(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超高圧液体クロマトグラフィー・質量分析装置によりＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を検査することを含む、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する方法であって、該クロマトグラフィーの条件は、以下：
クロマトグラフィーカラム：アジレントＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．８μｍ（「ＺＯＲＢＡＸ」はアジレント社の登録商標である）；
移動相：移動相Ａは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液、移動相Ｂは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸アセトニトリル溶液であり；
以下の溶出プログラムに従う勾配溶出の使用、該移動相の割合は、全て体積パーセンテージである：
０−０．５分、移動相Ａを９５％、移動相Ｂを５％；
０．５−１０分、移動相Ａを９５％−７５％へ、移動相Ｂを５％−２５％へ；
１０−１５分、移動相Ａを７５％−４５％へ、移動相Ｂを２５％−５５％へ；
１５−１８分、移動相Ａを４５％−０％へ、移動相Ｂを５５％−１００％へ；
１８−２０分、移動相Ａを０％、移動相Ｂを１００％；
を含み、
該クロマトグラフィーの条件は、以下：
流速：０．３５ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
注入量：５μｌ
も含み、さらに、
前記Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像は、１８の特徴ピークを含み、特徴ピークそれぞれの保持時間は、
ピーク１：７．１分、ピーク２：７．５分、ピーク３：８．１分、ピーク４：８．６分、ピーク５：９．２分、ピーク６：９．９分、ピーク７：１０．９分、ピーク８：１１．３分、ピーク９：１１．７分、ピーク１０：１２．７分、ピーク１１：１３．４分、ピーク１２：１３．７分、ピーク１３：１４．４分、ピーク１４：１４．８分、ピーク１５：１５．１分、ピーク１６：１５．５分、ピーク１７：１５．９分、ピーク１８：１６．３分であり、さらに、
前記Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像において、ピーク２およびピーク１２はそれぞれ、カリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶである、方法。
【請求項２】
前記質量分析の条件は、以下：
イオン源は、ＥＳＩ源であり、検出は、ネガティブイオンモードで操作する；
噴霧されたガス圧：３５ｐｓｉｇ；
乾燥ガス温度：３５０℃；
乾燥ガス流速：１０Ｌ／分；
キャピラリー電圧：３，５００Ｖ；
キャピラリー出口の電圧：１３５Ｖ；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、さらに、以下の工程による対照溶液の調製を含む、請求項１または２に記載の方法：適正量のカリコシングルコシドまたはアストラガロシドＩＶの重量を正確に測定する工程、およびメタノールを加えて、１ｍｌあたりカリコシングルコシドを０．００４ｍｇまたは１ｍｌあたりアストラガロシドＩＶを０．００６ｍｇ含有する溶液をそれぞれ調製する工程。
【請求項４】
前記方法は、さらに、以下の工程による検査試料溶液の調製を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法：Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を０．２２μｍ精密濾過膜で濾過する工程。
【請求項５】
超高圧液体クロマトグラフィー・質量分析装置によりＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を検査することを含む、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する方法であって、以下の工程：
（１）対照溶液の調製：適正量のカリコシングルコシドまたはアストラガロシドＩＶの重量を正確に測定する工程、および次いでメタノールを加えて、１ｍｌあたりカリコシングルコシドを０．００４ｍｇまたは１ｍｌあたりアストラガロシドＩＶを０．００６ｍｇ含有する溶液をそれぞれ調製する工程；
（２）検査試料溶液の調製：Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を０．２２μｍ精密濾過膜で濾過する工程；
（３）測定：該対照溶液または該検査試料溶液を、それぞれ、正確に５μｌ吸引する工程、および次いで該溶液を超高圧液体クロマトグラフィー・質量分析装置に注入し、以下の条件に従って測定を行って該Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の該指紋的固有組成像を得る工程：
を含み、
該クロマトグラフィーの条件は、以下：
クロマトグラフィーカラム：アジレントＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．８μｍ（「ＺＯＲＢＡＸ」はアジレント社の登録商標である）；
移動相：移動相Ａは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液、移動相Ｂは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸アセトニトリル溶液であり；
以下の溶出プログラムに従う勾配溶出の使用、該移動相の割合は、全て体積パーセンテージである：
０−０．５分、移動相Ａを９５％、移動相Ｂを５％；
０．５−１０分、移動相Ａを９５％−７５％へ、移動相Ｂを５％−２５％へ；
１０−１５分、移動相Ａを７５％−４５％へ、移動相Ｂを２５％−５５％へ；
１５−１８分、移動相Ａを４５％−０％へ、移動相Ｂを５５％−１００％へ；
１８−２０分、移動相Ａを０％、移動相Ｂを１００％；
を含み、
該クロマトグラフィーの条件は、以下：
流速：０．３５ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
も含み；
前記Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像は、１８の特徴ピークを含み、特徴ピークそれぞれの保持時間は、
ピーク１：７．１分、ピーク２：７．５分、ピーク３：８．１分、ピーク４：８．６分、ピーク５：９．２分、ピーク６：９．９分、ピーク７：１０．９分、ピーク８：１１．３分、ピーク９：１１．７分、ピーク１０：１２．７分、ピーク１１：１３．４分、ピーク１２：１３．７分、ピーク１３：１４．４分、ピーク１４：１４．８分、ピーク１５：１５．１分、ピーク１６：１５．５分、ピーク１７：１５．９分、ピーク１８：１６．３分であり、さらに、
前記Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像において、ピーク２およびピーク１２はそれぞれ、カリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶである、方法。
【請求項６】
前記質量分析の条件は、以下：
イオン源は、ＥＳＩ源であり、検出は、ネガティブイオンモードで操作する；
噴霧されたガス圧：３５ｐｓｉｇ；
乾燥ガス温度：３５０℃；
乾燥ガス流速：１０Ｌ／分；
キャピラリー電圧：３，５００Ｖ；
キャピラリー出口の電圧：１３５Ｖ；
を含む、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、さらに以下を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法：複数のＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を比較して、共通する特徴ピークを選出し、該Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像を得る工程。
【請求項８】
前記Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像または前記Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像は、対照のアストラガロシドＩＶを参照ピークとして用いて換算すると、特徴ピークそれぞれの相対保持時間が以下のとおりになる、請求項７に記載の方法：
ピーク１：０．５２、ピーク２：０．５４、ピーク３：０．５９、ピーク４：０．６２、ピーク５：０．６６、ピーク６：０．７２、ピーク７：０．７９、ピーク８：０．８２、ピーク９：０．８５、ピーク１０：０．９２、ピーク１１：０．９７、ピーク１２：１．００、ピーク１３：１．０４、ピーク１４：１．０７、ピーク１５：１．１０、ピーク１６：１．１３、ピーク１７：１．１６、ピーク１８：１．１９。
【請求項９】
前記カリコシングルコシドのピークおよび該アストラガロシドＩＶピークの面積対該当する参照ピークの面積の比は、０．５〜１．５である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法に従って確立された前記試験試料の前記Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像または前記Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像を、前記方法に従って確立された前記標準のＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像または前記Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像と比較することを含む、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物検査の分野に属し、詳細にはＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
漢方生薬の品質管理は、漢方医学の現代化の発展を妨げる重大な問題点の１つである。漢方医学の基本理論は、漢方薬の総合的な作用を重視しており、効力における相乗効果に重要性を置いている。漢方薬に含まれる１種または２種の有効成分を定性的および定量的指標として採用しても、漢方薬の品質を効果的に管理および査定するにはほど遠く、まして漢方薬の安全性および有効性を反映させることはほとんどできない。漢方生薬は、疾患治療に用いられる２種以上の漢方薬草を組み合わせた生薬製剤であり、その品質管理は単独の漢方薬草よりも困難である。近年、漢方薬を指紋のように特定する組成像および特徴的な指紋的固有組成像が品質管理に広く用いられている。この漢方薬の特徴的な指紋的固有組成像とは、漢方薬の指紋的固有組成像から特異性が良好な複数のクロマトグラフィーのピークまたは特異性が良好なクロマトグラフィーのピークの組み合わせを選択することにより作られた特徴的な指紋的固有組成像を示す。この特徴的な指紋的固有組成像を用いて、固有ピークの有無および変化を観察することにより、漢方薬の品質を観測することができる。中国薬局方２０１０年版では、すでに特徴的な指紋的固有組成像が様々な漢方薬の生薬成分の品質管理に広く適用されている。
【０００３】
超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）技法は、クロマトグラフィー技法の画期的な進歩である。ＵＨＰＬＣは、超高速、超高感度、および超高分解能という利点を有し、使用するクロマトグラフィーカラム充填技術はより小さくなりながら、検出性能はより速くより高感度になる。ＵＨＰＬＣは、諸外国において、残留農薬および薬物代謝について広く利用されており、中国でもその利用が普及しつつある。
【０００４】
クロマトグラフィー・質量分析技術は、ここ数年で急速に発達した先進の分析技法である。この技法では、ガスクロマトグラフィー・質量分析（ＧＣ−ＭＳ）技術が広範に利用されてきたが、その後、液体クロマトグラフィー・質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法が別の技法として徐々に認識され利用されるようになっている。しかし、ＬＣ−ＭＳは高価な装置のため、まだ広くは利用されていない。液体クロマトグラフィー・質量分析装置に適合したイオン化技術は、紫外線を吸収しないある物質（サポニン類など）の検出にまつわる問題を解決できるだけでなく、イオン化成分の正確な分子量を得ることも可能にし、これにより、その成分の同定および確認ならびに構造についてデータの裏付けを与える。
【０００５】
Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液は、点滴用漢方薬で、気に有効に作用して抵抗力を高める効果があり、肺・脾臓の不全により引き起こされる倦怠感、しゃべりたくないほどの息切れ、突発性発汗、および回転性めまいの治療に用いられるとともに、これらの症状を示す肺癌患者および胃癌患者用の補助療法としても用いられる。Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液は、中国漢方薬保護品種（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の１種であり、その保護品種番号は、ＺＹＢ２０７２００４０７３である。Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液についての品質基準のうち、高速液体クロマトグラフィー・紫外線検出器を用いた検出を述べている「指紋的固有組成像」の項目には、いくつかの制限がある。例えば、主成分のサポニンは紫外線を吸収しない。サポニン成分は、高速液体クロマトグラフィー・蒸発光散乱検出器を用いて観測することができるが、試料を用意するための前処理は手間がかかり、しかも分析は長時間を要する。このため、主成分を包括的および迅速に観測することができず、改善が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする技術課題は、先行技術分野の欠点の改善であり、本発明の目的は、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する方法を提供することである。本発明に記載される方法により確立された指紋的固有組成像を、指紋的固有組成像基準として用いてＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の同定に応用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の技術的解決策を用いることで、上記課題を達成する：
Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する方法、この方法は、超高圧液体クロマトグラフィー・質量分析装置、例えば、超高速液体クロマトグラフィー・四重極飛行時間型質量分析装置によりＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を検査する工程を含み、この方法において、クロマトグラフィー条件は以下を含む：
クロマトグラフィーカラム：アジレントＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．８μｍ；
移動相：移動相Ａは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液、移動相Ｂは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸アセトニトリル溶液；
以下の溶出プログラムに従う勾配溶出を使用（移動相の割合は、全て体積パーセンテージである）：
０−０．５分、移動相Ａを９５％、移動相Ｂを５％；
０．５−１０分、移動相Ａを９５％−７５％へ、移動相Ｂを５％−２５％へ；
１０−１５分、移動相Ａを７５％−４５％へ、移動相Ｂを２５％−５５％へ；
１５−１８分、移動相Ａを４５％−０％へ、移動相Ｂを５５％−１００％へ；
１８−２０分、移動相Ａを０％、移動相Ｂを１００％。
【０００８】
好ましくは、クロマトグラフィー条件は、以下をさらに含む：
流速：０．３５ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
注入量：５μｌ。
【０００９】
好ましくは、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する上記方法において、質量分析条件は以下を含む：
イオン源は、ＥＳＩ源であり、検出は、ネガティブイオンモードで操作する；
噴霧されたガス圧：３５ｐｓｉｇ；
乾燥ガス温度：３５０℃；
乾燥ガス流速：１０Ｌ／分；
キャピラリー電圧：３，５００Ｖ；
キャピラリー出口の電圧：１３５Ｖ。
【００１０】
好ましくは、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する上記方法は、以下の工程による対照溶液の調製をさらに含む：
適正量のカリコシングルコシドまたはアストラガロシドＩＶの重量を正確に測定する工程、および次いでメタノールを加えて、１ｍｌあたりカリコシングルコシドを０．００４ｍｇまたは１ｍｌあたりアストラガロシドＩＶを０．００６ｍｇ含有する溶液をそれぞれ調製する工程。
【００１１】
好ましくは、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する上記方法は、以下の工程による検査試料溶液の調製をさらに含む：Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を０．２２μｍ精密濾過膜で濾過する工程。
【００１２】
好ましくは、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する上記方法は、以下の工程を含む：
（１）対照溶液の調製：適正量のカリコシングルコシドまたはアストラガロシドＩＶの重量を正確に測定する工程、および次いでメタノールを加えて、１ｍｌあたりカリコシングルコシドを０．００４ｍｇまたは１ｍｌあたりアストラガロシドＩＶを０．００６ｍｇ含有する溶液をそれぞれ調製する工程；
（２）検査試料溶液の調製：Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を０．２２μｍ精密濾過膜で濾過する工程；
（３）測定：対照溶液または検査試料溶液を、それぞれ、正確に５μｌ吸引する工程、および次いで溶液を超高圧液体クロマトグラフィー・質量分析装置、例えば、超高速液体クロマトグラフィー・四重極飛行時間型質量分析装置に注入し、以下の条件に従って測定を行ってＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を得る工程：
この方法において、クロマトグラフィー条件は以下を含む：
クロマトグラフィーカラム：アジレントＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．８μｍ；
移動相：移動相Ａは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液、移動相Ｂは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸アセトニトリル溶液；
以下の溶出プログラムに従う勾配溶出を用いる（移動相の割合は、全て体積パーセンテージである）：
０−０．５分、移動相Ａを９５％、移動相Ｂを５％；
０．５−１０分、移動相Ａを９５％−７５％へ、移動相Ｂを５％−２５％へ；
１０−１５分、移動相Ａを７５％−４５％へ、移動相Ｂを２５％−５５％へ；
１５−１８分、移動相Ａを４５％−０％へ、移動相Ｂを５５％−１００％へ；
１８−２０分、移動相Ａを０％、移動相Ｂを１００％。
【００１３】
好ましくは、クロマトグラフィー条件は、以下をさらに含み：
流速：０．３５ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
好ましくは、質量分析条件は以下を含む：
イオン源は、ＥＳＩ源であり、検出は、ネガティブイオンモードで操作する；
噴霧されたガス圧：３５ｐｓｉｇ；
乾燥ガス温度：３５０℃；
乾燥ガス流速：１０Ｌ／分；
キャピラリー電圧：３，５００Ｖ；
キャピラリー出口の電圧：１３５Ｖ。
【００１４】
好ましくは、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する上記方法は、以下をさらに含む：
複数のＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を比較して、共通する特徴的なピークを選出し、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像を得る工程。
【００１５】
好ましくは、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する上記方法において、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像またはＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像は、１８の特徴ピークを含み、特徴ピークそれぞれの保持時間は以下のとおりである：
ピーク１：７．１分、ピーク２：７．５分、ピーク３：８．１分、ピーク４：８．６分、ピーク５：９．２分、ピーク６：９．９分、ピーク７：１０．９分、ピーク８：１１．３分、ピーク９：１１．７分、ピーク１０：１２．７分、ピーク１１：１３．４分、ピーク１２：１３．７分、ピーク１３：１４．４分、ピーク１４：１４．８分、ピーク１５：１５．１分、ピーク１６：１５．５分、ピーク１７：１５．９分、ピーク１８：１６．３分。
【００１６】
好ましくは、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する上記方法において、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像またはＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像は、対照のアストラガロシドＩＶを参照ピークとして用いて換算すると、特徴ピークそれぞれの相対保持時間が以下のとおりになる：
ピーク１：０．５２、ピーク２：０．５４、ピーク３：０．５９、ピーク４：０．６２、ピーク５：０．６６、ピーク６：０．７２、ピーク７：０．７９、ピーク８：０．８２、ピーク９：０．８５、ピーク１０：０．９２、ピーク１１：０．９７、ピーク１２：１．００、ピーク１３：１．０４、ピーク１４：１．０７、ピーク１５：１．１０、ピーク１６：１．１３、ピーク１７：１．１６、ピーク１８：１．１９。
【００１７】
好ましくは、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像またはＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像において、ピーク２およびピーク１２はそれぞれ、カリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶであり；好ましくは、カリコシングルコシドピークおよびアストラガロシドＩＶピークの面積対相当する参照ピークの面積の比は、０．５〜１．５である。
【００１８】
本発明は、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を同定する方法も提供し、本方法は上記方法に従って確立された試験試料の指紋的固有組成像または特徴的な指紋的固有組成像を、上記方法に従って確立された標準の指紋的固有組成像または特徴的な指紋的固有組成像と比較することで、本物であることを確認する工程を含む。
【００１９】
好適な実施形態において、本発明は、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する方法を提供し、本方法は、以下の工程を含む：
カリコシングルコシドを濃度０．００４ｍｇ／ｍｌで、およびアストラガロシドＩＶを濃度０．００６ｍｇ／ｍｌで含有する、カリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶの混合対照溶液を調製する工程；
Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の濾液を試験溶液として用意する工程；
上記の対照溶液および検査試料溶液を、超高速液体クロマトグラフィー・四重極飛行時間型質量分析装置により分析する工程、この工程においてクロマトグラフィー条件は以下を含む：
クロマトグラフィーカラム：アジレントＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．８μｍ；
移動相：移動相Ａは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液、移動相Ｂは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸アセトニトリル溶液；
勾配溶出；
流速：０．３５ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
注入量：５μｌ；
Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液について超高速液体クロマトグラフィー・四重極飛行時間型質量分析による指紋的固有組成像（全イオンクロマトグラム特性）が得られる；
勾配溶出の工程は以下を含む：０−０．５分、移動相のアセトニトリル：水を５：９５とする；０．５−１０分、移動相のアセトニトリル：水を５：９５から２５：７５へ徐々に変更する；１０−１５分、移動相のアセトニトリル：水を２５：７５から５５：４５へ徐々に変更する；１５−１８分、移動相のアセトニトリル：水を５５：４５から１００：０へ徐々に変更する；１８−２０分、移動相のアセトニトリル：水を１００：０とする。
【００２０】
Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像は、指紋的固有組成像（全イオンのクロマトグラム図）および指紋的固有組成像（全イオンのクロマトグラム図）から抽出された特徴的な指紋的固有組成像（抽出されたイオンのクロマトグラム図）に従って決定され、これによりＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の品質を観測する。
【００２１】
勾配溶出の工程を表１にも示す：
【００２２】
【表１】
0006266637.tif 000002
【００２３】
本発明の方法に従って、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の１００のバッチについての全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を分析比較して、共通する特徴ピークを選び出し、それらピークのイオン質量数を用いて、選出されたイオンのクロマトグラム（ＥＩＣ）を得、続いて共通する特徴ピークそれぞれの保持時間（Ｒｔ）を付記して、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像を得る。
【００２４】
共通する特徴ピークは１８存在し、それらの保持時間（Ｒｔ）および質量数は以下のとおりである：それぞれ、７．１分（４７１．２０８３）、７．５分（４９１．１１９５）、８．１分（４４１．１９１９）、８．６分（３０９．１５５５）、９．２分（１８７．０９７６）、９．９分（４４１．１７６６）、１０．９分（５９３．１８７６）、１１．３分（５０７．１５０８）、１１．７分（４６３．１６１０）、１２．７分（９９１．５１１９）、１３．４分（９９１．５１１９）、１３．７分（８２９．４５９１）、１４．４分（８７１．４６９７）、１４．８分（８７１．４６９７）、１５．１分（８７１．４６９７）、１５．５分（９１３．４６５０）、１５．９分（９１３．４６５０）、１６．３分（９１３．４６５０）、これらのピークのうち、Ｒｔが７．５分および１３．７分のクロマトグラフィーピークは、それぞれ、カリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶと確認されている；ピークＳは、アストラガロシドＩＶ参照ピークに該当するピークである；特徴ピークそれぞれの相対保持時間は計算によるものであるが、計算された保持時間の変動は、指定値の±５％以内でなければならず、指定値とは順番に、０．５２、０．５４、０．５９、０．６２、０．６６、０．７２、０．７９、０．８２、０．８５、０．９２、０．９７、１．００、１．０４、１．０７、１．１０、１．１３、１．１６、１．１９である；カリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶのピーク面積対それらに該当する参照ピーク面積の比は、０．５〜１．５以内でなければならない。
【００２５】
本発明の方法により確立された特徴的な指紋的固有組成像を、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の同定に用いることができる。
【発明の効果】
【００２６】
先行技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する：
Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液用の品質基準において、「指紋的固有組成像」の項目には、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像が高速液体クロマトグラフィー・ＵＶ検出により決定されると記述があるが、高速液体クロマトグラフィー・ＵＶ検出は品質を観測するという目的をある程度は達成するものの、主成分のサポニン類が実質的に紫外線を吸収しない；「成分決定」の項目には、全サポニン類含量がバニリン氷酢酸を用いたＵＶ分光光度測定により測定され、アストラガロシドＩＶ含量が高速液体クロマトグラフィー・蒸発光散乱検出器により測定されると記述があるが、これでは依然として各サポニン成分の含量を完全には反映できない。企業の内部管理において、高速液体クロマトグラフィー・蒸発光散乱検出器をさらに使用して、サポニン成分を観測することにより、指紋的固有組成像を決定することができるが、試料の前処理が追加で必要になり、分析も長時間を要すると思われる。
【００２７】
したがって、本発明の方法に従って超高速液体クロマトグラフィー・四重極飛行時間型質量分析により確立されたＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像についての技術標準は、特徴的な指紋的固有組成像の共通ピークの有無および特徴に基づいて、より簡単に薬物品質を包括的、迅速、かつ効果的に観測できるようにし、その結果、確実に一定、均一、および制御可能な品質を得ることができる。本発明は、その方法の先進性ならびにより良好な安定性および再現性という特長を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明により提供される、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示し、図中の矢印は、左から右へそれぞれ、特徴ピーク１〜１８を示す；
【図２】図２は、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の選出されたイオンのクロマトグラム（ＥＩＣ）を示し、図中の矢印は、左から右へそれぞれ、特徴ピーク１〜１８を示す；
【図３】図３は、対照混合物の選出されたイオンのクロマトグラム（ＥＩＣ）を示し、図中のピーク２およびピーク１２は順に、カリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶを表す。
【図４】図４は、本発明によるＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像と偽造品との比較を示すグラフであり、グラフ中、「１」はＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の認定品、「２」は偽造品（Ｄａｎｓｈｅｎ注射液と推定）、および「３」はＤａｎｓｈｅｎ注射液の溶液を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の技術的解決策を、さらに、具体的な実施例と合わせて詳細に説明する。
【実施例１】
【００３０】
１．装置および検査薬物
１．１装置：アジレントＬＣ／ＭＳＤ（１２９０ＵＨＰＬＣ複式勾配ポンプ、内蔵型真空脱気装置、１００ビットオートサンプラ、インテリジェントカラムオーブン、高精度四重極タンデム時間飛行型質量分析装置システム）；クロマトグラフィーカラム：アジレントＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．８μｍ）。
【００３１】
１．２検査薬物：Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液、Ｌｉｖｚｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｍｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆａｃｔｏｒｙから提供されたもの。実験で使用した試薬のアセトニトリルおよびギ酸は、両方ともクロマトグラフィーで調べて純粋であった。また水は超純水であった。
【００３２】
２．方法および結果
２．１検査試料溶液の調製：Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を０．２２μｍ精密濾過膜で濾過した。
【００３３】
２．２混合対照溶液の調製：適正量のカリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶの重量を正確に測定し、次いでメタノールを加えて、１ｍｌあたり、それぞれ、カリコシングルコシドを０．００４ｍｇおよびアストラガロシドＩＶを０．００６ｍｇ含有する溶液を調製した。
【００３４】
２．３クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラムは、アジレントＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１．８μｍであった；移動相は、０．１％ギ酸水溶液（Ａ）および０．１％ギ酸アセトニトリル溶液（Ｂ）であった；カラム温度は、４０℃であった；注入量は５μｌであった；表２に示すとおりの勾配溶出プログラムを用いた：
【００３５】
【表２】
0006266637.tif 000003
【００３６】
２．４質量分析条件：イオン源はＥＳＩ源であり、検出は、ネガティブイオンモードで操作した；噴霧されたガス圧：３５ｐｓｉｇ；乾燥ガス温度：３５０℃；乾燥ガス流速：１０Ｌ／分；Ｖｃａｐキャピラリー電圧：３，５００Ｖ；キャピラリー出口の電圧：１３５Ｖ。
【００３７】
２．５測定方法
対照溶液または検査試料溶液を、それぞれ、５μｌ正確に吸引し、次いで、それぞれ、液体クロマトグラフィー・質量分析装置に注入し、測定を行い、２０分間スペクトルを記録した。
【００３８】
２．６共通する特徴ピークの決定
Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の１００のバッチの全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を比較することで、共通する特徴ピークを選び出した（詳細は図１を参照）；これらの共通する特徴ピークのイオン質量数を用いて、選出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を得た（詳細は図２を参照）（具体的には、データ分析ソフトウェアＭａｓｓｈｕｎｔｅｒに含まれる定量分析ソフトウェアを用いイオン抽出機能を利用して一連の標的イオンを図１から抽出し、そうすることにより図２を得た）；次いで共通する特徴ピークそれぞれの保持時間（Ｒｔ）を付記し、そうすることでＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の特徴的な指紋的固有組成像を得た。共通する特徴ピークは１８存在し、それらの保持時間（Ｒｔ）および質量数は以下のとおりであった：それぞれ、７．１分（４７１．２０８３）、７．５分（４９１．１１９５）、８．１分（４４１．１９１９）、８．６分（３０９．１５５５）、９．２分（１８７．０９７６）、９．９分（４４１．１７６６）、１０．９分（５９３．１８７６）、１１．３分（５０７．１５０８）、１１．７分（４６３．１６１０）、１２．７分（９９１．５１１９）、１３．４分（９９１．５１１９）、１３．７分（８２９．４５９１）、１４．４分（８７１．４６９７）、１４．８分（８７１．４６９７）、１５．１分（８７１．４６９７）、１５．５分（９１３．４６５０）、１５．９分（９１３．４６５０）、１６．３分（９１３．４６５０）、これらのピークのうち、Ｒｔが７．５分および１３．７分のクロマトグラフィーピークは、それぞれ、カリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶと確認された（詳細は図３を参照）；ピークＳは、アストラガロシドＩＶ参照ピークに該当するピークであった、特徴ピークそれぞれの相対保持時間は計算されたものであり、計算された保持時間の変動は、指定値の±５％以内でなければならず、指定値とは、順番に、０．５２、０．５４、０．５９、０．６２、０．６６、０．７２、０．７９、０．８２、０．８５、０．９２、０．９７、１．００、１．０４、１．０７、１．１０、１．１３、１．１６、１．１９であった；カリコシングルコシドおよびアストラガロシドＩＶのピーク面積対それらに該当する参照ピーク面積の比は、０．５〜１．５以内でなければならない。
【００３９】
２．７精度検定：同一のＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液に由来する検査試料溶液を、連続して６回注入し、続いて特徴ピークを抽出して保持時間を付記した。アストラガロシドＩＶのピーク１２をピークＳとし、次いで、他の特徴ピークそれぞれの相対保持時間を計算した。結果から、特徴ピークそれぞれの相対保持時間のＲＳＤは、全て１％未満であり、装置の精度は優れていることがわかった。精度検定の結果を表３に示す：
【００４０】
【表３】
0006266637.tif 000004
【００４１】
２．８安定性検定：同一のＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液に由来する検査試料溶液を、０時間、１時間、２時間、４時間、８時間、および１２時間、それぞれの時点で注入し、続いて特徴ピークを抽出して保持時間を付記した。アストラガロシドＩＶのピーク１２をピークＳとし、次いで、他の特徴ピークそれぞれの相対保持時間を計算した。結果から、特徴ピークそれぞれの相対保持時間のＲＳＤは、全て１％未満であり、検査試料溶液は、放置している間１２時間安定であったことがわかった。安定性検定の結果を表４に示す：
【００４２】
【表４】
0006266637.tif 000005
【００４３】
２．９反復再現性検定：同一バッチの６つのＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を使い、検査試料溶液の調製法に従って調製し、次いで注入し、続いて特徴ピークを抽出して保持時間を付記した。アストラガロシドＩＶのピーク１２をピークＳとし、次いで、他の特徴ピークそれぞれの相対保持時間を計算した。結果から、特徴的なピークそれぞれの相対保持時間のＲＳＤは、全て１％未満であり、この方法の反復再現性が良好であることがわかった。反復再現性検定の結果を表５に示す：
【００４４】
【表５】
0006266637.tif 000006
【００４５】
２．１０室内再現精度：同一バッチ由来のＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を用いて、それぞれ上記の方法に従ってアッセイしたが、ただし、異なる日付であったり異なる分析者であったりと様々な要因下で行った。
【００４６】
２．１０．１異なる分析日：同一バッチ由来のＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を用いて、それぞれ、異なる日付の日に、検査試料溶液の調製法に従って調製し、次いで３つの検査試料溶液を平行して注入し、続いて特徴ピークを抽出して保持時間を付記した。アストラガロシドＩＶのピーク１２をピークＳとし、次いで、他の特徴ピークそれぞれの相対保持時間を計算した。表６に示すとおり、結果から、特徴ピークそれぞれの相対保持時間のＲＳＤは、全て１％未満であることがわかった：
【００４７】
【表６】
0006266637.tif 000007
【００４８】
２．１０．２異なる分析者：同一バッチ由来のＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を用いて、それぞれ、異なる分析者により、検査試料溶液の調製法に従って調製し、３つの検査試料溶液を平行して注入し、続いて特徴ピークを抽出して保持時間を付記した。アストラガロシドＩＶのピーク１２をピークＳとし、次いで、他の特徴ピークそれぞれの相対保持時間を計算した。表７に示すとおり、結果から、特徴ピークそれぞれの相対保持時間のＲＳＤは、全て１％未満であることがわかった：
【００４９】
【表７】
0006266637.tif 000008
【実施例２】
【００５０】
Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の同定
近年、臨床でのＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の使用が増加するにつれて、欲に目がくらんだ犯罪者が、他の品種を用いたＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液偽造品を販売して利益を得ている。偽造品は、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液のブランドに大きなマイナスの影響を及ぼすとともに、正規にＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を製造販売している企業に対して顕著な経済損失をもたらしている。こうしたＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液偽造品は、本物とほとんど同じ外観をしているため、本物と偽物を識別することは難しい。
【００５１】
この実施例では、実施例１に記載した方法を応用して、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液認定品（Ｌｉｖｚｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｍｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆａｃｔｏｒｙが提供）、疑わしい試料、およびＤａｎｓｈｅｎ注射液を検査して、該当する指紋的固有組成像を確立した。結果を図４に示した。疑わしい試料の指紋的固有組成像はＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液認定品のものと完全に異なっていることが見てわかる。偽造品の成分は、質量分析法により得られる正確な分子量を用いて推定した。偽造品の成分は、Ｄａｎｓｈｅｎに由来することが、実質的に確認された。
【００５２】
このように、超高圧液体クロマトグラフィー・質量分析装置（ＵＨＰＬＣ−ＭＳ）により確立されたＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を用いて、迅速かつ正確な様式で、本物のＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液を同定することができ、またこの特性を用いて、偽造品を定性分析してその材料を実質的に確認することができる。ＤａｎＳｈｅｎ注射液を用いたＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液偽造品を犯罪者がどのように作ったとしても、上記の方法に従って、すなわち注射液の指紋的固有組成像をＳｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液認定品のものと比較し、質量分析法により得られる正確な分子量を用いて成分を推定し、偽造品の材料を実質的に推定することにより、偽造品を同定することができる。
【００５３】
したがって、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液のＵＨＰＬＣ−ＭＳによる指紋的固有組成像を利用することで、偽造を防ぐとともに、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の真っ当な製造および良好な流通を保証することができ、それにより企業の正当な権利および利益を保護する。
【００５４】
本発明が提供する、Ｓｈｅｎｑｉ  Ｆｕｚｈｅｎｇ注射液の指紋的固有組成像を確立する方法を、本明細書中ここまで詳細に説明してきた。本発明の原理および実施形態は、本明細書中いくつかの具体的な実施例とともに記載されているものの、上記の実施例は、本発明の方法および中核概念を理解するのを助けることを意図するにすぎない。当然ながら、当業者なら、本発明の原理から逸脱することなく、本発明に多数の改善および修飾を導入することができ、そのような改善および修飾も、添付の請求項により定義される特許請求の範囲内に含まれるはずである。
【図１】
0006266637.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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