(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ｂ*２７に結合し、ＨＬＡ−Ｂ*２７によって誘導されるＴ細胞活性化をインビトロで遮断する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ：配列番号１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３領域を含む、単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２】
抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１４６／１５４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ｐＨ５．７５において、ｐＨ７．２におけるＨＬＡ−Ｂ*２７への抗体結合のＫDよりも少なくとも５倍大きいＫDでＨＬＡ−Ｂ*２７と結合し、ＨＬＡ−Ｂ*２７によって誘導されるＴ細胞活性化をインビトロで遮断する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２２６／２３４、２５８／２６６、２９０／２９８、３３８／３４６、および３７０／３７８からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項５】
脊椎関節症を処置する、予防する、または改善する方法において使用するための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
脊椎関節症は、強直性脊椎炎、反応性関節炎（ライター症候群）、急性前部ブドウ膜炎、筋実質炎、乾癬性関節炎、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＨＬＡ−Ｂ*２７に特異的な抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおける主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）として知られている。ＨＬＡ分子は、抗原提示と免疫反応に深く関与している。ＨＬＡ−Ｂ*２７は、強直性脊椎炎やその他の血清反応陰性脊椎関節症の高い発生率に関連する特定のＨＬＡ対立遺伝子である。
【０００３】
例えばＨＬＡ−Ｂ*２７などのＨＬＡクラスＩ分子は、２つの鎖、すなわち：３つのＩｇ−ドメイン（アルファ−１、アルファ−２、およびアルファ−３）からなる膜結合型重鎖と、ベータ−２−ミクログロブリン（β２ｍ）として知られている非共有結合で会合した共通の軽鎖とからなる。ＨＬＡ−Ｂ*２７には対立遺伝子サブタイプがいくつか存在し、例えばＨＬＡ−Ｂ*２７０１からＨＬＡ−Ｂ*２７２８などのサブタイプがある。ＨＬＡ対立遺伝子間の配列の差は、大部分が重鎖のアルファ−１ドメインとアルファ−２ドメインの間のペプチド結合クレフトに限定される。ＨＬＡ−Ｂ*２７の場合における細胞内由来のペプチド（自己またはウイルスペプチド）が提示されると、特定のペプチドに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＨＬＡ制限Ｔ細胞クローンの活性化が起こる。
【０００４】
ＨＬＡ−Ｂ*２７に対する抗体は一般的に当業界公知であるが、主として診断および／または検出用途での使用に関して説明されている。（例えば、特許文献１および非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，３６９，０１０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｕｒｂａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１５３４〜１５３８ページ（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当技術分野では、治療用途および他の使用に適した抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体との新しい高親和性の結合が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヒトＨＬＡ−Ｂ*２７に特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、特に、ＨＬＡ−Ｂ*２７によって提示された抗原によるＴ細胞の認識を妨害すること、およびＨＬＡ−Ｂ*２７が介在する抗原提示によって引き起こされる、またはそれに関連する疾患および障害を処置することに関して有用である。例えば、本発明の抗体は、強直性脊椎炎やその他の脊椎関節症を処置または緩和するために患者に投与してもよい。
【０００９】
本発明の抗体は完全長（例えばＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）であり得、または抗原結合部分（例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、例えば残留するエフェクタ機能を除去するために機能性に影響を及ぼすように本発明の抗体を改変してもよい（Ｒｅｄｄｙ他、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５〜１９３３ページ）。
【００１０】
本発明は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、および３７０からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
本発明はまた、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、および３７８からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントも提供する。
【００１２】
本発明はまた、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、および３７０／３７８からなる群より選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１３】
本発明はまた、配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、および３７６からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；ならびに配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、および３８４からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントも提供する。
【００１４】
特定の実施形態において、抗体または抗体の抗原結合部位は、配列番号８／１６、２４／３２、４０／４８、５６／６４、７２／８０、８８／９６、１０４／１１２、１２０／１２８、１３６／１４４、１５２／１６０、１６８／１７６、１８４／１９２、２００／２０８、２１６／２２４、２３２／２４０、２４８／２５６、２６４／２７２、２８０／２８８、２９６／３０４、３１２／３２０、３２８／３３６、３４４／３５２、３６０／３６８、３７６／３８４からなる群より選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【００１５】
本発明はまた、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、および３７２からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、および３７４からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、および３８０からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；ならびに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、および３８２からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインをさらに含む抗体またはそのフラグメントも提供する。
【００１６】
所定の非限定的かつ例示的な本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、それぞれ、配列番号４−６−８−１２−１４−１６（例えばＨ１Ｍ２４７７Ｎ）；２０−２２−２４−２８−３０−３２（例えばＨ１Ｍ２４９０Ｎ）；３６−３８−４０−４４−４６−４８（例えばＨ２Ｍ２４８２Ｎ）；５２−５４−５６−６０−６２−６４（例えばＨ１Ｍ２４７７Ｎ２）；６８−７０−７２−７６−７８−８０（例えばＨ１Ｍ２４９０Ｎ２）；８４−８６−８８−９２−９４−９６（例えばＨ２Ｍ２４８２Ｎ２）；１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２（例えばＨ１Ｍ２４８０Ｎ）；１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８（例えばＨ１Ｍ２４９７Ｎ）；１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４（例えばＨ２Ｍ２４９１Ｎ）；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０（例えばＨ２Ｍ２４９９Ｎ）；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６（例えばＨ２Ｍ２７１８Ｎ）；１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２（例えばＨ４Ｈ２５２４Ｐ）；１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８（例えばＨ４Ｈ２５２６Ｐ）；２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４（例えばＨ４Ｈ２５２８Ｐ）；２２８−２３０−２３２−２３６−２３８−２４０（例えばＨ４Ｈ２５３０Ｓ）；２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６（例えばＨ４Ｈ２５３２Ｐ）；２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２（例えばＨ４Ｈ２５３４Ｓ）；２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８（例えばＨ４Ｈ２５３８Ｐ）；２９２−２９４−２９６−３００−３０２−３０４（例えばＨ４Ｈ２５４２Ｐ）；３０８−３１０−３１２−３１６−３１８−３２０（例えばＨ４Ｈ２５５５Ｐ）；３２４−３２６−３２８−３３２−３３４−３３６（例えばＨ４Ｈ２５５９Ｐ）；３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２（例えばＨ４Ｈ２５６０Ｐ）；３５６−３５８−３６０−３６４−３６６−３６８（例えばＨ４Ｈ２５６２Ｓ）；および３７２−３７４−３７６−３８０−３８２−３８４（例えばＨ４Ｈ２５６４Ｓ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。
【００１７】
関連する実施形態において、本発明は、ＨＬＡ−Ｂ*２７と特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合フラグメントであって、該抗体またはフラグメントは、重鎖配列および軽鎖配列内に、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、および３７０／３７８からなる群より選択される重鎖ＣＤＲドメインおよび軽鎖ＣＤＲドメインを含む、上記抗体または抗体の抗原結合フラグメントを包含する。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定する方法および技術は当業界周知であり、本明細書に開示した特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するのに使用できる。ＣＤＲの境界を同定するのに使用できる例示的な規則としては、例えば、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、およびＡｂＭの定義が挙げられる。大まかに言えば、Ｋａｂａｔの定義は配列の変異性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造的なループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭの定義は、ＫａｂａｔのアプローチとＣｈｏｔｈｉａのアプローチとを合わせたものである。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８ページ（１９９７）；およびＭａｒｔｉｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８〜９２７２ページ（１９８９）を参照されたい。また公開データベースも、抗体内のＣＤＲ配列を同定するのに利用可能である。
【００１８】
関連する実施形態において、本発明は、他のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子変異体と比較してＨＬＡ−Ｂ*２７への増大した結合を示す単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号５２−５４−５６−６０−６２−６４を含むＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含み、ＨＣＤＲ１ドメインの３３位のアミノ酸にヒスチジン置換、ＨＣＤＲ２ドメインの５２位のアミノ酸にヒスチジン置換、またはＨＣＤＲ１ドメインの３３位のアミノ酸にヒスチジン置換、およびＨＣＤＲ２の５２位のアミノ酸にヒスチジン置換を有する、上記抗体またはその抗原結合フラグメントを包含する。
【００１９】
関連する実施形態において、本発明は、他のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子変異体と比較してＨＬＡ−Ｂ*２７への増大した結合を示す単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０を含むＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含み、以下の１つまたはそれ以上のヒスチジン置換、すなわち：ＨＣＤＲ１ドメインの３２位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＨＣＤＲ２ドメインの５３位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＨＣＤＲ１ドメインの３２位のアミノ酸にヒスチジン置換、およびＨＣＤＲ２ドメインの５３位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ１ドメインの２７位、３０位、および３２位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ１ドメインの２７位、２８位、および３２位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ１ドメインの２８位、３０位、および３２位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ１ドメインの２８位、３０位、および３１位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ１ドメインの２７位、２８位、３０位、および３２位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ３ドメインの９０位、９２位、９３位、および９７位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ３ドメインの９０位、９２位、および９７位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ３ドメインの９２位、９３位、および９７位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ３ドメインの９０位および９３位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＬＣＤＲ３ドメインの９２位および９３位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＨＣＤＲ３ドメインの９８位、１００位、および１０６位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＨＣＤＲ３ドメインの９８位、１００位、および１０４位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＨＣＤＲ３ドメインの１００位、１０４位、および１０６位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＨＣＤＲ３ドメインの９８位、１００位、１０４位、および１０６位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＨＣＤＲ３ドメインの９８位、１０４位、および１０６位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＨＣＤＲ３ドメインの１００位、１０４位、および１０６位のアミノ酸にヒスチジン置換、ならびにＬＣＤＲ１ドメインの２８位、３０位、および３１位のアミノ酸にヒスチジン置換；ＨＣＤＲ３ドメインの１００位、１０４位、および１０６位のアミノ酸にヒスチジン置換、ならびにＬＣＤＲ３ドメインの９０位、９２位、および９７位のアミノ酸にヒスチジン置換；またはＨＣＤＲ３ドメインの１００位、１０４位、および１０６位のアミノ酸にヒスチジン置換、ならびにＬＣＤＲ３ドメインの９２位、９３位、および９７位のアミノ酸にヒスチジン置換を有する、上記抗体または抗原結合フラグメントを包含する。
【００２０】
関連する実施形態では、本発明は、ｐＨ６．０において、ｐＨ７．２におけるＨＬＡ−Ｂ*２７０５への抗体結合のＥＣ50よりも少なくとも１．５倍大きいＥＣ50でＨＬＡ−Ｂ*２７０５と結合する、ヒスチジンが置換された単離抗体または抗原結合フラグメントを包含する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、ｐＨ５．７５において、ｐＨ７．２におけるＨＬＡ−Ｂ*２７への抗体結合のＫDよりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍または少なくとも２５倍大きいＫDでＨＬＡ−Ｂ*２７と結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを包含する。いくつかの実施形態では、ｐＨ５．７５において、ｐＨ７．２におけるＨＬＡ−Ｂ*２７への抗体結合のＫDより大きいＫDでＨＬＡ−Ｂ*２７と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２２６／２３４、２５８／２６６、２９０／２９８、３３８／３４６、および３７０／３７８からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００２２】
関連する実施形態では、本発明は、ｐＨ６．０において、ｐＨ７．２におけるＨＬＡ−Ｂ*２７０５への抗体結合のＥＣ50よりも少なくとも１．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍または少なくとも２５倍大きいＥＣ50でＨＬＡ−Ｂ*２７０５と結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを包含する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体またはそのフラグメントをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を含む組み換え発現ベクター、およびそのようなベクターが導入されている宿主細胞も本発明に包含されており、抗体の産生を可能にする条件下での宿主細胞の培養による抗体の産生および産生した抗体の回収の方法も本発明に包含される。
【００２４】
一実施形態において、本発明は、配列番号１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、３０５、３２１、３３７、３５３、および３６９からなる群より選択される核酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列によってコードされたＨＣＶＲを含む抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００２５】
本発明はまた、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、３１３、３２９、３４５、３６１、および３７７からなる群より選択される核酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列によってコードされたＬＣＶＲを含む抗体またはそのフラグメントも提供する。
【００２６】
本発明はまた、配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５、３１１、３２７、３４３、３５９、および３７５からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列によってコードされたＨＣＤＲ３ドメイン；ならびに配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７、３０３、３１９、３３５、３５１、３６７、および３８３からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列によってコードされたＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントも提供する。
【００２７】
本発明はまた、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０７、３２３、３３９、３５５、および３７１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列によってコードされたＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９、２４５、２６１、２７７、２９３、３０９、３２５、３４１、３５７、および３７３からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列によってコードされたＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３、２９９、３１５、３３１、３４７、３６３、および３７９からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列によってコードされたＬＣＤＲ１ドメイン；ならびに配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７、２５３、２６９、２８５、３０１、３１７、３３３、３４９、３６５、および３８１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列によってコードされたＬＣＤＲ２ドメインをさらに含む、抗体またはそのフラグメントも提供する。
【００２８】
特定の実施形態によれば、本抗体またはそのフラグメントは：配列番号１および９（例えばＨ１Ｍ２４７７Ｎ）、１７および２５（例えばＨ１Ｍ２４９０Ｎ）、３３および４１（例えばＨ２Ｍ２４８２Ｎ）、４９および５７（例えばＨ１Ｍ２４７７Ｎ２）、６５および７３（例えばＨ１Ｍ２４９０Ｎ２）、８１および８９（例えばＨ２Ｍ２４８２Ｎ２）、９７および１０５（例えばＨ１Ｍ２４８０Ｎ）、１１３および１２１（例えばＨ１Ｍ２４９７Ｎ）、１２９および１３７（例えばＨ２Ｍ２４９１Ｎ）、１４５および１５３（例えばＨ２Ｍ２４９９Ｎ）、１６１および１６９（例えばＨ２Ｍ２７１８Ｎ）、１７７および１８５（例えばＨ４Ｈ２５２４Ｐ）、１９３および２０１（例えばＨ４Ｈ２５２６Ｐ）、２０９および２１７（例えばＨ４Ｈ２５２８Ｐ）、２２５および２３３（例えばＨ４Ｈ２５３０Ｓ）、２４１および２４９（例えばＨ４Ｈ２５３２Ｐ）、２５７および２６５（例えばＨ４Ｈ２５３４Ｓ）、２７３および２８１（例えばＨ４Ｈ２５３８Ｐ）、２８９および２９７（例えばＨ４Ｈ２５４２Ｐ）、３０５および３１３（例えばＨ４Ｈ２５５５Ｐ）、３２１および３２９（例えばＨ４Ｈ２５５９Ｐ）、３３７および３４５（例えばＨ４Ｈ２５６０Ｐ）、３５３および３６１（例えばＨ４Ｈ２５６２Ｓ）、および３６９および３７７（例えばＨ４Ｈ２５６４Ｓ）の核酸配列によってコードされた重鎖ＣＤＲ配列および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００２９】
本発明は、改変グリコシル化パターンを有する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を包含する。いくつかの用途において、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変が有用であり得、またはオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分が欠けている抗体が例えば抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるのに有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ他（２００２）ＪＢＣ２７７：２６７３３参照）。別の用途において、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の改変を行ってもよい。
【００３０】
別の態様において、本発明は、ＨＬＡ−Ｂ*２７と特異的に結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体と第２の治療剤との組み合わせを含む組成物を特徴とする。一実施形態において、第２の治療剤は、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体と組み合わされることが有利な任意の物質である。抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体と組み合わせることが有利な可能性がある例示的な物質としては、これらに限定されないが、ＨＬＡ−Ｂ*２７活性を阻害する他の物質（例えば他の抗体またはその抗原結合フラグメント、ペプチド阻害剤、低分子物質のアンタゴニスト等）、および／またはＨＬＡ−Ｂ*２７とは直接結合しないが、ＨＬＡ−Ｂ*２７が介在するＴ細胞活性化に干渉する、そのような活性化を遮断する、もしくは弱める物質などが挙げられる。
【００３１】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体または抗体の抗原結合部分を用いてＨＬＡ−Ｂ*２７が介在する活性を阻害する方法であって、本発明の抗体または抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む治療方法を提供する。処置、予防または改善される障害は、ＨＬＡ−Ｂ*２７活性（例えば、ＨＬＡ−Ｂ*２７が介在する抗原提示）の除去、阻害または低下により向上する、改善する、抑制される、または予防されるあらゆる疾患または状態であり得る。本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体または抗体フラグメントは、ＨＬＡ−Ｂ*２７／ペプチド複合体とＴ細胞受容体との相互作用に干渉するように機能する可能性もあるし、または別の方法でＨＬＡ−Ｂ*２７が介在する抗原提示および／もしくはＴ細胞活性化を阻害するように機能する可能性もある。したがって、本発明の一態様は、ＨＬＡ−Ｂ*２７活性に関連する、またはＨＬＡ−Ｂ*２７活性が介在する疾患もしくは障害を処置、予防または改善する方法であり、本方法は、ＨＬＡ−Ｂ*２７活性に関連する、またはＨＬＡ−Ｂ*２７活性が介在する疾患もしくは障害に罹患している、またはそれらに罹患する危険性がある患者に、本発明の抗体または抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＬＡ−Ｂ*２７活性に関連する、またはＨＬＡ−Ｂ*２７活性が介在する疾患もしくは障害は、脊椎関節症、固形臓器移植の拒絶、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の方法により処置、予防もしくは改善される脊椎関節症は、強直性脊椎炎、反応性関節炎（ライター症候群）、急性前部ブドウ膜炎、筋実質炎、乾癬性関節炎、および／または潰瘍性大腸炎である。
【００３２】
本発明はまた、ＨＬＡ−Ｂ*２７活性に関連する、またはＨＬＡ−Ｂ*２７活性によって発症する疾患もしくは障害を治療するための薬剤の製造における、本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体または抗体の抗原結合部分の使用も含む。
【００３３】
別の実施形態は、以下の詳細な説明のレビューから明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明を説明する前に、説明された特定の方法および実験条件に本発明は限定されず、したがって方法および条件は変更し得ることを理解すべきである。本発明の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解すべきである。
【００３５】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。用語「約」は本明細書で用いられる場合、特定の列挙した数値に関して用いられる場合に値が列挙した数値から１％以下で変動し得ることを意味する。例えば、語句「約１００」は本明細書で用いられる場合、９９および１０１ならびにその間にある全ての値（例えば９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
【００３６】
本明細書で説明したものと同様の、または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。
【００３７】
定義
語句「ＨＬＡ−Ｂ*２７」（あるいは「ＨＬＡ−Ｂ２７」と称される）は、ベータ−２−ミクログロブリンポリペプチドと会合した、ＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子重鎖のアルファ−１、アルファ−２、およびアルファ−３Ｉｇドメインを含むポリペプチド複合体を意味する。語句「ＨＬＡ−Ｂ*２７」は、本明細書で用いられる場合、ＨＬＡ−Ｂ*２７０１からＨＬＡ−Ｂ*２７２８までのＨＬＡ−Ｂ*２７ファミリーに属する全ての対立遺伝子サブ変異体（ｓｕｂｖａｒｉａｎｔ）を包含する。例示的なＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子サブ変異体は、配列番号３８５のアミノ酸配列を有する重鎖を含むＨＬＡ−Ｂ*２７０５である。別の例示的なＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子サブ変異体は、配列番号３８６のアミノ酸配列を有する重鎖を含むＨＬＡ−Ｂ*２７０９である。他のＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子サブ変異体のアミノ酸配列は、公開データベースより入手でき、当業者には周知であると予想される。語句「ＨＬＡ−Ｂ*２７」は、細胞表面で発現されるＨＬＡ−Ｂ*２７複合体（例えば本明細書の実施例４〜６を参照）、加えてベータ−２−ミクログロブリンタンパク質および場合によりＨＬＡ制限ペプチドに融合したＨＬＡ−Ｂ*２７アルファ−１、アルファ−２、およびアルファ−３Ｉｇドメインを含む、人工的に加工された可溶性融合タンパク質を包含する（例えば本明細書の実施例３を参照）。そのような可溶性ＨＬＡ−Ｂ*２７融合タンパク質の例の１つは、本明細書では「ｓｃＨＬＡ−Ｂ２７」と称される配列番号３８７のアミノ酸配列を含むコンストラクトである。
【００３８】
用語「抗体」は、本明細書で用いられる場合、特定の抗原（例えばＨＬＡ−Ｂ*２７）に特異的に結合するかまたはそれらと相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むあらゆる抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」は、ジスルフィド結合で相互に連結された４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖、および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を包含し、加えてその多量体（例えばＩｇＭ）も包含する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶHと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、すなわちＣH１、ＣH２およびＣH３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶLと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣL１）を含む。ＶHおよびＶL領域を、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が散在している超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）にさらに細分化することができる。各ＶHおよびＶLは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されている。本発明の様々な実施形態において、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲはヒト生殖系列配列と同一であることができ、または前記ＦＲを天然にもしくは人工的に改変することができる。２つまたはそれ以上のＣＤＲの並行分析（side-by-side analysis）に基づいてアミノ酸コンセンサス配列を定義することができる。
【００３９】
用語「抗体」は本明細書で用いられる場合、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。抗体の用語「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」等は、本明細書で用いられる場合、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成された、または遺伝子工学的に改変されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含み、ポリペプチドまたは糖タンパク質は抗原と特異的に結合して複合体を形成する。タンパク質分解、または抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組み換え遺伝子工学技術等の任意の適切な標準的技術を用いて、例えば完全な抗体分子から抗体の抗原結合フラグメントを得ることができる。そのようなＤＮＡは公知であり、および／またはそのようなＤＮＡを例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えばファージ抗体ライブラリ等）から容易に入手することができ、もしくは合成することができる。例えば１つまたはそれ以上の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切な配置に配列するために、またはコドンを導入するために、システイン残基を作成するために、アミノ酸を改変する、付加するもしくは欠失させる等のために、ＤＮＡをシーケンスし、化学的にまたは分子生物学的技術を用いて操作することができる。
【００４０】
抗原結合フラグメントの非限定的な例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基（例えばＣＤＲ３ペプチド等の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））または拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメイン等の別の改変分子も本明細書で用いられる語句「抗原結合フラグメント」に包含される。
【００４１】
抗体の抗原結合フラグメントは少なくとも１つの可変ドメインを典型的には含むであろう。可変ドメインは、任意の大きさのアミノ酸組成物であり得、１つまたはそれ以上のフレームワーク配列と隣接するまたはフレームワーク配列とインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを一般的に含むであろう。ＶLドメインと会合したＶHドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶHドメインおよびＶLドメインは任意の適切な配置で、互いに関して位置し得る。例えば、可変領域は二量体であり得、ＶH−ＶH二量体、ＶH−ＶL二量体またはＶL−ＶL二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶHドメインまたはＶLドメインを含んでもよい。
【００４２】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合的に連結された少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的かつ例示的な配置として、（ｉ）ＶH−ＣH１；（ｉｉ）ＶH−ＣH２；（ｉｉｉ）ＶH−ＣH３；（ｉｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２；（ｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ）ＶH−ＣH２−ＣH３；（ｖｉｉ）ＶH−ＣL；（ｖｉｉｉ）ＶL−ＣH１；（ｉｘ）ＶL−ＣH２；（ｘ）ＶL−ＣH３；（ｘｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２；（ｘｉｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｘｉｉｉ）ＶL−ＣH２−ＣH３；および（ｘｉｖ）ＶL−ＣLが挙げられる。前記に列挙した例示的な配置のいずれか等の可変ドメインおよび定常ドメインの任意の配置において、可変ドメインおよび定常ドメインを互いに直接連結していてもよく、または完全なもしくは部分的なヒンジ領域またはリンカー領域により連結していてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接した可変ドメインおよび／または定常ドメインの間の柔軟なまたは半柔軟な連結をもたらす少なくとも２個（例えば５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個またはより多く）のアミノ酸からなっていてもよい。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いに非共有結合的に会合した、および／または１つもしくはそれ以上の単量体ＶHドメインまたはＶLドメインと（例えばジスルフィド結合（単数または複数）により）非共有結合的に会合した、前記に列挙した可変ドメインおよび定常ドメインの配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または別の多量体）を含んでいてもよい。
【００４３】
完全な抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは単一特異的であり得、または多重特異的（例えば二重特異的）であり得る。抗体の多重特異的な抗原結合フラグメントは少なくとも２つの異なる可変ドメインを典型的には含み、各可変ドメインは別々の抗原または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合し得るであろう。当技術分野において利用可能である日常的な技術を用いて、本明細書に開示した例示的な二重特異的抗体フォーマット等の任意の多重特異的な抗体フォーマットを、本発明の抗体の抗原結合フラグメントに関連して用いるのに適応させてもよい。
【００４４】
本発明の抗体は、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞介在障害（ＡＤＣＣ）を通じて機能し得る。「補体依存性細胞障害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下における本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞介在障害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）を発現する非特異的な細胞障害性細胞が標的細胞に結合した抗体を認識し、それにより標的細胞を溶解させる細胞媒介性反応を指す。当技術分野で公知であるとともに利用可能なアッセイを用いて、ＣＤＣおよびＡＤＣＣを測定することができる（例えば米国特許第５，５００，３６２号および米国特許第５，８２１，３３７号ならびにＣｌｙｎｅｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２〜６５６ページ（１９９８）参照）。抗体の定常領域は、補体を固定して細胞依存性細胞障害を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、細胞障害を媒介することが抗体にとって望ましいかどうかに基づいて、抗体のアイソタイプを選択することができる。
【００４５】
用語「ヒト抗体」は本明細書で用いられる場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列でコードされていないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダムもしくは部位特異的な変異誘発により、またはインビボでの体細胞変異により導入された変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３中に含んでもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は本明細書で用いられる場合、マウス等の別の哺乳類の種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことを意図しない。
【００４６】
用語「組み換えヒト抗体」は本明細書で用いられる場合、組み換え手段により調製した、発現させた、作成したまたは単離した全てのヒト抗体、例えば宿主細胞（下記にさらに説明する）中に遺伝子導入した組み換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、組み換え組み合わせヒト抗体ライブラリ（下記にさらに説明する）から単離した抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子導入動物（例えばマウス）から単離した抗体（例えばＴａｙｌｏｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５ページ（１９９２）参照）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の別のＤＮＡ配列へのスプライシング等の任意の別の手段により調製した、発現させた、作成したもしくは単離した抗体を含むことを意図する。そのような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、そのような組み換えヒト抗体はインビトロでの変異誘発（またはヒトＩｇ配列の遺伝子導入動物が用いられる場合、インビボでの体細胞変異誘発）を受けており、したがって、組み換え抗体のＶH領域およびＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶH配列およびＶL配列に由来および関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない可能性がある配列である。
【００４７】
ヒト抗体は、ヒンジ異質性と関連した２種の形態で存在することができる。一形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合により結合している約１５０〜１６０ｋＤａの安定した４つの鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、供給結合的にカップリングした軽鎖および重鎖で構成された約７５〜８０ｋＤａの分子（半抗体）が形成されている。これらの形態は、親和性精製後でも分離することが極めて困難である。
【００４８】
様々なインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は抗体のヒンジ領域のアイソタイプと関連した構造的差異に起因するが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換により、一般にヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて観察されるレベルまで第２の形態の出現を著しく低減し得る（Ａｎｇａｌ他（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３０：１０５ページ）。本発明は、所望の抗体の形態の収率を高めるために、例えば産生において望ましい可能性があるヒンジ、ＣH２領域またはＣH３領域中に１つまたはそれ以上の変異を有する抗体を包含する。
【００４９】
「単離抗体」は本明細書で用いられる場合、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定して分離したおよび／または回収した抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するもしくは天然に産生される組織もしくは細胞から分離されたまたは取り出された抗体は、本発明の目的のための「単離抗体」である。単離抗体はまた、組み換え細胞内でのインサイチュの抗体も含む。単離抗体は、少なくとも１つの精製工程または単離工程に供される抗体である。特定の実施形態によれば、単離抗体は、別の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５０】
「中和」または「遮断」抗体は、本明細書で用いられる場合、ＨＬＡ−Ｂ*２７への結合がＨＬＡ−Ｂ*２７／ペプチド複合体とＴ細胞受容体との間の相互作用を阻害する抗体を指すことを意図している。ＨＬＡ−Ｂ*２７中和または遮断抗体に起因する阻害は、適切なアッセイを使用して検出可能である限り完全である必要はない。ＨＬＡ−Ｂ*２７とＴ細胞受容体との間の相互作用を抗体が遮断するかどうかを判断する例示的なアッセイは当業界公知であり、本明細書のどこかで説明されている。
【００５１】
本明細書に開示した抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体は、抗体が得られた対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖の可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域において１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含んでもよい。本明細書に開示したアミノ酸配列と例えば公的な抗体配列データベースから入手可能である生殖系列配列とを比較することにより、そのような変異を容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示したアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１個またはそれ以上のアミノ酸が、抗体が得られた生殖系列配列の対応する残基（単数または複数）に、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基（単数または複数）に変異しており、または対応する生殖系列残基（単数または複数）に保存的アミノ酸置換変異している（そのような配列の変化を本明細書においてまとめて「生殖系列変異」と称する）。当業者は、本明細書に開示した重鎖および軽鎖の可変領域の配列から、１つまたはそれ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗原結合フラグメントを容易に産生することができる。特定の実施形態において、ＶHドメインおよび／またはＶLドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全ては、抗体が得られたオリジナルの生殖系列配列中に見られる残基に復帰変異されている。別の実施形態において、特定の残基のみ、例えばＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内にもしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見られる変異残基のみがオリジナルの生殖系列配列に復帰変異されている。別の実施形態において、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（単数または複数）は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体がもともと得られていた生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（単数または複数）に変異されている。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つまたはそれ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含むことができ、例えば、オリジナルの生殖系列配列とは異なる特定の別の残基が維持されているか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異されているが、特定の個々の残基は特定の生殖系列配列の対応する残基に変異されている。ひとたび得られれば、向上した結合特異性、増加した結合親和性、向上したまたは増大したアンタゴニスト生物学的特性またはアゴニスト生物学的特性（場合により）、低下した免疫原性等の１種またはそれ以上の所望の特性に関して、１つまたはそれ以上の生殖系列変異を含む抗体および抗原結合フラグメントを容易に試験することができる。この一般的な方法で得られる抗体および抗原結合フラグメントは本発明に包含される。
【００５２】
本発明はまた、１個またはそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体も包含する。例えば、本発明は、本明細書に開示したＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比べて、例えば１０個またはそれ未満、８個またはそれ未満、６個またはそれ未満、４個またはそれ未満等の保存的アミノ酸置換を有する、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を包含する。
【００５３】
本発明はまた、ｐＨ依存性の結合特性を有する（すなわち、中性ｐＨと比較して低いｐＨで結合が低下する）、ＨＬＡ−Ｂ*２７サブ変異体への結合が増大した（例えば、ＨＬＡ−Ｂ*０７と比較して、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５および／またはＨＬＡ−Ｂ*２７０９への結合親和性がより大きい）、ならびに向上したインビボでの有効性（例えば、より長い抗体の血清中半減期、Ｔ細胞活性化の持続的な阻害等）を有する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体変異体を含む抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体も包含する。そのような変異体としては、親抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体のＣＤＲ配列が変更されて、１つまたはそれ以上のヒスチジン以外のアミノ酸がヒスチジン残基で置き換えられている抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体変異体が挙げられる。変更された結合特徴（例えば、増大したｐＨ依存性の結合特徴）を有するように改変すること、突然変異させること、または別の方法で加工することが可能な「親」抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の例としては、本明細書の実施例２の表１で開示されたような相補性決定領域（ＣＤＲ）または重鎖および軽鎖の可変ドメイン（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）のいずれかを含む抗ＨＬＡ＿Ｂ*２７抗体が挙げられる。
【００５４】
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域中における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は複数のエピトープを有することができる。したがって、異なる抗体は抗原の異なる領域に結合することができ、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは立体構造であってもよく、または線状であってもよい。立体構造エピトープは、線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからの、空間的に並列したアミノ酸によって形成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって形成されるエピトープである。特定の状況において、エピトープは抗原上の糖、ホスホリル基またはスルホニル基の部分を含んでもよい。
【００５５】
用語「実質的な同一性」または「実質的に同一」は核酸またはそのフラグメントを指す場合、ヌクレオチドを適切に挿入または欠失しつつ別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列させた場合に、下記に述べるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ等の任意の公知の配列同一性のアルゴリズムによって評価した場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％でヌクレオチド配列の同一性があることを示す。参照核酸分子に対して実質的な同一性を有する核酸分子は、参照核酸分子でコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを場合によってはコードしていてもよい。
【００５６】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似」は、２つのペプチド配列を、デフォルトのギャップウェイトを用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより等で最適に整列させた場合に、それらのペプチド配列が少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基が、類似した化学的特性（例えば電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基に置換される。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合には、配列同一性の割合または類似性の程度を上方に調整して置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行う手段は当業者に公知である。例えばＰｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７〜３３１ページ（１９９４）参照。類似した化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸群の例として、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩、ならびに（７）システインおよびメチオニンである硫黄含有側鎖が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１４４３〜１４４５ページ（１９９２）に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有する任意の変化である。
【００５７】
ポリペプチドに関する配列類似性は配列同一性とも称されており、配列解析ソフトウェアを用いて典型的には評価される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換等の様々な置換、欠失および別の改変に割り当てられる類似性の尺度を用いて、類似する配列を整合させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアはＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔ等のプログラムを含み、このプログラムをデフォルトのパラメータと共に用いて、異なる種の生物に由来する相同なポリペプチド等の密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を評価することができる。例えばＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１参照。ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムである、デフォルトのまたは推奨されるパラメータを用いるＦＡＳＴＡを用いて、複数のポリペプチド配列を比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２およびＦＳＡＴＡ３）はアラインメント、およびクエリと検索配列との間で最も重なる領域の配列同一性の割合を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前記を参照）。本発明の配列を異なる生物に由来する多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトのパラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＢＬＡＳＴＮである。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０ページ（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２ページ（１９９７）参照。
【００５８】
抗体の生物学的特徴
本発明は、ＨＬＡ−Ｂ*２７に特異的に結合する抗体を包含する。用語「特異的に結合する」または同種の表現は、抗体またはその抗原結合フラグメントが、生理学的な条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、２５℃および中性ｐＨで約１×１０-7Ｍまたはそれ未満のＫDを有することによって特徴付けることができる。２つの分子が特異的に結合するかどうかを判断する方法は当業界周知であり、このような方法としては、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴等が挙げられる。しかしながら、特定のＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子サブ変異体に特異的に結合する単離抗体は、他のＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子サブ変異体に対する交差反応性を有する可能性がある。したがって、「ＨＬＡ−Ｂ*２７に特異的に結合する」抗体は、ＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子サブ変異体の全部または一部と特異的に結合する抗体を包含する。例えば、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５および／またはＨＬＡ−Ｂ*２７０９と特異的に結合する抗体は、「ＨＬＡ−Ｂ*２７と特異的に結合する」抗体と考えられる。
【００５９】
本発明は、２５℃および中性ｐＨ（例えば、約ｐＨ７．２）で、約２６０ｎＭ未満のＫDで可溶性ＨＬＡ−Ｂ*２７融合タンパク質（例えば、ｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨ［配列番号３８７］）と結合する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を包含する。例えば、本発明は、表面プラズモン共鳴で試験した場合、２５℃およびｐＨ７．２で（例えば本明細書における実施例３を参照）、約２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、９００ｐＭ未満、８５０ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７５０ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６５０ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５５０ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４５０ｐｍ未満、４００ｐＭ未満、３５０ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、またはそれより低いＫDでｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨと結合する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を包含する。
【００６０】
本発明は、ＨＬＡ−Ｂ*２７に対してｐＨ依存性結合を示す抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、語句「ｐＨ依存性結合」は、本明細書で用いられる場合、抗体が、表面プラズモン共鳴を使用して試験した場合、酸性ｐＨ（例えばｐＨ５．７５）において、中性ｐＨ（例えばｐＨ７．２）におけるそのＫD値よりも少なくとも５倍大きいＫD値を示すことを意味し、ここで酸性ｐＨおよび中性ｐＨにおけるＫD値は、同じ、または実質的に同じ実験条件（例えば、温度、抗原／抗体の方向、試薬濃度、流速等）で測定される。例えば、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体は、本開示の目的に関して、ｐＨ５．７５で該抗体がＨＬＡ−Ｂ*２７に結合するときのＫD値の、ｐＨ７．２で該抗体がＨＬＡ−Ｂ*２７に結合するときのＫD値に対する比率が、少なくとも約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１５．０、２０．０、２５．０であるか、またはそれより大きい比率である場合、「ｐＨ依存性結合」を有すると考えられる（例えば、本明細書における表６［実施例３］を参照）。本発明のいくつかの実施形態において、語句「ｐＨ依存性結合」は、本明細書で用いられる場合、結合アッセイ（例えば、化学発光アッセイ）で、抗体が、酸性ｐＨ（例えばｐＨ６．０）において、中性ｐＨ（例えばｐＨ７．２）でのＥＣ50値よりも少なくとも３倍大きいＥＣ50値（すなわち、最大有効濃度の半分）を示すことを意味し、ここで酸性ｐＨおよび中性ｐＨにおけるＥＣ50値は、同じ、または実質的に同じ実験条件（例えば、温度、抗原／抗体の方向、試薬濃度、流速等）で測定される。例えば、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体は、本開示の目的に関して、ｐＨ６．０で該抗体がＨＬＡ−Ｂ*２７に結合するときのＥＣ50値の、ｐＨ７．２で該抗体がＨＬＡ−Ｂ*２７に結合するときのＥＣ50値に対する比率が、少なくとも約１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１５．０、２０．０、２５．０であるか、またはそれより大きい比率である場合、「ｐＨ依存性結合」を有すると考えられる（例えば、本明細書における表２１および２２［実施例１１］を参照）。本発明のいくつかの実施形態において、ｐＨ依存性結合は、結合の会合速度定数（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ｋa）、結合の解離速度定数（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ｋd）、または解離半減期（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  ｈａｌｆ−ｌｉｖｅｓ）（ｔ1/2）に関して測定される場合もある。
【００６１】
本発明はまた、インビトロでＨＬＡ−Ｂ*２７が介在するＴ細胞活性化を遮断するか、または減少させることができる抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体も包含する。本明細書の実施例４に、抗体がインビトロでＨＬＡ−Ｂ*２７が介在するＴ細胞活性化を遮断するか、または低下させるかどうかを判断するための例示的なアッセイを示す。この実施例において、２種の加工された細胞株が使用される。第１の細胞株は、その表面上に、ヒトβ２ｍおよびＨＬＡ制限ペプチドと共にＨＬＡ−Ｂ*２７の重鎖対立遺伝子変異体を発現するものである。第２の細胞株は、活性化されると検出可能なルシフェラーゼシグナルを産生するＴ細胞受容体を発現するレポーター細胞株である。第１の細胞株に様々な量の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を添加して、その後、レポーター細胞株と混合して、ＩＣ50値を計算する。本発明は、実施例４で示されるような遮断バイオアッセイ、または実質的に類似したアッセイで試験した場合、約１２．５ｎＭ未満のＩＣ50を示す抗体を包含する。例えば、本発明は、実施例４で示されるような遮断バイオアッセイ、または実質的に類似したアッセイで試験した場合、約１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、８ｎＭ未満、６ｎＭ未満、４ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、９００ｐＭ未満、８５０ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７５０ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６５０ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５５０ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４５０ｐｍ未満、４００ｐＭ未満、またはそれより低いＩＣ50を示す抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を包含する。
【００６２】
また本発明は、他の（非Ｂ*２７）ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子変異体（例えばＨＬＡ−Ｂ*０７など）と比較して、ＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子変異体（例えばＨＬＡ−Ｂ*２７０５および／またはＨＬＡ−Ｂ*２７０９など）への増大した結合を示す抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体も包含する。本明細書の実施例８に、抗体が１種またはそれ以上のＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子変異体（単数または複数）への増大した結合を示すかどうかを判断するアッセイの例示的な様式を示す。この実施例では、ＨＬＡを発現しない親細胞への各抗体の結合と比較した、ＨＬＡ−Ｂ*０７、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５またはＨＬＡ−Ｂ*２７０９のいずれかを発現する細胞への各抗体の相対的な結合が判断される。このタイプのアッセイの様式を使用して、親細胞株への結合と比較して少なくとも５０倍大きいＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子変異体発現細胞への結合（表１５では［＋＋］または［＋＋＋］で示される）を示すが、非ＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子変異体（例えばＨＬＡ−Ｂ*０７）発現細胞への結合は、親細胞への結合と比較して１０倍未満である（表１５では［＋］で示される）抗体が、別のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子変異体（単数または複数）と比較してＨＬＡ−Ｂ*２７に対して「増大した結合」を示す抗体と考えられる。特定の例において、本明細書の実施例８のアッセイの様式、または実質的に類似したアッセイの様式で試験した場合、抗体が、親細胞への結合と比較して少なくとも５０倍大きい、ＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子変異体発現細胞への結合（表１５では［＋＋］または［＋＋＋］で示される）を示すが、非ＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子変異体（例えばＨＬＡ−Ｂ*０７）発現細胞への結合は、親細胞への結合と比較して３倍未満である場合（表１５では［−］で示される）、その抗体は、他のＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子変異体と比較してＨＬＡ−Ｂ*２７への「増大した結合」を示すと考えられる。
【００６３】
エピトープマッピングおよび関連する技術
本発明は、ＨＬＡ−Ｂ*２７重鎖のアルファ−１、アルファ−２、および／またはアルファ−３のＩｇドメイン内に見出される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を包含する。ＨＬＡ−Ｂ*２７０５（配列番号３８５）およびＨＬＡ−Ｂ*２７０９（配列番号３８６）の場合、アルファ−１のＩｇドメインは、対応する完全な重鎖アミノ酸配列のアミノ酸２５〜１１４からなり、アルファ−２のＩｇドメインは、対応する完全な重鎖アミノ酸配列のアミノ酸１１５〜２０６からなり、アルファ−３のＩｇドメインは、対応する完全な重鎖アミノ酸配列のアミノ酸２０７〜２９８からなる。抗体が結合するエピトープは、ＨＬＡ−Ｂ*２７重鎖の１つまたはそれ以上のＩｇドメイン内に位置する３つまたはそれより多くの（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多くの）アミノ酸の単一の連続した配列からなっていてもよい。あるいは、このようなエピトープは、ＨＬＡ−Ｂ*２７重鎖の１つまたはそれ以上のＩｇドメイン内に位置する複数の連続していないアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。また本発明の抗体は、β２ｍ配列（配列番号３８８）内の１つまたはそれ以上のアミノ酸とも相互作用する可能性がある。
【００６４】
当業者に公知の様々な技術を用いて、抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを判断することができる。例示的な技術として、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．、ニューヨーク州）で説明されているもの等の日常的な交差遮断アッセイ、アラニン・スキャニング変異分析、ペプチド・ブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２４８：４４３〜４６３ページ（２００４））およびペプチド切断分析が挙げられる。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出および化学修飾等の方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ９：４８７〜４９６ページ（２０００））。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定するために用いることができる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。大まかに言えば、水素／重水素交換法は、検査対象であるタンパク質を重水素標識すること、続いて重水素標識したタンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体で保護されている残基（重水素標識のままである）を除く全ての残基で水素−重水素交換させる。抗体が解離した後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析に供し、それにより抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えばＥｈｒｉｎｇ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６７（２）：２５２〜２５９ページ（１９９９）；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ〜２６５Ａページ（２００１）参照。
【００６５】
本発明はさらに、本明細書で説明される特定の例示的な抗体のいずれか（例えば、Ｈ１Ｍ２４７７Ｎ、Ｈ１Ｍ２４９０Ｎ、Ｈ２Ｍ２４８２Ｎ、Ｈ１Ｍ２４７７Ｎ２、Ｈ１Ｍ２４９０Ｎ２、Ｈ２Ｍ２４８２Ｎ２、Ｈ１Ｍ２４８０Ｎ、Ｈ１Ｍ２４９７Ｎ、Ｈ２Ｍ２４９１Ｎ、Ｈ２Ｍ２４９９Ｎ、Ｈ２Ｍ２７１８Ｎ、Ｈ４Ｈ２５２４Ｐ、Ｈ４Ｈ２５２６Ｐ、Ｈ４Ｈ２５２８Ｐ、Ｈ４Ｈ２５３０Ｓ、Ｈ４Ｈ２５３２Ｐ、Ｈ４Ｈ２５３４Ｓ、Ｈ４Ｈ２５３８Ｐ、Ｈ４Ｈ２５４２Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５５Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５９Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６０Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６２Ｓ、Ｈ４Ｈ２５６４Ｓ等）と同じエピトープに結合する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体も包含する。同様に、本発明はまた、本明細書で説明される特定の例示的な抗体のいずれか（例えば、Ｈ１Ｍ２４７７Ｎ、Ｈ１Ｍ２４９０Ｎ、Ｈ２Ｍ２４８２Ｎ、Ｈ１Ｍ２４７７Ｎ２、Ｈ１Ｍ２４９０Ｎ２、Ｈ２Ｍ２４８２Ｎ２、Ｈ１Ｍ２４８０Ｎ、Ｈ１Ｍ２４９７Ｎ、Ｈ２Ｍ２４９１Ｎ、Ｈ２Ｍ２４９９Ｎ、Ｈ２Ｍ２７１８Ｎ、Ｈ４Ｈ２５２４Ｐ、Ｈ４Ｈ２５２６Ｐ、Ｈ４Ｈ２５２８Ｐ、Ｈ４Ｈ２５３０Ｓ、Ｈ４Ｈ２５３２Ｐ、Ｈ４Ｈ２５３４Ｓ、Ｈ４Ｈ２５３８Ｐ、Ｈ４Ｈ２５４２Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５５Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５９Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６０Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６２Ｓ、Ｈ４Ｈ２５６４Ｓ等）とＨＬＡ−Ｂ*２７への結合に関して競合する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体も包含する。
【００６６】
当技術分野で公知の日常的な方法を用いることにより、抗体が参照抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体と同じエピトープに結合するか、または結合に関して参照抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体と競合するかどうかを容易に判断することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判断するために、参照抗体をＨＬＡ−Ｂ*２７複合体（例えば、可溶性ＨＬＡ−Ｂ*２７／ペプチド融合タンパク質、またはＨＬＡ制限ペプチドと複合体を形成する細胞表面で発現されるＨＬＡ−Ｂ*２７）に結合させる。次に、ＨＬＡ−Ｂ*２７複合体に結合する試験抗体の能力を評価する。参照抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体との飽和結合後に試験抗体がＨＬＡ−Ｂ*２７に結合することができる場合、試験抗体は参照抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、参照抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体との飽和結合後に試験抗体がＨＬＡ−Ｂ*２７複合体に結合することができない場合、そのときには試験抗体は本発明の参照抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。次いで、観察された試験抗体の結合の欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するかどうか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠如の原因であるかどうかを、追加の日常的な実験（例えばペプチド変異および結合分析）を行って確認することができる。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリーまたは当技術分野で利用可能である任意の別の定量的なまたは定性的な抗体結合アッセイを用いてこの種の実験を実施することができる。本発明の特定の実施形態によれば、例えば１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰である一方の抗体が、競合的結合アッセイでの測定で少なくとも５０％であるが好ましくは７５％、９０％またはさらには９９％で他方の結合を阻害する場合、２つの抗体は同じ（または重複する）エピトープに結合する（例えばＪｕｎｇｈａｎｓ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５〜１５０２ページ参照）。あるいは、一方の抗体の結合を低減するまたは排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合を低減するまたは排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると考えられる。一方の抗体の結合を低減するまたは排除するアミノ酸変異の一部のみが他方の結合を低減するまたは排除する場合、２つの抗体は「重複するエピトープ」を有すると考えられる。
【００６７】
結合に関して抗体が参照抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体と競合するかどうかを判断するために、前述した結合方法論が２つの方向で実施される：第１の方向では、飽和条件下で参照抗体をＨＬＡ−Ｂ*２７複合体に結合させ、続いてＨＬＡ−Ｂ*２７複合体への試験抗体の結合を評価する。第２の方向では、飽和条件下で試験抗体をＨＬＡ−Ｂ*２７複合体に結合させ、続いてＨＬＡ−Ｂ*２７複合体への参照抗体の結合を評価する。両方向において第１の（飽和）抗体のみがＨＬＡ−Ｂ*２７複合体に結合することができる場合、そのときはＨＬＡ−Ｂ*２７への結合に関して試験抗体と参照抗体とが競合すると結論付けられる。当業者に十分理解されるように、参照抗体との結合が競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しなくてもよいが、重複または隣接するエピトープに結合することにより参照抗体の結合を立体的に遮断することができる。
【００６８】
ヒト抗体の調製
完全ヒトモノクローナル抗体等のモノクローナル抗体の作成方法は当技術分野で公知である。そのような公知の任意の方法を本発明と関連して用いてヒトＨＬＡ−Ｂ*２７に特異的に結合するヒト抗体を作ることができる。
【００６９】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術またはモノクローナル抗体を作成する任意の別の公知の方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＨＬＡ−Ｂ*２７に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。下記の実験セクションのように、親和性、選択性、エピトープ等を含む望ましい特徴に関して抗体が特徴付けられて選択される。マウス定常領域が所望のヒトの定常領域と置き換えられて本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型または改変したＩｇＧ１またはＩｇＧ４が作成される。選択された定常領域を特定の用途に従って変更することができるが、高親和性抗原結合および標的特異度特性は可変領域中に存在する。
【００７０】
生物学的同等物
本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体および抗体フラグメントは、説明した抗体の配列とは異なるがヒトＨＬＡ−Ｂ*２７に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較した場合にアミノ酸の１個またはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが、説明した抗体の生物化学的活性と本質的に同等である生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示した配列と比較した場合にヌクレオチドの１個またはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体または抗体フラグメントと本質的に生物学的に同等である抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体または抗体フラグメントをコードする配列を包含する。そのような変異アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は上記で論じられている。
【００７１】
２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば同じ実験条件下において同じモル用量で単回投与または複数回投与される際に、その吸収速度および量が顕著な差異を示さない医薬同等物または医薬代替物である場合に、生物学的に同等であるとみなされる。いくつかの抗体は、それらの吸収量は同等であるが吸収速度は同等ではなく、それにも関わらず、吸収速度におけるそのような差異が計画的であり、ラベリングに反映されており、有効な体内薬物濃度の達成に、例えば慢性使用において不可欠ではなく、そして研究された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないと判断されるためになお生物学的に同等であると判断し得る場合、それらの抗体は同等物または医薬代替物と判断されるであろう。
【００７２】
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度および力価において臨床的に有意な差異がない場合には、生物学的に同等である。
【００７３】
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、参照製品と生物学的製品とを１回またはそれ以上切り替えられずに継続される治療と比較して、免疫原性における臨床的に有意な変化等の予期される副作用リスクの増加がなく、または有効性の減少がなく、患者が参照製品と生物学的製品とを１回またはそれ以上切り替えることができる場合には、生物学的に同等である。
【００７４】
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、それらが使用条件（単数または複数）に関して作用の共通の機序（単数または複数）によって両方ともそのような機序が公知である程度まで作用する場合には生物学的に同等である。
【００７５】
生物学的同等性をインビボおよびインビトロの方法によって実証することができる。生物学的同等性の測定として、例えば（ａ）血液、血漿、血清または別の体液における抗体またはその代謝産物の濃度を時間の関数として測定する、ヒトまたは別の哺乳類におけるインビボ試験；（ｂ）ヒト・インビボ生物学的利用能のデータと相関させ、前記データを合理的に予測するインビトロ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理効果を時間の関数として測定する、ヒトまたは別の哺乳類におけるインビボ試験；および（ｄ）抗体の安全性、有効性または生物学的利用能もしくは生物学的同等性を確立する、十分に管理された臨床試験が挙げられる。
【００７６】
例えば残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または生物学的活性に必要ではない末端のもしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることにより、本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の生物学的に同等な変異体を構築することができる。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を欠失させることにより、または別のアミノ酸と置き換えることにより、再生時の不必要なまたは不適当な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。別の状況において、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除するまたは除去する変異を含む抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の変異体を含むことができる。
【００７７】
免疫結合体
本発明は、細胞毒素、化学療法薬、免疫抑制剤または放射性同位体等の治療部分に結合した抗ＨＬＡ−Ｂ*２７モノクローナル抗体（「免疫結合体」）を包含する。細胞毒性剤として、細胞に有害である任意の薬剤が挙げられる。免疫結合体の形成に適した細胞毒性剤および化学療法剤の例は当技術分野で公知である（例えばＷＯ０５／１０３０８１参照）。
【００７８】
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、または１超の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してもよい。例えばＴｕｔｔ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９ページ（１９９１）；Ｋｕｆｅｒ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８〜２４４ページ（２００４）参照。本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を別の機能性分子（例えば別のペプチドまたはタンパク質）に連結させることができ、または機能性分子と共発現させることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントを別の抗体または抗体フラグメント等の１つまたはそれ以上の別の分子的実在物に（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合または別の方法によって）機能的に連結させることにより、第２の結合特異性を備えた二重特異性抗体または多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがＨＬＡ−Ｂ*２７またはそのフラグメントに特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームが第２の治療標的に特異的であるかまたは治療部分に結合されている二重特異性抗体を含む。
【００７９】
本発明との関連で用いることができる例示的な二重特異性抗体フォーマットは第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣH３ドメインおよび第２のＩｇＣH３ドメインを用いることを含み、第１のおよび第２のＩｇＣH３ドメインは少なくとも１個のアミノ酸が互いに異なっており、少なくとも１個のアミノ酸の差異は、アミノ酸の差異を欠く二重特異性抗体と比較してプロテインＡへの二重特異性抗体の結合を弱める。一実施形態において、第１のＩｇＣH３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣH３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン・ナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）等のプロテインＡ結合を弱めるまたは消失させる変異を含有する。第２のＣH３は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含んでもよい。第２のＣH３内に見られるさらなる改変として、ＩｇＧ１抗体の場合にはＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）が挙げられ；ＩｇＧ２抗体の場合にはＮ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）が挙げられ；ならびにＩｇＧ４抗体の場合にはＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。前述した二重特異性抗体フォーマットでの多様性は本発明の範囲内で考慮される。
【００８０】
本発明の状況で使用できる他の例示的な二重特異的なフォーマットとしては、これらに限定されないが、例えば、ｓｃＦｖベースの、または二重特異性抗体の二重特異的フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えばノブ・イントゥ・ホールを有する共通の軽鎖）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異的フォーマット（前述のフォーマットのレビューに関しては、例えばＫｌｅｉｎ他、２０１２、ｍＡｂｓ  ４：６、１〜１１ページ、およびそこで引用された文献を参照）などが挙げられる。また二重特異性抗体は、例えばペプチド／核酸の共役を使用して構築することもでき、その場合、定向性の化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して部位特異的な抗体−オリゴヌクレオチド結合体を作成し、次いで決められた組成、原子価、および幾何学的配置で多量体の複合体に自己集合させる。（例えば、Ｋａｚａｎｅ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［電子出版：２０１２年１２月４日］を参照）。
【００８１】
治療用製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適切な担体、賦形剤および移送、送達、耐性等を改善する別の薬剤と共に製剤化される。全ての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ中に多数の適切な製剤を見出すことができる。これらの製剤として、例えば粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）等）、ＤＮＡ接合体、無水吸収ペースト、水中油型のおよび油中水型のエマルション、エマルション・カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲルならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ他、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８〜３１１ページも参照。
【００８２】
患者に投与される抗体の用量を患者の年齢および大きさ、標的とする疾患、症状、投与経路等に応じて変更することができる。好ましい用量は、体重または体表面積に従って典型的には算出される。成人の患者においてＨＬＡ−Ｂ*２７活性と関連した症状または疾患を治療するために本発明の抗体が用いられる場合、通常は約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で本発明の抗体を静脈内投与することが好都合であり得る。症状の重症度に応じて治療の頻度および継続期間を調整することができる。ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の投与に効果的な投薬量およびスケジュールを経験的に決定することができ、例えば患者の経過を周期的な評価でモニタリングし、モニタリングに基づいて用量を調整することができる。さらに、当技術分野で公知の方法を用いて種間での投薬量のスケーリングを実施することができる（例えばＭｏｒｄｅｎｔｉ他、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１ページ（１９９１））。
【００８３】
様々な送達系、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、変異ウイルスを発現できる組み換え細胞、受容体介在エンドサイトーシスが知られており、本発明の医薬組成物の投与に用いることができる（例えばＷｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２ページ（１９８７）参照）。導入法として皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。任意の好都合な経路により、例えば点滴またはボーラス注入により、上皮もしくは粘膜皮膚の内膜（例えば口腔粘膜、直腸および腸の粘膜等）を介した吸収により組成物を投与することができ、および別の生物学的活性剤と共に組成物を投与することができる。全身にまたは局所的に投与することができる。
【００８４】
標準的な針およびシリンジにより、皮下にまたは静脈内に本発明の医薬組成物を送達することができる。加えて、皮下送達に関して、本発明の医薬組成物の送達にペン型送達デバイスが容易に適用される。そのようなペン型送達デバイスは再使用可能であり、または使い捨てであってもよい。再使用可能なペン型送達デバイスは、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを一般的には利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジを容易に廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。その後、ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは交換可能なカートリッジがない。正確に言えば、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバ中に収容される医薬組成物が予め充填されている。リザーバの医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
【００８５】
本発明の医薬組成物の皮下送達に多数の再使用可能なペン型および自己注射型送達デバイスが適用される。ほんの数例を挙げると、例としてＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、イギリス）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、スイス）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、ドイツ）が挙げられるが、これらに限定されない。ほんの数例を挙げると、本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン型送達デバイスの例として、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自己注射器（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、カリフォルニア州）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、ドイツ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  イリノイ州）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
特定の状況では、制御された放出系において医薬組成物を送達することができる。一実施形態において、ポンプを用いてもよい（Ｌａｎｇｅｒ、前記参照；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１ページ参照）。別の実施形態において、ポリマー材料を用いてもよい；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、１９７４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ参照。さらに別の実施形態において、制御された放出系を組成物の標的の近くに設置することができ、結果として全身用量のごく一部が必要となる（例えばＧｏｏｄｓｏｎ、１９８４、ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、前記の第２巻、１１５〜１３８ページ参照）。別の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７〜１５３３ページで述べられている。
【００８７】
注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴等のための剤形を含むことができる。これらの注射可能な調製物を公知の方法で調製することができる。例えば、前述の抗体またはその塩を、注射用に従来用いられていた無菌の水性媒体または油性媒体に溶解すること、懸濁すること、または前記媒体で乳化すること等により注射可能な調製物を調製することができる。注射用の水性媒体として、例えば生理食塩水、グルコースおよび別の助剤等を含有する等張液が挙げられ、水性媒体をアルコール（例えばエタノール）、多価アルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）添加物）］等の適切な可溶化剤と組み合わせて用いることができる。油性媒体として、例えばゴマ油、大豆油等が用いられ、油性媒体を、安息香酸ベンジル、ベンジル・アルコール等の可溶化剤と組み合わせて用いてもよい。このように調製された注射剤は、適切なアンプル中に好ましくは充填される。
【００８８】
好都合なことに、前述の経口用途または非経口用途の医薬組成物は、活性成分の用量に合うように適合された単位用量で剤形に調製される。そのような単位用量の剤形として、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤等が挙げられる。含有される前述の抗体の量は、一般的に単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり；特に注射剤の形態では、前述の抗体は約５〜約１００ｍｇで含有され、別の剤形では約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【００８９】
抗体の治療用途での使用
本発明の抗体（およびそれらを含む医薬組成物）は、ＨＬＡ−Ｂ*２７活性に関連する、もしくはＨＬＡ−Ｂ*２７活性が介在するあらゆる疾患または障害、またはＨＬＡ−Ｂ*２７が介在する抗原提示を遮断もしくは弱化することによって処置可能なあらゆる疾患または障害の処置、予防、および／または改善に特に有用である。本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を用いて処置が可能な例示的な疾患および障害としては、例えば、強直性脊椎炎、反応性関節炎（ライター症候群）、急性前部ブドウ膜炎、筋実質炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎等などの脊椎関節症が挙げられる。本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を用いて予防、処置および／または改善が可能な追加の疾患および障害としては、固形臓器移植の拒絶、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が挙げられる。
【００９０】
投与レジメン
本発明の特定の実施形態によれば、決められた時間経過で抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の複数回の用量を対象に投与してもよい。本発明のこの形態に係る方法は、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の複数回の用量を対象に連続投与することを含む。「連続投与」は、本明細書で用いられる場合、異なる時点で、例えば予め決められた間隔（例えば、数時間、数日、数週間または数カ月）で隔てられた異なる日に、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の各用量を対象に投与することを意味する。本発明は、１回の初回用量の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体、それに続いて１回またはそれ以上の第二の用量の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体、場合によりそれに続いて１回またはそれ以上の第三の用量の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を患者に連続投与することを含む方法を包含する。
【００９１】
用語「初回用量」、「第二の用量」、および「第三の用量」は、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体投与の時系列を指す。したがって、「初回用量」は、処置レジメンの最初に投与される用量であり（また「ベースラインの用量」とも称される）；「第二の用量」は、初回用量の後に投与される用量であり；「第三の用量」は、第二の用量の後に投与される用量である。初回、第二、および第三の用量は、全ての同じ量の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を含んでいてもよいが、一般的には、投与回数に応じて互いに異なっていてもよい。しかしながら、特定の実施形態において、初回、第二、および／または第三の用量に含まれる抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の量は、処置の経過で互いに異なる（例えば必要に応じて上方または下方調節される）。特定の実施形態において、処置レジメンの最初に「負荷用量」として２回またはそれ以上（例えば２回、３回、４回、または５回）の用量が投与され、続いて次の用量はそれより少ない回数で（例えば「維持量」で）投与される。
【００９２】
本発明の典型的な実施形態の一つにおいて、第二および／または第三の用量のそれぞれは、すぐ前の投与から１週間後から２６週間後（例えば、１週間後、１週間半後、２週間後、２週間半後、３週間後、３週間半後、４週間後、４週間半後、５週間後、５週間半後、６週間後、６週間半後、７週間後、７週間半後、８週間後、８週間半後、９週間後、９週間半後、１０週間後、１０週間半後、１１週間後、１１週間半後、１２週間後、１２週間半後、１３週間後、１３週間半後、１４週間後、１４週間半後、１５週間後、１５週間半後、１６週間後、１６週間半後、１７週間後、１７週間半後、１８週間後、１８週間半後、１９週間後、１９週間半後、２０週間後、２０週間半後、２１週間後、２１週間半後、２２週間後、２２週間半後、２３週間後、２３週間半後、２４週間後、２４週間半後、２５週間後、２５週間半後、２６週間後、２６週間半後、またはそれより後）に投与される。成句「すぐ前の投与」は、本明細書で用いられる場合、一連の複数回投与において、その順番において次の用量が投与される前に患者に投与される抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の投与であって、その間に投与が行われないことを意味する。
【００９３】
本発明のこの態様に係る方法は、患者に、あらゆる回数の第二および／または第三の用量の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を投与することを含んでいてもよい。例えば、特定の実施形態において、第二の用量が１回のみ患者に投与される。別の実施形態において、２回またはそれ以上（例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、またはそれより多くの回数）の第二の用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態において、第三の用量が１回のみ患者に投与される。別の実施形態において、２回またはそれ以上（例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、またはそれより多くの回数）の第三の用量が患者に投与される。
【００９４】
複数回の第二の用量を含む実施形態において、第二の用量のそれぞれは、他の第二の用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、第二の用量のそれぞれは、すぐ前の投与から１週間後から２週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数回の第三の用量を含む実施形態においても、第三の用量のそれぞれは、他の第三の用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、第三の用量のそれぞれは、すぐ前の投与から２週間後から４週間後に患者に投与されてもよい。あるいは、第二および／または第三の用量が患者に投与される頻度を、処置レジメンの経過中に変えることもできる。また、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、処置の経過中に医師が投与頻度を調節してもよい。
【００９５】
併用療法
本発明は、少なくとも１種の追加の治療活性を有する成分と組み合わせて、本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を投与することを含む治療用投与レジメンを包含する。そのような追加の治療活性を有する成分の非限定的な例としては、他のＨＬＡ−Ｂ*２７遮断剤、例えば、第２の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体などが挙げられる。本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体と組み合わせた投与が有益な可能性がある他の物質としては、サイトカイン阻害剤（例えば、小分子サイトカイン阻害剤、および例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカインまたはそれぞれ個々の受容体に結合する抗体等）、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、ならびに／またはＮＳＡＩＤが挙げられる。
【００９６】
本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の投与の前に、同時に、または後に追加の治療活性成分（単数または複数）を投与することができる（本開示の目的のために、そのような投与レジメンを追加の治療活性成分と「組み合わされた」抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の投与とみなす）。
【００９７】
抗体の診断での使用
また本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を使用して、例えば診断目的で、サンプル中のＨＬＡ−Ｂ*２７またはＨＬＡ−Ｂ*２７発現細胞を検出および／または測定できる。例えば、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体、またはそのフラグメントを使用して、ＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子サブ変異体（例えば、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５またはＨＬＡ−Ｂ*２７０９）の存在を特徴とする状態または疾患を診断できる。ＨＬＡ−Ｂ*２７に関する例示的な診断アッセイは、例えば患者から得たサンプルを本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体と接触させることを含むことができ、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体は検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて、標識されていない抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を診断用途で用いることができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓもしくは125Ｉ等の放射性同位体；フルオロセイン・イソチオシアネートもしくはローダミン等の蛍光部分もしくは化学発光部分；またはアルカリ・ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼ等の酵素であることができる。サンプル中のＨＬＡ−Ｂ*２７を検出するためにまたは測定するために用いることができる特定の例示的なアッセイとして、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【００９８】
本発明に係るＨＬＡ−Ｂ*２７診断アッセイで用いることができるサンプルとして、正常な状態下または病的状態下で患者から得ることができる、検出可能な量のＨＬＡ−Ｂ*２７タンパク質またはそのフラグメント等の任意の組織サンプルまたは液体サンプルが挙げられる。一般的には、健康な患者（例えば、ＨＬＡ−Ｂ*２７または特定のＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子に関連する疾患または状態に罹患していない患者）から得られた特定のサンプル中のＨＬＡ−Ｂ*２７のレベルを測定することにより、最初にベースラインまたは標準のＨＬＡ−Ｂ*２７レベルが確立されると予想される。次に、このベースライン・レベルのＨＬＡ−Ｂ*２７を、ＨＬＡ−Ｂ*２７に関連した疾患または状態を有する疑いがある個体から得たサンプルで測定したＨＬＡ−Ｂ*２７のレベルと比較することができる。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのようにして作るかおよび用いるかを当業者に完全に開示するとともに説明するために提示されており、発明者らが自らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図していない。用いた数字（例えば量、温度等）に関して、正確性を確保する努力はしているが、多少の実験的誤差および偏差を考慮すべきである。特に指示がない場合、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１００】
〔実施例１〕
ヒトＨＬＡ−Ｂ*２７に対するヒト抗体の作成
抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を作成するために、可溶性ＨＬＡ−Ｂ*２７融合タンパク質（ＨＬＡ制限ペプチドに融合したＨＬＡ−Ｂ*２７０５重鎖細胞外ドメインおよびβ２ｍ配列を含む）、またはＨＬＡ−Ｂ*２７を発現する組織／細胞のいずれかを用いた、加えてその組み合わせを用いた標準的な方法に従ってＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（例えば米国特許第６，５９６，５４１号を参照）を免疫化した。ＨＬＡ−Ｂ*２７特異的なイムノアッセイによって抗体免疫反応をモニターした。所望の免疫反応が達成されたら、脾細胞を回収してマウス骨髄腫細胞と融合させ、その生存率を保ち、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングして選択することにより、ＨＬＡ−Ｂ*２７特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技術を使用して、数種の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを有する抗体）を得た；この方式で作成された代表的な抗体を以下のように名付けた：２４７７Ｎ、２４９０Ｎ、２４８２Ｎ、２４７７Ｎ２、２４９０Ｎ２、２４８２Ｎ２、２４８０Ｎ、２４９７Ｎ、２４９１Ｎ、２４９９Ｎ、および２７１８Ｎ。
【０１０１】
また抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体も、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１で説明されているようにして骨髄腫細胞に融合させずに抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。この方法を使用して、数種の完全ヒト抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体（すなわち、ヒト可変ドメインとヒト定常ドメインとを有する抗体）を得た；この方式で作成された代表的な抗体を、以下のように名付けた：２５２４Ｐ、２５２６Ｐ、２５２８Ｐ、２５３０Ｓ、２５３２Ｐ、２５３４Ｓ、２５３８Ｐ、２５４２Ｐ、２５５５Ｐ、２５５９Ｐ、２５６０Ｐ、２５６２Ｓ、および２５６４Ｓ。
【０１０２】
以下に記載の実施例で、この実施例の方法に従って作成された代表的な抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の特定の生物学的特性を詳細に説明する。
【０１０３】
〔実施例２〕
重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列
表１に、選択された抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の重鎖および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ）ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）に関するアミノ酸配列の識別子（配列番号）を記載する。
【０１０４】
【表１】
0006320993.tif 000002
【０１０５】
抗体は、典型的には、本明細書では以下の命名法に従って名付けられる：Ｆｃを示す接頭辞（例えば「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２Ｍ」）、続いて数字の識別子（例えば表１で示されるように「２４７７」または「２５２４」）、続いて「Ｐ」、「Ｎ」または「Ｓ」を示す接尾辞。したがって、抗体は、本明細書にではこの命名法に従って例えば「Ｈ１Ｍ２４７７Ｎ」または「Ｈ４Ｈ２５２４Ｐ」と称することができる。本明細書において使用される抗体の名称の前に付けられるＨ４Ｈ、Ｈ１Ｍ、およびＨ２Ｍという接頭語は、抗体の特定のＦｃ領域を提示する。例えば、「Ｈ１Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ１のＦｃを有し、それに対して「Ｈ４Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ４のＦｃを有する。当業者であれば理解しているものと予想されるが、Ｈ１ＭまたはＨ２Ｍ抗体はＨ４Ｈ抗体に変換することができ、逆もまた同様であるが、いずれの場合においても表１で示される数字の識別子で表示されている可変ドメイン（例えばＣＤＲ等）は同じままであると予想される。
【０１０６】
〔実施例３〕
表面プラズモン共鳴によって得られたヒトモノクローナル抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の結合親和性および速度定数
リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００、３０００、またはＴ１００−２）を使用して、精製した抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体に対する抗原結合に関する会合速度定数および解離速度定数（それぞれｋaおよびｋd）と計算された平衡解離定数および解離半減期（それぞれＫDおよびｔ1/2）を決定した。以下の構成要素：Ｎ末端のＨＬＡ制限ペプチド配列（ＳＲＹＷＡＩＲＴＲ、配列番号３８７のアミノ酸１〜９）；続いて第１のリンカー配列（配列番号３８７のアミノ酸１０〜１９）；続いてヒトベータ−２ミクログロブリン（β２ｍ）配列（配列番号３８７のアミノ酸２０〜１１８）；続いて第２のリンカー配列（配列番号３８７のアミノ酸１１９〜１３３）；続いてＨＬＡ−Ｂ*２７０５重鎖の細胞外領域（配列番号３８７のアミノ酸１３４〜４０９）；およびｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンＣ末端タグを有する終端（配列番号３８７のアミノ酸４１０〜４３７）からなる加工されたＨＬＡ−Ｂ*２７細胞外ドメインを有するインライン融合タンパク質（「ｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨ」、配列番号３８７）への結合に関して抗体を試験した。
【０１０７】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップへの直接のアミンカップリングによって作成されたポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ−ガンマ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ、番号１０９−００５−０９８）またはモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、番号ＢＲ−１００８−３９）のいずれかの表面上で、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を捕捉した。モノクローナル抗体を捕捉した表面上に様々な濃度のｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨを４分で注入して、会合速度を決定し、次いで解離を８分間モニターした。ＨＢＳＴ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）を使用して、２５℃および３７℃で、５０μｌ／分の流速で、温度依存性結合（表４および５）を決定した。０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０を含むＰＢＳ緩衝液中で、同じ流速で、ｐＨ依存性結合（表２および３）を決定した。
【０１０８】
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０カーブフィッティングソフトウェアを使用してデータを１：１結合モデルに加工してフィッティングすることにより速度論的な会合（ｋa）速度定数と解離（ｋd）速度定数を決定した。速度論的な速度定数から、ＫD（Ｍ）＝ｋd／ｋaおよびｔ1/2（分）＝［ｌｎ２／（６０*ｋd）］に従って結合解離平衡定数（ＫD）と解離半減期（ｔ1/2）を計算した。表２〜５に結果を示す（ＩＣ＝不適合；ＮＢ＝結合なし）。
【０１０９】
【表２】
0006320993.tif 000003
【０１１０】
【表３】
0006320993.tif 000004
【０１１１】
【表４】
0006320993.tif 000005
【０１１２】
【表５】
0006320993.tif 000006
【０１１３】
表２で示されるように、ｐＨ７．２のＰＢＳ中、２５℃で、２１種の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体のうち２０種が、３７０ｐＭから２３９ｎＭの範囲のＫD値でｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨと結合した。１種の抗体、Ｈ４Ｈ２４９９Ｎが低い結合シグナルを生じ、その速度論データは標準モデルにフィットさせることができなかった（ＩＣ）。
【０１１４】
表３で示されるように、ｐＨ５．７５のＰＢＳ中、２５℃で、２１種の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体のうち２０種が、６４１ｐＭから４８８ｎＭの範囲のＫD値でｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨと結合した。１種の抗体、Ｈ４Ｈ２４９９Ｎが低い結合シグナルを生じ、その速度論データは、標準モデルにフィットさせることができなかった（ＩＣ）。
【０１１５】
表４で示されるように、ｐＨ７．４のＨＢＳＴ中、２５℃で、試験された２４種の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体のうち２３種が、４５２ｐＭから２５９ｎＭの範囲のＫD値でｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨと結合した。この条件下で、１種の抗体、Ｈ４Ｈ２４７７ＮがｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨに結合しなかった（ＮＢ）。
【０１１６】
表５で示されるように、ｐＨ７．４のＨＢＳＴ中、３７℃で試験したところ、試験された２１種の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体のうち２０種が、８３７ｐＭから４３０ｎＭの範囲のＫD値でｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨと結合した。この条件下で、１種の抗体、Ｈ４Ｈ２４８０ＮがｓｃＨＬＡ−Ｂ２７−ｍｍＨに結合しなかった。
【０１１７】
抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体のｐＨ依存性の結合特性を評価するために、試験された抗体のそれぞれについてｐＨ５．７５におけるＫD値とｐＨ７．２におけるＫD値との比率を計算した（表６）。本明細書で用いられる場合、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体は、高いｐＨ値において、それより低いｐＨ値で示された結合と比較してより高いレベルの結合（例えばより低いＫD値）を示す場合、その抗体は「ｐＨ依存性結合」を示すとする；これは、結合比として表すことができる（例えば、そのような場合、ｐＨ依存性結合は、ｐＨ５．７５におけるＫD値が、そのｐＨ７．２におけるＫD値よりも少なくとも５倍大きいことによって実証される（以下の表６に示される通り）。
【０１１８】
【表６】
0006320993.tif 000007
【０１１９】
表６で示されるように、上述の定義に従ってｐＨ依存性結合を示した本発明の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体は：Ｈ４Ｈ２５３０Ｓ、Ｈ４Ｈ２５３４Ｓ、Ｈ４Ｈ２５４２Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６０Ｐ、およびＨ４Ｈ２５６４Ｓである。
【０１２０】
〔実施例４〕
インビトロで抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体はＨＬＡ−Ｂ*２７によって誘導されるＴ細胞活性化を遮断する
２種の哺乳動物細胞株：ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ分子を低い内因性レベルで発現するかまたはそれらの内因性レベルがゼロであることがこれまでに示されているＢリンパ芽球様細胞株であるＣ１Ｒ−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ、番号ＣＲＬ−２３６９）；およびＪｕｒｋａｔヒトＣＤ４＋Ｔ細胞株から得られた混合培養物を利用することによりバイオアッセイを行って、ＨＬＡ−Ｂ*２７−ペプチド複合体と対応するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との相互作用により誘導されたＴ細胞活性化を測定した。
【０１２１】
バイオアッセイの第１の構成要素について、インフルエンザＡウイルスの核タンパク質から誘導された９アミノ酸のＨＬＡ−Ｂ*２７制限ペプチドであるＮＰ３８３−３９１（ＳＲＹＷＡＩＲＴＲ［配列番号３８９］）と共に、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５対立遺伝子サブ変異体の重鎖（配列番号３８５のアミノ酸２５〜３６２）およびヒトベータ２ミクログロブリン（β２ｍ；配列番号３８８のアミノ酸２１〜１１９）を過剰発現するように、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞株を安定してトランスフェクトした。ＦＡＣＳによってＮＰ３８３−３９１陽性細胞をソートし、安定な細胞株を単離し（Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ／ＨＬＡ−Ｂ*２７０５／β２ｍ／ＮＰ３８３−３９１）、これを１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンが補充されたイスコフ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９０３２）中で維持した。
【０１２２】
バイオアッセイの第２の構成要素について、（１）２つのサブユニット、すなわちＨＬＡ−Ｂ*２７+個体からクローニングされたアルファ（配列番号３９０）およびベータ（配列番号３９１）からなるＴＣＲであるＧＲｂ（インタクトな受容体であるＧＲｂＡＢは、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５と複合体を形成するＮＰ３８３−３９１ペプチドに特異的に結合する）；および（２）２つのサブユニット、すなわちクラスＩ制限ＴＣＲ（通常はＣＤ８＋Ｔ細胞で発現される）の活性化に必要なアルファ（配列番号３９２）およびベータ（配列番号３９３）からなるＣＤ８補助受容体を発現するように、レポーター細胞株であるＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ発現と組み合わせたＩＬ−２応答配列を有する［ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼ］）を加工した。得られた安定な細胞株（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ／ＣＤ８ＡＢ／ＧＲｂＡＢ）を単離し、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンが補充されたＲＰＭＩ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号９１６０）中で維持した。
【０１２３】
バイオアッセイのために、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ／ＨＬＡ−Ｂ*２７０５／β２ｍ／ＮＰ３８３−３９１細胞を、９６ウェルのアッセイプレートに１ウェルあたり細胞１０，０００個で植え付けた。ＩＣ50値を決定するために、１００ｎＭから開始して０．１ｎＭまでの抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の１：３の連続希釈液（抗体対照なし）を細胞に添加し、５％ＣＯ2中、３７℃で１時間インキュベートした。ＨＬＡ−ＴＣＲ相互作用を刺激するために、各ウェルに１００，０００個のＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ／ＣＤ８ＡＢ／ＧＲｂＡＢ細胞を添加し、５％ＣＯ2中、３７℃で５時間インキュベートした。ＯｎｅＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｅ６０５１）試薬を添加することによってルシフェラーゼ活性を検出した。表７に結果を要約する。
【０１２４】
【表７】
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【０１２５】
表７で示されるように、混合培養物のバイオアッセイで試験された２１種の抗ＨＬＡ抗体のうち１３種が、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ／ＣＤ８ＡＢ／ＧｒｂＡＢ細胞のＣ１Ｒ−Ｎｅｏ／ＨＬＡ−Ｂ*２７０５／β２ｍ／ＮＰ３８３−３９１細胞依存性刺激を８５．６ｐＭから１８．１ｎＭの範囲のＩＣ50値で遮断した。加えて、このアッセイにおいて２１種の抗体のうち６種も遮断したが、Ｓ字状の様式ではなかった。試験されたもののうちの１種の抗体、Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２が、混合培養物のバイオアッセイにおいて強い活性化を示したが、Ｓ字状の様式ではなかった。
【０１２６】
〔実施例５〕
ＨＬＡ−Ｂ*２７発現細胞への抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の結合を確認するためのフローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー分析を利用して、ＨＬＡ−Ｂ*２７+細胞への抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の結合を確認した。試験した細胞は以下の通りである：（ａ）Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ−Ｂ*２７０５細胞株；（ｂ）ＨＬＡ−Ｂ*２７トランスジェニックマウスからの脾細胞；および（ｃ）ＨＬＡ−Ｂ*２７+個体からの一次ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）。Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ−Ｂ*２７０５細胞株は、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５対立遺伝子の重鎖およびヒトベータ２ミクログロブリンを過剰発現するように安定してトランスフェクトされた親Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞株の派生株である（実施例４を参照）。トランスフェクトされていないＣ１Ｒ−ｎｅｏ親細胞を陰性対照として使用した。ＨＬＡ−Ｂ*２７０５の重鎖およびヒトβ２ミクログロブリンのトランスジェニックヘテロ接合型発現によりトランスジェニックマウス株［Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（ＨＬＡ−Ｂ２７）３０−４Ｔｒｇマウス株；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号００３４４０］を作成した。野生型同腹子からの脾細胞を、ヘテロ接合型ＨＬＡ−Ｂ*２７+脾細胞の陰性対照として使用した。ＨＬＡ−Ｂ*２７陽性として一次ヒトＰＢＭＣを遺伝子型解析し、市販の抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体（ＨＬＡ  ＡＢＣ  Ａｂ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ＭＡＢ１２８５Ｆ）で染色することによってＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子の発現を確認した。ＨＬＡ−Ｂ*２７-ドナーからのＰＢＭＣを陰性対照として使用した。
【０１２７】
マウス脾細胞を用いた実験のために、マウスを処分し、脾臓を取り出し、機械的にホモジナイズした。細胞懸濁液をろ過し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配カラムで単核細胞を精製した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配カラムで白血球濃縮物からヒトＰＢＭＣを精製した（Ｌｅｕｋｏｐａｋ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ，ＮＹ、番号Ｅ３７５２Ｖ００）。
【０１２８】
フローサイトメトリー分析のために、染色緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、番号００−４２２２）中で１００，０００個の細胞を洗浄し、全ヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、番号００９−０００−００３）と共に４℃で１５分インキュベートして、細胞上のＦｃ受容体を遮断した。次に、抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を指定された濃度（０．１または１μｇ／ｍｌ）で添加し、４℃で３０分インキュベートした。細胞を一回洗浄し、次いで二次抗ヒトＦｃ抗体（１：２０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、番号７０９−１１６−１４９）と共に４℃で２０分インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＤ）を使用して蛍光測定値を得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。全ヒトＩｇＧ単独での遮断は、二次抗ｈＦｃ抗体で検出したところ、バックグラウンドを超える結合シグナルを生じなかった。表８に結果を要約する（ＷＴ＝野生型マウス；ＴＧ＝ＨＬＡ−Ｂ２７／ｈβ２ｍトランスジェニックマウス）。
【０１２９】
【表８】
0006320993.tif 000009
【０１３０】
表８で示されるように、全ての試験された抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体が、ＨＬＡ−Ｂ*２７+トランスジェニック脾細胞に結合し、一方で野生型マウスからの脾細胞ではバックグラウンドレベルを超える結合は検出されなかった。同様に、全ての抗体がＣ１Ｒ−ｎｅｏ−Ｂ*２７０５細胞に結合した。親Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞では、Ｈ４Ｈ２４９９Ｎ、Ｈ４Ｈ２５４２Ｐ、およびＨ４Ｈ２５６２Ｐに関してバックグラウンドレベルを超える結合は検出されず、一方でその他全ての抗体はバックグラウンドレベルを超える様々なレベルの結合を示したが、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ−Ｂ*２７０５細胞への結合のレベルよりも低かった。ヒトＰＢＭＣにおいて、全ての抗体が、遺伝子型解析によりＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子を発現することが確認された個体の血液から単離された細胞（「Ｂ２７（陽性）」）を染色した。ＨＬＡ−Ｂ*２７陰性ドナー（「Ｂ２７（陰性）」）からのＰＢＭＣへの結合と比較したところ、結合比は１．１から５．６の範囲であり、なかでもＨ４Ｈ２４９９ＮがＨＬＡ−Ｂ*２７+ＰＢＭＣに対して最大の特異性を示した。
【０１３１】
〔実施例６〕
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へのＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の結合
ＨＬＡ−Ｂ*２７以外の対立遺伝子を発現することが示されているＰＢＭＣを使用して追加のフローサイトメトリー実験を行った。４人のドナーからのヒト血液をＫ２−ＥＤＴＡ抗凝血薬チューブ（ＢＤ、番号３６６６４３）に収集した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、番号５１３０４）を使用して、全血サンプルからゲノムＤＮＡを製造元の説明書の通りに精製した。次いでゲノムＤＮＡサンプルを増幅し、次のＨＬＡ遺伝子座特異的シーケンス反応を、ＳｅＣｏｒｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、遺伝子座Ａは番号５３００９２５、遺伝子座Ｂは番号５３１１９２５Ｄ、遺伝子座Ｃは番号５３２０９２５）を使用して実行した。ＡＢＩ３７３０ｘＬ  ＤＮＡ解析装置を使用してＤＮＡ配列を決定し、ｕＴｙｐｅ  ＳＢＴ  ＨＬＡ配列決定ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号５３９９９−１）を使用してＨＬＡタイプを判断した。
【０１３２】
フィコール遠心分離によりヒトＰＢＭＣを同じドナーの血液から単離した。ＰＢＭＣを、ＣｈｒｏｍＰｕｒｅヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号００９−０００−００３）で遮断し、１μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ抗体で４℃で３０分染色し、続いて染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５５４６５７）で洗浄し、ＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号１０９−１３６−０９８）の１：５００希釈液と共に４℃で２０分インキュベートした。次いでＰＢＭＣを洗浄し、安定化用固定剤（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号３３８０３６）に再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ装置でソートした。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
【０１３３】
表９に、ドナーＨＤ１、ＨＤ２、ＨＤ３、およびＨＤ４から判断されたＨＬＡクラスＩ対立遺伝子を示す。試験された４人のドナーは誰もＨＬＡ−Ｂ*２７陽性と判定されなかった。
【０１３４】
【表９】
0006320993.tif 000010
【０１３５】
表１０に、フローサイトメトリーによって決定されたＨＬＡタイプのドナーのＰＢＭＣに対する抗ＨＬＡ抗体の結合を示す。
【０１３６】
【表１０】
0006320993.tif 000011
【０１３７】
表１０で示されるように、全ての抗ＨＬＡ抗体は、全てのドナーからのＰＢＭＣにある程度は結合したが、抗体Ｈ４Ｈ２５３４Ｓ、Ｈ４Ｈ２５３８Ｐ、Ｈ４Ｈ２５４２Ｐ、およびＨ４Ｈ２５５５Ｐは、ＨＤ２ドナーからのＰＢＭＣに結合しなかった。抗体Ｈ４Ｈ２４９９ＮおよびＨ４Ｈ２７１８Ｎ（表１０の最後の２列）は、非Ｂ*２７ドナーからのＰＢＭＣには最小量の結合を示した。
【０１３８】
〔実施例７〕
表面ＨＬＡ*ＢへのＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の結合
フローサイトメトリー分析をさらに利用して、様々なＨＬＡ*Ｂ対立遺伝子を過剰発現するように加工された細胞株に対する抗ＨＬＡ抗体の結合特異性を決定した。様々なＨＬＡ対立遺伝子を発現する細胞株を作成するために、親Ｋ５６２（不死化ヒト骨髄性白血病）細胞をＤＮＡプラスミドでエレクトロポレーションして、２３種の異なるＨＬＡ対立遺伝子（表１１に示される）と、ネオマイシンまたはハイグロマイシンのいずれかに対する抗生物質耐性遺伝子との安定な統合を促した。次いで、抗生物質による選択条件下にエレクトロポレーションした細胞株を２．５週間から５週間置き、特異的なＨＬＡ対立遺伝子を発現する細胞を選択した。フィコエリトリン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、番号３１１４０６）にコンジュゲートしたＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ  ｐａｎ特異的抗体（クローンＷ６／３２）を使用して、得られたＫ５６２／ＨＬＡ細胞株をＦＡＣＳでソートして、最大レベルの表面ＨＬＡ（発現するもののうち上位１０％）を示す集団を得た。
【０１３９】
【表１１】
0006320993.tif 000012
【０１４０】
フローサイトメトリー分析を行うために、１ウェルあたり細胞約２×１０5個を２００μＬの染色緩衝液（ＢＳＡ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、番号５５４６５７）中で洗浄し、１μｇ／ｍＬの精製ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、番号００９−０００−００３）で室温で１５分遮断した。次に、抗ＨＬＡ抗体を１μｇ／ｍＬで添加し、４℃で３０分インキュベートした。細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、次いで１：５００希釈したヒトＩｇＧＦｃ−ガンマフラグメントに特異的なアロフィコシアニンにコンジュゲートしたヤギポリクローナルＦ（ａｂ’）２二次試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、番号１０９−１３６−０９８）と共に４℃で２０分インキュベートした。細胞を２００μＬで２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＤ）を使用して蛍光測定値を得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して分析した。
【０１４１】
親Ｋ５６２細胞株のＭＦＩシグナルに対するＭＦＩシグナルの比率として示された、様々なＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子を発現するＫ５６２細胞株への２０種の抗ＨＬＡ抗体の結合に関する結果を、以下の表１２、１３、および１４に示す。試験された２０種の抗体のうち、Ｈ４Ｈ２４９９Ｎが最大の程度の特異性を示した。
【０１４２】
【表１２】
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【０１４３】
【表１３】
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【０１４４】
【表１４】
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【０１４５】
〔実施例８〕
ＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子サブ変異体に対する抗体の優先結合
電気化学発光検出技術を使用して、細胞表面のヒトＨＬＡ−Ｂ*２７対立遺伝子サブ変異体（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５およびＨＬＡ−Ｂ*２７０９）に結合する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の能力を、そのＨＬＡ−Ｂ*０７対立遺伝子変異体への結合能力と比較して測定した。これらの研究のために、ＨＬＡ−Ｂ*０７重鎖（ＣＲ１−Ｂ７、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２３７１）、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５重鎖（配列番号３８５のアミノ酸２５〜３６２）、またはＨＬＡ−Ｂ*２７０９重鎖（配列番号３８６のアミノ酸２５〜３６２）のいずれかを発現するように安定してトランスフェクトされたＣ１Ｒ−ｎｅｏ細胞を使用した。それぞれのＨＬＡ−Ｂ*発現細胞株はさらに、ＨＬＡ重鎖と非共有結合により複合体を形成するヒトベータ２ミクログロブリン（β２ｍ；配列番号３８８のアミノ酸２１〜１１９）も発現した。
【０１４６】
細胞を回収し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標）Ａｕｔｏ  Ｔ４細胞計数器（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して計数した。ＰＢＳ中で１ウェルあたりおよそ２０，０００個の細胞を炭素電極プレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、番号Ｌ１５−ＸＢ−３／Ｌ１１ＸＢ−３）に植え付け、次いで３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで２５℃で１時間遮断した後、プレートに結合した細胞に１ｎＭまたは１．１ｎＭのいずれかの抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を移し、２５℃で１時間インキュベートした。ＡｑｕａＭａｘ２０００プレートウォッシャー（ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して未結合の抗体を洗い落とした。ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）にコンジュゲートした抗ｍＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、番号１１５−００５−１６４）または抗ｈＦｃ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、番号Ｒ３２ＡＪ−１）抗体のいずれかを用いて細胞に結合した抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体を検出した。細胞結合を測定するために、細胞−抗体混合物にＭＳＤ読取り用緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、番号Ｒ９２ＴＤ−２）を添加し、電気化学的な刺激の前にそのまま室温で１５分インキュベートした。６２０ｎｍ波長のフィルターを使用するＳＥＣＴＯＲイメージャー６０００リーダー（ＭＳＤ）を使用して発光を検出した。発光強度は、細胞に結合した抗体の量との相関を示す。表１５に、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ親細胞に対する、Ｃ１Ｒ−Ｂ*０７、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏＢ*２７０５またはＣ１Ｒ−ｎｅｏＢ*２７０９細胞のいずれかへの抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の結合の特異性の比率を示す。（−）は、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞への結合よりも１倍から３倍高い比率を示し；（＋）は、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞への結合よりも３倍から１０倍高い比率を示し；（＋＋）は、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞への結合よりも１０倍から５０倍高い比率を示し；および（＋＋＋）は、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞への結合よりも５０倍よりも高い比率を示す。
【０１４７】
【表１５】
0006320993.tif 000016
【０１４８】
表１５で示されるように、Ｈ２ａＭ２４８２ＮだけがＨＬＡ−Ｂ*０７対立遺伝子発現細胞への有意な結合を示した（特異性の比率は、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞への結合よりも１０倍から５０倍高かった）。抗体Ｈ１Ｍ２４７７Ｎ、Ｈ１Ｍ２４８０Ｎ、Ｈ２ａＭ２４８２Ｎ、Ｈ１Ｍ２４９０Ｎ、Ｈ２ａＭ２４９９Ｎ、Ｈ４Ｈ２５２４Ｐ、Ｈ４Ｈ２５２６Ｐ、Ｈ４Ｈ２５２８Ｐ、Ｈ４Ｈ２５３２Ｐ、Ｈ４Ｈ２５３８Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５５Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５９Ｐ、およびＨ４Ｈ２５６２Ｓは、ＨＬＡ−Ｂ*２７０９対立遺伝子変異体発現細胞への結合とほぼ同等のＨＬＡ−Ｂ*２７０５対立遺伝子変異体発現細胞への結合を示した。一方で、特定の例示的な抗体は、ＨＬＡ−Ｂ*２７０９対立遺伝子（例えば、Ｈ１Ｍ２４９７Ｎ、Ｈ２ｂＭ２７１８Ｎ、Ｈ４Ｈ２５３０Ｓ、Ｈ４Ｈ２５３４Ｓ、Ｈ４Ｈ２５４２Ｐ、およびＨ４Ｈ２５６０Ｐ）発現細胞と比較して、それよりも比較的強いＨＬＡ−Ｂ*２７０５対立遺伝子発現細胞への結合を示した。
【０１４９】
試験された全ての抗体は、Ｈ２ｂＭ２４９１ＮおよびＨ４Ｈ２５６４Ｓを除いて、ＨＬＡ−Ｂ*０７対立遺伝子変異体発現細胞と比較して、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５および／またはＨＬＡ−Ｂ*２７０９対立遺伝子サブ変異体発現細胞への増大した結合を示した。抗体Ｈ２ａＭ２４９９Ｎは、例えば、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞への結合よりも少なくとも５０倍大きい、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５およびＨＬＡ−Ｂ*２７０９対立遺伝子サブ変異体発現細胞への結合を示し（表１５では［＋＋＋］で示される）、ＨＬＡ−Ｂ*０７対立遺伝子変異体発現細胞への結合は、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏ細胞への結合と比較して３倍未満であった（表１５では［−］で示される）。表１５で示されるように、この実施例で試験された、いくつかのその他の例示的な抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体では、類似しているがそれほど顕著ではない増大した結合特徴が観察された。
【０１５０】
〔実施例９〕
インビボで決定された抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の活性
インビボでの抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体の活性を調査した。ＤＮＡの流体力学的送達（ＨＤＤ）によりＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られたＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスの肝臓で、ＨＬＡ−Ｂ*２７（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０３９８９のアミノ酸２５〜３６２）およびヒトベータ２ミクログロブリン（β２ｍ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４０３９のアミノ酸２１〜１１９）を過剰発現させた。ＨＤＤ実験のために、ＷＴマウスをコホート１つあたりマウス２〜５匹のグループに分け、各マウスに、ＨＬＡ−Ｂ*２７を発現するプラスミド５０μｇおよびβ２ｍを発現するプラスミド５０μｇ、または空の対照プラスミド５０μｇのいずれかを注射した。ＨＤＤ注射から３日目および１０日目に、４つのコホートのそれぞれのマウスに、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＨＬＡ抗体Ｈ４Ｈ２５４２Ｐ、Ｈ４Ｈ２４９９ＮもしくはＨ４Ｈ２４８２Ｐ、またはアイソタイプ対照抗体を腹腔内注射した。ＨＤＤから１４日目にマウスを処分し、コラゲナーゼ処置とパーコールでの遠心分離により肝臓に浸潤する細胞を単離した。ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、番号Ａ１４９２−０１）を使用して肝臓の赤血球を溶解させた。浸潤免疫細胞を、生細胞／死細胞色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号Ｌ３４９５７）と抗ＣＤ４５抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、番号１２−０４５１−８２）とで染色して浸潤白血球を検出し、さらに抗ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５５２７７４）、抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、番号１００４１４）、および抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、番号１００７３４）抗体で染色して、様々なＴ細胞群を同定した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏでフローサイトメトリーを行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。処分された動物の肝臓への、一般的には免疫細胞、特定にはＣＤ８+およびＣＤ４+細胞の浸潤レベルを、頻度に関して、すなわち（例えば肝細胞とは逆に）コラゲナーゼ処置とパーコールでの遠心分離を用いて単離された肝臓からのインタクト細胞／生細胞（リンパ球、ＣＤ８+細胞、またはＣＤ４+細胞）のパーセンテージとして測定した。
【０１５１】
リンパ球ゲートにおける生細胞の頻度（表１６）、加えて肝臓に浸潤するＣＤ８+（表１７）およびＣＤ４+（表１８）Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーで分析した。対照プラスミドが注射されたマウスは、抗体処置に関係なく、約１０％の免疫細胞と１％の肝臓に浸潤するＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の頻度を示した。それに対して、ＨＬＡ−Ｂ*２７およびβ２ｍの過剰発現は、アイソタイプ対照抗体で処置されたマウスにおいて、例えばＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の増加（それぞれ６．１％および３．３％）などの浸潤免疫細胞の頻度の増加（平均＝２７％）をもたらした。ＨＬＡ−Ｂ*２７／β２ｍ発現マウスを抗ＨＬＡ抗体、Ｈ４Ｈ２５４２ＰおよびＨ４Ｈ２４９９Ｎで処置したところ、肝臓に浸潤する免疫細胞において有意な低下が起こった。これはＨ４Ｈ２４９９Ｎで処置されたマウスにおいて最も顕著であり、その場合でもＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞のパーセンテージの有意な減少をもたらした。それに対して、抗ＨＬＡ抗体Ｈ４Ｈ２４８２Ｐおよびアイソタイプ対照は、免疫細胞の肝臓への浸潤において有意な低下はみられなかった。
それゆえに、抗ＨＬＡ抗体Ｈ４Ｈ２４９９Ｎは、ＨＤＤによりＨＬＡ−Ｂ*２７とβ２ｍとを過剰発現するマウスの肝臓への炎症細胞の浸潤を遮断できる。
【０１５２】
【表１６】
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【０１５３】
【表１７】
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【０１５４】
【表１８】
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【０１５５】
〔実施例１０〕
抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体のヒスチジン置換変異体の構築
ｐＨ依存性の結合特性（すなわち、中性ｐＨと比較して低いｐＨにおける結合の低下）を有し、向上したインビボでの有効性（例えば、より長い抗体の血清中半減期、Ｔ細胞活性化の持続的な阻害等）を有する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体変異体を作成する試みにおいて、一連の変異抗体を構築した。特に、各抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）内の（ヒスチジン以外の）各アミノ酸をそれぞれヒスチジンに突然変異させた親抗体Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２およびＨ４Ｈ２４９９Ｎの突然変異体バージョンを構築した。表１で示されるように、親Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、親Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、親Ｈ４Ｈ２４９９Ｎ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、配列番号１４６のアミノ酸配列を含み、親Ｈ４Ｈ２４９９Ｎ抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は、配列番号１５４のアミノ酸配列を含み；親Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２およびＨ４Ｈ２４９９Ｎ抗体のＣＤＲ配列は、それぞれ表１９Ａおよび１９Ｂに表される。
【０１５６】
【表１９】
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【０１５７】
Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２の４８種の別個のヒスチジン置換変異体（３１種の重鎖ＣＤＲ突然変異体および１７種の軽鎖ＣＤＲ突然変異体）を作製し；Ｈ４Ｈ２４９９Ｎの４３種の別個のヒスチジン置換変異体（２５種の重鎖ＣＤＲ突然変異体および１８種の軽鎖ＣＤＲ突然変異体）を作製した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での一過性発現後に培地（上清）から得られた変異抗体を、ｐＨ依存性結合に関して、すなわち中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおけるＨＬＡ−Ｂ*２７発現細胞への結合の低下に関してスクリーニングした。表２０で要約したように、最初の上清のスクリーニングに基づいて、ＣＤＲ中に単一および複数のヒスチジン置換を含む数種の変異抗体をさらなる研究のために選択した。表２０に示されるヒスチジン置換の名称（例えば、Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２の場合は「Ｙ３３Ｈ」、「Ｎ５２Ｈ」等；Ｈ４Ｈ２４９９Ｎの場合は「Ｙ３２Ｈ」、「Ｔ５３Ｈ」等）は、Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２（すなわち配列番号５０／５８）およびＨ４Ｈ２４９９Ｎ（すなわち配列番号１４６／１５４）の重鎖および軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）アミノ酸配列に関する。表２０において空白のセルは親配列を示す。
【０１５８】
【表２０】
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【０１５９】
【表２１】
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【０１６０】
〔実施例１１〕
ＨＬＡ−Ｂ*２７発現細胞に対する抗ＨＬＡ−Ｂ*２７抗体のヒスチジン置換変異体のｐＨ選択的な結合
２つの抗ＨＬＡ抗体、Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２およびＨ４Ｈ２４９９ＮのＣＤＲ領域における親アミノ酸（単数または複数）の単一部位および複数部位にヒスチジン置換を行って、ｐＨ選択的結合を増加させた（実施例１０を参照）。電気化学発光検出技術を同様に使用して、ｐＨ７．２およびｐＨ６．０の両方におけるＣ１Ｒ−ｎｅｏＨＬＡ−Ｂ*２７０５細胞上で発現された細胞表面のヒトＨＬＡ−Ｂ２７への結合に関して、これらのヒスチジン変異体およびそれらの親抗体を試験した。上述したようにして、細胞を回収し、計数し、９６ウェルの炭素電極プレートに植え付け、遮断した（実施例８を参照）。ｐＨ６．０での結合を決定するために、抗体添加の前に、プレートに結合した細胞をｐＨ６．０の緩衝液［５０ｍＭのＭＥＳ、０．００２５ＭのＫＣｌ、０．１３７ＭのＮａＣｌ、０．０００５ＭのＭｇＣｌ2×６Ｈ2Ｏ、０．０００９ＭのＣａＣｌ2、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ；５ＭのＮａＯＨの添加によりｐＨ６．０に調節］ですすいだ。ｐＨ７．２で結合を決定するための中性ｐＨ緩衝液［ＰＢＳ＋０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ；ｐＨ７．２］中、またはｐＨ６．０での結合を決定するためのｐＨ６．０緩衝液中のいずれかで、抗ＨＬＡ抗体を５０ｎＭから開始して希釈し、１２ポイントで３倍の連続希釈液を得て、次いでプレートに結合した細胞に移し、２５℃で１時間インキュベートした。ＡｑｕａＭａｘ２０００プレートウォッシャー（ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して未結合の抗体を洗い落とした。ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）とコンジュゲートした抗ヒトＣH１特異的抗体（社内で作成）を使用して細胞に結合した抗ＨＬＡ抗体を検出した。ＭＳＤ読取り用緩衝液の添加、電気化学刺激、および発光検出も前述したようにして行った。発光強度（ＲＬＵとして示される）は、細胞に結合した抗体の量との相関を示した。ヒスチジン変異体に関するＣ１Ｒ−ｎｅｏＢ*２７０５細胞への抗ＨＬＡ抗体Ｈ４Ｈ２４９９ＮおよびＨ４Ｈ２４７７Ｎ２の結合のＥＣ50値をＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算し、それぞれ表２１および２２に示した。
【０１６１】
【表２２】
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【０１６２】
【表２３】
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【０１６３】
それぞれ異なる２日で、親抗体Ｈ４Ｈ２４９９Ｎおよびそのヒスチジン変異体の結合実験を行った。いくつかの抗体は両方の実験で用いられており、両方の実験からのデータを表２１に示す。数種のヒスチジン変異体（Ｈ４Ｈ２４９９Ｎ３、Ｈ４Ｈ２４９９Ｎ４、Ｈ４Ｈ２４９９Ｎ１１、Ｈ４Ｈ２４９９Ｎ１７、Ｈ４Ｈ２４９９Ｎ２０、Ｈ４Ｈ２４９９Ｎ２１、およびＨ４Ｈ２４９９Ｎ２２）は、ｐＨ６．０のＥＣ50値において、そのｐＨ７．２のＥＣ50値と比較して３倍を超える減少を示したが、２つの実験において、親抗体は、ｐＨ６．０のＥＣ50値において、そのｐＨ７．２のＥＣ50値と比較して１．６倍および２．６倍の減少を示した。ヒスチジン変異体のうち２種、すなわちＨ４Ｈ２４９９Ｎ１６およびＨ４Ｈ２４９９Ｎ１９のＥＣ50値は、試験された抗体濃度で完全なＳ字状曲線にならなかったために、ｐＨ６．０およびｐＨ７．２のどちらにも当てはめることができなかった。
【０１６４】
表２２で示されるように、Ｃ１Ｒ−ｎｅｏＢ*２７０５細胞への結合に関して試験された親抗体Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２のヒスチジン変異体のうち２種（Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ３およびＨ４Ｈ２４７７Ｎ４）は、ｐＨ６．０のＥＣ50値において、そのｐＨ７．２のＥＣ50値と比較してそれぞれ７．７倍および２１．８倍の減少を示したが、親Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ２抗体は、ｐＨ６．０のＥＣ50値において、そのｐＨ７．２のＥＣ50値と比較して測定可能な減少を示さなかった。ヒスチジン変異体Ｈ４Ｈ２４７７Ｎ５の場合、ＥＣ50値は、試験された抗体濃度で完全なＳ字状曲線にならなかったために、ｐＨ７．２およびｐＨ６．０のどちらにも当てはめることができなかった。
【０１６５】
本発明は、本明細書に記載された具体的な実施形態によって範囲が限定されないものとする。実際には、本明細書で説明された事項に加えて、前述の説明と添付の図面から本発明の様々な改変が当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【配列表】
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