(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二段階の超臨界抽出法により植物体からグリセロ糖脂質を抽出してグリセロ糖脂質含有組成物を製造する方法であって、第一段階の抽出として、超臨界二酸化炭素を抽出溶媒として抽出した後の抽出残渣のみを回収し、この抽出残渣に対して第二段階の抽出として、超臨界二酸化炭素とエタノールを抽出溶媒として抽出することを特徴とする、グリセロ糖脂質含有組成物を製造する方法。
【請求項２】
植物体がケール、大麦若葉、ヨモギ、コマツナから選択される１又は２以上の植物体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
植物体から抽出された還元糖とグリセロ糖脂質を含むグリセロ糖脂質含有組成物であって、還元糖の含有率が１％以下である、請求項１または２に記載の方法で得た抽出物からなるグリセロ糖脂質含有組成物。
【請求項４】
請求項３に記載のグリセロ糖脂質含有組成物を内包するソフトカプセル製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセロ糖脂質を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、分子内に糖と脂質の両者を含む物質群をいう。糖脂質はさらにスフィンゴ糖脂質、グリセロ糖脂質、その他のものに分類される。グリセロ糖脂質は親水性基として炭水化物を持ち、脂溶性（非極性）基としてジアシルグリセロール、アルキルアシルグリセロール、あるいはアルケニルアシルグリセロールを持つ糖脂質の一群の総称である（非特許文献１）。
グリセロ糖脂質は動植物から微生物に至るまで広く分布している。上記のように親水基と脂溶性基が存在するため、天然の界面活性剤として利用されている。また脳機能改善などの生理活性が知られている。このため、医薬品、食品、毛髪ケア、皮膚化粧品などに利用されており、さらに新しい用途が開発されている。
特許文献１には、アブラナ科植物であるケール由来グリセロ糖脂質のインターロイキン４産生抑制作用やメラニン産生抑制効果が記載されている。
グリセロ糖脂質を得るためには、特定の化合物を化学的に反応させて合成する方法（特許文献２）、植物から抽出する方法が知られている。植物から抽出する方法としては、例えば、茶葉に水を加え、水溶性成分を抽出した後に生じる茶殻に、エタノールなどの有機溶媒を加え、グリセロ糖脂質を抽出する方法が知られている（特許文献３）。
しかし、植物から抽出する方法は、グリセロ糖脂質が両親媒性の化合物であることから抽出効率（溶媒分配）が低く、高含有のグリセロ糖脂質抽出物を得ることは困難である。また、あらかじめ水抽出などで水溶性成分を除かずに、エタノールなどの溶媒で抽出を行うと、グルコースやフルクトースといった還元糖が、目的とするグリセロ糖脂質と同様の挙動を示すため、これらの混入した抽出物が得られる。抽出物中の還元糖はメイラード反応により、抽出物を褐変化させてしまう。
また、グリセロ糖脂質を製剤化するに際して、ゼラチン製などのソフトカプセル製剤に封入する技術が普及している。しかし、還元糖は、カプセル中で結晶化しやすく、結晶化によりカプセル皮膜内面に析出する。そして、カプセルの崩壊遅延を引き起こす要因になることが指摘されている。従って、植物からグリセロ糖脂質を抽出する場合は、還元糖含有量をできるだけ少なくすることが求められている。
さらにまた、植物中のグリセロ糖脂質の含有量は極めて少ないため、効率よく抽出する技術が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４７４９６９６号公報
【特許文献２】特許第２９３９６４９号公報
【特許文献３】特許第４３０８７１４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】生化学辞典、東京化学同人刊、1989年  363ページ、860ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、植物から還元糖の含有量の少ないグリセロ糖脂質含有組成物及びその製造方法を提供することを課題とする。また本発明は、保存中の褐変化が抑制され、崩壊遅延が起こりにくいグリセロ糖脂質を内包するソフトカプセル製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）二段階の超臨界抽出法により植物体からグリセロ糖脂質を抽出してグリセロ糖脂質含有組成物を製造する方法であって、第一段階の抽出として、超臨界二酸化炭素を抽出溶媒として抽出した後の抽出残渣のみを回収し、この抽出残渣に対して第二段階の抽出として、超臨界二酸化炭素とエタノールを抽出溶媒として抽出することを特徴とする、グリセロ糖脂質含有組成物を製造する方法。
（２）植物体がケール、大麦若葉、ヨモギ、コマツナから選択される１又は２以上の植物体である（１）に記載の方法。
（３）植物体から抽出された還元糖とグリセロ糖脂質を含むグリセロ糖脂質含有組成物であって、還元糖の含有率が１％以下である、（１）または（２）に記載の方法で得た抽出物からなるグリセロ糖脂質含有組成物。
（４）（３）に記載のグリセロ糖脂質含有組成物を内包するソフトカプセル製剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、植物体から還元糖含有量の低いグリセロ糖脂質含有組成物を製造する方法が提供される。本発明の方法は、従来の技術で使用していた有機溶媒を使用しないため、安全な組成物を得ることができる。そして製造工程が簡単であり、溶媒抽出法のような複雑な操作を必要としない。
また、本発明のグリセロ糖脂質含有組成物は、還元糖含有率が低く、メイラード反応による褐変を抑制し、ソフトカプセル製剤の崩壊遅延を引き起こしにくくする。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１で得られた抽出物を分析したＨＰＬＣクロマトグラフィーのチャートを示す。
【図２】実施例２で得られた抽出物を分析したＨＰＬＣクロマトグラフィーのチャートを示す。
【図３】比較例１で得られた抽出物を分析したＨＰＬＣクロマトグラフィーのチャートを示す。
【図４】比較例２で得られた抽出物を分析したＨＰＬＣクロマトグラフィーのチャートを示す。
【図５】比較例３で得られた抽出物を分析したＨＰＬＣクロマトグラフィーのチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、超臨界抽出法により植物体からグリセロ糖脂質を抽出してグリセロ糖脂質含有組成物を製造する方法であって、超臨界二酸化炭素を抽出溶媒とすることを特徴とする、グリセロ糖脂質含有組成物を製造する方法である。また本発明は、植物体から抽出された還元糖とグリセロ糖脂質を含むグリセロ糖脂質含有組成物であって、還元糖の含有率が１０％以下であるグリセロ糖脂質含有組成物に係る発明である。
【００１０】
（１）原料
本発明の方法の原料としては、グリセロ糖脂質を含む植物であればどのようなものでも使用できるが、好ましくは食用又は薬用とされている植物が好ましい。次の植物を例示できる。
アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマチャ、アマチャヅル、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オクラ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールも含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カリン、ガルシニア、カルダモン、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クローブ、クロマツ、クロマメ、ケール、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽も含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠も含む）、コリアンダー、コンニャク芋（コンニャクトビ粉も含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、ゼニアオイ、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンジン、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ヘチマ、ベニバナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マタタビ、マリーゴールド、マンゴー、ミツバ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕も含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ、リンドウ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビも含む）。これらの植物の全体、葉、あるいは果実などが使用可である。なかでもケール、大麦若葉、ヨモギ、コマツナが好ましく、ケールが特に好ましい。
植物体は、乾燥させた後、粉砕することが好ましい。ケール、大麦若葉、ヨモギ、コマツナにあっては、青汁飲料用として収穫後、搾汁した搾汁残渣であっても良い。
【００１１】
（２）超臨界抽出操作
本発明には、超臨界抽出装置であれば、特に制限はない。
抽出操作に当たっては、原料を超臨界抽出装置内の抽出槽に収納し、抽出溶媒として二酸化炭素を用いて、各々の抽出条件にて抽出操作を行う。適切な抽出条件は、例えば、二酸化炭素流量１０〜１００ｇ／分、抽出圧力１０〜１００MPaおよび抽出温度３２〜１００℃である。より好ましくは二酸化炭素流量６５ｇ／分、抽出圧力２５MPaおよび抽出温度４０℃である。抽出時間が長いほど多くのグリセロ糖脂質を得ることができるが、好ましくは０．５〜1時間である。また、エントレーナーとしてエタノールやメタノールなどの極性有機溶媒を使用することが好ましい。特に好ましい極性溶媒はエタノールである。極性溶媒をエントレーナーとして使用することで、さらに還元糖含有量の少ないグリセロ糖脂質含有組成物を得ることができる。
かくして得られる抽出組成物は、グリス状を呈し、グリセロ糖脂質を含有しており、還元糖含有率が１０％以下である。この組成物をカラムクロマトグラフィーや分取型高速液体クロマトグラフィー装置（HPLC）にかけてさらにグリセロ糖脂質含有率を高めた原料とすることもできる。
【００１２】
（３）グリセロ糖脂質の確認方法
得られた抽出物中のグリセロ糖脂質は以下に示す方法で分析を行い確認することができる。
１）グリセロ糖脂質含有抽出物の前処理方法
i)  得られた抽出物を適量秤取し、ジメチルスルホキシドを加え、溶解させる。
ii)  i)で得られた溶液は成分濃度に応じてジメチルスルホキシドで適宜希釈し、分析用試料とする。
２）分析方法
i)高速液体クロマトグラフ質量分析器（LC-MS）による分析
LC-MS分析条件は次のとおり
検出器：LCMS-2000（株式会社島津製作所）
イオン化条件：(+/-)-ESI
移動相Ａ：0.5mMギ酸アンモニウム、0.1%ギ酸水溶液
移動相Ｂ：0.5mMギ酸アンモニウム、0.1%ギ酸アセトニトリル：メタノール＝１：１溶液
分析カラム：Merck Select B 250×4mm, 5μm
Injection Volume：１０μL
カラムオーブン：２５℃
分析時間：１００分
流速：０．５mL/分
グラジエント条件は以下に示すとおり
(1)０−３０分
移動相A：８５% → ０%、移動相B：１５% → １００%
(2)３０―８０分
移動相A：０% 、移動相B：１００%
(3)８０―９０分
移動相A：０→８５%、移動相B：１００%→１５%
(4)９０−１００分
移動相A：８５% 、移動相B：１５%
本分析条件により、下記のイオン化パターンを示すピークの有無を確認する。ここでは特許文献１の下記IUPAC名のケール由来グリセロ糖脂質のピークを確認し、指標とすることができる。他の構造をしたグリセロ糖脂質も同様の挙動を示すことから、下記IUPAC名の化合物を含有することはその他の構造のグリセロ糖脂質も同様に含有していることを示す。
(+)-ESI： 699[M+NH4]+,  515[M-Gal+H]+,  353[M-2Gal+H]+,
261[C18H29O]+
(-)-ESI： 721[M+HCOO]-   ,675[M-H]- ,  277[C18H29O2]-
IUPAC名
(9Z,12Z,15Z)-2-hydroxy-3-((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-tetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)methyl)-tetrahydro-2H-pyran-2-yloxy)propyl octadeca-9,12,15-trienoate
ii)HPLCによる分析
HPLC分析条件は以下の通り
分析装置：Ultimate 3000 HPLC System (サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)
検出器：荷電化粒子検出器 (サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)
その他、条件はLC-MSの条件と同じ
【００１３】
（４）還元糖の確認方法
本発明組成物中の還元糖の確認及び含有量は以下の方法で分析可能である。
i)LC-MSによる分析
上記条件にて、グルコース、フルクトース及びスクロースの標準品と各抽出物のイオン化パターンを比較した。還元糖であるグルコースおよびフルクトースを含む抽出物には質量電荷比225,297,367のピークが検出される。
ii)HPLCによる分析
上記条件にて、グルコース、フルクトース及びスクロースの標準品と各抽出物のクロマトグラフを比較する。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例、比較例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）
ケール乾燥粉末を約１g採取し、これを超臨界抽出装置（三菱化工機株式会社）の耐圧容器（抽出槽，０．５L容器）に移した。次いで抽出溶媒として二酸化炭素を用いて、昇温・昇圧操作を行い、４０℃、２５MPaの条件下で１時間（CO2流速：６５g/分）、超臨界二酸化炭素を抽出槽に通して抽出操作を行った。
抽出物は回収槽に移し、秤量した。本条件での抽出操作により、秤量した原料の約８％が抽出された。
【００１５】
（実施例２）
実施例１で得られた超臨界抽出残渣に対して、４０℃、２５MPaの条件下で１時間（CO2流速：６５g/分）、超臨界二酸化炭素を抽出槽に通して抽出操作を行った。このときエントレーナーとしてエタノールを使用した（流速：３mL/分）。
抽出物は回収槽に移し、秤量した。本条件での抽出操作により、秤量した原料の約３５％が抽出された。
【００１６】
（比較例１）
ケール乾燥粉末を約１g採取し、約５０mLのエタノールを加えて室温にて、１時間の振盪抽出を行った。ろ紙を使用して抽出液と抽出残渣を分離した後、減圧処理により溶媒を除去し、抽出物を得た。本条件での抽出操作により、秤量した原料の約１０％が抽出された。
【００１７】
（比較例２）
ケール乾燥粉末を約１g採取し、約５０mLのメタノールを加えて室温にて、１時間の振盪抽出を行った。ろ紙を使用して抽出液と抽出残渣を分離した後、減圧処理により溶媒を除去し、抽出物を得た。本条件での抽出操作により、秤量した原料の約３０％が抽出された。
【００１８】
（比較例３）
ケール乾燥粉末を約１g採取し、約５０mLの２：１=クロロホルム：メタノール混液を加えて室温にて、１時間の振盪抽出を行った。ろ紙を使用して抽出液と抽出残渣を分離した後、減圧処理により溶媒を除去し、抽出物を得た。本条件での抽出操作により、秤量した原料の約２０％が抽出された。
【００１９】
［抽出効率の評価］
表１に実施例、比較例の抽出された組成物の、原料に対する回収率を示す。
【００２０】
【表１】
0006339426.tif 000002
【００２１】
溶媒抽出と超臨界抽出による抽出量には大きな相違はなかった。
【００２２】
［グリセロ糖脂質含有組成物の評価］
実施例、比較例で得た組成物のグリセロ糖脂質の存在確認結果及び還元糖の含有率の概算値を表2に示す。なお組成物中の還元糖含有率は、クロマトチャートのピーク面積からの推計値である。
【００２３】
【表２】
0006339426.tif 000003
【００２４】
本発明の実施例1、２の組成物はいずれも比較例1〜3に比して還元糖含有率が低いことが確認された。
【００２５】
（実施例３）
実施例2、比較例1の組成物を用いて、これを１０％含有する中鎖脂肪酸トリグリセリドに分散させた溶液を常法によりゼラチン製ソフトカプセルに内包させたソフトカプセル製剤を調製した。この製剤を温度４０℃、湿度７５％に調整した恒温恒湿槽に１ヶ月保管した後内容物の褐変状態、及び崩壊性試験を行った。
実施例２のグリセロ糖脂質含有組成物を内包したソフトカプセル製剤は内容物の変色も、崩壊時間の遅延も観察されなかった。
一方、比較例２のグリセロ糖脂質含有組成物を内包したソフトカプセル製剤は、内容物が褐変化し、さらに崩壊時間が遅延した。
【図１】
0006339426.tif 000004
【図２】
0006339426.tif 000005
【図３】
0006339426.tif 000006
【図４】
0006339426.tif 000007
【図５】
0006339426.tif 000008