(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望ウイルスを含むサンプルを精製する方法であって、前記所望ウイルスがバクテリオファージを含み、前記方法は、（ｉ）負帯電多孔性粒子を含む充填クロマトグラフィーカラムを提供する工程であって、前記負帯電多孔性粒子が陽イオン交換粒子を含む、工程と、（ｉｉ）前記充填クロマトグラフィーカラムを、前記サンプル中の前記所望ウイルスが溶出される条件であって、４〜７の範囲にあるｐＨ及び０．１〜３０ｍＳ／ｃｍの範囲にある電導度値を含む条件に平衡化緩衝液を用いて平衡化する工程と、（ｉｉｉ）添加するサンプルの容量が前記充填クロマトグラフィーカラムのボイド容量以下の容量であるように、前記サンプルを前記充填クロマトグラフィーカラムに接触させる工程と、ならびに（ｉｖ）前記充填クロマトグラフィーカラムから前記所望ウイルスを溶出する工程を含み、前記所望ウイルスは、より精製された状態となりおよび前記充填クロマトグラフィーカラムが平衡化された条件下にある、方法。
【請求項２】
前記サンプルが、未精製、中間レベルの精製度、または高精製のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所望ウイルスが、カラムに添加する前に濃縮されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記所望ウイルスが、前記充填クロマトグラフィーカラムに添加する前に、限外濾過法により濃縮されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスを前記充填クロマトグラフィーカラムに添加する前には前記ウイルスが実質的に負帯電表面または複数の負帯電表面に結合しない条件下で、前記サンプルを前記負帯電表面または複数の負帯電表面に事前にさらす、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記負帯電表面または複数の負帯電表面が、膜、モノリス、繊維もしくは複数の繊維、粒子もしくは複数の粒子、またはその複合構造体を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記充填クロマトグラフィーカラムが負帯電多孔性粒子だけで充填され、および、前記カラムに添加されるサンプルの容量が前記充填クロマトグラフィーカラムの容量の４０％未満の容量である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプル中の前記所望ウイルスが溶出される前記条件が４．５〜６．０の範囲のｐＨを含む条件である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプル中の前記所望ウイルスが溶出される前記条件が０．１〜１５ｍＳ／ｃｍの範囲の電導度値を含む条件である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが、２〜１０の範囲のｐＨを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、ゼロではない電導度から特定の塩または塩の組み合わせの飽和溶液に対応する電導度までの範囲にある電導度値を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
電気陰性が、カルボキシル部分、スルホ部分、またはホスホ部分からなる群より選択される部分により、部分的に前記負帯電多孔性粒子に付与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記充填クロマトグラフィーカラムが、前記負帯電多孔性粒子に加えてさらなる粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記負帯電多孔性粒子と前記さらなる粒子の少なくとも一つ、またはその両者が、陰イオン交換、疎水性相互作用、水素結合、π−π相互作用、および金属キレートからなる群より選択される一又は複数の二次的化学機能性を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルを前記充填クロマトグラフィーカラムと接触させる前記工程の前に、前記サンプルを一又は複数の夾雑物解離剤と接触させる追加的工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記夾雑物解離剤が、塩、非イオン性有機ポリマー、有機溶剤、界面活性剤、およびカオトロープからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記夾雑物解離剤が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールからなる群より選択される非イオン性有機ポリマーである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非イオン性有機ポリマーが、１３０〜１０００Ｄの範囲の平均分子量を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記夾雑物解離剤が、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、およびフェノキシエタノールからなる群より選択される有機溶剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記夾雑物解離剤が、０．０１％〜２５％重量／容量の範囲の濃度で提供される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記夾雑物解離剤が、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯおよびオクチルグルコシドからなる群より選択される界面活性剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記界面活性剤が、０．００１％〜１％重量／容量の範囲の濃度で提供される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記界面活性剤が、０．００１％〜０．１％重量／容量の範囲の濃度で提供される、請求項２１または２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス粒子精製方法に関する。本発明はさらに、所望の最終精製レベルを実現するために、本能力と他の精製方法を一体化することに関する。
【背景技術】
【０００２】
帯電した表面を有する固形材料は、ウイルス精製分野において広く使用される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。これらの材料は、一般的に、いわゆるイオン交換体を含み、それは二つの応用型式のいずれかで通常使用される。結合−溶出モードでは、サンプルとイオン交換体を、目的ウイルス種が結合できるような状態に平衡化する。帯電した表面と弱く相互作用するか又は全く相互作用しない夾雑物は結合せずに排除される。ウイルスよりも強く相互作用する夾雑物は、より強く結合する。洗浄して結合しない夾雑物を除去した後、塩濃度を増加させることにより、カラムから溶出することができる。これにより、イオン交換体との相互作用の強さが増す順序で、結合種を分画することが可能になり、従って、高度なウイルス精製を実現する。流入−通過（フロースルー）モードでは、サンプルとイオン交換体を、ウイルスが結合するのを妨げる状態に共に平衡化する。ウイルスよりも強くイオン交換体と相互作用する種は結合しそれにより除去されるが、ウイルスよりも弱く結合する種はイオン交換体を通過し夾雑物として残存する。両モードは、各種固相構成（カラムに充填されるか、大容量の水性サンプルに加えられるか、またはモノリス若しくは膜上にある多孔性または非多孔性粒子を含むもの）で提示される帯電表面上で実施される。これら様々な構成は、互いに異なる流動特性、容量、および分解能を付与するが、フロースルー又は結合−溶出クロマトグラフィーの明確な化学的特徴は、物理的型式に関わらず一定である。両方法は、サンプルがカラムに導入される前に、イオン交換体とサンプルを同じ状態に平衡化することに依存している。
【０００３】
いくつかのクロマトグラフィー媒体は、荷電と他のタイプの化学的機能性の組み合わせを合体化する。これらの媒体は、混合モードまたは多モード材料として広く知られている。そして、荷電を、疎水性基、金属親和性基、官能基、または水素結合を支持する化学基と様々に組み合わせてもよい。それら媒体は、二次的機能性の性質に依存して、様々な化学条件下で操作されるが、結合−溶出モードおよびフロースルーモードで依然として操作される。
【０００４】
荷電を物理的機能性（例えば、帯電材料がサイズによって種をソートする能力を併せ持つ場合）と組み合わせる多モード材料も、少数であるが記載されている。そのような例の一つは、多様なサイズ排除機能性を正に荷電した表面と組み合わせて使用するものである（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。この方法は、サイズ依存的様式でタンパク質が粒子の孔に入ることと一般的に関与する一方で、そのタンパク質上の荷電および緩衝液条件への共依存性も呈する。分画のための他の帯電材料のように、Ｈｕｎｔｅｒらにより記載されたこの材料は、結合−溶出およびフロースルー応用例用にもっぱら記載される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．ら、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ，  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍ．Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ  Ｅｄ．、Ｊ．Ｔ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、５９１−１６１１
【非特許文献２】Ｗｏｌｆｆ，Ｍ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １０：１４５１−１４７５（２０１１）
【非特許文献３】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｌ．Ｓｕｐｐｌ．６：２４−３０
【非特許文献４】Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ８９７：６５−８０（２０００）
【非特許文献５】Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ８９７：８１−９７（２０００）
【非特許文献６】Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．９３０：７９−９３（２０００）
【非特許文献７】Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ９７１：１０５−１１６（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
方法、材料、およびキットを、ウイルス粒子精製のために提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、所望ウイルス種を含むサンプルを精製する方法であって、（ｉ）負帯電多孔性粒子を含む充填クロマトグラフィーカラムを提供する工程と、（ｉｉ）前記充填クロマトグラフィーカラムを、前記サンプル中の前記所望ウイルスが溶出される条件に平衡化する工程と、（ｉｉｉ）前記充填クロマトグラフィーカラムへ添加するサンプル量が前記充填クロマトグラフィーカラム中の前記負帯電多孔性粒子の粒子間空間以下であるように、前記サンプルを前記充填クロマトグラフィーカラムに接触させる工程と、ならびに（ｉｖ）前記充填クロマトグラフィーカラムから前記所望ウイルスを溶出する工程を含み、前記所望ウイルスは、より精製された状態となりおよび前記充填クロマトグラフィーカラムが平衡化された条件下にある、方法である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、電気陰性多孔性粒子で充填されたカラムに関する。そのカラム中では、粒子孔からの立体的排除と独立するか若しくは組み合わせる静電反発力によるか、または粒子孔からの立体的排除単独によるかで、ウイルスは実質的に粒子間空間（つまり、粒子間スペースもしくは空隙（ボイド空間））に制限される。このことにより、ウイルスを、排他的ではないかもしれないが、実質的にそのボイド空間を伝ってカラムを通過させることが可能になる。立体的排除は、特に、ウイルス粒子が、粒子孔中の負帯電リガンド構成により奏される物理的抵抗を乗り越えるのを妨げる条件下で孔空間に侵入できないような、メカニズムのことを指す。多くの夾雑タンパク質（ウイルスが生産された宿主細胞から生じるものを含む）および細胞培養培地成分（塩類、非イオン性種、および双性イオン性種を含む）は、そうと考えられているのは、任意の理論に縛られるものではないが、そのカラム内輸送を遅延させるため、および、緩衝液がカラムを流れるにしたがって早く移動するウイルスからそれらを分離させるために、粒子孔に入り込むことができる。アルカリ性夾雑物は、電気陰性表面に結合することによりさらに遅延する場合がある。この方法が、サンプル条件に関わらず、ほとんどの夾雑物の化学的特性に関わらず、および、抗体をカラムに通すようにサンプル添加直後に添加される緩衝液の組成に関わらずに、とりわけウイルス粒子を効果的に分画可能にすることが発見された。ある実施形態では、本発明の利点は、広範囲の条件（ｐＨ、塩濃度、電導度等）で実施可能であることである。従って、所望のＩｇＧ抗体または断片の製造および精製の過程で、本発明の方法の前後のプロセスと合わせて本発明の方法が便利に実施できるように、上記条件を選択してもよい。ある実施形態では、これらのユニークな操作特性と結果は、カラム中の負帯電粒子の粒子間容量を超えない量にサンプル添加を限定することにより実現される。さらに、いくつかの実施形態では、本方法は、他のタイプの負帯電材料（非多孔性粒子、膜、またはモノリスを含むもの）を使って適用されることもないし、サンプル内で、負帯電多孔性もしくは非多孔性粒子または可溶性負帯電ポリマーを分散させることにより適用されることもない。むしろ、好ましい本実施形態では、本方法は多孔性粒子の充填カラムを用いて実施される。ある実施形態では、本発明が多孔性粒子を充填したカラムを使用する他のウイルス精製方法よりも特に有利なのは、粒子間空間を通過する輸送が拡散的というよりはむしろ対流性であるからだ。このことは、本発明を他の粒子−カラム法よりもずっと高速の流速で効果的に実施可能にし、より生産性が高くなる。
【０００９】
ある実施形態では、付加的表面機能性によりウイルスが保持されるか有意に遅く移動するようにならない条件にカラムを平衡化する限り、カラム床中の粒子にこれら付加的表面機能性を含ませることにより、本発明のある実施形態の有する固有の分画能力が向上する場合がある。そのような機能性は、限定はされないが、正帯電基、疎水性基、Π−Π結合基、水素結合基、または金属キレート基を含んでもよい。これら付加的機能性は、負帯電基と同じ化学部分上に存在してもよいし、負帯電基と同じ多孔性粒子上に存在してもよいし、または多孔性もしくは非多孔性である場合がある異なる粒子上に存在してもよい。二次的機能性が別の粒子に含まれるように付加される場合、添加され得るサンプル量は、カラム中の負帯電多孔性粒子のみの間で存在する粒子間空間に対応する容量に限定される。この容量は、カラムの負帯電多孔性粒子の重力沈降容量の約４０％であると推定可能であるが、もし粒子床が物理的に圧縮させた場合はそれよりも少ない場合がある。そして、その容量は実験により定量して決定することができる。
【００１０】
ある実施形態では、本方法により可能とされる精製度を、ウイルスと結合する可能性のある夾雑物の解離を促進する薬剤を用いてサンプルを前処理することにより向上することができる。そのような薬剤は、特に、各種解離剤（高濃度の塩類、尿素、アミノ酸類、非イオン性有機ポリマー、有機溶剤、界面活性剤等を含むもの）を含む。本方法を決まった手順で実施する際には、この解離剤をサンプル中の他の小分子とともに除去する。
【００１１】
ある実施形態で、本発明が提供するのは、所望ウイルスを含むサンプルを精製する方法であって、（ｉ）負帯電多孔性粒子を含む充填クロマトグラフィーカラムを提供する工程と、（ｉｉ）前記カラムを、前記サンプル中の前記所望ウイルスが溶出される条件に平衡化する工程と、（ｉｉｉ）前記カラムへ加えるサンプル量が前記カラム中の前記負帯電多孔性粒子の粒子間空間以下であるように、前記サンプルを前記カラムに接触させる工程と、（ｉｖ）前記カラムから前記所望ウイルスを溶出する工程を含み、前記所望ウイルスは、より精製された状態となりおよび前記カラムが平衡化された条件下にある、方法である。
【００１２】
前述の実施形態では、所望のウイルス種は、脂質で包まれたウイルス、脂質で包まれていないウイルス、バクテリオファージ、シュードウイルス、またはウイルス様粒子種である場合がある。所望のウイルスは、自然起源または組換え体起源のものであってもよい。
【００１３】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプルは事前に未精製である場合がある。
【００１４】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプルを本発明の実施前に濃縮する場合がある。
【００１５】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプルを限外濾過法により濃縮した場合がある。
【００１６】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプルを、事前精製工程を経て中間的レベルの純度または高レベルの純度にする場合がある。
【００１７】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプルの中間的レベルの純度は、約４０％〜約９０％以上の純度の範囲にある場合がある。
【００１８】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプルの高レベルの純度は、約９０％以上であってもよい。
【００１９】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプル量は、充填クロマトグラフィーカラム中の負帯電多孔性粒子の粒子間空間の９０％未満である場合がある。
【００２０】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプル量は、充填クロマトグラフィーカラム中の負帯電多孔性粒子の粒子間空間の８０％未満である場合がある。
【００２１】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプル量は、充填クロマトグラフィーカラム中の負帯電多孔性粒子の粒子間空間の７０％未満である場合がある。
【００２２】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプル量は、充填クロマトグラフィーカラム中の負帯電多孔性粒子の粒子間空間の６０％未満である場合がある。
【００２３】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプル量は、充填クロマトグラフィーカラム中の負帯電多孔性粒子の粒子間空間の５０％未満である場合がある。
【００２４】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプル量は、充填クロマトグラフィーカラム中の負帯電多孔性粒子の粒子間空間の０．１％未満である場合がある。
【００２５】
一又は複数の各先行実施形態では、充填クロマトグラフィーカラムを負帯電多孔性粒子それだけで充填してもよいし、サンプル量はその充填クロマトグラフィーカラムの容量の４０％未満であってもよい。
【００２６】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプル添加条件のｐＨの範囲は、約３〜約９である。
【００２７】
一又は複数の各先行実施形態では、充填クロマトグラフィーカラムを、ｐＨが約４〜約８になるように平衡化する場合がある。
【００２８】
一又は複数の各先行実施形態では、充填クロマトグラフィーカラムを、ｐＨが約４．５〜約６．０の緩衝液を用いて平衡化する場合がある。
【００２９】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプル添加条件の電導度値の範囲は、約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約２５０ｍＳ／ｃｍである。
【００３０】
一又は複数の各先行実施形態では、充填クロマトグラフィーカラムを、電導度値が約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍになるように平衡化する場合がある。
【００３１】
一又は複数の各先行実施形態では、充填クロマトグラフィーカラムを、電導度値が約０．１〜約１５ｍＳ／ｃｍになるように平衡化する場合がある。
【００３２】
一又は複数の各先行実施形態では、充填クロマトグラフィーカラムを、ｐＨが約４．５およびゼロではない電導度値が約１ｍＳ／ｃｍ未満の緩衝液を用いて平衡化する場合がある。
【００３３】
一又は複数の各先行実施形態では、充填クロマトグラフィーカラムを、溶離液に実施される次の精製工程用のサンプル添加条件付近の条件に平衡化する場合がある。
【００３４】
一又は複数の各先行実施形態では、負帯電多孔性粒子は、陽イオン交換粒子である。
【００３５】
一又は複数の各先行実施形態では、陽イオン交換粒子は電気陰性であり、その電気陰性の少なくとも一部は、カルボキシル基、スルホ基、またはホスホリル基からなる群より選択される部分（ｍｏｉｅｔｙ）により提供される。
【００３６】
一又は複数の各先行実施形態では、電気陰性を、一より多い負帯電部分種により付与してもよい。
【００３７】
一又は複数の各先行実施形態では、電気陰性を、二次的反応性を付与する他の機能性と組み合わせる、カルボキシル基、スルホ基、またはホスホ基を含む錯体リガンドにより付与してもよい。そのような実施形態の一つでは、負帯電リガンドが金属配位に関与する能力を強くするように、少なくとも一つのアミノ基と組み合わせる一又は複数のカルボキシル基を含む錯体リガンドにより、電気陰性を付与してもよい。そのようなリガンドの例は、イミノ二酢酸またはニトリロ酢酸（ｎｔｉｒｉｌｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）であるかもしれない。そのような実施形態の別のものでは、錯体リガンドは、一又は複数の負電荷に直接または間接的に共有結合した芳香族または脂肪族の疎水性基を含む場合がある。
【００３８】
一又は複数の各先行実施形態では、充填クロマトグラフィーカラムは、電気陰性多孔性粒子に加えて別の粒子をさらに含む。
【００３９】
一又は複数の各先行実施形態では、電気陰性多孔性粒子と別の粒子の少なくとも一つは、陰イオン交換、疎水性相互作用、水素結合、Π−Π相互作用、および金属キレートからなる群より選択される一又は複数の二次的化学機能性を含む。
【００４０】
一又は複数の各先行実施形態では、本方法は、サンプルを充填クロマトグラフィーカラムと接触させる工程の前に、前記サンプルを一又は複数種の解離剤と接触させる追加的工程をさらに含んでもよい。その解離剤の目的は、ウイルス種が非特異的に結合する可能性のある夾雑物から、そのウイルス種を解離させることにある。
【００４１】
一又は複数の各先行実施形態では、解離剤は有機溶剤である場合がある。
【００４２】
一又は複数の各先行実施形態では、解離剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エタノール、またはイソプロパノールである場合がある。
【００４３】
一又は複数の先行実施形態では、解離剤の存在する濃度の範囲は、ゼロではない量から、０．１％以上、１％以上、１０％以上、または２０％以上である場合がある。
【００４４】
一又は複数の先行実施形態では、解離剤は、ゼロではない濃度から、８Ｍ以上、例えば、０．５Ｍ以上、１Ｍ以上、２Ｍ以上、４Ｍ以上、６Ｍ以上のカオトロープ（例、尿素）であってもよい。
【００４５】
一又は複数の先行実施形態では、解離剤は界面活性剤であってもよい。
【００４６】
一又は複数の先行実施形態では、界面活性剤は、非イオン性のもの（例、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、もしくはＢｒｉｊ）；または双性イオン性界面活性剤（例、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、もしくはオクタグルコシド）である場合がある。
【００４７】
一又は複数の先行実施形態では、界面活性剤は、０．１％未満の濃度でサンプル中に存在する場合がある。
【００４８】
一又は複数の先行実施形態では、解離剤は水素結合解離剤（例、尿素またはソルビトール）である場合がある。
【００４９】
一又は複数の先行実施形態では、解離剤はアミノ酸（例、アルギニン、リジン、またはヒスチジン）である場合がある。
【００５０】
一又は複数の先行実施形態では、アミノ酸の濃度の範囲は、ゼロではない量〜５００ｍＭであってもよい。
【００５１】
一又は複数の先行実施形態では、解離剤は、キレート剤（例、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、またはデフェロキサミン）である場合がある。
【００５２】
一又は複数の先行実施形態では、キレート剤の濃度の範囲は、ゼロではない量〜５０ｍＭであってもよい。
【００５３】
一又は複数の各先行実施形態では、本方法は、サンプルを充填クロマトグラフィーカラムと接触させる工程の前に、前記サンプルを一又は複数種の塩と接触させる追加的工程をさらに含んでもよい。その塩の目的は、ウイルス種が非特異的に結合する可能性のある夾雑物から、そのウイルス種を解離させることにある。
【００５４】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプルに添加される塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、または、他のいわゆる中性塩からなっていてもよい。
【００５５】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプルに添加される塩は、カオトロピック塩（例、グアニジン）からなっていてもよい。
【００５６】
一又は複数の各先行実施形態では、塩濃度の範囲は、ゼロではない濃度〜２Ｍ以上；例えば、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、１Ｍ以上であってもよい。
【００５７】
一又は複数の各先行実施形態では、夾雑物は、核酸、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質、細胞培養培地成分、他の種のウイルス、またはその組み合わせである場合がある。
【００５８】
一又は複数の各先行実施形態では、サンプルが、一又は複数の夾雑物を含む場合がある。そして、本明細書中に開示される方法を実施する結果としてのサンプルと比較すると、所望ウイルスの純度がより高くなると、そのような夾雑物の含有量は減少する。
【００５９】
任意の先行実施形態に記載される方法を簡便に実施するために、キットを提供する場合がある。
【００６０】
ある実施形態では、所望のウイルスは、脂質で包まれたウイルス、脂質で包まれていないウイルス、バクテリオファージ、シュードウイルス、またはウイルス様粒子である。この最後の用語は、例えば、組換え手段により改変されて非感染性にされたウイルス誘導体を表すものと理解される。
【００６１】
ある実施形態では、粒子間空間は、サンプル量の約二倍よりも大きい。ある実施形態では、多孔性電気陰性粒子を含むカラム部分の粒子間空間は、サンプル量よりも大きい。ある実施形態では、カラムを負帯電多孔性粒子単独で充填するので、サンプル量は、充填カラムの容量の約４０％以下である。ある実施形態では、カラムを負帯電多孔性粒子および別の粒子で充填するので、サンプル量は、カラム中に重力により沈降した負帯電多孔性粒子の容量の約４０％以下である。
【００６２】
ある実施形態では、カラムに充填された負帯電多孔性粒子の粒子間空間は、サンプルとほぼ同じ容量であるか、あるいは、サンプル量よりも１０％大きいか、サンプル量よりも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％大きいか、サンプル量の１．５、２、２．５、３、４、または５倍以上大きい。
【００６３】
ある実施形態では、サンプルをカラムと接触させる前に、平衡化緩衝液を用いて、カラムを平衡化する。そのようなある実施形態では、カラムを約３〜約９の間のｐＨへと平衡化する。そのようなある実施形態では、カラムを約４〜約６．０の間のｐＨの緩衝液を用いて平衡化する。そのようなある実施形態では、カラムを約４．５〜約５．５の間のｐＨの緩衝液を用いて平衡化する。ある実施形態では、カラムを約１〜約３０ｍＳ／ｃｍの電導度値へと平衡化する。ある実施形態では、カラムのｐＨ、塩濃度および電導度条件は、電気陰性多孔性粒子と所望のウイルス以外のサンプル成分との静電相互作用が実質的に維持されないように選択する。平衡化緩衝液および／または溶出液のｐＨ、塩濃度および電導度条件を、電気陰性多孔性粒子と所望タンパク質以外のサンプル成分との静電相互作用が実質的に維持されないように、本発明のある実施形態において選択する場合がある。ある実施形態では、平衡化したカラムの電導度は、約０．１〜約１５ｍＳ／ｃｍの間である。ある実施形態では、カラムを、溶離液に実施される次の精製工程用のサンプル添加条件付近の条件に平衡化する場合がある。
【００６４】
ある実施形態では、サンプル条件は、約３〜約１０のｐＨの範囲にある場合がある。そのようなある実施形態では、サンプル電導度値の範囲は、約０．１〜約２５０ｍＳ／ｃｍである場合がある。ある実施形態では、サンプル条件は、約２〜約１０のｐＨの範囲にある場合がある。そして、ある実施形態では、サンプル条件の電導度値の範囲は、約０．ｌ〜約２５０ｍＳ／ｃｍである場合がある。
【００６５】
ある実施形態では、溶出条件は、約２〜約１０のｐＨの範囲にある場合がある。そのようなある実施形態では、サンプル添加の直後に添加される緩衝液の電導度の範囲は、約０．ｌ〜約２５０ｍＳ／ｃｍである場合がある。ある実施形態では、サンプル添加直後に添加される緩衝液の電導度は、そのサンプルまたは平衡化緩衝液よりも低い。ある実施形態では、サンプル添加直後に添加される緩衝液の電導度は、そのサンプルまたは平衡化緩衝液よりも高い。
【００６６】
ある実施形態では、添加塩分のない２０ｍＭ以下の濃度の酢酸により媒介されるので、カラム平衡化緩衝液のｐＨは約５．０であり、電導度は１ｍＳ／ｃｍ未満である場合がある。いくつかの実施形態では、アセテートの濃度の範囲は、約２０〜約５０ｍＭである場合がある。
【００６７】
ある実施形態では、サンプル添加直後に添加される緩衝液は、平衡化緩衝液と同じ組成であってもよい。ある実施形態では、サンプル添加直後に添加される緩衝液は、平衡化緩衝液と異なる組成であってもよい。ある実施形態では、負帯電粒子に結合する可能性のある正帯電粒子を除去する目的で、サンプル添加直後に添加される緩衝液は、平衡化緩衝液よりも電導度がずっと高い場合がある。
【００６８】
ある実施形態では、次回使用のサイクルの準備においてカラムを洗浄するために、過剰な塩または他の添加剤をサンプル中に含めてもよい。そのような添加剤は、また、抗体と夾雑物種との間の非特異的相互作用を解離する有利な効果を奏して、その結果、純度を増加させるか及び／又はこの技術により達成される凝縮物減少を促進する場合があることが理解されよう。
【００６９】
ある実施形態では、負帯電多孔性粒子は、いわゆる陽イオン交換粒子である。そのようなある実施形態では、陽イオン交換粒子は、部分（例、カルボキシル基、スルホ基、ホスホ基、イミノ二酢酸基、またはニトリロ酢酸基）により部分的に付与される電気陰性を有する。ある実施形態では、カラムは電気陰性多孔性粒子に加えて別の粒子を含む。ある実施形態では、電気陰性多孔性粒子および追加的粒子の少なくとも一つは、陽イオン交換、疎水性相互作用、水素結合、Π−Π相互作用、および金属キレートからなる群より選択される一又は複数の二次的化学機能性を含む。
【００７０】
ある実施形態では、ネットワークが強い正電荷がない溶質の侵入を物理的に妨げるかまたは阻止するように、粒子孔中の荷電基の高密度ネットワークを作り出すいわゆるグラフトされたリガンドを、この技術は利用する。
【００７１】
ある実施形態では、この技術は、ウイルス粒子が効果的に侵入するのを阻止する孔サイズを有する負帯電多孔性粒子クロマトグラフィー媒体を利用する。ウイルス粒子の侵入を阻止するのに有用な例示的孔サイズは、ウイルスサイズに依存して、約１０〜約１００ｎｍ（その間の任意の値やその分数を含むもの）の範囲を含む。１０ｎｍ未満の孔サイズが、限定はされないが、１、２、３、４、５、６、７、８、または９ｎｍを含めて使用される場合もあることを当業者は理解する。同様に、１００ｎｍより大きい孔サイズが、限定はされないが、１２０、１５０、２００、３００、および５００ｎｍ（その間の任意の値やその分数を含むもの）を含めて使用される場合があることを、当業者はまた理解する。当業者は、精製されるウイルスに基づいて孔サイズを適切に選択することを認識する。そのような多孔性粒子は、サンプル量全体またはそれよりも少ない任意の割合で構成可能である。
【００７２】
ある実施形態では、本発明は、サンプルをカラムと接触させる工程の前に、前記サンプルを解離剤と接触させる追加的工程を提供する。そのようなある実施形態では、解離剤は、塩、有機溶剤、有機ポリマー、水素結合解離剤、カオトロープ、界面活性剤、またはキレート剤であってもよい。
【００７３】
ある実施形態では、本発明は、サンプルをカラムと接触させる工程の前に、前記サンプルを一より多い解離剤と接触させる追加的工程を提供する。そのようなある実施形態では、解離剤は、一よりも多い下記クラスの任意の解離剤また様々な別クラスの薬剤の組み合わせを含む場合がある。それらのクラスには、例えば、塩、有機溶剤、有機ポリマー、水素結合解離剤、カオトロープ、界面活性剤、またはキレート剤を含む。
【００７４】
そのようなある実施形態では、解離剤は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールからなる群より選択される非イオン性有機ポリマーである。そのようなある実施形態では、解離剤の平均分子量は約５００Ｄ以下である。そのようなある実施形態では、解離剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、エタノール、およびグリセロールからなる群より選択される有機溶剤である。そのようなある実施形態では、解離剤は、約１％（ｗ／ｖ）以上の濃度で提供される。
【００７５】
ある実施形態では、解離剤は、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、およびオクチルグルコシドからなる群より選択される界面活性剤である。そのようなある実施形態では、界面活性剤は、約１％（ｗ／ｖ）以下のゼロではない濃度、または、約０．１％（ｗ／ｖ）以下のゼロではない濃度で提供される。
【００７６】
ある実施形態では、本発明は、サンプルをカラムと接触させる工程の前に、不溶性固形物を除去する追加的工程を含む方法を提供する。
【００７７】
ある実施形態では、本発明が提供する方法において、サンプルは、一又は複数の夾雑物を含み、本方法の実施の結果生じる所望ウイルス純度が高い状態では、サンプルと比較して、そのような夾雑物の含有量が減少する。例えば、夾雑物がタンパク質であるいくつかの実施形態では、タンパク質濃度は、１０倍より多く、２０倍より多く、５０倍より多く、９０倍より多く、または９５倍より多く減少する。
【００７８】
ある実施形態では、澄ましているがまだ未精製のサンプルを、本発明を実施する前に酸性度の高い夾雑物を除去する目的で、所望のウイルスが実質的に負帯電粒子に結合しないような条件下でその負帯電粒子に暴露することにより調製する。そのような実施形態の一つでは、負帯電粒子を、例えば、サンプル量全体の約２〜５％（ｖ：ｖ）の量で、サンプルに直接加える。そのようなある実施形態では、負帯電粒子は、二次的機能性（例、疎水性相互作用または金属配位に関与する能力）を含む。そのような実施形態では、本発明を実施するのに使用される負帯電カラムに充填された粒子と所望のウイルスとの相互作用に干渉する可能性のあるサンプル成分を除去することにより本発明の性能を改善すると、この操作は理解される。そのようなある実施形態では、限外濾過法によりウイルスを濃縮する前に、この処理を実行する。他のそのような実施形態では、この処理を、付随した限外濾過工程なしに実行する。他のそのような実施形態では、限外濾過法によりウイルスを濃縮した後に、この処理を実行する。第一のケースでは、限外濾過工程の性能を潜在的に改善することが理解される。最後のケースでは、処理プロセスの容量と酸性度の高い夾雑物を除去するのに必要な負帯電粒子の容量とを削減することが理解される。いずれのケースにしても、本発明による処理の前に粒子を除去するために、中間工程を事前に加えてもよい。
【００７９】
ある実施形態では、本発明は、本発明の方法を簡便に実施するためのキットであって、好ましくは本発明の方法の実施に便利な量および濃度で、本発明の実施に必要な材料の一部または全てを含むキットを提供する。そのようなキットは、また、キット中に提供される材料の使用に関する説明書を含んでもよい。
【００８０】
以下の用語を定義して、従って、本発明がより容易に理解されるであろう。追加的な定義を、詳細な説明全体に記載する。
【００８１】
「カラム平衡化」は、クロマトグラフィー媒体を用いて充填されるカラム中の所望の緩衝液が安定且つ均等に分配されることを実現することを指す。平衡状態では、カラム出口で測定される溶離液のｐＨ、電導度、およびＵＶ吸収は、カラム入口で導入される溶離液と実質的に同一である。
【００８２】
「カラム容量」は、カラムと呼ばれる通常円筒型装置中の充填粒子の総容量のことを指す。用語「カラム容量」は、３つの部分から構成されるいわゆる総カラム容量に対応すると一般的に理解される。これらの部分は、ボイド（空隙）容量として知られる粒子間空間と、孔（ｐｏｒｅ）容量として知られる孔内容量と、マトリクス容量としばしば呼ばれる固体マトリクスの粒子により占有される容量とからなる。
【００８３】
「電導度値」は、電解質溶液が電気を電導する能力を指す。電解質溶液の電導度は、例えば、決まった距離で隔離される二つの電極間のその溶液の抵抗を決定することで測定可能である。電導度値は、ｃｍ当たりのミリシーメンス（ｍｉｌｌｉＳｉｅｍｅｎｓ）（ｍＳ／ｃｍ）として最も一般的に表される。
【００８４】
「夾雑物」は、所望ウイルスの純度を減少する望ましくない任意の無機または有機実体を指す。夾雑物は、各種条件上で安定のままである、所望のウイルスと結合形成可能な実体を含む。本発明の方法は、そのような凝集体を能動的に解離させて、所望のウイルスが結合する夾雑物からその所望のウイルスを回収することを提供する。例示的な夾雑物は、特に、タンパク質を含むが、ＤＮＡ、細胞内容物、および細胞培養培地成分等を含むこともある。
【００８５】
「電気陰性多孔性粒子」または「負帯電多孔性粒子」は、およそ球形かそうでもないことがあり、任意のサイズの孔を有する場合がある不溶性固形物を指す。任意ではあるが、粒子サイズの範囲は、１０ミクロン未満〜１００ミクロンより大きいものである場合があり、その平均孔サイズの範囲は、１０ｎｍ未満（微小多孔性）〜１００ｎｍを超える（マクロ多孔性）場合がある。粒子の電気陰性は、化学基（限定はされないが、弱陰イオン交換基、カルボキシル基もしくはホスホ基、強陰イオン交換基（例、スルホ基）、または全体として負電荷を有する多モード部分、あるいは前記のものの組み合わせ）により付与される場合がある。負帯電表面上に多モード特性を創出する二次的機能性は、負帯電基もしくは正帯電基、疎水性基、Π−Π結合基、水素結合基、または金属キレート基からなる場合がある。二次的機能性は、その製造物または粒子を合成するプロセスの意図しない副産物として電気陰性粒子上に存在する場合がある。または、それらの二次的機能性は意図した設計により存在する場合もある。二次的機能性の濃度の範囲は、粒子１ｍＬ当たり１ミリ当量未満〜１ｍＬ当たり１００ミリ当量を超える場合がある。用語「電気陰性多孔性粒子」は、陽イオン交換体と呼ばれる、市販の多孔性粒子クロマトグラフィー材料を含み、そして、電気陰性となるいわゆる混合モードクロマトグラフィー材料を含む場合がある。
【００８６】
「粒子間容量」または「ボイド容量（空隙容量）」は、粒子自身に占有されないカラム容量、つまり、粒子の間の空間内の容量を指す。これは、しばしば、カラムのボイド容量と呼ばれる。同様のサイズのほぼ球形の粒子に関しては、ボイド容量は、一般的に、粒子が重力により沈降し、力学的手段で物理的に圧縮されない場合にそれら粒子で充填されたカラムの約４０％を構成する。
【００８７】
「孔容量」は、多孔性粒子の孔内の容量のことを指す。孔は、主として孔壁上に分布する正帯電基を用いて物理的に閉塞されることはないか、または、孔内にあるポリマーネットワーク上かその中に分布する正帯電基をもちいて部分的に閉塞される場合がある。孔が部分的に閉塞される場合、見かけ上の閉塞度は、抗体または他のサンプル成分の荷電特性とともに変化する場合があるか、及び／又は緩衝液条件（例、ｐＨおよび電導度）の関数として変化する場合もある。
【００８８】
「非イオン性有機ポリマー」は、荷電基を欠く連結反復有機サブユニットから構成される自然発生的または合成炭化水素を指す。それは、分岐が多少あるか又は非常に分岐した直鎖、または主に直鎖のものである場合がある。本発明の実施に適する例は、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。ＰＥＧの構造式は、ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈである。例には、限定はされないが、１００未満〜１０００ダルトンを超える範囲の平均ポリマー分子量を有する組成物が含まれる。
【００８９】
「解離剤」は、精製されるウイルスからの夾雑物の解離を促進するように夾雑を減少することができるか、または他の試薬と組み合わせて夾雑が減少するのを助長することができる有機または無機化合物を指す。有機解離剤は、限定はされないが、ウレイド類、アミノ酸類、非イオン性ポリマー、有機溶剤、キレート剤、および界面活性剤等を含む場合がある。無機解離剤は、特に塩類を含む。
【００９０】
「有機溶剤」は、液状で存在する、自然発生的または合成有機化合物を指す。本発明の実施に適する例は、限定はされないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ジメチルスルホキシド、エタノール、およびフェノキシエタノールを含む。
【００９１】
「ポリヌクレオチド」は、鎖中で共有結合した複数のヌクレオチド単量体から構成される生体ポリマーを指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。ポリヌクレオチドは、水素結合形成傾向が高くなる場合がある。
【００９２】
「タンパク質」は、炭素、水素、酸素、窒素、および通常硫黄を含む任意のグループの有機高分子複合体を指す。そして、タンパク質は、ペプチド結合で連結されたアミノ酸の一又は複数の鎖から主として構成される。タンパク質は、自然起源または組換え体起源のものであってもよい。タンパク質は、非アミノ酸部分（例えば、糖鎖付加、ペグ化、または他の化学部分との結合を介するもの）で改変される場合がある。タンパク質の例は、限定はされないが、抗体、凝固因子、酵素、およびペプチドホルモンを含む。
【００９３】
「ウイルス調製物」は、目的ウイルスを含む任意の水性またはほぼ水性溶液、例えば、細胞含有細胞培養収穫物、（実質的に）細胞不含有細胞培養上清、または精製段階由来の目的ウイルスを含む溶液を指す。
【００９４】
「サンプル添加条件」は、所望のタンパク質を含むサンプルを如何にして供給するかを指し、そして、例えば、サンプル濃度、溶離液電導度、およびｐＨ等を含む。サンプル添加条件を、これから実施する精製のためにカラムを平衡化する条件下へと、一般的に選択する場合もあるし、または、そのような条件と異なってもよい。
【００９５】
「固形材料」は、性質として、粒状、結晶性、重合性、線維性、多孔性−中空糸状、モノリス的、または膜状である場合がある不溶性有機固形物を指す。固形材料は、非多孔性もしくは多孔性粒子、多孔性膜、多孔性フィルタ、または多孔性モノリスからなる場合がある。もし粒状ならば、粒子は、ほぼ球状もしくはそうでない場合があり、そして、１００ｎｍ未満〜１００ミクロンを超える範囲のサイズである場合がある。多孔性粒子の平均孔サイズの範囲は、約１０ｎｍ未満（微小多孔性）〜約１００ｎｍ（マクロ多孔性）を超える場合がある。膜の平均孔サイズの範囲は、１００ｎｍ未満〜１ミクロンを超える場合がある。膜またはモノリスの平均チャネルサイズの範囲は、１ミクロン未満〜１０ミクロンを超える場合がある。固形材料は、例えば、粒子が網状マトリクス中に埋め込まれるか、膜に挟まれるか、またはその両者である複合構造体からさらになる場合がある。
【００９６】
「界面活性剤」は、「表面を活性化する薬剤」、例えば、一般的に疎水性部分と親水性部分とを合体させるので両親媒性と呼ばれる有機分子のクラスを含む。水性溶液中で十分な濃度である場合、界面活性剤は、自己会合してクラスターになり、中心部に集中している疎水性部分は水分との接触が最小限になり、外側に放射状に延びている親水性部分は水分との接触が最大限になる。生体調製物、特に、疎水性を有するか又は疎水性領域を有する物質を含むものでは、界面活性剤の疎水性部分は、疎水性物質のいくつかの部分と自発的に結合する傾向があり、および、界面活性剤の親水性部分の影響を介してその溶解度を増加させる。それら特性は、水性溶剤に共に溶解される互いに異なる疎水性物質間に起こる疎水性相互作用を修飾するのにも用いられる場合がある。本発明のある実施形態を実施するのに適する界面活性剤の例は、限定はされないが、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０、ポリオキシエチレン（２０）モノラウリン酸ソルビタンとＴｗｅｅｎ８０、ポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸ソルビタン）およびＴｒｉｔｏｎ（例、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル））ならびに双性イオン性界面活性剤（例、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）およびオクチルグルコシド（例、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−オクトキシオキサン−３，４，５−トリオール））を含む。
【００９７】
「ウレイド」は、一又は複数の尿素部分またはその誘導体を含む、自然起源または合成起源の環状または非環状分子を指す。ある実施形態では、本発明は、ウレイド類（例、尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン（ＣＡＳ番号９７−５９−６：アルクロキサ、アルジオキサ、ヘモケーン（ｈｅｍｏｃａｎｅ）、ウレイドヒダントイン、５−ウレイドヒダントイン、グリオキシウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル尿素）、プリン、およびその誘導体）を提供する。ある実施形態では、本発明は、相当する「Ｒ−基」がＨまたは任意の有機部分である場合がある式Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２、Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’、またはＲ’Ｒ’’ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ’’’Ｒ’’’’である有機分子を提供する。
【００９８】
「ウイルス」または「ビリオン」は、極微の（直径がおよそ２０〜３００ｎｍの）、代謝が不活性な、感染性物体であって、生体宿主（主として細菌、植物、および動物）の細胞内でのみ複製し、ＲＮＡもしくはＤＮＡコア、タンパク質コート、および（さらに複雑なタイプでは）それを取り巻くエンベロープから成り立っている。例には、脂質で包まれたウイルス、包まれていないウイルス、バクテリオファージ、シュードウイルス、またはウイルス様粒子が含まれる。
【００９９】
ある実施形態では、カラムがサンプル添加前に平衡化されたと同じ緩衝液中に、ウイルスを溶出する。そのような実施形態では、本発明は、サンプルが入っている緩衝液を最初の処方から他の方法による次の処理により適した処方へと交換する目的に使用可能であるという利点を提供する。サンプルが最初に入っている緩衝液の組成を、ウイルスにダメージを与えることを避ける必要性を除いて制限しない一方で、カラム平衡化緩衝液の組成は、大部分のウイルスを負帯電粒子に結合させることに十分なレベルでウイルスに正電荷を付与しない範囲内でなければならない。適切な平衡化条件は、負帯電多孔性粒子の選択と特異的ウイルスの特定の特徴によって変わる。一般的に、カラム平衡化条件は、限定はされないが、電導度値が０．１ｍＳ／ｃｍ未満〜３０ｍＳ／ｃｍを超える範囲、ｐＨ値が４．０未満〜９．０を超える範囲にある場合がある。
【０１００】
夾雑物レベルを減少させるのが技術目的である実施形態では、ウイルスが実質的に負帯電粒子に結合しないような最も低いｐＨおよび／または最も低い電導度を採用するのが有利である。最も低いｐＨおよび／または最も低い電導度の目安は、抗体の溶解性と安定性の必要条件に沿って加減される場合があることが理解される。
【０１０１】
電気陰性粒子が追加的な化学機能性を保持するある実施形態では、本方法を実施するために、ｐＨ値を上昇させること、または、ウイルスと粒子表面との相互作用性を調節する添加剤を含めることが必要であったり、有益であったりする場合がある。最も単純なそのような変量は、ＮａＣｌまたは他の塩を加えることである。ＮａＣｌ濃度を様々に増加させて（例、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ等）実験的に評価することにより、最も有効なレベルを決定してもよい。一旦その有効範囲が決定されると、さらに細かく増加して行われる引き続く実験をするか、または、いわゆる実験設計（ＤｏＥ）等の統計手法によって、有効範囲を精査してもよい。他の添加剤（糖類、カオトロープ、有機溶剤、界面活性剤等を含むもの）と同様に代替的塩類もまた考慮してもよい。添加剤の組み合わせ（各種ｐＨ値の組み合わせを含むもの）をまた、評価する場合がある。
【０１０２】
ある実施形態では、カラムに入っている負帯電粒子は、シングルタイプまたはマルチプルタイプ（多孔性および非多孔性粒子の組み合わせまたは様々な孔サイズの多孔性粒子の組み合わせ）である場合がある。本発明が様々なサイズの孔を有する粒子の組み合わせを採用する場合、ある一種のサブセットの粒子は抗体を物理的に排除するサイズの孔を有する場合がある一方で、別のサブセットはウイルスを排除しない孔サイズを有してもよい。そのようなケースでは、ウイルスを排除するのに十分でない大きさの孔を有するサブセットは、強い正電荷を欠くウイルスが孔に侵入するのを物理的に妨げるようにリガンドを提示する場合がある。
【０１０３】
ある実施形態では、本発明は、粗製サンプルからのウイルスの初期分画のため、または精製の任意の段階で使用可能である。どちらの場合であっても、特定のウイルス用途に必要な全体的精製度を達成するために、本発明が他の精製法と組み合わされる場合があることを説明する。
【０１０４】
ある実施形態では、導入されるサンプルを限外濾過法により濃縮する場合がある。
【０１０５】
ある実施形態では、カラムに導入する前に、サンプルを負帯電表面（複数可）にさらすことが有利である場合がある。そのようにさらすことにより、本発明の実施に使用されるカラムを汚す傾向があるかもしれない電気陽性度の高いサンプル成分を除去することになることが理解される。しかし、所望のウイルスを失わずに汚染物質を除去するための特別な条件をおそらく開発する必要があることも理解される。例えば、ウイルスの結合を阻止するのに十分であるが、ウイルスが産生される宿主細胞からのＤＮＡをコンパクションするタンパク質の結合を阻止するのに十分でない塩を加えることが必要な場合がある。本発明の実施前にサンプルをさらす場合がある負帯電表面には、粒子、膜、線維、モノリス、または複合構造体が含まれる。
【０１０６】
本発明の別の目的および利点は、引き続く説明に一部記載され、部分的には、その説明から自明であるか、または本発明を実施することにより学習可能である。本発明の目的および利点は、請求項に特定される要素およびその組み合わせによって、実現および達成される。
【０１０７】
理解されるのは、前述の一般的説明と以後の詳細な説明が例示的であり且つ説明するためだけのものであり、請求項に記載される本発明を限定するものではないことである。
【０１０８】
本発明のある実施形態を使用するための調製においては、カラムに対する使用可能なサンプル量を決定しなければならない。カラム中の全ての粒子が負帯電多孔性粒子である最も単純なモードでは、この値を、非圧縮重力沈降充填カラム床の総容量に０．４を掛けて推定してもよい。許容可能な最大サンプル量を、単純な実験（カラムを中程度ｐＨの低塩濃度緩衝液に平衡化し、高塩濃度緩衝液中のウイルスサンプルを添加し、その後、追加的平衡化緩衝液を添加するもの）により正確に決定してもよい。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の上昇により示される、ウイルスが溶出し始めるポイントをマークする。電導度の上昇により示される、高濃度の塩が溶出し始めるポイントをマークする。これらのマークの間の容量が、そのカラム１サイクル当たりの最大サンプル容量となる。
【０１０９】
多孔性電気陰性粒子以外の別の粒子（例、二次的化学表面を有するもの）を含むカラムに関する、本発明のある実施形態を実施するために適するサンプル量を、負帯電多孔性粒子のみの容量を掛けることにより推定する場合がある。上記実験は、最大サンプルを具体的に定義するために適用可能である。電気陰性および他の粒子が混ざった所定のカラム用の最大サンプル量は、電気陰性多孔性粒子カラムのみのものから、非電気陰性粒子が占有する相対的カラム容量に比例して引いて求めてもよい。
【０１１０】
ある実施形態では、特定ウイルスの精製方法の開発は、一般的に最も単純なオプション（負帯電多孔性粒子のみで充填されたカラムであるもの）の評価から始まる。適切な粒子は、いわゆる陰イオン交換クロマトグラフィーの技術を実施するために販売されている市販のクロマトグラフィー媒体からなっている場合がある。そのような製品のいろいろな例には、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｃａｐｔｏ  ＣＭ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、Ｓ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ヘルスケア））；ＧｉｇａＣａｐ  ＳおよびＳ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（Ｔｏｓｏｈ（東ソー）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）；Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ−Ｓ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓ、Ｎｕｖｉａ  Ｓ、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（バイオ・ラッド）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｓ、Ｓ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、（Ｍｅｒｃｋ（メルク））；およびＳ−ＨｙｐｅｒＤ（Ｐａｌｌ）が含まれる。そのような製品は、現在では以下の点に関して、ラベル表示はない：（表面の二次的機能性のアイデンティティーまたは濃度；孔サイズ；排他限界値；機能性を向上するためのリガンドグラフト方法を各々使用することから生じるバーチャルな孔サイズ；供給元から一般的に入手可能なそのような情報）。期待されるのは、全てのそのような製品は複数の物理的および化学的機能性を含み、そして、一つより多くの製品を評価して、どれが特定の抗体の精製に最も本質的に適切であるかを決定することが賢明であることである。一つの実施形態では、評価を、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  ＳおよびＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、または候補のいくつか少数のサブセットを用いて開始する。
【０１１１】
任意の所定のウイルスに関して、カラムが初めに平衡化されるｐＨ値および電導度値の範囲を評価するのが得策である。一般的事項として、夾雑物の削減は、ウイルスが可溶および安定のままである最も低いｐＨおよび最も低い電導度であるのがベストである。従って、中程度の酸性緩衝液（例、２０〜５０ｍＭアセテート、ｐＨ４．５）の初期条件が検討開始に便利なところである。より低いか高いｐＨ値（２．０〜９．０を超えるｐＨ値）および０．１未満〜３０ｍＳ／ｃｍを超える範囲の電導度値を、その後評価する場合がある。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、溶出サンプルを、さらにサンプル調製する必要なく次の精製工程へ添加するのに適するようにする条件を評価することが有用である場合がある。例えば、もし、溶出サンプルをｐＨ６．０の陰イオン交換カラムに引き続いて添加する場合、カラムをｐＨ６．０に平衡化するのが望ましい場合がある。もし、溶出サンプルがハイドロキシアパタイトカラムにその後添加される場合、中性ｐＨを使用し、緩衝液のリン酸塩濃度をハイドロキシアパタイトカラムが要求するレベルに設定すること、ならびにキレート剤（例、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩）を入れないことが適している場合がある。平衡化緩衝液をその後の分画方法との継続性に関して選択する任意のケースでも、低ｐＨ・低電導度条件を一般的に評価して、精製能力が本工程で犠牲とならないことを確保する。
【０１１３】
任意の特定の理論に縛られるものではないが、本方法は、サンプル組成にほぼ独立していると考えられる。結果として、ある実施形態では、サンプルは、ウイルス−夾雑物複合体の解離を向上するための各種薬剤を個々別々または組み合わせて含む場合がある。
【０１１４】
サンプル中のウイルスが上記解離剤で事前に処理されるか、または、本方法が未精製細胞培養上清のサンプルで実施されるような実施形態では、本方法の実行性は、実質的な二次的機能性と合わさった負帯電多孔性粒子を使用することにより向上可能である。例には、二次的機能性を意図的に組み合わせた、正電荷を合体させた多孔性粒子系市販クロマトグラフィー製品が含まれる。そのような媒体は、一般的に混合モードと呼ばれる。Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥヘルスケア）およびＮｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅ（バイオ・ラッド）は、疎水性相互作用、Π−Π結合、および水素結合に関与する能力を付与する機能性と正電荷を組み合わせた市販混合モードクロマトグラフィー製品の例である。同様の組み合わせが文献において知られていて、別の市販品も期待可能である。平衡化緩衝液の処方を、二次的機能性による滞留または遅延を阻止するために、改変する必要がある場合があることが、当業者には明らかである。Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、Ｎｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅの場合、例えば、陽イオン交換のために販売されているクロマトグラフィー媒体に要求されるよりも高いｐＨおよびより高い電導度で操作することが必要な場合がある。別のクラスのいわゆる多モード負帯電媒体には、いわゆる固定金属親和性クロマトグラフィーリガンド（ＩＭＡＣ）（例、イミノ二酢酸またはニトリロ酢酸）が含まれる。二次的機能性を含ませることは、しかしながら、サンプル組成に関わらずサンプルを適応させる本発明の能力を損なわない。このことは、高電導度のサンプル存在下で分画が全くできない標準的フロースルー法および結合−溶出法との、基本的且つ重要な差異である。
【０１１５】
サンプルが上記組成物を含むある実施形態では、多孔性電気陰性粒子と二次的化学機能性を合体させた異なる粒子とを組み合わせ、および、同一カラムに二つ又は数種類の粒子タイプを充填することがまた有用である場合がある。二次的機能性を保持する粒子は、多孔性であっても非多孔性であってもよい。上記した様に、本方法はサンプル組成から独立している。同様に、平衡化条件を、抗体と二次的機能性の間の相互作用を維持しない必要性により限定してもよい。例えば、もし、正電荷機能性を保持する粒子が存在し、特定のウイルスがそのような電荷に結合する傾向が強い場合、ｐＨを減少させ及び／又は電導度を増加させることが必要であるケースがある。上記ケースでの好ましい妥協点は、一又は複数の二次的機能性を含めることにより精製度をより高めることができることである。
【０１１６】
多孔性電気陰性粒子と二次的機能性を合体させた別の粒子と組み合わせるある実施形態では、後者の粒子を、電気陰性粒子床の上に積層するか、または、電気陰性粒子カラムの直前もしくは直後に配設される場合がある別のカラムに充填してもよい。いくつかの実施形態では、多孔性電気陰性粒子と二次的機能性を保持する別の粒子とを混ぜる。
【０１１７】
ある別の実施形態では、二次的粒子を潜在的に問題のある夾雑物を除去する前にサンプルに直接加えて、部分的に精製したサンプルをその後カラムと接触させるように、その粒子をその後、サンプルから分離して、本発明を実施してもよい。
【０１１８】
特定のウイルスの精製を最適化するために粒子混合物を開発する際、ｐＨ制御を向上し、および／またはカラムを所望の操作ｐＨに設定するのに必要な緩衝液量を削減する能力に従って、二次的機能性を代替的または追加的に選択してもよい。例えば、陰イオン交換体は、電導度の上昇にさらされた場合、制御不能な一時的なｐＨ増加を起こすことが知られている。陰イオン交換体は、電導度が減少すると、制御不能な一時的なｐＨ減少を起こす。これらの効果の大きさと持続時間は、工程間の電導度差異、交換体の荷電特性、および緩衝能力に伴って変化する。陽イオン交換体も同様の問題を受けるが、制御不能なｐＨ移動域の方向は陰イオン交換体に起こるものと逆である。一次的電気陰性機能性と二次的電気陽性機能性を組み合わせることは、従って、ｐＨ移動域の大きさと持続時間を減少させる。理想的な機能性の混合は、実験により容易に決定可能である。
【０１１９】
電気陰性粒子と異なる機能性を有する別の粒子を使用し、これらの異なる粒子が電気陰性粒子と混ぜ合わせられるか又は電気陰性粒子に先行するカラムに充填されるかする実施形態では、電気陰性粒子のみからなるカラムに添加されるであろう量から減らして初期サンプル量を調整し、ウイルスがカラムを通過する際に拡散するにしたがうウイルスの分散の結果起こるサンプル量の増加に対応することが必要になる場合がある。初期サンプル量の必要な減少度は、必要であれば、簡単な実験（評価基準は平衡化緩衝液中でウイルスを溶出することであるもの）により容易に決定可能である。
【０１２０】
ある実施形態では、本方法が負帯電多孔性粒子の他の応用例と違うのは、その有効性がサンプル添加直後に添加される緩衝液組成に独立していることである。多くの例では、サンプル添加の直後に、多孔性粒子に結合した物質を完全に溶出することを意図する緩衝液組成物を添加することが有利である。例えば、カラムを、２５ｍＭアセテート（ｐＨ４．５）に平衡化してもよい。１．０Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）を含むウイルス含有細胞培養上清を、カラム容量の３５％の容量で添加し、その後、２Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）を添加する。実質的に精製されたウイルスがアセテート緩衝液中に溶出する。このことが起こるのは、上記した様に、ウイルスが粒子間空間を専ら通過し、一方で、チェース（追いかける）緩衝液はその粒子内孔空間を通過しなければならないからだ。この方法の注目すべき特徴は、この方法が、処理サイクルを短縮、つまり処理時間と材料使用量を削減するという実際的利益とともに、夾雑物を溶出し同時にカラムを洗浄するユニークな能力を支持することである。このことは、大型カラム上で単回サイクルを実行するよりむしろ、小型カラム上で複数回サイクルを実行することを魅力的にし、さらに材料使用量を削減することになる。
【０１２１】
ある実施形態では、サンプル後に平衡化緩衝液または電導度のより低い緩衝液（例、２０ｍＭアセテート（ｐＨ４．０））を添加するのが有利である場合がある。その明白な目的（例、ウイルスのため）は、電気陰性多孔性粒子の平均孔直径よりも大きい流体力学的サイズを有する酸性夾雑物の滞留を促進することである。なぜなら、これら夾雑物は、ウイルスの境界域後端でさもなくば溶出する可能性があり、潜在的にウイルスに、過剰且つ不必要な程度混入する場合があるからだ。カラムに含まれる電気陽性粒子が増加するであろう程度で、この増加は電気陰性夾雑物の除去を促進する場合もある。低電導度のチェース緩衝液の理想的量は、充填カラム容量の約５０％で検討を始めることで、実験的に決定可能である。
【０１２２】
ある実施形態では、本方法は、多孔性粒子のクロマトグラフィーに関して一般的に使用されるよりも早い流速を支持する。なぜなら、ウイルスは、物質輸送が対流的である粒子間空間を専ら通過し、従って、ウイルスの拡散が遅いことや、流速またはサンプル粘度にも影響を受けないからである。従って、本方法は、５０〜１００ｃｍ／ｈｒ以下で実施される通常の多孔性粒子クロマトグラフィー操作に対して、１０００ｃｍ／ｈｒ以上までの線流速で効率よく実施可能である。３００ｃｍ／ｈｒを超える流速は、しかしながら、サンプル量を減らすことが必要である場合がある。なぜなら、孔に侵入可能な夾雑物の物質輸送は拡散的で、流速またはサンプル濃度が増加するにつれ効率が悪くなるからだ。過剰な流速は、夾雑物が多孔性粒子の孔と拡散平衡を達成する機会を減少させる。実験により、任意の所定のウイルスの理想的流速及び緩衝液組成物セットが明らかになる。
【０１２３】
電気陰性多孔性粒子が他の表面化学を保持する多孔性粒子のカラム中に合される実施形態では、最大サンプル量を電気陰性粒子のみの容量に基づいて決定することが一般的に有益である。それでも、実験的に最大サンプル量を決定することが賢明である場合がある。なぜなら、電気陰性表面を欠く粒子の存在は、カラム内のサンプルを希釈する効果を有する可能性があるからだ。
【０１２４】
ある実施形態では、電気陰性以外の表面化学を保持する粒子を、電気陰性粒子カラムと直列に配設する別のカラムに充填する場合がある。そのような構成では、他の化学の粒子を電気陰性粒子とともに同じカラム中に混合する状況に関して議論したものと同じ注意点が適用可能である。
【０１２５】
ある実施形態では、本明細書中に開示される方法は、サンプル調製後の初期精製工程のために使用可能である。他の実施形態では、本方法は、中間精製に使用される場合があり、または、最終精製に使用される場合もある。当業者に明らかであるのは、本方法が処理の最終工程として使用されない任意のケースでは、本方法が、夾雑物の削減と同時にサンプルの緩衝液交換する能力によって、処理全体の継続性を促進する能力を持っていることである。
【０１２６】
ある実施形態では、本発明は他の精製法と合わせて実施してもよい。具体的には、本発明が任意に組み合わされて使用可能なのは、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、優先排除（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、他の型のクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、あるいは生体親和性クロマトグラフィーである。また、析出法、結晶化法、超遠心分離法、および水溶性二相分離法と合わせて使用してもよい。
【０１２７】
処理済みウイルスを得た後、カラムの内容物は破棄可能である。代替的に、カラムを、高濃度の塩で洗浄し、その後、再平衡化により元の状態に復帰させ、さらなるサイクルに使用してもよい。カラムは、また、適切な薬剤（例、水酸化ナトリウム）で殺菌して衛生的にする場合もある。
【０１２８】
ある実施形態では、本発明を、処理量を増加させるために、機械化および自動化する場合がある。そのようなある実施形態では、例えば、本方法は、模擬移動床クロマトグラフィーを実施するために使用される等の自動化マルチカラムシステムを含む場合がある。
【実施例】
【０１２９】
実施例１：本発明を実施するための、適切なクロマトグラフィー媒体の同定
一連のクロマトグラフィー媒体（Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＰＯＲＯＳ  Ｓ、Ｎｕｖｉａ  Ｓ、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、およびＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓ）を、本方法を実施するために評価した。各々を、以下の様に調製した。４０ｍＬの５０％スラリーを、直径１．６ｃｍのカラム中に、線流速３００ｃｍ／ｈｒで充填した。これにより、床の高さは約１０ｃｍとなった。床の圧縮を避けるために、フローアダプタを床の表面に慎重に下ろした。サンプル添加用のいわゆるスーパーループをも配設したクロマトグラフィー装置に、そのカラムを配設した。カラムを、２５ｍＭのアセテート、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．０）を用いて、線流速２００ｃｍ／ｈｒで平衡化した。カラム容量（５ｍＬ）の２５％のサンプル（部分精製されたバクテリオファージＭ１３を含むもの）量を添加し、その後、平衡化緩衝液を添加した。ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  ＳおよびＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓ以外のすべての媒体は、許容できない結果（大量のウイルスがボイド容量に分画されないという形態）であった。ところで、有意な割合部分が、サンプル緩衝液中に溶出し続けた。９０％より多いウイルスが、両方のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ媒体で、ボイドに分画された。はっきりとしたサンプル境界が本発明の最善の実施に必要不可欠であるので、スーパーループを介するサンプル添加を強調することが重要だ。スーパーループ以外の器具またはシステムがサンプル添加に採用可能である。しかし、全てのケースにおいて、サンプルがカラムに入っていく際にサンプル量が適切に少量になることを確保するために、サンプル境界でできるだけ分散が起こらないように注意しなければならない。
【０１３０】
実施例２：ウイルスの安定性を維持するための適切な条件の同定
カラムを異なる様々なｐＨ値（５０ｍＭアセテート（ｐＨ４．０）、２５ｍＭアセテート、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ４．５）、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、および５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０））で平衡化した以外は、実施例１と同じ構成でＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ上で、実験した。ｐＨ４．０および４．５での実験は、サンプル−塩−溶出において第二ピークがあるのを明らかにし、それは、損傷したウイルスによるものであると我々は解釈した。その第二ピークは、より高いｐＨ値では観察されなかった。追加実験を、ＮａＣｌ量を増加させながらｐＨ４．０および４．５で行い、塩が低ｐＨ値の悪影響を和らげるかどうかを確認した。塩が和らげることはなかったので、４．５以下のｐＨ値は、このウイルスを使った本方法の実施に不適当であることを示している。
【０１３１】
実施例３：ウイルス精製条件の同定
ｐＨ５および７でＮａＣｌ濃度を変えながら行った実験は、ウイルスＭ１３が、全てのこれらの条件下でボイド容量に分画されることを示した。しかし、このことは、精製能が同じであることを示さない。なぜなら、カラムに結合可能な宿主細胞タンパク質および他の夾雑物の割合は、ｐＨおよび電導度の一次関数となるからだ。具体的には、ｐＨおよび電導度が低くなれば低くなるほど、電気陰性表面に結合することになる夾雑物種の多様性が大きくなる。また、換言すると、ウイルスが許容する最も低いｐＨおよび塩濃度は、ほとんどの夾雑物を結合させる結果になると考えられる。宿主タンパク質は、ｐＨ５で９９．３％減少するが、ｐＨ７．０（ＮａＣｌの存在しない緩衝液）ではたった２７％である。
【０１３２】
実施例４：本発明の前に陰イオン交換クロマトグラフィーをすることによる、バクテリオファージＭ１３の２工程ウイルス精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培地のウイルス含有溶液を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）２部を加えることで３倍に希釈した。そして、溶液を、流速５０ｍＬ／ｍｉｎで、８ｍＬの放射状流ＱＡ（陰イオン交換）モノリス上にロードした。ロード後、モノリスを平衡化緩衝液で洗浄し、非結合タンパク質と他の夾雑物を取り除いた。そのモノリスを、１ＭのＮａＣｌへの直線塩勾配で溶出した。ウイルスは、約０．４ＭのＮａＣｌで溶出した。ＤＮＡ残渣は、約０．６ＭのＮａＣｌで溶出した。宿主細胞タンパク質のＥＬＩＳＡにより、夾雑タンパク質が約９５％減少したことが分かった。サンプルを改変せずに、溶離液を、カラム容量の３０％に相当する量で、２０ｍＬのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓカラムに添加した。カラムを事前に２０ｍＭのクエン酸塩液（ｐＨ５．０）で平衡化し、サンプルをロード後に同じ緩衝液でチェース（追跡）した。ウイルスは、クエン酸塩緩衝液のボイド画分中に溶出した。夾雑物は、後にカラムを通過したサンプルの塩と共に溶出した。宿主細胞タンパク質のＥＬＩＳＡは、供給材料から宿主細胞タンパク質が９３％減少したことを示し、それは、上記２工程を通して９９％を超える化合物減少の量に相当する。
【０１３３】
実施例５：分画と同時にカラム再生を実現するサンプル緩衝液の改変
電導度が約１５ｍＳ／ｃｍの未精製ウイルス（バクテリオファージＭ１３）のサンプルを、事前に２０ｍＭクエン酸塩液（ｐＨ５．０）に平衡化してあったＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラム上にロードした。塩化ナトリウムを別のサンプルに、終濃度２Ｍとなるように加え、電導度が約１７０ｍＳ／ｃｍとなるようにした。ウイルスは、添加サンプルの塩濃度に関わらず、クエン酸塩緩衝液のボイドピーク中に溶出した。サンプルの塩のピークが有する高い電導度により、カラムに結合していた酸性夾雑物が溶出し、そして、次のサイクルに掛ける前に洗浄工程として高塩濃度緩衝液を添加する必要性がなくなった。
【０１３４】
実施例６：より高い精製度を実現する目的に向けての、ウイルスと夾雑物との間の非特異的複合体の解離を支持するサンプル緩衝液の改変
乾燥尿素を、終濃度３Ｍとなるように、ＯＨモノリス由来の溶離液に加え；乾燥ＮａＣｌを、終濃度３Ｍとなるように加え；５００ｍＭのＥＤＴＡ保存液から、ＥＤＴＡを終濃度１０ｍＭとなるように加えた以外は、実施例５の方法を繰り返した。非特異的水素結合および疎水性相互作用を解離するために、尿素を加えた。非特異的静電相互作用を解離するために、ＮａＣｌを加えた。ウイルスから金属イオンを解離するためにＥＤＴＡを加えた。実施例５に記載されるように、サンプルをＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラムに加えた。ウイルスは、尿素、ＮａＣｌ、およびＥＤＴＡ不含有の２０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）のボイド画分に溶出した。
【０１３５】
実施例７：分画条件の決定
バクテリオファージＴ４を、５０ｍＭアセテート（ｐＨ４．５）で平衡化したＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓカラムに添加した。サンプル量は、カラム容量の１０％であった。ウイルスはカラムに結合した。そのことは、ウイルスの等電点が約４．５であるにも関わらず、露出される正帯電基の存在を示す。同じ緩衝液に１５０ｍＭのＮａＣｌをプラスしたものに平衡化されたカラムを用いて、実験を繰り返した。ウイルスは、ボイド容量に分画された。このことは、ウイルスが、ボイド容量に分画されるために荷電によってはじかれる必要がないことを実証する。その誘引力が無効化（このケースではＮａＣｌによる）される条件下で添加される必要があるだけである。また実証されるのは、ウイルスのΠが、ウイルス表面上の荷電分布に従属していることである。もし、荷電が表面上に無作為に分布していたならば、バクテリオファージＭ１３のように、ｐＨ４．５でバクテリオファージＴ４は分画されたはずである。バクテリオファージＴ４が結合したという事実は、そのウイルス上の負電荷の逆の影響にも関わらず、交換体にｐＨ４．５で結合することができる正電荷クラスターの存在を示す。
【０１３６】
実施例８：カラムに充填される多モード電気陰性粒子上のウイルスのボイド分画
５ｍＬの純度９５％のバクテリオファージＭ１３を、２０ｍＬのＮｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅカラムに添加した。この材料は、陽イオン交換を二次的疎水性機能性と組み合わせたものとして、製造元により説明されている。一つの実験では、２５ｍＭのアセテート、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．０）を用いてｐＨ５．０に、カラムを平衡化した。約４０％のウイルスがカラムのボイド画分に溶出したが、残りはサンプルの塩と共に溶出した。実験を、平衡化緩衝液に２０ｍＭのＮａＣｌを加えたもので繰り返した。約９０％のウイルスがカラムのボイド画分に溶出し、残りはその後すぐに追うようであった。実験を、５０ｍＭのＮａＣｌで繰り返した。９５％を超えるウイルスが、カラムのボイド画分に溶出した。別のシリーズの実験を、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）中で、塩がないものと２０ｍＭのＮａＣｌが存在するもののそれぞれで実行した。塩の非存在下では、ウイルスはボイド画分に部分的にのみ溶出したが、２０ｍＭのＮａＣｌ中では、９８％を超えるものがボイド容量に分画された。別の実験を２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）で実行した。約９８％のウイルスが、ボイド画分にあった。このシリーズの実験は、ｐＨと電導度の相互作用およびウイルスをボイドへ排除する挙動への効果を説明する。さらに、適正なｐＨおよび電導度条件が同定可能な開発経路を説明する。参考として、同一サンプルを、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓカラムに添加した。ウイルスは、ＮａＣｌの非存在下にてｐＨ５．５でボイド画分に排他的に溶出した。
【０１３７】
実施例９：多モード負帯電多孔性粒子カラムの比較
実施例８の実験を延長して、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣを充填したカラムを含めた。Ｎｕｖｉａ  ｃＰｒｉｍｅは、ウイルスがボイド画分に完全に溶出するために２０ｍＭを超えるＮａＣｌを必要としたが、ＭＭＣは、２０ｍＭのＮａＣｌ中で完全な分画を実現した。しかし、ＭＭＣは、ＮａＣｌの非存在下では、分画を達成することはできなかった。
【０１３８】
実施例１０：ある充填粒子の負帯電カラムの不適正さの実証
実施例８および９の実験を延長して、Ｎｕｖｉａ  Ｓを充填したカラムを含めた。ウイルスは、単一ピークとして溶出したが、そのピークの最初の３５％のみしか、ボイド容量中になかった。残りは、サンプルの塩のピークと共溶出した。このことは、様々な負帯電クロマトグラフィー媒体のなかで異なる性能があることを説明し、適切な媒体を同定するためには実験が必要であることを強調する。
【０１３９】
カラム容量に比するサンプル量が重要であることを鑑みると、当業者は、サンプル境界でサンプルの分散が制御不能にならないようなやり方でサンプルを添加することの重要性を認識する。なぜなら、サンプルをカラムに入れる前に、サンプル量が意図せずに増加してしまう効果を有することになるであろうからだ。サンプル境界での分散を特に回避するスーパーループと呼ばれる器具によって、上記実施例の全てにおいてサンプルを添加した。
【０１４０】
本発明を他の精製方法と組み合わせて、よりハイレベルな精製を実現してもよい。そのような他の精製方法の例は、限定はされないが、ウイルスの精製に一般的に使用される他の方法（例、超遠心分離、限外濾過、密度勾配濾過、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定金属アフィニティークロマトグラフィー、および別の混合モードクロマトグラフィー法）ならびに析出法、結晶化法、および液−液抽出法を含む。各種方法のために適切な条件を開発し、それらを本明細書中の本発明と一体化して、特定のウイルスの必要な精製を実現することは、当業者の理解の範囲である。
【０１４１】
本明細書中に引用したすべての参考資料は、あらゆる目的のために参照により完全に組み込まれる。その程度は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が、あらゆる目的のために完全に参照により組む込まれることが、具体的に且つ個々に示されたと同じである。参照により組み込まれた刊行物および特許または特許出願が、本明細書中に含まれる開示と矛盾する場合は、本明細書が、任意のそのような矛盾する題材に取って代わり及び／又は優先することが意図される。
【０１４２】
本明細書および特許請求の範囲に使用される成分およびクロマトグラフィー条件等の量を表わす全ての数値は、用語「約」により全ての例で修飾されるものと理解される。従って、そのでないと明記されない限り、本明細書および添付された特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明により得られようとする所望の性能に依存して変化する場合がある近似値である。
【０１４３】
本発明の多くの改変例やバリエーションは、その精神と範囲から逸脱しないようになすことができ、それらは当業者には明らかである。本明細書中に記載される具体的実施形態は、例としてのみ提供されるものであり、いかなるやり方でも限定することを意味していない。本明細書および実施例は、例示的なものとしてのみ考慮されることが意図され、本発明の真の範囲と精神を、以下の特許請求の範囲により示す。