(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：
0006360896.tif 000009
Ｒ＝‐(ＣＨ２‐ＣＨ２-Ｏ)３‐ＣＨ３
の新規の非対称スクアライン染料およびその錯体。
【請求項２】
生細胞内のチオール濃度におけるミリモルからミクロモル変動の検出に有用である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
（ａ）１〜１．２ｍＬのＴＢＯＦを加えながら、４０〜４５ｍＬのイソプロパノール中で３〜０．３５ミリモルのＮ，Ｎ‐ジブチルアニリンのセミスクアラインを３〜０．３５ミリモルのスチリルピロール誘導体と反応させる工程、
（ｂ）上記混合物を、８０〜９０℃で１０〜１２時間環流する工程、
（ｃ）反応混合物を冷却し、蒸留によりイソプロパノールを除去する工程、
（ｄ）上記のように得られた粗製混合物を濾過し、クロロホルム中に再溶解し、更にカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル上で２％メタノール／クロロホルムを用いて精製して、式１の非対称スクアライン染料を得る工程
を含む、請求項１記載の式１の化合物の製造方法。
【請求項４】
（ａ）濃度１．２×１０−３〜２．４×１０−３Ｍのアセトニトリル中で式１のスクアライン染料の保存溶液を調製する工程、
（ｂ）濃度２．４×１０−３〜２．４×１０−３Ｍで、リン酸塩緩衝液中のＢＳＡまたはＨＳＡタンパク質の保存溶液を調製する工程、
（ｃ）４．２〜１１．６のｐＨ溶液で、上記工程（ｂ）で調製したＢＳＡまたはＨＳＡタンパク質の保存溶液を、１：１２（１×１０−６Ｍ：１２×１０−６Ｍ）、１：６（１×１０−６Ｍ：６×１０−６Ｍ）、１：１（１×１０−６Ｍ：１×１０−６Ｍ）、１：１／６（１×１０−６Ｍ：０．１６７×１０−６Ｍ）、および１：１／１２（１×１０−６Ｍ：０．０８３×１０−６Ｍ）から成る群から選択される比で、上記工程（ａ）のスクアライン染料の保存溶液に加えて、該溶液を１〜２時間保持した後、発光スペクトルを記録する種々のＳｑ‐タンパク質錯体を得る工程
を含む、請求項１記載のタンパク質錯体の製造方法。
【請求項５】
自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、ｐＨが４．２〜６．０である、血清アルブミンタンパク質の選択的非共有結合標識化法に有用である、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、ｐＨが７．２〜８．８である、血清アルブミンタンパク質の選択的共有結合標識化法に有用である、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
ミクロモル濃度での式１のスクアライン染料が、水中でサイズ１００〜２００ｎｍの球状集合体となる、請求項１記載の化合物。
【請求項８】
自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、他のチオール含有タンパク質および非チオール含有タンパク質の中で、血清アルブミンタンパク質を選択的に検出する、請求項１記載の化合物。
【請求項９】
自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、ＮＩＲ発光（６５０〜７５０）を示す４．２〜６．０の低ｐＨで、他のタンパク質および小分子の中で血清アルブミンタンパク質を選択的に検出する、請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、緑色蛍光発光（４５０〜６００ｎｍ）を示す７．２〜８．８の高ｐＨで、他のタンパク質および小分子の中で血清アルブミンタンパク質を選択的に検出する、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
１：１２（１×１０−６Ｍ：１２×１０−６Ｍ）、１：６（１×１０−６Ｍ：６×１０−６Ｍ）、１：１（１×１０−６Ｍ：１×１０−６Ｍ）、１：１／６（１×１０−６Ｍ：０．１６７×１０−６Ｍ）、１：１／１２（１×１０−６Ｍ：０．０８３×１０−６Ｍ）の異なる比での式１のスクアライン染料のＢＳＡとの組み合わせを、４．６〜１１．６のｐＨの異なる領域におけるｐＨの小変動を監視するのに用いることができる、請求項１記載の化合物のナノプローブ。
【請求項１２】
比１：６の式１のスクアライン染料のＢＳＡまたはＨＳＡタンパク質との組み合わせを、６．５〜７．５のｐＨ変動を監視するための生体細胞試料の画像化に用いることができる、請求項１記載の化合物のナノプローブ。
【請求項１３】
（ａ）３×１０−３Ｍ〜３×１０−６Ｍの濃度のＮＥＭと共に１５〜２０分間、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を培養する工程、
（ｂ）アセトニトリル中で調製した１．２×１０−３Ｍの式１：
0006360896.tif 000010
Ｒ＝‐(ＣＨ２‐ＣＨ２-Ｏ)３‐ＣＨ３
のスクアライン染料を細胞に加えて、１０分間保持する工程、
（ｃ）遠心分離を２回行うことによって、細胞を洗浄して該細胞の外面の該スクアライン染料を除去する工程、
（ｄ）６４０ｎｍの励起波長を有するフィルターおよび３８０ｎｍの励起波長を有するフィルターを用いる共焦点蛍光顕微鏡によって、上記のように得られた細胞を画像化する工程
を含む、細胞におけるチオール画像化方法。
【請求項１４】
（ａ）６．５〜７．５のｐＨでリン酸塩緩衝液と共に、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を予備培養し、１０分間保持する工程、
（ｂ）１：６（１×１０−６Ｍ：６×１０−６Ｍ）の比での式１：
0006360896.tif 000011
Ｒ＝‐(ＣＨ２‐ＣＨ２-Ｏ)３‐ＣＨ３
のスクアライン染料のＢＳＡとの組み合わせを各細胞に加えて、１０分間保持する工程、
（ｃ）上記のように得られた細胞を遠心分離して、２倍に希釈する工程、
（ｄ）６４０ｎｍの励起波長を有するフィルターおよび３８０ｎｍの励起波長を有するフィルターを用いる共焦点蛍光顕微鏡によって、画像化を行う工程
を含む、細胞におけるｐＨ変動の画像化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清アルブミンのチオール画像化、選択的標識化および検出のための式１：
【化１】
0006360896.tif 000002
Ｒ＝‐(ＣＨ２‐ＣＨ２-Ｏ)３‐ＣＨ３
のスクアライン系蛍光プローブに関する。本発明はまた、非常に高い感度を有するチオールの検出およびミリモル〜マイクロモルの間の生細胞内のチオール濃度のわずかな変動の監視に関連する。本発明は、特に生体媒質中でのわずかなｐＨの変化を監視するために、１：６染料‐タンパク質錯体を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体チオールは、酸化還元メチル転移およびＣｏＡ（コエンザイムＡ）関連反応などの様々な生物学的事象の規定に重要な役割を果たしている。細胞内のチオールの濃度レベルは、癌、エイズ、アルツハイマー病および心血管疾患を含む多くの疾患と関連している酸化ストレスに応答して劇的に変化する。したがって、細胞内チオールの、迅速で、高感度の、選択的同定は、細胞機能と疾患の検出および診断におけるその役割を調査するために大きな重要性を有する。今日使用される種々の分析技術の中でも、光学的検出は、数ある技術の中でも最も便利な方法であることが証明されており、蛍光発光は、その高い感度、低い検出限界のため重要な光学的検出方法であり、細胞内検出の優位性を有する。
【０００３】
チオールの求核性のために、蛍光発光系チオールセンサーは、マイケル付加、アルデヒドとの環化、スルホンアミド、スルホン酸エステルおよびジスルフィドの開裂を受ける。スクアライン染料は、化学センサーおよび化学線量計として広く研究されてきた。
【０００４】
タンパク質標識化は、タンパク質の機能、タンパク質動力学、タンパク質‐タンパク質相互作用などの多くの生物学的事象の直接的な可視化を可能にし、様々な生物学的に関連の分析物の検出のための重要な技術である。小さな有機発蛍光団を用いる標識化戦略が注目を集めている。レセプタータンパク質とリガンドとの間の相互作用の性質に依存して、標識化は、高親和性の非共有結合または部位特異的共有結合標識化のいずれかであってもよい。本明細書中においては、溶液のｐＨを変化させることにより、２つの異なるスペクトル応答を与える共有結合および非共有結合標識化の間の相互作用のモードを切り換える新規な蛍光分子を報告し、他のチオール含有競合分子の中から血清アルブミンタンパク質を選択的に検出する。
【０００５】
非特許文献１には、高感度で、生理的ｐＨ領域でチオールを検出する対称スクアライン系蛍光プローブが記載されている。その主な欠点は、チオールの検出が蛍光発光の消失に基づいているため、細胞内チオール画像化の検出には適用することができないことである。
【０００６】
非特許文献２には、レシオメトリックにチオールを検出する対称スクアライン染料を使用することが記載されている。その主な欠点は、プローブの反応性が非常に悪く、チオールの検出が、生体適合性の欠如のために、細胞内のチオール含有量を検出するために使用することができない塩基性のｐＨ９．６で起こることである。
【０００７】
非特許文献３および４には、濃度０．２〜１ｍＭのチオール不活性化分子ＮＥＭで前処理された細胞内でのチオールを検出する蛍光分子が記載されている。その主な欠点は、ミリモルの範囲内のみに限定される、細胞内でのチオールの検出である。
【０００８】
しかしながら、上記文献から明らかなように、ミリモルからマイクロモル範囲の濃度のＮＥＭで前処理した細胞内でのチオールの変動を画像化することができる蛍光プローブが未だ知られていないことである。
【０００９】
非特許文献５には、親和性リガンドの放出と共に部位特異的に合成プローブをタンパク質に導入することができる、リガンド指向型トシル（ＬＤＴ）化学と呼ばれる、タンパク質標識化方法が記載されており、上記分子は、最初にタンパク質と錯体を形成した後、共有結合標識化を行う。その主な欠点は、相互作用の両方のモードに対して分光学的応答が同じままであり、形成された初期の錯体があまり安定しておらず、すぐに共有結合標識化のみを可能とする反応を引き起こし、したがって、親和性に基づく不可逆的な共有結合標識化と呼ばれる。
【００１０】
上記文献から明らかなように、本発明における蛍光プローブは、異なる信号応答を生じる外部刺激を用いて制御することができる非共有結合および共有結合標識化との間のタンパク質との相互作用のモードを特異的に切り換える新規なアプローチである。
【００１１】
非特許文献６には、炭素ナノドットへの２つの異なる蛍光体を組み込むことによる、蛍光ｐＨナノセンサーが記載されており、炭素ナノドットの表面を官能化したこれらの蛍光体の比率を変えることにより、ｐＨスケールにおける感度の領域を調整することができる。この文献の主な欠点は、炭素ナノドット上を官能化した蛍光体の比率に基づく調整が、異なる比率の蛍光体で炭素ナノドットの新しい合成によって可能であることである。
【００１２】
非特許文献７には、ナノ粒子を形成するポリマーと共に蛍光染料を使用することが記載されており、異なる染料はｐＨスケールの異なる領域に感度を示す。この文献の主な欠点は、感度の異なる領域のために、異なる染料を有するポリマーを、別々に合成しなければならないことである。
【００１３】
標識化法は、溶液のｐＨの変化に対して可逆的であるので、細胞内のｐＨの変化を監視するために染料‐タンパク質錯体を使用した。細胞内ｐＨは、細胞増殖、受容体シグナル伝達、酵素活性、カルシウム調節および細胞接着を含む様々な細胞事象の調節に重要な役割を果たしている。通常の生理学的条件下では、ｐＨが７．３５〜７．４５の範囲内に維持される。この範囲外への少しの逸脱は、心肺および神経学的問題を引き起こす可能性があり（例えば、アルツハイマー病）、更に極端な変動は致命的である。細胞内のｐＨ変化のそのような検出は非常に重要である。小分子蛍光プローブ、ならびに蛍光タンパク質は、細胞内ｐＨ検出のために広く使用されてきた。本明細書中において、細胞内でのわずかなｐＨの変動を監視するために、特定比の染料タンパク質錯体を使用する。
【００１４】
上記文献から明らかなように、蛍光に基づくｐＨセンサーは、狭いｐＨ領域内のｐＨの変化を高感度で検出するか、または広い範囲のｐＨをより低感度で検出する。しかしながら、広い領域のｐＨの変化を高感度で検出するのに使用することができる単純なプローブは、まだ知られていない。本明細書中において、異なる比で混合することによって調製し、高感度で４．６〜１１．６のｐＨを検出するために使用できる、様々な比の染料タンパク質錯体が報告されている。
【００１５】
スクアライン染料は、チオールを検出するための測色プローブおよび蛍光プローブとして使用されてきた。最初の報告は、非特許文献１に記載されている。この文献では、著者らは、生理的ｐＨ領域（６．５〜７．５）においてチオールを高感度で検出するために、アニリン誘導体の対称スクアレン染料を使用した。チオールの検出は、基本的に蛍光消失に基づいているので、このプローブは、細胞画像化に有用ではない。その後、本発明者らは、チオールの相互作用によって活性化することができる、リングの両側にある２つの発色団を有する対称スクアライン染料を報告した（非特許文献２）。塩基性ｐＨ領域（９．６）でチオールの反応性と検出が悪いものとなるため、染料は生体適合性でなく、細胞画像化の目的のために有用ではなかった。
【００１６】
既知のスクアリン染料に関連する欠点を回避するために、スクアリン系蛍光プローブを提供することが必要とされている。したがって、本発明者らは、生理学的ｐＨ（７．２〜７．８）において、蛍光発光「開始」によってチオールを高感度で検出する非対称スクアライン染料を合成した。チオールに対する生理的ｐＨ領域でのこの高い反応性および蛍光「開始」応答により、本発明者らが、マイクロモル範囲にミリモルからマイクロモルまでの範囲の生物細胞内部のチオール変動の検出のために、このプローブを使用するのに役立つ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｒ．ＭＭａｎｅｚらのＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４年、１２６、４０６４頁
【非特許文献２】Ａ．Ａｊａｙａｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ． ２００８年、１２０、８００１頁
【非特許文献３】Ｓ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ． ２０１１年、１３、６頁
【非特許文献４】Ｓ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ．ＣｏｍＭｕｎ．、２０１１年、４７、５１４２頁
【非特許文献５】Ｉ．Ｈａｍａｃｈｉ． Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ． ２００９年、５、３４１
【非特許文献６】Ｈ．Ｍａ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ． ２０１２年、５１、１頁
【非特許文献７】Ｊ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、７８０３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の主な目的は、多目的スクアライン系蛍光プローブを提供することである。
本発明の別の目的は、血清アルブミンタンパク質の選択的標識化のためのスクアライン系蛍光プローブを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、微小ｐＨ監視のための染料‐タンパク質錯体を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、他のチオールおよび非チオール含有タンパク質および小分子から共有結合的または非共有結合的に血清アルブミンタンパク質の選択的標識化のためのＮＩＲ染料（電磁スペクトルの近赤外領域で吸収および発光する染料）を開発することである。
本発明のさらに別の目的は、細胞内チオール濃度の小さな変動を検出するためのＮＩＲ染料を使用することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、自己組織化された状態での染料が非蛍光性であり、未反応のプローブの存在下で標識化する位置で直ちに標識化反応の過程を視覚化するのに役立つその標的に結合した時に、強い蛍光性となることを確認することである。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、他のチオール含有小分子およびタンパク質のうち、血清アルブミンタンパク質を選択的に検出する自己組織化した分子を提供することである。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、ｐＨスケールの異なる領域におけるｐＨ変化の高感度検出のための染料‐タンパク質錯体を使用することである。
【００２２】
本発明のさらに他の目的は、生物培地中のｐＨ変化のレシオメトリック感応性検出のための染料‐タンパク質錯体を使用することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
従って、本発明は、式１：
【化２】
0006360896.tif 000003
Ｒ＝‐(ＣＨ２‐ＣＨ２-Ｏ)３‐ＣＨ３
の新規な非対称スクアライン染料を提供する。
【００２４】
本発明の１つの態様において、上記化合物は、生細胞内のチオール濃度のミリモル〜マイクロモル変動の検出に有用である。
【００２５】
本発明はまた、（ａ）１〜１．２ｍＬのＴＢＯＦを加えながら、４０〜４５ｍＬのイソプロパノール中で３〜０．３５ミリモルのＮ，Ｎ‐ジブチルアニリンを３〜０．３５ミリモルのスチリルピロール誘導体と反応させる工程、
（ｂ）上記混合物を、８０〜９０℃で１０〜１２時間環流する工程、
（ｃ）反応混合物を冷却し、蒸留によりイソプロパノールを除去する工程、
（ｄ）上記のように得られた粗製混合物を濾過し、クロロホルム中に再溶解し、更にカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル上で２％メタノール／クロロホルムを用いて精製して、式１の非対称スクアライン染料を得る工程
を含む、式１の化合物の製造方法を提供する。
【００２６】
（ａ）濃度１．２×１０−３〜２．４×１０−３Ｍのアセトニトリル中の式１のスクアライン染料の保存溶液を調製する工程、
（ｂ）濃度２．４×１０−３〜２．４×１０−３Ｍで、リン酸塩緩衝液中のＢＳＡまたはＨＳＡタンパク質の保存溶液を調製する工程、
（ｃ）４．２〜１１．６のｐＨ溶液で、上記工程（ｂ）で調製したＢＳＡまたはＨＳＡタンパク質の保存溶液を、１：１２（１×１０−６Ｍ：１２×１０−６Ｍ）、１：６（１×１０−６Ｍ：６×１０−６Ｍ）、１：１（１×１０−６Ｍ：１×１０−６Ｍ）、１：１／６（１×１０−６Ｍ：０．１６７×１０−６Ｍ）、１：１／１２（１×１０−６Ｍ：０．０８３×１０−６Ｍ）の異なる比で、上記工程（ａ）のスクアライン染料の保存溶液に加えて、該溶液を１〜２時間保持した後、発光スペクトルを記録する種々のＳｑ‐タンパク質錯体を得る工程
を含む、タンパク質錯体の製造方法。
【００２７】
本発明の１つの態様において、自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、ｐＨが４．２〜６．０である、血清アルブミンタンパク質の選択的非共有結合標識化法に有用である。
【００２８】
本発明の他の態様において、自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、ｐＨが７．２〜８．８である、血清アルブミンタンパク質の選択的共有結合標識化法に有用である。
【００２９】
本発明の更に他の態様において、ミクロモル濃度での式１のスクアライン染料が、水中でサイズ１００〜２００ｎｍの球状集合体となる。
【００３０】
本発明の更に別の態様において、自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、他のチオール含有タンパク質および非チオール含有タンパク質の中で、血清アルブミンタンパク質を選択的に検出する。
【００３１】
本発明のもう１つの態様において、自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、ＮＩＲ発光（６５０〜７５０）を示す４．２〜６．０の低ｐＨで、他のタンパク質および小分子の中で血清アルブミンタンパク質を選択的に検出する。
【００３２】
本発明の更なる態様において、自己組織化された状態での式１のスクアライン染料が、緑色蛍光（４５０〜６００ｎｍ）を示す７．２〜８．８の高ｐＨで、他のタンパク質および小分子の中で血清アルブミンタンパク質を選択的に検出する。
【００３３】
１：１２（１×１０−６Ｍ：１２×１０−６Ｍ）、１：６（１×１０−６Ｍ：６×１０−６Ｍ）、１：１（１×１０−６Ｍ：１×１０−６Ｍ）、１：１／６（１×１０−６Ｍ：０．１６７×１０−６Ｍ）、１：１／１２（１×１０−６Ｍ：０．０８３×１０−６Ｍ）の異なる比での式１のスクアライン染料のＢＳＡとの組み合わせを、４．６〜１１．６のｐＨの異なる領域におけるｐＨの小変動を監視するのに用いることができる、本発明に開示される化合物のナノプローブ。
【００３４】
比１：６の式１のスクアライン染料のＢＳＡまたはＨＳＡタンパク質との組み合わせを、６．５〜７．５のｐＨ変動を監視するための生体細胞試料の画像化に用いることができる、本発明に開示される化合物のナノプローブ。
【００３５】
本発明のもう１つの態様において、細胞におけるチオール画像化方法は、
（ａ）３×１０−３Ｍ〜３×１０−６Ｍの濃度のＮＥＭと共に１５〜２０分間、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を培養する工程、
（ｂ）アセトニトリル中で調製した１．２×１０−３Ｍの式１のスクアライン染料を細胞に加えて、１０分間保持する工程、
（ｃ）遠心分離を２回行うことによって、細胞を洗浄して該細胞の外面の該スクアライン染料を除去する工程、
（ｄ）フィルターとしてＡｌｅｘａ（６４０ｎｍ励起）およびＤＡＰＩ（３８０ｎｍ励起）を用いる共焦点蛍光顕微鏡によって、上記のように得られた細胞を画像化する工程
を含む。
【００３６】
本発明の更に別の態様において、
細胞におけるｐＨ変動の画像化方法は、
（ａ）６．５〜７．５のｐＨでリン酸塩緩衝液と共に、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を予備培養し、１０分間保持する工程、
（ｂ）１×１０−６Ｍの１：６のＳｑ‐ＢＳＡの組み合わせを各細胞に加えて、１０分間保持する工程、
（ｃ）上記のように得られた細胞を遠心分離して、２倍に希釈する工程、
（ｄ）フィルターとしてＡｌｅｘａ（６４０ｎｍ励起）およびＤＡＰＩ（３８０ｎｍ励起）を用いる共焦点蛍光顕微鏡によって、画像化を行う工程
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
式１の化合物は非対称スクアライン染料１の分子構造を示す。
【図１】（ａ）紫外線／可視光領域の吸収、（ｂ）および（ｃ）ＧＳＨ添加時の、８．０のｐＨ、励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍおよび６４０ｎｍそれぞれでのＳｑ（２μＭの３０％ＡＣＮ／リン酸塩緩衝液）の発光スペクトル変化を示す。
【図２】５１０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）でのＳｑ（２μＭの３０％ＡＣＮ／リン酸塩緩衝液、ｐＨ８．０）の、ｐＨ８．０の異なるアミノ酸に対する蛍光応答を示し、黒い棒グラフは、２０当量の異なるアミノ酸添加時の蛍光強度を表し、グレーの棒グラフは、上記混合物に更に１当量のＧＳＨの添加を表す。
【図３】２〜１００ｎＭのＧＳＨ濃度の関数としての５１０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）でのＳｑの蛍光強度のプロットを示す。
【図４】（ａ）様々な濃度のＮＥＭ（Ｎ‐エチルマレイミド、チオール非活性化分子）で前処理し、次いで、Ｓｑ染料培養したＨｅｐ−Ｇ２細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像を示し、上記細胞の画像は、３８０ｎｍでの励起および長光路（＞４１０ｎｍ）発光フィルターを用いて得られる。（ｂ）様々な濃度のＮＥＭに対してプロットされた、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞（図４ａ）から得られた５１０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）での蛍光強度を示す。
【図５】１５％アセトニトリル／２５ｍＭリン酸塩緩衝液中での上記染料１（６×１０−６Ｍ）の（ａ）吸収および（ｂ）発光スペクトルの温度依存性を示す。
【図６】２５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ４．２）中での自己組織化プローブ１（６×１０−６Ｍ）の（ａ）ＡＦＭ、（ｂ）ＴＥＭおよび（ｃ）ＤＬＳ分析を示す。
【図７】ｐＨ４．２を有する２５ｍＭリン酸塩緩衝液中でのＢＳＡタンパク質添加量の増加に伴う上記染料１（６×１０−６Ｍ）の（ａ）吸収および（ｂ）発光スペクトルを示す。（ｃ）は、ｐＨ４．２でのＢＳＡタンパク質添加の前後でのＳｑの写真である。
【図８】ｐＨ８．２を有する２５ｍＭリン酸塩緩衝液中でのＢＳＡタンパク質添加量の増加に伴う上記染料１（６×１０−６Ｍ）の（ａ）吸収および（ｂ）発光スペクトルを示す。（ｃ）は、ｐＨ８．２でのＢＳＡタンパク質添加の前後でのＳｑの写真である。最初の図は可視変色を示し、最後の図は対応する蛍光変色を示す。
【図９】他のチオールおよび非チオール含有タンパク質からのＢＳＡおよびＨＳＡタンパク質に対する染料１の選択性を示す。（ａ）１０当量の異なるタンパク質を用いたｐＨ４．２で７００ｎｍ（励起波長λｅｘｃ６４０ｎｍ）で監視した染料１（６μＭ）の蛍光強度のプロットを示し、（ｂ）１当量のＢＳＡおよびＨＳＡ並びに１０当量の他のタンパク質を用いたｐＨ８．２で４８０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）で監視した染料１（６μＭ）の蛍光強度のプロットを示す。
【図１０】他のチオール含有小分子からのＢＳＡおよびＨＳＡタンパク質に対する染料１の選択性を示す。１当量のＢＳＡおよびＨＳＡ並びに１０当量のチオール含有小分子を用いたｐＨ８．２で４８０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）で監視した染料１（６μＭ）の蛍光強度のプロットを示す。
【図１１】酸／塩基サイクルに対する１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体の蛍光応答を示す。７００ｎｍ（励起波長λｅｘｃ６４０ｎｍ）および４８０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）での蛍光強度を監視した。
【図１２】溶液のｐＨに対するＳｑ‐ＢＳＡ錯体の様々な組成に対するＳｑ（１μＭ）の４８０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）での正規化した発光スペクトルを示す。
【図１３】溶液のｐＨに対するＳｑ‐ＢＳＡ錯体の様々な組成に対するＳｑ（１μＭ）の７００ｎｍ（励起波長λｅｘｃ６４０ｎｍ）での正規化した発光スペクトルを示す。
【図１４】生理的ｐＨ領域（６．４〜７．６）における１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体（１μＭ）のレシオメトリック蛍光変化を示す。溶液のｐＨの増加に関する７００ｎｍ（励起波長λｅｘｃ６４０ｎｍ；●）および４８０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ；■）で監視された１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体（１μＭ）の蛍光強度のプロットを示す。
【図１５】ｐＨ６．５（ａ〜ｃ）、７．０（ｄ〜ｆ）および７．５（ｇ〜ｉ）で１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体を用いて培養されたＨｅｐ−Ｇ２細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。
【００３８】
【表１】
0006360896.tif 000004
【発明を実施するための形態】
【００３９】
従って、本発明は、血清アルブミンタンパク質のチオール画像化、選択的標識化のためのスクアライン系蛍光プローブ、ｐＨ監視用染料‐タンパク質錯体、およびそれらの製造方法を提供する。上記方法は、式１のスクアライン染料が８．０のｐＨを有する３０％ＡＣＮ／２５ｍＭのリン酸塩緩衝液中で調製され、共有結合標識化に対応する緑色蛍光発光「開始」および非共有結合標識化に対応するＮＩＲ蛍光発光をそれぞれ提供する塩基性ｐＨおよび酸性ｐＨで、共有結合的または非共有結合的な血清アルブミンタンパク質の標識化に適用される２５ｍＭのリン酸塩緩衝液中で調製される時に、上記染料が自己組織化系を形成する場合に、生細胞内のチオール含有量を検出および画像化する式１のスクアライン染料を含有する。上記溶液のｐＨとの相互作用は可逆的であり、また、チオールおよび非チオール含有タンパク質並びにチオール含有有機小分子の内、血清アルブミンタンパク質に対して高い選択性を示す。異なる比率で作製した染料タンパク質錯体は、４．６〜１１．６の範囲のｐＨスケールの異なる領域において異なるｐＨ変化を高感度で検出し、１：６比の染料タンパク質錯体は、生細胞内のｐＨ変化を検出する。
【００４０】
本発明においては、ｐＨ８．０を有する３０％ＡＣＮ／２５ｍＭのリン酸塩緩衝液中で調製された式１の化合物は、生細胞内のチオール含量を検出および画像化する。
【００４１】
本発明においては、式１の化合物は、ｐＨ４．２での非共有結合によって、他の生物学的に関連する材料の中で血清アルブミンタンパク質を選択的に標識化する。
【００４２】
式１のスクアライン染料は、ｐＨ８．２での共有結合によって、他の生物学的に関連する材料の中で、血清アルブミンタンパク質を選択的に標識化する。
【００４３】
本発明においては、式１の化合物は、共有結合モードの標識化に対して、緑色蛍光発光「開始」を提供する。
【００４４】
本発明においては、式１の化合物は、非共有結合モードの標識化に対して、ＮＩＲ発光「開始」を提供する。
【００４５】
本発明においては、様々な比の染料‐タンパク質錯体がｐＨスケールの異なる領域におけるｐＨ変化を高感度で検出する。
【００４６】
本発明においては、１：６のＳｑ‐ＢＳＡならびにＳｑ‐ＨＳＡ錯体は、生体細胞サンプル中のｐＨの変化を検出することができる。
【００４７】
本発明において、ｐＨ変化の検出における標識化方法は可逆的である。本発明では、式１の新規な非対称スクアライン染料が合成されている。式１のスクアライン染料は、異なる溶媒条件で調製され、様々な用途に使用することができる。リン酸塩緩衝液中に取り込まれた分子は集合体を形成し始めるが、３０％ＡＣＮ／リン酸塩緩衝液中で調製した場合の式１の染料は、それらのモノマーの状態で存在する。ｐＨ８．０（このｐＨ条件で、最大の反応性が観察された）の３０％ＡＣＮ／リン酸塩緩衝液中で調製した式１の化合物は、他の生物学的に関連する材料の中のチオールの選択的検出に使用することができる。チオールに対する上記染料の高い感度（２ｎＭ）は、生細胞内でのわずかなチオール変動（ミリモル〜マイクロモルの範囲）の検出のために役立つ。
【００４８】
従って、本発明は、染料を８．０のｐＨを有する３０％ＡＣＮ／２５ｍＭのリン酸塩緩衝液中で調製する際に、生細胞内のチオール含有量を検出および画像化する、式１：
【化３】
0006360896.tif 000005
Ｒ＝‐(ＣＨ２‐ＣＨ２-Ｏ)３‐ＣＨ３
のスクアライン染料を提供する。自己組織化された状態の上記染料は、上記溶液の特定のｐＨで、血清アルブミンタンパク質を共有結合的または非共有結合的に標識化する。
【００４９】
式１のプローブは、具体的に低ｐＨで血清アルブミンタンパク質と非共有結合し、ＮＩＲ発光「開始」を提供するが、高ｐＨでは共有結合し、緑色蛍光発光「開始」を提供する。上記プローブは、他のチオール含有小分子の存在下で、選択的に血清アルブミンタンパク質を検出するので、上記プローブは、血清アルブミンタンパク質のための優れたセンサーとして使用することができる。様々な比の染料‐タンパク質錯体は、４．６〜１１．６の広い領域内のｐＨ変化を高感度で検出するのに使用することができる。高い生体適合性および水溶性のために、染料‐タンパク質錯体は、細胞環境内でのわずかなｐＨ変化のレシオメトリック検出に有用である。リン酸塩緩衝液中で調製された染料は、他のチオールおよび非チオール含有タンパク質並びにチオール含有小分子の内、選択的に血清アルブミンタンパク質を標識するのに役立つ。４．２のｐＨでの上記染料のタンパク質との相互作用は、単にＮＩＲ発光「開始」を伴う非共有結合である。一方でｐＨが８．２での上記染料のタンパク質との相互作用は、単に緑色蛍光発光「開始」を伴う共有結合である。２つの異なるｐＨ条件での上記分子は、２つの異なるスペクトル領域での信号を与えるので、
条件は、測定の精度を比較することができる。
【００５０】
異なる比率でタンパク質と複合体を形成し、リン酸塩緩衝液中で調製された式１の化合物は、高感度で４．６〜１１．６のｐＨの変化を検出するのに役立つ。１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体は、生細胞内のｐＨの変化の高感度検出のための効率的なレシオメトリック蛍光プローブとして使用することができる。
【００５１】
0006360896.tif 000006
【００５２】
本発明のより良い理解を容易にするために、本発明の好ましい態様の詳細な説明は、添付図面を参照して説明する。これは、開示された態様は、種々の形態で実施することができる本発明の単なる例示であることが理解される必要がある。したがって、本明細書中に開示された詳細は、単に特許請求の範囲の基礎として、本発明を製造または使用する方法を当業者に教示するための基礎として、限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５３】
以下のスキーム１における、化合物１（(Ｅ)‐２‐(４‐(ジブチルアミノ)フェニル)‐４‐(５‐(２，５‐ジメトキシ)‐１‐(２‐(２‐(２‐メトキシエトキシ)エトキシ)エチル)‐１Ｈ‐イミダゾールピロール‐２‐イル)‐３‐ヒドロキシシクロ-２-ブテノン）は、化合物２（スチリルピロール発色団）および化合物３（Ｎ，Ｎ‐ジブチルアニリンのセミスクアライン）を用いて合成される。０．３ミリモルの化合物２および０．３ミリモルの化合物３を３０ｍＬのイソプロパノール中に溶解し、十分に撹拌した。１ｍＬのＴＢＯＦを加えた。１２時間環流した後、得られた反応混合物を冷却し、次いで蒸留によってイソプロパノールを除去した。粗生成物を石油エーテルから沈殿させ、次いで濾過した。その後、ＣＨＣｌ３中に再溶解し、カラムクロマトグラフィーによりシリカゲル上で２％メタノール／クロロホルムを用いて更に精製した。次いで、スキーム１の生成物を、ＵＶ、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲおよびＨＲＭＳにより、特性化する。
【００５４】
ｐＨ８．０の３０％ＡＣＮ／２５ｍＭのリン酸塩緩衝液混合物中に溶解した式１の化合物は、３８０ｎｍでの新しいバンドの形成と同時に起こる６７０ｎｍでの吸光度の消失（図１ａ）および７００ｎｍ発光の消失と同時に起こる５１０ｎｍでの蛍光発光「開始」をもたらす３８０ｎｍでの励起（図１ｂ）を用いてチオールを検出する。同時に６４０ｎｍでの励起は、７００ｎｍでの蛍光発光の消失（図１ｃ）をもたらした。
【００５５】
ｐＨ８．０の３０％ＡＣＮ／２５ｍＭのリン酸塩緩衝液中で調製された式１の化合物は、異なるアミノ酸に対する５１０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）での蛍光強度のプロットから明らかであるチオール含有分子に対して高い選択性を示した（図２）。ＧＳＨ、ＣｙｓおよびＨｃｙなどのチオール含有分子は、５１０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）で蛍光増強を示すが、他のアミノ酸はあまり蛍光増強を示さない。Ｓｑは高い感度で（２ｎＭ）と定量的にＧＳＨを検出する（図３）。ｐＨ８．０の３０％ＡＣＮ／２５ｍＭのリン酸塩緩衝液中で調製された式１の化合物は、細胞内のチオール変化を監視するために使用される。３０％ＡＣＮ／２５ｍＭのリン酸塩緩衝液中で調製されたＳｑ染料は、それによって細胞内のわずかなチオール変動を検出するプローブの能力を確認する段階的な蛍光変化を示した、３×１０−６〜３×１０−３Ｍの濃度の（細胞内チオール含量の濃度を変化させるために使用された）ＮＥＭで既に処理された細胞に培養される（図４ａおよび図４ｂ）。アセトニトリル中に溶解した式１の化合物は、分子が単量体の状態で存在する６７０ｎｍに吸収極大を示し、一方、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液中の式１の化合物は、式１の化合物の集合体による５５０〜８５０ｎｍの範囲からのブロードな吸収を示した。上記集合体は、１５％アセトニトリル／水混合物中の紫外線／可視光線の温度依存性および発光分光研究によって確認された（図５ａおよび図５ｂ）。Ｓｑの自己組織化は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、遷移電子顕微鏡（ＴＥＭ）およびＤＬＳ分析により確証した。ＡＦＭおよびＴＥＭ分析は、１００〜３００ｎｍの範囲の直径を有する染料の球状集合体の形成を明らかにした（図６ａおよび６ｂ）。Ｓｑ（６μＭ）を含有する緩衝液の動的光散乱（ＤＬＳ）測定により、平均直径２００ｎｍを有する集合体を示した（図６ｃ）。ｐＨ４．２を有する２５ｍＭリン酸塩緩衝液中で調製された式１の化合物は、血清アルブミンタンパク質を非共有結合的に標識化し、これは上記紫外線−可視光線および発光分光研究から明らかである。ＢＳＡタンパク質の添加により７００ｎｍ（励起波長λｅｘｃ６４０ｎｍ）での蛍光発光「開始」と共に狭くなるＳｑ集合体の吸収に対応するブロードな吸収（５５０〜８５０ｎｍ）が観察される（図７ａおよび図７ｂ）。リン酸塩緩衝液中の上記Ｓｑ染料の溶液は青色を有するが、非発光性である（図７ｃ、上）。ＢＳＡの添加により、上記染料の色は、赤色発光を示したレーザーポインタを用いる励起により淡緑色に変化する（図７ｃ、下）。８．２の高ｐＨにおいて、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液中で調製された式１の化合物は、血清アルブミンタンパク質と共有結合的に相互作用する。３８０ｎｍでの吸収の形成と同時に消失したＳｑ集合体の吸収に対応するブロードな吸収（５５０〜８５０ｎｍ）が観察された（図８ａ）。同様に発光スペクトルは、４８０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）で蛍光応答「開始」を示した（図８ｂ）。上記染料の対応する吸収と発光色の変化は、図８ｃ中の写真に示されている。上記写真から、Ｓｑの水色溶液は、８．２のｐＨのリン酸塩緩衝液中でのＢＳＡタンパク質の添加により、緑色発光と共に色が淡黄色になる���とは明らかである。２５ｍＭリン酸塩緩衝液中のプローブ１は、官能基としてのチオールを有する他の競合分子の存在下で、ＢＳＡおよびＨＳＡタンパク質に対して高い選択性を示した。低ｐＨ（４．２）では、ＢＳＡおよびＨＳＡのみが７００ｎｍ（励起波長λｅｘｃ６４０ｎｍ）での蛍光増強を示したが、１０当量の他のチオールおよび非チオール含有タンパク質の添加時に、ＮＩＲ領域には蛍光増強は観察されなかった（図９ａ）。高ｐＨ（８．２）では、ＨＳＡだけでなくＢＳＡは、共有結合標識化を示す４８０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）の緑色発光を示すが、１０当量のチオール含有タンパク質、例えばヘモグロビン、グルタチオン還元酵素、ブロメラインでさえ４８０ｎｍで蛍光増強を生じることができなかった（図９ｂ）。発光スペクトル（図１０）から、上記プローブは、チオール含有小分子の存在下で、血清アルブミンタンパク質に対して高い選択性を示すことが明らかである。上記アルブミンＨＳＡおよびＢＳＡの上記染料との非共有結合および共有結合性相互作用は、５．８〜７．４の低ｐＨおよび高ｐＨ値の１：６のＳｑ‐ＢＳＡ（または１：６のＳｑ‐ＨＳＡ）錯体を用いる数サイクル間において高度に可逆的であることがわかる（図１１）。１：１２〜１：１／１２の範囲の異なる比のＳｑ‐ＢＳＡ錯体を、４．６〜１１．６の広いｐＨ領域内のｐＨの変化を検出するために使用した。１：１２のＳｑ‐ＢＳＡ錯体は上記ｐＨ領域４．６〜６．４を感知し、５．８〜７．４に対して１：６、７．２〜８．８に対して１：１、８．６〜１０．２に対して１：１／６および１０．２〜１１．６に対して１：１／１２である（図１２および図１３）。ｐＨ感度が生理学的領域内にあり、レシオメトリック蛍光応答（図１４）に起因する１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体を、細胞内のわずかなｐＨ変動をレシオメトリックに監視するためのこの系に用いた。染料認識化タンパク質を、異なるｐＨ（６．５、７．０、７．５）を有するウェル中で生長させたＨｅｐ−Ｇ２細胞に導入する。ｐＨ変動に伴う細胞中の蛍光発光変化を、図１５に示す。細胞中のｐＨ測定に対する定量データを、ソフトウェア「Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ」を用いて得た（表２）。
【００５６】
本発明の新規な特徴は：
（１）分子は、細胞内小酸化ストレスの間に生成マイクロモルのチオール変動ミリモルの検出のために使用することができる。
（２）本発明における蛍光プローブ、特に明確なシグナル応答が得られ、外部刺激に制御することができる非共有結合と共有結合の標識間のタンパク質との相互作用のモードを切り替えるには、新規なアプローチである。
（３）分子の精度を確認するのに役立つ、二つの異なるスペクトル領域の信号を与える二つの異なるｐＨ条件での血清アルブミンタンパク質を検出することができる測定。
（４）高感度で広い領域のｐＨの変化を検出するために使用することができる比較的単純なプローブは、まだ知られていません。わずかに異なる比率で混合することによって調製した染料タンパク質錯体を高感度で４．６〜１１．６のｐＨを検出するために用いることができる。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例は、例示の目的のために提供されるものであり、したがって本発明の範囲を限定するものではないと解されるべきである。
【００５８】
実施例１
式１の化合物の調製：
【化４】
0006360896.tif 000007
スキーム１
０．３ミリモルの化合物２および０．３ミリモルの化合物３を、３０ｍＬのイソプロパノール中に溶解し、十分に撹拌した。１ｍＬのＴＢＯＦを加えた。８０℃で１２時間還流した後、得られた反応混合物を冷却し、次いで蒸留によりイソプロパノールを除去した。石油エーテルから沈殿させた粗生成物を濾過し、ＣＨＣｌ３中に再溶解し、更にカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル上で２％ＭｅＯＨ／ＣＨＣ１３を用いて精製した。収率４０〜４５％。上記生成物を、ＵＶ、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲおよびＨＲＭＳによって特徴付けた。
【００５９】
１Ｈ ＮＭＲ (５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δ）：８．３（ｄ, ２Ｈ, ＡｒＨ）, ７．９２（ｄ, １Ｈ, ＡｒＨ）, ７．６４（ｄ, １Ｈ, ビニル, Ｊ＝１６．５Ｈz）, ７．３５（ｄ, １Ｈ, ビニル, Ｊ＝１６．５Ｈz）, ７．１６（ｓ, １Ｈ, ＡｒＨ）, ６．９６（ｄ, １Ｈ, ＡｒＨ）, ６．８６（ｄ, ２Ｈ, ＡｒＨ）, ６．７１（ｄ, ２Ｈ, ＡｒＨ）, ４．９８（ｔ, ２Ｈ, ‐ＮＣＨ２）, ３．８７（ｓ, ６Ｈ, ‐ＯＣＨ３） ３．８３（ｔ, ２Ｈ, ‐ＯＣＨ２）, ３．５５（ｔ、４Ｈ、‐ＮＣＨ２）, ３．３６−３．５５（ｍ, ８Ｈ, ‐ＯＣＨ２）, ３．２８（ｓ, ３Ｈ, ‐ＯＣＨ２）, １．６３（ｍ, ４Ｈ, ＣＨ２）, １．４１（ｍ, ４Ｈ, ＣＨ２）, ０．９８（ｔ, ６Ｈ, ＣＨ３）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１５０ＭＨｚ） δ １３．８８, ２０．２３, ２９．５９, ４７．１５, ５１．１０, ５５．８３, ５６．１５, ５８．８７, ７０．４９, ７１．００, ７１．０１, ７１．９９, １１２．１５, １１２．２２, １１４．２５, １１５．３９, １１．６．８６, １１９．６８, １２５．５５, １２６．０７, １２９．７７, １３０．５０, １３２．３９, １４９．６４, １５２．０７, １５２．６４, １５３．７５, １７３．６１, １７８．８０, １８０．２０, １８１．４１. ＦＡＢ−ＭＳ：Ｃ４０Ｈ５３ＮＯ７，６５９．８５に対して計算した［Ｍ］＋；６５９．４２.
【００６０】
実施例２
血清アルブミンタンパク質を非共有結合標識化するための手順：
Ｓｑ（１．２×１０−３Ｍ）の保存溶液をアセトニトリル中で調製し、ＢＳＡタンパク質（２．４×１０−３Ｍ）の保存溶液をｐＨ４．２の２５ｍＭリン酸塩緩衝液中で調製し、上記保存溶液からの１５μＬのＳｑをｐＨ４．２の２５ｍＭリン酸塩緩衝液に加えて、ＢＳＡまたはＨＳＡタンパク質の保存溶液を調製し、上記溶液の得られる濃度を６×１０−６Ｍとした。この溶液に、７．５〜１５０μＬの異なる体積のＢＳＡタンパク質を加え、２０分ごとに吸収および発光スペクトルを記録した。７００ｎｍ（励起波長λｅｘｃ６４０ｎｍ）発光での開始蛍光発光と共に狭くなるＳｑ集合体の吸収に相当する広い吸収（５５０〜８５０ｎｍ）が観察された。
【００６１】
実施例３
血清アルブミンタンパク質を共有結合標識化するための手順：
Ｓｑ（１．２×１０−３Ｍ）の保存溶液をアセトニトリル中で調製し、ＢＳＡタンパク質（２．４×１０−３Ｍ）の保存溶液をｐＨ８．２の２５ｍＭリン酸塩緩衝液中で調製した。上記保存溶液からの１５μＬのＳｑをｐＨ８．２の２５ｍＭリン酸塩緩衝液に加えて、上記溶液の得られる濃度を６×１０−６Ｍとした。この溶液に、１．５〜３６μＬの異なる体積のＢＳＡタンパク質を加え、１５分ごとに吸収および発光スペクトルを記録した。３８０ｎｍでの吸収の形成と共に消失するＳｑ集合体の吸収に相当する広い吸収（５５０〜８５０ｎｍ）が観察された（図８ｂ）。同様に、発光スペクトルは、４８０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）での開始蛍光応答（図８ｂ）を示した。
【００６２】
実施例４
ｐＨ監視用の種々の染料‐タンパク質錯体を調製するための手順：
Ｓｑ（１．２×１０−３Ｍ）の保存溶液をアセトニトリル中で調製し、ＢＳＡタンパク質（２．４×１０−３Ｍ）の保存溶液を２５ｍＭリン酸塩緩衝液中で調製した。異なる比（１：１２、１：６、１：１、１：１／６、１：１／１２）の様々なＳｑ‐ＢＳＡ錯体の調製を、種々のｐＨ溶液（４．２〜１１．６）中で行い、上記溶液を１時間保持した後、その発光スペクトルを記録した。７００ｎｍ（励起波長λｅｘｃ６４０ｎｍ）での蛍光発光応答は消失するが、発光スペクトルは、４８０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）での開始蛍光応答（図８ｂ）を示した。
【００６３】
実施例５
細胞培養（Ｈｅｐ−Ｇ２細胞）
１３．４ｇのＤＭＥＭ−高グルコース（米国のＳｉｇｍａ）を１Ｌの蒸留水中に溶解することによって培地を作製した。重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ）を上記培地に加えて、上記培地のｐＨを７．４に調節した。この培地を次いで、真空ポンプを用いて、０．２２μｍフィルター（米国のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備え付けた除菌濾過集合体を通過させることによって殺菌した。次に、上記培地を、予備殺菌したＢｏｒｏｓｉｌポリプロピレンボトル中に４℃で更に使用するまで保存した。作製した培地に、抗菌性混合物（２０μＬ／ｍＬの１００倍濃縮物、米国Ｓｉｇｍａ）を加えた。ウシ胎児血清（ＦＢＳ；米国Ｓｉｇｍａ）もまた上記培地に加えて、最終濃度１０％（９００ｍＬの培地に１００ｍＬのＦＢＳを加えた）とした。
【００６４】
インド、ＰｕｎｅのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅから得られたＨｅｐ−Ｇ２細胞（肝癌細胞株）を、−１９６℃の液体窒素中で、クライオバイアル中に、７０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および２０％ＤＭＥＭを含む媒体中で保存した。回復のため、３７℃に保持した水浴中に２〜３分間入れ、次いで３０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによって、上記バイアルを解凍した。上澄みを除去し、培地中で懸濁した後の沈殿物を放射線殺菌した培養フラスコ、Ｔ‐２５ｃｍ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。次いで、上記フラスコをＣＯ２培養器中に２時間入れた。死細胞は上記培地中に残るが、生細胞は上記培養フラスコに付着する。次いで、上記培地を、１０％ＦＢＳを含有する新しい培地と交換し、細胞の培養密度７０〜８０％になるまで培養した。次いで、所望の培養密度の後、上記培地を処分した。培養密度の後、上記Ｈｅｐ−Ｇ２細胞は本質的に付着するので、０．９％塩化ナトリウムを含有するトリプシン（０．２５％）‐ＥＤＴＡ（０．５３ｍＭ）緩衝液１ｍＬを用いて５分間トリプシン処理した。次いで、上記細胞を遠心分離管に移し、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄みを除去した。
【００６５】
継代培養のため、無菌条件下で１０％ＦＢＳを含有する新しいＤＭＥＭを加えた。細胞が培地中に完全に分散するまで、ピペット（１ｍＬ）の助けを借りて細胞を洗い流した。次いで、無菌完全培地中で細胞を１：３倍に希釈して、新しい培養フラスコに移した。次いで、上記フラスコを、ＣＯ２培養器中に入れた。
【００６６】
細胞内のｐＨ変化を画像化するための手順：
ｐＨ感度が生理学的領域内にあり、レシオメトリック蛍光応答（図１４）に起因する１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体を、細胞内のわずかなｐＨ変動を監視するためのこの系に用いた。Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を、異なるｐＨ（６．５、７．０、７．５）を有するリン酸塩緩衝液と共に予備培養し、１０分間保持した。５μＬのＳｑ（４×１０−５Ｍ、アセトニトリル中で調製）および１５μＬのＢＳＡタンパク質（１．２×１０−３Ｍ、リン酸緩衝液４．２中で調製）を混合することによって調製した上記１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体（１×１０−６Ｍ）を各細胞に加え、１０分間保持した。次いで、上記細胞を遠心分離し、２倍に希釈し、フィルターとしてＡｌｅｘａ（６４０ｎｍ励起）およびＤＡＰＩ（３８０ｎｍ励起）を用いる共焦点蛍光顕微鏡によって画像を得た。ｐＨ変動に伴う細胞中の蛍光発光変化を、図１５に示す。細胞のｐＨに対して、ＤＡＰＩ画像からの蛍光強度を強調し、Ａｌｅｘａ画像を抑制した。細胞中のｐＨ測定に対する定量データを、ソフトウェア「Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ」を用いて得た（表２）。Ｓｑ‐ＢＳＡ錯体の培養後の細胞の生育力を、明視野透過率測定によって確認した（図１５ｃ）。
【００６７】
【表２】
0006360896.tif 000008
蛍光強度は、ソフトウェア「Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ」を用いて細胞から得られる。
【００６８】
実施例６
Ｈｅｐ−Ｇ２細胞内のわずかなチオール変動の検出のための手順：
Ｈｅｐ−Ｇ２細胞を、種々の濃度（３×１０−３Ｍ〜３×１０−６Ｍ）のＮＥＭと共に予備培養し、１５分間保持した。アセトニトリル中で調製した式１の化合物５０μＬ（１．２×１０−３Ｍ）を各細胞に加えて、１０分間保持した。次いで、上記細胞を遠心分離し、２倍希釈し、フィルターとしてＡｌｅｘａ（６４０ｎｍ励起）およびＤＡＰＩ（３８０ｎｍ励起）を用いる共焦点蛍光顕微鏡によって画像を得た。低濃度のＮＥＭで前処理された細胞は、強化された蛍光強度（図４ａ）を提供するのに対して、高濃度のＮＥＭで前処理した細胞は、Ｓｑ染料の導入の際に弱い緑色蛍光発光を示した。蛍光強度プロット（図４ｂ）から、蛍光強度は、それによって細胞内のわずかなチオール変動を検出するプローブの能力を確認する、ＮＥＭの濃度の増加に対して序々に消光することが明らかとなった。
【００６９】
実施例７
グルタチオン添加による式１の化合物の吸収および発光スペクトル変化：
３０％ＡＣＮ／リン酸塩緩衝液混合物中に溶解した式１の化合物は、６７０ｎｍに吸収を示し、７００ｎｍに発光を示した。ｐＨ８．０のグルタチオン（ＧＳＨ）の添加により、３８０ｎｍでの新しいバンドの形成に伴って、６７０ｎｍでの吸光度の消失
を示した（図１ａ）。発光スペクトルもまた、ＧＳＨの添加により同様の挙動を示した。３８０ｎｍで励起した場合、Ｓｑ‐ＧＳＨ付加物の発光スペクトルは、Ｓｑ染料の発光に対応する７００ｎｍでの蛍光強度を消失したが、緑色蛍光発光を伴う５１０ｎｍでの新しいバンドを示した（図１ｂ〜１Ｃ）。吸収および発光スペクトルにおけるこれらの変化は、新たな強い蛍光発色団の形成につながるシクロブテン環へのチオール基の付加に起因する。
【００７０】
実施例８
チオールに対する選択性および感度の検討：
選択性を調べるために、式１の化合物を、２０当量の９つの異なるアミノ酸（図２）並びに1当量のＣｙｓ、ＨｃｙおよびＧＳＨなどのチオール含有生体分子で処理した。上記非チオール化分子は、蛍光強度における劇的な増加を引き出したＳｑと、Ｃｙｓ、ＨｃｙおよびＧＳＨのみとにおける蛍光のかなりの変化は誘発しなかった。更に、これらの競合種の存在下で、ＧＳＨ（最も重要な生物学的に関連性のチオール含有分子）は、プローブが９つの異なるアミノ酸の内、ＧＳＨに対して高い選択性を有することを示唆する、同様の蛍光変化を依然としてもたらし、それによって細胞内に存在する他のアミノ酸からの妨害を回避することができる。ＧＳＨ濃度に伴う５１０ｎｍ（励起波長λｅｘｃ３８０ｎｍ）での蛍光強度は、２ｎＭの検出限界を有する直線関係を示し、Ｓｑが高い感度でＧＳＨを定量的に検出できることを示している（図３）。
【００７１】
実施例９
式１の化合物の吸収および発光スペクトル変化の温度依存性：
５ｍＭリン酸塩緩衝液中の式１の化合物は、式１の化合物の集合体による５５０〜８５０ｎｍの範囲の広い吸収を示すのに対して、アセトニトリル中に溶解した式１の化合物は、分子がモノマー状態で存在する６７０ｎｍの吸収極大を示した。上記集合体は、１５％アセトニトリル／水の混合物中の紫外線／可視光線の温度依存性および発光分光研究によって確認された。溶液温度が２５〜７５℃上昇した時に、高温での集合した染料の解体を示す、６８０ｎｍの吸収での上記強度にかなりの増加が観察された（図５ａ）。同様に、溶液温度の上昇に伴って観察された発光強度の段階的増加は、非蛍光性Ｓｑ集合体の蛍光染料モノマーへの段階的な変換を示唆している（図５ｂ）。
【００７２】
実施例１０
形態学的研究による特性化：
Ｓｑの自己組織化は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、遷移電子顕微鏡（ＴＥＭ）およびＤＬＳ分析により確証した。ＡＦＭおよびＴＥＭ分析は、１００〜３００ｎｍの範囲の直径を有する染料の球状集合体の形成を明らかにした（図６ａおよび６ｂ）。Ｓｑ（６μΜ）を含有する緩衝液の動的光散乱（ＤＬＳ）測定により、平均直径２００ｎｍを有する集合体を示した（図６ｃ）。
【００７３】
実施例１１
ｐＨ４．２で式１の化合物による血清アルブミンタンパク質の非共有結合標識化：
スクアライン染料と血清アルブミンタンパク質との非共有結合相互作用およびスクアライン染料とチオール含有小分子との共有結合相互作用は、それぞれの場合に知られているにもかかわらず、外部刺激と可逆的な単一プローブによって両方のタイプの相互作用を達成することが要求され続けている。そのため、第１の課題は、相互作用の異なるモードの間に明確な発光波長を有する広いｐＨ領域で安定している適切な切り換え可能な染料分子を識別すること、および調整可能なｐＨ応答の相互作用を有することである。Ｓｑは、ｐＨの広い範囲（２〜１２）で安定であることがわかった。４．２の低ｐＨで２５ｍＭリン酸塩緩衝液中のＳｑ（６μΜ）は、５５０〜８５０ｎｍの間に広い吸収バンドを示した（図７ａ）。この溶液に、ＢＳＡタンパク質を添加すると、６７０ｎｍでの狭い吸収バンドの形成をもたらした。この吸収バンドは、分子がモノマーの状態で存在するアセトニトリル中のＳｑの吸収と同様である。この観察により、ＢＳＡタンパク質を添加すると、さらに、蛍光特性の変化によって更に確認されるＳｑ集合体の解体を誘導することを示している。２５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ４．２）中のＳｑ（６μΜ）は、集合によって７００ｎｍで全く発光しない。ＢＳＡタンパク質を添加すると、７００ｎｍでの蛍光強度の緩やかな向上が観察された（図７ｂ）。この蛍光発光の強化は、集合物の解体および結果として生じるＳｑとＢＳＡタンパク質との間の非共有結合相互作用によるものである。２５ｍＭリン酸塩緩衝液中のＳｑ染料の溶液は青色をしており、この段階での染料は、非放射性である（図７ｃ、上）。ＢＳＡを添加すると、染料の色は、赤色発光を示したレーザーポインタを用いる励起により淡緑色に変化する（図７ｃ、下）。
【００７４】
実施例１２
ｐＨ８．２で式１の化合物による血清アルブミンタンパク質の共有結合標識化：
８．２の高ｐＨでは、２５ｍＭリン酸塩緩衝液中のＳｑ（６μΜ）へのＢＳＡの添加は、３８０ｎｍでの吸収の形成と共に、Ｓｑ集合体に相当する特徴的な広い吸収バンド（５５０〜８５０ｎｍ）の消失をもたらした。同時に、２７９ｎｍでのＢＳＡタンパク質中のトリプトファン発色団の吸収が増加する（図８ａ）。上記染料は、最初は３８０ｎｍの励起により４８０ｎｍの領域内に発光を有さない。しかし、タンパク質の添加は、４８０ｎｍでのバンドの形成をもたらした（図８ｂ）。染料の対応する吸収および発光色の変化は、図８ｃ中の写真に示されている。写真から、Ｓｑの水色溶液は、８．２のｐＨの２５ｍＭリン酸塩緩衝液中でのＢＳＡタンパク質の添加により、緑色発光と共に色が淡黄色になることは明らかである。吸収および発光スペクトルにおけるこれらの変化は、染料共役長の破壊をもたらすＳｑのシクロブテン環への、ＢＳＡ中に存在するシステイン残基のチオール基の付加に起因する。その結果、新しい強く発光する緑色蛍光発色団を形成し、認識化工程を信号で知らせる。
【００７５】
実施例１３
他のチオールおよび非チオール含有タンパク質内での血清アルブミンタンパク質の選択的検出：
２５ｍＭリン酸塩緩衝液中で自己組織化されたプローブ１による標識化は、チオール官能基を有する他の競合分子の存在下で、ＢＳＡおよびＨＳＡタンパク質に対して高い選択性を示した。低ｐＨ（４．２）では、７００ｎｍでの蛍光増強により示されるように、ＢＳＡおよびＨＳＡの両方が標識化されたが、１０当量の他のチオールおよび非チオール含有タンパク質の添加時に、ＮＩＲ領域には蛍光増強は観察されなかった（図９ａ）。この選択性は、明らかに、血清アルブミンタンパク質の分子認識部位により行われるＳｑ解体に由来する。８．２の高ｐＨでは、ＨＳＡだけでなくＢＳＡは共有結合標識化を示す４８０ｎｍの緑色発光を示すが、１０当量のチオール含有タンパク質、例えばヘモグロビン、グルタチオン還元酵素、ブロメラインでさえ４８０ｎｍで蛍光増強を生じることができなかった（図９ｂ）。この結果は、高ｐＨでの２５ｍＭリン酸塩緩衝液中Ｓｑ染料はまた、自己組織化された状態で存在し、したがって、他のチオール含有タンパク質と任意の化学反応を受けることができなかったことを示している。
【００７６】
実施例１４
他のチオール含有小分子内での血清アルブミンタンパク質の選択的検出：
染料がチオールアルキル化反応を受けることが予想される、８．２の高ｐＨでのシステイン、ホモシステイン、グルタチオン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスタミンおよびチオグリコール酸などのチオール含有小分子からの血清アルブミンタンパク質に対する本発明のナノプローブの選択性を調べた。１０当量のチオール含有小分子の添加により、４８０ｎｍの領域において多くの蛍光増強を生じることができないことがわかった。棒グラフにより、自己組織化された状態のプローブが他のチオール含有小分子の中で血清アルブミンタンパク質を検出することが可能であることを明確に示す、他のチオール含有小分子（図１０）からのＢＳＡおよびＨＳＡタンパク質（６×１０−６Ｍ）に対するＳｑ（６×１０−６Ｍ）の選択性を表す。
【００７７】
実施例１５
上記アルブミンの線量との非共有結合および共有結合相互作用の可逆性：
５．８〜７．４の低または高ｐＨ値で１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体を使用することによって、アルブミンＨＳＡおよびＢＳＡの上記染料との非共有結合および共有結合相互作用は、数サイクルの間、可逆的であることがわかった（図１１）。上記分子が上記タンパク質と共有結合する７．４のｐＨで、酸の添加により、４８０ｎｍでの発光の消失と共に７００ｎｍの発光の増強をもたらした。これは、共有結合したＳｑ染料が上記タンパク質から切り離され、タンパク質キャビティ内で再結合していることを示す。その後の塩基の添加により、７００ｎｍの発光の消失に伴う４８０ｎｍの発光を増強することによって、プロセスを逆転させた。この切り換えは、酸‐塩基の添加の少なくとも４サイクルの間、観察された。
【００７８】
実施例１６
ｐＨ監視の研究：
１：１２〜１／１２の範囲の異なる比率のＳｑ‐ＢＳＡ錯体を、４．６〜１１．６の広いｐＨ領域内のｐＨの変化を検出するために使用した。これは、同じプローブが高感度で広い領域のｐＨの変化を検出するために使用された最初の報告である。１：１２のＳｑ‐ＢＳＡ錯体は上記ｐＨ領域４．６〜６．４を感知し、５．８〜７．４に対して１：６、７．２〜８．８に対して１：１、８．６〜１０．２に対して１：１／６および１０．２〜１１．６に対して１：１／１２である（図１２）。感度の変化は、効果的にタンパク質と反応するＳｑ染料分子の数および塩基触媒の作用に依存する反応速度の変化によるものである。比１：１２および１：６の場合のようにＢＳＡ濃度が大きいと、Ｓｑ分子はそのモノマーの状態で存在し、酸性ｐＨにおいてさえも求核付加反応を受けることができる。タンパク質の高い濃度において、モノマーとして存在するＳｑ染料がｐＨを増加する際に求核付加反応を起こし、７００ｎｍでの上記染料の発光は減少する。従って、１：１２および１：６のＳｑ‐ＢＳＡに対して、４８０ｎｍおよび７００ｎｍの領域における蛍光強度の変化は、非常にレシオメトリックである（図１２および１３）。タンパク質の低当量で、上記Ｓｑ染料のほとんどは、それらの自己組織化された状態にあり、高ｐＨのみでのタンパク質と反応する。その集合状態にある分子が、反応が起こるためには、それらのモノマーの状態となる必要がある。その結果、７００ｎｍでの蛍光強度の変化は、溶液のｐＨの増加に対してわずかな変化を有する。したがって、１：１／６および１：１／１２に対して、蛍光応答はレシオメトリックではない（図１２および１３）。
【００７９】
本発明の優位性
（１）そのモノマー状態のプローブが、高い選択性および感度を有して、チオールを検出する。
（２）３０％ＡＣＮ／リン酸塩緩衝液中で調製したプローブは、生細胞内でのチオール濃度のわずかな変動の検出に有用である。
（３）同じプローブは、溶液のｐＨを変化させることによって、血清アルブミンタンパク質の共有結合および非共有結合標識化の両方のために使用した。
（４）スクアライン染料の自己組織化性により、アミノ酸およびタンパク質の他の生体関連分子からの血清アルブミンタンパク質の共有結合および非共有結合標識化のための高い選択性を提供する。
（５）未反応のプローブの存在下での標識化点において標識化反応の過程を可視化するのに役立つＳｑとの相互作用の間に、共有結合および非共有結合標識化は、蛍光発光「開始」を起こす。
（６）標識化は、高度に可逆的であり、かつ高速動力学に従うことがわかった。
（７）血清アルブミンタンパク質に対するＳｑのｐＨ制御の共有結合および非共有結合標識化が、上記染料とタンパク質との間の比率を変えることにより、４．６〜１１．６のｐＨの広い領域におけるわずかなｐＨの変動を監視するために利用される。
（８）１：６のＳｑ‐ＢＳＡ錯体は、生細胞内部のｐＨの変化の高感度検出のための効率的なレシオメトリック蛍光プローブとして使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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