(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィー装置であって、
装置ハウジングと；そして
前記装置ハウジング内に配置されたクロマトグラフィー担体と
を含み、前記担体は、イオン交換材料で官能化された表面またはプロテインベースのアフィニティリガンドで官能化された表面を有する多孔性無機粒子を含み、前記多孔性無機粒子は少なくとも３００オングストローム（Å）のメジアン細孔径；少なくとも０．８の細孔径分布相対スパンを有し；そして前記官能化表面は３００ｇ／ｍｏｌより大きい分子量を有する少なくとも一つの分子を含み、
前記細孔径分布相対スパンは、（ｄ９０−ｄ１０）／ｄ５０
（式中、ｄ９０は細孔容積の９０％がそれを下回る細孔径に属する細孔径であり、ｄ１０は細孔容積の１０％がそれを下回る細孔径に属する細孔径であり、そしてｄ５０はメジアン細孔径であり、測定は水銀ポロシメトリーによる）により表される比と定義される、
クロマトグラフィー装置。
【請求項２】
前記多孔性無機粒子が少なくとも５００Åのメジアン細孔径を有する、請求項１に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項３】
前記多孔性無機粒子が少なくとも８００Åのメジアン細孔径を有する、請求項１又は２に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項４】
前記多孔性無機粒子が２０ｍ２／ｇ〜２０００ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項５】
前記多孔性無機粒子が水銀ポロシメトリーにより少なくとも１ｃｃ／ｇの細孔容積を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項６】
前記多孔性無機粒子が１０μｍ〜１２０μｍのメジアン粒子寸法を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項７】
前記多孔性無機粒子が１０μｍ〜９０μｍのメジアン粒子寸法を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項８】
前記多孔性無機粒子が、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項９】
前記多孔性無機粒子が、粒子の全重量を基にして少なくとも９７重量％のＳｉＯ２を有するシリカを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１０】
前記官能化表面が、５００ｇ／ｍｏｌより大きい分子量を有する少なくとも一つの分子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１１】
前記官能化表面が、５００ｇ／ｍｏｌより大きく５００，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する少なくとも一つの分子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１２】
前記多孔性無機粒子が、官能化表面に結合された一つ又は複数のリガンドを有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１３】
前記一つ又は複数のリガンドが、スルホン酸、第四アンモニウム、ジエチルアミノエチル、カルボキシルメチルの各基；合成色素；アルキル及びアリール化合物；タンパク質；レクチン；抗体；抗原；酵素又はそれらの組合せを含む、請求項１２に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１４】
前記多孔性無機粒子が少なくとも０．９の細孔径分布相対スパンを有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１５】
前記多孔性無機粒子が少なくとも１．０の細孔径分布相対スパンを有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１６】
前記装置ハウジングが、管状ハウジング部材と、少なくとも一つの別の取り付け可能な管状ハウジング部材端部キャップとを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１７】
前記装置ハウジングが、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１８】
前記装置ハウジングが生分解性ポリマー材料を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置の製造法であって、前記方法は、
多孔性無機粒子を装置ハウジングに組み込む工程を含む方法。
【請求項２０】
さらに、
装置ハウジングを熱成形工程によって形成することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記熱成形工程が、管状ハウジング部材と、少なくとも一つの別の取り付け可能な管状ハウジング部材端部キャップを熱成形することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、
一つ又は複数のバリデーション試験によってクロマトグラフィー装置をバリデーションすることを含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置の使用法であって、前記方法は、
クロマトグラフィー装置をクロマトグラフィーシステムの操作位置内に配置し；そして
流体をクロマトグラフィー装置に通して処理する
ことを含む方法。
【請求項２４】
流体が一つ又は複数の生体分子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
流体が、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体、ウィルス、ワクチン又はそれらの任意の組合せを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、クロマトグラフィーシステム内での定置洗浄工程を含まない、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置の使用法であって、前記方法は、
クロマトグラフィー装置を使用者に供給することを含み、前記供給工程は、プレパックされバリデーションされたクロマトグラフィー装置を使用者に供給することを含む方法。
【請求項２８】
クロマトグラフィー担体であって、
イオン交換材料で官能化された表面またはプロテインベースのアフィニティリガンドで官能化された表面を有する多孔性無機粒子を含み、前記多孔性無機粒子は少なくとも３００オングストローム（Å）のメジアン細孔径；少なくとも０．８の細孔径分布相対スパンを有し；そして前記官能化表面は３００ｇ／ｍｏｌより大きい分子量を有する少なくとも一つの分子を含み、
前記細孔径分布相対スパンは、（ｄ９０−ｄ１０）／ｄ５０
（式中、ｄ９０は細孔容積の９０％がそれを下回る細孔径に属する細孔径であり、ｄ１０は細孔容積の１０％がそれを下回る細孔径に属する細孔径であり、そしてｄ５０はメジアン細孔径であり、測定は水銀ポロシメトリーによる）により表される比と定義される、
クロマトグラフィー担体。
【請求項２９】
前記多孔性無機粒子が少なくとも５００Åのメジアン細孔径を有する、請求項２８に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３０】
前記多孔性無機粒子が少なくとも８００Åのメジアン細孔径を有する、請求項２８又は２９に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３１】
前記多孔性無機粒子が１ｍ２／ｇ〜２０００ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３２】
前記多孔性無機粒子が少なくとも１ｃｃ／ｇの細孔容積を有する、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３３】
前記多孔性無機粒子が１０μｍ〜１２０μｍのメジアン粒子寸法を有する、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３４】
前記多孔性無機粒子が１０μｍ〜９０μｍのメジアン粒子寸法を有する、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３５】
前記多孔性無機粒子が、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３６】
前記多孔性無機粒子が、粒子の全重量を基にして少なくとも９３重量％のＳｉＯ２を有するシリカを含む、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３７】
前記官能化表面が、５００ｇ／ｍｏｌより大きい分子量を有する少なくとも一つの分子を含む、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３８】
前記官能化表面が、５００より大きく５００，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する少なくとも一つの分子を含む、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項３９】
前記多孔性無機粒子が、官能化表面に結合された一つ又は複数のリガンドを有する、請求項２８〜３８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項４０】
前記一つ又は複数のリガンドが、スルホン酸、第四アンモニウム、ジエチルアミノエチル、カルボキシルメチルの各基；合成色素；アルキル及びアリール化合物；タンパク質；レクチン；抗体；抗原；酵素又はそれらの組合せを含む、請求項３９に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項４１】
前記多孔性無機粒子が少なくとも０．９の細孔径分布相対スパンを有する、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項４２】
前記多孔性無機粒子が少なくとも１．０の細孔径分布相対スパンを有する、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項４３】
前記多孔性無機粒子が少なくとも５００Åのメジアン細孔径を有する、請求項９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項４４】
前記多孔性無機粒子が少なくとも８００Åのメジアン細孔径を有する、請求項９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項４５】
前記多孔性無機粒子が２０ｍ２／ｇ〜２０００ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する、請求項９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項４６】
前記多孔性無機粒子が少なくとも１ｃｃ／ｇの細孔容積を有する、請求項９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項４７】
前記多孔性無機粒子が１０μｍ〜１２０μｍのメジアン粒子寸法を有する、請求項９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項４８】
前記多孔性無機粒子が１０μｍ〜９０μｍのメジアン粒子寸法を有する、請求項４７に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項４９】
前記多孔性無機粒子が、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含む、請求項９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項５０】
前記多孔性無機粒子が、粒子の全重量を基にして少なくとも９５重量％のＳｉＯ２を有するシリカを含む、請求項４９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項５１】
前記官能化表面が、５００ｇ／ｍｏｌより大きい分子量を有する少なくとも一つの分子を含む、請求項９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項５２】
前記官能化表面が、５００より大きく５００，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する少なくとも一つの分子を含む、請求項５１に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項５３】
前記多孔性無機粒子が、官能化表面に結合された一つ又は複数のリガンドを有する、請求項５１または５２に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項５４】
前記一つ又は複数のリガンドが、スルホン酸、第四アンモニウム、ジエチルアミノエチル、カルボキシルメチルの各基；合成色素；アルキル及びアリール化合物；タンパク質；レクチン；抗体；抗原；酵素又はそれらの組合せを含む、請求項５３に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項５５】
前記多孔性無機粒子が少なくとも０．９の細孔径分布相対スパンを有する、請求項９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項５６】
前記多孔性無機粒子が少なくとも１．０の細孔径分布相対スパンを有する、請求項９に記載のクロマトグラフィー装置。
【請求項５７】
前記無機粒子は、粒子の全重量を基にして少なくとも９７重量％のＳｉＯ２の純度を有する無機酸化物を含む、請求項２８に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項５８】
前記多孔性無機粒子が少なくとも５００Åのメジアン細孔径を有する、請求項５７に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項５９】
前記多孔性無機粒子が少なくとも８００Åのメジアン細孔径を有する、請求項５８に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６０】
前記多孔性無機粒子が３０ｍ２／ｇ〜２０００ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６１】
前記多孔性無機粒子が少なくとも１ｃｃ／ｇの細孔容積を有する、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６２】
前記多孔性無機粒子が１０μｍ〜１２０μｍのメジアン粒子寸法を有する、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６３】
前記多孔性無機粒子が１０μｍ〜９０μｍのメジアン粒子寸法を有する、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６４】
前記多孔性無機粒子が、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含む、請求項５７〜６３のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６５】
前記多孔性無機粒子が、粒子の全重量を基にして少なくとも９７重量％のＳｉＯ２を有するシリカを含む、請求項５７〜６４のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６６】
前記官能化表面が、５００ｇ／ｍｏｌより大きい分子量を有する少なくとも一つの分子を含む、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６７】
前記官能化表面が、５００より大きく５００，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する少なくとも一つの分子を含む、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６８】
前記多孔性無機粒子が、官能化表面に結合された一つ又は複数のリガンドを有する、請求項５７〜６７のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項６９】
前記一つ又は複数のリガンドが、スルホン酸、第四アンモニウム、ジエチルアミノエチル、カルボキシルメチルの各基；合成色素；アルキル及びアリール化合物；タンパク質；レクチン；抗体；抗原；酵素又はそれらの組合せを含む、請求項６８に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項７０】
前記多孔性無機粒子が少なくとも０．９の細孔径分布相対スパンを有する、請求項５７〜６９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【請求項７１】
前記多孔性無機粒子が少なくとも１．０の細孔径分布相対スパンを有する、請求項５７〜６９のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、クロマトグラフィー担体及びクロマトグラフィー担体を含有するクロマトグラフィー装置、クロマトグラフィー装置の製造法、及びクロマトグラフィー装置の使用法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]当分野においては、クロマトグラフィー操作における生産性及びプロセス効率の増大が求められている。
【発明の概要】
【０００３】
[0003]本発明は、クロマトグラフィー担体及びそのようなクロマトグラフィー担体を含有するクロマトグラフィー装置の導入によって、上記困難及び問題の一部に取り組んでいる。開示されたクロマトグラフィー装置は、従来のクロマトグラフィー操作に優る一つ又は複数の下記利点のために、より効率的、生産的及び／又は環境に優しいクロマトグラフィー操作を可能にする。すなわち、使用者による装置充填工程の排除；定置洗浄（clean-in-place,ＣＩＰ）工程の排除；水酸化ナトリウム溶液を利用する定置洗浄（ＣＩＰ）工程の排除；使用者による何らかのバリデーション（妥当性確認）工程の排除；及び生分解性材料を含むクロマトグラフィー装置の使用、といった利点である。
【０００４】
[0004]一つの例示的態様において、本発明のクロマトグラフィー担体は、官能化表面を有し、そして少なくとも約３００オングストローム（Å）、又は少なくとも約３００Å〜約３０００Åまでのメジアン細孔径を有する多孔性無機粒子を含む。多孔性無機粒子は、少なくとも約４００Å（又は少なくとも約５００Å；又は少なくとも約６００Å；又は少なくとも約７００Å；又は少なくとも約８００Å；又は約１０００Åより大）のメジアン細孔径を有しうる。別の例示的態様において、無機粒子は、少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、又は約３０ｍ２／ｇ、最大約２０００ｍ２／ｇまでのＢＥＴ表面積を有しうる。無機粒子は、少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、少なくとも約３０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約３５ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有しうる。無機粒子は、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１の細孔径分布相対スパンを有しうる。無機粒子は、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１、最大約２．０までの細孔径分布相対スパンを有しうる。別の態様において、粒子は、少なくとも約３００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約４００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約５００ｇ／ｍｏｌ、最大約５００，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する少なくとも一つの分子を含む官能化表面を有しうる。別の態様において、粒子は、粒子の全重量を基にして、少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９４重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９５重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９６重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９７重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９８重量％のＳｉＯ２、最大１００重量％までのＳｉＯ２の純度を有するシリカを含みうる。
【０００５】
[0005]本発明は、クロマトグラフィー担体又は保持体の製造法にも向けられる。本発明の一態様において、担体は、非圧縮性無機樹脂の使用により、アフィニティークロマトグラフィーのみならず、イオン交換、疎水性相互作用などのクロマトグラフィーのためにも処理量（スループット）を増大するように設計されている。一つの例示的方法において、クロマトグラフィー担体の製造法は、多孔性無機粒子を処理してその上に官能化表面を形成することを含み、その多孔性無機粒子は、少なくとも約３００オングストローム（Å）、又は少なくとも約３００Å〜約３０００Åまでのメジアン細孔径を有する。多孔性無機粒子は、少なくとも約４００Å（又は少なくとも約５００Å；又は少なくとも約６００Å；又は少なくとも約７００Å；又は少なくとも約８００Å；又は約１０００Åより大）、最大約６０００Åまでのメジアン細孔径を有しうる。別の例示的態様において、無機粒子は、少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、又は約３０ｍ２／ｇ、最大約２０００ｍ２／ｇまでのＢＥＴ表面積を有しうる。無機粒子は、少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、少なくとも約３０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約３５ｍ２／ｇ、最大約１５０ｍ２／ｇまでのＢＥＴ表面積を有しうる。無機粒子は、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１の細孔径分布相対スパンを有しうる。無機粒子は、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１、最大約２．０までの細孔径分布相対スパンを有しうる。別の態様において、粒子は、少なくとも約３００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約４００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約５００ｇ／ｍｏｌ、最大約５００，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する少なくとも一つの分子を含む官能化表面を有しうる。別の態様において、粒子は、粒子の全重量を基にして、少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９４重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９５重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９６重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９７重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９８重量％のＳｉＯ２、最大１００重量％までのＳｉＯ２の純度を有するシリカを含みうる。
【０００６】
[0006]別の例示的態様において、本発明のクロマトグラフィー装置は、ハウジングと；そのハウジング内に配置された多孔性無機粒子とを含み、多孔性無機粒子は、官能化表面を有し、そして少なくとも約３００オングストローム（Å）、又は少なくとも約３００Å〜約６０００Åまでのメジアン細孔径を有する。多孔性無機粒子は、少なくとも約４００Å（又は少なくとも約５００Å；又は少なくとも約６００Å；又は少なくとも約７００Å；又は少なくとも約１０００Å；又は少なくとも約２０００Å；又は少なくとも約３０００Å；又は少なくとも約４０００Å）、最大約６０００Åまでのメジアン細孔径を有しうる。別の例示的態様において、無機粒子は、少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、又は約３０ｍ２／ｇ、最大約２０００ｍ２／ｇまでのＢＥＴ表面積を有しうる。無機粒子は、少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、少なくとも約３０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約３５ｍ２／ｇ、最大約１５０ｍ２／ｇまでのＢＥＴ表面積を有しうる。無機粒子は、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１の細孔径分布相対スパンを有しうる。無機粒子は、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１、最大約２．０までの細孔径分布相対スパンを有しうる。別の態様において、粒子は、少なくとも約３００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約４００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約５００ｇ／ｍｏｌ、最大約５００，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する少なくとも一つの分子を含む官能化表面を有しうる。別の態様において、粒子は、粒子の全重量を基にして、少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９４重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９５重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９６重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９７重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９８重量％のＳｉＯ２、最大１００重量％までのＳｉＯ２の純度を有するシリカを含みうる。カラムハウジングは、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料から形成でき、望ましくは生分解性ポリマー材料から形成される。
【０００７】
[0007]本発明はクロマトグラフィー装置の製造法にも向けられる。一つの例示的方法において、クロマトグラフィー装置の製造法は、多孔性無機粒子をハウジングに組み込むことを含み、その多孔性無機粒子は、官能化表面と、少なくとも約３００オングストローム（Å）、又は少なくとも約３００Å〜約６０００Åまでのメジアン細孔径とを有する。多孔性無機粒子は、少なくとも約４００Å（又は少なくとも約５００Å；又は少なくとも約６００Å；又は少なくとも約７００Å；又は少なくとも約８００Å；又は約１０００Åより大；又は少なくとも約２０００Å；又は少なくとも約３０００Å；又は少なくとも約４０００Å）、最大約６０００Åまでのメジアン細孔径を有しうる。別の例示的態様において、無機粒子は、少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、又は約３０ｍ２／ｇ、最大約２０００ｍ２／ｇまでのＢＥＴ表面積を有しうる。無機粒子は、少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、少なくとも約３０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約３５ｍ２／ｇ、最大約１５０ｍ２／ｇまでのＢＥＴ表面積を有しうる。無機粒子は、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１の細孔径分布相対スパンを有しうる。無機粒子は、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１、最大約２．０までの細孔径分布相対スパンを有しうる。別の態様において、粒子は、少なくとも約３００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約４００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約５００ｇ／ｍｏｌ、最大約５００，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する少なくとも一つの分子を含む官能化表面を有しうる。別の態様において、粒子は、粒子の全重量を基にして、少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９４重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９５重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９６重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９７重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９８重量％のＳｉＯ２、最大１００重量％までのＳｉＯ２の純度を有するシリカを含みうる。クロマトグラフィー用カラムを製造する一部の方法において、該方法は、多孔性無機粒子を、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料、望ましくは生分解性ポリマー材料から形成されたカラムハウジングに組み込むことを含む。
【０００８】
[0008]本発明はさらに、クロマトグラフィー装置の使用法にも向けられる。クロマトグラフィー装置の一つの例示的使用法において、該方法は、クロマトグラフィー装置をクロマトグラフィーシステムの操作位置内に配置し；そして流体をクロマトグラフィー装置に通して処理することを含む。一部の態様において、方法は、クロマトグラフィー装置がクロマトグラフィーシステムの操作位置にある場合、一つ又は複数の生体分子を含有する流体をそのクロマトグラフィー装置に通して処理することを含む。例えば、流体は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含みうる。
【０００９】
[0009]本発明のこれら及びその他の特徴及び利点は、以下の、開示された態様の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲を検討すれば明らかになるであろう。
[0010]本発明を添付の図面を参照しながらさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】[0011]図１は、本発明の例示的なクロマトグラフィー装置の図を示す。
【図２】[0012]図２は、図１に示されたクロマトグラフィーカラムを含む例示的クロマトグラフィーシステムの図を示す。
【図３】[0013]図３は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の細孔径分布のグラフを示す。
【図４】[0014]図４は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の反応スキームを示す。
【図５】[0015]図５は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の反応スキームを示す。
【図６】[0016]図６は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の反応スキームを示す。
【図７】[0017]図７は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の反応スキームを示す。
【図８】[0018]図８は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様の反応スキームを示す。
【図９】[0019]図９は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様を製造するための反応スキームを示す。
【図１０】[0020]図１０は、本発明のクロマトグラフィー担体の例示的態様を製造するための反応スキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
[0021]本発明の原理をさらに理解してもらうために、続いて本発明の特定の態様について記載する。特定の態様の記載にあたり特定の用語が使用されるが、特定の用語の使用によって本発明の範囲を制限するつもりはないことは、それでもなお理解されるであろう。論じられる本発明の原理の変更、さらなる修正、及びそのようなさらなる適用は、本発明に関係する分野の当業者には通常思い浮かぶと考えられる。
【００１２】
[0022]本明細書及び添付のクレームにおいて、単数形の“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈上明白に他の意味に解釈すべき場合を除いて、複数形の指示対象も含むことに注意せねばならない。従って、例えば、“一つの酸化物(an oxide)”への言及は複数のそのような酸化物を含み、“酸化物(oxide)”への言及は一つ又は複数の酸化物及び当業者に公知のそれらの等価物を含むといったことなどである。
【００１３】
[0023]開示の態様の説明において使用される、例えば組成物中の成分の量、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、回収率又は収率、流速、及び同様の値、ならびにそれらの範囲を修飾している“約(about)”は、例えば、典型的な測定及び取扱い手順を通じて、これらの手順における故意でない誤りを通じて、方法を実施するために使用される成分の違いを通じて、及び同様の近似考慮を通じて発生しうる数量の変動を意味する。“約(about)”という用語は、特定の初期濃度又は混合物を有する製剤（配合物）の老化（熟成）が原因で異なる量、及び特定の初期濃度又は混合物を有する製剤（配合物）の混合又は加工が原因で異なる量も包含する。“約(about)”という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、本明細書に添付されたクレームは、これらの量の等価物を含む。
【００１４】
[0024]本明細書において、“生体分子”という用語は、生体によって産生される何らかの分子、例えば、タンパク質、多糖類、脂質、及び核酸のような大分子、ならびに一次代謝産物、二次代謝産物、及び天然産物のような小分子を意味する。生体分子の例は、細胞及び細胞残屑；抗体、タンパク質及びペプチド；ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸；内毒素；ウィルス；ワクチンなどである。生体分子のその他の例は、ＷＯ２００２／０７４７９１及び米国特許第５，４５１，６６０号に列挙されているものなどである。
【００１５】
[0025]本明細書において、“無機酸化物”は、無機成分が陽イオンで酸化物が陰イオンである二元酸素化合物と定義される。無機材料は金属を含み、メタロイドも含みうる。金属は、周期表でホウ素からポロニウムへと引かれた対角線の左側にある元素を含む。メタロイド又は半金属は、この線の右側にある元素を含む。無機酸化物の例は、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニアなど、及びそれらの混合物を含む。
【００１６】
[0026]本明細書において、“多孔性無機粒子”は、無機材料、又は無機材料（例えば、金属、半金属、及びそれらの合金；無機酸化物を含むセラミックなど）と有機材料（例えば有機ポリマー）の組合せ、例えば本質的に不均質又は均質である複合材料で構成される粒子を含む。例えば、不均質複合材料は、材料の単なる混合物、層状材料、コアシェルなどを含む。均質複合材料の例は、合金、有機−無機ポリマーのハイブリッド材料などを含む。粒子は、チェーン形、ロッド形又はラス（木摺）形を含む様々な対称、非対称又は不規則形でよい。粒子は非晶質又は結晶構造などを含む様々な構造を有しうる。粒子は、異なる組成、サイズ、形状又は物理的構造を含む粒子の混合物を含んでいても、又は表面処理が異なる以外は同じであってもよい。粒子の多孔率(porosity)は、粒子内の多孔率であっても、又は小粒子が凝集して大粒子を形成している場合、粒子間の多孔率であってもよい。一つの例示的態様において、粒子は、無機酸化物、硫化物、水酸化物、炭酸塩、ケイ酸塩、リン酸塩などの無機材料で構成されるが、好ましくは無機酸化物である。これは任意の公知法によって形成できる。例えば、コロイド粒子を形成する場合のような溶液重合、溶融粒子を形成する場合のような連続火炎加水分解、ゲル化粒子を形成する場合のようなゲル化、沈殿、噴霧、型取り、ゾル−ゲルなどであるが、これらに限定されない。
【００１７】
[0027]本明細書において、“規則性多孔体”という用語は、細孔径分布が０．５未満という相対スパン（本明細書中に定義の通り）を有するような非常に狭い細孔径分布を持つ構造秩序を有する多孔性粒子のことを言う。
【００１８】
[0028]本明細書において、“不規則性多孔体”という用語は、細孔径分布が０．５を超える相対スパン（本明細書中に定義の通り）を有するような均一でない細孔径分布（すなわち、多峰性の非常に広い細孔径分布）を有する多孔性粒子のことを言う。
【００１９】
[0029]本明細書において、“官能化表面”という用語は、粒子表面（粒子の外側部分の表面領域及び／又は内部細孔の表面領域を含む）の少なくとも一部の湿潤性又は選択性を変更するために、官能性化合物との反応によって表面修飾されている無機粒子を意味する。官能化表面は、結合相（共有結合又はイオン結合）、被覆表面（例えば逆相Ｃ１８結合）、クラッド表面（例えばＥＰ６におけるような炭素クラッド）、重合表面（例えばイオン交換）、固有表面（例えば無機／有機ハイブリッド材料）などを形成するために使用できる。例えば、無機粒子をオクタデシルトリクロロシランと反応させると、シランが無機表面に共有結合することによって“逆相”が形成される（例えば、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８など）。別の例では、無機粒子をアミノプロピルトリメトキシシランと反応させた後、アミノ基を四級化すると“陰イオン交換相”が形成される。第三の例では、結合相は、無機粒子をアミノプロピルトリメトキシシランと反応させた後、酸塩化物でアミドを形成させることによって形成できる。他の結合相は、ジオール、シアノ、陽イオン、アフィニティー、キラル、アミノ、Ｃ１８、親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、混合モード、サイズ排除などを含む。結合相又は官能化表面の一部として、米国特許第４，８９５，８０６号に示されているように、リガンドを使用すれば標的分子又は生体分子（例えばリゲート）との特異的相互作用を提供することもできる。
【００２０】
[0030]本明細書において、“分子量”という用語は、特定化合物又はポリマーの単一分子のモル質量を意味すると定義される。
[0031]本明細書において、“クロマトグラフィー”という用語は、移動相に溶解させた混合物を、カラム又はカートリッジ又はその他の容器内に収容された固定相（すなわちクロマトグラフィー担体）に通し、標的分子を混合物中の他の分子から分離し、それを単離することを可能にするプロセスを意味する。使用されるクロマトグラフィーの種類に応じて、標的分子は固定相上に吸着されうるが望まざる成分は装置を通過するか、又はその逆である。“液体クロマトグラフィー”という用語は、液体が移動相として使用され、固体又は固体保持体上の液体が固定相として使用されるクロマトグラフィーの形態である。“フラッシュクロマトグラフィー”という用語は、陽圧下（例えば最大３００ｐｓｉ）で実施される液体クロマトグラフィーを意味する。“高速液体クロマトグラフィー”（ＨＰＬＣ）という用語は、高陽圧下（例えば最大約５０００ｐｓｉ）で実施される液体クロマトグラフィーを意味する。“分取クロマトグラフィー”という用語は、標的化合物又は分子を単離及び精製するためのＨＰＬＣを意味する。“高速タンパク質液体クロマトグラフィー”（ＦＰＬＣ）という用語は、生体分子の分離に有用なＨＰＬＣの形態である。
【００２１】
[0032]本明細書において、“不純物”という用語は、無機粒子中に存在する、その無機物以外の物質を意味する。
[0033]本明細書において、無機粒子に適用される“不規則”という用語は、粒子ごとの粒子形状が一様でなく（すなわちランダムな粒子形状）、アスペクト比が１．０より大きいことを意味する。
【００２２】
[0034]本明細書において、“ハウジング”という用語は、クロマトグラフィーで使用する固定相を保持するための容器又はコンテナを意味し、カートリッジ、カラム、管、デバイス、ベッド、バッグなどを含む。
【００２３】
[0035]本明細書において、“固定相”又は“クロマトグラフィー担体”又は“クロマトグラフィー保持体”という用語は、サンプル混合物中の異なる成分に対して異なる親和性を示す官能化表面（例えば、無機粒子の表面に何らかの官能基を介して結合されているリガンド）を含む材料を意味し、標的分子（例えばリゲート）を一つ又は複数のその他の分子の混合物から分離するためにクロマトグラフィーで使用される。固定相は、有機及び無機材料、又はそれらのハイブリッドを含み、粒子、モノリス、膜、コーティングなどの形態でありうる。
【００２４】
[0036]本明細書において、“細孔径分布”という用語は、多孔性無機粒子の代表体積中の各細孔径の相対存在量を意味する。本明細書において、“メジアン細孔径”は、粒子内細孔容積の５０％が属する孔径である。図３参照。
【００２５】
[0037]本明細書において、“相対スパン”という用語は、細孔径分布の幅の尺度を意味すると定義される。“スパン”は、水銀ポロシメトリーによる測定で、ｄ９０細孔径（細孔容積の９０％がそれを下回る細孔径に属する）からｄ１０細孔径（細孔容積の１０％がそれを下回る細孔径に属する）を引くことによって測定される。“相対スパン”という用語は（ｄ９０−ｄ１０）／ｄ５０の比と定義され、図３に示されている。
【００２６】
[0038]本発明はクロマトグラフィーカラムに向けられる。本発明はさらに、クロマトグラフィーカラムの製造法ならびにクロマトグラフィーカラムの使用法にも向けられる。例示的なクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィーカラムの製造法、及びクロマトグラフィーカラムの使用法の説明を以下に提供する。
【００２７】
[0039]図１に、本発明の例示的クロマトグラフィーカラム１００の図を提供する。図１に示されているように、例示的クロマトグラフィーカラム１００は、カラムハウジング１５０；カラムハウジング１５０内に配置された担体ベッド空間１５１を含む。望ましくは、担体１５１は、少なくとも１０オングストローム（Å）のメジアン細孔径を有する多孔性無機粒子を含む。図１にさらに示されているように、カラムハウジング１５０は、典型的には、管状ハウジング部材１５６、第一の管状ハウジング部材端部キャップ１５２、端部キャップ１５２の反対側に第二の管状ハウジング部材端部キャップ１５３、カラム入口１５４、及びカラム出口１５５を含む。カラム１００には、カラム入口１５４からスラリー状の多孔性無機粒子を充填でき、カラム入口は、内部に通路を有するセントラルボア(central bore)１５７、及びノズル１５８を含む。ベッド空間内へのスラリーの分配及びさらには充填までも容易にする様々なノズルが使用できる。フィルター１５９が端部キャップ１５２、１５３の内面にそれぞれ配置され、管状部材１５６と共にベッド空間１５１を規定する働きのほか、ベッド空間１５１からの粒状担体の漏出を防止する役割も果たしている。分配チャネル１６０は、第一の端部キャップ１５２及び／又は第二の端部キャップ１５３の面を横断して配置され、フィルター１５９と流体連結されている。流体分配チャネル１６０は、液体の放射状分配を促進するための働きをする。単純な形態では、分配チャネル１６０は、第一及び／又は第二の端部キャップ１５２及び１５３の面に少なくとも一つの円周方向及び／又は放射状の溝を含む。溝は、入口１５４のノズル１５８から放出される液体の周方向及び／又は放射状分配が実行できるように配置される。カラムを使い捨てカラムとして使用する場合、広範囲のカラム容積、典型的には０．１〜２０００リットル、及び０．１〜１００リットルの範囲のカラム容積が可能であることは理解されるであろう。ＵＳ２００８／００１７５７９も参照（その全主題は引用によって本明細書に援用する）。
【００２８】
[0040]カラムハウジング１５０は様々な材料から形成できる。典型的には、カラムハウジング１５０は、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含み、望ましくはポリマー材料を含む。カラムハウジング１５０を形成するための適切なポリマー材料は、ポリオレフィンを含む成形可能なプラスチックのような任意の合成又は半合成有機固体などであるが、これらに限定されない。
【００２９】
[0041]カラムハウジング１５０は、慣用の熱成形技術を用いて形成できる。例えば、カラムハウジング１５０の管状ハウジング部材１５６、第一の管状ハウジング部材端部キャップ１５２、及び第二の管状ハウジング部材端部キャップ１５３は、それぞれ独立に成形工程を通じて形成できる。一部の態様では、カラムハウジング１５０の管状ハウジング部材１５６と、（ｉ）第一の管状ハウジング部材端部キャップ１５２及び（ii）第二の管状ハウジング部材端部キャップ１５３の一つは、単一成形工程を通じて形成される（すなわち、端部キャップの一つは管状ハウジング部材１５６の一つの端部に一体形成される）。
【００３０】
[0042]前述のように、カラムハウジング１５０内に配置されている担体１５１は、少なくとも約３００Åのメジアン細孔径を有する多孔性無機粒子を含みうる。別の態様において、多孔性無機粒子は、少なくとも約３００Å（又は少なくとも約３５０Å；又は少なくとも約４００Å；又は少なくとも約４５０Å；又は少なくとも約５００Å；又は少なくとも約６００Å；又は少なくとも約７００Å；又は少なくとも約８００Å；又は約１０００Åより大、又は少なくとも約２０００Å、又は少なくとも約３０００Å；又は少なくとも約４０００Å）、最大約６０００Åまでのメジアン細孔径を有する。一部の態様において、多孔性無機粒子は、約５００Å〜約６０００Åのメジアン細孔径を有する。
【００３１】
[0043]他の態様において、多孔性無機粒子は、典型的には、メジアン粒子寸法による測定で、約１ミクロン（μｍ）〜約１５０μｍの範囲の粒径を有する。多孔性無機粒子は、典型的には、約１μｍ、より典型的には約１２０μｍ未満のメジアン粒子寸法を有する。一部の態様において、多孔性無機粒子は、約１０〜約１２０μｍ、より望ましくは約２０〜約９０μｍのメジアン粒子寸法を有する。
【００３２】
[0044]さらなる態様において、多孔性無機粒子は典型的には不規則形を有するが、任意の形状を有していてもよい（例えば、球形、楕円形など）。形状にかかわらず、多孔性無機粒子は典型的には本明細書中に解説されているメジアン粒子寸法を有する。
【００３３】
[0045]追加の態様において、多孔性無機粒子は、典型的には、例えば透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）技術を用いて測定されるアスペクト比が少なくとも約１．０である。本明細書において、“アスペクト比”という用語は、（ｉ）多孔性無機粒子のメジアン粒子寸法と（ii）多孔性無機粒子のメジアン断面粒子寸法の比を言うのに使用され、断面粒子寸法は多孔性無機粒子の最大粒子寸法に対して実質的に直交している。本発明の一部の態様において、多孔性無機粒子は、少なくとも約１．１（又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．３、又は少なくとも約１．４）、最大約５．０までのアスペクト比を有する。典型的には、多孔性無機粒子は、約１．０〜約１．５のアスペクト比を有する。
【００３４】
[0046]一部の態様において、多孔性無機粒子は、典型的には、窒素ポロシメトリーによる測定で、少なくとも約０．５ｃｃ／ｇの細孔容積を有する。本発明の一つの例示的態様において、多孔性無機粒子は、窒素ポロシメトリーによる測定で、約１．０ｃｃ／ｇ〜約３．０ｃｃ／ｇの細孔容積を有する。本発明の別の例示的態様において、多孔性無機粒子は、窒素ポロシメトリーによる測定で、約１．０ｃｃ／ｇ〜約２．０ｃｃ／ｇの細孔容積を有する。
【００３５】
[0047]別の態様において、多孔性無機粒子は、ＢＥＴ窒素吸着法（すなわち、ブルナウアー・エメット・テラー法）による測定で、少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、又は少なくとも約３０ｍ２／ｇの表面積も有する。本発明の一つの例示的態様において、多孔性無機酸化物粒子は、約２０ｍ２／ｇ〜約２０００ｍ２／ｇ、又は２５ｍ２／ｇ〜約２０００ｍ２／ｇ、又は約３０ｍ２／ｇ〜約１０００ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する。本発明のさらなる例示的態様において、多孔性無機酸化物粒子は、約２０ｍ２／ｇ〜約１０００ｍ２／ｇ、又は約２５ｍ２／ｇ〜約１０００ｍ２／ｇ、又は約３０ｍ２／ｇ〜約１０００ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する。
【００３６】
[0048]別の態様において、粒子は、少なくとも約３００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約４００ｇ／ｍｏｌ、又は少なくとも約５００ｇ／ｍｏｌ、最大約５００，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する少なくとも一つの分子を含む官能化表面を有しうる。別の態様において、粒子は、粒子の全重量を基にして、少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９４重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９５重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９６重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９７重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９８重量％のＳｉＯ２、最大１００重量％までのＳｉＯ２の純度を有するシリカを含みうる。
【００３７】
[0049]さらなる態様において、多孔性無機粒子は、典型的には、細孔径分布に関し、少なくとも約０．８、又は少なくとも約０．９、又は少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１、又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．３、又は少なくとも約１．４、又は少なくとも約１．５の相対スパンを有する。他の態様において、多孔性無機粒子は、典型的には、細孔径分布に関し、少なくとも約０．８、又は少なくとも約０．９、又は少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１、又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．３、又は少なくとも約１．４、又は少なくとも約１．５、最大約２．０の相対スパンを有する。例示的粒子の細孔径分布が示されている図３を参照。
【００３８】
[0050]一部の例示的態様において、本発明の多孔性無機粒子は、様々な多孔性無機材料から製造される。さらなる態様において、多孔性無機粒子は、多孔性沈降無機酸化物、無機酸化物ゲル及びフュームド酸化物を含む。
【００３９】
[0051]ゲルを含む態様において、親粒子は多孔性無機酸化物ゲルから誘導される。例えば、ＳｉＯ２を含むゲルであるが、これに限定されない。ゲルは、ヒドロゲル、エーロゲル、又はキセロゲルでありうる。ヒドロゲルはアクアゲルとしても知られる。これは水中で形成されるので、結果としてその細孔は水で満たされる。キセロゲルは水が除去されたヒドロゲルである。エーロゲルはキセロゲルの一種で、水の除去によるゲル構造の何らかの崩壊又は変化を最小限にするような方法で液体が除去されている。
【００４０】
[0052]ゲルは当該技術分野でよく知られている。Ｉｌｅｒの“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ”，ｐ．４６２（１９７９）参照。ゲル（例えばシリカゲル）粒子は、コロイドシリカ又は沈降シリカ粒子とは区別できる。例えば、コロイドシリカは濃厚非孔性シリカ粒子のスラリーとして製造される。コロイドシリカ粒子は典型的には２００ｎｍ（０．２ミクロン）より小さい。先述のように、これらの粒子は内部細孔を持たない。他方、典型的な分散沈降粒子は多少の内部細孔を有している。しかしながら、一部の場合、典型的な沈降粒子の内部細孔は、乾燥中に水が蒸発するので水のメニスカスの減退によって生じる毛細管圧下で大部分崩壊する。コロイドシリカ及び沈降シリカを製造するための条件は周知である。
【００４１】
[0053]他方、ゲルは、一次粒子（典型的には、透過型電子顕微鏡法すなわちＴＥＭ下での測定で約１〜約１０ｎｍのメジアン粒径を有している）の凝集を促進する条件下で製造され、比較的硬質の三次元網目構造が形成される。ゲルの凝集は、無機酸化物、例えばシリカの分散物が、構造的完全性を有する“ゲル”又は“ゲル化”塊に硬化すると、マクロスケールで示される。
【００４２】
[0054]無機酸化物ゲルの製造法は当分野で周知である。例えば、シリカゲルは、アルカリ金属ケイ酸塩（例えばケイ酸ナトリウム）の水溶液を硝酸又は硫酸のような強酸と混合することによって製造される。混合は適切な撹拌条件下で実施され、透明なシリカゾルが形成される。これが約３０分未満でヒドロゲル、すなわちマクロゲルに硬化する。得られたゲルを次に洗浄する。ヒドロゲル中に形成された無機酸化物、すなわちＳｉＯ２の濃度は、通常、約１０〜約５０、好ましくは約２０〜約３５、最も好ましくは約３０〜約３５重量パーセントの範囲であり、そのゲルのｐＨは、約１〜約９、好ましくは１〜約４である。広範囲の混合温度が使用できるが、この範囲は典型的には約２０〜約５０℃である。
【００４３】
[0055]新しく形成されたヒドロゲルは、絶えず動いている水流中に単に浸漬することによって洗浄される。これによって望ましくない塩が浸出し、約９９．５重量パーセント以上純粋な無機酸化物が後に残る。
【００４４】
[0056]洗浄水のｐＨ、温度、及び時間は、シリカの物理的性質、例えば表面積（ＳＡ）及び細孔容積（ＰＶ）に影響を及ぼす。６５〜９０℃、ｐＨ８〜９で約１５〜約３６時間洗浄されたシリカゲルは、通常、約２５０〜約４００ｍ２／ｇのＳＡを有し、約１．４〜約１．７ｃｃ／ｇｍのＰＶを有するエーロゲルを形成する。ｐＨ３〜５、約５０〜約６５℃で約１５〜約２５時間洗浄されたシリカゲルは、約７００〜約８５０ｍ２／ｇのＳＡを有し、約０．６〜約１．３ｍｌ／ｇのＰＶを有するエーロゲルを形成する。これらの測定は周知のＮ２ポロシティ法によって得られる。ヒドロゲルは、ヒドロゲルベッドに１００〜１８０℃の範囲の温度の空気を送風することにより、ゲル中の水分が約２０重量％未満、好ましくは約１０重量％未満、さらに好ましくは約５重量％未満になるまで乾燥される。キセロゲルの製造法は、米国特許第６，５６５，９０５号及び５，６２２，７４３号に見出すことができる。
【００４５】
[0057]米国特許第４，１５７，９２０号に記載されているような強化沈降シリカも本発明の分散物の製造に使用できる。前記特許の内容は引用によって本明細書に援用する。例えば、強化沈降シリカは、アルカリ無機ケイ酸塩をまず酸性化して初期沈降物を生成させることによって製造することができる。得られた沈降物は、次に追加のケイ酸塩及び酸によって強化又は“後調整”される。２回目のケイ酸塩及び酸の添加によって得られた沈降物は、初期に製造された沈降物の１０〜７０重量％を含む。この沈降物の強化構造は、第二の沈降の結果、従来の沈降物よりもさらに硬質であると考えられる。この強化ケイ酸塩は、粉砕、遠心及びその後の乾燥の後でも、その網目構造の剛性及び多孔性を実質的に維持していると考えられる。これは、米国特許第５，０３０，２８６号に開示されているような他の沈降シリカとは対照的である。
【００４６】
[0058]別の態様において、無機酸化物はフュームドシリカを含む。フュームドシリカは独特許ＤＥ７６２７２３号に記載されている方法を用いて製造することができる。フュームドシリカの製造は、ＵｌｌｍａｎｎのＥｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．Ａ２３，１９９３，第６章でも論じられている。
【００４７】
[0059]多孔性粒子が形成されたら、次にそれらを粉砕する。一般的な粉砕条件は、供給材料、滞留時間、羽根車の速度、及び粉砕媒体の粒径に応じて変動しうる。これらの条件を変更すれば、約１〜約１２０ミクロンの範囲内の所望サイズを得ることができる。所望の分散物を得るためのこれらの条件の選択及び変更技術は当業者には公知である。多孔性無機酸化物粒子を粉砕するために使用される粉砕装置は、例えば機械的作用を通じて苛酷粉砕及び材料を約１〜約１２０ミクロンのサイズを有する粒子に縮小できる種類のものであるべきである。そのような粉砕機は市販されており、ハンマーミル及びサンドミルがこの目的のために特に適している。ハンマーミルは必要な機械的作用を高速金属ブレードを通じて提供し、サンドミルはジルコニア又はサンドビーズのような急速撹拌媒体を通じて作用を提供する。衝撃式粉砕機も使用できる。衝撃式粉砕機もハンマーミルも、金属ブレードで無機酸化物に衝撃を与えることにより粒径を縮小する。本発明に使用するためのその他の適切な粉砕機は、風力分級ミル（Air Classifying Mill，ＡＣＭ）又は流体エネルギーミル（Fluid Energy Mill，ＦＥＭ）などであるが、これらに限定されない。粉砕された無機酸化物粒子は、分級が粉砕工程中に実施されなかった場合、風力分級機を用いて分級できる。
【００４８】
[0060]本発明の一態様において、粉砕された多孔性無機粒子は次に、約１００〜約４００℃で約２〜約２０時間、約８〜約１０のｐＨで熱水処理される。あるいは、熱水処理は、米国特許第５，９７６，４７９号：４，７３２，８８７号；及び４，１０４，３６３号に示されているように実施されてもよい。熱水処理の条件は、粒子の細孔容積、表面積、細孔径及び構造的完全性に影響を及ぼす。
【００４９】
[0061]多孔性無機酸化物粒子は、無機酸化物粒子表面への所望材料の結合が選択的に増強されるように表面修飾することができる。例えば、多孔性無機酸化物粒子は、クロマトグラフィーカラムを通過して処理される所与の流体に含まれる一つ又は複数の材料に選択的に結合するような表面化学（表面に結合された一つ又は複数の化学部分という形態の）をさらに含むことができる。これを本明細書中では官能化表面と呼ぶ。二官能性リガンドなどの化学部分は、例えば、出願人Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．−Ｃｏｎｎの米国特許第７，１６６，２１３号に記載されているように、粒子表面に結合させることができる。前記特許の主題は引用によってその全文を本明細書に援用する。一態様において、この固定／結合相、又はクロマトグラフィー担体は、粒子の官能化表面の一部として活性基又はリガンドを含む。これは典型的には何らかの結合を介して粒子に共有結合されている。リガンドは、別の分子成分（この場合は標的生体分子）と特異的相互作用を示す任意の化学種でよい。公知のリガンドは、荷電基（例えば、スルホン酸、第四アンモニウム、ジエチルアミノエチル、カルボキシルメチル）；合成色素；アルキル及びアリール化合物（例えばボロン酸フェニル、オクチル）；タンパク質；レクチン；抗体；抗原；酵素などである。リゲート、すなわちクロマトグラフィー技術によって分離できる化合物は、タンパク質；酵素；ペプチド；抗体；抗原；レクチン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；抗生物質のような様々な生体分子などである。
【００５０】
[0062]本発明の一態様において、無機酸化物粒子の表面はまず、異なる官能基を持つ２組のシランで処理される。第一の組の官能基は、その第一の組の官能基（例えばリンカー）を介して粒子表面上での一つ又は複数のモノマーの重合を可能にし、第二の組の官能基は、前記表面の湿潤性を増大する。その後の重合で、生体分子との相互作用及び結合を可能にするイオン電荷基が導入される。
【００５１】
[0063]例示的クロマトグラフィーカラム１００のような本発明のクロマトグラフィーカラムは、所与の用途における使用に合わせて製造できる。用途にかかわらず、例示的クロマトグラフィーカラム１００のような本発明のクロマトグラフィーカラムは、様々なクロマトグラフィーシステムに挿入できるようなサイズにすることができる。図２は、図１に示されたクロマトグラフィーカラムを含む例示的クロマトグラフィーシステム２００の図を描いている。
【００５２】
[0064]図２に示されているように、例示的クロマトグラフィーシステム２００は、下記の構成要素を含む。すなわち、クロマトグラフィーカラム１００；溶媒貯留槽２０１；ポンプ２０２；プレカラム２０３；注入口２０４；検出器２０６；記録器／モニター２０７；及び廃液回収装置２０８である。図２は示されていないが、クロマトグラフィーカラム１００は、例示的クロマトグラフィーシステム２００のようなクロマトグラフィーシステムに使用するのに適切な他のシステム構成要素を組み合わせて使用することもできる。その場合、他のシステム構成要素は、複数の溶媒貯留槽２０１、真空ポンプ、フロースプリッター、圧力計、脱気装置、画分回収装置などであるが、これらに限定されない。
【００５３】
[0065]本発明はクロマトグラフィーカラムの製造法にも向けられる。一態様において、クロマトグラフィーカラムの製造法は、多孔性無機酸化物粒子をカラムハウジングに組み込むことを含む。クロマトグラフィーカラムの製造法は、さらに一つ又は複数の追加工程を含んでいてもよい。適切な追加工程は、熱成形工程（例えば何らかの成形工程、例えば射出成形）によるカラムハウジングの形成；カラムハウジング内に配置された多孔性無機酸化物粒子を非ＮａＯＨ溶液に暴露することによる多孔性無機酸化物粒子のクリーニング；一つ又は複数のバリデーション試験によるクロマトグラフィーカラムのバリデーション；及びクリーニング及びバリデーション済みクロマトグラフィーカラムを輸送可能な容器にパッキングすることなどであるが、これらに限定されない。
【００５４】
[0066]開示された方法において、熱成形工程によるカラムハウジングの形成工程は、管状ハウジング部材と、少なくとも一つの別の取り付け可能な管状ハウジング部材端部キャップを熱成形することを含みうる。一部の態様において、熱成形工程は、（ｉ）第一の開口端と閉鎖された反対端を有する管状ハウジング部材（すなわちカラムハウジング出口をその中に有する一体形成された端部キャップ）と、（ii）管状ハウジング部材の開口端に取り付け可能な別の第一の管状ハウジング部材端部キャップを熱成形することを含む。他の態様において、熱成形工程は、（ｉ）反対側開口端を有する管状ハウジング部材と、（ii）管状ハウジング部材の第一の開口端に取り付け可能な別の第一の管状ハウジング部材端部キャップと、そして（iii）管状ハウジング部材の第二の開口端に取り付け可能な別の第二の管状ハウジング部材端部キャップを熱成形することを含み、第二の管状ハウジング部材端部キャップは、第一の管状ハウジング部材端部キャップの反対側の管状ハウジング部材端部キャップに取り付け可能である。
【００５５】
[0067]本発明はさらに、クロマトグラフィーカラムの使用法にも向けられる。一態様において、本発明のクロマトグラフィーカラムの使用法は、クロマトグラフィーカラムをクロマトグラフィーシステムの操作位置内に配置し；そして流体をクロマトグラフィーカラムに通して処理することを含む。一部の態様において、クロマトグラフィーカラムの使用法は、一つ又は複数の生体分子を含有する流体をクロマトグラフィーカラムに通して処理することを含む。例えば、流体は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はそれらの任意の組合せを含みうる。
【００５６】
[0068]一態様において、カラム１００上で分離するための一つ又は複数の被検体（標的分子）又は物質を含有する移動相又は液体は、カラム入口１５４から添加される。出口１５８を出てベッド空間１５１に入った移動相は、分配チャネル１６０越しに均一に分配され、フィルター１５９を通過してから粒状担体１５１のベッドを通って一様に溶出する。移動相は最終的にはカラム出口１５５を通ってカラムを出る。
【００５７】
[0069]例示的クロマトグラフィーカラム１００のような、本発明のクロマトグラフィーカラムの開示された使用法は、有益にも、クロマトグラフィーシステム（例えば図２に示された例示的クロマトグラフィーシステム２００）内での定置洗浄(clean-in-place)工程を含まない。言い換えれば、図２に示された例示的クロマトグラフィーシステム２００のような所与のクロマトグラフィーシステムで、定置洗浄工程の必要なしに、多数回の運転を実施できる。それどころか、所与のクロマトグラフィーカラムが使用されていてクリーニングが必要になった場合、使用済みクロマトグラフィーカラムは交換用クロマトグラフィーカラムと交換され、クロマトグラフィーシステムは定置洗浄工程に伴う遅延なしに運転が続けられる。
【００５８】
[0070]本発明の開示されたクロマトグラフィーカラムの開示された使用法は、クロマトグラフィーカラムを使用者に供給する工程も含みうる。その供給工程は、プレパックされバリデーションされたクロマトグラフィーカラムを使用者に供給することを含む。この工程は、使用者が一つ又は複数のカラム調製工程を実施する必要を排除するので、使用者の時間及び処理容量の効率的使用をさらに可能にする。
【００５９】
[0071]使い捨てカラムの使用法は、サンプルから一つ又は複数の生体分子を分離するのに適切でありうる。何らかの特定の用途に限定されないが、本発明の使い捨てカラムの使用法は、サンプルから一つ又は複数の生体分子を分離するのに使用でき、その一つ又は複数の生体分子は、少なくとも一つのタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、多糖類、脂質、核酸、代謝産物、ウィルス、ワクチン、又はそれらの任意の組合せから選ばれる。
【００６０】
[0072]例示的態様において、本発明の多孔性粒子は、本明細書中で述べたすべての結合相を含む様々な用途に使用できる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除などである。イオン交換クロマトグラフィーは、免疫グロブリンを単離するためのプロトコルで頻繁に使用される。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの負に帯電したアミノ酸側鎖がクロマトグラフィーマトリックスの正に帯電したリガンドと相互作用をする。他方、陽イオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの正に帯電したアミノ酸側鎖がクロマトグラフィーマトリックスの負に帯電したリガンドと相互作用をする。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、免疫グロブリンを単離するためのプロトコルに記載され使用されている別の方法である。高純度免疫グロブリン生成物が目的の場合、ＨＩＣを一つ又は複数のさらなる工程と組み合わせることが一般に推奨される。ＨＩＣでは、免疫グロブリンをＨＩＣマトリックスに効率的に結合させるために、移動相への離液性塩(lyotropic salts)の添加が必要となる。結合免疫グロブリンは、その後、離液性塩の濃度を低下させることによってマトリックスから放出される。アフィニティークロマトグラフィーは、標的生体分子と生体特異的リガンド間の鍵と鍵穴認識の原理(principle of lock-key recognition)の特異的相互作用に基づく。従って、標的とリガンドは、抗原／抗体、酵素／受容体などのようなアフィニティーペアを構成する。プロテインベースのアフィニティーリガンドは周知で、例えばプロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬアフィニティークロマトグラフィーはどちらも抗体を単離及び精製するための広く普及した方法である。プロテインＡクロマトグラフィーは、特にモノクローナル抗体に対して卓越した特異性を提供し、結果として高純度を得ることができる。イオン交換、疎水性相互作用、ヒドロキシアパタイト及び／又はゲルろ過工程と組み合わせて使用されることで、プロテインＡベースの方法は、多数のバイオ医薬品会社にとって第一選択の抗体精製法となっている。例えばＷＯ８４００７７３及び米国特許第５，１５１，３５０号参照。
【００６１】
[0073]例示的態様において、本発明の多孔性粒子は、混合モード又は多モード分離マトリックス又は担体など、様々な用途に使用できる。用語“多モード”分離担体とは、結合される化合物と相互作用する少なくとも二つの異なる、しかし協調的な部位を提供できるマトリックスのことを言う。例えば、これらの部位の一つは、リガンドと目的物質との間に誘引的な電荷−電荷相互作用を提供できる。他の部位は、電子受容体−供与体相互作用及び／又は疎水性及び／又は親水性相互作用を提供できる。例えば、米国特許第７，７１４，１１２号参照。さらに、本発明の多孔性粒子は、吸着流動床(expanded bed adsorp-tion)において（例えば米国特許第６，６２０，３２６号参照）；精製性能を改良するための膜の一部として（例えば米国特許公開第２０１１／００４９０４２号参照）；流動床吸着を用いる用途において（例えば米国特許公開第２００５／０２６９２５７号参照）；及び幅広い多孔性材料を用いる精製又は吸着に適切ないずれかその他の用途において使用できる。
【００６２】
[0074]本発明を以下の実施例によってさらに説明する。これらの実施例は、決して本発明の範囲に制限を課すものと見なされてはならない。それどころか、様々なその他の態様、修正、及びその等価物のための手段となりうることは明らかに理解されるはずである。そうしたその他の態様、修正、及びその等価物は、本明細書中の記載を読めば、当業者には本発明の精神及び／又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく思い浮かぶであろう。
【実施例】
【００６３】
[0075]以下の実施例で、イオン交換及びプロテインＡを含む官能化表面を有するクロマトグラフィー担体を製造するための本発明による方法を記載するが、他の表面官能化も使用できる。実施例中に示される本発明の一態様は、多孔性無機担体をベースとするイオン交換材料に関する。これは二つの主な工程からなる方法によって製造された。すなわち、（１）粗孔シリカに二つのシラン：（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン及び３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートを結合して初期結合中間体を形成し；そして（２）初期結合シリカ中間体の存在下、アゾ開始剤を用いてイオン性モノマーを溶液重合し、強陰イオン交換担体（Ｑ−シリカ）又は強陽イオン交換担体（Ｓ−シリカ）のいずれかを製造した。
【００６４】
[0076]実施例に示されている本発明の別の態様はＱ−シリカの製造法であり、そこで利用されたモノマーは、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、少量のジアリルジメチルアンモニウムクロリド溶液であり、開始剤は２，２'−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド（Ｖ−５０開始剤）であった。
【００６５】
[0077]実施例に示されている本発明の別の態様はＳ−シリカの製造法である。この方法は、初期結合中間体をテトラメチルアンモニウムクロリド溶液で洗浄する追加の工程を含むが、これは重合を補助するために追加される。この重合の態様において、モノマーは２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）であり、開始剤は４，４'−アゾビス（シアノ吉草酸）（Ｖ−５０１開始剤）である。この重合は、連鎖移動剤（ＣＴＡ）、例えばＳ，Ｓ’−ビス（α、α’−ジメチル−α”−酢酸）−トリチオカーボネート（ＡＢＣＲ  ＧｍｂＨ  ＫＧ社より入手できる）を使用する。ＣＴＡの機能は、重合の鎖長を制御すること及び細孔の何らかの閉塞を削減する手助けをすることである（図４参照）。この方法は本質的にリビングラジカル重合法の一種である可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合である。
【００６６】
[0078]これらの方法によって多くの異なる種類の多孔性粒子を官能化した。一部の実施例ではシリカゲルを利用した。これは、７５ミクロンの粒径と２５０、５００、８００、１０００Åのメジアン細孔径を有するシリカゲルであった。シリカゲルは下記手順を用いて製造された。１９０ｇの１９％硫酸溶液を、オーバーヘッド撹拌機を備え、５℃に冷却された反応器に装入した。別に、２６３ｇのケイ酸ナトリウム溶液（２２．９％ＳｉＯ２）も５℃に冷却した。その後、ケイ酸ナトリウム溶液を、全量のケイ酸塩が１５分で添加されるような速度で硫酸溶液にポンプを通して加えた。添加中、温度は５℃に維持された。添加完了後、反応器を室温に温め、撹拌せずに内容物をゲル化させた。ゲル化後、ゲル塊を小片に切断し、水中に浸漬して、反応中に形成された硫酸ナトリウムを除去した。材料中に残留している硫酸ナトリウムのレベルを定期的にチェックしながら、洗浄水を排水して新鮮水をゲルに加えた。レベルが１％を下回ったら、ゲルを水中に懸濁させ、液体のｐＨをｐＨ＝９．７に調整し、溶液を６７℃に加熱した。温度を２０時間２０分維持した。加熱時間終了後、ゲルをろ過により回収し、１６０℃のオーブン中でゲルの水分含量が約５重量％未満になるまで乾燥させた。このようにして得られたシリカゲルは、３２５ｍ２／ｇの窒素ＢＥＴ表面積及び１．２４ｃｃ／ｇの窒素細孔容積を有していた。円筒形の細孔と仮定し、等式：細孔径（オングストローム）＝４００００×ＰＶ／ＳＡを用いると、この材料は１５３オングストロームの細孔径を示す。その後、ＡＣＭを用いてゲルを所望の粒径（７５ミクロン）に粉砕した後、３００℃のオートクレーブ中で所望の細孔径が達成されるまで熱水処理する。
【００６７】
[0079]実施例中で報告されている粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．社製のＭａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００を用い、ＡＳＴＭ  Ｂ８２２−１０に従って、光散乱により測定された。細孔径分布は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．社製のＡｕｔｏｐｏｒｅ  ＩＶ  ９５２０を用いて水銀圧入により測定される。本明細書中で参照されている細孔容積は、１０，０００Ａ以下の細孔への水銀圧入を表す。ＢＥＴ表面積は窒素吸着分析からも得られる。炭素及び硫黄含量の元素分析は、ＬＥＣＯ  Ｃｏｒｐ．社製のＬＥＣＯ  Ｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｌｆｕｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＳＣ−６３２を用いて実施された。平均分子量は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．社製のＲＩ及び粘度測定検出付きＧＰＣＶ  ２０００を用い、ＧＰＣ分析により決定された。シリカの純度は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐ．社製のＩＣＰＥ−９０００を用い、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によって測定された。
【００６８】
[0080]本発明のシリカゲル粒子の細孔径分布は本明細書中に記載の方法によって求めた。図３から分かるように、本発明の多孔性粒子は幅広の細孔径分布を有している（すなわち大きい相対スパン）。
【００６９】
[0081]図４は、Ｑ−シリカ及びＳ−シリカの一般的合成経路を示す。
[0082]実施例１１〜２４のサンプルの分子量は下記の手順を用いて決定された。０．５グラムの表面官能化シリカサンプルを５０ｍｌの遠心管に量り取り、１０ｍｌの脱イオン水を加え、次いで２．２ミリリットルの４８％フッ化水素酸を加え、徹底的に混合後、サンプルを３０分間放置した。その後、ホウ酸３．５グラムを加えて遊離フッ化物を封鎖し、サンプルをリストアクションシェーカー(wrist action shaker)に６０分間入れて置いた。遠心分離し、真空下０．２μｍフィルターを通してろ過した後、透明上清を分析のために回収した。上清をＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．社製のＲＩ及び粘度測定検出付きＧＰＣＶ  ２０００を用い（ウルトラヒドロゲルガードカラム(Ultrahydrogel guard column)と１２０、２５０、及び１０００カラムを含む）、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析に付した。上記の溶液を、ＲＩ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステムを用い、移動相の１％硝酸カリウム水溶液中に注入した。溶液の分子量は、ポリエチレングリコール及びポリエチレンオキシドを較正標準として用いることによって決定した。上記ポリマーの分子量は約２００〜３００ＫＤ未満であった。
【００７０】
[0083]Ｑの静的結合試験は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（バッファー中２５ｍｇ／ｍｌの濃度）を用い、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファーによりｐＨ８．０で実施した。結合／洗浄バッファーはｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで、溶出バッファーはｐＨ８．０の５０ｍＭ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１Ｍ  ＮａＣｌであった。乾燥シリカサンプルをバイアルに量り取り、次に結合バッファー中のタンパク質溶液を加えた。一晩吸着後、サンプルを遠心分離し、上清を分離／廃棄した。シリカサンプルを、遠心分離と分離により洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄工程後、溶出バッファーを加え、溶出を２回繰り返した。合わせた溶出液について、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社製のＧｅｎｅｓｙｓ  １０Ｓ  Ｂｉｏ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用い、２８０ｕｍでＵＶ／Ｖｉｓ吸収を測定した。
【００７１】
[0084]Ｓの静的結合試験は、ニワトリ卵白リゾチーム又はウシガンマグロブリン（バッファー中２５ｍｇ／ｍｌの濃度）を用い、５０ｍＭ  ＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃバッファーによりｐＨ４．０で実施した。結合／洗浄バッファーはｐＨ４．０の５０ｍＭ  ＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃで、溶出バッファーはｐＨ４．０の５０ｍＭ  ＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃ中１Ｍ  ＮａＣｌであった。乾燥シリカサンプルをバイアルに量り取り、次に結合バッファー中のタンパク質溶液を加えた。一晩吸着後、サンプルを遠心分離し、上清を分離／廃棄した。シリカサンプルを、遠心分離と分離により洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄工程後、溶出バッファーを加え、溶出を２回繰り返した。合わせた溶出液について、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社製のＧｅｎｅｓｙｓ  １０Ｓ  Ｂｉｏ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用い、２８０ｕｍでＵＶ／Ｖｉｓ吸収を測定した。
【００７２】
[0085]動的結合試験は、直径０．６６ｃｍのＯｍｎｉガラスカラムを用いて実施した。２ｍｌのカラムの場合、カラム長はほぼ５．８ｃｍであった。シリカサンプルをＤＩ水で洗浄した後、Ａｋｔａ  ＦＰＬＣを用い、約４０００ｃｍ／ｈの線速度でカラムにスラリー充填した。Ｑの破過曲線について、ｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中ＢＳＡタンパク質（又は、Ｓについては、ｐＨ４．０の５０ｍＭ  ＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃバッファー中リゾチーム又はガンマグロブリン）を、Ａｋｔａを用い、約５００又は１０００ｃｍ／ｈでカラムに通液した。２８０ｎｍにおけるＵＶ−ＶｉｓシグナルをＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ社製ＵＶ９００を用いて測定し、クロマトグラムをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで記録及びプロットした。動的結合容量（Dynamic Binding Capacities, ＤＢＣ）は、下記の等式を用いて５％破過点で算出した。
【００７３】
【数１】
0006360482.tif 000002
【００７４】
実施例１〜１０
[0086]初期結合多孔性シリカ粒子のサンプルは、シリカ粒子を、処理剤１（ビニルシラン）、すなわち３−（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート、及び／又は処理剤２（エポキシシラン）、すなわち（３−グリシドオキシプロピル）−トリメトキシシランで処理することによって製造した。ビニル及びエポキシシランを予備混合した。丸底フラスコに多孔性粒子を装入し、一定量の処理剤ミックスをフラスコに加えた。混合物を一晩回転させた。シリカの１／１０の量（重量による）の０．５Ｍ硫酸を加えた。混合物を室温で１時間回転させ、次に７０℃に１時間加熱した。フラスコを放冷した後、シリカを１Ｍ硫酸に３０分浸漬し、次いでろ過した。それを次にＤＩ水で５回洗浄し、ろ過し、７０℃で一晩乾燥させた。得られたサンプルを、元素分析（ＬＥＣＯ）にかけてシリカ上の炭素のパーセンテージを求め、それぞれ実施例１〜１０と標識した。これらの実施例の結果を以下の表１に示す。
【００７５】
【表１】
0006360482.tif 000003
【００７６】
[0087]実施例３以外は、等量の２種類のシランをこれらの官能化に使用した。得られた炭素の量は、一般に、使用されたシランの総量に比例していた。実施例３では乾式結合にビニルシランのみが使用された。表１に示されているように、結合工程後の清浄かつ乾燥シリカサンプルの元素分析によって測定された炭素の量は、表面官能化後の表面官能基の量を決定するための指標として使用された。
【００７７】
実施例１１〜２４
[0088]実施例１１〜２４に強陰イオン交換材料の製造法を記載する。これらの実施例では、実施例１〜１０の初期結合シリカを、第一のモノマー、すなわち（３−アクリルアミドプロピル）−トリメチルアンモニウムクロリド（７５％水溶液）；代替モノマー１、すなわち［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド（５０％水溶液）；代替モノマー２、すなわち［２−（アクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド（８０％水溶液）；第二のモノマー、すなわちジアリルジメチルアンモニウムクロリド（６５％水溶液）；Ｖ−５０開始剤；及び追加の脱イオン水（ＤＩＷ）を用いて表面処理した。
【００７８】
[0089] 三つ口丸底フラスコに、気密嵌合されたオーバーヘッド機械撹拌機、窒素ガスの入口と出口、及び熱電対フィードバック付き加熱マントルを備え付けた。シリカと、開始剤以外の全試薬をまずフラスコに装入した。システムに窒素を２０分間通気した。次いで開始剤を導入した。窒素をさらに２０分間通気した後、フラスコを徐々に６５℃に加熱する。混合物をオーバーヘッド撹拌しながら６５℃に２時間維持し、その後室温に冷却した。混合物をビーカー中の５％ＮａＣｌ溶液中に注いだ。フラスコをＤＩ水で濯ぎ、フラスコ内部の残留シリカを完全に取り出した。混合物をオーバーヘッド撹拌機で数分間撹拌後、ろ過し、５％ＮａＣｌで３回、そしてＤＩ水で３回、繰り返し洗浄した。サンプルは、少量のシリカを９０℃で一晩乾燥させてから炭素含量の元素分析に付した以外は風乾させた。上記サンプルについて結合容量を計算した。得られたサンプルを実施例１１〜２４と標識した。これらの実施例の分析結果と結合容量を以下の表２に示す。
【００７９】
【表２】
0006360482.tif 000004
【００８０】
[0090]試薬比は、反応に使用された試薬の量の重量比である。表２において、使用されたすべてのモノマーは水溶液なので、実際の量は濃度を掛け算して補正される。例えば、実施例１１では、試薬の量は、シリカ＝１０ｇ、モノマー＝６．６ｇ、第二のモノマー＝０．６ｇ、開始剤＝０．０４５ｇ、ＤＩ水＝６５ｇなので、比は、１０：（６．６×０．７５）：（０．６×０．６５）：０．０４５：６５＝１：０．５：０．０４：０．００４５：６．５と計算される。Ｃ％［初期結合］は、元素分析によって測定された初期結合工程後の乾燥シリカサンプル上の炭素の量である。Ｃ％［最終］は、元素分析によって測定された精製乾燥シリカサンプル上の炭素の量である。Ｃ［ポリ］＝Ｃ％［最終］−Ｃ％［初期結合］は、シリカ表面上のポリマー基によって寄与された炭素の量である。Ｃ［ポリ］／Ｃ［初期結合］比は二つの炭素数の割り算であり、ポリマーによって寄与された炭素を初期結合によって寄与された炭素と比べた尺度である。理論に拘束されるつもりはないが、比が高いほど表面上の鎖の数が少ない長鎖ポリマーを示しており、これは、より高いタンパク質結合のためには、表面上に鎖の多い短鎖を示す低い比よりも好適である。長鎖の方が結合ポリマーに対してより柔軟性を提供するからである。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をサンプルのすべての結合試験のモデルタンパク質として使用した。高い結合値ほど好適である。Ｓは、ＢＳＡの修飾シリカへの結合が静的モードで測定された静的結合（ＳＢＣ）を表す（測定の手順については以下を参照）。Ｄは、ＢＳＡの修飾シリカへの結合が動的フローモードで測定された動的結合（ＤＢＣ）を表す（測定の手順については以下を参照）。ｎ／ｍは測定されなかったことを意味することに注意する。
【００８１】
[0091]表２から分かるように、実施例１３以外、全サンプルとも容認できる結合結果を提供した。実施例１３では、ポリマーのシリカ表面への結合はなかった。実施例１４及び１５では、第二のモノマー、ジアリルジメチルアンモニウムクロリドが一般に高いＢＳＡタンパク質結合を提供した。実施例１６では、Ｃ％［ポリマー］／Ｃ％［初期結合］の比が増大し、ＢＳＡの結合が改良された。実施例１７、１８及び２０では代替モノマーを試験した。代替モノマー１は、第一のモノマーのサンプル（実施例１９）よりわずかに高いＢＳＡ結合を示したが、代替モノマー２は、第一のモノマーよりずっと低いタンパク質結合しか示さなかった。実施例２１では、サンプルは８００Åの細孔径／サイズを有するシリカを用いて製造され、これが最も高いＢＳＡタンパク質結合をもたらした。実施例２２は２３よりも高いＢＳＡ結合を示したが、これは実施例２２の方が高い炭素数比を有していたためである。実施例２４では低いタンパク質結合しか得られなかった。
【００８２】
実施例２５〜２８
[0092]実施例２５〜２８に強陰イオン交換材料の別の製造法を示す。実施例２５〜２８（表３）の初期結合サンプルのための一般的手順は次の通りであった。回転蒸発器上の乾燥１Ｌ丸底フラスコ中で、５０ｇの乾燥シリカを０．６ｇのビニルシラン及び０．６ｇのエポキシシランと周囲温度で一晩（１６時間）混合し、次いでシリカを１Ｌビーカーに移して５００ｍｌの１Ｍ硫酸に１時間浸漬した。ろ過及び５×５００  ＤＩ水による洗浄で初期結合シリカサンプルを得、これを７０℃で一晩乾燥させた。
【００８３】
実施例２５〜２７
[0093]実施例２５〜２７の重合法手順は次の通りであった。実施例１１〜２４で使用された方法と同様に、前工程からの乾燥シリカ３０ｇを表３に従ってモノマー、開始剤及び水と混合した。実施例２５〜２７の最終生成物の分析結果も表３に示した。
【００８４】
実施例２８
[0094]実施例２８の方法手順は次の通りであった。２５０ｍｌビーカーに、表３の実施例２８に記載されている量の試薬を混合した。すべてが水に溶解するように撹拌する。この溶液を、３０ｇの初期結合シリカ（０．７６％炭素）を含有する２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコに注ぎ入れた。窒素ガスをフラスコに３０分間通気した後（シリカと水溶液をよく混合させるためにフラスコを時々振盪した）、ガス管を素早く除去し、フラスコの頂部をテープで密封した。水浴を用いてフラスコを徐々に６５℃に加熱し（〜３０分間）、温度を６５℃に２時間維持した。次いで混合物を室温に冷却した。混合物を１Ｌビーカー中の４００〜５００ｍｌの１０％ＮａＣｌ溶液中に注ぎ入れ、フラスコ内部の残留シリカを完全に取り出すために多少のＤＩ水で濯いだ。シリカをスパチュラで数分間撹拌した後、放置して粒子を沈降させた。上部の液相上清をデカントして廃棄し、残留シリカを５００ｍｌの５％ＮａＣｌ溶液と混合した。次に、シリカサンプルを３×５００ｍｌの５％ＮａＣｌ溶液、さらに３×５００ｍＬのＤＩ水で洗浄した。各洗浄ごとに真空下でろ過した。最終サンプルは、少量のサンプルを炭素インプット量の元素分析のために９０℃で乾燥させた以外は風乾させた。分析結果及び結合容量の結果を以下の表３に示す。
【００８５】
【表３】
0006360482.tif 000005
【００８６】
[0095]実施例２９〜４１に強陽イオン交換材料の製造法を示す。
実施例２９〜３４
[0096]ビニル及びエポキシシラン（それぞれ２．５ｇ）を２０ｍｌのシンチレーションバイアル中に予備混合した。２Ｌの丸底フラスコに２００グラムのＤ１０００シリカを装入し、一定量の処理剤ミックスを良く混合しながらフラスコに滴下添加した。フラスコ中の混合物を回転蒸発器内で一晩回転させた。２０ｍｌの０．５Ｍ硫酸を加えた。混合物を室温で１時間回転させた後、７０℃に１時間加熱した。フラスコを放冷した後、シリカを５００ｍｌの１Ｍ硫酸に３０分間浸漬し、次いでろ過した。それを次にＤＩ水で５回洗浄し、ろ過した。１００ｇのテトラメチルアンモニウムクロリドを１０００ｍｌのメタノール中に溶解し、シリカをこの溶液中に１時間浸漬した後、シリカをろ過し、３×５００ｍｌのメタノールで洗浄した。シリカを７０℃で一晩乾燥させた。サンプルを元素分析（ＬＥＣＯ）に付し、シリカ上の炭素のパーセンテージを求めた。サンプルは、１００ｇのサンプルあたり０．７９ｇの炭素を含有していることが分かった（０．７９％）。表４に記録されている実施例２９〜３４のすべての初期結合は上記のようにして製造された。
【００８７】
[0097]５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに、気密嵌合されたオーバーヘッド機械撹拌機、窒素ガスの入口と出口、及び熱電対フィードバック付き加熱マントルを備え付けた。初期結合されテトラメチルアンモニウムクロリドで処理されたシリカ（３０ｇ）、及び３７．５ｇのＡＭＰＳ、少量のＣＴＡ及び２００ｍｌのＤＩ水をまずフラスコに装入した。システムに窒素を２０分間通気した。次いで０．１５ｇのＶ５０１開始剤を導入した。窒素をさらに２０分間通気した後、フラスコを徐々に６５℃に加熱する。混合物をオーバーヘッド撹拌しながら６５℃に２時間維持し、次いでさらに２時間８０℃にした。フラスコを室温に放冷した。混合物をビーカー中の６００ｍｌの５％ＮａＣｌ溶液中に注いだ。フラスコをＤＩ水で濯ぎ、フラスコ内部の残留シリカを完全に取り出した。混合物をオーバーヘッド撹拌機で数分間撹拌後、ろ過し、５００ｍｌの５％ＮａＣｌで３回、そして５００ｍｌのＤＩ水で３回、繰り返し洗浄した。サンプルは、少量のシリカを９０℃で一晩乾燥させてから炭素及び硫黄含量の元素分析に付した以外は風乾させた。
【００８８】
【表４】
0006360482.tif 000006
【００８９】
[0098]実施例２９〜３４では、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｍｗ約１７ｋＤ）及びウシガンマグロブリン（Ｍｗ約１４０ｋＤ）タンパク質を陽イオン交換材料の静的結合試験に使用した。試験手順は、上の実施例１１〜２４で記載したＱ−シリカのＢＳＡの場合と同様であったが、ただし、異なるタンパク質を使用し（同じく２５ｍｇ／ｍｌ濃度）、結合及び洗浄バッファーはｐＨ４．０の５０ｍＭ  ＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃであった。溶出バッファーはｐＨ４．０の５０ｍＭ  ＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃ中１Ｍ  ＮａＣｌであった。リゾチーム又はグロブリンタンパク質の静的結合容量は表４にまとめた。
【００９０】
[0099]Ｑ−シリカとは異なり、ＡＭＰＳの重合は少量の連鎖移動剤（ＣＴＡ）、例えばＳ’−ビス（α，α’−ジメチル−α”−酢酸）−トリチオカーボネートの使用を必要とすることが分かった。ＣＴＡなしでは、タンパク質のシリカサンプルへの結合はずっと少なかった。表４から分かるように、ＣＴＡの量は、結合ポリマーの量（炭素及び硫黄含量によって測定）だけでなく、サンプルの静的結合容量にも顕著な影響を及ぼしていた。ＣＴＡの量が多いと、少量のポリマー結合、低いリゾチーム結合をもたらしたが、ずっと大きいサイズのタンパク質であるグロブリンに対しては高結合をもたらした。ＣＴＡがなければ、リゾチーム及びグロブリンの場合とも著しく少ない結合量しか達成されなかった。
【００９１】
実施例３５及び３６
[0100]実施例３５及び３６では、重合で使用されるＣＴＡの量に対するポリマーのサイズについて示す（シリカ使用せず）。三つ口丸底フラスコに、３７．５ｇ（１８１ｍｍｏｌ）のＡＭＰＳ、１．４ｇ（１８．１ｍｍｏｌ）のメタクリル酸、０．２ｇ（実施例３６では１ｇ）のＣＴＡ、及び２００ｍｌのＤＩ水を装入した。重合は上記と同様に実施した（シリカなし）。重合後、サンプルをＧＰＣ分析に付し、製造されたポリマーの分子量を求めた。実施例３５のポリマーのＭｗは８７４７１で、実施例３６のポリマーのＭｗは２０６７８であった。
【００９２】
実施例３７
[0101]この実施例では強陽イオン交換相を製造するための代替法を提示する。この方法は熱的に不安定なアゾ基のほか親水性カルボン酸基も含有する官能基を化学的に結合させることを含む。図５に示されているように、アゾ開始剤をまずアミノプロピルトリメトキシシランと結合させた後、官能基をシリカと結合させる。重合はモノマーの存在下で熱により進行する。
【００９３】
[0102]Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１１．５ｇを３５０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、溶液を氷浴で約５℃に冷却した。この溶液に、７．７８ｇの４，４’−アゾビス（シアノ吉草酸）（Ｖ−５０１開始剤）を加え、次いで１０ｇのアミノプロピルトリメトキシシランを加えた。混合物を冷温で３時間撹拌した後、さらに２時間で室温に温まらせた。反応後、未溶解の固体（大部分は尿素副産物）をろ過除去し、ろ液に１００ｇの実施例７の未処理シリカ（８００Å）を混合した。混合物を１Ｌの丸底フラスコに装入し、回転蒸発器上、室温で一晩回転させ、次いでろ過し、４×４００ｍｌのメタノールで洗浄した。固体を室温で一晩風乾させた。少量のサンプルを元素分析に付し、サンプルについて２．０３％という炭素数が得られた。
【００９４】
[0103]３０ｇの上記シリカを２００ｍｌの水中で４０ｇのＡＭＰＳモノマーと混合した。水性混合物中に窒素を３０分間通気した後、三つ口丸底フラスコを窒素下で撹拌しながら６５℃に２時間加熱した。反応後、混合物をろ過し、３×５００ｍｌの５％ＮａＣｌ、次いで３×５００ｍｌのＤＩ水で洗浄した。サンプルの乾燥後、乾燥サンプルの元素分析から、炭素数４．２３％、硫黄数１．１７％が示された。ＢＳＡタンパク質の静的結合（ｐＨ４．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーを使用）により、このサンプルのＢＳＡ結合容量は１５０ｍｇ／ｍｌであることが示された。
【００９５】
実施例３８
[0104]この実施例では、異なる反応の組を使用して強陽イオン交換材料を製造した。図６に示されているように、シリカゲルをまずアミノプロピルトリメトキシシランと結合させた後、修飾シリカをＤＭＦ中でカップリング触媒作用（ＤＣＣ）を用いてアゾ開始剤と結合させ、次いでＡＭＰＳモノマーの存在下、高温で重合させた。
【００９６】
[0105]Ｄ１０００（平均粒径７５μｍ、平均細孔径１０００Å）、２００ｇを、実施例１〜１０と同様の手順を用いて、まず２０ｇのアミノプロピルトリメトキシシランと結合させた。一晩回転した後、シリカを６００ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌに浸漬し、その後ろ過した。１ＬのＤＩ水による３回の洗浄を実施し、各工程ごとに真空下でろ過した。シリカろ過ケーキを７０℃で一晩乾燥させ、乾燥シリカの炭素の量は０．８０％と決定された。
【００９７】
[0106]上記の乾燥シリカ３５ｇを、１００ｍｌの乾燥ＤＭＦ溶媒中１．９２ｇのＤＣＣ、２．２４ｇのＶ−５０１アゾ開始剤、及び０．８ｇのトリエチルアミンの溶液と混合した。混合物を５００ｍｌの丸底フラスコに入れ、回転蒸発器上、室温で４時間回転させた。得られた混合物をろ過し、２×２００ｍｌのＤＭＦ、そして２×１５０ｍｌのアセトンで洗浄した。サンプルをオーブン中で乾燥させて元素分析をしたところ、炭素含量１．７４％が示された。残りのシリカはドラフト内にて室温で６時間乾燥させた。
【００９８】
[0107]３４ｇの上記シリカを２００ｇのＤＩ水中で４０ｇのＡＭＰＳモノマーと混合した。システムを窒素で２０分間フラッシュ洗浄した後、撹拌しながら６５℃に加熱し、この温度に２時間維持した。その後、混合物を室温に冷却し、３×５００ｍｌの５％ＮａＣｌ、次いで３×５００ｍｌのＤＩ水で洗浄した。サンプルの乾燥後、乾燥サンプルの元素分析から、炭素数５．４７％、硫黄数１．６９％が示され、ｐＨ７．０（５０ｍｍｏｌリン酸塩バッファー）におけるゾチームタンパク質の静的結合容量１２５ｍｇ／ｍｌが得られた。
【００９９】
実施例３９及び４０
[0108]これらの実施例では、図７に示されているように、ＡＭＰＳ（９０ｍｏｌ％）及びメタクリル酸（１０ｍｏｌ％）からなるポリマーを連鎖移動剤を用いて最初に合成し（実施例３９）、次いでポリマー溶液を、表面アミノ基を有する修飾シリカ（実施例３８の初期結合Ｄ１０００シリカ）と混合し、そして混合物を１６０℃で数時間焼成して、ポリマーと表面アミン基との間に共有アミド結合を形成させた（実施例４０）。
【０１００】
実施例３９
[0109]１０００ｍｌの三つ口丸底フラスコ（機械撹拌機、窒素の入口と出口、及び熱電対を備えている）に、１００ｇのＡＭＰＳモノマー、４．２ｇのメタクリル酸、１．２ｇのＣＴＡ、及び６００ｍｌのＤＩ水を加えた。この混合物を撹拌し、２０分間窒素フラッシュした後、０．４ｇのＶ−５０１開始剤を加えた。さらに２０分間窒素通気した後、系を徐々に６５℃に加熱し、２時間維持し、次いで８０℃にしてさらに２時間維持した。室温に冷却後、ポリマーをＳＥＣによって分析し（標準として異なる分子量のデキストランを使用）、ポリマーのＭｗは１９４１７、Ｍｎは１５４７７であると決定された。
【０１０１】
実施例４０
[0110]実施例３８のアミノプロピル結合シリカ（初期結合）２０ｇを、実施例３９に記載のポリマー溶液２００ｇと混合した。混合物は、１０ＭのＮａＯＨを加えてｐＨをおよそ７に調整した。次にこれをセラミック製の結晶化皿に入れ、その皿をドラフト内の対流式オーブン（Ｆｉｓｈｅｒ  ５０６Ｇオーブン）に入れた。オーブンの温度を１６０℃に設定し、サンプルをオーブン内で６時間焼成した。その後、室温に冷却し、５００ｍｌの１０％ＮａＣｌ溶液と混合した。シリカをろ過し、３×５００ｍｌの５％ＮａＣｌ溶液、３×５００ｍｌのＤＩ水で洗浄した。サンプルの炭素及び硫黄含量は、それぞれ６．０６％、１．７０％と決定された。リゾチームのＤＢＣの測定はｐＨ７．０で１０７．６ｍｇ／ｍｌであった（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー）。
【０１０２】
実施例４１
[0111]この実施例では表面ポリマーの成長がＣｅ（IV）化学によって促進されたことを示す（米国特許第５，４５３，１８６号）。（図８参照）。１００ｇのシリカ（メジアン細孔径１０００Å、メジアン粒径７０μｍ）を実施例１〜１０と同様の手順を用いて（ただしビニルシランは使用せず）１０ｇのエポキシシランと乾式結合させた。得られたシリカは１．６９％という炭素％測定値を有していた。この乾燥シリカ３０ｇを三つ口丸底フラスコの中で３０ｇのＡＭＰＳモノマー、及び２００ｍＬのＤＩ水と混合した。窒素を２０分間通気して混合物から酸素を除去した後、２．３７ｇの硫酸セリウム（IV）を加え、混合物を７０℃で２時間加熱撹拌した。２時間後、混合物を冷却し、ろ過した後、５×３００ｍｌの１Ｍ硝酸、次いで５×３００ｍｌのＤＩ水でスラリー洗浄した。元素分析によれば、乾燥サンプルの炭素及び硫黄含量は、それぞれ２．２７及び０．５８であった。リゾチームに対するこの材料のＤＢＣ測定値は、２ｍｌのカラムを用い、ｐＨ７．０（５０ｍＬリン酸塩バッファー）で１０７ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０３】
実施例４２〜４３
[0112]実施例４２及び４３では、プロテインＡを実施例１のシリカに結合させる。シリカは、粒径７５μｍ、メジアン粒径７０μｍ、そしてメジアン細孔径１０００Åであった。実施例４２は、表面ジオール基をＮａＩＯ４で酸化してアルデヒドを得、次いでプロテインＡ鎖上のアミノ基を表面アルデヒド基で還元的アミノ化するという周知の化学（例えばＷＯ１９９００９２３７）を使用した（図９のスキーム１）。実施例４３は異なる化学を利用した。図９のスキーム２に示されているように、シリカをまずアミノプロピルトリメトキシシランと結合させ、次いで表面上のアミノ基をトルエン中５℃で塩化シアヌルと反応させた後、第二の塩素基をプロテインＡの鎖上のアミノ基と反応させた。
【０１０４】
[0113]実施例４２では、実施例１に記載の初期結合手順を利用して、（３−グリシドオキシプロピル）−トリメトキシシラン（７５ｍｇ）を実施例１のシリカ（１０００Å）１５ｇと結合させた。洗浄及び乾燥後、約０．１８％の炭素がシリカ表面に結合していることが分かった。その後、この初期結合シリカ１．２ｇを１８ｍｌの５０ｍＭ  ＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ４．０、０．２５ＭのＮａＩＯ４をバッファー中に含む）と混合した。混合物を２０ｍｌのシンチレーションバイアル中、室温で一晩、低速で振盪した。次にシリカを５０ｍｌのＤＩ水で５回洗浄及びろ過し、次いで、５０ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ８の１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー１５ｍｌで洗浄した。サンプルをろ過し、約０．２ｇのシリカサンプルを対照用として取り、残りをｐＨ８の上記バッファー５ｇ及び４００ｍｇのプロテインＡ溶液と混合した（プロテインＡは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社より商品名ｒＳＰＡで入手した組換えプロテインＡであった）。サンプルを室温で４時間振盪し、次いで上記バッファー１ｍｌ中０．１６ｇのＮａＢＨ３ＣＮを加えた。サンプルをさらに４時間振盪した。サンプルを５×２０ｍｌの５％ＮａＣｌ、次いで４×２０ｍｌのＤＩ水で洗浄した。乾燥後、熱重量分析による重量減（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．社製ＴＧＡ  Ｑ５００を用い、１２０〜８００℃でのＴＧＡ）をサンプル及び対照（対照サンプルもプロテインＡなしで同じ方法に従った）について測定した。結果を以下の表５に示す。
【０１０５】
【表５】
0006360482.tif 000007
【０１０６】
[0114]対照サンプルの１．１９％より高い３．３０％という量の重量減は、プロテインＡの結合を示している。
[0115]実施例４３では、実施例３８に記載されているのと同様の初期結合手順を利用して、５０ｇのシリカ（１０００Å）を５ｇのアミノプロピルトリメトキシシランと結合させた。洗浄及び乾燥後、炭素の量は元素分析により２．４６％と決定された。ＴＧＡ重量減（１２０〜８００℃）は３．１２％であった。次に、６．７ｇの塩化シアヌルを７０ｍｌの無水トルエンに溶解し、溶液を氷浴中で５℃に冷却した三つ口丸底フラスコ内で撹拌した。２２ｇの初期結合シリカと１．６ｇのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加えた。混合物を冷温で３時間撹拌した。シリカをろ過し、３×３００ｍｌのアセトンで洗浄し、４℃で保管した。ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂ．Ｖ．社製Ａｘｉｏｓ  ｍＡＸ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＷ  ４０００を用いた蛍光Ｘ線分析により、サンプルは約２．１２％の表面塩素を含有していることが示され、塩化シアヌルの結合が示唆された。次に、プロテインＡ溶液３．６ｇを５０ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中に溶解した。上記シリカを加え、混合物を室温で一晩混合した。サンプルをろ過し、３×５００ｍｌの５％ＮａＣｌ及び３×５００ｍｌのＤＩＷで洗浄した。対照も、プロテインＡ溶液の存在を除き同量の試薬を用いて実験した。
【０１０７】
[0116]表６に示されているように、上記サンプルのＴＧＡは、プロテインＡと反応させたサンプルでは高い熱損失を示し、タンパク質の結合を示していた。
【０１０８】
【表６】
0006360482.tif 000008
【０１０９】
実施例４４〜４６
[0117]実施例４４〜４６では、実施例１０のシリカゲル（２５０Å）、ＷＯ２０１１／１４４３４６に記載の方法によって製造された沈降シリカ、及び米国特許第７，２２９，６５５号；６，５５５，１５１号；５，１４９，５５３号；及び６，２４８，９１１号に記載の方法によって製造されたエアセットシリカ(air set silica)を含む、代替のシリカ材料を利用した。
【０１１０】
[0118]実施例４４〜４６の各サンプルを以下の方法に従って処理した。１００ｇのシリカを１Ｌの窪み付き丸底フラスコに加え、このシリカに６．５ｇのエポキシシランを加えた。混合物を回転蒸発器上、室温で一晩回転させた（図８）。次に、１０ｇの０．５Ｍ硫酸を加え、混合物を室温で１時間、次いで湯浴を用いて７０℃でさらに１時間回転させた。シリカを５００ｍｌの１Ｍ硫酸に３０分間浸漬後、ろ過し、３×５００ｍｌのＤＩ水及び３×２５０ｍｌのメタノールで洗浄した。乾燥後、１５ｇの上記シリカを３００ｍｌの三つ口丸底フラスコに入れ、８０ｇのＤＩ水も１５グラムのＡＭＰＳモノマーと共に加えた。撹拌混合物に窒素を２０分間通気した後、３グラムの硫酸セリウム（IV）を加えた。混合物を７０℃に２時間加熱し、次いでシリカをろ過し、３×２００ｍｌの１Ｍ硝酸及び３×３００ｍｌのＤＩ水で洗浄し、乾燥させた。得られたシリカの性質を以下の表７に示した。
【０１１１】
【表７】
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【０１１２】
表７から分かるように、粒子表面上の硫黄の量は表面官能化が達成されたことを示し、そしてまた官能化材料がリゾチームの容認できる静的結合を提供したことも示している。
実施例４７
[0119]実施例４７では、実施例４５の沈降シリカを使用する。ただしシリカの平均粒径は５０ミクロンであった。４０ｇのシリカを実施例１に記載の手順を用いて４ｇのビニルシラン及び４ｇのエポキシシランで処理した。修飾後の結合材料の炭素数は６．４％であった。重合は、実施例１１〜２４で行われたように、１５ｇの修飾シリカ、１２．８ｇのＱモノマー、１．２ｇの第二のモノマー、７０ｍｇの開始剤及び１００ｇのＤＩ水を用いて実施された。重合後の炭素含量は１３．９％であった。
【０１１３】
実施例４８及び４９
[0120]実施例４８及び４９では、エポキシ多孔性樹脂（ポリメタクリレートポリマー樹脂）粒子を使用した（図１０参照）。粒子（５０μｍ又は１００μｍの平均粒径）はエポキシ基（これは水性媒体中で加水分解されてジオール基になる）を有しているので、Ｑポリマーの重合に関して修飾に必要なのはビニル基のみである。従って、１００ｇの粒子を、４００ｍｌのＮＭＰ中４０ｍｌのアリルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で、室温で１時間、次いで６０℃で１時間処理した。冷却後、サンプルをろ過し、３×５００ｍｌのＤＩ水、次いで５００ｍｌのメタノールで洗浄し、一晩風乾させた。３０ｇの上記修飾樹脂の重合は実施例１１に記載の手順を用いて実施した。表８から分かるように、どちらの実施例も容認できるＢＳＡタンパク質の静的結合を提供した。
【０１１４】
【表８】
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【０１１５】
[0121]本発明を限られた数の態様に関して記載してきたが、これらの特定の態様は、本明細書において別段に記載され特許請求されている本発明の範囲を制限することを意図したものではない。当業者には、本明細書中の例示的態様を検討すれば、更なる修正、等価物、及び変形が可能であることは明白であろう。実施例中ならびに本明細書の残りの部分において、すべての部及びパーセンテージは、特に明記されない限り重量による。さらに、本明細書又は特許請求の範囲に列挙されている、特定の一連の性質、測定単位、条件、物理的状態又はパーセンテージを表すような何らかの数値範囲は、文字通り、そのように列挙された何らかの範囲内のいずれかの数値のサブセットも含め、そのような範囲内に入るあらゆる数字を引用又はその他によって本明細書中に明示的に取り込むことを意図している。例えば、下限ＲＬ及び上限ＲＵを有する数値範囲が開示される場合はいつでも、その範囲内に入る任意の数値Ｒも具体的に開示される。特に、その範囲内の下記数値Ｒが具体的に開示される。すなわち、Ｒ＝ＲＬ＋ｋ（ＲＵ−ＲＬ）、ここでｋは、１％ずつ増加する１％〜１００％の範囲の変数、例えば、ｋは１％、２％、３％、４％、５％．．．５０％、５１％、５２％．．．９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。さらに、上で計算されたような、Ｒの任意の二つの数値によって表される何らかの数値範囲も具体的に開示される。本明細書中に示され記載されたものに加えて、当業者には本発明の何らかの修正が上記の説明及び添付の図面から明らかになるであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。本明細書中で引用されたすべての文献は、参照によってそれらの全文を本明細書に援用する。
【符号の説明】
【０１１６】
１００  クロマトグラフィーカラム
１５０  カラムハウジング
１５１  担体ベッド空間
１５２  第一の端部キャップ
１５３  第二の端部キャップ
１５４  カラム入口
１５５  カラム出口
１５６  管状ハウジング部材
１５７  セントラルボア
１５８  ノズル
１５９  フィルター
１６０  分配チャネル
２００  クロマトグラフィーシステム
２０１  溶媒貯留槽
２０２  ポンプ
２０３  プレカラム
２０４  注入口
２０６  検出器
２０７  記録器／モニター
２０８  廃液回収装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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