(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を用いて、果糖からプシコースを生産する方法であって、
前記エンシファー属菌株は、寄託番号ＫＣＣＭ１１４０５Ｐを有するエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＳＹＧ２９である、プシコースを生産する方法。
【請求項２】
前記方法が、非イオン性界面活性剤で処理する段階を追加的に含む、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項３】
前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株は、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項４】
前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を、果糖と反応させる段階を含む、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項５】
前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を、果糖と反応させる段階が、エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を、果糖が含まれている培地で培養する段階である、請求項４に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項６】
前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を、果糖と反応させる段階が、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株の菌体、前記菌株の培養物および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を果糖と混合する段階である、請求項４に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項７】
前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を果糖と反応させる段階が、６０〜７５℃の温度条件で果糖と反応させる段階である、請求項４に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項８】
マンガン、マグネシウム、ニッケル、コバルト、鉄およびアルミニウムからなる群より選択された１種以上の金属イオンを添加する段階を追加的に含む、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項９】
緩衝溶液を使用しないことを特徴とする、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項１０】
前記果糖が、４０〜７５％（ｗ／ｗ）の濃度で使用される、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項１１】
ｐＨ６〜９および４０〜８０℃の条件下で行われる、請求項１〜６および８のうちのいずれか一項に記載のプシコースを生産する方法。
【請求項１２】
果糖をプシコースに転換する活性を有する、エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を含む、果糖からプシコースを生産するプシコース生産用組成物であって、エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が、寄託番号ＫＣＣＭ１１４０５Ｐを有するエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＳＹＧ２９である、プシコース生産用組成物
【請求項１３】
前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が、６０〜７５℃の温度条件で、果糖をプシコースに転換する活性を有する、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＳＹＧ２９である、請求項１２に記載のプシコース生産用組成物。
【請求項１４】
前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上である、請求項１２または１３に記載のプシコース生産用組成物。
【請求項１５】
果糖をプシコースに転換する活性を有し、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＳＹＧ２９（寄託番号：ＫＣＣＭ１１４０５Ｐ）である、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
土壌から新規に分離された菌株エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）およびこれを用いたプシコース製造方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）は、果糖の３番炭素のエピマーであって、果糖の７０％に該当する甘味度を有しており、血糖調節、虫歯予防および肝で脂肪合成を阻害する機能性糖である。
砂糖代替甘味料として多く使用されている糖アルコール類は、一定量以上摂取時、下痢を誘発するなどの副作用があるが、プシコースは知られた副作用がない。したがってプシコースの甘味料としての関心が高まっており、効率的なプシコース生産方法に対する開発必要性が高まっている。
従来のプシコース生産は、モリブデン酸イオンの触媒作用を用いて果糖からプシコースを生産する化学的方法による生産と、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のプシコースエピメラーゼによって果糖からプシコースを生産するような生物学的方法による生産とに分けられる。化学的方法によるプシコース生産は効率が低く副産物が発生することが問題となっており、生物学的方法も収率が低く生産費用が高いという問題点がある。
したがって、副産物を生成しないながら、産業化に適した温度およびｐＨ条件下で高い収率でプシコースを生産できる方法が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の一例は、果糖をプシコースに転換する酵素を生産する菌株を根圏土壌から分離する方法を提供する。
他の例は、プシコースに転換する新規なエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を提供する。
他の例は、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株、前記菌株の培養物、および／または前記菌株の破砕物を含むプシコース生産用組成物を提供する。
他の例は、前記菌株を用いて果糖からプシコースを生産する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
果糖をプシコースに転換する活性に優れた新規エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株（例えば、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ））を土壌から分離および同定し、前記菌株の菌体を用いて果糖からプシコースへの転換能を確認し、高いプシコース転換能を得るための菌体反応の最適温度、最適ｐＨおよび金属イオン要求性有無を確認しプシコースを効率的に大量生産するための条件を確立して本発明を完成した。
【０００５】
本発明の一例は、果糖をプシコースに転換する新規エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を提供する。前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株は、例えば、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）であり得る。
他の例は、前記菌株を用いて果糖からプシコースを生産する方法を提供する。前記製造方法において、高いプシコース転換能を得るための菌体の最適反応条件およびプシコースの大量生産のための条件を提案する。
【０００６】
以下、本発明をより詳しく説明する。
まず、新規なエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が提供される。前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株は果糖をプシコースに転換する活性に優れた菌株であって、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、エンシファーグラマティクス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｇａｒａｍａｎｔｉｃｕｓ）、エンシファーソヤー（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｓｏｊａｅ）、エンシファーメキシカヌス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｍｅｘｉｃａｎｕｓ）、エンシファーヌミディクス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｎｕｍｉｄｉｃｕｓ）などからなる群より選択された１種以上であり、例えば、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株であり得る。
【０００７】
一具体例で、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株は、寄託番号ＫＣＣＭ１１４０５Ｐのエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株であり得る。前記エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株は１６ＳリボソームＲＮＡ配列が配列番号１の通りであり、硝酸塩還元能、ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ）活性、ベータ−グルコシダーゼ活性、およびベータ−ガラクトシダーゼ活性を有し、代謝基質としてＤ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−マルトース、およびリンゴ酸（Ｍａｌｉｃａｃｉｄ）を用いることができる。また、前記エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株は、Ｌ−トリプトファン分解能、Ｄ−グルコース発酵能、アルギニンジヒドロラーゼ（Ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｌａｓｅ）活性、ゼラチン加水分解能、グルコン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）利用能、カプリン酸（Ｃａｐｒｉｃ  ａｃｉｄ）利用能、アジピン酸（Ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ）利用能、クエン酸三ナトリウム（Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）利用能、およびフェニル酢酸（Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）利用能は有しない。
【０００８】
前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株は、果糖をプシコースに転換させるプシコース転換能に優れることを特徴とする。前記プシコース転換能は、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が果糖をプシコースに転換させる酵素を生産することによって得られるものであって、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株はプシコース転換能の高い酵素を生産するかプシコース転換酵素を大量で生産して優れたプシコース転換能を示すことができる。したがって、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株はプシコース製造に有用に適用され、プシコース生産収率をより増進させることができる。
【０００９】
したがって、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株の菌体、前記菌株の培養物、および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を含むプシコース生産用組成物が提供される。前記培養物は前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株から生産された酵素を含むものであって、前記菌株の前記菌株を含むか、菌株を含まない無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）形態であり得る。前記破砕物は、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を破砕した破砕物または前記破砕物を遠心分離して得られた上澄み液を意味するものであって、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株から生産された酵素を含むものである。本明細書において、別途の言及がない限り、プシコースの製造に使用されるエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株は、前記菌株の菌体、前記菌株の培養物および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を意味するものとして使用される。
【００１０】
また、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を使用するプシコース生産方法が提供される。前記プシコース生産方法は、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を果糖と反応させる段階を含む。一具体例で、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を果糖と反応させる段階は、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株の菌体を果糖が含まれている培養培地で培養する段階によって遂行できる。他の具体例で、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を果糖と反応させる段階は、前記菌株（菌体、菌株の培養物、および／または菌株の破砕物）を果糖と接触させる段階、例えば、前記菌株を果糖と混合する段階または前記菌株が固定化された担体に果糖を接触させる段階によって遂行できる。
このようにエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を果糖と反応させることによって果糖をプシコースに転換して果糖からプシコースを生産することができる。
【００１１】
前記プシコース生産方法において、効率的なプシコース生産のために、基質として使用される果糖の濃度は、全体反応物基準に４０〜７５％（ｗ／ｖ）、例えば、５０〜７５％（ｗ／ｖ）であり得る。果糖の濃度が前記範囲より低ければ経済性が低くなり、前記範囲より高ければ果糖がよく溶解されないので、果糖の濃度は前記範囲にすることがよい。前記果糖は緩衝溶液または水（例えば、蒸留水）に溶解された溶液状態で使用することができる。
前記プシコース生産方法において、前記反応は、ｐＨ６〜９．５、例えば、ｐＨ７〜９、ｐＨ７〜８またはｐＨ８〜９の条件下で遂行できる。また、前記反応は、３０℃以上、例えば、４０℃以上の温度条件下で遂行できる。温度が８０℃以上になれば、基質である果糖の褐変現象が起こることがあるので、前記反応は、４０〜８０℃、例えば、５０〜７５℃、６０〜７５℃、または６８〜７５℃の条件下で遂行できる。また、前記反応時間が長いほど、プシコース転換率が高まる。
【００１２】
例えば、前記反応時間は、１時間以上、例えば２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上または６時間以上にすることがよい。反応時間が４８時間を超過すればプシコース転換率の増加率が微小であるか、むしろ減少するので、反応時間は４８時間を超過しないことがよい。したがって、前記反応時間は１〜４８時間、２〜４８時間、３〜４８時間、４〜４８時間、５〜４８時間、または６〜４８時間にすることができ、産業的および経済的側面を考慮して、１〜４８時間、２〜３６時間、３〜２４時間、３〜１２時間、または３〜６時間程度にすることができるが、これに制限されるのではない。前記条件は、果糖からプシコースへの転換効率が最大化される条件として選定されたものである。
【００１３】
また、前記プシコース生産方法において、使用される菌株の菌体濃度は、全体反応物基準に、５ｍｇ（ｄｃｗ：乾燥細胞重量）／ｍｌ以上、例えば、５〜１００ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、１０〜９０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、２０〜８０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、３０〜７０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、４０〜６０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、または４５〜５５ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌであり得る。菌体濃度が前記範囲未満である場合にはプシコース転換活性が低いか殆どなく、前記範囲を超過すれば菌体が過度に多くなってプシコース転換反応の全体的な効率が低くなるので、菌体濃度は前記範囲にすることがよい。
【００１４】
前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が生産する果糖をプシコースに転換させる酵素（例えば、エピメラーゼ）は金属イオンによって活性化が調節されるので、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を用いたプシコース生産において、金属イオンを添加すると、果糖からプシコースへの転換効率、即ち、プシコース生産率が増加できる。
したがって、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を含むプシコース生産用組成物は、金属イオンを追加的に含むものであり得る。また、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を用いたプシコース生産方法は、金属イオンを添加する段階を追加的に含むことができる。一実施形態で、前記金属イオンは前記培養段階の培養培地に添加されるか、前記培養段階が前記金属イオンが添加された培養培地で行われるのであり得る。他の実施形態で、前記金属イオンは果糖に添加されるか、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株と果糖との混合物に添加することができる。また他の実施形態で、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が固定化された担体に添加されるか（果糖添加前）、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が固定化された担体と果糖との混合物に添加されるか（果糖添加後）、または果糖添加時に果糖と混合物の形態にまたはそれぞれ添加することができる。
【００１５】
前記金属イオンは、銅イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオンなどからなる群より選択された１種以上であり得る。例えば、前記金属イオンは、マンガンイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオンなどからなる群より選択された１種以上であり、一例で、前記金属イオンは、マンガンイオン、コバルトイオン、またはこれらの混合物であり得る。前記金属イオンの添加量が０．５ｍＭ未満である場合にはプシコース生産収率増進効果が微小であるので、前記金属イオンの添加量は０．５ｍＭ以上にすることができる。一方、前記金属イオンの添加量が５ｍＭを超過すればその超過量に比べて効果が微小であるため、前記金属イオンの添加量は５ｍＭ以下にすることができる。例えば、前記金属イオンの添加量は０．５ｍＭ〜５ｍＭ、例えば、０．５〜２ｍＭ範囲にすることができる。
【００１６】
前記担体は、固定された菌株、または前記菌株から生産される酵素の活性が長期間維持される環境を造成することができるものであって、酵素固定化用途として使用できる公知された全ての担体であり得る。例えば、前記担体としてアルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｕｉｍ  ａｌｇｉｎａｔｅ）を使用することができる。アルギン酸ナトリウムは海藻類の細胞壁に豊富に存在する天然コロイド性多糖類であって、マンヌロン酸（β−Ｄ−ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）とグルロン酸（α−Ｌ−ｇｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が造成されており、含量面では無作為にベータ−１，４結合をなして形成され、菌株または酵素が安定的に固定されて優れたプシコース収率を示すのに有利であり得る。一具体例で、プシコースの収率をより増進させるために、１．５〜４．０％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液）、例えば、約２．５％の（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液を菌株の固定化に使用することができる。例えば、菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養液、または前記菌株の破砕物の１〜２体積倍のアルギン酸ナトリウム水溶液に前記菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物を添加して混合した後、前記得られた混合液を注射器ポンプと真空ポンプを用いて約０．２Ｍカルシウムイオン溶液に落としてビーズが生成されるようにすることによって、アルギン酸ナトリウム担体に菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物が固定化させることができる。前記酵素は、前記菌株、菌株培養物または前記菌株の破砕物から通常の方法、例えば透析、沈殿、吸着、電気泳動、親和クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法によって精製されたものであり得る。
【００１７】
前記プシコース生産において、非イオン性界面活性剤を追加的に使用することによってプシコース生産効率をより増進させることができる。前記非イオン性界面活性剤は細胞膜の透過性を高めて、細胞膜内部にある酵素が遊離されるようにし、これによってプシコース生産効率を増進させることができる。前記非イオン性界面活性剤は、例えば、オクチルフェノールエトキシレート（トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００；Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ；ｎ＝９または１０）であり得る（図８参照）。
したがって、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を含むプシコース生産用組成物は、非イオン性界面活性剤、例えば、オクチルフェノールエトキシレートを追加的に含むものであり得る。また、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株を用いたプシコース生産方法は、非イオン性界面活性剤を添加する段階を追加的に含むことができる。一実施形態で、前記非イオン性界面活性剤は、前記培養段階の培養培地に添加されるか、前記培養段階が前記非イオン性界面活性剤が添加された培養培地で行われるのであり得る。他の実施形態で、前記非イオン性界面活性剤は、果糖を含む基質反応物に添加されるか、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株と基質反応物の混合物に添加することができる。また、他の実施形態で、前記非イオン性界面活性剤は前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が固定化された担体に添加されるか、前記エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属菌株が固定化された担体と果糖の混合物に添加されるか、果糖添加時に共に添加することができる。
【００１８】
プシコース生産収率を考慮する時、前記非イオン性界面活性剤の添加量は、全体培養物または反応物体積を基準に、０．０１〜０．５％（ｖ／ｖ）、例えば、０．０５〜０．４５％（ｖ／ｖ）、０．２乃至０．４５％（ｖ／ｖ）、または０．３〜０．４２％（ｖ／ｖ）であり得る。
【００１９】
本発明で提案されるプシコース製造方法は、緩衝溶液を使用せず、菌体を用いて果糖をプシコースに転換することが可能であるので、より簡便な方法でプシコースを高い収率で生産することができるという長所がある。図１１で示されるように、緩衝溶液を使用せず、初期ｐＨを前述の範囲（例えば、ｐＨ７〜９、ｐＨ７〜８またはｐＨ８〜９）にして反応を実施する場合、前記範囲を離脱する場合と比較してプシコース転換率が高く維持され得る。
［発明の効果］
【００２０】
本発明は、土壌分離菌株エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株は産業的に有用な範囲のｐＨ、温度で安定性を有し、果糖から高い収率でプシコースを生産する活性を有するので、機能性糖関連健康食品および医薬産業で幅広く使用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、一実施形態で分離されたエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株がプシコースから果糖を生産したことを薄層クロマトグラフィーで分析した結果示したものである（１；果糖とプシコーススタンダード、２−３；エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）培養菌体を破砕して上澄み液をプシコースと反応して果糖に転換されたことを確認した結果）。
【図２】図２は、高濃度果糖からプシコースが生産されたことをＨＰＬＣ分析で確認したクロマトグラムを示したものである。
【図３】図３は、一実施形態で分離されたエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株の系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅ）分析結果を示したものである。
【図４】図４は、菌体濃度によるプシコース生産量を示したものである。
【図５】図５は、温度によるプシコース生産量を示したものである。
【図６】図６は、ｐＨによるプシコース生産量を示したものである。
【図７】図７は、金属イオン種類によるプシコース生産相対活性を示したものである。
【図８】図８は、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００濃度によるプシコース生産量を示したものである。
【図９】図９は、一実施形態で分離されたエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株の温度による安定性を示したものである。
【図１０】図１０は、反応６時間の間の温度別プシコース生産性を示したものである。
【図１１】図１１は、緩衝溶液を使用せずＨＣＬおよびＮａＯＨを用いて調節した基質の初期ｐＨによってプシコース生産性を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を具体的な実施例によってより詳しく説明する。しかし、本発明は下記の実施例に限定されたものでなく、本発明の思想と範囲内で様々な変形または修正が可能であるのは、この分野で当業者に明白なのである。したがって、添付された請求項は広く本発明の思想と範囲に符合するように解釈されなければならない。
【実施例】
【００２３】
実施例１．果糖をプシコースに転換する土壌由来微生物の分離
果糖をプシコースに転換する菌株を分離するために１％（ｗ／ｖ）プシコースが添加された最小培地（ＫＨ２ＰＯ４２．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４５．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２・ＳＯ４２．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、酵母エキス（ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）１ｇ／Ｌ）を使用した。
根圏土壌１ｇを０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ１０ｍＬに懸濁し、１００μｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）を取って寒天培地に塗抹した後、３０℃で培養した。前記寒天培地で形成されたコロニーのうちの形状と大きさが異なるコロニーを選別した後、前記最小培地に接種して３０℃で２４時間振盪培養し、遠心分離した後、菌体のみ回収した。回収した菌体は５０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））緩衝溶液（ｐＨ８．０）１００μｌに入れて浮遊させ、音波振動機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．ＣｏｌｅｐＰａｒｍｅｒ）を用いて破砕した。前記破砕液を１２，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離し、上澄み液を回収して酵素液（ｃｒｕｄｅ  ｅｎｚｙｍｅ）として使用し、前記酵素液を１０ｍＭプシコースを基質にして３０℃で８時間反応させた。
【００２４】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を通じて前記反応液でプシコースが果糖への転換が行われたのか確認した。前記薄層クロマトグラフィー分析は、横２０ｃｍ、縦５ｃｍのシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０  Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ））固定相とアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と水を８５：１５条件で混合した移動相展開溶媒を用いて３分３０秒間２回ずつ展開して行った。前記液体クロマトグラフィー分析は、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）が装着されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＲＩＤ）行った。移動相溶媒は水を使用し、温度は８０℃、流速は０．６ｍｌ／ｍｉｎにした。
【００２５】
前記ＴＬＣ分析結果を図１に示した。
前記分析を通じてプシコースから果糖への転換が確認された菌株を選別して１％（ｗ／ｖ）果糖と０．０５％（ｗ／ｖ）プシコースが添加された最小培地に接種して３０℃で２４時間振盪培養し、遠心分離した後、菌体のみ回収した。回収した菌体は０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した後、菌体濃度４０ｍｇ−ｄｃｗ／ｍｌ条件で４００ｇ／Ｌ果糖と１ｍＭマンガンイオンを添加した５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を入れて浮遊させ、７０℃で６時間菌体と果糖との反応を実施した。前記反応結果物を１００℃で５分間加熱して反応を停止させ、ＨＰＬＣを通じてプシコース生産を確認した。前記ＨＰＬＣ分析は、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）が装着されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＲＩＤ）前述の条件（溶媒は：水、温度：８０℃、流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ）で行った。前記得られた結果を図２に示した。図２のように、ＨＰＬＣ分析を通じて果糖からプシコースを最も多く生産した菌株１種を最終選定した。
【００２６】
実施例２．プシコース転換菌株の同定
前記実施例１で分離された菌株を同情するために１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列および生化学的特性を確認した。分離菌株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列（５’→３’）は配列番号１および下記配列の通りである。
＜分離菌株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列＞
0006339680.tif 000002
【００２７】
図３に示されているように、分離菌株は塩基配列分析（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅ）を通じてエンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）と１００％同一性を示すことを確認して、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＳＹＧ２９と命名した。前記菌株は、２０１３年３月２９日付で韓国微生物保存センターに寄託して受託番号ＫＣＣＭ１１４０５Ｐを付与された。
【００２８】
前記菌株の生化学的特性を下記の表１に示した。
【表１】
0006339680.tif 000003
【００２９】
実施例３．前記菌株の菌体反応を用いたプシコース生産最適条件確立
前記で分離された菌株のｐＨおよび温度変化によるプシコース転換率を調査するために、多様なｐＨおよび温度条件下で前記分離された菌株の菌体と基質を反応させてプシコース転換活性を比較した。
【００３０】
３−１．菌体濃度による活性分析
プシコース生産最小菌体濃度を確認するために、５００ｇ／Ｌ果糖と１ｍＭマンガン（Ｍｎ）金属イオンを添加した５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）溶液に、実施例１で分離された菌株の菌体濃度を５−５０ｇ（ｄｃｗ）／Ｌ範囲に変化させながら、６０℃下で２時間反応させ、基質反応停止のために１３，０００ｒｐｍで遠心分離後、上澄み液を５分間加熱して反応を終了（停止）させた後に、ＨＰＬＣ分析を通じてプシコース生産量を測定した。前記ＨＰＬＣ分析は、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）が装着されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて（Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０ＲＩＤ）前述の条件（溶媒は：水、温度：８０℃、流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ）で行った。
【００３１】
前記得られた結果を図４に示した。図４に示されているように、菌体濃度が増加するほどプシコース生産量も増加することを確認した。前記菌体反応結果、菌体濃度が５０ｇ（ｄｃｗ）／Ｌである場合に７８．２ｇ／Ｌのプシコースを生産して試験濃度の中で最大活性を示すことが確認され、最小５ｇ／Ｌ菌体濃度でもプシコース転換活性があることを確認した。
【００３２】
３−２．温度による活性分析
プシコース生産最適温度を確認するために、前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度が２０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌであることを除いて、実施例３−１と同様な反応および分析条件で、４０〜７０℃範囲で温度を変化させながら、２時間反応させ、反応終了後、ＨＰＬＣ分析を通じてプシコース生産量を測定した。
前記得られた結果を図５に示した。図５に示されているように、反応温度が高まるほど活性が増加した。７０℃で５１．５ｇ／Ｌプシコースが生産され、前記温度で最大活性を示すことが確認された。
【００３３】
３−３．ｐＨによる活性分析
また、転換反応でｐＨ効果を調査するために、前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度２５ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌおよび果糖濃度５００ｇ／Ｌの１ｍＭマンガンイオンを添加した緩衝溶液ＭｃＩｌｖａｉｎｅ（０．１Ｍクエン酸（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）と０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液をｐＨ別に量を異にして添加して製造する緩衝溶液）ｐＨ６．０−８．０および１００ｍＭグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）ｐＨ８．５−９．５をそれぞれ用いて、各ｐＨ条件で７０℃で反応させ、反応終了後、前記実施例３−１と同様な方法でＨＰＬＣ分析を通じてプシコース生産量を測定した。
【００３４】
前記得られた結果を図６に示した。図６に示されているようにｐＨ７．０−９．０範囲で高い活性を示し、特に、ｐＨ７．０−８．０の中性ｐＨ範囲でもプシコースの効率的な生産が可能であった。
【００３５】
３−４．金属イオンによる活性分析
金属イオン要求性を確認するために、４００ｇ／Ｌ果糖を基質として使用し、前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度２０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、７０℃、およびｐＨ７．０で、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝溶液に溶かした１ｍＭ金属イオン（ＣｕＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮｉＳＯ４、ＣｏＣｌ２、またはＦｅＳＯ４）溶液をそれぞれ用いて２時間反応させ、反応終了後、前記実施例３−１と同様な方法でＨＰＬＣ分析を通じてプシコース生産量を測定した。
【００３６】
前記得られた結果を図７に示した。図７で確認されるように、金属イオンを添加しない場合と比較した時、マンガンイオンとコバルトイオンを添加した場合で比較的に高いプシコース転換活性を示した。
【００３７】
実施例４．プシコース大量生産のための条件
４−１．トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００濃度による生産性
細胞膜の透過性を高めるトリトンＸ−１００を添加すると、細胞膜内部にある酵素が遊離されるようにして、これによってプシコース生産時間を短縮することができる。
【００３８】
菌体反応を通じたプシコースの効果的な生産のために、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００の添加濃度によるプシコース生産能力を確認した。前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度が２０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌであることを除いて、実施例３−１と同様な反応（果糖５００ｇ／Ｌ、１ｍＭマンガンイオン添加）および分析条件（ＨＰＬＣ）で、０〜０．５％（ｖ／ｖ）濃度のトリトンＸ−１００を添加し、６０℃で２時間反応させ、反応終了後、ＨＰＬＣ分析を通じて生産されるプシコースの量を確認した。
【００３９】
前記得られた結果を図８に示した。図８に示されているように、トリトン添加によってトリトンを添加しない場合（トリトン濃度：０％（ｖ／ｖ））と比較してプシコース生産量が増加したことを確認でき、特にトリトン濃度が０．４％（ｖ／ｖ）である場合にプシコース生産量が４８．９ｇ／Ｌであって最も高いことが確認された。
【００４０】
４−２．菌体の温度安定性分析
前記分離された菌株の温度安定性を確認するために、前記実施例１で分離された菌株の菌体を１ｍＭマンガンイオンを添加した５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝溶液で浮遊させ、温度を５５℃または６０℃で２２時間熱衝撃を加えた。実施例３−１と同様な方法で最終果糖濃度４００ｇ／Ｌ、菌体濃度２０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌにして、５５℃で１時間さらに反応させた後、熱衝撃が加えられた時間別プシコース生産量をＨＰＬＣ分析を通じて測定してプシコース転換活性を得た。
【００４１】
前記得られた結果を図９に示した。図９に示されているように、５５℃で熱衝撃を加えた場合、熱衝撃を加えない場合のプシコース転換活性を比較した時、２２時間以後に相対活性が約５２％維持されることを確認した。６０℃では熱衝撃を加えた場合、２２時間以後に相対活性が１０％まで減少し、これによって活性の半減期は４５６分（７．６時間）に確認された。
【００４２】
４−３．プシコース生産性
前記で確立されたプシコース大量生産条件下で反応時間による最大生産性を確認した。前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度４０ｍｇ−ｄｃｗ／ｍｌ、５００ｇ／Ｌ果糖濃度およびｐＨ７．０条件下で、温度条件を４０、５０、または７０℃にして前記実施例３−１の方法を参照して反応を実施した。前記反応は６時間進行し、１時間間隔でプシコース生産性をＨＰＬＣ分析を通じて確認した。反応液は１００℃で５分間加熱して反応を停止させた。
【００４３】
前記得られた結果を図１０に示した。図１０に示されているように、反応温度が増加し時間が経過するほどプシコース生産性が増加し、特に７０℃、６時間後、プシコース最大生産性を示した（プシコース生産量：１３０．３ｇ／Ｌ；約２６％の転換率）。
【００４４】
４−４．初期ｐＨによるプシコース生産性
前記分離された菌株の初期ｐＨによるプシコース大量生産の可能性を確認するために緩衝溶液の代わりに蒸留水に基質を溶かし、ＨＣｌおよびＮａＯＨを用いて初期ｐＨを調整した。前記実施例３−１の方法を参照して、初期ｐＨを６．０、６．５、または７．０にして、１ｍＭマンガンイオン、果糖４００ｇ／Ｌ、前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度４０ｍｇ−ｄｃｗ／ｍｌ、および７０℃条件で０．４％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を添加して６時間反応を実施し、反応終了後、ＨＰＬＣ分析を通じてプシコース生産量を測定した。
【００４５】
前記得られた結果を図１１に示した。図１１に示したように、初期ｐＨ７．０である場合、緩衝溶液を使用しなくても反応６時間以後に９７．３ｇ／Ｌプシコースが生産されて２４．３％の転換率を示すことを確認した。
【受託番号】
【００４６】
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１１４０５Ｐ
受託日付：２０１３０３２９
【図１】
0006339680.tif 000004
【図２】
0006339680.tif 000005
【図３】
0006339680.tif 000006
【図４】
0006339680.tif 000007
【図５】
0006339680.tif 000008
【図６】
0006339680.tif 000009
【図７】
0006339680.tif 000010
【図８】
0006339680.tif 000011
【図９】
0006339680.tif 000012
【図１０】
0006339680.tif 000013
【図１１】
0006339680.tif 000014
【配列表】
0006339680000001.app