(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的ＣＲＺ１ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を欠いている単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞であって、ここで、前記ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は、ファーメンターまたはバイオリアクターにおいて、メタノール誘導後３２℃で約９０〜約１１０時間の間生存するという耐熱性表現型を有する、前記単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
【請求項２】
内在性ＣＲＺ１遺伝子が突然変異、破壊、部分欠失または全欠失されている；または、ＣＲＺ１ポリペプチドの発現がＣＲＺ１遺伝子の転写またはＣＲＺ１遺伝子の翻訳を干渉することによって低減されているかまたはＣＲＺ１ポリペプチドの分解が増加されている；または、ＣＲＺ１ポリペプチドの活性が化学阻害剤によって阻害されている、請求項１の単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
【請求項３】
（ｉ）内在性ＣＲＺ１遺伝子が：Ｌ３３→ＳＴＯＰ；Ｑ２１４→ＳＴＯＰ；Ｌ２９４→ＳＴＯＰ；Ｓ２９８→ＳＴＯＰ；Ｅ４０３→Ｇ；Ｆ４０６→Ｓ；Ｆ４０６→Ｌ：Ｃ４１１→Ｆ；およびＫ４６９→Ｎから成る群より選択される一または複数の突然変異を含むことにおいて、野生型ＣＲＺ１ポリペプチドと異なるポリペプチドをコードする；または
（ｉｉ）内在性ＣＲＺ１遺伝子が：ａ１４０７ｃ；ｇ１２３２ｔ：ｔ１２１６ｃ；ｔ１２１７ｃ；ａ１２０８ｇ；ｃ８９３ａ；ｔ８８１ｇ；ｃ６４０ｔ；およびｔ９８ａから成る群より選択される一または複数の突然変異を含むことにおいて、野生型ＣＲＺ１遺伝子と異なるヌクレオチド配列を含んでいる；または
（ｉｉｉ）内在性ＣＲＺ１遺伝子が、それが機能的Ｃ末端ジンクフィンガードメインをコードしないことにおいて野生型ＣＲＺ１遺伝子と異なる、
請求項１〜２のいずれかの単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
【請求項４】
（ｉ）一または複数の内在性ベータ‐マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化または部分欠失または全欠失されている；
（ｉｉ）アルファ‐１，２マンノシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｉｉｉ）ホスホマンノシルトランスフェラーゼをコードする一または複数の内在性遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化または部分欠失または全欠失されている；
（ｉｖ）単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｖ）内在性ＡＬＧ３遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化または部分欠失または全欠失されている；
（ｖｉ）エンドマンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｖｉｉ）二機能性ＵＤＰ‐Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ／Ｎ‐アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸‐９‐リン酸シンターゼまたはＣＭＰ‐シアル酸シンターゼをコードする一または複数のポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｖｉｉｉ）内在性ＡＴＴ１遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化または部分欠失または全欠失されている；
（ｉｘ）内在性ＯＣＨ１遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化または部分欠失または全欠失されている；
（ｘ）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｘｉ）糖ヌクレオチド輸送体をコードするヌクレオチドを含んでいる；
（ｘｉｉ）シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｘｉｉｉ）アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる；および／または
（ｘｉｖ）プロテアーゼをコードする一または複数の内在性遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化および部分欠失または全欠失されている、
請求項１〜３のいずれかの単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞であって、異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、前記ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
【請求項６】
該異種ポリペプチドが免疫グロブリンである、請求項１〜５のいずれかの単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
【請求項７】
（ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、さらに、Ｌ３３→ＳＴＯＰ；Ｑ２１４→ＳＴＯＰ；Ｌ２９４→ＳＴＯＰ；Ｓ２９８→ＳＴＯＰ；Ｅ４０３→Ｇ；Ｆ４０６→Ｓ；Ｆ４０６→Ｌ：Ｃ４１１→Ｆ；およびＫ４６９→Ｎから成る群より選択される、一の突然変異を含む、または
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列を含み、さらに、ａ１４０７ｃ；ｇ１２３２ｔ：ｔ１２１６ｃ；ｔ１２１７ｃ；ａ１２０８ｇ；ｃ８９３ａ；ｔ８８１ｇ；ｃ６４０ｔ；およびｔ９８ａから成る群より選択される、一の突然変異を含む、
単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７のポリヌクレオチドを含む単離ベクター。
【請求項９】
バイオプロセス発酵条件下で改善された生存能を有する単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞を製造するための方法であって：
（ｉ）内在性ＣＲＺ１ポリペプチドをコードする遺伝子に突然変異を導入することであって、当該突然変異が以下から成る群より選択される、一の突然変異を有する変異ＣＲＺ１ポリペプチドに産生すること：
Ｌ３３→ＳＴＯＰ；Ｑ２１４→ＳＴＯＰ；Ｌ２９４→ＳＴＯＰ；Ｓ２９８→ＳＴＯＰ；Ｅ４０３→Ｇ；Ｆ４０６→Ｓ；Ｆ４０６→Ｌ：Ｃ４１１→Ｆ；およびＫ４６９→Ｎ；または
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに突然変異ａ１４０７ｃ；ｇ１２３２ｔ：ｔ１２１６ｃ；ｔ１２１７ｃ；ａ１２０８ｇ；ｃ８９３ａ；ｔ８８１ｇ；ｃ６４０ｔ；またはｔ９８ａを導入すること
を含み、
前記（ｉ）または（ｉｉ）において、前記突然変異は、生物発酵プロセス条件下において、改善した生存率を有するピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を生産し、ここで、当該改善した生存率は、ファーメンターまたはバイオリアクターにおいて、メタノール誘導後３２℃で約９０〜約１１０時間の間生存するという耐熱性表現型を含む前記方法。
【請求項１０】
請求項９の方法によって産生される単離真菌宿主細胞。
【請求項１１】
前記ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞に、同細胞内で内在性ＣＲＺ１遺伝子と相同的に組換えられ、かつ内在性ＣＲＺ１遺伝子を部分欠失または全欠失し、または内在性ＣＲＺ１遺伝子を破壊する異種ポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項１〜６のいずれかの単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を作成する方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法によって産生される単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞。
【請求項１３】
（ｉ）該異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを請求項１〜４、６、１０および１２のいずれかの単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞に導入すること；および
（ｉｉ）該ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を培養することおよび；さらに
（ｉｉｉ）該ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含んでもよい、一または複数の異種ポリペプチドを製造するための方法。
【請求項１４】
該異種ポリペプチドをコードする該異種ポリヌクレオチドが作動可能にメタノール誘導性プロモーターに結合され、かつ該単離ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞がメタノール存在下で該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で培養される、請求項１３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／７１６，６７０号の利益を主張し；該仮出願は、本明細書でその全体を参照することで援用される。
【０００２】
本発明は、その使用方法と併せて、ＣＲＺ１突然変異対立遺伝子および該対立遺伝子を含むピキア・パストリス（Ｐｉｃｋａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の真菌宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＧｌｙｃｏＦｉ社は、ヒト様糖鎖修飾を有する組換え糖タンパク質を産生するためにピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）を遺伝子操作した。しかしながら広範に渡る遺伝子組換えは、また細胞壁構造における根本的な変化も引き起こし、これらの糖操作株を発酵中に細胞溶解し易く、および細胞ロバスト性（頑強性）が低減し易くなった。これらの望ましくない形質は、実質的な細胞生存率の低下、ならびに発酵ブロスへの細胞内プロテアーゼ漏出の顕著な増加をもたらし、結果として組換え産物の収量および質の双方における低下をもたらした。単離真菌宿主細胞、例えばカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）；ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等は、真菌のグリコシル化経路におけるポリペプチドである機能的ＯＣＨ１を欠いていて、温度感受性であることが知られている。例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）ｏｃｈ１破壊株は４２℃において温度感受性であり（Ｂａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｕｔｅｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｎ‐Ｇｌｙｃａｎｓ  Ａｒｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃｎａｓ（外鎖Ｎ‐グリカンは、カンジダ・アルビカンスの細胞壁完全性およびビルレンスのために必要とされる），Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１：９０‐９８（２００６））；ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ｏｃｈ１破壊株は４５℃において温度感受性であり（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＨＯＣ１，ＯＣＨ１，ａｎｄ  ＯＣＲ１  Ｇｅｎｅｓ  ａｓ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  ＯＣＨ１  Ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｏｎ（タンパク質のグリコシル化に関わる酵母ＯＣＨ１マンノシルトランスフェラーゼ・ファミリーのメンバーとしての、ハンゼヌラ・ポリモルファＨＯＣ１、ＯＣＨ１およびＯＣＲ１遺伝子の機能的キャラクタリゼーション），Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８１：６２６１‐６２７２（２００６））；シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ｏｃｈ１破壊株は３７℃において温度感受性であり（Ｙｏｋｏ‐ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ｏｃｈ１＋  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａｌｐｈａ‐１，６‐Ｍｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｅｄ  ｉｎ  ｏｕｔｅｒ  ｃｈａｉｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ‐ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（シゾサッカロミセス・ボンベｏｃｈ１＋株は、Ｎ‐���合型オリゴ糖の外鎖伸長に関わるアルファ‐１，６‐マンノシルトランスフェラーゼをコードする），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８９：７５‐８０（２００１））；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｏｃｈ１破壊株は３７℃において温度感受性であり（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＯＣＨ１  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ  ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ｏｕｔｅｒ  ｃｈａｉｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｐａｒａｇｉｎｅ‐ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＯＣＨ１は、新規の膜結合性マンノシルトランスフェラーゼをコードする：アスパラギン結合オリゴ糖の外鎖伸長），ＥＭＢＯ  Ｊ．１１（７）：２５１１‐９（１９９２））；ならびにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｏｃｈ１破壊株は３７℃において温度感受性である（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎｉｚｅ  Ｎ‐ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（酵母ピキア・パストリスにおけるＮ‐結合型グリコシル化をヒト化するためのコンビナトリアル遺伝子ライブラリの使用），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００（９）：５０２２‐７（２００３））。細胞培養において、ｏｃｈ１−真菌宿主細胞（例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞）をよりロバスト性にするためのさらなる遺伝子操作は、価値があるであろう。
【０００４】
ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の発酵ロバスト性を増強するための遺伝子操作のための思いもかけない候補は、ＣＲＺ１、ジンクフィンガー転写因子である。ＣＲＺ１は、いくつかのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）原形質膜および細胞壁調節遺伝子を調節することが知られている（Ｃｙｅｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３１１：１１４３‐１１５０（２００３））。ＣＲＺ１の突然変異に起因する原形質膜および細胞壁合成の混乱は、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞をより弱いロバスト性とすると予想されたであろう。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｅｉａｅ）ＣＲＺ１の公表されたキャラクタリゼーションは、機能的なＣＲＺ１を欠くピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞が高温度ストレス下に置かれたとき、生存性およびロバスト性がより弱くなるであろう、と予想するように当業者を導いたであろう。（Ｍａｔｈｅｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１：３４４５‐３４５８（１９９７）；Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１：３４３２‐３４４４（１９９７））。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、機能的なＣＲＺ１ポリペプチドを欠く単離真菌宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））を提供し、例えば、ここで該細胞は、機能的ＣＲＺ１を発現する細胞と比較して発酵ロバスト性の増強および免疫グロブリン等の異種ポリペプチド産生の増加を示し、例えば、ここで内在性ＣＲＺ１は突然変異、破壊または部分的にまたは完全に欠失されていて；任意選択的に免疫グロブリン等の異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド（例えば、メタノール誘導性プロモーター等のプロモーターに作動可能に結合されている）を含んでいる。本発明の一実施形態において、（ｉ）内在性ＣＲＺ１は、Ｌ３３→ＳＴＯＰ；Ｑ２１４→ＳＴＯＰ；Ｌ２９４→ＳＴＯＰ；Ｓ２９８→ＳＴＯＰ；Ｅ４０３→Ｇ；Ｆ４０６→Ｓ；Ｆ４０６→Ｌ；Ｃ４１１→Ｆ；およびＫ４６９→Ｎ、内在性ＣＲＺ１の破壊、内在性ＣＲＺ１の全欠失、内在性ＣＲＺ１の部分欠失（例えば、ＣＲＺ１ポリペプチドの３３ａａ‐末端、２１４ａａ‐末端、２９４‐末端、２９８‐末端を欠失している）から成る群より選択される一または複数の突然変異を含むポリペプチドをコードし；または（ｉｉ）内在性ＣＲＺ１は、ａ１４０７ｃ；ｇ１２３２ｔ；ｔ１２１６ｃ；ｔ１２１７ｃ；ａ１２０８ｇ；ｃ８９３ａ；ｔ８８１ｇ；ｃ６４０ｔ；およびｔ９８ａから成る群より選択される一または複数の突然変異を含み；または（ｉｉｉ）内在性ＣＲＺ１は、機能的なＣ末端ジンクフィンガードメインをコードしない。本発明の一実施形態において、単離真菌宿主細胞は、また以下の特性の一または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３または１４のいずれか）を含み：（ｉ）ここで、一または複数の内在性ベータ‐マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子が、突然変異、破壊、トランケート化または部分もしくは全欠失されている；（ｉｉ）アルファ‐１，２マンノシダーゼ、アルファ‐１，３マンノシダーゼまたはアルファ‐１，６マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む；（ｉｉｉ）ここで、一または複数の内在性ホスホマンノシルトランスフェラーゼが、突然変異、破壊、トランケート化または部分もしくは全欠失されている；（ｉｖ）単一サブユニット性オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ｄ）を含む；（ｖ）ここで、内在性ドリコールリン酸マンノース依存アルファ‐１，３‐マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＡＬＧ３）が、突然変異、破壊、トランケート化または部分もしくは全欠失されている；（ｖｉ）エンドマンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む；（ｖｉｉ）二機能性ＵＤＰ‐Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ／Ｎ‐アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸‐９‐リン酸シンターゼまたはＣＭＰ‐シアル酸シンターゼをコードする一または複数のポリヌクレオチドを含む；（ｖｉｉｉ）ここで、内在性ＡＴＴ１遺伝子が、突然変異、破壊、トランケート化または部分的にもしくは完全に欠失されている；（ｉｘ）ここで、アルファ‐１，６‐マンノシルトランスフェラーゼ（例えば��ＯＣＨ１）が、突然変異、破壊、トランケート化または部分的にもしくは完全に欠失されている；（ｘ）ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えば、アルファ１，３‐ガラクトシルトランスフェラーゼまたはベータ１，４‐ガラクトシルトランスフェラーゼを含む；（ｘｉ）糖ヌクレオチド輸送体、例えば、ＵＤＰ‐ガラクトースト輸送体（ＤｍＵＧＴ）を含む；（ｘｉｉ）シアリルトランスフェラーゼ、例えば、アルファ‐２，６‐シアリルトランスフェラーゼ（ＭｍＳＴ６−３３）を含む；（ｘｉｉｉ）アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、例えば、ＧＮＴ１またはＧＮＴ２またはＧＮＴ４を含む；および／または（ｘｉｖ）ここで、一または複数の内在性プロテアーゼ遺伝子（例えば、ＰＥＰ４およびＰＲＢ１）が、突然変異、破壊または部分的にもしくは完全に欠失されている。本発明はまた、内在性ＣＲＺ１と相同的に組み換え、かつ内在性ＣＲＺ１を部分的にまたは完全に欠失させるまたは内在性ＣＲＺ１を破壊する、異種ポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む、本発明の単離真菌宿主細胞を作成するための方法を、該方法によって産生される真菌宿主細胞と共に提供する。
【０００６】
本発明はまた、例えば、ａ１４０７ｃ、；ｇ１２３２ｔ；ｔ１２１６ｃ；ｔ１２１７ｃ；ａ１２０８ｇ；ｃ８９３ａ；ｔ８８１ｇ；ｃ６４０ｔおよびｔ９８ａから成る群より選択される突然変異を含む配列番号２のヌクレオチド配列を含み、Ｌ３３→ＳＴＯＰ；Ｑ２１４→ＳＴＯＰ；Ｌ２９４→ＳＴＯＰ；Ｓ２９８→ＳＴＯＰ；Ｅ４０３→Ｇ；Ｆ４０３→Ｓ；Ｆ４０６→Ｌ；Ｃ４１１→ＦおよびＫ４６９→Ｎから成る群より選択される突然変異を含む配列番号３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。当該ポリヌクレオチドを含む単離されたベクターもまた、本発明の一部をなす。当該ヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチドもまた、本発明の一部をなす。
【０００７】
本発明はまた、ポリペプチドをコードする、Ｌ３３→ＳＴＯＰ；Ｑ２１４→ＳＴＯＰ；Ｌ２９４→ＳＴＯＰ；Ｓ２９８→ＳＴＯＰ；Ｅ４０３→Ｇ；Ｆ４０６→Ｓ；Ｆ４０６→Ｌ；Ｃ４１１→ＦおよびＫ４６９→Ｎから成る群より選択される突然変異を、真菌細胞中の内在性ＣＲＺ１遺伝子に導入することを含む、高温（例えば、３２°）における改善された生存能を有する単離されたｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））を作成する方法も提供する。
【０００８】
本発明はまた、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該単離されたｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））（例えば、本明細書記載のいずれか）に導入すること；および（ｉｉ）該細胞中の該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で（例えば、２４℃で）宿主細胞を培養すること、および；（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチド（例えば、免疫グロブリンのポリペプチド）を産生する方法も提供する。本発明の一実施形態において、該異種ポリペプチドをコードする該異種ポリヌクレオチドは、メタノール誘導性プロモーターに作動可能に結合され、かつここで単離された該真菌宿主細胞は、メタノールの存在下に該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で培養される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】改善された発酵ロバスト性およびＦｃ力価を示す耐熱性突然変異株。
【図２Ａ】突然変異誘発されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の系列。
【図２Ｂ】突然変異誘発されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の系列。
【図２Ｃ】突然変異誘発されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の系列。
【図３】耐熱性突然変異株のＮ‐グリカンプロファイル。Ｇ０＝ＧｌｃＮａｃで終結するＮ‐グリカン；Ｇ１＝単独のガラクトースで終結するＮ‐グリカン；Ｇ２＝二重のガラクトースで終結するＮ‐グリカン；Ａ１＝単独のシアル酸で終結するＮ‐グリカン；Ａ１Ｈ＝Ａ１ハイブリッド、混成構造を有する単独のシアル酸で終結するＮ‐グリカン；Ａ２＝二重のシアル酸で終結するＮ‐グリカン；Ｍ５＝Ｍａｎ５；Ｍ６＋＝Ｍａｎ６＋。
【図４】囲んだ「＋」印に相当する、Ｐｐ０２ｇ０２ｇ０２１２０（ＣＲＺ１）における多重変異およびＰｐ０１ｇ００６８０（ＡＴＴ１）における二の変異が確認された耐熱性突然変異株の大規模シークエンシング。
【図５】突然変異タンパク質Ｐｐ０２ｇ０２１２０は、ストレス応答に関わるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＲＺ１ジンクフィンガー転写因子と相同だった。種々の単離された突然変異ＰｐＣＲＺ１対立遺伝子を示す。「＊」は表示する変異の位置を示す。
【図６】プラスミドｐＧＬＹ１２８２９。
【図７】プラスミドｐＧＬＹ１２８３２。
【図８】ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１欠失およびトランケート化のために構築されたＤＮＡコンストラクト。
【図９】ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１欠失およびトランケート化突然変異株は３２℃における発酵ロバスト性の改善を示した。
【図１０】ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１欠失は３４℃におけるａｔｔ１突然変異株における発酵ロバスト性を改善する。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
予想に反して、機能的ＣＲＺ１を欠くピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞は、耐熱性の向上およびロバスト性の増強を示した。
【００１１】
菌株の特性を広範に改善するためにランダム突然変異誘発を実施し、いくつかの顕著に改善された発酵ロバスト性を有する耐熱性突然変異株であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を同定した。非突然変異誘発糖操作親株が温度感受性の表現型を示し（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、３２℃での誘導後４０ないし６０時間生存するのに対して、すべての突然変異株は３２℃での誘導後９０ないし１１０時間持続した。この延長された誘導期間により、これらの耐熱性株で発現される組換えタンパク質の収量および特性は顕著に向上した。この熱耐性および発酵ロバスト性向上の原因である突然変異を明らかにするために、独立して単離された９個の突然変異株に対するゲノムシークエンシングを実施し、突然変異株ごとに別個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内での非同義突然変異を確認した。驚くべきことにすべて９の突然変異株は、一遺伝子、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１のコーディング領域内に別個の突然変異を含んでいた。さらに重要なことにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１突然変異は、３の突然変異株ＹＧＬＹ２９０１０、ＹＧＬ２９０３１およびＹＧＬ２９０４２に検出された唯一の非同義一塩基多様性であった。まとめるとこれらのゲノムシークエンシングの結果は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１遺伝子内の突然変異が耐熱性および発酵ロバスト性の表現型の原因であることを示している。さらに内在性ＣＲＺ１が突然変異した、従って機能的ＣＲＺ１タンパク質を欠く非突然変異誘発糖操作菌株は、同様に３２℃での誘導後９０〜１１０時間の生存能を示した。
【００１２】
「ＣＲＺ１ｗｔ」真菌宿主細胞は野生型ＣＲＺ１を含む。
【００１３】
「ＰｐＣＲＺ１」は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１である。
【００１４】
「ＳｃＣＲＺ１」は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＲＺ１である。
【００１５】
ピキア属（Ｐｉｃｈａ）等の単離された真菌細胞、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の増殖に関する高温度とは、２８℃、２９℃または３０℃以上、例えば、３２℃である。
【００１６】
異種ポリヌクレオチドとは、真菌宿主細胞に導入されたポリヌクレオチドであり、かつ異種ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。例えば、異種ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖、例えば、軽鎖または重鎖可変ドメイン、および任意選択的に、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント由来の、例えば、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント、一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントまたはｄｓＦｖ抗体フラグメント等の抗体の抗原結合フラグメント由来の抗体定常ドメインをコードし得る。当該抗体のいずれも、インスリン様増殖因子受容体１、ＶＥＧＦ、インターロイキン‐６（ＩＬ６）、ＩＬ６受容体、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、ＣＤ２０、腫瘍壊死因子アルファ、ＮＦカッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）またはＲＡＮＫＬの受容体ＲＡＮＫ、ＩｇＥ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３または上皮成長因子受容体等のいかなるエピトープにも特異的に結合し得る。
【００１７】
「内在性」遺伝子とは、遺伝子の染色体コピーである。
【００１８】
本明細書で言及され得る遺伝子名の用語集は以下の通りである：
ＳｃＳＵＣ２        Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ
ＯＣＨ１            アルファ‐１，６‐マンノシルトランスフェラーゼ
Ｋ１ＭＮＮ２‐２    Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ‐ＧｌｃＮＡｃ輸送体    糖ヌクレオチド輸送体
ＢＭＴ１            ベータ‐マンノース‐トランスファー（ベータ‐マンノース除去）    ベータ‐マンノシルトランスフェラーゼ
ＢＭＴ２            ベータ‐マンノース‐トランスファー（ベータ‐マンノース除去）
ＢＭＴ３            ベータ‐マンノース‐トランスファー（ベータ‐マンノース除去）
ＢＭＴ４            ベータ‐マンノース‐トランスファー（ベータ‐マンノース除去）
ＭＮＮ４Ｌ１        ＭＮＮ４様１（電荷除去）
ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ＵＤＰ‐ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ
ＰＮＯ１            Ｎ‐結合型オリゴ糖のホスホマンノシル化（電荷除去）
ＭＮＮ４            マンノシルトランスフェラーゼ（電荷除去）
ＳｃＧＡＬ１０      ＵＤＰ‐グルコース４‐エピメラーゼ
ＸＢ３３            ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧａｌＴ１
ＤｍＵＧＴ          ＵＤＰ‐ガラクトース輸送体
ＫＤ５３            ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＤｍＭＮＳＩＩ
ＴＣ５４            ＳｃＭＮＮ２リーダーに融合したトランケート化ＲｎＧＮＴＩＩ
ＮＡ１０            ＰｐＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＨｓＧＮＴＩ
ＦＢ８              ＳｃＳＥＣ１２リーダーに融合したトランケート化ＭｍＭＮＳ１Ａ
ＭｍＣＳＴ          マウスＣＭＰ‐シアル酸輸送体
ＨｓＧＮＥ          ヒトＵＤＰ‐ＧｌｃＮＡｃ２‐エピメラーゼ／Ｎ‐アセチルマンノサミンキナーゼ
ＨｓＣＳＳ          ヒトＣＭＰ‐シアル酸シンターゼ
ＨｓＳＰＳ          ヒトＮ‐アセチルノイラミン酸‐９‐リン酸シンターゼ
ＭｍＳＴ６‐３３    ＳｃＫＲＥ２リーダーに融合したトランケート化マウスアルファ‐２，６‐シアリルトランスフェラーゼ
ＴｒＭＤＳ１        分泌型Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＭＮＳ１
ＳＴＥ１３          ゴルジ体ジペプチジルアミノペプチダーゼ
ＤＡＰ２            液胞ジペプチジルアミノペプチダーゼ
ＡＬＧ３            ドリコールリン酸マンノース依存アルファ（１‐３）マンノシルトランスフェラーゼ
ＳＴＴ３Ｄ          オリゴサッカリルトランスフェラーゼ
ＣｉＭＮＳ１        コクシジオイデス‐イミチスマンノシダーゼＩ
分子生物学
本発明においては、当該分野の技術範囲内で従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が使用し得る。本明細書で別途定義がない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および専門用語は、当業者によって通常理解される意味を有するものとする。さらに文脈上他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、かつ複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、生化学、酵素学、分子および細胞生物学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して本明細書で用いられる専門語および技術は、当該技術分野において周知でありかつ通常用いられているものである。本発明の方法および技術は、別途指摘のない限り本明細書を通して引用され議論される、当該技術分野において周知の従来法に従って、および種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載された通りに一般的に実施される。例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｃｒｅｇｇ（Ｅｄｉｔｏｒ（編者）），Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ピキアのプロトコル（分子生物学の方法）），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２０１０）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験マニュアル），２ｎｄ  ｅｄ（第２版）．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学のカレントプロトコル），Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２００２（２００２年の補遺））；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（抗体：実験マニュアル），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（糖鎖生物学序説），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ（ワージントン酵素マニュアル），Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  １（生化学ハンドブック：セクションＡタンパク質、第１巻），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（糖鎖生物学綱要），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（動物細胞培養）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（編）（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（固定化細胞と固定化酵素）（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング実践ガイド）（１９８４）を参照されたい。
【００１９】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」には、一本鎖形態、二本鎖形態またはその他の形態のＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。
【００２０】
「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の、核酸における一連の核酸のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも称される）であり、一連の二以上のヌクレオチドを意味する。本明細書で示すヌクレオチド配列を含むいかなるポリヌクレオチド（例えば、ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ）も本発明の一部を成す。
【００２１】
ＲＮＡまたはポリペプチド等の「コード配列」または発現産物を「コードする」配列とは、発現された時に産物（例えば、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖等の異種ポリペプチド）の産生をもたらすヌクレオチド配列（例えば、異種ヌクレオチド）である。
【００２２】
本明細書で用いる場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成可能な、一般的にわずか約１００ヌクレオチド（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０）の核酸を表す。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ‐ヌクレオチド、３Ｈ‐ヌクレオチド、１４Ｃ‐ヌクレオチド、３５Ｓ‐ヌクレオチドまたはビオチン等の標識が共有結合されたヌクレオチドの取り込によって標識され得る。
【００２３】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」（例えば、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖等の異種ポリペプチド）は、二以上のアミノ酸の連結した列を含む。本明細書で示されるアミノ酸配列を含むいかなるポリペプチド（例えば、Ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔポリペプチド）も、本発明の一部を構成する。
【００２４】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド中の一連の二以上のアミノ酸を表す。
【００２５】
用語「単離ポリヌクレオチド」または「単離ポリペプチド」には、細胞中または組換えＤＮＡ発現系中に通常見出される他の成分または任意の他の夾雑物から部分的にまたは完全に分離されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドがそれぞれ含まれる。これらの成分には、制限されるものではないが、細胞膜、細胞壁、リボゾーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来性ゲノム配列が含まれる。本発明の範囲には、本明細書で示される単離されたポリヌクレオチド（例えば、ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ）および当該ポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチドが含まれる。
【００２６】
単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、実質的に分子の均質な組成物であるのが好ましいが、ある不均一性を含んでも良い。
【００２７】
ＤＮＡの「増幅」には、用いる場合、ＤＮＡ配列の混合物内で特定のＤＮＡ配列の濃度を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用が含まれる。ＰＣＲの解説についてはＳａｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８７を参照されたい。
【００２８】
一般的に、「プロモーター」または「プロモーター配列」とは、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼを結合し（例えば、直接にまたは他のプロモーター結合性タンパク質もしくは物質によって）かつそれが作動可能に結合するコード配列の転写を開始する能力のあるＤＮＡ調節領域である。プロモーターに作動可能に結合されたｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔポリヌクレオチドは、本発明の一部を成す。また、プロモーターに作動可能に結合された異種ポリヌクレオチド（例えば、免疫グロブリンのポリペプチドをコードしている）を含む単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞も本発明の一部を成す。
【００２９】
コード配列（例えば、異種ポリヌクレオチド、例えば、レポーター遺伝子または免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖のコード配列）が転写および翻訳調節配列（例えば、本発明のプロモーター）「に作動可能に結合して」、「の調節下に」、「に機能的に関連して」または「に作動可能に関連して」いるとその時、該配列は、該コード配列のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡへのＲＮＡポリメラーゼ媒介性転写を命令し、次にＲＮＡはＲＮＡスプライシングされ得て（イントロを含んでいる場合）しかも任意選択的に該コード配列によってコードされたタンパク質に翻訳され得る。
【００３０】
本発明には、ｃｒｚ1ｍｕｔａｎｔポリヌクレオチドを含むベクターまたはカセットが含まれる。異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有するベクターは、また異種ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）の産生のために種々のｃｒｚ1ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞においても使用し得る。用語「ベクター」には、該宿主を形質転換するために、および任意選択的に、導入された配列の発現および／または複製を促進するために、それによってＤＮＡまたはＲＮＡ配列が該宿主細胞に導入され得るビヒクル（例えば、プラスミド）が含まれる。本明細書での使用に適したベクターには、宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））のゲノムへの核酸の導入を促進し得る、プラスミド、組込み可能なＤＮＡ断片および他のビヒクルが含まれる。プラスミドが最も普通に使用されるベクターの形態であるが、同様の機能を供給し、当該技術分野において知られているまたは知られるようになるベクターの他のすべての形態が、本明細書での使用に適している。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（クローニングベクター：実験マニュアル），１９８５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（補遺），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ（編）），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ（ベクター：分子クローニングベクター概説およびその使用），１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照されたい。当該ベクターは、任意選択的に異種ポリヌクレオチドに作動可能に結合された分泌シグナル（例えば、アルファ交配因子（α‐ＭＦ）プレ−プロリーダー配列）を含む。また、例えば、作動可能にプロモーターに結合した異種ポリヌクレオチド（例えば、免疫グロブリンのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含有するベクターを含む単離されたｃｒｚ1ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞も本発明の一部を成す。
【００３１】
作動可能にプロモーターに結合したポリヌクレオチド（例えば、異種ポリヌクレオチド、例えば、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖をコードする異種ポリヌクレオチド）は、発現系において発現され得る。用語「発現系」とは、適当な条件下で、タンパク質または該ベクターによって運ばれ該宿主細胞に導入される核酸を発現できる、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。通常の発現系には、真菌宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ）および哺乳動物宿主細胞とベクターが含まれる。
【００３２】
用語「メタノール誘導」とは、該宿主細胞をメタノールに暴露することによって、本発明の宿主細胞中のメタノール誘導性プロモーターに作動可能に結合したポリヌクレオチド（例えば、異種ポリヌクレオチド）の発現を増加させることを表す。メタノール誘導性プロモーターに作動可能に結合したポリヌクレオチドを含有するｃｒｚ1ｍｕｔａｎｔは、本発明の一部を成す。プロモーターコンストラクトを含むｃｒｚ1ｍｕｔａｎｔ真菌細胞をメタノールに暴露することにより、当該メタノール誘導性プロモーターに融合した異種ポリヌクレオチドの発現を誘導するための方法、およびコードされた異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該細胞を培養するための方法は、本発明の一部を成す。
【００３３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献は、本明細書で参照することにより援用される：ＢＬＡＳＴ  ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ（ＢＬＡＳＴアルゴリズム）：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３‐４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．（１９９３）３：２６６‐２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９６）２６６：１３１‐１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９‐３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９７）７：６４９‐６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）１７：１４９‐１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９４）１０：６７‐７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＣＯＲＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ（アラインメント・スコアリング・システム）：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（タンパク質配列および構造に関する図譜における「タンパク質の進化的変化のモデル」），（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３（補遺３）．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ（編）），ｐｐ．３４５‐３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｏｎｓｈｉｐｓ．”ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（タンパク質配列および構造に関する図譜における「遠位関係検出のための行列」），（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３（補遺３）．“Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ（編）．），ｐｐ．３５３‐３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２１９：５５５‐５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９１）３：６６‐７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１０９１５‐１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．（１９９３）３６：２９０‐３００；ＡＬＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ（アライメント統計）：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４‐２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３‐５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．（１９９４）２２：２０２２‐２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．”Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．“ｉｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ゲノム研究における理論的およびコンピュータ的方法における「複数の明瞭な局所アライメントの統計的有意差の評価」）（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ（編）．），（１９９７）ｐｐ．１‐１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００３４】
ＣＲＺ１
本発明は、当該方法で（例えば、突然変異、部分欠失または全欠失または遺伝子破壊で）突然変異された内在性ＣＲＺ１を含む単離真菌宿主細胞に加えて、突然変異（ｃｒｚ1ｍｕｔａｎｔポリヌクレオチド）を含む単離されたＣＲＺ１ポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（ｃｒｚ1ｍｕｔａｎｔポリペプチド）を含む。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１ポリヌクレオチドにおける当該突然変異の具体例は、以下の突然変異：ａ１４０７ｃ；ｇ１２３２ｔ；ｔ１２１６ｃ；ｔ１２１７ｃ；ａ１２０８ｇ；ｃ８９３ａ；ｔ８８１ｇ；ｃ６４０ｔ；およびｔ９８ａの一または複数を有する、配列番号２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。これらのＣＲＺ１ポリヌクレオチドは、以下の突然変異：Ｌ３３→ＳＴＯＰ（終止コドン）；Ｑ２１４→ＳＴＯＰ；Ｌ２９４→ＳＴＯＰ；Ｓ２９８→ＳＴＯＰ；Ｅ４０３→Ｇ；Ｆ４０６→Ｓ；Ｆ４０６→Ｌ；Ｃ４１１→Ｆ；およびＫ４６９→Ｎの一または複数を有する、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＲＺ１ポリペプチドをコードする。当該変異型ポリヌクレオチドは、野生型の内在性ＣＲＺ１を変異型ＣＲＺ１と置換するために、内在性ＣＲＺ１染色体座の中へ導入され得る。
【００３５】
本発明は、機能的Ｃ末端ジンクフィンガードメインを欠くＣＲＺ１ポリペプチドをコードする突然変異（例えば、ナンセンス突然変異またはジンクフィンガードメインをトランケート化する欠失）を含む、いかなるＣＲＺ１ポリヌクレオチドをも包含する。当該ポリペプチドもまた本発明の範囲内である。
【００３６】
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１ポリペプチドのジンクフィンガードメインは、アミノ酸配列：SIYACSLCSKRFTRPYNLK SHLRTHADERPFQCSICGKAFARSHDRKRHEDLHSGERKYCCKGVLSDGVTTWGCEKRFARTDALGRHFKTECGKLC（配列番号３のアミノ酸３７６‐４７１）を含む。
【００３７】
ランダム変異スクリーンにおいて確認された、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＲＺ１ポリペプチド（配列番号１）とピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１ポリペプチド（配列番号３）の間のＢＬＡＳＴＰ比較は、以下の通りである： 
0006383359.tif 000002
0006383359.tif 000003
本発明は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の突然変異株およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｄｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＲＺ１ポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＲＺ１ポリペプチドの具体例は、上に示すＢＬＡＳＴＰ比較において★または＾で特記した位置に、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する一または複数の変化を含む。
【００３８】
ＣＲＺ１の相同性は、当該技術分野において既知である。ＣＲＺ１の具体例は、以下に示す。本発明の一実施形態において、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＲＺ１ポリペプチドまたはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１ポリペプチドは、それぞれ配列番号１または３に対して少なくとも約９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）の配列類似性または配列相同性を含む。本発明の一実施形態において、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１ポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも約９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）の配列相同性を含む。
【００３９】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＲＺ１野生型ポリペプチド
0006383359.tif 000004
（配列番号１）
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１野生型オープンリーディングフレーム
0006383359.tif 000005
0006383359.tif 000006
（配列番号２）
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１野生型ポリペプチド
0006383359.tif 000007
（配列番号３）
宿主細胞
本発明は、その遺伝的背景にさらなる突然変異を含有し得る単離されたｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞を含む。「ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ」真菌宿主細胞において（半数体にせよ二倍体にせよ）、内在性の染色体ＣＲＺ１遺伝子が、突然変異、破壊または部分的にまたは完全に欠失されているか、またはＣＲＺ１タンパク質の発現が、何らの方法で（例えば、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）等の干渉ＲＮＡによって）低減されているか、またはＣＲＺ１ポリペプチドの活性が、化学的に（例えば、小分子阻害剤によって）不活性化されていて、従って該細胞は、ＣＲＺ１が突然変異または干渉等されなかった単離真菌宿主細胞と比較して、どんな程度にでも機能的ＣＲＺ１ポリペプチド濃度および／またはＣＲＺ１活性を部分的にまたは完全に欠く。本発明の一実施形態において、該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、高温または２４℃において、完全なレベルのＣＲＺ１を含む真菌宿主細胞よりも（例えば、ファーメンターまたはバイオリアクターにおいて）生存可能であり，例えば３２℃において、例えば３２℃での誘導の約９０〜１１０時間までのあいだ生存可能である。本発明の一実施形態において、例えば、異種Ｆｃポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む単離されたｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は（例えば、ファーメンターまたはバイオリアクターにおいて）、Ｆｃポリペプチドをコードする当該異種ヌクレオチドを含むＣＲＺ１野生型真菌宿主細胞よりも、顕著に多くの異種ポリペプチド（例えば、４倍または５倍以上）、例えば、Ｆｃポリペプチドを発現する（当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は本発明の範囲内である）。本発明の一実施形態において、例えば、異種Ｆｃポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む単離されたｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は（例えば、ファーメンターまたはバイオリアクターにおいて）、ＣＲＺ１ｗｔ真菌宿主細胞のＮ‐グリカンプロファイルと実質的に同一のＮ‐グリカンプロファイルを有する、例えば、効率的にそのＮ‐グリカン、例えば、高レベルの末端シアル酸を有し、および／または７７から８４％の範囲のＡ２レベル、および／または４から７％のＡ１レベルを有する、ＦｃＮ‐グリカンを効率的に修飾することのできる異種ポリペプチド、例えば、Ｆｃポリペプチドを発現する（当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、本発明の範囲内である）。
【００４０】
本発明の一実施形態において、本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、内在性の突然変異ＣＲＺ１ポリペプチドを含み、例えば、それは以下の突然変異：Ｌ３３→ＳＴＯＰ；Ｑ２１４→ＳＴＯＰ；Ｌ２９４→ＳＴＯＰ；Ｓ２９８→ＳＴＯＰ；Ｅ４０３→Ｇ；Ｆ４０６→Ｓ；Ｆ４０６→Ｌ；Ｃ４１１→Ｆ；およびＫ４６９→Ｎの一または複数を有する配列番号３のアミノ酸配列を含み；例えば、本発明の一実施形態において、単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞の突然変異内在性ＣＲＺ１ポリヌクレオチドは、以下の突然変異：ａ１４０７ｃ；ｇ１２３２ｔ；ｔ１２１６ｃ；ｔ１２１７ｃ；ａ１２０８ｇ；ｃ８９３ａ；ｔ８８１ｇ；ｃ６４０ｔ；およびｔ９８ａの一または複数を有する配列番号２のヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態において、本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞中で、内在性ＣＲＺ１はそれが変異またはトランケート化によって機能的Ｃ末端ジンクフィンガードメインを欠くように突然変異されている。本発明の一実施形態において、真菌宿主細胞の内在性ＣＲＺ１は、突然変異株のＣＲＺ１、例えば本明細書で示されるナンセンス突然変異株、欠失突然変異株、全欠失突然変異株またはナンセンス突然変異を含む突然変異株を含む突然変異株等のＣＲＺ１のいずれかとも置換された。
【００４１】
単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞における内在性ＣＲＺ１遺伝子は、部分的に欠失され得るので、結果としてＣＲＺ１が自然に生じるであろう染色体座内のＣＲＺ１コード配列の一部だけを残す（例えば、ここでＣＲＺ１ジンクフィンガードメインは部分的にまたは完全に欠失される）；完全に欠失され得るので、結果としてＣＲＺ１が自然に生じるであろう染色体座内にＣＲＺ１コード配列をまったく残さない（例えば、ここでＣＲＺ１は完全に欠失され栄養要求性マーカー等の他のポリヌクレオチドと置換される）；破壊され得るので、結果としてＣＲＺ１染色体遺伝子内に異種配列を挿入する；染色体遺伝子内の一または複数の箇所で突然変異され得る；ＣＲＺ１がそのように突然変異されていない細胞と比較して細胞内（例えば、その中に部分的にまたは完全に不活性化する突然変異がＣＲＺ１ジンクフィンガードメイン内に導入される）においてより低いＣＲＺ１発現レベルまたは活性となるように突然変異され得る；またはさもなければ、形はどうであれ部分的にまたは完全に不活性化され得る。別法として、相当量の機能的ＣＲＺ１ポリペプチドが細胞中で発現されないように、当該の内在性ＣＲＺ１遺伝子の調節領域が部分的にまたは完全に欠失され、破壊されまたは突然変異されうる。さらにＣＲＺ１発現は、何らかの方法、例えば、アンチセンスＣＲＺ１分子、ＳｉＲＮＡ  ＣＲＺ１分子を使用する発現の干渉によって、またはＣＲＺ１タンパク質分解の増強によって、または小分子阻害剤を使用する化学的阻害によって低下または除去され得る。当該単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、本発明の一部である。
【００４２】
本発明の範囲は、高温で「生存可能」であり、かつ発酵の間よりロバスト性である単離されたｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞、ならびに本明細書で述べる当該細胞の使用を包含する。バイオリアクター／ファーメンター環境内の細胞培養液中の、例えば３２℃等の高温での単離真菌宿主細胞の生存能は、本発明の一実施形態において、細胞培養液中における細胞溶解を測定することによって決定される。ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞溶解は、本発明の一実施形態において、顕微鏡的にまたは培養液の二本鎖ＤＮＡ含量を測定することによって評価される。顕微鏡的評価は、培養液中に観察される細胞残屑量をスコア化することによって行われる。培養液中の細胞残屑は、細胞溶解の結果であり、従って細胞溶解に対するマーカーであり、培養液中での細胞の生存能を測定するための手法である。１、２、３、４または５のスコアが与えられる；５により最大の溶解、すなわち９０％以上の細胞溶解を表す。ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、３２℃での誘導後９０ないし１１０時間のあいだ溶解に対しスコア５未満を示した。３２℃で誘導されたｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞を含む培養液は、９０ないし１１０時間のあいだ３０ミリグラム／ミリリットル以下の二本鎖ＤＮＡを有した。細胞が溶解するとき、二本鎖ＤＮＡは培地中に放出される；従って培養液の二本鎖ＤＮＡ含量は、細胞溶解のマーカーであり、培養液中での細胞の生存能を決定するための手法である。二本鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡに対する親和性により培養液中の二本鎖ＤＮＡに結合した蛍光染料（例えば、ビスベンズイミダゾール、ヘキスト３３３４２、ヘキスト３３２５８等のインドール誘導体染料または４９，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール；エチジウムブロミドまたはヨウ化プロピジウム等のフェナントリジニウム染料；ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ等のシアニン染料、ＹＯＹＯ‐１ヨウ化物、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩまたはＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ；例えば、Ｃｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７３（６）：５８５‐５９９（２００１）を参照されたい）の含量を測定することを含む、当該技術分野において既知のいくつかの方法のいずれかを使用して測定し得る。培養液中の二本鎖ＤＮＡの含量は、次にこれに基づき決定され得る。その結果、顕微鏡的な５未満の溶解スコアおよび／または３０ミリグラム／ミリリットル以下の二本鎖ＤＮＡ含量を有する培養液中の細胞は、「生存可能」とみなされる。
【００４３】
３２℃での誘導後約９０ないし約１１０時間のあいだ生存可能な単離真菌宿主細胞は、本明細書で「耐熱性の（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ‐ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」または「耐熱性（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ‐ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」表現型と表され得る。
【００４４】
本発明には、異種ポリペプチド（例えば、リポーターまたは免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖）をコードする異種ポリヌクレオチド、ここで該異種ポリヌクレオチドは作動可能にプロモーターに結合していてもよく；ならびにその使用方法、例えば、該真菌宿主細胞中での該異種ポリペプチドの発現方法が含まれる。例えば、本発明には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞に導入することおよび（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下でｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞を培養すること、任意選択的に、（ｉｉｉ）該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含み、任意選択的に一または複数のさらなる変化（例えば、内在性遺伝子および／または一または複数の他の遺伝子の発現に対する突然変異；例えば、本明細書で述べる通り、例えば発現されるポリペプチドのグリコシル化修飾を産生するための突然変異）を含む、単離されたｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞（例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））において一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００４５】
本発明の一実施形態においてｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、またＡＴＴ１における突然変異も含む。本発明の一実施形態においてｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、ＡＴＴ１における突然変異を含まず、例えば内在性ＡＴＴ１は野生型である（例えば、該細胞は野生型の、機能的ＡＴＴ１ポリペプチドを含む）、‐当該細胞およびその使用は、本明細書で述べる通り、本発明の一部である。
【００４６】
本発明の単離真菌宿主細胞は、真菌界に属する細胞であり、例えば本発明の一実施形態において真菌宿主細胞は、出芽酵母および／または分裂酵母等の任意の酵母である。本発明の一実施形態において宿主細胞は、任意のメタノール資化性酵母である。メタノール資化性酵母は、メタノールを唯一の炭素源およびエネルギー源として利用し得る酵母菌種の小グループである。メタノール資化性酵母には、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｕｔａ）（ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）およびカンジダ・ボイディニー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）が含まれる。本発明の一実施形態において宿主細胞は、任意のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）（ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラメ（Ｐｉｃｈａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラメファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ミニュータ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（オガタエ・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンチェ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｒｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルカム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｕｃｕｕｍ）、ピキア・ピジペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スチプチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）またはピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）等；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｓｓｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍｕ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓ���ａ）から成る群より選択される。本発明の特別な一実施形態において単離真菌宿主細胞は、当該用語からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を除くという点を除いて上記に述べ通りである。
【００４７】
本発明の一実施形態において、単離真菌宿主細胞は糖操作されている。本発明の一実施形態において当該細胞は、糖タンパク質を産生するために遺伝子改変されていて、ここでＮ‐またはＯ‐結合型グリコシル化は、例えば、ＯＣＨ１、ＡＬＧ３、ＰＮＯ１および／またはＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＭＢＴ４等のＮ‐グリコシル化に関わる遺伝子、またはＰＭＴ１、ＰＭＴ２および／またはＰＭＴ４等のＯ‐グリコシル化に関わる遺伝子の不活性化または欠失によって、またはＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧａｌＴおよび／またはＳｉａｌＴ等のグリコシルトランスフェラーゼ、またはＭＮＳＩおよび／またはＭＮＳＩＩ等のグリコシダーゼの異種発現によって、その天然型から修飾される。例えば本発明の一実施形態において、糖操作単離真菌宿主細胞は以下の特性：
（ｉ）ここで一または複数の内在性ベータ‐マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化または部分的にまたは完全に欠失されている；
（ｉｉ）アルファ‐１，２マンノシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｉｉｉ）ここで一または複数の内在性ホスホマンノシルトランスフェラーゼが突然変異、破壊、トランケート化または部分的にまたは完全に欠失されている；
（ｉｖ）単一サブユニット・オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）ＳＴＴ３Ｄ）を含んでいる；
（ｖ）ここで内在性ドリコールリン酸マンノース依存アルファ‐１，３‐マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＡＬＧ３）が突然変異、破壊、トランケート化または部分的にまたは完全に欠失されている；
（ｖｉ）エンドマンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｖｉｉ）二機能性ＵＤＰ‐Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ／Ｎ‐アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸‐９‐リン酸シンターゼまたはＣＭＰ‐シアル酸シンターゼをコードする一または複数のポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｖｉｉｉ）ここで内在性ＡＴＴ１遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化または部分的にまたは完全に欠失されている；
（ｉｘ）ここで内在性アルファ‐１，６‐マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＯＣＨ１）が突然変異、破壊、トランケート化または部分的にまたは完全に欠失されている；
（ｘ）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｘｉ）糖ヌクレオチド輸送体をコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｘｉｉ）シアリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいる；
（ｘｉｉｉ）アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいるおよび／または
（ｘｉｖ）ここで一または複数の内在性プロテアーゼ（例えば、ＰＥＰ４およびＰＲＢ１）が然変異、破壊、トランケート化または部分的にまたは完全に欠失されている、のいずれか一または複数を含む。本明細書において、糖操作単離真菌宿主細胞におけるＣＲＺ１の突然変異が、温度感受性を逆転させること、培養中の細胞ロバスト性を増強すること、かつ乏しい産生性を逆転すること、すなわち当該細胞中での免疫グロブリン等の異種ポリペプチドの産生性を少なくとも部分的に増進することが明らかにされた。当該糖操作単離真菌宿主細胞は、本発明の一部である。ＣＲＺ１を突然変異させることまたは別な方法でＣＲＺ１ポリペプチドの発現を低減させることによって糖操作単離真菌宿主細胞の温度感受性を逆転するための方法および／または発酵の間の細胞ロバスト性を増強するための方法もまた本発明の一部である。
【００４８】
本明細書で用いる場合、用語「Ｎ‐グリカン」および「グリコフォーム」は、同じ意味で用いられ、Ｎ‐結合型オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基へのアスパラギン‐Ｎ‐アセチルグルコサミン結合によって結合しているＮ‐結合型オリゴ糖を表す。Ｎ‐結合型糖タンパク質は、タンパク質内のアスパラギン残基のアミド窒素に結合するＮ‐アセチルグルコサミン残基を含む。糖タンパク質に見出される主な糖類は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ‐アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ‐アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ‐アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。
【００４９】
Ｎ‐グリカンは、共通の五糖コアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを表し；「Ｇｌｃ」はグルコースを表し；および「ＮＡｃ」はＮ‐アセチルを表し；ＧｌｃＮＡｃはＮ‐アセチルグルコサミンを表す）を有する。Ｎ‐グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「パウチマンノースコア」とも表されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される周辺糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数によって異なる。Ｎ‐グリカンは、その分枝構成要素に従って分類される（例えば、高マンノース型、複合型または混成型）。「高マンノース」型Ｎ‐グリカンは、五以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ‐グリカンは、典型的には「トリマンノース」コアの１，３マンノースアームに結合した少なくとも一のＧｌｃＮＡｃおよび同コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも一のＧｌｃＮＡｃを有する。複合型Ｎ‐グリカンはまた、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」、ここで「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を表しおよび「Ａｃ」はアセチルを表す）により任意選択的に修飾されるガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ‐アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基も有する。複合型Ｎ‐グリカンはまた、「二分枝」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む鎖内置換基も有し得る。複合型Ｎ‐グリカンは、「トリマンノースコア」上に複数のアンテナも有し得て、しばしば「多アンテナ型グリカン」と表される。「混成」Ｎ‐グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端上に少なくとも一のＧｌｃＮＡｃおよびトリマンノースコアの１，６マンノースアーム上に０個以上のマンノースを有する。種々のＮ‐グリカンは、また「グリコフォーム」とも表される。「ペプチド：Ｎ‐グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ）」または「グリカナーゼ」とは、ペプチドＮ‐グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を表す。
【００５０】
本発明の一実施形態において、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞等（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、分泌の指示をするシグナルペプチドを有するα‐１，２‐マンノシダーゼをコードする核酸を含有するように遺伝子改変される。例えば本発明の一実施形態においてｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ宿主細胞は、５．１ないし８．０、好ましくは５．９ないし７．５の間に至適ｐＨを有する外来性α‐１，２‐マンノシダーゼ酵素を発現するように改変される。本発明の一実施形態において外来性酵素は、宿主細胞の小胞体またはゴルジ体を標的とし、そこで該酵素はＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２等のＮ‐グリカンをトリミングしてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を産する。米国特許第７，０２９，８７２号を参照されたい。本発明は、（ｉ）異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、α‐１，２‐マンノシダーゼ＋宿主細胞に導入することおよび（ｉｉ）該細胞中で該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養することおよび、任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法を含む。本発明はまた、糖タンパク質上のＮ‐グリカンに関してアルファ‐１，６マンノシルトランスフェラーゼ（例えば、ＯＣＨ１）活性を示さない、ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞内でＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む、Ｎ‐グリカン構造を含む異種組換え糖タンパク質を産生するための方法も包含し、該方法はｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔｏｃｈ１−真菌宿主細胞に、異種組換え糖タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および前記宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体において至適活性を有するように選択されるアルファ‐１，２マンノシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを導入するステップを含み、該酵素は（ａ）前記ＥＲまたはゴルジ体においてｐＨ５．１ないし８．０の間に至適活性を有するアルファ‐１，２マンノシダーゼ触媒ドメインを含み；（ｂ）宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体に対するマンノシダーゼ酵素を標的とするために選択される触媒ドメインと通常は関連しない細胞の標的シグナルペプチドに融合されていて；および異種組換え糖タンパク質の発現に好ましい条件下で該真菌宿主細胞を培養するが、それによって、宿主細胞のＥＲまたはゴルジ体を通る異種組換え糖タンパク質の発現および通過の際に、それに結合されるＮ‐グリカン構造の３０モル％以上が、インビボでＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩの基質として役立ち得るＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有する。
【００５１】
ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）宿主細胞等（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））の本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、本発明の一実施形態において、β‐マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３および／またはＢＭＴ４）（米国特許第７，４６５，５７７号を参照されたい）の一または複数を欠失または破壊することによって、または干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を使用してベータ‐マンノシルトランスフェラーゼの一または複数をコードするＲＮＡの翻訳を抑制することによって、アルファ‐マンノシダーゼ抵抗性Ｎ‐グリカンを有する糖タンパク質を除去するために遺伝子改変されている。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、β‐マンノシルトランスフェラーゼ−（例えば、ｂｍｔ１−、ｂｍｔ２−、ｂｍｔ３−および／またはｂｍｔ４−）宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００５２】
本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞（例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））にはまた、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を使用して、ホスホマンノシルトランスフェラーゼの一または複数を欠失または破壊すること、またはてホスホマンノシルトランスフェラーゼの一または複数をコードするＲＮＡの翻訳を抑制することを含み得る、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂ（例えば米国特許第７，１９８，９２１号および７，２５９，００７号を参照されたい）の一つまたは双方を欠失または破壊することによって、ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を除去するように遺伝子改変された当該細胞も含まれる。本発明の一実施形態において当該真菌宿主細胞は、複合型Ｎ‐グリカン、混成型Ｎ‐グリカンおよび高マンノース型Ｎ‐グリカンから成る群より選択されるＮ‐グリカンを主として有する糖タンパク質を産生し、ここで複合型Ｎ‐グリカンは、本発明の一実施形態において、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡＣ（１‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（１‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択され；混成型Ｎ‐グリカンは、本発明の一実施形態において、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択され；および高マンノース型Ｎ‐グリカンは、本発明の一実施形態において、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択される。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ−（例えば、ｐｎｏ１−および／またはｍｎｎ４ｂ−）宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００５３】
本発明のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）宿主細胞（例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））等の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞には、リーシュマニア属種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）の単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼＳＴＴ３Ａタンパク質、ＳＴＴ３Ｂタンパク質、ＳＴＴ３Ｃタンパク質、ＳＴＴ３Ｄタンパク質またはその組み合せをコードする、ＷＯ２０１１／０６３８９に記載される核酸等の核酸を含むように遺伝子改変された単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞が含まれる。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ＳＴＴ３Ａ＋、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ＳＴＴ３Ｂ＋、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ＳＴＴ３Ｃ＋および／またはリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ＳＴＴ３Ｄ＋）宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００５４】
本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））にはまた、例えば米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０１７０４５２号に記載される、ドリコールリン酸マンノース依存アルファ（１‐３）マンノシルトランスフェラーゼ、例えば、ＡＬＧ３をコードする核酸を除去するために遺伝子改変された単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞も含まれる。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、ａｌｇ３−宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００５５】
本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞、例えば、該宿主細胞内の小胞体コンパートメントを標的とする、エンドマンノシダーゼ活性（例えば、ヒト（例えば、ヒトの肝臓）、ラットまたはマウスエンドマンノシダーゼ）を有するポリペプチドを発現するピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））等は、本発明の一部である。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、エンドマンノシダーゼ＋宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００５６】
単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞、例えば、本発明のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））等は、本発明の一実施形態において、該宿主細胞において組換えシアル化糖タンパク質を産生するように改変されており、例えば、ここで該宿主細胞は、（ａ）二機能性ＵＤＰ‐Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ／Ｎ‐アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ‐アセチルノイラミン酸‐９‐リン酸シンターゼおよびＣＭＰ‐シアル酸シンターゼをコードする一または複数のポリヌクレオチドをｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞に形質転換すること；（ｂ）ＣＭＰ‐シアル酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドを該宿主細胞に形質転換すること；および（ｃ）例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｎｎ２のヌクレオチド１‐１０８によりコードされる、細胞標的シグナルペプチドに融合される２，６‐シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド分子を該宿主細胞に形質転換することを含む方法によって、Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（１‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から成る群より選択されるグリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生するように選抜または改変されており；ここで宿主細胞の分泌経路を経由する組換え糖タンパク質の通過の際に、ＮＡＮＡ（１‐４）Ｇａｌ（１‐４）ＧｌｃＮＡｃ（１‐４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃグリコフォームから成る群より選択されるグリコフォームを含む組換えシアル化糖タンパク質が産生される。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、二機能性ＵＤＰ‐Ｎ‐アセチルグルコサミン‐２‐エピメラーゼ／Ｎ‐アセチルマンノサミンンキナーゼ＋、Ｎ‐アセチルノイラミン酸‐９‐リン酸シンターゼ＋、ＣＭＰ‐シアル酸シンターゼ＋、ＣＭＰ‐シアル酸トランスポーター＋、２，６‐シアルリルトランスフェラーゼ＋宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００５７】
さらに本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞（例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））等は、本発明の一実施形態において、例えば、該糖タンパク質上に末端ガラクトース残基を有し、実質的にフコースおよびシアル酸残基を欠く、ガラクトシル化タンパク質を産生するために改変される。本発明の一実施形態において単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞は、β‐ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をコードする単離核酸分子およびＵＤＰ‐ガラクトーストランスポート活性、ＵＤＰ‐ガラクトースＣ４エピメラーゼ活性、ガラクトキナーゼ活性またはガラクトース‐１‐リン酸ウリジルトランスフェラーゼをコードする少なくとも一のヌクレオチドを含み、例えば、ここで該宿主細胞は、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＮ‐結合型オリゴ糖を産生するために遺伝子改変されており、および該宿主細胞中でＵＤＰ‐ガラクトースから糖タンパク質のＮ‐グリカンのＮ‐結合オリゴ糖分枝の末端ＧｌｃＮＡｃ残基上に、ガラクトース残基を転移する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでおり、ここでＮ‐結合オリゴ糖分枝は、ＧｌｃＮＡｃβ１，２‐Ｍａｎα１；ＧｌｃＮＡｃβ１，４‐Ｍａｎα１，３、ＧｌｃＮＡｃβ１，２‐Ｍａｎα１，６、ＧｌｃＮＡｃβ１，４‐Ｍａｎα１，６およびＧｌｃＮＡｃβ１，６‐Ｍａｎα１，６から成る群より選択され；ここで宿主細胞は、ドリキルリン酸マンノース：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２‐ＰＰ‐ドリキルα‐１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性が低減または枯渇しており、およびここで宿主細胞は、一または複数のガラクトース残基を有する糖タンパク質を産生する。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００５８】
本発明の一実施形態において本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞（例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））等は、機能的ＯＣＨ１タンパク質を欠いており、例えば、ここで内在性ＯＣＨ１は突然変異されている。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ，ｏｃｈ１−宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００５９】
本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ、例えばアルファ１，３‐ガラクトシルトランスフェラーゼまたはベータ１，４‐ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するピキア属（Ｐｉｃｈａ）細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））等は、本発明の一部である。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、ガラクトシルトランスフェラーゼ＋宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００６０】
本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞、糖ヌクレオチド輸送体を発現するピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））等は、本発明の一部である。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、糖ヌクレオチド輸送体＋宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００６１】
本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞、例えば、シアリルトランスフェラーゼを発現するピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））等は、本発明の一部である。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、シアリルトランスフェラーゼ＋宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００６２】
本発明の単離ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ真菌宿主細胞、例えば、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、例えば、ＧＮＴ１またはＧＮＴ２またはＧＮＴ４を発現するピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）細胞（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））等は、本発明の一部である。本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ＋宿主細胞に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。
【００６３】
本明細書で用いる場合、用語「実質的に含まれていない（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ  ｏｆ）」は、糖タンパク質上の特定の糖残基、フコースまたはガラクトース等の欠如に関連するとき、糖タンパク質成分が当該残基を含有するＮ‐グリカンを実質的に欠くことを示すために用いられる。純度の面から表現すれば実質的に含まれていないとは、当該糖残基を含有するＮ‐グリカン構造の量が、１０％を超えず、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であることであり、ここでパーセンテージは重量またはモルパーセントによるものである。
【００６４】
本明細書で用いる場合、糖タンパク質組成物がフコースまたはガラクトース等の特定の糖残基を「欠く（ｌａｃｋ）」または「欠いている（ｉｓ  ｌａｃｋｉｎｇ）」ときは、検出可能な量の当該糖残基は、Ｎ‐グリカン構造上に存在しない。例えば、本発明の一実施形態において、本発明の宿主細胞によって産生される糖タンパク質組成物は、「フコースを欠き（ｌａｃｋ  ｆｕｃｏｓｅ）」得るが、何故ならば該細胞はフコシル化Ｎ‐グリカン構造を産生するために必要とされる酵素を有さないからである。従って、用語「実質的にフコーが含まれていない（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｅ）」は、用語「フコースを欠いている（ｌａｃｋｉｎｇ  ｆｕｃｏｓｅ）」を包含する。しかしながら、たとえ該組成物がもとはフコシル化Ｎ‐グリカン構造を含有したとしても、または上記のようにわずかであるが検出可能な量のフコシル化Ｎ‐グリカン構造を含むとしても、組成物は「実質的にフコースが含まれていない」ことがあり得る。
【００６５】
本発明の範囲は、片方だけの内在性染色体ＣＲＺ１遺伝子が突然変異、破壊、トランケート化または部分的にまたは完全に欠失されていて、かつもう片方の内在性染色体ＣＲＺ１遺伝子は突然変異、破壊、トランケート化または部分的にまたは完全に欠失されておらず、かつ機能的ＣＲＺ１ポリペプチドをコードする、二倍体の単離真菌宿主細胞を包含する。例えば、双方のＣＲＺ１遺伝子の内在性染色体コピーが、突然変異、破壊、トランケート化または部分的にまたは完全に欠失されているために、機能的ＣＲＺ１ポリペプチドを欠く同質二倍体もまた本発明の一部である。
【００６６】
タンパク質発現
本発明の範囲には、（ｉ）該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを当該ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ宿主細胞（例えば、本明細書で述べる通り）に導入すること、および（ｉｉ）該細胞における該異種ポリペプチドの発現に好ましい条件下で、該細胞が生存可能である限りの間、該宿主細胞を培養すること、および任意選択的に、（ｉｉｉ）該宿主細胞から該異種ポリペプチドを単離することを含む、一または複数の異種ポリペプチドを産生するための方法が含まれる。真菌宿主細胞において異種ポリペプチドを発現するための方法は、一般的に知られかつ当該分野でありふれた方法である。
【００６７】
本発明は、本明細書において述べる、液体培養培地中に懸濁されるいかなる真菌宿主細胞をも包含する。本明細書において述べる、単離真菌宿主細胞のいかなる溶菌液もまた本発明の範囲内である。
【００６８】
真菌宿主細胞発現系のために使用される培養条件は、手元の個々の条件に依存して変動し得る。本発明の一実施形態において真菌宿主細胞は、振盪フラスコまたはファーメンター（例えば、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、３０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、１０，０００Ｌ容）中の液体培地中で増殖され得る。種々の増殖培地が真菌宿主細胞を培養するために使用し得る。本発明の一実施形態において該培地は、ｐＨ３ないし７（例えば、３、４、５、６または７）の間のｐＨである；本発明の一実施形態においてｐＨは、水酸化アンモニウム等の塩基により上昇される。本発明の一実施形態において温度は、約２４℃または２６℃または２８℃または３０℃または３２℃または３４℃に維持される。本発明の一実施形態において増殖培地中の溶存酸素は、約２０％または３０％に維持される。本発明の一実施形態において増殖培地は、酵母窒素源基礎培地（例えば、硫酸アンモニア添加；必須アミノ酸添加または無添加）、ペプトンおよび／または酵母エキスを含有する。種々のサプリメント、例えばビオチン、デキストロース、メタノール、グリセリン、カザミノ酸、Ｌ‐アルギニン塩酸塩、アンモニウムイオン（例えば、リン酸アンモニウム態）等が増殖培地に添加され得る。本発明の一実施形態において増殖培地は、酵母窒素源基礎培地、水、デキストロース、メタノールまたはグリセリン等の炭素源、ビオチンおよびヒスチジンを含む最小培地である。本発明の一実施形態において細胞培養液は、銅、ヨウ素、マンガン、モリブデン、ホウ素、コバルト、亜鉛、鉄、ビオチンおよび／または硫黄、例えばＣｕＳＯ４、ＮａＩ、ＭｎＳＯ４、Ｎａ２ＭｏＯ４、Ｈ３ＢＯ３、ＣｏＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＦｅＳＯ４、ビオチンおよび／またはＨ２ＳＯ４等の微量ミネラル／栄養素を含む。本発明の一実施形態において細胞培養液は、消泡剤（例えば、シリコン）を含む。
【００６９】
本発明は、単離真菌ｃｒｚ１ｍｕｔａｎｔ宿主細胞（例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等）に、例えば、プロモーター、例えば、メタノール誘導性プロモーターに作動可能に結合されている前記ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを導入すること、および
（ｉ）該細胞がグリセリン等の非発酵性炭素源により増殖されるバッチフェーズ（例えば、グリセリンバッチフェーズ）中で、例えば非発酵性炭素源が枯渇するまで；
（ｉｉ）追加の非発酵性炭素源（例えば、グリセリン）が供給される添加バッチフェーズ（例えば、グリセリン添加バッチフェーズ）中で、例えば増殖制限速度で；および
（ｉｉｉ）該細胞がメタノールおよび、任意選択的に、追加のグリセリンの存在下で増殖されるメタノール添加バッチフェーズで、該宿主細胞を培養することを含む、異種ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン鎖または抗体またはその抗体結合性フラグメント）を産生するための方法を包含する。
【００７０】
本発明の一実施形態において、メタノール添加バッチフェーズ中のメタノール濃度は、メタノール約２グラム／リットルないしメタノール約５グラム／リットル（例えば２、２．５、３、３．５、４、４．５または５）に設定される。
【００７１】
本発明の一実施形態において、バッチフェーズに先立って、最初の種培養が高密度（例えば、ＯＤ６００が約２以上）に増殖され、次に種培養の増殖細胞が初期バッチフェーズの培養液に接種するために使用される。
【００７２】
本発明の一実施形態において、添加バッチフェーズの後かつメタノール添加バッチフェーズの前に宿主細胞は、培養液リットル当たりメタノール約２ｍｌの存在下で細胞が増殖される転換フェーズにおいて増殖される。例えば、該細胞は転換フェーズにおいて、メタノール濃度が約ゼロになるまで増殖され得る。
【００７３】
真菌宿主細胞から単離された異種ポリペプチドは、本発明の一実施形態において精製される。もしも該異種ポリペプチドが該真菌宿主細胞から液体増殖培地に分泌されるならばポリペプチドは、増殖培地からの該真菌宿主細胞の除去を含むプロセスによって精製され得る。該培地からの該細胞の除去は、遠心分離によって行われ得て、該細胞は廃棄されおよび液体培地の上清は貯留される。もしも該異種ポリペプチドが分泌されないならば該液体培地は、該真菌宿主細胞から分離後に廃棄され、該細胞が保持される。その後真菌宿主細胞は、それから該異種ポリペプチドがさらに精製される粗細胞可溶化物を産生するために溶解され得る。
【００７４】
異種ポリペプチドの精製は、本発明の一実施形態において、クロマトグラフィー、例えばカラムクロマトグラフィーによって行われる。クロマトグラフィー精製には、イオン交換、例えば陰イオン交換および／または陽イオン交換、プロテインＡクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が含まれ得る。精製には、該ポリペプチドを含む組成物のウイルス不活性化、沈殿および／または凍結乾燥が含まれる。
【００７５】
［実施例］
この節は本発明をより深く説明することを意図しており、本発明をさらに限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に示すいかなる組成物または方法も本発明の一部をなす。
【００７６】
［実施例１］
ＣＲＺ１突然変異の同定。
【００７７】
実験方法
紫外線誘発突然変異、流加培養、ＩｇＧ精製、Ｎ‐グリカンのキャラクタリゼーション（特徴づけ）、ならびに他のすべての分析アッセイは、前述の通りに行った（Ｂａｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｆ２００８）。別に明示する場合を除き、１Ｌのバイオリアクターによる発酵工程（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｒｕｎ）は、ＭｅＯＨ導入の１００〜１２０時間後に終了するように計画した。しかしながら、過剰な細胞溶解が観察された場合には、発酵工程は早めて終了した。細胞溶解は、顕微鏡検査によるか、または上清に放出される核ＤＮＡの量を測定するかによって定量した（Ｂａｒｎａｒｄ，２０１０）。過剰な細胞溶解は、顕微鏡検査による９０％以上の溶解細胞、またはＰｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイにより測定される上清中の３０ミリグラム／ｍｌ以上のＤＮＡ濃度によって定義された。
【００７８】
結果および考察
発酵ロバスト性の実質的な増強を示す耐熱性突然変異株。
【００７９】
発酵ロバスト性の増強を備えるピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）宿主菌株を特定するために発明者らは、温度感受性の欠陥を抑制する特定の第二部位突然変異が細胞ロバスト性の欠乏も補償し得るという理論的根拠の下に、温度感受性の糖操作菌株（ＹＧＬＹ１２９０５、ＹＧＬＹ２２８３５およびＹＧＬＹ２７８９０）を紫外線誘発突然変異し、耐熱性突然変異株を選択した。その耐熱性の表現型を確認した後にこれらの突然変異株は、１ＬのＤａｓＧｉｐバイオリアクター中で標準的なＭｅＯＨ添加バッチ工程を使用して発酵した。広範な発酵スクリーニングキャンペーンの後に発明者らは、発酵プロセスの間に細胞ロバスト性の顕著な増強を示す９個の突然変異株を特定した。図１に示す通り非突然変異誘発の対照菌株に対する培養プロセスは、３２℃での誘導の約４８時間における過剰な細胞溶解のために、終結しなければならなかった。対照的に突然変異株のすべては、発酵ロバスト性の顕著な改善を示した。ＹＧＬＹ２９０１０、ＹＧＬＹ２９０３０、ＹＧＬＹ２９０３１およびＹＧＬＹ２９０１２は、約９０時間発酵することが可能だった；ＹＧＬＹ２８９９７、ＹＧＬＹ２８９９８、ＹＧＬＹ１７１５９、ＹＧＬＹ２８９９９およびＹＧＬＹ２９０４２のすべては、３２℃での誘導の１００時間以上の間存続した。
【００８０】
耐熱性突然変異株のタンパク質生産性およびＮ‐グリカンの品質評価。
【００８１】
耐熱性突然変異株の５株（ＹＧＬＹ２９０１０、ＹＧＬＹ２９０３０、ＹＧＬＹ２９０３１、ＹＧＬＹ２９０４２およびＹＧＬＹ２９０１２）は、ヒトＦｃフラグメントを発現するＹＧＬＹ２７８９０に由来した（図２）。これらの耐熱性突然変異がＦｃ生産性およびＮ‐グリカンの品質に関しどのような影響を及ぼしたかを評価するために発明者らは、３２℃の１Ｌバイオリアクター由来のＦｃフラグメントを精製し、ブロス力価を定量し（図１）、さらに耐熱性突然変異株４株ならびにその非突然変異誘発の親株ＹＧＬＹ２７８９０のＮ‐グリカンンのプロファイル（特性）を分析した（図３）。親株の対照と比較して突然変異株の４株（ＹＧＬＹ２９０１０、ＹＧＬＹ２９０３０、ＹＧＬＹ２９０３１およびＹＧＬＹ２９０４２）は、産物力価において実質的な増加を示した：実際にＹＧＬＹ２９０４２およびＹＧＬＹ２９０１０はなんと約４〜５倍以上のＦｃ産物を分泌した。対照的にＹＧＬＹ２９０１２由来の産物力価は、対照菌株の力価のわずか約５０％であった。Ｆｃ産物由来のＮ‐グリカンに対し発明者らは、Ｎ‐グリカンプロファイルにおけるいかなる顕著な変化も観察しなかった（表３）。対照菌株ＹＧＬＹ２７８９０と同様に（Ａ２が８３％およびＡ１が４％）すべての５株の突然変異株は、高レベルの末端シアル酸により、７７から８４％までの範囲のＡ２レベルおよび４から７％までのＡ１レベルにより、そのＦｃＮ‐グリカンを効果的に改変することができた。まとめるとこれらの結果は、ＹＧＬＹ２９０１０、ＹＧＬＹ２９０３０、ＹＧＬＹ２９０３０１およびＹＧＬＹ２９０４２によって獲得された紫外線誘発突然変異は、非相同的に発現されるそのヒトＦｃフラグメントを産生するための能力に悪影響を与えず、該突然変異は、Ｎ‐グリカンの品質に顕著な劣化ももたらさない、ということを明らかにした。
【００８２】
耐熱性および発酵ロバスト性の増強の原因となる原因的突然変異を同定するためのゲノム配列決定。
【００８３】
発酵中の細胞ロバスト性の維持に関わる分子機構をより理解するために発明者らは、これらの９株の耐熱性突然変異株、ならびに２株の非突然変異誘発の空の宿主菌株ＹＧＬＹ２２８１２およびＹＧＬＹ２２８３５のゲノムを配列決定した。該突然変異株と該非突然変異誘発菌株の間のゲノム全域にわたる比較の後に発明者らは、これら９株の突然変異株のそれぞれにおいて、１ないし７の非同義突然変異（図４の「＋」によって示した）を同定した。三株の突然変異株、ＹＧＬＹ２９０１０、ＹＧＬＹ２９０３１およびＹＧＬＹ２９０４２は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣＲＺ１遺伝子に高いレベルの配列相同性を示す一の遺伝子Ｐｐ０２ｇ０２１２０内に単一突然変異を含んでいた。驚くべきことには同じＰｐＣＲＺ１遺伝子における別個の突然変異が、ＹＧＬＹ２８９９７、ＹＧＬＹ２８９９８、ＹＧＬＹ１７１５９、ＹＧＬＹ２８９９９、ＹＧＬＹ２９０３０およびＹＧＬＹ２９０１２においても検出された。ＳｃＣＲＺ１は、ストレス応答に関わるカルシニューリン応答性ジンクフィンガー転写因子である。ジンクフィンガードメインは、ＰｐＣＲＺ１とＳｃＣＲＺ１の間で非常に良好に保存されており、双方ともｃ末端に位置している（上記のシーケンスアラインメントを参照されたい）。図５に図解した通り該耐熱性突然変異株から見出だされた４つのナンセンス、終止コドン変異は、ジンクフィンガーの上流に位置していたために、すべてがジンクフィンガードメインの無いトランケート化されたＰｐＣＲＺ１フラグメントを発生させた。残り５つの突然変異株については、ミスセンス、アミノ酸置換突然変異を含み、それらのすべてはジンクフィンガードメインに位置し、それらの４つについては２５ヌクレオチド内に密集していた。独立して単離された９株の耐熱性突然変異株がＰｐＣＲＺ１遺伝子内に異なるナンセンスまたはミスセンス突然変異を含んでいたという発見は、これらのＣＲＺ１突然変異が耐熱性および増強された発酵ロバスト性の表現型の原因であることを強く示唆した。さらに突然変異株の２株（ｙＧＬＹ１７１５９およびｙＧＬＹ２８９９８）はまた、耐熱性および細胞ロバスト性において重要な役割を果たすことが以前に明らかにされている遺伝子であるＰｐＡＴＴ１においてもさらなる突然変異を有していた。ｙＧＬＹ１７１５９およびｙＧＬＹ２８９９８の双方が単離された最もロバスト性の突然変異株の一つであったと言う事実は、ＡＴＴ１およびＣＲＺ１突然変異の組合せが糖鎖ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）菌株における耐熱性および発酵ロバスト性の増強に対する相加作用または相乗作用を有し得ることを示唆した。
【００８４】
ＰｐＣＲＺ１配列。
【００８５】
１．ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＲＺ１野生型オープンリーディングフレーム
0006383359.tif 000008
0006383359.tif 000009
（配列番号２）
２．ｙＧＬＹ２８９９７から単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株ＣＲＺ１（コードする突然変異：Ｌ３３→ＳＴＯＰ、突然変異したヌクレオチドは太字体である）
0006383359.tif 000010
（突然変異ｔ９８ａを含む配列番号２）
３．ｙＧＬＹ２９０１２から単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株ＣＲＺ１（コードする突然変異：Ｑ２１４→ＳＴＯＰ、突然変異したヌクレオチドは太字体である）
0006383359.tif 000011
0006383359.tif 000012
（突然変異ｃ６４０ｔを含む配列番号２）
４．ｙＧＬＹ２９０１０から単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株ＣＲＺ１（コードする突然変異：Ｌ２９４→ＳＴＯＰ、突然変異したヌクレオチドは太字体である）
0006383359.tif 000013
0006383359.tif 000014
（突然変異ｔ８８１ｇを含む配列番号２）
５．ｙＧＬＹ２９０４２から単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株ＣＲＺ１（コードする突然変異：Ｓ２９８→ＳＴＯＰ、突然変異したヌクレオチドは太字体である）
0006383359.tif 000015
0006383359.tif 000016
（突然変異ｃ８９３ａを含む配列番号２）
６．ｙＧＬＹ２８９９８から単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株ＣＲＺ１（コードする突然変異：Ｅ４０３→Ｇ、突然変異したヌクレオチドは太字体である）
0006383359.tif 000017
（突然変異ａ１２０８ｇを含む配列番号２）
７．ｙＧＬＹ１７１５９から単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株ＣＲＺ１（コードする突然変異：Ｆ４０６→Ｓ、突然変異したヌクレオチドは太字体である）
0006383359.tif 000018
（突然変異ｔ１２１７ｃを含む配列番号２）
８．ｙＧＬＹ２８９９９から単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株ＣＲＺ１（コードする突然変異：Ｆ４０６→Ｌ、突然変異したヌクレオチドは太字体である）
0006383359.tif 000019
0006383359.tif 000020
（突然変異ｔ１２１６ｃを含む配列番号２）
９．ｙＧＬＹ２９０３０から単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株ＣＲＺ１（コードする突然変異：Ｃ４１１→Ｆ、突然変異したヌクレオチドは太字体である）
0006383359.tif 000021
0006383359.tif 000022
（突然変異ｇ１２３２ｔを含む配列番号２）
１０．ｙＧＬＹ２９０３１から単離されたピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）突然変異株ＣＲＺ１（コードする突然変異：Ｋ４６９→Ｎ、突然変異したヌクレオチドは太字体である）
0006383359.tif 000023
（突然変異ａ１４０７ｃを含む配列番号２）
［実施例２］
指向的菌株改変による表現型の確認
本明細書で述べる通り、突然変異株それぞれの同じＣＲＺ１遺伝子における独立した突然変異は、この転写因子の不活性化が観察された耐熱性および発酵ロバスト性表現型の原因であることを強く示唆した。この結論を確認するために図８に示す通り、５‐ＦＯＡ対抗選択によりＹＧＬＹ１７１０８に由来する非突然変異誘発ｕｒａ５栄養要求性ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）菌株であるＹＧＬＹ２１２０３において、ＣＲＺ１  ＯＲＦが完全に欠失されるか、または内在性ＣＲＺ１遺伝子がトランケート化されたバージョンと置換された。
【００８６】
プラスミドｐＧＬＹ１２８２９（図６）は、ＣＲＺ１  ＯＲＦの直ぐ上流で、ｌａｃＺ‐ＵＲＡ５‐ｌａｃＺ  ＵＲＡブラスターによって伴われる、ＡＬＧ３ターミネーターの前に１．５ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築され、さらに次にＣＲＺ１  ＯＲＦの最後の２３４ｂｐおよび下流領域の１．７ｋｂを含む２ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントに結合された。ＳｆｉＩ消化の後にこのＣＲＺ１‐上流‐ＵＲＡブラスター‐ＣＲＺ１‐下流ＤＮＡフラグメントは、非突然変異誘発宿主菌株（例えば、ＹＧＬＹ１７１０８）の中に形質転換された。ＣＲＺ１上流および下流領域の双方における相同組換えによってこのＵＲＡブラスター‐カセットは、ＣＲＺ１のコーディング領域の８５％を欠失させながら内在性ＣＲＺ１遺伝子を置換し、結果としてＣＲＺ１完全ノックアウト突然変異株を作成した。ＣＲＺ１  ＯＲＦの正しい置換を確認するために、ＰＣＲプライマーとして以下のオリゴヌクレオチド：遺伝子置換の５´ジャンクションを確認するためにＧＴＡＴＧＣＧＡＴＡＴＡＧＴＧＴＧＧＡ (配列番号４、ＣＲＺ１開始点の４，１５４３５ｂｐ上流）およびＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧ（配列番号５、ＡＬＧ３ターミネーター内）；遺伝子置換の３´ジャンクションを確認するためにＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣ（配列番号６、ｌａｃＺ内）およびＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＣＡＧ（配列番号７、ＣＲＺ１終止コドンの７，２０４５ｂｐ下流）；さらに野生型ＣＲＺ１  ＯＲＦの欠落を確認するためにＧＡＣＡＣＡＴＧＣＧＡＡＡＴＧＴＣＣＴＧ（配列癌号８、ＣＲＺ１終止コドンの１２０ｂｐ下流））およびＴＴＧＡＧＴＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧ（配列癌号９、ＣＲＺ１  ＯＲＦ内、開始点の後１０７５ｂｐ）、を使用してゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを実施した。プラスミドｐＧＬＹ１２８３２（図７）は、１．５ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントを、ｌａｃＺ‐ＵＲＡ５‐ｌａｃＺ  ＵＲＡブラスターによって伴われるＡＬＧ３ターミネーターの前に（０．６ｋｂの上流領域、ＣＲＺ１  ＯＲＦの最初の８７９ｂｐおよび２の終止コドン）クローニングすることによって構築され、さらに次に、ＣＲＺ１  ＯＲＦの最後の下流２３４ｂｐと下流領域の１．７ｋｂを含む２ｋｂのゲノムＤＮＡフラグメントに結合された。ｐＧＬＹ１２８３２（図７）のＳｆｉＩフラグメントと染色体ＣＲＺ１領域との間の相同組換え媒介性二重交叉は、内在性ＣＲＺ１  ＯＲＦを最初の２９４アミノ酸残基だけしか有さないＣＲＺ１のトランケート化バージョンと置換した。
【００８７】
ＤＮＡ構築物が内在性ＣＲＺ１遺伝子を相当する欠失体またはトランケート化体と正確に置換したことを確認した後に、固形培地上３５℃でおよびバイオリアクターの液体培地中３２℃で増殖するその能力を検討した。これらのＣＲＺ１Δトランケート化株および欠失突然変異株は、紫外線突然範囲誘発によって単離された元の突然変異株に観察された耐熱性表現型と、非常に類似した耐熱性表現型を示すことが確認された。
【００８８】
次にトランケート化株および欠失突然変異株は、それらが３２℃でも増強された発酵ロバスト性を示すか否かを検討するために、標準的なＤａｓＧｉｐ  ＭｅＯＨ添加バッチ発酵工程（Ｈｏｐｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）に置かれた。図９に示す通り対照菌株ＹＧＬＹ１７１０８は重度の溶解を示し、３２℃でのＭｅＯＨ誘導の６５時間内に生存できなくなった。対照的にＣＲＺ１遺伝子の全欠失およびトランケート化の変異を持つ菌株は、発酵ロバスト性の顕著な増加を示し、ＭｅＯＨ誘導の１３０時間以上を成功裡に完了した。これらの結果は、完全にまたは部分的にＣＲＺ１  ＯＲＦを欠失させることによるＣＲＺ１の不活性化が、糖操作菌株の発酵ロバスト性を改善するために十分であることを明らかにした。さらにこれらの指向的遺伝子置換菌株によって示された表現型は、相当する紫外線誘発突然変異株によって示される表現型と密接に類似していて、ＣＲＺ１遺伝子内の突然変異が紫外線誘発突然変異株に観察された耐熱性および発酵ロバスト性の改善の原因であったことを説明している。
【００８９】
ＡＴＴ１遺伝子の不活性化は、菌株の発酵ロバスト性における劇的な改善をもたらした。ＣＲＺ１およびＡＴＴ１の不活性化が非常に類似する表現型（すなわち、耐熱性および発酵ロバスト性の向上）を引き起こしたので発明者らは、ＣＲＺ１欠失がすでにＡＴＴ１欠失突然変異を含む菌株の発酵ロバスト性をさらに改善するか否かを検討したいと思う。この目的を達成するために発明者らは、ｃｒｚ１、ａｔｔ１二重欠失突然変異株を構築し、ＤａｓＧｉｐバイオリアクター中３４℃で標準的ＭｅＯＨ添加バッチ発酵工程を実施することによって、その発酵ロバスト性を試験した。この非常にストリンジェントな発酵条件下において、ａｔｔ１単一欠失菌株ＹＧＬＹ２９１２８は、７５時間のあいだ生存可能であった一方で、ｃｒｚ１、ａｔｔ１二重突然変異株は１１５時間以上のあいだ生存可能であった（図１０）。これらの結果は、ａｔｔ１欠失およびｃｒｚ１欠失に由来する発酵ロバスト性の改善が相加的であり、しかもｃｒｚ１、ａｔｔ１二重突然変異株が単一突然変異株よりも高いレベルの発酵ロバスト性を示すことを明確に明らかにした。
【００９０】
参考文献
Ｂａｒｎａｒｄ  ＧＣ，Ｋｕｌｌ  ＡＲ，Ｓｈａｒｋｅｙ  ＮＳ，Ｓｈａｉｋｈ  ＳＳ，Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｒ  ＡＭ，Ｂｕｒｎｉｎａ  Ｉ，Ｊｉａｎｇ  Ｙ，Ｌｉ  Ｆ，Ｌｙｎａｕｇｈ  Ｈ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｔ，Ｎｅｔｔ  ＪＨ，Ｎｙｌｅｎ  Ａ，Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒ  ＴＩ，Ｐｒｉｎｚ  Ｂ，Ｒｉｏｓ  ＳＥ，Ｚｈａ  Ｄ，，Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎ  Ｎ，Ｓｔａｄｈｅｉｍ  ＴＡ，Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ  Ｐ（２０１０）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（モノクローナル抗体を発現する酵母細胞系の高処理スクリーニングおよび選抜）．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７（９）：９６１‐７１
Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ  Ｐ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＲＣ，Ｌｉ  Ｈ，Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒ  ＴＩ，Ｎｅｔｔ  ＪＨ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＳＲ，Ｓｔａｄｈｅｉｍ  ＴＡ，Ｍｉｅｌｅ  ＲＧ，Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ  Ｂ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｔ，Ｒａｕｓｃｈ  Ｓ，Ｒｅｎｆｅｒ  Ｅ，Ｗｉｌｄｔ  Ｓ（２００４）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃａｉａｌ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｉｎ  ｃｏｒｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ（酵母ピキア・パストリスにおけるコアオリゴ糖アセンブリにおいてブロックされた人工的グリコシル化経路の改変：末端ガラクトースを有するヒト化複合型糖タンパク質の産生）．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１４（９）：７５７‐６６．
Ｃｈｏｉ  ＢＫ，Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ  Ｐ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＲＣ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＳＲ，Ｋｕｎｇ  ＤＨ，Ｌｉ  Ｈ，Ｍｉｅｌｅ  ＲＧ，Ｎｅｔｔ  ＪＨ，Ｗｉｌｄｔ  Ｓ，Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ  ＴＵ（２００３）Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎａｎｉｚｅ  Ｎ‐ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（酵母ピキア・パストリスにおけるＮ‐結合型グリコシル化をヒト化するためのコンビナトリアル遺伝子ライブラリの使用）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００（９）：５０２２‐７．
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Ｊｉａｎｇ  Ｙ，Ｌｉ  Ｆ，Ｚｈａ  Ｄ，Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒ  ＴＩ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｔ，Ｍｏｏｒｅ  Ｒ，Ｃｕｋａｎ  Ｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ‐Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＮＲ，Ｎｙｌｅｎ  Ａ，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＪＥ，ＭｃＫｅｌｖｅｙ  ＴＷ，ｄ´Ａｎｊｏｕ  Ｍ，Ｓｔａｄｈｅｉｍ  ＴＡ，Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎ  Ｎ，Ｌｉ  Ｈ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｉｎａｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（糖操作ピキア・パストリスにおいて発現される組換えモノクローナル抗体の精製プロセス開発）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２０１１  Ｍａｒ；７６（１）：７‐１４．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｎｏｖ  １１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１０７４６１７．
Ｌｉ  Ｈ，Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎ  Ｎ，Ｓｔａｄｈｅｉｍ  ＴＡ，Ｚｈａ  Ｄ，Ｐｒｉｎｚ  Ｂ，Ｂａｌｌｅｗ  Ｎ，Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚ  Ｐ，Ｃｈｏｉ  ＢＫ，Ｃｏｏｋ  ＷＪ，Ｃｕｋａｎ  Ｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ‐Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＮＲ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｒ，Ｇｏｎｇ  Ｂ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＳＲ，Ｈｏｏｐｅｓ  ＪＰ，Ｊｉａｎｇ  Ｙ，Ｋｉｍ  Ｎ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  Ｒ，Ｎｅｔｔ  ＪＨ，Ｒｉｏｓ  Ｓ，Ｓｔｒａｗｂｒｉｄｇｅ  Ｒ，Ｗｉｌｄｔ  Ｓ，Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ  ＴＵ（２００６）Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＩｇＧｓ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉ（糖操作ピキア・パストリスにおけるヒト化ＩｇＧの最適化）．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１０‐５．
Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒ  ＴＩ，Ｃｕｋａｎ  Ｍ，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＪＥ，Ｈｏｕｓｔｏｎ‐Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＮＲ，Ｊｉａｎｇ  Ｙ，Ｌｉ  Ｆ，Ｌｙｎａｕｇｈ  Ｈ，Ｍａｌｌｅｍ  Ｍ，ＭｃＫｅｌｖｅｙ  ＴＷ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｔ，Ｎｙｌｅｎ  Ａ，Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｒ  Ａ，Ｓｔａｄｈｅｉｍ  ＴＡ，Ｚｈａ  Ｄ，ｄ´Ａｎｊｏｕ  Ｍ．（２００９）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（糖操作ピキア・パストリスによるモノクローナル抗体の産生）．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３９（４）：３１８‐２５．
Ｔｒａｖｅｎ  Ａ，Ｊｅｌｉｃｉｃ  Ｂ，Ｓｏｐｔａ  Ｍ．（２００６）Ｙｅａｓｔ  ＧＡＬ４：ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ（酵母ＧＡＬ４：転写パラダイム再考）．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．７（５）：４９６‐９．
Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｆ（２００８）ＥＭＳ  ａｎｄ  ＵＶ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ（酵母におけるＥＭＳおよび紫外線突然変異誘発）．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２：１３．３Ｂ１‐１３．３Ｂ．５
Ｗｕｒｍ  ＦＭ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ（哺乳動物培養細胞における組換えタンパク質薬の産生）．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４Ｎｏｖ；２２（１１）：１３９３‐８．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５５２９１６４．
Ｚｈａｎｇ  Ｎ，Ｌｉｕ  Ｌ，Ｄａｎ  Ｄｕｍｉｔｒｕ  Ｃ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＮＲ，Ｃｕｋａｎ  Ｍ，Ｊｉａｎｇ  Ｙ，Ｌｉ  Ｙ，Ｌｉ  Ｆ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｔ，Ｍａｌｌｅｍ  ＭＲ，Ｏｕ  Ｙ，Ｐａｔｅｌ  ＲＮ，Ｖｏ  Ｋ，Ｖｏ  Ｋ，Ｖｏ  Ｋ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｂｕｒｎｉｎａｌ  Ｉ，Ｃｈｏｉ  ＢＫ，Ｈｕｂｅｒ  ＨＥ，Ｓｔａｄｈｅｉｍ  ＴＡ，Ｚｈａ  Ｄ．Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉ‐ＨＥＲ２  ｉｓ  ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ（糖操作ピキア属が産生した抗ＨＥＲ２は前臨床試験においてトランスヅズマブに匹敵する）．ＭＡｂｓ．２０１１Ｍａｙ  １；３（３）．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ（印刷前電子出版）］ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１４８７２４２．
本発明は、本明細書で記載される具体的な実施例による範囲に限定されるものではない。実際に本発明の範囲には、本明細書で具体的に示される実施形態および本明細書では具体的に示されない他の実施形態が含まれる；本明細書で具体的に示される実施形態は、必ずしも網羅的であることを意図していない。本明細書で記載される変更に加えて種々の変更が、当業者にとって前述の記載から明白となるであろう。当該変更は、本特許請求の範囲に含まれると意図されている。
【００９１】
特許、特許出願、文献、製品説明書およびプロトコルが本出願の至る所で引用されるが、その開示は全体が本明細書で参照することによってあらゆる目的に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006383359.tif 000026
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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