(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップa)並びにb)：
a) ニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞を、ニューロン分化のために該腫瘍細胞を刺激する条件下及び期間、培地で培養するステップであって、前記腫瘍細胞がSiMa細胞である、前記ステップ；並びに
b) a)のニューロン分化のために刺激した前記腫瘍細胞を、150〜240 mOsm/kgの重量モル浸透圧濃度を有し、且つ(i)B27サプリメント及び/又は(ii)N2サプリメントを含む分化培地で少なくとも3日間培養し、それにより神経毒素感受性のニューロン分化細胞を取得するステップ、
を含む、神経毒素感受性のニューロン分化細胞の作成のための方法。
【請求項２】
前記重量モル浸透圧濃度が180〜230 mOsm/kg又は200〜225 mOsm/kgである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分化培地がレチノイン酸をさらに含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記レチノイン酸が0.01 μM〜300 μMの濃度で存在する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記分化培地が抗生剤及び/又は非ニューロン細胞の増殖を阻害する細胞増殖抑制剤をさらに含み、且つ前記細胞増殖抑制剤がシトシン-1-β-D-アラビノフラノシド(AraC)である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記分化培地がGT1bをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記GT1bが25〜75 μMの濃度で、又は50 μMの濃度で存在する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ニューロン分化のために請求項１のa)において前記細胞を刺激する前記の条件及び期間が、前記培養培地からの血清の削減及び/又はレチノイン酸の添加を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍細胞がSiMa細胞(DSMZ ACC寄託番号：164)である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記のステップa)における培養培地が、80〜98.8％のOptiMEM、1〜10％のFBS、0.2〜5％のB27サプリメント及び/又は0.2〜5％のN2サプリメントを含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記のステップa)における培養培地が、非必須アミノ酸及び/又は抗生物質をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記のステップb)における分化培地が、150〜240 mOsm/kgの重量モル浸透圧濃度を有する培地、1〜10％のFBS、0.5〜2％のGlutaMAX、0.2〜5％のB27サプリメント、及び/又は0.2〜5％のN2サプリメントを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記150〜240 mOsm/kgの重量モル浸透圧濃度を有する培地が78〜98.3％のニューロン基本培地である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記SiMa細胞をステップa)において少なくとも36時間培養する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記のステップa)における培養培地が、抗生剤及び/又は非必須アミノ酸(NEAA)をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記SiMa細胞を、ステップa)において、以下：ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、コラーゲン、ラミニン、及びゼラチンから成る群より選択される少なくとも1種の化合物でコーティングした組織培養皿で培養する、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法により取得可能な神経毒素感受性ニューロン分化細胞。
【請求項１８】
以下のステップa)〜c)：
a) 請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法により取得可能な神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、神経毒素ポリペプチドと接触させるステップ；
b) ステップa)の神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、前記神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮できる条件下で3〜74時間培養するステップ；及び
c) ステップb)による培養後の前記細胞における前記神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定するステップ、
を含む、神経毒素ポリペプチドの活性を決定する方法。
【請求項１９】
前記ステップb)における培養時間が72時間である、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下のステップa)ならびにb)：a)ニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞を、ニューロン分化のために該腫瘍細胞を刺激する条件下および期間、培地で培養するステップ；ならびにb)a)のニューロン分化のために刺激した該腫瘍細胞を、100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有し、かつ(i)B27サプリメントおよび／または(ii)N2サプリメントを含む分化培地で少なくとも3日間培養し、それによって神経毒素感受性ニューロン分化細胞を取得するステップを含む、神経毒素感受性ニューロン分化細胞の作成のための方法に関係するものである。本発明はさらに、本発明の方法により取得可能な神経毒素感受性ニューロン分化細胞に関するものである。加えて、本発明は、以下のステップa)〜c)：a)本発明の方法により取得可能な神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、神経毒素ポリペプチドと接触させるステップ；b)ステップa)の神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮できる条件下で3〜74時間または72時間培養するステップ；およびc)ステップb)による培養後の該細胞における神経毒素ポリペプチドの該活性を決定するステップを含む、神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定する方法を包含するものである。最後に、本発明は、OptiMEM、FBS、B27サプリメント、およびN2サプリメントを含む培地を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)および破傷風菌(Clostridium tetani)は、非常に強力な神経毒素、すなわちボツリヌス毒素(BoNT)および破傷風毒素(TeNT)をそれぞれ産生する。これらのクロストリジウム神経毒素(CNT)はニューロン細胞に特異的に結合して神経伝達物質放出を遮断する。各毒素は、不活性な、プロセシングされていない約150 kDaの一本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセシングは、ジスルフィド架橋の形成および細菌性プロテアーゼ(複数可)による限定加水分解(ニッキング)を伴う。活性な神経毒素は、ジスルフィド結合により連結された、約50 kDaのN-末端軽鎖と約100 kDaの重鎖との2つの鎖からなる。CNTは、構造上および機能上、3つのドメイン、すなわち触媒軽鎖と、移行ドメイン(N-末端側の半分)および受容体結合ドメイン(C-末端側の半分)を含む重鎖とからなる；例えば、Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39；Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41；Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49を参照されたい。ボツリヌス神経毒素は、150 kDaの神経毒素タンパク質とこれに結合した無毒タンパク質を含む分子複合体として合成される。該複合体のサイズはクロストリジウム菌株および別個の神経毒素血清型によって異なり、300 kDa、500 kDa超、および900 kDaである。これらの複合体中の無毒タンパク質は、神経毒素を安定化して該神経毒素を分解から保護している；Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19 - S26を参照されたい。
【０００３】
ボツリヌス菌は、A〜Gと命名された7種の抗原性の異なる血清型のボツリヌス神経毒素(BoNT)を分泌する。全ての血清型は、破傷風菌により分泌される関連破傷風神経毒素(TeNT)と共に、SNAREタンパク質を切断することによりシナプス開口分泌を遮断するZn2+-エンドプロテアーゼである；Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759を参照されたい。CNTはボツリヌス中毒および破傷風に見られる弛緩性筋麻痺を引き起こす；Fischer 2007, PNAS 104, 10447を参照されたい。
【０００４】
その毒作用にもかかわらず、ボツリヌス毒素複合体は多くの疾患において治療薬として使用されている。ボツリヌス毒素血清型Aは、斜視、眼瞼痙攣、および他の障害の治療のために、1989年に米国でヒトへの使用が認可された。これは、ボツリヌス毒素A(BoNT/A)タンパク質製剤として、例えば、商品名BOTOX(Allergan, Inc.)で、または商品名DYSPORT/RELOXIN(Ipsen, Ltd)で市販されている。改良された、複合体を含まないボツリヌス毒素A製剤は、商品名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals, GmbH)で市販されている。治療用途の場合、該製剤を治療すべき筋肉に直接注入する。生理学的pHでは、該毒素がそのタンパク質複合体から放出されて所望の薬理作用が生じる。ボツリヌス毒素の効果は一時的なものに過ぎず、これが、治療効果を維持するためにボツリヌス毒素の反復投与が必要となりうる理由である。
【０００５】
クロストリジウム神経毒素は随意筋の筋力を弱めるものであり、また斜視、局所性ジストニア、例えば頸部ジストニア、および良性本態性眼瞼痙攣の有効な治療法である。それらはさらに、片側顔面痙攣、および限局性痙縮を軽減すること、さらには、広範な他の適応症、例えば、胃腸障害、多汗症、および美容目的のシワ取りに有効であることが示されている；Jost 2007, Drugs 67, 669を参照されたい。
【０００６】
クロストリジウム神経毒素の製造工程中は、該神経毒素の定性的および定量的測定ならびに生物学的に活性な神経毒素ポリペプチドの品質管理が特に重要である。加えて、行政機関は、簡単で、信頼性があり、かつ有効性が認められたボツリヌス毒素活性アッセイしか認めない。現時点では、マウスLD50バイオアッセイ、致死試験が依然として製薬業者が自らの製剤の効力を分析するために利用する「ゴールドスタンダード」とされている；Arnonら(2001), JAMA 285, 1059-1070を参照されたい。しかし、近年は、動物実験の必要性、ならびにこのタイプの動物ベースのアッセイに関連する不都合な点、コストおよび倫理的懸念の全てを軽減するための代替アプローチを探し出すために、相当な努力がなされている。加えて、監督機関は、ボツリヌス神経毒素の効力試験に3つの「R」の原則：「削減する、軽減する、代替法を用いる(Reduce, Refine, Replace)」を適用することを製薬会社に約束させている；Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313を参照されたい。結果として、生きた動物を用いる方法の合理的な代替案を提供するために、細胞ベースの試験系が開発された。しかし、今のところ、神経毒素の生物学的活性の決定に利用できるのは、神経毒素ポリペプチドに対して十分に感受性を示すことが証明されている3種の細胞試験系のみである。これらの細胞ベースの試験系は、齧歯動物の胚から単離したin vitroで分化させる初代ニューロン(Pellettら(2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392)、ニューロン分化誘導多能性幹細胞(Whitemarshら(2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35)、およびSiMa細胞系のサブクローン(WO 2010/105234 A1)の利用を含む。
【０００７】
しかし、初代ニューロンの単離は動物の殺傷を必要とし、また面倒な上に時間がかかる。さらに、種々の初代ニューロンを使用する試験系は大きなばらつきを示す。同様に、ニューロン分化誘導多能性幹細胞の作成は難しく、また時間がかかる。加えて、かかる細胞の保管には非常に問題が多い。腫瘍細胞系を使用するアッセイは、BoNTに対して十分な感受性を示さないことが頻繁にある。その上、該腫瘍細胞系には複雑な分化プロトコールが必要とされるため、この細胞系を使用するアッセイのばらつきが大きくなり、かつ／または失敗率が高くなる。
【０００８】
上記内容を考慮すると、行政機関に認められ、かつ動物ベースの試験系の代替案を提供する、神経毒素ポリペプチド活性の決定のためのさらなる試験系が非常に望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO 2010/105234 A1
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39
【非特許文献２】Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41
【非特許文献３】Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49
【非特許文献４】Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19 - S26
【非特許文献５】Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759
【非特許文献６】Fischer 2007, PNAS 104, 10447
【非特許文献７】Jost 2007, Drugs 67, 669
【非特許文献８】Arnonら(2001), JAMA 285, 1059-1070
【非特許文献９】Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313
【非特許文献１０】Pellettら(2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392)
【非特許文献１１】Whitemarshら(2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の根底にある技術的課題は、前述の必要性を満たす手段および方法の提供とみなすことができる。この技術的課題は、特許請求の範囲および以下本明細書中で特徴付けられる実施形態により解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、第1の態様では、以下のステップa)ならびにb)：
a)ニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞を、ニューロン分化のために該腫瘍細胞を刺激する条件下および期間、培地で培養するステップ；ならびに
b)a)のニューロン分化のために刺激した前記腫瘍細胞を、100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有し、かつ(i)B27サプリメントおよび／または(ii)N2サプリメントを含む分化培地で少なくとも3日間培養し、それによって神経毒素感受性ニューロン分化細胞を取得するステップ
を含む、神経毒素感受性ニューロン分化細胞の作成のための方法に関する。
【００１３】
本発明のこの方法では、ニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞を、最初に、ニューロン分化のために該腫瘍細胞を刺激する条件下および期間、細胞培養培地で増殖させる。その後、こうしてニューロン分化のために刺激した該腫瘍細胞を、100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する分化培地に移し入れる。さらに、この分化培地は少なくとも(i)B27サプリメントおよび／または(ii)N2サプリメントを含む。あるいは、該分化培地は、B27サプリメントおよび／またはN2サプリメントの代わりにNS21サプリメントを含みうる。該分化培地での培養は少なくとも3日間実施する。それによって、神経毒素-感受性ニューロン分化細胞を取得する。好ましくは、該分化培地はニューロン基本培地（Neurobasal medium）を含む。
【００１４】
本発明のこの新規分化方法またはプロトコールの結果として、後述の実施例において詳細に示すように、神経毒素ポリペプチドに対して有意に改善された感受性を呈する神経毒素感受性ニューロン分化細胞が取得される。
【００１５】
クロストリジウム神経毒素は、それらがシナプス前神経終末からの神経伝達物質の分泌を特異的に阻害するという点を特徴とする。末梢ニューロンに対するこの選択性は、2つの異なる受容体、SV2およびGT1bの認識により媒介される。前記神経毒素の生理学的作用は、該受容体の結合と該神経毒素の軽鎖の移行後に生じる、いわゆるSNARE複合体のタンパク質の切断に基づくものである。BoNTの生物学的活性の決定は、この神経毒素タンパク質の特徴付けにおける重要な側面であり、また、特に、BoNT含有製品の認可に際して規制当局により義務付けられている。BoNTの生物学的活性の測定のための信頼性のある試験は、それ故に、BoNTを含有する製品の研究、開発およびマーケティングの基盤である。さらに、細胞ベースの試験系は、倫理的理由から、これまで主流であった動物実験に取って代わるだろう。かかる細胞ベースの試験系を確立するためには、ボツリヌス神経毒素に対するニューロン細胞または細胞系の十分に高い感受性が不可欠である。しかし、そうした高い感受性を得るためには、今のところ、ニューロン細胞系の面倒な分化方法が必要とされている。結果として、ごく少数の細胞ベースの試験系しかまだ利用できない。医薬製品中のボツリヌス毒素の生物学的活性を決定するためには、ニューロン細胞または細胞系は以下の性質を有しているべきである：第1に、該細胞は、その標的、すなわちヒト受療者に出来るだけ忠実に似せるために、ヒトの、ニューロン起源のものとすべきである。第2に、該細胞系は、最終製品中の賦形剤に対して、および好ましくは、生産工程の中間段階における不純物に対しても、ロバストなものとすべきである(工程管理)。第3に、前記の細胞ベースの試験系は、バイアル中のBoNTの生物学的活性(例えば、50U BoNT/A)の正確な決定を可能にするダイナミック測定レンジを呈するものとすべきである。賦形剤の溶解度、細胞培養培地の量などといった技術的要素を考慮すると、1 pM未満のBoNT濃度が正確に決定されなければならない。本発明者らの知る限りの知識によれば、今のところ、BoNTに対して十分に高い感受性を示す細胞ベースの試験系はわずか3種しか利用できない。これらのものとしては、本明細書中の他の箇所で既に述べたように、齧歯動物由来の胚の初代ニューロン、ニューロン分化誘導多能性幹細胞、およびSiMa細胞系のサブクローンが挙げられる。しかし、これらの細胞系は、しばしば大きなばらつきを伴う複雑で面倒な分化プロトコールの後にのみ、十分に高い感受性を呈することが報告されている。それに対して、本発明は、前述の要件を満たしかつ当分野で記載されている細胞試験系と比較するとさらに改善されている、ボツリヌス神経毒素(BoNT)の生物学的活性の測定のための簡単で信頼性があり、かつロバストな細胞ベースの試験系を提供する。
【００１６】
より具体的には、SiMa(ヒト神経芽細胞腫)およびP19(マウス胚性癌腫)腫瘍細胞を最初に先行技術において記載されているように培養し、次いで、本明細書中の他の箇所および後述の実施例中に記載したように、マルチウェルプレートに播種してからニューロン分化のために刺激した。後の新規分化ステップでは、細胞培養培地を、低い重量モル浸透圧濃度、例えば100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する培地を含む分化培地と置き換えた。低い重量モル浸透圧濃度を有するかかる培地の一例はニューロン基本培地である。培地を新鮮培地と取り替えた分化の期間(例えば、3〜7日)後、妥当であれば、神経毒素ポリペプチドを前記細胞培養培地に添加した。さらには、GT1bを、本発明の方法においてBoNTに対する感受性の増強剤として使用した。例えば、50μMのGT1bを、神経毒素ポリペプチドによる前記細胞の中毒の際、および／または中毒に先立って、前記ニューロン基本培地に添加した。神経毒素ポリペプチドとのさらなる72時間のインキュベーション後、前記細胞を停止させてから、該神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を解析した。結果として、BoNTに対する前記細胞の感受性の有意な増加が見出された。
【００１７】
驚いたことに、後述の実施例で実証した通り、前記分化培地の低い重量モル浸透圧濃度が、本発明の方法により製造された神経毒素感受性ニューロン分化細胞のBoNTに対する増加した感受性の原因であることが、本発明者らにより見出された。この知見は、最終的に本発明の方法に行き着いた実験の履歴から明らかなように、自明のものではなかった：当初、本発明者らは、MEM＋N2サプリメント＋B27サプリメントを含む、当分野で記載されている分化培地を使用した；実施例中の分化培地2を参照されたい。この分化培地により達成することができたBoNTに対するニューロン分化細胞の感受性は、約1〜2 pMであった。次の段階では、レチノイン酸の添加はニューロン分化細胞のBoNTに対する感受性を少ししか増加させないことが見出された。それに対して、約7〜10倍に有意に改善された感受性を、ニューロン基本培地の使用により達成することができた。例えば、本発明の方法において、ニューロン基本培地＋2％のB27サプリメント＋1％のGlutaMAX＋3マイクロモルのレチノイン酸(RA)を含む分化培地を使用した場合、SiMa細胞に関して0.22ピコモル(2.18×10-13 mol／L)のEC50が見出された。さらに、該分化培地においては、ニューロン基本培地が含まれている限り、ニューロン分化細胞の改善された感受性にとってレチノイン酸は必須ではないことを示すことができた。意外なことに、本発明者らは、225 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度まで希釈されてさえいれば、本発明者らが一連の実験の開始時に使用した当分野で記載されている分化培地(MEM＋N2サプリメント＋B27サプリメントを含有する分化培地)を使用することによっても、改善された感受性が達成されることを実証できた。それに対して、前述の成分を含有する非希釈分化培地は、300 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有していた。従って、本発明の方法により製造される神経毒素感受性ニューロン分化細胞のBoNTに対する増加した感受性は、その分化培地の低い重量モル浸透圧濃度の結果である。改善された感受性に加えて、前記の本発明の新規分化プロトコールは、当分野で公知の方法と比較して、神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を試験する上でのより高い精度およびロバストネスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書中で使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上他に明確に指示しない限り、単数と複数の両方の指示対象を含む。例として、「細胞(a cell)」は1個または2個以上の細胞を指す。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、記載した項目、数、百分率、または期間の値を修飾している場合、その記載した項目、数、百分率、または期間の値のプラスまたはマイナス10パーセント、9パーセント、8パーセント、7パーセント、6パーセント、5パーセント、4パーセント、3パーセント、2パーセントまたは1パーセントの範囲を指す。好適なのは、プラスまたはマイナス10パーセントの範囲である。
【００２０】
本明細書中で使用する「含む(comprising)」、「含む(comprises)」および「からなる(comprised of)」という用語は、「含む(including)」、「含む(includes)」または「含有する(containing)」、「含有する(contains)」の同義語であり、また包括的であるかまたは幅広い解釈が可能であって、追加の、再引用されたものではないメンバー、要素または方法ステップを除外するものではない。明らかに、「含む(comprising)」という用語は「からなる(consisting of)」という用語を包含する。より具体的には、本明細書中で使用する「含む(comprise)」という用語は、その主張が、記載されている要素または方法ステップを全て包含するが、追加の、不特定の要素または方法ステップもまた含みうることを意味する。例えば、ステップa)、b)およびc)を含む方法は、その最も狭い意味では、ステップa)、b)およびc)からなる方法を包含する。「からなる」という句は、その組成物(または装置、または方法)が、列挙されている要素(またはステップ)だけを有することを意味する。それに対して、「含む」という用語は、ステップa)、b)およびc)に加えてさらなるステップ、例えば、ステップd)およびe)を含む方法もまた包含しうる。
【００２１】
「濃度0.1〜0.5マイクロモルのレチノイン酸」などの数値範囲を本明細書中で使用する場合、その範囲には0.1〜0.5マイクロモルだけでなく、0.1〜0.5マイクロモル内の任意の数値、例えば、0.2、0.3および0.4マイクロモルも含まれる。
【００２２】
本明細書中で使用する「in vitro」という用語は、動物またはヒトの身体の外部、または外側を表している。本明細書中で使用する「in vitro」という用語は、「ex vivo」を含むものと理解されたい。「ex vivo」という用語は、典型的には、動物またはヒトの身体から取り出し、かつ該身体の外部で(例えば、培養容器中で)維持するかまたは増殖させた組織または細胞を指す。本明細書中で使用する「in vivo」という用語は、動物またはヒトの身体の内部、または内側を表している。
【００２３】
本明細書中で使用する「神経毒素感受性細胞」という用語は、神経毒素ポリペプチドに特徴的な生物学的特性、すなわち、(a)受容体結合、(b)インターナリゼーション、(c)サイトゾル内へのエンドソーム膜を通過する移行、および／または(d)シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質のタンパク質内部分解的(endoproteolytic)切断、を呈する神経毒素ポリペプチドの影響を受けやすい細胞を意味する。従って、本明細書中で言及する「神経毒素感受性細胞」は、神経毒素中毒になりやすい。より具体的には、本明細書中に示す「神経毒素中毒になりやすい」は、神経毒素ポリペプチド(例えば、BoNT/A)が神経毒素基質(例えば、BoNT/A基質SNAP-25)を切断するその全細胞性機構を経ることができる細胞を意味しており、またその対応受容体への神経毒素の結合(例えば、BoNT/A受容体へのBoNT/Aの結合)、神経毒素／受容体複合体のインターナリゼーション、細胞内小胞から細胞質への神経毒素軽鎖の移行、および神経毒素基質のタンパク質分解的切断を包含している。神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定するためのアッセイは当分野で周知であり、また本明細書中の他の箇所にも記載されている(例えば、Pellettら、WithemarshらToxicological Sciences 126(2), 426-435 (2012)、WO 2010/105234 A1を参照されたい)。当業者には理解されるように、神経毒素感受性細胞は、好ましくは、まず神経毒素を取り込むことが可能であり、かつその後で先に挙げた全細胞性機構を経るものである。本明細書中で使用する神経毒素感受性細胞は、例えば、約100ナノモル(nM)、約10 nM、約1 nM、約500ピコモル(pM)、約400 pM、約300 pM、約200 pM、約100 pM、約90 pM、約80 pM、約70 pM、約60 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約20 pM、約10 pM、約9 pM、約8 pM、約7 pM、約6 pM、約5 pM、約4 pM、約3 pM、約2 pM、約1 pM、約0.5 pM、もしくは約0.1 pMの神経毒素ポリペプチド、またはここに示した値のうちの1つよりもさらに少量を取り込むことができる。100 pMを超えるEC50値が文献に報告されている。定義によれば、神経毒素中毒になりやすい細胞は、少なくとも1種の神経毒素受容体および少なくとも1種の神経毒素基質を発現しなければならないか、または発現するよう操作されていなければならない。神経毒素の受容体および基質については当分野で記載されている。従って、前記細胞は、好ましくは、本明細書中で定義したように、生物学的に活性であるかまたは成熟した神経毒素ポリペプチドの影響を受けやすいものである。本明細書中で使用する「神経毒素感受性細胞」という用語は、細胞または細胞系、例えば、単離された、初代細胞もしくはその細胞系または樹立細胞系の細胞または樹立細胞系、好ましくは本明細書中で定義した神経芽細胞腫細胞もしくは神経芽細胞腫細胞系を含む。好ましくは、本明細書中で使用する「神経毒素感受性細胞」は、例えば、約1 nMまたはそれ未満、500 pMもしくはそれ未満、約400 pMもしくはそれ未満、約300 pMもしくはそれ未満、約200 pMもしくはそれ未満、約100 pMもしくはそれ未満、約90 pMもしくはそれ未満、約80 pMもしくはそれ未満、約70 pMもしくはそれ未満、約60 pMもしくはそれ未満、約50 pMもしくはそれ未満、約40 pMもしくはそれ未満、約30 pMもしくはそれ未満、約20 pMもしくはそれ未満、約10 pMもしくはそれ未満、約9 pMもしくはそれ未満、約8 pMもしくはそれ未満、約7 pMもしくはそ��未満、約6 pMもしくはそれ未満、約5 pMもしくはそれ未満、約4 pMもしくはそれ未満、約3 pMもしくはそれ未満、約2 pMもしくはそれ未満、約1 pMもしくはそれ未満、約0.9 pMもしくはそれ未満、約0.8 pMもしくはそれ未満、約0.7 pMもしくはそれ未満、約0.6 pMもしくはそれ未満、約0.5 pMもしくはそれ未満、約0.4 pMもしくはそれ未満、約0.3 pMもしくはそれ未満、約0.2 pMもしくはそれ未満で、または約0.1 pMもしくはそれ未満でさえ神経毒素中毒になりやすい。例えば、本発明の新規分化方法を利用すると、SiMa細胞に関しては0.1 pM未満という極端に低いEC50値に達し、またP19細胞に関しては1 pM未満というEC50に達した。当分野で知られているように、「半最大有効濃度(EC50)」は、ある特定の曝露時間後にベースラインと最大値の中間の反応を誘導する薬物、抗体または毒物の濃度を指す。これは薬物の効力の尺度として一般に使用されている。段階的(graded)用量反応曲線のEC50は、それ故に、化合物の最大効果の50％が観察される該化合物の濃度を表している。素量的(quantal)用量反応曲線のEC50は、特定の曝露期間後に母集団の50％が反応を呈する化合物の濃度を表している。
【００２４】
神経毒素中毒になりやすい細胞または細胞系および／または神経毒素取込み能力を有する細胞または細胞系、すなわち本明細書中で定義した神経毒素感受性細胞の同定のための方法は当分野で公知である；例えばUS 2012/0122128 A1を参照されたい。神経毒素ポリペプチドの生物学的活性は、ある態様では、前述の生物学的特性全てに起因する。本明細書中の他の箇所に示したように、神経毒素の生物学的活性の決定のために使用しうる、神経毒素に対する十分に高い感受性を有するごく少数の細胞ベースのアッセイが、これまでに先行技術において記載されている。神経毒素の生物学的活性を評価するためのin vivoアッセイとしては、例えば、既に述べたマウスLD50アッセイならびにPearceらおよびDressierらにより記載されたex vivoマウス片側横隔膜アッセイが挙げられる；Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128：69-77およびDressier 2005, Mov. Disord. 20：1617-1619を参照されたい。本発明の方法は、複雑な分化プロトコールを必要とする、当分野で記載されている細胞試験系と比較して、神経毒素ポリペプチドに対する感受性が増加した、簡単で、信頼性があり、かつロバストな細胞ベースの試験系を提供する。従って、本発明の方法は、神経毒素の生物学的活性を決定するための、当分野の細胞試験系または動物実験の改善された代替案を提供する。当業者には公知であるように、神経毒素の生物学的活性は一般にマウス単位(MU)で表される。1 MUは、腹腔内注射後に特定のマウス集団の50％を殺す神経毒素成分の量、すなわちマウスi.p. LD50である。
【００２５】
本明細書中で使用する「分化」、「分化する」または「分化した」という用語は、特殊化していないか、または相対的により特殊化していない細胞が、相対的により特殊化した状態になる過程を表している。細胞の個体発生との関連においては、形容詞「分化した」は相対語である。従って、「分化細胞」は、ある特定の発生経路を、比較されている細胞よりもさらに先に進んでいる細胞である。分化細胞は、例えば、最終分化した細胞、すなわち、生体の様々な組織および臓器における特殊機能を担う十分に特殊化した細胞であってよく、また有糸分裂後のものであってもよいが、そうである必要はない。別の例では、分化細胞は、さらに増殖および／または分化しうる、ある分化系統内の前駆細胞であってもよい。同様に、細胞は、該細胞が比較されている細胞よりもある特定の発生経路をさらに先に進んでいる場合には「相対的により特殊化した」ものであり、後者の細胞はそれ故に「特殊化していない」かまたは「相対的により特殊化していない」と見なされる。相対的により特殊化した細胞は、前記の特殊化していないかまたは相対的により特殊化していない細胞とは、1つまたはそれ以上の実証可能な表現型の特徴、例えば、特定の細胞性成分または生成物(例えば、RNA、タンパク質、特異的細胞性マーカーもしくは他の物質)の存在、不在もしくは発現レベル、ある特定の生化学的経路の活性、形態学的外観、増殖能力および／もしくは動態、分化能ならびに／または分化シグナルへの応答などの点で異なっていてもよく、ここでかかる特徴は、相対的により特殊化した細胞の、その発生経路に沿ったさらなる進行を意味するものとする。
【００２６】
本明細書中で使用する「ニューロン分化細胞」という用語は、最終的なニューロン分化状態に到達した細胞を意味する。例えば、本発明の方法で使用するマウス胚性癌腫細胞であるP19細胞は、それらがさらにニューロンに分化する前に、まずニューロン前駆細胞に分化する。このニューロン分化プロセスの後に、例えば、表現型的に(位相差顕微鏡法)および／またはニューロン分化マーカーの発現を行うことができる；例えば、Babuskaら(2010), Prague Medical Report 111, 289-299またはMiglioreおよびShepherd, Nature Reviews Neuroscience 6, 810-818 (2005)を参照されたい。前記ニューロン分化マーカーの発現の決定のために利用できるアッセイとしては、例えば、当分野では公知であるPCR、RT-PCR、ノーザンブロット、ウェスタンブロットまたはドットブロット、免疫沈降解析、酵素結合免疫吸着分析(ELISA)またはFACS解析が挙げられる；例えば、Sambrook, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 第3版、2001を参照されたい。ニューロン分化細胞のさらなる特徴を試験するためのアッセイもまた当分野では公知である。
【００２７】
本明細書中で使用する「ニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞」という用語は、例えば、神経芽細胞腫細胞、胚性癌腫細胞、奇形腫細胞、神経ハイブリッド細胞(例えばニューロン×膠芽腫細胞)、または線維芽細胞腫細胞を意味する。本発明の方法は、マウスおよびヒトの腫瘍細胞、すなわち、それぞれP19(マウス胚性癌腫)細胞およびSiMa(ヒト神経芽細胞腫)細胞を使用して例示されている。
【００２８】
本明細書中で使用する「神経芽細胞腫」という用語は、身体の幾つかの部位に見られる神経細胞から発生する癌を意味する。神経芽細胞腫は、最も一般的には、神経細胞と同様の起源を有しかつ腎臓の上に位置する副腎の内部および周辺に生じる。しかし、神経芽細胞腫は、神経細胞群が存在する腹部の他の部位ならびに胸部、頸部および骨盤部でも発生する。本明細書中で使用する「神経芽細胞腫細胞」という用語には、神経毒素感受性でありかつニューロン細胞に分化する能力がある1種またはそれ以上の神経芽細胞腫細胞が含まれる。神経芽細胞腫細胞は初代神経芽細胞腫細胞または初代神経芽細胞腫細胞系でありうる。この用語には樹立神経芽細胞腫細胞または細胞系もまた包含される。神経芽細胞腫細胞は哺乳動物の神経芽細胞腫細胞、例えば、齧歯動物の神経芽細胞腫細胞(例えば、ラットまたはマウスの神経芽細胞腫細胞)でありうるが、サル神経芽細胞腫細胞(例えば、アカゲザル、マカク、もしくはカニクイザルの神経芽細胞腫細胞)または霊長類動物の神経芽細胞腫細胞(例えば、チンパンジー神経芽細胞腫細胞もしくは、好ましくは、ヒト神経芽細胞腫細胞)でもありうる。樹立神経芽細胞腫細胞系の具体例には、例えば、Neuro-2a(マウス神経芽細胞腫)、Kelly(ヒト神経芽細胞腫)、SH-SY5Y(ヒト神経芽細胞腫)またはSiMa(ヒト神経芽細胞腫)が含まれる。神経毒素感受性ニューロン分化細胞を作成するためには、本発明の方法においてヒト神経芽細胞腫細胞を使用することが好ましい。より好ましくは、本明細書中で定義した神経芽細胞腫細胞は、SiMa細胞またはSiMa細胞系である。これは、SiMa細胞はBoNT-感受性形態で移送しやすいからである。加えて、それらはBoNTに対する高い感受性を有している。その上、SiMa細胞のための分化プロトコールは、他の神経芽細胞腫細胞または細胞系と比較すると、簡単でありかつかなり短い。本発明の方法で使用するSiMa細胞は、親SiMa細胞または該細胞に由来する(サブ)クローンでありうる。
【００２９】
前述の本発明の方法のステップa)においては、「培養する」は、本明細書中で定義したニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞の、ニューロン分化のために該腫瘍細胞を刺激する条件下および期間の、細胞培養培地での培養を意味する。細胞分化プロセスにおいて使用する「刺激する(priming)」という用語は当分野では公知である；例えばKhooら、PLOS ONE 6(5)：e19025, (2011)；Steindler, ILAR Journal 48(4), 323-338 (2007)；VazeyおよびConnor, Stem Cell Research & Therapy 1：41 (2010) を参照されたい。本明細書中で使用する「ニューロン分化のために腫瘍細胞を刺激する」とは、本明細書中で定義した腫瘍細胞を、指示された細胞培養条件、時間および細胞培養培地によりニューロン分化のために誘導することを意味する。ニューロン分化のための腫瘍細胞の該刺激は、例えば、適当な細胞培養培地での培養により、および、場合によっては、細胞培養培地中の血清の削減および／またはレチノイン酸の添加により、実施することができる。当業者には公知であるように、腫瘍細胞の分化状態(該腫瘍細胞を「ニューロン分化のために誘導した」状態または「ニューロン分化のために刺激した」状態)は、例えば、本明細書中の他の箇所に明記したように、ニューロン誘導マーカーの発現を特徴とする。しかし、当業者には明らかであるように、腫瘍細胞のこの「刺激した」または「誘導した」分化状態は、本明細書中の他の箇所に明記した特徴により定義される該腫瘍細胞の最終的なニューロン分化状態をまだ表してはおらず、ニューロン分化系統におけるそれ以前の分化段階を表している。本発明の分化方法のステップb)を実施して初めて、腫瘍細胞は最終的に分化する、すなわち、本明細書中で定めたニューロン分化細胞となる。本明細書中で定義した腫瘍細胞の、ニューロン分化のために該腫瘍細胞を刺激する条件下および期間の培養培地での培養は、該腫瘍細胞を適当な細胞培養培地において37℃で12時間〜7日間、好ましくは24時間〜6日間、より好ましくは36時間〜5日間培養することを意味しており、このことは当分野では公知である。ニューロン分化のために該腫瘍細胞を刺激する際に使用しうる適当な細胞培養培地(本明細書中では「刺激培地(priming medium)」とも記す)としては、例えば、OptiMEM、MEMalpha、RPMI-1640、最少必須培地(MEM)、ハムF12培地、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)またはDMEM：F12(1：1)が挙げられる。該刺激培地は、当分野で公知のさらなる成分、例えば、血清(例えばFBS)、NEAA、レチノイン酸、増殖因子(例えばNGFもしくはFGF)、ビタミン、脂肪酸、ホルモンおよび／または抗生物質を含みうる。ニューロン分化のためにSiMa細胞を刺激する際の適当な細胞培養培地は、例えば、80〜98.6％のOptiMEM、1〜7.5％のFBS、0.2〜5％のB27サプリメント、0.2〜5％のN2サプリメント、および、場合によっては、0.1〜2.5％の非必須アミノ酸(NEAA)を含む。都合の良いことに、後述の実施例に示す通り、92.5％のOPTI-MEM(登録商標)、5％のFBS、1％の非必須アミノ酸、1％のB-27サプリメントおよび0.5％のN-2サプリメントを含む細胞培養培地はSiMa細胞の刺激に特に適していることが、本発明者らにより見出されている。ニューロン分化のためにSiMa細胞を刺激する場合、好適な培養期間は12時間〜5日間である。好ましくは、SiMa細胞の刺激は、後述の実施例に示すような細胞培養条件下で実施する。P19細胞の刺激の場合、例えば、90〜99.8％のMEM-alpha、0.2〜10％のFBS、および0.001〜10マイクロモル(μM)のレチノイン酸(RA)、好ましくは0.1 μMのRAを使用することができる。この際、培養期間は好ましくは3日間〜7日間である。
【００３０】
本発明の神経毒素感受性ニューロン分化細胞の作成のための方法のステップb)において使用する用語「分化培地」は、100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する細胞培養培地である。好ましくは、該分化培地の重量モル浸透圧濃度は、120〜250 mOsm／kg、より好ましくは150〜240 mOsm／kg、より一層好ましくは180 mOsm／kg〜230 mOsm／kg、最も好ましくは200〜225 mOsm／kgであり、また最も好適なのは約225 mOsm／kgである。本明細書中の他の箇所および後述の実施例において明記したように、本発明者らは、驚いたことに、分化培地の低い重量モル浸透圧濃度が本発明の方法により製造される神経毒素感受性ニューロン分化細胞のBoNTに対する増加した感受性の原因であることを見出した。例えば、培地配合物中のNaCl濃度の削減により、または水での培地の希釈により適当な重量モル浸透圧濃度に合わせれば、分化培地として、例えば、ニューロン基本培地、MEM、DMEM：F12または当分野で公知のあらゆる基本培地を使用することができる。さらに、該分化培地は、少なくとも1種のサプリメントを含む。該サプリメントは(i)B27サプリメント、(ii)N2サプリメント、(iii)NS21サプリメント、または(iv)その組み合わせでありうる。例えば、B27サプリメントは、N2サプリメントと組み合わせて使用することができる。B27サプリメントは当分野で公知であり、また一般に、ニューロンの増殖および維持のために使用されている。さらに、B27サプリメントは、例えばLife Technologiesから市販されている。典型的には、B27サプリメントを、本発明の方法において0.2％〜5％の濃度で使用することができる。N2サプリメント(例えば、Life Technologiesから入手可能)は、BottensteinのN-1製剤をベースとする、化学的に規定された組成の無血清サプリメントである。N2サプリメントは、末梢神経系(PNS)および中枢神経系(CNS)の両方に由来する初代培養における有糸分裂後ニューロンならびに神経芽細胞腫の増殖および発現の際に推奨される。N2サプリメントは、本発明の方法において0.2％〜5％の濃度で使用することができる。NS21サプリメントは、例えばChenらによる刊行物(Chenら(2008), Journal of Neuroscience Methods 171, 239-247)中に記載されているように、21種の異なる成分がニューロン培養のために使用されている、再規定されかつ変更されたB27サプリメントである。典型的には、NS21サプリメントを、本発明の方法において0.2％〜5％の濃度で使用する。先に言及した分化培地に使用するさらなる成分には、グルタミンもしくはGlutaMax、1種もしくはそれ以上の抗生剤、NEAA、FBS(0.1〜20％)、GT1b(0.1〜300 μM)、レチノイン酸(RA)(1ナノモル(nM)〜300 μM)、増殖因子(例えば、100 ng／mLのNGF、40 ng／mLのBDNF、40 ng／mLのCNTF、5 ng／mLのLIF、5 ng／mLのGDNF、TGFもしくはFGF)または当分野で公知のさらなる分化因子(1％のDMSO、1 mMのジブチリルcAMP、1 mMの酪酸塩、5 μg／mLのセレコキシブ、Y-27632、SB431542、ソニックヘッジホッグ(SHH)など)が含まれる。この本発明の方法のステップb)の細胞を、神経毒素感受性ニューロン分化細胞を取得するために前記分化培地で好ましくは少なくとも3日間培養する。培養は、より長期であってよく、例えば、少なくとも3.5日間、4日間、4.5日間、5日間、6日間、7日間(1週間)、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間(2週間)、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間(3週間)ま���はさらに長期であってもよい。好適なのは、P19腫瘍細胞の2〜3週間の培養、およびSiMa細胞の3日間〜7日間の培養である。ニューロン分化を可能にする好適な分化培地および細胞培養条件を後述の実施例に示す。好ましくは、前記ニューロン分化細胞は、本明細書中の他の箇所で定義した、最終的に分化したニューロン細胞である。
【００３１】
本明細書中で使用する「重量モル浸透圧濃度」という用語は、溶液1キログラム(kg)当たりの溶質のオスモル(Osm)数(osmol／kgまたはOsm／kg)と定義しうる、溶質濃度の尺度を意味する。溶液の重量モル浸透圧濃度は、通常はOsm／kgで表される。重量モル浸透圧濃度は、溶液の単位質量当たりの溶質粒子のオスモル数を測定したものである。容積モル浸透圧濃度は、溶媒1リットル当たりの溶質のオスモルの尺度(osmol／LまたはOsm／L)である。重量モル浸透圧濃度および容積モル浸透圧濃度は浸透圧計で決定することができる。
【００３２】
さらなる態様では、前述の本発明の方法は追加のステップを含みうる。例えば、この追加のステップは、本明細書中で定義した神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定するためのステップを含みうる。この目的のために、本発明の方法により取得されるかまたは取得可能である神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、まず神経毒素ポリペプチドと接触させる。本発明の方法に従って使用する「接触させる」という用語は、前述の細胞と神経毒素を、物理的および／または化学的および／または生物学的な相互作用が可能となるように物理的に近接させることを指す。該神経毒素は試料、好ましくは生物学的試料、例えば、細胞、細胞溶解物、血液、血漿、血清またはリンパ液に含まれている可能性がある。特異的相互作用を可能にする適切な条件は当業者には周知である。該条件は本発明の方法に適用する細胞および神経毒素に応じて異なり、また当業者であれば、さらなる手間を掛けることなく適合させることができる。その上、相互作用を可能にするのに十分な時間もまた、当業者が日常的な実験により決定することができる。例えば、本明細書中で定義した特定の量の単離もしくは組換え神経毒素ポリペプチドまたはその変異体、あるいは神経毒素ポリペプチドを含む試料を、神経毒素感受性ニューロン分化細胞に添加することができる。その後、該細胞を、該神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮できる条件下で少なくとも24時間、好ましくは48時間、より好ましくは72時間、該神経毒素ポリペプチドと共にインキュベートする。本明細書中で使用する「神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮できる条件」は、当分野で公知である。その後、該細胞を、例えば溶解緩衝液の添加により停止させてから、該神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を、例えば後述の実施例に示すように決定する。
【００３３】
本発明で使用する「神経毒素」、「神経毒素ポリペプチド」または「神経毒素タンパク質」という用語は、ボツリヌス神経毒素の7つの別個の血清型、すなわちBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、および破傷風神経毒素(TeNT)、ならびに本明細書中で定義したその変異体を指す。その対応する核酸およびアミノ酸配列は当分野で公知である；例えば、UniprotまたはTREMBL配列データベースを参照されたい。好ましくは、BoNT/Aを本発明の方法に使用する(WO 2009/114748)。前記神経毒素のための対応する受容体および基質については本明細書中の他の箇所で言及する。前記神経毒素ポリペプチドは、天然に存在する神経毒素、または天然には存在しない神経毒素でありうる。天然に存在する神経毒素ポリペプチド(例えば、翻訳後修飾によって産生されるアイソフォーム、選択的にスプライシングされた転写産物または自然突然変異およびサブタイプを含む)は、天然に存在するプロセスにより産生される。例えば、BoNT/Aサブタイプは、BoNT/A1サブタイプ、BoNT/A2サブタイプ、BoNT/A3サブタイプ、BoNT/A4サブタイプまたはBoNT/A5サブタイプである。天然に存在する神経毒素ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100またはそれ以上のアミノ酸残基が付加されているか、置換されているか、または欠失している、先に言及した配列を含む。天然に存在するBoNT/Aを含む市販の医薬組成物については導入部で既に述べた。天然には存在しない神経毒素ポリペプチドとは、その構造が人間による操作を利用して修飾されている、あらゆる神経毒素ポリペプチド(例えば、ランダム変異導入または合理的設計を利用する遺伝子操作により製造された改変アミノ酸配列を有する神経毒素ポリペプチド、および化学的合成により作成された神経毒素ポリペプチドを含む)を意味する。こうした天然には存在しない神経毒素ポリペプチドは当分野で記載されている。
【００３４】
本発明の別の態様では、前記神経毒素ポリペプチドは、本明細書中で定義したBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、または破傷風神経毒素のアミノ酸配列と少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有する。本発明で使用する場合、同一であるとは、最高の順序の一致が得られるように複数のアミノ酸配列を整列させた際の該アミノ酸配列の配列同一性を指す。これは、例えば、BLASTP、BLASTN、FASTA、Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215, 403などのコンピュータープログラムに体系化されている公表済みの技術および方法を利用することにより達成できる。そのパーセント同一性の値は、ある態様では、アミノ酸配列全体にわたって算出される。当業者であれば、種々の配列を比較するために、多様なアルゴリズムに基づく一連のプログラムを利用することができる。これに関しては、Needleman and WunschまたはSmith and Watermanのアルゴリズムが特に信頼性のある結果を与える。配列アラインメントを実行するためには、GCGソフトウェアパケット(Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)の一部である、プログラムPileUp(1987, J. Mol. Evolution 25, 351；Higgins 1989 CABIOS 5, 151)またはプログラムGapおよびBestFit(Needleman and Wunsch 1970, J Mol Biol 48；443；Smith and Waterman 1981, Adv. Appl. Math. 2, 482)を使用すべきである。パーセント(％)で先に列挙した前記の配列同一性の値は、本発明の一態様では、前記プログラムGAPを使用し、配列領域全体にわたり、以下の設定：Gap Weight：50、Length Weight：3、Average Match：10.000およびAverage Mismatch：0.000(これらの設定は、他に指定しない限り、常に配列アラインメントのための標準設定として使用するものとする)を用いて決定すべきである。前述の変異体は、本発明のある態様では前記の神経毒素の生物学的特性のうちの少なくとも1つを保持しているものとし、またある態様では本明細書中に列挙した神経毒素ポリペプチドの生物学的特性ポリペプチドの全てを保持しているものとすることは理解されよう。さらなる態様では、前記変異体は改善または改変された生物学的特性を有する神経毒素である場合があり、例えば、それらは酵素認識に関して改善された切断部位を含んでいてもよいし、または受容体結合もしくは先に指定した任意の他の性質に関して改善されていてもよい。
【００３５】
本明細書中で言及する神経毒素は、原則として、N-末端軽鎖およびC-末端重鎖を含む。該神経毒素は、「プロセシングされていない神経毒素ポリペプチド」と称される一本鎖前駆体分子として産生される。その後のプロセシングの結果として、「プロセシングされた神経毒素ポリペプチド」が得られる。このプロセシングされた神経毒素ポリペプチドは、神経毒素に特徴的な生物学的特性、すなわち、(a)受容体結合、(b)インターナリゼーション、(c)サイトゾル内へのエンドソーム膜を通過する移行、および／または(d)シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質のタンパク質内部分解的切断、を呈する。従って、プロセシングされた神経毒素ポリペプチドは、生物学的に活性であるかまたは成熟した神経毒素ポリペプチドと称される。該神経毒素ポリペプチドの生物学的活性は、ある態様では、本明細書中の他の箇所に明記したように、前述の生物学的特性の全てに起因する。
【００３６】
別の態様では、本発明の方法に合致する神経毒素ポリペプチドはキメラ分子であってもよい。該キメラ分子は、ある態様では、単一ドメインが置換されていてもよい。従って、別の態様では、その神経毒素の重鎖の一部分が、抗体のFcドメインの一部分と取り替えられている。
【００３７】
本明細書中で使用する「量」という用語は、例えば、神経毒素ポリペプチドの絶対量、該ポリペプチドの相対量または濃度、ならびにそれらと相関するかまたはそれらから導き出される任意の値またはパラメーターを包含する。
【００３８】
例えば、神経毒素ポリペプチドの「量を決定する」という用語は、例えば、該神経毒素ポリペプチドの絶対量、相対量または濃度を、定量的または半定量的な方法で測定することに関する。検出のための適切な尺度は当業者には周知である。神経毒素ポリペプチドの量の決定には、ある態様では、予め規定された量の神経毒素ポリペプチドを含む標準液を用いることによる前記方法の較正もまた必要であることは理解されよう。かかる較正を実行する手段は当業者には周知である。
【００３９】
本明細書中で使用する「神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定する」という用語は、神経毒素タンパク質の生物学的活性、すなわち、(a)受容体結合、(b)インターナリゼーション、(c)サイトゾル内へのエンドソーム膜を通過する移行、および／または(d)シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質のタンパク質内部分解的切断、を測定することを意味する。より具体的には、神経毒素(例えば、BoNT/A)が神経毒素基質(例えば、SNAP-25)を切断するその全細胞性機構は、該神経毒素のその対応受容体への結合(例えば、BoNT/AのBoNT/A受容体への結合)、該神経毒素／受容体複合体のインターナリゼーション、該神経毒素の軽鎖の細胞内小胞から細胞質内への移行および該神経毒素基質のタンパク質分解的切断を包含する。神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定するためのin vitroおよびin vivo アッセイは当分野で周知であり、また本明細書中の他の箇所に記載されている(例えば、Pellettら、Withemarshら Toxicol. Sciences 126(2), 426-435 (2012)、WO 2010/105234 A1)を参照されたい。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「神経毒素(ポリペプチド)活性に対する感受性」という用語は、非処理対照で検出されるシグナルまたはバックグラウンドシグナルを一貫して上回るシグナルをアッセイにより測定しうる最低用量を指す。
【００４１】
本発明の方法の一態様では、前述の本発明の方法のステップb)において使用する分化培地は、レチノイン酸をさらに含む。好ましくは、該レチノイン酸は、ニューロン基本培地中に0.01マイクロモル(μM)〜300 μMの濃度で存在する。より好ましくは、レチノイン酸は、P19腫瘍細胞の場合は0.1〜0.5 μMのレチノイン酸の濃度で、すなわち0.1、0.2、0.3、0.4または0.5 μMのレチノイン酸の濃度で存在し；またSiMa細胞の場合は1〜5 μM、すなわち1、2、3、4、または5 μMの濃度で、最も好ましくは3 μMの濃度で存在する。レチノイン酸は、神経芽細胞腫細胞を含むニューロン細胞の分化を誘導することができる公知の神経誘導因子である。本発明の方法のステップb)において使用する分化培地への低濃度のレチノイン酸の添加は、神経毒素ポリペプチドに対する前記の腫瘍細胞の感受性を有利に高めることが見出されている。
【００４２】
本発明の方法のさらなる態様では、ステップb)における前記分化培地は、抗生剤および／または非ニューロン細胞の増殖を阻害する細胞増殖抑制剤をさらに含む。抗生剤としては、例えば、ペニシリン-ストレプトマイシンを使用することができる。細胞増殖抑制剤としては、例えば、シトシン-1-β-D-アラビノフラノシド(AraC)を使用することができる。抗生剤の添加は細胞培養培地における細菌の増殖を阻止し、一方で細胞増殖抑制剤は非腫瘍／非ニューロン細胞の細胞成長および増殖を阻害するものであり、そうでなければ本発明の分化方法において前記腫瘍細胞が異常増殖する可能性がある。
【００４３】
本発明の方法のさらに別の態様では、ステップb)における前記分化培地は、GT1bをさらに含む。GT1bは、神経毒素と結合し、かつニューロンに対する該神経毒素の選択性を潜在的に媒介するガングリオシドである。従って、GT1bは、本発明の方法において前記腫瘍細胞内へのBoNT取り込みのための増強剤として使用することができる。好ましくは、該GT1bは、25〜75 μMの濃度で、すなわち25 μM、30 μM、35 μM、40 μM、45 μM、50 μM、55 μM、60 μM、65 μM、70 μMまたは75 μMの濃度で、より好ましくは50 μMの濃度で存在する。
【００４４】
本発明の方法のまた別の態様では、前記の本発明の方法のステップa)は、(細胞)培養培地からの血清の削減および／またはレチノイン酸の添加を含む細胞培養条件を含む。本明細書中で使用する「培養培地からの血清の削減」とは、例えば、血清の段階的削減、例えば、2〜5日の間隔で10％から5％、2.5％、1％、0％とする段階的削減を意味する。あるいは、血清含有細胞培養培地を、一段階で無血清細胞培養培地と取り替えることができる。血清に含有されている増殖因子の除去により、本明細書中で定義した前記腫瘍細胞の分化が可能となる。加えて、または別法として、本明細書中の他の箇所に明記したように、レチノイン酸を低濃度で前記培養培地に添加することができる。
【００４５】
本発明の方法の幾つかの態様では、前記のニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞は、例えば、DSMZ(German collection of Microorganisms and Cell cultures)からACC寄託番号：164で入手可能なSiMa細胞である。このSiMa細胞系DSMZ ACC 164は親SiMa細胞系としても知られている。本発明の方法で使用するSiMa細胞は、親SiMa細胞またはその(サブ)クローンでありうる。かかるサブクローンもまた当分野で公知である；例えば、WO 2010/105234, US 8,476,068 B2またはEster Fernandez-Salas, Joanne Wang, Yanira Molina, Jeremy B. Nelson, Birgitte P. S. Jacky, K. Roger Aoki - PloSOne；2012 7(11) e49516を参照されたい。
【００４６】
SiMa細胞はDMSZのプロトコールに従って培養することができる。ある態様では、SiMa細胞を、本発明の方法のステップa)においてニューロン分化のために該SiMa細胞を刺激する条件下および期間、細胞培養培地で培養することは、少なくともOptiMEM、FBS、B27サプリメント、N2サプリメントおよび、場合によってはNEAAを含む細胞培養(または増殖)培地における、37℃で少なくとも12時間(h)、少なくとも24時間または好ましくは少なくとも36時間の該SiMa細胞の培養を含む。
【００４７】
本発明の方法のある態様では、ステップa)におけるSiMa細胞用の培養培地または刺激培地は、80％〜98.8％のOptiMEM、1〜10％のFBS、0.2〜5％のB27サプリメントおよび／または0.2〜5％のN2サプリメントを含む。場合によっては、SiMa細胞用の該培養培地は、非必須アミノ酸および／または抗生物質および／またはレチノイン酸をさらに含む。
【００４８】
好ましくは、ステップa)におけるSiMa細胞用の培養培地または刺激培地は、92.5％のOptiMEM、5％のFBS、1％のB27サプリメント、0.5％のN2サプリメントおよび1％のNEAAを含む。
【００４９】
本発明の方法のある態様では、ステップb)における前記分化培地は、100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する培地を含む。好ましくは、該培地は、86〜98.8％の濃度で使用されるニューロン基本培地である。該分化培地は、次の成分：0.2〜5％のB27サプリメントおよび／または0.2〜5％のN2サプリメント；0.5〜2％の非必須アミノ酸(NEAA)；1〜5 μMのレチノイン酸；0.5〜2％のGlutaMAXおよび／または25〜75 μMのGT1bのうちの1つまたはそれ以上をさらに含みうる。
【００５０】
好ましくは、ステップb)における前記分化培地は、97％のニューロン基本培地、2％のB27サプリメント、1％のGlutaMAX、および3 μMのレチノイン酸を含む。
【００５１】
本発明の方法のある態様では、前記SiMa細胞を、ステップa)において少なくとも36時間培養する。
【００５２】
本発明の方法のある態様では、前記SiMa細胞を、ステップa)において、以下：ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、コラーゲン、ラミニン、およびゼラチンからなる群より選択される少なくとも1種の化合物でコーティングした組織培養皿で培養する。細胞培養皿のコーティングは当業者には周知である。好ましくは、該組織培養皿をポリ-L-リジンでコーティングする。
【００５３】
本発明は、神経毒素ポリペプチドに対するSiMa細胞の感受性の有意な増加を達成しうる新規分化プロトコールを提供するものである。。加えて、この試験系は、当分野で記載されている神経毒素ポリペプチドの生物学的活性のための試験よりも正確かつロバストである。ニューロン分化のためにSiMa細胞を刺激する第1のステップでは、該SiMa細胞を、92.5％のOpti-MEM(登録商標)、5％のFBS、1％のB27サプリメント、0.5％のN2サプリメントおよび1％のNEAAを含む新規刺激培地で培養した。妥当であれば、1種またはそれ以上の抗生剤もその細胞培養培地に添加した。前記細胞をその後、コーティング済みマルチウェルプレートに播種した。最適な結果は、ポリ-L-リジンでコーティングした細胞培養皿を用いて達成された。あるいは、コラーゲン、ポリ-D-リジン、ラミニン、ゼラチン、またはその組み合わせを該細胞培養皿のコーティングのために使用することもできる。先に言及した増殖培養培地または刺激培地での、前記の播種細胞の少なくとも36時間の増殖後、該培地を、比較として、6つの異なる分化培地に置き換えた。3〜7日間の分化(その間に該分化培地を新鮮な分化培地に取り替えた)後、妥当であれば、神経毒素ポリペプチド(BoNT/Aなど)を該分化培地に添加した。さらなる75時間のインキュベーション後、前記細胞を停止させてから、添加した神経毒素ポリペプチドの生物学的活性について解析した。比較すると、低い重量モル浸透圧濃度を有する分化培地が最も良い結果をもたらした：2％のB27サプリメント、1％のGlutaMAXおよび3 μMのレチノイン酸を含有するニューロン基本培地を含む分化培地の使用は、0.22 pMのEC50値を与えた。該分化培地は約225 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有していた。0.24 pMのEC50値という同様の結果が、MEM、2％のB27サプリメント、1％のN2サプリメント、および3 μMのレチノイン酸を含み、約225 mOsm／kgに希釈した分化培地について見出された。本発明の比較的簡単な分化プロトコールは、高い再現性および高い感受性(0.3 pM未満のEC50；0.1 pM未満のLLOD)を可能にするものであり、そのため解析すべき試料の高希釈が可能になる。従って、本発明の分化方法により作成されるSiMa細胞の感受性は、好ましくは、10 pM未満、5 pM未満、2 pM未満、1 pM未満、0.5 pM未満、または0.3 pM未満ですらある。
【００５４】
本発明の方法の他の態様では、前記のニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞は、例えば、DSMZからACC寄託番号：316で、ATCCからCRL-1825で、またはECACCから95102107で取得できるP19細胞である。P19細胞はDSMZのプロトコールに従って培養することができる。ある態様では、P19細胞を、本発明の方法のステップa)においてニューロン分化のために該P19細胞を刺激する条件下および期間、細胞培養培地で培養することは、細胞集塊が形成されるような、少なくとも3日間、4日間または好ましくは5日間の、少なくともMEM-alphaおよびFBSを含む細胞培養(または増殖)培地における、細菌学的ペトリ皿での該P19腫瘍細胞の培養を含む。ある態様では、P19細胞用の該細胞培養培地は、レチノイン酸を好ましくは75〜125 nM、より好ましくは100 nMの濃度で含む。ある態様では、該細胞培養培地は、95％のMEM-alpha、5％のFBSおよび0.1 μMのレチノイン酸を含む。好ましくは、前記のP19細胞集塊を回収してから、ニューロン分化のために刺激した単離細胞を該集塊からプロテアーゼ処理、例えばトリプシン処理により作成する。本発明の方法のある態様では、本発明の方法のステップb)におけるP19細胞を、本明細書中で定義した低い重量モル浸透圧濃度を有する分化培地、好ましくは約225 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有するニューロン基本培地で2〜3週間培養する。
【００５５】
本発明は、後述の実施例において実証されているように、BoNTに対するP19細胞の感受性の有意な増加を達成しうる、該P19細胞のための新規分化プロトコールを提供するものである。本発明の分化プロトコールでは、P19細胞を先行技術において記載されている通りに培養した。ニューロン分化のために該P19細胞を刺激する際に、該細胞を細菌に用いるペトリ皿(すなわち無細胞培養皿)に播種してから、100 nMのレチノイン酸を添加した。5日後、得られた細胞集塊を単離してからトリプシン処理した。その後、該細胞をマルチウェルプレートに播種してから、さらに培養した。驚いたことに、本発明者らは、ニューロン基本培地(2％のB27サプリメント、1％のN2サプリメントおよび1％のGlutaMAXを含むニューロン基本培地)の使用ならびに低濃度のレチノイン酸(100 nM)の添加がBoNTに対する前記細胞の感受性を一層増加させうることを見出した。非ニューロン細胞の増殖は、細胞増殖抑制性の薬物(例えば、5 μMのAraC)の添加により阻害することができた。その上、BoNTによる前記細胞の中毒時に前記培地にGT1bを添加すると、GT1bの添加により前記細胞のBoNTの取り込みが増強されることが見出された。この目的のために、例えば、50 μMのGT1bを使用した。2〜3週間の分化(その間、前記培地を必要に応じて取り替えた)後、BoNTをその細胞培養培地に添加した。BoNTとの72時間のインキュベーション後、前記細胞を停止させてから、後述の実施例に示す方法により解析した。
【００５６】
2つの異なる細胞系について例示したように、本発明は、神経毒素の生物学的活性の決定のための、新規の細胞ベースの試験系を提供するものである。本発明のこの細胞ベースの試験系は、極めて感受性が高くかつロバストであり、また従来の動物実験の代替案を提供するものである。さらには、本発明の細胞ベースの試験系は、当分野で記載されている細胞ベースの試験系と比較して簡単な分化プロトコールであり、また解析すべき神経毒素含有試料の高希釈を可能にする、高い再現性および高い感受性(SiMa細胞の場合は0.1 pM未満のEC50、またP19細胞の場合は1 pM未満のEC50)を可能にするものである。試料のかかる高希釈は、解析すべき試料に含有されている賦形剤または不純物に関して言えば、この邪魔になる可能性のある物質を可能な限り低い濃度で用いるために極めて重要である。最後に、本発明の細胞ベースの試験系は、先行技術において記載されている系よりも柔軟性がありかつ経済的である。
【００５７】
先に記載した前記用語の定義および説明は、他に指示した場合を除き、必要な変更を加えれば本明細書中以下に記載した全ての態様に適用されることを理解されたい。
【００５８】
本発明はさらに、本発明の方法により取得可能であるかまたは取得される神経毒素感受性ニューロン分化細胞に関するものである。好ましくは、SiMa細胞を使用する場合、該細胞は10 pM未満、5 pM未満、2 pM未満、1 pM未満、0.5 pM未満、または0.3 pM未満ですらあるEC50値を有する。また、本発明の分化方法により作成されるニューロン分化SiMa細胞のボツリヌス神経毒素への感受性は、当分野で記載されているニューロン分化プロセスにおいて一般に使用される約290〜350 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する分化培地で分化させたSiMa細胞と比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍またはさらに少なくとも10倍に増加していることが好ましい。P19細胞を使用して同様の結果を達成することができた；実施例を参照されたい。
【００５９】
加えて、本発明は、以下のステップa)〜c)：
a)好ましくは本発明の方法により取得可能であるかまたは取得される神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、神経毒素ポリペプチドと接触させるステップ；
b)ステップa)の神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、前記神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮できる条件下で3〜74時間、または好ましくは72時間培養するステップ；および
c)ステップb)による培養後の前記細胞における前記神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定するステップ
を含む、神経毒素ポリペプチドの活性を決定する方法を提供するものである。
【００６０】
具体的には、前記の神経毒素ポリペプチドの活性を決定する方法は、以下のステップa)〜e)：
a)ニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞を、ニューロン分化のために該腫瘍細胞を刺激する条件下および期間、培地で培養するステップ；
b)ステップa)のニューロン分化のために刺激した前記腫瘍細胞を、100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有し、かつ(i)B27サプリメントおよび／または(ii)N2サプリメントを含む分化培地で少なくとも3日間培養し、それによって神経毒素感受性ニューロン分化細胞を取得するステップ；
c)ステップb)の神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、神経毒素ポリペプチドと接触させるステップ；
d)ステップc)の神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、前記神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮できる条件下で3〜74時間、または好ましくは72時間培養するステップ；ならびに
e)ステップd)による培養後の前記細胞における前記神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定するステップ
を含む。
【００６１】
神経毒素ポリペプチドの生物学的活性の決定は、当分野で記載されている方法により実行することができる(例えば、Pellettら、WithemarshらToxicological Sciences 126(2),426-435 (2012)、WO 2010/105234 A1、WO 2009/114748、WO 2012/123370、WO 2013/131991を参照されたい)。好ましくは、ニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞は、SiMa細胞、より好ましくは親SiMa細胞(DSMZ ACC 164)である。神経毒素ポリペプチドは、好ましくはBoNT/Aである。
【００６２】
本発明はまた、ニューロン分化細胞、好ましくは神経芽細胞腫細胞からex vivoで神経毒素感受性ニューロン分化細胞を作成するための本発明の方法において指定した細胞培養培地および／または分化培地の使用に関係するものである。
【００６３】
さらなる態様では、本発明は、80〜98.8％のOptiMEM、1〜10％のFBS、0.2〜5％のB27サプリメントおよび／または0.2〜5％のN2サプリメントを含む細胞培養培地または刺激培地を提供するものである。あるいは、0.2〜5％のNS21サプリメントを使用することができる。好ましくは、前記培地は93.5％のOptiMEM、5％のFBS、1％のB27サプリメントおよび0.5％のN2サプリメントを含む。前記培地はSiMa細胞を刺激する上で特に有用である。Opti-MEM(登録商標)血清削減培地(reduced serum media)(Life Technologies)は、HEPESおよび重炭酸ナトリウムで緩衝化し、かつヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、微量元素および増殖因子を添加した、イーグルの最少必須培地の変更態様である。この培養培地は、ある態様では、本明細書中で定義した抗生剤および／または非必須アミノ酸(NEAA)をさらに含みうる。本発明の該培養培地は、SiMa細胞を使用する本発明の神経毒素感受性ニューロン分化細胞の作成のための方法のステップa)において特に有用である。
【００６４】
最後に、本発明は、前述の方法を実行するのに適したキットに関するものであり、該キットは、80〜98.8％のOptiMEM、1〜10％のFBS、0.2〜5％のB27サプリメントおよび／または0.2〜5％のN2サプリメントならびに、場合によっては、非必須アミノ酸および／または抗生物質、ならびにSiMa細胞を含む細胞培養培地を含む。好ましくは、該細胞培養培地は、93.5％のOptiMEM、5％のFBS、1％のB27サプリメントおよび0.5％のN2サプリメント、ならびにSiMa細胞を含む。該キットは、100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する本明細書中で定義した分化培地、好ましくはニューロン基本培地、および本明細書中で指定した少なくとも1種のサプリメント、すなわちB27、N2またはNS21サプリメントをさらに含みうる。好ましくは、該分化培地は、78〜98.3％のニューロン基本培地、1〜10％のFBS、0.5〜2％のGlutaMAX、0.2〜5％のB27サプリメント、および／または0.2〜5％のN2サプリメントを含む。本発明のキットに使用しうるさらに好適な培地を後述の実施例に示す。
【００６５】
本発明のキットは、本明細書中で先に言及した方法を実践するために使用されるものと理解されたい。1つの態様では、全ての構成要素が先に言及した方法を実践するために即時使用可能な形で提供されると考えられる。さらなる態様では、該キットは前記方法を実行するための説明書を含有する。該説明書は、紙面または電子的様式のユーザーマニュアルにより提供することできる。例えば、該マニュアルは、本発明のキットを使用して前述の方法を実行した場合に得られる結果を解釈するための説明書を含んでいてもよい。
【００６６】
本明細書中に引用した全ての参考文献は、それらの全開示内容および本明細書で具体的に述べた開示内容に関して、参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
本明細書中で使用する略語：
OptiMEM：Opti-MEM(登録商標)血清削減培地(Life Technologies)は、HEPESおよび重炭酸ナトリウムで緩衝化し、かつヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、微量元素および増殖因子を添加した、イーグルの最少必須培地の変更態様である。血清添加培地で増殖させた大抵の細胞は、血清を最低でも50％削減したOpti-MEM(登録商標)に移すことができる。
【００６７】
FBS：ウシ胎仔血清は、真核細胞のin vitro細胞培養のための、最も広く使用されている血清添加物である。FBSは多くの製造業者、例えばSigma-Aldrich、Invitrogen、Life Technologiesなどから市販されている。
【００６８】
B27サプリメント：B27サプリメントは、一般に、ニューロンの増殖および維持のために使用されている。B27サプリメントは、50xまたは100xストック溶液として、例えばLife Technologiesから市販されている。
【００６９】
N2サプリメント：50xまたは100xストック溶液として、例えばLife Technologiesから市販されている。N2サプリメントは、末梢神経系と中枢神経系の両方に由来する初代培養における有糸分裂後ニューロンならびに神経芽細胞腫の増殖および発現の際に推奨される。N2サプリメントはBottensteinのN1製剤の代用品として使用することができる。N2サプリメントは、bFGFもしくはEGFなどの増殖因子を添加したニューロン基本培地と共に使用するか、またはDMEMと共に使用することができる。
【００７０】
NS21サプリメント：NS21サプリメントは、例えば、Chenらによる刊行物(Chenら(2008), Journal of Neuroscience Methods 171, 239-247)に記載されているように、21種の異なる成分がニューロン培養のために使用されている、再規定されかつ変更されたB27サプリメントである。
【００７１】
NEAA：InvitrogenまたはCyagenなどの多くの製造業者から市販されている非必須アミノ酸細胞培養添加物は、通常は、数種の非必須アミノ酸、例えば、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-セリンまたはL-プロリンを含有するストック溶液として提供される。NEAAは最適化された細胞増殖のための細胞培養培地への添加物として使用される。
【００７２】
P19細胞：P19細胞は、マウスの胚性奇形腫に由来する胚性癌腫細胞系である。該細胞系は、3つの胚葉細胞型全てに分化することができる多能性細胞である。また、P19細胞は、異なる特定の処理により心筋細胞およびニューロン細胞へと特異的に誘導することができる、最も特徴付けられた胚性癌腫(EC)細胞系である。集合したP19細胞をジメチルスルホキシド(DMSO)に曝露することにより、心筋および骨格筋に分化させることができる。また、P19細胞をレチノイン酸(RA)に曝露することにより、それらをニューロン細胞に分化させることができる(McBurney & Rogers (1982), Dev.Biol 89(2)：503-508；Rudnicki,ら(1990) Dev.Biol 138(2)：348-358)。
【００７３】
SiMa細胞：SiMa細胞は、継代開始時および継代後期の両方で報告されている、二重微小染色体(dmin)、der(1)t(1；17)(p35；q12)およびder(22)t(17；22)(q22；p13)の形成ならびに第11染色体の欠損によるN-MYCの増幅を含む、予後不良のNbに関連する主な再発性染色体変化をもつ神経芽細胞腫(Nb)細胞系に相当する。これらの予後不良の細胞遺伝学的徴候とは対照的に、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)測定によるカテコールアミン合成の分析から、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(DOPA)、ノルアドレナリン、ホモバニリン酸(HVA)、およびバニリルマンデル酸(VMA)産生率が高い、高度な程度のアドレナリン作動性分化が明らかとなった。対比的に高度な分化と予後不良の遺伝子マーカーを結び付けることで、SiMaをNbの病理および治療法を研究するためのユニークな手段とする(Mariniら、Cancer Genet. Cytogenet. (1999), 112：161-4)。
【００７４】
MEM-alpha：最少必須培地alpha(Invitrogen, Life Technologies)
ニューロン基本培地(neurobasal medium)：Neurobasal(登録商標)培地(Invitrogen, Life Technologies)は、GIBCO(登録商標)B-27(登録商標)サプリメントと共に使用した場合に胎生期および胚ニューロン細胞の特殊な細胞培養要件を満たす基本培地である。Neurobasal(登録商標)培地を使用することにより、海馬、皮質および脳の他の領域から得たニューロン細胞を増殖させることができる。Neurobasal(登録商標)培地により、星状膠細胞支持細胞層を必要としない、ニューロン細胞の均質集団の長期的および短期的維持が共に可能となる。
【００７５】
GlutaMax：GIBCO(登録商標)GlutaMAX(商標)培地は、長期培養中でも分解およびアンモニアの蓄積を防ぐ、L-グルタミン由来の安定化形態のジペプチド、L-アラニル-L-グルタミンを含有する細胞培養培地である。水溶液中で極めて安定なL-アラニル-L-グルタミンジペプチドは、貯蔵またはインキュベーション時にL-グルタミンのようにアンモニアに分解されることはない。
【００７６】
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）以下のステップa)ならびにb)：
a)ニューロン細胞に分化することができる腫瘍細胞を、ニューロン分化のために該腫瘍細胞を刺激する条件下および期間、培地で培養するステップ；ならびに
b)a)のニューロン分化のために刺激した前記腫瘍細胞を、100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有し、かつ(i)B27サプリメントおよび／または(ii)N2サプリメントを含む分化培地で少なくとも3日間培養し、それにより神経毒素感受性のニューロン分化細胞を取得するステップ
を含む、神経毒素感受性のニューロン分化細胞の作成のための方法。
（２）前記分化培地がレチノイン酸をさらに含む、（１）記載の方法。
（３）前記レチノイン酸が0.01 μM〜300 μMの濃度で存在する、（２）記載の方法。
（４）前記分化培地が抗生剤および／または非ニューロン細胞の増殖を阻害する細胞増殖抑制剤をさらに含む、（１）〜（３）のいずれか１記載の方法。
（５）前記分化培地がGT1bをさらに含む、（１）〜（４）のいずれか１記載の方法。
（６）前記GT1bが25〜75 μMの濃度で、または50 μMの濃度で存在する、（５）記載の方法。
（７）ニューロン分化のために（１）のa)において前記細胞を刺激する前記の条件および期間が、前記培養培地からの血清の削減および／またはレチノイン酸の添加を含む、（１）〜（６）のいずれか１記載の方法。
（８）前記腫瘍細胞がSiMa細胞(DSMZ ACC寄託番号：164)である、（１）〜（７）のいずれか１記載の方法。
（９）前記のステップa)における培養培地が、80〜98.8％のOptiMEM、1〜10％のFBS、0.2〜5％のB27サプリメントおよび／または0.2〜5％のN2サプリメントならびに、場合によっては、非必須アミノ酸および／または抗生物質を含む、（８）記載の方法。
（１０）前記のステップb)における分化培地が、100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する培地、好ましくは78〜98.3％のニューロン基本培地、1〜10％のFBS、0.5〜2％のGlutaMAX、0.2〜5％のB27サプリメント、および／または0.2〜5％のN2サプリメントを含む、（８）または（９）記載の方法。
（１１）前記SiMa細胞をステップa)において少なくとも36時間培養する、（８）〜（１０）のいずれか１記載の方法。
（１２）前記のステップa)における培養培地が、抗生剤および／または非必須アミノ酸(NEAA)をさらに含む、（８）〜（１１）のいずれか１記載の方法。
（１３）前記SiMa細胞を、ステップa)において、以下：ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、コラーゲン、ラミニン、およびゼラチンからなる群より選択される少なくとも1種の化合物でコーティングした組織培養皿で培養する、（８）〜（１２）のいずれか１記載の方法。
（１４）前記腫瘍細胞がP19細胞(DSMZ ACC寄託番号：316)である、（１）〜（７）のいずれか１記載の方法。
（１５）（１）のa)におけるニューロン分化のためにP19細胞を刺激する前記の条件および期間が、細胞集塊が形成されるような、少なくとも5日間の、増殖培地における細菌学的皿での該P19細胞の培養をさらに含む、（１４）記載の方法。
（１６）前記細胞集塊を回収してから、ニューロン分化のために刺激した単離単一細胞を該集塊からプロテアーゼ処理により作成する、（１４）または（１５）記載の方法。
（１７）前記P19細胞を、（１）のb)において100〜270 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する培地、好ましくはニューロン基本培地で2〜3週間培養する、（１４）〜（１６）のいずれか１記載の方法。
（１８）（１）〜（１７）のいずれか１記載の方法により取得可能な神経毒素感受性ニューロン分化細胞。
（１９）以下のステップa)〜c)：
a)好ましくは（１）〜（１７）のいずれか１記載の方法により取得可能な神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、神経毒素ポリペプチドと接触させるステップ；
b)ステップa)の神経毒素感受性ニューロン分化細胞を、前記神経毒素ポリペプチドがその生物学的活性を発揮できる条件下で3〜74時間、または好ましくは72時間培養するステップ；および
c)ステップb)による培養後の前記細胞における前記神経毒素ポリペプチドの生物学的活性を決定するステップ
を含む、神経毒素ポリペプチドの活性を決定する方法。
（２０）93.5％のOptiMEM、5％のFBS、1％のB27サプリメントおよび0.5％のN2サプリメントを含む細胞培養培地。
本発明をここで下記実施例により例示するが、該実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００７７】
実施例：ニューロン基本培地とMEM培地の差異がボツリヌス神経毒素(BoNT)感受性に与える影響
i)SiMa親細胞をDSMZ(German collection of Microorganisms and Cell cultures)のプロトコールに従って培養した。該細胞を96ウェルプレートに蒔く1日前に、その培地を、「刺激培地」としての92.5％のOPTI-MEM(登録商標)(Gibco by Life Technologies(商標)#51985)＋5％のFBS(PAA #A15-152)＋1％の非必須アミノ酸(NEAA；Gibco by Life Technologies(商標)#11140-038)＋1％のB-27サプリメント(Gibco by Life Technologies(商標)#17504-044)＋0.5％のN-2サプリメント(Gibco by Life Technologies(商標)#17502-048)に変更した。細胞(30,000個の細胞／cm2)を、上述の刺激培地へのボツリヌス神経毒素(BoNT)の添加の5日前に96ウェルプレート(TPP #92096)に蒔いた。該細胞を蒔いてから24時間後、該培地を以下の分化培地：
1.97％のNeurobasal(Gibco by Life Technologies(商標)#21103)＋2％のB-27サプリメント(Gibco by Life Technologies(商標)#17504-044)＋1％のGlutaMAX(商標)(Gibco by Life Technologies(商標)#35050-038)＋3 μMのレチノイン酸(RA；Sigma-Aldrich #R2625)
または
2.96％のMEM(Gibco by Life Technologies(商標)#42360)＋2％のB-27サプリメント(上記参照)＋1％のN-2サプリメント(上記参照)＋1％のNEAA(上記参照)＋3 μMのRA(上記参照)
または
3.96％のMEM(上記参照)＋2％のB-27サプリメント(上記参照)＋1％のN-2サプリメント(上記参照)＋1％のNEAA(上記参照)＋3 μMのRA(上記参照)＋ビタミンB12＋Fe＋Zn(低)
または
4.96％のMEM(上記参照)＋2％のB-27サプリメント(上記参照)＋1％のN-2サプリメント(上記参照)＋1％のNEAA(上記参照)＋3 μMのRA(上記参照)＋ビタミンB12＋Fe＋Zn(高)
または
5.96％のMEM(上記参照)＋2％のB-27サプリメント(上記参照)＋1％のN-2サプリメント(上記参照)＋1％のNEAA(上記参照)＋3 μMのRA(上記参照)；225 mOsm／kgに希釈
または
6.97％のNeurobasal(上記参照)＋2％のB-27サプリメント(上記参照)＋1％のGlutaMAX(商標)(上記参照)＋3 μMのレチノイン酸(上記参照)＋Zn(高)
のうちの1つと交換した。
【００７８】
分化培地への変更の4日後、1ウェル当たりの該培地の半分を、BoNT/Aを種々の濃度で含有する新鮮培地(10 pMから開始した11段階に及ぶ連続1：2希釈物およびBoNT/A不含陰性対照)と交換した。BoNTの添加の72時間後、該培地を吸引してから、ベンゾナーゼを含有する溶解緩衝液を添加した。このプレートを室温(RT)でインキュベートし、その後Roti-load 1 (Roth #K929.1)を添加した。前述の通りに調製した試料は、-70℃未満の温度で保存することが可能であった。SNAP-25はより高い貯蔵温度では特異的に分解されると思われるので、この低温は非常に重要である。その後、前記試料をSDS-PAGEを利用して分離させてから、続いてウェスタンブロットにより解析した。EC50を決定し、その値を表1(4回の実験の平均値を記載)で比較した。
【００７９】
【表１】
0006300807.tif 000002
【００８０】
驚いたことに、BoNT/Aに対する前記細胞の感受性は、MEMをNeurobasal培地と置き換えるだけで10倍に増加した(2.と1.)。MEMに欠けているNeurobasal培地の成分(鉄、ビタミンB12および亜鉛)をMEMに添加しても、BoNT/Aに対する前記細胞の感受性には影響を及ぼさなかった(2.と3.および4.)。しかし、MEMを滅菌脱イオン水で225 mOsm／kgに希釈すると、Neurobasal培地の使用と同様の驚くべき効果が生じた。従って、重量モル浸透圧濃度を300 mOsm／kgから225 mOsm／kgに低下させると、SiMa細胞の感受性が〜2 pMから〜0.2 pMへと劇的に増加した。
【００８１】
表2は分化培地1〜6の重量モル浸透圧濃度値を示したものである。
【００８２】
【表２】
0006300807.tif 000003
【００８３】
例えば、MEMは約300 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する。通常、先行技術において使用されている細胞培養培地は290〜350 mOsm／kgの重量モル浸透圧濃度を有する。細胞培養培地の重量モル浸透圧濃度は、本質的に他の成分による影響を受けない。添加物に関しては、望ましい範囲内の重量モル浸透圧濃度を選択する。
ii)P19細胞をDSMZ(German collection of Microorganisms and Cell cultures)のプロトコールに従って培養した。該細胞を96ウェルプレートに蒔く5日前に、該細胞を細菌グレードのペトリ皿に移してから、その培地を、「刺激培地」としての5％のFBS(PAA #A15-152)および0.1 μMのレチノイン酸(RA；Sigma-Aldrich #R2625)を添加した95％のMEM-alpha(Gibco by Life Technologies(商標)#32571)に変更した。5日間の増殖中に、前記細胞は凝集塊または集塊を形成した。それらをトリプシン処理してから、その細胞(30,000個の細胞／cm2)を上述の刺激培地へのボツリヌス神経毒素(BoNT)の添加の5日前に96ウェルプレート(TPP #92096)に蒔いた。該細胞を蒔いてから24時間後、該培地を以下の分化培地：
1.97％のNeurobasal(Gibco by Life Technologies(商標)#21103)＋2％のB-27サプリメント(Gibco by Life Technologies(商標)#17504-044)＋1％のGlutaMAX(商標)(Gibco by Life Technologies(商標)#35050-038)＋3 μMのレチノイン酸(RA；Sigma-Aldrich #R2625)；225 mOsm／kg。
2.95％のMEM-alpha(Gibco by Life Technologies(商標)#32571)＋5％のFBS(PAA #A15-152)＋0.1 μMのレチノイン酸(RA；Sigma-Aldrich #R2625)；300 mOsm／kg。
3.90％のMEM-alpha(Gibco by Life Technologies(商標)#32571)＋10％のFBS(PAA #A15-152)；300 mOsm／kg。
4.97％のMEM-alpha(Gibco by Life Technologies(商標)#32571)＋2％のB-27サプリメント(上記参照)＋1％のN-2サプリメント(上記参照)＋1％のNEAA(上記参照)＋1 μMのレチノイン酸(RA；Sigma-Aldrich #R2625)；300 mOsm／kg。
のうちの1つと交換した。
【００８４】
分化培地への変更の4日後、1ウェル当たりの該培地の半分を、BoNT/Aを種々の濃度で含有する新鮮培地(10 pMから開始した11段階に及ぶ連続1：2希釈物およびBoNT/A不含陰性対照)と交換した。BoNTの添加の72時間後、該培地を吸引してから、ベンゾナーゼを含有する溶解緩衝液を添加した。このプレートを室温(RT)でインキュベートし、その後Roti-load 1 (Roth #K929.1)を添加した。前述の通りに調製した試料は、-70℃未満の温度で保存することが可能であった。SNAP-25はより高い貯蔵温度では特異的に分解されると思われるので、この低温は非常に重要である。その後、前記試料をSDS-PAGEを利用して分離させてから、続いてウェスタンブロットにより解析した。EC50を決定し、その値を表3(4回の実験の平均値を記載)で比較した。
【００８５】
【表３】
0006300807.tif 000004