(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、および少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、抗体組成物であって、該少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ３抗体は、それぞれ配列番号：５４および５５；それぞれ配列番号：５６および５７；それぞれ配列番号：５８および５９；またはそれぞれ配列番号：６０および６１中の、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、抗体組成物。
【請求項２】
ａ）配列番号：４２の重鎖可変領域配列および配列番号：４３の軽鎖可変領域配列を含む抗体；
ｂ）配列番号：４６の重鎖可変領域配列および配列番号：４７の軽鎖可変領域配列を含む抗体；
ｃ）配列番号：５０の重鎖可変領域配列および配列番号：５１の軽鎖可変領域配列を含む抗体；
ｄ）配列番号：５２の重鎖可変領域配列および配列番号：５３の軽鎖可変領域配列を含む抗体；
ｅ）配列番号：５４の重鎖可変領域配列および配列番号：５５の軽鎖可変領域配列を含む抗体；ならびに
ｆ）配列番号：６０の重鎖可変領域配列および配列番号：６１の軽鎖可変領域配列を含む抗体
を含む、抗体組成物。
【請求項３】
ａ）抗ＥＧＦＲ抗体が、
ｉ）Ａｒｇ４４、Ｖａｌ８３およびＩｌｅ１０４を有する配列番号：１を含む重鎖可変領域配列、ならびにＬｅｕ３４、Ｔｙｒ４１、Ｌｅｕ５１およびＰｈｅ９２を有する配列番号：３を含む軽鎖可変領域配列；
ｉｉ）Ａｒｇ４４、Ｖａｌ８３およびＩｌｅ１０４を有する配列番号：１を含む重鎖可変領域配列、ならびにＴｙｒ４１、Ｌｅｕ５１およびＰｈｅ９２を有する配列番号：３を含む軽鎖可変領域配列；
ｉｉｉ）Ａｒｇ４４およびＶａｌ８３を有する配列番号：１を含む重鎖可変領域配列、ならびにＡｌａ１９およびＰｈｅ９２を有する配列番号：２を含む軽鎖可変領域配列；
ｉｖ）Ｌｅｕ２０、Ｉｌｅ４８およびＡｌａ６８を有する配列番号：４を含む重鎖可変領域配列、ならびにＶａｌ７５およびＰｈｅ８７を有する配列番号：５を含む軽鎖可変領域配列；または
ｖ）Ｌｅｕ２０、Ｉｌｅ４８、Ｌｅｕ５６およびＡｌａ６８を有する配列番号：４を含む重鎖可変領域配列、ならびにＶａｌ７５およびＰｈｅ８７を有する配列番号：５を含む軽鎖可変領域配列
を含み
ｂ）抗ＨＥＲ２抗体が、
ｉ）Ｓｅｒ５５、Ｌｅｕ７０、Ｖａｌ７２、Ｌｙｓ７４およびＡｌａ７９を有する配列番号：６を含む重鎖可変領域配列、ならびにＶａｌ４４、Ｍｅｔ４８およびＴｙｒ７０を有する配列番号：７を含む軽鎖可変領域配列；
ｉｉ）Ｓｅｒ５５およびＶａｌ７２を有する配列番号：６を含む重鎖可変領域配列、ならびにＭｅｔ４８およびＴｙｒ７０を有する配列番号：７を含む軽鎖可変領域配列；または
ｉｉｉ）Ａｌａ４９、Ｉｌｅ７４およびＳｅｒ７７を有する配列番号：８を含む重鎖可変領域配列、ならびにＴｈｒ５６、Ｔｙｒ７１、Ｓｅｒ８５およびＬｅｕ１０４を有する配列番号：９を含む軽鎖可変領域配列
を含み；そして
ｃ）抗ＨＥＲ３抗体が、
ｉ）Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＩｌｅ６８を有する配列番号：１０を含む重鎖可変領域配列、ならびにＰｈｅ３６、Ｖａｌ４４、Ｐｈｅ４９およびＩｌｅ８５を有する配列番号：１１を含む軽鎖可変領域配列；
ｉｉ）Ａｓｎ４４、Ｓｅｒ５５およびＴｈｒ９３を有する配列番号：１０を含む重鎖可変領域配列、ならびにＰｈｅ３６、Ｐｈｅ４９およびＬｅｕ７３を有する配列番号：１１を含む軽鎖可変領域配列；
ｉｉｉ）Ｖａｌ４６、Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＡｒｇ７２を有する配列番号：１２を含む重鎖可変領域配列、ならびにＶａｌ２１、Ｔｈｒ２９、Ｖａｌ４４およびＰｈｅ８７を有する配列番号：１３を含む軽鎖可変領域配列；または
ｉｖ）Ｐｈｅ４１、Ｖａｌ４６、Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＡｒｇ７２を有する配列番号：１２を含む重鎖可変領域配列、ならびにＶａｌ２１、Ｖａｌ４４、Ｔｙｒ７１、Ｐｈｅ８７およびＬｅｕ１０４を有する配列番号：１３を含む軽鎖可変領域配列
を含む、
請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項４】
ａ）それぞれ配列番号：３８および３９、それぞれ配列番号：４０および４１、またはそれぞれ配列番号：４２および４３のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗ＥＧＦＲ抗体；
ｂ）それぞれ配列番号：４４および４５、またはそれぞれ配列番号：４６および４７のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗ＥＧＦＲ抗体；
ｃ）それぞれ配列番号：４８および４９、またはそれぞれ配列番号：５０および５１のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗ＨＥＲ２抗体；
ｄ）それぞれ配列番号：５２および５３のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗ＨＥＲ２抗体；
ｅ）それぞれ配列番号：５４および５５、またはそれぞれ配列番号：５６および５７のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗ＨＥＲ３抗体；および
ｆ）それぞれ配列番号：５８および５９、またはそれぞれ配列番号：６０および６１のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗ＨＥＲ３抗体
を含む、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の抗体組成物および薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項６】
組成物中の少なくとも１種の抗体が、抗体が抗癌剤と結合した免疫複合体である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも１種のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体、少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ２抗体、および少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物の製造方法であって、
少なくとも第一、第二および第三の宿主細胞であって、該第一の宿主細胞が、請求項４のａ）またはｂ）に記載の抗ＥＧＦＲ抗体を発現することができ、該第二の宿主細胞が、請求項４のｃ）またはｄ）に記載の抗ＨＥＲ２抗体を発現することができ、該第三の宿主細胞が、請求項４のｅ）またはｆ）に記載の抗ＨＥＲ３抗体を発現することができる、細胞を提供し、
該第一、第二および第三の宿主細胞を、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体および抗ＨＥＲ３抗体の発現に適する条件下で培養し、そして
得られた抗体を単離すること
を含む、方法。
【請求項８】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２および／またはＨＥＲ３の発現または過剰発現により特徴付けられる障害を有する患者の処置における使用のための、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の抗体組成物または請求項５もしくは６に記載の医薬組成物を含む医薬組成物。
【請求項９】
患者における癌の処置における使用のための、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の抗体組成物または請求項５もしくは６に記載の医薬組成物を含む医薬組成物。
【請求項１０】
患者が抗体および／またはチロシンキナーゼ阻害剤を用いる処置に対して獲得耐性を有する、請求項８もしくは９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
患者における癌の増殖の阻害における使用のための、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の抗体組成物または請求項５もしくは６に記載の医薬組成物を含む医薬組成物。
【請求項１２】
癌患者において、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２もしくはＨＥＲ３の発現の低減またはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２もしくはＨＥＲ３の上方制御の阻止における使用のための、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の抗体組成物または請求項５もしくは６に記載の医薬組成物を含む医薬組成物。
【請求項１３】
患者が膵臓癌、所望によりＫＲＡＳ変異を有する膵臓癌；骨肉腫；大腸癌；子宮内膜癌；または尿管癌を患う、請求項９ないし１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
少なくとも１種の抗体が抗癌剤と複合体を形成している、請求項９ないし１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
患者がこれまでに癌の処置を受けていない、請求項９ないし１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
患者がこれまでに癌の処置を受けている、請求項９ないし１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
患者が、これまでにセツキシマブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブの処置を受けている、請求項９ないし１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
患者が、セツキシマブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブに対して獲得耐性を有する、請求項９ないし１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
患者がヒトである、請求項８ないし１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
他出願の引用
本出願は、２０１２年５月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６４１，７５６号、および２０１３年４月５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０９，１５９号に基づく優先権の利益を主張する。それらの出願の開示は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーを標的とする新規ヒト化組換え抗体および癌治療における使用のための２種またはそれ以上のこれらの抗体を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
上皮細胞増殖因子受容体ファミリー（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリー）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の下位群であり、４つのメンバー：ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４を含む。ＥＧＦＲファミリーのメンバーは、細胞外リガンド結合領域、単一の細胞膜貫通ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメインを有する密接に関連した一本鎖モジュラー糖タンパク質である。通常の生理的条件下では、ＥｒｂＢファミリーは、細胞増殖、分化および移動の調整において重要な事象を調節する。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３は、正常細胞の悪性転換および癌細胞の持続的な増殖において極めて重要な役割を果たすと考えられる。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、多くの上皮癌にて過剰発現されていることが見出されている。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の過剰発現はさらに、いくつかのヒト上皮癌における疾患の進行、生存率の低下、応答不良および化学療法抵抗性に関係している。悪性転換および癌の進行におけるＨＥＲ４の役割については論争があり、本発明においてはさらに議論しない。
【０００４】
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、実証された癌の標的であり、これらのチロシンキナーゼのモノクローナル抗体および低分子阻害剤の両方は、種々の癌の処置のために承認されている。ＨＥＲ３は、現在、可能性のある治療標的として探求されている。しかしながら、これらの治療に最初に応答する患者はしばしば、耐性の獲得により再発する。前臨床治験は、耐性発現における非標的化受容体の一方または両方の関与を指摘する。故に、ＥｒｂＢ受容体が、成長刺激性シグナル伝達および悪性表現型を維持するために、互いに置き換わる能力を有するようである。従って、２つまたは３つ全ての受容体の同時標的化が、ＥｒｂＢファミリーに依存する癌細胞を阻害するより有効な方法であり得る。
【０００５】
ＥＧＦＲは、１１８６アミノ酸残基の単一のポリペプチド鎖からなる１７０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質であり、ヒト外陰部癌腫細胞株に由来するヒトｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定により最初に決定され、記載された。ＥＧＦＲは、３つの主なドメイン：細胞外ドメイン、細胞膜貫通ドメインおよびチロシンキナーゼを含む細胞内ドメインを含む。ＥＧＦＲの触媒活性は、チロシンキナーゼドメイン（残基６８５−９５３）に帰属し、リガンド結合により活性化される。
【０００６】
ＥＧＦＲは、２つの異なるコンフォメーション、すなわち膜繋留型（tethered）コンフォメーション（屈曲型）および非繋留型（extended）コンフォメーション（伸張型）として存在する。受容体は、２つのコンフォメーション間で入れ替わる。ＥＧＦＲの細胞外領域の膜繋留型コンフォメーションドメインＩＩおよびＩＶが相互作用した状態では、受容体は自己抑制状態のままである。さらに、ドメインＩＩＩは、ドメインＩからかなり離れた場所に保持されており、それにより、両ドメインへのＥＧＦの結合は、同時には不可能である。ＥＧＦＲの伸張型コンフォメーションにおいて、ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩは、Ｃ形に立体的に配置され、ＥＧＦ結合のための空間を提供する。さらに、構造変化は、“二量体化アーム（dimerization arm）”としても知られているドメインＩＩ内の２０残基領域からなるβ−ヘアピンの暴露を誘導する。ＥＧＦＲのドメインＩＩから伸びる該二量体化アームは、別のＥＧＦＲのドメインＩＩと広範囲に結合して、ＥＧＦＲ二量体を形成する。
【０００７】
二量体化は、受容体の調節領域におけるチロシン残基のリン酸化のために十分近い受容体の活性な細胞質チロシンキナーゼドメインをもたらす。さらに、２つの受容体の膜近傍領域は、チロシンキナーゼ二量体の安定化に重要であることが見出されている逆平行二量体（antiparallel dimer）を形成する。“受容体により仲介される”二量体化機序は、“リガンドにより仲介される”二量体化がさらに共通するテーマである他のチロシンキナーゼ受容体と比較して、ＥｒｂＢファミリーに関してユニークである。
【０００８】
ＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼドメインの活性化の多くの様式が示唆されている。他の受容体チロシンキナーゼとは異なり、デフォルトのＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインは、リン酸化および活性化キナーゼにおいてのみ通常観察されるコンフォメーションをとる。このことは、ＥＧＦＲのキナーゼドメインが構成的に活性であることを示す。従って、構成的チロシンキナーゼの制御は、トランス−リン酸化のための二量体化パートナーのＣ末端制御領域の送達を介して起こる。チロシンキナーゼドメインの活性化が結晶学的研究において視覚化されていない阻害相互作用の変位を含むという別の可能性がある。しかしながら、ＥＧＦＲの膜近傍領域およびチロシンキナーゼ領域の結晶構造分析により、２つのＥＧＦＲの二量体化により形成されるチロシンキナーゼの非対称二量体が、チロシンキナーゼ活性の制御に重要であるということが明らかにされている。この非対称ホモ二量体において、一方のチロシンキナーゼは、受容体(レシーバー)として働き、他方のチロシンキナーゼは、供与体（ドナー）として働く。レシーバーキナーゼドメインのみが触媒活性を有し、受容体のＣ末端におけるチロシン残基をリン酸化する（シスまたはトランスまたは両方のいずれかは知られていない）。
【０００９】
クラスリン介在性エンドサイトーシスは、ＥＧＦＲの下方制御の最も重要な機序である。ＥＧＦＲの運命は、リガンド−受容体複合体の安定性に依存する。ＥＧＦがＥＧＦＲへ結合すると、ＥＧＦＲホモ二量体は、迅速にクラスリン被覆ピットに標的化され、リガンド誘導エンドサイトーシスを介して内在化される(internalized)。同時に、ＥＧＦＲは、モノユビキチンおよびポリユビキチンの両方の結合により大きくユビキチン化される。ユビキチンリガーゼＣｂｌは、ＥＧＦＲのユビキチン化に関与する。Ｃｂｌは、直接的に、またはＧｒｂ２のようなアダプタータンパク質を介して間接的のいずれかで、ＥＧＦＲの調節領域におけるリン酸化チロシン残基へ結合する。Ｇｒｂ２を介するＥＧＦＲへのＣｂｌの結合は、受容体の細胞内への移行（internalization（インターナリゼーション））のために必要である。Ｅｓｐ１５もまた、ＥＧＦＲの細胞内への移行において役割を果たす。しかしながら、Ｅｓｐ１５の正確な役割については、未だ論争されている。ユビキチン化は、ＥＧＦＲのエンドサイトーシス下方調節およびリソソームへのＥＧＦＲのエンドソーム選別に関与する。ユビキチン鎖は、輸送のために必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）および初期エンドソームの膜にユビキチン化タンパク質を保持するＨｒｓ／ＳＴＡＭにより認識され、それによりＥＧＦＲのリサイクルを妨げる。その後、ＥＧＦＲは、腔内小胞（ＩＬＶ）に送られ、後期エンドソームへのＥＧＦＲの送達および最後にリソソームにおける分解を引き起こす。
【００１０】
ＥＧＦＲの分解と対照的に、ＥＧＦに結合されるとき、ＴＧＦ−αの結合は受容体リサイクルを可能にする。ＴＧＦ−αリガンドは、酸性環境によって初期エンドソームにおいてＥＧＦＲから迅速に解離し、受容体の脱リン酸化、脱ユビキチン化をもたらし、それによる細胞表面への受容体のリサイクルを引き起こす。
【００１１】
ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２またはＮｅｕ）は、１９８４年にSchechterらにより最初に報告された。ＨＥＲ２は、１２３４個のアミノ酸からなり、４つのサブドメインＩ−ＩＶ、細胞膜貫通ドメイン、膜近傍ドメイン、細胞内細胞質チロシンキナーゼおよび制御Ｃ−末端ドメインからなる細胞外ドメインを有するＥＧＦＲと構造的に類似している。
【００１２】
膜繋留型ＥＧＦＲにおけるドメイン配置を制限するドメインＩＩ−ＩＶ結合は、ＨＥＲ２に存在しない。不活性化ＥＧＦＲにおける膜繋留を安定化させるために重要な７つの保存された残基のうちの３つは、ＨＥＲ２と異なる。従って、ＨＥＲ２は、暴露され、一見保たれている二量体化アームを有する非繋留型（伸張型）におけるＥＧＦＲに似ており、受容体−受容体相互作用を駆動する。膜繋留型ＨＥＲ２コンフォメーションの非存在は、該受容体がＥｒｂＢファミリーの他のメンバーに対して見られる通りの自己阻害を欠いていることを示す。サブドメインＩ−ＩＩＩの安定な接合面は、ＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体の拡張型立体配置と同様の拡張型立体配置におけるＨＥＲ２を維持しているようである。ドメインＩおよびＩＩＩ間の相互作用は、ＥＧＦＲのドメインＩおよびＩＩＩにおけるリガンド−結合部位に対応する領域に関与し、リガンドに対する立体的空間をなくし、ＨＥＲ２のリガンドへの結合を不可能にする。ドメインＩＩおよびＩＶは、ＨＥＲ２およびＥｒｂＢファミリーの別のメンバーのヘテロ二量体形成を安定化させる２つの別個の接合面を形成する。
【００１３】
生物物理学的試験は、溶液または結晶において有意なＨＥＲ２ホモ二量体化を検出しなかった。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のドメインＩＩの残基は類似である。しかしながら、二量体接合面でのＡｒｇ２８５は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２間で保存されていない。ＨＥＲ２において、残基２８５はＬｅｕである。突然変異試験は、この位置のＬｅｕが、溶液においてＨＥＲ２ホモ二量体の不存在と部分的に関与することを示唆する。インビボでの無傷のＨＥＲ２の二量体化は、ＨＥＲ２の細胞膜貫通ドメインにおける部位のさらなる相互作用を必要とし得る。
【００１４】
ＨＥＲ２は、既知のリガンドを結合しないＥｒｂＢファミリーの唯一のメンバーである。ＨＥＲ２は代わりに、他のＥｒｂＢファミリーメンバーとの異種複合体の形成によって活性化されて、それによりＥＦＧＲおよびＨＥＲ３リガンドにより間接的に制御される。ＨＥＲ２は、３つの他のＥｒｂＢ受容体の好ましいヘテロ二量体化パートナーである。ＨＥＲ２は、リガンド−受容体複合体の解離速度を遅くすることにより、他のＥｒｂＢ受容体のそれらのリガンドとの親和性を増強させ、それによりＨＥＲ２は、シグナル伝達を増強および延長させる。他のＥｒｂＢ受容体のリガンド親和性を増強させるＨＥＲ２の能力は、ヘテロ二量体化パートナーとして、ＨＥＲ２の雑多な性質を反映し得る。ＨＥＲ２およびＥｒｂＢファミリーの別のリガンド結合受容体のヘテロ二量体化は、クロスリン酸化を引き起こし、Ｃ末端チロシン残基のリン酸化をもたらす。最も活動的なＨＥＲ２ヘテロ二量体は、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３複合体である。ＨＥＲ２は、活性キナーゼを提供することによりキナーゼ−欠失ＨＥＲ３を補足する。
【００１５】
ＥＧＦＲと対照的に、ＨＥＲ２は、過剰発現されるとき、内在化（インターナリゼーション）抵抗性である。ＨＥＲ２の過剰発現はさらに、他のＥｒｂＢファミリーメンバーのエンドサイトーシスを阻害することが報告されている。ＨＥＲ２がリソソーム分解を免れ、それにより細胞膜に残存する２つのメカニズムが、示唆されている。ＨＥＲ２がインターナリゼーションを回避するか、またはそれが効率的にエンドサイトーシスからリサイクルされ細胞膜に戻る。標識された抗体を用いる試験は、ＨＥＲ２が常にインターナリゼーションされ、リサイクルされることを示した。対照的に、他の試験は、リサイクルを阻害することが知られている化合物で処理された細胞において細胞内ＨＥＲ２を検出しなかった。
【００１６】
ＨＥＲ２のカルボキシル末端が、インターナリゼーションに必要な全てのシグナルを有さないこと、またはクラスリン介在性エンドサイトーシスに必須の阻害シグナルを含むことが提案されている。加えて、試験は、ＨＥＲ２ヘテロ二量体がエンドソームに送達されないことを示した。ＥＧＦＲ上に見出される１つのようなＣｂｌドッキング部位はまた、ＨＥＲ２（Ｙ１１１２）上に同定されている。故に、Ｃｂｌは、ＨＥＲ２に捕捉されて、ＨＥＲ２のユビキチン化を引き起こし得るが、Ｃｂｌの実際の結合効率は不明である。ＨＥＲ２が膜突出との結合によってインターナリゼーション抵抗性であることが提案されている。最後に、他の試験は、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲヘテロ二量体のエンドサイトーシス抵抗性が、クラスリン被覆ピットの非効率的なＥＧＦ誘導性形成と関係することを示した。
【００１７】
ヒト上皮細胞増殖因子受容体３（ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ３）として公知の、ＥｒｂＢファミリーの３番目のメンバーは、Kraus M. Hらにより１９８９年に同定された。ＨＥＲ３遺伝子は、１３４２アミノ酸のタンパク質をコード化し、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と顕著な構造的類似性を有する。全体的な大きさ、２つのシステインクラスター（ドメインＩＩおよびＩＶ）を伴う４つの細胞外サブドメイン（Ｉ−ＩＶ）、およびチロシンキナーゼドメインのような特徴は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と構造的類似性を示す。ＨＥＲ３のチロシンキナーゼドメインは、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインと５９％の配列相同性を示す。
【００１８】
ＥＧＦＲと同様に、ＨＥＲ３は、膜繋留型(屈曲型)コンフォメーションおよび非繋留型(伸張型)コンフォメーションで存在する。膜繋留型コンフォメーションにおいて、二量体化アームは、ドメインＩＶとの相互作用により埋没し、ドメインＩおよびＩＩＩは効率的なリガンド結合のためには離れすぎている。細胞外ドメインＩおよびＩＩＩへのリガンド結合は、ＨＥＲ３の非繋留型コンフォメーションで起こり、ＥｒｂＢファミリーの他のメンバーとのヘテロ二量体化をもたらす。リガンド結合によりＨＥＲ３ホモ二量体は形成されない。非繋留型およびリガンド結合型ＨＥＲ３分子は、優先的に、ＨＥＲ２とヘテロ二量体化する。
【００１９】
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２と対照的に、ＨＥＲ３のチロシンキナーゼは、触媒活性が損なわれており、検出可能な生物学的応答のためには不十分である。タンパク質キナーゼの触媒ドメインにおいて高度に保存された２つのアミノ酸残基は、ＨＥＲ３の触媒ドメインでは変化している。これらは、残基８１５のアスパラギン酸のアスパラギンによる置換および残基７４０のグルタミン酸のヒスタミンによる置換である。該２つのアミノ酸置換は、ＨＥＲ３がそのチロシンキナーゼドメインの触媒活性を欠く理由であり得る。ＨＥＲ３の内因性キナーゼ活性の低下のため、受容体は、それ自体のリガンド結合に応答するために別のＥｒｂＢファミリーメンバーとヘテロ二量体化する必要がある。
【００２０】
ＨＥＲ３のエンドサイトーシスについてはほとんど知られていない。さらに、種々の試験は、ＨＥＲ３が、ＨＥＲ２と同程度にエンドサイトーシスが低下していることを示唆している。これと一致して、ＨＥＲ３−ＮＲＧ１複合体は、ＥＧＦＲ−ＥＧＦ複合体よりもインターナリゼーションが非効率的で、より緩慢であることが見出されており、ＨＥＲ３がＥＧＦＲほど効率よくエンドサイトーシスされないという考え方を支持している。しかしながら、ＥＧＦＲのＣ末端尾部がＨＥＲ３のＣ末端尾部で置換されたとき、ＥＧＦＲはエンドサイトーシス障害となり、ＨＥＲ３のＣ末端の領域が受容体をインターナリゼーションから保護することを示唆した。また、ＮＲＧ１は、ＥＧＦがＴＧＦαによって活性化されるときに観察されるように、エンドソームにおけるリガンド−受容体複合体の解離のためにＨＥＲ３を効率的に標的として分解に至らしめることもないことが示唆されている。
【００２１】
ＥｒｂＢファミリーの標的化は、癌処置戦略として最近１０年間で強く遂行されている。異なる処置様式、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびリガンドトラップが、探索されている。癌の処置のためのモノクローナル抗体の利点は標的特異性であり、慣用の細胞毒性癌化学療法と比較して低い毒性を保証する。モノクローナル抗体は、異常に高レベルのＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を有する固形腫瘍の処置に対して承認されており、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を標的とする多数のｍＡｂが臨床治験を行われている。ＴＫＩは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のチロシンキナーゼドメインにおけるＡＴＰ−結合部位に結合することにより受容体シグナル伝達を阻害する。エルロチニブ／タルセバ（登録商標）は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼを阻害し、ラパチニブ／タイケルブ（登録商標）は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方のチロシンキナーゼを阻害する。エルロチニブおよびラパチニブ(laptinib)は両方とも、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）およびＨＥＲ２を過剰発現する転移性乳癌のそれぞれの処置における使用のためのＦＤＡ承認ＴＫＩである。
【００２２】
しかしながら、モノクローナル抗体治療およびＴＫＩの臨床的有用性にもかかわらず、処置に対する獲得耐性の広がりは重大化しつつある問題である。ｍＡｂおよび慣用の細胞毒性化学療法の組み合わせ療法は、処置有効性を増加させるために行われているアプローチの１つである。さらに、いくつかの戦略は、モノクローナル抗体の有効性を増加させるため、エフェクター機能の増強を含むため、および直接的または間接的な放射性核種または毒素を用いる抗体の武装（ａｒｍ）のために試験されている。
【００２３】
故に、既存の処置に耐性を獲得した患者を含む患者群におけるＥＧＦＲファミリー関連疾患を処置するためのさらなる薬物が必要とされている。これらのさらなる薬物はまた、ヒト患者の処置に用いられたとき、望まれない免疫応答を誘発する危険が低くなければならない。
【発明の概要】
【００２４】
発明の概要
本発明者らはＥＧＦＲファミリーの２種またはそれ以上のメンバー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３）のヒト化抗体を用いる同時標的化が、癌増殖の効果的な阻害をもたらすことを発見した。本発明者らはまた、多数のＥＧＦＲファミリーメンバーを標的化する組成物は、１種のＥＧＦＲファミリーメンバーのみを標的化する薬物療法に対する耐性を獲得した癌を含む、膵臓、骨肉腫、大腸癌、子宮内膜癌、または尿管癌のような癌の処置に使用され得ることも見出した。
【００２５】
従って、本発明は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対するヒト化抗体、ならびにこれらの標的の２つまたはそれ以上に対する２つまたはそれ以上のヒト化抗体を含む組成物に関する。本発明はさらに、ヒト癌療法のための抗体および組成物の使用に関する。
【００２６】
本発明の一面は、少なくとも１種のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組換え抗体組成物に関する。
【００２７】
本発明のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号：１の重鎖可変領域配列および配列番号：３または配列番号：２の軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに配列番号：４の重鎖可変領域配列および配列番号：５の軽鎖可変領域配列を含む抗体から選択され得る。一態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、Ａｒｇ４４およびＶａｌ８３を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１）、ならびにＡｌａ１９およびＰｈｅ９２を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：２）；Ａｒｇ４４、Ｖａｌ８３およびＩｌｅ１０４を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１）、ならびにＴｙｒ４１、Ｌｅｕ５１およびＰｈｅ９２を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：３）；または、Ａｒｇ４４、Ｖａｌ８３およびＩｌｅ１０４を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１）、ならびにＬｅｕ３４、Ｔｙｒ４１、Ｌｅｕ５１およびＰｈｅ９２を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：３）を含み得る。別の態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｌｅｕ２０、Ｉｌｅ４８およびＡｌａ６８を含む重鎖可変領域配列（配列番号：４）、ならびにＶａｌ７５およびＰｈｅ８７を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：５）；または、Ｌｅｕ２０、Ｉｌｅ４８、Ｌｅｕ５６およびＡｌａ６８を含む重鎖可変領域配列（配列番号：４）、ならびにＶａｌ７５およびＰｈｅ８７を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：５）を含み得る。
【００２８】
いくつかの態様において、本発明は、重鎖および軽鎖アミノ酸配列が、それぞれ配列番号：４３および４４、それぞれ配列番号：３８および３９、それぞれ配列番号：４１および４２、それぞれ配列番号：４５および４６、またはそれぞれ配列番号：４７および４８、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む、ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体を包含する。
【００２９】
本発明のヒト化抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号：６の重鎖可変領域配列および配列番号：７の軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに配列番号：８の重鎖可変領域配列および配列番号：９の軽鎖可変領域配列を含む抗体から選択され得る。一態様において、抗ＨＥＲ２抗体は、Ｓｅｒ５５、Ｌｅｕ７０、Ｖａｌ７２、Ｌｙｓ７４およびＡｌａ７９を含む重鎖可変領域配列（配列番号：６）、ならびにＶａｌ４４、Ｍｅｔ４８およびＴｙｒ７０を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：７）；または、Ｓｅｒ５５およびＶａｌ７２を含む重鎖可変領域配列（配列番号：６）、ならびにＭｅｔ４８およびＴｙｒ７０を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：７）を含み得る。別の態様において、抗ＨＥＲ２抗体は、Ａｌａ４９、Ｉｌｅ７４およびＳｅｒ７７を含む重鎖可変領域配列（配列番号：８）、ならびにＴｈｒ５６、Ｔｙｒ７１、Ｓｅｒ８５およびＬｅｕ１０４を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：９）を含み得る。
【００３０】
いくつかの態様において、本発明は、重鎖および軽鎖アミノ酸配列が、それぞれ配列番号：５１および５２、それぞれ配列番号：４９および５０、またはそれぞれ配列番号：５３および５４、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体を包含する。
【００３１】
本発明のヒト化抗ＨＥＲ３抗体は、配列番号：１０の重鎖可変領域配列および配列番号：１１の軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに配列番号：１２の重鎖可変領域配列および配列番号：１３の軽鎖可変領域配列を含む抗体から選択され得る。一態様において、抗ＨＥＲ３抗体は、Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＩｌｅ６８、またはＡｓｎ４４、Ｓｅｒ５５およびＴｈｒ９３を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１０）、ならびにＰｈｅ３６、Ｖａｌ４４、Ｐｈｅ４９およびＩｌｅ８５、またはＰｈｅ３６、Ｐｈｅ４９およびＬｅｕ７３を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：１１）を含み得る。別の態様において、抗ＨＥＲ３抗体は、Ｖａｌ４６、Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＡｒｇ７２を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１２）、ならびにＶａｌ２１、Ｖａｌ４４およびＰｈｅ８７、および任意にＴｈｒ２９を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：１３）；または、Ｐｈｅ４１、Ｖａｌ４６、Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＡｒｇ７２を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１２）、ならびにＶａｌ２１、Ｖａｌ４４、Ｔｙｒ７１、Ｐｈｅ８７およびＬｅｕ１０４を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：１３）を含み得る。
【００３２】
いくつかの態様において、本発明は、重鎖および軽鎖アミノ酸配列が、それぞれ配列番号：５５および５６、それぞれ配列番号：５７および５８、それぞれ配列番号：５９および６０、またはそれぞれ配列番号：６１および６２、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む、ヒト化抗ＨＥＲ３抗体を包含する。
【００３３】
本発明はまた、上記の抗体の２、３、４、５または６種を含む抗体組成物を包含する。いくつかの態様において、抗体組成物は、(i)抗体１１２９４および／または１１３０２；(ii)抗体１１２４９および／または１１１４５；ならびに、(iii)抗体１０７３８および／または１１０５２を含み得る。一態様において、該組成物は全て６種の抗体を含む。
【００３４】
抗体組成物は、（ａ）抗ＥＧＦＲ抗体１０２９２、１０４６０、または１１２９４；（ｂ）抗ＥＧＦＲ抗体１０５６０または１１３０２；（ｃ）抗ＨＥＲ２抗体１０７０４または１１２４９；（ｄ）抗ＨＥＲ２抗体１１１４５；（ｅ）抗ＨＥＲ３抗体１０７３８または１０８１０；および、（ｆ）抗ＨＥＲ３抗体１１００６または１１０５２を含み得る。好ましい態様において、抗体組成物は、抗ＥＧＦＲ抗体１１２９４および１１３０２、抗ＨＥＲ２抗体１１２４９および１１１４５、ならびに抗ＨＥＲ３抗体１０７３８および１１０５２を含む。抗体１０２９２、１０４６０、１１２９４、１０５６０、１１３０２、１０７０４、１１２４９、１１１４５、１０７３８、１０８１０、１１００６、または１１０５２は、表４中、“Ｘａａ”として示される重鎖および／または軽鎖アミノ酸残基のいずれかの少なくとも１個のさらなる置換を含み得る。
【００３５】
一態様において、抗体組成物は、（ａ）配列番号：４３の重鎖可変領域配列および配列番号：４４の軽鎖可変領域配列を含む抗体；（ｂ）配列番号：４７の重鎖可変領域配列およびの配列番号：４８軽鎖可変領域配列を含む抗体；（ｃ）配列番号：５１の重鎖可変領域配列および配列番号：５２の軽鎖可変領域配列を含む抗体；（ｄ）配列番号：５３の重鎖可変領域配列および配列番号：５４の軽鎖可変領域配列を含む抗体；（ｅ）配列番号：５５の重鎖可変領域配列および配列番号：５６の軽鎖可変領域配列を含む抗体；ならびに、（ｆ）配列番号：６１の重鎖可変領域配列および配列番号：６２の軽鎖可変領域配列を含む抗体、を含み得る。
【００３６】
本発明のさらなる局面は、本発明の抗体および抗体組成物の製造方法；本発明の抗体または抗体組成物、および薬学的に許容される希釈剤、担体、または添加剤を含む医薬組成物；ヒトまたは他の哺乳動物における癌の処置方法であって、処置を必要とする対象に、治療的有効量の本発明の組換え抗体組成物または医薬組成物を投与することを含む方法；癌の処置のための医薬の製造を目的とする、本発明の組換え抗体組成物または医薬組成物の使用；ならびに、癌の処置のための医薬として使用するための本発明の組換え抗体組成物または医薬組成物に関する。ヒトの処置用に、抗体は、好ましくは、ヒトのＨＥＲファミリーメンバーを対象とする。いくつかの態様において、これらの組成物はそれぞれ、標的化ＨＥＲにおける異なるエピトープにそれぞれ結合する、２種以上のモノクローナル抗体を含む。いくつかの態様において、少なくとも１種の抗体は、抗癌剤、例えば、細胞毒性剤、サイトカイン、毒素、または放射性核種と結合されている。
【００３７】
本発明の方法によって処置可能な癌としては、膵臓癌（ＫＲＡＳ変異により促進される膵臓癌を含む）、頭頸部癌、乳癌、骨肉腫、大腸癌（結腸直腸癌を含む）、子宮内膜癌、尿管癌、皮膚癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、他の上皮癌、ならびにＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の１種またはそれ以上に依存する癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
患者は、癌処置歴を有していてもよい。例えば、患者は、単一のＥＧＦＲファミリーメンバーを標的とする薬物を用いて処置され、該薬物（例えば、セツキシマブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブ）に耐性を有していてもよい。
【００３９】
本発明はまた、本明細書に記載の重鎖または軽鎖可変領域を有する抗体のいずれかをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。本発明はまた、かかる核酸分子を含む発現ベクターおよびかかる核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、本明細書に記載の抗体のいずれかを発現し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１：完全ヒトフレームワーク領域に移植された、オリジナルマウスＣＤＲで構成されたin silicoで設計された配列を有する抗ＥＧＦＲヒト化モノクローナル抗体１０２９２、１０４６０、および１１２９４の可変鎖のアミノ酸配列アライメント。ドット（点）は同一を示し、他方、異なる位置ではアミノ酸の一文字表記が記載されている。斜線部分はＩＭＧＴ(データベース)により定義されるＣＤＲを示す。上：ＣＤＲ移植配列（１２７７＿ＣＤＲ移植−Ｈ；配列番号：６２）に整列された１０２９２（配列番号：３８）、１０４６０（配列番号：４０）、および１１２９４（配列番号：４２）の可変重鎖。中：ＣＤＲ移植配列（１２７７＿ＣＤＲ移植−Ｌ；配列番号：６３）に整列された１０２９２（配列番号：３９）の可変軽鎖。下：ＣＤＲ移植配列（１２７７Ａ＿ＣＤＲ移植−Ｌ；配列番号：６４）に整列された１０４６０（配列番号：４１）および１１２９４（配列番号：４３）の可変軽鎖。
【図２】図２：完全ヒトフレームワーク領域に移植された、オリジナルマウスＣＤＲで構成されたin silicoで設計された配列を有する抗ＥＧＦＲヒト化モノクローナル抗体１０５６０および１１３０２の可変鎖のアミノ酸配列アライメント。ドット（点）は同一を示し、他方、異なる位置ではアミノ酸の一文字表記が記載されている。斜線部分はＩＭＧＴにより定義されるＣＤＲを示す。上：ＣＤＲ移植配列（１５６５＿ＣＤＲ移植−Ｈ；配列番号：６５）に整列された１０５６０（配列番号：４４）および１１３０２（配列番号：４６）の可変重鎖。下：ＣＤＲ移植配列（１５６５＿ＣＤＲ移植−Ｌ；配列番号：６６）に整列された１０５６０（配列番号：４５）および１１３０２（配列番号：４７）の可変軽鎖。
【図３】図３：完全ヒトフレームワーク領域に移植された、オリジナルマウスＣＤＲで構成されたin silicoで設計された配列を有する抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体１０７０４および１１２４９の可変鎖のアミノ酸配列アライメント。ドット（点）は同一を示し、他方、異なる位置ではアミノ酸の一文字表記が記載されている。斜線部分はＩＭＧＴにより定義されるＣＤＲを示す。上：ＣＤＲ移植配列（４３８４＿ＣＤＲ移植−Ｈ；配列番号：６７）に整列された１０７０４（配列番号：４８）および１１２４９（配列番号：５０）の可変重鎖。下：ＣＤＲ移植配列（４３８４＿ＣＤＲ移植−Ｌ；配列番号：６８）に整列された１０７０４（配列番号：４９）および１１２４９（配列番号：５１）の可変軽鎖。
【００４１】
【図４】図４：完全ヒトフレームワーク領域に移植された、オリジナルマウスＣＤＲで構成されたin silicoで設計された配列を有する抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体１１１４５の可変鎖のアミノ酸配列アライメント。ドット（点）は同一を示し、他方、異なる位置ではアミノ酸の一文字表記が記載されている。斜線部分はＩＭＧＴにより定義されるＣＤＲを示す。上：ＣＤＲ移植配列（４５１７＿ＣＤＲ移植−Ｈ；配列番号：６９）に整列された１１１４５（配列番号：５２）の可変重鎖。下：ＣＤＲ移植配列（４５１７＿ＣＤＲ移植−Ｌ；配列番号：７０）に整列された１１１４５（配列番号：５３）の可変軽鎖。
【図５】図５：完全ヒトフレームワーク領域に移植された、オリジナルマウスＣＤＲで構成されたin silicoで設計された配列を有する抗ＨＥＲ３ヒト化モノクローナル抗体１０７３８および１０８１０の可変鎖のアミノ酸配列アライメント。ドット（点）は同一を示し、他方、異なる位置ではアミノ酸の一文字表記が記載されている。斜線部分はＩＭＧＴにより定義されるＣＤＲを示す。上：ＣＤＲ移植配列（５０３８＿ＣＤＲ移植−Ｈ；配列番号：７１）に整列された１０７３８（配列番号：５４）および１０８１０（配列番号：５６）の可変重鎖。下：ＣＤＲ移植配列（５０３８＿ＣＤＲ移植−Ｌ；配列番号：７２）に整列された１０７３８（配列番号：５５）および１０８１０（配列番号：５７）の可変軽鎖。
【図６】図６：完全ヒトフレームワーク領域に移植された、オリジナルマウスＣＤＲで構成されたin silicoで設計された配列を有する抗ＨＥＲ３ヒト化モノクローナル抗体１１００６および１１０５２の可変鎖のアミノ酸配列アライメント。ドット（点）は同一を示し、他方、異なる位置ではアミノ酸の一文字表記が記載されている。斜線部分はＩＭＧＴにより定義されるＣＤＲを示す。上：ＣＤＲ移植配列（５０８２＿ＣＤＲ移植−Ｈ；配列番号：７３）に整列された１１００６（配列番号：５８）および１１０５２（配列番号：６０）の可変重鎖。下：ＣＤＲ移植配列（５０８２＿ＣＤＲ移植−Ｌ；配列番号：７４）に整列された１１００６（配列番号：５９）および１１０５２（配列番号：６１）の可変軽鎖。
【００４２】
【図７】図７：ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体変異体１０２９２とそのキメラ抗ＥＧＦＲパートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。Ａ４３１ＮＳ細胞（上パネル）およびＨ３５８細胞（下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図８】図８：ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体変異体１０４６０とそのキメラ抗ＥＧＦＲパートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。Ａ４３１ＮＳ細胞（上パネル）およびＨ３５８細胞（下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図９】図９：ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体変異体１０５６０とそのキメラ抗ＥＧＦＲパートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。Ａ４３１ＮＳ細胞（上パネル）およびＨ３５８細胞（下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図１０】図１０：ヒト化抗ＨＥＲ２抗体変異体１０７０４とそのキメラ抗ＨＥＲ２パートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。ＯＥ１９細胞（上パネル）およびＢＴ４７４細胞（下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図１１】図１１：ヒト化抗ＨＥＲ２抗体変異体１１１４５とそのキメラ抗ＨＥＲ２パートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。ＯＥ１９細胞（上パネル）およびＢＴ４７４細胞（下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【００４３】
【図１２】図１２：ヒト化抗ＨＥＲ３抗体変異体１０７３８とそのキメラ抗ＨＥＲ３パートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。ＭＢＡ−ＭＤ−１７５ ＶＩＩ細胞（上パネル）およびＭＣＦ−７細胞（１ｎＭヘレグリン−βの存在下；下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図１３】図１３：ヒト化抗ＨＥＲ３抗体変異体１０８１０とそのキメラ抗ＨＥＲ３パートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。ＭＢＡ−ＭＤ−１７５ ＶＩＩ細胞（上パネル）およびＭＣＦ−７細胞（１ｎＭヘレグリン−βの存在下；下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図１４】図１４：ヒト化抗ＨＥＲ３抗体変異体１１００６とそのキメラ抗ＨＥＲ３パートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。ＭＢＡ−ＭＤ−１７５ ＶＩＩ細胞（上パネル）およびＭＣＦ−７細胞（１ｎＭヘレグリン−βの存在下；下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図１５】図１５：ヒト化抗ＨＥＲ３抗体変異体１１０５２とそのキメラ抗ＨＥＲ３パートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。ＭＢＡ−ＭＤ−１７５ ＶＩＩ細胞（上パネル）およびＭＣＦ−７細胞（１ｎＭヘレグリン−βの存在下；下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図１６】図１６：キメラおよびヒト化抗体の、ヒト、カニクイザルおよびマウスのＨＥＲファミリー抗原との交差反応パターン。抗体４０ｎＭでのＯＤシグナルを、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで測定して、陰性（−；ＯＤ＜０．１）から強陽性（＋＋＋；ＯＤ＞２．５）までスコア化した。
【００４４】
【図１７】図１７：ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体変異体１１２９４とそのキメラ抗ＥＧＦＲパートナー抗体との組み合わせのインビトロ活性。Ａ４３１ＮＳ細胞（上パネル）およびＦａＤｕ細胞（下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図１８】図１８：ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体変異体１１３０２とそのキメラ抗ＥＧＦＲパートナー抗体の組み合わせのインビトロ活性。Ａ４３１ＮＳ細胞（上パネル）およびＦａＤｕ細胞（下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図１９】図１９：ヒト化抗ＨＥＲ２抗体変異体１１２４９とそのヒト化抗ＨＥＲ２パートナー抗体１１１４５との組み合わせのインビトロ活性。ＯＥ１９細胞（上パネル）およびＢＴ４７４細胞（下パネル）を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図２０】図２０：ヒト化抗体（変異体１１２９４、１１３０２、１１２４９、１１１４５、１０７３８および１１０５２；ヒト化Ｐａｎ−ＨＥＲ）の混合物およびキメラ抗体（１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８および５０８２；キメラＰａｎ−ＨＥＲ）の混合物のインビトロ活性。示された細胞株を、異なる濃度の上記の抗体混合物で９６時間処理した。データは、平均±ＳＥＭで示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、Ｐａｎ−ＨＥＲとそのＥＧＦＲ（左）、ＨＥＲ２（中）およびＨＥＲ３（右）標的タンパク質との相互作用の図である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、Ａ４３１ＮＳ、ＨＣＣ２０２、およびＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ細胞株それぞれの代謝活性におけるＥＧＦＲ（左）、ＨＥＲ２（中）およびＨＥＲ３（右）抗体処理の効果を示すチャートである。左パネルの図の説明（Figure Legend)は、上から下へ、ネガティブコントロール、１２７７、１５６５、１２７７＋１５６５である。中パネルの図の説明は、上から下へ、ネガティブコントロール、４３８４、４５１７、４３８４＋４５１７である。右パネルの図の説明は、上から下へ、ネガティブコントロール、５０３８、５０８２、５０３８＋５０８２である。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、示された抗体および抗体混合物で処理したＡ４３１ＮＳ、ＨＣＣ２０２およびＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ癌細胞それぞれの全細胞溶解物中のＥＧＦＲ（左）、ＨＥＲ２（中）、およびＨＥＲ３（右）の濃度を示すウェスタンブロットイメージ。
【００４５】
【図２２】図２２は、Ｐａｎ−ＨＥＲ（１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８および５０８２；キメラＰａｎ−ＨＥＲ）で処理した７３種の癌細胞株におけるＥＧＦＲ（左）、ＨＥＲ２（中）、およびＨＥＲ３（右）の受容体リン酸化レベルを示す画である。
【図２３】図２３は、Ｐａｎ−ＨＥＲ混合物（１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８および５０８２；キメラＰａｎ−ＨＥＲ）、Ｐａｎ−ＨＥＲサブコンポーネントおよびネガティブコントロール抗体で処理後の、未処理（ヘレグリンまたはＥＧＦなし）対照細胞の割合（１００％に設定）として最大代謝活性を示す表である。
【図２４】図２４は、５ｎＭヘレグリンの存在下、Ｐａｎ−ＨＥＲ（１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８および５０８２；キメラＰａｎ−ＨＥＲ）、Ｐａｎ−ＨＥＲサブコンポーネントおよびネガティブコントロール抗体で処理後の、リガンド不存在下での未処理対照細胞の割合（１００％に設定）として最大代謝活性を示す表である。細胞を、抗体およびリガンドを含む媒体に９６時間暴露した（すなわち、リガンドおよび抗体を、細胞に同時に添加した）。
【図２５】図２５は、１ｎＭ  ＥＧＦの存在下、Ｐａｎ−ＨＥＲ（１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８および５０８２；キメラＰａｎ−ＨＥＲ）、Ｐａｎ−ＨＥＲサブコンポーネンおよびネガティブコントロール抗体で処理後の、リガンド不存在下での未処理対照細胞の割合（１００％に設定）としての最大代謝活性を示す表である。細胞を、抗体およびリガンドを含む媒体に９６時間暴露した（すなわち、リガンドおよび抗体を、細胞に同時に添加した）。
【００４６】
【図２６】図２６は、７種の膵臓癌細胞株（ＣＡＰＡＮ−１、ＰＫ−１、ＣＦＰＡＣ−１、ＢｘＰＣ３、ＡＳＰＣ１、ＣＡＰＡＮ−２、Ｐａｎ０８．１３、ＰＡＮＣ−１、ＫＰ４、ＭｉａＰａｃａ−２およびＰＳＮ１）における、上部に列記した遺伝子の変異状態を示す画である。
【図２７】図２７は、ヘレグリンおよびリガンドの不存在下（左）またはヘレグリン（中）存在下、およびＥＧＦ（右）リガンド存在下でのＰａｎ−ＨＥＲ処理に対するＣＡＰＡＮ−１細胞株の用量−応答を示すグラフである。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【図２８】図２８は、親細胞株（上）ならびにセツキシマブ、トラスツズマブまたはペルツズマブに耐性を獲得した対応する耐性クローン（下）の代謝活性におけるＰａｎ−ＨＥＲおよび参照抗体の効果を示すグラフである。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。左上パネルの図の説明は、上から下へ、Ｐａｎ−ＨＥＲ、セツキシマブ、ネガティブコントロールである。中上パネルの図の説明は、上から下へ、Ｐａｎ−ＨＥＲ、トラスツズマブ、ネガティブコントロールである。右上パネルの図の説明は、上から下へ、Ｐａｎ−ＨＥＲ、ペルツズマブ、ネガティブコントロールである。
【図２９】図２９は、抗体処理後のＨ２９２（上）およびＯＶＣＡＲ−８（下）細胞株の全細胞溶解物中のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の濃度を示すウェスタンブロットイメージである。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【００４７】
【図３０】図３０は、異種移植モデルＢｘＰＣ−３における腫瘍容積に対する、Ｐａｎ−ＨＥＲまたはそのサブコンポーネント処理の効果を示すグラフである。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ”は、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”は、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”は、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”は、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”は、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【図３１】図３１は、処置の中止の３日後にビークルおよびＰａｎ−ＨＥＲで処理したＢｘＰＣ−３異種移植片から切除された腫瘍のＥＧＦＲおよびＨＥＲ２免疫標識した領域を示す画である。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【図３２】図３２は、Ｃａｌｕ−３異種移植モデルにおける腫瘍容積に対するＰａｎ−ＨＥＲまたはそのサブコンポーネント処理の効果を示すグラフである。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ”は、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”は、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”は、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”は、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”は、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【００４８】
【図３３】図３３（上）は、抗体処理後のＢｘＰＣ−３腫瘍溶解物中のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびβ−アクチンローディングコントロールの濃度を示すウェスタンブロットイメージである。ウェスタンブロットバンド強度におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３濃度の相対定量を、図３３（下）チャートに示す。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ”は、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”は、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”は、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”は、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”は、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【図３４】図３４は、ＫＲＡＳ変異膵臓癌の患者由来の腫瘍異種移植モデルＳＴ１９１、ＳＴ２０４、ＳＴ３８３、ＳＴＳ０２１、ＳＴ１７９、ＳＴ３８５、ＳＴＳ０６４、ＳＴ３３４、ＳＴＳ０５９、およびＳＴＳ０５８における腫瘍容積に対するＰａｎ−ＨＥＲの効果を示すグラフである。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【図３５】図３５は、ＫＲＡＳ変異膵臓癌の患者由来腫瘍異種移植モデルＳＴ１７９およびＳＴ３８３における腫瘍容積に対するＰａｎ−ＨＥＲまたはそのサブコンポーネント処理の効果を示すグラフである。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ”は、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”は、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”は、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”は、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”は、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【００４９】
【図３６】図３６は、ＨＮ５クローンにおけるセツキシマブ耐性の獲得およびクローニングを図示するスキームである。
【図３７】図３７は、親ＨＮ５細胞ならびにセツキシマブ耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４におけるセツキシマブ処理の用量−応答効果を示すグラフである。
【図３８】図３８は、固定した親ＨＮ５細胞ならびにセツキシマブ耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４に対するセツキシマブの結合曲線を示すグラフである。
【図３９】図３９は、親ＨＮ５細胞ならびにセツキシマブ耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４における、蛍光フローサイトメトリーにより見出されるＥＧＦＲの相対的表面レベルを示すグラフである。
【図４０】図４０は、未処理（左）またはＥＧＦ刺激した（右）、親ＨＮ５細胞ならびにセツキシマブ耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４からの細胞溶解物中のＥＧＦＲ、リン酸化ＥＧＦＲ種、およびβ−アクチンローディングコントロールの全濃度を示すウェスタンブロットイメージである。
【００５０】
【図４１】図４１は、未処理（左）またはＥＧＦ刺激した（右）、親ＨＮ５細胞ならびにセツキシマブ耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４からの細胞溶解物中のＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＥＲＫ１／２、ｐＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、およびβ−アクチンローディングコントロールの全濃度を示すウェスタンブロットイメージである。
【図４２】図４２は、ＥＧＦＲ−ＬＮＡ、セツキシマブ、ＥＧＦＲ−２ミックス（抗体１２７７および１５６５）またはコントロールで処理した、親ＨＮ５細胞ならびにセツキシマブ耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２およびＨＮ５ ＣＲ１４の生存率を示すグラフである。
【図４３】図４３は、ＥＧＦＲ−ＬＮＡ、セツキシマブ、ＥＧＦＲ−２ミックス（抗体１２７７および１５６５）またはコントロールで処理した、親ＨＮ５細胞ならびにセツキシマブ耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２およびＨＮ５ ＣＲ１４におけるＥＧＦＲの全濃度を示すウェスタンブロットイメージである。
【図４４】図４４は、示されるＥＧＦＲ抗体で処理した親ＨＮ５細胞ならびにセツキシマブ耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４の生存率を示すグラフである。“ＥＧＦＲ ２ミックス”は、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“Ｈｅｒ３ ２ミックス”は、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。
【図４５】図４５は、親ＨＮ５細胞（Ｆｉｇ。４５Ａ）およびセツキシマブ耐性クローン  ＨＮ５ ＣＲ２（図４５Ｂ）の示される抗体での処理に対する用量−応答生存率を示すグラフである。“ＥＧＦＲ ２ミックス”は、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“Ｈｅｒ３ ２ミックス”は、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３ ４ミックス”は、抗体１２７７、１５６５、５０３８および５０８２の混合物を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
数種のモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ、トラスツズマブ、およびペルツズマブ）が、ＥＧＦファミリー関連疾患の処置に使用されているが、これらの処置は、全ての患者に有効というわけではない。さらに、患者はしばしば、初期使用後にかかる薬物に対して耐性を生じる。本発明は、ＥＧＦＲファミリーメンバーであるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３を標的とする新規ヒト化抗体の発見に基づき、かかるヒト化抗体（ヒト化ｐａｎ−ＨＥＲ抗体組成物）の混合物は、標的を効果的に下方制御し、そして種々の癌細胞株の増殖を阻害し得る。本発明者らはまた、ＥＧＦＲファミリーメンバーであるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３を標的とする抗体混合物が、治療が難しい患者由来の膵臓癌モデルを含む、ヒト癌の多数の異種移植モデルにおける腫瘍増殖を効果的に抑制することを発見した。本発明者はらはまた、２種以上のＥＧＦＲファミリーメンバーを標的とする抗体混合物が、セツキシマブ、トラスツズマブ、およびペルツズマブのような治療的モノクローナル抗体に対して耐性を獲得した細胞において阻害効果を保持することを示した。
【００５２】
ヒト化抗体
本発明の一面は、ＥＧＦＲファミリーメンバーであるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３に結合するヒト化抗体に関する。用語“抗体”または“抗体分子”は、血清の機能性成分を表し、しばしば分子（抗体もしくは免疫グロブリン）の集合体または１つの分子（抗体分子もしくは免疫グロブリン分子）を意味する。抗体は、特異的抗原決定基（抗原または抗原性エピトープ）と結合または反応することができ、続いて免疫学的エフェクター機構の誘導を導き得る。個々の抗体は通常、単一特異性と見なされ、抗体の組成物はモノクローナル（すなわち、同一抗体分子からなる）またはポリクローナル（すなわち、同じ抗原またはさらには別個の異なる抗原上の同一または異なるエピトープと反応する２またはそれ以上の異なる抗体からなる）であり得る。それぞれの抗体は、その対応する抗原に特異的に結合することを可能にするユニークな構造を有し、すべての天然抗体は、２つの同一軽鎖および２つの同一重鎖の同じ全体的基本構造を有する。抗体はまた、集合的に免疫グロブリンとしても知られる。
【００５３】
特に断らない限り、本明細書で用いる用語“抗体(単数)または(複数)”は、一本鎖抗体ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメントまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントなどの抗体の結合フラグメント、ならびに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＭなどの多量体形態を包含することを意図する。故に、本明細書および特許請求の範囲において、“抗体(単数)または(複数)”とは、結合フラグメント(複数可)および一本鎖抗体を包含することを意図する。ただし、明白にこれと異なる説明がなされるか、またはこれと異なることが文脈上明らかである場合を除く。
【００５４】
抗体の各重鎖は、典型的には重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、典型的にはＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と称される３つのドメインを含む。各抗体軽鎖は、典型的には軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（を含む。軽鎖定常領域は、典型的にはＣＬと称される単一ドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変性の領域（配列および／または構造的に規定されるループにおいて超可変的であり得る“超可変領域”）にさらに細分され得る。抗体の可変ドメイン内に見出される“超可変”領域は、抗体の結合特異性を決定するのに重要な役割を果たす。これらはまた、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれ、より保存された領域が間に介在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。抗体の各重鎖および軽鎖は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲ領域を含み、そのうち、ＣＤＲ３は、最も可変性を示す。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端の方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含む。可変領域内のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔの番号付け方式として知られる標準化された番号付け方法を用いて番号付けされることが多い(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)が、ＣｈｏｔｈｉａおよびＩＭＧＴのような他の番号付け方法もある。
【００５５】
用語“組換え抗体”は、抗体のコーディング配列（該コーディング配列が細胞と天然には関係のないものである）を含む発現ベクター（または、可能な場合、２種以上の発現ベクター、例えば２種の発現ベクター）を用いて形質転換された細胞または細胞株から発現される抗体を意味する。
【００５６】
本明細書で用いる４桁の抗体番号、すなわち、１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８および５０８２は、ＷＯ２０１２／０５９８５７に記載のキメラ親抗体を意味し、本発明のヒト化抗体はそれらに由来する。以下の表１は、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖（ＬＣ）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列について、表８に記載の配列番号を示す。
【表１】
0006325527.tif 000002
【００５７】
抗体の標的抗原との相互作用の特異性は、主として重鎖および軽鎖の６つのＣＤＲ内に位置するアミノ酸残基に存する。故に、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間ではるかに可変的である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特異的抗体からのＣＤＲ配列を発現する発現ベクターを構築することにより、特異的な天然に生じる抗体、またはより一般的に所定のアミノ酸配列を有する任意の特異的抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である。結果として、非ヒト抗体を“ヒト化”し、なおも元の抗体の結合特異性および親和性を実質的に維持することが可能である。ヒト化についてのより詳細な考察を以下で述べる。
【００５８】
“キメラ抗体”は、その最も広い意味で、１つの抗体からの１またはそれ以上の領域と１またはそれ以上の他の抗体からの１またはそれ以上の領域を含む抗体を意味し、典型的に、部分的にヒト起源であり、かつ部分的に非ヒト起源である、すなわち一部が非ヒト動物、例えばマウス、ラットもしくは他のげっ歯動物、またはニワトリなどの鳥類に由来する抗体である。キメラ抗体は、ヒトの抗抗体応答、例えばマウス抗体の場合にはヒトの抗マウス抗体応答の危険性を低減するために、非ヒト抗体よりも好ましい。典型的なキメラ抗体の例は、可変領域配列がマウスの免疫化に由来するマウス配列であり、一方、定常領域配列がヒトである抗体である。キメラ抗体の場合、非ヒト部分は、抗体をヒト化するためにさらなる変化に供され得る。本明細書中、特に断らない限り、本発明は、マウス可変領域配列を有する特定のキメラ抗体のヒト化に基づく。
【００５９】
用語“ヒト化”は、抗体が完全にまたは部分的に非ヒト起源であるという事実、例えば対象とする抗原でのマウスの免疫化から得られたマウス抗体またはかかるマウス抗体に基づくキメラ抗体を意味し、ヒトにおける免疫応答を回避するか、または最小限に抑えるために特定のアミノ酸、特にフレームワーク領域ならびに重鎖および軽鎖の定常ドメインのアミノ酸を置換することが可能である。すべての抗体はヒトの抗抗体応答を惹起する潜在能を有し、ヒトの抗抗体応答は、問題の抗体の「ヒトらしさ(humanness)」の度合いとある程度相関することが知られている。免疫原性を正確に予測し、それによって特定の抗体のヒト抗抗体応答を予測することは不可能であるが、非ヒト抗体はヒト抗体よりも免疫原性が高い傾向がある。異種（通常はげっ歯動物）定常領域が、ヒト起源の配列で置換されたキメラ抗体は、一般に完全な異種起源の抗体よりも免疫原性が低く、治療用抗体はヒト化または完全ヒト抗体を目指す傾向にある。キメラ抗体または非ヒト起源の他の抗体に関しては、それゆえ、ヒトの抗抗体応答の危険性を低減するためにヒト化されることが好ましい。
【００６０】
キメラ抗体に関して、ヒト化は、典型的には可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部であるアミノ酸残基は、ほとんどの場合ヒト化に関連して変化させないが、一部の場合には、例えばグリコシル化部位、脱アミド化部位、アスパラギン酸異性化部位または望ましくないシステインもしくはメチオニン残基を除去するために、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることが望ましいと考えられる。Ｎ結合グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここでは、ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る）中のアスパラギン残基へのオリゴ糖鎖の連結によって起こる。Ｎ−グリコシル化部位の除去は、好ましくは保存的置換によって、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に突然変異させることによって達成され得る。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出などの因子によって起こり得る。アスパラギン残基は、主として配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、およびより低い度合いでＡｓｎ−Ａｌａなどの他のジペプチド配列中に存在する場合、特に脱アミド化を受けやすい。そのような脱アミド化部位、特にＡｓｎ−ＧｌｙがＣＤＲ配列中に存在するときは、それゆえ、典型的には関与する残基の１つを除去する保存的置換によって、その部位を除去することが望ましいと考えられる。
【００６１】
抗体配列のヒト化のための多数の方法が当技術分野で公知である；例えばAlmagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633による総説を参照のこと。１つの一般的に使用される方法はＣＤＲ移植であり、この方法は、例えばマウス由来のキメラ抗体に関しては、マウス可変領域遺伝子に対するヒト生殖細胞遺伝子対応物の同定およびこのフレームワークへのマウスＣＤＲ配列の移植を含む。ＣＤＲ移植はＫａｂａｔのＣＤＲ定義に基づき得るが、最近の公表文献（Magdelaine-Beuzelin et al. (2007) Crit Rev.Oncol Hematol. 64: 210-225）は、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義（the international ImMunoGeneTics information system（登録商標）、www.imgt.org）がヒト化の結果を改善し得ることを示唆した（Lefranc et al. (2003), IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, Dev. Comp Immunol. 27, 55-77を参照のこと）。ＣＤＲ移植は、ＣＤＲ移植した非ヒト抗体の結合特異性および親和性を低下させ、したがって生物学的活性を低下させ得るため、親抗体の結合特異性および親和性を再構築するために、ＣＤＲ移植した抗体の選択位置、典型的にはフレームワーク領域内に復帰突然変異を導入し得る。可能な復帰突然変異のための位置の同定は、文献および抗体データベースにおいて入手可能な情報を用いて実施することができる。復帰突然変異の候補であるアミノ酸残基は、典型的には抗体分子の表面に位置するものであるが、埋もれた残基または表面露出の度合いが低い残基は、通常変化させない。ＣＤＲ移植と復帰突然変異に代わる選択的ヒト化技術は、非ヒト起源の非表面露出残基を保持し、表面残基をヒト残基に変化させる、表面再構成である。
【００６２】
特定の場合には、標的エピトープに対する結合親和性を改善するために１またはそれ以上のＣＤＲアミノ酸残基を変化させることも望ましいであろう。これは“親和性成熟（affinity maturation）”として知られ、例えば抗体のヒト化が結合特異性または親和性の低下をもたらし、復帰突然変異だけでは結合特異性または親和性を十分に改善することができない状況では、場合によりヒト化と併せて実施され得る。種々の親和性成熟方法が当技術分野において公知であり、例えばBurks et al. (1997) PNAS USA, vol. 94, pp. 412−417に記載されたインビトロスキャニング飽和突然変異誘発およびWu et al. (1998) PNAS USA, vol. 95, pp. 6037−6042に記載の段階的インビトロ親和性成熟法が挙げられる。
【００６３】
本明細書中、アミノ酸残基は、一文字表記または三文字表記の何れかで記載され得る。対照配列と比較したアミノ酸置換は、例えば、形式“Ｇ４４Ｒ”を用いて示されてよく、それは、対照配列の４４番目に位置するグリシン残基がアルギニン残基に変異していることを示す。例えば、以下の表３において、“Ｇ４４Ｒ”は、ＣＤＲ移植抗体におけるグリシン残基のアルギニン残基への変異を示す。形式“Ａｒｇ４４”で記載されるアミノ酸残基は、特定の位置における特定の残基を示し、すなわち、この場合、４４番目のアルギニン残基を意味する。特に断らない限り、アミノ酸残基の番号付けは、添付の配列表に従う。
【００６４】
上記の通り、本発明は、ヒト化抗体、より具体的にはＷＯ２０１２／０５９８５７に記載の特定のキメラ親抗体に基づくヒト化抗体に関する。本発明のヒト化抗体は、ＷＯ２０１２／０５９８５７に記載の選択されたキメラ抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２および抗ＨＥＲ３抗体から始めて、ＣＤＲ移植および復帰突然変異、およびいくつかの場合には、望まれない配列モチーフの変化を用いて開発された。これらのヒト化抗体を開発するために用いた特定の方法、ならびにそれらが開発された元のキメラ抗体と比較したヒト化抗体の機能的特定の評価結果を、以下の実施例に記載する。とりわけ、実施例に記載のデータは、本発明のヒト化抗体を含む混合物が、元のキメラ抗体の対応する混合物の有効性に相当するインビトロ有効性を有することを示し、ヒト化方法が、これらの抗体の阻害特性または互いに結合する機能へのそれらの能力に影響を与えないことを証明する。データはまた、ヒト化抗体混合物もまた、ＷＯ２０１２／０５９８５７に記載の元のキメラ抗体混合物の有効性に相当するインビボ有効性を示し得ることを強く示唆する。
【００６５】
本明細書で用いる５桁の抗体番号、例えば“抗体１０５６０”は、キメラ親抗体に基づきＣＤＲ移植により製造された、以下に記載の特定のヒト化抗体を意味する。例えば、抗体１０５６０は、配列番号：４に記載の重鎖可変領域配列（ＶＨ）を含む重鎖および配列番号：５に記載の軽鎖可変領域配列（ＶＬ）を含む軽鎖を有し、さらに元のＣＤＲ移植抗体と比較して特定の位置に置換基（例えば、復帰突然変異）を含む抗体である（表３および図１−６を参照のこと）。以下の例において、抗体はまた、ヒトカッパ定常領域配列（ＷＯ２０１２／０５９８５８およびＵＳ２０１１／０２１７３０５の配列番号：４２、Ｎ末端Ａｒｇ残基を有する）およびヒトＩＧＨＧ１重鎖定常領域配列（ＷＯ２０１２／０５９８５８およびＵＳ２０１１／０２１７３０５の配列番号：４４）を含む。
【００６６】
本発明の特定のヒト化抗体は、本明細書中、抗体番号で、すなわち、１０２９２、１０４６０、１１２９４、１０５６０、１０７０４、１１３０２、１１１４５、１１２４９、１０７３８、１０８１０、１１００６または１１０５２と記載される。これらは、実施例１に記載の通り、ＣＤＲ移植、その後の特定の位置の変異、主として復帰突然変異によりＷＯ２０１２／０５９８５７に記載のキメラ抗体（マウス可変領域、ヒト定常領域）に由来する。以下の表２は、本発明のヒト化抗体が、ＷＯ２０１２／０５９８５７に記載のキメラ親抗体と如何に関係するかを説明する。
【表２】
0006325527.tif 000003
【００６７】
以下の表３は、本発明の例示的ヒト化抗体の配列番号を提供し、ならびに元のＣＤＲ移植抗体と比較して重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）における個々の置換基（復帰突然変異、および特定の場合、望ましくない配列モチーフを変えるための変異（複数可））を示す。表３に列記する抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、図１−６に表３中、括弧で囲まれた別々の配列番号で提供される。図１−６においてＣＤＲ配列は、陰付きで記載される。
【表３】
0006325527.tif 000004
【００６８】
表２に列記される番号が付されたヒト化抗体の何れかは、“表４中、“Ｘａａ”と記載される重鎖および／または軽鎖アミノ酸残基の何れかにおける少なくとも１個のさらなる置換基”を含み得るという記載は、抗体が上記の表３に列記される置換基以外の１個またはそれ以上の“Ｘａａ”残基のさらなる置換を含み得ることを意味する。
表４：選択されたヒト化抗体の配列
【表４】
0006325527.tif 000005
【表５】
0006325527.tif 000006
【表６】
0006325527.tif 000007
【表７】
0006325527.tif 000008
【表８】
0006325527.tif 000009
【表９】
0006325527.tif 000010
【表１０】
0006325527.tif 000011
【表１１】
0006325527.tif 000012
【表１２】
0006325527.tif 000013
【表１３】
0006325527.tif 000014
【表１４】
0006325527.tif 000015
【表１５】
0006325527.tif 000016
【表１６】
0006325527.tif 000017
【表１７】
0006325527.tif 000018
【表１８】
0006325527.tif 000019
【表１９】
0006325527.tif 000020
【００６９】
完全ヒトフレームワーク領域中に元のマウスＣＤＲ移植から製造されたそれぞれin silicoで設計された配列を有するこれらのヒト化抗体のＣＤＲ移植重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列アライメントを、図１−６に示す。
【００７０】
本発明の一面は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３を標的とする特定のヒト化抗体に関する。これらの個々の抗体は、
・（ａ）配列番号：１の重鎖可変領域配列および配列番号：２または配列番号：３の軽鎖可変領域配列を含む、ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体；
・（ｂ）配列番号：４の重鎖可変領域配列および配列番号：５の軽鎖可変領域配列を含む、ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体；
・（ｃ）配列番号：６の重鎖可変領域配列および配列番号：７の軽鎖可変領域配列を含む、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体；
・（ｄ）配列番号：８の重鎖可変領域配列および配列番号：９の軽鎖可変領域配列を含む、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体；
・（ｅ）配列番号：１０の重鎖可変領域配列および配列番号：１１の軽鎖可変領域配列を含む、ヒト化抗ＨＥＲ３抗体；ならびに、
・（ｆ）配列番号：１２の重鎖可変領域配列および配列番号：１３の軽鎖可変領域配列を含む、ヒト化抗ＨＥＲ３抗体
を含む。
【００７１】
上記のヒト化抗体は、典型的に、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列の両方、表４ならびに実施例および添付の図に記載の１またはそれ以上の可能性のある置換（主として復帰突然変異であるが、特定の場合に、望ましくない配列モチーフを変えるための変異でもある）を含む。重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列は、典型的に、２個、３個、４個または５個のかかる置換基をそれぞれ含み得る。
【００７２】
好ましい抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）の例としては、
(i)Ａｒｇ４４およびＶａｌ８３を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１）、およびＡｌａ１９およびＰｈｅ９２を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：２）を含む抗体［例えば、抗体１０２９２］；
(ii)Ａｒｇ４４、Ｖａｌ８３およびＩｌｅ１０４を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１）、およびＴｙｒ４１、Ｌｅｕ５１およびＰｈｅ９２を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：３）を含む抗体［例えば、抗体１０４６０］；または
(iii)Ａｒｇ４４、Ｖａｌ８３およびＩｌｅ１０４を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１）、およびＬｅｕ３４、Ｔｙｒ４１、Ｌｅｕ５１およびＰｈｅ９２を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：３）を含む抗体［例えば、抗体１１２９４］が挙げられる。
【００７３】
抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）はまた、抗体１０２９２、１０４６０または１１２９４に対応する抗体であるが、表４にて“Ｘａａ”と記載される重鎖および／または軽鎖アミノ酸残基の何れかにおける少なくとも１個のさらなる置換基、例えば、１個、２個、３個または４個のかかる“Ｘａａ”残基の置換を含む抗体であり得る。配列番号：２は、位置３３−３４にＸａａを含むため、ＣＤＲ移植配列が、これらの位置に脱アミド化部位（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）を有する。両方の位置で置換が起こり得るが、脱アミド化部位を除くためには２個の位置のうち一方の改変で十分である。故に、該配列は、典型的に、位置３３にＡｓｎまたは位置３４にＧｌｙの何れかを含み得る。
【００７４】
好ましい抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）の例としては、
(i)Ｌｅｕ２０、Ｉｌｅ４８およびＡｌａ６８を含む重鎖可変領域配列（配列番号：４）、およびＶａｌ７５およびＰｈｅ８７を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：５）を含む抗体［例えば、抗体１０５６０］；または
(ii)Ｌｅｕ２０、Ｉｌｅ４８、Ｌｅｕ５６、およびＡｌａ６８を含む重鎖可変領域配列（配列番号：４）、およびＶａｌ７５およびＰｈｅ８７を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：５）を含む抗体［例えば、抗体１１３０２］が挙げられる。
【００７５】
抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）はまた、抗体１０５６０または１１３０２に対応する抗体であるが、表４にて“Ｘａａ”と記載される重鎖および／または軽鎖アミノ酸残基の何れかにおける少なくとも１個のさらなる置換基、例えば、１個、２個、３個または４個のかかる“Ｘａａ”残基の置換を含む抗体であり得る。配列番号：４は、位置５５−５６にＸａａを含むため、ＣＤＲ移植配列が、これらの位置に脱アミド化部位（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）を有する。両方の位置で置換が起こり得るが、脱アミド化部位を除くためには２個の位置のうち一方の改変で十分である。故に、該配列は、典型的に、位置５５にＡｓｎまたは位置５６にＧｌｙの何れかを含み得る。
【００７６】
好ましい抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）の例としては、
(i)Ｓｅｒ５５、Ｌｅｕ７０、Ｖａｌ７２、Ｌｙｓ７４およびＡｌａ７９を含む重鎖可変領域配列（配列番号：６）、およびＶａｌ４４、Ｍｅｔ４８およびＴｙｒ７０を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：７）を含む抗体［例えば、抗体１０７０４］；または
(ii)Ｓｅｒ５５およびＶａｌ７２を含む重鎖可変領域配列（配列番号：６）、およびＭｅｔ４８およびＴｙｒ７０を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：７）を含む抗体［例えば、抗体１１２４９］が挙げられる。
【００７７】
抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）はまた、抗体１０７０４または１１２４９に対応する抗体であるが、表４にて“Ｘａａ”と記載される重鎖および／または軽鎖アミノ酸残基の何れかにおける少なくとも１個のさらなる置換基、例えば、１個、２個、３個または４個のかかる“Ｘａａ”残基の置換を含む抗体であり得る。
【００７８】
好ましい抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）の例としては、Ａｌａ４９、Ｉｌｅ７４およびＳｅｒ７７を含む重鎖可変領域配列（配列番号：８）、およびＴｈｒ５６、Ｔｙｒ７１、Ｓｅｒ８５およびＬｅｕ１０４を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：９）を含む抗体［例えば、抗体１１１４５］が挙げられる。抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）はまた、抗体１１１４５に対応する抗体であるが、表４にて“Ｘａａ”と記載される重鎖および／または軽鎖アミノ酸残基の何れかにおける少なくとも１個のさらなる置換基、例えば、１個、２個、３個または４個のかかる“Ｘａａ”残基の置換を含む抗体であり得る。
【００７９】
好ましい抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）の例としては、Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＩｌｅ６８、またはＡｓｎ４４、Ｓｅｒ５５およびＴｈｒ９３を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１０）、およびＰｈｅ３６、Ｖａｌ４４、Ｐｈｅ４９およびＩｌｅ８５、またはＰｈｅ３６、Ｐｈｅ４９およびＬｅｕ７３を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：１１）を含む抗体が挙げられる。かかる抗ＨＥＲ３抗体の特定の例としては、
(i)Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＩｌｅ６８を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１０）、およびＰｈｅ３６、Ｖａｌ４４、Ｐｈｅ４９およびＩｌｅ８５を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：１１）を含む抗体［例えば、抗体１０７３８］；または
(ii)Ａｓｎ４４、Ｓｅｒ５５およびＴｈｒ９３を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１０）、およびＰｈｅ３６、Ｐｈｅ４９およびＬｅｕ７３を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：１１）を含む抗体［例えば、抗体１０８１０］が挙げられる。
【００８０】
抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）はまた、抗体１０７３８または１０８１０に対応する抗体であるが、表４にて“Ｘａａ”と記載される重鎖および／または軽鎖アミノ酸残基の何れかにおける少なくとも１個のさらなる置換基、例えば、１個、２個、３個または４個のかかる“Ｘａａ”残基の置換を含む抗体であり得る。
【００８１】
好ましい抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）の例としては、
(i)Ｖａｌ４６、Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＡｒｇ７２を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１２）、およびＶａｌ２１、Ｖａｌ４４およびＰｈｅ８７、および任意に、Ｔｈｒ２９を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：１３）を含む抗体［例えば、抗体１１００６］；または
(ii)Ｐｈｅ４１、Ｖａｌ４６、Ｍｅｔ４９、Ｓｅｒ５５およびＡｒｇ７２を含む重鎖可変領域配列（配列番号：１２）、およびＶａｌ２１、Ｖａｌ４４、Ｔｙｒ７１、Ｐｈｅ８７およびＬｅｕ１０４を含む軽鎖可変領域配列（配列番号：１３）を含む抗体［例えば、抗体１１０５２］が挙げられる。
【００８２】
抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）はまた、抗体１１００６または１１０５２に対応する抗体であるが、表４にて“Ｘａａ”と記載される重鎖および／または軽鎖アミノ酸残基の何れかにおける少なくとも１個のさらなる置換基、例えば、１個、２個、３個または４個のかかる“Ｘａａ”残基の置換を含む抗体であり得る。
【００８３】
抗体は、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、またはマウスアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡのような、異なる種類（アイソタイプ）として存在することが、当技術分野で公知である。本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤを含む、何れかのアイソタイプであり得る。
【００８４】
ヒト化抗体組成物
本発明のさらなる面は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３から選択される少なくとも２つの異なる受容体に対する少なくとも２つの本発明のヒト化抗体を含む組換え抗体組成物（または混合物）に関する。用語“ポリクローナル抗体”または“［モノクローナル］抗体の混合物”は、同じかまたは異なる抗原上の異なる特異的抗原決定基と結合するかまたは反応することができる、２またはそれ以上の異なる抗体分子の組成物を意味する。本発明に関連して、抗体の混合物の個々の抗体は、少なくとも２つのＨＥＲファミリー受容体の異なる抗原決定基に結合する。同じ受容体に結合する２つの異なる抗体を含む抗体混合物の場合、個々の抗体は、好ましくは、その受容体の異なるエピトープに結合し、より好ましくは、別個の実質的にオーバーラップしないエピトープに結合する。
【００８５】
用語“ｐａｎ−ＨＥＲ”または“ｐａｎ−ＨＥＲ抗体組成物”は、少なくとも２つのＨＥＲファミリー受容体上の少なくとも２つの異なる抗原に結合することができる抗体分子の組成物を意味する。本発明の文脈において、抗体組成物の個々の抗体は、ＨＥＲファミリーの異なる抗原決定因子に結合する。故に、抗体組成物の個々の抗体は、それぞれ、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、またはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に結合し、好ましくは、３つの受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に結合する。
【００８６】
用語“エピトープ”は、動物において抗原性または免疫原性活性を有する、より大きな分子（例えば、抗原または抗原性部位）の一部分を表すために使用される。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を惹起する、より大きな分子の一部分である。抗原性活性を有するエピトープは、当技術分野で公知の任意の方法によって決定したとき、抗体が免疫特異的に結合するより大きな分子の一部分である。抗原は、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する物質、例えば毒素、ウイルス、細菌、タンパク質またはＤＮＡである。抗原または抗原性部位は、非常に小さなものでない限り、多くの場合２以上のエピトープを有し、多くの場合免疫応答を刺激することができる。エピトープは、直鎖状または立体的であり得る。直鎖状エピトープは、一般に、抗体によって認識されるタンパク質分子上の約６〜１０の隣接アミノ酸からなる。これに対し、立体構造エピトープでは、アミノ酸は線状に配列されておらず、抗体は特定の三次元構造を認識する。タンパク質分子が三次元構造に折りたたまれたとき、エピトープを形成するアミノ酸が並置されて、抗体が立体構造エピトープを認識することが可能になる。変性タンパク質では、直鎖状エピトープのみが認識される。立体配座エピトープは、当然、折りたたまれたタンパク質の外側になければならない。
【００８７】
用語“別個のエピトープ”は、本発明の２つの異なる抗体が別個のエピトープに結合するとき、抗原結合に関して１００％未満の競合、好ましくは抗原結合に関して８０％未満の競合、より好ましくは抗原結合に関して５０％未満の競合、および最も好ましくはできる限り少ない競合、例えば抗原結合に関して約２５％未満の競合が存在するという事実を意味する。同じ抗原への結合に関して互いに競合することができる抗体は、同じエピトープもしくはオーバーラップするエピトープに結合し得るか、または互いのすぐ近傍に結合部位を有し得るので、競合は主として立体障害によって引き起こされる。抗体対の“別個のエピトープ”についての分析は、当技術分野で公知の方法によって、例えばＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）もしくは関連する受容体抗原および個々の蛍光標識抗体を発現する細胞に関する他のフローサイトメトリー分析を用いた飽和抗体条件下での結合実験によって、またはフローセル表面に捕捉されたか、または結合した抗原を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施され得る。
【００８８】
別個のエピトープは、好ましくは、同じ受容体に結合する本発明の組成物中の２つの異なる抗体が、それらのそれぞれのエピトープに同時に結合することができるのに十分なほど抗原結合に関して低い競合を有するという意味で「オーバーラップしてない」。種々の度合いのオーバーラップが存在し得ること、および別個のエピトープは、それぞれの抗体がそれらのエピトープに実質的に結合することができる限り、ある程度の競合の存在にもかかわらず「オーバーラップしていない」とみなされ得ることは当業者に理解される。これは一般に、２つの抗体間の抗原結合に関する競合が約５０％未満であるときに当てはまると考えられる。抗体間の競合を決定するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ２０１１／１０７９５７に記載の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が用いられる。
【００８９】
同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体は、エピトープの位置によって、それらが結合する抗原の活性に対し種々の作用を有し得る。抗原の活性部位にあるエピトープに結合する抗体は、抗原の機能を完全にブロックし得るが、異なるエピトープに結合する別の抗体は、単独では抗原の活性に殆どまたは全く作用を及ぼさないこともあり得る。そのような抗体は、しかしながら、なおも補体を活性化し、それによって抗原を発現する細胞の排除をもたらすことがあり、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する１またはそれ以上の抗体と組み合わせたとき、相乗的増殖阻害効果をもたらし得る。本発明に関連して、エピトープは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３（野生型または変異型）の細胞外ドメインの一部分である。故に、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、本発明の抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合し、そして本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに結合する。
【００９０】
本発明のこの面の特定の態様は、上記のヒト化抗体（ａ）−（ｆ）に関連して、
・抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）および抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）および抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）および抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）および抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）および抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）および抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）および抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）および抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）；
・抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）および抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）；
・抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）および抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）；
・抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）および抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）；または
・抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）および抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）
を含む組成物を包含する。
【００９１】
一態様において、本発明は、少なくとも１種のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体、少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ２抗体、および少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物に関する。
【００９２】
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも１種のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体、少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ２抗体、および少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物であって、ここで、
少なくとも１種のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体が、（ａ）配列番号：１の重鎖可変領域配列および配列番号：２または配列番号：３の軽鎖可変領域配列を含む抗体、および（ｂ）配列番号：４の重鎖可変領域配列および配列番号：５の軽鎖可変領域配列を含む抗体から選択され、
少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ２抗体が、（ｃ）配列番号：６の重鎖可変領域配列および配列番号：７の軽鎖可変領域配列を含む抗体、および（ｄ）配列番号：８の重鎖可変領域配列および配列番号：９の軽鎖可変領域配列を含む抗体から選択され、そして
少なくとも１種のヒト化抗ＨＥＲ３抗体が、（ｅ）配列番号：１０の重鎖可変領域配列および配列番号：１１の軽鎖可変領域配列を含む抗体、および（ｆ）配列番号：１２の重鎖可変領域配列および配列番号：１３の軽鎖可変領域配列を含む抗体から選択される、
組成物に関する。
【００９３】
１個の抗ＥＧＦＲ抗体、１個の抗ＨＥＲ２抗体および１個の抗ＨＥＲ３抗体を含む抗体組成物の場合、故に、該組成物は、上記のヒト化抗体（ａ）−（ｆ）に関連して、
・抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）、および抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）、および抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）、および抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）、および抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）、および抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）、および抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）；
・抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）、および抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）；または、
・抗ＥＧＦＲ抗体（ｂ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｄ）、および抗ＨＥＲ３抗体（ｆ）
を含み得る。
【００９４】
１個の抗ＥＧＦＲ抗体、１個の抗ＨＥＲ２抗体および１個の抗ＨＥＲ３抗体を含む好ましい組成物の例は、例えば：
・抗体１０２９２、１０７０４および１０７３８；
・抗体１０２９２、１０７０４および１０８１０；
・抗体１０２９２、１０７０４および１１００６；
・抗体１０２９２、１０７０４および１１０５２；
・抗体１０４６０、１０７０４および１０７３８；
・抗体１０４６０、１０７０４および１０８１０；
・抗体１０４６０、１０７０４および１１００６；
・抗体１０４６０、１０７０４および１１０５２；
・抗体１１２９４、１０７０４および１０７３８；
・抗体１１２９４、１０７０４および１０８１０；
・抗体１１２９４、１０７０４および１１００６；ならびに
・抗体１１２９４、１０７０４および１１０５２である。
【００９５】
さらにより好ましい態様において、抗体組成物は、６個のヒト化抗体、すなわち、３種の受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する２個のヒト化抗体を含み、ここでは、同じ受容体に結合する抗体の各対は、その受容体の別個のオーバーラッピングしないエピトープに結合する。これは、特に、抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）および（ｂ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）および（ｄ）、および抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）および（ｆ）を含む組成物であり得る。この場合、１個、２個、３個、４個、５個または６個全ての抗体が、抗体１０２９２、１０４６０、１１２９４、１０５６０、１１３０２、１０７０４、１１２４９、１１１４５、１０７３８、１０８１０、１１００６および１１０５２から選択され得る。
【００９６】
特定の態様において、抗体組成物は、
（ａ）抗ＥＧＦＲ抗体１０２９２、１０４６０、または１１２９４；
（ｂ）抗ＥＧＦＲ抗体１０５６０または１１３０２；
（ｃ）抗ＨＥＲ２抗体１０７０４または１１２４９；
（ｄ）抗ＨＥＲ２抗体１１１４５；
（ｅ）抗ＨＥＲ３抗体１０７３８または１０８１０；および
（ｆ）抗ＨＥＲ３抗体１１００６または１１０５２
を含む。
【００９７】
あるいは、この態様において、抗体（ａ）−（ｆ）の何れか１つまたはそれ以上は、表４中、“Ｘａａ”と記載される重鎖および／または軽鎖アミノ酸残基の何れかにおける少なくとも１個のさらなる置換基を含み得て、例えば、組成物中の１またはそれ以上の抗体に対して、抗体当たり１個、２個、３個または４個のかかる“Ｘａａ”残基の置換のような、組成物中の１またはそれ以上の抗体に対して、抗体当たり５または６個までのかかる“Ｘａａ”残基の置換を含み得る。
【００９８】
好ましい態様において、抗体組成物は、抗ＥＧＦＲ抗体１１２９４および１１３０２、抗ＨＥＲ２抗体１１２４９および１１１４５、および抗ＨＥＲ３抗体１０７３８および１１０５２を含む。該抗体組成物は、（ａ）配列番号：４３の重鎖可変領域配列および配列番号：４４の軽鎖可変領域配列を含む抗体、（ｂ）配列番号：４７の重鎖可変領域配列および配列番号：４８の軽鎖可変領域配列を含む抗体、（ｃ）配列番号：５１の重鎖可変領域配列および配列番号：５２の軽鎖可変領域配列を含む抗体、（ｄ）配列番号：５３の重鎖可変領域配列および配列番号：５４の軽鎖可変領域配列を含む抗体、（ｅ）配列番号：５５の重鎖可変領域配列および配列番号：５６の軽鎖可変領域配列を含む抗体、ならびに（ｆ）配列番号：６１の重鎖可変領域配列および配列番号：６２の軽鎖可変領域配列を含む抗体を包含し得る。
【００９９】
本発明の抗体混合物の個々の抗体が２以上のアイソタイプの抗体を含むことは可能であるが、それらは、すべて同じアイソタイプであり得る。
【０１００】
ヒト化抗体および抗体組成物の特性
本発明のヒト化抗体は、ＨＥＲまたはＥＧＦＲファミリーメンバー、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３に結合する。用語“ＨＥＲ”は、“ヒト上皮細胞増殖因子受容体”を表し、しばしば用語“ＥｒｂＢ”と互換的に使用され、４つのメンバーＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４からなる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の下位群を特徴付ける。同時に、これらの４つの受容体は、“ＨＥＲファミリー”（または、ＥｒｂＢもしくはＥＧＦＲファミリー）受容体を構成する。
【０１０１】
本発明の１種またはそれ以上の抗体、特に本発明のｐａｎ−ＨＥＲ抗体組成物の、ＨＥＲファミリー受容体への結合は、好ましくは、該受容体を発現する細胞（すなわち、典型的に腫瘍細胞）の成長および増殖を阻害する。関与する機序は、例えば、以下の１つまたはそれ以上を含み得る：受容体の二量体化の阻害、リガンド結合の阻害、受容体のインターナリゼーションおよび分解の促進、チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）のリン酸化の低下、受容体シグナル伝達の減少、ならびに食作用、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）および／またはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の誘導。
【０１０２】
本明細書で用いる用語“増殖を阻害する”（例えば、細胞に関して）は、抗ＨＥＲファミリー抗体またはｐａｎ−ＨＥＲ抗体組成物と接触したとき、該抗体または組成物の非存在下で同じ細胞の増殖と比較して、細胞の増殖（細胞数の増加）または代謝の測定可能な低下、例えば少なくとも約１０％、より好ましくは、例えば少なくとも約２０％または３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％または５０％、例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％、またはさらには約１００％の細胞培養物の増殖の阻害を包含することを意図する。増殖阻害は、例えば、以下の実施例に記載の関連する癌細胞株にて決定され得る。
【０１０３】
二重特異性結合分子
さらなる面において、本明細書に記載の何れか２つの個々の抗体の結合特異性は、１つの二重特異性結合分子に組み込まれ得る。かかる二重特異性結合分子は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３から選択される２種の異なる受容体を標的とする２種の抗体の結合特異性を有し得るか、または同じ受容体を標的とする２種の抗体の結合特異性を有し得る。例えば、二重特異性結合分子は、抗ＥＧＦＲ抗体（ａ）および（ｂ）の結合特異性、抗ＨＥＲ２抗体（ｃ）および（ｄ）の結合特異性、または抗ＨＥＲ３抗体（ｅ）および（ｆ）の結合特異性を有し得る。より具体的には、二重特異性結合分子は、例えば、（１）抗ＥＧＦＲ抗体１０２９２、１０４６０または１１２９４、および抗ＥＧＦＲ抗体１０５６０または１１３０２、（２）抗ＨＥＲ２抗体１０７０４または１１２４９、および抗ＨＥＲ２抗体１１１４５、または（３）抗ＨＥＲ３抗体１０７３８または１０８１０、および抗ＨＥＲ３抗体１１００６または１１０５２の結合特異性を有し得る。二重特異性結合分子は、二重可変ドメイン抗体であってよく、すなわち、抗体の２つのアームが、２つの異なる可変ドメインを含むか、または二重特異性Ｆａｂフラグメントまたは二重特異性ｓｃＦｖのような抗体フラグメントの形態であり得る。
【０１０４】
核酸分子、ベクター、および本発明の抗体および抗体組成物の製造
本発明のさらなる面は、本発明の抗体、特に抗体１０２９２、１０４６０、１１２９４、１０５６０、１１３０２、１０７０４、１１２４９、１１１４５、１０７３８、１０８１０、１１００６および１１０５２からなる群より選択される抗体をコード化するか、またはかかる抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域配列をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびにかかる核酸分子を含む発現ベクター、ならびに該核酸分子または発現ベクターを含む宿主細胞に関し、ここで、該宿主細胞は、核酸分子によりコード化される抗体を発現し得る。
【０１０５】
用語“ベクター”は、核酸配列が、異なる遺伝的環境の間での輸送のためおよび／または宿主細胞における発現のために挿入され得る核酸分子を意味する。核酸配列の転写のための調節エレメント（少なくとも好適なプロモーター）を担持するベクターは、“発現ベクター”と称される。用語“プラスミド”および“ベクター”は、互換的に使用され得る。本発明に関連して使用される発現ベクターは、当技術分野で公知の任意の好適な種類、例えばプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【０１０６】
本発明のさらなる面は、ヒト化組換え抗体の製造方法および本発明の抗体を含む組成物に関する。本発明のこの面の一態様は、本明細書に記載の抗体の製造方法であって、該抗体を発現可能な宿主細胞の提供、該抗体の発現に好適な条件下での該宿主細胞の培養、および得られた抗体の単離を含む方法に関する
【０１０７】
さらなる態様において、本発明は、少なくとも１種のヒト化組み換え抗ＥＧＦＲ抗体、少なくとも１種のヒト化組み換え抗ＨＥＲ２抗体、および少なくとも１種のヒト化組み換え抗ＨＥＲ３抗体を含む組換え抗体組成物の製造方法であって、
少なくとも第一、第二および第三宿主細胞（ここで、第一宿主細胞は、本発明の組み換え抗ＥＧＦＲ抗体を発現可能であり、第二宿主細胞は、本発明の組み換え抗ＨＥＲ２抗体を発現可能であり、そして第三宿主細胞は、本発明の組み換え抗ＨＥＲ３抗体を発現可能である）を提供し、
該第一、第二および第三宿主細胞を抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体および抗ＨＥＲ３抗体の発現に好適な条件下で培養し、
得られた抗体を単離することを含む方法に関する。
【０１０８】
本発明の抗体または抗体組成物は、組み換えモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造について当技術分野で一般的に公知の方法により製造され得る。故に、本発明の単一抗体の製造の場合、組み換えモノクローナル抗体の製造について当技術分野で公知の何れかの方法が使用可能である。抗体の混合物を含む本発明の抗体組成物の製造に関して、個々の抗体は別個に製造され得て、すなわち、各抗体を別個のバイオリアクターで製造するか、または個々の抗体を、単一のバイオリアクターで共に製造し得る。抗体組成物が２以上のバイオリアクターで製造されるとき、精製された抗体組成物は、各バイオリアクターから個々に精製された上清から得られた抗体を集めることにより得られ得る。多数のバイオリアクターにおけるポリクローナル抗体組成物の製造のための種々の方法が、ＷＯ２００９／１２９８１４（引用により本明細書中に包含される）に記載されており、該方法では、細胞株または抗体製剤を上流のより後の時点で、または下流のプロセシングの前もしくは間に組み合わせる。
【０１０９】
単一のバイオリアクター中で個々の複数の抗体を製造する場合、これは、例えばＷＯ２００４／０６１１０４またはＷＯ２００８／１４５１３３（両方とも、引用により本明細書中に包含される）に記載の通りに実施され得る。ＷＯ２００４／０６１１０４に記載の方法は、個々の宿主細胞のゲノムへの抗体コード配列の部位特異的組み込みに基づき、ＷＯ２００８／１４５１３３に記載の方法は、単一のバイオリアクターにおける抗体の製造にランダム組み込みを用いる別法に関する。
【０１１０】
本発明の抗体および組成物を製造するのに好適な方法に関するさらなる情報は、ＷＯ２０１２／０５９８５７（引用により本明細書中に包含される）に見出され得る。
【０１１１】
治療組成物
本発明の別の面は、本発明の抗体または抗体組成物を有効成分として含む医薬組成物である。かかる組成物は、癌の改善、予防および／または処置を目的とする。医薬組成物は、ヒトまたは家畜もしくはペットに投与され得るが、典型的にはヒトに投与され得る。
【０１１２】
本発明の治療用組成物中の個々の抗体間の比率は、または本発明の個々の抗体が同時に、連続的にもしくは別個に投与される場合には、抗体が等量で投与される比率であることが多いが、これは必ずしもそうである必要はない。従って、２つの抗ＥＧＦＲファミリー抗体を含む本発明の組成物は、それらをおよそ１：１の比率で含むことが多く、３つの抗ＥＧＦＲファミリー抗体を含む本発明の組成物は、それらをおよそ１：１：１の比率で含むことが多い。同様に、受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する２つの抗体である６つの抗体を含む抗体組成物は、それらをおよそ１：１：１：１：１：１の比率含むことが多い。しかしながら、個々の抗体の特定によっては、異なる抗体を等しくない量で使用することが望ましい場合がある。本発明の組成物中の異なる抗ＨＥＲ抗体についての好適な比率は、ＷＯ２０１０／０４０３５６（引用により本明細書中に包含される）に記載されているように決定され得て、そこには、最適の効力および効果を有するコンビナトリアル薬物を得るために、コンビナトリアル薬物製品、例えばポリクローナル抗体組成物中の化学物質間の最適化学量論比を特定し、選択するための方法が記載されている。
【０１１３】
本発明のヒト化組換え抗体またはその結合フラグメントに加えて、医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤、担体または添加剤をさらに含み得る。これらには、例えば防腐剤、安定化剤、界面活性剤／湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤が含まれ得る。溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンなどの増粘物質をさらに含み得る。医薬組成物についての好適なｐＨ値は、一般に、必要に応じて緩衝剤を使用して維持され、約５．５〜８．５、例えば約６〜８の範囲内、例えば約７であり得る。
【０１１４】
従来の製薬慣例を用いて、例えば癌患者に投与する好適な製剤または組成物を当技術分野で公知の常套的投与経路により提供し得る。同様に、本発明の医薬組成物は、組換え抗体組成物の製造についてそれ自体公知の方法で製造され得る。製剤、投与などのさらなる情報については、ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４８３４を参照のこと。
【０１１５】
本発明の抗体および組成物の治療的使用
本発明の抗体および組成物は、哺乳動物における疾患の処置または改善のため、特にヒトにおける癌の処置のために使用され得る。本明細書で用いる用語“処置”は、症状または疾患状態を緩和する、軽減する、改善するまたは根絶する（治癒させる）のに十分な量での抗体、または好ましくは本発明の抗体組成物の投与を意味する。本発明の２またはそれ以上のｐａｎ−ＨＥＲ抗体の投与は、一般に抗体の同時投与として、好ましくは処置に使用されるすべてのｐａｎ−ＨＥＲ抗体を含む組成物の形態で行われ得る。しかしながら、本発明の２またはそれ以上の抗体を別個に投与することも可能である。故に、本明細書における、例えば少なくとも２つの抗ＨＥＲファミリー抗体を含む組換え抗体組成物の投与と言えば、少なくとも２つの抗体をそのまま含む組成物の投与のみならず、抗体の別個の投与も包含することが理解されるべきである。従って、本発明の２またはそれ以上の抗体の組合せは、同時に、連続的にまたは別個に投与され得る。本発明の一態様は、ヒトまたは他の哺乳動物において癌に伴う１またはそれ以上の症状を予防、処置または改善する方法であって、本発明の医薬抗体組成物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法である。
【０１１６】
特定の態様は、ＥＧＦＲファミリー受容体であるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の何れか１つまたはそれ以上の発現または過剰発現または依存を特徴とする障害、特に癌を有する患者、典型的にはヒト患者を処置するための方法であって、本明細書で定義される組換え抗体組成物または医薬組成物を該患者に投与することを含む方法に関する。用語“ＨＥＲ依存”は、悪性特性、例えば増殖、成長、運動性、浸潤、生存および／または化学療法耐性を維持するための１つ以上のＨＥＲファミリー受容体に依存を有する癌細胞を意味する。依存は、受容体過剰発現、受容体変異、自己分泌増殖因子生産および／または他の受容体系とのクロストーク(cross-talk)により引き起こされ得る。
【０１１７】
さらなる態様において、本発明は、抗体および／またはチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）での処置に耐性を獲得している患者、典型的にはヒト患者における癌の処置方法であって、有効量の本明細書に定義の組換え抗体組成物または医薬組成物を該患者に投与することを含む方法に関する。
【０１１８】
数々の要因に基づき、特に、以下の腫瘍タイプが、本発明の抗体組成物を用いる処置に適応され得る：乳癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、黒色腫、頭頸部癌、および非小細胞肺癌。本発明の抗体組成物は、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を過剰発現する癌、例えば多くの乳癌、卵巣癌および胃癌などの特定の上皮癌の処置に特に適用できることが考えられる。
【０１１９】
一態様において、本発明の抗体組成物は、膵臓癌を有する患者の処置に使用される。該患者はＫＲＡＳ変異を有し得る。
【０１２０】
一態様において、患者は、以前に癌の処置を受けていない。別の態様において、患者は以前に癌の処置を受けている。患者は、以前にセツキシマブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブで処置されていてよい。患者における癌は、に対するセツキシマブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブに対する耐性を獲得していてもよい。
【０１２１】
これらの適応症のそれぞれに関して、２つの主要な臨床適用、すなわち１）少なくとも１つの付加的な治療処置に関連する補助療法、または２）単独療法が考えられる。
【０１２２】
１）補助療法：併用療法としても知られる補助療法では、患者は、少なくとも１つの付加的な治療処置、典型的には化学療法剤もしくは抗腫瘍薬および／または放射線療法を併用して本発明の抗体で処置され得る。あるいはまたは付加的に、本発明の組成物はまた、異なる抗癌抗体、例えばＶＥＧＦを標的とする抗体と組み合わせて使用され得る。従って、上記で列挙した一次癌標的は、標準的な第一選択療法および第二選択療法に加えて本発明の抗体または組成物の投与によって処置され得る。プロトコールの設計は、例えば腫瘍量の低減ならびに標準的な化学療法の通常用量を低減する能力によって評価される有効性に対応し得る。そのような投与量の低減は、化学療法剤の用量関連毒性を低減することにより付加的および／または長期的な治療を可能にし得る。
【０１２３】
本発明の抗体組成物を、癌細胞の最終的分化を誘導することが知られている薬物と組み合わせることにより、効果をさらに改善し得る。そのような化合物は、例えば、レチノイン酸、トランスレチノイン酸、シスレチノイン酸、フェニルブチレート、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、活性型ビタミンＤ３、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート、ヘキサメチレンビスアセトアミド、トランスフォーミング増殖因子β、酪酸、サイクリックＡＭＰおよびベスナリノンからなる群より選択され得る。好ましくは、該化合物は、レチノイン酸、フェニルブチレート、オールトランスレチノイン酸、および活性型ビタミンＤからなる群より選択される。
【０１２４】
本発明の抗体組成物および少なくとも１種の化学療法化合物または抗腫瘍化合物を含む医薬品は、癌療法における同時、個別または連続投与のための併用処置として使用され得る。化学療法化合物としては、問題の特定の癌の処置に適する任意の化学療法剤、例えば、アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチンおよび／またはオキサリプラチンなどの白金誘導体；植物アルカロイド(alkoid)、例えばパクリタキセル、ドセタキセルおよび／またはイリノテカン；抗腫瘍抗生物質、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン(luteomycin)および／またはマイトマイシン；トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤；ならびに／または、代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシルおよび／または他のフルオロピリミジンからなる群より選択される薬物であり得る。
【０１２５】
また、本発明の抗体組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に関連する補助療法において使用され得ることも考えられる。これらは、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、細胞内Ｍｇ−ＡＴＰ部位に関して競合することによりリガンド誘導性受容体リン酸化を阻害する、合成の、主にキナゾリン由来の低分子量分子である。ＨＥＲ２キナーゼを阻止するいくつかのチロシンキナーゼ阻害剤が現在臨床開発段階にある。これらのいくつかはまた、ＥＧＦＲまたは他のＥＧＦＲファミリー受容体を標的とする。これらのＴＫＩの総説については、Spector et al. (2007) Breast Cancer Res.9(2):205を参照のこと。従って、本発明の抗体組成物およびＨＥＲ２を標的とする少なくとも１種のＴＫＩを含む医薬品は、癌療法における同時、別個または連続投与のための併用処置としても使用され得る。
【０１２６】
他の態様において、本発明の抗体組成物を他の抗体治療薬、例えばＶＥＧＦに対する抗体（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））と組み合わせて使用し得る。さらに他の態様では、本発明の抗体組成物は、免疫系の細胞を刺激することが知られている薬物と組み合わせて使用してもよく、そのような併用処置は、本発明の抗体組成物の効果の免疫介在性増強をもたらす。そのような免疫刺激剤の例としては、組換えインターロイキン（例えばＩＬ−２１およびＩＬ−２）が挙げられる。
【０１２７】
２）単独療法：腫瘍の単独療法における本発明による抗体組成物の使用に関連して、該抗体組成物は、化学療法剤または抗腫瘍薬の同時使用を伴わずに、すなわち単独療法剤として患者に投与され得る。
【０１２８】
免疫複合体
本発明の組成物の治療的使用についての別の選択肢は、免疫複合体、すなわち１またはそれ以上の抗癌剤と結合した抗体の形態である。特に、別個のエピトープに結合する本発明の組成物の場合、これは細胞表面に架橋した抗体−受容体格子を生成し、それにより単一モノクローナル抗体の使用と比較して受容体インターナリゼーションのレベル上昇を潜在的にもたらし得ることが考えられる。故に、そのような組成物の個別抗体の１またはそれ以上の、１またはそれ以上の抗癌剤への結合は、結合した抗癌剤を特異的かつ有効に腫瘍細胞の内部へと送達する可能性を有し、それにより本発明の抗体組成物の作用を増大させ、改善された腫瘍細胞死滅活性を提供する。
【０１２９】
細胞毒性剤（従来の化学療法剤および他の低分子抗癌薬）、サイトカイン（この場合複合体は、“免疫サイトカイン”と称され得る）、毒素（この場合、複合体は“免疫毒素”と称され得る）および放射性核種を含む、様々な種類の抗癌剤を本発明の抗体と結合することができ、少数の免疫複合体は既に臨床使用に関して承認されている。これらには、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（９０Ｙに結合したマウス抗ＣＤ２０抗体）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（１３１Ｉに結合したマウス抗ＣＤ２０抗体）およびＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（カリケアマイシンに結合したヒト化抗ＣＤ３３抗体）が含まれる。臨床試験で検討されている他の免疫複合体には、例えばドキソルビシンまたはメイタンシノイド化合物に結合した抗体が含まれる。臨床治験で検討されている免疫毒素には、切頭型シュードモナス外毒素Ａに結合したいくつかの抗体が含まれる。ＩＬ−２に結合したヒト化ＥｐＣＡＭ抗体を含む免疫サイトカインも試験されている。
【０１３０】
細胞毒性剤に結合させた本発明の抗体の場合、これらは、例えば、アルキル化剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、カペシタビン、ゲムシタビン）、アントラサイクリン（例えばブレオマイシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ）ならびに植物アルカロイド（例えばドセタキセルおよびパクリタキセルなどのタキサン類、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド類）を含む、化学療法剤の主要なクラスのいずれかに属し得る。免疫複合体の使用は、抗癌剤を腫瘍に、特にインターナリゼーション後に腫瘍細胞の内部に特異的に向かわせるため、本発明の抗体に基づく免疫複合体は、有利には、カリケアマイシンもしくはメイタンシン誘導体などの高度細胞毒性剤、または細菌毒素（例えばシュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素）もしくは植物毒素（例えばリシン）などの毒素に基づき得る。
【０１３１】
免疫複合体中の結合した抗癌剤は、一般に、血清中では比較的安定であるが、免疫複合体が標的細胞内にインターナライズされたときに薬物の放出を可能にする、不安定なリンカーによって抗体に連結される。好適なリンカーとしては、例えば、血清中の中性ｐＨでは安定であるが、インターナリゼーション後にリソソーム内の弱酸性条件下で酸加水分解を受ける化学的リンカー、細胞内チオールによって切断されるジスルフィドリンカー、および血清中で安定であるが、細胞内区画では酵素切断を受けるペプチドリンカーが挙げられる。
【０１３２】
種々の結合方法が、本発明の２またはそれ以上の抗体を含む組成物において想定され得る。例えば、２つの抗体に関しては、抗体を２もしくはそれ以上の異なる抗癌剤に結合するか、または一方の抗体を、他方の抗体に結合した酵素などの作用物質によって活性化されるプロドラッグに結合することが可能である。抗体指向性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）の一般的な概念が、モノクローナル抗体に関して記載されており、ここでは、ｍＡＢ−酵素複合体により腫瘍に対して標的化された酵素によってプロドラッグが活性化されるが、本発明は、この方法を特定の条件に適合させる可能性を提供し得る。故に、正常組織への損傷を回避または低減しつつ、腫瘍細胞の死滅を特異的に増大させることが可能であり得る。
【０１３３】
抗癌性免疫複合体に関するさらなる情報については、Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Schrama et al. (2006) Nature Reviews/Drug Discovery 5:147-159;および、Rohrer (2009) chimica oggi/Chemistry Today 27(5):56-60を参照のこと。
【０１３４】
２またはそれ以上のＥＧＦＲファミリー受容体に対する抗体を含む本発明の組成物は、免疫複合体の形態で単一抗体を含み得るか、またはそれらは、免疫複合体の形態、例えば受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれを標的とする１つまたは場合によっては２つの免疫複合体の形態で２またはそれ以上の抗体を含み得る。
【０１３５】
用量および投与経路
本発明の抗体組成物は、問題の病状の処置に有効な量で、すなわち所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で投与され得る。治療的有効量は、処置される特定の病状、患者の年齢、性別および体重などの因子、ならびに抗体が単独処置として投与されるか、または１もしくはそれ以上の付加的な抗癌処置と組み合わせて投与されるかによって異なり得る。
【０１３６】
腫瘍治療のための有効量は、患者において疾患の進行を安定化する、および／または症状を改善する、好ましくは、例えば腫瘍サイズを縮小することによって、疾患の進行を止めるその能力によって測定され得る。癌を阻害する本発明の抗体または組成物の能力は、例えば実施例に記載の通り、インビトロアッセイによって、ならびにヒト腫瘍における効果を予測する好適な動物モデルにおいて評価され得る。好適な投与量レジメンは、個々の特定状況において最適の治療応答を提供するために選択され、例えば単回ボーラスとしてまたは持続点滴として、および場合によりそれぞれの症例の緊急性によって指示される投与量の調整を伴って投与される。
【０１３７】
本発明による抗体についての明確な用量はまだ決定されていないが、治療的使用に関して承認されている類似製品（例えば、ＨＥＲ２またはＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体）との比較を通して一定の投与上の考慮事項を決定することはできる。従って、本発明の抗体組成物の適切な投与量は、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））または抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））についての推奨投与量と同様であることが考えられる。特定の状態によって、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、４ｍｇ／ｋｇの初回用量およびその後週１回の２ｍｇ／ｋｇの用量、または８ｍｇ／ｋｇの初回用量およびその後３週間に１回の６ｍｇ／ｋｇの用量のいずれかで乳癌の処置のために（点滴によって）投与され、一方、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）は、１４日毎に６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１３８】
本発明の抗体組成物の好適な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であると考えられる。抗体組成物は、例えば、少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、および例えば最大５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大３０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大２０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大１５ｍｇ／ｋｇまでの投与量で投与され得る。投与は、通常は好適な間隔で、例えば週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、担当医師が適切と判断する期間に亘って繰り返され、担当医師は場合により必要に応じて用量を増加または減少させ得る。
【０１３９】
３つの別個の送達方法が、本発明の抗体の送達のために検討される。従来の静脈内送達は、おそらく腫瘍の大多数についての標準的な送達技術であり得る。しかしながら、卵巣、胆管、他の管等の腫瘍のような腹腔における腫瘍に関しては、腹腔内投与が、腫瘍に高用量の抗体を得るため、および抗体のクリアランスを最小限に抑えるために好ましいことが証明され得る。同様に、一部の固形腫瘍は、局所灌流に適した脈管構造を有する。局所灌流は、腫瘍部位で高用量の抗体を得ることを可能にし、抗体の短期間クリアランスを最小限に抑え得る。
【０１４０】
タンパク質または抗体の注入に基づく治療用製品と同様に、安全上の懸案事項は、主として(i)サイトカイン放出症候群、すなわち低血圧、熱、震え、悪寒、(ii)タンパク質に対する免疫原性応答の発現（すなわち、組換え抗体製品に対する患者によるヒト抗体の発現）、および(iii)ＨＥＲファミリー受容体を発現する正常細胞、例えば多くの上皮細胞への毒性に関連する。そのような安全上の懸案事項を監視するために標準的な試験およびフォローアップ手順が用いられる。
【０１４１】
診断的使用および組成物
本発明の抗体はまた、診断的方法において有用である（例えば、インビトロ、エキソビボ）。例えば、抗体は、患者からのサンプル（例えば、組織サンプル、または炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液、もしくは尿のような体液サンプル）中のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３のレベルを検出および／または測定するために使用可能である。好適な検出および測定方法としては、フローサイトメトリー、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光分析法、放射免疫測定法、および免疫組織学のような免疫学的方法が挙げられる。本発明はさらに、本明細書に記載の抗体を含む複数部分のキット（例えば、診断用キット）を包含する。
【０１４２】
特に断らない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるのと同様のまたはそれらに相当するあらゆる方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、方法および材料の例を以下に記載する。本明細書中に記載される全ての文献および他の出版物は、引用によりその全体を本明細書中に包含される。コンフリクトの場合には、定義を含む本明細書の記載は、制限され得る。多数の文献が本明細書で引用されているが、この引用は、これらの文献の何れかが当技術分野における通常の一般的知識の一部を形成するという承認を構成しない。本明細書および態様で記載する、用語“包含する（comprise）”またはその変形“含む（comprises）”もしくは“含む（comprising）”は、表示の整数または整数群を含むことを意図するが、他の整数または整数群を排除することを意図するものではないことが理解され得る。材料、方法および実施例は、単なる例示であって、限定することを意図しない。
【０１４３】
以下の実施例は、本発明の方法および材料を説明することを意味する。記載の条件およびパラメーターの適切な改変および適応は、通常、当業者に明らかなものであり、本発明の精神および範囲内であって、当技術分野でよく見られることである。用語“抗原結合フラグメント”および“抗原結合部分”は、本明細書中、互換的に用いられる。
【実施例】
【０１４４】
実施例
実施例１：キメラ抗体のヒト化
変異のためのアクセプターフレームワークおよび重要な位置（critical position）の同定
ヒト化のために選択された方法は、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植と、その後のコンビナトリアルライブラリー法を用いる重要な残基の復帰突然変異に基づくもので、同時に、１３個までの復帰突然変異の全ての組み合わせが評価された。
【０１４５】
ドナーマウス抗体のＣＤＲを、ドナー抗体のＶ領域アミノ酸配列をヒト生殖細胞系レパートリーのＶおよびＪ領域配列（IMGT reference directory）と比較して見出された最も近似のヒトＶ領域（可変領域）アクセプターフレームワーク中に移植した。各抗体について同定された最も近似の生殖細胞系ＶおよびＪ領域を下記表５に示す。
【０１４６】
１２７７ＶＬに関して、最も近似のヒト生殖細胞系Ｖ領域は、ＩＧＫＶ２−３０＊０２であった。しかしながら、ＩＧＫＶ２ファミリーはヒトレパートリーに滅多に使用されないため、第二のアクセプターフレームワークもまた、ＩＧＫＶ１ファミリーから選択された。２つのフレームワークはそれぞれ、ＶＬ復帰突然変異ライブラリーの作製に用いられ、単一の１２７７ＶＨ復帰突然変異ライブラリーと組み合わされた。
【０１４７】
ＣＤＲ移植のみでは、げっ歯動物抗体の結合特異性および親和性、そしてそれによる生物学的活性の再形成に十分ではないため、復帰突然変異が重要な位置に導入されるべきである。可能性のある重要な位置としては、ドナー抗体中で体細胞超変異される位置、抗原または影響を及ぼすＣＤＲ構造（構造決定残基またはバーニアゾーン（vernier zone）残基）と直接接触し得る位置、ＶＨ／ＶＬ境界面中の、またはＶＨ／ＶＬ折り畳み角度に関与する位置、および統計的に稀な（抗体レパートリーと比較して）または構造的に望ましくない残基によって占拠される位置が挙げられる。これらの位置は、文献および抗体データベース（例えば、Padlan (1994) Mol.Immunol. 31: 169-217; Honegger and Plueckthun (2001) J.Mol.Biol. 309: 657-670; http://www.bioc.uzh.ch/antibody; Martin and Thornton (1996) J.Mol.Biol.. 263: 800-815; http://www.bioinf.org.uk/abs/; Foote and Winter (1992) J.Mol.Biol. 224: 487-499）で利用可能な情報を用いて同定され得るか、またはin silico移植配列の構造モデリングを行うことにより同定され得る。これらの２つの方法の組み合わせを、抗体のそれぞれの復帰突然変異のための可能性のある重要な位置を同定するために使用した。
【０１４８】
復帰突然変異位置に加えて、ＣＤＲ中の露出した望まれない配列モチーフもまた同定した。これらのモチーフとしては、アスパラギン脱アミド化（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）、アスパラギン酸異性化（Ａｓｐ−Ｇｌｙ）およびメチオニン酸化のための部位が挙げられる。同定された配列モチーフは、（マウス配列への復帰突然変異とは対照的に）位置の１つで頻繁に生じるアミノ酸残基での保存的置換または置換によって変更された。
【０１４９】
最大１３の重要な位置が同定され、各抗体のライブラリー設計に包含された（表５）。位置の数は、結果として復帰突然変異ライブラリーのサイズに基づき選択された。例えば、１３個の位置が、２つの異なるアミノ酸（例えば、ヒトまたはマウス残基）間で変えられるとき、これは、１つの分子ライブラリーへ組み合わせられたとき８１９２種の変異形を生じる。各抗体中の同定された位置の部位は、添付した配列表に示され、ここで、“Ｘａａ”で示されるアミノ酸残基は、変異のために選択された可能性のある重要な位置である。
【０１５０】
【表２０】
0006325527.tif 000021
【０１５１】
復帰突然変異ライブラリーの作製
各ＶＨおよびＶＬ配列のための復帰突然変異ライブラリーは、配列の６０−８０塩基対に亘りオリゴＤＮＡをオーバーラップさせるＰＣＲ遺伝子アセンブリ法により合成された。軽鎖定常領域を、完全長軽鎖遺伝子を作製するためにオーバーラップ伸張ＰＣＲにより加えた。ヒト化抗体変異形の分子ライブラリーは、他の文献に記載の通り（Meijer et al. (2009) Methods Mol Biol. 525:261-77）、哺乳動物の発現ベクターへの各抗体用のＶＨおよび軽鎖ライブラリーのサブクローニング、その後の３８４ウェルフォーマットでのＨＥＫ２９３細胞中の個々の抗体変異体の一時的発現により作製した。発現上清を収集し、スクリーニングに用いた。
【０１５２】
ヒト化ライブラリーのオフレート（off-rate）スクリーニング
ライブラリー発現上清を、低密度でコートされた抗ヒトＩｇＧ  ＦｃによりＩｇＧ捕捉し、その後一価のビオチニル化抗原で検出する工程を備えるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。このＥＬＩＳＡは、親和性作用からの干渉を受けない結合親和性の感受性および信頼性のランク付け、または個々のクローンの発現レベルの変更を考慮して設定された。８８３２の個々のウェルおよびおよそ１のライブラリーサンプル（異なるライブラリーメンバーを回収するためのｐ＝０．６５）に対応して、計２４枚の３８４ウェルプレートを各ライブラリースクリーニングに用いた。抗体発現レベルに関わらず、全ての上清が結合平衡に達するのを確実にするため、５μｌの各ライブラリー発現上清を、コートした抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄し、ビオチニル化抗原（ヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３； Sino Biological, Beijing, P.R. China; 自家ビオチニル化）を、キメラ抗体標準の飽和に十分なことが予め決定された濃度で添加した。プレートを洗浄し、抗原を、キメラ親抗体標準の測定された解離によって変わる所定時間間隔の間、捕捉抗体から解離させた。最後に、ストレプトアビジンペルオキシダーゼポリマー（Ｓｉｇｍａ）を添加し、プレートをＴＭＢ−プラス基質（Kem-En-Tec Diagnostics, Taastrup, Denmark）を用いて作製した。
【０１５３】
キメラ親抗体のＯＤシグナルと同程度またはそれより高いＯＤシグナルを有する各ライブラリーからのおよそ１００ヒットを、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫ３８４装置（Fortebio, Menlo Park, CA）を用いてオフレートランク付けを行った。タンパク質Ｇバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を、４０μｌの発現上清から抗体を捕捉し、次いで２００ｎＭのヒトまたはカニクイザル抗原と共にインキュベートするために用いた。ヒト抗原はSino Biological社から入手し、カニクイザル抗原は、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞（Koefoed et al. (2011) mAbs, 3:6, 1-12）における一時的発現により自家製造した。その後、該バイオセンサーをＰＢＳ中でインキュベートし、抗原の解離を解離速度の信頼できる決定を可能にするために２０分間記録した。レスポンスを、解離定数の計算のためにLangmuir  １：１結合モデルに全体的に適合させた。全体として、各ライブラリーからの多数のヒットは、ヒトおよびカニクイザル抗原の両方が、親抗体の解離定数と同程度またはそれより遅い速度であることが見出された。
【０１５４】
配列分析
オフレートランク付け用に選択されたヒットをコード化するプラスミドを、ＤＮＡ配列決定（MWG Biotech, Ebersberg, Germany）を行い、得られた配列を整列させ、in silicoで作製したＣＤＲ移植Ｖ領域と比較した。選択したヒットのアライメントを図１−６に示す。抗体１２７７および１５６５に基づくイニシャルライブラリーのスクリーニングからの全てのヒットが、脱ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＨ２のそれぞれにアミド化部位（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）を有することが見出され、故に、標的との相互作用に該モチーフが重要であることが示唆された。しかしながら、たった１つの変異置換（ＡｓｎからＳｅｒ）が、両方の場合に計画され、配列モチーフを欠く結合変異体が、該モチーフを構成する一方または両方の位置の飽和突然変異により生じる可能性が高い。脱アミド化部位のＰＣＲに基づく飽和突然変異により作製されるライブラリーのスクリーニングによって、この望ましくない配列モチーフを欠くヒットが得られた（図１および２）。望ましくない配列モチーフを欠く強力に結合する抗体変異体が、全ての他のライブラリーで見出された。
【０１５５】
各ライブラリースクリーニングからの４ないし１０ヒットが、ヒトおよびカニクイザル抗原への維持または改善された結合、復帰突然変異の数およびラージスケールでの発現とタンパク質Ａによるクロマトグラフィーによる精製のための望ましくない配列モチーフの欠失に基づいて選択された。ヒト化変異体の１つである抗体１１００６は、ライブラリー設計の一部ではなかったにもかかわらず、ＣＤＲＬ１（Ｉ２９Ｔ；配列番号：１３および図６）における偶発的変異を有することが見出され、改善された解離速度およびＣＤＲＨ２中のアスパラギン酸異性化部位の除去により、発現のために選択された。
【０１５６】
表面プラズモン共鳴によるヒト化変異体の結合反応速度分析
精製したヒト化変異体の結合反応速度分析を、一価の条件下での可溶性抗原に対する全体のＩｇＧ分子の抗体親和性の測定を可能とする、Ｃａｎｚｉａｎｉら（Anal. Biochem. (2004) 325:301-307）が報告したＩｇＧ捕捉アッセイを利用するＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６バイオセンサー（BioRad, USA）を用いて行った。簡単には、モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（GE Healthcare, Denmark）のおよそ５０００の共鳴単位（RU：Resonance Unit）を、製造業者の指示書に従いＧＬＣチップ表面（BioRad, USA）へ結合させ、その後、抗Ｆｃセンサー表面上に本発明の個々の抗体またはネガティブコントロールを捕捉させる。捕捉抗体の密度を各クローンに対して最適化し、アッセイにおいて用いた最も高い抗原濃度の結合は、〜３０  ＲＵを超過しなかった。次に、１００ｎＭ  ストック溶液からの連続する３倍希釈の２５０μｌの一価抗原（Sino Biologicals）を、５０μｌ／分の流速で注入し、応答曲線を作成した。チップ表面を、３Ｍ  ＭｇＣｌ２（GE Healthcare, Denmark）の１０秒間注入により捕捉抗体／抗原複合体を該表面から剥がすことを３回反復して、各サイクル間で再構成した。最後に、結合レスポンスを、ダブル リファレンシング(double referencing)を用いて、オンレート（ｋｏｎまたはｋａ）、オフレート（ｋｏｆｆまたはｋｄ）および親和性（ＫＤ）定数の計算のためにLangmuir  １：１結合モデルに適合させた。結合反応速度分析の結果を、選択された変異体が、キメラ親抗体と比較して、ヒトおよびカニクイザル抗原に対して保持されたか、または改善された親和性を有することを示す（表６）。
【０１５７】
【表２１】
0006325527.tif 000022
【０１５８】
ヒト化変異体のインビトロ機能評価
ヒト化抗体変異体を、同じ受容体を標的とする２つの抗体間の機能的相乗効果がヒト化後に保存されたかどうかを決定するために、特定の標的の異なるエピトープに対する２つの抗体を含む抗体混合物中のキメラ“パートナー抗体”と組み合わせて生存性アッセイにおける機能的効果について試験した（ここで、“パートナー抗体”は、抗体１２７７変異体（抗ＥＧＦＲ）が、キメラ抗ＥＧＦＲ抗体１５６５と共に試験され、抗体４３８４変異体（抗ＨＥＲ２）が、キメラ抗ＨＥＲ２抗体４５１７と組み合わせて試験されたことなどを意味する）。各ヒト化変異体を、２つの細胞株で試験し、２つのキメラ抗体の親混合物およびネガティブコントロール抗体と比較した。用いた細胞株を、それらの予め決定された受容体依存性、すなわち、Ａ４３１ＮＳ  上皮癌、Ｈ３５８  非小細胞肺癌、およびＥＧＦＲによるＦａＤｕ  頭頸部癌、ＯＥ１９  食道癌およびＨＥＲ２によるＢＴ４７４  乳癌、ならびにＨＥＲ３によるＭＤＡ−ＭＢ−１７５ ＶＩＩおよびＭＣＦ−７  乳癌に基づいて選択した。
【０１５９】
さらに、６つのヒト化変異体（１１２９４、１１３０２、１１２４９、１１１４５、１０７３８および１１０５２；ヒト化Ｐａｎ−ＨＥＲ）の組み合わせを多数の細胞株にて試験し、６つのキメラ抗体（１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８および５０８２；キメラＰａｎ−ＨＥＲ）の組み合わせと比較した。用いた細胞株、Ｎ８７  胃癌、ＦａＤｕ  頭頸部癌、Ａ４３１ＮＳ  上皮癌、ＯＥ１９  食道癌、ＨＮ５  頭頸部癌、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ ＶＩＩ  乳癌およびＭＦＥ−２８０  子宮内膜癌を、それらの予め決定したＨＥＲファミリー受容体への依存性に基づき選択した。
【０１６０】
生存性アッセイを行う前に、適当な抗体および抗体混合物を、０．５−２％のＦＢＳおよび１％のＰ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）を補った適当な培地において１００μｇ／ｍｌの最終全抗体濃度に希釈し、最も高い抗体濃度を含むウェルにおいて５０μｇ／ｍｌの最終全抗体濃度を得た。次に、３８４ウェルプレートにて抗体の３倍連続希釈を行い、次いで、関連する数の細胞を、実験ウェルに加えた。ＭＣＦ−７細胞もまた、１ｎＭ  ヘレグリンベータで刺激した。プレートを加湿インキュベータにおいて３７℃で４日間インキュベートした。ＷＳＴ−１試薬(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)を各プレートに添加し、プレートを３７℃で１−３時間インキュベートした。プレートを軌道プレートシェーカーに移して1時間振盪し、ＥＬＩＳＡリーダーにて４５０と６２０ｎｍ（参照波長）で吸光度を測定した。代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を以下のように非処理対照のパーセントとして計算した。
【数１】
0006325527.tif 000023
【０１６１】
選択したヒト化抗体変異体のインビトロ活性を、図７−１５および１７−１９に示す。結果は、選択したヒト化変異体の全てが、それらのキメラまたはヒト化親抗体と組み合わせたとき抗増殖効果を示し、それは、２つのキメラ親抗体の対応する混合物の効果と極めて類似していることを示す。さらに、６つのヒト化変異体の組み合わせもまた、６つのキメラ親抗体の組み合わせの効果と極めて類似する効果を示す（図２０）。
【０１６２】
ヒト化変異体の特異性（交差反応性）
キメラ親抗体および選択したヒト化変異体を、ヒト、カニクイザルおよびマウス由来のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、ならびにヒトおよびマウスＨＥＲ４への結合について試験し、交差反応性パターンに変化をもたらすかどうかを決定した。
【０１６３】
抗体−抗原結合を、コートした抗原を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。ヒト抗原をSino Biologicalsから入手した。すべての他の抗原をＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞中での一時的発現により自家製造した。キメラおよびヒト化抗体、ならびにアイソタイプ・コントロール抗体を、異なる濃度でコートした抗原と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ−（西洋わさびペルオキシダーゼ）−結合二次抗体により検出した。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した４０ｎＭ  抗体からのＯＤシグナルを、陰性（−；ＯＤ＜０．１）から強陽性（＋＋＋；ＯＤ＞２．５）までスコア化した。
【０１６４】
結果は、図１６の表に示し、代表的ヒト抗原とカニクイザル抗原の間の交差反応が、全てのヒト化抗体変異体で保存されていること、および上皮細胞増殖因子受容体ファミリーのメンバーに対する新たな反応性はもたらされないことが示される。
【０１６５】
まとめと考察
ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４８３４に記載のキメラ抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２および抗ＨＥＲ３抗体の多数のヒト化変異体は、可能性のある重要なフレームワーク領域の復帰突然変異により、およびいくつかの場合には、望ましくないＣＤＲ配列モチーフの改変により作製されるＣＤＲ移植ライブラリーのスクリーニングにより製造された。関連標的抗原への結合親和性について選択された各ライブラリーからのおよそ１００ヒットは、オフレートランク付けを行い、そして、親キメラ抗体の解離速度と同程度またはそれより遅い速度を有する変異体を、選択し、配列決定した。各ライブラリースクリーニングからの４ないし１０ヒットが、ヒトおよびカニクイザル抗原への維持または改善された結合、復帰突然変異の数およびラージスケールでの発現および精製のための望ましくない配列モチーフの欠失に基づいて選択された。選択した精製ヒト化変異体を、ヒトおよびカニクイザル抗原に対する結合親和性を決定するために結合反応速度分析を行い、同じ受容体の異なるエピトープに結合するキメラパートナー抗体と組み合わせて生存性アッセイにてインビトロ機能分析を行い、および交差反応アッセイを行った。
【０１６６】
ヒト化変異抗体１０２９２、１０４６０、１１２９４、１０５６０、１１３０２、１０７０４、１１２４４９、１１１４５、１０７３８、１０８１０、１１００６および１１０５２のそれぞれが、それらが由来する元のキメラ親抗体の機能的特性と極めて類似した特性を有していて、
・同程度またはより高い結合親和性；
・同程度またはより遅い解離速度；
・同じヒトおよびカニクイザル抗原に結合し、同時に、マウス抗原または他のＥＧＦＲファミリー受容体への結合を欠き；そして
・キメラパートナー抗体と併用して機能的インビトロアッセイで試験したとき、２つの異なる細胞株における高度に類似した抗増殖効果
を含む特性を示すことが見出された。
【０１６７】
故に、これらの結果は、本発明のヒト化抗体変異体が、それらが由来する代表的親キメラ抗体と極めて類似する機能的特性を有することを証明する。このことは、本発明のヒト化抗体の混合物、例えばＥＧＦＲファミリー受容体ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のそれぞれに対する１または２つのかかる抗体を含む混合物が、ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４８３４に記載の親キメラ抗体の混合物の効果と同様のインビボ抗癌作用を証明され得ることを示唆する。
【０１６８】
実施例２：ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３上のオーバーラップしないエピトープに対する２つのモノクローナル抗体は、相乗的インビトロ増殖阻害活性を示し、効果的に標的の下方制御を誘導する
図２１Ａに示す通り、ＥＧＦＲ（すなわち、１２７７および１５６５）、ＨＥＲ２（すなわち、４３８４および４５１７）、およびＨＥＲ３（すなわち、５０３８および５０８２）上のオーバーラップしないエピトープに対する抗体を、癌細胞株Ａ４３１ＮＳ、ＨＣＣ２０２、およびＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩそれぞれの成長および増殖を阻害する能力について、生存性アッセイを用いて試験した。各受容体に対する抗体からなる抗体処理を、単独で、または以下の組み合わせ：１２７７および１５６５混合物、４３８４および４５１７混合物、および５０３８および５０８２混合物を用いて行った。細胞損傷は、代謝細胞機能および増殖のためのエネルギーを維持し、提供する細胞の能力の欠失を伴い得る。代謝活性アッセイはこの前提に基づき、通常、ミトコンドリア活性を測定する。細胞増殖試薬  ＷＳＴ−１（Roche Cat. No 11 644 807 001）は、生細胞の代謝活性を測定する、すぐに使用できる基質である。代謝活性が生細胞数と相関すると仮定される。この例において、ＷＳＴ−１アッセイは、癌細胞を種々の濃度の抗体で９６時間処理後に、代謝活性細胞の数を測定するために使用された。
【０１６９】
ＷＳＴ−１アッセイの実施前に、適当な抗体および抗体混合物を、２％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを添加した適当な媒体中、１００μｇ／ｍｌの最終全抗体濃度に希釈して、最も高い抗体濃度を含むウェル中、５０μｇ／ｍｌの最終全抗体濃度を得た。その後、抗体の３倍連続希釈を行った。その後、関連する数の細胞を３８４ウェルプレートの実験プレートに添加した。プレートを、加湿インキュベータ中、３７℃にて４日間インキュベートした。その後、ＷＳＴ−１試薬を該プレートに添加し、プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。プレートを軌道プレートシェーカーに１時間移し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０および６２０ｎｍ（参照波長）で吸光度を測定した代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を以下のように非処理対照のパーセントとして計算した。
【数２】
0006325527.tif 000024
【０１７０】
抗体処理のインビトロ作用は、抗体の混合物が、試験した３つのＨＥＲ受容体のそれぞれに対する個々の抗体よりも優れていることを示した（図２１Ｂ）。さらに、ウェスタンブロット分析により抗体処理したＡ４３１ＮＳ、ＨＣＣ２０２およびＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ細胞（各処置の全抗体濃度２０μｇ／ｍｌで４８時間）から単離した細胞溶解物中のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３レベルの分析は、抗体処理細胞が、未処理細胞と比較してＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の低下したレベルを示したことを示した（図２１Ｃ）。
【０１７１】
この実施例は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３に対する２つの抗体が、相乗的インビトロ増殖阻害活性を示し、効果的に標的の下方制御をもたらすことを証明する。
【０１７２】
実施例３：Ｐａｎ−ＨＥＲは、異なる組織源および遺伝的背景の多数の細胞株において幅広い阻害活性を有する。
【０１７３】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、および／またはＨＥＲ３上のオーバーラップしないエピトープに対する抗体の混合物を、多岐に亘る癌細胞株の成長および増殖を阻害するそれらの能力について試験した。Ｐａｎ−ＨＥＲ（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する６つのモノクローナル抗体の混合物；抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２）、２種のＨＥＲファミリーメンバー（すなわち、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、ならびにＨＥＲ２およびＨＥＲ３）を標的とする抗体混合物、および１種のＨＥＲファミリーメンバー（すなわち、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３）を標的とする抗体混合物での処理の効果を、以下の細胞株で測定した。ＨＮ５、ＭＤＡ−ＭＢ１７５−ＶＩＩ、ＨＣＣ８２７、Ｎ８７、Ａ４３１ＮＳ、ＦａＤｕ、ＯＥ１９、ＳＷ９４８、ＢＴ４７４、ＲＭＧ−１、ＴＥ１１、ＧＥＯ、Ｈ３５８、ＣＡＬＵ−３、Ｈ２９２、ＨＣＣ２０２、ＬＳ１７４Ｔ、ＺＲ−７５−３０、Ｈ１９７５、ＫＹＳＥ５２０、ＡＵ−５６５、ＣＡＰＡＮ−１、ＩＧＲ−ＯＶ１、ＯＥ３３、ＰＫ−１、ＣＦＰＡＣ−１、ＢｘＰＣ３、Ａ４３１、ＳＷ１４６３、ＣＯＬＯ６７８、Ｈ８２０、ＣＯＬＯ６８０Ｎ、ＡＳＰＣ１、ＨＣＣ１９３７、Ｈ６６１、ＭＦＥ−２８０、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−５、ＳＫ−ＢＲ−３、ＳＷ４０３、ＯＶＣＡＲ−８、ＲＬ９５−２、ＲＭＵＧ−Ｓ、ＳＷ８３７、Ｔ８４、ＣＡＰＡＮ−２、ＧＰ５ｄ、ＣａＣＯ２、ＢＴ２０、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＤＵ１４５、Ａ５４９、ＣＡＬ−１２０、ＥＢＣ１、Ｈ１９９３、Ｈ２２６、ＨＥＣ−１０８、ＬｏＶｏ、Ｐａｎｃ０８．１３、ＲＴ−１１２、Ｕ２−ＯＳ、ＤＬＤ−１、ＳＫＯＶ３、Ｈ４６０、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４−ＶＩ、ＭＫＮ−４５、ＰＡＮＣ−１、ＲＴ−４、ＳＮＵ−１６、Ａ２０５８、ＭＣＦ７、ＳＷ４８０。ＰａｔｈＳｃａｎ  ＲＴＫシグナリング抗体アレイ(Cell  Signaling Technology)を用いた、これらの７３細胞株におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の受容体リン酸化レベルの特性化は、ＨＥＲファミリーの高活性化を証明した（図２２）。
【０１７４】
７０以上の癌細胞株（試験した１００以上の細胞株のうち）での抗体処理の代謝活性への効果を、実施例２の記載と同様のＷＳＴ−１アッセイを用いて９６時間インキュベーション後に決定した。結果は、異なる組織源および遺伝的背景の多数の癌細胞株において、ヘレグリン存在下（図２４）、ＥＧＦ存在下（図２５）、またはリガンド不存在下（図２３）にて幅広い阻害活性を有することを示した。“ＥＧＦＲ”とは、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”とは、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”とは、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”とは、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”とは、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。これらの結果はさらに、３種の受容体の同時標的化が、単一受容体またはＨＥＲファミリーの２種の受容体のいずれかの組み合わせの標的化よりも広範な効果を提供することを証明した。
【０１７５】
実施例４：Ｐａｎ−ＨＥＲは、リガンド誘導性増殖を効果的に阻害する。
抗体混合物が、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３リガンドの存在下で有効かどうかを決定するために、１、２または３種のＨＥＲファミリー受容体に対する抗体混合物を、ヘレグリン存在下、ＥＧＦ存在下、またはリガンド不存在下で、膵臓癌細胞株の成長および増殖を阻害する能力を試験した。Ｐａｎ−ＨＥＲ（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する６つのモノクローナル抗体の混合物；抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２）、ＨＥＲファミリーメンバー（すなわち、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、およびＨＥＲ２およびＨＥＲ３）に対する抗体混合物、および１種のＨＥＲファミリーメンバー（すなわち、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３）に対する抗体混合物での処理の効果を、以下の細胞株について測定した：ＣＡＰＡＮ−１、ＰＫ−１、ＣＦＰＡＣ−１、ＢｘＰＣ３、ＡＳＰＣ１、ＣＡＰＡＮ−２、Ｐａｎｃ０８．１３、ＰＡＮＣ−１、ＫＰ４、ＭｉａＰａｃａ−２およびＰＳＮ１）。これらの細胞株の変異状態を図２６に示す。１、２または３種のＨＥＲファミリー受容体に対する抗体混合物の、ヘレグリン存在下、ＥＧＦ存在下、またはリガンド不存在下での多種の癌細胞株の成長および増殖の阻害能もまた、試験した（図２３−２５）。細胞を、抗体およびリガンドを含む培地に９６時間暴露した（リガンドおよび抗体を、細胞に同時に添加した）。代謝活性を、実施例２の記載と同様のＷＳＴ−１アッセイを用いて９６時間インキュベート後に決定した。“ＥＧＦＲ”とは、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”とは、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”とは、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”とは、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”とは、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。Ｐａｎ−Ｈｅｒは、ＥＧＦまたはヘレグリンの存在下で、多種の癌細胞株の効果的阻害を示した。
【０１７６】
実施例５：Ｐａｎ−ＨＥＲは、承認された治療抗体に対して獲得耐性を有する細胞において阻害効果を維持する。
Ｐａｎ−ＨＥＲ（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する６つのモノクローナル抗体の混合物；抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２）を、セツキシマブ、トラスツズマブまたはペルツズマブのそれぞれに対して獲得耐性を有するＨＮ５、ＯＥ１９およびＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ細胞株または細胞集団の成長および増殖を阻害するその能力について試験した。セツキシマブ耐性ＨＮ５細胞株を、実施例１１に記載の通りに作製した。トラスツズマブ耐性ＯＥ１９細胞およびペルツズマブ耐性ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ細胞は、親細胞を、増加濃度のトラスツズマブ［１０−１００μｇ／ｍｌ］およびペルツズマブ［１−５０μｇ／ｍｌ］それぞれに、それぞれ８ヶ月間および１２ヶ月間暴露することにより確立した。細胞を、細胞を指数増殖に維持するために、週に１または２回継代した。耐性レベルを、実施例２に記載のＷＳＴ−１  生存性アッセイにて、耐性細胞集団が確立されるまで毎月試験した。トラスツズマブ耐性ＯＥ１９細胞の単一細胞クローンを、実施例１１に記載のＯＥ１９細胞のトラスツズマブ獲得耐性集団の限界希釈クローニングにより作製した。
【０１７７】
代謝活性を、実施例２の記載と同様のＷＳＴ−１アッセイを用いて、９６時間インキュベート後に決定した。Ｐａｎ−ＨＥＲ処理した耐性細胞ならびに親細胞は、低下したレベルの代謝活性を示した（図２８）。対照的に、代謝活性は、親ＨＮ５、ＯＥ１９およびＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ細胞で低下したが、セツキシマブ、トラスツズマブ、またはペルツズマブのそれぞれで処理した耐性クローンでは変化がなかった。この実施例は、Ｐａｎ−ＨＥＲが、承認された治療抗体に獲得耐性を有する細胞において阻害効果を維持することを証明する。
【０１７８】
実施例６：Ｐａｎ−ＨＥＲは、インビトロで代償性受容体上方制御を効果的に阻止する。
代償性受容体上方制御が、本発明の抗体混合物での処理の結果生じるかどうかを決定するために、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３レベルを、４８時間の抗体処理（２０μｇ／ｍｌ）後のＨ２９２およびＯＶＣＡＲ８細胞株からの全細胞溶解物にて、ウェスタンブロット分析により測定した。Ｐａｎ−ＨＥＲ（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する６つのモノクローナル抗体の混合物；抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２）、ならびに１種のＨＥＲファミリーメンバー（すなわち、ＥＧＦＲ（抗体１２７７、１５６５、または１２７７＋１５６５）、ＨＥＲ２（抗体４３８４、４５１７、または４３８４＋４５１７）およびＨＥＲ３（抗体５０３８、５０８２、または５０３８＋５０８２））に対する抗体混合物での処理の効果を決定した。β−アクチンを、ローディングコントロールとして用いた。結果は、抗ＥＧＦＲ処理が、Ｈ２９２細胞にてＨＥＲ２の上方制御をもたらすこと（図２９、上；セツキシマブレーン、１２７７、１５６５、および１２７７＋１５６５レーン）、および抗ＨＥＲ３処理が、ＯＶＣＡＲ−８にてＨＥＲ２の上方制御をもたらすこと（図２９、下；ＭＭ−１２１レーン、５０３８、５０８２、および５０３８＋５０８２レーン）、一方、Ｐａｎ−ＨＥＲ処理が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の下方制御をもたらすこと（図２９；Ｐａｎ−Ｈｅｒレーン）を示した。これらの結果は、Ｐａｎ−ＨＥＲが、獲得耐性の可能性のある機序である、３つの標的全ての同時の下方制御を効果的にもたらし、代償性受容体上方制御を阻止することを証明した。
【０１７９】
実施例７：ＢｘＰＣ−３（膵臓癌）異種移植モデルにおける多数のＨＥＲファミリー受容体を標的とする相乗効果
ヒト癌の異種移植モデルにおけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３ならびに２および３種の受容体標的の組み合わせに対する抗体混合物の効果を評価するために、ＢｘＰＣ−３（膵臓癌）異種移植モデルを抗体混合物で処理し、腫瘍サイズに対する効果をアッセイした。
【０１８０】
このアッセイにおいて、ＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞をマウスに接種した。簡単には、５ｘ１０６  ＢｘＰＣ３細胞を、８週ないし１０週令のメスの胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍をキャリパーで週に３回測定し、腫瘍容積（ｍｍ３）を式：（幅）２ｘ長さｘ０．５により計算した。１４０ｍｍ３の平均腫瘍サイズでマウスを無作為化し、処理を開始した。マウスを、５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射で週に３回処理し（計１０回注射）、その後、観察した。腫瘍容積データのグラフ表示は、平均±ＳＥＭで表した。
【０１８１】
結果は、Ｐａｎ−ＨＥＲ（抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２）が、ＢｘＰＣ−３異種移植モデルにて腫瘍増殖を効果的に抑制したことを示した（図３０；Ｎ＝７／群；処理期間は、グラフの灰色部分で示される）。ＢｘＰＣ３腫瘍異種移植の増殖制御で最も効果的な上記組み合わせと共に、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３ならびにＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を標的化するとき、明確な相乗効果が観察された。“ＥＧＦＲ”とは、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”とは、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”とは、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”とは、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”とは、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。さらに、Ｐａｎ−ＨＥＲによりインビボで下方制御されるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は、処理の中止の３日後に切除された腫瘍からの組織切片の免疫組織化学により確認された（図３１）。
【０１８２】
実施例８：Ｃａｌｕ−３（ＮＳＣＬＣ）異種移植モデルにおける多数のＨＥＲファミリー受容体を標的とする相乗効果
ヒト癌の異種移植モデルにおけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３ならびに２および３種の受容体標的の組み合わせに対する抗体混合物の効果を評価するために、Ｃａｌｕ−３（ＮＳＣＬＣ）異種移植モデルを抗体混合物で処理し、腫瘍サイズに対する効果をアッセイした。
【０１８３】
このアッセイにおいて、Ｃａｌｕ−３  ＮＳＣＬＣ細胞をマウスに接種した。簡単には、１ｘ１０７  Ｃａｌｕ−３細胞を、８週ないし１０週令のメスの胸腺欠損ヌードマウスの左脇腹に皮下注射した。腫瘍をキャリパーで週に３回測定し、腫瘍容積（ｍｍ３）を式：（幅）２ｘ長さｘ０．５により計算した。１７０ｍｍ３の平均腫瘍サイズでマウスを無作為化し、処理を開始した。マウスを、５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射で週に３回処理した（計８回注射）。腫瘍容積データのグラフ表示は、平均±ＳＥＭで表した。
【０１８４】
結果は、Ｐａｎ−ＨＥＲ（抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２）が、Ｃａｌｕ−３異種移植モデルにて腫瘍増殖を効果的に抑制したことを示した（図３２；Ｎ＝５／群；処理期間は、グラフの灰色部分で示される）。結果は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を同時に標的化したとき相乗効果が示されるが、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ３を標的化したとき、ＥＧＦＲの単一標的化の抗腫瘍応答と比較して明確な相乗効果は観察されなかった。“ＥＧＦＲ”とは、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”とは、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”とは、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”とは、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”とは、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【０１８５】
実施例９：Ｐａｎ−ＨＥＲは、インビボでの代償性受容体上方制御を効果的に阻止する。
本発明の抗体混合物での処理の結果としてインビボで代償性受容体上方制御の阻止が起こるかどうかを決定するため、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３レベルを、ウェスタンブロット分析により抗体処理したＢｘＰＣ−３腫瘍溶解物で測定した。Ｐａｎ−ＨＥＲ（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対する６つのモノクローナル抗体の混合物；抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２）、２種のＨＥＲファミリーメンバー（すなわち、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、およびＨＥＲ２およびＨＥＲ３）を標的とする抗体混合物、および１種のＨＥＲファミリーメンバー（すなわち、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３）を標的とする抗体混合物での処理の効果を決定した。β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【０１８６】
結果は、抗ＥＧＦＲ処理がＥＧＦＲ下方制御をもたらすこと（図３３上）、抗ＨＥＲ２処理がＨＥＲ２下方制御をもたらすこと（図３３上）、および抗ＨＥＲ３処理がＨＥＲ３下方制御をもたらすこと（図３３上）を示した。ウェスタンブロットバンド強度の相対的定量化は、ＨＥＲ２が、抗ＨＥＲ３処理に応答して顕著に上方制御されたことを示した（図３３；下）。対照的に、Ｐａｎ−ＨＥＲ処理は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の同時かつ効果的な下方制御をもたらした（図３３上；グリーンボックスおよび図３３下）。“ＥＧＦＲ”とは、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”とは、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”とは、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”とは、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”とは、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【０１８７】
この実施例は、Ｐａｎ−ＨＥＲが、３つ全ての標的の同時下方制御を効果的に誘導し、インビボで代償性受容体の上方制御を阻止得ることを証明した。
【０１８８】
実施例１０：患者由来のＫＲＡＳ変異膵臓腫瘍異種移植モデルにおける多数のＨＥＲファミリー受容体を標的化する相乗効果
ＫＲＡＳ変異膵臓癌の患者由来の腫瘍異種移植モデル（START Discovery, San Antonio, TX）におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３ならびに２および３種の受容体標的の組み合わせに対する抗体混合物のインビボ効果を評価するために、抗体混合物で処理し、腫瘍サイズに対する効果をアッセイした。
【０１８９】
このアッセイにおいて、患者由来の膵臓癌細胞をマウスに接種した。簡単には、切除した患者の生腫瘍材料を免疫不全マウスに移植し、順次インビボへ移行した。１００−２００ｍｍ３の腫瘍容積で、動物を処理群および対照群に無作為化し、投与を開始した。投与計画：５０ｍｇ／ｋｇ  腹腔内注射。週に３回、計１０回投与（０−２０日目）。Ｎ＝５／群。データを平均±ＳＥＭで表す。アステリクスは、ｐ＜０．０５を有する第一日を示す。グループ間の処理応答における統計的に顕著な相違は、実験期間中維持された。
【０１９０】
結果は、Ｐａｎ−ＨＥＲが、膵臓癌の治療困難な患者由来のモデルにおいて腫瘍増殖を効果的に抑制したことを示した（図３４；Ｎ＝５／群）。さらに、デコンボリューション法は、ＳＴ１７９異種移植モデルにてＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の標的化、ＳＴ３８３異種移植モデルにてＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の標的化、およびＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のより少ない程度の標的化が強く相乗的であることを明らかにした（図３５；Ｎ＝７−８／群；処理期間は、グラフの灰色部分で示される）。“ＥＧＦＲ”とは、抗体１２７７および１５６５の混合物を意味する。“ＨＥＲ２”とは、抗体４３８４および４５１７の混合物を意味する。“ＨＥＲ３”とは、抗体５０３８および５０８２の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ２”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、および４５１７の混合物を意味する。“ＥＧＦＲ＋ＨＥＲ３”とは、抗体１２７７、１５６５、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“ＨＥＲ２＋ＨＥＲ３”とは、抗体４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。“Ｐａｎ−ＨＥＲ”とは、抗体１２７７、１５６５、４３８４、４５１７、５０３８、および５０８２の混合物を意味する。
【０１９１】
【表２２】
0006325527.tif 000025
【０１９２】
実施例１１：セツキシマブ獲得耐性ＨＮ５クローンは、高ＥＧＦＲ活性と共に、全ＥＧＦＲの低減レベルを示す
セツキシマブ耐性ＨＮ５クローンを、親ＨＮ５細胞をセツキシマブの増加濃度［１−１００μｇ／ｍｌ］で６ヶ月間暴露することにより確立した。細胞を、対数増殖を維持するために、週に２回継代した。セツキシマブに対する耐性レベルを、実施例２に記載のＷＳＴ−１ 生存性アッセイにて、セツキシマブ耐性細胞集団が確立されるまで毎月試験した。単細胞クローンを、セツキシマブ獲得耐性を有するＨＮ５細胞集団の限界希釈クローニングにより作製した。０．５細胞／ウェルを、３８４ウェルプレートにプレートした。単細胞コロニーの成長および増殖を、Novartis Cellavista Imagerを用いて行った。最も耐性の個々のクローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４を、さらなる特性化のために選択した（図３６）。
【０１９３】
生存性：
個々のクローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４のセツキシマブ耐性レベルを、実施例１に記載のＷＳＴ−１ 生存性アッセイにて試験した。簡単には、細胞を一定の範囲の濃度のセツキシマブで処理し、９６時間後にアッセイした。親ＮＨ５細胞とは異なり、耐性クローンは増加濃度のセツキシマブ処理に生存性であった（図３７）。
【０１９４】
固定細胞へのセツキシマブ結合：
親ＨＮ５および耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４へのセツキシマブの結合強度を決定した。結合曲線を、細胞数（ＤＲＡＱ−５染色）およびセツキシマブ濃度に対して標準化した蛍光シグナルをプロットすることにより作成した。結果は、セツキシマブの最大半量の結合（すなわち、ＥＣ５０値）は親細胞と比較して変化しないが、最大結合は耐性クローンで低減したことを証明する（図３８）。
【０１９５】
ＥＧＦＲ発現およびシグナル伝達：
ＥＧＦＲの比表面レベルを、親ＨＮ５および耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４で決定した。簡単には、細胞を抗ＥＧＦＲ−ＦＩＴＣ（ａｂｃａｍ、＃１１４００）またはアイソタイプ・コントロール（ａｂｃａｍ、＃１８４４６）で染色するし、生細胞の比蛍光をフローサイトメトリーで定量した。ＥＧＦＲの比表面レベルは、親細胞と比較してセツキシマブ耐性ＨＮ５クローンでより低かった（図３９）。
【０１９６】
ＥＧＦ刺激に対するセツキシマブ耐性クローンの応答を試験した。ＥＧＦＲの全レベル、リン酸化ＥＧＦＲおよび下流シグナル伝達分子のレベルを、親ＨＮ５および耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４で決定した。親ＨＮ５細胞およびセツキシマブ耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４を、処理しないか、または１ｎＭ  ＥＧＦで１５分間刺激し、その後死滅させた。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで画分化し、その後、ＥＧＦＲ、リン酸化ＥＧＦＲ種であるｐＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）、ｐＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０４５）、ｐＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１１７３）、ｐＥＧＦＲ（Ｔｙｒ９９２）、ｐＥＧＦＲ（Ｔｈｒ６６９）、およびｐＥＧＦＲ（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）、ならびにシグナル伝達分子ＡＫＴ、ｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＥＲＫ１／２、ｐＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）についてウェスタンブロットした（図４０および４１）。β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。結果は、全レベルのＥＧＦＲおよびリン酸化ＥＧＦＲが、親細胞と比較してセツキシマブ耐性ＨＮ５クローンで低かったことを示した（図４０）。結果はまた、セツキシマブ耐性クローンにおける減少したレベルのｐＥＧＦＲ（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）を示し、ＥＧＦＲを制御するフィードバック機序が、セツキシマブ耐性クローンでより活性が低いことを示唆した（図４０）。ＥＧＦ刺激は、親ＨＮ５細胞と比較してセツキシマブ耐性クローンでｐＡＫＴおよびｐＥＲＫ１／２のより強い活性化を誘導した（図４１）。それと共に、これらの結果は、ＥＧＦＲはセツキシマブ耐性クローンでも活性であるが、ＥＧＦＲ発現は親ＨＮ５細胞と比較して減少することを証明する。
【０１９７】
実施例１２：ＥＧＦＲを標的とする抗体混合物は、高効率のＥＧＦＲインターナリゼーションと、その後の受容体の分解により、セツキシマブ耐性を克服する
ＥＧＦＲ上のオーバーラップしないエピトープを標的とする抗体の混合物を、セツキシマブ耐性ＨＮ５クローンＨＮ５ ＣＲ２およびＨＮ５ ＣＲ１４にて誘導されたセツキシマブ耐性を部分的に克服するその能力について試験した。親ＨＮ５、ＨＮ５ ＣＲ２、およびＨＮ５ ＣＲ１４細胞を、ＥＧＦＲ−ＬＮＡ(商標)（ＥＧＦＲ標的化を欠失する核酸、Ｅｘｉｑｏｎ）、セツキシマブまたはＥＧＦＲ−２ミックス（抗体１２７７および１５６５）で４８時間処理した。成長および増殖を、実施例２に記載のＷＳＴ−１アッセイを用いて測定し、効果の定量を、データ点を平均＋／−ＳＥＭ（ｎ＝４）で示してプロットした（図４２）。ＥＧＦＲ−ＬＮＡ、およびＥＧＦＲ−２ミックスは、両方とも、細胞生存性の同程度の減少を誘導した。これらの結果は、ＥＧＦＲ上のオーバーラップしないエピトープを標的とする抗体の混合物が、誘導されたセツキシマブ耐性を部分的に克服し、セツキシマブ耐性クローンが依然として成長および増殖に関してＥＧＦＲに依存することを証明した（図４２）。
【０１９８】
ＥＧＦＲ−ＬＮＡ、セツキシマブまたはＥＧＦＲ−２ミックスで４８時間処理した細胞におけるＥＧＦＲレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで細胞溶解物を画分化し、次いでにＥＧＦＲついてウェスタンブロットすることにより決定した。結果は、高効率のＥＧＦＲインターナリゼーションと、その後の受容体のリソソーム分解が、抗体処理した耐性細胞で誘導されたことを示し（図４３）、故に、ＥＧＦＲを標的とする抗体混合物のセツキシマブ耐性を克服する能力についての機序を提供した。
【０１９９】
実施例１３：セツキシマブ耐性ＨＮ５クローンは、ＨＥＲ３およびＩＧＦ１Ｒを介する処理を免れる
しかしながら、抗ＥＧＦＲ混合物による耐性クローンの観察される阻害レベルは、親細胞におけるのと同程度の効率的な増殖阻害を誘導せず、別の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）がセツキシマブ獲得耐性の機序に関与し得ることを示唆した。親ＮＨ５および耐性クローンＨＮ５ ＣＲ２、ＨＮ５ ＣＲ６、ＨＮ５ ＣＲ１３、およびＨＮ５ ＣＲ１４における、ＨＥＲ３活性の役割を試験するために、細胞を、２種のＥＧＦＲ抗体の混合物（抗体１２７７および１５６５）、２種のＨＥＲ３抗体の混合物（抗体５０３８および５０８２）、２種のＥＧＦＲおよび２種のＨＥＲ３抗体の混合物（抗体１２７７、１５６５、５０３８および５０８２）、またはセツキシマブで４８時間処理した。成長および増殖を、実施例２に記載のＷＳＴ−１ アッセイを用いて測定し、効果の定量を、平均＋／−ＳＥＭ（ｎ＝６）として表すデータ点でプロットした。結果は、ＥＧＦＲ抗体混合物のみにより誘導される効果と比較して、ＨＥＲ３およびＥＧＦＲの両方を標的とする抗体を含む混合物のより優れた効果を示した。これらの結果は、セツキシマブ獲得耐性における別のＲＴＫの関与の仮説を支持する（図４４）。親ＨＮ５および耐性ＨＮ５ ＣＲ２細胞の抗体混合物に対する用量応答曲線を、図４５ＡおよびＢに示す。
【０２００】
本明細書に記載のセツキシマブに対する獲得耐性におけるＨＥＲ３の関与は、インビトロでのセツキシマブに対する獲得耐性の機序としてＲＴＫファミリーの可塑性を示す。
【０２０１】
【表２３】
0006325527.tif 000026
【表２４】
0006325527.tif 000027
【表２５】
0006325527.tif 000028
【表２６】
0006325527.tif 000029
【表２７】
0006325527.tif 000030
【表２８】
0006325527.tif 000031
【表２９】
0006325527.tif 000032
【表３０】
0006325527.tif 000033
【図１】
0006325527.tif 000034
【図２】
0006325527.tif 000035
【図３】
0006325527.tif 000036
【図４】
0006325527.tif 000037
【図５】
0006325527.tif 000038
【図６】
0006325527.tif 000039
【図７】
0006325527.tif 000040
【図８】
0006325527.tif 000041
【図９】
0006325527.tif 000042
【図１０】
0006325527.tif 000043
【図１１】
0006325527.tif 000044
【図１２】
0006325527.tif 000045
【図１３】
0006325527.tif 000046
【図１４】
0006325527.tif 000047
【図１５】
0006325527.tif 000048
【図１６】
0006325527.tif 000049
【図１７】
0006325527.tif 000050
【図１８】
0006325527.tif 000051
【図１９】
0006325527.tif 000052
【図２０】
0006325527.tif 000053
【図２１】
0006325527.tif 000054
【図２２】
0006325527.tif 000055
【図２３】
0006325527.tif 000056
【図２４】
0006325527.tif 000057
【図２５】
0006325527.tif 000058
【図２６】
0006325527.tif 000059
【図２７】
0006325527.tif 000060
【図２８】
0006325527.tif 000061
【図２９】
0006325527.tif 000062
【図３０】
0006325527.tif 000063
【図３１】
0006325527.tif 000064
【図３２】
0006325527.tif 000065
【図３３】
0006325527.tif 000066
【図３４】
0006325527.tif 000067
【図３５】
0006325527.tif 000068
【図３６】
0006325527.tif 000069
【図３７】
0006325527.tif 000070
【図３８】
0006325527.tif 000071
【図３９】
0006325527.tif 000072
【図４０】
0006325527.tif 000073
【図４１】
0006325527.tif 000074
【図４２】
0006325527.tif 000075
【図４３】
0006325527.tif 000076
【図４４】
0006325527.tif 000077
【図４５Ａ】
0006325527.tif 000078
【図４５Ｂ】
0006325527.tif 000079
【配列表】
0006325527000001.app