(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号２または１４のアミノ酸配列を含み、ならびに、前記軽鎖は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、単離されたＩＬ‐１β特異的抗体。
【請求項２】
前記ＩＬ‐１βが、ヒト、マウス、またはサルＩＬ‐１βである、請求項１に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体。
【請求項３】
前記抗体が、モノクローナル、ポリクローナル、二重特異性、多重特異性、またはヘテロ接合（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）である、請求項１または２に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体。
【請求項４】
前記抗体が、完全にヒトのものである、請求項３に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体。
【請求項５】
前記抗体が、サブタイプＩｇＧ１、サブタイプＩｇＧ２、サブタイプＩｇＧ４、またはサブタイプＩｇＧ３の抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体。
【請求項６】
前記抗体が、組換えである、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体。
【請求項７】
前記抗体が、免疫接着分子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、造影剤、治療剤、および細胞傷害剤から成る群より選択される剤をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体。
【請求項８】
前記剤が、放射標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、およびビオチンから成る群より選択される造影剤である、請求項７に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体。
【請求項９】
前記剤が、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、トキシン、およびアポトーシス剤から成る群より選択される治療剤または細胞傷害剤である、請求項７に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体。
【請求項１０】
癌の治療のための、あるいは、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、痛風、糖尿病、ぶどう膜炎、クリオピリン関連周期性症候群、および炎症性ざ瘡から成る群より選択される炎症性疾患または自己免疫性疾患の治療のための医薬の製造方法であって、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体を製剤化することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか一項に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体、および薬理学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項１２】
１つ以上の治療剤をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
癌の治療のための、あるいは、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、痛風、糖尿病、ぶどう膜炎、クリオピリン関連周期性症候群、および炎症性ざ瘡から成る群より選択される炎症性疾患または自己免疫性疾患の治療のための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか一項に記載の単離されたＩＬ‐１β特異的抗体を産生する能力を有する単離された細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原結合タンパク質、特には、ＩＬ‐１β抗原結合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、結合タンパク質、ならびに重および軽鎖の配列に関する。抗原結合タンパク質を含む組成物、抗原結合タンパク質の使用、および作製のための方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン‐１ベータ（ＩＬ‐１β）は、インターロイキン‐１サイトカインファミリーのメンバーであり、炎症応答の重要なメディエーターである。これは、炎症性サイトカインであり、細胞の増殖、分化、およびアポトーシスに関与している。
【０００３】
ＩＬ‐１βの過剰発現は、クリオピリン関連周期性症候群および関連する障害、糖尿病、クローン病、関節リウマチ、腎細胞癌、痛風、および炎症性ざ瘡などの数多くの炎症性ならびに自己免疫性疾患と関連付けられてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ＩＬ‐１βの活性を中和して、高められたＩＬ‐１β産生に関連する疾患の予防または治療を行うことができるＩＬ‐１βに特異的な抗原結合タンパク質を提供することである。
【０００５】
現在のところ、ＩＬ‐１βシグナル伝達経路を標的とする３つの生物学的製剤が臨床使用について承認されている：アナキンラ（ＩＬ‐１受容体アンタゴニスト）、リロナセプト（ＩＬ‐１受容体１を含む融合タンパク質）、およびカナキヌマブ（モノクローナル抗体）。
【０００６】
上述した３つの承認ＩＬ‐１遮断剤に加えて、ヒト化モノクローナル抗体ＸＯＭＡ‐０５２（ゲボキズマブ）が、現在臨床開発中である。各分子は、独特の作用機構を示し、異なる交差反応性および薬理プロファイルを提示する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の態様によると、以下の結合ユニットから成る群より選択される１つ以上の結合ユニットを含む単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質が提供される：
（ｉ）配列番号３のＫａｂａｔ残基２３−３５または配列番号４、１５、もしくは１６のＫａｂａｔ残基２４−３３を含む結合ユニットＬ１、または結合ユニットＬ１中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｉｉ）配列番号３のＫａｂａｔ残基５１−５７または配列番号４、１５、もしくは１６のＫａｂａｔ残基４９−５５を含む結合ユニットＬ２、または結合ユニットＬ２中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｉｉｉ）配列番号３のＫａｂａｔ残基９２−１０２または配列番号４、１５、もしくは１６のＫａｂａｔ残基８８−９６を含む結合ユニットＬ３、または結合ユニットＬ３中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｉｖ）配列番号１のＫａｂａｔ残基３１−３５または配列番号２もしくは１４のＫａｂａｔ残基３１−３５を含む結合ユニットＨ１、または結合ユニットＨ１中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｖ）配列番号１のＫａｂａｔ残基５０−６６または配列番号２もしくは１４のＫａｂａｔ残基５０−６５を含む結合ユニットＨ２、または結合ユニットＨ２中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｖｉ）配列番号１のＫａｂａｔ残基９９−１１４または配列番号２もしくは１４のＫａｂａｔ残基９８−１０８を含む結合ユニットＨ３、または結合ユニットＨ３中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体。
【０００８】
第二の態様によると、細胞刺激アッセイにおいて、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、または０．２ｎＭ未満のＩＣ５０値でＩＬ‐１βを中和する、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質が提供される。
【０００９】
第三の態様によると、細胞阻害アッセイにおいて、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、または０．４ｎＭ未満のＩＣ５０値でＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生を阻害する、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質が提供される。
【００１０】
第四の態様によると、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満のＫD値でＩＬ‐１βと結合する、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質が提供される。
【００１１】
第五の態様によると、１ｐＭから１００ｐＭのＩＣ５０値でヒトＩＬ‐１βを中和する、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質が提供される。
【００１２】
第六の態様によると、１００ｐＭから１０００ｐＭのＩＣ５０値でマウスＩＬ‐１βを中和する、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質が提供される。
【００１３】
第七の態様によると、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質が提供され、ここで、前記結合タンパク質は、１ｐＭから１００ｐＭのヒトＩＬ‐１βに対する親和性（ＫＤ）を有する。
【００１４】
第八の態様によると、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質が提供され、ここで、前記結合タンパク質は、５ｐＭから２００ｐＭのマウスＩＬ‐１βに対する親和性（ＫＤ）を有する。
【００１５】
第九の態様によると、癌、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、痛風、糖尿病、ぶどう膜炎、クリオピリン関連周期性症候群、および炎症性ざ瘡から成る群より選択される炎症性疾患または自己免疫性疾患の治療に用いるための、前述の請求項のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質が提供される。
【００１６】
第十の態様によると、癌、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、痛風、糖尿病、ぶどう膜炎、クリオピリン関連周期性症候群、および炎症性ざ瘡から成る群の治療のための医薬の作製における、上記で定める単離された抗原結合タンパク質の使用が提供される。
【００１７】
第十一の態様によると、上記で定める抗原結合タンパク質および薬理学的に許容されるキャリアを含む組成物が提供される。
【００１８】
第十二の態様によると、上記で定める抗原結合タンパク質を産生する能力を有する単離された細胞株が提供される。
【００１９】
第十三の態様によると、配列番号１、または配列番号２、もしくは１４、またはその断片から選択される配列を含む、またはその配列から成る単離された核酸分子が提供される。
【００２０】
第十四の態様によると、配列番号３、または配列番号４、１５、もしくは１６、またはその断片から選択される配列を含む、またはその配列から成る単離された核酸分子が提供される。
【００２１】
第十五の態様によると、上記で定める核酸分子を含むベクターが提供される。
【００２２】
第十六の態様によると、上記で定める核酸分子を含む宿主細胞が提供される。
【００２３】
第十七の態様によると、上記で定めるベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００２４】
第十八の態様によると、上記で定める抗原結合タンパク質を作製する方法が提供され、その方法は、上記で定める宿主細胞を適切な条件下で培養すること、および前記タンパク質をそれから回収することを含む。
【００２５】
第十九の態様によると、癌、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、痛風、糖尿病、ぶどう膜炎、クリオピリン関連周期性症候群、および炎症性ざ瘡から成る群より選択される炎症性疾患または自己免疫性疾患を治療する方法が提供され、ここで、上記で定める単離された抗原結合タンパク質が、対象に投与される。
【００２６】
＜定義＞
本明細書で用いられる以下の単語および用語は、示される意味を有するものとする。
【００２７】
「抗原結合タンパク質」の用語は、本明細書で用いられる場合、ＩＬ‐１βと結合する能力を有する抗体、抗体断片、およびドメインなどのその他のタンパク質コンストラクトを意味する。
【００２８】
「抗体」の用語は、本明細書においてその最も広い意味で用いられる場合、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を意味し、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性、多重特異性、およびヘテロ結合（heteroconjugate）抗体；単一可変ドメイン（single variable domain）、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的有効断片（imunologically effective fragments）、一本鎖Ｆｖ、ダイアボディ、Ｔａｎｄａｂｓ（商標）などが挙げられる（別の選択肢としての「抗体」フォーマットの概要については、Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136を参照）。
【００２９】
「単一可変ドメイン」の語句は、異なる可変領域またはドメインとは独立して抗原またはエピトープと特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメイン（例えば、ＶH、ＶHH、ＶL）を意味する。
【００３０】
「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原と結合する能力を有する「単一可変ドメイン」と同一であると見なされ得る。単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってよいが、げっ歯類（例えば、ＷＯ  ００／２９００４に開示されるように）、アメリカテンジクザメ、およびラクダ科のＶHHｄＡｂなど、他の種からの単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科ＶHHは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これらの種は、自然に軽鎖が欠失している重鎖抗体を産生する。そのようなＶHHドメインは、本技術分野で利用可能である標準的な技術に従ってヒト化されてよく、そのようなドメインは、「ドメイン抗体」であると見なされる。本明細書で用いられる場合、ＶHは、ラクダ科ＶHHドメインを含む。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、「ドメイン」の用語は、タンパク質の残りの部分とは独立した三次構造を有する折り畳みタンパク質構造を意味する。一般的に、ドメインは、タンパク質の別々の機能特性を担っており、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの部分の機能を失うことなく、付加、除去、または他のタンパク質への転移が行われ得る。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳みポリペプチドドメインである。従って、それは、完全な抗体可変ドメイン、および１つ以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列で置き換えられたものを例とする修飾可変ドメイン、または、切断された、またはＮ‐もしくはＣ‐末端伸長部を含む抗体可変ドメイン、ならびに完全長ドメインの結合活性および特異性を少なくとも維持している可変ドメインの折り畳み断片を含む。ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは独立して、抗原またはエピトープと結合することができる。
【００３２】
抗原結合断片は、ドメインなどの非抗体タンパク質骨格上に１つ以上のＣＤＲを配置することによって提供されてよい。ドメインは、ドメイン抗体であってよく、またはＣＴＬＡ‐４（エビボディ（Evibody））；リポカリン；プロテインＡのＺ‐ドメイン（アフィボディ（Affibody）、ＳｐＡ）、Ａ‐ドメイン（アビマー（Avimer）／マキシボディ（Maxibody））などのプロテインＡ由来分子；ＧｒｏＥｌおよびＧｒｏＥＳなどの熱ショックタンパク質；トランスフェリン（トランスボディ（trans‐body））；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒトγ‐クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン（affilin））；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツ型ドメイン（scorpion toxinkunitz type domain）；およびフィブロネクチン（アドネクチン）から成る群より選択される骨格の誘導体であるドメインであってもよく、これは、その天然のリガンド以外のリガンドとの結合を得る目的でタンパク質操作が施されたものである。
【００３３】
ＣＴＬＡ‐４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）は、主としてＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇ折り畳み構造を有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を付与するために、異種配列で置換されてよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ‐４分子は、エビボディとしても知られる。さらなる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)を参照されたい。
【００３４】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド、および脂質などの疎水性小分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。これらは、異なる標的抗原と結合するように操作され得る円錐状構造の開口端部のいくつかのループを持つリジッドなβ‐シート二次構造を有する。アンチカリン（Anticalin）は、１６０−１８０アミノ酸のサイズであり、リポカリンから誘導される。さらなる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482:
337-350 (2000)、ＵＳ７２５０２９７Ｂ１、およびＵＳ２００７０２２４６３３を参照されたい。
【００３５】
アフィボディは、抗体と結合するように操作され得る、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のプロテインＡから誘導される骨格である。ドメインは、およそ５８アミノ酸の三重らせん束（three-helical bundle）から成る。表面残基の無作為化によってライブラリーが作製されている。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)およびＥＰ１６４１８１８Ａ１を参照されたい。
【００３６】
アビマーは、Ａ‐ドメイン骨格ファミリーから誘導されるマルチドメインタンパク質である。およそ３５アミノ酸の自然ドメインが、定められたジスルフィド結合構造を取っている。Ａ‐ドメインのファミリーによって示される天然の変異をシャッフリングすることによって多様性が作り出される。さらなる詳細については、Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)およびExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)を参照されたい。
【００３７】
トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容表面ループ（permissive surface loop）にペプチド配列を挿入することにより、異なる標的抗原と結合するように操作され得る。操作されたトランスフェリン骨格の例としては、トランスボディが挙げられる。さらなる詳細については、J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)を参照されたい。
【００３８】
設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、膜内在性タンパク質の細胞骨格への結合を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンから誘導される。単一のアンキリンリピートは、２つのα‐へリックスとβ‐ターンとから成る３３残基のモチーフである。これらは、各リピートの第一のα‐へリックスおよびβ‐ターンの残基を無作為化することによって、異なる標的抗原と結合するように操作され得る。これらの結合面は、モジュール数を増加させることによって、増加され得る（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)、およびJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)、およびＵＳ２００４０１３２０２８Ａ１を参照されたい。
【００３９】
フィブロネクチンは、抗原と結合するように操作され得る骨格である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５の繰り返しユニットの１０番目のドメインの天然アミノ酸配列のバックボーンから成る。β‐サンドイッチの一方の端部の３つのループは、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識できるように操作され得る。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)、ＵＳ２００８０１３９７９１、ＷＯ２００５０５６７６４、およびＵＳ６８１８４１８Ｂ１を参照されたい。
【００４０】
ペプチドアプタマーは、定常骨格タンパク質（constant scaffold protein）から成るコンビナトリアル認識分子であり、典型的には、活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループ（constrained variable peptide loop）を有するチオレドキシン（ＴｒｘＡ）である。さらなる詳細については、Expert Opin. Biol. Ther.5, 783-797 (2005)を参照されたい。
【００４１】
マイクロボディ（Microbodies）は、３−４つのシステイン架橋を含有する長さが２５−５０アミノ酸である天然のマイクロタンパク質から誘導され、マイクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢ１およびコノトキシンおよびノッチンが挙げられる。マイクロタンパク質は、マイクロタンパク質の全体の折り畳みに影響を与えることなく、２５個までのアミノ酸を含ませるように操作され得るループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、ＷＯ２００８０９８７９６を参照されたい。
【００４２】
その他の結合ドメインとしては、異なる標的抗原結合特性を操作するための骨格として用いられてきたタンパク質が挙げられ、ヒトγ‐クリスタリンおよびヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン（kunitz type domains）、Ｒａｓ‐結合タンパク質ＡＦ‐６のＰＤＺ‐ドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）が挙げられ、Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)のチャプター７−Non-Antibody ScaffoldsおよびProtein Science 15:14-27 (2006)においてレビューされている。本発明の結合ドメインは、これらの別の選択肢としてのタンパク質ドメインのいずれから誘導することも可能である。
【００４３】
抗原結合断片または免疫学的有効断片は、部分的な重または軽鎖可変配列を含んでよい。断片は、少なくとも５、６、８、または１０アミノ酸の長さである。別の選択肢として、断片は、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００アミノ酸の長さである。
【００４４】
「中和する」の用語は、本明細書全体にわたって用いられる場合、ＩＬ‐１βの生物学的活性が、生体外または生体内にて、抗原結合タンパク質の非存在下におけるＩＬ‐１βの活性と比較して、本明細書で述べる抗原結合タンパク質の存在下では減少されることを意味する。中和は、ＩＬ‐１βがその受容体へ結合することの阻止、ＩＬ‐１βがその受容体を活性化することの防止、ＩＬ‐１βもしくはその受容体の下方制御、またはエフェクター機能への影響の１つ以上に起因し得る。
【００４５】
生物学的活性の減少または阻害は、部分的であっても、または完全であってもよい。中和抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の非存在下におけるＩＬ‐１β活性に対して、ＩＬ‐１βの活性を、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％中和することができる。
【００４６】
中和は、当業者に公知の、または本明細書で述べる１つ以上のアッセイを用いて特定、または測定されてよい。例えば、ＩＬ‐１βとの抗原結合タンパク質の結合は、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、ＦＭＡＴ、ＦＯＲＴＥｂｉｏ、または類似の生体外アッセイで評価されてよいが、細胞機能アッセイで評価されてもよい。
【００４７】
「ＣＤＲ」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。これらは、免疫グロブリン重および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。従って、本明細書で用いられる場合、「ＣＤＲ」は、３つすべての重鎖ＣＤＲ、３つすべての軽鎖ＣＤＲ、すべての重および軽鎖ＣＤＲ、または少なくとも２つのＣＤＲを意味する。
【００４８】
本明細書全体において、可変ドメイン配列および完全長抗体配列中のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付与則に従って番号付与される。同様に、実施例で用いられる「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」の用語は、Ｋａｂａｔ番号付与則に従う。さらなる情報については、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。
【００４９】
当業者にとっては、可変ドメイン配列および完全長抗体配列中のアミノ酸残基に対する
別の選択肢としての番号付与則が存在することは明らかである。また、ＣＤＲ配列に対する別の選択肢としての番号付与則も存在し、例えば、Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883に示されるものである。抗体の構造およびタンパク質折り畳みは、他の残基がＣＤＲ配列の一部であると見なされ、当業者であればそうであると理解されることを意味し得るものである。
【００５０】
当業者が利用可能であるＣＤＲ配列のためのその他の番号付与則としては、「ＡｂＭ」（バース大学）および「コンタクト（contact）」（ユニバーシティカレッジロンドン）の方法が挙げられる。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、およびコンタクトの方法うちの少なくとも２つを用いて最小重複領域を特定し、「最小結合ユニット」を提供することができる。最小結合ユニットは、ＣＤＲのサブ部分であり得る。
【００５１】
以下の表は、各ＣＤＲまたは結合ユニットに対して各番号付与則を用いた１つの定義を示す。表１では、Ｋａｂａｔ番号付与スキームを用いて可変ドメインアミノ酸配列に番号付与している。ＣＤＲ定義の一部が、用いられる個々の刊行物に応じて変わり得ることには留意されたい。
【００５２】
【表１】
0006383665.tif 000002
【００５３】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列において、「同一」または「配列同一性」の用語は、最適にアライメントされ、適切な挿入または欠失と比較された場合の、２つの核酸または２つのアミノ酸配列間の同一性の度合いを示す。
【００５４】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アライメントのために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの特定は、以下で述べるように、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。
【００５５】
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて特定することができ、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み（gap weight）、および
１、２、３、４、５、または６の長さ重み（length weight）が用いられる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）のアルゴリズムを用いて特定することもでき、重み残基表（weight residue
table）はＰＡＭ１２０、ギャップ長ペナルティは１２、およびギャップペナルティは４が用いられる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）のアルゴリズムを用いて特定することができ、Ｂｌｏｓｓｕｍ
６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、ならびに１、２、３、４、５、または６の長さ重みが用いられる。
【００５６】
例えば、ポリヌクレオチド配列は、本明細書で述べる参照ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号Ｘを参照）と同一であってよく、すなわち、１００％同一であり、または、それは、参照配列と比較した場合に、ある整数個までのヌクレオチド変化を含んでもよく、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％同一、などである。そのような変化は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入から選択され、ならびにここで、前記変化は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置に、または、参照配列中においてヌクレオチド間で個別に、もしくは参照配列内の１つ以上の近接群としてのいずれかで散在して、これらの末端位置の間のいずれの位置に存在してもよい。ヌクレオチド変化の数は、以下に示すように、参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数と対応する同一性パーセント（１００で除したもの）のパーセントの数値とを掛け算し、その積を、参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの前記総数から差し引くことによって特定され：
ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ）
ここで、ｎnは、ヌクレオチド変化の数であり、ｘnは、参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数であり、ｙは、５０％に対しては０．５０、６０％に対しては０．６０、７０％に対しては０．７０、７５％に対しては０．７５、８０％に対しては０．８０、８５％に対しては０．８５、９０％に対しては０．９０、９５％に対しては０．９５、９８％に対しては０．９８、９９％に対しては０．９９、または１００％に対しては１．００であり、・は、掛け算演算子の符号であり、およびここで、ｘnおよびｙの整数ではない積は、いずれも、ｘnから差し引く前に切り捨てによって整数とされる。
【００５７】
同様に、ポリペプチド配列は、ポリペプチド参照配列と同一であってよく、すなわち、１００％同一であり、または、それは、参照配列と比較した場合に、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％同一など、同一性パーセントが１００％未満となるように、ある整数個までのアミノ酸変化を含んでもよい。そのような変化は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的および非保存的置換を含む置換、または挿入から成る群より選択され、ならびにここで、前記変化は、参照ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置に、または、参照配列中においてアミノ酸間で個別に、もしくは参照配列内の１つ以上の近接群としてのいずれかで散在して、これらの末端位置の間のいずれの位置に存在してもよい。任意の同一性％に対するアミノ酸変化の数は、以下のように、ポリペプチド参照配列によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数と対応する同一性パーセント（１００で除したもの）のパーセントの数値とを掛け算し、次にその積を、ポリペプチド参照配列中のアミノ酸の前記総数から差し引くことによって特定され：
ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ）
ここで、ｎaは、アミノ酸変化の数であり、ｘaは、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸の総数であり、ｙは、５０％に対しては０．５０、６０％に対しては０．６０、７０％に対しては０．７０、７５％に対しては０．７５、８０％に対しては０．８０、８５％に対しては０．８５、９０％に対しては０．９０、９５％に対しては０．９５、９８％に対しては０．９８、９９％に対しては０．９９、または１００％に対しては１．００であり、・は、掛け算演算子の符号であり、およびここで、ｘaおよびｙの整数ではない積は、いずれも、ｘaから差し引く前に切り捨てによって整数とされる。同一性％は、配列の長さ全体にわたって特性され得る。
【００５８】
「特異的に結合する」の用語は、本明細書全体にわたって抗原結合タンパク質に関して
用いられる場合、抗原結合タンパク質が、非標的エピトープと結合する場合に得られるものよりも高い親和性でＩＬ‐１β上の標的エピトープと結合することを意味する。特定の実施形態では、特異的結合は、非標的エピトープに対する親和性よりも少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、または１０００倍高い親和性での標的との結合を意味する。例えば、結合親和性は、通常の方法によって測定されるものであってよく、例えば、競合ＥＬＩＳＡ、またはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、ＫＩＮＥＸＡ（商標）、もしくはＰＲＯＴＥＯＮ（商標）によるＫｄの測定による。
【００５９】
「ＩＣ５０」の用語は、本明細書で用いられる場合、参照アゴニストの有効性または生物学的標的の構成的活性を、特定の試験サンプルに対するアンタゴニスト曲線（最大−最小）の５０％低下させる物質（アンタゴニスト）のモル濃度を意味する。
【００６０】
「ＥＣ５０」の用語は、本明細書で用いられる場合、用量‐応答曲線の最大効果の５０％の応答を誘発する物質（アゴニスト）のモル濃度を意味する。
【００６１】
本明細書全体にわたって、可変ドメイン配列および完全長抗体配列中のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付与則に従って番号付与される。さらなる情報については、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of
Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。
【００６２】
当業者であれば、可変ドメイン配列および完全長抗体配列中のアミノ酸残基に対する別の選択肢としての番号付与則が存在することは明らかである。また、ＣＤＲ配列に対する別の選択肢としての番号付与則も存在し、例えば、Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883に示されるものである。抗体の構造およびタンパク質折り畳みは、他の残基がＣＤＲ配列の一部であると見なされ、当業者であればそうであると理解されることを意味し得るものである。
【００６３】
当業者が利用可能であるＣＤＲ配列のためのその他の番号付与則としては、「ＡｂＭ」（バース大学）および「コンタクト」（ユニバーシティカレッジロンドン）の方法が挙げられる。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、およびコンタクトの方法うちの少なくとも２つを用いて最小重複領域を特定し、「最小結合ユニット」を提供することができる。最小結合ユニットは、ＣＤＲのサブ部分であり得る。
【００６４】
「薬理学的に許容されるキャリア」の用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことを意図している。そのような媒体および剤を薬理活性物質に対して用いることは、本技術分野にて公知である。従来の媒体または剤のいずれも、化合物と不適合でない限りにおいて、治療組成物、ならびに治療および予防の方法におけるその使用が考慮される。補助的な活性化合物も、本発明に従う組成物中に組み込まれてよい。投与の容易性および用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で製剤することは、特に有利である。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、核酸とは、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ分子のいずれをも意味し、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡなどである。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、製剤の成分の濃度に関して、「約」の用語は、典型的には、記載した数値の＋／−５％、より典型的には、記載した数値の＋／−４％、より典型的には、記載した数値の＋／−３％、より典型的には、記載した数値の＋／−２％、さらにより典型的には、記載した数値の＋／−１％、さらにより典型的には、記載した数値の＋／−０．５％を意味する。
【００６７】
本開示全体を通して、特定の実施形態は、範囲のフォーマットで開示される場合がある。範囲のフォーマットでの記述は、単に便宜上および簡潔さのためであることは理解されるべきであり、開示される範囲の余地を固定的に限定するものとして解釈されるべきではない。従って、範囲の記述は、その範囲内の個々の数値だけでなく、考え得るすべてのサブ範囲も具体的に開示したものとして見なされるべきである。例えば、１から６などの範囲の記述は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などのサブ範囲、さらには、１、２、３、４、５、および６を例とするその範囲内の個々の数字を具体的に開示したものとして見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質の代表的な限定されない実施形態をここで開示する。
【００６９】
１つの実施形態では、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、以下の結合ユニットから成る群より選択される１つ以上の結合ユニットを含む：
（ｉ）配列番号３のＫａｂａｔ残基２３−３５または配列番号４、１５、もしくは１６のＫａｂａｔ残基２４−３３を含む結合ユニットＬ１、または結合ユニットＬ１中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｉｉ）配列番号３のＫａｂａｔ残基５１−５７または配列番号４、１５、もしくは１６のＫａｂａｔ残基４９−５５を含む結合ユニットＬ２、または結合ユニットＬ２中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｉｉｉ）配列番号３のＫａｂａｔ残基９２−１０２または配列番号４、１５、もしくは１６のＫａｂａｔ残基８８−９６を含む結合ユニットＬ３、または結合ユニットＬ３中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｉｖ）配列番号１のＫａｂａｔ残基３１−３５または配列番号２もしくは１４のＫａｂａｔ残基３１−３５を含む結合ユニットＨ１、または結合ユニットＨ１中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｖ）配列番号１のＫａｂａｔ残基５０−６６または配列番号２もしくは１４のＫａｂａｔ残基５０−６５を含む結合ユニットＨ２、または結合ユニットＨ２中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体；
（ｖｉ）配列番号１のＫａｂａｔ残基９９−１１４または配列番号２もしくは１４のＫａｂａｔ残基９８−１０８を含む結合ユニットＨ３、または結合ユニットＨ３中に少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失を有するその変異体。
【００７０】
１つの実施形態では、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、重鎖および／または軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号１または配列番号２もしくは１４から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列から成り、およびここで、軽鎖は、配列番号３または配列番号４、１５、もしくは１６から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列から成る。
【００７１】
重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμ重鎖から成る群より選択されてよい。好ましくは、重鎖は、γである。
【００７２】
軽鎖は、好ましくは、λまたはκ軽鎖から選択される。好ましくは、軽鎖は、λである。
【００７３】
１つの実施形態では、配列番号４、１５、または１６のＫａｂａｔ残基８８−９６は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３のアミノ
酸１−９から選択される群から成る残基より選択されてよい。
【００７４】
１つの実施形態では、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、細胞機能中和アッセイにおいて、約２０ｎＭ未満のＩＣ５０値でＩＬ‐１βを中和する。
【００７５】
別の実施形態では、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、細胞刺激アッセイにおいて、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．２ｎＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、または約１ｐＭのＩＣ５０値でＩＬ‐１βを中和する。
【００７６】
ある実施形態では、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、ヒトＩＬ‐１βから選択され、マウスまたはサルＩＬ‐１βと交差反応する。
【００７７】
１つの実施形態では、本明細書で述べる単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、細胞阻害アッセイにおいて、約２０ｎＭ未満から選択されるＩＣ５０値で、ＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生を阻害する。別の実施形態では、本明細書で述べる単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、細胞阻害アッセイにおいて、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、または約０．４ｎＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、または約５ｐＭ未満から選択されるＩＣ５０値で、ＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生を阻害する。
【００７８】
１つの実施形態では、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、約１０ｎＭ未満のＫD値でＩＬ‐１βと結合する。別の実施形態では、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満のＫD値でＩＬ‐１βと結合する。
【００７９】
１つの実施形態では、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、１ｐＭから５ｎＭのＩＣ５０値でヒトＩＬ‐１βを中和する。
【００８０】
１つの実施形態では、単離されたＩＬ‐１β特異的抗原結合タンパク質は、１００ｐＭから１５ｎＭのＩＣ５０値でマウスＩＬ‐１βを中和する。
【００８１】
１つの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、ＩＬ‐１βと特異的に結合する能力を有する。
【００８２】
ある実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、以下を含むか、または以下から成る：
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖、および配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖；または
（ｉｉ）配列番号２もしくは１４のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖、および配列番号４、１５、もしくは１６のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖。
【００８３】
１つの実施形態では、配列番号４、１５、もしくは１６のＫａｂａｔ残基８８−９６は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３のアミノ酸１−９から選択される群から成る残基より選択されてよい。
【００８４】
１つの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質またはその断片は、配列番号１、２、１４、３、４、１５、または１６に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、
少なくとも７０％、少なくとも８０％、および少なくとも９０％から成る群より選択される同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列から成る。
【００８５】
１つの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、抗体である。好ましくは、抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、二重特異性、またはヘテロ接合である。
【００８６】
１つの実施形態では、抗体は、完全にヒトのものであってよい。
【００８７】
１つの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、またはＩｇＧ３から選択される抗体である。
【００８８】
１つの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的有効断片、一本鎖Ｆｖ、ディアボディ、または四価二重特異性抗体（Ｔａｎｄａｂ）である。１つの実施形態では、抗原結合断片は、ドメインなどの非抗体タンパク質骨格上に配置された１つ以上のＣＤＲを含んでよい。
【００８９】
１つの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、組換えられている。
【００９０】
１つの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、免疫接着分子（immunoadhesion molecule）、造影剤、治療剤、および細胞傷害剤から成る群より選択される剤を含む。
【００９１】
免疫接着分子は、細胞接着分子（ＣＡＭ）の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、インテグリン、カドヘリン、およびセレクチンの１つ以上を含んでよい。
【００９２】
１つの実施形態では、造影剤は、放射標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、およびビオチンから成る群より選択されてよい。
【００９３】
放射標識の適切な例としては、これらに限定されないが、３２‐リン、またはトリチウム標識したチミジンの形態のトリチウムが挙げられる。
【００９４】
適切な蛍光標識の例としては、シアニン、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ｆｌｕｏｒｓ、ＡＴＴＯ染料、およびＢＯＤＩＰＹ染料が挙げられる。
【００９５】
適切な発光標識の例としては、ルミノールおよびルテニウムプローブが挙げられるがこれらに限定されない化学発光標識、ならびにルシフェリンが挙げられるがこれに限定されない生物発光標識が挙げられる。
【００９６】
１つの実施形態では、剤は、治療剤または細胞傷害剤である。治療剤または細胞傷害剤は、抗代謝剤、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、トキシン、およびアポトーシス剤から成る群より選択されてよい。
【００９７】
１つの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、癌、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、痛風、糖尿病、ぶどう膜炎、クリオピリン関連周期性症候群、および炎症性ざ瘡から成る群より選択される炎症性疾患または自己免疫性疾患の治療に用いられる。
【００９８】
１つの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、癌、関節炎、炎症性腸疾患、
クローン病、関節リウマチ、痛風、糖尿病、ぶどう膜炎、クリオピリン関連周期性症候群、および炎症性ざ瘡から成る群より選択される炎症性疾患または自己免疫性疾患の治療のための医薬の作製に用いられる。
【００９９】
１つの実施形態では、クリオピリン関連周期性症候群は、家族性感冒自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、および新生児期発症多臓器性炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ、慢性乳児神経皮膚関節炎症候群またはＣＩＮＣＡとも称される）から選択され得る。
【０１００】
１つの実施形態では、本明細書で述べる抗原結合タンパク質および薬理学的に許容されるキャリアを含む組成物が提供される。
【０１０１】
１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、注射によって投与されてよい。注射溶液の場合、キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なこれらの混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散体の場合は必要とされる粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を用いることにより、適切な流動性が維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および／または抗真菌剤を含めることによって達成され得る。適切な剤は、当業者に公知であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、アスコルビン酸、チメロサールなどが挙げられる。多くの場合、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、および塩化ナトリウムを例とする等張剤を組成物中に含めることが好ましいものであり得る。注射用組成物の持続的な吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを例とする吸収を遅延する剤を組成物中に含めることによって得られ得る。
【０１０２】
滅菌注射溶液は、必要に応じて上記で列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に、必要とされる量の類似体を適切な溶媒中に組み込み、続いて滅菌ろ過を行うことによって作製され得る。一般的に、分散体は、基本的な分散媒および上記で列挙したものからの必要とされるその他の成分を含有する滅菌媒体中に類似体を組み込むことによって作製される。
【０１０３】
好ましくは、医薬組成物は、酸加水分解を最小限に抑えるために、適切な緩衝剤をさらに含んでよい。適切な緩衝剤は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、およびこれらの混合物が挙げられる。
【０１０４】
本発明に従う医薬組成物の単一、または複数の投与が行われてよい。当業者であれば、通常に実験により、本発明の化合物および／または組成物の有効な無毒性用量レベル、ならびに化合物および組成物が適用可能である疾患および／または感染症の治療に適する投与パターンを決定することが可能であろう。
【０１０５】
さらに、当業者であれば、治療決定試験（treatment determination test）の慣行的な進め方を用いることによって、定められた日数にわたって一日あたりに与えられる本発明の化合物または組成物の投与回数などの治療の最適な進め方が確認され得ることは明らかである。
【０１０６】
一般的に、２４時間あたりの有効用量は、体重１ｋｇあたり約０．０００１ｍｇから約１０００ｍｇ；適切には、体重１ｋｇあたり約０．００１ｍｇから約７５０ｍｇ；体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇから約５００ｍｇ；体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇから約５００ｍｇ；体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇから約２５０ｍｇ；または体重１ｋｇあたり約１
．０ｍｇから約２５０ｍｇの範囲であってよい。より適切には、２４時間あたりの有効用量は、体重１ｋｇあたり約１．０ｍｇから約２００ｍｇ；体重１ｋｇあたり約１．０ｍｇから約１００ｍｇ；体重１ｋｇあたり約１．０ｍｇから約５０ｍｇ；体重１ｋｇあたり約１．０ｍｇから約２５ｍｇ；体重１ｋｇあたり約５．０ｍｇから約５０ｍｇ；体重１ｋｇあたり約５．０ｍｇから約２０ｍｇ；または体重１ｋｇあたり約５．０ｍｇから約１５ｍｇの範囲であってよい。
【０１０７】
別の選択肢として、有効用量は、約５００ｍｇ／ｍ2までであってよい。例えば、一般的に、有効用量は、約２５から約５００ｍｇ／ｍ2、約２５から約３５０ｍｇ／ｍ2、約２５から約３００ｍｇ／ｍ2、約２５から約２５０ｍｇ／ｍ2、約５０から約２５０ｍｇ／ｍ2、および約７５から約１５０ｍｇ／ｍ2の範囲であると考えられる。
【０１０８】
１つの実施形態では、組成物は、本明細書で述べる１つ以上の治療剤をさらに含む。
【０１０９】
また、本明細書で述べる抗原結合タンパク質を産生する能力を有する単離された細胞株も提供される。
【０１１０】
抗原結合タンパク質を産生する能力を有する細胞株の例としては、ＨＥＫ２９３およびＣＨＯが挙げられる。
【０１１１】
また、配列番号１、または配列番号２もしくは１４、またはその断片から選択される配列を含むか、またはその配列から成る単離された核酸分子も提供される。
【０１１２】
また、配列番号３、または配列番号４、１５、もしくは１６、またはその断片から選択される配列を含むか、またはその配列から成る単離された核酸分子も提供される。
【０１１３】
１つの実施形態では、単離された核酸分子またはその断片は、配列番号１、２、１４、３、４、１５、または１６に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、および少なくとも９０％から成る群より選択される同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそのヌクレオチド配列から成る。
【０１１４】
また、本明細書で定める核酸分子を含むベクターも提供される。
【０１１５】
１つの実施形態では、ベクターは、プラスミドまたはウィルスであってよい。当業者であれば、多くの適切なベクターが存在し、それらが本開示の範囲に含まれることは明らかである。
【０１１６】
好ましくは、ベクターは、前記核酸分子と操作可能に連結された発現制御配列を含む。
【０１１７】
発現制御配列は、目的の遺伝子またはタンパク質の発現を促進、増加、または抑制する核酸断片であってよい。
【０１１８】
また、上記で定める核酸分子を含む宿主細胞も提供される。
【０１１９】
宿主細胞は、培養された細胞株、生体内細胞、または生体外細胞であってよい。
【０１２０】
１つの実施形態では、宿主細胞は、本明細書で述べるベクターを含む。
【０１２１】
また、本明細書で述べる抗原結合タンパク質を作製する方法も提供され、その方法は、本明細書の記述に従って適切な条件下にて宿主細胞を培養すること、およびそこから前記
タンパク質を回収することを含む。
【０１２２】
また、癌、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、痛風、糖尿病、ぶどう膜炎、クリオピリン関連周期性症候群、および炎症性ざ瘡から成る群より選択される炎症性疾患または自己免疫性疾患を治療する方法も提供され、ここで、本明細書で述べる単離された抗原結合タンパク質が、対象へ投与される。
【０１２３】
添付の図面は、開示される実施形態を例証するものであり、開示される実施形態の原理を説明する役割を有する。しかし、これらの図面が、単に例証を目的として描かれたものであり、本発明の範囲を定めるものとして描かれたものではないことは理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、Ｆａｂクローン１Ｈおよび２ＨによるＩＬ‐１βの中和を示す。ＩＬ‐１βの中和は、６５５ｎｍで読み取る光学密度（ＯＤ）およびＦａｂの濃度に基づいて測定した。結果は、クローン１Ｈおよび２Ｈが、それぞれ、１．３１および０．２１のＩＣ５０でＩＬ‐１βの活性化を遮断することを示している。
【図２−１】図２−１は、１Ｈ  Ｆａｂクローンの重鎖ならびに軽鎖の配列決定結果を示す。
【図２−２】図２−２は、２Ｈ  Ｆａｂクローンの重鎖ならびに軽鎖の配列決定結果を示す。
【図３】図３は、ＩｇＧ１  １Ｈおよび２ＨによるヒトＩＬ‐１βの中和を示す。ＩＬ‐１βの中和は、６５５ｎｍで読み取る光学密度（ＯＤ）およびＩｇＧの濃度に基づいて測定した。結果は、クローン１Ｈおよび２Ｈが、それぞれ、２．６ｎＭおよび０．１７ｎＭの効力（ＥＣ５０）でヒトＩＬ‐１βを中和することを示している。
【図４】図４は、ＩｇＧ１  １Ｈおよび２ＨによるマウスＩＬ‐１βの中和を示す。ＩＬ‐１βの中和は、６５５ｎｍで読み取る光学密度（ＯＤ）およびＩｇＧの濃度に基づいて測定した。結果は、クローン１Ｈおよび２Ｈが、それぞれ、１１．５ｎＭおよび１．５ｎＭの効力（ＥＣ５０）でマウスＩＬ‐１βを中和することを示している。
【図５】図５は、ＩｇＧ  １Ｈおよび２Ｈが、ＭＲＣ５細胞中においてヒトＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生を阻害することを示す。ヒトＩＬ‐１βを中和する効力は、ＩｇＧ  １Ｈおよび２Ｈの存在下で産生されるＩＬ‐６のレベルを測定することによって特定した。ＭＲＣ５細胞を、種々の濃度のＩｇＧ  １Ｈおよび２Ｈと共に、４ｐＭのＩＬ‐１βで刺激した。結果は、ＩｇＧ  １Ｈおよび２Ｈが、それぞれ、３．９２ｎＭおよび０．３５ｎＭの阻害効力（ＥＣ５０）を有することを示している。
【図６】図６は、ＩｇＧ  ２Ｈが、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、ヒトＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生を生体内で阻害することを示す。ＩｇＧ  ２Ｈの中和効力は、４もしくは２０ｍｇ／ｋｇの２Ｈ、または４００μＬのＰＢＳを、および翌日にヒトＩＬ‐１βまたはＰＢＳをマウスに腹腔内注射することによって評価した。血液を採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ‐６を測定した。結果は、ＩｇＧ  ２Ｈが、用量依存的様式で、マウスにおけるヒトＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生を阻害することができたことを示している。
【図７】図７は、ＩｇＧ１  ２Ｈが、ＩＬ‐１βに対して特異的であり、ＩＬ‐１αは認識しないことを示す。ＩｇＧ  ２Ｈの結合特異性は、４６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）およびＩｇＧ  ２Ｈの濃度に基づいて特定した。結果は、ＩｇＧ  ２Ｈが、ヒトおよびマウスＩＬ‐１βの両方とは用量依存的様式で結合したが、ヒトまたはマウスＩＬ‐１αのいずれとも結合しなかったことを示している。
【図８】図８は、ＩｇＧ  ２Ｈの親和性成熟から得られた５つのＩｇＧクローンの中和効力を示す。中和効力は、各ＩｇＧクローンの濃度に対する分泌されたＩＬ‐６の濃度に基づいて特定した。結果は、すべての成熟ＩｇＧクローンが、マウスＩＬ‐１βの両方に対して高い中和効力を提示したことを示している。結果はまた、マウスＩＬ‐１βの中和では、成熟クローンが、非成熟ＩｇＧ  ２Ｈよりも、２から８倍効果的であることも示している。
【図９】図９は、ＩｇＧ  ２Ｈの親和性成熟から得られた５つのＩｇＧクローンの中和効力を示す。中和効力は、各ＩｇＧクローンの濃度に対する分泌されたＩＬ‐６の濃度に基づいて特定した。結果は、すべての成熟ＩｇＧクローンが、ヒトＩＬ‐１βの両方に対して高い中和効力を提示したことを示している。結果はまた、ヒトＩＬ‐１βの中和では、成熟クローンが、非成熟ＩｇＧ  ２Ｈよりも、３から２３倍効果的であることも示している。
【図１０】図１０は、Ｐ２Ｄ７ＫＫの配列を示す。Ｐ２Ｄ７ＫＫは、重鎖可変領域の７５および８１の位置において、１つのアルギニン残基および１つのセリン残基を、リジン残基（太字および下線）に変更することによってＰ２Ｄ２から誘導した。
【図１１】図１１は、抗コラーゲン抗体による関節炎の誘発後の、ＤＢＡマウスにおける関節炎スコアを示す。マウスに、５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ、５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｄ７ＫＫ、または１５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｄ７ＫＫのいずれかを注射した。結果は、Ｐ２Ｄ７ＫＫで処理したマウスは、アイソタイプコントロールを注射したマウスよりも、非常に低い関節炎スコアを有していたことを示している。
【図１２】図１２は、関節炎誘発、およびアイソタイプコントロール（左図）、Ｐ２Ｄ７ＫＫの５ｍｇ／ｋｇ（中央図）、またはＰ２Ｄ７ＫＫの１５ｍｇ／ｋｇ（右図）の投与後における、典型的な前足（上図）および後ろ足（下図）の腫張を示す。結果は、Ｐ２Ｄ７ＫＫで処理したマウスが、アイソタイプコントロールを注射したマウスと比較して足の腫張を起こさなかったことから、Ｐ２Ｄ７ＫＫが明らかに炎症を抑制したことを示している。
【図１３】図１３は、アイソタイプ抗体を注射したマウス（左図）、または５ｍｇ／ｋｇ（中央図）、もしくは１５ｍｇ／ｋｇ（右図）のＰ２Ｄ７ＫＫで処理したマウスからの、前足（上図）および後ろ足（下図）の関節の典型的な組織学的分析を示す。結果は、Ｐ２Ｄ７ＫＫで処理したマウスでは、実質的に免疫細胞の浸潤が無い状態で関節が維持されているのに対し、アイソタイプを注射したマウスの関節は、高い炎症反応を起こしている部位であったことが示されている。
【図１４】図１４は、ＰＢＳの注射（１）、尿酸一ナトリウム結晶の注射、およびそれに続くＰＢＳの投与（２）、アナキンラ  ３０ｍｇ／ｋｇの注射（３）、アイソタイプヒト抗体  １５ｍｇ／ｋｇの注射（４）、Ｐ２Ｄ７ＫＫ  ５ｍｇ／ｋｇの注射（５）、またはＰ２Ｄ７ＫＫ  １５ｍｇ／ｋｇの注射（６）後の、腹膜腔における免疫細胞の浸潤を示す。平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。独立ｔ検定：*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．  有意差無し
【図１５】図１５は、Ｐ２Ｄ７ＫＫまたはアイソタイプコントロールで処理したマウスにおける、癌細胞接種後第７日から１７日の腫瘍成長を示す。平均±ＳＤを示す。二元配置ＡＮＯＶＡ検定（ターキーの多重比較（Turkey's multiple comparison））  *ｐ＜０．０５
【図１６】図１６は、マウス関節の流入領域リンパ節における細胞の絶対数を示す。グラフ１は、Ｐ．アクネス（P. acnes）を感染させたマウスを表し；グラフ４は、Ｐ．アクネスを感染させ、ＰＢＳを注射したマウスを表し；グラフ３は、Ｐ．アクネスを感染させ、アイソタイプコントロールを注射したマウスを表し；グラフ２は、Ｐ．アクネスを感染させ、Ｐ２Ｄ７ＫＫで処理したマウスを表す。
【図１７】図１７は、Ｐ．アクネスを感染させていないマウス（各群の一番左の棒グラフ）、Ｐ．アクネスを感染させ、ＰＢＳを注射したマウス（各群の左から二番目の棒グラフ）、Ｐ．アクネスを感染させ、アイソタイプコントロールを注射したマウス（各群の左から三番目の棒グラフ）、またはＰ．アクネスを感染させ、Ｐ２Ｄ７ＫＫで処理したマウス（各群の左から四番目の棒グラフ）の表皮中におけるリンパ球の数を示す。ｐ値は、独立ｔ検定を意味する。
【実施例】
【０１２５】
最良の形態を含む本発明の限定されない例、および比較例について、特定の実施例を参照することによって、より詳細にさらに記載する。特定の実施例は、いかなる形であっても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１２６】
＜実施例１  −  抗ヒトＩＬ‐１β抗体の単離および細胞アッセイにおけるＩＬ‐１β中和能力の特性決定＞
抗ＩＬ‐１β抗体は、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー（Ｈｕｍａｎｙｘ  ＨＸ−０２ライブラリー）から、生体外選別を介して単離した。最初に、ＦａｂフォーマットのＩＬ‐１β特異的モノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡによって識別した。これらのＥＬＩＳＡ陽性Ｆａｂを、組換えヒトＩＬ‐１受容体を過剰発現する操作されたＨＥＫ２９３細胞株であるＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ（商標）  ＩＬ‐１β細胞（インビボジェン（InvivoGen、米国）へ添加した。
【０１２７】
ＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ（商標）  ＩＬ‐１β細胞の表面上でのＩＬ‐１βのその受容体ＩＬ‐１Ｒへの結合は、ＮＦ‐ｋＢの活性化およびそれに続く分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生に繋がるシグナル伝達カスケードを誘発する。ＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ（商標）  ＩＬ‐１β細胞の上澄中でのＳＥＡＰの検出は、比色ＳＥＡＰ基質、ＱＵＡＮＴＩ‐Ｂｌｕｅ（商標）を用いて容易に評価することができる。ＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ細胞は、ヒトおよびマウスＩＬ‐１βの両方に対して感受性であるが、ヒトＩＬ‐１αまたはＴＮＦ‐αに対しては非感受性である。
【０１２８】
２２のＥＬＩＳＡ陽性Ｆａｂのうち、２つのクローン１Ｈおよび２Ｈが、それぞれ、１．３１および０．２１ｎＭのＩＣ50（ＩＬ‐１β活性の５０％を阻害する濃度）で、ＩＬ‐１β刺激によるＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ  ＩＬ‐１β細胞の活性化を遮断することが見出された（図１）。配列決定の結果から、両方のクローンがλ軽鎖を持つことが明らかとなった。クローン１Ｈおよび２Ｈの重ならびに軽鎖の配列を、図２に示す。
【０１２９】
＜実施例２  −  ＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ細胞アッセイにおけるＩｇＧ１  １Ｈおよび２ＨによるＩＬ‐１βの中和＞
２つのＦａｂクローン１Ｈおよび２Ｈを、各クローンの重および軽鎖をＰＣＲによって別々に増幅し、哺乳類細胞発現ベクター中にクローン化することによって、完全長ＩｇＧに変換した。続いて、ヒトＩｇＧ１サブタイプを有する得られたプラスミドを用いて、哺乳類細胞中への一過性トランスフェクションによる完全長抗体発現を行った。抗体は、プロテインＧカラムによって精製した。
【０１３０】
＜ヒトＩＬ‐１β＞
次に、ＩｇＧクローン１Ｈおよび２ＨのヒトＩＬ‐１βに対する中和効力を、上述のＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ細胞を用いて分析した。細胞を、種々の濃度の抗体と共に、４ｐＭのヒトＩＬ‐１βで刺激した。用量‐応答曲線を、ＥＣ50（半数効果濃度）が算出されるシグモイド非線形回帰式（可変傾斜）でフィッティングした。本アッセイにおいて、クローン１Ｈおよび２Ｈは、それぞれ、２．６ｎＭおよび０．１７ｎＭの効力（ＥＣ50）でヒトＩＬ‐１βを中和した（図３）。
【０１３１】
＜マウスＩＬ‐１β＞
ＩｇＧクローン１Ｈおよび２ＨのマウスＩＬ‐１βに対する中和効力を、上述のＨＥＫ‐Ｂｌｕｅ細胞を用いて調べた。但し、細胞の刺激は、種々の濃度の抗体と共に、マウスＩＬ‐１βで行った。本アッセイにおいて、クローン１Ｈおよび２Ｈは、それぞれ、１１．５ｎＭおよび１．５ｎＭの効力（ＥＣ50）でマウスＩＬ‐１βを中和した（図４）。
【０１３２】
＜実施例３  −  ヒトＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生の阻害  ＩｇＧ  １Ｈおよび２Ｈ＞
＜生体外＞
ＩｇＧ  １Ｈおよび２ＨによるヒトＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生の阻害を、ヒト線維芽細胞株、ＭＲＣ５を用いて生体外で調べた。ヒト肺線維芽細胞株、ＭＲＣ５をＩＬ‐１βで刺激すると、ＩＬ‐６産生が発生する。
【０１３３】
ＩｇＧ  １Ｈおよび２ＨのヒトＩＬ‐１β中和効力を、抗体の存在下で産生されるＩＬ‐６のレベルを測定することによって調べた。細胞を、種々の濃度の抗体と共に、ヒトＩＬ‐１βで刺激し、ＩＬ‐６をＥＬＩＳＡによって定量した。本アッセイにおいて、ＩｇＧ  １Ｈおよび２Ｈは、それぞれ、３．９２および０．３５ｎＭの阻害効力（ＥＣ50）を示した（図５）。
【０１３４】
＜生体内＞
ＩｇＧ  １Ｈおよび２ＨによるヒトＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生の阻害を、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて生体内で調べた。ヒトＩＬ‐１βをＢａｌｂ／ｃマウスに投与すると、それに続いて、ＥＬＩＳＡによって血清中で検出可能であるマウスＩＬ‐６が迅速に分泌される。
【０１３５】
ＩｇＧ  ２Ｈの中和効力を評価するために、４もしくは２０ｍｇ／ｋｇの２Ｈ、または４００μＬのＰＢＳを、マウスに腹腔内注射した。翌日、マウスに、ヒトＩＬ‐１βまたはＰＢＳ（ネガティブコントロール）を投与した。ＩＬ‐１β注射の２時間後、血液を採取し、ＥＬＩＳＡによって血清中のＩＬ‐６を測定した。
【０１３６】
結果は、２Ｈが、マウス中において、ヒトＩＬ‐１β誘発ＩＬ‐６産生を用量依存的様式で阻害することができることを示した（図６）。
【０１３７】
＜実施例４  −  ＩｇＧ  ２Ｈの特異性＞
ＩｇＧ  ２Ｈの結合特異性を、ＩＬ‐１の２つのサブタイプ、αおよびβに対して、直接ＥＬＩＳＡによって調べた。結果は、ＩｇＧ  ２Ｈが、ヒトおよびマウスＩＬ‐１βの両方と用量依存的様式で結合したのに対し、ヒトまたはマウスＩＬ‐１αの場合、試験した濃度範囲においてそのいずれとも結合しなかったことを示している（図７）。従って、ＩｇＧ  ２Ｈは、ＩＬ‐１αと比較して、ＩＬ‐１βに対して強力な選択性を示した。従って、ＩｇＧ  ２Ｈは、ＩＬ‐１βに特異的であり、ＩＬ‐１αは認識しない。
【０１３８】
＜実施例５  −  ＩｇＧ  ２Ｈの親和性成熟＞
ＩｇＧ  ２Ｈを、ファージディスプレイ法を用いて親和性成熟し、軽鎖のＣＤＲ３領域に変異を有する５つの成熟クローンを、ＭＲＣ５細胞に対するＩＬ‐１β中和アッセイ後に選別した。
【０１３９】
成熟ＩｇＧクローンはすべて、本アッセイにおいて、マウスおよびヒトＩＬ‐１βの両方に対して高い中和効力を示した。成熟クローンは、初期ＩｇＧ  ２Ｈよりも、マウスＩＬ‐１βの中和では２から８倍効果的であり、ヒトＩＬ‐１βの中和では３から２３倍効果的であり、効力は、マウスサイトカインの場合は１５８．４から６２３．２ｐＭのＥＣ50の範囲（図８）、そのヒト対応物の場合は６．５から４５．３ｐＭのＥＣ50の範囲（図９）である。
【０１４０】
成熟クローン（Ｐ１Ｅ８以外）を、ＰｒｏｔｅＯｎバイオアナライザー（バイオラッド（BioRad），ハーキュリーズ，米国）を用いて、マウスおよびヒトＩＬ‐１βに対する親和性について試験した。
【０１４１】
結果から、マウスＩＬ‐１βに対する親和性は、ＩｇＧ  ２Ｈと比較して、成熟クロー
ンの場合は、３から１３倍高く、ヒトＩＬ‐１βについては、８から２５倍高いことが示された（表１）。
【０１４２】
【表２】
0006383665.tif 000003
【０１４３】
＜親和性成熟クローンの配列＞
成熟クローンを配列決定し、その軽鎖ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を表２に示す。
【０１４４】
【表３】
0006383665.tif 000004
【０１４５】
逆翻訳後の軽鎖ＣＤＲ３領域の対応するヌクレオチド配列を以下に示す。
＞２Ｈ
ＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＡ    （元の２Ｈ配列）
Ａ    Ｔ          ＴＴＣＴ    Ｔ    Ｃ    Ｇ    Ｔ    （同じアミノ酸を
Ａ                Ａ          Ａ          Ｃ      コードする配列）
Ｃ                Ｇ                      Ｇ
＞Ｐ１Ｄ９
ＴＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＴ
Ｃ    Ｃ          Ｃ    Ｃ    Ｃ    Ｃ    Ｇ    Ｃ
Ａ                      Ａ                Ａ
Ｇ                      Ｇ                Ｇ
＞Ｐ１Ｅ８
ＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴ
Ｇ    Ｃ          Ｃ    Ｃ    Ｃ    Ｃ    Ｇ    Ｃ
Ａ                Ａ    Ａ    Ａ          Ａ
Ｇ                Ｇ    Ｇ    Ｇ          Ｇ
＞Ｐ１Ｈ８
ＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＴＴ
Ｇ    Ｃ          Ｃ    ＣＡＧＣ    Ｃ    Ｇ    Ｃ
Ａ          Ａ          Ａ                Ａ
Ｇ          Ｇ          Ｇ                Ｇ
＞Ｐ２Ｄ７
ＴＡＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＡＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＴ
Ｃ    Ｃ          Ｃ    Ｃ    Ｃ    Ｃ    Ｇ    Ｃ
Ａ          Ａ          Ａ                Ａ
Ｇ          Ｇ          Ｇ                Ｇ
＞Ｐ２Ｄ８
ＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＡＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＴ
Ｇ    Ｃ          Ｃ    Ｃ    Ｃ    Ｃ    Ｇ    Ｃ
Ａ          Ａ          Ａ                Ａ
Ｇ          Ｇ          Ｇ                Ｇ
【０１４６】
＜実施例６  −  Ｐ２Ｄ７ＫＫの生体内有効性＞
＜Ｐ２Ｄ７ＫＫの誘導＞
５つの親和性成熟クローンからＰ２Ｄ７を選択し、生殖系列様抗体となるように操作し、それをＰ２Ｄ７ＫＫと称した。Ｐ２Ｄ７ＫＫは、重鎖可変領域の７５および８１の位置において、１つのアルギニン残基および１つのセリン残基を、リジン残基に変更することによってＰ２Ｄ２から誘導した（図１０）。
【０１４７】
次に、Ｐ２Ｄ７ＫＫを、（１）ＣＡＩＡ：コラーゲン抗体誘発関節炎、関節リウマチのモデル、（２）ＭＳＵ：尿酸一ナトリウム結晶誘発炎症、痛風の模擬モデル、（３）ＲＣＣ：腎細胞癌成長、腫瘍成長を阻害するための腫瘍微小環境におけるＩＬ‐１β抗体の使用について評価、ならびに（４）Ｐ．アクネス：プロピオニバクテリウム・アクネスを用いた炎症性ざ瘡のモデル、の４つの異なる疾患動物モデルにおいて、生体内有効性について予備試験した。
【０１４８】
＜ＣＡＩＡ  −  コラーゲン抗体誘発関節炎＞
第０日に１．５ｍｇ／マウスの抗コラーゲン抗体カクテルを腹腔内注射し、続いて２５μｇのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を注射することで、Ｂａｌｂ／ｃマウスに関節炎を誘発した。
【０１４９】
８体のマウスのグループに対し、第２、５、および９日に、５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｄ７ＫＫを腹腔内投与した。同じスケジュールに従って、別のグループには、１５ｍｇ／ｋｇのＰ２Ｄ７ＫＫを投与し、１つのコントロールグループには、５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロールを投与した。
【０１５０】
結果から、Ｐ２Ｄ７ＫＫで処理したマウスは、アイソタイプコントロールを注射したマウスよりも、非常に低い関節炎スコアを有することが示された（図１１）。従って、Ｐ２Ｄ７ＫＫの投与により、関節炎の発症が阻害された。
【０１５１】
また、結果は、Ｐ２Ｄ７ＫＫで処理したマウスが、アイソタイプ抗体を注射したマウスが起こしたような足の腫張を起こさなかったことから、Ｐ２Ｄ７ＫＫが明らかに炎症を抑制したことも示した（図１２）。
【０１５２】
後ろ足の組織学的分析から、Ｐ２Ｄ７ＫＫで処理したマウスでは、実質的に免疫細胞の
浸潤が無い状態で関節が維持されているのに対し、アイソタイプを注射したマウスの関節は、高い炎症反応を起こしている部位であったことが示された（図１３）。
【０１５３】
＜ＭＳＵ：尿酸一ナトリウム結晶誘発炎症＞
Ｃ５７／ＢＬ６マウスの６つのグループに、２００μＬのＰＢＳ中の３ｍｇの尿酸一ナトリウムを、またはコントロールグループにはＰＢＳ単独を腹腔内注射した。次に、マウスに以下を注射した：
・３００μＬのＰＢＳ中のＰ２Ｄ７ＫＫ  ５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）
・３００μＬのＰＢＳ中のＰ２Ｄ７ＫＫ  １５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）
・３００μＬのＰＢＳ中のアイソタイプ抗体  １５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）
・３００μＬのＰＢＳ中のアナキンラ  ３０ｍｇ／ｋｇ  ９ｎ＝５）
・３００μＬのＰＢＳ（ｎ＝３、媒体コントロールグループ）
・３００μＬのＰＢＳ（ｎ＝５、ＭＳＵ無しのコントロールグループ）
【０１５４】
抗体投与の６時間後、マウスを屠殺し、５ｍＬの冷完全培地で腹膜洗浄した。フローサイトメトリーにより、洗浄液中の好中球および単球をカウントした。
【０１５５】
結果は、腹膜へのＭＳＵの注射により、好中球および単球の動員が誘発されることを示した。アナキンラと同様に、Ｐ２Ｄ７ＫＫは、腹腔内における好中球（１５および５ｍｇ／ｋｇの両方において）および単球（１５ｍｇ／ｋｇのみにおいて）の浸潤を大きく低減することができた（図１４）。
【０１５６】
ＲＣＣ  −  ヒト腎細胞癌異種移植
６−８週齢の雌のＳＣＩＤマウスに、２×１０6のＲＣＣ４細胞を筋肉内注射した。次に、マウス６体の１つのグループに対し、腫瘍接種後の第１、３、５、７、および９日に、１００μｇ／マウスのＰ２Ｄ７ＫＫを腫瘍部位に注射した。マウス６体の別のグループには、アイソタイプコントロール抗体を投与した。
【０１５７】
腫瘍成長を、第７日から１７日まで、２日おきにモニタリングした。
【０１５８】
結果は、Ｐ２Ｄ７ＫＫが、処理マウスにおいて、腫瘍成長を大きく低減したことを示した（図１５）。
【０１５９】
＜Ｐ．アクネス  −  炎症性ざ瘡＞
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、４００μｇのＰ２Ｄ７ＫＫまたはアイソタイプコントロールを、第−１日および第１日に腹腔内注射した。第０日に、マウスを、１０8コロニー形成ユニットのプロピオニバクテリウム・アクネスで右耳に感染させ、左耳にＰＢＳを投与した。いくつかのコントロールマウスは感染させず、いくつかは、感染させたが、いずれの抗体も投与しなかった。
【０１６０】
真皮および表皮における免疫パラメーターを、第２、５、および９日に評価した。
【０１６１】
結果は、第９日に、リンパ節中の細胞数の減少によって観察されるように、Ｐ２Ｄ７ＫＫが炎症を低減したことを示した（図１６）。理論に束縛されるものではないが、Ｐ２Ｄ７ＫＫは、恐らく、表皮におけるリンパ球浸潤を低減するものと考えられる（図１７）。
【０１６２】
従って、Ｐ２Ｄ７ＫＫは、ヒト疾患の４つの異なるモデル、すなわち、関節リウマチ、痛風、腎細胞癌、および炎症性ざ瘡において、生体内での有効性を示した。
【０１６３】
＜応用＞
本発明の趣旨および範囲から逸脱することのない本発明の種々のその他の改変および適合が、上述の開示事項の読後、当業者にとって明白となることは明らかであり、そのような改変および適合はすべて、添付の請求項の範囲内に含まれることを意図している。
【図１】
0006383665.tif 000005
【図２−１】
0006383665.tif 000006
【図２−２】
0006383665.tif 000007
【図３】
0006383665.tif 000008
【図４】
0006383665.tif 000009
【図５】
0006383665.tif 000010
【図６】
0006383665.tif 000011
【図７】
0006383665.tif 000012
【図８】
0006383665.tif 000013
【図９】
0006383665.tif 000014
【図１０】
0006383665.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
0006383665.tif 000017
【図１３】
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【図１４】
0006383665.tif 000019
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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