(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グレムリン−１に対する抗体であって、該抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列を有し、かつ、前記重鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列を有し、かつ、
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）に非依存的な方式によりグレムリン−１を抑制することにより、癌に対して治療効果を有することを特徴とする、前記抗体。
【請求項２】
軽鎖不変領域及び重鎖不変領域をさらに含む、請求項１に記載のグレムリン−１に対する抗体。
【請求項３】
前記抗体の軽鎖不変領域及び重鎖不変領域が、ヒトまたはウサギのものであることを特徴とする請求項２に記載のグレムリン−１に対する抗体。
【請求項４】
前記抗体が、グレムリン−１が癌細胞に直接的に結合することを抑制することを特徴とする請求項１に記載のグレムリン−１に対する抗体。
【請求項５】
前記抗体が、グレムリン−１に依存する細胞移動性(ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ)、
細胞浸潤性(ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ)及び細胞増殖(ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ)を抑制することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記癌が、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、腎臓癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、乳房癌、甲状腺癌、皮膚癌、骨癌、基底細胞癌、扁平細胞癌、鼻咽頭癌、膀胱癌、子宮癌、皮膚癌、食道癌及び頭頸部癌よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体を含む癌診断用キット。
【請求項９】
前記癌が、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、腎臓癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、乳房癌、甲状腺癌、皮膚癌、骨癌、基底細胞癌、扁平細胞癌、鼻咽頭癌、膀胱癌、子宮癌、皮膚癌、食道癌及び頭頸部癌よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グレムリン−１（ｇｒｅｍｌｉｎ−１）に対する抗体に係り、さらに詳しくは、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）または血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）に非依存的な方式によりグレムリン−１を抑制することにより、癌に対して治療効果を有するグレムリン−１に対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
グレムリン−１（ｇｒｅｍｌｉｎ−１，２０．７ｋＤａ）は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の拮抗剤であり、システインリッチな領域、システインノットモチーフ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｍｏｔｉｆ）及びＴＧＦ−βスーパーファミリの構成員と共通する構造を有する１８４個のアミノ酸よりなるタンパク質である。前記タンパク質は進化的に保存されており、ヒトグレムリン遺伝子（ＧＲＥＭ１）は染色体１５ｑ１３−ｑ１５の上に位置する（Ｔｏｐｏｌ  ＬＺ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １７：  ４８０１−４８１０；  Ｔｏｐｏｌ  ＬＺ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，  ８９：  ７９−８４）。グレムリン−１は分泌タンパク質であり、３種類のアイソフォーム(ｉｓｏｆｏｒｍ)が報告されている（Ｔｏｐｏｌ  ＬＺ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：  ８７８５−８７９３）。アイソフォーム１は最も頻繁に見られるアイソフォームであり、アイソフォーム２及び３はそれぞれアミノ酸３９−７９及び１０−７９が欠失している。
【０００３】
グレムリン−１は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７とヘテロダイマー(ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ)を形成することにより、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が細胞表面上の受容体に結合することを抑制する（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．，  ７７：  １７３−１８４；  Ｍｅｒｉｎｏ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １２６：  ５５１５−５５２２；  Ｌａｐｐｉｎ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．，  ９：  ４６９−４７２）。また、グレムリン−１は、肺、腕脚及び腎臓発達過程だけではなく、神経堤細胞(ｎｅｕｔｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｃｅｌｌ)の分化過程においてＢＭＰを調節する重要な役割を果たす（Ｌｕ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎ．，  ２２２：  ６６７−６８０；  Ｓｈｉ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２８０：  Ｌ１０３０−１０３９）。グレムリン−１は可溶性リガンドに対して拮抗効果を示すだけではなく、細胞内においてＢＭＰ−４前駆タンパク質と相互作用して胚芽肺においてＢＭＰ−４媒介信号伝達活性を下向き調節する（Ｓｕｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８１：  ２９３４９−２９３５６）。さらに、グレムリン−１は分泌された軸索ガイダンスタンパク質(ａｘｏｎａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ)の一つであるスリットタンパク質(Ｓｌｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ)と相互作用し、単核球走化性(ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ)の抑制剤として働く（Ｃｈｅｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７３：  ５９１４−５９１７）。最近には、グレムリン−１が骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に非依存的な方式により血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）に結合して血管形成を調節するということが報告されている（Ｍｉｔｏｌａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｂｌｏｏｄ，  １１６：  ３６７７−３６８０）。グレムリン−１は、子宮頸管、子宮内膜、肺、卵巣、腎臓、乳房、大腸及び膵臓の癌腫をはじめとする様々なヒト腫瘍において過発現されるが（Ｎａｍｋｏｏｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，  ６：  ７４；  Ｓｈａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．，  ９１：  ３５０−３５８）、腫瘍形成におけるその役割は詳細に研究されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、グレムリン−１の腫瘍関連の特性について鋭意検討したところ、グレムリン−１が骨形成タンパク質（ＢＭＰ）や血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）とは無関係に癌細胞と直接的に相互作用をするということを見出し、これに基づいてグレムリン−１を抑制する抗体を開発するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
本発明は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）に非依存的な方式によりグレムリン−１を抑制することにより、癌または免疫疾患に対して治療効果を有するグレムリン−１に対する抗体を提供する。
また、本発明は、前記抗体及び薬学的に許容可能な添加剤を含む癌または免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
さらに、本発明は、前記抗体またはこれを含む薬学的組成物をこれを必要とする対象に投与することを含む癌または免疫疾患の治療方法を提供する。
さらにまた、本発明は、前記抗体を含む癌または免疫疾患の診断用キットを提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によるグレムリン−１に対する抗体は、グレムリン−１が骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）に非依存的な方式により癌細胞に結合することを抑制するので、グレムリン−１によって媒介される各種の癌または免疫疾患の予防または治療に効果的に使用される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、２次抗体、グレムリン−１単独及びグレムリン−１と本発明による抗体または対照群抗体との組み合わせを４種の癌細胞（Ａ５４９、ＨｅＬａ、Ａ１７２及びＡ４３１）と反応させた後、フローサイトメトリーにより測定したグラフである。
【図２】図２Ａは、グレムリン−１をヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣ）細胞と反応させた後、フローサイトメトリーにより測定したグラフである。図２Ｂは、グレムリン−１をＨＵＶＥＣ、Ａ５４９及びＨｅＬａ細胞と反応させた後、 ＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ−ＰＣＲ）法により測定した結果である。図２Ｃは、グレムリン−１をＨＵＶＥＣ、Ａ５４９及びＨｅＬａ細胞と反応させた後、ＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を免疫ブロット分析により測定した結果である。
【図３】図３Ａは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７にグレムリン−１単独、本発明による抗体単独及びこれらの組み合わせを反応させてＢＭＰに結合されたグレムリン−１の量を酵素免疫分析により測定した結果である。図３Ｂは、Ａ５４９細胞とグレムリン−１を反応させ、ここに１０倍モル過量のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７を加えた後、フローサイトメトリーにより測定したグラフである。
【図４】図４Ａは、Ａ５４９細胞をグレムリン−１と反応させた後、クリスタルバイオレットで染色して撮影した細胞のイメージである。図４Ｂは、Ａ５４９細胞をグレムリン−１と反応させた後、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の発現を免疫ブロット分析により測定したものである。図４Ｃは、Ａ５４９細胞をグレムリン−１と反応させた後、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の発現を免疫蛍光染色により測定したものである。図４Ｄは、Ａ５４９細胞をグレムリン−１単独及びグレムリン−１と本発明による抗体または対照群抗体との組み合わせと反応させた後、細胞の移動を測定したグラフである。
【図５】図５Ａは、グレムリン−１−Ａ５４９細胞株、 ｍｏｃｋ-Ａ５４９細胞株におけるグレムリン−１ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロットによって測定したものである。図５Ｂは、グレムリン−１−Ａ５４９細胞株、 ｍｏｃｋ-Ａ５４９細胞株及び本発明による抗体及び対照群抗体を処理したグレムリン−１−Ａ５４９細胞株におけるＥ−カドヘリンの発現量を免疫ブロット分析方法により測定したものである。図５Ｃは、ｍｏｃｋ-Ａ５４９細胞株及びグレムリン−１−Ａ５４９細胞株において浸潤された細胞の数を測定したグラフである。図５Ｄは、グレムリン−１−Ａ５４９細胞株、 ｍｏｃｋ-Ａ５４９細胞株及び本発明による抗体及び対照群抗体を処理したグレムリン−１−Ａ５４９細胞株における細胞移動を測定したグラフである。図５Ｅは、グレムリン−１−Ａ５４９細胞株、 ｍｏｃｋ-Ａ５４９細胞株及び本発明による抗体を処理したグレムリン−１−Ａ５４９細胞株の細胞成長を測定したグラフである。図５Ｆは、グレムリン−１−Ａ５４９細胞株及び ｍｏｃｋ-Ａ５４９細胞株をヌードマウスに注射した後、形成された腫瘍体積を測定したグラフである。
【図６Ａ】免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（皮膚、乳房）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した結果である。
【図６Ｂ】免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（リンパ節、肺）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した結果である。
【図６Ｃ】免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（肝、食道）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した結果である。
【図６Ｄ】免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（胃）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した結果である。
【図６Ｅ】免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（結腸、直腸）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した結果である。
【図６Ｆ】免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（腎臓、膀胱）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した結果である。
【図６Ｇ】免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（前立腺、睾丸）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した結果である。
【図６Ｈ】免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（子宮頸、子宮内膜）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した結果である。
【図６Ｉ】免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（甲状腺癌組織）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明を実施するための最良の態様
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、グレムリン−１に対する抗体を提供する。前記抗体は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）に非依存的な方式によりグレムリン−１を抑制することにより、癌に対して治療効果を有することを特徴とする。前記抗体は、免疫抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であってもよいが、これらに制限されない。
【０００９】
前記グレムリン−１に対する抗体は、例えば、ファージ−ディスプレイ技術を応用して選別することができる。すなわち、フィラメント(ｆｉｌａｍｅｎｔ)状のファージ表皮タンパク質を発現する遺伝子に目的とする抗体を発現する遺伝子を融合させ、前記融合された抗体がバクテリオファージ粒子の表面に露出された抗体−ファージ状のウィルス粒子を生成した後、バイオパニング(ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ)技法を応用してファージライブラリーから所望の抗体を選別することができる。上述したファージ−ディスプレイ技術を用いて多数の優れた効果を有する抗体を確保することができ、これらの中でも非常に優れた効果を有する７種の抗体を得た。
【００１０】
前記抗体は、軽鎖不変領域、重鎖不変領域、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域がそれぞれ下記のアミノ酸配列を有する抗体であってもよい：
（１）配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体；
（３）配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体；
（４）配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体；
（５）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体；
（６）配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体；及び
（７）配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体。
【００１１】
本発明において、前記（１）〜（７）の抗体をそれぞれＲ−８０、Ｒ−８８、Ｏ−１、Ｏ−１３、Ｏ−２６、Ｊ−１及びＯ−１３（ヒト化）抗体と命名した。
前記抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、ヒトまたはウサギのものであってもよい。前記抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域はそれぞれ単独で用いられてもよく、両方が組み合わせられて用いられてもよく、この技術分野における公知の軽鎖不変領域及び重鎖不変領域とそれぞれ組み合わせられて用いられてもよく、これらの断片が用いられてもよい。なお、前記軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は公知の方法により ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）の形に製造されてもよい。
【００１２】
前記配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の場合、１〜２２番目のアミノ酸はフレームワーク領域（ＦＲ１）であり、２３〜３３番目のアミノ酸は相補性決定領域１（ＣＤＲ１）であり、３４〜４８番目のアミノ酸はＦＲ２であり、４９〜５５番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、５６〜８７番目のアミノ酸はＦＲ３であり、８８〜１００番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１０１〜１１０番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００１３】
また、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の場合、１〜２４番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２５〜３４番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３５〜４８番目のアミノ酸はＦＲ２であり、４９〜６４番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、６５〜９５番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９６〜１０５番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１０６〜１１６番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００１４】
さらに、配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の場合、１〜２２番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２３〜３３番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３４〜４８番目のアミノ酸はＦＲ２であり、４９〜５５番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、５６〜８７番目のアミノ酸はＦＲ３であり、８８〜１００番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１０１〜１１０番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００１５】
さらに、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の場合、１〜２４番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２５〜３４番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３５〜４８番目のアミノ酸はＦＲ２であり、４９〜６４番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、６５〜９５番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９６〜１０９番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１１０〜１２０番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００１６】
さらに、配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の場合、１〜２２番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２３〜３５番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３６〜５０番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５１〜５７番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、５８〜８９番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９０〜１００番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１０１〜１１０番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００１７】
さらに、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の場合、１〜２５番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２６〜３５番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３６〜４９番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５０〜６６番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、６７〜９８番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９９〜１１０番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１１１〜１２２番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００１８】
さらに、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の場合、１〜２２番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２３〜３５番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３６〜５０番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５１〜５７番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、５８〜８９番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９０〜１００番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１０１〜１１０番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００１９】
さらに、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の場合、１〜２５番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２６〜３５番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３６〜４９番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５０〜６６番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、６７〜９８番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９９〜１１０番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１１１〜１２１番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００２０】
さらに、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の場合、１〜２２番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２３〜３５番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３６〜５０番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５１〜５７番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、５８〜８９番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９０〜１００番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１０１〜１１０番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００２１】
さらに、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の場合、１〜２５番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２６〜３５番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３６〜４９番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５０〜６６番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、６７〜９８番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９９〜１１０番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１１１〜１２１番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００２２】
さらに、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の場合、１〜２３番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２４〜３４番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３５〜４９番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５０〜５６番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、５７〜８８番目のアミノ酸はＦＲ３であり、８９〜９７番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、９８〜１０７番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００２３】
さらに、配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の場合、１〜３０番目のアミノ酸はＦＲ１であり、３１〜３５番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３６〜４９番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５０〜６６番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、６７〜９８番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９９〜１１０番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１１１〜１２１番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００２４】
さらに、配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の場合、１〜２３番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２４〜３６番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３７〜５１番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５２〜５８番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、５９〜９０番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９１〜１０１番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１０２〜１１１番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００２５】
さらに、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の場合、１〜２５番目のアミノ酸はＦＲ１であり、２６〜３５番目のアミノ酸はＣＤＲ１であり、３６〜４９番目のアミノ酸はＦＲ２であり、５０〜６６番目のアミノ酸はＣＤＲ２であり、６７〜９８番目のアミノ酸はＦＲ３であり、９９〜１１０番目のアミノ酸はＣＤＲ３であり、１１１〜１２１番目のアミノ酸はＦＲ４である。
【００２６】
前記配列番号１のアミノ酸配列は配列番号１５の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号２のアミノ酸配列は配列番号１６の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号３のアミノ酸配列は配列番号１７の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号４のアミノ酸配列は配列番号１８の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号５のアミノ酸配列は配列番号１９の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号６のアミノ酸配列は配列番号２０の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号７のアミノ酸配列は配列番号２１の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号８のアミノ酸配列は配列番号２２の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号９のアミノ酸配列は配列番号２３の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号１０のアミノ酸配列は配列番号２４の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号１１のアミノ酸配列は配列番号２５の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号１２のアミノ酸配列は配列番号２６の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号１３のアミノ酸配列は配列番号２７の塩基配列によってコードされてもよく、配列番号１４のアミノ酸配列は配列番号２８の塩基配列によってコードされてもよい。
【００２７】
従来よりグレムリン−１が癌組織において発現されるということが知られているが、その具体的な役割は未だ究明されていない。グレムリン−１は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）拮抗剤として知られているだけではなく、グレムリン−１が血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）に結合して血管形成を調節することが報告されているため、グレムリン−１がＢＭＰやＶＥＧＦＲ２を通じて癌と関連していることが予想された。しかしながら、驚くべきことに、本発明は、グレムリン−１がＢＭＰやＶＥＧＦＲ２に非依存的に、すなわち、これらによって媒介されることなく、癌細胞と直接的に結合して細胞移動、浸潤及び増殖を誘導するということを見出した。なお、グレムリン−１は、Ｅ−カドヘリン(E-ｃａｄｈｅｒｉｎ)の発現を抑制することにより、癌細胞の成長を誘導する。
【００２８】
前記細胞移動、浸潤及び増殖などは上述したグレムリン−１に対する抗体によって抑制される。このため、グレムリン−１抗体は、ＢＭＰやＶＥＧＦＲ２に非依存的にグレムリン−１を抑制することにより、すなわち、グレムリン−１が癌細胞に直接的に結合することを抑制することにより、癌に対する治療効果を有する。
【００２９】
そこで、本発明は、前記抗体及び薬学的に許容可能な添加剤を含む癌予防または治療用薬学的組成物を提供する。前記添加剤は、担体、賦形剤またはその他の添加剤であってもよい。本発明による組成物は、通常的な方法にて薬学的剤形を製造することができる。剤形を製造するに当たり、前記抗体を担体と一緒に混合または希釈するか、あるいは容器形の担体内に封入させることが好ましい。希釈剤として用いられる担体としては、抗体に対する担体、賦形剤またはミディアム（ｍｅｄｉｕｍ）として作用する固形、半固形または液状の物質が挙げられる。このため、剤形は、錠剤、丸剤、粉剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒ）、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ剤、エアゾール剤、軟質または硬質ゼラチンカプセル剤、滅菌注射剤、滅菌粉剤などの形が挙げられる。適合な担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び及び鉱油が挙げられる。剤形は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明による組成物は、哺乳動物に投与された後に抗体の迅速、持続または遅延放出を与えるように当業界の公知の方法を用いて剤形化することができる。本発明による抗体組成物は、前記抗体と共にインターフェロン、抗-ＨＢＶ単一クローン抗体、抗-ＨＢＶ ポリクローナル抗体、 ヌクレオチド類似体、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ製剤または治療ワクチンを抗ウィルス剤としてさらに含むことができる。
【００３０】
本発明による抗体またはこれを含む薬学的組成物をこれを必要とする対象、例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物に投与することにより、癌を治療することができる。このとき、前記抗体の投与量は、処理される対象、疾病または病態の重症度、投与の速度及び処方医師の判断による。有効成分として、前記抗体は、哺乳動物に対して一日につき０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは、０．００５〜１ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で１日につき１回または１日につき複数回に分けて非経口的に投与することができる。場合に応じて、上述した範囲よりも少ない投与量の方がより好ましく、有害な副作用を引き起こさないつつもより多い投与量が使用されてもよく、より多い投与量の場合には一日につき複数回に分けて少量ずつ投与してもよい。
【００３１】
このため、本発明は、本発明による抗体または前記薬学的組成物をこれを必要とする対象に投与することを含む癌の治療方法を提供する。前記本発明による抗体は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）または血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）に非依存的な方式によりグレムリン−１を抑制することにより、癌を治療することを特徴とする。
【００３２】
上述した癌の例としては、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、腎臓癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、乳房癌、甲状腺癌、皮膚癌、骨癌、基底細胞癌、扁平細胞癌、鼻咽頭癌、膀胱癌、子宮癌、皮膚癌、食道癌及び頭頸部癌が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３３】
一方、本発明による抗体は、免疫疾患の予防または治療用途にも使用可能である。グレムリン−１が免疫疾患と深い関係があるということがいくつかの文献により立証された（ＭｅｚｚａｎｏＳ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｅｍｌｉｎ，  ａ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，  ｉｎ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐａｕｃｉ−ｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，  ｄｉａｌｙｓｉｓ，  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  −  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ２２（７）：１８８２−１８９０）。
【００３４】
このため、本発明によるグレムリン−１を抑制する抗体は、免疫疾患を予防または治療するのに使用可能である。
【００３５】
前記免疫疾患の例としては、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性進行性硬化症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、全身性紅斑性狼瘡（ｌｕｐｕｓ）、アトピー皮膚炎、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ａｒｅａｔａ）、乾癬、天疱瘡、喘息、アフタ性潰瘍、慢性甲状腺炎、後天性再生不良貧血、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、硅素肺症、石綿肺症、ＩｇＡ腎臓疾患、連鎖球菌感染後糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、自己免疫性溶血性貧血（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、結節性多発動脈炎（Ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ  ｎｏｄｏｓａ）、強直性脊椎炎（Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、線維筋痛症（Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び側頭動脈炎（Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３６】
一方、本発明は、本発明による抗体を含む癌または免疫疾患診断用キットを提供する。前記キットは、本発明による抗体に加えて、免疫組織化学染色法のための通常の試薬などをさらに含むことができる。さらに含まれ得る構成要素としては、ＦＩＴＣ試薬、抗原賦活液（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、対照群抗体、ＨＲＰ-結合された重合体、ＤＡＢ(３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ)溶液、マイヤ−ヘマトキシリン液（Ｍａｙｅｒ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などが挙げられるが、これらに制限されない。前記キットは、正常組織と診断のための組織に標識された本発明による抗体を反応させ、これを染色して顕微鏡で観察することにより、本発明による抗体と反応した組織を、癌または免疫疾患にかかったまたは危険性のある組織であると診断することができる。
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎないもので、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１：グレムリン−１の発現及び精製
＜１−１＞  細胞培養
Ａ５４９、ＨｅＬａ、Ａ１７２及びＡ４３１細胞は韓国細胞株銀行（ソウル、韓国）から入手し、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はインビトロジェン社（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手した。一方、Ａ５４９、Ａ１７２及びＡ４３１細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ社製、グランドアイランド、ニューヨーク州）入りＲＰＭＩ−１６４０培地（ウェルジーン社製、韓国）で、ＨｅＬａ細胞は１０％ＦＢＳ入りＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地（ウェルジーン社製）で、そしてＨＵＶＥＣは内皮細胞成長培地−２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ−２；ＥＧＭ−２）（ロンザ社製、ウォーカーズヴィル、メリーランド州）で培養した。
【００３９】
＜１−２＞  グレムリン−１発現ベクターの製造及び形質感染
文献［Ｎａｍｋｏｏｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：  ７４］の方法を参照して、ヒト子宮組織ｃＤＮＡライブラリーからグレムリンｃＤＮＡを増幅させて得た。次いで、下記のＰＣＲプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により前記グレムリンｃＤＮＡの５’及び３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を導入した。
【００４０】
５’−ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣ−３’（配列番号２９）
５’-ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＴＡＴ  ＧＣ−３’（配列番号３０）
【００４１】
前記ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで切断した後、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（インビトロジェン社製）内にライゲーションしてグレムリン−１発現ベクターを製造した。
【００４２】
一方、形質感染の１日前に、Ａ５４９細胞（５．０×１０５細胞）をプレートに塗抹して７０％ コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到達させた。次いで、前記製造されたグレムリン−１発現ベクターをリポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン社製）を用いてメーカーのガイドラインに従ってＡ５４９細胞に形質感染させた。前記形質感染された細胞を１．０ｍｇ／ｍｌの抗生剤Ｇ４１８（インビトロジェン社製）を用いて選別した。前記選別されたグレムリン−１発現細胞株を「グレムリン−１−Ａ５４９」細胞株と命名した。
【００４３】
上述した方式に従い、グレムリン−１が挿入されていないｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター単独でＡ５４９細胞を形質感染させて「ｍｏｃｋ-Ａ５４９」細胞株を得た。
【００４４】
＜１−３＞  グレムリン−１の発現及び精製
グレムリン−１及びヒトＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を文献［Ｐａｒｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ４１１：  １２３８−１２４２］に記載の方式に従い、オーバーラッピングＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）法を用いて製造した。前記ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられたグレムリン−１及びＩｇＧ−Ｆｃに対するリンカープライマー配列は、下記の通りである：
（１）グレムリン−１
Ｆ：５’−ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＧＡＴ−３’（配列番号３１）
Ｒ：５’−ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＣ−３’（配列番号３２）
（２）ＩｇＧ−Ｆｃ
Ｆ：５’−ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＴＡＣ−３’（配列番号３３）
Ｒ：５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ−３’（配列番号３４）
【００４５】
前記ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで切断してｐＣＥＰ４発現ベクター（インビトロジェン社製）内にクローニングして、グレムリン−１−Ｆｃ融合タンパク質を発現するベクターを製造した。
【００４６】
一方、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社製）をＧＩＢＣＯ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３発現培地（インビトロジェン社製）に０．１×１０６〜２．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で培養した後、通気孔蓋体付き使い捨て三角組織培養フラスコ（コーニング社製）に移してオービタル攪拌培養器（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ；３７℃、８％ＣＯ２、Ｍｉｎｉｔｒｏｎ、ＩＮＦＯＲＳＨＴ、スイス）上において１３５ｒｐｍにて攪拌しながら培養した。形質感染の１日前に、前記細胞培養物に新鮮な培地を添加して１．０×１０６細胞／ｍｌの密度に希釈し、２．０×１０６細胞／ｍｌの密度に達するまで培養した。次いで、前記ＨＥＫ２９３細胞をリポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いて上述したグレムリン−１及びヒトＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質を発現するベクターで形質感染させた。形質感染された細胞を再びオービタル攪拌培養器で培養し、形質感染の３日目に培養上澄み液を回収した。次いで、文献［Ｐａｒｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ４１１：  １２３８−１２４２］に記載の過程に従い、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを用いてグレムリン−１−Ｆｃ融合タンパク質を精製した。
【００４７】
実施例２：グレムリン−１抗体の生成
＜２−１＞  免疫化
５μｇのグレムリン−１−Ｆｃを２ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と混合し、３７℃で３０分間培養して、これを２％スクワレン中に毒素が除去された内毒素であるＭＰＬ(ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ  ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）及びマイコバクテリアの細胞壁成分であるＴＤＷ及びＣＷＳを含有する乳中水乳化液である補助剤（シグマ社製、セントルイス、ミズーリ州）に乳化させた後、ニュージーランド産の白いウサギに注入した。免疫化を３週おきに３回行った。免疫化されたウサギの抗体力価(ｔｉｔｅｒ)を二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役のマウス抗ウサギＩｇＧ多クローン抗体（ピアス・ケミカル社製、ロックフォード、イリノイ州）を用いて酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。
【００４８】
前記免疫化されたウサギの脾臟及び骨髄からＴＲＩ試薬（インビトロジェン社製）を用いて総ＲＮＡを得た。抽出された脾臟及び骨髄をホモジナイザーを用いて５０％アウトプット(ｏｕｔｐｕｔ)において１分間ＴＲＩ試薬中において均質化させ、室温下で５分間培養した。均質化された試料を４℃で１０分間２，５００ｇにおいて遠心分離した。上澄み液を５０ｍＬの遠心分離チューブに移し、各上澄み液に３ｍＬの１−ブロモ−３−クロロ−プロパン（ＢＣＰ）（シグマ社製）を添加した。次いで、前記混合物を１５秒間ボルテックスし(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)、室温下で１５分間培養した。混合物を４℃で１５分間１７，０００ｇにおいて遠心分離し、無色の上層水性相を新たな５０ｍＬのチューブに移した。次いで、１５ｍＬのイソプロパノールを添加して室温下で１０分間培養した。４℃で１５分間１７，５００ｇにおいて遠心分離した後、上澄み液を丁寧に除去し、ペレットを再懸濁させずに３０ｍＬの７５％エタノールで洗浄した。ペレットを１０分間再び遠心分離して上澄み液を除去した後、ペレットを室温下で空気乾燥した。次いで、ペレットをＲＮａｓｅのない水に溶解させ、−８０℃に保管した。２６０ｎｍにおいて光学密度を測定してＲＮＡ濃度を決定し（４０ｎｇ／μＬのＲＮＡがＯＤ２６０＝１を生成する）、純度をＯＤ２６０／ＯＤ２８０の割合によって計算した（通常、１．６〜１．９の範囲である）。
【００４９】
＜２−２＞  総ＲＮＡからの第一鎖ｃＤＮＡの合成
オリゴ（ｄＴ）プライミング(ｐｒｉｍｉｎｇ)を有する第一鎖ｃＤＮＡ合成キットに対するスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ）IIIシステム（インビトロジェン社製）を用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成した。前記分離された５μｇの総ＲＮＡを１μＬの０．５μｇ／μＬオリゴ（ｄＴ）、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ及びジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理された水と混合して最終的な体積を１０μＬに調整した。前記混合物を６５℃で５分間培養し、氷中で冷却した。前記ＲＮＡ試料に２μＬの１０倍濃度反応緩衝液、４μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μＬの１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１μＬのＲＮａｓｅ  ＯＵＴ（リボヌクレアーゼ阻害剤）及び１μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔIII逆転写酵素を添加し、５０℃で５０分間培養した。８５℃で５分間培養した後、氷中で冷却して反応を終了した。次いで、１μＬのＲＮａｓｅ  Ｈを添加し、３７℃で２０分間培養した。前記第一鎖ｃＤＮＡを−２０℃で保管した。
【００５０】
＜２−３＞  １次 ＰＣＲ
ウサギの脾臟及び骨髄から得た第一鎖ｃＤＮＡに対してＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（ロシュ・モレキュラーシステムズ社製、インディアナ州、米国）を用いた３０サイクルのＰＣＲを行った。ウサギＶＬ（９×Ｖｋ及び１×Ｖλ）コード配列の増幅のための１０個のプライマー組み合わせ及びウサギＶＨコード配列（表１）の増幅のための４つの組み合わせを併用した。各反応において、１μＬのｃＤＮＡを６０ｐｍｏｌの各プライマー、１０μＬの１０倍濃度反応緩衝液、８μＬの２．５ｍｍ ｄＮＴＰ（プロメガ社製、マディソン、ウィスコンシン州）、０．５μＬのＴａｑ ＤＮＡ重合酵素及び水と混合して最終的な体積を１００μＬに調整した。下記の条件下でＰＣＲを行った：９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で９０秒の３０サイクル後に、７２℃で１０分間の最終延長。約３５０ｂｐの長さを有する断片を１．５％アガロースゲルに搬入して電気泳動した後、ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（キアゲン社製、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて精製した。精製されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物をＯＤ ２６０ｎｍにおいて読み取って定量した（１ＯＤ単位＝５０μｇ／ｍＬ）。
【００５１】
＜２−４＞  ２次 ＰＣＲ
２次ＰＣＲにおいて、１次ＶＬ産物をオーバーラップ延長ＰＣＲによって１次ＶＨ産物とランダムに連結した（表２）。長いリンカーの単鎖断片に対して少なくとも１０回の反応を行った。各反応において、１００ｎｇの精製された軽鎖産物及び重鎖産物を６０ｐｍｏｌの各プライマー、１０μＬの１０倍濃度反応緩衝液、８μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（プロメガ社製）、０．５μＬのＴａｑ ＤＮＡ重合酵素及び水と混合して最終的な体積を１００μＬに調整した。下記の条件下でＰＣＲを行った：９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で２分の２０サイクル後に、７２℃で１０分間の最終延長。約７００ｂｐの大きさの断片を１．５％アガロースゲルに搬入して電気泳動した後、ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（キアゲン社製、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて精製した。精製されたＰＣＲ産物をＯＤ ２６０ｎｍにおいて読み取って定量した（１ＯＤ単位＝５０μｇ／ｍＬ）。
【００５２】
＜２−５＞  精製されたオーバーラップ延長産物及びベクターＤＮＡの制限酵素処理
ＰＣＲ産物及びｐＣｏｍｂ３Ｘベクター（スクリプス研究所製）をクローニングのためにＳｆｉＩ制限酵素で処理した。１０μｇの精製されたオーバーラップＰＣＲ産物を３６０ユニットのＳｆｉＩ（１μｇのＤＮＡ当たりに１６ユニット、ロシュ・モレキュラーシステムズ社製）、２０μＬの１０倍濃度反応緩衝液Ｍ及び水と混合して最終的な体積を２００μＬに調整した。２０μｇのｐＣｏｍｂ３Ｘベクターを１２０ユニットのＳｆｉＩ（１μｇのＤＮＡ当たりに６ユニット、ロシュ・モレキュラーシステムズ社製）、２０μＬの１０倍濃度反応緩衝液Ｍ及び水と混合して最終的な体積を２００μＬに調整した。前記混合物を５０℃で５時間培養した。約７００ｂｐの長さを有する切断された挿入物を１％アガロースゲルで精製し、約３,４００ｂｐの長さを有するベクターＤＮＡ及びｐＣｏｍｂ３Ｘベクター内に含有されている約１,６００ｂｐの長さを有する断片を０．６％アガロースゲルで精製した。
【００５３】
＜２−６＞  処理されたオーバーラップＰＣＲ産物とベクターＤＮＡのライゲーション（ligation）
高効率のライゲーション及び形質転換のためのベクター並びに挿入物の適合性を評価するために、小規模のライゲーションを行った。ベクターＤＮＡのＳｆｉＩ処理物のみを含有するライゲーション反応を５％未満のライブラリーサイズであるバックグラウンドライゲーションに対して評価した。ライゲーションのために、１４０ｎｇのＳｆｉＩで処理されて精製されたベクターＤＮＡ及び７０ｎｇのＳｆｉＩで処理されて精製されたＰＣＲ産物またはスタッファーＤＮＡ、４μＬの５倍濃度リガーゼ緩衝液、１μＬのＴ４リガーゼ（インビトロジェン社製）及び水を混合して総体積を２０μＬに調整した。前記ライゲーション混合物を室温下で４時間培養した。前記ライゲーションされた産物１μＬを０．２ｃｍキュベット及び遺伝子パルサー （Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ；バイオラッドラボラトリーズ製、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて２．５ｋＶ、２５μＦ及び２００Ωで電気穿孔法によって５０μＬのＥＲ２７３８エレクトロコンピテント細胞（ＮＥＢ）内に形質転換させた。前記細胞を３ｍＬのＳＢ培地に再懸濁させ、２２５〜２５０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で１時間培養した。形質転換体の総数をＬＢ＋カルベニシリンプレートの上に１μＬ、１０μＬ及び１００μＬを塗抹して決定した。理想的には、最終的なライブラリーの大きさはベクターＤＮＡμｇに対して少なくとも１０８集落形成単位（ｃｆｕ）にならなければならず、５％バックグラウンドライゲーション未満でなければならない。
【００５４】
＜２−７＞  エレクトロコンピテント大腸菌の製造
大腸菌ＥＲ２７３８菌株を１５ｍＬのＳＢ入り５０ｍＬのポリプロピレンチューブで培養し、２５０ｒｐｍにて攪拌しながら３７℃で一晩中成長させた。翌日に、２．５ｍＬの培養物を５００ｍＬのＳＢ、１０ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）グルコース及び５ｍＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２入り２Ｌフラスコ内に希釈させ、６００ｎｍにおけるＯＤが０．８〜０．９に達するまで３７℃で２５０ｒｐｍで攪拌した。次いで、培養物を予め冷却した５００ｍＬの遠心分離瓶に入れ、４℃で２０分間３,０００ｇにおいて遠心分離した。上澄み液を除去し、ペレットを予め冷却した３０ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）グリセロールに再懸濁させた。再懸濁されたペレットを遠心分離し、グリセロールで３回洗浄した後、５ｍＬの１０％グリセロールに再懸濁して−８０℃で保管した。
【００５５】
＜２−８＞  ヘルパーファージの製造
＜２−７＞において製造された１０μＬのＥＲ２７３８懸濁液を１０ｍＬのＳＢ培地に接種し、３７℃で１時間２５０ｒｐｍにて攪拌した。新たに製造されたプレートから得た単一ヘルパーファージプラークをピペットチップを用いて培養物内に移した。前記感染された１０ｍＬの培養物をカナマイシン入りの予め加熱した（３７℃）ＳＢ培地５００ｍＬ入りの２Ｌの三角フラスコに移して最終的な濃度を７０μｇ／ｍＬに調整した後、３７℃で一晩中２５０ｒｐｍにて攪拌した。翌日に、培養物を２,５００ｇにおいて１５分間遠心分離し、上澄み液を水槽中において７０℃で２０分間培養した。２,５００ｇにおいて１５分間遠心分離した後、上澄み液を新たな５０ｍＬのポリプロピレンチューブに移して４℃で保管した。
【００５６】
＜２−９＞  ライブラリーライゲーション及び形質転換
１．４μｇのＳｆｉＩで切断したｐＣｏｍｂ３Ｘ、７００ｎｇの＜２−５＞において得た、ＳｆｉＩで切断されたＰＣＲ産物、４０μＬの５倍濃度リガーゼ緩衝液、１０μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び水（最終的な体積を２００μＬに調整する）を用いてライブラリーライゲーションを行った。前記ライゲーション混合物を室温下で一晩中培養した後、−８０℃で一晩中エタノールで沈殿させた。マイクロ遠心分離器を用いて最高の速度にて４℃で１５分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、ペレットを１ｍＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄して乾燥させた。ペレットを１５μＬの水に溶解させた。前記結さつされたライブラリーサンプルを３００μＬのエレクトロコンピテント大腸菌内に形質転換させ、５ｍＬのＳＢ培地において３７℃で１時間培養した。前記培養物に１００ｍＬの予め加熱したＳＢ培地及び３μＬの１００ｍｇ／ｍＬカルベニシリンを添加した。５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢ培地に前記培養物０．１μＬ、１μＬ及び１０μＬを塗抹してライブラリーの大きさを決定した。培養物を２５０ｒｐｍにて１時間攪拌した。前記培養物に４．５μＬの１００ｍｇ／ｍＬカルベニシリンを添加して１時間さらに攪拌した。前記培養物に２ｍＬのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ、１８３ｍＬの予め加熱したＳＢ及び９２．５μＬの１００ｍｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加して３００ｒｐｍ及び３７℃で２時間攪拌した。前記培養物に２８０μＬの５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを添加し、前記培養物を３００ｒｐｍ及び３７℃で一晩中攪拌した。翌日に、培養物を３,０００ｇにおいて４℃で１５分間遠心分離した。上澄み液を５００ｍＬの遠心分離瓶に移し、次いで、８ｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−８０００及び６ｇのＮａＣｌを添加した。氷中で３０分間保管した後、上澄み液を１５,０００ｇにおいて４℃で１５分間遠心分離した。上澄み液を廃棄し、ファージペレットを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）に再懸濁させた。
【００５７】
＜２−１０＞  固定化された抗原上におけるライブラリーのパニング
常磁性ビーズ（ダイナル・バイオテク社製、レイクサクセス、ニューヨーク州）を用いてバイオパニングを行った。３μｇのグレムリン−１を室温下で２０時間１×１０７ビーズと結合させた。前記ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で４回洗浄し、ブロッキング緩衝液とともに室温下で１時間培養した。グレムリン−１と結合したビーズを＜２−９＞において得たｓｃＦｖをディスプレイするファージとともに室温下で２時間培養した。前記洗浄段階を１次における３回から後続する４次においては１０回に増やした。結合されたファージを５０μＬの０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を用いて溶出させ、３μＬの２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．１）によって中和させた。このようなファージ入り上澄み液を用いてＥＲ２７３８を感染させ、ファージミドを一晩中増幅するためにヘルパーファージＶＣＳＭ１３を用いてレスキュー(ｒｅｓｃｕｅ)した。翌日に、＜２−９＞において上述したようにＰＥＧ−８０００及びＮａＣｌを添加してファージを製造した。なお、前記ファージにより感染された培養物を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢプレートの上に塗抹して投入(ｉｎｐｕｔ)及び生産(ｏｕｔｐｕｔ)ファージ力価を決定した。
【００５８】
＜２−１１＞  ファージＥＬＩＳＡによるクローンの選別
追加の分析のために選ばれた個別クローンからｓｃＦｖ結合を確認するために、精製された組換えグレムリン−１に対してｓｃＦｖをディスプレイするファージを用いてＥＬＩＳＡを行った。グレムリン−１によりコーティングされたマイクロタイタープレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて３７℃で１時間ブロッキングした。次いで、ファージ上澄み液をＰＢＳ中の６％ＢＳＡと同様に混合し、３７℃で１時間培養した。０．０５％のツイーン添加リン酸緩衝生理食塩水(Ｔｗｅｅｎ  ａｄｄｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳＴ)で洗浄した後、プレートをＨＲＰの結合された抗Ｍ１３抗体（１：５０００希釈、ピアス・ケミカル社製）とともに培養した。色相反応のために、２,２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸；ＡＢＴＳ）基質溶液（アムレスコ社製、ソロン、オハイオ州）を使用した。
ｓｃＦｖ断片を全長ＩｇＧに転換させて過発現させた。本発明による抗体（Ｏ−１３）の特異性をウェスタンブロット分析法を用いて決定した。本発明による抗体（Ｏ−１３）の特異性を決定するために、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−グレムリン−１で形質感染されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の培養上澄み液をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。ブロットを１００ｎｇ／ｍＬの本発明による抗体（Ｏ−１３）と４℃で一晩中培養した後、ＨＲＰの結合された抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的、１：１０００希釈；ピアス・ケミカル社製）とともに室温下で１時間培養した。ブロットをメーカーのガイドラインに従い、向上された化学発光システム（ピアス社製）を用いて視覚化させた。ゲルをメーカーのガイドラインに従い、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０（シグマ社製）を用いて視覚化させた。
前記過程により得た７種類の抗体をそれぞれＲ−８０、Ｒ−８８、Ｏ−１、Ｏ−１３、Ｏ−２６、Ｊ−１及びＯ−１３（ヒト化）抗体と命名し、アミノ酸及び塩基配列を分析した。
配列分析の結果、前記Ｒ−８０抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、Ｒ−８８抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、Ｏ−１抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、Ｏ−１３抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、Ｏ−２６抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、Ｊ−１抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、Ｏ−１３（ヒト化）抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
予備実験により、前記抗体のうち最も優れた効果を有するＯ−１３抗体を今後の実験に供試した。
【００５９】
実施例３：グレムリン−１の癌細胞との相互作用の分析
グレムリン−１が癌細胞と直接的に相互作用するかどうかを調べるために、グレムリン−１を４種類の癌細胞（Ａ５４９、ＨｅＬａ、Ａ１７２及びＡ４３１）と共に培養した後、フローサイトメトリーにより分析した。
具体的に、付着細胞をトリプシンで処理し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で洗浄した。懸濁細胞を５００×ｇにおいて２分間遠心分離して回収し、ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで洗浄した。全ての細胞をＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１００ｎＭの最終濃度のヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有するグレムリン−１（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、ミネアポリス、ミネソタ州）と共に３７℃で１時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで２回洗浄し、５μｇ／ｍｌの最終濃度のＦＩＴＣ-結合されたＨｉｓ抗体（アブカム社製、ケンブリッジ、イギリス）と共に暗所で３７℃で３０分間培養した。次いで、細胞をＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社製、サンノゼ、カリフォルニア州）上において分析する前に５００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。
一方、グレムリン−１抗体（Ｏ−１３）の中和効能を分析するために、細胞をヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有するグレムリン−１ １００ｎＭ及びＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中の１０μＭの本発明による抗体（Ｏ−１３）と共に３７℃で１時間培養した後、ＦＩＴＣの結合されたＨｉｓ抗体（アブカム社製）で探針させた。
【００６０】
Ａ５４９細胞を１μＭのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、ミネアポリス、ミネソタ州）及び１００ｎＭのグレムリン−１−Ｆｃで同時に処理し、３７℃で１時間培養した。細胞をＦＩＴＣの結合されたＩｇＧ−Ｆｃ特異的抗体（５μｇ／ｍｌ、インビトロジェン社製）で探針させた。次いで、細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター上において分析した。
前記実験結果を図１に示す。同図に示すように、グレムリン−１は癌細胞株と直接的に相互作用し、これはグレムリン−１抗体によって抑制された。
【００６１】
実施例４：グレムリン−１と癌細胞との相互作用に対する血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）の影響
グレムリン−１と細胞株との相互作用がグレムリン−１の唯一に知られている細胞表面受容体であるＶＥＧＦＲ２によって媒介されるか否かを評価した。
【００６２】
＜４−１＞  フローサイトメトリー
グレムリン−１がヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と結合するか否かを実施例３と同じ過程に従い、フローサイトメトリーによって分析した。前記結果を図２Ａに示す。同図に示すように、グレムリン−１はＨＵＶＥＣと結合しなかった。ＨＵＶＥＣがＶＥＧＦＲ２を発現するため、グレムリン−１がＨＵＶＥＣと結合しないということは、グレムリン−１がＶＥＧＦＲ２とは無関係に癌細胞に結合するということを示唆する。
【００６３】
＜４−２＞ ＲＴ−ＰＣＲ
Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞及びＨＵＶＥＣ細胞 における ＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現をＲＴ−ＰＣＲ及び免疫ブロット分析法を用いて確認した。
具体的に、ＲＴ−ＰＣＲのために、トリゾール試薬（インビトロジェン社製）を用いてメーカーのガイドラインに従い、Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞及びＨＵＶＥＣから総ＲＮＡを分離した。次いで、前記ＲＮＡからスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＲ）ＩＩＩ第一鎖(Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ)合成システム（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。下記のプライマーを用いて２７２０サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製、フォスターシティ、カリフォルニア州）においてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは９４℃で３０秒、５６℃で３０秒及び７２℃で１分間３５サイクルで行った。
【００６４】
（１）ＶＥＧＦＲ−２
Ｆ：５’−ＴＧＡＴＣＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＣＴＧＧＡ−３’（配列番号３５）
Ｒ：５’−ＴＧＣＴＴＣＡＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号３６）
（２）グレムリン−１
Ｆ：５’−ＡＡＣＡＧＴＣＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡ−３’（配列番号３７）
Ｒ：５’−ＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＡ−３’（配列番号３８）
（３）ＧＡＰＤＨ
Ｆ：５’−ＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧ−３’（配列番号３９）
Ｒ：５’−ＡＧＧＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡ−３’（配列番号４０）
【００６５】
前記ＲＴ−ＰＣＲ結果を図２Ｂに示す。図２Ｂに示すように、ＨＵＶＥＣ細胞にはＶＥＧＦＲ２が存在するが、Ａ５４９及びＨｅＬａ細胞からはＶＥＧＦＲ２が検出されなかった。実施例３において、グレムリン−１が癌細胞と相互作用したにも関わらず、ＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡが検出されなかったということは、グレムリン−１と癌細胞との相互作用がＶＥＧＦＲ２によって媒介されないということを示す。
【００６６】
＜４−３＞  免疫ブロット分析
ＨＵＶＥＣ、Ａ５４９細胞及びＨｅＬａ細胞をプロテアーゼ抑制剤カクテル（シグマアルドリッチ社製、セントルイス、ミズーリ州）を含有する冷たい溶解緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ］に溶解させた後、文献［Ｌｅｅ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  （Ｌａｒｃｈｍｔ）  ２７：  １８−２４］に記載の過程に従いウェスタンブロットを行った。このとき、一次抗体としてＶＥＧＦＲ−２（１：１,０００希釈；セル・シグナリング・テクノロジー社製、ダンバース、マサチューセッツ州）及びβ−アクチン（１：１０,０００希釈；アプライドバイオロジカルマテリアルズ社製、リッチモンド、ブリティッシュコロンビア州）抗体を使用し、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の結合された抗マウスＩｇＧ（１：１,０００希釈；ピアス・ケミカル社製、ロックフォード、イリノイ州）またはＨＲＰの結合された抗ウサギＩｇＧ（１：１,０００希釈；ピアス・ケミカル社製）を使用した。ブロットを増強された化学発光システム（ピアス社製）を用いてメーカーのガイドラインに従い視覚化させた。
前記免疫ブロット分析実験結果を図２Ｃに示す。図２Ｃに示すように、ＨＵＶＥＣとは異なり、Ａ５４９及びＨｅＬａ細胞はＶＥＧＦＲ２を発現しなかった。前記結果もまた、グレムリン−１と癌細胞との相互作用がＶＥＧＦＲ２によって媒介されないということを示す。
【００６７】
実施例５：グレムリン−１と癌細胞との相互作用に対するＢＭＰの影響
グレムリン−１は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７に特異的に結合してこれらの活性を抑制するＢＭＰ拮抗剤である。ＢＭＰは多くの組織の形態の形成及び恒常性において重要な役割を果たすと知られている多機能性成長因子である。また、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７は乳房癌及び前立腺癌をはじめとする様々な癌において頻繁に過発現される（Ｓｉｎｇｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２１：  ２９９−３１３；  Ｃｈｅｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２２：  ２３３−２４１；  Ｂｏｂｉｎａｃ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｃｒｏａｔ  Ｍｅｄ  Ｊ  ４６：  ３８９−３９６）。ＢＭＰ−４はＢＣＣ細胞の増殖を減少させ、グレムリン−１の添加はＢＭＰ−４の抗増殖効果を間接的に減少させることが報告されている（Ｓｎｅｄｄｏｎ  ＪＢ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３：  １４８４２−１４８４７）。このため、ＢＭＰがグレムリン−１と癌細胞との相互作用に影響を及ぼすか否かを調べてみた。
【００６８】
＜５−１＞  酵素免疫分析
まず、グレムリン−１がＢＭＰと結合するか否かを調べるために、下記のようにして酵素免疫分析を行った。具体的に、マイクロタイタープレート（コーニング・コスター社製、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を１００ｎＭのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７（Ｒ＆Ｄシステム社製）でコーティングし、ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）脱脂油でブロッキングした。次いで、各ウェルにグレムリン−１−Ｆｃ（１０ｎＭ）単独及びグレムリン−１−Ｆｃ（１０ｎＭ）と５００ｎＭの本発明による抗体（Ｏ−１３）との組み合わせを添加した。洗浄後に、プレートをＨＲＰの結合されたＩｇＧ−Ｆｃに特異的な抗体（１：５,０００希釈；ピアス・ケミカル社製）とともに培養した。次いで、文献［Ｃｈｕｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １８：  ３６１−３６３］に従い、２,２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸；ＡＢＴＳ）基質溶液（アムレスコ社製、ソロン、オハイオ州）を用いて発色反応(ｃｏｌｏｒｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ)させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。前記結果を図３Ａに示す。図３Ａに示すように、グレムリン−１はＢＭＰ−７を除くＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４と相互作用することが分かり、本発明による抗体（Ｏ−１３）はグレムリン−１とＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４との相互作用にいかなる影響も及ぼさなかった。
【００６９】
＜５−２＞  フローサイトメトリー
Ａ５４９細胞とグレムリン−１を反応させ、ここに１０倍モル過量のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７を加えた後、実施例３の方法と同様にしてフローサイトメトリーを行った。前記結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示すように、ＢＭＰの存在はグレムリン−１のＡ５４９細胞との相互作用に影響を及ぼさなかった。これらの結果は、グレムリン−１にＡ５４９細胞とＢＭＰとの相互作用を媒介する２つの別途のモチーフが存在することを示唆する。
【００７０】
実施例６：グレムリン−１及びこの抗体が癌細胞の分散及び移動に及ぼす効果の分析
＜６−１＞  細胞分散の分析
グレムリン−１処理時における癌細胞の形状を調べるために、Ａ５４９細胞をクリスタルバイオレット染色法により分析した。具体的に、Ａ５４９細胞を２４ウェルプレート（１．０×１０４細胞／ウェル）に塗抹し、１００ｎＭのヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有するグレムリン−１で３日間処理した。培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定させた。細胞を蒸留水中の０．０５％クリスタルバイオレットで３０分間染色した。文献［Ｌｉ  ＸＬ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６４：  １０９７−１１０４］に開示された方法に従い染色溶液を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。ライカＤＦＬ２９０カメラ（ライカマイクロシステムズ社製、ヴェッツラー、ドイツ）を用いてイメージを得、これをライカ・アプリケーション・スイート・ソフトウェア（ライカマイクロシステムズ社製）を用いて分析した。
前記撮影されたイメージを図４Ａに示す。図４Ａに示すように、グレムリン−１で処理されたＡ５４９細胞はその形状が繊維芽細胞とほとんど同様であり、細胞が分散されたことが分かる。
【００７１】
＜６−２＞  Ｅ−カドヘリン発現変化の分析
Ｅ−カドヘリン(E-ｃａｄｈｅｒｉｎ)の下向き調節は上皮間葉移行（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥＭＴ）と関連があり、癌が進行したときにＥ−カドヘリン及び上皮間葉移行（ＥＭＴ）の抑制が共通して観察される（Ｐｅｒｌ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：  １９０−１９３）。このため、免疫ブロット分析法及び免疫蛍光染色によりグレムリン−１処理によるＥ−カドヘリンの発現の変化を調べてみた。
免疫ブロット分析の場合、Ａ５４９細胞（１．０×１０５細胞／ウェル）を６０ｍｍのディッシュの上に塗抹し、５０％コンフルエンシーまで成長させた。前記細胞を１００ｎＭのヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有するグレムリン−１で３日間処理した。前記細胞をプロテアーゼ抑制剤カクテル（シグマアルドリッチ社製、セントルイス、ミズーリ州）を含有する冷たい溶解緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ］に溶解させた後、文献［Ｌｅｅ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  （Ｌａｒｃｈｍｔ）  ２７：  １８−２４］に記載の過程に従いウェスタンブロットを行った。このとき、一次抗体としてＥ−カドヘリン（１：１,０００希釈；アブカム社製）及びβ−アクチン（１：１０,０００希釈；アプライドバイオロジカルマテリアルズ社製、リッチモンド、ブリティッシュコロンビア州）抗体を使用し、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）の結合された抗マウスＩｇＧ（１：１,０００希釈；ピアス・ケミカル社製、ロックフォード、イリノイ州）またはＨＲＰの結合された抗ウサギＩｇＧ（１：１,０００希釈；ピアス・ケミカル社製）を使用した。前記ブロットを増強された化学発光システム（ピアス社製）を用いてメーカーのガイドラインに従い視覚化させた。
【００７２】
前記結果を図４Ｂに示す。図４Ｂに示すように、グレムリン−１で処理されたＡ５４９細胞においてＥ−カドヘリン(E-ｃａｄｈｅｒｉｎ)の発現が大幅に減少した。
また、免疫蛍光染色の場合、Ａ５４９細胞（１．０×１０５細胞／ウェル）をポリＬ−リシン（１００μｇ／ｍｌ、シグマ社製）によりコーティングされたガラスカバースリットの上に塗抹し、５０％コンフルエンシーまで成長させた。細胞を１００ｎＭのヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有するグレムリン−１で３日間処理し、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで常温下で３０分間固定させた。固定された細胞をＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ−１００（ツイーン添加リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ））で常温下で１０分間透過させた後、ＰＢＳＴ中の１％ゼラチンで常温下でブロッキングした。Ｅ−カドヘリン抗体（アブカム社製）後にアレクサ(Alexa)４８８の結合された二次抗体（インビトロジェン社製）を用いて免疫蛍光染色を行った。核は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ ＤＡＰＩ）（rhodamine-phalloidin １：１,０００希釈；インビトロジェン社製）で染色し、アクチンフィラメントはローダミン・ファロイジン（１：１,０００希釈；インビトロジェン社製）を用いて染色した。カバースリットを退色防止剤(anti-fading agent)を有する水溶性マウンティング培地(aqueous moutingmedium)を用いてガラススリットの上に載せた。次いで、ＬＳＭ ５ ＰＡＳＣＡＬレーザースキャニング顕微鏡（カール・ツァイス社製、ドイツ）を用いてイメージを得、これをＬＳＭ ５ ＰＡＳＣＡＬソフトウェアを用いて分析した。
前記結果を図４Ｃに示す。図４Ｃに示すように、グレムリン−１で処理されたＡ５４９細胞においてＥ−カドヘリン(E-ｃａｄｈｅｒｉｎ)の発現が大幅に減少された。
【００７３】
＜６−３＞  細胞移動の分析
細胞の移動有無を確認するために、下記のようにして細胞移動分析を行った。具体的に、細胞を１ウェル当たりに１．０×１０５細胞の密度で２４ウェルプレートに塗抹した。ピペットチップでスクラッチして傷を付けた。脱着された細胞を除去するために培地で洗浄した後、前記培養物に１００ｎＭのヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有するグレムリン−１を２４時間添加した。直後に、且つ、２４時間後にライカＤＦＬ２９０カメラ（ライカマイクロシステムズ社製）を用いてイメージを分析した。スクラッチにより形成された面積を通じて細胞が移動した距離を２４時間目に傷付幅を測定し、開始時点の傷付幅からこれを差し引くことにより決定した。次いで、前記得られた値を従来の技術に従い未処理の細胞の移動距離を１００％に設定して％移動で表した。
本発明による抗体（Ｏ−１３）の中和効能を決定するために、傷付いた細胞をヒスチジンヘキサマータグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有するグレムリン−１単独または１０μＭの本発明による抗体（Ｏ−１３）（または、１０μＭの対照群抗体）とともに２４時間培養した。上述したようにして距離を決定した。
同じプロトコールを用いて、Mockの形質感染されたＡ５４９細胞及びグレムリン−１で形質感染されたＡ５４９細胞を塗抹し、傷を付けた。 Mock-Ａ５４９細胞はいかなる処理なしに培養したのに対し、グレムリン−１−Ａ５４９細胞は１０μＭの本発明による抗体（Ｏ−１３）または対照群抗体の存在下で２４時間培養した。上述したようにして距離を決定した。結果は、３回の独立した実験の代表値である。
前記測定結果を図４Ｄに示す。図４Ｄに示すように、グレムリン−１で処理した場合、Ａ５４９細胞の移動が大幅に増大され、これは、中和抗体を添加したときに完全に消失した。
これらの結果は、グレムリン−１が癌細胞の分散及び移動を誘導し、これをグレムリン−１抗体を用いて抑制することができるということを示す。
【００７４】
実施例７：グレムリン−１で形質感染されたＡ６５４９細胞の特性の究明
＜７−１＞  グレムリン−１ｍＲＮＡ及びタンパク質発現量の測定
実施例＜１−２＞において製造された「グレムリン−１−Ａ５４９」細胞株及び「 ｍｏｃｋ-Ａ５４９」細胞株に対して、グレムリン−１転写体及びタンパク質の数値変化を上述した逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及びウェスタンブロットによって確認した。
前記実験結果を図５Ａに示す。図５Ａに示すように、 ｍｏｃｋ-Ａ５４９細胞株においてはグレムリン−１ｍＲＮＡ及びタンパク質が発現されなかったのに対し、グレムリン−１−Ａ５４９細胞株においてはその数値が急増した。
【００７５】
＜７−２＞  Ｅ−カドヘリン発現量の測定
また、下記のように免疫ブロット分析方法に従い、Ｅ−カドヘリンの発現量を測定した。具体的に、グレムリン−１−Ａ５４９細胞及びMock-Ａ５４９細胞（１．０×１０５細胞／ウェル）を６０ｍｍディッシュの上に塗抹して５０％コンフルエンシーまで成長させた。Mock-Ａ５４９細胞を処理なしに培養し、グレムリン−１−Ａ５４９細胞を１０μＭの本発明による抗体（Ｏ−１３）または対照群抗体（パリビズマブ(Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ)、シナジス、アボット・ラボラトリーズ製、アボットパーク、イリノイ州）の存在下で２４時間培養した。細胞を溶解させ、実施例６に記載の免疫ブロット分析方法に従い分析した。
前記結果を図５Ｂに示す。図５Ｂに示すように、Ｅ−カドヘリン発現はMock-Ａ５４９細胞と比較してグレムリン−１−Ａ５４９細胞において減少し、中和抗体を添加した場合に僅かに増加した。
【００７６】
＜７−３＞  細胞浸潤の分析
細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）によりコーティングされた内側チャンバー（ケミコン社製、テメキュラ、カリフォルニア州）を用いてメーカーのガイドラインに従い細胞浸潤分析を行った。Mock-Ａ５４９細胞及びグレムリン−１−Ａ５４９細胞（３．０×１０５細胞／ウェル）を３００μＬの無血清培地に懸濁させた。プレートの底面ウェルに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する完全培地（５００μＬ）を添加した。細胞を４８時間培養した。非移動細胞を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。膜をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定させ、クリスタルバイオレット染色溶液（ケミコン社製）で染色した。ライカＤＦＬ２９０カメラ（ライカマイクロシステムズ社製）を用いてイメージを得、これをライカ・アプリケーション・スイート・ソフトウェアを用いて分析した。移動された細胞を１ウェル当たりに４個の別途のフィールドにおいて計数した。次いで、得られた値をMock-Ａ５４９細胞の細胞数を１００％に設定して％浸潤で表した。
前記結果を図５Ｃに示す。図５Ｃに示すように、Mock-Ａ５４９細胞と比較してグレムリン−１−Ａ５４９が遥かに多量移動した。
【００７７】
＜７−４＞  細胞移動の分析
実施例６に記載の方法に従い細胞移動分析を行った。Mock-Ａ５４９細胞及びグレムリン−１−Ａ５４９細胞を塗抹し、傷を付けた。Mock-Ａ５４９細胞は何の処理なしに培養し、グレムリン−１−Ａ５４９細胞は１０μＭの本発明による抗体（Ｏ−１３）または対照群抗体の存在下で２４時間培養した。次いで、上述したようにして距離を決定した。
前記測定結果を図５Ｄに示す。前記図５Ｄに示すように、グレムリン−１−Ａ５４９細胞はMock-Ａ５４９細胞と比較して増加された移動を示し、このような増加された移動は本発明による抗体（Ｏ−１３）を添加したときに大幅に抑制された。
【００７８】
＜７−５＞  細胞増殖の分析
グレムリン−１が細胞成長に影響を及ぼすか否かを確認するために、細胞増殖の分析を行った。前記分析は、セルタイター９６アクオス・ワン・ソリューション・セル・プロリフェレーション・アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）（プロメガ社製、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ−１６４０培地において９６ウェルプレートで行った。具体的に、Mock-Ａ５４９細胞及びグレムリン−１−Ａ５４９細胞を１ウェル当たりに１,０００の細胞密度で塗抹した。２４時間後に細胞を無血清培地で２回洗浄し、３μＭの本発明による抗体（Ｏ−１３）が含有するかあるいは含有していない完全培地１００μＬで培養した。細胞増殖を４９２ｎｍのフィルターを有する９６ウェルプレートに対してラブシステムズ・マルチスカン・アセント・フォトメトリック・プレート・リーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（サーモ・ラブシステムズ社製、フランクリン、マサチューセッツ州）を用いて決定した。実験は３回繰り返し行った。
前記測定結果を図５Ｅに示す。前記図５Ｅに示すように、グレムリン−１−Ａ５４９細胞はMock-Ａ５４９細胞と比較してさらに高い成長速度を示し、前記増大された成長速度は本発明による抗体（Ｏ−１３）の添加によって抑制された。
【００７９】
＜７−６＞  腫瘍成長の分析
腫瘍形成に対するグレムリン−１の効果を評価するために、下記のようにしてグレムリン−１−Ａ５４９細胞またはMock-Ａ５４９細胞をヌードマウス内に皮下注射した後、腫瘍体積を測定した。
全ての動物実験は実験動物資源ソウル大学協会及び使用委員会（Ｐｅｒｍｉｔ ｎｕｍｂｅｒ：ＳＮＵ−１１−０２０７）の承認を受けた。グレムリン−１−Ａ５４９細胞及びMock-Ａ５４９細胞（１．０×１０６細胞／マウス）を４〜６週齢の雌無胸腺ヌードマウス（各処理群当たりに７匹）の右側わき腹に皮下注射した。腫瘍の形成及び大きさを腫瘍の長さ及び幅をノギスで測定して毎週評価した後、下記式を用いて腫瘍の体積を計算した（Ｔｏｍａｙｋｏ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２４：  １４８−１５４）：
腫瘍の体積＝（長さ×幅×高さ）／２
前記測定結果を図５Ｆに示す。グレムリン−１−Ａ５４９細胞を注射したマウスにおける腫瘍の体積は、 Mock-Ａ５４９細胞を注射したマウスよりも急増し、注射してから１４週目に略５００ｍｍ３の腫瘍サイズ差を示す。この結果は、グレムリン−１の発現増加が腫瘍の形成に重要な役割を果たすということを示す。
【００８０】
実施例８：グレムリン−１抗体を用いた癌の診断
免疫組織化学染色法を用いて正常組織及び癌組織（皮膚、乳房、リンパ節、肺、肝、食道、胃、結腸、直腸、腎臓、膀胱、前立腺、睾丸、子宮頸、子宮内膜及び甲状腺癌組織）を本発明による抗体（Ｏ−１３）と反応させてグレムリン−１の発現量を比較した。
具体的に、本発明による抗体（Ｏ−１３）（２ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌをＦＩＴＣ試薬と混合してメーカーのガイドラインに従い抗体をＦＩＴＣでラベリングした（Ｐｉｅｒｃｅ  ＦＩＴＣ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ，  ５３０２７）。正常組織及び癌組織を固定させた組織配列スライド（Ｔｉｓｓｕｅ ａｒｒａｙ ｓｌｉｄｅ；スーパーバイオチップ社製、ＢＣ８）に対してメーカーのガイドラインに従いパラフィン除去作業を行った。前記スライドを抗原賦活液（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｏｌｉｔｉｏｎ； ＴＥｐＨ９．０）入りガラスジャー(ｇｌａｓｓ  ｊａｒ)に入れた後、プレッシャークッカー(ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｏｏｋｅｒ)で３０分間加熱した。スライドを取り出して６０〜６５℃に冷却させ、蒸留水で洗浄し、冷たい９５％エタノールに１０分間浸漬した後、流水で１０分間洗浄した。次いで、メーカーのガイドラインに従い、サーモ・ウルトラビ 液ジョン・ＬＰ・デテクション・システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｒａ−ｖｉｓｉｏｎ ＬＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（サーモ社製）を用いて組織スライドに前記ＦＩＴＣによりラベリングされた抗体を反応させた。前記抗体は１：７５で使用し、抗ＦＩＴＣマウスＩｇＧ（ライフスパン(ＬＳ)・バイオサイエンス社製）は１：２００で使用した。次いで、ＨＲＰの結合された重合体（ラブビジョン社製）を１５分間処理した後、ＤＡＢ溶液を１分間処理した。マイヤ−ヘマトキシリン液(Ｍａｙｅｒ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ)で反対染色した後、顕微鏡で４倍率、２００倍率及び４００倍率の順に観察した。前記実験を行うに当たって、ＩｇＧｋａｐｐａ抗体を対照群として使用した。
【００８１】
前記実験結果を図６Ａ〜６Ｉに示す。前記図６に示すように、本発明による抗体は、正常組織と比較して皮膚、乳房、リンパ節、肺、肝、食道、胃、結腸、直腸、腎臓、膀胱、前立腺、睾丸、子宮頸、子宮内膜及び甲状腺癌組織において強い反応性を示す。これは、様々な癌組織においてグレムリン−１が分布されており、過発現されることを示す。したがって、本発明によるグレムリン−１に対する抗体を用いて癌または免疫疾患を診断することが可能になる見込みである。
【図１】
0006339063.tif 000002
【図２】
0006339063.tif 000003
【図３】
0006339063.tif 000004
【図４】
0006339063.tif 000005
【図５】
0006339063.tif 000006
【図６Ａ】
0006339063.tif 000007
【図６Ｂ】
0006339063.tif 000008
【図６Ｃ】
0006339063.tif 000009
【図６Ｄ】
0006339063.tif 000010
【図６Ｅ】
0006339063.tif 000011
【図６Ｆ】
0006339063.tif 000012
【図６Ｇ】
0006339063.tif 000013
【図６Ｈ】
0006339063.tif 000014
【図６Ｉ】
0006339063.tif 000015
【配列表】
0006339063000001.app