(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする個体において疾患を治療するための医薬であって、
（ａ）イムノコンジュゲートであって、
（ｉ）線維芽細胞活性タンパク質（ＦＡＰ）に指向し、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域、配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号１６の軽鎖可変領域、配列番号４７の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域、配列番号６３の重鎖可変領域及び配列番号６２の軽鎖可変領域、又は配列番号６７の重鎖可変領域及び配列番号６６の軽鎖可変領域を含む第一抗体、あるいはカルシノ胚性抗原（ＣＥＡ）に指向し、配列番号１１４の重鎖可変領域及び配列番号１１５の軽鎖可変領域を含む第一抗体であって、全長ＩｇＧクラス抗体であり、イムノグロブリン重鎖において、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）のアミノ酸置換を含む第一抗体、及び
（ｉｉ）Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇのアミノ酸置換を含む変異ヒトＩＬ−２分子、を含むイムノコンジュゲート、及び
（ｂ）第二抗体であって、
（ｉ）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に指向し、配列番号１０２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、
（ｉｉ）ＨＥＲ３に指向し、配列番号１４２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１４６の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、及び
（ｉｉｉ）セツキシマブ、から成る群から選択される第二抗体、を含み、（ａ）と（ｂ）が組合せで投与される、医薬。
【請求項２】
それを必要とする個体において疾患を治療するための医薬であって、
（ｉ）線維芽細胞活性タンパク質（ＦＡＰ）に指向し、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域、配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号１６の軽鎖可変領域、配列番号４７の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域、配列番号６３の重鎖可変領域及び配列番号６２の軽鎖可変領域、又は配列番号６７の重鎖可変領域及び配列番号６６の軽鎖可変領域を含む第一抗体、あるいはカルシノ胚性抗原（ＣＥＡ）に指向し、配列番号１１４の重鎖可変領域及び配列番号１１５の軽鎖可変領域を含む第一抗体であって、全長ＩｇＧクラス抗体であり、イムノグロブリン重鎖において、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）のアミノ酸置換を含む第一抗体、及び
（ｉｉ）Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇのアミノ酸置換を含む変異ヒトＩＬ−２分子、を含むイムノコンジュゲートを含み、
ここで、
（ｉ）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に指向し、配列番号１０２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、
（ｉｉ）ＨＥＲ３に指向し、配列番号１４２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１４６の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、及び
（ｉｉｉ）セツキシマブ、から成る群から選択される第二抗体との組合せで投与される、医薬。
【請求項３】
変異ヒトＩＬ−２分子が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２の医薬。
【請求項４】
第一抗体が、ＩｇＧ１サブクラス抗体である、請求項１から３の何れか一項に記載の医薬。
【請求項５】
第一抗体がヒトＩｇＧＦｃ領域を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の医薬。
【請求項６】
変異ヒトＩＬ−２分子が、アミノ又はカルボキシ末端のペプチド結合を第一抗体と共有する、請求項１から５の何れか一項に記載の医薬。
【請求項７】
イムノコンジュゲートが、変異ヒトＩｌ−２分子及び第一抗体から本質的になり、
ここで、変異ヒトＩｌ−２分子が、そのアミノ末端アミノ酸で、第一抗体の重鎖の一方のカルボキシ末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して、融合される、請求項１から６の何れか一項に記載の医薬。
【請求項８】
第二抗体が、完全長ＩｇＧクラス抗体、特にＩｇＧ１サブクラス抗体である、請求項１から７の何れか一項に記載の医薬。
【請求項９】
疾患が、エフェクター細胞機能を刺激することにより治療可能な疾患、特に癌である、請求項１から８の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１０】
個体が、哺乳動物、特にヒトである、請求項１から９の何れか一項に記載の医薬。
【請求項１１】
薬学的に許容可能な担体中に、
（ａ）イムノコンジュゲートであって、
（ｉ）線維芽細胞活性タンパク質（ＦＡＰ）に指向し、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域、配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号１６の軽鎖可変領域、配列番号４７の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域、配列番号６３の重鎖可変領域及び配列番号６２の軽鎖可変領域、又は配列番号６７の重鎖可変領域及び配列番号６６の軽鎖可変領域を含む第一抗体、あるいはカルシノ胚性抗原（ＣＥＡ）に指向し、配列番号１１４の重鎖可変領域及び配列番号１１５の軽鎖可変領域を含む第一抗体であって、全長ＩｇＧクラス抗体であり、イムノグロブリン重鎖において、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）のアミノ酸置換を含む第一抗体、及び
（ｉｉ）Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇのアミノ酸置換を含む変異ヒトＩＬ−２分子、を含むイムノコンジュゲート、及び
（ｂ）第二抗体であって、
（ｉ）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に指向し、配列番号１０２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、
（ｉｉ）ＨＥＲ３に指向し、配列番号１４２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１４６の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、及び
（ｉｉｉ）セツキシマブ、から成る群から選択される第二抗体、
を含む薬学的組成物。
【請求項１２】
（ａ）イムノコンジュゲートであって、
（ｉ）線維芽細胞活性タンパク質（ＦＡＰ）に指向し、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域、配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号１６の軽鎖可変領域、配列番号４７の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域、配列番号６３の重鎖可変領域及び配列番号６２の軽鎖可変領域、又は配列番号６７の重鎖可変領域及び配列番号６６の軽鎖可変領域を含む第一抗体、あるいはカルシノ胚性抗原（ＣＥＡ）に指向し、配列番号１１４の重鎖可変領域及び配列番号１１５の軽鎖可変領域を含む第一抗体であって、全長ＩｇＧクラス抗体であり、イムノグロブリン重鎖において、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）のアミノ酸置換を含む第一抗体、及び
（ｉｉ）Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇのアミノ酸置換を含む変異ヒトＩＬ−２分子、を含むイムノコンジュゲート、及び
（ｂ）第二抗体であって、
（ｉ）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に指向し、配列番号１０２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、
（ｉｉ）ＨＥＲ３に指向し、配列番号１４２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１４６の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、及び
（ｉｉｉ）セツキシマブ、から成る群から選択される第二抗体、
の個体における疾患の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項１３】
（ａ）イムノコンジュゲートであって、
（ｉ）線維芽細胞活性タンパク質（ＦＡＰ）に指向し、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域、配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号１６の軽鎖可変領域、配列番号４７の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域、配列番号６３の重鎖可変領域及び配列番号６２の軽鎖可変領域、又は配列番号６７の重鎖可変領域及び配列番号６６の軽鎖可変領域を含む第一抗体、あるいはカルシノ胚性抗原（ＣＥＡ）に指向し、配列番号１１４の重鎖可変領域及び配列番号１１５の軽鎖可変領域を含む第一抗体であって、全長ＩｇＧクラス抗体であり、イムノグロブリン重鎖において、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）のアミノ酸置換を含む第一抗体、及び
（ｉｉ）Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇのアミノ酸置換を含む変異ヒトＩＬ−２分子、を含むイムノコンジュゲートの、個体における疾患の治療のための医薬の製造のための使用であって、
（ｂ）第二抗体であって、
（ｉ）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に指向し、配列番号１０２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、
（ｉｉ）ＨＥＲ３に指向し、配列番号１４２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１４６の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、及び
（ｉｉｉ）セツキシマブ、から成る群から選択される第二抗体、との組合せでの使用。
【請求項１４】
（ａ）イムノコンジュゲートであって、
（ｉ）線維芽細胞活性タンパク質（ＦＡＰ）に指向し、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域、配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号１６の軽鎖可変領域、配列番号４７の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域、配列番号６３の重鎖可変領域及び配列番号６２の軽鎖可変領域、又は配列番号６７の重鎖可変領域及び配列番号６６の軽鎖可変領域を含む第一抗体、あるいはカルシノ胚性抗原（ＣＥＡ）に指向し、配列番号１１４の重鎖可変領域及び配列番号１１５の軽鎖可変領域を含む第一抗体であって、全長ＩｇＧクラス抗体であり、イムノグロブリン重鎖において、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）のアミノ酸置換を含む第一抗体、及び
（ｉｉ）Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇのアミノ酸置換を含む変異ヒトＩＬ−２分子、を含むイムノコンジュゲートの、個体におけるエフェクター細胞機能を刺激するための医薬の製造のための使用であって、
（ｂ）第二抗体であって、
（ｉ）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に指向し、配列番号１０２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、
（ｉｉ）ＨＥＲ３に指向し、配列番号１４２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１４６の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、及び
（ｉｉｉ）セツキシマブ、から成る群から選択される第二抗体、との組合せでの使用。
【請求項１５】
疾患を治療するためのキットであって、
（ａ）イムノコンジュゲートであって、
（ｉ）線維芽細胞活性タンパク質（ＦＡＰ）に指向し、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号１１の軽鎖可変領域、配列番号１７の重鎖可変領域及び配列番号１６の軽鎖可変領域、配列番号４７の重鎖可変領域及び配列番号４６の軽鎖可変領域、配列番号６３の重鎖可変領域及び配列番号６２の軽鎖可変領域、又は配列番号６７の重鎖可変領域及び配列番号６６の軽鎖可変領域を含む第一抗体、あるいはカルシノ胚性抗原（ＣＥＡ）に指向し、配列番号１１４の重鎖可変領域及び配列番号１１５の軽鎖可変領域を含む第一抗体であって、全長ＩｇＧクラス抗体であり、イムノグロブリン重鎖において、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）のアミノ酸置換を含む第一抗体、及び
（ｉｉ）Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇのアミノ酸置換を含む変異ヒトＩＬ−２分子、を含むイムノコンジュゲート、及び
（ｂ）第二抗体であって、
（ｉ）上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に指向し、配列番号１０２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、
（ｉｉ）ＨＥＲ３に指向し、配列番号１４２の重鎖可変ドメイン及び配列番号１４６の軽鎖可変ドメインを含み、非操作抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された、ＩｇＧクラス抗体、及び
（ｉｉｉ）セツキシマブ、から成る群から選択される第二抗体、及び
（ｃ）任意選択的に、疾患を治療するための方法として、併用治療の使用を指示する印刷された使用説明書を含むパッケージ挿入物、
を同じ又は別々の容器に含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、一般的に免疫療法に関連する。より具体的には、本発明は、免疫療法剤として組合せて使用するための抗原を標的とするイムノコンジュゲート及びＦｃ操作抗体に関する。更に、本発明は、前記イムノコンジュゲート及び抗体の組合せを含有する薬学的組成物と、疾患の治療において該組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床設定において望ましい場合が多い。例えば、健常細胞及び組織を完全なままで損傷を受けない状態にしつつ、腫瘍細胞を特異的に破壊することは癌治療の主要な目標である。これを達成する魅力的な方法は、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃させる、腫瘍に対する免疫応答を誘導することによる。エフェクター細胞は、免疫細胞の表面へのそれらの受容体の結合を介してシグナル伝達事象を誘発させる多くのサイトカイン類を含む様々な刺激により活性化されうる。例えば、とりわけ、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び活性化を刺激するインターロイキン−２（ＩＬ−２）は、転移性の腎細胞癌及び悪性メラノーマの治療用として承認されている。しかしながら、急速な血液クリアランス及び腫瘍特性の欠乏には、免疫応答を活性化させ、抗腫瘍効果を有するよう、腫瘍部位で高濃度のサイトカインを獲得するため、高用量のサイトカインを全身的に投与する必要がある。このように、サイトカインが全身的に高レベルであると、重度の毒性及び有害反応に至るおそれがあり、ＩＬ−２についての場合もしかりである。従って、癌治療に使用するためには、腫瘍又は腫瘍微小環境に、特異的にサイトカインを送達させることが望まれる。これは、腫瘍抗原に特異的な抗体又は抗体断片等、標的部分にサイトカインをコンジュゲートさせることにより達成可能である。このようなイムノコンジュゲートのさらなる利点は、非コンジュゲートサイトカインと比較して、血清半減期が長いことである。免疫賦活性を最大にするそれらの能力は腫瘍部位で活性化され、低用量で全身性の副作用を最小に維持することは、サイトカインイムノコンジュゲートを最適な免疫療法剤にする。
【０００３】
エフェクター細胞を活性化させる他の方法は、免疫グロブリンのＦｃ部分又はＦｃ領域を含む組換え融合タンパク質による、それらの表面上の活性化Ｆｃ受容体の関与を介している。そのＦｃ領域により媒介されるいわゆる抗体のエフェクター機能は、抗体ベースの癌免疫療法における重要な作用機序である。抗体依存性細胞−媒介性細胞傷害、つまり抗体被覆標的細胞（例えば腫瘍細胞）のＮＫ細胞による破壊は、細胞表面に結合した抗体がＮＫ細胞上のＦｃ受容体と相互作用する場合に誘発される。ＮＫ細胞は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスの免疫グロブリンを認識するＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）を発現する。更に、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含み、種々の免疫細胞型が、種々のタイプ及びサブタイプの免疫グロブリン重鎖定常ドメイン（例えば、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭクラスの抗体に対応するα、δ、γ、ε、又はμ重鎖定常ドメイン）を認識する種々のＦｃ受容体セットを有するため、抗体のクラス及びサブクラスによって変化する。抗体のエフェクター機能を増加させるための様々な方策が使用されている。例えば、Shieldsら（J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001)）は、Ｆｃ領域の２９８、３３３及び／又は３３４位のアミノ酸置換により、ＦｃγＩＩＩａ受容体及びＡＤＣＣへの、抗体の結合性が改善されることを示している。更に、Ｆｃ領域にアミノ酸修飾を有し、改善されたＦｃ受容体結合性及びエフェクター機能を示す抗体変異体が、米国特許第６７３７０５６号、国際公開第２００４／０６３３５１号、及び国際公開第２００４／０９９２４９号に記載されている。また、受容体結合性及びエフェクター機能の増加は、抗体のグリコシル化を変えることにより、得ることができる。癌の免疫療法において最も一般に使用されているＩｇＧ１型の抗体は、Ｆｃ領域の各ＣＨ２ドメインにおいて、Ａｓｎ２９７に保存されたＮ結合グリコシル化部位を有する。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合二分岐オリゴ糖はＣＨ２ドメインの間に埋在しており、ポリペプチド骨格と広大な接触部を形成し、それらの存在は、抗体が抗体依存性細胞−媒介性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を含むエフェクター機能を媒介するのに必須である(Lifely et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferis et al., Immunol Rev 163, 59-76 (1998); Wright and Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997)。タンパク質工学研究では、FcγRはIgGのCH2ドメインの下側のヒンジ領域と相互作用することが示されている (Lund et al., J Immunol 157, 4963-69 (1996))。しかしながら、ＦｃγＲ結合には、ＣＨ２領域にオリゴ糖の存在が必要であり（Lund et al., J Immunol 157, 4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech 15, 26-31 (1997)）、オリゴ糖及びポリペプチドが双方とも相互作用部位に直接寄与するか、又はオリゴ糖が活性化ＣＨ２ポリペプチドの立体構造を維持するために必要であることが示唆される。よって、オリゴ糖構造の修飾は、ＩｇＧ１とＦｃγＲとの相互作用の親和性を増加させるため、またＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を増加させるための手段として調べることができる。Umanaら（その内容の全体が出典明示によりここに援用されるNat Biotechnol 17, 176-180 (1999)及び米国特許第６６０２６８４号（国際公開��９９／５４３４２号））には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における、二分岐オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴＩＩＩ）の過剰発現がその細胞において産生される抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増加させることが示されている。生産細胞株におけるＧｎＴＩＩＩの過剰発現は、一般的に非フコシル化型でハイブリッド型である二分岐型オリゴ糖に富んだ抗体をもたらす。ＧｎＴＩＩＩに加えて、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）が産生細胞株で過剰発現している場合、複合型の二分岐、非フコシル化オリゴ糖に富む抗体が得られる（Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)）。双方のタイプの抗体は、未修飾のグリカンを有する抗体と比較して、強く増加したＡＤＣＣを示すが、Ｎ−グリカンの大部分が複合型のものである抗体のみが、有意な補体−依存性細胞傷害を誘導することができる（Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)）。ＡＤＣＣ活性を増加させるための重要な要因は、ＦｃγＲＩＩＩａへのＩｇＧ Ｆｃドメインの結合性を改善する、オリゴ糖コア部の最深部のＮ−アセチルグルコサミン残基からフコースを除去することであると思われる（Shinkawa et al., J Biol Chem 278, 3466-3473 (2003)）。フコシル化が低減した抗体を生成するためのさらなる方法は、例えば、α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼを欠く宿主細胞における発現を含む（Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614-622 (2004); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)）。
【０００４】
遊離のサイトカイン、イムノコンジュゲート、又は操作抗体の使用による抗癌免疫療法において達成された成功にもかかわらず、癌治療において新規の効果的で安全な治療選択肢が絶えず必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者は、局所的な免疫細胞活性のためのこれら２つの方策の組み合せ、すなわち、サイトカインイムノコンジュゲートにより、及び増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体により、エフェクター細胞の同時刺激が抗癌免疫療法の効能を大きく改善することを見出した。
【０００６】
従って、本発明は、疾患の治療にそれを必要とする個体において使用される（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組み合せを提供する。一実施態様において、エフェクター部分はサイトカインである。一実施態様において、サイトカインは、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、及びＩＬ−１２からなる群から選択される。特定の実施態様において、エフェクター部分はＩＬ−２である。別の実施態様において、エフェクター部分はＩＬ−１２である。他の特定の実施態様において、ＩＬ−２エフェクター部分は、未変異ＩＬ−２エフェクター部分と比較すると、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する変異ＩＬ−２エフェクター部分の親和性を減少させ又は無効にするが、中程度の親和性のＩＬ−２受容体に対する変異ＩＬ−２エフェクター部分の親和性を保存している少なくとも一つのアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む変異ＩＬ−２エフェクター部分である。特定の実施態様において、変異ＩＬ−２エフェクター部分は、ヒトＩＬ−２（配列番号１）の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される１、２又は３の位置で、１、２又は３のアミノ酸置換を有する。更に特定の実施態様において、変異ＩＬ−２エフェクター部分は、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５及び７２に対応する位置で、３のアミノ酸置換を有する。また更に特定の実施態様において、変異ＩＬ−２エフェクター部分は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを有するヒトＩＬ−２である。所定の実施態様において、変異ＩＬ−２エフェクター部分は、ＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位が除去された、ヒトＩＬ−２の３位に対応する位置で、アミノ酸変異を付加的に含む。特定の実施態様において、変異ＩＬ−２エフェクター部分は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。一実施態様では、エフェクター部分は、単鎖エフェクター部分である。
【０００７】
一実施態様において、第一抗体は、全長のＩｇＧクラス抗体、特に完全長のＩｇＧ１サブクラス抗体である。一実施態様において、エフェクター部分は、アミノ又はカルボキシ末端のペプチド結合を第一抗体と共有する。一実施態様において、エフェクター部分は、第一抗体とアミノ又末端のペプチド結合を共有する。一実施態様において、エフェクター部分はそのＮ末端で、第一抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合している。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、１個以下のエフェクター部分を含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、一以上のペプチドリンカーで連結される、エフェクター部分と第一抗体から本質的になる。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、エフェクター部分、特に単鎖エフェクター部分と、第一抗体、特に完全長ＩｇＧクラス抗体を含み、ここで、エフェクター部分は、そのアミノ末端アミノ酸で、第一抗体の重鎖の一方のカルボキシ末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合される。所定の実施態様において、第一抗体は、そのＦｃ領域に、２つの非同一免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含む。特定の実施態様において、前記修飾は、免疫グロブリン重鎖の一方にノブ修飾を、２つの免疫グロブリン重鎖の他の一方にホール修飾を含む、ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）修飾である。一実施態様において、第一抗体は、ＣＨ３ドメインの２つの免疫グロブリン重鎖の間の界面に修飾を含み、ここで、ｉ）一重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、他の重鎖のＣＨ３ドメイン内の界面の中のキャビティ（「ホール」）に配置可能である、一重鎖のＣＨ３ドメイン内の界面の中に突起（「ノブ」）を生成し、及び、ｉｉ）他の重鎖のＣＨ３ドメイン内で、アミノ酸残基はより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、その中に、第一のＣＨ３ドメイン内の界面の中の突起（「ノブ」）を配置可能である、第二のＣＨ３ドメイン内の界面の中にキャビティ（「ホール」）を生成する。一実施態様において、第一抗体は、免疫グロブリン重鎖の一方に、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗと、任意でアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、かつ、免疫グロブリン重鎖の他方に、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖと、任意でアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。特定の実施態様において、エフェクター部分は、ノブ修飾を含む免疫グロブリン重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に融合している。
【０００８】
一実施態様において、第一抗体の低下したエフェクター機能は、低下した活性化Ｆｃ受容体への結合、低下したＡＤＣＣ、低下したＡＤＣＰ、低下したＣＤＣ及び低下したサイトカイン分泌からなる群から選択される。一実施態様において、低下したエフェクター機能は、活性化Ｆｃ受容体への結合の低下である。一実施態様において、活性化Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、活性化Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。特定の実施態様において、活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩａの群から選択される。一実施態様において、活性化Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、低下したエフェクター機能は低下したＡＤＣＣである。一実施態様において、低下したエフェクター機能は、活性化Ｆｃ受容体への結合の低下と、低下したＡＤＣＣである。
【０００９】
一実施態様において、第一抗体は、そのＦｃ領域において一以上のアミノ酸変異の導入によって操作される。特定の実施態様において、アミノ酸の変異とはアミノ酸置換である。特定の実施態様において、第一抗体、特にヒト完全長ＩｇＧ１サブクラス抗体は、免疫グロブリン重鎖の位置Ｐ３２９でアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）。より特異的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、抗体は、免疫グロブリン重鎖のＳ２２８、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様において、抗体は、免疫グロブリン重鎖の位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５でアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）。更に特定の実施態様では、抗体は、免疫グロブリン重鎖においてアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ）を含む。
【００１０】
ある実施態様において、第一抗体は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に対するものである。特定の実施態様において、第一抗体は、線維芽細胞活性タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシン−ＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ Ａ１）、テネイシン−ＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、カルシノ胚性抗原（ＣＥＡ）、及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）からなる群から選択される抗原に対するものである。特定の実施態様において、第一抗体はＣＥＡに対するものである。別の実施態様において、第一抗体はＦＡＰに対するものである。
【００１１】
一実施態様において、第二抗体の増加したエフェクター機能は、増加した活性化Ｆｃ受容体への結合、増加したＡＤＣＣ、増加したＡＤＣＰ、増加したＣＤＣ、増加したサイトカイン分泌からなる群から選択される。一実施態様において、増加したエフェクター機能は、増加した活性化Ｆｃ受容体への結合である。特定の実施態様において、活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩａの群から選択される。一実施態様において、活性化Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様において、増加したエフェクター機能は、増加したＡＤＣＣである。一実施態様において、増加したエフェクター機能は、活性化Ｆｃ受容体への結合の増加と、増加したＡＤＣＣである。
一実施態様において、第二抗体は、そのＦｃ領域において一以上のアミノ酸変異の導入によって操作される。特定の実施態様において、アミノ酸の変異とはアミノ酸置換である。一実施態様において、第二抗体は、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により操作される。特定の実施態様において、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。さらなる特定の実施態様において、Ｆｃ領域において増加した割合の非フコシル化オリゴ糖は、Ｆｃ領域の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％の非フコシル化オリゴ糖である。別の特定の実施態様において、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分岐オリゴ糖の割合が増加している。さらなる特定の実施態様において、Ｆｃ領域において増加した割合の二分岐オリゴ糖は、Ｆｃ領域の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％の二分岐オリゴ糖である。さらなる他の特定の実施態様において、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分岐の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している。
【００１２】
好ましくは第二抗体は、Ｆｃ領域に、少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、又は少なくとも約５０％の二分岐の非フコシル化オリゴ糖を有する。特定の実施態様において、第二抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。抗体のＦｃ領域において非フコシル化オリゴ糖の割合が増加することで、抗体のエフェクター機能、特にＡＤＣＣが増加する。特定の実施態様において、非フコシル化オリゴ糖は二分岐の非フコシル化オリゴ糖である。
【００１３】
一実施態様において、第二抗体は、完全長のＩｇＧクラス抗体、特に完全長のＩｇＧ１サブクラス抗体である。ある実施態様において、第二抗体は、腫瘍細胞に存在する抗原に対するものである。特定の実施態様において、第二抗体は、ＣＤ２０、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質−１（ＣＤＣＰ１）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びメラノーマ関連コンドロイチンスルファートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）の群から選択される抗原に対するものである。
特定の実施態様において、第二抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗ＣＤ２０抗体である。適切な抗ＣＤ２０抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される国際公開第２００５／０４４８５９号に記載されている。他の特定の実施態様において、第二抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗ＥＧＦＲ抗体である。適切な抗ＥＧＦＲ抗体は、それぞれその全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００６／０８２５１５号及び国際公開第２００８／０１７９６３号に記載されている。更に特定の実施態様において、第二抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体である。適切な抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されている。さらなる他の特定の実施態様において、第二抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗ＣＥＡ抗体である。適切な抗ＣＥＡ抗体は、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２３７８７に記載されている。さらなる他の特定の実施態様において、第二抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗ＨＥＲ３抗体である。適切な抗ＨＥＲ３抗体は、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０７６６８３に記載されている。さらなる他の特定の実施態様において、第二抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作された抗ＣＤＣＰ１抗体である。適切な抗ＣＤＣＰ１抗体は、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２３３８９に記載されている。一実施態様において、第二抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域にてグリコシル化が修飾され、一又は複数のグリコシルトランスフェラーゼの活性が変化した宿主細胞で抗体が生成されるように操作されている。
【００１４】
一実施態様において、第二抗体は、増加したβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する宿主細胞に抗体を生成させることにより、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。特定の実施態様において、宿主細胞は、付加的に、増加したα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する。別の実施態様において、第二抗体は、低減したα（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主細胞に抗体を生成させることにより、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。
【００１５】
一実施態様において、疾患はエフェクター細胞の機能を刺激することにより治療可能な疾患である。一実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌である。特定の実施態様において、癌は、肺癌、結腸直腸癌、腎癌、前立腺癌、乳癌、頭部及び頸部の癌、卵巣癌、脳癌、リンパ腫、白血病、及び皮膚癌の群から選択される。一実施態様において、個体は動物である。特定の実施態様において、個体はヒトである。
【００１６】
特定の実施態様において、本発明は、
（ａ）Ｆｃ領域に一以上のアミノ酸変異の導入により低下したエフェクター機能を有するように操作された、第一の完全長ＩｇＧクラス抗体と、サイトカインを含むイムノコンジュゲートであって、エフェクター部分が、そのアミノ末端アミノ酸で、第一抗体の重鎖の一方のカルボキシ末端に、任意でペプチドリンカーを介して、融合されるイムノコンジュゲート、及び
（ｂ）疾患の治療においてそれを必要とする個体における使用のために、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により増加したエフェクター機能を有するように操作された、第二の完全長ＩｇＧクラス抗体
の組合せを提供する。別の態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体中に、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体を含む薬学的組成物を提供する。
本発明はまた、個体における疾患の治療のための医薬の製造のために、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の使用を網羅する。
【００１７】
本発明は、更に、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せを、治療的有効量、個体に投与することを含む、個体の疾患を治療する方法を提供する。
【００１８】
また本発明により提供されるのは、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せを、エフェクター細胞機能を刺激するのに有効な量、個体に投与することを含む、個体のエフェクター細胞機能を刺激する方法である。
【００１９】
更なる態様において、本発明は、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体、及び（ｃ）任意で、疾患を治療するための方法として、併用治療の使用を指示する印刷された使用説明書を含むパッケージ挿入物を、同じ又は別々の容器に収容してなる、疾患を治療することを意図したキットを提供する。
【００２０】
本発明の薬学的組成物、使用、方法及びキットに使用されるイムノコンジュゲート及び第二抗体は、本発明に有用な第二抗体及びイムノコンジュゲートに関連した上述の段落に記載された特徴の任意のものを、単独で又は組み合せて含みうることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＣＤ２５への結合を欠いているＩＬ−２四重変異体（ｑｍ）、及び抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂを含む、ＦＡＰ−標的２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲート（Ａ）又は非標的ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲート（Ｂ）が、ＳＣＩＤマウスへ舌の内部に注射されたヒトの頭頸部癌細胞株ＦａＤｕで試験された。データは、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートではなく、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、それぞれのイムノコンジュゲート又は抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独に比べて、高められた生存期間の中央値の観点から優れた効果を媒介することを示している（実施例１を参照）。
【図２】種々の濃度の抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの存在下における、０．５７ｎＭの（Ａ）又は５．７ｎＭの（Ｂ）Ｆａｐ−標的２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート又はＩＬ−２（プロロイキン（Proleukin））を用いて、前処理した又はしていない、ＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４時間）による、全体的なＡ５４９腫瘍細胞の死滅（実施例２を参照）。
【図３】ＣＤ２５への結合を欠いているＩＬ−２四重変異体（ｑｍ）を含むＣＥＡ標的ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートと、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ（Ａ）又はセツキシマブ（Ｂ）が、ＳＣＩＤ ＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスへ脾臓内に注射されたヒト結腸直腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔで試験された。データはＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍのＱＭのイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、それぞれのイムノコンジュゲート、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ又はセツキシマブ単独、並びにＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートとセツキシマブの組合せに比べて、高められた生存期間の中央値の観点から優れた効果を媒介することを示している（実施例３参照）。
【図４】ＣＤ２５への結合を欠いているＩＬ−２四重変異体（ｑｍ）を含むＣＥＡ標的ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートと、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ（Ａ）又はセツキシマブ（Ｂ）が、ＳＣＩＤ ＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスへ静脈内注射されたヒト肺癌細胞株Ａ５４９で試験された。データはＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍのＱＭのイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、それぞれのイムノコンジュゲート又は抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独、並びにＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートとセツキシマブの組合せに比べて、高められた生存期間の中央値の観点から優れた効果を媒介することを示している（実施例４参照）。
【図５】ＣＤ２５への結合を欠いているＩＬ−２四重変異体（ｑｍ）を含むＣＥＡ標的ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートと、抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂが、ＳＣＩＤ ＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスへ脾臓内に注射されたヒト結腸直腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔで試験された。データは、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと、抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、それぞれのイムノコンジュゲート又は抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独に比べて、高められた生存期間の中央値の観点から優れた効果を媒介することを示している（実施例５を参照）。
【図６】ＣＤ２５への結合を欠いているＩＬ−２四重変異体（ｑｍ）を含むＦＡＰ標的２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートと、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂが、ＳＣＩＤ ＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスへ腎臓内に注射されたヒト腎臓癌細胞株ＡＣＨＮで試験された。データは、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せが、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独、又はプロロイキン（登録商標）と組合せた抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂと比べて、高められた生存期間の中央値の観点から優れた効果を媒介することを示している（実施例６を参照）。
【図７】抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独（左パネル）、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲート単独（右パネル）又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの抗Ｈｅｒ３ ＧｌｙｃｏＭａｂとの組合せ（右パネル）による処置による、全体的なＬＳ１７４Ｔ細胞の死滅。
【図８】抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独（左パネル）、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲート単独（右パネル）又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの抗Ｈｅｒ３ ＧｌｙｃｏＭａｂとの組合せ（右パネル）による処置による、ＮＫ細胞上でのＣＤ２５（Ａ）又はＣＤ６９（Ｂ）の発現。
【００２２】
発明の詳細な説明
第一の態様において、本発明は、疾患の治療にそれを必要とする個体において使用される（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組み合せを提供する。
【００２３】
本発明は、更に、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せを、治療的有効量、個体に投与することを含む、個体の疾患を治療する方法を提供する。
【００２４】
また本発明により提供されるのは、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せを、エフェクター細胞機能を刺激するのに有効な量、個体に投与することを含む、個体のエフェクター細胞機能を刺激する方法である。
【００２５】
定義
本明細書において、用語は、以下に定義されていない限り、当技術分野で一般的に使用されるように使用される。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「イムノコンジュゲート」は、少なくとも一のエフェクター部分とを含む、ポリペプチド分子を意味する。所定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、１個以下のエフェクター部分を含む。本発明による特定のイムノコンジュゲートは、一以上のペプチドリンカーにより連結される、１個のエフェクター部分と抗体から本質的になる。本発明による特定のイムノコンジュゲートは、融合タンパク質であり、すなわち、イムノコンジュゲートの構成成分がペプチド結合により連結される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「コントロール抗体」は、エフェクター部分を含まないで存在するであろう抗体を意味する。例えば、本明細書に記載されるＩｇＧ−ＩＬ２イムノコンジュゲートをコントロール抗体と比較する場合、コントロール抗体は遊離のＩｇＧであり、ここでＩｇＧ−ＩＬ２イムノコンジュゲートと遊離のＩｇＧ分子は共に同一抗原決定基に特異的に結合することができる。
【００２８】
本明細書で使用されるように、用語「抗原決定基」は「抗原」及び「エピトープ」と同義語であり、抗体が結合し、抗体−抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子の部位（例えば、非隣接アミノ酸の種々の領域を形成する、アミノ酸又は立体構造的配置の隣接伸長）を意味する。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上で、ウイルス感染細胞の表面上で、他の疾患細胞の表面上で、血清中に遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見つけることができる。
【００２９】
「特異的に結合する」とは、結合が抗原について選択的であり、不必要な又は非特異的相互作用と区別されうることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗体の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）のいずれかによって測定することができる。
【００３０】
用語「抗［抗原］抗体」及び［抗原］に結合する抗体」は、抗体が、抗原を標的とし、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でそれぞれの抗原に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗［抗原］抗体の、無関係なタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体の抗原への結合の約１０％未満である。ある実施態様において、［抗原］へ結合する抗体は、解離定数（ＫＤ）≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。
【００３１】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離の比率である解離定数（ＫＤ）及び会合速度定数（ぞれぞれｋｏｆｆとｋｏｎ）で表すことができる。従って、同等の親和性は、速度定数の比が同じままである限り、別の速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で良く確立される方法によって測定することができる。親和性を測定するための特別な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００３２】
一実施態様によると、ＫＤは、ＣＭ５チップ上に固定されたリガンド（例えば、エフェクター部分受容体、Ｆｃ受容体又は標的抗原）を用いて、２５℃で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機器（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５,GE Healthcare）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。組換えリガンドを１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で０．５−３０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１００−５０００になるように１０μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学測定のために、イムノコンジュゲートの３から５倍の段階希釈（〜０．０１ｎＭから３００ｎＭの間の範囲）が、ＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、２５℃、ｐＨ７．４）中で約３０〜５０μｌ／分の流量で注入される。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、 Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。
【００３３】
「低下した結合」とは、例えばＦｃ受容体又はＣＤ２５に対する結合の低下であり、例えばＳＰＲにより測定される場合、それぞれの相互作用の親和性の低下を指す。明確にするために、この用語はまた、親和性がゼロへの低下（又は分析法の検出限界以下）、即ち、相互作用の完全な消滅をも含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、抗体に関して「第１」及び「第２」なる用語は、１以上の各タイプの部分が存在する場合に、簡便に区別するために使用される。これらの用語の使用は、明確に述べられていないならば、イムノコンジュゲートの特定の順番又は方向を付与することを意図したものではない。
【００３５】
本明細書で使用しているように、用語「エフェクター部分」なる用語は、例えば、シグナル伝達又は他の細胞経路を介して、細胞活性に影響を与えるポリペプチド、例えばタンパク質又は糖タンパク質を意味する。従って、本発明のエフェクター部分は、エフェクター部分に対する一又は複数の受容体を担持する細胞にて、反応を調節するため、細胞膜の外側からシグナルを伝達する、受容体媒介性シグナル伝達に関連している。一実施態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する一又は複数の受容体を担持する細胞に、細胞傷害性反応を引き起こすことができる。他の実施態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する一又は複数の受容体を担持する細胞に、増殖反応を引き起こすことができる。他の実施態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する受容体を担持する細胞に、分化を引き起こすことができる。他の実施態様において、エフェクター部分は、エフェクター部分に対する受容体を担持する細胞において、内在性細胞タンパク質の発現を変更する（例えば、アップレギュレート又はダウンレギュレート）ことができる。非限定的エフェクター部分には、サイトカイン類、成長因子、ホルモン、酵素、基質、及び補助因子が含まれる。エフェクター部分は種々の立体配置で抗体と結合し、イムノコンジュゲートを形成する。
【００３６】
本明細書で使用しているように、用語「サイトカイン」は、生物学的又は細胞性機能又はプロセス（例えば免疫、炎症及び造血）を媒介及び／又は制御する分子を指す。本願明細書において使用する用語「サイトカイン」には、「リンホカイン」、「ケモカイン」、「モノカイン」及び「インターロイキン」が含まれる。有用なサイトカインの例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βが含まれるが、これに限定されるものではない。特定のサイトカインはＩＬ−２及びＩＬ−１２である。本明細書で使用される場合、「サイトカイン」なる用語は、対応する野生型サイトカインのアミノ酸配列に、一又は複数のアミノ酸変異を含むサイトカイン変異体であって、例えばSauve et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 4636-40 (1991); Hu et al., Blood 101, 4853-4861 (2003)及び米国特許第２００３／０１２４６７８号；Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000); Heaton et al., Cancer Res 53, 2597-602 (1993)及び米国特許第５２２９１０９号；米国特許第２００７／００３６７５２号；国際公開第２００８／００３４４７３号；国際公開第２００９／０６１８５３号；又は上述及び以下に記載するものを含むことを意味する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「単鎖」なる用語は、ペプチド結合により直線的に結合したアミノ酸モノマーを含有する分子を意味する。一実施態様において、エフェクター分子は単鎖エフェクター部分である。単鎖エフェクター部分の非限定的な例には、サイトカイン、増殖因子、ホルモン類、酵素、基質、補助因子が含まれる。エフェクター部分がサイトカインであり、対象とするサイトカインが天然で多量体として通常見いだされるときに、多量体のサイトカインの各サブユニットはエフェクター部分の単鎖によって逐次にコードされる。従って、有用な単鎖エフェクター部分の非限定的な例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βが含まれる。
【００３８】
本明細書で使用しているように、用語「コントロールエフェクター部分」は、コンジュゲートしていないエフェクター部分を指す。例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２イムノコンジュゲートをコントロールエフェクター部分と比較した場合、コントロールエフェクター部分はフリーな、コンジュゲートしていないＩＬ−２である。同様に、例えば、ＩＬ−１２イムノコンジュゲートをコントロールエフェクター部分と比較した場合、コントロールエフェクター部分はフリーな、コンジュゲートしていないＩＬ−１２（例えば、ｐ４０及びｐ３５サブユニットがジスルフィド結合（一又は複数）だけを共有するヘテロ二量体タンパク質として存在する）である。
【００３９】
本明細書で使用しているように、用語「エフェクター部分受容体」は、エフェクター部分に特異的に結合が可能なポリペプチド分子を指す。例えば、ＩＬ−２がエフェクター部分であるとき、ＩＬ−２分子（例えばＩＬ−２を含むイムノコンジュゲート）と結合するエフェクター部分受容体はＩＬ−２受容体である。同様に、例えば、ＩＬ−１２がイムノコンジュゲートのエフェクター部分であるとき、エフェクター部分受容体はＩＬ−１２受容体である。エフェクター部分が特異的に複数の受容体と結合するとき、エフェクター部分と特異的に結合するすべての受容体はそのエフェクター部分のための「エフェクター部分受容体」である。
【００４０】
用語「抗体」は最も広義の意味で使用され、種々の抗体構造を含み、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の抗原−結合活性を示し、免疫グロブリンのＦｃ領域又はＦｃ領域に等価な領域を含む限り、それらの抗体断片を含む。
【００４１】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」なる用語は、本明細書では交換可能に使用され、天然の免疫グロブリン構造に実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。
【００４２】
用語「免疫グロブリン」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）がある。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインがある。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ  （ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの１つに割り当てることができ、そのうち幾つかは更にγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプに分割され得る。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子及びＦｃ領域から本質的になる。
【００４３】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、単−ドメイン抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。所定の抗体断片の総説については、 Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第１１３巻， Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), 頁269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは２価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク質分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００４４】
「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全体に相補的であり、特異的に結合する領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により与えられうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００４５】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似した構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの高頻度可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 第６版， W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照。単ＶＨ又はＶＬドメインは、抗原−結合特異性を付与するのに十分であり得る。
【００４６】
本明細書で使用される用語「高頻度可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループ（「高頻度可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、天然の四鎖抗体は６つのＨＶＲを含む；つまり、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。ＨＶＲは、一般に高頻度可変ループ及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を有し、後者は、抗原認識に関与し、及び／又は最も高い配列可変性をしている。ＶＨのＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般に高頻度可変ループからのアミノ酸残基を有する。高頻度可変領域（ＨＶＲ）は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の一部に関連して、交換可能に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) 及びChothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)により記載され、定義には、互いに比較した場合に、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを意味するいずれかの定義の適用は、本明細書において定義され、使用される場合の用語の範囲内にあることを意図している。上記の引用文献の各々によって定義されるように、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として以下の表１に記載されている。特定のＣＤＲを含む正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変わるであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を付与する特定のＣＤＲを含む残基を、常套的に決定できる。
【００４７】
0006290209.tif 000002
【００４８】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えた任意の実験データに頼ることなく、任意の可変領域配列に対してこのＫａｂａｔの番号付けシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で用いる場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)で明記されている番号付けシステムを指す。特記されない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
【００４９】
配列表のポリペプチド配列（即ち、配列番号３、４、５、６、７、８、９など）はＫａｂａｔの番号付けシステムに従って番号付けされてはいない。しかし、Ｋａｂａｔの番号付けを配列表の配列の番号に変換することは当業者の通常の技術の範囲内である。
【００５０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、高頻度可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般に４のＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲとＦＲ配列は、一般にＶＨ（又はＶＬ）：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４の配列のようになるであろう。
【００５１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。
用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、若干異なる場合があるものの、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端へ伸展するように定義されている。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００５２】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の自然に生じた対立遺伝子変異体、並びに、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞−媒介性細胞障害性）を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させることのない、置換、付加又は欠失を生じる変更を有する変異体を含むことを意図している。例えば、一又は複数のアミノ酸が、実質的に生物学的機能を失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失する可能性がある。このような変異体は、活性における影響が最小になるように、当該技術で公知の一般的規則に従い、選択することができる（例えばBowie et al., Science 247, 1306-10 (1990)）を参照）。
【００５３】
「ヘテロ二量体化促進修飾」は、ホモ二量体を形成する同一なポリペプチドとのポリペプチドの会合を低減するか防止する、ペプチド骨格の操作又はポリペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖の翻訳後修飾である。ヘテロ二量体化促進修飾は、本明細書で使用される場合、二量体を形成することが所望される２つのポリペプチドの各々になされる別々の修飾を特に含み、その修飾は２つのポリペプチドの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、ヘテロ二量体化促進修飾は、その会合をそれぞれ立体的又は静電気的に好ましくするために、二量体を形成することが所望されるポリペプチドの一方又は双方の構造又は電荷を改変しうる。ヘテロ二量体化は、重鎖の各々に融合された更なるイムノコンジュゲート要素（例えば、エフェクター部分）が同じではない、２つの免疫グロブリン重鎖などの、２つの非同一ポリペプチド間で生じる。本発明のイムノコンジュゲートにおいて、ヘテロ二量体化促進修飾は、重鎖においてであり、具体的には免疫グロブリン分子のＦｃ領域においてである。幾つかの実施態様では、ヘテロ二量体化促進修飾は、アミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、ヘテロ二量体化促進修飾は、２つの免疫グロブリン重鎖の各々において、別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
【００５４】
抗体に関して使用される場合、「エフェクター機能」なる用語は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合性及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体−依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原の取込、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」なる用語は、エフェクター部分の受容体、例えばサイトカイン受容体、及び／又はそれらがエフェクター部分に結合するのを介してそれらの表面上にあるＦｃ受容体、例えばサイトカイン、及び／又は腫瘍細胞等、標的細胞の破壊に寄与する抗体のＦｃ領域を示す、リンパ球の集団を意味する。エフェクター細胞は、例えば細胞傷害又は食作用効果を媒介可能である。エフェクター細胞は、限定されるものではないが、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ８＋細胞傷害Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、及びマクロファージ／単球が含まれる。それらの受容体発現パターンに依存して、種々のサブセットのエフェクター細胞、すなわち（ａ）Ｆｃ受容体ではなく、特定のエフェクター部分に対する受容体を発現し、本発明の抗体ではない、イムノコンジュゲートにより刺激される細胞（例えば、ＩＬ−２受容体を発現するＴ細胞）；（ｂ）特定のエフェクター部分に対する受容体ではない、Ｆｃ受容体を発現し、本発明のイムノコンジュゲートではない抗体により刺激される細胞；及び（ｃ）Ｆｃ受容体と特定のエフェクター部分に対する受容体の双方を発現し、抗体と本発明のイムノコンジュゲートにより同時に刺激される細胞（例えば、ＦｃγＩＩＩ受容体及びＩＬ−２受容体を発現するＮＫ細胞）が存在する。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「操作、操作された、操作する」といった用語は、自然に生じた又は組換えポリペプチド又はその断片の、ペプチド骨格の任意のマニピュレーション又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、又は個々のアミノ酸の側鎖基のアミノ酸配列の修飾、並びにこれらのアプローチの組み合せが含まれる。特に、接頭語「グリコ−」を有する「操作する」、並びに「グリコシル化操作」なる用語には、細胞で発現する糖タンパク質のグリコシル化の改変を達成するための、オリゴ糖合成経路の遺伝的マニピュレーションを含む細胞のグリコシル化の仕組みの代謝的操作が含まれる。更にグリコシル化操作には、グリコシル化における変異及び細胞環境の影響が含まれる。一実施態様において、グリコシル化操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性における変更である。特定の実施態様において、操作により、グルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性の変更に至る。グリコシル化操作は、「ＧｎＴＩＩＩ活性が増加した宿主細胞」（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する一又は複数のポリペプチドを、増加したレベルで発現するようにマニピュレートされている宿主細胞）、「ＭａｎＩＩ活性が増加した宿主細胞」（例えば、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する一又は複数のポリペプチドを、増加したレベルで発現するようにマニピュレートされている宿主細胞）、又は「α（１，６）フコシルトランスフェラーゼ活性が低減した宿主細胞」（例えば、α（１，６）フコシルトランスフェラーゼを、低減したレベルで発現するようにマニピュレートされている宿主細胞）を得るために使用することができる。
【００５７】
「アミノ酸変異」なる用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合せにより、最終的なコンストラクトに達することができ、但し、最終コンストラクトは、所望の特徴、例えばＦｃ受容体への結合性の低下を有する。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ−及び／又はカルボキシ末端の欠失及びアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、即ち一のアミノ酸を、異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸と置換することが特に所望される。アミノ酸置換は、２０の標準的アミノ酸の非天然に生じるアミノ酸又は天然に生じるアミノ酸誘導体による置換を含む（例えば４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）。アミノ酸変異は、当分野でよく知られた遺伝学的又は化学的方法を使用して生成されうる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含みうる。化学的修飾など、遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基の改変方法がまた有用でありうることが意図される。本明細書において同一のアミノ酸変異を示すために様々な名称が使用されてもよい。例えば、Ｆｃ領域の位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。
【００５８】
ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、特にデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと一致しない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００５９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は、親細胞と、核酸含有物において完全に同一ではなく、変異を含む場合もある。元来の形質転換細胞において、スクリーニング又は選択された場合に、同様の機能又は生物活性を有する変異子孫がここに含まれる。宿主細胞は、本発明で使用されるイムノコンジュゲート及び抗体を生成するために使用可能な、任意のタイプの細胞システムである。一実施態様において、宿主細胞は、修飾されたオリゴ糖による抗体の産生を可能にするように操作されている。特定の実施態様において、宿主細胞は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作されている。特定の実施態様において、宿主細胞は、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように更に操作されている。宿主細胞は、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯの骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞などの哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、わずかな例を挙げると、しかしまた、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織の中に含まれる細胞も含む。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド」とは、Ｎ−結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合型マンノシドへのβ１−４結合でのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒できるポリペプチドを指す。これは、用量依存性を伴うか又は伴わない特定の生物学的アッセイで測定した場合に、生化学と分子生物学の国際連合命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）に従って、β−１，４−マンノシル−糖タンパク質の４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４４）としても知られているβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの活性に、必ずしも同一ではないが、類似した酵素活性を示す融合ポリペプチドを含む。用量依存性が存在する場合、それは、ＧｎＴＩＩＩのものと同一である必要はなく、むしろＧｎＴＩＩＩに比べた場合、付与された活性における用量依存性に実質的に類似している（すなわち、候補のポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩに比べて、より大きい活性を示すか又は最高で約２５倍以下の活性、好ましくは最高で約１０倍以下の活性、及びより最も好ましくは最高で約３倍以下の活性を示し得る）。特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種性ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメイン及びＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。特に、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩの局在化ドメインであり、最も具体的にはマンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである。あるいは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン、及びα１，６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。このような融合ポリペプチドを生成する方法、及び増加したエフェクター機能を有する抗体を生成するためのそれらの使用は、その全内容が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００４／０６５５４０号、米国仮特許出願第６０／４９５，１４２号及び米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７号に開示されている。
【００６１】
本明細書において用いられる場合、用語「ゴルジ局在化ドメイン」は、ゴルジ複合体内の位置にポリペプチドを固定するために関与するゴルジ常在性ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般的に、局在化ドメインは酵素のアミノ末端「尾部」を含む。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチド」は、Ｎ結合型オリゴ糖の分岐したＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２マンノース中間体における末端１，３−及び１，６−結合α−Ｄ−マンノース残基の加水分解を触媒することができるポリペプチドを指す。これは、生化学と分子生物学の国際連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）による、マンノシルオリゴ糖１，３−１，６−α−マンノシダーゼＩＩ（ＥＣ３．２．１．１１４）としても知られる、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩの活性に必ずしも同一ではないが類似の酵素活性を示すポリペプチドを含む。
【００６３】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合後に、エフェクター機能を遂行させるために受容体を持つ細胞を刺激するシグナル伝達イベントを誘発させるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。
【００６４】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその断片が、Ｎ末端にあるタンパク質部分を一般に介してＦｃ領域に特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、用語「増加した／低下したＡＤＣＣ」は、標的細胞を取り囲む培地中で、上に定義されたＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に、抗体の所定の濃度で溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に、所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要とされる、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加／低下は、同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法（当業者に周知である）を使用して、同じ型の宿主細胞によって産生されるが、操作されていない、同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに相対するものである。例えば、本明細書に記載の方法によりグリコシル化のパターンを改変されるように（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴＩＩＩ、又は他のグリコシルトランスフェラーゼを発現させるために）操作された宿主細胞により産生される抗体により媒介されるＡＤＣＣの増加は、同じタイプの非操作型宿主細胞により産生される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣに相対するものである。
【００６５】
「増加した／低下した抗体依存性細胞−媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する抗体」は、当業者に周知の任意の適した方法により測定される、増加したＡＤＣＣを有する抗体を意味する。承認されているインビトロＡＤＣＣアッセイは以下の通りである：
１）このアッセイは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を使用する；
２）このアッセイは、エフェクター細胞として、ランダムに選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）このアッセイは以下のプロトコールに従って使用される。
ｉ）ＰＢＭＣを、標準的な密度遠心分離手順を使用して単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中、５×１０６細胞／ｍｌで懸濁する；
ｉｉ）標的細胞を、標準的な培養方法によって増殖させ、９０％よりも高い生存度を有する指数増殖期から収集し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中で洗浄し、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、そして１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培養培地中に再懸濁する；
ｉｉｉ）１００マイクロリットルの上記の最終的な標的細胞懸濁物を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）抗体を、細胞培養培地中で４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで段階希釈し、得られる抗体溶液の５０マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に加えて、上記の全体の濃度範囲を網羅する種々な抗体濃度を３通りで試験する；
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルは、抗体溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルの２％（Ｖ／Ｖ）非イオン性界面活性剤（Nonidet,Sigma,St.Louis）の水溶液を受容する；
ｖｉ）自発性放出（ＳＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルに、抗体溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を受容する；
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０×ｇで１分間遠心分離し、そして１時間４℃でインキュベートする；
ｖｉｉｉ）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記の要点ｉ）を各ウェルに加えて２５：１のエフェクター：標的細胞比を生じ、そしてプレートをインキュベーター中、５％ＣＯ２大気、３７℃下に４時間配置する；
ｉｘ）各ウェルからの無細胞上清を収集し、実験的に放出された放射能（ＥＲ）をガンマカウンターを使用して定量する；
ｘ）特異的溶解のパーセンテージを、計算式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００に従って各抗体について計算し、ここで、ＥＲは抗体濃度について定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、ＭＲはＭＲコントロール（上記の要点ｖを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、そしてＳＲはＳＲコントロール（上記の要点ｖｉを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）である；
４）「増加した／低下したＡＤＣＣ」は、上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増加／低下、及び／又は上記の試験された抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要とされる抗体の濃度の低下／増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加／低下は、同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法（当業者に公知である）を使用して、同じ型の宿主細胞によって産生されるが、操作されていない、同じ抗体によって媒介され、上のアッセイにより測定される、ＡＤＣＣに相対するものである。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「組合せ」（及び「組合せる又は「組合せた」等のその文法的変形」）は、本発明の抗体とイムノコンジュゲートの組合せを含み、ここで抗体とイムノコンジュゲートは、同一又は異なった容器、同一又は異なった薬学的製剤にあり、一緒又は別々に投与され、任意の順序で連続して又は同時に投与され、同一又は異なった経路で投与されるが、但し、抗体とイムノコンジュゲートは、体内の生物学的効果を同時に働きかける、すなわちエフェクター細胞を同時に刺激することができるようにされる。例えば、本発明の抗体とイムノコンジュゲートを「組合せる」とは、特定の薬学的製剤において、まずイムノコンジュゲートを投与し、続いて、他の薬学的組成物において抗体を投与する、又はその逆を意味する。
【００６７】
薬剤の「有効量」は、それが投与される細胞又は組織に生理学的変化をもたらすのに必要な量を意味する。
【００６８】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望する治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。治療的に有効な量の薬剤は例えば、疾患の有害作用を除去、低下、遅延、最小化又は防止させる。いくつかの活性成分の組合せの治療的有効量は、各活性成分の治療的有効量であってよい。あるいは、治療に起因する副作用を低減するために、いくつかの活性成分の組合せの治療的有効量は、付加的又は超付加的な、もしくは相乗効果を生じるのに有効であり、組合せて治療的に有効であるが、それらが単独で使用された場合、活性成分の一つ又はいくつかの治療量以下であってもよい、個々の活性成分の量である。
【００６９】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特に、個体又は被検体はヒトである。
【００７０】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００７１】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（treat）」又は「治療している（treating）」など文法上の変形）は、治療されている個体における疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の組合せは、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００７２】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００７３】
イムノコンジュゲート
本発明で有用なイムノコンジュゲートは、少なくとも一つのエフェクター部分と少なくとも一つの抗原−結合部分を有するポリペプチド分子である。
【００７４】
イムノコンジュゲートは、抗原−結合部分にエフェクター部分を化学的にコンジュゲートすることにより、又は融合タンパク質として、抗原−結合部分とエフェクター部分を発現させることにより調製することができる（例えばNakamura and Kubo, Cancer 80, 2650-2655 (1997); 及び Becker et al., Proc Natl Acad Sci USA 93, 7826-7831 (1996)を参照）。本発明で使用するために、融合タンパク質として発現したイムノコンジュゲートが、一般に好ましい。従って、ある実施態様において、エフェクター部分は、抗原−結合部分とアミノ−又はカルボキシ−末端ペプチド結合を共有している（すなわち、イムノコンジュゲートは融合タンパク質である）。このようなイムノコンジュゲートにおいて、エフェクター部分は免疫グロブリン重鎖又は軽鎖に融合していてもよい。本発明において特に有用なものは、完全長ＩｇＧクラス抗体、特に、完全長ＩｇＧ１サブクラス抗体を含む、イムノコンジュゲートである。
【００７５】
一実施態様において、エフェクター分子は単鎖エフェクター部分である。一実施態様において、エフェクター部分はサイトカインである。イムノコンジュゲートの抗体及びエフェクター部分は、上述及び以下に詳細に述べるものを含む。イムノコンジュゲートの抗体は、様々な標的分子に対するものであることができる（例えば、腫瘍細胞又は腫瘍ストローマにおいて発現したタンパク質分子常の抗原決定基）。抗体の限定されない例が、本明細書において記載される。本明細書に開示される特に有用なイムノコンジュゲートは、特に、同じ抗原決定基を標的にし、同じエフェクター部分を保有する、異なる構成のイムノコンジュゲートと比較して典型的には、以下の特性：作用の高い特異性、低下した毒性、良好な生産可能性及び／又は改善された安定性の一又は複数を示す。本発明に使用のための特定のイムノコンジュゲートは、その全体内容が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１２／１４６６２８に更に記述される。
【００７６】
イムノコンジュゲートのフォーマット
ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１２／１４６６２８に記載されるイムノコンジュゲートは、１個以下のエフェクター部分を含む。従って、特定の実施態様において、本発明において使用のためのイムノコンジュゲートは、１個以下のエフェクター部分を含む。特定の実施態様において、エフェクター部分は、単鎖エフェクター部分である。本発明にかかるイムノコンジュゲートに含まれる抗体は、完全長ＩｇＧクラス抗体、より具体的には、完全長ＩｇＧ１サブクラス抗体である。一実施態様において、抗体はヒトである。他の実施態様では、抗体はヒト、ヒト化、又はキメラである。一実施態様において、抗体は、ヒトＦｃ領域、より具体的にはヒトＩｇＧのＦｃ領域、最も具体的にはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。本発明に有用な抗体は、配列番号１２４に記載される、ヒトＩｇガンマ−１重鎖定常領域を含み得る（すなわち、抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスである）。
【００７７】
一実施態様において、エフェクター部分は、アミノ又はカルボキシ末端のペプチド結合を抗体と共有する。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、一以上のペプチドリンカーにより連結された、エフェクター部分と抗体、特にＩｇＧクラス抗体、より具体的にはＩｇＧ１サブクラス抗体である。特定の実施態様において、エフェクター部分は、そのアミノ末端のアミノ酸で、免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合している。
【００７８】
所定の実施態様において、特にイムノコンジュゲートが単一エフェクター部分のみを含む場合、抗体は、そのＦｃ領域に、２つの非同一免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃ領域の２つのポリペプチド鎖間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにある。従って、一実施態様では、前記修飾は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにある。特定の実施態様において、前記修飾は、免疫グロブリン重鎖の一方にノブ修飾を、免疫グロブリン重鎖の他の一方にホール修飾を含む、ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）修飾である。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二
量体形成を妨げるように、突起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での突起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「穴」）を導入することを含む。突起は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。突起と同一又はより小さい大きさの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって第二ポリペプチドの界面に作成される。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することにより、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により作製することができる。特定の実施態様において、ノブ修飾は、２つの免疫グロブリン重鎖の一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、そしてホール修飾は、２つの免疫グロブリン重鎖の他の一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）。更なる特定の実施態様において、ノブ修飾を含む免疫グロブリン重鎖は、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含む免疫グロブリン重鎖は、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これらの２つのシステイン残基の導入は、更に二量体を安定化させる、２つの重鎖間のジスルフィド架橋の形成をもたらす（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【００７９】
特定の実施態様において、エフェクター部分は、ノブ修飾を含む免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端のアミノ酸に連結している。
【００８０】
代わりの実施態様において、２つの非同一ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのポリペプチド鎖の界面で、荷電したアミノ酸残基による一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【００８１】
Ｆｃ領域は、その標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織−血液分配比率に寄与する長い血清半減期を含む、好ましい薬物動態学的特性をイムノコンジュゲートに付与する。しかし、同時期に、好適な抗原保有細胞に対するよりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対するイムノコンジュゲートの所望されない標的化を導く。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出につながる可能性があり、イムノコンジュゲートのエフェクター部分と長い半減期とが組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化及び全身投与の際に重篤な副作用をもたらす。これに伴い、従来のＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートは注入反応に関連することが説明されている（例えばKing et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)）。
【００８２】
従って、イムノコンジュゲートに含まれる抗体は、対応する非操作抗体と比較して、低下したエフェクター機能を有するように操作される。特定の実施態様において、低下したエフェクター機能は、活性化Ｆｃ受容体への結合の低下である。一つのそうした実施態様において、抗体は、そのＦｃ領域に、活性化Ｆｃ受容体に対するイムノコンジュゲートの結合親和性を減少させる一以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、同一の一以上のアミノ酸置換が２つの免疫グロブリン重鎖の各々に存在する。一実施態様において、前記アミノ酸置換は、活性化Ｆｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍減少させる。Ｆｃ受容体に対するイムノコンジュゲートの結合親和性を減少させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様において、これらのアミノ酸変異は、活性化Ｆｃ受容体に対するイムノコンジュゲートの結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は更に少なくとも５０倍減少させ得る。一実施態様において、操作された抗体を含むイムノコンジュゲートは、非操作抗体を含んでなるイムノコンジュゲートと比較した場合、活性化Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満を示す。特定の実施態様において、活性化Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体であり、より具体的にはＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩ
Ｉａ受容体である。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合が減少する。幾つかの実施態様において、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性もまた減少する。一実施態様において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に類似な結合、すなわち、前記受容体への免疫グロブリンの結合親和性の保存は、抗体（又は前記Ｆｃドメインを含んでなるイムノコンジュゲート）が、ＦｃＲｎに対し、非操作型形態の抗体（又は前記非操作型形態の抗体を含んでなるイムノコンジュゲート）の約７０％より大きな結合親和性を呈する場合に達成される。抗体又は前記抗体を含むイムノコンジュゲートは、その親和性の約８０％を越える、又は更に約９０％を越える親和性を示す場合がある。一実施態様では、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様において、抗体、特にヒト完全長ＩｇＧ１サブクラス抗体は、免疫グロブリン重鎖の位置Ｐ３２９でアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）。より特異的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、抗体は、免疫グロブリン重鎖のＳ２２８、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様において、抗体は、免疫グロブリン重鎖の位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５でアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔのＥＵ番号づけ）。更に特定の実施態様では、抗体は、免疫グロブリン重鎖においてアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ）を含む。参照によってその全体が援用される、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されるように、アミノ酸置換のこの組合せは、ヒトＩｇＧ分子のＦｃγ受容体結合をほとんど特に効率的に消失させ、従って、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む、エフェクター機能を低下させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号はまた、このような変異体抗体を調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などその特性を決定するための方法を記載する。
【００８３】
変異体抗体は、当技術分野で知られている遺伝子的又は化学的方法を用いて、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードするＤＮＡ配列、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。
【００８４】
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（GE Healthcare）など標準的な計測機器を使用してＥＬＩＳＡによって又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができ、そのようなＦｃ受容体は、組換え発現によって得ることができる。適切なこのような結合アッセイが本明細書に記載されている。代わりに、抗体又は、Ｆｃ受容体に対する抗体を含むイムノコンジュゲートの結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞などを使用して評価することができる。
【００８５】
幾つかの実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、非操作抗体と比較して、低下したエフェクター機能を有するように、とりわけＡＤＣＣを低下されるように操作される。
【００８６】
抗体又は抗体を含むイムノコンジュゲートのエフェクター機能は、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイが本明細書に記載されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号：Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. Patent No. 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照）を用いることができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
【００８７】
幾つかの実施態様において、補体成分に対する、具体的にはＣ１ｑに対する抗体の結合が改変される。従って、抗体が、低下したエフェクター機能を有するように操作される幾つかの実施態様において、前記低下したエフェクター機能は低下したＣＤＣを含む。イムノコンジュゲートがＣ１ｑに結合することができそれ故にＣＤＣ活性を有するかを決定するためにＣ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)；及び Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)）。
【００８８】
幾つかの実施態様において、イムノコンジュゲートは、エフェクター部分と抗体との間に位置する一以上のタンパク質分解性切断部位を含む。イムノコンジュゲートの構成要素は、直接又は様々なリンカー、特に、一以上のアミノ酸を含み、典型的には、本明細書に記載されているか、又は当技術分野で知られている約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーによって連結されていてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーを含み、ｎは一般に、１と１０の間、典型的には２と４の数である。
【００８９】
イムノコンジュゲートの抗体
本発明のイムノコンジュゲートは、一般に、特定の抗原決定基に結合し、かつ標的部位、例えば抗原決定基を担う特定のタイプの腫瘍細胞又は腫瘍間質に結合する実体（例えば、エフェクター部分）を指向することができる免疫グロブリン分子である。イムノコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞の表面、ウイルス感染細胞の表面、他の疾患細胞の表面、血清中に遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見出される抗原決定基に結合可能である。腫瘍抗原の非限定的例には、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチターゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ−結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）及びその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、及びＰＳＡ−３、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ−細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、ＭＡＧＥ−腫瘍抗原ファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、ＧＡＧＥ−腫瘍抗原ファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００ Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス生成物、例えばヒト乳頭腫ウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶ−コード化核内抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、及びｃ−ｅｒｂＢ−２が含まれる。ウイルス性抗原の非限定例は、インフルエンザウイルス血球凝集素、エプスタイン・バーウイルスＬＭＰ−１、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、ＨＩＶ ｇｐ１６０、及びＨＩＶ ｇｐ１２０を含む。ＥＣＭ抗原の非限定例は、シンデカン、ヘパラナーゼ、インテグリン、オステオポンチン、リンク、カドヘリン、ラミニン、ラミニンタイプＥＧＦ、レクチン、フィブロネクチン、ノッチ、テネイシン、及びマトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）を含む。本発明のイムノコンジュゲートは、次の特異的な非���定的例の細胞表面抗原：ＦＡＰ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２（Ｔ−細胞表面抗原）、ＣＤ３（ＴＣＲと結合したヘテロマルチマー）、ＣＤ２２（Ｂ−細胞受容体）、ＣＤ２３（低親和性のＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体α鎖）、ＣＤ３０（サイトカイン受容体）、ＣＤ３３（骨髄細胞表面抗原）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体）、ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ６受容体）、ＣＤ２０、ＭＣＳＰ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質−１（ＣＤＣＰ１）、及びＰＤＧＦβＲ（β血小板由来成長因子受容体）に結合可能である。
【００９０】
ある実施態様において、抗体は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境内に存在する抗原に対するものである。特定の実施態様において、抗体は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシン−ＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ Ａ１）、テネイシン−ＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）の群から選択される抗原に対するものである。
【００９１】
抗体は、抗原決定基に特異的に結合することを保持し、かつＦｃ領域を含む抗体又はその断片の任意のタイプとすることができる。一実施態様において、抗体は、完全長抗体である。特に好ましい抗体は、ＩｇＧクラス、具体的にはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。
【００９２】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１及び／又はＡ４ドメイン（ＴＮＣ−Ａ１又はＴＮＣ−Ａ４又はＴＮＣ−Ａ１／Ａ４）に特異的である抗体をを含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号８又は配列番号９の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号６又は配列番号７の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。更に特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号８又は配列番号９の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号６又は配列番号７の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。
【００９３】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ２ドメイン（ＴＮＣ−Ａ２）に特異的である抗体を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号５、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３及び配列番号８５の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号３、配列番号４；配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２及び配列番号８４の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。より特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号５、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３及び配列番号８５の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号３、配列番号４；配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２及び配列番号８４の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。
【００９４】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的である抗体を含む。具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７及び配列番号６９からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６及び配列番号６８からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７及び配列番号６９からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６及び配列番号６８からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列又は機能性を保持しているその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号１２の重鎖可変領域配列、及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域配列、及び配列番号１６の軽鎖可変領域配列を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号４７の重鎖可変領域配列、及び配列番号４６の軽鎖可変領域配列を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号６３の重鎖可変領域配列、及び配列番号６２の軽鎖可変領域配列を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号６７の重鎖可変領域配列、及び配列番号６６の軽鎖可変領域配列を含む。別の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号１２５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、配列番号１２６に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号１２９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。別の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号１２７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、配列番号１２８に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号１２９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。別の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号１３０に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、配列番号１３１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号１３２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。
【００９５】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的である抗体を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号８６又は配列番号１２２の何れかの配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号８７又は配列番号１２３の何れかの配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。更に特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号８６又は配列番号１２２の何れかの配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号８７又は配列番号１２３の何れかの配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。より特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号８６の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号８６の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
【００９６】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、癌胎児抗原（ＣＥＡ）に特異的である抗体を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号１１４の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号１１５の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持しているその変異体を含む。より特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗体は、配列番号１１４の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号１１５の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。別の特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号１３６に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、配列番号１３７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体、及び配列番号１３８に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持しているその変異体を含む。
【００９７】
本発明によるイムノコンジュゲートは、配列番号３〜８７、１０８〜１３２及び１３６〜１３８に記載された配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％同一である配列を、その機能性断片又は変異体を含み、含むものを含む。本発明によるイムノコンジュゲートはまた、保存的アミノ酸置換を有する配列番号３〜１２７の配列を含む抗体も包含する。配列番号１２６、１２８、１３１、１３４及び１３７の配列において、本明細書に記載される変異体ＩＬ−２の配列の配列（配列番号２を参照）は、ヒトＩＬ−２の配列（配列番号１を参照）により置換され得ることが理解される。
【００９８】
イムノコンジュゲートのエフェクター部分
本発明における使用のためのエフェクター部分は、一般に、例えばシグナル伝達経路を介して細胞活性に影響を与えるポリペプチドである。従って、本発明において有用なイムノコンジュゲートのエフェクター部分は、細胞内応答を調節する細胞膜の外側からシグナルを伝達する受容体媒介性シグナル伝達と関連することができる。例えば、イムノコンジュゲートのエフェクター部分は、サイトカインとすることができる。特定の実施態様において、エフェクター部分は、本明細書で記載されたような、単鎖エフェクター部分である。一実施態様において、本発明によるイムノコンジュゲートのエフェクター部分、典型的には単鎖エフェクター部分は：ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、及びＩＬ−１２からなる群から選択されるサイトカインである。一実施態様において、エフェクター部分はＩＬ−２である。他の実施態様において、イムノコンジュゲートの単鎖エフェクター部分は：ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、及びＴＧＭ−βからなる群から選択されるサイトカインである。
【００９９】
一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＩＬ−２である。特定の実施態様において、ＩＬ−２エフェクター部分は：活性化Ｔリンパ球細胞における増殖、活性化Ｔリンパ球細胞における分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＣ）活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞ＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、及びＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞傷害からなる群から選択される、一又は複数の細胞反応を誘発させることができる。ある実施態様において、ＩＬ−２エフェクター部分は、変異していないＩＬ−２エフェクター部分と比較して、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する変異ＩＬ−２エフェクター部分の親和性は減少させ又は無効になっているが、中程度の親和性のあるＩＬ−２受容体（ＩＬ−２受容体のβ−及びγ−サブユニットからなる）に対する、変異ＩＬ−２エフェクター部分の親和性は保存されている、少なくとも一つのアミノ酸変異を有するＩＬ−２エフェクター部分である。一実施態様において、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。特定の実施態様において、変異ＩＬ−２エフェクター部分は、ヒトＩＬ−２（配列番号１）の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される１、２又は３の位置（複数）に、１、２又は３のアミノ酸置換を有する。更に特定の実施態様において、変異ＩＬ−２エフェクター部分は、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５及び７２に対応する位置で、３のアミノ酸置換を有する。また更に特定の実施態様において、変異ＩＬ−２エフェクター部分は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを有するヒトＩＬ−２である。一実施態様において、変異ＩＬ−２エフェクター部分は、ヒトＩＬ−２の３位に対応する位置に、アミノ酸変異を付加的に有し、ＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位が除去されている。特に、前記付加的なアミノ酸変異は、スレオニン配列がアラニン残基で置き換えられたアミノ酸置換である。アミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを有する四重変異（ＱＭ）ＩＬ−２の配列を、配列番号２に示す。適切な変異ＩＬ−２分子は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１２／１０７４１７に詳細に記載されている。
【０１００】
イムノコンジュゲートにおけるエフェクター部分として有用な変異型サイトカイン分子は、当技術分野で公知の遺伝的又は化学的方法を用いて、欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードするＤＮＡ配列、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。これに関し、天然ＩＬ−２のヌクレオチド配列は、Taniguchiら (Nature 302, 305-10 (1983))に記載されており、ヒトＩＬ−２をコードする核酸は、例えばAmerican Type Culture Collection (Rockville MD）などの公の受託者から入手することができる。ヒトＩＬ−２の例示的な配列は、配列番号１に示されている。置換又は挿入は、天然ならびに非天然のアミノ酸残基を含むことができる。アミノ酸修飾は、グリコシル化部位の付加又は除去又は炭水化物連結など化学修飾の周知の方法を含む。
【０１０１】
一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＧＭ−ＣＳＦである。特定の実施態様において、ＧＭ−ＣＳＦのエフェクター部分は、顆粒球、単球又は樹状細胞において増殖及び／又は分化を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＩＦＮ−αである。特定の実施態様において、ＩＦＮ−αのエフェクター部分は、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害、及び主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ Ｉ）の発現の上方制御からなる群から選択される細胞応答の一以上を誘発することができる。別の特定の実施態様では、ＩＦＮ−αのエフェクター部分は、腫瘍細胞において増殖を阻害することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＩＬ−１２である。特定の実施態様において、ＩＬ−１２のエフェクター部分は、ＮＫ細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、Ｔ細胞における増殖、及びＴ細胞分化からなる群から選択される細胞応答の一つ以上を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＩＬ−８である。特定の実施態様において、ＩＬ−８のエフェクター部分は、好中球において走化性を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＭＩＰ−１αである。特定の実施態様において、ＭＩＰ−１αのエフェクター部分は、単球及びＴリンパ球細胞において走化性を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＭＩＰ−１βである。特定の実施態様において、ＭＩＰ−１βのエフェクター部分は、単球及びＴリンパ球細胞において走化性を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＴＧＦ−βである。特定の実施態様において、ＴＧＦ−βのエフェクター部分は、単球における走化性、マクロファージにおける走化性、活性化マクロファージにおけるＩＬ−１発現の上方制御、及び活性化Ｂ細胞におけるＩｇＡ発現の上方制御からなる群から選択される細胞応答の一以上を誘発することができる。
【０１０２】
イムノコンジュゲートと組合せのための抗体
本発明によれば、イムノコンジュゲートと組合せのための抗体は、増加したエフェクター機能を有するように操作される。イムノコンジュゲートと組合せのための本発明における有用な抗体は、特定の抗原決定基、例えば特定の腫瘍細胞抗原に結合し、Ｆｃ領域を含む抗体又は抗体断片を含む。ある実施態様において、抗体は、腫瘍細胞に存在する抗原に対するものである。本発明で有用な抗体の特定の標的抗原は、限定されるものではないが、細胞表面受容体、例えば上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ジペプチジルペプチターゼＩＶ（ＣＤ２６、ＤＰＰＩＶ）、ＦＡＰ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ２０、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質−１（ＣＤＣＰ１）、及び扁平上皮癌抗原（ＳＣＣＡ）等を含む、腫瘍細胞の表面で発現する抗原を含む。
【０１０３】
特定の実施態様において、抗体は、ＣＤ２０、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質−１（ＣＤＣＰ１）、及びメラノーマ関連コンドロイチンスルファートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）の群から選択される抗原に対するものである。一実施態様において、抗体、多重特異性抗体は、ＣＤ２０、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＵＢドメイン含有タンパク質−１（ＣＤＣＰ１）、及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）の群から選択される、２又はそれ以上の抗原に対するものである。
【０１０４】
本発明で有用な特定の抗ＣＤ２０抗体は、マウスＢ−Ｌｙ１抗体の結合特異性を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスＩＩ型の抗ＣＤ２０抗体である（Poppema and Visser, Biotest Bulletin 3, 131-139 (1987)）。特に有用であるのは、
ａ）重鎖可変ドメインに、配列番号８８のＣＤＲ１、配列番号８９のＣＤＲ２、及び配列番号９０のＣＤＲ３、及び
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号９１のＣＤＲ１、配列番号９２のＣＤＲ２、及び配列番号９３のＣＤＲ３；
を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスＩＩ型の抗ＣＤ２０抗体である。
【０１０５】
特に、前記抗体の重鎖可変領域フレームワーク領域（ＦＲ）ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、ＶＨ１ １０ヒト生殖系配列によりコードされるヒトＦＲ配列であり、前記抗体の重鎖可変領域ＦＲ４は、ＪＨ４ヒト生殖系配列によりコードされるヒトＦＲ配列であり、前記抗体の軽鎖可変領域ＦＲ、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、ＶＫ ２ ４０ヒト生殖系配列によりコードされるヒトＦＲ配列であり、前記抗体の軽鎖可変領域ＦＲ４は、ＪＫ４ヒト生殖系配列によりコードされるヒトＦＲ配列である。
【０１０６】
特に本発明で有用な特定の抗ＣＤ２０抗体は、配列番号９４の重鎖可変ドメイン、及び配列番号９５の軽鎖可変ドメインを含む。
【０１０７】
そのような抗ＣＤ２０抗体は、その全体が出典明示によりここに援用される国際公開第２００５／０４４８５９号に記載されている。
【０１０８】
本発明で有用な特定の抗ＥＧＦＲ抗体は、ラットＩＣＲ６２抗体の結合特異性を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗体である（Modjtahedi et al., Br J Cancer 67, 247-253 (1993)）。特に有用であるのは、
ａ）重鎖可変ドメインに、配列番号９６のＣＤＲ１、配列番号９７のＣＤＲ２、及び配列番号９８のＣＤＲ３、及び
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号９９のＣＤＲ１、配列番号１００のＣＤＲ２、及び配列番号１０１のＣＤＲ３；
を含む、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗ＥＧＦＲ抗体である。
【０１０９】
本発明で有用なより特定の抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１０２の重鎖可変ドメイン、及び配列番号１０３の軽鎖可変ドメインを含む。
【０１１０】
そのような抗ＥＧＦＲ抗体は、それぞれその全体が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００６／０８２５１５号及び国際公開第２００８／０１７９６３号に記載されている。
【０１１１】
本発明で有用な他の適切なヒト化されたＩｇＧクラスの抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ／ＩＭＣ−Ｃ２２５（アービタックス（登録商標）、Goldstein et al., Clin Cancer Res 1, 1311-1318 (1995)に記載）、パニツムナブ／ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Yang et al., Cancer Res 59, 1236-1243 (1999)、Yang et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology 38, 17-23 (2001)に記載）、ニモツズマブ／ｈ−Ｒ３（ＴｈｅｒａＣｉｍ（登録商標）、Mateo et al., Immunotechnology 3, 71-81 (1997); Crombet-Ramos et al., Int J Cancer 101, 567-575 (2002)、Boland & Bebb, Expert Opin Biol Ther 9, 1199-1206 (2009)に記載）、マツズマブ／ＥＭＤ７２０００（Bier et al., Cancer Immunol Immunother 46, 167-173 (1998)、Kim, Curr Opin Mol Ther 6, 96-103 (2004)）に記載）、及びザルツムマブ／２Ｆ８（Bleeker et al., J Immunol 173, 4699-4707 (2004)、Lammerts van Bueren, PNAS 105, 6109-6114 (2008)に記載）を含む。
【０１１２】
本発明で有用な特定の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、その全内容が出典明示によりここに援用される、国際公開第２００５／００５６３５号及び国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されており、インスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）への、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）及びインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）の結合を阻害する。
【０１１３】
本発明で有用な抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、好ましくはモノクローナル抗体、更にキメラ抗体（ヒト定常ドメイン）、ヒト化抗体、特に好ましくは全長ヒト抗体である。本発明で有用な特定の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、抗体１８に競合して、ヒトＩＧＦ−１Ｒに結合する、すなわち、それらは、国際公開第２００５／００５６３５号に記載されているように、抗体１８と、ＩＧＦ−１Ｒの同じエピトープに結合する。特定の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ＩＧＦ−１Ｒへの親和性が１０−８Ｍ（ＫＤ）未満、特に約１０−９〜１０−１３Ｍであることにより更に特徴付けられ、好ましくはインスリン受容体へのインスリン結合性の検出可能な濃度依存性阻害を示さない。
【０１１４】
本発明で有用な特定の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、次の配列：
ａ）配列番号１０４又は１０６のＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体重鎖；
ｂ）配列番号１４５又は１４７のＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体軽鎖；
を有する、補体決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１１５】
特に、本発明で有用な抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、配列番号１０４の抗体重鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号１０５の抗体軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、又は配列番号１０６の抗体重鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号１０７の抗体軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を有する。
【０１１６】
本発明で有用な特定の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、それぞれ、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２５８７及びＤＳＭ ＡＣＣ ２５９４にて、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託されている、ハイブリドーマ細胞株＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン１８及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢ−クローン２２から得ることができる。
【０１１７】
本発明で有用な他の適切な抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、例えば、全長ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂシクツムマブ（cixutumumab）／ＩＭＣ−Ａ１２（Burtrum et al., Cancer Res 63, 8912-21 (2003); Rowinsky et al., Clin Cancer Res 13, 5549s-5555s (2007)に記載）、全長ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂ ＡＭＧ−４７９（Beltran et al., Mol Cancer Ther 8, 1095-1105 (2009); Tolcher et al., J Clin Oncol 27, 5800-7 (2009)に記載）、ヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂ ＭＫ−０６４６／ｈ７Ｃ１０（Goetsch et al., Int J Cancer 113, 316-28 (2005); Broussas et al., Int J Cancer 124, 2281-93 (2009); Hidalgo et al., J Clin Oncol 26, abstract 3520 (2008); Atzori et al., J Clin Oncol 26, アブストラクト3519 (2008)に記載）、ヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂ ＡＶＥ１６４２（Descamps et al., Br J Cancer 100, 366-9 (2009); Tolcher et al., J Clin Oncol 26, abstract 3582 (2008); Moreau et al., Blood 110, abstract 1166 (2007); Maloney et al., Cancer Res 63, 5073-83 (2003)に記載）、全長ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂフィギツムマブ／ＣＰ−７５１、８７１（Cohen et al., Clin Cancer Res 11, 2063-73 (2005); Haluska et al., Clin Cancer Res 13, 5834-40 (2007); Lacy et al., J Clin Oncol 26, 3196-203 (2008); Gualberto & Karp, Clin Lung Cancer 10, 273-80 (2009)、全長ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂ ＳＣＨ−７１７４５４（国際公開第２００８／０７６２５７号又はKolb et al., Pediatr Blood Cancer 50, 1190-7 (2008)に記載）、２．１３．２．ｍＡｂ（米国特許第７０３７４９８号（国際公開第２００２／０５３５９６号）に記載）、又は全長ヒトＩｇＧ４ ｍＡｂ ＢＩＩＢ０２２である。
【０１１８】
本発明で有用な特定の抗ＣＥＡ抗体は、マウスＰＲ１Ａ３抗体の結合特異性を有する、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗体である（Richman and Bodmer, Int J Cancer 39, 317-328 (1987)）。特に有用であるのは、
ａ）重鎖可変ドメインに、配列番号１０８のＣＤＲ１、配列番号１０９のＣＤＲ２、及び配列番号１１０のＣＤＲ３、及び
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号１１１のＣＤＲ１、配列番号１１２のＣＤＲ２、及び配列番号１１３のＣＤＲ３；
を含む、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗ＣＥＡ抗体である。
【０１１９】
本発明において有用である、より特定の抗ＣＥＡ抗体は、配列番号１１４の重鎖可変ドメイン、及び配列番号１１５の軽鎖可変ドメインを含む。
【０１２０】
そのような抗ＣＥＡ抗体は、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２３７８７に記載されている。
【０１２１】
本発明で有用な特定の抗ＨＥＲ３抗体は、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗体、例えば、Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３、特にＭａｂ ２０５．１０．２で、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０７６６８３に記載されているものである。特に有用であるのは、
ａ）重鎖可変ドメインに、配列番号１３９のＣＤＲ１、配列番号１４０のＣＤＲ２、及び配列番号１４１のＣＤＲ３、及び
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号１４３のＣＤＲ１、配列番号１４４のＣＤＲ２、及び配列番号１４５のＣＤＲ３；
を含む、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗ＨＥＲ３抗体である。
【０１２２】
本発明において有用である、より特定の抗ＨＥＲ３抗体は、配列番号１４２の重鎖可変ドメイン、及び配列番号１４６の軽鎖可変ドメインを含む。
【０１２３】
本発明で有用な特定の抗ＣＤＣＰ１−抗体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２３３８９に記載されているような、ＣＵＢ４抗体（寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２５５１（ＤＳＭＺ）から誘導される、ヒト化されたＩｇＧクラスの抗体である。
【０１２４】
本発明で使用可能な例示的な抗ＭＣＳＰ抗体は、例えば欧州特許出願番号ＥＰ１１１７８３９３．２号に記載されている。特に有用であるのは、
ａ）重鎖可変ドメインに、配列番号１１６のＣＤＲ１、配列番号１１７のＣＤＲ２、及び配列番号１１８のＣＤＲ３、及び
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号１１９のＣＤＲ１、配列番号１２０のＣＤＲ２、及び配列番号１２１のＣＤＲ３；
を含む、ヒト化された、ＩｇＧクラスの抗ＭＣＳＰ抗体である。
【０１２５】
本発明において有用である、より特定の抗ＭＣＳＰ抗体は、配列番号１２２の重鎖可変ドメイン、及び配列番号１２３の軽鎖可変ドメインを含む。
【０１２６】
一実施態様において、抗体は、ＩｇＧクラスの完全長抗体である。特定の実施態様において、抗体はＩｇＧ１抗体である。一実施態様において、抗体は、ヒトＦｃ領域、より具体的にはヒトＩｇＧのＦｃ領域、最も具体的にはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。上述される、抗ＩＧＦ−１Ｒ、抗ＥＧＦＲ及び抗ＣＤ２０抗体など、本発明に有用な抗体は、配列番号１２４に記載される、ヒトＩｇガンマ−１重鎖定常領域を含み得る（すなわち、抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスである）。
【０１２７】
本発明で有用な抗体は、対応する非操作抗体と比較して、増加したエフェクター機能を有するように操作されている。一実施態様において、増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体は、対応する非操作抗体と比較して、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、又は少なくとも１００倍増加したエフェクター機能を有する。増加したエフェクター機能には、限定されるものではないが、一又は複数の次の特徴：増加したＦｃ受容体結合性、増加したＣ１ｑ結合性及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、増加した抗体−依存性細胞−媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、増加した抗体−依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）、増加したサイトカイン分泌性、抗原提示細胞による増加した免疫複合体−媒介性抗原の取込、増加したＮＫ細胞への結合性、増加したマクロファージへの結合性、増加した単球への結合性、増加した多形核細胞への結合性、増加した直接的シグナル伝達誘発性アポトーシス、増加した標的結合抗体の架橋性、増加した樹状細胞の成熟、又は増加したＴ細胞プライミングが含まれる。
【０１２８】
一実施態様において、増加したエフェクター機能は、増加したＦｃ受容体結合性、増加したＣＤＣ、増加したＡＤＣＣ、増加したＡＤＣＰ、及び増加したサイトカイン分泌性の群から選択される、一又は複数のものである。一実施態様において、増加したエフェクター機能は、増加した活性化Ｆｃ受容体への結合である。このような実施態様において、活性化Ｆｃ受容体への結合親和性は、対応する非操作抗体の結合親和性と比較して、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍に増加している。特定の実施態様において、活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及びＦｃＲγＩＩａの群から選択される。一実施態様において、活性化Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ、特にヒトＦｃγＲＩＩＩａである。他の実施態様において、増加したエフェクター機能は増加したＡＤＣＣである。このような実施態様において、ＡＤＣＣは、対応する非操作抗体により媒介されるＡＤＣＣと比較して、少なくとも１０倍、特に少なくとも１００倍に増加している。他の実施態様において、増加したエフェクター機能は、活性化Ｆｃ受容体への結合性、及び増加したＡＤＣＣである。
【０１２９】
増加したエフェクター機能は、当業者に周知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイが本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号：Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985);米国特許第５，８２１，３３７号; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照）を用いることができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）など標準的な計測機器を使用してＥＬＩＳＡによって又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができ、そのようなＦｃ受容体は、組換え発現によって得ることができる。特定の実施態様によれば、活性化Ｆｃ受容体への結合親和性は、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。代わりに、Ｆｃ受容体に対する抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞などを使用して評価することができる。抗体がＣ１ｑに結合することができそれ故にＣＤＣ活性を有するかを決定するためにＣ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003);及び Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)）。
【０１３０】
増加したエフェクター機能は、例えば、Ｆｃ領域の糖鎖操作から、又は抗体のＦｃ領域のアミノ酸の変異の導入から生じ得る。一実施態様において、抗体は、そのＦｃ領域において一以上のアミノ酸変異の導入によって操作される。特定の実施態様において、アミノ酸の変異とはアミノ酸置換である。さらなる特定の実施態様において、アミノ酸置換は、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位に存在する（残基のＥＵ番号付け）。更に適切なアミノ酸変異は、例えばShields et al., J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001)；米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０６３３５１号及び国際公開第２００４／０９９２４９号に記載されている。変異Ｆｃ領域は、当該技術でよく知られている遺伝的又は化学的方法を使用し、アミノ酸を欠失、置換、挿入又は修飾することにより調製することができる。遺伝的方法は、コードするＤＮＡ配列、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。
【０１３１】
別の実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域におけるグリコシル化の修飾により操作される。特定の実施態様において、抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。抗体のＦｃ領域において非フコシル化オリゴ糖の割合が増加することで、抗体のエフェクター機能、特にＡＤＣＣが増加する。
【０１３２】
更に特定の実施態様において、抗体のＦｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは約７０％が、非フコシル化型である。非フコシル化オリゴ糖はハイブリッド又は複合型であってよい。
【０１３３】
他の特定の実施態様において、抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分岐オリゴ糖の割合が増加するように操作されている。更に特定の実施態様において、抗体のＦｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％が二分岐である。二分岐オリゴ糖はハイブリッド又は複合型であってよい。
【０１３４】
さらなる他の特定の実施態様において、抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域における二分岐の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加するように操作されている。更に特定の実施態様において、抗体のＦｃ領域におけるＮ結合オリゴ糖の、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、又は少なくとも約５０％が、二分岐の非フコシル化である。二分岐の非フコシル化オリゴ糖はハイブリッド又は複合型であってよい。
【０１３５】
Ｆｃドメイン中のオリゴ糖構造は、当該分野で周知の方法によって、例えばUmana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)又はFerrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)で説明したように、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法により分析することができる。非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖に対する、フコース酸基を欠くオリゴ糖の量であり（例えば、複合した、ハイブリッドの高マンノース構造）、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより、Ｎ−グルコシダーゼＦ処理されたサンプルにおいて同定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域においてほぼ２９７位に位置するアスパラギン残基を意味する（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）が；抗体中の小さな配列変化のために、Ａｓｎ２９７は、２９７位のほぼ±３アミノ酸の上流又は下流、すなわち２９４〜３００位に位置していてもよい。二分岐、又は二分岐の非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、同様に決定される。
【０１３６】
一実施態様において、抗体は、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域にてグリコシル化が修飾され、一又は複数のグリコシルトランスフェラーゼに活性が変化した宿主細胞で抗体が生成されるように操作されている。グリコシルトランスフェラーゼには、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）、及びα（１，６）−フコシルトランスフェラーゼが含まれる。特定の実施態様において、抗体は、増加したβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する宿主細胞に抗体を生成させることにより、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。更に特定の実施態様において、宿主細胞は、付加的に、増加したα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する。本発明に有用な抗体を操作するために使用可能な糖鎖工学法は、その全内容が出典明示によりここに援用される、Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)；国際公開第９９／５４３４２号（米国特許第６６０２６８４号；欧州特許出願公開第１０７１７００号）；国際公開第２００４／０６５５４０号（米国特許第２００４／０２４１８１７号；欧州特許出願公開第１５８７９２１号）、国際公開第０３／０１１８７８号（米国特許第２００３／０１７５８８４号）に更に詳細に記載されている。この方法を使用して糖鎖操作された抗体は、本明細書ではＧｌｙｃｏＭａｂと称する。
一般に、ここで論議される細胞株を含む、任意の種類の培養された細胞株は、変化したグリコシル化パターンを有する抗ＴＮＣ Ａ２抗体を生成するための細胞株の作製に使用することができる。特定の細胞株には、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞、及び他の哺乳動物細胞が含まれる。特定の実施態様において、宿主細胞は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作されている。特定の実施態様において、宿主細胞は、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように更に操作されている。特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種性ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメイン及びＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。特に、前記ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩのゴルジ局在化ドメインである。このような融合ポリペプチドを生成し、増加したエフェクター機能を有する抗体を産生するためにそれらを使用するための方法はFerrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)及び国際公開第２００４／０６５５４０号に開示され、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０１３７】
本発明で有用な抗体のコード化配列、及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのコード化配列を有し、生物学的に活性な遺伝子生成物を発現する宿主細胞は、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；「マーカー」遺伝子機能の存在又は不在；宿主細胞における、それぞれのｍＲＮＡ転写の発現により測定される場合の転写レベルの評価；又はイムノアッセイ又はその生物活性により測定される場合の、遺伝子生成物の検出で、当該技術でよく知られている方法により同定可能である。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎ ＩＩ活性は、例えば、ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩの生合成産物に結合するレクチンを用いることによって検出することができる。そのようなレクチンの例は二分するＧｌｃＮＡｃを含むオリゴ糖に優先的に結合するＥ４−ＰＨＡレクチンである。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドの生合成産物（すなわち、特定のオリゴ糖構造）はまた、前記ポリペプチドを発現する細胞により生産される糖タンパク質から遊離されたオリゴ糖の質量分析によって検出することができる。あるいは、ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドを用いて操作された細胞により生成された抗体で媒介される、増加したエフェクター機能、例えば増加したＦｃ受容体結合性を測定する機能アッセイを使用してもよい。
【０１３８】
他の実施態様において、抗体は、低下したα（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主細胞に抗体を生成させることにより、非操作抗体と比較して、Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するように操作される。低下したα（１，６）−フコシルトランスフェラーゼを有する宿主細胞は、α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊又は不活性化された、例えばノックアウトされた細胞であってよい（Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol Bioeng, 94(4), 680-688 (2006); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)を参照）。
【０１３９】
脱フコシル化（defucosylated）抗体を生成可能な細胞株の他の例には、タンパク質フコシル化におけるＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞欠失（Ripka et al., Arch Biochem Biophys 249, 533-545 (1986)；米国特許第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）が含まれる。本発明で有用な抗体は、例えば、抗体生成に使用される宿主細胞における、ＧＤＰ−フコーストランスポータータンパク質の活性を減少させ又は無効にすることにより、欧州特許出願公開第１１７６１９５Ａ１号、国際公開第０３／０８４５７０号、国際公開第０３／０８５１１９号、及び米国特許第２００３／０１１５６１４号、同２００４／０９３６２１号、同２００４／１１０２８２号、同２００４／１１０７０４号、同２００４／１３２１４０号、米国特許第６９４６２９２号（Ｋｙｏｗａ）に開示されている技術に従い、Ｆｃ領域におけるフコース残基を低減させるように糖鎖操作することができる。
【０１４０】
本発明で有用な糖鎖操作された抗体は、修飾された糖タンパク質を生成する発現システムにても生成可能であり、例えば国際公開第０３／０５６９１４号（GlycoFi, Inc.）又は国際公開第２００４／０５７００２号及び国際公開第２００４／０２４９２７号（Greenovation）に教示されている。
【０１４１】
組換え方法
本発明で有用な抗体及びイムノコンジュゲートを生成する方法は、当該技術でよく知られており、例えば国際公開第２０１２／１４６６２８号、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００６／０８２５１５号、国際公開第２００８／０１７９６３号、国際公開第２００５／００５６３５号、国際公開第２００８／０７７５４６号、国際公開第２０１１／０２３７８７号、国際公開第２０１１／０７６６８３号、国際公開第２０１１／０２３３８９号、及び国際公開第２００６／１００５８２号に開示されている。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を生成するための確立された方法も、例えば、Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載されている。
【０１４２】
天然に生じない抗体又はその断片は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、組換え的に生成することもでき（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載）、又は可変重鎖及び可変軽鎖を有するコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることにより（例えば、米国特許第５９６９１０８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）得ることができる。本発明で有用なイムノコンジュゲート及び抗体を組換え生成するために、該イムノコンジュゲート又は抗体をコードする一又は複数のポリヌクレオチド（複数）を単離し、宿主細胞において更にクリーニングし及び／又は発現させるために、一又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。当業者によく知られてる方法を使用し、適切な転写／翻訳コントロールシグナルと共に、抗体又はイムノコンジュゲートのコード化配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ組換え／遺伝的組換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。
【０１４３】
本発明で有用なイムノコンジュゲートは、全イムノコンジュゲートをコードする単一のポリヌクレオチドから、又は共発現される複数（例えば、２又はそれ以上）のポリヌクレオチドから発現され得る。共発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能性イムノコンジュゲートを形成している。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートの一部からの、別々のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現されたとき、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合し、抗体を形成する。
【０１４４】
組換えタンパク質の複製及び発現の補助に好適な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は、適切である場合、特定の発現ベクターを用いて形質移入又は形質導入されてよく、多量のベクター含有細胞は、例えば臨床用途に、十分な量のタンパク質を得るために、大規模発酵槽に播種して増殖させることができる。好適な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、組換えタンパク質は、特にグリコシル化が必要でない場合、細菌中に生成させてもよい。発現後、タンパク質は可溶化フラクションにおいて、細菌細胞ペーストから単離され、更に精製することもできる。原核生物に加え、真核微生物、例えば糸状菌又は酵母は、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌及び酵母株を含む、タンパク質−コード化ベクターに対する適切なクローニング又は発現宿主であり、部分的又は全長ヒトグリコシル化パターンを有するタンパク質の生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）タンパク質の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組合せて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞の他の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）系（例えば、Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977))に記載されているような２９３又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)）；及び骨髄腫細胞株、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が含まれる。タンパク質生成に適したある種の哺乳動物宿主細胞の概説について、例えばYazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, 248巻 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), 頁255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば、��乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、また、トランスジェニック生物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、又はリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０１４５】
抗体及びイムノコンジュゲートがヒト使用を意図している場合、抗体又は抗原結合部分のキメラ形態が使用されてよく、ここで抗体定常領域はヒトからのものである。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体がまた、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、限定されなが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体の機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴うか又は伴わない、ヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植する、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみを移植ヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植する、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様部分（section）で「覆い隠す」。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５，５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号； Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、それに由来することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 頁51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); 及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)）。ファージは典型的には、抗体断片を短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としてディスプレイする。
【０１４６】
ある実施態様において、本発明で有用な抗体は、例えば、その全内容が出典明示によりここに援用される、米国特許第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従い、高められた結合親和性を有するように操作されている。特定の抗原決定基に結合する本発明において有用な抗体の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000))）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかによって測定することができる。
【０１４７】
本明細書で記載のように調製される抗体及びイムノコンジュゲートは、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明瞭であろう。
【０１４８】
薬学的組成物
別の態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体中に、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体を含む薬学的組成物を提供する。これらの薬学的組成物は、例えば以下に記載する任意の治療方法に使用することができる。
【０１４９】
本明細書で記載されたように、増加したエフェクター機能を有する抗体とイムノコンジュゲートの薬学的組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態に、一又は複数の任意の薬学的に許容可能な担体と、所望の純度を有する抗体とこのようなイムノコンジュゲートを混合することによって調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Printing Company (1990)）。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容可能な担体には、更に、間質薬剤分散剤、例えば可溶性の中性−活性化ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）が含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０１５０】
例示的な凍結乾燥製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１５１】
本明細書において、薬学的組成物は、治療される特定の兆候に必要な付加的な活性成分、特に互いに悪影響を与えない相補活性を有するものを、更に含有してよい。例えば、治療すべき疾患が癌である場合、１つ又は複数の抗癌剤、例えば、化学療法剤は、腫瘍細胞の増殖の阻害剤、又は腫瘍細胞のアポトーシスの活性化剤などを更に提供するのが望まれ得る。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０１５２】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（methylmethacylate））マイクロカプセル）により、コロイド薬物送達系で（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Printing Company (1990)に開示されている。
【０１５３】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。
【０１５４】
インビボ投与に使用される組成物は、一般に滅菌されてる。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を介して濾過することにより、容易に達成される。
【０１５５】
治療の方法
本明細書において提供される、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せが、治療方法において使用され得る。
【０１５６】
一態様において、医薬として使用のための、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せが提供される。更なる態様において、疾患の治療において使用のための、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せが提供される。ある実施態様において、治療の方法において使用のための、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せが提供される。ある実施態様において、本発明は、組合せの治療的有効量を、個体に投与することを含む、疾患に罹患している個体を治療する方法に使用するための、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組み合せを提供する。このような一実施態様において、本方法は、以下に記載するような、少なくとも一つの付加的な治療的有効量を、個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本発明は、エフェクター細胞機能の刺激に使用するための、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せを提供する。ある実施態様において、本発明は、エフェクター細胞機能を刺激するために、有効量の組合せを個体に投与することを含む、個体のエフェクター細胞機能を刺激する方法に使用するための、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組み合せを提供する。上述した任意の実施態様の「個体」は、哺乳動物、特にヒトである。上述した任意の実施態様の「疾患」は、エフェクター細胞機能の刺激により治療可能な疾患である。ある実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患、特に癌である。
【０１５７】
更なる態様において、本発明は、医薬の製造又は調製における、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の使用を提供する。一実施態様において、医薬は疾患を治療するためのものである。さらなる実施態様において、医薬は、治療的有効量の医薬を、疾患に罹患している個体に投与することを含む、疾患を治療する方法において使用するためのものである。このような一実施態様において、本方法は、以下に記載するような、少なくとも一つの付加的な治療的有効量を、個体に投与することを更に含む。さらなる実施態様において、医薬は、エフェクター細胞機能を刺激するためのものである。さらなる実施態様において、医薬は、エフェクター細胞機能を刺激するために、医薬的有効量、個体に投与することを含む、個体のエフェクター細胞機能を刺激する方法に使用されるものである。上述した任意の実施態様の「個体」は、哺乳動物、特にヒトである。上述した任意の実施態様の「疾患」は、エフェクター細胞機能の刺激により治療可能な疾患である。ある実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患、特に癌である。
【０１５８】
更なる態様において、本発明は疾患を治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せを、治療的有効量、このような疾患に罹患している個体に投与することを含む。このような一実施態様において、本方法は、以下に記載するような、少なくとも１つの付加的な治療剤を治療的有効量、個体に投与することを更に含む。上述した任意の実施態様の「個体」は、哺乳動物、特にヒトである。上述した任意の実施態様の「疾患」は、エフェクター細胞機能の刺激により治療可能な疾患である。ある実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患、特に癌である。
【０１５９】
更なる態様において、本発明は、個体におけるエフェクター細胞機能を刺激する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、エフェクター細胞機能を刺激するために、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せを有効量、個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」は哺乳動物、特にヒトである。
【０１６０】
更なる態様において、本発明は、例えば上述した治療方法のいずれかに使用するための、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せの何れかを含む、薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体の組合せ、及び薬学的に許容可能な担体を含有する。他の実施態様において、薬学的組成物は、例えば以下に記載するような、少なくとも１つの付加的な治療剤と、ここで提供される任意の組合せを含有する。
【０１６１】
上述した任意の実施態様によれば、疾患は、エフェクター細胞機能を刺激することにより治療可能な疾患である。本発明の組合せは、疾患の治療に有用であり、宿主の免疫系の刺激により、特に細胞免疫反応を高めることが所望される病状において有効である。これらには、宿主免疫反応は不十分又は欠失している病状も含まれる。本発明の組合せを投与可能な病状は、細胞免疫反応が特定の免疫に対して重要なメカニズムである、腫瘍又は肝炎を含む。本発明の組合せを使用可能な特定の病状には、癌、特に腎細胞癌又はメラノーマ；特にＨＩＶ−ポジティブの患者における免疫不全、免疫抑制された患者、慢性感染症が含まれる。ある実施態様において、疾患は細胞増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌、特に肺癌、結腸直腸癌、腎癌、前立腺癌、乳癌、頭部及び頸部の癌、卵巣癌、脳癌、リンパ腫、白血病、皮膚癌からなる群から選択される癌である。
【０１６２】
本発明の組合せは、治療において、単独で、又は他の薬剤と共に使用することができる。例えば、本発明の組合せは、少なくとも一つの付加的な治療剤と同時投与されてよい。ある実施態様において、付加的な治療剤は抗癌剤、例えば化学療法剤、腫瘍細胞増殖のインヒビター、又は腫瘍細胞アポトーシスのアクチベーターである。
【０１６３】
ここで提供される併用療法は、抗体とイムノコンジュゲートを一緒に投与すること（２又はそれ以上の治療剤が、同じ又は別々の処方剤に含有されている場合）、又は抗体の投与が、イムノコンジュゲート、付加的な治療剤、及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に生じるケースでは別々に投与することを含む。また、本発明の組合せは、放射線療法と併用することもできる。
【０１６４】
本発明の組合せ（及び任意の付加的な治療剤）は、非経口、肺内、及び経鼻による投与、局所的治療が所望されている場合は、病巣内投与が可能である。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。抗体及びイムノコンジュゲートは、同じ又は違う経路で投与されてよい。投与は、短期間又は慢性的であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば注射、特に静脈又は皮下注射とすることができる。限定されるものではないが、種々の時点での単一又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む、種々の投与スケジュールが、ここで考慮される。
【０１６５】
本発明の組合せは、良好な医療行為に矛盾しない方式で、処方、服用、及び投与されるであろう。ここで考慮される要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、患者個体の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医者に公知の他の要因が含まれる。組合せが、必要ではないが、場合によっては当該問題の疾患を予防又は治療するのに現在使用されている一又は複数の薬剤と共に処方されてもよい。このような他の薬剤の有効量は、製剤に存在する抗体及びイムノコンジュゲートの量、疾患又は治療の種類、及び上述にて論議した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０１６６】
疾患の予防又は治療のために、（場合によっては、一又は複数の他の付加的な治療剤との併用で使用される場合）抗体及びイムノコンジュゲートの適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、抗体及びイムノコンジュゲートのタイプ、疾患の重篤度及び経過、組合せが予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、事前治療、患者の臨床病歴及び抗体及び／又はイムノコンジュゲートに対する応答性、及び担当医師の裁量に依存する。抗体及びイムノコンジュゲートは一度に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。
【０１６７】
疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体の約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組合せ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。例示的投与レジメンは、抗体の約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量を投与することを含む。投与に関して、同じ考慮が、本発明の組合せに使用されるイムノコンジュゲートにも適用される。しかしながら、他の投与レジメンも有益であり得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０１６８】
製造品
本発明の他の態様では、上述の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、一又は複数の容器、及び容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、組成物自体、又は病状の治療、予防及び／又は診断に有効な他の組成物と組合せて収容され、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は、本発明の組合せに使用される抗体である。他の活性剤は、本発明の組合せに使用されるイムノコンジュゲートであり、抗体と同じ組成物及び容器に存在していてよく、又は異なる組成物及び容器において提供されてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択した症状の治療のために使用されることを示している。
【０１６９】
一態様において、本発明は、（ａ）低下したエフェクター機能を有するように操作された第一抗体と、エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート、及び（ｂ）増加したエフェクター機能を有するように操作された第二抗体を、同じ又は別々の容器に収容し、及び任意で、（ｃ）疾患を治療するための方法として、併用治療の使用を指示する印刷された使用説明書を含むパッケージ挿入物を更に含む、疾患を治療することを意図したキットを提供する。更に、キットは、（ａ）増加したエフェクター機能を有するように操作された抗体を含有する組成物を収容する第１の容器；（ｂ）少なくとも一つの抗原結合部分とエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートを含有する組成物を収容する第２の容器；及び場合によっては（ｃ）更に細胞傷害剤又は他の治療剤を含有する組成物を収容する第３の容器を具備していてよい。本発明のこの実施態様のキットは、組成物が、特定の病状を治療するのに使用可能であることを示したパッケージ挿入物を更に含んでいてよい。代替的に、又は付加的に、キットは、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第３（又は第４）の容器を更に具備していてもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【実施例】
【０１７０】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０１７１】
一般的な方法
抗体のＦｃ領域の糖鎖操作により、高められたＡＤＣＣ誘発及び抗腫瘍効果に順に翻訳される、ヒトＦｃγＲＩＩＩ受容体に対する、結合親和性の増加に至る。ヒトＦｃγＲＩＩＩ受容体は、マクロファージ、好中球、及びナチュラルキラー（ＮＫ）、樹状細胞及びγδＴ細胞において発現する。マウスにおいて、前臨床効能を試験するために最も広く利用されている種、マウスＦｃγＲＩＶ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのマウス類似体は、マクロファージ及び好中球に存在するが、ＮＫ細胞には存在しない。よって、糖鎖操作された抗体を用いた任意の予期される改善された効能は、全ての程度ではないが、これらのモデルに反映されている。我々は、血液、リンパ様組織及び腫瘍中のマウスＮＫ細胞において、安定したヒトＣＤ１６ａ発現を示す、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に対してトランスジェニックなマウスを作製した。更に、これらのトランスジェニックマウスの血液中の、刺激していないＮＫ細胞における、ヒトＣＤ１６ａの発現レベルは、ヒトにおいて見出されたものに類似している。また、我々は、抗体治療を抗腫瘍活性と相互に関連させた後、腫瘍結合ＮＫ細胞のヒトＦｃγＲＩＩＩａのダウンレギュレーションを示した。最後に、我々は、この新規のマウス株を使用した腫瘍モデルにおいて、それらのヒトＣＤ１６−ネガティブ同腹仔と比較して、糖鎖操作された抗体治療によりかなり改善された効能が示されることを示した。
【０１７２】
実施例１
ＦａＤｕ頭頸部癌異種移植モデル
ＩＬ−２四重突然変異体（ｑｍ）を含むＦＡＰ標的２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２及び非標的ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２イムノコンジュゲート（それぞれ、配列番号１２５、１２６、１２９、及び配列番号１３３−１３５）及び抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ（配列番号１０２及び１０３）を、ＳＣＩＤマウスの舌の内部に注射されたヒト頭頸部癌細胞株ＦａＤｕにおいて試験した。
【０１７３】
この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織のＩＨＣにより、ＦＡＰに対してポジティブであることが示された。ＦａＤｕ細胞は元々ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から入手し、増殖後Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託されたものである。腫瘍細胞株は、５％ＣＯ２で水飽和した大気中、３７℃で、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ中で常套的に培養された。９５．８％生存率のインビトロ継代９を舌内注射用に使用した。２０μｌの細胞懸濁液（ＡｉｍＶ培地（Ｇｉｂｃｏ）に２×１０５ＦａＤｕ細胞）が舌内に注射された。実験の開始時に８−９週齢であったメスのＳＣＩＤマウス（Taconics, Denmark）を、認定されたガイドライン（GV-Solas; Felasa; TierschG）に従い、特定の病原体が無い条件下、１２時間明所／１２時間暗所の１日のサイクルで維持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された（Ｐ２００８０１６）。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために一週間保管された。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。マウスに、２×１０５のＦａＤｕ細胞を、試験の０日目に舌内注射し、無作為化し、計量した。腫瘍細胞注射の１週間後、マウスに、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ、又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを、週に１回で４週間、静脈注射した。全てのマウスは２００μｌの適切な溶液を静脈注射された。投与量は表２に明記されている。ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、処置群には２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ、又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを注射した。２００μｌあたりの適切なる量のイムノコンジュゲートを得るために、原液は必要な場合にＰＢＳで希釈された。図１Ａには、ＦＡＰ標的２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組み合せが、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート又は抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、高められた生存期間中央値において、優れた有効性を媒介することが示されている。これとは対照的に、非標的ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せは、単剤投与への優位性を示さなかった（図１Ｂ）。
【０１７４】
0006290209.tif 000003
【０１７５】
実施例２
ＩＬ−２イムノコンジュゲートによるＮＫ細胞の殺傷能力のインビトロ増強
ＮＫ細胞におけるイムノコンジュゲートの効果を測定するために、我々は、イムノコンジュゲート、特にエフェクター部分としてＩＬ−２を含むイムノコンジュゲートを用いた処理時における、腫瘍細胞の死滅性を評価する。この目的のために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, USA）を使用して、標準的な手順に従い単離した。簡単には、静脈血が健常なボランティアからヘパリン化シリンジで採取された。カルシウム又はマグネシウムを含有しないＰＢＳを用いて、血液を２：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に層化させた。中断することなく、室温（ＲＴ）で３０分、４５０ｘｇで、勾配を遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する中間相を収集し、全体で３回（３５０×ｇ、続いて３００×ｇを、ＲＴで１０分）、ＰＢＳで洗浄した。
【０１７６】
単離されたＰＢＭＣを、細胞上清に添加されたＩＬ−２（プロロイキン（Proleukin））又はＩＬ−２イムノコンジュゲートと共に、４５時間インキュベートした。続いて、ＰＢＭＣを回収し、１０：１のＥ：Ｔにて４時間、Ａ５４９細胞の抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ−媒介性ＡＤＣＣに使用した。標的細胞の死滅を細胞上清へのＬＤＨの放出を測定することにより検出した（Roche Cytotoxicity Detection Kit LDH）。図２は、種々の濃度の抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの存在下にて、０．５７ｎＭ（Ａ）又は５．７ｎＭ（Ｂ）のＦＡＰ−標的２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート又はＩＬ−２（プロロイキン）により前処理した又はしていないＰＢＭＣによる、全体的なＡ５４９腫瘍細胞の死滅を示す。グラフは、エフェクター細胞のイムノコンジュゲートによる前処置が、未処置のエフェクター細胞と比較して、ＧｌｙｃｏＭａｂの濃度の増加に伴って標的細胞の死滅を大きく増加させる結果をもたらすことを示している。
【０１７７】
実施例３
ＬＳ１７４Ｔ結腸直腸異種移植モデル
ＣＥＡ標的ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート（配列番号１３６−１３８）、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ（配列番号１０２及び１０３）及びセツキシマブを、ＳＣＩＤ−ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに脾臓内注射された、ヒト結腸直腸ＬＳ１７４Ｔ細胞株において試験した。この腫瘍モデルは、新鮮な凍結組織状で、ＩＨＣにより、ＣＥＡに対してポジティブであることが示された。ＬＳ１７４Ｔ細胞（ヒト結腸癌細胞）は、元々ＥＣＡＣＣ（細胞培養の欧州コレクション）から得、増殖後にＧｌｙｃａｒｔの内部細胞バンクに寄託されたものである。ＬＳ１７４Ｔを、１０％のＦＣＳ（PAA Laboratories, Austria）、１％のグルタマックス、及び１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（Sigma）を含有するＭＥＭイーグルにて培養した。その細胞を、５％のＣＯ２で水飽和した大気中、３７℃で培養させた。９９％の生存率で、インビトロ継代１９又は２３を脾臓内注射用に使用した。麻酔されたＳＣＩＤ ＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスの左腹部に、小さな切込を入れた。３０マイクロリットルの細胞懸濁液（ＡｉｍＶ培地に２×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞）を、脾臓の嚢の真下に腹壁を通して注射した。クランプ又は分解可能な縫合糸使用し、皮膚創傷を閉じた。実験の開始時に８−９週齢であったメスのＳＣＩＤ ＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウス（Taconics, Denmarkから購入）を、認定されたガイドライン（GV-Solas; Felasa; TierschG）に従い、特定の病原体が無い条件下、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで維持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された（Ｐ ２００８０１６、Ｐ２０１１／１２８）。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために１週間保管された。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。マウスに、２×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞を、試験の０日目に脾臓内注射し、無作為化し、計量した。腫瘍細胞注射の１週間後、マウスに、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、セツキシマブ、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ、又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートとセツキシマブの組合せを、週に１回で３週間、静脈注射した。全てのマウスは２００μｌの適切な溶液を静脈注射された。投与量は表３に明記されている。ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、処置群にはＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、又は抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、セツキシマブ、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ、又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートとセツキシマブの組合せを注射した。２００μｌあたりの適切なる量のイムノコンジュゲートを得るため、原液は必要な場合にＰＢＳで希釈された。図３及び表３Ａと３Ｂには、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組み合せが、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート単独、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独、セツキシマブ単独、又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートとセツキシマブの組合せと比較して、高められた生存期間中央値及び全生存期間において、優れた有効性を媒介することが示されている。
【０１７８】
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【０１７９】
実施例４
Ａ５４９肺異種移植モデル
ＣＥＡ標的ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート（配列番号１３６−１３８）、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ（配列番号１０２及び１０３）及びセツキシマブを、ＳＣＩＤ−ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに静脈内注射された、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９において試験した。
【０１８０】
Ａ５４９非小細胞肺癌細胞は、元々ＡＴＣＣ（ＣＣＬ−１８５）から入手され、増殖後にＧｌｙｃａｒｔの内部細胞バンクに寄託されたものである。腫瘍細胞株は、５％ＣＯ２で水飽和した大気中、３７℃で、１０％ＦＣＳ（Gibco）を含有するＤＭＥＭ中で常套的に培養された。９７−９８％生存率の継代８を移植用に使用した。動物あたり５×１０６細胞を、２００μｌのＡｉｍ Ｖ細胞培養培地（Gibco）中で尾部静脈に静脈注射した。
【０１８１】
実験の開始時に８−９週齢であったメスのＳＣＩＤ−ＦｃγＲＩＩＩマウス（Roche-Glycart; Switzerland）を、認定されたガイドライン（GV-Solas; Felasa; TierschG）に従い、特定の病原体が無い条件下、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで維持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために１週間保管された。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。
【０１８２】
マウスに、５×１０６のＡ５４９細胞を、試験の０日目に静脈注射し、無作為化し、計量した。腫瘍細胞注射の１週間後（図４Ａ）又は２週間後（図４Ｂ）、マウスに、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、セツキシマブ、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ、又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートとセツキシマブの組合せを、週に１回で３週間、静脈注射した。全てのマウスは２００μｌの適切な溶液を静脈注射された。投与量は表４に明記されている。ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、処置群にはＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ、又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートとセツキシマブの組合せを注射した。２００μｌあたりの適切なる量のイムノコンジュゲートを得るために、原液は必要な場合にＰＢＳで希釈した。
【０１８３】
図４及び表４Ａと４Ｂには、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂの組み合せが、該イムノコンジュゲート、抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ又はセツキシマブ単独、並びに、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートとセツキシマブの組合せと比較して、高められた生存期間中央値及び全生存期間において、優れた有効性を媒介することが示されている。
【０１８４】
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【０１８５】
実施例５
ＬＳ１７４Ｔ結腸直腸異種移植モデル
ＣＥＡ標的ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート（配列番号１３６−１３８）及び抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ（配列番号１４２及び１４６）を、ＳＣＩＤ−ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに脾臓内注射された、ヒト結腸直腸ＬＳ１７４Ｔ細胞株において試験した。
【０１８６】
ＬＳ１７４Ｔ細胞（ヒト結腸癌細胞）は、元々ＥＣＡＣＣ（細胞培養の欧州コレクション）から入手し、増殖後にＲｏｃｈｅ−Ｇｌｙｃａｒｔの内部細胞バンクに寄託されたものである。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、１０％のＦＣＳ（PAA Laboratories, Austria）、１％のグルタマックス、及び１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）を含有するＭＥＭイーグルにて培養した。細胞を、５％のＣＯ２で水飽和した大気中、３７℃で培養した。９７．９％生存率のインビトロ継代２１を脾臓内注射用に使用した。麻酔されたＳＣＩＤ−ヒト ＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスの左腹部に、小さな切込を入れた。３０マイクロリットルの細胞懸濁液（ＡｉｍＶ培地に２×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞）を、脾臓の嚢の真下に腹壁を通して注射した。分解可能な縫合糸使用して、皮膚創傷を閉じた。
【０１８７】
実験の開始時に８−９週齢であったメスのＳＣＩＤ−ヒト ＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウス（Roche-Glycart, Switzerland）を、認定されたガイドライン（GV-Solas; Felasa; TierschG）に従い、特定の病原体が無い条件下、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで維持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために１週間保管された。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。
【０１８８】
マウスに、２×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞を、試験の０日目に脾臓内注射し、無作為化して計量した。腫瘍細胞注射の１週間後、マウスに、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ、又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを、週に１回で３週間、静脈注射した。
【０１８９】
全てのマウスは２００μｌの適切な溶液を静脈注射された。投与量は表５に明記されている。
ビヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、処置群にはＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート、抗Ｈｅｒ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ、又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ｑｍイムノコンジュゲートと抗Ｈｅｒ３  ＧｌｙｃｏＭａｂとの組合せを注射した。２００μｌあたりの適切なる量のイムノコンジュゲートを得るために、原液は必要な場合にＰＢＳで希釈された。図５及び表５Ａには、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂの組み合せが、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート又は抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独と比較して、高められた生存期間中央値において、優れた有効性を媒介することが示されている。
【０１９０】
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【０１９１】
実施例６
ＡＣＨＮ腎臓癌異種移植モデル
ＩＬ−２四重変異体（ｑｍ）を含むＦＡＰ標的２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２イムノコンジュゲート（配列番号１２５、１２６及び１２９）及び抗ＥＧＦＲ ＧｌｙｃｏＭａｂ（配列番号１０２及び１０３）を、ＳＣＩＤ−ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに腎臓内注射された、ヒト腎細胞株ＡＣＨＮにおいて試験した。
【０１９２】
ＡＣＨＮ細胞（ヒト腎臓癌細胞）は元々ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から入手し、増殖後Ｒｏｃｈｅ−Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託されたものである。ＡＣＨＮは、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養された。細胞を、５％のＣＯ２で水飽和した大気中、３７℃で培養した。９６．４％生存率のインビトロ継代２２を腎臓内注射用に使用した。麻酔されたＳＣＩＤ−ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスの右脇腹と腹膜壁に、小さな切込（２ｃｍ）を入れた。５０μｌの細胞懸濁液（ＡｉｍＶ培地中に１×１０６のＡＣＨＮ）が、腎臓に被膜下２ｍｍに注射された。分解可能な縫合糸使用して、皮膚創傷と腹膜壁を閉じた。
【０１９３】
実験の開始時に８−９週齢であったメスのＳＣＩＤ−ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウス（Roche-Glycart, Switzerland）を、認定されたガイドライン（GV-Solas; Felasa; TierschG）に従い、特定の病原体が無い条件下、１２時間明所／１２時間暗所の１日サイクルで維持した。実験の調査プロトコルは、地方自治体により調査され承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために１週間保管された。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。
【０１９４】
マウスに、１×１０６のＡＣＨＮ細胞を、試験の０日目に腎臓内注射し、無作為化し、計量した。腫瘍細胞注射後１週間で、マウスは、ビヒクル、抗ＥＧＦ−ＧｌｙｃｏＭａｂ、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２イムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ−ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ、又はプロロイキン（登録商標）と抗ＥＧＦＲ−ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを静脈注射された。ＥＧＦＲ−ＧｌｙｃｏＭａｂ及び２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２イムノコンジュゲートは、３週間、週１回投与された。プロロイキン（登録商標）は３週間月曜から金曜まで毎日注射された。
【０１９５】
全てのマウスは２００μｌの適切な溶液を静脈注射された。投与量は表６に明記されている。ビヒクル群のマウスはＰＢＳを注射され、処置群は、抗ＥＧＦ−ＧｌｙｃｏＭａｂ、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２イムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ−ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ、又はプロロイキン（登録商標）と抗ＥＧＦＲ−ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せを静脈注射された。２００μｌあたりの適切なる量のイムノコンジュゲートを得るために、原液は必要な場合にＰＢＳで希釈された。
【０１９６】
図６及び表６Ａは、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２イムノコンジュゲートと抗ＥＧＦＲ−ＧｌｙｃｏＭａｂは、抗ＥＧＦＲ−ＧｌｙｃｏＭａｂ単独及びプロロイキン（登録商標）と抗ＥＧＦＲ−ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せと比較して、高められた生存期間中央値及び全生存期間において、優れた有効性を媒介することを示している。
【０１９７】
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【０１９８】
実施例７
ＩＬ-２イムノコンジュゲートによるＮＫ細胞の殺傷能力並びにＣＤ２５及びＣＤ６９発現のインビトロ増強
実施例２にあるように、イムノコンジュゲート、特に、エフェクター部分としてＩＬ−２、及びＧｌｙｃｏＭａｂ、この場合には抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂを含むイムノコンジュゲートを用いた処置の際の、ＮＫ細胞による腫瘍細胞（ＬＳ１７４Ｔ）の死滅を評価した。標的細胞の死滅は、細胞上清中へのＬＤＨ放出を測定することによって検出された。
【０１９９】
ＰＢＭＣを、新鮮な血液から単離した。簡潔には、血液はＰＢＳで３：１に希釈された。血液／ＰＢＳ混合物の約３０ｍｌが、１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Sigma）の上に積層され、ブレーキなしで３０分間、４５０×ｇで３０分間遠心分離された。リンパ球を、５ｍｌピペットを用いてＰＢＳを含有する５０ｍｌのチューブに収集した。チューブはＰＢＳで５０ｍｌにまで充填され、３５０ｇで１０分間遠心分離された。上清は廃棄され、ペレットは５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁され、３００ｇで１０分間遠心分離された。洗浄工程を１回繰り返した。細胞を計数し、１ｍｌあたり１×１０６細胞を有する１０％ＦＣＳと１％グルタミンを含有する予め温められたＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を回収し、計数した。
【０２００】
ＬＳ１７４Ｔ（ECACC #87060401）は、ヒト白人結腸腺癌細胞株である。細胞を、１％グルタミン、１％非必須アミノ酸及び１０％ＦＣＳを含有するＥＭＥＭ中で培養し、コンフルエンスに到達する前に、２日から３日毎に分割された。ＬＳ１７４Ｔ細胞をトリプシンを用いて剥離した。細胞を計数し、生存率を確認した。アッセイ前の細胞の生存率は９９．４％であった。細胞を１ｍｌあたり０．３×１０６で、それぞれの培地に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養処理された平底プレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、上清を細胞から除去した。次いで、１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ（配列番号１４２及び１４６）又は培地を５０μｌ、それぞれのウェルに加えた。次いで示された濃度でのＣＥＡ標的ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍイムノコンジュゲート（配列番号１３６−１３８）（図７を参照）又は培地を５０μｌ、ウェル毎に加えた。室温で１０分間インキュベートした後、１ｍｌあたり３×１０６細胞のＰＢＭＣ又は培地１００μｌをウェルあたり２００μｌの最終体積に達するまで加えた。
【０２０１】
細胞をインキュベーター中で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを４００ｇで４分間遠心分離し、上清を回収した。ウェルあたり５０μｌの上清が、ＬＤＨ放出を測定するために使用された（Roche Cytotoxicity Detection Kit LDH）。残りの上清は、次に使用するまで−２０℃で保存された。細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ染色を開始する前に４℃で保存した（下記参照）。
【０２０２】
図７は、抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独（左パネル）、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲート単独（右パネル）又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗Ｈｅｒ３ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ（右パネル）を用いた処置の際の、ＰＢＭＣによる全体的なＬＳ１７４Ｔ細胞の死滅を示す。
【０２０３】
ＰＢＭＣを、２４時間後に回収し、ＮＫ細胞のＣＤ２５及びＣＤ６９発現のＦＡＣＳ分析のために用いた。細胞を、４００ｇで４分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で一回洗浄した。その後、ウェルあたり２０μｌの抗体混合物を細胞に加えた。細胞を、冷蔵庫で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ウェルあたり２％のＰＦＡを含むＦＡＣＳ緩衝液２００μｌに再懸濁した。分析は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ及び以下の抗体混合物：ＣＤ３ ＰＥ／Ｃｙ７（BioLegend, #300420；１：４０希釈）、ＣＤ５６ ＡＰＣ（BioLegend #318310；１：２０希釈）、ＣＤ６９Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１（BioLegend #310929；１：４０希釈）、ＣＤ２５ ＰＥ（BD Bioscience #557138；１：２０希釈）を使用して実施された。
【０２０４】
図８は、抗ＨＥＲ３ ＧｌｙｃｏＭａｂ単独（左パネル）、ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲート単独（右パネル）又はＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートと抗Ｈｅｒ３ ＧｌｙｃｏＭａｂの組合せ（右パネル）を用いた処置の際の、ＮＫ細胞上でのＣＤ２５（Ａ）又はＣＤ６９（Ｂ）の発現を示す。
【０２０５】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用された全ての特許及び科学文献の開示はその全体が出典明示により明示的に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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