(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本の同一のアミノ酸鎖のホモ二量体タンパク質であって、各アミノ酸鎖が、（１）シグナルペプチド、（２）標的化ユニット、（３）二量体化モチーフ、及び（４）抗原性ユニットを含んでなり、該標的化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記標的化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３を含む標的化ユニットの機能活性を維持しているか及び／又は該活性を増強し、そして、該抗原性ユニットが、ＨＰＶ１６の初期タンパク質Ｅ６に由来するアミノ酸配列及びＨＰＶ１６の初期タンパク質Ｅ７に由来するアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記初期タンパク質Ｅ６に由来するアミノ酸配列が位置Ｆ４７におけるアミノ酸置換及び位置Ｃ６３又はＣ１０６における少なくとも１つの更なるアミノ酸置換をさらに含む、ホモ二量体タンパク質。
【請求項２】
前記シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列１−２３に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、前記シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列１−２３を含むシグナルペプチドの機能活性を維持しているか及び／又は該活性を増強する、請求項１記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３】
ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７に由来する抗原性ユニットを含んでなる、請求項１又は２記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項４】
前記抗原性ユニットが発癌特性を中和するための変異を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項５】
前記抗原性ユニットが、さらに、配列番号２２のＬ５０、及びＩ１２８及び／又は配列番号２３のＣ２４、Ｅ２６、Ｃ５８、Ｃ６１、Ｃ９１、及びＣ９４からなるリストから選択された位置に１若しくは複数のアミノ酸置換、又は配列番号２２のＹ４３−Ａ４６及びＲ４８−Ｌ５０及び／又は配列番号２３のＬ２２−Ｅ２６及び／若しくはＣ５８−Ｃ６１及び／若しくはＣ９１−Ｓ９５からなるリストから選択された１若しくは複数のアミノ酸が関与する欠失を含んでなる、請求項４記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項６】
二量体化モチーフが、リンカーを通じてヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインへ結合されたヒンジエクソンｈ１及びｈ４からなる、請求項１〜５のいずれか一項記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項７】
（１）シグナルペプチド、（２）標的化ユニット、（３）二量体化モチーフ、及び（４）抗原性ユニットを含んでなるアミノ酸鎖であって、該標的化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３に対する少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記標的化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３を含む標的化ユニットの機能活性を維持しているか及び／又は該活性を増強し、そして、該抗原性ユニットが、ＨＰＶ１６の初期タンパク質Ｅ６に由来するアミノ酸配列及びＨＰＶ１６の初期タンパク質Ｅ７に由来するアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記初期タンパク質Ｅ６に由来するアミノ酸配列が位置Ｆ４７におけるアミノ酸置換及び位置Ｃ６３又はＣ１０６における少なくとも１つの更なるアミノ酸置換をさらに含み、かつ、そのアミノ酸鎖が、請求項１〜６のいずれか一項記載のホモ二量体タンパク質を形成することができる、アミノ酸鎖。
【請求項８】
請求項７記載のアミノ酸鎖をコードしている、核酸分子。
【請求項９】
（１）配列番号１のアミノ酸配列１−２３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナルペプチド、ここで、前記シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列１−２３を含むシグナルペプチドの機能活性を維持しているか及び／又は該活性を増強する；（２）配列番号１のアミノ酸配列２４−９３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる標的化ユニット、ここで、前記標的化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３を含む標的化ユニットの機能活性を維持しているか及び／又は該活性を増強する；（３）リンカーを通じてヒトＩｇＧ３のＣＨ３ドメインへ結合されたヒンジエクソンｈ１及びｈ４からなる二量体化モチーフ；及び（４）発癌特性を中和するための変異を含む、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７に由来する抗原性ユニット、を含んでなるアミノ酸鎖をコードする、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が、ヒトコドンに最適化されている、請求項８又は９記載の核酸分子。
【請求項１１】
ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項８〜１０のいずれ一項記載の核酸分子。
【請求項１２】
配列番号１８、配列番号２０、配列番号３１及び配列番号３３からなるリストから選択されたヌクレオチド配列、又はそれらの変種のいずれか一つを含んでなる、請求項８記載の核酸分子。
【請求項１３】
ベクターにより構成される、請求項８〜１２のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１４】
医薬品として使用するための、請求項１〜６のいずれか一項記載のホモ二量体タンパク質、又は請求項７記載のアミノ酸鎖、又は請求項８〜１３のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項記載のホモ二量体タンパク質、又は請求項７記載のアミノ酸鎖、又は請求項８〜１３のいずれか一項記載の核酸分子を含有する、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項８〜１３のいずれか一項記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のホモ二量体タンパク質、又は請求項７記載のアミノ酸鎖を調製する方法であって：
ａ）請求項８〜１３のいずれか一項記載の核酸分子を、細胞集団へトランスフェクトする工程；
ｂ）この細胞集団を培養する工程；
ｃ）この細胞集団から発現されたホモ二量体タンパク質、又はアミノ酸鎖を収集し、且つ精製する工程：を含んでなる、方法。
【請求項１８】
請求項８〜１３のいずれか一項記載の核酸分子の免疫学的有効量を含有する、ワクチンを調製する方法であって：
ａ）請求項８〜１３のいずれか一項記載の核酸分子を調製する工程：
ｂ）工程ａ）で得られた核酸分子を、医薬的に許容し得る担体、希釈剤、又は緩衝液中に溶解する工程：を含んでなる、方法。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか一項記載のホモ二量体タンパク質、又は請求項７記載のアミノ酸鎖、又は請求項８〜１３のいずれか一項記載の核酸分子の免疫学的有効量、ならびに医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含有する、ＨＰＶに対するワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対するワクチン、並びに特にＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８に対するＤＮＡワクチンなど、治療的化合物に関する。本発明は更に、ホモ二量体性ペプチドをコードしているタンパク質構築体に関し、このペプチドは、ＤＮＡワクチンから放出されるか又は個別に使用されてよい。医薬製剤、宿主細胞、及びワクチンの製造方法に加え、適用により、癌及び感染症などの様々なＨＰＶ誘発性疾患の治療方法が更に説明されている。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮頸癌、並びに肛門生器（肛門、陰門、膣及び陰茎）癌及び一部の頭頸部癌などの他のＨＰＶ関連悪性疾患の原因であることは、現在良く確立されている。特に、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は、世界中の全ての子宮頸癌の約７０％の原因である。
【０００３】
今日までに、２種の予防的ＨＰＶワクチンが、市販されている（Ｇａｒｄａｓｉｌ及びＣｅｒｖａｒｉｘ）。これらの予防的ワクチンの目的は、ＨＰＶウイルスキャプシドタンパク質Ｌ１及びＬ２に特異的な中和抗体の産生を刺激することにより、体液性免疫応答を誘導することである。これらの予防用ワクチンは、ＨＰＶ誘発性子宮頸癌及び恐らく他のＨＰＶ関連悪性疾患の制御に関する画期的な節目であるが、これらのワクチンの作用は、２０〜４０歳について有意には認められない（Ｍａ  Ｂら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１０）。更には、これらの予防的ワクチンの大規模ワクチン接種の対象は、既にＨＰＶ感染した世界規模での実質的集団に加え、現在まで限定されているので、ＨＰＶ関連悪性疾患は、進行し続けるであろう。従って、ＨＰＶ関連悪性疾患及びその前駆病巣の死亡率及び罹患率を低下するために、ＨＰＶ特異的治療的ワクチンを開発することは重要であろう（Ｍａ  Ｂら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１０）。
【０００４】
様々な癌ワクチン及び癌免疫療法戦略の開発は、最近２０年間を通じ拡大している。更に、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ社）と称される唯一の治療的癌ワクチンが、前立腺癌の標準療法として適用されることが、これまでに承認されている。明白に、倫理的理由のために、治療的癌ワクチンの大部分は、最終病期の腫瘍を生じる患者群において試験される。この患者群は、実質的に免疫抑制されており、このことは、その腫瘍細胞は長期間免疫系を回避しており、且つ腫瘍に沿った発癌現象に対し免疫寛容を誘導することに寄与していることを意味する。加えてワクチンとして適用される抗原の選択（腫瘍−特異的、対、腫瘍−関連）は、腫瘍−特異的免疫応答を誘導し、且つ重篤有害事象へと繋がり得る患者における健常細胞の死滅を避けるために、重大である。従って癌免疫療法における大きな課題は、免疫寛容を破壊し、腫瘍−特異的エフェクター機能を活性化し且つ腫瘍細胞を認識し且つ殺傷することである。一部の症例報告は、後期病期の腫瘍患者における治療的癌ワクチンに対する臨床反応を示しているが、最も一般的な主要エンドポイントは、通常の療法（手術、化学療法及び放射線療法）と比べた、全般的生存に対する影響を観察することである。しかし殆どの研究は、確定的ではないか、又はこのことを示すのに完全に失敗したかのいずれかである。負の結果の理由の一つは、最初に治療に挑戦している末期腫瘍を有する患者群にある。可能性のある戦略は、治療的ワクチン治験において初期の腫瘍を持つ患者を含むべきである。
【０００５】
一つの戦略は、前癌病変を標的化することである。この戦略の課題は、主として、多くの組織について前癌病変により特異的に発現される信頼できるバイオマーカーを欠いていること、及び貧弱な医学的スクリーニング（存在しないか又は現存する方法は感度不足により悩まされているかのいずれか）である。例外的に、これは、ＨＰＶ誘発性悪性疾患症例には当てはまらない。例えば西欧の主要国は、パパニコロウ試験（Ｐａｐスメア試験）を実行することによる子宮頸部異形成症及び子宮頸癌の良好なスクリーニングプログラムを有する。Ｐａｐスメア試験から不明瞭な又は異常な結果が得られた場合は、膣頸管検査が実施されるであろう（米国子宮頸癌連合（ＮＣＣＣ））。またＨＰＶ−試験が、前癌病変の「ハイリスク」ＨＰＶ型の存在が検出された一部の患者には推奨される。従って、ＨＰＶは、ＨＰＶに関連した前癌病変、特に子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）についての可能性のあるバイオマーカーを表している。
【０００６】
ＤＮＡワクチンは、ヒト疾患、特に癌の治療に関して、増大する将来性を示している。ＤＮＡワクチンは、強力な抗原−特異的免疫応答を誘導し、且つ標的−特異的免疫応答を維持するために、反復投与することができる。そのようなワクチンは、他の癌療法フォーマットと比べ、大規模で行われるために、安全で簡便で且つ安価であるべきであると考えられる。多くの免疫療法的介入は、免疫記憶を誘導することに失敗している。例外的にＤＮＡワクチン接種は、インビボにおけるワクチン生成物の持続された放出を確実にし、これは抗原−特異的免疫記憶を増強する。抗原の専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）への直接送達は、インビボにおいてＣＤ４+及びＣＤ８+の両方のＴ細胞免疫応答を刺激する。そのような強力な細胞性免疫応答は、インビトロ及びインビボの両方において効果的に、抗原陽性の悪性細胞を特異的に認識し、且つ殺傷することが明らかにされている。
【０００７】
当該技術分野において、感染症及び癌の両方の原因となるＨＰＶに対する強力且つ特異的免疫応答を誘導するための改善されたワクチンが、依然必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
（発明の目的）
ＨＰＶにより引き起こされる疾患及び状態に対する、ＤＮＡワクチンなどの、特異的且つ高度に有効な治療的化合物を提供することは、本発明の実施態様の目的である。
【０００９】
（発明の概要）
本発明者らにより、ｈＭＩＰ−１αの標的化モジュールと、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８などのＨＰＶ由来の初期遺伝子産物Ｅ６及びＥ７の抗原を組合せることにより、治療的ワクチンが提供され、ここで、ＨＰＶ遺伝子産物の強力な免疫原性エピトープは、ＡＰＣに対し高い効率で提示され、特異的且つ強力な免疫応答を誘導することがわかった。本発明の生成物は、ＤＮＡワクチンなどの、治療的核酸ワクチンとして最初に想定されており、ここではワクシボディ（ｖａｃｃｉｂｏｄｙ）構築体をコードしている核酸構築体は、そのワクチンを受け取るヒトにおいてそのタンパク質生成物のインビボにおける生成に繋がる治療的化合物として使用される。しかし別の方法として、このタンパク質生成物それ自身は、製剤化され、ワクチンにおいて直接使用することができる。
【００１０】
従って第一の態様において、本発明は、２本の同一のアミノ酸鎖のホモ二量体タンパク質であって、各アミノ酸鎖が、（１）シグナルペプチド、（２）標的化ユニット、（３）二量体化モチーフ、及び（４）抗原性ユニットを含んでなり、該標的化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３に対する少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに抗原性ユニットが、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８の初期タンパク質Ｅ６及び／又はＥ７由来の抗原性ユニットなどの、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８のアミノ酸配列を含む抗原性ユニットなどの、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のアミノ酸配列を含む、ホモ二量体タンパク質に関する。
【００１１】
第二の態様において、本発明は、（１）シグナルペプチド、（２）標的化ユニット、（３）二量体化モチーフ、及び（４）抗原性ユニットを含んでなるアミノ酸鎖であって、該標的化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３に対する少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに抗原性ユニットが、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８の初期タンパク質Ｅ６及び／又はＥ７由来の抗原性ユニットなどの、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８のアミノ酸配列を含む抗原性ユニットなどの、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のアミノ酸配列を含み、このアミノ酸鎖が、本発明に従いホモ二量体タンパク質を形成することができるアミノ酸鎖に関する。
【００１２】
第三の態様において、本発明は、（１）シグナルペプチド、（２）標的化ユニット、（３）二量体化モチーフ、及び（４）抗原性ユニットを含んでなるアミノ酸鎖をコードしているＤＮＡなどの核酸分子であって、該標的化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３に対する少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに抗原性ユニットが、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８の初期タンパク質Ｅ６及び／又はＥ７由来の抗原性ユニットなどの、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８のアミノ酸配列を含む抗原性ユニットなどの、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のアミノ酸配列を含み、このアミノ酸鎖が、本発明に従いホモ二量体タンパク質を形成することができる核酸分子に関する。
【００１３】
更なる態様において、本発明は、医薬品として使用するための、本発明のホモ二量体タンパク質、又は本発明のアミノ酸鎖、又は本発明の核酸分子に関する。
更なる態様において、本発明は、本発明のホモ二量体タンパク質、又は本発明のアミノ酸鎖、又は本発明の核酸分子を含有する医薬組成物に関する。
更なる態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００１４】
更なる態様において、本発明は、本発明のホモ二量体タンパク質、又は本発明のアミノ酸鎖を調製する方法であって、この方法が、ａ）本発明の核酸分子を、細胞集団へトランスフェクトする工程；ｂ）この細胞集団を培養する工程；ｃ）この細胞集団から発現されたホモ二量体タンパク質、又はアミノ酸鎖を収集し、且つ精製する工程：を含んでなる方法に関する。
【００１５】
更なる態様において、本発明は、本発明の核酸分子の免疫学的有効量を含有する、ＤＮＡワクチンなどの、ワクチンを調製する方法であって、この方法が、ａ）本発明の核酸分子を調製する工程：ｂ）工程ａ）で得られた核酸分子を、医薬的に許容し得る担体、希釈剤、又は緩衝液中に溶解する工程：を含んでなる方法に関する。
【００１６】
更なる態様において、本発明は、本発明のホモ二量体タンパク質、又は本発明のアミノ酸鎖、又は本発明のＤＮＡなどの核酸分子の免疫学的有効量を含有する、ＨＰＶに対するワクチンであって、ここで該ワクチンが、Ｔ細胞及びＢ細胞の両方の免疫応答を誘起することができるワクチンに関する。
【００１７】
更なる態様において、本発明は、患者においてＨＰＶにより引き起こされた癌又は感染症などの、ＨＰＶ誘発性疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、この方法が、本発明のホモ二量体タンパク質、又は本発明のアミノ酸鎖、又は本発明のＤＮＡなどの核酸分子を、それを必要とする患者へ投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
（図面の説明文）
【図１】図１：  Ｅ７／Ｅ６融合抗原を伴うワクシボディワクチンの全般的構造。ＤＮＡ及びタンパク質の両フォーマットが示されている。ワクシボディは、３つの機能性モジュールからなる；標的化モジュール内のケモカインヒトＭＩＰ−１α（ＬＤ７８β）、二量体化モジュール内のヒトＩｇＧ３由来のヒンジ及びＣＨ３配列、並びにワクチンモジュール内の完全長Ｅ７及び／又はＥ６融合体。
【００１９】
【図２】図２：ＨＰＶ誘発性悪性疾患に対するワクシボディＤＮＡワクチンに関して示唆された作用様式。ワクシボディをコードしている裸のＤＮＡプラスミドが、皮内注射され、引き続きエレクトロポレーションされる。このプラスミドが、局所的細胞により取り込まれ、ワクシボディタンパク質が産生され且つ分泌される。走化性標的化モジュールは、ＣＣＲ１及びＣＣＲ５を発現している抗原提示細胞（ＡＰＣ）を引きつけ、樹状細胞（ＤＣ）への結合及び取込みを確実にする。ＤＣは、ＣＤ４+及びＣＤ８+  Ｔ細胞に対する抗原性ペプチドを示し、並びにＣＤ８+  Ｔ細胞は、子宮頸部においてＨＰＶ感染細胞及び悪性転換細胞を殺傷するであろう。
【００２０】
【図３】図３：異なる量で投与されたワクチンの機能としての、Ｅ７及びＥ６特異的Ｔ細胞反応の数を示す、ＥＬＩＳＰＯＴ結果。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＶＢ１００９及びＶＢ１０１６をコードしている裸のＤＮＡプラスミド並びにそれらの対応する対照を、皮内注射し、引き続き０日目及び７日目にエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、仏国）した。２１日目に脾細胞を収集し、ＭＨＣクラスＩ−制限されたＥ７又はＥ６ペプチドにより２４時間刺激した。ＩＦＮγを分泌している脾細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴにより算出した。（Ａ）ＶＢ１００９、対照１（抗原単独）及びｐＵＭＶＣ４ａ（空ベクター）の２５μｇの皮内接種後の、Ｅ７−特異的反応。（Ｂ）ＶＢ１０１６、対照２（抗原単独）及びｐＵＭＶＣ４ａ（空ベクター）の１２．５及び１．４μｇの皮内接種後の、Ｅ７−特異的反応。（Ｃ）ＶＢ１０１６、対照２（抗原単独）及びｐＵＭＶＣ４ａ（空ベクター）の１２．５及び１．４μｇの皮内接種後の、Ｅ６−特異的反応。
【００２１】
【図４】図４：測定された腫瘍容積により示された、ＶＢ１０１６の治療的作用。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＴＣ−１細胞５×１０5個を、０日目に、皮下注射した。３日目及び１０日目に、マウスに、ＶＢ１０１６をコードしている裸のＤＮＡプラスミド、対照２又は空ベクター１２．５μｇを、皮内注射し、引き続きエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、仏国）した。腫瘍サイズをキャリパーにより１週間に２〜３回測定し、腫瘍容積を算出した。
【００２２】
【図５】図５：測定された腫瘍容積により示された、ＶＢ１０１６の治療的作用。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＴＣ−１細胞５×１０4個を、０日目に、皮下注射した。３、７及び１０日目に、マウスに、ＶＢ１０１６をコードしている裸のＤＮＡプラスミド、対照２又は空ベクター２０μｇ又は２μｇを、皮内注射し、引き続きエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、仏国）した。腫瘍サイズをキャリパーにより１週間に２〜３回測定し、腫瘍容積を算出した。
【００２３】
【図６】図６：測定された腫瘍容積により示された、ＶＢ１０２０及びＶＢ１０２１の治療的作用。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＴＣ−１細胞５×１０4個を、０日目に、皮下注射した。３日目及び１０日目に、マウスに、ＶＢ１０１６、ＶＢ１０２０、ＶＢ１０２１をコードしている裸のＤＮＡプラスミド１０μｇ、又は空ベクターを、皮内注射し、引き続きエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、仏国）した。腫瘍サイズをキャリパーにより１週間に２〜３回測定し、腫瘍容積を算出した
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な開示）
本発明の発明者らにより本明細書に記載された構築体及びＤＮＡワクチン技術（「ワクシボディ」分子／ワクチン／構築体とも称される）は、感染症及び癌の両方に関する強力且つ特異的免疫応答を誘導する新規ワクチン戦略を表している。本明細書に記載されたＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７ワクチンなどの、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７は、ＤＮＡワクチンとして、皮内注射により投与することができ、好ましくは引き続きエレクトロポレーションする。これは、樹状細胞（ランゲルハンス細胞）を含む、注射部位（真皮）の細胞における、ワクシボディ−ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７ワクチンをコードしているＤＮＡ構築体の取込みを生じ、これはワクシボディ−Ｅ６／Ｅ７分子のインビボ生成に繋がる。
【００２５】
ＨＰＶ１６及び１８などの「ハイリスク」ＨＰＶ型由来の初期遺伝子産物Ｅ６及びＥ７は、基底上皮細胞の悪性転換、及び前癌病変の誘発の原因となり得る。両方のタンパク質は、高度に免疫原性のエピトープからなり、且つ強力な免疫応答を誘導し、インビトロ及びインビボの両方における、「ハイリスク」ＨＰＶ陽性腫瘍細胞の特異的根絶に繋がることが、本明細書において示されている。
【００２６】
本明細書に記載されたワクシボディ分子は、以下の３つのモジュールからなるホモ二量体である：標的化モジュール、二量体化モジュール及びワクチンモジュール（図１）。これら３つのモジュールをコードしている遺伝子は、一つの遺伝子として発現されるように、遺伝子操作されている。インビボにおいて発現された場合、ワクシボディ分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的化し、このことは同じ標的化されない抗原と比べ、増強されたワクチン効力を生じる。インビボにおけるケモカインヒトマクロファージ炎症タンパク質１α（ｈＭＩＰ−１α／ＬＤ７８β）の発現は、ＣＣＲ１及びＣＣＲ５受容体を保持するＤＣ、好中球及び他の免疫細胞の、その発現部位への誘引に繋がる。従って標的化モジュールとしてのｈＭＩＰ−１αからなるワクシボディ分子は、特異的細胞に対する抗原を標的化するのみではなく、加えて特異的免疫細胞の注射部位への動員により、反応増幅作用（アジュバント作用）も生じるであろう。この独特な機序は、ワクチンそれ自身がアジュバント作用を生じるので、患者が追加のアジュバントを伴わずにワクチンを受け取ることができ、これは臨床的状況において非常に重要である。
【００２７】
本発明の発明者らは、本明細書において、抗原性モジュールが、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８亜型を起源とするＥ６完全長配列に融合しているＥ７完全長遺伝子配列からなるワクチン構築体を説明する。このフォーマットの利点は、Ｅ６及びＥ７の両方が一つの構築体内に存在し、その結果インビボにおいて同等に発現され得ることである。結果的に、複数の−抗原性ユニットからなる一つのワクシボディ分子は、免疫系について同等レベルのＥ６及びＥ７を提示し得る。ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７遺伝子産物は、それらの天然型では発癌性である。これらの発癌特性を中和するために、特異的部位での変異が、Ｅ６及びＥ７遺伝子配列に導入されてよい。
【００２８】
下記の文献に説明されたいずれかなどの、Ｅ６及びＥ７の発癌特性を阻害することがわかっている欠失を含むこれらの変異は、特異的部位に導入されてよい：Ｄａｌａｌ  Ｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９６；Ｍｕｎｇｅｒ  Ｋら、ＥＭＢＯ、１９８９；Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９５；Ｃｒｏｏｋ  Ｔら、Ｃｅｌｌ、１９９１；Ｍｕｎｇｅｒ  Ｋら、ＨＰＶオンライン抄録、１９９７年（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｄｇｅｎ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ＿ＰＤＦ／９７ＰＤＦ／３／Ｅ７．ｐｄｆ）；Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｍら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２００２；Ｎｏｍｉｎｅ  Ｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、２００６；Ｍｏｏｄｙ  Ｃら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１０；Ｐｏｌａｋｏｖａ  Ｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１０；Ｘｉｅ  Ｑ、Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ、２０１１；Ｍｅｓｐｌｅｄｅ  Ｔら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２０１２；ＵＳ２００８／０１０２０８４及びＵＳ６３０６３９７、これらは引用により本明細書中に組み込まれている。従って本発明の一部の態様において、本発明の構築体は、下記の文献に説明された発癌特性を阻害することがわかっている位置に、ＨＰＶ１６  Ｅ６、Ｅ７のいずれか若しくは両方において１又は複数の変異を伴う、ＨＰＶ１６  Ｅ６、Ｅ７又はＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７キメラ構築体を含む：Ｄａｌａｌ  Ｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９６；Ｍｕｎｇｅｒ  Ｋら、ＥＭＢＯ、１９８９；Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９５；Ｃｒｏｏｋ  Ｔら、Ｃｅｌｌ、１９９１；Ｍｕｎｇｅｒ  Ｋら、ＨＰＶオンライン抄録、１９９７年（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｄｇｅｎ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ＿ＰＤＦ／９７ＰＤＦ／３／Ｅ７．ｐｄｆ）；Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｍら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２００２；Ｎｏｍｉｎｅ  Ｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、２００６；Ｍｏｏｄｙ  Ｃら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１０；Ｐｏｌａｋｏｖａ  Ｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１０；Ｘｉｅ  Ｑ、Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ、２０１１；Ｍｅｓｐｌｅｄｅ  Ｔら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２０１２；ＵＳ２００８／０１０２０８４又はＵＳ６３０６３９７。別の本発明の態様において、本発明の構築体は、本発明は、下記の文献に説明された発癌特性を阻害することがわかっている位置に、ＨＰＶ１８  Ｅ６、Ｅ７のいずれか若しくは両方において１又は複数の変異を伴う、ＨＰＶ１８  Ｅ６、Ｅ７又はＨＰＶ１８  Ｅ６／Ｅ７キメラ構築体を含む：Ｄａｌａｌ  Ｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９６；Ｍｕｎｇｅｒ  Ｋら、ＥＭＢＯ、１９８９；Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９５；Ｃｒｏｏｋ  Ｔら、Ｃｅｌｌ、１９９１；Ｍｕｎｇｅｒ  Ｋら、ＨＰＶオンライン抄録、１９９７年（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｄｇｅｎ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ＿ＰＤＦ／９７ＰＤＦ／３／Ｅ７．ｐｄｆ）；Ｍｏｏｄｙ  Ｃら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１０；ＵＳ２００８／０１０２０８４及びＵＳ６３０６３９７。
【００２９】
本ワクシボディ部分（標的化モジュール及び二量体化モジュール）は、最終の融合タンパク質において、Ｅ６及びＥ７野生型タンパク質の発癌特性を根絶し得る可能性が存在する。従って、本発明の更に別の態様は、ワクシボディ構築における野生型完全長Ｅ６及び／又はＥ７配列の利用である。
【００３０】
本発明は、全て図１に説明された全般的フォーマットを基にした、ワクシボディＨＰＶ治療的ＤＮＡワクチンのいくつかの変種を説明しており、この治療的ワクシボディ−ＨＰＶ  ＤＮＡワクチンは、ヒトにおいて天然に発現される遺伝子をコードしており；標的化モジュール遺伝子は、ケモカインｈＭＩＰ−１αをコードしており、これは、ＡＰＣの細胞表面に発現されたそのコグネイト受容体ＣＣＲ１及びＣＣＲ５に結合する。二量体化モジュール遺伝子は、ヒトＩｇＧ３由来などのヒンジ領域及び定常重鎖３をコードしており、これは、２つのワクシボディモノマーを結合させ、ホモ二量体分子を形成する。現在の戦略のためのワクチンモジュールをコードしている遺伝子は、任意に発癌特性を阻害する変異を１又は複数含む、完全長ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＥ６抗原などの、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８  Ｅ７及びＥ６抗原などのＨＰＶからなる。一旦インビボにおいて皮内注射により投与され、それに続きエレクトロポレーションされると、本ワクチン構築体を取り込んでいる真皮細胞は、ワクシボディ−ＨＰＶ分子を発現するであろう。インビボにおいて生成されたワクシボディワクチンは、皮膚のＡＰＣの、特にＤＣの表面上に発現されたＣＣＲ１及びＣＣＲ５を標的化する。ワクシボディ分子のそのコグネイト受容体への結合は、ＡＰＣにおけるその複合体のインターナリゼーション、これらのタンパク質の小型ペプチドへの分解に繋がり、これらはＭＨＣ分子上に負荷され且つＣＤ４+  及びＣＤ８+  Ｔ細胞を提示し、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７特異的免疫応答を誘導する。一旦刺激されたＣＤ８+  Ｔ細胞は、活性化されたＣＤ４+  Ｔ細胞から助けを借り、ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＥ７発現している細胞を標的化し且つ殺傷するであろう（図２）。「ビルトイン」アジュバント作用を伴うワクチンに対するそのような増強された免疫応答は、潜在的に免疫寛容を破壊することにより腫瘍−エスケープを克服し（腫瘍免疫監視機構）、且つ効果的に悪性細胞を殺傷する。ｈＭＩＰ−１α標的化ユニットは、ヒンジ領域などの二量体化モチーフを通じて、抗原性ユニットへ結合され、ここで抗原性ユニットは、ＣＯＯＨ−末端又はＮＨ2−末端のいずれかにある。本発明は、この組換えタンパク質をコードしているＤＮＡ配列のみではなく、ワクシボディＤＮＡ、ワクシボディＲＮＡ、又はワクシボディタンパク質によりワクチン接種することにより優先的に哺乳動物を治療するための、これらのＤＮＡ配列を含む発現ベクター、該発現ベクターを含む株化細胞にも関し、最後に該分子を含んでなる医薬品及びキットに関する。
【００３１】
本発明のタンパク質内の二量体化モチーフは、ヒンジ領域及び免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｃγ３ドメイン）、例えばカルボキシ末端のＣドメイン（ＣH３ドメイン）、又は該Ｃドメインと実質的に同一である配列を含むように構築されてよい。このヒンジ領域は、Ｉｇ由来であり、且つ鎖間共有結合、例えばジスルフィド橋の形成を通じ二量体化に寄与する。加えてこれは、ドメイン間の可動性スペーサーとして機能し、これら２つの標的化ユニットが、様々な距離で発現されたＡＰＣ上の２つの標的分子に同時に結合することを可能にする。これらの免疫グロブリンドメインは、非共有的相互作用、例えば疎水性相互作用を通じた、ホモ二量体化に寄与する。好ましい実施態様において、ＣH３ドメインは、ＩｇＧに由来する。これらの二量体化モチーフは、他の多量体化部分（例えば、他のＩｇアイソタイプ／サブクラス由来）と交換されてもよい。好ましくは、二量体化モチーフは、ヒトＩｇＧなどの、未変性のヒトタンパク質に由来する。
【００３２】
二量体化モチーフは、抗原性ユニット及び標的化ユニットに関して任意の配向を有してよいことは理解されるべきである。一実施態様において、抗原性ユニットは二量体化モチーフのＣＯＯＨ−末端にあり、標的化ユニットは二量体化モチーフのＮ−末端にある。別の実施態様において、抗原性ユニットは二量体化モチーフのＮ−末端にあり、標的化ユニットは二量体化モチーフのＣＯＯＨ−末端にある。
【００３３】
その開示が引用により本明細書中に組み込まれている、国際出願ＷＯ２００４／０７６４８９は、本発明に従い使用することができる、核酸配列及びベクターを開示している。
【００３４】
本発明のタンパク質は、完全長ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＥ６抗原などの、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＥ６抗原、更にはそれらの免疫原性断片又は変種などのＨＰＶ由来の抗原性ユニットを含んでいる。この抗原性配列は、十分な長さでなければならない。そのような抗原性ユニットの最小の長さは、およそ９個のアミノ酸であってよい。従って一部の実施態様において、ＨＰＶ由来の抗原性ユニットは、そのような抗原性ユニットをコードしている核酸配列内の少なくとも約２７個のヌクレオチドに対応する、少なくとも９個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＨＰＶ由来の抗原性ユニットは、完全長ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＥ６抗原など、かなり長い。所与のＨＰＶ遺伝子型内に、コード領域（頻度＜２％で）及び非コード領域（頻度＜５％で）の制限されたヌクレオチド変化を通じて、多様性が生じる（Ｂｅｒｎａｒｄ  ＨＵら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００６）。そのような変種は、それらの地理的起源を基に系統的に識別され、その結果ヨーロッパ、アフリカ、アジア、アジア系アメリカ、及び北アメリカと表示される。ワクシボディフォーマット内のそのような配列の挿入は、その免疫応答の両方のアームの活性化に繋がり得る。
【００３５】
ワクシボディタンパク質、ワクシボディＤＮＡ、又はワクシボディＲＮＡによるワクチン接種は、後者の２つは、例えば筋肉内又は皮内注射により、それに続くエレクトロポレーションを伴うか伴わずに達成され、これらは全て、本発明に従い実行可能な方法である。
【００３６】
先に考察したように、本発明は、ＨＰＶにより引きおこされた癌又は感染症に対するワクチン組成物に関し、このワクチン組成物は、本発明の分子をコードしている核酸又はそれらの縮重変種を免疫学的有効量含有している。このワクチンは、Ｔ細胞及びＢ細胞の両方の免疫反応を誘起することができてよい。本発明はまた、診断、医療又は科学目的のためのワクシボディＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質を含んでなるキットにも関する。
【００３７】
本発明は更に、本発明の組換え分子を調製する方法であって、本発明の分子を含むベクターを、細胞集団へトランスフェクトする工程；細胞集団を培養する工程；細胞集団から発現された組換えタンパク質を収集する工程；及び、発現されたタンパク質を精製する工程を含む方法に関連している。
【００３８】
前述のヌクレオチド配列は、例えば特異的プロモーターの制御下で、遺伝子治療に適したベクターへ挿入し、且つ細胞へ導入することができる。一部の実施態様において、該ＤＮＡ配列を含むベクターは、ウイルス、例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルス又はアデノ随伴ウイルスである。一部の実施態様において、レトロウイルスが、ベクターとして使用される。好適なレトロウイルスの例は、例えばＭｏＭｕＬＶ又はＨａＭｕＳＶである。遺伝子治療を目的として、本発明のＤＮＡ／ＲＮＡ配列は、コロイド状分散体の形状で、標的細胞へ輸送されることもできる。これらは、例えば、リポソーム又はリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ）を含む。
【００３９】
本発明は、標的化ユニットに加え、本明細書に規定されたアミノ酸配列との、又は本明細書に規定された特異的特性を有するポリペプチドとの最小の程度の配列同一性又は配列相同性を有する抗原性ユニットの使用を包含している。本発明は、特に配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３４のいずれか一つとある程度の配列同一性を有する、本発明の構築体において使用される、ペプチド変種又はペプチドユニットの使用を包含している。ここで用語「変種」とは、対象アミノ酸配列又は対象ヌクレオチド配列とある程度の配列同一性を有する実体を意味し、ここで対象アミノ酸配列は好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３，配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、又は配列番号３４である。
【００４０】
一態様において、変種又は断片のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３４のポリペプチドの機能活性を維持しているか及び／又は活性を増強するポリペプチドを提供するか及び／又はコードしていなければならない。
【００４１】
本文脈において、変種配列は、対象配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であることができる、アミノ酸配列を含むとみなされる。典型的には、本明細書に従い使用される変種は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含むであろう。相同性は、類似性に関すると考えることもできる（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）が、本発明の文脈においては、これは配列同一性に関する相同性を表すことが好ましい。
【００４２】
配列同一性比較は、目視によるか、又はより通常的は、容易に入手可能な配列比較用コンピュータプログラムの助けを借りて実行することができる。これらの市販されているコンピュータプログラムは、複雑な比較アルゴリズムを使用し、２種以上の配列間の差異に繋がり得る進化的事象を最良に反映している２つ以上の配列をアラインメントする。従ってこれらのアルゴリズムは、同一又は類似のアミノ酸のアラインメントをリワードとし、並びにギャップ挿入、ギャップイクステンション及び類似していないアミノ酸のアラインメントをペナルティとする、スコアリングシステムと共に操作する。比較アルゴリズムのスコアリングシステムは、以下を含む：
ｉ）ギャップを挿入する各時点での、ペナルティスコアの割り当て（ギャップペナルティスコア）、
ｉｉ）存在するギャップを余分な位置でイクステンションする各時点での、ペナルティスコアの割り当て（イクステンションペナルティスコア）、
ｉｉｉ）同一アミノ酸のアラインメント時の、高スコアの割り当て、並びに
ｉｖ）同一でないアミノ酸のアラインメント時の、変数スコア（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｃｏｒｅ）の割り当て。
【００４３】
ほとんどのラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することが可能である。しかし、配列比較のためのそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが、好ましい。
【００４４】
同一でないアミノ酸のアラインメントのために与えられたスコアは、置換マトリクスとも称されるスコアリングマトリクスに従い割り当てられる。このような置換マトリクスにおいて提供されたスコアは、進化時に別のアミノ酸と置換されている一つのアミノ酸の尤度は、変動し、且つ置換されるアミノ酸の物理的／化学的性質に依存するという事実を反映している。例えば、極性アミノ酸が別の極性アミノ酸と置換される尤度は、疎水性アミノ酸と置換されるものと比べ、より高い。従ってこのスコアリングマトリクスは、同一アミノ酸に最高スコアを、同一でないが類似したアミノ酸により低いスコアを、並びに同一でなく類似してもいないアミノ酸に更に低いスコアを割り当てるであろう。最も頻繁に使用されるスコアリングマトリクスは、ＰＡＭマトリクス（Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）、Ｊｏｎｅｓら（１９９２））、ＢＬＯＳＵＭマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２））、並びにＧｏｎｎｅｔマトリクス（Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２））である。
【００４５】
そのようなアラインメントの実行に適したコンピュータプログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、並びにＣｌｕｓｔａｌＶ、ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ及びＳｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９２）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）、Ｌａｒｋｉｎら（２００７））を含むが、これらに限定されるものではない。様々なアラインメントツールの選択は、ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバー（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）から入手可能である。配列アラインメントを実行することができるソフトウェアの別の例は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）であり、これはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／において認められる、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブページから入手可能であり、且つ最初にＡｌｔｓｃｈｕｌらの論文、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２１５；４０３−４１０（１９９０）において説明された。
【００４６】
一旦ソフトウェアが、アラインメントを作製したならば、％類似性及び％配列同一性を計算することが可能である。このソフトウェアは通常は、配列比較の一部としてこれを実行し、数値の結果を生じる。
【００４７】
一実施態様において、配列アラインメントの実行のためには、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを使用することが好ましい。好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷによるアラインメントは、対のあるアラインメントのために、下記のパラメータにより実行される：
【表１】
0006258864.tif 000002
【００４８】
ＣｌｕｓｔａｌＷ２は、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）により、ＥＭ  ＢＬ−ＥＢＩウェブページｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋで、ツール−配列解析−ＣｌｕｓｔａｌＷ２の下、インターネット上で利用可能に作製されている。現時点の、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ツールの正確なアドレスは、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２である。
【００４９】
別の実施態様において、配列アラインメントを実行するために、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）においてプログラムＡｌｉｇｎ  Ｘを使用することが好ましい。一実施態様において、Ｅｘｐ１０は、デフォルトの設定を使用することができる：
ギャップオープニングペナルティ：１０
ギャップイクステンションペナルティ：０．０５
ギャップセパレーションペナルティ範囲：８
スコアマトリクス：ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２
【００５０】
従って本発明は、本明細書に規定されたタンパク質、ポリペプチド、モチーフ又はドメインの任意のアミノ酸配列の、特に配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１ｌ、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３４の配列の、変種、断片、及び誘導体の使用も包含している。
【００５１】
配列、特に配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１ｌ、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３４の変種、断片、及び誘導体の配列は、サイレント変化を生じ且つ機能的に同等の物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有してもよい。計画的なアミノ酸置換は、その物質の副次的な結合活性が維持される限りは、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性を基に行うことができる。例えば、負帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み；正帯電したアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み；並びに、類似した親水値を有する非帯電の極性ヘッド基を持つアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンを含む。
【００５２】
本発明はまた、起こり得る、保存的置換（置換及び置き換えは両方とも、現存するアミノ酸残基の代替の残基による相互変換を意味するように本明細書において使用される）、すなわち、塩基性の塩基性との、酸性の酸性との、極性の極性とのなどの、同種（ｌｉｋｅ−ｆｏｒ−ｌｉｋｅ）置換を包含している。同じく非保存的置換、すなわち、残基の一つのクラスの別の残基クラスへの置換、或いは、オルニチン（以後Ｚと称す）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後Ｂと称す）、ノルロイシンオルニチン（以後Ｏと称す）、ピリル（ｐｙｒｉｙｌ）アラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなど、非天然のアミノ酸の含有が関与する置換も、起こり得る。
【００５３】
起こり得る保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、ヒドロキシルアミノ酸（セリン、トレオニン）、大型アミノ酸（フェニルアラニン及びトリプトファン）、並びに小型アミノ酸（グリシン、アラニン）の群内である。
【００５４】
置き換えはまた、非天然のアミノ酸によっても起こり得；α＊及びα−二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然のアミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えばトリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＃＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（ｌ，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃、及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊が挙げられる。記号＊は、上記考察（相同又は非保存的置換に関する）の目的で、誘導体の疎水性性質を示すのに用いられているのに対し、＃は、誘導体の親水性性質を示すのに用いられ、＃＊は両親媒性の特徴を示す。
【００５５】
変種アミノ酸配列は、グリシン残基又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む配列のいずれか２つのアミノ酸残基間に挿入されてよい適切なスペーサー基を含んでもよい。更なる変形の形状には、ペプトイド型の１又は複数のアミノ酸残基の存在が関与し、これは当業者には良く理解されているであろう。疑義を避けるために、「ペプトイド型」は、α−炭素置換基が、α−炭素以外のその残基の窒素原子上にある変種アミノ酸残基を指すように使用される。ペプトイド型でペプチドを調製する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｓｉｍｏｎ  ＲＪら（１９９２）、Ｈｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ．（１９９５）の文献がある。
【００５６】
一実施態様において、本発明のホモ二量体タンパク質において使用される変種標的化ユニットは、それとの少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸の配列を有する変種である。
【００５７】
一態様において、本発明において使用されるタンパク質又は配列は、精製された形状であることが好ましい。用語「精製された」とは、所与の成分が、高レベルで存在することを意味する。この成分は望ましくは、組成物中に存在する最も有力な活性成分である。
【００５８】
「変種」又は「変種類」とは、タンパク質、ポリペプチド、ユニット、モチーフ、ドメイン又は核酸をいう。用語「変種」は、用語「変異体」と互換的に使用されてよい。変種は、アミノ酸又はヌクレオチドの配列内の１又は複数の位置での、各々挿入、置換、トランスバージョン、切断及び／又は反転を含む。語句「変種ポリペプチド」、「ポリペプチド」、「変種」及び「変種酵素」は、配列番号１のアミノ酸配列から修飾されているアミノ酸配列を有するポリペプチド／タンパク質を意味する。変種ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１ｌ、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３４のアミノ酸配列と、ある割合の配列同一性、例えば８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５９】
「変種核酸」は、本明細書に提示されたヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である配列と相補的である配列を含むことができる。例えば、変種配列は、例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）などの、ストリンジェント条件下で、本明細書に提示されたヌクレオチド配列へハイブリダイズすることが可能な配列と相補的である。より特定すると、用語変種は、例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣなどのより高度にストリンジェントな条件下で、本明細書に提示されたヌクレオチド配列へハイブリダイズすることが可能である配列と相補的である配列を包含している。変種核酸の融解温度（Ｔｍ）は、野生型核酸のＴｍよりも、約１、２、又は３℃低いことができる。変種核酸は、本発明のホモ二量体タンパク質を形成することができるモノマータンパク質をコードしている配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１ｌ、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３４をコードしている核酸と、ある割合の配列同一性、例えば８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
変異の具体的範疇は、下記のＥ６及びＥ７における変異である：
Ｅ６タンパク質は、ｐ５３結合を不可能にすることにより解毒することができる。完全長ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質内の５つの位置Ｆ４７、Ｌ５０、Ｃ６３、Ｃ１０６及びＩ１２８は、Ｅ６機能性を失活するための変異の位置である。これらの位置の中の任意のアミノ酸置換は、Ｅ６の失活に繋がり、且つ腫瘍抑制を誘導することができる。これらの位置のいずれか一つにおける任意の異なる１個のアミノ酸との置換は、潜在的に利用することができる。潜在的変異の部位は、配列番号２２に示されている。
【００６１】
Ｅ７タンパク質において、Ｎ−末端Ｒｂ（網膜芽細胞腫結合タンパク質）結合部位モチーフ（ＬＸＣＸＥ）及びＺｎ−結合モチーフを伴う２つの保存領域３（ＣＸＸＣ）（上流及び下流）を含む、発癌特性に関連した保存された領域が存在する（Ｐｈｅｌｐｓら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、４月号、１９９２、６６巻、４２４１８−２４２頁；Ｇｕｌｌｉｖｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９７、８月号；７１（８）参照）。ＬＸＣＸＥ−モチーフにおける好ましい変異部位は、Ｃ２４及びＥ２６である。２つのＣＸＸＣモチーフにおける好ましい部位は、Ｃ５８、Ｃ６１、Ｃ９１及びＣ９４である。しかし、これらの領域における任意の変異は、結合機能を低下するために置換され、その結果Ｅ７の発癌作用が無効にされると想定することができる。潜在的変異の部位は、配列番号２３に示されている。
【００６２】
シグナルペプチド：
新生ポリペプチドのＮ−末端のシグナルペプチドは、ゴルジ複合体への輸送前に、前記分子をＥＲへ方向づける。シグナルペプチドは、一旦タンパク質のＥＲへの標的化及び輸送のその目的を果たすと、これはシグナルペプチダーゼにより切断される。これらのシグナルペプチドは一般に、１５〜３０個のアミノ酸であるが、５０残基以上を有することができる（Ｍａｒｔｏｇｌｉｏ，  Ｂ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８；Ｋｎａｐｐｓｋｏｇ，  Ｓら、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００７）。未変性のシグナルペプチドは、哺乳動物、原核生物又は海洋生物起源からのシグナルペプチドにより置き換えることができる。一般に使用されるシグナルペプチドは、大量のタンパク質を分泌するそれらの天然の能力のために、例えば、ヒトＩＬ−２及びヒトアルブミンである。シグナルペプチドの選択は、合成され且つ分泌されるタンパク質の量に対しかなりの影響を有することができる。
【００６３】
一部の実施態様において、本発明のタンパク質構築において使用されるシグナルペプチドは、ＬＤ７８βのシグナル配列などの、ケモカインタンパク質に由来する。
【００６４】
一部の実施態様において、シグナルペプチドは、国際出願である国際公開公報ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６０６２８に開示されたｐＬＮＯＨ２（Ｂ１−８可変免疫グロブリンリーダー）からは誘導されない。
一部の実施態様において、シグナルペプチドは、免疫グロブリン遺伝子から誘導されない。
【００６５】
本明細書において使用される用語「ホモ二量体タンパク質」とは、２本の個別のアミノ酸同一鎖、又は水素結合、イオン（帯電した）相互作用、実際の共有ジスルフィド結合、若しくはこれらの相互作用のいくつかの組合せにより単独の二量体タンパク質として一緒に保持されたサブユニットを含むタンパク質をいう。
【００６６】
本明細書において使用される用語「二量体化モチーフ」とは、ヒンジ領域及び二量体化に貢献し得る任意の第二ドメインを含む、抗原性ユニットと標的化ユニットの間のアミノ酸の配列をいう。この第二ドメインは、免疫グロブリンドメインであってよく、且つ任意にヒンジ領域及び第二ドメインは、リンカーを通じて結合される。従って、二量体化モチーフは、抗原性ユニットと標的化ユニットを結合するよう働くが、本発明のホモ二量体タンパク質へのこれら２つのモノマータンパク質の二量体化を促進するヒンジ領域も含む。
【００６７】
本明細書において使用される用語「標的化ユニット」とは、ＣＤ４+  Ｔ細胞へのＭＨＣクラスＩＩ−制限された提示のための、又はＭＨＣクラスＩ制限によるＣＤ８+  Ｔ細胞への交差提示を提供するための、マウス又はヒトＡＰＣへとその抗原を備えたタンパク質を輸送するユニットをいう。本発明の構築体において使用される標的化ユニットは、成熟ＬＤ７８−βに由来するか又はこれと同一である。
【００６８】
本明細書において使用される用語「抗原性ユニット」とは、抗体、又はＴ細胞上の表面受容体などの免疫系の他の成分により特異的に認識され得る、ペプチドなどの任意の分子をいう。免疫応答を誘導することができる免疫原も、この定義に含まれる。用語「エピトープ」又は「抗原性エピトープ」は、抗原性ユニット内の短いペプチド配列により提供される分子表面などの、個別の分子表面を指すように使用される。一部の実施態様において、抗原性ユニットは、２種以上の抗原性エピトープを含む。本発明の構築体において使用される抗原性ユニットは、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８などの、ＨＰＶの初期遺伝子産物Ｅ６及びＥ７から誘導されるか又はこれと同一である。
【００６９】
用語「ヒンジ領域」とは、例えばジスルフィド橋などの鎖内共有結合の形成などを通じてなど、二量体化を促進する、ホモ二量体タンパク質のペプチド配列をいう。ヒンジ領域は、ＩｇＧ３などの、Ｉｇのヒンジエクソンｈ１＋ｈ４など、Ｉｇ由来であることができる。
【００７０】
（本発明の具体的実施態様）
前述のように、本発明は、２本の同一のアミノ酸鎖のホモ二量体タンパク質であって、各アミノ酸鎖が、（１）シグナルペプチド、（２）標的化ユニット、（３）二量体化モチーフ、及び（４）抗原性ユニットを含んでなり、該標的化ユニットが、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３に対する少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに抗原性ユニットが、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８の初期タンパク質Ｅ６及び／又はＥ７由来の抗原性ユニットなどの、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８のアミノ酸配列を含む抗原性ユニットなどの、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のアミノ酸配列を含む、ホモ二量体タンパク質に関する。本発明の一部の実施態様において、アミノ酸鎖内の該標的化ユニット、二量体化モチーフ及び抗原性ユニットは、Ｎ−末端からＣ−末端へ標的化ユニット、二量体化モチーフ及び抗原性ユニットの順番である。
【００７１】
一部の実施態様において、本発明の構築体において使用される抗原性ユニットは、初期タンパク質Ｅ６及び／又はＥ７に由来など、ＨＰＶ１６に由来している。
一部の実施態様において、本発明の構築体において使用される抗原性ユニットは、ＨＰＶ１６のＥ６に由来している。
一部の実施態様において、本発明の構築体において使用される抗原性ユニットは、ＨＰＶ１６のＥ７に由来している。
【００７２】
一部の実施態様において、本発明の構築体において使用される抗原性ユニットは、初期タンパク質Ｅ６及び／又はＥ７に由来など、ＨＰＶ１８に由来している。
一部の実施態様において、本発明の構築体において使用される抗原性ユニットは、ＨＰＶ１８のＥ６に由来している。
一部の実施態様において、本発明の構築体において使用される抗原性ユニットは、ＨＰＶ１８のＥ７に由来している。
【００７３】
本発明の一部の実施態様において、シグナルペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列１−２３に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
本発明の一部の実施態様において、シグナルペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列１−２３に対する、少なくとも８５％、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００７４】
本発明の一部の実施態様において、標的化ユニットは、配列番号１のアミノ酸配列２４−９３に対する、少なくとも８５％、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００７５】
本発明の一部の実施態様において、二量体化モチーフは、ヒンジ領域、及び任意にリンカーを介して結合された免疫グロブリンドメインなどの二量体化を促進する任意に別のドメインを含んでなる。
【００７６】
本発明の一部の実施態様において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ３由来など、Ｉｇ由来である。
本発明の一部の実施態様において、ヒンジ領域は、１、２又はいくつかの共有結合を形成する能力を有する。本発明の一部の実施態様において、共有結合は、ジスルフィド橋である。
【００７７】
本発明の一部の実施態様において、二量体化モチーフの免疫グロブリンドメインは、カルボキシ末端のＣドメイン、又は該Ｃドメイン若しくはそれらの変種と実質的に同一である配列である。
本発明の一部の実施態様において、カルボキシ末端のＣドメインは、ＩｇＧ由来である。
【００７８】
本発明の一部の実施態様において、二量体化モチーフの免疫グロブリンドメインは、ホモ二量体化する能力を有する。
【００７９】
本発明の一部の実施態様において、免疫グロブリンドメインは、非共有的相互作用を介してホモ二量体化する能力を有する。本発明の一部の実施態様において、非共有的相互作用は、疎水性相互作用である。
【００８０】
本発明の一部の実施態様において、二量体化ドメインは、ＣＨ２ドメインを含まない。
本発明の一部の実施態様において、二量体化モチーフは、リンカーを通じてヒトＩｇＧ３のＣH３ドメインへ結合されたヒンジエクソンｈ１及びｈ４からなる。
【００８１】
本発明の一部の実施態様において、二量体化モチーフは、配列番号３のアミノ酸配列９４−２３７に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
本発明の一部の実施態様において、リンカーは、Ｇ3Ｓ2Ｇ3ＳＧリンカーである。
【００８２】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニット及び二量体化モチーフは、ＧＬＧＧＬリンカー又はＧＬＳＧＬリンカーなどの、リンカーを通じて結合される。
【００８３】
本発明の一部の実施態様において、標的化ユニットは、配列番号１のアミノ酸２４−９３、又はそれらの変種からなる。
【００８４】
本発明の一部の実施態様において、ホモ二量体タンパク質は、配列番号１のアミノ酸２４−９３からなる標的化ユニット、又はそれらの変種を伴う同じホモ二量体タンパク質の親和性と比べ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５から選択されたいずれか一つのケモカイン受容体に対する増大した親和性を有する。
【００８５】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号３のアミノ酸配列２４３−２９３に対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００８６】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号３のアミノ酸配列２４３−２９３に対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００８７】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号２２のＦ４７、Ｌ５０、Ｃ６３、Ｃ１０６及びＩ１２８からなるリストから選択された位置に１若しくは複数のアミノ酸置換を、又は配列番号２２のＹ４３−Ｌ５０からなるリストから選択された１若しくは複数のアミノ酸が関与する欠失を含んでなる。
【００８８】
本発明は一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号２２に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８又は２０以下のアミノ酸の置換及び／又は欠失を含んでなる。
【００８９】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、若しくは配列番号９のアミノ酸配列２４３−２９３、又はそれらの変種若しくは抗原性断片を含んでなる。
【００９０】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、若しくは配列番号９のアミノ酸配列２４３−２９３、又はそれらの変種若しくは抗原性断片からなる。
【００９１】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号１１のアミノ酸配列２４３−３４０に対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００９２】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号１１のアミノ酸配列２４３−３４０に対する、少なくとも８０％など、少なくとも８１％、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００９３】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号２３のＣ２４、Ｅ２６、Ｃ５８、Ｃ６１、Ｃ９１、及びＣ９４からなるリストから選択された位置に１若しくは複数のアミノ酸置換を、又は配列番号２３のＬ２２−Ｅ２６及び／若しくはＣ５８−Ｃ６１及び／若しくはＣ９１−Ｓ９５からなるリストから選択された１若しくは複数のアミノ酸が関与する欠失を含んでなる。
【００９４】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号２３に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８又は２０以下のアミノ酸の置換及び／又は欠失を含んでなる。
【００９５】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、若しくは配列番号１７のアミノ酸配列２４３−３４０、又はそれらの変種若しくは抗原性断片を含んでなる。
【００９６】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、若しくは配列番号１７のアミノ酸配列２４３−３４０、又はそれらの変種若しくは抗原性断片からなる。
【００９７】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３２、又は配列番号３４のアミノ酸配列２４３−５０１に対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【００９８】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３２、又は配列番号３４のアミノ酸配列２４３−５０１に対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００９９】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、初期タンパク質Ｅ６及びＥ７の両方に由来したヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）のアミノ酸配列を含んでなる。
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、初期タンパク質Ｅ６及びＥ７の両方に由来したヒトパピローマウイルス１８（ＨＰＶ１８）のアミノ酸配列を含んでなる。
【０１００】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号２２のＦ４７、Ｌ５０、Ｃ６３、Ｃ１０６及びＩ１２８、並びに配列番号２３のＣ２４、Ｅ２６、Ｃ５８、Ｃ６１、Ｃ９１、Ｃ９４からなるリストから選択された位置に、１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる。
【０１０１】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号２２及び配列番号２３に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８又は２０以下のアミノ酸の置換及び／又は欠失を含んでなる。
【０１０２】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３２、若しくは配列番号３４のアミノ酸配列２４３−５０１、又はそれらの変種若しくは抗原性断片からなる。
【０１０３】
本発明の一部の実施態様において、アミノ酸鎖は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３２、及び配列番号３４からなるリストから選択されたアミノ酸配列、又はそれらの変種若しくは抗原性断片からなる。
【０１０４】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。
【０１０５】
本発明の一部の実施態様において、抗原性ユニットは、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列に対する、少なくとも８０％、少なくとも８１％など、少なくとも８２％など、少なくとも８３％など、少なくとも８４％など、少なくとも８５％など、少なくとも８６％など、少なくとも８７％など、少なくとも８８％など、少なくとも８９％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％など、少なくとも９２％など、少なくとも９３％など、少なくとも９４％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％などの配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【０１０６】
一部の実施態様において、本発明のホモ二量体タンパク質は、任意のシグナルペプチド配列を伴わない、その成熟型である。
一部の実施態様において、本発明の核酸分子は、ヒトコドンに最適化されている。
【０１０７】
本発明のヒトコドンに最適化された核酸分子は、野生型配列と比べ、１又は複数の核酸置換を含み、この置換は、ヒトコード領域においてより高いコドン使用頻度を伴うコドンを提供することは理解されるべきである。ホモ・サピエンスにおけるコドン使用頻度は、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｉｋｉ．ｅｄｕ−ｗｉｋｉ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｃｏｃｏｎ＿ｔａｂｌｅにおいて認めることができる。
【０１０８】
一部の実施態様において、本発明の核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号３１及び配列番号３３からなるリストから選択されたヌクレオチド配列、又はそれらの変種のいずれか一つを含んでなる。
【０１０９】
一部の実施態様において、本発明の核酸分子は、ベクターにより構成される。
一部の実施態様において、本発明の核酸分子は、患者におけるホモ二量体タンパク質の生成を誘導するための、該患者への投与のために製剤化されている。
【０１１０】
一部の実施態様において、本発明のワクチンは、医薬的に許容し得る担体及び／又はアジュバントを更に含有する。
【０１１１】
一部の実施態様において、本発明に従い、患者においてＨＰＶにより引き起こされた癌又は感染症などの、ＨＰＶ誘発性疾患又は状態を治療又は予防する方法は、本発明のＤＮＡなどの、核酸分子を、それを必要とする患者へ投与し、エレクトロポレーションの後続の工程を伴うことを含む。一部の実施態様において、投与は、皮内又は筋肉内で行われる。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１  ワクチンの構築及び発現）
遺伝子配列を、下記構造に従いデザインした：１：ヒトＬＤ７８  ｂに関する未変性のリーダー配列、２：完全長ＬＤ７８ｂ配列、３：ＩｇＧ３由来のヒトヒンジ−領域１、４：ＩｇＧ３由来のヒトヒンジ領域４、５：グリシン−セリンリンカー、６：ＩｇＧ３由来のヒトＣＨ３ドメイン、７：グリシン−ロイシンリンカー、８：野生型及び変異型ヒトパピローマウイルス癌遺伝子Ｅ６、Ｅ７、並びにグリシン−セリンリンカーにより分割されたＥ６及びＥ７の両方の融合タンパク質。これらの構築体は、下記のようなそれらのＥ６及び／又はＥ７組成に従い、命名されている：
ＶＢ１００１：ワクシボディ−Ｅ６  野生型；
ＶＢ１００５：ワクシボディ−Ｅ７  野生型；
【０１１３】
変異型は、対応する未変性のＥ６又はＥ７配列内のアミノ酸の位置に従い、命名されている。
ＶＢ１００２：ワクシボディ−Ｅ６  Ｃ６３Ｒ；
ＶＢ１００３：ワクシボディ−Ｅ６  Ｃ１０６Ｒ；
ＶＢ１００４：ワクシボディ−Ｅ６  Ｆ４７Ｒ、Ｃ６３Ｒ、Ｃ１０６Ｒ；
ＶＢ１００６：ワクシボディ−Ｅ７  Ｃ２４Ｇ、Ｅ２６Ｇ；
ＶＢ１００７：ワクシボディ−Ｅ７  Ｃ２４Ｇ、Ｅ２６Ｇ、Ｃ５８Ｇ、Ｃ６１Ｇ；
ＶＢ１００８：ワクシボディ−Ｅ７  Ｃ２４Ｇ、Ｅ２６Ｇ、Ｃ９１Ｇ、Ｃ９４Ｇ；
ＶＢ１００９：ワクシボディ−  Ｅ７  Ｃ２４Ｇ、Ｅ２６Ｇ／Ｅ６  Ｆ４７Ｒ、Ｃ６３Ｒ、Ｃ１０６Ｒ；
ＶＢ１０１６：ワクシボディ−  Ｅ７  Ｃ２４Ｇ、Ｅ２６Ｇ／Ｅ６  Ｃ６３Ｒ、Ｃ１０６Ｒ；
ＶＢ１０２０：ワクシボディ−  Ｅ７  Ｃ２４Ｇ、Ｅ２６Ｇ／Ｅ６  Ｆ４７Ｒ、Ｃ６３Ｒ、Ｃ１０６Ｒ、ヒトコドンに最適化
ＶＢ１０２１：ワクシボディ−  Ｅ７  Ｃ２４Ｇ、Ｅ２６Ｇ／Ｅ６  Ｆ４７Ｒ、Ｌ５０Ｇ、Ｃ１０６Ｒ、Ｉ１２８Ｔ、ヒトコドンに最適化。
【０１１４】
抗原のみから構成される対照ワクチンは、以下を含んでいる：
対照１：Ｅ７  Ｃ２４Ｇ、Ｅ２６Ｇ／Ｅ６  Ｆ４７Ｒ、Ｃ６３Ｒ、Ｃ１０６Ｒ；
対照２：Ｅ７  Ｃ２４Ｇ、Ｅ２６Ｇ／Ｅ６  Ｃ６３Ｒ、Ｃ１０６Ｒ。
【０１１５】
全ての遺伝子配列は、Ａｌｄｅｖｒｏｎ社（ファーゴ、ＮＤ、米国）又はＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ社から整理され、発現ベクターｐＵＭＶＣ４ａへクローニングされた。
全ての構築体は、２９３Ｅ細胞へトランスフェクトし、無傷のワクシボディタンパク質の発現の検証は、ドットブロット及びＥＬＩＳＡにより行った（データは示さず）。対照１及び２を除く、全てのアミノ酸配列は、配列番号として示している。
【０１１６】
（実施例２  免疫応答試験）
ＶＢ１００９、ＶＢ１０１６、ＶＢ１０２０及びＶＢ１０２１を、各々、それらの対応する対照１及び２と共に、ワクチン候補として選択した。陰性対照として、空のｐＵＭＶＣ４ａベクターを利用した。
【０１１７】
各候補のプラスミドＤＮＡの２５、１２．５及び１．４μを、Ｃ５７ＢＩ／６マウスの腰部に皮内注射し、引き続きＤｅｒｍａｖａｘエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、パリ、仏国）した。７日後、マウスを、類似量のワクチン及び対照プラスミドにより追加免疫した。２１日目に、マウスを屠殺し、脾臓を摘出した。
Ｔ細胞反応は、ＥＬＩＳＰＯＴにより計算した（図３ａ、ｂ及びｃ）。
【０１１８】
（実施例３  治療的作用）
対応する対照１及び２と共に、ＶＢ１０１６、ＶＢ１０２０及びＶＢ１０２１を、治療的ワクチン試験のためのワクチン候補として選択した。
ＴＣ−１細胞５×１０4又は５×１０5個（ジョンホプキンス大学、ボルチモア、米国、Ｌｉｎ  ＫＹら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９６）を、Ｃ５７ＢＩ／６マウスの頸部又は大腿部領域へ注射した。３日目及び１０日目、又は３、７及び１０日目に、マウスを、プラスミドＤＮＡ  ２μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ又は２０μｇにより、ワクチン接種し、引き続きＤｅｒｍａｖａｘエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、仏国）した。ＴＣ−１細胞注射後４９日目まで、腫瘍サイズを、１週間に２〜３回測定した（図４、５及び６）。
【０１１９】
（実施例４）
使用される治療的ＤＮＡワクチンは、ＧＭＰ細胞バンク、医薬物質及び医薬製品の製造に関するＧＭＰ、ＩＣＨ安定性試験、並びにＤＮＡワクチンの製剤化（Ｆｉｌｌ  ＆  Ｆｉｎｉｓｈ）を含む、規制当局の指針に従い、プラスミドワクチンのＧＭＰ製造により、調製することができる。ＤＮＡワクチンは、１０ｎＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡなどの塩溶液中に、濃度２〜５ｍｇ／ｍｌで溶解することにより、製剤化することができる。ワクチンは、皮内又は筋肉内のいずれかに投与し、引き続きエレクトロポレーションを伴う又は伴わないことができる。
【０１２０】
配列：
シグナルペプチド（太字のアミノ酸１−２３）及び成熟型ペプチド（ＬＤ７８−β）、アミノ酸２４−９３（配列番号１）を含む、Ｃ−Ｃモチーフケモカイン３−様１前駆体：
【表２】
0006258864.tif 000003
【０１２１】
ワクシボディＨＰＶ構築体の特異的ＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列：
Ｅ６又はＥ７単独構築体：
単に例示する目的で、この構築体の様々なドメインを、下記の順番で、ドメインを伴う「｜」により分離した：シグナルペプチド｜ヒトＭＩＰ−１α｜ヒンジｈ１｜ヒンジｈ４｜Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー又はＧｌｙ−Ｌｅｕリンカー｜ｈＣＨ３  ＩｇＧ３｜Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー又はＧｌｙ−Ｌｅｕリンカー｜野生型若しくは変異体完全長Ｅ６又はＥ７。太字のアミノ酸又はヌクレオチドは、変異の位置を例示している。
【０１２２】
ＶＢ１００１のＤＮＡ配列（配列番号２）
【表３】
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【０１２３】
ＶＢ１００１のタンパク質配列（Ｅ６を伴う本発明のホモ二量体構築物、配列番号３）：アミノ酸配列：３９３個のアミノ酸
【表４】
0006258864.tif 000005
【０１２４】
ＶＢ１００２のＤＮＡ配列（配列番号４）
【表５】
0006258864.tif 000006
【０１２５】
ＶＢ１００２のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物、配列番号５）：アミノ酸配列、３９３個のアミノ酸
【表６】
0006258864.tif 000007
【０１２６】
ＶＢ１００３のＤＮＡ配列（配列番号６）
【表７】
0006258864.tif 000008
【０１２７】
ＶＢ１００３のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物、配列番号７）：アミノ酸配列、３９３個のアミノ酸
【表８】
0006258864.tif 000009
【０１２８】
ＶＢ１００４のＤＮＡ配列（配列番号８）
【表９】
0006258864.tif 000010
【０１２９】
ＶＢ１００４のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物、配列番号９）：アミノ酸配列、３９３個のアミノ酸
【表１０】
0006258864.tif 000011
【０１３０】
ＶＢ１００５のＤＮＡ配列（配列番号１０）
【表１１】
0006258864.tif 000012
【０１３１】
ＶＢ１００５のタンパク質配列（Ｅ７による本発明のホモ二量体構築物、配列番号１１）：アミノ酸配列、３４０個のアミノ酸
【表１２】
0006258864.tif 000013
【０１３２】
ＶＢ１００６のＤＮＡ配列（配列番号１２）
【表１３】
0006258864.tif 000014
【０１３３】
ＶＢ１００６のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物、配列番号１３）：アミノ酸配列、３４０個のアミノ酸
【表１４】
0006258864.tif 000015
【０１３４】
ＶＢ１００７のＤＮＡ配列（配列番号１４）
【表１５】
0006258864.tif 000016
【０１３５】
ＶＢ１００７のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物、配列番号１５）：アミノ酸配列、３４０個のアミノ酸
【表１６】
0006258864.tif 000017
【０１３６】
ＶＢ１００８のＤＮＡ配列（配列番号１６）
【表１７】
0006258864.tif 000018
【０１３７】
ＶＢ１００８のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物、配列番号１７）：アミノ酸配列、３４０個のアミノ酸
【表１８】
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【０１３８】
Ｅ６及びＥ７を伴う構築体：
単に例示する目的で、この構築体の様々なドメインを、下記の順番で、ドメインを伴う「｜」により分離した：シグナルペプチド｜ヒトＭＩＰ−１α｜ヒンジｈ１｜ヒンジｈ４｜Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー又はＧｌｙ−Ｌｅｕリンカー｜ｈＣＨ３  ＩｇＧ３｜Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー又はＧｌｙ−Ｌｅｕリンカー｜Ｅ７変異体｜Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー又はＧｌｙ−Ｌｅｕリンカー｜Ｅ６変異体。太字のアミノ酸又はヌクレオチドは、変異の位置を例示している。
【０１３９】
ＶＢ１００９のＤＮＡ配列（配列番号１８）
【表１９】
0006258864.tif 000020
【０１４０】
ＶＢ１００９のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物、配列番号１９）：アミノ酸配列、５０１個のアミノ酸
【表２０】
0006258864.tif 000021
【０１４１】
ＶＢ１０１６のＤＮＡ配列（配列番号２０）
【表２１】
0006258864.tif 000022
【０１４２】
ＶＢ１０１６のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物、配列番号２１）：アミノ酸配列、５０１個のアミノ酸
【表２２】
0006258864.tif 000023
【０１４３】
配列番号２２：
＞ｔｒ｜Ｑ７７８Ｉ６｜Ｑ７７８Ｉ６＿ＨＰＶ１６  Ｅ６  タンパク質  ＯＳ＝ヒトパピローマウイルス型１６  ＧＮ＝Ｅ６  ＰＥ＝４  ＳＶ＝１；（下線付きアミノ酸は、欠失され得るアミノ酸を示す；変異され得る可能性のあるアミノ酸は、強調している）
【表２３】
0006258864.tif 000024
【０１４４】
配列番号２３：
＞ｓｐ｜Ｐ０３１２９｜ＶＥ７＿ＨＰＶ１６  タンパク質Ｅ７  ＯＳ＝ヒトパピローマウイルス型１６  ＧＮ＝Ｅ７  ＰＥ＝１  ＳＶ＝１；（下線付きアミノ酸は、欠失され得るアミノ酸を示す；変異され得る可能性のあるアミノ酸は、強調している）
【表２４】
0006258864.tif 000025
【０１４５】
配列番号２４：
＞ｓｐ｜Ｐ０６４６３｜ＶＥ６＿ＨＰＶ１８  タンパク質Ｅ６  ＯＳ＝ヒトパピローマウイルス型１８  ＧＮ＝Ｅ６  ＰＥ＝１  ＳＶ＝１
【表２５】
0006258864.tif 000026
【０１４６】
配列番号２５：
＞ｓｐ｜Ｐ０６７８８｜ＶＥ７＿ＨＰＶ１８  タンパク質Ｅ７  ＯＳ＝ヒトパピローマウイルス型１８  ＧＮ＝Ｅ７  ＰＥ＝３  ＳＶ＝２
【表２６】
0006258864.tif 000027
【０１４７】
配列番号２６：
ヒンジ領域（ＩｇＧ３  ＵＨヒンジ）、１２個のアミノ酸：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ
【０１４８】
配列番号２７：
ヒンジ領域（ＩｇＧ３、ＭＨヒンジ、１５個のアミノ酸）：ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ
【０１４９】
配列番号２８：
Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー：ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ
【０１５０】
配列番号２９：ｈＣＨ３  ＩｇＧ３：
【表２７】
0006258864.tif 000028
【０１５１】
配列番号３０：リンカー：ＧＬＧＧＬ
【０１５２】
配列番号３１；ＶＢ１０２０のＤＮＡ配列
【表２８】
0006258864.tif 000029
【０１５３】
配列番号３２；ＶＢ１０２０のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物）：アミノ酸配列、５０１個のアミノ酸
【表２９】
0006258864.tif 000030
【０１５４】
配列番号３３；ＶＢ１０２１のＤＮＡ配列
【表３０】
0006258864.tif 000031
【０１５５】
配列番号３４；ＶＢ１０２１のタンパク質配列（本発明のホモ二量体構築物、配列番号９）：アミノ酸配列、５０１個のアミノ酸
【表３１】
0006258864.tif 000032
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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