(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ反応においてハイブリダイゼーションプローブとして使用される標識オリゴヌクレオチドの製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）ローダミン誘導体である蛍光色素を準備するステップ、ここで、前記蛍光色素には二機能性リンカー分子が取り付けられており、ここで前記二機能性リンカー分子は、Ｌ−トレオニノールである；
（ｂ）前記オリゴヌクレオチド内に前記蛍光色素を組み込むために、前記二機能性リンカー分子を介して、前記蛍光色素に反応基を結合させるステップ；
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドの２つの内部ヌクレオチドの間に前記蛍光色素を組み込むステップ、但し、前記蛍光色素は、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に組み込まれることはない
を含む、方法。
【請求項２】
前記蛍光色素が、次の一般式：
【化１】
0006339590.tif 000006
｛式中、
Ｃａ、Ｃｂ、Ｃｃ及びＣｄは、それぞれＣ原子を意味し、ＣａとＣｂは、単結合又は二重結合のいずれかによって一緒に連結され、そして、ＣｃとＣｄは、単結合又は二重結合のいずれかによって一緒に連結され；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ７及びＸ１０は、水素であり、且つ、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１及びＸ１２は、メチルであり；
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なっており、且つ、水素及び１〜２０個のＣ原子を有するアルキルから成る群から選択され、ここで、前記アルキル残基は、少なくとも１つのヒドロキシル、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、カルボキシ又はアルコキシカルボニル基によって任意に置換され、且つ、少なくともＲ１は、活性化可能な基を含んでおり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１は、塩素又はフッ素のいずれかであり、そして、Ｂ２は、塩素、フッ素又は水素のいずれかである｝
の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光色素が：
【化２】
0006339590.tif 000007
である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識オリゴヌクレオチドが、前記標識オリゴヌクレオチドの５’末端に取り付けられたクエンチャー分子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試験サンプル中の標的核酸又は核酸の標的対立遺伝子の存在又は不存在を検出する方法であって、以下のステップ：
前記標的核酸にハイブリダイズする標識プローブオリゴヌクレオチドの使用を伴ったＰＣＲ反応を実施するステップ、ここで、前記標識プローブオリゴヌクレオチドは：
二機能性リンカー分子が取り付けられたローダミン誘導体である蛍光色素、ここで前記二機能性リンカー分子は、Ｌ−トレオニノールである；及び
前記オリゴヌクレオチドの２つの内部ヌクレオチドの間に蛍光色素を組み込むための、前記二機能性リンカー分子に結合された反応基
を有することを特徴とし、但し、前記蛍光色素はオリゴヌクレオチドの５’末端には組み込まれない；
前記蛍光色素からのシグナルを検出するステップ、ここで、前記シグナルの強さは前記標的核酸の存在又は不存在を示す、
を含む、方法。
【請求項６】
前記蛍光色素が、以下の一般式：
【化３】
0006339590.tif 000008
｛式中、
Ｃａ、Ｃｂ、Ｃｃ及びＣｄは、それぞれＣ原子を意味し、ＣａとＣｂは、単結合又は二重結合のいずれかによって一緒に連結され、そして、ＣｃとＣｄは、単結合又は二重結合のいずれかによって一緒に連結され；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ７及びＸ１０は、水素であり、且つ、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１及びＸ１２は、メチルであり；
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なっており、且つ、水素及び１〜２０個のＣ原子を有するアルキルから成る群から選択され、ここで、前記アルキル残基は、少なくとも１つのヒドロキシル、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、カルボキシ又はアルコキシカルボニル基によって任意に置換され、且つ、少なくともＲ１は、活性化可能な基を含んでおり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１は、塩素又はフッ素のいずれかであり、そして、Ｂ２は、塩素、フッ素又は水素のいずれかである｝
の化合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光色素が：
【化４】
0006339590.tif 000009
である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識オリゴヌクレオチドが、前記標識オリゴヌクレオチドの５’末端に取り付けられたクエンチャー分子をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸が、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
核酸の前記標的対立遺伝子が、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子の３３４Ｔ／Ｃ対立遺伝子又は４７２Ｔ／Ｃ対立遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用による核酸配列の検出及び分析の方法に関する。本発明には、遺伝子型決定、病原体検出、及びインビトロ診断向けの適用がある。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術の開発は、遺伝子分析及び遺伝子工学科学に革命をもたらした。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、選択されたプライマー核酸を使用して特定の標的核酸を増幅して、例えば、診断への応用、法医学への応用、又は他の応用の一部として標的核酸の検出を容易にするために一般的に使用されている。プライマーは、典型的には、選択された標的領域を包含するために互いに向かって伸長するように設計されていた二本一組で機能する。典型的なＰＣＲサイクルには、その間に二本鎖核酸が互いに分離する高温（例えば、８５℃以上）変性ステップ、その間にプライマーが、分離した一本鎖にハイブリダイズする低温（例えば、４５〜６５℃）アニーリングステップ、及びその間に核酸ポリメラーゼがプライマーを伸長する中温（例えば、約７２℃）伸長ステップが含まれる。二温度熱サイクル手順も使用される。これらには、一般的に、高温変性ステップ及び低温アニーリング−伸長ステップが含まれる。
【０００３】
増幅産物を検出するための様々なストラテジーが開発されてきたが、最も広く使用される方法の１つは、５’ヌクレアーゼ又はＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイである。５’ヌクレアーゼアッセイでは、典型的には、一連のＰＣＲ中に５’ヌクレアーゼプローブを切断する、特定のＤＮＡポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を使用する。このアッセイは、一般的に、増幅産物を複数ステップで取り扱うことに頼ることなく、標的を増幅すること及び標識を検出のために放出することの両方を可能にする。その５’ヌクレアーゼプローブには、一般的に、蛍光リポーター色素 (reporter dye)及びクエンチャー色素 (quencher dye)等の標識化部分が含まれる。プローブが完全である場合、リポーター色素がクエンチャー色素と接近していることにより、その結果として一般的にリポーター蛍光の抑制がもたらされる。５’ヌクレアーゼ反応中にプローブが切断されると、リポーター色素及びクエンチャー色素が互いから分離され、リポーターからの蛍光が検出可能に増加する結果となる。ＰＣＲ産物又は増幅産物の蓄積は、典型的には、この蛍光増加をリアルタイムでモニターすることにより間接的に検出される。
【０００４】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術はまた、シングルステップアッセイにおけるＤＮＡ増幅と遺伝子型検出にも使用できる。この形式において、各対立遺伝子について一つずつ、２つのオリゴヌクレオチドプローブが使用されるが、それらは、対立遺伝子特異的なヌクレオチドを含むＤＮＡ鋳型の領域にハイブリダイズするように設計されている。それらのプローブは、異なった蛍光色素でそれぞれ標識される。ＰＣＲの増幅ステップ中に、鋳型に完全に合致するプローブが消化されて、対応する色素からの蛍光シグナルの増大をもたらす。しかしながら、１つのヌクレオチドミスマッチを有するプローブは、鋳型ＤＮＡに安定してアニーリングすることができないので、ヌクレアーゼ活性によって分解されることはない。「ミスマッチ」プローブからの対応するレポーター色素は、クエンチャー分子によってクエンチされたままとなるので、蛍光シグナルを呈することはないであろう。より精巧な蛍光検出装置の利用により、複数の遺伝子又は１つの遺伝子の複数の対立遺伝子位置の遺伝子型決定が、それぞれの独特な蛍光レポーター色素で標識された複数のプローブを用いた使用するによって、この種のアッセイにおいて実施できる。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、標的核酸を検出するためのＰＣＲ反応において使用するための蛍光ローダミン由来色素を含む標識オリゴヌクレオチドプローブの製造方法を対象とする。第一の態様において、本発明は、以下を含むＰＣＲ反応においてハイブリダイゼーションプローブとして使用するための標識オリゴヌクレオチドを作製する方法であって、以下のステップ：
ローダミン誘導体である蛍光色素を準備するステップ、ここで、前記蛍光色素には二機能性リンカー分子が取り付けられている；
前記ヌクレオチド内に前記蛍光色素を組み込むために、前記二機能性リンカー分子を介して前記蛍光色素に反応基を結合させるステップ；そして、
前記オリゴヌクレオチドの２つの内部ヌクレオチドの間に当該蛍光色素を組み込むステップ、但し、前記蛍光色素は、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に組み込まれない、
を含む、方法に関する。
【０００６】
第二の態様において、本発明は、試験サンプル中の標的核酸又はある核酸の標的対立遺伝子の存在又は不存在を検出する方法であって、以下のステップ：前記標的核酸にハイブリダイズする標識プローブオリゴヌクレオチドの使用を伴ったＰＣＲ反応を実施するステップ、ここで、前記標識プローブオリゴヌクレオチドは：二機能性リンカー分子が取り付けられたローダミン誘導体である蛍光色素；及び前記オリゴヌクレオチドの２つの内部ヌクレオチドの間に蛍光色素を組み込むための、前記二機能性リンカー分子に結合された反応基を有することを特徴とし、但し、前記蛍光色素は、前記オリゴヌクレオチドの５’末端には組み込まれない；前記蛍光色素からのシグナルを検出するステップ、ここで、前記シグナルの強度が、前記標的核酸の存在又は不存在を示す、を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】（Ａ）ローダミン色素コア及び（Ｂ）Ｌ−トレオニノールの化学構造を示す。
【図２】ＪＡ２７０（カルボン酸類似体）の化学構造を示す。
【図３】同じ日の朝（上）と晩（下）におこなった、５種類の色素基準試薬（５種類の色素混合物、２μＭの混合物）のＵＰＬＣカラムにおけるオリゴヌクレオチドの溶出パターンを示す。
【図４】蛍光検出を使用した、内部標識ＪＡ２７０オリゴヌクレオチドを含む５種類の色素基準試薬のＵＰＬＣ分析を示す。
【図５】ＵＰＬＣによって分析した場合の、「マスターミックス」溶液中に存在しているオリゴヌクレオチドを示す。
【図６】ＵＰＬＣによって分析した場合の、４℃にて３日間の保管後の同じ「マスターミックス」溶液中に存在しているオリゴヌクレオチドを示す。
【図７ａ】陽性対照プラスミド鋳型（ＲＲ）又は陰性対照プラスミド鋳型（ＣＣ）と共に、０日間、３週間又は６週間保存された、Ｒ３３プローブを使用して作成したＰＣＲ成長曲線を示す。
【図７ｂ】陽性対照プラスミド鋳型（ＲＲ）又は陰性対照プラスミド鋳型（ＣＣ）と共に、０日間、３週間又は６週間保存された、Ｒ３４プローブを使用して作成したＰＣＲ成長曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者により共通に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本願発明で使用する多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書中で使用され場合、次の用語は、別段の明記がない限り、それらに帰する意味を有する。
【０００９】
用語「核酸」は、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体等）を意味し、そしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡ−ＤＮＡコンジュゲート、ＰＮＡ−ＲＮＡコンジュゲート、等を含み、線状に又は分枝状に相互の共有結合したヌクレオチドを含む。核酸は、典型的には１本鎖又は２本鎖であり、そして一般にホスホジエステル結合を含むであろう。但し、場合によっては、核酸類似体が含まれ、これは他の主鎖を含み、これには例えば、ホスホルアミド（Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925）、ホスホロチオエート（Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、О−メチルホスホロアミダイト連結（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)を参照のこと）、並びにペプチド核酸主鎖及び連結（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895を参照のこと）が含まれる。他の類似体核酸には、正に荷電した主鎖を有するもの（Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）、非イオン性主鎖を有するもの（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号及び同第４，４６９，８６３号）及び非リボース主鎖を有するものが含まれ、米国特許第５，２３５，０３３号及び同第５，０３４，５０６号に記載されているものが含まれる。１又は複数の炭素環式糖を含有する核酸も核酸の定義に含まれ（Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp. 169-176を参照のこと）、そして類似体も、例えばRawls, C & E News Jun. 2, 1997, page 35に記載されている。リボース−ホスフェート主鎖のこれらの修飾は、標識のごとき追加の成分の付加を促進するため、又は生理的環境における上記のような分子安定性及び半減期を変更するために行われるであろう。
【００１０】
核酸中に典型的に見出される天然の複素環塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）に加えて、ヌクレオチド類似体にはまた、例えばSeela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640に記載されているような非天然核酸塩基も含んでもよい。ヌクレオチド類似体において使用されるある種の塩基は、融解温度（Ｔｍ）調節剤として機能する。例えば、これらの幾つかには７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン等）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例えば、プロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣ等）等が含まれる。米国特許第５，９９０，３０３号を参照のこと。他の代表的な複素環塩基には、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシチジン；５−フルオロシチジン；５−クロロシチジン；５−イオドシチジン；５−ブロモシチジン；５−メチルシチジン；５−プロピニルシチジン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−イオドウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピニルウラシル等が含まれる。
【００１１】
「ヌクレオシド」は、糖成分又は糖成分の機能的同等物（例えば炭素環）に共有結合した塩基又は塩基性基（少なくとも１つの同素環式環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール環、及び／又はこれらに類するもの）を含む核酸成分を意味する。例えば、ヌクレオシドが糖成分を含む場合、塩基は、典型的には糖成分の１位に結合する。上記の通り、塩基は、天然塩基でも非天然塩基でもよい。ヌクレオシドの例にはリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド及び炭素環式ヌクレオシドが含まれる。
【００１２】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのエステル、例えば、ヌクレオシドの糖成分の５’位に共有結合した１個、２個、３個又はそれより多くのリン酸基を有するヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。
【００１３】
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、より短いポリヌクレオチドを記述するのに用いられることのある用語である。オリゴヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列のある領域に対応する少なくとも６個のヌクレオチド、例えば少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５〜３０個のヌクレオチドで構成することができる。
【００１４】
「野生型 (wild-type)」という用語は、本明細書中で使用される場合、天然に存在する起源から単離されたときにその遺伝子又は対立遺伝子の特徴を有する遺伝子又は対立遺伝子を指す。野生型遺伝子又は野生型対立遺伝子は、集団で最も頻繁に観察されるものであり、且つ、その遺伝子又は対立遺伝子の「標準 (normal)」又は「野生型」の形態として任意に指定されるものである。
【００１５】
対照的に、「突然変異体 (mutant)」又は「突然変異した (mutated)」という用語は、野生型遺伝子又は対立遺伝子と比較したときに配列に修飾を示す遺伝子又は対立遺伝子を指す。「突然変異 (mutation)」という用語は、通常保存されている核酸配列のヌクレオチド配列における変化を指し、正常な（変更のない）又は野生型の配列と区別される突然変異体の形成をもたらす。突然変異は一般に、２つの大まかなクラス、すなわち、塩基対置換（例えば、単一ヌクレオチド置換）とフレームシフト突然変異に分類できる。後者は、１つ〜いくつかのヌクレオチド対の挿入又は欠失を伴う。
【００１６】
「対立遺伝子 (allele)」という用語は、１つ又はいくつかの塩基しか異なっていない２つの配列を指す。
【００１７】
「相補的」又は「相補性」という用語は、ワトソン−クリック型塩基対規則によって関係付けられたポリヌクレオチドの逆平行鎖に関して使用する。「完全に相補的」又は「１００％相補的」という用語は、逆平行鎖間の全塩基がワトソン−クリック対となっている相補的配列、すなわちポリヌクレオチド二本鎖のどの２個の塩基間にもミスマッチが存在しない配列を意味する。しかし完全な相補性が存在しない場合でさえ、逆平行鎖の間に二本鎖が形成される。「部分的に相補的」又は「不完全に相補的」という用語は、逆平行ポリヌクレオチド鎖の間の塩基のアラインメントで、１００％完全に至らないあらゆるものを意味する（ポリヌクレオチド二本鎖の中に例えば少なくとも１個のミスマッチ又は一致しない塩基が存在する）。部分的に相補的な鎖の間の二本鎖は、一般に、完全に相補的な鎖の間の二本鎖よりも安定性が劣る。
【００１８】
「サンプル」という用語は、核酸を含んでいるか、核酸を含むと考えられる任意の組成物を意味する。その中には、個人から単離した組織又は流体、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、臓器、腫瘍のサンプルが含まれると共に、個人から採取した細胞から確立したインビトロ培養物のサンプル（例えばその個人から単離したホルマリン固定パラフィン包埋組織 (formalin-fixed paraffin embedded tissues)（ＦＦＰＥＴ）や核酸）も含まれる。
【００１９】
「一次配列」という用語は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの中のヌクレオチドの配列を意味する。ヌクレオチドの修飾、例えば窒素性塩基修飾、糖修飾、骨格のその他の修飾等は、一次配列の一部ではない。標識、例えばオリゴヌクレオチドと共役した発色団等も一次配列の一部ではない。したがって２つのオリゴヌクレオチドは同じ一次配列を共有できるが、修飾と標識に関しては異なっている可能性がある。
【００２０】
「プライマー」という用語は、標的核酸中のある配列とハイブリダイズし、合成に適した条件下で核酸の相補鎖に沿ってその合成の起点として機能することのできるオリゴヌクレオチドを意味する。この明細書では、「プローブ」という用語は、標的核酸中のある配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、通常は検出可能な標識を有するものを意味する。プローブは修飾されていてもよく（例えば、核酸ポリメラーゼによる伸長ができないように３’末端が修飾されている等）、１若しくは複数の発色団を備えていてもよい。配列が同じオリゴヌクレオチドは、あるアッセイではプライマーとして機能し、異なるアッセイではプローブとして機能することができる。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、「二機能性リンカー分子 (bifunctional linker molecule)」という用語は、２つ以上の追加化合物をそれらと化学的に相互作用することによって同時に結びつける化合物を指す。本発明において、例えば、二機能性リンカー分子は、例えば蛍光色素等の標識と結合するのに好適な一方の機能性ドメインと、オリゴヌクレオチドの３’末端位置若しくは５’末端位置、又は内部の位置 (internal position)と結合するのに好適な別の機能性ドメイン又は他の機能性ドメインを有することができる。本発明において、二機能性リンカー分子は、例えば、Ｌ−トレオニノールを含み得る。オリゴヌクレオチドの内部の位置に標識を連結することができる様々な二機能性リンカー分子が、米国特許第５，５８５，４８１号、同第６，１３０，３２３号及びNelson et al., Nucl. Acid. Res. 20: 6253-6259, 1992に記載されている。
【００２２】
この明細書では、「標的配列」、「標的核酸」、「標的」という用語は、核酸配列のうちで増幅される部分、又は検出される部分、又はその両方を意味する。
【００２３】
「ハイブリダイズした」と「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つの核酸の間の塩基対相互作用を意味し、その結果として二本鎖が形成される。ハイブリダイゼーションを実現するのに２つの核酸が全長にわたって１００％相補的である必要はない。
【００２４】
「選択的ハイブリダイゼーション」及び「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、特定の核酸以外に他の核酸も存在する複合混合物の中にあるその特定の核酸に優先的なハイブリダイゼーション（ハイブリダイズする分子の５０％以上）、又はその特定の核酸にほぼ限定されるハイブリダイゼーション（ハイブリダイズする分子の９０％以上）を意味する。例えば典型的なＰＣＲ条件下では、プライマーは標的核酸に特異的にハイブリダイズし、溶液中にやはり存在する非標的核酸は除外される。特異的にハイブリダイズしたプライマーは標的核酸の増幅を促進してその標的核酸の増幅産物を生成させる。その増幅産物は少なくとも最も優勢な増幅産物であり、ほぼすべてを占める（例えばサンプル中の全増幅産物の９０％以上を占める）増幅産物であることが好ましい。非特異的増幅産物は、検出できない程度のわずかな量が存在するか、少量がしか検出されないため特異的増幅産物から容易に区別できることが好ましい。同様に、プローブは標的核酸に特異的にハイブリダイズし、反応混合物に同様に存在する非標的核酸は除外される。特異的にハイブリダイズしたプローブによって検出可能な信号が発生するため標的核酸の特異的な検出が可能になる。その信号は、少なくとも最も優勢な信号であり、ほぼすべてを占める（例えばサンプル中の全増幅産物の９０％以上を占める）信号であることが好ましい。
【００２５】
対立遺伝子特異的プローブ
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、突然変異配列の一方に特異的なオリゴヌクレオチドを、核酸試料を増幅することで得られた増幅産物とハイブリダイズさせることにより、少なくとも１つの塩基が異なっている２つのＤＮＡ分子間での識別に依拠している。対立遺伝子特異的アッセイは、２つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、例えば、一方の変異体と、他方の変異体に対し、別個にハイブリダイズする、最初の変異体用の対立遺伝子特異的プローブ及び第二の変異体用の対立遺伝子特異的プローブを含んで成ることがある。対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションは、典型的には、短いオリゴヌクレオチド、例えば１５〜３５個の長さのヌクレオチドを利用する。かかるプローブを設計するための原理及びガイダンスは当業界で入手可能なものである。ハイブリダイゼーション条件は、十分にストリンジェントであるべきであり、これは、対立遺伝子間でハイブリダイゼーション強度に有意な違いがあること、好ましくは本質的に二種類の応答に有意な違いがあって、プローブが当該対立遺伝子の一方にのみハイブリダイズする条件のことである。プローブによっては、標的ＤＮＡの１セグメントとハイブリダイズし、その結果、注目の部位が、前記プローブの中心部に整列するが、このデザインは必須ではない。
【００２６】
対立遺伝子の量及び／又は存在は、試料とハイブリダイズする対立遺伝子特異的プローブの量を測定することで決定される。典型的に、オリゴヌクレオチドは、標識、例えば蛍光標識で標識される。例えば、標的核酸の対立遺伝子に特異的な対立遺伝子特異的プローブは、対立遺伝子との優先的なハイブリダイゼーションをもたらすハイブリダイゼーション条件下で、生体試料から得られた核酸とハイブリダイズする。蛍光強度は、特異的なオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたか否かを決定するために測定される。
【００２７】
単一ヌクレオチド多形性部位に存在しているヌクレオチドは、当該多形性部位を包含している領域内の野生型の対立遺伝子と実質的に相補的であるか、この部位の標的対立遺伝子と完全に相補的であるオリゴヌクレオチドとの十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションによって同定される。このような十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、プローブと標的対立遺伝子との間でのみ安定な二本鎖が形成する。これらのプローブオリゴヌクレオチドは、約１０〜約３５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約１５〜約３５ヌクレオチドの長さであり得る。
【００２８】
完全というより実質的に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ハイブリダイゼーション条件の最適化が制限されるアッセイフォーマットにおいて望ましいことがある。例えば、多数の標的が固定されたプローブアッセイフォーマットにおいては、各標的のプローブは、単一の固相支持体に固定される。ハイブリダイゼーションは、この固相支持体と標的ＤＮＡを含む溶液とを接触させることで同時に実施される。全てのハイブリダイゼーションが同一の条件下で実施される場合、当該ハイブリダイゼーションは、各プローブについて別個に最適化することはできない。アッセイフォーマットがハイブリダイゼーション条件の調節を妨げる場合、プローブ内へのミスマッチの導入を利用して二本鎖の安定性を調節することができる。二本鎖の安定性に対する特定の導入済みミスマッチの効果は周知であり、そして二本鎖の安定性は、上述のとおり、ルーチンに推定し、且つ実験的に決定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件は、プローブの実際のサイズ及び配列に依存しており、これは、本明細書で提供され、そして当業界で周知のガイダンスを実験的に用いて選択することができる。オリゴヌクレオチドプローブを使用して配列内の一塩基対の違いを決定することは、Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282、並びに米国特許第５，４６８，６１３号及び同第５，６０４，０９９号に記載されている。
【００２９】
完全にマッチしたハイブリダイゼーション二本鎖と一塩基がミスマッチしているハイブリダイゼーション二本鎖との間の安定性の比例した変化は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの長さに依存する。より短いプローブ配列で形成された二本鎖は、ミスマッチの存在により比例的により不安定化される。実際に、約１５個〜約３５個の長さのオリゴヌクレオチドは、配列特異的な検出にとって好ましい。更に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの末端は、熱エネルギーに起因する連続的な無作為の分離及び再アニーリングを受けるため、いずれかの末端でのミスマッチは、内部で生じるミスマッチよりもハイブリダイゼーション二本鎖を不安定化させる。好ましくは、標的配列内の一塩基対の変化を識別するために、プローブ配列は、突然変異部位が当該プローブの内部領域に生じるように標的配列とハイブリダイズするものが選択される。
【００３０】
５’ヌクレアーゼアッセイ
核酸試料の検出は、米国特許第５，２１０，０１５号；同第５，４８７，９７２号；及び同第５，８０４，３７５号；及びHolland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280に記載の「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」又は「５’ヌクレアーゼアッセイ」を用いて実施され得る。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイでは、増幅された領域内でハイブリダイズする標識済みの検出プローブが増幅反応中存在している。プローブは、当該プローブがＤＮＡ合成のためのプライマーとして働かないように修飾される。増幅は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて実施される。増幅の各合成ステップでは、伸張されるプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。従って、新しい標的鎖の合成はプローブの分解をもたらし、この分解産物の蓄積は、標的配列の合成の指標となる。
【００３１】
分解産物を検出するための好適な任意の方法を、５’ヌクレアーゼアッセイで使用することができる。検出プローブは、一般的には、２種の蛍光色素で標識化され、そのうちの一つは他の色素の蛍光をクエンチングすることができる。色素は一般的に５’末端に結合されたレポーター又は検出色素、及び内側の部位 (internal site)に結合されたクエンチング色素を用いて当該プローブに結合される。その結果、当該プローブはハイブリダイズしていない状態にある場合、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブの開裂が当該２種の色素間で起こるようにクエンチングが生じる。増幅は、色素間でのブローブの開裂を招くと共に、これに伴うクエンチングの排除及び最初にクエンチングした色素から観察される蛍光の増大をもたらす。分解産物の蓄積は、反応中の蛍光の増加量を測定することによって追跡できる。米国特許第５，４９１，０６３号及び同第５，５７１，６７３号は、増幅と同時に生じるプローブの分解の代替的検出方法を説明している。
【００３２】
標的核酸を検出するための５’ヌクレアーゼアッセイは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する任意のポリメラーゼを利用することができる。従って、幾つかの態様において、５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、熱安定性及び熱活性を有する核酸ポリメラーゼである。かかる熱安定性ポリメラーゼには、限定されないが、真正細菌属であるサーマス（Thermus）、サーマトガ（Thermatoga）、及びサーモシフォ（Thermosipho）の様々な種に由来する天然及び組換え型のポリメラーゼ、並びにそれらのキメラ型を含む。例えば、本発明の方法で使用することのできるサーマス種のポリメラーゼには、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス種ｓｐｓ１７（ｓｐｓ１７）、及びサーマス種Ｚ０５（例えば、米国特許第５，４０５，７７４号；同第５，３５２，６００号；同第５，０７９，３５２号；同第４，８８９，８１８号；同第５，４６６，５９１号；同第５，６１８，７１１号；同第５，６７４，７３８号及び同第５，７９５，７６２号に記載のもの）が含まれる。本発明の方法で使用することのできるサーマトガポリメラーゼには、例えば、サーマトガ・マリチマ（Thermatoga maritima）ＤＮＡポリメラーゼ及びサーマトガ・ネアポリタナ（Thermatoga neapolitana）ＤＮＡポリメラーゼがあり、一方、使用することのできるサーモシフォポリメラーゼの例には、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）ＤＮＡポリメラーゼがある。サーマトガ・マリチマ（Thermatoga maritima）及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）ＤＮＡポリメラーゼの配列は、国際出願ＷＯ９２／０６２００で公開されている。サーマトガ・ネアポリタナ（Thermatoga neapolitana）の配列は、国際出願ＷＯ９７／０９４５１で見られる。
【００３３】
５’ヌクレアーゼアッセイにおいて、増幅検出は通常増幅と並行して行われる（すなわち、「リアルタイム」）。幾つかの態様において、増幅の検出は定量的であり、且つ、増幅の検出はリアルタイムである。幾つかの態様において、増幅の検出は定性的である（例えば、標的核酸の存在又は不在の終点検出）。幾つかの態様において、増幅の検出は増幅の後である。幾つかの態様において、増幅の検出は定性的であり、且つ、増幅の検出は増幅の後である。
【００３４】
プローブは、任意の数の標識で検出することができるが、通常、これは蛍光標識である。幾つかの態様において、フルオロフォア部分は、フルオレセインファミリーの色素、ポリハロフルオレセインファミリーの色素、ヘキサクロロフルオレセインファミリーの色素、クマリンファミリーの色素、ローダミンファミリーの色素、シアニンファミリーの色素、オキサジンファミリーの色素、チアジンファミリーの色素、スクアラインファミリーの色素、キレート化ランタニドファミリーの色素、アゾファミリーの色素、トリフェニルメタンファミリーの色素、及びＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ファミリーの色素から成る群から選択される。
【００３５】
本アッセイは、しばしば、蛍光標識及びクエンチャー部分で標識されたプローブを含んで成る。幾つかの態様において、クエンチャー部分は、フルオレセインファミリーの色素、ポリハロフルオレセインファミリーの色素、ヘキサクロロフルオレセインファミリーの色素、クマリンファミリーの色素、ローダミンファミリーの色素、シアニンファミリーの色素、オキサジンファミリーの色素、チアジンファミリーの色素、スクアラインファミリーの色素、キレート化ランタニドファミリーの色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ファミリーの色素、アゾファミリーの色素、トリフェニルメタンファミリーの色素、低蛍光クエンチャー部分（すなわち、「ジムドナー（dim donor）」）、及び非蛍光クエンチャー部分（例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）を含む、いわゆる「ダーククエンチャー」）から成る群から選択される。
【００３６】
ローダミン由来色素
ローダミンは、図１Ａに示されているコア構造を含む蛍光色素である。例えばカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）やスルホローダミン１０１酸クロリド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）等のローダミンのいくつかの誘導体もまた、造影目的で一般的に使用される蛍光色素である。その蛍光放出最大値が６００ｎｍの範囲内にある新規ローダミン誘導体が米国特許第６，１８４，３７９号（‘３７９）に開示されている。これらの誘導体は、次の式：
【００３７】
【化１】
0006339590.tif 000002
【００３８】
｛式中、Ｃａ、Ｃｂ、Ｃｃ及びＣｄは、それぞれＣ原子を意味し、ＣａとＣｂは、単結合又は二重結合のいずれかによって連結され、そして、ＣｃとＣｄは、単結合又は二重結合のいずれかによって一緒に連結され；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ７及びＸ１０は、水素であり、且つ、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２はメチルであり；
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なっており、且つ、水素及び１〜２０個のＣ原子を有するアルキルから成る群から選択され、ここで、前記アルキル残基は、少なくとも１つのヒドロキシル、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、カルボキシ又はアルコキシカルボニル基によって任意に置換され、且つ、少なくともＲ１は、活性化可能な基を含んでおり；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１は、塩素又はフッ素のいずれかであり、そして、Ｂ２は、塩素、フッ素又は水素のいずれかである。｝で表される構造を有する。２種類の特定の化合物、ＪＡ２７０及びＪＦ９もまた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）システムの形で使用され得るフルオロフォアとして特に好適であることが示されたＪＡ２７０のカルボン酸類似体（図２）を含めて、‘３７９特許に記載されている。
【００３９】
ＪＡ２７０の特に好ましい使用は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおける、オリゴヌクレオチドプローブに結合されたフルオロフォアとしての使用であろう。当該フルオロフォアは、プローブに同様に結合されている好適なクエンチャー分子によってクエンチングされ得る。さらに、蛍光標識としてＪＡ２７０の有用性を最大限に引き出すために、プローブオリゴヌクレオチド配列内のどこにでも標識の置換を可能にする二機能性リンカーをＪＡ２７０に結合させることが望ましいであろう。好適な二機能性リンカーは、Ｌ−トレオニノール又は（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−１，３−ブタンジオール（図１Ｂ）であろう。それらは、ＪＡ２７０とアミド結合を形成することができ、さらに、ホスホラミダイト等のオリゴヌクレオチド合成のための標準的な反応基や４，４’ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）等のブロック基のヒドロキシル残基の両方に結合されることができる。本発明に記載のとおり、プローブオリゴヌクレオチドの内部部位におけるＪＡ２７０色素の置換は、プローブの安定性及び機能における予想外の改善を示すであろう。
【００４０】
アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）遺伝子の多型性
ＡｐｏＥは、様々なリポタンパク質種の主な成分であり、血漿コレステロールレベルの制御において中心的役割を担っている。ａｐｏＥをコードする遺伝子は、不均一型で存在し、それらの一部では、転写活性に特異的に影響すること、又は構造的若しくは機能的に異なったタンパク質アイソフォームをコードすることが知られている。ａｐｏＥ２、ａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４というａｐｏＥの三大アイソフォームは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体に対して異なった結合親和力を有しているので、異なった血漿脂質レベル及びリポタンパク質レベルに関係している。その三大アイソフォームは、ａｐｏＥポリペプチド鎖の１１２位におけるａｐｏＥ２及びａｐｏＥ３型のシスチン（Ｃｙｓ）とａｐｏＥ４型のアルギニン（Ａｒｇ）、そして、１５８位におけるａｐｏＥ２型のＣｙｓとａｐｏＥ３及びａｐｏＥ４型のＡｒｇの存在を特徴としている。第１１２及び１５８アミノ酸の変異性は、それぞれａｐｏＥ遺伝子のヌクレオチド配列３３４位及び４７２位に存在している一塩基多型（ＳＮＰ）に基づいている。それぞれの位置において、ＣｙｓはコドンＴＧＣによって決定され、そして、ＡｒｇはコドンＣＧＣによって決定される。これらの対立遺伝子は、本明細書中では３３４Ｔ／Ｃ対立遺伝子及び４７２Ｔ／Ｃ対立遺伝子と呼ばれる。組み合わせ、３３４Ｔ／４７２Ｔ、３３４Ｔ／４７２Ｃ、及び３３４Ｃ／４７２Ｃは、それぞれ既知のアイソフォーム特異的ａｐｏＥ対立遺伝子、ε２、ε３、及びε４を形成する。
【００４１】
心血管疾患や神経学的疾患に関してリスクのある個人を同定するのに貴重な情報を提供するとして認められているため、ａｐｏＥ遺伝子型決定には大きな関心が集まっている。特に、ａｐｏＥ対立遺伝子ε４の存在が、末梢及び冠状動脈の動脈疾患、並びに散発性及び遅発性家族型のアルツハイマー疾患を含めた神経変性疾患の発症機序に関連していることがわかった。遺伝子型決定に一般的に使用される方法には、ＰＣＲ−制限断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）分析や、ＰＣＲと、それに続く配列決定法又は質量分析法が含まれるが、両方とも手間がかかって処理能力が低い方法である。対立遺伝子特異的プライマー又は対立遺伝子特異プローブのいずれかを使用したリアルタイムＰＣＲによる遺伝子型決定もまた記載され（Calero et al., J. Neurosci Methods. 2009, 183(2):238-40; Koch et al., Clin. Chem. Lab Med. 2002, 40:1123-1131）、迅速かつ効果的な代替手段になることが示された。そのため、ａｐｏＥ対立遺伝子を迅速、且つ、正確に遺伝子型決定できる、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術等のリアルタイムＰＣＲ分析に使用される試薬を開発する必要がある。
【００４２】
以下の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供される。本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。当然のことながら、本発明の趣旨から逸脱することなく記載の手段には変更が加えられてもよい。
【実施例】
【００４３】
実施例１  較正に使用されるＪＡ２７０標識対照オリゴヌクレオチドの分析
蛍光検出の較正に使用するための基準試薬溶液を製造し、そして、それは、５種類の異なった蛍光色素を使用して５’末端ヌクレオチドですべて標識した、１０ｍｅｒのデオキシチミジン（ｄＴ）オリゴヌクレオチドを２μＭの濃度で含んでいた。その５種類の蛍光色素とは、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、Ｃｏｕｍａｒｉｎ−３４３、及びＣｙ５．５であった。この基準溶液の純度及び安定性を、Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ（ＰＤＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ及び蛍光検出によって分析した。クロマトグラフィーを、Ａｃｑｕｉｔｙ ＯＳＴ Ｃ８の１．７μｍの粒子カラムで実施した。移動相はバッファーＡとしての０．１Ｍの酢酸ヘキシルアンモニウム（ＨＡＡ）ｐＨ７．０とバッファーＢとしての１００％のアセトニトリルから成り、そして、当該オリゴヌクレオチドを、１ｍＬ／分の流速にて、最初の０．６分間の３０−６０％のバッファーＢと、それに続く１．４分間の６０−９５％のバッファーＢのグラジエントにわたって分離した。同じ日の朝（上）と晩（下）に実施した実験におけるオリゴヌクレオチドの溶出プロフィールを図３に示す。興味深いことに、ＪＡ２７０ピークは、晩の実施においてサイズが大きく減少しており、他ならぬこのオリゴヌクレオチドの安定性に問題がある可能性を示唆している。ＪＡ２７０色素のサイズと疎水性のため、他ならぬこのオリゴヌクレオチドが溶液中に析出する（fall out of solution）であろうことが推測された。ＪＡ２７０標識オリゴヌクレオチドの疎水性を低下させるために、ＪＡ２７０を５’末端の代わりに内部の位置に配置したＪＡ２７０で標識した１０ｍｅｒのｄＴを合成することを決めた。ＪＡ２７０色素の内側への配置を、当該色素のカルボン酸部分にＬ−トレオニノールリンカー結合させ、そして、オリゴヌクレオチド内の内側のホスファートと連結可能な反応性ホスホラミダイト基を追加することによって可能にした。ＵＰＬＣ分析を再び実施し、そして、その結果を、図４に描かれた表及び棒グラフに示す。ＪＡ２７０色素をオリゴヌクレオチドの内部部位に配置することによって、１カ月の保管後であってもＪＡ２７０で標識した１０ｍｅｒのｄＴの安定性を維持できた。
【００４４】
実施例２  ａｐｏＥ遺伝子型決定のためのＪＡ２７０標識プローブの分析
ａｐｏＥ遺伝子のε２、ε３、及びε４対立遺伝子を遺伝子型決定するためのアッセイを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術及び対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブオリゴヌクレオチドを使用して開発した。「マスターミックス」オリゴヌクレオチド溶液を調製し、それには、次のプローブ：
３３４Ｔ対立遺伝子選択性の５’末端ＦＡＭ標識２２ｍｅｒプローブ
３３４Ｃ対立遺伝子選択性の５’末端ＨＥＸ標識２２ｍｅｒプローブ
４７２Ｃ対立遺伝子選択性の５’末端ＪＡ２７０標識２２ｍｅｒプローブ
４７２Ｔ対立遺伝子選択性の５’末端Ｃｙ５．５標識２２ｍｅｒプローブ、
が含まれていた。
【００４５】
その「マスターミックス」溶液を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＯＳＴ Ｃ１８の１．７μｍの粒子カラムを使用したＵＰＬＣによって正しい組成と安定性について分析した。移動相は、バッファーＡとしての０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）ｐＨ７．０と、バッファーＢとしての１００％のアセトニトリルから成り、そして、当該オリゴヌクレオチドを、１ｍＬ／分の流速にて、３分間の５−６０％のバッファーＢのグラジエントにわたって分離した。４つのプローブと２つのＰＣＲプライマーのためのすべてでオリゴヌクレオチドピークが観察できた０日目の「新しい」溶液の溶出プロフィールを図５に示す。しかしながら、図６に見られるように、４℃にて３日間の保管後にこの溶液を分析したとき、ＪＡ２７０標識オリゴヌクレオチドのピークは見えなくなっていた。実施例１における５’末端で標識したＪＡ２７０標識基準ｄＴオリゴヌクレオチドの不安定性の理由であると考えられたことと同様に、ＪＡ−２７０標識ａｐｏＥプローブの不安定性もまたオリゴヌクレオチドの凝集に起因すると考えられ、そしてそれも溶液中に析出した。
【００４６】
不安定性の問題を解決するために、ＪＡ２７０標識プローブの長さを、まず２２ｍｅｒのオリゴヌクレオチドから２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドに延長した。２５ｍｅｒプローブの１つのバージョンでは、まだ５’末端にＪＡ２７０を配置し（プローブＲ３３とした）、それに対し、別のバージョンにおいて、ここでは、ＪＡ２７０色素を、第１２ヌクレオチドと第１３ヌクレオチドの間の内側に配置した（プローブＲ３４とした）。色素の内側への置換は、ＪＡ２７０上のカルボン酸部分にＬ−トレオニノールリンカーを結合させることによって可能にした。次に、リアルタイムＰＣＲアッセイを、次の表１及び２に挙げたバッファー及び条件下、プローブＲ３３及びＲ４４の両方を使用して実施した。４７２Ｃ対立遺伝子を担持する陽性対照プラスミド鋳型及び４７２Ｔ対立遺伝子を担持する陰性対照プラスミド鋳型を、対立遺伝子特異的ＰＣＲ成長曲線を作成するためのＲ３３及びＲ３４プローブの能力と比較するために使用した。図７に示されているように、内側に配置したＪＡ２７０色素を有するＲ３４プローブは、３週間又は６週間のいずれかの間保存したプローブを使用した成長曲線においても有意な変化のない、良好な安定性を示した。対照的に、５’末端で標識したＲ３３プローブは、３週間又は６週間保存したプローブによって作成した成長曲線において蛍光シグナルの非常に大きな減少を示した。この結果は、プローブオリゴヌクレオチド内の内部部位にＪＡ２７０色素を配置することで、当該プローブの安定性及び能力を大きく増強することを明確に示した。
【００４７】
【表１】
0006339590.tif 000003
【００４８】
【表２】
0006339590.tif 000004
【００４９】
【表３】
0006339590.tif 000005
【図１（Ａ）】
0006339590.tif 000010
【図１（Ｂ）】
0006339590.tif 000011
【図２】
0006339590.tif 000012
【図３】
0006339590.tif 000013
【図４】
0006339590.tif 000014
【図５】
0006339590.tif 000015
【図６】
0006339590.tif 000016
【図７ａ】
0006339590.tif 000017
【図７ｂ】
0006339590.tif 000018