(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
食餌療法を必要とする対象に、
第１の期間に第１の食事制限を施すための食事制限パッケージの製造方法において、前記第１の食事制限が、第１日に対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり４．５〜７キロカロリーおよび前記第１の食事制限の第２〜第５日に１日当たり対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり３〜５キロカロリーを提供し、前記食事制限パッケージが、第１のセットを含み、当該第１のセットに、
第１日用に３０グラム未満の糖、
第２〜第５日用に２０グラム未満の糖、
第１日用に２８グラム未満のタンパク質、
第２〜第５日用に１８グラム未満のタンパク質、
第１日用に２０〜３０グラムの一価不飽和脂肪、
第２〜第５日用に１０〜１５グラムの一価不飽和脂肪、
第１日用に６〜１０グラムの多価不飽和脂肪、
第２〜第５日用に３〜５グラムの多価不飽和脂肪、
第１日用に１２グラム未満の飽和脂肪、
第２〜第５日用に６グラム未満の飽和脂肪、および
第２〜第５日用に１日当たり１２〜２５グラムのグリセロール
を含めることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記食事制限パッケージが、第２の期間に前記対象に第２の食事制限を施すための第２のセットを更に含み、前記第２の食事制限が、前記第１の食事制限後の２５〜２６日間、対象の通常のカロリー消費量の１０パーセント以内にある総カロリー消費量を提供することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記第１の食事制限および前記第２の食事制限の組み合わせが、前記対象の通常のカロリー摂取量の１０パーセント以内のカロリーの総数を前記対象に提供することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記第１の食事制限が、終日の食物繊維の一日推奨量の少なくとも５０％を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記対象が、体重減少を必要とすることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記対象が、組織再生を必要とすることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、ＩＧＦ−Ｉのレベルが減少し、ＩＧＦＢＰ１のレベルが増加することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、癌の危険性または症状が低下することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、炎症疾患の危険性または症状が低下することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、皮膚炎の危険性または症状が低下することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、骨密度の損失の危険性または症状が低下することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、肝障害の危険性または症状が低下することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、前記対象が、幹細胞、前駆細胞、または胚様幹細胞再生を必要とすることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記対象が、若く健康な哺乳動物／ヒトにおいて観察されるものと類似するＷＢＣ再生および／またはバランスのとれたリンパ／骨髄比を必要とすることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、免疫制御、免疫不全、および免疫抑制の危険性または症状が低下することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、前記対象が、若いおよび高齢の哺乳動物の両方における短期記憶、長期記憶、および運動協調性に共に関係する神経発生および認知機能の改善を必要とすることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法において、前記対象が、認知低下の逆転を必要とすることを特徴とする方法。
【請求項１８】
対象に第１の期間に施されることになっている第１の食事制限のための食料の第１のセットを含む食事制限パッケージであって、前記第１の食事制限が、第１日に対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり４．５〜７キロカロリーおよび前記第１の食事制限の第２〜第５日に１日当たり対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり３〜５キロカロリーを提供し、前記食事制限パッケージが、
第１日用に３０グラム未満の糖、
第２〜第５日用に２０グラム未満の糖、
第１日用に２８グラム未満のタンパク質、
第２〜第５日用に１８グラム未満のタンパク質、
第１日用に２０〜３０グラムの一価不飽和脂肪、
第２〜第５日用に１０〜１５グラムの一価不飽和脂肪、
第１日用に６〜１０グラムの多価不飽和脂肪、
第２〜第５日用に３〜５グラムの多価不飽和脂肪、
第１日用に１２グラム未満の飽和脂肪、
第２〜第５日用に６グラム未満の飽和脂肪、および
第２〜第５日用に１日当たり１２〜２５グラムのグリセロール
を含むことを特徴とする食事制限パッケージ。
【請求項１９】
請求項１８に記載の食事制限パッケージにおいて、第２の期間に前記対象に施されることになっている第２の食事制限のための食料の第２のセットをさらに含み、前記第２の食事制限が、前記第１の食事制限後の２５〜２６日間、対象の通常のカロリー消費量の１０パーセント以内にある総カロリー消費量を提供することを特徴とする食事制限パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１０月２２日に提出された米国仮特許出願第６１／７１６，６７６号明細書、２０１２年１２月１２日に提出された米国仮特許出願第６１／７３６，３０８号明細書、および２０１２年１２月２８日に提出された米国仮特許出願第６１／７４６，７８７号明細書の利益を主張し、これらの開示は、本明細書において参照によってそれらの全体が組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、契約番号ＰＯ１ＡＧ０３４９０６、ＰＯ１ＡＧ０３４９０６−０１、およびＰＯ１ＡＧ０２０６４２の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、組織および／または器官再生を増進するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
再生療法は、変性疾患または加齢に関連する、化学療法または放射線治療によって引き起こされる、損傷した組織／器官の補充において使用されてもよい。
【０００５】
従来の再生療法は、ドナー由来の再生細胞の導入および／または再生を刺激する生物学的に活性な分子の投与に一般に依存する。倫理的な問題に加えて、幹細胞の単離、維持、増殖、ドナー−レシピエントマッチング、および移植における技術的なおよび安全性の難題が、存続し、既存の従来の再生療法の有用性および実用性を制限している。従来の療法は、典型的に、組織再生を必要とする患者に有効な処置を有する食事療法プロトコールを利用してこなかった。食事制限は、様々な環境において組織保護をもたらすことが知られているが。従来の療法の主な弱みは、胎児における組織発生に至る発生プロセスによく似ている協調的な再生プロセスの欠如である。本出願において記載される製剤および方法は、これらの弱みを改善することができる。
【０００６】
栄養失調を伴わないカロリー制限（ＣＲ）は、加齢および酸化ストレスから脳を保護するのに有効である（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。いくつかの研究は、げっ歯動物における認知機能における年齢依存性の衰弱から保護する際のこの食事療法による介入についての有益な役割を支持する（Ｆｏｎｔａｎ−Ｌｏｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。そのうえ、ＣＲは、いくつかの動物モデルにおいて、発作、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、およびアルツハイマー病（ＡＤ）を含む神経変性疾患に対して優れた神経保護特性を示す（Ｍａｔｔｓｏｎ  ２００５；  Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。
【０００７】
様々なＡＤマウスモデルにおける最近の研究は、食物摂取量を低下させることがＡＤ関連性の神経病理および認知機能障害を縮小することができることを報告した。たとえば、ＣＲは、ＦＡＤ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）、ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）、およびＡＰＰ＋ＰＳ−１（プレセニリン１）（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；  Ｍｏｕｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）について突然変異を持つＡＤマウスの海馬および大脳皮質においてβアミロイド（Αβ）沈着の進行を低下させる。ＣＲは、ｃＤＫＯ（コンディショナルダブルノックアウト）ＡＤマウスにおいて、物体認識および恐怖条件付け文脈学習（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  ｆｅａｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ）によって評価される神経変性表現型を寛解させる（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。Ｍａｔｔｓｏｎおよび共同研究者らは、ＣＲはまた、年齢関連性の記憶障害を寛解させることも、ＡＤ（ＰＳ−１、ＡＰＰ）および前頭側頭型認知症（タウ）に関連づけられる突然変異を過剰発現するトリプルトランスジェニックマウス（３×Ｔｇ−ＡＤ）においてΑβおよびリン酸化タウ蓄積物を減少させることもできることを示した（Ｈａｌａｇａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。ヒト集団における研究もまた、食事制限がＡＤにおいて重要な役割を果たし、食物摂取量の低下が、この病態から保護するかもしれないことを示唆する。たとえば、Ｌｕｃｈｓｉｎｇｅｒおよび共同研究者らによる疫学的な研究は、低カロリー摂取量の個人がＡＤを発症する危険性が低下したという証拠を提供した（Ｌｕｃｈｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。
【０００８】
ＣＲによって引き起こされる多数の代謝のおよび生理学的な変化の中で、成長ホルモン（ＧＨ）／インスリン様因子（ＩＧＦ−１）シグナル伝達軸の低下は、その保護効果にとって重要であるかもしれない（Ｆｏｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。循環ＩＧＦ−１は、主として、エネルギー代謝、細胞増殖、細胞分化、身体の大きさ、および寿命を調節する肝臓によって産生されるホルモンである。ＩＧＦ−１レベルは、カロリーおよび／またはタンパク質利用率によって調節され、長期的なＣＲは、げっ歯動物においておよそ３０〜４０％、血清ＩＧＦ−１濃度を減少させる（Ｔｈｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４）が、タンパク質摂取量もまた低下させない限り、ヒトにおいて減少しない（Ｆｏｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）／ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性を減少させる突然変異は、ＣＲと同様に、寿命を延長し、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）を含めて（Ｐａｒｒｅｌｌａ＆Ｌｏｎｇｏ  ２０１０）、広範囲の生物および組織においてストレス抵抗性を増強することができる（Ｋｅｎｙｏｎ  ２００５）。これらの栄養的介入および遺伝的介入によって改変される経路の間の重なり合いは、部分的であるようにしか思われないが、ＩＧＦ−１レベルにおける低下が、ＣＲによってもたらされる有益な効果の一部を媒介し得ることが提唱された（Ｓｏｎｎｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。この理論を支持するものとして、最近、ＡＰＰ突然変異およびＰＳ−１突然変異を持つＡＤマウスにおいてＩＧＦ−１シグナル伝達を低下させることが、認知障害および神経炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を含むアルツハイマー病様の疾患症状から保護することが示された（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。特に、ＧＨ受容体欠損（ＧＨＲＤ）のマウスおよびヒトは、大病から保護され（Ｇｕｅｖａｒａ−  Ａｇｕｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１；  Ｉｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；  Ｍａｓｔｅｒｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）、ＧＨＲＤマウスは一貫して４０％長く生きる（Ｃｏｓｃｈｉｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）。さらに、アシュケナージのユダヤ人の百歳以上の人のコホートに対して実行された研究は、コントロールと比較して、百歳以上の人の中でＩＧＦ−１シグナル伝達の低下をもたらすヒトＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）上の遺伝子改変を同定した（Ｓｕｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。他方では、ライフスパンに対するＩＧＦ−１欠損またはＩＧＦ−１Ｒ欠損の影響は一貫せず（Ｂｏｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）、ＩＧＦ−１の低下が、ＧＨＲ欠損の抗加齢効果の媒介物のうちの１つにすぎないかもしれないことを示唆する。
【０００９】
タンパク質およびアミノ酸（ＡＡ）の利用率は、ＩＧＦ−１遺伝子発現の調節において重要である。さらに、タンパク質制限は、ＩＧＦ−１産生速度を減少させるだけではなく、その排除を加速し、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）とのＩＧＦ−１相互作用を調節し、ＩＧＦ−１の生物学的作用を弱める（Ｋｅｔｅｌｓｌｅｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）。ＣＲは、維持するのが非常に困難であり、体重減少、性欲の損失、飢餓、通常の室温で寒く感じること、および免疫系副作用の可能性に余儀なく関連するので。
【００１０】
したがって、アルツハイマー病および／または他の変性疾患の症状を軽減するためのならびに組織再生を増進するための食事療法プロトコールについての必要性がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、少なくとも１つの実施形態では、食餌療法を必要とする対象を処置するための方法を提供することによって、先行技術の１つ以上の問題を解決する。方法は、食餌療法を必要とする対象を同定するステップおよび第１の期間に対象に第１の食事制限を施すステップを含む。第１の食事制限は、第１日に対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり４．５〜７キロカロリーおよび第１の食事制限の第２〜第５日に１日当たり対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり３〜５キロカロリーを提供する。第１の食事制限は、第１日に３０ｇ未満の糖；第２〜第５日に２０ｇ未満の糖；第１日に２８ｇ未満のタンパク質；第２〜第５日に１８ｇ未満のタンパク質；第１日に２０〜３０グラムの一価不飽和脂肪；第２〜第５日に１０〜１５グラムの一価不飽和脂肪；第１日に６〜１０グラムの多価不飽和脂肪；第２〜第５日に３〜５グラムの多価不飽和脂肪；第１日に１２ｇ未満の飽和脂肪；第２〜第５日に６グラム未満の飽和脂肪；および第２〜第５日に１日当たり１２〜２５グラムのグリセロールを含む。
【００１２】
他の実施形態では、上記に示される食事制限プロトコールを実施する食事制限パッケージが、提供される。食事制限パッケージは、対象に第１の期間に施されることになっている第１の食事制限のための食料の第１のセットを含み、第１の食事制限は、第１日に対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり４．５〜７キロカロリーおよび第１の食事制限の第２〜第５日に１日当たり対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり３〜５キロカロリーを提供する。食事制限パッケージは、第１日に３０ｇ未満の糖；第２〜第５日に２０ｇ未満の糖；第１日に２８ｇ未満のタンパク質；第２〜第５日に１８ｇ未満のタンパク質；第１日に２０〜３０グラムの一価不飽和脂肪；第２〜第５日に１０〜１５グラムの一価不飽和脂肪；第１日に６〜１０グラムの多価不飽和脂肪；第２〜第５日に３〜５グラムの多価不飽和脂肪；第１日に１２ｇ未満の飽和脂肪；第２〜第５日に６グラム未満の飽和脂肪；および第２〜第５日に１日当たり１２〜２５グラムのグリセロールを提供する食料を含む。
【００１３】
他の実施形態では、対象において、幹細胞および／または前駆細胞の数を増加させるための方法が提供される。方法に従って、幹細胞および／または前駆細胞の数の増加を必要とする対象が同定され、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性の低下が誘発される。
【００１４】
他の実施形態では、免疫無防備状態の対象において症状を軽減するまたは対象の免疫状態を押し上げるための方法が提供される。方法は、免疫無防備状態の対象または免疫状態の改善を所望する対象を同定するステップおよび次いで、免疫無防備状態の対象においてＰＫＡ活性の低下を誘発するステップを含む。
【００１５】
他の実施形態では、対象に、細胞造血幹細胞／前駆細胞を移入するための方法が提供される。方法は、免疫無防備状態の対象を同定するステップを含む。プロテインキナーゼＡ活性および／またはＩＧＦ−Ｉ受容体レベルの低下は、ドナーの骨髄または幹細胞において誘発される。処置後、次いで、細胞は、再生を必要とする免疫無防備状態のまたは他の対象の中に移植される。
【００１６】
他の実施形態では、再生細胞の増殖を増進するための方法が提供される。方法は、第１の期間および第２の期間に対象に食事制限プロトコールを施すステップを含む。第１の期間の間に、少なくとも５０パーセントのカロリーが脂肪に由来する低カロリー食事制限が、対象に提供される。第２の期間の間に、せいぜい９００ｋｃａｌ／日の第２の低カロリー食事制限が、対象に提供される。任意選択で、再生細胞が対象から単離され、レシピエントへ移入される。
【００１７】
他の実施形態では、アルツハイマー病の症状を軽減するための方法が提供される。方法は、あるアミノ酸を有するアミノ酸特異的な食事制限を施すステップを含む。この実施形態では、通常の食事制限およびタンパク制限食のサイクル（タンパク質制限サイクル、ＰＲＣ）の長期的な交替が、Αβおよびタウの病態の両方を蓄積している３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいてＧＨＲ／ＩＧＦ−１レベル／シグナル伝達を低下させ、ＡＤ様の症状を寛解させることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、マウスおよびヒトにおける体組成に対する、断食を模倣する食事制限（ＦＭＤ）の効果を示す表９を提供する。１６．５月齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、体重をルーチン的に測定した。１サイクルのＦＭＤは、適宜食物を供給したコントロールと比較して１８％、体重を有意に低下させた。再供給後、重量における有意な差異は存続せず、すべてのマウスが第１のサイクルの終了後に食事療法措置から回復したことを示す。重量における減少は、サイクルの４日すべてを考慮した場合、−８０％低下した、ＦＭＤサイクルの間の比較的低いカロリー摂取量に帰することができる。マウスに再供給の間にわずかな過剰摂取によってＦＭＤ供給後に補い、したがってカロリー摂取量を標準化したので、カロリー摂取量における差異は、食事制限およびコントロール群の間で観察されなかった。全体脂肪ならびに下位区分の脂肪沈着物（皮下および内臓）に対するＦＭＤレジメンの長期的な効果は、Ｘ線コンピューター断層撮影（ＣＴ）走査によって評価した。２８月齢時、２３ＦＭＤサイクルの終了後に、肥満に関連する病態に密接に関係する全体脂肪および内臓体脂肪は、ＦＭＤマウスにおいて低下した。皮下脂肪沈着物に対しては小さな効果しか測定可能ではなかった。ヒトにおいて、断食を模倣する食事制限の１および３サイクルの後に、体重（ＦＭＤの開始前のベースライン値と比較した％として）は、有意に低下し、したがって、前臨床実験において見られるような類似する効果を有する。ＦＭＤの３サイクルの終了に際してのヒト対象についての相対的体幹脂肪パーセンテージは、「二重エネルギーＸ線吸収測定法」（ＤＥＸＡ）によって評価した。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、コントロールまたはベースラインと比較。
【図２】図２は、マウスおよびヒトにおける血液バイオマーカーに対する、断食を模倣する食事制限の効果を示す表１０を提供する。適宜に食物を供給したコントロール動物と比較して、ＦＭＤ食事制限を１６．５月齢時に開始して維持したマウスは、ライフスパンにわたって癌発生率が有意に低下した。そのうえ、癌進行は、ＦＭＤの食物を供給したマウスにおいて有意に遅延した。約３３か月のＣ５７ＢＬ／６マウス株の最大のライフスパンを考慮すると（データ示さず）、ＦＭＤ食事制限は、３．５か月または１０％、癌の進行の発症を遅延させた。腫瘍発症および進行を増進することを発明者らおよび他が示したグルコースおよびＩＧＦ−１は、ＦＭＤレジメンの間に有意に低下した。ＩＧＦ−１に結合し、その生物学的利用率を低下させるＩＧＦＢＰ−１は増加し、それによってＩＧＦ−１シグナル伝達をさらに低下させた。ヒトにおいて、癌発生率または発症についてのデータは入手可能ではない。前臨床データと同様に、ＩＧＦ−１は、第１および第３ＦＭＤサイクルの後に低下した。ＩＧＦＢＰ−１レベルは増加した。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、コントロールまたはベースラインと比較。
【図３】図３は、断食を模倣する食事制限がげっ歯動物における炎症を低下させることを例証する表１１を提供する。適宜に食物を供給したコントロール動物と比較して、ＦＭＤ食事制限を１６．５月齢時に開始して維持したマウスは、死体解剖時に検出された、炎症を起こした組織の発生率が有意に低下した。炎症を起こした組織は、とりわけ、雌のマウスの肝臓および生殖器系を含んだ（図示せず）。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（両方の性別）は、進行的に悪化する潰瘍性皮膚炎を特に発症しがちである。ＦＭＤ食事制限により食物を供給した雌のマウスは、適宜食物を供給したコントロール動物と比較して、それらのライフスパンにわたって皮膚炎発生率における５０％の低下を示した（それぞれ１０．３％対１９．６％）。＊ｐ＜０．０５、コントロールと比較。
【図４】図４は、骨塩量に対する、断食を模倣する食事制限の効果を示す表１２を提供する。大腿部の骨の骨塩量［ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）ｍｇ／ｃｍ３で］は、１２および２８月齢のコントロールの食物を供給した動物においておよび２８月齢（再供給）時にインビボにおいてＦＭＤコホートにおけるマウスの再供給の７日後に、Ｘ線コンピューター断層撮影（ＣＴ）走査によって分析した。骨塩量における低下は、１２〜２８月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて観察された。しかしながら、ＦＭＤ食事制限を１６．５月齢時に開始して食物を供給したマウスは、それらの適宜に食物を供給し、年齢が一致したカウンターパートと比較した場合に、骨塩量の損失の有意な低下を示した。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして示す。ΛΛΛｐ＜０．００１、中年群と比較。＊ｐ＜０．０５、高齢と比較。
【図５】図５は、肝臓再生に対する、断食を模倣する食事制限の効果を示す表１３および写真を提供する。適宜食物を供給したコントロール由来の２０〜２２．５月齢のマウスと比較して、１６．５月齢時に実験的なＦＭＤ食事制限を開始して食物を供給した動物は、肝臓重量を有意に低下させ、ＦＭＤレジメンの終了時にもとの肝臓質量の約３５％を失った。肝細胞の損傷および肝臓健康の評価のための臨床診断マーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、ＦＭＤレジメンの終了時に上昇したが、７日間の再供給の内に通常のレベルに戻った。ＡＬＴにおける増加は、ＦＭＤが肝細胞を萎縮させたという観察と一致する（Ｂ、アスタリスク）。しかしながら、再供給に際して、肝臓重量は正常な重量に戻り、さらにそれを超過し（＋１０％）、コントロール（Ａ）および再供給の２４時間後のＦＭＤ群（Ｂ）の肝臓Ｈ＆Ｅ染色は、静脈のまわりの非組織的細胞（矢印）の浸潤を示し、再供給直後の［若い］肝細胞による肝臓再生および再増殖を示す。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして示す。＊＊ｐ＜０．０１、コントロールと比較。
【図６】図６は、短期間の飢餓（ＳＴＳ）または断食を模倣する食事制限のサイクルがマウスおよびヒト対象において幹細胞／前駆細胞を刺激することを示す表１４およびプロットを提供する。骨髄中に存在する造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ、Ａ）ならびに非造血間葉系および内皮幹細胞／前駆細胞（ＭＳＣ／ＥＰＣ、Ｂ）の頻度は、マウスにおいて、ＳＴＳまたはＦＭＤのサイクルの繰り返しの後に増加する。ＨＳＰＣ（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−ｌ＋Ｃ−ｋｉｔ＋）は、血球のすべての系列を構成する多分化能前駆細胞である。ＭＳＣ／ＥＰＣ（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５−）は、特異的な結合組織に分化することができる多分化能前駆細胞である。同様に、ＦＭＤのサイクルの後のヒト末梢血において循環するＨＳＰＣ（Ｃ、Ｌｉｎ−ＣＤ１８４＋ＣＤ４５＋）およびＭＳＣ／ＥＰＣ（Ｄ、Ｌｉｎ−ＣＤ１８４＋ＣＤ４５−）細胞の頻度は増加する。表におけるデータは平均±ＳＤとして示し、図におけるデータは平均±ＳＥＭとして示した。
【図７】図７は、絶食のサイクルが、化学療法が骨髄抑制を誘発した後に、マウスおよびヒト対象において造血再生を改善することを示す表１５を提供する。化学療法前の絶食ありおよびなしの化学療法による処置のサイクルの後のマウスおよびヒト対象の血液プロファイルを示す。絶対白血球（ＷＢＣ）数およびリンパ球数を自動血球分析機器により測定した。免疫系ホメオスタシスの指標であるリンパ−骨髄比（Ｌ／Ｍ）は、個人当たりのリンパ球の総数／骨髄性細胞の数として計算した。マウスおよびヒトでは、化学療法による処置は、ＷＢＣ、リンパ球、およびＬ／Ｍ比の数を低下させた。化学療法前の絶食の組み合わせは、これらの影響を寛解させ、測定したすべてのパラメーターを通常のレベルに維持した。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして示す。
【図８】図８は、断食を模倣する食事制限のサイクルが、マウスおよびヒト対象において造血再生を改善し、年齢依存性の骨髄抑圧を遅延させることを示す表１６を提供する。免疫系ホメオスタシスの指標であるリンパ−骨髄比（Ｌ／Ｍ）は、マウスおよびヒト対象において年齢とともに減少する。マウスでは、１０月齢時のＦＭＤの供給は、骨髄抑圧の影響を遅延させ、有意な年齢依存性の低下は、測定することができなかった。ヒトでは、ＦＭＤの１サイクルは、様々な年齢の群においてＬ／Ｍ比を再建した。若い動物およびヒトについての参照Ｌ／Ｍ比は、赤色の太字で示す。データはすべて平均±ＳＥＭとして示す。
【図９】図９は、成長ホルモン受容体ノックアウト（ＧＨＲＫＯ）マウスにおける、短期間の飢餓による、造血幹細胞（ＨＳＰＣ）の数ならびに非造血間葉系および内皮幹細胞／前駆細胞（ＭＳＣ／ＥＰＣ）の頻度の増加を示す。（Ａ）野生型（同腹仔、ＬＭ）およびＧＨＲ／ＩＧＦ−１欠損を有する成長ホルモン受容体ノックアウト（ＧＨＲＫＯ）マウスにおける造血幹細胞（ＨＳＣ、Ｌｉｎ−Ｓｃａ−ｌ＋Ｃ−ｋｉｔ＋）。（Ｂ）シクロホスファミド（ＣＰ）化学療法による６サイクルの処置は、マウスにおけるＭＳＣ／ＥＰＣ（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５−）頻度に対して効果を全く有していなかった（点線は、未処置動物におけるレベルを示す）。ＳＴＳと組み合わせた場合、ＭＳＣ／ＥＰＣ（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５−）頻度は、有意に上昇した。（Ｃ）同様に、それらの野生型同腹仔と比較して、ＣＰにより処置した場合、ＧＨＲＫＯマウスは高ＭＳＣ／ＥＰＣ頻度を有した。これは、ＧＨＲ／ＩＧＦ−１欠損が、ＳＴＳ効果を模倣し、骨髄由来の幹前駆細胞を刺激することができることを示唆する。
【図１０】図１０は、ＰＫＡシグナル伝達の阻害が短期間の飢餓を模倣し、骨髄由来の幹細胞／前駆細胞を増加させ、造血再構成を刺激することを示す。（Ａ）体外培養した骨髄細胞における造血幹細胞（ＨＳＰＣ．  Ｌｉｎ−Ｓｃａ−ｌ＋Ｃ−ｋｉｔ＋）および（Ｂ）ＭＳＣ／ＥＰＣ（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ＣＤ４５−）を２４時間、コントロールまたはＳＴＳ（４８時間）マウスに由来する１０％血清を補足した標準的な培養培地においてインキュベートした。絶食マウス由来の血清は、ＨＳＰＣおよびＭＳＣ／ＥＰＣの数を有意に増加させた。（ＣおよびＤ）ＰＫＡＣα  ｓｉＲＮＡによる処置は同様の増加をもたらし、ＰＫＡシグナル伝達における低下が、絶食を模倣し、骨髄由来幹細胞／前駆細胞を刺激することを示す。（ＥおよびＦ）競合再増殖アッセイは、インビボにおいてＨＳＰＣの血液再構成能力を試験するために実行した。適宜食物を供給したマウス（Ｅ、コントロール）および４８時間絶食マウス（Ｅ、ＳＴＳ）から収集した骨髄細胞を、免疫無防備状態のレシピエントマウスに移植した。競合細胞に対する比でのドナーＨＳＰＣによって再生成された血球をドナー由来の細胞の移植の％として測定した。絶食マウス（Ｅ）由来の骨髄細胞と同様に、ＰＫＡ  ｓｉＲＮＡにより処置した骨髄細胞の再構成能力は有意に改善された（Ｆ）。
【図１１】図１１は、脳および認知機能に対する、断食を模倣する食事制限の効果を示す表１７およびプロットを提供する。マウスにおける増殖インデックスおよび成人の神経発生は、ＦＭＤ食事制限の第１２サイクルの４日前に開始したブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組み込みに基づいて評価し、年齢が一致する適宜食物を供給したコントロール（２３月か月）と比較した。ＢｒｄＵ陽性細胞は、顆粒細胞ゾーンにおいて上昇する。ＤＣＸ＋染色は、歯状回における未成熟神経細胞を測定するために実行した。ＦＭＤ群では、ＢｒｄＵ保持細胞の１７．６％はまた、コントロールにおける３．１Ｔと比較して、ＤＣＸについても陽性であり、ＦＭＤ群が、神経細胞系列に傾倒した神経前駆細胞を増加させたことを示す。データはすべて平均±ＳＥＭとして示した。＊ｐ＜０．０５、適宜食物を供給したマウスと比較。成人の神経発生は、老齢のマウスにおいて、運動協調性能力、短期間の認識、および長期的な空間認識能に密接に結び付けられた。運動協調性および運動能力学習を試験するために、コントロールおよびＦＭＤコホート由来のマウスを加速ロータロッド（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｒｏｔａｒｏｄ）により試験した（Ａ）。６回の治験セッションの中のベストスコア（秒で）は、２３月齢の適宜食物を供給したマウスと比較して、ＦＭＤコホートにおけるマウスについて有意に改善された。空間認識および短期の間記憶は、新規な物体認識試験（Ｂ）およびＹ迷路（Ｃ）により評価した。新規な物体認識行動試験は、状況依存性の記憶を評価し、よく知られている物体と新規な物体の間で費やされた時間（秒で）の比として定義される認識インデックスとして計算する。調整の間に、２つの同一の物体を長方形のケージの内部に置き、両方の物体を探索するのに費やされた時間を記録した。この調整期間の後に、一方の物体を新規な物体と交換し、両方の物体を探索するのに費やされた時間を記録した（Ｂ）。ＦＭＤコホートにおけるマウスは、この試験において有意により良好に機能し、より良好な物体関連性の短期間の記憶を示した。（Ｃ）作業記憶機能は、Ｙ迷路における自発的交替行動（ＳＡＢ）に基づいて調査した。ＦＭＤの食物を供給したマウスは、適宜食物を供給したマウスよりも有意に良好にこの試験において機能した。（Ｄ〜Ｈ）空間学習は、コントロールおよびＦＭＤ群における動物について２３月齢時にＢａｒｎｅｓ迷路により試験した。エラーの数（Ｄ、あらゆる偽標的穴に対するノーズポークおよび頭部のふれとして定義される）、逃避箱からのずれ（Ｅ、逃避箱からどれだけの穴が離れているかを第１のエラーとした）、潜伏時間（Ｆ、マウスが逃避箱に入るのにかかった時間）、ならびに成功率（Ｇ、１００％、２分以内に逃避箱を見つけるまたは０％＞、２分以内に逃避箱を見つけない）を記録した。記憶保持は、１５日目にそれぞれのマウスを試験することによって評価し、測定値は、それぞれのマウスについての値を得るための２回の試験から平均した。（Ｈ）検索戦略は、ランダム（迷路の中心を横断することによって切り離される局所的な穴検索）、連続的（時計回りもしくは反時計回り方向の規則正しい穴検索）、または空間的（共に３以下のエラーおよびずれ��コアで逃避箱に直接動く）に分類した。ＦＭＤの食物を供給したコホートにおけるマウスは、１５日目に、優れた検索戦略およびそれらの逃避箱についてのより良好な記憶力を示し、したがって、運動学習ならびに海馬依存性の短期的なおよび長期的な記憶において認知能力の改善を実証する。Ａ〜Ｈにおけるバーは平均値を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、適宜食物を供給したマウスと比較。
【図１２】図１２は、ヒト対象に対して調整した、断食を模倣する食事制限のカロリーの概要を示す表１８を提供する。断食を模倣する食事制限（ＦＭＤ）、Ｐｒｏｌｏｎは、栄養物を最大限にしながら絶食様の応答を誘発する。食事制限の５日間のそれぞれの日についての摂取カロリーならびに体重４５３．５９グラム（１ポンド）および１キログラム当たりに調整したｋｃａｌを示す。５日の食事療法レジメンの間に摂取されたカロリーにおける低下（△５日）は、１）１日当たり２，０００カロリーの食事制限に基づいてまたは２）それぞれ≧２００、１５０〜２００、および≦１５０ｌｂの人の重量について２，８００、２，４００、および２，０００カロリーの食事制限に基づいて示す。
【図１３】図１３は、１８０〜２００ｌｂヒト対象に対して調整した、それぞれの食事制限日について定められた多量栄養素含有量を示す表１９を提供する。平均１８０〜２００ｌｂの人に基づく５日のＦＭＤレジメンのそれぞれの日についての多量栄養素含有量。食事制限の１日目のカロリー摂取量は、身体が低カロリー摂取に順応するのを可能にするために、以降の日（２〜５）と比較して、それほど低下させない。Ｐｒｏｌｏｎレジメンのそれぞれの日について脂肪、炭水化物（詳細には糖による）、およびタンパク質が寄与するカロリーの％を示す。
【図１４】図１４は、本発明の変形における１８０〜２００ｌｂヒト対象に対して調整した、それぞれの食事制限日について定められた微量栄養素含有量を示す表２０を提供する。平均１８０〜２００ｌｂの人に基づく５日のＦＭＤレジメンのそれぞれの日についての微量栄養素含有量。一日量のパーセント（％  ＤＶ）は、２，０００カロリーの食事制限に基づいて計算する。＊微量栄養素のうちのいくつかについては、ＤＶは定められない；示す値は、参照一日摂取量（ＲＤＩ）に基づく。
【図１５】図１５は、体重およびカロリー摂取プロファイルを提供する。（Ａ）研究において使用されるコントロールおよびＰＲＣ食事療法レジメンを示す図。（Ｂ、Ｃ）マウス体重は、０日目にスコア化した初期重量のパーセンテージとして測定し、プロットした（群当たり１３〜１５匹の動物）。マウスは、最初の２週間、毎日（Ｂ）および残りの１６週間、毎週（Ｃ）、計量した。（Ｂ）食事療法による介入の最初の２週間、ＰＲＣレジメンを受けさせたＷＴおよび３×Ｔｇ−ＡＤのマウスは、対応するコントロールと比較した場合に、有意に異なる体重プロファイルを示した（＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ＷＴおよび３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ群ならびに対応するコントロールの間の異なる体重プロファイルは、食事療法処置の全１８週間にわたって維持された（＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。さらに、発明者らは、３×Ｔｇ−ＡＤコントロールおよびＰＲＣ群ならびに対応するＷＴ動物の体重プロファイルの間の有意な差異を見つけた（＋＝ｐ＜０．０５、３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対ＷＴコントロールおよび３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ対ＷＴ  ＰＲＣ）。（Ｄ、Ｅ）体重のグラムについて標準化したカロリー摂取量は、食事療法処置の最初に（１および２週目、Ｄ）ならびにの終了時に（１７〜１８週目、Ｅ）、毎日スコア化し、ＰＲ食および通常の食事制限の再供給の２週間を組み合わせて計算したパーセンテージとして表現した。
【図１６】図１６は、ＰＲＣレジメンが血中グルコースレベルを変更しないが、循環ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰを調整することを示す。（Ａ）血中グルコースレベルは濃度（ｍｇ／ｄＬ）として表現する。有意な差異は実験群（群当たり６〜１３のサンプル）の間で検出されなかった。（Ｂ−Ｄ）マウス血清ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ−１／３レベルは、濃度（ｎｇ／ｍＬ）として表現する（群当たり３〜７サンプル）。（Ｂ）ＰＲ食サイクルの終了時に屠殺したＷＴマウスは、対応するコントロール群と比較した場合に、有意により低いＩＧＦ−１レベルを示した（＊＝ｐ＜０．０５）。３×Ｔｇ−ＡＤマウスは、ＰＲ食サイクルの間だけではなく、通常の食事制限の再供給の間にもＩＧＦ−１レベルにおける著しい減少を示した（＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。発明者らは、ＷＴコントロールおよび３×Ｔｇ−ＡＤコントロール群の間の有意な差異を検出する（＃＃＝ｐ＜０．０１）。（Ｃ）３×Ｔｇ−ＡＤマウスは、ＰＲ食の食物を供給した時（＊＊＊＝ｐ＜０．００１）だけではなく、再供給サイクル（＊＊＝ｐ＜０．０１）の間にも、ＩＧＦＢＰ−３レベルにおける有意な減少を示した。（Ｄ）発明者らは、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいてＰＲサイクルの終了時にＩＧＦＢＰ−１レベルにおける有意な増加を決定した（＊＊＝ｐ＜０．０１）。
【図１７】図１７は、ＰＲＣレジメンが３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて年齢依存性の行動変化を軽減することを示す。（ＡおよびＢ）あらゆる食事療法処置の前の８〜９月齢時に（Ａ）またはＰＲＣレジメンの１８週間後の１２．５〜１３−５月齢時に（Ｂ）Ｙ迷路試験によりマウスを試験して得られたＳＡＢ（自発的交替行動）パーセンテージを示す。（Ａ）３×Ｔｇ−ＡＤマウスは、ＷＴコントロール群よりも有意に悪く機能する作業記憶機能障害を既に示した（＊＝ｐ＜０．０５、群当たり１３〜１４匹のマウス）。（Ｂ）３×Ｔｇ−ＡＤコントロール群のみがＷＴ群よりも悪く機能した（＊＝ｐ＜０．０５、ＷＴ群と比較、群当たり１３〜１４匹のマウス）。（Ｃ）ＮＯＲ試験は、ＲＩ（認識インデックス）を計算するために使用した。３×Ｔｇ−ＡＤコントロール動物についてスコア化されたＲＩは、ＷＴ群について計算された値よりも有意に低かった（＊＝ｐ＜０．０５、ＷＴ群と比較、群当たり１２〜１４匹のマウス）。（Ｄ）ＥＰＭ試験は、オープンアームにおいてげっ歯動物が費やした時間をスコア化するために使用した。有意な差異は実験群（群当たり１３〜１４匹のマウス）の間で検出されなかった。
【図１８】図１８は、ＰＲＣレジメンが３×Ｔｇ−ＡＤマウス海馬においてΑβ蓄積を遅らせないことを示す。１２．５〜１３．５月齢のＷＴコントロール、３×Ｔｇ−ＡＤコントロール、および３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣマウスの海馬台またはＣＡ１の海馬領域におけるΑβ免疫反応性を示す代表的な画像を示す。Αβ斑を矢印によって示す。海馬台および海馬のＣＡ１領域における負荷値によるΑβ蓄積物の定量化をそれぞれ（Ａ）および（Ｂ）において示す。Αβ斑の数およびサイズを（Ｃ）および（Ｄ）において示す。（群当たり１０〜１２（Ａ、Ｂ、Ｃ）および５〜７（Ｄ）サンプル）。
【図１９】図１９は、ＰＲＣレジメンが３×Ｔｇ−ＡＤマウス海馬においてＡＴ８陽性神経細胞を低下させることを示す。１２．５〜１３．５月齢の３×Ｔｇ−ＡＤコントロール、３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ、およびＷＴコントロールマウスの、異常にリン酸化されたタウを認識するＡＴ８抗体により免疫染色した海馬切片を示す代表的な画像を示す。ＡＴ８免疫反応性細胞の数の定量化を示す（＊＝ｐ＜０．０５、３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ対３×Ｔｇ−ＡＤコントロール、群当たり１０〜１２サンプル）。
【図２０】図２０は、ＰＲＣレジメンが、３×Ｔｇ−ＡＤマウス海馬においてＣＤ１１ｂ−ｉｒ細胞の総数も活性化段階も調整しないことを示す。１２．５〜１３．５月齢のＷＴコントロール、３×Ｔｇ−ＡＤコントロール、および３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣマウスの海馬切片におけるＣＤ１１ｂ免疫反応性（ＣＤ１１ｂ−ｉｒ）ミクログリアを示す代表的な画像を示す。記載される実験群におけるＣＤ１１ｂ−ｉｒ細胞の総数の定量化を図２０Ａにおいて示す。様々なミクログリア活性化段階（１〜４）のパーセンテージを図２０Ｂにおいて示す（すべての図について：＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ＷＴと比較、群当たり５〜１０サンプル）。
【図２１】図２１は、食物摂取量を測定し、カロリー摂取量を計算するために使用したことを示す。体重のグラムについて標準化したカロリー摂取量を、食事療法処置の最初に（１および２週目、Ａ）ならびに終了時に（１７〜１８週目、Ｂ）、毎日スコア化し、同じ期間の間にスコア化したコントロール食事制限値と比較した、食事制限サイクルの第１の週（１〜７日目、ＰＲ食）または第２週（８〜１４日目、通常の食事制限による再供給）に計算したパーセンテージとして表現した（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図２２】図２２は、（Ａ）１２週間のＰＲＣレジメンの後にＹ迷路によりマウスを試験して得られたＳＡＢ（自発的交替行動）を示す。３×Ｔｇ−ＡＤ群は、ＷＴコントロール群よりも悪く機能した（＊＝ｐ＜０．０５．群当たり１３〜１４匹のマウス）。（Ｂ）あらゆる食事療法処置の前に８〜９月齢時にＥＰＭによりマウスを試験してスコア化したオープンアームにおいて費やされた時間を示す。発明者らは、スコア化されたパラメーターにおいて有意な差異を検出しなかった（群当たり１３〜１４匹のマウス）。
【図２３】図２３は、１８週間の食事制限介入の後、マウスはＹ迷路およびＮＯＲ試験で試験したことを示す。（Ａ）Ｙ迷路タスクの間にスコア化されたアーム侵入の数を示す。発明者らは、ＷＴおよび３×Ｔｇ−ＡＤ群（群当たり１３〜１４匹のマウス）の間で有意な差異を検出しなかった。（Ｂ）治験１のＮＯＲ試験で、げっ歯動物に、２つの同一の物体を含有する箱を探索させ（物体Ａおよび物体Ｂ）、それらを探索するのに費やされた時間を記録した。動物が異なる物体を探索するのにかけられた時間において有意な差異は見出されなかった（ｔ−検定：時間物体Ａ対時間物体Ｂ、群当たり１２〜１４匹のマウス）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の目下好ましい組成物、実施形態、および方法についてここで詳細に言及する。図は必ずしも一定の縮尺ではない。開示される実施形態は、様々なおよび代替の形態で例示されてもよい本発明の単なる例証である。そのため、本明細書において開示される詳細については、限定として解釈されないものとするが、単に、本発明の任意の態様の代表的な基礎としておよび／または本発明を様々に用いるために当業者に教示するための代表的な基礎として解釈されるものとする。
【００２０】
実施例以外または別段の指示がある場合以外、反応および／または使用の材料の量または条件を示す、この説明におけるすべての数量は、本発明の最も広範な範囲を説明するのに、語「約」によって修飾されるものとして理解されるものとする。述べられる数の範囲内での実施が一般に好ましい。また、別段の指示がない限り、パーセント、「の一部」、および比の値は重量によるものであり、本発明に関する所定の目的に適しているまたは好ましい材料のグループまたはクラスについての説明は、グループまたはクラスの任意の２つ以上のメンバーの混合物が等しく適しているまたは好ましいことを暗示し、化学用語での構成要素の説明は、説明において指定される任意の組み合わせへの追加の時の構成要素を指し、一度混合されたら、混合物の構成要素の間の化学的相互作用を必ずしも起こらないようにするわけではなく、頭文字または他の略語の最初の定義は、同じ略語の本明細書におけるすべての続く使用に適用され、最初に定義された略語の通常の文法上の変形に変更すべき点を変更して適用され、別段の指示がない限り、特性の測定値は、同じ特性についてあらかじめまたは後で参照されるものと同じ技術によって決定される。
【００２１】
本発明は、特定の構成成分および／または条件がもちろん変わってもよいように、下記に説明される特定の実施形態および方法に限定されない。さらに、本明細書において使用される術語は、本発明の特定の実施形態を説明する目的のみのために使用され、決して限定するようには意図されない。
【００２２】
本明細書および添付の請求項において使用されるように、文脈が明らかに示さない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数形の指示物を含む。たとえば、単数の構成成分への言及は、複数の構成成分を含むことが意図される。
【００２３】
用語「必須アミノ酸」は、生物によって合成することができないアミノ酸を指す。ヒトでは、必須アミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリンを含む。そのうえ、下記のアミノ酸もまた、ある条件でヒトにおいて必須である−ヒスチジン、チロシン、およびセレノシステイン。
【００２４】
用語「キロカロリー」（ｋｃａｌ）および「カロリー」は、食物カロリーを指す。用語「カロリー」は、いわゆる小カロリーを指す。
【００２５】
用語「対象」は、ヒトまたは霊長動物（特に高等霊長動物）、ヒツジ、イヌ、げっ歯動物（たとえばマウスもしくはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、および雌ウシなどのようなすべての哺乳動物を含む動物を指す。
【００２６】
本発明の実施形態は、組織および／または器官再生、特に幹細胞ベースの再生のための方法に関する。本明細書において下記に詳述されるように、また、あらゆる特定の理論に限られることを望むものではないが、１つ以上の実施形態における本発明は、幹細胞および前駆細胞を含む再生細胞の利用率および機能性を増強し、組織／器官再生および再構成、特に造血幹細胞／前駆細胞および他の免疫細胞を増進すると考えられる。一変形では、再生細胞が、脳細胞、筋細胞、肝臓細胞、およびそれに由来する細胞を含む。成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害は、哺乳動物における再生細胞の利用率および機能性を増強する。そのような阻害は、下記に示されるように、遺伝子サイレンシング、医薬阻害、および低カロリー食事療法プロトコールを施すことによって実現される。この組織および／または再生は、再生細胞のドナーおよびレシピエントが同じ個人であるレジデンシャル（ｒｅｓｉｄｅｎｔｉａｌ）再生ならびに再生細胞のドナーおよびレシピエントが２人の異なる個人である移植再生の両方に適用可能である。この点では、本発明は、比較的それほど攻撃的ではないアプローチにおいてレジデンシャル再生をもたらすのに特に有利であり、これはより費用効果的なものとなり得、ドナー−レシピエントマッチング障害を含む、いくらかの問題の発生を低下させることができる。
【００２７】
一実施形態では、対象を食餌療法するための方法が提供される。方法は、食餌療法を必要とする対象を同定するステップを含む。第１の食事制限は、対象に第１の期間に施される。本明細書において使用されるように、時に、この実施形態の第１の食事制限は、断食を模倣する食事制限（ＦＭＤ）と呼ばれる。一改良では、第１の食事制限が、第１日（１日目）に対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり４．５〜７キロカロリーおよび次いで、第１の食事制限の第２〜第５日（２〜５日目）に１日当たり対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり３〜５キロカロリーを提供する。第２の食事制限は、第２の期間に対象に施される。一改良では、第２の食事制限が、第１の食事制限後（たとえば直後）の２５〜２６日間、対象の通常のカロリー消費量の２０パーセント以内にある総カロリー消費量を提供する。一改良では、対象が、体重減少をもたらす方法による体重減少を必要とする。他の改良では、対象が、そのような組織再生をもたらす方法による組織再生を必要とする。特徴として、ＩＧＦ−Ｉのレベルが減少し、ＩＧＦＢＰ１のレベルが増加することが観察される。一改良では、この実施形態の方法が、１〜５回、繰り返される。他の改良では、この実施形態の方法が、２〜３回、繰り返される。さらに他の改良では、この実施形態の方法が、数年の期間または対象の一生を通じて繰り返される。他の改良では、第１の食事制限および第２の食事制限の組み合わせが、対象の通常のカロリー摂取量の１０パーセント以内のカロリーの総数を対象に提供する。他の改良では、第１の食事制限および第２の食事制限の組み合わせが、対象の通常のカロリー摂取量の５パーセント以内のカロリーの総数を対象に提供する。他の改良では、第１の食事制限および第２の食事制限の組み合わせが、対象の通常のカロリー摂取量の１パーセント以内のカロリーの総数を対象に提供する。
【００２８】
本発明の実施形態に照らして、食餌療法を必要とする対象が、減量を必要とする対象を含む。他の変形では、食餌療法を必要とする対象が、幹細胞、前駆細胞、および胚様幹細胞再生を必要とする対象；ＷＢＣ再生およびバランスのとれたリンパ／骨髄比を必要とする対象；免疫制御、免疫不全、および免疫抑制の逆転を必要とする対象；若いおよび高齢の哺乳動物の両方における短期記憶、長期記憶、および運動協調性に共に関係する神経発生および認知機能の改善を必要とする対象；認知低下の逆転を必要とする対象；癌を有する対象；炎症疾患（たとえば皮膚炎）を有する対象；骨密度の損失（たとえば骨粗鬆症）を有する対象；ならびに肝障害を有する対象を含む。アルツハイマー病のそのような症状の例は、学習および記憶の機能障害、言語障害、失認症、失行症、錯語症、短期記憶喪失、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない。免疫制御、免疫不全、および免疫抑制のそのような症状の例は、感染症に対する感受性および癌に対する感受性を含むが、これらに限定されない。炎症疾患のそのような症状の例は、炎症、腫脹、発赤、痛み、熱、および機能の損失を含むが、これらに限定されない。肝障害のそのような症状の例は、ＡＬＴの上昇、ＡＬＰ、ビリルビンの上昇、かゆみ、黄疸、新生物、肝細胞の壊死、区域壊死、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
一改良では、方法が、骨密度の損失の危険性を低下させるまたは骨量減少の症状を低下させる。さらに他の実施例では、方法が、肝障害の危険性を低下させるまたは肝障害の症状を軽減する。さらなる改良では、肝障害の評価に関する方法が、肝臓マーカーのレベルをモニターするステップを含む。特に、アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルは、当業者に知られているように、血液検査において測定される。
【００３０】
他の改良では、対象が、幹細胞、前駆細胞、または胚様幹細胞再生を必要とする。さらに他の改良では、対象が、若く健康な哺乳動物／ヒトにおいて観察されるものと類似する白血球（ＷＢＣ）再生および／またはバランスのとれたリンパ／骨髄比を必要とする。さらに他の改良では、対象が、免疫制御、免疫不全、および免疫抑制の危険性がありまたは対象が、これらの状態のうちの１つを有し、方法が、その少なくとも１つの症状を軽減する。
【００３１】
他の改良では、対象が、若いおよび高齢の哺乳動物の両方における短期記憶、長期記憶、および運動協調性に共に関係する神経発生および認知機能の改善を必要とする。このカテゴリーにおける対象は、認知低下の逆転を必要とする対象を含む。そのような認知状態の例は、アルツハイマー病および関係する状態を含むが、これらに限定されない。
【００３２】
一変形では、断食を模倣する食事制限（ＦＭＤ）プログラムが、５日間、対象の食事制限と完全に置換されることを含む。この５日間の期間の間に、対象は、多くの水を摂取する。標準体重（１８．５〜２５の間のボディマス指数またはＢＭＩ）の健康な対象については、食事制限は、最初の３か月間、月に一度（５日間、食事制限および２５〜２６日間、彼らの通常の食事制限）およびその後３か月ごとに（３か月ごとに５日間）摂取される。対象の体重が測定され、対象は、次のサイクルが始められる前に、食事制限の間の失われた体重の少なくとも９５％を取り戻さなければならない。１８．５未満のＢＭＩを有する対象は、医師によって推奨されないおよび監督されない限り、ＦＭＤを行うべきでない。同じレジメン（３か月間、毎月一度、その後３か月ごとに一度）は、特許出願において示される状態のすべての処置のためにまたは処置のサポートに採用することができる。
【００３３】
過体重対象（ＢＭＩ：２５〜３０）のためのＦＭＤの改良は、医学的な監督の下で、理想体重に到達するまで、一度／月または２度／月の頻度の食事制限に従うことを要する。肥満の対象（ＢＭＩ＞３０）のためのＦＭＤのさらなる改良では、医師は、適切な医学的な監督と共に、週に一度（５日間、食事制限、２日間、食事制限なし）の頻度での食事制限の摂取を推奨する。
【００３４】
ＦＭＤのための摂取ガイドラインは、カロリー、多量栄養素、および微量栄養素に関する栄養成分表（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｓ）を含む。カロリーは、利用者の体重に従って摂取される。全カロリー消費量は、１日目、４５３．５９グラム（１ポンド）当たり４．５〜７カロリー（または１キログラム当たり１０〜１６カロリー）および２〜５日目、４５３．５９グラム（１ポンド）当たり３〜５カロリー（または１キログラム当たり７〜１１カロリー）である。図１２〜１４は、１日目〜５日目の栄養素の表を提供する。多量栄養素に加えて、食事制限は、１日目に３０ｇ未満の糖および２〜５日目に２０ｇ未満の糖を含有するべきである。食事制限は、１日目に２８ｇ未満のタンパク質および２〜５日目に１８ｇ未満のタンパク質を含有するべきである。食事制限は、１日目に２０〜３０グラムの一価不飽和脂肪および２〜５日目に１０〜１５グラムの一価不飽和脂肪を含有するべきである。食事制限は、１日目に６〜１０グラムの多価不飽和脂肪および２〜５日目に３〜５グラムの多価不飽和脂肪を含有するべきである。食事制限は、１日目に１２ｇ未満の飽和脂肪および２〜５日目に６グラム未満の飽和脂肪を含有するべきである。典型的に、終日の脂肪は、以下のものの組み合わせに由来する：アーモンド、マカダミアナッツ、ペカン、ココナッツ、ヤシ油、オリーブ油、および亜麻仁。一改良では、ＦＭＤ食事制限が、終日の食物繊維の推奨一日量の５０％以上を含む。さらなる改良では、食物繊維の量が、５日間ずっと、１日当たり１５グラム以上である。食事制限は、２〜５日目に、１日当たり１２〜２５グラムのグリセロールを含有するべきである。一改良では、グリセロールが、体重４５３．５９グラム（１ポンド）当たり０．１グラム／日で提供される。
【００３５】
一変形では、ＦＭＤが、下記の微量栄養素を含む（少なくとも９５％非動物ベース）：１日当たり５，０００ＩＵ以上のビタミンＡ（１〜５日目）；１日当たり６０〜２４０ｍｇのビタミンＣ（１〜５日目）；１日当たり４００〜８００ｍｇのカルシウム（１〜５日目）；１日当たり７．２〜１４．４ｍｇの鉄（１〜５日目）；１日当たり２００〜４００ｍｇのマグネシウム（１〜５日目）；１日当たり１〜２ｍｇの銅（１〜５日目）；１日当たり１〜２ｍｇのマンガン（１〜５日目）；１日当たり３．５〜７ｍｃｇのセレン（１〜５日目）；１日当たり２〜４ｍｇのビタミンＢ１（１〜５日目）；１日当たり２〜４ｍｇのビタミンＢ２（１〜５日目）；１日当たり２０〜３０ｍｇのビタミンＢ３（１〜５日目）；１日当たり１〜１．５ｍｇのビタミンＢ５（１〜５日目）；１日当たり２〜４ｍｇのビタミンＢ６（１〜５日目）；１日当たり２４０〜４８０ｍｃｇのビタミンＢ９（１〜５日目）；１日当たり６００〜１０００ＩＵのビタミンＤ（１〜５日目）；１日当たり１４〜３０ｍｇのビタミンＥ（１〜５日目）；１日当たり８０ｍｃｇ以上のビタミンＫ（１〜５日目）；１６〜２５ｍｃｇのビタミンＢ１２が、全５日間の期間の間に提供される；６００ｍｇのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、藻類由来）が、全５日間の期間の間に提供される。ＦＭＤ食事制限は、ケール、カシュー、黄ピーマン、タマネギ、レモン汁、酵母、ウコン、マッシュルーム、ニンジン、オリーブ油、ビート汁、ホウレンソウ、トマト、コラード、イラクサ、タイム、塩、胡椒、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、ビート、バターナットカボチャ、コラード、トマト、オレガノ、トマト汁、オレンジ汁、セロリ、ロメインレタス、ホウレンソウ、クミン、オレンジの皮、クエン酸、ナツメグ、クローブ、およびその組み合わせを含む、ほとんど（つまり重量で５０パーセント以上）が自然の供給源由来の高微量栄養素内容物を提供する。表１は、ＦＭＤ食事制限において提供することができる、さらなる微量栄養素補給の例を提供する。
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【００３６】
他の実施形態では、上記に示される食事制限プロトコールの実施のための食事制限パッケージが、提供される。食事制限パッケージは、対象に第１の期間に施されることになっている第１の食事制限のための食料の第１のセットを含み、第１の食事制限は、第１日に対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり４．５〜７キロカロリーおよび第１の食事制限の第２〜第５日に１日当たり対象４５３．５９グラム（１ポンド）当たり３〜５キロカロリーを提供する。食事制限パッケージは、第１日に３０ｇ未満の糖；第２〜第５日に２０ｇ未満の糖；第１日に２８ｇ未満のタンパク質；第２〜第５日に１８ｇ未満のタンパク質；第１日に２０〜３０グラムの一価不飽和脂肪；第２〜第５日に１０〜１５グラムの一価不飽和脂肪；第１日に６〜１０グラムの多価不飽和脂肪；第２〜第５日に３〜５グラムの多価不飽和脂肪；第１日に１２ｇ未満の飽和脂肪；第２〜第５日に６グラム未満の飽和脂肪；および第２〜第５日に１日当たり１２〜２５グラムのグリセロールを提供する食料を含む。一改良では、食事制限パッケージが、上記に示される微量栄養素を提供するのに十分な食料をさらに含む。さらなる改良では、食事制限パッケージが、上記に示される方法の詳細を提供する説明書を提供する。
【００３７】
他の実施形態では、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡを阻害するための方法が提供される。この実施形態の方法は、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡの阻害を必要とする対象を同定するステップおよび次いで、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡの少なくとも１つを阻害するステップを含む。一改良では、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡの少なくとも２つが阻害される。他の改良では、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡの少なくとも３つが阻害される。さらに他の実施形態において、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡのすべてが阻害される。
【００３８】
本発明の実施形態に照らして、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡの阻害を必要とする対象が、食餌療法または減量を必要とする対象を含む。実際に、上記に示される食事制限プロトコールは、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡの阻害を達成する。他の変形では、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡ阻害を必要とする対象が、幹細胞、前駆細胞、および胚様幹細胞再生を必要とする対象；ＷＢＣ再生およびバランスのとれたリンパ／骨髄比を必要とする対象；免疫制御、免疫不全、および免疫抑制の逆転を必要とする対象；若いおよび高齢の哺乳動物の両方における短期記憶、長期記憶、および運動協調性に共に関係する神経発生および認知機能の改善を必要とする対象；認知低下の逆転を必要とする対象；癌を有する対象；炎症疾患（たとえば皮膚炎）を有する対象；骨密度の損失（たとえば骨粗鬆症）を有する対象；ならびに肝障害を有する対象を含む。アルツハイマー病のそのような症状の例は、学習および記憶の機能障害、言語障害、失認症、失行症、錯語症、短期記憶喪失、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない。免疫制御、免疫不全、および免疫抑制のそのような症状の例は、感染症に対する感受性および癌に対する感受性を含むが、これらに限定されない。炎症疾患のそのような症状の例は、炎症、腫脹、発赤、痛み、熱、および機能の損失を含むが、これらに限定されない。肝障害のそのような症状の例は、ＡＬＴの上昇、ＡＬＰ、ビリルビンの上昇、かゆみ、黄疸、新生物、肝細胞の壊死、区域壊死、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の実施形態の変形では、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、またはＰＫＡを阻害するステップが、小さな薬剤、アンタゴニスト、阻害性ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または抗体を対象に投与するステップを含む。一改良では、ＧＨＲ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＲ、および／またはＰＫＡを阻害するステップが、ＧＨ／ＩＧＦ−１軸阻害性組成物を対象に投与するステップを含む。適したＧＨ／ＩＧＦ−１軸阻害性組成物の例は、成長ホルモン受容体アンタゴニスト、ＩＧＦ−Ｉ受容体アンタゴニスト、ＧＨ放出ホルモン（ＧＨＲＨ）受容体アンタゴニスト、およびその組み合わせを含む。
【００４０】
他の実施形態において、免疫無防備状態の対象において症状を軽減するための方法が提供される。方法は、免疫無防備状態である対象または免疫状態における改善を所望する対象を同定するステップを含む。プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性および／またはＩＧＦ−Ｉレベルにおける低下が、対象において誘発される。任意選択で、対象の進行は、それぞれの目標レベルが実現されていることを検証するためにＰＫＡ活性および／またはＩＧＦレベルを測定することによってモニターされる。一改良では、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性および／またはＩＧＦ−Ｉレベルにおける低下が、下記に示される低カロリー食事制限プロトコールを施すことによって低下する。特に有用な食事制限プロトコールは、全開示が参照によってこれによって組み込まれる国際公開第２０１１／０５０３０２号パンフレットによって提供される。他の改良では、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性および／またはＩＧＦ−Ｉレベルにおける低下が、下記に示される低カロリー食事制限プロトコールを施すことによって低下する。
【００４１】
他の実施形態では、対象に、細胞造血幹細胞／前駆細胞を移入するための方法が提供される。方法は、免疫無防備状態の対象を同定するステップを含む。プロテインキナーゼＡ活性および／またはＩＧＦ−Ｉレベルにおける低下は、上記に示されるようにドナーにおいて誘発される。任意選択で、再生造血幹細胞／リジェネレーター細胞（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｃｅｌｌ）は、ドナーから単離され、次いで、免疫無防備状態の対象の中に移植される。
【００４２】
他の実施形態では、再生細胞の増殖を増進するための方法が提供される。方法は、第１の期間および第２の期間に対象に食事療法プロトコールを施すステップを含む。第１の期間の間に、少なくとも５０パーセントのカロリーが脂肪に由来する低カロリー食事制限が、対象に提供される。第２の期間の間に、せいぜい９００ｋｃａｌ／日の第２の低カロリー食事制限が、対象に提供される。特に有用な食事制限プロトコールは、上記に示される国際公開第２０１１／０５０３０２号パンフレットによって提供される。任意選択で、再生細胞が対象から単離され、レシピエントへ移入される。
【００４３】
さらに他の実施形態では、対象における組織再生を増進するための方法が提供される。方法は、再生が所望される組織において目標ＰＫＡレベルまたは活性を有するドナーから再生細胞の集団を単離するステップを含んでいてもよい。ドナーは、目標ＰＫＡ活性に到達するようにＰＫＡ活性を低くするためにあらかじめ処置される。一改良では、再生細胞の集団が、組織再生が望ましい対象の一部に送達される。他の改良では、対象およびドナーが、同じ個人である。これらの事例では、再生細胞の集団は、対象の第１の身体部位から単離し、その後、第１の身体部位と異なる対象の第２の身体部位に堆積させることができる。あらゆる特定の理論に限られることを望むものではないが、単離され、同じ個人に堆積させる再生細胞によるレジデント再生（ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、本明細書において別記されるドナー−レシピエントマッチング問題などのようなある問題を軽減すると考えられる。他の改良では、ドナーおよび対象が、異なる個人である。単離される再生細胞の集団は、幹細胞および前駆細胞の少なくとも１つを含む。再生細胞の例は、骨髄、脳、肝臓、およびその他同種のものから得られる。目標ＰＫＡ活性を得るために、ドナーは、ＰＫＡ活性を低下させて所定の値の範囲内にするために、医薬組成物によりあらかじめ処置されてもよい。その代わりに、ドナーは、国際公開第２０１１／０５０３０２号パンフレットから適合されるように、ＰＫＡ活性を低下させて所定の値の範囲内にするために、食事制限パッケージから提供される構成成分を有する食事療法プロトコールによりあらかじめ処置されてもよい。食事制限パッケージが使用される事例では、食事制限パッケージは、第１の食事制限および第２の食事制限についての構成成分を含む。第１の食事制限は、第１の期間にドナーに施され、第２の食事制限は、第２の期間に施される。特徴として、第１の食事制限は、第２の食事制限と組成が異なる。一改良では、食事制限パッケージが、第３の期間にドナーに施される第３の食事制限についての構成成分を含んでいてもよい。典型的に、ドナーの体重は、第２の食事制限の前に測定される。ドナーの体重が、あらかじめ決定された重量の範囲内となるまで、第２の食事制限は、施されなくてもよい。典型的に、ドナーの体重は、第３の食事制限を施す前に測定される。ドナーの体重が、あらかじめ決定された重量の範囲内となるまで、第３の食事制限は、施されなくてもよい。あらかじめ決定された重量範囲は、第１の食事制限前のドナー／対象の体重の７０〜９９パーセントであってもよい。第１の期間は、２０〜１２０時間、２０〜１００時間、２０〜８０時間、２０〜７０時間、２０〜６０時間、２０〜５０時間、２０〜４０時間、または２０〜３０時間であってもよい。ある事例では、第１の期間が、２０〜２８時間である。第２の期間は、２０〜１２０時間、３０〜１１０時間、４０〜１００時間、５０〜９０時間、または６０〜８０時間であってもよい。ある事例では、第２の期間が、６８〜７６時間である。第１の食事制限の開始および第２の食事制限の開始の間の時間差は、典型的に、１〜４週間である。第１の食事制限は、対象の通常のカロリー摂取量のせ���ぜい５０％をドナー／対象に提供するために施されてもよく、少なくとも５０％のキロカロリーが脂肪に由来する。第１の食事制限は、７００〜１２００ｋｃａｌ／日でドナー／対象に施されてもよい。第２の食事制限は、せいぜい５００ｋｃａｌ／日、４００ｋｃａｌ／日、３００ｋｃａｌ／日、または２００ｋｃａｌ／日のカロリー投入量をドナー／対象に提供するために施されてもよい。第３の食事制限は、ドナーの通常のカロリー摂取量の５０％以上をドナー／対象に提供するために施されてもよい。第３の食事制限は、１つ以上の必須アミノ酸をドナー／対象に提供するために施されてもよい。一改良では、第３の期間が、１２０時間以上であってもよい。
【００４４】
上記に示されるように、本発明の実施例は、ＰＫＡ活性を減少させることを試みる。ＰＫＡ活性における減少および／またはＩＧＦ−Ｉレベルにおける減少は、完全な摂食制限（つまり断食もしくは飢餓）または上記に示されるＦＭＤ食事制限の食事制限プロトコールを施すことによって実現される。カロリー制限の激しいが短期間の形態は、再生効果の増進ならびに幹細胞および／または前駆細胞における増加にとって重要となり得る本質的な生理学的状態（たとえば血中グルコースおよび循環ＩＧＦ−Ｉレベルの低下ならびにＩＧＦ−Ｉシグナル伝達の低下）に効率的に（マウスにおいて４８時間およびヒトにおいて１２０時間）到達することができる。絶食状態は、文書で証明された治療上の応用によりいくつかの幹細胞集団を誘発し、多分化能成人組織特異的な幹細胞／前駆細胞およびまれな多能性胎児／胚様幹細胞を含んだ。絶食状態は、初期条件（たとえば年齢）についての特別な必要条件なしで、また、長期的な再生能を損なうことなく、幹細胞数の衰退を逆転させ、生じた再生障害を正す。この高効率、幹細胞のクラスに対する広範な効果、低い初期必要条件、および長期的な安全性／有益性は、本発明が、化学療法および放射線治療を含む様々なタイプの療法と共に実際に組み込まれることを可能にする。侵襲性のアプローチを必要することなく、それは、常在性幹細胞を直接刺激するおよび／またはレシピエントにおいて移植された幹細胞の再生を増進するためにミクロ環境を間接的に変化させ得る方法で従来の再生アプローチに役立ち得る。
【００４５】
他の変形では、置換食事制限が、ＰＫＡ活性またはＩＧＦ−Ｉレベルを減少させるために対象に提供される。本発明の変形は、１２０時間の絶食が低コンプライアンスおよび栄養失調の副作用によりヒト対象が実現するのが困難であるかもしれないという点において、特に有用である。本発明の変形の置換食事制限は、再生を増進する際に絶食状態の有益な効果に干渉することなく微量栄養素を最大限にする。幹細胞ベースの再生を増進する絶食状態は、インビボにおける絶食／絶食サイクルによってならびに部分的にｉｉ）インビボにおける置換食事制限およびＩＧＦ−ＩまたはＰＫＡシグナル伝達のエクスビボにおける阻害よって、実現された。ヒト対象については、下記に示される置換食事制限は、栄養失調を最小限にしながら、７２〜１２０時間絶食しているヒト対象によって実現される状態を模倣する。さらに、食事制限は、Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ  （ＧＲＡＳ）の成分からなる。特に有用な食事制限プロトコールは、上記に示されるように国際公開第２０１１／０５０３０２号パンフレットによって提供される。ヒト以外の対象のための置換食事制限はヒトについて本明細書において記載されるものと類似することが十分に理解されるべきである。そのような食事制限は、非ヒト対象の重量および通常の食物摂取量を考慮に入れることによって調整される。
【００４６】
上記に示される実施形態の改良では、食事制限の５日間の供給が、スープ／ブロス、ソフトドリンク、ナッツバー、およびサプリメントを含む。食事制限は、以下のように施される：１）第１の日に、高微量栄養物を有する１０００〜１２００ｋｃａｌ食事制限が提供される；２）次の４日間、６５０〜８００ｋｃａｌの毎日の食事制限プラス６０〜１２０ｋｃａｌを提供するグルコース置換炭素供給源を含有する飲料が提供される。置換炭素供給源は、幹細胞活性化に対する絶食の効果に干渉しない。
【００４７】
上記に示される実施形態の他の改良では、６日間の低タンパク質食事制限プロトコールが、スープ／ブロス、ソフトドリンク、ナッツバー、およびサプリメントを含む。食事制限は、以下のように施される：１）第１の日に、高微量栄養物を有する１０００〜１２００ｋｃａｌ食事制限が提供される；２）次の３日間、２００ｋｃａｌ未満の毎日の食事制限プラス６０〜１２０ｋｃａｌを提供するグルコース置換炭素供給源を含有する飲料。この置換炭素供給源は、幹細胞活性化に対する絶食の効果に干渉しない；３）５日目に、対象は通常の食事制限を摂取する；ならびに４）６日目に、３００ｋｃａｌの高脂肪供給源および微量栄養物ミックスからなるさらなる補充食物、６日目に、３００ｋｃａｌの高脂肪供給源および微量栄養物ミックスからなる補充食物が、通常の食事制限に加えて提供される。
【００４８】
さらに他の改良では、食事制限プロトコールが、スープ／ブロス、ソフトドリンク、ナッツバー、およびサプリメントを含む低タンパク質食事制限の６日間の供給を含む。１）第１の日に、高微量栄養物を有する１０００〜１２００ｋｃａｌ食事制限が提供される；２）次の３日間、１０グラム未満のタンパク質および糖由来の２００ｋｃａｌ未満を含有する６００〜８００ｋｃａｌの毎日の食事制限；３）５日目に、対象は通常の食事制限を受ける；ならびに４）６日目に、３００ｋｃａｌの高脂肪供給源および微量栄養物ミックスからなるさらなる補充食物、６日目に、３００ｋｃａｌの高脂肪供給源および微量栄養物ミックスからなる補充食物が、通常の食事制限に加えて提供される。
【００４９】
本発明は、１つ以上の実施形態において、組織および器官再生のための栄養製剤および方法を提供する。この目的を実現する方法および組成物の特定の実施形態は下記に示される。本発明の作用は、いかなる特定のメカニズムにも限られないが、本発明の様々な実施形態において観察される保護は、部分的にＰＫＡ経路の調整によるものである。絶食の保護効果の基礎は、栄養素が不足するまたは不在である場合に、生殖／成長から保護／維持にエネルギーを再分配する能力に基づくように思われる。長期的な食餌制限は、絶食と比較してＩＧＦ−Ｉおよびグルコースにおけるはるかにより緩やかな低下を引き起こすことが指摘されるべきである。さらに、絶食と異なり、長期的な食餌制限は、それが慣性的な体重減少を引き起こし、維持するのが非常に困難であるので、大多数の集団にとって実現可能ではない。代わりに、処置前および処置後２４時間の平均約６２時間の絶食は、処置を受けている対象が十分に耐えることができる。
【００５０】
本発明の実施形態および変形は、食事療法プロトコールを施すことによって対象におけるＰＫＡ活性および／またはＩＧＦ−Ｉレベルにおける低下を実現する。上記に示されるように、特に有用な食事制限プロトコールおよび食事療法パッケージは、国際公開第２０１１／０５０３０２号パンフレットおよび本明細書における食事療法プロトコールによって提供される。特に、対象は、第１の期間に第１の食事制限、第２の期間に第２の食事制限、および第３の期間に任意選択の第３の食事制限が提供される。第１の食事制限は、対象の通常のカロリー摂取量のせいぜい５０％を対象に提供し、少なくとも５０％のキロカロリーが脂肪、好ましくは一価不飽和脂肪に由来する。対象の通常のカロリー摂取量は、彼または彼女の重量を維持するために対象が摂取するｋｃａｌの数値である。対象の通常のカロリー摂取量は、対象にインタビューすることによってまたは対象の重量を考慮して推定されてもよい。おおよその目安として、対象の通常のカロリー摂取量は、平均して男性については２６００ｋｃａｌ／日および女性については１８５０ｋｃａｌ／日である。ある事例では、第１の食事制限は、７００〜１２００ｋｃａｌ／日を対象に提供する。特に有用な改良では、第１の食事制限が、約１１００ｋｃａｌ／日を平均重量の男性の対象および９００ｋｃａｌ／日を平均重量の女性の対象に提供する。典型的に、第１の所定の期間は、約１〜５日である。ある事例では、第１の所定の期間は、１日である。第１の食事制限における脂肪のレベルを客観的に把握するために、Ｕ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎは、典型的な２０００キロカロリーの１日の食事制限について以下の栄養の内訳を推奨している：６５グラムの脂肪（約５８５キロカロリー）、５０グラムのタンパク質（約２００キロカロリー）、３００グラムの全炭水化物（約１２００キロカロリー）。そのため、第１の食事制限のあるバージョンにおいて、炭水化物およびタンパク質由来の大部分のカロリーが省かれる。
【００５１】
第１の食事制限は、脂肪の事実上任意の供給源を包含するが、一価不飽和脂肪供給源および多価不飽和脂肪供給源を含む不飽和脂肪が高い供給源は特に有用である（たとえばオメガ−３／６必須脂肪酸）。一価不飽和食物供給源の適した例は、ピーナッツバター、オリーブ、ナッツ（たとえばアーモンド、ペカン、ピスタチオ、カシュー）、アボカド、種子（たとえばゴマ）、油（たとえばオリーブ、ゴマ、ピーナッツ、キャノーラ）などを含むが、これらに限定されない。多価不飽和食物供給源の適した例は、クルミ、種子（たとえばパンプキン、ヒマワリ）、アマニ、魚（たとえばサケ、マグロ、サバ）、油（たとえばベニバナ、ダイズ、トウモロコシ）を含むが、これらに限定されない。第１の食事制限はまた、野菜抽出物、ミネラル、オメガ−３／６必須脂肪酸、およびその組み合わせからなる群から選択される構成成分をも含む。一改良では、そのような野菜抽出物は、推奨される毎日の１回分の野菜の５回分の相当物を提供する。野菜抽出物に適した供給源は、パクチョイ、ケール、レタス、アスパラガス、ニンジン、バターナットカボチャ、アルファルファ、グリーンピース、トマト、キャベツ、カリフラワー、ビートを含むが、これらに限定されない。オメガ−３／６必須脂肪酸に適した供給源は、サケ、マグロ、サバ、青魚、メカジキ、およびその他同種のものなどのような魚を含む。
【００５２】
次いで、対象は、第２の期間に第２の食事制限が提供される。第２の食事制限は、せいぜい９００ｋｃａｌ／日を対象に提供する。ある事例では、第２の食事制限は、せいぜい２００ｋｃａｌ／日を対象に提供する。典型的に、第２の所定の期間は、約２〜７日である。ある特定の事例では、第２の所定の期間は、３日である。さらに他の改良では、第２の食事制限が、野菜抽出物、ミネラル、オメガ−３／６必須脂肪酸、およびその組み合わせからなる群から選択される構成成分を含む。一改良では、そのような野菜抽出物は、推奨される毎日の１回分の野菜の５回分の相当物を提供する。野菜抽出物に適した供給源は、パクチョイ、ケール、レタス、アスパラガス、ニンジン、バターナットカボチャ、アルファルファ、グリーンピース、トマト、キャベツ、カリフラワー、ビートを含むが、これらに限定されない。オメガ−３／６必須脂肪酸に適した供給源は、サケ、マグロ、サバ、青魚、メカジキ、およびその他同種のもの由来の魚油を含む。
【００５３】
本明細書における食事療法プロトコールの有効性は、多くの対象のパラメーターの測定値によってモニターされる。たとえば、ＩＧＦ−Ｉの対象の血清濃度は、第２の食事制限期間の終了までに２５〜９０％低下することが望ましい。対象における血中グルコース濃度は、第２の食事制限期間の終了までに２５〜７５％低下することもまた望ましい。一改良では、低下を確実にするための関心のある組織または細胞におけるＰＫＡ活性が、少なくとも１５パーセントのＰＫＡ活性である。他の改良では、低下を確実にするための関心のある組織または細胞におけるＰＫＡ活性が、少なくとも２５パーセント、３０パーセント、または５０パーセントのＰＫＡ活性である。ＰＫＡ活性は、当業者らに知られている任意の数の方法によって決定されてもよい。Ｐｒｏｍｅｇａから市販で入手可能なＰｒｏＦｌｕｏｒ（登録商標）ＰＫＡアッセイは、この目的に有用である１つのアッセイである。
【００５４】
本発明の実施形態の変形では、対象は、第３の所定の期間に第３の食事制限が提供される。第３の食事制限は、対象の通常の食事制限を補足するためのものである。特徴として、補充する組成物は、必須アミノ酸、ミネラル、および必須脂肪を含む。好都合に、第３の食事制限は、対象が標準体重を取り戻し、体力を最大限にするのを可能にするであろう。典型的に、第３の所定の期間は、少なくとも５日である。補充する組成物はまた、任意選択で、多くのさらなる構成成分をも含むであろう。たとえば、補充する組成物は、野菜抽出物を含んでいてもよい。一改良では、そのような野菜抽出物は、推奨される毎日の１回分の野菜の５回分の相当物を提供する。野菜抽出物に適した供給源は、パクチョイ、ケール、レタス、アスパラガス、ニンジン、バターナットカボチャ、アルファルファ、グリーンピース、トマト、キャベツ、カリフラワー、ビートを含むが、これらに限定されない。補充する組成物はまた、オメガ−３／６必須脂肪酸および非必須アミノ酸を含んでいてもよい。適した非必須アミノ酸の例は、ヒスチジン、セリン、タウリン、チロシン、システイン、グルタミン、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。補充する組成物はまた、鉄、亜鉛、銅、マグネシウム、およびカルシウムを含有するマルチミネラル錠剤を含んでいてもよく、また、ビタミンＢ１２を含むビタミンＢ複合体を含有していてもよい。
【００５５】
上記に示されるように、対象の通常の食事制限に加えた第３の食事制限は、対象が標準体重を取り戻し、体力を最大限にするのを可能にするであろう。典型的に、第３の所定の期間は、少なくとも５日であり、無期限に継続してもよい。ある事例では、第３の所定の期間は、約４日〜約１４日である。一週間は、この目的にほぼ最適であることが推定される。補充する組成物はまた、任意選択で、多くのさらなる構成成分をも含むであろう。たとえば、補充する組成物は、野菜抽出物を含んでいてもよい。一改良では、そのような野菜抽出物は、推奨される毎日の１回分の野菜の５回分の相当物を提供する。野菜抽出物に適した供給源は、パクチョイ、ケール、レタス、アスパラガス、ニンジン、バターナットカボチャ、アルファルファ、グリーンピース、トマト、キャベツ、カリフラワー、ビートを含むが、これらに限定されない。補充する組成物はまた、オメガ−３／６必須脂肪酸および非必須アミノ酸を含んでいてもよい。適した非必須アミノ酸の例は、ヒスチジン、セリン、タウリン、チロシン、システイン、グルタミン、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。第３の食事制限のさらなる詳細は、上記に示されるものと同じである。
【００５６】
他の実施形態では、アルツハイマー病の症状を軽減するための方法が、提供される。方法は、第１の期間に、あるアミノ酸を有するアミノ酸特異的な食事制限を施すステップを含む。第１の期間は、任意の所望される期間であってもよいが、一改良では、第１の期間は、約５日〜１４日であり、７日が典型的である。一変形では、アミノ酸特異的な食事制限が、以下のアミノ酸、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびアルギニンを実質的に除外する。この文脈において、「実質的に除外する」は、除外されるアミノ酸の合計が、好ましい順に、対象の食事制限の全重量の５重量パーセント、３重量パーセント、１重量パーセント、および０．５重量パーセント未満であることを意味する。代わりに、アミノ酸特異的な食事制限は、窒素の供給源として１つ以上の以下のアミノ酸を提供する；アラニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、プロリン、セリン、およびチロシン。表２〜４は、下記に示されるようにタンパク質を制限するものでもあるマウスについてのアミノ酸特異的な食事制限の特徴を提供する。典型的なマウス食事制限は、１日当たり約１９ｋｃａｌを提供する。ヒトなどのような他の哺乳動物については、タンパク質制限（ＰＲ）食は、必須カロリーを提供するように調整される。たとえば、米国における成人についての典型的なカロリー摂取量は、１日当たり約２２００カロリーである。表５は、ヒト対象についてのそれぞれの供給源由来の１日当たりのキロカロリーを提供するが、表６は、ヒトについてのそれぞれの供給源由来の１日当たりのグラムを提供する。
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【００５７】
一改良では、マウスについての１キログラムのアミノ酸特異的な食事制限が、約２ｇ〜２０ｇアラニン、１０ｇ〜３０ｇアスパラギン酸、２ｇ〜２０ｇシステイン、４０ｇ〜８０ｇグルタミン酸、２ｇ〜２０ｇグリシン、２ｇ〜２０ｇヒスチジン、１５ｇ〜５０ｇプロリン、５ｇ〜３０ｇセリン、および５〜３０ｇチロシンを含む。ヒト対象については、ヒト対象についての１日当たりの食事療法製剤の組成物を提供するためにこれらの範囲に係数（すなわち約０．５７２）を掛ける。たとえば、アミノ酸特異的な食事制限におけるヒト（２２００カロリー／日の食事制限）についての特定のアミノ酸の毎日の量は、約２〜１２ｇアラニン、５ｇ〜３０ｇアスパラギン酸、１ｇ〜７ｇシステイン、１８ｇ〜７３ｇグルタミン酸、２ｇ〜９ｇグリシン、２ｇ〜１０ｇヒスチジン、９ｇ〜３７ｇプロリン、５ｇ〜２１ｇセリン、および５〜２１ｇチロシンである。他の改良では、アミノ酸特異的な食事制限が、１キログラムの食事制限当たり約１６０〜約２４０ｇの特定のアミノ酸を含む。そのため、ヒトについて、アミノ酸特異的な食事制限は、１キログラム当たりの食事制限値を、約２２００カロリー／日のヒト食事制限を代表する値に変換するために係数（０．５７２）を使用すると、１日当たり約８０〜１６０ｇの特定のアミノ酸を提供する。他の変形では、アミノ酸特異的な食事制限が、上記に示された量で、アラニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、プロリン、セリン、およびチロシンからなる群から選択される少なくとも６つのアミノ酸を含む。さらに他の変形では、アミノ酸特異的な食事制限が、表７において示される１日当たりのヒト体重１Ｋｇ当たりのアミノ酸の量をグラムで提供する。特に、アミノ酸特異的な食事制限は、１日当たりヒト体重１Ｋｇ当たり以下のグラム、０．０６ｇアラニン、０．１４ｇアスパラギン酸、０．０４ｇシステイン、０．４５ｇグルタミン酸、０．０５ｇグリシン、０．０６ｇヒスチジン、０．２３ｇプロリン、０．１３セリン、および０．１３ｇチロシンを提供した。他の改良では、これらのアミノ酸のそれぞれが、所定の値のプラスまたはマイナス３０パーセントの範囲内にある。
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【００５８】
他の実施形態では、アルツハイマー病の症状を軽減するための他の方法が提供される。方法は、第１の期間に対象にタンパク質制限（ＰＲ）食を施すステップを含む。一変形では、ＰＲ食が、特異的なアミノ酸の栄養補助食品を含む。一改良では、第１の期間は、約５日〜１４日であり、７日が典型的である。さらに、低タンパク質食は、対象の通常のカロリー摂取量の７０〜１００パーセントを対象に提供する。ＰＲ食は、窒素の供給源としてアミノ酸のみを実質的に含む。たとえば、タンパク制限食は、タンパク質からそのカロリーの１０パーセント未満を得る。他の改良では、タンパク制限食が、タンパク質からそのカロリーの５パーセント未満を得る。他の改良では、タンパク制限食が、タンパク質からそのカロリーの０パーセントを得る。特に、タンパク制限食は、実質的に以下のアミノ酸、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびアルギニンを除外する。この文脈において、「実質的に除外する」は、除外されるアミノ酸の合計が、好ましい順に、５重量パーセント、３重量パーセント、１重量パーセント、および０．５重量パーセント未満であることを意味する。代わりに、タンパク制限食は、窒素の供給源として１つ以上の以下のアミノ酸を提供する；アラニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、プロリン、セリン、およびチロシン。表２〜４は、下記に示されるマウス研究についての栄養補助食品を含むタンパク制限食の特徴を提供する。典型的なマウス食事制限は、１日当たり約１９ｋｃａｌを提供する。ヒトなどのような他の哺乳動物については、ＰＲ食は、必須カロリーを提供するように調整される。たとえば、米国における成人についての典型的なカロリー摂取量は、１日当たり約２２００ｋカロリーである。表５は、ヒト対象についてのそれぞれの供給源由来の１日当たりのキロカロリーを提供するが、表６は、ヒトについてのそれぞれの供給源由来の１日当たりのグラムを提供する。
【００５９】
一改良では、マウスについてのＰＲ食の１キログラムにおけるアミノ酸が、表８において提供される。一改良では、マウスについての１キログラムのＰＲ食が、約２ｇ〜２０ｇアラニン、１０ｇ〜３０ｇアスパラギン酸、２ｇ〜２０ｇシステイン、４０ｇ〜８０ｇグルタミン酸、２ｇ〜２０ｇグリシン、２ｇ〜２０ｇヒスチジン、１５ｇ〜５０ｇプロリン、５ｇ〜３０ｇセリン、および５〜３０ｇチロシンを含む。ヒト対象については、ヒト対象についての１日当たりのこれらのアミノ酸についての毎日の必要量を提供するためにこれらの範囲に係数（すなわち約０．５７２）を掛ける。たとえば、ＰＲ食におけるヒト（２２００カロリー／日の食事制限）についての特定のアミノ酸の毎日の量は、約２〜１２ｇアラニン、５ｇ〜３０ｇアスパラギン酸、１ｇ〜７ｇシステイン、１８ｇ〜７３ｇグルタミン酸、２ｇ〜９ｇグリシン、２ｇ〜１０ｇヒスチジン、９ｇ〜３７ｇプロリン、５ｇ〜２１ｇセリン、および５〜２１ｇチロシンである。他の改良では、タンパク制限食が、１キログラムの食事制限当たり約１６０〜約２４０ｇの特定のアミノ酸を含む。そのため、ヒトについて、ＰＲ食は、１キログラム当たりの食事制限値を、約２２００カロリー／日のヒト食事制限を代表する値に変換するために係数（０．５７２）を使用すると、１日当たり約８０〜１６０ｇの特定のアミノ酸を提供する。他の変形では、タンパク制限食が、上記に示された量で、アラニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、プロリン、セリン、およびチロシンからなる群から選択される少なくとも６つのアミノ酸を含む。表８は、マウス食事制限についてのタンパク制限食におけるアミノ酸内容物の例を提供する。表８はまた、コントロール（通常の食事制限）に対するタンパク制限食における特定のアミノ酸の比である係数を提供する。これらの比は、ヒト対象などのような他の哺乳動物に等しく適用可能である。さらに他の変形では、ＰＲ食が、表８において示される１日当たりのヒト体重１ｋｇ当たりのアミノ酸の量をグラムで提供する。特に、ＰＫ食は、１日当たりヒト体重１Ｋｇ当たり以下のグラム、０．０６ｇアラニン、０．１４ｇアスパラギン酸、０．０４ｇシステイン、０．４５ｇグルタミン酸、０．０５ｇグリシン、０．０６ｇヒスチジン、０．２３ｇプロリン、０．１３セリン、および０．１３ｇチロシンを提供した。他の改良では、これらのアミノ酸のそれぞれが、所定の値のプラスまたはマイナス３０パーセントの範囲内にある。
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【００６０】
いくつかの変形では、上記に示される方法が、第１の期間に続く第２の期間に対象に通常の食事制限（すなわちコントロール食事制限）を施すステップをさらに含む。通常の食事制限は、タンパク質に関していかなる制限をも伴わない通常のカロリー摂取量を対象に提供する。さらに、通常の食事制限から明示的に除外されるアミノ酸はない。典型的に、第２の期間は、５日〜２８日以上である。一変形では、対象は、タンパク制限食および通常の食事制限を通して、１回以上繰り返して、タンパク制限食プラスアミノ酸サプリメントおよび通常の食事制限が交互に提供される。表２は、通常の食事制限におけるアミノ酸内容物の例を提供する。表２〜４は、下記に示されるマウス研究についての通常の食事制限の特徴を提供する。ヒトなどのような他の哺乳動物については、食事制限は、必須カロリーを提供するように調整される。たとえば、米国における成人についての典型的なカロリー摂取量は、１日当たり約２２００カロリーであり、そのため、ヒト対象に関連するデータを提供するためにマウスデータに係数（０．５８５）を掛ける。表５は、ヒト対象についての通常の食事制限についてのそれぞれの供給源由来の１日当たりのキロカロリーを提供するが、表６は、ヒト対象についての通常の食事制限についてのそれぞれの供給源の１日当たりのグラムを提供する。
【００６１】
他の実施形態では、対象の食事制限と組み合わせた栄養補助食品が提供される。一変形では、対象の食事制限が、低い（たとえば５、３、１、もしくは０．５重量パーセント未満）または０パーセントのタンパク質を有する。そのため、この変形では、栄養補助食品プラス対象の食事制限が、上記に示されるＰＲ食を形成する。他の変形では、対象の食事制限が、対象の通常の食事制限（たとえばヒトについて２２００カロリー／日）または特定のアミノ酸の追加が所望される任意の食事制限である。栄養補助食品は、上記に示される食事療法の必要量を満たすのに十分な量の特定のアミノ酸を含む。特に、栄養補助食品は、アラニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、プロリン、セリン、およびチロシンを含むが、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、およびアルギニンを実質的に除外する。一改良では、栄養補助食品が、上記に示される量のこれらのアミノ酸を提供するために十分な量の特定のアミノ酸を含む。表８は、栄養補助食品におけるシステインに対するアミノ酸比の範囲を提供する。一変形では、栄養補助食品が、第１の期間を通して１つ以上のサイクルの間に十分な量のアミノ酸を含む。典型的に、栄養補助食品は、上記に示される食事療法プロトコールを実行するための説明書を含む。
【００６２】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証する。当業者らは、本発明の精神および請求項の範囲内にある多くの変形を認識するであろう。
【００６３】
食餌制限および／またはカロリー制限（ＣＲ）は、消化器系の幹細胞の自己再生および神経の再生を増進し、加齢の間のＨＳＣ数の衰退を低下させ、それらの長期的な再生能を保護する（１〜４）。しかしながら、免疫不全および造血系の幹細胞ベースの再生に対するＣＲまたは断食の効果は以前に知られていなかった。また、ＣＲは、体重減少から引き離すことができず、ＩＧＦ−Ｉおよびグルコースレベルに対して中程度の効果しか引き起こさない、長期にわたる介入である（５）。対照的に、発明者らは、マウスが標準体重を取り戻し、かつそれを維持するのを可能にする断食サイクルが、重度の欠乏を引き起こす条件下でさえ、脳、肝臓、および血液を含む複数の系の再生を伴う、多能性ＣＤ４５−  ＭＳＣ／ＥＰＣおよび多分化能成人ＨＳＰＣにおける大きな増加を増進することを示す。これらの結果は、完全な摂食制限のサイクルが、階層的な様式で、幹細胞自己再生または脱分化／再プログラムのトリガーとして果たし得ることを示唆する。
【００６４】
動物およびヒト研究からの証拠に基づいて、成人期の間に様々な形態の断食を組み込むライフスタイルは健康を増進するが、同時に、特に太り過ぎで、座ってばかりいる人々にとって、多くの慢性疾患の危険性を低下させる。特に、様々な絶食アプローチは、たとえば、対象のライフスタイルへの大きな介入ならびに食習慣、低コンプライアンス、および栄養失調の副作用のために、難題のままである。そのため、対象における絶食様の効果を誘発する低カロリーの断食を模倣する食事制限（ＦＭＤ）は、絶食に対する代案を提起する。そのうえ、絶食ではなく食事制限は、好ましくは可能な限り自然食品の供給源を通して微量栄養物を提供することを可能にする。発明者らは、ここで、ＦＭＤのサイクルの繰り返しが、対象において、ヘルススパン、成人神経発生、認知機能、および組織維持ならびに組織再生を増進するという例を示す。
【００６５】
図１は、げっ歯動物およびヒト対象における体組成に対する効果を例証する表９を提供する。１６．５月齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、１サイクルのＦＭＤは、適宜食物を供給したコントロールと比較して１８％、体重を有意に低下させた。再供給後、重量における有意な差異は存続せず、すべてのマウスが第１のサイクルの終了後に食事療法措置から回復したことを示す。重量における減少は、サイクルの４日すべてを考慮した場合、約８０％低下させた、ＦＭＤサイクルの間の比較的低いカロリー摂取量に帰することができる。マウスに再供給の間にわずかな過剰摂取によってＦＭＤ供給後に補い、したがってカロリー摂取量を標準化したので、カロリー摂取量における差異は、食事制限およびコントロール群の間で観察されなかった。断食を模倣する食事制限の供給サイクルの繰り返しは、２つの群の体重を引き離した。コントロール群におけるマウスは、１０供給サイクルの間にそれらの体重を増加させたが、ＦＭＤ群におけるマウスは、重量におけるゆるやかな減少が明らかになる前に、およそ１２供給サイクルの間、ＦＭＤ措置の開始前のそれらの重量に近い体重を維持した。そのため、全体脂肪ならびに下位区分の脂肪沈着物（皮下および内臓）に対するＦＭＤレジメンの長期的な効果は、Ｘ線コンピューター断層撮影（ＣＴ）走査によって評価した。２８月齢時、２３ＦＭＤサイクルの終了後に、肥満に関連する病態に密接に関係する全体脂肪および内臓体脂肪は、ＦＭＤの食物を供給したマウスにおいて低下した。皮下脂肪沈着物に対しては小さな効果しか測定可能ではなかった。ヒト対象において、断食を模倣する食事制限の１および３サイクルの後に、体重（ＦＭＤの開始前のベースライン値と比較した％として）は、有意に低下し、したがって、前臨床実験において見られるものと類似する効果を有する。ヒト対象についての体幹脂肪の相対的なパーセンテージは、ヒト対象において、「二重エネルギーＸ線吸収測定法」（ＤＥＸＡ）によってＦＭＤの３サイクルの終了に際して評価した。
【００６６】
図２は、癌発生率における低下を実現する、癌関連性の死亡の発症を遅延させる、ならびに／または対象におけるヘルススパンおよびライフスパンに関連するバイオマーカーに影響を与えるＦＭＤ食事制限を例証する表１０を提供する。検死に際して、新生物が、対象において見つけられた最も目立つ変化であったが、ＦＭＤの食物を供給した対象において罹患率は低下した。競合リスク回帰分析は、ＦＭＤコホートにおける対象についての新生物形成関連性の死亡において著しい減少（ｐ＝０．０２）を示した。新生物形成発生率を考慮した場合、ＦＭＤコホートにおける対象が、後年、新生物で死んだこともまた明らかになった。共に腫瘍発症および進行を増進することが示されたグルコースおよびＩＧＦ−１は、ＦＭＤレジメンの間に有意に低下した。ＩＧＦ−１に結合し、その生物学的利用率を低下させるＩＧＦＢＰ−１は増加し、それによってＩＧＦ−１シグナル伝達をさらに低下させた。前臨床データと同様に、ＩＧＦ−１は、第１および第３ＦＭＤサイクルの後に低下した。ＩＧＦＢＰ−１レベルは増加した。
【００６７】
図３は、様々な組織および器官における炎症を低下させるための栄養製剤および方法を提供する表１１を提供する。炎症は、アテローム性動脈硬化症、癌、肥満、糖尿病、鬱血性心不全、消化器疾患、およびアルツハイマー病などのような多くの年齢関連性の疾患の発症において種々の役割を果たす（６）。適宜に食物を供給したコントロール動物と比較して、ＦＭＤ食事制限を１６．５月齢時に開始して維持した対象は、死体解剖時に検出された、炎症を起こした組織の発生率が有意に低下した。炎症を起こした組織は、とりわけ、雌の対象の肝臓および生殖器系を含んだ（図示せず）。いくつかのＣ５７Ｂ１／６株（両方の性別）特異的バックグラウンド疾患のうちの１つは、重度の潰瘍性皮膚炎に多くの場合進行する限局性脱毛症の出現である。ＦＭＤ食事制限により食物を供給した対象は、適宜食物を供給したコントロール対象と比較して、それらのライフスパンにわたって皮膚炎発生率における５０％の低下を示した（それぞれ１０．３％対１９．６％）。
【００６８】
図４は、ＦＭＤ食事制限により食物を供給した対象が、加齢関連性の骨塩量の損失の遅延を示した表１２を提供する。骨塩量（ＢＭＤ）は年齢と共に減少し、低ＢＭＤは、骨折についての最も重要な危険因子のうちの１つである。大腿部の骨の骨塩量［ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）ｍｇ／ｃｍ３で］は、１２および２８月齢のコントロールの食物を供給したマウスにおいておよび２８月齢（再供給）時にインビボにおいてＦＭＤコホートにおける対象の再供給の７日後に、Ｘ線コンピューター断層撮影（ＣＴ）走査によって分析した。隔月でＦＭＤ置換食事制限の食物を供給した１２か月後に、ＦＭＤの食物を供給した対象の大腿骨におけるハイドロキシアパタイト／ｃｍのレベルは、標準的な食事制限の食物を供給した対象と比較して、より高く（ｐ＜０．０５）、この群における老人性骨粗鬆症の低下を示した。
【００６９】
図５は、肝臓再生のための栄養製剤および方法を提供する表１３を提供する。適宜食物を供給したコントロール由来の２０〜２２．５月齢のマウスと比較して、１６．５月齢時に実験的なＦＭＤ食事制限を開始して食物を供給した対象は、肝臓重量を有意に低下させ、ＦＭＤレジメンの終了時にもとの肝臓質量の約３５％を失った。肝細胞の損傷および肝臓健康の評価のための臨床診断マーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、ＦＭＤレジメンの終了時に上昇したが、７日間の再供給の内に通常のレベルに戻った。ＡＬＴにおける増加は、ＦＭＤ食事制限が、肝細胞の広範囲な構造的変化および自家融解を引き起こすという観察と一致する（表１３Ｂ、アスタリスク）。再供給の２４時間後に、肝臓重量は正常な重量に戻り、さらにそれを超過し（＋１０％）、それによって、新しく生成された細胞による、失われた肝臓の塊の再増殖を示す。コントロール（表１３Ａ）および再供給の２４時間後のＦＭＤ群における対象の肝臓Ｈ＆Ｅ染色は、静脈のまわりの非組織的細胞の浸潤を実証し（表１３Ｂ、矢印）、再供給直後の肝細胞による肝臓再生および再増殖を示す。
【００７０】
図６は、幹細胞／前駆細胞を増加させる栄養製剤および方法のための結果を提供する。マウスでは、造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、２サイクルの短期間の飢餓（ＳＴＳ、表１４Ａ）の後に骨髄を増加させ始めた。短期間の飢餓の４８時間後にマウスにおいて間葉系および内皮幹細胞／前駆細胞（ＭＳＣ／ＥＰＣ）の誘発もまた、観察することができた（表１４Ｂ）；１２サイクルのＦＭＤは、同様の効果をもたらした（表１４）。ヒト対象では、ＨＳＰＣ（表１４Ｃ）およびＭＳＣ／ＥＰＣ（表１４Ｄ）は、１ＦＭＤサイクルの終了後に増加し、その効果は再供給後に存続した。
【００７１】
図７は、造血再生を増進する栄養製剤および方法についての結果を提供する。マウスでは、複数のサイクルのシクロホスファミドが、白血球（ＷＢＣ）欠損およびリンパ／骨髄（Ｌ／Ｍ）の偏りを引き起こした（表１５）。断食のサイクルは、ＷＢＣの回復を加速し、リンパ系列または骨髄系列のホメオスタシスを再建した（表１５）。免疫抑制性の化学療法を受けているヒト対象では、同様の再生促進性の（ｐｒｏ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）効果は、２サイクルの絶食の後にＷＢＣおよびＬ／Ｍにおいて観察された（表１５）。
【００７２】
図８は、年齢依存性の骨髄の偏りを軽減する栄養製剤についての結果および方法を提供する。血液系列のホメオスタシスは、加齢の間に乱れ、骨髄系列の方に偏るようになる（表１６）。マウスおよびヒト対象の両方では、ＦＭＤのサイクルは、系列バランスからのずれを予防し、中年の対象における変性の影響を逆転させる（表１６）。
【００７３】
図９および１０は、絶食を模倣して、ＧＨＲ／ＩＧＦ−１またはＰＫＡシグナル伝達を鈍らせることによって幹細胞／前駆細胞を刺激するための方法を例証する。絶食によって引き起こされるものと同様に、成長ホルモン受容体遺伝子（ＧＨＲＫＯ）の標的破壊は、マウスにおいて、循環ＩＧＦ−１における著しい減少ならびにＨＳＰＣおよびＭＳＣ／ＥＰＣの誘発を引き起こす（図９）。ＰＫＡ活性を阻害するＰＫＡ  ｓｉＲＮＡ処置もまた、エクスビボにおいて幹細胞／前駆細胞における同様の誘発を引き起こした。再生細胞における増加の再生能は、インビボにおいて免疫無防備状態のレシピエントマウスにおいて明らかであった（図１０）。
【００７４】
図１１〜１４は、成人の神経発生を誘発し、認知機能を改善する栄養製剤および方法についての実験結果を提供する（表１７）。対象における増殖インデックスおよび成人の神経発生は、ＦＭＤ食事制限の第１２サイクルの４日前に開始したブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組み込みに基づいて評価し、年齢が一致する適宜食物を供給したコントロール対象（２３月か月）と比較した。ＢｒｄＵ陽性細胞は、顆粒細胞ゾーンにおいて上昇する。ＤＣＸ＋染色は、歯状回における未成熟神経細胞を測定するために実行した。ＦＭＤコホートでは、ＢｒｄＵ保持細胞の１７．６％はまた、コントロールにおける３．１％と比較して、ＤＣＸについても陽性であり、ＦＭＤ群における対象が、神経細胞系列に傾倒した神経前駆細胞を増加させたことを示す。成人の神経発生は、老齢のマウスにおいて、運動協調性能力、短期間の認識、および長期的な空間認識能に密接に結び付けられた。ＦＭＤで維持した対象は、長期的な空間学習および記憶（Ｂａｒｎｅｓ迷路）、短期間の記憶（新規な物体認識）、ならびに作業記憶（Ｙ迷路）ならびに協調およびバランス（ロータロッド）について試験し、通常のげっ歯動物固形飼料によりに食物を供給した対象と比較した。行動試験はすべて、２３〜２４月齢時に１０〜１２の食事制限サイクル（ＦＭＤ食事制限で５〜６か月）の間に行った。飢餓誘発性の機能亢進または普通でない動きを予防するために、対象が通常の体重を取り戻すのにかかるおよその時間である再供給の３日後以降にＦＭＤ対象に行動試験を受けさせた。運動協調性および運動能力学習を試験するために、コントロールおよびＦＭＤコホート由来の対象を加速ロータロッドにより試験した（表１７Ａ）。６回の治験セッションの中のベストスコア（秒で）は、２３月齢の適宜食物を供給した対象と比較して、ＦＭＤコホートにおける対象について有意に改善された。空間認識および短期間の記憶は、新規な物体認識試験（表１７Ｂ）およびＹ迷路（表１７Ｃ）により評価した。新規な物体認識行動試験は、状況依存性の記憶を評価し、よく知られている物体および新規な物体の間で費やされた時間（秒で）の比として定義される認識インデックスとして計算する。調整段階の間に、２つの同一の物体を長方形のケージの内部に置き、両方の物体を探索するのに費やされた時間を記録した。この調整期間の後に、一方の物体を新規な物体と交換し、両方の物体を探索するのに費やされた時間を記録した（表１７Ｂ）。ＦＭＤコホートにおける対象は、この試験において有意により良好に機能し、より良好な物体関連性の短期間の記憶を示した。作業記憶機能は、Ｙ迷路における自発的交替行動（ＳＡＢ）に基づいて調査した（表１７Ｃ）。ＦＭＤの食物を供給した対象は、適宜食物を供給した対象よりも有意に良好にこの試験において機能した。空間学習は、コントロールおよびＦＭＤ群における対象について２３月齢時にＢａｒｎｅｓ迷路により試験した（表１７Ｄ〜Ｈ）。エラーの数（表１７Ｄ、あらゆる偽標的穴に対するノーズポークおよび頭部のふれとして定義される）、逃避箱からのずれ（表１７Ｅ、逃避箱からどれだけの穴が離れているかを第１のエラーとした）、潜伏時間（表１７Ｆ、マウスが逃避箱に入るのにかかった時間）、ならびに成功率（表１７Ｇ、１００％、２分以内に逃避箱を見つけるまたは０％、２分以内に逃避箱を見つけない）を記録した。記憶保持は、１５日目にそれぞれの対象を試験することによって評価し、測定値は、それぞれの対象についての値を得るための２回の試験から平均した。検索戦略は、ランダム（迷路の中心を横断することによって分けられる局所的な穴検索）、連続的（時計回りもしくは反時計回り方向の規則正しい穴検索）、または空間的（共に３以下のエラーおよびずれスコアで逃避箱に直接動く）に分類した（表１７Ｈ）。ＦＭＤの食物を供給したコホートにおける対象は、１５日目に、優れた検索戦略およびそれらの逃避箱についてのより良好な記憶力を示し、したがって、運動学習ならびに海馬依存性の短期的なおよび長期的な記憶における認知能力の改善を実証する。
【００７５】
ＰＲＣレジメンは、長期にわたる低重量状態も、カロリー摂取量における全体的な減少も引き起こさない。通常の食事制限により食物を供給したコントロール動物と異なって、７日間のＰＲ食の後に、３×Ｔｇ−ＡＤおよびＷＴマウスは両方とも、初期体重の１３〜１７％を失い、これは、以降の７日間の通常の食事制限による再供給の間に完全に回復した（図１５Ｂ、反復測定、ＡＮＯＶＡ、その後に続くＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定：ｐ＜０．００１、ＰＲＣレジメンと比較したコントロールレジメン）。同様の体重プロファイルは、食事療法処置の全１８週間の間にＰＣＲレジメンを受けさせたマウスによって維持された（図１５Ｃ、反復測定、ＡＮＯＶＡ、その後に続くＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定：ｐ＜０．００１、ＰＲＣレジメンと比較したコントロールレジメン）。また、発明者らは、ＷＴおよび３×Ｔｇ−ＡＤ群の間で有意な差異を見つけ、３×Ｔｇ−ＡＤげっ歯動物は６〜７週目に徐々にかつわずかに重量が減少した（図１５Ｃ、反復測定、ＡＮＯＶＡ、その後に続くＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定：ｐ＜０．０５、３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対ＷＴコントロールおよび３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ対ＷＴ  ＰＲＣ）。３×Ｔｇ−ＡＤコントロール群における徐々の体重低下を考慮すると、ＰＲ食での３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣマウスの年齢依存性の体重減少は、食事制限ではなく突然変異に主として依存性であるように思われる。総合的に考えると、これらのデータは、より長い期間の通常の食事制限の再供給が、長期的なサイクルのタンパク質制限の後に重量維持を可能にするために必要とされるかもしれないことを示唆するが、これらのデータは、ＰＲＣレジメンがＷＴおよび３×Ｔｇ−ＡＤマウスの両方において長期にわたる低体重に関連しなかったことを示す。
【００７６】
次に、食事療法に対するＣＲの影響の可能性を調査するために、発明者らは、処置の初め（１および２週目）ならびに終了時（１７および１８週目）にカロリー摂取量をモニターした。処置の初め（１および２週目）に、ＰＲ食の最初の７日間（１〜７日目）に、平均カロリー摂取量は、ＷＴにおいて２４．３％および３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて２４．２％低下した（図２１Ａ、ｔ−検定：それぞれＦ＝２．４６および３．７９、ｐ＜０．００１）。必須ＡＡを欠く食事制限は、風味が低く、げっ歯動物を含むほとんどの動物は、必須ＡＡを欠く食物を摂取した後に食物摂取量を低下させる（Ｇｉｅｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。しかしながら、再供給（ＰＲサイクルの８〜１４日目）の間に、平均カロリー摂取量は、ＷＴにおいて２２．５％および３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて１７．２％増加した（図２１Ａ、ｔ−検定：ＷＴについてＦ＝１．５３およびｐ＜０．０１、３×Ｔｇ−ＡＤについてＦ＝１．６２およびｐ＜０．０５）。同様のカロリー摂取量プロファイルは、処置の終了時（１７および１８週目）に検出された。平均カロリー摂取量は、ＰＲ食供給の間にＷＴにおいて２０．３％および３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて１０．５％減少した（図２１Ｂ、ｔ−検定：ＷＴについてのＦ＝３．５７およびｐ＜０．０５、３×Ｔｇ−ＡＤについてＦ＝２７．７８およびｐ＞０．０５）。さらに、再供給期間は、カロリー摂取の有意な増加に結び付けられた（図２１Ｂ、ＷＴにおいて４０．１％および３×Ｔｇ−ＡＤにおいて２５．３％、ｔ−検定：ＷＴについてＦ＝３．４７およびｐ＜０．００１、３×Ｔｇ−ＡＤについてＦ＝１．５０およびｐ＜０．０５）。
【００７７】
ＰＲおよび通常の食事制限再供給の両方の期間についての値を組み合わせることによって計算した平均カロリー摂取量は、処置の第１週および最終週の両方の間のコントロールレジメンの平均と同様であった（図１５Ｄおよび１５Ｅ、ｔ−検定、ｐ＞０．０５）。発明者らは、ＰＲＣレジメンは、ＰＲ食段階の間にのみ、緩やかであるが避けられないＣＲに関連し（長期的に見ると効果が減少するにもかかわらず）、ＷＴについて１９〜１７％および３×Ｔｇ−ＡＤについて２５．６〜１３％の範囲にわたり、以降の通常の食事制限再供給期間の間にカロリー摂取量の増加によって相殺されたと結論づけた。ＰＲＣ介入のカロリー摂取量プロファイルは、ＣＲレジメンだけではなく、断続的な絶食（ＩＲ）（または一日おきの供給−ＥＯＤＦ−）、一日おきに２４時間の摂食制限があり、長い間にわたる２０〜３０％のカロリー摂取量低下およびＣＲに類似する有益な効果によって特徴付けられる他の食餌制限とも異なる（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。
【００７８】
ＰＲＣレジメンは、血中グルコースレベルの有意な減少を引き起こさない。血中グルコースレベルは、食事制限の間に注目すべき変化を受ける。たとえば、げっ歯動物における２０〜４０％のＣＲの延長は、２０〜４０％の血中グルコース低下を引き起こし得る（Ｌｅｅ＆Ｌｏｎｇｏ  ２０１１）。しかしながら、ＰＲＣレジメンは、血中グルコースレベルにおける有意な変化を増進しなかったが、ＰＲ食の食物を供給する期間の終了時にのみ、グルコース濃度低下の傾向を引き起こした（ＷＴにおいて１７％および３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて８％）（図１６Ａ）。これらのデータは、ＰＲＣ効果がＣＲによるものではないという発明者らの結論を支持する。
【００７９】
ＰＲＣレジメンは、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて、３０〜７０％、循環ＩＧＦ−１レベルを、２０〜４０％、ＩＧＦＢＰ−３を低下させ、３〜８倍、ＩＧＦＢＰ−１を増加させる。脳に作用するＩＧＦ−１のおよそ９５％は、肝臓に由来することが示された（Ｙａｍａｍｏｔｏ＆Ｍｕｒｐｈｙ  １９９５）。ＩＧＦ−１は、その受容体および結合タンパク質もまた脳中に存在し、局部的に生成されるが、ＩＧＦ−１は、脳血液関門を横切って能動的に輸送され、そのため、循環ＩＧＦ−１における変化は、脳へのＩＧＦ−１投入量における変化に至り得る（Ｃａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）。ＩＧＦ−１の生物学的利用率および生物活性は、ＩＧＦについてのキャリヤとして作用する６つのタンパク質のファミリーであるＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）によって調節される（Ｊｏｎｅｓ＆Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  １９９５）。様々な結合タンパク質の中で、ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−１は、ＩＧＦ−１生物学的利用率において顕著な役割を果たす。
【００８０】
ＩＧＦＢＰ−３は、定量的に最も代表されるＩＧＦＢＰであり、８０％以上の循環ＩＧＦ−１に結合し、血清からの急速な分解または排除からそれを保護する（Ｊｏｎｅｓ＆Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  １９９５）。
【００８１】
他のＩＧＦＢＰとは異なって、ＩＧＦＢＰ−１は、ＩＧＦ−１自体に結合し、ＩＧＦ受容体へのその結合を予防することによって、ＩＧＦ−１作用を阻害する（Ｊｏｎｅｓ＆Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  １９９５）。
【００８２】
ＩＧＦ−１測定値は、３×Ｔｇ−ＡＤが、ＷＴと比較して、より高い循環レベルのホルモンを有することを明らかにした（図１６Ｂ、ｔ−検定：ＷＴ対３ＸＴｇ−ＡＤ、ｐ＜０．０５）。３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて、ＩＧＦ−１レベルは、ＰＲ食期間の間だけではなく（図１６Ｂ、７０％の低下、ＰＲ食サイクルの終了時の３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ、ｐ＜０．００１）、通常の食事制限再供給の間にも（図１６Ｂ、２８％の低下、通常の食事制限再供給サイクルの終了時の３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ、ｐ＜０．００１）、ＰＲＣレジメンによって低下した。類似しているがより弱い効果が、ＰＲ食の終了時にＷＴマウスにおいて検出された（図１６Ｂ、４４％の低下、ＰＲ食の終了時のＷＴコントロール対ＷＴ  ＰＲＣ、ｐ＜０．０５）。ＩＧＦＢＰ−３の循環レベルは、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて、ＰＲ食および再供給サイクルの両方の終了時にＰＲＣレジメンによって有意に減少した（図１６Ｃ、３７％の低下、ＰＲサイクルの終了時の３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ、ｐ＜０．００１；１７％の低下、通常の食事制限再供給の終了時の３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ、ｐ＜０．０１）。ＷＴマウスにおいて、発明者らは、ＰＲ食供給の間の低下の傾向に気づいたが、ＰＲＣ介入は、ＩＧＦＢＰ−３レベルにおける有意な変化を引き起こさなかった。最終的に、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて、ＰＲＣレジメンは、ＰＲサイクルの終了時に循環ＩＧＦＢＰ−１レベルの有意な増加を増進した。（図１６Ｄ、８倍増加、ＰＲサイクルの終了時の３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ、ｐ＜０．０１）。発明者らがＰＲ食の間にＩＧＦＢＰ−１の増加の傾向を観察したにもかかわらず、ＰＲＣレジメンは、ＷＴマウスにおいてその血中濃度の有意な調整を引き起こさなかった。
【００８３】
総合的に考えると、これらの結果は、１８〜１９週間のＰＲＣレジメンが、最終的な効果がＩＧＦ−１の循環レベルを低下させることである、ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰの強い調整を増進したことを明らかに示す。効果は、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいてより大きかった。
【００８４】
ＰＲＣレジメンは、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて年齢依存性の作業記憶障害を軽減する。ＰＲＣレジメンが認知機能の改善に関連するかどうかを決定するために、発明者らは、３×Ｔｇ−ＡＤおよびＷＴマウスの両方においてＹ迷路（海馬依存性作業記憶）を実行した。マウスは、食事療法による介入（８〜９月齢）の開始および毎月の処置の前に試験した。文献（Ｒｏｓａｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）に一致して、８〜９月齢の３×Ｔｇ−ＡＤの雄マウスは、年齢が一致するＷＴと比較した場合に、Ｙ迷路により検出可能な認知機能障害を示した（図１７Ａ  一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝３．４６、ｐ＜０．０５  ３×Ｔｇ−ＡＤ群対ＷＴコントロール）。１２．５〜１３．５月齢時に、３×Ｔｇ−ＡＤコントロールマウスはなお、ＷＴマウスと比較して有意な作業記憶障害を示したのに対して、１８週間のＰＲＣレジメンを受けさせた３×Ｔｇ−ＡＤマウスは示さず、食事制限によってもたらされた保護効果を示す（図１７Ｂ、一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝３．４６、ｐ＜０．０５  ３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対ＷＴコントロール）。興味深いことには、１２週間の処置の後、３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣマウスはなお、ＷＴと比較して、有意な記憶障害を示し、食事療法による介入が、効果的になる前に、潜在期を必要とするかもしれないことを示唆する（図２２Ａ、一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝２．４１、ｐ＜０．０５  ３×Ｔｇ−ＡＤ群対ＷＴコントロール）。発明者らは、ＷＴおよび３×Ｔｇ−ＡＤ群の間でアーム侵入の数における有意な差異を見出さず、食事制限がげっ歯動物の活動レベルに干渉しないことを示唆する（図２３Ａ、一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝４．２３）。
【００８５】
ＰＲＣレジメンは、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて短期の空間記憶障害を軽減する。記載されたマウスは、新規な物体認識（ＮＯＲ）試験を使用して、短期の空間記憶について試験した。ＮＯＲ試験は、処置の終了時に一度実行した（１２．５〜１３〜５月齢）。試験は、新規な物体を優先的に探索する自然のげっ歯動物行動に依存し、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて作業空間記憶を研究するために使用されてきた（Ｇｕｌｉｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。治験１の試験で、げっ歯動物に、２つの同一の物体を含有する箱を探索させ、それらを探索するのに費やされた時間を記録した。予想通りに、２つの物体の間の有意な偏好は、様々な実験群において検出されなかった（図２３Ｂ、ｐ＞０．０５、物体Ａ対物体Ｂ、ｔ−検定）。治験の終了時に、マウスを３分間ホームケージに戻し、次いで、物体のうちの一方を新規な物体と交換した箱に再び置き（治験２）、物体を探索するのに費やされた時間を、ＲＩ値を計算するために再び記録した。３×Ｔｇ−ＡＤコントロールマウスはＷＴと比較して、有意により低いＲＩを示したのに対して、ＰＲＣレジメンの３×Ｔｇ−ＡＤ動物は示さなかった（図１７Ｃ、一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｆ＝２．４３、ｐ＜０．０５  ３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対ＷＴコントロール  ）。これらの結果は、ＰＣＲが、マウスにおける３×Ｔｇ−ＡＤ突然変異によって引き起こされる空間記憶障害を軽減することができることを示す。
【００８６】
ＰＲＣレジメンは、研究したマウスにおいて不安に影響を与えない。適切に機能するように、ＣＮＳは、様々な神経伝達物質および神経調節物質の合成のための基質としてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、およびアルギニンを含む食事制限において見つけられるＡＡを必要とし、それらのうちのいくつかの利用率は、気分の調節において重要な役割を果たし得る（Ｙｏｕｎｇ  １９９６）。
【００８７】
不安に対する食事制限の影響を分析するために、発明者らは、タンパク質栄養不良によって引き起こされる行動変容を分析するために使用される試験である高架式十字迷路（ＥＰＭ）でＷＴおよび３×Ｔｇ−ＡＤマウスを試験した（Ｙｏｕｎｇ  １９９６）。試験は、処置の前に（８〜９月齢）および１８週間の食事療法による介入の後に（１２．５〜１３．５月齢）実行し、オープンアームにおいて費やされた時間をスコア化した。オープンアームにおいて費やされた時間が長いほど、不安のレベルが低いことを反映する。
【００８８】
食事制限介入の前に、３×Ｔｇ−ＡＤおよびＷＴの両方における実験群の間でスコア化されたパラメーターにおいて有意な差異は検出されなかった（図２２Ｂ、ｔ−検定、Ｆ＝１．６５、ｐ＞０．０５  コントロール対ＰＲＣ）。１８週間の食事制限処置の後、発明者らは、不安のレベルの増加を示す、げっ歯動物がオープンアームにおいて費やした時間における低下に気づいた。ベースライン時および食事療法による介入の終了時にスコア化されたパラメーターの間の大きな差異は、すべての実験群に共通であり、マウス処置の結果かもしれない。しかしながら、発明者らはなお、オープンアームにおいて費やされた時間においていかなる有意な差異をも検出しなかった（図１７Ｄ、ｔ−検定、Ｆ＝２．４５、ｐ＞０．０５  コントロール対ＰＲＣ）。発明者らは、タンパク質制限によって引き起こされる気分の調節に対する副作用の可能性を完全には除外することができないが、これらの結果は、食事制限介入が、処置マウスにおける有意な不安レベルの変化を引き起こさないことを示す。ＰＲＣレジメンは、３×Ｔｇ−ＡＤマウス海馬においてΑβ蓄積物を低下させない。ＰＲＣレジメンが老齢の３×Ｔｇ−ＡＤマウスの脳においてΑβ蓄積物における減少と結び付けられたかどうかを決定するために、脳切片をΑβに対して特異的な抗体を使用して免疫染色した。発明者らは、海馬台においても（図１８Ａ、ｔ−検定：Ｆ＝２．６０、ｐ＝０．７６）、ＣＡ１（図１８Ｂ、ｔ−検定：Ｆ＝１．７３、ｐ＝０．８７）海馬領域においても、コントロールおよびＰＲＣレジメンの間のΑβ  ＩＲにおいていかなる有意な差異をも見出さなかった。さらに、コントロールおよびＰＣＲ食事制限群の間で、数（図１８Ｃ、ｔ−検定：Ｆ＝４．０９、ｐ＝０．１７）においてもΑβ斑のサイズにおいても（図１８Ｄ、ｔ−検定：Ｆ＝１．７６、ｐ＝０．４４）差異はなかった。
【００８９】
ＰＲＣレジメンは、３×Ｔｇ−ＡＤマウス海馬においてタウリン酸化を低下させる。Αβ蓄積に加えて、３×Ｔｇ−ＡＤマウスは、ＡＤにおいて観察される進行性の認知機能障害において中心となると考えられるリン酸化タウの年齢依存性の蓄積を発症する。タウリン酸化のレベルに対するＰＲＣレジメンの効果を調査するために、発明者らは、ＡＤ病態に関連するＳｅｒ  ２０２および３０５でタウタンパク質のリン酸化を認識するＡＴ８抗体と免疫反応性の細胞の数を定量化した（Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）。発明者らは、ＰＲＣレジメンを受けさせたマウスが、通常の食事制限により食物を供給したマウスと比較して、リン酸化タウレベルにおける有意な減少を示すことを見つけた（図１９、ｔ−検定：Ｆ＝１．３１、ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＰＲＣが、独立してまたはΑβの下流でタウリン酸化を阻害するかもしれないことを示す。
【００９０】
ＰＲＣレジメンは、３×Ｔｇ−ＡＤマウス海馬においてミクログリア活性化を低下させない。次に、発明者らは、ＰＲＣレジメンが脳炎に影響を与え得るかどうかを調査することに決めた。神経炎症はＡＤの顕著な特徴であり、ミクログリア活性化のマーカーの増加が３×Ｔｇ−ＡＤマウスを含むＡＤげっ歯動物モデルにおいて報告された。最初に、発明者らは、ミクログリア特異的なマーカーＣＤ１１ｂを使用して、研究したマウスの海馬において活性化されたミクログリアの存在を定量化した。発明者らのデータは、ＷＴと比較して、３×Ｔｇ−ＡＤマウスの海馬におけるＣＤ１１ｂ−ｉｒ細胞の総数の劇的な増加を確認した（図２０Ａ、＊＊＊＝ｐ＜０．００１  ３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対ＷＴコントロール）。しかしながら、３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣマウスにおけるＣＤ１１ｂ−ｉｒ細胞の総数は、通常の食事制限により食物を供給した３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいてスコア化された値と異ならなかった（図２０Ａ、ｐ＞０．０５  ３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ対３×Ｔｇ−ＡＤコントロール、＊＊＊＝ｐ＜０．００１  ３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ対ＷＴコントロール）。
【００９１】
次に、発明者らは、休止、活性化分枝型、アメーバ状、食細胞の範囲にわたる４段階の形態学的な分類に基づいてミクログリアの活性化を定量化した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）。３×Ｔｇ−ＡＤコントロールマウスは、ＷＴと比較した場合に、より活性化された段階の蔓延を示した（図２０Ｂ：段階１、３×Ｔｇ−ＡＤコントロール２０％対ＷＴコントロール４２％；段階３、３×Ｔｇ−ＡＤコントロール３５％対ＷＴコントロール２２％；段階４、３×Ｔｇ−ＡＤコントロール７％対ＷＴコントロール１％．＊＊＊＝ｐ＜０．００１  ３×Ｔｇ−ＡＤコントロール対ＷＴコントロール）。さらに、ＰＲＣレジメンは、３×Ｔｇ−ＡＤマウスの海馬においてミクログリアの形態に影響を及ぼさなかった（図２０Ｂ、ｐ＞０．０５  ３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ対３×Ｔｇ−ＡＤコントロール、＊＊＊＝ｐ＜０．００１  ３×Ｔｇ−ＡＤ  ＰＲＣ対ＷＴコントロール）。これらのデータは、ＰＲＣが、炎症促進性の経路を改変することによって、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて、タウリン酸化および行動の欠陥に影響を与えないことを示す。
【００９２】
議論
発明者らの発見は、通常の食事制限およびタンパク質制限の毎週のサイクルが、ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰの循環レベルを調節し、また、タウリン酸化をも低下させ、ＡＤの動物モデルにおいて年齢依存性の記憶障害をも軽減するという証拠を提供する。
【００９３】
ＰＲＣは、ＡＤマウスモデルにおいて認知低下を完全には逆転させることができなかったが、結果は、発明者らが、有意な認知機能障害およびＡＤ様の病態を既に示しているマウスに対するＰＲＣ処置を開始したという事実に照らして重要である。通常の食事制限により食物を供給した３×ＴｇＡＤマウスは、非トランスジェニックコントロールマウスと比較した場合、作業および空間記憶の妨害を示した。対照的に、１８〜１９週間、ＰＲＣレジメンで維持した３×ＴｇＡＤマウスはＷＴマウスよりも有意に悪く機能しなかった。さらに、行動試験はすべて、通常の食事制限再供給期間の間に実行されたことに注目すべきである。一過性の循環ホルモンレベルおよび陽性の記憶機能の間の関係を仮定すると、発明者らは、ＰＲサイクルの間に、さらにより良好な結果を記録することができたことを除外することができない。興味深いことには、ＡＤ病態の２つの重要な特徴である、Αβ蓄積およびミクログリア活性化は、タンパク質制限３×Ｔｇ−ＡＤマウスの海馬において変化しなかった。他方では、発明者らは、ＰＲＣレジメンを受けさせた３×Ｔｇ−ＡＤが、通常の食事制限により食物を供給した３×Ｔｇ−ＡＤマウスと比較した場合に、リン酸化タウレベルの低下を示すことが分かった。証拠は、ＡＤによって影響を受けたヒト対象におけるリン酸化タウレベルおよび認知障害および軽度の認知機能障害（ＭＣＩ）の間の強い関連性を示す（ｄｅ  Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。タウリン酸化の低下は、ＡＤモデルに対して行った研究によって示されるように記憶障害を軽減し得る（Ｒｏｂｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。
【００９４】
Αβ沈着と無関係のタウリン酸化の低下の有益な効果は、Αβ病態がこのＡＤモデルにおいてタウ病態に先行するという事実によって説明され得る（Ｏｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。実際、Αβ沈着は、３×Ｔｇ−ＡＤマウスの海馬において６月齢までに存在するのに対して、およそ１２か月までリン酸化タウに対するＡＴ８免疫反応性が容易に検出可能になることはない（Ｏｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。したがって、３×Ｔｇ−ＡＤ脳におけるΑβのレベルは、処置の開始時にΑβ病態が進行期にあるために、ＣＲに関する従来の研究においても報告されるように（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５；  Ｈａｌａｇａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；  Ｍｏｕｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）、ＰＲＣ介入によって影響を及ぼされなかったかもしれない。
【００９５】
３×Ｔｇ−ＡＤ脳において、神経外Αβもまた、ミクログリア活性化に先行し、炎症の発症において主な役割を果たす（Ｋｉｔａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。そのため、ＣＲに関する従来の研究において観察されたように（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）、ミクログリア活性化に対するタンパク質制限の有益な効果を検出することができないのは、食事療法による介入の開始が遅いことによってまたは炎症に対する食事制限の他の構成成分（グルコースなど）の影響によって引き起こされるかもしれない。
【００９６】
タンパク質制限レジメンは、少なくとも部分的に、ＡＤマウスにおいて転帰の改善を担うことができたＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３、およびＩＧＦＢＰ−１の循環レベルの調整に結び付けられた。
【００９７】
最近、発明者らは、小人症ＧＨＲ／ＩＧＦ−１欠損マウスおよびＴｏｒ／Ｓｃｈ９欠損酵母からの結果（Ｂｒｏｗｎ−Ｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６；  Ｃｏｓｃｈｉｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００；  Ｆａｂｒｉｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１；  Ｆｏｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）に一致して、ＧＨＲおよびＩＧＦ−１欠損対象（Ｇｕｅｖａｒａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）における癌および糖尿病の発生率の低下を公表した。ＧＨＲＤの既知の世界人口は、小さく（４００未満）、それらのほとんどは９０歳以上の年齢に達していないが、ＡＤの症例は、ＧＨＲＤについてまだ報告されておらず、それらの神経系もまた加齢および認知症から保護されるかもしれないという可能性を高める。したがって、ＧＨＲ／ＩＧＦ−１シグナル伝達をダウンレギュレートする方法は、加齢および年齢関連性の疾患に対して保護するためのそれらの可能性について試験されるべきである。
【００９８】
他方では、ＩＧＦ−１は、脳維持において重大であり、神経細胞発達および可塑性などのようなＣＮＳの主な側面に関与する。脳における局所的なＩＧＦ−１利用率は、ＡＤにおいて神経保護の役割を果たし、神経発生および神経細胞生存を増加させ、脳Αβ排除を調整することができる（Ｃａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。
【００９９】
発明者らの血清ＩＧＦ−１測定値は、ＷＴ群と比較して、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて有意により高いレベルの循環ホルモンを示した。循環ＩＧＦ−１の増加はまた、ＡＤ患者においても観察され（Ｖａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）、ホルモンの作用に対する感受性の損失によって特徴付けられる、ＩＧＦ−１シグナル伝達に対して抵抗性の状態を克服するための試みによって引き起こされ得る（Ｃａｒｒｏ＆Ｔｏｒｒｅｓ−  Ａｌｅｍａｎ  ２００４）。最近、Ａｒｎｏｌｄおよび共同研究者らは、ＡＤ脳がＩＧＦ−１抵抗性であるということを直接実証し、インスリン／ＩＧＦ−１シグナル伝達の下流の分子の活性化形態が、ＡＤ患者脳において劇的に上昇することを示した（Ｔａｌｂｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）。
【０１００】
この研究において、発明者らは脳ＩＧＦ−１シグナル伝達を分析しなかったが、発明者らは、ＰＲＣレジメンによって誘発されるＩＧＦ−１レベルにおける長期にわたる全身性の低下は、３×Ｔｇ−ＡＤ脳におけるＩＧＦ−１感受性を増加させ、認知およびタウ病態に対する有意な有益な効果に至り得ることを推測する。発明者らの結果に一致して、海馬におけるＩＧＦ−１タンパク質レベルの増加および循環ＩＧＦ−１欠損によって特徴付けられる成人Ａｍｅｓ小人症マウスの海馬からの器官型切片は、Αβ誘発性のタウリン酸化過剰に対して抵抗性である（Ｓｃｈｒａｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。そのうえ、老齢のＡｍｅｓおよびＧＨＲ−ＫＯマウスは、年齢が一致するＷＴと比較して、より良好な記憶機能を示し（Ｋｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）、Ａｍｅｓマウスは、海馬の傷害後に神経発生の増加を示し（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）、脳におけるより高いレベルのホルモンと一緒に循環ＩＧＦ−１の低下を示唆し、さらなる保護をもたらし、神経細胞増殖を介して認知機能を増進し得る。
【０１０１】
結論として、ここで示される結果は、ＰＲＣレジメンが、おそらくタウリン酸化を調整することによって、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいてＡＤ様の症状を軽減することができる介入であることを示す。特に、食事制限介入は、ＣＲに結び付けられず、３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて明らかな副作用を引き起こさない。これらの発見は、食事療法による介入が既に有意なＡＤ様の症状を示しているマウスに対して効果的であったという事実と組み合わせると、ＰＲＣを、ＣＲ介入以上に、初期の中程度のＡＤによって影響を受けた患者の長期的な処置に臨床的に移すことができるという可能性を高める。患者に適用可能な処置条件は、マウスにおいて１週間のタンパク質制限によって実現されるように、ヒトにおいてＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ−１において同様の変化を有するのに必要とされる時間の長さを決定することによって確立されるべきである。将来、この有望な処置の安全性をさらに調査し、かつその作用メカニズムを解明するためにより多くの研究が必要とされる。
【実施例】
【０１０２】
実験手順
食事制限組成物
以下の実験食を使用した：
−通常の食事制限（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  ＬＭ−４８５、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）
−タンパク質制限（ＰＲ）食（９つのＡＡ：イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニンを欠く食事制限）（Ｔｅｋｌａｄ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）
【０１０３】
ＰＲ食は、通常の食事制限とは異なって、タンパク質を含有せず、遊離ＡＡのみが窒素供給源に相当する。２つの食事制限は窒素含有量が類似しており、したがってカロリー密度が類似している（表２）。通常およびＰＲ食における等価な窒素含有量を維持するために、発明者らは、残りのＡＡの数量を増加させることによって、指定されるＡＡの欠如を補った（表７）。
【０１０４】
必須ＡＡは哺乳動物によってデノボ合成することができず、そのため、食事制限を通して供給されなければならない。長期的な必須ＡＡ欠乏は、重度の健康障害を引き起こし、最終的に、死亡に至り得る。通常およびＰＲ食を交替するレジメンは、必須ＡＡの経時的な欠乏を克服するように選んだ。以下の食事療法レジメンを使用した（図１５Ａ）：コントロール（通常の食事制限）、タンパク質制限サイクル（ＰＲＣ）（７日間のＰＲ食に７日間の通常の食事制限の再供給が続く）
【０１０５】
マウスおよび実験計画
３×Ｔｇ−ＡＤおよび対応する野生型（ＷＴ）（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９Ｓ）マウスをこの研究において使用した。３×Ｔｇ−ＡＤマウスは、Αβ斑、超リン酸化タウ濃縮体の両方の発達および年齢依存性のアルツハイマー様認知機能障害をもたらす、ＡＤ（ｐｒｅｓｅｎｅｌｉｎ−１、ＡＰＰ）および前頭側頭型認知症（タウ）に関連づけられる突然変異を含む３つのヒト遺伝子を過剰発現する（Ｏｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。記載されるマウスのコロニーは、実験動物の使用についてのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのガイドラインおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコールに従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで飼育し、維持した。雄の３×Ｔｇ−ＡＤおよびＷＴマウスは、食事レジメンの開始の数日前に単一のケージに入れた（食物摂取量をモニターするために）。８〜９月齢時に（この年齢時、作業記憶機能障害などのような認知障害が３×Ｔｇ−ＡＤマウスにおいて検出可能である図２２Ａ（Ｒｏｓａｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６））、３×Ｔｇ−ＡＤおよびＷＴの動物は２つの群（群当たり１２〜１４匹のマウス）に分割し、上記に記載される食事療法レジメンに割り当てた。
【０１０６】
マウスは、体重に基づいて食事療法群に無作為に割り当てた（３×Ｔｇ−ＡＤについて２９．６ｇの平均体重、ＷＴについて３２．４ｇ）。げっ歯動物は１２時間明／暗サイクルで維持し、適宜、水および記載される食事制限を摂れるようにした。食物は、２日または３日ごとに（７日の食事制限サイクルの０、２、および４日目）、食事療法レジメンにより新しくした。動物は１８〜１９週間、交互のレジメンを受けさせた。
【０１０７】
様々な食事療法措置の間に、体重を毎週測定した。さらに、マウス重量および食物摂取量は、食事療法処置の初めに、１および２週目、終了時、１７および１８週目に、毎日測定した。再供給期間の間に重量を取り戻さなかったまたは不快のサインを示した様々な食事レジメンを受けさせたマウスは研究から取り除いた。（コントロール群から１匹の３×Ｔｇ−ＡＤマウスおよびＰＲＣ群から１匹を除外した）。
【０１０８】
処置の開始の前および食事療法レジメンの４週間ごとに、マウスは、Ｙ迷路（海馬依存性作業記憶）および高架式十字迷路（不安検出）により試験した。食事療法による介入の終了時に、動物はまた物体認識試験（短期空間記憶）により試験した。食事制限組成物における差異によって引き起こされる、いかなる可能性のある正常でない行動をも最小限にするために、行動試験は、通常の食事制限再供給期間の間に実行した。
【０１０９】
食事制限処置の終了時に、マウスはイソフルラン麻酔下で屠殺し、血液および脳を収集した。血液は、グルコース測定のために尾を切って、ホルモン分析のために心臓を穿刺して収集した。得られた血清はすべて、アッセイされるまで−８０℃で保った。脳は２つに分割した：一方の半球は解剖し、凍結させ、−８０℃で保存し、他方は、４８時間、新鮮な４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍ  ＰＢＳ中で液浸固定し、次いで、０．１Ｍ  ＰＢＳ／０．２％アジ化ナトリウム中で４℃で保存した。
【０１１０】
グルコース測定
グルコースレベルは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘｔｒａ  ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、尾を切って収集した血液について屠殺の前に測定した。
ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３、およびＩＧＦＢＰ−１測定値
【０１１１】
マウス血清ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ−３レベルは、以前に記載される（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）ように、組織内のｍＩＧＦ−１およびｍＩＧＦＢＰ−３  ＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＧＦ−１アッセイは、０．１ｎｇ／ｍｌの感受性を有し、ＩＧＦ−２と交差反応性を有しない。アッセイ内およびアッセイ間の変動係数（ＣＶ）は、１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲で＜１０％であった。マウスＩＧＦＢＰ−３アッセイは、０．２ｎｇ／ｍｌの感受性を有する。アッセイ内およびアッセイ間のＣＶは、１〜６ｎｇ／ｍＬの範囲で、それぞれ＜６％および＜８％であった。マウスＩＧＦＢＰ−１血清レベルは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓの組換えマウスタンパク質および抗体を使用して、組織内のＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（捕捉抗体としてＭＡＢ  １２４０および検出抗体としてＢＡＦ  １２４０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）。アッセイは、０．１ｎｇ／ｍｌの感受性を有し、アッセイ内およびアッセイ間のＣＶは、それぞれ＜１０％であった。
【０１１２】
行動試験：
Ｙ−迷路：
群当たり１２〜１４匹マウスを、Ｙ迷路（４０ｃｍの壁を有するアーム２１ｃｍ（長さ）×４ｃｍ（幅））を使用して、作業記憶について試験した。マウスは、８〜９月齢時に食事療法による介入の前におよび１２．５〜１３．５月齢まで毎月の処置で試験した。試験は迷路のアームのうちの一方にげっ歯動物を置くことによって開始した。マウスに８分間、環境を自由に探索させ、アーム侵入およびアーム選択の総数を記録した。アーム選択は、前足および後足の両方がアームに完全に入ることとして定義した。自発的交替行動（ＳＡＢ）スコアは、交替の機会の総数に対する交替（前の２回の選択と異なるアーム選択）の割合として計算した（Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０；  Ｒｏｓａｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。
【０１１３】
新規な物体認識（ＮＯＲ）試験
群当たり１２〜１４匹マウスを、新規な物体認識（ＮＯＲ）試験を使用して、短期間の空間記憶について試験した。マウスは、１２．５〜１３．５月齢時に食事療法処置の終了時に一度試験した。迷路は、６１ｃｍ（長さ）×３６ｃｍ（幅）×３０ｃｍ（高さ）の不透明のプラスチック箱で構成される。試験はＧｕｌｉｎｅｌｌｏおよび共同研究者によって記載されるプロトコールに基づく（Ｇｕｌｉｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。手短に言えば、試験の第１日目（慣らしの日）に、マウスを箱に置き、５分間フィールドを探索させた。２４時間後（試験の日）、慣らしたマウスを、２つの同一の無毒性の物体が存在する箱に再び置き、５分間、それらを自由に探索させた（治験１）。物体を探索するのに費やされた時間を記録し、物体とのあらゆる物理的な接触および／または５ｃｍ以内のそれに対する明白な方向を伴う接近を探索と見なした。治験１の終了時に、動物をホームケージに戻した。３分後、マウスを、見慣れた物体のうちの一方が新規な物体と交換された試験フィールドに戻した。マウスに５分間、活動領域を探索させ、物体を探索する時間を再びモニターした。認識インデックス（ＲＩ）は、動物が、両方の物体を探索するのに費やされた全時間に対して新規な物体を探索するのに費やされた時間として計算した。
【０１１４】
高架式十字迷路（ＥＰＭ）：
群当たり１２〜１４匹のマウスを高架式十字迷路（ＥＰＭ）を使用して、不安について試験した。マウスは、８〜９月齢時に食事療法による介入の前におよび１２．５〜１３．５月齢まで毎月の処置で試験した。ＥＰＭは、中央のプラットフォームから伸びる２つの交互のオープンアームおよび２つの交互のクローズドアームによって形成された十字形の形状を有し、それぞれのアームは長さが３０ｃｍ、幅が５ｃｍ、高さが１５ｃｍである（Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。試験は、オープンスペースに対する自然なげっ歯動物の嫌悪によってバランスをとった、げっ歯動物探索行動に基づく。高いオープンアームの回避は、強度の不安の徴候である。試験の間に、マウスを中央のフィールドに置き、５分間迷路を自由に探索させ、より低い不安レベルに対応する、オープンアームにおいて費やされた時間を測定した。
【０１１５】
免疫組織化学的検査
群当たりの８〜１０の固定した半脳を、ｖｉｂｒａｔｏｍｅ  Ｌｅｉｃａ  Ｖ１０００Ｓ  （Ｌｅｉｃａ）を使用して、水平面で完全に切片にし（４０μｍ）、次いで、免疫組織化学的検査のために処理した。７枚ごとの切片（脳当たり１０枚）をΑβ（７１−５８００  Αβ、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、超リン酸化タウ（ＡＴ８、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）、またはＣＤ１１ｂ（ＭＣＡ７１１、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｋｉｄｌｍｇｔｏｎ、ＵＫ）に対して向けられる抗体により、ＡＢＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＥｌｉｔｅキットおよびＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して免疫染色した。すべての実験について、免疫反応性の定量化は、サンプル特徴について盲目の２人の観察者によって評価し、値を平均した。
【０１１６】
Αβ：
Αβ免疫反応性（ＩＲ）を増強するために、切片は９９％ギ酸中で５分間すすいだ。Αβ  ＩＲは、負荷値として計算した。手短に言えば、海馬の重複しない免疫標識切片の選択したフィールド（海馬台について２つのフィールドおよびＣＡ１−アンモン角エリア１−について３つ）をとらえ、顕微鏡につながれたビデオキャプチャーシステムを使用してデジタル化した。ＮＩＨ  Ｓｃｉｏｎ  ｉｍａｇｅ  １．６２Ｃソフトウェアを使用して、画像を二進数／負のデータに変換し、陽性のピクセル（ＩＲエリアに等価）を定量化した（Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。また、Αβ斑を、神経細胞内のΑβ  ＩＲとは異なる球状の形状および形態を示す細胞外Αβ免疫反応性沈着物として定義した（Ｒｏｓａｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。定量化のために、上記に定義される切片からの海馬のＣＡ１および海馬台領域の組み合わせを光学顕微鏡下で検査し、細胞外斑の総数を数えた。それぞれの斑の面積はＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。
【０１１７】
タウ
ＡＴ８免疫反応性の神経細胞は、ほとんどの細胞表面にわたって強いＡＴ８免疫標識を示す細胞として定義した。陽性の細胞は、海馬ＣＡ１および海馬台領域を組み合わせた範囲内で数えた（Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。
【０１１８】
ＣＤ１１ｂ：
ＣＤ１１ｂ−免疫反応性（ｉｒ）陽性ミクログリア細胞は、細胞体および突起にわたってＣＤ１１ｂ免疫染色することによってカバーされた細胞として定義した。ＣＤ１１ｂ−ｉｒ細胞は、海馬の海馬台およびＣＡ１領域を組み合わせた２つの隣接した重複しない免疫標識切片（合計５つの切片）において数えた。さらに、細胞活性化の段階はそれらの形態によって同定した。手短に言えば、発明者らは、ミクログリア活性化の４つの段階を定義した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）：
・段階１：休止ミクログリア。多くの長く薄い分枝型突起を有する杆体状の体細胞。
・段階２：活性化分枝型ミクログリア。長方形の細胞体、突起はより厚い。
・段階３：著しい細胞の肥大および短く厚い突起を示すアメーバ状のミクログリア
・段階４：食細胞。円形細胞および突起は検出可能ではない。
異なる活性化段階におけるＣＤ１１ｂ−ｉｒ細胞を数え、総ｉｒ細胞数のパーセンテージとしてプロットした。
【０１１９】
統計分析
長い間にわたる体重およびカロリー摂取量の変化を反復測定ＡＮＯＶＡ、その後に続くＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定によって分析した。生の行動データは、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後に続く、Ｆｉｓｈｅｒの最小有意差検定を使用するグループ間の比較によって分析した。ｔ−検定は適している場合に使用した。データはすべて平均値＋／−ＳＥＭを示す。
【０１２０】
例証的な実施形態が上記に記載されたが、これらの実施形態が本発明のすべての形態を記載することは意図されない。正確に言うと、本明細書において使用される語は、限定ではなく説明のための語であり、様々な変化が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされてもよいことが理解される。そのうえ、様々な実行するための実施例の特徴は、本発明のさらなる実施例を形成するために組み合わせられてもよい。
【０１２１】
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Ｃａｒｒｏ  Ｅ  ，  Ｔｏｒｒｅｓ−Ａｌｅｍａｎ  Ｉ  （２００４），  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ  ．  ４，  ７９−８６．
Ｃａｒｒｏ  Ｅ，  Ｔｒｅｊｏ  ＪＬ，  Ｇｏｍｅｚ−Ｉｓｌａ  Ｔ，  ＬｅＲｏｉｔｈ  Ｄ  ，  Ｔｏｒｒｅｓ−Ａｌｅｍａｎ  Ｉ  （２００２），  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ８，  １３９０−１３９７．
Ｃａｒｒｏｌｌ  ＪＣ，  Ｒｏｓａｒｉｏ  ＥＲ，  Ｖｉｌｌａｍａｇｎａ  Ａ  ，  Ｐｉｋｅ  ＣＪ  （２０１０），  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １５１，  ２７１３−２７２２．
Ｃｏｈｅｎ  Ｅ，  Ｐａｕｌｓｓｏｎ  ＪＦ，  Ｂｌｉｎｄｅｒ  Ｐ，  Ｂｕｒｓｔｙｎ−Ｃｏｈｅｎ  Ｔ，  Ｄｕ  Ｄ，  Ｅｓｔｅｐａ  Ｇ，  Ａｄａｍｅ  Ａ，  Ｐｈａｍ  ＨＭ，  Ｈｏｌｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍ，  Ｋｅｌｌｙ  ＪＷ，  Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ  ，  Ｄｉｌｌｉｎ  Ａ  （２００９），  Ｃｅｌｌ．  １３９，  １１５７−１  １６９．
Ｃｏｓｃｈｉｇａｎｏ  ＫＴ，  Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  Ｄ，  Ｂｅｌｌｕｓｈ  ＬＬ  ，  Ｋｏｐｃｈｉｃｋ  ＪＪ  （２０００），  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．  １４１，  ２６０８−２６１３．
ｄｅ  Ｌｅｏｎ  ＭＪ，  ＤｅＳａｎｔｉ  Ｓ，  Ｚｉｎｋｏｗｓｋｉ  Ｒ，  Ｍｅｈｔａ  ＰＤ，  Ｐｒａｔｉｃｏ  Ｄ，  Ｓｅｇａｌ  Ｓ，  Ｒｕｓｉｎｅｋ  Ｈ，  Ｌｉ  Ｊ，  Ｔｓｕｉ  Ｗ，  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＬＡ，  Ｃｌａｒｋ  ＣＭ，  Ｔａｒｓｈｉｓｈ  Ｃ，  Ｌｉ  Ｙ，  Ｌａｉｒ  Ｌ，  Ｊａｖｉｅｒ  Ｅ，  Ｒｉｃｈ  Ｋ，  Ｌｅｓｂｒｅ  Ｐ，  Ｍｏｓｃｏｎｉ  Ｌ，  Ｒｅｉｓｂｅｒｇ  Ｂ，  Ｓａｄｏｗｓｋｉ  Ｍ，  ＤｅＢｅｒｎａｄｉｓ  ＪＦ，  Ｋｅｒｋｍａｎ  ＤＪ，  Ｈａｍｐｅｌ  Ｈ，  Ｗａｈｌｕｎｄ  ＬＯ  ，  Ｄａｖｉｅｓ  Ｐ  （２００６），  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．  ２７，  ３９４−４０１．
Ｆａｂｒｉｚｉｏ  Ｐ，  Ｐｏｚｚａ  Ｆ，  Ｐｌｅｔｃｈｅｒ  ＳＤ，  Ｇｅｎｄｒｏｎ  ＣＭ  ，  Ｌｏｎｇｏ  ＶＤ  （２００１，  （Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２９２，  ２８８−２９０．
Ｆｏｎｔａｎ−Ｌｏｚａｎｏ  Ａ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｌｌｕｃｈ  Ｇ，  Ｄｅｌｇａｄｏ−Ｇａｒｃｉａ  ＪＭ，  Ｎａｖａｓ  Ｐ  ，  Ｃａｒｒｉｏｎ  ＡＭ  （２００８），  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ３８，  １６７−１７７．
Ｆｏｎｔａｎａ  Ｌ，  Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｌ  ，  Ｌｏｎｇｏ  ＶＤ  （２０１０），  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３２８，  ３２１−３２６．
Ｆｏｎｔａｎａ  Ｌ，  Ｗｅｉｓｓ  ＥＰ，  Ｖｉｌｌａｒｅａｌ  ＤＴ，  Ｋｌｅｉｎ  Ｓ  ，  Ｈｏｌｌｏｓｚｙ  ＪＯ  （２００８），  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．  ７，  ６８１−６８７．
Ｇｉｅｔｚｅｎ  ＤＷ，  Ｈａｏ  Ｓ  ，  Ａｎｔｈｏｎｙ  ＴＧ  （２００７），  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．  ２７，  ６３−７８．
Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｍ，  Ｊａｋｅｓ  Ｒ  ，  Ｖａｎｍｅｃｈｅｌｅｎ  Ｅ  （１９９５），  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．  １８９，  １６７−１６９．
Ｇｕｅｖａｒａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  Ｊ，  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  Ｐ，  Ｇｕｅｖａｒａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  Ｍ，  Ｗｅｉ  Ｍ，  Ｍａｄｉａ  Ｆ，  Ｃｈｅｎｇ  ＣＷ，  Ｈｗａｎｇ  Ｄ，  Ｍａｒｔｉｎ−Ｍｏｎｔａｌｖｏ  Ａ，  Ｓａａｖｅｄｒａ  Ｊ，  Ｉｎｇｌｅｓ  Ｓ，  ｄｅ  Ｃａｂｏ  Ｒ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ  ，  Ｌｏｎｇｏ  ＶＤ  （２０１１），  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｉ  Ｍｅｄ．  ３  ，  ７０ｒａ  １３．
Ｇｕｌｉｎｅｌｌｏ  Ｍ，  Ｇｅｒｔｎｅｒ  Ｍ，  Ｍｅｎｄｏｚａ  Ｇ，  Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ  ＢＰ，  Ｏｄｄｏ  Ｓ，  ＬａＦｅｒｌａ  Ｆ，  Ｃｈｏｉ  ＣＨ，  ＭｃＢｒｉｄｅ  ＳＭ  ，  Ｆａｂｅｒ  ＤＳ  （２００９），  Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  １９６，  ２２０−２２７．
Ｈａｌａｇａｐｐａ  ＶＫ，  Ｇｕｏ  Ｚ，  Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｙ，  Ｃｕｔｌｅｒ  ＲＧ，  Ｌａｆｅｒｌａ  ＦＭ  ，  Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ  （２００７），  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．  ２６，  ２１２−２２０．
Ｈｗａｎｇ  ＤＬ，  Ｌｅｅ  ＰＤ  ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ  （２００８），  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ  ＩＧＦ  Ｒｅｓ．  １８，  ６５−７４．
Ｉｋｅｎｏ  Ｙ，  Ｈｕｂｂａｒｄ  ＧＢ，  Ｌｅｅ  Ｓ，  Ｃｏｒｔｅｚ  ＬＡ，  Ｌｅｗ  ＣＭ，  Ｗｅｂｂ  ＣＲ，  Ｂｅｒｒｙｍａｎ  ＤＥ，  Ｌｉｓｔ  ＥＯ，  Ｋｏｐｃｈｉｃｋ  ＪＪ，  Ｂａｒｔｋｅ  Ａ  （２００９）．  Ｊ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  Ａ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．  ６４，  ５２２−５２９．
Ｊｏｎｅｓ  ＪＩ  ，  Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ  （１９９５），  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．  １６，  ３−３４．
Ｋｅｎｙｏｎ  Ｃ  （２００５），  Ｃｅｌｌ．  １２０，  ４４９−４６０．
Ｋｅｔｅｌｓｌｅｇｅｒｓ  ＪＭ，  Ｍａｉｔｅｒ  Ｄ，  Ｍａｅｓ  Ｍ，  Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ＬＥ  ，  Ｔｈｉｓｓｅｎ  ＪＰ  （１９９５），  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  ４４，  ５０−５７．
Ｋｉｎｎｅｙ  ＢＡ，  Ｃｏｓｃｈｉｇａｎｏ  ＫＴ，  Ｋｏｐｃｈｉｃｋ  ＪＪ，  Ｓｔｅｇｅｒ  ＲＷ  ，  Ｂａｒｔｋｅ  Ａ  （２００１），  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｅｈａｖ．  ７２，  ６５３−  ６６０
Ｋｉｔａｚａｗａ  Ｍ，  Ｏｄｄｏ  Ｓ，  Ｙａｍａｓａｋｉ  ＴＲ，  Ｇｒｅｅｎ  ＫＮ  ，  ＬａＦｅｒｌａ  ＦＭ  （２００５），  ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．  ２５，  ８８４３−８８５３．
Ｌｅｅ  Ｃ  ，  Ｌｏｎｇｏ  ＶＤ  （２０１  １），  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ３０，  ３３０５−３３１６．
Ｌｕｃｈｓｉｎｇｅｒ  ＪＡ，  Ｔａｎｇ  ＭＸ，  Ｓｈｅａ  Ｓ  ，  Ｍａｙｅｕｘ  Ｒ  （２００２），  Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５９，  １２５８−１２６３．
Ｍａｒｔｉｎ  Ｂ，  Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ  ，  Ｍａｕｄｓｌｅｙ  Ｓ  （２００６），  Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．  ５，  ３３２−３５３．
Ｍａｓｔｅｒｎａｋ  ＭＭ，  Ｐａｎｉｃｉ  ＪＡ，  Ｂｏｎｋｏｗｓｋｉ  ＭＳ，  Ｈｕｇｈｅｓ  ＬＦ  ，  Ｂａｒｔｋｅ  Ａ  （２００９）．  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  Ａ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．  ６４，  ５１６−５２１．
Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ  （２００５），  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ．  ２５，  ２３７−２６０．
Ｍｏｕｔｏｎ  ＰＲ，  Ｃｈａｃｈｉｃｈ  ＭＥ，  Ｑｕｉｇｌｅｙ  Ｃ，  Ｓｐａｎｇｌｅｒ  Ｅ  ，  Ｉｎｇｒａｍ  ＤＫ  （２００９），  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．  ４６４，  １８４−  １８７．
Ｏｄｄｏ  Ｓ，  Ｃａｃｃａｍｏ  Ａ，  Ｋｉｔａｚａｗａ  Ｍ，  Ｔｓｅｎｇ  ＢＰ  ，  ＬａＦｅｒｌａ  ＦＭ  （２００３），  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．  ２４，  １０６３−  １０７０．
Ｐａｒｒｅｌｌａ  Ｅ  ，  Ｌｏｎｇｏ  ＶＤ  （２０１０），  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌ  ．  １０，  １６１−１７７．
Ｐａｔｅｌ  ＮＶ，  Ｇｏｒｄｏｎ  ＭＮ，  Ｃｏｎｎｏｒ  ＫＥ，  Ｇｏｏｄ  ＲＡ，  Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ＲＷ，  Ｍａｓｏｎ  Ｊ，  Ｍｏｒｇａｎ  ＤＧ，  Ｍｏｒｇａｎ  ＴＥ  ，  Ｆｉｎｃｈ  ＣＥ  （２００５），  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．  ２６，  ９９５−１０００．
Ｒｏｂｅｒｓｏｎ  ＥＤ，  Ｓｃｅａｒｃｅ−Ｌｅｖｉｅ  Ｋ，  Ｐａｌｏｐ  ＪＪ，  Ｙａｎ  Ｆ，  Ｃｈｅｎｇ  ＩＨ，  Ｗｕ  Ｔ，  Ｇｅｒｓｔｅｉｎ  Ｈ，  Ｙｕ  ＧＱ  ，  Ｍｕｃｋｅ  Ｌ  （２００７），  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３１６，  ７５０−７５４．
Ｒｏｓａｒｉｏ  ＥＲ，  Ｃａｒｒｏｌｌ  ＪＣ，  Ｏｄｄｏ  Ｓ，  ＬａＦｅｒｌａ  ＦＭ  ，  Ｐｉｋｅ  ＣＪ  （２００６），  ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．  ２６，  １３３８４−１３３８９．
Ｓｃｈｒａｇ  Ｍ，  Ｓｈａｒｍａ  Ｓ，  Ｂｒｏｗｎ−Ｂｏｒｇ  Ｈ  ，  Ｇｈｒｉｂｉ  Ｏ  （２００８），  Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．  １８，  ２３９−２４４．
Ｓｈａｒｍａ  Ｓ，  Ｄａｒｌａｎｄ  Ｄ，  Ｌｅｉ  Ｓ，  Ｒａｋｏｃｚｙ  Ｓ  ，  Ｂｒｏｗｎ−Ｂｏｒｇ  ＨＭ  （２０１２），  Ａｇｅ  （Ｄｏｒｄｒ）．  ３４，  ６０９−６２０．
Ｓｈａｒｍａ  Ｓ，  Ｈａｓｅｌｔｏｎ  Ｊ，  Ｒａｋｏｃｚｙ  Ｓ，  Ｂｒａｎｓｈａｗ  Ｓ  ，  Ｂｒｏｗｎ−Ｂｏｒｇ  ＨＭ  （２０１０）．  Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．  １３１  ，  ４２２−４３５．
Ｓｏｎｎｔａｇ  ＷＥ，  Ｌｙｎｃｈ  ＣＤ，  Ｃｅｆａｌｕ  ＷＴ，  Ｉｎｇｒａｍ  ＲＬ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＳＡ，  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＰＬ  ，  Ｋｈａｎ  ＡＳ  （１９９９）．  Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＩＧＦ）−ｌ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｉｎｇ：  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｃａｌｏｒｉｃ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｉｍａｌｓ．  Ｊ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  Ａ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．  ５４，  Ｂ５２１−５３８．
Ｓｕｈ  Ｙ，  Ａｔｚｍｏｎ  Ｇ，  Ｃｈｏ  ＭＯ，  Ｈｗａｎｇ  Ｄ，  Ｌｉｕ  Ｂ，  Ｌｅａｈｙ  ＤＪ，  Ｂａｒｚｉｌａｉ  Ｎ  ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ  （２００８），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １０５，  ３４３８−３４４２．
Ｔａｌｂｏｔ  Ｋ，  Ｗａｎｇ  ＨＹ，  Ｋａｚｉ  Ｈ，  Ｈａｎ  ＬＹ，  Ｂａｋｓｈｉ  ＫＰ，  Ｓｔｕｃｋｙ  Ａ，  Ｆｕｉｎｏ  ＲＬ，  Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ＫＲ，  Ｓａｍｏｙｅｄｎｙ  ＡＪ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＲＳ，  Ａｒｖａｎｉｔａｋｉｓ  Ｚ，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＪＡ，  Ｗｏｌｆ  ＢＡ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＤＡ，  Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ  ＪＱ  ，  Ａｒｎｏｌｄ  ＳＥ  （２０１２），  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２２，  １３１６−１３３８．
Ｔｈｉｓｓｅｎ  ＪＰ，  Ｋｅｔｅｌｓｌｅｇｅｒｓ  ＪＭ  ，  Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ＬＥ  （１９９４），  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．  １５，  ８０−１０１．
Ｖａｒｄｙ  ＥＲ，  Ｒｉｃｅ  ＰＪ，  Ｂｏｗｉｅ  ＰＣ，  Ｈｏｌｍｅｓ  ＪＤ，  Ｇｒａｎｔ  ＰＪ  ，  Ｈｏｏｐｅｒ  ＮＭ  （２００７），  Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．  １２，  ２８５−２９０．
Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｈｏ  Ｌ，  Ｑｉｎ  Ｗ，  Ｒｏｃｈｅｒ  ＡＢ，  Ｓｅｒｏｒ  Ｉ，  Ｈｕｍａｌａ  Ｎ，  Ｍａｎｉａｒ  Ｋ，  Ｄｏｌｉｏｓ  Ｇ，  Ｗａｎｇ  Ｒ，  Ｈｏｆ  ＰＲ  ，  Ｐａｓｉｎｅｔｔｉ  ＧＭ  （２００５），  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９，  ６５９−６６１．
Ｗｕ  Ｐ，  Ｓｈｅｎ  Ｑ，  Ｄｏｎｇ  Ｓ，  Ｘｕ  Ｚ，  Ｔｓｉｅｎ  ＪＺ  ，  Ｈｕ  Ｙ  （２００８），  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．  ２９，  １５０２−１５１１．
Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｈ  ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＬＪ  （１９９５），  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １４６，  １４１−１４８．
Ｙｏｕｎｇ  ＳＮ  （１９９６），  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｉｏｂｅｈａｖ  Ｒｅｖ．  ２０，  ３１３−３２３．
Ｚｈａｎｇ  Ｓ，  Ｗａｎｇ  ＸＪ，  Ｔｉａｎ  ＬＰ，  Ｐａｎ  Ｊ，  Ｌｕ  ＧＱ，  Ｚｈａｎｇ  ＹＪ，  Ｄｉｎｇ  ＪＱ  ，  Ｃｈｅｎ  ＳＤ  （２０１  ｌ）ｍ，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  ８，  １５４．
Ｌ．  Ｂｏｎｄｏｌｆｉ，  Ｆ．  Ｅｒｍｉｎｉ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｌｏｎｇ，  Ｄ．  Ｋ．  Ｉｎｇｒａｍ，  Ｍ．  Ｊｕｃｋｅｒ，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２５，  ３３３  （２００４）．
Ｒ．  Ｐ．  Ｅｒｔｌ，  Ｊ．  Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  Ｍ．  Ａｓｔｌｅ，  Ｔ．  Ｍ．  Ｄｕｆｆｙ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｂｌｏｏｄ  １１１，  １７０９  （２００８）．
Ｊ．  Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  Ｍ．  Ａｓｔｌｅ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３１，  １０９７  （２００３）．
Ｏ．  Ｈ．  Ｙｉｌｍａｚ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４８６，  ４９０  （２０１２）．
Ｃ．  Ｌｅｅ，  Ｖ．  Ｄ．  Ｌｏｎｇｏ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０，  ３３０５  （２０１１）．
Ａ．  Ｂａｒｔｋｅ，  Ｌ．Ｙ．  Ｓｕｎ，  Ｖ．  Ｌｏｎｇｏ，  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．  ９３，  ５７１−９８  （２０１３）．
【図１】
0006325555.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006325555.tif 000016
【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006325555.tif 000019
【図１１】
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【図１２】
0006325555.tif 000021
【図１３】
0006325555.tif 000022
【図１４】
0006325555.tif 000023
【図１５】
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【図１６】
0006325555.tif 000025
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0006325555.tif 000029
【図２１】
0006325555.tif 000030
【図２２】
0006325555.tif 000031
【図２３】
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