(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団であって、前記集団内の各ペプチドが以下を含む、単離ペプチドの集団：
（ｉ）
0006325553.tif 000035
の配列であって、
式中、Ｘ２が、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５が、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８が、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０が、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１が、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２が、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３が、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２が、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３が、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４が、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５が、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６が、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３９が、任意のアミノ酸であり、Ｘ４４が、任意のアミノ酸であり、Ｘ４９が、任意のアミノ酸であり、Ｘ５６が、任意のアミノ酸であり、且つＸ５８が、任意のアミノ酸である、前記配列、
（ｉｉ）
0006325553.tif 000036
の配列であって、
式中、Ｘ２が、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５が、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８が、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０が、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１が、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２が、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３が、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２が、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３が、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４が、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５が、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６が、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３９が、任意のアミノ酸であり、Ｘ４１が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４４が、任意のアミノ酸であり、Ｘ４８が、ＶおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４９が、任意のアミノ酸であり、Ｘ５６が、任意のアミノ酸であり、且つＸ５８が、任意のアミノ酸である、前記配列、または
（ｉｉｉ）
0006325553.tif 000037
の配列であって、
式中、Ｘ７が、任意のアミノ酸であり、Ｘ１２が、任意のアミノ酸であり、Ｘ１７が、任意のアミノ酸であり、Ｘ２４が、任意のアミノ酸であり、且つＸ２６が、任意のアミノ酸である、前記配列。
【請求項２】
（i）配列番号３または７２のＸ３９が、Ｋである；
（ii）配列番号３または７２のＸ４４が、ＫおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、且つＸ４９が、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸である；または
（iii）配列番号３または７２のＸ５６が、ＫおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、且つＸ５８が、ＥおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である、
請求項１に記載の単離ペプチドの集団。
【請求項３】
各単離ペプチドが、天然ＯＭＰ−１配列であるかまたは非ＯＭＰ−１エールリヒア抗原である付加的Ｎ末端またはＣ末端ペプチド配列を含む、請求項１に記載の単離ペプチドの集団。
【請求項４】
前記単離ペプチドのうちの１つ以上が、
（i）リガンドに共役されているか、またはビオチン化されている；または
（ii）アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、酵素、または金属ナノ粒子もしくはナノシェルに共役されている、
請求項１に記載の単離ペプチドの集団。
【請求項５】
任意に金属ナノ層を介して固体支持体に固定化されている、請求項１に記載の単離ペプチドの集団。
【請求項６】
前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路、マイクロタイタープレート内のウェル、またはローター内の流路である、請求項１に記載の単離ペプチドの集団。
【請求項７】
エールリヒア種からの１つ以上の抗原ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の単離ペプチドの集団。
【請求項８】
（i）配列番号７１のＸ７が、Ｋである；
（ii）配列番号７１のＸ１２が、ＫおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、且つ配列番号７１のＸ１７が、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸である；または
（iii）配列番号７１のＸ２４が、ＫおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、且つ配列番号７１のＸ２６が、ＥおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である、
請求項１に記載の単離ペプチドの集団。
【請求項９】
試料中のエールリヒア抗原のエピトープに対する抗体を検出するための方法であって、
試料を、請求項１に記載の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の１つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、エールリヒア抗原のエピトープに対する抗体が前記試料中に存在することを示す、方法。
【請求項１０】
前記エールリヒア抗原が、エールリヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エールリヒア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｗｉｎｇｉｉ）、エールリヒア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）、またはエールリヒア・ムリス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｍｕｒｉｓ）種に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象における単球および／または顆粒球エールリヒア症を検査するための方法であって、
前記対象からの試料を、請求項１に記載の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の１つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、前記対象が前記単球および／または顆粒球エールリヒア症を有することを示す、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の単離ペプチドの集団と、前記集団内の１つ以上のペプチドのエピトープを認識する抗体に結合することができる標識試薬とを含む、キット。
【請求項１３】
非ヒト対象における単球および／または顆粒球エールリヒア症を診断するための方法であって、
前記対象からの試料を、請求項１に記載の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の１つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、前記対象が前記単球および／または顆粒球エールリヒア症を有することを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１０月１１日に出願された米国仮出願第６１／７１２，５７８号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。配列表のコンピューター可読形式コピー（ファイル名：ＡＢＡＸ＿０４０＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日２０１３年１０月１０日、ファイルサイズ６２キロバイト）。
【背景技術】
【０００３】
エールリヒア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）細菌は、哺乳類宿主内で循環リンパ球に感染する偏性細胞内病原体である。エールリヒア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）およびエールリヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）は、イヌおよびヒトに感染する同じ亜属群のメンバーであり、それぞれイヌ単球エールリヒア症（ＣＭＥ）およびヒト単球エールリヒア症（ＨＭＥ）を引き起こす。エールリヒア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｗｉｎｇｉｉ）として知られるエールリヒアの別種は、顆粒球に対する指向性を有し、顆粒球エールリヒア症を引き起こす。イヌの疾患は、発熱、てんかん、協調不全、倦怠感、出血症状、リンパ節症、体重減少、および汎血球減少症によって特徴付けられる。ヒトにおいて、疾患は、発熱、頭痛、筋肉痛、および白血球減少によって特徴付けられる。早期検出および治療は、イヌおよびヒトエールリヒア症の両方を治療するために重要である。
【０００４】
間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、これらの疾患の診断において典型的に使用されている。これらのアッセイは、対象の血液、血漿、もしくは血清からの抗エールリヒア抗体の、感染細胞、細胞溶解物、または部分的に精製された全エールリヒアタンパク質への結合を測定するか、または他の方法で検出する。しかしながら、抗エールリヒア抗体またはその断片を検出するための現在知られているアッセイは、これらの試験において使用されるエールリヒア抗原（複数可）の不純性質に直接関連する感度および特異度の問題に起因して、有用性が厳しく制限される。つまり、現在知られているアッセイは、多くの全エールリヒア抗原または種に特異的でない抗原の混合物を使用する。
【０００５】
したがって、当該技術分野において、エールリヒア抗原を検出するためのさらなるアッセイ、ならびに単球エールリヒア症および顆粒球エールリヒア症の血清診断の必要性が存続する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、エールリヒア外膜タンパク質１（ＯＭＰ−１）タンパク質の断片中の特定の配列変異体が、さまざまなエールリヒア種に対する抗体反応の強固な検出を提供するという発見に部分的に基づいている。したがって、本発明は、エールリヒア抗原に結合する抗体の検出、ならびに単球および／または顆粒球エールリヒア症の診断に有用な組成物、デバイス、方法、およびキットを提供する。
【０００７】
一態様において、本発明は、エールリヒア抗原を認識する抗体に結合することができるペプチドを提供する。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000002
の配列、またはその断片を含み、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＥおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２７は、Ｈ、Ｎ、Ｓ、またはＡを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ２８は、Ａ、Ｓ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ２９は、Ｄ、Ｐ、Ｎ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３０は、Ａ、Ｅ、Ｄ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３１は、Ｄ、Ｎ、Ｖ、またはＨを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３２は、ＦまたはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３３は、Ｎ、Ｆ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３４は、Ｎ、Ｔ、またはＤを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３５は、Ｋ、Ｖ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３６は、Ｇ、Ｐ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３７は、Ｙ、Ｎ、またはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３８は、Ｓ、Ｙ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３９は、ＦまたはＳを除く任意のアミノ酸である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000003
の配列、またはその断片を含み、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＥおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、ＳおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２７は、Ｈ、Ｎ、Ｓ、またはＡを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ２８は、Ａ、Ｓ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ２９は、Ｄ、Ｐ、Ｎ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３０は、Ａ、Ｅ、Ｄ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３１は、Ｄ、Ｎ、Ｖ、またはＲを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３２は、ＦまたはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３３は、Ｎ、Ｆ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３４は、Ｎ、Ｔ、またはＤを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３５は、Ｋ、Ｖ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３６は、Ｇ、Ｐ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３７は、Ｙ、Ｎ、またはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３８は、Ｓ、Ｙ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３９は、ＦまたはＳを除く任意のアミノ酸である。
【０００９】
他の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000004
の配列、またはその断片を含み、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３９は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４１は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４４は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４８は、ＶおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４９は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５６は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５８は、任意のアミノ酸である。
【００１０】
関連実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000005
の配列、またはその断片を含み、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４０は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４５は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５０は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５９は、任意のアミノ酸である。
【００１１】
さらに他の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000006
の配列、またはその断片を含み、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３９は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４４は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４９は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５６は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５８は、任意のアミノ酸である。
【００１２】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号３または配列番号７２の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ３９はＫである。他の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号３または配列番号７２の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ４４は、ＫおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４９は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸である。さらに他の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号３または配列番号７２の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ５６は、ＫおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５８は、ＥおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号７２の断片を含む。かかる断片は、配列番号１からの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、もしくは３５個の連続したアミノ酸、または配列番号３もしくは配列番号７２からの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、もしくは４０個の連続したアミノ酸を含み得る。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７１、配列番号８４、または配列番号８６の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００１４】
特定の実施形態において、本明細書に記載の本発明のペプチドは、付加的Ｎ末端ペプチド配列をさらに含み得る。付加的Ｎ末端ペプチド配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができ、天然配列または非天然配列のいずれかであり得る。他の実施形態において、本明細書に記載の本発明のペプチドは、付加的Ｃ末端配列をさらに含み得る。付加的Ｃ末端ペプチド配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができ、天然配列または非天然配列のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、非天然配列は、非ＯＭＰ−１エールリヒア抗原（例えば、エールリヒアｐ３８、ｐ４３、ｐ１２０、ｐ１４０、ｐ１５３、ｐ１５６、ｐ２００、ｇｐ１９、ｇｐ３６、ｇｐ４７、ｇｐ２００、またはＨＧＥ−３）を含む。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、少なくとも２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはそれ以上のアミノ酸を含む。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、単離（例えば、合成および／または精製）ペプチドである。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、リガンドに共役されている。例えば、特定の実施形態において、ペプチドはビオチン化されている。他の実施形態において、ペプチドは、ストレプトアビジン、アビジン、またはニュートラアビジンに共役されている。他の実施形態において、ペプチドは、担体タンパク質（例えば、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、または免疫グロブリンＦｃ領域）に共役されている。さらに他の実施形態において、ペプチドは、デンドリマーに共役されている、および／または多抗原性ペプチド系（ＭＡＰＳ）の一部である。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。一実施形態において、本発明のペプチドは、金属ナノ層を介して固体支持体に付着している。特定の実施形態において、固体支持体は、ビーズ（例えば、コロイド粒子、金属ナノ粒子もしくはナノシェル、ラテックスビーズ等）、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路（例えば、多孔質膜）、ブロット（ウェスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロット）、分析用もしくは遠心分離用ローター内の流路、または管もしくはウェル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに好適なプレート内）である。
【００１７】
別の態様において、本発明は、本発明の２つ以上のペプチドを含む組成物を提供する。例えば、特定の実施形態において、この組成物は、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物または集団を含み、各ペプチドは、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物または集団を含み、各ペプチドは、配列番号３の配列を含む。他の実施形態において、この組成物は、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物または集団を含み、各ペプチドは、配列番号７２の配列を含む。さらに他の実施形態において、この組成物は、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物または集団を含み、各ペプチドは、配列番号７の配列を含む。さらに他の実施形態において、この組成物は、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物または集団を含み、各ペプチドは、配列番号７０の配列を含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物または集団を含み、各ペプチドは、配列番号８３の配列を含む。他の実施形態において、この組成物は、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物または集団を含み、各ペプチドは、配列番号８５の配列を含む。特定の実施形態において、この組成物は、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物または集団を含み、各ペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６の配列を含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、本発明のペプチドをコードする配列を含む核酸を提供する。加えて、本発明は、かかる核酸を含むベクター、およびかかるベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、ベクターは、シャトルベクターである。他の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである（例えば、細菌または真核発現ベクター）。特定の実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。
【００１９】
別の態様において、本発明は、デバイスを提供する。特定の実施形態において、デバイスは、イムノアッセイを行うために有用である。例えば、特定の実施形態において、デバイスは、ラテラルフローイムノアッセイデバイスである。他の実施形態において、デバイスは、分析用または遠心分離用ローターである。他の実施形態において、デバイスは、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに好適なプレート内の管またはウェルである。さらに他の実施形態において、デバイスは、電気化学、光学、または光電子工学センサーである。
【００２０】
特定の実施形態において、デバイスは、本発明のペプチドを含む。他の実施形態において、デバイスは、本発明の異なるペプチドの混合物を含む。例えば、特定の実施形態において、デバイスは、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドを含む。特定の実施形態において、ペプチドまたは混合物中の各ペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６の配列を含む。特定の実施形態において、ペプチドは、デバイスに付着しているか、またはその表面に固定化されている。
【００２１】
別の態様において、本発明は、試料中のエールリヒア抗原のエピトープに対する抗体を検出する方法を提供する。特定の実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明のペプチドと接触させることと、該ペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、該複合体の形成は、該試料における、エールリヒア抗原のエピトープに対する抗体の存在を示す。特定の実施形態において、エールリヒア抗原は、感染性エールリヒア種、例えば、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、またはエールリヒア・ムリスに由来する。特定の実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明の異なるペプチドの混合物または集団（すなわち、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物）と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、これらの方法は、試料中の複数のエールリヒア種（例えば、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、およびエールリヒア・ムリス）からの抗原に対する抗体の検出を同時に提供する。
【００２２】
特定の実施形態において、ペプチドまたは混合物中の各ペプチドは、単離（例えば、合成および／または精製）ペプチドである。特定の実施形態において、ペプチドまたはペプチドの混合物もしくは集団は、固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。一実施形態において、ペプチドまたはペプチドの混合物もしくは集団は、金属（例えば、金）ナノ層を介して固体支持体に付着している。特定の実施形態において、この固体支持体は、ビーズまたは複数のビーズ（例えば、コロイド粒子、金属ナノ粒子もしくはナノシェル、ラテックスビーズ等）、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路（例えば多孔質膜）、分析用もしくは遠心分離用ローター内の流路、ブロット（ウェスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロット）、または管もしくはウェル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに好適なプレート内）である。特定の実施形態において、この固体支持体は、金属、ガラス、セルロース系物質（例えば、ニトロセルロース）、またはポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリスルホン等）を含む。特定の実施形態において、ペプチドまたは異なるペプチドの混合物もしくは集団は、デンドリマーに付着している、および／またはＭＡＰＳ系に組み込まれている。特定の他の実施形態において、ペプチドまたは異なるペプチドの混合物もしくは集団は、ＢＳＡに付着している。
【００２３】
特定の実施形態において、検出するステップは、ＥＬＩＳＡアッセイを行うことを含む。他の実施形態において、検出するステップは、ラテラルフローイムノアッセイを行うことを含む。他の実施形態において、検出するステップは、凝集アッセイを行うことを含む。他の実施形態において、検出するステップは、試料を分析用または遠心分離用ローター内で回転させることを含む。他の実施形態において、検出するステップは、ウェスタンブロット、スロットブロット、またはドットブロットを使用して、試料を分析することを含む。さらに他の実施形態において、検出するステップは、電気化学センサー、光学センサー、または光電子工学センサーを用いて、試料を分析することを含む。特定の実施形態において、検出するステップは、波長シフトアッセイを行うことを含む。
【００２４】
特定の実施形態において、試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、粘膜、または唾液のような体液である。他の実施形態において、試料は、組織（例えば、組織ホモジネート）または細胞溶解物である。特定の実施形態において、試料は、野生動物に由来する（例えば、シカまたは齧歯類、例えば、マウス、シマリス、リス等）。他の実施形態において、試料は、実験動物に由来する（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、霊長類等）。他の実施形態において、試料は、家畜または野生動物に由来する（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）。さらに他の実施形態において、試料は、ヒトに由来する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、対象における単球および／または顆粒球エールリヒア症を診断する方法を提供する。特定の実施形態において、これらの方法は、対象からの試料を本発明のペプチドと接触させることと、該ペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、該複合体の形成は、対象が単球および／または顆粒球エールリヒア症を有することを示す。特定の実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明の異なるペプチドの混合物または集団（すなわち、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドの混合物）と接触させることを含む。
【００２６】
なおも別の態様において、本発明はキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、本発明のペプチドを含む。特定の実施形態において、キットは、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドを含む。ペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６の配列を含むことができる。特定の実施形態において、ペプチドは、任意に金属ナノ層を介して固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。特定の実施形態において、固体支持体は、ビーズ（例えば、コロイド粒子、金属ナノ粒子もしくはナノシェル、ラテックスビーズ等）、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路、分析用もしくは遠心分離用ローター内の流路、または管もしくはウェル（例えばプレート内）である。特定の実施形態において、１つまたは複数のペプチドは、デンドリマーに付着している、および／またはＭＡＰＳ系に組み込まれている。特定の他の実施形態において、ペプチドまたは、異なるペプチドの混合物は、ＢＳＡに付着している。
【００２７】
特定の実施形態において、キットは、ビーズの集団またはプレート（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに好適なプレート）をさらに含む。他の実施形態において、キットは、ラテラルフローイムノアッセイデバイス、分析用もしくは遠心分離用ローター、ウェスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、電気化学センサー、光学センサー、または光電子工学センサーのようなデバイスをさらに含む。特定の実施形態において、ビーズの集団、プレート、またはデバイスは、イムノアッセイを行うために有用である。例えば、特定の実施形態において、ビーズの集団、プレート、またはデバイスは、試料からの抗体および本発明のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出するために有用である。特定の実施形態において、本発明のペプチドまたは異なるペプチドの混合物は、ビーズ、プレート、またはデバイスに付着しているか、またはその表面に固定化されている。
【００２８】
特定の実施形態において、キットは指示書をさらに含む。例えば、特定の実施形態において、キットは、エールリヒア抗原に対する抗体を検出するためまたは単球および／もしくは顆粒球エールリヒア症を診断するために本発明のペプチドを使用する方法を示す、指示書を含む。特定の実施形態において、キットは、１つ以上のエールリヒア抗原に対する抗体を検出するためまたは単球および／もしくは顆粒球エールリヒア症を診断するためにビーズの集団、プレート、またはデバイス（例えば、本発明のペプチドまたは異なるペプチドの混合物を含む）を使用する方法を示す、指示書を含む。
【００２９】
[本発明1001]
3つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団であって、前記集団内の各ペプチドが以下を含む、単離ペプチドの集団：
（ｉ）
0006325553.tif 000007
の配列もしくはその断片であって、
式中、Ｘ2が、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ5が、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ8が、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ10が、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ11が、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ12が、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ13が、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ18が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ20が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ22が、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ23が、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ24が、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ25が、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ26が、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ39が、任意のアミノ酸であり、Ｘ44が、任意のアミノ酸であり、Ｘ49が、任意のアミノ酸であり、Ｘ56が、任意のアミノ酸であり、Ｘ58が、任意のアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、または
（ｉｉ）
0006325553.tif 000008
の配列もしくはその断片であって、
式中、Ｘ2が、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ5が、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ8が、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ10が、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ11が、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ12が、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ13が、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ18が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ20が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ22が、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ23が、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ24が、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ25が、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ26が、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ39が、任意のアミノ酸であり、Ｘ41が、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ44が、任意のアミノ酸であり、Ｘ48が、ＶおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ49が、任意のアミノ酸であり、Ｘ56が、任意のアミノ酸であり、Ｘ58が、任意のアミノ酸である、前記配列もしくはその断片。
[本発明1002]
Ｘ39が、Ｋである、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1003]
Ｘ44が、ＫおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ49が、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸である、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1004]
Ｘ56が、ＫおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ58が、ＥおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1005]
前記断片が、配列番号3または配列番号72からの少なくとも20個、25個、30個、35個、または40個の連続したアミノ酸を含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1006]
前記断片が、配列番号3または配列番号72のアミノ酸33〜71を含む、本発明1005の単離ペプチドの集団。
[本発明1007]
各単離ペプチドが、天然ＯＭＰ−1配列であるかまたは非ＯＭＰ−1エールリヒア抗原である付加的Ｎ末端ペプチド配列を含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1008]
各単離ペプチドが、天然ＯＭＰ−1配列であるかまたは非ＯＭＰ−1エールリヒア抗原である付加的Ｃ末端ペプチド配列を含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1009]
各単離ペプチドが、少なくとも70個、75個、80個、または85個のアミノ酸を含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1010]
前記単離ペプチドのうちの1つ以上が、リガンドに共役されているか、またはビオチン化されている、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1011]
前記単離ペプチドのうちの1つ以上が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、酵素、または金属ナノ粒子もしくはナノシェルに共役されている、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1012]
任意に金属ナノ層を介して固体支持体に固定化されている、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1013]
前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路、マイクロタイタープレート内のウェル、またはローター内の流路である、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1014]
エールリヒア種からの1つ以上の抗原ペプチドをさらに含む、本発明1001の単離ペプチドの集団。
[本発明1015]
前記1つ以上の抗原ペプチドが、
0006325553.tif 000009
の配列またはその断片を有し、式中、Ｘ7が、任意のアミノ酸であり、Ｘ12が、任意のアミノ酸であり、Ｘ17が、任意のアミノ酸であり、Ｘ24が、任意のアミノ酸であり、Ｘ26が、任意のアミノ酸である、本発明1014の単離ペプチドの集団。
[本発明1016]
配列番号71のＸ7が、Ｋである、本発明1015の単離ペプチドの集団。
[本発明1017]
配列番号71のＸ12が、ＫおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、配列番号71のＸ17が、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸である、本発明1015の単離ペプチドの集団。
[本発明1018]
配列番号71のＸ24が、ＫおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、配列番号71のＸ26が、ＥおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である、本発明1015の単離ペプチドの集団。
[本発明1019]
試料中のエールリヒア抗原のエピトープに対する抗体を検出するための方法であって、
試料を、本発明1001の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の1つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、エールリヒア抗原のエピトープに対する抗体が前記試料中に存在することを示す、方法。
[本発明1020]
前記エールリヒア抗原が、エールリヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エールリヒア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｗｉｎｇｉｉ）、エールリヒア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）、またはエールリヒア・ムリス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｍｕｒｉｓ）種に由来する、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記単離ペプチドの集団が、任意に金属ナノ層を介して固体支持体に固定化されている、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフローアッセイデバイス内の流路、マイクロタイタープレート内のウェル、またはローター内の流路である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記検出するステップが、（ｉ）ＥＬＩＳＡアッセイを行うこと、（ｉｉ）ラテラルフローアッセイを行うこと、（ｉｉｉ）凝集アッセイを行うこと、（ｉｖ）ウェスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロットを行うこと、（ｖ）波長シフトアッセイを行うこと、または（ｖｉ）試料を分析用または遠心分離用ローターに供することを含む、本発明1019の方法。
[本発明1024]
前記試料が、ヒト、イヌ、またはネコ対象に由来する、本発明1019の方法。
[本発明1025]
前記試料が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、組織抽出物、尿、または唾液試料である、本発明1019の方法。
[本発明1026]
複数の抗体−ペプチド複合体の形成が検出され、かつ前記複合体の形成が、複数のエールリヒア種からのエールリヒア抗原のエピトープに対する抗体が前記試料中に存在することを示す、本発明1019の方法。
[本発明1027]
対象における単球および／または顆粒球エールリヒア症を診断するための方法であって、
前記対象からの試料を、本発明1001の単離ペプチドの集団と接触させることと、
前記集団内の1つ以上のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することと
を含み、
前記複合体の形成が、対象が前記単球および／または顆粒球エールリヒア症を有することを示す、方法。
[本発明1028]
本発明1001の単離ペプチドの集団と、前記集団内の1つ以上のペプチドのエピトープを認識する抗体に結合することができる標識試薬とを含む、キット。
[本発明1029]
前記単離ペプチドの集団が、任意に金属ナノ層を介して固体支持体に付着しているかまたはその表面に固定化されている、本発明1028のキット。
[本発明1030]
前記固体支持体が、複数のビーズ、管もしくはウェル、ラテラルフローアッセイデバイス、または分析用もしくは遠心分離用ローターである、本発明1028のキット。
[本発明1031]
前記標識試薬が、検出可能な標識に共役された抗ヒト、抗イヌ、もしくは抗ネコＩｇＧ抗体または抗ヒト、抗イヌ、もしくは抗ネコＩｇＭ抗体である、本発明1028のキット。
[本発明1032]
前記検出可能な標識が、酵素、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、または着色ラテックス粒子である、本発明1031のキット。
[本発明1033]
前記標識試薬が、検出可能な標識に共役された、プロテインＡ、プロテインＧ、および／またはプロテインＡ／Ｇ融合タンパク質である、本発明1028のキット。
[本発明1034]
前記検出可能な標識が、酵素、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、または着色ラテックス粒子である、本発明1033のキット。
本発明の付加的態様および実施形態は、続く詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】エールリヒア抗原に対する抗体を検出するために使用することができる、二重抗原サンドイッチアッセイの図である。この実施形態において、本発明のペプチドは、試験部位において好適な基体（例えば、ニトロセルロース膜、ＥＬＩＳＡプレートのウェル）に固定化されている。試験試料中のエールリヒア抗原に対する抗体は、本発明の固定化ペプチドによって結合されている。適切なエールリヒア抗原に対する試験試料抗体は、次に、試験部位において固定化されたペプチドの第１の組に結合された抗体の存在を検出する、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子またはナノシェル（例えば、コロイド金）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、フルオロフォア、着色ラテックス粒子）に共役された本発明のペプチドの第２の組に結合する。特定の実施形態において、検出シグナルを増幅するために、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子またはナノシェル（例えば、コロイド金）、ＨＲＰ、ＡＬＰ、フルオロフォア、着色ラテックス粒子）に共役されたプロテインＡおよび／またはプロテインＧ分子を、試験部位に適用することができ、それらは、本発明の固定化ペプチドによって捕捉されたエールリヒア抗原に対する任意の抗体のＦｃ領域に結合する。
【図２】エールリヒア抗原に対する抗体を検出するために使用することができる、一種の間接サンドイッチアッセイの図である。この実施形態において、抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ、抗イヌＩｇＧ／ＩｇＭ、または抗ネコＩｇＧ／ＩｇＭ抗体は、試験部位において好適な基体（例えば、ニトロセルロース膜、ＥＬＩＳＡプレートのウェル）に固定化されている。試験試料中のエールリヒア抗原に対する抗体は、固定化抗体によって結合されている。次に、適切なエールリヒア抗原に対する試験試料抗体は、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子またはナノシェル（例えば、コロイド金）、ＨＲＰ、ＡＬＰ、フルオロフォア、着色ラテックス粒子）に共役された本発明のペプチドに結合する。
【図３】エールリヒア抗原に対する抗体を検出するために使用することができる、別種の間接サンドイッチアッセイの図である。この実施形態において、本発明のペプチドは、試験試料中の抗エールリヒア抗体を捕捉するために、基体（例えば、ニトロセルロース膜、ＥＬＩＳＡプレートのウェル）に固定化され得る。検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子またはナノシェル（例えば、コロイド金）、ＨＲＰ、ＡＬＰ、フルオロフォア、着色ラテックス粒子）に共役された抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ、抗イヌＩｇＧ／ＩｇＭ、または抗ネコＩｇＧ／ＩｇＭ抗体を使用して、試験部位において固定化ペプチドに結合された抗体の存在を検出することができる。
【図４】エールリヒア抗原に対する抗体を検出するために使用することができる、イムノアッセイデバイスの図である。イムノアッセイデバイスのこの実施形態において、本発明のペプチドは、試験部位において好適な基体（例えば、ニトロセルロース膜、ＥＬＩＳＡプレートのウェル）に固定化されている。試験試料中の抗エールリヒア抗体は、本発明の固定化ペプチドによって結合されている。検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子もしくはナノシェル（例えば、コロイド金）、ＨＲＰ、ＡＬＰ、フルオロフォア、着色ラテックス粒子）に共役された、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＡ／Ｇ融合タンパク質が系に添加され、捕捉された抗エールリヒア抗体のＦｃ部分に結合し、それによって陽性シグナルを産生する。この実施形態において、デバイスは、検出可能な標識に共役されたプロテインＡ、検出可能な標識に共役されたプロテインＧ、および／または検出可能な標識に共役されたプロテインＡ／Ｇ融合を認識する結合パートナーが固定化されている、制御部位をさらに含むことができる。かかる結合パートナーは、抗プロテインＡ、抗プロテインＧ、マウスＩｇＧ、および／または他の同様のＩｇＧ分子を含み得るが、これらに限定されない。
【図５】エールリヒア抗原に対する抗体を検出するために使用することができる、ラテラルフローアッセイデバイスの一例を表す。本発明のペプチドは、担体タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）に連結され、得られたＢＳＡ−ペプチド共役体は、試験部位（Ｔ）においてニトロセルロース（ＮＣ）膜の表面に固定化されている。同じＢＳＡ−ペプチド共役体は、検出可能な標識（例えば、コロイド金）に共役され、試験部位の上流に位置付けられた共役パッドに沈着する。金共役プロテインＡおよび金共役プロテインＧ（すなわち、増幅体）は、捕捉された抗エールリヒア抗体のＦｃ部分に結合することによって、シグナルを強化するように共役パッドに添加される。このデバイスは、金共役プロテインＡおよび／または金共役プロテインＧを認識する結合パートナーが固定化されている、制御部位（Ｃ）をさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
本明細書において使用されるとき、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００３２】
本明細書において使用されるとき、「抗原」という用語は、抗体によって認識されることができる分子を指す。抗原は、例えば、ペプチドまたはその修飾形態であり得る。抗原は、１つ以上のエピトープを含み得る。
【００３３】
本明細書において使用されるとき、「エピトープ」という用語は、抗体によって特異的に認識される抗原の一部分である。エピトープは、例えば、ペプチド（例えば、本発明のペプチド）を含み得るか、またはそれからなり得る。エピトープは、線状エピトープ、連続エピトープ、または立体構造エピトープであり得る。特定の実施形態において、エピトープは、非隣接領域を含んでよい。
【００３４】
「ＯＭＰ−１タンパク質」という用語は、エールリヒアの外膜タンパク質１パラログのうちのいずれかを指し、エールリヒア・カニスＰ−３０、エールリヒア・カニスＰ３０−１、エールリヒア・シャフェンシスＰ２８、エールリヒア・シャフェンシスＯＭＰ−１Ｃ、エールリヒア・シャフェンシスＯＭＰ−１Ｄ、エールリヒア・シャフェンシスＯＭＰ−１Ｅ、およびエールリヒア・シャフェンシスＯＭＰ−１Ｆを含むが、これらに限定されない。
【００３５】
「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において同義的に使用され、一本鎖または二本鎖に関わらず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ならびにその化学修飾を包含する。
【００３６】
本明細書において使用される一文字のアミノ酸の省略形は、当該技術分野におけるそれらの標準的な意味を有し、本明細書に記載される全てのペプチド配列は、慣習に従って、Ｎ末端から左、Ｃ末端から右に書かれる。
【００３７】
追加の用語は、必要に応じて、続く詳細な説明において定義されるものとする。
【００３８】
組成物およびデバイス
本発明は、エールリヒアＯＭＰ−１タンパク質の断片中の特定の配列変異体が、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、およびエールリヒア・ムリスを含むさまざまなエールリヒア種に対する抗体反応の強固な検出を提供するという発見に部分的に基づいている。したがって、一態様において、本発明は、エールリヒア抗原を認識する抗体に結合することができるペプチドを提供する。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000010
の配列、またはその断片を含み、さらに指定がない限り、本明細書全体にわたって使用される配列番号１は、以下の特徴を有する：Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＥおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２７は、Ｈ、Ｎ、Ｓ、またはＡを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ２８は、Ａ、Ｓ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ２９は、Ｄ、Ｐ、Ｎ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３０は、Ａ、Ｅ、Ｄ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３１は、Ｄ、Ｎ、Ｖ、またはＨを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３２は、ＦまたはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３３は、Ｎ、Ｆ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３４は、Ｎ、Ｔ、またはＤを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３５は、Ｋ、Ｖ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３６は、Ｇ、Ｐ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３７は、Ｙ、Ｎ、またはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３８は、Ｓ、Ｙ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３９は、ＦまたはＳを除く任意のアミノ酸である。
【００４０】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ２はＶであり、Ｘ１０はＴである。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ１０はＴであり、Ｘ２６は、ＳおよびＮからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ２４はＡであり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択され、Ｘ２６は、ＳおよびＮからなる群から選択される。さらに他の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ２６は、ＳおよびＮからなる群から選択され、Ｘ３１は、Ｄ、Ｎ、Ｖ、Ｒ、またはＨを除く任意のアミノ酸である。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ２７〜Ｘ３９は、
0006325553.tif 000011
からなる群から選択される配列を有する。
【００４１】
関連実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000012
の配列、またはその断片を含み、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＥおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、ＳおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２７は、Ｈ、Ｎ、Ｓ、またはＡを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ２８は、Ａ、Ｓ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ２９は、Ｄ、Ｐ、Ｎ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３０は、Ａ、Ｅ、Ｄ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３１は、Ｄ、Ｎ、Ｖ、またはＲを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３２は、ＦまたはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３３は、Ｎ、Ｆ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３４は、Ｎ、Ｔ、またはＤを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３５は、Ｋ、Ｖ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３６は、Ｇ、Ｐ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３７は、Ｙ、Ｎ、またはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３８は、Ｓ、Ｙ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３９は、ＦまたはＳを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号８３の配列を含み、式中、Ｘ２７〜Ｘ３９は、
0006325553.tif 000013
からなる群から選択される配列を有する。
【００４２】
本発明の特定の他の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000014
の配列、またはその断片を含み、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３９は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４１は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４４は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４８は、ＶおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４９は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５６は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５８は、任意のアミノ酸である。
【００４３】
さらに他の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000015
の配列、またはその断片を含み、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４０は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４５は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５０は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５９は、任意のアミノ酸である。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000016
の配列、またはその断片を含み、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ３９は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４４は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４９は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５６は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５８は、任意のアミノ酸である。特定の一実施形態において、配列番号７２の配列を含むペプチドは、複数の種（例えば、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、およびエールリヒア・ムリス）からのエールリヒア抗原に対する抗体の検出を同時に可能にする。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号３または配列番号７２の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ３９はＫである。他の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号３または配列番号７２の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ４４は、ＫおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４９は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸である。さらに他の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号３または配列番号７２の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ５６は、ＫおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５８は、ＥおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００４６】
本発明の別の態様において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000017
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ４は、ＥおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８は、ＰおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＡおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＥおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＰおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、ＳおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000018
0006325553.tif 000019
の配列を含むか、またはそれからなる。
【００４８】
他の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000020
0006325553.tif 000021
の配列を含むか、またはそれからなる。
【００４９】
本発明の特定の一実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000022
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、Ｓ、Ｖ、およびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ｙ、Ｆ、およびＷからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１６は、ＫおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１９は、ＷおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２７〜Ｘ３９のそれぞれは、任意のアミノ酸である。特定の実施形態において、Ｘ２７〜Ｘ３９は、
0006325553.tif 000023
からなる群から選択される配列を有する。
【００５０】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５、および付加的Ｎ末端ペプチド配列（例えば、Ｎ末端伸長）を含む。付加的Ｎ末端ペプチド配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。特定の実施形態において、Ｎ末端ペプチド配列は、約５〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２０、約２０〜約２５、約２５〜約３０、約３０〜約４０、または約４０〜約５０のアミノ酸の長さを有する。一実施形態において、Ｎ末端ペプチド配列は、１つ以上の連結残基であり得る（例えば、１つ以上のグリシン、システイン、またはセリン残基）。例えば、特定の実施形態において、本明細書に記載の配列のうちのいずれかにおけるカルボキシル末端システイン残基は、代わりにアミノ末端に位置することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000024
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ３は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１９は、ＥおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２１は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２７は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２８は、Ｈ、Ｎ、Ｓ、またはＡを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ２９は、Ａ、Ｓ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３０は、Ｄ、Ｐ、Ｎ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３１は、Ａ、Ｅ、Ｄ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３２は、Ｄ、Ｎ、Ｖ、またはＨを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３３は、ＦまたはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３４は、Ｎ、Ｆ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３５は、Ｎ、Ｔ、またはＤを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３６は、Ｋ、Ｖ、またはＰを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３７は、Ｇ、Ｐ、またはＳを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３８は、Ｙ、Ｎ、またはＴを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ３９は、Ｓ、Ｙ、またはＩを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ４０は、ＦまたはＳを除く任意のアミノ酸である。さらに他の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000025
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ３は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ９は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１４は、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１９は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２１は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２７は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４０は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４２は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４５は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４９は、ＶおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５０は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５９は、任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000026
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ３は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ６は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ９は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１４は、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１９は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２１は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２７は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ４０は、任意のアミノ酸であり、Ｘ４５は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５０は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５９は、任意のアミノ酸である。
【００５１】
付加的Ｎ末端ペプチド配列は、天然配列であり得る。本明細書において使用されるとき、「天然」配列は、天然に存在するエールリヒアＯＭＰ−１配列からのペプチド配列、またはその変異体である。特定の実施形態において、ペプチド配列は、天然に存在するエールリヒアＯＭＰ−１配列の断片である。ペプチド配列は、例えば、ＯＭＰ−１の保存領域または非保存領域に由来し得る。ペプチド配列は、例えば、免疫優勢エピトープのようなエピトープ、または宿主（例えば、ヒト、イヌ等）免疫系によって認識可能な任意の他のエピトープを含むことができる。ＯＭＰ−１タンパク質およびそのペプチドは、例えば、米国特許第６，５４４，５１７号、同第６，８９３，６４０号、同第６，９２３，９６３号、同第７，０６３，８４６号、および同第７，４０７，７７０号、米国特許出願第２００４／０２６５３３３号および同第２００９／００７５３６８号、ならびに欧州特許第１０２６９４９号に記載されており、それらの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００５２】
変異体ポリペプチドは、配列番号１〜７３および８３〜８６に示されるペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり、それらも本発明のポリペプチドである。配列同一性のパーセントは、当該技術分野において認識されている意味を有し、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する方法は多くある。例えば、Ｌｅｓｋ，Ｅｄ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）、Ｓｍｉｔｈ，Ｅｄ．，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９３）、Ｇｒｉｆｆｉｎ＆Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖ＆Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｅｄｓ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９１）を参照されたい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを整列するための方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））、ならびにスミスおよびウォーターマンの局所相同性アルゴリズムを使用するＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）（Ａｄｖ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．，２：４８２−４８９（１９８１））を含むコンピュータープログラムにおいて体系化される。例えば、−１２のギャップオープンペナルティおよび−２のギャップ伸長ペナルティを用いるアフィンギャップ検索とともに、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いるコンピュータープログラムＡＬＩＧＮを使用することができる。
【００５３】
配列アラインメントプログラムのうちのいずれかを使用して、特定の配列が例えば、参照配列と約９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメータは、同一性の割合が参照ポリヌクレオチドの全長にわたって計算され、かつ参照ポリヌクレオチド内のヌクレオチド総数の最大５％の同一性のギャップが許容されるように、設定される。
【００５４】
ペプチド配列の変異体は、配列の既知の特性に部分的に基づいて、当業者によって容易に選択され得る。例えば、変異体ペプチドは、アミノ酸置換（例えば、保存アミノ酸置換）および／または欠失（例えば、小さな単一アミノ酸欠失、または２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、もしくはそれ以上の連続したアミノ酸を包含する欠失）を含み得る。故に、特定の実施形態において、天然ペプチド配列の変異体は、（ｉ）１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上）の保存アミノ酸置換、（ｉｉ）１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上）のアミノ酸の欠失、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせによって、天然に存在する配列とは異なるものである。欠失アミノ酸は、連続または非連続であり得る。保存アミノ酸置換は、それらの側鎖および化学特性において関連するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。これらは、例えば、（１）酸性アミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；（４）非電荷極性アミノ酸：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン；（５）脂肪族アミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン（セリンおよびトレオニンは、任意に脂肪族ヒドロキシルとして別個に分類される）；（６）芳香族アミノ酸：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（７）アミドアミノ酸：アスパラギン、グルタミン；ならびに（９）硫黄含有アミノ酸：システインおよびメチオニンを含む。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｅｄ．ｂｙ  Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．：１９８１を参照されたい。変異体ペプチドが好適であることを確認するための方法は、慣習的であり、ルーチンである。
【００５５】
ペプチド配列の変異体は、以前に定義されたペプチド配列上の変化を包含する。例えば、既知のエピトープを含む前述のペプチド配列は、一端または両端において（例えば、約１〜３個のアミノ酸だけ）延長または短縮され得、および／または１個、２個、３個、４個、またはそれ以上のアミノ酸は、保存アミノ酸等によって置換され得る。さらに、タンパク質の領域が、関心対象のエピトープを含有すると特定された場合、研究者は、活性を最適化するために、関心対象の領域を（例えば、いずれかの方向に約５個のアミノ酸だけ）元の粗領域の終点から「シフト」することができる。
【００５６】
特定の実施形態において、付加的Ｎ末端ペプチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５の配列を有する別のペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。故に、いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５の配列を有する配列の多量体であり得る。他の実施形態において、Ｎ末端ペプチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５の配列のＮ末端に天然に隣接している天然のＯＭＰ−１ペプチド配列である。他の実施形態において、ペプチドは、任意に１つ以上の連結アミノ酸を介した、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５の配列の融合を含むことができる。例えば、一実施形態において、ペプチドは、任意に１つ以上の連結アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、またはシステイン残基）を介して配列番号３または配列番号８５に連結した、配列番号１の配列を含むことができる。別の実施形態において、ペプチドは、任意に１つ以上の連結アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、またはシステイン残基）を介して配列番号３または配列番号８５に連結した、配列番号７の配列を含むことができる。別の実施形態において、ペプチドは、任意に１つ以上の連結アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、またはシステイン残基）を介して配列番号３または配列番号８５に連結した、配列番号８３の配列を含むことができる。さらに別の実施形態において、ペプチドは、任意に１つ以上の連結アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、またはシステイン残基）を介して配列番号７２に連結した、配列番号１、配列番号７、または配列番号８３の配列を含むことができる。なおも別の実施形態において、ペプチドは、任意に１つ以上の連結アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、またはシステイン残基）を介して配列番号７１に連結した、配列番号１、配列番号７、または配列番号８３の配列を含むことができる。
【００５７】
特定の実施形態において、付加的Ｎ末端ペプチド配列は、非天然配列である。本明細書において使用されるとき、「非天然」配列は、エールリヒアタンパク質に由来するかまたはそれ以外の、天然のＯＭＰ−１ペプチド配列ではない任意のタンパク質配列である。特定の実施形態において、付加的Ｎ末端ペプチド配列は、エールリヒア表面抗原のエピトープを含む。特定の実施形態において、付加的Ｎ末端ペプチド配列は、ｐ３８、ｐ４３、ｐ１２０、ｐ１４０、ｐ１５３、ｐ１５６、ｐ２００、ｇｐ１９、ｇｐ３６、ｇｐ４７、ｇｐ２００、またはＨＧＥ−３のようなエールリヒア抗原のエピトープを含む。エールリヒア抗原に対応するタンパク質およびペプチド配列について説明されている。例えば、米国特許第６，３０６，４０２号、同第６，３５５，７７７号、同第７，２０４，９９２号、および同第７，４０７，７７０号、ならびに国際公開第ＷＯ２００６／１３８５０９号を参照されたい（それらの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。他の微生物から得られるポリペプチドまたはペプチドを使用することもできる。
【００５８】
特定の実施形態において、付加的Ｎ末端ペプチド配列は、配列の組み合わせである。例えば、付加的Ｎ末端ペプチド配列は、天然配列、非天然配列、またはかかる配列の任意の組み合わせを含むことができる（例えば、２つ以上の天然配列、２つ以上の非天然配列、または１つ以上の非天然配列と組み合わせた１つ以上の天然配列）。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５によって定義された配列を含み、付加的Ｃ末端配列をさらに含む。付加的Ｃ末端ペプチド配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。特定の実施形態において、付加的Ｃ末端ペプチド配列は、約５〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２０、約２０〜約２５、約２５〜約３０、約３０〜約４０、または約４０〜約５０のアミノ酸の長さを有する。付加的Ｃ末端ペプチド配列は、天然ＯＭＰ−１配列であり得る。特定の実施形態において、Ｃ末端ペプチド配列は、天然に存在するエールリヒアＯＭＰ−１配列の断片である。ペプチド配列は、例えば、ＯＭＰ−１の保存領域または非保存領域に由来し得る。ペプチド配列は、例えば、免疫優勢エピトープのようなエピトープ、または宿主（例えば、ヒト、イヌ等）免疫系によって認識可能な任意の他のエピトープを含むことができる。特定の実施形態において、付加的Ｃ末端ペプチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５の配列を有する別のペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。例えば、特定の実施形態において、本発明のペプチドは、それぞれが配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５の配列を有する配列の多量体であり得る。他の実施形態において、天然配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５の配列のＣ末端に天然に隣接しているＯＭＰ−１配列である。
【００６０】
特定の実施形態において、付加的Ｃ末端ペプチド配列は、非天然配列である。特定の実施形態において、付加的Ｃ末端ペプチド配列は、ＯＭＰ−１以外のエールリヒア表面抗原のエピトープを含む。特定の実施形態において、付加的Ｃ末端ペプチド配列は、ｐ３８、ｐ４３、ｐ１２０、ｐ１４０、ｐ１５３、ｐ１５６、ｐ２００、ｇｐ１９、ｇｐ３６、ｇｐ４７、ｇｐ２００、またはＨＧＥ−３のようなエールリヒア抗原のエピトープを含む。他の微生物から得られるポリペプチドまたはペプチドを使用することもできる。
【００６１】
特定の実施形態において、付加的Ｃ末端ペプチド配列は、配列の組み合わせである。例えば、付加的Ｃ末端ペプチド配列は、天然配列、非天然配列、またはかかる配列の任意の組み合わせを含むことができる（例えば、２つ以上の天然配列、２つ以上の非天然配列、または１つ以上の非天然配列と組み合わせた１つ以上の天然配列）。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５によって定義された配列を含み、付加的Ｎ末端配列および付加的Ｃ末端配列をさらに含む。付加的Ｎ末端およびＣ末端ペプチド配列は、上記のとおりであり得る。本発明のペプチドは、全長ＯＭＰ−１タンパク質からなる訳ではない。しかしながら、特定の実施形態において、本発明のペプチドは、全長ＯＭＰ−１タンパク質を含むことができる。他の実施形態において、本発明のペプチドは、全長ＯＭＰ−１タンパク質を含まない。
【００６３】
付加的Ｎ末端および／またはＣ末端ペプチド配列を含む本発明のペプチドは、エールリヒア感染を感染後早期に（例えば、感染の発症後１〜２週間以内に）診断するために設計され得る。例えば、特定の実施形態において、付加的Ｎ末端および／またはＣ末端ペプチド配列は、エールリヒア感染の早期段階と関連付けられた抗原またはエピトープを含む。
【００６４】
上記配列に加えて、付加的Ｎ末端およびＣ末端配列は、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、凝集アッセイ等）において、検出のために本発明のペプチドをより良く提示するように設計された柔軟な配列を含み得るか、またはそれからなり得る。かかる柔軟な配列は、当業者によって容易に特定され得る。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、２５個以上（例えば、２６個、２７個、２８個、２９個、またはそれ以上）のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、３０個以上（例えば、３１個、３２個、３３個、３４個、またはそれ以上）のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、３５個以上（例えば、３６個、３７個、３８個、３９個、またはそれ以上）のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、４０個以上（例えば、４１個、４２個、４３個、４４個、またはそれ以上）のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、４５個以上（例えば、４６個、４７個、４８個、４９個、またはそれ以上）のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、５０個以上（例えば、５１個、５２個、５３個、５４個、またはそれ以上）のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはそれ以上のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなる。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、本明細書に記載のペプチド配列のエピトープを含む。例えば、特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１〜７３および８３〜８６からなる群から選択された配列のエピトープを含む。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、本明細書に記載のペプチド配列の断片を含む。例えば、特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１〜７３および８３〜８６からなる群から選択された配列の断片を含む。断片は、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４のアミノ酸長であり得る。断片は、連続であり得るか、または１つ以上の欠失（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失）を含み得る。例えば、一実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号１の断片を含む。かかる断片は、配列番号１から少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、または３５個の連続アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、配列番号１のアミノ酸１〜２６を含む。故に、一実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000027
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＥおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００６８】
特定の一実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号３または配列番号７２の断片を含む。かかる断片は、配列番号３または配列番号７２から少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、または４０個の連続アミノ酸を含み得る。例えば、特定の実施形態において、かかる断片は、配列番号３または配列番号７２のアミノ酸１〜２６を含み得る。故に、一実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000028
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ２は、ＡおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ５は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ８は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＴおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＧおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＬおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＹおよびＦからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＳおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２３は、Ａ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＡおよびＩからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２５は、ＴおよびＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、Ｓ、Ｎ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸である。他の実施形態において、断片は、配列番号３または配列番号７２のアミノ酸３３〜７１を含み得る。故に、一実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000029
の配列を含むか、またはそれからなり、式中、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ９は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２は、任意のアミノ酸であり、Ｘ１６は、ＶおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２４は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２６は、任意のアミノ酸である。別の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000030
の配列を含み、式中、Ｘ８は、任意のアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＤおよびＮからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は、任意のアミノ酸であり、Ｘ１７は、ＶおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１８は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２５は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２７は、任意のアミノ酸である。さらに別の実施形態において、本発明のペプチドは、
0006325553.tif 000031
の配列を含み、式中、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ１２は、任意のアミノ酸であり、Ｘ１７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２４は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２６は、任意のアミノ酸である。
【００６９】
特定の実施形態において、断片は、米国特許第６，３０６，４０２号、同第６，３５５，７７７号、同第７，２０４，９９２号、もしくは同第７，４０７，７７０号、または国際公開第ＷＯ２００６／１３８５０９号に記載の配列を含む。特定の実施形態において、断片は、米国特許第６，３０６，４０２号、同第６，３５５，７７７号、同第７，２０４，９９２号、および同第７，４０７，７７０号、ならびに国際公開第ＷＯ２００６／１３８５０９号のうちの１つ以上に記載の配列からなる訳ではない。本明細書に記載のペプチド配列の断片を含む本発明のペプチドは、付加的Ｎ末端ペプチド配列、付加的Ｃ末端ペプチド配列、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。付加的Ｎ末端およびＣ末端ペプチド配列は、上記のとおりであり得る。
【００７０】
付加的Ｎ末端またはＣ末端ペプチド配列を含む本発明のペプチドは、ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、もしくは配列番号８５のペプチド、またはその断片）を、付加的Ｎ末端またはＣ末端ペプチド配列と接続するリンカーをさらに含むことができる。リンカーは、例えば、ペプチドスペーサーであり得る。かかるスペーサーは、例えば、約１個〜５個（例えば、約３個）のアミノ酸残基、好ましくは、非電荷アミノ酸、例えば、グリシンまたはアラニンのような脂肪族残基からなり得る。一実施形態において、スペーサーは、トリプレットグリシンスペーサーである。別の実施形態において、スペーサーは、トリプレットアラニンスペーサーである。なおも別の実施形態において、スペーサーは、グリシン残基およびアラニン残基の両方を含む。代替として、リンカーは、化学（すなわち、非ペプチド）リンカーであり得る。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、合成化学によって産生される（すなわち、「合成ペプチド」）。他の実施形態において、本発明のペプチドは、生物学的に（すなわち、リボソームのような細胞機構によって）産生される。特定の実施形態において、本発明のペプチドは単離される。本明細書において使用されるとき、「単離」ペプチドは、合成的または生物学的のいずれかで産生され、次にペプチドを産生するために使用された化学物質および／または細胞機構から少なくとも部分的に精製されたペプチドである。特定の実施形態において、本発明の単離ペプチドは、実質的に精製される。本明細書において使用されるとき、「実質的に精製された」という用語は、細胞物質（タンパク質、脂質、炭水化物、核酸等）、培養培地、化学前駆体、ペプチドの合成に使用される化学物質、またはそれらの組み合わせを実質的に含まないペプチドのような分子を指す。実質的に精製されたペプチドは、約４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％未満、またはそれ以下の細胞物質、培養培地、他のポリペプチド、化学前駆体、および／またはペプチドの合成に使用される化学物質を有する。したがって、ペプチドのような実質的に純粋な分子は、乾燥重量で少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の関心対象の分子であり得る。本発明の単離ペプチドは、水中、緩衝液中、または、例えばキットの一部として、再構成を待つ乾燥形態であり得る。本発明の単離ペプチドは、薬学的に許容される塩の形態であり得る。本発明のペプチドで塩を形成することができる好適な酸および塩基は、当業者に周知であり、無機および有機の酸および塩基を含む。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、親和性精製される。例えば、特定の実施形態において、本発明のペプチドは、それらが抗エールリヒア抗体（例えば、ＯＭＰ−１タンパク質および任意の他のエールリヒア抗原に対する抗体）に結合する能力によって、ペプチド−抗体複合体が形成するようにかかる抗体を本発明のペプチドと接触させ、ペプチド−抗体複合体を洗浄して不純物を除去し、次にペプチドを抗体から溶離することによって、精製される。抗体は、例えば、固体支持体に付着してい得る。親和性精製の方法は、当業者に周知であり、ルーチンである。
【００７３】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは修飾される。本発明のペプチドは、多様な技術によって、例えば、熱および／または洗剤（例えば、ＳＤＳ）での変性によって修飾され得る。代替として、本発明のペプチドは、１つ以上のさらなる部分との結合によって修飾され得る。結合は、共有結合性または非共有結合性であり得、例えば、リジンもしくはシステインのような末端アミノ酸リンカー、化学カップリング剤、またはペプチド結合を介し得る。付加的部分は、例えば、リガンド、リガンド受容体、融合パートナー、検出可能な標識、酵素、またはペプチドを固定化する基体であり得る。
【００７４】
本発明のペプチドは、リガンド、例えば、ビオチン（例えば、システインもしくはリジン残基を介して）、脂質分子（例えば、システイン残基を介して）、または担体タンパク質（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、例えば、システインもしくはリジン残基を介して）に共役され得る。ビオチンのようなリガンドへの付着は、ペプチドを、アビジン、ストレプトアビジン、ポリマーストレプトアビジン（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１０／００８１１２５号、および同第２０１０／０２６７１６６号を参照）、またはニュートラアビジンのようなリガンド受容体と結合させるために有用であり得る。アビジン、ストレプトアビジン、ポリマーストレプトアビジン、またはニュートラアビジンは次に、シグナル伝達部分（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）もしくはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のような酵素、または金属ナノ粒子もしくはナノシェルのような可視化され得る他の部分（例えば、コロイド金）または蛍光部分）、あるいは固体基体（例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）またはニトロセルロース膜）に連結され得る。代替として、本発明のペプチドは、アビジン、ストレプトアビジン、ポリマーストレプトアビジン、またはニュートラアビジンのようなリガンド受容体に融合または結合され得、それによって対応するリガンド、例えば、ビオチンおよび任意の部分（例えば、シグナル伝達部分）またはそこに付着している固体基体とのペプチドの結合を促進する。他のリガンド−受容体対の例は、当該技術分野において周知であり、同様に使用することができる。
【００７５】
本発明のペプチドは、精製を改善する、宿主細胞中のペプチドの発現を強化する、検出を補助する、ペプチドを安定化する等のために使用することができる融合パートナー（例えば、ペプチドまたは他の部分）に融合され得る。融合パートナーに好適な化合物の例としては、担体タンパク質（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ＫＬＨ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ヒスチジンタグ等が挙げられる。融合は、例えば、ペプチド結合によって達成され得る。例えば、本発明のペプチドおよび融合パートナーは、融合タンパク質であり得、インフレームで直接融合され得るか、または付加的Ｎ末端およびＣ末端ペプチド配列の文脈において上述のとおり、ペプチドリンカーを含み得る。特定の実施形態において、本発明のペプチドの混合物は、デンドリマーによって、例えば、ＭＡＰＳ構造内にあるように連結され得る。
【００７６】
加えて、本発明のペプチドは、多様な既知の化学基または分子のうちのいずれかを含むように修飾され得る。かかる修飾としては、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ポリエチレングリコールへの共有結合（例えば、ＰＥＧ化）、フラビンの共有結合、半部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジリノシトールの共有結合、架橋、周期化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化、脂肪酸での修飾、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、例えば、アルギニル化等が挙げられるが、これらに限定されない。置換連結を持つアミノ酸（非天然アミノ酸を含む）およびペプチドの類似体も含まれる。本明細書に論じられる配列のうちのいずれかからなる本発明のペプチドは、論じられる修飾のうちのいずれかによって修飾され得る。かかるペプチドは、依然としてアミノ酸「からなる」。
【００７７】
上記のような修飾は、当業者に周知であり、科学文献において極めて詳細に説明されている。いくつかの特に一般的な修飾、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰ−リボシル化は、例えば、多くの基本的なテキスト、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に説明されている。この表題に関して、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６、およびＲａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２のような多くの詳細なレビューが入手可能である。
【００７８】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、固体または半固体支持体のような基体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。付着は、共有結合性または非共有結合性であり得、かつ、共有結合または非共有結合を可能にするペプチドと結合した部分によって、例えば、担体、支持体、または表面に付着した構成要素に対して高い親和性を有する部分によって、促進され得る。例えば、ペプチドを、ビオチンのようなリガンドと結合させることができ、かつ、表面と結合した構成要素は、アビジンのような対応するリガンド受容体であり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ペプチドの基体への付着を促進する融合パートナー、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合し得る。他の実施形態において、本発明のペプチドは、金属ナノ層を介して基体に付着しているかまたはその表面に固定化されている。一実施形態において、金属ナノ層は、カドミウム、亜鉛、水銀、または貴金属、例えば、金、銀、銅、および白金で構成される。ペプチドまたはペプチドの混合物は、イムノアッセイ中、抗体を含有する試料の添加前または添加後のいずれかに基体に付着され得るか、またはその表面に固定化され得る。
【００７９】
特定の実施形態において、基体は、コロイド粒子（例えば、金、銀、白金、銅、カドミウム、金属組成物、他の軟金属、コアシェル構造粒子、もしくは中空金ナノ球）あるいは他の種類の粒子（例えば、磁気ビーズまたはシリカ、ラテックス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、もしくはＰＶＤＦを含む粒子またはナノ粒子）のようなビーズである。かかる粒子は、標識（例えば、比色分析、化学発光、または蛍光標識）を含むことができ、イムノアッセイ中にペプチドの位置を可視化するために有用であり得る。特定の実施形態において、本発明のペプチドの末端システインを使用して、ペプチドを、金、銀、白金、銅、カドミウム、金属組成物、もしくは他の軟金属、または金属ナノシェル（例えば、金中空球、金コーティングシリカナノシェル、およびシリカコーティング金シェル）から作製されたナノ粒子に直接結合する。
【００８０】
特定の実施形態において、基体は、ドットブロットまたはラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路である。例えば、ペプチドは、多孔質膜、例えば、ＰＶＤＦ膜（例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）膜）、ニトロセルロース膜、ポリエチレン膜、ナイロン膜、または同様の種類の膜に付着し得るか、またはその表面に固定化され得る。
【００８１】
特定の実施形態において、基体は、分析用または遠心分離用ローター内の流路である。他の実施形態において、基体は、管またはウェル、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおける使用に好適なプレート（例えば、マイクロタイタープレート）内のウェルである。かかる基体は、ガラス、セルロース系物質、熱可塑性ポリマー、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、もしくはポリエステル、粒子物質からなる焼結構造（例えば、ガラスもしくは様々な熱可塑性ポリマー）、またはニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホン等からなる注型膜フィルムを含むことができる。基体は、多孔質ポリエチレンとして一般に知られているポリエチレン、例えば、Ｃｈｒｏｍｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）からの０．２〜１５ミクロンの多孔質ポリエチレンの焼結された微粒子であり得る。これらの基体物質の全ては、好適な形状、例えば、フィルム、シート、もしくはプレートで使用され得るか、またはそれらは、紙、ガラス、プラスチックフィルム、もしくは布地のような適切な不活性担体の表面にコーティングされ得るか、または結合もしくは積層され得る。ペプチドを固相の表面に固定化するための好適な方法としては、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用等が挙げられる。
【００８２】
したがって、別の態様において、本発明はデバイスを提供する。特定の実施形態において、デバイスは、イムノアッセイを行うために有用である。例えば、特定の実施形態において、デバイスは、ラテラルフローイムノアッセイデバイスである。いくつかの実施形態において、デバイスは、ペプチドまたはペプチドの集団が付着している複数のビーズで構成されたスライドである。他の実施形態において、デバイスは、分析用または遠心分離用ローターである。他の実施形態において、デバイスは、ドットブロット、スロットブロット、またはウェスタンブロットである。他の実施形態において、デバイスは、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに好適なプレート内の管またはウェルである。さらに他の実施形態において、デバイスは、電気化学センサー、光学センサー、または光電子工学センサーである。
【００８３】
特定の実施形態において、デバイスは、本発明のペプチドまたはペプチドの集団を含む。他の実施形態において、デバイスは、本発明の異なるペプチドの混合物を含む。例えば、特定の実施形態において、デバイスは、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるペプチドを含む。特定の実施形態において、ペプチドまたは混合物中の各ペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、配列番号８５の配列、またはその断片を含む。他の実施形態において、ペプチドまたは混合物中の各ペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号７２の配列、またはその断片を含む。特定の実施形態において、ペプチドの混合物または集団は、任意に金属ナノ層を介してデバイスに付着しているか、またはその表面に固定化されている。デバイスは、試料中の複数の種（例えば、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、およびエールリヒア・ムリス）からのエールリヒア抗原に対する抗体を同時に検出するように使用され得る。一実施形態において、デバイスは、３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団を含み、この集団内の各ペプチドは、配列番号７２の配列を含む。関連実施形態において、単離ペプチドの集団は、配列番号３および／または配列番号７１の配列を含むペプチドをさらに含む。別の実施形態において、デバイスは、３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団を含み、この集団内の各ペプチドは、配列番号３の配列を含む。別の実施形態において、デバイスは、３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団を含み、この集団内の各ペプチドは、配列番号１の配列を含む。さらに別の実施形態において、デバイスは、３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団を含み、この集団内の各ペプチドは、配列番号７１の配列を含む。他の実施形態において、デバイスは、３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団を含み、この集団内の各ペプチドは、配列番号７、配列番号７０、配列番号８３、または配列番号８５の配列を含む。
【００８４】
別の態様において、本発明は、本発明の１つ以上のペプチドを含む組成物を提供する。例えば、特定の実施形態において、本発明は、配列番号１の配列を含むペプチドを含む組成物、またはその混合物を提供する。特定の実施形態において、この組成物は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、またはそれ以上のペプチド（例えば、配列番号１によって定義される全ての可能なペプチド）の混合物を含む。故に、本発明は、３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団を提供し、この集団内の各ペプチドは、配列番号１の配列を含む。特定の実施形態において、集団または混合物内のペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端付加を含み、ならびに／または本明細書に記載のとおり（例えば、１つ以上のさらなる部分との結合によって）修飾される。特定の実施形態において、ペプチドは、同じＮ末端および／またはＣ末端付加を含む。他の実施形態において、ペプチドは、異なるＮ末端および／またはＣ末端付加を含む。
【００８５】
さらに他の実施形態において、本発明は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、配列番号８５の配列を含むペプチドを含む組成物、またはその混合物を提供する。特定の実施形態において、この組成物は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、またはそれ以上のペプチド（例えば、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５によって定義される全ての可能なペプチド）の混合物を含む。故に、本発明は、３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団を提供し、この集団内の各ペプチドは、配列番号３の配列を含む。別の実施形態において、本発明は、３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団を提供し、この集団内の各ペプチドは、配列番号７２の配列を含む。他の実施形態において、本発明は、３つ以上の異なるペプチドを含む単離ペプチドの集団を提供し、この集団内の各ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号８３、または配列番号８５の配列を含む。集団または混合物内のペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端付加を含み得、ならびに／または本明細書に記載のとおり（例えば、１つ以上のさらなる部分との結合によって）修飾される。
【００８６】
特定の実施形態において、組成物は、本発明の１つ以上のペプチド（もしくはペプチドの１つ以上の集団）、ならびに、１つ以上の付加的ペプチド、例えば、エールリヒアペプチドもしくは抗原、１つ以上の感染性エールリヒア種からのペプチドもしくは抗原、または単球および／もしくは顆粒球エールリヒア症の１つ以上の原因物質からのペプチドもしくは抗原を含む。エールリヒアペプチドまたは抗原は、任意のエールリヒア表面ペプチドもしくは抗原、または本明細書に記載の任意のペプチドもしくは抗原であり得る（例えば、ＯＭＰ−１、ｐ３８、ｐ４３、ｐ１２０、ｐ１４０、ｐ１５３、ｐ１５６、ｐ２００、ｇｐ１９、ｇｐ３６、ｇｐ４７、ｇｐ２００、もしくはＨＧＥ−３タンパク質の任意のペプチドもしくは抗原、またはその任意の断片もしくはエピトープ）。組み合わせは、個別のペプチドもしくはポリペプチドのカクテル（単純混合物）を含み得るか、融合ペプチドもしくはポリペプチド（例えば、多量体ペプチド）の形態であり得るか、またはペプチドは、デンドリマーによって（例えば、ＭＡＰＳ構造内にあるように）、任意に連結残基（例えば、リジンもしくはシステイン残基）を介して連結され得る。例えば、特定の実施形態において、組成物は、１つ以上の本発明のペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５の配列を有するペプチド）および
0006325553.tif 000032
の配列またはその断片を有する１つ以上の抗原性エールリヒアペプチドを含み、式中、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ１２は、任意のアミノ酸であり、Ｘ１７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２４は、任意のアミノ酸であり、Ｘ２６は、任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、Ｘ７は、Ｋである。他の実施形態において、Ｘ１２は、ＫおよびＲからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１７は、ＥおよびＤからなる群から選択されるアミノ酸である。さらに他の実施形態において、Ｘ２４は、ＫおよびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２６は、ＥおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である。
【００８７】
特定の実施形態において、ペプチドの混合物または集団は、配列番号３の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドを含む。さらに他の実施形態において、ペプチドの混合物または集団は、配列番号１の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドを含む。一実施形態において、ペプチドの混合物または集団は、配列番号３の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７２の配列を有する１つ以上のペプチドを含む。別の実施形態において、ペプチドの混合物または集団は、配列番号７２の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドを含む。特定の一実施形態において、ペプチドの混合物または集団は、配列番号３の配列を有する１つ以上のペプチド、配列番号７２の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドを含む。かかる混合物は、試料中の複数の種（例えば、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、およびエールリヒア・ムリス）からのエールリヒア抗原に対する抗体の検出を同時に可能にする。
【００８８】
本発明のペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端において、別の好適なペプチドに融合され得る。本発明のペプチドの２つ以上のコピーは、互いに連結され得るか、単独であり得るか、または１つ以上の付加的ペプチドと併せて連結され得る。融合ペプチドまたはポリペプチドと非融合ペプチドまたはポリペプチドとの組み合わせを使用することができる。一実施形態において、付加的ペプチド（複数可）は、エールリヒアペプチドもしくは抗原からのＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープ、感染性エールリヒア種からのペプチドもしくは抗原、または単球および／もしくは顆粒球エールリヒア症の原因物質からのペプチドもしくは抗原を含有する。
【００８９】
別の態様において、本発明は、本発明のペプチドをコードする配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸が含むのは微生物のゲノム全体よりも少なく、かつこれは一本鎖または二本鎖であり得る。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸は、タンパク質、脂質、および他のポリヌクレオチドのような他の構成要素を含まないように精製され得る。例えば、核酸は、５０％、７５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％精製され得る。本発明の核酸は、本明細書に記載のペプチドをコードする。特定の実施形態において、核酸は、配列番号１〜７３および８３〜８６の配列を有するペプチド、またはその組み合わせをコードする。本発明の核酸は、他のヌクレオチド配列、例えば、リンカーをコードする配列、シグナル配列、ＴＭＲ輸送停止配列、膜貫通領域、またはタンパク質精製に有用なリガンド、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡを含み得る。
【００９０】
本発明の核酸は、単離され得る。「単離」核酸は、それが天然に結合している５′および３′隣接ゲノム配列の一方または両方と直接連続していないものである。単離核酸は、天然に存在するゲノム内で組み換えＤＮＡ分子に直接隣接することが天然に見出される核酸配列が除去されるか、または不在であるならば、例えば、任意の長さの組み換えＤＮＡ分子であり得る。単離核酸は、天然に存在しない核酸分子も含む。本発明の核酸は、免疫原性ペプチドをコードする断片も含み得る。本発明の核酸は、全長ポリペプチド、ペプチド断片、および変異体または融合ペプチドをコードすることができる。
【００９１】
本発明の核酸は、例えば、感染した個体からの血液、血清、唾液、または組織のような生体試料中に存在する核酸配列から少なくとも部分的に単離され得る。核酸は、例えば、自動合成器を使用して、研究室内で合成することもできる。ＰＣＲのような増幅方法を使用して、ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかから少なくとも部分的に核酸を増幅することができる。
【００９２】
本発明の核酸は、天然に存在するポリペプチドのコード配列を含むことができるか、または天然に存在しない改変配列をコードすることができる。所望される場合、核酸は、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、または宿主細胞中の本発明のポリヌクレオチドの発現を駆動する他の調節要素を含む発現制御要素を含む発現ベクターに、クローン化され得る。発現ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、もしくはＣｏｌＥ１のようなプラスミド、またはアデノウイルス２型ベクターもしくは５型ベクターのようなアデノウイルスベクターであり得る。任意に、シンドビスウイルス、シミアンウイルス４０、αウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ならびにサイトメガロウイルスおよびレトロウイルスベクター、例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスを含むが、これらに限定されない、他のベクターを使用することができる。ＭＣおよびＭＣ１のようなミニ染色体、バクテリオファージ、ファージミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、コスミド（ファージλコス部位が挿入されたプラスミド）、およびレプリコン（細胞においてそれら自体の制御下で複製することができる遺伝要素）を使用することもできる。
【００９３】
発現制御配列に操作可能に連結されたポリヌクレオチドを調製し、それらを宿主細胞内で発現するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，３６６，２４６号を参照されたい。本発明の核酸は、ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を指示する１つ以上の発現制御要素に隣接してまたはその近位に位置付けられるとき、操作可能に連結されている。
【００９４】
故に、例えば、本発明のペプチドは、従来の遺伝子工学技術に従って組み換えで産生され得る。本発明の組み換えペプチドを産生するために、ペプチドをコードする核酸は、好適な発現系に挿入される。一般に、選択されたペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、ペプチドの発現を可能にする発現制御配列に操作可能に連結される、組み換え分子またはベクターが構築される。例えば、細菌、ウイルス、酵母、真菌、昆虫、または哺乳類発現系を含有するベクターを含む、多種の適切な発現ベクターが、当該技術分野において既知である。かかる発現ベクターを入手し、使用するための方法は周知である。本発明の組成物または方法に使用されるこの分子生物学的技術およびその他におけるガイダンスについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，現行版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８：２７７−２９８（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，現行版）、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，現行版）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，（Ｔｕａｎ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，現行版）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓａｂｅｌｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（現行版）、およびそこに引用される参照文献を参照されたい。
【００９５】
したがって、本発明は、本発明の核酸を含むベクター、およびかかるベクターを含む宿主細胞も提供する。特定の実施形態において、ベクターは、シャトルベクターである。他の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである（例えば、細菌または真核発現ベクター）。特定の実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。
【００９６】
この方法による本発明の形質導入の組み換え核酸またはベクターに好適な宿主細胞または細胞株は、細菌細胞を含む。例えば、大腸菌（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）の様々な株は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。枯草菌（バチルス・サブティリス）、シュードモナス、ストレプトミセス、および他の桿菌等をこの方法で用いることもできる。代替として、本発明のペプチドは、従来の手順を使用して、酵母、昆虫、哺乳類、または他の細胞型において発現され得る。無細胞インビトロ合成および／または酵素媒介の合成機構が使用されてもよい。
【００９７】
本発明は、例えば、電気穿孔のような従来の手段によって、本発明のポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つの発現ベクターを持つ宿主細胞を、発現制御配列（例えば、転写調節配列）の制御下で、形質導入または形質転換することを伴う、組み換えペプチドまたはポリペプチドを産生するための方法も提供する。次に、形質導入または形質転換された宿主細胞は、ペプチドまたはポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養される。発現ペプチドまたはポリペプチドは、細胞から（または細胞外で発現された場合は培養培地から）、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等を使用する液体クロマトグラフィー（例えば、順相もしくは逆相）、親和性クロマトグラフィー（例えば、無機リガンドもしくはモノクローナル抗体を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、固定化金属キレートクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当業者に既知の適切な手段によって、回収、単離、および任意に精製される。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、最適な単離および精製技術を選択することができる。当業者は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、カラムクロマトグラフィー（例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アミノ末端アミノ酸分析、および定量アミノ酸分析を含む、標準方法を使用することによって、ペプチドまたはポリペプチドの純度を決定することができる。
【００９８】
方法
別の態様において、本発明は、試料中のエールリヒア抗原のエピトープに対する抗体を検出する方法を提供する。特定の実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明のペプチドと接触させることと、該ペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、該複合体の形成は、該試料における、エールリヒア抗原のエピトープに対する抗体の存在を示す。いくつかの実施形態において、エールリヒア抗原は、感染性エールリヒア種に由来する。特定の実施形態において、エールリヒア抗原は、病原性エールリヒア種、例えば、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、エールリヒア・ムリス、またはエールリヒア・カニスに由来する。単球および／または顆粒球エールリヒア症に関与した他のエールリヒア種は、それらが本発明のペプチドと特異的に反応することができる抗体を誘導するならば、本発明の方法を使用して検出することもできる。故に、本明細書において使用されるとき、「病原性エールリヒア」という用語は、単球および／または顆粒球エールリヒア症を引き起こす、任意のかかるエールリヒア種を指す。特定の実施形態において、これらの方法は、試料中の複数の種（例えば、エールリヒア・カニス、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・エウィンギ、およびエールリヒア・ムリス）からのエールリヒア抗原に対する抗体の検出を同時に提供する。
【００９９】
特定の実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上（例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、またはそれ以上）の異なるペプチドの混合物または集団と接触させることを含む。例えば、特定の一実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号１の配列を含む。別の特定実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号３の配列を含む。さらに別の実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号７２の配列を含む。いくつかの実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号７２の配列を含む。他の実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号８３、または配列番号８５の配列を含む。
【０１００】
特定の実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明の１つ以上のペプチドおよび１つ以上の他のペプチド（例えば、エールリヒアペプチド、またはその抗原性断片もしくはエピトープ、例えば、エールリヒア表面抗原、またはＯＭＰ−１、ｐ３８、ｐ４３、ｐ１２０、ｐ１４０、ｐ１５３、ｐ１５６、ｐ２００、ｇｐ１９、ｇｐ３６、ｇｐ４７、ｇｐ２００、またはＨＧＥ−３タンパク質）の混合物と接触させることを含む。例えば、いくつかの実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明の１つ以上のペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５）および配列番号７１の配列を有する１つ以上のエールリヒア抗原性ペプチドの混合物と接触させることを含む。特定の一実施形態において、これらの方法は、試料を、配列番号３の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドの混合物と接触させることを含む。別の実施形態において、これらの方法は、試料を、配列番号７２の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドの混合物と接触させることを含む。別の実施形態において、これらの方法は、試料を、配列番号７２の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号３の配列を有する１つ以上のペプチドの混合物と接触させることを含む。一実施形態において、これらの方法は、試料を、配列番号７２の配列を有する１つ以上のペプチド、配列番号３の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドの混合物と接触させることを含む。本発明のペプチドの混合物は、いくつかの実施態様において、試料中の複数のエールリヒア種（例えば、エールリヒア・カニス、エールリヒア・ムリス、エールリヒア・シャフェンシス、およびエールリヒア・エウィンギ）からの抗原に対する抗体の検出を同時に可能にする。
【０１０１】
特定の実施形態において、ペプチドまたは混合物もしくは集団中の各ペプチドは、単離（例えば、合成および／または精製）ペプチドである。特定の実施形態において、ペプチドまたはペプチドの混合物（すなわち、ペプチドの集団）は、固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。特定の実施形態において、固体支持体は、ビーズ（例えば、金属ナノ粒子もしくはナノシェル、ナノ粒子、ラテックスビーズ等）、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路（例えば多孔質膜）、分析用もしくは遠心分離用ローター内の流路、ブロット（ウェスタンブロット、ドットブロット、もしくはスロットブロット）、管もしくはウェル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに好適なプレート内）、またはセンサー（例えば、電気化学、光学、または光電子工学センサー）である。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはペプチドの混合物は、いくつかの実施形態において、カドミウム、亜鉛、水銀、または貴金属（例えば、金、銀、銅、および白金）で構成され得る金属ナノ層を介して固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。
【０１０２】
特定の実施形態において、検出するステップは、ＥＬＩＳＡまたは免疫蛍光アッセイを行うことを含む。他の実施形態において、検出するステップは、ラテラルフローイムノアッセイを行うことを含む。他の実施形態において、検出するステップは、凝集アッセイ（例えば、血球凝集または粒子／ビーズ凝集アッセイ）を行うことを含む。他の実施形態において、検出するステップは、試料を分析用または遠心分離用ローター内で回転させることを含む。いくつかの実施形態において、検出するステップは、波長シフトアッセイを行うことを含む。かかる波長シフトアッセイは、金属ナノ層または金属ナノ粒子／ナノシェルに付着したペプチドへの抗体の結合から生じる表面プラズモン共鳴または局所表面プラズモン共鳴の変化を測定または決定することを含み得る。さらに他の実施形態において、検出するステップは、電気化学、光学、または光電子工学センサーを用いて、試料を分析することを含む。
【０１０３】
本発明のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出するための多数の異なる従来アッセイがある。例えば、検出するステップは、ＥＬＩＳＡアッセイを行うこと、免疫蛍光アッセイを行うこと、ラテラルフローアッセイを行うこと、凝集アッセイを行うこと、波長シフトアッセイを行うこと、ウェスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロットを行うこと、分析用もしくは遠心分離用ローター内で試料を分析すること、または電気化学、光学、もしくは光電子工学センサーを用いて試料を分析することを含み得る。これらの異なるアッセイは、本明細書に記載される、および／または当業者に周知である。
【０１０４】
一実施形態において、方法は、感染した対象の免疫系によってその生体液または組織中で産生され、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組み合わせ、および任意に１つ以上の好適な付加的抗原性ポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合することができる、１つ以上のエールリヒア抗原（例えば、病原性エールリヒア、例えば、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・ムリス、エールリヒア・エウィンギ、またはエールリヒア・カニスの抗原）に対する天然に存在する抗体の存在を検出することを伴う。
【０１０５】
好適なイムノアッセイ方法は、典型的に、抗体を含有する可能性がある体液または組織の試料を（例えば、患者から）受け取るか、または入手することと、アッセイされる試料を、特異的ペプチド−抗体複合体の形成に（例えば、抗体へのペプチドの特異的結合に）有効な条件下で、本発明のペプチドと接触させること（例えば、インキュベートするか、または反応させること）と、接触した（反応した）試料を抗体−ペプチド反応の存在についてアッセイすること（例えば、抗体−ペプチド複合体の量を決定すること）とを含む。漸増量の抗体−ペプチド複合体の存在は、対象が、感染性エールリヒア種に曝露され、感染したことを示す。その修飾形態を含む、エールリヒア抗原に対する抗体に「特異的に結合する」（例えば、該抗体「に特異的な」または該抗体に対して「選好的に」結合する）ペプチドは、抗体の検出を可能にする量で、十分な時間、抗体と相互作用するか、またはそれとの物理的結合を形成もしくは経験する。「特異的に」または「選好的に」とは、ペプチドが、試料中の他の抗体に対するよりも、かかる抗体に対して高い親和性（例えば、より高い程度の選択性）を有することを意味する。例えば、ペプチドは、試料中の他の抗体に対するよりも、その抗体に対して少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、またはそれより高い親和性を有し得る。かかる親和性または特異度の程度は、例えば、競合的結合研究を含む、多様なルーチン手順によって決定され得る。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、陽性応答は、健常対照の群の平均値よりも大きな値２または３の標準偏差として定義される。いくつかの実施形態において、単球および／または顆粒球エールリヒア症の明白な血清診断を提供するために、二次アッセイが必要とされる。
【０１０６】
「抗体を含有する試料」または「試料中の抗体を検出する」のような表現は、抗体が含有されていないか、または検出されない場合に、試料または決定（例えば、検出試行）を排除することを意味しない。一般的な意味において、この発明は、感染性エールリヒアの感染に応答して産生された抗体が、検出されるか否かに関わらず、試料中に存在するかどうかを決定するアッセイを伴う。
【０１０７】
ペプチドおよび抗体を、それらが特異的に反応するように反応させるための条件は、当業者に周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）を参照されたい。
【０１０８】
方法は、抗体を含有する可能性のある体液または組織の試料を、対象から受け取ること、または入手することを含む。抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＡ型であり得る。一般に、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡ抗体は、例えば、感染の早期段階での検出のために検出される。ＩｇＧ抗体は、上述の付加的ペプチドのうちのいくつかがこの方法で使用されるときに検出され得る（例えば、鞭毛タンパク質の検出のためのペプチド）。試料は、好ましくは入手が容易であり、静脈血試料またはさらには指穿刺から得られる全血、血漿、または血清であってよい。他の身体部分または他の体液、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、胃分泌液、粘膜、尿等からの組織は、抗体を含有することが知られており、試料の供給源として使用され得る。試料は、組織抽出物または細胞溶解物であってもよい。
【０１０９】
ペプチド抗原および試料抗体を好適な培地中で反応させることができたら、抗体−ペプチド反応の存在または不在を決定するためのアッセイを行う。多種の好適なアッセイの中で、免疫沈降および凝集アッセイは熟練者に明らかとなるであろう。
【０１１０】
本発明の特定の実施形態において、アッセイは、試料中の抗体（複数可）を固定化することと、本発明のペプチドを添加することと、ペプチドに結合された抗体の程度を、例えば、標識されるペプチドによって、または標識結合パートナーのような標識物質（例えば、ストレプトアビジン−ＨＲＰもしくはストレプトアビジン−コロイド金複合体）、またはペプチドを特異的に認識する標識抗体を添加することによって検出することとを含む。例えば、図２を参照されたい。他の実施形態において、アッセイは、本発明のペプチドを固定化することと、抗体を含有する試料を添加することと、ペプチドに結合された抗体の量を、例えば、標識（例えば、金属ナノ粒子もしくは金属ナノシェル蛍光標識）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）に直接または間接的に共役された本発明の別のペプチドを添加することによって、または結合パートナーのような標識物質、もしくは試料抗体を特異的に認識する標識抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＧ抗体、抗イヌＩｇＭ抗体、抗ネコＩｇＧ抗体、抗ネコＩｇＭ抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ、またはそれらの組み合わせ等）を添加することによって検出することとを含む。例えば、図１、３、および４を参照されたい。他の実施形態において、アッセイは、本発明のペプチドを固定化することと、抗体を含有する試料を添加することと、ペプチドに結合された抗体の量を、例えば、試料抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＧ抗体、抗イヌＩｇＭ抗体、抗ネコＩｇＧ抗体、抗ネコＩｇＭ抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ等）を特異的に認識する第１の結合パートナーを添加し、第２の結合パートナー（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ等）をさらに添加することによって検出することとを含み、この第２の結合パートナーは標識され、該第１の結合パートナーを認識する。さらに他の実施形態において、アッセイは、ペプチドおよび抗体を含有する試料を、固定化されている反応物質のいずれも用いることなく反応させることと、次に、抗体およびペプチドの複合体の量を、例えば、標識されているペプチドによって、または標識結合パートナーのような標識物質（例えば、ストレプトアビジン−ＨＲＰもしくはストレプトアビジン−コロイド金複合体）またはペプチドを特異的に認識する標識抗体の添加によって検出することとを含む。
【０１１１】
本発明のペプチドの固定化は、共有結合性または非共有結合性のいずれかであり得、非共有結合性の固定化は、非特異的であり得る（例えば、マイクロタイターウェルにおいて、例えば、ポリスチレン表面に非特異的に結合する）。固体もしくは半固体担体、支持体、または表面への特異的もしくは半特異的結合は、固体もしくは半固体担体、支持体、または表面へのその共有結合もしくは非共有結合を可能にする部分を有する（それと結合している）ペプチドによって、達成され得る。例えば、この部分は、担体、支持体、または表面に付着した構成要素に対する親和性を有することができる。この場合、この部分は、例えば、ビオチンもしくはビオチニル基、またはペプチドのアミノ酸基に結合したその類似体、例えば、６−アミノヘキサン酸であってよく、次に構成要素は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはその類似体である。代替例は、この部分が、アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号８２）を有し、担体は、Ｎｉ＋＋またはＣｏ＋＋イオンで電荷されたニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）誘導体を含む。特定の実施形態において、部分は、融合パートナー、例えば、ＢＳＡである。例示的実施形態において、本発明のペプチドは、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端残基を介してＢＳＡに共役され得る。一実施形態において、本発明の１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、またはそれ以上のペプチドが、ＢＳＡに置換され得る、例えば、ＢＳＡと共役され得る。当業者によって理解されるように、置換レベルは、アッセイの感度に影響し得る。より少ないペプチドの分子を含有する高濃度のＢＳＡ−ペプチドによって提供される感度を達成するために、より低濃度の高度置換ＢＳＡが必要とされる。特定の他の実施形態において、融合パートナーは、ＭＡＰＳであり得る。特定の例示的実施形態において、ＭＡＰＳは、４つ、８つ、またはそれ以上の非対称分岐からなり得る。
【０１１２】
好適な担体、支持体、および表面としては、金属ナノ層、ビーズ（例えば、磁気ビーズ、コロイド粒子、もしくは金属ナノ粒子、もしくはナノシェル、例えば、コロイド金、またはシリカ、ラテックス、ポリスチレン、ポリカーボネート、もしくはＰＤＶＦ）、コポリマーのラテックス、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン、水酸化スチレン−ジビニルベンゼン、ポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、カーボンブラックのビーズ、非活性化または塩化ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル活性化ガラス、エポキシ活性化多孔質磁気ガラス、ゼラチンもしくは多糖類粒子または他のタンパク質粒子、赤血球、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはかかる抗体のＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
特異的抗体の検出のために抗原を使用するイムノアッセイのプロトコルは、当該技術分野において周知である。例えば、従来のサンドイッチアッセイを使用することができるか、または従来の比較アッセイ形式を使用することができる。いくつかの好適な種類のアッセイに関する論考については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上記）を参照されたい。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、抗体を含有する試料の添加前または添加後のいずれかに、共有結合または非共有結合によって固体もしくは半固体表面または担体の表面に固定化されている。
【０１１４】
特異的結合アッセイ、特にイムノアッセイを行うためのデバイスは既知であり、本方法で使用するために容易に適合され得る。固相アッセイは、一般に、試薬の分離がより早く単純であるため、沈降、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、または磁力のような分離ステップを必要とする異種アッセイ方法よりも容易に行われる。固相アッセイデバイスとしては、マイクロタイタープレート、フロースルーアッセイデバイス（例えばラテラルフローイムノアッセイデバイス）、ディップスティック、および免疫キャピラリーまたは免疫クロマトグラフィーイムノアッセイデバイスが挙げられる。
【０１１５】
本発明の実施形態において、固体もしくは半固体表面または担体は以下である：マイクロタイターウェル内の床もしくは壁、フィルター表面もしくは膜（例えば、ニトロセルロース膜もしくはＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）膜、例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）膜）、中空ファイバー、ビーズ付きクロマトグラフィー培地（例えば、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル）、磁気ビーズ、繊維状セルロースマトリックス、ＨＰＬＣマトリックス、ＦＰＬＣマトリックス、ペプチドが結合している分子が液相に溶解または分散されたときにフィルターによって保持できるようなサイズの分子を有する物質、ミセルを形成できるかミセルの形成に関与でき該ミセルを混入することなく液相を変化させるか交換する物質、水溶性ポリマー、または任意の他の好適な担体、支持体、もしくは表面。
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態において、ペプチドは、検出を可能にする好適な標識とともに提供される。単独で、または他の組成物もしくは化合物と併せて、検出可能なシグナルを提供することができる従来の標識が使用され得る。好適な標識は、酵素（例えば、ＨＲＰ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識、放射性標識、着色ラテックス粒子、および金属共役標識（例えば、金属ナノ層、金属ナノ粒子、または金属ナノシェル共役標識）を含むが、これらに限定されない。好適な金属ナノ粒子または金属ナノシェル標識としては、金粒子、銀粒子、銅粒子、白金粒子、カドミウム粒子、複合粒子、金中空球、金コーティングシリカナノシェル、およびシリカコーティング金シェルが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な層に好適な金属ナノ層は、カドミウム、亜鉛、水銀、および貴金属（例えば、金、銀、銅、および白金）で構成されるナノ層を含む。
【０１１７】
好適な検出方法としては、例えば、比色分析アッセイを用いて直接もしくは間接的にタグ付けされた剤の検出（例えば、ＨＲＰもしくはβ−ガラクトシダーゼ活性の検出のため）、光学顕微鏡を使用する目視検査、共焦点顕微鏡を含む免疫蛍光顕微鏡、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、オートラジオグラフィー（例えば、放射性標識された剤の検出のため）、電子顕微鏡法、免疫染色、細胞下分画等が挙げられる。一実施形態において、放射性元素（例えば、放射性アミノ酸）は、ペプチド鎖に直接組み込まれ、別の実施形態において、蛍光標識は、ビオチン／アビジン相互作用、フルオレセイン共役抗体との結合等を介してペプチドと結合する。一実施形態において、抗体の検出可能な特異的結合パートナーが、混合物に添加される。例えば、結合パートナーは、検出可能な二次抗体、または一次抗体に結合する他の結合剤（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、またはそれらの組み合わせ）であり得る。この二次抗体または他の結合剤は、例えば、放射性、酵素、蛍光、発光、金属ナノ粒子もしくは金属ナノシェル（例えば、コロイド金）、またはアビジン／ビオチン系のような他の検出可能な標識で標識され得る。別の実施形態において、結合パートナーは、ホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼのような酵素、または他のシグナル伝達部分に直接または間接的に（例えば、ビオチン／アビジン相互作用を介して）共役され得る、本発明のペプチドである。かかる実施形態において、検出可能なシグナルは、色原体、蛍光発生、または化学発光基質のような検出可能なシグナルを産生する酵素の基質を添加することによって、産生される。
【０１１８】
結合されたペプチドを検出するための「検出系」は、本明細書において使用されるとき、ペプチドに特異的な抗体のような検出可能な結合パートナーを含み得る。一実施形態において、結合パートナーは、直接標識される。別の実施形態において、結合パートナーは、シグナル生成試薬、例えば、好適な基質の存在下で検出可能なシグナルを産生することができる酵素に付着している。ペプチドを固定化するための表面は、任意に検出系を伴うことができる。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態において、検出手順は、抗体−ペプチド複合体を色変化について目視検査すること、または抗体−ペプチド複合体を物理化学変化について検査することを含む。物理−化学変化は、酸化反応または他の化学反応とともに発生し得る。それらは、目視、分光光度計を使用する等によって検出され得る。
【０１２０】
特に有用なアッセイ形式は、ラテラルフローイムノアッセイ形式である。ヒトまたは動物（例えば、イヌ、マウス、シカ等）免疫グロブリン、またはスタフＡ、Ｇ、もしくはＬタンパク質に対する抗体は、乾燥され、ガラスファイバーパッド（試料適用パッドまたは共役パッド）上に置かれたシグナルジェネレーターまたはレポーター（例えば、コロイド金）で標識され得る。診断ペプチドは、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）膜（例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）膜）のような膜の表面に固定化されている。試料（血液、血清等）の溶液が試料適用パッドに適用される（または共役パッドを通じて流れる）と、それは標識レポーターを溶解し、次に試料中の全ての抗体に結合する。次に、得られた複合体は、毛管作用によって次の膜（ＰＶＤＦまたは診断ペプチドを含有するニトロセルロース）に輸送される。診断ペプチドに対する抗体が存在する場合、それらは膜上で縞状の診断ペプチドに結合し、それによってシグナル（例えば、見ることができるか、または可視化され得るバンド）を生成する。標識抗体または二次標識抗体に特異的な付加抗体を使用して、制御シグナルを産生することができる。
【０１２１】
ラテラルフローイムノアッセイの代替形式は、リガンド（例えば、ビオチン）に共役され、標識リガンド受容体（例えば、ストレプトアビジン−コロイド金）と複合体形成する本発明のペプチドまたは組成物を含む。標識ペプチド複合体は、試料適用パッドまたは共役パッド上に置かれ得る。抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭまたは抗動物（例えば、イヌ、マウス、シカ）ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体または本発明の他のペプチドは、ＰＶＤＦのニトロセルロースのような膜上の試験部位（例えば、試験ライン）で固定化されている。試料が試料適用パッドに添加されると、試料中の抗体は、標識ペプチド複合体と反応し、本発明のペプチドに結合する抗体が間接的に標識されるようになる。次に、試料中の抗体は、毛管作用によって次の膜（ＰＶＤＦもしくは診断ペプチドを含有するニトロセルロース）に輸送され、固定化抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭもしくは抗動物ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（もしくはプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ、もしくはそれらの組み合わせ）または本発明の固定化ペプチドに結合する。試料抗体のうちのいずれかが本発明の標識ペプチドに結合されている場合、ペプチドと結合した標識を、試験部位において見ることができるか、または可視化され得る。本発明のペプチドを試験部位における固定化捕捉剤としておよび試料中の抗体と反応するための可溶性標識複合体として使用する、この種類のラテラルフローデバイスの別の実施形態は、図１に示される。かかる実施形態において、検出シグナルを増幅するために、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子またはナノシェル、ＨＲＰ、ＡＬＰ、フルオロフォア、着色ラテックス粒子）に共役された、プロテインＡ、プロテインＧ、および／またはプロテインＡ／Ｇ融合タンパク質を、試験部位に適用することができ、それらは、本発明の固定化ペプチドによって捕捉されたエールリヒア抗原に対する任意の抗体のＦｃ領域に結合する。このアッセイに好適な対照は、例えば、試料適用パッドまたは共役パッドに位置するニワトリＩｇＹ−コロイド金共役体、および試験部位の近位に位置する対照部位に固定化された抗ニワトリＩｇＹ抗体を含むことができる。
【０１２２】
血液製剤または他の生理液もしくは生体液のスクリーニングのための別のアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ、すなわち、ＥＬＩＳＡである。典型的に、ＥＬＩＳＡにおいて、本発明の単離ペプチドまたはペプチドの混合物もしくは集団は、マイクロタイターウェルの表面に直接、または捕捉マトリックス（例えば、抗体）を介して、吸着される。次に、表面上の残存非特異的タンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱不活性化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、またはＢＬＯＴＴＯ（保存剤、塩、および消泡剤も含有する無脂肪乾燥乳の緩衝溶液）のような適切な薬剤で阻止する。次に、特異的抗エールリヒア（例えば、抗エールリヒア・シャフェンシス、抗エールリヒア・ムリス、抗エールリヒア・エウィンギ、または抗エールリヒア・カニス）抗体を含有することが疑われる生体試料と共にウェルをインキュベートする。試料は未希釈で適用され得るか、またはより多くの場合、通常はＢＳＡ、ＮＧＳ、またはＢＬＯＴＴＯのような少量のタンパク質（０．１〜５．０重量％）を含有する緩衝溶液に、希釈され得る。特異的結合を発生させるのに十分な長さの時間インキュベートした後、ウェルを洗浄して非結合タンパク質を除去し、次に、最適濃度の適切な抗免疫グロブリン抗体（例えば、ヒト対象、イヌ、マウス、ウシ等の別の動物からの抗ヒト免疫グロブリン（αＨｕＩｇ））と共に、または、標準手順によって酵素もしくは他の標識に共役されかつ阻止緩衝液に溶解される本発明の別のペプチドと共に、インキュベートする。標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ等を含む多様な酵素から選択することができる。特異的結合が再度発生するように十分な時間をかけ、次にウェルを再度洗浄して非結合共役体を除去し、酵素に好適な基質を添加する。発色させて、ウェルの内容物の光学密度を目視または器具で決定する（適切な波長で測定する）。カットオフＯＤ値は、エールリヒア症が風土病ではない地域からの個体から収集された少なくとも５０例の血清試料の平均ＯＤ＋３標準偏差（ＳＤ）として、または他のかかる従来の定義によって定義され得る。非常に特異的なアッセイの場合、ＯＤ＋２  ＳＤをカットオフ値として使用することができる。
【０１２３】
ＥＬＩＳＡの一実施形態において、本発明のペプチドを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートまたはストレプトアビジンもしくは同様のビオチン結合化合物でコーティングされた同等の固相のような表面上で、アルカリコーティング緩衝液中、最適濃度で固定化し、４℃で終夜インキュベートする。標準洗浄緩衝液で好適な回数洗浄した後、従来の阻止緩衝液に溶解された最適濃度のビオチン化形態の本発明のペプチドまたは組成物を、各ウェルに適用する。次に、試料を添加し、アッセイを上記のとおり進める。ＥＬＩＳＡアッセイを行うための条件は、当該技術分野において周知である。
【０１２４】
ＥＬＩＳＡの別の実施形態において、本発明のペプチドまたはペプチドの混合物は、融合パートナー、例えば、ＢＳＡまたはＭＡＰＳを介して、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートまたは同等の固相のような表面上に固定化されている。次に、試料を添加し、アッセイを上記のとおり進める。
【０１２５】
ＥＬＩＳＡアッセイの代替形態は、ＨＲＰのような適切な酵素に付着している（例えば、融合される）本発明のペプチド（複数可）を特徴とする。かかるＥＬＩＳＡを実行するためのステップは、プレートのウェルを抗イヌ、抗ネコ、または抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭでコーティングすることと、本発明のペプチドに対する抗体を含有することが疑われる試料を、固定化された該各ＩｇＧ／ＩｇＭと共にインキュベートすることと、未反応の試料を除去して、ウェルを好適な洗浄緩衝液で洗浄することと、本発明の酵素結合（例えば、ＨＲＰ結合）ペプチドを適用することと、それを任意の捕捉された抗エールリヒア抗体と反応させることと、適切な酵素基質（例えば、ＴＭＢ）を適用することによって酵素結合ペプチドを可視化することと、を含む。
【０１２６】
別の実施形態において、これらの方法は、凝集アッセイを含む。例えば、特定の実施形態において、金属ナノ粒子もしくは金属ナノシェル（例えば、コロイド金等）またはラテックスビーズは、本発明のペプチドまたは組成物に共役されている。続いて、生体液を、ビーズ／ペプチド共役体と共にインキュベートし、それによって反応混合物を形成する。次に、反応混合物を分析して、抗体の存在を決定する。特定の実施形態において、凝集アッセイは、（１）競合アッセイの場合、本発明の組成物のペプチドに特異的な抗体、または（２）サンドイッチアッセイの場合、試料抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧもしくはＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＧもしくはＩｇＭ抗体、抗ネコＩｇＧもしくはＩｇＭ抗体等）を検出することができる抗体に共役されている、金属ナノ粒子もしくは金属ナノシェル（例えば、コロイド金等）またはラテックスビーズのような粒子の二次集団の使用を含む。好適な凝集方法は、凝集の程度を評価する手段として遠心分離を含み得る。
【０１２７】
さらに他の実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、ニトロセルロース紙の上にエレクトロブロットまたはドットブロットされる。続いて、生体液（例えば、血清または血漿）のような試料を、ブロット抗原と共にインキュベートし、生体液中の抗体を、抗原（複数可）に結合させる。次に、結合抗体は、例えば、標準免疫酵素方法によって、または可視化によって、二次抗体に結合された金属ナノ粒子もしくはナノシェル、または他の抗体結合剤、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ、もしくはそれらの組み合わせを使用して検出することができる。
【０１２８】
任意の数の従来のタンパク質アッセイ形式、特にイムノアッセイ形式は、対象におけるエールリヒア抗体および病原性エールリヒア（例えば、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・ムリス、エールリヒア・エウィンギ、またはエールリヒア・カニス）による感染の検出のために本発明の単離ペプチドを利用するように設計され得る。故に、本発明は、特定のアッセイ形式の選択によって限定されず、当業者に既知のアッセイ形式を包含すると考えられる。
【０１２９】
特定の実施形態において、これらの方法で使用される試料は、血液、血清、脳脊髄液、尿、または唾液のような体液である。他の実施形態において、試料は、組織（例えば、組織ホモジネート）または細胞溶解物である。特定の実施形態において、試料は、野生動物に由来する（例えば、シカまたは齧歯類、例えば、マウス、シマリス、リス等）。他の実施形態において、試料は、実験動物に由来する（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、霊長類等）。他の実施形態において、試料は、家畜または野生動物に由来する（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）。さらに他の実施形態において、試料は、ヒトに由来する。
【０１３０】
前述の論考の大部分は、病原性エールリヒアに対する抗体の検出を対象とする。しかしながら、この論考は、インビトロまたはインビボのいずれかでの感作されたＴ細胞の検出にも適用することを理解されたい。
【０１３１】
ＩｇＧが産生されるため、細胞媒介性免疫応答（例えば、Ｔヘルパー応答）が生成されることが予想される。したがって、感作されたＴ細胞と本発明のペプチドとの間の免疫学的反応性を決定することが可能となることが予想される。これはインビトロで、対象から単離されたＴ細胞をインキュベートし、免疫反応性を測定することによって、例えば、続くＴ細胞増殖を測定することによって、またはＩＦＮ−γのようなＴ細胞からのサイトカインの放出を測定することによって、行うことができる。これらの方法は、当該技術分野において周知である。
【０１３２】
本発明の方法が、インビボで行われるとき、多様な従来のアッセイのいずれかを使用することができる。例えば、皮膚試験の形態で、例えば、対象において本発明のペプチドを皮内注射することによってアッセイを行うことができる。注射箇所での陽性皮膚応答は、対象が、単球および／または顆粒球エールリヒア症を引き起こすことができる病原性エールリヒアに曝露され、感染したことを示し、注射箇所での陰性皮膚応答は、対象がそれに曝露／感染しなかったことを示す。この試験、または他のインビボ試験は、対象におけるＴ細胞反応の検出に依存する。
【０１３３】
別の態様において、本発明は、対象における単球および／または顆粒球エールリヒア症を診断する方法を提供する。対象は、単球および／または顆粒球エールリヒア症の原因物質に対する抗体を有することが疑われる対象であり得る。診断方法は、単球および／または顆粒球エールリヒア症の臨床症状を呈する対象を診断するために有用である。ヒト単球／顆粒球エールリヒア症の臨床症状としては、発熱、頭痛、不快感、筋肉痛、発疹、血小板減少症、白血球減少症、および上昇した血清トランスアミナーゼレベルが挙げられるが、これらに限定されない。動物（例えば、イヌ）におけるエールリヒア症の臨床症状としては、発熱、点状出血、出血障害、血管炎、リンパ節症、鼻および眼からの分泌物、脚および陰嚢の浮腫、体重減少、貧血に起因する淡い歯肉、血小板減少症に起因する出血、血管炎、リンパ節症、呼吸困難、咳、多尿、多渇症、および跛行が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
特定の実施形態において、これらの方法は、対象からの試料を、本発明のペプチドと接触させることと、該ペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、該複合体の形成は、対象がエールリヒア症疾患を有することを示す。特定の実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明の２つ、３つ、４つ、またはそれ以上（例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、またはそれ以上）の異なるペプチドの混合物または集団と接触させることを含む。例えば、特定の一実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号１の配列を含む。別の特定実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号３の配列を含む。さらに別の実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号７２の配列を含む。いくつかの実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号１、配列番号３、または配列番号７２の配列を含む。他の実施形態において、これらの方法は、試料を、２つ以上の異なる単離ペプチドの混合物または集団と接触させることを含み、各単離ペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号８３、または配列番号８５の配列を含む。
【０１３５】
特定の実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明の１つ以上のペプチドおよび１つ以上の他のペプチド（例えば、エールリヒアペプチド、またはその抗原性断片もしくはエピトープ、例えば、エールリヒア表面抗原、またはエールリヒアＯＭＰ−１、ｐ３８、ｐ４３、ｐ１２０、ｐ１４０、ｐ１５３、ｐ１５６、ｐ２００、ｇｐ１９、ｇｐ３６、ｇｐ４７、ｇｐ２００、またはＨＧＥ−３タンパク質の混合物と接触させることを含む。例えば、いくつかの実施形態において、これらの方法は、試料を、本発明の１つ以上のペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、または配列番号８５）および配列番号７１の配列を有する１つ以上のエールリヒア抗原性ペプチドの混合物と接触させることを含む。特定の一実施形態において、これらの方法は、試料を、配列番号３の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドの混合物と接触させることを含む。別の実施形態において、これらの方法は、試料を、配列番号７２の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドの混合物と接触させることを含む。別の実施形態において、これらの方法は、試料を、配列番号７２の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号３の配列を有する１つ以上のペプチドの混合物と接触させることを含む。一実施形態において、これらの方法は、試料を、配列番号７２の配列を有する１つ以上のペプチド、配列番号３の配列を有する１つ以上のペプチド、および配列番号７１の配列を有する１つ以上のペプチドの混合物と接触させることを含む。
【０１３６】
特定の実施形態において、ペプチドまたは混合物もしくは集団中の各ペプチドは、単離（例えば、合成および／または精製）ペプチドである。特定の実施形態において、ペプチドまたは異なるペプチドの混合物（すなわち、ペプチドの集団）は、基体（例えば、固体または半固体支持体）に付着しているか、またはその表面に固定化されている。例えば、特定の実施形態において、基体は、ビーズ（例えば、コロイドもしくは他の種類の粒子、または金属ナノ粒子もしくはナノシェル）、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路（例えば多孔質膜）、分析用もしくは遠心分離用ローター内の流路、ブロット（例えば、ウェスタンブロット、ドットブロット、もしくはスロットブロット）、管もしくはウェル（例えばＥＬＩＳＡアッセイに好適なプレート内）、またはセンサー（例えば、電気化学、光学、または光電子工学センサー）である。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはペプチドの混合物は、いくつかの実施形態において、カドミウム、亜鉛、水銀、または貴金属（例えば、金、銀、銅、および白金）で構成され得る金属ナノ層を介して固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。
【０１３７】
本発明のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出するための多数の異なる従来アッセイがある。例えば、検出するステップは、ＥＬＩＳＡアッセイを行うこと、ラテラルフローアッセイを行うこと、凝集アッセイを行うこと、波長シフトアッセイを行うこと、ウェスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロットを行うこと、分析用もしくは遠心分離用ローター内で試料を分析すること、または電気化学、光学、もしくは光電子工学センサーを用いて試料を分析することを含み得る。これらの異なるアッセイは、上述される、および／または当業者に周知である。
【０１３８】
特定の実施形態において、試料は、血液、血清、脳脊髄液、尿、または唾液のような体液である。他の実施形態において、試料は、組織（例えば、組織ホモジネート）または細胞溶解物である。特定の実施形態において、対象は、野生動物である（例えば、シカまたは齧歯類、例えば、マウス、シマリス、リス等）。他の実施形態において、対象は、実験動物である（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、霊長類等）。他の実施形態において、対象は、家畜または野生動物である（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）。さらに他の実施形態において、対象は、ヒトである。
【０１３９】
キット
なおも別の態様において、本発明はキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、本発明のペプチドを含む。特定の実施形態において、キットは、本発明の２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上の異なるペプチド、または本発明のペプチドの混合物もしくは集団を含む。ペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８３、配列番号８５の配列、またはその断片を含むことができる。特定の実施形態において、ペプチドは、固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。いくつかの実施形態において、ペプチドは、金属ナノ層（例えば、カドミウム、亜鉛、水銀、金、銀、銅、または白金ナノ層）を介して固体支持体に付着しているか、またはその表面に固定化されている。特定の実施形態において、固体支持体は、ビーズ（例えば、コロイド粒子、もしくは金属ナノ粒子、もしくはナノシェル）、ラテラルフローイムノアッセイデバイス内の流路、分析用もしくは遠心分離用ローター内の流路、管もしくはウェル（例えばプレート内）、またはセンサー（例えば、電気化学、光学、もしくは光電子工学センサー）である。
【０１４０】
特定の種類のアッセイのための試薬は、本発明のキットで提供することもできる。故に、キットは、ビーズの集団（例えば、凝集アッセイもしくはラテラルフローアッセイに好適な）またはプレート（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに好適なプレート）を含み得る。他の実施形態において、キットは、ラテラルフローイムノアッセイデバイス、分析用もしくは遠心分離用ローター、ウェスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、電気化学センサー、光学センサー、または光電子工学センサーのようなデバイスを含む。ビーズの集団、プレート、またはデバイスは、イムノアッセイを行うために有用である。例えば、それらは、試料からの抗体および本発明のペプチドを含む抗体−ペプチド複合体の形成を検出するために有用であり得る。特定の実施形態において、ペプチド、本発明の異なるペプチドの混合物（すなわち、ペプチドの集団）、または本発明のペプチド組成物は、ビーズ、プレート、またはデバイスに付着しているか、またはその表面に固定化されている。
【０１４１】
加えて、キットは、様々な希釈液および緩衝液、標識共役体または特異的に結合した抗原もしくは抗体の検出のための他の剤（例えば、標識試薬）、および他のシグナル生成試薬、例えば、酵素基質、共因子、および色原体を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、もしくは酵素）に共役された抗ヒト、抗イヌ、または抗ネコＩｇＧ／ＩｇＭ抗体を標識試薬として含む。他の実施形態において、キットは、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、もしくは酵素）に共役された、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ、またはそれらの組み合わせを標識試薬として含む。例示的プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質は、プロテインＡから４つのＦｃ結合領域を、プロテインＧからの２つと合わせる。例えば、Ｓｉｋｋｅｍａ，Ｊ．Ｗ．Ｄ．，Ａｍｅｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌａｂ，７：４２，１９８９、およびＥｌｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，４３２３−４３２７，１９８８を参照されたい（いずれも参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。さらに他の実施形態において、キットの標識試薬は、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、もしくは酵素）に共役された本発明の第２のペプチドの集団である。第２のペプチドの集団は、第１のペプチドの集団と同じであり得るか、または異なり得、任意に固体支持体に付着し得るか、またはその表面に固定化され得る。
【０１４２】
キットの他の構成要素は、当業者によって容易に決定され得る。かかる構成要素は、コーティング試薬、本発明のペプチドに特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル捕捉抗体、または抗体のうちの２つ以上のカクテル、標準としてこれらの抗原の精製もしくは半精製抽出物、モノクローナル抗体検出抗体、検出可能な標識に共役された抗マウス、抗イヌ、抗ネコ、抗ニワトリ、もしくは抗ヒト抗体、比色分析比較のための指標チャート、使い捨てグローブ、除染指示書、アプリケーター棒もしくは容器、試料調製カップ等を含んでよい。一実施形態において、キットは、緩衝液またはペプチド−抗体複合体を形成させる反応培地を構成するために適切な他の試薬を含む。
【０１４３】
かかるキットは、臨床検査室が、病原性エールリヒア、例えば、エールリヒア・シャフェンシス、エールリヒア・ムリス、エールリヒア・エウィンギ、またはエールリヒア・カニスによる感染を診断するための便宜的、効率的な方法を提供する。故に、特定の実施形態において、キットは指示書をさらに含む。例えば、特定の実施形態において、キットは、１つ以上のエールリヒア抗原に対する抗体を検出するか、または単球および／もしくは顆粒球エールリヒア症を診断するために、本発明のペプチドまたはペプチドの集団を使用する方法を示す指示書を含む。特定の実施形態において、キットは、１つ以上のエールリヒア抗原に対する抗体を検出するか、または単球および／もしくは顆粒球エールリヒア症を診断するために、ビーズの集団、プレート、またはデバイス（例えば、本発明のペプチドまたは異なるペプチドの混合物を含む）を使用する方法を示す指示書を含む。
【０１４４】
本発明のペプチド、ペプチドを含む組成物およびデバイス、キット、ならびに方法は、多数の利点を提供する。例えば、それらは、単球および／または顆粒球エールリヒア症の簡素、安価、迅速、高感度、および正確な検出を可能にし、同様の症状を持つ他の状態との血清学的交差反応を防ぐ。これが正確な診断を可能にする。さらに、本発明の診断試験（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、もしくは凝集アッセイ）は、エールリヒアの外面タンパク質に基づいて、抗ＯＭＰ−１抗体またはワクチンに応答して産生された他の抗体を含有する血清試料中で有用である。
【０１４５】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する。当然のことながら、これらの実施例は、本発明の特定の実施形態のみを単に説明するものであり、本発明の範囲に制限を設けるものではないことを理解されたい。
【実施例】
【０１４６】
実施例１−ＥＬＩＳＡアッセイ
３つの異なるペプチドの集団を、標準合成手順を使用して合成した。第１のペプチドの集団内の各ペプチド（ＥＣＨＥＷ１）は、配列番号７２の配列を含有していた。第１のペプチドの集団は、複数のエールリヒア種（例えば、カニス、シャフェンシス、およびエウィンギ）によって誘発された抗体に特異的に結合する。第２のペプチドの集団内の各ペプチド（ＥＥ１２ＥＷ１）は、配列番号３の配列を含有していた。第２のペプチドの集団は、主にエールリヒア・カニスおよびエールリヒア・シャフェンシスによって誘発された抗体に特異的に結合し、エールリヒア・エウィンギに対していくらかの交差反応性を有する。第３のペプチドの集団内の各ペプチド（ＥＥ１３）は、配列番号７１の配列を含有していた。第３のペプチドの集団は、主にエールリヒア・エウィンギによって誘発された抗体に特異的に結合し、エールリヒア・カニスおよびエールリヒア・シャフェンシスに対していくらかの交差反応性を有する。
【０１４７】
第３のペプチドの集団内の各ペプチドを、チオ−エーテル化学作用を使用して、担体タンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に別個に連結した。得られたＢＳＡ−ペプチド共役体を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにおいて捕捉実体として使用し、３つの別個のＥＬＩＳＡアッセイ（１プレート当たり１つのペプチド集団）を創出した。次に、プレートを閉鎖して望ましくない非特異的結合を防いだ。
【０１４８】
エールリヒア種に対して陽性のイヌ血漿試料を、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ＩＤＥＸＸ  ＳＮＡＰ  ４ＤＸ  Ｐｌｕｓ（商標）、および／またはＳＮＡＰ  ３Ｄｘ（商標）によって決定されるように、３つのＥＬＩＳＡプレートのそれぞれにおいて、固定化した捕捉ペプチドと共にインキュベートした。１時間のインキュベーション後、マイクロウェルを洗浄することによって、未反応の物質を除去した。特異的に捕捉されたイヌＩｇＧまたはＩｇＭは、ＨＲＰ標識プロテインＡとの反応によって検出された。市販のＴＭＢ基質を使用して、ＨＲＰをアッセイした。各ウェルの光学密度を、プレートリーダーを用いて６５０ｎｍで読み出した。
【０１４９】
合計１５６個の試料を評価したところ、そのうち１５２個は、ＥＬＩＳＡプレートにおいて試験結果が陽性であり、４個の試料は、試験結果が陰性であった。故に、試験の感度のパーセントは、９７．４％であった。感染性エールリヒア種によって選別された結果の要約は、以下の表１に示される。これらの実験結果は、配列番号７２、配列番号３、または配列番号７１によって定義されたペプチドの集団が、様々なエールリヒア種からの抗原に対する抗体の存在を検出することにおいて高い程度の感度を有することを示す。
【０１５０】
（表１）既知のエールリヒア陽性試料のＥＬＩＳＡ結果
0006325553.tif 000033
１これらの試料は、ペプチドのＥＣＨＥＷ１（配列番号７２）およびＥＥ１２ＥＷ１（配列番号３）集団を用いたＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性の試験結果を示し、ＩＦＡでエールリヒア・カニスに対してより高い力価を有した。
２これらの試料は、ペプチドのＥＣＨＥＷ１（配列番号７２）およびＥＥ１２ＥＷ１（配列番号３）集団を用いたＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性の試験結果を示し、ＩＦＡでエールリヒア・シャフェンシスに対してより高い力価を有した。
３これらの試料は、ペプチドのＥＣＨＥＷ１（配列番号７２）およびＥＥ１３（配列番号７１）集団を用いたＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性の試験結果を示した。
４これらの試料中のエールリヒア種を、ＩＦＡまたはＳＮＡＰアッセイによって確定することはできなかったが、試料は、ＥＣＨＥＷ１（配列番号７２）を用いたＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性の試験結果を示した。
【０１５１】
実施例２−ラテラルフローアッセイ
二重抗原サンドウィッチ形式のラテラルフローイムノアッセイを、複数種からのエールリヒア抗原に特異的な抗体の存在を検出するように構築した。配列番号７２によって定義されたペプチドの集団をＢＳＡに連結し、得られた複合体を、試験共役体（金ナノ粒子で標識されたペプチド）としても、捕捉体（デバイスの試験ラインで固定化された）としても使用した。試験ラインにおいて産生されたシグナルは、標識ペプチド共役体に付加されたプロテインＡおよびプロテインＧ−金共役体によって強化された。デバイスは、図５に表される。
【０１５２】
アッセイを行うために、抗凝固処理済の全血、血清、または血漿の一滴は、デバイスの試料ポートに適用される。血液分離パッドは、全血から血液細胞を濾過する。血漿（または血清）は、移動して、共役パッド上に存在する試験共役体に特異的に結合し、任意の形成された抗体−ペプチド複合体は、試験領域および制御領域を含有するニトロセルロース膜に移行する。試料適用後のチェイス緩衝液の適用は、遊離および結合試験共役体を、ニトロセルロース膜を通じて上部吸収パッドに向かって動かす。標識ペプチド−抗体複合体は試験ラインまで移動し、ここで固定化ペプチドが、抗体上の第２の結合部位を介して標識ペプチド−抗体複合体を捕捉する。共役体混合物中のプロテインＡ−金およびプロテインＧ−金共役体は、検出シグナルを増幅する捕捉抗体に結合する。試験部位における１本の赤いラインおよび制御部位における第２の１本の赤いラインの出現は、試料における、エールリヒア種（例えば、カニス、シャフェンシス、またはエウィンギ）に対する抗体の存在を示す。制御部位のみでの赤いラインの出現は、試料における、エールリヒア種の全てに対する抗体の不在を示す。この試験は、（ｉ）試験ラインでのシグナルは出現するが、制御ラインでのシグナルは存在しない場合、または（ｉｉ）制御ラインもしくは試験ラインのいずれかにおいてシグナルが観察されない場合に無効であると見なされる。
【０１５３】
実施例１においてＥＬＩＳＡアッセイによって評価された同じ１５６個の既知のエールリヒア陽性イヌ血漿試料を、ラテラルフローデバイス内で試験した。加えて、間接免疫蛍光アッセイまたはＩＤＥＸＸ  ＳＮＡＰ  ４ＤＸ  Ｐｌｕｓ（商標）によって陰性であると決定された１２０個のイヌ試料（血漿試料１００および全血試料２０）も評価した。結果を以下の表２に要約する。ラテラルフローアッセイは、９３．６〜９９．３％の９５％信頼区間で９７．４％の感度を有した。アッセイの特異度は、９４．１〜９９．８％の９５％信頼区間で９８．３％であった。この実施例は、配列番号７２によって定義されたペプチドの集団が、ラテラルアッセイ形式で用いられるときに、エールリヒア抗原に対する抗体を効果的に検出できることを実証する。
【０１５４】
（表２）既知のエールリヒア陽性および陰性試料のラテラルフローアッセイ結果
0006325553.tif 000034
【０１５５】
実施例３−間接蛍光抗体アッセイ
間接蛍光抗体試験は、本発明の１つ以上のペプチドでコーティングされたラテックスビーズを使用して構築される。特定の実施形態において、配列番号７１、配列番号７２、配列番号３、または配列番号５によって定義されたペプチドを使用する。本発明のペプチドを、チオ−エーテル化学作用を使用して、マレイミド誘導体化ラテックスビーズの表面にコーティングする。代替として、本発明のペプチドは、チオ−エーテル化学作用または同様の化学作用を介してＢＳＡに共役されてよく、ラテックスビーズ表面に受動的に吸収される。次に、かかるビーズの集団を、既知の技術を使用してガラススライドの表面上に固定化する。
【０１５６】
アッセイを行うために、抗エールリヒア抗体を有することが疑われるイヌからの一滴の血清または血漿（好適な緩衝液で適切に希釈された）を、ラテックスビーズでコーティングされたガラススライドに適用する。好適なインキュベーション時間に続いて、未反応の物質を洗い流し、一滴の蛍光標識抗イヌＩｇＧ（またはＩｇＭ）を適用して、スライドを追加の期間インキュベートする。最終調製物を蛍光顕微鏡下で見て、蛍光タグ付けされたラテックスビーズを決定する。試験血清／血漿の陽性または陰性分類は、適切な対照との比較に基づく。可視化ステップが酵素基質を用いる場合、蛍光標識の代わりに酵素標識が使用されてもよい。例えば、アルカリホスファターゼで標識された抗イヌＩｇＧ／ＩｇＭは、スライドをＢＣＩＰ−ニトロＢＴ基質に曝露することによって可視化することができる。標識プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＡ／Ｇ融合を、標識抗イヌＩｇＧおよび抗イヌＩｇＭの代わりに使用して、ペプチドコーティングされたビーズに結合された抗体を検出することができる。
【０１５７】
参照により組み込まれる文書における任意の定義が、本明細書に提供される定義と一致する限り、本明細書に提供される定義が優先する。本発明は、現在好まれている実施形態を参照して説明されたが、当業者には明らかとなるように、様々な変更および修飾を、本発明の趣旨から逸脱することなく行うことができることを理解されたい。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【０１５８】
本明細書で引用されるありとあらゆる特許、特許出願、および刊行物の特許請求の範囲、図、および／または図面の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
0006325553.tif 000038
【図２】
0006325553.tif 000039
【図３】
0006325553.tif 000040
【図４】
0006325553.tif 000041
【図５】
0006325553.tif 000042
【配列表】
0006325553000001.app