(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IGFBP3/TMEM219軸のインヒビター及び薬学的に許容される担体を含む、糖尿病の治療及び/又は予防における使用のための医薬組成物であって、前記インヒビターが、受容体TMEM219の断片であり、前記断片が、TMEM219の細胞外ドメインを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記インヒビターがecto-TMEM219である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記インヒビターが可溶性である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記インヒビターがペグ化されている、請求項1から3のいずれ一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
IGFBP3/TMEM219軸のインヒビター及び薬学的に許容される担体を含む、糖尿病の治療及び/又は予防における使用のための医薬組成物であって、前記インヒビターが、請求項1から3のいずれか一項に定義される受容体TMEM219の断片をコードするポリヌクレオチドである、医薬組成物。
【請求項６】
IGFBP3/TMEM219軸のインヒビター及び薬学的に許容される担体を含む、糖尿病の治療及び/又は予防における使用のための医薬組成物であって、前記インヒビターが、請求項5に定義されるポリヌクレオチドを含む又は前記ポリヌクレオチドを発現するベクターである、医薬組成物。
【請求項７】
IGFBP3/TMEM219軸のインヒビター及び薬学的に許容される担体を含む、糖尿病の治療及び/又は予防における使用のための医薬組成物であって、前記インヒビターが、請求項1から3のいずれか一項に定義される受容体TMEM219の断片又は請求項5に定義されるポリヌクレオチドを発現する、遺伝子工学的に作出された宿主細胞である、医薬組成物。
【請求項８】
前記糖尿病が、1型又は2型糖尿病である、請求項1から7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
対象が、1型及び/又は2型糖尿病を発症するリスクがある対象、初期段階の1型及び/又は2型糖尿病を有する対象からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
治療剤を更に含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療剤が、任意の形態のインスリン、プラムリンチド(Symlin)、アンジオテンシン変換酵素(ACE)インヒビター、又はアンジオテンシンII受容体遮断薬(ARB)、アスピリン、コレステロール降下薬、メトホルミン(Glucophage、Glumetzaなど)、スルホニルウレア剤(グリブリド(DiaBeta、Glynase)、グリピジド(Glucotrol)及びグリメピリド(Amaryl)、メグリチニド(例えば、レパグリニド(Prandin)及びナテグリニド(Starlix))、チアゾリジンジオン(例えば、ロシグリタゾン(Avandia)及びピオグリタゾン(Actos))、DPP-4インヒビター(シタグリプチン(Januvia)、サキサグリプチン(Onglyza)及びリナグリプチン(Tradjenta))、GLP-1受容体作動薬(エキセナチド(Byetta)及びリラグルチド(Victoza))、例としてカナグリフロジン(Invokana)及びダパグリフロジン(Farxiga)を含むSGLT2インヒビターからなる群から選択される、請求項10に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の発現におけるIGFBP3/TMEM219軸(IGFBP3/TMEM219 axis)の役割、並びに糖尿病の治療及び/又は予防のためのIGFBP3/TMEM219軸インヒビターの関連する使用に関する。本発明は、1型及び/又は2型糖尿病を発症するリスクがある対象を識別する方法、並びに関連するキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
胃不全麻痺、腹部膨満、過敏性腸症候群、及び便失禁からなる胃腸の障害は、1型糖尿病(T1D)の個体において一般的である(1993)。実際、遷延性T1Dを有する個体は、末期腎疾患(ESRD)を含むいくつかの糖尿病合併症に一般的に罹患するが(1993;Atkinsonら、2013;Fiorinaら、2001)、その最大80%が腸症状を示す。糖尿病性腸疾患(DE)として知られているこのような胃腸症状が存在すると、生活の質が有意に低下し(1993;Atkinsonら、2013;Camilleri、2007;Talleyら、2001)、またその病因もほとんど不明である(Feldman及びSchiller、1983)。前臨床試験により、糖尿病の齧歯類において腸粘膜形態の顕著な乱れが明らかとなり(Domenechら、2011;Zhaoら、2003)、T1Dでは腸のホメオスタシスが変化し得ることが示唆される;但し、ヒトでは入手可能なデータはほとんど存在しない。腸上皮は、腸幹細胞(intestinal stem cell)及びそのニッチにより維持され、生理学的ストレス及び環境被害に反応する(Barker、2014;Medema及びVermeulen、2011)。大腸の陰窩基底部に位置し、マーカーの中でもとりわけエフリンB受容体2(EphB2)、ロイシンリッチ反復領域を含有するGタンパク質共役型レセプター5(leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5)(LGR5)、h-TERT、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Aldh)を発現する結腸幹細胞(CoSC)(Carlone及びBreault、2012;Carpentinoら、2009;Jungら、2011;Sato及びClevers、2013)は、局所的微環境と共にCoSCニッチを構成する(van der Flier及びClevers、2009;Zekiら、2011)。最近の試験では、腸のホメオスタシスの多くの特徴を取り戻し、また自己再生性の正常で大型の陰窩オルガノイドをin vitroで生成する条件、又はいわゆる「ミニ・ガット(mini-gut)」を確立した(Sato及びClevers、2013)。全身的因子、例えば循環性ホルモン等が、CoSCの制御に役立っているかどうかについてはまだ立証されていない(Stange及びClevers、2013)。
【０００３】
胃腸の障害、特に糖尿病性腸疾患の治療には、下痢、腹痛、便秘、及び消化不良のための対処療法薬(symptomatic drug)及び緩和薬物治療が含まれる。糖尿病性腸疾患で利用可能な特別な療法は、今日まで存在しない。
【０００４】
胃腸の障害、特に糖尿病性腸疾患の診断には、結腸内視鏡検査、胃内視鏡検査、肛門直腸内圧測定、食道内圧測定、及び糞便試料分析、末梢がんマーカー(すなわち、CEA、Ca 19.9、α-フェトプロテイン、Ca125)、及びセリアックマーカー(celiac marker)の評価が含まれる。上記方法のいずれも、糖尿病性腸疾患について確診を提供する能力を有さない。
【０００５】
国際公開第2011133886号及び同第2007024715号は、IGFBP3結合抗体型の治療複合物について開示する。
【０００６】
国際公開第0187238号は、特に結腸がん治療用として治療上有効なTMEM219を含む、抗がん医薬組成物に関する。
【０００７】
国際公開第2014089262号は、慢性炎症性(肥満)障害(特に、炎症性の腸疾患、例えばUC及びクローン病及び結腸がん等)に関する診断マーカーとしてのIGFBP3の使用について開示する。
【０００８】
米国特許第6066464号は、紙である固体支持体上でIGFBP3を検出するための免疫測定法に関する。
【０００９】
国際公開第2013152989号は、結腸直腸がんに関するバイオマーカーとしてのIGFBP3の使用に関する。
【００１０】
国際公開第0153837号は、腫瘍マーカーの組み合わせ及びIGF軸(IGF axis)の少なくとも1つの成分を測定する工程を含む、疾患状態をモニタリング又は診断する方法について開示する。IGFBP3が、結腸腫瘍のマーカーとして提案される。
【００１１】
1型糖尿病(T1D)は、インスリン産生膵臓β細胞の破壊を引き起こす、T細胞が媒介する自己免疫疾患と従来みなされてきた(Bluestoneら、2010;Eisenbarth、1986)。この考え方によれば、開始因子が自己抗原に対する免疫応答を引き起こす契機となり、その後、新たに活性化された自己反応性T細胞が、膵島及びインスリン産生β細胞を標的とし、更に破壊する(Bluestoneら、2010)。β細胞の破壊は自己免疫性の攻撃によりもっぱら決定づけられるのか、又はその他の機構、例えばパラクリン調節、代謝調節解除、非免疫性β細胞のアポトーシス、及びβ細胞再生停止等がT1Dの病因に寄与するのか、現在議論の的となっている(Atkinson及びChervonsky、2012;Atkinsonら、2015)。近年、環境因子、特にウイルス感染症が、T1Dにおいて自己免疫応答を開始するのに必要とされることが観察されており(Filippi及びvon Herrath、2008)、また腸微生物叢の影響に関する試験では、エンテロウイルスが、自己反応性T細胞の活性化に関与していることが判明した(McLeanら、2015)。現在行われている試験では、その他の環境上のリスク因子、例えば食事、新生児期のミルク及びグルテンへの曝露、及び離乳年齢等についても注目し、T1Dの病因を試験するための新規アプローチが徐々に出現していることが示唆され(McLeanら、2015)、したがって遺伝的要因がT1Dの唯一の決定要素とはもはやみなされない(Alperら、2006)、(oilinkiら、2012)。
【００１２】
更に、免疫療法戦略は、過去10年間においてT1Dの治癒を確実にするための主要な概念とみなされてきたが、その有効性も今日疑問を呈する(Ben Nasrら、2015a)。免疫抑制療法又は制御促進性の治療法を使用して自己免疫応答を標的とする戦略は、齧歯類では良好であることが明らかにされたが、そのような戦略では、それとは裏腹に、T1Dの個体においてインスリン非依存性を実現した人数は無視し得る程度であった(Atkinsonら、2015)。動物モデルとヒトとの間の差異を際立たせると共に、これらのデータは、免疫反応の研究では、末梢で生ずる免疫事象が主たる調査対象であったが、膵島、特にβ細胞内で生ずる疾患プロセスに関してほとんど未知であるという事実も明確にした。こうしたことから、T1Dにおけるβ細胞喪失の開始/促進に関与する新規要因の発見が、重要な価値を有するであろう。そのような発見は、疾患のごく最初の段階で停止させる、又はそれを遅延させる能力を有する新規治療アプローチの道を開く可能性がある。したがって、T1D及びT2Dに対する代替的治療ニーズがなおも存在する。
【００１３】
国際公開第2008153788号は、インスリン抵抗性又はTD2を治療するために、IGFBP3を阻害する、又はそのレベルを低下させる方法について主張するが、その場合のインヒビターは、IGFBP3 mRNAに対して相補的な核酸、又はIGFBP3に結合する抗体の抗IGFBP3である。該文献は、IGFBP3/TMEM219軸について何も記載していない。
【００１４】
Muzumdarら(Muzumdarら、2006)は、IGFBP3は、中枢機構を通じてインスリン拮抗薬として作用し、末梢グルコースの取り込み低下を引き起こすことを開示する。この文献は、IGFBP3/TMEM219軸の阻害について開示していない。
【００１５】
国際公開第9739032号は、糖尿病を治療するためのIGFBP3インヒビターの使用について主張するが、その場合のインヒビターは、IGFBP3がIGF-1に結合するのを阻止する。IGFBP3/TMEM219軸の阻害については検討されていない。D'Addioら(2015)は、eco-TEM219が、循環性IGF-I/IGFBP3のレベルを正常化することを示唆する。
【００１６】
国際公開第2007024715号は、工学的に作出された多価多重特異性結合タンパク質、すなわちデュアル可変ドメイン免疫グロブリンの使用に関し、同タンパク質は、単一の中間リンカーを使用して、2つの異なる抗原又は標的ペプチドに結合し、また二重特異性である。該文献は、非常に多くの標的タンパク質の中でも、その他のファミリーメンバーと組み合わせたIGFBP3について記載する。
【００１７】
国際公開第2011133886号は、抗体及びその他の多量体タンパク質複合体、すなわち2つ以上の標的と特異的に結合する能力を有するヘテロ多量体タンパク質を生成する方法に関する。IGFBP3は、有望な標的を代表し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第2011133886号
【特許文献２】国際公開第2007024715号
【特許文献３】国際公開第0187238号
【特許文献４】国際公開第2014089262号
【特許文献５】米国特許第6066464号
【特許文献６】国際公開第2013152989号
【特許文献７】国際公開第0153837号
【特許文献８】国際公開第2008153788号
【特許文献９】国際公開第9739032号
【特許文献１０】米国特許第3,773,919号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol、A.編(1980)
【非特許文献２】Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、2000、Marck Publishing Company社、Easton、Pennsylvaniaのパート5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
結腸上皮及び結腸幹細胞(CoSC)のホメオスタシスを制御するために、全身的要因が役立っているかどうか、なおも不明確なままである。本発明者らは、循環性の「ホルモン性」ダイアドが、CoSCを制御し、また遷延性1型糖尿病(T1D)において破壊され、糖尿病性腸疾患(DE)を引き起こすものと仮定する。遷延性T1Dを有する個体は、腸粘膜及びCoSCの異常を示し、in vitroでのミニ・ガットを生成することができなかった。血清プロテオミクスプロファイリングにより、高血糖が媒介するIGFBP3の肝臓放出量増加のエビデンスにより、遷延性T1Dの個体において、インスリン様増殖因子1(IGF-I)及びその結合タンパク質-3(IGFBP3)の循環レベルが変化していることが判明した。IGFBP3は、TMEM219依存性/カスパーゼ媒介型IGF-I非依存性の効果により、in vitroでのミニ・ガットの増殖を阻止し、また前臨床モデルでは、in vivoにおいてCoSCを破壊した。遷延性T1Dにおける腎膵移植による正常血糖修復、及び糖尿病マウスにおけるecto-TMEM219組換えタンパク質による治療では、IGF-I/IGFBP3の循環レベルが適切なレベルに修復することにより、CoSCが再構築された。末梢IGF-I/IGFBP3ダイアドは、CoSCを制御するが、またDEでは機能不全状態にある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本明細書では、本発明者らは、遷延性T1D及びDEを有する個体では、CoSCが変化しており、またIGFBP3レベルの増加を示すことを実証する。DEの前臨床モデルにおいてIGFBP3を投与すると、循環性IGF-Iが消失することにより、及びCoSCに対してTMEM219依存性/カスパーゼ媒介型の毒性効果を発揮することにより、CoSC再生特性、並びにin vitro及びin vivoでの粘膜形態が変化する。最終的に、IGFBP3受容体(TMEM219)の細胞外ドメインに基づく新規ecto-TMEM219組換えタンパク質を生成した。ecto-TMEM219は、末梢IGFBP3を消失させ、末梢IGFBP3がIGFBP3受容体であるTMEM219に結合するのを阻止する。したがって、そのようなecto-TMEM219組換えタンパク質を用いて、CoSC上で発現するIGFBP3を標的とすれば、in vitro及びin vivoでのIGFBP3の有害効果が抑制される。
【００２２】
本発明は、IGFBP3放出量は、T1D及びT2Dのリスクが高い個体では増加していることを示す、説得力のあるデータについて報告する。興味深いことに、本発明者らは、IGFBP3受容体であるTMEM219が、β細胞系内及びマウス/ヒト膵島上で発現していること、並びにそのIGFBP3によるライゲーションはβ細胞にとって有毒であり、内因性β細胞毒の存在の可能性を高めることを発見した。これは、特に膵島/β細胞の傷害が自己抗原の免疫細胞に対する曝露を促進する可能性がある初期段階において、β細胞毒[βトキシン]が、TD1の病因に関与しており、したがって局所的炎症環境を形成し、免疫反応を遷延させ得ることを示唆する。興味深いことに、著者らは前T2D及びT2Dの個体のいずれにおいてもIGFBP3レベルの増加を認め、この軸に対して役割を演じている可能性が、T2Dにおいても明白であることを示唆する。
【００２３】
本発明者らは、IGFBP3は、in vitroにおいて、カスパーゼ8に依存して、β細胞及びマウス/ヒト膵島のアポトーシスを誘発する可能性があることも認めた。最終的に、IGFBP3を消失させる能力を有する、TMEM219細胞外ドメインに基づく、新規に生成した組換えecto-TMEM219タンパク質は、膵臓β細胞上のTMEM219を経由するIGFBP3のシグナリングを阻止する。Ecto-TMEM219治療は、糖尿病(T1D及びT2D)のマウスモデルにおいて、in vivoでβ細胞の喪失を低下させ、膵島のインスリン含有量及び糖代謝制御を改善する一方、in vitroでは、IGFBP3で誘発されたアポトーシスから膵島及びβ細胞を保護する。本発明者らは、IGFBP3は、糖尿病(T1D及びT2D)のリスクが高い個体において大量に放出される内因性の末梢β細胞毒(又はβトキシン)であることを実証する。β細胞上でのIGFBP3受容体(TMEM219)が同時発現すると、β細胞死が開始/亢進し、したがって糖尿病の発現/進行が起こりやすくなる。
【００２４】
換言すれば、本発明は、IGFBP3/IGF-1非依存性の有害な効果を媒介するIGFBP3受容体のTMEM219は、膵島及びβ細胞上で発現している;更に、ecto-TMEM219を用いてIGFBP3/TMEM219軸を標的とすると、糖尿病マウスにおいて適切なIGFBP3シグナリングが再構築され、及びβ細胞の喪失が阻止され、及び膵島形態が維持され、これにより糖尿病におけるβ細胞の喪失に有利に働くIGFBP3/TMEM219軸の重要な役割が確認される、という所見に基づく。
【００２５】
IGFBP3/TMEM219軸の阻害に基づく本治療アプローチは、糖尿病の発症を引き起こすβ細胞の損傷と、その結果生ずるインスリン分泌の低下又は消滅を予防し得るので、T1D及びT2Dに対する現行療法の限界を克服し得る。
【００２６】
したがって、先行技術の治療法に対する本発明の利点として、
-β細胞及び膵島破壊の阻止、
-β細胞塊及びインスリン産生細胞の保護、
-主要な糖尿病合併症の予防、
-T1Dにおける、膵島に対する自己免疫攻撃の制限、
-T2Dにおけるインスリン抵抗性の予防、及び
-T1Dにおいて免疫療法が不要
が挙げられる。
【００２７】
したがって、本発明は、対象における糖尿病の治療及び/又は予防における使用のためのIGFBP3/TMEM219軸のインヒビターを提供する。
【００２８】
好ましくは、前記インヒビターは、
a)ポリペプチド、
b)前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はIGFBP3/TMEM219軸を阻害することができるポリヌクレオチド、
c)前記ポリヌクレオチドを含む、又は発現するベクター、
d)前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを発現する、遺伝子工学的に作出された宿主細胞、
e)小分子、
f)ペプチド、タンパク質、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、アンチセンス発現ベクター、若しくは組換えウイルス、又はIGFBP3/TMEM219軸を阻害することができる任意のその他の因子
からなる群から選択される。
【００２９】
好ましくは、前記インヒビターは、受容体TMEM219又はその断片である。
【００３０】
好ましくは、TMEM219の断片は、TMEM219の細胞外ドメインを含む断片である。
【００３１】
好ましい実施形態では、インヒビターは、ecto-TMEM219である。好ましくは、インヒビターは、可溶性である。
【００３２】
好ましくは、前記インヒビターは融合タンパク質TMEM219-Igであり、好ましくは、前記融合タンパク質は、循環性IGFBP3を消失させ、循環性IGFBP3がTMEM219に結合するのを阻止する。
【００３３】
好ましくは、インヒビターは抗IGFBP3抗体であり、好ましくは、前記抗体はTMEM219結合部位を選択的にブロックする。
【００３４】
好ましくは、前記インヒビターは抗TMEM219抗体であり、好ましくは、前記抗体は、TMEM219受容体のIGFBP3結合部位を占有し、したがってIGFBP3の結合を阻止する。
【００３５】
より好ましくは、前記インヒビターは、IGFBP3 mRNAに対して相補的なオリゴヌクレオチドである。
【００３６】
好ましい実施形態では、糖尿病は、1型又は2型糖尿病である。
【００３７】
なおも好ましくは、対象は、1型及び/又は2型糖尿病を発症するリスクがある対象、初期段階の1型及び/又は2型糖尿病を有する対象からなる群から選択される。
【００３８】
本発明は、本発明のインヒビター及び薬学的に許容される担体を含む、糖尿病の治療及び/又は予防における使用のための医薬組成物も提供する。好ましくは、医薬組成物は、治療剤を更に含む。
【００３９】
好ましくは、治療剤は、任意形態のインスリン、プラムリンチド(Symlin)、アンジオテンシン変換酵素(ACE)インヒビター又はアンジオテンシンII受容体遮断薬(ARB)、アスピリン、コレステロール降下薬、メトホルミン(Glucophage、Glumetzaなど)、スルホニルウレア剤(グリブリド(DiaBeta、Glynase)、グリピジド(Glucotrol)及びグリメピリド(Amaryl)、メグリチニド(例えばレパグリニド(Prandin)及びナテグリニド(Starlix))、チアゾリジンジオン(例えば、ロシグリタゾン(Avandia)及びピオグリタゾン(Actos))、DPP-4インヒビター(シタグリプチン(Januvia)、サキサグリプチン(Onglyza)及びリナグリプチン(Tradjenta))、GLP-1受容体作動薬(エキセナチド(Byetta)及びリラグルチド(Victoza))、例としてカナグリフロジン(Invokana)及びダパグリフロジン(Farxiga)が挙げられるSGLT2インヒビターからなる群から選択される。
【００４０】
本発明は、1型及び/若しくは2型を発症するリスクがある対象を識別する、又は対象の治療的処置に対する応答をモニターする方法であって、
a)対象から得た生体試料中のタンパク質IGFBP3の量、又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの量を測定する工程、
b)タンパク質IGFBP3の測定した量、又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの測定した量を、対照の量と比較する工程であって、前記測定した量が前記対照の量よりも高い場合は、前記対象は、1型及び/又は2型糖尿病を発症するリスクがある、工程
を含む方法も提供する。
【００４１】
好ましくは、IGFBP3の量は、抗体により測定される。
【００４２】
より好ましくは、生体試料は、血清、尿、細胞培養物上清からなる群から選択される。
【００４３】
本発明は、タンパク質IGFBP3の量を測定する手段、及び/又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの量を測定する手段、及び任意選択で本発明の方法で使用される対照手段(control means)を含むキットも提供する。
【００４４】
本発明では、IGFBP3/TMEM219軸を阻害することとは、例えば循環からIGFBP3を消失させることにより、IGFBP3のTMEM219への結合をブロックすることを意味するが、またTMEM219のIGFBP3結合部位をブロックすること、TMEM219上のIGFBP3結合部位をブロックすることも意味する。そのようなブロックは、TMEM219の機能及び/又は発現及び/又はシグナリングを阻害することを更に意味し、これは、例えば特にsiRNA又はオリゴヌクレオチドを用いてTMEM219の発現を停止させることにより実現し得る。また、IGFBP3の機能及び/又は発現を阻害することも意味する。
【００４５】
本発明によれば、TMEM219に結合するIGFBP3のインヒビターは、下記の分子のうちの1つであり得る:
・循環性IGFBP3を中和する可溶性Ecto-TMEM219(TMEM219の細胞外部分);
・TMEM219ペプチド又はその細胞外部分に直接結合した免疫グロブリンFcドメインから構成され、循環性IGFBP3を消失させ、循環性IGFBP3がβ細胞上で発現するTMEM219に結合するのを阻止する、Fcに基づく融合タンパク質である融合タンパク質TMEM219-Ig;
・TMEM219結合部位を選択的にブロックする抗IGFBP3抗体;
・TMEM219受容体のIGFBP3結合部位を占有し、したがってIGFBP3の結合を阻止する抗TMEM219抗体(IGFBP3に対して拮抗的活性を有する)
・IGFBP3 mRNAに対して相補的なオリゴヌクレオチド。
【００４６】
本発明では、治療され得る患者は、T1D(末梢抗膵島自己抗体、又は遺伝的素因若しくは家族性素因、又はβ細胞機能変化の存在に基づく自己免疫性糖尿病)、或いはT2D(糖尿病の診断基準を満たさないが、空腹時血糖の障害及び/又は耐糖能の障害というエビデンスに基づく非自己免疫性糖尿病)を発症するリスクがある個体、或いは疾患のいずれかの段階においてT1D又はT2Dを発症する個体、特に初期段階の1型及び/又は2型糖尿病を有する対象であり、β細胞が更に破壊されないように保護する目的を有する。保存されたβ細胞がある程度存在することが、治療の奏功法を評価する唯一の要件である。
【００４７】
IGFBP3の発現は、組織及び細胞上でのRT-PCR、組織及び細胞上でのウェスタンブロット、組織上での免疫組織化学検査、組織及び細胞上での免疫蛍光検査の各手段により測定され得る。生体液中のIGFBP3レベルは、免疫標的式アッセイ及びプロテオーム分析により測定可能である。
【００４８】
IGFBP3の機能は、RT-PCR、マイクロアレイを使用して標的細胞上でのカスパーゼ8及び9の発現を検出する手段により、汎カスパーゼインヒビター、カスパーゼ8及び9インヒビターと共に標的細胞/構造を同時培養し、生存細胞/構造を測定することにより測定され得る。
【００４９】
本発明では、「IGFBP3とその受容体TMEM219との相互作用を阻害又はブロックする」とは、循環性IGFBP3を消失させること、及び循環性IGFBP3が膵島及びβ細胞上で発現するTMEM219受容体に結合するのを阻止することを意味する。IGFBP3-TMEM219結合は、IGFBP3遮断抗体の使用によっても阻止され得る。更に、TMEM219遮断抗体はTMEM219受容体に結合し、したがってIGFBP3が循環から出現したときに、受容体の利用を不可能にする。
【００５０】
本発明のインヒビターは、受容体TMEM219(MGNCQAGHNLHLCLAHHPPLVCATLILLLLGLSGLGLGSFLLTHRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSRLLVLGSFLLLFCGLLCCVTAMCFHPRRESHWSRTRL、配列番号1)又はその断片であり得る。
【００５１】
特に、TMEM219の断片は、例えばIGFBP3がTMEM219に接近する、及び/又はそれに結合することをブロックする/阻止するように設計され、より小型の分子量を有し、ジスルフィド架橋を形成する5つのシステイン及び球形構造を含む。好ましくは、断片は、少なくともアミノ酸50個分の長さ、好ましくはアミノ酸100個分の長さ、なおも好ましくはアミノ酸120個分の長さ、いっそう好ましくはアミノ酸150個分の長さ、好ましくは少なくともアミノ酸160個分の長さである。
【００５２】
好ましい実施形態では、断片は、少なくともアミノ酸162、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235個分の長さである。好ましくは、断片は、TMEM219の配列と少なくとも65%の同一性、好ましくはTMEM219の配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%の同一性を有する。
【００５３】
好ましくは、TMEM219の断片は、TMEM219の細胞外ドメインの断片(ecto-TMEM219)であり、特に断片は、配列:
THRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR (配列番号2)
を含む。
【００５４】
好ましくは、TMEM219の断片は、TMEM219の細胞外ドメインであり、特に断片は、配列:
SFLLTHRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR (配列番号3)
を含む。
【００５５】
好ましくは、TMEM219の断片は、
THRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR (配列番号2)
からなる。
【００５６】
好ましくは、TMEM219の断片は、
SFLLTHRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR (配列番号3)
からなる。
【００５７】
本発明では、TMEM219は、好ましくは真核生物TMEM219、好ましくは哺乳動物TMEM219、なおも好ましくはヒトTMEM219である。
【００５８】
IGFBP3とTMEM219との相互作用は、標的細胞に対するIGFBP3の効果を間接的に評価する手段(RT-PCRによるカスパーゼ8及び9発現の増加)、液相又は固相リガンド結合アッセイ(すなわち、免疫沈降法、RT-PCR、免疫測定法)、及び非放射性リガンド結合アッセイを用いて、IGFBP3-IGFBP3受容体(TMEM219)結合を直接評価する手段により測定され得る。
【００５９】
本発明では、「遷延性T1D」とは、糖尿病合併症の発症と関連して、15年より長い1型糖尿病の病歴を意味する。
【００６０】
本発明の好ましい態様では、インヒビターは、抗体、又はその合成若しくは組換え誘導体である。前記抗体は、好ましくはモノクロナール若しくはポリクロナール抗体、又はその合成若しくは組換え誘導体であり、より好ましくは、前記抗体は、ヒト化モノクロナール抗体である。
【００６１】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、RNA又はDNAであり、好ましくはsiRNA、shRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００６２】
好ましい実施形態では、上記ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、及びファージからなる群から選択される発現ベクターである。
【００６３】
好ましくは、前記宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞からなる群から選択されるが、好ましくは動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。
【００６４】
好ましい実施形態では、これまでに定義したインヒビターは、(a)少なくとも1つの治療剤と併用され、(b)併用物又は併用調製物を定義する。治療剤は、抗糖尿病剤、糖尿病を予防するのに使用される薬剤、抗アポトーシス剤、抗炎症剤、免疫抑圧剤、臓器移植における補助療法、細胞療法アプローチにおける保護剤の鎮痛剤であり得る。
【００６５】
治療剤の例として、任意の形態のインスリン療法、プラムリンチド(Symlin)、アンジオテンシン変換酵素(ACE)インヒビター、又はアンジオテンシンII受容体遮断薬(ARB)、アスピリン、コレステロール降下薬、メトホルミン(Glucophage、Glumetzaなど)、スルホニルウレア剤(グリブリド(DiaBeta、Glynase)、グリピジド(Glucotrol)及びグリメピリド(Amaryl)、メグリチニド(例えば、レパグリニド(Prandin)及びナテグリニド(Starlix))、チアゾリジンジオン(例えば、ロシグリタゾン(Avandia)及びピオグリタゾン(Actos))、DPP-4インヒビター(シタグリプチン(Januvia)、サキサグリプチン(Onglyza)及びリナグリプチン(Tradjenta))、GLP-1受容体作動薬(エキセナチド(Byetta)及びリラグルチド(Victoza))、例としてカナグリフロジン(Invokana)及びダパグリフロジン(Farxiga)を含むSGLT2インヒビターが挙げられる。
【００６６】
用語「併用物」及び「併用調製物」は、本明細書で使用される場合、これまでに定義したような併用パートナー(a)及び(b)は独立に、又は併用パートナー(a)及び(b)の量が異なる、異なる固定された組み合わせの使用により、すなわち同時に又は異なる時点において投与され得るという観点から、「キット部品」をも定義する。キット部品の一部は、次に、例えばキット部品の任意の一部について、同時又は時系列的に交互に、すなわち異なる時点において、及び等しい又は異なる時間間隔を置いて投与可能である。併用調製物において投与される、併用パートナー(a)の併用パートナー(b)に対する総量の比は、例えば、治療の対象となる患者部分集団のニーズ又は単一のニーズに対処するために変化し得る。
【００６７】
併用療法は、糖尿病の治療において予期せぬ改善をもたらす可能性がある。同時投与、連続投与、又は個別投与の場合、インヒビターと他方の治療剤が相乗的に相互作用して糖尿病を抑える可能性がある。この予期せぬ相乗作用は、各化合物の必要用量の低下を可能にし、副作用の低下並びに化合物及び治療の臨床的有効性の増強をもたらす。1つ又は複数の成分の間の相乗的な相互作用を判断する場合、最適な効果の範囲及び効果に要する各成分の絶対的な用量範囲は、治療を必要とする患者に対して異なるw/w比の範囲及び異なる用量において成分を投与することにより確定的に測定され得る。ヒトでは、患者に対して臨床試験を実施する際の複雑性及びコストにより、相乗作用に関する一次モデルとしてこの形態の試験を利用することは非実用的なものとなる。しかし、1つの種において相乗作用が観察されれば、その他の種における効果についても予測可能であり、また相乗的効果を測定するための本明細書に記載するような動物モデルが存在し、そのような試験の結果は、薬物動態/薬力学的方法を適用することにより、その他の種で必要とされる有効用量、及び血漿濃度比の範囲、及び絶対用量、及び血漿濃度を予測するためにも利用可能である。糖尿病モデルとヒトに見られた効果との間の立証された相関により、動物の相乗作用は、例えば、下記の実施例に記載するようなモデルにおいて実証され得ることが示唆される。
【００６８】
上記医薬組成物は、好ましくは全身、口腔、局所的、好ましくは経直腸投与、又は局所的投与用である。
【００６９】
対照の量は、適正な制御下で測定された量である。
【００７０】
対照手段は、これまでに定義したような化合物の量又は増加量をふさわしい対照と比較するのに利用可能である。ふさわしい対照は、例えば、正常な対象又は正常な集団に由来する既知の標準を参照して取得され得る。
【００７１】
上記診断方法は、対象を治療する工程も含み得るが、特に治療法は、本発明に規定するようなIGFBP3/TMEM219軸のインヒビター、又はこれまでに示したような糖尿病に対する既存の治療法であり得る。
【００７２】
これまでに定義したような、IGFBP3の量を測定する手段は、好ましくは少なくとも1つの抗体、その機能的類似体又は誘導体である。前記抗体、その機能的類似体又は誘導体は、前記化合物に対して特異的である。
【００７３】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、
-前記化合物に対して特異的な固相接着型の抗体と、
-リガンド特異的バイオマーカー複合体からなる検出手段と、
を含む。
【００７４】
本発明によるキットは、通常の助剤、例えばバッファー、担体、マーカー等、及び/又は使用説明書を更に含み得る。
【００７５】
ふさわしい対照は、健康な患者又は糖尿病以外の障害に罹患した患者から採取された試料であり得る。
【００７６】
糖尿病の進行をモニターする方法又はキットの場合、疾患の進行がモニターされ、またふさわしい対照は、同一の対象から様々な時点において採取された、又は別の患者から採取された試料であり得、ふさわしい対照の量は、同一の対象から様々な時点において採取された、又は別の患者から採取された試料中で測定された同一のタンパク質又はポリヌクレオチドの量であり得る。
【００７７】
治療的処置の有効性又はそれに対する応答をモニターする方法又はキットの場合、ふさわしい対照は、療法開始前に同一の対象から採取された試料、又は療法の過程で様々な時点において採取された試料であり得、適正な対照の量は、療法開始前に同一の対象から採取された試料、又は療法の過程で様々な時点において採取された試料中で測定された、同一のタンパク質又はポリヌクレオチドの量であり得る。療法は、本発明のインヒビターを用いた療法であり得る。
【００７８】
本発明では、「量を測定する」という表現は、各タンパク質及び/又はそのmRNA及び/又はそのDNAの量又は濃度又はレベルを測定すること、好ましくは半定量的又は定量的測定を意図し得る。タンパク質の測定は直接的又は間接的に実施可能である。直接的な測定は、タンパク質から直接得られ、また試料中に存在するタンパク質分子の数と直接関連付けられるシグナルに基づくバイオマーカーの量又は濃度の指標を意味する。強度シグナルと呼ばれることもあるこのシグナルは、例えば、バイオマーカーの化学的又は物理的特性の強度値を測定することにより取得可能である。間接的な測定には、二次成分(例えば、遺伝子発現産物とは異なる成分)から得られる測定、及び生物学的測定システム(例えば、細胞の応答、リガンド、「タグ」、又は酵素的反応生成物の測定)が含まれる。
【００７９】
用語「量」とは、本説明で使用する場合、タンパク質及び/又はそのmRNA及び/又はそのDNAの絶対的又は相対的な量、及びそれと関連した、又はそれに起因し得る任意のその他の数値若しくはパラメーターを指すが、但しこれらに限定されない。そのような数値又はパラメーターは、直接測定により取得されるタンパク質の物理的又は化学的特性から得られるシグナルの強度値、例えば免疫測定法、質量分析法、又は核磁気共鳴法における強度値を含む。更に、これらの数値又はパラメーターには、間接測定、例えば本明細書に記載する測定システムのいずれかにより取得されたものが含まれる。試料中のmRNA及びDNAを測定する方法は、当技術分野において公知である。核酸レベルを測定するために、試験試料中の細胞は溶解され得、ライセート内の、又はライセートから精製若しくは半精製されたRNA内のmRNAレベルは、当業者にとってなじみ深い任意の多様な方法により測定可能である。そのような方法として、検出可能に標識されたDNA若しくはRNAプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ(すなわち、ノーザンブロッティング)、又は該当するオリゴヌクレオチドプライマーを使用する定量的又は半定量的RT-PCR法が挙げられる。或いは、定量的又は半定量的in situハイブリダイゼーションアッセイが、例えば組織切片、又は未溶解の細胞懸濁物、及び検出可能に標識された(例えば、蛍光又は酵素標識された)DNA又はRNAプローブを使用して実施可能である。mRNAを定量する更なる方法として、RNA保護アッセイ(RPA)、cDNA及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、代表差異分析(representation difference analysis)(RDA)、ディファレンシャルディスプレイ、EST配列分析、及び遺伝子発現のシリアル分析(SAGE)が挙げられる。
【００８０】
タンパク質IGFBP3の測定した量、又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの測定した量と、対照試料から得られた量との比較により、対象から単離された試料中の前記化合物の量が、より高い数値に対応する場合、該対象は、疾患を呈する、又は前記疾患が増悪するおそれがある。
【００８１】
タンパク質IGFBP3の測定した量、又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの測定した量と対照試料から得られた量との比較により、対象から単離された試料中の前記化合物の量が、類似した数値又は低い数値に対応する場合には、該対象は、疾患に罹患していない、又は疾患が改善する可能性がそれぞれある。
【００８２】
或いは、「検出」又は「量を測定すること」という表現には、分子の変化を測定することが意図されている。前記変化は、これまでに定義したような化合物の量の増加又は減少を反映し得る。タンパク質IGFBP3又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの増加は、疾患の増悪と相関し得る。タンパク質IGFBP3又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの減少は、疾患の改善又は対象の回復と相関し得る。
【００８３】
「タンパク質IGFBP3」又は「IGFBP3」又は「TMEM219」という表現には、IGFBP3又はTMEMのオーソロガス若しくはホモロガスな遺伝子、その機能的突然変異体、機能的誘導体、機能的断片若しくは類似体、アイソフォームからエンコードされた対応するタンパク質も含まれるように意図されている。
【００８４】
「遺伝子IGFBP3」又は「IGFBP3」又は「遺伝子TMEM219」又は「TMEM219」という表現には、対応するオーソロガス若しくはホモロガスな遺伝子、その機能的突然変異体、機能的誘導体、機能的断片若しくは類似体、アイソフォームも含まれるように意図されている。
【００８５】
本発明では、タンパク質の「機能的突然変異体」は、その配列内で1つ又は複数のアミノ酸を突然変異させることにより生成可能であり、且つ糖尿病を治療するためにタンパク質の活性を維持する突然変異体である。実際、本発明のタンパク質は、必要であれば、例えばグリコシル化、ミリストイル化、アミド化、カルボキシル化、又はリン酸化により、in vitro及び/又はin vivoで修飾され得、並びに、例えば、当技術分野において公知の合成又は組換え技術により取得され得る。本発明のタンパク質、「IGFBP3」又は「TMEM219」は、当技術分野において公知の方法により、そのバイオアベイラビリティ又は半減期が増加するように修飾され得る。例えば、タンパク質は、ポリマーに結合し得る、ペグ化等され得る。
【００８６】
本発明では、有効成分は、コロイド状の薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)、又はマクロエマルジョンにおいて、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製したマイクロカプセル中、例えばヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル、及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中にそれぞれ捕捉される場合もある。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A.編(1980)に開示されている。
【００８７】
in vivo投与で使用される製剤は、無菌の状態でなければならない。これは滅菌濾過メンブレンを経由する濾過により容易に実現する。
【００８８】
徐放性調製物が調製可能である。徐放性調製物の適当な例として、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、同マトリックスは成形品の形態、例えばフィルム、又はマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸及び[γ]エチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性のエチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えば乳酸-グリコール酸コポリマーと、ロイプロリドアセテートと、ポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸とから構成される注入型ミクロスフェア等が挙げられる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、100日間にわたり分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短期間放出する。カプセル化抗体が長期間身体内に留まる場合、抗体は、37℃で湿気に曝露した結果、変性又は凝集する可能性があり、その結果生物活性が失われ、また免疫原性が変化するおそれがある。関係する機構に応じて安定化させるために、合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集機構が、チオジスルフィドの交換を通じた分子間S-S結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含量を制御すること、ふさわしい添加物を使用すること、及び特別なポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成され得る。
【００８９】
本発明では、「機能的」には、例えば糖尿病の治療処置において、例えば「その活性を維持すること」が意図されている。
【００９０】
用語「類似体」とは、タンパク質を参照しながら本明細書で使用される場合、ペプチドの1つ若しくは複数のアミノ酸残基がその他のアミノ酸残基と置換された、及び/又は1つ若しくは複数のアミノ酸残基がペプチドから欠損した、及び/又は1つ若しくは複数のアミノ酸残基がペプチドから欠損した、及び/又は1つ若しくは複数のアミノ酸残基がペプチドに付加した修飾型のペプチドを意味する。アミノ酸残基のそのような付加又は欠損は、ペプチドのN末端及び/又はペプチドのC末端において生じ得る。
【００９１】
用語「誘導体」とは、タンパク質に関連して本明細書で使用される場合、少なくとも1つの置換基が、非修飾型ペプチド又はその類似体には存在しない、化学的に修飾されたペプチド又はその類似体、すなわち、共有結合的に修飾されたペプチドを意味する。代表的な修飾として、アミド、炭化水素、アルキル基、アシル基、エステル等が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「誘導体」は、例えば、IGFBP3と、又はIGFBP3のオーソロガス若しくはホモロガスな遺伝子からエンコードされる対応する領域のアミノ酸配列と、少なくとも41%、好ましくは少なくとも41.5%、50%、54.9%、60%、61.2%、64.1%、65%、70%、又は75%、より好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90%、及びなおいっそうより好ましくは少なくとも95%の同一性の割合(%)を有する、より長い又はより短いポリペプチドを指す。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「断片」とは、好ましくは少なくともアミノ酸10個分、より好ましくはアミノ酸少なくとも15個分、少なくとも17個分、又は少なくともアミノ酸20個分、なおいっそうより好ましくは少なくともアミノ酸25個分、又は少なくともアミノ酸37若しくは40個分、及びより好ましくは少なくともアミノ酸50、又は100、又は150又は200又は250又は300又は350又は400又は450又は500個分の長さを有するポリペプチドを指す。
【００９３】
本発明によれば、組成物の「有効量」は、所望の生物学的効果、この場合糖尿病の改善又は治療を実現するのに十分な量である。
【００９４】
有効な用量は、レシピエントの年齢、性別、健康、及び体重、併用治療の種類、該当する場合、治療の頻度、及び所望の効果の性質に依存するものと理解される。本発明のインヒビター又は分子の有効用量の提示する範囲(例えば、1mg/kg〜1000mg/kg、特に全身的に投与される)は、本発明を制限する意図を含まず、また好ましい用量範囲を表している。但し、好ましい用量は、過度の実験を行わなくても、当業者が理解し、決定可能なように、個々の対象に適合させることができる。
【００９５】
本発明のオリゴヌクレオチドの投与は、公知の方法により実施され得るが、その場合、核酸がin vitro又はin vivoで所望の標的細胞に導入される。
【００９６】
本発明の態様は、送達媒介物に含まれた核酸構築物を含む。送達媒介物は、ヌクレオチド配列を少なくとも1つの媒体から別の媒体に輸送可能にする実体である。送達媒介物は、核酸構築物内でエンコードされる配列を発現させるために、及び/又は構築物を細胞内に送達するために一般的に使用され得る。送達媒介物は、RNAに基づく媒介物、DNAに基づく媒介物/ベクター、脂質に基づく媒介物、ウイルスに基づく媒介物、及び細胞に基づく媒介物の群から選択される媒介物であり得ることは本発明の範囲に含まれる。そのような送達媒介物の例として、生分解性のポリマーミクロスフェア、脂質に基づく製剤、例えばリポソーム担体等、構築物を金コロイド粒子上にコーティングしたもの、リポ多糖類、ポリペプチド、多糖類、ウイルス媒介物をペグ化したものが挙げられる。
【００９７】
本発明の1つの実施形態では、送達媒介物としてウイルスを含み得るが、該ウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、泡沫状ウイルス、サイトメガロウイルス、セムリキ森林ウイルス、ポックスウイルス、RNAウイルスベクター、及びDNAウイルスベクターから選択され得る。そのようなウイルスベクターは、当技術分野において周知されている。
【００９８】
一般的に使用される遺伝子移入法として、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、トランスフェクション、エレクトロポレーション、及び微量注射法、及びウイルス法が挙げられる。DNAを細胞に導入する別の技術として、カチオン性リポソームの使用が挙げられる。市販のカチオン性脂質製剤として、例えば、Tfx 50(Promega社)、又はLipofectamin 2000(Life Technologies社)が挙げられる。
【００９９】
本発明の組成物は、溶液の形態、例えば、注射液、クリーム、軟膏、錠剤、懸濁物等であり得る。組成物は、任意の適する方法で、例えば、注射により、特に眼内注射により、口腔、局所、鼻腔、直腸への適用等により投与され得る。担体は、任意の適する医薬担体であり得る。好ましくは、RNA分子の標的細胞への進入効率を高める能力を有する担体が使用される。適するそのような担体の例として、リポソーム、特にカチオン性リポソームが挙げられる。
【０１００】
本発明の組換発現ベクターは、任意の適する組換発現ベクターであり得るが、また任意の適する宿主を変換又はトランスフェクトするのに使用され得る。適するベクターとして、繁殖及び増殖用、又は発現用、又はその両方のために設計されたベクター、例えばプラスミド及びウイルス等が挙げられる。本発明の組換発現ベクターは、標準的な組換えDNA法を使用して調製され得る。発現ベクターの構築物は、円形状又は直線状であり、原核生物又は真核生物の宿主細胞内で機能的な複製系を含むように調製され得る。複製系は、例えばCoIEl、2μプラスミド、λ、SV40、ウシパピローマウイルス等に由来し得る。
【０１０１】
望ましくは、組換発現ベクターは、宿主の種類(例えば、バクテリア、菌類、植物、又は動物)に固有の制御配列、例えば転写及び翻訳の開始及び終止コドン等を含み、組換発現ベクターがDNAに基づくか又はRNAに基づくかを考慮しながら、同ベクターは該宿主に適宜導入される。組換発現ベクターは、変換又はトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする1つ又は複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生剤耐性、例えば抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性等を提供するための栄養要求性宿主における補完が含まれる。本発明の発現ベクターにとって適するマーカー遺伝子として、例えば、ネオマイシン/G418耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。組換発現ベクターは、PCYOX1インヒビター(その機能的部分及び機能的変異体を含む)をエンコードするヌクレオチド配列、又はRNAをエンコードするヌクレオチド配列に対して相補的な、若しくはそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に結合した天然の又は規範的なプロモーターを含み得る。プロモーター、例えば強い、弱い、誘導可能な、組織特異的、及び発達特異的なプロモーターの選択は、当業者の通常技能の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせも、当業者の技能の範囲内である。プロモーターは、非ウイルス性プロモーター又はウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、及びマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復配列(long-terminal repeat)に見出されるプロモーターであり得る。
【０１０２】
本発明の組換発現ベクターは、一過性の発現、安定的な発現、又はその両方を目的として設計され得る。また、組換発現ベクターは、構成的な発現又は誘導可能な発現を目的として作成され得る。
【０１０３】
上記IGFBP3組成物について、更なる材料並びに処理技術等が、参照として本明細書に組み込まれているRemington's Pharmaceutical Sciences、第20版、2000、Marck Publishing Company社、Easton、Pennsylvaniaのパート5に記載され得る。
【０１０４】
本発明の化合物は、徐放形態で、又は徐放薬物送達システムからも投与可能である。代表的な徐放材料の説明は、Remington's Pharmaceutical Sciencesの組込み材料にも見出すことができる。更に、医薬製剤は、医薬品技術分野において一般的に公知のプロセスを使用して調製可能である。
【０１０５】
本発明では、本発明の分子が別の治療剤と共に投与される場合、同時に又は連続して投与され得る。
【０１０６】
配列
IGFBP3のアミノ酸配列:
MQRARPTLWAAALTLLVLLRGPPVARAGASSAGLGPVVRCEPCDARALAQCAPPPAVCAELVREPGCGCCLTCALSEGQPCGIYTERCGSGLRCQPSPDEARPLQALLDGRGLCVNASAVSRLRAYLLPAPPAPGEPPAPGNASESEEDRSAGSVESPSVSSTHRVSDPKFHPLHSKIIIIKKGHAKDSQRYKVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNVLSPRGVHIPNCDKKGFYKKKQCRPSKGRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCYSMQSK (配列番号4)
【０１０７】
IGFBP3のヌクレオチド配列:ホモサピエンスインスリン様増殖因子結合タンパク質3(IGFBP3)、第7染色体上のRefSeqGene、NCBI参照配列:NG_011508.1
【０１０８】
IGFBP3のmRNA配列:ホモサピエンスインスリン様増殖因子結合タンパク質3 (IGFBP3)、転写物変異体1、mRNA、NCBI参照配列: NM_001013398.1
【０１０９】
TMEM219のアミノ酸配列:
MGNCQAGHNLHLCLAHHPPLVCATLILLLLGLSGLGLGSFLLTHRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSRLLVLGSFLLLFCGLLCCVTAMCFHPRRESHWSRTRL (配列番号2).
【０１１０】
TMEM219のヌクレオチド配列: TMEM219膜貫通タンパク質219 [ホモサピエンス(ヒト)]、遺伝子ID: 124446.
【０１１１】
TMEM219のmRNA配列:ホモサピエンス膜貫通タンパク質219 (TMEM219)、転写物変異体1、mRNA、NCBI参照配列: NM_001083613.1
【０１１２】
下記の図を参照しながら、本発明を非制限的な実施例を用いて説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１−１】遷延性T1Dにおける糖尿病性腸疾患は、腸粘膜の異常及び結腸幹細胞内の障害により特徴付けられることを示す図である。A、B、C。棒グラフは、健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)におけるGSRS質問票の実施による下痢、腹痛、及び便秘のスコアを表す。グレー部分は、パラメーターの正常範囲を示す。D、E、F。棒グラフは、健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)における肛門直腸内圧測定による肛門直腸括約筋収縮張力(anorectal sphincter contracting tone) (mmHg)、反射応答(ml)、及び切迫容積(urgency volume) (ml)の測定結果について報告する。グレー部分は、パラメーターの正常範囲を示す。CTRL N=20及びT1D+ESRDの個体n=60が評価に含まれた。G1〜G2、I1〜I2、K1〜K2、M1〜M2、O1〜O2、Q1〜Q2。健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)から得られた生検試料におけるヘマトキシリン及びエオシン(H&E)組織学染色、免疫染色したMIB1+細胞、赤矢印が神経内分泌小胞(neuroendocrine vesicle)の局在場所及び存在を示す神経構造の超微細構造分析、免疫染色した5HT+、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(Aldh)+細胞、及びEphB2+発現に関する代表的画像である。超微細構造分析のスケールバー: 2000nm。オリジナルの倍率: G1〜G2では100×; I1〜I2、K1〜K2では400×; O1〜O2では40×; Q1〜Q2では200×。スケールバー80ミクロン。H、J、L、N、P、R。棒グラフは、CTRL及び遷延性T1Dの対象(T1D+ESRD)における、陰窩、MIB1+細胞、神経終末の神経内分泌小胞(神経終末1つにつき>3のNE小胞が検出されたケースの数)、5HT+細胞、Aldh+細胞、及びEphB2+発現(強度スコア0〜5)の測定について報告する。CTRL N=20及びT1D+ESRDの個体n=60が評価に含まれた。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001。略号: GSRS、胃腸症状評価尺度; CoSC、腸管幹細胞; T1D、1型糖尿病; ESRD、末期腎疾患; CTRL、健康な対象; H&E、ヘマトキシリン及びエオシン; MIB1、Ki67に対する抗体; EphB2、エフリンB受容体2; Aldh、アルデヒドデヒドロゲナーゼ; 5HT、セロトニン; NE、神経内分泌小胞。
【図１−２】図1-1参照。
【図１−３】図1-1参照。
【図２−１】遷延性T1Dにおける糖尿病性腸疾患は、CoSCの欠陥と関連することを示す図である。A、B。健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)におけるEphB2low、EphB2medium、及びEphB2hi細胞の代表的フロードットプロット(flow dot plot)である。C、D、E。棒グラフは、新鮮分離した陰窩におけるEphB2hi+、EphB2hi+LGR5+、及びEphB2+h-TERT+細胞のフローサイトメトリー分析結果を表す(CTRL n=10及びT1D+ESRD n=10)。F、G、H。棒グラフは、単離された腸陰窩上で、定量的RT-PCRによりCoSCマーカーであるEphB2、LGR5、h-TERTを測定し、その発現データを標準化したmRNA発現として表す。すべての試料は三重測定し、ハウスキーピング遺伝子ACTBの発現に対して標準化した(ΔΔCt)。I。散布図は、健康な対象(CTRL)n=10、及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)n=10の新鮮分離した腸陰窩について調べた、CoSCシグネチャーマーカー(signature marker)及び幹細胞トランスクリプトームプロファイリングを表す。J1〜J2。遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)及び健康な対象(CTRL)のこれまでに単離した陰窩から取得し、in vitroで8日間培養したミニ・ガットの代表的な画像である。倍率10×。スケールバー50ミクロン。K。棒グラフは、CTRL n=10及びT1D+ESRDの個体n=10に由来する新鮮分離した腸陰窩を培養し、その8日目における全体に対するミニ・ガットの発生割合(%)を表す。L1〜L4。健康な対象(CTRL)のこれまでに単離された陰窩から取得し、下記の条件で8日間培養したミニ・ガットの代表的な画像である:L1=正常(FBS)血清+正常グルコース(5mM);L2=T1D+ESRD血清+正常グルコース;L3=正常血清+高濃度グルコース(35mM);L4=T1D+ESRD血清+高濃度グルコース。倍率10×。スケールバー50ミクロン。M。棒グラフは、新鮮分離した腸陰窩を下記の条件で培養し、それに由来する培養の8日目における全体に対するミニ・ガットの発生割合(%)をグループ化して表す:正常(FBS)血清+正常グルコース(5mM);T1D+ESRD血清+正常グルコース;正常血清+高濃度グルコース(35mM);T1D+ESRD血清+高濃度グルコース。異なる培養条件を比較することにより、各グループ(正常グルコース+正常血清、培地+高濃度グルコース、培地+遷延性T1D血清、高濃度グルコース+遷延性T1D血清)内で、統計的有意性を計算した。棒グラフ内の比較とは、正常血清+正常グルコースに対してすべての条件を比較することを指す。N。トランスクリプトームプロファイリングは、健康な対象から取得し、高濃度グルコース及び/又は遷延性T1D血清を含め/含めずに培養した、単離された陰窩におけるCoSCシグネチャーマーカーの発現を表す。1群当たり対象N=10を評価した。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01;**p<0.001;***p<0.0001。略号:CoSC、結腸幹細胞;T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;EphB2、エフリンB受容体2;LGR5、ロイシンリッチ反復領域を含有するGタンパク質共役型レセプター5;RT-PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;ACTB、ベータアクチン;FBS、ウシ胎仔血清。
【図２−２】図2-1参照。
【図２−３】図2-1参照。
【図２−４】図2-1参照。
【図３−１】循環性IGF-I及びIGFBP3は、遷延性T1Dにおいて変化していること、及びそのin vitroでの操作は、CoSC増殖及び自己再生に対して重要な効果を誘発することを示す図である。A。ヒートマップは、遷延性T1D(T1D+ESRD)におけるプロテオミクスプロファイルを、健康な対象(CTRL)と比較して表す。識別及び定量化したタンパク質の完全なデータセットについて、統計分析を実施した(p<0.01)。有意に異なり発現しているタンパク質を、階層的クラスタリングを通じて更に分析した。CTRL n=10及びT1D+ESRDの個体n=10の血清を分析した。B。棒グラフは、非標的式プロテオーム分析から外挿された単一のタンパク質、インスリン様増殖因子結合タンパク質3(IGFBP3)に関するLFQ強度を表す。C1〜C2。肝臓におけるIGFBP3発現の代表的な画像(倍率40×)である。IGFBP3は、健康な対象に由来する肝臓実質内では軽度且つ拡散的に発現するが(C1)、一方遷延性糖尿病の個体では、よりゾーン状の陽性を示す(C2)。D。棒グラフは、異なるグルコース濃度(35mM:高濃度グルコース;20mM:中間濃度グルコース;5mM:正常グルコース)で5日間培養した不死化ヒトヘパトーマ細胞系(HuH-7)の上清において、ELISAにより測定したIGFBP3レベルを表す。実験は三重測定であった。E。棒グラフは、健康な対象及び遷延性T1D(T1D+ESRD)の血清中でELISAにより測定した、インスリン様増殖因子1(IGF-I)レベルを表す。F。ウェスタンブロット分析(クロップドブロット)により、腸陰窩表面上でのIGF-IR及びTMEM219発現を確認した。WBによるIGF-IR総発現量の評価には、IGF-IRのタンパク質全体のサブユニットであるIGF-IRαの検出が含まれる。CTRLから得た直腸粘膜生検試料上で実施した、TMEM219 in situハイブリダイゼーションの代表的な画像である(G1陰性対照、G2 TMEM219染色)。倍率20×。G1〜G2。CTRLから得た直腸粘膜生検試料上で実施した、TMEM219 in situハイブリダイゼーションの代表的な画像である(G1陰性対照、G2 TMEM219染色)。倍率400×。H。棒グラフは、ΔΔCt法を使用して標準化した、TMEM219(IGFBP3受容体)のmRNA発現を表す。1群当たり対象N=5を評価した。I。棒グラフは、異なる条件において遷延性T1Dの個体から得た、全体に対するミニ・ガット発生割合(%)についてグループ化し、またIGF-I、IGFBP3、及び抗IGF-IRの効果を示す。P値は、ベースライン条件とIGF-Iの培養への添加との比較である。J。棒グラフは、健康な対象から単離し、IGFBP3及びIGF-I+IGFBP3の存在下で培養し、これを3回実施した陰窩におけるカスパーゼ8及び9の標準化したmRNA発現を表す。K。棒グラフは、健康な対象から取得し、汎カスパーゼインヒビター、カスパーゼ8、9、及び3の選択的インヒビター、並びにIGFBP3の存在下で培養したときの、その培養8日目における全体に対するミニ・ガット発生割合(%)についてグループ化する。アッセイは3回実施した。L。棒グラフは、健康な対象から取得し、異なる条件(正常グルコース+正常血清、高濃度グルコース+正常血清、T1D+ESRD血清+正常グルコース、T1D+ESRD血清+高濃度グルコース)で培養したときの、全体に対するミニ・ガット発生割合(%)についてグループ化し、またIGF-I、IGFBP3、及び抗IGF-IRの効果を示す。P値は、ベースライン条件(培地単独、培地+高濃度グルコース、培地+遷延性T1D血清、高濃度グルコース+遷延性T1D血清)の比較である。更なるP値を、下記の条件:培地単独対培地+高濃度グルコース、対培地+高濃度グルコース+遷延性T1D���清との比較におけるミニ・ガット増殖の差異を比較するために計算した。アッセイは3回実施した。M。棒グラフは、健康な対象から取得し、8日間培養し、siRNAによりTMEM219の標的化に曝露し、最終的に、培地単独及び培地+高濃度グルコース+遷延性T1D血清中で、TMEM219を発現する陰窩と比較したときの、全体に対するミニ・ガット発生割合(%)についてグループ化する。アッセイは3回実施した。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01;**p<0.001;***p<0.0001。略号:IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;IGF-IR、インスリン様増殖因子1受容体;CoSC、結腸幹細胞;T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;RT-PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;ACTB、ベータアクチン;LFQ、ラベルフリーの定量;SEM、平均値の標準誤差;siRNA、低分子干渉RNA;inhib、インヒビター。
【図３−２】図3-1参照。
【図３−３】図3-1参照。
【図３−４】図3-1参照。
【図３−５】図3-1参照。
【図４−１】末梢IGF-I/IGFBP3ダイアドの、単一細胞由来のin vitroミニ・ガット、及びカスパーゼカスケードに対する効果を示す図である。末梢IGF-I/IGFBP3ダイアドを操作すると、糖尿病性腸疾患の前臨床モデルにおいて、糖尿病性腸疾患の進行が変化するが、一方、膵腎同時移植(SPK)により遷延性T1Dを治療すると腸症状、運動性、及び形態が改善する。A。棒グラフは、健康な対象の陰窩から得た単一細胞をEphB2+選別し、その細胞内のTMEM219、LRP1、TGF-b I及びII型の標準化したmRNA発現を表す。実験は3回実施した。B。棒グラフは、健康な対象の新鮮分離した陰窩から選別し、異なる条件(正常グルコース+正常血清、高濃度グルコース+正常血清、T1D+ESRD血清+正常グルコース、T1D+ESRD血清+高濃度グルコース)で培養したEphB2+細胞から得た単一細胞由来のミニ・ガットの発生割合(%)(全体に対する)を示し、またIGF-I及びIGFBP3の効果を示す。P値は、ベースライン条件との比較である。C、D。散布図は、健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)の新鮮分離した腸陰窩を、IGFBP3及びIGF-Iを含め/含めずに培養し、その腸陰窩において調べたアポトーシストランスクリプトームプロファイリングを表す。実験は三重測定であった。E。CoSC上での循環性IGF-I及びIGFBP3の効果を表す説明の案。F、G、I。折れ線グラフは、STZで治療した糖尿病性腸疾患発症B6マウス(B6+STZ)、naive B6(WT)、及びIGFBP3で治療したnaive B6(WT+IGFBP3)から、ベースライン時及び8週間後に採取した下部腸管切片において評価した陰窩の数(B)、陰窩の深度(C)、及び陰窩の幅(E)について報告する。WT:野生型、STZ:ストレプトゾチシンで治療した。1群当たりマウスN=3を評価した。H1〜H3。WT、糖尿病性腸疾患発症B6+STZマウス、及びIGFBP3で治療したnaive B6(WT+IGFBP3)のH&E切片上の腸陰窩に関する代表的な画像である。組織学倍率400×。J。棒グラフは、STZで治療した糖尿病性腸疾患発症B6マウス、WT、及びIGFBP3で治療したnaive B6(WT+IGFBP3)の免疫染色切片内のAldh+細胞の数/mm2を表す。K1〜K3。STZで治療した糖尿病性腸疾患発症B6マウス、WT、及びIGFBP3で治療したnaive B6(WT+IGFBP3)から採取した下部腸管の免疫染色切片におけるAldh+細胞の代表的な画像である。組織学倍率、400×。L、N、P。棒グラフは、対象4群(CTRL n=20、SPK n=30、K+T1D n=、及びT1D+ESRD n=60)における、MIB1+細胞及びAldh+細胞の数、並びにEphB2+発現(強度スコア0〜5)について報告する。M1〜M2、O1〜O2、Q1〜Q2。フォローアップの8年目において、腎単独(K+T1D)移植又は膵腎同時(SPK)移植を受けたT1D+ESRDの直腸粘膜生検の免疫染色試料における、MIB1+細胞及びAldh+細胞の数、並びにEphB2+発現に関する代表的な画像である。組織学倍率は、M1〜M2及びO1〜O2につき400×、Q1〜Q2につき20×。スケールバー80ミクロン。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01;**p<0.001;***p<0.0001。略号:WT、野生型;STZ、ストレプトゾチシンで治療した;B6、C57BL/6Jマウス;IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;IGF-IR、インスリン様増殖因子1受容体;CoSC、結腸幹細胞;T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;SPK、膵腎同時移植;K+T1D、1型糖尿病における腎単独移植;H&E、ヘマトキシリン及びエオシン;MIB1、Ki67に対する抗体;EphB2、エフリンB受容体2;Aldh、アルデヒドデヒドロゲナーゼ;SEM、平均値の標準誤差。
【図４−２】図4-1参照。
【図４−３】図4-1参照。
【図４−４】図4-1参照。
【図４−５】図4-1参照。
【図５−１】SPKにより遷延性T1Dを治療すると、CoSCが補充されること、並びに循環性IGF-I及びIGFBP3の修復を通じてCoSCシグネチャープロファイル及びミニ・ガットの発生が修復することを示す図である。A、B、C。棒グラフは、遷延性T1D(ベースライン)、フォローアップの8年目において膵腎同時(SPK)移植又は腎単独(K+T1D)移植を受けたT1D+ESRDから陰窩を単離し、その陰窩から得たEphB2hi+、EphB2hi+LGR5+、EphB2+h-TERT+細胞のフローサイトメトリー分析の結果を表す。1群当たり対象N=10を評価した。D、E、F。棒グラフは、遷延性T1D(ベースライン)、フォローアップの8年目において膵腎同時(SPK)移植又は腎単独(K+T1D)移植を受けたT1D+ESRDから取得し、単離された腸陰窩において、定量的RT-PCRにより測定された腸管幹細胞マーカーEphB2、LGR5、h-TERTの標準化したmRNA発現を表す。すべての試料は三重測定し、ΔΔCt法を使用してハウスキーピング遺伝子ACTBの発現に対して標準化した。1群当たり対象N=10を評価した。G。ウェスタンブロット分析は、フォローアップの8年目において、4群から単離した腸陰窩におけるEphB2、LGR5、h-TERTの発現を表す。1群当たり対象N=5を評価した。H。棒グラフは、遷延性T1Dの個体(ベースライン)、フォローアップの8年目におけるSPK及びK+T1Dの対象から取得し、新鮮分離した腸陰窩の培養8日目における、全体に対するミニ・ガット発生割合(%)を表す。1群当たり対象N=10を評価した。I。ヒートマップは、CTRL、遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)、フォローアップの8年目におけるSPK及びK+T1Dの対象の腸陰窩を新鮮分離し、その腸陰窩において調べたCoSCシグネチャーマーカーのトランスクリプトームプロファイリングを表す。1群当たり対象N=10を評価した。J。棒グラフは、フォローアップの8年目における、対象4群の血清におけるELISAにより測定したIGF-Iレベルを表す。1群当たり対象N=10を評価した。K。棒グラフは、対象4群の血清において、ELISAにより測定したIGFBP3レベルを表す。1群当たり対象N=20を評価した。L、M。IGFBP3血清レベルとK+T1D(L)及びSPK (M)群の対象n=20におけるGSRS質問票(0〜7)を使用して評価した腸症状との間の相関である。すべての群を比較する際には、ANOVA(p<0.05)を使用して分析を実施した。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01;**p<0.001;***p<0.0001。略号:CoSC、結腸幹細胞;T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;SPK、膵腎同時移植;EphB2、エフリンB受容体2;LGR5、ロイシンリッチ反復領域を含有するGタンパク質共役型レセプター5;RT-PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;ACTB、ベータアクチン;K+T1D、1型糖尿病における腎単独移植;IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;SEM、平均値の標準誤差。
【図５−２】図5-1参照。
【図５−３】図5-1参照。
【図６−１】新規に生成した組換えタンパク質ecto-TMEM219(ecto-TMEM219)で治療すると、前臨床モデルにおいてIGFBP3が媒介するミニ・ガットの破壊が抑制され、またCoSCが保存されることを示す図である。A。棒グラフは、異なる条件で健康な対象から得た全体に対するミニ・ガットの発生割合(%)についてグループ化し、IGFBP3で治療したミニ・ガット及び高濃度グルコースに曝露したミニ・ガットにおける様々な濃度(IGFBP3と比較して1:2、1:1、及び2:1のモル比)でのecto-TMEM219の効果を示す。P値は、ベースライン条件との比較である。B。棒グラフは、健康な対象から単離し、IGFBP3及びecto-TMEM219+IGFBP3の存在下で培養し、これを3回実施した陰窩における、EphB2の標準化したmRNA発現を表す。C。D。棒グラフは、健康な対象から単離し、IGFBP3及びecto-TMEM219+IGFBP3の存在下で培養し、これを3回実施した陰窩におけるカスパーゼ8及び9の標準化したmRNA発現を表す。E、F、G。折れ線グラフは、STZで治療した糖尿病性腸疾患発症B6マウス(B6+STZ)、naive B6(WT)、及びecto-TMEM219で治療したSTZ-B6マウスから、ベースライン時及び8週間後に採取した下部腸管切片において評価した陰窩の数(E)、陰窩の深度(F)、及び陰窩の幅(G)について報告する。WT:野生型、STZ:ストレプトゾチシンで治療した。1群当たりマウスN=3を評価した。H。折れ線グラフは、STZで治療した糖尿病性腸疾患発症B6マウス(B6+STZ)、naive B6(WT)、及びecto-TMEM219で治療した糖尿病性腸疾患発症STZ治療B6マウスのベースライン時及び8週間後の体重について報告する。WT:野生型、STZ:ストレプトゾチシンで治療した。1群当たりマウスN=3を評価した。I。棒グラフは、naive B6マウス、STZで治療したB6マウスから、及び8週目にecto-TMEM219で治療したSTZ-B6マウスにおいて収集した腸試料から単離したEphB2+細胞のフローサイトメトリー分析結果を表す。J。naive B6マウス、STZで治療したB6マウスから、及び8週目にecto-TMEM219で治療したSTZ-B6マウスにおいて単離した陰窩から単離したEphB2+細胞の代表的なフローヒストグラムである。1群当たりマウスN=3〜5を評価した。K。棒グラフは、naive B6マウス、STZで治療したB6マウスから、及び8週目にecto-TMEM219で治療したSTZ-B6マウスにおいて収集した腸試料におけるEphB2の標準化したmRNA発現を表す。L、M。棒グラフは、naive B6マウス、STZで治療したB6マウスから、及び8週目にecto-TMEM219で治療したSTZ-B6マウスにおいて収集した腸試料におけるカスパーゼ8(K)及びカスパーゼ9(L)の標準化したmRNA発現を表す。N。棒グラフは、naive B6マウス(WT)、及びSTZで治療したB6マウス(B6+STZ)、及び8週目にecto-TMEM219で治療したB6+STZマウスにおいて測定したIGFBP3循環レベルを表す。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01;**p<0.001;***p<0.0001。略号:WT、野生型;STZ、ストレプトゾチシンで治療した;B6、C57BL/6Jマウス;IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;CoSC、結腸幹細胞;H&E、ヘマトキシリン及びエオシン;EphB2、エフリンB受容体2;SEM、平均値の標準誤差、T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;RT-PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;ACTB、ベータアクチン。
【図６−２】図6-1参照。
【図６−３】図6-1参照。
【図６−４】図6-1参照。
【図７−１】CTRL、T1D、及びT1D+ESRDの個体の血清(A)及び尿(B)におけるIGFBP3レベルの評価を示す図である。(C)この試験において評価したコホートのすべての対象における血清IGFBP3レベルと尿中IGFBP3レベルとの間の相関である。(D〜E)透析中のT1D+ESRDを有する対象(D)、及びeGFRが>15ml/min/m2であるT1Dを有する対象(E)における、IGFBP3血清レベルとMDRD式により計算したeGFRとの間の相関である。(F)この試験において評価したコホートのすべての対象における血清IGFBP3レベルと尿中IGFBP3レベルとの間の相関である。グレー部分は、IGFBP3の尿中及び血清レベルにおける正常範囲を示す。
【図７−２】図7-1参照。
【図８−１】遷延性T1Dの対象及び健康な対象におけるCoSCプロファイル、ミニ・ガットのin vitro生成、肝臓内でのIGFBP3の発現、及びCoSC上でのIGF-IRの発現を示す図である。A〜B。健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)におけるPI-細胞ゲーティング戦略の代表的なフロードットプロットである。C。棒グラフは、新鮮分離した陰窩におけるPI-細胞のフローサイトメトリー分析結果を表す(CTRL n=10及びT1D+ESRD n=10)。D〜E。健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)におけるEphB2hiLGR5+細胞(D)、及びEphB2+h-TERT+細胞の代表的なフロードットプロットである。F。ウェスタンブロット分析(クロップドブロット)により、遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)のin vitroで単離された腸陰窩におけるEphB2、LGR5、h-TERTの発現は低いことを確認する。完全長ブロットを図5に示す。1群当たり対象N=5を評価した。G。散布図は、健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)の新鮮分離した腸陰窩において調べた幹細胞トランスクリプトームプロファイリングを表す。表は、分析した遺伝子及び経路について要約する(表S1)。1群当たり対象N=10を評価した。H〜I。健康な対象及び遷延性T1Dの個体から取得し、新鮮分離してDAPIで染色した陰窩の代表的な画像である。倍率20×。J。棒グラフは、健康な対象及び遷延性T1Dの個体から得た陰窩を播種して12時間経過したときのミニ・ガット形成効率(%)を表す。1群当たり対象N=10を評価した。K。棒グラフは、健康な対象及び遷延性T1Dの個体から得た肝臓試料における免疫組織化学評価の際のIGFBP3強度/拡散について算出した複合スコア(0〜6)を表す。1群当たり対象N=3を評価した。L1〜L6。肝臓内IGFBP3発現の代表的な画像である(倍率63×)。免疫蛍光検査法により、Hep Par-1+細胞及びIGFBP3発現の同時局在が確認されたが(L1〜L3)、一方、IGFBP3細胞とCD163+細胞の間では同時局在は認められなかった(L4〜L6)。M。棒グラフは、単離した腸陰窩上での定量的RT-PCRにより測定したIGF-I受容体(IGF-IR)の標準化したmRNA発現を表す。すべての試料は三重測定し、ΔΔCt法を使用してハウスキーピング遺伝子ACTBに対して標準化した。N1〜N2。CTRL及びT1D+ESRDの個体から得た直腸粘膜試料上のIGF-IR+細胞の代表的な画像である。黒矢印は、陰窩基底部における陽性細胞を示す。倍率200×。O1〜O2。CTRL及びT1D+ESRDの個体から得た直腸粘膜生検試料上で実施したTMEM219 in situハイブリダイゼーションの代表的な画像である。倍率400×。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01。略号:PI、ヨウ化プロピジウム;IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;IGF-IR、インスリン様増殖因子1受容体;CoSC、結腸幹細胞;T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;EphB2、エフリンB受容体2;LGR5、ロイシンリッチ反復領域を含有するGタンパク質共役型レセプター5;RT-PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;ACTB、ベータアクチン;SEM、平均値の標準誤差。
【図８−２】図8-1参照。
【図８−３】図8-1参照。
【図８−４】図8-1参照。
【図８−５】図8-1参照。
【図８−６】図8-1参照。
【図９−１】IGF-I/IGFBP3で培養したミニ・ガット内でカスパーゼが発現し、またその他の循環因子の効果が存在しなければ、ミニ・ガット発生に対してIGFBP3は多大なアポトーシス促進効果を有することが確認されたことを示す図である。A。棒グラフは、T1D+ESRDを有する個体から単離し、IGFBP3、IGF-I+IGFBP3、及びIGF-Iの存在下で培養し、これを3回実施した陰窩におけるカスパーゼ8の標準化したmRNA発現を表す。B。棒グラフは、T1D+ESRDを有する個体から単離し、IGFBP3、IGF-I+IGFBP3、及びIGF-Iの存在下で培養し、これを3回実施した陰窩におけるカスパーゼ9の標準化したmRNA発現を表す。C、D。棒グラフは、健康な対象(C)及び遷延性T1Dの個体(D)から発生し、FBSを含む培地、及び健康な対象から得た血清「CTRL血清」を含む培地の存在下で培養したミニ・ガットの割合(%)についてグループ化する。アッセイは三重測定であった。E。棒グラフは、健康な対象から得られ、8日間培養し、siRNAによるTMEM219の標的化及び抗IGF-IRに曝露したときの、全体に対するミニ・ガットの発生割合(%)についてグループ化し、最終的に培地単独及び培地+高濃度グルコース+遷延性T1Dの血清中のTMEM219発現陰窩と比較する。アッセイは3回実施した。F、G。棒グラフは、健康な対象(F)、及び遷延性T1Dの個体(G)から取得し、培地単独及びプロテオーム分析により識別された様々な分子の存在下で培養した、培養8日目のミニ・ガット発生割合(%)についてグループ化する(表S7)。アッセイは3回実施した。H。棒グラフは、健康な対象から取得し、インスリンを含めて/含めずに、培地単独、培地+高濃度グルコース、培地+高濃度グルコースと遷延性T1D血清、IGF-I、IGFBP3の存在下で培養したミニ・ガットの割合(%)についてグループ化する。アッセイは3回実施した。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01;**p<0.001。略号:IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;IGF-IR、インスリン様増殖因子1受容体;CoSC、結腸幹細胞;T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;RT-PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;ACTB、ベータアクチン;SEM、平均値の標準誤差;siRNA、低分子干渉RNA;ALDOA、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼA;RNASE、膵臓リボヌクレアーゼ;MASP、マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ1。
【図９−２】図9-1参照。
【図９−３】図9-1参照。
【図１０−１】IGF-I/IGFBP3ダイアドの単一細胞由来のミニ・ガット、幹細胞トランスクリプトームプロファイル、及びアポトーシス経路に対する効果を示す図である。A1〜A3。健康な対象のこれまでに単離されたEphB2+選別細胞から取得し、培地単独、培地+IGFBP3、培地+35mMグルコース+遷延性T1Dの血清を用いて培養した、8日間in vitro培養した単一細胞由来のミニ・ガットの代表的な画像である。画像は、倍率10×で示す。スケールバー50ミクロン。B、C、D。棒グラフは、健康な対象から単離し、異なる条件で培養したEphB2+細胞をフロー選別し、その細胞から増殖させた単一細胞由来のミニ・ガット内におけるカスパーゼ8、カスパーゼ9、及びKi67の標準化したmRNA発現を表す。アッセイは3回実施した。E、F。散布図は、IGFBP3及びIGF-Iを含め/含めずに培養した、健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)の新鮮分離した腸陰窩において調べた幹細胞トランスクリプトームプロファイリングを表す。アッセイは3回実施した。G、H。散布図は、IGF-Iを含め/含めずに培養した健康な対象(CTRL)及び遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)の新鮮分離した腸陰窩において調べたアポトーシストランスクリプトームプロファイリングを表す。表は、分析した遺伝子及び経路について要約する(表S3)。アッセイは3回実施した。I、J。棒グラフは、健康な対象(I)及び遷延性T1D(J)から取得し、次に培地単独、Fasリガンド(FasL)、過酸化水素(H2O2)、及び腫瘍壊死因子α(TNF-α)の存在下で培養した陰窩から発生したミニ・ガットの割合(%)についてグループ化する。アッセイは3回実施した。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01;**p<0.001;***p<0.0001。略号:IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;CoSC、結腸幹細胞;T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;RT-PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;ACTB、ベータアクチン;SEM、平均値の標準誤差;FasL、Fasリガンド;H2O2、過酸化水素;TNF-α、腫瘍壊死因子α。
【図１０−２】図10-1参照。
【図１０−３】図10-1参照。
【図１０−４】図10-1参照。
【図１１−１】糖尿病性腸疾患の前臨床モデルにおけるIGF-I/IGFBP3ダイアドの操作を示す図である。A。棒グラフは、naive B6マウス(WT)及びSTZで治療したB6マウス(B6+STZ)において測定したIGFPB3循環レベルを表す。B。棒グラフは、naive B6マウス(WT)及びSTZで治療したB6マウス(B6+STZ)において測定したIGF-I循環レベルを表す。C。棒グラフは、naive B6マウス(WT)及びSTZで治療したB6マウス(B6+STZ)において測定したインスリン血清レベルを表す。D、E、F:折れ線グラフは、ベースライン時及び8週間後に、STZで治療した糖尿病性腸疾患発症B6マウス(B6+STZ)、naive B6(WT)、及びIGFBP3で治療したSTZ-B6マウス(B6+STZ+IGFBP3)又はIGF-Iで治療したSTZ-B6マウス(B6+STZ+IGF-I)から採取した下部腸管切片上で評価した陰窩の数(D)、陰窩の深度(E)、及び陰窩の幅(F)について報告する。WT:野生型、STZ:ストレプトゾチシンで治療した。1群当たりマウスN=3を評価した。G。棒グラフは、STZで治療した糖尿病性腸疾患発症B6マウス、WT、及びIGFBP3で治療したSTZ-B6マウス(B6+STZ+IGFBP3)又はIGF-Iで治療したSTZ-B6マウス(B6+STZ+IGF-I)の免疫染色切片におけるAldh+細胞/mm2の数を表す。H1〜H2:IGFBP3で治療したSTZ-B6マウス(B6+STZ+IGFBP3)(H1)、又はIGF-Iで治療したSTZ-B6マウス(B6+STZ+IGF-I)(H2)のH&E切片上における腸陰窩の代表的な画像である。組織学倍率、400×。I。折れ線グラフは、STZで治療した糖尿病性腸疾患発症B6マウス(B6+STZ)、naive B6(WT)、IGFBP3で治療した糖尿病性腸疾患発症STZ治療B6マウス(B6+STZ+IGFBP3)の体重について報告する。WT:野生型、STZ:ストレプトゾチシンで治療した。1群当たりマウスN=3を評価した。J。棒グラフは、naive B6マウス、STZで治療したB6マウスから、及びIGFBP3で治療したSTZ-B6マウス(B6+STZ+IGFBP3)において収集した腸試料中のEphB2+細胞のフローサイトメトリー分析結果を表す。K、L。棒グラフは、naive B6マウス、STZで治療したB6マウスから、及びIGFBP3で治療したSTZ-B6マウス(B6+STZ+IGFBP3)において収集した腸試料中でのEphB2(K)及びLGR5(L)の標準化したmRNA発現を表す。M、N。棒グラフは、naive B6マウス、STZで治療したB6マウスから、及びIGFBP3で治療したSTZ-B6マウス(B6+STZ+IGFBP3)において収集した腸試料中のカスパーゼ8(M)及びカスパーゼ9(N)の標準化したmRNA発現を表す。別途報告がなければ、データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。*p<0.01;**p<0.001;***p<0.0001。略号:WT、野生型;STZ、ストレプトゾチシンで治療した;B6、C57BL/6Jマウス;IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;CoSC、結腸幹細胞;H&E、ヘマトキシリン及びエオシン;EphB2、エフリンB受容体2;Aldh、アルデヒドデヒドロゲナーゼ;SEM、平均値の標準誤差。
【図１１−２】図11-1参照。
【図１１−３】図11-1参照。
【図１１−４】図11-1参照。
【図１２−１】SPKにより遷延性T1Dを治療すれば、糖尿病性腸疾患が改善することを示す図である。A、B、C。棒グラフは、健康な対象(CTRL)、遷延性T1Dの個体(ベースライン)、膵腎同時(SPK)移植又は腎単独(K+T1D)移植を受けたT1D+ESRDにおけるGSRS質問票による腹痛、下痢、及び便秘のスコアを表す。グレー部分は、すべてのパラメーターの正常範囲を示す。統計は、平均値±SEMとして表す。D1〜D2、E1〜E2、G1〜G2、J1〜J2。フォローアップの8年目において膵腎同時(SPK)移植又は腎単独(K+T1D)移植を受けたT1D+ESRDから得た直腸粘膜生検試料上で実施した、神経構造(赤矢印は、神経内分泌小胞の局在場所及び存在を示す)、Schwann細胞(赤矢印は細胞質の乱れを示す)、及び5HT+細胞のヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色、及び超微細構造的分析の代表的な画像である。倍率400×。F、H、I、K。棒グラフは、電子顕微鏡検査法、5HT+細胞を使用して、CTRL、遷延性T1Dの個体(ベースライン)、8年フォローアップ期間に膵腎同時(SPK)移植又は腎単独(K+T1D)移植を受けたT1D+ESRDの直腸粘膜から得た生検試料上で実施した、神経内分泌小胞(神経終末1つにつき>3のNE小胞が検出されたケースの割合(%))、濃縮した核(picnotic nuclei)及び細胞質の乱れを有するシュワン細胞の割合(%)(陽性ケースの割合(%))の測定について報告する。統計は、平均値±SEMとして表す。CTRL N=20、SPK n=30、K+T1D n=30、及びT1D+ESRD n=60の対象を評価した。統計は、平均値±SEMとして表す。調べたすべてのパラメーターは、異なる群を比較したとき、以下のように統計的に有意に異なった:*p<0.01;**p<0.001;***p<0.0001。1群当たり対象N=10を評価した。略号:GSRS、胃腸症状評価尺度;SPK、膵腎同時移植;K+T1D、1型糖尿病における腎単独移植;CTRL、健康な対象;T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;5HT、セロトニン;H&E、ヘマトキシリン及びエオシン;NGF、神経増殖因子;SEM、平均値の標準誤差;NE、神経内分泌小胞。
【図１２−２】図12-1参照。
【図１２−３】図12-1参照。
【図１２−４】図12-1参照。
【図１３−１】SPK群及びK+T1D群の糖尿病性腸疾患における結腸幹細胞、IGF-IR、及び循環性因子のプロテオミクスプロファイルの分析を示す図である。A1〜A6。遷延性T1Dの個体、フォローアップの8年目において膵腎同時(SPK)移植又は腎単独(K+T1D)移植を受けたT1D+ESRDのこれまでに単離した陰窩から取得し、in vitroで8日間培養したミニ・ガットの代表的な画像である。画像は、倍率5×及び10×で示す。スケールバー10ミクロン。B。散布図は、SPK個体の新鮮分離した腸陰窩について調べた幹細胞トランスクリプトームプロファイリングを表す。対象N=3を評価した。C。棒グラフは、定量的RT-PCRにより測定された健康な対象(CTRL)、遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)、SPK、及びK+T1Dの単離した陰窩上におけるIGF-I受容体(IGF-IR)の相対的発現レベルを表す。すべての試料は三重測定し、ΔΔCt法を使用してACTB相対的発現レベルに対して標準化した。結果は、平均値±SEMとして表す。D。ヒートマップは、遷延性T1Dのプロテオミクスプロファイルを、CTRL及びフォローアップの8年目におけるSPKの対象と比較して表す。同定及び定量化したタンパク質の完全なデータセットについて統計分析を行った(p<0.05)。有意に異なり発現しているタンパク質について、階層的クラスタリングを通じて更に分析した。統計は、平均値±SEMとして表す。1群当たり対象n=10の血清を評価した。調べたすべてのパラメーターは、異なる群を比較したとき、以下のように統計的に有意に異なった:*p<0.01。略号:T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;SPK、膵腎同時移植;K+T1D、1型糖尿病における腎単独移植;RT-PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;ACTB、ベータアクチン;IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;IGF-IR、インスリン様増殖因子1受容体;SEM、平均値の標準誤差。
【図１３−２】図13-1参照。
【図１３−３】図13-1参照。
【図１３−４】図13-1参照。
【図１４】SPK群及びK+T1D群における腸症状と、インスリン、HbA1C、及び血中グルコースのレベルとの相関を示す図である。A、B。K+T1D群(A)及びSPK群(B)の対象n=20において、GSRS質問票を使用し、最高スコア(0〜7)の項目を考慮して、インスリン血清レベルと腸症状との間の相関を評価した。すべての群を比較する際に、ANOVA(p<0.05)を使用して分析を行った。C。K+T1D群(A)及びSPK群(B)の対象n=20について、遊離インスリン法(Free-Insulin method)を使用してインスリン血清レベルを測定した。データは、平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表す。D、E。K+T1D群(A)及びSPK群(B)の対象n=20において、GSRS質問票(0〜7)を使用して、糖化ヘモグロビン(HbA1C)血清レベルと腸症状との間の相関を評価した。すべての群を比較する際に、ANOVA(p<0.05)を使用して分析を実施した。F、G。K+T1D群(A)及びSPK群(B)の対象n=20において、GSRS質問票(0〜7)を使用して、血中グルコースレベル(糖血症)と腸症状との間の相関を評価した。すべての群を比較する際に、ANOVA(p<0.05)を使用して分析を実施した。略号:T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;SPK、膵腎同時移植;K+T1D、1型糖尿病における腎単独移植;IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3。
【図１５】異なる培養条件に曝露したミニ・ガットにおける細胞系列マーカーの発現を示す図である。A1〜A4、B1〜B4、C1〜C4、D1〜D4、E1〜E4。健康な対象CTRL(A1〜A4)、及びT1D+ESRDの個体(B1〜B4)から単離した陰窩から取得し、IGFBP3(C1〜C4)、35mMグルコース(D1〜D4)、及び35mMグルコース+遷延性T1D血清(T1D+ESRD血清)+IGF-I(E1〜E4)と共に培養したミニ・ガットにおけるサイトケラチン20(KRT20)、ビメンチン、シナプトフィシン、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)発現の代表的な画像である(倍率10×)。免疫蛍光検査法により、CTRL(A1〜A4、B1〜B4)と比較して、T1D+ESRDの個体から得たミニ・ガットでは、すべての系列マーカーの発現が低下しており、ALDHが最小発現マーカーであること(B4)を確認した。ALDH発現の減少は、IGFBP3で治療したミニ・ガットでも検出されたが(C4)、一方、高濃度グルコース及び遷延性T1D血清に曝露し、IGF-Iで治療したミニ・ガットは、ALDH発現の明確な回復を示した。F。棒グラフは、定量的RT-PCRにより測定した、非幹細胞(EphB2-細胞)上でのTMEM219、KRT20、上皮細胞接着分子(EpCam)、及びクロモグラニンA(CHGA)の発現を表す。すべての試料は三重測定し、またΔΔCt法を使用してACTB相対的発現レベルに対して標準化した。結果は、平均値±SEMとして表す。略号:T1D、1型糖尿病;ESRD、末期腎疾患;CTRL、健康な対象;IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;IF、免疫蛍光検査法;KRT20、サイトケラチン20、ALDH、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、EpCam、上皮細胞接着分子;CHGA、クロモグラニンA;RT-PCR、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応;ACTB、ベータアクチン。
【図１６】in vitroミニ・ガットアッセイで候補タンパク質を試験するための選択戦略を示す図である。フロー図は、in vitroミニ・ガットアッセイで試験されるプロテオミクスプロファイルに基づき、タンパク質候補を選択するのに使用される戦略を表す。
【図１７−１】陰窩ドメイン定量基準を利用する、発生したミニ・ガットの分析を示す図である。A〜P。棒グラフは、本論文全体を通じてすでに報告済みの異なる条件で検出可能な、少なくとも1つの陰窩ドメインを有するミニ・ガットの発生割合(%)についてグループ化する。
【図１７−２】図17-1参照。
【図１７−３】図17-1参照。
【図１８】末梢IGFBP3レベルが、健康な対象と比較して、炎症性腸疾患を有する個体で増加していることを示す図である。
【図１９】T1D(A)及びT2D(B)のヒト対象では、IGFBP3末梢レベルが、前糖尿病及び糖尿病の状態において増加していることを示す図である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;CTRL、健康な対象;T1D、1型糖尿病;T2D、2型糖尿病;AutoAb陽性:膵島ペプチドに対する抗体が陽性であることが検出済みである、T1Dを発症するリスクがある非糖尿病の対象;IGT:絶食及び非絶食条件においてOGTT(経口耐糖能試験)で測定したときに耐糖能に障害を有する。NGT:OGTTで測定したときに耐糖能が正常。IFG:空腹時の耐糖能をOGTTで測定したときに障害を示し、絶食状態においてのみ陽性結果を示す。
【図２０】T1D(A)及びT2D(B)のマウスモデルにおける、前糖尿病及び糖尿病の状態でのIGFBP3末梢レベル増加を示す図である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:C57BL6/J、B6マウス;B6、naiveマウス;NOD、非肥満性糖尿病マウス;HFD、高脂肪食、IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3。
【図２１】グルコース曝露(11mM、20mM、35mM)(A)、及び炎症(IFNγが1,000U/ml、且つIl-1βが2ng/ml)(B)期間中に、ヒト初代培養肝細胞内でIGFBP3産生が増加することを示す図である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:INF、炎症(IFNγ+Il-1β);mM、ミリモル;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3。
【図２２】TMEM219が、ヒト膵島上で発現していることを示す図である(A〜C)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:β-ACT、ベータアクチン。
【図２３】TMEM219が、マウス膵島(A)及びマウスβ細胞系(B〜D)上で発現していることを示す図である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:β-TC、マウスβ細胞系;β-ACT、ベータアクチン。
【図２４】IGFBP3(50ng/ml)は、マウスβ細胞系においてin vitroでの炎症促進性刺激(IFNγ+Il-1β)と比較して、それよりも大幅にアポトーシス及びカスパーゼ8発現を増加させ(A〜B)、並びにインスリンの放出及び発現を低下させる(C、D1〜D2、E)ことを示す図である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:IFNγ、インターフェロンγ;IL-1β、インターロイキンβ;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;β-TC、マウスβ細胞系。
【図２５】IGFBP3(50ng/ml)は、マウス膵島において、in vitroでアポトーシス(A)及びカスパーゼ8発現(B)を増加させ、インスリンを低下させる(C)ことを示す図である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
【図２６】IGFBP3(50ng/ml)は、ヒト膵島において、in vitroでアポトーシス及びカスパーゼ8発現を増加させ(A〜B及びC1〜C2)、並びにインスリン発現を低下させること(D1〜D2、E)を示す図である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:Pi、ヨウ化プロピジウム;M30、カスパーゼ開裂型のサイトケラチン18を認識するモノクロナール抗体M30;INS、インスリン、IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3。
【図２７】C57BL/6マウスにIGFBP3注射(150μg/日で15日間)を行うと、8週間の糖尿病の後、膵島形態がin vivoで変化することを示す図である(A1〜A6)。略号:STZ、ストレプトゾトシン;B6、naive C57BL6/Jマウス。
【図２８】Ecto-TMEM219(130ng/ml)は、マウスβ細胞系に対するIGFBP3関連アポトーシス効果を阻止することを示す図である(A〜B、C1〜C3)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:β-TC、マウスβ細胞系;INS、インスリン、IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3。
【図２９】Ecto-TMEM219治療(130ng/ml)は、マウス膵島においてin vitroでカスパーゼ8及びインスリン発現をほぼ正常化させることを示す図である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3。
【図３０】Ecto-TMEM219(130ng/ml)は、ヒト膵島に対するIGFBP3関連アポトーシス効果を阻止することを示す図である(A〜B、C1〜C3)。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。略号:M30、カスパーゼ開裂型のサイトケラチン18を認識するモノクロナール抗体M30;INS、インスリン;IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3。
【図３１】糖尿病マウスにEcto-TMEM219治療(130ng/ml)を行うと、血清インスリン(A、C)及び血中グルコースレベル(B)が回復することを示す図である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
【図３２】作業仮説を示す図である。略号:IGFBP3、インスリン様増殖因子結合タンパク質3;IGF-I、インスリン様増殖因子1;IGF-IR、インスリン様増殖因子1受容体。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１１４】
材料及び方法
膵腎同時移植(SPK)の待機名簿に登録されている遷延性T1Dを有する個体(T1D+ESRD)60例が本試験に登録、年齢及び性別が一致した健康な対象(CTRL)20例と比較された。胃腸症状、腸の運動性、及び腸粘膜病理学の評価により、DEを定義した。CoSCを、CoSC特異的マーカーの発現に基づき(フローサイトメトリー、RT-PCR、ウェスタンブロット、トランスクリプトームプロファイリング)、精製した結腸陰窩上で識別した。CoSC自己再生特性を、in vitroでのミニ・ガット発生割合(%)の評価、及び異なる条件での細胞系統マーカー発現の特徴付けを行うことにより評価した(図15)。幅広い血清プロテオミクスを、CoSCを制御し得る循環性因子を検出するのに使用し、次に候補因子をin vitroミニ・ガットアッセイで試験した(図16)。方法の詳細及び統計分析を以下に記載する。本試験は、Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico Ospedale San Raffaele、Milano、Italy (Enteropathy-Pancreas KidneyTransplantation/01 Secchi/Fiorina)治験審査委員会により承認を受けた。
【０１１５】
患者及び治験デザイン
年齢(41〜43歳)、性別、及びT1Dの期間(29.4±1.8年)が一致し、膵腎同時移植(SPK)の待機名簿に登録されているT1D+ESRDを有する個体60例が、本試験に登録した。腎機能正常及び糖代謝パラメーター正常で、年齢及び性別が一致した健康な対象(CTRL)20例についても試験した。T1D+ESRDの対象はすべて、本試験登録時に強化インスリン治療を受けていたが、一方CTRL群は薬物治療を一切受けていなかった。T1D+ESRDの対象はすべて、抗血小板療法(ASA)及び抗高血圧(アンジオテンシン変換酵素インヒビター)として同一の治療を受けていたが、一方、60例中40例が、本試験登録時にスタチンの投与を受けていた。炎症性腸疾患並びにセリアック病の明確な兆候を有する対象は登録しなかった。
【０１１６】
T1D+ESRDの個体は、移植時の巨視的外科的評価に従い、SPK(n=30)又はK+T1D(n=30)の移植を受けた後、8年間フォローアップされた(平均フォローアップ:8.6±1.1年)。経口抗凝固剤を服用する個体は含まれなかった。SPKの個体はすべて、全フォローアップ期間においてインスリン非依存性であったが、K+T1Dの個体は、強化皮下インスリン療法を受けた。すべての対象は、試験登録前にインフォームドコンセントを提出した。ルーチン臨床フォローアップに含まれない試験は、該当する治験審査委員会の承認の対象とされた(Enteropatia-trapianto/01 Secchi/Fiorina)。
【０１１７】
移植及び免疫抑制
移植用の臓器を、「北イタリア移植」臓器調達コンソーシアム(NITp、Milan)を通じて死去したドナーから取得した。ATG(サイモグロブリン、IMTIX、SANGSTAT社)で誘発した後、シクロスポリン(100〜250ng/mlのレベル)、又はFK506(10〜15ng/mlのレベル)、ミコフェノール酸モフェチル(500〜2000mg/日)、及びメチルプレドニゾロン(10mg/日)を使用して、免疫抑制を維持した。移植後3〜6カ月以内にステロイドを中止した。T1D+ESRD群及びSPK群に含まれるすべての患者は、移植片血栓症又は瘻孔性の血栓を予防するために抗血小板療法(80%ASA及び20%チクロピジン)を受けた。代謝状態、腎機能、及び血圧について、登録期間中、以後移植後2年毎に検査した。推定糸球体濾過率(eGFR)を、腎疾患における食事の修正(Modification of Diet in Renal Disease)(MDRD)の式(Leveyら、1999)を使用して計算した。
【０１１８】
胃腸症状評価尺度(GSRS)
胃腸症状を、健康な対象、遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)、並びに移植後2、4、及び8年目のSPK群及びK+T1D群においてGSRS質問票により評価した。胃腸症状評価尺度(GSRS)は、説明担当者(descriptive anchor)が定義する7等級化されたリッカート尺度を有する15項目からなる質問票である(Svedlundら、1988)。質問票は、胃腸症状を幅広く評価するように設計されたインタビューに基づく評価尺度として当初構成されたが、自己実施型の質問票となるように後に修正された。スコアが高いほど、症状は重度となる:スケールは最小値1から最大値7の範囲である。個体が試験への参加を中止する場合、利用可能な最後の観察所見時の数値が分析に提出される。項目は、要因分析に基づいてあらかじめ識別された5つの次元:腹痛症候群(3項目)、還流症候群(2項目)、消化不良症候群(4項目)、下痢症候群(3項目)、及び便秘症候群(3項目)にグループ化され得る。
【０１１９】
肛門直腸内圧測定
肛門直腸内圧測定に関するデータは、7つの管腔、及びプローブの端部に緊結された4cmラテックスバルーンを備えたカスタム仕様の、先端開口式、直径14-Fr、PVCプローブ(Bioengineering Laboratories Plc.、Milan、イタリア)を使用して、健康な対象についてすでに入手可能であったが、そのデータを遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)について肛門直腸内圧測定を実施することにより取得されたデータと比較した(Carringtonら、2014;Remes-Trocheら、2010)。10分間の導入期間後に括約筋の長さを測定し、肛門圧力を休止状態で15分間記録した。次に肛門をできる限りしっかりと、できる限り長く、少なくとも20秒間引き締めるように対象に指示した。発明者らの試験では、下記の項目について評価した:静止時張力、収縮張力、反射応答、及び切迫応答。
【０１２０】
病理学、免疫組織化学、及び電子顕微鏡検査
健康な対象、ベースラインの遷延性T1Dの個体(T1D+ESRD)、並びに移植後2、4、及び8年目のSPK群及びK+T1D群において、Welch Allyn社のオプティックシグモイドスコープを使用して結腸直腸内視鏡手技を実施した。腸粘膜試料を緩衝化ホルマリン(4%w/vホルムアルデヒド及び0.05Mアセテートバッファー)内で固定し、パラフィンワックスでルーチン的に処理した。形態的な評価を行うために、各登録症例の厚さ3μmの切片を、ヘマトキシリン&エオシン(H&E)で染色した。免疫組織化学では、厚さ3μmの切片を、ポリL-リジンコーティングスライドにマウントし、脱パラフィン化し、等級化アルコールから水に通して水和させた。切片を、650Wの電子レンジ内の0.01Mクエン酸バッファー、pH6中に10分間浸漬することにより、抗原回復を実施し、並びに切片を3%過酸化水素中に10分間浸漬することにより、内因性ペルオキシダーゼ活性阻害を実施した後、一次抗体と共に4℃で18〜20時間インキュベーションを実施し、その後にアビジン-ビオチン複合体手順が続いた(Hsuら、1981)。0.03%の3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドを使用して免疫反応を発現させ、次に切片をハリスヘマトキシリンで対比染色した。下記の抗体を使用した:Ki67(モノクロナール、クローンMIB1、1:100稀釈、Dako社、Carpinteria、CA、米国)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(モノクロナール、クローン44/ALDH、1:1000稀釈、Transduction Laboratories社、Franklin Lakes、NJ、米国)、EphB2(モノクロナール、クローン48CT12.6.4、1:200稀釈、Lifespan Biosciences社、Seattle、WA、米国)、LGR5(モノクロナール、クローン2A2、1:100稀釈、Origene Technologies社、Rockville、MD、米国)、hTERT(モノクロナール、クローンY182、1:500稀釈、Millipore社、Billerica、MA、米国)、グリセンチン(ポリクロナール、1:1250稀釈、Milab社、Malmo、スウェーデン)、膵臓ポリペプチド(ポリクロナール、1:500稀釈、Peninsula社、Belmont、CA、米国)、PYY(ポリクロナール、1:1000稀釈、Biogenesis社、Bournemouth、英国)、セロトニン(モノクロナール、クローンYC5、1:50稀釈、Biogenesis社)、ソマトスタチン(ポリクロナール、1:550稀釈、Dako社)、IGF-I(ポリクロナール、1:500、Abcam社)、及びIGF-1R(ポリクロナール、1:100、Cell Signaling Technologies社)、(Fiorinaら、2003)。超微細構造試験では、0.05Mカコジレートバッファー、pH7.3中2%パラホルムアルデヒドと2%グルタルアルデヒドの混合物中において試料を4℃で2時間固定した。試料を1%四酸化オスミウム中、室温で1時間事後固定化し、次に脱水し、エポン-アラルダイト中に包埋した。超薄切片をダイヤモンドナイフで切り出し、ホルムバールフィルムであらかじめコーティングした200メッシュニッケルグリッド上にマウントした。超薄切片を、酢酸ウランとReynoldのクエン酸鉛の水溶液で染色し、その後Philips Morgagni 268D電子顕微鏡で検査した。統計分析用として、神経内分泌小胞の数(n>3及びn<3)に応じて、症例をグループ化した。陰窩の単離では、抗生物質の混合物を含有する試料内で組織を収集し、次のパラグラフの記載に従い処理した。EphB2の免疫染色強度を、1(EphB2陰性グラジエントから1視野1陰窩当たり数個の細胞が陽性)〜5(すべての縦方向の陰窩において強度のEphB2グラジエント)として等級化した。抗IGFBP3一次抗体(ポリクロナール、1:50稀釈、Sigma Aldrich社)を、1型糖尿病を有する患者から得た肝臓生検において免疫組織化学的に試験した。病理学所見を有さ��い肝臓生検を対照として使用した。これらの組織試料はすべて、イタリア、ParmaのUniversity of Parma、Unit of Pathology of the Department of Biomedical、Biotechnological, and Translational Sciencesで保管されているファイルに由来した。免疫染色強度を、1(軽度)、2(中等度)、及び3(強度)として、一方、その拡散を1(限局性)、2(ゾーン状)、及び3(拡散性)として等級化した。
【０１２１】
免疫蛍光検査法
肝臓生検から得た免疫蛍光検査試料を、63×油浸対物レンズ(oil objective)を備えた共焦点システムを使用して観察した(Axiovert 200M倒立顕微鏡と共に組み込まれたLSM 510メタスキャンヘッド;Carl Zeiss社、Jena、ドイツ)。連続的で独立した光学経路を使用して、画像をマルチトラックモードで取得した。下記の一次抗体を使用した:ウサギIGFBP3(1:10、Sigma社)、マウスHep Par-1(1:20、モノクロナール、Dako社)、マウスCD163(1:10、クローンMRQ26、CellMarque社)。
【０１２２】
細胞系統マーカーの発現を評価するために、IGFBP3を含め/含めずに、遷延性T1D血清+高濃度グルコース(35mMグルコース)を含め/含めずに同時培養したミニ・ガット、及びT1D+ESRD個体の陰窩から得たミニ・ガットを、免疫蛍光分析用としてビメンチン、シトケラチン20(Citocheratin 20)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及びシナプトフィシンで染色した(図15: A1〜A4、B1〜B4、C1〜C4、D1〜D4、E1〜E4)。下記の一次抗体を使用した:マウスビメンチン(1:80、モノクロナール、クローン:V9、Dako社)、マウスアルデヒド(1:1000、モノクロナール、クローン:44、BD社)、マウスシトケラチン20(1:100、モノクロナール、クローン:Ks20.8、Dako社)、及びシナプトフィシン(1:100、モノクロナール、クローン:syn88、BioGenex社)。
【０１２３】
in situハイブリダイゼーション
標準手順に従い、ヒト結腸粘膜のパラフィン切片を脱パラフィン化し、再水和した。0.2M HClを使用して、室温で15分間切片を処理した後、切片をPBS中で3回洗浄し、プロテイナーゼK(PBS中30μg/ml)中、37℃で15分間インキュベートした。プロテイナーゼK活性を中和するために、PBS中0.2%グリシンを1分間添加し、試料をPBS中で2回洗浄した。4% PFA中、室温で10分間事後固定化し、PBS中で3回洗浄した後、試料を1.5%トリエタノールアミン、0.15% HCl、及び0.6%無水酢酸を含有する水溶液中で5分間、2回インキュベートすることにより、ヒストンアセチル化を実現した。次いで試料を洗浄し、ハイブリダイゼーション溶液(50%ホルムアミド、5×SSC、pH4.5、2%ブロッキング試薬(Roche社)、0.05%CHAPS(Sigma社)、5mM EDTA、50μg/mlヘパリン(Sigma社)、及び50μg/ml酵母菌RNA)中、68℃で1時間事前ハイブリダイズした。TMEM219では、ジゴキシゲニン標識プローブを、ハイブリダイゼーション溶液で750ng/mlに稀釈し、65℃で24時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後の洗浄を、50%ホルムアミド/2×SSC中、65℃で3×20分間実施した。切片をTBS-Tバッファー(0.1MトリスHCl、pH7.5、0.15M NaCl、0.1%ツイーン20)中でリンスし、ブロッキング溶液(0.5%ブロッキング試薬、TBS-T中10%ヒツジ血清)中、室温で30分間ブロックした。ヒツジ抗DIG抗体(Fab断片、Roche社)を、ブロッキング溶液で1/2000に稀釈し、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。この後、TBS-T、次にNTMバッファー(0.1Mトリス、pH9.5、0.1M NaCl、0.05M MgCl2)中で試料を洗浄し、NBT/BCIP溶液(Roche社)中で24時間展開させた。
【０１２４】
CoSCの特徴付け
陰窩の精製
筋肉層及び粘膜下組織を、新鮮なヒト直腸生検試料から慎重に除去し、粘膜を抗生物質(Normocin、[Invivogen社、San Diego、California 92121、米国]、ゲンタマイシン[Invitrogen社、Carlsbad、CA,米国]、及びファンギゾン[Invitrogen社])の混合物と共に、室温(RT)で15分間インキュベートした。次に、組織を小片に切断し、10mMジチオスレイトール(DTT)(Sigma社、St. Louis、MO 63103、米国)と共に、PBS中、RTで5分間、2〜3回インキュベートした。次に試料をPBS中8mM EDTAに移し、4℃で60〜75分間ゆっくりと回転させた。上清を新鮮なPBSに置換し、試料を激しく振盪させ、結腸陰窩に富んだ上清を得た。ウシ胎仔血清(FBS、Sigma社)を最終濃度5%となるように添加し、単一細胞を取り除くために、分画を40×gで2分間遠心分離した。この洗浄手順を、2mM GlutaMax(Invitrogen社)、10mM HEPES(Sigma社)、及び5% FBS(Sigma社)が補充されたAdvanced DMEM/F12(ADF、Gibco社)培地を用いて3回反復した。
【０１２５】
単離したヒト結腸陰窩200〜300ユニットを、マトリゲル50μlと混合し、すでに記載したように、事前加温した24ウェル培養皿上に播種した。固化(37℃で15〜20分間)後、陰窩に、陰窩完全培養培地600μlを積層した[Wnt3a順化培地、及びGlutamax、10mM HEPES、N-2[1×]、レチノイン酸を含まないB-27[1×]、10mMニコチンアミド、1mM N-アセチル-L-システイン、50ng/mlヒトEGF(Life Technologies社、Grand Island、NY)、1μg/ml RSPO1(Sino Biological社、Beijing、中国)、100ng/mlヒトノギン(Peprotech社、Rocky Hill、NJ、米国)、1μg/mlガストリン(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)、500nM LY2157299(Axon MedChem社、Groningen、オランダ)、10μM SB202190(Sigma社)、及び0.01μM PGE2(Sigma社)が補充されたAdvanced DMEM/F12(Life Technologies社、Grand Island、NY)50:50]。培地を一日おきに交換した。RockインヒビターY-27632(10μM、Sigma社)を、最初の2〜3日間、培養物に添加した。精製した陰窩を8日間直接培養した。CHGA、KRT20、及びEPCAM(Life Technologies社、Grand Island、NY)を試験することにより、ミニ・ガットにおいて、並びにEphB2+及びEphB2-選別後の単一細胞内において、RT-PCRを用いて腸細胞及び腸内分泌細胞に関する細胞系統マーカーを評価した。生検手順及び単離処理が、in vitro培養におけるミニ・ガット形成効率を損なったおそれがあるという懸念を除外するために、コロニー形成効率(%)を新鮮分離した陰窩上で評価した。DAPI染色を実施して、CTRL及びT1D+ESRDの対象から得た新鮮分離した陰窩内の核の数を確認した。発生したミニ・ガットを測定する、より定量的な基準を追加するために、少なくとも1つの陰窩ドメインを有する発生したミニ・ガットについても計測を行い、割合(%)を計算した(図17:A〜P)。遷延性T1D(T1D+ESRD)血清及びCTRL血清上で測定したインスリン及びグルコースレベルを下記の通り報告する:
グルコースレベル(T1D+ESRD対CTRL、178±47.5対90±5.5mg/dl、p0.0001);
インスリンレベル(T1D+ESRD対CTRL、12.9±4.6対5.8±1.6μIU/ml、p=0.009)。
【０１２６】
フローサイトメトリー
CoSCマーカーであるEphB2(APC抗ヒトEphB2抗体、R&D社、Minneapolis、MN)、及びLGR5(PE抗ヒトLGR5、Origene社、Rockville、MD)の発現を、フローサイトメトリーにより、CD45-及びCD11b-陽性細胞(V450抗ヒトCD45及びCD11b、BD Biosciences社、San Jose、CA)を除去して測定した。ヨウ化プロピジウム(PI)を添加して(10μg/ml)、死亡した細胞を除去した。培養を目的として単一細胞懸濁物を取得するために、EphB2+細胞もフローサイトメトリーにより選別した。ヒト-tert(hTERT)の細胞内検出を、細胞の透過処理、及び一次抗ヒトhTERT抗体(GeneTex社、Irvine、CA)、その後にDAPI抗ヤギ二次抗体(Life Technologies社)を用いた染色により実施した。分析に関して、細胞はすべて、その他の表面又は細胞内のマーカーの評価前にPI-として最初にゲート化されたものである。試料は、BD LSR-Fortessa上で測定し、FSC Express 3.0(DeNovo Software社、Los Angeles、CA、米国)により分析した。
【０１２７】
in vitroミニ・ガット生成試験
陰窩を、健康な対象の直腸生検試料から単離し、これまでの記載に従い培養して、ミニ・ガットを生成した。高血糖状態を生み出すために、異なる濃度(35mM:高濃度グルコース;5mM:正常グルコース)でグルコースを添加することにより培養培地を改変した。尿毒症の状態を模倣するために、ESRDを有する遷延性T1Dの個体から得たヒト尿毒症血清を陰窩に添加し、これを陰窩培養法のセクションで報告したように培養した。8日後、陰窩を収集し、形態、ミニ・ガットの増殖、腸シグネチャーマーカー(EphB2、LGR5、h-TERT)、IGF-IR、及びTMEM219 (Life Technologies社)、及びカスパーゼ9(Life Technologies社)の発現について、RT-PCRを使用して検査した。IGFBP3の抗アポトーシス効果を確認するために、汎カスパーゼインヒビター(カスパーゼインヒビターZ-VAD-FMK、20mM、Promega社、Madison、WI)、カスパーゼ8選択的インヒビター(Z-IETD-FMK、BD Pharmingen社)、カスパーゼ9選択的インヒビター(Z-LEHD-FMK、BD Pharmingen社)、カスパーゼ3インヒビターZ-DEVD-FMK(BD Pharmingen社)を、ミニ・ガット内でin vitroで使用した。
【０１２８】
通常のFBSの代わりに、健康な対象のヒト血清、すなわちCTRL血清を含有する陰窩培養培地を用いて、単離した陰窩を培養するために、10%CTRL血清中でL-Wnt3細胞を増殖させて順化培地を生成し、この順化培地は、これまでに記載したような陰窩培養培地を得るために、Advanced DMEM/F12培地に50:50で更に添加される(陰窩の精製を参照)。
【０１２９】
ミニ・ガット生成において、選別したEphB2+細胞の特性を評価するために、選別した細胞2000個を、マトリゲル50μlと混合し、事前加温した24ウェル培養皿上に播種した。マトリゲルの固化後(37℃で10〜15分間)、細胞に「単一細胞増殖培地」(=陰窩培養完全培地+10M RockインヒビターY-27623)を積層した。培地を新鮮な単一細胞増殖培地で一日おきに置換した。Rockインヒビターは、7〜9日間、培養培地中に含めた。
【０１３０】
免疫ブロッティング
腸生検試料の総タンパク質を、Laemmliバッファー(62.5mmol/lトリス-HCl、pH6.8、20%グリセロール、2%SDS、5%β-メルカプトエタノール)中で抽出し、その濃度を測定した(Lowryら、1951)。総タンパク質35μgを7%SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース(Schleicher & Schuell社、Dassel、ドイツ)にブロッティングした。ブロットを、次にポンソーSで染色した。メンブレンを、TBS(トリス[10mmol/l]、NaCl [150mmol/l])、0.1%ツイーン-20、5%脱脂粉乳中、pH7.4、25℃で1時間ブロックし、1:200に稀釈した200mg/mlのポリクロナール抗ヤギEphB2抗体、又はポリクロナール抗ヤギLGR5抗体(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA、米国)、又はモノクロナールIGF-IR(Santa Cruz Biotechnology社)、及びポリクロナールTMEM219(R&D社、Minneapolis、MN)、或いは1:1000に稀釈したモノクロナールマウス抗β-アクチン抗体(Santa Cruz Biotechnology社)と共に、TBS-5%ミルク中、4℃で12時間インキュベートし、TBS-0.1%ツイーン-20で4回洗浄し、次に1:1000に稀釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギIgG二次抗体(又はβ-アクチンに対するウサギ抗マウス)(Santa Cruz Biotechnology社)と共にTBS-5%ミルク中でインキュベートし、最終的にTBS-0.1%ツイーン-20で洗浄した。得られたバンドを、増感化学発光を使用して可視化した(SuperSignal;Pierce社、Rockford、IL、米国)。
【０１３１】
腸陰窩増殖のライブ画像検査
CTRL、T1D+ESRD、及びSPKの個体の腸陰窩を精製及び培養することにより取得したミニ・ガットのライブ画像検査を、5%CO2及び95%空気からなる加湿された事前混合ガス気体が注入され、また装置全体が37℃に設定されたチャンバーを有する環境制御(イタリア、Oko-Lab社製)を備えたZeiss Axiovert S100上で実施した。画像を20分間隔で72時間取得した。Time Lapse(Oko-Lab社、イタリア)を使用して画像を取得及び処理し、必要な場合には、画像編集を、Adobe Photoshop Elements 7.0を使用して実施した。
【０１３２】
形態画像分析
ミニ・ガットの画像を、倒立顕微鏡Leica DH/RBにより、0、5、及び8日目に撮影し、Axio Vision AC Release 4.3を用いて取得した。図で報告した画像は、5日目、倍率10×でのミニ・ガットを表す。
【０１３３】
トランスクリプトームプロファイリング
全RNAを、RNeasy Miniキット(Qiagen社、Valencia、CA)を使用して、オンカラムDNase I消化により、精製した腸陰窩懸濁物から単離した。次に、各試料から得た全RNA3μgを、RT2 First Strandキット(C-03;SABiosciences社、Frederick、MD)を使用して逆転写した。本発明者らは、ヒト幹細胞RT2プロファイラーPCRアレイ(PAHS-405Z)、ヒト幹細胞シグナリングPCRアレイ(PAHS-047Z)、及び下記の遺伝子を含むカスタムアレイ:AXIN2、OLFM4、BMI1、RNF43、CDCA7、SLC12A2、CDK6、SOX9、DKC1、ZNRF3、ETS2、EPHB2、FAM84A、LGR5、GPX2、ACTB(SABiosciences社)を使用した。プロファイラーPCRアレイは、SYBR GreenベースのリアルタイムPCRを使用して遺伝子パネルの発現を定量的に測定する(Kosinskiら、2007)。アポトーシスマーカー及び酸化ストレスマーカーのトランスクリプトームプロファイリングを評価するために、ヒトアポトーシスPCRアレイ(PAHS-012Z、SABiosciences社)、及びヒト酸化ストレスPCRアレイ(PAHS-065Z、SABiosciences社)を用いた。
【０１３４】
qRT-PCR分析
Trizol試薬(Invitrogen社)を使用して、精製済みの腸陰窩からRNAを抽出し、TaqManアッセイ(Life Technologies社、Grand Island、NY)を使用して、製造業者の指示に従い、qRT-PCR分析を実施した。ΔΔCt法を使用して、標準化した発現数値を決定した。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)のデータをACTBの発現に対して標準化し、ΔΔCt値を計算した。統計分析では、一元ANOVAにより、患者毎に全細胞集団にわたり遺伝子発現を比較し、その後、目的とする集団とその他の全集団の間で多重比較するためにボンフェローニ事後検定(Bonferroni post-test)を行った。また、利用可能なソフトウェア、RT2 Profiler PCR Array Data Analysis(Qiagen社)も使用して、統計分析を実施した。2群比較では、スチューデントのt検定を採用した。分析は、新鮮な陰窩では単離後、及び/又はミニ・ガットでは培養から8日後に、3回実施した。Table I-B(表1)は、使用したプライマーの主要な特徴について報告する。
【０１３５】
【表１】
0006360265.tif 000002
【０１３６】
ELISAアッセイ
対象のすべての群、並びに治療した及び未治療マウスのすべての群のプール血清/血漿について、IGF-I及びIGFBP3レベルを、製造業者の指示に従い、市販のELISAキットを使用して評価した(R&D社及びSigma社)。
【０１３７】
ヒト不死化ヘパトーマ細胞系HuH-7を、異なるグルコース濃度、すなわち5.5mM、20mM、及び35.5mMのDMEM/10%FBS中で5日間培養した。培養上清を収集し、IGFBP3 ELISAキット(Sigma社)を使用して、製造業者の指示に従いIGFBP3を評価した。収集した細胞をトリプシンにより分離し、血球計算機で計測した。
【０１３８】
アッセイ内及びアッセイ間変動係数(CV)が3.0%及び5.0%である微粒子酵素免疫測定法(Mercodia Iso-Insulin ELISA)を用いて、インスリンレベルをアッセイした。
【０１３９】
組換えタンパク質及び介入試験
組換えヒトIGF-I(Sigma社、I3769)、(IGF-I)、組換えヒトIGFBP3(Life Technologies社、10430H07H5)、(IGFBP3)、及び抗IGF-IR(Selleckchem社、Boston、OSI-906)を、単離から+2日目に陰窩培養物に添加した。IGFBP3(Reprokine社、Valley Cottage、NY)を、naive B6マウス及びSTZで治療したB6マウスに、0.3mg/マウス/日で15日間投与した;IGF-I(Reprokine社)及びecto-TMEM219を、STZで治療したB6マウスに、糖尿病が2週間経過した後に、5μg/マウス/日の用量で20日間、及び100μg/マウス/日の用量で15日間それぞれ、in vivoで投与した。
【０１４０】
その他の分子を、in vitroミニ・ガットアッセイで試験し、単離から+2日目に陰窩培養物に添加した:アディポネクチン(R&D社)、サイモシンβ4(Abcam社)、C反応性タンパク質(Merck Millipore社)、シスタチンC(Cell Signaling Technologies社)、クロモグラニンA(Life Technologies社)、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ(Novoprotein社)、オステオポンチン(R&D社)、膵臓リボヌクレアーゼ(RNASE社、Novoprotein)、血清アミロイドAタンパク質(Abcam社)、マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ1(MASP1、Novoprotein社)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α、R&D社)、FaSリガンド(FasL、R&D社)。過酸化水素(H2O2、50μM)も、ミニ・ガットアッセイで試験した。
【０１４１】
組換えヒトecto-TMEM219の生成
合成用発現宿主として大腸菌(E. coli)を使用して、組換えヒトecto-TMEM219を生成した。要するに、細胞外TMEM219の遺伝子配列を得た:
THRTGLRSPDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHVVGLLTTLNFGDGPDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR (配列番号2)
【０１４２】
細胞外TMEM219のDNA配列を、lacプロモーターを含有するハイコピープラスミドにクローン化し、次にこのプラスミドを細菌の大腸菌に変換した。IPTG(ラクトース類似体)を添加すると、lacプロモーターが活性化され、細菌に細胞外TMEM219(ecto-TMEM219)を発現させる。SDS-PAGE及びウェスタンブロットを、90%よりも高純度を確認するのに使用した。新規に生成したタンパク質、組換えヒトecto-TMEM219の分子量は80kdaであった。
【０１４３】
健康な対象に由来する陰窩を、これまでの記載に従い単離、培養し、ecto-TMEM219を、使用したIGFBP3濃度と比較して(2:1、1:1及び1:2)、3つの濃度(260ng/ml、130ng/ml、及び75ng/ml)で培養物に添加し、適切な対照を濃度毎に用意した。培養から8日後、カスパーゼ8及び9の発現、CoSCSCシグネチャーマーカー(EphB2及びLGR5)の発現、発生したミニ・ガットの数を更に評価した。
【０１４４】
低分子干渉RNA
健康な対象から取得し、単離した陰窩を増殖させ、完全培地内、及びこれまでに記載したように、高濃度グルコース及び遷延性T1D血清を添加して改変した培養用培地内において、in vitroでミニ・ガットを生成させた(オンライン法内のin vitroミニ・ガット生成試験を参照)。培養から72時間後、これにより陰窩の回復が可能になり、HiPerFectトランスフェクション試薬(Qiagen社)6μlを含む無血清培養培地100μl中の低分子干渉RNA (siRNA;Flexitube siRNA SI04381013、Qiagen社、Valencia、CA)750ngを室温でインキュベートして、トランスフェクション複合体の形成を可能にした。陰窩を、このトランスフェクション複合体と共に、その通常の増殖条件下で6時間インキュベートした。遺伝子発現停止分析を、正常なミニ・ガットの発生割合(%)を評価することにより、24、48、及び72時間において実施した。対照siRNAを、遺伝子発現停止の効果を確認するための陰性対照として使用した。
【０１４５】
プロテオーム分析
1群当たり患者10例から得たプール血清8μlを、ProteoPrep 20スピンカラム(Sigma社)を使用して枯渇させ、したがって20種類の高度に豊富なタンパク質の除去を可能にした。約99%の枯渇を実現するため、製造業者の指示に従い、手順を2回反復した。総タンパク質濃度を決定するために、Direct Detect IR分光光度計、及び標準としてBSAを使用して、回収した上清を分析した。プロテオーム分析用として十分なタンパク質を取得するために、各プール品に由来する32μlを、上記のように処理した。文献で報告されたように(Wisniewskiら、2009)、フィルター支援式試料調製(Filter Aided Sample Preparation)(FASP)プロトコールを使用して、各試料に由来する総タンパク質40μgを溶液中消化した。C18自家製チップカラム(C18 Emporeメンブレン、3M社)を使用して試料を脱塩し、キャピラリークロマトグラフィーシステム(EasyLC、Proxeon Biosystems社、Thermo Scientific社)に注入した。3μmのReproSil Pur 120 C18-AQを充填した自家製の25cm逆相スプレーイング溶融シリカキャピラリーカラム上で、ペプチド分離を実施した。溶離液A(2%v/v ACN、0.5%v/v酢酸を含む純水)と溶離液B(0.5%v/v酢酸と共に20%v/v ACNを含む純水)のグラジエントを使用して、分離を実現した(流速0.15μL/分)(230分間で10〜35%B、5分間で35〜50%B、及び30分間で50〜70%B)。ナノエレクトロスプレーイオン源(Proxeon Biosystems社)を備えたLTQ-オービトラップ質量分析装置(Thermo Scientific社、Waltham、MA)を使用して、マススペクトロメトリー分析を実施した。ロックマスオプションを用いてフルスキャン質量分析スペクトルを取得し、また分解能を60,000に設定した。試料毎の取得質量範囲は、m/z 300〜1750Daであった。最も強度の高い二重及び三重荷電したイオン10種類を選択し、ノーマライズした衝突エネルギー37%を使用して、イオントラップ内で断片化した。MS/MS用にすでに選択した標的イオンを、120秒間、動的に除外した。すべてのMS/MS試料について、Mascot(v.2.2.07、Matrix Science社、London、英国)サーチエンジンを使用して分析を行い、UniProt_Human Complete_Proteome_cp_hum_2013_12をサーチした。トリプシン特異性、未切断部位2箇所許容、固定修飾としてシステインカルバミドメチル化、タンパク質のN末端アセチル化、及び可変修飾としてメチオニン酸化により、サーチを実施した。質量許容差を、前駆体イオン及び断片イオンについて、5ppm及び0.6Daにそれぞれ設定した。タンパク質を定量化するためには、生データをMaxQuantソフトウェア、バージョン1.3.0.5に負荷した(Coxら、2011)。ラベルフリーのタンパク質定量は、前駆体の強度に基づいた。1%未満のFDR、1タンパク質当たり最低2個のペプチドについて、ペプチド及びタンパク質を許容した。実験をテクニカルトリプリケートで実施した。プロテオーム分析により取得したタンパク質の完全なデータセット(Table I-C) (表2)を、MeVソフトウェアV. 4_8_1を使用して、スチューデントのt検定により分析した。更に対照プール品対T1D-ESDRプール品で有意に異なった(p値<0.01)、47種類のタンパク質を、階層的クラスタリング分析に提出した。
【０１４６】
【表２Ａ】
0006360265.tif 000003
【０１４７】
【表２Ｂ】
0006360265.tif 000004
【０１４８】
【表２Ｃ】
0006360265.tif 000005
【０１４９】
【表２Ｄ】
0006360265.tif 000006
【０１５０】
【表２Ｅ】
0006360265.tif 000007
【０１５１】
候補タンパク質を選択する戦略
遷延性T1Dの対象及び健康な対照者において個別に分離された46個の因子のうち、本発明者らは、両群を比較して、LFQ強度においてより有意な差異を有する因子(p>0.005)を最初に選択し、12因子を除外した(図16)。次に、本発明者らは、本分野においてすでに報告されている研究や公開資料をサーチすることにより、因子の変化が腸の障害及び/又は糖尿病の発症と関連し得るかどうか評価した。これにより、その他の12因子を除外することとなった。また、本発明者らは、リンパ球様コンパートメント(lymphoid compartment)と主に関連する因子も除外した(n=5)。本発明者らは17個の因子に辿り着いた。本発明者らは、細胞膜タンパク質(n=4)を除外し、ミニ・ガットアッセイにおいて残りの因子(n=13)について試験することとした。2つの因子が、in vitro試験において利用不能であった。本発明者らは、合計n=11のタンパク質について試験した。
【０１５２】
動物試験
C57BL/6(B6)マウスを、Jackson Laboratory社、Bar Harbor、Maineから取得した。ハーバード大学医学大学院の動物管理使用委員会より承認を受けた施設ガイドラインに従い、すべてのマウスを管理及び使用した。ストレプトゾトシン注射によりマウスを糖尿病にさせた(225mg/kg、i.p.投与;Sigma社)。糖尿病は、3回連続測定したときに血中グルコースレベルが>250mg/dLであることとして定義した。糖尿病性腸疾患を以下の通り評価した:要するに、全腸を絶命させたマウスから取り出し、PBSでフラッシュした。次に、結腸の端部を切断し、2つの部分に分割した。結腸組織の一方の部分をホルマリン中に直接浸漬した一方、他方の部分は縦方向に切開して管腔及び内部粘膜を露出させ、次にホルマリン中に浸漬した。次に、組織をパラフィン包埋し、H&E及び免疫染色用に処理した。更に、結腸組織も切断し、これまでの記載に従い、結腸幹細胞の単離を実施した(Merlos-Suarezら、2011)。要するに、結腸を2〜4mmの小片に切断し、断片を氷冷PBS 30mL中で洗浄した。断片を事前加温した20mM EDTA-PBSを含有する50mlの試験管に移し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁した組織を、冷却PBS 30mlを含有する試験管に移し、遠心分離した。陰窩を冷却DMEMF12 13ml中に再懸濁し、PBSで洗浄し、トリプシン/DNAse溶液5〜10ml中、37℃で30分間消化した。次に、陰窩をDMEMF12/EDTA中で再懸濁し、40ミクロンストレーナー内で2回濾過し、洗浄した。最終的に、陰窩をフロー培地(DMEM+FBS+EDTA)中で再懸濁し、抗EphB2-APC(R&D社)、マウス抗CD45-PeRCP、及びマウス抗CD11b-PE(BD Pharmingen社)について染色した。FACSCaliburアナライザーを使用して試料を測定し、データをFlowJoにより分析した。組織の一部について急速凍結も行い、下記のマーカーについてRT-PCR試験を実施するためにTryzol中で保管した:
【０１５３】
【表３】
0006360265.tif 000008
【０１５４】
最終的に、血漿及び血清を収集して、IGF-I(IGF-I ELISAキット、R&D社)、IGFBP3(IGFBP3 ELISAキット、R&D社)、及びインスリンレベル(Mercodia Mouse Insulin ELISAキット)の分析を実施した。糖尿病の発現及び持続性を確認するために、血中グルコースを週2回、8週間モニタリングした。
【０１５５】
統計分析
データは、平均値及び平均値の標準誤差(SEM)として提示し、コルモゴロフ-スミルノフ検定により正規分布について、及びルビーン検定により等分散性について検定した。差異の統計的有意性を、両側t-検定及びχ二乗(χ2)検定により検定した。二群間の有意性を、対応のない両側スチューデントのt検定により判定した。多重比較では、ボンフェローニ補正を伴うANOVA検定を採用した。すべてのデータをStatistical Package for the Social Science(SPSS(登録商標)、IBM(登録商標)、SPSS Inc.社、Chicago、IL)に入力し、分析した。GraphPad Prismバージョン5.0(GraphPad Software社、La Jolla、CA)を使用して、グラフを生成した。すべての検定を5%有意水準で実施した。
【０１５６】
結果
腸の機能障害及び臨床症状は、遷延性T1Dに存在する
本発明者らは、遷延性T1D及び末期腎疾患を有する個体(T1D+ESRD)の集団、並びに健康な対象(CTRL)において、腸の形態及び機能について最初に特徴付けを行った。重度の腸症状、例えば下痢、腹痛、及び便秘等は、胃腸症状評価尺度(GSRS)質問票を使用して評価したとき、T1D+ESRDの個体において明白であった(図1:A〜C)。症状は、肛門直腸括約筋機能の異常と関連した(図1:D〜F)。腸粘膜は、健康な対象と比較してT1D+ESRDを有する個体で変化しており、陰窩数の減少、粘膜固有層の歪み、及びゾーン状の硬化症を伴った(図1:G1〜G2、H)。Ki67(MIB1抗体)染色により評価される上皮細胞増殖の有意な低下(図1:I1〜I2、J)、神経退化の兆候(図1:K1〜K2、L)、及び腸の神経内分泌細胞におけるセロトニン発現低下(図1:M1〜M2、N)が認められ、このような個体にDEが存在することを確認した。
【０１５７】
CoSCは、遷延性T1Dで変化した
結腸陰窩について特徴付けを行い、健康な対象と比較してT1D+ESRDの個体において、いずれも局所的幹細胞のマーカーであるEphB2+の発現、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Aldh)+免疫反応性細胞の数が有意に低下していることが判明した(Carpentinoら、2009;Jungら、2011) (図1:O1〜O2、P、Q1〜Q2、R)。FACS分析においてPI-細胞上でゲート化したとき(図8:A〜C)、健康な対象と比較して、T1D+ESRDの個体から得た腸陰窩から単離したEphB2hi、EphB2hi+LGR5+、及びEphB2+h-TERT+細胞の割合(%)が顕著に低下することが明白であり(図2:A〜B、C〜E、図8:D〜E)、それはRT-PCR(図2:F〜H)、及びウェスタンブロット(WB)分析(図8F)によって確認された。T1D+ESRDから得た陰窩のトランスクリプトームプロファイリングにより、CoSCを制御しているこれまでに知られた経路であるノッチ経路(Notch1及び2、JAG1、Dll1、Sox1及び2)、Wnt経路(APC、FZD1、DKC1、ETS2、FAM84A、GPX2、RNF43)、及びBMP経路(BMP1、BMP2、BMP3)の各遺伝子の発現が、健康な対象のこれらの遺伝子の発現と比較してそれよりも低下していることが立証された(図8G及びTable II(表4))。
【０１５８】
【表４】
0006360265.tif 000009
【０１５９】
CoSCシグネチャー遺伝子の分析により、LGR5、EphB2(Graczら、2013;Merlos-Suarezら、2011)、h-TERT(Breaultら、2008)、及びその他の腸幹細胞マーカー遺伝子(Hughesら、2011;Munozら、2012;Ziskinら、2013)も、やはり健康な対象と比較して、T1D+ESRDにおいて有意に過少発現していたことが判明し(図2I)、DEを有する個体でCoSCが変化していることを確認した。
【０１６０】
ミニ・ガットをin vitroで生成させたとき、遷延性T1Dで変化している
CoSCの自己再生特性を評価するために、本発明者らは、in vitroミニ・ガットアッセイを使用した。実際、T1D+ESRDの個体から単離し、in vitroで8日間培養した陰窩は、小型のスフェロイド状のミニ・ガットを形成したが、両群の生存率(図8:H〜I)、及びミニ・ガット形成効率(図8J)は同等であったにもかかわらず、健康な対象と比較して増殖は不奏功であった(図2:J1、J2、K)。循環性因子及び高濃度グルコースのCoSCに対する効果の解明を始めるに当たり、本発明者らは、健康な対象から取得し、単離した腸陰窩を、遷延性T1Dの個体から得た血清を含め/含めずに、高濃度グルコース中、in vitroで8日間培養した(図2:L1〜L4、M)。高濃度グルコースは、完全に成熟したミニ・ガットの生成を部分的に防げ、CoSCの自己再生特性変化では、ミニ・ガットが虚脱したように見えるように、遷延性T1Dの個体の血清と相乗作用を示した(図2:L2〜L4)。遺伝子発現の分析により、CoSCシグネチャーの変化も判明し(図2N)、したがって高血糖及び循環性因子は、協調的に作用して、遷延性T1DにおけるCoSC再建特性を変化させることが示唆される。
【０１６１】
血清の偏りのないプロテオミクスプロファイリングにより、遷延性T1DにおけるIGFBP3レベルの増加が判明した
腸作用性のホルモンとしての役割を果たし、またCoSCの制御において役割を演じ得る潜在的な循環性因子を識別するために、本発明者らは、偏りのないプロテオミクスアレイを使用して、健康な対象の血清プロテオームをT1D+ESRDの個体と比較した。健康な対象と比較して、T1D+ESRDの個体において、プロテオミクスプロファイルが明瞭であることが明白になり、検出されたタンパク質の50%超が、1つの群又は他方の群を区別する(図3A)。いくつかのタンパク質が糖尿病と関連し、またいくつかは、増殖因子若しくは幹細胞関連タンパク質であり、又はおそらくは腸機能に関与した(図3A)。特に、IGF-I結合タンパク質(IGFBP2及び3)レベルは、健康な対象と比較して遷延性T1Dの個体において検出可能であり、IGFBP3はほぼ5倍に高まった一方(図3B)、IGFBP1、4、5、及び6は、ほぼ検出不能な状態に留まった。興味深いことに、遷延性T1Dの個体の肝臓では、クッパー細胞ではなく肝細胞が、健康な対象と比較してそれよりも高いIGFBP3免疫組織化学的発現を示し(図3:C1〜C2、図8:K、L1〜L6)、IGFBP3の肝臓合成及び放出が増加していることを示唆する。高濃度グルコースに曝露したヒト不死化肝細胞の上清において、IGFBP3レベルの増加が検出され、これによりIGFBP3の肝臓放出に対する高濃度グルコースの効果が確認された(図3D)。最終的に、遊離IGF-Iの血清レベルは、健康な対象と比較して、遷延性T1Dにおいて有意に低下していると思われ(図3E)、循環性IGF-I及びIGFBP3レベルが、遷延性T1Dで変化していることが示される。
【０１６２】
末梢IGFBP3及びIGF-IはCoSCを制御する
CoSC及び腸上皮増殖の制御における循環性IGF-I及びIGFBP3の役割を更に解明するために、本発明者らは、単離した陰窩上でのIGF-IR及びIGFBP3受容体(TMEM219)の発現を、RT-PCR及びWB(図3:F、H、図8M)を使用して実証し(図3:F、H、図8:M、N1〜N2)、免疫染色によりCoSC上でのIGF-IRの発現(図8:N1〜N2)、及びin situハイブリダイゼーションにより、TMEM219の発現(図3:G1〜G2)を確認した。CoSC上でのIGF-I及びIGFBP3の役割を機構的に確認するために、本発明者らは、プロテオミクスプロファイリングにより識別されたいくつかの分子の効果について、そのin vitroミニ・ガットアッセイで試験した。潜在的標的を選択する発明者らの戦略は、補足情報で報告されている。T1D+ESRDの個体から取得した腸試料から生成した重度に変化したミニ・ガットは、組換えヒトIGF-I(IGF-I)を培養培地に添加することにより救済されたが(図3I)、一方、組換えヒトIGFBP3(IGFBP3)を添加すると、その結果、IGF-Iで認められた陽性効果の抑制が引き起こされ、ミニ・ガットの発生が減少し、虚脱し、歪んだオルガノイドの形成が高まった(図3I)。IGFBP3は、IGFBP3受容体(TMEM219)(Baxter、2013)を介してIGF-Iに独立的に作用することが最近明らかにされたので(Williamsら、2007)、IGFBP3は、IGF-Iに結合することによりCoSC対してその効果を発揮するのか、又はCoSC上のTMEM219を直接標的とすることにより発揮するのか、そのいずれかを明確にすることが必要であった。健康な対象及び遷延性T1Dの個体から取得し、IGFBP3と共に培養したミニ・ガットにおいて、カスパーゼ8及び9の発現が増加していること(図3J、図9:A〜B)、一方、汎カスパーゼインヒビター(Z-VAD-FMK)を添加すると、又はその他のカスパーゼカスケードインヒビター(カスパーゼ3インヒビター)ではなく、カスパーゼ8及び9の両方の選択的インヒビターを添加すると、IGFBP3効果が抑制されること(図3K)を実証することにより、本発明者らは、IGFBP3は、CoSCに対して直接的なアポトーシス促進効果を有することを最初に確認した。本発明者らは、次に、IGF-Iを添加しても、健康な対象から取得し、IGFBP3に曝露したミニ・ガットにおいて、その発生は救済されないこと(図3L)を実証し、IGFBP3は直接的及び間接的IGF-I機構の両方を通じて作用し得ることを確認した。興味深いことに、高濃度グルコースのみでは、ミニ・ガットの増殖を完全に破綻させることはできず、また抗IGF-IRは、健康な対象から形成されたミニ・ガットの増殖及び形態に悪影響を及ぼさなかった(図3L)。健康な対象から生成したが、高濃度グルコース及び遷延性T1Dの個体由来の血清と共に培養したミニ・ガットにIGF-Iを添加すると、ミニ・ガットの形態は救済されたが、一方、IGFBP3は、ミニ・ガット培養物に添加したとき、IGF-Iの陽性効果を抑制した(図3L)。興味深いことに、遷延性T1Dから得た陰窩を培養する際に、健康な対象「CTRL」の血清を使用すると、ミニ・ガットの発生/形態がほぼ修復され、循環性因子、特にIGF-I/IGFBP3ダイアドがCoSCを制御していることを示す(図9:C〜D)。本発明者らは、次に健康な対象から得たミニ・ガットにおいて、siRNAをin vitroで使用することにより、TMEM219の発現を遺伝的に調節した。ミニ・ガット中のTMEM219をノックダウンさせると、遷延性T1Dの血清と共にIGFBP3及び高濃度グルコースを添加しても、ミニ・ガットの増殖及び自己再生する能力が保持された(図3M)。SiRNAによりTMEM219を、また遮断���体によりIGF-IRを同時ブロックしても、健康な対象又は遷延性T1Dから得た血清を使用したにもかかわらず、ミニ・ガットの発生に対して、何らかの更なる有益な効果を引き起こすことはなかった(図9E)。
【０１６３】
遷延性T1Dの個体の血清プロテオームで変化していると思われるその他の循環性タンパク質を、in vitroミニ・ガットアッセイにおいて試験したが、ミニ・ガット増殖に対して何らかの有意な効果を示さなかった(図9:F〜G)。C-ペプチド及びインスリンは、そのレベルがT1Dで一般的に変化しており、またIGF-IRに結合することによりIGF-I/IGFBP3ダイアドを妨害する可能性があり(図9H)、それらについても試験したが、何らの効果も示さなかった。
【０１６４】
IGF-I/IGFBP3ダイアドは、CoSCも有効に標的とし、陰窩に限らないことを更に確認するために、本発明者らは、単一細胞由来のミニ・ガットに対するその効果について試験した。本発明者らは、単離した陰窩に由来するEphB2+細胞をフローソートし、またTMEM219はその表面上で高度に発現していることを立証した(図4A)。本発明者らは、次に単一細胞由来のミニ・ガットに関するin vitroアッセイにおいてEphB2+細胞を培養し、高濃度グルコース及び遷延性T1D血清に曝露し、並びにIGFBP3を添加すると、単一細胞由来のミニ・ガットの増殖が有意に抑制され、したがって陰窩由来のミニ・ガットに関するこれまでの観察で報告された主要な特徴が再現されたことを確認した(図4B、図10:A1〜A3)。更に、カスパーゼ8及び9の発現は、IGFBP3で治療したミニ・ガット、並びに高濃度グルコース及び遷延性T1D血清に曝露したミニ・ガットにおいて上方制御されていたが、一方、増殖のマーカーであるKi67は、有意に過少発現していた(図10:B〜D)。
【０１６５】
CoSCを制御している、これまでに公知の経路に対するIGF-I/IGFBP3ダイアドの効果
CoSCニッチ機能(すなわち、Wnt/Notch/BMP)に関与していることがこれまでに公知の経路に対するIGF-I/IGFBP3ダイアドの効果を明確にするために、本発明者らは、ニッチ特異的遺伝子転写物の発現をその幹細胞トランスクリプトームプロファイルから得た。IGF-Iは、T1D+ESRDの陰窩から得たミニ・ガット上のWnt/Notchシグナリング経路と関連したいくつかの因子の発現を有意に修復するが(図10E、Table III(表5))、一方、健康な対象の陰窩又はT1D+ESRDの陰窩から得たミニ・ガットにおいては、Wnt/Notch/BMP遺伝子発現に対するIGFBP3の影響は不十分である(図10F、Table III (表5))。
【０１６６】
【表５】
0006360265.tif 000010
【０１６７】
こうして、IGF-Iは、Wnt/Notch/BMPシグナリングに関与するいくつかの遺伝子の発現を維持するだけでなく、IGFBP3も、これまでに公知のその他の経路の重要な標的遺伝子の発現に重大な変化をもたらすことなく、CoSCに対して独立に作用することを確認する。
【０１６８】
CoSC内のアポトーシス経路に対するIGF/IGFBP3ダイアドの効果
ミニ・ガットに対するIGFBP3のカスパーゼ媒介型の効果を明確にするために実施した、広範にわたるトランスクリプトーム分析(図4:C〜D、図10:G〜H、Table IV(表6))では、健康な対象の陰窩から増殖させたミニ・ガットにIGFBP3を添加すると、それはカスパーゼ-カスケード活性化因子(カスパーゼ8及び9)、及びアポトーシス促進遺伝子の有意な上方制御と関連する一方、抗アポトーシス遺伝子Bcl2は下方制御されることが明らかになった(図4C)。
【０１６９】
【表６】
0006360265.tif 000011
【０１７０】
興味深いことに、健康な対象と比較して、T1D+ESRDの陰窩から増殖させたミニ・ガットでは、抗アポトーシス遺伝子(Bcl2、Fas、Nol3)も有意に過少発現していたが、一方、カスパーゼ関連遺伝子(カスパーゼ1、5、7、8、9、14)の大部分は過剰発現していた(図10G)。更に、その他のアポトーシス促進経路に関与する遺伝子の発現は、T1D+ESRDのミニ・ガットにおいて不変であった(すなわち、Fasリガンド、FADD、TNF)、又は阻害されなかった(TRADD)。IGF-Iを添加すると反対の効果が認められた(図4D、図10H)。酸化ストレス標的遺伝子の発現に変化がないこと(Table V(表7))、及び酸化ストレス因子について何らかの効果が存在しないことから(図10:I〜J)、主要なアポトーシス関連カスパーゼ媒介型のIGFBP3機構と、これにより循環性IGFBP3はCoSCを直接制御していることを確認した(図4E)。
【０１７１】
【表７】
0006360265.tif 000012
【０１７２】
循環性IGF-I/IGFBP3ダイアドを操作すると、前臨床モデルにおいて、糖尿病性腸疾患経過が変化する
in vivoでのIGF-I/IGFBP3循環性因子の意義を更に実証するために、本発明者らは、DEの前臨床モデルにおいて、IGF-I及びIGFBP3投与の効果について試験した。糖尿病の化学的誘発(ストレプトゾトシン[STZ]を使用して)から8週間後に、C57BL/6(B6)マウスは、結腸直腸組織内の陰窩数減少を示し(図4F)、該陰窩は、70%を超えるケースで深度及び幅の増加(図4:G、H1〜H2、I)、及びAldh+細胞数の減少(図4:J、K1〜K2)を示した。興味深いことに、これらのマウスは、IGFBP3の血清レベルの増加、及び低レベルのIGF-Iを示し、マウスインスリンレベルは、naive B6と比較して、それよりも低かった(図11:A〜C)。Naive B6マウスにIGFBP3を腹腔内(i.p.)投与すると、局所的陰窩数の減少を引き起こし(図4:F、H3)、大部分の陰窩は、深度及び幅の増加(図4:G、H3、I)を示し、また未治療マウスと比較してAldh+細胞は有意に低下した(図4:J、K3)。これらの特徴は、STZで治療したB6マウスにIGFBP3を投与することにより更に悪化し(図11:D〜G、H1〜H2)、体重減少(図11J)、CoSCの喪失(図11:J〜L)、及びカスパーゼ8及び9発現の上方制御(図11:M〜N)といったエビデンスを有する。STZで治療したB6マウスにIGF-Iをi.p.投与しても、部分的に粘膜形態を改善し、正常な陰窩の数を増加させるに過ぎず、異常のままであり(図11D)、またAldh+細胞数を部分的に修復するに過ぎない(図11:G、H1〜H2)。
【０１７３】
膵腎同時移植(SPK)による遷延性T1Dの治療は、DEの臨床的及び形態的特徴を回復させる
遷延性T1Dに対する最良標準治療はSPKであり、安定な糖代謝制御、ほぼ正常化したリスク因子、及び生存延長を実現した(Table VI(表8))(Fiorinaら、2004;Fiorinaら、2005;Folliら、2010;Secchiら、1998;Smetsら、1999)。
【０１７４】
【表８】
0006360265.tif 000013
【０１７５】
しかし、T1D+ESRDを有する個体も、腎単独移植で治療されるが、糖尿病の状態は存続する(K+T1D)(Fiorinaら、2001)。胃腸症状の有意な改善は、移植を受けた個体からなる発明者らのコホートにおいて、SPK後長期にわたり明白であった一方、K+T1D群はベネフィットを一切報告せず(図12:A〜C)、DEは可逆的であることを示唆する。
【０１７６】
SPKによる遷延性T1Dの治療は、腸粘膜の形態及び局所的自己再生特性を再構築する
腸粘膜試料の分析により、SPK群において上皮コンパートメントの構造の有意な回復、代償性の上皮過形成が示された(図12:D1〜D2)。遷延性T1Dの治療に奏功したとき、正常な陰窩の組織学及び数の回復は、SPK群において明白であった一方、これらの特徴のいずれも、腎移植のみを受け、糖尿病の状態が存続した個体では明白ではなかった(図12:D1〜D2)。上皮細胞の増殖(MIB1+細胞)は、SPK後、ベースライン及び各時点におけるK+T1Dと比較して長期にわたり増加し(図4:L、M1〜M2)、腸の形態、上皮再生、及び神経の特徴はほぼ正常化した(図12:E1〜E2、F、G1〜G2、H〜I、J1〜J2、K)。これは、遷延性T1DをSPKにより治療すれば、腸上皮の修復及び自己再生特性の回復が促進されることを実証する。
【０１７７】
遷延性T1Dの治療は、CoSCの修復を促進する
遷延性T1DのSPKによる治療は、Aldh+細胞の増加(図4:N、O1〜O2)、及び腸陰窩内でのEphB2+発現(図4:P、Q1〜Q2)と関連し、また単離された腸陰窩内のEphB2hi+、EphB2+hTERT+、及びEphB2hi+LGR5+細胞の割合(%)を、ベースラインと比較してほぼ正常化させる(図5:A〜C)。CoSCマーカー発現(図5:D〜G)、及びSPKの個体から得たミニ・ガットの増殖/形態も、ほぼ正常化した(図5H、図13:A1〜A6)。トランスクリプトーム分析により、SPKは、幹細胞及びCoSCマーカー、並びにCoSCの保存に関与する経路の発現をほぼ修復させることが判明した(図5I、図13B、Table VII(表9))。
【０１７８】
【表９】
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【０１７９】
SPKによる遷延性T1Dの治療は、循環性IGF-I及びIGFBP3を修復する
幅広いプロテオーム分析及び標的を定めた免疫測定法により、IGF-IRの発現がほぼ再構築されたことと関連して(図13C)、SPK後に、IGFBP3及びIGF-Iの血清レベルがほぼ正常化したことが判明した(図5:J〜K)。このような結果は、低レベルのIGF-I(図5J)及びIGF-IR発現(図13C)、並びにIGFBPプロファイルにおいて部分的な回復のみ(図13D)を示したK+T1D群では不明瞭であった。SPK群及びK+T1D群の両群における、IGFBP3血清レベルと腸症状との間の有意な相関により、但し後者でより明白であったが、IGFBP3レベルの修復は、糖尿病性腸疾患の改善と関連することを確認した(図5:L〜M、図14:A〜G)。SPKにより遷延性T1Dを治療すれば、循環性IGF-I/IGFBP3ダイアドのグルコース関連の修復により、糖尿病性腸疾患が改善する。
【０１８０】
Ecto-TMEM219組換えタンパク質は、in vitroでのIGFBP3が媒介するミニ・ガット破壊を抑制し、またDEのマウスモデルにおいて、in vivoでCoSCを保存する。
CoSCに対するIGFBP3が媒介する有害効果を更に実証するために、本発明者らは、TMEM219細胞外ドメインに基づき、組換えタンパク質を生成した(ecto-TMEM219)。Ecto-TMEM219(IGFBP3とのモル比2:1)をCTRLから得た陰窩に添加し、IGFBP3と共に培養すると、ミニ・ガットに対するIGFBP3のアポトーシス促進効果が抑制され、陰窩の再生特性が保持されてミニ・ガットが生成される(図6A)。IGFBP3及びecto-TMEM219と共に培養したミニ・ガットでは、CoSCシグネチャーマーカー、EphB2、及びLGR5の発現が有意に回復し、CoSCの保存における好ましい効果が強調され(図6B)、それは高濃度グルコースで培養したミニ・ガットでも確認された(図6A)。更に、RT-PCRによるカスパーゼ8及び9の分析により、IGFBP3で培養したミニ・ガットにecto-TMEM219を添加したとき、IGFBP3単独と比較して、カスパーゼ8及び9の発現の正味の減少を立証した(図6:C〜D)。本発明者らは、次にSTZ-B6マウスをecto-TMEM219で治療し、粘膜形態の改善を認め、陰窩の数、深度、及び幅が回復した(図6:E、F、G)。Ecto-TMEM219の投与は、STZで治療したB6と比較して、マウス体重の増加と関連すると共に(図6H)、CoSCが有意に復活し(図6:I〜K)、カスパーゼ8及び9の発現が減少し(図6:L〜M)、循環性IGFBP3レベルが再構築された(図6N)。
【０１８１】
考察
糖尿病性腸疾患は、生活の質の低下、栄養失調、及び吸収障害と関連するので、T1Dを有する個体における臨床的に意義のある合併症を代表する(Bytzerら、2002;Farajら、2007;Talleyら、2001)。特に、遷延性T1Dを有する個体(T1D+ESRD)では、腸の障害が高い頻度と重症度を伴い生じ(Canoら、2007;Wuら、2004)、体重減少及び悪液質を引き起こし(Pupimら、2005)、腸疾患は遷延性T1Dの重要な合併症であることを示す(Atkinsonら、2013;Pambiancoら、2006)。発明者らの結果は、遷延性T1Dを有する個体は重度の腸の障害を経験したこと(Table VIII(表10))、及びこれらの臨床状態は、腸管上皮細胞の増殖低下及び神経退化の兆候を伴う腸粘膜の変化と関連することを実証している。
【０１８２】
【表１０】
0006360265.tif 000015
【０１８３】
類似した特徴が、T1D及びDEの齧歯類モデルでも報告されている(Domenechら、2011)。発明者らのデータは、初めて、DEをCoSCにおける欠陥に結びつけ、IGFBP3が腸上皮のホメオスタシスの維持において重要な役割を有することを示す。高血糖は、T1Dの顕著な特徴であるが、発明者らのin vitro試験は、この特徴はDEを十分に説明することはできないこと、また循環性因子が重要な役割を演じている可能性があることを示唆する。プロテオーム分析により、IGF-IがCoSCのホメオスタシスに関与する腸疾患因子として同定された。本発明者らは、次にIGF-I及びIGFBP3はCoSCを制御していること、及びこの軸は遷延性T1Dにおいて非機能的であることを確認した。発明者らのデータは、IGF-Iは、陰窩の増殖を促進し、またIGF-IRを通じてCoSCを制御する循環性腸疾患因子として作用する一方、IGFBP3は、循環性IGF-Iに結合しそのバイオアベイラビリティを低減させることにより、IGF-Iシグナリングをブロックし得ることを示している。更に、最も重要なこととして、本発明者らは、CoSCがTMEM219(IGFBP3受容体)を発現していることを実証したが、そのCoSCに対して、IGFBP3が、アポトーシス促進性のIGF-Iとは独立した機構を通じて作用し、これによりミニ・ガット増殖の不具合を誘発することを、本発明者らは明らかにした。この後者の効果は、カスパーゼ8及び9媒介型であり、またTMEM219依存性である;実際、CoSC上にIGFBP3受容体(TMEM219)が存在しないと、高濃度グルコース関連のCoSC傷害は大幅に減少した。飢餓及び悪液質と共にT1Dは、内因性インスリンにより制御され、刺激を受ける肝臓IGF-Iの放出低下に起因して(Le Roith、1997;Sridhar及びGoodwin、2009)、循環性IGF-Iレベルが低いことにより特徴付けられる(Bondyら、1994;Giustinaら、2014)。より重要なこととして、高血糖は、IGFBP3の肝臓合成及び放出に対して直接的な効果を有すると思われた。したがって、IGFBP3は、高血糖期間中に腸管吸収能力を低下させる肝臓ホルモンとして作用し得る。興味深いことに、SPKは、本発明者らの仮説に対する概念証明をもたらし、またCoSCを制御する循環性因子の存在に関する本発明者らの所見を支持した。本発明者らは、その研究においてDEの臨床的及び機能的特徴の目覚ましい改善を認めたが、そのような改善はCoSCの補充、並びに循環性IGF-I及びIGFBP3の修復と関連して、発明者らの仮説を強化する。最後に、新規に生成したecto-TMEM219組換えタンパク質は、糖尿病マウスのDEをin vivoで改善し、またin vitroで正常に増殖するミニ・ガットの能力を修復し、したがってCoSCを制御する際、及び新規の潜在的治療戦略の道を開く際の、IGFBP3の役割が確認される。まとめとして、発明者らの研究は、高血糖と関連したIGFBP3が媒介するCoSCの破壊は、DEにおいて明白であることを示す。本発明者らは、循環性IGF-I/IGFBP3は、CoSCを制御するホルモン性のダイアドに相当し、特に長期にわたる真性糖尿病により引き起こされた腸の障害を有する個体のための新規治療標的を代表することを示唆する(Bondyら、1994;Bortvedt及びLund、2012;Boucherら、2010)。
【実施例２】
【０１８４】
材料及び方法
患者及び治験デザイン
年齢(41〜43歳)、性別、及びT1Dの期間(29.4±1.8年)が一致しており、膵腎同時移植(SPK)の待機名簿に登録されているT1D+ESRDを有する個体60例が、本試験に登録した。10〜20年間、1型糖尿病(T1D)に罹患していた対象20例も登録した。腎機能が正常であり、且つ糖代謝パラメーターも正常である、年齢及び性別が一致した健康な対象(CTRL)20例についても試験した。T1D+ESRDの対象はすべて、本試験登録時に強化インスリン治療を受けていたが、一方CTRL群は薬物治療を一切受けていなかった。T1D+ESRDの対象はすべて、抗血小板療法(ASA)及び抗高血圧(アンジオテンシン変換酵素インヒビター)として同一の治療を受けていたが、一方、60例中40例が、本試験登録時にスタチンの投与を受けていた。炎症性腸疾患並びにセリアック病の明確な兆候を有する対象は登録しなかった。
【０１８５】
T1D+ESRDの個体は、移植時の巨視的外科的評価に従い、SPK(n=30)又はK+T1D(n=30)の移植を受けた後、8年間フォローアップされた(平均フォローアップ:8.6±1.1年)。経口抗凝固剤を服用する個体は含まれなかった。SPKの個体は、全フォローアップ期間において、すべてインスリン非依存性であったが、K+T1Dの個体は、強化皮下インスリン療法を受けた。すべての対象は、試験登録前にインフォームドコンセントを提出した。ルーチン臨床フォローアップに含まれない試験は、該当する治験審査委員会の承認の対象とされた(Enteropatia-trapianto/01 Secchi/Fiorina)。
【０１８６】
尿中及び血清中IGFBP3評価
遠心分離後、新鮮血3mlから血清を収集した。尿試料を、新鮮収集、遠心分離し、-80℃で保管した。すべての対象の群について、そのIGFBP3レベルを、市販のELISAキットを使用して、製造業者の指示に従い(R&D社)、血清及び尿の凍結試料中で評価した。
【０１８７】
統計分析
Prism Graphpadソフトウェアを使用して、相関分析及びグラフ化を実施した。相関分析には、評価した個体の尿中に対する血清中のIGFBP3レベル、推定糸球体濾過率(eGFR)に対するIGFBP3血清レベルの評価が含まれた。P値が<0.05であったとき、統計的に有意とみなした。
【０１８８】
腎機能及び糖代謝パラメーターの測定
MDRDの式を、ml/min/m2として推定糸球体濾過率(eGFR)を評価するのに使用した。血液検査には、試験に登録した全対象のクレアチニン、血中グルコース、糖化ヘモグロビンの評価が含まれ、CTRLと、T1Dの個体及び遷延性T1D(T1D+ESRD)を有する個体との比較に重点が置かれた。
【０１８９】
結果
血清IGFBP3レベルは、尿中IGFBP3レベルと相関する
本試験に登録した全対象におけるIGFBP3の血清及び尿中レベルの分析により、CTRLと比較して、及びT1Dの個体と比較した場合には、その程度はより少ないものの、T1D+ESRDの対象では、IGFBP3の血清(図7A)及び尿中(図7B)レベルの両方において有意な増加を立証した。IGFBP3の尿中レベルと血清レベルとの間の有意な相関は、評価した全対象で認められた(図7C)。血清IGFBP3レベルが高くなるほど、これと相関して尿中IGFBP3レベルは高くなる。これが腎機能と関連する可能性を排除するために、IGFBP3血清レベルと腎機能(eGFR)との間の対比を実施した。IGFBP3血清レベルは、ESRDを有する対象(eGFR<15ml/min/m2)で有意に高かった(図7D)。但し、eGFRが>15ml/min/m2である対象はESRDによる影響を受けず、T1Dの有無及び病歴に関係なく、eGFRとIGFBP3血清レベルとの間で、何らかの統計的有意な相関を示さなかった(図7E)。CTRLにおけるIGFBP3の尿中レベル対血清レベルの相関を考慮し、25°〜75°のパーセンタイル内でその平均値とメジアン値を比較すれば、発明者は、下記のように尿中IGFBP3の範囲を設定することができる:
<350pg/ml:正常レベル(健康な対象に認められるレベル)
350〜500pg/ml:変化レベル(疾患歴が<5年のT1Dに認められるレベル)
>500pg/ml:腸疾患を示唆する(遷延性T1D、その他のT1D合併症を伴い、>5年のT1Dの病歴を有するT1Dの対象に認められるレベル)。
本発明者らは、尿中IGFBP3レベルの正常範囲(<350pg/ml)も、その血清IGFBP3レベルとの相関を考慮することにより、図7F中のグレー部分で示すように識別することができる。
【実施例３】
【０１９０】
長期炎症性腸疾患(IBD)を有する個体5例が登録し、糖尿病試料の分析に関して上記した方法と同一の方法に従い、IGFBP3、IGF-1の末梢レベル、及びIGFBP3/IGF-1の比についてスクリーニングされた。
【０１９１】
IGFBP3はわずかに増加したが、IGF-1のレベルは著しく低下し、IGFBP3/IGF-1比が全体的に変化したことが見出された(図18)。したがって、炎症性腸疾患では、多量のIGFBP3が遊離した状態にあり、腸幹細胞に対してその毒性効果を発揮するのに利用可能である。
【０１９２】
したがって、IGFBP3のインヒビターも、炎症性腸疾患の治療及び/又は予防において有益である。
【実施例４】
【０１９３】
材料及び方法
患者及び治験デザイン
年齢及び性別が一致した1型(T1D)を有する個体、長期間(>15年)にわたりT1Dを有する個体(遷延性T1D)、及び健康な志願者(CTRL)に由来する血清試料60件を、San Raffaele病院の血液コレクションから取得した。膵島自己抗体試験陽性とスクリーニングされた個体に由来する血清試料20件を、Gainsville(Florida)の協力施設で収集した。耐糖能が正常な個体(NGT)、耐糖能が障害性の個体(IGT)、及び2型糖尿病(T2D)の個体に由来する血清試料235、200、及び81件を、Genfievプロトコール試験の下、University of Pisa(イタリア)から収集した。ADA 2003基準によるOGTT試験の結果に応じて、NGT、IGT、及びT2Dを決定した。
【０１９４】
T1D及び遷延性T1Dの対象はすべて、試験登録時に強化インスリン治療を受けていたが、一方CTRL群は薬物治療を一切受けていなかった。T1Dの対象はすべて、抗血小板療法(ASA)及び抗高血圧(アンジオテンシン変換酵素インヒビター)として同一の治療を受けていた。併用治療、組入れ及び除外基準はすでに記載されており(Diabetes Care 2015)、また下記のウェブサイト、https://clinicaltrials.gov/ct2/show/record/NCT00879801?term=GENFIEVで報告されている。
【０１９５】
すべての対象は、試験登録前にインフォームドコンセントを提出した。ルーチン臨床フォローアップに含まれない試験は、該当する治験審査委員会の承認の対象とされた(Enteropatia-trapianto/01 Secchi/Fiorina)。
【０１９６】
膵島
本試験で使用したヒト膵島は、Niguarda  Ca Granda倫理評議員会により承認された倫理要件に適合した、すでに記載されている手順(Petrelliら、2011)に従い、死体臓器ドナーから単離した。要するに、すでに記載されている自動化された方法を使用して、膵島を単離した(D'Addioら、2014)。2種類の酵素を使用した:P型コラゲナーゼ(1〜3mg/ml)及びリベラーゼ(0.5〜1.4mg/ml)(Roche社、Indianapolis、IN、米国)。膵島を、シリンジ中で不連続グラジエントにより(密度勾配:1,108;1,096;1,037:Euroficoll、Sigma-Aldrich社、Milan、イタリア)、又はこれまでの記載に従い、冷却したCOBEプロセッサーを用いて連続グラジエントにより(Nanoら、2005)精製した。単離後、膵島を、加湿雰囲気(5%CO2)内、M199培地(Euroclone社、Celbio社、Milan、イタリア)中、又は10%FCS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩(Euroclone社、Celbio社)、及び2mmol/lグルタミン(Mediatech社、Cellgro社、VA、米国)が補充されたCMRL(Mediatech社、Cellgro社、VA、米国)中、22℃で培養した。単離後72時間以内に処理した膵島材料上で、膵島のin vitroでの特徴付け及び培養を実施した。膵島を、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩(Euroclone社、Celbio社)、及び2mmol/lグルタミン(Mediatech社、Cellgro社、VA、米国)が補充され、10%FCSを含み、グルコース濃度が5mMのCMRL中で4日間培養した。
【０１９７】
マウス膵島は、James Markmann教授の好意により提供された(Transplantation Unit、Department of Surgery、Massachusetts General Hospital、Harvard Medical School、Boston)(Ben Nasrら、2015b;Verganiら、2010)。これまでの記載に従い、コラゲナーゼ消化とその後の密度勾配分離、次に手作業選別により、膵島をC57Bl6/Jマウスから単離した(フォーブズら、2010)。膵島を次に播種し、すでに記載されているように、L-グルタミン、ペニシリン、及び10%***が補充され、グルコース濃度が5mMのRPMI 1640培地中で4日間培養した。
【０１９８】
β細胞系
マウスβTC3及びαTC1細胞は、University of MilanのCarla Peregoの好意により、Douglas Hanahan教授(Department of Biochemistry and Biophysics、University of California、San Francisco、CA)の許可を得て提供された(Di Cairanoら、2011)。記載に従い、0.1mMグルタミン酸を含有し、0.7mMグルタミンが補充されたRPMI 1640培地(Sigma社)中で、βTC3を培養した(Di Cairanoら、2011)。グルコース濃度は、細胞系について11mMであった。
【０１９９】
病理学及び免疫組織化学
試料を、緩衝化ホルマリン(4%w/vホルムアルデヒド及び0.05Mアセテートバッファー)中で固定し、パラフィンワックスでルーチン的に処理した。各登録症例の厚さ3μmの切片を、形態評価用としてヘマトキシリン&エオシン(H&E)で染色した。免疫組織化学用として、厚さ3μmの切片を、ポリ-L-リジンコーティングスライドにマウントし、脱パラフィン化し、等級化アルコールから水に通して水和させた。650Wの電子レンジ内の0.01Mクエン酸バッファー、pH6中に、切片を10分間浸漬することにより、抗原回復を実施し、並びに切片を3%過酸化水素中に10分間浸漬することにより、内因性ペルオキシダーゼ活性阻害を実施した後、一次抗体と共に4℃で18〜20時間インキュベーションを実施し、その後にアビジン-ビオチン複合体手順が続いた。0.03%の3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドを使用して免疫反応を発現させ、次に切片をハリスヘマトキシリンで対比染色した。下記の抗体を使用した:インスリン(Dako社、A0564)、抗IGFBP3一次抗体(ポリクロナール、1:50稀釈、Sigma Aldrich社HPA013357)、及び抗TMEM219一次抗体(ポリクロナール、1:100、Sigma社HPA059185)。これらの抗体を、健康な対象、B6マウス、及びNODマウスの膵臓組織、並びにT1D/T2Dを有する患者、インスリン非依存性を実現しなかった膵島移植患者の肝臓生検において免疫組織化学的に試験した。病理学的所見を有さない組織を対照として使用した。これらの組織試料すべては、イタリア、ParmaのUniversity of Parma、Unit of Pathology of the Department of Biomedical、Biotechnological, and Translational Sciencesで保管されているファイルに由来した。免疫染色強度を、1(軽度)、2(中等度)、及び3(強度)として、一方、その拡散を1(限局性)、2(ゾーン状)、及び3(拡散性)として等級化した。
【０２００】
免疫蛍光検査
免疫蛍光検査試料を、共焦点システム(Leica TCS SP2 Laser Scanning Confocal)を使用して観察した。連続及び独立した光学経路を使用して、画像をマルチトラックモードで取得した。ヒト組織/細胞を染色するのに下記の一次抗体を使用した:サイトケラチン18 M30のマウスモノクロナール抗カスパーゼ切断生成物(クローンM30、Hoffmann-LaRoche社、Basel、スイス)、ウサギポリクロナールIGFBP3(1:250、Sigma社、HPA013357)、ウサギポリクロナールTMEM219(1:250、Sigma社、HPA059185)、及びモルモットポリクロナールインスリン(1:50、DAKO社、A0564)。下記の一次抗体をマウス組織/細胞を染色するのに使用した:ウサギポリクロナールIGFBP3(1:250、Sigma社、SAB4501527)、ヤギポリクロナールTMEM219(1:50、Santa Cruz社、244405)、モルモットポリクロナールインスリン(1:50、DAKO社、A0564)。下記の二次抗体を、ヒト組織/細胞を染色するのに使用した:ロバ抗ウサギFITC(Jackson社)、及びロバ抗モルモットTRITC(Jackson社)。下記の抗体をマウス組織/細胞を染色するのに使用した:ロバ抗ヤギFITC(Jackson社)。
【０２０１】
IGFBP3(Life Technologies社、10430H07H5)を含め/含めずに、ecto-TMEM219 (Genscript社と協力して自家生成した、130ng/ml)を含め/含めずに、高濃度グルコース(20mMグルコース)を含め/含めずに、IFN-γ及びIL-1β(R&D Systems社、Minneapolis、MN 201-LB-005、2ng/ml、及びPeProTech社、300-02、1,000U/ml)を含め/含めずに同時培養したヒト及びマウス膵島を、同時局在試験の免疫蛍光検査用として、TMEM219、インスリン、及びM30で染色した。膵島と同一条件で同時培養したマウスβ細胞を、10%の中性緩衝化した***中で30分間固定し、PBSで3回洗浄し、及びPBS - 2%BSA、0.3%トリトンX100で20分間透過処理し、10%血清でブロックし、最終的に一次抗体と共に4℃、オーバーナイトでインキュベートし、その後蛍光二次抗体により室温で2時間標識した。一次及び二次抗体は上記のように選択した。
【０２０２】
膵島及びβ細胞のin vitroでの試験及び特徴付け
培養条件
ヒト及びマウス膵島を、異なるグルコース濃度(5mM、20mM、Sigma社)で、炎症刺激/カクテル(IFN-γ+IL-1β、それぞれ2ng/ml R&D Systems社、及び1,000U/ml Peprotech社)を含め/含めずに、IGFBP3(Life Technologies社、50ng/ml)を含め/含めずに、ecto-TMEM219(130ng/ml、組換えタンパク質及び介入試験を参照)を含め/含めずに培養し、膵島を、免疫蛍光試験、RNA抽出、アポトーシス検出、及びタンパク質分析用として収集した。上清を、インスリン、IGFBP3、及びIGF-I分泌の評価用として収集した。
【０２０３】
これまでの記載に従い、炎症性刺激/カクテル(IFN-γ+IL-1β)を含め/含めずに、IGFBP3を含め/含めずに、ecto-TMEM219(組換えタンパク質及び介入試験を参照)を含め/含めずに、β-TCを培養し、細胞を膵島試験用として収集した。
【０２０４】
免疫ブロッティング
腸生検試料の総タンパク質を、Laemmliバッファー(62.5mmol/lトリス-HCl、pH6.8、20%グリセロール、2%SDS、5%β-メルカプトエタノール)中に抽出し、その濃度を測定した。総タンパク質35mgを、7%SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース上にブロットした(Schleicher & Schuell社、Dassel、ドイツ)。ブロットを、次にポンソーSで染色した。メンブレンを、TBS(トリス[10mmol/l]、NaCl[150mmol/l])、0.1%ツイーン-20、5%脱脂粉乳中、pH7.4、25℃で1時間ブロックし、TBS-5%ミルク中で1:250に稀釈したウサギポリクロナールIGFBP3抗体(Sigma社、HPA013357)、又は1:200に稀釈したヤギポリクロナールTMEM219(Santa Cruz Biothechnology社、244404又は244405)、又は1:500に稀釈したモノクロナールマウス抗β-アクチン抗体(Santa Cruz Biothechnology社)と共に、4℃で12時間インキュベートし、TBS-0.1%ツイーン-20で4回洗浄し、次にTBS-5%ミルク中で1:1000に稀釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗ウサギIgG二次抗体(DAKO社)(IGFBP3用)、又はウサギ抗ヤギ(TMEM219用)、又はβ-アクチン用としてウサギ抗マウス(Santa Cruz Biotechnology社)と共にインキュベートし、最終的にTBS-0.1%ツイーン-20で洗浄した。得られたバンドを、増感化学発光を使用して可視化した(SuperSignal;Pierce社、Rockford、IL、米国)。
【０２０５】
qRT-PCR分析
Trizol試薬(Invitrogen社)を使用して、精製済みの腸陰窩からRNAを抽出し、TaqManアッセイ(Life Technologies社、Grand Island、NY)を使用して、製造業者の指示に従い、qRT-PCR分析を実施した。ΔΔCt法を使用して、標準化した発現数値を決定した。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)のデータをACTBの発現について標準化し、ΔCt値を計算した。統計分析では、一元ANOVAにより、患者毎に全細胞集団にわたり遺伝子発現を比較し、その後、目的とする集団とその他の全集団の間で多重比較するためにボンフェローニ事後検定を行った。また、利用可能なソフトウェア、RT2 Profiler PCR Array Data Analysis(Qiagen社)も使用して、統計分析を実施した。2群比較では、スチューデントのt検定を採用した。分析は、培養の3日前/3日後に3回実施した。以下は、ヒト遺伝子で使用したプライマーの主要な特徴について報告する:
【０２０６】
【表１１】
0006360265.tif 000016
【０２０７】
以下は、マウス遺伝子で使用したプライマーの主要な特徴について報告する:
【表１２】
0006360265.tif 000017
【０２０８】
ELISAアッセイ
対象のすべての群、並びに治療した及び未治療マウスのすべての群について、そのプール血清/血漿中のIGF-I及びIGFBP3レベルを、市販のELISAキットを使用して、製造業者の指示に従い評価した(R&D社SG300及びSigma社RAB0235)。
【０２０９】
ヒト初代培養肝細胞(HEP10(商標)ヒトプール肝細胞、ThermoFisher Scientific社)を、製造業者の指示に従い、Williams培地中、異なるグルコース濃度:11mM、20mM、及び35mMで3日間培養した。培養上清を収集し、IGFBP3 ELISAキット(Sigma社、RAB0235)を使用して、製造業者の指示に従い、IGFBP3を評価した。収集した細胞をトリプシンにより分離し、血球計算機で計測した。
【０２１０】
アッセイ内及びアッセイ間変動係数(CV)が3.0%及び5.0%である微粒子酵素免疫測定法(Mercodia Iso-Insulin ELISA、10-1113-01)を用いて、インスリンレベルをアッセイした。
【０２１１】
組換えタンパク質及び介入試験
組換えヒトIGF-I(Sigma社、I3769)、100ng/ml(IGF-I)、組換えヒトIGFBP3(Life Technologies社、10430H07H5)、50ng/ml(IGFBP3)、抗IGF-IR(Selleckchem社、Boston、OSI-906)、1mM/L、及びecto-TMEM219(D'Addioら、2015)、130ng/mlを、膵島収集/細胞培養から+1日目に膵島/細胞培養物に添加した。また、膵島及びβ細胞についても、複合的な糖尿病誘発条件:20mMグルコース、2ng/mlの組換えヒトIL-1β(R&D Systems社、Minneapolis、MN 201-LB-005)と1,000U/mlの組換えヒトIFN-γ(PeProTech社、300-02)の混合物に72時間曝露した。
【０２１２】
IGFBP3(Reprokine社、Valley Cottage、NY)を、150μg/マウス/日で、15日間、naive B6マウスに腹腔内(i.p.)投与した;ecto-TMEM219を、STZで治療したB6マウス、10週齢NODマウス、及び高脂肪食を与えたB6マウス(HFD-B6)に対して、STZで治療したB6マウス及びNODマウスでは150μg/マウス/日の用量で15日間、及びHFD-B6マウスでは100μg/マウスの用量で隔日8週間、in vivoにて腹腔内(i.p.)投与した。
【０２１３】
動物試験
オスC57BL/6(B6)マウス及びメス非肥満性糖尿病(NOD)マウス(4週齢及び10週齢)を、Jackson Laboratory社、Bar Harbor、Maineから取得した。すべてのマウスを、ハーバード大学医学大学院の動物管理使用委員会より承認を受けた施設ガイドラインに従い、管理及び使用した。ストレプトゾトシン(STZ)注射(225mg/kg、i.p.投与;Sigma社S0130)による化学的アプローチを使用してB6マウスを糖尿病にさせ、このモデルは、T1D糖尿病モデルとして許容され、また妥当性確認されている(Carvelloら、2012;Petrelliら、2011;Verganiら、2013)。糖尿病は、STZで治療したB6及びNODのいずれにおいても、3回連続測定したときに血中グルコースレベルが>250mg/dLであることとして定義した。
【０２１４】
T2Dの発現及び進行を試験するため、B6マウス(6週齢)を実験動物管理基準(Principles of Laboratory Animal Care)(NIH Publication No 85-23、1985年改訂)に従い、無菌の動物舎内に収容し、水及び食物を適宜与えた。試験プロトコールは、現地の倫理委員会により承認された。マウスには、Research Diets社(Mucedola、Settimo Milanese、イタリア)から購入した高脂肪食(HFD)(DIO食D12492、総カロリーの60%が脂肪由来)、又は正常脂肪食(NFD;DIO食D12450B;総カロリーの10%が脂肪由来)のいずれかを与えた。治療又は対照の各群は、動物10匹からなっていた。16週間後、糖血症を測定し、IV耐糖能試験(IVGTT)を実施した。翌日、マウスを麻酔し、次に血液試料を取得し、膵臓を組織学試験用として採取した。組織の一部も、RT-PCR試験を実施するために、Trizol中で急速凍結及び保管した。
【０２１５】
最終的に、血漿及び血清を収集して、IGF-I(IGF-I ELISAキット、R&D社MG100)、IGFBP3(IGFBP3 ELISAキット、R&D社MGB300)、及びインスリンレベル(マウスインスリンELISAキット、Mercodia社、10-1247-01)の各分析を実施した。糖尿病の発現と持続性を確認するために、HFD-B6において血中グルコースを週2回、最長12週間モニタリングした。
【０２１６】
統計分析
データは、平均値及び平均値の標準誤差(SEM)として提示し、コルモゴロフ-スミルノフ検定により正規分布について、及びルビーン検定により等分散性について検定した。差異の統計的有意性を両側t検定及びχ二乗(χ2)検定により検定した。二群間の有意性を、対応のない両側スチューデントのt検定により判定した。多重比較では、ボンフェローニ補正を伴うANOVA検定を採用した。すべてのデータをStatistical Package for the Social Science(SPSS(登録商標)、IBM(登録商標)、SPSS Inc.社、Chicago、IL)に入力し、分析した。GraphPad Prismバージョン5.0(GraphPad Software社、La Jolla、CA)を使用して、グラフを生成した。すべての統計的検定を5%有意水準で実施した。
【０２１７】
結果
IGFBP3の末梢レベルは、前糖尿病マウス及び糖尿病マウスで増加している。
β細胞死の誘発において役割を有し得る潜在的な循環性因子を識別するために、本発明者らは、偏りのないプロテオミクスアプローチを使用して、1つ又は複数の抗膵島自己抗体の存在に基づき、健康な対象及びT1Dのリスクがある個体の血清プロテオームをプロファイルした。対照のプール品対T1Dのリスクがある個体のプール品において有意に異なったタンパク質(p値<0.01)を、階層的クラスタリング分析に更に提出した。健康な対象と比較して、T1Dのリスクがある個体において(及び明らかにT1Dの個体においても)プロテオミクスプロファイルが明瞭であることが明白になり、検出されたタンパク質の50%超が、1つの群又は他方の群を区別する。特に、IGF-I結合タンパク質3(IGFBP3)のレベルは、免疫標的アッセイを使用した場合、T1Dのリスクがある個体で増加しており(図19A)、したがって高血糖の発現に先行した。興味深いことに、IGFBP3レベルはGenfiev試験から得た試料においても変化していたが、同試験では、800例を超える個体が登録し、それをOGTT試験結果に基づき主要な3つのカテゴリー:耐糖能が正常な対象(NGT)、耐糖能が障害性の対象(IGT)、及びT2Dの個体(T2D)に分類した。本発明者らは、IGFBP3レベルは、NGTの対象と比較して、IGT及びT2Dで増加していたことを認め、IGFBP3の末梢レベル高値は前糖尿病状態を主に特徴付けることを確認した(図19B)。
【０２１８】
膵島及びβ細胞に対するIGFBP3の有害な効果を実証するために、本発明者らは、前糖尿病のNODマウス並びに糖尿病のNODマウス、及びストレプトゾトシンで誘発した糖尿病のC57BL/6マウス(STZ-B6)は、naive B6と比較して末梢IGFBP3レベルの増加を示すことを最初に実証した(図20A)。本発明者らは、次にHFDモデルのT2Dマウスモデルにおいてこれを確認した。高脂肪食を与え、16週間のうちにT2Dを発症するC57Bl6/J(B6)マウスは、正常脂肪食を与えたB6マウスと比較して、末梢IGFBP3レベルの増加を示した(図20B)。
【０２１９】
炎症性の環境及びT1Dでは、肝細胞によるIGFBP3産生が増加する。
肝臓は、IGFBP3産生部位であることが公知である。炎症性刺激が肝臓のIGFBP3産生に影響し得るか調査するために、本発明者らは、様々なサイトカインと共に、異なるグルコース濃度(11、20、及び35mM)でヒト初代培養肝細胞を培養し、異なる炎症促進性刺激及びグルコースレベルの増加の後、上清中のIGFBP3レベルが急速に増加することを実証した(図21:A〜B)。
【０２２０】
TMEM219はヒト膵島内で発現している。
膵島及びβ細胞に対するIGFBP3/TMEM219軸の効果を評価するために、本発明者らは、免疫蛍光検査法を使用することによりTMEM219の発現を、共焦点顕微鏡でそのインスリンとの同時局在について最初に評価した(図22:A1〜A2)。膵臓が臓器提供に適さなかった死体ドナーから得たヒト膵島について試験した。TMEM219(緑色の染色)は膵島内に分散して発現し、インスリン(赤色の染色)と同時局在している(図22:A1〜A2)。本発明者らは、IGFBP3に対するその他の公知受容体(すなわち、LPR1、TGF-bR1、及びTGF-bR2)の発現について更に評価したが、いずれも発現していないと思われた(図22B)。本発明者らは、次にRT-PCR及びWBを使用して、TMEM219の発現を確認した(図22:B〜C).
【０２２１】
本発明者らは、RT-PCRを使用してマウス膵島内でのTMEM219の発現を更に証明し、その他の細胞及びモデルですでに記載されているその他の公知のIGFBP3受容体(LRP1、1型TGF-β及び2型TGF-β)の発現を除外した(Baxter、2013;Forbesら、2010)(図23A)。最終的に、本発明者らは、マウスβ及びα細胞系(αTC及びβTC)のアベイラビリティを利用し、RT-PCRにより、TMEM219の発現はβ細胞に限定される一方、α細胞等のその他の膵島細胞はTMEM219を発現しないことを明確にし(図23B)、またWBによりTMEM219の発現を更に確認する(図23C)。TMEM219(緑色)の蛍光免疫染色及びそのインスリンとの同時局在も、共焦点顕微鏡においてβ細胞系上で確認した(図23D)。
【０２２２】
IGFBP3はin vitroでβ細胞系に損傷を与える。
IGFBP3は膵島内のβ細胞を標的とすることを実証するために、本発明者らは、IGFBP3を含め/含めずにβ細胞系(βTC)を3日間培養した。生存率/アポトーシスアッセイを使用することにより、本発明者らは、未治療と比較して、IGFBP3で治療した条件では生存するβ細胞の割合(%)が低下していることを実証することができた(図24A)。興味深いことに、IGFBP3で治療したβ細胞は、カスパーゼ8発現の有意な増加(図24B)、及び免疫蛍光検査法及びRT-PCRの両方によりインスリン発現低下も示した(図24:C、D1〜D2、E)。興味深いことに、IGFBP3で誘発されたアポトーシスは、炎症促進性刺激因子のIL-1β及びIFN-γにより誘発されたアポトーシスよりも顕著に高く(図24:A〜B)、インスリンの発現及び放出はわずかに低下したに過ぎなかった(図24:C〜E)。
【０２２３】
IGFBP3はin vitroでマウス膵島に損傷を与える。
膵島に対するIGFBP3が媒介する有害な効果を更に実証するために、本発明者らは、C57BL/6マウスから単離したマウス膵島を、IGFBP3を含め/含めずに4日間培養した。FACS (アネキシンV+7AAD-)により評価したときの広範なアポトーシスの出現により、IGFBP3で治療した膵島は、RT-PCRによるカスパーゼ8発現増加、及びインスリン発現減少と関連して、早期にアポトーシスが生ずることが立証された(87±2対67±2%、p=0.004)(図25:A〜C)。
【０２２４】
IGFBP3はヒト膵島にin vitroで損傷を与える。
膵臓が臓器提供に適さなかった死体ドナーから得たヒト膵島ヒトをin vitroで培養し、IGFBP3に4日間曝露すると、大量にアポトーシスが生じ(図26A)、免疫染色したとき(図26:D1〜D2)、及びRT-PCR(図26E)を使用したときのインスリン発現減少と関連して、カスパーゼ8発現の増加(図26B)、及びアポトーシスのマーカーであるM30の発現増加(図8:C1〜C2)を示すことを実証することにより、本発明者らは、ヒト膵島におけるIGFBP3が媒介する有害な効果を最終的に確認した。
【０２２５】
C57BL/6マウスにIGFBP3注射すると、膵島の形態がin vivoで変化する。
IGFBP3は、膵島の形態を変化させることを確認するために、本発明者らは、組換えIGFBP3(Reprokine社)を、naive B6及びSTZで治療したB6マウスに注射した(毎日150μg、15日間)。収集した膵臓の組織学(H&E)分析により、naive及びSTZ-B6マウスの膵島と比較して、免疫染色したときに散在性のインスリン発現により確認されるように、STZ-B6とIGFBP3で治療したマウスの膵島では混乱が増加したことを実証した(図27:A1〜A6)。
【０２２６】
組換えタンパク質ecto-TMEM219は、β細胞系におけるIGFBP3関連の損傷をin vitroで予防する。
ecto-TMEM219は、特にβ細胞に対するIGFBP3関連の有害な効果を阻止することを実証するために、本発明者らはβ細胞系を、IGFBP3及びecto-TMEM219と共に培養し、β細胞のアポトーシスは、ecto-TMEM219の添加により大幅に低下することを認めた。該効果は、IGFBP3のみと培養したβ細胞と比較して、IGFBP3+ecto-TMEM219で治療したβ細胞で低下したように見えるカスパーゼ8発現の分析によっても確認された(図28:A〜B)。インスリン発現は、RT-PCR及び免疫蛍光検査法(赤色)により評価されるように、ecto-TMEM219をIGFBP3で培養したβ細胞に添加することにより一貫して増加した(図28:C1〜C3)。
【０２２７】
組換えタンパク質ecto-TMEM219は、マウス膵島におけるIGFBP3関連の有害な効果をin vitroで阻止する。
IGFBP3関連の損傷予防におけるecto-TMEM219の治療特性を更に確認するために、本発明者らは培養したマウス膵島内におけるecto-TMEM219の効果をin vitroで試験した。IGFBP3と共に同時培養したC57BL/6膵島を単離し、これにecto-TMEM219(IGFBP3と2:1のモル比)を添加すると、IGFBP3のアポトーシス促進効果が抑制された。更に、カスパーゼ8発現は、IGFBP3及びecto-TMEM219と共に培養した膵島で有意に低下した(図29A)。IGFBP3と共に培養したマウス膵島にecto-TMEM219を添加すると、インスリン発現は増加し(図29B)、それは膵島機能の保持に対するecto-TMEM219の好ましい効果を際立たせる。
【０２２８】
組換えタンパク質ecto-TMEM219は、ヒト膵島に対するIGFBP3の有害な効果をin vitroで阻止する。
膵島破壊の阻止におけるecto-TMEM219の有益な効果を実証するために、本発明者らは、ヒト膵島をIGFBP3及びecto-TMEM219と共に4日間培養し、RT-PCRにおけるインスリン発現増加及びカスパーゼ8発現減少と関連して、ecto-TMEM219により、IGFBP3が媒介する膵島損傷が救済されることを実証した(図30:A〜B)。
【０２２９】
興味深いことに、インスリン(赤色)とアポトーシスのマーカーであるM30(緑色)を同時染色すると、インスリン産生細胞は、IGFBP3との同時培養期間中、ecto-TMEM219により保護されることを確認した(図30:C1〜C3)。
【０２３０】
組換えタンパク質ecto-TMEM219は、IGFBP3に関連する膵島変化を阻止する。
糖尿病の治療におけるecto-TMEM219の効果を証明するために、本発明者らは、STZで治療した糖尿病マウスのインスリン血清レベルを8週目に測定し、ecto-TMEM219で治療したマウス(i.p.、隔日150μgを2週間)では、未治療のSTZ-B6と比較して、インスリンが有意に増加したことを認めた(図31A)。最終的に、膵島傷害をin vivoで有する別のモデルにおいて、高脂肪食を与えたB6マウス(B6-HFD)は、血中グルコース及びインスリンレベルの変化を示したが、一方ecto-TMEM219で治療したB6-HFD(i.p.、隔日100μgを6週間)は、ほぼ正常なグルコース及びインスリンレベルを維持し(図31B)、したがって1型及び2型糖尿病におけるecto-TMEM219の治癒的効果を示唆する。
【０２３１】
考察
1型糖尿病(T1D)は、従来インスリン産生膵臓β細胞の破壊を引き起こすT細胞が媒介する自己免疫疾患とみなされてきた(Bluestoneら、2010;Eisenbarth、1986)。この考え方によれば、開始因子が、自己抗原に対する免疫反応を引き起こす契機となり、その後、新たに活性化された自己反応性T細胞がインスリン産生β細胞を標的とし、更に破壊する(Bluestoneら、2010)。β細胞の破壊は自己免疫攻撃によりもっぱら決定づけられるのか、又はその他の機構、例えばパラクリン調節、代謝的調節解除、及び非免疫性β細胞のアポトーシス等がT1Dの病因に寄与するのか、現在論議の的となっている(Atkinson及びChervonsky、2012;Atkinsonら、2015)。近年、環境因子(例えば、ウイルス感染症、食事、新生児期のミルク及び微生物叢への曝露)が、T1Dにおいて自己免疫応答を開始するのに必要とされ得ることが観察されている(Filippi及びvon Herrath、2008;McLeanら、2015)。したがって、免疫学的及び遺伝的要因がT1Dの唯一の決定要素とはもはやみなされない(Alperら、2006;Oilinkiら、2012)ことから、T1Dの病因を試験する新規アプローチが徐々に出現している(McLeanら、2015)。更に、免疫療法戦略は、過去10年間においてT1Dの治癒を確実にするための主要な概念とみなされてきたが、その有効性も今日疑問を呈する(Ben Nasrら、2015a)。免疫抑制療法又は制御促進性の治療法を使用して自己免疫応答を標的とする戦略は、齧歯類では良好であることが明らかにされたが、そのような戦略では、それとは裏腹に、T1Dの個体においてインスリン非依存性を実現した人数は無視し得る程度であった(Atkinsonら、2015)。動物モデルとヒトとの間の差異を際立たせると共に、これらのデータは、免疫反応の研究では、末梢で生ずる免疫事象が主たる調査対象であったが、膵島、特にβ細胞内で生ずる疾患プロセスに関してほとんど未知であるという事実も明確にした。こうしたことから、T1Dにおけるβ細胞喪失の開始/促進に関与する新規要因の発見が、重要な価値を有するであろう。そのような発見は、疾患のごく最初の段階で停止させる、又はそれを遅延させる能力を有する新規治療アプローチの道を開く可能性がある。本発明では、T1Dのリスクが高い個体、及びT1Dが明らかな個体において、IGFBP3末梢レベルが増加していることが見出された。興味深いことに、耐糖能がすでに検出可能であるようなT2D発症リスクがある個体(IGT、IFG)、及びT2Dが確立した個体でも類似したパターンが認められ、病因が異なっても、両種類の糖尿病で生ずるβ細胞喪失のメディエーターは、IGFBP3と呼ばれる同一のβトキシンであり得ることを確認した。事実、T1D及びT2Dは、いずれもインスリンの分泌低下、血中グルコースレベルの制御不良、及び高血糖を引き起こすβ細胞喪失により特徴付けられる(Brennand及びMelton、2009;Yiら、2014)。病因メカニズムが異なるにもかかわらず、T1Dにおける自己免疫応答又はT2Dにおけるインスリン抵抗性/炎症は、β細胞量の進行的低下を引き起こす。いくつかのアプローチが、T1D及びT2Dを治療するのに現在利用可能であるが、そのいずれも、β細胞喪失を標的とすること、β細胞の傷害から保護すること、及びβ細胞量を維持すること、したがって糖尿病発現を予防することを目的としていない。IGFBP3は、T2Dを有する患者に認められる代償不全を説明する機構でもあり得、同機構は徐々に、しかし着実に患��のβ細胞の機能を奪い、インスリン産生を停止させる。T2Dに認められた慢性的なIGFBP3過剰産出は、β細胞の破壊に対して有利に働く可能性があり、例えば経口抗糖尿病薬を効かなくさせるおそれがある。本発明者らは、IGFBP3受容体(TMEM219)はマウス/ヒトの膵島内で発現していること、及びそのIGFBP3によるライゲーションはβ細胞にとって有毒であり、T1Dの初期段階、及び一般的な糖尿病に関与し得る内因性β細胞毒(βトキシン)の存在確率を高めることも認めた。非免疫学的因子は、膵島/β細胞傷害を決定づけ、また免疫細胞に対する自己抗原の曝露を促進する可能性があり、したがって局所的炎症環境及び持続的免疫反応を惹起する。肝臓は、IGFBP3の主要な供給源であることがすでに立証されており、肝臓を炎症及び高グルコースレベルに曝露すると、循環内IGFBP3放出が有意に増加する。その結果、IGFBP3は、膵島及びβ細胞を標的とし、したがってそれらの損傷及び喪失に有利に働く。したがって、組換えecto-TMEM219等の新規に生成されたIGFBP3/TMEM219軸のインヒビターの使用を通じてIGFBP3が媒介するβ細胞傷害を中和すれば、末梢IGFBP3が消失し、したがってそのTMEM219を経由するシグナリングが遮断され、T1Dの進行が停止/遅延することにより、β細胞の喪失を阻止することができる(図32)。これは、糖尿病予防分野における臨床応用に繋がり、その結果T1Dのリスクが高い個体、及び最終的にはT2Dにおいてecto-TMEM219の使用を実現する可能性がある。IGFBP3/TMEM219軸のインヒビターは、したがってIGFBP3が標的組織上で発現するTMEM219に結合するのを阻害することにより、T1Dの初期段階と関連した初期のβ細胞傷害を予防する可能性がある。β細胞の初期の喪失を阻止するインヒビターの役割を考慮すれば、IGFBP3/TMEM219軸のインヒビターは、T2Dの初期治療においても有益と考えることができる。したがって、IGFBP3/TMEM219軸のインヒビターは、糖尿病発現を予防する、並びにβ細胞を喪失及び損傷から保護する、したがってT1D及びT2Dの両方の糖尿病を発症するリスクがある個体にとって、及び初期段階の糖尿病を有する個体において意義のある臨床的オプションとなる治療戦略を代表し得る。T1Dを発症するリスクがある個体は、健康な対象には通常存在しない、膵島ペプチドに対する複数の自己抗体が、血清中で早期に検出されることにより主に特徴付けられる(Zieglerら、2013)。このような個体は、通常、T1Dを有する個体の親族(兄弟、姉妹)であるが、T1Dと関連する兆候又は症状を一切有さない。このような対象では、10年以内にT1Dに進行する確率は高く、その大部分(70%)は、その後15年のうちにT1Dを発症するが、多くの場合過小評価されている(Zieglerら、2013)。T2Dを発症するリスクがある個体を、特に初期段階で識別するのは困難である。予防は、疾患の発現を遅延させ得るライフスタイルの変更から主になるが、疾患予防は不可能であった(Schwarzら、2012)。グルコース代謝の変化を初期に検出する様々なスクリーニング法(遺伝子解析、メタボロミクスプロファイル、肥満及びリスク因子評価)は開発途上にあるが、T2Dの発現を予防する又はそれから保護する能力を有する治療剤は入手不能であり、また現行オプションは、高血糖を制御し、T2Dの進行を遅延させる抗糖尿病剤(メトホルミン)、又はその他のリスク因子を制御する薬剤(脂質降下及び血圧降下剤)のみを含��(Nathan、2015)。したがって、一般集団の糖尿病、すなわちT1D及びT2Dの両方の負荷低減を目的とする治療は、これらの高リスク集団を重視すべきである。本発明では、β細胞喪失を緩和し、またβ細胞量を維持することにより、糖尿病を発症するリスクがある個体において、その発現を予防し、また疾患の初期段階(新規発現)にある個体において、確立した糖尿病に進行しないように保護するために使用される新規の臨床治療剤が意図されている。β細胞の喪失及び損傷を予防するその役割を前提とし、IGFBP3/TMEM219軸のインヒビターは、T1D又はT2Dを発症するリスクがある個体、及び初期段階にある疾患を有する個体において有用である。
(参考文献)
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【図１−１】
0006360265.tif 000025
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
0006360265.tif 000089
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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