(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経支配のある筋構造物を生成する方法であって、
平滑筋細胞を得るステップと、
神経前駆細胞を得るステップと、
フィブリンまたはコラーゲンを含む第１のマトリックス材料中で神経前駆細胞を浮遊させるステップと、
フィブリンまたはコラーゲンを含む第２のマトリックス材料中で平滑筋細胞を浮遊させるステップと、
細胞が播種された前記第１及び第２のマトリックス材料を互いに接触させて中央部柱を有する培養プレート上に配置することにより、平滑筋細胞及び神経前駆細胞の構築物を播種するステップと、
前記播種した細胞を培養して、方向性配向した平滑筋細胞の、神経支配のある平滑筋細胞構築物を形成するステップと、
中央部柱を有する前記培養プレートから神経支配のある平滑筋細胞構築物を取り除き、管状足場付近に前記神経支配のある平滑筋細胞構築物を配置するステップと、
神経支配のない筋構築物に神経支配のある筋構築物を連結して、前記管状足場付近に細長い複合構造物を形成するステップと、及び
前記神経支配のない筋構築物に、前記神経支配された筋構造物の神経細胞を浸潤させるステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞を播種するステップは、コラーゲン溶液またはコラーゲン／ラミニン溶液のうち少なくとも１つの、生体適合溶液中にニューロスフィアとして前記神経細胞を浮遊させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経前駆細胞溶液をゲル化させ、次いで、平滑筋細胞の第２の浮遊液を沈降させるステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記平滑筋細胞の第２の浮遊液は、コラーゲン溶液をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記神経前駆細胞の分化を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ（商標）培地またはＢ‐２７（登録商標）サプリメントのうちの少なくとも１つへ暴露することにより、誘発するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記管状足場はキトサンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
神経支配のある筋構造物を２つまたはそれ以上を互いに連結して、細長い複合構造物を形成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記神経支配のある筋構造物は管状であり、
該方法は、前記神経支配のある筋構造物を刺激して、前記管状構造物を伝わる収縮の進行波を生成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【米国政府支援】
【０００１】
本発明は、米国立衛生研究所より認可された許可第ＮＩＨ  ＲＯ１ＤＫ０７１６１４号及び第ＮＩＨ  ＲＯ１ＤＫ０４２８７６号のもとに米国政府支援によりなされた。米国政府は本発明において所定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年１月３１日に出願された、「Ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」と題する米国仮特許出願第６１／５９２，８９０号および「Ｔｕｂｕｌａｒ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」と題する米国仮特許出願第６１／５９２，８７１号に基づく優先権を主張し、それらの内容は参照により本明細書に完全に援用される。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、組織工学に関し、特に、組織工学により作製した構造物の神経支配に関する。
【背景技術】
【０００４】
神経支配は、人体のほぼすべての部位の機能を維持するために非常に重要である。胃腸管（ＧＩ管）の神経支配は、平滑筋細胞がその表現型を維持し運動機能を行うのに、すなわち、流体が胃腸管を移動するために必要な力を生成するのに非常に重要である。
【０００５】
神経が損傷すると、通常、筋委縮が観察される。老化によるものか糖尿病（胃不全麻痺）によるものかに関わらず、さまざまな進行度合の消化管麻痺を患う患者たちが、神経要素を欠くのと同時に筋委縮も呈する。同様に、無神経節性消化管障害（例えばヒルシュスプルング病）を持って生まれた子供たちも神経変性を呈する。
【０００６】
組織工学が提案されて、変性筋を新たな筋構造物と置換することにより、罹病または損傷したＧＩ管要素の機能を復元することが可能となってきている。しかしながら、筋または筋前駆体を播種した細胞外マトリックスを用いて筋再生を行っても、最大で、失った筋量の約１０パーセントしか置換することができない。懸命なリハビリテーションを行ったとしても、力の生成については、概して約３０パーセントほどしか回復が見込めない。
【０００７】
例えば、ラットを用いた実験において、複合ＰＬＧＡメッシュに播種した胃部上皮オルガノイドユニットと生来の胃を置換して、胃粘膜機能を回復させた例が報告されている。しかしながら、適切な方向を向く層化平滑筋層の再生は課題として残っている。しかも、機能的な運動性の回復は従来の研究ではなされておらず、ＧＩ神経筋組織の機能的組織工学において未だ残る最大の課題が強調される。
【０００８】
胃の再構築も組織工学における課題である。膀胱組織工学により、種々の生体材料を用いて新規に膀胱リザーバを製造可能となった。この膀胱組織工学の側面を、胃の筋系を再設計する際のテンプレートとして利用することが提案されている。胃の再構築においては、埋め込み可能な胃刺激ユニットを、胃の再構築における構成要素として用いることが提案されている。当該ユニットは、既に肥満外科手術および胃不全麻痺において一般に用いられており、腸ニューロンを刺激したり、胃の電気的リズムを擬態するものである。Ｍｉｃｃｉ氏らの報告書によると、ＣＮＳ由来の神経前駆細胞を移植すると、胃不全麻痺のげっ歯類モデルの幽門部において、一酸化窒素含有ニューロンを再生息させることができる。同時に胃の機能も向上させることができる。
【０００９】
組織工学は、また、短腸症候群患者に対して一般に行われている腸を伸ばす外科手術を進化させる可能性を示した。イヌ科モデルにおいて、自家由来の平滑筋細胞を播種したコラーゲンスポンジ足場を、パッチグラフトとして埋め込むことに成功した。これらのパッチグラフト片により絨毛構造が再生し、粘膜および腸の上皮層も再生した。しかしながら、これらグラフト片は収縮してしまうという問題をかかえている。Ｄｕｎｎ氏らは、腸平滑筋細胞を播種したコラーゲンスポンジ足場から形成した偽管状構造物を用いた。それら管状構造物は、ネットワーク内での事前の血管新生化を経た後、１か月以内に血管新生化した。あいにく、これらの技術では腸ニューロン層は再生せず、平滑筋細胞の表現型は非収縮形へ転換してしまった。
【００１０】
同様に、組織工学により作製した小腸の構築物においては、適切な力と運動性を生じさせて養分吸収を容易にする、きわめて重要と思われる平滑筋細胞の配列やそれらの神経支配は再生していない。
【００１１】
同様にまた、結腸断片の再生も実現し難い。結腸は小腸と隣接しており、水分の吸収と用便の排泄を容易にする。例えば、神経節細胞欠損（ヒルシュスプルング病）や炎症を処置するため、外科手術による切除で結腸の断片を喪失した場合、結腸運動性は著しく変化する。結腸運動性の破壊は通過時間を変化させ、結果として便秘または下痢を引き起こす。これらの病状の一部は特発性を有するため、組織工学による生体外結腸モデルの作製は強く求められている。その作製に際して、病態生理学的状態における変化を理解できるよう、個々の要素（平滑筋、腸ニューロン、間細胞、および粘膜）に対して調査を行うことができる。さらに、結腸のぜん動および断片的収縮の変化は、個人の生活の質に直接関連してくる。
【００１２】
近年、Ｖａｃａｎｔｉ氏らにより、Ｓ字結腸から単離したオルガノイドユニットを播種したポリ乳酸とグリコール酸ポリマーとの複合体を用いて作製した組織工学による結腸構築物が報告された。Ｖａｃａｎｔｉ氏らにより、組織工学による導管は、動物に埋め込んだ際かなりの吸収力を有することが確認されたが、ぜん動または運動性についての直接的な測定はなかった。
【００１３】
ＧＩ管の相動性神経筋構造物は、腸ニューロン神経叢と交錯する平滑筋の直交層を含む。それら構造物は、また、カハール間細胞（ＩＣＣ）および特殊化粘膜層とも関連している。ぜん動波が伝播することにより、この神経筋組織の相動性が確定する。ぜん動波により、輪走平滑筋層と縦走平滑筋層がともに収縮および弛緩する。神経要素およびＩＣＣにより、ぜん動の調整を行う電気的活動が発生する。この電気的活動は、平滑筋層内における細胞内生化学現象と結合しており、消化管の運動性を規制する。これら機構は、また、腸ニューロン神経叢およびＩＣＣの電気的活動から種々の神経伝達物質が放出されることにより分節的に調節される。
【００１４】
Ｐａｎ氏らによる最近の研究によると、ヒルシュスプルング病のラットモデルの遠位結腸に、新生期のラットから単離した神経冠前駆体を移植した。これらの細胞は、宿主結腸内でニューロンおよびグリアへ分化した。また、これら細胞は、神経節性の宿主結腸内での、ニューロンにより媒介される運動性を救援するという性質も示した。Ｍｅｔｚｇｅｒ氏らは、成人の消化管に由来する腸前駆細胞が、器官培養で成長させたヒト無神経節性結腸の断片を再生息させ得ることを示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
相動性神経筋構造物の組織工学は著しい発展を遂げてはいるが、機能的な平滑筋および腸ニューロン神経叢を再生するために提案されている諸技術には、多くの欠落部分が存在する。したがって、神経支配のある工学的組織を作製するにはより高度な技術が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
神経支配のある筋構造物の生成方法、および組織修復用または組成再生用の、生体工学による構造物を開示する。該方法は、平滑筋細胞および神経前駆細胞の集団を取得するステップと、それら細胞をともにマトリックス材料に播種するステップと、それに続く、その播種した細胞を培養して、方向性配向した平滑筋細胞からなる、神経支配のある平滑筋細胞構築物を形成するステップとを含むことができる。一実施形態では、例えば、フィブリン溶液、コラーゲン溶液、またはコラーゲン／ラミニン溶液など、生体適合性のある溶液に神経前駆細胞をニューロスフィアとして最初に播種し、ゲル化させることができる。次に、神経前駆細胞層とは別の層として、第２の浮遊液である平滑筋細胞を沈降させることができる。あるいは、まず筋細胞を播種し、次に神経前駆細胞を播種することもできる。筋細胞と神経細胞とが交互に重なる複数層構造物もこのやり方で形成することができる。平滑筋細胞と神経前駆細胞の浮遊液を、別々または一緒に、中央部柱付近に沈降させて、神経支配のある管状平滑筋細胞構築物の形成を誘発することができる。次いで、例えば、キトサン含有管などの管状足場付近に神経支配のある平滑筋細胞構築物を沈降させることもできる。
【００１７】
神経前駆細胞は、胚性の中枢神経系および腸神経系ならびに出生直後の齧歯類およびヒトの両方に存在することが認められている。神経冠由来の幹細胞は、成人発達を通じて持続することが示されており、消化管神経筋組織を再構築するための自家神経細胞のもととなりうる。細胞培養技術が進歩したことにより、種々の成熟腸神経サブタイプへと分化する能力があることを示すＲｅｔおよびｐ７５マーカーを発現する腸神経前駆細胞およびグリア前駆細胞を単離することが可能となった。Ｋｕｌｋａｒｎｉ氏らによる最近の調査報告では、消化管由来の可溶性因子の存在下においてＣＮＳ由来の神経前駆細胞を培養することにより、それら細胞を腸表現型へと進めることに焦点が当てられている。Ｍｅｔｚｇｅｒ氏らも、また、最高で８４歳の成人の腸から、信頼性および再現性をもって腸神経前駆細胞の単離を行った。
【００１８】
神経前駆細胞は、分化するよう誘発することもできる。神経前駆細胞は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ（商標）培地といった分化培地で培養すること、および／またはＢ‐２７（登録商標）サプリメントといった分化剤に暴露することができる。  
【００１９】
また、本発明の方法は、神経支配のある筋構造物を２つ以上連結して、それら神経支配のある筋構造物を接合することにより、神経支配のある管状構造物を形成して、刺激を受けると、各神経支配管状筋構造物に伝わる収縮の進行波を生成することができる細長い複合構造物を形成することを含む。
【００２０】
本発明の別の態様では、生体工学により作製した、結腸の３次元フィブリン系モデルにおける輪走平滑筋層は、開存管腔付近で自動的に同心円状に並ぶことが発見された。これらの生体工学による組織は、生来の平滑筋の配列を模倣し、ぜん動や収縮、弛緩のような結腸の生理機能的側面を維持する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】生体工学によって作製した、完全な形の、神経支配のある結腸平滑筋構築物を示す図である。
【図２】神経支配のある平滑筋構築物における電気機械結合の一体性を示すグラフである。
【図３】神経支配のない平滑筋構築物における電気機械結合の一体性を示すグラフである。
【図４】最初から神経支配のある構築物における、アセチルコリンを用いたコリン作動性収縮（黒い線）と、神経遮断薬テトロドトキシン（ＴＴＸ）の存在下での収縮（グレイの線）を示すグラフである。
【図５】最初は神経支配のなかった構築物における、アセチルコリンを用いたコリン作動性収縮（黒い線）と、神経遮断薬ＴＴＸの存在下での収縮（グレイの線）を示すグラフである。
【図６】神経支配のある構築物における、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）を用いた処置による弛緩と、神経遮断薬ＴＴＸの存在下での弛緩（グレイの線）を示すグラフである。
【図７】神経支配のない構築物における、ＶＩＰを用いた処置による弛緩（黒い線）と、神経遮断薬ＴＴＸの存在下での弛緩（グレイの線）を示すグラフである。
【図８】神経支配のある構築物における、基礎力を急激に弛緩させ、その後基準値への回復を誘発する電気刺激（黒い線）と、神経遮断薬ＴＴＸの存在下における刺激（グレイの線）を示すグラフである。
【図９】神経支配のない構築物における、基礎力を急速に弛緩させ、その後基準値への回復を誘発する電気刺激（黒い線）と、神経遮断薬ＴＴＸの存在下における刺激（グレイの線）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
消化管（ＧＩ）管要素の置換を設計する際には、ＧＩ管の各運動性パターンは、分節的ではあるが、元来、互いに連結しており、それらは高度に協調して作動する、ということを常に念頭におくことが重要である。この現象の一例としては、食道に食物を挿入すると下部食道括約筋（ＬＥＳ）が弛緩し、それにより胃までその食物が運ばれる、という現象が挙げられる。組織工学により作製したＬＥＳ構築物は筋原性基礎緊張を生成する能力を備えていなくてはならない。それらＬＥＳ構造物は、また、高度に生体適合性を有しており、既存のニューロンネットワークと統合して、食道のぜん動に伴い、一時的に弛緩して食物を食道から胃へ通過させなければならない。
【００２３】
本明細書に開示する、構造物、機能、製造方法、および装置と方法との利用方法の原則を全体として理解できるよう、所定の例示的実施形態を以下に記載する。本明細書に具体的に記載したそれらの装置および方法は、本発明を限定するための例示的実施形態ではなく、本発明の権利範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ定義される、ということは当業者であれば理解可能であろう。一例示的実施形態に関連して例示または記載した特徴を、他の実施形態の特徴と組み合わせてもよい。そのような修正や改変を本発明の範囲に含むことを意図する。
【００２４】
これより前に記載したか後に記載したかにかかわらず、本明細書で引用したすべての刊行物、特許、および特許出願の内容は参照により本明細書に完全に援用される。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形（「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」）は、文脈から明らかに単数であるとの示唆がない限り、複数の指示対象を含む。本発明において用いる用語は、当業者が通常認める標準的定義を支持する。万が一、さらなる説明が必要な場合に備え、以下でいくつかの用語をさらに説明する。
【００２５】
本明細書において用いる「対象」という用語は、あらゆる生体を意味し、限定はしないが、ヒト、チンパンジーや他の猿人類またはサル種といったヒト以外の霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマといった家畜類、イヌ、ネコといった家畜哺乳類、マウス、ラット、ウサギ、モルモットといったげっ歯類などの実験動物を含む。本用語は、特定の年齢や性別を示すものではない。特定の実施形態においては、対象はヒトである。
【００２６】
「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療介入（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、病気や疾患、または病気や疾患にかかりやすい傾向のある対象に、以下の目的で、１つ以上の治療薬または治療手段を適用することを意味する。その目的とは、病気の進行を防止、軽減、緩和、改変、治癒、改善、向上、作用、抑止、停止する、または、病気の悪化、病気または疾患の少なくとも一症状、またはそれら病気または疾患にかかりやすい傾向を抑止、停止する、というものである。
【００２７】
平滑筋細胞
一態様においては、生体工学による、輪走平滑筋を有する管状組織を生成する。平滑筋組織より作製した管状構造物の生理学的モデルは、自然発生的な平滑筋組織と同様の機能を示す。輪走平滑筋を含む器官または組織は、開示する培養系を用いてモデル化してもよい。そのような器官や組織は、ＧＩ管要素、例えば、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、および結腸を含む。また、本発明の方法および構成物は、気管、気管支、子宮、血管、リンパ管、尿道、腺管、および眼の毛様体筋といった他の内腔構造物を再構築する際にも有用となりうる。
【００２８】
「機能的に同様」という用語は、天然の管状組織と同様の収縮力を有する、または等尺性収縮力において天然の管状組織と同様の変化を有する、生体工学による輪走平滑筋を包含する生体工学管状組織または管状組織を意味する。収縮力は、管状構造物の平滑筋細胞のぜん動力または波状の収縮／弛緩として測定する。平滑筋細胞における収縮反応や電気的刺激を誘発するには、作用物質が有用となり得る。収縮反応は、平滑筋細胞または平滑筋組織の平均的長さの減少として定義される。収縮に作用する物質の例としては、アセチルコリン、ボンベシン、物質Ｐ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、エンドセリン、他の神経伝達物質、およびペプチド類が挙げられる。
【００２９】
平滑筋は多くの中空器官の支持体を取り囲むものである。例えば、消化管においては、平滑筋は胃と腸路とを取り囲んでいる。この筋の収縮により、食物はかき混ぜられ、消化路内を運ばれる。 心臓血管系においては、平滑筋は、動脈および大静脈の壁を取り囲み、血管の内径を制御するよう機能する。平滑筋には、一様に近い細胞形状と、骨格筋細胞と心筋細胞との格子状分布が欠落している。しかしながら、平滑筋細胞は細長い双極細胞形状をはっきりと示している。集団としては、平滑筋細胞は、一連の重複する細胞層として類似する軸に沿って組織化されている。 この組織パターンにより、平滑筋は複雑なパターンで収縮力を発揮することが可能になる。 
【００３０】
本発明は、単離した初代培養平滑筋細胞またはその初代培養細胞や腫瘍等に由来する細胞株を用いて実行する。用いる細胞は、内部腸括約筋平滑筋細胞株または内部肛門括約筋平滑筋細胞株、気道平滑筋細胞株、および他の市販の平滑筋細胞株といった、利用可能な平滑筋株であってもよい。例えば、筋肉由来の細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州べセスダ）といった細胞株バンクから入手してもよい。 そのような細胞平滑筋細胞株の例としては、ヒト腸骨静脈平滑筋細胞（ＨＩＶＳ‐１２５；ＡＴＣＣ信託番号第ＣＲＬ‐２４８２号）、シリアンゴールデンハムスター精管平滑筋細胞（ＤＤＴ１；第ＣＲＬ‐１７０１号）、ヒト臍静脈平滑筋細胞（ＨＵＶＳ‐１１２Ｄ；第ＣＲＬ−２４８１号）、ラット大動脈平滑筋細胞（Ｈｅｐ‐Ｓａ；第ＣＲＬ‐２０１８号）、およびヒト大動脈平滑筋細胞（Ｔ/Ｇ  ＨＡ‐ＶＳＭＣ；第ＣＲＬ‐２４９８号）が挙げられる。購入した特定の細胞株の成長状況は生物源に依存し、通常、ＡＴＣＣからの細胞株とともに細胞成長についての説明書が提供される。別の適用例においては、平滑筋は、組織工学による構造物の受容者となる患者から入手することもできる。そのような自家細胞は、外科的切除または生検により入手でき、本分野で知られる種々の技術にしたがい、単離、培養、拡大、濃縮することができる。
【００３１】
一態様においては、単離細胞または細胞株は分化可能であり（単離、濃縮、または誘発した脱分化により取得）、収縮機能を有する細胞に分化することができる。それら細胞は、いかなる脊椎動物源または無脊椎動物源に由来してもよい。例えば、動物源は、そのような細胞を採種可能な、ヒト、サル、他の哺乳動物、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、魚類、鳥類、または他の動物とすることができる。一態様においては、三次元培養に用いる平滑筋細胞は哺乳類細胞である。所定の実施形態においては、それら細胞はヒト細胞または霊長類細胞としてもよいが、本発明では、ラット細胞およびウサギ細胞も有用に用いてもよい。入手後、細胞を培養し、培養物に適切な成長因子を加えてもよい。 培養において維持されるそのような因子の濃度は、監視、調整して、細胞の成長を最適化する。このように培養した細胞は、生体内への移植または埋め込みに用いることができる。上述のように、筋細胞は患者自身の組織（自家細胞）から入手するのが好ましい状況がしばしばある。
【００３２】
本発明は、平滑筋および／または輪走平滑筋を含む種々の器官から単離した初代培養平滑筋細胞を用いて実行することができる。輪走平滑筋を含む器官としては、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、気管、気管支、子宮、血管、リンパ管、尿道、腺管、および眼の毛様体筋が挙げられる。 以前より著されているように（Ｂｉｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６０，Ｇ５３７‐Ｇ５４２，１９９１；Ｂｉｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２４２，Ｇ４００‐Ｇ４０７，１９８２）、例えば、平滑筋細胞は、ニュージーランド白ウサギの内部肛門括約筋（ＩＡＳ）から単離できる。
【００３３】
初代培養細胞は、当業者に知られている標準的な技術を用いて、細胞の入手源となる適切な器官または組織を脱凝集することにより容易に単離できる。例えば、組織または器官は、機械的に脱凝集でき、かつ／または、隣接細胞同士の結合を弱める消化酵素もしくはキレート剤またはその両方を用いて処置できる。これにより、目に見える細胞破損を起こすことなく、組織片を分散させ細胞個々を浮遊状態とすることが可能となる。酵素による解離作用は、組織を細分化し、細分化した組織を任意の数の消化酵素を用いて処置することで達成できる。消化酵素は単独で用いてもよいし、組み合わせで用いてもよい。消化酵素としては、限定しないが、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、および／またはヒアルウロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、およびプロナーゼが挙げられる。機械的に分割してもよく、種々の方法で達成できる。限定はしないが、いくつか例を挙げると、研磨機、配合機、ふるい器、ホモジナイザ、受圧器、超音波処理機等を用いて該分割を達成することができる。組織を脱凝集する技術については、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｄ  Ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，Ｃｈ．９， ｐｐ．１０７‐１２６を参照されたい。
【００３４】
組織を細胞個々の浮遊状態に希釈したら、その浮遊液を副次集団へ断片化することができ、そこからミオサイトおよび／または繊維芽細胞を取得できる。断片化は、細胞分離の標準技術を用いて達成してもよい。限定はしないが、例えば、特定の種類の細胞のクローン化および選択、望まない細胞の選択的破壊（負の選択）、混合種集団における細胞凝集性の差異に基づく分離、凍結融解操作に基づく分離、混合種個体群における細胞の付着性差異に基づく分離、ろ過作用による分離、従来型のゾーン遠心分離、遠心水簸（向流遠心分離）、単位重力分離、向流分配、電気泳動蛍光活性化細胞分類等が挙げられる。クローン選択および細胞分離技術については、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｄ  Ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，Ｃｈ．１１およびＣｈ．１２，ｐｐ．１３７−１６８を参照されたい。
【００３５】
神経細胞
本発明の方法に用いるのに適している幹細胞は、神経細胞（すなわち、ニューロン）、星状膠細胞、および乏突起膠細胞に分化可能な多能性細胞である。（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４，１３１３‐１３１７（１９９８）；Ｐａｌｍｅｒ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８：３８９‐４０４  １９９７）
【００３６】
開示する方法に用いるのに適しうる他の細胞の例としては、星状膠細胞と乏突起膠細胞とに発展するグリア細胞前駆体を生成することができる神経限定系統に関係づけられる前駆細胞、およびニューロンに発展する神経前駆体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の関係づけられる前駆細胞の例としては、限定はしないが、グリア細胞、ニューロン細胞、星状膠細胞、および乏突起膠細胞が挙げられる。
【００３７】
成熟神経細胞および／または未分化幹細胞と前駆神経細胞を含む神経細胞は、多種類の組織から取得し、単離してもよい。いくつかの例としては、腸神経系および中枢神経系の組織と器官が挙げられるが、これらに限定されるものではない。腸神経系は、一次求心ニューロンや介在ニューロン、エフェクターニューロンといった多くの異なる神経集団を含み、中枢神経系の組織と器官は、脳や脊髄等である。繰り返すが、所定の実施形態においては、神経前駆細胞は、神経支配のある構築物の受容者となる患者から取得した自家細胞である。
【００３８】
神経細胞は、組織の連結細胞外マトリックスから、個々の細胞を解離することで取得することができる。例えば、ある特定の神経領域からの組織は、無菌操作を用いて提供者から採種してもよく、細胞は、本分野で知られる任意の方法を用いて解離してよい。例えばトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素を用いて処置してよい。または、鈍器等を用いた物理的な方法で解離してもよい。一態様においては、細胞は組織培養培地において解離してもよい。解離した細胞は、２００ｒｐｍ〜２０００ｒｐｍの低速、通常は４００ｒｐｍ〜８００ｒｐｍ、で遠心分離して、その後、再び培養培地に浮遊させてもよい。次いで、神経細胞は、浮遊状態または固定基質で培養することができる。その後、細胞浮遊液を容器に播種してもよい。容器は、細胞の維持が可能であればいかなるものでもよいが、具体的には、培養瓶、培養プレート、ローラボトル、より具体的には小型の培養瓶が挙げられる。浮遊状態で培養した細胞は、その後、望ましい濃度で再度浮遊させてもよい。
【００３９】
一実施形態においては、解離した細胞を培養培地に設置することにより、解離した神経細胞を培養してニューロスフィアを形成することができる。培養培地は、ニューロスフィアの形成を促進可能であれば本分野で知られるいかなるものであってもよい。そのような培養培地としては、例えば、ＨＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ‐１２、およびそれらの組み合わせが挙げられる。培養培地は、グルタミンや他のアミノ酸類、ビタミン類、ミネラル類、およびトランスフェリン等の有用なタンパク質類といった、細胞代謝に必要な補助剤を含んでいてもよい。培養培地は、また、酵母菌、バクテリア、およびペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンといった真菌類による汚染を防ぐべく抗生物質を含んでいてもよい。培地は、ウシ科の動物、ウマ科の動物、ニワトリ等に由来する血清を含む場合もある。しかしながら、血清は分化を誘発する傾向があり、不明（すなわち、確認されていない）の要素を含むため、ニューロスフィアの形成を促進する培地は典型的には血清を含まない。細胞が移植目的である場合は、決定培養培地を用いてもよい。例えば、培養培地は、ＤＭＥＭと、Ｆ１２と、決定されたホルモンと塩の混合物と、の混合物を含んでいてもよい。
【００４０】
培養培地には、ニューロスフィアを誘発する成長因子および／または化合物を少なくとも１つ補充してもよい。本明細書で用いられる「成長因子」という語は、神経幹細胞および／または神経幹細胞子孫に影響を与える、成長作用、増殖作用、分化作用、または栄養作用を有するタンパク質、ペプチド、または他の分子もしくは化合物を意味する。成長因子の例としては、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、アンフィレグリン、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦα）、神経成長因子（ＮＧＦ）、Ｎ２（インヴィトロゲン社）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。一態様においては、培養培地に含まれる成長因子としてＥＧＦとＦＧＦが挙げられる。
【００４１】
別の実施形態においては、未分化幹神経細胞および前駆神経細胞をニューロンへ分化させるのに、幹細胞の神経細胞系の細胞への分化を誘発する化学的因子または生物学的因子といった神経分化因子を用いることができる。神経分化因子の例としては、限定はしないが、塩基性線維芽細胞成長因子、線維芽細胞増殖因子−８、脳由来神経栄養因子、ソニック・ヘッジホッグ、Ｎ２サプリメント（Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（商標）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。これらは、培養において幹細胞の神経分化を調整可能である。諸方法により分化した神経細胞は、成熟した表現型を有し、神経機能を呈する。神経分化の進行状況は、例えば、神経分化の遺伝子マーカの発現のためのスクリーニングを行うことで監視可能である。培養下の細胞の発生進行状況は、例えば、限定するわけではないが、ｃ−Ｒｅｔ、ｓｏｘ１、ｏｔｘ２、ｏｔｘ１、ｐａｘ２、ｐａｘ５、およびＮｕｒｒ１、ネスチン、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、ＮＦ２００、ドーパミン、ＴＨ、ＧＡＢＡ、ＴｒＨ、およびＤＢＨのためのｍＲＮＡを含む、神経外胚葉転写因子のレベルを測定することで監視可能である。遺伝子発現を監視するための分析法（例えばリアルタイムＰＣＲ）は本分野では周知であり、標準的方法を用いて実施することができる。
【００４２】
細胞特性または表現型の性質を発現する細胞を、神経細胞上の細胞タンパク質、星状細胞および／または乏突起膠細胞を検出する抗体を用いた免疫細胞化学による方法（二重標識免疫蛍光検査法および免疫ペルオキシダーゼ法）等を用いて選択し、神経細胞を分離してもよい。 特に、神経細胞用の細胞マーカーの例としては、ＮＳＥ、ＮＦ、ＭＡＰ‐２が挙げられ、グリア用細胞マーカーとしては、ＧＦＡＰ（星状細胞の識別子）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）（乏突起膠細胞のミエリン糖脂質識別子）等が挙げられる。
【００４３】
免疫細胞化学は神経伝達物質の発現を検出するのに用いることもできる。または神経伝達物質合成に関与する酵素の発現を検出するのに用いられる場合もある。神経細胞を同定するために、アセチルコリン（ＡＣｈ）；ドーパミン；エピネフリン；ノルエピネフリン；ヒスタミン；セロトニンすなわち５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）；物質Ｐ、副腎皮質刺激ホルモン、バソプレッシンすなわち抗利尿ホルモン、オキシトシン、ソマトスタチン、アンギオテンシンＩＩ、ニューロテンシン、およびボンベシン等の神経ペプチド類；ＴＲＨおよび黄体形成放出ホルモン等の視床下部放出ホルモン；血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、およびＣＣＫ様ペプチド等の胃腸ペプチド類；βエンドルフィンといったエンドルフィン類およびメトエンケファリンとロイエンケファリンといったエンケファリン類等のオピオイドペプチド類；プロスタグランジン；ＧＡＢＡ、グリシン、グルタメート、システイン、タウリン、およびアスパラギン酸塩等のアミン酸；およびカルノシン等のジペプチド類の存在を検出する抗体を用いることができる。 神経伝達物質合成酵素に対する抗体も用いることができる。該酵素の例としては、ＧＡＢＡの合成に関与するグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、ＡＣｈ合成のためのコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、ドーパミンのためのドーパ脱炭酸酵素、ノルエピネフリンのためのドーパミン‐β‐ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）、および５‐ＨＴのためのアミノ酸デカルボキシラーゼ等が挙げられる。神経伝達物質の不活性化に関与する酵素に対する抗体も有用でありうる。そのような酵素の例としては、ＡＣｈを不活性化するアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）等が挙げられる。神経伝達物質のその終着点への再取り込みに関与する酵素に対する抗体もニューロンを同定しうる。そのような酵素の例としては、ドーパミンと５−ＨＴのためのモノアミンオキシダーゼとカテコール‐Ｏ‐メチル転移酵素、およびＧＡＢＡのためのＧＡＢＡ転移酵素等が挙げられる。ニューロンの他のマーカーとしては、神経伝達物質受容体に対する抗体が挙げられる。神経伝達物質受容体の例としては、ＡＣｈＥニコチン性・ムスカリン性受容体、アドレナリン受容体α１、α２、β１およびβ２、およびドーパミン受容体等が挙げられる。
【００４４】
筋構築物および神経組織構築物
発明の一態様においては、置換構造物は多数の筋構築物および神経細胞構築物から生体工学的に作られる。筋構築物および神経構築物を培養で生成するには、平滑筋細胞と神経細胞を、適切な養分を含む培養液で成長させる。多くの市販の培地、例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ、ＭｃＣｏｙ’ｓ等が使用に適しうる。さらに、培養構築物には定期的に「給餌（ｆｅｄ）」して使用済み培地を取り除き、放出する細胞を減らすべきである。
【００４５】
これらの手順は、バイオリアクタを用いると非常に容易に行うことができる。バイオリアクタは、筋細胞の接種を行った三次元フレームを収容する閉鎖系である。バイオリアクタを使用することで汚染の可能性が減り、断続的かつ定期的な与圧下における培養を維持でき、対流による軟骨組織構築の間ずっと、平滑筋細胞へ適切な栄養素の供給が維持できる環境状態を作り出す。
【００４６】
各筋細胞構築物および神経細胞構築物を生成するために、相同の平滑筋細胞集団と神経細胞集団は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む細胞培養容器内で一緒に、または別々に培養可能である。細胞外マトリックスタンパク質の例としては、ゼラチン、アラビアゴム、コラーゲン類（例えばコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＶＩＩ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＩＸ、およびコラーゲンＸ）、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン類、それらの混合物、および細胞培養分野の当業者に知られる、生体マトリックス分子と類似の性質を有する他の物質が挙げられる。
【００４７】
フィブリンゲルを、特に、本発明の構築物の形成に用いることができる。フィブリンは、フィブリンモノマー同士を相互作用させてフィブリンの形成を可能にするセリンプロテアーゼトロンビンによりフィブリノゲンを酵素的に切断することにより得られる。フィブリンマトリックス内では、細胞は迅速に移動し、増殖し、フィブリンを消化し、フィブリンマトリックスを細胞自身の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と置換する。（Ｇｒａｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０：６０７−６１２，２００２．  Ｇｒａｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６Ａ：５５０−５６１，２００３．Ｎｅｉｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １７：３７１７−３７３１，２００２．Ｒｏｓｓ＆Ｔｒａｎｑｕｉｌｌｏ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２：４７７−４９０，２００３）
【００４８】
一実施形態では、神経細胞はフィブリンゲル内、またはコラーゲンもしくはコラーゲンマトリックス内／ラミニンマトリックス内で成長させることができる。マトリックス材料と混合した後、神経細胞集団を培養して神経細胞層を形成する。神経細胞集団は培養され円筒状リングを被覆してもよい。一実施形態においては、円筒状リングは、Ｓｙｌｇａｒｄ（商標）という商品名で市販されるようなシリコーンから作製してもよい。また、神経細胞集団は、シリコーン処置した表面上で培養してもよい。
【００４９】
また、フィブリンゲル内で平滑筋細胞を成長させ、過渡的な三次元マトリックスを生成してもよい。さらに、平滑筋細胞は、コラーゲンまたはコラーゲン／ラミニンマトリックス内で培養して過渡的な三次元マトリックスを製造することができる。平滑筋細胞／マトリックス混合物は、神経細胞集団に積層することができる。あるいは、平滑筋細胞／マトリックス混合物を第１の層として培養し、平滑筋／マトリックス混合物の上に神経細胞／マトリックス混合物が積層するようにしてもよい。別の実施形態においては、平滑筋集団と神経細胞集団をマトリックス材料と混合して同時に培養して過渡的な三次元マトリックスを製造する。
【００５０】
フィブリン、コラーゲン、および／またはラミニンといったマトリックスタンパク質により、平滑筋細胞は、培養下では、一定方向を向いて形成するよう誘導されて、機能的な平滑筋細胞構築物を形成する。本発明の細胞培養容器を被覆するマトリックスのタイプの制限は事実上なく、生体マトリックスおよび合成マトリックスの両方が含まれる。マトリックスは、「生体適合性」と一般的に関連するすべての特徴を備える。生体適合性がある形とは、哺乳類宿主に投与した際に、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を起こさないことである。このようなマトリックスは天然材料または合成材料から形成してもよい。
【００５１】
本発明の別の態様では、円筒状モールドを用いて構築物の作製を誘導または形成する。このようなモールドは、Ｓｙｌｇａｒｄ（商標）という商品名で市販されるようなシリコーンから作製することができる。別の態様では、構築物の作製を誘導する、または形成するのに非円筒状モールドを用いることができる。構築物の形状およびサイズには、事実上制限はない。
【００５２】
組織構造物
個々の平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物を組み立てて、組織構造物を形成することができる。平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物は、意図する組織にとって適切な次元を有する足場上に設置することができる。組織構造物に用いる平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物の数は、組織工学により作られる組織構造物のサイズおよび次元に依存する。さらに、平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物は、平滑筋細胞構築物または神経細胞構築物と交互に並べることもできる。例示的実施形態においては、平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物は、神経細胞または十分な神経支配を欠く、隣接する平滑筋細胞構築物または組織と接合している。
【００５３】
一実施形態においては、縫合、加熱、ホチキス留め、生体的／外科的接着材を用いた接着、またはこれらの方法の組み合わせ、といった標準的な技術を用いて、多数の収縮性のある平滑筋細胞構築物を積層するかまたは接続して、構築物同士を接合して組織構造物を形成することもできる。構築物は、また、管状足場といった足場と接合するか、または接続することもできる。１つ以上の構築物を接合、接着、積層、または接続することにより組織構造物を強化することもできる。
【００５４】
接着剤や組織シール剤は本分野では周知であり、１０年以上にわたって、米国以外で市販されている。主としてヨーロッパで、１９６４年頃からホルムアルデヒドと架橋したゼラチンに基づく接着剤が実験的に用いられている。いくつかの調合が提案され、その中では「ＧＲＦ」（ゼラチン、レゾルシノール、ホルモル）が最もよく知られている。選出したゼラチンの熱溶液をインサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で主にホルムアルデヒド溶液からなる硬化剤と混合する。混合物は、急速に、組織に付着する固体として固まる。
【００５５】
フィブリン接着剤は、天然作用である血栓の形成を利用して接着剤またはシール剤組成物を生成する。市販製品の１つに、フランスのランジスの「Ｔｕｓｓｉｃｏｌ（登録商標）」がある。別のものとして、オーストリアのウィーン、Ａ−１２２０にあるＩｍｍｕｎｏ  ＡＧの小会社であるＯｓｔｅｒｒｅｉｅｈｉｓｅｈｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  Ｉｌａｅｍｏｄｅｒｉｖａｔｅ，ＧＭＢＨより市販されている「Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ  Ｋｉｔ １．０」 がある。ある２つの要素を組み合わせて人工的な血栓を形成する。その要素のうちの１つは、フィブリノゲンと、Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩといった血液凝固因子との溶液であり、もう１つは、主にトロンビンとカルシウムイオンの溶液である。
【００５６】
別の実施形態においては、構築物は、十分な神経支配を欠く組織または器官構造物と接合して神経パッチとしての役割を果たすこともできる。神経パッチは、縫合、加熱、ホチキス留め、生体的／外科的接着材を用いた接着、またはこれらの方法の組み合わせ、といった標準的な技術を用いて組織と接続することができる。構築物は、また、足場と接合または接続した後、組織と接合することもできる。１つ以上の神経パッチを接着、積層、または接続して、組織構造物を強化したり、さらなる神経源を提供することもできる。
【００５７】
組織培養容器
当業者であれば、本明細書に記載の細胞培養および組織工学的方法を、種々の環境下（すなわち、容器類またはコンテナ類）で行ってもよいことは、容易に理解するであろう。平滑筋細胞は付着依存性を有し、ゆえに培養を用いて平滑筋細胞を成長させるには、容器の表面は、該細胞の付着および成長への動きを可能にするべく、無毒性かつ生物学的に不活性、また光学的に透明であることが必要である。組織培養容器または組織培養プレートは、無菌状態で供給されかつ使い捨て可能な、特別な処置を施したポリスチレンプラスチックを含む。これらの例としては、ペトリ皿、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、ローラーボトル、ねじ蓋フラスコ（表面積Ｔ‐２５ｃｍ２、Ｔ‐７５ｃｍ２、Ｔ‐１５０ｃｍ２）、培養袋、または細胞を収容可能であり好ましくは無菌環境の任意の容器が挙げられる。
【００５８】
本発明の一実施形態では、バイオリアクタの使用も、組織構造の生体工学による作製、および平滑筋または神経細胞の培養に有用である。例えば、現在、いくつかの製造業者により、細胞培養に利用可能かつ本発明の方法と組み合わせて利用可能な装置が製造されている。例えば、Ｃｅｌｄｙｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．；Ｕｎｉｓｙｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．；Ａａｓｔｒｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．；Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ，Ｂｅｄｍｉｎｓｔｅｒ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。さらに、そのようなバイオリアクタを取り扱う特許文献としては、米国特許第６０９６５３２号明細書、米国特許第６００１６４２号明細書、米国特許第５９８５６５３号明細書、米国特許第５８８８８０７号明細書、米国特許第５６８８６８７号明細書、米国特許第５６０５８３５号明細書、米国特許第５１９０８７８号明細書が挙げられ、それらの内容は参照により本明細書に援用される。
【００５９】
低剪断、高灌流環境を提供するよう設計された装置である、いくつもの異なる種類のバイオリアクタが市販されている。例えば、本発明は、大型の外部シリンダの内部に設置される小型の内部シリンダと管状構造からなる、回転壁バイオリアクタ内で実施してもよい。本発明の管状構造は内部シリンダ上に作製してもよいが、バイオリアクタ内の他の位置に該構築物を設置してもよい。内部シリンダと外部シリンダとの隙間が細胞培養の容器空間としての役割を果たす。培養培地には外部疎水性膜を介して酸素供給することができる。回転バイオリアクタの低剪断環境により、激しい攪拌に伴う栄養素の損壊または「洗い流し」を起こすことなく、細胞間および細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との間における相互作用が促進される。
【００６０】
三次元培養系
本発明の三次元培養系は種々の用途で利用することができる。一実施形態においては、三次元培養系を用いて、被験者に移植または植え込みを行う前に、個々の平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物または生体外で組織工学により作られた組織構造のいずれかを調整することができる。
【００６１】
三次元組織構造物を培養で生成するには、平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物または生体工学による組織構造物は、市販のＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ、ＭｃＣｏｙ’ｓ等のような適切な養分を含む培養液で成長させなくてはいけない。さらに、三次元培養物は、定期的に「給餌（ｆｅｄ）」して、使用済み培地を取り除き放出細胞を減らすべきである。
【００６２】
当業者であれば、本明細書に記載の細胞培養および組織工学的方法を、種々の環境下（すなわち、容器類またはコンテナ類）で行ってもよいことは、容易に理解するであろう。平滑筋細胞は付着依存性を有し、ゆえに培養を用いて平滑筋細胞を成長させるには、容器の表面は、該細胞の付着および成長への動きを可能にするべく、無毒性かつ生物学的に不活性、また光学的に透明であることが必要である。組織培養容器または組織培養皿は、無菌状態で供給されかつ使い捨て可能な、特別な処理を施したポリスチレンプラスチックを含む。これらの例としては、ペトリ皿、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、ローラーボトル、ねじ蓋フラスコ（表面積Ｔ‐２５ｃｍ２、Ｔ‐７５ｃｍ２、Ｔ‐１５０ｃｍ２）、培養袋、または細胞を収容可能であり、好ましくは無菌環境の、任意のコンテナが挙げられる。これらの手順は、バイオリアクタを用いると非常に容易に行うことができる。バイオリアクタは、筋細胞の接種を行った三次元フレームを収容する閉鎖系であってもよい。バイオリアクタを使用することで汚染の可能性が減り、断続的かつ定期的な与圧下における培養を維持でき、対流による軟骨組織構築の間、継続して、平滑筋細胞へ適切な栄養素の供給が維持できる環境状態を作り出す。
【００６３】
本発明の一実施形態では、バイオリアクタの使用も、平滑筋細胞および／または神経細胞の培養によって行う組織構造物構築物の生体工学的作製に有用である。例えば、現在、いくつかの製造業者により、細胞培養に利用可能かつ本発明の方法と組み合わせて利用可能な装置が製造されている。
【００６４】
これらの方法は、平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物または生体工学による組織構造物の生成に用いてもよいし、かつ、その生体工学による組織構造物が自然発生の哺乳類組織と機能的に類似するかどうかを判断するのに用いてもよい。さらに、Ｇｏｒｅｎｎｅ氏らによるＡｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５；Ｈ１３１−Ｈ１３８，１９９８に記載されるように、平滑筋細胞の機能は血管筋内で測定してもよい。
【００６５】
マトリックス材料／足場材料
生体工学による平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物は、それぞれ、より大きい組織構造物の構成要素としての役割を果たして、現存の器官と置換されるものであってもよいと考えられる。対象に移植または埋め込みを行う前に、生体工学による組織構造物の形成に用いた足場を取り除いてもよいし、または生体工学による組織構造物の一部として足場を挿入してもよい。生体工学による組織構造物を、必要としている哺乳動物へ挿入するために、平滑筋細胞構築物／神経細胞構築物の形成に用いるマトリックス、もしくは生体工学による組織構造物の形成に用いる足場、またはその両方を、体内で時間の経過とともに徐々に分解されて完全な天然組織となる生分解性材料から作製してもよい。これらのマトリックスおよび足場は、いかなる慢性炎症反応も誘発せず、感染症の長期にわたる生育地にもならない。生分解性高分子を用いて、宿主組織と構造的に統合する組織が構築されている。生体内環境で最終的に生分解する、天然由来のマトリックス様材料を種々用いてもよい。さらに、合成生分解性マトリックス／足場の使用は、しばしば利点をもたらす。なぜなら、このような合成材料が生分解に要する時間は、培養された細胞からの新たな組織の形成と一致するよう設計されているからである。
【００６６】
マトリックス材料／足場材料は、特定の状況、および用いる細胞のタイプ（平滑筋および／または神経細胞）または生体工学により作製する組織のタイプによって選択する。当業者に周知であるように、例えば、生体適合性、生分解性、強度、剛性、界面特性、および表面的な外観といった物理的および化学的特徴が、マトリックスを選択する際に考慮されてもよい。適切なマトリックスであれば、哺乳類の修復細胞が移動する際に透過する原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の足場として機能する。マトリックス材料／足場材料は、１つ以上の材料の混合物とすることもでき、合成材料同士の混合物、合成材料と天然材料との混合物、または天然材料同士の混合物とすることができる。
【００６７】
フィブリンゲルは、器官の置換に用いられうる適切な材料である。フィブリンゲルは、トロンビンに活性化されたフィブリノゲンによって生成された単量体フィブリン分子からなるネットワークである。この生体高分子は止血および創傷治癒に関与することが知られている。フィブリンは、一時的な組織置換用および吸収性埋め込み材料として用いられている生分解性材料である。
【００６８】
別の適切な材料の、特定の例としては、線維状コラーゲンが挙げられ、それは組織から抽出し部分的に浄化した後、凍結乾燥し、その後殺菌してもよい。マトリックスは、例えば、Ｓｉｇｍａ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎといった種々の商業的な供給源から入手できるような、腱コラーゲンまたは皮膚コラーゲンから調製してもよい。
【００６９】
それら種々のコラーゲン材料は、石灰化コラーゲンの形であってもよい。例えば、Ｎｏｒｉａｎ  Ｃｏｒｐ．，（１０２５  Ｔｅｒｒａ  Ｂｅｌｌａ  Ａｖｅ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．９４０４３）から入手できるような、ＵｌｔｒａＦｉｂｅｒ（商標）と呼ばれる線維状コラーゲン埋め込み材料をマトリックス形成に用いてもよい。米国特許番号第５２３１１６９号明細書には、分散コラーゲン原線維の存在下において、インサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での軽度攪拌で、リン酸カルシウム無機物を形成することによる石灰化コラーゲンの調製が記載されている。なお該明細書の内容は参照により本明細書に援用する。
【００７０】
別のタイプの利用可能な生体材料は小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）である。ＳＩＳグラフト材料は、成豚の空腸の一断片から調製してもよい。組織試料の単離は、Ｂａｄｙｂａｋ氏らによって記されるような（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．４７：７４‐８０，１９８９）慣例的な組織培養技術を用いて行ってもよい。ＳＩＳ材料は、腸間膜組織を切除し、その切除断片を反転させ、その後粘膜と粘膜下層表面を機械的剥離技術により除去して調製する。上記断片をもとの向きに戻した後、漿膜と筋層を洗浄し、後の使用に備えて保管する。
【００７１】
ラミニン類は、大半の細胞および器官のタンパク質ネットワーク基盤である基底膜における主なタンパク質である。このラミニン類は、基底膜の重要かつ生物学的に活性する部分であり、細胞の表現型や存続のみならず、分化、移転、付着にも影響を及ぼす。
【００７２】
マトリックスや足場もキチンに由来しうる。本明細書で用いるキチンは、節足動物の殻、特に甲殻類の動物または昆虫類の殻、から調製した多糖類組成物を意味する。キチンは、生体適合性を有し、生体に自然と分解吸収される。また、以前から、薬物の徐放、骨誘導、および止血に用いられてきた。（例えば、Ｃｈａｎｄｙ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｍａ，Ｂｉｏｍａｔ．Ａｒｔ．Ｃｅｌｌｓ＆Ｉｍｍｏｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９１）１９：７４５−７６０，Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８５）３３（９）：３９８６−３９９２，ａｎｄ  Ｋｌｏｋｋｅｖｏｌｄ，Ｐ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒ．（１９９２）５０：４１−４５を参照。これらの内容は参照により本明細書に援用される。）足場は、未誘導の形のキチンおよび／または誘導された形のキチンを用いて製造してもよい。
【００７３】
「キトサン」はキチンの誘導体であり、適切な多糖足場の一例として挙げられる。本明細書で用いる「キトサン」は、キチンのＮ‐アセチルグルコサンのアセトアミド基を加水分解して生成される任意の多糖も含む。生物医学グレードキトサンをカルボキシメチル化して生成した水溶性キチン誘導体であるＮＯＣ‐キトサンに由来する足場も一例としてあげられる。米国特許第４６１９９９５号明細書にＮＯＣ‐キトサンの組成物と調製が記載される。その内容は本明細書に参照により援用される。キチンおよびその誘導体は、凍結乾燥したキチン、気乾したキチンから、また生成当初の粉砕キチンから、粉末状または固体状に調製することができる。架橋キチン誘導体に由来する足場も一例に挙げられる。（例えば、Ａｄｅｋｏｇｂｅ，Ｉ．「Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＴＢＰ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００５）２６（３５），７２４１‐５０を参照。この内容は参照により本明細書に援用される。）これらに限定するわけではないが、キチン足場およびその製造方法の別の例が、米国特許第６１２４２７３号明細書（キチンおよびキトサンヒドロゲルが開示される）、米国特許第６６９９２８７号明細書および米国特許第６６４２２１３号に記載されている。これらの内容は参照により本明細書に援用される。
【００７４】
種々の実施形態において、足場は、限定するわけではないが、キトサン、キチン、セルロース、アルギン酸塩、寒天、ゼラチン、大豆タンパク、ヒアルロン酸コラーゲン、エラスチン、および絹を含む種々のポリマー組成物から構築することができる。それらポリマー組成物は単独で用いてもよいし、任意の濃度および任意の割合で、他の任意のポリマー組成物と組み合わせて用いてもよい。一実施形態においては、足場は、１つ以上の他の材料と、別々でまたは組み合わせてキトサンを含む。別の実施形態では、キトサンは、ゼラチンまたはアルギン酸塩といった他の材料と組み合わせて用いてもよい。
【００７５】
非生物分解性マトリックス／非生物分解性足場になりうるものの例として、ポリ（アクリロニトリル‐ｃｏ‐ビニル塩化物）、ポリリシン、アセチルセルロース、およびポリスルホンといった半透明ポリマーのような非生分解性ポリマーが挙げられる。通常は固定化細胞での使用を意図しているが、このようなポリマーの本発明の文脈での使用が、除外されることはない。これらのポリマーは、アルギン酸塩およびポリホスファゼンをはじめとする種々のゲルとともに用いてもよい。ポリホスファゼンは合成ポリマーであり、ポリホスファゼンの水溶液は特定のイオンの存在下でゲル化する。これらのポリマーの使用法はアルギン酸塩と同じである。これらの合成ポリマーの主鎖は非常に安定しているため、穏やかな生理学的ゲル化条件を損なうことなく、側基の機能を大幅に変化させることが可能となる。
【００７６】
コラーゲン等の天然材料およびポリグリコール酸等の合成材料は、ともに利点と欠点を有する。天然生体材料の構造概念または該材料の特定の生物的活動を組み入れた合成材料は、天然材料と合成材料の両方の利点を備える可能性がある。合成ポリマーが有する再現可能な大規模合成および柔軟性は、天然材料が有する生体適合性および生物学的活動と組み合わせることができる。
【００７７】
マトリックス材料と足場材料は、同じ材料または異なる材料から作製することができる。一実施形態においては、マトリックス材料は、コラーゲンまたはコラーゲン／ラミニン混合物とすることができる。別の実施形態においては、足場材料はキトサンとすることができる。
【００７８】
別の実施形態においては、１つ以上の他の材料と、別々に、または組み合わせて、アルギン酸塩を足場材料として用いることができる。アルギン酸塩は容易に加工でき、水溶性であり、かつ非免疫原性である。アルギン酸塩は、容易なゲル化性を呈する遊離ヒドロキシル基を有する生分解性アニオン性多糖である。アルギン酸塩は、歯科医療における印象採得から医療包帯に至るまで種々の医学的応用に用いられてきたワカメの誘導体である。容易に成型可能であるという能力を有し、生体適合性が実証されているため、アルギン酸塩は本発明で使用するのに望ましい材料である。アルギン酸塩は水分をよく吸収し保持するため、湿潤環境が治癒に理想的な場合の損傷を修復するのに理想的である。
【００７９】
平滑筋細胞機能を測定する分析法
生体内で、胃腸平滑筋片を規定し検査するための（収縮性、弛緩性、および自発的緊張）標準的プロトコルは、Ｇｌａｖｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６５，Ｇ７９２−Ｇ７９８，１９９３，Ｇｌａｖｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２７２，Ｇ１０７５−Ｇ１０８２，１９９７，Ｃｈａｋｄｅｒ＆Ｒａｔｔａｎ，Ａｍ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６４，Ｇ７０２−Ｇ７０７，１９９３，Ｋｎｕｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９，Ｇ２３２−Ｇ２３９，１９９５により教示されている。筋片を引き延ばし平衡期間をおいた後、適切な刺激での収縮および弛緩する能力によって、阻害されることがなければ、長期間、自発的張力／自発的緊張は、一定の張力振動、または安定した張力／安定した規則的緊張として描かれる。本発明の生体工学による構造物は自発的張力を示した。基本張力の引き延ばしおよび安定化の後、生体工学により作製した輪は、一定かつ安定した張力／緊張を一定期間示した。基本張力に変化があったのは、作用物質に誘発された刺激があった場合のみであった。一貫性のある力の測定を行うために、輪により生成された安定した張力を、ゼロに設定した。
【００８０】
これらの方法は、任意の輪走平滑筋細胞を用いて生成した神経支配のある管状組織構造物に用いてもよいし、かつ、その生体工学によって作られた組織構造物が、自然発生の哺乳類構造物または単離した平滑筋細胞と機能的に類似するかどうかを判断するのに用いてもよい。生体工学による構造物の実験計画は以下のとおりである。（１）生体工学によって作製した管状組織構造物が自発的基礎緊張を生じる。（２）弛緩伝達物質である８‐ｂｒ‐ＡＭＰ、８‐ｂｒ‐ｃＡＭＰを添加すると、生体工学構造物の基礎張力／基礎緊張に急速かつ大幅な低下が誘発される（弛緩）。この低下は力発生の低下として発現し測定される。（３）アセチルコリンを添加すると、アセチルコリンが大幅かつ即座に、力の発生を誘発したことが測定された（収縮）。（４）８−ｂｒ−ｃＡＭＰを添加すると、アセチルコリンにより誘発された、生体工学構造物の収縮および力の発生の急速な弛緩が誘発された。
【００８１】
神経支配のある管状組織構造物のぜん動力または推進性も、本分野で公知の方法により測定することができる。例えば、他端が固定された状態の足場の一端に流体を挿入すると、神経支配のある管状組織構造物の中央部分が拡張し、一方向のみへ流体を流すことが可能になる。生体工学による管状組織構造物のぜん動運動が発生すると、液体は、挿入された端とは逆端において排出され、それにより管状組織構造物の中央部分における圧力は低下する。神経支配のある管状組織構造物が、漏出や逆流の兆候なく排出することが可能な、流体の最大容量も測定することができる。また、数回、流体圧力をかけて、漏出や逆流がないかを測定することができる。
【００８２】
さらに、平滑筋細胞の機能は、Ｇｏｒｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５：Ｈ１３１−Ｈ１３８，１９９８に記載されるように、血管筋において測定してもよい。等尺性力を測定するには、動脈から余分な接続組織を除去してもよく、内皮は、綿棒を用いて内膜を軽くこすり取ることにより採種する。ブタの頸動脈の中央条片（０．５３７ｍｍ）を、室温でＭｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎに仕込み、ＰＳＳ中で９０分間平衡化する。１００ｍｇの受動力をすべての組織に加える。平衡化した後、作用薬（５０μＭ）を用いて組織を最大限収縮させ、その後、基礎力が回復するまでＰＰＳで洗浄する。その後、ＰＳＳまたは拮抗薬を含むＰＳＳのどちらかにおいて組織を２時間培養する。この培養期間の後、作用薬に対する累積濃度反応曲線を求める。
【００８３】
いくつかの実施形態においては、平滑筋細胞機能は、神経支配のある異なる管状筋構造物において少なくとも２回の誘発収縮を含むパターン動作である。神経支配のある異なる管状筋構造物は、任意で、隣接する管状筋構造物および／または遠隔の神経支配のある管状組織構造物を含む。いくつかの実施形態においては、上記少なくとも２回の誘発収縮は、前もって設定した順序に応じて、順番にかつ／または適時に発生する。いくつかの実施形態においては、平滑筋細胞の動作は遠位方向へ進む収縮波を含み、必須ではないが、任意で、ぜん動運動を含む。いくつかの実施形態においては、このような平滑筋細胞刺激系および／または平滑筋細胞刺激方法を用いると逆流が減少する。いくつかの場合においては、このような方法により、神経支配のある管状筋構造物を刺激して、天然のぜん動運動を模倣する遠位方向への収縮波を生成する、という上記結果が達成される。
【００８４】
神経細胞機能を測定する分析法
神経細胞機能は本分野で知られる方法を用いて評価することができる。例えば、神経遮断薬の存在下における薬剤の効果を検討することができる。神経伝達物質または電流といった刺激物質に反応して基礎緊張を弛緩する能力とともに、自発的基礎緊張の生理的機能の比較を行う。組織構造物を植込む前と植込んだ後、外部刺激がほとんどかあるいは全くない状態において、自発的基礎緊張を測定することができる。自発的基礎緊張のパターンを、植込み前の組織構造物と植込み後の組織構造物との間で測定することができる。
【００８５】
基礎緊張は、神経伝達物質もしくは他の刺激物等の薬剤または外部物質からも影響を受ける。本方法において有用な神経伝達物質としては、限定はしないが、Ｎ‐ニトロ‐Ｌ‐アルギニンメチル塩酸塩、アセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフロン、ヒスタミン、セロトニン、アデノシン、アナンダミド、一酸化窒素、γ‐アミノ酪酸、グルタメート、および血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）受容体作用薬といった、ｎＮＯＳ‐ブロッカーが挙げられる。埋込み前の組織構造物と埋込み後の組織構造物における自発的基礎緊張を比較するのに、ニフェジピンといった、基礎緊張を妨げる阻害物質を用いることができる。
【００８６】
コリン性刺激に反応して、受容体の一体性および細胞間でのシグナル伝達も、植込み前の組織構造物と植込み後の組織構造物で自発的に観察される。基礎緊張または弛緩に下降があれば、機能的カルシウムチャネルおよびＶＩＰ受容体といった、平滑筋における細胞間シグナル伝達機構が維持されていることが示唆される。
【実施例】
【００８７】
実施例１
自家移植のウサギＩＡＳ平滑筋および腸神経前駆細胞を用いて、生体工学によって、神経支配のある内肛門括約筋（ＩＡＳ）構築物および神経支配のない内肛門括約筋（ＩＡＳ）構築物を作製した。４日間の培養後、それら構築物を生分解性複合キトサン管状足場の付近に設置した。神経支配のない（神経細胞を欠く）筋構築物を、神経支配のある（神経細胞を有する平滑筋細胞）構築物の一端と接するよう設置した。別の神経支配のない筋構築物を、前述の神経支配のある構築物の他端から１ｍｍ離れた位置に設置した。それらの構築物の生理的機能性を生体外で評価した。
【００８８】
生体工学による神経支配のある構築物は、ＮＡＤＰＨ‐ジアホラーゼ染色において陽性を示したため、一酸化窒素含有ニューロンの存在が確認された。
【００８９】
顕微鏡画像によると、足場への設置からわずか４日目で、神経支配のある構築物とない構築物のすき間を架橋する細胞プロセスが示された。１０日目に、分化したニューロンのネットワークを顕微鏡で観察できた。
【００９０】
２０日目に構築物を足場から取り除き、それらの生理的活動を評価した。（ａ）最初から元々神経支配のある構築物の場合：（ｉ）アセチルコリン（１μＭ）により１５３μＮの力の発生が誘発されたが、その力は、ＴＴＸ（５８％）とアトロピン（９０％）を用いた前処理により抑制された。これによりコリン作動性収縮の筋原性要素と神経要素の一体性が示された。（ｉｉ）ＥＦＳにより６０μＮの弛緩が誘発されたが、その弛緩はＴＴＸを用いた前処理により完全に抑止された。これにより、弛緩の神経要素の一体性が示された。（ｂ）神経支配のある構築物から１ｍｍ離れて設置した、最初は神経支配のなかった構築物の場合：（ｉ）アセチルコリン（１μＭ）により８０μＮの力の発生が誘発されたが、その力は、ＴＴＸ（４０％）とアトロピン（７５％）を用いた前処理により抑制された。これにより、筋原性要素の一体性とコリン作動性収縮する新たな神経要素の出現が示された。（ｉｉ）ＥＦＳにより８８μＮの弛緩が誘発され、その弛緩は、ＴＴＸを用いた前処理により完全に抑止された。これにより、新たに生じた機能的な抑制性運動ニューロンの出現が認められた。
【００９１】
上記が、神経支配のない筋に神経支配を発生させるのに用いる神経筋パッチの最初の例証である。これにより、消化管の神経筋疾患の再生医療治療における新たな道が開かれる。
【００９２】
実施例2
本実施例においては、最初から神経支配のある、三次元のウサギ結腸構築物を生体工学により作製しかつ分析した。
【００９３】
トリプシンを用いて平滑筋細胞を消化し、アクターゼを用いてニューロスフィアを剥離した。５００ｋ平滑筋細胞と２００ｋ腸神経前駆細胞を遠心分離機にかけて、細胞ペレットを形成した。
【００９４】
０．４ｍｇ／ｍＬコラーゲン（タイプＩラット尾部）とラミニン（５μｇ／ｍＬ）との溶液に腸神経前駆細胞を再浮遊させた。シルガード（Ｓｙｌｇａｒｄ）で被覆した３５ｍｍ皿の中央部柱付近にその溶液をピペットで移した。溶液は、３７℃の培養器に入れると１５分〜３０分でゲル化した。
【００９５】
平滑筋細胞ペレットを０．４ｍｇ／ｍＬコラーゲン溶液に再浮遊させ、第１のゲル層の上にピペットで移し、培養器へ戻した。
【００９６】
２〜４時間後、無菌２２ｇ針を用いてゲルをプレートの縁からはずした。
【００９７】
１ｍＬのＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ＋Ｂ２７）を添加して、プレートを分化のために３７℃／７％  ＣＯ２培養器に戻した。
【００９８】
試薬：成長培地および成長補助剤を含むあらゆる細胞培養試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。 平滑筋用の成長培地には、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１．５％の抗生物質‐抗真菌剤、および０．６％のＬ‐グルタミン酸を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）からなるものを使用した。神経前駆細胞用の成長培地には、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、および抗生物質‐抗真菌剤からなるものを使用した。神経分化培地には、ウシ胎児血清、Ｂ２７サプリメント、および抗生物質‐抗真菌剤を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ培地からなるものを使用した。コラゲナーゼタイプＩＩは、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）から購入した。タイプＩラット尾部コラーゲンはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。
【００９９】
中間分子量のキトサン（７５〜８５％脱アセチル化）、グリコサミノグリカンヘパラン硫酸、１‐エチル‐３‐（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、アセチルコリン（ＡＣｈ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、およびテトロドトキシン（ＴＴＸ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。シルガード［ポリ（ジメチルシロキサン）；ＰＤＭＳ］は、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）から購入した。
【０１００】
ウサギの結腸輪走平滑筋細胞の単離：ウサギの結腸輪走平滑筋細胞（ＲＣＳＭＣｓ）を、ウサギのＳ状結腸から単離した。すぐに、結腸組織をよく冷やしたＨＢＳＳで清潔にし洗浄した。漿膜、縦走平滑筋、および粘膜を採種した。輪走平滑筋を細かく切り刻み、タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）で２度消化させ、ろ過して細胞残屑を排除した。消化した細胞を洗浄し、成長培地に再浮遊させ、組織培養フラスコに固定した。実験で用いる前に、細胞は成長して合流した。
【０１０１】
ウサギの神経前駆細胞の単離：神経前駆細胞をウサギの空腸から単離した。すぐに、ＨＢＳＳを用いて、ウサギの空腸の生検からあらゆる物質を取り除いた。組織を切り刻み、コラゲナーゼ／ディスパーゼの混合剤で消化させた。次いで、細胞懸濁液を４０μｍメッシュでろ過し、ペトリ皿に固定した。
【０１０２】
複合キトサン足場の作製：複合キトサン足場は、タイプＩコラーゲン（０．１ｍｇ／ｍＬ）と体積比１：１で混合した２ｗ／ｖ％キトサン溶液を用いて調製した。中央部に開口部を有する管状モールドに混合液を注入し、−８０℃で３時間凍結させ、次いで２４時間凍結乾燥させた。０．２ｍＮａＯＨで該足場を中和し、カルボジイミドを用いてヘパラン硫酸と共有結合的に架橋させる。その後、ＰＢＳと蒸留水を用いて足場の洗浄を複数回行う。足場を紫外線殺菌し、次いでラミニン（０．０５ｍｇ／ｍｌ）で被覆して、室温で２時間、神経移動を増進させる。
【０１０３】
最初から神経支配のある三次元輪走平滑筋構築物を生体工学により作製した。シルガードで被覆した、中央部に円柱状の柱を有するプレートに、ウサギの神経前駆細胞を２×１０５個含むコラーゲン／ラミニンゲルを載置した。ゲルの第１層の上に、第２層となる、ウサギの結腸輪走平滑筋細胞を５×１０５個含むコラーゲンゲルを載置した。ゲル化後、神経分化培地をプレートに添加し、３７℃で培養した。神経支配のない、ウサギの結腸構築物は、中央部に柱を有する、シルガードで被覆したプレート上に、ウサギの結腸輪走平滑筋細胞を５×１０５個含むコラーゲンゲルを載置することにより生体工学的に作製した。ゲル化後、同じ神経分化培地をプレートに添加した。神経支配のある平滑筋構築物を固定してパラフィン包埋した。α‐平滑筋アクチン（Ｆ３７７７；Ｓｉｇｍａ）および平滑筋に特異的なカルデスモン（ｃ‐４５６２；Ｓｉｇｍａ）の免疫染色分析を行った。
【０１０４】
４日目、同じ管状複合キトサン足場付近に、神経支配のある平滑筋組織構築物と神経支配のない平滑筋構築物を隣接して設置した。それら構築物を含む足場を、神経分化培地に１８日〜２０日の間放置した。
【０１０５】
顕微分析：足場付近に構築物を設置してから５日後、神経支配のある生体工学による平滑筋構築物と神経支配のない平滑筋構築物との間の接合部の顕微分析を評価した。顕微分析を行って、神経前駆細胞が、付着する神経支配のない構築物と共に、分化および神経ネットワークの形成を開始したかどうかを調べた。
【０１０６】
足場付近に構築物を設置してから１８日〜２０日後、構築物を取り外し、各構築物を顕微分析した。
【０１０７】
生理的機能：生理的機能のプロトコルは前述した。等尺性力変換器（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて構築物によるリアルタイムでの力の生成を記録した。温かい組織槽で構築物の培養を続け、組織試料を３７℃±１℃の状態に維持した。１５日目に、力の生成を測定するために、足場から生体工学による組織構築物（神経支配のある構築物および神経支配のない構築物）を取り外した。変換器の測定アーム部に組織構築物の片側を巻き付け、逆側を固定基準ピンに取り付けた。組織構築物を新しい培地を含む組織槽内で平衡させた。すべての記録された力数値は、組織の結果として生成した活動張力を示すものである。基準値を確立した後、極微操作装置を用いて組織を１０％〜１５％引き延ばした。組織試料により確立された伸長基準を任意でゼロに設定し、数値は力の生成の変化を示す。
【０１０８】
検査プロトコルは、足場付近で神経支配のある構築物に付着する平滑筋構築物の神経支配が新生する可能性を調べるよう設計した。神経遮断薬テトロドトキシン（ＴＴＸ）の存在下と非存在下において、神経血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）と電場刺激の影響を調査して弛緩を評価する。カルシウムチャネル遮断薬ニフェジピンの存在下で、塩化カリウム（ＫＣｌ）を用いて、電気機械結合を検査した。コリン作動性収縮は、ＴＴＸの存在下と非存在化において、アセチルコリン（Ａｃｈ）を用いて調査した。組織は、各実験毎に新しい緩衝液で洗浄した。
【０１０９】
免疫蛍光法：１８日〜２０日目に神経支配のある構築物および神経支配のない構築物を足場から取り外し、３．７％ホルムアルデヒドに一晩固定した。それら構築物をパラフィン包埋し、厚さ６μｍ断面を得た。α‐平滑筋アクチン（Ｆ３７７７；Ｓｉｇｍａ）、平滑筋に特異的なカルデスモン（ｃ‐４５６２；Ｓｉｇｍａ）、および神経に特異的なβ‐ＩＩＩチューブリン（ａｂ２５７７０、Ａｂｃａｍ）の免疫蛍光染色を行った。フルオロフォア共役二次抗体を用いて、ニコンのＴｉ‐Ｅ蛍光顕微鏡で免疫蛍光を検出した。
【０１１０】
細胞浸潤：構造物を取り外した後、組織学的分析を行うために、足場を３．７％ホルムアルデヒドに固定し、パラフィン包埋した。ヘマトキシリン‐エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いて、構造物から足場への平滑筋細胞の浸潤を調べた。
【０１１１】
データ分析：ウィンドウズ（Ｗｉｎｄｏｗｓ）のグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を用いて取得データの分析を行った。数値はすべて、３回〜６回の実験の平均値とＳＥＭとして表した。二次Ｓａｖｉｔｚｋｙ‐Ｇｏｌａｙ平滑化を生データに適用した。ｐ値が０．０５未満の場合、有意とみなした。
【０１１２】
顕微分析：ウサギの腸神経前駆細胞とともにウサギの結腸輪走平滑筋細胞をコラーゲン／ラミニンゲル中に載置した。１日おきに構築物に神経分化培地を供給した。図１に、生体工学による、完全に形成された、神経支配のある結腸平滑筋構築物を示す。４日目に、神経支配のある構築物の顕微的評価を行ったところ、腸神経前駆細胞が構築物周辺に向かって整列している様子が見られた。構築物中に初期分化と軸索突起を観測した。免疫蛍光分析によると、α‐平滑筋アクチンと平滑筋に特異的なカルデスモンに陽性染色が観察された。
【０１１３】
生体工学によって作製した構築物を形成から４日目に使用した。神経前駆細胞を欠く平滑筋構築物に付着するよう、同じ複合キトサン足場付近に、神経前駆細胞を含む平滑筋構築物を設置した。該構築物を有する足場を神経分化培地で培養した。足場付近に構築物を設置してから５日目に、両構築物の接合部の顕微的評価を行ったところ、それら構築物を架橋して連続的なネットワークを形成する、細胞の伸長プロセスが認められた。
【０１１４】
１６日〜１８日目に、足場から組織構築物を両方とも取り外し、顕微分析を行ったところ、神経前駆細胞を含む構築物中に軸索突起の形成が認められた。また、最初は全く神経要素のなかった平滑筋構築物内においても軸索突起を可視することができ、新たな神経要素の出現が認められた。
【０１１５】
生理的機能性：複合キトサン足場付近に構築物を設置してから１８日〜２０日目に、足場からそれら構築物を取り外し、その生理的機能性をリアルタイムでの力の発生を用いて評価した。
【０１１６】
平滑筋における電気機械結合の一体性を検査するために、６０ｍＭ  ＫＣｌで構築物を処置した。最初から神経支配のある構築物（図２）と神経支配のない構築物（図３）の両方において、収縮値の急上昇が発生した。神経支配のある構築物では３００±２４μＮの平均収縮が見られ、神経支配のない構築物では２２４±４２μＮの平均収縮が見られた。カルシウムチャネル遮断薬ニフェジピンの存在下においては、ＫＣｌの濃度が同じ場合は、構築物の両方ともにおいて（緑で示す波形）収縮は誘発されることはなかった。これは、これらの構造物においてカルシウムチャネルが存在し、維持されていることを示唆する。ＫＣｌへの反応性は、平滑筋要素の一体性が維持されていることを示す。
【０１１７】
コリン作動性収縮はアセチルコリン（Ａｃｈ）を用いて調査した。１μＭのＡｃｈで両構築物を処置すると、最初から神経支配のある構築物（図４の黒い線）と最初は神経支配のなかった（図５の黒い線）構築物の両方で急速に収縮が誘発された。平均収縮は、神経支配のある組織では１５０±２４μＮであり、神経支配のない組織では１３０±２８μＮであった。最初から神経支配のある構築物の最大収縮のピーク値は、神経遮断薬ＴＴＸの存在下では５０％〜６０％減少した（図４、グレイの線）。同様に、最初は神経支配のなかった構築物もＴＴＸにより最大収縮が減少した（図５、グレイの線）。構築物は不活性状態の基礎力へ戻ることができた。両方の構築物において、興奮性神経伝達物質Ａｃｈにより誘発した収縮性反応は、神経の特質と筋原性の特質の両方を呈した。
【０１１８】
これら構築物の弛緩はＶＩＰを用いた処置を行って調査した。ＶＩＰを１μＭ添加すると、基本値の急減少が誘発され、最大弛緩平均が、神経支配のある構築物においては１４５±１５μＮ（図６、黒い線）であり、神経支配のない構築物においては、１２０±１８μＮ（図７、黒い線）であった。ＴＴＸの存在下では、ＶＩＰの濃度が同じだと、最初から神経支配のある構築物においては弛緩の減少（６０％の抑制）が誘発される（図６、グレイの線）。ＴＴＸは、最初は神経支配のなかった構築物においても、ＶＩＰに反応した弛緩を抑制（５０％）した（図７、グレイの線）。ＶＩＰとＴＴＸへの反応による両方の構築物の生理機能により、当該反応に関与する、筋原性要素と神経要素の存在が認められる。
【０１１９】
生体工学により作製した最初から神経支配のある平滑筋構築物に、８Ｈｚで０．９ミリ秒間電気刺激（ＥＦＳ）を与えると、基準力の弛緩が急速に誘発され、その後、基本値へ回復する（図８、黒い線）。最初から神経支配のある構築物においては、平均弛緩として２９１±１３μＮが評価された。これらの構築物をＴＴＸで前保温するとＥＦＳへの反応は完全になくなった。これにより、弛緩は、完全に分化した当初より備わっているニューロンを刺激することに由来したことがわかる（図８、グレイの線）。最初は神経支配のなかった構築物に適用したＥＦＳの同じパラメータにより、平均１２５±１５μＮの弛緩が生じた（図９、黒い線）。その弛緩はＴＴＸの存在下では完全に遮断された（図９、グレイの線）。これにより、これらの構築物では、弛緩が神経細胞により媒介されることがわかる。
【０１２０】
生体工学により作製した、神経支配のある平滑筋構築物と神経支配のない平滑筋構築物を足場から取り外し、３，７％ホルムアルデヒドに固定した。組織試料を脱水しパラフィン包埋した。最初から神経支配のある構築物の断面において、神経特異的マーカーβ‐ＩＩＩチューブリンに対する陽性染色があった。これにより組織の神経支配を確認した。最初は神経支配のなかった構築物に神経が新生したことは、β‐ＩＩＩチューブリンに対して陽性染色が見られたことにより確認した。免疫蛍光法を行うことにより、両方の構築物において、完全に分化したニューロンの存在を確認できた。
【０１２１】
組織学的分析により、平滑筋細胞が構築物から足場のポアを介して浸潤したかどうかについての洞察が得られる。構築物を取り外した後の足場のみにＨ＆Ｅ染色を行った。染色により、足場には細胞成分が全くないことが示された。したがって、構築物は足場で細胞を喪失せず、一体性を保っていたことが示唆される。
【０１２２】
他の実施形態および用途は、本明細書、および本明細書に開示した方法と構造の実践を考慮することにより、当業者には明らかとなるだろう。理由のいかんにかかわらず、本明細書に引用したすべての米国特許および参考文献は、参照により具体的に援用される。明細書および実施例は例としてのみ考えるべきであり、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲により示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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