(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
0006379296.tif 000157
［式中、
Ｒ1は、基：
【化２】
0006379296.tif 000158
（式中Ｘ1およびＸ2のそれぞれは、独立に水素、フルオロ、または−ＣＨ3から選択され、あるいはＸ1およびＸ2のうちの１つは、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）2またはモルホリン−４−イルから選択され、もう一方は、水素である）、
【化３】
0006379296.tif 000159
（式中それぞれのｎは、独立に０、１または２から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、全てが水素ではないという条件、ならびに全てのｎが同時に０ではないという条件、ならびにさらに１つのｎのみが２であってよく、かつ１つのｎが２である場合、Ｙ1、Ｙ2およびＹ3のそれぞれは、独立にフルオロ、−ＯＨ、または−ＣＦ3から選択されるという条件で、独立に水素、−ＯＨ、フルオロ、−ＮＨ2または−ＣＦ3から選択される）、
【化４】
0006379296.tif 000160
（式中Ｑ1およびＱ2は、独立に水素、−ＣＨ3または−ＣＨ2ＣＨ3から選択される）、
【化５】
0006379296.tif 000161
（式中Ｚ1およびＺ2のそれぞれは、独立に水素またはフルオロから選択される）、
【化６】
0006379296.tif 000162
から選択され、
Ｒ2は、水素またはフルオロである］
またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
Ｒ1は、基：
【化７】
0006379296.tif 000163
（式中Ｘ1およびＸ2のそれぞれは、独立に水素、フルオロ、または−ＣＨ3から選択され、あるいはＸ1およびＸ2のうちの１つは、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）2またはモルホリン−４−イルから選択され、もう一方は、水素である）、
【化８】
0006379296.tif 000164
（式中それぞれのｎは、独立に０、１または２から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、全てが水素ではないという条件、ならびに全てのｎが同時に０ではないという条件、ならびにさらに１つのｎのみが２であってよく、かつ１つのｎが２である場合、Ｙ1、Ｙ2およびＹ3のそれぞれは、独立にフルオロ、−ＯＨ、または−ＣＦ3から選択されるという条件で、独立に水素、−ＯＨ、フルオロ、−ＮＨ2または−ＣＦ3から選択される）、
【化９】
0006379296.tif 000165
（式中Ｚ1およびＺ2のそれぞれは、独立に水素またはフルオロから選択される）、
【化１０】
0006379296.tif 000166
から選択され、
Ｒ2は、水素またはフルオロである、
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
Ｒ1は、基：
【化１１】
0006379296.tif 000167
（式中Ｘ1およびＸ2のそれぞれは、独立に水素、フルオロ、または−ＣＨ3から選択される）、
【化１２】
0006379296.tif 000168
（式中Ｚ1およびＺ2のそれぞれは、独立に水素またはフルオロから選択される）、
【化１３】
0006379296.tif 000169
から選択され、
Ｒ2は、フルオロである、
請求項１もしくは２に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
前記化合物が、
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−（３，３−ジフルオロ−（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリダジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（１Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシシクロペンチル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、あるいは
５−（５−エチル−５−メチル−６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
前記化合物が、
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩
である、請求項１、２、３または４のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項６】
薬学的に許容可能な担体と共に、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
【請求項７】
【化１４】
0006379296.tif 000170
【化１５】
0006379296.tif 000171
【化１６】
0006379296.tif 000172
【化１７】
0006379296.tif 000173
【化１８】
0006379296.tif 000174
【化１９】
0006379296.tif 000175
【化２０】
0006379296.tif 000176
【化２１】
0006379296.tif 000177
【化２２】
0006379296.tif 000178
もしくは
【化２３】
0006379296.tif 000179
またはその薬学的に許容可能な塩。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
哺乳類の葉酸代謝サイクルは、複雑であるが一炭素単位生体分子の移動のための重要なプロセスである。葉酸は、合成できないが食餌を通して得られる。食餌の葉酸は、サイクルの基本の分子テトラヒドロ葉酸（テトラヒドロホラート、ＴＨＦＡ）のための出発原料である。葉酸代謝の１つの機能は、核酸構築ブロックの生成を介したＤＮＡ合成および修復の支持である。この代謝プロセスには、酵素チミジル酸シンターゼによるメチル基の追加とそれに続くデオキシヌクレオチド三リン酸へのリン酸化によるデオキシウリジンモノホスファート（ｄＵＭＰ）からのデオキシチミジンモノホスファート（ｄＴＭＰ）のｄｅ  ｎｏｖｏ合成が含まれる。プリンヌクレオチドｄｅ  ｎｏｖｏ生合成は、活性化された糖５−ホスホリボシル−１−ピロホスファート（ＰＲＰＰ）で始まる。テトラヒドロホラートも含めた、一連の反応を通して、この経路は、イノシン５’−モノホスファート（ＩＭＰ）を与える。ＩＭＰは、続いてアデノシンモノホスファート（ＡＭＰ）またはグアノシンモノホスファート（ＧＭＰ）のいずれかに変換され得る。
【０００２】
ＩＭＰプリンｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路における１つのステップは、酵素５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ（ＡＩＣＡＲＦＴ）によって触媒される。ＡＩＣＡＲＦＴは、Ｎ１０−ホルミル−テトラヒドロホラート（１０−ホルミルテトラヒドロホラート、１０−ＣＨＯ−ＴＨＦＡ）による５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−Ｄ−リボフラノシル−５’−モノホスファート（ＺＭＰ）の５−ホルミルアミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＦＡＩＣＡＲ）へのホルミル化を触媒する。プリンヌクレオチド機能には、増殖および自己再生が含まれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの合成、ならびに結果として生じる正常細胞および悪性細胞の両方による細胞分裂および増殖におけるプリンヌクレオチドの重要性のため、プリン生合成経路は、抗がん剤開発のための魅力的な標的と長い間見なされてきた。
【０００３】
葉酸代謝の干渉は、正常に分裂する細胞に対するよりも大きい急速に分裂する細胞への毒性効果を有する。葉酸代謝は、細胞複製および細胞生存に必要であるため、代謝阻害剤である化合物は、毒性および限定された適用を有するにもかかわらず、抗腫瘍療法論として用いられてきた。アミノプテリン、メトトレキサート、ラリトレキセド（ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）（米国内では入手できない）、プララトレキサート、およびペメトレキセドは、葉酸類縁体（抗葉酸剤）の例である。化学療法剤５−フルオロウラシルも、葉酸類縁体とは考えられていないものの、葉酸代謝阻害剤である抗腫瘍療法論である。
【０００４】
それらの主要な作用の機構とは考えられていないものの、メトトレキサートおよびペメトレキセドは、共にＡＩＣＡＲＦＴ阻害活性を示すことが報告されている。さらには、ＡＩＣＡＲＦＴ阻害剤として有用であると報告された化合物は、特許文献１において提供されている。それにもかかわらず、これまで、市販のＡＩＣＡＲＦＴ阻害化学療法剤は、現れていない。
【０００５】
葉酸代謝経路において他の酵素を上回るＡＩＣＡＲＦＴ阻害活性を主として有する化合物を見つける必要がある。一般にはＩＭＰ経路シグナル伝達阻害活性に、および具体的にはＡＩＣＡＲＦＴ阻害活性に寄与し得る化合物を見つける必要がさらにある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０００／１３６８８号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、式ＩのＡＩＣＡＲＦＴ阻害剤化合物：
【化１】
0006379296.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、基：
【化２】
0006379296.tif 000003
（式中Ｘ１およびＸ２のそれぞれは、独立に水素、フルオロ、または−ＣＨ３から選択され、あるいはＸ１およびＸ２のうちの１つは、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２またはモルホリン−４−イルから選択され、もう一方は、水素である）、
【化３】
0006379296.tif 000004
（式中それぞれのｎは、独立に０、１または２から選択され、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、全てが水素ではないという条件、ならびに全てのｎが同時に０ではないという条件、ならびにさらに１つのｎのみが２であってよく、かつ１つのｎが２である場合、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３のそれぞれは、独立にフルオロ、−ＯＨ、または−ＣＦ３から選択されるという条件で、独立に水素、−ＯＨ、フルオロ、−ＮＨ２または−ＣＦ３から選択される）、
【化４】
0006379296.tif 000005
（式中Ｑ１およびＱ２は、独立に水素、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ３から選択される）、
【化５】
0006379296.tif 000006
（式中Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立に水素またはフルオロから選択される）、
【化６】
0006379296.tif 000007
から選択され、
Ｒ２は、水素もしくはフルオロである］、
またはその薬学的に許容可能な塩である。
【０００８】
本発明のさらなる態様は、式Ｉの化合物（式中、
Ｒ１は、基：
【化７】
0006379296.tif 000008
（式中Ｘ１およびＸ２のそれぞれは、独立に水素、フルオロ、または−ＣＨ３から選択され、あるいはＸ１およびＸ２のうちの１つは、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２またはモルホリン−４−イルから選択され、もう一方は、水素である）、
【化８】
0006379296.tif 000009
（式中それぞれのｎは、独立に０、１または２から選択され、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、全てが水素ではないという条件、ならびに全てのｎが同時に０ではないという条件、ならびにさらに１つのｎのみが２であってよく、かつ１つのｎが２である場合、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３のそれぞれは、独立にフルオロ、−ＯＨ、または−ＣＦ３から選択されるという条件で、独立に水素、−ＯＨ、フルオロ、−ＮＨ２または−ＣＦ３から選択される）、
【化９】
0006379296.tif 000010
（式中Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立に水素またはフルオロから選択される）、または
【化１０】
0006379296.tif 000011
から選択され、
Ｒ２は、水素もしくはフルオロである）
またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物（式中、
Ｒ１は、基：
【化１１】
0006379296.tif 000012
（式中Ｘ１およびＸ２のそれぞれは、独立に水素、フルオロ、または−ＣＨ３から選択される）、
【化１２】
0006379296.tif 000013
（式中Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立に水素またはフルオロから選択される）、または
【化１３】
0006379296.tif 000014
から選択され、
Ｒ２は、フルオロである）
またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、化合物：
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−（３，３−ジフルオロ−（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４−ジヒドロピリダジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、あるいは
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（１Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシシクロペンチル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩
である。
【００１１】
本発明の別の態様は、化合物： 
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩
である。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、薬学的に許容可能な担体と共に含む医薬組成物である。
【００１３】
本発明の別の態様は、それを必要とする患者に治療的有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む患者における膠芽腫、子宮頸がん、子宮がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、頭頸部がん、腎臓がん、黒色腫、膵臓がん、肝臓がん、肺がん（中皮腫を含む）、大腸がん、胃がん、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫を含む）、線維芽細胞肉腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ；Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、および単球性白血病を含む）であるがんを治療する方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、それを必要とする患者に治療的有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む患者におけるトリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、肺がん（中皮腫を含む）、大腸がん、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫を含む）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ；Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、および単球性白血病を含む）であるがんを治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の態様は、療法において使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、膠芽腫、子宮頸がん、子宮がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、頭頸部がん、腎臓がん、黒色腫、膵臓がん、肝臓がん、肺がん（中皮腫を含む）、大腸がん、胃がん、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫を含む）、線維芽細胞肉腫、慢性骨髄性白血病、または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ；Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、および単球性白血病を含む）であるがんの治療において使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、肺がん（中皮腫を含む）、大腸がん、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫を含む）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ；Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、および単球性白血病を含む）であるがんの治療において使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、膠芽腫、子宮頸がん、子宮がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、頭頸部がん、腎臓がん、黒色腫、膵臓がん、肝臓がん、肺がん（中皮腫を含む）、大腸がん、胃がん、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫を含む）、線維芽細胞肉腫、慢性骨髄性白血病、または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ；Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、および単球性白血病を含む）であるがんの治療のための薬物の製造のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、肺がん（中皮腫を含む）、大腸がん、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫を含む）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ；Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、および単球性白血病を含む）であるがんの治療のための薬物の製造のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
「患者」と言う語は、哺乳動物を意味し、「哺乳動物」には、これに限らないが、ヒトならびに家猫（イエネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ））、家犬（イエイヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））、および家畜ウマ（ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｆｅｒｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ））を含めたコンパニオン動物が含まれる。
【００２１】
「治療的有効量」は、がん患者におけるＡＩＣＡＲＦＴを阻害するためおよび標的がん細胞を破壊または患者におけるがんの進行を遅くするもしくは止めるために必要な式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、あるいは式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能な塩を含有する医薬組成物の投与量を意味する。式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の予期される投与量は、１００から８００ｍｇ／患者／日の範囲である。好ましい投与量は、１５０から６００ｍｇ／患者／日の範囲であることが予期される。最も好ましい投与量は、２２５から５００ｍｇ／患者／日の範囲であることが予期される。患者を治療するために必要な正確な投与量および治療時間の長さは、疾患のステージおよび重症度ならびに個々の患者の特定のニーズおよび反応を考慮して医師によって決定されるであろう。１日当たりを基準とする投与量として表わされるが、投与計画は、より最適な治療の利益を患者に提供するためおよび患者によるいかなる有害反応も管理または改善するために調節してよい。
【００２２】
「治療」、「治療する」および「治療すること」という語は、症状のうちの１つまたは複数を軽減するため、遅くするため、または逆転させるため、およびがんが実際に除去されない場合でもがんの進行を遅らせるための活性化合物の投与などの、それから患者が苦しんでいるがんに関するあらゆる関与が含まれることを意味する。治療される患者は、哺乳動物、具体的には人間である。
【００２３】
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩は、好ましくは医薬組成物として薬学的に許容可能な担体を用いて製剤され、種々の経路によって投与される。好ましくは、こうした組成物は、経口投与用である。こうした医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは、当技術分野においてよく知られている。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら編、第１９編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９９５年）を参照されたい。特定の実施形態において、医薬組成物は、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、および薬学的に許容可能な担体ならびに場合によっては具体的には一般的にがんの治療または特有のがん型のための他の治療成分を含む。
【００２４】
実施例１などの、本発明の化合物は、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド（ＩＵＰＡＣ）という名で呼ばれ、かつ２−チオフェンスルホンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１，２−ジヒドロ−１−オキソ−７−イソキノリニル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−ピロリジニル］−（ＣＡＳ）という名でも呼ばれ、他の名前を本発明の化合物を明白に特定するために用いてよい。
【００２５】
当業者は、式Ｉの化合物、具体的にはピロリジン−１−イル基の３位および場合によっては４位、場合によってはピペリジン−１−イル基の３、４および５位、シクロペンチル基の３位および場合によっては４位、場合によっては６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル基の５位、シクロペンタ−１−エン−１−イル基の４位、およびシクロヘキサ−１−エン−１−イル基の４位におけるＲ１基およびＲ１基上の置換基は、２つ、またはより多くの立体異性体のラセミ混合物を与える、キラル中心である、またはキラル中心を生じ得ることを理解するであろう。本明細書で使用する場合、置換基に結合したくさび形または斜線から区別されるように、実線の結合線には、既知の範囲までさらに指定しない限り、名前が付けられた化合物を含めて未確定の配置の個々の立体異性体およびラセミ混合物（１種または複数）が含まれる。特有の立体異性体は、鏡像異性的に純粋または濃縮された出発原料を用いて立体特異的合成することにより調製され得る。どちらの出発原料、中間体、または最終生成物の特有の立体異性体も、キラル固定相でのクロマトグラフィー、酵素分割、または分別結晶あるいはジアステレオマー塩などの、その目的のために形成されたジアステレオマーのクロマトグラフィーを含めた、Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｅ．Ｉ．ＥｌｉｅｌおよびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ１９９４）およびＥｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｊ．，Ｊａｃｑｕｅｓ、Ａ．Ｃｏｌｌｅｔ、およびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ（Ｗｉｌｅｙ１９９１）において見られるものなどの、当技術分野においてよく知られている技術によって分解され得る。キラル化合物が、その異性体に単離または分解されるが、絶対配置または旋光が決定されない場合、異性体は、キラルクロマトグラフィーからそれぞれが溶離する順に対応して異性体１および異性体２として任意に指定され、キラルクロマトグラフィーが合成の早期に開始される場合は、同じ指定がその後の中間体および実施例に適用される。
【００２６】
当業者は、式Ｉの化合物が、互変異性平衡において存在し得ることを認めるであろう。例示目的のために、平衡が下に示される。
【化１４】
0006379296.tif 000015
【００２７】
便宜のため、４−オキソ形態が式Ｉにおいて描かれ、対応する命名法が本明細書全体を通して用いられる。しかしながら、こうした描写には、対応する互変異性体のヒドロキシ形態が含まれる。
【００２８】
本発明の化合物の合成における最初の出発原料として用いられる化合物は、良く知られており、市販されていないものについては、当業者によって一般に用いられる標準の手順によって、特有の提供されている参考文献を用いて容易にすぐに合成される、または一般的な参考文書において見つかる。
【００２９】
既知の手順および方法の例には、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ、１９８９年；Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１〜１０巻、１９７４〜２００２年、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５編、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．ＳｍｉｔｈおよびＪｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４編、パートＢ、Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓ  Ａ．ＣａｒｅｙおよびＲｉｃｈａｒｄ  Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２０００年など、およびその中に引用された参考文献などの一般的な参考文書に記載されているものが含まれる。
【００３０】
さらに、以下のスキームに記載されているある種の中間体は、１つまたは複数の保護基を含有し得る。可変の保護基は、特定の反応条件および実行される特定の変換に応じてそれぞれの存在において同一または異なっていてよい。保護および脱保護条件は、当業者に良く知られており、文献に記載されている（例えば「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第４編、Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．ＷｕｔｓおよびＴｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００７年を参照されたい）。
【００３１】
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩は、その一部が下記の調製および実施例において例示される、当技術分野において既知の種々の手順によって調製され得る。記載された経路のそれぞれのための特有の合成ステップは、式Ｉの化合物、またはその塩を調製するために、異なる方法において組み合わせてよく、または異なる手順からのステップと併用してよい。それぞれのステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、ろ過、摩砕、および結晶化を含めた、当技術分野においてよく知られている従来の方法によって回収してよい。さらに、別段の指示がない限り全ての置換基は、前に定義した通りである。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「ＡＣＮ」は、アセトニトリルを指し、「ＡＩＣＡｒ」は、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド１−β−Ｄ−リボフラノシルを指し、「ＡＴＩＣ」は、５−アミノ−４−イミダロレドカルボキサミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ／イノシン５’−モノホスファートシクロヒドララーゼ（５−ａｍｉｎｏ−４−ｉｍｉｄａｌｏｌｅｄｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｙｌａｓｅ／Ｉｎｏｓｉｎｅ  ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｙｃｌｏｈｙｄｒａｌａｓｅ）を指し、「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを指し、「Ｂｕ」は、ブチルを指し、「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを指し、「ＤＩＰＥＡ」は、ジイソプロピルエチルアミンを指し、「ＤＭＡＰ」は、４−ジメチルアミノピリジンを指し、「ＤＭＥＭ」は、ダルベッコ変法イーグル培地を指し、「ＤＭＦ−ＤＭＡ」は、１，１−ジメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−メタンアミンを指し、「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し、「ＤＴＴ」は、ジチオスレイトールを指し、「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を指し、「ｅｅ」は、鏡像体過剰率を指し、「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指し、「Ｅｘ」は、実施例を指し、「Ｆ１２」は、ハムＦ１２培地を指し、「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指し、「ＨＥＰＥＳ」は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を指し、「ＨＯＡｃ」は、酢酸を指し、「ＨＰＢＣＤ」は、ヒドロキシプロピルベータ−シクロデキストリンを指し、「ＩＣ５０」は、その薬剤について可能な最大阻害反応の５０％を発生させる薬剤の濃度を指し、「ＩＭＰ」は、イノシン５’−モノホスファートを指し、「ＩＰＡ」は、イソプロピルアルコールまたはイソプロパノールを指し、「ｍｉｎ」は、分を指し、「ＩＰＴＧ」は、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを指し、「ＭｅＯＨ」は、メタノールまたはメチルアルコールを指し、「ＭＴＢＥ」は、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指し、「Ｎｉ−ＮＴＡ」は、ニッケル−ニトリロ三酢酸を指し、「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝食塩水を指し、「Ｐｒｅｐ」は、調製を指し、「ｐｓｉ」は、ポンド毎平方インチを指し、「ＱＤ」は、１日１回の投薬を指し、「ＲＰＭＩ」は、ロズウェルパーク記念研究所を指し、「Ｒｔ」は、保持時間を指し、「ＳＣＸ」は、強陰イオン交換クロマトグラフィーを指し、「ＳＦＣ」は、超臨界流体クロマトグラフィーを指し、「ＳＥＭ」は、平均の標準誤差を指し、「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を指し、「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指す。
【００３３】
以下の調製および実施例は、本発明をさらに例示する。
【化１５】
0006379296.tif 000016
【００３４】
Ｒ２は、式Ｉについて上記で定義した通りである。スキーム１において例示されるように、イソキノリン−１−オンの合成は、トリホスゲンを用いるフェネチルアミンまたは３−フルオロフェネチルアミンのフリーデル・クラフツ環化および撹拌しながらトリエチルアミンなどの有機塩基の滴加で開始しその後にアルミニウムトリクロリドなどのルイス酸の追加が続いてステップ１の生成物を与える。ステップ２においては、硫酸などの無機酸および硝酸カリウムの一部ずつの追加を用いて、当技術分野においてよく知られている条件下で７位におけるニトロ化が進行する。ステップ３は、６−置換または非置換−７−ニトロ−１，２−ジヒドロイソキノリン−１−オンを与えるための約１２０℃までの加熱と共にジクロロエタン中、約１８当量の、大過剰の二酸化マンガンを用いる酸化を含む。それに続くニトロ基の還元は、当業者に既知の種々の条件下で進行し得る。例えば、約５０ｐｓｉ圧力および約６０℃におけるＭｅＯＨなどの極性非プロトン溶媒におけるパラジウム媒介性の水素化は、６−置換または非置換−７−アミノ−１，２−ジヒドロイソキノリン−１−オンを与える、（ステップ３）。
【００３５】
代替の調製（スキーム１、ステップ４）において、ＤＭＦ−ＤＭＡは、アセトンなどの極性非プロトン溶媒において、約９０〜１００℃に加熱してメチル２−メチル−５−ニトロ−ベンゾアートと反応してステップ４の生成物としてメチル２−［２−ジメチルアミノ）ビニル］−５−ニトロ−ベンゾアートを与える。ステップ５において、この中間体は、約９０〜１００℃に加熱しながらトルエンなどの非極性溶媒において２，４−ジメトキシベンジルアミンを用いて環化され、７−アミノ−（６−置換または非置換−２−（２，４−ジメトキシベンジル）イソキノリン−１（２Ｈ）−オンを与える。ニトロ基は、ステップ３において上記で述べた通りに還元されてよくまたは代わりに、約１：１のＭｅＯＨおよびアンモニウムクロリドを含む水の溶液において亜鉛粉末を加えることおよび約４０〜８０℃に加熱することによって７−アミノ−２−（２，４−ジメトキシベンジル）−（６−フルオロまたは非置換）−イソキノリン−１−オンを提供する。２，４−ジメトキシベンジル保護基の除去は、約８０〜９５℃に加熱しながら水中のＴＦＡまたはＨＢｒを用いるなどの当技術分野においてよく知られている条件を用いて合成におけるステップ６またはそれ以降のステップに示されるように完了してよい。
【化１６】
0006379296.tif 000017
【００３６】
スキーム２は、Ｒ１が、式Ｉについて定義された通りである場合に式Ｉのスルホンアミド化合物を与えるための５−置換チオフェン−２−スルホニルクロリドの調製および保護または非保護イソキノリン−１（２Ｈ）−オンとのカップリングを例示する。必須の中間体スルホニルクロリドを生成するために必要なため、２−置換５−ブロモチオフェンは、−７８℃でＴＨＦなどの極性非プロトン溶媒中でブチルリチウムで処理し次いで硫黄ジオキシドおよびスルフリルクロリドで処理してよい（ステップ１）。この中間体は、ステップ２からの式Ｉの化合物を与えるためにＤＣＭなどの溶媒およびピリジンなどの有機塩基中の７−アミノ−２Ｈ−イソキオンリン−１−オンに加えてよい。保護イソキノリン−１（２Ｈ）−オンが用いられる場合、保護基は、ＴＦＡなどの酸で除去してよい。他の選択肢は、クロロスルホン酸またはクロロスルホン酸および五塩化リンで２−置換チオフェンから、（ステップ４）、および１，３−ジクロロ−５，５−ジメチルヒダントインで保護５−スルファニル−２−置換チオフェンから（ステップ３）ステップ１の生成物を調整することを含む。
【化１７】
0006379296.tif 000018
【００３７】
スキーム３に示されるような代替の調製において、５−ハロ−置換チオフェン−２−スルホニルクロリドの保護または非保護イソキノリン−１（２Ｈ）−オンとのカップリングは、有用なスルホンアミド中間体を提供する。これは、ステップ１のスルホンアミド中間生成物を与えるために０℃から室温においてＤＣＭなどの溶媒を伴うまたは伴わない、ピリジンなどの有機塩基の存在下でアミンの５−ハロ−チオフェン−２−スルホニルクロリドとの反応によってもたらされる。ステップ１の中間生成物は、ＴＦＡなどで、任意の保護基が除去されているものとしても例示される。ステップ１からの中間生成物は、適切なボロン酸で鈴木−宮浦クロスカップリング条件下でさらにアルキル化してよい。当業者は、こうしたクロスカップリング反応を促進するために有用な種々の条件があることを認めるであろう。したがって、適したパラジウム試薬には、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド、トリス（ジベンジリデンアセトン）二パラジウム（０）と共にトリシクロヘキシルホスフィン、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド、パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン、またはパラジウム（ＩＩ）アセタートが含まれる。適した塩基には、セシウムカルボナート、ナトリウムカルボナート、カリウムカルボナート、または三塩基性リン酸カリウム一水和物が含まれる。反応は、ジオキサンなどの非極性溶媒中で約１００〜１５０℃の温度に加熱してよい。
【００３８】
あるいは、ステップ１の５−ブロモ−チオフェン生成物の銅媒介性のアミノ化は、ステップ２における式Ｉの化合物を与えるために、ＤＭＳＯなどの極性非プロトン溶媒中の銅ブロミド（Ｉ）、有機塩基、ヒドロキシプロリン、適切なアミン、およびセシウムカルボナートまたはカリウムカルボナートなどの無機塩基を用いて、約１００℃に加熱して達成され得る。さらなるカップリング例は、式Ｉの化合物を与えるためにピリジンおよび／またはＤＩＰＥＡなどの有機塩基、適切なアミンを用いて、約１００℃に加熱して、ハロ（Ｈａｌ）がフッ素である、ステップ１からの中間体のＳｎＡｒ反応によって達成され得る。どちらの場合にも、ＷがＰＧである場合、保護基は、ＴＦＡなどの酸で除去される。
【００３９】
任意のステップにおいて、式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な塩は、標準条件下で適した溶媒における式Ｉの化合物の適切な薬学的に許容可能な塩基との反応によって形成され得る。こうした塩の形成は、当技術分野において良く知られ、理解されている。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．、「Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１〜２１７（１９８６年）；Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．ら、「Ｓａｌｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、４：４２７〜４３５（２０００年）；およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６：１〜１９、（１９７７年）を参照されたい。式Ｉの化合物は、容易に変換され、ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはマグネシウム塩などの、薬学的に許容可能な塩として単離され得ることを当業者なら理解するであろう。
【実施例】
【００４０】
調製および実施例
以下の調製および実施例は、本発明をさらに例示する。
【００４１】
調製１
メチル２−［（Ｅ）−２−（ジメチルアミノ）ビニル］−５−ニトロ−ベンゾアート
【化１８】
0006379296.tif 000019
メチル２−メチル−５−ニトロ−ベンゾアート（１．７９Ｋｇ、９．１７ｍｏｌ）を、アセトン（１６Ｌ）に加える。ＤＭＦ−ＤＭＡ（１．８３Ｋｇ、１５．４ｍｏｌ）を加える。得られる混合物を、９５〜１００℃で１６時間撹拌する。２０〜２５℃に冷却し混合物を撹拌しながら水（４８Ｌ）に注いでスラリーを形成する。固体をろ過してケークを水で洗う。固体を水（２×１６Ｌ）でスラリー化して固体をろ過する。固体を空気中で２日間乾燥させて粗製標記化合物を赤色固体として与える（２．４２Ｋｇ、１０５％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２，２．８Ｈｚ），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ），３．９２（３Ｈ，ｓ），３．０２（６Ｈ，ｓ）。
【００４２】
調製２
２−（２，４−ジメトキシベンジル）−７−ニトロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン
【化１９】
0006379296.tif 000020
メチル２−［（Ｅ）−２−（ジメチルアミノ）ビニル］−５−ニトロ−ベンゾアート（２．４Ｋｇ粗製、９．６５ｍｏｌ）、２，４−ジメトキシベンジルアミン（２．１４Ｋｇ、１２．８ｍｏｌ）およびトルエン（３０Ｌ）を加える。混合物を９５〜１００℃に加熱してその温度で１６時間撹拌する。２０〜２５℃に冷却して沈殿した固体をろ過によって収集する。黄色固体を空気中で２日間乾燥して粗製生成物（２．１７Ｋｇ、６６％）を与えこれをさらなる精製をせずに用いる。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３４１．１（Ｍ＋Ｈ）。
【００４３】
調製３
７−アミノ−２−（２，４−ジメトキシベンジル）イソキノリン−１（２Ｈ）−オン
【化２０】
0006379296.tif 000021
ＭｅＯＨ（１０Ｌ）、水（１０Ｌ）、およびアンモニウムクロリド（１．５６Ｋｇ、２９．２ｍｏｌ）を加える。２−（２，４−ジメトキシベンジル）−７−ニトロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（２Ｋｇ、５．８４ｍｏｌ）を加える。得られる混合物を４０℃に加熱する。次いで、亜鉛粉末（１．５３Ｋｇ、２３．３７ｍｏｌ）を４０℃で混合物に加える。熱を除去する。内部温度は７０℃までゆっくり上昇する。反応を８０℃に加熱してその温度で１６時間撹拌する。反応混合物を１５〜２０℃に冷却する。混合物をろ過してケークをＥｔＯＡｃ（１Ｌ×２）で洗う。ろ液に水（１５Ｌ）を加えてＥｔＯＡｃ（５Ｌ×３）で抽出する。組み合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過して、濃縮乾固する。結果として生じる残留物をＭＴＢＥ／ＭｅＯＨで処理して標記化合物（９４２ｇ、５３％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１１．１（Ｍ＋Ｈ）。
【００４４】
調製４
７−アミノイソキノリン−１（２Ｈ）−オン
【化２１】
0006379296.tif 000022
７−アミノ−２−（２，４−ジメトキシベンジル）イソキノリン−１（２Ｈ）−オン（８４９ｇ、２．７４ｍｏｌ）およびＴＦＡ（５Ｌ）を一緒に加えて褐色混合物を形成する。混合物を８０〜８５℃に加熱してその温度で２時間撹拌する。固体が徐々に溶解して混合物が暗紫色に変わる。反応混合物を２０〜２５℃に冷却する。ＴＦＡの大部分を減圧下で除去する。ＭｅＯＨ（５Ｌ）を加えて４０〜５０℃で３０分間撹拌する。混合物をろ過してろ液を濃縮乾固する。残留物をＥｔＯＡｃ（５Ｌ）および水（５Ｌ）に溶解する。水相をＥｔＯＡｃ（５Ｌ）で抽出する。水相を５５〜６０℃に加熱して活性炭（９０ｇ）を加える。混合物をその温度で１時間撹拌する。混合物を珪藻土を通してろ過して水ですすぐ。ろ液を３５℃まで自然に冷却して３５〜４０℃で固体Ｎａ２ＣＯ３（１５３ｇ）でｐＨ＝７〜８に中和する。混合物を５〜１０℃に冷却して１６時間撹拌する。沈殿した固体をろ過によって収集し、冷水およびＭＴＢＥで洗い、開放空気中で乾燥して標記化合物（２６０ｇ、５９％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６１．１（Ｍ＋Ｈ）。
【００４５】
代替の調製４
７−アミノ−２−（２，４−ジメトキシベンジル）イソキノリン−１（２Ｈ）−オン（２．１Ｋｇ、３．７２ｍｏｌ）をＨＢｒ溶液（２１Ｌ、Ｈ２Ｏ中４０％）に加える。得られる混合物を９５℃に加熱してその温度で１８時間撹拌する。反応を２０〜２５℃に冷却する。反応をろ過して不溶性の物質を除去する。ろ液をＣＨＣｌ３／ＩＰＡ（１０／１、２×１１Ｌ）で抽出する。有機相を分離する。水性懸濁液固体沈殿物をろ過する。ケークをＣＨＣｌ３／ＩＰＡ（１０／１、１１Ｌ）およびＨＢｒ溶液（１Ｌ、Ｈ２Ｏ中４０％）に加える。混合物を、８０℃で２時間撹拌する。混合物をろ過して粗製固体を与える。粗製固体を水（１Ｌ）に加えて１０Ｍ  ＮａＯＨ溶液でｐＨを７〜８に調節する。固体をろ過し炉内で４０℃で２４時間乾燥して標記化合物を褐色固体（４７５ｇ、４４％）として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６１．１（Ｍ＋Ｈ）。
【００４６】
調製５
６−フルオロ−３，４−ジヒドロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン
【化２２】
0006379296.tif 000023
ＤＣＭ（２Ｌ）中の２−（３−フルオロフェニル）エタンアミン（１Ｋｇ、７．１８ｍｏｌ）の溶液を、氷浴中のＤＣＭ（５Ｌ）中のトリホスゲン（８５２．４ｇ、２．８７ｍｏｌ）の溶液に加える。次いで、トリエチルアミン（２Ｌ、１４．３６ｍｏｌ）を滴加する。得られる溶液を２時間撹拌し珪藻土を通してろ過してＤＣＭで洗う。ろ液を、０℃でＤＣＭ（６Ｌ）中のＡｌＣｌ３（３．８２Ｋｇ、２８．７２ｍｏｌ）の懸濁液に加える。得られる溶液を室温に温めて１８時間撹拌する。水および次いで１０％ＨＣｌの追加によって反応をクエンチする。相分離によって有機層を収集し水層をＤＣＭで抽出する。組み合わせたＤＣＭ層を、ナトリウムビカルボナート溶液および塩水溶液で洗い、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して真空で濃縮し、石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝２：１で溶離するシリカゲル上で精製して標記化合物を与える（４７４．７３ｇ、４０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＣＤＣｌ３）δ８．０５−８．０９（ｍ，１Ｈ），７．０２−７．０４（ｍ，１），６．９０−６．９２（ｍ，１Ｈ），６．７７（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），３．５５−３．５９（ｍ，２Ｈ），２．９７−３．００（ｔ，２Ｈ）。
【００４７】
調製６
６−フルオロ−７−ニトロ−３，４−ジヒドロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン
【化２３】
0006379296.tif 000024
Ｈ２ＳＯ４（１０Ｌ）中の６−フルオロ−３，４−ジヒドロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（１Ｋｇ、６．０６ｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却してＫＮＯ３（６４３ｇ、６．３６ｍｏｌ）を一部ずつ加える。得られる混合物を氷浴中で２時間撹拌する。混合物を氷水中に注いで固体をろ過する。固体を水で洗い５０℃で真空で一晩乾燥して標記化合物を与える（１．１８Ｋｇ、９３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ）δ８．４３−８．４５（ｄ，１Ｈ），８．２６（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），７．５９−７．６２（ｄ，１Ｈ），３．３９−３．４３（ｍ，２Ｈ），３．０１−３．０４（ｍ，２Ｈ）。
【００４８】
調製７
６−フルオロ−７−ニトロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン
【化２４】
0006379296.tif 000025
ＭｎＯ２（４．１３６Ｋｇ、４７．６０ｍｏｌ）を、クロロエタン（１０Ｌ）中の６−フルオロ−７−ニトロ−３，４−ジヒドロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（１Ｋｇ、４．７６ｍｏｌ）の溶液に加えて混合物を１２０℃に５時間加熱する。ＭｎＯ２（２．０６８Ｋｇ、２３．８ｍｏｌ）を加えて混合物を一晩撹拌する。さらにＭｎＯ２（１．２４１Ｋｇ、１４．２８ｍｏｌ）を加えて反応を一晩撹拌する。混合物を約８０℃に冷却し、珪藻土上でろ過して、ＤＭＳＯ（５×）ですすぐ。ろ液を濃縮してジクロロエタンを除去しＤＭＳＯ溶液を水中に注ぐ。沈殿した黄色固体をろ過し、水で洗い、乾燥して標記化合物を得る（４４６ｇ、４５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＭｅＯＤ）δ８．９８−９．００（ｄ，１Ｈ），７．６２−７．６５（ｄ，１Ｈ），７．３８−７．４０（ｄ，１Ｈ），６．６８−６．７０（ｄ，１Ｈ）。
【００４９】
調製８
７−アミノ−６−フルオロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン
【化２５】
0006379296.tif 000026
容器に注意深く湿らせたＭｅＯＨ（１．５Ｌ）中の１０％パラジウム炭素（２０ｇ、０．１８ｍｏｌ）および６−フルオロ−７−ニトロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（１００ｇ、０．４８ｍｏｌ）の混合物を加える。容器を密封してＨ２で３回パージする。得られる混合物を、６０℃で５０ｐｓｉのＨ２下で２．５時間撹拌する。混合物をろ過し、ＭｅＯＨで繰り返しすすいで、濃縮乾固する。残留物をＭＴＢＥ中に懸濁させ、ろ過し、ＭＴＢＥですすぎ、乾燥して標記化合物（８１．２ｇ、９５％）を褐色固体として与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１０．８８（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），７．４９−７．５１（ｄ，１Ｈ），７．２５−７．２９（ｄ，１Ｈ），６．８５−６．８８（ｍ，１Ｈ），６．３２−６．３４（ｄ，１Ｈ），５．５２（ｂｒ，ｓ，２Ｈ）。
【００５０】
調製９
５−ブロモ−Ｎ−［２−（２，４−ジメトキシベンジル）−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル］チオフェン−２−スルホンアミド
【化２６】
0006379296.tif 000027
ピリジン（７８．２ｍＬ、９６６ｍｍｏｌ）および５−ブロモチオフェン−２−スルホニルクロリド（６９．５３ｇ、２６６ｍｍｏｌ）を、０℃でＤＣＭ（７５０ｍＬ）中の７−アミノ−２−（２，４−ジメトキシベンジル）イソキノリン−１（２Ｈ）−オン（７５ｇ、２４１．６ｍｍｏｌ）の溶液に加える。得られる溶液を室温で２時間撹拌する。水（５００ｍＬ）を加えて暗色固体を沈殿させる。混合物をろ過して固体を水（３×３００ｍＬ）およびＭＴＢＥで洗い、真空下で乾燥して標記化合物を与える（９１ｇ、７０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）５３５／５３７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００５１】
調製１０
５−ブロモ−Ｎ−（１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化２７】
0006379296.tif 000028
ＴＦＡ（１００ｍＬ）中の５−ブロモ−Ｎ−［２−（２，４−ジメトキシベンジル）−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル］チオフェン−２−スルホンアミド（５０ｇ、９３．３８ｍｍｏｌ）の溶液を、８０℃に３時間加熱する。室温に温まらせる。残留物をＴＨＦ（６０ｍＬ）に溶解してアンモニア（６０ｍＬ）を注意深く加える。得られる混合物を室温で一晩撹拌する。懸濁液中の固体をろ過し、ＥｔＯＡｃで洗い、乾燥して、収集する。ろ液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で洗い２つの相を分離する。水相を９：１混合物ＣＨＣｌ３／ＩＰＡ（４×２５０ｍＬ）で抽出して有機抽出物を組み合わせ、乾燥して蒸発乾固する。９：１ＭＴＢＥ／ＩＰＡ混合物中の残留物を、淡褐色固体が沈殿するまで摩砕する。固体をろ過し、ＭＴＢＥで洗い、乾燥して固体を収集する。ろ液を濃縮しシリカゲルカラム（１：１ＡＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２）において精製して追加の生成物を得る。ＡＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２の１：１混合物において３つの固体を摩砕する。組み合わせた固体をろ過し、ＩＰＡで洗い、乾燥し、固体を収集して標記化合物（２４．５ｇ、６８％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３８５／３８７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００５２】
代替の調製１０
７−アミノイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（１５．１ｇ、９４．２７ｍｍｏｌ）、５−ブロモチオフェン−２−スルホニルクロリド（２６．２ｇ、９７．１０ｍｍｏｌ）およびピリジン（４５．７ｍＬ、５６５．６３ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（５００ｍＬ）に加える。得られる混合物を、窒素下で室温で３０分間撹拌する。混合物を水で希釈して５Ｎ  ＨＣｌで約４のｐＨに酸性化する。１０分間撹拌する。得られる沈殿物をろ過し、水、エーテルですすいで固体を乾燥する。沈殿物をＭｅＯＨ中に懸濁させＮＨ３／ＥｔＯＨを加えてそれを溶解する。溶液を活性炭と共に撹拌し、珪藻土上でろ過して、ろ液を蒸発させる。得られる固体をアセトン中に懸濁させ、ろ過し、固体を乾燥して標記化合物（２４ｇ、６６％）を淡黄色固体として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３８５／３８７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００５３】
調製１１
５−ブロモ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化２８】
0006379296.tif 000029
５−ブロモチオフェンスルホニルクロリド（５４．４８ｇ、２０２．０６ｍｍｏｌ）を、ピリジン（２１０ｍＬ）中の７−アミノ−６−フルオロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン（３０ｇ、１６８ｍｍｏｌ）の溶液に小分けに加える。得られる混合物を、窒素下で室温で２時間撹拌する。混合物をＤＣＭ（１２０ｍＬ）および水（２１０ｍＬ）で希釈する。混合物を濃ＨＣｌで約６のｐＨまで酸性化する。沈殿した固体をろ過し、水（２×）、１Ｎ  ＨＣｌ、水（３×）、およびＭＴＢＥで洗い、乾燥し固体を収集して標記化合物（５３．６ｇ、７９％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）４０３／４０５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００５４】
下記の化合物を、実質的には適切なスルホニルクロリドを用いる調製１１の方法、反応を０℃に冷却することおよびＮａＯＨ（１Ｎ）で洗うことによって仕上げること（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｕｐ）およびＥｔＯＡｃで抽出することその後に続く酸性化および調製１１におけるような仕上げによって調製する。
【表１】
0006379296.tif 000030
【００５５】
調製１３
５−アセチル−Ｎ−（１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化２９】
0006379296.tif 000031
５−ブロモ−Ｎ−（１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（０．５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解して得られる混合物をドライアイス／アセトン浴において窒素下で冷却する。ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、２．９ｍＬ、４．６４ｍｍｏｌ）をゆっくり加え冷却しながら約４０分間撹拌してその結果懸濁液が形成する。次いでＴＨＦ（２ｍＬ、２４．６ｍｍｏｌ）中のＮ−メトキシ−Ｎ−メチル−アセトアミド（０．１７ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）を加えて混合物を０℃に温まらせる。反応混合物を氷／水でクエンチし、ｐＨを約５に調節して、混合物をＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を組み合わせ減圧下で濃縮して残留物を与える。残留物を、０〜１０％ＭｅＯＨ−ＮＨ３／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、５０％純度の標記化合物（０．５２ｇ、１１５％）を与えてこれをさらなる精製をせずに用いる。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３４７（Ｍ−Ｈ）。
【００５６】
調製１４
ラセミトランスベンジル−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボキシラート
【化３０】
0006379296.tif 000032
ラセミトランス−４−メトキシピロリジン−３−オール、ヒドロクロリド（１．０２ｇ、６．６４ｍｍｏｌ）を、ナトリウムカルボナート（１．５ｇ、１４．１５ｍｍｏｌ）ならびにＴＨＦ（２０ｍＬ、２４５．８ｍｍｏｌ）および水（２０ｍＬ、１．１１ｍｍｏｌ）の混合物と組み合わせて混合物を氷浴中で冷却する。ベンジルクロロホルマート（１．３ｍＬ、８．８１ｍｍｏｌ）を加えて混合物を室温に温めながら窒素下で撹拌する。完了時に、反応を水で希釈して水性混合物をＥｔＯＡｃで抽出する。組み合わせた抽出物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し減圧下で濃縮して残留物を与える。残留物を、０〜５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して標記化合物（１．６８ｇ、１００％）を濃厚な油として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５２（Ｍ＋Ｈ）。
【００５７】
調製１５
ラセミシスベンジル−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボキシラート
【化３１】
0006379296.tif 000033
ラセミシスベンジル−３−メトキシ−４−（４−ニトロベンゾイル）オキシ−ピロリジン−１−カルボキシラート（１．８０ｇ、４．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ、２４５．８ｍｍｏｌ）に溶解し、アンモニア／ＭｅＯＨ（２Ｍ、５０ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を加えて混合物を室温で６時間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮して残留物を与える。残留物を、０〜１０％ＴＨＦ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して標記化合物（０．９４５ｇ、８４％）を濃厚な油として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５２（Ｍ＋Ｈ）。
【００５８】
調製１６
シス−４−メトキシピロリジン−３−オール
【化３２】
0006379296.tif 000034
ラセミシスベンジル−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−ピロリジン−１−カルボキシラート（０．９３ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中のパラジウム黒（０．０２３ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）および５％パラジウム炭素（０．１０５ｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）の混合物と組み合わせて水素下（３４５ｋＰａ）で室温で４時間撹拌する。反応混合物を珪藻土を通してろ過してエタノールで洗う。ろ液を減圧下で濃縮して標記化合物（０．４９３ｇ、１１３％）を濃厚な油として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１１８（Ｍ＋Ｈ）
【００５９】
調製１７
シス［４−［（１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−フルオロ−ピロリジン−３−イル］オキシカルボニルフェニル］アジナート
【化３３】
0006379296.tif 000035
ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（９．６６ｍＬ、４８．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ，４Ｒ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−カルボキシラート（５．０ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）、４−ニトロ安息香酸（８．１４ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１２．８ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）の冷却した氷浴（０℃）溶液に加えて２時間撹拌する。反応を室温に温まらせて１８時間撹拌する。ナトリウムビカルボナート溶液を加えて反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥する。ろ過し減圧下で濃縮して油を与える。２５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶離する、順相シリカゲルクロマトグラフィーによって油を精製して白色固体を与え不純物は持ち越す（１０．７グラム、１２４％）。ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｅ  ２９９［Ｍ＋１］＋−ｔ−ブチル。キラル反応物で開始したが、キラル純度は、この調製または次の調製あるいは調製１７の化合物を用いる実施例を通して維持されなかった。
【００６０】
以下の化合物を、実質的にラセミトランスベンジル−３−ヒドロキシル−４−メトキシ−ピロオリジン−１−カルボキシラートを用いる調製１７の方法によって調製する。
【表２】
0006379296.tif 000036
【００６１】
調製１９
シスｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−カルボキシラート
【化３４】
0006379296.tif 000037
ナトリウムヒドロキシド（２Ｎ、６０ｍＬ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の［４−［（３Ｓ，４Ｒ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−フルオロ−ピロリジン−３−イル］オキシカルボニルフェニル］アジナート（１０．７グラム、３０．２ｍｍｏｌ）の冷却した氷浴（０℃）溶液に加える。０℃で２時間撹拌する。減圧下で油に濃縮する。５０％ＭＴＢＥ−ヘキサン（検出２２１４ｎｍ）で溶離する、順相シリカゲルクロマトグラフィーによって油を精製して透明油を与える（２．７２ｇ、４３．９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３９９．８１ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ５．３７（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），４．９５−４．８１（ｍ，１Ｈ），４．２０−４．１８（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．４１（ｍ，３Ｈ），２．９９−２．９１（ｍ，１Ｈ），１．３５（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，９Ｈ）。キラル反応物で開始したが、キラル純度は、この調製または次の調製あるいは調製１９の化合物を用いる実施例を通して維持されなかった。
【００６２】
調製２０
シス，メソ−ｔｅｒｔ−ブチル３，４−ジヒドロキシピロリジン−１−カルボキシラート
【化３５】
0006379296.tif 000038
Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（１．９８グラム、１４．２ｍｍｏｌ）を、アセトン（５０ｍＬ）、および水（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２，５−ジヒドロピロール−１−カルボキシラート（２．０グラム、１１．８ｍｍｏｌ）、オスミウムテトラオキシド（０．０４Ｍ、５．９３ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）の溶液に加える。室温で１８時間撹拌する。反応を減圧下で濃縮して水相をＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を減圧下で濃縮する。８０％（５％ＭｅＯＨ−ＴＨＦ）−２０％ヘキサンで溶離する、順相クロマトグラフィーによって油を精製して標記化合物（０．５１グラム、２１．２％）を与える。ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｅ  ２０２［Ｍ−Ｈ］−
【００６３】
調製２１
３−（５−ブロモ−２−チエニル）シクロペンタノン
【化３６】
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２．５Ｍのブチルリチウム（１２．２ｍＬ、１７．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ中の２，５−ジブロモチオフェン（２ｍＬ、９７．３ｍｍｏｌ）の冷却した（−７８℃）溶液に加えて温度を−７０℃に維持する。反応を−６０℃に温まらせ次いで冷却して−７８℃に戻す。亜鉛ブロミド（４．９８ｇ、２２．１２ｍｍｏｌ）を固体として加える。反応を−１０℃に温め次いで−７８℃に冷却する。滴下で、２−シクロペンテン−１−オン（１．８５ｍＬ、２２．１２ｍｍｏｌ）を加えて−７８℃で５分間撹拌し、次いで滴下で、クロロトリメチルシラン（２．９３ｍＬ、２３．０ｍｍｏｌ）を加える。反応を室温に温まらせて１８時間撹拌する。１Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）を加えて反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出して、硫酸マグネシウム上で乾燥する。ろ過し減圧下で濃縮して赤色油を与える。３０％ＴＨＦ−ヘキサンで溶離する、順相クロマトグラフィーによって油を精製して透明油（２．９０グラム、１１．８２ｍｍｏｌ、６６．８％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（３９９．８１ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ７．０４（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄｄ，Ｊ＝１．０，３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．６２−３．５９（ｍ，１Ｈ），２．６０−２．５５（ｍ，１Ｈ），２．３５−２．３２（ｍ，４Ｈ），１．９３−１．８５（ｍ，１Ｈ）。
【００６４】
以下の化合物を、実質的に２−シクロペンテン−１−オン（２−ｃｌｙｃｌｏｐｅｔｅｎ−１−ｏｎｅ）（調製２５）の代わりに（２−オキソシクロペンタ−３−エン−１−イル）アセタートを用いて調製２１の方法によって調製する。
【表３】
0006379296.tif 000040
【００６５】
調製２３
３−（５−ブロモ−２−チエニル）シクロペンタノール
【化３７】
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ナトリウムボロヒドリド（０．２５４ｇ、６．７３ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（２０ｍＬ）中の３−（５−ブロモ−２−チエニル）シクロペンタノン（０．５５ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）の懸濁液に加える。滴下で、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加えて、１時間撹拌する。滴下で、ＭｅＯＨ（約２０ｍＬ）を加えて、反応をクエンチする。反応を減圧下で濃縮する。３５％ＴＨＦ−ヘキサンで溶離する、順相シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して透明油（０．３２５グラム、５８．６％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（３９９．８１ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ６．９８−６．９６（ｍ，１Ｈ），６．６８（ｔｄ，Ｊ＝３．６，０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６２（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，０．７Ｈ），４．５５−４．５４（ｍ，０．３Ｈ），４．２３−４．１９（ｍ，０．３Ｈ），４．１７−４．１０（ｍ，０．７Ｈ），３．４７−３．４３（ｍ，０．３Ｈ），３．２１−３．１３（ｍ，０．７Ｈ），２．３２−２．２７（ｍ，０．７Ｈ），２．１５−２．１２（ｍ，０．３Ｈ），１．９９−１．９３（ｍ，１．３Ｈ），１．７５−１．６９（ｍ，３．９Ｈ）。
【００６６】
調製２４
２−（３−ベンジルオキシシクロペンチル）−５−ブロモ−チオフェン
【化３８】
0006379296.tif 000042
ベンジルブロミド（１．２２ｍＬ、１０．２ｍｍｏｌ）およびナトリウムヨージド（０．２５ｇ、１．７０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の３−（５−ブロモ−２−チエニル）シクロペンタノール（２．１ｇ、８．５ｍｍｏｌ）の溶液に加える。反応を０℃に冷却する。５分後、ナトリウムヒドリド（６０％、０．４１グラム、１０．２ｍｍｏｌ）を反応に加えて室温に温める。ＤＭＦを加えて可溶性を補助する。５０℃に１時間加熱し、飽和アンモニアクロリドを加えて反応をクエンチしＥｔＯＡｃで抽出して硫酸マグネシウム上で乾燥する。ろ過し減圧下で濃縮して油を与える。２５％ＴＨＦ−ヘキサンで溶離する、順相シリカゲルクロマトグラフィーによって油を精製して鮮やかな黄色油（１．３ｇ、４５．４％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（３９９．８１ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ７．３３−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．９９−６．９７（ｍ，１Ｈ），６．７２−６．６９（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，２Ｈ），４．０９−４．０５（ｍ，１Ｈ），３．４５−３．３７（ｍ，０．３Ｈ），３．２５−３．１８（ｍ，０．７Ｈ），２．４２−２．３７（ｍ，０．７Ｈ），２．２０−１．７８（ｍ，５．３Ｈ）。
【００６７】
調製２５
（２−オキソシクロペンタ−３−エン−１−イル）アセタート
【化３９】
0006379296.tif 000043
四酢酸鉛（１１．７ｇ、２６．４ｍｍｏｌ）を、密閉した容器内の、ベンゼン（１００ｍＬ）中の２−シクロペンテン−１−オン（２ｍＬ、２３．９ｍｍｏｌ）の溶液に加える。８０℃に７２時間加熱する。室温に冷却し、シリカゲルのパッド上でろ過して、ＤＣＭで洗う。減圧下で濃縮して褐色油を与える。ヘキサンから２５％ＴＨＦ−ヘキサンで溶離する、シリカゲルクロマトグラフィーによって油を精製して透明油（１．４２ｇ、４２．３％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（３９９．８０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６５（ｄｄｄ，Ｊ＝６．１，３．０，２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．２５（ｄｔ，Ｊ＝６．１，２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．１１（ｄｄ，Ｊ＝３．１，６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．１９−３．１６（ｍ，１Ｈ），２．６３−２．５７（ｍ，１Ｈ），２．１３（ｄ，Ｊ＝０．５Ｈｚ，３Ｈ）。
【００６８】
調製２６
［４−（５−ブロモ−２−チエニル）−２，２−ジフルオロ−シクロペンチル］アセタート
【化４０】
0006379296.tif 000044
ビス（２−メトキシエチル）アミノサルファートリフルオリド（２．６ｍＬ、１１．７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の［４−（５−ブロモ−２−チエニル）−２−オキソ−シクロペンチル］アセタート（１．１８ｇ、３．８９ｍｍｏｌ）の溶液に加える。室温で１８時間撹拌する。ナトリウムビカルボナート溶液を加えて反応をクエンチし、１５分間撹拌しながら反応が気体を放出し次いでＤＣＭで抽出して硫酸マグネシウム上で乾燥する。ろ過し減圧下で濃縮して褐色油を与える。２０％ＴＨＦ−ヘキサンで溶離する、シリカゲルクロマトグラフィーによって油を精製して透明油（０．７７ｇ、６０．８％）を与える。ＧＣ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３２４／３２６［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００６９】
調製２７
２−（４−ベンジルオキシ−３，３−ジフルオロ−シクロペンチル）−５−ブロモ−チオフェン
【化４１】
0006379296.tif 000045
カリウムカルボナート（０．８５ｇ、６．１５ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中の［４−（５−ブロモ−２−チエニル）−２−オキソ−シクロヘキシル］アセタート（１．０ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）の溶液に加えて室温で約１２時間撹拌する。溶媒を除去し残留物を真空下で乾燥する。ベンジルブロミド（０．４ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の残留物の溶液に加えて反応を室温で１８時間撹拌する。反応をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和アンモニウムクロリド溶液を加えて反応をクエンチし、水相をＤＣＭで逆抽出して組み合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥する。ろ過し減圧下で濃縮して褐色油を与える。２０％ＴＨＦ−ヘキサンで溶離する、シリカゲルクロマトグラフィーによって油を精製して透明油（１．０ｇ、８７．１％）を与える。ＧＣ／ＭＳ  ｍ／ｅ（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）３７２／３７４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００７０】
調製２８
５−（４−ベンジルオキシ−３，３−ジフルオロ−シクロペンチル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化４２】
0006379296.tif 000046
注射器ポンプによって２．５Ｍブチルリチウム（２．５ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（７５ｍＬ）中の２−（４−ベンジルオキシ−３，３−ジフルオロ−シクロペンチル）５−ブロモチオフェン（２．１ｇ、５．６３ｍｍｏｌ）の冷却した（−７８℃）溶液に加えて少なくとも−７０℃の温度を維持する。−７８℃で１時間撹拌して新しく調製した（−７８℃でスパージ管によって気体において泡立ちすることによって調製した）−７８℃のＴＨＦ（５０ｍＬ）中の硫黄ジオキシドの飽和溶液にカニューレによって加えて少なくとも−７０℃の温度を維持する。反応を１時間−７８℃で撹拌し次いで滴下で、スルフリルクロリド（１．４ｍＬ、１６．９ｍｍｏｌ）を加える。反応を室温に温まらせて１８時間撹拌する。反応を２Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）でクエンチし、固体ナトリウムクロリドを加えて溶液を飽和させＭＴＢＥで抽出する。有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥する。ろ過し減圧下で濃縮して濃厚な褐色油を与えこれをＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解する。滴下漏斗によって、褐色溶液を、０℃に冷却したＤＣＭ（２０ｍＬ）およびピリジン（５０ｍＬ）中の７−アミノ−６−フルオロイソキノリン−１−（２Ｈ）−オン（１．０ｇ、５．６３ｍｍｏｌ）の溶液に加える。反応を室温で３６時間撹拌する。減圧下で濃縮して油を与える。９０％（１０％ＭｅＯＨ−ＥｔＯＡｃ）−１０％ヘキサンで溶離する、シリカゲルクロマトグラフィーによって油を精製して橙色固体（１．４９ｇ、４９．５％）を与える。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５３５（Ｍ＋Ｈ）。
【００７１】
調製２９
ラセミ−４，４−ジフルオロピペリジン−３−オール
【化４３】
0006379296.tif 000047
ラセミ−４，４−ジフルオロピペリジン−３−オールの調製については、Ｓｙｎｌｅｔｔ２００９、Ｎｏ．１２、１９３３〜１９３６およびその中の参考文献を参照されたい。
【００７２】
調製３０
ラセミ，トランス−４−フルオロピペリジン−３−オールヒドロクロリド
【化４４】
0006379296.tif 000048
ＨＣｌ（５７．０ｍＬ、２２８ｍｍｏｌ、ジオキサン中４Ｍ）を、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中のラセミ，トランス−ｔｅｒｔ−ブチル−４−フルオロ−３−ヒドロキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート（５ｇ、２２．８ｍｍｏｌ）の溶液に加える。周囲温度で１６時間撹拌し減圧下で濃縮して標記化合物（３．７ｇ、１００％）を与える：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ９．５４−９．５２（ｍ，２Ｈ），６．１５−６．１４（ｍ，１Ｈ），４．６６−４．５２（ｍ，１Ｈ），３．９２−３．８６（ｍ，１Ｈ），３．１５（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２Ｈ），２．９７−２．８２（ｍ，２Ｈ），２．２２−２．１５（ｍ，１Ｈ），１．９４−１．８５（ｍ，１Ｈ）。
【００７３】
調製３１
ラセミ，シス−ｔｅｒｔ−ブチル４−フルオロ−３−（４−ニトロベンゾイル）オキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート
【化４５】
0006379296.tif 000049
ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（８．６６ｍＬ、４２．８ｍｍｏｌ）を、０℃でＴＨＦ（１５０ｍＬ）中のラセミ，トランス−４−フルオロ−３−ヒドロキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート（４．８４ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）、４−ニトロ安息香酸（７．３ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）、およびトリフェニルホスフィン（１１．３ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）の混合物に滴下で加える。混合物を、徐々に周囲温度に温めながら１６時間撹拌する。ナトリウムビカルボナート飽和水溶液でクエンチしてＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を組み合わせて水、塩水で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。１５〜２５％アセトン／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（４．４ｇ、５６％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９１（Ｍ＋２３）。
【００７４】
調製３２
ラセミ，シス−ｔｅｒｔ−ブチル４−フルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシラート
【化４６】
0006379296.tif 000050
２Ｎリチウムヒドロキシド水溶液（２４ｍＬ、４８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のラセミ，シス−ｔｅｒｔ−ブチル４−フルオロ−３−（４−ニトロベンゾイル）オキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート（４．４ｇ、１２ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１時間撹拌し、水で希釈して、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を組み合わせて水で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して標記化合物（２．７８ｇ、１００％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２４１（Ｍ＋２３）。
【００７５】
調製３３
ラセミ，シス−４−フルオロピペリジン−３−オールヒドロクロリド
【化４７】
0006379296.tif 000051
ＨＣｌ（３１．７ｍＬ、１２７ｍｍｏｌ、ジオキサン中４Ｎ）を、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中のラセミ，シス−ｔｅｒｔ−ブチル４−フルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシラート（２．７８ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）の溶液に加えて１６時間撹拌する。減圧下で濃縮して残留物を与える。ジエチルエーテル：ＭｅＯＨ（１０：１）からの残留物を摩砕し、沈殿物をろ過し、ジエチルエーテルですすぎ乾燥して標記化合物（１．６ｇ、８１％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ９．６５−８．９９（ｍ，２Ｈ），６．１７−６．１５（ｍ，１Ｈ），４．８８−４．７４（ｍ，１Ｈ），４．０４−３．９７（ｍ，１Ｈ），３．０８−２．９６（ｍ，４Ｈ），２．１５−２．０２（ｍ，２Ｈ）。
【００７６】
調製３４
ｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシ−４，４−ジメトキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート
【化４８】
0006379296.tif 000052
国際公開第２００９０３３５８１号に従ってｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシ−４，４−ジメトキシ−ピペリジン−１−カルボキシラートを調製する。カリウムヒドロキシド（７．０４０ｇ、１２５．４７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）に溶解して０℃に冷却する。Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−４−ピペリドン（１０ｇ、５０．１９ｍｍｏｌ）で処理して１５分間撹拌した後にＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中のヨウ素（１５．２８６ｇ、６０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を滴下で加える。０℃で１時間撹拌し次いで冷却浴を除去して１時間撹拌する。真空下で濃縮する。トルエンと混合してろ過する。濃縮乾固して標記化合物（１３．１ｇ（９９％）を油として与えこれをさらなる精製をせずに用いる。
【００７７】
調製３５
ｔｅｒｔ−ブチル３−ベンジルオキシ−４，４−ジメトキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート
【化４９】
0006379296.tif 000053
ナトリウムヒドリド（６１２．２２２ｍｇ、１５．３１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２５ｍＬ）と混合して０℃に冷却する。ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシ−４，４−ジメトキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート（２ｇ、７．６５ｍｍｏｌ）の溶液を加える。０℃で１０分間撹拌した後にベンジルブロミド（２．６１８ｇ、１５．３１ｍｍｏｌ）を加える。周囲温度で２時間撹拌する。ベンジルトリメチルアンモニウムヨージド（０．２ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えて１６時間撹拌を継続する。ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）および塩水（１００ｍＬ）の混合物に注ぐ。層を分離し、有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥して、３．５ｇの油に濃縮する。ヘキサンおよびＥｔＯＡｃ７０／３０で溶離するシリカゲルクロマトグラフィー上でクロマトグラフを行い標記化合物を油（２．５２ｇ、９３％）として与える。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．４３（ｓ，９Ｈ），１．６７−１．７９（ｍ，１Ｈ），１．８−１．９７（ｍ，１Ｈ），２．７１−２．８９（ｍ，１Ｈ），２．９−３．０９（ｍ，１Ｈ），３．３（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｓ，３Ｈ），３．３８−３．４９（ｍ，１Ｈ），４．０１−４．３（ｍ，２Ｈ），４．３７−４５（ｍ  １Ｈ），４．８５−４．７３（ｍ，１Ｈ），７．２−７．４（ｍ，５Ｈ）
【００７８】
調製３６
ベンジル３−ベンジルオキシ−４−オキソ−ピペリジン−１−カルボキシラート
【化５０】
0006379296.tif 000054
ｔｅｒｔ−ブチル３−ベンジルオキシ−４，４−ジメトキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート（１４．５６ｇ、４１．４３ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（２５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）と混合する。周囲温度で５０時間撹拌する。油に濃縮する。Ｈ２Ｏ（２５ｍＬ）と混合して周囲温度で１時間撹拌する。最低限の加熱と共に真空下で粘性の琥珀色油に濃縮する。ＤＣＭ（１５０ｍＬ）で希釈して０℃に冷却する。ベンジルクロロホルマート（１０．６０１ｇ、６２．１４ｍｍｏｌ）その後ＤＩＰＥＡ（１６．０６４ｇ、１２４．２９ｍｍｏｌ）を滴下で加える。１６時間撹拌し、１Ｎ  ＨＣｌ（３×１００ｍＬ）で洗い、ＭｇＳＯ４上で乾燥する。濃縮乾固しヘキサンおよびエチルアセタート７０／３０で溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して標記化合物を油（１３．８６ｇ、９８％）として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３５７（Ｍ＋Ｈ）。
【００７９】
調製３７
ラセミベンジル３−ベンジルオキシ−４−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−１−カルボキシラート、ジアステレオマー１
【００８０】
調製３８
ラセミベンジル３−ベンジルオキシ−４−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−１−カルボキシラート、ジアステレオマー２
【化５１】
0006379296.tif 000055
ベンジル３−ベンジルオキシ−４−オキソ−ピペリジン−１−カルボキシラート（２．６ｇ、７．６６ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（３０ｍＬ）と混合してＮ２下で１０℃に冷却する。（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（１．６３４ｇ、１１．４９ｍｍｏｌ）その後ＴＨＦ中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド（１３．８３５ｇ、１５．３２ｍｍｏｌ）を滴下で加える。１０℃で３０分間撹拌し次いで冷却浴を除去して周囲温度で撹拌する。１時間後ＴＨＦ中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオリド（４ｍＬ）を加えて１０分間撹拌する。塩水（５０ｍＬ）で反応をクエンチして層を分離する。水性をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出して元のＴＨＦ層と組み合わせる。ＭｇＳＯ４上で乾燥して濃縮乾固する。ヘキサンＥｔＯＡｃ７０／３０で溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物を油として回収する。ジアステレオマー１（１ｇ、３１％）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１０（Ｍ＋Ｈ）。ジアステレオマー２（１ｇ、３１％）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１０（Ｍ＋Ｈ）。
【００８１】
調製３９
ラセミ４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール（ｒａｃｅｍｉｃ  ４−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−３，４−ｄｉｏ）、ジアステレオマー１
【化５２】
0006379296.tif 000056
【００８２】
ベンジル３−ベンジルオキシ−４−ヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−１−カルボキシラート、ジアステレオマー１（１．５ｇ、３．６６ｍｍｏｌ）、パラジウム炭素１０％（１ｇ）、ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）および酢酸（１０ｍＬ）を混合する。混合物中にＨ２を泡立たせながら周囲温度で１６時間撹拌する。ろ過して真空下で濃縮する。トルエンと混合して油に再濃縮し０．８５ｇの油性膜を回収する。ＭｅＯＨに溶解し、１０ｇＳＣＸカートリッジ上に溶離して、１カラム体積のＭｅＯＨで洗う。生成物をＭｅＯＨ中の２Ｍ  ＮＨ３で溶離する。濃縮して標記化合物を固体（０．６ｇ、８８％）として与える。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．３６−１．４８（ｍ，１Ｈ），１．５７−１．６５（ｍ，１Ｈ），１．８−１．９７（ｍ，１Ｈ），２．２（ｂｓ，１Ｈ），２．４−２．５（ｍ，１Ｈ），２．５２−２．７（ｍ，２Ｈ），３．５−３．６（ｍ，１Ｈ），４．８（ｂｓ，１Ｈ），５．３（ｂｓ，１Ｈ）。
【００８３】
以下の化合物を、実質的に調製３９の方法によって調製する。
【表４】
0006379296.tif 000057
【００８４】
調製４１
シス，メソ−ｔｅｒｔ−ブチル４，４−ジフルオロ−３，５−ジヒドロキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート、異性体１
【００８５】
調製４２
ラセミ，トランス−ｔｅｒｔ−ブチル４，４−ジフルオロ−３，５−ジヒドロキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート、異性体２
【化５３】
0006379296.tif 000058
セシウムカルボナート（３．１３ｇ、９．６１ｍｍｏｌ）を、０℃で氷冷したＡＣＮ（３０ｍＬ）中のシクロヘキサン−１，３−ジオン（１．００ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）の溶液に加えて撹拌する。１５分後、１−クロロメチル−４−フルオロ−１，４−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタンビス（テトラフルオロボラート）（Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（商標）、３．９９ｇ、１１．２６ｍｍｏｌ）を加える。３０分後、冷却浴を除去して反応混合物を周囲温度に温まらせる。２時間後、ろ過して減圧下で濃縮する。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｎ塩酸水溶液で抽出し、塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して、減圧下で濃縮する。残留物を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）およびエタノール（２５ｍＬ）の混合物に溶解する。氷浴中で０℃に冷却する。ナトリウムボロヒドリド（８８７ｍｇ、２３．５ｍｍｏｌ）を加える。３０分後、冷却浴を除去して反応混合物を周囲温度に温まらせる。１．５時間後、アンモニウムクロリド飽和水溶液で反応をクエンチする。溶媒の大部分を減圧下で除去する。残留物をＥｔＯＡｃで溶解し、水および塩水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して、減圧下で濃縮する。０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して異性体１および異性体２（０．４３ｇ、３６％）の３：１混合物（異性体１の収率２７％および異性体２の収率９％）を与える。１９Ｆ  ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ｄ４−ＣＤ３ＯＤ）δ−１２１．８（ｄ，１Ｆ，Ｊ＝２４０Ｈｚ，異性体１），−１２６．５（ｄｄ，２Ｆ，Ｊ＝５７０，２４０Ｈｚ，異性体２），−１４２．０（ｄ，１Ｆ，Ｊ＝２４０Ｈｚ，異性体１）。さらなる精製をせずに用いる。
【００８６】
調製４３
ラセミ，トランス−ｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシラート
【００８７】
調製４４
ラセミ，シス−ｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシラート
【化５４】
0006379296.tif 000059
ナトリウムボロヒドリド（１．２０ｇ、３１．７ｍｍｏｌ）を、０℃で氷冷したＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−オキソピペリジン−１−カルボキシラート（４．５ｇ、１９．６８ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１５分後、冷却浴を除去して反応混合物を周囲温度に温まらせる。４５分後、アンモニウムクロリド飽和水溶液で反応をクエンチする。溶媒の大部分を減圧下で除去する。残留物をＥｔＯＡｃで溶解し、塩水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して、減圧下で濃縮する。２０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製してラセミ，トランス−ｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシラート（０．７５ｇ、１７％）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．３４（ｄｄｄ，０．５Ｈ），４．２０（ｄｄｄ，０．５Ｈ），４．０６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．８６−３．７６（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．０６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．９８（ｄｄｄ，１Ｈ），２．００−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．５６−１．４６（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）、およびラセミ，シス−ｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシラート（２．５５ｇ、５９％）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．６６−４．５７（ｍ，０．５Ｈ），４．５５−４．４５（ｍ，０．５Ｈ），４．００−３．７８（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．３２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．１０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．８５（ｓ，１Ｈ），１．８４−１．７４（ｍ，１Ｈ），１．７１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）を与える。
【００８８】
調製４５
エチル４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２，２−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタノアート
【化５５】
0006379296.tif 000060
インジウム（８．６６ｇ、７５．４ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のエチル２−ブロモ−２，２−ジフルオロアセタート（９．６７ｍＬ、７５．４ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル（２−オキソエチル）カルバマート（１０．０ｇ、６２．８ｍｍｏｌ）の溶液に加える。混合物を、５５℃で１６時間加熱して周囲温度に冷却する。アンモニウムクロリド飽和水溶液で反応をクエンチする。溶媒の大部分を減圧下で除去する。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、水、および塩水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して、減圧下で濃縮する。粗製物質（１７．８ｇ、６２．８ｍｍｏｌ）を、さらなる精製をせずに用いる：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．０５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），４．３７（ｑ，２Ｈ），４．２５−４．０８（ｍ，２Ｈ），３．６０−３．５０（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．３３（ｍ，１Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．３７（ｔ，３Ｈ）。
【００８９】
調製４６
ｔｅｒｔ−ブチル４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−３，３−ジフルオロ−２−オキソピロリジン−１−カルボキシラート
【化５６】
0006379296.tif 000061
ジオキサン（１００ｍＬ）中の４．０Ｍ  ＨＣｌ溶液を、粗製エチル４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２，２−ジフルオロ−３−ヒドロキシブタノアート（１７．８ｇ、６２．８ｍｍｏｌ）に加える。２時間後、全ての溶媒を減圧下で除去する。残留物をＡＣＮ（７５ｍＬ）に溶解する。トリエチルアミン（７５ｍＬ）を加える。１７時間後、ＤＭＡＰ（０．６５ｇ、５．３ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（３０．２ｍＬ、１３８ｍｍｏｌ）を加える。２時間後、溶媒を減圧下で除去する。水および塩水を残留物に加える。１：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を組み合わせて、塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して、減圧下で濃縮する。０から５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（６．５０ｇ、３１％）を与える：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．２８−５．２１（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｄｄ，１Ｈ），３．８８−３．８０（ｍ，１Ｈ），１．５７（ｓ，９Ｈ），１．５３（ｓ，９Ｈ）。
【００９０】
調製４７
４，４−ジフルオロピロリジン−３−オール
【化５７】
0006379296.tif 000062
ジオキサン（２００ｍＬ）中の４．０Ｍ  ＨＣｌ溶液を、ｔｅｒｔ−ブチル４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）−３，３−ジフルオロ−２−オキソピロリジン−１−カルボキシラート（６．００ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）に加える。８時間後、溶媒を減圧下で除去する。残留物をＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解して反応混合物を氷浴中で０℃に冷却する。トルエン中のビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムヒドリド（Ｒｅｄ−Ａｌ（商標）、１７．４ｍＬ、８８．９ｍｍｏｌ）の６０重量％溶液を加える。３０分後、冷却浴を除去して反応混合物を周囲温度に温まらせる。３時間後、反応混合物を氷浴中で０℃に冷却する。硫酸ナトリウム十水和物で反応をクエンチする。冷却浴を除去して反応混合物を勢いよく撹拌しながら周囲温度に温まらせる。３０分後、固体をろ過し、ＴＨＦで洗い、減圧下で濃縮する。ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中の０から１０％７Ｍアンモニア溶液で溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（１．８０ｇ、８２％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ４．１２−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．３６−３．２３（ｍ，１Ｈ），３．２２−３．０２（ｍ，２Ｈ），２．９０−２．７５（ｍ，１Ｈ）。
【００９１】
調製４８
２，２−ジメチル−４−オキソ−４−（２−チエニル）ブタン酸
【化５８】
0006379296.tif 000063
アルミニウムトリクロリド（３．１２ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）を、０℃で氷冷したＤＣＭ（６０ｍＬ）中のチオフェン（７．７７ｍＬ、９７．５６ｍｍｏｌ）および３，３−ジメチルテトラヒドロフラン−２，５−ジオン（２．５０ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）の溶液に加える。反応混合物を、周囲温度にゆっくり温まらせる。１６時間後、反応混合物を氷浴中で０℃に冷却する。２Ｎ  ＨＣｌ水溶液でクエンチする。ＤＣＭで抽出する。全ての有機層を組み合わせ、水および塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し減圧下で濃縮して標記化合物（４．１５ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）を与えこれをさらなる精製をせずに用いる。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１４（Ｍ＋Ｈ）。
【００９２】
調製４９
５，５−ジメチル−３−（２−チエニル）−１，４−ジヒドロピリダジン−６−オン
【化５９】
0006379296.tif 000064
ヒドラジン（１５ｍＬ、４６８ｍｍｏｌ）を、ＩＰＡ（６０ｍＬ）中の粗製２，２−ジメチル−４−オキソ−４−（２−チエニル）ブタン酸（４．１５ｇ、１９．５ｍｍｏｌ）の溶液に加える。混合物を、１１０℃で１７時間加熱して周囲温度に冷却する。溶媒を減圧下で除去して残留物を与える。０から１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（０．６５ｇ、１６％）を与える：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１０．８（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄｄ，１Ｈ），７．４６（ｄｄ，１Ｈ），７．１１（ｄｄ，１Ｈ），２．８６（ｓ，２Ｈ），１．０９（ｓ，６Ｈ）。
【００９３】
調製４９ａ
２−ベンジルスルファニル−５−ブロモ−チオフェン
【化６０】
0006379296.tif 000065
Ｎ−ブロモスクシンイミド（２３２．６ｇ、１．３０ｍｏｌ）を、０℃でＤＣＭ（１．９Ｌ）中の２−ベンジルスルファニルチオフェン（３２１ｇ、１．４８ｍｏｌ）の溶液に一度に加える。冷却浴を除去して室温で３０分間撹拌する。混合物をろ過して固体をＭＴＢＥ（２×５０ｍＬ）ですすぐ。ろ液を真空で濃縮する。残留物を、ＭＴＢＥ（１Ｌ）中で３０分間スラリー化する。固体をろ過してＭＴＢＥ（２×１００ｍＬ）ですすぐ。ろ液を氷／水（２００ｍＬ）および塩水（２００ｍＬ）で洗う。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空で濃縮して標記化合物（３９０ｇ、９９％）を与える。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．３−７−２（３Ｈ，ｍ），７．２−７．１（２Ｈ，ｍ），６．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），６．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），３．９２（２Ｈ，ｓ）。
【００９４】
調製４９ｂ
６−［５−（ベンジルスルファニル）チオフェン−２−イル］−４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロピリダジン−３（２Ｈ）−オン
【化６１】
0006379296.tif 000066
イソプロピルマグネシウムクロリド（４４ｍＬ、８８．３ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中２．０Ｍ）を、室温でＴＨＦ（２３０ｍＬ）中の２−ベンジルスルファニル−５−ブロモ−チオフェン（２２．９ｇ、８０．３ｍｍｏｌ）の溶液に滴下で加えて３０分間撹拌する。溶液を、−７８℃でカニューレによってＴＨＦ（１１５ｍＬ）中の２，２−ジメチルコハク酸無水物（１１．５ｇ、８８．３ｍｍｏｌ）の溶液に加える。−７８℃で１５分間撹拌して混合物を徐々に室温に温まらせる。冷却浴を除去して室温で３０分間撹拌する。ＭＴＢＥ（２００ｍＬ）を加えて１Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）で洗う。２つの相を分離して水性をＭＴＢＥ（２×５０ｍＬ）で抽出する。組み合わせた有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空で褐色固体に濃縮する。固体を４：１ヘキサン／ＭＴＢＥ混合物中に懸濁させ、摩砕して、固体をろ過する。灰色固体をヘキサンで洗い、乾燥して収集し中間体４−（５−ベンジルスルファニル−２−チエニル）−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタン酸（１８．７ｇ、７０％）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３５（Ｍ＋Ｈ）。
【００９５】
４−（５−ベンジルスルファニル−２−チエニル）−２，２−ジメチル−４−オキソ−ブタン酸（１８．７ｇ、５５．９ｍｍｏｌ）を、２−プロパノール（１８７ｍＬ）に溶解してヒドラジン一水和物（４．１５ｍＬ、８３．９ｍｍｏｌ）を加える。混合物を８０℃で一晩撹拌する。混合物を室温に温まらせて溶媒を蒸発乾固する。黄色残留物をＭＴＢＥ中に懸濁させる。山吹色固体をろ過し、ＭＴＢＥで洗い乾燥して標記化合物（１６ｇ、８７％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３１（Ｍ＋Ｈ）。
【００９６】
調製５０
Ｎ−アリル−２，２−ジメチル−ペンタ−４−エンアミド
【化６２】
0006379296.tif 000067
ＤＩＰＥＡ（４．０８ｍＬ、２３．４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中の２，２−ジメチルペンタ−４−エン酸（２．００ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）、プロパ−２−エン−１−アミン（１．７６ｍＬ、２３．４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（４．４９ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１２％水、３．１６ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）の溶液に加える。５時間後、ＥｔＯＡｃを加える。１Ｎ  ＨＣｌ水溶液および塩水で抽出する。硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。０から５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（２．２０ｇ、９０％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．９０−５．６７（ｍ，３Ｈ），５．２０−５．０１（ｍ，４Ｈ），３．８８（ｔ，２Ｈ），２．２９（ｄ，２Ｈ），１．１９（ｓ，６Ｈ）。
【００９７】
調製５１
３，３−ジメチル−１，４−ジヒドロピリジン−２−オン
【化６３】
0006379296.tif 000068
（１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン）ジクロロ（フェニルメチル−エン）（トリシクロヘキシルホスフィン）ルテニウム（Ｇｒｕｂｂｓ触媒、第二世代、０．５１ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を、トルエン（５０ｍＬ）中のＮ−アリル−２，２−ジメチル−ペンタ−４−エンアミド（２．００ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１０分間窒素を散布することによって反応混合物をガス抜きする。混合物を、１０５℃で５時間加熱して周囲温度に冷却する。減圧下で濃縮して残留物を与える。０から５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（１．０５ｇ、７０％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１２６（Ｍ＋Ｈ）。
【００９８】
調製５２
ｔｅｒｔ−ブチル３，３−ジメチル−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシラート
【化６４】
0006379296.tif 000069
ＤＭＡＰ（０．１０ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（３．８５ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ）を、ＡＣＮ（４０ｍＬ）中の３，３−ジメチル−１，４−ジヒドロピリジン−２−オン（１．０５ｇ、８．３９ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１時間後、溶媒を減圧下で除去して残留物を与える。０から２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（１．８０ｇ、９５％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．７８−６．７０（ｍ，１Ｈ），５．１８−５．０９（ｍ，１Ｈ），２．２０−２．１５（ｍ，２Ｈ），１．５３（ｓ，９Ｈ），１．２２（ｓ，６Ｈ）。
【００９９】
調製５３
ｔｅｒｔ−ブチル５−ヨード−３，３−ジメチル−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシラート
【化６５】
0006379296.tif 000070
Ｎ−ヨードスクシンイミド（１．４５ｇ、６．４６ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（２１．５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３，３−ジメチル−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシラート（０．９７ｇ、４．３１ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１７時間後、チオ硫酸ナトリウム飽和水溶液および水で反応をクエンチする。エーテルで抽出する。有機抽出物を組み合わせて水および塩水で洗う。硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。０から５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（０．９５ｇ、６３％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．２０−７．１７（ｍ，１Ｈ），２．６１（ｄ，２Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），１．２７（ｓ，６Ｈ）。
【０１００】
調製５４
３，３−ジメチル−５−（チオフェン−２−イル）−３，４−ジヒドロピリジン−２（１Ｈ）−オン
【化６６】
0006379296.tif 000071
ＴＨＦ（１０．８ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）中の０．５Ｍ  ２−チエニル亜鉛ブロミド溶液を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル５−ヨード−３，３−ジメチル−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシラート（９５０ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）および［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）、ＤＣＭ（２２１ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）との錯体の溶液に加える。１０分間窒素を散布することによって反応混合物をガス抜きする。混合物を６０℃で１７時間加熱して周囲温度に冷却する。２Ｎ  ＨＣｌ水溶液でクエンチして勢いよく撹拌する。ＥｔＯＡｃで希釈する。有機層を分離して１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、水、および塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。０から５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（４５０ｍｇ、８０％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．１２（ｄｄ，１Ｈ），６．９９（ｄｄ，１Ｈ），６．９１（ｄｄ，１Ｈ），６．５９（ｄ，１Ｈ），２．６０（ｄ，２Ｈ），１．２８（ｓ，６Ｈ）。
【０１０１】
調製５５
ラセミ２−エチル−２−メチルペンタ−４−エン酸
【化６７】
0006379296.tif 000072
ヘキサン（２８．８ｍＬ、７２．０ｍｍｏｌ）中の２．５Ｍ  ｎ−ブチルリチウム溶液を、−７８℃でＴＨＦ（１００ｍＬ）中のジイソプロピルアミン（１０．５６ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）のドライアイス／アセトン冷却溶液に加える。１５分後、反応混合物を氷浴中で０℃に温める。３０分後、２−メチルブタン酸（３．２８ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加える。１５分後、冷却浴を除去して反応混合物を周囲温度に温める。１時間後、反応混合物を氷浴中で０℃に冷却する。アリルヨージド（３．０１ｍＬ、３３ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（３．００ｍＬ、１７．２ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を、一晩周囲温度にゆっくり温まらせる。１６時間後、アンモニウムクロリド飽和水溶液で反応をクエンチする。溶媒の大部分を減圧下で除去する。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、水、および塩水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して標記生成物（６．０９ｇ、３０ｍｍｏｌ）を与えこれをさらなる精製をせずに用いる：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１２．１０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．７８−５．６４（ｍ，１Ｈ），５．１０−５．００（ｍ，２Ｈ），２．３３−２．０８（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．３３（ｍ，２Ｈ），１．０１（ｓ，３Ｈ），０．８０（ｔ，３Ｈ）。
【０１０２】
調製５６
ラセミＮ−アリル−２−エチル−２−メチル−ペンタ−４−エンアミド
【化６８】
0006379296.tif 000073
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（８．６３ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１２％水、６．０８ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２００ｍＬ）中の粗製ラセミ２−エチル−２−メチルペンタ−４−エン酸（６．０９ｇ、３０ｍｍｏｌ）の溶液に加える。プロパ−２−エン−１−アミン（３．３８ｍＬ、４５．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７．８５ｍＬ、４５．０ｍｍｏｌ）を加える。４時間後、さらにＤＣＭを加える。１Ｎ  ＨＣｌ水溶液および塩水で抽出する。硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。０から５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（２．２０ｇ、４０％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．９３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．８５−５．５９（ｍ，２Ｈ），５．１７−４．９４（ｍ，４Ｈ），３．８６−３．８０（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｄｄ，１Ｈ），２．０９（ｄｄ，１Ｈ），１．７３−１．５９（ｍ，１Ｈ），１．４５−１．３４（ｍ，１Ｈ），１．０８（ｓ，３Ｈ），０．８０（ｔ，３Ｈ）。
【０１０３】
調製５７
ラセミ３−エチル−３−メチル−１，４−ジヒドロピリジン−２−オン
【化６９】
0006379296.tif 000074
（１，３−ビス（２，４，６−トリメチルフェニル）−２−イミダゾリジニリデン）ジクロロ（フェニルメチル−エン）（トリシクロヘキシルホスフィン）ルテニウム（Ｇｒｕｂｂｓ触媒、第二世代、０．５１ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を、トルエン（６０ｍＬ）中のＮ，４−ジアリルテトラヒドロピラン−４−カルボキサミド（２．００ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液に加える。５分間窒素を散布することによって反応混合物をガス抜きする。混合物を、１００℃で５時間加熱して周囲温度に冷却する。減圧下で濃縮して残留物を与える。０から５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（１．１０ｇ、７２％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．１０−５．９８（ｍ，１Ｈ），５．０７−５．００（ｍ，１Ｈ），２．３１−２．２０（ｍ，１Ｈ），２．１６−２．０７（ｍ，１Ｈ），１．７０−１．５２（ｍ，２Ｈ），１．１４（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｔ，３Ｈ）。
【０１０４】
調製５８
ラセミｔｅｒｔ−ブチル３−エチル−３−メチル−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシラート
【化７０】
0006379296.tif 000075
ＤＭＡＰ（１００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート（３．６３ｍＬ、１５．８ｍｍｏｌ）を、ＡＣＮ（４０ｍＬ）中の３−エチル−３−メチル−１，４−ジヒドロピリジン−２−オン（１．１０ｇ、７．９０ｍｍｏｌ）の溶液に加える。２時間後、溶媒を減圧下で除去して残留物を与える。０から５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（２．００ｇ、９５％）を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．７６−６．６９（ｍ，１Ｈ），５．１４−５．０６（ｍ，１Ｈ），２．２４−２．１８（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．６８（ｍ，２Ｈ），１．５４（ｓ，９Ｈ），１．１８（ｓ，３Ｈ），０．８９（ｔ，３Ｈ）。
【０１０５】
調製５９
ラセミｔｅｒｔ−ブチル３−エチル−５−ヨード−３−メチル−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシラート
【化７１】
0006379296.tif 000076
Ｎ−ヨードスクシンイミド（１．５２ｇ、６．７７ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（２３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−エチル−３−メチル−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシラート（１．２０ｇ、４．５１ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１７時間後、チオ硫酸ナトリウム飽和水溶液および水で反応をクエンチする。エーテルで４回抽出する。全ての有機抽出物を組み合わせて水および塩水で洗う。硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。０から２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（１．１５ｇ、７０％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３６６（Ｍ＋Ｈ）。
【０１０６】
調製６０
ラセミ３−エチル−３−メチル−５−（２−チエニル）−１，４−ジヒドロピリジン−２−オン
【化７２】
0006379296.tif 000077
ＴＨＦ（４．３８ｍＬ、２．１９ｍｍｏｌ）中の０．５Ｍ  ２−チエニル亜鉛ブロミド溶液を、ＴＨＦ（１１ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−エチル−５−ヨード−３−メチル−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシラート（４００ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）および［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）、ＤＣＭ（８９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）との錯体の溶液に加える。１０分間窒素を散布することによって反応混合物をガス抜きする。混合物を６０℃で１８時間加熱して周囲温度に冷却する。２Ｎ  ＨＣｌ水溶液でクエンチして勢いよく撹拌する。ＥｔＯＡｃで希釈する。有機層を分離して１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、水、および塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。０から５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（１８０ｍｇ、７４％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２２２（Ｍ＋Ｈ）。
【０１０７】
調製６１
ｔｅｒｔ−ブチル−シクロペンタ−３−エン−１−イルオキシ−ジフェニル−シラン
【化７３】
0006379296.tif 000078
ｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシラン（３６．６６ｇ、１３３．３８ｍｍｏｌ）を、−２０℃で乾性ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の３−シクロペンテン−１−オール（１０．２ｇ、１２１．２６ｍｍｏｌ）および１Ｈ−イミダゾール（１８．１６ｇ、２６６．７７ｍｍｏｌ）に滴下で加える。追加完了後、反応温度を徐々に周囲温度に温まらせて窒素下で一晩撹拌する。反応混合物に水、アンモニウムクロリド、およびＥｔＯＡｃを加えて混合物を１時間撹拌する。有機層を分離してｐＨが酸性になるまでアンモニウムクロリド（５×）、水（２×）、および塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して標記化合物（４０．２２ｇ、９３％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０５．２（Ｍ＋２  ＭｅＣＮ＋Ｈ）。
【０１０８】
調製６２
ラセミ，トランス，ｔｅｒｔ−ブチル−（３，４−ジブロモシクロペントキシ）−ジフェニル−シラン
【化７４】
0006379296.tif 000079
カーボンテトラクロリド（１０ｍＬ）中の臭素（２２．２３ｇ、７．１５ｍＬ、１３９．１０ｍｍｏｌ）の溶液を、−２０℃で撹拌したカーボンテトラクロリド（２００ｍＬ）およびエタノール（０．１ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル−シクロペンタ−３−エン−１−イルオキシ−ジフェニル−シラン（４０．２ｇ、１１５．９２ｍｍｏｌ）の溶液に滴下で２０分掛けて加える。冷却浴中でもう１時間撹拌を継続する。反応混合物を、ナトリウムビカルボナートに注ぐ。有機層を分離する。有機抽出物を塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して標記化合物（５５．１９ｇ、１０６．４１ｍｍｏｌ、９３％）を与える。ＧＣＭＳ  ４２５（Ｍ−５６）。
【０１０９】
調製６３
ラセミ（３−ブロモシクロペンタ−３−エン−１−イル）オキシ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニル−シラン
【化７５】
0006379296.tif 000080
乾性ＴＨＦ（５００ｍＬ）中のトランス、ラセミｔｅｒｔ−ブチル−（３，４−ジブロモシクロペントキシ）−ジフェニル−シラン（５０．４４ｇ、１０４．５８ｍｍｏｌ）の原液を調製して２部に分割する。固体ナトリウムアミド（５．２ｇ、１３０．５ｍｍｏｌ）および固体ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１８ｇ、１８８ｍｍｏｌ）を加える。得られるそれぞれの容器のクリーム色の混合物を、室温で２９時間撹拌する。ＧＣＭＳは、フラスコ１において８５：１５生成物／出発原料およびフラスコ２において完成を示す。さらに０．５当量のナトリウムアミドを、フラスコ１に加えてそれをさらに２４時間撹拌させる。フラスコ２を飽和アンモニウムクロリドでクエンチし、エーテルで抽出する（３×）。有機抽出物を組み合わせて塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して褐色油を与える。それぞれの反応について同じ仕上げを完了する。両方の部を組み合わせて２０〜５０％のグラジエントでヘキサン中ヘキサン：５％ＤＣＭで溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（１８．４５ｇ、４３．９５％）を与える。ＧＣＭＳ（Ｍ−５６）３４５．１。
【０１１０】
調製６４
ラセミ５−［４−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジフェニル）シリル］オキシシクロペンテン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化７６】
0006379296.tif 000081
ラセミ（３−ブロモシクロペンタ−３−エン−１−イル）オキシ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニル−シラン（２．７１ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）、ビス（ピノコラト）ジボロン（５．１４ｇ、２０．２５ｍｍｏｌ）、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（３３０．７９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）、カリウムアセタート（４．６４ｇ、４７．２６ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（６０ｍＬ）に加える。反応混合物を１００℃で２時間に加熱する。反応混合物を室温に冷却させる。水を加えてＥｔＯＡｃで抽出する。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して、減圧下で濃縮する。ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９０：１０）で溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって粗製を精製して中間体ボロナートを与える。５−ブロモ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（２．１ｇ、５．２１ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニル−［３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）シクロペンタ−３−エン−１−イル］オキシ−シラン（３．５０ｇ、７．８１ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（４８１．４３ｍｇ、０．４１６ｍｍｏｌ）、およびカリウムホスファート、三塩基酸、Ｎ−水和物（３．５７ｇ、１６．８２ｍｍｏｌ）を、マイクロ波バイアル（ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｖｉａｌ）において１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）および水（５ｍＬ）と組み合わせる。バイアルをＢｉｏｔａｇｅ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ内に置いて１４０℃に２０分間加熱する。水および次いで１Ｎ  ＨＣｌを加えて溶液を酸性にする。混合物をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出する。有機抽出物を組み合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して、減圧下で濃縮する。粗製物質をＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９０：１０）で溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して標記化合物（２１０ｍｇ、７％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：６４３．０（Ｍ−Ｈ）。
【０１１１】
調製６５
ラセミ５−（４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝シクロヘキサ−１−エン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化７７】
0006379296.tif 000082
５−ブロモ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（０．６ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）シクロヘキサ−３−エン−１−イル］オキシ−シラン（１．０１ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．１３８ｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）、およびカリウムホスファート、三塩基酸、Ｎ−水和物（１．０２ｇ、４．８１ｍｍｏｌ）を、マイクロ波バイアルにおいて１，４−ジオキサン（８ｍＬ）および水（４ｍＬ）と組み合わせる。バイアルをＢｉｏｔａｇｅ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ内に置いて１４０℃に２０分間加熱する。水および次いで１Ｎ塩酸を加えて溶液を酸性にする。混合物をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出する。有機抽出物を組み合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して暗褐色油脂を与える。ＤＣＭを油脂に加える。数分後、溶液から固体が沈澱する。固体をろ過して標記化合物（０．５１３ｇ、６４．５％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５３５．２（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１２】
調製６６
５−（４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝シクロヘキサ−１−エン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１１３】
調製６７
５−（４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝シクロヘキサ−１−エン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化７８】
0006379296.tif 000083
ラセミ５−（４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝シクロヘキサ−１−エン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（０．５７５ｇ、１．０８ｍｍｏｌ）で開始し、エナンチオマーを７０ｇ／分の流速で３０％ＩＰＡ：７０％ＣＯ２で溶離するＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２１×２５０ｍｍカラムを用いてキラルクロマトグラフィーで分離して調製６６、異性体１（０．２２２ｇ、３８％、＞９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５３５．０（Ｍ＋Ｈ）および調製６７、異性体２（０．２１６ｇ、３８％、９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５３５．０（Ｍ＋Ｈ）を与える。
【０１１４】
実施例１
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド
【化７９】
0006379296.tif 000084
５−ブロモ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（０．５９ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）、（Ｒ）−３−ピロリジノール（０．２６５ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）、銅ブロミド（Ｉ）（０．０５２ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ヒドロキシプロリン（０．１０ｇ、０．８ｍｍｏｌ）およびセシウムカルボナート（１．０３ｇ、３．１６ｍｍｏｌ）を、密閉したバイアルにおいてＤＭＳＯ（８ｍＬ）と組み合わせて得られる混合物を１００℃で一晩加熱する。反応混合物を水で希釈してｐＨを約５に調節する。水性混合物を、ＥｔＯＡｃでその後少量のＭｅＯＨを含有するＤＣＭで抽出する。固体を含有するいかなる生成物からも水を傾瀉して出し固体を５０／５０  ＤＣＭ／ＭｅＯＨに取り上げる。全ての有機物を組み合わせ減圧下で濃縮して残留物を与える。得られる残留物を、０〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー上で精製する。適切な物質をＥｔＯＡｃ／ヘキサンから濃縮し乾燥して標記化合物（０．１６ｇ、２７％）を黄褐色固体として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１０（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１５】
以下の化合物を、実質的に実施例１について記載された手順によって調製する。
【表５−１】
0006379296.tif 000085
【表５−２】
0006379296.tif 000086
【表５−３】
0006379296.tif 000087
【０１１６】
代替の調製、実施例１
（Ｒ）−３−ピロリジノール（２３．５ｇ、２６９．９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１２６ｍＬ、７１９．８ｍｍｏｌ）を、ピリジン（４３０ｍＬ）中の５−ブロモ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（７０ｇ、１８０ｍｍｏｌ、８８％純度）の溶液に加えて得られる混合物を１０５℃（内部温度）で５時間加熱する。混合物を、高真空下で４０℃で濃縮する。残留物を、シリカゲルのパッドを通して精製しアセトン／ヘキサン１：１からアセトン１００％で溶離する。得られる物質を、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）において３０分間スラリー化する。沈殿した固体をろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍＬ）で洗い、乾燥し、収集して標記化合物（３２ｇ、４３％）をベージュ色固体として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１０（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１７】
実施例２２
５−［（１Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシエタンイミドイル］−Ｎ−（１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化８０】
0006379296.tif 000088
５−アセチル−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（０．５ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、エタノール（２０ｍＬ、３４３．５ｍｍｏｌ）中のヒドロキシルアミンヒドロクロリド（０．２１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）と組み合わせて混合物を窒素下で８０℃で一晩加熱する。反応混合物を減圧下で濃縮して残留物を与える。残留物を水で希釈し、ｐＨを約５に調節して、混合物をＥｔＯＡｃで抽出する。組み合わせた抽出物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し溶液を減圧下で残留物に濃縮する。残留物を、０〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。大部分がオキシム異性体（Ｅ異性体）に濃縮されている溶離画分を濃縮する。物質をジエチルエーテル中で摩砕し、沈殿物を収集し、乾燥して標記化合物（０．１２７ｇ、２４％、９：１Ｅ／Ｚ混合物）を与える。ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３６４（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１８】
以下の化合物を、実質的に適切なケトンを用いて調製２２の手順によって調製する。
【表６】
0006379296.tif 000089
【０１１９】
実施例２５
シスＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［３−ヒドロキシ−４−メトキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１２０】
実施例２６
シスＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［３−ヒドロキシ−４−メトキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化８１】
0006379296.tif 000090
実施例２５および２６を、セシウムカルボナートの代わりにカリウムカルボナートを用いることおよびｐＨ５の代わりにｐＨを４に調節することを除いて実質的に実施例１に記載のように調製する。粗製物質を精製し次いで残留物を逆相フラッシュクロマトグラフィー（１０％ＴＦＡを含むＨ２Ｏ：１０％ＴＦＡを含むＡＣＮ）、グラジエント：１０％ＴＦＡアイソクラチックを含む１５％ＡＣＮを３分間１５〜３０％を５分間によって再精製してシス異性体（６６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の混合物を与える。エナンチオマーを、次の異なるパラメーター：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＡ、２１×２５０ｍｍ、ＢＰＲ設定値：１０３ｋＰａを用いて実施例３３および３４で述べたようにキラルクロマトグラフィーによって分離する。第１の溶離ピークを実施例２５、異性体１として取得する（０．０２７ｇ、４％、Ｒｔ＝３．１８分、＞９９％ｅｅ）、ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４０（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを実施例２６、異性体２として取得する（０．０２３ｇ、３％、Ｒｔ＝３．８３分、９７．５％ｅｅ）、ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４０（Ｍ＋Ｈ）。
【０１２１】
実施例２７
ラセミ，シス５−［３，４−ジヒドロキシピペリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化８２】
0006379296.tif 000091
５−フルオロ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、シス−ピペリジン−３，４−ジオールヒドロクロリド（エナンチオマーの混合物５３．９ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（０．３Ｍ、１ｍＬ）およびジイソプロピルアミン（２００μＬ）を組み合わせて密閉したバイアル内で１００℃で１８時間加熱する。周囲温度に冷却して蒸発させる。１〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭグラジエントでシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して標記化合物をシスエナンチオマーの混合物（８３．５ｍｇ、６５％）として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４０（Ｍ＋１）。
【０１２２】
実施例２８
ナトリウム（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）｛［５−（４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）チオフェン−２−イル］スルホニル｝アザニド
【化８３】
0006379296.tif 000092
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（実施例５）（１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、２−プロパノール（１０ｍＬ、１３１ｍｍｏｌ）、および１Ｎナトリウムヒドロキシド水溶液（２．４ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を組み合わせる。混合物を加熱して全ての固体を溶解し０．４５μＭシリンジフィルターを通して温めてろ過する。加熱して得られるいかなる沈殿物も溶解し、次いで室温で混合物を撹拌して結晶化させる。固体をろ過し、２−プロパノールで洗い、真空下で５０℃で乾燥して標記化合物（９２０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２４（遊離酸のＭ＋Ｈ）。
【０１２３】
以下の化合物を、実質的に実施例２８に関する手順によって調製する。
【表７】
0006379296.tif 000093
【０１２４】
実施例３０
ラセミ，シス５−（３−フルオロ−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化８４】
0006379296.tif 000094
ＴＦＡ（６ｍＬ、７９ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１２ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３Ｒ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−カルボキシラート（１．０ｇ、４．８７ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１時間撹拌する。減圧下で濃縮して高真空で一晩乾燥する。ＤＭＳＯ（１２ｍＬ）中の５−ブロモ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（１．０ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）、銅ブロミド（０．１１ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）ヒドロキシプロリン（０．２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびカリウムカルボナート（１．３７ｇ、９．９２ｍｍｏｌ）と組み合わせる。１１０℃で２時間マイクロ波にかける。逆相クロマトグラフィーによって油を精製する。０．１％ギ酸５％アイソクラチックを含むＨ２Ｏを５分間、次いで０．１％ギ酸を含む５〜５０％ＡＣＮ。減圧下で油に濃縮して標記化合物（２４４ｍｇ、２３．０％）を与える。ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｅ  ４２８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２５】
以下の化合物を、実質的に実施例３０の手順によって調製する。
【表８】
0006379296.tif 000095
【０１２６】
実施例３３
５−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化８５】
0006379296.tif 000096
【０１２７】
実施例３４
５−［（３Ｒ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化８６】
0006379296.tif 000097
ラセミ，シス５−（３−フルオロ−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（２４４ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を、２．５ｍＬのＭｅＯＨおよび０．５ｍＬのＤＣＭおよび数滴のイソプロピルアミンに溶解して次のパラメーターを用いてキラルクロマトグラフィーによって精製する−カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、１５０×２１．２ｍｍ、流速：７０ｍＬ／分、検出：３２０ｎｍ、移動相：４０％ＭｅＯＨ／６０％ＣＯ２、カラム温度：３５℃、ＢＰＲ設定値：１００バール、ＢＰＲ温度：４０℃。第１の溶離ピークを、標記化合物実施例３３として収集する（７５ｍｇ、３０．８％、Ｒｔ＝２．２０分、９６．８％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２８（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを、標記化合物実施例３４として収集する（７１ｍｇ、２９．２％、Ｒｔ＝３．３１分、９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２８（Ｍ＋Ｈ）。
【０１２８】
実施例３５
５−［（３Ｓ，４Ｓ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化８７】
0006379296.tif 000098
【０１２９】
実施例３６
５−［（３Ｒ，４Ｒ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化８８】
0006379296.tif 000099
次のパラメーターを用いて実施例３３および３４に記載のラセミ混合物からエナンチオマーを分割する：カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２１．２×２５０ｍｍ、検出：２２５ｎｍ。第１の溶離ピークを標記化合物実施例３５として取得する（４６ｍｇ、Ｒｔ＝１．５８分、９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２８（Ｍ＋Ｈ）。（２９３ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）でのキラル精製を繰り返して第２の溶離ピークを実施例３６として取得する（１２９ｍｇ、Ｒｔ＝２．９分、９６．８％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２８（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３０】
実施例３７
ラセミ５−（３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化８９】
0006379296.tif 000100
ピリジン（５０ｍＬ）中の５−フルオロ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（２．５０ｇ、７．３０ｍｍｏｌ）および４，４−ジフルオロピロリジン−３−オール（１．９０ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）の溶液を１１０℃で４０時間加熱して周囲温度に冷却する。溶媒を減圧下で除去する。残留物を、逆相クロマトグラフィー、移動相Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ：ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡによって精製する。Ａ中の１０から４５％Ｂで溶離する。２．５から７．５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物をさらに精製して標記化合物（１．７０ｇ、５２％）を与える。ＥＳ／ＭＳ  ｍ（ｍ／ｚ）：４４６（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３１】
実施例３８
５−［（４Ｓ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド；プロパン−２−アミン
【化９０】
0006379296.tif 000101
【０１３２】
実施例３９
５−［（４Ｒ）−３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド−プロパン−２−アミン
【化９１】
0006379296.tif 000102
次のパラメーターを用いて実施例３３および３４に記載のラセミ混合物（実施例３７）からエナンチオマーを分割する：カラム：Ｌｕｘ  Ａｍｙｌｏｓｅ−２、２１．２×２５０ｍｍ、検出：２２５ｎｍ、移動相：３０％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）／７０％ＣＯ２。第１の溶離ピークを標記化合物実施例３８として取得する（５４ｍｇ、Ｒｔ＝３．２２分、９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４６（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを標記化合物実施例３９として取得する（４８ｍｇ、Ｒｔ＝４．４３分、９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４６（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３３】
以下の化合物を、実質的に実施例３８および３９で述べた通りに調製する。
【表９】
0006379296.tif 000103
【０１３４】
実施例４２
ラセミトランスＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（３−ヒドロキシシクロペンチル）チオフェン−２−スルホンアミド
【０１３５】
実施例４３
ラセミシスＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（３−ヒドロキシシクロペンチル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化９２】
0006379296.tif 000104
パラジウムヒドロキシド（２０％炭素上、０．８３ｇ）を、反応容器に加えて容器を窒素でパージする。触媒をエタノール（２５ｍＬ）で湿潤させ次いでエタノール（２５ｍＬ）中の５−（３−ベンジルオキシシクロペンチル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（０．６４４ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）の溶液を触媒に加える。反応を、Ｐａｒｒシェーカーにおいて室温で水素雰囲気下で（３０ｐｓｉｇ）１８時間振とうする。さらに触媒（０．８４４ｇ）を加え水素下で（３０ｐｓｉｇ）反応を２４時間振とうする。さらに触媒（１．２３ｇ）を加え水素下で（３０ｐｓｉｇ）反応を２４時間振とうする。懸濁液をろ過し減圧下で濃縮して透明油を与える。ＬＣカラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８３０×７５ｍｍ５μＭ；Ａ＝５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、Ｂ＝ＡＣＮ化合物グラジエント：６％Ｂアイソクラチック４分間、６〜１３．４％Ｂ  ３分以内、１３．４〜３０％Ｂ  １分以内；カラム温度：周囲；流速：８５ｍＬ／分で溶離する逆相精製によって油を精製する。第１の溶離ピークを、実施例４２として単離する（４０ｍｇ、７．６％、Ｒｔ＝６．６３分）ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０９（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを、実施例４３として単離する、（１２０ｍｇ、２２．９％、Ｒｔ＝７．３０分）。ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０９（Ｍ＋Ｈ）。
【０１３６】
代替の調製例４２
【０１３７】
代替の調製例４３
ホウ素トリブロミド（ヘプタン中１Ｍ、４０ｍＬ）を、ＤＣＭ（６００ｍＬ）中の５−（３−ベンジルオキシシクロペンチル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（２０ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）の０℃溶液に滴下で加える。反応を、ＬＣ／ＭＳ（ＭｅＯＨ中の試料）が出発原料が消費されることを示すまで（約３時間）室温で撹拌する。反応を０℃に冷却して反応をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で滴下でクエンチする。反応を減圧下で濃厚な赤色油に濃縮する。４％（ＡＣＮ中０．１％ギ酸）／９６％（水中０．１％ギ酸）で溶離する逆相精製によって５分間油を精製し、次いで３０分の間にＡＣＮ量を４〜５５％ＡＣＮから増加して、第１の溶離ピークをラセミトランス異性体（１．８５ｇ、１１．３％）、ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０９（Ｍ＋Ｈ）としておよび第２の溶離ピークをラセミシス異性体（２．３９ｇ、１４．６％）、ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０９（Ｍ＋Ｈ））として与える。
【０１３８】
以下の化合物を、実質的に代替の調製例４２および４３の手順によって調製する。
【表１０】
0006379296.tif 000105
【０１３９】
実施例４６
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（１Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシシクロペンチル］チオフェン−２−スルホンアミド
【化９３】
0006379296.tif 000106
【０１４０】
実施例４７
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（１Ｓ，３Ｓ）−３−ヒドロキシシクロペンチル］チオフェン−２−スルホンアミド
【化９４】
0006379296.tif 000107
次のパラメーターを用いて実施例３３および３４に記載のラセミ混合物からエナンチオマーを分割する：カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２１×２５０ｍｍ、検出：２２５ｎｍ、移動相：３５％ＭｅＯＨ／６５％ＣＯ２、カラムＢＰＲ設定値：１０３ｋＰａ。第１の溶離ピークを標記化合物実施例４６として取得する（１４ｍｇ、３５％、Ｒｔ＝２．４５分、９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０９（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを、標記化合物実施例４７として取得する（１４ｍｇ、３５％、Ｒｔ＝２．８１分、９５．９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０９（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４１】
実施例４８
シスＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（３−ヒドロキシシクロペンチル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１４２】
実施例４９
シスＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（３−ヒドロキシシクロペンチル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化９５】
0006379296.tif 000108
次のパラメーターを用いて実施例３２および３３に記載のラセミ混合物からエナンチオマーを分割する：イソプロピルアミンは溶解において用いない、カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２１×２５０ｍｍ、検出：２２５ｎｍ、移動相：３５％ＭｅＯＨ／６５％ＣＯ２、ＢＰＲ設定値：１０３ｋＰａ、ＢＰＲ。第１の溶離ピークを、実施例４８、異性体１として取得する（４５ｍｇ、３８％、Ｒｔ＝２．２２分、９９．２％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０９（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを、実施例４９、異性体２として取得する（４０ｍｇ、３３％、Ｒｔ＝２．６１分、９７．６％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０９（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４３】
実施例５０
トランス５−（３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシシクロペンチル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１４４】
実施例５１
トランス５−（３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシシクロペンチル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化９６】
0006379296.tif 000109
次のパラメーターを用いて実施例３３および３４に記載のラセミ混合物からエナンチオマーを分割する：イソプロピルアミンは溶解において用いない、カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２０×１５０ｍｍ、検出：２２５ｎｍ、移動相：３５％ＩＰＡ／６５％ＣＯ２、ＢＰＲ設定値：１０３ｋＰａ。第１の溶離ピークを、実施例５０、異性体１として取得する（３２ｍｇ、３０％、Ｒｔ＝２．０６分、９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４５（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを、実施例５１、異性体２として取得する（４４ｍｇ、４１％、Ｒｔ＝２．４２分、９８．７％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４５（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４５】
実施例５２
シス，５−（３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシシクロペンチル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１４６】
実施例５３
シス，５−（３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシシクロペンチル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化９７】
0006379296.tif 000110
次のパラメーターを用いて実施例３３および３４に記載のラセミ混合物からエナンチオマーを分割する：カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２１×２５０ｍｍ、検出：２２５ｎｍ、移動相：３５％ＩＰＡ／６５％ＣＯ２。第１の溶離ピークを、実施例５２、異性体１として取得する（１１９ｍｇ、４０％、Ｒｔ＝２．２３分、９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４５（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを、実施例５３、異性体２として取得する（１１９ｍｇ、４０％、Ｒｔ＝２．８０分、９７．６％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４５（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４７】
実施例５４
ラセミ５−（４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化９８】
0006379296.tif 000111
ラセミ４，４−ジフルオロピペリジン−３−オール（１．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１０ｍＬ）中の５−フルオロ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（１．４ｇ、４．１ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１００℃に２０時間加熱して周囲温度に冷却する。混合物を水で希釈し濃ＨＣｌ水溶液で酸性化する。ＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を組み合わせて水で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。０．１％ＴＦＡを含む１０〜４５％ＡＣＮ：０．１％ＴＦＡを含むＨ２Ｏのグラジエントで溶離するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって２０分間掛け次いで４５％に１０分間保持して残留物を精製する。続いてＭｅＯＨ：：ＤＣＭ（４：６）で溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して標記化合物（０．７５ｇ、４０％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６０（Ｍ＋Ｈ）。
【０１４８】
以下の化合物を、実質的に実施例５４の方法によって調製する。
【表１１】
0006379296.tif 000112
【０１４９】
実施例５７
ラセミ，シス−５−（４−フルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化９９】
0006379296.tif 000113
ラセミ，シス−４−フルオロピペリジン−３−オールヒドロクロリド（１．６ｇ、１０ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨに溶解し、ＳＣＸカラム上に充填し、７Ｎ  ＮＨ３／ＭｅＯＨで溶離して濃縮しラセミ，シス−４−フルオロピペリジン−３−オール（１．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を与える。ラセミ，シス−４−フルオロピペリジン−３−オール（０．８４ｇ、７．０ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１０ｍＬ）中の５−フルオロ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（１．２ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の溶液に加える。混合物を１００℃で１６時間加熱して減圧下で濃縮する。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、濃ＨＣｌ水溶液で酸性化してＥｔＯＡｃで抽出する。組み合わせた有機層を水および塩水で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、濃縮して残留物を与える。１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（１．０ｇ、６５％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４２（Ｍ＋Ｈ）。
【０１５０】
実施例５８
５−［（３Ｓ）−（４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−イル）］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化１００】
0006379296.tif 000114
【０１５１】
実施例５９
５−［（３Ｒ）−（４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−イル）］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化１０１】
0006379296.tif 000115
次のパラメーターを用いて実施例３２および３３に記載のラセミ混合物からエナンチオマーを分割する：イソプロピルアミンは溶解において用いない、カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、１５０×２０ｍｍ、検出：２２５ｎｍ、移動相：４０％ＩＰＡ／ＣＯ２、カラム温度：４０℃、ＢＰＲ設定値：１０３ｋＰａ、ＢＰＲ温度：３５℃。第１の溶離ピークを、実施例５８として取得する（０．３５ｇ、４２％、Ｒｔ＝２．３９分、９８％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６０（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを、実施例５９として取得する（０．３４ｇ、３８％、Ｒｔ＝２．９２分、９８．８％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６０（Ｍ＋Ｈ）。
【０１５２】
実施例６０
トランス−５−（４−フルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１５３】
実施例６１
トランス−５−（４−フルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化１０２】
0006379296.tif 000116
次のパラメーターを用いて実施例３２および３３に記載のラセミ混合物からエナンチオマーを分割する：カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２１×２５０ｍｍ、検出：２２５ｎｍ、移動相：４０％ＩＰＡ／ＣＯ２、ＢＰＲ設定値：１０３ｋＰａ。第１の溶離ピークを、実施例６０、異性体１として取得する（０．２６ｇ、３２％、Ｒｔ＝２．５７分、９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４２（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを、実施例６１、異性体２として取得する（０．３１ｇ、３９％、Ｒｔ＝３．１７分、９７％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４２（Ｍ＋Ｈ）。
【０１５４】
実施例６２
シス−５−（４−フルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１５５】
実施例６３
シス−５−（４−フルオロ−３−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化１０３】
0006379296.tif 000117
次のパラメーターを用いて実施例３３および３４に記載のラセミ混合物からエナンチオマーを分割する：ＭｅＯＨに溶解する、カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、５×１５０ｍｍ、検出：３００ｎｍ、移動相：３５％ＥｔＯＨ／ＣＯ２、カラム温度：４０℃、ＢＰＲ設定値：１０３ｋＰａ。第１の溶離ピークを、実施例６２、異性体１として取得する（０．４４ｇ、４５％、Ｒｔ＝４．５２分、＞９８％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４２（Ｍ＋Ｈ）。第２の溶離ピークを、実施例６３、異性体２として取得する（０．４４ｇ、４６％、Ｒｔ＝５．２９分、＞９４％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４２。
【０１５６】
実施例６４
ラセミ、５−［３，４−ジヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、ジアステレオマー１
【化１０４】
0006379296.tif 000118
カリウムカルボナート（２９８．６ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）を、４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−３，４−ジオール、ジアステレオマー１（０．２ｇ、１．０８ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（１２ｍＬ）と組み合わせる。銅ブロミド（Ｉ）（６１．９８ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）ヒドロキシプロリン（１２０．４ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）および５−ブロモ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（４３５ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を加える。雰囲気をＮ２で置換して１００℃で１６時間加熱する。ＤＭＳＯの大部分を、高真空を用いて蒸留によって除去する。ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液（０．２５ｍＬ）を加えてＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で希釈する。ろ過して油に濃縮する。移動相Ａ：水中０．１０％ＴＦＡ、および移動相Ｂ：ＡＣＮ中０．１０％ＴＦＡで、Ｃ１８  ＡＸＩＡ充填３０×７５ｍｍカラムを用いて低ｐＨ逆相ＨＰＬＣによって残留物を精製する。Ａ中５％から４２％Ｂで溶離して標記化合物（１８７ｍｇ、３４％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０８（Ｍ＋Ｈ）。
【０１５７】
以下の化合物を、実質的に実施例６４の方法によって調製する。
【表１２】
0006379296.tif 000119
【０１５８】
実施例６６
５−［３，４−ジヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１５９】
実施例６７
５−［３，４−ジヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化１０５】
0006379296.tif 000120
２つのエナンチオマーを、次のパラメーターを用いて実施例３３および３４に記載のようにクロマトグラフィーキラル手順を用いてラセミ、５−［３，４−ジヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、ジアステレオマー１から分離する：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２０×１５０ｍｍカラム。第１の溶離ピークを収集して実施例６６、異性体１（４７ｍｇ、２６％、＞９９％ｅｅ）ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０８（Ｍ＋Ｈ）および実施例６７、異性体２（４９ｍｇ、２７％、＞９９％ｅｅ）ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０８（Ｍ＋Ｈ）を与える。
【０１６０】
実施例６８
５−［３，４−ジヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１６１】
実施例６９
５−［３，４−ジヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）ピペリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化１０６】
0006379296.tif 000121
２つのエナンチオマーを、７０ｍＬ／分の流速で、４０％ＭｅＯＨ／ＣＯ２で溶離する、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２０ｘ１５０ｍｍカラムを用いてキラルクロマトグラフィーによってラセミ５−［−３，４−ジヒドロキシ−４−（トリフルオロメチル）−１−ピペリジル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミドジアステレオマー２（２３ｍｇ）から分離して、実施例６８、異性体１（８．８ｍｇ、３８％、＞９９％ｅｅ）ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０８（Ｍ＋Ｈ）および実施例６９、異性体２（９．３ｍｇ、４０％、＞９９％ｅｅ）ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０８（Ｍ＋Ｈ）を与える。
【０１６２】
実施例７０
シス，メソ，５−（４，４−ジフルオロ−３，５−ジヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、ジアステレオマー１
【化１０７】
0006379296.tif 000122
【０１６３】
実施例７１
ラセミ，トランス，５−（４，４−ジフルオロ−３，５−ジヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、ジアステレオマー２
【化１０８】
0006379296.tif 000123
ＤＣＭ（３ｍＬ）およびＴＦＡ（３ｍＬ）を、シス，メソ−ｔｅｒｔ−ブチル４，４−ジフルオロ−３，５−ジヒドロキシ−ピペリジン−１−カルボキシラートおよびラセミ，トランス−ｔｅｒｔ−ブチル４，４−ジフルオロ−３，５−ジヒドロキシ−ピペリジン−１−カルボキシラート（０．４２ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）の３：１混合物に加える。２時間後、溶媒を減圧下で除去する。５−フルオロ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（０．１５ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（３ｍＬ）およびピリジン（６ｍＬ）を加える。混合物を、１００℃で２４時間加熱して周囲温度に冷却する。溶媒を減圧下で除去する。ＳＣＸカラム上に充填する。ＭｅＯＨで溶離してろ液を濃縮する。２つのジアステレオマーを、移動相Ａ：５％ＭｅＯＨを含む１０ｍＭアンモニウムビカルボナート水溶液、移動相Ｂ：ＡＣＮで、Ｃ１８  ＯＢＤ  ３０×７５ｍｍカラムを用いて高ｐＨ逆相ＨＰＬＣによって分離する。Ａ中２％から１２％Ｂ、流速８５ｍＬ／分で溶離して、実施例７０、ジアステレオマー１、（４０ｍｇ、１９％）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７６（Ｍ＋Ｈ）、および実施例７１、ジアステレオマー２、（２０ｍｇ、１０％）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７６（Ｍ＋Ｈ）を与える。
【０１６４】
実施例７２
５−（３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１６５】
実施例７３
５−（３，３−ジフルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化１０９】
0006379296.tif 000124
実施例６６および６７に記載のようにラセミ混合物からエナンチオマーを分割して実施例７２、異性体１（４０ｍｇ、２７％、＞９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６０（Ｍ＋Ｈ）、および実施例７３、異性体２（４０ｍｇ、２７％、＞９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６０（Ｍ＋Ｈ）を与える。
【０１６６】
実施例７４
ラセミ，トランス５−（３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化１１０】
0006379296.tif 000125
ＴＦＡ（３ｍＬ）を、ＤＣＭ（３ｍＬ）中のラセミ，トランス−ｔｅｒｔ−ブチル３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシラート（２８８ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）の溶液に加える。２時間後、溶媒を減圧下で除去する。５−フルオロ−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（１８０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）およびピリジン（５ｍＬ）を加える。ＤＩＰＥＡ（０．５０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、１００℃で１８時間加熱して周囲温度に冷却する。溶媒を減圧下で除去する。残留物を４：１ＤＣＭ／ＩＰＡに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液および塩水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して、減圧下で濃縮する。０から１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（１４５ｍｇ、６２％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４２（Ｍ＋Ｈ）。
【０１６７】
以下の化合物を、実質的に実施例７４の方法によって調製する。
【表１３】
0006379296.tif 000126
【０１６８】
実施例７６
トランス５−（３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１６９】
実施例７７
トランス５−（３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化１１１】
0006379296.tif 000127
実施例６６および６７に記載のようなラセミ，トランス５−（３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミドから２つのエナンチオマーを分離して実施例７６、異性体１（５０ｍｇ、２２％、９９．４％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＡ（ｍ／ｚ）：４４２（Ｍ＋Ｈ）、および実施例７７、異性体２（５０ｍｇ、２２％、９８．９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４２（Ｍ＋Ｈ）を与える。
【０１７０】
実施例７８
シス５−（３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１７１】
実施例７９
シス５−（３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化１１２】
0006379296.tif 000128
２つのエナンチオマーを、７０ｇ／分の流速で、２５％ＭｅＯＨ／ＣＯ２で溶離する、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＯＪ−Ｈ、２１×２５０ｍｍカラムを用いてキラルクロマトグラフィーによってラセミ，シス５−（３−フルオロ−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（１７５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）から分離して実施例７８、異性体１（３０ｍｇ、１７％、９７．５％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４２（Ｍ＋Ｈ）、および実施例７９、異性体２（５０ｍｇ、２９％、９９．３％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４２（Ｍ＋Ｈ）を与える。
【０１７２】
実施例８０
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化１１３】
0006379296.tif 000129
ジオキサン（４０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）中の５−ブロモ−Ｎ−（１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（１．００ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル２−オキソ−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−３，４−ジヒドロピリジン−１（２Ｈ）−カルボキシラート（１．１２ｇ、３．４７ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニル−ホスフィン）パラジウム（０）（１４８ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）の混合物を、１００℃に加熱する。２４時間後、反応混合物を周囲温度に冷却する。溶媒を減圧下で除去する。残留物を４：１ＤＣＭ／ＩＰＡに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液および塩水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。逆相クロマトグラフィー、移動相Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ：ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡによって精製する。Ａ中の１０から５０％Ｂで溶離する。０から１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製して標記化合物（１８０ｍｇ、１７％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２０（Ｍ＋Ｈ）。
【０１７３】
実施例８１
５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化１１４】
0006379296.tif 000130
クロロスルホン酸（０．４３０ｍＬ、６．５１ｍｍｏｌ）を、０℃でＤＣＭ（６０ｍＬ）中の３，３−ジメチル−５−（チオフェン−２−イル）−３，４−ジヒドロピリジン−２（１Ｈ）−オン（４５０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）の氷冷した溶液に加える。１５分後、冷却浴を除去して反応混合物を周囲温度に温まらせる。１．５時間後、反応混合物を氷冷した塩水に注ぐ。ＤＣＭ（４×）で抽出する。有機抽出物を組み合わせて、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。氷浴中で０℃で残留物を冷却する。７−アミノ−６−フルオロ−１，２−ジヒドロイソキノリン−１−オン（１９４ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）およびピリジン（５ｍＬ）を加える。追加後冷却浴を除去して反応混合物を周囲温度に温まらせる。１６時間後、ｐＨ＝１まで５Ｎ  ＨＣｌ水溶液を加える。ＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を組み合わせて１Ｎ  ＨＣｌ水溶液および塩水で洗う。硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。０から１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残留物を精製して標記化合物（２８０ｍｇ、５７％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４８（Ｍ＋Ｈ）。
【０１７４】
実施例８２
５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリダジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化１１５】
0006379296.tif 000131
五塩化リン（２００ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を、０℃で氷冷したクロロスルホン酸（０．１６ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）に加える。１５分後、５，５−ジメチル−３−（２−チエニル）−１，４−ジヒドロピリダジン−６−オン（２００ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を加える。冷却浴を除去して反応混合物を周囲温度に温まらせる。４時間後、反応混合物を氷冷した塩水に注ぐ。ＥｔＯＡｃで抽出する。有機層を組み合わせて、硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して残留物を与える。７−アミノ−６−フルオロ−１，２−ジヒドロイソキノリン−１−オン（１３７ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）およびピリジン（５ｍＬ）を、残留物に加える。１７時間後、溶媒を減圧下で除去する。ＳＣＸカラム上に充填する。ＭｅＯＨで溶離してろ液を濃縮する。残留物を、０から１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離する、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。生成物を含有する画分を、減圧下で濃縮する。逆相クロマトグラフィー、移動相Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ：ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡによってさらに精製する。Ａ中１０から４５％Ｂで溶離して、標記化合物（２０ｍｇ、６％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４９（Ｍ＋Ｈ）。
【０１７５】
以下の化合物を、実質的に実施例８２の方法によって調製する。
【表１４】
0006379296.tif 000132
【０１７６】
代替の調製例８２
１，３−ジクロロ−５，５−ジメチルヒダントイン（１７ｇ、８６ｍｍｏｌ）を、追加の間内部温度を＜２５℃に維持して０℃でＡＣＮ（２９０ｍＬ）、酢酸（９．５ｍＬ）および水（１９ｍＬ）中の６−［５−（ベンジルスルファニル）チオフェン−２−イル］−４，４−ジメチル−４，５−ジヒドロピリダジン−３（２Ｈ）−オン（１９ｇ、５７ｍｍｏｌ）の懸濁液に一部ずつ加える。ＭＴＢＥ（２００ｍＬ）を反応混合物に加えて白色固体をろ過し、ＭＴＢＥで洗い、乾燥し、収集して中間化合物、５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４−ジヒドロピリダジン−３−イル）チオフェン−２−スルホニルクロリドを与える。ろ液を濃縮乾固し、ＤＣＭに溶解し、水相＞５の最終ｐＨまでＮａＨＣＯ３飽和水溶液で洗う。有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空で黄色固体に濃縮する。両方の固体をＭＴＢＥ中に懸濁させて摩砕する。白色固体をろ過し、ＭＴＢＥで洗い、乾燥し、収集して８６％純度の５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４−ジヒドロピリダジン−３−イル）チオフェン−２−スルホニルクロリド化合物（１３．１ｇ、６４％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０５（Ｍ−Ｈ）。
【０１７７】
５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４−ジヒドロピリダジン−３−イル）チオフェン−２−スルホニルクロリド（１３．１ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）を、０℃でピリジン（７９ｍＬ）中の７−アミノ−６−フルオロ−１，２−ジヒドロイソキノリン−１−オン（５．８９ｇ、３３ｍｍｏｌ）の溶液に小分けに加える。室温で２．５時間撹拌する。濃縮乾固する。残留物を、橙色懸濁液が形成するまでＤＣＭ（１００ｍＬ）で超音波処理する。固体をろ過し、ＤＣＭおよびＭＴＢＥで洗い、乾燥して、標記化合物（１４ｇ、８０％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４９（Ｍ＋Ｈ）。
【０１７８】
実施例８４
５−（５−エチル−５−メチル−６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（５−（５−Ｅｔｈｙｌ−５−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｘｏ−１，４，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌ）−Ｎ−（６−ｆｌｕｏｒｏ−１−ｏｘｏ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−７−ｙｌ）ｔｈｉｏｐｈｅ２ｎｅ−２−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、異性体１
【０１７９】
実施例８５
５−（５−エチル−５−メチル−６−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化１１６】
0006379296.tif 000133
２つのエナンチオマーを、７０ｇ／分の流速で、４０％ＭｅＯＨ／ＣＯ２で溶離する、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ、２１．２×１５０ｍｍカラムを用いてキラルクロマトグラフィーによってラセミ５−（５−エチル−５−メチル−６−オキソ−１，４−ジヒドロピリジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（１９０ｍｇ、０．４１２ｍｍｏｌ）から分離して、実施例８２、異性体１（８５ｍｇ、４５％、＞９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６２（Ｍ＋Ｈ）、および実施例８３、異性体２（８５ｍｇ、４５％、＞９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６２（Ｍ＋Ｈ）を与える。
【０１８０】
実施例８６
ラセミＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（４−ヒドロキシシクロペンタ−１−エン−１−イル）チオフェン−２−スルホンアミド
【化１１７】
0006379296.tif 000134
テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド（ＴＨＦ中１Ｍ、８ｍＬ）を、５−［４−［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシシクロヘキセン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド（０．１３５ｇ、０．２５２ｍｍｏｌ）に加える。室温で１．５時間撹拌する。飽和アンモニウムクロリドを加え、次いでＥｔＯＡｃで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥して、減圧下で濃縮する。粗製物質を、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９５：５）で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して無色油脂を与える。ＤＣＭを油に加え得られる固体をろ過して標記ラセミ化合物（１１０ｍｇ、８１％）を与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０７．１（Ｍ＋Ｈ）。
【０１８１】
実施例８７
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（４−ヒドロキシシクロペンタ−１−エン−１−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体１
【０１８２】
実施例８８
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（４−ヒドロキシシクロペンタ−１−エン−１−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、異性体２
【化１１８】
0006379296.tif 000135
ラセミＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−（４−ヒドロキシシクロペンタ−１−エン−１−イル）チオフェン−２−スルホンアミドを、２２５ｎｍにおける検出で、７０ｇ／分の流速で４０％エタノール：６０％ＣＯ２で溶離するＬｕｘ  ５ｕ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−２、２１ｘ２５０ｍｍカラムを用いてキラルクロマトグラフィーで分離して実施例８７、異性体１（２２ｍｇ、１６．６％、＞９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０７．１（Ｍ＋Ｈ）および実施例８８、異性体２（２５ｍｇ、１９％、＞９９％ｅｅ）、ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）、４０７．１（Ｍ＋Ｈ）を与える。
【０１８３】
以下の化合物を、実質的に実施例８７および８８の方法によって調製する。
【表１５】
0006379296.tif 000136
【０１８４】
がんは、その開始および進行が、ＤＮＡ修復、ゲノム安定性、細胞増殖、細胞死、接着、血管新生、浸潤、ならびに細胞および組織微小環境における転移を調節する１種または複数の遺伝子の異常性の機能によって誘発される異種の疾患の集合とますます認識されている。「がん」遺伝子の変異形または異常性の機能は、自然に発生するＤＮＡ多形現象、ゲノムコピー数の変化（増幅、欠失、染色体消失、または複製による）、遺伝子および染色体構造の変化（染色体転座、逆位、または脱調節遺伝子発現に繋がる他の再配列による）、ならびに点突然変異体から生じ得る。がん新生物は、１つの異常性遺伝子機能によって誘発され、かつ同一の異常性遺伝子機能によって維持される場合があり、または維持および進行がさらなる異常性遺伝子機能によって悪化する。
【０１８５】
上述の遺伝子の染色体異常以外に、がんのそれぞれは、ＤＮＡメチル化、ゲノム刷り込み、およびアセチル化、メチル化、またはリン酸化によるヒストン修飾を含めたゲノムの後成的修飾も含み得る。後成的修飾は、悪性腫瘍の誘発および／または維持において役割を果たし得る。
【０１８６】
ヒトがんにおける細胞遺伝学的異常の広範な目録が、編纂されておりかつオンラインで維持および定期的に更新されている（米国立がん研究所（ＮＣＩ）がんゲノム解剖プロジェクト（ＣＧＡＰ）ウェブサイトのＴｈｅ  Ｍｉｔｅｌｍａｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。データベースには、本発明の悪性腫瘍の少なくとも一部に関する染色体異常が含まれる。Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔは、腫瘍形成と因果的に関連してきた全てのヒト遺伝子の詳細化されたオンライン「Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／Ｃｅｎｓｕｓを参照）ならびにヒトがんにおける体細胞突然変異のＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃを参照）を維持している。種々のがんと因果的に関連する細胞遺伝学的変化の豊富な情報を含むさらなる情報源は、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（ｈｔｔｐ：／／ａｔｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｓｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／／Ａｎｏｍａｌｉｅｓ／Ａｎｏｍｌｉｓｔｅ．ｈｔｍｌ＃ＭＤＳ）である。これらのデータベースにも、本発明の悪性腫瘍の少なくとも一部に関する染色体異常が含まれる。
【０１８７】
生検、免疫表現型検査および他の試験によるがん悪性腫瘍の診断は、既知であり、日常的に用いられる。高分解能染色体分染法および高度な染色体の画像化技術に加えて、がんが疑われる症例における染色体異常は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、核型分析、スペクトル核型分析（ＳＫＹ）、多重ＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、単一ヌクレオチド多形現象アレイ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｒｒａｙｓ）（ＳＮＰ  Ｃｈｉｐｓ）および当業者に既知のかつ用いられている他の診断および分析試験などの細胞遺伝学的分析によって決定され得る。
【０１８８】
抗葉酸剤は、葉酸代謝サイクル内の１種または複数の標的酵素を阻害することによって葉酸の作用に干渉し、増殖に必要なＤＮＡ前駆物質の細胞を奪う。がん細胞は、急成長し、したがってＤＮＡ前駆物質に対する高い需要を有し、それらを抗葉酸剤の効果に対して特に感受性にする。葉酸代謝サイクルにおけるＡＩＣＡＲＦＴの選択的阻害を通して作用するものの、式Ｉの化合物は、メトトレキサート、ラリトレキセド、プララトレキサート、ペメトレキセド、ならびに５−フルオロウラシルを含めた既知の抗葉酸剤として同一および類似のがんに対して有効であると予想される。式Ｉの化合物が有効であると予想されるがんには、膠芽腫、子宮頸がん、子宮がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、頭頸部がん、腎臓がん、黒色腫、膵臓がん、肝臓がん、肺がん（中皮腫を含む）、大腸がん、胃がん、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫を含む）、線維芽細胞肉腫、慢性骨髄性白血病、または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ；Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、および単球性白血病を含む）が含まれる。
【０１８９】
以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ調査は、ＡＩＣＡＲＦＴを阻害すること、ＡＩＣＡＲＦＴを阻害することに対する選択性、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性における、例示された式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の阻害活性および有効性を実証する。これらのアッセイは、一般にはヒト臨床化学療法活性を表すとして当業者に認識されている。ＡＩＣＡＲＦＴ阻害活性および有効性の証拠となるアッセイは、実質的に以下のようにまたは類似のデータを与える類似のアッセイによって実行してよい。
【０１９０】
アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖性アッセイ
クローン作成＆酵素精製
ヒトＡＩＣＡＲＦＴ（ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿００４０４４．６）ｃＤＮＡは、Ｏｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏ．から購入する（カタログ番号ＭＨＳ１０１１−６２３１０、クローンＩＤ：４３００５７０、受託：ＢＣ００８８７９）。完全長ヒトＡＩＣＡＲＦＴをエンコードするヌクレオチド配列を、Ｎ末端ＨＩＳタグを有するｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターに挿入する。細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を発現宿主として用いて、タンパク質発現の誘導を１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む２×ＴＹ培地において１８℃で一晩実行する。細胞ペレットを、次のタンパク質精製のために−８０℃で保存する。タンパク質精製を４℃で行う。凍結細胞ペレットを、細胞ペレット１リットル当たり５０ｍＬの冷溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５ｍｇ／ｍＬ  リゾチーム、５Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭイミダゾール、およびＲｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅプロテアーゼ阻害剤）において撹拌しながらインキュベーションおよび音波処理によって溶解する。細胞溶解物を、Ｂｅｃｈｍａｎ  ＪＡ−１８ロータにおいて４５分間１６，５００ｒｐｍで遠心分離によって清澄にする。上清を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）で３時間インキュベートし、その後に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する１０樹脂体積の緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭイミダゾール）での最初のバッチ洗いが続く。次いで樹脂をカラムに充填して緩衝液Ａで洗う。ＨＩＳタグ付きのＡＩＣＡＲＦＴタンパク質を、緩衝液Ａ中１０〜５００ｍＭイミダゾールグラジエントで溶離する。溜まったＨＩＳ−ＡＩＣＡＲＦＴを含有する画分を、濃縮し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填して、保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール）で溶離する。ＨＩＳ−ＡＩＣＡＲＦＴを含有する画分を溜めてＢＳＡを標準として用いてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによってタンパク質濃度を決定する。タンパク質を分取して−８０℃で保存する。
【０１９１】
テトラヒドロホラート基質合成
酵素反応の基質の１つ、１０−ホルミルテトラヒドロホラート（１０−Ｆ−ＴＨＦＡ）は、限定された化学安定性を有し、したがってＡＴＩＣ酵素アッセイを実行する日と同日に合成する。一般的な合成経路は、Ｐ．Ｒｏｗｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８、７３３〜７３５、（１９７１年）およびＪ．Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６、８１４〜８１５、（１９６３年）に記載されている。本合成における第１のステップは、フォリン酸（Ｓｉｇｍａ  ＣＡＳ  １４９２−１８−８）の５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸（５，１０−Ｍ−ＴＨＦＡ）への変換である。この変換は、典型的には酵素アッセイを実行する前の日に行うが、最大１週間前に実行して室温で保存してもよい。フォリン酸（８１．６ｍｇ）に、β−メルカプトエタノール（２ｍＬ）を加えて、３７％濃ＨＣｌ（８０μＬ）を加える。この反応を、時々混合しながら最低３時間室温でインキュベートする。透明から黄色に視覚的に色が変わり、フォリン酸の５，１０−Ｍ−ＴＨＦＡへの完全な変換が石英キュベットを用いるスペクトル分析によって観察される。ＵＶ吸収は、本ステップの間に２６６ｎｍから３５６ｎｍに変化するであろう。これは、５，１０−Ｍ−ＴＨＦＡの８０ｍＭの溶液を生じる。アッセイの朝、８０ｍＭの５，１０−Ｍ−ＴＨＦＡを、（その日に新たに作成した）４０μＭのアンモニウムビカルボナートにおいて１．６ｍＭに希釈する。この反応を、室温で３〜５時間インキュベートする。黄色から透明に視覚的に色が変わり、５，１０−Ｍ−ＴＨＦＡの１０−Ｆ−ＴＨＦＡへの変換が石英キュベットを用いるスペクトル分析によって観察される。ＵＶ吸収は、本ステップの間に３５６ｎｍから２５８ｎｍに変化するであろう。これは、１０−Ｆ−ＴＨＦＡの１．６ｍＭの溶液を生じる。試験化合物を、１０ｍＭの原液を作成するためにＤＭＳＯにおいて調製する。原液を、ＤＭＳＯにおいて３倍に段階的に希釈して１００μＭから５ｎＭの最終化合物濃度範囲で１０点希釈曲線を取得する。アッセイにおける最終ＤＭＳＯ濃度は、５％である。
【０１９２】
酵素アッセイ手順
３８４−ウェルポリプロピレンアッセイプレート（ＮＵＮＣ  ２６４５７３）のそれぞれのウェルに、１μＬのＤＭＳＯ（対照ウェル）またはＤＭＳＯ中の化合物および水中の９μＬの５５．５６μＭ  ＺＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＣＡＳ３０３１−９４−５）を加える。次いで、１０μＬの２００μＭ  １０−Ｆ−ＴＨＦＡおよび４０μＭのアンモニウムビカルボナート中の６ｎＭ  ＡＴＩＣ酵素を加える。１００％阻害を定義するために用いたウェルから酵素を除外する。最終アッセイ条件は、２５μＭ  ＺＭＰ、１００μＭ  １０−Ｆ−ＴＨＦＡ、３ｎＭ  ＡＴＩＣ酵素、および２０μＭアンモニウムビカルボナートである。アッセイを室温で１時間インキュベートし、その後４０μＬのＡＣＮを加えて反応を停止する。
【０１９３】
ＡＩＣＡＲＦＴ生化学アッセイの阻害は、ＩＭＰおよびＺＭＰからのシグナルを観察する液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法によって決定される。方法は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ３００クロマトグラフィーシステムおよびＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ６５００（商標）三連四重極型質量分析計をＡｎａｌｙｓｔ（登録商標）２．１ソフトウェアと共に利用した。生化学試料を、０．６秒間の（約３０μＬ）採取時間および１．２５ｍＬ／分で流れる１０％ＡＣＮ中１ｍＭアンモニウムアセタートの添加緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いる特定用途向けに詰めたポリマー弱陰イオン交換ガードカラムに充填する。試料を１秒間洗い、次いで１．２５ｍＬ／分の合計流速で２０ｍＭアンモニウムアセタート、ｐＨ１０およびＡＣＮの６０：４０混合物を用いて２秒間溶離する。溶離に続いて、次の注入の開始の前にカラムを添加緩衝液で３０００ミリ秒間再平衡させる。このシステムは、約９秒間／試料の合計サイクル時間を有する。
【０１９４】
質量分析計を、７５０℃の発生源温度で陰イオンＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）複数反応モニタリングモードで運転する。それぞれの分析物の前駆物質およびフラグメントイオンは、ＩＭＰ（３４７→７９）およびＺＭＰ（３３７→７９）である。ＩＭＰおよびＺＭＰについてのピーク面積を、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ（商標）バージョン２．１を用いて決定する。ＩＭＰおよびＺＭＰピーク面積の和で割ったＩＭＰピーク面積を、反応の変換率を概算するために用いる。変換率を、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ  ４．０を用いて４パラメータロジスティック方程式に適合させてＩＣ５０値を決定する。本アッセイにおいて試験した例示された化合物の代表的な活性の特有の値を、表１５に示す。
【表１６】
0006379296.tif 000137
【０１９５】
表１５におけるデータは、実施例１、８、３３、４１、４６、８１、および８４の化合物が、本アッセイにおいてＡＩＣＡＲＦＴを阻害することを実証する。
【０１９６】
低葉酸培地
１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（５ｍＬ）、１００ｍＭピルビン酸Ｎａ（５ｍＬ）および０．５ｇ／ｍＬグルコース（２．５ｍＬ）を含む５００ｍＬのＧｉｂｃｏ葉酸不含ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃２７０１６−０２１）を補給して、高葉酸ＡＴＣＣ  ＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ  ＃３０−２００１）につり合わせる。完全培地を作成するために、通常および葉酸不含ＲＰＭＩ培地の両方に１０％ＦＢＳを補給する。葉酸不含培地へのＦＢＳの追加は、低レベルの葉酸を追加し、これで低葉酸培地であるとみなされる。
【０１９７】
低葉酸培地培養ＮＣＩ  Ｈ４６０細胞におけるＺＭＰのＭＳ検出
完全高葉酸ＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ  ＃３０−２００１）においてＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を、細胞のコンフルエンスが約８０％に達するまで成長させる。細胞をＰＢＳで洗い、トリプシン処理し、細胞を完全低葉酸ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃２７０１６−０２１）に再懸濁させて細胞計数を実行する。１．２５×１０６個の細胞を、完全低葉酸ＲＰＭＩ培地（４０ｍＬ）を含有するＴ２２５フラスコに移す。７日間成長させる。コンフルエンスが８０％を超えた場合は完全低葉酸培地で再び細胞を分割する。細胞をＰＢＳで洗い、トリプシン処理し、細胞を完全低葉酸ＲＰＭＩ培地に再懸濁させて、細胞計数を実行する。クライオバイアル１つ当り１０×１０６個の細胞を完全低葉酸培地（１ｍＬ）＋５％ＤＭＳＯに分取する。細胞凍結装置を用いて細胞を−８０℃の冷凍庫内で緩速かつ制御された手法で凍結する。翌日、長期保存のために細胞を液体窒素に移す。クライオバイアルからの凍結細胞を３７℃の水浴中で解凍し、細胞を低葉酸アッセイ培地：葉酸不含ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、＃２７０１６−０２１）、グルコース（Ｓｉｇｍａ、＃Ｇ５７６７）、Ｈｅｐｅｓ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３０２３７．０１）、ピルビン酸Ｎａ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃Ｓｈ３０２３９．０１）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００７０．０３）で１回洗う。細胞濃度を培地で２５０，０００細胞／ｍＬに調節し、Ｂｉｏｃｏａｔポリ−Ｄ−リシン９６−ウェルプレート（ＢＤ、＃３５−４６４０）内に１００μｌ／ウェル（２５，０００細胞／ウェル）を加えることによって細胞を平板培養して、５％ＣＯ２で３７℃で一晩インキュベートする。細胞を、３％ＤＭＳＯを含有する培地で希釈した２０μｌ／ウェルの化合物で処理する。５％ＣＯ２で３７℃で１６時間インキュベートし、次いで培地を除去して１×ＳｕｒｅＦｉｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０μＬ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｅｍ、ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）Ｋｉｔ構成要素）をそれぞれのウェルに加え静かに振とうしながら室温で１０分間インキュベートする。
【０１９８】
ＡＩＣＡＲＦＴ阻害のＺＭＰ、２’−デオキシウリジン５’−モノホスファート（ｄＵＭＰ）およびＮ１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド（ＡＩＣＡｒ）の濃度への細胞効果を、ＬＣ−ＭＳによって決定する。９６−ウェルプレートにおいて成長した細胞は、培地が除去されておりＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）溶解緩衝液に溶解する。５〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度のＺＭＰ、ｄＵＭＰおよびＡＩＣＡｒを含む標準曲線を、４０ｍＭアンモニウムアセタート、ｐＨ４において調製する。それぞれの標準または試料のアリコート（４０μＬ）を、深型９６−ウェルプレートにおいて４０ｍＭアンモニウムアセタート、ｐＨ４中１００ｎｇ／ｍＬで１３Ｃ５−ＺＭＰ（カスタム合成）および１３Ｃ５−ＡＩＣＡｒ（カスタム合成）を含有する１６０μＬの内部標準溶液と組み合わせる。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸリキッドハンドラーを用いて４００μＬのＤＣＭをそれぞれの試料に加える。試料を密閉し、５分間ボルテックスして、少なくとも３０分間冷却装置内に置く。試料を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離機を用いて４，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離し、Ｂｉｏｍｅｋリキッドハンドラーを用いて７５μＬの水層を清浄な９６−ウェルプレート内に移す。分析の前にプレートを密閉する。
【０１９９】
ＬＣ−ＭＳ法は、Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）２．１ソフトウェアを実行しているＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ５５００（商標）またはＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ６５００（商標）三連四重極型質量分析計に接続したＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ２０Ａ  ＨＰＬＣシステムを利用する。抽出した試料を、１５μＬの注入体積および１ｍＬ／分の流速でＴｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（商標）Ｊａｖｅｌｉｎカードカラム（２．１×２０ｍｍ、５μＭ）を用いて分離する。移動相Ａは、５０ｍＭアンモニウムホルマート、ｐＨ４およびＡＣＮの９５：５混合物である。移動相Ｂは、０．３％ギ酸および２％濃アンモニウムヒドロキシド溶液（ｖ／ｖ）を添加したＡＣＮおよびＭｅＯＨの７０：３０混合物である。グラジエントは次の通りである：０分、０％Ｂ；０．２５分、０％Ｂ；２．００分、３０％Ｂ；２．０１分、９５％Ｂ；３．５０分、９５％Ｂ、３．５１分、０％Ｂ、５．００分、停止。
【０２００】
質量分析計を、７００℃の発生源温度で陽イオンＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）複数反応モニタリングモードで運転する。それぞれの分析物の前駆物質およびフラグメントイオンは、ＺＭＰ（３３９→１１０）、１３Ｃ５−ＺＭＰ（３４４→１１０）、ｄＵＭＰ（３０９→８１）、ＡＩＣＡｒ（２５９→１２７）および１３Ｃ５−ＡＩＣＡｒ（２６４→１２７）である。較正曲線を、分析物濃度対分析物／内部標準ピーク面積比をプロットすることおよびＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ（商標）２．１ソフトウェアで重み付けして１／濃度を用いてデータの線形回帰を実行することによって構築する。逆算したＺＭＰ濃度を、ＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ４．０を用いて４パラメータロジスティック方程式に適合させてＩＣ５０値を決定する。本アッセイにおいて試験した例示された化合物の代表的な活性の特有の値を、表１６に示す。
【表１７】
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【０２０１】
表１６におけるデータは、培地中の低レベルの葉酸の存在がある程度調節するものの、実施例１、８、３３、４１、４６、８１、および８４の化合物は、本アッセイにおいてまだＡＩＣＡＲＦＴを阻害することを実証する。
【０２０２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖アッセイ
実施例１および４１のＩｎ  ｖｉｔｒｏでの抗増殖活性を、ＡＴＣＣ、ＣＡＳＴＣＣ、ＣＬＳ、ＤＳＭＺ、ＥＣＡＣＣ、ＨＳＲＲＢ、ＩＣＬＣ、ＪＣＲＢ、ＮＣＩ、ＲｉｋｅｎおよびＳＮＵ細胞バンクから得られる副腎、自律神経節、胆道、血液ＡＬＬ、血液ＡＭＬ、血液ＣＭＬ、血液ホジキンリンパ腫、血液リンパ腫、血液多発性骨髄腫、血液ＮＨＬ、血液ＲＡＥＢ、骨、乳房ＥＲ＋、乳房線維芽細胞、混合型乳房線維芽細胞（ｂｒｅａｓｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｍｉｘｅｄ）、乳房ＨＥＲ２、正常乳房（ｂｒｅａｓｔ  ｎｏｒｍａｌ）、トリプルネガティブ乳房、子宮頸部、ＣＮＳ、子宮内膜、眼球、正常線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｎｏｒｍａｌ）、腎臓ｎｓ（ｋｉｄｎｅｙ  ｎｓ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ  ｒｅｎａｌ）、大腸、肝臓、正常肝臓（ｌｉｖｅｒ  ｎｏｒｍａｌ）、肺腺癌、肺ｎｓ（ｌｕｎｇ  ｎｓ）、肺ＮＳＣＬＣ、混合型肺ＮＳＣＬＣ（ｌｕｎｇ  ＮＳＣＬＣ  ｍｉｘｅｄ）、肺ＳＣＬＣ、肺扁平上皮、黒色腫、正常黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｎｏｒｍａｌ）、食道腺癌、食道ｎｓ（ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ｎｓ）、食道扁平上皮、卵巣、膵臓腺癌、膵臓管癌、膵臓ｎｓ（ｐａｎｃｒｅａｓ  ｎｓ）、胸膜中皮腫、前立腺腺癌、前立腺小細胞、唾液腺、小腸、軟組織、胃、精巣、甲状腺、甲状腺扁平上皮、正常臍静脈内皮細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｅｌｌ  ｎｏｒｍａｌ）、上気道消化管扁平上皮、尿路ｎｓ（ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｎｓ）、尿路移行上皮癌、および陰門扁平上皮由来の細胞株のパネルに対する細胞数計数アッセイによって決定する。細胞を、試料取得の日に細胞バンク推奨培養条件を用いて成長させる。適切なウマ血清（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６０５０１３０）またはＦＢＳ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１００９９−１４１またはＨｙｃｌｏｎｅカタログ番号ＣＨ３０１６０．０３）および添加剤を追加して完全培地を調製する。
【０２０３】
付着した細胞株については、真空ポンプを用いて培養培地を除去して廃棄する。細胞層を、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−０．０３８％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ溶液で簡単にすすいでトリプシン阻害剤を含有する血清を残さず除去する。３．０ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液をフラスコに加えて細胞層が分散するまで倒立顕微鏡下で細胞を観察する。８．０ｍＬの完全成長培地を加えてピペット操作によって静かに細胞を吸引する。
【０２０４】
懸濁液細胞株については、細胞懸濁液を遠心管に移して８００〜１０００ｒｐｍで３〜５分間遠心分離する。真空ポンプを用いて上清を捨てる。適切な体積の完全培地を加える。ピペット操作によって静かに細胞ペレットを懸濁させる。細胞数を計数して細胞を適切な播種密度に調節する。１００μｌ（４８、９６および１２０時間で試験する細胞の場合）または２００μｌ（１４４時間で試験する細胞の場合）の細胞懸濁液を、計画的なプレートレイアウトに従って９６−ウェル白色壁透明底プレート（例えばＣｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３７０７または３６１０）に加えプレートをＣＯ２インキュベーター内に一晩置く。
【０２０５】
増殖アッセイにおいて試験する化合物の２ｍＭ  ＤＭＳＯ原料を調製する。試験する濃度を決定して化合物を低葉酸培地において２００×最終濃度に希釈する。ＤＭＳＯは、希釈剤である。希釈剤において化合物の１：３段階希釈を実行する。０．５または１μｌ／ウェルの希釈した化合物を、平板培養した細胞に加える。化合物の最終濃度は、１×になる。プレートを、それぞれの細胞株について決定した通りに３７℃で約２倍加時間インキュベートする。倒立顕微鏡下で細胞形態を観察する。プレートおよびその内容物を約３０分間室温に平衡させる。１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７１）を、アッセイプレートに加える。内容物を、オービタルシェーカー上で２分間混合して細胞溶解を誘発する。プレートを室温で１０分間インキュベートさせて発光シグナルを安定させる。透明底を白色裏面封止材と張り合わせてＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で発光を記録する。設定は、発光（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、積分時間５００ｍｓにすべきである。それぞれの試料について阻害％を決定する（表１７を参照）。
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【０２０６】
表１７におけるデータは、本アッセイにおいて試験した実施例１および４１の化合物が、標準培地条件下でがん細胞の増殖を阻害することを実証する。本アッセイからの代表的なデータとして、実施例１および実施例４１は、標準培地条件下で、評価した４９の肺腺癌細胞株のうちの１つにおいて大細胞肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０についてそれぞれ０．６１μＭおよび１．８８μＭのＩＣ５０を実証し、２８の大腸細胞株うちの１つにおいて、結腸直腸癌ＨＣＴ−１１６についてそれぞれ８．１μＭおよび１０．８μＭのＩＣ５０を実証した。
【０２０７】
低葉酸ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ
実施例１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を、ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ、ＪＣＲＢ、およびＲｉｋｅｎ細胞バンクから得られる肺、結腸直腸、胃、膵臓、肝臓、乳房、脳、黒色腫、膵臓、線維肉腫、腎臓、Ｔ細胞白血病、リンパ芽球、単球およびＣＭＬ由来の４６のがん細胞株のパネルに対する細胞数計数アッセイによって決定する。高葉酸ＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ  ＃３０−２００１）＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＃ＳＨ３００７０．０３）において成長している細胞を、低葉酸ＲＰＭＩ培地に移して７日間葉酸飢餓にする。高葉酸培地において成長した細胞をＰＢＳで洗い、トリプシン処理して、低葉酸培地に再懸濁させる。低葉酸培地において細胞を７日間成長させて７日後８０％コンフルエンスを超えない密度になるように組織培養フラスコに播種する。細胞をＰＢＳ中で洗い、トリプシン処理し、低葉酸培地に再懸濁させて細胞を計数する。１００μｌ低葉酸培地中３０００細胞／ウェルで９６ウェルポリＤリシンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３５４６４０）に播種する。細胞を一晩付着させる。増殖アッセイにおいて試験する化合物の１０ｍＭ  ＤＭＳＯ原料を調製する。試験する濃度を決定して化合物を低葉酸培地において２×最終濃度に希釈する。この溶液のＤＭＳＯ％を計算してこの値を希釈剤として用いる。希釈剤において化合物の１：２または１：３段階希釈を実行する。１００μｌ／ウェルの希釈した化合物を、平板培養した細胞に加える。化合物の最終濃度は、１×になる。最終ＤＭＳＯ％が０．５％を超えないことを徹底させる。最大および最小シグナル基準対照を、カラム＃１（２μＭスタウロスポリン）およびカラム＃１２（１／２希釈剤濃度のＤＭＳＯ）用に確保する。細胞に当該の化合物を７日間投薬する。増殖結果を測定するために、１／１０体積のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存性試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＡＬ−１１００）をそれぞれのウェルに加える。プレートを組織培養インキュベーターに戻して約１．５〜４時間反応を進行させる。５７０ｎｍにおける励起および５８５ｎｍにおける放射で、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、または他の蛍光プレートリーダー上でプレートを読み取る。それぞれの試料について阻害％を決定する（表１８を参照）。
【表１９】
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【０２０８】
表１８におけるデータは、実施例１、本アッセイにおいて試験した例示される化合物が、ヒト血漿と同様の葉酸レベルで培地条件下でがん細胞の増殖を阻害することを実証する。本アッセイからの代表的なデータとして、実施例１は、低葉酸培地において、２１の肺細胞株のうちの１つにおいて大細胞肺がんＮＣＩ−Ｈ４６０について２０ｎＭのＩＣ５０を立証し、６の胃腸細胞株のうちの１つにおいて結腸直腸癌ＨＣＴ−１１６について、３ｎＭのＩＣ５０を立証した。
【０２０９】
ヒト癌腫マウス異種移植モデルにおける抗腫瘍効果
実施例１のｉｎ  ｖｉｖｏ抗がん活性を、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖性アッセイデータに基づいて感受性であると予測されるヒト結腸直腸腺がん細胞株ＨＣＴ−１１６およびヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０マウス異種移植腫瘍モデルにおいて調査する。Ｉｎ  ｖｉｖｏ調査を、初回測定時に２３〜２８ｇの体重を有する雌の無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ）を用いて実行する。受け取り時および調査を通して、動物は、接した寝床を備えた適切なサイズの堅牢な底のケージ内に１ケージ当たり５匹を収容する。動物室を、１２時間の明暗周期に維持する。動物を、自由な低葉酸食餌（Ｔｅｋｌａｄ  １３０４５１）および加圧滅菌した水道水を自由に与えてＮＣＩ−Ｈ４６０またはＨＣＴ−１１６細胞の組織移植に先立って１４日間順応させる。ＨＣＴ−１１６およびＮＣＩ−Ｈ４６０細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から取得しＡＴＣＣの指示に従って培養する。組織移植のために用いた細胞は、対数期成長時に採取して無血清培地に懸濁させる。懸濁させた細胞を、次いでＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ（ｒｅｆ  ３５４２３４）で１：１希釈する。細胞を、５．０Ｅ＋０６細胞（０．２ｍＬ細胞／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液）で右脇腹に注射する。腫瘍を、移植後８日に開始して観察する。動物を、平均腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時に独自開発の無作為化ソフトウェアを利用して１群当り５〜６動物を含む群に再分配する。群１〜１２は、投薬開始の２８時間前およびそれぞれの投薬の４時間前に開始した表１９に一覧表示した投薬量で低葉酸食餌（Ｔｅｋｌａｄ  １３０４５１）および葉酸（Ｓｉｇｍａ  Ｆ８７９８ロット＃ＳＬＢＨ０９０９Ｖ）投与を維持する。葉酸を、ＰＢＳにおいて週に１回製剤して０．２ｍＬで強制経口投与によって投薬する。群１３〜１６は、無作為で標準固形飼料（Ｔｅｋｌａｄ  ２９２０Ｘ）で飼育する。化合物を、１モル当量のＮａＯＨを加えたリン酸緩衝液ｐＨ８中の２０％ＨＰＢＣＤにおいて週に１回製剤する。製剤した化合物を、強制経口投与によって表１９に示した投薬量およびスケジュールで投与する（０．２ｍＬ）。ビヒクルも、調査のコントロールアームとしてＱＤで与える。腫瘍体積および体重を、週２回測定する。腫瘍体積を、キャリパ測定（ｍｍ）によっておよび楕円球体の式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅２／２（式中、長さおよび幅は、それぞれの測定において収集した垂直方向のより大きいおよびより小さい寸法を指す）を用いて測定する。動物挙動および動物健康状態を、投薬期間中１日１回観測する。調査を、表１９に示した最後の投薬後に終了する。
【０２１０】
腫瘍体積データの統計的分析は、時間および処理群にわたる分散を平均化するための対数尺度へのデータ変換で始める。対数体積データを、時間による二元配置反復測定分散分析およびＳＡＳソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．３）におけるＭＩＸＥＤ手順を用いる処理で分析する。反復測定のための相関モデルは、Ｓｐａｔｉａｌ  Ｐｏｗｅｒである。処置群を、各時点において対照群と比較する。ＭＩＸＥＤ手順をそれぞれの処置群に別々に用いて各時点における調整平均および標準誤差を計算する。どちらの分析も、各動物内の自己相関および大きい腫瘍を有する動物を調査から早期に除去した場合に発生するデータの損失を説明している。調整平均および標準誤差を、各処置群対時間についてプロットする。処置群を対照群と各時点において比較する分析は、ｌｏｇ１０腫瘍体積を使用してｐ値を生成する。示したｐ値の統計的有意性に関して、「＊」＝Ｐ＜０．０５である。
【０２１１】
デルタＴ／Ｃ、％計算を用いる。方程式：Ｔ＝処置群における最終腫瘍体積、Ｔ０＝処置群におけるベースライン腫瘍体積（Ｃ０と同じと仮定される）、Ｃ＝対照群における最終腫瘍体積、Ｃ０＝対照群におけるベースライン腫瘍体積（Ｔ０と同じと仮定される）、デルタＴ／Ｃ、％＝１００＊（Ｔ−Ｔ０）／（Ｃ−Ｃ０）。
【０２１２】
ＡＩＣＡＲＦＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ標的阻害（ＩＶＴＩ）アッセイ
ＡＩＣＡＲＦＴ阻害の経路関連分析物の濃度へのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を、腫瘍異種移植片の液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）分析によって決定する。ドライアイス上の腫瘍異種移植試料を、化学天秤で秤量し、２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋ  Ｔｕｂｅ（商標）に移して、ドライアイス上に置く。ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（８０：２０）中に１３Ｃ５−ＺＭＰ（１０００ｎｇ／ｍＬ）、１３Ｃ５−ＡＩＣＡｒ（５００ｎｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（０．１％）、およびギ酸（０．１％）を含有する内部標準溶液を調製して２０℃で保存する。試料管内の組織１ｍｇ毎に、１０μＬの内部標準溶液を加える。ＺＭＰ、ｄＵＭＰ、ＡＩＣＡｒを７．６〜５０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で含有する標準曲線を、内部標準溶液において別個に調製する。
【０２１３】
１つの５ｍｍスチールビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）をそれぞれの試料管に加えて管をウェットアイス上に１５分間置く。試料を、Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ上で１５Ｈｚで５分間均質化し、次いでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４３０Ｒ微量遠心機上で１３，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離する。それぞれの上清のアリコート（２００μＬ）を取り出して深型９６−ウェルプレート内に置く。それぞれの標準曲線溶液のアリコート（２００μＬ）も、深型９６−ウェルプレート内に置く。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸリキッドハンドラーでＤＣＭ（６００μＬ）および０．１％アスコルビン酸溶液（２００μＬ）をそれぞれのウェルに加える。プレートを密閉し、５分間ボルテックスし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離機上で４，０００ｒｐｍおよび４℃で５分間遠心分離する。上層のアリコート（７５μＬ）を清浄な９６−ウェルプレートに移し、追加の７５μＬの４０ｍＭアンモニウムアセタート、ｐＨ４をそれぞれのウェルに加える。分析の前にプレートを密閉する。ＬＣ−ＭＳ法は、Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアを実行しているＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ５５００（商標）またはＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ６５００（商標）三連四重極型質量分析計に接続したＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ２０Ａ  ＨＰＬＣシステムを利用した。抽出した試料を、１５μＬの注入体積および０．７５ｍＬ／分の流速で直列に接続した２つのＴｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（商標）Ｊａｖｅｌｉｎカードカラム（２．１×２０ｍｍ、５μＭ）を用いて分離する。移動相Ａは、５０ｍＭアンモニウムホルマート、ｐＨ４およびＡＣＮの９５：５混合物である。移動相Ｂは、０．３％ギ酸および２％濃アンモニウムヒドロキシド溶液（ｖ／ｖ）を添加したＡＣＮおよびＭｅＯＨの７０：３０混合物である。グラジエントは次の通りである：０分、０％Ｂ；０．２５分、０％Ｂ；４．００分、３０％Ｂ；４．０１分、９５％Ｂ；５．５０分、９５％Ｂ、３．５１分、０％Ｂ、７．５０分、停止。質量分析計を、７００℃の発生源温度で陽イオンＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）複数反応モニタリングモードで運転する。それぞれの分析物の前駆物質およびフラグメントイオンは、ＺＭＰ（３３９→１１０）、１３Ｃ５−ＺＭＰ（３４４→１１０）、ｄＵＭＰ（３０９→８１）、ＡＩＣＡｒ（２５９→１２７）、および１３Ｃ５−ＡＩＣＡｒ（２６４→１２７）である。較正曲線を、分析物濃度対分析物／内部標準ピーク面積比をプロットすることおよびＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ（商標）２．１ソフトウェアで重み付けして１／濃度を用いてデータの線形回帰を実行することによって構築する。１３Ｃ５−ＺＭＰを、ＺＭＰおよびｄＵＭＰのための内部標準として用いる。１３Ｃ５−ＡＩＣＡｒを、ＡＩＣＡｒのための内部標準として用いる。
【０２１４】
マウスおよびイヌ血漿におけるＡＩＣＡＲＦＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ標的阻害（ＩＶＴＩ）アッセイ
ＡＩＣＡＲＦＴ阻害のＡＩＣＡｒの血中濃度へのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって決定する。ＡＩＣＡｒを１ｎｇ／ｍＬ〜２０００ｎｇ／ｍＬの濃度で含有する標準曲線を、４０ｍＭアンモニウムアセタート、ｐＨ４において調製する。血漿試料（７５μＬ）または標準（７５μＬ）を、ＡＣＮ中１３Ｃ５−ＡＩＣＡｒ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびギ酸（１％）を含有する３００μＬの内部標準溶液と組み合わせる。試料を、５分間ボルテックス混合してＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｐｈｒｅｅ９６−ウェルリン脂質除去ＳＰＥプレートを通過させる。溶離液を９６−ウェルプレートに収集して５０℃で加熱した窒素下で乾燥する。それぞれの試料を、５０μＬの４０ｍＭアンモニウムアセタート、ｐＨ４において再構成する。プレートを密閉して分析に先立って５分間ボルテックスする。ＬＣ−ＭＳ法は、Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアを実行しているＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ５５００（商標）またはＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ６５００（商標）三連四重極型質量分析計に接続したＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ２０Ａ  ＨＰＬＣシステムを利用した。抽出した試料を、１５μＬの注入量および１ｍＬ／分の流速で直列に接続した２つのＴｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（商標）Ｊａｖｅｌｉｎカードカラム（２．１×２０ｍｍ、５μＭ）を用いて分離する。移動相Ａは、５０ｍＭアンモニウムホルマート、ｐＨ４およびＡＣＮの９５：５混合物である。移動相Ｂは、０．３％ギ酸および２％濃アンモニウムヒドロキシド溶液（ｖ／ｖ）を添加したＡＣＮおよびＭｅＯＨの７０：３０混合物である。マウス血漿試料については以下のグラジエントを用いる：０分、０％Ｂ；０．２５分、０％Ｂ；２．００分、２５％Ｂ；２．０１分、９５％Ｂ；３．５０分、９５％Ｂ；３．５１分、０％Ｂ；４．５０分、停止。イヌ血漿試料については以下のグラジエントを用いて内因性干渉を除去する：０分、０％Ｂ；０．２５分、０％Ｂ；５．９９分、２０％Ｂ；６．００分、９５％Ｂ；８．００分、９５％Ｂ；８．０１分、０％Ｂ；１０．００分、停止。質量分析計を、７００℃の発生源温度で陽イオンＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）複数反応モニタリングモードで運転する。それぞれの分析物の前駆物質およびフラグメントイオンは、ＡＩＣＡｒ（２５９→１２７）および１３Ｃ５−ＡＩＣＡｒ（２６４→１２７）である。較正曲線を、分析物濃度対分析物／内部標準ピーク面積比をプロットすることおよびＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ（商標）２．１ソフトウェアで重み付けして１／濃度を用いてデータの線形回帰を実行することによって構築する。
【表２０】
0006379296.tif 000142
【０２１５】
上表１９に示すように、本アッセイにおいて試験した実施例１の例示の化合物は、２週間連続的にＱＤを与えられた場合のＨＣＴ−１１６およびＮＣＩ−Ｈ４６０異種移植腫瘍へのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗がん活性を実証する。この活性は、ＨＣＴ−１１６およびＮＣＩ−Ｈ４６０がん細胞株で観察されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性と一致する。マウスは、ヒトより有意に高い血清葉酸レベルを有し（ＣＰ  Ｌｅａｍｏｎら（２００８年）ＪＰＥＴ  ３２７：９１８〜９２５）、組織培養における葉酸レベルへの抗増殖性ＩＣ５０の依存性に基づいてヒトにおいて観察された活性を過小評価し得る。観察された腫瘍成長阻害活性は、腫瘍ＺＭＰおよび血漿ＡＩＣＡｒにおける増加と関連する。表１９におけるデータは、ＡＩＣＡＲＦＴ阻害のためのバイオマーカーとしての血漿ＡＩＣＡｒの使用も支持する。
【０２１６】
ビーグル犬における薬力学的反応
実施例１、実施例３３、および実施例４１に対する薬力学的（ＰＤ）反応を、ビーグル犬においての単回漸増用量調査における最重要の非臨床的種において評価する。ビーグル犬、非ヒト霊長類およびヒトは低血清葉酸種であるのに対して、齧歯類は高血清葉酸である（ＣＰ  Ｌｅａｍｏｎら（２００８年）ＪＰＥＴ  ３２７：９１８〜９２５）。ＡＩＣＡＲＦＴ阻害剤で処置したイヌにおける薬力学反応は、ＡＩＣＡＲＦＴ阻害剤で処置した患者における予想される薬力学反応をよりよく代表するようになる。
【０２１７】
「正常」、すなわち非腫瘍担持における標的結合を実証するために、処置経験のあるビーグル犬の組を、強制経口投与によってＡＩＣＡＲＦＴ阻害剤で処置する；それぞれの実験には、交互の機会に処置される２対の１匹の雄および１匹の雌のイヌを含んでいた−それぞれのイヌの組は少なくとも７日間空けた２回の処置を受けた。
【０２１８】
処置の後、血漿試料を、増加した血漿ＡＩＣＡｒ濃度によって実証されるような薬力学反応の測定のためのタイミングの時間間隔で取る。動物を、実験の完了後の再利用のために集団に戻す。
【表２１】
0006379296.tif 000143
表２０に示すように、本アッセイにおいて試験した実施例１、実施例４１、および実施例３３の化合物は、イヌにおけるＡＩＣＡＲＦＴのｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害を実証する。イヌにおけるこの活性は、上述の、ＨＣＴ−１１６およびＮＣＩ−Ｈ４６０マウス異種移植評価において観察されたこれらの化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性と一致する。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
式Ｉの化合物：
【化１１９】
0006379296.tif 000144
［式中、
Ｒ１は、基：
【化１２０】
0006379296.tif 000145
（式中Ｘ１およびＸ２のそれぞれは、独立に水素、フルオロ、または−ＣＨ３から選択され、あるいはＸ１およびＸ２のうちの１つは、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２またはモルホリン−４−イルから選択され、もう一方は、水素である）、
【化１２１】
0006379296.tif 000146
（式中それぞれのｎは、独立に０、１または２から選択され、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、全てが水素ではないという条件、ならびに全てのｎが同時に０ではないという条件、ならびにさらに１つのｎのみが２であってよく、かつ１つのｎが２である場合、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３のそれぞれは、独立にフルオロ、−ＯＨ、または−ＣＦ３から選択されるという条件で、独立に水素、−ＯＨ、フルオロ、−ＮＨ２または−ＣＦ３から選択される）、
【化１２２】
0006379296.tif 000147
（式中Ｑ１およびＱ２は、独立に水素、−ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ３から選択される）、
【化１２３】
0006379296.tif 000148
（式中Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立に水素またはフルオロから選択される）、
【化１２４】
0006379296.tif 000149
から選択され、
Ｒ２は、水素またはフルオロである］
またはその薬学的に許容可能な塩。
［２］
Ｒ１は、基：
【化１２５】
0006379296.tif 000150
（式中Ｘ１およびＸ２のそれぞれは、独立に水素、フルオロ、または−ＣＨ３から選択され、あるいはＸ１およびＸ２のうちの１つは、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２またはモルホリン−４−イルから選択され、もう一方は、水素である）、
【化１２６】
0006379296.tif 000151
（式中それぞれのｎは、独立に０、１または２から選択され、
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、全てが水素ではないという条件、ならびに全てのｎが同時に０ではないという条件、ならびにさらに１つのｎのみが２であってよく、かつ１つのｎが２である場合、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３のそれぞれは、独立にフルオロ、−ＯＨ、または−ＣＦ３から選択されるという条件で、独立に水素、−ＯＨ、フルオロ、−ＮＨ２または−ＣＦ３から選択される）、
【化１２７】
0006379296.tif 000152
（式中Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立に水素またはフルオロから選択される）、
【化１２８】
0006379296.tif 000153
から選択され、
Ｒ２は、水素またはフルオロである、
［１］に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［３］
Ｒ１は、基：
【化１２９】
0006379296.tif 000154
（式中Ｘ１およびＸ２のそれぞれは、独立に水素、フルオロ、または−ＣＨ３から選択される）、
【化１３０】
0006379296.tif 000155
（式中Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、独立に水素またはフルオロから選択される）、
【化１３１】
0006379296.tif 000156
から選択され、
Ｒ２は、フルオロである、
［１］もしくは［２］に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［４］
前記化合物が、
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−（３，３−ジフルオロ−（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、
５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４−ジヒドロピリダジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩、あるいは
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（１Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシシクロペンチル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩
である、［１］、［２］または［３］のいずれか一項に記載の化合物。
［５］
前記化合物が、
Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはその薬学的に許容可能な塩
である、［１］、［２］、［３］または［４］のいずれか一項に記載の化合物。
［６］
薬学的に許容可能な担体と共に、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
［７］
治療的有効量の［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩をそれを必要とする患者に投与するステップを含む患者における膠芽腫、子宮頸がん、子宮がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、頭頸部がん、腎臓がん、黒色腫、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、中皮腫、大腸がん、胃がん、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、線維芽細胞肉腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、または単球性白血病であるがんを治療する方法。
［８］
治療的有効量の［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩をそれを必要とする患者に投与するステップを含む患者におけるトリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、肺がん、中皮腫、大腸がん、非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、または単球性白血病であるがんを治療する方法。
［９］
療法における使用のための、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［１０］
膠芽腫、子宮頸がん、子宮がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、頭頸部がん、腎臓がん、黒色腫、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、中皮腫、大腸がん、胃がん、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、線維芽細胞肉腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、または単球性白血病であるがんの治療における使用のための、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［１１］
トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、肺がん、中皮腫、大腸がん、非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、または単球性白血病であるがんの治療における使用のための、［１］に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［１２］
膠芽腫、子宮頸がん、子宮がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、頭頸部がん、腎臓がん、黒色腫、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、中皮腫、大腸がん、胃がん、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、線維芽細胞肉腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、または単球性白血病であるがんの治療のための薬物の製造のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
［１３］
トリプルネガティブ乳がん、膀胱がん、肺がん、中皮腫、大腸がん、非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、Ｔ−ＡＬＬ、リンパ芽球、または単球性白血病であるがんの治療のための薬物の製造のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。