(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質と、
複数のナノワイヤであって、前記複数のナノワイヤのそれぞれのナノワイヤが未結合端を有するように、前記基質の表面に付着されているかまたは一体化されているかの少なくとも一方である前記複数のナノワイヤと、
前記複数のナノワイヤのそれぞれの少なくとも前記未結合端に形成された温度応答性材料の層と、
前記複数のナノワイヤのそれぞれに形成された前記温度応答性材料の層の複数の部分に付着された少なくとも１つの型の細胞選択性結合分子と、
を備え、
前記温度応答性材料の層は、第１温度において捕捉され、第２温度において放出される複数の細胞の放出を促進するように、前記第１温度における縮小した構造および前記第２温度における伸長した構造を有する、複数の細胞型を含む流体サンプルから事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項２】
前記第１温度および前記第２温度は、どちらも、約１気圧における水の氷結温度よりも高く且つ水の沸騰温度よりも低い、請求項１に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項３】
前記第１温度および前記第２温度は、どちらも、捕捉され且つ放出された細胞の生存率を維持する温度範囲内にある、請求項１に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項４】
前記複数のナノワイヤのそれぞれは、５００ナノメートルよりも小さい平均直径を有する、請求項１に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項５】
前記複数のナノワイヤのそれぞれは、２５０ナノメートルよりも小さく且つ２０ナノメートルよりも大きい平均直径を有する、請求項１に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項６】
前記複数のナノワイヤのそれぞれは、２００ナノメートルから１００ナノメートルの包括的な範囲内にある平均直径を有する、請求項１に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項７】
前記少なくとも１つの型の細胞選択性結合分子は、ビオチンコンジュゲーションまたはストレプトアビジンコンジュゲーションの少なくとも一方によって、前記温度応答性材料の層に付着される、請求項１から６のいずれか１項に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項８】
前記細胞選択性結合分子は、前記複数の細胞型のうちのその他の複数の細胞型よりも優先的に、循環癌細胞（ＣＴＣｓ）に結合する、請求項１から６のいずれか１項に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項９】
前記細胞選択性結合分子は抗体を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１０】
前記抗体は、ＣＴＣｓを捕捉するためのＥｐＣＡＭ、ＣＡ１９−９、ＣＤ１４６、またはＣＤ１４７抗体の少なくとも１つを含む、請求項９に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１１】
前記細胞選択性結合分子は、前記複数の細胞型のうちのその他の複数の細胞型よりも優先的に、母体血からの胎児有核赤血球（ｆＮＲＢＣｓ）に結合する、請求項１から６のいずれか１項に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１２】
前記抗体は、母体血から胎児有核赤血球（ｆＮＲＢＣｓ）を捕捉するためのＣＤ７１またはＣＤ１４７抗体の少なくとも１つを含む、請求項９に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１３】
前記複数のナノワイヤのそれぞれの少なくとも前記未結合端に形成された前記温度応答性材料の層は、温度応答性ポリマーを含む、請求項１に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１４】
前記複数のナノワイヤのそれぞれの少なくとも前記未結合端に形成された前記温度応答性材料の層は、温度応答性ポリマーを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１５】
前記温度応答性ポリマーは、
【化１】
0006300799.tif 000019
【化２】
0006300799.tif 000020
【化３】
0006300799.tif 000021
【化４】
0006300799.tif 000022
【化５】
0006300799.tif 000023
【化６】
0006300799.tif 000024
で表される式（Ｉ）−（ＶＩ）のうちの１つのモノマーユニットを含み、式中、
Ｒ１は、任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルまたは任意で置換されたＣ３−Ｃ８シクロアルキルであり、
Ｒ２は、Ｈ、任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、または任意で置換されたＣ３−Ｃ８シクロアルキルであり、
あるいは、Ｒ１およびＲ２は、これらが付着されている１または複数の原子と一緒になって５−８員の任意で置換されたヘテロ環を形成し、前記ヘテロ環は、少なくとも１つのＮと、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される追加のヘテロ原子を任意で１から３個含み、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３'は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、または−ＣＯ２Ｒ４'であり、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ３アルキル、または、−（ＣＨ２ＣＨ（Ｒ４'）Ｏ）ｙ−Ｒ４'であり、
Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｘ−、または、−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｒ４'のそれぞれは、独立にＨ、または任意で置換されたＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ａは、単結合またはＯであり、
ｘは０から３までであり、
ｙは０から１０までである、請求項１３または請求項１４に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１６】
前記温度応答性ポリマーは、前記複数のナノワイヤのそれぞれの少なくとも前記未結合端に対し、共有結合によってグラフトされる、請求項１５に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１７】
前記温度応答性ポリマーは、式（ＶＩＩ）
【化７】
0006300799.tif 000025
で表されるモノマーユニットをさらに含み、式中、
Ｌ１は、任意で置換されたＣ１−Ｃ８アルキレンであり、
Ｒ５は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ６は、Ｈまたは
【化８】
0006300799.tif 000026
である、請求項１５または請求項１６に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１８】
前記温度応答性ポリマーは、式
【化９】
0006300799.tif 000027
を有するモノマーユニットを含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項１９】
前記温度応答性ポリマーは、式
【化９】
0006300799.tif 000028
を有する第１モノマーユニットと、細胞選択性結合分子をそこへ付着するのに適した第２モノマーユニットとを有するコポリマーである、請求項１８に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項２０】
細胞選択性結合分子をそこへ付着するのに適した前記第２モノマーユニットは、式
【化１０】
0006300799.tif 000029
を有する、請求項１９に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項２１】
前記細胞選択性結合分子は抗体を含む、請求項２０に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項２２】
前記抗体は抗−ＥｐＣＡＭである、請求項２１に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項２３】
前記コポリマーは、前記第１モノマーユニットおよび前記第２モノマーユニットを含み、前記第２モノマーユニットの割合は約０．１％から１０％である、請求項２０に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項２４】
前記コポリマーは、約４０００から２０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の分子量、および、約６ｎｍから３０ｎｍの範囲内の厚さを有する、請求項２３に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか１項に記載の温度応答性のナノ構造化された細胞捕捉装置を提供するステップと、
前記温度応答性のナノ構造化された細胞捕捉装置の細胞捕捉表面上にサンプルを堆積するステップと、
生存可能な捕捉された複数の細胞の除去を促進するために、前記温度応答性のナノ構造化された細胞捕捉装置の温度を変化させるステップと、
前記温度応答性のナノ構造化された細胞捕捉装置からの除去に続いて、捕捉された複数の細胞を収集するステップと、
を備える、複数の細胞型を含む流体サンプルから事前選択された複数の細胞型を捕捉する方法。
【請求項２６】
前記温度を前記変化させるステップの前に、細胞シートを成長させるために、捕捉された複数の細胞をインキュベートするステップをさらに備え、
前記温度を変化させるステップは、前記細胞シートの除去を促進する、請求項２５に記載の事前選択された複数の細胞型を捕捉する方法。
【請求項２７】
前記複数のナノワイヤ、前記温度応答性材料の層、前記温度応答性材料の層の複数の部分に付着された少なくとも１つの型の細胞選択性結合分子の組み合わせは、少なくとも７０％の細胞捕捉収率を提供する、
請求項１に記載の複数の細胞型を捕捉する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
この出願は、２０１２年７月３１日に出願された米国特許仮出願第６１／６７７，８２５号からの優先権を主張し、その全内容は、参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、National Institutes of Healthから認可された認可番号Ｒ２１ＣＡ１５１１５９およびＲ３３ＣＡ１５７３９６の政府支援の下に成された。米国政府は、本発明に対して所定の権利を有する。
【０００３】
現在請求されている本発明の複数の実施形態の分野は、循環細胞の選択的捕捉および刺激された放出のための複数の装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
循環腫瘍細胞［１］（ＣＴＣｓ）は、原発腫瘍または転移部のどちらかから発せられた癌細胞であり、転移癌の細胞起源として末梢血中を循環する［２］。癌の診断に対する現在の最も信頼できる基準は、侵襲性の生体調査、および、それに続く生体調査サンプルの組織病理学的分析を必要とする。しかしながら、転移または再発の初期段階においては、組織収集生体調査にとって、転移／再発部を特定することは困難である。従ってＣＴＣｓは、致命的な転移が生じる前に、腫瘍細胞に対する簡便なアクセスを提供する、腫瘍の"液体生検"とみなされることができる。疾患の進行を伝え、治療の実施を導くことができるような新たな癌の"バイオマーカ"としてＣＴＣｓを活用するために、癌患者の血中にてＣＴＣｓを検出することおよび計数することの可能な診断試験を開発することに対し、相当な研究努力［３］が注がれてきた。主な技術的挑戦は、血液サンプル中の数多く（１０９細胞／ｍＬ）の血液学的細胞［４］のうちの、極めて少量（数個から数１００個の細胞／ｍＬ）のＣＴＣｓを効率的且つ特異的に捕捉することである。様々な作用メカニズムに基づいて、過去数十年にわたって、多様なＣＴＣ試験が生み出されてきた。例えば、免疫磁気分離手法［５］は、ＣＴＣｓを捕捉するためのＣＴＣ特異的捕捉剤（例えば抗体またはアプタマー）で覆われた磁気ビーズを利用する。免疫磁気分離に基づくCellSearch（登録商標）試験は、転移性の乳癌、前立腺癌、および大腸癌の予測的結果を予測することのできる、ＦＤＡの認可を得た唯一のＣＴＣ計数方法である。最近、CellSearch（登録商標）試験が直面する低ＣＴＣ捕捉効率の懸念に対処するために、マイクロチップをベースとするいくつかの技術［６］が開発されてきた。現段階では、ますます多くの新たなＣＴＣ試験が、癌患者におけるＣＴＣ計数に対するその大きな感度を立証してきた。計数を超えてＣＴＣｓの診断価値をさらに活用するために、現在の研究事業は、ＣＴＣｓの分子解析および機能解析を確立することに専念されている。ＣＴＣ導出された分子署名および機能的読出しは、治療的介入が重大な差異を生じ得るであろう臨界期の間の腫瘍生物学において、貴重な見識を与えるであろうことが想像できる。ＣＴＣｓの分子解析および機能解析に向けた道を開くため、高効率でＣＴＣｓを捕捉することができるだけでなく、周囲の白血球（ＷＢＣｓ）の汚染を最小限にし、ＣＴＣｓの生存率および機能に対する崩壊が無視できる程度でＣＴＣｓの放出もできるような、新たなＣＴＣ分析を開発することが、心底必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一実施形態に従うと、複数の細胞型を含む流体サンプルから事前選択された複数の細胞型を捕捉する装置は、基質と、複数のナノワイヤのそれぞれのナノワイヤが未結合端を有するように、上記基質の表面に付着されているかまたは一体化されているかの少なくとも一方である上記複数のナノワイヤと、上記複数のナノワイヤのそれぞれの少なくとも上記未結合端に形成された温度応答性材料の層と、を含む。上記温度応答性材料の層は、第１温度における縮小した構造および第２温度における伸長した構造を有し、上記第２温度において放出されるべきであって上記第１温度において捕捉された複数の細胞の放出を促進するようになっている。
【０００６】
本発明の一実施形態に従うと、複数の細胞型を含む流体サンプルから事前選択された複数の細胞型を捕捉する方法は、温度応答性のナノ構造化された細胞捕捉装置を提供することと、温度応答性のナノ構造化された細胞捕捉装置の細胞捕捉表面上にサンプルを堆積することと、生存している捕捉された細胞の除去を促進するために、温度応答性のナノ構造化された細胞捕捉装置の温度を変化させることと、温度応答性のナノ構造化された細胞捕捉装置からの除去に続いて、捕捉された細胞を収集することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
さらなる複数の目的および利点は、記載、図面、および実施例を考慮することにより明らかになるであろう。
【０００８】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に従った、複数の細胞型を含む流体サンプルから、事前選択された複数の細胞型を捕捉するための装置の略図を与える。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態に従った、複数の細胞型を含む流体サンプルから、事前選択された複数の細胞型を捕捉するための装置の略図を与える。
【０００９】
【図２】本発明の一実施形態に従った、流体チップに組み込まれた図１Ａおよび１Ｂの装置の一例を示す。この実施形態においては、細胞−基質接触頻度を促進する蛇行したカオス混合チャネルを有する、重ねられたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チップが含まれる。ＣＴＣ捕捉のために、装置は３７℃に設定される。続いて、ＣＴＣｓを含む血液サンプルが装置を通って流れ、チャネル天盤のヘリンボーン微細パターンが、微細チャネル中の垂直な流れを誘起する。その結果として、ＣＴＣｓとナノベルクロ（NanoVelcro）基質との間の接触頻度が増大し、高められたＣＴＣ捕捉効率をもたらす。ナノ構造化された基質にＣＴＣｓがひとたび捕捉されると（固定されると）、装置は４℃に設定されることができ、基質からのＣＴＣｓの特異的な放出をもたらす。
【００１０】
【図３】本発明のいくつかの実施形態のいくつかの概念を説明するのに役立つ模式図である。この例におけるナノベルクロＣＴＣ試験（NanoVelcro CTC assay）に対して熱応答性を与えるために、ビオチン官能基化されたポリマーブラシ（すなわちＰＩＰＡＡｍ）が、シリコンナノワイヤ基質（ＳｉＮＷＳ）上に共有結合によってグラフトされて（grafted）いる。３７℃においては、ビオチン化されたＰＩＰＡＡｍのビオチン基および疎水性ドメインが、ビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳの表面に存在する。ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって、ビオチン化された抗−ＥｐＣＡＭがビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳ上に導入されることができ、高い効率のＣＴＣ捕捉を可能にする。４℃まで温度が冷却されると、表面グラフトされたビオチン化されたＰＩＰＡＡｍの骨格が伸長し、基質からのＣＴＣの放出に至る。
【００１１】
図４Ａ−４Ｃは以下を示す。
【図４Ａ】ビオチン化されたＰＩＰＡＡｍをＳｉＮＷＳ上に共有結合によってグラフトするために使用される合成手法。２つのモノマー性前駆体の比率を変化させることにより、３つの異なる密度（２．５、５、および１０％）のビオチン基が、生じたビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳ上に組み込まれた。
【図４Ｂ】３つのビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳの熱応答性を調査するために、接触角が使用された。
【図４Ｃ】ビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳ上に抗−ＥｐＣＡＭを導入した後には、どのような温度が適用されたとしても、表面は親水性になる。
【００１２】
図５Ａ−５Ｄは、本発明の一実施形態を、代替的な構造と比較したデータを与える。
【図５Ａ】異なる密度（２．５、５、および１０％）のビオチン基を有する３つのビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳの細胞捕捉／放出性能の定量的評価である。
【図５Ｂ】繰り返される抗−ＥｐＣＡＭコンジュゲーション（conjugation）有り／無しの場合の、複数回の／順次の連続調査における、１０％ビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳの細胞捕捉／放出性能である。
【図５Ｃ】３つの対照サンプルを使用して、細胞捕捉／放出調査が実施された。（ｉ）ＰＩＰＡＡｍ−ＳｉＮＷＳ、（ｉｉ）抗−ＥｐＣＡＭコートされたＳｉＮＷＳ、および（ｉｉｉ）平坦なＳｉチップ上の抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐが、１０％ビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳと並行して調査された。
【図５Ｄ】３つのＥｐＣＡＭ陽性癌細胞株（すなわちＭＣＦ７、ＬｎＣＡＰ、およびＰＣ３癌細胞株）、２つのＥｐＣＡＭ陰性癌細胞株（すなわちＨｅＬａおよびＪｕｒｋａｔ細胞株）、および新たに単離されたヒト白血球を使用した１０％ビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳの一般的適用可能性および特異性の定量的評価である。
【００１３】
図６Ａ−６Ｄは以下のデータを与える。
【図６Ａ】３つの異なるタイプのサンプルにおける、１０−１０００細胞ｍＬ−１の範囲にわたる異なる細胞数における細胞捕捉効率である。ＤＭＥＭ媒体（□）および全血（△）である。
【図６Ｂ】抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳ（白抜きの棒グラフ）およびＳｉＮＷＳ（黒の棒グラフ）を使用したＭＣＦ７細胞捕捉／放出調査に対して観測された、細胞放出性能および放出された細胞の生存率である。
【図６Ｃ】抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳから捕捉および放出された後に、ＤｉＯ着色されたＭＣＦ７細胞が成功裏に培養された。
【００１４】
図７Ａ−７Ｄは以下のデータを与える。
【図７Ａ】本発明の一実施形態に従った熱応答性のナノベルクロＣＴＣチップの、流量０．１、０．２、０．５、１、２、および５ｍＬｈ−１における細胞捕捉効率である。
【図７Ｂ】熱応答性のナノベルクロチップ上に捕捉された細胞の分布がＰＢＳ中で評価された。ＣＴＣｓの大部分（７８％）が最初の４つのチャネルに捕捉されている。
【図７Ｃ】３つの異なる肺癌細胞株（すなわち、ＥｐＣＡＭを発現するＡ５４９、ＨＣＣ８２７、およびＨ２２２８）、並びに、対照細胞（ＥｐＣＡＭを発現しないＪｕｒｋａｔ、Ｈｅｌａ、およびＷＢＣ）の、３７℃および４℃の両方におけるＰＢＳ中の捕捉効率である。エラーバーは全て標準偏差（ｎ≧３）を示す。
【図７Ｄ】１０−１０００細胞ｍＬ−１の範囲にわたる異なるスパイク細胞数における捕捉効率である。
【００１５】
図８Ａ−８Ｃは以下のデータを与える。
【図８Ａ】流量および溶出時間の関数としてのＣＴＣ放出性能である。これらのデータから、本発明の一実施形態に従って、最適な条件（流量０．１ｍＬ／ｈ、および溶出時間２０分）が決定される。
【図８Ｂ】３７℃と４℃との間で、それぞれ加熱と冷却とを複数回サイクル実行することにより、細胞放出性能が高められる。４−５サイクルの加熱および冷却後に、優れた細胞放出性能が達成される。本発明の一実施形態に従った次世代の熱応答性ナノベルクロＣＴＣチップにおいて、約２００のＣＴＣｓを捕捉することによってこの実験データが得られたことに言及しておく。所与の加熱／冷却サイクル後に、次世代の熱応答性ナノベルクロＣＴＣチップから流れ出る溶出液中のＣＴＣｓが収集され、カウントされた。
【図８Ｃ】加熱／冷却サイクルの関数としてのＣＴＣ純度および生存率である。複数回の加熱／冷却サイクルはＣＴＣ放出性能を支援するが、細胞生存率および純度は幾分か損なわれる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態が以下に詳細に議論される。複数の実施形態を説明することにおいて、明瞭性のために、特定の用語が使用されている。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図されるものではない。関連分野の当業者であれば、本発明の広い概念から逸脱することなく、他の等価な構成要素が使用されることができ、他の方法が開発されることができることを理解するであろう。背景技術および発明を実施するための形態のセクションを含む本明細書中のどこかにおいて引用される全ての参照文献は、あたかもそれぞれ個別に組み込まれていたかのように、参照により組み込まれる。
【００１７】
"温度応答性材料"または"熱応答性材料"、または"熱応答性の材料"は、温度の変化に対する応答を示す任意の材料であり、例えば、温度が変化するに連れて、その材料の１または複数の特性が変化する。温度応答性材料は、一般的に、１または複数の特性において、相当且つ不連続の変化を受ける。特性の変化は、臨界温度においてまたはその付近で生じることができる。相当且つ不連続の変化を受ける特性は、溶解性であることができる。溶解性に関連する他の複数の特性も、相当且つ不連続の変化を受けることができる。
【００１８】
温度応答性材料は、温度応答性ポリマーを含むことができる。温度応答性材料の温度応答性の挙動は、温度応答性ポリマーの温度応答性の挙動によって与えられることができる。
【００１９】
"温度応答性ポリマー"または"熱応答性ポリマー"または"熱応答性のポリマー"は、温度の変化に応じて、１または複数の特性において相当な変化を受けるポリマーである。そのような特性の１つは、例えば水または水溶液のような、特定の溶媒中での溶解性であることができる。溶解性の変化は、ポリマー分子内およびポリマー分子間の分子内および分子間相互作用における変化に関連することができる。例えば、いくつかの条件下では（ポリマーの特性、溶媒の特性、ポリマー濃度、および温度を含む複数の因子に応じて）、複数のポリマー分子にとって自己会合することがエネルギー的に好ましい場合がある。その他の条件下では、溶媒との相互作用がエネルギー的に好ましいであろう。"温度応答性ポリマー"は、熱応答性ポリマーブラシを含む。"ポリマーブラシ"とは、表面に付着されたまたはグラフトされたポリマー、例えば、ポリマー鎖の一端が表面に付着されている（例えば、共有結合によってグラフトされている）線型ポリマーを指す。
【００２０】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）および／または下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）に関連して特徴付けられることができる。所与の溶媒中において温度応答性ポリマーは、温度がＬＣＳＴよりは高いがＵＣＳＴよりは低い場合に、全ての濃度でその溶媒と混和できる。
【００２１】
ＬＣＳＴに関して言えば、溶液の温度が相分離温度を越えて上昇されると、ポリマーの疎水性の骨格およびその他の非極性の基が会合する傾向にある。これは、個々のポリマー鎖の崩壊およびポリマーの沈殿に至る分子内および分子間の凝集を引き起こす。
【００２２】
従って、いくつかの実施形態においては、温度感受性の材料が、温度の変化に応じて、溶媒混和性における変化を受けることができる。例えば、ポリマー分子間において、ポリマー分子内およびポリマー分子間での分子内および分子間相互作用を低減するには伸張した立体配座をより好み、ポリマー分子内およびポリマー分子間での分子内および分子間相互作用を促進するには縮小した立体配座をより好む、コイル−グロビュール転移のようなポリマー立体配座の変化に、溶媒混和性における変化が関連付けられる。
【００２３】
単体で、または、より大きい部分（すなわち、"アルコキシ"、"ヒドロキシアルキル"、"アルコキシアルキル"、および"アルコキシカルボニル"）の一部分として使用される"アルキル"という用語は、１から１０個の炭素原子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子）を含む直鎖および分岐鎖の両者、並びに、シクロプロピルおよびシクロブチルのような環状構造を含む。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒ）（ｎ−プロピル（ｎＰｒまたはｎ−Ｐｒ）、イソプロピル（ｉＰｒまたはｉ−Ｐｒ）、およびシクロプロピル（ｃＰｒまたはｃ−Ｐｒ）を含む）、ブチル（Ｂｕ）（ｎ−ブチル（ｎＢｕまたはｎ−Ｂｕ）、イソブチル（ｉＢｕまたはｉ−Ｂｕ）、tert-ブチル（ｔＢｕまたはｔ−Ｂｕ）、およびシクロブチル（ｃＢｕまたはｃ−Ｂｕ）を含む）、ペンチル（Ｐｅ）（ｎ−ペンチルを含む）、等を含む。アルキル基はまた、炭素原子の総数を越えない限りにおいて、シクロペンチルメチル、シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル等のような、環状のアルキル基と直線型のアルキル基とが混合されたものも含む。"アルキル"という用語はまた、任意で置換された構造も指す。
【００２４】
"ヘテロ環"、"ヘテロシクリル"、または"ヘテロ環状"という用語は、そうでないと示されない限り、５から１４員環、好ましくは５から１０員環を有し、その中で１または複数、好ましくは１から４個の環状炭素がそれぞれＮ、Ｏ、またはＳのようなヘテロ原子によって置換された非芳香族環系を含む。ヘテロ環状環の例としては、３−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−オン、（１−置換された）−２−オキソ−ベンゾイミダゾール−３−イル、２−テトラヒドロフラニル、３−テトラヒドロフラニル、２−テトラヒドロピラニル、３−テトラヒドロピラニル、４−テトラヒドロピラニル、［１，３］−ジオキサラニル、［１，３］−ジチオラニル、［１，３］−ジオキサニル、２−テトラヒドロチオフェニル、３−テトラヒドロチオフェニル、２−モルホリニル、３−モルホリニル、４−モルホリニル、２−チオモルホリニル、３−チオモルホリニル、４−チオモルホリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、４−チアゾリジニル、ジアゾロニル、Ｎ−置換されたジアゾロニル、１−フタルイミジニル、ベンゾオキサニル、ベンゾピロリジニル、ベンゾピペリジニル、ベンゾオキソラニル、ベンゾチオラニル、および、ベンゾチアニルを含む。また、本明細書中にて用いられる"ヘテロシクリル"または"ヘテロ環状"という用語の範囲内に含まれるものは、インドリニル、クロマニル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロキノリニルにおけるような、非芳香族ヘテロ原子含有環が、１または複数の芳香族または非芳香族環に結合されている基である。ここでは、ラジカルまたは付着点が非芳香族ヘテロ原子含有環上にある。"ヘテロ環"、"ヘテロシクリル"、または"ヘテロ環状"という用語は、飽和であろうと部分的に不飽和であろうと、任意で置換された環も指す。"ヘテロシクリルアルキル"という用語は、ヘテロシクリルによって置換されたアルキル基を指す。
【００２５】
"置換された"という用語は、水素原子が置換基によって置換されている化学構造を指す。"置換基"とは、置換された構造上の水素原子を置換する化学構造である。"置換基"という用語は、置換された構造よりも置換基が小さいことを示唆するものではない。"置換基"は、これらに限定されるものではないが、ハロゲン、アルキル、アルケニル、ニトロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルオキシ、ジアルキルアミノカルボニルオキシ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリール、ヘテロアリール、および、ヘテロサイクルのような基を含む。
【００２６】
ＣＴＣの改良に対する従来の手法とは対照的に、本発明者達は、以前に、ナノベルクロ細胞親和性試験（NanoVelcro cell-affinity assay）を提供した。これにより、抗−ＥｐＣＡＭ［７］（上皮細胞接着分子）がコートされたナノ構造化された基質（例えば、垂直に方向付けられたシリコンナノワイヤ基質、ＳｉＮＷＳ）が、固定式装置設定［８］中において４０から７０％の範囲の捕捉効率でＣＴＣｓを捕捉するために利用された。（例えば、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、"Device for Capturing Circulating Tumor Cells"という米国特許出願公開第２０１２／０００３７１１Ａ１号明細書を参照のこと。）我々のナノベルクロＣＴＣ試験の新規な特徴は、ナノ構造化された基質の使用である。ＳｉＮＷＳとナノスケールの細胞表面成分（例えば、微絨毛）との間での高められた局所的トポグラフィー相互作用［９］は、ナノスケールのベルクロの動作原理と類似している。その結果、非構造化された（つまり、平坦な）基質に対して観測されたものと比べて、大きく改善された細胞捕捉親和性をもたらす。ナノベルクロの概念の一般的な適用可能性は、ｉ）その他の型のナノ構造化された基質、例えば、電気化学的に堆積され、コンジュゲートされたポリマーナノ機構［１０］、および、水平方向に詰められた超長ＴｉＯ２ナノファイバ［１１］もまた、捕捉剤と協同して、高められたＣＴＣ捕捉性能を達成するための相乗効果を示すことを我々が立証した我々の最近の研究、および、ｉｉ）免疫細胞の亜集団を分類するために、免疫細胞特異的捕捉剤コートされたＳｉＮＷＳが利用された他者の研究［１２］、によって支持されている。（２０１３年５月２９日に出願された、"Systems, Methods and Components for Isolating Cells from a Fluid Sample"という国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／４３１７１号も参照のこと。これは、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。）ナノベルクロ細胞親和性試験は、高められた細胞捕捉性能を示したが、（酵素による処置によって）固定化された細胞を、捕捉剤コートされた基質から放出することは困難なことが判明した。いくつかの実施例においては、わずか１０％の生存細胞が放出され、乏しい細胞生存率が観測された。
【００２７】
従って、本発明のいくつかの実施形態は、高効率でＣＴＣｓを捕捉することが可能なだけでなく、ナノ基質固定されたＣＴＣｓをより低い温度で放出することもできるような、以前のナノベルクロ細胞親和性試験に対する改良を提供することができる。しかしながら、本発明の一般的な概念は、この実施形態のみに限定されるものではない。
【００２８】
図１Ａおよび１Ｂは、本発明のいくつかの概念を説明するのに役立つ模式図である。図１Ａおよび１Ｂは、本出願の一実施形態に従った、複数の細胞型を含む流体サンプルから、事前選択された複数の細胞型を捕捉するための装置１００の模式図を与える。装置１００は、基質１０２と、複数のナノワイヤ１０４（例えば、そのうちの１つが１０６とラベルされている）とを含む。複数のナノワイヤ１０４は、複数のナノワイヤ１０４のそれぞれのナノワイヤ（例えば１０６）が未結合端１１０を有するように、基質１０２の表面１０８に付着されているかまたは一体化されているかの少なくとも一方である。装置１００はまた、複数のナノワイヤ１０４のそれぞれの少なくとも未結合端に形成された温度応答性材料の層１１２も含む。第１温度において捕捉され第２温度において放出される複数の細胞１１４の放出を促進するように、温度応答性材料の層１１２は、第１温度においては縮小した構造を有し（図１Ａ）、第２温度においては伸長した構造を有する（図１Ｂ）。
【００２９】
ナノワイヤという用語は、２つの直交する横方向の大きさよりも、縦方向の大きさの方が大きいナノ構造を含むことが意図されている。２つの横方向の大きさは、両方とも１μｍよりも小さい。縦方向の大きさは、いくつかの実施形態においては１μｍよりも小さくてよい。あるいは、いくつかの実施形態においては１μｍよりも大きくてよい。ナノワイヤという用語は、いくつかの実施形態においては、ナノファイバまたはナノピラーを含むことができるような広い定義を有することが意図されている。いくつかの実施形態においては、ナノワイヤ１１２は、図１Ａおよび１Ｂ中に図示されるように、垂直に方向付けられることができる。しかしながら、本発明の一般的概念は、この例のみに限定されるものではない。いくつかの実施形態においてナノワイヤ１１２は、これらに限定されるものではないが、光リソグラフィによる露光とエッチング、および／または、エピタキシャル成長技術のような半導体プロセス技術によって製造されることができる。いくつかの実施形態においては、基質および／または複数のナノワイヤは、これに限定されるものではないが、シリコンのような半導体であることができる。いくつかの実施形態においては、複数のナノワイヤは、これらに限定されるものではないが、例えばＳｉＯ２またはＴｉＯ２のような酸化物であることができる。いくつかの実施形態において複数のナノワイヤは、熱可塑性材料、または、同様な機械的特性を持つその他の材料であることができる。
【００３０】
図１Ａおよび１Ｂは、複数のナノワイヤ１０４のそれぞれの未結合端に形成された温度応答性材料の層１１２の一例を図示するものである。しかしながらこれは、いくつかの温度応答性材料が複数のナノワイヤの側面に、および／または、表面１０８に付着される複数の実施形態を排除するものではない。さらに、温度応答性材料の層１１２は、それぞれ互いから離れていることができるし、あるいは、幾分かの重なりがあってもよいだろう。いくつかの実施形態において温度応答性材料の層１１２は、複数のナノワイヤのトポロジー的な構造が、複数の細胞の捕捉におけるその役割を果たすことができるように、隣接する複数の層から実質的に離れている。
【００３１】
いくつかの実施形態においては、第１温度および第２温度はどちらも、約１気圧における水の氷結温度よりは高く、且つ、水の沸騰温度よりは低い。いくつかの実施形態においては、第１温度および第２温度はどちらも、捕捉され放出された細胞の生存率を維持するための温度の範囲内にある。
【００３２】
いくつかの実施形態においては、複数のナノワイヤ１０４のそれぞれは、５００ナノメートルよりも小さい平均直径を有する。複数のナノワイヤはおおよそ円形の断面形状を有するように図示されているが、複数のナノワイヤ１０４は、そのような構造のみに限定されるものではない。しかしながら、ある特定のナノワイヤの断面形状によらず、それは有効直径を有するものとみなすことができる。例えば、複数のナノワイヤのうちの任意のものの断面積は、有効直径を画定するための円の面積と同じと考えられる。しかしながら、本発明の広い概念は、この例に限定されるものではない。さらに、複数のナノワイヤ１０４は、実質的に均一であることができる。あるいは、製造公差および／または熟考された設計のどちらかによって変動することができる。同様に、複数のナノワイヤ１０４は、複数のナノワイヤ１０４を特徴付けるための、平均直径または平均有効直径を有するものと考えることができる。従って、いくつかの実施形態においては、そのような平均直径は５００ナノメートルよりも小さくてよい。いくつかの実施形態においては、平均直径は、２５０ナノメートルよりは小さく、２０ナノメートルよりは大きくてよい。いくつかの実施形態においては、平均直径は、２００ナノメートルから１００ナノメートルまでの包括的な範囲内にあることができる。
【００３３】
いくつかの実施形態において装置１００は、複数のナノワイヤのそれぞれに形成された温度応答性材料の層の複数の部分に付着された、少なくとも１つの型の細胞選択性結合分子をさらに含むことができる。いくつかの実施形態においては、該少なくとも１つの型の細胞選択性結合分子が、ビオチンコンジュゲーションまたはストレプトアビジンコンジュゲーションの少なくとも一方により、温度応答性材料の層に対して付着されることができる。
【００３４】
いくつかの実施形態において細胞選択性結合分子は、複数の細胞型のうちのその他複数の細胞型よりも、優先的に循環癌細胞（ＣＴＣｓ）に結合する。細胞選択性結合分子は、ＣＴＣ捕捉に対する抗体を含むことができる。例えば、抗体ＣＴＣ捕捉は、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１９−９、ＣＤ１４６、またはＣＤ１４７抗体のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【００３５】
いくつかの実施形態において細胞選択性結合分子は、複数の細胞型のうちのその他複数の細胞型よりも、優先的に母体血からの胎児有核赤血球（ｆＮＲＢＣｓ）に結合する。この場合、細胞選択性結合分子は、母体血からの胎児有核赤血球（ｆＮＲＢＣｓ）の捕捉に対するＣＤ７１またはＣＤ１４７抗体のうち少なくとも一方を含むことができる。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、複数のナノワイヤのそれぞれの未結合端に少なくとも形成された温度応答性材料の層は、温度応答性ポリマーを含むことができる。いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、下記式（Ｉ）−（ＶＩ）のうちの１つのモノマーユニットを含むことができる。
【化１】
0006300799.tif 000002
【化２】
0006300799.tif 000003
【化３】
0006300799.tif 000004
【化４】
0006300799.tif 000005
【化５】
0006300799.tif 000006
【化６】
0006300799.tif 000007
式（Ｉ）−（ＶＩ）においては、Ｒ１は、任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルまたは任意で置換されたＣ３−Ｃ８シクロアルキルであることができる。Ｒ２は、Ｈ、任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルまたは任意で置換されたＣ３−Ｃ８シクロアルキルであることができる。あるいは、いくつかの実施形態においては、それらが付着されている原子と一緒になってＲ１およびＲ２が、５−８員の任意で置換されたヘテロ環を形成することができる。ここでヘテロ環は、少なくとも１つのＮと、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される追加のヘテロ原子を任意で１から３個含む。
【００３７】
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルであることができる。Ｒ３'は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、または−ＣＯ２Ｒ４'であることができる。Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ３アルキル、または、−（ＣＨ２ＣＨ（Ｒ４'）Ｏ）ｙ−Ｒ４'であることができる。Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｘ−、または、−Ｃ（＝Ｏ）−であることができる。Ｒ４'は、それぞれ独立にＨまたは任意で置換されたＣ１−Ｃ３アルキルであることができる。ｘは０から３であることができ、ｙは０から１０であることができる。
【００３８】
温度応答性ポリマーは、複数のナノワイヤのそれぞれの少なくとも未結合端に対して、共有結合によってグラフトされることができる。温度応答性ポリマーは、細胞選択性結合分子をそこへ付着するのに適したモノマーユニットを含むことができる。
【００３９】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、式（Ｖ）、または式（ＶＩ）のモノマーユニットのホモポリマーであることができる。いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、コポリマーであることができる。コポリマーは、２またはそれよりも多くの異なるモノマーユニットを含むことができる。例えば、コポリマーは、異なる構造を有する２またはそれよりも多くのモノマーユニットを含むことができる。この場合、該２またはそれよりも多くのモノマーユニットは、式（Ｉ）のそれぞれ、式（ＩＩ）のそれぞれ、式（ＩＩＩ）のそれぞれ、式（ＩＶ）のそれぞれ、式（Ｖ）のそれぞれ、または、式（ＶＩ）のそれぞれである。いくつかの実施形態においてコポリマーは、式（Ｉ）−（ＶＩ）のうちの１または複数から選択された、異なる複数の構造を有する、２またはそれよりも多くのモノマーユニットを含む。いくつかの実施形態においてコポリマーは、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、式（Ｖ）、または式（ＶＩ）のモノマーユニットを少なくとも１つと、例えば以下に記載される式（ＶＩＩ）のような異なる構造を有するモノマーユニットの少なくとも１つと、を含むことができる。
【００４０】
式（Ｉ）−（ＶＩ）の複数のモノマーユニットを含むいくつかの温度応答性ポリマーが、例えば、その内容全体が参照により組み込まれるAseyev, V., et al., Adv. Polym. Sci. 2011, 242, 29-89に記載されている。
【００４１】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式（Ｉ）のモノマーユニットを含む。
【化１】
0006300799.tif 000008
いくつかの実施形態においては、Ｒ１は任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであることができ、Ｒ２は任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであることができる。いくつかの場合、Ｒ１は置換されていないＣ１−Ｃ６アルキルであることができ、および／または、Ｒ２は置換されていないＣ１−Ｃ６アルキルであることができる。いくつかの場合、Ｒ３はＨまたはＣＨ３であることができる。
【００４２】
いくつかの実施形態においては、それらが付着されている原子と一緒になってＲ１およびＲ２が、５−８員の任意で置換されたヘテロ環を形成することができる。ここでヘテロ環は、少なくとも１つのＮと、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される追加のヘテロ原子を任意で１から３個含む。いくつかの実施形態においては、ヘテロ環は、１または複数のＯＨおよび−ＣＯ２−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）によって置換されることができる。
【００４３】
式（Ｉ）のポリマーの複数の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）類、Ｎ−一置換およびＮ−二置換されたポリ（アクリルアミド）類、および、Ｎ−一置換およびＮ−二置換されたポリ（メタクリルアミド）類を含む。いくつかの例は、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）（ＰＥＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−エチルメタクリルアミド）（ＰＥＭＡＡｍ）、ポリ（Ｎ，Ｎ'−エチルメチルアクリルアミド）（ＰＥＭＡＡｍ）、ポリ（Ｎ，Ｎ'−ジエチルアクリルアミド）（ＰＤＥＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド）（ＰｎＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド）（ＰｎＰＭＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰｉＰＡＡｍまたはＰＮＩＰＡＭ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）（ＰｉＰＭＡＡｍまたはＰＮＩＰＭＡｍ）、ポリ（Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド）（ＰｃＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−（Ｌ）−（１−ヒドロキシメチル）プロピルメタクリルアミド）（Ｐ（Ｌ−ＨＭＰＭＡＡｍ））、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリジン）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピペリジン）（ＰＡＯＰｉｐ）、ポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリンメチル）（ＰＡＰｒｏＭＥｓ）、ポリ（Ｎ−アクリロイル−４−trans−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンメチル）（ＰＡＨＰｒｏＭＥｓ）、ポリ（Ｎ−メチルアクリルアミド）（ＰＭＡＡｍ）、ポリ（Ｎ，Ｎ'−ジメチルアクリルアミド）（ＰＤＭＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−アクリリルグリシンアミド）、および、ポリ（Ｎ−メタクリリルグリシンアミド）を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式（ＩＩ）のモノマーユニットを含む。
【化２】
0006300799.tif 000009
いくつかの実施形態においては、Ｒ１は任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであることができ、Ｒ２は任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであることができる。いくつかの場合、Ｒ１は置換されていないＣ１−Ｃ６アルキルであることができ、および／または、Ｒ２は置換されていないＣ１−Ｃ６アルキルであることができる。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、それらが付着されている原子と一緒になってＲ１およびＲ２が、５−８員の任意で置換されたヘテロ環を形成することができる。ここでヘテロ環は、少なくとも１つのＮと、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される追加のヘテロ原子を任意で１から３個含む。いくつかの実施形態においては、Ｒ１およびＲ２は共に、任意で置換されたＣ２−Ｃ７アルキレンまたはオキシアルキレン鎖である。
【００４６】
いくつかの実施形態においては、Ｒ１は任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであることができ、Ｒ２はＨであることができる。いくつかの場合、Ｒ１は置換されていないＣ１−Ｃ６アルキルであることができ、Ｒ２はＨであることができる。Ｒ３'は−ＣＯ２Ｒ４'であることができる。ここで、Ｒ４'は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルであることができる。いくつかの実施形態においては、Ｒ１は置換されていないＣ１−Ｃ６アルキルであることができ、Ｒ２はＨであることができ、Ｒ３'は−ＣＯ２Ｒ４'であることができる。ここでＲ４'は、Ｃ１−Ｃ３アルキルであることができる。
【００４７】
式（ＩＩ）のポリマーの複数の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリ（Ｎ−ビニルアミド）類、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）（ＰＶＣＬ）、ポリ（Ｎ−ビニルプロピルアセトアミド）、ポリ（Ｎ−ビニル−５−メチル−２−オキサゾリドン）、ポリ（Ｎ−ビニルイソブチルアミド）（ＰＶｉＢＡｍ）、ポリ（２−アルキルアミドアクリル酸メチル）類、ポリ（２−アセトアミドアクリル酸メチル）、ポリ（２−プロピオンアミドアクリル酸メチル）、ポリ（２−イソブチルアクリル酸メチル）、ポリ（２−ｎ−ブチルアミドアクリル酸メチル）、水酸基を有するポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）類、Ｎ−一置換およびＮ−二置換されたポリ（アクリルアミド）類、Ｎ−一置換およびＮ−二置換されたポリ（メタクリルアミド）類、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）（ｐＡＯＭ）、および、ポリ（Ｎ−tert−ブチルアクリルアミド）を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式（ＩＩＩ）のモノマーユニットを含む。
【化３】
0006300799.tif 000010
【００４９】
いくつかの実施形態においては、Ｒ１は任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであることができる。いくつかの実施形態においては、Ｒ１は置換されていないＣ１−Ｃ３アルキルであることができる。
【００５０】
式（ＩＩＩ）のポリマーの複数の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリ（オキサゾリン）類、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）（ＰＭＯｚ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）（ＰＭＯｚ）、ポリ（２−ｎ−プロピル−２−オキサゾリン）（ＰｎＰＯｚ）、および、ポリ（２−イソプロピル−２−オキサゾリン）（ＰｉＰＯｚ）、および、ポリ（２−置換された−２−オキサゾリン）類を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式（ＩＶ）のモノマーユニットを含む。
【化４】
0006300799.tif 000011
いくつかの実施形態においては、Ｒ２はＨまたは任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであることができる。いくつかの実施形態においては、Ｒ２はＨまたは置換されていないＣ１−Ｃ３アルキルであることができる。
【００５２】
式（ＩＶ）のポリマーの複数の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とも呼ばれることのあるポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、および、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）とも呼ばれることのあるポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式（Ｖ）のモノマーユニットを含む。
【化５】
0006300799.tif 000012
いくつかの実施形態においては、Ａは単結合であることができ、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｘ−であることができ、ｘは０であってよく、Ｒ４は−（ＣＨ２ＣＨ（Ｒ４'）Ｏ）ｙ−Ｒ４'であることができる。いくつかの実施形態においては、ｘは０であってよく、Ｒ４は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−Ｒ４'であることができる。ここでＲ４'はＣ１−Ｃ３アルキルであることができる。
【００５４】
いくつかの実施形態においては、Ａは単結合であることができ、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｘ−であることができ、ｘは０であってよく、Ｒ４はＨまたは−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ３アルキルであることができる。
【００５５】
いくつかの実施形態においては、ＡはＯであることができ、Ｌ２は−（ＣＨ２）ｘ−であることができ、ｘは１であってよく、Ｒ４はＨまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであることができる。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、Ａは単結合であることができ、Ｌ２は−（Ｃ＝Ｏ）−であることができ、Ｒ４は−（ＣＨ２ＣＨ（Ｒ４'）Ｏ）ｙ−Ｒ４'であることができ、ｙは１から１０までであってよい。いくつかの実施形態においては、Ａは単結合であることができ、Ｌ２は−（Ｃ＝Ｏ）−であることができ、Ｒ４は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−Ｒ４'であることができ、ｙは１から１０までであってよく、Ｒ４'は任意で置換されたＣ１−Ｃ３アルキルであることができる。
【００５７】
式（Ｖ）のポリマーの複数の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリ（ビニルエーテル）類、ポリ（メチルビニルエーテル）（ＰＭＶＥｔｈ）、ポリ（２−メトキシエチルビニルエーテル）（ＰＭＯＶＥｔｈ）、ポリ（２−エトキシエチルビニルエーテル）（ＰＥＯＶＥｔｈ）、ポリ（２−（２−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル）、ポリ（４−ヒドロキシブチルビニルエーテル）、アルキルグリシジルエーテル類：ポリ（メチルグリシジルエーテル）、ポリ（エチルグリシジルエーテル）、および、ポリ（エトキシエチルグリシジルエーテル）、ポリ（ビニルアルコール）ＰＶＡｌ、ポリ（酢酸ビニル）ＰＶＡｃ、グラフトされたポリメタクリレート類（分子ブラシ）、ポリ［アクリル酸２−（２−エトキシエトキシ）エチル］（ＰＥＥＯ２Ａ）、ポリ［メタクリル酸２−（２−メトキシエトキシ）エチル］（ＰＭＥＯ２ＭＡ）、ポリ（メタクリル酸２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エチル）（ＰＭＥＯ３ＭＡ）、ポリ［オリゴメタクリル酸（エチレングリコール）］（ＰＯＥＧＭＡ）、ポリ（アクリル酸２−ヒドロキシプロピル）（ＰＨＰＡ）、および、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式（ＶＩ）のモノマーユニットを含む。
【化６】
0006300799.tif 000013
いくつかの実施形態においては、Ｒ１は任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであることができる。いくつかの実施形態においては、Ｒ１は置換されていないＣ１−Ｃ６アルキルであることができる。いくつかの実施形態においては、Ｒ１は置換されていないＣ１−Ｃ３アルキルであることができる。
【００５９】
式（ＶＩ）のポリマーの複数の例は、これらに限定されるものではないが、ポリ（リン酸エステル）類、ポリ（リン酸エチルエチレン）とも呼ばれることのできるポリ（２−エトキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）、および、ポリ（リン酸イソプロピルエチレン）とも呼ばれることのできるポリ（２−イソプロポキシ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン）を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式（ＶＩＩ）のモノマーユニットをさらに含むことができる。
【化７】
0006300799.tif 000014
ここでＬ１は、任意で置換されたＣ１−Ｃ８アルキレンであることができる。Ｒ５はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルであることができる。Ｒ６はＨまたは
【化８】
0006300799.tif 000015
であることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式
【化９】
0006300799.tif 000016
を有するモノマーユニットを含むことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において温度応答性ポリマーは、式
【化９】
0006300799.tif 000017
を有する第１モノマーユニット、および、細胞選択性結合分子をそこへ付着するのに適したものであることができる第２モノマーユニットを含むことのできるコポリマーであることができる。
【００６３】
いくつかの実施形態においては、細胞選択性結合分子をそこへ付着するのに適したものであることができる第２モノマーユニットは、式
【化１０】
0006300799.tif 000018
を有することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において細胞選択性結合分子は、抗体であることができる。いくつかの実施形態において抗体は、これに限定されるものではないが、抗−ＥｐＣＡＭであることができる。
【００６５】
いくつかの実施形態においてコポリマーは、第２モノマーユニットが約０．１％から１０％の割合となるように、第１モノマーユニットおよび第２モノマーユニットを含むことができる。いくつかの実施形態においてコポリマーは、第２モノマーユニットが約２．５％から１０％の割合となるように、第１モノマーユニットおよび第２モノマーユニットを含むことができる。
【００６６】
いくつかの実施形態においてコポリマーは、分子量が約４０００から２０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にあり、厚さが約６ｎｍから３０ｎｍの範囲にある鎖を持つことができる。
【００６７】
いくつかの実施形態において装置１００は、例えば体液および解離された組織から希少細胞を単離するために使用されることができる。抗−ＥｐＣＡＭがポリマー層にグラフトされている場合、装置は、例えば転移乳癌患者から収集された腹水から乳癌細胞を捕捉するために使用されることができる。抗−ＣＡ１９−９がポリマー層にグラフトされている場合、装置は、例えば（約１０％の癌細胞と９０％の間質細胞を含む）解離された膵臓癌組織から膵臓癌細胞を捕捉するために使用されることができる。いくつかの実施形態においては、その後の分子および機能解析用に、単体の膵臓癌細胞が単離されることができる。カクテル抗体試薬（例えば、抗−ＣＤ７１および抗−ＣＤ１４７）がポリマー層にグラフトされている場合、装置は、例えば妊娠６−１５週の母体血から胎児有核赤血球（ｆＮＲＢＣｓ）を捕捉するために使用されることができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において装置１００は、図２に概略的に図示される流体チップ２００のような流体チップに組み込まれることができる。流体チップ２００は、装置１００上に流動できるように封止されたチャネル画定層２０２を含むことができる。チャネル画定層２０２は、これに限定されるものではないが、例えばＰＤＭＳ層であることができる。チャネル画定層２０２は、より大きな表面積を覆うように、装置１００の表面上の蛇行路を画定することができる。チャネル画定層２０２はまた、層流を防止し、それ故に細胞捕捉効率を改善するためのカオス混合（chaotic mixer）表面構造を含むことができる。いくつかの実施形態において流体チップ２００は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／４３１７１号に記載され、参照により本明細書に組み込まれるシステム中で使用されることができる。しかしながら、装置１００は、流体チップでの使用に限定されるものではない。その他の実施形態においては、サンプルが、これに限定されるものではないが、液滴として装置１００上に配置されることもできるであろう。そのような場合、サンプルは装置１００の表面上を流れなくても良い。その他の複数の実施形態は、サンプル中に浸されるように作られた装置１００を含むことができる。
【００６９】
図３は、装置１００の動作を説明するのに役立つ模式図を提供する。この例においては、温度応答性材料は３７℃において縮小した構造をしている。この構造は、ＣＴＣに対する物理的なベルクロ様の付着に加えて、ＣＴＣに結合するために利用可能であるべき抗−ＥｐＣＡＭの数が増大することを可能にする。温度が４℃まで下げられるに連れて、温度応答性材料は伸長した構造を取るようになる。抗−ＥｐＣＡＭはポリマー鎖に沿って付着されるので、伸張によって、ＣＴＣへの抗−ＥｐＣＡＭの付着の多くが解き放たれ、その結果、生存条件にあるＣＴＣの除去を促進する。
実施例
【００７０】
以下の複数の例は、本発明のいくつかの概念を説明するのに役立つ。しかしながら、本発明の一般的な概念は、複数の特定の例に限定されるものではない。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態は、以下のように、温度応答性材料の層を有するナノ構造化された装置を提供する。この例における概念は、熱応答性ポリマーブラシ、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）を、表面開始原子移動ラジカル重合によって、ＳｉＮＷＳ上（図１Ａ、１Ｂ、３、および４Ａ）に共有結合によってグラフトすることである（ポリマーグラフトされたＳｉＮＷＳはＰ−ＳｉＮＷＳと略記する）［１３］。これらのポリマーブラシにおいて、我々は、少量（２．５−１０％）のアミノエチルメタクリル酸メチル（methyl aminoethylmethacrylate）を含有するイソプロピルアクリルアミドを重合することにより、共有結合により結び付けられたビオチン基を戦略的に導入した。ポリマーブラシ上のアミノ基は、その後、ビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳを形成するために、活性化されたビオチン（ビオチン−ＮＨＳ）と直接コンジュゲートされた。３７℃においては、ビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳの表面に、これらのポリマーのビオチン基および疎水性ドメインが存在する。ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して、捕捉剤（すなわち、この例においてはビオチン化された抗−ＥｐＣＡＭ）が基質上に導入されることができ、ナノベルクロ細胞親和性試験［８］について観測されたものに匹敵する高い効率のＣＴＣ捕捉を可能にする。温度が４℃まで下げられると、基質グラフトされたＰＩＰＡＡｍの骨格が、立体配座の変化を受けることで、伸長されたポリマーブラシ内部に埋め込まれた抗−ＥｐＣＡＭの内在化へと導く。その結果、ナノ基質固定されたＣＴＣｓが効果的に放出される。ＰＩＰＡＡｍ［１４］は、十分に確立された生体適合性のポリマーであり、その表面特性の熱応答性の転換によって、複数の細胞を可逆的に結合および放出することができる。ＰＩＰＡＡｍグラフトされた基質の最も有力な効用の１つは、"細胞シート"技術であり、そこでは、３７℃においてＰＩＰＡＡｍの複数の疎水性ドメインに対して複数の細胞が付着し、続いて集密体へと成長する［１５］。その後、ＰＩＰＡＡｍの下限臨界溶液温度（例えば４℃）を下回るまで基質は冷却されて、その表面の疎水性から親水性への転換を誘起し、"細胞シート"を生成するために、集密的に培養された複数の細胞が基質から脱離することを可能にする［１６］。明らかに、ＰＩＰＡＡｍの動作温度は、それらの播種および放出プロセスの間における、細胞の生存率および機能に対する崩壊を最小限にすることを確実にする［１７］。ＣＴＣｓを捕捉および放出するためにビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳを使用した場合、同じ利点が当てはまることを実証するであろう。
【００７２】
ビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳは、図４Ａに図示されるように調製された。最初に、直径１００−２００ｎｍおよび長さ１５−２０μｍを有し、密集して詰められたＳｉＮＷＳを、湿式化学エッチング法を使用して、複数のシリコンウェハ上に製造した。これらのＳｉＮＷＳ上に、アミノシロキサンの単層が構築され、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）用の開始剤が、共有結合性のアミド結合を通じて導入された。イソプロピルアクリルアミドおよびアミノエチルメタクリル酸メチルの混合物によって表面開始ＡＴＲＰが実行され、グラフトされたポリマーブラシを得た。熱応答を確認するため、特定の長さ閾値を越えるようなポリマーを取得する必要があったので、重合は６時間にわたって実行された。重合は、あまり長く行われることはできない。そうでないとナノ構造が失われかねない。これらのポリマーブラシの分子量は８８００ｇ／ｍｏｌであり、厚さは１４ｎｍと推定された［１８］。その後複数のビオチン部分は、これらのポリマーブラシの遊離したアミノ基へとコンジュゲートされ、所望のビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳを得た。２．５、５、および１０％の官能基密度を有する３つのビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳが調製され、これらのビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳの熱応答性の表面特性を調査するために、温度に依存する水滴の接触角測定が利用された。図４Ｂに示されるように、３つのビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳの全てが、それぞれ３７℃および４℃において、疎水性表面と親水性表面との間で可逆的転換を受けた。これらのビオチン密度に関しては、ほんの微小な差異しか観測されなかった。細胞の捕捉および放出性能に対するビオチン密度の影響を調査するために、ストレプトアビジンコンジュゲーション（４０μｇ／ｍＬ）によって、ビオチン化された抗−ＥｐＣＡＭ（１０μｇ／ｍＬ）が、２．５、５、および１０％のビオチン部分を含むビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳ上に導入された。抗体の導入後には、３７℃において表面は親水性となり（図４Ｃ）、温度が変化した場合でも、疎水性と親水性との間でもはや表面は転換しなかった。これは、表面に充填された抗体のためである。しかしながら、ＰＩＰＡＡｍの同じ骨格の動きのため、ポリマーブラシの熱応答性は、図３に図示されるもののままのはずである。
【００７３】
熱応答性ナノベルクロ細胞親和性試験の細胞捕捉性能を調査するために、ＤＭＥＭ媒体中においてＥｐＣＡＭ陽性の乳癌細胞株（つまりＭＣＦ７）を含む細胞懸濁液（１０５細胞ｍＬ−１）が調製され、その後、抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳ（１×２ｃｍ、市販の細胞チャンバスライド中に配置されている）上に導入され、続いて、３０分インキュベーションされた（５％ＣＯ２、３７℃）。リンス後に、基質に固定された細胞（ＤｉＯ緑蛍光染料によって予め着色されている）が撮像され、蛍光マイクロスコープ（Ｎｉｋｏｎ、９０ｉ）によってカウントされた。引き続いて、４℃の冷蔵庫で３０分間、上述の（抗−ＥｐＣＡＭコートされた基質上に固定されたＭＣＦ７細胞を有する）チャンバスライドによって、細胞放出の調査が実行された。その後、基質上に残っているＭＣＦ７細胞が定量化された。図５Ａにまとめられている結果は、３７℃においては、１０％のビオチンを含むビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳが最も高い細胞捕捉性能を示し、一方、４℃においては、最も低い細胞保持力も観測されたことを示唆している。最適な細胞捕捉／放出性能が与えられたので、我々は、我々のさらなる特性評価および最適化の調査を、ビオチン１０％を有するビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳに集中させた。繰り返される細胞の捕捉および放出に対してこの基質を試験するために、我々は、ＭＣＦ７細胞を再び使用して、複数回サイクルの調査を順次実行した。我々は、実験サイクルの回数が増大するに連れて、徐々に減衰される細胞捕捉／放出性能を観測した（図５Ｂ中の実線を参照のこと）。捕捉剤、抗−ＥｐＣＡＭは、複数の捕捉／放出プロセスの間におけるその熱応答性の立体配座変化の結果として、ポリマーブラシから解離することができるものと我々は仮定する。この仮説を確認するために、我々は、細胞捕捉／放出調査の前に、抗−ＥｐＣＡＭコンジュゲーションを繰り返し行った。そのようにすることによって、新たなサイクルにおいて細胞捕捉／放出性能が回復された（図５Ｂ中の破線を参照のこと）。
【００７４】
我々のプラットフォームが、細胞の捕捉および放出のための３つの異なる特徴を統合することは、他に類を見ないものである。性能に対する抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳ（１０％のビオチン）の個々の寄与を確認するために、３つの対照試験が、（ｉ）ＰＩＰＡＡｍ−ＳｉＮＷＳ：温度誘起されたＰＩＰＡＡｍの立体配座変化が細胞捕捉／放出に対してどのように寄与するかを調査するために捕捉剤無し、（ｉｉ）抗−ＥｐＣＡＭコートされたＳｉＮＷＳ：元々のナノベルクロ細胞親和性試験のように熱応答性無し、および、（ｉｉｉ）平坦なＳｉチップ上の抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐ（ナノ構造無し）、を使用して実施された。図５Ｃにまとめられている結果は、３つの因子（捕捉剤、熱応答性ポリマーブラシ、およびナノ構造）全てが、高められた細胞捕捉／放出性能を達成することにおいて重要な役割を果たしていることを示唆した。これは、概念的な記述（図３）を支持している。ＰＩＰＡＡｍ−ＳｉＮＷＳおよび平坦なＳｉチップ上の抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐの場合、捕捉効率がより低かった。一方、確立された抗−ＥｐＣＡＭコートされたＳｉＮＷＳ［８］は、抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳと同様な捕捉効率を示した。しかしながら、結合されたこれらの細胞は、表面が４℃まで冷却された場合にも、表面に対して付着されたままであった。最後に我々は、ＥｐＣＡＭ陽性の癌細胞を捕捉することに対するビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳの一般的な適用可能性および特異性を調査した。３つのＥｐＣＡＭ陽性癌細胞株（ＭＣＦ７細胞、ＬｎＣＡＰおよびＰＣ３前立腺癌細胞）が、２つのＥｐＣＡＭ陰性癌細胞株（ＨｅＬａ子宮頸癌細胞およびＪｕｒｋａｔ白血病細胞）および新たに単離されたヒト白血球（ＷＢＣｓ）と並行して調査された。図５Ｄにまとめられている結果は、抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳが、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞を特異的に捕捉および放出可能なことを示唆した。これに反して、ＥｐＣＡＭ陰性細胞（すなわちＨｅＬａおよびＪｕｒｋａｔ）並びにヒトＷＢＣｓに対しては、相対的に少ない細胞数が観測された。
【００７５】
熱応答性ナノベルクロ細胞親和性試験のダイナミックレンジを試験するために、ＤＭＥＭ媒体および健康なドナーの血液を、１ｍＬの血液当り１０、５０、１００、５００、および１，０００個の細胞の密度で、ＤｉＯ着色されたＭＣＦ７細胞によってスパイクする（spiking）ことにより、一連の人工ＣＴＣ血液サンプルが調製された。結果は図６Ａにまとめられている。抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳは、以前に立証された抗−ＥｐＣＡＭコートされたＳｉＮＷＳ［８］に対して観測されたものと同様に、大きく改善された捕捉収率（＞７０％）を示している。最も重要なことは、抗−ＥｐＣＡＭコートされたビオチン−Ｐ−ＳｉＮＷＳが生存癌細胞を捕捉および放出可能なことである。１，０００のＭＣＦ細胞がＣＴＣ捕捉調査を受けた場合、基質から、９０％よりも多くの細胞が（３７℃において）捕捉され（４℃において）放出されることができる（図６Ｂ、白抜きの棒グラフ）。さらに、放出された細胞の約９０％が生存したままであり（図６Ｂ、白抜きの棒グラフ）、それらは培養下でさらに増大されることができる（図６Ｃ）。対照的に、抗−ＥｐＣＡＭコートされたＳｉＮＷＳ上でも細胞は効率よく捕捉されることができるが、その一方で、トリプシン処理された細胞放出は、中程度の細胞放出性能および乏しい細胞生存率を引き起こした（図６Ｂ、黒の棒グラフ）。
【００７６】
結論として、熱応答性ポリマーブラシに基づいた、特異的な認識に向けられた捕捉剤、ナノ構造増幅された細胞捕捉、および、刺激された細胞放出の特徴が統合された、本発明の一実施形態に従った革新的な細胞捕捉および放出のプラットフォームを、我々は立証した。このプラットフォームは、（１）３７℃において高効率で癌細胞を捕捉すること、および、（２）４℃において、高い生存率と維持された機能性で、捕捉された癌細胞を放出すること、における優れた性能を立証することができる。両方の特徴により、周囲の白血球（ＷＢＣｓ）の汚染を最小限にしつつ、ＣＴＣｓの生存率および機能に対する崩壊が無視できる程度で、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）の単離が可能である。それ故に、ＣＴＣｓの分子解析および機能解析に対する有用なツールを提供する。ＣＴＣ導出された分子署名および機能的読出しは、治療的介入が重大な差異を生じ得るであろう臨界期の間の腫瘍生物学において、貴重な見識を与えるであろうことが想像できる。
【００７７】
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［１８］E. Turan, S. Demirci, T. Caykara, Thin Solid Films 2010, 518, 5950-5954.
【００７８】
本明細書において示され、議論されている複数の実施形態は、本発明をどのように成し、使用するのかを、当業者に教示することが意図されているのみである。本発明の複数の実施形態を説明するにあたり、明瞭性のために、特定の用語が使用されている。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることが意図されるものではない。上記の教示を考慮すれば当業者に認識されるように、本発明の上述の複数の実施形態は、本発明から逸脱することなく修正または変更され得る。従って、具体的に記載されているものとは違うやり方でも、請求項およびその均等物の範囲内において、本発明が実施され得ることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
0006300799.tif 000030
【図１Ｂ】
0006300799.tif 000031
【図２】
0006300799.tif 000032
【図３】
0006300799.tif 000033
【図４Ａ】
0006300799.tif 000034
【図４Ｂ】
0006300799.tif 000035
【図４Ｃ】
0006300799.tif 000036
【図５Ａ】
0006300799.tif 000037
【図５Ｂ】
0006300799.tif 000038
【図５Ｃ】
0006300799.tif 000039
【図５Ｄ】
0006300799.tif 000040
【図６Ａ】
0006300799.tif 000041
【図６Ｂ】
0006300799.tif 000042
【図６Ｃ】
0006300799.tif 000043
【図６Ｄ】
0006300799.tif 000044
【図７Ａ】
0006300799.tif 000045
【図７Ｂ】
0006300799.tif 000046
【図７Ｃ】
0006300799.tif 000047
【図７Ｄ】
0006300799.tif 000048
【図８Ａ】
0006300799.tif 000049
【図８Ｂ】
0006300799.tif 000050
【図８Ｃ】
0006300799.tif 000051