(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
0006290910.tif 000052
0006290910.tif 000053
を有する化合物；または医薬として許容されるこの塩。
【請求項２】
有効量の請求項１に記載の化合物または医薬として許容されるこの化合物の塩、および医薬として許容される担体またはビヒクルを含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物または医薬として許容されるこの化合物の塩を含有する、網膜変性疾患の治療のための組成物。
【請求項４】
網膜変性疾患が、網膜色素変性、レーバー先天性黒内障、症候性網膜変性、加齢性黄斑変性またはアッシャー症候群である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
アッシャー症候群が、アッシャーＩ症候群、アッシャーＩＩ症候群またはアッシャーＩＩＩ症候群である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
網膜変性疾患が、アッシャーＩＩＩ症候群である、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物または医薬として許容されるこの化合物の塩を含有する、アッシャー症候群に伴う聴力損失の治療のための組成物。
【請求項８】
アッシャー症候群が、アッシャーＩ症候群、アッシャーＩＩ症候群またはアッシャーＩＩＩ症候群である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
アッシャー症候群が、アッシャーＩＩＩ症候群である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
網膜変性疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載の化合物または医薬として許容されるこの化合物の塩の使用。
【請求項１１】
網膜変性疾患が、網膜色素変性、レーバー先天性黒内障、症候性網膜変性、加齢性黄斑変性またはアッシャー症候群である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
アッシャー症候群が、アッシャーＩ症候群、アッシャーＩＩ症候群またはアッシャーＩＩＩ症候群である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
網膜変性疾患が、アッシャーＩＩＩ症候群である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
アッシャー症候群に伴う聴力損失の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載の化合物または医薬として許容されるこの化合物の塩の使用。
【請求項１５】
アッシャー症候群が、アッシャーＩ症候群、アッシャーＩＩ症候群またはアッシャーＩＩＩ症候群である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
アッシャー症候群が、アッシャーＩＩＩ症候群である、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年１０月２５日に出願された米国仮出願第６１／７１８，５９３号および２０１３年３月８日に出願された米国仮出願第６１／７７５，３７６号の利益を主張し、これらの仮出願のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
アッシャー症候群は、希な遺伝的障害であり、難聴および失明の主な原因であって、１０個の遺伝子のいずれか１個の変異に関連している。この症候群に対する他の名称としては、Ｈａｌｌｇｒｅｎ症候群、Ｕｓｈｅｒ−Ｈａｌｌｇｒｅｎ症候群、ＲＰ−Ｄｙｓａｃｕｓｉｓ症候群、およびＤｙｓｔｒｏｐｈｉａ  Ｒｅｔｉｎａｅ  Ｄｙｓａｃｕｓｉｓ症候群が挙げられる。
【０００３】
アッシャー症候群は、難聴および徐々の視力損失を特徴とする。聴力損失は内耳欠陥に伴うが、一方で視力損失は、網膜細胞の変性である網膜色素変性（ＲＰ）に伴う。通常、網膜の桿体細胞が最初に影響を受け、初期の夜盲症および周辺視の徐々の損失をもたらす。一部の場合は、黄斑の錐体細胞の初期変性に伴い、中心視（ｃｅｎｔｒａｌ  ａｃｕｉｔｙ）の損失をもたらす。一部の場合、患者の中心窩視力がなしで済まされ、「ドーナツ型の視覚（ｄｏｕｇｈｎｕｔ  ｖｉｓｉｏｎ）」をもたらし、ここでは、中心および周辺の視覚は損なわれないままであるが、失明の輪（ｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）によって妨げられる。
【０００４】
アッシャー症候群は、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩと示される、３つの臨床サブタイプを有する。アッシャーＩの対象は、重度に難聴に生まれ、１０年以内に視力を失い始め、平衡困難性を示す。彼らは、前庭異常のために、子供として歩行するのを習得することが遅い。アッシャーＩＩの対象は、聴力損失をあまり受けず、身体的平衡異常を受けず、思春期に視力を失い始める。彼らの聴力の多くは、中年まで保存され得る。アッシャーＩＩＩの対象は、聴力および視力の徐々の損失を受け、身体的平衡異常を受けることがあり得る。
【０００５】
アッシャー症候群は、変わりやすい状態であり；重症度の程度は、サブタイプと緊密には結び付けられない。例えば、アッシャーＩＩＩの対象は、小児期に無症候性であるが、成人早期から中期までに重度の聴力および視力の損失を発症することがある。５０歳前の実質的な視力障害は、アッシャーＩＩＩの対象によく見られる。他方で、アッシャーＩの対象は、生まれたときから難聴であるが、良好な中心視力を老年まで維持することがある。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、以下の構造：
【０００７】
【化１】
0006290910.tif 000002
0006290910.tif 000003
を有する化合物；および医薬として許容されるこれらの塩を提供する。
【０００８】
上記化合物１−化合物１４のそれぞれ、または医薬として許容されるこの塩（「ピラゾロピリダジン化合物」または「本発明の化合物」）は、網膜変性疾患またはアッシャー症候群に伴う聴力損失を処置するために有用である。
【０００９】
本発明はさらに、有効量のピラゾロピリダジン化合物、および医薬として許容される担体またはビヒクルを含む組成物を提供する。この組成物は、網膜変性疾患またはアッシャー症候群に伴う聴力損失を処置するために有用である。
【００１０】
本発明はさらに、網膜変性疾患を処置するための方法であって、これを必要としている対象に有効量のピラゾロピリダジン化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明はなおさらに、アッシャー症候群に伴う聴力損失を処置するための方法であって、これを必要としている対象に有効量のピラゾロピリダジン化合物を投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】細胞におけるＮ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１発現の密度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、本発明の化合物、本発明の化合物を含む組成物、および網膜変性疾患またはアッシャー症候群に伴う聴力損失を処置するための方法であって、ピラゾロピリダジン化合物または医薬として許容されるこの塩を投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明の化合物
数値に直ぐ先立つ場合の「約」という語は、その値のプラスまたはマイナス１０％の範囲を意味し、例えば、「約１００ｍｇ」は、９０ｍｇから１１０ｍｇ、「約３００ｍｇ」は、２７０ｍｇから３３０ｍｇを意味するなどである。
【００１５】
略語：
ＡＰＣＩ        大気圧化学イオン化
ＤＡＰＩ        ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール
ＤＩＰＥＡ      ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ        ダルベッコ変性イーグル培地
ＤＭＦ          ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ        ジメチルスルホキシド
ＥＤＡＣ        １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＥＳＩ          エレクトロスプレーイオン化
ＥＳＩ−ＴＯＦ  エレクトロスプレーイオン化−飛行時間
ＨＡＴＵ        ２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＰＯ        ２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド
ＨＰＬＣ        高速液体クロマトグラフィー
ＬＣＭＳ        液体クロマトグラフィー−質量分析
ＬＤＡ          リチウムジイソプロピルアミド
ｍ／ｚ          質量対電荷比
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  マトリックス補助レーザ脱着イオン化−飛行時間
ＭＳ            質量分析
ＰＢＳ          リン酸緩衝生理食塩水
Ｒｔ            保持時間
ＳＤＳ          ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＨＦ          テトラヒドロフラン
【００１６】
本発明は、以下の構造：
【００１７】
【化２】
0006290910.tif 000004
0006290910.tif 000005
を有する化合物；および医薬として許容されるこれらの塩を提供する。
【００１８】
本明細書で開示される化合物の一部、例えば、化合物１−４および１４は、絶対立体化学を示す、ボールド体またはハッチ型ウェッジを有して描かれている。
【００１９】
いずれの特定の機構によっても拘束されることなく、ピラゾロピリダジン化合物のビスフェニルピラゾロピリダジン部分は、アッシャーＩＩＩ症候群で変異した遺伝子によってコードされたタンパク質であるＣｌａｒｉｎ  Ｉの活性およびトラフィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）の回復に関与していると考えられる（Ａｄａｔｏら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、２００２年６月；１０（６）：３３９−５０頁）。
【００２０】
本発明の化合物は、塩の形態であり得る。一部の実施形態において、塩は、医薬として許容される塩である。医薬として許容される塩には、例えば、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩を形成する酸は、有機酸または無機酸であり得る。塩基付加塩を形成する塩基は、有機塩基または無機塩基であり得る。一部の実施形態において、医薬として許容される塩は、金属塩である。一部の実施形態において、医薬として許容される塩は、アンモニウム塩である。
【００２１】
酸付加塩は、本発明の化合物の遊離塩基形態への酸の付加から生じ得る。一部の実施形態において、酸は有機である。一部の実施形態において、酸は無機である。好適な酸の非限定的な例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、亜硝酸、硫酸、亜硫酸、リン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、乳酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、酒石酸、アスコルビン酸、ゲンチシン酸、グルコン酸、グルカロン酸、サッカリン酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、パントテン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸、シュウ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、グリコール酸、リンゴ酸、桂皮酸、マンデル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、フェニル酢酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−ホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、およびアミノ酸が含まれる。
【００２２】
好適な酸付加塩の非限定的な例には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、炭酸塩、重炭酸塩、ニコチン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、４−アミノサリチル酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、ゲンチシン酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、パントテン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、メチルマレイン酸塩、グリコール酸塩、リンゴ酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、２−フェノキシ安息香酸塩、２−アセトキシ安息香酸塩、エンボン酸塩、フェニル酢酸塩、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、エタン−１，２−ジスルホン酸塩、４−メチルベンゼンスルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸塩、２−ホスホグリセリン酸塩、３−ホスホグリセリン酸塩、グルコース−６−リン酸塩、およびアミノ酸塩が含まれる。
【００２３】
金属塩は、カルボキシル基を有する本発明の化合物への無機塩基の付加から生じ得る。無機塩基は、塩基性対イオン、例えば、水酸化物イオン、炭酸イオン、重炭酸イオン、またはリン酸イオンなどと対になった金属カチオンからなる。金属は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、または典型金属であり得る。好適な金属の非限定的な例には、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム、セリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、カルシウム、ストロンチウム、コバルト、チタン、アルミニウム、銅、カドミウム、および亜鉛が含まれる。
【００２４】
好適な金属塩の非限定的な例には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、セリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩、コバルト塩、チタン塩、アルミニウム塩、銅塩、カドミウム塩、および亜鉛塩が含まれる。
【００２５】
アンモニウム塩は、カルボキシル基を有する本発明の化合物へのアンモニアまたは有機アミンの付加から生じ得る。好適な有機アミンの非限定的な例には、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリン、ピペリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ジベンジルアミン、ピペラジン、ピリジン、ピラゾール、イミダゾール、ピラジン、ピピラジン、エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、プロカイン、クロロプロカイン、コリン、ジシクロヘキシルアミン、およびＮ−メチルグルカミンが含まれる。
【００２６】
好適なアンモニウム塩の非限定的な例には、トリエチルアンモニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩、エタノールアンモニウム塩、ジエタノールアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、モルホリニウム塩、Ｎ−メチルモルホリニウム塩、ピペリジニウム塩、Ｎ−メチルピペリジニウム塩、Ｎ−エチルピペリジニウム塩、ジベンジルアンモニウム塩、ピペラジニウム塩、ピリジニウム塩、ピラゾリウム塩、イミダゾリウム塩、ピラジニウム塩、エチレンジアンモニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアンモニウム塩、プロカイン塩、クロロプロカイン塩、コリン塩、ジシクロヘキシルアンモニウム塩、およびＮ−メチルグルカミン塩が含まれる。
【００２７】
ピラゾロピリダジン化合物を作製するための方法
ピラゾロピリダジン化合物は、以下を包含する。
【００２８】
【化３】
0006290910.tif 000006
【００２９】
スキーム１は、１−Ｎ−メチル基を有し、Ｒ’およびＲ”が、独立して、非置換または置換フェニル基であるピラゾロピリダジン化合物の調製について一般的に記載する。例えば、Ｒ’が非置換または置換フェニルである２−シアノカルボニル化合物は、Ｎ−メチルヒドラジンと縮合して、３−置換−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−アミンを与える。５−アミノ基は、例えば、塩基、例えば、ピリジンの存在下で無水酢酸によってアシル化されて、５−アミド化合物を与える。５−アミド化合物は、例えば、エタノール（ＥｔＯＨ）などの溶媒中でヨウ素およびヨウ素酸の混合物によってヨウ素化されて、Ｎ−（３−置換−４−ヨード−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アセトアミドを与える。例えば、トリエチルアミンなどの塩基と一緒のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒中ヨウ化銅（Ｉ）の存在下でパラジウム（ＩＩ）ビストリフェニルホスフィンジクロリドなどのパラジウム錯体により触媒される、アセトアミドとＲ”置換末端アルキンとのパラジウム媒介クロスカップリング、例えば、Ｓｏｎａｇａｓｈｉｒａクロスカップリングは、Ｒ”が非置換または置換フェニルである二置換アルキンを与える。エタノールなどの溶媒中水酸化ナトリウムなどの塩基によるアルキンアセトアミドの鹸化は、第一級アミンを与える。濃塩酸中亜硝酸ナトリウムによる第一級アミンのジアゾ化は、ジアゾ中間体を与え、このジアゾ中間体は環化して、１−Ｎ−メチル基を有し、Ｒ’およびＲ”が、独立して、非置換または置換フェニル基であるピラゾロピリダジン化合物を与える。
【００３０】
【化４】
0006290910.tif 000007
【００３１】
スキーム２は、Ｒ３基を有し、Ｒ’が非置換または置換フェニル基であるピラゾロピリダジン化合物の調製について一般的に記載する。Ｒ’およびＲ３は、同一でありまたは異なることができる。例えば、４，６−ジクロロ−３−フェニルピリダジンは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの溶媒中リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）などの塩基によって脱プロトン化され、得られた５−リチオ種は、非置換または置換ベンズアルデヒドと縮合して、第二級アルコールを与える。このアルコールは、トルエンなどの溶媒中二酸化マンガンなどの酸化剤によってケトンに酸化される。ケトンは、エタノールなどの溶媒中Ｒ３−置換ヒドラジンと縮合して、中間体ヒドラゾンを与え、この中間体ヒドラゾンは環化して、１−Ｎ−Ｒ３基を有するピラゾロピリダジン化合物を与え、ここで、Ｒ３は、式ＩＩおよび式ＩＩＩにおけるように定義され、Ｒ’は、非置換または置換フェニル基である。
【００３２】
【化５】
0006290910.tif 000008
【００３３】
スキーム３は、１−Ｎ−メチル基を有し、Ｒ’が、シアノ基、アルキン、アルケンまたはアリール基であるピラゾロピリダジン化合物の調製について一般的に記載する。例えば、１−メチル−３−ヨードフェニル−４−クロロ−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジンは、場合によってパラジウム錯体などの適切な触媒の存在下で、場合によって亜鉛塩または銅塩などの非パラジウム遷移金属塩の存在下で、場合によってトリフェニルホスフィンまたは有機アミン塩基などの添加剤の存在下で、適切なカップリングパートナー、例えば、シアン化物塩、末端アルキン、ハロゲン化アルケニル、またはハロゲン化アリールとカップリングして、１−Ｎ−メチル基を有し、Ｒ’がシアノ基、アルキン、アルケンまたはアリール基であるピラゾロピリダジン化合物を与える。生成物中のＲ’の位置、すなわち、オルト、メタまたはパラは、出発物質中のヨード基の位置と同一である。
【００３４】
【化６】
0006290910.tif 000009
【００３５】
スキーム４は、ピラゾロピリダジン化合物の調製について一般的に記載する。
【００３６】
治療上の使用
本発明の化合物は、これを必要としている対象に網膜変性疾患の処置のために投与され得る。網膜変性疾患の非限定的な例には、網膜色素変性、レーバー先天性黒内障、症候性網膜変性、滲出型および萎縮型加齢黄斑変性を含む加齢黄斑変性、およびアッシャー症候群が含まれる。一部の実施形態において、アッシャー症候群はアッシャー症候群のサブタイプである。一部の実施形態において、サブタイプはアッシャーＩである。一部の実施形態において、サブタイプは、アッシャーＩＩである。一部の実施形態において、サブタイプはアッシャーＩＩＩである。
【００３７】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の化合物は、これを必要としている対象にアッシャー症候群に伴う聴力損失の処置のために投与され得る。一部の実施形態において、アッシャー症候群は、アッシャー症候群のサブタイプである。一部の実施形態において、サブタイプは、アッシャーＩである。一部の実施形態において、サブタイプは、アッシャーＩＩである。一部の実施形態において、サブタイプは、アッシャーＩＩＩである。
【００３８】
「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、または非ヒト霊長類、例えば、サル、チンパンジー、ヒヒもしくは赤毛猿である。一実施形態において、対象はヒトである。
【００３９】
本発明の化合物は、医薬として許容される担体またはビヒクルを含む組成物の成分として対象に投与され得る。好適な医薬担体またはビヒクルの非限定的な例には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、緩衝水、およびリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。これらの組成物は、例えば、ドロップ剤、溶液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、および持続放出性製剤として投与され得る。一部の実施形態において、組成物は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水シロップ、メチルセルロース、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ならびに鉱油を含む。組成物は、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、甘味剤、または香味剤を追加的に含み得る。
【００４０】
組成物は、有効量の本発明の化合物を含み得る。本発明の化合物の「有効量」は、対象における網膜変性疾患またはアッシャー症候群に伴う聴力損失を処置するために有効である量である。組成物は、有効量の本発明の化合物を含む単位剤形で製剤化され得る。一部の実施形態において、組成物は、例えば、約１ｎｇから約１，０００ｍｇの本発明の化合物を含む。一部の実施形態において、組成物は、約１００ｍｇから約１，０００ｍｇの本発明の化合物を含む。一部の実施形態において、組成物は、約１００ｍｇから約５００ｍｇの本発明の化合物を含む。一部の実施形態において、組成物は、約２００ｍｇから約３００ｍｇの本発明の化合物を含む。
【００４１】
本発明の化合物の投与量は、対象の症状、年齢、および体重、網膜変疾患またはアッシャー症候群に伴う聴力損失の性質および重症度、投与の経路、ならびに組成物の形態に依存して変わり得る。本明細書で記載される組成物は、単回用量または分割用量で投与され得る。一部の実施形態において、本発明の化合物の投与量は、対象の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｎｇから約１０ｇ、１ｋｇ当たり約１ｎｇから約０．１ｇ、または１ｋｇ当たり約１００ｎｇから約１０ｍｇの範囲である。
【００４２】
投与は、例えば、局所、耳内、眼内、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋内、頭蓋内、眼窩内、脳室内、嚢内、脊髄内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアゾール、坐剤、または経口であり得る。経口使用のための製剤には、非毒性の、医薬として許容される賦形剤との混合物中に本発明の化合物を含有する錠剤が含まれる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、滑沢剤、流動促進剤、および抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、またはタルク）であり得る。眼に使用するための製剤は、点眼剤の形態であり得る。
【００４３】
本発明の化合物またはこの組成物は、非経口、皮下、皮内、筋内、または静脈内投与のために、例えば、等張緩衝液、水性緩衝液または生理食塩緩衝液中で再構成するための凍結乾燥形態で提供され得る。本発明の組成物はまた、経口、耳内、経鼻、または舌下投与に有用な液体調製物、例えば、懸濁剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であり得る。本発明の組成物はまた、経口投与に適した形態、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、およびチュアブル固体製剤であり得る。本発明の組成物はまた、液体、粘性液体、ペースト、または粉末として、経皮投与のためのクリーム剤として調製され得る。本発明の組成物はまた、エアゾール性成分の有無にかかわらず、肺投与のための散剤として調製され得る。
【００４４】
組成物は、血液脳関門を横切ることができることに加えて、経口、耳内、鼻腔内、舌下、十二指腸内、皮下、頬側、結腸内、直腸、経膣、粘膜、肺、経皮、皮内、非経口、静脈内、筋内、および眼用剤形であり得る。
【００４５】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な手段によって投与され得る。例えば、本発明の組成物は、経口投与され得、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤またはシロップ剤として製剤化され得る。代替として、本発明の組成物は、注射剤（例えば、静脈内、筋内または皮下）、ドロップ注入（ｄｒｏｐ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）調製物または坐剤として非経口投与され得る。眼科用途のために、本発明の組成物は、点眼剤または眼軟膏剤として製剤化され得る。耳用組成物は、内部的または表面的のいずれかで、耳への適用のために点耳剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、クリーム剤、液剤、ゲル剤、または膏薬（ｓａｌｖｅ）として製剤化され得る。これらの製剤は、従来の手段で調製され得、組成物は、任意の従来の添加剤、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤、またはコーティング剤と混合され得る。
【００４６】
本発明の組成物は、湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、香味剤および賦香剤、保存剤ならびに抗酸化剤を含み得る。
【００４７】
組成物は、例えば、経口、耳内、眼内、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、経膣、エアゾールおよび／または非経口投与に適切であり得る。組成物は、単位剤形で提供され得、当技術分野で公知の任意の方法により調製され得る。
【００４８】
経口投与に適した製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤、散剤、顆粒剤の形態で、または水性もしくは非水性液体中溶液剤もしくは懸濁剤として、または水中油型もしくは油中水型の液体乳剤として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはパステル剤（不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアを用いる）としての形態であってもよい。本発明の組成物はまた、ボーラス剤、舐剤、またはペースト剤として投与され得る。
【００４９】
医薬として許容される担体またはビヒクルの追加の例には、（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシア；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレー；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物；（１０）着色剤；ならびに（１１）緩衝剤が含まれる。類似の組成物を、軟質または硬質のゼラチン充填カプセル中で充填剤として用いることができる。
【００５０】
経口投与のための液体剤形は、医薬として許容される乳剤、マイクロエマルション、ゲル剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。液体剤形は、当技術分野で一般に用いられる不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸ジエチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油、例えば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有し得る。
【００５１】
懸濁剤形は、懸濁している、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物を含有し得る。
【００５２】
主題組成物の経皮投与のための剤形には、ドロップ剤、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、およびパッチ剤が含まれる。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、およびゲル剤は、賦形剤、例えば、動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有し得る。
【００５３】
散剤およびスプレー剤は、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末、またはこれらの混合物を含有し得る。スプレー剤は、慣例の噴射剤、例えば、クロロフルオロヒドロカーボン、および揮発性非置換炭化水素、例えば、ブタンおよびプロパンを追加的に含有してもよい。
【００５４】
組成物は、固体粒子のエアゾールで投与され得る。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁剤が使用され得る。超音波ネブライザが使用され得るが、それらが分解を引き起こし得る剪断への暴露を最小限にするからである。
【００５５】
水性エアゾールは、本発明の化合物の水溶液または水性懸濁液を、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎｓ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、またはポリエチレングリコール）；タンパク質、例えば、血清アルブミン；ソリビタンエステル；脂肪酸；レシチン；アミノ酸；緩衝剤；塩；糖；または糖アルコールのような任意の従来の医薬として許容される担体またはビヒクルと一緒に製剤化することによって作製され得る。
【００５６】
非経口投与に適した組成物は、本発明の化合物、および１種以上の医薬として許容される滅菌の等張性水性または非水性の溶液剤、分散液剤、懸濁剤、もしくは乳剤、または抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、もしくは製剤を対象の血液と等張性にさせる溶質を含有し得る、滅菌の注射可能な溶液剤もしくは分散液剤中に使用直前に再構成され得る滅菌の散剤、ならびに懸濁化剤または増粘剤を含む。
【００５７】
特定の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、他の実施形態が本明細書の考察から当業者に明らかとなる。本発明は、以下の実施例への参照によりさらに明らかにされる。材料および方法の両方への多くの変更が、本発明の範囲から逸脱することなく実施されてもよいことが当業者に明らかである。
【実施例】
【００５８】
一般合成方法
特に断りのない限り、全ての化学薬品は、商業的供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。
【００５９】
標準塩基性ＬＣ−ＭＳ条件：（１０ｃｍ＿ＥＳＣＩ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＭｅＣＮ）
【００６０】
アセトニトリル（遠ＵＶ等級）：１０ｍＭの重炭酸アンモニウム（炭酸水素アンモニウム）を有する水（ＰｕｒｅＬａｂ  Ｏｐｔｉｏｎユニットによる高純度）の勾配を使用するＷａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳ  ５μｍＣ１８、１００×４．６ｍｍ（プラスガードカートリッジ）を使用した。流量は２ｍＬ／分であった。ＵＶ検出は、Ｗａｔｅｒｓダイオードアレー検出器（開始レンジ２１０ｎｍ、終了レンジ４００ｎｍ、レンジ間隔４ｎｍ）を使用して行った。質量検出は、単一四重極ＬＣ−ＭＳ装置によって行った。イオン化は、化合物の種類に応じてＥＳＩまたはＡＰＣＩのいずれかである。使用した勾配は、０．００分の時点で水性溶媒９５％から、４．０分の時点で水性溶媒５％まで及んだ。次いで、このパーセンテージをさらに１．５分間保持した。
【００６１】
標準酸性ＨＰＬＣ条件：（１０ｃｍ＿ギ酸＿ＡＣＥ３Ｃ１８ＡＲ＿ＨＰＣＬ＿ＣＨ３ＣＮ）
【００６２】
０．１％（Ｖ／Ｖ）ギ酸を有するアセトニトリル（遠ＶＵ等級）：０．１％ギ酸を有する水（ＰｕｒｅＬａｂ  Ｏｐｔｉｏｎユニットによる高純度）の勾配を使用するＨｉｃｈｒｏｍ  ＡＣＥ３Ｃ１８−ＡＲ混合モード  １００×４．６ｍｍカラムを使用した。流量は１ｍＬ／分であった。ＵＶ検出は、Ａｇｉｌｅｎｔダイオードアレー検出器（３００ｎｍ、バンド幅２００ｎｍ；基準４５０ｎｍ、バンド幅１００ｎｍ）を使用して行った。使用した勾配は、０．００分から３．００分まで水性溶媒９８％から、１２．００分の時点で水性溶媒１００％まで及んだ。次いで、このパーセンテージをさらに２．４分間保持した。
【００６３】
標準塩基性ＨＰＬＣ条件：（１５ｃｍ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＧｅｍｉｎｉＮＸ＿ＨＰＬＣ）
アセトニトリル（遠ＵＶ等級）：１０ｍＭ重炭酸アンモニウムを有する水（ＰｕｒｅＬａｂ  Ｏｐｔｉｏｎユニットによる高純度）の勾配を使用するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＧｅｍｉｎｉＮＸ、３μｍＣ１８、１５０×４．６ｎｍカラムを使用した。流量は、１ｍＬ／分であった。ＵＶ検出は、Ａｇｉｌｅｎｔダイオードアレー検出器（３００ｎｍ、バンド幅２００ｎｍ；基準４５０ｎｍ、バンド幅１００ｎｍ）を使用して行った。使用した勾配は、０．００分の時点で水性溶媒９５．５％から９．００分の時点で水性溶媒０％まで及んだ。次いで、このパーセンテージをさらに４．５分間保持した。
【００６４】
標準酸性ＨＰＬＣ条件：（１５ｃｍ＿ギ酸＿ＡＳＣＥＮＴＩＳ＿ＨＰＬＣ）
【００６５】
０．１％（Ｖ／Ｖ）ギ酸を有するアセトニトリル（遠ＵＶ等級）：０．１％ギ酸を有する水（ＰｕｒｅＬａｂ  Ｏｐｔｉｏｎユニットによる高純度）の勾配を使用するＳｕｐｅｌｃｏ、Ａｓｃｅｎｔｉｓ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８またはＨｉｃｈｒｏｍ  Ｈａｌｏ、Ｃ１８、２．７μｍ  Ｃ１８、１５０×４．６ｍｍカラムを使用した。流量は１ｍＬ／分であった。ＵＶ検出は、Ａｇｉｌｅｎｔダイオードアレー検出器（３００ｎｍ、バンド幅２００ｎｍ；基準４５０ｎｍ、バンド幅１００ｎｍ）を使用して行った。使用した勾配は、０．００分の時点で水性溶媒９６％から、９．００分の時点で水性溶媒０％まで及んだ。次いで、このパーセンテージをさらに４．５分間保持した。
【００６６】
本発明の例証化合物の合成的調製
実施例１
２−［４−クロロ−３−（４−フルオロフェニル）−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル］−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン（化合物１）
工程１：Ｎ−（１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アセトアミド
【００６７】
【化７】
0006290910.tif 000010
【００６８】
１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（５０ｇ、０．６０２ｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（１６０ｍＬ、１．４４ｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２Ｌ）中溶液に、塩化アセチル（９９ｍＬ、１．３８ｍｏｌ）を窒素の雰囲気下０℃で滴下した。この反応混合物を室温で１日間撹拌した。一部のジアセチル化生成物をＬＣＭＳで観察した。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた固体をＭｅＯＨ（２Ｌ）に懸濁させ、０℃に冷却した。４Ｍ  ＮａＯＨ溶液（水性、４４０ｍＬ、１．７５ｍｏｌ）をゆっくりと添加し、この混合物を１．５時間かけて室温に加温させた。ＭｅＯＨを真空中で除去し、固体をろ過により収集し、最小限の冷水で洗浄し、真空中で乾燥させて、表題化合物を固体（６０ｇ）として得た。
【００６９】
工程２：Ｎ−（４−ヨード−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アセトアミド
【００７０】
【化８】
0006290910.tif 000011
【００７１】
Ｎ−（１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アセトアミド（６０ｇ、０．４８ｍｏｌ）、ヨウ素酸（２１．１ｇ、０．１２ｍｏｌ）およびヨウ素（６１ｇ、０．２４ｍｏｌ）のエタノール（１．６Ｌ）中懸濁液を６０℃で１．５時間加熱し、室温に冷却した。この反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチルおよび２Ｍ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液間に分配した。層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を脱水し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮して、表題化合物を固体（１０５ｇ）として得た。
【００７２】
工程３：Ｎ−（４−（フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アセトアミド
【００７３】
【化９】
0006290910.tif 000012
【００７４】
Ｎ−（４−ヨード−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アセトアミド（３０ｇ、１２０ｍｍｏｌ）、炭素上１０％パラジウム（５０％水、７．４ｇ、３ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（１．１４ｇ、６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（６．３ｇ、２４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５０ｍＬ、３６０ｍｍｏｌ）のエタノール（６００ｍＬ）中懸濁液を通して窒素を２０分間泡立てた。フェニルアセチレン（１８．３ｇ、１７９ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を通して窒素をさらに２５分間泡立てた。次いで、この反応混合物を加熱し、窒素の雰囲気中還流条件下で３日間撹拌し、室温に冷却した。反応混合物をセライトに通してろ過し、ろ液を真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、イソヘキサン／酢酸エチル９：１から０：１）により精製し、表題化合物を固体（１７．６ｇ）として得た。
【００７５】
工程４：１−（１−エトキシエチル）−４−（フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン
【００７６】
【化１０】
0006290910.tif 000013
【００７７】
Ｎ−（４−（フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アセトアミド（１７．６ｇ、７８ｍｍｏｌ）、エトキシエテン（１１．２ｍＬ、１１７ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン中ＨＣｌ（１ｍＬ、４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５２０ｍＬ）中溶液を室温で１時間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をエタノール（２６０ｍＬ）および２５％ＮａＯＨ水溶液（２６０ｍＬ）に溶解させ、この反応混合物を７５℃に４時間加熱し、室温に冷却した。エタノールを真空中で部分濃縮し、得られた固体をろ過により収集し、水および最小限の冷エタノールで洗浄し、真空中で乾燥させて、表題化合物を固体（１６ｇ）として得た。
【００７８】
工程５：４−クロロ−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン
【００７９】
【化１１】
0006290910.tif 000014
【００８０】
亜硝酸ナトリウム（４．３ｇ、６３ｍｍｏｌ）を濃ＨＣｌ（３１４ｍＬ）に−１５℃で添加し、１０分間撹拌した。１−（１−エトキシエチル）−４−（フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（３ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を−１０℃で１０分間および室温で１日間撹拌した。この反応混合物を０℃に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）を添加した。激しい撹拌下で、Ｎａ２ＣＯ３（１６０ｇ）、続いて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を、ｐＨが７になるまで２時間にわたって注意深く添加し、さらなる塩基の添加後にはもはや泡立ちはなかった。層を分離し、水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機層を脱水し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、イソヘキサン／ジエチルエーテル１：０から０：１）により精製し、表題化合物を固体（３．４３ｇ）として得た。
【００８１】
工程６：４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン
【００８２】
【化１２】
0006290910.tif 000015
【００８３】
４−クロロ−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（２．４４ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヨードスクシンイミド（３．５８ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０６ｍＬ）中懸濁液を還流において１日間加熱した。黄色の固体を温かい間にろ過により収集して、表題化合物および出発原料の混合物（９：１、４ｇ）を得た。
【００８４】
工程７：２−（４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン
【００８５】
【化１３】
0006290910.tif 000016
【００８６】
クロロアセチルクロリド（６３２μＬ、７．９４ｍｍｏ）を、（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン（１ｇ、７．９４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．２ｍＬ、１５．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中溶液に５℃で滴下した。この反応混合物を室温で１時間撹拌した。水およびＣＨ２Ｃｌ２を添加した。層を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機物を脱水し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮して、２−クロロ−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン（４．７ｇ）を得た。
【００８７】
水素化ナトリウム（鉱油中６０％、２４０ｍｇ、６ｍｍｏｌ）を、４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（１．０６ｇ、３ｍｍｏｌ）および２−クロロ−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン（７４０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）中溶液に室温で添加した。この反応混合物を室温で１６時間撹拌した。４％ＬｉＣｌ水溶液および酢酸エチルを添加した。層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機物を脱水し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、イソヘキサン／酢酸エチル１：０から３：７）により部分的に精製した。得られた固体を最小限のＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、固体が沈殿するまでジエチルエーテルを添加した。固体をろ過により収集して、表題化合物を固体（８４６ｍｇ）として得た。
【００８８】
工程８：２−［４−クロロ−３−（４−フルオロフェニル）−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−−１−イル］−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン（化合物１）
【００８９】
【化１４】
0006290910.tif 000017
【００９０】
２−（４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン（７０ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）、４−フルオロフェニルボロン酸（２２ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）およびＫ３ＰＯ４（９２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．１ｍＬ）および水（０．４ｍＬ）中懸濁液を通して窒素を２０分間泡立てた。１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（ＩＩ）ジクロリドジクロロメタン錯体（１２ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を添加し、管を密封し、マイクロ波照射を用いて６０℃に３０分間加熱した。この粗反応混合物をろ過し、分取ＨＰＬＣにより部分的に精製した。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル、イソヘキサン／酢酸エチル１：０から７：３）により精製して、化合物１（２０ｍｇ）を得た。
【００９１】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.８２-７.７２  (４  H,  m),  ７.５５-７.４７  (３  H,  m),  ７.２２-７.１３  (２  H,  m),  ５.６８-５.５２  (２  H,  m),  ５.５０-５.２０  (１  H,  m),    ４.００-３.７９  (３  H,  m),  ３.６８-３.５７  (１  H,  m),  ２.４９-２.２７  (２  H,  m).
【００９２】
ＬＣＭＳ（１０ｃｍ＿ＥＳＣＩ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＭｅＣＮ）Ｒｔ３．９７分；ｍ／ｚ  ４５４［Ｍ＋Ｈ］９９．６％純度。
【００９３】
実施例２
２−［４−クロロ−３−（３，４−ジフルオロフェニル）−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル］−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン（化合物２）
【００９４】
【化１５】
0006290910.tif 000018
【００９５】
工程８において４−フルオロフェニルボロン酸の代わりに３，４−ジフルオロフェニルボロン酸を用いることを除いて、実施例１に従って化合物２を合成した。
【００９６】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.７５-７.７２  (２  H,  m),  ７.６８-７.６２  (１  H,  m),  ７.５７-７.４８  (４  H,  m),  ７.３４-７.３０  (１  H,  m),  ５.７０-５.５３  (２  H,  m),  ５.４６-５.１９  (１  H,  m),  ３.９８-３.８１  (３  H,  m),  ３.６５-３.５８  (１  H,  m),    ２.５０-２.００  (２  H,  m).
【００９７】
ＬＣＭＳ（１５ｃｍ＿ギ酸＿ＡＳＣＥＮＴＩＳ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  １０．３２分；ｍ／ｚ  ４７２［Ｍ＋Ｈ］９９．６％純度。
【００９８】
実施例３
２−［４−クロロ−３−（２，５−ジフルオロフェニル）−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル］−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン（化合物３）
【００９９】
【化１６】
0006290910.tif 000019
【０１００】
工程８において４−フルオロボロン酸の代わりに２，５−ジフルオロフェニルボロン酸を用いることを除いて、実施例１に従って化合物３を合成した。
【０１０１】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.７８-７.７４  (２  H,  m),  ７.５５-７.４７  (３  H,  m),  ７.３８-７.３３  (１  H,  m),  ７.１９-７.１４  (２  H,  m),  ５.６８-５.５３  (２  H,  m),  ５.３９-５.３３  (１  H,  m),  ４.００-３.８１  (３  H,  m),  ３.６５-３.５５  (１  H,  m),  ２.５０-２.００  (２  H,  m).
【０１０２】
ＬＣＭＳ（１５ｃｍ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＧｅｍｉｎｉＮＸ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  １０．５１分；ｍ／ｚ  ４７２［Ｍ＋Ｈ］９３．７２％純度。
【０１０３】
実施例４
２−［４−クロロ−３−（２，３−ジフルオロフェニル）−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル］−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン（化合物４）
【０１０４】
【化１７】
0006290910.tif 000020
【０１０５】
工程８において４−フルオロボロン酸の代わりに２，３−ジフルオロフェニルボロン酸を用いることを除いて、実施例１に従って化合物４を合成した。
【０１０６】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.７７-７.７４  (２  H,  m),  ７.５４-７.４７  (３  H,  m),  ７.４３-７.３７  (１  H,  m),  ７.３３-７.２９  (１  H,  m),  ７.２４-７.１７  (１  H,  m),  ５.６９-５.５４  (２  H,  m),  ５.４１-５.２５  (１  H,  m),  ４.０１-３.７８  (３  H,  m),  ３.６５-３.５８  (１  H,  m),  ２.００  (２  H,  m).
【０１０７】
ＬＣＭＳ（１５ｃｍ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＧｅｍｉｎｉＮＸ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  １０．５２分；ｍ／ｚ  ４７２［Ｍ＋Ｈ］９５．５％純度。
【０１０８】
実施例５
４−クロロ−３−（２，３−ジフルオロフェニル）−１−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル］−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（化合物５）
【０１０９】
【化１８】
0006290910.tif 000021
【０１１０】
４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジンおよび４−クロロ−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（９：１、１．４ｇ）、２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタノール（１．１３ｇ、７．８ｍｍｏｌ）、ジエチルアゾジカルボキシレート（１．３７ｇ、７．８ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（２．０７ｇ、７．９ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２６ｍＬ）中溶液を８５℃に１時間加熱し、次いで、室温に冷却し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、イソヘキサン／酢酸エチル１：０から０：１で開始し、次いで酢酸エチル／ＭｅＯＨ中４Ｍ  ＮＨ３１：０から９：１）により部分的に精製して、４−クロロ−３−ヨード−１−（２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル）−５−フェニル−１Ｈピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（７６１ｍｇ）を得た。
【０１１１】
工程８において４−フルオロフェニルボロン酸の代わりに２，３−ジフルオロフェニルボロン酸および２−（４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノンの代わりに４−クロロ−３−ヨード−１−（２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル）−５−フェニル−１Ｈピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジンを用いることを除いて、実施例１に従って化合物５を合成した。分取ＨＰＬＣにより、化合物５を二ギ酸塩として得た。
【０１１２】
１H  NMR  δ  (ppm)(DMSO-d６):  ８.１８  (２  H,  s),  ７.６８-７.６４  (２  H,  m),  ７.６２-７.５４  (１  H,  m),  ７.５４-７.４０  (４  H,  m),  ７.３７-７.３０  (１  H,  m),  ４.８５  (２  H,  t),  ２.８９  (２  H,  t),  ２.４４  (４  H,  bs),  ２.１３  (４  H,  bs),  ２.０２  (３  H,  bs).
【０１１３】
ＬＣＭＳ（１０ｃｍ＿ギ酸＿ＡＣＥ３Ｃ１８ＡＲ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  ９．９４分；ｍ／ｚ  ４６９［Ｍ＋Ｈ］９５．９８％純度。
【０１１４】
実施例６
２−［４−クロロ−３−（２−フルオロフェニル）−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル］−１−ピロリジン−１−イル−エタノン（化合物６）
【０１１５】
【化１９】
0006290910.tif 000022
【０１１６】
水素化ナトリウム（鉱油中６０％、３２ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）を、４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（４００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）および２−クロロ−１−（ピロリジン−１−イル）エタノン（５４ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（７．５ｍＬ）中溶液に室温で添加した。室温で１．５時間後、さらに水素化ナトリウム（鉱油中６０％、２７ｍｇ）を添加し、この懸濁液を２時間撹拌した。４％ＬｉＣｌ水溶液および酢酸エチルを添加した。層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機物を脱水し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、イソヘキサン／酢酸エチル１：０から０：１）により部分的に精製した。得られた固体を最小限のＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、ジエチルエーテルを固体が沈殿するまで添加した。固体をろ過により収集して、２−（４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）−１−（ピロリジン−１−イル）エタノン（２４６ｍｇ）を得た。
【０１１７】
工程８において４−フルオロフェニルボロン酸の代わりに２−フルオロフェニルボロン酸および２−（４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノンの代わりに２−（４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）−１−（ピロリジン−１−イル）エタノンを用いることを除いて、実施例１に従って化合物６を合成した。
【０１１８】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.７７-７.７４  (２  H,  m),  ７.６６-７.６１  (１  H,  m),  ７.５３-７.４５  (４  H,  m),  ５.５８  (２  H,  s),  ３.６６  (２  H,  t),  ３.５４  (２  H,  t),  ２.１１-２.０５  (２  H,  m),  １.９６-１.９０  (２  H,  m).
【０１１９】
ＬＣＭＳ（１５ｃｍ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＧｅｍｉｎｉＮＸ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  １０．６２分；ｍ／ｚ  ４３６［Ｍ＋Ｈ］９５．３６％純度。
【０１２０】
実施例７
４−クロロ−３，５−ジフェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジンのための合成スキーム：
【０１２１】
【化２０】
0006290910.tif 000023
【０１２２】
工程１：Ｎ−（２−アセチル−５−フェニル−ピラゾール−３−イル）アセトアミド
【０１２３】
【化２１】
0006290910.tif 000024
【０１２４】
５−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン（１８．６ｇ、０．１１７ｍｏ）およびＮ−メチルモルホリン（３０．８ｍＬ、０．２８１ｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）中溶液に、塩化アセチル（２０ｍＬ、０．２８１ｍｏｌ）を窒素の雰囲気下０℃で滴下した。この反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２および水で希釈した。層を分離し、有機層を水およびブラインで洗浄し、脱水し（相分離カートリッジ）、真空中で濃縮した。残渣にジエチルエーテルを添加し、固体をろ過により収集し、表題化合物を固体（２５．１ｇ）として得た。
【０１２５】
工程２：Ｎ−（２−アセチル−４−ヨード−５−フェニル−ピラゾール−３−イル）アセトアミド
【０１２６】
【化２２】
0006290910.tif 000025
【０１２７】
Ｎ−（２−アセチル−５−フェニル−ピラゾール−３−イル）アセトアミド（２５．１ｇ、０．１０３ｍｏｌ）、ヨウ素酸（４．５ｇ、０．０２６ｍｏｌ）およびヨウ素（１５．７ｇ、０．０６２ｍｏｌ）のエタノール（２５０ｍＬ）中懸濁液を５０℃で３時間加熱し、室温に冷却した。この反応混合物を真空中で濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２および２Ｍ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液間に分配した。層を分離し、有機層をブラインで洗浄し、脱水し（相分離カートリッジ）、真空中で濃縮して、表題化合物および出発物質の混合物（２．２：１、３０．３ｇ）を得た。この混合物をエタノール（２５０ｍＬ）中ヨウ素酸（１．６ｇ、９．６ｍｍｏｌ）およびヨウ素（９．７ｇ、３８ｍｍｏｌ）を用いて同じ条件下で再び反応させて、表題化合物を固体（３１．９ｇ）として得た。
【０１２８】
工程３：Ｎ−［３−フェニル−４−（２−フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］アセトアミド
【０１２９】
【化２３】
0006290910.tif 000026
【０１３０】
Ｎ−（２−アセチル−４−ヨード−５−フェニル−ピラゾール−３−イル）アセトアミド（３１．８７ｇ、８６．４ｍｍｏｌ）、フェニルアセチレン（１７．６ｇ、１７３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２００ｍＬ）およびＤＭＦ（１００ｍＬ）の混合物を通して窒素を１５分間泡立てた。ヨウ化銅（１．６４ｇ、８．６ｍｍｏｌ）およびビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド（３．０ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を窒素下９０℃で３時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチルおよび水で希釈した。有機相を水およびブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、イソヘキサン／酢酸エチル５：１から１：１）により精製し、表題化合物を固体（１２．５ｇ）として得た。
【０１３１】
工程４：３−フェニル−４−（２−フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン
【０１３２】
【化２４】
0006290910.tif 000027
【０１３３】
Ｎ−［３−フェニル−４−（２−フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］アセトアミド（１２．５ｇ、４２ｍｍｏｌ）、エタノール（１００ｍＬ）および２５％ＮａＯＨ水溶液（１００ｍＬ）の混合物を撹拌し、９０℃に１時間加熱し、室温に冷却した。この反応混合物を酢酸エチルおよび水で希釈した。有機相を水およびブラインで洗浄し、脱水し（相分離カートリッジ）、真空中で濃縮した。残渣にジエチルエーテルを添加し、固体をろ過により収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて、表題化合物を固体（５．４ｇ）として得た。
【０１３４】
工程５：４−クロロ−３，５−ジフェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン
【０１３５】
【化２５】
0006290910.tif 000028
【０１３６】
亜硝酸ナトリウム（２．８８ｇ、４２ｍｍｏｌ）を濃ＨＣｌ（３１４ｍＬ）に−１５℃で少しずつ添加し、１５分間撹拌した。３−フェニル−４−（２−フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（５．４ｇ、２１ｍｍｏｌ）を固体として添加し、続いて、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を添加した。この反応混合物を加温させ、室温で１時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（４４ｍＬ）で希釈し、ＮａＣｌ（２．７ｇ）を添加した。この反応混合物を５０℃に１日間加熱した。層を分離し、有機層を水で洗浄し、脱水し（相分離カートリッジ）、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、イソヘキサン／酢酸エチル４：１、次いでＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル１：０から４：１）により精製し、表題化合物を固体（３．０ｇ）として得た。
【０１３７】
実施例８
４−クロロ−３−（３−フルオロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジンのための合成スキーム
【０１３８】
【化２６】
0006290910.tif 000029
【０１３９】
工程１：Ｎ−［３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］アセトアミド
【０１４０】
【化２７】
0006290910.tif 000030
【０１４１】
３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（６．５ｇ、３６ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（９．７ｍＬ、８８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）中溶液に、塩化アセチル（６ｍＬ、８５ｍｍｏｌ）を窒素の雰囲気下０℃で滴下した。この反応混合物を室温で１日間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮した。残渣に０℃でＭｅＯＨ（５０ｍＬ）およびＴＨＦ（５０ｍＬ）を添加し、続いてＮａＯＨ溶液（水性２．５Ｍ、４２．５ｍＬ）を０℃で添加した。この反応混合物を室温で１５分間撹拌し、ｐＨが約６に達するまでＨＣｌ溶液を添加した。有機溶媒を真空中で蒸発させた。得られた水性懸濁液から固体をろ過により収集し、表題化合物を固体（７．６ｇ）として得た。
【０１４２】
工程２：Ｎ−［３−（３−フルオロフェニル）−４−ヨード−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］アセトアミド
【０１４３】
【化２８】
0006290910.tif 000031
【０１４４】
Ｎ−［３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］アセトアミド（７．６ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）、ヨウ素酸（１．５ｇ、８．５ｍｍｏｌ）およびヨウ素（４．４ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）のエタノール（２００ｍＬ）中懸濁液を６０℃で１時間加熱し、室温に冷却した。この反応混合物を真空中で濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２および２Ｍ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液間に分配した。層を分離し、有機層をブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮して、表題化合物を固体（１０．８ｇ）として得た。
【０１４５】
工程３：Ｎ−［３−（３−フルオロフェニル）−４−（２−フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］アセトアミド
【０１４６】
【化２９】
0006290910.tif 000032
【０１４７】
Ｎ−［３−（３−フルオロフェニル）−４−ヨード−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］アセトアミド（１０．８ｇ、４４ｍｍｏｌ）、フェニルアセチレン（１２．５ｇ、１２３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１００ｍＬ）およびＤＭＦ（４０ｍＬ）の混合物を通して窒素を１５分間泡立てた。ヨウ化銅（８４０ｍｇ、４．４２ｍｍｏｌ）およびビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド（１．５ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を窒素下９０℃で６時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチルおよび水で希釈した。有機相を水およびブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、イソヘキサン／酢酸エチル１：０から０：１）により精製し、表題化合物を固体（４ｇ）として得た。
【０１４８】
工程４：３−（３−フルオロフェニル）−４−（２−フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン
【０１４９】
【化３０】
0006290910.tif 000033
【０１５０】
Ｎ−［３−（３−フルオロフェニル）−４−（２−フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］アセトアミド（２ｇ、６．２ｍｍｏｌ）、エタノール（２２ｍＬ）および２５％ＮａＯＨ水溶液（２２ｍＬ）の混合物を８０℃に１時間撹拌および加熱し、室温に冷却した。この反応混合物を酢酸エチルおよび水で希釈した。有機相を水およびブラインで洗浄し、脱水し（相分離カートリッジ）、真空中で濃縮して、表題化合物を固体（１．２ｇ）として得た。
【０１５１】
工程５：４−クロロ−３−（３−フルオロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン
【０１５２】
【化３１】
0006290910.tif 000034
【０１５３】
亜硝酸ナトリウム（７４０ｍｇ、１０．７ｍｍｏｌ）を濃ＨＣｌ（２４ｍＬ）に−１５℃で少しずつ添加し、１５分間撹拌した。３−（３−フルオロフェニル）−４−（２−フェニルエチニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を固体として添加し、続いてＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を添加した。この反応混合物を加温させ、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、ＮａＣｌ（０．５ｇ）を添加した。この反応混合物を５０℃に１日間加熱した。層を分離し、有機層を水で洗浄し、脱水し（相分離カートリッジ）、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／イソヘキサン０：１から７：３）により精製し、表題化合物を固体（５００ｍｇ）として得た。
【０１５４】
実施例９
４−クロロ−１−（２−イソプロポキシエチル）−３，５−ジフェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（化合物７）
【０１５５】
【化３２】
0006290910.tif 000035
【０１５６】
４−クロロ−３，５−ジフェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（０．３３ｍｍｏｌ）、２−イソプロポキシエタノール（０．６５ｍｍｏｌ）、ジエチルアゾジカルボキシレート（１１４ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１７１ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２ｍＬ）中混合物を、マイクロ波照射を用いて８５から１２０℃の温度に３０から９０分間加熱した。この反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物７を得た。
【０１５７】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.７９-７.７４  (４  H,  m),  ７.５５-７.４４  (６  H,  m),  ４.９８  (２  H,  t),  ４.０８  (２  H,  t),  ３.７１-３.６３  (１  H,  m),  １.１０  (６  H,  t).
【０１５８】
ＬＣＭＳ（１０ｃｍ＿ギ酸＿ＡＣＥ３Ｃ１８ＡＲ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  １３．１８分；ｍ／ｚ  ３９３［Ｍ＋Ｈ］９３．６５％純度。
【０１５９】
実施例１０
４−クロロ−３−（３−フルオロフェニル）−１−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル］−５−フェニル−１−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（化合物８）
【０１６０】
【化３３】
0006290910.tif 000036
【０１６１】
４−クロロ−３−（３−フルオロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（０．３３ｍｍｏｌ）、２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタノール（０．６５ｍｍｏｌ）、ジエチルアゾジカルボキシレート（１１４ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１７１ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２ｍＬ）中混合物を、マイクロ波照射を用いて８５から１２０℃の温度に３０から９０分間加熱した。この反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物８を得た。
【０１６２】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.８１-７.７７  (２  H,  m),  ７.５７-７.４４  (６  H,  m),  ７.２０-７.１８  (１  H,  m),  ４.９５  (２  H,  t),  ３.０７  (２  H,  t),  ２.６５  (４  H,  bs),  ２.３５  (４  H,  bs),  ２.２５  (３  H,  s).
【０１６３】
ＬＣＭＳ（１０ｃｍ＿ギ酸＿ＡＣＥ３Ｃ１８ＡＲ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  ９．９３分；ｍ／ｚ  ４５１［Ｍ＋Ｈ］９９．１８％純度。
【０１６４】
実施例１１
４−［２−［４−クロロ−３−（３−フルオロフェニル）−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル］エチル］モルホリン（化合物９）
【０１６５】
【化３４】
0006290910.tif 000037
【０１６６】
４−クロロ−３−（３−フルオロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（０．３３ｍｍｏｌ）、２−モルホリノエタノール（０．６５ｍｍｏｌ）、ジエチルアゾジカルボキシレート（１１４ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１７１ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２ｍＬ）中混合物を、マイクロ波照射を用いて８５から１２０℃の温度に３０から９０分間加熱した。この反応混合物を真空中で濃縮し、分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物９を得た。
【０１６７】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.８０-７.７７  (２  H,  m),  ７.６０-７.４５  (６  H,  m),  ７.２２-７.１６  (１  H,  m),  ４.９５  (２  H,  t),  ３.６２  (４  H,  t),  ３.０６  (２  H,  t,,  ２.６１  (４  H,  t).
【０１６８】
ＬＣＭＳ（１５ｃｍ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＧｅｍｉｎｉＮＸ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  １１．１６分；ｍ／ｚ  ４３８［Ｍ＋Ｈ］９７．２３％純度。
【０１６９】
実施例１２
４−クロロ−３−（３，４−ジフルオロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン
【０１７０】
【化３５】
0006290910.tif 000038
【０１７１】
工程１において３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミンの代わりに３−（３，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミンを用いることを除いて、実施例８に従って４−クロロ−３−（３，４−ジフルオロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジンを合成した。
【０１７２】
実施例１３
４−クロロ−３−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エチル］−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（化合物１０）
【０１７３】
【化３６】
0006290910.tif 000039
【０１７４】
４−クロロ−３−（３，４−ジフルオロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（０．３３ｍｍｏｌ）、２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エタノール（０．６５ｍｍｏｌ）、ジエチルアゾジカルボキシレート（１１４ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１７１ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２ｍＬ）中混合物を、マイクロ波照射を用いて８５から１２０℃の温度に３０から９０分間加熱した。この反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１０を得た。
【０１７５】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.７８-７.７５  (２  H,  m),  ７.６５-７.５９  (１  H,  m),  ７.５８-７.５１  (４  H,  m),    ７.３３-７.２９  (１  H,  m),  ４.９３  (２  H,  t),  ３.１６  (２  H,  t),  ３.０８  (４  H,  bs),  １.５９  (４  H,  bs),  ２.６７  (３  H,  s).
【０１７６】
ＬＣＭＳ（１０ｃｍ＿ＥＳＣＩ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＭｅＣＮ）Ｒｔ  ４．２７分；ｍ／ｚ  ４６９［Ｍ＋Ｈ］９６．０２％純度。
【０１７７】
実施例１４
４−クロロ−５−（３−フルオロフェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン
【０１７８】
【化３７】
0006290910.tif 000040
【０１７９】
工程３においてフェニルアセチレンの代わりに３−フルオロフェニルアセチレンを用いることを除いて、実施例７に従って４−クロロ−５−（３−フルオロフェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジンを合成した。
【０１８０】
実施例１５
２−［４−クロロ−５−（３−フルオロフェニル）−３−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル］−１−ピロリジン−１−イル−エタノン（化合物１１）
【０１８１】
【化３８】
0006290910.tif 000041
【０１８２】
４−クロロ−５−（３−フルオロフェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（０．３３ｍｍｏｌ）、２−ヒドロキシ−１−（ピロリジン−１−イル）エタノン（０．６５ｍｍｏｌ）、ジエチルアゾジカルボキシレート（１１４ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１７１ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（２ｍＬ）中混合物を、マイクロ波照射を用いて８５から１２０℃の温度に３０から９０分間加熱した。この反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣにより精製して、化合物１１を得た。
【０１８３】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.８１-７.７６  (２  H,  m),  ７.５５-７.４５  (６  H,  m),  ７.２３-７.１５  (１  H,  m),  ５.５８  (２  H,  s),  ３.６７  (２  H,  t),  ３.５４  (２  H,  t),  ２.１３-２.０５  (２  H,  m),  １.９７-１.８９  (２  H,  m).
【０１８４】
ＬＣＭＳ（１０ｃｍ＿ＥＳＣＩ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＭｅＣＮ）Ｒｔ  ３．６９分；ｍ／ｚ  ４３６［Ｍ＋Ｈ］９８．６７％純度。
【０１８５】
実施例１６
イソブチル２−（４−クロロ−３，５−ジフェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）アセテート（化合物１２）
イソブチル２−（４−クロロ−３，５−ジフェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）アセテートのための合成スキーム
【０１８６】
【化３９】
0006290910.tif 000042
【０１８７】
工程１：エチル２−（５−アセトアミド−３−フェニル−ピラゾール−１−イル）アセテート
【０１８８】
【化４０】
0006290910.tif 000043
【０１８９】
エチル２−（５−アミノ−３−フェニル−ピラゾール−１−イル）アセテート（４９ｇ、０．１７ｍｏｌ）のピリジン（２００ｍＬ）中溶液に、無水酢酸（１７．４ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を窒素の雰囲気下０℃で滴下した。この反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２および水で希釈した。層を分離し、有機層を水およびブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２を添加し、固体をろ過により収集し、表題化合物を固体（２２ｇ）として得た。母液を真空中で濃縮し、冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄して、第２のバッチ１５ｇを得た。
【０１９０】
工程２：エチル２−（５−アセトアミド−４−ヨード−３−フェニル−ピラゾール−１−イル）アセテート
【０１９１】
【化４１】
0006290910.tif 000044
【０１９２】
エチル２−（５−アセトアミド−３−フェニル−ピラゾール−１−イル）アセテート（３７ｇ、１２９ｍｍｏｌ）、ヨウ素酸（５．６ｇ、３２ｍｍｏｌ）およびヨウ素（１９．７ｇ、７７ｍｍｏｌ）のエタノール（４００ｍＬ）中懸濁液を５０℃で２時間加熱し、室温に冷却した。この反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２／ジエチルエーテル（１：０から９７：３）でシリカゲルのパッドを通して溶離させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２および２Ｍ  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液間に分配した。層を分離し、有機層を脱水し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮して、残渣を得、この残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２／イソヘキサン１：１から１：０、次いでＣＨ２Ｃｌ２／ジエチルエーテル９：１から８：２）により部分的に精製し、次いで、ジエチルエーテルで粉砕し、表題化合物をオフホワイトの固体（４３ｇ）として得た。
【０１９３】
工程３：エチル２−［５−アセトアミド−３−フェニル−４−（２−フェニルエチニル）ピラゾール−１−イル］アセテート
【０１９４】
【化４２】
0006290910.tif 000045
【０１９５】
エチル２−（５−アセトアミド−４−ヨード−３−フェニル−ピラゾール−１−イル）アセテート（１８．６ｇ、４５ｍｍｏｌ）、フェニルアセチレン（９．２ｇ、９０ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（８６０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２００ｍＬ）およびＤＭＦ（７５ｍＬ）の混合物を通して窒素を１５分間泡立てた。ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリド（１．６ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を窒素下９０℃で４．５時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチルおよび水で希釈した。有機相を水およびブラインで洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２、次いでイソヘキサン／酢酸エチル１：１、続いてＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル９：１から８：２）により部分的に精製し、次いでジエチルエーテルで粉砕して、表題化合物を固体（１３ｇ）として得た。
【０１９６】
工程４：２−［５−アミノ−３−フェニル−４−（２−フェニルエチニル）ピラゾール−２−イル］酢酸ナトリウム
【０１９７】
【化４３】
0006290910.tif 000046
エチル２−［５−アセトアミド−３−フェニル−４−（２−フェニルエチニル）ピラゾール−１−イル］アセテート（１３ｇ、３４ｍｍｏｌ）、エタノール（１５０ｍＬ）および２５％ＮａＯＨ水溶液（１５０ｍＬ）の混合物を撹拌し、８０℃に８時間加熱し、室温に冷却した。冷却後、沈殿物が形成した。沈殿物をろ過し、酢酸エチル／水（１：１）の冷混合物で洗浄した。固体をジエチルエーテルでさらに粉砕し、ろ過し、乾燥させて、表題化合物９．８ｇを得た。
【０１９８】
工程５：２−（４−クロロ−３，５−ジフェニル−１Ｈピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）酢酸
【０１９９】
【化４４】
0006290910.tif 000047
亜硝酸ナトリウム（１．８６ｍｇ、２６．９ｍｍｏｌ）を濃ＨＣｌ（３０ｍＬ）に０℃で少しずつ添加し、１５分間撹拌した。２−［５−アミノ−３−フェニル−４−（２−フェニルエチニル）ピラゾール−１−イル］酢酸ナトリウム（３ｇ、８．８５ｍｍｏｌ）を固体として、少しずつ添加した。次いで、この懸濁液を室温で１６時間撹拌した。この反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水およびブラインで洗浄した。有機層を脱水し（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジエチルエーテル／ＣＨ２Ｃｌ２１：９）により精製し、表題化合物を固体（１．７ｇ）として得た。
【０２００】
工程６：イソブチル２−（４−クロロ−３，５−ジフェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）アセテート（化合物１２）
【０２０１】
【化４５】
0006290910.tif 000048
トリエチルアミン（５３５μＬ、３．８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中２−（４−クロロ−３，５−ジフェニル−１Ｈピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）酢酸（７００ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）に０℃で添加し、続いてイソブチルクロロホルメート（３４２ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を１時間撹拌した。次いで、水素化ホウ素ナトリウム（２２０ｍｇ、５．８ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、この反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を０．５Ｍ  ＨＣｌで希釈し、水層を酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機相を水およびブラインで洗浄し、脱水し（相分離器）、真空中で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／イソヘキサン０：１から１：０）により精製して、化合物１２を固体（５０ｍｇ）として得た。
【０２０２】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.８０-７.７３  (４  H,  m),  ７.５６-７.４８  (６  H,  m),  ５.６０  (２  H,  s),  ３.９９  (２  H,  d),  １.９７-１.９０  (１  H,  m),    ０.９０  (６  H,  d).
【０２０３】
ＬＣＭＳ（１０ｃｍ＿ＥＳＣＩ＿Ｂｉｃａｒｂ＿ＭｅＣＮ）Ｒｔ  ４．２４分；ｍ／ｚ  ４２１［Ｍ＋Ｈ］９８．８８％純度。
【０２０４】
実施例１７
４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−１−（２−ピロリジン−１−イルエチル）ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン
【０２０５】
【化４６】
0006290910.tif 000049
【０２０６】
工程７において２−クロロ−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノンの代わりに２−ピロリジン−１−イルエタノールを用いることを除いて、工程６を通して実施例１に従って、４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−１−（２−ピロリジン−１−イルエチル）ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジンを合成して、表題化合物を得た。
【０２０７】
実施例１８
４−クロロ−３，５−ジフェニル−１−（２−ピロリジン−１−イルエチル）ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン（化合物１３）
【０２０８】
【化４７】
0006290910.tif 000050
【０２０９】
実施例１、４−フルオロフェニルボロン酸の代わりにフェニルボロン酸を用いおよび２−（４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル）−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノンの代わりに４−クロロ−３−ヨード−５−フェニル−１−（２−ピロリジン−１−イルエチル）ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジンを用いる工程８に従って、化合物１３を合成した。
【０２１０】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.７９-７.７６  (４  H,  m),  ７.５５-７.４４  (６  H,  m),  ４.９７  (２  H,  t),  ３.２２  (２  H,  t),  ２.６８  (４  H,  bs),  １.８８-１.６５  (４  H,  m).
【０２１１】
ＬＣＭＳ（１０ｃｍ＿ギ酸＿ＡＣＥ３Ｃ１８ＡＲ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  ９．９８分；ｍ／ｚ  ４０４［Ｍ＋Ｈ］９５．９１％純度。
【０２１２】
実施例１９
２−［４−クロロ−３−（３−フルオロフェニル）−５−フェニル−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリダジン−１−イル］−１−［（３Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル］エタノン（化合物１４）
【０２１３】
【化４８】
0006290910.tif 000051
【０２１４】
実施例１、４−フルオロフェニルボロン酸の代わりに３−フルオロフェニルボロン酸を用いる工程８に従って、化合物１４を合成した。
【０２１５】
１H  NMR  δ  (ppm)(CHCl３-d):  ７.７６-７.７４  (２  H,  m),  ７.６１-７.５９  (１  H,  m),  ７.５６-７.４３  (５  H,  m),  ７.１８  (１  H,  m),  ５.６９-５.５４  (２  H,  m),  ５.３６  (１  H,  m),  ４.００-３.８４  (３  H,  m),  ３.６２  (１  H,  m),  ２.５０-２.００  (２  H,  m).
【０２１６】
ＬＣＭＳ（１０ｃｍ＿ギ酸＿ＡＳＣＥＮＴＩＳ＿ＨＰＬＣ＿ＣＨ３ＣＮ）Ｒｔ  １０．２５分；ｍ／ｚ  ４５４［Ｍ＋Ｈ］９６．１３％純度。
【０２１７】
実施例２０
Ｎ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１の発現を回復する本発明の化合物の活性を示すアッセイ法（２４時間インキュベーション）
Ｃｌａｒｉｎ−１は、アッシャーＩＩＩ症候群において変異した遺伝子によってコードされたタンパク質である（Ａｄａｔｏら、２００２年）。北米でＣｌａｒｉｎ−１において最もよく見られる変異はＮ４８Ｋであり、この変異は、グリコシル化の消失およびトラフィッキング障害を引き起こすことが報告されている（Ｔｉａｎら、２００９年）。結果として、Ｎ４８Ｋタンパク質は、原形質膜に到達せず、プロテアソームにより分解される。したがって、Ｎ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１の細胞表面へのトラフィッキングの回復は、アッシャーＩＩＩ症候群への介入の手段を与えると考えられている。
【０２１８】
Ｎ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１の発現を回復する本発明の化合物の有用性を実証する有用な細胞モデルは、ＨＥＫ２９３−Ｃｌａｒｉｎ−１  Ｎ４８Ｋ−ＨＡ  Ｄ９細胞系である（Ｔｉａｎら、２００９年）。典型的な実験において、３７℃、５％ＣＯ２で加湿インキュベータにおいて１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中１ウェル当たり２０，０００個の細胞の細胞密度でコラーゲン被覆９６−ウェルプレート上に、これらの細胞を播種した。インキュベーション一晩後、３７℃、５％ＣＯ２で加湿インキュベータにおいて１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地中に２４時間インキュベーションのために化合物を添加した。負対照として、ＤＭＳＯを０．２５％最終濃度で使用した。化合物を典型的には３通り方式で試験した。化合物と一緒にインキュベーション２４時間後、１０％緩衝ホルマリンの添加により細胞をウェルに固定して、最終濃度４％ホルマリンを得た。室温で固定２０分後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．０２リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）でウェルを３回洗浄した。
【０２１９】
ＨＡタグ付きＮ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中１：１０００の希釈でＨＡタグに対する抗体（ＨＡ．１１  Ｃｌｏｎｅ  １６Ｂ１２モノクローナル抗体、Ｃｏｖａｎｃｅ  ＃ＭＭＳ−１０１Ｐ）によって検出した。インキュベーション９０分後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳでウェルを３回洗浄し、このウェルに二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｃｙ３（１．５ｍｇ／ｍｌ）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩＲ  Ｅｕｒｏｐｅ＃１１５１６５００３）を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中１：２５０の希釈で４５分間添加した。その後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳでウェルを３回洗浄し、核に対する最終の染色を１：１０，０００の希釈でＤＡＰＩ（４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）の添加により行った。染色細胞の画像化は、ＩｎＣｅｌｌ  １０００Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行い、Ｎ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１に対してＣｙ３チャネルおよび核に対してＤＡＰＩチャネルを読み出した。特定のアルゴリズムを用いて画像を分析および定量化した。このアルゴリズムにより、ＤＡＰＩシグナルの追加の核セグメンテーションに基づいてそれぞれの細胞についてのＨＡ−Ｃｌａｒｉｎ−１染色が測定された（図１）。このアルゴリズムにより、細胞１個当たりの強度が測定され、したがって、細胞数の変化に対してあまり感度が高くない。ウェル１つ当たり、およそ２，０００個の細胞を測定して、細胞１個当たりの平均密度測定値を得た。
【０２２０】
実施例２１
Ｎ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１の発現を回復する本発明の化合物の活性を示すアッセイ法（２時間インキュベーション）
【０２２１】
Ｃｌａｒｉｎ−１は、アッシャーＩＩＩ症候群において変異した遺伝子によりコードされたタンパク質である（Ａｄａｔｏら、２００２年）。北米でＣｌａｒｉｎ−１において最もよく見られる変異はＮ４８Ｋであり、この変異は、グリコシル化の消失およびトラフィッキング障害を引き起こすことが報告されている（Ｔｉａｎら、２００９年）。結果として、Ｎ４８Ｋタンパク質は、原形質膜に到達せず、プロテアソームにより分解される。したがって、Ｎ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１の細胞表面へのトラフィッキングの回復は、アッシャーＩＩＩ症候群への介入の手段を与えると考えられている。
【０２２２】
Ｎ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１の発現を回復する本発明の化合物の有用性を実証する有用な細胞モデルは、ＨＥＫ２９３−Ｃｌａｒｉｎ−１  Ｎ４８Ｋ−ＨＡ  Ｄ９細胞系である（Ｔｉａｎら、２００９年）。典型的な実験において、３７℃、５％ＣＯ２で加湿インキュベータにおいて１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中１ウェル当たり２０，０００個の細胞の細胞密度でコラーゲン被覆９６−ウェルプレート上に、これらの細胞を播種した。インキュベーション一晩後、３７℃、５％ＣＯ２で加湿インキュベータにおいて１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地中に２時間インキュベーションのために化合物を添加した。負対照として、ＤＭＳＯを０．２５％最終濃度で使用した。化合物を典型的には３通り方式で試験した。化合物と一緒にインキュベーション２時間後、細胞を新鮮な培地中で２２時間インキュベートした。次いで、１０％緩衝ホルマリンの添加により細胞をウェルに固定して、最終濃度４％ホルマリンを得た。室温で固定２０分後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．０２リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）でウェルを３回洗浄した。
【０２２３】
ＨＡタグ付きＮ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中１：１０００の希釈でＨＡタグに対する抗体（ＨＡ．１１  Ｃｌｏｎｅ  １６Ｂ１２モノクローナル抗体、Ｃｏｖａｎｃｅ  ＃ＭＭＳ−１０１Ｐ）によって検出した。インキュベーション９０分後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳでウェルを３回洗浄し、このウェルに二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｃｙ３（１．５ｍｇ／ｍｌ）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩＲ  Ｅｕｒｏｐｅ＃１１５１６５００３）を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中１：２５０の希釈で４５分間添加した。その後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳでウェルを３回洗浄し、核に対する最終の染色を１：１０，０００の希釈でＤＡＰＩ（４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）の添加により行った。染色細胞の画像化は、ＩｎＣｅｌｌ  １０００Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行い、Ｎ４８Ｋ  Ｃｌａｒｉｎ−１に対してＣｙ３チャネルおよび核に対してＤＡＰＩチャネルを読み出した。特定のアルゴリズムを用いて画像を分析および定量化した。このアルゴリズムにより、ＤＡＰＩシグナルの追加の核セグメンテーションに基づいてそれぞれの細胞に対するＨＡ−Ｃｌａｒｉｎ−１染色が測定された（図１）。このアルゴリズムにより、細胞１個当たりの強度が測定され、したがって、細胞数の変化に対してあまり感度が高くない。ウェル１つ当たり、およそ２，０００個の細胞を測定して、細胞１個当たりの平均密度測定値を得た。
【０２２４】
実施例２２
本発明の化合物５−化合物１２についてのＩＣ５０値を、実施例２０のアッセイ法に従って得た。化合物５−化合物１２について得たＩＣ５０値は、２マイクロモル以下であった。
【０２２５】
化合物１−化合物４、化合物１１、化合物１３および化合物１４についてのＩＣ５０値は、実施例２１のアッセイ法に従って得た。化合物１−化合物４、化合物１１、化合物１３および化合物１４について得たＩＣ５０値は、１４マイクロモル以下であった。化合物１−化合物３、化合物１１、化合物１３および化合物１４について得たＩＣ５０値は、６マイクロモル以下であった。化合物２、化合物１１および化合物１３について得たＩＣ５０値は、４マイクロモル以下であった。化合物１３について得たＩＣ５０値は、１マイクロモル以下であった。
【０２２６】
実施例２０の方法に従ってアッセイした化合物１１について得たＩＣ５０値は、２マイクロモル未満であった。実施例２１の方法に従ってアッセイした化合物１１について得たＩＣ５０値は、３マイクロモル未満であった。
【０２２７】
本出願で開示されたそれぞれの参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
0006290910.tif 000054