(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＣウイルスを中和できる、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質に対するヒトモノクローナル抗体であって、
少なくとも１つの重鎖可変領域及び少なくとも１つの軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が配列番号１の配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号２の配列を有し、又は
前記重鎖可変領域が配列番号３の配列によりコードされ、前記軽鎖可変領域が配列番号４の配列によりコードされる、
上記抗体。
【請求項２】
完全長免疫グロブリン、又は
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される機能的免疫グロブリン断片である、
請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＪＣＶ感染症又はＪＣＶ感染症に関連する疾患の治療剤又は予防剤の製造における、請求項１又は２に記載のヒトモノクローナル抗体の使用。
【請求項４】
ＪＣＶ感染症に関連する疾患が進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
【請求項６】
ＪＣＶ感染症又はＪＣＶ感染症に関連する疾患の治療的又は予防的処置において使用するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＪＣＶ感染症に関連する疾患が進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）である、請求項６に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
ＪＣＶ感染症又はＪＣＶ感染症に関連する疾患の診断を補助するための、インビトロの方法であって、
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体と、ＪＣＶによる感染が疑われる患者から単離された生体試料を接触させるステップと、
ＪＣＶ  ＶＰ１抗原に対する前記モノクローナル抗体の結合を検出するステップと
を含む、上記方法。
【請求項９】
ＪＣＶ感染症に関連する疾患が進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫学的ＥＬＩＳＡアッセイ又は免疫学的蛍光アッセイ又は免疫組織化学アッセイである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ＪＣＶ感染症又はＪＣＶ感染症に関連する疾患を診断するための免疫診断キットであって、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体、及びインビトロ免疫診断方法を行うための指示書を含む上記キット。
【請求項１２】
ＪＣＶ感染症に関連する疾患が進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＪＣＶ感染症に罹患しているヒト患者におけるＪＣＶウイルスを中和するための医薬組成物であって、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体の有効量を含む上記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学分野、具体的にはウイルス病原体の抗原に対する中和抗体の分野にある。
【０００２】
より詳細には、本発明は、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）のＶＰ１タンパク質に対するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＪＣウイルス（ＪＣＶ）は、ポリオーマウイルス科ファミリーのヒトポリオーマウイルスであって、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）と呼ばれる極めて重篤な、しばしば致死的な脱髄疾患に関与する病原体である。ＪＣウイルスは、環状二本鎖ＤＮＡゲノムを取り囲む、エンベロープのない二十面体カプシドを有する。主なカプシド成分は、ウイルスタンパク質ＶＰ１である。ビリオンでなされた構造研究は、ポリオーマウイルスカプシドが、Ｃ末端を通じて連結されたＶＰ１単量体により形成される７２個の五量体から成ることを明らかにした。ＶＰ１は標的細胞上の受容体に結合し、これにより感染を開始する。
【０００４】
ＪＣウイルスは、成人の８５％より多くに感染する。一次感染後、ＪＣウイルスは腎臓及びリンパ器官に静止状態で留まる。健康な個体ではこのウイルスは腎尿細管細胞で複製する可能性があるが、いずれの疾患も引き起こすことなく尿中に排泄される。しかし、重篤な免疫抑制の場合、臓器移植を受けた被験者、癌患者、新規のモノクローナル抗体ベースの免疫調節療法で処置された患者、又はＡＩＤＳに罹患しているヒトにおいて、ＪＣウイルスは、中枢神経系に広がり進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）を引き起こす可能性がある。前ｃＡＲＴ（併用抗レトロウイルス療法）時代には、ＨＩＶ患者におけるＰＭＬ発生率は０．３％から８％であったが、抗レトロウイルス処置の広範な使用は、この大幅な減少に至った。ＨＩＶ感染は、依然として最も高い頻度（症例の約８０％）でＰＭＬと関連する免疫不全原因であるが、免疫調節剤で処置される血液腫瘍（約８％）、固形腫瘍（約３％）、臓器移植、及び自己免疫疾患がこれに続く。
【０００５】
しかし、この１０年間でＨＩＶ／ＡＩＤＳと関連のないＰＭＬ症例数の増加が報告された。これらの新たな症例の多くは、近年利用可能な薬物による免疫療法を受けた個体で生じている。２０１２年２月２９日までに、全世界のナタリズマブで処置された多発性硬化症を患う９９，５７１人の患者に関して、ナタリズマブ処置と関係がある２１２症例のＰＭＬが文書に記録されている。ＰＭＬはまた、エファリズマブ、ミコフェノール酸モフェチル、及びリツキシマブを含む他の免疫調節療法にも関連している。
【０００６】
ＰＭＬを処置するために、例えば標的細胞への進入及びゲノムの複製などの異なるウイルス複製周期に対する幾つかの治療戦略が試みられている。しかし、いずれも有意な有益効果をもたらさなかった。ＰＭＬと重篤な免疫抑制状態の関係に基づき、免疫学的アプローチも試みられた。例えば、予後がより好ましいＰＭＬ罹患患者は、より強いＪＣＶ特異的細胞性及び液性応答を特徴とすることが示された。特異的抗ＪＣＶ応答（特にＶＰ１に対する）の潜在的重要性は、ＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質で免疫された動物（ウサギ）血清の強い中和活性により確認された（Ｇｏｌｄｍａｎｎ  Ｃら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９年５月、４４６５〜４４６９頁）。
【０００７】
抗ＪＣＶ抗体に基づく代替療法が、故にＰＭＬ罹患患者の処置に適用され得る。特に、ＪＣＶ感染の初期段階におけるＶＰ１タンパク質の重要な役割を考慮すると、最良の候補はＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質に対する抗体であり得る。
【０００８】
目下このようなニーズは、ＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質に対する完全ヒトモノクローナル抗体であって、該ウイルスに対する中和活性を有することによりＰＭＬの治療的処置での使用に適切化された前記抗体を得ることに初めて成功した本発明者らにより満たされる。
【０００９】
ヒト抗ＪＣＶ  ＶＰ１モノクローナル抗体、とりわけヒト抗ＪＣＶ  ＶＰ１中和モノクローナル抗体は今まで記載されていないことから、これらの結果は技術水準に照らして新しく、驚くべきものであると考えられる。
【００１０】
上記Ｇｏｌｄｍａｎｎ  Ｃらは、ＪＣＶに対する中和特性を有するウイルス様粒子により惹起されたウサギ抗ＶＰ１抗体を含む高度免疫血清を記載した。
【００１１】
日本国特許出願ＪＰ９０６７３９７Ａは、ＶＰ１タンパク質の一部に対応する合成ペプチドでラットを免疫するステップと、ラットから免疫血清を回収するステップと、ガンマグロブリン画分を分離するステップとを含む、中和抗ＪＣＶ抗体を得る方法について述べている。この特許において、モノクローナル抗体、とりわけヒトに由来するモノクローナル抗体の選択は言及されなかった。
【００１２】
Ａｂｃａｍ（登録商標）、英国により市販されているａｂ３４７５６と呼ばれる抗ＪＣＶ  ＶＰ１モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによるウイルスの検出に使用されるマウス抗体であり、とりわけヒトにおける治療的適用には明らかに適さない。
【００１３】
したがって、先行技術の抗ＪＣＶ抗体はいずれも、ヒト患者におけるＪＣＶ感染症又はＪＣＶ感染症と関連する疾患に対する治療的又は予防的適用での使用に適さない可能性があると予想される。
【００１４】
本発明者らにより試験が行われる前、中和抗ＪＣＶ抗体の存在がヒト液性応答において正確に評価された科学刊行物は利用可能でなかったため、当業者は、ＪＣウイルスを中和できる完全ヒト抗ＪＣＶモノクローナル抗体を得るとは当然予期していなかったであろうことも指摘される。例として、Ｇ．Ｂｌｏｏｍｇｒｅｎら  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１２；３６６：１８７０〜８０頁による論文が挙げられる。著者らは該論文の中で、多発性硬化症罹患患者におけるＰＭＬのリスク層別化を提案している。リスク層別化に対し、著者らは３つのリスク要因、すなわち抗ＪＣＶ抗体の有無、免疫抑制剤の以前の使用、及びナタリズマブによる処置の長さを提案しているが、ヒト液性応答における中和抗体の存在の評価については全く提案又は言及されていない。一方、先行技術は、例えばＲａｐｈａｅｌ  Ｐ．Ｖｉｓｃｉｄｉ及びＢａｒｂａｒａ  Ｃｌａｙｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６；５７７（）：７３〜８４頁、並びにＷｅｎｄｙ  Ａ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６；５７７（）：１９〜４５頁で、ヒトにおける液性ＪＣＶ応答の検出に関連する技術的問題を指摘している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
故に、本発明の第１の目的は、ヒト抗体であり、ＪＣウイルスを中和できることを特徴とする、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質に対するモノクローナル抗体である。
【００１６】
本記載の範囲内では、用語「モノクローナル抗体」は、抗原（この場合はＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質）を結合することができるいずれのペプチド構造も意味することが意図される。この用語は故に、完全長免疫グロブリンと、一般的に重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含むが単一の可変ドメインも含み得る機能的免疫グロブリン断片との両方を含む。機能的免疫グロブリン断片の具体的だが非限定的な例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体である。一本鎖抗体は例えば、ＬａｄｎｅｒらのＵＳ４，９４６，７７８特許に記載されている方法により構築される。一本鎖抗体は、柔軟な結合部分（リンカー）を介して連結された軽鎖及び重鎖可変領域を含む。単一ドメイン抗体と呼ばれる抗体断片は、単離された単一ＶＨドメインを含むことから、一本鎖抗体よりさらに小さい。少なくとも部分的に完全長抗体と同じ結合能力を有する単一ドメイン抗体を得るための手法は、先行技術に記載されており、当業者の技術の範囲内である。Ｗａｒｄらは、「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から分泌される単一免疫グロブリン可変ドメインのレパートリーの結合活性（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜６頁において、標的エピトープに対して単離形態で結合するのに十分強力な親和性を有する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ単一ドメイン抗体）を得るためのスクリーニング方法を記載している。
【００１７】
用語「免疫グロブリン」は、本記載で使用される場合、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを単量体及び多量体形態の両方で含む。
【００１８】
用語「ＪＣウイルスを中和する」又は「ＪＣウイルスを中和できる」は、本発明の目的のモノクローナル抗体がＪＣウイルス複製サイクルをこの期の１つでブロックし、これによりＪＣウイルスの生物学的活性、及びＪＣウイルスに関連する疾患の少なくとも１つに影響を与えることができることを意味する。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＪＣＶモノクローナル抗体は、Ｉ６２、Ｓ６５、Ａ１２７、Ｄ１３０、Ｎ１３１、Ａ１３３及びＡ１７５、又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質の一次配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、ＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質の立体構造エピトープに結合することができる。より特定の実施形態において、立体構造エピトープは、ＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質の一次配列のアミノ酸残基Ｉ６２、Ｓ６５、Ａ１２７、Ｄ１３０、Ｎ１３１、Ａ１３３及びＡ１７５を含む。
【００２０】
アミノ酸残基の番号付けは、Ｍａｄ１株由来のＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）の番号付けに基づく。配列番号７は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（スイスＩＤ：Ｐ０３０８９特徴識別子：ＰＲＯ＿００００１１５０２１）で利用可能である。
【００２１】
用語「立体構造エピトープ」は、抗体との結合に直接関与する全てのアミノ酸残基、又はタンパク質の全体的な立体構造を変化させないように変異されていても、それでもやはり抗体自体の結合親和性に影響を与える全てのアミノ酸残基（たとえタンパク質の一次配列において連続していなくても）を意味することが意図される。
【００２２】
さらに好ましい実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、少なくとも１つの重鎖可変ドメイン及び少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインは配列番号１の配列を有し（又は配列番号３の配列によりコードされ）、軽鎖可変ドメインは配列番号２の配列を有する（又は配列番号４の配列によりコードされる）。このような特定のモノクローナル抗体は、ＧＲＥ１とも呼ばれる。
【００２３】
本発明の別の態様は、ＪＣＶ感染症又はＪＣＶ感染症に関連する疾患、好ましくは進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）の治療的及び予防的処置において使用するための、以前に定義されたＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質に対するヒトモノクローナル抗体である。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体から有効量の特定、及び本発明の範囲内での使用に適した医薬組成物への製剤化は、過度の発明的努力をすることなく当業者の技術の範囲内である。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体は、高い感受性及び特異性を特徴とすることから診断分野で使用されるのにも適している。このモノクローナル抗体は、Ｍａｄ１株由来の組換えＶＰ１に高い親和性（約１ｎＭ）を示し、市販のマウス抗体（Ａｂｃａｍ（登録商標））と同じ濃度でＥＬＩＳＡによる高度に改良されたシグナルを示す。ＪＣＶ感染（Ｍａｄ４株）ＣＯＳ−７細胞で実行された免疫蛍光アッセイにより評価された場合でさえ、該抗体は、市販のＡｂｃａｍ（登録商標）抗体と比べてより高い感受性及び特異性を示した。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡによる組換えＢＫＶ  ＶＰ１（ＪＣＶとしてポリオーマウイルス科ファミリーに属するウイルス；ＪＣＶ及びＢＫＶ  ＶＰ１は、約７５％のヌクレオチド配列相同性を示す）に対する反応性を示さず、これによりＪＣＶ  ＶＰ１に対する比類なく高い特異性を示したことを指摘することが重要である。
【００２６】
故に、本発明のモノクローナル抗体がＪＣＶ特異的診断試薬として使用される、ＪＣＶ感染症を診断するためのインビトロ診断方法及び関連キットは本発明の範囲内である。
【００２７】
インビトロの免疫診断方法は、ＪＣＶ  ＶＰ１抗原が試料中に存在する場合、本発明のモノクローナル抗体がＪＣＶ  ＶＰ１抗原に結合するのに適した条件下で、ＪＣＶによる感染が疑われる患者由来の生体試料を本発明のモノクローナル抗体と接触させるステップと、本発明のモノクローナル抗体とＪＣＶ  ＶＰ１抗原の結合を定性的及び定量的に検出するステップとを含む。
【００２８】
本発明の免疫診断方法は、例えばＥＬＩＳＡ免疫酵素アッセイ又は免疫蛍光アッセイとして行われる。アッセイが実行される試料は、例えば血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ｃｅｐｈａｌｏ−ｒａｃｈｉｄｉｃ  ｌｉｑｕｉｄ）、生検、又は適切と見なされる任意の他の生体試料である。
【００２９】
該方法を行うための免疫診断キットは、特異的試薬としての本発明のモノクローナル抗体、及びアッセイを実行するための指示書を含み、それに加えて最終的に、アッセイのタイプに応じて異なり、それ自体が当業者に既知である他の成分も含む。キットに場合により含有されてもよい追加の成分の例は、抗体と抗原の結合の成功を定性的及び／又は定量的に検出するための手段、１つ又は複数の固体担体（例えばマイクロタイタープレートなど）、ブランク溶液、目的とする抗原の既知量を含有する１つ又は複数の標準溶液、対照溶液、試験試料の希釈溶液、検出可能なマーカー（例えば蛍光分子）又は検出可能な生成物を形成する基質と反応することができる酵素とコンジュゲートされた検出抗体、緩衝洗浄溶液、酵素基質を含有する溶液、停止溶液等である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の方法及びキットは、多様な素因状態を有する患者においてＰＭＬを発症するリスクを層別化するのに有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、幾つかの試験血清の中和活性のパーセンテージを示す。
【００３２】
【図２】図２は、変性条件下のウエスタンブロットアッセイの結果を示す。
【００３３】
【図３】図３は、変性ＶＰ１及び野生型立体構造でのＶＰ１の両方で実行されたドットブロットアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下に記載される実施例は、本発明の範囲内のヒト中和モノクローナル抗体の同定及び特徴付け、並びに前記抗体により認識されるエピトープの特徴付けを例証する。これらの例は、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲の単なる例として、限定する意図なく提供される。
【実施例】
【００３５】
（例１）
以前に記載された方法（Ｐｌａｉｓａｎｔ、Ｐ．ら、ファージディスプレイコンビナトリアルベクターへのレパートリークローニングにより得られたＨＣＶ抗原に特異的なヒトモノクローナル組換えＦａｂｓ（Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆａｂｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ＨＣＶ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）．Ｒｅｓ  Ｖｉｒｏｌ、１９９７．１４８（２）：１６５〜９頁）に類似した方法により、ＩｇＧ１／ｋアイソタイプの、及び２×１０７エレメントの推定サイズを有するヒト抗体断片（一価Ｆａｂ）のコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを、ｐＰＤファージミドベクターに構築した。ライブラリーは、ＥＬＩＳＡによる抗ＶＰ１／ＪＣＶ抗体の存在試験で血清が陽性を示した６８歳男性の骨髄から生成した。ＥＬＩＳＡは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１００ｎｇ／ウェルの組換えＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質（Ｍａｄ１、Ａｂｃａｍ（登録商標））で９６ウェルプレートをコーティングして実行した。幾つかの血清希釈液をＶＰ１コートプレートに２連で添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで０．１％ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ  ２０で洗浄した。結合抗体を、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ１抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））により検出した。
【００３６】
抗ＶＰ１抗体を選択するためのファージ発現コンビナトリアル抗体ライブラリーのバイオパニングは、以前に記載されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ら、単一コンビナトリアルライブラリー由来の多量のウイルス病原体に対するヒトモノクローナル抗体（Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｐｌｅｔｈｏｒａ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９９３．９０（９）：４１４１〜５頁）通りに行った。簡単に言えば、１ミリリットル当たり１０１２ファージの濃度のファージ調製物（０．１ｍｌ／ウェル）を、Ｍａｄ１株由来のＶＰ１でコーティングした高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））上で抗体を選択するための各バイオパニングサイクルにおいて使用した。合計５バイオパニングサイクルを行い、最後の３サイクルから得られたファージを、可溶性Ｆａｂを発現するファージミド系に変換した。
【００３７】
Ｆａｂ発現ベクターで形質転換したＸＬ−１−ブルー株（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））由来の大腸菌細胞を、選択したＦａｂ分子をさらなる特徴付けのために生成するのに使用した。簡単に言えば、Ｆａｂ調製物は培養物からの凍結融解手順により得た。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含有する５ｍｌのＳＢ（スーパーブロス）に形質転換した細菌を接種し、回転撹拌機で７時間、３７℃で増殖させた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、１ｍｍｏｌ／ｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を増殖している細菌に添加し、一晩、３０℃でさらにインキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳ／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に再懸濁し、凍結融解手順（３ラウンド）に供した。細胞片を、微量遠心機中、室温、１３０００ｇでの遠心分離により嵩を減らしてペレット化し、上清はさらに処理することなくＥＬＩＳＡアッセイで使用した。ＥＬＩＳＡは以前に記載されているように実行した。
【００３８】
ＥＬＩＳＡによりＪＣＶ  ＶＰ１に対してＯＤ４５０＞０．８を生じたクローンを陽性と見なし、さらに特徴付けた。
【００３９】
１０５個のクローンを分析し、１１個のクローンが試験で陽性を示した（１０．５％）。ＢＳＡに対する反応性は示されなかった。
【００４０】
陽性クローンの特異性をＥＬＩＳＡにより確認するために、これらをＭａｄ４  ＪＣＶ株（Ｍａｄ１株由来の組換えＶＰ１タンパク質をＥＬＩＳＡで使用した）に感染したＣＯＳ−７細胞（形質転換されたアフリカミドリザル腎臓線維芽細胞）での免疫蛍光アッセイにより試験した。フルオレセインイソチオシアネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＦａｂ抗血清を二次抗体として使用した。ＥＬＩＳＡで試験された陽性クローンは全て、感染細胞に結合できることが確認されたのに対し、非感染細胞との反応性は検出されなかった。ＥＬＩＳＡで試験された陰性クローンは、感染細胞に結合することができなかった。
【００４１】
ＥＬＩＳＡで試験された陽性クローン由来の核酸をＳｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））により得、３７３Ａシーケンサー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標））で配列決定した。重鎖を配列決定するために、（＋）鎖に結合するプライマーＳＥＱＧｚ（５’−ＧＴＣＧＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＧ−３’）（配列番号５）を使用した。軽鎖には、（＋）鎖に結合するプライマーＳＥＱＫｂ（５’−ＡＴＡＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡ−３’）（配列番号６）を使用した。配列分析はＢＬＡＳＴ及びＩＭＧＴツールを用いて行い、全てのクローンが重鎖についてはＶＨ遺伝子の、軽鎖についてはＶｋ遺伝子の同じサブファミリーに由来し、同じ配列を共有することを示した。さらに、抗体のＤＮＡ配列は新しい。ＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質に対するヒト抗体は今まで文献に記載されていないことを指摘することも重要である。したがって、これは、記載される初めてのヒト抗ＪＣＶ  ＶＰ１モノクローナル抗体である。この抗体は、ＧＲＥ１という名前により識別されている。
【００４２】
ヒト抗ＶＰ１  ＧＲＥ１抗体の中和活性を試験するために、５×１０４／ウェルＣＯＳ−７細胞を２４ウェルプレート中の完全ＤＭＥＭ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））に播種した。ＣＯＳ−７はＪＣＶによる感染に許容性の細胞である。
【００４３】
翌日、約１００フォーカス形成単位のＪＣＶ（Ｍａｄ４株）を、ＧＲＥ１の段階的希釈液１００μｌ（２倍希釈液、約２０μｇ／ｍｌから０．３μｇ／ｍｌ）に添加した。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いでＣＯＳ−７細胞に添加した。その後、これらを３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄後、５００μｌの新鮮培地を各ウェルに添加し、細胞を３７℃で６日間インキュベートした。
【００４４】
中和活性の評価
抗体の中和活性は、免疫蛍光により評価した。簡単に言えば、免疫蛍光を感染後６日で行った。スライドは、製造者のガイドラインに従って、メタノール／アセトン混合物（１：１比）で細胞を１５分間室温で固定し、及び市販のＡｂｃａｍ（登録商標）マウス抗ＶＰ１抗体（１μｇ／ｍｌ）を一次抗体として、ＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗Ｆａｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を二次抗体として用いて調製した。
【００４５】
評価は、ウイルスをＧＲＥ１に添加したウェル中の陽性細胞の数を、抗体の非存在下で感染した細胞（１００％感染）と比較して行う。
【００４６】
蛍光顕微鏡下で観察したデータも、陽性細胞をバックグラウンドと自動的に区別することができるロボット化蛍光読み取りシステム（ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｉｚｅｒ  Ｓｉｓｔｅｍ  １０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により確認し、Ｆａｂ断片としての抗体が、１ｎｇ／μｌの濃度でＪＣＶ感染を５０％超阻害できることを示した。
【００４７】
類似の実験は、ＪＣＶ  ＶＰ１に対して反応性の患者由来の血清の全てが該ウイルスを中和できるわけではないことも実験で示した。
【００４８】
この目的のため、約１００血清を１：４００希釈（ＰＢＳ／１％ＢＳＡへの希釈）でＥＬＩＳＡにより試験して、抗ＪＣＶ抗体の存在を検証した。要するに、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））を１００ｎｇの組換えＶＰ１（Ａｂｃａｍ（登録商標））を含有する溶液２５μｌ／ウェルで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを水で洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）でブロックした。その後、試験血清の単一希釈液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中１：４００）４０μｌを添加し、プレートを次いで３７℃で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡマイクロプレート用の自動洗浄機（ＥＴＩ−Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋａｓｈｅｒ、ＤｉａＳｏｒｉｎ）により、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で５回洗浄を行った後、製造者の指示に従って４０μｌ／ウェルの市販の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体を添加した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））。プレートを次いで３７℃で４５分間インキュベートした。以前に記載されているように数回洗浄を行った後、生じる酵素反応に対して４０μｌの基質（Ｈ２Ｏ２及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの１：１溶液、ＴＭＢ基質キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加した。約１５分後、４０μｌ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ）を添加して酵素活性をブロックし、比色反応を分光光度計（Ｍｏｄｅｌ  ６８０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により４５０ｎｍの波長で測定した。
【００４９】
ＢＳＡ抗原又は別の適切な抗原を陰性対照として各実験に導入し、Ｏ．Ｄ．４５０を可能性のある非特異的反応性の検出に使用した。
【００５０】
ＪＣＶ  ＶＰ１に対する反応性がＯ．Ｄ．４５０＞１を示した幾つかの血清を、中和アッセイで分析した。簡単に言えば、感染前日に、５×１０４／ウェルＣＯＳ−７細胞（ＪＣＶによる感染に許容性の）を２４ウェルプレート中の完全ＤＭＥＭ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））に播種した。翌日、２００μｌのＪＣＶ（Ｍａｄ１）含有培地を、試験血清の１：２００希釈液２００μｌに添加した（血清の最終希釈は次いで１：４００であり、同じ希釈液をＥＬＩＳＡアッセイに使用した）。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いでＣＯＳ７細胞に添加した。その後、これらを３７℃で２時間インキュベートした。１回のＰＢＳ洗浄後、５００μｌの新鮮培地を各ウェルに添加し、細胞を３７℃で６日間インキュベートした。
【００５１】
試験試料の中和活性は、間接免疫蛍光により評価した。スライドは、製造者により提供されたガイドラインに従って、メタノール／アセトン混合物（１：１比）で細胞を１５分間室温で固定し、及び市販のＡｂｃａｍ（登録商標）マウス抗ＶＰ１抗体（１μｇ／ｍｌ）を一次抗体として、ＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を二次抗体として用いて調製した。
【００５２】
評価は、ウイルスを試験試料に添加したウェル中の陽性細胞の数を、試料の非存在下で感染した細胞（１００％感染）と比較して行った。
【００５３】
この分析は、ＥＬＩＳＡによるＶＰ１に対する反応性にもかかわらず、無視できない数の血清が中和抗ＪＣＶ活性を示さないことを示した。得られた結果は、図１のグラフに図示されている。図１のグラフには、幾つかの試験血清の中和活性のパーセンテージが報告されている。報告された血清は全て、ＶＰ１に対してＯ．Ｄ．４５０＞１の反応性をＥＬＩＳＡにより示した。
【００５４】
生検試料での免疫蛍光及び免疫組織化学
本発明の抗ＪＣＶ  ＶＰ１  ＧＲＥ１抗体を免疫蛍光及び免疫組織化学アッセイで使用することにより、ＪＣＶの存在を生検試料において判定することができる。この抗体は、ＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質に対する高い感受性及び特異性を実際に示したが、反対にＢＫＶ  ＶＰ１に対する反応性を示さなかった。
【００５５】
生検試料は、新鮮試料又は固定試料又はパラフィン試料であってもよい。固定試料及びパラフィン試料の場合、必要であれば試料を脱パラフィンし、標準的手順に従って抗原性を回復させる。試料は次いで３７℃で３０分間、ＧＲＥ１（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）とインキュベートする。インキュベーション期間後、試料をＰＢＳ中で５回洗浄し、次いで、製造者のガイドラインに従って、３７℃で３０分間、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＦａｂ又は西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＦａｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））とインキュベートする。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗体を使用する場合、ペルオキシダーゼの存在下で可能性のある抗体結合を可視化させる茶色い沈殿物を生成する基質（ジアミノベンジジン、ＤＡＢ基質キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することが必要である。
【００５６】
アッセイの評価は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗体を使用する場合、蛍光顕微鏡下で若しくは自動蛍光検出システムにより、又は西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を使用する場合、光学顕微鏡法若しくは自動画像システムにより試料を観察して行われる。
【００５７】
生体試料中のＪＣＶを検出するための捕捉ＥＬＩＳＡ
ヒト抗ＪＣＶ  ＶＰ１  ＧＲＥ１抗体を用いてＥＬＩＳＡアッセイを行うために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））を、ＰＢＳ中４０ｎｇのヒツジ抗ヒトＦｄ抗体を含有する溶液２５μｌ／ウェルで被覆し（１．６μｇ／ｍｌ最終濃度）、４℃で一晩インキュベートする。翌日、プレートを水で洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）でブロックする。その後、４０μｌのＧＲＥ１（ＰＢＳ／１％  ＢＳＡ中最終濃度約４ｎｇ／μｌ）をウェルごとに添加し、プレートを次いで３７℃で１時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡマイクロプレート用の自動洗浄機（ＥＴＩ−Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋａｓｈｅｒ、ＤｉａＳｏｒｉｎ）により、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で５回洗浄を行った後、試験生体試料の幾つかの希釈液（無希釈から開始して１：１０００希釈までの、連続１０倍希釈液）４０μｌを各ウェルに添加する。プレートを次いで３７℃で１時間インキュベートする。以前に記載されているように数回洗浄を行った後、市販のマウス抗ＶＰ１抗体（ＰＢＳ／ＢＳＡに希釈したＡｂｃａｍ（登録商標））の１：１０００希釈液４０μｌを各ウェルに添加する。プレートを３７℃で１時間休ませる。さらに洗浄後、マウスＩｇＧのＦｃ部分を結合し、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートするヤギ抗体のポリクローナル調製物（ヤギで産生された抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ペルオキシダーゼ抗体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））４０μｌ／ウェルを添加する。プレートを３７℃で４５分間インキュベートする。以前に記載されているようにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０による５回の洗浄を行った後、生じる酵素反応に対して４０μｌの基質（Ｈ２Ｏ２及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの１：１溶液、ＴＭＢ基質キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加する。約１５分後、４０μｌ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ）を添加して酵素活性をブロックし、比色反応を分光光度計（Ｍｏｄｅｌ  ６８０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により４５０ｎｍの波長で測定する。
【００５８】
ＢＳＡ抗原又は別の適切な抗原を陰性対照として各実験に導入し、ＯＤ４５０を可能性のある非特異的反応性の検出に使用する。
【００５９】
（例２）
ＧＲＥ１モノクローナル抗体により認識されるエピトープの（線形又は立体構造的）性質の定義
ＧＲＥ１モノクローナル抗体により認識されるエピトープの（線形又は立体構造的）性質を定義するために、ウエスタンブロット及びＤｏｔ  Ｂｌｏｔアッセイを変性タンパク質及び野生型タンパク質の両方で行った。
【００６０】
図２は、変性条件下のウエスタンブロットアッセイの結果を示す。タンパク質を、β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒ）又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて変性させた。市販のマウス抗体はＡｂｃａｍと表され、一方、ＧＲＥ１抗ＪＣＶ  ＶＰ１モノクローナル抗体はＧＲＥと表される。
【００６１】
図３は、変性ＶＰ１及び野生型立体構造でのＶＰ１の両方で実行されたドットブロットアッセイの結果を示す。市販のマウス抗体はＡｂｃａｍと表され、一方、ＧＲＥ１抗ＪＣＶ  ＶＰ１モノクローナル抗体はＩｇＧ  ＧＲＥと表される。
【００６２】
結果は、ＧＲＥ１が該タンパク質の変性形態に結合できないこと、しかし、非変性タンパク質を認識することのみできることを示している。この事実を確証するために、ＶＰ１線形エピトープに対する市販のマウス抗体（Ａｂｃａｍ（登録商標）、ａｂ３４７５６）は、代わりに、両方のタンパク質形態を認識することができた。故に、これらの結果から、ＧＲＥ１モノクローナル抗体により認識されるエピトープが立体構造エピトープであると結論付けられる。
【００６３】
ＧＲＥ１モノクローナル抗体の特異性の定義
人を感染させることができる主なポリオーマウイルスであるＢＫウイルスゲノム（ＢＫＶ）とＪＣＶゲノムの高いヌクレオチド配列相同性（約７０％）は、文献に広範囲に記載されている。
【００６４】
ＧＲＥ１がＪＣＶのみを認識できるかどうかを判定するために、この反応性を、組換えＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質（Ａｂｃａｍ（登録商標）、ａｂ７４５６９）及び組換えＢＫＶ  ＶＰ１タンパク質（Ａｂｃａｍ（登録商標）、ａｂ７４５６７に）に対してＥＬＩＳＡアッセイにより試験した。ＧＲＥ１は、ＪＣＶ  ＶＰ１タンパク質にのみ結合できることが判明し、この絶対的特異性を指摘するものであった。
【００６５】
アラニンスキャニング部位特異的変異誘発によるＧＲＥ１モノクローナル抗体により認識されるエピトープの特徴付け
２つのタンパク質間の大きな違い（電荷及び極性などの）を示し、及び本発明の抗体が２つのタンパク質に対して有する結合差に関与し得る残基を有する部分を同定するために、ＪＣＶ  ＶＰ１及びＢＫＶ  ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＸプログラムにより整列させた。ＪＣＶとＢＫＶ  ＶＰ１間で（電荷及び極性に関して）完全に異なる３３個のアミノ酸残基をこの分析により同定した。
【００６６】
ＧＲＥ１モノクローナル抗体との結合に関与する重要なＶＰ１残基を明確にするために、以前に同定した残基を個々にアラニン（又は元の残基がアラニンであった場合はグリシン）に変異させた。簡単に言えば、部位特異的変異誘発を、Ｍａｄ１株ＪＣＶ由来のＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列が以前にクローニングされているｐｃＤＮＡ（商標）３．１発現ベクター／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））で実行した。変異誘発に使用したプライマーは、約３０個のヌクレオチド長であり、及び有効な変異誘発産物を得るような形で５末端に１５〜２０個のヌクレオチド重複領域を示すように設計した。増幅反応後、テンプレートとして使用したメチル化ＤＮＡを取り除くために、ＰＣＲ産物を３７℃で４時間、酵素ＤｐｎＩで消化した。消化後、１μＬの増幅物を用いてエレクトロコンピテント細胞を形質転換した。所望の変異が挿入されたかどうかを分析するために、数個の形質転換コロニーを単離し、配列決定によりチェックした。変異ＶＰ１を次いで、別の発現ベクター（ｐＣＡＧＥＮ、Ａｄｄｇｅｎｅ＃１１１６０）にクローニングした。
【００６７】
ＨＥＫ  ２９３Ｔ（ヒト上皮腎臓）細胞をｐＣＡＧ−ＶＰ１ｍｕｔベクターでトランスフェクトし、これらの変異ＶＰ１に対する抗ＶＰ１抗体の結合をＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）により評価した。要するに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、変異ＶＰ１がクローニングされた４μｇのベクターでトランスフェクトした。遠心分離及び４％パラホルムアルデヒドによる固定後、トランスフェクト細胞を室温で３０分間、ＧＲＥ１又はＣ末端線形配列に対するＡｂｃａｍ（登録商標）市販抗体とインキュベートし、１μｇ／ｍｌの濃度で透過処理溶液に希釈した。細胞を次いで洗浄し、製造者の指示に従って（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））室温で３０分間、抗ヒト又は抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートモノクローナル抗体とインキュベートし、その後ＦＡＣＳにより分析した。非変異ＶＰ１タンパク質で観察された反応性を１００％結合と見なし、代わりに非トランスフェクト細胞を陰性対照として使用した。
【００６８】
ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを、ＦＡＣＳにより得られたデータの分析及び図形編集に使用した。
【００６９】
ＦＡＣＳ分析により、変異されている場合、結合を妨害する残基は：Ｉ６２Ａ、Ｓ６５Ａ、Ａ１２７Ｇ、Ｄ１３０Ａ、Ｎ１３１Ａ、Ａ１３３Ｇ、Ａ１７５Ｇ（１位のＭｅｔから開始する番号付けによる、Ｍａｄ１株ＶＰ１の残基に基づくアミノ酸番号付け）であることが観察された（図４）。その代わり、該タンパク質の立体構造を変化させることができる、又はインビトロでこの発現を大幅に減少させることができる変異残基は、この分析では検討されなかった。
【００７０】
文献で以前に既に記載されており、受託コード３ＮＸＧ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｅｘｐｌｏｒｅ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｄｏ？ｓｔｒｕｃｔｕｒｅＩｄ＝３ＮＸＧ）でフリーアクセスＲＣＳＢ−ＰＤＢデータバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に申請された結晶学的モデルを、ＧＲＥ１により認識されるエピトープの構造的特徴付けに使用した。このモデルを使用したところ、単一の単量体において遠くに離れている残基が、逆に、五量体型での２つの隣接単量体においては極めて近く、シアル酸との結合に関与するタンパク質の部分に完全に隣接していることがわかった。これらの構造データは、ＧＲＥ１の相当な中和活性を説明するものである。
【００７１】
得られた実験データは、ＧＲＥ１が、少なくとも以下の残基：Ｉ６２、Ｓ６５、Ａ１２７、Ｄ１３０、Ｎ１３１、Ａ１３３、Ａ１７５（１位のＭｅｔから開始する番号付けによる、Ｍａｄ１株ＶＰ１の残基に基づくアミノ酸番号付け）を含む、線形エピトープではなく立体構造エピトープを認識することを示している。
【００７２】
特に、変異されている場合、ＧＲＥ１の結合を妨害する残基は、ＶＰ１タンパク質とこの受容体の結合に重要である領域に極めて近いことが見出された。これはＧＲＥ１の中和活性を説明するものである。
【００７３】
生体試料中の中和抗体の存在をインビトロで判定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
生体試料中（特に、脳脊髄液、血清、又は血漿中、ただしこれらに限定されない）の中和抗体の存在を判定するために、ＧＲＥ１（中和抗体）により認識されるエピトープをＥＬＩＳＡアッセイで使用した。迅速及び効果的な検出システムのセットアップは、２つの戦略を用いて行った。これらの一方は、競合ＥＬＩＳＡアッセイを試料及びＧＲＥ１で行い、他方は、中和抗体により依然として認識され得るＶＰ１の最小部分（元のタンパク質の５０位と１４０位の間の残基を含む）を抗原として使用する。後者のアッセイの変形もセットアップし、ＧＲＥ１により認識される部分とは異なるＶＰ１部分を認識することができる抗体を反応からより効果的に取り去るために、試験生体試料を、ＧＲＥ１により認識される残基でのみ変異されているＶＰ１と液相で競合するように作製した。
【００７４】
ＧＲＥ１モノクローナル抗体とのＶＰ１タンパク質をめぐる競合により中和抗体の存在をインビトロで判定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
試験生体試料中の他のヒト抗体とＧＲＥ１を区別するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））とコンジュゲートした市販のモノクローナル抗体ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２によってのみ認識されるように、ＧＲＥ１をアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫとの遺伝子発現融合の方法により標識した。
【００７５】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））を３００ｎｇの組換えＶＰ１（Ａｂｃａｍ（登録商標）、ａｂ７４５６９）を含有する溶液２５μＬ／ウェルで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを水で洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）でブロックした。その後、試験生体試料の幾つかの希釈液（無希釈から開始して１：１０００希釈までの、連続１０倍希釈液）４０μＬを添加し、プレートを次いで３７℃で１時間インキュベートした。その後、４０μＬのＧＲＥ１抗ＪＣＶ  ＶＰ１抗体（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中最終濃度約１ｎｇ／μＬ）を、様々な試料希釈液を含む各ウェルに添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡマイクロプレート用の自動洗浄機（ＥＴＩ−Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋａｓｈｅｒ、ＤｉａＳｏｒｉｎ）により、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で５回洗浄を行った後、４０μＬ／ウェルの市販の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体を添加した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））。プレートを次いで３７℃で４５分間インキュベートした。以前に示されているように数回洗浄を行った後、生じる酵素反応に対して４０μＬの基質（Ｈ２Ｏ２及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの１：１溶液、ＴＭＢ基質キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加した。約１５分後、４０μＬ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ）を添加して酵素活性をブロックし、比色反応を分光光度計（Ｍｏｄｅｌ  ６８０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により４５０ｎｍの波長で測定した。
【００７６】
ＢＳＡ抗原又は別の適切な抗原を陰性対照として各実験に導入し、Ｏ．Ｄ．４５０を可能性のある非特異的反応性の検出に使用した。
【００７７】
モノクローナル抗体を異なる希釈の試験生体試料と共に添加したウェル、及びモノクローナル抗体を単独で添加したウェルにおいて検出した吸光度の差を、ＧＲＥ１結合の阻害を推定するために観察した。
【００７８】
特に、モノクローナル抗体を異なる希釈の生体試料と共に添加したウェルにおける吸光度が、モノクローナル抗体単独で観察された吸光度より低ければ、試料中のＧＲＥ１と抗体の間にＶＰ１上のエピトープ結合をめぐる競合があり、これにより試料中のＪＣＶ−ＧＲＥ１様抗体の存在、及び故に、中和及び防御抗体の存在を示している。
【００７９】
ＧＲＥ１モノクローナル抗体により結合される同じエピトープを認識することができる生体試料中の抗体の存在をインビトロで判定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
ＧＲＥ１モノクローナル抗体により認識されるエピトープを含有し、及びさらに立体構造的特徴を保持するＶＰ１の最小部分を判定するために、Ｍａｄ１株ＪＣＶ由来のＶＰ１をコードするヌクレオチド配列を、ランダムに切断されたＶＰ１配列を得るようにＤＮａｓｅで消化した。該モノクローナル抗体により依然として認識されるＶＰ１部分を、ＧＲＥ１に対するバイオパニングにより選択するために、様々なＶＰ１部分をファージミドにクローニングした。ＧＲＥ１により依然として認識される部分が決定されたら、該断片を特定のソフトウェアにより分析して立体構造をインシリコで決定し、これを完全長ＶＰ１タンパク質の立体構造と場合により比較した。
【００８０】
この予測結果を考慮して、ＧＲＥ１により認識される最小部分をコードし、元のタンパク質の５０位と１４０位の間の残基を含む選択されたヌクレオチド配列を、６×Ｈｉｓタグ及びトロンビン切断部位とインフレームで細菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂにクローニングした（ｐＥＴｍｉｎｉＶＰ１）。制限部位ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ（ベクタークローニング領域に存在するが、ＶＰ１内には存在しない）をクローニングに使用した。この目的のため、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ５’及び３’で挿入して、目的とするＶＰ１領域をＰＣＲにより増幅した。ｐＥＴｍｉｎｉＶＰ１を含有するコロニーの選択は、アンピシリン耐性に基づき、及び配列分析により行った。
【００８１】
断片を精製するために、１つのｐＥＴｍｉｎｉＶＰ１含有コロニーを、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢに接種し、３７℃で一晩増殖させた。翌日、５ｍｌの培養物を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む５００ｍｌのＬＢ培地に継代接種した。培養物を分光光度計により一定間隔で分析して、細菌の増殖をチェックした。培養物が０．６〜１のＯＤ６００に達したとき、０．４ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地に添加し、室温で一晩撹拌させた。
【００８２】
翌日、細菌培養物を３９００ｒｃｆで１５分間遠心分離し、細菌ペレットを２０ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、５％グリセロール、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール）に再懸濁した。細胞を次いで超音波破砕機を用いて溶解した。懸濁液を１２，０００ｒｃｆで４５分間遠心分離し、０．４μｍフィルターで濾過して細菌残屑を取り除いた。
【００８３】
断片を次いで、ニッケルカラムで親和性クロマトグラフィーにより精製した。試料をカラムに適用する前に、樹脂を３倍量の緩衝液Ａ、３倍量の緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、５％グリセロール、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で洗浄し、８倍量の緩衝液Ａで再平衡化した。この時点で、試料をカラムに流した。５０ｍｌの緩衝液Ａを用いて非結合試料からカラムを洗浄し、試料を０％〜１００％勾配の緩衝液Ｂで溶出した。溶出後、カラムを緩衝液Ａで再平衡化した。濃縮されたら、試験生体試料に影響を与える可能性があるヒスチジンテールを取り除くために、断片をトロンビンで消化した。精製断片の潜在的用途に影響を与える可能性がある微量の溶出緩衝液を取り除くために、溶出物をＰＢＳに対して透析した。以後ｍｉｎｉＶＰ１と呼ばれる断片の質及び濃度を、１２％ＳＤＳゲルにより分析した。
【００８４】
ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））を、３００ｎｇのｍｉｎｉＶＰ１断片（以前に記載されているように生成した）を含有する溶液２５μＬ／ウェルで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを水で洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）でブロックした。
【００８５】
プレートのインキュベーションの終了時に、試験生体試料の幾つかの希釈液（無希釈から開始して１：１０００希釈までの、連続１０倍希釈液）４０μＬを添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡマイクロプレート用の自動洗浄機（ＥＴＩ−Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋａｓｈｅｒ、ＤｉａＳｏｒｉｎ）により、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で５回洗浄を行った後、ヒトＩｇＧのＦｃ部分を結合する西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗体のポリクローナル調製物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））４０μＬ／ウェルを添加した。プレートを３７℃で４５分間インキュベートした。以前に記載されているようにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０による５回の洗浄を行った後、生じる酵素反応に対して４０μＬの基質（Ｈ２Ｏ２及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの１：１溶液、ＴＭＢ基質キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加した。約１５分後、４０μＬ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ）を添加して酵素活性をブロックし、比色反応を分光光度計（Ｍｏｄｅｌ  ６８０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により４５０ｎｍの波長で測定した。
【００８６】
ＢＳＡ抗原又は別の適切な抗原を陰性対照として各実験に導入し、Ｏ．Ｄ．４５０を可能性のある非特異的反応性の検出に使用した。ＧＲＥ１モノクローナル抗体は、１ｎｇ／μＬの最終濃度で陽性対照として使用した。
【００８７】
ＢＳＡと比べてｍｉｎｉＶＰ１に対しより高い反応性を示した試料を陽性と見なし、故に中和（故に防御）活性を有するＪＣＶ−ＧＲＥ１様抗体を含有すると見なした。
【００８８】
ＧＲＥ１モノクローナル抗体により結合される同じエピトープを認識することができる生体試料中の抗体（変異ＶＰ１による競合を有するバリアント）の存在をインビトロで判定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
以前のアッセイのストリンジェンシーを増加させるために、タンパク質へのＧＲＥ１の結合に重要である残基において変異されたＶＰ１と試験試料をプレインキュベートするステップを加えて、別のバージョンの実験をセットアップした。
【００８９】
ＧＲＥ１結合部位で修飾され、及び生体試料中の抗体を除外することにより後に作用するであろうＶＰ１タンパク質を得るために、部位特異的変異誘発戦略を幾つかの変更を加えて使用した。変異させる幾つかの残基は極めて近いため、数個の残基が同時に変異された。先ず、以下のプライマーＦｗ：５’−ｇｔｔｔｔａｇｔａａｇｃａＧＣａ６２Ｉ／ＡｔｃｔａｔａＧｃａ６５Ｓ／Ａｇａｔａｃ−３’（配列番号８）及びリバースとしての５’−ｔｇａｃｔｔａｃｔａａａａｃｃｃｃｔａａｇａｔｇｃｔｃａｔｃｔｇｇ−３’（配列番号９）を用いて、残基Ｉ６２及びＳ６５を変異させた。ＶＰ１  Ｍａｄ１株由来のＪＣＶが以前にクローニングされているベクターｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をテンプレートとして使用した。変異タンパク質も含有する増幅産物をＰＣＲにより得た。（所望の変異を確実に含有しない）反応に使用したＤＮＡテンプレートを除去するために、反応産物を３７℃で４時間、ＤｐｎＩで消化した。その後、以前に処理した増幅産物２μＬでエレクトロコンピテント細胞を形質転換した。プラスミドを含有する細胞をアンピシリン耐性に基づき選択し、次いで配列分析によりチェックした。最初の増幅反応で挿入された変異を示したベクターを第二の増幅反応のテンプレートとして使用し、１２７Ａ、１３０Ｄ、１３１Ｎ、１３３Ａ位が変異された。これらの変異を挿入するために、５’−ｃａｃｔｃｔａａｔｇｇｇｃａａｇＧａ１２７Ａ／ＧａｃｔｃａｔｇＣｃ１３０Ｄ／ＡＧＣｔ１３１Ｎ／ＡｇｇｔｇＧａ１３３Ａ／Ｇｇｇｇ−３’（配列番号１０）をＦｗプライマーとして、及び５’−ｃｔｔｇｃｃｃａｔｔａｇａｇｔｇｃａｃａｔｔｃａｔｃａａａｃ−３’（配列番号１１）を逆プライマーとして使用した。ＰＣＲ産物を３７℃で４時間、ＤｐｎＩで消化した。その後、以前に処理した増幅産物２μＬでエレクトロコンピテント細胞を形質転換した。プラスミドを含有する細胞をアンピシリン耐性に基づき選択し、次いで配列分析によりチェックした。配列分析により挿入変異の全てを示したＶＰ１を、６×Ｈｉｓタグ及びトロンビン切断部位とインフレームで細菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂにクローニングした（ｐＥＴ−ＶＰ１ｍｕｔ）。変異ＶＰ１（ＶＰ１ｍｕｔ）を次いで、ｍｉｎｉＶＰ１の精製に使用したのと同じプロトコルで精製した。
【００９０】
ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））、３００ｎｇのｍｉｎｉＶＰ１断片（以前に記載されているように生成した）を含有する溶液２５μＬ／ウェルで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを水で洗浄し、３７℃で１時間、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）でブロックした。その一方で、５０μｇ／ｍＬの変異ＶＰ１を、試験生体試料の幾つかの希釈（１：１０００希釈液まで無希釈から開始する連続１０倍希釈液）とプレインキュベートし、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートのインキュベーションの終了時に、様々な血清希釈液（又は他の生体試料）と変異ＶＰ１との混合液４０μＬを添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡマイクロプレート用の自動洗浄機（ＥＴＩ−Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋａｓｈｅｒ、ＤｉａＳｏｒｉｎ）により、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で５回洗浄を行った後、ヒトＩｇＧのＦｃ部分を結合する西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗体のポリクローナル調製物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））４０μＬ／ウェルを添加した。プレートを３７℃で４５分間インキュベートした。以前に記載されているようにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０による５回の洗浄を実施した後、生じる酵素反応に対して４０μＬの基質（Ｈ２Ｏ２及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの１：１溶液、ＴＭＢ基質キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加した。約１５分後、４０μＬ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ）を添加して酵素活性をブロックし、比色反応を分光光度計（Ｍｏｄｅｌ  ６８０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により４５０ｎｍの波長で測定した。
【００９１】
ＢＳＡ抗原又は別の適切な抗原を陰性対照として各実験に導入し、Ｏ．Ｄ．４５０を可能性のある非特異的反応性の検出に使用した。ＪＣＶ−ＧＲＥ１モノクローナル抗体は、１ｎｇ／μＬの最終濃度で陽性対照として使用した。
【００９２】
ＢＳＡと比べてｍｉｎｉＶＰ１に対しより高い反応性を示した試料を陽性と見なし、故にＪＣＶ−ＧＲＥ１様中和（及び故に防御）抗体を含有すると見なした。
【図１】
0006320375.tif 000002
【図２】
0006320375.tif 000003
【図３】
0006320375.tif 000004
【図４】
0006320375.tif 000005
【配列表】
0006320375000001.app