(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（３）に示す工程を含む、結核菌のリファンピシリン耐性の検出方法。
（１）試料中の結核菌に由来する核酸と、以下の（Ａ）および（Ｂ）に記載の核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（Ａ）配列番号１および２で示された、グアニンに近接すると消光する蛍光色素で標識された２本の核酸プローブ
（Ｂ）配列番号３で示された１本の無標識核酸プローブ
（２）工程（１）で得られた複合体を検出する工程
（３）工程（２）で測定または検出されるデータを解析することで結核菌のリファンピシリン耐性を判別する工程
【請求項２】
以下の（１）から（３）に示す工程を含む、結核菌のリファンピシリン耐性の検出方法。
（１）試料中の結核菌に由来する核酸と、以下の（Ａ）および（Ｂ）に記載の核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（Ａ）配列番号４および５で示された、グアニンに近接すると消光する蛍光色素で標識された２本の核酸プローブ
（Ｂ）配列番号６から９のうちいずれかで示された１本の無標識核酸プローブ
（２）工程（１）で得られた複合体を検出する工程
（３）工程（２）で測定または検出されるデータを解析することで結核菌のリファンピシリン耐性を判別する工程
【請求項３】
請求項１または２に記載のリファンピシリン耐性結核菌の検出方法であって、検出対象が、ｒｐｏＢ遺伝子におけるコドン５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５２０、５２１、５２２、５２３、５２６、５２７、５２９、５３１および５３３からなる群のうちいずれか１以上に生じる塩基変異である、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、確実かつ簡便な結核菌のリファンピシリン耐性遺伝子変異の検出のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸菌属は抗酸性の性質をもつグラム陽性桿菌であり、結核菌やらい菌など、重篤な病変を引き起こす病原菌が多い。中でもヒト型結核菌はヒトに結核を起こす病原体であり、その検査は臨床上、極めて重要である。ヒト型結核菌が起因となる病変には肺結核が圧倒的に多いが、ほとんど全ての臓器に結核性病変を起こし、結核性胸膜炎、結核性髄膜炎、カリエス、腸結核、腎結核、関節結核などを起こす。感染源は患者であり、飛沫感染などによって経気道的に感染する。
【０００３】
結核菌の治療は化学療法が中心であり、大半は適切な化学療法で治癒させることができる。使用される治療薬としては、イソジアニド（ＩＮＨ）、リファンピシリン（ＲＦＰ）、リファブチン（ＲＢＴ）、ピラジナミド（ＰＺＡ）、エタンブトール（ＥＢ）、ストレプトマイシン（ＳＰ）などが挙げられる（非特許文献１）。
【０００４】
一方で、結核菌の中には薬剤耐性を獲得した株が存在する。薬剤耐性菌の検査としては培地に治療薬を含有させて培養法を行う薬剤感受性試験が一般的である。しかし、結核菌は培養に数週間を要する菌であり、その間、結核患者の治療方針が決定できないという問題がある。
【０００５】
薬剤耐性は特定遺伝子の変異によって獲得されることが報告されている。そのため、薬剤耐性を引き起こす遺伝子変異を検査することで薬剤耐性を推測する方法が構築されている。
【０００６】
このうち、ｒｐｏＢ遺伝子に変異が生じるとリファンピシリンに対する耐性を獲得することは以前から知られている（非特許文献２〜４）。そのため、ｒｐｏＢ遺伝子を検査することでリファンピシリン耐性を確認することが可能であり、遺伝子検査による薬剤耐性検査キットも市販されている（非特許文献２）。当該キットはｒｐｏＢ遺伝子の部分配列をｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲによって核酸増幅し、その後試験片に固定されたプローブによって５１１番目から５３３番目のコドンに対応した塩基配列内の変異を検出する。
【０００７】
ｒｐｏＢ遺伝子の変異のうちコドン５０９〜５３３に生じる変異が全体の９５％を占めると言われている（非特許文献２、５）。そのため結核菌ｒｐｏＢ遺伝子の前記コドン領域の変異を検出することで、ＲＦＰ耐性結核菌のほとんどを検出することが可能である。
【０００８】
前記コドン領域内の変異は塩基の置換変異が最も多い。この他、コドン５１４では塩基の挿入変異が起こりうることが、一部のコドンでは塩基の欠失変異が起こることが報告されている（非特許文献５）。
【０００９】
遺伝子検査においては、通常は標的核酸をＰＣＲ等の核酸増幅法で増幅してから検出することが行われるが、この場合に核酸増幅産物が検出系に混入し偽陽性となるコンタミネーションが問題となる。コンタミネーションが起こる原因の一つは、核酸増幅反応後に反応容器を開放することである。上記キットもｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ後に反応容器を開放して核酸増幅産物を検出用試薬と混合することで遺伝子変異を検出しているため、コンタミネーションの可能性を排除できない。
【００１０】
また、上記キットではＰＣＲに２時間３０分以上、ＰＣＲ後の検出に１０５分間以上を要しており、より迅速なｒｐｏＢ変異検出法が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】結核診療ガイドライン，２００９，日本結核病学会・編  南江堂
【非特許文献２】稲垣ら，結核，２０１０，８５，ｐ．７０３−７０９
【非特許文献３】Ｔｅｌｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．１９９３，３４１，ｐ．６４７−６５０
【非特許文献４】Ｋａｐｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．１９９５，１１９，ｐ．１３１−１３８
【非特許文献５】Ｊａｍｅｓ  Ｍ．  Ｍｕｓｓｅｒ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｒｅｖ．１９９５，ｐ．４９６−５１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、コンタミネーションが発生しない閉鎖系によるｒｐｏＢ遺伝子検査系の構築およびｒｐｏＢ遺伝子検査の時間短縮である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、消光プローブを含む特定のプローブ用いることで、閉鎖系でのｒｐｏＢ遺伝子検出が可能であることを見出した。また、当該遺伝子検出系は従来の検査キットよりも短時間での検査が可能であることを確認し、本発明を完成させた。
【００１４】
［１]
以下の（１）から（３）に示す工程を含む、結核菌のリファンピシリン耐性の検出方法。
（１）試料中の結核菌に由来する核酸と、以下の（Ａ）および（Ｂ）に記載の核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（Ａ）配列番号１および２で示された蛍光標識された２本の核酸プローブ
（Ｂ）配列番号３で示された１本の無標識核酸プローブ  
（２）工程（１）で得られた複合体を検出する工程
（３）工程（２）で測定または検出されるデータを解析することで結核菌のリファンピシリン耐性を判別する工程
［２]
以下の（１）から（３）に示す工程を含む、結核菌のリファンピシリン耐性の検出方法。
（１）試料中の結核菌に由来する核酸と、以下の（Ａ）および（Ｂ）に記載の核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（Ａ）配列番号４および５で示された蛍光標識された２本の核酸プローブ
（Ｂ）配列番号６から９のうちいずれかで示された１本の無標識核酸プローブ  
（２）工程（１）で得られた複合体を検出する工程
（３）工程（２）で測定または検出されるデータを解析することで結核菌のリファンピシリン耐性を判別する工程
［３］
［１］または［２］に記載のリファンピシリン耐性結核菌の検出方法であって、検出対象が、コドン５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５２０、５２１、５２２、５２３、５２６、５２７、５２９、５３１および５３３からなる群のうちいずれか１以上に生じる塩基変異である、［１］または［２］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、リファンピシリン耐性結核菌を合計３本の核酸プローブを用いた閉鎖系で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の検出系の一部を示すモデル図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。
【図３】実施例１の結果を示す図である。
【図４】実施例１の結果を示す図である。
【図５】実施例１の結果を示す図である。
【図６】実施例１の結果を示す図である。
【図７】実施例１の結果を示す図である。
【図８】実施例１の結果を示す図である。
【図９】実施例２の結果を示す図である。
【図１０】実施例２の結果を示す図である。
【図１１】実施例２の結果を示す図である。
【図１２】実施例２の結果を示す図である。
【図１３】実施例２の結果を示す図である。
【図１４】実施例２の結果を示す図である。
【図１５】実施例２の結果を示す図である。
【図１６】実施例２の結果を示す図である。
【図１７】実施例２の結果を示す図である。
【図１８】実施例２の結果を示す図である。
【図１９】実施例３の結果を示す図である。
【図２０】実施例３の結果を示す図である。
【図２１】実施例３の結果を示す図である。
【図２２】実施例３の結果を示す図である。
【図２３】実施例３の結果を示す図である。
【図２４】実施例３の結果を示す図である。
【図２５】実施例３の結果を示す図である。
【図２６】実施例３の結果を示す図である。
【図２７】実施例３の結果を示す図である。
【図２８】実施例３の結果を示す図である。
【図２９】実施例３の結果を示す図である。
【図３０】実施例４の結果を示す図である。
【図３１】実施例４の結果を示す図である。
【図３２】実施例４の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、リファンピシリン結核菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよび、該オリゴヌクレオチドを用いたリファンピシリン耐性結核菌の検出方法に関する。
【００１８】
本発明の方法において、結核菌のリファンピシリン耐性はｒｐｏＢ遺伝子の変異を分析することにより行う。本発明におけるｒｐｏＢ遺伝子とは、以後特に断りが無い限り、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子を意味する。ｒｐｏＢ遺伝子の塩基配列を本明細書の配列番号１８として示す。
【００１９】
［本発明に用いる核酸プローブ］
本発明で用いられる核酸プローブは、ｒｐｏＢ遺伝子の変異を検出することで結核菌のリファンピシリン耐性を検出するための核酸プローブである。前記核酸プローブはｒｐｏＢ遺伝子の一部または全部とハイブリダイズして複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、ｒｐｏＢ遺伝子のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくはｒｐｏＢ遺伝子の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
前記核酸プローブが複合体を形成する対象は、試料中に存在する結核菌ゲノム中のｒｐｏＢ遺伝子でもよく、当該遺伝子の一部または全部を核酸増幅させて得られた核酸増幅産物でもよい。より好ましくは核酸増幅産物である。
【００２０】
前記核酸プローブとしては、ｒｐｏＢ遺伝子のコドン５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５２０、５２１、５２２、５２３、５２６、５２７、５２９、５３１および５３３からなる群のうちいずれか１以上に生じうる変異を検出するための核酸プローブが例示できる。以下、前記のｒｐｏＢ遺伝子に生じうる変異をｒｐｏＢ遺伝子変異群（文脈から明らかな場合は単に「変異群」）と記載する。前記核酸プローブは１種類の塩基配列で、前記コドンの中の一つまたは複数の変異を検出対象とすることができる。
【００２１】
前記核酸プローブは、「野生型のｒｐｏＢ遺伝子を検出し、かつ前記コドンに変異の有無があるかを鑑別することが可能な性質」を有してもよいし、「前記コドンに変異があった場合のみｒｐｏＢ遺伝子を検出する性質」を有してもよい。より好ましくは「野生型のｒｐｏＢ遺伝子を検出し、かつ前記コドンに変異の有無があるかを鑑別する性質」を有する核酸プローブである。
【００２２】
本発明で用いる核酸プローブの塩基数は特に制限されない。好ましい下限は１５塩基であり、さらに好ましくは１６塩基であり、さらに好ましくは１７塩基である。好ましい上限は３３塩基であり、さらに好ましくは３１塩基であり、さらに好ましくは２９塩基である。
【００２３】
このような核酸プローブの塩基配列として、配列番号１〜９が例示できる。
【００２４】
本発明で用いる核酸プローブは、配列番号１〜９と相補的な配列を有するものを使用してもよい。また、配列番号１〜９において数塩基の置換が含まれていてもよい。ここでいう数塩基とは、１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは４塩基以下、より好ましくは３塩基以下、より好ましくは２塩基以下、より好ましくは１塩基以下である。
【００２５】
また、本発明で用いる核酸プローブは、その少なくとも一つが、前記の配列番号１〜９のいずれかに記載されている塩基配列（またはそれらの相補的配列）の一部分から構成されていてもよい。たとえば、各配列番号のうち１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチドから構成されていればよい。
別の言い方をすると、配列番号１〜９に記載されている塩基配列のうち一番長いものは２９塩基、一番短いものは１９塩基であるが、前記の核酸プローブの長さは、各塩基配列で示される配列の全長を有することが最も好ましい。前記「塩基配列の一部分」については、全長が１５塩基未満とならない範囲内であれば、その配列の連続性を維持する前提で、少なくともいずれかの末端を欠いてもよい。その場合の塩基配列の長さは、長いほうが好ましい。例えば配列番号１であれば１５塩基以上であれば良いが、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、より好ましくは１９塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２１塩基以上、より好ましくは２２塩基以上、より好ましくは２３塩基以上、より好ましくは２４塩基以上、より好ましくは２５塩基以上、より好ましくは２６塩基以上、より好ましくは２７塩基以上、より好ましくは２８塩基以上、最も好ましくは２９塩基である。また、例えば配列番号９であれば１５塩基以上であれば良いが、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、最も好ましくは１９塩基である。
【００２６】
さらに、前記の核酸プローブは、は、前記のいずれかに記載されている塩基配列を含めば、いずれかの末端に数塩基が付加されていてもよい。いずれかの末端に塩基を付加することで、プローブの全長が、１８塩基以上となることが好ましく、より好ましくは、２０塩基以上、より好ましくは、２３塩基以上となることが好ましい。この場合、プローブ全長の上限は、３５塩基であることが好ましく、さらに好ましくは３２塩基、さらに好ましくは３０塩基である。
【００２７】
本発明においてｒｐｏＢ遺伝子変異群は複数の核酸プローブで検出される。前記変異群の検出に用いる核酸プローブは、蛍光標識された核酸プローブと、無標識の核酸プローブの両方である。これらの核酸プローブの本数については特に制限されないが、好ましい下限は２本であり、さらに好ましくは３本である。好ましい上限は６本であり、さらに好ましくは５本であり、さらに好ましくは４本であり、さらに好ましくは３本である。また、無標識の核酸プローブの本数は蛍光標識された核酸プローブの本数以下であることが好ましい。
【００２８】
蛍光標識された核酸プローブにおいて標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。
【００２９】
蛍光標識された核酸プローブの蛍光物質には特に制限は無いが、好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。
【００３０】
無標識の核酸プローブとは蛍光物質やビオチンなどが核酸プローブ中のいずれの核酸にも標識されていない核酸プローブを指す。ただし、核酸プローブ中のいずれかまたは両方の末端がリン酸化されていることは標識に含めない。このため、無標識の核酸プローブであっても、末端の核酸がリン酸化されることは妨げない。
【００３１】
［核酸プライマーセット］
本発明のリファンピシリン耐性結核菌検出において、検出対象は試料中に含まれる結核菌のゲノム中のｒｐｏＢ遺伝子を核酸増幅させて得られた核酸増幅産物であることが好ましい。核酸増幅産物を検出対照とする場合は、本発明に記載の核酸プローブと共に、ｒｐｏＢ遺伝子の一部を特異的に増幅するための核酸プライマーセットを使用してもよい。
【００３２】
上記の核酸プライマーセットは、ｒｐｏＢ遺伝子の一部を核酸増幅するために用いられるものであり、該核酸プライマーセットは１本のフォワードプライマーと１本のリバースプライマーとから成る。さらにフォワードプライマーとリバースプライマーのいずれもＴｍ値が核酸プローブのＴｍ値と同値以上であることが好ましい。
【００３３】
本発明における核酸プライマーまたは核酸プローブのＴｍ値計算には公知の計算方法を用いることができ、いずれの方法を用いてもよい。具体的な計算方法としては、最近接塩基対法、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法が挙げられる。
【００３４】
前記核酸プライマーセットを構成する核酸プライマーの塩基数は特に制限されない。好ましい下限は２４塩基であり、さらに好ましくは２５塩基であり、さらに好ましくは２６塩基である。好ましい上限は３５塩基であり、さらに好ましくは３４塩基であり、さらに好ましくは３３塩基である。
【００３５】
このような核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号１０〜１３のいずれかで示される塩基配列と、リバースプライマーとして配列番号１４〜１７のいずれかで示される塩基配列との組合せが例示できる。
【００３６】
前記のプライマーセットは、配列番号１０〜１７と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択されるものであってもよい。また、配列番号１０〜１７において数塩基の置換が含まれていてもよい。ここでいう数塩基とは、１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは４塩基以下、より好ましくは３塩基以下、より好ましくは２塩基以下、より好ましくは１塩基以下である。
【００３７】
また、前記のプライマーセットは、その少なくとも一つが、前記の配列番号１０〜１７のいずれかに記載されている塩基配列（またはそれらの相補的配列）の一部分から構成されていてもよい。たとえば、１組のプライマーセットにおいて、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーが、各配列番号のうち１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチドから構成されていればよい。
別の言い方をすると、配列番号１０〜１７に記載されている塩基配列のうち一番長いものは３２塩基、一番短いものは２７塩基であるが、前記の核酸プローブの長さは、各塩基配列で示される配列の全長を有することが最も好ましい。前記「塩基配列の一部分」については、全長が１５塩基未満とならない範囲内であれば、その配列の連続性を維持する前提で、少なくともいずれかの末端を欠いてもよい。その場合の塩基配列の長さは、長いほうが好ましい。例えば配列番号１０であれば１５塩基以上であれば良いが、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、より好ましくは１９塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２１塩基以上、より好ましくは２２塩基以上、より好ましくは２３塩基以上、より好ましくは２４塩基以上、より好ましくは２５塩基以上、より好ましくは２６塩基以上、より好ましくは２７塩基以上、より好ましくは２８塩基以上、より好ましくは２９塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、より好ましくは３１塩基以上、最も好ましくは３２塩基である。また、例えば配列番号１７であれば１５塩基以上であれば良いが、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、より好ましくは１９塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２１塩基以上、より好ましくは２２塩基以上、より好ましくは２３塩基以上、より好ましくは２４塩基以上、より好ましくは２５塩基以上、より好ましくは２６塩基以上、最も好ましくは２７塩基である。
【００３８】
さらに、前記のプライマーセットは、その少なくとも一つが、前記のいずれかに記載されている塩基配列を含めば、いずれかの末端に数塩基が付加されていてもよい。いずれかの末端に塩基を付加することで、プライマーの全長が、１８塩基以上となることが好ましく、より好ましくは、２０塩基以上、より好ましくは、２３塩基以上となることが好ましい。この場合、プローブ全長の上限は、３５塩基であることが好ましく、さらに好ましくは３２塩基、さらに好ましくは３０塩基である。
【００３９】
［リファンピシリン耐性結核菌の検出方法］
本発明のリファンピシリン耐性結核菌の検出方法は、試料中に存在する結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の変異を検出することを特徴とする。
【００４０】
本発明の実施態様の一つは、以下の（１）から（３）に示す工程を含む、結核菌のリファンピシリン耐性の検出方法である。
（１）試料中の結核菌に由来する核酸と、以下の（Ａ）および（Ｂ）に記載の核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（Ａ）配列番号１および２で示された蛍光標識された２本の核酸プローブ
（Ｂ）配列番号３で示された１本の無標識核酸プローブ  
（２）工程（１）で得られた複合体を検出する工程
（３）工程（２）で測定または検出されるデータを解析することで結核菌のリファンピシリン耐性を判別する工程
【００４１】
本発明の実施態様の一つは、以下の（１）から（３）に示す工程を含む、結核菌のリファンピシリン耐性の検出方法である。
（１）試料中の結核菌に由来する核酸と、以下の（Ａ）および（Ｂ）に記載の核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（Ａ）配列番号４および５で示された蛍光標識された２本の核酸プローブ
（Ｂ）配列番号６から９のうちいずれかで示された１本の無標識核酸プローブ  
（２）工程（１）で得られた複合体を検出する工程
（３）工程（２）で測定または検出されるデータを解析することで結核菌のリファンピシリン耐性を判別する工程
【００４２】
前記各実施態様においては、結核菌のリファンピシリン耐性を蛍光標識された２本の核酸プローブと、１本の無標識核酸プローブを用いることを特徴とする。
【００４３】
前記実施態様においては、蛍光標識された２本の核酸プローブとして、配列番号１、２で示される塩基配列を有する核酸プローブが、無標識核酸プローブとして、配列番号３で示される塩基配列を有する核酸プローブがそれぞれ例示できる。あるいはまた、蛍光標識された２本の核酸プローブとして、配列番号４、５で示される塩基配列を有する核酸プローブが、無標識核酸プローブとして、配列番号６から９のうちいずれかで示される塩基配列を有する核酸プローブがそれぞれ例示できる。しかし、本発明方法で用いられる核酸プローブは配列番号１〜９に限定されず、分子生物学的手法を用いて結核菌のリファンピシリン耐性を検出するために用いることができる核酸プローブであれば、いかなる塩基配列、および標識形態であっても使用できうる。
【００４４】
本発明の方法における検出対象としては、コドン５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５２０、５２１、５２２、５２３、５２６、５２７、５２９、５３１および５３３からなる群のうちいずれか１以上に生じる塩基変異が例示できる。本発明の検出方法では、前記コドンの全てに生じうる変異を検出対象としてもよいし、一部のコドンのみを検出対象としてもよい。また、コドンに生じうる全ての変異を検出対象としてもよいし、一部の変異のみを検出対象としてもよい。
【００４５】
本発明の方法において、試料中の結核菌に由来する核酸は、試料中に存在する結核菌ゲノム中のｒｐｏＢ遺伝子に該当する核酸でもよく、前記核酸の一部または全部を増幅させて得られた核酸増幅産物でもよい。より好ましくは核酸増幅産物である。
すなわち、本発明の結核菌のリファンピシリン耐性の検出方法は、以下の工程（０）を含む方法であってもよい。
（０）ｒｐｏＢ遺伝子を核酸増幅するための核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
この実施態様では、工程（０）は、遅くとも前記工程（３）の開始前に行うことが好ましい。さらに好ましくは前記工程（２）の前に行うことが好ましい。また、前記工程（１）の前に行うことも可能である。
また、この実施態様では、工程（２）においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる。この実施態様で用いられる核酸プライマーセットおよび核酸プローブとしては前記のものを使用できる。
【００４６】
本発明において、結核菌のリファンピシリン耐性の判別方法は、特に限定されないが、例えば被検核酸のｒｐｏＢ遺伝子の変異の有無を判定することによって行うことができる。ｒｐｏＢ遺伝子の検出が可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。
【００４７】
本発明の方法において核酸増幅工程（前記の工程（０））をともなう場合、工程（０）〜（３）は反応系を開放しても開放しなくても実施可能だが、開放することなく工程（０）〜（３）全てが行われることが好ましい。「開放する」とは反応容器の蓋をあけるなどの方法で核酸増幅産物を暴露させることを言う。「開放しない」とは逆に反応容器を開放せず、核酸増幅産物を外部に暴露させないことを言う。
【００４８】
前記方法の工程（２）の一つの実施態様として、以下の工程（２’）が挙げられる。
（２’）工程（１）で得られた複合体を含む反応系の温度を段階的に上昇させて融解曲線分析を行い、複合体を形成していた核酸増幅産物と核酸プローブの解離の有無を検知する工程
【００４９】
前記方法の工程（３）の一つの実施態様として、以下の工程（３’）が挙げられる。
（３’）工程（２’）で解離が検知できた場合に、ｒｐｏＢ遺伝子が存在していたと判断し、さらに複合体の融解温度の差からｒｐｏＢ遺伝子が変異を有するか否かを判定する工程
【００５０】
前記（０）（１）（２）（３）の工程、あるいは（０）（１）（２’）（３’）の工程を開始してから全て完了するまでの時間は特に制限されないが、１時間以内に終えることが好ましい。より好ましくは５５分間以内であり、５０分間以内であり、４５分間以内である。この時間は工程（０）の核酸増幅が開始されてから工程（３）の複合体検出または（３’）の解離の有無の検知が完了するまでの時間を指し、工程（０）に用いられる反応液の調製時間は含まれない。
【００５１】
該方法で用いられるｒｐｏＢ遺伝子を増幅し検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブは、それぞれ前記したものを用いることができる。さらに、例えばｒｐｏＢ遺伝子とは異なる核酸を増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーセットや核酸プローブを追加することも特に制限されない。
【００５２】
［被検核酸の増幅］
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００５３】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。この試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる。あるいは、前記生体試料から適当な方法でＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を調製してもよい。調製方法としては特に制限されず、公知の核酸精製キット、自動核酸精製機器、フェノール・クロロホルム法など、従来公知の方法を用いることができる。
【００５４】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、喀痰、組織片、糞便、尿、胃液、胸水、咽頭拭い液、気管支洗浄液、血液などが挙げられる。また、これらの生体試料を培地または培養液に添加して培養された結核菌を試料としてもよい。
【００５５】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５６】
ＰＣＲ法では通常、変性反応、アニーリング反応、伸長反応の３段階の反応が繰り返される。ただし、アニーリング反応と伸長反応の反応条件を同一とすることで、２段階の反応を繰り返す場合もある。本発明において、ＰＣＲ法の反応は２段階でもよく、３段階でもよく、４段階以上でもよいが、好ましくは３段階である。
【００５７】
前記各反応の温度および時間の条件に制限はないが、変性反応の温度は９０〜１００℃のいずれかが好ましい。変性反応の時間は０〜１０秒間のいずれかが好ましい。ここでの０秒とは一瞬だけ既定の温度にし、すぐに次の段階の反応へと進むことを意味しており、変性反応を行わないことを意味しない。また、アニーリング反応の温度は５０〜７０℃のいずれかが好ましく、アニーリング反応の時間は０〜１５秒間のいずれかが好ましい。伸長反応の温度は５８〜７５℃のいずれかが好ましく、伸長反応の時間は１〜１５秒間のいずれかが好ましい。
【００５８】
変性反応、アニーリング反応、伸長反応を各１回行うことをＰＣＲサイクルと言い、ＰＣＲ法による核酸増幅反応全体でＰＣＲサイクルを行う回数をサイクル数と言う。本発明において実施可能なサイクル数は特に制限されないが、３５〜１００回の範囲であることが好ましい。サイクル数の下限は好ましくは４０回、より好ましくは５０回である。サイクル数の上限は好ましくは８０回、より好ましくは７０回である。
【００５９】
［ＤＮＡポリメラーゼ］
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００６０】
本発明プローブが含まれる反応系でｒｐｏＢ遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のｒｐｏＢ遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中に被検核酸と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００６１】
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’−  ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるｒｐｏＢ遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００６２】
他方、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００６３】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
【００６４】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−が望ましい。
【００６５】
前記ポリメラーゼを用いることで、従来よりも短時間でＰＣＲを行うことが可能になる。通常のＴａｑポリメラーゼではデオキシリボ核酸合成速度は６０塩基／秒程度であると言われているが、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどは１００塩基／秒を越えるデオキシリボ核酸合成速度を持つため、伸長時間を通常の半分に縮めることができる。
【００６６】
また、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュダイアグノスティクス社製）やＧＥＮＥＣＵＢＥ（東洋紡製）など、細いキャピラリー状の反応容器を用いて核酸増幅反応を行わせる核酸増幅装置を併用することで、さらにＰＣＲを高速化することが可能である。これらの技術を利用することで、本発明の実施例が示すように１時間以内のＰＣＲが可能となる。
【００６７】
［核酸増幅産物とプローブとの複合体形成］
本発明のｒｐｏＢ遺伝子検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
【００６８】
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００６９】
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００７０】
［核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出］
前記方法の（２）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、前記（２’）のように融解曲線分析による方法が挙げられる。
【００７１】
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００７２】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のリファンピシリン耐性結核菌検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
【００７３】
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
【００７４】
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００７５】
本発明で用いる蛍光標識された核酸プローブはグアニン消光プローブと同様の構造であるが、蛍光標識された塩基がグアニン以外であってもよい。具体例としては配列番号１や５が例示できる。
【００７６】
前記核酸プローブは鋳型となる核酸である核酸増幅産物と結合しても、蛍光標識された塩基がグアニンと結合しないため蛍光が消光せず、該核酸増幅産物と核酸プローブとの複合体が検知できない。しかし、該核酸プローブが該核酸増幅産物と複合体を形成したとき、該核酸プローブに隣接するように該核酸増幅産物と結合する塩基配列を有し、さらに蛍光標識された該核酸プローブと隣接する塩基がグアニンとなる無標識核酸プローブを同時に使用することで、無標識核酸プローブのグアニンによって蛍光標識された該核酸プローブでグアニン消光が生じ、該核酸増幅産物との複合体が検出できる。
【００７７】
前記検出系を使用する場合、もしも被検核酸であるｒｐｏＢ遺伝子中の蛍光標識された該核酸プローブとの結合領域内に変異が含まれると、該核酸プローブと該核酸増幅産物とは、ｒｐｏＢ遺伝子が野生型である場合よりも弱く結合する。その場合、例えば融解曲線解析を実施した場合に、該核酸プローブがｒｐｏＢ遺伝子の野生型を検査するときと比較して低い温度で融解し、無標識核酸プローブから離れて蛍光を発することになる。
同様に、ｒｐｏＢ遺伝子中の無標識核酸プローブとの結合領域内に変異が含まれると、無標識核酸プローブと該核酸増幅産物とは、ｒｐｏＢ遺伝子が野生型である場合よりも弱く結合する。その場合、例えば融解曲線解析を実施した場合に、無標識核酸プローブがｒｐｏＢ遺伝子の野生型を検査するときと比較して低い温度で融解し、蛍光標識された該核酸プローブの蛍光標識塩基に隣接したグアニンが離れるため、該核酸プローブが蛍光を発することになる。
従っていずれの核酸プローブと結合する位置に変異が含まれていても、前記検出系によって変異を検知することが可能になる。
【００７８】
前記検出系のモデル図を図１として示す。蛍光標識プローブおよび無標識プローブの両方が検出対象となる核酸と結合せず遊離している状態が図１のＡで示される。Ａの状態の反応系を、例えば３５〜５０℃程度の温度に置くことで、図１のＢで示すように両プローブを検出対象に結合させることができる。検出対象となった核酸、すなわちｒｐｏＢ遺伝子の中に蛍光標識された該核酸プローブとの結合領域内に変異が含まれる場合、その後、例えば融解曲線解析を実施することで、図１のＣで示されるように該核酸プローブが遊離する。他方、もしもｒｐｏＢ遺伝子中の無標識核酸プローブとの結合領域内に変異が含まれる場合、例えば融解曲線解析を実施することで、図１のＣ’で示されるように無標識核酸プローブが遊離し、蛍光標識された該核酸プローブが蛍光を発するようになる。
【００７９】
この他、蛍光標識された末端がシトシンである通常のグアニン消光プローブであれば、単独でｒｐｏＢ遺伝子の検出が可能である。また、例えば融解曲線解析を実施した場合に、該核酸プローブがｒｐｏＢ遺伝子の野生型を検査するときと比較して低い温度で融解し蛍光を発するため、融解温度によってｒｐｏＢ遺伝子のうち核酸プローブが結合する領域内の変異を検知することが可能である。
【００８０】
本発明の一つの実施態様としては、前述した通常のグアニン消光プローブと、末端がグアニンになっていない特殊消光プローブと無標識核酸プローブとのセット、を用いてリファンピシリン耐性結核菌を検出する。当該実施態様の１例として、通常のグアニン消光プローブが配列番号２、特殊消光プローブが配列番号１、無標識核酸プローブが配列番号３、という組み合わせが例示できる。
【００８１】
また、異なる１例として、通常のグアニン消光プローブが配列番号４、特殊消光プローブが配列番号５、無標識核酸プローブが配列番号６〜９のいずれか、という組み合わせが例示できる。
【００８２】
前述した実施態様において、前記核酸プローブ３本は全て一つの検出系に添加して用いてもよいし、通常のグアニン消光プローブと、特殊消光プローブと無標識核酸プローブとのセットを別々の検出系で用いてもよい。より好ましくは３本の核酸プローブ全てを一つの検出系で用いる実施態様である。
【００８３】
［融解曲線解析の方法］
工程（１）によって得られた核酸増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００８４】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００８５】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００８６】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００８７】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００８８】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００８９】
被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００９０】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００９１】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【００９２】
本明細書で用いられるＤＮＡ合成酵素の活性測定方法について、以下に記す。
［ＤＮＡ合成活性］
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００９３】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：  ４０ｍＭ          Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ          塩化マグネシウム
１５ｍＭ          ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ：  ２μｇ／μｌ      活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：  １．５ｍＭ        ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ：  ２０％            トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：  １μｇ／μｌ      キャリアーＤＮＡ
【００９４】
［３’−５’エキソヌクレアーゼ活性］
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８  ａｔ  ２５℃），  １０ｍＭ  ＫＣｌ，  ６ｍＭ  硫酸アンモニウム，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．００１％  ＢＳＡ，５  μｇ  トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【実施例】
【００９５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００９６】
〔実施例１：本発明方法のうち２本の核酸プローブによるｒｐｏＢ遺伝子変異の検出〕
蛍光標識された核酸プローブと無標識の核酸プローブとを用いることで、ｒｐｏＢ遺伝子を検出し、かつ野生型ｒｐｏＢ遺伝子と変異型ｒｐｏＢ遺伝子とを鑑別できることを示す実験を行った。
（１）試料の調製
配列番号１９で示されるフォワードプライマーと配列番号２０で示されるリバースプライマーとを用いてｒｐｏＢ遺伝子のうちコドン５０９〜コドン５３３に相当する領域を含む塩基配列をＰＣＲによって核酸増幅した。次いで、核酸増幅産物をクローニングベクターｐＵＣ１９に組み込み野生型ｒｐｏＢ陽性試料とした。さらに、該野生型ｒｐｏＢ陽性試料からｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲによる部位特異的変異導入法を用いて変異を導入した直鎖状ＤＮＡを調製し、該直鎖状ＤＮＡをライゲーションすることで、所定の変異型ｒｐｏＢ遺伝子部分配列を含む環状ＤＮＡを調製した。左記環状ＤＮＡを変異型ｒｐｏＢ陽性試料とした。
ｒｐｏＢ遺伝子の核酸増幅にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ｖｅｒ．２（東洋紡製）を用いた。部位特異的変異導入法にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いた。作製した陽性試料の一覧を表１に記載した。
【００９７】
【表１】
0006379871.tif 000002
【００９８】
表１において、部分配列とは配列番号１９および２０からなる核酸プライマーを用いて核酸増幅したｒｐｏＢ遺伝子の一部配列、のことを指す。
【００９９】
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件により核酸増幅および融解曲線分析を行い核酸プローブと核酸増幅産物との複合体を検出した。分析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いた。
【０１００】
［核酸増幅用試薬］
以下の試薬を含む溶液を調製した。試料には前記野生型または変異型ｒｐｏＢ陽性試料を２５コピー／μｌとなるように濃度調製したものを使用した。
１００μＭフォワードプライマー（配列番号１０）０．２５μｌ
１００μＭリバースプライマー（配列番号１４）０．０５μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号１、５´末端ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３´末端リン酸化）０．０３μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号２、５´末端ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３´末端リン酸化）０．０３μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号３、３´末端リン酸化）０．０６μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μｌ
ＤＭＳＯ  ０．３２μｌ
精製水  ０．４６μｌ
試料  ４μｌ
（試料として、ＷＴ（野生型）、５１１ＧＴＧ、５１２ＧＧＣ、５１６ＧＴＣ、５１６ＣＡＣ、５３１ＴＴＧ、５３１ＴＧＧ、５３３ＣＣＧを使用した。本明細書において各変異体陽性試料は「コドン番号  変異後の塩基配列」を名称としている。例えば５１１ＧＴＧならば、コドン５１１の塩基がＧＴＧに置換変異された試料となる。）
【０１０１】
［核酸増幅および融解曲線分析］
９４℃・３０秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃〜８０℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【０１０２】
［結果］
図２は、配列番号１０からなる塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号１４からなる塩基配列を有するリバースプライマーとで構成される核酸プライマーセットと、配列番号１〜３からなる塩基配列をそれぞれ有する核酸プローブとを用いて、ＷＴおよび５１１ＧＴＧを試料として核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。本実施例で用いた核酸プローブは消光プローブであり、核酸増幅産物と共に３９℃に置くことによって増幅された標的核酸と結合し消光する。その後、徐々に温度を上げることで核酸プローブは標的核酸から遊離し、蛍光を発する。従って、徐々に温度を上げる過程で蛍光変化量が正に変化すれば、それは即ち標的核酸と結合していた核酸プローブが遊離したことを示している。
図２から、ＷＴを試料とした場合は約７０℃で蛍光の大きな変化が生じ検出ピークが得られたことがわかる。一方、５１１ＧＴＧでは約６５℃と約７０℃の両方で蛍光の大きな変化が生じ検出ピークが得られている。ＷＴと５１１ＧＴＧとで検出ピーク形状が異なることから、本発明の方法により野生型のｒｐｏＢ遺伝子とコドン５１１が変異したｒｐｏＢ遺伝子とを識別できることが示された。
同様に図３〜８はそれぞれ、５１２ＧＧＣ、５１６ＧＴＣ、５１６ＣＡＣ、５３１ＴＴＧ、５３１ＴＧＧ、５３３ＣＣＧがＷＴと検出ピークが異なることを示しており、本結果からコドン５１１、５１２、５１６、５３１、５３３のいずれかに変異を有するｒｐｏＢ遺伝子を野生型ｒｐｏＢ遺伝子と区別することが可能であることが明らかになった。
【０１０３】
〔実施例２：本発明方法のうち２本の核酸プローブによるｒｐｏＢ遺伝子変異の検出〕
蛍光標識された核酸プローブと無標識の核酸プローブとを用いることで、ｒｐｏＢ遺伝子を検出し、かつ野生型ｒｐｏＢ遺伝子と変異型ｒｐｏＢ遺伝子とを鑑別できることを示す実験を行った。
（１）試料の調製
配列番号１９で示されるフォワードプライマーと配列番号２０で示されるリバースプライマーとを用いてｒｐｏＢ遺伝子のうちコドン５０９〜コドン５３３に相当する領域を含む塩基配列をＰＣＲによって核酸増幅した。次いで、核酸増幅産物をクローニングベクターｐＵＣ１９に組み込み野生型ｒｐｏＢ陽性試料とした。さらに、該野生型ｒｐｏＢ陽性試料からｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲによる部位特異的変異導入法を用いて変異を導入した直鎖状ＤＮＡを調製し、該直鎖状ＤＮＡをライゲーションすることで、所定の変異型ｒｐｏＢ遺伝子部分配列を含む環状ＤＮＡを調製した。左記環状ＤＮＡを変異型ｒｐｏＢ陽性試料とした。
ｒｐｏＢ遺伝子の核酸増幅にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ｖｅｒ．２（東洋紡製）を用いた。部位特異的変異導入法にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いた。作製した陽性試料の一覧を表２に記載した。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件により核酸増幅および融解曲線分析を行い核酸プローブと核酸増幅産物との複合体を検出した。分析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いた。
【０１０４】
［核酸増幅用試薬］
以下の試薬を含む溶液を調製した。試料には前記野生型または変異型ｒｐｏＢ陽性試料を２５コピー／μｌとなるように濃度調製したものを使用した。
１００μＭフォワードプライマー（配列番号１０）０．２５μｌ
１００μＭリバースプライマー（配列番号１４）０．０５μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号１、５´末端ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３´末端リン酸化）０．０３μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号２、５´末端ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３´末端リン酸化）０．０３μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号３、３´末端リン酸化）０．０６μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μｌ
ＤＭＳＯ  ０．３２μｌ
精製水  ０．４６μｌ
試料  ４μｌ
（試料として、ＷＴ、５１０＿ＡＧ、５１０ＣＡＴ、５１３ＴＡＡ、５１３ＡＡＴ、５１３ＣＣＡ、５１４ＴＴＣ＋、５１５ＧＴＧ、５２３ＣＧＧ、５２６ＣＡＡ、５２９ＡＡＡを使用した。５１０＿ＡＧの＿は元の塩基が欠失していることを指す。また、５１４ＴＴＣ＋の＋は挿入変異であることを指す。）
【０１０５】
【表２】
0006379871.tif 000003
【０１０６】
［核酸増幅および融解曲線分析］
９４℃・３０秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃〜８０℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【０１０７】
［結果］
図９は、配列番号１０からなる塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号１４からなる塩基配列を有するリバースプライマーとで構成される核酸プライマーセットと、配列番号１〜３からなる塩基配列をそれぞれ有する核酸プローブとを用いて、ＷＴおよび５１０＿ＡＧを試料として核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図９から、ＷＴを試料とした場合は約７０℃で蛍光の大きな変化が生じ検出ピークが得られたことがわかる。一方、５１０＿ＡＧでは約７０℃以外に約６５℃でも蛍光の変化が生じ検出ピークが得られている。ＷＴと５１０＿ＡＧとで検出ピーク形状が異なることから、本発明の方法により野生型のｒｐｏＢ遺伝子とコドン５１１が変異したｒｐｏＢ遺伝子とを識別できることが示された。
同様に図１０〜１８はそれぞれ、５１０ＣＡＴ、５１３ＴＡＡ、５１３ＡＡＴ、５１３ＣＣＡ、５１４ＴＴＣ＋、５１５ＧＴＧ、５２３ＣＧＧ、５２６ＣＡＡ、５２９ＡＡＡがＷＴと検出ピークが異なることを示しており、本結果からコドン５１０、５１３、５１４、５１５、５２３、５２６、５２９のいずれかに変異を有するｒｐｏＢ遺伝子を、野生型ｒｐｏＢ遺伝子と区別することが可能であることが明らかになった。
【０１０８】
〔実施例３：様々な核酸プライマーセットを用いて得られた拡散増幅産物に対する本発明方法の適用〕
実施例１、２とは異なる核酸プライマーセットを用いて核酸増幅させた核酸増幅産物を検出対象とし、蛍光標識された核酸プローブと無標識の核酸プローブとを用いることで、ｒｐｏＢ遺伝子を検出し、かつ野生型ｒｐｏＢ遺伝子と変異型ｒｐｏＢ遺伝子とを鑑別できることを示す実験を行った。
（１）試料の調製
実施例１、２で使用したＷＴを使用した。濃度は２５コピー／μｌとし、濃度調製は１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で行った。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件により核酸増幅および融解曲線分析を行い核酸プローブと核酸増幅産物との複合体を検出した。分析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いた。
【０１０９】
［核酸増幅用試薬］
以下の試薬を含む溶液を調製した。核酸プライマーの組み合わせは表３に記載した。
１００μＭフォワードプライマー（配列番号１０、１１、１２、１３のいずれか）０．２５μｌ
１００μＭリバースプライマー（配列番号１４、１５、１６、１７のいずれか）０．０５μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号１、５´末端ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３´末端リン酸化）０．０３μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号２、５´末端ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３´末端リン酸化）０．０３μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号３、３´末端リン酸化）０．０６μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μｌ
ＤＭＳＯ  ０．３２μｌ
精製水  ０．４６μｌ
試料  ４μｌ
（試料として、ＷＴを使用した）
【０１１０】
【表３】
0006379871.tif 000004
【０１１１】
［核酸増幅および融解曲線分析］
実施例２に同じ
【０１１２】
［結果］
図１９は、配列番号１０からなる塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号１４からなる塩基配列を有するリバースプライマーとで構成される核酸プライマーセットと、配列番号１〜３からなる塩基配列をそれぞれ有する核酸プローブとを用いて、ＷＴを試料として核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。
同様に図２０〜２９は表３に記載した核酸プライマー組み合わせで同様の実験を行った結果である。本実施例から、本発明の検出方法および本発明で用いられる核酸プローブセットは、特定の塩基配列を有する核酸プライマーによる核酸増幅産物を対象とせず、様々な塩基配列を有する核酸プライマーセットを用いて得られた核酸増幅産物を対象とした検出が可能であることが示された。
【０１１３】
〔実施例４：異なる塩基配列を有する核酸プローブを用いた本発明の方法によるｒｐｏＢ遺伝子検出〕
実施例１、２とは異なる塩基配列を有する核酸プローブを用いて、ｒｐｏＢ遺伝子を検出し、かつ野生型ｒｐｏＢ遺伝子と変異型ｒｐｏＢ遺伝子とを鑑別できることを示す実験を行った。
（１）試料の調製
実施例１、２で使用した試料のうちＷＴ、５１１ＧＴＧ、５１２ＧＧＣ、５３１ＴＴＧを使用した。濃度は２５コピー／μｌとし、濃度調製は１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で行った。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件により核酸増幅および融解曲線分析を行い核酸プローブと核酸増幅産物との複合体を検出した。分析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いた。
【０１１４】
［核酸増幅用試薬］
以下の試薬を含む溶液を調製した。試料には前記野生型または変異型ｒｐｏＢ陽性試料を２５コピー／μｌとなるように濃度調製したものを使用した。核酸プライマーの組み合わせは表２に記載した。
１００μＭフォワードプライマー（配列番号１０、１１、１２、１３のいずれか）０．２５μｌ
１００μＭリバースプライマー（配列番号１４、１５、１６、１７のいずれか）０．０５μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号４、３´末端ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．０３μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号５、３´末端ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．０３μｌ
１００μＭ核酸プローブ（配列番号６、３´末端リン酸化）０．０６μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）４μｌ
ＤＭＳＯ  ０．３２μｌ
精製水  ０．４６μｌ
試料  ４μｌ
【０１１５】
［核酸増幅および融解曲線分析］
実施例２に同じ
【０１１６】
［結果］
図３０は、配列番号１０からなる塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号１４からなる塩基配列を有するリバースプライマーとで構成される核酸プライマーセットと、配列番号４〜６からなる塩基配列をそれぞれ有する核酸プローブとを用いて、ＷＴおよび５１１ＧＴＧを試料として核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。
同様に図３１、３２は５１１ＧＴＧの代わりに、５１２ＧＧＣ、５３１ＴＴＧを試料として同様の実験を行った結果である。本実施例から、本発明で用いる核酸プローブは配列番号１〜３に限定されず、左記とは異なる塩基配列を有する核酸プローブも使用可能であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明により、閉鎖系でのｒｐｏＢ遺伝子検出が可能となった。また、当該遺伝子検出系は従来の検査キットよりも短時間での検査が可能であることを確認した。これにより、迅速、確実かつ簡便な結核菌のリファンピシリン耐性遺伝子変異の検出が可能になった。
【図１】
0006379871.tif 000005
【図２】
0006379871.tif 000006
【図３】
0006379871.tif 000007
【図４】
0006379871.tif 000008
【図５】
0006379871.tif 000009
【図６】
0006379871.tif 000010
【図７】
0006379871.tif 000011
【図８】
0006379871.tif 000012
【図９】
0006379871.tif 000013
【図１０】
0006379871.tif 000014
【図１１】
0006379871.tif 000015
【図１２】
0006379871.tif 000016
【図１３】
0006379871.tif 000017
【図１４】
0006379871.tif 000018
【図１５】
0006379871.tif 000019
【図１６】
0006379871.tif 000020
【図１７】
0006379871.tif 000021
【図１８】
0006379871.tif 000022
【図１９】
0006379871.tif 000023
【図２０】
0006379871.tif 000024
【図２１】
0006379871.tif 000025
【図２２】
0006379871.tif 000026
【図２３】
0006379871.tif 000027
【図２４】
0006379871.tif 000028
【図２５】
0006379871.tif 000029
【図２６】
0006379871.tif 000030
【図２７】
0006379871.tif 000031
【図２８】
0006379871.tif 000032
【図２９】
0006379871.tif 000033
【図３０】
0006379871.tif 000034
【図３１】
0006379871.tif 000035
【図３２】
0006379871.tif 000036
【配列表】
0006379871000001.app