(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原子間力顕微鏡を用いた細胞の複素弾性率の計測方法であり、
マイクロパターン基板上に配列された細胞にカンチレバーの探針が近づくように前記カンチレバーを移動させるステップと、
周波数が互いに異なり、各周波数の２倍波が他の周波数と一致しないように設定された複数の周波数成分を多重した加振信号を生成するステップと、
前記カンチレバーを前記加振信号に基づいて励振させるステップと、
前記カンチレバーの変位を検出し、前記変位を示す変位信号を生成するステップと、
前記変位信号に基づいて、前記カンチレバーの前記各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、前記各周波数成分における前記加振信号と前記変位信号との位相差を示す位相差信号を生成するステップと、
前記振幅信号と前記位相差信号に基づいて、前記全ての周波数成分における細胞の複素弾性率を同時に計測するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞の複素弾性率の周波数特性を解析するステップをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記原子間力顕微鏡は、細胞の位置を観察できる光学顕微鏡と一体化したものである、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロパターン基板は、ガラス基板、金属基板、または高分子系基板からなり、細胞の形状や運動を制御し、細胞を基板表面に配列するために用いる、
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
マイクロパターン基板上に配列された細胞にカンチレバーの探針を近づけ、前記カンチレバーを加振信号に基づいて励振させて前記カンチレバーの変位を検出し、前記変位を示す変位信号を生成する原子間力顕微鏡と、
周波数が互いに異なり、各周波数の２倍波が他の周波数と一致しないように設定された複数の周波数成分を多重して前記加振信号を生成し、前記変位信号に基づいて、前記カンチレバーの前記各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、前記各周波数成分における前記加振信号と前記変位信号との位相差を示す位相差信号を生成するアナログ信号入出力装置と、
前記振幅信号と前記位相差信号に基づいて、前記各周波数成分における細胞の複素弾性率を同時に計測するパーソナルコンピュータと、
を具備する計測システム。
【請求項６】
前記パーソナルコンピュータは、さらに、前記細胞の複素弾性率の周波数特性を解析する、
請求項５に記載の計測システム。
【請求項７】
前記原子間力顕微鏡は、細胞の位置を観察できる光学顕微鏡と一体化したものである、
請求項５または６に記載の計測システム。
【請求項８】
前記マイクロパターン基板は、ガラス基板、金属基板、または高分子系基板からなり、細胞の形状や運動を制御し、細胞を基板表面に配列するために用いる、
請求項５から７のいずれか１項に記載の計測システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原子間力顕微鏡を用いた、細胞の複素弾性率の計測方法と計測システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の力学特性は、細胞の機能と密接に関係している。近年、正常細胞とがん細胞を力学的に識別できることが指摘され（非特許文献１）、細胞の力学特性が細胞疾患診断の重要な指標になると考えられている。がん細胞に限らず、細胞の力学特性から様々な細胞の診断を行うためには、多数の細胞の力学特性を計測し、その計測値の統計を採り、解析を行うことができるシステム・技術の発展が必要不可欠である。
【０００３】
多数の細胞の力学特性を高速に計測することができる有力な方法として、光ストレッチ法（非特許文献２）、磁気ビーズ法（非特許文献３）、そして、原子間力顕微鏡法（Atomic Force Microscopy:ＡＦＭ）（非特許文献４，５）が知られている。
【０００４】
光ストレッチ法は、フローサイトメーターと光ピンセット法を組み合わせたもので、浮遊させた細胞を光の圧力で変形させ、その変形量から細胞の力学特性を計測する方法である。ただし、光ストレッチ法は、基質に接着して生きている細胞を、基質からはがして計測するため、自然な状態の細胞の力学特性を計測することができない。
【０００５】
磁気ビーズ法は、細胞表面に磁気ビーズを付着させ、変動磁場による磁気ビーズの変位から細胞の力学特性を計測する方法である。磁気ビーズ法は、一度に多数の接着細胞の力学特性を計測することができるという利点があるが、細胞表面へのビーズの付着位置を制御することができないため、細胞間の力学特性の差異を評価することには適さない。
【０００６】
ＡＦＭは、カンチレバー先端の探針（プローブ）を細胞に接触させ、カンチレバーを所定の振動周波数で励振させ、探針が受ける引力あるいは斥力により生じるカンチレバーのたわみ量を測定し、細胞の力学特性を計測する方法である。ＡＦＭは、多数の細胞を配列することができるマイクロアレイ技術と併用することにより、接着細胞の力学特性を細胞毎に精密に計測することができる。
【０００７】
細胞の力学特性は、複素弾性率で表される。また、細胞の力学特性のべき乗応答は普遍的な性質であるため、複素弾性率の精密な計測が細胞診断技術において重要となる。なお、複素弾性率の実部を貯蔵弾性率、虚部を損失弾性率と呼ぶ。
【０００８】
細胞は、形状を維持する弾性と変形流動する粘性の両方の性質を併せ持つ粘弾性体であるため、細胞の複素弾性率は、一定ではなく時間や周波数の関数となる。
【０００９】
したがって、細胞の力学特性を精密に計測するためには、複数の周波数について各細胞の複素弾性率を計測し、複素弾性率の周波数特性を解析することが必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Cross, S. E.; Jin, Y. S.; Rao, J.; Gimzewski, J. K., (2007) Nature Nanotech., 2, 780-783.
【非特許文献２】Guck, J. et al. (2005) Biophys. J., 88(5), 3689-3698.
【非特許文献３】Fabry, B. et al. (2001) Phys. Rev. Lett., 87 (14) 148102.
【非特許文献４】Hiratsuka, S. et al. Ultramicroscopy 109 (2009) 937-941.
【非特許文献５】Cai P.G. et al. Biophys. J. 105 (2013) 1093-1102.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来のＡＦＭでは、カンチレバーに印加する振動周波数を段階的に変化させる方法を用いている。このため、対象周波数の数に比例して複素弾性率の計測時間（カンチレバーのたわみ量の測定時間）が増大してしまう。
【００１２】
そこで、本発明者は、細胞力学診断装置の実現に必要とされる計測精度を損なうことなく、多数の細胞の複素弾性率を高速に計測することができる細胞の複素弾性率の計測方法および計測システムを提案することを検討した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の計測方法は、原子間力顕微鏡を用いた細胞の複素弾性率の計測方法であり、マイクロパターン基板上に配列された細胞にカンチレバーの探針が近づくように前記カンチレバーを移動させるステップと、周波数が互いに異なり、各周波数の２倍波が他の周波数と一致しないように設定された複数の周波数成分を多重した加振信号を生成するステップと、前記カンチレバーを前記加振信号に基づいて励振させるステップと、前記カンチレバーの変位を検出し、前記変位を示す変位信号を生成するステップと、前記変位信号に基づいて、前記カンチレバーの前記各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、前記各周波数成分における前記加振信号と前記変位信号との位相差を示す位相差信号を生成するステップと、前記振幅信号と前記位相差信号に基づいて、前記全ての周波数成分における細胞の複素弾性率を同時に計測するステップと、を含む。
【００１４】
本発明の計測システムは、マイクロパターン基板上に配列された細胞にカンチレバーの探針を近づけ、前記カンチレバーを加振信号に基づいて励振させて前記カンチレバーの変位を検出し、前記変位を示す変位信号を生成する原子間力顕微鏡と、周波数が互いに異なり、各周波数の２倍波が他の周波数と一致しないように設定された複数の周波数成分を多重して前記加振信号を生成し、前記変位信号に基づいて、前記カンチレバーの前記各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、前記各周波数成分における前記加振信号と前記変位信号との位相差を示す位相差信号を生成するアナログ信号入出力装置と、前記振幅信号と前記位相差信号に基づいて、前記各周波数成分における細胞の複素弾性率を同時に計測するパーソナルコンピュータと、を具備する構成を採る。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、互いに異なるｍ個の周波数成分（ｍは複数）を多重した信号を用いることにより、従来の周波数を段階的に変化させる手法よりも、ｍ倍高速に細胞の複素弾性率を計測することができる。また、本発明によれば、従来の手法に対して計測精度が損なわれることはない。なお、複素弾性率の周波数依存性を高度に精密に計測するには、ｍが１０以上であることが必要になる。
【００１６】
また、本発明によれば、測定周波数の数を増加させ、複素弾性率の広範囲の周波数特性を解析しても、複素弾性率の計測時間が増加しないという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施の形態に係る計測システムの構成図
【図２】図１の計測システムで計測された所定の周波数における細胞の貯蔵弾性率と損失弾性率の細胞数分布を示す図
【図３】平均貯蔵弾性率Ｇ’の周波数特性を示す図
【図４】本発明によって測定された細胞の複素弾性率のべき指数ａの細胞数分布を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本実施の形態について、図面を用いて説明する。図１は、本発明の一実施の形態に係る計測システムの構成図である。図１に示すように、本実施の形態の計測システムは、マイクロパターン基板１１と、ＡＦＭ１２と、アナログ信号入出力装置１３と、ＰＣ（パーソナルコンピュータ）１４と、から主に構成される。
【００１９】
マイクロパターン基板１１は、ガラス基板、金属基板、または高分子系基板からなる。マイクロパターン基板１１の上面には、所定のパターン形状で配列された複数の細胞接着領域が形成される。パターン形状には、例えば、矩形、円形形状がある。各細胞接着領域には、培養ディッシュ上で培養された細胞が播種され、培養される。細胞を各細胞接着領域に播種・培養することにより、細胞の形状や運動を制御し、細胞を所定の間隔で配列させることができる。なお、マイクロパターン基板１１上に配列される各細胞接着領域の細胞の形状を可能な限り均一にすることが望ましい。細胞種は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、骨格筋細胞、およびそれらのがん化細胞など任意の細胞腫に適用することができる。
【００２０】
ＡＦＭ１２は、自由端に探針を有するカンチレバー１２ａを備える。カンチレバー１２ａは、ばね定数が低く、液中の共振周波数が高いものが適している。カンチレバー１２ａの一例として、生体用カンチレバー（Biolever mini，オリンパス社）がある。
【００２１】
ＡＦＭ１２は、マイクロパターン基板１１上に配列された細胞にカンチレバー１２ａの探針を接触させ、マイクロパターン基板１１をその上面に沿うｘ，ｙ方向に移動させる。また、ＡＦＭ１２は、マイクロパターン基板１１の上面に直交するｚ方向に、アナログ信号入出力装置１３から供給された加振信号に基づいて所定の振動周波数でカンチレバー１２ａを励振させる。
【００２２】
探針を細胞に近づけることによって探針が受ける引力あるいは斥力により、カンチレバー１２ａは変位する（たわむ）。ＡＦＭ１２は、カンチレバー１２ａの変位（たわみ量）を、公知の変位検出機構により検出する。ＡＦＭ１２は、検出した変位（カンチレバー１２ａの応答波形）を示す変位信号を生成し、アナログ信号入出力装置１３に出力する。
【００２３】
なお、ＡＦＭ１２として、原子間力顕微鏡と光学顕微鏡が一体化した装置を用いてもよい。当該装置の一例として、Ｎｉｋｏｎ社の光学顕微鏡（ＴＥ−２０００）に装着されたＡｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＡＦＭ装置（ＭＦＰ−３Ｄ−Ｂｉｏ）がある。当該装置を用いることにより、ユーザが、光学顕微鏡を用いてマイクロパターン基板上の細胞の位置を観察し、ＡＦＭ計測を開始する細胞の位置決めをすることができる。
【００２４】
アナログ信号入出力装置１３は、カンチレバー１２ａをその機械的共振周波数近傍の振動周波数で所定の振幅で励振させるための加振信号をＡＦＭ１２に供給する。本発明において、加振信号は、多重周波数成分からなる信号（互いに異なる複数の周波数成分を多重した信号）である。多重周波数のセットは、各周波数のｎ倍波（ｎ＞１）が他の周波数と一致しないように設定される。なお、生細胞の複素弾性率を計測する場合、ｎ＝２でも、十分な精度を得ることができた。
【００２５】
また、アナログ信号入出力装置１３は、ＡＦＭ１２から出力された変位信号に基づいて、カンチレバー１２ａの各周波数成分における振幅を示す振幅信号と、各周波数成分における加振信号と変位信号との位相差を示す位相差信号を生成し、ＰＣ１４に出力する。
【００２６】
アナログ信号入出力装置１３の一例として、National Instruments社のデータ集録（ＤＡＱ）デバイス(USB-6259)がある。また、各周波数成分の振幅および位相差は、ロックインアンプを多重化したソフトウェアを用いることにより、オンラインでもオフラインでも計測することができる。
【００２７】
ＰＣ１４は、アナログ信号入出力装置１３から出力された振幅信号と位相差信号に基づいて、全ての周波数成分において細胞の複素弾性率（貯蔵弾性率と損失弾性率）を同時に計測する。さらに、ＰＣ１４は、細胞の複素弾性率の周波数特性を解析する。
【００２８】
なお、計測システムは、１つの細胞接着領域の細胞について測定した後、隣の細胞の複素弾性率を同様の方法で計測し、最終的に、多数の細胞の複素弾性率のデータを得ることができる。
【００２９】
図２は、図１の計測システムで計測された所定の周波数におけるコンフルエントな細胞の貯蔵弾性率（ａ）と損失弾性率（ｂ）の細胞数分布を示す図である。図２のそれぞれにおいて、横軸は平均貯蔵弾性率Ｇ’あるいは損失弾性率Ｇ”（対数表示）（単位［Ｐａ］）、縦軸は細胞数である（単位無し）。また、実線２１は、対数正規分布によるフィット線である。
【００３０】
図２に示すように、細胞の複素弾性率の周波数特性の細胞数分布は、対数正規分布に従う。また、本発明によって得られた細胞の複素弾性率の周波数特性は、従来技術により得られるもの（非特許文献４，５）と良い一致を示した。このことは、本発明が、計測精度を損なうことなく、高速に細胞の複素弾性率を計測することができることを示している。
【００３１】
図３は、本発明によって測定された細胞の平均貯蔵弾性率Ｇ’の周波数特性を示す図である。図３において、横軸は周波数（対数表示）（単位［Ｈｚ］）、縦軸は平均貯蔵弾性率Ｇ’である（対数表示）（単位［Ｐａ］）。
【００３２】
生細胞の貯蔵弾性率は、周波数のべき乗則に従う。図３から明らかなように、平均貯蔵弾性率は、周波数の増加とともに単一のべき乗則で増大している。このべき乗指数をａとする。
【００３３】
図４は、本発明によって測定された細胞の複素弾性率のべき指数ａの値の細胞数分布を示す図である。図４において、横軸はべき指数ａ（単位無し）、縦軸は細胞数である（単位無し）。また、実線４１は、ガウスフィット線である。
【００３４】
このべき指数ａの値は、従来の方法で計測されたものと良い一致を示している。このことは、本発明が、計測精度を損なうことなく、高速に細胞の複素弾性率の周波数特性を計測することができることを示している。
【００３５】
以上のように、本発明によれば、従来技術よりも高速に、細胞の複素弾性率の周波数特性を得ることができる。この計測時間の大幅な短縮により、従来法に比べて多数の細胞の複素弾性率を計測することが可能となる。
【００３６】
また、細胞の複素弾性率の解析において、カンチレバーの押し込み量が必要であり、この押し込み量が複素弾性率を決定する重要な変数の１つである。この押し込み量は、細胞が粘弾性体であることから、細胞の押し込み時間に強く依存して変化する。従って、従来法では、計測時間が長いため、押し込み瞬間の押し込み量を近似値として用いていた。そのため、各周波数の複素弾性率は、計測順が後ろのデータほど誤差が大きくなってしまう。
【００３７】
一方、本発明は、押し込み時間を従来法よりも高速に（１／ｍ、ここで、ｍは周波数成分の数であって複数）することができ、かつ、全ての周波数成分において細胞の複素弾性率を同時に計測することができるため、従来法より生じていた誤差を無くすことができ、細胞の複素弾性率を精密に計測することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、正常細胞とがん細胞等の疾患細胞等が混在する系において、細胞の状態を力学的に識別する細胞診断技術に利用することができる。
【符号の説明】
【００３９】
１１  マイクロパターン基板
１２  ＡＦＭ
１３  アナログ信号入出力装置
１４  ＰＣ
【図１】
0006360735.tif 000002
【図２】
0006360735.tif 000003
【図３】
0006360735.tif 000004
【図４】
0006360735.tif 000005