(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前培養および発酵槽中の本培養における発酵培地中のシステイン生産微生物菌株の発酵によるＬ−システインならびにその誘導体であるＬ−シスチンおよびチアゾリジンの製造ための方法であって、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−スレオニンが、本培養における発酵培地に、各々１．５から５ｇ／Ｌの濃度範囲で添加されることを特徴とし、微生物菌株が、対応する野生型酵素と比較して、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が多くても２分の１に低下している修飾されたセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼを保有しているか、または野生型細胞と比較して、エフラックス遺伝子の過発現により、細胞からのシステイン搬出が少なくとも２倍に増加していることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前培養および発酵槽中の本培養における発酵培地中のシステイン生産微生物菌株の発酵によるＬ−システインならびにその誘導体であるＬ−シスチンおよびチアゾリジンの製造ための方法であって、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニンまたはＬ−スレオニンおよびＬ−メチオニンが、本培養における発酵培地に、各々０．１から１０ｇ／Ｌの濃度範囲で添加されることを特徴とし、微生物菌株が、対応する野生型酵素と比較して、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が多くても２分の１に低下している修飾されたセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼを保有しているか、または野生型細胞と比較して、エフラックス遺伝子の過発現により、細胞からのシステイン搬出が少なくとも２倍に増加していることを特徴とする、前記方法。
【請求項３】
メチオニンおよびイソロイシンが、添加されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
腸内細菌科の微生物菌株が使用されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
微生物菌株が、対応する野生型酵素と比較して、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が多くても２分の１に低下しているセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼを保有しているだけではなく、エフラックス遺伝子の過発現により、野生型細胞と比較して、細胞からのＬ−システイン搬出も少なくとも２倍に増加している、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
さらに、対応する野生型酵素と比較して、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が多くても２分の１に低下している変性された３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素を有し、ならびに少なくとも１種のＬ−システイン分解酵素が、野生型細胞と比較して、この酵素活性の最大でも５０％のみが細胞中に存在するように弱体化されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞が好気性成長条件下で培養され、発酵中の酸素含有量が最大５０％飽和で設定されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
炭素供給源が、発酵培地中の炭素供給源含有量が製造段階中に１０ｇ／Ｌを超えないようなやり方で添加されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＬ−システインならびに該アミノ酸の誘導体であるＬ−シスチンおよび２−メチルチアゾリジン−２，４−ジカルボン酸の発酵生産のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−シスチンは、Ｌ−システイン二分子の酸化によって生成されるジスルフィドである。この反応は可逆的であり、還元によりＬ−シスチンをＬ−システインに転化して戻すことができることを意味する。
【０００３】
２−メチルチアゾリジン−２，４−ジカルボン酸（チアゾリジン）は、Ｌ−システインとピルビン酸の縮合生成物であり、完全に化学反応で生成される（ＵＳ５９７２６６３Ａ）。この反応も同様に可逆的である。したがって、チアゾリジンは、例えば高温で酸により分解し、その出発成分に戻ることもある。
【０００４】
アミノ酸であるＬ−システインは、経済的に重要である。例えば、食品添加物（特にパン・菓子製造業における）、化粧品の原材料、そして医薬活性成分（特にＮ−アセチルシステインおよびＳ−カルボキシメチルシステイン）の生産のための原料としても使用されている。
【０００５】
Ｌ−システインは、すべての生物における硫黄代謝において重要な役割を果たし、タンパク質、グルタチオン、ビオチン、リポ酸、メチオニンおよび他の硫黄含有代謝生成物の合成に使用されている。さらに、Ｌ−システインは、補酵素Ａを生合成するための前駆体として役立っている。Ｌ−システインの生合成は、細菌、特に腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）で詳細に研究されており、Ｋｒｅｄｉｃｈ（１９９６，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ，  ｐ．５１４−５２７．Ｉｎ  Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，  Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ，Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍ．Ｅ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｌｏｗ，Ｂ．Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｍ．Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．Ｕｍｂａｒｇｅｒ（ｅｄ．），  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ．ｅｄ．  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）に詳細に記載されている。
【０００６】
Ｌ−システイン生合成における中央代謝からの重要な前駆体は、解糖の中間体である３−ホスホグリセリン酸である。したがって、Ｌ−システインはＬ−セリンおよびグリシンと共にホスホグリセリン酸類の一部として考えられている。対照的にタンパク質を構成するアミノ酸であるＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−スレオニンは、中央代謝からの共有前駆体がクエン酸回路中間体のオキサロ酢酸であるので、オキサロ酢酸類に属する。炭素供給源、例えばグルコースなどから進めると、物質の流れは同化アミノ酸代謝のこれらの２つの異なった枝を介して概ね互いに独立して進行する。しかしながら、ホスホグリセリン酸類の中間体もしくは最終生成物とオキサロ酢酸類の個別の生合成工程との一定の相互作用が知られている。例えば、ホモセリンデヒドロナーゼＩ、Ｌ−アスパルギン酸セミアルデヒドのＬ−ホモセリンへの還元を触媒するｔｈｒＡ遺伝子産物は、Ｌ−セリンによってのみならず、Ｌ−システインによっても阻害され得ることが記載されている（Ｈａｍａら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９，６０４−８；Ｄａｔｔａ，１９６７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８，６３５−４１）。さらに、同化スレオニンデアミナーゼＩｌｖＡはＬ−システインによって阻害されることが知られている（Ｈａｒｒｉｓ，  １９８１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １４５，１０３１−３５）。さらに、Ｌ−スレオニンに類似しているＬ−セリンはＩｌｖＡ遺伝子産物の基質として役立つことができる（Ｒａｓｋｏら、１９７１，Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１，４２４−２７）。
【０００７】
ホスホグリセリン酸類のアミノ酸の発酵生産において、Ｌ−イソロイシンを培地に添加し得ることが種々の特許に記載されている（ＥＰ１２３３０６７、ＥＰ１３８２６８４）が、Ｌ−イソロイシンが種々の可能な添加剤の１つとしてだけ明細書などに引用されている。しかしながら、Ｌ−イソロイシンはアミノ酸生産に有益な効果を有するであろうという事実は、まったく示されてもいなければ明らかにもなっていない。
【０００８】
Ｄａｓｓｌｅｒら（２０００，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１１０１−１１１２）には、アミノ酸であるＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−ロイシンをホスホグリセリン酸類のアミノ酸の発酵生産における前培養培地に添加する（各々、０．３ｇ／Ｌ）ことが記載されている。しかしながらこれらのアミノ酸は発酵槽の本培養培地には添加されていなかった。ここでも前培養培地のアミノ酸補給がシステインまたはアセチルセリンの生産に有益な効果を有するであろうことも何ら示されていない。
【０００９】
髪、剛毛、角、ひずめおよび羽などのケラチン性材料からの抽出、あるいは前駆体の酵素転化による生体内変化によるＬ−システインの古典的な製法に加えて、Ｌ−システインの発酵による製法方法も数年前に開発された。微生物を使用するＬ−システインの発酵による製造に関する先行技術は、例えばＵＳ６２１８１６８Ｂ１、ＵＳ５９７２６６３Ａ、ＵＳ２００４００３８３５２Ａ１、ＣＡ２３８６５３９Ａ１、ＵＳ２００９００５３７７８Ａ１およびＵＳ２００９０２２６９８４Ａ１に記載されている。
ここで使用されている細菌性ホスト生物は、とりわけ、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌株、ならびに例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）などの腸内細菌科の代表である。
【００１０】
突然変異および淘汰によって改良されたＬ−システイン生産菌に到達する古典的な手順に加えて、菌株に対する遺伝子変性も、効果的なＬ−システインの過生産を達成するために標的にされて行われている。
【００１１】
したがって、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を低減させたセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ対立遺伝子の導入によって、システイン生産を増加させている（ＵＳ６２１８１６８Ｂ１；Ｎａｋａｔｏｍｉら、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１６０７−１６１１）。Ｌ−システインの直接前駆体であるＯ−アセチル−Ｌ−セリンの生成は、フィードバック耐性のＣｙｓＥ酵素により細胞内でＬ−システインレベルから実質的にデカップリングされている。
【００１２】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは、Ｌ−セリンおよびアセチル−ＣｏＡから形成される。したがって、Ｌ−システイン製造のための十分な量のＬ−セリンを提供することは非常に重要である。これはＬ−セリンによるフィードバック阻害を低減させた３−ホスホグリセリンセリン脱水素酵素をコードするｓｅｒＡ対立遺伝子を導入することによって達成することができる。その結果、Ｌ−セリンの前駆体である３−ヒドロキシピルビン酸の生成は、細胞のＬ−セリンレベルから実質的にデカップリングされる。このようなＳｅｒＡ酵素の例は、ＥＰ０６２０８５３およびＵＳ２００５００９１６２Ａ２に記載されている。
【００１３】
さらに、発酵におけるＬ−システイン収率は、Ｌ−システイン分解酵素、例えば、トリプトファナーゼＴｎａＡまたはシスタチオニン−β−リアーゼＭａｌＹもしくはＭｅｔＣをコードする遺伝子を弱体化または破壊することによって増加し得ることが知られている（ＥＰ１５７１２２３）。
【００１４】
細胞からのＬ−システインの搬出を増加させることは、さらに培地内の生成物の収率を増加させる可能性もある。これはエフラックス遺伝子と呼ばれる過発現によって達成され得る。これらの遺伝子は細胞からのＬ−システインの搬出を仲介する膜結合型タンパク質をコードする。種々のエフラックス遺伝子はＬ−システイン搬出に対して記載されている（ＵＳ５９７２６６３Ａ，ＵＳ２００４００３８３５２Ａ１）。
【００１５】
Ｌ−システインを細胞から発酵培地に搬出することは多くの利点がある：
１）Ｌ−システインは、細胞内反応平衡から連続的に抽出され、その結果、細胞内のこのアミノ酸のレベルが低く保たれ、そのためＬ−システインによる敏感な酵素のフィードバック阻害が存在しない：
（１）Ｌ−システイン（細胞内）  ←→  Ｌ−システイン（培地）
２）培地中に分泌されたＬ−システインは、培養中の培地に導入された酸素存在下でジスルフィドＬ−システインに酸化される（ＵＳ５９７２６６３Ａ）：
（２）２Ｌ−システイン＋１／２Ｏ２  ←→  Ｌ−シスチン＋Ｈ２Ｏ
中性ｐＨでの水溶液中におけるＬ−シスチンの溶解度は、特にＬ−システインと比較して非常に低いので、ジスルフィドは低濃度でも沈殿し、そして白色沈殿を生成する。
（３）Ｌ−シスチン（溶解した）  ←→  Ｌ−シスチン（沈殿する）
Ｌ−シスチンの沈殿のため、培地中に溶解した生成物のレベルは低下し、その結果、（１）および（２）の反応平衡は各々の場合において生成物側にシフトする。
３）アミノ酸は発酵培地から直接得られる場合には、生成物が細胞内に蓄積し、そして最初に細胞消化が進行しなければならない場合よりも、生成物を精製するための技術的な労力は著しく低下する。
【００１６】
本発明の文脈における「総システイン」という用語は、Ｌ−システインならびにＬ−システインから生成される化合物Ｌ−シスチンおよびチアゾリジンを組合せており、これらが発酵中に生成し、培養上清および沈殿の中で蓄積する。
【００１７】
Ｌ−システイン生産菌の遺伝子組み換えに加えて、発酵方法、すなわち、細胞を培養するタイプおよび仕方を最適化することは、効果的な製造方法の開発にも重要な役割を果たす。
【００１８】
この場合、種々の培養パラメーター、例えば炭素供給源とエネルギー源のタイプと用量、温度、酸素供給量（ＤＥ１０２０１１０７５６５６Ａ１）、ｐＨおよび培地の組成などは、Ｌ−システインの発酵生産における製品収量および／または製品範囲に影響を与える場合がある。
【００１９】
原料およびエネルギーコストが絶えず増加するため、Ｌ−システインの生産における生産収量を増加させ、順々にこのやり方で、方法の経済的効率を改善する必要が常にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５９７２６６３号明細書
【特許文献２】欧州特許第１２３３０６７号明細書
【特許文献３】欧州特許第１３８２６８４号明細書
【特許文献４】米国特許第６２１８１６８号明細書
【特許文献５】米国特許第５９７２６６３号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００４／００３８３５２号明細書
【特許文献７】カナダ特許第２３８６５３９号明細書
【特許文献８】米国特許第２００９００５３７７８号明細書
【特許文献９】米国特許第２００９０２２６９８４号明細書
【特許文献１０】欧州特許第０６２０８５３号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００５／００９１６２号明細書
【特許文献１２】欧州特許第１５７１２２３号明細書
【特許文献１３】米国特許第５９７２６６３号明細書
【特許文献１４】独国特許出願公開第１０２０１１０７５６５６号明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｋｒｅｄｉｃｈ（１９９６、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ，  ｐ．５１４−５２７．Ｉｎ  Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，  Ｒ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ，Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍ．Ｅ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｍ．Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．Ｕｍｂａｒｇｅｒ（ｅｄ．）
【非特許文献２】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ．ｅｄ．  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
【非特許文献３】Ｈａｍａら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９，６０４−８．
【非特許文献４】Ｄａｔｔａ，１９６７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８，６３５−４１．
【非特許文献５】Ｈａｒｒｉｓ，  １９８１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １４５，１０３１−３５．
【非特許文献６】Ｒａｓｋｏら、１９７１，Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１，４２４−２７．
【非特許文献７】Ｄａｓｓｌｅｒら、２０００，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１１０１−１１１２．
【非特許文献８】Ｎａｋａｔｏｍｉら、１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１６０７−１６１１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、前培養および発酵槽中の本培養における発酵培地中のシステイン生産微生物菌株の発酵によって、Ｌ−システインならびにその誘導体であるＬ−シスチンおよびチアゾリジンの製造ための改良された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本目的は、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−スレオニンを本培養中の発酵培地に、各々、０．１から１０ｇ／Ｌの濃度範囲で添加することを特徴とする方法によって達成される。
【００２４】
生産方法における種々の化学物質の効果に関して、それらをスクリーニングすると、アミノ酸であるＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−スレオニンで本培養中の発酵培地に補給することによって、驚くべきことに総システイン収量が増加し得ることが見出された。これは、発酵によるシステイン生産方法に習慣的に使用されている細菌の菌種が前記アミノ酸に対して原栄養性であるのでさらに驚くべきことである。
【００２５】
Ｌ−システインおよび本培養中のこのアミノ酸の上記誘導体の発酵生産において、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−スレオニンを供給する有益な効果は今日まで記述されなかったし、また明らかにされてもいない。これらのアミノ酸のいずれもがシステイン生合成における代謝前駆体ではないので、発酵システイン生産方法における収量がこれらのアミノ酸を添加することによって増加し得るという事実は原理的に驚くべきことである。
【００２６】
Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−スレオニンを、本培養中の発酵培地に、好ましくは０．５〜５ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．５〜３ｇ／Ｌの濃度範囲で各々添加する。
【００２７】
この場合に、メチオニンとイソロイシンの組合せ、メチオニンとスレオニンの組合せは単一のアミノ酸のみより好ましい供給である。この場合、特に好ましいのはメチオニンとイソロイシンの組合せである。アミノ酸の組合せを添加する場合には、個々のアミノ酸で挙げたものと同一の濃度範囲が好ましい。
【００２８】
対応するアミノ酸により培地に補給することは、本培養を培養する開始時においてバッチ添加として進めることもできる。あるいは発酵中に最初に連続的にアミノ酸を培地に添加することができる。
【００２９】
本培養（生産培養）中のシステイン生産は、バイオリアクター、好ましくは少なくとも５ｍ３の容積、好ましくは少なくとも２０ｍ３の容積、特に好ましくは少なくとも５０ｍ３の容積を有する攪拌タンク発酵槽の、当業者に公知の発酵方法による原理で進行する。システイン生産細胞の培養を通常複数の段階で実行する。保存培養から進めると、細胞は少なくとも一つの前培養で最初に成長し、最終的に本培養を最後の前培養で接種する。この場合、一般的には、実験室スケールの発酵槽を介する振盪フラスコから工業スケールのバイオリアクターまで連続的なスケールアップが進む。
【００３０】
本発明の方法のための微生物として、先行技術に記載されているすべてのシステイン生産菌株を使用することができる。そのような菌株は、例えばＵＳ６２１８１６８Ｂ１、ＵＳ５９７２６６３Ａ、ＵＳ２００４００３８３５２Ａ１、ＣＡ２３８６５３９Ａ１、ＵＳ２００９００５３７７８またはＥＰ２１３８５８５に開示されている。
【００３１】
微生物菌株として、腸内細菌科の代表が好ましく、特に好ましくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）とパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の代表、特に非常に好ましくはＥ．ｃｏｌｉとＰ．ａｎａｎａｔｉｓ種の菌株である。
【００３２】
これらの微生物菌株のうちで、対応する野生型酵素と比較して、少なくとも２のファクターで、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下している変性されたセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼを保有しているか、または野生型細胞と比較して、エフラックス遺伝子の過発現により、少なくとも２のファクターで細胞からのシステイン搬出が増加している微生物菌株が好ましい。特に好ましい微生物菌株は、対応する野生型酵素と比較して、少なくとも２のファクターで、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下しているセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼを保有しているだけではなく、野生型細胞と比較して、エフラックス遺伝子の過発現により、少なくとも２のファクターで細胞からのシステイン搬出も増加している。そのような菌株は、例えばＵＳ６２１８１６８Ｂ１およびＵＳ５９７２６６３Ａから公知である。特に非常に好ましい菌株は、さらに変性された３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素を保有する菌株であり、対応する野生型酵素と比較して、少なくとも２のファクターでＬ−セリンによるフィードバック阻害が低下しており（ＵＳ２００５００９１６２Ａ２）、ならびに野生型細胞と比較して、この酵素活性の最大でも５０％のみが細胞中に存在するように、少なくとも１種のＬ−システイン分解酵素が弱体化している。
【００３３】
セリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼの好ましい変形体は、対応する野生型酵素と比較して、少なくとも５のファクターで、特に好ましくは少なくとも１０のファクターで、特に非常に好ましくは少なくとも５０のファクターで、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下している。
【００３４】
エフラックス遺伝子は、好ましくはＥ．ｃｏｌｉのｙｄｅＤ（ＵＳ５９７２６６３Ａ参照）、ｙｆｉＫ（ＵＳ２００４００３８３５２Ａ１参照）、ｃｙｄＤＣ（ＷＯ２００４１１３３７３参照）、ｂｃｒ（ＵＳ２００５２２１４５３参照）およびｅｍｒＡＢ（ＵＳ２００５２２１４５３参照）の群または他の微生物からの対応する同族体遺伝子から生じる。同族体遺伝子は、前記遺伝子の配列が対応するＥ．Ｃｏｌｉ遺伝子のＤＮＡ配列に少なくとも８０％一致することを意味する。
【００３５】
エフラックス遺伝子の過発現は、野生型細胞と比較して、好ましくは少なくとも５のファクターで、特に好ましくは少なくとも１０のファクターで、特に非常に好ましくは少なくとも２０のファクターで、細胞からのシステイン搬出増加につながる。
【００３６】
３−ホスホグリセリン酸脱水素酵素の好ましい変形体は、対応する野生型酵素と比較して、少なくとも５のファクターで、特に好ましくは少なくとも１０のファクターで、特に非常に好ましくは少なくとも５０のファクターで、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害が低下している。
【００３７】
Ｌ−システイン分解酵素は、好ましくはトリプトファナーゼ（ＴｎａＡ）およびシスタチオニン−β−リアーゼ（ＭａｌＹ、ＭｅｔＣ）の群に由来する。
【００３８】
野生型菌株と比較して、酵素活性の最大で１０％のみが細胞内に依然として存在する程度に、これらの酵素の少なくとも一種が弱体化する微生物菌株が特に好ましい。特に非常に好ましくは、これらの酵素の少なくとも一種が完全に不活性化されている菌株である。
【００３９】
Ｌ−システイン製造の場合において、好気性成長条件下、ここで本培養の発酵中の酸素含有量は最大５０％飽和で設定して細胞を培養する。培地の酸素飽和はこの場合ガス供給および攪拌速度を介して自動的に調整される。
【００４０】
炭素供給源として、好ましくは糖、糖アルコール、有機酸または糖含有植物加水分解物を使用する。特に好ましくは、炭素供給源としてグルコース、フルクトース、ラクトース、グリセロールまたはこれら２以上の化合物を含む混合物を本発明による方法に使用する。
【００４１】
本発明による発酵方法の製造段階は、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチンまたはチアゾリジンが本培養のブロス培養中で初めて検出された時点から開始し、培養の終了まで続く。典型的には、この製造段階は生産発酵槽の接種後およそ８〜１０時間から開始する。
【００４２】
好ましくは、発酵槽中の炭素供給源含有量が製造段階中に１０ｇ／Ｌを超えないようなやり方で、炭素供給源を本培養に添加する。好ましくは最大濃度が２ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．５ｇ／Ｌ、特に非常に好ましくは０．１ｇ／Ｌである。
【００４３】
本発明の方法におけるＮ供給源として、好ましくはアンモニア、アンモニウム塩またはタンパク質加水分解物を使用する。アンモニアがｐＨを一定に保つための補正手段として使用する場合、このＮ供給源を発酵中に定期的に供給する。
【００４４】
さらに培地添加剤として、元素リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄の塩および元素モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛およびニッケルの微量の塩（例：μＭ濃度で）を添加することができる。
【００４５】
さらに、有機酸（例：酢酸塩、クエン酸塩）およびビタミン（例：Ｂ１、Ｂ６）を培地に添加することができる。
【００４６】
複合栄養供給源として、例えば酵母抽出物、コーンスティープ液、大豆粉または麦芽抽出物を使用することができる。
【００４７】
中温性微生物、例えばＥ．ＣｏｌｉまたはＰ．ａｎａｎａｔｉｓなどのための培養温度は、好ましくは１５〜４５℃、特に好ましくは３０〜３７℃である。
【００４８】
発酵中の発酵培地のｐＨは、５．５から７．５の範囲が好ましく、特に好ましくは６．５〜７．５のｐＨ、非常に好ましくは７．０のｐＨである。
【００４９】
発酵中に、Ｌ−システインおよびＬ−システイン誘導体の製造のためには、硫黄源を供給しなければならない。好ましくは、ここでは硫酸塩またはチオ硫酸塩を使用する。
【００５０】
本方法で発酵した微生物は、初期成長段階の後のバッチ方法または流加バッチ方法で、８時間から１５０時間の間、高い効率で培養培地内にＬ−システインおよびＬ−システインから誘導される化合物を分泌する。
【００５１】
発酵後、沈殿物として存在するＬ−シスチンを、例えばデカンターを用いて培養ブロスの残渣成分から公知の方法を用いて分離することができる。
【００５２】
粗生成物のさらなる精製のため、以下の工程を行うことができる。
−粗生成物を無機酸で溶解する。
−粗生成物溶液を遠心分離または濾過によって分離する。
−溶液を脱色する。
−沈殿結晶化
【００５３】
Ｌ−シスチンのＬ−システインへの還元は、例えばＥＰ０２３５９０８に記載されるように電気化学的工程を介して進めることができる。
【００５４】
下記の例は本発明をさらに説明するのに役立つ。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］
システイン生産菌株の生成
野生型菌種Ｅ．Ｃｏｌi  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）およびＰ．ａｎａｎａｔｉｓ（ＡＴＣＣ  １１５３０）を、各々、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６（ＵＳ５９７２６６３Ａの実施例２に開示されている）を使用して、ＵＳ５９７２６６３Ａに記載されている電気穿孔法によって形質転換した。複製起点およびテトラサイクリン耐性遺伝子に加えて、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６は、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低下しているセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼおよびエフラックス遺伝子ｙｄｅＤ（ＯＲＦ３０６）をコードするｃｙｓＥＸ対立遺伝子をさらに含み、その発現が構成するＧＡＰＤＨプロモーターによって制御される。
【００５６】
プラスミドを有する細胞を、テトラサイクリン１５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天板上で選択した。
【００５７】
ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）によってプラスミド単離を繰返し、制限分析の後、所望の形質転換体、すなわちプラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６を取り入れた細胞を単離し、実施例２および３に記載する培養において使用した。
【００５８】
［実施例２］
種々のアミノ酸の供給によるシステイン製造
前培養１：
１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地２０ｍＬに、三角フラスコ（１００ｍＬ）中で、それぞれの菌株（Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６またはＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６）を接種し、そして振盪機（１５０ｒｐｍ、３０℃）で７時間培養した。
【００５９】
前培養２：
次いで、前培養１をＳＭ１培地（１２ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ  クエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＮａＣl、１ｍＬ／Ｌの微量の元素溶液（０．１５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．５ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．７ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏからなる））１００ｍＬに完全に移し、５ｇ／Ｌのグルコース、５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１および１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを補給した。培養物を三角フラスコ（１Ｌ）中において３０℃、１７時間、１５０ｒｐｍで振盪した。この培養後、６００ｎｍ(ＯＤ６００）での光学密度は３と５の間であった。
【００６０】
本培養：
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＳｔｅｄｉｍからのＢＩＯＳＴＡＴ  Ｂタイプの発酵槽で発酵を行った。全容積２Ｌを有する培養容器を使用した。発酵培地（９００ｍＬ）は、グルコース（１５ｇ／Ｌ）、トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）（１０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）（５ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１．５ｇ／Ｌ）、ＮａＣl（０．５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．３ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０１５ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０７５ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ（１ｇ／Ｌ）および微量元素溶液（１ｍＬ）（上記参照）、ビタミンＢ１（０．００５ｇ／Ｌ）およびテトラサイクリン（１５ｍｇ／Ｌ）を含む。種々の実験設定では、さらにアミノ酸であるＬ−メチオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−スレオニンを、個々にまたは種々の濃度で組み合せるかのいずれかで培地に添加した（表１参照）。
【００６１】
２５％ＮＨ４ＯＨ溶液をポンプ注入して発酵槽のｐＨを開始時に７．０に調整した。発酵中のｐＨは２５％ＮＨ４ＯＨを使って自動補正により７．０に維持した。接種のために、前培養２（１００ｍＬ）を発酵槽容器にポンプで供給した。したがって、初期容積は約１Ｌであった。培養物を開始時に４００ｒｐｍで攪拌し、そして無菌フイルターを経由して無菌の圧縮空気を２ｖｖｍで通気し殺菌した。これらの初期条件下で、酸素プローブを接種前に１００％飽和に校正しておいた。発酵中のＯ２飽和に対する目標値を５０％に調整した。Ｏ２飽和が目標値よりも下に低下した後、調整カスケードを開始し、Ｏ２飽和を目標値まで戻した。この場合、まずガス導入を連続的に増加させ（最大で５ｖｖｍまで）、次いで攪拌速度を連続的に増加させた（最大で１５００ｒｐｍまで）。
【００６２】
発酵を３０℃の温度で行った。２時間の発酵後、無菌の６０％チオ硫酸ナトリウム・５Ｈ２Ｏ原液の形態で硫黄源を１．５ｍＬ／時間の速度で供給した。発酵槽中のグルコース含有量が初期の１５ｇ／Ｌからおよそ２ｇ／Ｌまで低下したとき、直ぐに５６％グルコース溶液を連続的に添加した。次いで、供給速度を、発酵槽中のグルコース濃度が２ｇ／Ｌを超えないように調整した。グルコースを、ＹＳＩ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，  Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）からグルコース分析器を用いて決定した。
【００６３】
発酵時間は４８時間だった。次いで、サンプルを抽出し、培養液上清（主に、Ｌ−システインおよびチアゾリジン）および沈殿物（Ｌ−シスチン）における、Ｌ−システインおよびＬ−システインに由来する誘導体の含有量を、各々、互いに別々に分けて決定した（表１参照）。この目的には、Ｇａｉｔｏｎｄｅの比色分析計を各々使用した（Ｇａｉｔｏｎｄｅ，Ｍ．Ｋ．（１９６７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０４、６２７−６３３）。ここで、強い酸性反応条件下での試験がＬ−システイン、Ｌ−システインとビルビン酸の縮合生成物、２−メチルチアゾリジン−２，４−ジカルボン酸（チアゾリジン）を識別しない事実（ＥＰ０８８５９６２Ａ１に記載されている）を考慮する必要がある。Ｌ−シスチンは２つのＬ−システイン分子の酸化によって生成し、ｐＨ８．０の希釈溶液中でジチオトレイトールでの還元による試験では同様にＬ−システインとして検出される。沈殿物中にあるＬ−シスチンを最初に８％塩酸中に溶解させてから、同様に定量することができた。
【００６４】
【表１】
0006258329.tif 000002