(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２の２種類の異なるエピトープに特異的に結合する結合分子であって、ここで該結合分子は、
（ａ）ＨＥＲ２の第一のエピトープに特異的に結合する第一の結合ポリペプチド、但し、前記第一の結合ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列；または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり、前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、以下の式Ｉの配列を有し、ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10ＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16ＧＸ17ＷＷＸ18ＡＲＳＬＴＴＧＥＸ19ＧＸ20ＩＰＳＸ21ＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式Ｉ）
式中
Ｘ1は、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｎ、Ｓ、ＦまたはＫから選択され、
Ｘ2は、Ｓ、Ａ、ＲまたはＴから選択され、
Ｘ3は、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、ＷまたはＳから選択され、
Ｘ4は、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｈ、Ｔ、ＧまたはＦから選択され、
Ｘ5は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｆ、ＹまたはＥから選択され、
Ｘ6は、Ｒ、Ｍ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｌ、ＡまたはＰから選択され、
Ｘ7は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｆ、ＳまたはＡから選択され、
Ｘ8は、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｙから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ9は、Ｑ、Ｄ、Ｓ、Ｈから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ10は、Ｄ、Ｖから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ11は、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｗ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｐ、Ａ、ＤまたはＶから選択され、
Ｘ12は、Ｍ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｆ、Ｐ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｖ、ＬまたはＷから選択され、
Ｘ13は、Ｅ、Ｗ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｙ、ＬまたはＭから選択され、
Ｘ14は、Ｄ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｗから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｍ、Ｈ、Ｙから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ16は、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｉ、Ｅ、Ｑ、Ｐ、Ｄ、Ｎ、Ｈから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ17は、Ｖ、Ｄ、Ｔ、Ｉ又はＹから選択され、
Ｘ18は、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｔ又はＱから選択され、
Ｘ19は、Ｔ、Ｉ又はＶから選択され、
Ｘ20は、Ｙ、Ｌ又はＦから選択され、
Ｘ21は、Ｎ又はＳから選択される；および
（ｂ）ＨＥＲ２の第二のエピトープに特異的に結合する第二の結合ポリペプチド、但し、前記第二の結合ポリペプチドは、重鎖が配列番号１５４のアミノ酸配列；または配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり、かつ、軽鎖が配列番号１５５のアミノ酸配列；または配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる抗体であって、前記抗体のＣＤＲドメインは、配列番号１５４の３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６６（ＣＤＲ２）および９９〜１０８（ＣＤＲ３）番目のアミノ酸、および配列番号１５５の２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）番目のアミノ酸である；
を含む。
【請求項２】
前記第一の結合ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列；または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり、前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、以下の式Ｉの配列を有し、ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10ＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16ＧＸ17ＷＷＸ18ＡＲＳＬＴＴＧＥＸ19ＧＸ20ＩＰＳＸ21ＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式Ｉ）
式中
Ｘ1は、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｎ、Ｓ、ＦまたはＫから選択され、
Ｘ2は、Ｓ、Ａ、ＲまたはＴから選択され、
Ｘ3は、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、ＷまたはＳから選択され、
Ｘ4は、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｈ、Ｔ、ＧまたはＦから選択され、
Ｘ5は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｆ、ＹまたはＥから選択され、
Ｘ6は、Ｒ、Ｍ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｌ、ＡまたはＰから選択され、
Ｘ7は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｆ、ＳまたはＡから選択され、
Ｘ8は、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｙから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ9は、Ｑ、Ｄ、Ｓ、Ｈから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ10は、Ｄ、Ｖから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ11は、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｗ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｐ、Ａ、ＤまたはＶから選択され、
Ｘ12は、Ｍ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｆ、Ｐ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｖ、ＬまたはＷから選択され、
Ｘ13は、Ｅ、Ｗ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｙ、ＬまたはＭから選択され、
Ｘ14は、Ｄ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｗから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｍ、Ｈ、Ｙから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ16は、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｉ、Ｅ、Ｑ、Ｐ、Ｄ、Ｎ、Ｈから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ17は、Ｖ、Ｄ、Ｔ、Ｉ又はＹから選択され、
Ｘ18は、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｔ又はＱから選択され、
Ｘ19は、Ｔ、Ｉ又はＶから選択され、
Ｘ20は、Ｙ、Ｌ又はＦから選択され、
Ｘ21は、Ｎ又はＳから選択される、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
前記第一の結合ポリペプチドと第二の結合ポリペプチドがリンカーで連結されている、請求項１又は２に記載の結合分子。
【請求項４】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項３に記載の結合分子。
【請求項５】
前記リンカーが（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である、請求項４に記載の結合分子。
【請求項６】
結合分子に非共有結合または共有結合してもよい薬学上および／または診断上有効な成分である少なくとも１つの追加のポリペプチドをさらに含み、かつポリペプチドの用語は、３０までのアミノ酸からなる一群のペプチド、ならびに３０を上回るアミノ酸からなる一群のポリペプチドを含む、一群の分子を指す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項７】
（ｉ）第一の結合ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる；および
（ｉｉ）前記第二の結合ポリペプチドの前記抗体は、配列番号１５４のアミノ酸配列からなる重鎖、および、配列番号１５５のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項８】
配列番号１のＣ末端が配列番号１５５のＮ末端とリンクする、請求項７に記載の結合分子。
【請求項９】
配列番号１のＣ末端が配列番号１５５のＮ末端と（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカーを介してリンクする、請求項８に記載の結合分子。
【請求項１０】
（ｉ）第一の結合ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴で決定した場合に、ＨＥＲ２結合に関して少なくとも１×１０-8Ｍの解離定数を有し、かつ
配列番号１７２内にあるエピトープと結合し；および
（ｉｉ）前記第二の結合ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴で決定した場合に、ＨＥＲ２結合に関して少なくとも１×１０-9Ｍの解離定数を有する、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１】
前記エピトープは配列番号１７２のＴ１６６、Ｒ１８８、Ｐ１９７、Ｓ２０２およびＲ２０３の位置を含む、請求項１０に記載の結合分子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の結合分子をコードしている核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２の核酸分子を含んでいるベクター。
【請求項１４】
請求項１３のベクターで形質転換した宿主細胞または非ヒト宿主。
【請求項１５】
好適な条件における請求項１４の宿主細胞の培養、および産生された結合分子の単離を含む、ＨＥＲ２の２種類の異なるエピトープに特異的に結合する結合分子の産生方法。
【請求項１６】
組成物であって、
（ｉ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の結合分子；
（ｉｉ）請求項１２に記載の核酸分子；
（ｉｉｉ）請求項１３に記載のベクター；または
（ｉｖ）請求項１４に記載の宿主細胞、
のうちの少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項１７】
腫瘍の治療に用いるための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の結合分子であって、前記腫瘍が、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、膵癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、上部消化管に関する癌、結腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部の扁平細胞癌、子宮頸癌、膠芽腫、悪性腹水、リンパ腫および白血病からなる群より選択される、前記結合分子。
【請求項１８】
腫瘍の治療に用いるための、請求項１２に記載の核酸分子であって、前記腫瘍が、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、膵癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、上部消化管に関する癌、結腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部の扁平細胞癌、子宮頸癌、膠芽腫、悪性腹水、リンパ腫および白血病からなる群より選択される、前記核酸分子。
【請求項１９】
腫瘍の治療に用いるための、請求項１３に記載のベクターであって、前記腫瘍が、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、膵癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、上部消化管に関する癌、結腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部の扁平細胞癌、子宮頸癌、膠芽腫、悪性腹水、リンパ腫および白血病からなる群より選択される、前記ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞で発現している抗原の２種類の異なるエピトープに特異的に結合する結合分子に関し、ここでこの結合分子は、（ａ）腫瘍細胞で発現している前記抗原の第一のエピトープに特異的に結合する第一の結合（ポリ）ペプチド、但し、前記第一の結合（ポリ）ペプチドはＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドである、；および（ｂ）腫瘍細胞で発現している前記抗原の第二のエピトープに特異的に結合する第二の結合（ポリ）ペプチドを含む。本発明はさらに、本発明の結合分子をコードしている核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、ならびに前記ベクターで形質転換した宿主細胞または非ヒト宿主に関する。本発明はまた、本発明の結合分子の産生方法、ならびに医薬用組成物および診断用組成物にも関する。加えて本発明はまた、腫瘍の治療に用いるための本発明の結合分子、核酸分子、ベクターまたは宿主細胞にも関する。
【０００２】
本明細書では、特許出願や製造業者の手引きを含む多数の文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性には関連がないと見なされたとしても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、参照した全ての文書が、あたかも個々の文書が具体的にかつ個別に参照により組み込まれると示されるかのように、参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
非免疫グロブリン由来結合試薬（まとめて「足場」と呼ばれている；例えば、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）（２０００）分子認識学雑誌（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．）１３、１６７〜１８７を参照のこと）の、診断薬および治療薬としての使用が提案されている。過去１０年から１５年の間に、５０種類を上回るタンパク質足場が提唱されてきており、この分野で最も進んでいるアプローチとしては（ゲバウアー（Ｇｅｂａｕｅｒ）およびスケラ（２００９）化学生物学における最新の見解（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１３：２４５〜２５５にまとめられている通り）：アフィボディ（ブドウ球菌プロテインＡのＺ−ドメインをベースとしたもの）、クニッツ型ドメイン、アドネクチン（ヒトフィブロネクチンの１０番目のドメインをベースとしたもの）、アンチカリン（リポカリン由来）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートタンパク質由来）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）（多量体化ＬＤＬＲ−Ａをベースとしたもの）、そして、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメイン由来のフィノマーがある。
【０００４】
ＳＨ３ドメインは一般に、細胞のシグナル伝達に関与する多種多様なタンパク質に含まれている（ムサッチオ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ）ら（１９９４）生物物理学および分子生物学における進歩（Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）６１；２８３〜２９７）。これらドメインのタンパク質中での位置は固定されておらず、個別に発現させて、精製することができる。現在、１０００を上回るドメインの存在が知られており、その中にはおよそ３００種類のヒトＳＨ３ドメインが含まれている（ムサッチオ（２００３）タンパク質化学における進展（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）６１；２１１〜２６８）。ＳＨ３ドメインの配列は非常に多様性に富んでいるが、それらの全てが、２つの逆平行ベータシートから形成されているコンパクトなベータバレルという共通の折り畳み構造を有している（ムサッチオ（２００３）タンパク質化学における進展（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）６１；２１１〜２６８）。ＳＨ３ドメインは典型的に、ＰＸＸＰコア結合モチーフを含有しているプロリンリッチペプチドに結合するが（レン（Ｒｅｎ）ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９；１１５７〜１１６１）、一般的ではないＳＨ３結合部位の例についても記載がある（カークカイネン（Ｋａｒｋｋａｉｎｅｎ）ら（２００６）ＥＭＢＯレポート（ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．）７；１８６〜１９１）。現在までに配列が決定されているＳＨ３ドメインの大部分は、その全長がおよそ６０〜６５アミノ酸であるが、このうちのいくつかは、二次構造の主要な保存エレメント同士を連結しているループ内にアミノ酸が挿入されているために、８５ものアミノ酸を含んでいることを特徴としている場合がある（コヤマ（Ｋｏｙａｍａ）ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２（６）；９４５〜９５２）。数種のＳＨ３ドメインのアライメントから、適切な構造の形成ならびに標準的なプロリンリッチモチーフの認識に関わっている、保存されているアミノ酸残基が明らかになった（ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら（２０００）タンパク質科学（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）９；２１７０〜２１８０）。
【０００５】
標準的な化学療法薬を用いた腫瘍の治療は、薬剤が速い速度で分裂している腫瘍細胞を、正常な細胞よりも優先的に殺すという予測に基づいている。しかしながら、腫瘍細胞に対する選択性を欠いていることから、高い増殖率を有する正常な組織、例えば骨髄、胃腸管、および毛包では毒性を生じる。化学療法薬は、不十分な血液潅流、不規則な脈管構造、および腫瘍環境における高い間質圧による腫瘍量では、あまり蓄積しない（ボスレット（Ｂｏｓｓｌｅｔ）ら（１９９８）癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）５８：１１９５〜１２０１）。さらに、多剤耐性タンパク質は、薬剤の取り込みを低下させる可能性がある（ラマハンドラン（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ）ら（１９９９）分子診断学雑誌（Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ）４：８１〜９４）。その結果、腫瘍細胞を優先的に標的とする治療薬の開発が、現在の抗癌剤研究における主たる焦点となっている。こうした中、現在の抗癌研究の中で発展しつつある分野が、治療薬を、腫瘍関連抗原に結合させることによって腫瘍部位を標的として送達することであり、このことによって、正常な組織を維持しながら、腫瘍性病変に生理活性分子を濃縮することが期待される（パッフェン（Ｐｆａｆｆｅｎ）ら（２０１０）実験学的細胞研究（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ）３１６（５）８３６〜８４７）。例えば、乳癌および卵巣癌ではＨＥＲ２タンパク質の上方制御が観察され、予後不良と関連がある（スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）ら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：１７７〜１８２；スラモンら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：７０７〜７１２）。膀胱、唾液腺、子宮内膜、膵臓、甲状腺、腎臓、肺、上部消化管および結腸の癌腫など、一定の範囲の他の腫瘍型でも、ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅によることが多いが一律ではない）が観察された（ショル（Ｓｃｈｏｌｌ）ら（２００１）腫瘍学学会誌紀要（Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ）１２、付録１：Ｓ８１〜８７；ロスＪＳ（２０１１）薬学におけるバイオマーカー（Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｍｅｄ）３：３０７〜３１８；フクシゲ（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ）ら（１９８６）分子・細胞生物学雑誌（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）３：９５５〜９５８；コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら（１９８９）腫瘍遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）１：８１〜８８；ヴァイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ら（１９９０）癌研究５０：４２１〜４２５；パク（Ｐａｒｋ）ら（１９８９）癌研究２３：６６０５〜６６０９；ツァウ（Ｚｈａｕ）ら（１９９０）発癌の分子機構（Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．）５：２５４〜２５７；アースランド（Ａａｓｌａｎｄ）ら（１９８８）英国癌学会誌（Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ）４：３５８〜３６３；セリガー（Ｓｅｌｉｇｅｒ）ら（２０００）国際癌学会誌（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ）８７（３）：３４９〜３５９）。加えて、ＨＥＲ２が、乳癌組織と比較すると低いレベルではあるが、前立腺癌で過剰発現していることも分かっている（ミンネ（Ｍｉｎｎｅｒ）ら（２０１０）臨床学的癌研究（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）１６（５）：１５５３〜１５６０）。
【０００６】
これまでに、いくつかのＨＥＲ２結合タンパク質、例えばアフィボディやＤＡＲＰｉｎについて記載されてきた（ウィクマン（Ｗｉｋｍａｎ）ら（２００４）タンパク質の工学、設計および選択（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ）１７（５）：４５５〜４６２；ツァーント（Ｚａｈｎｄ）ら（２００７）３６９（４）：１０１５〜１０２８）。さらに、ハヅィアック（Ｈｕｄｚｉａｋ）らは、ヒト乳腺腫瘍細胞株を使って解析したマウス抗ＨＥＲ２抗体（４Ｄ５および２Ｃ４抗体を含む）のパネルの生成について記載している（ハヅィアックら（１９８９）分子・細胞生物学雑誌９（３）：１１６５〜１１７２；米国特許第５，６７７，１７１号もまたを参照のこと）。抗体に曝露した後の細胞の、相対的な細胞増殖を決定した。著者らは、抗体４Ｄ５が最も効果的に細胞増殖を阻害したことを示した。マウス抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化バージョン（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５〜８、トラスツズマブ、ハーセプチン（登録商標）、米国特許第５，８２１，３３７号もまた参照のこと）は、化学療法との併用におけるＨＥＲ２陽性転移性乳癌（ＭＢＣ）の管理に関し、１９９８年、米国食品医薬品局によって認可された。現在トラスツズマブは、単剤として（限られた患者群で）または内分泌療法もしくは化学療法との併用のいずれかにおいて、ならびに補助療法として、転移性ＨＥＲ２陽性腫瘍患者の第一選択治療として推奨されている（アワダ（Ａｗａｄａ）ら（２０１２）癌治療論評（Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ）、１０６（１）：６〜１３）。しかしながら、トラスツズマブを用いた治療の間には、一次（内因性）耐性または二次（治療中に獲得される）耐性が生じることが多い（ツァング（Ｔｓａｎｇ）ら（２０１２）英国癌学会誌１０６：６〜１３）。例えば、ＨＥＲ２を過剰発現している転移性乳癌のトラスツズマブ単剤治療に対する一次耐性の発生率が６６〜８９％であることが認められている。加えて、トラスツズマブを使用した投与計画に当初反応を示した患者の大部分が、１年以内に耐性を発現している（ナータ（Ｎａｈｔａ）ら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ臨床・実践学的腫瘍学（Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ）３（５）：２６９〜２８０）。トラスツズマブ治療に対する耐性を克服するためのいくつかの戦略が文献中に記載されている（ツァングら（２０１２）英国癌学会誌１０６：６〜１３；アワダら（２０１２）癌治療論評１０６（１）：６〜１３の総説を参照のこと）。
【０００７】
耐性を克服するための魅力的な方法の一つが、ＨＥＲ２結合剤の組み合わせを用いて表されている。こうした中、複数のグループが２種類の抗ＨＥＲ２抗体を組み合わせると、１種類の抗体のみで治療するよりもヒト腫瘍細胞株の成長が、インビトロでおよび／またはインビボで阻害されることを示した（ヤマシタ−カシマ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ−Ｋａｓｈｉｍａ）ら（２０１１）臨床学的癌研究１７（１５）：５０６０〜５０７０；ショイヤー（Ｓｃｈｅｕｅｒ）ら（２００９）癌研究６９（２４）：９３３０〜９３３６；リー−ホウフリック（Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈ）ら（２００８）癌研究６８（１４）：５８７８〜５８８７；カスプシュリック（Ｋａｓｐｒｚｙｋ）ら（１９９２）癌研究５２：２７７１〜２７７６；ベン−カズス（Ｂｅｎ−Ｋａｓｕｓ）ら（２００９）米国科学アカデミー紀要１０６（９）：３２９４〜３２９９）。特に、トラスツズマブをペルツズマブとの併用で使用した前臨床試験で高い効力が観察され（ペルツズマブは、ハヅィアックら（ハヅィアックら（１９８９）分子・細胞生物学雑誌９（３）：１１６５〜１１７２；米国特許第５，６７７，１７１号）に記載のマウス抗体２Ｃ４のヒト化形態である）；アダムス（Ａｄａｍｓ）Ｃ．Ｗ．ら（２００６）癌の免疫学および免疫療法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ）５５：７１７〜７２７；国際公開第２００１／００２４５号））、第ＩＩ相臨床試験では、トラスツズマブとペルツズマブを同時投与すると、それまでにトラスツズマブベースの治療を受けていても疾患が進行していた患者において、抗腫瘍応答の生成が認められた（バゼルガ（Ｂａｓｅｌｇａ）ら（２０１０）臨床腫瘍学会誌（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）２８：１１３８〜１１４４）。ペルツズマブはＨＥＲ２の細胞外部分のドメインＩＩに結合し、一方トラスツズマブは、膜の近位にある、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内のある部位に結合する。その結合特異性によってペルツズマブが、ＨＥＲ２が他のＨＥＲ受容体（例えばＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）と、活性型ヘテロ二量体を形成するのを妨げることが分かっている（アガス（Ａｇｕｓ）ら（２００２）癌細胞（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ）２：１２７〜１３７；フェンドリー（Ｆｅｎｄｌｙ）ら（１９９０）癌研究５０（５）：１５５０〜１５５８）。
【０００８】
近年、第ＩＩＩ相臨床試験において、ペルツズマブとトラスツズマブとドセタキセルの併用を、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌患者に対する第一選択治療として用いると、偽薬とトラスツズマブとドセタキセルとの併用と比較して、無増悪生存期間が有意に延長されたことが分かった（バゼルガら（２０１２）ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン３６６（２）：１０９〜１１９）。しかしながら、中央値に依存しない評価を行った無増悪生存期間は、６．１ヶ月しか延長していなかった（対照群で１２．４ヶ月なのに対してペルツズマブ群で１８．５ヶ月）。さらに、２種類以上の生体化合物の併用には２種類の分子の投与が必要となり、一般に、制御方法や臨床手順がより難しくなる。さらに、薬物動態や組織濃度の違いが、２種類の抗体の効力を低下させる可能性がある。
【０００９】
ＨＥＲ２またはＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）の異なるエピトープを標的とした抗体の組み合わせの高い治療効果に基づいて（ペレーラ（Ｐｅｒｅｒａ）ら（２００５）臨床学的癌研究１１：６３９０〜６３９９）、ＥＧＦＲ（国際公開第２０１１／０２００３３号）またはＨＥＲ２（２０１１年９月２７日に米国、ボストンで開催された二重特異性抗体サミット（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｕｍｍｉｔ）２０１１におけるヴォイセッチュレーガー（Ｗｏｉｓｅｔｓｃｈｌａｅｇｅｒ）Ｍ．の口頭発表。スライド番号５と１５）のいずれか一方の異なるエピトープに結合するＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を標的としする多重特異性タンパク質を設計するための試みがなされてきた。
【００１０】
国際公開第２０１１／０２００３３号では、フィブロネクチンドメインを使ったＥＧＦＲ結合タンパク質を単離し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体２２５（セツキシマブ（アービタックス（登録商標））としても知られている）の重鎖および／または軽鎖いずれかのＣ−またはＮ−末端に融合させた。ＥＧＦＲ結合フィブロネクチンドメインが抗体２２５とは異なるエピトープを認識することが示された。得られたフィブロネクチン−抗体融合体のうちのいくつかが、そのままの抗体２２５よりも効率的にＥＧＦＲのクラスター化と下方制御を誘導することが分かった。
【００１１】
ヴォイセッチュレーガーＭ．の発表では（２０１１年９月２７日に米国、ボストンで開催された二重特異性抗体サミット２０１１におけるヴォイセッチュレーガーＭ．の口頭発表。スライド番号５と１５）、ＨＥＲ２の２種類の異なるエピトープに結合するトラスツズマブベースの二重特異性ＨＥＲ２標的指向化抗体であるトラスツズマブ−Ｈｅｒ２−１が説明されていた。しかしながら、改変を行っていないトラスツズマブと比較して、二重特異性トラスツズマブベース抗体の活性の上昇は観察されなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、抗腫瘍治療を改善するための多くの研究が行われてきているという事実にもかかわらず、上述した欠点を克服する、癌のより効果的な治療用の新規治療用化合物の同定に対するニーズが未だ存在する。
【００１３】
特許請求の範囲で特徴付けた態様の提供により、このニーズに対応するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って本発明は、腫瘍細胞で発現している抗原の２種類の異なるエピトープに特異的に結合する結合分子に関し、ここでこの結合分子は、（ａ）腫瘍細胞で発現している前記抗原の第一のエピトープに特異的に結合する、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドである、第一の結合（ポリ）ペプチド、；および（ｂ）腫瘍細胞で発現している前記抗原の第二のエピトープに特異的に結合する第二の結合（ポリ）ペプチドを含む。
【００１５】
用語「抗原の２種類の異なるエピトープに特異的に結合する結合分子」は、腫瘍細胞で発現している１種類の抗原に対して、２種類の異なる結合特異性を有する結合分子に関する。言い換えれば、本発明の結合分子は、前記１種類の抗原の２つの別個の結合部位（つまりエピトープ）に特異的に結合することが可能である。さらに、本発明の二重特異性結合分子は、前記２種類の異なるエピトープに同時に結合することが可能である。
【００１６】
本発明によれば、それぞれの分子が同様の構造のエピトープに交差反応しないか、または本質的に交差反応しない場合、その分子は特異的に結合すると見なされる（本明細書では、特異的に相互作用するとも言われる）。研究対象の分子のパネルの交差反応性は、例えば、前記分子のパネルの、標準的な条件下での目的のエピトープに対する結合と、構造的および／または機能的に、関係の深いまたは関係の弱い複数のエピトープに対する結合とを評価することによって、試験することができる。問題とされる状況（例えば、タンパク質の構造に含まれる特異的なモチーフ）で目的のエピトープには結合するが、その他のどのエピトープにも結合しないまたは本質的に結合しない分子だけが、目的のエピトープに特異的であると見なされる。例えば、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）の『抗体：実験の手引き（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）』コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局（１９８８）、またはハーロウおよびレーン『抗体の使用：実験の手引き（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）』コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局（１９９９）に、相当する方法が記載されている。用語「同様の構造のエピトープに本質的に交差反応しない分子」とは、本明細書で使用する場合、標的の抗原に、同様の構造のエピトープに対するよりも少なくとも５倍高い親和性で、より好ましくは少なくとも１０倍高い親和性で、例えば少なくとも５０倍高い親和性などで、より好ましくは少なくとも１００倍高い親和性で、例えば少なくとも５００倍高い親和性などで結合する分子を指す。さらにより好ましくは、「同様の構造のエピトープに本質的に交差反応しない分子」は、標的抗原に、同様の構造のエピトープに対するよりも少なくとも１，０００倍高い親和性で、例えば少なくとも１０，０００倍高い親和性などで、より好ましくは少なくとも１００，０００倍高い親和性で、結合する。
【００１７】
用語「腫瘍細胞で発現している抗原」は、非腫瘍細胞では発現していないか、または非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞で多量に発現しているかのいずれかである抗原を指す。好ましくは、抗原は、腫瘍細胞において、非腫瘍細胞においてよりも少なくとも２倍多い量で、より好ましくは少なくとも５倍多い量で、例えば少なくとも１０倍多い量などで、さらにより好ましくは少なくとも１００倍多い量で、例えば少なくとも１０００倍多い量などで、最も好ましくは少なくとも１０，０００倍多い量で、発現している。好適な標的抗原には、腫瘍細胞でより強く発現しているそのような抗原のいずれもが含まれ、好ましくは、抗原は、本明細書の下記で定義する抗原のうちの１種である。
【００１８】
用語「（ポリ）ペプチド」は、本発明に従って使用する場合、一本鎖タンパク質またはその断片を含む、アミノ酸の直線状の分子鎖を表す。この用語は、３０までのアミノ酸からなる一群のペプチド、ならびに３０を上回るアミノ酸からなる一群のポリペプチド（本明細書ではタンパク質とも言う）を含む、一群の分子を指す。
【００１９】
さらに、アミノ酸および／またはペプチド結合が機能的類似体で置き換えられている、そのような（ポリ）ペプチドのペプチド模倣体も本発明に包含される。そのような機能的類似体には、遺伝子にコードされている２０種類のアミノ酸以外の全てのアミノ酸、例えばセレノシステインが含まれる。用語（ポリ）ペプチドはまた、その改変が、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化および当該分野においてよく知られている同様の修飾によってなされた、自然に改変された（ポリ）ペプチドも指す。
【００２０】
本発明によれば、結合分子は、（ａ）および（ｂ）で定義した２種類の結合（ポリ）ペプチドを含む。
【００２１】
第一の結合（ポリ）ペプチドは、腫瘍細胞で発現している前記抗原の第一のエピトープに特異的に結合し、かつ、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来のポリペプチドである。当然のことながら、本発明の結合分子には、１コピー以上の前記第一の結合（ポリ）ペプチド、例えば２、３または４コピーなどの第一の結合（ポリ）ペプチドが含まれ得る。
【００２２】
エピトープは、立体構造的なエピトープであっても、または連続的なエピトープであってもよい。ポリペプチド抗原においては、立体構造的（または不連続な）エピトープは、一次配列上では離れているが、エピトープを構成する天然の三次元構造をとるようにポリペプチドが折り畳まれた場合に、分子の表面で互いが近い位置になる、不連続な２つ以上のアミノ酸残基が存在することを特徴とする（セラ（Ｓｅｌａ）（１９６９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６６、１３６５およびレイバー（Ｌａｖｅｒ）（１９９０）Ｃｅｌｌ、６１、５５３〜６）。エピトープに寄与する不連続な２つ以上のアミノ酸残基は、抗原の別個のセクションに存在するか、あるいは１本以上の（ポリ）ペプチド鎖に存在することさえある。対照的に、直線状または連続的なエピトープは、ある（ポリ）ペプチド鎖の単一の直線状セグメントの中で、互いが近くに位置している別個の２つ以上のアミノ酸残基からなる。
【００２３】
用語「Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチド」は、本明細書では用語「フィノマー」と同じ意味で使用され、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する、非免疫グロブリン由来結合（ポリ）ペプチド（例えば、上述したいわゆる足場）を指す。Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドは当該分野でよく知られており、例えば、グラブロフスキ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ）ら（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁または国際公開第２００８／０２２７５９号、ベルツチンガー（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ）ら（２００７）タンパク質の工学、設計および選択２０（２）：５７〜６８、ゲバウアーおよびスケラ（２００９）化学生物学における最新の見解１３：２４５〜２５５）に記載されている。
【００２４】
ＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメイン（Ｆｙｎ  ＳＨ３）は６３の残基、すなわちセンバ（Ｓｅｍｂａ）ら（１９８６）（米国科学アカデミー紀要８３（１５）：５４５９〜６３）およびカワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）ら（１９８６）（分子・細胞生物学雑誌６（１２）：４１９５〜２０１）によって報告されている配列の８３〜１４５番目のアミノ酸を含み、その配列は、配列番号１６４で示す通り、
0006325463.tif 000002
である。Ｆｙｎは、５９ｋＤａの、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼのメンバーである。選択的スプライシングの結果、Ｆｙｎタンパク質は、キナーゼドメインが異なる２種類のイソ型として存在する。第一の形態は胸腺細胞、脾細胞およびいくつかの血液リンパ細胞株で見られ、第二の形態は主に脳で蓄積する（クック（Ｃｏｏｋｅ）およびペールムッター（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ）（１９８９）、新しい生物学（Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．）１（１）：６６〜７４）。細胞内タンパク質であるＦｙｎの生物学的機能は多様であり、Ｔ細胞受容体を介したシグナル伝達、脳機能の制御ならびに接着介在性シグナル伝達を含む（レッシュ（Ｒｅｓｈ）（１９９８）国際生物化学・細胞生物学雑誌（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）３０（１１）：１１５９〜６２）。他のＳＨ３ドメインと同様、ＦｙｎのＳＨ３は２つの逆平行β−シートから構成されており、他のタンパク質の相互作用するための２つの可動性ループ（ＲＴ−Ｓｒｃ−ループとｎ−Ｓｒｃ−ループ）を含んでいる。２の可動性ループの配列（ＲＴ−Ｓｒｃ−ループおよびｎ−Ｓｒｃ−ループと呼ばれている）はそれぞれ、下線および二重下線で示してある。Ｆｙｎ  ＳＨ３のアミノ酸配列は、ヒト、マウス、ラットおよびサル（テナガザル）で完全に保存されている。
【００２５】
当該分野において示されているように（国際公開第２００８／０２２７５９号；グラブロフスキら（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁）、ＦｙｎのＳＨ３ドメインは、結合タンパク質の生成にとって特に魅力的な足場、すなわちフィノマーである。この理由は、フィノマーが、（ｉ）細菌内では、可溶性の形態で多量に発現し得ること、（ｉｉ）溶液の状態で保存しても凝集しないこと、（ｉｉｉ）非常に安定であること（Ｔｍ：７０．５℃）、（ｉｖ）システイン残基を欠損していること、および（ｖ）元来、アミノ酸配列がマウスからヒトで完全に保存されていることを特徴とするヒト由来であり、不要な免疫原性反応が抑えられるためである。
【００２６】
当該分野では、特定の標的抗原に対する、特異的な結合Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドの誘導が記載されてきた。例えば、前記配列番号１６４で示す配列を変化させた、異なるＦｙｎ  ＳＨ３のライブラリーを作成することができる。好ましくは、この変化は（ｉ）ＲＴ−ループを表している配列もしくは必要に応じて、前記配列に隣接して２つまでの位置にあるアミノ酸を表している配列において（つまり前記配列番号１６４の、ＤＹＥＡＲＴＥＤＤＬの配列）、または（ｉｉ）Ｓｃｒループもしくは必要に応じて、前記配列に隣接して２つまでの位置にあるアミノ酸において（つまり、上で二重下線で示した配列番号１６４中の配列ＬＮＳＳＥＧ）または（ｉｉｉ）両方の配列において同時に、行われる。好ましくは、この変化は、当該分野において説明されているような、置換、欠損または付加である（例えば、国際公開第２００８／０２２７５９号；グラブロフスキら（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁を参照のこと）。アミノ酸配列を変化させるための手段や方法は当該分野においてよく知られており、また、当該分野では、例えばグラブロフスキら（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁に記載されている。
【００２７】
その後、このＦｙｎ  ＳＨ３ライブラリーをファージミドベクター、例えばｐＨＥＮ１などにクローニングすることができ（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら「糸状ファージ表面のマルチサブユニットタンパク質：抗体（Ｆａｂ）重鎖および軽鎖の提示方法（Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ）ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ）」、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）１９（１５）：４１３３〜７、１９９１年）、次いでライブラリーをファージ表面に提示させ、そして、それぞれの抗原に対するパニングを、このましくはパニングを何回か、例えば少なくとも２回、より好ましくは少なくとも３回など、繰り返して行う。その後、確立されている手法によって、例えばモノクローナルファージ−ＥＬＩＳＡなどによって、結合（ポリ）ペプチドのスクリーニングを実施することができる。次いで、このようにして同定したクローンの配列決定を利用して、濃縮された配列を明かにしてもよい。さらにこのようにして同定した結合（ポリ）ペプチドを、例えば、同定した配列の変化を基にした追加のライブラリーを生成し、ファージディスプレーとパニング工程を繰り返すことなどによる、さらなる成熟工程にかけてもよい。最後に、得られたＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドの交差反応性と免疫原性を解析してもよく、および標的抗原に特異的なＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドを選択することができる。
【００２８】
ファージディスプレースクリーニングや結合（ポリ）ペプチドの最適化に関するこれらの方法は、当該分野で一般的に知られている。
【００２９】
（ｂ）で定義した第二の結合（ポリ）ペプチドは、腫瘍細胞で発現している前記抗原の第二のエピトープに特異的に結合する。従って、かつ、本明細書前記で記載したように、このことは同じ抗原ではあるが、前記抗原が結合しているのとは異なるエピトープに、この第二の結合（ポリ）ペプチドが結合することを意味している。用語「異なる」エピトープは、第一の結合（ポリ）ペプチドが特異的に結合するエピトープとは重複していないエピトープを指す。従って、本発明による結合（ポリ）ペプチドのうち１種の結合は、第二の結合（ポリ）ペプチドの結合を遮断せず、従って両方の結合（ポリ）ペプチドが同時に結合することが可能になる。第二の結合（ポリ）ペプチドは、例えば抗体または上述した非免疫グロブリン由来結合試薬すなわち足場のいずれか、このましくは、アフィボディ（ブドウ球菌プロテインＡのＺ−ドメインをベースにしたもの）、クニッツ型ドメイン、アドネクチン（ヒトフィブロネクチンの１０番目のドメインをベースにしたもの）、アンチカリン（リポカリン由来）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートタンパク質由来）、アヴィマー（多量体化ＬＤＬＲ−Ａベース）からなる群より選択される足場などの、標的エピトープに特異的に結合することが可能ないかなる（ポリ）ペプチドであってもよい。これら全ての足場は当該分野においてよく知られており、かつ、本明細書前記で引用した参考文献に記載されている。
【００３０】
本発明の結合分子に含まれている結合（ポリ）ペプチドは単一のポリペプチド鎖を形成していてもよく、または、共有結合でもしくは非共有結合で違いに結合していてもよい複数のポリペプチド鎖として本発明の結合分子中に存在してもよい。結合（ポリ）ペプチドが単一のポリペプチド鎖を形成している場合、これらは前記分子中でどのような順序で配置されていても、例えば（ａ）から（ｂ）もしくは（ｂ）から（ａ）の順などで配置されていてもよい。より好ましくは、（ａ）と（ｂ）の結合（ポリ）ペプチドは詳述した順序、例えばＮ−末端からＣ−末端に向かって（ａ）から（ｂ）の順序で配置される。結合（ポリ）ペプチドが単一のポリペプチド鎖を形成しない場合、それでもそれらの結合（ポリ）ペプチドは、その中で互いが結合している直鎖を形成し得る。このような場合、それらは前記直鎖の中でどのような順序で配置されていても、例えば（ａ）から（ｂ）または（ｂ）から（ａ）などの順序で配置されていてもよい。より好ましくは、（ａ）と（ｂ）の結合（ポリ）ペプチドは、詳述した順序、例えば（ａ）から（ｂ）の順序で配置される。結合（ポリ）ペプチドは互いに対して頭部から尾部の順序で、つまり一方の結合（ポリ）ペプチドのＮ−末端が、（共有的にまたは非共有的に）もう一方の結合（ポリ）ペプチドのＣ−末端に結合する順序で配置されてもよい。または、結合（ポリ）ペプチドは、頭部同士もしくは尾部同士の順序で、つまり一方の結合（ポリ）ペプチドのＮ−末端が、（共有的にまたは非共有的に）もう一方の結合（ポリ）ペプチドのＮ−末端に結合するか、または一方の結合（ポリ）ペプチドのＣ−末端がもう一方の結合（ポリ）ペプチドのＣ−末端に結合する順序で配置されていてもよい。当然のことながら、結合（ポリ）ペプチドは非直線形の配置を形成してもよい。また、本明細書に記載の全ての結合分子に関し、２種類の結合（ポリ）ペプチドのそれぞれのエピトープに対する結合活性は、結合分子を形成した後も、つまり２種類の結合（ポリ）ペプチドが共有結合もしくは非共有結した後も、本明細書下記で定義するように、保持されるかまたは本質的に保持されることに留意されたい。結合分子が複数の（ポリ）ペプチド鎖を形成する場合、これらの鎖が互いに共有結合していることが好ましい。
【００３１】
本発明の結合分子は、当該分野において知られている（ポリ）ペプチド産生方法のうちのいずれかによって産生することができる。例えば、本明細書下記でより詳細に説明するように、本発明の結合分子をコードしている１つ以上核酸分子を好適な宿主中で発現させてもよく、このようにして産生された結合分子をその後単離することができる。本発明の結合分子の別の産生方法には、ｍＲＮＡのインビトロ翻訳がある。本発明に従って使用するための好適な無細胞発現系には、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽抽出物、イヌ膵臓ミクロソーム膜、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ３０抽出物、およびＴＮＴ−システム（プロメガ）などの転写と翻訳を統合した系が含まれる。これらの系では、クローニングベクター、ＤＮＡ断片、またはコード領域を含有しているＲＮＡ配列および適切なプロモーターエレメントを加えて、組換え（ポリ）ペプチドを発現させることができる。
【００３２】
組換えによる産生に加えて、本発明の結合分子を合成することによって、例えば固相技術を用いた直接的なペプチド合成（スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら（１９６９）固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）；フリーマン株式会社、サンフランシスコ；メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、米国化学学会誌（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．）８５（１９６３）、２１４９〜２１５４を参照のこと）によって産生してもよい。人工的なタンパク質合成は、手動の技術で、または自動化によって実施され得る。自動化された合成は例えば、アプライドバイオシステムズ４３１Ａペプチド合成機（パーキンエルマー、フォスターシティ、カリフォルニア）を使用し、製造業者が提供する説明に従って実施することで達成することができる。様々な断片を個別に化学的に合成し、その後化学的な手法を用いて組み合わせて完全長分子を産生してもよい。前述の通り、化学合成、例えばハウトン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）によって記載されている固相手順（米国科学アカデミー紀要（８２）（１９８５）、５１３１〜５１３５）を用いることができる。さらに、本発明の結合分子を半合成的に、例えば組換え産生と合成産生を組み合わせることによって、産生してもよい。
【００３３】
本発明によれば、驚いたことに、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドと、同じ抗原ではあるが、前記抗原の異なるエピトープに対する結合特異性を有する第二の結合（ポリ）ペプチドとを含む結合分子が、腫瘍細胞に対して優れた抗増殖活性を生じることが発見された。この活性は、単一特異性Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチド（Ｆｃ融合体で二価型）の活性よりも、また第二の結合（ポリ）ペプチド単独の活性よりも高く、さらに驚くべきことには、双方の化合物を併用して投与した場合の抗増殖効果よりも高かった。従って、本発明の結合分子の生成は、２種類の別個の結合（ポリ）ペプチドよりも高い効果をもたらす。
【００３４】
従って、本発明は結合分子を提供し、ここで前記結合分子が、それぞれの標的抗原を表面に発現している腫瘍細胞に結合すると、第一の単一特異的結合タンパク質が（ａ）のＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはこれからなり、および第二の単一特異的結合タンパク質が（ｂ）の結合（ポリ）ペプチドを含むかまたはこれからなる、２種類の単一特異的な結合タンパク質の結合の組み合わせによって得られる腫瘍活性の阻害よりも高い、改善された腫瘍活性の阻害が生じる。好ましくは、改善される腫瘍活性の阻害は相乗的である、つまり２種類の単一特異的結合タンパク質の結合の組み合わせによって得られる腫瘍活性の阻害と比較した時に、相加作用を上回るものである。
【００３５】
本発明の結合分子の好ましい態様では、腫瘍細胞で発現している抗原は、ＨＥＲ２、他のＥＧＦＲファミリーメンバー（ＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４を含む）、他の受容体チロシンキナーゼファミリー（ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ、ＥＰＨ、ＦＧＦＲ、ＥＰＨ、ＦＧＦＲ、ＩＮＳＲ、ＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ、ＲＯＳ、ＲＹＫ、ＴＩＥ、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＡＡＴＹＫファミリーを含む）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２およびＣＤ３０からなる群より選択される。
【００３６】
ＨＥＲ２は関連技術を踏まえて定義されており、かつ、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＥｒｂＢ−２とも呼ばれる、前記を参照のこと）との関連がある１８５−ｋＤａの受容体で、１９８４年に最初に記載された（シュレヒター（Ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｒ）ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ、３１２：５１３〜５１６）。ヒトＨＥＲ２（配列番号１７１）は、ＮＣＢＩの参照番号ＮＰ＿００４４３９（公開日２０１２年２月２６日）で表され、当該分野において、例えばロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら（２０００）腫瘍遺伝子１９：５５４８〜５５５７ならびに本明細書前記で引用した参考文献中において記載されてきた。他の受容体チロシンキナーゼファミリー（ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ、ＥＰＨ、ＦＧＦＲ、ＥＰＨ、ＦＧＦＲ、ＩＮＳＲ、ＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ、ＲＯＳ、ＲＹＫ、ＴＩＥ、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＡＡＴＹＫ）の標的は当該分野でよく知られており、かつ、ロビンソンら（２０００）腫瘍遺伝子１９：５５４８〜５５５７に、ＮＣＢＩの参照番号を含めて記載されている。
【００３７】
ＥｐＣＡＭは関連技術を踏まえて定義されており、かつ、ほとんど全ての癌腫に発現している全上皮分化抗原である、上皮細胞接着分子と関連している。ヒトＥｐＣＡＭは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１６４２２．２で表され（公開日２０１２年２月２２日）、および当該分野では、例えばステルナッド（Ｓｔｒｎａｄ）ら（１９８９）癌研究、４９（２）：３１４〜３１７で記載されている。
【００３８】
ＣＤ２０は関連技術を踏まえて定義されており、かつ、Ｂ−リンパ球抗原ＣＤ２０と関連している。ヒトＣＤ２０はＮＣＢＩの参照配列：ＮＰ＿６９０６０５．１で表され（公開日２０１２年１月８日）、および当該分野では、例えばダヴィドヴィクツ（Ｄａｗｉｄｏｗｉｃｚ）ら（２０１１）臨床および実験学的リウマチ学（Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）２９（５）：８３９〜８４２で記載されている。
【００３９】
ＣＤ３３は関連技術を踏まえて定義されており、かつ、ＣＤ３３抗原に関連している。ヒトＣＤ３３はＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７６３．３で表され（公開日２０１１年１２月１８日）、および当該分野では、例えばラポニ（Ｒａｐｏｎｉ）ら（２０１１）白血病とリンパ腫（Ｌｅｕｋ．  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）５２（６）：１０９８〜１１０７で記載されている。
【００４０】
ＣＤ５２は関連技術を踏まえて定義されており、かつ、ＣＤ５２抗原（ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原）に関連している。ヒトＣＤ３３はＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＡＸ０７８２２．１で表され（公開日２０１０年２月４日）、および当該分野では、例えばヴェンター（Ｖｅｎｔｅｒ）ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９１（５５０７）：１３０４〜１３５１に記載されている。
【００４１】
ＣＤ３０は関連技術を踏まえて定義されており、かつ、ＣＤ３０抗原に関連している。ヒトＣＤ３０はＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＡ５１９４７．１で表され（公開日１９９４年１１月１日）、および当該分野では、例えばデュルコップ（Ｄｕｒｋｏｐ）、Ｈら（１９９２）Ｃｅｌｌ、６８（３）：４２１〜４２７に記載されている。
【００４２】
本発明の二重特異性結合分子の好ましい態様では、抗原はＨＥＲ２である。
【００４３】
本発明の結合分子のさらに好ましい態様では、第二の結合（ポリ）ペプチドは抗体である。
【００４４】
抗体は、いかなるクラスの抗体のモノクローナル抗体であってもまたはポリクローナル抗体であってもよい。用語「抗体」は、それぞれの完全長または非改変抗体の結合特異性を今まで通り保持している抗体断片またはその誘導体をも含む。本発明の抗体はまた、例えば合成抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体およびヒト化抗体の態様も包含する。
【００４５】
用語「抗体断片」は、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨＣおよびＣＨ１ドメインからなる）、（ｉｖ）Ｆｖ断片および（ｖ）例えば可変領域の抗原結合部分に特異的に結合するのに十分なフレームワークを有する単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）、などの断片に関する。用語「抗体誘導体」は、本発明の文脈においては、化学的に改変した抗体および抗体断片を定義する。これには、ｓｃＦｖ断片、単一ドメイン抗体などが含まれる。従って抗体誘導体は、化学的／生化学的または分子生物学的方法によって改変された抗体分子および／または（ポリ）ペプチドから誘導された（ポリ）ペプチドであることが多い。抗体断片とその特異的エピトープとの特異的な相互作用に最低限必要とされるのは、抗体断片とエピトープとの適合が可能な状況の中で、親抗体の可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）に由来する１つ以上のＣＤＲが存在することである。そのような状況は、抗体の適切なフレームワークを使用することで提供することができる。当該分野で知られている通り、用語「フレームワーク」とは、抗体または抗体誘導体に関し、ＣＤＲ同士の間のスペーサーとして機能し、そのＮ末端側およびＣ末端側に伸長し、ＣＤＲによる抗原結合部位の形成を可能にする構造をもたらすアミノ酸配列を定義する。フレームワーク配列またはＣＤＲ配列の改変、例えば分子生物学的な方法によって結合親和性を高めるための改変は、当該分野で知られている標準的な技術、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／または組換えおよび／または当該分野において知られている任意の他の改変（例えば翻訳後および化学的修飾、例えばグリコシル化やリン酸化）を単独で、あるいは組み合わせて用いる（ポリ）ペプチドの改変を含み得る。免疫グロブリンのアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にこのような改変を導入する方法は当業者には良く知られており；例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験の手引き（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、第二版（１９８９年）および第三版（２００１年）；ゲルハルト（Ｇｅｒｈａｒｄｔ）ら、一般的なおよび分子学的細菌学に関する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）ＡＳＭ出版、１９９４；レフコヴィッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）、免疫学的手法の手引き（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ）：技術に関する包括的な教科書（Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、アカデミック・プレス、１９９７；またはゴレミス（Ｇｏｌｅｍｉｓ）、タンパク質間相互作用（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）：分子クローニングの手引き（Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、２００２を参照のこと。
【００４６】
本発明による抗体は、エピトープと特異的に結合／相互作用することが可能である。エピトープはポリペプチド構造であっても、ならびにアミノ酸を含まない化合物、例えば多糖などであってよい。用語「特異的に結合／相互作用する」とは、本明細書前記で定義した通りである。
【００４７】
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。さらにより好ましくは、その（モノクローナル）抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭクラス（ならびにそのサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４））の抗体である。
【００４８】
当然のことながら、本明細書下記で定義するように２種類の結合（ポリ）ペプチドの結合能が保持されるかまたは本質的に保持される限りは、第一の結合（ポリ）ペプチドを表しているＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドを任意の可能な位置で抗体と結合させてもよい。例えば、完全長抗体を利用する場合には、第一の結合（ポリ）ペプチドを表しているＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドを、抗体の重鎖または軽鎖いずれかのＮ末端またはＣ末端に結合させることができる。好ましくは、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドを、抗体の軽鎖のＮ末端に結合させる。
【００４９】
本発明の結合分子の別の好ましい態様では、第一のおよび第二の結合（ポリ）ペプチドはリンカーによって連結される。
【００５０】
用語「リンカー」は、本発明に従って使用される場合、本発明の結合分子の結合（ポリ）ペプチドを隔てている、連続したアミノ酸（つまりペプチドリンカー）ならびに非ペプチドリンカーに関する。当然のことではあるが、結合分子が単一のポリペプチド鎖として存在する場合には、リンカーはペプチドリンカーである。
【００５１】
リンカーの特性、つまり長さおよび／または組成（例えばアミノ酸配列など）は、分子の安定性および／または溶解度を改変または向上させ得、生じる結合分子の柔軟性を向上させ得、および／または立体障害を抑制することで、標的抗原に対する結合を改善させ得る。リンカーの長さや組成は、本発明の結合分子のそれぞれの結合（ポリ）ペプチドの組成に依存する。当業者であれば、異なるリンカーの適正を試験するための方法に精通している。例えば、異なる種類のリンカーを用いる場合には、結合分子の特性はその結合親和性を解析することで容易に試験することができる。加えて、対応する測定を、それぞれの結合（ポリ）ペプチド単体に関して行い、結合分子の結合親和性と比較してもよい。生じる分子の安定性は、当該分野において知られている方法、例えばヒト血清と共に、３７℃で、一定の期間、数回インキュベートした後の分子の残存結合能を決定するＥＬＩＳＡ法などを用いることによって、測定することができる。
【００５２】
本発明で想定されるペプチドリンカーは、アミノ酸で構成される（ポリ）ペプチドリンカーである。好ましくは、リンカーの長さは１〜１００アミノ酸である。より好ましくは、リンカーの長さは５〜５０アミノ酸であり、さらにより好ましくは、リンカーの長さは１０〜２０アミノ酸である。最も好ましくは、リンカーの長さは１５アミノ酸である。好ましい態様では、リンカーは、例えばアミノ酸のアラニンとセリンまたはグリシンとセリンを用いた柔軟なリンカーである。好ましくは、リンカー配列は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。最も好ましくは、リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。
【００５３】
用語「非ペプチドリンカー」とは、本発明に従って使用される場合、上述のペプチドリンカーを除く、２つ以上の反応基を有する結合基を指す。例えば、非ペプチドリンカーは例えば、両端に反応基を有し、それぞれが個別に本発明の分子の結合部分の反応基（例えば、アミノ末端、リシン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基）に結合する、ポリエチレングリコールなどのポリマーであってよい。ポリマーの反応基としては、ヒドロキシル基、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、ケトン基、ビニルスルホン基、チオール基、ヒドラジド基、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）基、炭酸ニトロフェニル（ＮＰＣ）基、トリシレート（ｔｒｙｓｙｌａｔｅ）基、イソシアナート基、およびスクシンイミド誘導体が挙げられる。スクシンイミド誘導体の例としては、プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＡ）、ブタン酸スクシンイミジル（ＳＢＡ）、スクシンイミジル＝カルボキシメチラート（ＳＣＭ）、スクシンイミジル＝スクシンアミド（ＳＳＡ）、スクシンイミジル＝スクシナート（ＳＳ）、炭酸スクシンイミジル、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が挙げられる。非ペプチドポリマーの両端の反応基は同じであってもまたは異なっていてもよい。例えば、非ペプチドポリマーは片側の末端にマレイミド基を有し、もう一方の末端にアルデヒド基を有していても良い。好ましくは、ポリマーはポリエチレングリコールである。
【００５４】
最も好ましくは、リンカーはペプチドリンカーである。
【００５５】
別の好ましい態様では、本発明の結合分子は少なくとも１つの追加の（ポリ）ペプチドをさらに含む。
【００５６】
そのような追加の（ポリ）ペプチドの非限定的な例としては、例えば、本発明の結合分子の性能を改善するのに好適なタグまたは機能性（ポリ）ペプチドを含む、薬学上および／または診断上有効な成分がある。
【００５７】
薬学上および／または診断上有効な成分は、例えば、サイトカイン、毒性化合物、ケモカイン、酵素、蛍光色素および光増感剤、抗凝血因子、好ましくは組織因子、放射性核種または本発明の結合分子の血清半減期を調節する化合物から選択してもよい。
【００５８】
サイトカインの非限定的な例としては、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ＣＤ８０、Ｂ７０、ＴＮＦベータ、ＬＴ−ベータ、ＣＤ−４０リガンド、Ｆａｓ−リガンド、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１アルファおよびＩＬ−１ベータが挙げられる。
【００５９】
毒性化合物の例としては、限定するものではないが、カリチアマイシン、マイタンシノイド、ネオカルチノスタチン、エスペラミシン、ジネマイシン、ケダルシジン、マズロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アウリスタチン、リシンＡ鎖、モデシン、切断型緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素および組換えゲロニンが挙げられる。
【００６０】
ケモカインの非限定的な例としては、ＩＬ−８、ＧＲＯアルファ、ＧＲＯベータ、ＧＲＯガンマ、ＥＮＡ−７８、ＬＤＧＦ−ＰＢＰ、ＧＣＰ−２、ＰＦ４、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＳＤＦ−１アルファ／ベータ、ＢＵＮＺＯ／ＳＴＲＣ３３、Ｉ−ＴＡＣ、ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＤＣ、ＴＥＣＫ、ＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＤＣ−ＣＫ１、ＭＩＰ−３アルファ、ＭＩＰ−３ベータ、ＭＣＰ−１〜５、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９、ＭＰＩＦ−１、６Ｃｋｉｎｅ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、リンホタクチンおよびフラクタルキンが挙げられる。
【００６１】
蛍光色素としては例えば、アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）またはＣｙ色素が挙げられ、光増感剤としては例えば、光毒性赤色蛍光タンパク質のキラーレッド（ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）またはヘマトポルフィリンが挙げられる。
【００６２】
酵素の非限定的な例としては、プロドラッグ活性化用の酵素、好ましくは、カルボキシ−ペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼからなる群より選択される酵素が挙げられる。
【００６３】
放射性核種は例えば、ガンマ線放出同位元素の群、好ましくは９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎから；陽電子放出核種の群、好ましくは１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉから；ベータ線放出核種の群、好ましくは１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕから；またはアルファ線放出核種の群、好ましくは２１３Ｂｉ、２１１Ａｔから選択することができる。
【００６４】
血清半減期を調節する化合物の例としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、抗体のＦｃドメイン、アルブミン−結合タンパク質および立体構造が異常なポリペプチド配列が挙げられる。
【００６５】
タグの非限定的な例としては、ストレプ（Ｓｔｒｅｐ）−タグ、ヒス（Ｈｉｓ）−タグ、ミック（Ｍｙｃ）−タグ、タップ（ＴＡＰ）−タグまたはフラグ（Ｆｌａｇ）−タグが挙げられる。追加の機能性（ポリ）ペプチドには、例えば、カッパ分泌リーダーなどの分泌ペプチドまたはＮ−グリコシル化部位を供与しているペプチドがある。
【００６６】
本明細書前記で概説したように、追加の（ポリ）ペプチドのうちのいくつかは、追加の医薬的または診断的活性を有し得るか、または本発明の結合分子の安定性を向上させて、それによって、その抗腫瘍原性活性を高め得るが、他の追加の（ポリ）ペプチドはその代わりに、結合分子の調製および／または精製を促進し得る。
【００６７】
本発明の結合分子に、上で定義した追加の（ポリ）ペプチドを追加する方法は、当業者にはよく知られており、また、例えばサンブルック、２００１、前記引用に記載されている。追加の（ポリ）ペプチドが、本発明の結合分子に非共有結合しても、または共有結合してもよいこと、例えば、追加の（ポリ）ペプチドが結合分子と融合タンパク質を形成してもよいこと、例えばそれらが単一のポリペプチド鎖を形成してもよいことに留意されたい。そのような融合タンパク質は例えば、単一の核酸分子にコードされる場合もある。
【００６８】
また、多量体、例えば、本発明の結合分子を形成し、必要に応じて本明細書前記で定義した追加の（ポリ）ペプチドを含む、例えば二量体、三量体、四量体なども本発明に包含される。そのような多量体は共有結合または非共有結合で形成されていてもよく、好ましくは共有結合で形成されている。好ましくは、多量体は、本明細書前記で定義したリンカー、好ましくは上で定義したペプチドリンカーを介して形成される。より好ましくは、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２であるか、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。最も好ましくは、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。
【００６９】
本発明の結合分子のさらに好ましい態様では、第一の結合（ポリ）ペプチドは、（ｉ）配列番号１〜１５２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
【００７０】
結合（ポリ）ペプチドが詳述したアミノ酸配列を含む（からなる、というよりはむしろ）そのような態様では、追加のアミノ酸は、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか、または両端の特異的配列にかけて伸長している。好ましくは、Ｎ末端に存在する追加のアミノ酸が５０以下であり、かつ、Ｃ末端に存在する追加のアミノ酸が５０以下である。より好ましくは、４０以下、例えば３０以下、より好ましくは２０以下、例えば１０、以下９、以下８、以下７、以下６、以下５、以下４、以下３、以下２以下、さらにより好ましくは１以下の追加のアミノ酸が、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか一方の末端か、またはＮ末端もしくはＣ末端の両端に独立して存在する。当然のことながら、これら追加のアミノ酸が含まれていても、標的抗原の２種類の異なるエピトープに対する結合分子の結合能が、本明細書下記で定義するように、保持されているかあるいは本質的に保持されていることが必要条件である。例えば、追加の配列は、例えば精製のために導入された配列を含んでいてもよい。好ましくは、第一の結合（ポリ）ペプチドは、（ｉ）または（ｉｉ）で詳述したアミノ酸配列からなる。より好ましくは、第一の結合（ポリ）ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００７１】
本発明によれば、用語「％の配列同一性」とは、整列させた２つ以上のアミノ酸または核酸配列の中で、そのアミノ酸配列または核酸の全長（またはその比較される部分全体）を構成するアミノ酸残基またはヌクレオチドの数と比較した場合に、同一のアミノ酸／ヌクレオチドの一致（「ヒット」）した数を説明するものである。言い換えれば、整列させることで、比較する範囲にかけてもしくは当該分野において知られている配列比較アルゴリズムを使って測定した指定した領域にかけて一致が最大になるように（部分）配列を比較・配列させた場合に、または手動で配列し、目視で精査した場合に、２つ以上の配列または部分配列に関し、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージ（例えば、６５％または８０％同一性）を決定することができる。本発明による好ましい（ポリ）ペプチドは、少なくとも約１５〜２５の長さのアミノ酸領域にかけて記載した同一性を有する（ポリ）ペプチドであり、より好ましくは、少なくとも約３０〜５０の長さのアミノ酸領域にかけて同一性を有するものである。本発明による、より好ましい（ポリ）ペプチドは、本明細書に具体的に詳述した（ポリ）ペプチドの全長にわたって、記載した配列同一性を有するものである。当業者であれば、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴアルゴリズム（スティーブン・Ｆ．アルチュル（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、トーマス・Ｌ．マデン（Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ）、アレサンドロ・Ａ．シャファー（Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）、ジンフイ・ジャン（Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ）、シェン・シャン（Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ）、ウェブ・ミラー（Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ）、およびデビッド・Ｊ．リプマン（Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ）（１９９７）、「ギャップのあるＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳ）：新世代のタンパク質データベース検索プログラム（ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」核酸研究２５：３３８９〜３４０２）、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）核酸研究２（１９９４）、４６７３〜４６８０）またはＦＡＳＴＡ（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリプマン（Ｌｉｐｍａｎ）、米国科学アカデミー紀要、１９８８、８５；２４４４）に基づくアルゴリズムなどを使って、どのように配列間の同一性（％）を決定すればよいか知っているだろう。
【００７２】
本発明によれば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するのが好ましい。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトの状態では、ワード長（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ、Ｗ）が３、見込み（Ｅ）が１０で実行される。核酸配列に関するＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトでは、ワード長（Ｗ）が１１、見込み（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較で実行される。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）米国科学アカデミー紀要、１９８９、８９：１０９１５）は、アライメント（Ｂ）が５０、見込み（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較で実行される。従って、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムを使って決定した配列同一性が少なくとも８０％の（ポリ）ペプチドの全てが、本発明の範囲に含まれる。
【００７３】
本発明のこの態様によれば、少なくとも６５％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％および少なくとも９０％の配列同一性を有する配列も包含される。さらにより好ましくは、同一性は少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、少なくとも９９％であり、最も好ましくは少なくとも９９．５％である。
【００７４】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは以下の式Ｉの配列を有する：
ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＧＸ１７ＷＷＸ１８ＡＲＳＬＴＴＧＥＸ１９ＧＸ２０ＩＰＳＸ２１ＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式Ｉ）
式中、Ｘ１〜Ｘ７およびＸ１１〜Ｘ１３およびＸ１７〜Ｘ２１はそれぞれ独立してＧ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、ＮおよびＣから、より好ましくはＧ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、ＰおよびＮから選択され；および
式中、Ｘ８〜Ｘ１０およびＸ１４〜Ｘ１６はそれぞれ独立してＧ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、ＮおよびＣから、より好ましくはＧ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、ＰおよびＮから選択され、
または、式中、Ｘ８〜Ｘ１０およびＸ１４〜Ｘ１６のうちの１つ以上が欠損している。
【００７５】
より好ましくは、
Ｘ１は、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｎ、Ｓ、ＦまたはＫから選択され、
Ｘ２は、Ｓ、Ａ、ＲまたはＴから選択され、
Ｘ３は、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、ＷまたはＳから選択され、
Ｘ４は、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｈ、Ｔ、ＧまたはＦから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｆ、ＹまたはＥから選択され、
Ｘ６は、Ｒ、Ｍ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｌ、ＡまたはＰから選択され、
Ｘ７は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｆ、ＳまたはＡから選択され、
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｙから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ９は、Ｑ、Ｄ、Ｓ、Ｈから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ１０は、から選択されＤ、Ｖまたは欠損しており、
Ｘ１１は、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｗ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｐ、Ａ、ＤまたはＶから選択され、
Ｘ１２は、Ｍ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｆ、Ｐ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｖ、ＬまたはＷから選択され、
Ｘ１３は、Ｅ、Ｗ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｙ、ＬまたはＭから選択され、
Ｘ１４は、Ｄ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｗから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ１５は、Ｇ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｍ、Ｈ、Ｙから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ１６は、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｉ、Ｅ、Ｑ、Ｐ、Ｄ、Ｎ、Ｈから選択されるかまたは欠損しており、
Ｘ１７は、Ｖ、Ｄ、Ｔ、ＩまたはＹから選択され、
Ｘ１８は、Ｅ、Ａ、Ｒ、ＴまたはＱから選択され、
Ｘ１９は、Ｔ、ＩまたはＶから選択され、
Ｘ２０は、Ｙ、ＬまたはＦから選択され、
Ｘ２１は、ＮまたはＳから選択される。
【００７６】
好ましい態様では、式Ｉ中の残基Ｘは独立して、Ｘ１〜Ｘ１０はＴＳＹＮＴＲＤ（つまりＸ８〜Ｘ１０は欠損している）；Ｘ１１〜Ｘ１６はＲＭＥＤ（つまりＸ１４〜Ｘ１６は欠損している）；Ｘ１７はＶ；Ｘ１８はＥ；Ｘ１９はＴ；Ｘ２０はＹおよび／またはＸ２１はＮ、から選択される。
【００７７】
好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる結合（ポリ）ペプチドは、配列番号１からなる結合（ポリ）ペプチドの結合能を保持しているか、または本質的に保持している。つまり、それぞれの標的エピトープへの結合強度を保持しているかまたはまたは本質的に保持している。
【００７８】
Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）の、そのＨＥＲ２上の特異的エピトープに対する解離定数は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で決定した場合、７×１０−８Ｍである。そのため、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドは、例えば、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）センサーチップ上に固定したヒス−タグ特異的抗体によって補足される。特異的エピトープを含有する抗原を注入すると、複合体の形成がモニタリングされ、ビアコアの評価ソフトウェアを使って曲線に当てはめることで、動的会合定数（ｋｏｎ）および動的解離定数（ｋｏｆｆ）、または解離速度定数（ＫＤ）が得られる。従って、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかあるいはそれからなる結合（ポリ）ペプチドの結合能は、好ましくは同じ条件で、ＨＥＲ２−結合に関する解離定数が少なくとも１×１０−４Ｍに保持されていれば、例えば少なくとも１×１０−５Ｍに、より好ましくは少なくとも１×１０−６Ｍにおよび最も好ましくは少なくとも１×１０−７Ｍなどに保持されていれば、本質的に保持されている。また本発明によれば、結合（ポリ）ペプチドは、配列番号１からなる結合（ポリ）ペプチドよりも高い結合能、つまり１００％を上回る活性を有する。例えば、本明細書においては想定されるのは、少なくとも１×１０−８Ｍ、例えば少なくとも１×１０−９Ｍなど、より好ましくは少なくとも１×１０−１０Ｍ、例えば少なくとも１×１０−１１Ｍなど、さらにより好ましくは少なくとも１×１０−１２Ｍ、および最も好ましくは少なくとも１×１０−１３Ｍの解離定数を有する結合（ポリ）ペプチドである。結合能の評価方法は当該分野において良く知られており、限定するものではないが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術またはＥＬＩＳＡが含まれる。
【００７９】
添付の実施例で示すように、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）と、第二の結合特異性を含む結合分子は、腫瘍抗原ＨＥＲ２に特異的に結合し、第二の結合（ポリ）ペプチドと共に、改善された阻害効果を生じる。従って、本発明の結合分子が配列番号１を含むかまたはこれからなるＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドを含んでいることが好ましい。
【００８０】
本明細書下記の実施例１４から明かなように、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）は、ＨＥＲ２のドメインＩ（配列番号１７２）内に位置しているＨＥＲ２のエピトープに結合する。ＨＥＲ２タンパク質のうち、これに関与している残基をアラニンスキャニング法で決定し、ＨＥＲ２のドメインＩの中の、Ｔ１６６、Ｒ１８８、Ｐ１９７、Ｓ２０２およびＲ２０３の位置のアミノ酸がＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２とＨＥＲ２との結合に関わっていることが分かった。
【００８１】
その結果、本発明の結合分子の別の好ましい態様では、第一の結合（ポリ）ペプチドはＨＥＲ２のドメインＩ（配列番号１７２）にあるエピトープに結合するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり、かつ、ＨＥＲ２のドメインＩ（配列番号１７２）内にあるエピトープは好ましくはそのＴ１６６、Ｒ１８８、Ｐ１９７、Ｓ２０２およびＲ２０３の位置にあるアミノ酸を含んでいる。
【００８２】
本発明の結合分子の別の好ましい態様では、第二の結合（ポリ）ペプチドは抗体であり、ここで、（ｉ）抗体の重鎖が配列番号１５４のアミノ酸配列を含んでいるかまたはこれからなり、かつ、抗体の軽鎖が配列番号１５５のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；（ｉｉ）抗体の重鎖が配列番号１６０を含むかまたはこれからなり、かつ、抗体の軽鎖が配列番号１６３のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；（ｉｉｉ）抗体の重鎖が配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり、かつ、抗体の軽鎖が配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；または（ｉｖ）抗体の重鎖が配列番号１６０のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり、かつ、抗体の軽鎖が配列番号１６３のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。
【００８３】
配列番号１５４、１５５、１６０および１６３の重鎖および軽鎖をコードしている核酸分子の例をそれぞれ、配列番号１６５、１６６、１６８および１６９に示す。
【００８４】
本発明のこの態様によれば、詳述したアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％および少なくとも９０％の配列同一性を有する配列も（ｉｉｉ）および（ｉｖ）に包含される。さらにより好ましくは、詳述したアミノ酸配列に対する同一性は少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、少なくとも９９％および最も好ましくは少なくとも９９．５％である。
【００８５】
より好ましくは、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）で定義される抗体は、配列同一性の点での変動が抗体の可変ドメインでのみ生じており、変異型抗体の定常領域が、（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれで定義した抗体の定常領域と同一の抗体である。本明細書で用いられる抗ＨＥＲ２抗体１の可変ドメインは、配列番号１５４の１〜１１９番目のアミノ酸、および配列番号１５５の１〜１０７番目のアミノ酸の部分に位置しているが、本明細書で用いられる抗ＨＥＲ２抗体２の可変ドメインは、配列番号１６０の１〜１２０番目のアミノ酸、および配列番号１６３の１〜１０７番目のアミノ酸の部分に位置している。さらにより好ましくは、配列同一性の点での変動は、抗体のＣＤＲドメインのみで生じ、変異型抗体のその他の（非ＣＤＲ）領域は、（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれで定義した抗体のその他の（非ＣＤＲ）領域と同一のである。本明細書で用いられる抗ＨＥＲ２抗体１のＣＤＲドメインは、配列番号１５４の３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６６（ＣＤＲ２）および９９〜１０８（ＣＤＲ３）番目のアミノ酸、および配列番号１５５の２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）番目のアミノ酸の部分に位置しているが、本明細書で用いられる抗ＨＥＲ２抗体２のＣＤＲドメインは、配列番号１６０の３１〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６６（ＣＤＲ２）および９９〜１０９（ＣＤＲ３）番目のアミノ酸、および配列番号１６３の２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）番目のアミノ酸の部分に位置している。
【００８６】
第一の結合（ポリ）ペプチドに関して提供した全ての定義は、例えば、用語「含む」、および配列同一性の好ましい数値、ならびにこれらの決定方法に関する定義は、本発明の結合分子のこの第二の結合（ポリ）ペプチドにも準用される。
【００８７】
さらに、（ｉｉｉ）で定義した第二の結合（ポリ）ペプチドは、好ましくは（ｉ）で定義した結合（ポリ）ペプチドの結合能を保持しているかまたは本質的に保持しており、かつ、（ｉｖ）で定義した第二の結合（ポリ）ペプチドは、好ましくは（ｉｉ）で定義した結合（ポリ）ペプチドの結合能を保持しているかまたは本質的に保持している。本明細書前記で定義した通り、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の結合（ポリ）ペプチドの結合能は、その結合能が少なくとも６０％保持されている場合、本質的に保持されている。好ましくは、その結合能は、少なくとも７５％またはより好ましくは少なくとも８０％保持される。（ｉ）または（ｉｉ）それぞれで定義した結合（ポリ）ペプチドの結合能は、より好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％保持される。結合能が完全に、つまり１００％保持されていることが最も好ましい。また、本発明によれば、結合（ポリ）ペプチドは（ｉ）または（ｉｉ）それぞれで定義した結合（ポリ）ペプチドよりも高い結合能を、つまり１００％を上回る活性を有している。好ましくは結合能は、結合（ポリ）ペプチドのＨＥＲ２に対する結合能を指す。結合能の評価方法は本明細書前記に記載している。
【００８８】
この態様の（ｉ）および（ｉｉ）で定義した抗体は、ＨＥＲ２上のそれらの特異的エピトープに対して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で決定した場合に、２×１０−９Ｍ〜２×１０−１０Ｍの解離定数を有する。そのため、これらの抗体は、ビアコアセンサーチップ上に固定したヒトＩｇＧ−特異的抗体によって補足される。特異的エピトープを含有する抗原を注入すると、複合体の形成がモニタリングされ、ビアコアの評価ソフトウェアを使って曲線に当てはめることで、動的会合定数（ｋｏｎ）および同定解離定数（ｋｏｆｆ）、または解離速度定数（ＫＤ）が得られる。従って、（ｉ）または（ｉｉ）の抗体に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する抗体の結合能は、好ましくは同じ条件で測定して、ＨＥＲ２−結合に関する解離定数が少なくとも１×１０−５Ｍに保持されている場合に、例えば少なくとも１×１０−６Ｍ、より好ましくは少なくとも１×１０−７Ｍ、さらにより好ましくは少なくとも１×１０−８Ｍおよび最も好ましくは少なくとも１×１０−９Ｍなどに保持されている場合に、本質的に保持されている。また、本発明によれば、抗体は、（ｉ）または（ｉｉ）の抗体よりも高い結合能を、つまり１００％を上回る活性を有している。例えば、本明細書においては、少なくとも１×１０−１０Ｍ、例えば少なくとも１×１０−１１Ｍ、より好ましくは少なくとも１×１０−１２Ｍおよび最も好ましくは少なくとも１×１０−１３Ｍなどの解離定数を有する抗体が想定される。
【００８９】
好ましくは、第二の結合（ポリ）ペプチドは抗体であり、ここでこの抗体の重鎖は配列番号１５４のアミノ酸配列からなり、かつ、抗体の軽鎖は配列番号１５５のアミノ酸配列からなる。
【００９０】
好ましくは、第一の結合（ポリ）ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなり、かつ、第二の結合（ポリ）ペプチドは抗体であり、ここでこの抗体の重鎖は配列番号１５４のアミノ酸配列からなり、かつ、抗体の軽鎖は配列番号１５５のアミノ酸配列からなる。より好ましくは、配列番号１のＣ末端は、前記抗体の軽鎖、つまり配列番号１５５のＮ末端に連結されている。本発明の結合分子のさらにより好ましい態様では、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一の結合（ポリ）ペプチドは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを介して、抗体である第二の結合（ポリ）ペプチドに連結されており、ここでこの抗体の重鎖は配列番号１５４のアミノ酸配列からなり、かつ、抗体の軽鎖は配列番号１５５のアミノ酸配列からなり、リンカーは、配列番号１のＣ末端と、抗体の軽鎖つまり配列番号１５５のＮ末端とを繋いでいる。配列番号１、リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３および配列番号１５５で表される軽鎖の、この融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５９に示す（このアミノ酸配列をコードしている核酸分子の例は配列番号１６７に示す）。当然のことながら、例えば、２本の軽鎖と２本の重鎖を含む抗体を第二の結合（ポリ）ペプチドとして用い、かつ、第一の結合（ポリ）ペプチドを前記抗体の軽鎖または重鎖のいずれかに融合させた場合、本発明に従って生じる結合分子は１つの前記抗体と、抗体の２種類の鎖のうちのいずれか１種（軽鎖または重鎖のいずれか）に融合した２つの第一の結合（ポリ）ペプチドを含んでいてもよい。そのような本発明の結合分子の例を添付の実施例で説明しており、また、例えば下記図８に示している。
【００９１】
添付の実施例で示すように、上で定義した結合分子（本明細書においてはＣＯＶＡ２０８とも呼ぶ）は、ＨＥＲ２を発現している腫瘍に対し、優れた抗腫瘍活性をもたらす。本発明の結合分子を用いて観察された抗腫瘍活性は、２種の単一特異的結合タンパク質の結合を合わせて得られる腫瘍活性の阻害よりも有意に高く、ここで、第一の単一特異的結合タンパク質は、配列番号１５３を有する二価のＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチド（つまりＣ１２のＦｃ融合体（配列番号１））であり、第二の単一特異的結合タンパク質は抗ＨＥＲ２抗体１で、この抗体の重鎖は配列番号１５４のアミノ酸配列からなり、かつ、抗体の軽鎖は配列番号１５５のアミノ酸配列からなる。
【００９２】
本発明はさらに、本発明の結合分子をコードしている核酸分子に関する。
【００９３】
本発明によれば、用語「核酸分子」（本明細書では「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」とも呼ばれる）は、３０を上回るヌクレオチドからなる直鎖分子を定義する。「核酸分子」は、本発明によれば、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなど、およびＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む。さらに、当該分野において知られている核酸模倣分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの合成または半合成誘導体および混合ポリマーなども含まれる。本発明のそのような核酸模倣分子または核酸誘導体には、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミデート核酸、２’−Ｏ−メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）（ブラーシュ（Ｂｒａａｓｃｈ）およびコリー（Ｃｏｒｅｙ）、化学および生物学（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ）２００１、８：１を参照のこと）が含まれる。ＬＮＡは、リボース環を、２位の酸素原子と４位の炭素原子との間のメチレン結合で拘束したＲＮＡ誘導体である。当業者であれば容易に理解できるように、それらは追加の非天然のまたは誘導体ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。
【００９４】
当然のことながら、本発明の結合分子は単一の核酸分子によってコードされていても、または結合分子の一部分、例えば個々の結合（ポリ）ペプチドまたは抗体の異なる鎖などをコードしている複数の核酸分子によってコードされていてもよい。これらの核酸分子が発現すると、それらは非共有結合、例えば水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力もしくは疎水性相互作用などを介して、または共有結合、例えばジスルフィド結合を介して、本発明の結合分子を形成する。
【００９５】
例えば、結合分子が、例えばｓｃＦｖ断片またはｄＡｂのみを含んでいる抗体断片に結合したＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドである場合、結合分子は単一の核酸分子にコードされ得る。結合分子が、添付の実施例に示すように、完全長抗体に結合したＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドを含んでいる場合、第一の核酸分子はＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドとＦｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドが結合している抗体の鎖をコードしていてもよく、第二の核酸分子が抗体のその他の鎖をコードしていてもよい。あるいは単一の核酸分子が、例えば、コード核酸配列が、各コード配列に関するそれぞれの制御エレメントを含むベクターに含まれている場合、これら別個の複数のポリペプチド鎖をコードしている可能性もある。当然のことながら本発明の結合分子をコードするのに複数の核酸配列（または以下に記載するベクター）を利用する場合、本発明の結合分子を形成させるために、結果として発現したポリペプチドを接触させる必要がある場合がある。
【００９６】
本発明によれば、用語「本発明の核酸分子」は、本発明の結合分子の全ての構成要素がそれらにコードされている限り、単一の核酸分子ならびに複数の核酸分子の双方を包含する。
【００９７】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含んでいるベクターに関する。
【００９８】
好ましくは、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは、標準的に用いられている、例えば遺伝子工学で用いられている別のベクターである。
【００９９】
本発明の核酸分子を複数の市販されているベクターに挿入してもよい。非限定的な例としては、原核生物用のプラスミドベクター、例えばｐＱＥ−１２、ｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）、発現ベクターのｐＥＴ−シリーズ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））またはｐＣＲＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ラムダｇｔ１１、ｐＪＯＥ、ｐＢＢＲ１−ＭＣＳシリーズ、ｐＪＢ８６１、ｐＢＳＭｕＬ、ｐＢＣ２、ｐＵＣＰＫＳ、ｐＴＡＣＴ１および、哺乳類細胞での発現に適しているベクター、例えばＥ−０２７  ｐＣＡＧ  Ｋｏｓａｋ−Ｃｈｅｒｒｙ（Ｌ４５ａ）ベクターシステム、ｐＲＥＰ（インビトロジェン）、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン）、ｐＸＴ１（ストラタジーン）、ｐＳＧ５（ストラタジーン）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳＰＯＲＴ１（ギブコＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ（プロメガ）、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（クロンテック）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（クロンテック）、ｐＥＡＫ−１０（エッジバイオシステムズ）ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（ノバジェン）およびｐＣＩＮｅｏ（プロメガ）が挙げられる。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に適したプラスミドベクターの例としては、例えば、プラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９ＫおよびｐＰＩＣ３．５Ｋ（全てインビトロジェン）が含まれる。アフリカツメガエル胚、ゼブラフィッシュ胚ならびに様々な哺乳類および鳥類の細胞におけるタンパク質発現に好適な別のベクターとしては、多目的発現ベクターのｐＣＳ２＋がある。
【０１００】
また、上述した本発明の核酸分子を、別の核酸分子との翻訳融合体が生成されるように、ベクター中に挿入してもよい。その他の核酸分子は例えば、本発明の核酸分子によってコードされている結合分子の溶解度を高めるおよび／またはその精製を促進するタンパク質を、または蛍光画像法で観察される目的のタンパク質をコードしていてもよい。そのようなベクターの非限定的な例としては、ｐＥＴ３２、ｐＥＴ４１、ｐＥＴ４３が挙げられる。ベクターはまた、タンパク質の正しい折り畳みを促進するための、１つ以上のシャペロンをコードしている、追加の発現可能なポリヌクレオチドを含んでいてもよい。好適な細菌性の発現宿主には、例えば、ＴＧ１、ＢＬ２１（例えばＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＡＲＥ）またはロゼッタ（Ｒｏｓｅｔｔａｅ）由来の株が含まれる。
【０１０１】
ベクターの改変技術に関しては、サンブルックおよびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）、２００１を参照のこと。通常ベクターは、１つ以上の複製起点（ｏｒｉ）およびクローニングまたは発現のための遺伝システム、宿主中での選抜用の１つ以上のマーカー、例えば、抗生物質耐性、および１つ以上の発現カセットを含んでいる可能性がある。好適な複製起点としては、例えば、Ｃｏｌ  Ｅ１、ＳＶ４０ウイルスおよびＭ  １３の複製起点が挙げられる。
【０１０２】
ベクター中に挿入されたコード配列を、例えば、標準的な方法で合成する、または天然の供給源から単離することができる。コード配列の、転写制御エレメントへのおよび／または他のアミノ酸をコードしている配列へのライゲーションは、確立されている方法によって実施することができる。そのような制御配列は当業者には良く知られており、また、限定するものではないが、確実に転写を開始させる制御配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（オーウェンズ（Ｏｗｅｎｓ）、米国科学アカデミー紀要９８（２００１）、１４７１〜１４７６）および必要に応じて確実に転写を終止させ、転写産物を安定化する制御エレメントが含まれる。確実に転写を開示させる制御配列の非限定的な例としては、転写開始コドン、エンハンサー、例えばＳＶ４０エンハンサーなど、インスレーターおよび／またはプロモーター、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ｌａｃＺプロモーター、トリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（トリベータ−アクチンプロモーターとサイトメガロウィルスの最初期エンハンサーを組み合わせたもの）、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーターＣａＭ−キナーゼプロモーター、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、キンウワバの一種（ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターなど、または哺乳類や他の動物細胞中のグロビンイントロンが挙げられる。ｌａｃプロモーターは、原核細胞に有用な典型的な誘導性プロモーターであり、乳糖の類似体であるイソプロピルチオール−ｂ−Ｄ−ガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）を使って誘導することができる。確実に転写を終止する制御エレメントの非限定的な例としては、Ｖ４０−ポリＡ部位、ｔｋ−ポリＡ部位またはＳＶ４０、ｌａｃＺまたはＡｃＭＮＰＶポリヘドリンポリアデニル化シグナルが挙げられ、これらは本発明の核酸配列の下流に含まれる。追加の制御エレメントとしては、翻訳エンハンサー、コザック配列およびＲＮＡスプライシングに関する供与部位と受容部位とに挟まれている介在配列、分泌シグナルをコードしているヌクレオチド配列または、使用される発現系に依存するが、発現したポリペプチドを細胞内コンパートメントに向かうようにすることができるシグナル配列、を挙げることができる。例えば、当該分野では「シグナルペプチド」とも呼ばれているＮ末端隣接配列または「リーダー配列」が含まれ得る。当業者は容易に、好適なリーダー配列を選択することができる。リーダー配列は好ましくは、任意の抗体鎖（軽鎖、重鎖を含む）またはドメインを発現させるために用いられるが、発現した、成熟した構築物中ではもはや必要とされない。さらに、複製起点、薬剤耐性遺伝子、制御因子（誘導性プロモーターの一部として）なども含まれ得る。
【０１０３】
本発明の発現ベクターは、複製、ならびに本発明の核酸分子およびそれらにコードされている結合分子の発現を誘導することができる。
【０１０４】
ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンなどとの同時導入を行うことで、形質転換細胞の同定および単離が可能になる。導入した核酸を増幅して、大量のコードされた結合分子を発現させることもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカーは、数百コピーまたは数千コピーもの目的の遺伝子を保有する細胞株の開発に有用である。別の有用な選択マーカーには、酵素であるグルタミン合成酵素（ＧＳ）（マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら１９９１；ベビントン（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）ら１９９２）がある。これらのマーカーを使い、細胞を選択培地中で生育させ、そして最も高い耐性をもつ細胞を選択する。発現ベクターは好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。そのようなマーカーとしては、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性遺伝子、および大腸菌や他の細菌は培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１０５】
上述したように、本発明の核酸分子を、直接導入するために、またはエレクトロポレーション法（例えばエッペンドルフ社のマルチポレーター（Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ）またはバイオ・ラッド社のジーンパルサー（Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ）を使って）、ＰＥＩ（ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、ウォリントン、エッペルハイム）、Ｃａ２＋介在性形質転換を介して、または細胞内へのリポソーム（例えば、「リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）」（インビトロジェン））、非リポソーム化合物（例えば、「フジーン（Ｆｕｇｅｎｅ）」（ロシュ））、リポソーム、ファージベクターまたはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）を介して導入するように設計することができる。加えて、バキュロウイルス系またはワクチニアウイルスもしくはセムリキ森林ウイルスをベースとした系も、本発明の核酸分子用の真核性発現系のベクターとして使用することができる。レトロウイルス、ワクチニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどに由来する発現ベクターを、核酸分子またはベクターを標的とした細胞に送達するために使用してもよい。当業者によく知られている方法を用いて、組換えウイルスベクターを構築することができる。例えば、サンブルック（２００１）およびアウルベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（２００１）に記載されている技術を参照のこと。
【０１０６】
当然のことながら、本発明の結合分子が１種を上回る核酸分子によってコードされている場合、前記複数の核酸分子は１つのベクター中にまたは複数のベクター中に含まれ得る。用語「本発明のベクター」は、本発明の結合分子の全ての構成要素がそれらによってコードされている限り、単一のベクターと複数のベクターの両方を包含する。
【０１０７】
本発明はさらに、本発明のベクターで形質転換した宿主細胞または非ヒト宿主に関する。
【０１０８】
前記宿主または宿主細胞は、本発明のベクターを宿主または宿主細胞に導入することによって生成することができ、これはその存在によって、ベクターによってコードされている結合分子の発現を仲介する。
【０１０９】
本発明によれば、宿主は、本発明のベクターを形質転換した、および／または本発明のベクターを発現しているトランスジェニック非ヒト動物であってよい。好ましい態様では、トランスジェニック動物は哺乳類、例えばハムスター、ウシ、ネコ、ブタ、イヌまたはウマである。
【０１１０】
好ましい態様では、宿主は細胞、細胞培養の一部分であってよい、単離した細胞などである。
【０１１１】
好適な原核性宿主細胞には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の種の細菌が含まれる。好適な真核性宿主細胞には、例えば、真菌細胞、とりわけ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、またはショウジョウバエＳ２細胞およびヨトウガＳｆ９細胞などの昆虫細胞、および植物細胞ならびに哺乳類細胞がある。上述した宿主細胞に適切な培地や条件は当該分野で知られている。
【０１１２】
哺乳類の宿主細胞としては、限定するものではないが、ヒトのヒーラ（Ｈｅｌａ）、ＨＥＫ２９３、Ｈ９およびジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびボーズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞が挙げられる。あるいは、本発明の結合分子を、染色体に統合された本発明の核酸分子またはベクターを包含している遺伝子構築物を含む安定な細胞株中で発現させることもできる。
【０１１３】
別の好ましい態様では、前記細胞は初代細胞かまたは初代細胞株である。初代細胞とは、生体から直接得られた細胞である。好適な初代細胞には、例えば、マウス胎仔線維芽細胞、マウス初代肝細胞、心筋細胞およびニューロン細胞、ならびにマウス筋幹細胞（サテライト細胞）およびそれらに由来する、安定な、不死化した細胞株がある。
【０１１４】
本発明はまた、好適な条件における本発明の宿主細胞の培養、および前記宿主細胞によって産生された結合分子の単離を含む、本発明の結合分子の産生方法にも関する。
【０１１５】
原核または真核宿主を培養するための好適な条件は、当業者に良く知られている。例えば、細菌を培養するのに好適な条件は、細菌を、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で、空気にさらしながら生育させるものである。発現産物の収量と溶解度を高めるために、培地を緩衝するか、またはこれらの両方を高めるかまたは促進することが知られている好適な添加剤を培地に補充することができる。大腸菌は４〜約３７℃で培養することができ、抽出温度または一連の温度は、過剰発現させる分子に依存する。当業者であれば通常、宿主のニーズや発現した結合分子の要求に、これらの条件を適応させなければならないことも知っている。宿主細胞中に存在するベクター内の本発明の核酸分子を、誘導性プロモーターが制御する例では、結合分子の発現は、適切な誘導剤を添加することで誘導することができる。好適な発現プロトコールおよび戦略は、当業者には知られている。
【０１１６】
細胞型やその特定の要求に応じて、哺乳類細胞は例えば、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地またはＤＭＥＭ培地中で培養することができる。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、水飽和雰囲気下で維持することができる。
【０１１７】
昆虫細胞に好適な培地には例えば、１０％ＦＣＳ含有ＴＮＭ培地またはＳＦ９００培地がある。昆虫細胞は一般に、２７℃で、接着培養または懸濁培養として生育される。
【０１１８】
真核細胞に好適な発現プロトコールは当業者には良く知られており、また例えば、サンブルック（２００１）前記引用から検索することができる。
【０１１９】
産生された結合分子の単離方法は、当該分野においてよく知られており、また、方法を限定するものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ディスクゲル電気泳動または免疫沈降等の工程を含む。例えば、サンブルック（２００１）前記引用を参照のこと。
【０１２０】
本発明はまた、（ｉ）本発明の結合分子、（ｉｉ）本発明の核酸分子；（ｉｉｉ）本発明のベクターまたは（ｉｖ）本発明の宿主細胞、のうちの少なくとも１つを含む組成物を提供する。
【０１２１】
用語「組成物」とは、本発明に従って使用される場合、詳述した化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物に関する。組成物は必要に応じて、本発明の化合物の特徴を変化させることが可能で、それによって、それらの機能を、例えば、安定化する、調節するおよび／または向上させる、さらなる分子を含んでいてもよい。組成物は固体であっても液体の形態であってもよく、とりわけ、粉末、錠剤、または溶液の形態であってよい。
【０１２２】
好ましい態様では、組成物は医薬組成物であり、必要に応じて、薬学上許容可能な担体をさらに含んでいる。
【０１２３】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、上で詳述した化合物を含む。本発明の医薬組成物は、随意選択でおよび追加として、薬学上許容可能な担体を含んでいてもよい。「薬学上許容可能な担体」とは、いかなる型もの、非有毒な固体、半固体もしくは液体賦形剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤化補助剤を意味する。好適な医薬担体の例は当該分野においては良く知られており、塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝塩化ナトリウム溶液、水、エマルション、例えば油／水エマルション、種々の湿潤剤、無菌溶液、有機溶媒等が含まれる。好ましくは、担体は非経口担体であり、より好ましくは、受容者の血液と等張な溶液である。用語「非経口」は、本明細書で使用する場合、投与経路を指し、投与経路には、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入が含まれる。担体は好適には、微量の添加剤、例えば等張性や化学安定性を高める物質を含む。そのような材料は、使用する用量および濃度では受容者にとって有毒ではないもので、緩衝剤（リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸、またはそれらの塩など）；酸化防止剤（アスコルビン酸など）；低分子量の（約１０残基未満の）（ポリ）ペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、またはさらに免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなど）；単糖類、二糖類、および他の糖質（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；対イオン（ナトリウムなど）；および／または非イオン性界面活性剤（ポリソルベート、ポロキサマー、またはＰＥＧなど）を含む。
【０１２４】
そのような担体を含む組成物を、良く知られている標準的な方法によって製剤化することができる。通常製剤は、医薬組成物の成分を、液体担体ともしくは微粉化した固体担体とまたはその両方と、均一にかつ密に接触させることによって調製される。その後、必要であれば、産物を所望の製剤に成形する。
【０１２５】
これらの医薬組成物を、好適な用量で対象に投与することができる。投与計画は、担当医および臨床学的因子によって決定される。医学分野では良く知られているように、任意の一人の患者に対する用量は、患者の背格好、体表面積、年齢、投与する具体的な化合物、性別、投与の時間および経路、総体的な健康、ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多数の因子に依存する。所定の状況における治療上有効量は、日常的な実験によって容易に決定され、また、普通の臨床医または医師の技能や判断の範囲内である。医薬組成物は単回投与用であっても、または長期間にわたって定期的に投与するためのものであってもよい。通常、医薬組成物の投与は、例えば、単回投与に関しては、体重１ｋｇあたり１０μｇ〜体重１ｋｇあたり２ｇの範囲となる。しかしながら、単回投与に関するより好ましい用量は、１ｋｇあたり１００μｇ〜体重１ｋｇあたり１．５ｇの範囲、さらにより好ましくは体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜体重１ｋｇあたり１ｇ、さらにより好ましくは体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり５００ｍｇであろう。
【０１２６】
本発明の医薬組成物の投与を、異なる方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、皮内、鼻腔内または気管支内への投与によって達成してもよい。
【０１２７】
治療上の投与に用いられる医薬組成物の成分は無菌的でなければならない。滅菌は、無菌的な濾過膜（例えば、０．２ミクロンの膜）を通じた濾過によって、容易に達成される。
【０１２８】
医薬組成物の成分は通常、単位容器中でまたは複数回投与用の容器中で、例えば、密閉されたアンプルまたはバイアル中で、水溶液または再構成用の凍結乾燥した製剤として保存される。凍結乾燥した製剤の例としては、５ｍｌの濾過滅菌した１％（ｗ／ｖ）水溶液を１０ｍｌのバイアルに充填し、その後、得られる混合物を凍結乾燥する。この凍結乾燥した化合物を、注射用の静菌性の水で再構成することで、注入用の溶液を調製する。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが含まれる場合もある。医薬組成物は、医薬組成物の使用目的に応じたさらなる薬剤を含んでいてもよい。
【０１２９】
医薬組成物は、以下に開示する通り、腫瘍の治療にとって特に有用な可能性がある。
【０１３０】
別の好ましい態様では、本発明の組成物は診断用組成物である。
【０１３１】
本発明によれば、用語「診断用組成物」は、本発明の医薬組成物に対して起こし得る反応、または本発明の医薬組成物による完全治癒の可能性に関して、個々の患者を診断するための組成物に関する。本発明の診断用組成物は上で詳述した化合物を含む。診断用組成物は、適切な緩衝液などをさらに含んでいてもよい。診断用組成物は１つの容器にまたは複数の容器に梱包されていてもよい。
【０１３２】
本発明はさらに、腫瘍の治療に用いるための本発明の結合分子、本発明の核酸分子または本発明のベクターに関する。
【０１３３】
用語「腫瘍」は、本発明によれば、細胞の制御不可能な分裂を特徴とする疾患または障害のクラスに関し、かつ、全ての型の腫瘍、例えば癌性腫瘍および良性腫瘍ならびに固形腫瘍および非固形腫瘍などを包含する。癌性腫瘍はさらに、浸潤を介した隣接した組織への直接的な成長か、または転移による離れた部位への移植（この場合、腫瘍細胞は血流またはリンパ系を介して輸送される）のいずれかによる、これら腫瘍の広がる能力によって特徴付けられる。
【０１３４】
好ましくは腫瘍は、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宮内膜癌、膵癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、上部消化管に関する癌、結腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、頭頸部の扁平細胞癌、子宮頸癌、膠芽腫、悪性腹水、リンパ腫および白血病からなる群より選択される癌性腫瘍である。
【０１３５】
本明細書に記載の全ての型の癌は、当業者には良く知られているものであり、関連技術や当業者に共通の一般知識を踏まえて定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１ＡはＨＥＲ２を過剰発現しているＢＴ−４７４細胞を使ったＦＡＣＳ結合実験。抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １；ここで重鎖は配列番号１５４のアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖は配列番号１５５のアミノ酸配列を有する；重鎖および軽鎖をコードしている核酸分子の例を配列番号１６５と１６６に示す）のエピトープおよび抗ＨＥＲ２抗体２（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  ２；ここで重鎖は配列番号１６０のアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖は配列番号１６３のアミノ酸配列を有する；重鎖および軽鎖をコードしている核酸分子例を配列番号１６８と１６９に示す）のエピトープを予めブロッキングしておいた、またはブロッキングしなかったＨＥＲ２に対する、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）およびＧ１０（配列番号２）の結合。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）は陰性対照を表す。図１ＢはＨＥＲ２を過剰発現しているＢＴ−４７４細胞を使ったＦＡＣＳ結合実験。抗ＨＥＲ２抗体１および抗ＨＥＲ２抗体２のエピトープを予めブロッキングしておいた、またはブロッキングしなかった状態でのビオチン化抗ＨＥＲ２抗体１およびビオチン化抗ＨＥＲ２抗体２（ビオチン化抗体は「ｂｔ」の略号で示している）の結合。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）は陰性対照を表す。
【図２−１】図２ＡはＨＥＲ２を過剰発現している胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７を使ったインビトロ増殖アッセイ。Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させ、Ｆｃ−Ｃ１２（配列番号１５３）と呼ばれる二価の単一特異性タンパク質を作成した。フィノマーＣ１２−Ｆｃと抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １）の組み合わせ混合物は、相当する抗ＨＥＲ２抗体のみよりも効率的にはＮＣＩ−Ｎ８７細胞の増殖速度を低下させなかった。図２ＢはＨＥＲ２を過剰発現している胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７を使ったインビトロ増殖アッセイ。Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させ、Ｆｃ−Ｃ１２（配列番号１５３）と呼ばれる二価の単一特異性タンパク質を作成した。結合分子ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）の抗増殖性活性は、対応する未改変抗体の活性よりも高かった。ＣＯＶＡ２０８は、Ｃ１２（配列番号１）を抗体１の軽鎖（配列番号１５４および１５５）のＮ−末端に繋いだ誘導体からなる。図８もまた参照のこと。
【図２−２】図２ＣはＨＥＲ２を過剰発現している胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７を使ったインビトロ増殖アッセイ。Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させ、Ｆｃ−Ｃ１２（配列番号１５３）と呼ばれる二価の単一特異性タンパク質を作成した。フィノマーＣ１２−Ｆｃと抗ＨＥＲ２抗体２（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  ２））の組み合わせ混合物は、相当する抗ＨＥＲ２抗体のみよりも効率的にはＮＣＩ−Ｎ８７細胞の増殖速度を低下させなかった。図２ＤはＨＥＲ２を過剰発現している胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７を使ったインビトロ増殖アッセイ。Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合させ、Ｆｃ−Ｃ１２（配列番号１５３）と呼ばれる二価の単一特異性タンパク質を作成した。ＣＯＶＡ２１０（配列番号１６０と１６１；配列番号１６１をコードしている核酸分子の例を配列番号１７０に示す）の抗増殖性活性は、対応する未改変抗体の活性よりも高かった。ＣＯＶＡ２１０は、Ｃ１２（配列番号１）を抗体２の軽鎖（配列番号１６０および１６３）のＮ−末端に繋いだ誘導体からなる。図８もまた参照のこと。
【図３】図３Ａは抗ＨＥＲ２フィノマー−抗体融合体の抗増殖性活性は、フィノマーと抗体の結合部位との相対的な向きに依存して多様である。ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞を用いた増殖細胞アッセイにおける、異なるフィノマー−抗体融合タンパク質の抗増殖性活性では（図Ａ）および（図Ｂ）の差異が示された。表では最大の効果を、生存率のパーセンテージで示している。ＣＯＶＡ２０１（配列番号１５６と１５５）とＣＯＶＡ２０２（配列番号１５４と１５７）は両方とも、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）と抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １）（配列番号１５４と１５５）との融合タンパク質である。ＣＯＶＡ２０１はＣ末端重鎖融合体からなり、ＣＯＶ２０２はＣ末端軽鎖融合体を表している。図８もまた参照のこと。図３Ｂは抗ＨＥＲ２フィノマー−抗体融合体の抗増殖性活性は、フィノマーと抗体の結合部位との相対的な向きに依存して多様である。ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞を用いた増殖細胞アッセイにおける、異なるフィノマー−抗体融合タンパク質の抗増殖性活性では（図Ａ）および（図Ｂ）の差異が示され、また、ＣＯＶＡ２０８がこの細胞株に対して最も高い抗増殖性効果を示した。表では最大の効果を、生存率のパーセンテージで示している。ＣＯＶＡ２０７（配列番号１５８と１５５）とＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）は両方とも、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）と抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １）（配列番号１５４と１５５）との融合タンパク質である。ＣＯＶＡ２０７はＮ末端重鎖融合体からなり、およびＣＯＶＡ２０８はＮ末端軽鎖融合体を表している。図８もまた参照のこと。
【図４】ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）（フィノマーＣ１２を抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １、配列番号１５４と１５５）の軽鎖のＮ−末端に繋いだ融合体）の抗増殖性活を、ＨＥＲ２を過剰発現している乳癌細胞株ＢＴ−４７４を使った細胞アッセイで決定した。ＣＯＶＡ２０８は未改変抗体と比較して、非常に優れた抗増殖性活性を示した。
【図５】図５では、ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種稙片マウスモデルを用いた動物試験を図示している。ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞をＣＤ１ヌードマウス（１処理群あたりｎ＝６）の皮下に接種した。腫瘍が約１４０ｍｍ３の大きさに達したら、動物を負荷投与量３０ｍｇ／ｋｇのＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）、抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））または偽薬（ＰＢＳ）で処理した。処理を、腹腔内注射（１５ｍｇ／ｋｇ）（矢印で示した）によって、１週間に１回、４回にわたって継続し、腫瘍の大きさをノギスで測定した。ＣＯＶＡ２０８が、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体１または偽薬（ＰＢＳ）よりも有意に腫瘍の成長を阻害することが分かった。６匹のマウスの平均腫瘍体積（処理を開始した０日に対して）±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示している。
【図６】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１回静脈注射した後、様々な時点でのＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）および抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））の血清濃度。最後の６時点を使って、２４７時間（ＣＯＶＡ２０８）および１８７時間（抗ＨＥＲ２抗体１）の終末相半減期を計算した。平均血清濃度を時間に対してプロットした。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表している。
【図７】ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）および抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上図）ならびに、精製した後と、４℃で１ヶ月および２ヶ月保存した後の、ＣＯＶＡ２０８のサイズ排除クロマトグラム（下図）。ＣＯＶＡ２０８が凝集体を全く形成しなかったことが明かである。
【図８】抗原の２種類の異なるエピトープに結合する、様々なフォーマットの結合分子の模式図。ＣＯＶＡ２０１（配列番号１５６と１５５）、ＣＯＶＡ２０２（配列番号１５４と１５７）、ＣＯＶＡ２０７（配列番号１５８と１５５）およびＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）は全て、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）と抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １）（配列番号１５４および１５５）との融合タンパク質である。ＣＯＶＡ２０１はＣ末端重鎖融合体からなり、ＣＯＶ２０２はＣ末端軽鎖融合体を表し、ＣＯＶＡ２０７はＮ末端重鎖融合体からなり、ＣＯＶＡ２０８はＮ末端軽鎖融合体を表す。ＣＯＶＡ２１０（配列番号１６０と１６１）は、Ｃ１２（配列番号１）を抗体２（配列番号１６０および１６３）の軽鎖のＮ−末端に繋いだ融合体からなる。
【図９−１】図９ＡはＨＥＲ２を発現している細胞株を用いたインビトロ増殖アッセイ。ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）は、抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））よりも効果的に、ＯＥ１９の成長を阻害した。図９ＢはＨＥＲ２を発現している細胞株を用いたインビトロ増殖アッセイ。ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）は、抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））よりも効果的に、Ｃａｌｕ−３細胞の成長）を阻害した。
【図９−２】図９ＣＨＥＲ２を発現している細胞株を用いたインビトロ増殖アッセイ。図９Ｃでは、１０種類の異なる細胞株について行ったインビトロ増殖アッセイの結果をまとめている。それぞれについて、阻害の最大レベルをプロットした。２種類の化合物間の比較を容易にするために、ＣＯＶＡ２０８と抗ＨＥＲ２抗体１に関し、対応するデータ点を繋いだ。ＣＯＶＡ２０８は１０種類全ての細胞株に対して、抗ＨＥＲ２抗体１よりも高い細胞成長の阻害を示している。
【図１０】図１０Ａはカスパーゼ−３／７活性で決定した通り、ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）はアポトーシスを誘導することが可能である。抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））は、カスパーゼ−３／７活性を向上させなかった。このことは、アポトーシスの誘導能がＣＯＶＡ２０８に固有のものであることを示している。スタウロスポリンを陽性対照として用いた。図１０Ａ中のエラーバーは、３つ組で行った実験の標準偏差を示している。図１０ＢはＴＵＮＥＬ染色で決定した通り、ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）はアポトーシスを誘導することが可能である。抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の画分も増加させなかった。このことは、アポトーシスの誘導能がＣＯＶＡ２０８に固有のものであることを示している。スタウロスポリンを陽性対照として用いた。
【図１１】ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）は、ＭＣＦ−７細胞のリガンドに依存したＨＥＲ２シグナル伝達の活性化と（左図）、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞のリガンドに依存しないＨＥＲ２シグナル伝達の活性化を阻害する（右図）。抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））はＭＣＦ−７細胞のシグナル伝達しか阻害せず、抗ＨＥＲ２抗体２（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  ２（配列番号１６０と１６３））はＮＣＩ−Ｎ８７細胞のみに対してしか活性でない。ビンキュリンをローディングコントロールとした。
【図１２】ＣＯＶＡ２０８はＮＣＩ−Ｎ８７細胞に取り込まれる。表面染色し、その後５時間インキュベートした後には、イマリス（Ｉｍａｒｉｓ）ソフトウェアで解析した共焦点レーザー走査型画像から決定されるように、５２％のＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）が、サイトゾル中で球状のドットとして見られた。抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））の染色は主に膜付近にとどまっており、染色のうちの９％だけがサイトゾルの球状ドット中に局在した。
【図１３】ＫＰＬ−４乳癌異種稙片マウスモデルを用いた動物試験を図示している。ＫＰＬ−４乳癌細胞をＳＣＩＤベージュマウスの皮下に接種した（１処理群あたりｎ＝８）。腫瘍が約７０ｍｍ３の大きさに達したら、動物を、負荷投与量３０ｍｇ／ｋｇのＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）、抗ＨＥＲ２抗体１（抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ  １（配列番号１５４と１５５））または偽薬（ＰＢＳ）で処理した。処理を腹腔内注射で（１５ｍｇ／ｋｇ）、１週間に１回、４回継続して行い（矢印で示した）、ノギスで腫瘍の大きさを測定した。ＣＯＶＡ２０８が、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体１または偽薬（ＰＢＳ）よりも有意に腫瘍成長を阻害したことが分かった。８匹のマウスの平均腫瘍体積±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示している。
【実施例】
【０１３７】
実施例によって本発明を例示する。
【０１３８】
実施例１：Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドはＨＥＲ２に結合する
【０１３９】
方法
１）組換えＨＥＲ２タンパク質のファージＥＬＩＳＡ
配列番号９〜１２１で示すアミノ酸をコードしているＤＮＡを、グラブロフスキらでＦｙｎ  ＳＨ３ライブラリーに関して記載されているように（グラブロフスキら（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁）、ファージミドベクターｐＨＥＮ１にクローニングした。ファージの産生は、標準的なプロトコール（ビティ（Ｖｉｔｉ），Ｆ．ら（２０００）酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）３２６、４８０〜５０５）に従って実施した。ＥＬＩＳＡには、ファージを含有しているモノクローナルな細菌上清を使用した：完全長タンパク質の２３〜６５２番目のアミノ酸を含んでいるＨＥＲ２のビオチン化細胞外ドメイン（ベンダーメドシステムズから、またはヒトＦｃγ１との融合体としてＲ＆Ｄから購入した；ビオチン化は、製造業者の説明に従って、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス）を使って行った）をストレプトアビジンでコーティングされているウェル（ストレプタウェル、ハイバインド、ロシュ）に固定化し、ＰＢＳに溶解した２％の脱脂粉乳（ラピライト（Ｒａｐｉｌａｉｔ）、ミグロス、スイス）でブロッキングした後、ＰＢＳに溶解した１０％の脱脂粉乳を２０μｌと、ファージ上清８０μｌをアプライした。１時間インキュベートした後、未結合のファージを洗い落とし、結合したファージを抗Ｍ１３−ＨＲＰ抗体複合体（ＧＥヘルスケア）で検出した。ＢＭブルーＰＯＤ基質（ロシュ）を添加し、１ＭのＨ２ＳＯ４を添加して反応を停止させることで、ペルオキシダーゼ活性を検出した。ファージＥＬＩＳＡ陽性クローンを、ストレプトアビジン（ストレプタウェル、ハイバインド、ロシュ）およびヒトＩｇＧ（シグマ）に対する交差反応性がないことについて、ファージＥＬＩＳＡによって試験した。
【０１４０】
ＤＮＡ配列決定により、特異的結合剤のＤＮＡ配列を確認した。
【０１４１】
２）ＨＥＲ２を過剰発現しているＳＫＯＶ−３細胞のＦＡＣＳ実験
配列番号１〜８および配列番号１２２〜１５２に示すポリペプチドをコードしているＤＮＡを、グラブロフスキら（グラブロフスキら（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁）に記載されているように、生じる構築物がＣ末端ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１６２）を保有するように、細菌性発現ベクターのｐＱＥ１２にサブクローニングした。ポリペプチドを大腸菌のサイトゾル中で発現させ、当初の培養１ｍｌあたり１．８ｍｌの清澄な溶菌液を調製した。ポリペプチドを含有している１００μｌの清澄な溶菌液を、ＰＢＳ／１％ＦＣＳ／０．２％アジ化ナトリウムに溶解した１．２５×１０５個のＳＫＯＶ−３細胞を含有している１００μｌの細胞懸濁液と混合した。氷上で６０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、結合した配列を、１０μｇ／ｍｌの抗ｍｙｃマウス抗体９Ｅ１０（ロシュ）、次いで抗マウスＩｇＧ-アレクサ４８８複合体（インビトロジェン）を用いて検出した。その後、染色された細胞をＦＡＣＳアナライザー中で解析した。特異的結合剤のＤＮＡ配列をＤＮＡの配列決定によって確認した。
【０１４２】
結果：
Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ＨＥＲ２結合剤のアミノ酸配列は、配列リストに添付の通り、配列番号１〜１５２に示している。
【０１４３】
実施例２：Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドは、抗ＨＥＲ２抗体と異なる、ＨＥＲ２の他のエピトープに結合する。
【０１４４】
方法：
Ｆｙｎ  ＳＨ３由来クローンＣ１２（配列番号１）およびＧ１０（配列番号２）をコードしているＤＮＡ配列を、生じる構築物がＣ末端ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１６２）を保有するように、細菌性の発現ベクターｐＱＥ１２にサブクローニングし、２種類の構築物を発現させ、グラブロフスキら（グラブロフスキら（２００７）ＪＢＣ、２８２、３１９６〜３２０４頁）に記載されているように、ヘキサヒスチジンタグの手段によって精製した。
【０１４５】
抗ＨＥＲ２抗体１の重鎖と軽鎖（配列番号１５４と配列番号１５５）および抗ＨＥＲ２抗体２の重鎖と軽鎖（配列番号１６０と配列番号１６３）をＣＨＯ細胞内で、一過的に同時に発現させた。培養上清から、抗体を、マブセレクトシュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）カラム（ＧＥヘルスケア）を使ったアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【０１４６】
１０５個のＢＴ−４７４細胞（ＡＴＣＣ）を氷上で６０分間、過剰量の１μＭ抗ＨＥＲ２抗体１、抗ＨＥＲ２抗体２、またはＰＢＳとプレインキュベートした。その後、ブロッキング抗体を洗浄せずに、３００ｎＭのＣ１２またはＧ１０に２０ｎＭマウス抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（ロシュ）を加えたものを細胞に添加した。４５分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、結合したＣ１２／９Ｅ１０複合体およびＧ１０／９Ｅ１０複合体を、抗マウスＩｇＧ−アレクサ４８８複合体を使って検出した。細胞をＦＡＣＳで解析した。Ｃ１２およびＧ１０の、抗ＨＥＲ２抗体１または抗ＨＥＲ２抗体２でブロッキングした細胞表面への結合を、ブロッキングしなかった細胞への結合と比較した。抗ＨＥＲ２抗体１および抗ＨＥＲ２抗体２によるエピトープ遮断の効力を解析するために、プレブロッキングしておいた細胞に、２５ｎＭビオチン化抗体（ビオチン化は、製造業者の説明に従って、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス）を使って行った）を添加し、その後、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン複合体を使って検出した。
【０１４７】
結果：
この実験の結果を図１に示す。抗体のいずれかでプレブロッキングすると、対応するビオチン化抗体の結合が劇的に低下した。このことは、２種類の異なる抗体のエピトープが、プレブロッキング工程によって効果的に、かつ、特異的にブロッキングされたことを示している（図１Ｂ）。
【０１４８】
Ｃ１２およびＧ１０の結合は、抗ＨＥＲ２抗体１を使ったプレブロッキングによっても、抗ＨＥＲ２抗体２を使ったプレブロッキングによっても影響されなかった。このことは、これら両方のクローンが、抗ＨＥＲ２抗体１および抗ＨＥＲ２抗体２とは別のエピトープに結合することを示している（図１Ａ）。
【０１４９】
実施例３：本発明の結合分子は、個々の結合タンパク質の組み合わせよりも強い抗増殖性効果を有する。
２種類の異なる結合特異性を有するＨＥＲ２標的指向化分子を、Ｃ１２を、グリシン−セリン（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを介して、抗ＨＥＲ２抗体１の軽鎖のＮ−末端に（ＣＯＶＡ２０８と呼ばれるタンパク質を生じる）または抗ＨＥＲ２抗体２の軽鎖のＮ−末端に（ＣＯＶＡ２１０と呼ばれる）に融合させることで作成した。
【０１５０】
方法：
抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と配列番号１５５）、抗ＨＥＲ２抗体２（配列番号１６０および配列番号１６３）、ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と配列番号１５９）およびＣＯＶＡ２１０（配列番号１６０、配列番号１６１）を、ＣＨＯ細胞内で一過的に同時に発現させ、培養上清から、マブセレクトシュアカラム（ＧＥヘルスケア）を使ったアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。二価の単一特異性フォーマットのクローンＣ１２を、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を介したヒトＦｃγ１のＣ−末端への融合によって作成し、Ｆｃ−Ｃ１２（配列番号１５３）を得た。抗ＨＥＲ２抗体１、抗ＨＥＲ２抗体２、ＣＯＶＡ２０８およびＣＯＶＡ２１０に関して上で記載したのと同様に、タンパク質を発現させ、精製した。
【０１５１】
ＨＥＲ２標的指向化構築物の成長阻害効果を、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍細胞株（ＡＴＣＣから購入）を使い、インビトロで調査した。このヒトＨＥＲ２を過剰発現している胃細胞株を、１０％ＦＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；５６℃で４５分間、熱不活性化した）を補充したＲＰＭＩ１６４０（ギブコ）中で生育させた。９６−ウェルプレートに、１ウェルあたり、１００μｌの生育培地に入れた７０００個の細胞を播種した。３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、２０μｌの抗ＨＥＲ２構築物Ｆｃ−Ｃ１２、ＣＯＶＡ２０８、ＣＯＶＡ２１０、抗ＨＥＲ２抗体１または抗ＨＥＲ２抗体２、またはこれら薬剤の組み合わせを添加した。それぞれの条件について３つ組みで実験を行い、薬剤は、３００ｎＭ〜０．０１５ｎＭの間で、３倍に段階希釈して添加した。組み合わせの実験については、各薬剤を記載した濃度（例えば、３００ｎＭのＦｃ−Ｃ１２と３００ｎＭの抗ＨＥＲ２抗体１）で用いた。５日後、処理した培養の生存率をＸＴＴ（ロシュ）で解析した。ＸＴＴ試薬は、代謝が活性な細胞によって、色のついたホルマザン産物に変換され、これは４５０ｎｍの波長で光を吸収する。吸光度は、生きている細胞の数と直接相関する。ＰＢＳで処理し細胞に対する生存率（％）を、以下の式に従って計算した。
【０１５２】
【数１】
0006325463.tif 000003
【０１５３】
平均生存率（％）をｌｏｇ１０（濃度）に対してプロットし、得られた用量−反応曲線をプリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを使い、非線形回帰で分析した。非線形回帰には、以下の三パラメータ方程式を用いた。
【０１５４】
【数２】
0006325463.tif 000004
【０１５５】
結果：
ＳＨ３由来結合剤Ｃ１２をヒトＦｃγ１のＣ−末端に繋いだ融合体であるＦｃ−Ｃ１２は、細胞の生存率にいかなる効果も及ぼさなかった（図２Ａおよび２Ｃ）。抗ＨＥＲ２抗体１または抗ＨＥＲ２抗体２と組み合わせて添加した場合には、Ｆｃ−Ｃ１２は、これらの２種類の抗体の活性を有意に増加もまたは低下もさせなかった（図２Ａおよび２Ｃ）。しかしながら、クローンＣ１２を、抗ＨＥＲ２抗体１（ＣＯＶＡ２０８）または抗ＨＥＲ２抗体２（ＣＯＶＡ２１０）の軽鎖のＮ−末端に融合させて、抗原に対し、２つの異なる結合特異性を有する分子を生成した場合には、未改変の対応する抗体の抗増殖性効果を増強させた（図２Ｂおよび２Ｄ）。
【０１５６】
まとめると、これらの結果は、分子ＣＯＶＡ２０８およびＣＯＶＡ２１０が個々の単一特異性結合タンパク質の組み合わせよりも優れていることを示している。
【０１５７】
実施例４：抗ＨＥＲ２フィノマー−抗体融合体の抗増殖性活性は、フィノマーと抗体の結合部位の相対的な向きによって異なる。
Ｆｙｎ  ＳＨ３由来配列を抗体に結合したときの融合部位の影響を調査するために、複数の異なるＣ１２-抗体融合体の、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍細胞の成長阻害能を試験した。
【０１５８】
方法：
ＣＯＶＡ２０１（配列番号１５６；配列番号１５５）、ＣＯＶＡ２０２（配列番号１５４；配列番号１５７）、ＣＯＶＡ２０７（配列番号１５８；配列番号１５５）およびＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４；配列番号１５９）は全て、クローンＣ１２を、重鎖のＣ−末端（ＣＯＶＡ２０１）、軽鎖のＣ−末端（ＣＯＶＡ２０２）、重鎖のＮ−末端（ＣＯＶＡ２０７）および軽鎖のＮ−末端（ＣＯＶＡ２０８）のいずれかに融合させた、Ｃ１２−抗ＨＥＲ２抗体１融合体である。発現と精製は、実施例３でＣＯＶＡ２０８に関して記載したのと同様に行った。細胞の成長阻害アッセイは、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を用い、実施例３で記載したのと同様に行った。
【０１５９】
結果：
異なるフォーマットのＣ１２−抗ＨＥＲ２抗体１が、異なる活性を示すことが分かった（図３Ａおよび３Ｂ）。腫瘍細胞の成長阻害という点では、ＣＯＶＡ２０８の効果が最も高く、相対生存率を３７％まで抑えた。ＣＯＶＡ２０７とＣＯＶＡ２０１は中程度の活性を示し（生存率はそれぞれ、５２％および６１％）、ＣＯＶＡ２０２の活性が最も弱く、生存率を６７％までしか阻害しなかったが、それでも抗ＨＥＲ２抗体１（８１〜８２％の生存率）の活性よりは高かった。
【０１６０】
これらの結果は、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来配列と抗体の１対の融合体は、融合部位によって異なる活性を有すること、およびＣ１２と抗ＨＥＲ２抗体１との軽鎖Ｎ末端融合体（＝ＣＯＶＡ２０８）が最も強い抗増殖性効果を現したことを示している。
【０１６１】
実施例５：ＣＯＶＡ２０８は、抗ＨＥＲ２抗体１よりも高い効力でＢＴ−４７４細胞の成長を阻害する。
【０１６２】
方法：
ヒト乳腺腫瘍細胞株ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣから購入）に対するＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）による腫瘍細胞の成長阻害を抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）と比較した。このＨＥＲ２を過剰発現している細胞株は、ＨＥＲ２標的指向化剤の活性を試験するための、最も解析が進んでいるモデルの１つである。ＢＴ−４７４細胞を、１０％の熱不活性化したＦＢＳ（ギブコ）と１０μｇ／ｍｌのヒト組換えインスリンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ギブコ）中で生育させた。アッセイは、実施例３でＮＣＩ−Ｎ８７細胞に関して記載したのと同様に行った。
【０１６３】
結果：
ＣＯＶＡ２０８は、抗ＨＥＲ２抗体１よりも高い抗増殖性活性を示した（図４）。
【０１６４】
実施例６：ＣＯＶＡ２０８はインビボで、抗ＨＥＲ２抗体１よりも効果的に、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍成長を阻害する。
ＣＯＶＡ２０８を腫瘍成長の阻害に関してインビボで調査し、抗ＨＥＲ２抗体１と比較した。
【０１６５】
方法：
５×１０６個のヒト胃腫瘍細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−５８２２）を、胸腺欠損ＣＤ−１ヌードマウス（チャールスリバー）の皮下に接種した。腫瘍体積と体重を、１週間に３回記録した。腫瘍体積は、式：溶液＝（幅）２×長さ×π／６に従って計算した。腫瘍を接種して４２日後、腫瘍の大きさの平均が約１４０ｍｍ３に達したら、マウスを６匹ずつ、無作為に３つの処理群に振り分け、処理を開始した。ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）および抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）を１週間に１回、４週間にわたって腹腔内投与した（合計で５回の注射）。初回（負荷）投与量を３０ｍｇ／ｋｇとし、各その後の（維持）投与量は１５ｍｇ／ｋｇとした。対照群のマウスにはＰＢＳを注射した。
【０１６６】
結果：
抗ＨＥＲ２抗体１の処理は、弱い腫瘍成長の阻害しか生じなかった（図５）。ＣＯＶＡ２０８は、処理を行っている期間にわたり、抗ＨＥＲ２抗体１よりも高い腫瘍成長の抑制効果を示した。３２日目、ＣＯＶＡ２０８で処理したマウスの腫瘍体積は、処理開始時（ｄ＝０）の最初の腫瘍の大きさと比較して、８％小さくなっていたが、抗ＨＥＲ２抗体１で処理したマウスでは、容積は８８％の増加を示した。
【０１６７】
この結果は、抗ＨＥＲ２抗体１と比較して、ＣＯＶＡ２０８がインビボでも有意に優れた効力を示すことを現している。
【０１６８】
実施例７：ＣＯＶＡ２０８はインビボで、抗体様ＰＫプロファイルを示す。
【０１６９】
方法：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールスリバー）におけるＣＯＶＡ２０８の薬物動態プロファイルを調査し、抗ＨＥＲ２抗体１と比較した。３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、２００μｇのＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）または抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）を静脈注射した。１０分、および６、２４、４８、９６、１２０、１４４、１６８時間後、血液をＥＤＴＡでコーティングされた採血管（マイクロベット、ザルスタット）に採取し、９３００ｇで１０分間遠心分離し、そして、ＣＯＶＡ２０８または抗ＨＥＲ２抗体１の血清レベルをＥＬＩＳＡで決定した。黒のマキシソープマイクロタイタープレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））を、５０ｎＭのＨＥＲ２  ＥＣＤ（ベンダーメドシステムズ）でコーティングした。ＰＢＳに溶解した４％の脱脂粉乳（ラピライト、ミグロス、スイス）でブロッキングした後、４０μｌのＰＢＳと、適切に希釈した１０μｌの血清をアプライした。１時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、結合したＣＯＶＡ２０８または抗ＨＥＲ２抗体１を、プロテインＡ−ＨＲＰ複合体（シグマ）で検出した。クオンタレッド（ＱｕａｎｔａＲｅｄ）蛍光発生基質（ピアス）を使ってアッセイを発光させ、５〜１０分後に、蛍光強度を５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）で測定した。ＣＯＶＡ２０８および抗ＨＥＲ２抗体１の検量線（それぞれ３３３〜０．５ｎｇ／ｍｌに希釈した）から、ＣＯＶＡ２０８および抗ＨＥＲ２抗体１の血清レベルを決定した。決定した、血清中の様々な時点でのＣＯＶＡ２０８および抗ＨＥＲ２抗体１の濃度、ならびに得られる排出相の勾配ｋ（片対数目盛りでプロットした）から、式：ｔ１／２＝ｌｎ２／−ｋを使って半減期を計算した。
【０１７０】
結果：
図６に示すように、排出相（ベータ相、２４時間〜１６８時間の時点）から決定したＣＯＶＡ２０８および抗ＨＥＲ２抗体１の半減期は非常に似ていた（それぞれ、２４７時間および１８７時間）。これらのデータは、ＣＯＶＡ２０８が薬剤様のインビボＰＫ特性を有していることを示している。
【０１７１】
実施例８：ＣＯＶＡ２０８は安定であり、かつ、凝集しない
ＣＯＶＡ２０８の完全性および安定性をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーで評価した。
【０１７２】
方法
精製したＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）と抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。還元したまたは還元していないいずれかのジスルフィド結合を有する４μｇのタンパク質を、１×ＭＯＰＳ泳動用緩衝液（インビトロジェン）に入れた４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ）ゲルに、分子量マーカー（ＲＰＮ８００ｅ；ＧＥヘルスケア）と共に負荷した。タンパク質のバンドをクーマシー染色によって可視化した。
【０１７３】
ＣＯＶＡ２０８の、精製した直後のタンパク質と、精製し、ＰＢＳ中、４℃で１または２ヶ月保存した後のタンパク質の、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のプロファイルを決定した。濃度１．７５ｍｇ／ｍＬのＣＯＶＡ２０８を１００μｌ、スパデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア）に負荷し、ＰＢＳを０．５ｍｌ／分の速さで流して、カラムからの溶出をＯＤ２８０で測定することでモニタリングした。
【０１７４】
結果：
ＣＯＶＡ２０８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とＳＥＣプロファイルを図７に示す。ＣＯＶＡ２０８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、予想される分子量の、特徴のはっきりとしたバンドとして流れている（上図）。特に興味がもたれるのは、ＣＯＶＡ２０８には検出可能な天然の軽鎖（ＭＷおよそ３０ｋＤａ）がないということが見出されることであり、このことは、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来クローンＣ１２の抗体軽鎖からの切断がないことを示している。
【０１７５】
１つの主要なピークとして、保持容量１３．１ｍｌでＳＥＣカラムから溶出されたＣＯＶＡ２０８（下図）。抗ＨＥＲ２抗体１は１３．２ｍｌで溶出された。最も重要なことは、ＣＯＶＡ２０８タンパク質調製物では、８ｍｌの付近で溶出される凝集体が検出されなかったことである。
【０１７６】
４℃で２ヶ月間保存しても、ＣＯＶＡ２０８のＳＥＣプロファイルは変化しなかった。溶出ピークは狭く、対称に保たれ、同じ保持容量に現れた。１ヶ月および２ヶ月保存した後も、タンパク質調製物には凝集体が含まれないままであった。このことは、ＣＯＶＡ２０８は、４℃で長期間保存しても安定性を保持することを示している。要約すると、これらの結果は、ＣＯＶＡ２０８が安定な、最適な生物物理学的特性を有する単分散分子であることを支持するものである。
【０１７７】
実施例９：ＣＯＶＡ２０８は１０種類のＨＥＲ２を発現している腫瘍細胞株のパネルに対し、抗ＨＥＲ２抗体１よりも優れた成長阻害活性を有する。
数種類の異なるＨＥＲ２陽性細胞株に対するＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）の抗増殖性活性を、抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）と比較した。ＸＴＴアッセイは、実施例３に記載したのと本質的に同様に行った。この実験で使用した細胞株および実験条件を表１に示す。用量−反応曲線を実施例３で記載したのと同様に三パラメーター方程式に当てはめ、最大成長阻害を以下の式に従って計算した。
阻害の最大レベル（％）＝１００％−最低値
前記式における種々の最低値は、以下の式を使った、用量−反応曲線の非線形回帰から導く。
【０１７８】
【数３】
0006325463.tif 000005
【０１７９】
これらアッセイの結果を図９に示す。図９Ａおよび９Ｂは、ＯＥ１９細胞株とＣａｌｕ−３細胞株のそれぞれに関して得られた用量−反応曲線を示している。図９Ｃは、ＣＯＶＡ２０８および抗ＨＥＲ２抗体１を用い、各細胞株について得られた最大成長阻害（図２および４で示したＮＣＩ−Ｎ８７およびＢＴ−４７４細胞株に関する結果を含む）を表している。ＣＯＶＡ２０８は１０種類全ての細胞株に対して抗ＨＥＲ２抗体１よりも高い抗増殖性活性を示す。
【０１８０】
実施例１０：ＣＯＶＡ２０８はＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞でのアポトーシスを誘導する
ＣＯＶＡ２０８のＮＣＩ−Ｎ８７細胞に対するアポトーシス誘導能を、カスパーゼ３／７の酵素活性を解析すること、およびＴＵＮＥＬ染色によってＤＮＡの断片化を検出することによって調査した。
【０１８１】
方法
カスパーゼ３／７アッセイ：４５，０００個のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに播種した。１日後、１００ｎＭの抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）、ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）またはＰＢＳを細胞に添加した。それぞれの処理は三つ組で準備した。陽性対照としては、１μＭのスタウロスポリンを添加した。２日間インキュベートした後、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７の活性を蛍光Ａｐｏ−ｏｎｅ（登録商標）同種カスパーゼ−３／７キット（ピアス）を使って決定した。
【０１８２】
並行して複製プレートを使い、処理した培養の生存率をＸＴＴで解析して、実施例３で記載したのと同様に、ＰＢＳで処理した試料に対する生存率（％）を計算した。
【０１８３】
カスパーゼ３／７活性を生存率（％）で除算し、正規化したカスパーゼ３／７活性を得た。
【０１８４】
ＴＵＮＥＬアッセイ：２ｍＬにした０．８×１０６個のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、６−ウェルプレートに塗り広げた。翌日、３００ｎＭの抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）、ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）またはＰＢＳを細胞に添加した。陽性対照としは、１μＭのスタウロスポリンを添加した。３日間インキュベートした後、細胞をはがし、ホルマリン固定し、氷冷した７０％エタノールで透過処理し、その後ＡＰＯ−ダイレクトキット（フェニックスフローシステムズ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｆｌｏｗ  ｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して、３’−ヒドロキシルＤＮＡ末端をフルオレセイン−デオキシウリジン三リン酸（ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ）で標識した。標識した細胞をＦＡＣＳで解析し、ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ陽性の細胞集団をゲーティングすることで、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（％）を決定した。
【０１８５】
結果
カスパーゼ３／７アッセイの結果を図１０Ａに示す。ＣＯＶＡ２０８はカスパーゼ３／７活性を上昇させた。このことは、ＣＯＶＡ２０８がＮＣＩ−Ｎ８７細胞においてアポトーシスを誘導したことを示している。抗ＨＥＲ２抗体１は誘導性カスパーゼ３／７活性を生じなかった。
【０１８６】
ＴＵＮＥＬアッセイの結果を図１０Ｂに示す。ＣＯＶＡ２０８は大部分の細胞においてＤＮＡの断片化を誘導しており、このことは、ＣＯＶＡ２０８がアポトーシスを誘導することが可能であるが、抗ＨＥＲ２抗体１はそうではないことを、さらに支持している。
【０１８７】
実施例１１：ＣＯＶＡ２０８は、リガンドに依存した、およびリガンドに依存していないＨＥＲ２介在性シグナル伝達を阻害する。
ＨＥＲ２下流シグナル伝達の活性化は、ＨＥＲ３のリン酸化を引き起こしてＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ経路を活性化させるか、またはＭＡＰＫ／Ｅｒｋ経路の活性化を引き起こす。ＨＥＲ２を十分に高密度で表面に提示している腫瘍細胞株では、ＨＥＲ３リガンドが欠損している場合、これらの下流経路は恒常的に活性化されている（リガンド非依存性シグナル伝達）。ＨＥＲ２下流シグナル伝達のリガンド非依存性活性化に加えて、ＨＥＲ２とＨＥＲ３のヘテロ二量体形成を促進するＨＥＲ３リガンドによっても下流経路は活性化される可能性がある（リガンド依存性シグナル伝達）。
【０１８８】
ＣＯＶＡ２０８がＨＥＲ２下流シグナル伝達に及ぼす影響を調査するために、ＨＥＲ２を過剰発現しているＮＣＩ−Ｎ８７細胞をＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）、抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）、抗ＨＥＲ２抗体２（配列番号１６０と１６３）、またはＰＢＳで処理し、免疫ブロット法により、細胞溶解物のリン酸化タンパク質を解析した。
【０１８９】
アッセイを、ＨＥＲ２の発現量が低いＭＣＦ−７細胞についても行った。ＭＣＦ−７細胞では、ＨＥＲ２の下流のリン酸化は、ＨＥＲ３リガンドであるヘレグリン−１βを添加した後にのみ誘導される。
【０１９０】
方法
完全培地に入れたＮＣＩ−Ｎ８７細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−５８２２）を、６ウェルの組織培養用プレートに、１ウェルあたり３ｍＬ、１×１０６細胞になるように分配した。一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした後、４０μｇ／ｍＬの抗ＨＥＲ２剤を添加し、細胞を７２時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。その後細胞を氷上で、細胞溶解用緩衝液（１％トリトン−Ｘ、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤カクテル含有、ロシュ・アプライド・サイエンス）中で溶解した。
【０１９１】
ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ；ＨＴＢ−２２）を、１０％のＦＢＳ（ギブコ）を添加したＭＥＭ（ギブコ）中で培養した。細胞を、６ウェルの培養用プレートで、１ウェルあたり３ｍＬ、０．５×１０６細胞で分配した。一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした後、細胞を血清を含まない培地中で３時間、血清飢餓の状態とした。次いで、４０μｇ／ｍＬの抗ＨＥＲ２剤を１時間、細胞を３７℃、５％ＣＯ２に維持しながら添加した。４５分後、２ｎＭのヒト組換えヘレグリン−１β（Ｒ＆Ｄシステムズ）を１５分間添加した。その後細胞を氷上で、細胞溶解用緩衝液（１％トリトン−Ｘ、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤カクテル含有、ロシュ・アプライド・サイエンス）中で溶解した。
【０１９２】
全細胞溶解液を、４℃で１０分間、１６，０００×ｇで遠心分離することで清澄化し、清澄化した溶解液のタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイ（バイオ・ラッド）で決定した。１０μｇのタンパク質をノヴェックス（登録商標）４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン）で分離し、ＰＶＤＦ膜上に移した。
【０１９３】
ＰＶＤＦ膜上のリン酸化タンパク質を、ｐＨＥＲ３Ｙ１２８９（ミリポア）、ｐＡｋｔＳ４７３（ＣＳＴ）またはｐＥｒｋ１／２Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＣＳＴ）に対する抗体と、次いでＨＲＰ結合二次抗体（ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を使用して検出した。ビンキュリンは、ビンキュリン特異的抗体（ミリポア）で検出し、ローディングコントロールとした。この免疫ブロットをＥＣＤプライム（ＥＣＤ  ｐｒｉｍｅ）化学発光ＨＲＰ基質（ＧＥヘルスケア）で発光させ、Ｘ線フィルム上で露光した。
【０１９４】
結果：
この実験の結果を図１１に示す。ＨＥＲ２下流シグナル伝達にＨＥＲ３リガンドが必要とされるＭＣＦ−７細胞では、ＣＯＶＡ２０８および抗ＨＥＲ２抗体１の両方がＨＥＲ３のリン酸化を遮断し、ＡｋｔおよびＥｒｋ１／２も同様であった。このことは、ＣＯＶＡ２０８がその親抗体の活性を保持していたことを示している。対照的に、抗ＨＥＲ２抗体２はＨＥＲ３、ＡｋｔまたはＥｒｋ１／２のリガンド誘導性のリン酸化を遮断していない。
【０１９５】
ＨＥＲ２下流シグナル伝達タンパク質のリン酸化が、ＨＥＲ３リガンドには依存せずにおこるＮＣＩ−Ｎ８７細胞では、ＣＯＶＡ２０８はＨＥＲ３、ＡｋｔまたはＥｒｋ１／２のリン酸化を効率的に遮断するが、抗ＨＥＲ２抗体１はリン酸化を遮断しない。これらの条件においては、抗ＨＥＲ２抗体２もＨＥＲ２のシグナル伝達を効率的に遮断することが可能である。これらの結果は、ＣＯＶＡ２０８は、リガンド依存性のＨＥＲ２下流シグナル伝達イベントとリガンド非依存性のＨＥＲ２下流シグナル伝達イベントの両方を遮断するが、抗ＨＥＲ２抗体１および抗ＨＥＲ２抗体２は、どちらか一方を遮断するが他方は遮断しないことを示している。
【０１９６】
実施例１２：ＣＯＶＡ２０８はＮＣＩ−Ｎ８７細胞に取り込まれる。
ＣＯＶＡ２０８がインビトロにおいてＨＥＲ２受容体の取り込みを促進するか否かを調査するために、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞をＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）または抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）存在下で培養した。次いで細胞を固定し、透過処理した後、蛍光二次抗体を使った方法によって、抗ＨＥＲ２剤を検出した。顕微鏡画像法を用い、蛍光シグナルの細胞内分布を評価した。
【０１９７】
方法
ラブテック（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）ＩＩ  ＣＣ２チャンバースライドのウェル内で生育させたＮＣＩ−Ｎ８７細胞の表面を、氷上で１時間、１００ｎＭのＣＯＶＡ２０８または抗ＨＥＲ２抗体１で標識した。その後、結合しなかった抗ＨＥＲ２剤を洗い落とした。陽性対照として、ＨＥＲ２の迅速な取り込みを生じる１μＭのゲルダナマイシン（Ｈｓｐ９０阻害剤）をいくつかのウェルに添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２に０時間または５時間移して内部移行させ、その後、ホルマリンで固定、次いでサポニンで透過処理した。アレクサ４８８で標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（インビトロジェン）を使用し、透過処理した細胞上の抗ＨＥＲ２剤を検出し、また、核をヘキスト３３３４２色素で染色した。染色した細胞を、ライカＴＣＳ  ＳＰ２−ＡＯＢＳレーザー走査共焦点顕微鏡で解析した。光学切片（ｚ−スタック、ｄ＝０．２μｍ）を収集し、３つの領域について解析した。それぞれのドットに局在している抗ＨＥＲ２剤の量を、検出された球状ドット用のイマリスの表面ツールを用い、ドット内に含まれている抗ＨＥＲ２剤のパーセンテージを表すイマリス７．４．０ソフトウェア（ビットプレーン（Ｂｉｔｐｌａｎｅ））で定量した。
ドット内の抗ＨＥＲ２剤（％）＝（ドット体積／全抗ＨＥＲ２染色の体積）×１００
【０１９８】
結果
表面を標識した後で、かつ、３７℃でインキュベートする前、ＣＯＶＡ２０８と抗ＨＥＲ２抗体１は細胞膜に局在していた。３７℃で５時間インキュベートすると、ＣＯＶＡ２０８はサイトゾル中のはっきりと識別できるドット内に含まれており、細胞膜は非常に薄くしか染色されなかった。一方、抗ＨＥＲ２抗体１は３７℃で５時間インキュベートした後も細胞膜にとどまっており、サイトゾル内のごく僅かなドットしか検出されなかった。ゲルダナマイシンと一緒にインキュベートした場合には、抗ＨＥＲ２抗体１もドット内に見出され、細胞膜は抗体に関して陰性であった。これらの結果は、ＣＯＶＡ２０８は抗ＨＥＲ２抗体１とは異なり、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞内に迅速に取り込まれることを示している。
【０１９９】
ドット内に見られる染色（％）の定量結果を図１２に示す。ＣＯＶＡ２０８の大部分がドット内に局在しているが、抗ＨＥＲ２抗体１はごく僅かしかドット内には認められない。
【０２００】
実施例１３：ＣＯＶＡ２０８はインビボでのＫＰＬ−４乳腺腫瘍の成長を、抗ＨＥＲ２抗体１よりも効果的に阻害する。
ＣＯＶＡ２０８をＫＰＬ−４乳腺腫瘍の成長阻害に関してインビボで調査し、抗ＨＥＲ２抗体１と比較した。
【０２０１】
方法：
３×１０６個のヒトＫＰＬ−４乳腺腫瘍細胞（クレバヤシ（Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ）ら（１９９９）英国癌学会誌７９；７０７〜７１７）を、メスのＳＣＩＤベージュマウス（チャールスリバー）の乳腺脂肪体に移植した。腫瘍体積および体重を１週間につき３回記録した。腫瘍体積は、式：容積＝（幅）２×長さ×π／６に従って計算した。腫瘍の大きさの平均が７０ｍｍ３に達した時点でマウスを、１群がそれぞれ８匹のマウスから構成される、３処理銀に無作為に振り分け、処理を開始した。ＣＯＶＡ２０８（配列番号１５４と１５９）、抗ＨＥＲ２抗体１（配列番号１５４と１５５）またはＰＢＳを１週間に１回腹腔内投与し、これを４週間継続した（合計で５回注射した）。初回（負荷）投与量を３０ｍｇ／ｋｇとし、その後の（維持）投与量は各回１５ｍｇ／ｋｇとした。
【０２０２】
結果：
抗ＨＥＲ２抗体１で処理しても、非常に弱い腫瘍成長の阻害しか生じなかった（図１３）。ＣＯＶＡ２０８は有意に高い腫瘍成長の制御を示した。この結果は、ＣＯＶＡ２０８が抗ＨＥＲ２抗体１と比較して、インビボにおいて有意に優れた効力を示すということをさらに支持するものである。
【０２０３】
実施例１４：Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２が結合するＨＥＲ２エピトープの決定
Ｆｙｎ  ＳＨ３由来クローンＣ１２（配列番号１）が結合するＨＥＲ２のエピトープを、インテグラルモレキュラー社（Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．、フィラデルフィア、米国）で行った、アラニンスキャニング変異導入法によって同定した。パエス（Ｐａｅｓ）ら（２００９）米国化学学会誌１３１（２０）：６９５２〜６９５４に記載されているように、ショットガン突然変異生成により突然変異体のライブラリーを作成した。簡単に説明すると、完全長ヒトＨＥＲ２をコードしている真核細胞用発現プラスミドを、Ｃ末端Ｖ５ヒス−エピトープタグを使って構築した。親ｃＤＮＡ構築物を鋳型として用い、アラニンスキャニングによる突然変異を、ＰＣＲを使った突然変異生成によって、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（配列番号１７１の２３〜６５２番目のアミノ酸）に導入した。親構築物中で既にアラニンだった残基は、メチオニンに変異させた。変異を導入した構築物と親ＨＥＲ２対照構築物をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中で発現させた。形質転換して２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を対照の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ＭＡＢ１１２９、Ｒ＆Ｄシステムズ）と、またはＦｙｎ  ＳＨ３由来クローンＣ１２（Ｎ末端Ｆｃ融合体として発現させた）と、１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を加えたＣａ２＋／Ｍｇ２＋添加ＰＢＳ（ＰＢＳ＋＋）中で１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をヤギ抗ヒトアレクサフルオロ４８８結合二次抗体（ジャクソン、ウェストグローブ、ペンシルバニア）と、ＮＧＳを加えたＰＢＳ＋＋中で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで２回洗浄した。マイクロプレートを、インテリサイト（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）ＨＴＦＣスクリーニングシステムを使ったフローサイトメトリーで測定し、フォアサイト（Ｆｏｒｅｃｙｔ）ソフトウェア（インテリサイト（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アルバカーキ、ニューメキシコ）を使って定量した。
【０２０４】
Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）が、ＨＥＲ２のドメインＩ（配列番号１７２）に局在しているＨＥＲ２のエピトープに結合することが分かった。より詳しく説明すると、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号１）を含む結合分子の結合が顕著に低下するが、対照抗体であるＭＡＢ１１２９の結合は保持される、５つのアラニンスキャニング突然変異を同定した。これらの突然変異には、配列番号１７２の配列と比較して、Ｔ１６６Ａ、Ｒ１８８Ａ、Ｐ１９７Ａ、Ｓ２０２ＡおよびＲ２０３Ａの変異が含まれていた。言い換えると、ＨＥＲ２のドメインＩの、少なくともＴ１６６、Ｒ１８８、Ｐ１９７、Ｓ２０２およびＲ２０３の位置のアミノ酸が、Ｆｙｎ  ＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２とＨＥＲ２との結合に関与している。
【０２０５】
【表１】
0006325463.tif 000006
【図１】
0006325463.tif 000007
【図２−１】
0006325463.tif 000008
【図２−２】
0006325463.tif 000009
【図３】
0006325463.tif 000010
【図４】
0006325463.tif 000011
【図５】
0006325463.tif 000012
【図６】
0006325463.tif 000013
【図７】
0006325463.tif 000014
【図８】
0006325463.tif 000015
【図９−１】
0006325463.tif 000016
【図９−２】
0006325463.tif 000017
【図１０】
0006325463.tif 000018
【図１１】
0006325463.tif 000019
【図１２】
0006325463.tif 000020
【図１３】
0006325463.tif 000021
【配列表】
0006325463000001.app