(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
1〜5個のアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、該置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ；
該野生型ロイコシジンサブユニットがパントンバレンタイン(Panton-Valentine)ロイコシジン(PVL)LukS-PVであり、且つ該変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドが、SEQ ID NO:6のT28に対応するスレオニンがフェニルアラニンで置換されているSEQ ID NO:6のT28に対応する位置におけるアミノ酸置換、SEQ ID NO:6のK97に対応するリジンがアラニンで置換されているSEQ ID NO:6のK97に対応する位置におけるアミノ酸置換、およびSEQ ID NO:6のS209に対応するセリンがアラニンで置換されているSEQ ID NO:6のS209に対応する位置におけるアミノ酸置換を含むか、または該野生型ロイコシジンサブユニットがPVL LukF-PVであり、且つ該変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドがSEQ ID NO:17のK102に対応するリジンがアラニンで置換されているSEQ ID NO:17のK102に対応する位置におけるアミノ酸置換を含む、
単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項２】
野生型ロイコシジンサブユニットが、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むLukS-PVである、請求項1に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項３】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項４】
野生型ロイコシジンサブユニットが、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、またはSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含むLukF-PVである、請求項1に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項５】
野生型ロイコシジンサブユニットが、SEQ ID NO:17のD121に対応する位置におけるアミノ酸置換をさらに含むLukF-PVである、請求項1または4に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項６】
SEQ ID NO:17の位置D121に対応するアスパラギン酸がアラニンで置換されている、請求項5に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項７】
野生型ロイコシジンサブユニットが、SEQ ID NO:17のE147に対応する位置におけるアミノ酸置換をさらに含むLukF-PVである、請求項1または4〜6のいずれか一項に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項８】
SEQ ID NO:17の位置E147に対応するグルタミンがアラニンで置換されている、請求項7に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項９】
変異型のLukF-PVサブユニットが、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項１０】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項１１】
SEQ ID NO:136のアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項１２】
好中球毒性アッセイにおいて、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比較して毒性が低い、請求項1〜11のいずれか一項に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項１３】
請求項1〜3のいずれか一項に記載のLukS-PV変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチドもしくは請求項4〜11のいずれか一項に記載のLukF-PV変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド、またはそれらの組み合わせ、およびさらなるブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体。
【請求項１４】
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項１５】
異種アミノ酸配列が、Hisタグ、ユビキチンタグ、NusAタグ、キチン結合ドメイン、Bタグ、HSBタグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質(MBP)、セルロース結合ドメイン(CBD)、アビジン/ストレプトアビジン/Strepタグ、trpE、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、lacZ(βガラクトシダーゼ)、FLAG(商標)ペプチド、Sタグ、T7タグ、該異種ペプチドのいずれかの断片、および該異種ペプチドの2種以上の組み合わせからなる群より選択されるペプチドをコードする、請求項14に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項１６】
異種アミノ酸配列が、免疫原、T細胞エピトープ、B細胞エピトープ、該異種ペプチドのいずれかの断片、および該異種ペプチドの2種以上の組み合わせをコードする、請求項14に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項１７】
野生型ロイコシジン成分とオリゴマー化しない、請求項1〜12または14〜16のいずれか一項に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項１８】
野生型ロイコシジン成分が、LukS-PVサブユニット、LukF-PVサブユニット、LukEサブユニット、LukDサブユニット、γヘモリシンA、γヘモリシンB、γヘモリシンC、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項17に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
【請求項１９】
請求項1〜12または14〜18のいずれか一項に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
異種核酸をさらに含む、請求項19に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
異種核酸が、前記ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合したプロモーターを含む、請求項20に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項19〜21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２３】
プラスミドである、請求項22に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項22または請求項23に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２５】
細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母、または植物細胞である、請求項24に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項25に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項24〜26のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程およびポリペプチドを回収する工程を含む、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドを産生する方法。
【請求項２８】
請求項1〜12もしくは14〜18のいずれか一項に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド、または請求項13に記載のポリペプチド複合体、および担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２９】
アジュバントをさらに含む、請求項28に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
さらなるブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項28または29に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
さらなるブドウ球菌抗原がαヘモリシンサブユニットポリペプチドである、請求項30に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)株に対する宿主免疫応答を誘導するための、請求項28〜31のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
免疫応答が抗体応答である、請求項32に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
免疫応答が、自然応答、体液性応答、抗体応答、T細胞応答、および該免疫応答の2種以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項32に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
免疫応答が、野生型ブドウ球菌ロイコシジン毒素の中和をもたらす、請求項32〜34のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
対象におけるブドウ球菌疾患またはブドウ球菌感染症を予防または処置するための、請求項28〜31のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
感染症が、皮膚、軟部組織、血液、もしくは臓器の限局性感染症もしくは全身感染症であるか、または自己免疫性の性質である、請求項36に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
疾患が呼吸器疾患である、請求項36に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
呼吸器疾患が肺炎である、請求項38に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
感染症が血液の全身感染症である、請求項37に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
対象が脊椎動物である、請求項36〜40のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
脊椎動物が哺乳動物である、請求項41に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
哺乳動物がヒトである、請求項42に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与によって投与される、請求項28〜43のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
以下の工程を含む、黄色ブドウ球菌感染症に対するワクチンを作製する方法:
(a)請求項1〜12もしくは14〜18のいずれか一項に記載の変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチド、または請求項13に記載のポリペプチド複合体を単離する工程;および
(b)変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチドまたはポリペプチド複合体をアジュバントと組み合わせる工程。
【請求項４６】
変異型ロイコシジンサブユニットポリペプチドまたはポリペプチド複合体をさらなるブドウ球菌抗原と組み合わせる工程をさらに含む、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
さらなるブドウ球菌抗原がαヘモリシンサブユニットポリペプチドである、請求項46に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出した配列表への言及
本願と共に出願された、ASCIIテキストファイルで電子的に提出した配列表(Name:2877.008PC01_SequenceListing_ascii.txt;サイズ: 419,519バイト;および作成日:2012年11月26日)の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
開示の分野
本開示は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus (S. aureus))感染症の処置および予防に関する。特に、本開示は、黄色ブドウ球菌感染症を予防するための組成物および方法、ならびにロイコシジン、例えば、パントンバレンタイン(Panton-Valentine)ロイコシジン(PVL)またはγ-ヘモリシンを発現する黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされる疾患を処置するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
黄色ブドウ球菌(SA)は、皮膚感染症および軟部組織感染症、例えば、軽度の皮膚感染症、例えば、面ぽう、膿痂疹、せつ(フルンケル)、蜂巣炎、毛包炎、よう、熱傷様皮膚症候群、および膿瘍から、命にかかわる全身感染症、例えば、命にかかわる深部感染症、例えば、肺炎、敗血症、心内膜炎、髄膜炎、術後創感染症、敗血症、および毒素性ショック症候群に及ぶ広範囲の病態に関連する、またはこれらの原因となるグラム陽性ヒト病原体である(Nizet, V., J Allergy Clin Immunol, 2007. 120(1): p.13-22(非特許文献1); Kotzin, et al., Adv Immunol, 1993. 54: p.99-166(非特許文献2); Meyer et al., Int J Infect Dis, 2001. 5(3): p.163-6(非特許文献3); Schuberth et al., Vet Microbiol, 2001. 82(2): p.187-99(非特許文献4);およびSilverstein et al., Microbiology, Davis et al., eds. (Lippincott, Philadelphia, 1990), pp.485-506(非特許文献5))。
【０００４】
肺炎は黄色ブドウ球菌感染の最も重篤であり、かつよく目につく合併症の1つであり、米国だけで1年に50,000件の症例を引き起こす(Kuehnert, et al., Emerg. Infect. Dis. 11:868-872, 2005(非特許文献6))。従来より、黄色ブドウ球菌肺炎は人工呼吸器と関連付けられてきたが、近年では、主として、他の点では健常な小児および若年者における市中感染性肺炎の大きな原因だとも認識されている。
【０００５】
SAに関連する病態の範囲は、この微生物が、コアグラーゼ、莢膜多糖、アドヘシン、プロテアーゼ、補体系を不活性化するエキソプロテイン、ポア形成毒素、および他の自然応答メディエーターを含む複数の病原因子を用いて自然免疫応答および適応免疫応答から逃れる多様な能力を反映するものである(Nizet, V., J Allergy Clin Immunol, 2007. 120(1): p.13-22(非特許文献1); Tristan et al., J Hosp Infect, 2007. 65 Suppl 2: p.105-9(非特許文献7))。メチシリン耐性SA(MRSA)の急速な蔓延は、MRSA感染症を予防するためのまたはMRSA感染症の重篤度を軽減するためのワクチンを開発することの重要性を強調する。ワクチン開発のための以前の大部分のアプローチでは、SAの免疫回避戦略を無力化するために弱毒化毒素成分を含めることの重要性が、無視されてきた。
【０００６】
感染処置に現在利用可能な抗生物質の大部分に対して耐性を示す黄色ブドウ球菌分離株の著しい増加が、世界中の病院において観察されている。当初、MRSA株は医療の場に限定されていたが、他の点で健常な集団において重篤な疾患を引き起こす最近の市中感染型黄色ブドウ球菌(CA-MRSA)の流行が報告されている。現在に至るまで、これらの大流行と5種のCA-MRSAクローン系統:中西部クローン(USA400、CC1)、欧州クローン(CC80)、南西太平洋クローン(CC30)、太平洋クローン(CC59)、およびパンデミッククローン(USA300、CC8)が関連付けられている。SCCmec IVに加えて、これらの主要なCA-MRSA系統の特徴は、溶原性ファージφSLT、φPVL、φSA2MW、およびφSA2usaによって運ばれる(Diep et al., Lancet, 2006. 367(9512): p.731-9(非特許文献8); Kaneko et al., Gene, 1998. 215(1): p.57-67(非特許文献9); Narita et al., Gene, 2001. 268(1-2): p.195-206(非特許文献10))、パントンバレンタインロイコシジン(PVL)をコードするlukPVオペロンを有することである(Diep, B.A. and M. Otto, Trends Microbiol, 2008. 16(8): p.361-9(非特許文献11))。黄色ブドウ球菌と闘うためにペニシリンが開発されたことは感染管理および処置の大きな進歩であった。残念なことに、ペニシリン耐性生物があっという間に出現し、新たな抗生物質の必要性は極めて高かった。新たな抗生物質が投入されるたびに、黄色ブドウ球菌はβラクタマーゼ、変化したペニシリン結合タンパク質、および変異した細胞膜タンパク質を用いて反撃し続けたため、この細菌は生き残り続けることができた。その結果、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)および多剤耐性生物が出現し、世界中の病院およびナーシングホームに大きな足がかりを得た(Chambers, H. F., Clin Microbiol Rev., 1: 173, 1988(非特許文献12);およびMulligan, M. E., et al., Am J Med., 94:313, 1993(非特許文献13))。今日、院内感染の原因となるブドウ球菌株のほぼ半分は、バンコマイシンおよびリネゾリドを除く全ての抗生物質に対して耐性がある。いくつかのバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌およびMRSAの中にも多くのバンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌(VISA)が文献において報告されているので、バンコマイシンも同様に効き目がなくなるのは時間の問題でしかないように思われる(Appelbaum PC., Clin Microbiol Infect., 12 Suppl 1: 16-23, 2006(非特許文献14))。
【０００７】
黄色ブドウ球菌感染に対する自然免疫は依然として十分には理解されていない。典型的に、健常なヒトおよび動物は黄色ブドウ球菌感染に対して高度の自然耐性を示す。防御は無傷の上皮障壁および粘膜障壁ならびに正常な細胞性応答および体液性応答によるものだと考えられている。重篤な感染後に黄色ブドウ球菌成分に対する抗体の力価は上昇する(Ryding et al., J Med Microbiol, 43(5):328-334, 1995(非特許文献15))。しかしながら、現在に至るまで、これらの後天的な抗体価とヒト免疫との間に相関関係があるという血清学的証拠は無い。
【０００８】
黄色ブドウ球菌によって分泌されるポア形成毒素は、黄色ブドウ球菌が免疫を回避するのに重要である。これらの毒素は、最初の感染段階の間に標的細胞の膜にポアを形成し、細胞死を誘導し、宿主を弱らせることによって、細菌にとって生存上有利な点を作り出す可能性がある。黄色ブドウ球菌感染症に対する処置モダリティーは限られているため、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の出現は極めて大きな公衆衛生上の脅威をもたらしている。この疾患の分子的基礎は依然としてはっきりしていないが、市中感染型MRSA感染は、約34kDaのLukF-PVタンパク質および約32kDaのLukS-PVタンパク質からなる二部構成の毒素であるパントンバレンタインロイコシジン(PVL)の存在と密接な関係がある(H. F. Chambers. The New England Journal of Medicine 352, 1485-1487, 2005(非特許文献16))。2種のPVL成分(LukF-PVおよびLukS-PV)の機能は相乗的であり、標的細胞の膜表面において一連の事象を必要とする(J. Kaneko and Y. Kamio. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68, 981-1003, 2004(非特許文献17))。最初の段階で、分泌された水溶性のLukF-PV単量体およびLukS-PV単量体が膜表面に凝集し、その後、集合してヘテロ二量体を構築する。段階的に、これらのヘテロ二量体はさらにオリゴマー化して、交互に現れるLukF-PVサブユニットおよびLukS-PVサブユニットを特徴とするヘテロ四量体を形成する。さらに、これらのヘテロ四量体は集合して、1:1化学量論で交互に現れるLukS-PVサブユニットおよびLukF-PVサブユニットからなる八量体円盤状構造を構築する(L. Jayasinghe and H. Bayley. Protein Sci 14, 2550-2561, 2005(非特許文献18))。この段階では、PVLは、完全には機能しておらずかつ細胞膜を貫通していないプレコアコンホメーションをとって八量体として存在することが実験データから分かっている。その後に、プレコア構造は、カルシウムイオンを流入させ、細胞死をまねく単一の膜貫通ポアを形成する大きなコンホメーション変化を経る(V. T. Nguyen, Y. Kamio, and H. Higuchi. The EMBO Journal 22, 4968-4979, 2003(非特許文献19))。PVLは、好中球などの免疫細胞を消失させる細胞溶解の原因となり、細菌散在(bacterial dissemination)を促進する組織損傷の原因ともなり得る。PVLは侵襲性肺炎および皮膚感染の発生に関与すると考えられている。
【０００９】
したがって、PVL発現黄色ブドウ球菌に対する免疫を安全に付与することができる組成物および方法が当技術分野において依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nizet, V., J Allergy Clin Immunol, 2007. 120(1): p.13-22
【非特許文献２】Kotzin, et al., Adv Immunol, 1993. 54: p.99-166
【非特許文献３】Meyer et al., Int J Infect Dis, 2001. 5(3): p.163-6
【非特許文献４】Schuberth et al., Vet Microbiol, 2001. 82(2): p.187-99
【非特許文献５】Silverstein et al., Microbiology, Davis et al., eds. (Lippincott, Philadelphia, 1990), pp.485-506
【非特許文献６】Kuehnert, et al., Emerg. Infect. Dis. 11:868-872, 2005
【非特許文献７】Tristan et al., J Hosp Infect, 2007. 65 Suppl 2: p.105-9
【非特許文献８】Diep et al., Lancet, 2006. 367(9512): p.731-9
【非特許文献９】Kaneko et al., Gene, 1998. 215(1): p.57-67
【非特許文献１０】Narita et al., Gene, 2001. 268(1-2): p.195-206
【非特許文献１１】Diep, B.A. and M. Otto, Trends Microbiol, 2008. 16(8): p.361-9
【非特許文献１２】Chambers, H. F., Clin Microbiol Rev., 1: 173, 1988
【非特許文献１３】Mulligan, M. E., et al., Am J Med., 94:313, 1993
【非特許文献１４】Appelbaum PC., Clin Microbiol Infect., 12 Suppl 1: 16-23, 2006
【非特許文献１５】Ryding et al., J Med Microbiol, 43(5):328-334, 1995
【非特許文献１６】H. F. Chambers. The New England Journal of Medicine 352, 1485-1487, 2005
【非特許文献１７】J. Kaneko and Y. Kamio. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 68, 981-1003, 2004
【非特許文献１８】L. Jayasinghe and H. Bayley. Protein Sci 14, 2550-2561, 2005
【非特許文献１９】V. T. Nguyen, Y. Kamio, and H. Higuchi. The EMBO Journal 22, 4968-4979, 2003
【発明の概要】
【００１１】
概要
本開示は、PVL発現黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導する方法、PVL発現黄色ブドウ球菌感染症を予防または処置する方法、ならびにPVL発現黄色ブドウ球菌感染症を予防または処置するための組成物を提供する。ある特定の態様において、本開示は、黄色ブドウ球菌感染症のワクチンとしてLukS-PVおよびLukF-PVの弱毒化変異体を提供する。
【００１２】
一部の態様は、保存残基における1〜5個のアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、前記置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、前記野生型ロイコシジンサブユニットが、アミノ末端からカルボキシ末端へと並んだA-B-Cと称する3つの連続した領域を含み、かつ領域BがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドを含む。
【００１３】
野生型ロイコシジンサブユニットの領域AがSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含み、かつ野生型ロイコシジンサブユニットの領域CがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットも開示される。
【００１４】
SEQ ID NO:2の位置K24におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットも開示される。ある特定の態様において、K24はアラニンで置換されている。
【００１５】
一部の態様は、SEQ ID NO:3の位置S18におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。ある特定の態様において、S18はアラニンで置換されている。
【００１６】
一部の態様は、SEQ ID NO:2の位置Y58におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンを含む。ある特定の態様において、Y58はアラニンで置換されている。
【００１７】
一部の態様は、SEQ ID NO:1の位置T11におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。ある特定の態様において、T11はフェニルアラニンで置換されている。
【００１８】
一部の態様は、SEQ ID NO:2の位置D28におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。ある特定の態様において、D28はアラニンで置換されている。
【００１９】
一部の態様において、野生型ロイコシジンサブユニットはパントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukS-PVである。ある特定の態様において、野生型ロイコシジンサブユニットは、SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:15、およびSEQ ID NO:16からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様において、変異型のLukS-PVサブユニットは、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットはSEQ ID NO:14のアミノ酸を含む。
【００２０】
一部の態様において、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットは、野生型パントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukF-PVサブユニットと複合体化した状態で600kcal/mol〜7500kcal/mol、または900kcal/mol〜3900kcal/mol、または2000kcal/mol〜3650kcal/molの分子エネルギー計算値を含む。
【００２１】
一部の態様は、保存残基における1〜5個のアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、前記置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、前記野生型ロイコシジンサブユニットがSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドを含む。
【００２２】
一部の態様において、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットは、位置K8におけるアミノ酸置換を含む。ある特定の態様において、K8はアラニンで置換されている。
【００２３】
一部の態様において、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットは、位置D28におけるアミノ酸置換を含む。ある特定の態様において、D28はアラニンで置換されている。
【００２４】
一部の態様において、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットは、位置E53におけるアミノ酸置換を含む。ある特定の態様において、E53はアラニンで置換されている。
【００２５】
一部の態様において、野生型ロイコシジンサブユニットはパントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukF-PVである。ある特定の態様において、野生型ロイコシジンサブユニットは、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、およびSEQ ID NO:27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様において、変異型のLukF-PVサブユニットは、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、およびSEQ ID NO:20からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。1つの態様において、変異型のLukF-PVサブユニットはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
一部の態様において、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットは、野生型パントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukS-PVと複合体化した状態で900kcal/mol〜1500kcal/molの分子エネルギー計算値を含む。
【００２７】
一部の態様は、好中球毒性アッセイにおいて、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比較して毒性が低い本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。
【００２８】
一部の態様は、野生型ロイコシジン成分とオリゴマー化しない、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。ある特定の態様において、野生型ロイコシジン成分は、LukS-PVサブユニット、LukF-PVサブユニット、γヘモリシンA、γヘモリシンB、γヘモリシンC、LukEおよびLukDサブユニット、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００２９】
本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含むポリペプチド複合体も開示される。
【００３０】
本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドも開示される。一部の態様において、前記ポリヌクレオチドは異種核酸をさらに含む。一部の態様において、異種核酸は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合したプロモーターを含む。
【００３１】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたは前記ベクターを含む宿主細胞も開示される。一部の態様において、ベクターはプラスミドである。一部の態様において、宿主細胞は、細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母、または植物細胞である。ある特定の態様において、細菌は大腸菌(Escherichia coli)である。
【００３２】
本明細書に記載の宿主細胞を培養する工程およびポリペプチドを回収する工程を含む、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドを産生する方法も開示される。
【００３３】
さらに、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットまたはポリペプチド複合体および担体を含む組成物が開示される。前記組成物はアジュバントをさらに含んでもよい。さらに、さらなるブドウ球菌抗原を含む組成物が開示される。ある特定の態様において、さらなるブドウ球菌抗原はαヘモリシンサブユニットポリペプチドである。
【００３４】
黄色ブドウ球菌株に対する宿主免疫応答を誘導する方法であって、前記免疫応答を必要とする対象に、本明細書に記載の組成物の有効量を投与する工程を含む方法も開示される。ある特定の態様において、免疫応答は抗体応答である。一部の態様において、免疫応答は、自然応答、体液性応答、抗体応答、T細胞応答、および前記免疫応答の2種以上の組み合わせからなる群より選択される。
【００３５】
対象におけるブドウ球菌疾患またはブドウ球菌感染症を予防または処置する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の組成物を投与する工程を含む方法も開示される。感染症は、皮膚、軟部組織、血液、もしくは臓器の限局性感染症もしくは全身感染症であり得るか、または自己免疫性の性質であり、かつ疾患は、肺炎などの呼吸器疾患であり得る。対象は動物、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトでもよい。本明細書に記載の組成物は、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与によって投与することができる。
【００３６】
黄色ブドウ球菌感染症に対するワクチンを作製する方法であって、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットまたはポリペプチド複合体を単離する工程、および変異型ロイコシジンサブユニットまたはポリペプチド複合体をアジュバントと組み合わせる工程を含む方法も含まれる。ある特定の態様において、前記方法は、変異型ロイコシジンサブユニットまたはポリペプチド複合体をさらなるブドウ球菌抗原と組み合わせる工程をさらに含むことを開示する。
[本発明1001]
保存残基における1〜5個のアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、該置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、該野生型ロイコシジンサブユニットが、アミノ末端からカルボキシ末端へと並んだA-B-Cと称する3つの連続した領域を含み、かつ領域BがSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
[本発明1002]
野生型ロイコシジンサブユニットの領域AがSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む、本発明1001の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1003]
野生型ロイコシジンサブユニットの領域CがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、本発明1001の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1004]
SEQ ID NO:2の位置K24におけるアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1003のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1005]
K24がアラニンで置換されている、本発明1004の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1006]
SEQ ID NO:3の位置S18におけるアミノ酸置換を含む、本発明1003〜1005のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1007]
S18がアラニンで置換されている、本発明1006の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1008]
SEQ ID NO:2の位置Y58におけるアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1007のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1009]
Y58がアラニンで置換されている、本発明1008の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1010]
SEQ ID NO:1の位置T11におけるアミノ酸置換を含む、本発明1002〜1009のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1011]
T11がフェニルアラニンで置換されている、本発明1010の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1012]
SEQ ID NO:3の位置T11におけるアミノ酸置換をさらに含む、本発明1006または本発明1007の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1013]
T11がフェニルアラニンで置換されている、本発明1012の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1014]
SEQ ID NO:2の位置D28におけるアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1013のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1015]
D28がアラニンで置換されている、本発明1014の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1016]
野生型ロイコシジンサブユニットがパントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukS-PVである、本発明1001〜1015のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1017]
野生型ロイコシジンサブユニットが、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、およびSEQ ID NO:16からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1018の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1018]
変異型のLukS-PVサブユニットが、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1016または本発明1017の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1019]
SEQ ID NO:14のアミノ酸を含む、本発明1018の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1020]
保存残基における1〜5個のアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、該置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、該野生型ロイコシジンサブユニットがSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチド。
[本発明1021]
位置K8におけるアミノ酸置換を含む、本発明1020の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1022]
K8がアラニンで置換されている、本発明1021の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1023]
位置D28におけるアミノ酸置換を含む、本発明1020〜1022のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1024]
D28がアラニンで置換されている、本発明1023の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1025]
位置E53におけるアミノ酸置換を含む、本発明1020〜1024のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1026]
E53がアラニンで置換されている、本発明1025の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1027]
野生型ロイコシジンサブユニットがパントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukF-PVである、本発明1020〜1026のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1028]
野生型ロイコシジンサブユニットが、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、およびSEQ ID NO:27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1027の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1029]
変異型のLukF-PVサブユニットが、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、およびSEQ ID NO:136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1027または本発明1028の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1030]
SEQ ID NO:18のアミノ酸を含む、本発明1029の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1031]
好中球毒性アッセイにおいて、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比較して毒性が低い、本発明1016〜1019または1027〜1030のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1032]
野生型パントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukF-PVサブユニットと複合体化した状態で600kcal/mol〜7500kcal/molの分子エネルギー計算値を含む、本発明1016〜1019のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1033]
野生型パントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukF-PVと複合体化した状態で900kcal/mol〜3900kcal/molの分子エネルギー計算値を含む、本発明1032の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1034]
野生型パントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukF-PVと複合体化した状態で2000kcal/mol〜3650kcal/molの分子エネルギー計算値を含む、本発明1033の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1035]
野生型パントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukS-PVと複合体化した状態で900kcal/mol〜1500kcal/molの分子エネルギー計算値を含む、本発明1027〜1030のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1036]
本発明1016〜1019のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニットもしくは本発明1027〜1030のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット、またはそれらの組み合わせ、およびさらなるブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体。
[本発明1037]
異種アミノ酸配列をさらに含む、本発明1001〜1035のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1038]
異種アミノ酸配列が、Hisタグ、ユビキチンタグ、NusAタグ、キチン結合ドメイン、Bタグ、HSBタグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質(MBP)、セルロース結合ドメイン(CBD)、アビジン/ストレプトアビジン/Strepタグ、trpE、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、lacZ(βガラクトシダーゼ)、FLAG(商標)ペプチド、Sタグ、T7タグ、該異種ペプチドのいずれかの断片、および該異種ペプチドの2種以上の組み合わせからなる群より選択されるペプチドをコードする、本発明1037の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1039]
異種アミノ酸配列が、免疫原、T細胞エピトープ、B細胞エピトープ、該異種ペプチドのいずれかの断片、および該異種ペプチドの2種以上の組み合わせをコードする、本発明1037の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1040]
野生型ロイコシジン成分とオリゴマー化しない、本発明1001〜1035または1037〜1039のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1041]
野生型ロイコシジン成分が、LukS-PVサブユニット、LukF-PVサブユニット、LukEサブユニット、LukDサブユニット、γヘモリシンA、γヘモリシンB、γヘモリシンC、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1040の変異型ロイコシジンサブユニット。
[本発明1042]
本発明1001〜1035または1037〜1041のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニットをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1043]
異種核酸をさらに含む、本発明1042のポリヌクレオチド。
[本発明1044]
異種核酸が、前記ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合したプロモーターを含む、本発明1043のポリヌクレオチド。
[本発明1045]
本発明1042〜1044のいずれかのポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1046]
プラスミドである、本発明1045のベクター。
[本発明1047]
本発明1045または本発明1046のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1048]
細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母、または植物細胞である、本発明1047の宿主細胞。
[本発明1049]
細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、本発明1048の宿主細胞。
[本発明1050]
本発明1047〜1049のいずれかの宿主細胞を培養する工程およびポリペプチドを回収する工程を含む、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドを産生する方法。
[本発明1051]
本発明1001〜1035のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット、本発明1037〜1041のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット、または本発明1036のポリペプチド複合体、および担体を含む、組成物。
[本発明1052]
アジュバントをさらに含む、本発明1051の組成物。
[本発明1053]
さらなるブドウ球菌抗原をさらに含む、本発明1051または1052の組成物。
[本発明1054]
さらなるブドウ球菌抗原がαヘモリシンサブユニットポリペプチドである、本発明1053の組成物。
[本発明1055]
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)株に対する宿主免疫応答を誘導する方法であって、該免疫応答を必要とする対象に、本発明1051〜1054のいずれかの組成物の有効量を投与する工程を含む方法。
[本発明1056]
免疫応答が抗体応答である、本発明1055の方法。
[本発明1057]
免疫応答が、自然応答、体液性応答、抗体応答、T細胞応答、および該免疫応答の2種以上の組み合わせからなる群より選択される、本発明1056の方法。
[本発明1058]
免疫応答が、野生型ブドウ球菌ロイコシジン毒素の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも80％の中和をもたらす、本発明1055〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
対象におけるブドウ球菌疾患またはブドウ球菌感染症を予防または処置する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1051〜1054のいずれかの組成物を投与する工程を含む方法。
[本発明1060]
対象におけるブドウ球菌疾患またはブドウ球菌感染症を予防または処置する方法であって、それを必要とする対象に、抗ロイコシジンサブユニット抗体および抗αヘモリシンサブユニットサブユニット抗体を含む組成物を投与する工程を含む方法。
[本発明1061]
感染症が、皮膚、軟部組織、血液、もしくは臓器の限局性感染症もしくは全身感染症であるか、または自己免疫性の性質である、本発明1059または1060の方法。
[本発明1062]
疾患が呼吸器疾患である、本発明1061の方法。
[本発明1063]
呼吸器疾患が肺炎である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
感染症が血液の全身感染症である、本発明1063の方法。
[本発明1065]
対象が脊椎動物である、本発明1058〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
脊椎動物が哺乳動物である、本発明1065の方法。
[本発明1067]
哺乳動物がヒトである、本発明1066の方法。
[本発明1068]
組成物が、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与によって投与される、本発明1055〜1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
以下の工程を含む、黄色ブドウ球菌感染症に対するワクチンを作製する方法:
(a)本発明1001〜1035のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット、本発明1037〜1041のいずれかの変異型ロイコシジンサブユニット、または本発明1036のポリペプチド複合体を単離する工程;および
(b)変異型ロイコシジンサブユニットまたはポリペプチド複合体をアジュバントと組み合わせる工程。
[本発明1070]
変異型ロイコシジンサブユニットまたはポリペプチド複合体をさらなるブドウ球菌抗原と組み合わせる工程をさらに含む、本発明1069の方法。
[本発明1071]
さらなるブドウ球菌抗原がαヘモリシンサブユニットポリペプチドである、本発明1070の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】LukS-PVのThr28とLukF-PVのAsn158およびPhe159との間の境界面相互作用。
【図２】LukS-PVのSer209とLukF-PVのLys102との間の境界面相互作用。
【図３】3000ng/mlもしくは300ng/mlのLukS-PV変異体(K97A、D101A、S209A、T28F、T28F/Y131A、T28F/S209A、もしくはT28F/K97A/S209A)または野生型LukS-PVと同濃度の野生型LukF-PVとの存在下でのHL-60由来好中球の生存率(％)。細胞のみのバーは毒素が添加されていない対照を示す。データは3〜5回の実験の平均として示す。標準偏差はエラーバーとして示す。
【図４】3000ng/mlもしくは300ng/mlのLukF-PV変異体(K102A、D121A、もしくはE147A)または野生型LukF-PVと同濃度の野生型LukS-PVもしくは図3において定義されたLukS-PV三重変異体との存在下でのHL-60由来好中球の生存率(％)。細胞のみのバーは毒素が添加されていない対照を示す。
【図５】ロイコシジンアミノ酸配列のSサブユニットのアラインメント。
【図６】抗LukS-PVまたは対照(ウサギ全IgG)で処理されたPVL陽性(USA300&400)SA株およびPVL陰性(Newman, 8325-4)SA株の上清中での多形核好中球(PMN)の生存率(％)。PVL:精製PVL; BHI:培地対照; および細胞のみ:毒素が添加されていない対照。
【図７】変異型PVLサブユニットの(A)SDS-PAGEおよび(B)ウエスタンブロット分析。M:MWマーカー; レーン1:LukS-PV Mut9; レーン2:LukF-PV Mut1。(C)LukF-PV三重変異体(K102A/D121A/E147A)のSDS-PAGE(レーン1)およびウエスタンブロット(レーン2)分析; M:MWマーカー。
【図８】(A)漸増濃度の野生型LukSまたは変異型LukSと野生型LukFとの組み合わせにより処理されたHL-60由来好中球の生存率(％)。結果は5回の独立した実験からのものである。野生型および三重変異体のみSTDVを示した。(B)漸増濃度の野生型LukFまたは変異型LukFと野生型LukSまたはLukS三重変異体(Mut9)との組み合わせにより処理されたHL-60由来好中球の生存率(％)。(C)漸増濃度の野生型LukFまたは三重変異型LukFまたはLukF変異体1と野生型LukSまたはLukS三重変異体(Mut9)との組み合わせを用いたHL-60の生存率(％)。
【図９】Sypro Orange色素を用いてthermofluorアッセイによってモニタリングされた時のLukS-PVタンパク質およびLukF-PVタンパク質の熱アンフォールディング(thermal unfolding)。(A)温度に対するPVLタンパク質(野生型LukS-PV、LukS-PV Mut8、LukS-PV Mut9、野生型LukF-PV、およびLukF-PV Mut1)の588nmでの蛍光強度のプロット。データを5℃ごとに収集した。(B)PVLタンパク質(野生型LukS-PV、LukS-PV Mut8、LukS-PV Mut9、野生型LukF-PV、およびLukF-PV Mut1)の熱アンフォールディング曲線から計算したアンフォールディング率(fraction unfolded)のプロット。
【図１０】様々なアジュバントを用いた、マウスにおけるLukS-Mut9、野生型LukS-PV、および対照(STEBVax)の免疫原性。使用用量:抗原:10ug; Al(OH)3:34ug、AlPO4:70ug、IDC-1001:20ug、およびCpG:10ug/マウス。(A)ELISAによって求めた個々のマウス血清の全抗体価(EC50;すなわち、野生型LukS-PVでコーティングしたELISAプレート上で最大シグナルの50％になる血清の希釈度)。(B)HL-60毒素中和アッセイにおいて野生型LukS-PV毒素およびLukF-PV毒素を用いて求めた中和。ワクチン接種マウスに由来する1:100希釈度の血清における野生型毒素の中和率(％)を示した(各群の5匹のマウスから血清をプールした)。
【図１１】2mgのナイーブIgG(N)、2mgのAT62-IgG(AT)、または2mgのAT62-IgGおよび0.25mgのLukS-PV IgG(AT+S)の組み合わせを用いてマウスを処置した後の血液ならびに臓器(肝臓、脾臓、肺、および腎臓)における細菌CFU。
【図１２】Luk(LukS Mut9、LukF Mut1、およびLukS Mut9+LukF Mut1)、ならびにHla(AT-62aa)ワクチン候補、ならびにLukS Mut9+LukF Mut1+AT-62aaの組み合わせ、ならびにBSA対照を用いた(A)菌血症/敗血症および(B)肺炎に対する防御を示した生存曲線。図示した時点の後に、さらなる死亡は観察されなかった。
【図１３】(A)相同抗原に対するLukS-PV変異体-9マウス血清の特異性、(B)LukS-PV変異体-9マウス血清とHlgB抗原との交差反応性、(C)LukS-PV変異体-9マウス血清とHlgC抗原との交差反応性。(D)ヒト好中球細胞株HL-60に基づくインビトロXTT細胞傷害性アッセイにおける200ng/mlのPVLおよびまたはγ-ヘモリシン毒素に対するLukS-PV変異体-9マウス血清の中和効力。
【図１４】(A)MPDベースのオリゴマー化アッセイ。レーン1:分子量マーカー; レーン2:LukS wt+LukF wt; レーン3:LukS wt+Lukf mut1; レーン4:LukS wt+γB; レーン5:LukF wt+LukS mut9; レーン6:LukS mut9+LukF mut1; レーン7:LukS mut9+γB。(B)抗LukS特異的ポリクローナル抗体によるオリゴマーバンドの阻害。レーン1:マーカー; レーン2〜8:LukS+LukF+2分の1漸減濃度(5.5mg/ml〜0.85mg/ml)の抗LukS pAb; レーン9:pAbの無いLukS+LukF; レーン10:MPDの無いLukS+LukF+pAb; レーン11:pAb+MPDのみ。(C)抗LukS特異的ポリクローナル抗体による、LukS-PV+hlgBによって形成されるオリゴマーバンドの阻害。レーン1:マーカー; レーン2〜8:LukS-PV+hlgB(各940ng)+2分の1漸減濃度(34.5ug/ml〜0.5mg/ml)の抗LukS pAb; レーン9:pAbの無いLukS-PV+hlgB; レーン10:MPDの無いLukS-PV+hlgB+pAb; レーン11〜14ナイーブウサギpAb(34.5ug/ml〜4.3mg/ml)+LukS-PV+hlgB(各940ng); およびレーン15:ナイーブウサギpAb+MPDのみ。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチド、例えば、変異型LukS-PVサブユニットポリペプチドもしくは変異型LukF-PVサブユニットポリペプチド、本明細書において開示される1種もしくは複数種の変異型ロイコシジンサブユニットを含む組成物、およびブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘発する方法または本明細書において開示される変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドの有効量を対象に投与する工程を含む、対象におけるブドウ球菌感染症を処置もしくは予防する方法が、本明細書において開示される。
【００３９】
「1つの(a)」または「1つの(an)」実体という用語は、この実体の1つまたは複数を指すことに留意すべきである。例えば、「ポリヌクレオチド」は1つまたは複数のポリヌクレオチドを表すと理解される。したがって、「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つ」のという用語は本明細書において同義に使用することができる。
【００４０】
「核酸」または「核酸断片」という用語は、ポリヌクレオチドまたは構築物に存在する、いずれか1種または複数種の核酸セグメント、例えば、DNA断片またはRNA断片を指す。本開示の2種以上の核酸が単一のポリヌクレオチド構築物、例えば、単一のプラスミドに存在してもよく、別々の(非同一の)ポリヌクレオチド構築物、例えば、別々のプラスミドに存在してもよい。さらに、任意の核酸または核酸断片が単一のポリペプチド、例えば、単一の抗原、サイトカイン、または調節ポリペプチドをコードしてもよく、複数種のポリペプチドをコードしてもよい。例えば、核酸が2種以上のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、核酸が調節エレメント、例えば、プロモーターまたは転写ターミネーターをコードしてもよく、ポリペプチドまたはタンパク質の特殊なエレメントまたはモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチドまたは機能ドメインをコードしてもよい。
【００４１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸または核酸断片ならびに複数の核酸または核酸断片を包含することが意図され、ポリヌクレオチドを含む、単離された分子または構築物、例えば、ウイルスゲノム(例えば、非感染性ウイルスゲノム)、メッセンジャーRNA(mRNA)、プラスミドDNA(pDNA)、またはpDNA誘導体(例えば、(Darquet, A-M et al., Gene Therapy 4: 1341-1349, 1997)に記載のミニサークル)を指す。ポリヌクレオチドは、直鎖型(例えば、mRNA)、環状型(例えば、プラスミド)、または分岐型、ならびに二本鎖型または一本鎖型で提供されてもよい。ポリヌクレオチドは従来型のホスホジエステル結合を含んでもよく、非従来型の結合(例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるアミド結合)を含んでもよい。
【００４２】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、2つ以上のアミノ酸からなる任意の鎖を含む。したがって、本明細書で使用する「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、「アミノ酸配列」、または2つ以上のアミノ酸からなる鎖をいうために用いられる他の任意の用語は、(この用語がそれぞれ、さらに具体的な意味を有する場合があっても)「ポリペプチド」の定義に含まれる。「ポリペプチド」という用語は、これらの任意の用語の代わりに、またはこれらの任意の用語と同義に使用することができる。これらの用語は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾を受けたポリペプチドをさらに含む。
【００４３】
本明細書で使用する「ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット」、「LukS-PVポリペプチド」、および「LukF-PVポリペプチド」という用語は、成熟したもしくは完全長のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PV)、ならびに成熟したもしくは完全長のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVおよびLukF-PV)の断片、変種、もしくは誘導体、ならびに成熟したもしくは完全長のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVおよびLukF-PV)または成熟したもしくは完全長のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVおよびLukF-PV)の1つもしくは複数の断片を含むキメラおよび融合ポリペプチドを包含する。ある特定の態様において、本明細書において開示されるブドウ球菌ロイコシジンサブユニットは、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比較して毒性が低い変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットである。「対応する野生型ロイコシジンサブユニット」とは、変異型ロイコシジンサブユニットが得られた天然ロイコシジンサブユニットを意味する。
【００４４】
ポア形成毒素、例えば、一成分αヘモリシンならびに二成分ヘモリシンおよびロイコトキシンはブドウ球菌免疫回避において重要な役割を果たす。これらの毒素は重要な免疫細胞を死滅させ、組織破壊を引き起こし、それによって、多くの場合、最初の感染段階の間に宿主を弱らせ、細菌散在および転移性増殖を促進する。2種のPVL成分であるLukS-PVおよびLukF-PVは別々に分泌され、LukS-PVがその受容体に結合し、その後にLukF-PVがLukS-PVに結合するとポア形成八量体複合体を形成する(Miles et al., Protein Sci, 2002. 11(4): p.894-902; Pedelacq et al, Int J Med Microbiol, 2000. 290(4-5): p.395-401)。PVL標的には、例えば、多形核好中球(PMN)、単球、およびマクロファージが含まれる。
【００４５】
黄色ブドウ球菌には他の二成分毒素:γ-ヘモリシンの場合、S成分HlgAおよびHlgCならびにF成分HlgB;lukE(S)およびlukD(F);ならびにlukM(S)およびlukF-PV-like(F)が特徴付けられている。これらはよく似ているため、これらのS成分はF成分と結合して、標的特異性の異なる活性毒素を形成することができる(Ferreras et al., Biochim Biophys Acta, 1998. 1414(1-2): p.108-26; Prevost et al., Infect Immun, 1995. 63(10): p.4121-9)。γ-ヘモリシンは溶血性が強く、PVLより白血球毒性(leukotoxic)が90％低いのに対して、PVLは非溶血性である。しかしながら、lukF-PVと対になったHlgAまたはHlgCは白血球毒性活性を促進する(Prevost et al., Infect Immun, 1995. 63(10): p.4121-9)。LukおよびPVLは好中球を溶解し、Hlgは溶血性であり(Kaneko et al., Biosci Biotechnol Biochem, 2004. 68(5): p.981-1003)、好中球を溶解することも報告された(Malachowa et al., PLoS One, 2011.6(4): p.el8617)。PVLサブユニットはファージ由来であるが(F&Sロイコシジン)、Hlgタンパク質はHlg遺伝子座(hlg)に由来し、臨床分離株の99％に見出される(Kaleko et al.)。黄色ブドウ球菌が血中で増殖している間にHlgサブユニットは強力にアップレギュレートされる(Malachowa et al.)。Hlgは血中での黄色ブドウ球菌の生存に関与することが示された(Malachowa et al., Virulence, 2011. 2(6))。変異体USA300Δ-hlgABCがマウス菌血症モデルにおいて死亡を引き起こす能力は低い(Malachowa et al., PLoS One, 2011.6(4): p.e18617)。AlonzoらはLukED毒素がマウスにおける血流感染に重要なことを示している(Alonzo et al., Mol Microbiol, 2012. 83(2): p.423-35)。PVLと協力してヒトPMN溶解を増強する別の新規の黄色ブドウ球菌ロイコトキシンLukGHも述べられている(Ventura et al., PLoS One, 2010. 5(7): p.e11634)。
【００４６】
「断片」、「類似体」、「誘導体」、または「変種」という用語は本開示のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVまたはLukF-PV)について言及している時、供給源タンパク質の免疫原性または抗原性の少なくとも一部を保持している任意のポリペプチドを含む。本明細書に記載のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVまたはLukF-PV)の断片には、タンパク質分解断片、欠失断片、特に、発現、精製、または動物への投与の間に高溶解性を示すブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVまたはLukF-PV)の断片が含まれる。本明細書に記載のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVまたはLukF-PV)の断片は、対象に送達された時に低い病原性または毒性を示すタンパク質分解断片または欠失断片をさらに含む。ポリペプチド断片は、直鎖エピトープならびに三次元エピトープを含む供給源ポリペプチドの抗原性エピトープまたは免疫原性エピトープを含む任意のポリペプチド部分をさらに含む。
【００４７】
ポリペプチド抗原の「エピトープ断片」は、エピトープを含有する抗原部分である。「エピトープ断片」は1つまたは複数のエピトープの他にアミノ酸配列を含有してもよいが、1つまたは複数のエピトープの他にアミノ酸配列を含有する必要はない。
【００４８】
本明細書で使用する「変種」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および/または改変により、列挙されたポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。非天然変種は、当技術分野において公知の変異誘発法を用いて産生することができる。一部の態様において、変種ポリペプチドは特定された配列と3個のアミノ酸またはそれより少ないアミノ酸の置換、欠失、または付加だけ異なる。このような変種は、一般的に、ポリペプチド配列を改変し、例えば、本明細書に記載の代表的な手順を用いて、改変されたポリペプチドの抗原性または病原性を評価することによって特定することができる。一部の態様において、野生型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)の変種は、野生型複合体よりも毒性が低いタンパク質複合体を形成する。
【００４９】
本明細書において開示されるポリペプチド変種は、特定されたポリペプチドと少なくとも約85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または99.9％の配列同一性を示す。変種ポリペプチドは保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含んでもよい。変種は、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、またはそれより多いアミノ酸置換を除いて野生型ロイコシジンサブユニットと同一のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を含んでもよい。ここで、置換は、変種ロイコシジンサブユニットを含むロイコシジン複合体の毒性を、対応する野生型タンパク質複合体より低くする。本明細書に記載のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVおよびLukF-PV)の誘導体は、天然ポリペプチドに見られない、さらなる特徴を示すように変えられているポリペプチドである。例には融合タンパク質が含まれる。類似体は、別の型の本明細書に記載のブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVおよびLukF-PV)である。一例は、プロタンパク質の切断によって活性化されて、活性のある成熟ポリペプチドをもたらすことができるプロタンパク質である。
【００５０】
変種はまた、もしくは代わりに他の改変を含有してもよい。例えば、この改変によって、ポリペプチドを、異種アミノ酸配列に、例えば、翻訳と同時に、または翻訳後にタンパク質移行を誘導する、タンパク質のN末端にあるシグナル(またはリーダー)配列に、コンジュゲートまたは結合、例えば融合することができる。また、ポリペプチドを、ポリペプチドの合成、精製、もしくは特定を容易にするために(例えば、6-His)、またはポリペプチドと固体支持体との結合を強化するためにリンカーもしくは他の配列にコンジュゲートすることができる、またはリンカーもしくは他の配列と結合した状態で産生することができる。例えば、ポリペプチドを免疫グロブリンFc領域にコンジュゲートまたは結合することができる。また、ポリペプチドを、ポリペプチドに対する免疫応答を付与または調節する配列(例えば、T細胞エピトープ、B細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカインなど)ならびに/または抗原提示細胞もしくは他の免疫系細胞によるポリペプチドの取り込みおよび/もしくは処理を強化する配列にコンジュゲートまたは結合することができる。また、ポリペプチドを、ブドウ球菌属(Staphylococcus)の種ならびに/または他の細菌および/もしくは他のウイルスに由来する他のポリペプチド/エピトープにコンジュゲートまたは結合して、単独で、または様々なアジュバントと組み合わせて他の病原性生物に対する防御免疫を誘発することができるハイブリッド免疫原性タンパク質を生成することができる。また、ポリペプチドは、アルブミン、免疫グロブリンFc領域、ポリエチレングリコール(PEG)などがあるが、これに限定されない、さらに大きな安定性を付与する、または半減期を改善する部分にコンジュゲートまたは結合することができる。また、ポリペプチドを、ブドウ球菌属の種ならびに/または他の細菌および/もしくは他のウイルスに由来する部分(例えば、免疫原性炭水化物、例えば、莢膜多糖または表面多糖)にコンジュゲートまたは結合して、単独で、または1種もしくは複数種のアジュバントと組み合わせて防御免疫を強化する、および/または防御免疫の作用を助けることができる改変された免疫原性タンパク質を生成することができる。ある特定の態様において、本明細書に記載のポリペプチドは免疫原性炭水化物をさらに含む。1つの態様において、免疫原性炭水化物は糖である。
【００５１】
本明細書全体を通して「糖」という用語は多糖またはオリゴ糖を示してもよく、その両方を含む。本発明の多糖は細菌から単離されてもよく、公知の方法によってサイズ変更されてもよい。例えば、完全長多糖は「サイズ変更」されてもよい(例えば、完全長多糖のサイズは、例えば、酸加水分解処理、過酸化水素処理、EMULSIFLEX(登録商標)によるサイズ変更の後に過酸化水素処理を行ってオリゴ糖断片または顕微溶液化をもたらすなどの様々な方法によって小さくされてもよい)。多糖試料中での粘度を小さくするために、および/またはコンジュゲートされた生成物の濾過性を改善するために多糖をサイズ変更することができる。オリゴ糖は少数の反復単位(例えば、5〜30反復単位)を有し、典型的には、加水分解多糖である。本発明の多糖は組換えにより産生されてもよい。
【００５２】
黄色ブドウ球菌莢膜抗原は表面に結合し、抗原特異性が限定され、臨床分離株の間で高度に保存されている。1つの態様において、本発明の免疫原性炭水化物は黄色ブドウ球菌の莢膜多糖(CP)である。1つの態様において、莢膜糖は完全長多糖でもよい。しかしながら、他の態様において、莢膜糖は1つのオリゴ糖単位でもよく、反復オリゴ糖単位からなる天然の長さより短い糖鎖でもよい。ブドウ球菌分離株の血清型検査から、いくつかの推定莢膜血清型が明らかになっている。臨床感染からの分離株の中で5型および8型(CP5およびCP8)が最も蔓延しており、それぞれ、ヒトから回収される分離株の約25％および50％を占めている(O'Riordan and Lee, Clinical Microbiology Reviews, January 2004, p.218-234, Vol.17, No.1; Poutrel and Sutra, J Clin Microbiol. 1993 Feb;31(2):467-9)。同じ分離株が家禽類、雌ウシ、ウマ、およびブタからも回収された(Tollersrud et al., J Clin Microbiol. 2000 Aug;38(8):2998-3003; Cunnion KM et al., Infect Immun. 2001 Nov;69(11):6796-803)。WuおよびPark(Wu and Park. 1971. J. Bacteriol. 108:874-884)によって以前に述べられたように、プロトタイプReynolds株から精製された5型莢膜多糖およびプロトタイプBecker株から精製された8型莢膜多糖は互いに、およびT株によって作られた莢膜と構造がよく似ている。5型は構造(→4)-3-0-Ac-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→) nを有し(Fournter, J. M., et al., 1987. Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 138:561-567; Moreau, M., et al., 1990. Carbohydr. Res. 201:285-297)、8型は構造(→3)-4-0-Ac-β-D-ManNAcA-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→) nを有する(Founder, J. M., et al., 1984. Infect, Immun. 45:87-93)。5型および8型多糖の違いは糖間の結合およびマンノサミヌロン酸残基のO-アセチル化部位の点しかないが、これらは血清学的に別個のものである。
【００５３】
解毒した組換え緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)エキソトキシンA担体とコンジュゲートした5型CPおよび8型CPはマウスモデルにおいて免疫原性および防御性が高いことが示された(A Fattom et al., Infect Immun. 1993 March; 61(3): 1023-1032; A Fattom et al., Infect Immun. 1996 May; 64(5): 1659-1665)。免疫動物からのCP5特異的抗体の受動伝達はマウスにおいて全身感染に対する防御を誘導し(Lee et al., Infect Immun. 1997 October; 65(10): 4146-4151)、血清型 5黄色ブドウ球菌に曝露したラットにおいて心内膜炎に対する防御を誘導した(Shinefield H et al., N Engl J Med. 2002 Feb 14;346(7):491-6)。マウスにおいて黄色ブドウ球菌曝露に対して75％の防御を提供する二価CP5・CP8コンジュゲートワクチン(StaphVAX(登録商標), Nabi Biopharmaceutical)が開発された。このワクチンはヒトにおいて試験された(Fattom AI et al., Vaccine. 2004 Feb 17;22(7):880-7; Maira-Litran T et al., Infect Immun. 2005 Oct;73(10):6752-62)。ある特定の態様において、 本発明のオリゴペプチドは免疫原性炭水化物(例えば、CP5、CP8、CP断片、またはそれらの組み合わせ)と共に、またはコンジュゲートした状態で組み合わされる。
【００５４】
ポリ-N-アセチルグルコサミン(PNAG)(McKenney D. et al., Science. 1999 May 28;284(5419): 1523-7)またはポリ-N-スクシニルグルコサミン(PNSG)(Tuchscherr LP. et al., Infect Immun. 2008 Dec;76(12):5738-44. Epub 2008 Sep 22)は両方とも黄色ブドウ球菌表面炭水化物であり、これらによる免疫化は、実験動物モデルにおける黄色ブドウ球菌曝露に対して少なくとも部分的な防御をもたらすことが示されている。PNSGは、生体材料へのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CoNS)の付着を媒介するS.エピデルミデス(S.epidermidis)莢膜多糖/アドヘシン(PS/A)の化学型として特定され、PS/Aを発現するCoNS株の莢膜として役立ち、防御抗体の標的である。PNSGも黄色ブドウ球菌によって作られ、環境により調節され、インビボで発現する表面多糖であり、同様に防御免疫の標的として役立つ(McKenney D. et al., J. Biotechnol. 2000 Sept 29;83(1-2): 37-44)。本発明のある特定の態様において、免疫原性炭水化物は、表面多糖、例えば、ポリ-N-アセチルグルコサミン(PNAG)、ポリ-N-スクシニルグルコサミン(PNSG)、表面多糖断片、またはそれらの組み合わせである。
【００５５】
壁テイコ酸(WTA)は、黄色ブドウ球菌株上に広範囲に発現している、よく目につく多糖である(Neuhaus, F.C. and J. Baddiley, Microbiol Mol Biol Rev, 2003. 67(4):686-723)。WTAに対する抗血清は単独で、および補体の存在下でオプソニン作用性死滅を誘導することが示されている((Thakker, M., et al., Infect Immun, 1998. 66(11): 183-9)およびFattom et al., 米国特許第7,754,225号)。WTAはペプチドグリカンと連結し、細胞壁から突き出て、無莢膜(non-encapsulated)株、例えば、米国における市中感染性MRSA(CA MRSA)の大部分の症例の原因であるUSA300に目立つように露出している(Hidron, A.I., et al., Lancet Infect Dis, 2009. 9(6):384-92)。
【００５６】
リポテイコ酸(LTA)はグラム陽性細菌、例えば、黄色ブドウ球菌の細胞壁の構成要素である。LTAは、非特異的に膜リン脂質を介して標的細胞に、または特異的にCD14およびToll様受容体に結合し得る。標的に結合したLTAは循環抗体と相互作用し、補体カスケードを活性化して受動免疫死滅現象を誘導することができる。標的に結合したLTAはまた、好中球およびマクロファージからの活性酸素種および活性窒素種、酸加水分解酵素、高カチオン性プロテイナーゼ、殺菌性カチオン性ペプチド、増殖因子、ならびに細胞傷害性サイトカインの放出も誘発する。これらは相乗作用して細胞損傷を増幅し得る。
【００５７】
ある特定の態様において、表面多糖は本開示のポリペプチドと組み合わされる、またはコンジュゲートされる。ある特定の態様において、表面多糖は、例えば、ポリ-N-アセチルグルコサミン(PNAG)、ポリ-N-スクシニルグルコサミン(PNSG)、壁テイコ酸(WTA)、リポテイコ酸(LPA)、前記表面多糖のいずれかの断片、または前記表面多糖の2種以上の組み合わせである。
【００５８】
本明細書で使用する「配列同一性」という用語は、2つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係または2つ以上のポリペプチド配列間の関係を指す。ある配列にある位置が比較配列の対応する位置において同じ核酸塩基またはアミノ酸で占められている場合、この配列はその位置において「同一」だと言われる。「配列同一性」のパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸が両配列において生じた位置の数を求めて「同一の」位置の数を得ることによって計算される。次いで、「同一の」位置の数を比較ウィンドウにある位置の総数で割り、これに100を掛けて「配列同一性」のパーセンテージを得る。「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウィンドウおよび別の分離株に由来する相同ポリペプチドにわたって2つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって求められる。比較のために配列を最適にアラインメントするために、比較ウィンドウにあるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、参照配列が一定に保たれている間に、ギャップと呼ばれる付加または欠失を含んでもよい。最適アラインメントは、ギャップがあっても、参照配列間および比較配列間で可能性のある最大数の「同一の」位置を生じるアラインメントである。2つの配列間の「配列同一性」のパーセンテージは、2004年9月1日の時点で米国立バイオテクノロジー情報センターから利用可能なプログラム「BLAST2配列」バージョンを用いて求めることができる。このプログラムは、プログラムBLASTN(ヌクレオチド配列比較用)およびBLASTP(ポリペプチド配列比較用)を組み込んでいる。これらのプログラムは、KarlinおよびAltschul(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993)のアルゴリズムに基づいている。「BLAST2配列」を利用した時に、ワードサイズ(word size)(3)、オープンギャップペナルティ(open gap penalty)(11)、エクステンションギャップペナルティ(extension gap penalty)(1)、ギャップドロップオフ(gap drop-off)(50)、期待値(10)、およびマトリックスオプション(matrix option)を含むが、これに限定されない他の任意の必要なパラメータには、2004年9月1日の時点でデフォルトパラメータであったパラメータを使用することができる。
【００５９】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて抗原活性または免疫原活性を有するポリペプチド部分を指す。本明細書で使用する「免疫原性エピトープ」は、当技術分野において公知の任意の方法によって決定された時に、動物において免疫応答を誘発するタンパク質部分であると定義される。本明細書で使用する「抗原性エピトープ」という用語は、当技術分野において周知の任意の方法によって決定された時に、抗体またはT細胞受容体がその抗原に免疫特異的に結合することができるタンパク質部分であると定義される。免疫特異的結合は非特異的結合を排除するが、必ずしも、他の抗原との交差反応性を排除するとは限らない。全ての免疫原性エピトープは抗原性であるが、抗原性エピトープは免疫原性である必要はない。
【００６０】
本明細書で使用する「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなされる場合がある。だが、いかなる隣接配列も、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーターなどはコード領域外にある。
【００６１】
「コドン最適化」という用語は、関心対象の宿主の細胞における発現増強のために、天然配列のうちの少なくとも1つのコドン、複数のコドン、またはかなりの数のコドンを宿主遺伝子内でさらに高い頻度で、または最も高い頻度で用いられるコドンで置換することによって核酸配列を改変することと本明細書において定義される。様々な種が、ある特定のアミノ酸のある特定のコドンに特有のバイアスを示す。
【００６２】
「組成物」または「薬学的組成物」という用語は、例えば、アジュバントまたは薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と共に、黄色ブドウ球菌感染症に既に罹患している個体または黄色ブドウ球菌感染に対する免疫化を必要とする個体に投与される、本開示の免疫原性ポリペプチドを含有する組成物を含んでもよい。
【００６３】
「薬学的に許容される」という用語は、適切な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性または他の合併症を引き起こすことなくヒトおよび動物の組織と接触させるのに適し、妥当なベネフィット/リスク比に見合った組成物を指す。一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、およびワクチンは薬学的に許容される。
【００６４】
「有効量」とは、単回投与または一連の投与の一部として個体に投与することが処置または予防に有効な量である。例えば、投与によって、例えば、感染性黄色ブドウ球菌に感染または曝露した後に確かめられた時に、未処置個体と比べて、菌血症の軽減、毒血症の軽減、敗血症の軽減、症状の軽減、免疫応答の増大、免疫応答の調節、または回復までに必要な時間の短縮を含むが、これに限定されない、黄色ブドウ球菌感染の発生率の低下が認められた時に、量は有効である。この量は、処置しようとする個体の健康状態および身体状態、処置しようとする個体の分類群(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、霊長類など)、個体の免疫系の応答能力、望ましい処置または防御の程度、ワクチンの処方、医師による医学的状態の評価、ならびに他の関連要因に応じて変化する。有効量は、日常的な試験によって決定することができる比較的広い範囲の中に入ると予想される。典型的に、単一用量は、約10μg〜10mg/kg体重の精製されたポリペプチド、あるいは同等量の本明細書に記載の組換えにより発現された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を提供するのに十分な、改変されたキャリア生物もしくはウイルスまたはその断片または残遺物の量である。「ペプチドワクチン」または「サブユニットワクチン」という用語は、動物に投与された時に、ブドウ球菌(例えば、黄色ブドウ球菌)感染に対する免疫応答の刺激において有用な1種または複数種の本明細書に記載のポリペプチドを含む組成物を指す。
【００６５】
「対象」という用語は、診断、予後、免疫化、または療法が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、例えば、クマ、スポーツ動物、ペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマ、雌ウシ;霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー;イヌ科の動物、例えば、イヌおよびオオカミ;ネコ科の動物、例えば、ネコ、ライオン、およびトラ;ウマ科の動物、例えば、ウマ、ロバ、およびシマウマ;食用動物、例えば、雌ウシ、ブタ、およびヒツジ;有蹄類、例えば、シカおよびキリン;げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどが含まれるが、これに限定されない。1つの態様において、対象はヒト対象である。
【００６６】
本明細書で使用する「それを必要とする対象」は、ブドウ球菌(例えば、黄色ブドウ球菌)疾患の症状を処置する、すなわち、予防する、治癒させる、遅らせる、もしくはブドウ球菌(例えば、黄色ブドウ球菌)疾患の症状の重篤度を下げること、または特定の期間にわたってブドウ球菌によって引き起こされる疾患を悪化させないこと、あるいはその両方が望ましい個体を指す。
【００６７】
本明細書で使用する「初回抗原刺激(priming)」または「プライマリ(primary)」および「ブースト(boost)」または「追加免疫(boosting)」という用語はそれぞれ、すなわち、これらの用語が免疫学において通常、有する定義に従って初回免疫化およびその後の免疫化を指す。しかしながら、ある特定の態様では、例えば、初回抗原刺激成分および追加免疫成分が1つの製剤の中にある態様では、「プライム(prime)」組成物および「ブースト(boost)」組成物が両方とも同時に投与されるので初回免疫化およびその後の免疫化は必要でない場合がある。
【００６８】
ポリペプチド
保存残基における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、もしくはそれより多いアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含むか、前記サブユニットからなるか、または前記サブユニットから本質的になる、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、前記置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、前記野生型ロイコシジンサブユニットが、アミノ末端からカルボキシ末端へと並んだA-B-Cと称する3つの連続した領域を含むか、前記3つの連続した領域からなるか、または前記3つの連続した領域から本質的になり、かつ領域Bが、SEQ ID NO:2として示されるアミノ酸コンセンサス配列
0006325452.tif 000002
を含み、ここで、
X1=グリシン(G)、セリン(S)、またはアラニン(A)
X2=リジン(K)、スレオニン(T)、セリン(S)、またはメチオニン(M)
X3=スレオニン(T)またはセリン(S)
X4=アスパラギン(N)またはリジン(K)
X5=プロリン(P)、リジン(K)、セリン(S)、またはグルタミン(Q)
X6=アスパラギン(N)またはチロシン(Y)
X7=バリン(V)、スレオニン(T)、またはイソロイシン(I)
X8=アスパラギン酸(D)、セリン(S)、またはフェニルアラニン(F)
X9=セリン(S)またはアミノ酸無し
X10=イソロイシン(I)またはアミノ酸無し
X11=チロシン(Y)、ヒスチジン(H)、またはスレオニン(T)
X12=アスパラギン(N)またはスレオニン(T)
X13=アスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)
X14=セリン(S)またはスレオニン(T)
X15=バリン(V)、スレオニン(T)、アラニン(A)、またはイソロイシン(I)
X16=アスパラギン(N)またはアスパラギン酸(D)
X17=セリン(S)またはグリシン(G)
X18=スレオニン(T)またはリジン(K)
X19=イソロイシン(I)またはバリン(V)
X20=グリシン(G)またはアミノ酸無し
X21=アスパラギン(N)、リジン(K)、またはアミノ酸無し
X22=フェニルアラニン(F)またはアミノ酸無し
X23=アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、またはアミノ酸無し
X24=セリン(S)、スレオニン(T)、またはアミノ酸無し
X25=グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、またはアミノ酸無し
X26=プロリン(P)またはアミノ酸無し
X27=セリン(S)、ロイシン(L)、またはアミノ酸無し
X28=スレオニン(T)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、またはアミノ酸無し
X29=グリシン(G)、アラニン(A)、またはアミノ酸無し
X30=アスパラギン(N)、セリン(S)、またはリジン(K)
X31=セリン(S)、アラニン(A)、またはグルタミン酸(E);および
X32=アスパラギン(N)またはセリン(S)
である、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドが開示される。
【００６９】
一部の態様において、野生型ロイコシジンサブユニットの領域Aは、SEQ ID NO:1として示されるアミノ酸コンセンサス配列
0006325452.tif 000003
を含み、ここで、
X1=グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、またはアミノ酸無し
X2=アスパラギン酸(D)、グリシン(G)、またはアミノ酸無し
X3=スレオニン(T)、リジン(K)、イソロイシン(I)、バリン(V)、またはアミノ酸無し
X4=セリン(S)、スレオニン(T)、アラニン(A)、またはアミノ酸無し
X5=アスパラギン酸(D)、リジン(K)、アスパラギン(N)、アルギニン(R)、またはアミノ酸無し
X6=リジン(K)、アルギニン(R)、またはアミノ酸無し
X7=トリプトファン(W)、ロイシン(L)、またはアミノ酸無し
X8=グリシン(G)、アラニン(A)、またはアミノ酸無し
X9=バリン(V)、イソロイシン(I)、またはアミノ酸無し
X10=イソロイシン(I)、バリン(V)、またはアミノ酸無し
X11=アスパラギン酸(D)、グリシン(G)、またはアミノ酸無し
X12=バリン(V)またはメチオニン(M)
X13=リジン(K)、スレオニン(T)、またはプロリン(P)
X14=アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、またはバリン(V)
X15=イソロイシン(I)またはバリン(V)
X16=ロイシン(L)、バリン(V)、またはイソロイシン(I)
X17=アスパラギン(N)、セリン(S)、またはリジン(K)
X18=リジン(K)またはアルギニン(R)
X19=スレオニン(T)、セリン(S)、またはアラニン(A)
X20=チロシン(Y)またはフェニルアラニン(F)
X21=チロシン(Y)、セリン(S)、アスパラギン(N)、またはスレオニン(T)
X22=アスパラギン(N)またはアスパラギン酸(D)
X23=チロシン(Y)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、またはセリン(S)
X24=アスパラギン(N)、リジン(K)、グリシン(G)、またはグルタミン(Q)
X25=スレオニン(T)、チロシン(Y)、セリン(S)、アスパラギン(N)、リジン(K)、またはアルギニン(R)
X26=グリシン(G)またはアミノ酸無し
X27=チロシン(Y)またはアミノ酸無し
X28=アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、プロリン(P)、またはアルギニン(R)
X29=ヒスチジン(H)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、またはアラニン(A)
X30=イソロイシン(I)、スレオニン(T)、バリン(V)、またはアスパラギン(N)
X31=アラニン(A)、アルギニン(R)、またはセリン(S)
X32=メチオニン(M)、イソロイシン(I)、またはロイシン(L);および
X33=アルギニン(R)、イソロイシン(I)、バリン(V)、またはロイシン(L)
である。
【００７０】
一部の態様において、野生型ロイコシジンサブユニットの領域Cは、SEQ ID NO:3として示されるアミノ酸コンセンサス配列
0006325452.tif 000004
を含み、ここで、
X1=バリン(V)またはアラニン(A)
X2=プロリン(P)またはアスパラギン酸(D)
X3=アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)
X4=アスパラギン(N)、セリン(S)、またはアスパラギン酸(D)
X5=グルタミン酸(E)またはグルタミン(Q)
X6=バリン(V)またはイソロイシン(I)
X7=ヒスチジン(H)、グルタミン(Q)、またはスレオニン(T)
X8=アラニン(A)またはスレオニン(T)
X9=バリン(V)またはロイシン(L)
X10=リジン(K)またはアルギニン(R)
X11=グリシン(G)またはアスパラギン酸(D)
X12=セリン(S)、リジン(K)、またはスレオニン(T)
X13=グリシン(G)、セリン(S)、またはリジン(K)
X14=アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、またはロイシン(L)
X15=スレオニン(T)、リジン(K)、またはイソロイシン(I)
X16=アルギニン(R)またはアミノ酸無し
X17=セリン(S)またはバリン(V)
X18=グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、またはアスパラギン(N)
X19=フェニルアラニン(F)またはロイシン(L)
X20=グルタミン酸(E)またはリジン(K)
X21=イソロイシン(I)またはフェニルアラニン(F)
X22=スレオニン(T)、セリン(S)、またはアラニン(A)
X23=メチオニン(M)またはロイシン(L)
X24=バリン(V)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、またはスレオニン(T)
X25=ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)
X26=スレオニン(T)、イソロイシン(I)、またはチロシン(Y)
X27=アルギニン(R)、リジン(K)、バリン(V)、ロイシン(L)、またはフェニルアラニン(F)
X28=アルギニン(R)、スレオニン(T)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L)
X29=スレオニン(T)、セリン(S)、アルギニン(R)、またはプロリン(P)
X30=スレオニン(T)、ヒスチジン(H)、アルギニン(R)、リジン(K)、またはプロリン(P)
X31=ヒスチジン(H)、アルギニン(R)、スレオニン(T)、ロイシン(L)、またはグルタミン(Q)
X32=チロシン(Y)またはアミノ酸無し
X33=グリシン(G)またはアミノ酸無し
X34=アスパラギン(N)またはアミノ酸無し
X35=セリン(S)またはアミノ酸無し;および
X36=チロシン(Y)またはグリシン(G)
である。
【００７１】
一部の態様において、変異型ロイコシジンサブユニットは、位置T11、K24、D28、Y58、S18、またはそれらの任意の組み合わせにおけるアミノ酸置換を含む。ある特定の態様において、置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様においてT11、K24、D28、Y58、またはS18はアラニンまたはフェニルアラニンで置換されている。
【００７２】
SEQ ID NO:2の位置K24におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットも開示される。置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様において、K24はアラニンで置換されている。
【００７３】
SEQ ID NO:3の位置S18におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットも開示される。置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様において、S18はアラニンで置換されている。
【００７４】
一部の態様は、SEQ ID NO:2の位置Y58におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様において、Y58はアラニンで置換されている。
【００７５】
一部の態様は、SEQ ID NO:1の位置T11におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様において、T11はフェニルアラニンで置換されている。
【００７６】
一部の態様は、位置T11およびY58におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様において、T11およびY58はそれぞれフェニルアラニンおよびアラニンで置換されている。
【００７７】
一部の態様は、位置T11およびS18におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様において、T11およびS18はそれぞれフェニルアラニンおよびアラニンで置換されている。
【００７８】
一部の態様は、位置T11、K24、およびS18におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含む。置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様において、T11はフェニルアラニンで置換され、K24およびS18はアラニンで置換されている。
【００７９】
SEQ ID NO:2の位置D28におけるアミノ酸置換を含む、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットも開示される。置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様において、D28はアラニンで置換されている。
【００８０】
保存残基における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、もしくはそれより多いアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含むか、前記サブユニットからなるか、または前記サブユニットから本質的になる、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、前記置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、前記野生型ロイコシジンがパントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukS-PVである、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドも開示される。一部の態様において、野生型LukS-PVは、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、およびSEQ ID NO:16からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、野生型LukS-PVは、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列
0006325452.tif 000005
(LukS-PVの前駆体タンパク質配列。GenBankアクセッション番号:NP_058465.1; 28アミノ酸シグナルペプチド(アミノ酸1〜28)に下線を引いた)を含む。
【００８１】
一部の態様において、変異型LukS-PVサブユニットは、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、およびSEQ ID NO:14からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットはSEQ ID NO:14のアミノ酸を含む。
【００８２】
保存残基における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、もしくはそれより多いアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含むか、前記サブユニットからなるか、または前記サブユニットから本質的になる、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、前記置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、前記野生型ロイコシジンサブユニットが、SEQ ID NO:4として示されるアミノ酸コンセンサス配列
0006325452.tif 000006
を含むか、前記アミノ酸コンセンサス配列からなるか、または前記アミノ酸コンセンサス配列から本質的になり、ここで、
X1=バリン(V)、イソロイシン(I)、またはアラニン(A)
X2=アスパラギン酸(D)またはヒスチジン(H)
X3=アスパラギン(N)またはグルタミン(Q)
X4=ロイシン(L)またはバリン(V)
X5=セリン(S)またはスレオニン(T)
X6=フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)
X7=セリン(S)またはアスパラギン(N)
X8=セリン(S)、イソロイシン(I)、アスパラギン(N)、またはスレオニン(T)
X9=リジン(K)またはアスパラギン(N)
X10=セリン(S)またはスレオニン(T)
X11=ロイシン(L)またはグリシン(G)
X12=セリン(S)またはアスパラギン(N)
X13=グルタミン酸(E)、スレオニン(T)、またはリジン(K)
X14=セリン(S)またはアラニン(A)
X15=スレオニン(T)またはアミノ酸無し
X16=スレオニン(T)またはセリン(S)
X17=イソロイシン(I)またはロイシン(L);および
X18=アスパラギン酸(D)またはセリン(S)
である、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドも開示される。
【００８３】
一部の態様において、変異型ロイコシジンサブユニットは、位置K8、D28、E53、またはそれらの任意の組み合わせにおけるアミノ酸置換を含む。ある特定の態様において、置換は、変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットの抗原性を維持する任意のアミノ酸によるものでよい。ある特定の態様において、K8、D28、またはE53はアラニンで置換されている。
【００８４】
保存残基における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、もしくはそれより多いアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含むか、前記サブユニットからなるか、または前記サブユニットから本質的になる、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、前記置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、前記野生型ロイコシジンがパントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukF-PVである、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドも開示される。一部の態様において、野生型LukF-PVは、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、およびSEQ ID NO:27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、野生型LukF-PVは、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列
0006325452.tif 000007
(LukF-PVの前駆体タンパク質配列。GenBankアクセッション番号:NP_058466.1; 24アミノ酸シグナルペプチド(アミノ酸1〜24)に下線を引いた)を含む。
【００８５】
一部の態様において、変異型LukF-PVサブユニットは、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、およびSEQ ID NO:136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、変異型LukF-PVサブユニットはSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、変異型LukF-PVサブユニットはSEQ ID NO:136のアミノ酸配列を含む。
【００８６】
本明細書に記載の変異型ロイコシジンサブユニットを含むポリペプチド複合体も開示される。置換は、変異型ロイコシジンサブユニット複合体の構造およびコンホメーションを維持する任意のアミノ酸でよい。
【００８７】
別の態様において、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を異種ポリペプチドに接続させることができる。安定化、分泌、または簡素化された精製を付与するN末端ペプチドまたはC末端ペプチド、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、ユビキチンタグ、NusAタグ、キチン結合ドメイン、ompT、ompA、pelB、DsbA、DsbC、c-myc、KSI、ポリアスパラギン酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n、ポリフェニルアラニン、ポリシステイン、ポリアルギニン、Bタグ、HSBタグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、インフルエンザウイルス血球凝集素(HAI)、カルモジュリン結合タンパク質(CBP)、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質(MBP)、セルロース結合ドメイン(CBD)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、連鎖球菌プロテインG、ブドウ球菌プロテインA、T7gene10、アビジン/ストレプトアビジン/Strepタグ複合体、trpE、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、lacZ(βガラクトシダーゼ)、Hisパッチチオレドキシン、チオレドキシン、FLAG(商標)ペプチド(Sigma-Aldrich)、Sタグ、またはT7タグを含むが、これに限定されない様々な異種ポリペプチドを使用することができる。例えば、Stevens, R.C., Structure, 8:R177-R185 (2000)を参照されたい。異種ポリペプチドはまた、宿主細胞からの本明細書に記載のLukS-PVおよび/またはLukF-PVポリペプチドの輸送、移動、処理、および/または精製を容易にする任意のプレ配列および/またはプロ配列、あるいは微生物病原体のT細胞エピトープまたは他の免疫原性タンパク質および/もしくは免疫原性エピトープをコードする配列を含むが、これに限定されない任意の有用な免疫原性配列を含んでもよい。
【００８８】
一部の態様において、本明細書に記載のように、異種ポリペプチドに接続された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)は、2つ以上のペプチド領域を含む配列をつなぐペプチドリンカー配列を含んでもよい。適切なペプチドリンカー配列は、可撓性の広がったコンホメーション、もしくはつなげられたエピトープと相互作用することができる二次構造をとる能力に基づいて、または融合ポリペプチドの全溶解度を高める能力に基づいて、またはつなげられたペプチド領域に影響を及ぼす静電相互作用もしくは水相互作用の欠如に基づいて選択することができる。
【００８９】
一部の態様において、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)が単離される。「単離された」ポリペプチドは、その天然環境から取り出されているポリペプチドである。「単離された」という用語は特定の精製レベルを意味しない。非天然宿主細胞内で発現され、組換えにより産生された本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)は本開示の目的では単離されたとみなされ、濾過、クロマトグラフィー、遠心分離などによる技法を含む任意の適切な技法によって分離された、分画された、または部分的もしくは実質的に精製されたポリペプチドも同様に単離されたとみなされる。
【００９０】
本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)は、本開示のポリペプチドを機能的にコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、ポリペプチドを回収することによって産生することができる。このような宿主細胞を培養し、ポリヌクレオチドを発現させるための条件の決定は一般的に宿主細胞および発現システムに特異的であり、当業者の知識の範囲内である。同様に、本開示のポリペプチドを回収するための適切な方法は当業者に公知であり、クロマトグラフィー、濾過、沈殿、または遠心分離を含むが、これに限定されない。
【００９１】
ある特定の態様において、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットは、7000kcal/mol未満、または4000kcal/mol未満、または2000kcal/mol未満、または600kcal/mol〜7500kcal/mol、または900kcal/mol〜3900kcal/mol、または900kcal/mol〜1500kcal/mol、または2000kcal/mol〜3650kcal/molの分子エネルギー計算値を含む。LukS-PV変異体およびLukF-PV変異体のヘテロ二量体複合体構造について計算した具体的な分子エネルギーを表1に示した。これらの測定値を実施例セクションにおいて詳細に説明する。
【００９２】
（表１）LukS-PV変異体およびLukF-PV変異体のヘテロ二量体複合体構造についての分子エネルギー計算値
0006325452.tif 000008
【００９３】
ポリヌクレオチド
さらに、本開示は、保存残基における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、もしくはそれより多いアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含むか、前記サブユニットからなるか、または前記サブユニットから本質的になる、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、前記置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、前記野生型ロイコシジンサブユニットが、アミノ末端からカルボキシ末端へと並んだA-B-Cと称する3つの連続した領域を含むか、前記3つの連続した領域からなるか、または前記3つの連続した領域から本質的になり、かつ領域BがSEQ ID NO:2のアミノ酸コンセンサス配列を含む、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００９４】
保存残基における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、もしくはそれより多いアミノ酸置換以外は野生型のブドウ球菌ロイコシジンサブユニットを含むか、前記サブユニットからなるか、または前記サブユニットから本質的になる、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドであって、前記置換が、変異型ロイコシジンサブユニットの毒性を、対応する野生型ロイコシジンサブユニットと比べて低下させ、前記野生型ロイコシジンサブユニットが、SEQ ID NO:4として示されるアミノ酸コンセンサス配列を含むか、前記アミノ酸コンセンサス配列からなるか、または前記アミノ酸コンセンサス配列から本質的になる、単離された変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドも開示される。
【００９５】
ある特定の態様において、本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書の他の場所において説明される、プロモーター、オペレーター、または転写ターミネーターなどの非コード領域をさらに含む。一部の態様において、本開示は本明細書に記載のポリヌクレオチドに関し、異種核酸をさらに含む。異種核酸は、一部の態様において、本明細書に記載のポリペプチドと融合した異種ポリペプチドをコードしてもよい。例えば、本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドは、さらなるコード領域、例えば、本明細書に記載のポリペプチドと融合した異種ポリペプチドをコードする、さらなるコード領域、または選択マーカー、さらなる免疫原、免疫エンハンサーなどがあるが、これに限定されない、本明細書に記載のポリペプチドとは別の異種ポリペプチドをコードするコード領域を含んでもよい。
【００９６】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む、発現構築物、ベクター、および/または宿主細胞も提供される。
【００９７】
単離されたポリヌクレオチドの一例は、ベクター内に含まれる組換えポリヌクレオチドである。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶解状態にある(部分的もしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが含まれる。本開示のある特定の態様において、ポリヌクレオチドは「組換え」である。本開示による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成により作製されたこのような分子をさらに含む。本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの純度の相対的な程度は周知の方法によって容易に決定される。
【００９８】
コドン最適化
本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)をコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチドも本開示の範囲内に開示される。本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット、例えば、(LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)をコードする核酸は、当業者によって、例えば、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発または新規核酸合成によって容易に改変することができる。
【００９９】
一部の態様は、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)をコードする核酸断片を含み、ポリペプチドをコードするコード領域がコドン最適化されている、単離されたポリヌクレオチドを開示する。当業者により理解されるように、様々な核酸コード領域が遺伝暗号の重複のために同じポリペプチドをコードする。任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列に偏りがあるとコード領域の配列中にばらつきが生じる。各コドンは3つのヌクレオチドからなり、DNAを含むヌクレオチドは4つの特定の塩基に限定されるので、64通りのヌクレオチドの組み合わせが考えられ、このうち61通りがアミノ酸をコードする(残り3つのコドンはシグナル終結翻訳をコードする)。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝暗号」は本明細書に表2として転載されている。結果として、多くのアミノ酸が複数のコドンによって指定されている。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは4種のトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは6種のトリプレットによってコードされるのに対して、トリプトファンおよびメチオニンは1種だけのトリプレットによってコードされる。この縮重のために、DNAによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化することなくDNA塩基組成が広範囲にわたって変化することが可能になる。
【０１００】
（表２）標準的な遺伝暗号
0006325452.tif 000009
【０１０１】
使用されるコドンに関係なく、本開示に従ってポリペプチドをコードする全てのポリヌクレオチドが本開示の範囲内にあると理解すべきである。
【０１０２】
多くの生物が、成長しているポリペプチド鎖の中に、特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンが用いられるバイアスを示す。生物間のコドン使用頻度の差であるコドン優先またはコドンバイアスは遺伝暗号縮重によって与えられ、多くの生物間で詳細に記録が残されている。
【０１０３】
翻訳選択、GC組成、鎖特異的変異バイアス、アミノ酸保存、タンパク質ハイドロパシー、転写選択、およびRNA安定性さえ含む様々な要因がコドン使用頻度優先に寄与すると提唱されている。コドン使用頻度を決定する要因の1つはゲノムGC組成を形作る変異バイアスである。この要因は、極端な塩基組成を有するゲノム:高GC含有量を有する種(例えば、グラム陽性細菌)において最も重要である。変異バイアスはコドン使用頻度の遺伝子間差だけでなく、同じゲノム内のコドン使用頻度バイアスも担っている(Ermolaeva M, Curr. Issues Mol. Biol. 3(4):91-97, 2001)。
【０１０４】
コドンバイアスはメッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関することが多く、その結果として、特に、翻訳されているコドンの特性および特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内における選択されたtRNAの数が圧倒的に多いことは、一般的に、ペプチド合成においてコドンが最も高い頻度で用いられることを反映している。したがって、ある特定の生物において遺伝子が最適に発現するようにコドン最適化に基づいて遺伝子を合わせることができる。
【０１０５】
本開示は、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチド(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)をコードするコドン最適化コード領域を含むポリヌクレオチドに関する。コドン使用頻度は、ある特定の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において最適化に発現するように合わせられる。
【０１０６】
コドン最適化ポリヌクレオチドは、ある特定の種の遺伝子における使用に好ましいコドンをDNA配列に組み込むことによって調製される。本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニットポリペプチド(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)をコードするコドン最適化コード領域を含むポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド発現構築物、ベクター、宿主細胞も提供される。
【０１０７】
多種多様な動物、植物、および微生物種に利用可能な多数の遺伝子配列があれば、コドン使用頻度の相対頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、例えば、http://www.kazusa.or.jp/codon/において入手可能な「コドン使用頻度データベース(Codon Usage Database)」において容易に入手することができる(2011年10月12日に訪れた)。これらの表をいろいろなやり方で作りかえることができる(Nakamura, Y., et al., 「Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000」 Nucl. Acids Res. 28:292, 2000)。
【０１０８】
入手可能な表を利用することによって、当業者であれば、特定のポリペプチド配列に頻度を適用し、望ましいポリペプチドをコードするが、ある特定の種に最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を作製することができる。例えば、本開示の一部の態様において、コード領域は大腸菌における発現のためにコドン最適化されている。
【０１０９】
DNA合成
当業者に周知の標準的かつ日常的な分子生物学的操作を用いて、前記の任意の方法によって設計されたコドン最適化コード領域を合成する多数の選択肢が利用可能である。さらに、遺伝子合成は容易に商業利用することができる。
【０１１０】
ベクターおよび発現システム
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターがさらに開示される。本明細書で使用する「ベクター」という用語は、例えば、異なる遺伝子環境間で輸送するために、または宿主細胞内で発現させるために、望ましい配列を挿入することができる、例えば、望ましい配列を制限処理および連結によって挿入することができる多数の任意の核酸を指す。核酸ベクターはDNAでもよくRNAでもよい。ベクターには、プラスミド、ファージ、ファージミド、細菌ゲノム、およびウイルスゲノムが含まれるが、これに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞内で複製することができるベクターであって、決定可能なやり方でベクターを切断することができ、新たな組換えベクターが宿主細胞内で複製能力を保持するように望ましいDNA配列を連結することができる1つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられるベクターである。プラスミドの場合、望ましい配列の複製は、プラスミドのコピー数が宿主細菌内で増える時に何回でも行われてもよく、宿主が有糸分裂により複製する前に1つの宿主あたり1回だけ行われてもよい。ファージの場合、複製は溶菌期(lytic phase)の間に能動的に行われてもよく、溶原期(lysogenic phase)の間に受動的に行われてもよい。ある特定のベクターは、ある特定のベクターが導入された宿主細胞内で自己複製することができる。他のベクターは宿主細胞に導入されたら宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。
【０１１１】
適切な宿主と使用することができる多種多様な任意の適切なクローニングベクターが当技術分野において公知であり、市販されている。本明細書で使用する「プラスミド」という用語は、遺伝物質が染色体外にあり、場合によっては自己複製する、遺伝物質(すなわち、核酸)で作られた環状二本鎖構築物を指す。本明細書に記載のポリヌクレオチドは環状プラスミド内にあってもよく、直線化プラスミド内にあってもよく、他の任意の種類のベクター内にあってもよい。ヌクレオチド配列をベクター、例えば、発現ベクターに挿入し、形質転換またはトランスフェクションによって適切な宿主細胞に導入し、発現に適した条件下で培養するための手順は一般的に当技術分野において公知である。
【０１１２】
本開示の一局面によれば、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)をコードする核酸配列を含むベクターが提供される。ある特定の態様において、ベクターは、適切な宿主細胞内で本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を発現することができる発現ベクターである。「発現ベクター」という用語は、本明細書に記載のポリペプチドを発現することができるベクターを指す。すなわち、ベクター配列は、プロモーター、オペレーター、転写終結部位、リボソーム結合部位などを含むが、これに限定されない、ポリペプチドの転写および翻訳に必要とされる制御配列を含有する。「発現」という用語は、コード配列によってコードされる産物の生物学的生産を指す。ほとんどの場合、コード配列を含むDNA配列は転写されてメッセンジャーRNA(mRNA)を形成する。次いで、メッセンジャーRNAは翻訳されて、関連した生物学的活性を有するポリペプチド産物を形成する。また、発現プロセスは、転写RNA産物へのさらなる処理工程、例えば、イントロンを除去するスプライシング、および/またはポリペプチド産物の翻訳後処理を伴ってもよい。
【０１１３】
ベクター-宿主システムには、インビボ、例えば、動物におけるシステム、またはインビトロ、例えば、細菌もしくは細胞培養におけるシステムのいずれか、例えば、細菌システム、哺乳動物システム、酵母システム、昆虫システム、または植物細胞システムが含まれるが、これに限定されない。適切な宿主の選択は、本明細書における開示から当業者が行う範囲内であると考えられる。ある特定の態様において、宿主細胞は細菌、例えば、大腸菌である。
【０１１４】
宿主細胞には、本開示のベクターを用いて遺伝子操作(感染、形質導入、形質転換、またはトランスフェクション)が行われる。したがって、本開示の一局面は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含有するベクターを含む宿主細胞に関する。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、またはポリヌクレオチドの増幅のために適宜改変された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に用いられた培養条件であり、当業者に明らかであろう。本明細書で使用する「トランスフェクトする」という用語は、真核細胞がそのゲノムに、プラスミドの形をしたDNAを含むが、これに限定されない単離されたDNAを受け入れ、組み込むように誘導される任意の手順を指す。本明細書で使用する「形質転換する」という用語は、細菌細胞がそのゲノムに、プラスミドの形をしたDNAを含むが、これに限定されない単離されたDNAを受け入れ、組み込むように誘導される任意の手順を指す。
【０１１５】
細菌宿主-発現ベクターシステムには、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換された原核生物(例えば、大腸菌)が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、大腸菌と共に用いられるプラスミドは、IPTG誘導を介してLacIタンパク質によって調節されるT7プロモーター駆動システムを使用する。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。例として以下の細菌ベクター:pET(Novagen)、pET28、pBAD、pTrcHIS、pBR322、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsk、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK243-3、pDR540、pBR322、pPS10、RSF1010、pRIT5(Pharmacia);pCR(Invitrogen);pLex(Invitrogen)、およびpUCプラスミド誘導体が提供される。
【０１１６】
適切な発現ベクターは、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)をコードする挿入ヌクレオチド配列に機能的につなげることができる制御配列を含有する。本明細書で使用する「制御配列」という用語は、宿主細胞による、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)をコードする挿入配列の転写に必要な、または転写の助けとなるヌクレオチド配列、および/あるいは結果として生じた転写物から望ましい変異型ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)への宿主細胞による翻訳に必要な、または翻訳の助けとなるヌクレオチド配列を意味する。制御配列には、5'配列、例えば、オペレーター、プロモーターおよびリボソーム結合配列ならびに3'配列、例えば、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターが含まれるが、これに限定されない。制御配列はエンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含んでよい。
【０１１７】
一般的に、細菌ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする、複製起点および選択マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、および下流構造配列の転写を誘導する高発現遺伝子由来プロモーターを含む。適切なプロモーターには、T7プロモーター、ラムダ(λ)プロモーター、T5プロモーター、およびlacプロモーター、または解糖酵素、例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、酸性ホスファターゼ、もしくは熱ショックタンパク質、もしくは誘導性プロモーター様カドミウム(pcad)、およびβラクタマーゼ(pbla)をコードするオペロンに由来するプロモーターが含まれるが、これに限定されない。
【０１１８】
発現ベクターが選択されたら、本明細書に記載のポリヌクレオチドをプロモーターの下流に、例えば、ポリリンカー領域にクローニングすることができる。ベクターで適切な細菌株を形質転換し、DNAを標準的な技法を用いて調製する。ポリヌクレオチドならびにベクターに含まれる他の全てのエレメントの方向およびDNA配列を、制限酵素マッピング、DNA配列分析、および/またはPCR分析を用いて確認する。正しいプラスミドを有する細菌細胞を細胞バンクとして保管することができる。
【０１１９】
免疫原性組成物および薬学的組成物
有効量の本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVまたはLukF-PV、もしくはその両方)あるいは本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する組成物、例えば、免疫原性組成物および薬学的組成物がさらに開示される。本明細書に記載の組成物は、例えば、多価ワクチンとして、さらなる免疫原性成分、ならびに担体、賦形剤、またはアジュバントをさらに含んでもよい。
【０１２０】
本明細書に記載の組成物は公知の方法に従って処方することができる。適切な調製方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)に記載されている。組成物は、水溶液、エマルジョン、ゲル、懸濁液、凍結乾燥型、または当技術分野において公知の他の任意の形を含むが、これに限定されない様々な形をとってもよい。さらに、組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および防腐剤を含む、薬学的に許容される添加物を含有してもよい。本開示の組成物は処方されたら、対象に直接投与することができる。処置される対象は動物でもよい。特に、ヒト対象を処置することができる。
【０１２１】
本開示の組成物と共に使用することができる担体は当技術分野において周知であり、例えば、チログロブリン、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、およびポリアミノ酸、例えば、ポリL-リジン、ポリL-グルタミン酸、インフルエンザ、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含むが、それに限定されるわけではない。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、0.8％食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。組成物は従来の周知の滅菌法によって滅菌されてもよく、滅菌濾過されてもよい。結果として生じた組成物は、使用のためにそのままで包装されてもよく、凍結乾燥されて包装されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与の前に滅菌溶液と混合される。組成物は、生理条件に近づけるのに必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、pH調節剤および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含有してもよい。
【０１２２】
本明細書に記載のある特定の組成物は、例えば、免疫原に対する免疫応答を増強するために、保持するために、局在させるために、または調節するために免疫原性組成物に添加される物質である1種または複数種のアジュバントさらに含む。「アジュバント」という用語は、(1)ある特定の抗原に対する免疫応答を変える、もしくは高める、または(2)薬理学的薬剤の効果を高める、もしくは助ける能力を有する任意の材料を指す。ポリペプチドの発現、抗原性、または免疫原性を高めることができる全ての化合物が潜在的アジュバントである。本明細書で使用する「免疫原性担体」という用語は、第2のポリペプチドまたはその断片、変種、もしくは誘導体の免疫原性を増強する、第1の部分、例えば、ポリペプチドまたはその断片、変種、もしくは誘導体を指す。
【０１２３】
多種多様な材料が様々な機構を介してアジュバント活性を有すると示されてきた。例えば、体液性免疫の増大は、典型的に、抗原に対して産生された抗体の力価の大幅な増加によって明らかにされ、T細胞活性の増加は、典型的に、細胞増殖または細胞傷害性またはサイトカイン分泌の増大となって現れる。アジュバントはまた、例えば、主として体液性応答すなわちTh2応答を主として細胞性応答すなわちTh1応答に変えることによって免疫応答を変える、または調節することができる。ある特定の抗原に対する免疫応答は、当業者に周知の、および/または本明細書の他の場所に記載の様々なイムノアッセイによって試験することができる。
【０１２４】
多数のアジュバントが当業者によく知られており、非常に多くの参考文献に記載されている。本明細書に記載の組成物において使用することができるアジュバントには、不活性担体、例えば、アラム、ベントナイト、ラテックス、およびアクリル粒子;不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント;アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム;Alhydrogel(Al(OH3));リン酸アルミニウム(AlPO4);カルシウム塩;シリカ;任意のTLR生物学的リガンド;IDC-1001(GLA-SE;グルコピラノシル脂質アジュバント安定エマルジョンとも知られる)(Coler et al, PLoS One, 2010. 5(10): p.e13677; Coler et al., PLoS One, 2011. 6(1): p.e16333); CpG (Mullen et al., PLoS One, 2008. 3(8): p.e2940)、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これに限定されない。アジュバントの量、処方方法、および投与方法、全てのパラメータは、十分に当業者が行う範囲内にある。
【０１２５】
一部の態様において、本開示の組成物は、例えば、製剤を安定化する、製剤をある特定の組織、例えば、リンパ系組織に標的化する、またはポリペプチド組成物の半減期を延ばすのに役立ち得る、リポソームまたは他の粒子担体をさらに含む。このような粒子担体には、エマルジョン、発泡体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層、iscomなどが含まれる。これらの調製物において、本明細書に記載のポリペプチドはリポソームまたは他の粒子の一部として組み込まれてもよく、リポソームと共に送達されてもよい。本開示に従う使用のためのリポソームは、一般的に、中性リン脂質および負に荷電しているリン脂質ならびにコレステロールなどのステロールを含む標準的な小胞形成脂質から形成することができる。リポソームまたは他の粒子懸濁液ならびに本明細書に記載のポリペプチドを含む組成物は、特に、投与方法、送達されているポリペプチド、および処置されている疾患の段階に応じて変化する量で、静脈内、局所、表面などに投与することができる。
【０１２６】
固体組成物の場合、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む従来の無毒の固体担体を使用することができる。経口投与の場合、一般的に用いられる任意の賦形剤、例えば、以前に列挙された担体、および一般的に10〜95％の活性成分、すなわえち、本明細書に記載のポリペプチド、多くの場合、25％〜75％の濃度の本明細書に記載のポリペプチドを組み込むことによって、薬学的に許容される無毒の組成物が形成される。
【０１２７】
エアロゾル投与または粘膜投与の場合、本明細書に記載のポリペプチドは、超微粒子の形で、任意で、界面活性剤ならびに噴霧剤および/または粘膜付着剤、例えば、キトサンと共に供給することができる。界面活性剤は、もちろん、薬学的に許容される界面活性剤でなければならず、一部の態様において、噴霧剤に溶けなければならない。このような薬剤を代表するものは、6〜22個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸(olesteric acid)、およびオレイン酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環式無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合エステル、例えば、混合グリセリドまたは天然グリセリドを使用することができる。界面活性剤は、組成物の0.1重量％〜20重量％、一部の態様において0.25〜5重量％を構成してもよい。通常、組成物の残りは噴霧剤であるが、噴霧剤が必要でなく、それに応じて他のパーセンテージが調節されるアトマイザーを使用することができる。一部の態様において、免疫原性ポリペプチドを空気力学的に軽い粒子、例えば、米国特許第6,942,868号または米国特許出願公開第2005/0008633号に記載の粒子の中に組み込むことができる。担体、例えば、鼻腔内送達の場合はレシチンも含めることができる。
【０１２８】
本開示はまた、本開示による組成物を産生する方法に関する。一部の態様において、組成物を産生する方法は、(a)本開示によるポリペプチドを単離する工程;ならびに(b)単離されたポリペプチドにアジュバント、担体、および/または賦形剤を添加する工程を含む。一部の態様は、ポリペプチドを他のブドウ球菌抗原と組み合わせる工程をさらに開示する。ブドウ球菌抗原。
【０１２９】
一部の態様は多価ワクチンを含む。本開示の多価ワクチンは、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)、あるいは一方または両方のサブユニットをコードするポリヌクレオチド、および1種または複数種のさらなる免疫原性成分を含む。このような成分は、同じ感染因子、例えば、黄色ブドウ球菌のさらなる免疫原でもよく、他のブドウ球菌に由来するさらなる免疫原でもよく、効果的に、都合よく、または経済的に一緒に投与することができる他の感染因子に由来する免疫原でもよい。ある特定の態様において、複数の細菌ビルレンス決定基を標的とすることができる広範囲の毒素に基づく多価ワクチンを作製するために、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を他の毒素または他の病原性成分に基づくワクチンと組み合わせることができる。他の態様において、単鎖の多価ワクチンを作製し、複数の抗原に対する免疫応答を誘導するために、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を、他の免疫原性の、生物学的に意味のある、または防御的なエピトープを含有するポリペプチドと融合することができる。さらに別の態様において、抗PVL抗体と一緒にT細胞免疫を誘導するために、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を1種または複数種のT細胞エピトープに融合することができる。
【０１３０】
処置/予防の方法およびレジメン
対象におけるブドウ球菌属感染症、例えば、黄色ブドウ球菌感染症を処置もしくは予防する方法またはブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌によって引き起こされる疾患を処置もしくは予防する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を含む本明細書に記載の組成物、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与する工程を含む方法も提供される。ある特定の態様において、対象は、動物、例えば、脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトである。一部の態様は、黄色ブドウ球菌株に対して免疫応答を誘導する方法であって、前記免疫応答を必要とする対象に、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を含む有効量の本明細書に記載の組成物、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与する工程を含む方法を含む。
【０１３１】
一部の態様において、予防的に、例えば、ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に潜在的もしくは実際に曝露される前に、またはブドウ球菌属関連症状に罹患する前に、健常な動物においてブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対する免疫を確立または増強し、したがって、疾患を予防する、症状を緩和する、症状を軽減する、または疾患症状の重篤度を下げるための予防ワクチンとして、対象には、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を含む本明細書に記載の組成物、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞が投与される。1つの態様において、疾患は呼吸器疾患、例えば、肺炎である。処置または予防される他の疾患または状態には、菌血症、敗血症、皮膚感染症、創傷感染症、心内膜炎、骨感染症および関節感染症、骨髄炎、ならびに/または髄膜炎が含まれるが、これに限定されない。本明細書に記載の1つまたは複数の組成物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞はまた、動物の免疫系をさらに刺激し、したがって、ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌の曝露に関連した症状を軽減または排除するように、ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に既に曝露されている対象、またはブドウ球菌属関連症状に既に罹患している対象を処置するのに使用することができる。本明細書において定義されるように「動物の処置」は、動物における黄色ブドウ球菌症状を予防する、治癒させる、遅らせる、もしくは黄色ブドウ球菌症状の重篤度を下げるための、および/または特定の期間にわたってブドウ球菌属の症状を悪化させないための本開示の1つまたは複数の組成物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を指す。本明細書に記載の任意の組成物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞が、ブドウ球菌感染に対する完全な防御を提供すること、または全てのブドウ球菌属関連症状を完全に治癒させるもしくは排除することは、必要とされない。
【０１３２】
本明細書で使用する「治療的免疫および/または予防的免疫を必要とする対象」は、ブドウ球菌属関連症状を処置する、すなわち、予防する、治癒させる、遅らせる、もしくはブドウ球菌属関連症状の重篤度を下げることが望ましい、または特定の期間にわたってブドウ球菌属関連症状を悪化させないことが望ましい対象を指す。本明細書で使用する「免疫応答を必要とする対象」は、任意のPVL発現ブドウ球菌株に対する免疫応答が望ましい対象を指す。
【０１３３】
本明細書に記載の免疫原性組成物、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む薬学的組成物を用いた処置は、適宜、別々に、または他の処置と併用して行うことができる。
【０１３４】
治療用途において、本開示の組成物、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドは、黄色ブドウ球菌PVL由来ポリペプチドに対して効果的な自然体液性応答もしくは細胞性応答またはこれらの両方の応答を誘発して、症状もしくは合併症を治癒させる、または症状もしくは合併症を少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で患者に投与される。
【０１３５】
これを達成するのに十分な量は「治療的有効用量」または「単位用量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの組成物、投与方法、処置されている疾患の段階および重篤度、患者の体重および全身の健康状態、ならびに処方を行う医師の判断に左右されるが、一般的に、ポリペプチドワクチンの初回免疫化の範囲は(治療的投与または予防的投与の場合)、例えば、患者血液中の抗体レベルを測定することによって、例えば、患者の応答および状態に応じて約0.1μg〜約5000μgのポリペプチドである。一部の態様において、初回抗原刺激投与の後に、ある期間にわたって追加免疫投与が行われる。
【０１３６】
本開示の非限定的な態様では、本明細書において開示される有効量の組成物は、抗体価を、投与前の抗体価の少なくとも2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、10^4倍、5x10^4倍、または10^5倍まで上昇させる。
【０１３７】
別の態様において、一般的に、ヒトの場合、(治療的投与または予防的投与のために)初回免疫化が投与された後に、患者血液中の抗体応答またはTリンパ球応答を測定することによって、患者の応答および状態に応じて数週間〜数ヶ月にわたって追加免疫レジメンに従って同じ用量範囲の追加免疫投与量が投与される。
【０１３８】
本明細書に記載のポリペプチドおよび組成物は、一般的に、重篤な疾患状態、すなわち、命にかかわる状況または潜在的に命にかかわる状況において使用できることを念頭におかなければならない。このような場合、異物の最小化およびポリペプチドの比較的無毒な性質を考慮して、かなり過剰な量のこれらのポリペプチド組成物を投与することが可能であり、処置を行っている医師は望ましいと感じる場合がある。
【０１３９】
治療的使用の場合、投与は、最初に黄色ブドウ球菌感染または危険因子の徴候が現れた時点で開始すべきである。ある特定の態様において、初回投与の後に、例えば、症状が実質的に軽減するまで、その後、ある期間にわって追加免疫投与が行われる。頻繁な感染では負荷投与の後に追加免疫投与が必要となる場合がある。
【０１４０】
ある特定の態様において、本明細書に記載の組成物は本明細書に記載の方法によって対象に送達され、それによって、効果的な免疫応答ならびに/または効果的な治療的免疫応答もしくは予防的免疫応答を実現する。ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対する免疫応答をもたらすのに十分な量で、および/またはブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対して予防的もしくは治療的に有効な免疫応答を、このような応答を必要とする動物においてもたらすのに十分な量で望ましいポリペプチドを望ましい組織に送達する、および/または望ましい組織において発現させる限り、任意の投与方法を使用することができる。開示された方法によれば、本明細書に記載の組成物は、粘膜送達、経皮送達、皮下注射、静脈内注射、経口投与、肺投与、筋肉内(i.m.)投与によって、または腹腔内注射によって投与することができる。他の適切な投与経路には、気管内投与、経皮投与、眼内投与、鼻腔内投与、吸入投与、腔内投与、管内投与(例えば、膵臓内)、および実質内投与(すなわち、任意の組織内)投与が含まれるが、これに限定されない。経皮送達には、皮内投与(例えば、真皮もしくは表皮への投与)、経皮投与(例えば、経皮的投与)、および経粘膜投与(すなわち、皮膚もしくは粘膜組織の中への投与または皮膚もしくは粘膜組織を通過する投与)が含まれるが、これに限定されない。腔内投与には、口腔、膣腔、直腸腔、鼻腔、腹腔、または腸腔(intestinal cavity)への投与、ならびに、くも膜下腔内(すなわち、脊柱管内)投与、室内(すなわち、脳室内または心室内)投与、動脈内(すなわち、心房内)投与、およびくも膜下(すなわち、脳のくも膜下腔内)投与が含まれるが、これに限定されない。
【０１４１】
ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対する免疫応答、および/またはブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対して予防的もしくは治療的に有効な免疫応答を、このような応答を必要とする動物においてもたらすのに十分な量で望ましいポリペプチドを送達および/または発現する限り、任意の投与方法を使用することができる。本明細書に記載の投与は、例えば、針注射(needle injection)、または当技術分野において公知の他の送達もしくは装置によるものでよい。
【０１４２】
一部の態様において、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を含む組成物、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞はブドウ球菌属感染、例えば、黄色ブドウ球菌感染から動物を防御するのに十分な抗体応答または細胞性免疫応答を刺激する。他の態様において、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を含む組成物、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は体液性応答および細胞性応答を両方とも刺激し、これらの組み合わせはブドウ球菌属感染、例えば、黄色ブドウ球菌感染から動物を防御するのに十分である。一部の態様において、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を含む組成物、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は自然免疫応答、抗体免疫応答、および/または細胞性免疫応答をさらに刺激する。
【０１４３】
一部の態様において、本明細書に記載の変異型ブドウ球菌ロイコシジンサブユニット(例えば、LukS-PVもしくはLukF-PVまたはその両方)を含む組成物、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞は黄色ブドウ球菌PVLに対する抗体応答を誘導する。ある特定の態様において、T細胞応答(例えば、T細胞エピトープ)を誘導する成分が、主として抗体応答を誘導する本明細書に記載のポリペプチドなどの成分と組み合わされる。
【０１４４】
対象における黄色ブドウ球菌感染に対する防御的免疫応答および/または治療的免疫応答をもたらす、増強する、または調節するための方法であって、治療的免疫および/または予防的免疫を必要とする対象に本明細書に記載の組成物の1つまたは複数を投与する工程を含む方法がさらに開示される。
【０１４５】
本明細書に記載の組成物は、投与されている動物の生活環の間いつでも動物に投与することができる。ヒトにおいて、他のワクチンが投与されている間に、例えば、本明細書の他の場所に記載のように多価ワクチンとして投与されている間に、本明細書に記載の組成物を投与することができ、多くの場合、有利に投与することができる。
【０１４６】
さらに、本明細書に記載の組成物は、任意の望ましい免疫化または投与レジメンにおいて、例えば、単回投与において、または年1回のワクチン接種などの定期ワクチン接種制度の一環として、または同じもしくは異なるポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの投与の前後に本開示の組成物もしくはポリペプチドもしくはポリヌクレオチドが投与されるプライム-ブースト制度のように使用することができる。最近の研究から、プライム-ブーストプロトコールは、多くの場合、ワクチンを投与する適切な方法であることが分かっている。プライム-ブーストプロトコールでは、1つまたは複数の本明細書に記載の組成物を「プライム-ブースト」レジメンにおいて使用することができる。「プライム-ブースト」レジメンの一例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Yang, Z. et al. J. Virol. 77:799-803, 2002に記載されている。
【０１４７】
処置される感染症には、皮膚、軟部組織、血液、もしくは臓器の限局性感染症もしくは全身感染症、または自己免疫疾患が含まれるが、これに限定されない。処置または予防される特定の疾患または状態には、呼吸器疾患、例えば、肺炎、敗血症、皮膚感染症、創傷感染症、心内膜炎、骨感染症および関節感染症、骨髄炎、ならびに/または髄膜炎が含まれるが、これに限定されない。
【０１４８】
免疫相関
黄色ブドウ球菌感染の多数の動物モデルが当技術分野において公知であり、過度の実験なく本明細書において開示される方法と共に使用することができる。例えば、抗菌剤試験のためにメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)肺炎ハムスターモデルが述べられている(Verghese A. et al., Chemotherapy. 34:497-503 (1988), Kephart PA. et al. J Antimicrob Chemother. 21:33-9, (1988))。さらに、成人における黄色ブドウ球菌誘発性肺炎のモデルである免疫応答性C57BL/6Jマウスが述べられている。免疫応答性C57BL/6Jマウスはヒト患者における肺炎の臨床特徴および病理学的特徴をそっくり模倣する(Bubeck-Wardenburg J. et al., Infect Immun. 75: 1040-4(2007))。さらに、McElroyらに記載のように(McElroy MC. et al., Infect Immun. 67:5541-4(1999))、黄色ブドウ球菌肺炎ラットモデルにおいてビルレンスが試験されている。最後に、新療法を評価するための標準化された、かつ再現性のあるMRSA誘発性敗血症性肺炎モデルがヒツジにおいて確立されている(Enkhbaatar P. et al., Shock. 29(5):642-9(2008))。
【０１４９】
本開示の実施では、特に定めのない限り、当技術分野の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来法が用いられる。このような技法は文献内で十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. 米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986);およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照されたい。
【０１５０】
免疫学の一般原則を示した標準的な参考図書には、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology, 6th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology, Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005);およびHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)が含まれる。
【実施例】
【０１５１】
実施例1:ワクチン候補の分子モデリングおよび設計
本実施例は、ワクチン候補を設計するために、パントンバレンタインロイコシジン(PVL)LukF-PVサブユニットおよびLukS-PVサブユニットの構造を導き出し、解析し、操作するための(コンピュータによる)分子モデリング法について説明する。
【０１５２】
弱毒化型のLukF-PVおよび/またはLukS-PVからなるワクチンを開発するために、インビボでのポアの組み立てならびにポア形成時に発生する細胞溶解作用および炎症作用を回避するようにサブユニットを改変した。各サブユニットの構造完全性を破壊することなくポア形成を無くす変異を受ける可能性のある、LukF-PVタンパク質表面およびLukS-PVタンパク質表面にある領域を特定するために、Aman et al. J Biomol Struct Dyn 28, 1-12, 2010に記載のように、LukF-PV/LukS-PVヘテロ二量体および八量体の構造をモデル化した。簡単に述べると、LukF-PV単量体およびLukS-PV単量体をそれぞれ1PVL結晶構造および1T5R結晶構造から抽出した。それぞれの構造の中の欠けている残基をモデル化してポリペプチドに入れた。結果として生じた構造のエネルギーをテザードミニマイゼーション(tethered minimization)を用いて精巧にした。それぞれのサブユニットは八量体環状構造において2つの相互作用面を有するので、それぞれのサブユニットにおける結合相互作用を十分に解明するために2つの異なるLukF-PV/LukS-PVヘテロ二量体モデルを構築することが必要であった。これらの2つの分子モデルはFR-SLおよびSL-FRであると特定された。この名前は、LukF-PV構成要素およびLukS-PV構成要素が八量体環状構造において隣り合わせに並んでいる関係に基づいている。FおよびSは2つの種類を表し、下付きのRおよびLはそれぞれ右面および左面を指している。FR-SLモデルにあるチャンネル内腔の内側から2つのサブユニットを見ると、LukF-PV(FR)の右側はLukS-PV(SL)の左側と結合している、または、SL-FRモデルでは、LukS-PV(SL)の右側はLukF-PV(FR)の左側と結合している。Red Hat Enterprise Linux 4が入っているDell Precision 690で動作するDiscovery Studio 2.1(Accelrys, Inc)プログラムを用いてタンパク質モデルを構築、視覚化、および解析した。シミュレーションをCHARMM力場において1の距離依存性誘電率(distance-dependent dielectric)および14Å以内に限定される非結合相互作用(nonbonded interaction)を用いて減圧下で行った。モデル構築におけるテンプレートはAman et al.に開示されている。
【０１５３】
FR-SLモデルから、Thr28側鎖は、隣接するLukF-PVサブユニットにある残基Asn158およびPhe159のポリペプチドバックボーンに接して緊密に詰め込まれていることが分かる(図1)。
【０１５４】
オリゴマー化にとって極めて重要な可能性のある他の相互作用部位を特定するために、前記の分子モデリングを用いて、変異した場合に単量体のほうを選んで単量体-二量体平衡定数を大きくシフトするホットスポットがあるかどうか、PVL八量体モデルの中にあるFR-SL境界面およびSR-FL境界面をスキャンした。成熟LukS-PVでは、これらの部位は、FR-SL境界面モデルから特定されたTyrl31およびSer209ならびにSR-FLモデルから特定されたLys97およびAsp101であった。成熟LukF-PVにある対応する部位はFR-SLモデルではLys102およびAsp121であり、SR-FLモデルではGlu147およびAsn220であった。
【０１５５】
二量体化に及ぼすそれぞれの変異体の影響を確かめるために使用した測定基準の1つとして、これらの位置をThr28の外側にある残基についてはアラニンに、Thr28についてはフェニルアラニンにインシリコで変異させた。一点変異複合体および二点変異複合体をエネルギー最小化し、これらの分子エネルギーを野生型と比べて計算した。分子モデルにおいてLukS-PVにあるLys97、Asp101、およびTyr131ならびにLukF-PVにあるLys102、Asp121、およびGlu147を同様にアラニンに変異させると、野生型と比べて複合体のエネルギー計算値が大幅に増加した(前記の表1を参照されたい)。不安定化エネルギーの最も劇的な増加はLukS-PVのSer209Ala変異体において観察された。Ser209はLukS-PVにおいてループ構造とストランド構造をつなぎ、LukS-PVのSer209とLukF-PVのLys102との間の二量体境界面の中央付近に埋もれている(図2)。
【０１５６】
前記部位における一点変異は、単量体のほうを選んでPVLの単量体-ヘテロ二量体平衡をシフトすることが予想された。これらの変異体をワクチン開発の候補として選択した。
【０１５７】
文献中にLukS-PV表面にあるThr28は二量体化において役割を果たすと報告されている(V. Guillet et al., The Journal of Biological Chemistry 279: 41028-41037(2004))。二重変異体におけるThr28の潜在的な有用性を調べた。この予備分析において、二重変異体Thr28Phe/Tyr131AlaおよびThr28Phe/Ser209Alaならびに三重変異体Thr28Phe/Tyr131Ala/Ser209Alaをインシリコで調べた。エネルギー計算に基づいて、Thr28Phe/Ser209Ala変異体に最も大きな影響があり、これに三重変異体が続いた。表1は、提案された異なるLukS-PVの単一変異および二重変異の結果としてのヘテロ二量体複合体構造におけるエネルギー計算値の増加も示す。
【０１５８】
実施例2:LukS-PV変異体およびLukF-PV変異体の作製
変異を八量体モデルに基づいて設計し、精製目的でN末端6xHisタグを有する、LukS-PVおよびLukF-PVのcDNA構築物に導入した。それぞれの成熟タンパク質配列をコードする野生型LukS-PV DNA断片およびLukF-PV DNA断片をPCRによって合成し、BamHIおよびKpnI制限酵素で処理して付着末端を作り出し、BamHIおよびKpnI制限酵素で消化したpQE30ベクター(Qiagen)にクローニングした。QickChangeRII Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて変異をDNAに導入した。野生型LukS-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 123として示す。変異型(K97A)LukS-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:124として示す。変異型(D102A)LukS-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:125として示す。変異型(Y131A)LukS-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:126として示す。変異型(S209A)LukS-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:127として示す。変異型(T28F)LukS-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:128として示す。変異型(T28F/Y131A)LukS-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:129として示す。変異型(T28F/S209A)LukS-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:130として示す。変異型(T28F/K97A/S209A)LukS-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:131として示す。野生型LukF-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:132として示す。変異型(K102A)LukF-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:133として示す。変異型(D121A)LukF-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:134として示す。変異型(E147A)LukF-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:135として示す。
【０１５９】
表1に列挙したLukF-PV三重変異体(K102A/D121A/E147A)をコードするプラスミド構築物も前記のように作製した。LukF-PV三重変異体(Lys102Ala(K102A)/Asp121Ala(D121A)/Glul47Ala(E147A))の成熟タンパク質配列を、変異アミノ酸に下線を引いて以下に記載し、SEQ ID NO:136として示す。
0006325452.tif 000010
【０１６０】
三重変異型(K102A/D121A/E147A)LukF-PVをコードするプラスミド構築物のヌクレオチド配列を以下に記載し(クローニング部位BamHIおよびKpnIに下線を引いた。変異に二重下線を引いた。終結コドンはイタリック体である)、SEQ ID NO:137として示す。
0006325452.tif 000011
【０１６１】
前記の構造分析に基づいて選択された変異体は、5種のLukS-PV単一変異体、2種のLukS-PV二重変異体、および1種のLukS-PV三重変異体、ならびに4種のLukF-PV単一変異体および1種のLukF-PV三重変異体を含んだ(表1)。変異型タンパク質とHisタグ化野生型サブユニットを大腸菌XL1-Blue株[recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB laqIqZΔM15 Tn10(Tetr)]において産生させ、製造業者の説明書に従って使用したHisTrap(商標)HPカラム(GE Healthcareカタログ番号17-5248-02)によって精製した。一般的な技法を用いたSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)およびそれぞれの抗体(LukS-PV:V5184ウサギポリクローナルAb(Genscript)、LukF-PV: 1A11mA(IBT))を用いたウェスタンブロッティングによって、全てのタンパク質が品質管理された。
【０１６２】
LukS-PV Mut9、LukF-PV Mut1、およびLukF-PV三重変異体(K102A/D121A/E147A)のSDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析を図7A〜Cに示した。
【０１６３】
実施例3:LukS-PV変異体およびLukF-PV変異体の弱毒化
好中球毒性アッセイにおいて、LukS-PV変異体およびLukF-PV変異体をそれぞれ野生型LukF-PVまたは野生型LukS-PVと組み合わせて、LukF-PV変異体を野生型LukS-PVと組み合わせて試験した。96ウェル丸底組織培養プレートを用いて、野生型または変異型のLukS-PVまたはLukF-PVタンパク質を2回繰り返してプレート中でアッセイ培地(RPMI、2％FBS、5mMグルタミン)で半対数希釈(semi-log dilute)した後に、5x105DMSOによって誘導されたHL-60細胞を添加した。HL-60細胞をDMSO処理することによって好中球に分化させた。懸濁液を軽くたたき、プレートを37℃、5％CO2および95％湿度で48時間インキュベートした。細胞生存率を求めるために、それぞれのウェルに20μLの2mg/mL希釈XTT(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を添加し、37℃、5％CO2および95％湿度で6時間インキュベートし、遠心分離し、上清をELISAプレートに移し、470nmまで読み取った。生存率(％)を以下の通り求めた:生存率(％)=(実験試料ウェルのOD値/PVL毒素を含まないHL-60細胞のOD値)×100。データを図3および図4に細胞生存率(％) として示す。
【０１６４】
変異型LukS-PVデータから、単一変異体または二重変異体は、それぞれ野生型LukF-PVと複合体化した状態でLukS-PV毒性をわずかに低下させが、変異T28F、K97A、およびS209Aを組み合わせた三重変異体はほぼ完全な弱毒化につながったことが分かった。三重変異体と野生型LukF-PVの組み合わせの存在下では細胞の90％以上が生き残った(図3)。
【０１６５】
変異型LukF-PVタンパク質を、前記のように好中球毒性アッセイにおいて、野生型LukS-PVまたはLukS-PV三重変異体(T28F、K97A、およびS209A)と組み合わせて試験した。図4に示したように、単一変異はそれぞれ野生型LukS-PVと組み合わされた時にLukF-PVの毒性を低下させた。試験した3種のLukF-PV変異体のうちK102A変異体は最も高い弱毒化度を示し、300ng/mlで毒性は完全に消失し、3000ng/mlで毒性は約50％低下した。LukS-PV三重変異体と組み合わされた時に3種全てのLukF-PV変異体(LukF K102A、LukF D121A、およびLukF E147A)が完全な不活性化を示した。
【０１６６】
実施例4:市中感染性黄色ブドウ球菌株USA300(LAC)による致死曝露からマウスを防御する、PVLに対するポリクローナル抗体
抗PVLポリクローナル抗体が、マウスにおいて黄色ブドウ球菌USA300によって引き起こされる菌血症から防御する能力を試験した。この試験のために、SEQ ID NO:6によって示されるLukS-PVの野生型配列およびN末端6xHisタグを含有するHisタグ化タンパク質で免疫化することによってウサギにおいてポリクローナル抗体を作製した。過免疫血清からポリクローナル抗体(全IgG)をプロテインGカラムで精製した。さらに、Amino Link(登録商標)Plus Immobilization Kit(Thermoscientific)を用いて全IgGから特異的抗LukS-PV抗体を精製した。キットは、試薬、カラム、およびアフィニティカラムにビーズを詰めるのに必要な緩衝液を含んだ。LukS-PVタンパク質と結合したビーズおよびポリクローナル抗LukS-PV抗体のアフィニティ精製は製造業者のプロトコールに従って行った。さらに、抗LukS-PV抗体が抗αヘモリシン抗体(Hla)と協力する能力を試験するために、抗LukS-PV抗体および抗Hlaポリクローナル抗体の組み合わせを調べた。Fattom et al., Infect Immun 64, 1659-1665, 1996に開示された、Hog-Mucinと混合した黄色ブドウ球菌を腹腔内経路によってBALB/cマウスに曝露するモデルを適用した。曝露の24時間前に、示された抗体でマウスを前処置した。ナイーブマウスIgGを対照として使用した。5x104個のUSA300および3％Hog-Mucin(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)への曝露後にマウスの罹患率および死亡率を5日間モニタリングした。表3に示したように、ナイーブマウスIgGで処置した全てのマウスが曝露後16〜20時間以内に死亡した。対照的に、50ugの精製抗LukS-PVを与えた5匹のマウスのうち3匹および2mgの抗Hla全IgGを与えた5匹のマウスのうち2匹が生存した。このことは、それぞれの成分が防御に寄与したことを示唆している。2mgの抗Hla IgGが50μgまたは25μgの精製抗LukS-PV抗体と組み合わされた時に、100％の生存が観察された。さらに低用量の精製抗LukS-PV(12.5μg)が抗Hlaに添加された時に、いずれかの成分が単独で実現する生存より高い80％の生存につながった。これらのデータは、LukS-PVワクチンまたはHlaワクチンの組み合わせによるワクチン接種によって、黄色ブドウ球菌菌血症に対する相加的または相乗的な防御効果が得られる可能性があることを示唆している。
【０１６７】
（表３）LukS-PVおよびHlaに対する抗体による、USA300菌血症に対する防御
0006325452.tif 000012
【０１６８】
実施例5:ブドウ球菌二成分ポア形成毒素の配列同一性
LukS、LukM、LukM、LukE、およびHIgA/Sの間の配列同一性を比較した。黄色ブドウ球菌γヘモリシン(Hlg)、ロイコシジン(Luk)、およびPVLは、関連する二成分ポア形成毒素であった(Kaneko et al., Biosci Biotechnol Biochem, 2004. 68(5): p.981-1003)。
【０１６９】
図5に示したように、LukS-PVはLukS、LukM、LukE、およびHIgA/Cと65％〜81％の高い配列同一性を有する。本明細書において試験された弱毒化三重変異型LukS-PVワクチン候補において変異誘発された3つ全ての部位がファミリー全体にわたって保存されていることが示された(図5の*が付いたボックスに示した)。同様に、LukF-PVはLukF、LukD、LukDv、およびHlgBと高度に相同であることが示され、本明細書において試験されたLukS-PVワクチンにおいて変異された部位が保存されていた。この相同性と一致して、LukS-PVポリクローナル抗体は、PVL陽性株(USA300&400)だけでなく、Newmanおよび8325-4などのPVL欠損株の上清中にあるPMNに対する細胞傷害活性を阻害することが示された(図6)。これらのデータから、PVLサブユニットに対して誘発された抗体はさらに広範囲の反応性を示し、非PVLロイコシジンを中和したことが分かった。
【０１７０】
実施例6:変異型タンパク質のインビトロでの構造的特徴付けおよび機能的特徴付け
本明細書において開示されるLukS-PV変異体およびLukF-PV変異体の機能活性を、好中球に分化させたHL-60細胞を用いた細胞傷害性アッセイ(Romero-Steiner et al., Clin Diagn Lab Immunol, 1997. 4(4): p.415-22)において試験した。変異体の構造完全性を保証するために、これらのタンパク質と野生型対応物を円二色性(CD)分光法によって分析した。さらに、タンパク質の熱安定性を、示差走査蛍光定量法(DSF)を用いて確かめた。
【０１７１】
細胞傷害性分析:
細胞傷害性は、それぞれの変異型サブユニットと野生型の他のサブユニットの組み合わせを使用し、インビトロで好中球に分化させたHL-60細胞(ATCC, カタログ番号CCL-240)を使用して試験した(Romero-Steiner et al.)。HL-60細胞をRPMI/15％FBSおよび1.6％ジメチルスルホキシド(DMSO)の中で6日間、増殖させた。分化好中球に似た細胞を収集し、PVL毒性アッセイのために5x105細胞/ウェルの最終密度で96ウェルプレートに移した。それぞれのPVLサブユニット(変異型または野生型)を200ng/mlで使用した。細胞を37℃で48時間インキュベートし、100μg/mlのXTT(Sigma-Aldrich)とさらに16時間インキュベートし、OD470nmで比色測定した後に細胞生存率を評価した。次いで、毒素を含まないウェルを比較して細胞の生存率(％)を計算した。
【０１７２】
図8Aに示したように、LukS-PV単一変異体は野生型LukFと組み合わされた時にPVL毒性に有意な影響を及ぼさなかった。二重変異体はPVL毒性をわずかに低下させた。しかしながら、三重変異型LukS-PV_T28F/K97A/S209A(Mut9として示される)は野生型LukFと組み合わせられたのにもかかわらず完全に弱毒化された(図8A)。3種全てのLukF単一変異体が用量反応曲線において右側シフトを引き起こし、LukF_K102A(Mut1として示される)で最も高い弱毒化が実現した(図8B)。この変異体がLukS Mut9と組み合わされた時に、毒性は観察されなかった(図8B)。LukF mut1が高濃度近くの野生型LukSと組み合わされた時に低毒性が観察された。LukF三重変異体(K102A/D121A/E147A)を構築および試験した。図8Cに示したように、三重LukF変異体は野生型LukSと組み合わされた時に完全に弱毒化され、LukS mut9と組み合わされた時にも完全に弱毒化された。
【０１７３】
熱安定性分析:
LukS-PV変異型タンパク質およびLukF-PV変異型タンパク質の熱安定性をThermofluor(示差走査蛍光定量法)によって、外部蛍光プローブとして、疎水性残基に結合してタンパク質アンフォールディング中の疎水性残基露出を検出するSypro Orangeを使用して評価した。臨界温度を超えて(LukSおよびLukF-PVの場合は>70℃)加熱された時に、タンパク質の折り畳みがほどける傾向がある。これにより蛍光が増加するが、アンフォールディングが凝集につながるのであれば、結果は蛍光の減少である。この蛍光シグナルの増加および減少は、タンパク質アンフォールディングをモニタリングし、融解温度を計算し、異なる実験条件下で異なるタンパク質の熱安定性を比較する手段である(Ericsson et al., Anal Biochem, 2006. 357(2): p.289-98; He et al., J Pharm Sci, 2010. 99(4): p.1707-20)。結果を図9に示した。
【０１７４】
図9Aは、色素存在下で熱アンフォールディング中のタンパク質の蛍光シグナルの変化を示すのに対して、図9Bは、Devi et al., Biochemistry, 2006. 45(6): p.1599-607に記載のように2状態方程式(two-state equation)を用いた、それぞれのタンパク質融解曲線のフィッティングに基づくアンフォールディングタンパク質率のプロットを示す。両サブユニットの野生型タンパク質および変異型タンパク質は25℃で正しく折り畳まれた時に非常に低いバックグラウンド蛍光を示し、タンパク質が安定なことを示す55℃まで強度を保持する。55℃超で融解することによってタンパク質は折り畳みがほどけるために蛍光シグナルは増加する。この急激な増加により、高度に協同的なアンフォールディングプロセスが裏付けられた。LukS-PV野生型曲線は右側にわずかにシフトした。このことは、LukS-PV野生型の安定性の方が高いことを示している。LukS-PV野生型については75℃で最大蛍光強度が観察されたのに対して、他の変異体については70℃で観察された。これらの温度より高く加熱された場合、全てのタンパク質について蛍光強度が低下した。このことは凝集事象が起こっていたことを示している。したがって、アンフォールディングタンパク質率のプロットを作り出すために75℃までしかない強度値が考慮に入れられた(図9B)。データのボルツマンシグモイド(Boltzmann Sigmoid)フィッティングからの見かけのTm値から、試験変異体全てのTmは野生型LukS(64.8)および野生型LukF(62.9)と似ている62.6〜63.6であることが分かり、変異はタンパク質の熱安定性に影響を及ぼさないことが示唆された。
【０１７５】
実施例7:臨床上関連する異なるアジュバントを用いた、マウスにおける免疫原性試験
免疫原性試験およびアジュバント試験:
免疫原性試験は、マウスにおいて2種類のアラムベースアジュバントであるAlhydrogel(Al(OH)3)およびリン酸アルミニウム(AlPO4)、ならびに現在、臨床試験中の2種の新規のアジュバント、IDC-1001(GLA-SE;グルコピラノシル脂質アジュバント安定エマルジョンとも知られる)(Coler et al., PLoS One, 2010. 5(10): p.el3677; Coler et al., PLoS One, 2011. 6(1): p.e16333)およびCpG (Mullen et al., PLoS One, 2008. 3(8): p.e2940)を含む臨床上関連する異なるアジュバントを用いて行った。
【０１７６】
5匹の雌BALB/cマウスからなる群に5μgのLukS-PV T28F/K97A/S209A(LukS-Mut9)とそれぞれのアジュバントを2週間間隔で3回、筋肉内(IM)にワクチン接種した。対照として、野生型(wt)LukS-PVならびに無関係の抗原(STEBVax;スタフエンテロトキシンBワクチン)をAlhydrogelと組み合わせた。21日目および35日目にマウスを採血した。試験されたアジュバントは全て、アジュバント無しより1log以上高い強力な全抗体応答を誘導した(図10A)。前記のようにHL-60由来好中球を用いて中和抗体力価を求めた。図10Bに示したように、アラムベースアジュバントおよびIDC-1001を用いた3回のワクチン接種後に最も高い中和力価を実現した。LukS-Mut9に対する抗体応答を野生型LukS-PVに対する応答と比較した。この結果から、変異体に免疫学的エピトープが保存されていることが裏付けられた。
【０１７７】
実施例8:マウス肺炎モデルおよび腹腔内敗血症モデルにおけるPVLワクチン候補の効力
マウス肺炎モデルおよび腹腔内敗血症モデルにおいて効力試験を行った。PVLワクチン候補を単独で、およびαヘモリシンのサブユニットワクチンであるAT-62 (Adhikari et al., PLoS One, 2012. 7(6): p.e38567)と組み合わせてPVLワクチン候補の効力を評価する試験を行った。最初に、マウスにおける菌血症モデルを使用し、エンドポイントとして致死率および細菌負荷(bacterial burden)を使用して受動免疫試験を行った。その後に、菌血症/敗血症モデルならびに肺炎モデルにおける概念実証能動免疫試験を行った。
【０１７８】
動物モデルの説明:
マウス肺炎モデルでは、雌BALB/cマウスをイソフルランで麻酔し、50μlのPBSに溶解した致死用量(約2x108)のUSA300を鼻腔内に(IN)接種し、うつぶせの体位にしてケージに入れ、罹患率(体重、背中を丸めた姿勢、努力呼吸、くしゃくしゃの毛、運動障害)および死亡率を最初の48時間以内には1日4回、次いで試験終了まで1日1回モニタリングした。菌血症モデルでは、Fattom et al., Infect Immun, 1996. 64(5): p.1659-65に以前に述べられたように、3％ムチン溶液に溶解したUSA300を腹腔内(IP)注射によって雌BALB/cマウスに曝露した。簡単に述べると、凍結乾燥されたhogムチンIII型をPBSに溶解して6％まで可溶化し、加圧滅菌によって滅菌し、氷上で急速冷却した。PBSで洗浄し、一晩増殖させた細菌を2x105CFU/mlでPBSに懸濁した。0.5mlの3％hogムチンの中で意図された曝露用量(以下の表4を参照されたい)となるように細菌およびムチン溶液を混合した。マウスの罹患率および死亡率を7〜14日間、1日2回モニタリングした。能動免疫原性試験用のマウスは6週齢であり、受動免疫原性試験用のマウスは10週齢であった。臓器への細菌散在を確かめるために、曝露して12時間後にマウスを安楽死させ、血液ならびに臓器(肝臓、両腎臓、肺、および脾臓)を無菌的に取り出し、ホモジナイズし、500μlのPBSに入れて採取した。血液試料および臓器ホモジネートを異なる希釈度でBHI寒天プレートに画線し、37℃でONインキュベーション後にCFUを数えた。
【０１７９】
受動免疫試験:
LukS-PVに対するウサギポリクローナル抗体(LukS-IgG)およびHlaに対するウサギポリクローナル抗体(AT62-IgG)の単独または組み合わせによる効力を菌血症モデルにおいて調査した。5匹のマウスからなる群に異なる用量の抗体をIP注射し、24時間に曝露し、7日間モニタリングした。表4(実験1)に示したように、0.25mgと低いLukS-IgGが完全防御を提供した。対照的に、100％の防御を提供するためには4mgのAT62-IgGが必要とされ、部分効力には2.5mgが必要とされた(表4(実験2)を参照されたい。
【０１８０】
（表４）USA300菌血症モデルにおける、LukSおよびα毒素に対するウサギポリクローナル抗体を用いた受動免疫の効力
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【０１８１】
次に、アフィニティ精製LukS-IgGを最適以下の用量(2mg)のAT62-IgGと組み合わせた。表5に示したように、50μgのアフィニティ精製LukS-IgGまたは2mgのAT62-IgGは部分防御を提供したのに対して、これらの用量の2種の抗体の組み合わせはマウスを完全防御した。2mgのAT62-IgGおよび25μgのアフィニティ精製LukS-IgGでも完全防御は観察され、12.5μgのLukS抗体と2mgのAT62-IgGとの組み合わせを用いて5匹のマウスのうち4匹が生存した。
【０１８２】
（表５）USA300菌血症モデルにおける、LukSおよびα毒素に対するウサギpAbの組み合わせ受動免疫試験
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【０１８３】
一組の類似試験において、USA300曝露の12時間後に求められた細菌散在に対するAT62-IgGおよびLukS-IgGを用いた前処置(曝露の24時間前)の相乗効果を試験した。図11に示したように、2種の抗体は強く協力して血液および臓器における細菌負荷を低下させた。これらのデータから、LukSおよびα毒素に対する抗体は致死性の菌血症および敗血症からの防御において相乗作用することが強く裏付けられた。
【０１８４】
BALB/cマウスにおいてLukS-PV mut9およびLukF-PV mut1とα毒素ワクチンAT-62との組み合わせの効力を試験した。10匹のマウスからなる群を、10μgのそれぞれのワクチンまたはBSA(対照として)で個々に、または2つ組み合わせてもしくは3つ組み合わせてAlPO4と一緒に1:8比、2週間間隔で3回、IM免疫化した。菌血症/敗血症モデルの場合、42日目に、3％ムチンに溶解した1xLD90のUSA300(5x104CFU)をマウスにIP曝露し、7日間モニタリングした。図12Aに示したように、S変異体およびF変異体はそれぞれ60％の防御および40％の防御を提供し、2種の変異型サブユニットを組み合わせると防御はAT-62単独に類似する80％まで増加した。3種の抗原が組み合わされた時に完全防御が観察された。肺炎モデルにおいて、USA300の高曝露用量(2x108CFU)を用いた類似試験を行った。個々の成分はいずれも有意な防御を提供しなかったが、2種のロイコシジンとAT-62を組み合わせると50％の防御につながった(P=0.0021)(図12B)。
【０１８５】
実施例9:インビボでLukS-PV mut9によって生じた交差反応性および交差中和性の抗体
免疫原性アッセイは、4匹のマウスからなる群においてLukS-PV変異体9(LukS-PV T28F/K97A/S209A)で免疫化することによって行った。4回目の免疫化の後に血清試料を収集し、野生型LukS-PV(図13A)、HlgC(図13B)、およびHlgB(図13C)に対する抗体価を求めた。これらの結果から、LukS-PV mut9による免疫化によって誘導された、HlgBおよびHlgC両方に対する交差反応性抗体が存在することがはっきりと分かる。HL-60細胞をベースとする中和アッセイに基づいて、ポリクローナル抗LukS-PV mut9抗体はPVL(野生型LukS-PV+LukF-PV)およびγヘモリシン(野生型HlgB+HlgC)ロイコトキシンを両方とも中和することが示された(図13D)。これらの実験から、LukS-PV mut9による免疫化によって交差防御性抗ロイコトキシン抗体が誘導されることがさらに確かめられ、この変異型ワクチンの広範囲の用途が裏付けられた。
【０１８６】
実施例10:ロイコシジンのオリゴマー化、およびLukS-PVに対する抗体によるオリゴマー化阻害
ロイコシジン成分のオリゴマー化は、これらの毒素が細胞傷害性になるために必要な段階である。本明細書に記載の試験では、(i)LukS-PVまたはLukF-PVの中の変異がロイコシジン成分の同種オリゴマー化および/または異種オリゴマー化を妨害するかどうか、ならびに(ii)LukSに対する抗体が同種オリゴマー化および/または異種オリゴマー化を阻害するかどうかを調査した。Yamashita et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(42): p.17314-9に記載のように2-メチル-2,4-ペンタンジオール(MPD)ベースのアッセイを用いてロイコシジン成分(PVLおよびγヘモリシン)のオリゴマー化アッセイを行った。簡単に述べると、等量の両成分を40％MPDの存在下で一緒に室温で24時間インキュベートした。ボイルすることなく試料をSDS PAGEに流し、ゲルをGel Code Blue(商標)試薬で染色した。PVLオリゴマー化を阻害するために、LukS-PVを漸減濃度のウサギ抗LukS-PVポリクローナル抗体(pAb)と30分間プレインキュベートした。等量のLukF-PVを混合物に添加し、40％MPDの存在下、室温で24時間インキュベートした。試料をボイルすることなくSDS PAGEで分析し、ゲルをGel Code Blue(商標)試薬で染色した。
【０１８７】
図14A(レーン2)に示したように、野生型(wt)のLukS-PVおよびLukF-PVは160kdを超えるオリゴマーバンドを形成した。LukF-PV変異体1を野生型LukS-PVと組み合わせて類似のオリゴマーバンドが見られた(図14A、レーン3)。野生型LukS-PVとγヘモリシン成分Bとの交差オリゴマー化を示した(図14A、レーン4)。しかしながら、LukS-PV変異体9は野生型LukF-PVともLukF-PV変異体1ともオリゴマー化しなかった(図14A、レーン5および6)。このことは、LukS-PV変異体9について観察された毒性の弱毒化と一致している。この変異体は野生型γヘモリシンBサブユニットともオリゴマー化せず(図14A、レーン7)、ワクチン候補として使用するための安全性をさらに裏付けている。図14Bは、ウサギポリクローナル抗LukS抗体による野生型LukS-PV/LukF-PVオリゴマー化の用量依存的な阻害を示している。図14Cは、ウサギポリクローナル抗LukS抗体がLukS-PV+hlgBの異種オリゴマー化を交差阻害できることも示した。
【０１８８】
本開示は、本開示の個々の局面の単一の例示と意図される説明された特定の態様に範囲が限定されず、機能的に等価な任意の組成物または方法が本開示の範囲内にある。実際には、本明細書に示された、および説明されたものに加えて本開示の様々な変更が前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような変更は添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０１８９】
本明細書において言及される全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照として組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に参照として本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【配列表】
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