(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸のアルギニン塩。
【請求項２】
化学量論が１：１のアルギニンと３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸を有する、請求項１に記載の塩。
【請求項３】
前記アルギニン塩がＬ−アルギニン塩である、請求項１から２のいずれか一項に記載の塩。
【請求項４】
水和されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の塩。
【請求項５】
一水和物である、請求項１から４のいずれか一項に記載の塩。
【請求項６】
非晶質固体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の塩。
【請求項７】
治療に使用するための、請求項１から６のいずれか一項に記載の塩を含む組成物。
【請求項８】
治療に使用するための医薬品の製造における、請求項１から６のいずれか一項に記載の塩の使用。
【請求項９】
前記治療が、被験体において免疫応答を引き起こす方法である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記治療が、被験体において免疫応答を引き起こす方法である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
被験体において免疫応答を引き起こすための組成物であって、請求項１から６のいずれか一項に記載の塩を含む、組成物。
【請求項１２】
３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸を、溶媒中でアルギニンと接触させるステップを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のアルギニン塩を調製する方法。
【請求項１３】
３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸のアルギニン塩および不溶性金属塩を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
免疫原をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
アジュバント複合体を調製する方法であって、３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸のアルギニン塩を、該酸が不溶性金属塩に吸着して該複合体を形成するように、該不溶性金属塩と混合するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１２年３月７日出願の米国仮特許出願第６１／６０８，０１１号の利益を請求するものであり、この出願文書は、あらゆる目的でその内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、免疫賦活薬化合物の塩形態およびインビボで使用するためのそれらの製剤の分野にある。特に、本発明はアルギニン塩に関する。
配列表
【０００３】
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含有し、それによってその全体を参照によって組み込むものとする。２０１３年３月４日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、５４８４８＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴと指定され、大きさは２４，９８９バイトである。
【背景技術】
【０００４】
特定のクラスの病原体の早期に検出は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を活用することにより、先天性免疫系によって達成される。検出された病原体には、ウイルス、細菌、原生動物および真菌が含まれ、これらはそれぞれ、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる、一組のクラス特異的な変異耐性分子を構成的に発現する。
【０００５】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、ＰＲＲの重要なファミリーであり、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、マスト細胞、好中球、内皮細胞および線維芽細胞を含む先天性免疫細胞に、広く発現される。ＴＬＲは、細菌、ウイルスおよび寄生虫が共有する保存された分子パターンに対して、広範な特異性を有する。
【０００６】
いくつかの異なるＴＬＲが、既に特徴付けられている。これらのＴＬＲは、様々な生物または構造に位置する様々なリガンドに結合し、それによって活性化される。当該分野では、特異的ＴＬＲにおける応答を誘発することができる免疫賦活薬化合物の開発が関心の対象となっている。
【０００７】
例えば、参考文献１は、ＴＬＲ７作動薬化合物である小分子免疫賦活薬（ＳＭＩＰ）の広範なクラスを開示している。これらの化合物を含む免疫原性組成物および医薬組成物も、この参考文献に開示されている。
【０００８】
本発明の一目的は、改善された特性を有し、例えば可溶性および光安定性が改善されており、遊離塩基と比較して塩のゲル化性質を低下する、以下に示す式（Ｉ）を有する特異的ＴＬＲ７化合物の塩形態を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０２７２２２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下に示す式（Ｉ）の免疫賦活薬化合物の塩に関し、この化合物は、ヒトＴＬＲ７の作動薬、３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸である。
【００１１】
【化１】
0006325986.tif 000002
【００１２】
特に本発明は、式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩に関する。先の化合物の異なる塩形態の研究では、驚くべきことに、アルギニン塩は、可溶性、収率、光安定性、対イオンの安定性、および生理的ｐＨにおける熱安定性などの広範な試験基準にわたって最も有利であることが見出された。特に、本発明のアルギニン塩は、式（Ｉ）の遊離塩基化合物と比較して、溶液中の改善された光安定性を示す。
【００１３】
式（Ｉ）の化合物およびアルギニンは、共に多塩基性の性質なので、本発明の塩は、式（Ｉ）の化合物とアルギニン対イオンのモル数に関して、様々な化学量論で存在し得る。例えば、式（Ｉ）の化合物：アルギニンの化学量論は、１：１、１：２または１：３であり得る。好ましくは、化学量論は１：１である。
【００１４】
本発明の塩は、溶媒和されていてもよく、または溶媒和されていなくてもよい。例えば、塩は、含水形態または無水形態として存在してもよい。塩は、一水和物または二水和物として存在してもよい（すなわち１モルまたは２モルの水を含有する）。好ましくは、塩は一水和物である。
【００１５】
本発明のアルギニン塩は、非晶質または結晶固体として存在してもよい。あるいは、塩は、非晶質と結晶固体の両方を含有する、部分的に結晶の固体として存在する。本発明の一態様では、塩は、短距離秩序部分を含有し、実質的に非晶質である。一実施形態では、塩の結晶形は、２θ；１０、１４および１８．５で表される、少なくとも以下の粉末Ｘ線回折ピークを呈する。塩形態は、図１に示したものと実質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを有し得る。本発明の固体状態のアルギニン塩の１３Ｃおよび１５Ｎ  ＮＭＲスペクトルを、それぞれ図１ａおよび１ｂに示す。
【００１６】
本発明はまた、治療に使用するための式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を提供する。本発明はさらに、治療に使用するための医薬品の製造における、式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩の使用を提供する。各場合、治療は、被験体の免疫応答を引き起こす方法であり得る。
【００１７】
被験体に、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を投与するステップを含む、被験体の免疫応答を引き起こす方法も提供する。
【００１８】
免疫賦活薬（特にＴＬＲ作動薬）のＰＫ／ＰＤは、これらの賦活薬を、不溶性金属塩、例えばアルミニウム塩に吸着させることによって改善することができる（参考文献２参照）。化合物の安定な吸着は、理想的には、吸着を媒介できるホスホネート基などの吸着性部分を介するリガンド交換によって行われる。吸着性部分を有するＳＭＩＰは、吸着した形態で送達される場合には、インビボでそれらの免疫学的活性を保持することができ、したがって活性を犠牲にすることなく、ＰＫ／ＰＤ特性が改善される。化合物の吸着とは、筋肉内注射部位に化合物がより長い滞留時間を有し、それによって全身曝露レベルが制御されることを意味する。全身曝露レベルが高いと、血中で高レベルの炎症性サイトカインの産生を誘発するおそれがあり、したがって注射部位における滞留時間が長いほど、血中の炎症性サイトカインの産生を最小限に抑えることができ、こうして化合物の安全性および／または忍容性が改善される。
【００１９】
不溶性金属塩に吸着させることによって免疫賦活薬のＰＫ／ＰＤ特性を改善するというこの概念は、本発明に適用できる。したがって、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩および不溶性金属塩を含む組成物を提供する。好ましくは、アルギニン塩中の本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、不溶性金属塩上に吸着する。一実施形態では、組成物は緩衝液を含む。
【００２０】
本発明はまた、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、不溶性金属塩および免疫原を含む組成物を提供する。好ましくは、組成物のアルギニン塩中の本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、不溶性金属塩上に吸着する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を、メタノールなどの溶媒中でアルギニンと接触させるステップを含む、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を調製する方法を提供する。該方法は、例えばエタノールを溶媒に（例えばメタノールに）添加することによって、アルギニン塩を結晶化するステップをさらに含むことができる。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどの溶媒と接触させるステップを含む、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩の結晶形を調製する方法を提供する。アルギニンは、Ｌ−もしくはＤ−アルギニン、またはラセミ混合物であってよい。好ましくは、Ｌ−アルギニンが使用される。
【００２２】
さらなる一態様では、本発明は、アルギニン塩中の本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物が不溶性金属塩に吸着して複合体を形成するように、式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を不溶性金属塩と混合するステップを含む、アジュバント複合体を調製する方法を提供する。本発明はまた、この方法によって得られた、または得ることができるアジュバント複合体を提供する。複合体を免疫原と混合すると、免疫原性組成物を提供することができる。
【００２３】
別の態様では、本発明は、アルギニン塩中の本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物が不溶性金属塩に吸着して複合体を形成するように、（ｉ）式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を不溶性金属塩と混合するステップと、（ｉｉ）複合体を滅菌するステップとを含む、無菌アジュバント複合体を調製する方法を提供する。本発明はまた、この方法によって得られた、または得ることができる無菌アジュバント複合体を提供する。無菌複合体を免疫原と混合すると、免疫原性組成物を提供することができる。滅菌法は、好都合には高圧蒸気殺菌法（または類似の手順［３］）によって達成することができる。
【００２４】
本発明はまた、（ｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩の溶液または懸濁液を滅菌するステップと、（ｉｉ）滅菌した溶液または懸濁液を、無菌不溶性金属塩と組み合わせるステップとを含む、無菌アジュバント複合体を調製する方法を提供する。本発明はまた、（ｉ）不溶性金属塩を滅菌するステップと、（ｉｉ）滅菌した不溶性金属塩を、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩の無菌溶液または懸濁液と組み合わせるステップとを含む、無菌アジュバント複合体を調製する方法を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩の無菌溶液または懸濁液を、無菌不溶性金属塩と組み合わせるステップを含む、無菌アジュバント複合体を調製する方法を提供する。アルギニン塩溶液／懸濁液の滅菌法は、好都合には無菌濾過によって達成することができ、この材料は、濃縮形態で調製することができる。不溶性金属塩の滅菌法は、好都合には高圧蒸気殺菌法によって達成することができる。無菌不溶性金属塩は、典型的に水性懸濁液である。本発明はまた、前述の方法のいずれか１つによって得られた、または得ることができる無菌アジュバント複合体を提供する。
【００２５】
別の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、不溶性金属塩、および免疫原を混合し、それによって免疫原性組成物を提供するステップを含む、免疫原性組成物を調製する方法を提供する。本発明はまた、この方法によって得られた、または得ることができる免疫原性組成物を提供する。
アルギニン
【００２６】
アルギニンは、以下に示す式を有するα−アミノ酸である。
【化２】
0006325986.tif 000003
【００２７】
アルギニンは、キラル中心（アスタリスクで印を付した炭素原子）を有し、いわゆるＬまたはＤ形態で存在することができる。アルギニンのＬ形態は、そのキラル中心にＳの絶対立体化学を有し、他方でＤ形態は、そのキラル中心にＲの絶対立体化学を有する。
【００２８】
Ｌ−アルギニンおよびＤ−アルギニンは共に、グアニジウム基の塩基特性に起因して、酸性化合物と塩を形成することができる。いくつかの実施形態では、本発明のアルギニン塩は、本明細書に開示の式（Ｉ）の化合物とＬ−アルギニンとの間に形成される。いくつかの実施形態では、本発明のアルギニン塩は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物とＤ−アルギニンとの間に形成される。好ましくは、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩は、Ｌ−アルギニン塩である。
不溶性金属塩
【００２９】
アルギニン塩形態中の本明細書に開示の免疫賦活薬化合物（すなわち式（Ｉ）の化合物）は、不溶性金属塩に吸着し、それによって吸着複合体を形成することができる。例えば、アルギニン塩形態の中の本明細書に開示の免疫賦活薬化合物は、不溶性カルシウム塩（例えば、リン酸カルシウム）、または好ましくは不溶性アルミニウム塩に吸着することができる。このようなアルミニウム塩は、長い間、例えばアジュバントとしてワクチンに使用されてきた。水酸化物イオンを含むアルミニウム塩は、本発明で使用するのに好ましい不溶性金属塩である。
【００３０】
したがって、本発明は、本明細書に開示のアルギニン塩中の式（Ｉ）の化合物がこのような不溶性金属塩に吸着する、様々な実施形態を提供する。
【００３１】
有用なアルミニウム塩として、水酸化アルミニウム、オキシ水酸化物アルミニウム、およびヒドロキシリン酸アルミニウム（ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウムを含む）が挙げられるが、それらに限定されない。このような塩は、例えば参考文献４の第８章および第９章に記載されている。
【００３２】
好ましい不溶性金属塩は、オキシ水酸化物アルミニウムおよび／またはヒドロキシリン酸アルミニウムである。これらは、免疫賦活薬化合物のホスホネート基とのリガンド交換を容易に受けて、安定に吸着することができるヒドロキシル部分を表面に有する。
【００３３】
一般に「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これらは通常、少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ−１に吸着帯が存在し、３０９０〜３１００ｃｍ−１に強いショルダー（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）が存在することによって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などの他のアルミニウム化合物と区別することができる（参考文献４の第９章）。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、回折帯の半値幅（ＷＨＨ）に反映され、結晶化度の低い粒子は、結晶子のサイズがより小さいことに起因して、より大きい線幅拡大を示す。表面積は、ＷＨＨが増大するにつれて増大し、アジュバントは、そのＷＨＨ値が大きいほど抗原吸着能が高いことがわかっている。繊維状の形態（例えば、透過電子顕微鏡写真でわかるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的に約１１であり、すなわちアジュバント自体は、生理的ｐＨで正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４においてＡｌ３＋１ｍｇ当たりタンパク質１．８〜２．６ｍｇの吸着能が報告されている。
【００３４】
一般に「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にヒドロキシリン酸アルミニウムであり、少量の硫酸塩を含有することも多い（すなわちヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）。これらのアジュバントは、沈殿によって得ることができ、沈殿中の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルに対するリン酸塩の置換度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般にＰＯ４３−／Ａｌ３＋のモル比が０．３〜１．２である。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基が存在することによって、厳密なＡｌＰＯ４とは区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトル帯（例えば、２００℃に加熱した場合）は、構造的なヒドロキシルの存在を示している（参考文献４の第９章）。
【００３５】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４３−／Ａｌ３＋モル比は、一般に０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩については一般に非晶質である。典型的なアジュバントは、ＰＯ４３−／Ａｌ３＋のモル比が０．８４〜０．９２であり、１ｍｌ当たりＡｌ３＋０．６ｍｇを含む非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般に粒子である（例えば、透過電子顕微鏡写真で見るとプレート様の形態である）。粒子の典型的な直径は、任意の抗原が吸着した後、０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。リン酸アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４においてＡｌ３＋１ｍｇ当たりタンパク質０．７〜１．５ｍｇの吸着能が報告されている。
【００３６】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するリン酸塩の置換度に反比例し、この置換度は、沈殿によって塩を調製するのに使用される反応条件および反応物の濃度に応じて変わり得る。またＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させることによって（リン酸塩が多い＝酸性ＰＺＣが高い）、またはヒスチジン緩衝液などの緩衝液を添加することによって（ＰＺＣをより塩基性にする）変わる。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【００３７】
溶液中では、リン酸アルミニウムおよび水酸化物アジュバントは、共に直径１〜１０μｍの安定な多孔質凝集体を形成する傾向がある［５］。
【００３８】
不溶性金属塩に吸着した本発明の塩形態を含む組成物は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液）を含むこともできる。
【００３９】
本発明で有用な吸着性金属塩は不溶性なので、本発明の吸着した塩形態を含有する組成物は、一般に濁った外観を有する懸濁液になる。これによって、汚染細菌の増殖が隠れるおそれがあるため、本発明の組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでもよい。組成物は、水銀材料を実質的に含まず（例えば＜１０μｇ／ｍｌ）、例えばチオメルサールを含まないことが好ましい。水銀を全く含有していないワクチンが、より好ましい。
【００４０】
組成物は、水酸化アルミニウム塩とリン酸アルミニウム塩の両方の混合物を含むことができ、本明細書に開示の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩形態は、これらの金属塩の一方または両方に吸着し得る。
【００４１】
患者に投与するための組成物中のＡｌ３＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満であり、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌ等である。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最大値＜０．８５ｍｇ／用量が好ましい。式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩が含まれることにより、アルミニウム塩のアジュバント効果を改善することができるので、本発明では、有利なことには１用量当たりより少ない量のＡｌ３＋で済み、したがって本発明の組成物は、有用なことには単位用量当たりＡｌ３＋を１０〜２５０μｇ含むことができる。現在の小児ワクチンは、典型的にＡｌ３＋を少なくとも３００μｇ含む。濃度に関して、本発明の組成物は、１０〜５００μｇ／ｍｌ、例えば１０〜３００μｇ／ｍｌ、１０〜２００μｇ／ｍｌ、または１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度のＡｌ３＋を有し得る。
【００４２】
一般に、組成物が、本発明のアルギニン塩およびアルミニウム塩の両方を含む場合、作動薬とＡｌ３＋の重量比は、５：１未満、例えば４：１未満、３：１未満、２：１未満、または１：１未満である。したがって、例えばＡｌ３＋の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌである場合、本発明のアルギニン塩の最大濃度は、２．５ｍｇ／ｍｌである。しかし、それより高いレベルまたは低いレベルを使用することもでき、Ａｌ３＋の質量よりも小さい質量のアルギニン塩が典型的であり、例えば１用量当たりＡｌ３＋が０．２ｍｇである場合、アルギニン塩は１００μｇである。ヒトの単位用量当たり、式Ｉの化合物の最大値は２．５ｍｇであることが好ましい（例えば、注射０．５ｍｌ当たり）。
【００４３】
組成物が本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩および不溶性金属塩を含む場合、組成物中の免疫賦活薬の少なくとも５０％（質量）、例えば≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、またはさらには１００％が、金属塩に吸着することが好ましい。最小値８０％の吸着が典型的であり、少なくとも９０％または９５％が好ましい。
【００４４】
先に論じた通り、不溶性金属塩に吸着した結果として、ＳＭＩＰのインビボ挙動が改変され得る。したがって、吸着ＳＭＩＰは、筋肉内注射された後、非吸着形態で注射された同じＳＭＩＰと比較して、筋肉内でより長い滞留時間を示すことができる（例えば、少なくとも２倍長い）。ある程度クリアランスが生じ得るものの、注射されたＳＭＩＰの検出可能な部分が、依然として存在することになる。したがって、例えば吸着ＳＭＩＰは、筋肉内注射された場合、注射された筋肉内に、少なくとも１２時間後、例えば２４時間後も依然として存在することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、吸着アルギニン塩は、非吸着形態と比較して低いピーク血清濃度を示すことができる。このピークは、通常はＣｍａｘ値と表される。例えば、吸着形態は、筋肉内注射された場合、非吸着形態で筋肉内注射された場合よりも低い血清Ｃｍａｘ値を有することができる（例えば、非吸着Ｃｍａｘの＜９５％、非吸着Ｃｍａｘの＜８０％、非吸着Ｃｍａｘの＜５０％、またはさらには非吸着Ｃｍａｘの＜３０％）。
【００４６】
いくつかの実施形態では、吸着アルギニン塩は、注射された後、非吸着形態で注射された同じ塩と比較して低い総全身曝露を示すことができる。全身曝露レベルは、通常ＡＵＣ（濃度−時間曲線下面積）値（例えば、ｎＭ・時間）と表される。有利なことには、例えば吸着ＳＭＩＰは、筋肉内注射された場合、非吸着形態で筋肉内注射された同じアルギニン塩よりも、注射の２４時間後に低い血清ＡＵＣ値を有することができる（例えば、非吸着ＡＵＣの＜９０％、非吸着ＡＵＣの＜８０％、またはさらには非吸着ＡＵＣの＜５０％等）。
免疫原
【００４７】
不溶性金属塩に吸着した本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物の塩形態の複合体は、免疫化の最中に有用である。したがって本発明の吸着複合体は、１つまたは複数の免疫原（複数可）と併用することができる。複合体および免疫原（複数可）は、混ぜ合わせたものとして提供することができ、または混合後に使用するために別個に提供することもできる。いくつかの実施形態では、本発明の塩形態は、不溶性金属塩がない状態で免疫原と組み合わせることができ、その後、哺乳動物に投与することができ、または後で哺乳動物に投与するために不溶性金属塩と組み合わせることもできる。
【００４８】
本発明は、広範な疾患を処置し、または広範な疾患から保護するために、広範な免疫原と共に使用することができる。免疫原は、ウイルス疾患（例えば、エンベロープを有するまたはエンベロープを有していないウイルスに起因する）、細菌疾患（例えば、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌に起因する）、真菌疾患、寄生虫疾患、自己免疫疾患、または他の任意の疾患から保護する免疫応答を誘発し得る。また免疫原は、免疫治療において、例えば腫瘍／癌、アルツハイマー病、または嗜癖を処置するのに有用な場合がある。
【００４９】
免疫原は、様々な形態をとることができ、例えば全生物、外膜小胞、ポリペプチド、サッカライド、リポサッカライド（ｌｉｐｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、コンジュゲート（例えば、担体とハプテンのコンジュゲート、または担体とサッカライドもしくはリポサッカライドのコンジュゲート）等であってよい。免疫原は、ポリペプチドである場合、典型的に表面ポリペプチド、例えばアドヘシン、赤血球凝集素、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質等である。
【００５０】
免疫原は、インフルエンザＡおよびＢウイルスを含むインフルエンザウイルスに対して免疫応答を誘発し得る。典型的に、生ウイルスまたは不活化ウイルスのいずれかに基づく様々な形態のインフルエンザウイルス免疫原が、現在利用可能である。不活化ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ  ｖｉｒｉｏｎ）、または精製表面抗原に基づくものであってよい。インフルエンザ抗原は、ビロソームの形態で提示することもできる。赤血球凝集素は、現在の不活化ワクチンの主な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にＳＲＩＤによって測定されるＨＡレベルを参照することによって標準化される。現存するワクチンは、典型的に株１つ当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば子どもに対して、または汎発状況下で、あるいはアジュバントを使用する場合には、それより低い用量を使用することもできる。１／２（すなわち株１つ当たり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８などの分割用量が使用されており、同様により高い用量も使用されている（例えば、３倍または９倍用量［６、７］）。したがって組成物は、インフルエンザ株１つ当たり０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等のＨＡを含んでもよい。特定の用量には、株１つ当たり例えば約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５等が含まれる。ワクチンに含まれる株ごとに実質的に同じ質量のＨＡを含むのが通常であり、その結果、例えば株ごとのＨＡ質量は、株１つ当たり平均ＨＡ質量の１０％以内であり、好ましくは平均の５％以内である。生ワクチンについては、用量は、ＨＡ含量ではなく組織培養感染量の中央値（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、株１つ当たり１０６〜１０８（好ましくは１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が典型的である。ウイルス増殖のための基質として、ウイルスが鶏卵の感染尿膜腔液から収集されるＳＰＦ卵を使用するよりも、インフルエンザウイルス複製を支持する細胞系を使用してもよい。細胞系は、典型的に哺乳動物起源、例えばＭＤＣＫの細胞系である。インフルエンザＡウイルス免疫原は、任意の適切なＨＡサブタイプ株、例えばＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９等、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２および／またはＨ５Ｎ１株に由来するものであってよい。
【００５１】
免疫原は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなどのカンジダ真菌に対して免疫応答を誘発し得る。例えば、免疫原は、担体タンパク質にコンジュゲートし得るβ−グルカンであってよい。グルカンは、β−１，３および／またはβ−１，６結合を含み得る。適切な免疫原には、参考文献８および９に開示のものが含まれる。
【００５２】
免疫原は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含むストレプトコッカス細菌に対して免疫応答を誘発し得る。例えば、免疫原は、担体タンパク質にコンジュゲートし得る莢膜サッカライドであってよい。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅについては、サッカライドは、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＶの１つまたは複数に由来するものであってよい。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについては、サッカライドは、血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび／または２３Ｆの１つまたは複数に由来するものであってよい。莢膜サッカライド免疫原（複数可）に加えて（または莢膜サッカライド免疫原（複数可）の代わりに）、参考文献１０に開示の通り、例えばＲｒｇＢを含むポリペプチド免疫原を使用して、抗ストレプトコッカス防御免疫応答を誘発し得る。
【００５３】
免疫原は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含むスタフィロコッカス細菌に対して免疫応答を誘発し得る。例えば、免疫原は、ＩｓｄＡ抗原、ＩｓｄＢ抗原、ＣｌｆＡ抗原、ＣｌｆＢ抗原、ＳｄｒＤ抗原、Ｓｐａ抗原、ＥｓｘＡ抗原、ＥｓｘＢ抗原、Ｓｔａ００６抗原、溶血素、および／またはＳｔａ０１１抗原を含み得る。適切なＳ．ａｕｒｅｕｓ免疫原およびそれらの組合せは、参考文献１１に開示されている。
【００５４】
免疫原は、髄膜炎菌性細菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対して免疫応答を誘発し得る。例えば、免疫原は、担体タンパク質にコンジュゲートし得る莢膜サッカライドであってよい。莢膜サッカライドは、髄膜炎菌の血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹから保護するのに特に有用である。莢膜サッカライド免疫原（複数可）に加えて（または莢膜サッカライド免疫原（複数可）の代わりに）、例えば参考文献１２に開示の通り、特に血清型Ｂに対して使用するために、ポリペプチド免疫原および／または外膜小胞を使用して、抗髄膜炎菌防御免疫応答を誘発し得る。ワクチン単位用量当たりの莢膜サッカライドの典型的な量は、２．５〜１０μｇであるが、本発明ではアジュバントの抗原節約性質に起因して、より低い用量を使用することができる。
【００５５】
免疫原は、肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよび／またはＥ型肝炎ウイルスに対して免疫応答を誘発することができる。例えば、免疫原は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）であってよい。ワクチン単位用量当たりのＨＢｓＡｇの典型的な量は、５〜２０μｇであるが、本発明ではアジュバントの抗原節約性質（ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐａｒｉｎｇ  ｎａｔｕｒｅ）に起因して、より低い用量を使用することができる。
【００５６】
免疫原は、呼吸器合胞体ウイルスに対して免疫応答を誘発し得る。免疫原は、Ａ群のＲＳＶおよび／またはＢ群のＲＳＶに由来するものであってよい。適切な免疫原は、例えば参考文献１３および１４に開示の通り、Ｆ糖タンパク質および／またはＧ糖タンパク質またはその断片を含み得る。
【００５７】
免疫原は、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むクラミジア細菌に対して免疫応答を誘発し得る。適切な免疫原には、参考文献１５〜２１に開示のものが含まれる。
【００５８】
免疫原は、腸外病原性株を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌に対して免疫応答を誘発し得る。適切な免疫原には、参考文献２２〜２４に開示のものが含まれる。
【００５９】
免疫原は、ヒトＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルスに対して免疫応答を誘発し得る。適切な免疫原は、スパイク糖タンパク質を含み得る。
【００６０】
免疫原は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ細菌に対して免疫応答を誘発し得る。適切な免疫原には、ＣａｇＡ［２５〜２８］、ＶａｃＡ［２９、３０］、および／またはＮＡＰ［３１〜３３］が含まれる。
【００６１】
免疫原は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ細菌に対して免疫応答を誘発し得る。適切な免疫原には、ジフテリアトキソイド（「ＤＴ」）が含まれる。小児ワクチン単位用量当たりのＤＴの典型的な量は、１５〜３０Ｌｆ（「限界凝集（ｌｉｍｅｓ  ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ）用量」）であるが、本発明ではアジュバントの抗原節約性質に起因して、より低い用量を使用することができる。青年または成人のブースターワクチンでも、より少ない量、例えば１〜１０Ｌｆ／用量が典型的である。
【００６２】
免疫原は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ細菌に対して免疫応答を誘発し得る。適切な免疫原には、破傷風トキソイド（「ＴＴ」）が含まれる。小児ワクチン単位用量当たりのＴＴの典型的な量は、５〜１５Ｌｆ（「限界凝集用量」）であるが、本発明ではアジュバントの抗原節約性質に起因して、より低い用量を使用することができる。青年または成人のブースターワクチンでも、より少ない量、例えば１〜５Ｌｆ／用量が典型的である。
【００６３】
免疫原は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細菌に対して免疫応答を誘発し得る。百日咳抗原は、細胞性（不活化Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細胞の形態の全細胞；「ｗＰ」）または無細胞性（「ａＰ」）のいずれかである。無細胞抗原が使用される場合、以下の抗原：（１）解毒化百日咳毒素（百日咳トキソイドまたは「ＰＴ」）、（２）線維状赤血球凝集素（「ＦＨＡ」）、（３）パータクチン（「６９キロダルトンの外膜タンパク質」としても公知）の１つ、２つ、または（好ましくは）３つが含まれる。ＰＴは、化学的に解毒されてもよいし、または酵素活性が変異原性によって低下している変異体ＰＴ［３４］、例えば９Ｋ／１２９Ｇ二重変異体［３５］であってもよい。ＰＴ、ＦＨＡおよびパータクチンと同様に、無細胞百日咳抗原の成分に線毛（例えば、凝集原２および３）を含むことも可能である。小児ワクチンにおけるＰＴの典型的な量は、１０〜３０μｇ／用量である。小児ワクチンにおけるＦＨＡの典型的な量は、１５〜３０μｇ／用量である。小児ワクチンにおけるパータクチンの典型的な量は、２〜１０μｇ／用量である。本発明ではアジュバントの抗原節約性質に起因して、より低い用量を使用することができる。ブースターワクチンでも、より少ない量、例えば約３分の１少ない量が典型的である。
【００６４】
免疫原は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＢ型細菌（「Ｈｉｂ」）に対して免疫応答を誘発し得る。適切な免疫原には、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのタンパク質Ｄ、および血清型Ｂ髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体にコンジュゲートした、Ｈｉｂ莢膜サッカライド（「ＰＲＰ」）のコンジュゲートが含まれる。Ｈｉｂコンジュゲートの典型的な量（サッカライドとして測定）は、１用量当たり２．５〜１５μｇであるが、本発明ではアジュバントの抗原節約性質に起因して、より低い用量を使用することができる。
【００６５】
免疫原は、ポリオウイルスに対して免疫応答を誘発し得る。適切な免疫原には、不活化ウイルスが含まれる。典型的な組成物は、３種類のポリオウイルス抗原、すなわちポリオウイルス１型（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、ポリオウイルス２型（例えば、ＭＥＦ−１株）、およびポリオウイルス３型（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）を含む。１用量当たりのポリオウイルスの典型的な量は、１型では４０ＤＵ（「Ｄ抗原単位」）、２型では８ＤＵ、３型では３２ＤＵであるが、本発明ではアジュバントの抗原節約性質に起因して、より低い用量を使用することができる。
【００６６】
免疫原は、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）に対して免疫応答を誘発することができる。例えば、免疫原は、組換え型の糖タンパク質Ｂ、例えば参考文献３６で使用される可溶性抗原であってよい。
【００６７】
免疫原は、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に対して免疫応答を誘発し得る。例えば、免疫原は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質であってよい。例えば、オリゴマーを形成することができるｇｐ１４０（「ｏ−ｇｐ１４０」と呼ばれる）などの遺伝子操作したエンベロープ糖タンパク質が利用可能である。ｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ１２０配列およびｇｐ４１の外部ドメインを含み［３７］、ｇｐ１２０よりも良好な免疫原であることが報告されている［３８］。したがって、有用なエンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ４１の一部を含み得るが、その膜貫通ドメインは含まない。エンベロープ糖タンパク質のｇｐ１４０形態は、そのＶ２ループを欠失させ、ｇｐ１４０ΔＶ２変異体を生成することができ、このような欠失は、免疫原性を改善することが報告されている。ｇｐ１４０のΔＶ２変異体は、三量体を形成することが示されている［３９］。
【００６８】
免疫原は、狂犬病ウイルスに対して免疫応答を誘発し得る。適切な免疫原は、不活化狂犬病ウイルスである（参考文献４０、ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標））。
【００６９】
免疫原は、ヒトパピローマウイルスに対して免疫応答を誘発することができる。有用な免疫原は、ウイルス様の粒子（ＶＬＰ）として公知の構造を形成するように構築できるＬ１カプシドタンパク質である。ＶＬＰは、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または昆虫細胞（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａなどのスポドプテラ細胞、またはショウジョウバエ細胞）におけるＬ１の組換え発現によって産生され得る。酵母細胞については、プラスミドベクターがＬ１遺伝子（複数可）を担持することができ、昆虫細胞については、バキュロウイルスベクターがＬ１遺伝子（複数可）を担持することができる。より好ましくは、組成物は、ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株の両方に由来するＬ１  ＶＬＰを含む。この二価の組合せは、非常に有効であることが示されている［４１］。ＨＰＶ−１６株およびＨＰＶ−１８株に加えて、ＨＰＶ−６株およびＨＰＶ−１１株に由来するＬ１  ＶＬＰを含むことも可能である。
【００７０】
免疫原は、腫瘍抗原、例えばＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３（ＭＡＧＥ−Ａ３）、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＴＲＰ−２等に対して免疫応答を誘発し得る。免疫原は、肺癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌等に対して免疫治療上の応答を誘発し得る。
【００７１】
免疫原は、担体タンパク質にコンジュゲートした、乱用薬物であるハプテンに対して免疫応答を誘発し得る［４２］。乱用薬物の例として、オピエート、マリファナ、アンフェタミン、コカイン、バルビツレート（ｂａｒｂｉｔｕａｔｅ）、グルテチミド、メチプリロン、抱水クロラール、メタカロン、ベンゾジアゼピン、ＬＳＤ、ニコチン、抗コリン作用薬物、抗精神病剤、トリプタミン、他の精神異常発現性薬物、鎮静剤、フェンシクリジン、サイロシビン、揮発性ニトライト、ならびに身体的および／または心理的依存を誘発する他の薬物が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７２】
様々な他の免疫原を使用してもよい。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して免疫化するための組成物
【００７３】
本発明は、髄膜炎菌、例えば血清型Ｂに対して免疫化するのに特に有用である。
【００７４】
本発明の好ましい免疫原性組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバント、（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、および（ｉｉｉ）配列番号１を含むポリペプチドを含み、ここで（ｉｉ）のアルギニン塩中の本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、水酸化アルミニウムに吸着する。
【００７５】
本発明の好ましい免疫原性組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバント、（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、および（ｉｉｉ）配列番号２を含むポリペプチドを含み、ここで（ｉｉ）のアルギニン塩中の本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、水酸化アルミニウムに吸着する。
【００７６】
本発明の好ましい免疫原性組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバント、（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、（ｉｉｉ）配列番号１を含む第１のポリペプチド、および（ｉｖ）配列番号２を含む第２のポリペプチドを含み、ここで（ｉｉ）のアルギニン塩中の本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、水酸化アルミニウムに吸着する。この組成物は、例えば配列番号３、４または５のいずれかを含むポリペプチド（複数可）をさらに含むことができる。
【００７７】
本発明の好ましい免疫原性組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバント、（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、（ｉｉｉ）配列番号１を含む第１のポリペプチド、（ｉｖ）配列番号２を含む第２のポリペプチド、および（ｖ）配列番号３を含む第３のポリペプチドを含み、ここで（ｉｉ）のアルギニン塩中の本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、水酸化アルミニウムに吸着する。
【００７８】
本発明の好ましい免疫原性組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバント、（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、（ｉｉｉ）配列番号１を含む第１のポリペプチド、（ｉｖ）配列番号２を含む第２のポリペプチド、および（ｖ）配列番号４を含む第３のポリペプチドを含み、ここで（ｉｉ）のアルギニン塩は、水酸化アルミニウムに吸着する。配列番号４は、参考文献４３の配列番号１２６である。
【００７９】
本発明の好ましい免疫原性組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバント、（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、（ｉｉｉ）配列番号１を含む第１のポリペプチド、（ｉｖ）配列番号２を含む第２のポリペプチド、および（ｖ）配列番号５を含む第３のポリペプチドを含み、ここで（ｉｉ）のアルギニン塩中の本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物は、水酸化アルミニウムに吸着する。
【００８０】
第１、第２および／または第３のポリペプチドのいずれかは、最大３個のアミノ酸だけ、関連する配列番号１、２、３、４または５とは異なる場合があり、ただしポリペプチドは、適宜、配列番号１、２、３、４または５からなるポリペプチドに結合する抗体を依然として誘発することができる。
【００８１】
理想的には、第１、第２および／または第３のポリペプチドの１つ、２つまたは３つは、水酸化アルミニウムに吸着する。これらのポリペプチドは、参考文献１２、４４および４５に、より詳細に開示されている。組成物は、各ポリペプチドを５〜１００μｇ含んでもよい。組成物は、理想的には、いずれの細菌外膜小胞も含まない。
【００８２】
組成物は、式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を５〜１００μｇ含んでもよい。
【００８３】
組成物は、ヒスチジン緩衝液、例えば１０ｍＭヒスチジン緩衝液を含んでもよい。組成物は、スクロースおよび／または塩化ナトリウムを含んでもよい。組成物は、例えば筋肉内注射では、投与量体積０．５ｍｌで投与されてもよい。
【００８４】
さらに本発明の免疫原性組成物は、（ｉ）水酸化アルミニウムアジュバント、（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、（ｉｉｉ）髄膜炎菌Ｈ因子結合タンパク質抗原を含んでもよく、ただしこの抗原は、参考文献４６の配列番号８を含むアミノ酸配列を有する融合タンパク質ではない。Ｈ因子結合タンパク質抗原も、水酸化アルミニウムに吸着することができる。
複数の異なる免疫原を含む組成物
【００８５】
さらなる一態様によれば、本発明は、少なくとも２つの異なる免疫原と組み合わせて、本発明のアジュバント複合体を含む組成物を提供する。
【００８６】
本発明はまた、（ｉ）第１の容器内にアジュバント複合体および（ｉｉ）第２の容器内に少なくとも１つの免疫原を含むキットを提供する。第１の容器は、必要に応じて、複合体に加えて少なくとも１つの免疫原を含むことができる。
【００８７】
アジュバント複合体における免疫原性化合物は、本明細書に開示の、式（Ｉ）の化合物の任意のアルギニン塩であり得る。
【００８８】
「少なくとも２つの異なる免疫原」は、いくつかの実施形態では、（ｉ）麻疹ウイルス免疫原、ムンプスウイルス免疫原、および風疹ウイルス免疫原の組合せ、（ｉｉ）麻疹ウイルス免疫原、ムンプスウイルス免疫原、風疹ウイルス免疫原、および水痘ウイルス免疫原の組合せ、（ｉｉｉ）ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、および百日咳ワクチン、（ｉｖ）髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来のコンジュゲートの四価の組合せ、（ｖ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の細菌抗原の組合せ、（ｖｉ）インフルエンザウイルスの２つ以上の異なる株由来の抗原を含む組合せ、（ｖｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、Ｘおよび／またはＢ由来の外膜小胞の組合せ、（ｖｉｉｉ）異なる肺炎球菌の血清型由来のサッカライドの組合せ、（ｉｘ）Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原の組合せ、（ｘ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓホロ毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ならびに／または凝集原２および３の組合せ、（ｘｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の複数の異なるポリペプチド抗原の組合せからなることはない。
【００８９】
「少なくとも２つの異なる免疫原」は、いくつかの実施形態では、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の複数の異なるポリペプチド抗原の組合せ、例えば参考文献１２および４６に開示の組合せからなることはない。
【００９０】
「少なくとも２つの異なる免疫原」は、少なくとも１つの細菌抗原および少なくとも１つのウイルス抗原を含むことができる。
【００９１】
「少なくとも２つの異なる免疫原」が、細菌免疫原だけを含む場合、それらの免疫原には、理想的には少なくとも２つの異なる種の細菌についての免疫原が含まれる（したがって、例えば異なる髄膜炎菌性莢膜サッカライドの組合せは、すべて単一種に由来するので排除される）。
【００９２】
「少なくとも２つの異なる免疫原」は、互いにコンジュゲートしないものとする。したがって、Ｈｉｂサッカライドと破傷風トキソイドのコンジュゲートは、本明細書で使用される場合、「少なくとも２つの異なる免疫原」ではない。
【００９３】
「少なくとも２つの異なる免疫原」の好ましい実施形態は、（ｉ）例えば百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素および／またはパータクチンを含む、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および無細胞百日咳抗原、（ｉｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＢ型莢膜サッカライドコンジュゲート、（ｉｉｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｉｖ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＢ型莢膜サッカライドコンジュゲート、（ｖ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、および不活化ポリオウイルス抗原、（ｖｉ）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳抗原、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＢ型莢膜サッカライドコンジュゲート、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、および不活化ポリオウイルス抗原、または（ｖｉｉ）Ａ型肝炎ウイルス抗原およびＢ型肝炎ウイルス抗原などの組成物を含む。
【００９４】
組成物は、不活化ポリオウイルス抗原を含む場合、好ましくはポリオウイルス１型（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、ポリオウイルス２型（例えば、ＭＥＦ−１株）、およびポリオウイルス３型（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）のそれぞれに由来する抗原を含む。
【００９５】
組成物は、百日咳抗原を含む場合、理想的には不活化Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの全細胞を含まず、すなわち理想的には無細胞ワクチンである。
【００９６】
本発明の組成物は、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂおよび／またはポリオウイルス抗原を含むだけでなく、例えばさらなる病原体由来の抗原をさらに含んでもよい。例えば、これらの抗原は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹの１つまたは複数）またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するものであってよい。したがって組成物は、（ｉ）Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂおよび／またはポリオウイルス抗原の１つまたは複数、（ｉｉ）髄膜炎菌血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹの１つまたは複数に由来するコンジュゲートした莢膜サッカライド、（ｉｉｉ）ｆＨｂｐなどの髄膜炎菌に由来するポリペプチド抗原の２つまたは３つを含んでもよい。
【００９７】
複数の免疫原を含む本発明の組成物は、好ましくはいずれの細菌外膜小胞も含まない。
その場での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）沈殿法
【００９８】
一態様によれば、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩と可溶性アルミニウム塩の水性混合物を調製するステップと、次に（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物が吸着した沈殿アルミニウム塩を形成するために、非アルミニウム塩を先の水性混合物に添加するステップとを含む、アジュバント複合体を調製する方法を提供する。
【００９９】
別の態様によれば、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩および可溶性アルミニウム塩の水性混合物を、（ｉｉ）免疫原の緩衝水性混合物と混合するステップを含む、免疫原性組成物を調製する方法を提供し、ここで混合するステップによって、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物および免疫原が吸着したアルミニウム塩が沈殿する。
【０１００】
本発明はまた、（ｉ）可溶性アルミニウム塩の水溶液を、（ｉｉ）免疫原および本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩の緩衝水性混合物と混合するステップを含む、免疫原性組成物を調製する方法を提供し、ここで混合するステップによって、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物および免疫原が吸着したアルミニウム塩が沈殿する。
【０１０１】
本発明はまた、（ｉ）可溶性アルミニウム塩および免疫原の水溶液を、（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩の緩衝水性混合物と混合するステップを含む、免疫原性組成物を調製する方法を提供し、ここで混合するステップによって、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物および免疫原が吸着したアルミニウム塩が沈殿する。
【０１０２】
本発明はまた、これらの方法によって得られた、または得ることができる免疫原性組成物を提供する。
【０１０３】
これらの方法では、可溶性アルミニウム塩は、典型的にミョウバン（ＫＡｌ（ＳＯ４）２、典型的にＫＡｌ（ＳＯ４）２．１２Ｈ２Ｏ）または塩化アルミニウムである。代替アニオンをこの可溶性塩に添加すると、アルミニウム塩アジュバントをその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で沈殿させることができる。
【０１０４】
代替アニオンは、典型的に緩衝液の一部として添加される。したがって、例えばリン酸緩衝液が可溶性アルミニウム塩に添加される場合、リン酸アルミニウムアジュバントが沈殿し得る。緩衝液は、典型的に酢酸緩衝液、炭酸緩衝液またはリン酸緩衝液である。緩衝液をミョウバン溶液に添加すると、非晶質ヒドロキシ（緩衝アニオン）硫酸アルミニウム、例えばヒドロキシリン酸硫酸アルミニウムが沈殿する（参考文献４の第９章を参照）。
医薬組成物および生成物
【０１０５】
本発明は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、不溶性金属塩および／または免疫原を含むこともできる。
【０１０６】
本発明はまた、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩および不溶性金属塩を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、免疫原を含むこともできる。
【０１０７】
本発明はまた、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩および免疫原を含む免疫原性医薬組成物を提供する。この組成物は、不溶性金属塩を含むこともできる。
【０１０８】
本発明はまた、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせるステップを含む、医薬組成物を調製する方法を提供する。
【０１０９】
医薬組成物は、通常、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、不溶性金属塩および／または免疫原に加えて、いくつかの成分を含み、例えば典型的に１つまたは複数の薬学的担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）を含む。このような成分に関する完全な議論は、参考文献４７に見ることができる。
【０１１０】
医薬組成物は、特に投与時点では、好ましくは水性形態であるが、非水性液体形態または乾燥形態で、例えばゼラチンカプセル剤として、または凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）等で提示することもできる。
【０１１１】
医薬組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの１つまたは複数の保存剤を含んでもよい。水銀を含まない組成物が好ましく、保存剤を含まないワクチンを調製することができる。
【０１１２】
医薬組成物は、例えば浸透圧を制御するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことができる。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が典型的であり、これは１〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば１０±２ｍｇ／ｍｌまたは９ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等が含まれる。
【０１１３】
医薬組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有することができる。
【０１１４】
医薬組成物は、淡水（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）に化合物を含んでもよいが（不溶性金属塩と共に、または不溶性金属塩なしに）、通常は１種または複数の緩衝液を含む。典型的な緩衝液には、リン酸緩衝液（第１５の態様を除く）、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントの場合）、またはクエン酸緩衝液が含まれる。緩衝塩は、典型的に５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０１１５】
医薬組成物は、典型的に５．０〜９．５、例えば６．０〜８．０のｐＨを有する。
【０１１６】
医薬組成物は、好ましくは無菌である。
【０１１７】
医薬組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば１用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）を含有し、好ましくは１用量当たり＜０．１ＥＵを含有する。
【０１１８】
医薬組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【０１１９】
医薬組成物は、動物（特にヒト）の患者に投与するのに適しており、したがってヒト用および獣医用の両方を含む。医薬組成物は、患者に組成物を投与するステップを含む、患者の免疫応答を引き起こす方法で使用してもよい。
【０１２０】
医薬組成物は、単位用量形態で調製されてもよい。いくつかの実施形態では、単位用量は、０．１〜１．０ｍｌ、例えば約０．５ｍｌの体積を有してもよい。
【０１２１】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する、例えば単位用量を含有する送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザー、スプレー、吸入器、皮膚パッチ等）を提供する。このデバイスを使用して、脊椎動物被験体に組成物を投与することができる。
【０１２２】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する、例えば単位用量を含有する無菌容器（例えば、バイアル）を提供する。
【０１２３】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の単位用量を提供する。
【０１２４】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する密封容器を提供する。適切な容器には、例えばバイアルが含まれる。
【０１２５】
本発明はまた、（ｉ）不溶性金属塩および免疫原を含む第１のキット成分と、（ｉｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を含む第２のキット成分を含むキットを提供する。第２の成分は、理想的には不溶性金属塩を含まず、かつ／または免疫原を含まない。第１および第２の成分を組み合わせると、被験体に投与するのに適した組成物を提供することができる。
【０１２６】
本発明はまた、（ｉ）不溶性金属塩および本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を含む第１のキット成分と、（ｉｉ）免疫原を含む第２のキット成分を含むキットを提供する。第２の成分は、理想的には不溶性金属塩および／またはＴＬＲ作動薬を含まない。いくつかの実施形態では、第２の成分は、凍結乾燥されている。第１および第２の成分を組み合わせると、被験体に投与するのに適した医薬組成物を提供することができる。
【０１２７】
本発明はまた、（ｉ）免疫原および本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を含む第１のキット成分と、（ｉｉ）不溶性金属塩を含む第２のキット成分を含むキットを提供する。第２の成分は、理想的には免疫原および／またはＴＬＲ作動薬を含まない。第１および第２の成分を組み合わせると、被験体に投与するのに適した医薬組成物を提供することができる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、これらのキットは、２つのバイアルを含む。他の実施形態では、これらのキットは、１つの既に充填（ｒｅａｄｙ−ｆｉｌｌｅｄ）されているシリンジと１つのバイアルを含み、シリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物と混合される。バイアルの内容物が凍結乾燥されている場合、シリンジ／バイアルの配置が、有用である。しかし通常は、第１および第２のキット成分の両方は、水性液体形態である。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、様々な形態で調製されてもよい。例えば組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製されてもよい。注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁させるのに適した固体形態（例えば、凍結乾燥組成物またはスプレーフリーズドライ組成物）を調製することもできる。局所投与するために、例えば軟膏剤、クリーム剤または散剤として組成物を調製してもよい。経口投与するために、例えば錠剤もしくはカプセル剤、スプレー剤、またはシロップ剤（場合によっては風味付けされる）として組成物を調製してもよい。例えば微粉末を使用する吸入器、またはスプレーによって肺投与するための組成物を調製してもよい。組成物は、坐剤またはペッサリー剤として調製されてもよい。鼻、耳または眼に投与するために、例えばスプレー剤または点滴剤として組成物を調製してもよい。組成物は、組み合わされた組成物が、患者への投与の直前に再構成されるように設計されたキットの形態であってよい。このようなキットは、液体形態の１つまたは複数の抗原、および１つまたは複数の凍結乾燥抗原を含んでもよい。筋肉内投与のための注射剤が典型的である。
【０１３０】
組成物は、有効量の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩を含み、すなわち個体に単回用量でまたは一連の一部として投与されると、同時投与される免疫原に対する免疫応答を高めるのに有効となる量のアルギニン塩を含む。この量は、処置を受ける個体の健康状態および身体状態、処置を受ける個体の年齢、分類学的な群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類等）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチン製剤、医学的状況に対する担当医の評価、ならびに他の関連因子に応じて変わり得る。その量は、相対的に広範な範囲に含まれ、その範囲は、通例の試験によって決定され得る。１用量当たり２．５ｍｇまでの量、例えば１用量当たり１〜１０００μｇまたは１用量当たり１０〜１００μｇを使用することができる。
処置方法および免疫原性組成物の投与
【０１３１】
本発明は、被験体に、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、本発明の複合体および／または組成物を投与するステップを含む、被験体の免疫応答を引き起こす方法を提供する。
【０１３２】
本発明はまた、被験体において免疫応答を引き起こす方法で使用するための、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、本発明の複合体および／または組成物を提供する。
【０１３３】
本発明はまた、被験体において免疫応答を引き起こすための医薬品の製造における、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩または本発明の複合体の使用を提供する。
【０１３４】
本発明はまた、被験体において免疫応答を引き起こすための医薬品の製造における、（ｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩および（ｉｉ）不溶性金属塩の使用を提供する。同様に、本発明はまた、被験体において免疫応答を引き起こすための医薬品（例えばワクチン）の製造における、（ｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩、（ｉｉ）不溶性金属塩、および（ｉｉｉ）免疫原の使用を提供する。
【０１３５】
本発明は、ヒトまたは非ヒト動物（特に哺乳動物）被験体において免疫応答を引き起こすのに適している。本発明に従って調製された組成物を使用して、子どもおよび成人の両方を処置してもよい。
【０１３６】
これらの方法および使用によって刺激された免疫応答は、一般に抗体応答、好ましくは防御抗体応答を含む。免疫化した後の抗体応答を評価するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、免疫応答は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＣＰ−１、ｍＫＣおよび／またはＴＮＦ−αの増大を含み得る。
【０１３７】
処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによって行うことができる。複数回用量は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールで使用されてもよい。免疫学的に無感作の患者では、２回以上の用量（典型的に２回用量）の投与が特に有用である。多回用量は、典型的に少なくとも１週間（例えば、約２週、約３週、約４週、約６週、約８週、約１０週、約１２週間等）空けて投与される。
【０１３８】
本発明はまた、以下に示す式（Ｉａ）の化合物
【０１３９】
【化３】
0006325986.tif 000004
【０１４０】
およびその塩または溶媒和物に関する。式（Ｉａ）の化合物の塩には、アルギニン塩、特にＬ−アルギニン塩が含まれる。
概要
【０１４１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる」および「本質的にからなる」を包含するものであり、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなる場合があり、または追加の何かを、例えばＸ＋Ｙを含む場合がある。
【０１４２】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除しないものであり、例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合がある。必要に応じて、用語「実質的に」は、本発明の定義から除外される場合がある。
【０１４３】
数値ｘに関する用語「約」は、任意選択であり、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１４４】
具体的に記載されない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、任意の特定の混合順序を必要としない。したがって、成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合、２つの成分は、互いに組み合わせることができ、次にその組合せを第３の成分等と組み合わされてもよい。
【０１４５】
細胞培養で動物（特にウシ）由来の材料が使用される場合、それらの材料は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まず、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるものにすべきである。全体として、動物由来の材料が全く存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
【０１４６】
あるいは、化合物が組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、適切なプロドラッグで置き換えることができる。
【０１４７】
当業者は、式Ｉの化合物が、互変異性体として存在し得ることを理解されよう（例えば、ベンゾナフチリジン環は、互変異性化し得る）。本発明は、互いに単離された異なる互変異性体の形態、ならびにこれらの互変異性体の混合物を包含する。遊離塩基の塩形態の調製によって、遊離塩基に対する互変異性体の平衡が変化し得る。
【０１４８】
本発明に従って用いられる亜リン酸含有基は、周囲環境のｐＨ、例えばそれらの基が溶解する溶媒のｐＨに応じて、いくつかのプロトン化および脱プロトン化形態で存在し得る。したがって、特定の形態が例示されているが、別段言及されない限り、これらの例示は単に代表的なものであり、特定のプロトン化または脱プロトン化形態に限定することを意図するものではない。例えば、リン酸基の場合、リン酸基は−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２と例示されているが、その定義には、プロトン化形態である−［ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ２）（ＯＨ）］＋および−［ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ２）２］２＋、ならびに脱プロトン化形態である−［ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ）］−および［ＯＰ（Ｏ）（Ｏ）２］２−が含まれ、これらは例えば異なるｐＨ値で存在し得る。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸のアルギニン塩。
（項目２）
化学量論が１：１のアルギニンと３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸を有する、項目１に記載の塩。
（項目３）
前記アルギニン塩がＬ−アルギニン塩である、項目１から２のいずれか一項に記載の塩。
（項目４）
水和されている、項目１から３のいずれか一項に記載の塩。
（項目５）
一水和物である、項目１から４のいずれか一項に記載の塩。
（項目６）
実質的に非晶質固体である、項目１から５のいずれか一項に記載の塩。
（項目７）
治療に使用するための、項目１から６のいずれか一項に記載の塩。
（項目８）
治療に使用するための医薬品の製造における、項目１から６のいずれか一項に記載の塩の使用。
（項目９）
前記治療が、被験体において免疫応答を引き起こす方法である、項目７または８のいずれか一項に記載の、使用するための塩または塩の使用。
（項目１０）
被験体において免疫応答を引き起こす方法であって、前記被験体に、項目１から６のいずれか一項に記載の治療有効量の塩を投与するステップを含む、方法免疫応答を引き起こす。
（項目１１）
３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸を、溶媒中でアルギニンと接触させるステップを含む、項目１から６のいずれか一項に記載のアルギニン塩を調製する方法。
（項目１２）
３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸のアルギニン塩および不溶性金属塩を含む、組成物。
（項目１３）
免疫原をさらに含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
アジュバント複合体を調製する方法であって、３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸のアルギニン塩を、該酸が不溶性金属塩に吸着して該複合体を形成するように、該不溶性金属塩と混合するステップを含む、方法。
（項目１５）
式（Ｉａ）の化合物
【化１０１】
0006325986.tif 000005
またはその塩（例えば、Ｌ−アルギニン塩を含むアルギニン塩）もしくは溶媒和物。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩のＴＧＡおよびＤＳＣ分析を示す図である。
【図１Ａ】図１ａは、式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１Ｂ】図１ｂは、式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩の１５Ｎ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】図２は、Ｌ−アルギニン塩および遊離塩基のＸＲＰＤパターンを示す図である。
【図３】図３は、ＤＶＳ処理前および処理後の式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩のＸＲＰＤパターンを示す図である。
【図３Ａ】図３ａは、ＤＶＳ処理前および処理後の式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩試料４ｇのＸＲＰＤパターンを示す図である。
【図４】図４は、ＤＶＳ分析前および分析後の式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩のＤＳＣ分析を示す図である。
【図５】図５は、（Ａ）Ａｌ−Ｈ単独、（Ｂ）ＳＭＩＰ５０μｇ、遊離塩基、（Ｃ）ＳＭＩＰ５０μｇ、アルギニン塩、（Ｄ）ＳＭＩＰ５μｇ、遊離塩基、（Ｅ）ＳＭＩＰ５μｇ、アルギニン塩、（Ｆ）ＳＭＩＰ１μｇ、遊離塩基、（Ｇ）ＳＭＩＰ１μｇ、アルギニン塩、（Ｈ）ＩＣ３１、（Ｉ）アジュバントなし、（Ｊ）緩衝液単独の、１０種類のグループのｌｏｇ１０抗ＲＳＶ力価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１５０】
遊離塩基の合成
３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸遊離塩基の合成を、スキーム１を参照しながら以下に記載する。
ステップ１：（Ｅ）−３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−クロロフェニル）アクリル酸エチル（３）
【０１５１】
５−ブロモ−２−クロロフェニルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１）（１．０当量）のアセトニトリル（０．３Ｍ）およびＥｔＯＨ（０．５Ｍ）溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２．０当量）を添加した。反応物を脱気し、Ｎ２でフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）し、次に（Ｅ）−３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アクリル酸エチル（２）（１．２当量）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．１当量）を添加した。反応物をＮ２で再度フラッシュし、１００℃で一晩かけて撹拌した。室温に冷却した後、ヘキサンを添加し、混合物をシリカパッドを介して濾過し、生成物が完全に溶離されるまでＥＡ／Ｈｅｘ（１：１）で溶離した。濾液を濃縮し、ＣｏｍｂｉｆｌａｓｈによりＨｅｘ中０〜１５％ＥＡで溶離して精製して、（Ｅ）−３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−クロロフェニル）アクリル酸エチル（３）を白色固体として得た。
【化４】
0006325986.tif 000006
【０１５２】
ステップ２：３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−クロロフェニル）プロパン酸エチル（４）
【０１５３】
（Ｅ）−３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−クロロフェニル）アクリル酸エチル（３）（１．０当量）の酢酸エチル／エタノール（１：１、０．３Ｍ）溶液に、ウィルキンソン触媒（０．１０当量）を添加した。水素ガスをバルーン（ｂａｌｌｏｎ）によって導入し、反応物を室温で２４時間撹拌した。混合物を、セライトパッドを介して濾過し、ジクロロメタンで洗浄した。濾液を真空中で濃縮し、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈによりヘキサン中０〜１０％酢酸エチルで精製して、３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−クロロフェニル）プロパン酸エチル（４）を固体として得た。
ステップ３：３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）プロパン酸エチル（５）
【０１５４】
３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−クロロフェニル）プロパン酸エチル（４）（１．０当量）、４，４，４’，４’，５，５，５’，５’−オクタメチル−２，２’−ビ（１，３，２−ジオキサボロラン）（２．０当量）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．０５当量）、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル（０．２０当量）、および酢酸カリウム（２．０当量）の１，４−ジオキサン（０．２Ｍ）溶液を脱気し、１００℃で一晩かけて撹拌した。周囲温度に冷却した後、反応内容物を真空中で濃縮した。粗製材料を、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈによりヘキサン中０〜５０％酢酸エチルで精製して、３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）プロパン酸エチル（５）を褐色油として得た。生成物を−２０℃で保存し、合成して１カ月以内に使用した。
ステップ４：１−ブロモ−４−（メトキシメトキシ）−２−メチルベンゼン（７）
【０１５５】
４−ブロモ−３−メチルフェノール（６）（１．０当量）のＤＭＦ（０．５Ｍ）溶液に、０℃で６０重量％のＮａＨ（１．５当量）を少しずつ添加した。内部反応温度が１０℃を超えないように、添加を制御した。反応物を室温で４５分間撹拌し、次にクロロ（メトキシ）メタン（１．２当量）のＤＭＦ（３Ｍ）溶液を、追加の漏斗によって滴加した。反応物を室温で３．５時間撹拌し、次に氷に注ぐことによって急冷した。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。エーテルを添加し、二層を分離した。水層をエーテルで抽出した（１回）。組み合わせた有機層を、水（２回）、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、１−ブロモ−４−（メトキシメトキシ）−２−メチルベンゼン（７）を無色油として得た。粗製材料を、さらなる精製なしに次のステップで使用した。
ステップ５：トリエチル（（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェニル）エチニル）シラン
【０１５６】
１−ブロモ−４−（メトキシメトキシ）−２−メチルベンゼン（１．０当量）、トリエチルアミン（５．０当量）のＤＭＦ（０．５Ｍ）溶液を脱気し、窒素でフラッシュした。反応物に、ＴＥＳ−アセチレン（１．０５当量）、ＣｕＩ（０．０９８当量）、およびＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（０．０９８当量）を添加した。反応物を６０℃に加熱し、一晩かけて撹拌した。室温に冷却した後、水およびエーテルを添加した。各層を分離し、有機層を水で洗浄した（２回）。有機層を分離し、シリカパッド（ヘキサンを充填した）を通過させた。シリカをＨｅｘ中１０％ＥＡで溶離した。画分を組み合わせ、濃縮して、トリエチル（（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェニル）エチニル）シランを黒色油として得た。粗製材料を、さらなる精製なしに次のステップで使用した。
ステップ６：１−エチニル−４−（メトキシメトキシ）−２−メチルベンゼン（８）
【０１５７】
トリエチル（（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェニル）エチニル）シラン（１．０当量）の溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＨＦ中１Ｍ溶液、０．２０当量）を０℃でゆっくり添加した。この時点で氷浴を除去し、反応混合物を室温で４５分間撹拌した。次に、反応混合物をシリカパッド（ヘキサンを充填した）に通過させ、ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃで溶離して、不溶性塩を除去した。次に、粗製生成物を、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈによりヘキサン中０〜１０％ＥｔＯＡｃを使用して精製して、１−エチニル−４−（メトキシメトキシ）−２−メチルベンゼン（８）をわずかに褐色の液体として得た。
ステップ７：３−クロロ−５−（（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェニル）エチニル）ピコリノニトリル（１０）
【０１５８】
１−エチニル−４−（メトキシメトキシ）−２−メチルベンゼン（８）（１．０当量）、３，５−ジクロロピコリノニトリル（９）（０．９０当量）、ＣｕＩ（０．１０当量）、およびＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（０．１０当量）、およびトリエチルアミン（５．０当量）のＤＭＦ（０．２５Ｍ）溶液を脱気し、窒素でフラッシュした。次に、反応混合物を６０℃に加熱し、一晩かけて撹拌した。室温に冷却した後、水を添加した。混合物をＥＡで抽出した（２回）。組み合わせた有機層を、１０％ＮＨ４ＯＨ水溶液（２回）、ブラインで洗浄し、濃縮した。粗製材料を、シリカパッド（ヘキサンで湿潤させた）によって濾過した。シリカを、Ｈｅｘ中１０％ＥＡで溶離した。画分を組み合わせ、濃縮した。得られた固体を、加熱したエーテルで洗浄し、濾過して黄色固体を得、それをさらなる精製なしに次のステップで使用した。濾液を濃縮し、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈによりヘキサン中０〜１０％ＥｔＯＡｃを使用して精製して、３−クロロ−５−（（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェニル）エチニル）ピコリノニトリル（１０）を黄色固体として得た。
ステップ８：３−（５−アミノ−２−（（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェニル）エチニル）−ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１１）
【０１５９】
３−クロロ−５−（（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェニル）エチニル）ピコリノニトリル（１０）（１．０当量）、３−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）プロパン酸エチル（５）（１．２５当量）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．１０当量）、ジシクロヘキシル（２’，６’−ジメトキシビフェニル−２−イル）ホスフィン（０．２０当量）、および重炭酸ナトリウム（３．０当量）のｎ−ブタノール／Ｈ２Ｏ（５：１、０．２Ｍ）溶液を脱気し、１００℃で一晩かけて撹拌した。周囲温度に冷却した後、反応内容物を酢酸エチルおよび水で希釈した。二相を分離し、水層を酢酸エチルで２回抽出した。組み合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。粗製材料を、フラッシュクロマトグラフィーによりＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）システム（ＩＳＣＯ）で、まずＤＣＭ中０〜４０％酢酸エチルを使用して精製して不純物を除去し、次にＤＣＭ中０〜４％ＭｅＯＨを使用して精製して、３−（５−アミノ−２−（（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェニル）エチニル）−ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１１）を得た。加熱したエーテルで沈殿させ、洗浄することによって、さらなる精製が達成された。
ステップ９：３−（５−アミノ−２−（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１２）
【０１６０】
３−（５−アミノ−２−（（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェニル）エチニル）−ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１１）（１．０当量）のＥｔＯＨ／ＴＨＦ（３：１、０．１６Ｍ）溶液を、窒素でフラッシュした。次に、１０重量％のＰｄ／Ｃ（重量で０．２０当量）を添加した。反応物を水素でフラッシュし（２回）、水素バルーンの下で撹拌した。２４時間後、反応物をセライトパッドを介して濾過し、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨで洗浄した。濾液を、出発材料の存在についてＬＣＭＳを使用してチェックした。アルキン出発材料またはアルケン中間体が検出されなくなるまで、水素化反応を反復した。粗製生成物を、ＣｏｍｂｉｆｌａｓｈによりＤＣＭ中０〜４％ＭｅＯＨを使用して精製して、３−（５−アミノ−２−（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１２）を白色固体として得た。
ステップ１０：３−（５−アミノ−２−（４−ヒドロキシ−２−メチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１３）
【０１６１】
３−（５−アミノ−２−（４−（メトキシメトキシ）−２−メチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１２）（１．０当量）を、ＥｔＯＨ（０．２Ｍ）に溶解し、次に４Ｍ  ＨＣｌのジオキサン（０．２Ｍ）溶液を添加した。生成物が黄色塩として沈殿した。３時間撹拌した後、反応物を、撹拌したエーテル溶液に注いだ。混合物を１０分間撹拌し、次に濾過し、エーテルで洗浄した。３−（５−アミノ−２−（４−ヒドロキシ−２−メチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１３）を黄色固体として得、それを真空状態で一晩かけて乾燥させた（ビスＨＣｌ塩）。あるいは、粗製生成物を、ＣｏｍｂｉｆｌａｓｈによりＤＣＭ中０〜５％ＭｅＯＨを使用して精製して、遊離塩基を得た。
ステップ１１：２−（２−（２−ヨードエトキシ）エトキシ）エチルホスホン酸ジエチル
【０１６２】
マイクロ波管に、撹拌子、市販の１，２−ビス（２−ヨードエトキシ）エタン（１．０当量）および亜リン酸トリエチル（１．０当量）を入れた。マイクロ波管に蓋をし、次に撹拌しながら１６０℃で４０分間照射した。反応混合物を室温まで冷却し、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈによりヘキサン中０〜７５％ＥｔＯＡｃを使用して精製し、あるいはＲＰ−ＨＰＬＣ（ＡＣＮ中０．０３５％ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ中０．０５％ＴＦＡ、Ｃ１８カラム）によって精製して、２−（２−（２−ヨードエトキシ）エトキシ）エチルホスホン酸ジエチルを薄黄色油として得た。
ステップ１２：３−（５−アミノ−２−｛２−［４−（２−｛２−［２−（ジエトキシホスホリル）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）−２−メチルフェニル］エチル｝ベンゾ［ｆ］１，７−ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１５）
【０１６３】
３−（５−アミノ−２−（４−ヒドロキシ−２−メチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１３）（１．０当量）を溶解したＤＭＦ（０．１４Ｍ）溶液に、先のステップ１１から得た２−（２−（２−ヨードエトキシ）エトキシ）エチルホスホン酸ジエチル（１４）（１．３当量）のＤＭＦ（０．７Ｍ）および炭酸セシウム（４当量）溶液を添加した。反応物を６０℃で撹拌した。１．５時間後（またはＬＣＭＳによって反応が完了するまで）、ＤＣＭ（２体積当量）を反応物に添加した。固体（無機）を濾過し、濾液を濃縮した。粗製生成物を、ＣｏｍｂｉｆｌａｓｈによりＤＣＭ中０〜５％ＭｅＯＨを使用して精製して、３−（５−アミノ−２−｛２−［４−（２−｛２−［２−（ジエトキシホスホリル）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）−２−メチルフェニル］エチル｝ベンゾ［ｆ］１，７−ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１５）を得た。
ステップ１３：３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸（１６）
【０１６４】
３−（５−アミノ−２−｛２−［４−（２−｛２−［２−（ジエトキシホスホリル）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）−２−メチルフェニル］エチル｝ベンゾ［ｆ］１，７−ナフチリジン−８−イル）プロパン酸エチル（１５）（１．０当量）のＤＣＭ（０．１６Ｍ）溶液に、ＴＭＳＢｒ（１０当量）を０℃でゆっくり添加した。反応物を一晩かけて室温で撹拌した。追加のＴＭＳＢｒ（５．０当量）を０℃で添加し、反応物を室温で一晩かけて再び撹拌した。溶媒を蒸発によって除去し、橙色の粗製固体を高真空（ｈｉ−ｖａｃ）で手短に乾燥させた。固体をＥｔＯＨ（０．５Ｍ）中に懸濁させ、２．５ＮのＮａＯＨ（１０．０当量）を添加した。反応物を８０℃で３時間撹拌した。室温に冷却した後、混合物をｐＨ９〜１０に調節し、ＲＰ−ＨＰＬＣによりＣ１８カラムを使用して、１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ９）中１０〜４０％の９５：５（ＭｅＣＮ／５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ）の勾配で溶離して、直接精製した。生成物を含有する画分を組み合わせ、真空中で濃縮した。得られた白色ゲルを、還流状態の１：１のＥｔＯＨ／水（０．０４Ｍ）に溶解させ、数滴の水酸化アンモニウムを添加した。混合物が温かい間に、その混合物を、５０℃に予熱し撹拌した加熱アセトン溶液（０．００９Ｍ）にゆっくり注いだ。アセトン懸濁液を、撹拌を継続しながら１５分間かけてゆっくり室温に冷却し、次に氷浴中に１０分間置いた。固体を濾過し、アセトン（２回）およびエーテル（２回）で逐次的に洗浄した。固体を高真空で一晩かけて乾燥させて、化合物（１６）を固体として得た。３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸について、１Ｈ  ＮＭＲ（ジメチルスルホキシド−ｄ６）によって以下を得た。δ  ９．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．５５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．０Ｈｚ），  ７．５８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．４Ｈｚ），  ７．０６  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．０Ｈｚ），  ６．７６  （ｓ，  １Ｈ），  ６．６８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．０Ｈｚ），  ４．０３−４．００  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７１−３．６９  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６０−３．５４  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５１−３．４９  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．１６−３．１２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０３−２．９６  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．６７−２．６６  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３３−２．３２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２６  （ｓ，  ３Ｈ）．ＬＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝５９８．２
アルギニン塩の形成
【０１６５】
３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸９８．０２５ｍｇを、秤量してガラスバイアルに入れ、８０／２０メタノール／水中０．１Ｍアルギニン１．７ｍｌを添加して、５７ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。溶液を５０℃で６０分間かけてスラリー状にした。次にエタノール７ｍＬを添加し、それによって、数時間撹拌した後に白色綿毛状の沈殿物を得た。固体を濾過し、真空オーブン中、４０℃で３日間乾燥させて、３−（５−アミノ−２−（２−メチル−４−（２−（２−（２−ホスホノエトキシ）エトキシ）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−８−イル）プロパン酸のアルギニン塩１１０ｍｇを得た。
ＮＭＲデータ
【０１６６】
図１ａおよび１ｂは、本発明のＬ−アルギニン塩のＮＭＲスペクトルを、遊離塩基と比較して示す。式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩（黒四角）、遊離塩基（黒丸）、および遊離アルギニン（黒菱形）。
ＸＲＰＤデータ
【０１６７】
図２は、先に得たＬ−アルギニン塩のＸＲＰＤデータを、遊離塩基と比較して示す。式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩（１００ｍｇ（黒菱形）および１０００ｍｇ（黒四角））、遊離塩基（黒丸）。
安定性の研究
【０１６８】
先の方法によって形成したＬ−アルギニン塩を、熱安定性および光安定性について試験した。比較する目的で、遊離塩基およびアンモニウム塩も試験した。
【０１６９】
式（Ｉ）の化合物のバルクのアンモニウム塩およびアルギニン塩、ならびにバルクの遊離塩基を、３６時間かけて４０℃で照射することによって（１２０万ルクス−時間）、光安定性について試験した。遊離塩基は１２．３６％の分解を示し、アルギニン塩は９．７％の分解を示し、アンモニウム塩は４．６％の分解を示した。
【０１７０】
また、式（Ｉ）の化合物のアルギニン塩およびバルクの遊離塩基について、３６時間かけて４０℃で照射することによって（１２０万ルクス−時間）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）の溶液中の光安定性に関して試験した。遊離塩基は２３．１％の分解を示し、アルギニン塩は９．８％の分解を示した。アンモニウム塩は、試験しなかった。
【０１７１】
また、式（Ｉ）の化合物のバルクのアンモニウム塩およびアルギニン塩、ならびにバルクの遊離塩基について、８０℃で７日間加熱することによって、生理的ｐＨ（７．４）における熱安定性に関して試験した。加熱後、遊離塩基は１８．１％の分解を示したのに対して、アルギニン塩は０．１％の分解を示した。
【０１７２】
したがってアルギニン塩は、遊離塩基と比較して、生理的ｐＨで改善された熱安定性および光安定性を示した。アンモニウム塩は、アルギニン塩よりもわずかに良好な光安定性を示したが、アンモニウム塩には、特にその分解生成物が毒性のあるアンモニアガスになるという他の欠点がある。このことにより、アンモニウム塩は、医薬製剤での使用および長期保存に適していない。さらに、本発明によって包含される滅菌手順（例えば、高圧蒸気殺菌法）の最中に使用される温度などの高温（８０℃）では、アルギニン塩は、アンモニウム塩よりも安定である。アルギニン塩はまた、高圧蒸気殺菌法で使用される高温（８０℃）で、遊離塩基よりも安定である。
化学量論の確認
【０１７３】
先で生成したアルギニン塩に対して、元素分析を実施した。分析を、以下の表に示す。
【表１】
0006325986.tif 000007
【０１７４】
この分析によって式（Ｉ）の化合物とＬ−アルギニンの化学量論が１：１であることが確認される。標的は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物の理論的な一水和物塩である。
熱分析
【０１７５】
先で生成したＬ−アルギニン塩を、熱重量分析（ＴＧＡ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析した。結果を図１に示す。
水分収着
【０１７６】
先の方法によって得たＬ−アルギニン塩に対して、動的蒸気収着（ＤＶＳ）実験を実施した。ＤＶＳ分析はまた、アルギニン塩が吸湿性であり、相対湿度９０％でおよそ１８％の水を吸収することを示している。ＤＶＳ前（黒菱形）およびＤＶＳ後（黒四角）の塩のＸＲＰＤを、図３に示す。遊離塩基も、比較のために示す（黒丸）。ＤＶＳ処理後のアルギニン塩のＤＳＣ分析も実施し、ＤＶＳ処理前（黒菱形）およびＤＶＳ処理後（黒四角）の結果を図４に示す。遊離塩基も、比較のために示す（黒丸）。
【０１７７】
また、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩の試料４ｇに対して、ＤＶＳを実施した。ＤＶＳ分析はまた、アルギニン塩が吸湿性であり、相対湿度９０％でおよそ１３．７１％の水を吸収することを示している。２回のサイクル後、同量の水が吸着し、脱着することが示される。このことは、水和物がそれ以上形成されなかったことを示している（可溶性に対して負の影響を及ぼす場合がある）。ＸＲＰＤでは形態変化は見られない。ＤＶＳ前（黒菱形）およびＤＶＳ後（黒四角）の塩のＸＲＰＤを、図３ａに示す。
吸着研究−リン酸アルミニウム
【０１７８】
式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩の、市販のリン酸アルミニウムアジュバントに対する吸着では、吸着効率９７％が得られた（脱着状態の式（Ｉ）の化合物を回収することによって見出した）。リン酸アルミニウムアジュバントを無機リン酸塩（リン酸カリウム）で前処理することは、吸着能に影響を及ぼし、吸着は、濃度依存的に阻害された。しかし、リン酸アルミニウムアジュバントを１０ｍＭリン酸カリウムで処理すると、＞９０％が吸着したままであった。
【０１７９】
０．４ｍｇ／ｍｌの式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩および３ｍｇ／ｍｌのリン酸アルミニウム（Ａｌ３＋濃度として表す）、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて１つの製剤を調製した。リン酸アルミニウムを、様々な濃度のリン酸カリウム（１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭ）で一晩かけて処理した後、アルギニン塩中の式（Ｉ）の化合物をリン酸アルミニウムとともにインキュベートした。
【表２】
0006325986.tif 000008
【０１８０】
吸着研究−水酸化アルミニウム
【０１８１】
式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩を、濃度１ｍｇ／ｍｌで、３ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウム（「Ａｌ−Ｈ」）に対する吸着について試験した。化合物の吸着効率をＲＰ−ＨＰＬＣによって求めると、９９％であった。
吸着研究−リン酸カルシウム
【０１８２】
市販のリン酸カルシウムアジュバントへの式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩の吸着を、ヒスチジン緩衝液なしにｐＨ６．４で試験した。共に１．１２ｍｇ／ｍｌのＣａ２＋を含むが、アルギニン塩を０．２５ｍｇ／ｍｌまたは０．１２５ｍｇ／ｍｌのいずれかで含む２種類の製剤を調製する。吸着は、両方の製剤について約９０％であった。
インビボ送達後の全身曝露
【０１８３】
マウスおよびラットの前臨床種で見出される通り、Ａｌ−Ｈへの式（Ｉ）の化合物の吸着によって、ピーク血清濃度が低下し、筋肉内注射部位における滞留時間が増加した。このことは、全身曝露レベルの改変および制御、血中の炎症性サイトカインの潜在的な問題の回避、式（Ｉ）の化合物の安全性および／または忍容性の改善に大幅に寄与する。
【０１８４】
１０ｍＭヒスチジン緩衝液中、３ＭｅｎＢ抗原の存在下で、Ａｌ−Ｈに吸着した２種類の異なる製剤（一方は遊離塩基を含有し、他方は式（Ｉ）の化合物のＬ−アルギニン塩を含有する）の単回用量を、用量４ｍｇ／ｋｇでマウスに筋肉内投与した。遊離塩基製剤は、Ｔ１／２が９．５時間、Ｔｍａｘが０．８３時間、Ｃｍａｘが４６５ｎＭ、ＡＵＣ０〜２４が４５５２ｈ＊ｎＭであった。式（Ｉ）の化合物は、Ｔ１／２が８．４８時間、Ｔｍａｘが０．６７時間、Ｃｍａｘが４５３ｎＭ、ＡＵＣ０〜２４が４５３８ｈ＊ｎＭであった。
髄膜炎菌Ｂ
【０１８５】
参考文献１２は、３種類の別個のポリペプチドから生成した血清型Ｂ髄膜炎菌（「ＭｅｎＢ」）のワクチンを開示している（参考文献４６も参照）。これらの３種類のポリペプチドは、水酸化アルミニウム（「Ａｌ−Ｈ」）に吸着することができ、この吸着は、化合物（Ｉ）のアルギニン塩がＡｌ−Ｈに予め吸着した後も生じる。
この３価のＭｅｎＢワクチンの改変版について、ＧＮＡ２０９１−１８７０融合タンパク質を、参考文献４３に開示の「９３６−１０Ａ−１０Ａ」によって置き換えて試験した。このタンパク質の混合物を、式（Ｉ）の化合物を遊離塩基またはアルギニン塩として用いて、２つの異なる強度により試験した。腹腔内（ＩＰ）または筋肉内（ＩＭ）によりワクチンで免疫したマウスから血清を得、次にその血清を、５種類の異なる株に対して殺菌アッセイ（ＳＢＡ）で試験した。殺菌力価は、以下の通りであった。
【表３】
0006325986.tif 000009
【０１８６】
したがって、遊離塩基およびＡｒｇ塩は、共にＡｌ−Ｈ単独と比較して応答が改善され、パネルのあらゆる株に対して高い力価を示すことができ、ＩＰ経路によって投与した場合には、あらゆる株に対して≧８１９２の力価を達成し、それによってワクチンの株の適用範囲が改善された。
【０１８７】
さらにこれらの結果は、ＳＢＡ試験によって、化合物が遊離塩基またはＬ−アルギニン塩として吸着しても生物学的同等性が変化しないことを示している。
ＲＳＶ
【０１８８】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の三量体Ｆ糖タンパク質（３μｇ）を、Ａｌ−Ｈに吸着した遊離塩基またはアルギニン塩（１μｇ、５μｇ、５０μｇ）としての式（Ｉ）の化合物と共に製剤化する。比較のために、ＩＣ３１（商標）アジュバントも試験する。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１グループ当たり６匹）を、０日目および２１日目に免疫し、免疫応答を評価する。第１の用量を与えた３週間後の力価を、図５に示す。すべての３つの用量のＳＭＩＰにおいて、アルギニン塩（図５、グループＣ、Ｅ、Ｇ）は、遊離塩基（グループＢ、Ｄ、Ｆ）よりもわずかに力価が高く、力価はＡｌ−Ｈ単独（グループＡ）と比較して増加している。
【０１８９】
本発明を単に例示によって説明してきたが、本発明の範囲および精神に含まれる限り、改変を加え得ることを理解されたい。
【化５−１】
0006325986.tif 000010
【化５−２】
0006325986.tif 000011
【化６】
0006325986.tif 000012
【図１】
0006325986.tif 000013
【図１ａ】
0006325986.tif 000014
【図１ｂ】
0006325986.tif 000015
【図２】
0006325986.tif 000016
【図３】
0006325986.tif 000017
【図３Ａ】
0006325986.tif 000018
【図４】
0006325986.tif 000019
【図５】
0006325986.tif 000020
【配列表】
0006325986000001.app