(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む方法により生成される比較を被験体の１つ以上の組織の健常状態の指標とする方法であって、該方法は、
（ａ）被験体から提供される第一の血漿または血清サンプルの無細胞トランスクリプトームに対する１つ以上の組織特異的ＲＮＡ転写物の相対的寄与率を定量化するステップであって、該１つ以上の組織特異的ＲＮＡ転写物は、無細胞ＲＮＡであり、さらに該定量化するステップは、逆転写、ポリヌクレオチド増幅、リアルタイムＰＣＲ、シーケンシング、プローブハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイハイブリダイゼーションからなる群から選択される１つ以上のプロセスを含む、ステップ、
（ｂ）該１つ以上の組織特異的ＲＮＡ転写物それぞれの相対的寄与率を、早期に集められた該被験体の第二の血漿または血清サンプルにおける対応する基準寄与率と比較するステップであって、該比較は、該被験体の１つ以上の組織の健常状態を示す、ステップ、を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）は、コンピュータシステムによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織特異的ＲＮＡ転写物は、２つ以上の異なる組織に特異的な２つ以上のＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織は、胎盤組織でも胎児組織でもない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組織特異的ＲＮＡ転写物は、図１８から選択される遺伝子の転写物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記基準寄与率は、正の数である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記定量化するステップは、前記組織特異的ＲＮＡ転写物を逆転写するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体における疾患または状態は前記比較に基づいて診断され得ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組織は、全血、骨、上皮、視床下部、平滑筋、肺、胸腺、リンパ節、甲状腺、心臓、腎臓、脳、小脳、肝臓、および皮膚からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織特異的ＲＮＡ転写物の相対的寄与率を定量化するステップは、シーケンシングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記シーケンシングは、単一反応において異なる配列を有する複数のポリヌクレオチドをシーケンシングすることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記シーケンシングは、ホールトランスクリプトームショットガンシーケンシングを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
以下のステップを含む方法により生成される比較を被験体の脳の健常状態の指標とする方法であって、該方法は、
（ａ）被験体から提供される第一の血漿または血清サンプルの無細胞トランスクリプトームに対する無細胞ＲＮＡ転写物の相対的寄与率を定量化するステップであって、該無細胞ＲＮＡ転写物は、脳特異的転写物を含み、さらに該定量化するステップは、逆転写、ポリヌクレオチド増幅、リアルタイムＰＣＲ、シーケンシング、プローブハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイハイブリダイゼーションからなる群から選択される１つ以上のプロセスを含む、ステップ；
（ｂ）無細胞ＲＮＡ転写物の相対的寄与率を、早期に集められた該被験体の第二の血漿または血清サンプルにおける無細胞ＲＮＡ転写物の基準寄与率と比較するステップであって、該比較は、該被験体の該脳の健常状態を示す、ステップ、を含む、方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）は、コンピュータシステムによって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）は、１つ以上の組織特異的ＲＮＡの相対的寄与率を定量化するステップをさらに含み、前記１つ以上の組織特異的ＲＮＡは、脳以外の１つ以上の組織に特異的である無細胞ＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記相対的寄与率は、複数の遺伝子に対する無細胞ＲＮＡの量を含み、前記基準寄与率は、該複数の遺伝子それぞれに対する無細胞ＲＮＡの量を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体における疾患または状態は前記比較に基づいて診断され得ることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患または状態は、アルツハイマー病、ハンチントン病および筋委縮性側索硬化症からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記無細胞ＲＮＡ転写物の相対的寄与率を定量化するステップは、シーケンシングを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的サンプル中の小胞を単離するステップを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記相対的寄与率を定量化するステップは、前記生物学的サンプルに対する各組織タイプの寄与率の比率を推測するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記寄与率の比率を推測するステップは、以下の式：
【化１】
0006320302.tif 000005
を使用し、
式中、Ｙは遺伝子ｉについて前記生物学的サンプルで観察された転写物量であり、ｘは公知の組織ｊ中の遺伝子ｉについて公知の転写物量であり、εは正規分布の誤差であり、πｉが各組織タイプの寄与率の比率であり、全ての比率の総和が条件：
【化２】
0006320302.tif 000006
および
【化３】
0006320302.tif 000007
で表される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
機構的に疾患に関与するタンパク質をコードしない無細胞ＲＮＡ転写物を定量するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記組織が脳である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織が視床下部である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織が肝臓である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織が心臓である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織が骨髄である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記相対的寄与率が前記基準寄与率と統計学的に差がある場合、前記組織が非健常として特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記第一の血漿または血清サンプルが血漿であり、前記第二の血漿または血清サンプルが血漿である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１２年１月２７日に出願された米国仮特許出願番号６１／５９１，６４２号の利益および優先権を主張し、この全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
本発明は、遺伝子材料を含有する生物学的サンプルからの核酸分析の分野に関する。特に、本発明の方法は、生物学的サンプル中の組織特異的核酸を定量することに関する。
【背景技術】
【０００３】
個体の身体内の器官の健常性を測定することは困難な場合が多い。
医師は、がんのスクリーニングのために診断バイオマーカーを同定し、腫瘍の開始および進行をモニターするため、高価な画像技法を使用する、または侵襲的バイオプシーを行うことを強いられることが多い。バイオプシーの侵襲的な特性により、バイオプシーを患者の広範なスクリーニングに不適切なものになっている。さらに、多くの診断バイオマーカーはがん細胞系において、または後期の疾患および転移のある患者から得られたバイオプシー検体から同定されるに過ぎない。
【０００４】
がん患者の血漿および血清中に検出可能な循環核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の存在は、非侵襲的診断ツールとなる利点が明らかであり、診断目的のためのマーカーとして機能するようにその使用の可能性について調査されている。血漿内のマーカーは、上記患者のがん原性組織に見つかったものと同一であることが示されている。循環ＲＮＡはＲＮＡマーカーが悪性腫瘍にかなり関連があるため、がんの初期検出スクリーニングにおいての使用が特に注目されている。
【０００５】
がん検出に加え、母体血漿中に存在する胎児特異的無細胞ＲＮＡの発見により、出生前分子診断の新たな展望が開かれている（例えば、Ｐｏｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６（１１）：１８３２−１８３４（２０００）を参照のこと）。特に、血漿ＲＮＡの分析は、胎児の非侵襲的遺伝子発現のプロファイリングの見込みがある。しかし、一握りの妊娠特異的無細胞ＲＮＡの転写物のみがこれまで特徴づけられているに過ぎない。このようなＲＮＡの包括的プロファイリングは行われていない。
非母体血液および母体血液中の無細胞ＲＮＡを分析する問題として、存在する無細胞ＲＮＡの生物学的原因を推定するのに適したデータが不足している。例えば、血中に存在する無細胞ＲＮＡの組織起源を決定する信頼できる方法が不足している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｏｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６（１１）：１８３２−１８３４（２０００）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、器官または組織の健常性を評価するための、無細胞ＲＮＡの起源をプロファイリングする方法を提供する。器官／組織が免疫系または病原体により働かなくなり始めるまたは免疫系または病原体により攻撃されるにつれ、これらの器官／組織特異的転写物が大量に血中に放出されると、正常な無細胞トランスクリプトームの異常（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）が生じる。その結果、炎症プロセスがこれらの有害な刺激に対する身体の複雑な生物学的応答の一部として生じ得る。本発明は、特定の態様によれば、健常な個体の組織特異的ＲＮＡ転写物を利用して、正常な無細胞トランスクリプトームにおける、異なる組
織の相対的に最適な寄与率（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を推測するものであり、上記サンプルの組織特異的ＲＮＡ転写物それぞれがその組織のアポトーシスの割合（ｔｈｅ  ａｐｏｔｏｐｉｃ  ｒａｔｅ）の指標となる。上記正常な無細胞トランスクリプトームは、他の個体の組織健常性を評価するための初期値または基準量（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｌｅｖｅｌ）として機能する。本発明は、血漿中に循環する組織特異的転写物のサンプル量を評価し、かつ該無細胞トランスクリプトームに寄与する組織の健常性を評価するために、該サンプルの無細胞トランスクリプトームと上記正常な無細胞トランスクリプトームとの比較測定を包含する。
【０００８】
正常な基準量に加え、本発明の方法は他の患者集団に特異的な無細胞トランスクリプトームについての基準量も利用する。本発明の方法を使用して、母体被験体、胎児被験体、および／または状態または疾患を有する被験体の無細胞トランスクリプトームに対する組織特異的転写物の相対的寄与率を決定することができる。
【０００９】
組織特異的転写物に基づいて組織の健常性を分析することにより、本発明の方法は利点として疾患関連タンパク質バイオマーカーに頼ることなく組織の健常性を評価することを可能にする。特定の態様において、本発明の方法は、生物学的サンプル中のＲＮＡのサンプル量（ｓａｍｐｌｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ＲＮＡ）と組織に特異的なＲＮＡの基準量とを比較すること、該サンプル量と該基準量との間に差が存在するかどうかを決定すること、および差を検出した場合、組織を異常として特徴づけることにより組織の健常性を評価する。例えば、上記正常な無細胞トランスクリプトームにおいて、特定の組織についての患者のＲＮＡ発現量がその特定の組織についての該ＲＮＡ発現量と異なる場合、これは患者の組織が適正に機能していないことを示す。
【００１０】
特定の態様において、本発明の方法は血中に特定量のＲＮＡが存在する場合、組織を異常として特徴づけることにより該組織の健常性を評価するステップを包含する。本方法はさらに、血液サンプル中のＲＮＡの量を検出するステップ、ＲＮＡのサンプル量と組織に特異的なＲＮＡの基準量とを比較するステップ、該サンプル量と該基準量との間に差が存在するかどうかを決定するステップ、および該サンプル量と該基準量が同じである場合、該組織を異常として特徴づけるステップを包含し得る。
【００１１】
本発明はまた、母体血漿中の胎児特異的無細胞ＲＮＡを包括的にプロファイリングし、異なる胎児組織タイプに相対した割合を有する胎児起源の無細胞トランスクリプトームの逆畳み込みを行うための方法を提供する。本発明の方法は、次世代シーケンシング技術および／またはマイクロアレイを使用して、種々の妊娠段階の母体血漿中に存在する無細胞ＲＮＡ転写物を特徴づけるステップを包含する。これらの転写物の定量化により、個々のトリメスターにわたってこれらの遺伝子の変化を推測することが可能になるため、転写物の時間的変化を定量化する方法が提供される。
【００１２】
本発明の方法は、妊娠中または妊娠後の合併症の可能性の診断および同定を可能にする。方法はまた、妊娠関連転写物の同定を可能にし、それは次には、母体および胎児の発達プログラムを解明する。本発明の方法は一般に、早産診断（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）ならびに胎児の発達経路に関連する転写物プロファイルの解明に有用である。したがって、本発明の方法は、胎児の発達を特徴づけるのに有用であり、妊娠に関連する疾患状態または合併症のみの特徴づけに限定されない。本方法の例示的な実施形態を以下に記載の発明を実施するための形態、特許請求の範囲および図面において説明する。
一実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
組織の健常性を評価する方法であって、
生物学的サンプル中のＲＮＡのサンプル量を検出するステップ、
ＲＮＡの該サンプル量と該組織に特異的なＲＮＡの基準量とを比較するステップ、
該サンプル量と該基準量との間に差が存在するかどうかを決定するステップ、および
差が検出された場合、該組織を異常として特徴づけるステップ
を含む方法。
（項目２）
疾患の進行について前記組織をモニタリングするステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記基準量が、時間点にて前記組織の状態に対応する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記基準量が健常状態の前記組織に特異的なＲＮＡの量である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記生物学的サンプルが、血液、血液画分、唾液、痰、尿、精液、経膣液、脳脊髄液、糞便、細胞または組織バイオプシーである、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記生物学的サンプルが血液である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ＲＮＡが無細胞ＲＮＡである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記検出するステップがシーケンシング技法、マイクロアレイ技法または両方により行われる、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記シーケンシング技法がホールトランスクリプトームショットガンシーケンシングである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記基準量がコンピュータにより作製されたデータベースにより決定される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記組織が、全血、骨髄、視床下部、平滑筋、肺、胸腺、リンパ節、および甲状腺からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
組織の健常性を評価する方法であって、ＲＮＡの特定量が血液に存在する場合、該組織を異常として特徴づけるステップを含む、方法。
（項目１３）
前記組織が、全血、骨髄、視床下部、平滑筋、肺、胸腺、リンパ節、および甲状腺からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
血液サンプル中のＲＮＡの量を検出するステップ、
ＲＮＡの該サンプル量と組織に特異的なＲＮＡの基準量とを比較するステップ、
該サンプル量と該基準量との間に差が存在するかどうかを決定するステップ、および
該サンプル量および該基準量が同じである場合、該組織を異常と特徴づけるステップ
をさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記基準量が疾患または状態の指標である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＲＮＡが無細胞ＲＮＡである、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記検出するステップがシーケンシング技法、マイクロアレイ技法または両方により行われる、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記シーケンシング技法がホールトランスクリプトームショットガンシーケンシングである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記基準量がコンピュータにより作製されたデータベースにより決定される、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
異なるゲノムソース由来の遺伝子材料の混合物を含む生物学的サンプルから差次的転写物量を検出するための方法であって、
ａ）複数の生物学的サンプルであって、それぞれが異なるゲノムソース由来の遺伝子材料の混合物を含有するサンプルを異なる時間点にわたり得るステップ、
ｂ）該複数の生物学的サンプルから複数のＲＮＡ転写物を増幅させて、複数の増幅させたサンプルであって、それぞれが異なるゲノムソース由来の増幅したＲＮＡ転写物の混合物を含有するサンプルを得るステップ、
ｃ）該増幅したサンプルのそれぞれから該ＲＮＡ転写物の１つもしくは複数の量を検出するステップ、および
ｄ）該増幅したサンプルのそれぞれの間で該ＲＮＡ転写物の１つもしくは複数の量を比較して、該異なる時間点にわたり該検出されたＲＮＡ転写物の１つもしくは複数についての差次的プロファイルを決定する分析を行う
ステップを含む、方法。
（項目２１）
前記生物学的サンプルが血液、血液画分、唾液、痰、尿、精液、経膣液、脳脊髄液、糞便、細胞または組織バイオプシーである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記生物学的サンプルが血液である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記血液が妊娠女性由来の末梢血またはその画分である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記異なるゲノムソースが妊娠女性および胎児由来である、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記検出するステップがシーケンシング技法、マイクロアレイ技法または両方により行われる、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記シーケンシング技法がホールトランスクリプトームショットガンシーケンシングである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記１つもしくは複数のＲＮＡ転写物の前記差次的プロファイルが疾患または状態の指標である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記疾患または状態が早産である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記疾患または状態が病的妊娠である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記差次的プロファイルが、ＰＶＡＬＢ、ＣＬＣＮ３、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＬＴＶ１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ、ＴＲＥＭＬ１、ＮＰＴＮ、ＬＳＭ２、ＳＣＧＢ１Ｃ１、ＮＯＰ１０、ＭＦＳＤ１、ＭＡＬＡＴ１、ＧＤＩ１、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＣＤ２２６、ＩＴＭ２Ｂ、ＭＬＬＴ６、ＡＮＯ６、およびＩＴＧＢ３からなる群から選択される１つもし
くは複数の遺伝子を含む、項目２７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、上位に検出された女性の妊娠に関連した差次的発現した転写物の一覧を示す。
【００１４】
【図２】図２は、実施例１で得られた無細胞ＲＮＡ転写物量についての２つのおもな主成分のプロットを示す。
【００１５】
【図３Ａ】図３Ａは、マイクロアレイを使用する、早産および正常妊娠（ｐｒｅｔｅｒｍ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）において様々な時間的な量を示す上位１００の無細胞転写物量のヒートマップを示す。
【図３Ａ−１】同上。
【図３Ａ−２】同上。
【００１６】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用する、早産および正常妊娠において様々な時間的な量を示す上位１００の無細胞転写物量のヒートマップを示す。
【図３Ｂ−１】同上。
【図３Ｂ−２】同上。
【００１７】
【図４】図４は、早産と正常妊娠との間で差次的発現した上位２０の転写物のランキングを示す。
【００１８】
【図５】図５は、図４の上位２０の共通のＲＮＡ転写物の遺伝子オントロジー分析の結果を示し、これは、これらの転写物が形質膜にまたは血小板の膜上に結合する（組み込まれるか、または弱く結合する）タンパク質を富化することを示している。
【００１９】
【図６】図６は、個々のトリメスターについてのＰＶＡＬＢに対する遺伝子発現プロファイルにより、早産（青で強調）が、正常妊娠に比較したときに認められる、より高い量の無細胞ＲＮＡ転写物を有することを示すことが示される。
【００２０】
【図７】図７は、サンプルの無細胞トランスクリプトームへの相対的組織寄与率を決定する例示的プロセスのステップを概説する。
【図７Ａ】同上。
【図７Ｂ】同上。
【００２１】
【図８】図８は、実施例２で作製された選択された胎児組織特異的転写物のパネルを示す。
【図８Ａ】同上。
【図８Ｂ】同上。
【００２２】
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、実際の無細胞ＲＮＡならびに同じ無細胞ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリを使用する、母体の時間点（第一のトリメスター、第二のトリメスター、第三のトリメスターおよび分娩後）にわたる変化を示す胎児の組織特異的転写物の並列定量化の生データを示す。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、実際の無細胞ＲＮＡならびに同じ無細胞ＲＮ@0010ＡのｃＤＮＡライブラリを使用する、母体の時間点（第一のトリメスター、第二のトリメスター、第三のトリメスターおよび分娩後）にわたる変化を示す胎児の組織特異的転写物の並列定量化の生データを示す。
【００２３】
【図１０】図１０は、母体の時間点（第一のトリメスター、第二のトリメスター、第三のトリメスターおよび分娩後）にわたる胎盤遺伝子の相対的発現を示す。
【図１０Ａ】同上。
【図１０Ｂ】同上。
【００２４】
【図１１】図１１は、母体の時間点（第一のトリメスター、第二のトリメスター、第三のトリメスターおよび分娩後）にわたる胎児脳遺伝子の相対的発現を示す。
【図１１Ａ】同上。
【図１１Ｂ】同上。
【００２５】
【図１２】図１２は、母体の時間点（第一のトリメスター、第二のトリメスター、第三のトリメスターおよび分娩後）にわたる胎児肝臓遺伝子の相対的発現を示す。
【図１２Ａ】同上。
【図１２Ｂ】同上。
【００２６】
【図１３】図１３は、血漿成人無細胞トランスクリプトームへの異なる器官の寄与率の相対的構成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示す。
【００２７】
【図１４】図１４は、ＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用する、血漿成人無細胞トランスクリプトームへの器官の寄与率の分解（ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示す。
【００２８】
【図１５−１】図１５は、ｑＰＣＲを用いて検証された実施例３の９４個の組織特異的遺伝子のパネルを示す。
【図１５−２】同上。
【図１５−３】同上。
【図１５−４】同上。
【００２９】
【図１６】図１６は、無細胞ＲＮＡにおいて検出可能な図１５の組織特異的転写物のヒートマップを示す。
【００３０】
【図１７】図１７は、特定の実施形態における本方法の流れ図を示す。
【００３１】
【図１８−１】図１８は、Ｈｕｍａｎ  Ｕ１３３Ａ／ＧＮＦ１Ｈ  Ｇｅｎｅ  ＡｔｌａｓおよびＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ａｔｌａｓデータベースからの生データを使用して得られた実施例３の組織特異的遺伝子の一覧を示す。
【図１８−２】同上。
【図１８−３】同上。
【図１８−４】同上。
【図１８−５】同上。
【図１８−６】同上。
【図１８−７】同上。
【図１８−８】同上。
【図１８−９】同上。
【図１８−１０】同上。
【図１８−１１】同上。
【図１８−１２】同上。
【図１８−１３】同上。
【図１８−１４】同上。
【図１８−１５】同上。
【図１８−１６】同上。
【図１８−１７】同上。
【図１８−１８】同上。
【図１８−１９】同上。
【図１８−２０】同上。
【図１８−２１】同上。
【図１８−２２】同上。
【図１８−２３】同上。
【図１８−２４】同上。
【図１８−２５】同上。
【図１８−２６】同上。
【図１８−２７】同上。
【図１８−２８】同上。
【図１８−２９】同上。
【図１８−３０】同上。
【図１８−３１】同上。
【図１８−３２】同上。
【図１８−３３】同上。
【図１８−３４】同上。
【図１８−３５】同上。
【図１８−３６】同上。
【図１８−３７】同上。
【図１８−３８】同上。
【図１８−３９】同上。
【図１８−４０】同上。
【図１８−４１】同上。
【図１８−４２】同上。
【図１８−４３】同上。
【図１８−４４】同上。
【図１８−４５】同上。
【図１８−４６】同上。
【図１８−４７】同上。
【図１８−４８】同上。
【図１８−４９】同上。
【図１８−５０】同上。
【図１８−５１】同上。
【図１８−５２】同上。
【図１８−５３】同上。
【図１８−５４】同上。
【図１８−５５】同上。
【図１８−５６】同上。
【図１８−５７】同上。
【図１８−５８】同上。
【図１８−５９】同上。
【図１８−６０】同上。
【図１８−６１】同上。
【図１８−６２】同上。
【図１８−６３】同上。
【図１８−６４】同上。
【図１８−６５】同上。
【図１８−６６】同上。
【図１８−６７】同上。
【図１８−６８】同上。
【図１８−６９】同上。
【図１８−７０】同上。
【図１８−７１】同上。
【図１８−７２】同上。
【図１８−７３】同上。
【図１８−７４】同上。
【図１８−７５】同上。
【図１８−７６】同上。
【図１８−７７】同上。
【図１８−７８】同上。
【図１８−７９】同上。
【図１８−８０】同上。
【図１８−８１】同上。
【図１８−８２】同上。
【図１８−８３】同上。
【図１８−８４】同上。
【図１８−８５】同上。
【図１８−８６】同上。
【図１８−８７】同上。
【図１８−８８】同上。
【図１８−８９】同上。
【図１８−９０】同上。
【図１８−９１】同上。
【図１８−９２】同上。
【図１８−９３】同上。
【図１８−９４】同上。
【図１８−９５】同上。
【図１８−９６】同上。
【図１８−９７】同上。
【図１８−９８】同上。
【図１８−９９】同上。
【図１８−１００】同上。
【図１８−１０１】同上。
【図１８−１０２】同上。
【図１８−１０３】同上。
【図１８−１０４】同上。
【図１８−１０５】同上。
【図１８−１０６】同上。
【図１８−１０７】同上。
【図１８−１０８】同上。
【図１８−１０９】同上。
【図１８−１１０】同上。
【図１８−１１１】同上。
【図１８−１１２】同上。
【図１８−１１３】同上。
【図１８−１１４】同上。
【図１８−１１５】同上。
【図１８−１１６】同上。
【図１８−１１７】同上。
【図１８−１１８】同上。
【図１８−１１９】同上。
【図１８−１２０】同上。
【図１８−１２１】同上。
【図１８−１２２】同上。
【図１８−１２３】同上。
【図１８−１２４】同上。
【図１８−１２５】同上。
【図１８−１２６】同上。
【図１８−１２７】同上。
【図１８−１２８】同上。
【図１８−１２９】同上。
【図１８−１３０】同上。
【図１８−１３１】同上。
【図１８−１３２】同上。
【図１８−１３３】同上。
【図１８−１３４】同上。
【図１８−１３５】同上。
【図１８−１３６】同上。
【図１８−１３７】同上。
【図１８−１３８】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書に記載の方法および材料は、生物学的サンプル中に存在するＲＮＡ配列を検出する、定量化する、そして特徴づけるための次世代シーケンシングおよびマイクロアレイ技法の組み合わせを適用する。特定の実施形態において、上記生物学的サンプルは、異なるゲノムソース、すなわち、妊娠女性および胎児由来の遺伝子材料の混合物を含有する。
【００３３】
上記サンプル中の核酸が少量の反応体積で名目上の単一標的分子に単離される他のデジタル分析法と異なり、本発明の方法は、該サンプル中の遺伝子材料を希釈することも分散させることもせずに行われる。本発明の方法は、複数のトランスクリプトームの同時スクリーニングを可能とし、一塩基量での各転写物の有益な配列情報を提供するため、限られた量の生物学的サンプルから広範囲にわたる被験体の疾患または状態の非侵襲的なハイスループットスクリーニングの機能を提供する。
【００３４】
特定の一実施形態において、本発明の方法は、早産または病的妊娠の指標となり得る種々の妊娠段階を通して差次的発現する転写物を同定するため、母体血液中で混ざり合う胎児および母体ＲＮＡの分析を包含する。転写物の分別検出は、種々の妊娠段階を通して母体血液から血漿ＲＮＡを単離することおよび増幅させること、ならびにマイクロアレイおよびＲＮＡ−Ｓｅｑにより単離された転写物を定量化することおよび特徴づけることにより一部達成される。
【００３５】
本明細書に記載のＲＮＡを含有する生物学的サンプル（非母体、母体、母体−胎児混合を含む）の分析に特異的な方法および材料は、本発明の方法をどのように適用することができるかのほんの一例であり、本発明を限定することを意図しない。本発明の方法はまた、血液、糞便、痰、尿、経膣液、乳頭吸引液、脳脊髄液などにおける無細胞ＲＮＡを使用する、がん診断、進行および／または予後に関連する標的遺伝子の差次的発現のスクリーニングに有用である。
【００３６】
特定の実施形態において、本発明の方法は一般に、以下のステップを含む：異なるゲノムソース由来の遺伝子材料を含有する生物学的サンプルを得るステップ、異なるゲノムソース由来の遺伝子材料の混合物（ｍｉｚｔｕｒｅ）を含有する生物学的サンプルを含有する該生物学的サンプル（ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）由来の総ＲＮＡを単離するステップ、総ＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡを調製し、増幅されたｃＤＮＡをシーケンシングして、デジタルカウンティングおよび分析を行うステップ、およびその増幅されたｃＤＮＡをプロファイリングするステップ。
【００３７】
本発明の方法はまた、上記無細胞トランスクリプトームに寄与する組織の健常性を評価するステップを包含する。特定の実施形態において、本発明は生物学的サンプルの無細胞トランスクリプトームを評価して、個々の組織の、該無細胞トランスクリプトームへの組織特異的寄与率を決定するステップを包含する。特定の態様において、本発明は、生物学的サンプル中のＲＮＡのサンプル量を検出すること、ＲＮＡの該サンプル量と上記組織に特異的なＲＮＡの基準量とを比較すること、ならびに差が検出された場合、該組織を異常として特徴づけることにより組織の健常性を評価する。本方法は非母体被験体、妊娠被験体および生存胎児の組織の健常性を特徴づけるのに適用可能である。図１７は特定の実施
形態における本方法の流れ図を示す。
【００３８】
特定の態様において、本発明の方法は組織についての基準量を決定するために、基準無細胞ＲＮＡトランスクリプトームの逆畳み込みを使用する。好ましくは、上記基準無細胞ＲＮＡトランスクリプトームは正常な健常トランスクリプトームであり、組織の基準量は健常な正常個体の血中に存在する組織に特異的なＲＮＡの相対量である。本発明の方法は、異なる組織タイプ由来のアポトーシス細胞が被験体の血漿にその細胞のＲＮＡを放出すると仮定する。これらの組織のそれぞれが、組織タイプに固有の特定数の遺伝子を発現し、被験体の無細胞ＲＮＡトランスクリプトームは異なる組織タイプの総和となる。各組織が１つもしくは複数の数の遺伝子を発現し得る。特定の実施形態において、上記基準量は特定の組織が発現した遺伝子の１つと関連する量である。他の実施形態において、上記基準量は特定の組織が発現した複数の遺伝子と関連する量である。なお、循環ＲＮＡに存在する組織特異的転写物についての基準量または閾値量は、ゼロまたは正の数となり得るものとする。
【００３９】
健常な正常被験体において、異なる組織タイプ由来の循環ＲＮＡの相対的寄与率は、相対的に安定であり、正常な被験体の無細胞ＲＮＡトランスクリプトームの組織特異的ＲＮＡ転写物はそれぞれ、その組織の基準量として機能し得る。本発明の方法を適用し、サンプルが組織に特異的なＲＮＡの基準量と異なるＲＮＡの量を含む場合、該組織は非健常または異常として特徴づけられる。ＲＮＡの実際量が上記基準量と統計学的に差がある場合、上記サンプルの組織を非健常として特徴づけ得る。統計学的有意性を当技術分野において公知の任意の方法により決定することができる。これらの測定値を、診断ツールとして、および医薬品に対する応答を測定するツールとしてまたは臨床試験において健常性をモニターするツールとして、器官の健常性をスクリーニングするために使用することができる。
【００４０】
ＲＮＡのサンプル量とＲＮＡの基準量との間に差を検出した場合、このような差は、関連する組織が適正に機能していないことを示唆する。循環ＲＮＡの変化は、臓器不全の前触れであり得、または上記組織が免疫系または病原体により攻撃されていることを示し得る。組織が異常として同定される場合、特定の実施形態において次のステップ（複数可）は、該組織のより広範囲の試験（例えば、該組織の侵襲的バイオプシー）、該組織に特異的な処置の処方コース、および／または該組織の定期的モニタリングを含み得る。
【００４１】
本発明の方法を使用して、器官の健常性を非侵襲的に推察することができる。この非侵襲的試験を使用して、虫垂炎、初期の糖尿病および、例えば、腎症、神経障害、網膜症などの糖尿病により誘発された病的状態のスクリーニングすることができる。さらに、本発明を使用して、臓器移植、具体的に骨髄移植レシピエントにおいて新たな免疫系が皮膚、消化管または肝臓を攻撃する移植片対宿主病の存在を決定することができる。本発明を使用して、心臓、肺および腎臓などの実質臓器移植レシピエントの健常性をモニタリングすることもできる。本発明の方法は、妊娠および胎児発達の未熟、妊娠高血圧腎症および異常の可能性を評価することができる。さらに、本発明の方法を使用して、細胞特異的死を伴う（例えば、ニューロンの細胞特異的死または脱髄による細胞特異的死）、またはプラークの生成またはタンパク質凝集の生成を伴う神経学的障害（例えば、多発性硬化症およびアルツハイマー病）を同定およびモニタリングすることができる。
【００４２】
組織特異的転写物の基準量を決定するための無細胞トランスクリプトームは、１例もしくは複数例の正常被験体、母体被験体、特定の状態および疾患を有する被験体または胎児被験体の無細胞トランスクリプトームであってよい。特定の状態の場合、組織の基準量は、特定の疾患または状態を有する１例もしくは複数例の被験体の血中に存在する、該組織に特異的なＲＮＡの量である。このような態様において、本方法は血中のＲＮＡの量を検
出するステップ、ＲＮＡのサンプル量と組織に特異的なＲＮＡの基準量とを比較するステップ、該サンプル量と該基準量との間に差が存在するかどうか決定するステップ、および該サンプル量と基準量とが同じである場合、異常として特徴づけるステップを含む。
【００４３】
無細胞トランスクリプトームの逆畳み込みを使用して、各組織タイプの、該無細胞ＲＮＡトランスクリプトームへの相対的寄与率を決定する。以下のステップを使用して、サンプル中の特定の組織の相対的ＲＮＡ寄与率を決定する。最初に、組織特異的転写物のパネルを同定する。次に、サンプル由来の血漿中の総ＲＮＡを当技術分野において公知の方法を使用して決定する。３つ目に、上記総ＲＮＡを組織特異的転写物の上記パネルに対して評価し、該総ＲＮＡがこれらの異なる組織特異的転写物の総和（ｓｕｍｍａｔｉｏｎ  ｔｈｅｓｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）であるとみなされる。二次計画法を制約付き最適化法として使用し、異なる器官／組織の、上記サンプルの無細胞トランスクリプトームへの相対的に最適な寄与率を推測することができる。
【００４４】
遺伝情報の１つもしくは複数のデータベースを使用して、組織特異的転写物のパネルを同定することができる。それに応じて、本発明の態様はデータベースの使用および開発のためのシステムおよび方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、組織タイプにわたり作製された既存のデータを含有するデータベースを利用して、組織特異的遺伝子を同定する。組織特異的遺伝子の同定に利用されるデータベースは、Ｈｕｍａｎ１３３Ａ／ＧＮＦ１Ｈ  Ｇｅｎｅ  ＡｔｌａｓおよびＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ａｔｌａｓを含むが、任意の他のデータベースまたは文献を使用することができる。１つもしくは複数のデータベースから組織特異的転写物を同定するために、特定の実施形態は、そのデータベースに対してテンプレートマッチングアルゴリズムを使用する。データをフィルタリングするために使用されるテンプレートマッチングアルゴリズムは当技術分野において公知であり、例えば、Ｐａｖｌｉｄｉｓ  Ｐ，Ｎｏｂｌｅ  ＷＳ（２００１）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒａｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ２：研究００４２．１−００４２．１５を参照のこと。
【００４５】
特定の実施形態において、二次計画法を制約付き最適化法として使用し、異なる器官／組織の、サンプル中の無細胞トランスクリプトームへの相対的に最適な寄与率を推測する。二次計画法は、当技術分野において公知であり、Ｇｏｌｄｆａｒｂ  ａｎｄ  Ａ．Ｉｄｎａｎｉ（１９８２）．Ｄｕａｌ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍａｌ−Ｄｕａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｏｌｖｉｎｇ  Ｓｔｒｉｃｔｌｙ  Ｃｏｎｖｅｘ  Ｑｕａｄｒａｔｉｃ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｉｎ  Ｊ．Ｐ．Ｈｅｎｎａｒｔ（ｅｄ．），Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐａｇｅｓ２２６〜２３９，および、Ｄ．Ｇｏｌｄｆａｒｂ  ａｎｄ  Ａ．Ｉｄｎａｎｉ（１９８３）．Ａ  ｎｕｍｅｒｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ｄｕａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｏｌｖｉｎｇ
ｓｔｒｉｃｔｌｙ  ｃｏｎｖｅｘ  ｑｕａｄｒａｔｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，２７，１〜３３に詳細に記載されている。
【００４６】
図７は、サンプルの無細胞トランスクリプトームへの相対的組織寄与率を決定するための例示的プロセスのステップを概説する。１つもしくは複数の組織特異的データベースにより提供された情報を使用して、組織特異的遺伝子のパネルを、テンプレートマッチング関数を用いて作製する。品質管理機能を適用して、その結果をフィルタリングすることができる。次いで、血液サンプルを分析して、各組織特異的転写物の、該サンプルの総ＲＮＡへの相対的寄与率を決定する。無細胞ＲＮＡを上記サンプルから抽出し、その無細胞ＲＮＡ抽出物を１つもしくは複数の定量化技法を使用して処理する（例えば、標準的なマイクロアレイおよびＲＮＡ配列プロトコール）。次いで、上記サンプルに対して得られた遺
伝子発現値を正規化する。これは、全ての遺伝子発現値をハウスキーピング遺伝子に対して再スケーリングすることを伴う。次に、上記サンプルの総ＲＮＡを、該サンプルの無細胞トランスクリプトームへの組織特異的相対的寄与率を決定するために二次計画法を使用して組織特異的遺伝子のパネルに対して評価する。以下の制約を使用して、上記二次計画分析中の相対的寄与率の推定値を得る：ａ）異なる組織のＲＮＡ寄与率はゼロ以上であり、ｂ）上記無細胞トランスクリプトームへの全ての寄与率の合計は１に等しい。
【００４７】
各組織についての相対的寄与率を決定するための本発明の方法を使用して、該組織の基準量を決定することができる。すなわち、被験体の特定の集団（例えば、母体、正常およびがん性）に、図７で解説した逆畳み込みプロセスを行い、その患者集団の組織特異的遺伝子発現の基準量を得ることができる。相対的組織寄与率を個別に考慮するときに、これらの組織特異的転写物のそれぞれの定量化を、その個々の集団のその個々の組織の基準アポトーシスの割合についての一尺度として使用することができる。例えば、１例もしくは複数例の健常な正常個体由来の血液を分析して、健常な正常個体についての、無細胞ＲＮＡトランスクリプトームへの組織の相対的ＲＮＡ寄与率を決定することができる。正常なＲＮＡトランスクリプトームを作製する組織のそれぞれの相対的ＲＮＡ寄与率が、その組織の基準量である。
【００４８】
特定の実施形態により、未知の血液サンプルに図７で概説したプロセスを行い、そのサンプルの無細胞ＲＮＡトランスクリプトームへの相対的組織寄与率を決定することができる。次いで、上記サンプルの相対的組織寄与率を、１つもしくは複数の基準量の、基準の無細胞ＲＮＡトランスクリプトームへの相対的寄与率と比較する。特定の組織が、基準無細胞ＲＮＡトランスクリプトームにおける該特定の組織の寄与率より大きいまたは小さい上記サンプルの無細胞ＲＮＡトランスクリプトームへの寄与率を示す場合、この時、差次的な寄与率を示す組織をそれに応じて特徴づけることが可能である。上記基準の無細胞トランスクリプトームが健常集団を表す場合、サンプルの無細胞トランスクリプトームにおける差次的ＲＮＡ寄与率を示す組織を非健常として分類することができる。
【００４９】
上記生物学的サンプルは、血液、唾液、痰、尿、精液、経膣液、脳脊髄液、汗、母乳、乳汁（例えば、乳頭吸引液）、糞便、細胞または組織バイオプシーであってよい。特定の実施形態において、同じ生物学的サンプルにおけるサンプルは経時的に該生物学的サンプル中の差次的転写物量を分析するために複数の異なる時間点にて得られる。例えば、母体血漿を各トリメスターにおいて分析することができる。いくつかの実施形態において、上記生物学的サンプルは採取された血液および循環核酸、例えば、無細胞ＲＮＡである。異なるゲノムソース由来であり得る無細胞ＲＮＡは、細胞内よりむしろ、血液または血漿に見出される。
【００５０】
特定の実施形態において、上記採取された血液は母体血液である。試験するのに十分な量の核酸を得るために、およそ１０〜５０ｍＬの血液が採取されることが好ましい。しかし、統計的有意性をあまり求められない遺伝学的スクリーニング、または上記ＲＮＡサンプルが胎児ＲＮＡについて富化される遺伝学的スクリーニングのために、血液の採取は少なくてよい。
【００５１】
本発明の方法は、生物学的サンプルから総ＲＮＡを単離するステップを包含する。総ＲＮＡを、当技術分野において公知の任意の方法を使用して上記生物学的サンプルから単離することができる。特定の実施形態において、総ＲＮＡを血漿から抽出する。血漿ＲＮＡ抽出は、Ｅｎｄｅｒｓら、“Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｐｌａｓｍａ  Ｉｓ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４９：７２７−７３１
，２００３に記載されている。そこに記載されるように、遠心分離ステップの後に回収された血漿を、Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびクロロホルムと混合する。その混合物を遠心分離し、その水性層を新しいチューブに移す。エタノールをこの水性層に添加する。次いで、その混合物をＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に入れ、製造者の推奨に従い処理する。
【００５２】
上記生物学的サンプルが母体血液である実施形態において、該母体血液を必要に応じて処理して、総ＲＮＡ中の胎児ＲＮＡ濃度を富化させることができる。例えば、抽出後、上記ＲＮＡをゲル電気泳動により分離することができ、胎児ＲＮＡに対応する大きさ（例えば、３００ｂｐ未満）の循環ＲＮＡを含有するゲル画分を注意深く切り取る。上記ＲＮＡをこのゲルスライスから抽出し、当技術分野において公知である方法を使用して溶離する。
【００５３】
あるいは、胎児特異的ＲＮＡを遠心分離および種々の酵素阻害剤を含む公知の方法により濃縮することができる。上記ＲＮＡを、選択膜（例えば、シリカ）に結合させ、夾雑物からそれを分離する。上記ＲＮＡは、好ましくは、３００ｂｐ未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ
ｌｅｓｓ）の、血漿中に循環する断片について富化される。このサイズ選択はＲＮＡサイズ分離媒体、例えば、電気泳動ゲルまたはクロマトグラフィ材料において行われる。
【００５４】
フローサイトメトリー技法を使用して、母体血液中の胎児細胞を富化することもできる（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ７６：１４５３−１４５５（１９７９）；Ｂｉａｎｃｈｉら、ＰＮＡＳ８７：３２７９−３２８３（１９９０）；Ｂｒｕｃｈら、Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ１１：７８７−７９８（１９９１））。米国特許第５，４３２，０５４号もポリエチレン製の上部が広く、底部が毛管状で狭いチューブを使用して、胎児有核赤血球を分離する技法について記載している。可変速度プログラムを使用した遠心分離により、分子の密度に基づいて毛細管に赤血球の積層が得られる。胎児赤血球を含む低密度の赤血球を含有する密度画分を回収後、差次的に溶血させ、母体赤血球を優先的に破壊する。高張性媒体の密度勾配を使用して、赤血球を分離し、次にリンパ球および破裂した母体細胞から胎児赤血球を富化させる。高張性溶液の使用により上記赤血球が収縮し、その密度が増加し、より密度の高いリンパ球からの精製を容易にする。上記胎児細胞を単離した後、胎児ＲＮＡを当技術分野において標準的な技法を使用して精製することができる。
【００５５】
さらに、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノエタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度のマグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ビモクロモル、スクロース、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラールフェニルアセタート（ｉｓｏｍｅｒ  Ａ  ｈｏｐａｎｅ  ｔｅｔｒａｌ  ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）、異性体Ｂホパンテトラールフェニルアセタート（ｉｓｏｍｅｒ  Ｂ  ｈｏｐａｎｅ  ｔｅｔｒａｌ  ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、コレステロールヘミスクシネート、ソルビトール、カルシウム、コエンザイムＱ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ペルフトラン（ｐｅｒｆｔｏｒａｎ）、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン（ｐｈｅｎｙｌｏｉｎ）、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）１８８が挙げられるがそれらに限定されない、細胞膜を安定化させる作用物質（ａｇｅｎｔ）を母体血液に添加して、母体細胞の溶解を低減させることができる。
【００５６】
この作用物質を使用するためのプロトコールの例は以下の通りである：血液を処理するまで４℃で保存する。上記チューブを、制動力をゼロに設定した遠心分離機で１０００ｒｐｍにて１０分間回転させる。上記チューブを１０００ｒｐｍにて１０分間、２回目の回転を行う。各サンプルの上清（血漿）を新しいチューブに移し、制動をゼロに設定し３０００ｒｐｍにて１０分間回転させる。その上清を新しいチューブに移し、−８０℃にて保存する。母体細胞を含有する、およそ２ミリリットルの「バフィコート」を分離チューブに入れ、−８０℃にて保存する。
【００５７】
本発明の方法はまた、総ＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡを調製するステップを包含する。ｃＤＮＡを調製し、単離されたＲＮＡサンプルを希釈することなく無作為に増幅させるか、または該単離されたＲＮＡ中の遺伝子材料の混合物を個別の反応サンプルへと分散させる。好ましくは、増幅を３’末端で、ならびに上記サンプル中の全トランスクリプトームを通してランダムに開始して、ｍＲＮＡおよび非ポリアデニル化転写物の両方を増幅させる。このようにして、二本鎖ｃＤＮＡ増幅産物を次世代シーケンシングプラットフォーム用のシーケンシングライブラリの作製用に最適化する。本発明の方法によるｃＤＮＡの増幅に適切なキットとしては、例えば、Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍが挙げられる。
【００５８】
本発明の方法はまた、その増幅したｃＤＮＡをシーケンシングするステップを包含する。任意の公知のシーケンシング方法を使用して、その増幅したｃＤＮＡ混合物を配列決定することができるが、一分子シーケンシング方法が好ましい。好ましくは、上記増幅したｃＤＮＡをホールトランスクリプトームショットガンシーケンシング（本明細書において、「ＲＮＡ−Ｓｅｑ」とも称す）により配列決定する。ホールトランスクリプトームショットガンシーケンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を種々の次世代シーケンシングプラットフォーム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラットフォーム、ＡＢＩ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプラットフォーム、またはＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ’ｓ  ４５４  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプラットフォームを使用して行うことができる。
【００５９】
本発明の方法はさらに、ｃＤＮＡにデジタルカウンティングおよび分析を行うステップを包含する。増幅サンプル中の各転写物用の増幅配列の数を配列読み取り（増幅ストランド当たり１読み取り）により定量することができる。これまでのデジタル分析方法と異なり、シーケンシングは異なるゲノムソース由来の遺伝子材料を含有する生物学的サンプルに存在する各転写物およびそれゆえ、複数のトランスクリプトームについての一塩基量での検出および定量を可能とする。
【００６０】
デジタルカウンティング後、種々の増幅した転写物の比を比較して、上記生物学的サンプル中の差次的転写物の相対量を決定することができる。複数の生物学的サンプルが異なる時間点にて得られる場合、その異なる転写物量を経時的に特徴づけることができる。
【００６１】
上記生物学的サンプル内の差次的転写物量を、マイクロアレイ技法を使用して（ｕｓｉｎｇ  ｖｉａ）分析することもできる。上記増幅したｃＤＮＡを使用して、１種もしくは複数種の状態または疾患（ｏｎｅ  ｏｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、例えば、任意の出生前状態、または任意の種類のがん、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患と関連する遺伝子転写物を含有するマイクロアレイをプローブすることができる。
【００６２】
本明細書において開示される方法および任意の流れ図をコンピュータプログラム命令により実施することができることが理解されよう。これらのプログラム命令は、コンピュータプロセッサに備えられ、そうしてその命令はプロセッサ上で実行され、フローチャート
のブロックに明記された動作または本明細書において開示された組織を評価するための方法に記載された動作を実施する手段を作製する。上記コンピュータプログラム命令をプロセッサにより実行させ、一連の操作ステップを該プロセッサにより実行させ、コンピュータ実装プロセスを作製することができる。上記コンピュータプログラム命令は、上記操作ステップの少なくとも一部を並行して実行させることもできる。さらに、上記ステップの一部を２つ以上のプロセッサにわたって実行させることもでき、例えば、マルチプロセッサコンピュータシステムにおいて開始させることができる。さらに、１つもしくは複数のプロセスを他のプロセスと同時に、またはさらに、本発明の範囲や趣旨から逸脱せずに、例示されたものとは異なる配列において行うこともできる。
【００６３】
上記コンピュータプログラム命令を、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、もしくは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル汎用ディスク（ＤＶＤ）または他の光学記憶、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶もしくは他の磁気記憶デバイス、あるいは所望の情報を記憶するために使用することができ、コンピュータデバイスによりアクセスすることができる任意の他の媒体が挙げられるが、それらに限定されない任意の適切なコンピュータ可読媒体に記憶することができる。
【実施例】
【００６４】
実施例１：ＲＮＡシーケンシングによる母体血漿無細胞ＲＮＡのプロファイリング（Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＲＮＡ  ｂｙ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）−包括的手法
【００６５】
概要：
マイクロアレイおよびＲＮＡ−Ｓｅｑを使用して、妊娠女性５例の血漿ＲＮＡプロファイルを第一のトリメスター、第二のトリメスター、分娩後に、ならびに非妊娠女性ドナー２例および男性ドナー２例の該プロファイルも収集した。
【００６６】
これらの妊娠のうち、早産などの臨床的合併症を伴う妊娠が２例および二葉胎盤を伴う妊娠が１例あった。これらの妊娠と正常例との比較により、妊娠の異なる時間的段階にわたり有意差のある遺伝子発現パターンを示す遺伝子が明らかとなった。合併症を伴う妊娠に関連するサンプルへの上記の技法の適用は、これらの病因を予測する分子マーカーとして使用することができる転写物の同定に役立ち得る（ｍａｙ  ｈｅｌｐ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ）。
【００６７】
試験計画および方法：
被験体
サンプルは第一のトリメスター、第二のトリメスター、第三のトリメスターの間、および分娩後の妊娠女性５例から収集した。対照として、血漿サンプルは非妊娠女性ドナー２例および男性ドナー２例からも収集した。
【００６８】
採血および処理
血液サンプルをＥＤＴＡチューブに採取し、１６００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を１．５ｍｌマイクロ遠心分離チューブに１ｍｌ分量入れ、次いで、１６０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離して、残留する細胞を除去した。次いで、上清を使用するまで−８０℃にて１．５ｍｌマイクロ遠心分離チューブに保存した。
【００６９】
ＲＮＡ抽出および増幅
上記無細胞母体血漿ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬により抽出した。抽出され、精製された総ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｏｖａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＮｕＧｅｎ）を使用して増幅させた。（上記ステップは、マイクロアレイおよびＲＮＡ−Ｓｅｑ
サンプル調製の両方と同じであった）。
【００７０】
上記ｃＤＮＡを、ＤＮａｓｅＩを使用して断片化し、ビオチンで標識した後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＳＴ１．０マイクロアレイにハイブリダイズさせた。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームおよび標準的なＩｌｌｕｍｉｎａライブラリ調製プロトコールをシーケンシングに使用した。
【００７１】
データ分析：
マイクロアレイとＲＮＡ−Ｓｅｑとの相関
ＲＭＡアルゴリズムを適用し、バックグランド補正および正規化についての生マイクロアレイデータを処理した。ＲＮＡ−ＳｅｑについてＣＡＳＡＶＡ１．７パイプラインを使用して、配列決定した転写物のＲＰＫＭ値を得た。上記ＲＮＡ−ＳｅｑのＲＰＫＭおよび上記マイクロアレイのプローブ強度をｌｏｇ２スケールに変換した。上記ＲＮＡ−Ｓｅｑデータについてｌｏｇ０となることを避けるため、ＲＰＫＭが０の遺伝子発現を、ｌｏｇを取る前に０．０１に設定した。次いで、これらの２つのプラットフォーム範囲の間の相関係数を算出した。
【００７２】
ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用するＲＮＡ転写物量の差次的発現
差次的遺伝子発現分析を、エッジＲ、すなわちデジタル遺伝子発現データを分析するために詳細に書かれた１組のライブラリ関数を使用して行った。次いで、遺伝子オントロジーを、ＤＡＶＩＤを使用して行い、有意に富化されたＧＯ項について同定した。
【００７３】
主成分分析および有意な時間変化する遺伝子の同定
主成分分析をＲのカスタムスクリプトを使用して行った。時間変化する遺伝子を同定するため、Ｒの関数の時間経過ライブラリを使用して、本発明者ら症例における個々の患者それぞれについての個々のトリメスターおよび分娩後となる時間経過を含む実験において差次的発現を評価するため、経験ベイズ法を実施した。
【００７４】
結果および考察
ＲＮＡ−Ｓｅｑにより、妊娠関連転写物が妊娠被験体と非妊娠被験体との間で有意差のある量で検出されることが明らかとなる。
【００７５】
妊娠被験体と非妊娠被験体との間のＲＮＡ−Ｓｅｑおよび遺伝子オントロジー分析を使用して得られた転写物量の比較により、差次的転写物量を示す転写物は、女性の妊娠と有意に関連することが明らかとなり、このことにより、ＲＮＡ−Ｓｅｑが妊娠によるこれらの２つのクラスのトランスクリプトーム間の実際の差の観察を可能にすることが示唆された。上位ランクの有意に発現した遺伝子はＰＬＡＣ４であり、これはトリソミー２１についてのＲＮＡ系試験を開発するための従来の試験での標的物質としても知られている。上位で検出された女性の妊娠関連の、差次的発現した転写物の一覧を図１に示す。
【００７６】
母体血漿中の血漿無細胞ＲＮＡ転写物の主成分分析（ＰＣＡ）は早産と正常妊娠との間を識別する。
主成分分析の入力として血漿無細胞転写物量プロファイルを使用して、異なる時間点の各患者からのプロファイルを、異なる病因クラスターにクラスター化することで、母体血漿中の無細胞血漿ＲＮＡ転写物プロファイルを使用して、早産と非早産妊娠を識別することができることが示唆された。
【００７７】
血漿無細胞ＲＮＡの量をマイクロアレイおよびＲＮＡ−Ｓｅｑの両方を使用して定量化した。各患者由来のマイクロアレイおよびＲＮＡ−Ｓｅｑからの転写物発現量プロファイルをおよそ０．７のピアソンの相関と相関する。無細胞ＲＮＡ転写物量についての２つの
おもな主成分のプロットを図２に示す。
【００７８】
３つ全てのトリメスターおよび分娩後にわたる早産と正常妊娠との間の有意差のある時間変化傾向を示す母体血漿中の無細胞ＲＮＡ転写物の同定
【００７９】
マイクロアレイを使用する早産および正常妊娠において異なる時間的量を示す上位１００の無細胞転写物量のヒートマップを図３Ａに示す。ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用する早産および正常妊娠において異なる時間的量を示す上位１００の無細胞転写物量のヒートマップを図３Ｂに示す。
【００８０】
３つ全てのトリメスターおよび分娩後にわたる早産と正常妊娠との間の有意差のある時間変化傾向を示すマイクロアレイおよびＲＮＡ−Ｓｅｑにより同定された共通の無細胞ＲＮＡ転写物
【００８１】
早産と正常妊娠との間で差次的発現する上位２０の転写物のランキングを図４に示す。これらの上位２０の共通のＲＮＡ転写物が遺伝子オントロジーを使用して分析され、形質膜または血小板の膜上に結合する（組み込まれるか、または弱く結合する）タンパク質が富化されることが示された（図５参照）。
【００８２】
ＰＶＡＬＢについての遺伝子発現プロファイル
ＰＶＡＬＢ遺伝子によりコードされるタンパク質は、カルモジュリンおよびトロポニンＣに構造的および機能的に類似する高親和性カルシウムイオン結合タンパク質である。上記コードされるタンパク質は筋肉の弛緩に関与すると考えられる。図６に示されるように、個々のトリメスターにわたるＰＶＡＬＢについての遺伝子発現プロファイルは、早産［青で強調］が正常妊娠と比較して認められる、より高い無細胞ＲＮＡ転写物量を有することを示す。
【００８３】
結論：
ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用する母体血漿無細胞ＲＮＡの定量化および特徴づけの結果は、妊娠関連転写物を検出することができることを強く示唆する。
【００８４】
さらに、ＲＮＡ−Ｓｅｑおよびマイクロアレイ法の両方は、たくさんの遺伝子転写物を検出することができ、該遺伝子転写物の量は差次的な時間傾向を示したが、それは、早産と関連する高い確率を有する。
【００８５】
本明細書に記載の方法を、種々の病的状況の妊娠を調査するように改変することができ、より多くの時間点で時間的変化を調査するように改変することもできる。
【００８６】
実施例２：妊娠中の時間的変動を示す組織特異的無細胞ＲＮＡの定量化
概要：
【００８７】
母体血漿に認められる無細胞胎児ＤＮＡは、非侵襲的診断に広く利用されてきた。対照的に、母体循環中に同様に検出されることがわかっていた無細胞胎児ＲＮＡは、診断の形態として広く利用されつつある（ｈａｓ  ｙｅｔ  ｂｅｅｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｗｉｄｅｌｙ  ａｓ  ａ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。胎児無細胞ＲＮＡおよびＤＮＡの両方は、双方とも母体成分が優位を占めているため、母体成分から胎児成分を識別する同様な難題に直面する。胎児起源の無細胞ＲＮＡを検出するために、胎児発達中にのみ高度に発現し、起源が胎児のものであると後に推察され、かつバックグランドの母体ＲＮＡから容易に識別される遺伝子に注目することができる。このような観点と、胎盤に高度に発現する遺伝子由来の無細胞胎児ＲＮＡが妊娠中の母体血漿中に検出可能であるこ
とを確立した試験を合わせる。
【００８８】
ＲＮＡをＤＮＡと区別する重要な特徴は、胎児発達中に十分反映されるＲＮＡ転写物の動的な性質に起因し得る。生命が受精とともに始まる一連の十分に組織化された事象として始まり、単一細胞の接合体を形成し、多様な組織タイプを有する多細胞生物で終わる。妊娠中、胎児組織の大部分が広範囲のリモデリングを行い、機能的に多様な細胞型を含有する。この基本的な多様性は、同じ核レパートリーからの差次的遺伝子発現の結果として生じ得、この場合、ゲノムが同一にも関わらず、細胞型が異なれば異なる量のタンパク質を作製することを、ＲＮＡ転写物の量が決定づけている。ヒトゲノムはおよそ３０，０００個の遺伝子を含む。わずかな遺伝子の組のみが、特定の分化した細胞型内でＲＮＡに転写されている。これらの組織特異的ＲＮＡ転写物は、多くの試験および古典的な動物モデルの胎児発達に関係するデータベースにより同定されている。利用可能な公知の文献とシーケンシングによりサンプルから作製されたハイスループットデータとを組み合わせて、母体血漿内に含有されるＲＮＡ転写物の収集全体を特徴づけることができる。
【００８９】
妊娠中の胎児の器官形成は、遺伝子発現の連続プログラムによる。ＲＮＡの量の時間的な制御は、胎児の器官発生を伴うこの細胞分化の事象の進行をもたらすために必要である。無細胞ＲＮＡの同様の時間的動態を解明するために、母体血漿無細胞ＲＮＡの発現プロファイル、特に遺伝子の選択された胎児組織特異的パネルを妊娠中の３つ全てのトリメスターおよび分娩後にわたる関数として分析した。無細胞胎児組織特異的ＲＮＡ転写物の同時定量化のためのハイスループットｑＰＣＲおよびシーケンシング技術の機能を活用して、母体血漿中の胎児起源のＲＮＡ転写物のスペクトルのシステムレベルの図が得られた。さらに、母体血漿を分析して、異なる胎児組織タイプの相対的割合として（ａ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ）胎児起源の異種無細胞トランスクリプトームの逆畳み込みを行った。この手法は、母体血漿における胎児の寄与率に関する物理的制約を組み込んでおり、特に各胎児組織の寄与率の比率はマイナスでなく、妊娠の３つ全てのトリメスターの間で合計１となることが必要とされた。そのデータセットにおけるこれらの制約により、その結果が、異なる胎児器官からの相対的割合として解釈されることを可能にした。すなわち、時間的変動を示す予め選択された胎児組織特異的ＲＮＡ転写物のパネルを、１つもしくは複数のサンプル中の相対的組織特異的ＲＮＡ寄与率を決定するために二次計画法を適用させるための基礎として使用することができる。
【００９０】
個々に考慮したときに、母体血漿内のこれらの胎児組織特異的転写物のそれぞれの定量化を、妊娠中のその個々の胎児組織のアポトーシスの割合の尺度として使用することができる。正常な胎児の器官発達は、細胞分裂およびアポトーシス細胞死により厳密に制御される。発達している組織は生存および増殖するために競合し、器官の大きさは細胞増殖と細胞死との間のバランスの結果となる。異常な細胞死と発達疾患との間の緊密な関連により、アポトーシスの治療的調整が、過熱する研究領域となりつつあるが、これは特定のアポトーシスの割合をモニタリングする必要が生じる。胎児無細胞ＲＮＡの定量化は、特に早産におけるこのような予後値をもたらし、この場合これらの早産の乳児の種々の器官におけるアポトーシスの発生率が、早産の乳児の神経発達障害および脳性まひに寄与することがわかっている（ｈａｓ  ｂｅｅｎ  ｈａｖｅ  ｂｅｅｎ  ｓｈｏｗｎ）。
【００９１】
サンプル収集および試験計画
胎児組織特異的転写物パネルの選択
これらの胎児組織特異的転写物の存在を検出するために、公知の胎児組織特異的遺伝子の一覧を、公知の文献およびデータベースから作製した。胎児組織の特異性を、２つのおもなデータベース：ＴＩＳＧｅＤ（Ｘｉａｏ，Ｓ．−Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．＆Ｊｉ，Ｚ．−Ｌ．ＴｉＳＧｅＤ：ａ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）２６
，１２７３〜１２７５（２０１０））およびＢｉｏＧＰＳ（Ｗｕ，Ｃ．ら、ＢｉｏＧＰＳ：ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ  ｐｏｒｔａｌ  ｆｏｒ  ｑｕｅｒｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ１０，Ｒ１３０（２００９）；Ｓｕ，Ａ．Ｉ．ら、Ａ  ｇｅｎｅ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０１，６０６２〜７（２００４））の間で相互参照することにより検証した。これらの選択された転写物のほとんどが、公知の胎児発達プロセスと関連する。この遺伝子の一覧をＲＮＡシーケンシングおよびマイクロアレイデータと重ね合わせ、図８に示される選択された胎児組織特異的転写物のパネルを作製した。
【００９２】
被験体
母体血液のサンプルを第一のトリメスター、第二のトリメスター、第三のトリメスター中および分娩後の正常な妊娠女性から収集した。陽性対照として、種々の胎児組織タイプ由来の胎児組織特異的ＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔから購入した。本実験の陰性対照について、水ならびに逆転写プロセスを行わなかったサンプルを用いて全プロセスを行った。
【００９３】
採血および処理
各時間点にて、７〜１５ｍＬの末梢血を各被験体から採血した。血液を１６００ｇにて１０分間遠心分離し、マイクロ遠心分離チューブに移し、さらに１６０００ｇにて１０分間遠心分離して、残留する細胞を除去した。上記ステップを採血の２４時間以内に行った。得られた血漿を次のＲＮＡ抽出用に−８０℃にて保存する。
【００９４】
ＲＮＡ抽出
無細胞ＲＮＡ抽出はＴｒｉｚｏｌを使用し、続いてＱｉａｇｅｎ’ｓ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して行われた。ＤＮＡの夾雑がないことを確実にするため、ＲＮＡの溶離後にＱｉａｇｅｎのＲＮａｓｅ  不含ＤＮａｓｅを使用してＤＮａｓｅ消化を行った。次いで、妊娠被験体由来の得られた無細胞ＲＮＡを標準的なマイクロアレイおよびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ−ｓｅｑプロトコールを使用して処理した。これらのステップはシーケンシングライブラリを作製するものであり、本発明者らは、ＲＮＡ−ｓｅｑデータならびにマイクロアレイ発現データを作製するためにそれを使用した。次いで、残りの無細胞ＲＮＡを並列ｑＰＣＲ用に使用する。
【００９５】
選択された転写物の並列ｑＰＣＲ
これらの胎児組織特異的転写物の正確な定量化が、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋシステム（例えば、Ｓｐｕｒｇｅｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｃ．＆  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｒ．Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｉｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｙｎａｍｉｃ  ａｒｒａｙ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ３，ｅ１６６２（２００８）を参照のこと）を使用して行われた。このシステムは、胎児組織特異的転写物のパネルの同時クエリを可能にする。２つの並列した形態の問い合わせが、異なる出発母体ソースを使用して行われた。１つはＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプロトコールからのｃＤＮＡライブラリを使用しており、もう１つは溶離したＲＮＡを直接使用する。両方の母体ソースを、目的の遺伝子を標的とするｅｖａｇｒｅｅｎプライマーを用いて増幅させた。両方のソースである、ＲＮＡおよびｃＤＮＡを予め増幅させた。ｃＤＮＡをｅｖａｇｒｅｅｎＰＣＲスーパーミックスおよびプライマーを使用して予め増幅させる。ＲＮＡソースをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣｅｌｌｓＤｉｒｅｃｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲキットを使用して予め増幅させる。逆転写のための長時間のインキュベーショ
ン時間に適応させる（ａｃｃｏｍｏｄａｔｅ）ため、デフォルトＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコールに改変がなされた。両方のソースに対して１９サイクルの予備増幅が行われ、収集したＰＣＲ産物を、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔを使用して洗浄した。後のｑＰＣＲステップの効率を定量化するダイナミックレンジおよび能力を増加させるため、ＰＣＲ産物に５倍、１０倍および１０希釈の連続希釈が行われた。各時間点にわたり個々の妊娠女性から採取された母体血漿のそれぞれに同じ手順を行い、Ｆｌｕｉｄｉｇｍの４８×４８  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｒｙ  Ｃｈｉｐに入れｑＰＣＲを行った。陽性対照として、種々の胎児組織タイプ由来の胎児組織特異的ＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔから購入した。胎児組織由来のこれらのＲＮＡのそれぞれに同じ予備増幅および洗浄ステップを行った。等しい割合の異なる胎児組織を含むプールサンプルを後の分析用に同様に作製し、プールしたサンプル中の各組織タイプの相対的寄与率を逆畳み込みした。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋシステムから収集したデータ全てをＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して予備処理し、全てのサンプルにわたる転写物のそれぞれについての各Ｃｔ値を得た。各実験の陰性対照について、水ならびに逆転写プロセスを行わなかったサンプルを用いて全プロセスを行った。
【００９６】
データ分析：
胎児組織特異的ＲＮＡ転写物は、出生後の短期間のうちに母体末梢血流から消失する。すなわち、母体血液の分娩後無細胞ＲＮＡトランスクリプトームは、胎児組織特異的ＲＮＡ転写物を欠く。その結果、これらの胎児組織特異的転写物の量が出生後より出生前で高いことが予想される。目的のデータは、新生児が誕生後のこの初期値量と比較して妊娠の３つ全てのトリメスターにわたり組織特異的転写物の相対的定量的変化が存在した。本方法を記載したように、胎児組織特異的転写物を実際の無細胞ＲＮＡならびに同じ無細胞ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリの両方を使用して並列して定量化した。得られた生データの例を、図９Ａおよび９Ｂに示す。ｑＰＣＲシステムは最初のソースとして無細胞ＲＮＡを使用して良好な品質の読み取り情報をもたらした。直接の無細胞ＲＮＡソースからのｑＰＣＲ結果に注目して、比較のための初期値として分娩後量を使用して３つ全てのトリメスターにわたるこれらの胎児組織特異的転写物のそれぞれの倍数変化量を比較することにより分析を行った。Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ  Ｃｔ法が使用された（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｔ．Ｄ．＆  Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｄａｔａ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ＣＴ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｎａｔｕｒｅ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ３，１１０１〜１１０８（２００８））。転写物発現量のそれぞれをハウスキーピング遺伝子と比較し、デルタＣｔ値を得た。続いて、各トリメスターを出生後と比較するため、デルタ−デルタＣｔ法が初期値として分娩後データを使用して適用された。
【００９７】
結果および考察：
図１０、１１、および１２に示されるように、組織特異的転写物は一般に、出生後と比較してトリメスターの間でより高い値となることがわかった。特に、胎盤、胎児脳および胎児肝臓特異的転写物の組織特異的パネルは同じバイアスを示したが、この場合、これらの転写物が典型的に出生後と比較したときに妊娠中で、より高い値で存在することが見出される。個々のトリメスターの間では、一般的傾向として、これらの転写物の量が妊娠に進行するとともに増加することが示された。
【００９８】
定量化した胎児組織特異的ＲＮＡの生物学的重要性：パネルの転写物のほとんどが、胎児器官の発達に関与したが、その多くがまた、羊水内で見つかっている。これまでのこのような例としてＺＮＦ２３８がある。この転写物は胎児脳組織に特異的であり、ニューロン層が形成されるときに胚形成中の大脳皮質の拡大に不可欠であることが知られている。中枢神経系におけるＺＮＦ２３８の不足は神経発生の深刻な破壊につながり、著しい出生
後小脳表現型（ｓｔｒｉｋｉｎｇ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｓｍａｌｌ−ｂｒａｉｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を生じる。本発明の方法を使用して、ＺＮＦ２３８が発達の段階に従い健常な正常量で存在しているかどうかを決定することができる。
【００９９】
ＺＮＦ２３８の不足により知られている欠損としては著しい出生後小脳表現型である、小頭症、脳梁の形成不全および小脳形成不全が挙げられる。小頭症は、出生前超音波により出生の前に診断され得ることもある。しかし、多くの場合、第三のトリメスターまで超音波により明らかにされない可能性がある。典型的に、出産まで、または新生児の頭囲が正常よりかなり小さいことがわかる乳児期後期まで診断されない。小頭症は生涯にわたる状態であり、現在治療は不可能である。小頭症で生まれた小児は、成長に従った頭部の発達をモニタリングするため医師による度重なる検査および診断試験を必要とする。本発明の方法を使用するＺＮｆ２３８差次的発現の早期検出により、出生前診断がもたらされ、薬物処置の予後値および処置のコースの間の投薬を把握することができる。
【０１００】
ＺＮＦ２３８の他に、特徴付けされた転写物の多くがアポトーシスを含む発達疾患、すなわち、神経発達中の不必要なニューロンの除去により生じる疾患における診断値を保持し得る。ニューロンのアポトーシスが発達中に不可欠であることがわかると、同様のアポトーシスがアルツハイマー病、ハンチントン病および筋委縮性側索硬化症などの神経変性疾患において活性し得ることが推定できた。このようなシナリオにおいて、本明細書に記載の方法論は疾患の進行を厳密にモニタリングすることを可能にし、進行に従ったできる限り理想的な投薬を可能にする。
【０１０１】
異なる胎児組織タイプの相対的寄与率の推測：特定の組織のアポトーシスの割合の違いは特定の発達疾患と直接相関し得る。すなわち、特定の発達疾患が母体トランスクリプトームで観察されている特定の特異的ＲＮＡ転写物の量を増加させ得る。種々の組織タイプからの相対的寄与率を知ることは、これらの疾患の進行中のこれらの変化のタイプを観察することを可能にする。妊娠中の胎児組織特異的転写物の定量化したパネルを種々の胎児組織からの寄与率の総和として考慮することができる。
【０１０２】
これを表すと、
【化１】
0006320302.tif 000002
式中、Ｙは遺伝子ｉについて母体血漿で観察された転写物量であり、Ｘは公知の胎児組織ｊ中の遺伝子ｉについて公知の転写物量であり、εは正規分布の誤差である。
さらなる物理的制約は、以下を包含する：
観察された定量化に寄与する全ての比率の総和が１であり、条件：
【化２】
0006320302.tif 000003
で表される
【０１０３】
２．各組織タイプからの寄与率全ては０以上となる必要がある。マイナスの寄与率を有することは物理的に意味をなさない。これは
【化３】
0006320302.tif 000004
で表され、それはπが各組織タイプの寄与率の割合として定義されるためである。
【０１０４】
よって、各組織タイプの最適な寄与率の比率を得るため、最小２乗の誤差を最小にする
。次いで、母体無細胞ＲＮＡ転写物への組織タイプの最適な相対的寄与率を得るためＲの二次計画法を使用して、上記の式を解く。ワークフローにおいて、ＲＮＡ転写物の量はｑＰＣＲから得られたＣｔ値の項のハウスキーピング遺伝子と比較して得られる。それゆえ、Ｃｔ値は、測定された転写物の量のプロキシと見なすことができる。Ｃｔ値１の増加が転写物量の２倍変化、すなわち、２の１乗に類似する。そのプロセスはハウスキーピング遺伝子と比較したＣＴのデータ全ての正規化で開始した（ｂｅｉｎｇｓ）後、二次計画法を行う。
【０１０５】
上記スキームの概念の証明として、異なる胎児組織タイプ（脳、胎盤、肝臓、胸腺、肺）を等しい割合で混合して、プールサンプルを作製した。プールした「サンプルとともに各胎児組織タイプ（脳、胎盤、肝臓、胸腺、肺）を、同じＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して定量化して、全ての組織およびプールしたサンプルにわたる胎児組織特異的転写物それぞれについてｑＰＣＲからＣｔ値を得た。これらの値を使用して、同じ逆畳み込みを行った。胎児組織器官（脳、胎盤、肝臓、胸腺、肺）のそれぞれについての得られた胎児の比率は、それぞれ０．１０９、０．２０６、０．２３６、０．２０２および０．２４５であった。
【０１０６】
結論：
要約すると、胎児特異的無細胞転写物のパネルにより、一度で異なる胎児組織にわたる貴重な生物学的情報がもたらされる。最も具体的には、本方法は総ＲＮＡに対して胎児組織特異的転写物の異なる相対的割合を推測することができ、個々に考慮するときに各転写物は、胎児組織のアポトーシスの割合の指標となり得る。このような測定値は発達医学および胎児医学において多数の潜在的用途を有する。ほとんどのヒト胎児発達研究は、おもに出生後組織検体または流産した胎児によるものであった。本明細書に記載の方法は、妊娠母体および胎児への危険が最小の、生存胎児における胎児組織／器官成長または死の割合の即座および迅速なアッセイを提供する。類似の方法を使用して、血漿中の特異的無細胞ＲＮＡ転写物を示す主要成人器官組織系をモニタリングすることができる。
【０１０７】
実施例３：成人無細胞トランスクリプトームの逆畳み込み
概要：
健常な正常成人４例の血漿ＲＮＡプロファイルを分析した。異なる組織タイプの遺伝子発現プロファイルに基づき、本法は各組織タイプの、ドナー血漿中の無細胞ＲＮＡ成分への相対的寄与率を定量化することを記載した（ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙ）。定量化のための、異なる組織タイプ由来のアポトーシス細胞は、それらのＲＮＡを血漿に放出すると仮定する。これらの組織のそれぞれが組織タイプに固有の特定数の遺伝子を発現した。そして、その観察された無細胞ＲＮＡトランスクリプトームはこれらの異なる組織タイプの総和となる。
【０１０８】
試験計画および方法：
組織特異的転写物の、無細胞成人トランスクリプトームへの寄与率を決定するために、公知の組織特異的遺伝子の一覧を公知の文献およびデータベースから作製した。２つのデータベースソース：Ｈｕｍａｎ  Ｕ１３３Ａ／ＧＮＦ１Ｈ  Ｇｅｎｅ  ＡｔｌａｓおよびＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ａｔｌａｓを利用した。これら２つのデータベースからの生データを使用して、組織特異的遺伝子を以下の方法により同定した。組織特異的遺伝子を同定するためにこの２つのデータベースから得られたデータに、テンプレートマッチング法を適用した。本方法により同定された組織特異的遺伝子の一覧を図１８に示す。パネルの特異性および感度はデータベースの組織サンプルの数により制約される。例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｕ１３３Ａ／ＧＮＦ１Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ａｔｌａｓデータセットは、８４個の異なる組織サンプルを含み、そのデータベースからのパネル特異性は、８４サンプルセットにより制約される。同様に、ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ａｔｌａｓについて１１個の異なる組織サンプルがあり
、特異性はこれらの１１の組織間を識別することに限定される。２つのデータベースから組織特異的転写物の一覧を得た後、これらの転写物の特異性を文献ならびにＴｉｓＧＥＤデータベースを用いて検証した。
【０１０９】
成人無細胞トランスクリプトームをこの２つのデータベースから得られた組織特異的転写物の総和としてみなすことができる。成人無細胞トランスクリプトーム中の異なる組織の相対的割合を定量的に推定するために、二次計画法を制約付き最適化法として行い、異なる器官／組織の、無細胞トランスクリプトームへの相対的に最適な寄与率を推定する。このプロセスの特異性および精度は、図Ｘに記載された遺伝子の表およびＲＮＡ−ｓｅｑおよびマイクロアレイで検出可能な範囲に依存する。
【０１１０】
被験体：血漿サンプルを、健常な正常成人４例から収集した。
【０１１１】
初期結果：
上記方法を使用する、マイクロアレイからの本発明者らの成人無細胞ＲＮＡトランスクリプトームの逆畳み込みにより、異なる組織および器官の相対的寄与率が明らかになり、それを図１３において表にする。
【０１１２】
図１３は、成人における正常な無細胞トランスクリプトームが４例の被験体全てにわたり一致することを示す。４例の被験体間の相対的寄与率はあまり差がなく、このことは、異なる組織タイプからの相対的寄与率は正常成人間では相対的に安定していることを示唆する。利用可能な８４の組織タイプのうち、推定された最適な主要寄与組織は、全血および骨髄由来である。
【０１１３】
循環ＲＮＡに寄与する興味深い組織タイプは視床下部である。視床下部は、有効な血液脳関門がない特定の脳領域が結合しており、これらの部位の毛細管内皮は有窓性であり、本症例において、本発明者らがこの領域のアポトーシス細胞由来のＲＮＡ転写物が血漿無細胞ＲＮＡ成分へと放出され得ると考えている、さらに大きなタンパク質および他の分子を自由に通過させることが可能である。
【０１１４】
同じ方法をＲＮＡ―ｓｅｑを使用して本被験体に行った。本明細書に記載の結果は、利用可能な組織特異的ＲＮＡ―ｓｅｑデータの量により制限されている。しかし、組織特異的データが種々の組織比のシーケンシングの割合の増加とともに拡大しており、今後の分析はこれらのデータセットを利用することができると理解される。ＲＮＡ―ｓｅｑデータについて（マイクロアレイと比較して）、全血および骨髄サンプルは利用できない。無細胞トランスクリプトームはＲＮＡ―ｓｅｑデータの利用可能な１１の異なる組織タイプに分解され得るに過ぎない。そのうち、図１４に示されるように、視床下部および脾臓からの相対的寄与率のみが観察された。
【０１１５】
９４個の組織特異的遺伝子の一覧（図１５に示される）はさらに、ｑＰＣＲを用いた検証のために選択された。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して、以下の組織由来のＲＮＡについてｑＰＣＲを行った：脳、小脳、心臓、腎臓、肝臓および皮膚。類似のｑＰＣＲワークフローを同様に無細胞ＲＮＡ成分に適用した。ハウスキーピング遺伝子と比較することによるデルタＣｔ値、ＡＣＴＢを図１６のヒートマップフォーマットにプロットし、これらの組織特異的転写物が無細胞ＲＮＡにおいて検出可能であることを示す。
【０１１６】
参照による引用
本開示を通して、他の文書、例えば、特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツを参照かつ引用している。このような文書全ては、本明細書においてあ
らゆる目的のために全内容を援用する。
【０１１７】
均等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴を逸脱することなく他の特定の形態に具体化され得る。それゆえ、上記の実施形態は、あらゆる点で本明細書に記載の発明の限定というよりむしろ例示とみなされる。したがって、本発明の範囲は上記の説明によるというよりむしろ添付の本特許請求の範囲により明示され、それゆえ、本特許請求の範囲の均等の意味および範囲内にある全ての変更が本明細書に包含され得ることが意図される。
【図１】
0006320302.tif 000008
【図２】
0006320302.tif 000009
【図３Ａ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１８−８】
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【図１８−９】
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【図１８−１０】
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【図１８−１１】
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【図１８−１２】
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【図１８−１３】
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【図１８−１４】
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【図１８−１５】
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【図１８−１６】
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【図１８−１７】
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【図１８−１８】
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【図１８−１９】
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【図１８−２０】
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【図１８−２１】
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【図１８−２２】
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【図１８−２３】
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【図１８−２４】
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【図１８−２５】
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【図１８−２６】
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【図１８−２７】
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【図１８−２８】
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【図１８−２９】
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【図１８−３０】
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【図１８−３１】
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【図１８−３２】
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【図１８−３３】
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【図１８−３４】
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【図１８−３５】
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【図１８−３６】
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【図１８−３７】
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【図１８−３８】
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【図１８−３９】
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【図１８−４０】
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【図１８−４１】
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【図１８−４２】
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【図１８−４３】
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【図１８−４４】
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【図１８−４５】
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【図１８−４６】
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【図１８−４７】
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【図１８−４８】
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【図１８−４９】
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【図１８−５０】
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【図１８−５１】
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【図１８−５２】
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【図１８−５３】
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【図１８−５４】
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【図１８−５５】
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【図１８−５６】
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【図１８−５７】
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【図１８−５８】
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【図１８−５９】
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【図１８−６０】
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【図１８−６１】
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【図１８−６２】
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【図１８−６３】
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【図１８−６４】
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【図１８−６５】
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【図１８−６６】
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【図１８−６７】
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【図１８−６８】
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【図１８−６９】
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【図１８−７０】
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【図１８−７１】
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【図１８−７２】
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【図１８−７３】
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【図１８−７４】
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【図１８−７５】
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【図１８−７６】
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【図１８−７７】
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【図１８−７８】
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【図１８−７９】
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【図１８−８０】
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【図１８−８１】
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【図１８−８２】
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【図１８−８３】
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【図１８−８４】
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【図１８−８５】
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【図１８−８６】
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【図１８−８７】
0006320302.tif 000130
【図１８−８８】
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【図１８−８９】
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【図１８−９０】
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【図１８−９１】
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【図１８−９２】
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【図１８−９３】
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【図１８−９４】
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【図１８−９５】
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【図１８−９６】
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【図１８−９７】
0006320302.tif 000140
【図１８−９８】
0006320302.tif 000141
【図１８−９９】
0006320302.tif 000142
【図１８−１００】
0006320302.tif 000143
【図１８−１０１】
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【図１８−１０２】
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【図１８−１０３】
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【図１８−１０４】
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【図１８−１０５】
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【図１８−１０６】
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【図１８−１０７】
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【図１８−１０８】
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【図１８−１０９】
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【図１８−１１０】
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【図１８−１１１】
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【図１８−１１２】
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【図１８−１１３】
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【図１８−１１４】
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【図１８−１１５】
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【図１８−１１６】
0006320302.tif 000159
【図１８−１１７】
0006320302.tif 000160
【図１８−１１８】
0006320302.tif 000161
【図１８−１１９】
0006320302.tif 000162
【図１８−１２０】
0006320302.tif 000163
【図１８−１２１】
0006320302.tif 000164
【図１８−１２２】
0006320302.tif 000165
【図１８−１２３】
0006320302.tif 000166
【図１８−１２４】
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【図１８−１２５】
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【図１８−１２６】
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【図１８−１２７】
0006320302.tif 000170
【図１８−１２８】
0006320302.tif 000171
【図１８−１２９】
0006320302.tif 000172
【図１８−１３０】
0006320302.tif 000173
【図１８−１３１】
0006320302.tif 000174
【図１８−１３２】
0006320302.tif 000175
【図１８−１３３】
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【図１８−１３４】
0006320302.tif 000177
【図１８−１３５】
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【図１８−１３６】
0006320302.tif 000179
【図１８−１３７】
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【図１８−１３８】
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