(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）分析対象生体試料から標的タンパク質の含まれたタンパク質試料を取得し、取得されたタンパク質試料を、該タンパク質試料中の標的タンパク質に特異的に結合するリガンドにオリゴヌクレオチドが連結された分析リガンドと反応させて、標的タンパク質−分析リガンド複合体のみを分離して得、（ｉｉ）前記生体試料と同じ生体試料から標的核酸の含まれた核酸試料を取得し、取得された核酸試料を、該核酸試料中の標的核酸に特異的に結合する上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドと反応させてハイブリダイゼーションさせた後、上流オリゴヌクレオチドと下流オリゴヌクレオチドとの間の分離された領域を連結させて完全な二重鎖核酸を得る段階と、
（ｂ）前記複合体と前記二重鎖核酸とを混合する段階と、
（ｃ）前記混合物から前記複合体のオリゴヌクレオチドと前記二重鎖核酸を同時に検出する段階とを含んでなることを特徴とする、生体試料中の標的タンパク質と標的核酸の同時分析方法。
【請求項２】
前記標的核酸は、ＲＮＡを逆転写して得たｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び重硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）処理されたゲノムＤＮＡよりなる群から選ばれた１つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸が非変異（野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ））標的核酸、変異（ｍｕｔａｎｔ）標的核酸またはメチル化標的核酸であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドが抗体、ペプチドまたはアプタマーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｃ）段階は、
（ｃ−１）前記混合物で前記複合体のオリゴヌクレオチドと前記二重鎖核酸を同時に増幅する段階、及び
（ｃ−２）前記複合体のオリゴヌクレオチドの増幅物と前記二重鎖核酸の増幅物を同時に検出する段階によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｃ−１）段階は、前記複合体のオリゴヌクレオチドと前記二重鎖核酸が、同じ配列の順方向プライマーが結合する領域及び同じ配列の逆方向プライマーが結合する領域を有することにより、１組の順方向プライマーと逆方向プライマーで行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複合体のオリゴヌクレオチドには、前記リガンドが特異的に結合する標的タンパク質を指示してその標的タンパク質を識別することを可能にする領域が存在し、
前記二重鎖核酸には、前記上流・下流オリゴヌクレオチドが特異的に結合する標的核酸を指示してその標的核酸を識別することを可能にする領域が存在し、
前記（ｃ−２）段階は、前記増幅物から前記標的タンパク質の識別領域と前記標的核酸の識別領域を同時に検出することにより行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記順方向プライマー及び前記逆方向プライマーのいずれか１つは検出シグナルを発生させるプライマーであり、
前記（ｃ−２）段階は前記増幅物から前記検出シグナルを検出して行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
検出シグナルを発生させるプライマーは順方向プライマーであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体を構成する前記分析リガンドのオリゴヌクレオチドは、順方向プライマーが結合する領域、逆方向プライマーが結合する領域、及びこれらの領域の間にリガンドが特異的に結合する標的タンパク質を指示してそのタンパク質を識別することを可能にする領域を含み、
前記二重鎖核酸を構成する前記上流オリゴヌクレオチドは、順方向プライマーが結合する領域と、該領域の下流で標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする領域を含み、
前記二重鎖核酸を構成する前記下流オリゴヌクレオチドは、前記上流オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーション領域が認知する標的核酸領域の下流を認知してハイブリダイゼーションする領域と、該ハイブリダイゼーション領域の下流で逆方向プライマーが結合する領域とを含み、
前記上流・下流オリゴヌクレオチドが特異的に結合する標的核酸を指示してその標的核酸を識別することを可能にする領域が、前記上流オリゴヌクレオチドの順方向プライマー結合領域とハイブリダイゼーション領域との間、または前記下流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション領域と逆方向プライマー結合領域との間に存在し、
前記複合体のオリゴヌクレオチドと前記二重鎖核酸の上流・下流オリゴヌクレオチドは、同じ配列の順方向プライマーが結合する領域と、同じ配列の逆方向プライマーが結合する領域とを有し、
これにより、
前記（ｃ）段階は、
（ｃ−ｉ）前記混合物で前記複合体のオリゴヌクレオチドと前記二重鎖核酸を１組の順方向プライマー及び逆方向プライマーで同時に増幅する段階と、
（ｃ−ｉｉ）前記複合体のオリゴヌクレオチドの増幅物と前記二重鎖核酸の増幅物から前記標的タンパク質識別領域と標的核酸識別領域を同時に検出する段階とを含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記順方向プライマーは、検出シグナルを発生させるプライマーであり、
前記（ｃ−ｉｉ）段階における前記標的タンパク質識別領域と標的核酸識別領域の同時検出は、前記検出シグナルを検出することにより行われることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ｃ−ｉｉ）検出段階は、
前記標的タンパク質の識別領域に相補的な捕捉プローブ、及び前記標的核酸の識別領域に相補的な配列を有する捕捉プローブが固着されたマイクロアレイに、前記増幅物を処理することにより、捕捉プローブと増幅物とのハイブリダイゼーションを誘導する段階と、
ハイブリダイゼーションされていない増幅物を除去する段階と、
捕捉プローブとハイブリダイゼーションされた増幅物から前記検出シグナルを検出する段階とを含んでなることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記（ａ）段階の標的核酸は、変異配列が存在するものと推定される標的核酸であり、
前記（ａ）段階は、前記変異配列に相補的な配列を有する追加の上流オリゴヌクレオチドを前記上流・下流オリゴヌクレオチドと共に前記標的核酸と反応させることにより行われ、
前記（ｃ−ｉ）段階は、前記追加の上流オリゴヌクレオチドに対する追加の順方向プライマーを前記順方向プライマー及び逆方向プライマーと共に添加することにより行われ、
前記追加の上流オリゴヌクレオチドは、順方向プライマーが結合する領域、該領域の下流で標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする領域、及び該ハイブリダイゼーション領域の下流で前記変異配列に相補的な配列を含み、
前記追加の順方向プライマーは、前記順方向プライマーとは異なる配列を有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異配列は１〜３のヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記（ａ）段階の標的核酸は、メチル化された配列が存在するものと推定されるゲノム核酸に二硫化物を処理して得た変形配列を有する標的核酸であり、
前記（ａ）段階は、前記変形配列に特異的に結合するハイブリダイゼーション領域を有する追加の上流オリゴヌクレオチドを前記上流・下流オリゴヌクレオチドと共に前記標的核酸と反応させることにより行われ、
前記（ｃ）段階は、前記追加の上流オリゴヌクレオチドに対する追加の順方向プライマーを前記順方向プライマー及び逆方向プライマーと共に添加することにより行われ、
前記追加の上流オリゴヌクレオチドは、順方向プライマーが結合する領域、該領域の下流で標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする領域、及び該ハイブリダイゼーション領域の下流で前記変形配列に相補的な配列を含み、
前記追加の順方向プライマーは、前記順方向プライマーとは異なる配列を有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、生体分子分析方法に関し、さらに具体的には、生体分子の生物学的意義を分析するために、様々な標的分子に結合する分析リガンド、及び標的核酸の特定の領域と完全に相補的に結合するオリゴヌクレオチドを用いて一度の検査で生体試料における生体分子を分析する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子は、生体試料を構成する数多くのタンパク質、核酸、脂質、及び炭水化物などの物質である。このような生体分子を分析する技術、及び生体試料における生体分子の量的な状態を総合化した情報、すなわち生体分子のプロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）を生産する技術は、物理学、生化学及び生物情報学の発達に伴って広く開発されたが、従来の方法や機器の使用及び維持費、容易性、精度、敏感度、検査時間及び過程の自動化などの問題により、効率のよい新規方法及び装置に対する必要性が非常に高い。
【０００３】
生体分子分析及びプロファイル生産技術は、それ自体が究極的な目標ではなく、目標を達成するための一つの手段であるが、微生物、細胞、組織などに有用に使用することができるため、医学、獣医学、環境工学、食品工学、農業などへと広範囲に応用されている。
【０００４】
生体試料である組織、細胞塊、細胞及び微生物などを構成する核酸、タンパク質及び有機物質などを含む生体分子のプロファイルは、物理・化学的な性質を利用して様々な方法で作られている。
【０００５】
生体試料にある生体分子のプロファイルを用いて生物学的意義を分析するための臨床意思決定支援システム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、医師が患者診療の際に診断及び治療に関する意思決定（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍａｋｉｎｇ）を行う過程を支援するシステムである。臨床意思決定支援システムは、事例ベースの機械学習推論システム（Ｃａｓｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）とエキスパートシステム（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）に大別される。事例ベースの機械学習推論システムは、疾患が判定された患者の臨床情報（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及び生物学的情報、すなわち生体分子プロファイルデータを収集した後、機械学習を利用して、与えられた臨床情報と生物学的情報などから疾患を推論または判別することができるようにするシステムである。エキスパートシステムは、医学専門家によって予め定められているルール（Ｒｕｌｅ）を使って疾病を診断するシステムである。
【０００６】
最も代表的な生体分子である遺伝物質たる核酸及びタンパク質について考察すると、遺伝情報は、染色体を構成するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の非常に長い分子形態で保存され、前記染色体は、ヒトゲノムを形成するおよそ３０億個のヌクレオチドを含む。染色体におけるヌクレオチドの配列は、各個体の特性を決定する上で重要な役割を果たす。多数の一般的な疾病は、個体間のヒトゲノムのヌクレオチド配列における変形に基づく。同種に属する生物体個体のゲノムに含まれている遺伝子コードは、互いに一致せず、多型性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と呼ばれる塩基配列上の違いが存在する。多型性には、１つ以上の塩基が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）されたものや、特定の塩基配列が重複（ｒｅｐｅａｔ）したものなどが知られている。一つの塩基が別の塩基で置換されたものは、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下「ＳＮＰ」と略す）と命名される。
【０００７】
多くのＳＮＰの遺伝子型分析化学（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）としては、ＰＣＲ−制限断片長多型分析（ＰＣＲ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、一本鎖高次構造多型検出（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、ジデオキシミニ配列分析（ｄｉｄｅｏｘｙ  ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｄｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）、アレル特異的ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下「ＡＳ  ＰＣＲ」と略記する。）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマー要求ヌクレオチド結合分析（ｐｒｉｍｅｒ−ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）、及び蛍光エネルギー移動に基づく分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ）などが提示された（非特許文献１〜３）。上記のリストに加えて、最近追加されたものは、短い単一ＤＮＡ断片の質量を正確に直接決定することが可能な質量分光法（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（非特許文献４）とオリゴヌクレオチドマイクロアレイに基づく分析（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（非特許文献５）がある。
【０００８】
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ａｌｌｅｌｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ＳＮＰ  ａｒｒａｙ（非特許文献６）、Ｉｄａｈｏ  Ｈｉ−Ｒｅｓ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（非特許文献７）、ｄｙ−ｎａｍｉｃ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＤＡＳＨ）（非特許文献８）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｒｒａｙｓ（非特許文献９）などがあり、蛍光エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ））は、ＴａｑＭａｎ（非特許文献１０）などがあり、分子ビーコン分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ａｓｓａｙｓ）は、非特許文献１１に開示されており、ＡＳ  ＰＣＲを活用した伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）技術は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ  （非特許文献１２）、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧｅｎｏｍｅＬａｂ  ＳＮＰｓｔｒｅａｍ  ｓｙｓｔｅｍ（非特許文献１３）、及びＳｅｑｕｅｎｏｍ  ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ＳＮＰ  ｓｙｓｔｅｍ（非特許文献１４）などがある。
【０００９】
これらのＳＮＰ同定を行うための方法は、特定の目的に応じて相対的な長所と短所を持っているので、どの方法が他の方法よりさらに優れるかについては断定的に言うことはできない。一方、ＤＮＡベースのマイクロアレイ技術は、特定の遺伝子または遺伝子群の存在、量または発現パターンを分析することができる簡単な方法として大きな脚光を浴びている（非特許文献１５〜１６）。
【００１０】
それぞれの細胞には５万〜１０万個程度の遺伝子があるが、細胞は選択的に遺伝子を使用する。その中の多くは細胞自身の生命維持活動や日常的な活動のための遺伝子である。このような遺伝子をハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ、以下「ＨＫＧ」という）と呼ぶ。また、内因性の標準発現遺伝子は、特定の遺伝子の機能を解明したり、特定機能の遺伝子を探索したり、特定条件の生物体の発現様相を作成したりする目的で対照群として用いられる。これらの様々な分子生物学的目的によって、特定或いは多数の遺伝子発現量の比較のために開発されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ、以下「ｍＲＮＡ」という）の定量分析を利用する様々な遺伝子発現測定法は、伝統的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下「ＲＴ−ＰＣＲ」という）から最近開発された定量的リアルタイム重合酵素連鎖反応法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：以下「ｑＲＴ−ＰＣＲ」という）、遺伝子発現系列分析（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：以下「ＳＡＧＥ」という）、及びマイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）などがある。
【００１１】
しかし、従来のＤＮＡマイクロアレイは、単にハイブリダイゼーション方式によって標的配列を検出するから、交差反応（ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）による偽陽性（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）問題が発生するので、ハイブリダイゼーションシグナルの信頼度を改善しなければならないという問題点がある。また、従来のマイクロアレイの場合、ハイブリダイゼーション方式によって検出を行うため、ハイブリダイゼーションの後に厳しい洗浄工程が要求されるという問題点があり、ハイブリダイゼーションの前に標的配列を一本鎖にする過程が不可欠である。一方、最近発表されたオンチップ（ｏｎ−ｃｈｉｐ）ＰＣＲは、ハイブリダイゼーションまたはプローブエクステンション（ｐｒｏｂｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方式により検出するため、既存のマイクロアレイと同様にｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍであり、リアルタイム検出が不可能で正確な定量が難しいという問題点がある。
【００１２】
また、最近では、プロテオームに対するハイスループットスクリーニング（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）技法でタンパク質チップ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ）またはアプタマーチップ（Ａｐｔａｍｅｒ  ｃｈｉｐ）（非特許文献１７〜１８）が開発されて使われている。このようなハイスループットスクリーニングに使用される支持体としては、スライドガラス、バイオセンサーの感知表面、ビーズ、ナノ粒子などがある。
【００１３】
また、プロファイルを分析して有用な生体分子を決定し、これを分離した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  Ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）などでこれらの構成成分を確認する方法などが行われている。最近では、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によってタンパク質プロファイルに関する多くの研究が行われている（非特許文献１９〜２１）。別の接近方法として、ＤＮＡと核酸ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いてシグナルを増幅する技術であるｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）の方法が開発された（非特許文献２２）。
【００１４】
前述のように、免疫分析法は、検出感度の向上及び多重分析能の向上において発展を重ねたが、依然として、分析費用の節減、分析時間の短縮、敏感度の向上、及び再現性の増大という技術的課題に直面している。
【００１５】
本発明者は、プロテオームに対するプロファイルを生産するｒｅｖｅｒｓｅ−ＳＥＬＥＸ（特許文献１参照）、アプタマーベースの核酸チップ（特許文献２参照）、アプタマーベースの核酸チップを用いた生物学的意義分析技術（特許文献３参照）、及び遺伝子変異分析方法（特許文献４）などを提案したが、生体試料におけるタンパク質と核酸を一度の検査で分析することができないという問題点があった。本発明はかかる問題点を解決するために提案された。
【００１６】
生体試料の生体分子を総体的に分析する研究は、医学的に病気に関連した生体分子のプロファイルを分析することにより、疾病を診断することが可能な生体分子、治療成績を分析することが可能な生体分子、疾病の発症及び進行に重要な役割を果たす生体分子、疾病に対する感受性に関連した生体分子、及び新薬開発の標的分子を解明することに使用することができるだろう。
【００１７】
上述した従来の生体分子をそれぞれ独立に分析する技術の問題点を克服して、生体分子をより改善された効率性及び敏感度でリアルタイムにて分析することができる技術を開発するために研究した結果、本発明のように様々な種類の生体分子を１回の検査で分析することが可能な方法を開発することにより、本発明の目的を達成した。
【００１８】
究極的に、生体試料の生体分子を総体的に分析する研究は、医学的に疾病に関連した生体分子のプロファイルを分析することにより、疾病を診断することが可能な生体分子、治療成績を分析することが可能な生体分子、疾病の発症及び進行に重要な役割を果たす生体分子、疾病に対する感受性に関連した生体分子、及び新薬開発の標的分子を解明することに使用することができるだろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】韓国特許登録第１０−０６７０７９９号
【特許文献２】韓国特許登録第１０−０４６４２２５号
【特許文献３】韓国特許登録第１０−０９２３０４８号
【特許文献４】韓国特許出願第１０−２０１３−０１１８２２２号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，  ８：７６９−７７６
【非特許文献２】Ｇｕｔ，  Ｉ．Ｇ．，  ２００１，  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ，  １７：４７５−４９２
【非特許文献３】Ｓｈｉ，  Ｍ．Ｍ．，  ２００１，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，  ４７：１６４−１７２
【特許文献４】Ｒｏｓｓ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２９：６２０−６２９
【非特許文献５】Ｗａｎｇ，  Ｄ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８０：１０７７−１０８２
【非特許文献６】Ｋｏｍｕｒａ  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００６；  １６：  １５７５−８４．  ６
【非特許文献７】Ｇｒａｈａｍ  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ５１：  １２９５−８
【非特許文献８】Ｐｒｉｎｃｅ  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １１：  １５２−６２
【非特許文献９】Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ３７：  ５４９−５４
【非特許文献１０】Ｈｏｌｌｏｗａｙ  Ｊ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．  １４：  ３４０−７
【非特許文献１１】Ｂａｒｒｅｉｒｏ  Ｌ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ５７８：  ２５５−７６
【非特許文献１２】Ｏｌｉｐｈａｎｔ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  Ｓｕｐｐｌ：  ５６−８，  ６０−１
【非特許文献１３】Ｂｅｌｌ  Ｐ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  ２００２；  Ｓｕｐｐｌ：  ７０−２，  ７４，  ７６−７
【非特許文献１４】Ｈａｙｅｓ  Ｂ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００７；  ２３：  １６９２−３
【非特許文献１５】Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７０：４６７−４７０
【非特許文献１６】ＤｅＲｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７−４６０
【非特許文献１７】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｍｉｃｓ，  １１−１８．  ２００３
【非特許文献１８】ＭｃＣａｕｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ３１９（２），  ２４４−２５０．  ２００３
【非特許文献１９】Ａｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６２，  ３６０９−３６１４．  ２００２
【非特許文献２０】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４８，  １２９６−１３０４．  ２００２
【非特許文献２１】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，  ３５９，５７２−５７７．  ２００２
【非特許文献２２】Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８，  １２０−１２２．  １９９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
上記目的を達成するために、本発明は、分析しようとする試料にあるタンパク質を含む２つまたはそれ以上の生体分子を核酸分析方法で分析することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００２２】
また、本発明は、前記試料を構成する前記生体分子からレセプター及び核酸を準備する段階と、前記レセプターと分析リガンドとを反応させてレセプター−分析リガンド複合体を形成する段階と、前記分析しようとする核酸である標的核酸、及び前記レセプター−分析リガンド複合体のオリゴヌクレオチドである標的核酸から標的ＤＮＡを製造する段階と、前記標的ＤＮＡを分析する段階とを含む方法によって、生体試料に含まれている生体分子の生物学的意義を分析することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００２３】
また、本発明は、生体試料に含まれているレセプター及び核酸の生物学的意義を分析するための、生体試料にある生体分子を１回の検査で分析する核酸チップを提供する。
【００２４】
また、本発明は、生体試料が、細菌、真菌類、ウイルス、細胞株及び組織よりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００２５】
本発明の目的は、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供し、これらを利用して効率よく生成した結合情報から、生体分子に関連した疾病情報を含む各種生物学的意義を分析することができるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明において、用語「生体分子」は、生体を構成するとともに機能を担当する特殊な分子である。その最も主なものとしては、例えばタンパク質、核酸、多糖類及び脂質などの大きな巨大分子、例えばアミノ酸、ヌクレオチド、単糖類及びビタミンなどの低分子物質、例えば鉄、銅などの金属、無機イオンなどが例示される。
【００２７】
リガンドは、レセプターに結合する物質であって、代表的には、抗体、ペプチド、核酸及びアプタマーなどがある。レセプターは、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質（ｌｉｐｉｄ）、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎａｌｏｇ）、補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）、阻害剤、薬、染料、栄養分、成長因子、細胞、組織などであってもよく、制限なくほぼ全ての化学的または生物学的エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）となり、いずれのサイズの分子でも検出できる標的分子を意味する。
【００２８】
レセプターは、リガンド（ら）とレセプターを結合し、相互作用、またはそうでなければレセプターと連合してレセプターの機能に作用し、変化させる或いは無効化する一つまたはそれ以上のリガンドに特異的な分子または分子のクラスターを含む構造を言及する。
【００２９】
抗体は、抗原との特異的結合をして抗原−抗体反応を起こす物質である。アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）は、低分子化合物からタンパク質まで様々な種類のレセプターに高い親和性及び特異性で結合することができる特性を有する小さな（２０〜６０ヌクレオチド）一本鎖核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）断片を意味する。
【００３０】
分析リガンドは、特定のリガンドにデザインされたオリゴヌクレオチドが連結された構造体である。前記オリゴヌクレオチドは、リガンドに結合するレセプターである生体分子を核酸分析方法で分析する用途に使用することができる。分析リガンドのオリゴヌクレオチドの構成は、次の一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする方法：
【００３１】
５’−Ｐ１α−Ｔ−Ｐ３β−３’  （Ｉ）
【００３２】
前記一般式（Ｉ）において、Ｐ１は、シグナルプライマー対における順方向プライマーと完全に相補的に結合する領域であり、Ｔは、捕捉プローブと完全に相補的に結合する領域であって、標的一本鎖核酸を識別するための、ハイブリダイゼーション反応で使用するプローブとして機能するように設計することができる。Ｐ３は、シグナルプライマー対における順方向プライマーと完全に相補的に結合する領域である。α及びβはヌクレオチドの個数を示し、α及びβは８〜３０の整数である。
【００３３】
標的核酸は、前記分析しようとする試料から分離される核酸、または前記分析しようとする試料から分離されるレセプターに結合するアプタマーを意味し、上流オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的に結合する領域、及び下流オリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的に結合する塩基配列を含むポリヌクレオチドを言及する。いくつかの態様において、当該標的核酸は、二つのオリゴヌクレオチドと完全に相補的に結合する領域の間に伸長領域或いは切れ目（ｎｉｃｋ）を有してもよい。標的核酸は、一本鎖または二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。また、標的ＤＮＡは、上流オリゴヌクレオチドと下流オリゴヌクレオチドとが直接結合する鋳型ＤＮＡを指し示す。
【００３４】
上記の目的を達成するために、本発明は、分析しようとする試料にあるタンパク質を含む２つまたはそれ以上の生体分子を核酸分析方法で分析することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００３５】
試料には、リガンドに結合するタンパク質を含む数多くの生体分子が存在している。このような点で、生体分子は、生体分子−リガンド複合体を形成することにより、リガンドシグナルで検出できる。これに基づいて生体分子分析技術が開発された。
【００３６】
本発明は、前記試料を構成する前記生体分子からレセプター及び核酸を準備する段階と、前記レセプターと分析リガンドとを反応させてレセプター−分析リガンド複合体を形成する段階と、前記分析しようとする核酸である標的核酸、及び前記レセプター−分析リガンド複合体のオリゴヌクレオチドである標的核酸から標的ＤＮＡを製造する段階と、前記標的ＤＮＡを分析する段階とを含む方法によって、生体試料に含まれているアプタマーのレセプター及び核酸の生物学的意義を分析することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００３７】
図１は、生体試料から核酸及びタンパク質を分離し、タンパク質を分析リガンドと反応させてタンパク質−分析リガンド複合体を製造し、核酸をＲＮＡ及びＤＮＡに分離した後、分析しようとする標的核酸が含まれている標的ＤＮＡを製造し、これらの標的核酸の特定の領域と完全に相補的に結合するオリゴヌクレオチドで生体分子を分析し、生体試料における生体分子の生物学的意義を決定する全体的なフローチャートを示す。
【００３８】
図２は、生体試料から分離されたレセプターと分析リガンドの複合体であり、分析リガンドはリガンドと、リガンドを指示する塩基配列及びユニバーサルＰＣＲプライマーからなるオリゴヌクレオチドとで構成されていることを示す。
【００３９】
本発明の好適な実施形態によれば、好ましくは、細胞で構成された生体試料における細胞を可溶化させてレセプターとしての生体分子を製造し、追加的な段階を行うことにより、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸を公知の方法で分離することができる。準備された前記生体分子とアプタマーとを反応させて生体分子−分析リガンド複合体を製造し、様々な方法によって、製造された複合体を分離することができる。好ましくは、製造された生体分子−分析リガンド複合体の分離方法は、まず、生体分子を支持体に結合させた後、分析リガンドを反応させて生体分子−分析リガンド複合体を形成し、洗浄段階を行って未結合分析リガンドを除去することにより、精製された複合体を準備することができる。前記分離されたＲＮＡ、ＤＮＡ、及び前記生体分子−分析リガンド複合体などの核酸を、分析しようとする標的核酸にして、一般な核酸分析方法で標的核酸の定量分析及び変異分析を行うことができる。そして、分析された結果から、生体分子の含まれている生体試料における生体分子の生物学的意義を決定することもできる。
【００４０】
本発明は、前記特定の核酸の定量分析、変異分析、及びメチル化有無分析を行うことを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００４１】
前記特定核酸変異は、遺伝子変異であって、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）と構造変異（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）などがある。遺伝子変異が表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の変化、疾病に対する敏感性、及び治療薬剤に対する反応の違いなど個人間の差を決定すると知られている。特に、疾患の発生及び進行過程に関与する変異を疾患関連遺伝子変異（Ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ）と呼ぶ。ＳＮＰは、ＤＮＡ塩基配列における１つの塩基配列（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の差を示す遺伝的変化または変異を意味する。構造変異は欠失、逆位、添加、複製などのＤＮＡ構造変異を意味する。
【００４２】
また、本発明において、細胞内核酸のメチル化有無分析は、核酸にバイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）を処理して発生する核酸のヌクレオチド変形を含むこともできる。前記核酸にバイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）を処理することにより、メチル化されていないシトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）残基はウラシル（ｕｒａｃｉｌ）残基に変形し、メチル化シトシン残基は変形のない状態で存在する。このようなバイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）の処理前後のヌクレオチド変化を分析することができた。その結果として、核酸のメチル化有無を確認することができる。
【００４３】
本発明において、アプタマーレセプター定量分析の内部精度管理は、分析しようとする生体試料に含まれていない物質を用いることを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００４４】
好ましくは、一般に、定性定量分析の場合、各種試験・検査時の比較のために分析しようとする生体試料に含まれている生体分子で内部精度管理を行う。前記精度管理用物質は、分析しようとする試料に常に一定量で存在する物質が理想的であるが、そうでない場合、試料に含まれていない物質である外来物質を使用することができ、好ましくは、分析しようとする試料が生体試料である場合、前記生体試料に含まれていない外来生体分子で構成できる。精度管理は、管理用試料のような外的基準を使用せず、毎回の測定で得られる一群の検査結果を分析して測定値の精度を管理する内部精度管理を意味する。
【００４５】
好ましくは、本発明において、内部精度管理用物質は、ヒト由来の生体試料を分析する場合、ヒト由来の生体試料に含まれていない生体分子であって、植物特異生体分子を使用することができる。現在、ヒトゲノムプロジェクト、及び植物の一種であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ゲノムプロジェクトが完了して植物特異タンパク質が報告されている。本発明では、ヒト由来の生体試料を分析するために、標準物質として植物特異タンパク質を使用することができる。
【００４６】
本発明において、標的核酸を定量分析し、或いは標的核酸の塩基配列を分析することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００４７】
前記標的核酸を分析する方法は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ｂＤＮＡ（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ）、Ｉｎｖａｄｅｒ方法、及びＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などとすることができる。好ましくは、前記標的核酸からＬＣＲで形成された二重鎖核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、生成された増幅産物を分析することができる。
【００４８】
本発明において、前記標的核酸と同じ方向に完全に相補的に結合する上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドを製造する段階と、前記標的核酸と前記上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドとを反応させて完全な二重鎖核酸を製造する段階と、前記完全な二重鎖核酸を鋳型として、シグナルプライマーを用いて標識及び増幅してターゲットプローブを製造する段階と、前記ターゲットプローブと捕捉プローブとをハイブリダイゼーション反応させ、形成された産物から発生するシグナルを分析する段階とを含んでなることを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００４９】
本発明に使用されているように、標的核酸を言及するときの「相補的結合塩基配列」は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容するのに十分な長さのヌクレオチドを意味し、相補的な塩基配列は、長さが約６〜１，０００ヌクレオチド長であり、好ましくは約８〜３０ヌクレオチド長、最も好ましくは１０〜２５ヌクレオチド長である。
【００５０】
本発明では、前記標的核酸と同じ方向に完全に相補的に結合するオリゴヌクレオチドの中でも、上流に位置するオリゴヌクレオチドを上流オリゴヌクレオチドと称し、下流に位置するオリゴヌクレオチドを下流オリゴヌクレオチドと称する。
【００５１】
本発明に係る「上流オリゴヌクレオチド」は、好ましくは長さが６〜１００、より好ましくは８〜３０、最も好ましくは２０ヌクレオチド長である。
【００５２】
本発明に係る「下流オリゴヌクレオチド」の３’領域は、標的核酸に少なくとも部分的に相補的であり、好ましくは長さが８〜８０、最も好ましくは１０〜２０ヌクレオチド長である。
【００５３】
「捕捉プローブ」は、反応におけるポリヌクレオチドの確認及び／またはポリヌクレオチドの源泉追跡のために用いられるユニークなヌクレオチド配列を意味する。捕捉プローブ配列は、シグナルプライマーの５末端または３末端にありうる。捕捉プローブ塩基配列は、大きさ及び組成において広範囲に多変することができる。次の参考資料は、特定の具体例に適した一連の捕捉プローブ塩基配列を選択するためのガイドラインを提示する（米国特許第５，６３５，４００号；Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００，  ＰＮＡＳ．，  ９７：  １６６５−１６７０；  Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １４：  ４５０−４５６；欧州特許公開０７９９８９７Ａ１；米国特許第５，９８１，１７９号、及びこれに類似するもの）。特定の具体例において、捕捉プローブの塩基配列は、４〜３６ヌクレオチド、または６〜３０ヌクレオチド、または８〜２０ヌクレオチド長を保有することができる。
【００５４】
また、本発明において、捕捉プローブの塩基配列は標的核酸の特異塩基配列であってもよい。
【００５５】
本発明において、前記標的核酸の定量分析のために、前記上流オリゴヌクレオチドは、順方向シグナルプライマーと完全に相補的に結合する塩基配列である領域、及び前記標的核酸と完全に相補的に結合する塩基配列である領域などから構成され、下流オリゴクレオタイドは、前記標的核酸と完全に相補的に結合する塩基配列である領域、前記捕捉プローブと完全に相補的に結合する塩基配列である領域、及び逆方向シグナルプライマーと完全に相補的に結合する塩基配列である領域などで構成されたことを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００５６】
図３は生体試料から分離されたＲＮＡを逆転写して形成された核酸に上流オリゴヌクレオチドグレードと下流オリゴヌクレオチドで二重鎖核酸を形成した後、定量分析する方法を示す図である。
【００５７】
また、本発明は、前記標的核酸の定量分析のために前記上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドを製作する段階において、前記上流オリゴヌクレオチドの構成は、（ｉ）シグナルプライマー対における順方向プライマーが完全に相補的に結合する領域、及び（ｉｉ）ハイブリダイゼーションされる標的核酸と実質的に相補的なハイブリダイゼーション配列領域などで構成されたオリゴヌクレオチドである。
【００５８】
上記において、前記上流オリゴヌクレオチドは次の一般式（ＩＩ）で表される：
【００５９】
５’−Ｐ１α−Ｈβ−３’（ＩＩ）
【００６０】
前記一般式（ＩＩ）において、Ｐ１は、シグナルプライマー対における順方向プライマーと完全に相補的に結合する領域であり、Ｈは、ハイブリダイゼーションされる標的核酸と実質的に相補的なハイブリダイゼーション配列領域である。α及びβはヌクレオチドの個数を示し、α及びβは８〜３０の整数である。
【００６１】
前記上流オリゴヌクレオチドとして、前記特定の標的核酸に完全に（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ）相補的な配列が利用できるが、特異的ハイブリダイゼーションを妨げない範囲内で実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）相補的な配列が利用されることも可能である。好ましくは、前記上流オリゴヌクレオチドは、本発明の特定標的核酸の１０〜３０個の連続ヌクレオチド残基を含む配列にハイブリダイゼーションできる配列を含む。
【００６２】
下流オリゴヌクレオチドの構成は、（ｉ）前記標的核酸に前記上流オリゴヌクレオチドと同じ方向に完全に相補的に結合する領域、（ｉｉ）前記捕捉プローブに完全に相補的に結合する領域と、（ｉｉｉ）シグナルプライマー対における逆方向プライマーに完全に相補的に結合する領域などである。
【００６３】
上記において、前記下流オリゴヌクレオチドは次の一般式（ＩＩＩ）で表される：
【００６４】
５’−Ｈα−Ｔβ−Ｐ３γ−３’（ＩＩＩ）
【００６５】
前記一般式（ＩＩＩ）において、Ｈは、前記標的核酸に前記上流オリゴヌクレオチドの３’末端が結合する位置の次の塩基配列から完全に相補的に結合する領域であり、Ｔは、捕捉プローブと完全に相補的に結合する領域であって、標的一本鎖核酸を識別するための、ハイブリダイゼーション反応で使用するプローブとして機能するように設計することができる。Ｐ３は、シグナルプライマー対における逆方向プライマーと完全に相補的に結合する領域である。α、β及びγは、ヌクレオチドの個数であって、８〜３０の整数である。
【００６６】
本発明において、前記標的核酸変異を分析するために、前記上流オリゴヌクレオチドは、順方向シグナルプライマーと完全に相補的に結合する塩基配列である領域、前記標的核酸と完全に相補的に結合する塩基配列、及び前記標的核酸の変異されたヌクレオチドを区分することが可能な塩基配列である３’末端領域などで構成され、前記下流オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸と完全に相補的に結合する塩基配列である領域、前記捕捉プローブと完全に相補的に結合する塩基配列である領域、逆方向シグナルプライマーと完全に相補的に結合する塩基配列である領域などで構成されることを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００６７】
図４は、生体試料から核酸及びレセプターを分離して核酸及びレセプター−分析リガンド複合体などから標的核酸を製造し、これらの標的核酸の特定領域に完全に相補的に結合するオリゴヌクレオチドで標的核酸変異分析を行う全体的なフローチャートを示す。
【００６８】
図５は、生体試料から分離した核酸にバイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）を処理して標的ＤＮＡを製造した後、これらの標的核酸の特定領域に完全に相補的に結合するオリゴヌクレオチドで核酸のメチル化有無分析を行う全体的なフローチャートを示す。
【００６９】
また、本発明は、標的核酸変異分析のために前記上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドを製作する段階において、前記上流オリゴヌクレオチドは、（ｉ）シグナルプライマー対における順方向プライマーと完全に相補的に結合する領域（Ｐ１）、（ｉｉ）標的核酸と完全に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する変異隣接領域（Ｈ）、及び（ｉｉｉ）ヌクレオチド変異に該当する変異領域（Ｖ）で構成され、ヌクレオチド変異情報を有する上流オリゴヌクレオチドは、２種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドなどからなる。
【００７０】
上記において、前記上流オリゴヌクレオチドは次の一般式（ＩＶ）で表される：
【００７１】
５’−Ｐ１α−Ｈβ−Ｖγ−３’（ＩＶ）
【００７２】
前記一般式（ＩＶ）において、Ｐ１は、シグナルプライマー対における順方向プライマーと完全に相補的に結合する領域であり、Ｈは、ハイブリダイゼーションされる標的核酸と完全に相補的なハイブリダイゼーション配列を有する変異隣接特異領域であり、Ｖは、ヌクレオチド変異に該当する変異特異領域である。α、β及びγはヌクレオチドの個数を示し、α及びβは８〜３０の整数であり、γは１〜３の整数である。
【００７３】
前記上流オリゴヌクレオチドとして、前記ＳＮＰを含む配列に完全に（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ）相補的な配列が利用できるが、特異的ハイブリダイゼーションを妨げない範囲内で実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）相補的な配列が利用されることも可能である。好ましくは、前記上流オリゴヌクレオチドは、本発明のＳＮＰを含む１０〜３０個の連続ヌクレオチド残基を含む配列にハイブリダイゼーションできる配列を含む。より好ましくは、前記上流オリゴヌクレオチドの３−末端は、前記ＳＮＰ塩基に相補的な塩基を有する。一般に、ハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）の安定性は、末端の配列の一致によって決定される傾向があるため、３’−末端にＳＮＰ塩基と相補的な塩基を有する上流オリゴヌクレオチドにおける末端領域がハイブリダイゼーションされなければ、このような二本鎖は厳しい条件の下で解体されることがある。
【００７４】
下流オリゴヌクレオチドは、（ｉ）前記標的核酸に上流オリゴヌクレオチドと同じ方向に完全に相補的に結合する領域（Ｈ）、（ｉｉ）前記捕捉プローブと完全に相補的に結合する領域（Ｔ）と、（ｉｉｉ）シグナルプライマー対における逆方向プライマーと完全に相補的に結合する領域（Ｐ３）などで構成される。
【００７５】
上記において、前記下流オリゴヌクレオチドは次の一般式（Ｖ）で表される：
【００７６】
５’−Ｈα−Ｔβ−Ｐ３γ−３’（Ｖ）
【００７７】
前記一般式（Ｖ）において、Ｈは、前記標的核酸と完全に相補的に結合する変異隣接特異領域であり、Ｔは、捕捉プローブと完全に相補的に結合する領域であって、変異に関連するヌクレオチドのある一本鎖核酸を識別するための、ハイブリダイゼーション反応で使用するプローブとして機能するように設計することができる。Ｐ３は、シグナルプライマー対における逆方向プライマーと完全に相補的に結合する領域である。α、β及びγは、ヌクレオチドの個数を示し、８〜３０の整数である。
【００７８】
前記上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドは、当該技術分野における公知の任意の適切な方法（化学的合成など）により合成及び製造される。また、前記上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドは、商業的供給源を介して簡単に利用可能である。
【００７９】
本発明に用いられる上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドは、鋳型の一部にハイブリダイゼーションまたはアニーリングされることにより二重鎖構造を形成する。このような二重鎖構造の形成に適した核酸ハイブリダイゼーションの条件は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）］及び文献［Ｈａｙｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．  （１９８５）］に開示されている。
【００８０】
本発明において、アニーリングは、標的ヌクレオチド配列とシグナルプライマーとの間に特異的結合を可能にする厳しい条件下で行われる。アニーリングのための厳しい条件は、配列依存的であり、周囲の環境的変数に応じて様々である。このように増幅された標的核酸は、一つの分子上に多重標的位置を含む標的核酸分子であり、これを用いて同時に多重標的位置を分析することができる。
【００８１】
本発明において、前記標的核酸と前記上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応によって形成された部分二重鎖核酸における二つのオリゴヌクレオチドの間に伸長領域がある場合、伸長反応し、連結反応して完全な二重鎖核酸を形成することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００８２】
本発明に使用されているように、「伸長領域」は、核酸重合化活性を介してオリゴヌクレオチドの伸長を許容するのに十分な長さのヌクレオチドを指す。「伸長領域」は、標的及び鋳型核酸のいくつかの態様に存在する。存在する場合、「伸長領域」は、標的または鋳型核酸の上流オリゴヌクレオチドと下流オリゴヌクレオチドとの間にある。「伸長領域」は、長さが約１〜１０００ヌクレオチド長であり、好ましくは約１〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは３〜５０ヌクレオチド長、最も好ましくは３〜１０ヌクレオチド長である。
【００８３】
伸長反応（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）は、ポリメラーゼを用いて前記伸長領域にヌクレオチドを追加することにより、プライマーを伸長させることをいう。核酸と完全に相補的に結合したオリゴヌクレオチドを伸長させると、この核酸は伸長反応のための鋳型として作用する。本発明において、前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択でき、これに限定されない。熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）ＤＮＡポリメラーゼであればいずれのものでも使用できる。
【００８４】
連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、上流オリゴヌクレオチドの３末端または伸張した上流オリゴヌクレオチドの３末端と下流オリゴヌクレオチドに酵素触媒的に連結させることをいう。本発明において、リガーゼはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びＡｍｐｌｉｇａｓｅリガーゼよりなる群から選択できる。
【００８５】
本発明において、前記標的核酸と前記上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション反応によって形成された部分二重鎖核酸が、二つのオリゴヌクレオチドの間に切れ目（ｎｉｃｋ）がある場合、連結反応して完全な二重鎖核酸を形成することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００８６】
前記連結反応は、リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）によるヌクレオチド配列の連結を触媒することが可能な反応をいう。特定長さの２種のオリゴヌクレオチドを、標的核酸と並んで完全に相補的に結合するようにした後、このときに形成される二重螺旋の切れ目（ｎｉｃｋ）部位をＤＮＡリガーゼによって通常の核酸の連結原理に立脚した通常の連結反応を介して、２種のオリゴヌクレオチドを一本鎖状態に連結する反応である。よって、核酸の連結を誘導するリガーゼとして、当業界で通常使用される酵素を制限なく使用することができる。
【００８７】
前記連結反応に使用する酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びＡｍｐｌｉｇａｓｅリガーゼなどよりなる群から選択でき、これに限定されない。ＤＮＡ結合活性を有するリガーゼであればいずれのものでも使用できる。
【００８８】
また、前記リガーゼ反応は、単一の標的遺伝子または変異の検出が可能であるうえ、複数の標的を認知する複数のオリゴヌクレオチドを用いて一度の反応で行うことができる。この場合には、それぞれのリガーゼオリゴヌクレオチド塩基配列のうち、標的核酸とハイブリダイゼーションされる部分のＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値の誤差が５以内となるように、それぞれの変異位置に合うリガーゼとオリゴヌクレオチドを選定することを特徴とすることができる。
【００８９】
本発明において、前記標的核酸と前記上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーション反応し、形成された前記部分二重鎖核酸を連結反応して前記完全な二重鎖核酸を形成する反応を二回またはそれ以上繰り返し行うことを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法を提供する。
【００９０】
本発明において、前記シグナルプライマーは標識物質のあるユニバーサル順方向ＰＣＲプライマーとユニバーサル逆方向ＰＣＲプライマーからなることを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００９１】
上記において、前記シグナルプライマー（ｓｉｇｎａｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ）は次の一般式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）で表される：
【００９２】
順方向プライマー：５’−Ｘ−Ｐ−３’（ＶＩ）
逆プライマー：５’−Ｐ−３’（ＶＩＩ）
【００９３】
一般式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）において、Ｘは、検出可能な標識物質であって、生体分子の定量分析のために対照区試料から製造されるターゲットプローブ、及び実験区試料から製造されるターゲットプローブに使用される標識物質は互いに異なってもよく、好ましくは、前者はＣｙ３、後者はＣｙ５である。
【００９４】
また、核酸の変異解析のために標識物質が使用される。例えば、前記プライマーの５’末端に蛍光レポーター分子、或いは物理的な特徴のあるレポーター分子などが結合して変異関連ヌクレオチドの種類、すなわち変異類型を識別する。好ましくは、蛍光分析は、ヌクレオチド変異によって、野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）はＣｙ３、突然変異型（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ）はＣｙ５で標識することができる。Ｐは、上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドシグナルプライマーが完全に相補的に結合する領域である。
【００９５】
前記シグナルプライマー対における順方向プライマー（Ｐ１またはＰ２）は、前記上流オリゴヌクレオチドの構成におけるシグナルプライマーの結合する領域の塩基配列に完全に相補的に結合する塩基配列から構成され、好ましくは、ユニバーサルＰＣＲプライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ）であり、標的核酸のヌクレオチド変異に応じて、前記シグナルプライマーの５’末端に蛍光レポーター分子、或いは物理的特徴のあるレポーター分子などである標識物質（Ｘ）が選定される。ハイブリダイゼーション反応を終結し、ヌクレオチド変異を決定するとき、標識物質から発生するシグナルを使用する。
【００９６】
また、前記シグナルプライマー対における逆方向プライマー（Ｐ３）は、前記下流オリゴヌクレオチドの構成におけるシグナルプライマーの結合する領域の塩基配列に完全に相補的に結合する塩基配列から構成され、好ましくは、ユニバーサルＰＣＲプライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ）である。ユニバーサルＰＣＲプライマーは、一般に塩基配列の決定やＰＣＲなどに多く使用される塩基配列であるオリゴヌクレオチドであって、商業的なクローニングベクターに多く存在する。
【００９７】
本発明において、前記捕捉プローブは、前記ターゲットプローブの標識物質がある一本鎖核酸と完全に相補的に結合する塩基配列を有することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【００９８】
本発明において、前記捕捉プローブは、ターゲットプローブの標識物質がある一本鎖核酸に存在する逆方向の下流オリゴヌクレオチドの特異塩基配列に完全に相補的に結合する塩基配列を有することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法を提供する。
【００９９】
前記捕捉プローブ（ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅｓ）は、前記増幅産物に結合してこれらを識別する役割を果たす。前記標的核酸を鋳型としてシグナルプライマーで増幅反応を行って作られた増幅産物は、プライマー結合領域（Ｔ）に基づいて、標識物質のある一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸、オリゴヌクレオチド、及びＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）などを製造するのに使用できる。
【０１００】
本発明において、前記ターゲットプローブは、対照区試料から製造する対照ターゲットプローブ、及び実験区試料から製造する分析ターゲットプローブで構成されることを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法を提供する。
【０１０１】
本発明に係る、対照区試料と実験区試料から生体分子を分離して定量分析をしようとする場合、対照区試料から分離された生体分子から標的ＤＮＡを製造した後、これを鋳型としてシグナルプライマーでＰＣＲを行って対照ターゲットプローブを製造し、実験区試料から製造された標的ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行って分析ターゲットプローブを製造する。これらの製造された対照ターゲットプローブと分析ターゲットプローブとを混合してターゲットプローブを準備する。対照ターゲットプローブの製造に使用するシグナルプライマーの標識物質と、対照ターゲットプローブの製造に使用するシグナルプライマーの標識物質とを互いに異なるようにすることができる。好ましくは、前者はＣｙ３、後者はＣｙ５蛍光物質を使用することができる。
【０１０２】
本発明において、前記捕捉プローブは支持体に結合することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法を提供する。
【０１０３】
本発明において、前記支持体はスライドガラス、バイオセンサーの感知表面、ビーズ、ナノ粒子などを含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法を提供する。
【０１０４】
図６は、スライドガラス基板に固定された前記捕捉プローブと標識物質のあるターゲットプローブとをハイブリダイゼーションさせて洗浄した後、発生するシグナルを分析して生体分子を分析することを示す図である。
【０１０５】
好ましくは、捕捉プローブは、スライドガラスまたはバイオセンサーの感知表面などに結合できるが、結合可能に変形してもよい。このような変形は、オリゴヌクレオチドの５’末端にＣ１〜Ｃ２０のアルキル基が結合でき、スライドガラス或いは感知表面との結合を容易にするために、チオールなどの物質が付加できる。ところが、このような変形は目的に応じて適宜変化が可能である。
【０１０６】
このように捕捉プローブが固定された支持台は、マイクロアレイの一種であり、バイオセンサーの感知表面を意味することができ、目標物質が結合して発生する変化を測定して目標物質を感知することができるものであればいずれでも使用できる。特に、蛍光変化は、捕捉プローブに結合した標識物質の蛍光物質を分析して測定できる。ここで利用可能なものは、従来の固体支持台たるスライドガラスである。
【０１０７】
前記ハイブリダイゼーション反応におけるハイブリダイゼーション（アニーリング）温度は、４０℃〜７０℃であり、好ましくは４５℃〜６８℃であり、より好ましくは５０℃〜６５℃であり、最も好ましくは６０℃〜６５℃である。ハイブリダイゼーションの条件は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）］及び文献［Ｈａｙｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．  （１９８５）］に開示された事項を参照して決定できる。ハイブリダイゼーションに適用される厳しい条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）は、温度、イオン強度（緩衝液の濃度）、及び有機溶媒などの化合物の存在などを調節して決定できる。このような厳しい条件は、ハイブリダイゼーションされる配列によって異なるように決定できる。例えば、前記厳しい条件の中でも、高厳格条件は、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡで６５℃の条件でハイブリダイゼーションし、０．１×ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）／０．１％  ＳＤＳで６８℃の条件で洗浄することを意味する。または、高厳格条件は、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウムで４８℃の条件で洗浄することを意味する。低厳格条件は、例えば、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃の条件で洗浄することを意味する。
【０１０８】
前記マイクロアレイにおいて、前記捕捉プローブは、ハイブリダイゼーションアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として用いられ、基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に固定化される。好ましい基体は、適した堅固性または半堅固性支持体であって、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハー、ファイバー、磁性ビーズまたは非磁性ビーズ、ゲル、管類、プレート、高分子、微小粒子及び毛細管を含む。前述した捕捉プローブは前記基体上に配列され、固定化される。このような固定化は、化学的結合方法またはＵＶなどの共有結合的方法によって行われる。例えば、前記捕捉プローブは、エポキシ化合物またはアルデヒド基を含むように変形したガラス表面に結合できるとともに、ポリリシンコーティング表面にＵＶによって結合できる。また、前記ハイブリダイゼーションアレイ要素はリンカー（例えば、エチレングリコールオリゴマー及びジアミン）によって基体に結合できる。
【０１０９】
前記捕捉プローブに結合した増幅産物の標識物質及び変異関連ヌクレオチドのある一本鎖核酸から発生するシグナルを計測する機器は、シグナルの種類に応じて決定される。ハイブリダイゼーション反応の後、発生したハイブリダイゼーションシグナルを検出する。ハイブリダイゼーションシグナルは、例えば、捕捉プローブに結合した標識の種類に応じて様々な方法で検出することができる。
【０１１０】
一方、本発明のマイクロアレイに適用される試料ＤＮＡは、標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）でき、マイクロアレイ上の捕捉プローブとハイブリダイゼーションされる。ハイブリダイゼーション条件は多様にすることができる。ハイブリダイゼーション程度の検出及び分析は標識物質に応じて様々に行われ得る。
【０１１１】
前記捕捉プローブに結合した標識物質は、ハイブリダイゼーション有無を検出させるシグナルを提供することができる。これはオリゴヌクレオチドに連結できる。適した標識は、蛍光団（例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、Ｃｙ３及びＣｙ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、発色団、化学発光団、磁性粒子、放射性同位元素（Ｐ３２及びＳ３５）、マス標識、電子密集粒子、酵素（アルカリ性ホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）、補助因子、酵素に対する基質、重金属（例えば、金）及び抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン及びキレート基などの特定の結合パートナーを有するヘプテンを含むが、これに限定されるものではない。標識は、当業界で通常行われる様々な方法、例えば、ニックトランスレーション（ｎｉｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）方法、ランダムプライミング方法（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｏｏｋｌｅｔ，  “Ａｍｅｒｓｈａｍ”（１９８９））、及びカイネーション方法（Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  １９８９，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６５：４９９）によって実施できる。標識は、蛍光、放射能、発色測定、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素的活性、マス分析、結合親和性、ハイブリダイゼーション高周波、またはナノ結晶によって検出することが可能なシグナルを提供する。
【０１１２】
前記マイクロアレイの製作方法は、当該技術分野における公知の任意の適切な方法により合成及び製造される。また、マイクロアレイ製作機器は、商業的供給源を用いて便利に利用可能である。従来の公知の様々な方法（Ｍ．  ｓｃｈｅｎａ，  １９９９，  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ；  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ）で、捕捉プローブが規則的に配列された核酸チップを製作することができる。
【０１１３】
本発明において、前記標識物質は、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、Ｃｙ２、ＧＦＰ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯＹＯ−１、カルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）、ＦＩＴＣ、ＦｌｏｕｒＸ、ＡＬＥＸＡ  ４８８、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １１０、ＡＢＩ  ５−ＦＡＭ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ  ４８８、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＡＢＩ  ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、Ｄｉｌ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、Ａｌｅｘａ  ５４６、ＴＲＩＴＣ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、ＡＢＩ  ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３．５、ＡＢＩ  ＲＯＸ、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｒｉｍｓｏｎ、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−３、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、Ｃ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＴＯＰＲＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｉｎｅ、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５及びＣｙ３から選択される蛍光色素を使用することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【０１１４】
本発明において、前記捕捉プローブがスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）されたチップ（ｃｈｉｐ）を製作する段階と、前記ターゲットプローブとチップの表面に固定化されたプローブとのハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応を行い、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）する段階と、蛍光色素に特異的な波長のレーザー（ｌａｓｅｒ）でチップをスキャン（ｓｃａｎｎｉｎｇ）し、ハイブリダイゼーション反応結果に基づく蛍光強度を測定することにより、標的核酸の量及び変異を同時に分析する段階とを含んでなることを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【０１１５】
本発明は、生体試料に含まれているレセプター及び核酸の生物学的意義を分析するための、オリゴヌクレオチドを用いて生体試料にあるレセプター及び核酸を分析するキットを提供する。
【０１１６】
本発明において、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法によって実施することを特徴とし、前記生体分子を含む試料からレセプターと核酸を準備する試料処理装置と、前記標的核酸を製造しこれを増幅するモジュール及び前記増幅された産物を分析するモジュールからなる増幅装置とを含む生体分子分析システムを有することを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析装置を提供する。
【０１１７】
本発明の生体分子分析方法をより効率よく測定するために、生体分子を含む試料からアプタマーレセプターと核酸を分離する試料処理装置と、前記標的核酸を製造して増幅するモジュール及び前記増幅された産物を分析するモジュールからなる増幅装置とを含む、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析装置において、本発明のシステムは、混合チャンバー、溶解チャンバー及び反応チャンバーからなる試料処理装置及び増幅装置で構成され、これらが統合されて運営されることも可能である。
【０１１８】
関心対象の生体分子を含有しているものとされるサンプルの分析は、一連のサンプル準備段階を伴い、混合チャンバーと溶解チャンバーからなる試料処理装置で行われる。これらの段階は、ろ過、細胞溶解、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びレセプターの精製、レセプター−分析リガンド複合体の製造、及び試薬との混合を含むことができる。生体分子分析結果に対する確信を持つためには、サンプル準備過程の汚染に対する制御が有用であろう。核酸増幅反応のためにサンプルを調製し、サンプル調製の有効性を検証する方法を提供する。
【０１１９】
サンプルは、細胞、胞子、微生物、及びウイルスよりなる群から選択される標的エンティティーを含有するものとされる。この標的エンティティーは少なくとも一つの標的生体分子を含む。前記方法は、サンプルとサンプル調製対照群とを混合する混合チャンバーを有する装置内にサンプルを導入する段階を含む。サンプル調製対照群は、細胞、胞子、微生物及びウイルスよりなる群から選択される。該サンプル調製対照群は精度管理物質を含む。また、前記装置は溶解チャンバーと反応チャンバーを備える。サンプルは混合チャンバー内でサンプル調製対照群と混合される。
【０１２０】
また、前記方法は、サンプル調製対照群及びサンプル内に存在する場合の標的エンティティーを溶解チャンバーで溶解処理して生体分子を精製する段階と、レセプター−分析リガンド複合体を形成する段階と、溶解チャンバー内で遊離したＲＮＡ、ＤＮＡ及びレセプター−分析リガンド複合体を反応チャンバー内で核酸増幅条件に晒す段階と、少なくとも一つの精度管理物質の存在有無を検出する段階とを含む。精度管理物質の肯定的検出の場合はサンプル調製過程が満足であったことを示すのに対し、精度管理物質を検出することができない場合はサンプルが不適切に調製されたことを示す。
【０１２１】
本発明は、核酸増幅反応のためのサンプルを調製し、そのサンプル調製の有効性を検証する増幅装置を提供する。サンプルは、細胞、胞子、微生物、及びウイルスよりなる群から選択される標的エンティティーを含有するものとされる。この標的エンティティーは、少なくとも一つの標的生体分子を含む。前記装置は、サンプルに混合されるサンプル調製対照群を収容する第１チャンバーのある本体を含む。サンプル調製対照群は細胞、胞子、微生物、及びウイルスよりなる群から選択され、このサンプル調製対照群は精度管理物質を含む。
【０１２２】
また、前記本体は、サンプル内に存在する場合の標的エンティティー及びサンプル調製対照群を溶解処理し、これらから生体分子を遊離させ、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びレセプターを分離する溶解チャンバーを含む。さらに、前記本体は、遊離したアプタマーレセプターとアプタマーとを反応させてレセプター−アプタマー複合体を形成する分析リガンド反応チャンバーを含む。さらに、前記本体は、増幅及び検出のための核酸を維持する反応チャンバーを含む。前記装置は、サンプル調製対照群と混合されたサンプルを、第１チャンバーから溶解チャンバー内へ流れるように案内し、溶解チャンバーで遊離した生体分子を反応チャンバー内へ流れるように案内する少なくとも一つの流れ制御器をさらに含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、溶解チャンバーは、サンプルが溶解チャンバーを介して流れる際に、サンプル内に存在する場合の標的エンティティー及びサンプル調製対照群を捕獲する酵素、少なくとも１つのフィルター及び固相物質を収容し、前記装置は、溶解チャンバーを介して流れた使用済みのサンプル流体を収容する少なくとも一つの廃棄チャンバーをさらに含む。また、前記少なくとも一つの流れ制御器は、溶解チャンバーを介して流れた使用済みのサンプル流体を廃棄チャンバーへ流れるように案内することができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、前記装置は、溶解チャンバーへ超音波を提供するために溶解チャンバーの壁に結合された超音波トランスデューサをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記装置は、サンプル調製対照群及び標的エンティティーを破裂させるために溶解チャンバー内にビーズをさらに含む。
【０１２５】
本発明の別の様態によれば、溶解過程の有効性を決定する方法を提供する。この方法は、細胞、胞子、微生物及びウイルスよりなる群から選択された標的エンティティーを含有するものとされるサンプルをサンプル調製対照群と混合する段階を含む。標的エンティティーは、少なくとも一つの精度管理物質を含む。サンプル調製対照群は細胞、胞子、微生物及びウイルスよりなる群から選択され、このサンプル調製対照群は精度管理物質を含む。サンプル調製対照群とサンプル内に存在する場合の標的エンティティーの混合物は溶解処理される。また、前記方法は、溶解処理中にサンプル調製対照群から生体分子が遊離したか否かを決定するように精度管理物質の存在有無を検出する段階をさらに含む。精度管理物質の肯定的検出の場合は、サンプル調製過程が満足であったことを示すのに対し、精度管理物質を検出することができない場合は、サンプルが不適切に調製されたことを示す。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、前記方法は、溶解処理の前に、サンプル調製対照群及びサンプル内に存在する場合の標的エンティティーを固相物質によって捕獲するために、サンプル調製対照群と混合されたサンプルが、固相物質を収容するチャンバーを介して流れるようにする段階を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、サンプルは、サンプルとサンプル調製対照群とを混合する前に予備濾過できる。いくつかの実施形態において、溶解処理は、サンプル調製対照群及び標的エンティティーを超音波エネルギーに露出させることを含む。また、いくつかの実施形態において、溶解処理は、サンプル調製対照群及び標的エンティティーを破裂させるためにビーズを攪拌させることを含む。いくつかの実施形態において、サンプル調製対照群は胞子である。いくつかの実施形態において、混合段階は、サンプル調製対照群を含有する乾燥ビーズを分解することを含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、溶解処理は化学的溶解剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、マーカー核酸配列は、マーカー核酸を（例えば、ＰＣＢによって）増幅し、増幅されたマーカー核酸配列を検出することにより検出される。いくつかの実施形態において、マーカー核酸配列は、マーカー核酸配列に結合できるプローブからのシグナルが限界値を超えるか否かを決定することにより検出される。
【０１２９】
増幅装置の反応容器の反応チャンバー内の反応混合物は核酸増幅条件に晒される。反応を利用したＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型の増幅は公知になっている［米国特許第４，６８３，１９５号；米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ．  ａｌ．，，  １９９０）］。ＤＮＡの核酸増幅は、ＤＮＡを熱変性させること、増幅されるＤＮＡ分節に側接する配列に２つのオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングすること、及びアニーリングされたプライマーをＤＮＡポリメラーゼによって伸長させることを１サイクルとし、該サイクルの繰り返しを伴う。プライマーは、標的配列の対向する鎖（ｓｔｒａｎｄ）にハイブリダイズする一方で、ポリメラーゼによるＤＮＡ合成がプライマー間の領域にわたって進行するように配向され、ＤＮＡ分節の量を効果的に２倍にする。また、拡張生成物は補完的であり、プライマーを結合することができるため、個々の連続的なサイクルは、前のサイクルで合成されたＤＮＡの量を実質的に２倍にする。これは、サイクル当たり２ｎ（ここで、ｎはサイクル数）の比率で特定標的分節の指数的蓄積をもたらす。増幅反応及びリガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＬＣＲ）などの方法が、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから標的ＤＮＡ配列の核酸配列を直接増幅させるのに使用できる。また、等温増幅反応が公知になっており、本発明の方法に応じて使用できる。
【０１３０】
核酸増幅反応は、好ましくは、反応容器内の反応混合物を増幅反応に必要な温度に加熱及び／または冷却させる熱処理装備を用いて行う。また、このような熱処理装備は、サンプル調製対照群のマーカー核酸配列、及びサンプルでテストするための一つ以上の標的核酸配列を検出する一つ以上の検出機構を含むことができる。反応容器内の核酸配列を増幅及び検出するための光学検出器が組み込まれた好ましい熱処理装備（米国特許第６，３６９，８９３号；米国特許第６，３９１，５４１号）を使用することができる。また、反応混合物の温度を制御し、この反応混合物における核酸配列を検出するための本発明に適した多くのその他の公知の方法がある。
【０１３１】
また、サンプル調製対照群の精度管理物質、及びサンプルでテストするための一つ以上の精度管理物質の検出は、プローブを用いて行うことが好ましい。反応容器は、光学的に検出できるプローブからのシグナルが通過する一つ以上の透明または光透過性の壁を有することが好ましい。好ましくは、捕捉プローブが核酸配列を検出及び定量化することに使用できる。核酸捕捉プローブを採用する様々な数多くの分析法がある。これらの捕捉プローブの一部は、他の分子またはモイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）との相互作用で変化により蛍光源の蛍光発光における変化を有するシグナルを生成する。
【０１３２】
増幅生成物の検出のための他の好ましい方法として、蛍光プローブは、蛍光レポーター染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｄｙｅ）全てによって標識化されたオリゴヌクレオチドからなる。捕捉プローブの分裂はレポーター染料の蛍光強度の増加を発生させる。
【０１３３】
サンプル内における標的生体分子の検出またはその欠如を確信するために、サンプル調製の汚染を制御しなければならない。これは、サンプル調製対照群がサンプル内の標的エンティティー（例えば、生体分子を含有している標的細胞、胞子、ウイルスまたは微生物）と同じ処理を受けなければならない理由である。サンプル調製対照群の精度管理物質が検出されれば、サンプル調製は満足すべきであるとみなされる。精度管理物質の存在が検出できなければ、サンプル調製は不適切であるとみなされ、標的核酸配列に対するテストの結果は「未定」であるとみなされる。好ましくは、精度管理物質の存在有無は、ターゲットプローブに結合することが可能な捕捉プローブからのシグナルが限界値、例えば分析法に対して有効であるとみなされるように満足または超過しなければならない所定の蛍光発光の限界値を超過するかどうかを決定することにより検出される。
【０１３４】
流体制御装置は所望のプロトコルに基づいてコンピュータで制御できる。単一バルブを使用すると、只一つの失敗要素により高い製造歩留まりを生成することができる。流体制御及び処理構成部材の統合は、コンパクトな装置（例えば、小型カートリッジの形態）を得ることができ、成形及び組立の自動化を容易にする。前述したように、そのようなシステムは、好ましくは希釈及び混合能力、中間洗浄能力及び確実な加圧能力を含むことができる。システム内の流体経路は、システム内の流体の汚染を最小限に抑え、かつ、そのような流体の収容及び制御を容易にするように通常閉鎖される。反応容器は、便利に取り外し及び交換が可能であり、いくつかの実施形態では廃棄可能である。
【０１３５】
本発明は、生体試料に含まれているアプタマーのレセプター及び核酸の生物学的意義を分析するための、オリゴヌクレオチドを用いて、生体試料にあるアプタマーのレセプター及び核酸を分析する核酸チップを提供する。
【０１３６】
本発明では、前記生体分子情報データを利用した生物学的意義分析のための構成は、患者群の前記生体分子情報と対照群の前記生体分子情報に関するデータの入力を受けてデータベースを構築するモジュールと、前記入力された情報データを用いて分析システムで前処理を行うモジュールと、前記前処理された結果に基づいて患者のモデルを生成するモジュールと、前記生成されたモデルをロードし、来院患者に適用してブラインドテスト（Ｂｌｉｎｄ  ｔｅｓｔ）たる診断を行うモジュールと、交差検定を用いてシステムの性能を評価するモジュールとを含むことを特徴とする、生体分子分析方法及び装置を提供する。
【０１３７】
本発明において、前記生体分子情報データを利用した生物学的意義予測システムは、例示的に診断であるが、これに限定されない。
【０１３８】
本発明で生成される多くの生体分子情報データは、高次元の特性を有する膨大な量の情報であって、細胞、組織または疾病に関連した様々な情報を生成することができる。前記入力されたデータを用いて分析システムで前処理を行うモジュールは、患者の状態に影響を及ぼす特徴を見付け、分類性能を向上させるための多変量分析方法は、正確な治療及び診断のために重要変数を見つけて次元を縮小したり、特性の変形によって主要特質を見つけたりする特徴抽出（Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）手続きである。
【０１３９】
特徴抽出は、細部的に、クラス情報を学習に使用するかどうかによって教師無し学習（Ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）方式または教師付き学習方式（Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）がある。教師無し学習方式に主に活用されているＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）またはＩＣＡ（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、変数の特性を考慮して特質を抽出することができる。教師付き学習方式は、クラス情報と変数間の統計的な有意性または変数間の相関関係を活用して変数を選択する方式である。この方式は、与えられた特質集合に対して前方向（Ｆｏｒｗａｒｄ）または後方向（Ｂａｃｋｗａｒｄ）に特質を順次追加または除去しながら分類器に適用させた性能を介して主要特質を算出することができる。
【０１４０】
前記前処理された結果を用いて学習を行って患者のモデルを生成するモジュールは、選択された特質を適切な分類器（Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）を用いてクラスによって分類するための手続きを行う。
【０１４１】
本発明において人工ニューラルネットワーク（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）を使用したが、入力と出力に応じて行動を決定する特性のため、パターン認識、関数近似、分類技法などの様々な分野で応用されている。人工ニューラルネットワークは、その構造が複数の層（ｌａｙｅｒｓ）、ノード（ｎｏｄｅｓ）、ニューラルネットワーク接続重みで構成される。本発明に使用されるニューラルネットワーク層間接続方式はフィードフォワード（Ｆｅｅｄ−ｆｏｒｗａｒｄ）方式である。入力パターンに応じて各ノードに対するニューラルネットワーク接続重みと活性化関数を用いて出力値を算出した。生成された結合情報を用いて特定の作業を処理したときに推定した値と実際の結果値とが異なる場合、算出された値を実際の結果値と比較しながら誤差を減らす過程を繰り返し行う方式が、フィードフォワード方式である。
【０１４２】
前記患者のモデルを生成する方法は、線形モデル（ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅｌｓ）、サポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅｓ）、ニューラルネットワーク（ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、分類及び回帰ツリー（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒｅｅｓ）、アンサンブル学習法（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）、判別式分析（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、最近隣方法（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ）、ベイジアンネットワーク（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、及び独立成分分析（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）よりなる群から選択されることを特徴とする、生体分子分析方法及び装置を提供する。
【０１４３】
正確かつ総合的なメカニズム（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）が解明されていない大多数の疾患については、事例をベースとする診断の重要性が非常に大きいといえる。ところが、特定の機械学習技法に限定して考案された、従来の事例ベースの機械学習推論システムは、精度が低い。よって、改善されたシステムの開発が持続的に求められている。また、従来のシステムは、学習された臨床検査項目全体を利用した疾患判別機専用に考案されており、各疾患別臨床検査項目の重要度や優先順位を活用することが可能な方法を提供していない。
【０１４４】
本発明は、医師の正確な疾患診断を支援するための事例ベースの機械学習推論を用いた疾患診断及び検査項目選定システムに関するもので、患者の事例データベース（Ｄａｔａｂａｓｅ）を介して訓練された人工ニューラルネットワーク（Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）を利用した機械学習器である疾患判別器によって新しい患者の検査情報を分析して疾患を判別し、予備診断による各疾患の最終判別のための最小の重要検査項目を選定して提供するシステムに関するものである。機械学習推論を利用した疾患診断法は、機械学習技法を個別に適用して構成している。前記患者のモデルを生成する方法は、線形モデル（ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅｌｓ）、サポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅｓ）、ニューラルネットワーク（ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、分類及び回帰ツリー（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒｅｅｓ）、アンサンブル学習法（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）、判別式分析（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、最近隣方法（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ）、ベイジアンネットワーク（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ）、独立成分分析（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）などがある。
【０１４５】
本システムは、構成及び実務への応用の観点から、２つに分けて構成することができるが、診断のみのための独立（ｓｔａｎｄ  ａｌｏｎｅ）型の診断システムと既存の病院情報システム、すなわち、ＯＣＳ、ＰＡＣＳ、ＬＩＳなどと連携した統合システムで構成することができる。統合システムとの連動のためにはＨＬ７及びＤＩＣＯＭ規約に基づいてシステムを構成しなければならない。本システムは、初期モデルとしてのＰＭＳ（Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）と連動して診断の精度を高めた。また、ＰＭＳだけでなく、ＯＣＳ、ＥＭＲ、ＰＡＣＳなどの様々な医療情報システムと連動したシステムとして開発し、様々な疾患因子を含んでいるより正確な診断システムとして開発することができる。
【０１４６】
本発明によれば、前記生体試料は細菌、真菌類、ウイルス、細胞株及び組織よりなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、オリゴヌクレオチドを用いた生体分子分析方法及び装置を提供する。
【発明の効果】
【０１４７】
本発明は、オリゴヌクレオチドを用いて生体分子を分析することにより、生体試料から生体分子の生物学的意義を確認することができ、蛍光学的に高い感度で検出することができる。さらに、一度の検査で様々な生体分子を分析することにより、生体試料における表現型の変化、疾病に対する敏感性、及び治療薬剤に対する反応の違いなど、個人間の差を効率よく決定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】生体試料から核酸及びタンパク質を分離した後、タンパク質と分析リガンドとを反応させて製造されたタンパク質−分析リガンド複合体、及び核酸から分離されたＲＮＡ及びＤＮＡなどの標的核酸を含む核酸から、分析しようとする標的ＤＮＡを製造し、標的核酸の特定領域に完全に相補的に結合するオリゴヌクレオチドを用いて生体分子を分析し、生物学的意義を分析する全体的なフローチャートである。
【図２】生体試料から分離されたレセプターと分析リガンドとの複合体である。
【図３】生体試料から分離されたＲＮＡを逆転写した後、ｃＤＮＡを対象としてＲＮＡの定量分析を行うことを示す図である。
【図４】生体試料から分離された標的核酸の特定領域に完全に相補的に結合するオリゴヌクレオチドを用いて標的核酸変異分析を行う全体的なフローチャートである。
【図５】生体試料から分離された標的核酸のメチル化有無分析を行う全体的なフローチャートである。
【図６】標識物質のあるターゲットプローブをアレイ上の捕捉プローブとハイブリダイゼーションして発生するシグナルを分析することにより生体分子を分析することを示す図である。
【図７】アレイ上にＩＬ１７及びＩＬ１７ＲＡに相応するアプタマー、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ変異及びメチル化有無に相応する捕捉プローブの配置図である。
【図８】ＩＬ１７及びＩＬ１７ＲＡに相応するタンパク質、ｍＲＮＡ及びＤＮＡ変異、並びにメチル化有無を分析するために、オリゴヌクレオチドを用いて部分的二本鎖核酸及び完全な二本鎖核酸を製作した後、これを鋳型としてシグナルプライマーの存在下でＰＣＲを介して標識及び増幅して得たターゲットプローブを、アレイに固着された前記捕捉プローブにハイブリダイゼーションすることにより形成されたイメージである。
【発明を実施するための形態】
【０１４９】
以下、添付図面と実施例を参照して、本発明に係る標準物質及び核酸チップの製造方法、並びにこれらを用いた２つまたはそれ以上の生体分子からなる生体試料にある生体分子の分析方法を詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を例示的に説明するものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものと意図されていない。
【０１５０】
本発明に使用される特定の生体分子は、ＩＬ１７及びＩＬ１７ＲＡであり、アレイを用いた一度の検査でこれらのタンパク質、ｍＲＮＡ及びＤＮＡ変異を分析しようとする。
【０１５１】
ＩＬ−１７は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であるＴｈ１７細胞が生産するサイトカインであって、例えばＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｄｅ  ＡＡＨ６７５０５やＮＰ００２１８１で示すアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＩＬ−１７はＩＬ−１７ＡまたはＣＴＬＡ−８と呼ばれることもある。ＩＬ−１７受容体はＩＬ−１７が結合する細胞表面タンパク質を意味する。ＩＬ−１７受容体ファミリーとしてＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ、ＩＬ−１７ＲＥが知られている。
【０１５２】
本発明において、「ＩＬ−１７媒介炎症性疾患」は、Ｔｈ１７細胞だけでなく、ガンマ／デルタＴ細胞、ＮＫ細胞、大食細胞、好中球などの免疫または炎症細胞から分泌されるＩＬ−１７により発生または悪化する呼吸器疾患、消化器疾患、皮膚疾患、血管または代謝性疾患、 骨関節疾患及び脳神経疾患などを含む。
【０１５３】
具体的に、前記呼吸器疾患は鼻炎、鼻ポリープ、副鼻腔炎、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、細気管支炎、肺炎、肺線維症、肺癌などを含み、前記消化器疾患は口腔炎、食道炎、胃炎、胃潰瘍、炎症性腸炎、過敏性腸症候群、胆導炎、膵炎、口腔癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆道癌、胆嚢癌、膵臓癌などを含む。
【０１５４】
また、前記血管または代謝性疾患は動脈硬化症、糖尿病、痛風などを含み、前記骨関節疾患は関節リウマチ、骨関節炎、骨粗しょう症などを含む。前記脳神経疾患は血管性認知症、アルツハイマー病、退行性脳疾患などを含む。
【０１５５】
定量分析するタンパク質及びＲＮＡ定量分析の対象は、ＩＬ１７及びＩＬ１７ＲＡであり、ＧｅｎＢａｎｋデータシステム（ｈｔｔｐ：／／  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から得られるＩＬ１７及びＩＬ１７ＲＡ遺伝子の塩基配列情報（ＩＬ１７のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００２１９０、及びＩＬ１７ＲＡのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿０１４３３９）である。
【０１５６】
ＤＮＡ変異の分析はＩＬ１７及びＩＬ１７ＲＡのＳＮＰを対象とし、これに関する情報はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐから収集した。
【０１５７】
核酸のメチル化有無分析は、ＩＬ１７プロモーター−１４４位置（Ｔｈｏｍａｓ，  Ｒ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８７（３０）：２５０４９−５９．）に対して行った。
【０１５８】
【表１−１】
0006325667.tif 000002
【０１５９】
【表１−２】
0006325667.tif 000003
【０１６０】
【表１−３】
0006325667.tif 000004
【０１６１】
【表２−１】
0006325667.tif 000005
【０１６２】
【表２−２】
0006325667.tif 000006
【０１６３】
【表３】
0006325667.tif 000007
【実施例】
【０１６４】
実施例１：生体分子の準備
【０１６５】
細胞或いは細胞からなる組織試料からＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、米国）で生体分子を分離した。本発明では、ヒトの軟骨組織（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、ドイツ）を生体試料として使用した。軟骨組織を製造社から提供されたバッファで溶解させ、溶解した試料をカラムに処理した後、遠心分離してＤＮＡをカラム膜に結合させ、濾過された溶液を収穫した。カラム膜にあるＤＮＡの分離は、ＤＮＡの在るカラムを洗浄し、膜からＤＮＡを抽出した後、遠心分離してＤＮＡを収穫した。前記収穫された濾過溶液を製造社から提供されるカラムに処理し、濾過された溶液中のタンパク質を沈殿及び遠心分離して収穫した。また、カラムにあるＲＮＡを洗浄し、膜にあるＲＮＡを抽出した後、遠心分離して収穫した。
【０１６６】
実施例２：分析リガンドの製造
【０１６７】
２−１．抗体及びアプタイマー分析リガンド
【０１６８】
前記軟骨組織で特定タンパク質の定量分析を行うために用いられる前記タンパク質−抗体分析リガンド複合体の製造のために、ＩＬ１７（カタログ番号ＢＡＦ３１７）及びＩＬ１７ＲＡ（カタログ番号ＢＡＦ１７７）ビオチン−抗体を購入した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）。
【０１６９】
前記軟骨組織で特定のタンパク質の定量分析を行うために用いられる前記タンパク質−アプタイマー複合体の製造のために使用されるアプタマーは、ＩＬ１７（韓国特許第１０−１２７６５１９−００００号）及びＩＬ１７ＲＡ（Ｃｈｅｎ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １９；  ７１１−７１８）に特異的に結合する一本鎖核酸であって、表４に提示された塩基配列を有する。ＩＬ１７及びＩＬ１７ＲＡビオチン−アプタマーを有機合成して準備した（Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、韓国）。
【０１７０】
【表４】
0006325667.tif 000008
【０１７１】
タンパク質定量分析のための抗体分析リガンドのビオチン−オリゴヌクレオチドの構成は、次の一般式（Ｉ）で表される。
【０１７２】
５’−ビオチン−Ｐ１−Ｔ−Ｐ３−３’  （Ｉ）
【０１７３】
前記一般式（Ｉ）において、Ｐ１は、検出シグナルを有する順方向プライマーに相補的に結合する領域であり、Ｔは、捕捉プローブと完全に相補的に結合する領域であって、リガンドが結合する標的タンパク質またはそれに対する一本鎖核酸を識別するための、ハイブリダイゼーション反応で使用するプローブとして機能するように設計することができる。Ｐ３は、シグナルのプライマー対における逆方向プライマーと相補的に結合する領域である。
【０１７４】
前記準備されたビオチン−抗体及びビオチン−アプタマーをアビジンを介してビオチン−オリゴニュクレオチドと連結して構造体を製造した。前者を抗体分析リガンドと称し、後者をアプタマー分析リガンドと称した。
【０１７５】
２−２．上流及び下流オリゴヌクレオチド
【０１７６】
２−２−１．核酸定量分析
【０１７７】
核酸定量分析を行うための前記上流オリゴヌクレオチドの構成は、次の一般式（ＩＩ）で表される。
【０１７８】
５’−Ｐ１−Ｈ−３’  （ＩＩ）
【０１７９】
前記一般式（ＩＩ）において、Ｐ１は、検出シグナルを有する順方向プライマーに相補的に結合する領域であり、Ｈは、ハイブリダイゼーションされる標的核酸と相補的にハイブリダイゼーションする配列領域である。
【０１８０】
前記下流オリゴヌクレオチドの構成は、次の一般式（ＩＩＩ）で表される。
【０１８１】
５’−ＨＴ−Ｐ３−３’  （ＩＩＩ）
【０１８２】
前記一般式（ＩＩＩ）において、Ｈは、前記標的核酸に前記上流オリゴヌクレオチドの３’末端が結合する位置の下流の配列と相補的に結合する領域であり、Ｔは、捕捉プローブと完全に相補的に結合する領域であって、標的核酸またはそれに対する一本鎖核酸を識別するための、ハイブリダイゼーション反応で使用するプローブとして機能するように設計することができる。Ｐ３は、逆方向プライマーと相補的に結合する領域である。
【０１８３】
前記一般式（ＩＩ）と一般式（ＩＩＩ）におけるＨは、β−ａｃｔｉｎ、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒ  ｍＲＮＡなどに対して特異的な塩基配列を有し、前記表１−１〜表１−３に提示されており、Ｔは表２−１〜表２−２に提示されており、Ｐ１及びＰ３は表３に提示されており、これらの配列を参照して核酸変異分析のための上流及び下流オリゴヌクレオチドを有機合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ社、韓国）。
【０１８４】
２−２−２．核酸変異分析
【０１８５】
標的核酸変異分析のための前記上流オリゴヌクレオチドの構成は、次の一般式（ＩＶ）で表される。
【０１８６】
５’−Ｐ２−Ｈ−Ｖ−３’  （ＩＶ）
【０１８７】
前記一般式（ＩＶ）において、Ｐ２は、検出シグナルを有する順方向プライマーが相補的に結合する領域であり、Ｈは、標的核酸と相補的にハイブリダイゼーションする配列を有する領域であり、Ｖは、標的核酸の変異配列と相補的にハイブリダイゼーションする変異配列に特異的な領域である。上流オリゴヌクレオチドは２つまたはそれ以上から構成できる。
【０１８８】
前記下流オリゴヌクレオチドの構成は、次の一般式（Ｖ）で表される。
【０１８９】
５’−Ｈ−Ｔ−Ｐ３−３’  （Ｖ）
【０１９０】
前記一般式（Ｖ）において、Ｈは、前記標的核酸の変異特異領域の下流で標的核酸と相補的にハイブリダイゼーションする配列領域であり、Ｔは、捕捉プローブと相補的に結合する領域であって、変異を有する標的核酸またはそれに対する一本鎖核酸を識別するための、ハイブリダイゼーション反応で使用するプローブとして機能するように設計することができる。Ｐ３は、逆方向プライマーと相補的に結合する領域である。
【０１９１】
前記一般式（ＩＶ）と一般式（Ｖ）におけるＨは、ＩＬ１７のＳＮＰ、ＩＬ１７ＲのＳＮＰ、メチル化ＩＬ１７などに対して特異的塩基配列を有し、表１−１〜表１−３に提示されており、Ｔは表２−１〜表２−２に提示されており、Ｐ２とＰ３は表３に提示されており、これらの配列を参照して核酸変異分析のための上流及び下流オリゴヌクレオチドを有機合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ社、韓国）。
【０１９２】
実施例３：精度管理一本鎖核酸の製造
【０１９３】
標準物質は、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐｌａｎｔ＿ｓｐｅｃｉｆｉｃ／から確保したＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５種類の植物特異タンパク質で構成されている（表５参照）。
【０１９４】
【表５】
0006325667.tif 000009
【０１９５】
選定された５種の植物特異タンパク質は、大腸菌発現システムを用いて、相応するタンパク質を発現させた後、発現されたタンパク質を分離し、標準ＳＥＬＥＸ方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，  Ａ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．  Ｓｚｏｓｔａｋ．  １９９０．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：  ８１８−８２２；  Ｇｏｌｄ，  Ｌ．，  Ｐ．  Ａｌｌｅｎ，  Ｊ．  Ｂｉｎｋｌｅｙ，  Ｄ．  Ｂｒｏｗｎ，  Ｄ．  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｓ．Ｒ．  Ｅｄｄｙ，  Ｃ．  Ｔｕｅｒｋ，  Ｌ．  Ｇｒｅｅｎ，  Ｓ．  Ｍａｃｄｏｕｇａｌ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｔａｓｓｅｔ  １９９３．  ＲＮＡ：  ｔｈｅ  ｓｈａｐｅ  ｏｆ  ｔｈｉｎｇｓ  ｔｏ  ｃｏｍｅ，  ｐｐ．  ４９７−５１０．  Ｉｎ：  Ｒ．Ｆ．  Ｇｅｓｔｅｌｅｎｄ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．  Ａｔｋｉｎｓ  （ｅｄｓ．）．  Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）によって、標準物質に結合する一本鎖核酸を確保した。
【０１９６】
これを精度管理一本鎖核酸と命名し、これらの塩基配列を用いて、ビオチンが結合されたビオチン−精度管理一本鎖核酸を製造し、実施例２の一般式（Ｉ）で表されるビオチン−オリゴヌクレオチドを製造した。ビオチン−精度管理一本鎖核酸をアビジンを介してビオチン−オリゴヌクレオチドと連結して標準物質分析のための構造体を製作し、これを便宜のために「精度管理理リガンド」と称した。
【０１９７】
実施例４：標的核酸の準備
【０１９８】
４−１．タンパク質
【０１９９】
４−１−１．抗体分析リガンド
【０２００】
前記準備された軟骨組織から分離したタンパク質溶液１００μＬを入れたマイクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｗｅｌｌ）を、４℃で一晩中或いは３７℃で２時間０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）でコートした。
【０２０１】
ビオチン−抗体（１０μｇ／ｍｌ）１００μＬにアビジン（７．２μｇ／ｍｌ）を添加したままで３０分間室温におき、前記ビオチン−オリゴヌクレオチドを添加して抗体−アビジン−オリゴヌクレオチド構造体を製造した。これを抗体分析リガンドと称した。
【０２０２】
ウェルを、３％脱脂粉乳、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．０２％アジ化ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝生理食塩水でブロック（１８０μＬ／ｗｅｌｌ）し、リン酸塩緩衝生理食塩水−ツイン２０で２回洗浄した後、抗体分析リガンド（１０μｇ／ｍｌ）１００μＬを添加して２時間３７℃で培養した。このウェルを５分間５回ツイン−リン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した後、非特異的に結合されたビオチン−オリゴヌクレオチドを除去するために蒸留水で５分間４回洗浄した。各ウェルにある内容物を５００μＬのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに移して保管し、これを核酸試料として用いた。
【０２０３】
４−１−２．アプタマー分析リガンド
【０２０４】
前記準備されたビオチン−ＩＬ１７アプタマー（１０／）１００及びビオチン−ＩＬ１７ＲＡアプタマー（１０／）１００にそれぞれアビジン（７．２／）を添加したままで３０分間室温におき、前記準備されたビオチン−オリゴヌクレオチド（１０／）を添加してアプタマー−アビジン−オリゴヌクレオチド構造体を製造し、これをアプタマー分析リガンドと称した。
【０２０５】
前記準備された軟骨組織から分離したタンパク質溶液をニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）ディスクに処理して固定させた後、ＳＥＬＥＸバッファで、前記タンパク質が付着したディスクとＩＬ１７及びＩＬ１７ＲＡアプタマー分析リガンドを３０分間処理し、タンパク質−アプタマー分析リガンド複合体を形成させた後、洗浄を行い、非特異的に結合したアプタマーを除去することにより精製されたタンパク質−アプタマー分析リガンド複合体を準備した。これをタンパク質の定量分析のために核酸試料として用いた。
【０２０６】
４−２．ＲＮＡ
【０２０７】
特定ＲＮＡの定量分析及び変異を分析するために、軟骨組織から精製した全ＲＮＡ１０ｎｇ、ｄＴ２０プライマー（（株）Ｂｉｏｎｅｅｒ、１００ｐｍｏｌｅｓ／２０μＬ反応液）、ＭＭＬＶ逆転写酵素（（株）Ｂｉｏｎｅｅｒ、２００Ｕ／２０μＬ反応液）、１０×反応緩衝溶液２μＬ、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ；１５Ｕ／２０μＬ反応液）及びベタイン（Ｓｉｇｍａ社；５００ｍＭ／２０μＬ反応液）を混合して逆転写反応液を製造した。製造された逆転写反応液を用いて、既存の単一温度条件である４２℃または５２℃１０分、２０分、４０分または６０分反応の後、３７℃２分、５０℃３分を１サイクルとして２サイクル、４サイクル、８サイクルまたは１２サイクル、或いは、３７℃１分、４７℃３分、５５℃１分を１サイクルとして２サイクル、４サイクル、８サイクルまたは１２サイクル繰り返して逆転写反応を行った。生成されたｃＤＮＡを核酸試料として用いた。
【０２０８】
４−３．ＤＮＡ変異
【０２０９】
特定ＤＮＡの変異有無を分析するためにキットを用いて、軟骨組織からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐを用いてその濃度を測定し、ＤＮＡ変異分析のための標的核酸として用いた。
【０２１０】
４−４．メチル化
【０２１１】
特定ＤＮＡのメチル化有無を分析するためにキットを用いて、軟骨組織からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐを用いてその濃度を測定した。その後、抽出したＤＮＡ約１〜２μｇ程度を０．５Ｎ濃度の水酸化ナトリウムと混ぜて１６ｍＭにして３７℃で１５分間反応させることにより、ＤＮＡが一本鎖となるように変形させた。その後、３．５Ｍ濃度の重硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）と０．０１Ｍ濃度のハイドロキノン（Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）試薬を添加し、５６℃で１６時間化学反応させた。その後、エタノールを用いた沈殿反応を行い、変換されたＤＮＡのみを濃縮させて純粋分離し、５０℃の３次蒸留水に溶かした後、０．１Ｍ濃度となるように水酸化ナトリウムを添加し、常温で１５分間反応させることにより、シトシンの脱硫酸化反応を行い、もう一度エタノール沈殿反応で濃縮させ、最終的に３０℃の３次蒸留水に溶かして２０℃に保管した。これを、メチル化有無を分析するための標的核酸として用いた。
【０２１２】
実施例５：増幅用核酸試料の製造
【０２１３】
前記軟骨組織から準備され且つ標的核酸が含まれた、ＲＮＡ試料、ゲノムＤＮＡ試料、タンパク質−分析リガンド複合体の核酸試料などから、各増幅用核酸試料を次のとおり準備し、混合することにより、増幅反応に使用される反応溶液とした。
【０２１４】
実施例４でタンパク質定量分析のために収穫したオリゴヌクレオチドを有するタンパク質−分析リガンド複合体をそのまま増幅用核酸試料として用いた。
【０２１５】
増幅用核酸試料は、実施例４でＲＮＡ定量分析のために分離されたＲＮＡが逆転写反応によってｃＤＮＡに転換された核酸試料、ＤＮＡ変異分析のために分離されたゲノムＤＮＡの核酸試料、及びメチル化有無の分析のためにゲノムＤＮＡのメチル化情報を反映した塩基配列の変化が生じた、メチル化有無の分析のための核酸試料から次のとおり製造した。
【０２１６】
前記核酸試料の混合物と前記上・下流オリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーション反応させて部分的二重鎖核酸を製造し、この部分的二重鎖核酸を完全な二重鎖核酸に転換させる連結反応を行うことにより、前記増幅用核酸試料を製造した。
【０２１７】
次の反応溶液でＰＣＲ機器を用いて、９５℃５分間変性の後、９５℃１分、７０℃１分、６８℃１分、６６℃１分及び６４℃３分を１サイクルとして１０サイクル繰り返し行った。
【０２１８】
１０ｍｌの反応溶液は、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨは７．６）、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＮＡＤ＋、０．１％Ｔｉｒｔｏｎ  Ｘ−１００、実施例２で準備された上流オリゴヌクレオチドと下流オリゴヌクレオチド（各５００ｐＭ）、１ｕｎｉｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ、米国）、及び上記で準備された１００μｇの核酸試料の混合物から構成された。
【０２１９】
実施例６：増幅反応
【０２２０】
前記増幅反応は、次の反応溶液でＰＣＲ機器を用いて、９５℃３分間変性の後、９５℃１０秒、５６℃１０秒及び７２℃２０秒を１サイクルとして４２サイクル繰り返し行った。前記２５ｍｌの反応溶液は、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％（Ｖ／Ｖ）グリセリン、１Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１ｐｍｏｌの順方向シグナルプライマー（野生型標的核酸分析のためにはＰ１のみを使用し、変異標的核酸分析のためにはＰ１とＰ２を使用する。）、２０ｐｍｏｌの逆方向シグナルプライマー（Ｐ３）、及び２ｍｌの実施例３の反応溶液などから構成された。
【０２２１】
野生型標的核酸分析ためのプライマーは、分析リガンドまたは上流オリゴヌクレオチドのＰ１領域に相補的に結合し且つ検出シグナルを発生させる、Ｃｙ３で標識している順方向プライマー、及びＰ３領域に相補的に結合する逆方向プライマーから構成する。
【０２２２】
変異標的核酸を分析するために、順方向プライマーは、非変異標的核酸を増幅させ且つＰ１領域に相補的に結合する、Ｃｙ３で標識している順方向プライマーと、Ｐ２領域に相補的に結合する、Ｃｙ５で標識している順方向プライマーの少なくとも２つから構成し、前記逆方向プライマーは、Ｐ３領域に対するユニバーサルなプライマーから構成する。これらのＰＣＲプライマーの塩基配列は表２−１〜表２−２に提示されている。
【０２２３】
実施例７：アレイの製造
【０２２４】
前記捕捉プローブは、標的核酸を識別するために、標的核酸に相応する塩基配列を有するオリゴマー（表３）を提示し、有機合成して（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）、製造された捕捉プローブを図４に準じてアレイに固定した。
【０２２５】
前記下流オリゴヌクレオチドを設計する際に、表３の捕捉プローブは、表４の下流オリゴヌクレオチドと完全に相補的に結合する標的核酸の特定領域を指示するようにした。
【０２２６】
これを具体的に考察すると、表１−１〜表１−３の番号１の捕捉プローブは、表２−１〜表２−２の番号１のβ−ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡの下流オリゴヌクレオチドと完全に相補的に結合する領域、表１−１〜表１−３の番号３の捕捉プローブは、表２−１〜表２−２の番号３のＩＬ１７  ｍＲＮＡの下流オリゴヌクレオチドと完全に相補的に結合する領域をそれぞれ指示するようにした。
【０２２７】
ＧＡＰＳ（Ｇａｍｍａ  Ａｍｉｎｏ  Ｐｒｏｐｙｌ  Ｓｉｌａｎｅ）がコートされたスライドガラスであるＵｌｔｒａＧＡＰＳＴＭ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｓｌｉｄｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を用いて、捕捉一本鎖核酸が一定の規則で固着された核酸チップを製作した。核酸チップの製作にはピン（ｐｉｎ）方式のマイクロアレイヤーシステム（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ、ＧｅｎＰａｋ社）を使用し、スポット間隔（ｓｐｏｔ  ｓｐａｃｉｎｇ）はスポットの中心間（ｃｅｎｔｅｒ−ｔｏ−ｃｅｎｔｅｒ）距離が１５０μｍとなるようにした。それぞれの捕捉一本鎖核酸を標準溶液に溶かして濃度を調節した。このとき、アレイヤー内の湿度を７０％に維持してスポットティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）を行った。スポットティングされたスライドは、加湿チャンバー（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）で２４〜４８時間放置した後、ＵＶ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒでベークする過程を行った。公知の方法で捕捉一本鎖核酸をスライドガラスに固定させ、スライドを直ちに遠心分離して乾燥させた後、遮光状態で保管した。前記アレイの製作方法における基板は、ガラスで製作されたスライドガラスである。このとき、基板は、アミン基またはアルデヒド基などでコートされたものを使用することができる。例えば、ＧＡＰＳ（Ｇａｍｍａ  Ａｍｉｎｏ  Ｐｒｏｐｙｌ  Ｓｉｌａｎｅ）がコートされたスライドガラスであるＵｌｔｒａＧＡＰＳＴＭ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｓｌｉｄｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を用いて、前記捕捉プローブを一定の規則で配列固着させてアレイを製作する。
【０２２８】
このようなアレイの製作では、アレイヤーシステム（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用することができ、それぞれの捕捉プローブを緩衝液に溶かして濃度を調節する。このとき、アレイヤー内の湿度は７０％〜８０％に維持してスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）を行う。
【０２２９】
スポッティングされたスライドは、加湿チャンバー（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）で放置した後、ＵＶ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒでベーク（ｂａｋｉｎｇ）する過程を行う。
【０２３０】
このような本発明に係るアレイは、関連技術分野で広く知られている方法によって捕捉一本鎖核酸をスライドガラスに固定させ、スライドを直ちに遠心分離して乾燥させた後、使用するまで遮光状態で保管する。
【０２３１】
実施例８：アレイハイブリダイゼーション及び分析
【０２３２】
前記表１−１〜表１−３にある標的核酸の特定領域の塩基配列と、捕捉プローブと完全に相補的に結合する領域とを含むターゲットプローブを本発明のアレイの捕捉プローブに処理して６０℃で４〜１２時間ハイブリダイゼーションし、４２℃で０．１×ＳＳＣ溶液で洗浄した。
【０２３３】
このとき、ハイブリダイゼーション溶液は、１Ｍの塩化ナトリウム、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳ、または１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、０．２％ウシ血清アルブミンまたは一本鎖核酸を含む。ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った後、アレイを洗浄溶液で洗浄した。
【０２３４】
このとき、洗浄溶液は、例えば、１×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ、１×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ、０．０１×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳの組成を含み、この順でそれぞれの段階ごとに４２℃で３０分間行った。
【０２３５】
実施例９：核酸チップのスポット探索及び分析
【０２３６】
実施例６の洗浄が終了した後、スライドガラスを遠心分離で乾燥させ、使用済みの蛍光染料を励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）するための適切な波長のレーザー（Ｃｙ５、６３５ｎｍ）を有するレーザースキャナー（ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｅｒ、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００、Ａｘｏｎ社）を用いて探索した。蛍光イメージは、ＴＩＦＦ（ｍｕｌｔｉ  ｉｍａｇｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｉｍａｇｅ  ｆｉｌｅ）フォーマットで保存した後、適切な画像分析（ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェア（ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ３．０、Ａｘｏｎ社）で分析した。
【０２３７】
スポット（ｓｐｏｔ）当たりのシグナル強度（ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、単位：ｑｕａｎｔａ）は、周囲の背景の基本的なシグナルを差し引いたものを使用する。ここで、背景シグナルは、特定のスポットの周囲にある４つのスポットの周辺シグナルからなるローカルバックグラウンド（ｌｏｃａｌ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を意味する。スポットが持っている画素（ｐｉｘｅｌ）の９０％以上が背景シグナル＋２標準偏差（Ｓ．Ｄ．；ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を超えるシグナル強度を示すときに、データの分析に含ませ、上記の条件を満たさなければ、データに含ませないスポット（ｂａｄ  ｓｐｏｔ）に分類し、分析に含ませないのが一般的である。
【０２３８】
標識効率（Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）による偏差（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ、ＩＳ）のシグナルを用いて正規化（例えば、Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ＝Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ／ＩＳ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）し、単一標識（ｍｏｎｏｌａｂｅｌｉｎｇ）をした場合にはＣｙ５チャネルのシグナル強度（ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）でその結果を記録し、スポットティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）が２倍以上になった場合には平均値を使用する。ターゲット一本鎖核酸のシグナル強度（ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、Ｓ）は、スポットのピクセル（ｐｉｘｅｌ）に対してそれぞれのシグナル強度を求めた後、これらの中央値（ｍｅｄｉａｎ）を使用する（ｍｅｄｉａｎ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｐｉｘｅｌ−ｂｙ−ｐｉｘｅｌ）。シグナル強度（Ｓ）は、内部標準（ＩＳ）を用いて標識効率による偏差を正規化する。
【０２３９】
Ｓ’（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｖａｌｕｅ）＝  Ｓ（Ｃｙ５−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）×（Ｃｙ５−ＩＳ）
【０２４０】
上記の方法でピクセル密度の分析結果と実際の試料量との関係を解明し、その相関関係を確認することができる。
【０２４１】
前記実験で得ることが可能な一例である図６を参照すると、アレイ上のスポット蛍光程度で生体試料におけるタンパク質定量分析、ｍＲＮＡ定量分析、ＤＮＡ変異分析及びＤＮＡメチル化有無分析などを行うことができる。
【０２４２】
図７は、ＩＬ１７及びＩＬ１７ＲＡに相応するタンパク質、ｍＲＮＡ及びＤＮＡ変異を分析するために、オリゴヌクレオチドを用いて部分的二本鎖核酸及び完全な二本鎖核酸を製作した後、これを鋳型としてシグナルプライマーの存在下でＰＣＲを介して標識及び増幅して得たターゲットプローブを、アレイに固着された前記捕捉プローブにハイブリダイゼーションすることにより形成されたイメージである。
【０２４３】
図８において、スポットの蛍光程度は、捕捉プローブと標識物質のあるターゲットプローブとが形成する二本鎖の性質に応じて多様であり、単一の捕捉プローブからなるスポットで標識物質のあるターゲットプローブのシグナルによって決定される。
【０２４４】
生体分子の標的核酸でＰＣＲして得た増幅産物に由来する標識物質のあるターゲットプローブとアレイ捕捉プローブの塩基配列は一本鎖核酸−捕捉プローブの二本鎖の安定性に影響を与え、アレイのスポットにある標識物質のあるターゲットプローブの量は蛍光程度に影響を与える。
【０２４５】
したがって、図８の蛍光程度は標識物質のあるターゲットプローブの量を表現し、前記標識物質のあるターゲットプローブの量は生体試料にある標的核酸に相応する生体分子の量を示す。
【０２４６】
対照区試料と実験区試料から分離される標的核酸から、互いに異なる標識物質、好ましくは、前者はＣｙ３、後者はＣｙ５標識シグナルプライマーを用いてターゲットプローブを準備した場合、すなわち、形成されるスポットが青−黄−赤のカラースペクトルを示すことは、捕捉プローブに結合したＣｙ−３標識ターゲットプローブとＣｙ−５標識ターゲットプローブの割合が多様であって現れる現象であり、特定のスポットのカラースペクトルの程度は、対照区試料と実験区試料で特定の生体分子が存在する様相に該当する。
【０２４７】
核酸変異分析のために、スポットのカラースペクトルから、スポットに相応する標的核酸を含む生体試料における標的核酸に相応する特定の遺伝子変異を確認することができる。標的核酸の特定領域の変異ヌクレオチドと完全に相補的に結合する場合にのみ増幅産物が生成され、これを鋳型としたターゲットプローブが作られるため、最終的に形成されたスポットのカラースペクトラムを分析してアレイの全スポットの程度を確認することにより、生体試料における特定遺伝子の変異を確認することができる。つまり、図７において、赤いスポットは、Ｃｙ５標識物質によって発生したものであり、変異に関連したシグナルプライマーＰ２に相応して生体試料におけるアレイ上の捕捉プローブに相応するＳＮＰが存在することを示す。
【０２４８】
メチル化有無を確認するために、メチル化特異上流オリゴヌクレオチドに相応するシグナルプライマーＰ１はＣｙ３で標識しており、非メチル化上流オリゴヌクレオチドに相応するシグナルプライマーＰ２はＣｙ５で標識している。図７においてＩＬ１７メチル化スポットが青色であるから、本実験に使用された試料のＩＬ１７プロモーター１４４位置のシトシンはメチル化されることが分かる。
【０２４９】
実施例１０：大腸菌の細胞外分子を含む生体分子の分析
【０２５０】
１１−１．ＡｍｐＲ遺伝子を分析するためのオリゴヌクレオチドの製造
【０２５１】
プラスミドｐＵＣ１９のＡｍｐＲ遺伝子を分析するためのオリゴヌクレオチドの構成は、前記一般式（ＩＶ）と一般式（Ｖ）に従って前記上流オリゴヌクレオチド及び下流オリゴヌクレオチドを表６のとおりデザインして有機合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ社、韓国）。
【０２５２】
【表６】
0006325667.tif 000010
【０２５３】
１０−２．細胞表面分子の分析リガンドの製作
【０２５４】
本発明者によって提案された大腸菌結合一本鎖核酸（韓国特許第１０−０７３０３５９号参照）の塩基配列は、表７のとおりである。この塩基配列に基づいて、ビオチン−一本鎖核酸リガンドとビオチン−オリゴヌクレオチドは、一般式（Ｉ）に従って、表２−１〜表２−２及び表３を参照してデザインして有機合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ社、韓国）。
【０２５５】
【表７】
0006325667.tif 000011
【０２５６】
前記準備されたビオチン−大腸菌アプタマー（１０μｇ／μＬ）１００μＬそれぞれにアビジン（７．２μｇ／μＬ）を添加したままで３０分間室温におき、前記準備されたビオチン−オリゴヌクレオチド（１０μｇ／μＬ）を添加してアプタマー−アビジン−オリゴヌクレオチド構造体を製造した。これをアプタマー分析リガンドと称した。
【０２５７】
１０−３．大腸菌−分析リガンド複合体からの生体分子の分離及び分析
【０２５８】
大腸菌とアプタマー分析リガンドプールとを反応させた後、大腸菌−アプタマー分析リガンド複合体を洗浄及び分離した。上記で収穫した大腸菌−分析リガンド複合体から、ｐＵＣ１９プラスミド及び大腸菌の表面に結合した一本鎖核酸などを含む総核酸を分離した。分離された総核酸を標的核酸として実施例５と同様の方法で標的ＤＮＡを製造した。実施例６と同様の方法で標識及び増幅し、実施例７で製作されたアレイを分析した。大腸菌の表面生体分子のプロファイル及びＡｍｐＲ遺伝子を確認した。
【産業上の利用可能性】
【０２５９】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、生体試料にある生体分子を一度の検査で分析することにより、生体試料の生体分子の生物学的意義を確認することができ、蛍光学的に高感度で検出することができる。したがって、本発明は、一度の検査で様々な生体分子を分析することにより、生体試料における表現型の変化、疾病に対する敏感性、及び治療薬剤に対する反応の違いなど、個人間の差を効率よく決定する方法を提供することが可能なので、人間の疾病の克服に大きく寄与し、経済的に医療産業上非常に有用な効果がある。
【図１】
0006325667.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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