(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、ＨＳＰ２７リン酸化阻害剤であって、前記部分ペプチドは配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、ＨＳＰ２７リン酸化阻害剤。
【請求項２】
前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のＨＳＰ２７リン酸化阻害剤。
【請求項３】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、アポトーシス誘導剤であって、前記部分ペプチドは配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、アポトーシス誘導剤。
【請求項４】
前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、抗癌剤であって、前記部分ペプチドは配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、抗癌剤。
【請求項６】
前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の抗癌剤。
【請求項７】
前記癌は、大腸癌、肺癌、肝癌、肉腫、血液腫瘍、及び癌幹細胞を含む腫瘍からなる群から選択される、請求項５または６に記載の抗癌剤。
【請求項８】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを含む抗癌剤であって、前記部分ペプチドは配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、抗癌剤。
【請求項９】
前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の抗癌剤。
【請求項１０】
前記癌は、大腸癌、肺癌、肝癌、肉腫、血液腫瘍、及び癌幹細胞を含む腫瘍からなる群から選択される、請求項８または９に記載の抗癌剤。
【請求項１１】
配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドの用途、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターの用途、及び、特定のペプチド又はそれらの薬理学的に許容される塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は重大な疾患であり、主たる死因である。近年、癌の診断および治療においては進展があるものもあるが、診断および治療を改善する必要性が依然として存在している。
【０００３】
熱ショックタンパク質の一つであるＨＳＰ２７は、哺乳動物細胞中で発現され、特に、病理学的状態において発現される分子シャペロンである。ＨＳＰ２７は、例えば、肺扁平上皮癌をはじめとする多くの癌で過剰に発現されており、放射線や化学療法などの治療への抵抗性を付与し、腫瘍の生存を助けること、転移や予後不良とも関連することが知られている。
【０００４】
ＨＳＰ２７の発現は、抗癌剤や放射線などにより癌細胞がストレスを受けると上昇することも明らかになっている。抗癌剤に対する薬剤耐性能（抗アポトーシス作用能）の一部は、癌細胞におけるＨＳＰ２７の発現の亢進や、細胞内シグナル伝達系の活性化によるＨＳＰ２７のリン酸化亢進により生じるとされている。例えば、肺扁平上皮癌にはＨＳＰ２７の過剰発現が見られており、ＨＳＰ２７の産生を阻害する物質や、ＨＳＰの発現低下を誘導する物質を用いて、化学療法と併用する治療法の確立が期待されている。このような物質としては、例えば、細胞中のＨＳＰ２７  ｍＲＮＡを標的とするオリゴマー化合物が知られている（特許文献１）。
【０００５】
また、腎臓癌の免疫療法に有用な腎臓癌特異的細胞傷害性リンパ球を誘導する、生体内に存在する分子に由来するペプチド等も知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１１−５２６４９４号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１２／１４１２０１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の抗癌剤は、物質由来の副作用やメカニズムに由来する薬剤耐性等を解決しなければ利用することが困難であった。本発明は、生体内に存在する分子に由来し、腫瘍と深く関連するＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する活性を有する分子の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記課題に鑑み、生体内に存在する分子に由来し、腫瘍と深く関連するＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する活性を有する新たな物質の探索、改良を行ったところ、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含むＨＳＰ２７リン酸化阻害剤などが上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
【０００９】
［１］ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、ＨＳＰ２７リン酸化阻害剤
。
［２］前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列から成る、［１］に記載のＨＳＰ２７リン酸化阻害剤。
［３］前記部分ペプチドは配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は、配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドである、［１］に記載のＨＳＰ２７リン酸化阻害剤。
［４］ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、アポトーシス誘導剤。
［５］前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列から成る、［４］に記載のアポトーシス誘導剤。
［６］前記部分ペプチドは配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は、配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドである、［４］に記載のアポトーシス誘導剤。
［７］ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、抗癌剤。
［８］前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列から成る、［７］に記載の抗癌剤。
［９］前記部分ペプチドは配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は、配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドである、［７］に抗癌剤。［１０］前記癌は、大腸癌、肺癌、肝癌、肉腫、血液腫瘍、及び癌幹細胞を含む腫瘍からなる群から選択される、［７］〜［９］のいずれかに記載の抗癌剤。
［１１］ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを含む抗癌剤。
［１２］前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列から成る、［１１］に記載の抗癌剤。
［１３］前記部分ペプチドは配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は、配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドである、［１１］に記載の抗癌剤。
［１４］前記癌は、大腸癌、肺癌、肝癌、肉腫、血液腫瘍、及び癌幹細胞を含む腫瘍からなる群から選択される、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の抗癌剤。
［１５］配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチド、又はそれらの薬理学的に許容される塩。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、生体内に存在する分子に由来し、腫瘍と深く関連するＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含むＨＳＰ２７リン酸化阻害剤などを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施態様である、実施例１及び比較例１における細胞の培養を行ったときの細胞を表す画像である（写真）。
【図２】本発明の一実施態様である、実施例２及び比較例２におけるＤＮＡ電気泳動の結果を表す画像である（写真）。
【図３】本発明の一実施態様である、実施例３及び比較例３におけるウエスタンブロットの結果を表す画像である（写真）。
【図４】本発明の一実施態様である、実施例４及び比較例４におけるウエスタンブロットの結果を表す画像である（写真）。
【図５】本発明の一実施態様である、参考例１〜４における細胞の培養を行ったときの細胞を表す画像である（写真）。
【図６】本発明の一実施態様である、参考例１〜４における細胞から抽出した総タンパク質量の結果を表すグラフである。
【図７】本発明の一実施態様である、実施例５、６及び比較例５における細胞の培養を行ったときの細胞を表す画像である（写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、以下の第一乃至第五の実施態様を含む。
本発明の第一の実施態様は、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、ＨＳＰ２７リン酸化阻害剤である。
本発明の第二の実施態様は、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、アポトーシス誘導剤である。
本発明の第三の実施態様は、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、抗癌剤である。
本発明の第四の実施態様は、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを含む抗癌剤である。
本発明の第五の実施態様は、配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１もしくは３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチド、又はそれらの薬理学的に許容される塩である。
【００１３】
＜１．第一の実施態様＞
本発明の第一の実施態様は、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質（本明細書では、「ＦＡＭ８３Ｇ」と略称することがある。）又はその部分ペプチドを含む、ＨＳＰ２７リン酸化阻害剤である。
【００１４】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質としては、ＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する限り特に限定されないが、例えば、マウスやヒトのＦＡＭ８３Ｇタンパク質が挙げられる。マウスのＦＡＭ８３Ｇタンパク質のアミノ酸配列の一例は配列番号２で表されるアミノ酸配列であり、ヒトのＦＡＭ８３Ｇタンパク質のアミノ酸配列の一例は配列番号４で表されるアミノ酸配列である。
【００１５】
ただし、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質はＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する限り、配列番号２や配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００１６】
その部分ペプチドとしては、ＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する限り特に限定されないが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。ここで、なお、１〜数個とは、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個である。ただし、アミノ酸がＮ末端側及び／またはＣ末端側に付加される場合は、１〜２０個程度であってもよい。
【００１７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列で表されるマウスのＦＡＭ８３Ｇタンパク質の一部（アミノ酸番号３４９〜３６３）の配列が挙げられる。
【００１８】
また、ＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する限り特に限定されないが、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は、配列番号３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペ
プチドが挙げられる。ここで、なお、１〜数個とは、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個である。ただし、アミノ酸がＮ末端側及び／またはＣ末端側に付加される場合は、１〜２０個程度であってもよい。
【００１９】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、例えば、配列番号４のアミノ酸配列で表されるヒトのＦＡＭ８３Ｇタンパク質の一部（アミノ酸番号３４９〜３６３）の配列が挙げられる。
【００２０】
ここで、後述する実施例で実証されるように、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドは、プロテインキナーゼＣ（以下、「ＰＫＣ」と称することがある。）のキナーゼドメインと結合してＰＫＣによるリン酸化を受ける。詳しくは、配列番号１で表されるＹＡＬＶＫＡＫＳＶＤＥＩＡＫＳのうち、Ｎ末端側から８残基目のＳ（セリン）がリン酸化される。配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドのリン酸化が亢進することにより、ＨＳＰ２７のリン酸化が減少することから、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドとＨＳＰ２７は、ＰＫＣへの結合を競合しているものと考えられる。
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むペプチドについても同様の作用効果が想定される。
【００２１】
配列番号１や３で表されるアミノ酸配列を含むペプチドの長さは、配列番号１や３で表されるアミノ酸配列（１５残基）を含み、ＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する限りは特段限定されず、２０残基以上であってもよい。
一方、細胞内へのペプチドの導入を十分に確保する観点から、好ましくは５０残基以下、より好ましくは３０残基以下である。
【００２２】
また、付加される配列はＦＡＭ８３Ｇ自体の配列（配列番号２や４におけるアミノ酸番号３４９〜３６３の前後の配列）であってもよいし、ＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する限り、例えば、HISタグやFLAGタグのような由来の異なるアミノ酸配列が付加されていても
よい。
【００２３】
また、部分ペプチドには、対象とする細胞に選択的に運ばれるアミノ酸配列が付加されていてもよい。例えば、大腸癌や、肺癌、肝癌、肉腫、血液腫瘍、癌幹細胞を含む腫瘍の細胞に選択的に運ばれる配列が知られている（Nature Communications 3:951 doi: 10.1038/ncomms1952.2012 Kondo E等）。
このような配列が付加されることで、正常細胞を損傷させることなく、対象とする細胞にのみ、部分ペプチドの効果を発揮させることができる。
【００２４】
また、配列番号１や３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドとしては、ＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する限り特に限定されないが、例えば、配列番号１や３で表されるアミノ酸配列における１〜数個のアミノ酸が置換されたペプチドが好ましく例示される。すなわち、ＦＡＭ８３Ｇのアミノ酸配列は多くの生物において知られており、それらは配列番号１や３のアミノ酸配列といくつか異なるが、Ｎ末端側から８残基目のＳ（セリン）は保存されているため、同様の効果が期待できる。配列番号１や３において１〜数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むペプチドはＮ末端側から８残基目のＳ（セリン）は保存されていることが好ましく、それら以外のアミノ酸はＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する範囲内で、１〜数個置換されてもよい。ここで、置換は他の生物由来の配列のように天然に生じる置換でもよいし、人工的に導入された置換でもよい。
【００２５】
また、上記置換は保存的置換が好ましく、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、
Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル
基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln
、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【００２６】
また、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、アミド化、脂質鎖の付加（脂肪族アシル化（パルミトイル化、ミリストイル化等）、プレニル化（ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化等）等）、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化）等を挙げることができる。
【００２７】
長さが短い部分ペプチドであれば、その製造方法は特段限定されず、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。例えば、固相合成法、液相合成法が挙げられる。部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチドを製造することができる。精製方法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせることでき、これにより、部分ペプチドを単離精製できる。得られるペプチドが遊離体である場合には、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には、公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２８】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドの製造方法としては、遺伝子工学操作によって製造する場合には、例えば、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを作製し、該ＤＮＡを用いて組換え発現ベクター（本明細書では、単に「ベクター」と称することがある。）を構築し、宿主に導入して発現させ、精製して製造することができる。いずれも公知の方法を用いて行うことができる。
【００２９】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡであって、該ＤＮＡを用いてベクターを構築し、宿主に導入して発現させられるのであれば、その塩基配列は特段制限されない。導入される細胞が元来有している遺伝子配列に基づいた塩基配列であってもよいし、イントロン領域が除かれたｃＤＮＡ配列に基づいた塩基配列であってもよい。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるため、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は容易に特定することができる。
【００３０】
マウスのＦＡＭ８３Ｇタンパク質をコードするＤＮＡの例としては、マウスが元来有している配列番号６で表される塩基配列（配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする。）が挙げられる。また、ヒトのＦＡＭ８３Ｇタンパク質をコードするＤＮＡの例としては、ヒトが元来有している配列番号８で表される塩基配列（配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードする。）が挙げられる。
【００３１】
マウスのＦＡＭ８３Ｇタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質がＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する限り、配列番号６または８の塩基配列の相補
配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション後に、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件で洗いを行う条件が例示される。
【００３２】
また、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡの例としては、マウスの場合であれば、マウスが元来有している配列番号５で表される塩基配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする。）が挙げられる。また、ヒトの場合であれば、ヒトが元来有している配列番号７で表される塩基配列（配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする。）が挙げられる。
【００３３】
マウスのＦＡＭ８３Ｇタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡは、コードされるペプチドがＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する限り、配列番号５または７の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション後に、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件で洗いを行う条件が例示される。
【００３４】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを製造する際には、宿主細胞及びベクターは公知のものを用いることができる。例えば、原核生物の宿主としては、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属の菌株を挙げることができ、該原核生物を宿主として使用する場合のベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７のような大腸菌株等のベクターを用いることができる。このとき、プロモーターとしては、例えば、トリプトファン・プロモーター、ＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター等を用いることができる。マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。
【００３５】
真核生物の宿主としては酵母が一般に広く用いられる。このときベクターとしては、例えばＹＲｐ７等を用いることができる。また、高等動物の培養細胞を宿主とする場合には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）等を用いることができる。プロモーターとしては、例えば、アデノウイルス２主後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、サイトメガロウイルス、ラウスザルコーマーウイルスからのプロモーター等を用いることができる。マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、メトトレキセート耐性ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＲ）遺伝子等を用いることができる。その他、ＢｍＮ４細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等の昆虫細胞を宿主として用いることができる。
【００３６】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを分離精製するには、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。例えば、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
【００３７】
また、無細胞発現系を用いてＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを発現させてもよい。例えば、ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写させて得られたｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液、麦芽抽出液、小麦胚抽出液等を用いたインビトロ翻訳システムにより翻訳させて、合成されたＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを精製してもよい。
【００３８】
また、ベクターを作製する際、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグなどのタグをコードするＤＮＡと、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡとを融合したものをベクターに挿入し、融合タンパク質として発現させてもよい。タグを利用して、目的のＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを容易に精製することが可能になるからである。タグは、最終段階で除去することができ、高速液体クロマトグラフィーなどの公知の方法により、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドだけを精製することができる。
【００３９】
部分ペプチドは、薬理学的に許容される塩であってもよい。薬理学的に許容される塩としては、薬理学的に許容される酸（例えば、無機酸、有機酸）や、塩基（例えば、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。これらの薬理学的に許容される塩は公知の方法で製造することができる。
【００４０】
上記した通り、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドは、ＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する。そのため、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドは、公知の製剤化のための方法を適宜採用することで、ＨＳＰ２７リン酸化阻害剤に用いることができる。このＨＳＰ２７リン酸化阻害剤は、例えば、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドと、後述する薬理学的に許容される担体などとを含有する剤とすることができ、安定である。
【００４１】
本実施態様に係るＨＳＰ２７リン酸化阻害剤は、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを単独で使用することもできるが、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質を用いることもでき、その具体例としては、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。製剤化の際には、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加剤を用いてもよい。
【００４２】
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軟質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどが挙げられる。
【００４３】
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ、ポリエチレングリコール６０００などが挙げられる。
【００４４】
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００４５】
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、軟質無水ケイ酸、炭酸
カルシウムなどが挙げられる。
【００４６】
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
【００４７】
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００４８】
懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
【００４９】
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、キシリトール、果糖などが挙げられる。
【００５０】
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
【００５１】
無痛化剤の好適な例としては、プロピレングリコール、塩酸リドカイン、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００５２】
防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【００５３】
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
【００５４】
着色剤の好適な例としては、水溶性着色タール色素（例、食用赤色２号および３号、食用黄色４号および５号、食用青色１号および２号などの食用色素）、不溶性レーキ色素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩）、天然色素（例、β−カロチン、クロロフィル、ベンガラ）などが挙げられる。
【００５５】
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸ニカリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。
【００５６】
本実施態様に係るＨＳＰ２７リン酸化阻害剤全量に対する前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドの含有量は、ＨＳＰ２７のリン酸化という効果が発揮されるのであれば特段限定されないが、溶解や保存等の都合から、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドとして、総量で、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上であり、一方で、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８０質量％以下である。
【００５７】
＜２．第二の実施態様＞
本発明における第二の実施態様は、前記第一の実施態様で説明したＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、アポトーシス誘導剤である。
上記した通り、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドが導入された細胞では、アポトーシス誘導が活性化される。そのため、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドは、公知の製剤化のための方法を適宜採用することで、アポトーシス誘導剤に用いることができる。
【００５８】
本実施態様に係るアポトーシス誘導剤は、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを単独で使用することもできるが、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質を用いることもでき、安定となる。具体例としては、上記第一の実施態様と同様である。
【００５９】
本実施態様に係るアポトーシス誘導剤全量に対する前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドの含有量は、対象とする細胞にアポトーシスを誘導するという効果が発揮されるのであれば特段限定されないが、溶解や保存等の都合から、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドとして、総量で、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上であり、一方で、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８０質量％以下である。
【００６０】
＜３．第三の実施態様＞
本発明における第三の実施態様は、前記第一の実施態様で説明したＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを含む、抗癌剤である。
【００６１】
上記した通り、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドは、細胞内のＨＳＰ２７のリン酸化を阻害し、該細胞の薬剤耐性能（抗アポトーシス作用能）を抑制して、該細胞のアポトーシス誘導を活性化する。その結果、該細胞はプログラム細胞死によって死滅する。そのため、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドは、公知の製剤化のための方法を適宜採用することで、抗癌剤に用いることができる。
【００６２】
本実施態様に係る抗癌剤が投与される対象となる癌は、ＨＳＰ２７を発現している癌であれば特段限定されないが、大腸癌、肺癌、肝癌、肉腫、血液腫瘍、及び癌幹細胞を含む癌であることが好ましい。
【００６３】
本実施態様に係る抗癌剤は、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドを単独で使用することもできるが、治療のための任意の有効成分との混合物として含有することができ、また、製剤学の技術分野において周知の方法により、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合することもできる。さらに、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質を用いることもでき、安定である。このような有効成分や担体の具体例は、上記第一の実施態様と同様である。
【００６４】
本実施態様に係る抗癌剤全量に対する前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドの含有量は、対象とする腫瘍細胞の増大を抑制したり、腫瘍細胞を減少したりすることができるのであれば特段限定されないが、溶解や保存等の都合から、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドとして、総量で、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上であり、一方で、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８０質量％以下である。
【００６５】
＜４．第四の実施態様＞
本発明の第四の実施態様は、前記第一の実施態様で説明したＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを含む抗癌剤である。
【００６６】
後述する実施例で実証されるように、配列番号２で表されるマウスのＦＡＭ８３Ｇをコ
ードするｃＤＮＡをベクターに挿入し、細胞に導入して過剰発現させると、ＨＳＰ２７のリン酸化が阻害されることが明らかとなった。これは、ＦＡＭ８３Ｇは、ＰＫＣのキナーゼドメインと結合してＰＫＣによるリン酸化を受けるためと考えられる。詳しくは、Ｎ末端側から３５６残基目のセリン（配列番号１で表されるＹＡＬＶＫＡＫＳＶＤＥＩＡＫＳのうち、Ｎ末端側から８残基目のＳ（セリン）に相当する。）がリン酸化され、その結果、細胞内のＨＳＰ２７のリン酸化が阻害されるためと考えられる。ＦＡＭ８３Ｇのリン酸化が亢進するとＨＳＰ２７のリン酸化が減少することから、ＦＡＭ８３ＧとＨＳＰ２７は、ＰＫＣへの結合を競合しているものと考えられる。
【００６７】
ＨＳＰ２７のリン酸化が阻害されると、該細胞の薬剤耐性能（抗アポトーシス作用能）が抑制される。即ち、アポトーシス誘導が活性化される。その結果、該細胞はプログラム細胞死によって死滅する。
【００６８】
このことから、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターは、腫瘍治療の用途に好ましく用いられる。
【００６９】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターは、例えば、第一の実施態様の説明に記載したような公知の方法を用いて、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することで製造することができる。
【００７０】
ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを生体細胞に導入する場合の動物細胞用発現ベクターとしては、導入された生体細胞内でＦＡＭ８３Ｇが正常に発現されれば、特に制限されない。例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。また、宿主細胞としては上記ベクターを挿入できる公知のものを用いることができ、宿主細胞への導入も公知の方法により行うことができる。
これら発現系は、ＦＡＭ８３Ｇの発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。また、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターには、リポソームも含まれる。
【００７１】
上記した動物細胞用ベクターの中でも、サイトメガロウイルスベクターが、安全性や使用の便からして好ましく、例えば、ｐＣＭＶ６プラスミドベクターなどがより好ましい。
【００７２】
上記した通り、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターは、細胞内のＨＳＰ２７のリン酸化を阻害し、該細胞の薬剤耐性能（抗アポトーシス作用能）を抑制して、該細胞のアポトーシス誘導を活性化する。その結果、該細胞はプログラム細胞死によって死滅する。そのため、ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の製剤化のための方法を適宜採用することで、抗癌剤に用いることができる。
【００７３】
この抗癌剤が投与される対象となる癌は、ＨＳＰ２７を発現している癌であれば特段限定されないが、大腸癌、肺癌、肝癌、肉腫、血液腫瘍、及び癌幹細胞を含む癌であることが好ましい。
【００７４】
抗癌剤には、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを単独で使用することもできるが、抗癌剤に含まれるベクターが安定であれば、治療のための任意の有効成分との混合物として含有することができ、また、製剤学の技術分野において周知の方法により、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合することもできる。さらに、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質を用いることもできる。このような有効成分や担体の具体例は、上記第一の実施態様と同様である。
【００７５】
抗癌剤全量に対する前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターの含有量は、対象とする癌細胞の増大を抑制したり、癌細胞を減少したりすることができるのであれば特段限定されないが、溶解や保存等の都合から、該ベクターとして、総量で、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上であり、一方で、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８０質量％以下である。
【００７６】
癌の治療において、前記ＦＡＭ８３Ｇタンパク質又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを病変部位に直接投与することもできる。例えば、サイトメガロウイルスベクター発現ベクターを利用する場合は、癌組織等の病変部位に本実施態様に係るベクターの懸濁液を直接接種することができる。また、ＦＡＭ８３ＧをコードするＤＮＡを収納したリポソームを用いる場合も、癌組織等の病変部位に該リポソームの懸濁液を直接接種することができる。
【００７７】
＜５．第五の実施態様＞
本発明の第五の実施態様は、配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１または３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチド、又はそれらの薬理学的に許容される塩である。
【００７８】
配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチド（ＨＳＰ２７のリン酸化を阻害する機能を有する）については、前記第一の実施態様の説明が援用される。
【００７９】
本実施態様に係る配列番号１または３で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び、配列番号１または３で表されるアミノ酸配列のうち１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドの薬理学的に許容される塩としては、薬理学的に許容される酸（例えば、無機酸、有機酸）や、塩基（例えば、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
これらの薬理学的に許容される塩は公知の方法で製造することができる。例えば、第一の実施態様で説明した方法などで製造することができる。
【実施例】
【００８０】
以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことはいうまでもない。
【００８１】
＜１．ＣＨＯＩＥ細胞株の調製＞
以下の実施例では、汎用されているＣＨＯ細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞株
）に、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体とインスリン受容体とを恒常的に発現させたＣＨＯＩＥ細胞株を用いて行った。
−８０℃でフリーズストックしておいた該細胞株を、３７℃の恒温槽で解凍し、１０ｍｌのα-MEM培地（GIBCO）＋ウシ胎児血清（HyClone）に溶解後、１５０ｍｍディッシュ（Nunc）に、５×１０６個／ディッシュの細胞濃度で播種した。その後、３７℃、ＣＯ２／空気＝６％／９４％の環境下で、ＣＨＯＩＥ細胞を２４時間培養した。また、ＤＭＳＯを除去するため、２４時間後に培地の交換を行った。
培養は、８０〜９０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の状態になったら継代した。
【００８２】
＜２．ｃＤＮＡ、発現ベクターｐＣＭＶ６、組換えベクターｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇ＞
Myc-DDK-tagged Mouse Fam83g cDNA cloneとしてOriGen社から購入した。ベクターはpCMV6でDDK=FLAG tagである。cDNAのシークエンスは全長に渡って確認して実験に用いた。
プラスミドはCsCl double banding法で精製した。
【００８３】
＜３．ｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇ導入後の細胞観察＞
［実施例１］
エレクトロポーレーション法によって、ＣＨＯＩＥ細胞内にｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇを導入した後、そのＣＨＯＩＥ細胞を３７℃、ＣＯ２／空気＝６％／９４％の環境下で培養した。ｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇ導入後に再度培養を開始してから４８時間経過後の細胞の様子を図１に示す。尚、図１には独立に実施した３回の結果を示している（＃１〜３で示している）。
【００８４】
［比較例１］
ＦＡＭ８３ＧをコードするｃＤＮＡを挿入しなかった発現ベクターｐＣＭＶ６を用いたこと以外は実施例１と同様にしたものを比較例１とした。
【００８５】
図１から分かるように、比較例１（ｐＣＭＶ６が導入された細胞）ではＣＨＯＩＥ細胞は非常に高密度な状態となったが、実施例１（ｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇが導入された細胞）では、比較例１に比べて細胞密度が非常に小さいことが分かった。
【００８６】
＜４．アポトーシスの検出＞
［実施例２、比較例２］
比較例１（ｐＣＭＶ６が導入された細胞）に比べて、実施例１（ｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇが導入された細胞）では細胞密度が非常に小さかったことの原因として、細胞がアポトーシスを起こしているのではないかと考えられた。それを確かめるために、ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ法でアッセイを行った。尚、ここでは、上記した実施例１の細胞を用いたものを実施例２と、比較例１の細胞を用いたものを比較例２とする。
【００８７】
アッセイは市販のキット（アポトティックＤＮＡラダーキット；ロシュ社）を用いて行った。その結果を図２に示す。比較例２では起点付近に濃染されるバンドを認識できるが、実施例２ではスメアーの中にバンドも検出されてアポトーシスが惹起されていることが示唆された。通常の培養後の観察であって、紫外線照射等のアポトーシスを誘導する刺激は全く与えていないにも拘わらず、アポトーシスが誘導されたわけでもあり非常に興味深い結果である。
【００８８】
＜５．ＦＡＭ８３Ｇのリン酸化の検出＞
［実施例３］
３．と同様にして、エレクトロポーレーション法によってＣＨＯＩＥ細胞内にｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇを導入し、細胞を培養した。ＣＨＯＩＥ細胞に発現させたＦＡＭ８３Ｇ
を、ｍｙｃ抗体（Millipore社）を用いて免疫沈降法で回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展
開した。その後、セリン残基の燐酸化を特異的に認識する抗体である抗ホスフォセリン抗体（abcam社）、又はＦＬＡＧタグを特異的に認識する抗体である抗FLAG抗体（シグマア
ルドリッチ社）でウエスタンブロットを行った。
【００８９】
［比較例３］
ＦＡＭ８３ＧをコードするｃＤＮＡを挿入しなかった発現ベクターｐＣＭＶ６を用いたこと以外は実施例３と同様にしたものを比較例３とした。
【００９０】
結果を図３に示す。図３中の（ａ）はＦＬＡＧ抗体を用いた場合であり、（ｂ）はホスフォセリン抗体を用いた場合である。図３から分かるように、実施例３ではＦＡＭ８３Ｇがリン酸化されていることが分かる。一方、比較例３ではバンドが検出されなかった。
【００９１】
＜６．ＨＳＰ２７リン酸化阻害の検出＞
［実施例４］
３．と同様にして、エレクトロポーレーション法によってＣＨＯＩＥ細胞内にｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇを導入し、細胞を培養した。ただし、後述する試験のために、血清を含むものと含まないものとに分けて培養を行った。
【００９２】
ｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇが導入されたＣＨＯＩＥ細胞中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開後、ＨＳＰ２７のリン酸化を特異的に認識する抗体である抗HSP27(Ser82)抗体（CSTジャパン社）でウエスタンブロットを行った。尚、この抗体は、ＨＳＰ２７のＮ
末端側から８２残基目のセリン残基のリン酸化を特異的に認識する抗体である。
【００９３】
［比較例４］
ＦＡＭ８３ＧをコードするｃＤＮＡを挿入しなかった発現ベクターｐＣＭＶ６を用いたこと以外は実施例４と同様にしたものを比較例４とした。
【００９４】
結果を図４に示す。図４から分かるように、培地が血清を含まない場合には、ＦＡＭ８３Ｇを過剰発現していない比較例４では、ＨＳＰ２７がリン酸化されていることが分かる。これは、細胞がＨＳＰ２７のリン酸化を高めて細胞死を防ごうとしているものと考えられる。一方で、ＦＡＭ８３Ｇを過剰発現させた実施例４では、そのリン酸化が顕著に低下していることが分かる。
また、培地が血清を含有する場合には、血清を含有しない場合に比べて、ＦＡＭ８３Ｇを過剰発現しているか、していないかに拘わらず、どちらのＨＳＰ２７のリン酸化も減少したが、ＦＡＭ８３Ｇが過剰発現している細胞では、さらに顕著に低下したことが分かる。
【００９５】
＜７．ＦＡＭ８３Ｇにおけるリン酸化部位の特定＞
［参考例１］
＜７−１．組換えベクターｐＣＭＶ６−Ｓ３５６Ａ−ＦＡＭ８３Ｇの調製＞
ＦＡＭ８３ＧのＮ末端側から３５６残基目のセリン残基をアラニン残基に置換してリン酸化が起きないようにした変異型のタンパク質を産生するようにｃＤＮＡを調製し、発現ベクターｐＣＭＶ６に挿入し、組換えベクターｐＣＭＶ６−Ｓ３５６Ａ−ＦＡＭ８３Ｇを調製した。
【００９６】
［参考例２］
＜７−２．組換えベクターｐＣＭＶ６−Ｙ５８６Ｆ−ＦＡＭ８３Ｇの調製＞
ＦＡＭ８３ＧのＮ末端側から５８６残基目のチロシン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異型のタンパク質を産生するようにｃＤＮＡを調製し、発現ベクターｐＣＭＶ６
に挿入し、組換えベクターｐＣＭＶ６−Ｙ５８６Ｆ−ＦＡＭ８３Ｇを調製した。
これは、前記したｐＣＭＶ６−Ｓ３５６Ａ−ＦＡＭ８３Ｇの３５６残基目のセリン残基はリン酸化を受けるが、アミノ酸を置換することでａｒｔｉｆａｃｔが起きないか検証するための対照として用意したものである。
【００９７】
［参考例３］
＜７−３．組換えベクターｐＣＭＶ６−ＷＴ−ＦＡＭ８３Ｇの調製＞
ｐＣＭＶ６−ＦＡＭ８３Ｇを用いたこと以外は参考例１と同様にしたものを参考例３とした。
【００９８】
［参考例４］
＜７−４．ベクターｐＣＭＶ６の調製＞
また、ｃＤＮＡを挿入しなかった発現ベクターｐＣＭＶ６を用いたこと以外は参考例１と同様にしたものを参考例４とした。
【００９９】
＜７−５．ベクター導入後の細胞観察＞
調製した参考例１〜４のベクターを、３．と同様にして、エレクトロポーレーション法によってＣＨＯＩＥ細胞内に導入し、細胞を培養した。
結果を図５に示す。図５から分かるように、参考例１および参考例２では、ＣＨＯＩＥ細胞は非常に高密度な状態となったが、参考例３および参考例４では、上記比較試験例に比べて細胞密度が非常に小さいことが分かった。
【０１００】
＜７−６．総タンパク質量を用いた細胞数の評価＞
上記の観察に加えて、総タンパク質量を用いた細胞数の評価を行った。
【０１０１】
結果を図６に示す。図６から分かるように、参考例１および参考例２に比べ、参考例３および参考例４では、総タンパク質量が少ないことが分かった。これは細胞数が少ないことによるものと考えられる。
【０１０２】
＜８．配列番号１で表されるペプチドの合成＞
配列番号１で表されるペプチド（ＹＡＬＶＫＡＫＳＶＤＥＩＡＫＳ）は、株式会社ペプチド研究所に合成を委託した。尚、純度（ＨＰＬＣグレード）は９９．６％であった。
【０１０３】
＜９．ペプチド導入後の細胞観察＞
［実施例５］
エレクトロポーレーション法によって、ＣＨＯＩＥ細胞内に配列番号１で表されるペプチドを導入した後、そのＣＨＯＩＥ細胞を３７℃、ＣＯ２／空気＝６％／９４％の環境下で培養した。ペプチド導入後に再度培養を開始してから１４時間経過後の細胞の様子を図７に示す。
【０１０４】
［実施例６］
また、配列番号１で表されるペプチドの最終濃度を５８０μＭとしたこと以外は実施例５と同様にしたものを実施例６とした。
【０１０５】
［比較例５］
一方、配列番号１で表されるペプチドを含まないこと以外は実施例５と同様にしたものを比較例５とした。
【０１０６】
図７に示すように、比較例５ではＣＨＯＩＥ細胞は非常に高密度な状態となったが、実施例５では、比較例１に比べて細胞密度が小さく、実施例６では、さらに細胞密度が小さ
いことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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