(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロゲン酸の含有量が９８重量％以上、不純物の含有量が１．９重量％以下であり、不純物には３−クマロイルキナ酸が含まれ、３−クマロイルキナ酸は、原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の総重量に対して０．１〜０．５％を占める原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調整方法であって、以下のステップａ〜ｉを含むことを特徴とする原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調整方法。
ａ.母液調製：クロロゲン酸含有量が２０重量％〜６０重量％の杜仲葉抽出物を用意し、クロロゲン酸の濃度を４０ｍｇ／ｍｌ〜４８０ｍｇ／ｍｌに調合し、調合温度を１０℃〜６０℃、ｐＨ＝１．０〜３．０とする、
ｂ.抽出：酢酸エチルを用いて抽出し、抽出回数は３〜８回、抽出１回当たりの酢酸エチルの使用量は母液体積の５〜１０倍、毎回の抽出前の母液ｐＨは１．０〜３．０とし、抽出温度は５℃〜６０℃とする、
ｃ.脱色:ステップｂの抽出物に漂白のために活性炭を加え、活性炭の使用量は粗生成物の質量の０．１〜０．５倍とし、脱色温度は５０℃〜７０℃、脱色時間は０．５ｈ〜２．０ｈとする、
ｄ.濃縮：ステップｃの脱色後の抽出液から炭素を除去した後、減圧下および低温下で濃縮し、濃縮温度は５０℃〜７０℃、真空度は−０．０６〜−０．０８ＭＰａとし、濃縮液のクロロゲン酸含有量を２０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌに制御する、
ｅ.沈降：ステップｄの濃縮液を冷却して沈降させ、沈降温度は０℃〜２５℃、沈降時間は１２ｈ〜２４ｈとする、
ｆ.結晶：ステップｅの沈降後の溶液を加熱し、攪拌して冷却し、結晶させ、結晶温度は５０℃〜７０℃、結晶時間は０．５ｈ〜３．０ｈとし、結晶後、１０℃〜４０℃まで冷却する、
ｇ.粉砕：ステップｆの結晶物を乳化又は研磨粉砕し、粉砕後の結晶体の粒度は１００μｍ〜５００μｍとし、粉砕の過程で溶剤は使用してもしなくてもよく、溶剤の種類は酢酸エチル、水又は体積比１％〜９９％の酢酸エチルと水との混合液とする、
ｈ.洗浄：ステップｇの粉砕後の結晶物を酢酸エチル、水又は１％〜９９％の比率の酢酸エチルと水との混合液で洗浄し、洗浄溶剤の使用量は、材料の質量の数値の１〜１０倍の数値の体積とし、温度は０℃〜７０℃とし、洗浄を行う、
ｉ.乾燥：ステップｈで洗浄した結晶物を乾燥させ、乾燥温度は３０℃〜８０℃、乾燥真空度は常圧〜−０．０９ＭＰａとする。
【請求項２】
請求項１において、
下記のステップa〜iを含んで調製されることを特徴とする原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製方法。
ａ.母液調製：クロロゲン酸の含有量が４０重量％の杜仲葉抽出物を用意し、濃度６０重量％の粗生成物水溶液を調合し、クロロゲン酸の濃度は２４０ｍｇ／ｍｌ、調合温度は２５℃、ｐＨ＝１．０とする、
ｂ.抽出：酢酸エチルを用いて抽出し、抽出回数は５回、抽出１回当たりの酢酸エチルの使用量は母液体積の８倍、毎回の抽出前の母液ｐＨは１．０とし、抽出温度は２５℃とする、
ｃ.脱色：ステップｂの抽出物に漂白のために活性炭を加え、活性炭の使用量は粗生成物の質量の０．２倍とし、脱色温度は６０℃、脱色時間は１．０ｈとする、
ｄ.濃縮：ステップｃの脱色後の抽出液から炭素を除去した後、減圧下および低温下で濃縮し、濃縮温度は６０℃、真空度は−０．０８ＭＰａとし、濃縮液のクロロゲン酸含有量を４０ｍｇ／ｍｌに制御する、
ｅ.沈降：ステップｄの濃縮液を冷却して沈降させ、沈降温度は２５℃、沈降時間は１２ｈとする、
ｆ.結晶：ステップｅの沈降後の溶液を加熱し、攪拌して冷却し、結晶させ、結晶温度は７０℃、結晶時間は１．０ｈ、結晶終了温度は２５℃とする、
ｇ.粉砕：ステップｆの結晶物を乳化又は研磨粉砕し、粉砕後の結晶体の粒度は２００μｍ〜３００μｍとし、粉砕の過程で酢酸エチル溶剤を使用する、
ｈ.洗浄：ステップｇの粉砕後の結晶物を水で洗浄し、水の使用量は材料の質量の数値の３倍の数値の体積とし、水の温度は５℃とする、
ｉ.乾燥：ステップｈで洗浄した結晶物を乾燥させ、乾燥温度は６０℃、乾燥真空度は−０．０８ＭＰａとする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロロゲン酸（ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、別名３−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）は、植物中に広く存在する一種のポリフェノール化合物であり、スイカズラ類、杜仲、コーヒー等の植物に多く含まれる。クロロゲン酸は、抗アレルギー、体内血糖の調節、酸素フリーラジカルの除去、抗癌、抗ＨＩＶ等の働きが比較的強く、その著しい治療効果や、毒性と副作用が少ないことから、広く研究がなされている。クロロゲン酸は植物から抽出するが、構造が不安定であるため、生産や貯蔵、輸送の過程で関連不純物が非常に入り込みやすい。薬物の安全性、有効性、品質の制御性を保証するため、関連不純物の研究は新薬の品質研究の重要部分となっており、そのためクロロゲン酸中の関連不純物についての研究はきわめて必要なものである。（田晨煦ほか、「高速液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析法によるクロロゲン酸及びその関連不純物の分離同定」、クロマトグラフィ、２００７年７月（田晨煦等、「高効液相色譜-串聯質譜法分離鑑定緑原酸及其相関雑質」、色譜、２００７年７月））。
【０００３】
また、クロロゲン酸の標準についても、以下のような関連文献により報告されている。廖麗雲、「クロロゲン酸及び凍結乾燥製剤の品質標準、安定性の研究及びクロロゲン酸精製品の構造識別」、薬物分析、四川大学、２００５、修士（廖麗云、「緑原酸及凍干制剤質量標準、穏定性的研究和緑原酸精制品結構確証」、薬物分析、四川大学、２００５、碩士）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記関連文献ではクロロゲン酸中の不純物を分析しているが、どの不純物がクロロゲン酸の品質に影響するかについては説明していない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の課題解決手段は、原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸とその調製方法及び質量検出方法を提供するものである。
【０００６】
本発明は、クロロゲン酸の含有量が９８重量％以上、不純物の含有量が１．９重量％以下の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸を提供し、不純物には３−クマロイルキナ酸が含まれ、３−クマロイルキナ酸は、中間体の総重量に対して０．１〜０．５％を占める。
【０００７】
本発明で述べる「原料クロロゲン酸」は、杜仲葉から抽出したクロロゲン酸単体であり、クロロゲン酸の含有量は９８重量％以上、その他不純物の含有量は１．９重量％以下である。杜仲を由来とする以外に、スイカズラなどクロロゲン酸を含む他の植物を由来として抽出し純化してもよい。
【０００８】
さらに好ましくは、原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸は、５−カフェオイルキナ酸（ネオクロロゲン酸）、４−ビニルピロカテコール（カフェ酸脱炭酸物）、カフェ酸、４−カフェオイルキナ酸（クリプトクロロゲン酸）、クロロゲン酸メチドのうちの一種又は複数種を含み、その含有量の重量％は以下の通り。すなわち、カフェ酸の含有量は０．４重量％以下、カフェ酸を除くその他関連物質の単独の含有量は０．５重量％以下である。
【０００９】
ただし、３−クマロイルキナ酸、５−カフェオイルキナ酸（ネオクロロゲン酸）、４−ビニルピロカテコール（カフェ酸脱炭酸物）、４−カフェオイルキナ酸（クリプトクロロゲン酸）、クロロゲン酸メチドの合計含有量は１．５重量％以下である。
【００１０】
好ましくは、原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸は、クロロゲン酸の含有量が９８．０〜９９．８重量％、不純物の含有量が０．１〜１．９重量％である。
【００１１】
本発明はさらに、原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製方法を提供し、それは以下のステップa〜iを含む。
【００１２】
ａ.母液調製：クロロゲン酸含有量が２０％〜６０％の杜仲葉抽出物を用意し、濃度２０％〜８０％の粗生成物水溶液を調合する。クロロゲン酸の濃度は４０ｍｇ／ｍｌ〜４８０ｍｇ／ｍｌ、調合温度は１０℃〜６０℃、ｐＨ＝１．０〜３．０とする。
【００１３】
ｂ.抽出：酢酸エチルを用いて抽出する。抽出回数は３〜８回、抽出１回当たりの酢酸エチルの使用量は母液体積の５〜１０倍、毎回の抽出前の母液ｐＨは１．０〜３．０とし、抽出温度は５℃〜６０℃とする。
【００１４】
ｃ.脱色:活性炭の使用量は粗生成物の質量の０．１〜０．５倍とし、脱色温度は５０℃〜７０℃、脱色時間は０．５ｈ〜２．０ｈとする。
【００１５】
ｄ.濃縮：濃縮温度は５０℃〜７０℃、真空度は−０．０６〜−０．０８ＭＰａとし、濃縮液のクロロゲン酸含有量を２０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌに制御する。
【００１６】
ｅ.沈降：沈降温度は０℃〜２５℃、沈降時間は１２ｈ〜２４ｈとする。
【００１７】
ｆ.結晶：沈降後、結晶させる。結晶温度は５０℃〜７０℃、結晶時間は０．５ｈ〜３．０ｈとし、結晶後、１０℃〜４０℃まで冷却する。
【００１８】
ｇ.粉砕：ステップｆの結晶物を乳化又は研磨粉砕する。粉砕後の結晶体の粒度は１００μｍ〜５００μｍとする。粉砕の過程で溶剤は使用してもしなくてもよく、溶剤の種類は酢酸エチル、水又は一定割合の酢酸エチルと水との混合液とし、酢酸エチルと水との混合比率は１％〜９９％とする。
【００１９】
ｈ.洗浄：酢酸エチル、水又は一定割合の酢酸エチルと水との混合液で洗浄する。酢酸エチルと水との混合比率は１％〜９９％、洗浄溶剤の使用量は、材料の質量の数値の１〜１０倍の数値の体積とし、溶剤（液）の温度は０℃〜７０℃とする。
【００２０】
ｉ.乾燥：乾燥材料の粒度は１２０メッシュ〜２０メッシュとし、乾燥温度は３０℃〜８０℃、乾燥真空度は常圧〜−０．０９ＭＰａとする。
【００２１】
より好ましくは、原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸は、下記のステップa〜iを含んで調製される。
【００２２】
ａ.母液調製：クロロゲン酸の含有量が４０％の杜仲葉抽出物を用意し、濃度６０％の粗生成物水溶液を調合し、クロロゲン酸の濃度は２４０ｍｇ／ｍｌ、調合温度は２５℃、ｐＨ＝１．０とする。
【００２３】
ｂ.抽出：酢酸エチルを用いて抽出する。抽出回数は５回、抽出１回当たりの酢酸エチルの使用量は母液体積の８倍、毎回の抽出前の母液ｐＨは１．０とし、抽出温度は２５℃とする。
【００２４】
ｃ.脱色：活性炭の使用量は粗生成物の質量の０．２倍とし、脱色温度は６０℃、脱色時間は１．０ｈとする。
【００２５】
ｄ.濃縮：濃縮温度は６０℃、真空度は−０．０８ＭＰａとし、濃縮液のクロロゲン酸含有量を４０ｍｇ／ｍｌに制御する。
【００２６】
ｅ.沈降：沈降温度は２５℃、沈降時間は１２ｈとする。
【００２７】
ｆ.結晶：沈降後、結晶させる。結晶温度は７０℃、結晶時間は１．０ｈ、結晶終了温度は２５℃とする。
【００２８】
ｇ.粉砕：ステップｆの結晶物を乳化又は研磨粉砕する。粉砕後の結晶体の粒度は２００μｍ〜３００μｍとする。粉砕の過程で酢酸エチル溶剤を使用する。
【００２９】
ｈ.洗浄：水で洗浄する。水の使用量は材料の質量の数値の３倍の数値の体積とし、水の温度は５℃とする。
【００３０】
ｉ.乾燥：乾燥材料の粒度は６０メッシュとし、乾燥温度は６０℃、乾燥真空度は−０．０８ＭＰａとする。
【００３１】
本発明はさらに、上記の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の検出方法を提供し、それはクロロゲン酸の検出方法及び不純物の検出方法を含む。
【００３２】
クロロゲン酸の含有量検出方法は以下の通りである。
【００３３】
高速液体クロマトグラフィ(中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ)によって測定する。
【００３４】
クロマトグラフィ条件とシステム適合性試験  オクタデシル基結合シリカを填充剤とし、０．１％のギ酸溶液−アセトニトリル（９２：８）を移動相とし、検出波長は２１５ｎｍとする。理論段数はクロロゲン酸のピークに基づいた計算で３０００以上とし、クロロゲン酸のピークと隣接する不純物のピークとの分離度が要求を満たすものとする。
【００３５】
測定法  本品を適量用意して精密に秤量し、移動相を加えて、１ｍｌ当たり約１０μｇ含有する溶液を作り、試験液とする。試験液を２０μｌ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録する。別途クロロゲン酸標準品を適量用意して精密に秤量し、移動相を加えて、１ｍｌ当たり１０μｇ含有する溶液を作り、同様の方法で測定する。外部標準法でピーク面積をもって計算する。
【００３６】
不純物の検出方法は以下の通りである。
【００３７】
本品を適量用意して精密に秤量し、移動相を加えて、１ｍｌ当たり０．５ｍｇ含有する溶液を作り、試験液とする。試験液を１ｍｌ用意して１００ｍｌメスフラスコに入れ、移動相を加えて目盛まで希釈し、希釈試験液とする。別途カフェ酸標準品を適量用意して精密に秤量し、移動相を加えて、１ｍｌ当たり２μｇ含有する溶液を作り、標準液とする。含有量測定項目におけるクロマトグラフィ条件に従い、希釈試験液を２０μｌ用意して液体クロマトグラフ装置に注入し、主成分のクロマトグラムピークのピーク高さがフルスケールの約２０％となるように検知感度を調節する。そして、試験液、希釈試験液及び標準液を各２０μｌ精密に秤取し、それぞれ液体クロマトグラフ装置に注入して、主成分のピーク保持時間の３倍までクロマトグラムを記録する。試験液のクロマトグラムにおいてカフェ酸不純物のピークが見られた場合は、外部標準法によって計算し、その他の不純物のピークが見られた場合は、自身対照法によって計算する。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製方法は、結晶後、再結晶工程を経て処理をする必要がなく、再結晶によるクロロゲン酸の損失を減らし、生成物の得率を高める。それとともに、再結晶工程を削減することで生産サイクルを短縮でき、実用性が高く、クロロゲン酸の大規模な生産調製に有利である。また、生成物の品質を制御しやすく、関連不純物はいずれも制御可能な範囲内にあり、含有量が０．１％以上の関連不純物は定性・定量分析が可能である。検出方法は、クロロゲン酸及び類似体に対する検知感度が高く、移動相は、関連物質の検知に対する明らかな干渉がない。また、理論段数が高く、分離度は良好で、主なピークの対称性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、原薬クロロゲン酸の水溶液と移動相溶液の紫外線スペクトル図である。
【図２】図２は、原薬クロロゲン酸の高温破壊ＤＡＤ三次元検出図である。
【図３】図３は、原薬クロロゲン酸の高温破壊ＨＰＬＣ図（２１５ｎｍ）である。
【図４】図４は、原薬クロロゲン酸の高温破壊の各ピークのＤＡＤ検出紫外線スペクトル図である。
【図５】図５は、原料クロロゲン酸のシステム適合クロマトグラムである。
【図６】図６は、クロロゲン酸検出限界図である。
【図７】図７は、クロロゲン酸定量限界図である。
【図８】図８は、システム適合性試験のＨＰＬＣ図である。
【図９】図９は、カフェ酸と試験品のアルカリ酸化破壊前後のＨＰＬＣ図である。
【図１０】図１０は、カフェ酸の定量限界図である。
【図１１】図１１は、カフェ酸の検出限界図である。
【図１２】図１２は、その他関連物質の検出クロマトグラムである。
【図１３】図１３は、実施例１の関連物質の検出クロマトグラムである。
【図１４】図１４は、実施例２の関連物質の検出クロマトグラムである。
【図１５】図１５は、実施例３の関連物質の検出クロマトグラムである。
【図１６】図１６は、実施例４有の関連物質の検出クロマトグラムである。
【図１７】図１７は、実施例５の関連物質の検出クロマトグラムである。
【図１８】図１８は、実施例６の関連物質の検出クロマトグラムである。
【図１９】図１９は、実施例７の関連物質の検出クロマトグラムである。
【図２０】図２０は、実施例８の関連物質の検出クロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
実施例１  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製
１.母液調製
杜仲葉抽出物（クロロゲン酸＝２０％）を１０ｋｇ用意し、５０Ｌになるまで水を加え、１０℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を４０ｍｇ／ｍｌの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でｐＨ値を１．０に調整した。
【００４１】
２.抽出
酢酸エチルを用いて８回抽出した。１回当たりの酢酸エチルの使用量は５００Ｌとし、毎回の抽出前の母液ｐＨ値を１．０に調整し、抽出温度は５℃とした。
【００４２】
３.脱色
合わせた抽出液に活性炭５ｋｇを加え、５０℃の条件下で２．０ｈ攪拌し脱色した。
【００４３】
４.濃縮
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、５０℃、真空度−０．０８ＭＰａの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約２０ｍｇ／ｍｌ（濃縮液の体積は約９０Ｌとした）となるよう制御した。
【００４４】
５.沈降
濃縮液を０℃の条件下で２４ｈ静置し、液温度を０℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
【００４５】
６.結晶
沈降後の濾液を７０℃まで加熱し、３．０ｈ攪拌し結晶させ、冷却水で１０℃まで冷却し、ろ過して３．３ｋｇの残渣を収集した。
【００４６】
７.粉砕
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル３０Ｌを加えて乳化機内で結晶体粒度が４００〜５００μｍになるまで乳化させ、ろ過して２．８ｋｇの残渣を収集した。
【００４７】
８.洗浄
粉砕した残渣を用意し、０℃の氷水２．８Ｌで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
【００４８】
９.乾燥
洗浄した残渣を、８０℃、真空度−０．０９ＭＰａの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を１２０メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
【００４９】
１０.生成物の特徴
（１）生成物重量：１．４０７ｋｇ
（２）含有量：９９．５６％（乾燥品で計算）
（３）関連物質：３−クマロイルキナ酸０．２３１％、カフェ酸０．０３８％
（４）クロロゲン酸移行率：７０．０４％
【００５０】
実施例２  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製
１.母液調製
杜仲葉抽出物（クロロゲン酸＝６０％）を１０ｋｇ用意し、１２．５Ｌになるまで水を加え、６０℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を４８０ｍｇ／ｍｌの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でｐＨ値を３．０に調整した。
【００５１】
２.抽出
酢酸エチルを用いて８回抽出した。１回当たりの酢酸エチルの使用量は１２５Ｌとし、毎回の抽出前の母液ｐＨ値を３．０に調整し、抽出温度は６０℃とした。
【００５２】
３.脱色
合わせた抽出液に活性炭５ｋｇを加え、７０℃の条件下で０．５ｈ攪拌し脱色した。
【００５３】
４.濃縮
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、７０℃、真空度−０．０６ＭＰａの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約５０ｍｇ／ｍｌ（濃縮液の体積は約１１０Ｌとした）となるよう制御した。
【００５４】
５.沈降
濃縮液を２５℃の条件下で１２ｈ静置し、液温度を２５℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
【００５５】
６.結晶
沈降後の濾液を７０℃まで加熱し、０．５ｈ攪拌し結晶させ、冷却水で４０℃まで冷却し、ろ過して９．３ｋｇの残渣を収集した。
【００５６】
７.粉砕
結晶しろ過された結晶体を用意し、水１０Ｌを加えて乳化機内で結晶体粒度が１００〜１５０μｍになるまで乳化させ、ろ過して６．４ｋｇの残渣を収集した。
【００５７】
８.洗浄
粉砕した残渣を用意し、０℃の氷水２０Ｌで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
【００５８】
９.乾燥
洗浄した残渣を、８０℃、真空度−０．０９ＭＰａの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を１２０メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
【００５９】
１０.生成物の特徴
（１）生成物重量：４．３２７ｋｇ
（２）含有量：９９．６９％（乾燥品で計算）
（３）関連物質：３−クマロイルキナ酸０．１２８％、カフェ酸０．０４０％、クリプトクロロゲン酸０．０１６％
（４）クロロゲン酸移行率：７１．８９％
【００６０】
実施例３  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製
１.母液調製
杜仲葉抽出物（クロロゲン酸＝４０％）を１０ｋｇ用意し、１５Ｌになるまで水を加え、２５℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を２６７ｍｇ／ｍｌの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でｐＨ値を１．０に調整した。
【００６１】
２.抽出
酢酸エチルを用いて３回抽出した。１回当たりの酢酸エチルの使用量は１５０Ｌとし、毎回の抽出前の母液ｐＨ値を１．０に調整し、抽出温度は２５℃とした。
【００６２】
３.脱色
合わせた抽出液に活性炭１ｋｇを加え、５０℃の条件下で２．０ｈ攪拌し脱色した。
【００６３】
４.濃縮
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、５０℃、真空度−０．０８ＭＰａの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約４０ｍｇ／ｍｌ（濃縮液の体積は約９０Ｌとした）となるよう制御した。
【００６４】
５.沈降
濃縮液を２５℃の条件下で１２ｈ静置し、液温度を２５℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
【００６５】
６.結晶
沈降後の濾液を５０℃まで加熱し、３．０ｈ攪拌し結晶させ、２５℃まで冷却し、ろ過して６．８ｋｇの残渣を収集した。
【００６６】
７.粉砕
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル２０Ｌを加えて乳化機内で結晶体粒度が３００〜４００μｍになるまで乳化させ、ろ過して５．２ｋｇの残渣を収集した。
【００６７】
８.洗浄
粉砕した残渣を用意し、２５℃の酢酸エチル５２Ｌで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
【００６８】
９.乾燥
洗浄した残渣を、７０℃、常圧の条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を２０メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
【００６９】
１０.生成物の特徴
（１）生成物重量：２．９９０ｋｇ
（２）含有量：９９．４７％（乾燥品で計算）
（３）関連物質：３−クマロイルキナ酸０．２１５％、ネオクロロゲン酸０．００９％、カフェ酸０．０４３％、クリプトクロロゲン酸０．０２２％
（４）クロロゲン酸移行率：７４．３５％
【００７０】
実施例４  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製
１.母液調製
杜仲葉抽出物（クロロゲン酸＝４０％）を１０ｋｇ用意し、２０Ｌになるまで水を加え、４０℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を２００ｍｇ／ｍｌの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でｐＨ値を３．０に調整した。
【００７１】
２.抽出
酢酸エチルを用いて８回抽出した。１回当たりの酢酸エチルの使用量は１００Ｌとし、毎回の抽出前の母液ｐＨ値を３．０に調整し、抽出温度は４０℃とした。
【００７２】
３.脱色
合わせた抽出液に活性炭３ｋｇを加え、６０℃の条件下で１．０ｈ攪拌し脱色した。
【００７３】
４.濃縮
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、６０℃、真空度−０．０６ＭＰａの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約５０ｍｇ／ｍｌ（濃縮液の体積は約７０Ｌとした）となるよう制御した。
【００７４】
５.沈降
濃縮液を２５℃の条件下で１２ｈ静置し、液温度を２５℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
【００７５】
６.結晶
沈降後の濾液を６０℃まで加熱し、０．５ｈ攪拌し結晶させ、２５℃まで冷却し、ろ過して６．３ｋｇの残渣を収集した。
【００７６】
７.粉砕
結晶しろ過された結晶体を用意し、研磨機内で結晶体粒度が５００μｍになるまで研磨した。
【００７７】
８.洗浄
研磨粉砕した材料を用意し、７０℃の酢酸エチル６３Ｌで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
【００７８】
９.乾燥
洗浄した残渣を、３０℃、真空度−０．０９ＭＰａの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を６０メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
【００７９】
１０.生成物の特徴
（１）生成物重量：２．８６１ｋｇ
（２）含有量：９８．９３％（乾燥品で計算）
（３）関連物質：３−クマロイルキナ酸０．３９５％、ネオクロロゲン酸０．０２０％、カフェ酸脱炭酸物０．０４０％、カフェ酸０．０２８％、クリプトクロロゲン酸０．０１７％、クロロゲン酸メチド０．０２９％
（４）クロロゲン酸移行率：７０．６９％
【００８０】
実施例５  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製
１.母液調製
杜仲葉抽出物（クロロゲン酸＝３０％）を１０ｋｇ用意し、３０Ｌになるまで水を加え、２５℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を１００ｍｇ／ｍｌの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でｐＨ値を１．０に調整した。
【００８１】
２.抽出
酢酸エチルを用いて６回抽出した。１回当たりの酢酸エチルの使用量は１５０Ｌとし、毎回の抽出前の母液ｐＨ値を１．０に調整し、抽出温度は２５℃とした。
【００８２】
３.脱色
合わせた抽出液に活性炭３ｋｇを加え、７０℃の条件下で１．０ｈ攪拌し脱色した。
【００８３】
４.濃縮
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、７０℃、真空度−０．０８ＭＰａの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約３０ｍｇ／ｍｌ（濃縮液の体積は約９０Ｌとした）となるよう制御した。
【００８４】
５.沈降
濃縮液を２５℃の条件下で２４ｈ静置し、液温度を２５℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
【００８５】
６.結晶
沈降後の濾液を７０℃まで加熱し、１．５ｈ攪拌し結晶させ、２５℃まで自然冷却し、ろ過して５．８ｋｇの残渣を収集した。
【００８６】
７.粉砕
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル混合液（酢酸エチル：水＝９９：１）１０Ｌを加えて、乳化機内で結晶体粒度が２００〜３００μｍになるまで乳化させ、ろ過して４．８ｋｇの残渣を収集した。
【００８７】
８.洗浄
粉砕した材料を用意し、２５℃の酢酸エチル混合液（酢酸エチル：水＝９９：１）４８Ｌで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
【００８８】
９.乾燥
洗浄した残渣を、６０℃、真空度−０．０９ＭＰａの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を６０メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
【００８９】
１０.生成物の特徴
（１）生成物重量：２．２０６ｋｇ
（２）含有量：９９．３４％（乾燥品で計算）
（３）関連物質：３−クマロイルキナ酸０．２１７％、ネオクロロゲン酸０．０３０％、カフェ酸脱炭酸物０．０５８％、カフェ酸０．０７４％
（４）クロロゲン酸移行率：７３．０５％
【００９０】
実施例６  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製
１.母液調製
杜仲葉抽出物（クロロゲン酸＝５０％）を１０ｋｇ用意し、２５Ｌになるまで水を加え、２５℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を２００ｍｇ／ｍｌの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でｐＨ値を２．０に調整した。
【００９１】
２.抽出
酢酸エチルを用いて４回抽出する。１回当たりの酢酸エチルの使用量は１５０Ｌとし、毎回の抽出前の母液ｐＨ値を２．０に調整し、抽出温度は２５℃とした。
【００９２】
３.脱色
合わせた抽出液に活性炭２ｋｇを加え、６０℃の条件下で１．０ｈ攪拌し脱色した。
【００９３】
４.濃縮
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、６０℃、真空度−０．０６ＭＰａの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約５０ｍｇ／ｍｌ（濃縮液の体積は約９０Ｌとした）となるよう制御した。
【００９４】
５.沈降
濃縮液を１５℃の条件下で２４ｈ静置し、液温度を１５℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
【００９５】
６.結晶
沈降後の濾液を６０℃まで加熱し、２．０ｈ攪拌し結晶させ、水で１０℃まで冷却し、ろ過して９．８ｋｇの残渣を収集した。
【００９６】
７.粉砕
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル混合液（酢酸エチル：水＝１：９９）１０Ｌを加えて、乳化機内で結晶体粒度が１００〜１５０μｍになるまで乳化させ、ろ過して８．２ｋｇの残渣を収集した。
【００９７】
８.洗浄
粉砕した材料を用意し、６０℃の酢酸エチル混合液（酢酸エチル：水＝１：９９）４８Ｌで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
【００９８】
９.乾燥
洗浄した残渣を、６０℃、真空度−０．０９ＭＰａの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を６０メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
【００９９】
１０.生成物の特徴
（１）生成物重量：３．５６３ｋｇ
（２）含有量：９９．６３％（乾燥品で計算）
（３）関連物質：３−クマロイルキナ酸０．０９６％、ネオクロロゲン酸０．０４３％、カフェ酸脱炭酸物０．０６２％、カフェ酸０．０４９％
（４）クロロゲン酸移行率：７１．００％
【０１００】
実施例７  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製
１.母液調製
杜仲葉抽出物（クロロゲン酸＝４０％）を１０ｋｇ用意し、２０Ｌになるまで水を加え、２５℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を２００ｍｇ／ｍｌの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でｐＨ値を２．０に調整した。
【０１０１】
２.抽出
酢酸エチルを用いて５回抽出した。１回当たりの酢酸エチルの使用量は１００Ｌとし、毎回の抽出前の母液ｐＨ値を２．０に調整し、抽出温度は２５℃とした。
【０１０２】
３.脱色
合わせた抽出液に活性炭３ｋｇを加え、５０℃の条件下で２．０ｈ攪拌し脱色した。
【０１０３】
４.濃縮
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、５０℃、真空度−０．０８ＭＰａの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約４０ｍｇ／ｍｌ（濃縮液の体積は約９０Ｌとした）となるよう制御した。
【０１０４】
５.沈降
濃縮液を２５℃の条件下で１２ｈ静置し、液温度を２５℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
【０１０５】
６.結晶
沈降後の濾液を７０℃まで加熱し、１．０ｈ攪拌し結晶させ、水で２５℃まで冷却し、ろ過して７．２ｋｇの残渣を収集した。
【０１０６】
７.粉砕
結晶しろ過された結晶体を用意し、水１０Ｌを加えて、乳化機内で結晶体粒度が１００〜１５０μｍになるまで乳化させ、ろ過して５．４ｋｇの残渣を収集した。
【０１０７】
８.洗浄
粉砕した材料を用意し、５℃の酢酸エチル５５Ｌで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
【０１０８】
９.乾燥
洗浄した残渣を、６０℃、真空度−０．０８ＭＰａの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を６０メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
【０１０９】
１０.生成物の特徴
（１）生成物重量：２．８１１ｋｇ
（２）含有量：９９．５２％（乾燥品で計算）
（３）関連物質：３−クマロイルキナ酸０．２３９％、カフェ酸０．０４０％
（４）クロロゲン酸移行率：６９．９４％
【０１１０】
実施例８  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製
１.母液調製
杜仲葉抽出物（クロロゲン酸＝４０％）を１０ｋｇ用意し、１６．７Ｌになるまで水を加え、２５℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を２４０ｍｇ／ｍｌの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でｐＨ値を１．０に調整した。
【０１１１】
２.抽出
酢酸エチルを用いて５回抽出した。１回当たりの酢酸エチルの使用量は１３４Ｌとし、毎回の抽出前の母液ｐＨ値を１．０に調整し、抽出温度は２５℃とした。
【０１１２】
３.脱色
合併した抽出液に活性炭２ｋｇを加え、６０℃の条件下で１．０ｈ攪拌し脱色した。
【０１１３】
４.濃縮
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、６０℃、真空度−０．０８ＭＰａの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約４０ｍｇ／ｍｌ（濃縮液の体積は約９０Ｌとした）となるよう制御する。
【０１１４】
５.沈降
濃縮液を２５℃の条件下で１２ｈ静置し、液温度を２５℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
【０１１５】
６.結晶
沈降後の濾液を７０℃まで加熱し、１．０ｈ攪拌し結晶させ、水で２５℃まで冷却し、ろ過して６．９ｋｇの残渣を収集した。
【０１１６】
７.粉砕
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル１０Ｌを加えて、乳化機内で結晶体粒度が２００〜３００μｍになるまで乳化させ、ろ過して５．８ｋｇの残渣を収集した。
【０１１７】
８.洗浄
粉砕した材料を用意し、５℃の水１７．４Ｌで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
【０１１８】
９.乾燥
洗浄した残渣を、６０℃、真空度−０．０８ＭＰａの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を６０メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
【０１１９】
１０.生成物の特徴
（１）生成物重量：３．２０４ｋｇ
（２）含有量：９９．７８％（乾燥品で計算）
（３）関連物質：３−クマロイルキナ酸０．１６５％
（４）クロロゲン酸移行率：７９．９２％
【０１２０】
実施例９  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸中の不純物の含有量範囲の実験根拠
ＨＰＬＣ法とＬＣ−ＭＳ法を用いて、原薬クロロゲン酸中に存在する関連物質について分離及び同定を行い、キナ酸、カフェ酸、ネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、３−クマロイルキナ酸、カフェ酸脱炭酸物及びクロロゲン酸メチド等、計７つの主要な関連物質を分離し同定した。
【０１２１】
【表１】
0006379286.tif 000002
【０１２２】
キナ酸には法定の標準品があり、ＨＰＬＣ標準品法を用いてキナ酸の分離検出条件、方法論及び含有量について予備研究を行った。その結果、原薬クロロゲン酸からはキナ酸は検出されなかったため、更なる研究と標準品の使用は行っていない。また、カフェ酸には法定の標準品があり、ＨＰＬＣ標準品法を用いてカフェ酸の分離検出条件と方法論について研究を行った。その結果、確立された検出条件と方法は、原薬クロロゲン酸中のカフェ酸の検査に適することが証明された。その他関連物質には法定の標準品はなく、いずれもクロロゲン酸の類似体であり、応答値がクロロゲン酸に近いため、ＨＰＬＣ自身対照法を用いてその他関連物質の分離検出条件と方法論について研究を行った。その結果、確立された検出条件と検出方法は、原薬クロロゲン酸中のその他関連物質の検査に適することが証明された。３グループの小サンプル（０８０８０１、０８０８０２、０８０８０３）及び３グループの中サンプル（０９０１０１、０９０１０２、０９０１０３）の関連物質検査結果と、３グループの中サンプル（１００１０１、１００１０２、１００１０３）の４８カ月の長期安定性実験における関連物質の検査結果は、表２、表３を参照。
【０１２３】
【表２】
0006379286.tif 000003
【０１２４】
【表３】
0006379286.tif 000004
【０１２５】
６グループのサンプル中のカフェ酸含有量は０．０７６〜０．０９２％、その他関連物質の合計含有量は０．４７９〜０．５１１％、その他関連物質の単独の含有量は０．０４５〜０．２２６％であった。また、４８カ月長期安定性実験における関連物質の検査結果では、カフェ酸含有量は０．１４９〜０．１６１％、その他関連物質の合計含有量は０．７７０〜０．７８７％、その他関連物質の単独の含有量は０．０９１〜０．３０９％であった。関連文献の報告では、マウスにＬＤ５０が１５８３ｍｇ／ｋｇのカフェ酸を腹腔注射し、ウサギに１４ｍｇ／ｋｇ／日のカフェ酸静脈注射を１０日間続けたところ、それらの心臓、肝臓、腎臓の機能及び解剖顕微鏡による検査では、ともに病理変化が見られなかった。これは、カフェ酸の安全性が比較的高いことを示しており、生産及び貯蔵の過程での影響因子の変動を考慮して、カフェ酸の含有量を０．４０％以下とした。また、その他関連物質は主にクロロゲン酸の異性体及びその類似体であり、生産及び貯蔵の過程での影響因子の変動を考慮して、その他の関連物質の単独の含有量を０．５０％以下、合計で１．５％以下とした。
実施例１０  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸中のクロロゲン酸の検出方法の試験
１）検出波長の選択
移動相溶液（アセトニトリル−０．１％ギ酸  ８：９２）及び水溶液におけるクロロゲン酸の紫外線スペクトルの特徴はほぼ一致しており、２１５ｎｍ及び３２３ｎｍの波長付近でいずれも最大吸收が見られた。また、原薬クロロゲン酸の高温破壊サンプルのＬＣ−ＤＡＤ三次元検出図では、クロロゲン酸及び検出された関連物質は波長２１５ｎｍと３２３ｎｍ付近でいずれも最大吸收が見られた。そのうち、３２３ｎｍの波長ではクロロゲン酸及びその類似体の検出感度が高かったが、２１５ｎｍの波長ではクロロゲン酸及びその類似体を検出できたうえ、さらに末端基のみが紫外線を吸収する不純物の検出に有利であった。３２３ｎｍの波長では、移動相の関連物質検出に対する目立った干渉は見られず、２１５ｎｍの波長では、溶剤のピークが比較的明らかでありながら、溶剤のピーク付近の関連物質検出に対して目立った干渉が見られなかった。従って、原薬クロロゲン酸の品質コントロールにおいて、２１５ｎｍの波長をクロロゲン酸関連物質検査の検出波長とした。スペクトル図及びクロマトグラムは図１〜４を参照。
【０１２６】
２）分離条件の選択
（ア）移動相の選択  異なる有機相（アセトニトリル、メタノール）、異なる酸により組成された移動相がクロロゲン酸及びその関連物質を分離するクロマトグラフィ動作について、それぞれ考察し、成分中の分離困難なペア（クロロゲン酸とカフェ酸）の分離度と分析時間を評価指標として、異なる移動相の分離効果について評価を行った。
【０１２７】
本品を約２５ｍｇ用意し、水５０ｍｌを加えて溶解させ、０．５ｍｇ／ｍｌ相当の溶液を作って試験液とした。
【０１２８】
異なる有機相の評価  下表に従って異なる有機相を含む移動相を調合し、ＯＤＳ  １５０ｍｍ×４．６ｍｍをクロマトグラフィカラムとし、検出波長２１５ｎｍ、流速１ｍｌ／ｍｉｎとした。試験液２０μｌを用意してクロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録した。結果は表４を参照。
【０１２９】
【表４】
0006379286.tif 000005
【０１３０】
この結果は、有機相の比率が同じ場合、メタノール系の分離度はアセトニトリル系の分離度より高いものの、メタノール系が費やした分析時間は長く、カラム効率はアセトニトリル系に劣ること、また、総合的な判断では、アセトニトリル系はメタノール系よりも優れ、アセトニトリル−０．１％ギ酸の比率が８：９２の場合、クロロゲン酸との分離が難しいカフェ酸の分離度はかなり理想的であることを示している。よって、実験では移動相としてアセトニトリル−０．１％ギ酸（８：９２）を選択した。
【０１３１】
異なる酸の評価  クロロゲン酸とその類似体が弱酸性であるという特徴から、移動相に適量の酸を加え、酸によりクロマトグラムのピークのテーリングを抑制してクロマトグラムの対称性を高めることとした。一般的なギ酸、酢酸及びリン酸を選択し、これらがクロロゲン酸及びその関連物質の分離に与える影響をそれぞれ考察した。ピーク対称性、分離度、分析時間等の要素を総合評価の指標とし、酸の種類をスクリーニングした。結果は表５を参照。
【０１３２】
【表５】
0006379286.tif 000006
【０１３３】
この結果は以下のことを示している。すなわち、リン酸溶液で水相を作った場合、主ピークの対称性は良好であったが、分離度は劣っていた。酢酸溶液で水相を作った場合、分離度は良好であったが、主ピークの対称性は劣っていた。ギ酸溶液で水相を作った場合、分離度は良好で、主ピークの対称性も良好であった。よって、０．１％ギ酸溶液で移動相の水相を作ることとした。
【０１３４】
総合評価を行った後、移動相を０．１％ギ酸−アセトニトリル（９２：８）とすることとした。
【０１３５】
（イ）クロマトグラフィカラムの選択：クロロゲン酸の主ピークのカラム効率、クロロゲン酸とカフェ酸の分離度を指標として評価を行い、ＡｉｃｈｒｏｍＢｏｎｄ−ＡＱ、Ｚｉｒｃｈｒｏｍ、Ｋｒｏｍａｓｉｌ、Ｇｅｍｉｎｉ等、異なるメーカーのＣ１８カラムのクロマトグラフィ動作について考察した。データは表６を参照。
【０１３６】
【表６】
0006379286.tif 000007
【０１３７】
この結果は、クロロゲン酸の主ピークのカラム効率が３０００以上となる場合、異なるＣ１８カラムはいずれも本品中の分離困難な成分であるクロロゲン酸とカフェ酸を良好に分離し、分離度はいずれも２を上回ったことを示している。よってＣ１８カラムを関連物質検出のカラムに選定した。
【０１３８】
以上から、関連物質はＨＰＬＣ法によって検出し、クロマトグラフィ条件は、オクタデシル基結合シリカを填充剤とし、０．１％ギ酸−アセトニトリル（９２：８）を移動相とし、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長は２１５ｎｍ、理論段数はクロロゲン酸のピークに基づいた計算で３０００を上回り、クロロゲン酸の主成分ピークとカフェ酸不純物ピークの分離度は１．５を上回る、と確認した。図５を参照。
【０１３９】
含有量測定方法論の考察
1クロマトグラフィ条件の選択とシステム適合性試験
クロロゲン酸関連物質の研究において決定した検出波長、移動相、カラムは、本品と関連物質を完全に分離することができ、且つ理論段数はクロロゲン酸のピークに基づいた計算で３０００を上回り、クロロゲン酸含有量の測定要求を満たす。よって２１５ｎｍを検出波長とし、オクタデシル基結合シリカを填充剤とし、０．１％ギ酸−アセトニトリル（９２：８）を移動相とすることとして、含有量の測定と研究を進めた。
【０１４０】
２測定方法
試験液の調製：原薬クロロゲン酸を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて溶解させ、希釈して１ｍｌ当たり約１０μｇ含有する溶液を作り、試験液とした。
【０１４１】
標準液の調製：クロロゲン酸標準品を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて１ｍｌ当たり約１０μｇ含有する溶液を作って、標準液とした。
【０１４２】
試験液と標準液を１０μｌずつ精密に秤取し、それぞれ液体クロマトグラフ装置に注入して、クロマトグラムを記録した。外部標準法によってクロロゲン酸の含有量を計算した。
【０１４３】
３直線性
クロロゲン酸標準品を約１２ｍｇ用意し、精密に秤量し、移動相を加え、溶解させて希釈し、１２５、７５、５０、２５、１２．５、２．５０、０．２５μｇ／ｍｌの一連の溶液を作った。一連の溶液を１０μｌずつ精密に秤取し、それぞれ液体クロマトグラフ装置に注入して、クロマトグラムを記録した。クロロゲン酸ピーク面積を縦軸に、対応する濃度を横軸とし、線形回帰を行って、線形方程式を得た。結果は表７を参照。
【０１４４】
【表７】
0006379286.tif 000008
【０１４５】
その結果、クロロゲン酸の濃度が０．２５〜１２５μｇ／ｍｌの範囲内であるとき、良好な線形関係をみせ、相関係数は０．９９９４であった。
【０１４６】
４検出限界と定量限界
直線性の研究における低濃度溶液（０．２５μｇ／ｍｌ）を用意し、徐々に希釈して投入した。信号雑音比法によって、Ｓ／Ｎ≧３で測定されたクロロゲン酸検出量は０．６２５ｎｇであり、Ｓ／Ｎ≧１０で測定されたクロロゲン酸検出量は２．５ｎｇであった。よって、クロロゲン酸の検出限界は０．６２５ｎｇ、定量限界は２．５ｎｇと確認した。クロマトグラムは図６、７を参照。
【０１４７】
５サンプル投入回収実験
本品を適量用意し、移動相を加えて溶解させ、希釈して、１ｍｌ当たり約７８．００μｇのクロロゲン酸を含有するストック溶液を作った。９つの１０ｍｌメスフラスコにストック溶液を１．０ｍｌずつ取って、低、中、高の３グループに分け、それぞれに濃度が５０μｇ／ｍｌ、６２．５μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌのクロロゲン酸標準液を１．０ｍｌ投入し、移動相を加え、目盛まで希釈して試験液とした。この試験液を１０μｌずつ精密に秤取し、それぞれ液体クロマトグラフ装置に注入して、クロマトグラムを記録し、以下の式でサンプル投入回収率を計算した。結果は表８を参照。
【０１４８】
【数１】
0006379286.tif 000009
【０１４９】
【表８】
0006379286.tif 000010
【０１５０】
この結果は、本方法によるサンプル投入回収率の平均値が１００．９％、ＲＳＤが０．８８％であることを示しており、この方法による測定結果の真度が優れていることを表している。
【０１５１】
６再現性
本品を適量用意し、精密に秤量して移動相を加え、低、中、高（約１０、１２、１５μｇ／ｍｌ）の３種類の濃度の試験液をそれぞれ３つずつ作った。試験液と標準液（１２．５μｇ／ｍｌ）をそれぞれ１０μｌずつ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録して、各グループの含有量の相対標準偏差（ＲＳＤ％）を計算した。結果は表９を参照。
【０１５２】
【表９】
0006379286.tif 000011
【０１５３】
測定結果の平均値は９９．４９％、ＲＳＤは０．２７％であり、この方法による再現性は良好であることを示している。
【０１５４】
７範囲
上記再現性の実験結果から、本品の３つの濃度勾配の精度はいずれも良好であり、試験液の濃度が９．６〜１４．４μｇ／ｍｌの間で、所定の方法で測定した場合、検出結果はいずれも良好な精度に達することができる、ということがわかった。
【０１５５】
８中間精度
異なる時間、異なる人員、異なる設備の条件のもとで中間精度の実験を行った。本品を適量用意し、精密に秤量して移動相を加え、低、中、高の３種類の濃度の試験液（計１８のサンプル）を作った。各試験液を１０μｌずつ精密に秤取して、液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録した。低、中、高濃度それぞれのグループの含有量の相対標準偏差（ＲＳＤ％）と総相対標準偏差（ＲＳＤ％）を計算した。結果は表１０を参照。
【０１５６】
【表１０】
0006379286.tif 000012
【０１５７】
含有量の平均値は９９．５９％、総平均相対標準偏差は０．４３％であり、異なる時間、異なる人員、異なる設備条件における本品の検出結果の中間精度は良好であることを示している。
【０１５８】
９溶液の安定性実験
同一の試験液を用意し、一定の時間を空けてそれぞれサンプル投入し、ピーク面積を記録した。測定結果は表１１を参照。ＲＳＤ＝２．３０％は、被測定溶液が２４時間以内で安定していることを示している。
【０１５９】
【表１１】
0006379286.tif 000013
【０１６０】
１０耐久性
中国薬典２０００年版二部付録ＸＩＸ  Ａ「薬品品質標準分析法の検証」の要求に従って、カラムのメーカーとロット番号、移動相の組成、カラム温度、波長等が変化する条件での、測定方法に対する影響を考察した。
【０１６１】
（１）異なるメーカーのクロマトグラフィカラム
上記試験液について、同一タイプでメーカーが異なるカラムを用いて、それぞれ含有量を測定した。結果は表１２を参照。異なるメーカーのＣ１８カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）を用いて測定したところ、保持時間ではわずかに差が見られたが、理論段数はいずれも要求を満たしており、含有量の結果には明らかな差がなかったことを示している。
【０１６２】
【表１２】
0006379286.tif 000014
【０１６３】
（２）比率の異なる移動相
上記試験液について、比率の異なる移動相でそれぞれ含有量を測定した。結果は表１３を参照。比率の異なる移動相という条件において、理論段数はいずれも要求を満たし、含有量の結果に明らかな差はなかったことを示している。よって、移動相の比率の微小な変化が含有量の測定に及ぼす影響は大きくない。
【０１６４】
【表１３】
0006379286.tif 000015
【０１６５】
（３）異なるカラム温度
上記試験液について、異なるカラム温度でそれぞれ含有量を測定した。結果は表１４を参照。異なるカラム温度という条件において、理論段数はいずれも要求を満たし、含有量の結果に明らかな差はなかったことを示している。従って、カラム温度が含有量の測定に与える影響は大きくない。
【０１６６】
【表１４】
0006379286.tif 000016
【０１６７】
（４）異なる検出波長
上記試験液について、２１５ｎｍと３２３ｎｍの波長でそれぞれ含有量を測定した。結果は表１５を参照。２つの検出波長という条件下で、理論段数はいずれも要求を満たし、含有量の結果に明らかな差は見られない。
【０１６８】
【表１５】
0006379286.tif 000017
【０１６９】
上記をまとめると、この方法はシステム適合性、特異性、直線性、真度、精度、耐久性において方法論のバリデーション要求に合致しており、本方法でのクロロゲン酸含有量測定は正確であり、実行可能であることを示している。
１１サンプルの含有量測定結果
上記方法により、実施例の各サンプルについて、それぞれクロロゲン酸の含有量を測定した。結果は表１６を参照。
【０１７０】
【表１６】
0006379286.tif 000018
【０１７１】
実施例１１  本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸中の関連物質の分離及び同定  
本品の関連物質を詳細に知り、研究するため、上記のクロマトグラフィ条件で原薬クロロゲン酸の関連物質について分離及び同定を行った。
【０１７２】
（１）カフェ酸の検査
１）機器と試薬
ＬＣ−６Ａ高速液体クロマトグラフ装置、ＳＰＤ−１０Ａｖｐ紫外可視検出器、Ｎ２０００クロマトグラフィワークステーション。
【０１７３】
カラム：Ａｉｃｈｒｏｍ  Ｂｏｎｄ  ＡＱ、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）。
【０１７４】
標準品：カフェ酸標準品（ロット番号１１４９３００５０）。
【０１７５】
試剤：アセトニトリルはクロマトグラフィグレード、ギ酸は分析グレードとし、水は自製した再蒸留水とした。
【０１７６】
２）クロマトグラフィ条件及びシステム適合性の実験
カフェ酸は、上記で決定した関連物質の分離と検出の条件において、保持時間が適度で、隣接する成分（クロロゲン酸）とは完全に分離されており、カフェ酸の定量測定の要求を満たすことができた。よって上記決定された関連物質の分離及び検出の条件を、カフェ酸検査のクロマトグラフィ条件とした。
【０１７７】
クロマトグラフィ条件及びシステム適合性：オクタデシル基結合シリカカラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）をクロマトグラフィカラムとし、０．１％ギ酸−アセトニトリル（９２：８）を移動相とし、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、理論段数はカフェ酸のピークに基づいた計算で３０００を上回り、検出波長は２１５ｎｍ、クロロゲン酸の主成分のピークとカフェ酸不純物のピークとの分離度は１．５を上回った。システム適合性試験のグラフは図８を参照。図８から、移動相は測定結果に干渉せず、クロロゲン酸とカフェ酸の分離度は１．５を上回り、相対保持時間０．３５までは溶剤ピークとシステムピークであることがわかる。よってこのクロマトグラフィ条件はカフェ酸の検査に適する。
【０１７８】
３）標準液の調製
カフェ酸標準品を精密に適量秤取し、移動相を加えて１ｍｌ当たり２μｇ含有する溶液になるよう定量に希釈し、標準液とした。
【０１７９】
４）試験液の調製
本品を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて１ｍｌ当たり０．５ｍｇ含有する溶液を作り、試験液とした。
【０１８０】
５）測定法
標準液と試験液をそれぞれ２０μｌずつ精密に吸い取って、液体クロマトグラフ装置に注入し、ピーク面積を測定して、外部標準法で計算した。
【０１８１】
６）方法論の考察
（ア）特異性の考察
上記決定したクロマトグラフィ条件が本品の関連物質を効果的に検出できるか考察し、この検査方法の特異性を検証した。そのため、原薬に対して強制破壊実験を行い、原薬の分解生成物について考察した。
【０１８２】
破壊実験  原薬水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ用意し、３０％の過酸化水素溶液を３ｍｌ、０．０１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液０．１ｍｌを加え、７０℃で３０ｍｉｎ水浴加熱し、試験液（破壊後）とした。別途原薬水溶液を用意して水を加え、０．２５ｍｇ／ｍｌの溶液に希釈し、希釈試験液（破壊前）とした。試験液と希釈試験液をそれぞれ２０μｌずつ精密に秤取して、液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録した。その結果、クロロゲン酸の主なピークと各不純物のピークはいずれも有効に分離され、各不純物のピークは互いにほぼ分離した。カフェ酸のピークは著しく高くなり、ネオクロロゲン酸のピークは明らかに高くなり、これはこのクロマトグラフィ条件が原薬のアルカリ酸化破壊後の関連物質を十分に分離検出でき、良好な特異性を有することを示している。クロマトグラムは図９を参照。
【０１８３】
上記実験結果はこのクロマトグラフィ条件が良好な特異性を有することを示している。
【０１８４】
（イ）直線性
カフェ酸標準品を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて１ｍｌ当たり０．０１ｍｇ含有するストック溶液を作った。ストック溶液をそれぞれ適量用意して、移動相を用いて希釈し、濃度が４．０、３．０、２．０、１．０、０．５、０．０５μｇ／ｍｌの一連の溶液を作った。上記溶液を２０μｌずつ精密に秤取して、液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録した。カフェ酸のピーク面積を縦軸に、濃度を横軸とし、回帰を行って線形方程式を得た。結果は表１７を参照。
【０１８５】
【表１７】
0006379286.tif 000019
【０１８６】
この結果は、カフェ酸は濃度０．０５〜４．０μｇ／ｍｌの範囲において良好な直線性関係を示し、相関係数は０．９９９６であることを表している。
【０１８７】
（ウ）検出限界と定量限界
直線性の研究における低濃度溶液（０．０５μｇ／ｍｌ）を用意し、徐々に希釈して投入した。信号雑音比法によって、Ｓ／Ｎ≧３のとき、カフェ酸の検出限界であると確認し、０．３ｎｇであった。Ｓ／Ｎ≧１０のとき、カフェ酸の定量限界であると確認し、１ｎｇであった。クロマトグラムは図１０、１１を参照。
【０１８８】
（エ）サンプル投入回収実験
原薬クロロゲン酸（０．０９％のカフェ酸を含む）を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて１ｍｌ当たり約５００μｇのクロロゲン酸を含有するストック溶液を作った。ストック溶液を１．０ｍｌ取って９つの１０ｍｌメスフラスコに入れ、２、４、６μｇ／ｍｌのカフェ酸標準液１．０ｍｌをそれぞれ添加し、移動相を加えて目盛まで希釈し、試験液とした。別途、直線性の研究項におけるカフェ酸標準液（０．５μｇ／ｍｌ）を用意し、標準液とした。標準液と試験液をそれぞれ２０μｌずつ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録した。標準曲線の方程式により測定量を計算し、さらに回収率を計算した。結果は表１８を参照。
【０１８９】
【表１８】
0006379286.tif 000020
【０１９０】
この結果は、本方法のサンプル投入回収率の平均値が１０１．１％で、ＲＳＤが０．５７％であることを示しており、この方法による測定結果の真度が優れていることを表している。
【０１９１】
（オ）再現性
原薬クロロゲン酸を約０．３５、０．５０、０．６５ｇ、それぞれ３部ずつ用意し、精密に秤量して、１００ｍｌメスフラスコに入れ、移動相を加えて溶解させ、目盛まで希釈し、さらに１ｍｌを精密に秤取して１０ｍｌフラスコに入れ、移動相で目盛まで希釈して試験液とした。別途適量のカフェ酸標準品を用意し、精密に秤量し、移動相を加えて１ｍｌ当たり０．５μｇ含有する溶液を作って標準液とした。試験液と標準液をそれぞれ２０μｌずつ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラフィのピーク面積を記録して、外部標準法で含有量及び相対標準偏差（ＲＳＤ％）を計算した。結果は表１９を参照。
【０１９２】
【表１９】
0006379286.tif 000021
【０１９３】
測定結果の総相対標準偏差は０．７７％であり、カフェ酸の検出結果の再現性が比較的良好であることを示している。
【０１９４】
（カ）範囲
上記再現性の実験結果から、本品の３つの濃度勾配の精度はいずれも良好であり、試験液中のカフェ酸濃度が０．３２〜０．６１μｇ／ｍｌの間で、所定の方法で測定した場合、検出結果はいずれも良好な精度に達することができる、ということがわかる。
【０１９５】
（キ）中間精度の実験
再現性の項に従って、低、中、高の試験液を調合した。別途カフェ酸標準品を適量用意し、移動相を加えてカフェ酸を０．５μｇ／ｍｌの割合で含有する溶液を作り、標準液とした。カフェ酸クロマトグラフィ条件に照らし、異なる人員、異なる時間、異なるクロマトグラフ装置で検出を行い、クロマトグラフィのピーク面積を記録した。１点法によって測定量を計算し、さらに相対標準偏差ＲＳＤを計算した。結果は表２０を参照。
【０１９６】
【表２０】
0006379286.tif 000022
【０１９７】
測定結果の平均含有量は０．０９３％、総相対標準偏差は０．８０％であり、この方法の中間精度が良好であることを示している。
【０１９８】
（ク）耐久性
中国薬典２０００年版二部付録ＸＩＸ  Ａ「薬品品質標準分析法の検証」の要求に従って、カラムのメーカーとロット番号、移動相の組成、カラム温度等が変化する条件での、検出方法に対する影響を考察した。
【０１９９】
異なるメーカーのクロマトグラフィカラム  同一の試験液を、同一タイプでメーカーの異なるカラムを用いて、それぞれ含有量を測定した。結果は表２１を参照。
【０２００】
【表２１】
0006379286.tif 000023
【０２０１】
異なるメーカーのＣ１８カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）を用いて測定したところ、保持時間ではわずかに差が見られたが、分離度、理論段数はいずれも要求を満たしており、測定されたカフェ酸含有量には明らかな差がなかったことを示している。
【０２０２】
比率の異なる移動相  上記の試験液について、比率の異なる移動相でそれぞれ含有量を測定した。結果は表２２を参照。
【０２０３】
【表２２】
0006379286.tif 000024
【０２０４】
この結果は、比率の異なる移動相という条件において、分離度、理論段数はいずれも要求を満たし、測定されたカフェ酸含有量には明らかな差はなかったことを示している。よって、移動相の比率の微小な変化が含有量の測定に及ぼす影響は大きくない。
【０２０５】
異なるカラム温度  上記試験液について、異なるカラム温度でそれぞれ含有量を測定した。結果は表２３を参照。異なるカラム温度という条件において、理論段数はいずれも要求を満たし、含有量の結果に明らかな差はなかったことを示している。従って、カラム温度がカフェ酸の測定に与える影響は大きくないこと示している。
【０２０６】
【表２３】
0006379286.tif 000025
【０２０７】
上記をまとめると、この方法はシステム適合性、特異性、直線性、真度、精度、耐久性において方法論のバリデーション要求に合致しており、本方法でのカフェ酸含有量測定は正確であり、実行可能であることを示している。
【０２０８】
７）検出と結果
上記検査方法により、試験品についてカフェ酸の検査を行った。結果は表２４を参照。
【０２０９】
【表２４】
0006379286.tif 000026
【０２１０】
（３）その他関連物質の検査
原薬クロロゲン酸中のその他関連物質は、ネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、３−クマロイルキナ酸、クロロゲン酸メチド及びその他同定されていない関連物質を含み、これら関連物質には法定の標準品がないため、いずれもクロロゲン酸主成分自身対照法で研究を行った。
【０２１１】
１）機器と試薬
ＬＣ−６Ａ高速液体クロマトグラフ装置、ＳＰＤ−１０Ａｖｐ紫外可視検出器、Ｎ２０００クロマトグラフィワークステーション。
【０２１２】
カラム：Ａｉｃｈｒｏｍ  Ｂｏｎｄ  ＡＱカラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）
試剤：アセトニトリルはクロマトグラフィグレード、ギ酸は分析グレードとし、水は自製した再蒸留水とした。
【０２１３】
２）クロマトグラフィ条件及びシステム適合性実験
カフェ酸のクロマトグラフィ条件及びシステム適合性試験は、その他関連物質を十分に分離し検出することができるため、その他関連物質の検出条件をカフェ酸と一致させることとした。
【０２１４】
３）試験液の調製
原薬クロロゲン酸を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて１ｍｌ当たり０．５ｍｇ含有する溶液を作って試験液とした。
【０２１５】
４）希釈試験液の調製
試験液を１．０ｍｌ精密に秤取して１００ｍｌメスフラスコに入れ、移動相を加えて目盛まで希釈し、希釈試験液とした。
【０２１６】
５）測定法
希釈試験液を２０μｌ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロロゲン酸主成分のピークがフルスケールの１０〜２０％となるように検出器の感度を調節した。そして上記試験液と希釈試験液を２０μｌずつ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロロゲン酸のピーク保持時間の３倍以上までクロマトグラムを記録した。試験液のクロマトグラムにおいてカフェ酸以外のその他不純物のピークが見られた場合は、その他各不純物のピーク面積と希釈試験液の主ピーク面積の比を計算し、その他関連物質の含有量を得て、その他関連物質の合計を計算した。
【０２１７】
６）方法論の考察
（ア）特異性の考察  カフェ酸の特異性考察の結果と同じ。
【０２１８】
（イ）検出限界
原薬クロロゲン酸を適量用意し、移動相を加えて１ｍｌ当たり１ｍｇ含有する溶液を作って試験液とした。試験液を徐々に希釈して投入し、クロマトグラムを記録した。ピーク面積が最小の関連物質を考察対象とし、信号雑音比（Ｓ／Ｎ）≧３のときにサンプルを注入した濃度を、その他関連物質の検出限界とした。
【０２１９】
この結果は、サンプル中のその他関連物質の検出限界は、試験液の濃度により０．１２５ｍｇ／ｍｌと計算されることを示している。原料クロロゲン酸中のその他関連物質を十分に検出するため、試験液の濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとした。クロマトグラムは図１２を参照。
【０２２０】
７）検出結果
上記関連物質の検出方法に基づいて、実施例における各生成物について、それぞれ関連物質の検出を行った。結果は表２５、図１３〜図２０を参照。
【０２２１】
【表２５】
0006379286.tif 000027
【図１】
0006379286.tif 000028
【図２】
0006379286.tif 000029
【図３】
0006379286.tif 000030
【図４】
0006379286.tif 000031
【図５】
0006379286.tif 000032
【図６】
0006379286.tif 000033
【図７】
0006379286.tif 000034
【図８】
0006379286.tif 000035
【図９】
0006379286.tif 000036
【図１０】
0006379286.tif 000037
【図１１】
0006379286.tif 000038
【図１２】
0006379286.tif 000039
【図１３】
0006379286.tif 000040
【図１４】
0006379286.tif 000041
【図１５】
0006379286.tif 000042
【図１６】
0006379286.tif 000043
【図１７】
0006379286.tif 000044
【図１８】
0006379286.tif 000045
【図１９】
0006379286.tif 000046
【図２０】
0006379286.tif 000047