直接測定することにより得られたものと比較して、空気乾燥時に母乳スポットサンプル中のＬＣＰＵＦＡの酸化損失があったかを決定し、母乳スポット中の脂肪酸組成に対するベースライン尺度を提供した。母乳スポットの３つのグループを室温（１９〜２３℃）の暗所でセロハンバッグ内に貯蔵し、そしてこれらのサンプル中の脂肪酸組成を母乳採取時の１、２、および４週間後に測定した。すべてのサンプルをトリプリケート方式で処理した。結果は表５に示される。
【０１２８】
【表５】
0006325985.tif 000006
【０１２９】
実施例４−紙および他の源に由来する汚染物質
材料および方法
血液スポット採取紙
５つのタイプの紙を血液スポット採取紙として使用した。それらは、２つの商業的に開発された血液スポット採取紙、すなわち、Ｆｌｕｋａ血液採取キット（シグマ  アルドリッチ、ブックス、スイス国）およびワットマン９０３検体採取カード（ワットマン、バッキンガム、英国）、ならびに３つのクロマトグラフィー紙、すなわち、ワットマン３ＭＭクロマトグラフィー紙（４６×５７ｃｍ、ワットマン、バッキンガム、英国）、ワットマンシリカゲルクロマトグラフィー紙（４６×５７ｃｍ、ワットマン、バッキンガム、英国）、およびワットマンガラスマイクロファイバーフィルター（ＧＦ／Ｂ４７ｍｍ、ワットマン、バッキンガム、英国）である。
【０１３０】
サンプル作製
３０歳の１名の健常志願者から前肘静脈を介して約５ｍｌの血液を採取し、そして採取直後に処理した。新鮮全血（５０μｌ）を５ｍｌ密封バイアル内の無水メタノール（ウィートン、ミルビル、米国）中で２ｍｌの１％（ｖ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４（１８Ｍ  ＡＲグレード、ＢＤＨ，サセックス、英国）と混合し、７０℃で３時間加熱することにより直接メチル基転移した。得られた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をヘプタン中に抽出し、すでに確立された方法（１）に従って分析用ＧＣに注入した。血液採取時、血液サンプルの２つのさらなるアリコート（それぞれ、２５μｌおよび５０μｌ）を紙ストリップ（１×１ｃｍ）上に配置し、そして新鮮血と同一の手順に従って処理した。血液なしの等価面積（１×１ｃｍ）のブランク採取紙ストリップを対照として同一の手順により処理した。すべてのサンプルをトリプリケート方式で処理した。
【０１３１】
サンプルの採取時、処理時、および貯蔵時に紙以外の源に由来する可能性のある汚染物質を評価するために、ラテックス手袋、ニトリル手袋、ポリエチレン（ＰＥ）ジップロックバッグ、アルミニウム箔ジップロックバッグ、またはセロハンバッグをはじめとする我々の実験室で使用される種々の材料の１０ｃｍ２の表面領域を、ブランクであるワットマンガラスマイクロファイバーフィルターストリップ（１×１ｃｍ）で払拭した。次いで、払拭された紙サンプルを以上に記載の方法によりメチル基転移し、そしてＧＣにより分析した。払拭されたガラスマイクロファイバーフィルターからブランクであるガラスマイクロファイバーフィルターの汚染物質含有率を引き算し、それらの手袋およびバッグに由来する汚染物質を評価した。すべてのサンプルをトリプリケート方式で処理した。
【０１３２】
ガスクロマトグラフィー分析
ＢＰＸ７０キャピラリーカラム５０ｍ×０．３２ｍｍ、フィルム厚０．２５μｍ（ＳＧＣ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．，ビクトリア、オーストラリア）、ＰＴＶ注入器、およびフレームイオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＧＣ（ヒューレット  パッカード  ６８９０；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，カリフォルニア、米国）を用いて、ＦＡＭＥを分離し定量した。注入器温度を２５０℃およびＦＩＤ温度を３００℃に設定し、プログラム温度ランプ（１４０〜２４０℃）を使用した。３５ｃｍ／秒のカラム内流量でヘリウムガスをキャリヤーとして利用し、入口スプリット比を２０：１に設定した。ヒューレット  パッカード  ケミステーションデータシステムを用いて、未知サンプルの保持時間およびピーク面積値を市販の脂質標準（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ  Ｉｎｃ．，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ，米国）のものと比較することにより、ＦＡＭＥの同定および定量を達成した。
【０１３３】
統計解析
ＰＡＳＷ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ１８を用いて、すべての統計解析を行った。値は、平均値±標準偏差（ＳＤ）として表される。一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、全血中脂質中の脂肪酸のパーセント間の有意差を決定し、統計的有意性の決定にｐ＜０．０５を使用した。
【０１３４】
結果および考察
血液スポットサンプルと新鮮血との間で異なる結果
新鮮血測定と比較した場合、シリカゲル紙およびガラスマイクロファイバーフィルターの両方の上にスポットされた２５μｌ血液の分析は、脂肪酸組成に関して同一の結果を生じた。これとは対照的に、Ｆｌｕｋａ試験キットまたはワットマン９０３採取カード上の２５μｌ血液スポットは、新鮮血測定と比較した場合、全血中脂質中のω−３脂肪酸およびアラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ−６）のパーセントが有意に低かった（表６）。血液スポットサンプル中のＡＡおよびω−３の割合のこの明らかな低下は、これらのサンプル中で測定された飽和脂肪酸、すなわち、パルミチン酸（１６：０）およびステアリン酸（１８：０）のパーセントの有意な増大により相殺された。血液スポットの体積を５０μｌに増加した場合、Ｆｌｕｋａ試験キット上に採取された血液スポットから測定された脂肪酸組成は、新鮮血と有意差がなかったが、ワットマン９０３採取カード上の５０μｌ血液スポットの分析は、依然として、新鮮血中のものと有意差のある脂肪酸プロファイルを生成した（表７）。
【０１３５】
【表６】
0006325985.tif 000007
【０１３６】
【表７】
0006325985.tif 000008
【０１３７】
ここに提示された結果から、血液スポットサンプルからの脂肪酸の状態の試験結果は、新鮮全血から得られたものと異なりうることが明確に実証される。Ｆｌｕｋａ血液採取キットおよびワットマン９０３検体採取カードは、血液採取に広く使用される市販品であり、ワットマン３ＭＭクロマトグラフィー紙もまた、臨床試験で血液採取紙として頻繁に使用される。しかしながら、１滴の全血からのＬＣＰＵＦＡの直接評価に使用した場合、これらの３つのタイプの紙のいずれの上の少量の血液（２５μｌ）も、脂肪酸の状態の曖昧な結果を生じた。我々のデータから、これらの採取紙に由来する汚染物質は、全脂質基準の割合としてそれぞれのクラスの脂肪酸の量を正確に決定するのを妨害することは明らかである。汚染物質を補正するために対照としてブランク採取紙を用いて、個別の脂肪酸組成試験を行うこと可能である。しかしながら、異なるタイプの血液採取紙に由来する汚染物質の量が異なるため、および同一のタイプの紙中に存在する汚染物質の量がシートごとにまたはバッチ間で異なる可能性があるため、とくに大規模な臨床試験では、ブランク紙の汚染物質に基づく補正因子を任意の確度で適用するのは非実用的である。
【０１３８】
異なる紙に由来する汚染物質
本発明者らは、すべてのタイプの採取紙中の２つの主要な汚染物質は、１６：０および１８：０飽和脂肪酸に対応することを見いだした（表８）。これは、新鮮血中のものと比較した場合、血液スポットサンプル中で検出された１６：０および１８：０飽和脂肪酸のパーセントの増加を説明する。さらに、異なるタイプの採取紙、たとえば、ワットマンシリカゲル紙の間で変化する汚染物質の全量は、０．１μｇ／ｃｍ２の汚染物質にすぎないが、ワットマン９０３紙のいくつかのバッチは、その量の２５倍に近かった。溶媒による紙の洗浄さらにはメチル基転移手順による紙の処理では、汚染物質を除去できなかったので、我々は、脂肪酸が紙の構成要素であると考えている。
【０１３９】
血液スポット試験に関する以前の研究は、採取紙を単独で処理した後、ＧＣピークが観察されなかったと主張したが、本発明者らは、試験したすべてのタイプの採取紙中に汚染物質のピークを見いだした。採取紙中の少量の汚染物質は、脂肪酸組成試験の結果を有意に変化させない可能性がある場合もありうる。たとえば、ワットマンシリカゲル紙およびワットマンガラスマイクロファイバーフィルターは、脂肪酸組成に関して新鮮血のものと同一の結果を示した。しかしながら、Ｆｌｕｋａ試験キットやワットマン９０３サンプル採取紙などの多量の汚染物質を含有する紙では、採取される血液の体積が少ない場合、脂肪酸の結果は、新鮮血とは明らかに異なっていた。これらの汚染物質は、樹脂酸または脂肪酸でありうる。なぜなら、両方とも、これら紙が最終的に合成される木材中に遊離酸または種々のエステルのいずれかで存在するからである。１６：０および１８：０飽和脂肪酸を含めて、製紙工場から得られた処理水サンプルから樹脂酸および脂肪酸が報告されている。したがって、これらの酸またはそれらのエステルは、最終紙製品中に不純物として残存する可能性があり、これらの紙上に採取された血液スポットの脂肪酸組成を評価する場合、汚染物質の導入を引き起こす可能性があると思われる。
【０１４０】
【表８】
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【０１４１】
他の源に由来する可能性のある汚染物質
ラテックス手袋、ニトリル手袋、ＰＥジップロックバッグ、アルミニウム箔ジップロックバッグ、およびセロハンバッグをはじめとする材料に紙を接触させることにより、我々の実験室で汚染物質源を試験した（表９）。ラテックス手袋は、有意量の汚染物質を含有するが、ニトリル手袋からは、汚染は実質上検出されなかった。ＰＥバッグおよびアルミニウムバッグはそれぞれ、オレイン酸（１８：１ｎ−９）およびエルカ酸（２２：１ｎ−９）に対応する多量の汚染物質を含有していたが、セロハンバッグは、有意な汚染の出現をなんら生じなかった。
【０１４２】
【表９】
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【０１４３】
ラテックス手袋、ＰＥバッグ、およびアルミニウムバッグは、多くの実験室で広く使用されている。実験時の汚染源としてラテックス手袋に焦点を当てたこれまでの研究は、存在しておらず、既存の研究では、ラテックス手袋がアレルギーを引き起こすおそれのあるエンドトキシンを放出しうることが報告されているにすぎない。しかしながら、我々の実験から、これらの広く使用される実験室備品は、疎水性汚染物質をする可能性を有し、とくに、血液サンプルの体積が少ない場合、血中脂肪酸組成試験の結果の変動の原因となりうることが示唆された。したがって、手袋およびバッグに由来する可能性のある汚染物質の問題を最小限に抑えるために、血液スポットサンプルの採取時、処理時、および貯蔵時のニトリル手袋およびセロハンバッグの使用が推奨される。
【０１４４】
要約すると、すべてタイプの採取紙は、汚染物質を放出し、これらの汚染物質は、とくに、血液スポットの体積が少ない場合、乾燥血液スポットサンプルの分析の結果を変化させる可能性を有する。紙の洗浄またはメチル基転移さらにはブランク値の引き算はいずれも、紙に由来する汚染物質の除去には効果的な戦略ではなく、最小汚染物質を含有する採取紙の選択が迅速な脂肪酸組成試験に重要である。本発明者らは、ワットマンシリカゲル紙およびワットマンガラスマイクロファイバーフィルターではいかなる有意な汚染物質も検出できなかったことから、紙上の血液の量が少ない場合でさえも（２５μｌ）、新鮮血中のものと同一の脂肪酸組成の結果であることを示した。さらにまた、本明細書に提示された実験結果から、ニトリル手袋およびセロハンバッグを用いて、サンプルの採取時、処理時、および貯蔵時に血液スポットサンプルが汚染する可能性を防止可能であることが明らかである。
【０１４５】
実施例５−キャピラリー血液スポットと脂肪酸の状態の従来の測定との比較
キャピラリー血液および静脈血の両方を５０名の被験体から採取した。全被験体のうち、３５名は、魚油補給をめったに行わなかったか、または行ったとしてもごく少量（＜３ｍｌ／日）を摂取したにすぎず、一方、１５名は、多量の魚油補給（約１５ｍＬ、ＭＡＸＥＰＡ）を行った。
【０１４６】
２ｍｇ／ｍｌのＢＨＴおよび５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡで含浸して室温（１９〜２３℃）で５〜６時間空気中乾燥させたワットマンシリカゲル紙上に１滴のキャピラリー血液（３０〜５０μｌ）を吸収させた。血液スポットサンプルを乾燥させた後、エステル交換し、得られたＦＡＭＥをＧＣにより分析した。静脈穿刺により採取された血液では、５００μｌの全血からクロロホルム／イソプロパノール（２：１、ｖ／ｖ）により全脂質を抽出した。血漿および赤血球（ＲＢＣ）を分離するために、残りの血液を４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。クロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）またはクロロホルム／イソプロパノール（２：１、ｖ／ｖ）を用いて、それぞれ、血漿中およびＲＢＣ中の全脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーによりリン脂質画分を全脂質から分離した。結果は表１０に示される。
【０１４７】
【表１０】
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【０１４８】
個体の脂肪酸の状態は、さまざまな方法で報告されているので、乾燥血液スポット中の脂肪酸スペクトルを血液中の脂肪酸を報告する標準的方法と比較することが重要であった。これらは、全血抽出物、血漿リン脂質、および赤血球脂肪酸を含んでいた。それに加えて、これらの各血液画分中のＥＰＡ＋ＤＨＡ（ω３指数）などの脂肪酸グループを、乾燥血液スポット中に見いだされた類似のグループと比較した。
【０１４９】
ここでの結果から、キャピラリー乾燥血液スポットの脂肪酸組成と、標準的血液画分中に見いだされる対応する脂肪酸値と、の間に高い相関があり（図４〜７参照）、これらは、単純な式として表現可能であることが実証される（表１１）。
【０１５０】
【表１１】
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【０１５１】
実施例６−脂肪酸安定性に及ぼす貯蔵温度の影響
乾燥血液スポット中の脂肪酸の安定性に及ぼす貯蔵温度の影響を試験した。２ｍｇ／ｍｌのＢＨＴおよび５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡで含浸して空気中で５時間乾燥させたワットマンシリカゲルクロマトグラフィー紙上に血液をスポットした。乾燥血液スポットサンプルを乾燥剤の存在下のジップロックアルミニウム箔バッグ内に−２０℃、４℃、および室温（１９〜２３℃）で貯蔵した。５時間後、２週間後、および４週間後、以上に記載したように乾燥血液スポットサンプルの脂肪酸組成を分析した。結果は、以下の表１２に示される。
【０１５２】
一般的には、−２０℃、４℃、および室温（１９〜２３℃）で貯蔵された乾燥血液スポットサンプル中の脂肪酸組成は、４週間の貯蔵にわたり有意差はなかった。
【０１５３】
【表１２】
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【０１５４】
実施例７−固体媒体に及ぼす貯蔵寿命の影響
固体媒体の安定性に及ぼす貯蔵期間の影響を試験した。ワットマンシリカゲルクロマトグラフィー紙に２ｍｇ／ｍｌのＢＨＴおよび５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡを含浸して、使用前に１ヶ月間および２ヶ月間貯蔵した。貯蔵された紙さらには新たに作製された保護剤溶液（２ｍｇ／ｍｌのＢＨＴ＋５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ）で処理された紙の両方の上に血液をスポットした。血液スポットを空気中で５時間乾燥させ、次いで、乾燥剤の存在下のジップロックアルミニウム箔バッグ内に室温（１９〜２３℃）で貯蔵した。５時間後、２週間後、および４週間後、以上に記載したように乾燥血液スポットサンプルの脂肪酸組成を分析した。結果は、以下の表１３および図８に示される。
【０１５５】
【表１３】
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【０１５６】
一般的には、使用の２ヶ月前に作製された固体媒体は、ＬＣＰＵＦＡの安定化に関して、新たに作製された固体媒体と同一の有効性を有することが、結果から実証された。この実施例では貯蔵寿命を２ヶ月間にわたり調べたが、あらかじめ作製された固体媒体は、より長い貯蔵寿命を有しうる可能性が、結果から明確に示唆される。
本発明の実施形態として、例えば以下を挙げることができる。
(1)  脂肪酸を安定化させるための方法であって、前記脂肪酸または前記脂肪酸を含むサンプルを、固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体に、適用することを含み、前記固体マトリックスが約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、方法。
(2)  前記固体マトリックスが約１μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、(1)に記載の方法。
(3)  前記固体マトリックスが約０．５μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、(2)に記載の方法。
(4)  前記汚染物質が飽和脂肪酸である、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)  前記固体マトリックスが、紙、ガラス系マトリックス、紙系マトリックス、セルロース系マトリックス、親水性ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ファイバーガラス、および多孔性セラミックスからなる群から選択される、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)  前記固体マトリックスが、紙、紙系マトリックス、およびガラス系マトリックスからなる群から選択される、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(7)  前記固体マトリックスがシリカゲル充填紙である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(8)  前記固体マトリックスがガラスマイクロファイバーフィルターである、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(9)  前記サンプルが生物学的サンプルである、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)  前記生物学的サンプルが体液である、(9)に記載の方法。
(11)  前記体液が、血液、唾液、母乳、尿、精液、血漿、および血清からなる群から選択される、(10)に記載の方法。
(12)  前記体液が血液である、(11)に記載の方法。
(13)  前記少なくとも１種のキレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸、アスコルビン酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩である、(1)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14)  前記少なくとも１種の抗酸化剤が、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、またはｔ−ブチルヒドロキノンである、(1)〜(13)のいずれかに記載の方法。
(15)  前記キレート化剤がアスコルビン酸および／またはエチレンジアミン四酢酸であり、かつ前記抗酸化剤がブチル化ヒドロキシトルエンである、(1)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(16)  前記脂肪酸が不飽和脂肪酸である、(1)〜(15)のいずれかに記載の方法。
(17)  前記固体媒体がストリップの形態である、(1)〜(16)のいずれかに記載の方法。
(18)  前記ストリップが約１ｃｍ×３ｃｍの寸法を有する、(17)に記載の方法。
(19)  前記抗酸化剤が約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの量で前記固体媒体上に存在する、(1)〜(18)のいずれかに記載の方法。
(20)  前記キレート化剤が約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの量で前記固体媒体上に存在する、(1)〜(19)のいずれかに記載の方法。
(21)  前記方法が、前記脂肪酸または前記脂肪酸を含む流体を、ガラスマイクロファイバーフィルターまたはシリカゲル充填紙と、エチレンジアミン四酢酸および／またはアスコルビン酸と、ブチル化ヒドロキシトルエンと、を含む固体媒体に、を適用することを含む、(1)に記載の脂肪酸を安定化させるための方法。
(22)  脂肪酸を含むサンプルの脂肪酸組成を決定するための方法であって、
（ａ）固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体に前記サンプルを適用することと、ただし、前記固体マトリックスは、前記サンプルが前記固体マトリックスに収着されるように、約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、
（ｂ）前記固体マトリックスに収着された前記サンプルの脂肪酸組成を決定することと、
を含む、方法。
(23)  前記固体マトリックスが約１μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、(22)に記載の方法。
(24)  前記固体マトリックスが約０．５μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、(22)に記載の方法。
(25)  前記汚染物質が飽和脂肪酸である、(22)〜(24)のいずれかに記載の方法。
(26)  前記固体マトリックスが、紙、ガラス系マトリックス、紙系マトリックス、セルロース系マトリックス、親水性ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ファイバーガラス、および多孔性セラミックスからなる群から選択される、(22)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(27)  前記固体マトリックスが、紙、紙系マトリックス、およびガラス系マトリックスからなる群から選択される、(22)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(28)  前記固体マトリックスがシリカゲル充填紙である、(22)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(29)  前記固体マトリックスがガラスマイクロファイバーフィルターである、(22)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(30)  前記サンプルが生物学的サンプルである、(22)〜(29)のいずれかに記載の方法。
(31)  前記生物学的サンプルが体液である、(30)に記載の方法。
(32)  前記体液が、血液、唾液、母乳、尿、精液、血漿、および血清からなる群から選択される、(31)に記載の方法。
(33)  前記体液が血液である、(32)に記載の方法。
(34)  前記少なくとも１種のキレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸、アスコルビン酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩である、(22)〜(33)のいずれかに記載の方法。
(35)  前記少なくとも１種の抗酸化剤が、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、またはｔ−ブチルヒドロキノンである、(22)〜(34)のいずれかに記載の方法。
(36)  前記キレート化剤がアスコルビン酸および／またはエチレンジアミン四酢酸であり、かつ前記抗酸化剤がブチル化ヒドロキシトルエンである、(22)〜(33)のいずれかに記載の方法。
(37)  工程（ｂ）が、
（ｉ）前記固体マトリックスに収着された前記サンプルの少なくとも一部を抽出して、誘導体化脂肪酸を含む抽出物を提供することと、
（ｉｉ）前記誘導体化脂肪酸の量に基づいて、前記サンプルの脂肪酸組成を決定することと、
を含む、(22)〜(36)のいずれかに記載の方法。
(38)  固体媒体であって、前記媒体が固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含み、前記固体マトリックスが約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、固体媒体。
(39)  前記固体マトリックスが約１μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、(38)に記載の固体媒体。
(40)  前記固体マトリックスが約０．５μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、(39)に記載の固体媒体。
(41)  前記汚染物質が飽和脂肪酸である、(38)〜(40)のいずれかに記載の固体媒体。
(42)  前記固体マトリックスが、紙、ガラス系マトリックス、紙系マトリックス、セルロース系マトリックス、親水性ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ファイバーガラス、および多孔性セラミックスからなる群から選択される、(38)〜(41)のいずれかに記載の固体媒体。
(43)  前記固体マトリックスが、紙、紙系マトリックス、およびガラス系マトリックスからなる群から選択される、(38)〜(41)のいずれかに記載の固体媒体。
(44)  前記固体マトリックスがシリカゲル充填紙である、(38)〜(41)のいずれかに記載の固体媒体。
(45)  前記固体マトリックスがガラスマイクロファイバーフィルターである、(38)〜(41)のいずれかに記載の固体媒体。
(46)  前記少なくとも１種のキレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸、アスコルビン酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩である、(38)〜(45)のいずれかに記載の固体媒体。
(47)  前記少なくとも１種の抗酸化剤が、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、またはｔ−ブチルヒドロキノンである、(38)〜(46)のいずれかに記載の固体媒体。
(48)  前記キレート化剤がアスコルビン酸および／またはエチレンジアミン四酢酸であり、かつ前記抗酸化剤がブチル化ヒドロキシトルエンである、(38)〜(45)のいずれかに記載の固体媒体。
(49)  前記固体媒体がストリップの形態である、(38)〜(48)のいずれかに記載の固体媒体。
(50)  前記ストリップが約１ｃｍ×３ｃｍの寸法を有する、(49)に記載の固体媒体。
(51)  前記抗酸化剤が約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの量で前記固体媒体上に存在する、(38)〜(50)のいずれかに記載の固体媒体。
(52)  前記キレート化剤が約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの量で前記固体媒体上に存在する、(38)〜(51)のいずれかに記載の固体媒体。
(53)  前記媒体が、ガラスマイクロファイバーフィルターまたはシリカゲル充填紙と、エチレンジアミン四酢酸および／またはアスコルビン酸と、ブチル化ヒドロキシトルエンと、を含む、(38)に記載の固体媒体。
(54)  固体マトリックスと少なくとも１種のキレート化剤と少なくとも１種の抗酸化剤とを含む固体媒体を作製するための方法であって、固体マトリックスを含む固体媒体を提供することと、前記固体媒体に前記少なくとも１種のキレート化剤および前記少なくとも１種の抗酸化剤を適用することと、を含み、前記固体マトリックスが約２μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、方法。
(55)  前記固体マトリックスが約１μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、(54)に記載の方法。
(56)  前記固体マトリックスが約０．５μｇ／ｃｍ２未満の汚染物質を含む、(55)に記載の方法。
(57)  前記汚染物質が飽和脂肪酸である、(54)〜(56)のいずれかに記載の方法。
(58)  前記固体マトリックスが、紙、ガラス系マトリックス、紙系マトリックス、セルロース系マトリックス、親水性ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、ファイバーガラス、および多孔性セラミックスからなる群から選択される、(54)〜(57)のいずれかに記載の方法。
(59)  前記固体マトリックスが、紙、紙系マトリックス、およびガラス系マトリックスからなる群から選択される、(54)〜(57)のいずれかに記載の方法。
(60)  前記固体マトリックスがシリカゲル充填紙である、(54)〜(57)のいずれかに記載の方法。
(61)  前記固体マトリックスがガラスマイクロファイバーフィルターである、(54)〜(57)のいずれかに記載の方法。
(62)  前記少なくとも１種のキレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸、アスコルビン酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩である、(54)〜(61)のいずれかに記載の方法。
(63)  前記少なくとも１種の抗酸化剤が、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、またはｔ−ブチルヒドロキノンである、(54)〜(62)のいずれかに記載の方法。
(64)  前記キレート化剤がアスコルビン酸および／またはエチレンジアミン四酢酸であり、かつ前記抗酸化剤がブチル化ヒドロキシトルエンである、(54)〜(61)のいずれかに記載の方法。
(65)  前記少なくとも１種の抗酸化剤および前記少なくとも１種のキレート化剤が、単一の溶液の形態で、または個別の溶液、すなわち、前記少なくとも１種の抗酸化剤を含む１つの溶液および前記少なくとも１種のキレート化剤を含む１つの溶液の形態で、前記固体媒体に適用される、(54)〜(64)のいずれかに記載の方法。
(66)  前記溶液がアルコールおよび水を含む、(65)に記載の方法。
(67)  前記溶液中の前記少なくとも１種の抗酸化剤の濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬである、(65)または(66)に記載の方法。
(68)  前記溶液中の前記少なくとも１種のキレート化剤の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬである、(65)〜(67)のいずれかに記載の方法。
(69)  前記固体媒体がストリップの形態である、(54)〜(68)のいずれかに記載の方法。
(70)  前記ストリップに適用される溶液の量が約１〜５００μＬである、(65)〜(68)のいずれかに記載の方法。
(71)  前記ストリップが約１ｃｍ×３ｃｍの寸法を有する、(69)または(70)に記載の方法。
(72)  (38)〜(53)のいずれかに記載の固体媒体を含むキット。
(73)  脂肪酸を含むサンプルを被験体から得るための先鋭な物体をさらに含む、(73)に記載のキット。
(74)  前記サンプルが血液である、(73)に記載のキット。
【０１５７】
参考文献：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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