(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＧＬＰ（glucagon like peptide）又はそのアナログと、（ｂ）免疫グロブリンＦｃポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドであって、
前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、（ｉ）配列番号２５のＣ末端から３５〜４９個の連続するアミノ酸配列からなる分離されたＩｇＤヒンジ（hinge）領域と、（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃポリペプチドのＣＨ２及びＣＨ３領域とを含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＧＬＰはＧＬＰ−１である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＧＬＰ−１は、配列番号１又は１３のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＧＬＰ−１のアナログは、ＤＰＰ−４酵素による切断部位（cleavage site）が変異したものであって、配列番号２〜１２及び１４〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ＧＬＰはＧＬＰ−２である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＧＬＰ−２は、配列番号４４のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−２のアナログは、ＤＰＰ−４酵素による切断部位（cleavage site）が変異したものであって、配列番号４５又は４６のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記ＩｇＤヒンジ領域は、配列番号２６〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃポリペプチドが融合されていないポリペプチドより増加した半減期を示すものである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記融合ポリペプチドは、配列番号３０〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドは、配列番号４７〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項２に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含む、糖尿病治療用薬学的組成物。
【請求項１３】
糖尿病治療のための薬剤を製造するための、請求項２に記載の融合ポリペプチドの使用。
【請求項１４】
請求項５に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含む、炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療のための薬剤を製造するための、請求項５に記載の融合ポリペプチドの使用。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号４１〜４３からなる群から選択される核酸配列からなる、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号５２〜５４からなる群から選択される核酸配列からなる、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰ（glucagon like peptide）及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃ融合ポリペプチドに関し、特にＧＬＰ又はそのアナログに適した免疫グロブリンハイブリッドＦｃを見出したことに基づく、従来の融合ポリペプチドに比べて半減期が増加して効能に優れた融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む、糖尿病、炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療用薬学的組成物に関する。また、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む宿主細胞も本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、遺伝的、環境的原因でインスリン分泌に問題が生じるか、インスリン機能に異常が生じることにより、血液中のブドウ糖が細胞のエネルギー源になれずに血中に多く残る高血糖症（hyperglycemia）の症状を示す代謝性疾患であり、合併症を伴うので現代で最も深刻な慢性疾病である。
【０００３】
糖尿病は、１型糖尿病（Type 1 diabetes）と２型糖尿病（Type 2 diabetes）に大別される。１型糖尿病は、全糖尿病患者の１０％未満を占め、主に小児に発症し、自己免疫疾患などによる膵臓β細胞の破壊によりインスリン合成及び分泌が行われずに発症することが報告されており、インスリン注射を生涯にわたって必要とする。それに対して、２型糖尿病は、全糖尿病患者の９０％以上を占め、主に成人に発症し、特に過体重及び肥満の成人の発症率が高く、膵臓からのインスリン分泌障害及びインスリン抵抗性が原因として報告されている。
【０００４】
このような糖尿病の治療のために、基本的に運動及び食餌療法が先行されるが、それらにより血糖の調節が困難な場合は、糖尿病治療剤の単独又は併用投与が行われる。米国糖尿病学会（ＡＤＡ）のガイドラインを参照すると、１次で選択される薬剤はメトホルミン（metformin）であり、２次、３次の薬物はスルホニルウレア（sulfonylurea）系、グリニド（glinide）系、チアゾール（thiazolidinedione）系、ＤＰＰ−４阻害剤などであり、その後ＧＬＰ−１（glucagon like peptide-1）アゴニスト（agonist）などの注射剤又はインスリン注射剤が用いられる。
【０００５】
しかし、現在臨床で用いられている従来の経口用糖尿病治療剤の場合、持続的な血糖の正常化維持という肯定的な面だけでなく、長期服用時に低血糖誘発、下痢、体重増加、心血管系問題、肝毒性などの様々な副作用を起こすので、結局は膵臓のβ細胞が破壊され、最後にインスリンが注射される。また、最後の治療方法であるインスリン投与も、毎日２〜３回皮下注射をしなければならないという不便があり、最大の副作用である低血糖誘発の可能性もある。
【０００６】
このような問題を解決するために、近年、次世代糖尿病治療剤として注目されているのがＧＬＰ−１である。ＧＬＰ−１及びそのアナログと誘導体は、２型糖尿病治療のための臨床試験で良好な可能性を示し、インスリン分泌刺激、グルカゴン分泌抑制、胃空腹化抑制、胃運動性又は腸運動性抑制、体重減量誘導などの多くの生物学的効果をもたらす。また、長期服用時にも膵臓保護機能を有し、低血糖のリスクがなく、長期間適正血糖を維持することができる。
【０００７】
しかし、生体内ではＤＰＰ−４という酵素により前記ＧＬＰ−１が切断されて不活性化されるので、生体内半減期が非常に短く、治療剤としての開発に困難がある。よって、生物学的活性を保持しつつＧＬＰ−１の半減期を延長したり、身体からのペプチドの除去率を下げるために様々なアプローチが行われてきた。すなわち、様々なＧＬＰ−１アナログの開発が活発に行われており、免疫グロブリンＦｃフラグメントにＧＬＰ−１を融合させるアプローチも行われてきた（特許文献１など）。
【０００８】
しかし、それにもかかわらず、いまだ免疫グロブリンＦｃを融合する技術の適用は、半減期の限界、ＡＤＣＣ誘発能、ＤＰＰ−４酵素に対する安定性などの面で商用化には十分でない現状である。
【０００９】
一方、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、遺伝的、免疫学的要因により発症するものと考えられているが、いまだその原因と治療法が明確でない難治性疾患である。消化管内壁に発生した炎症が原因で現れる慢性疾患であり、潰瘍性大腸炎とクローン病に大別される。
【００１０】
潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis, UC）は、消化管のうち大腸の粘膜に発生する慢性炎症性疾患であり、炎症は直腸から始まって口側の大腸に連続している。患者は下痢、血便、腹痛などを訴え、食欲減退、体重減少、疲労感なども比較的多く現れる症状である。ほとんどの場合に症状の悪化と好転が繰り返され、時には非常に長期間にわたって症状がない時期がある。
【００１１】
クローン病（Crohn's disease, CD）は、潰瘍性大腸炎とは異なり、炎症が腸の全層を侵し、病変の分布も連続的でなく、断続的であることが多い。症状は下痢、腹痛、食欲減退などが多く、症状の種類と程度は患者によって非常に多様であり、潰瘍性大腸炎に比べて患者の感じる苦痛が大きい例が多く、長期的な経過や治療に対する反応が悪いので、手術に至ることが多い。
【００１２】
前記炎症性腸疾患は、いまだ原因が明らかにされていないので完治に至る方法は知られていないが、病気の経過に影響を及ぼす因子については多くの研究が行われており、炎症を緩和するための様々な薬が開発されて用いられている。現在広く用いられている炎症性腸疾患治療剤は、症状の重度に応じて、抗炎症剤（5-ASA; 5-AminoSalicylic Acid）、ステロイド製剤、６−ＭＰ（6-mercaptopyrine）などの免疫抑制剤、ＴＮＦα阻害剤（anti-TNFα antibody, Infliximab）などの生物学的製剤の順に段階的に用いられる。しかし、現在用いられている治療剤には様々な副作用が伴うので、１）従来の薬物を補完又は代替できる効能を有する生物学的製剤、又は２）従来の薬物が有する機序とは異なる新たな機序を用いる生物学的製剤の開発が強く求められている現状である。
【００１３】
このような問題を解決するために、近年、炎症性腸疾患治療剤として注目されているのがＧＬＰ−２である。腸内Ｌ細胞から分泌されるＧＬＰ−２は、腸内細胞に発現するＧＬＰ−２受容体信号により、ＩＧＦ−１、ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）などの生成を誘導する。生成されたＩＧＦ−１はＰＩ−３Ｋ、ＡＫＴ信号伝達により腸細胞の成長を誘導し、ＮＯは腸内血流の改善をサポートする。また、ＧＬＰ−２は、ＶＩＰの生成を誘導することにより抗炎症作用をもたらすことが知られており、炎症性腸疾患だけでなく、短腸症候群（Short bowel syndrome）などに効果的であることが様々な研究チームにより実験的に立証されている。
【００１４】
実際に、ＧＬＰ−２アナログであるＧａｔｔｅｘ（teduglutide）が２０１２年末に米国のＮＰＳ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．により開発され、短腸症候群（short bowel syndrome, SBS）の治療剤として希少医薬品に指定され、適応症を拡大して炎症性腸疾患患者に臨床２相を行っている。
【００１５】
しかし、前記Ｇａｔｔｅｘも天然ＧＬＰ−２に比べて血中半減期が大きく増加するものの、１日１回注射をしなければならないので、依然として患者の利便性におけるニーズが満たされていない。しかも、炎症性腸疾患においては、炎症性腸疾患が生涯にわたって治療しなければならない自己免疫疾患であるということを考慮すると、多くとも週１回から月１回投与する長期持続型治療剤の形態に開発しなければならない現状である。すなわち、ＧＬＰ−２はペプチドホルモンであるため、その持続性がタンパク質治療剤に比べて著しく低いので、長期持続力が問題となり、それを解決する方法が必要である。
【００１６】
一方、癌細胞は急速に増殖して分裂する特徴があるので、ほとんどの抗癌剤は急速に成長する細胞を殺すように作られている。しかし、一部の正常細胞も癌細胞のように急速に増殖するので、抗癌化学療法においては正常細胞も損傷を受ける。正常細胞のうち急速に分裂増殖する細胞、すなわち骨髄で形成された血液細胞、口腔を含む消化器の上皮細胞、髪の毛の細胞、精子、卵子を作る生殖細胞などが大きな影響を受ける。特に、抗癌剤により消化器に粘膜炎が発生することが多いが、その場合は下痢を起こし、下痢が悪化すると脱水を防ぐために静脈注射で輸液と栄養分を供給しなければならない。よって、予定された抗癌化学療法の日程を変更しなければならない場合は、癌治療に莫大な影響を与える。よって、抗癌化学療法による腸粘膜炎と下痢を未然に防ぐことは、患者の苦痛を減らし、抗癌効果を最大化することができるので、その必要性が大きいといえる。ＧＬＰ−２においては、小腸細胞の絨毛を形成するクリプト細胞（crypt cell）の増殖を誘導するので、抗癌化学療法による副作用を早期に治癒することができ、長期持続型ＧＬＰ−２アナログの開発は、抗癌化学療法１サイクル（cycle）当たり１回の注射で抗癌化学療法による腸粘膜炎と下痢を予防することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第７４５２９６６号明細書
【特許文献２】国際公開第２００８／１４７１４３号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０１１７７５２号明細書
【特許文献４】国際公開第２０００／０１６７９７号
【特許文献５】国際公開第１９９８／００８５３１号
【特許文献６】国際公開第１９９８／０１９６９８号
【特許文献７】米国特許第６００６７５３号明細書
【特許文献８】国際公開第１９９９／０６４０６０号
【特許文献９】国際公開第２０００／００７６１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
こうした背景の下、本発明者らは、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２などのＧＬＰを含む短いペプチドの体内半減期を増加させて長期持続型治療剤として開発するために、従来の本発明者らの先行特許である特許文献２で作製した免疫グロブリンハイブリッドＦｃ技術を組み合わせ、そのうちＧＬＰ（glucagon like peptide）に特異的に最適化された免疫グロブリンＦｃを選択し、増加した半減期を有しながらもＤＰＰ−４酵素に対して優れた抵抗性を有する融合ポリペプチドを作製することにより、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、（ａ）ＧＬＰ（glucagon like peptide）又はそのアナログと、（ｂ）限られた数のＩｇＤヒンジ領域を含む免疫グロブリンＦｃポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドを提供することを目的とする。
【００２０】
また、本発明は、前記融合ポリペプチドを有効成分として含む、糖尿病、炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００２１】
さらに、本発明は、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の融合ポリペプチドは、従来のＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２より増加した半減期を有し、ＤＰＰ−４酵素に対する優れた抵抗性を有するので、糖尿病、炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療において従来の薬剤に比べて優れた薬物効果を示し、医薬品として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５の作製に関する図であり、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５の概略及び配列を示す図である。
【図２】ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９の作製に関する図であり、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９の配列及び概略を示す図である。
【図３】ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の作製に関する図であり、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の概略を示す図である。
【図４】ＧＬＰ−１ペプチドとＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５のＰＫプロファイルを確認するグラフである。
【図５】ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９のＰＫプロファイルに関する図であり、各時間における血液中に残存するタンパク質量及び薬物濃度曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す図である。
【図６】ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９のＰＫプロファイルに関する図であり、各時間における血液中に残存するタンパク質量を示す図である。
【図７】ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９の血清中安定性を確認する図であり、各反応時間における残存するタンパク質量及び時間別グラフの曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す図である。
【図８】ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９のＤＰＰ−４抵抗性を確認する図であり、各反応時間における残存するタンパク質量及び時間別グラフの曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す図である。
【図９】ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９のＰＤプロファイルに関する図であり、血中グルコースの濃度変化を測定してＡＵＣ値を求め、陰性対照群に対するＡＵＣの割合を示す図である。
【図１０】ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９の体重減少効果を確認する図であり、体重変化量及び累積食餌摂取量を示す図である。
【図１１】ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９及びＧＬＰ−１−ｌｉｎｋｅｒ−ＩｇＧ４−ｍｕｔのＡＤＣＣ阻害能を比較する図であり、Ｆｃγ受容体に対する結合能を確認する図である。
【図１２】ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性を確認する図であり、ｃＡＭＰにより誘導される膜脱分極を測定した結果を示す図である。
【図１３】ＧＬＰ−２−２Ｇ及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の炎症性腸疾患治療効果に関する図であり、インドメタシンを投与して誘導した炎症性腸疾患モデルにおける体重変化、ＴＮＦ−ａ発現量変化及び小腸長変化を示す図である。
【図１４】ＧＬＰ−２−２Ｇ及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の腸上皮細胞増殖促進効果を確認する図である。
【図１５】ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の小腸成長促進効果を確認する図であり、小腸の重量を示す図である。
【図１６】ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の下痢減少効果を確認する図であり、５−ＦＵにより誘導された下痢の減少効果を示す図である。
【図１７】ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の致死率減少効果を確認する図であり、５−ＦＵにより下痢が誘導されて発生した致死率の減少効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
前記目的を達成するための本発明の一態様は、（ａ）ＧＬＰ又はそのアナログと、（ｂ）限られた数のＩｇＤヒンジ領域を含む免疫グロブリンＦｃポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドを提供する。
【００２５】
具体的には、前記融合ポリペプチドは、（ａ）ＧＬＰ又はそのアナログと、（ｂ）免疫グロブリンＦｃポリペプチドとを含み、ここで前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、（ｉ）配列番号２５のＣ末端から３５〜４９個の連続するアミノ酸配列からなる分離されたＩｇＤヒンジ領域と、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列からなるＣＨ２及びＣＨ３領域とを含んでもよい。
【００２６】
前記ＧＬＰ又はそのアナログのＣ末端が免疫グロブリンＦｃポリペプチドのＮ末端と結合されたものであることが好ましく、免疫グロブリンＦｃポリペプチド内ではＩｇＤヒンジ領域のＣ末端がＣＨ２及びＣＨ３領域のＮ末端と結合されたものであることが好ましい。よって、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＧＬＰ又はそのアナログと、ＩｇＤヒンジ領域と、ＣＨ２及びＣＨ３領域とが順次結合されて含まれるものであってもよい。本発明における「融合ポリペプチド」とは、前記ＧＬＰなどの生物学的活性分子と免疫グロブリンＦｃポリペプチドが融合された形態を意味し、「Ｆｃ融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」などの用語と混用される。
【００２７】
本発明における前記ＧＬＰ（glucagon like peptide, グルカゴン様ペプチド）は、ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２の両方を含む概念である。
【００２８】
ＧＬＰ−１とＧＬＰ−２ ｐｅｐｔｉｄｅは、生体内での作用機序や役割は異なるが、ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ ｇｅｎｅにおいて１つのｍＲＮＡ前駆体から生成されるｐｅｐｔｉｄｅであり、アミノ酸配列の相同性が高く、ＤＰＰ−４酵素により切断される部位が同一であり、分子的特性が類似したホルモンであるので、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２を含むＧＬＰ（glucagon like peptide）は免疫グロブリンＦｃポリペプチド融合の際に類似した形態となる。具体的には、前記ＧＬＰは、本発明者らにより開発されたハイブリッドＦｃ（hybrid Fc, hyFc）ポリペプチドとの融合の際に類似した形態のｈｙＦｃとなる。
【００２９】
本発明における「ＧＬＰ−１（glucagon like peptide-1）」とは、消化器官から分泌されるホルモンであるインクレチンの一種であり、摂取に依存して腸管内のＬ細胞から分泌されて膵臓のインスリン分泌を増加させる役割と、グルカゴンの分泌を抑制することにより食後血糖の上昇を抑制する役割を果たすことが知られているタンパク質である。このように、ＧＬＰ−１は、以前から糖尿病治療用途が広く知られており、食欲の生理的調節に関与することによる体重減少効果も報告されている。
【００３０】
一方、前記天然ＧＬＰ−１は、最初の６個のアミノ酸が分子から切断されるように生体内で加工される。よって、当業界における慣行に従い、ＧＬＰ−１のＮ末端は７位、Ｃ末端は３７位と指定される。前記加工によりインスリン分泌機能のない形態であるＧＬＰ−１（１−３７）からＧＬＰ−１（７−３７）の形態にプロセシングされて活性型ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号３３の核酸配列）となり、Ｃ末端のグリシン残基が除去されてアミド基に置換されるように生体内でさらに改変されてＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列番号１３のアミノ酸配列及び配列番号３５の核酸配列）の形態となる。よって、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨとＧＬＰ−１（７−３６）アミドは２種類の天然ＧＬＰ−１に該当する。
【００３１】
しかし、生体内でＤＰＰ−４酵素により非常に急速に切断されて不活性化されるなど薬物として開発するには多くの難点があるので、生体内半減期を増加させるために様々な試みが行われてきた。そこで、前記ＧＬＰ−１に変異を起こしてＤＰＰ−４酵素による切断を減らすことによりＧＬＰ−１アナログを作製する試みが行われており、前記ＧＬＰ−１アナログには前記目的を達成するために当業界で公知のアナログが制限なく用いられている。
【００３２】
具体的には、８位のアミノ酸の置換はＤＰＰ−４酵素がＧＬＰ−１を不活性化させる速度を減少させることができ、２２位のアミノ酸の置換は分子が凝集する可能性を減少させて分子の効能を向上させることができ、３６位のアミノ酸の置換は融合タンパク質がヒトにおいて繰り返しかつ継続的な投与後に中和免疫反応を引き起こすリスクを減少させることができる。よって、これらに限定されるものではないが、８位、２２位及び３６位のアミノ酸が置換された形態のアナログを用いることができ、その他、特許文献１などに開示されているように、３３位、３４位及び３７位のアミノ酸が置換された形態のアナログを用いることもできる。
【００３３】
より具体的な一例として、前記ＧＬＰ−１のアナログは、ＤＰＰ−４酵素による切断部位が変異したものであることが好ましい。ＤＰＰ−４酵素が前記ＧＬＰ−１の８位のアミノ酸と９位のアミノ酸間でＧＬＰ−１を切断するので、８位のアミノ酸であるアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）又はバリン（Ｖ）に置換されたＧＬＰ−１アナログは、ＤＰＰ−４酵素による切断を減らすことができる。
【００３４】
また、２２位のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）はグルタミン酸（Ｅ）に置換されたものであってもよく、３６位のアミノ酸であるアルギニン（Ｒ）はグリシン（Ｇ）に置換されたものであってもよい。
【００３５】
よって、前記ＧＬＰ−１アナログは、ＧＬＰ−１（７−３７）から８位、２２位及び／又は３６位のアミノ酸が置換された形態である配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１アナログであることが好ましく、ＧＬＰ−１（７−３６）から８位、２２位及び／又は３６位のアミノ酸が置換された形態である配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１アナログであることが好ましい。また、ＤＰＰ−４酵素による切断部位である８位のアミノ酸が変異した配列番号２、３、６、７、８、９、１１、１２、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２３又は２４のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１アナログであることがより好ましく、８位のアミノ酸であるアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換された配列番号２のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１アナログであることが最も好ましい。前記配列番号２のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１アナログは、配列番号３４の核酸配列によりコードされる。本発明の一実施例においては、前記配列番号２のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１アナログを用いてその効能を確認した。前記ＧＬＰ−１アナログの変異位置を次の表に示す。
【００３６】
【表１】
0006379300.tif 000002
【００３７】
本発明における「ＧＬＰ−２（glucagon like peptide-2）」とは、腸の腸内分泌Ｌ細胞及び脳の特定領域でプログルカゴン前駆体の形態で生成され、腸内酵素による酵素切断により生成される３３個の短いアミノ酸（配列番号４４）を有するペプチドホルモンであり、食物の摂取と共に栄養分の消化に反応してグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、オキシントモジュリン及びグリセンチンと共に同時分泌されるものである。
【００３８】
前記ＧＬＰ−２は、炎症性腸疾患だけでなく、短腸症候群（Short bowel syndrome, SBS）などに効果的であることが周知である。実際に、ＧＬＰ−２アナログであるＧａｔｔｅｘ（teduglutide）が２０１２年末に米国のＮＰＳ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．により開発され、短腸症候群の治療剤として希少医薬品に指定され、現在適応症を拡大して炎症性腸疾患患者に臨床２相を行っている。
【００３９】
前記ＧＬＰ−２は、３３個のアミノ酸ペプチドとして分泌されるが、前記ＧＬＰ−１と同様に、ＤＰＰ−４酵素により切断される。具体的には、ＤＰＰ−４酵素により２位のアミノ酸であるアラニン（Ａ）において非常に急速に切断されて不活性ヒトＧＬＰ−２を生成するので、生体内半減期が短く、薬物として開発するのは困難であった。そこで、前記ＧＬＰ−２にも変異を起こしてＤＰＰ−４酵素による切断を減らすことによりＧＬＰ−２アナログを作製する試みが行われており、前記ＧＬＰ−２アナログには前記目的を達成するために当業界で公知のアナログが制限なく用いられる。
【００４０】
具体的には、２位のアミノ酸の置換はＤＰＰ−４酵素がＧＬＰ−２を不活性化させる速度を減少させることができる。すなわち、２位のアミノ酸であるアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）又はバリン（Ｖ）に置換されたＧＬＰ−２アナログは、ＤＰＰ−４酵素による切断を減らすことができる。また、他の例として、特許文献３に開示されているＧＬＰ−２アナログを用いることができる。具体的には、２位と、３、５、７、１０及び１１位のアミノ酸のさらなる置換、並びに／又は３１〜３３位のアミノ酸の欠失、並びに／又はＮ末端もしくはＣ末端への安定化ペプチド配列の付加と共に８、１６、２４及び２８位のアミノ酸の置換を含んでもよい。より具体的には、２位のアミノ酸であるアラニン（Ａ）はグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）又はバリン（Ｖ）に、３位のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）に、５位のアミノ酸であるセリン（Ｓ）はトレオニン（Ｔ）に、６位のアミノ酸であるフェニルアラニン（Ｆ）はプロリン（Ｐ）に、７位のアミノ酸であるセリン（Ｓ）はトレオニン（Ｔ）に、８位のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）はセリン（Ｓ）に、９位のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）はアスパラギン酸（Ｄ）に、１０位のアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）はロイシン（Ｌ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）又は酸化的に安定なＭｅｔ−代替アミノ酸に、１１位のアミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）はアラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）又はセリン（Ｓ）に、１２位のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）はリシン（Ｋ）に、１３位のアミノ酸であるイソロイシン（Ｉ）はグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）に、１４位のアミノ酸であるロイシン（Ｌ）はメチオニン（Ｍ）又はノルロイシン（Ｎｌｅ）に、１５位のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）はグルタミン酸（Ｅ）に、１６位のアミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）はアラニン（Ａ）に、１７位のアミノ酸であるロイシン（Ｌ）はグルタミン酸（Ｅ）に、１９位のアミノ酸であるアラニン（Ａ）はトレオニン（Ｔ）に、２０位のアミノ酸であるアルギニン（Ｒ）はリシン（Ｋ）に、２１位のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）はイソロイシン（Ｉ）に、２４位のアミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）はアラニン（Ａ）又はグルタミン酸（Ｅ）に、２８位のアミノ酸であるグルタミン（Ｑ）はアラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）に置換することができ、３１位のアミノ酸であるイソロイシン（Ｉ）はプロリン（Ｐ）に置換又は欠失することができ、３２位のアミノ酸であるトレオニン（Ｔ）は欠失することができ、３３位のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）はアスパラギン（Ｎ）に置換又は欠失することができる。
【００４１】
前記様々な変異をＧＬＰ−２に加えることができ、これらに限定されるものではないが、２位のアミノ酸であるアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換された配列番号４５のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−２アナログ、又はバリン（Ｖ）に置換された配列番号４６のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−２アナログであることが最も好ましい。前記配列番号４５のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−２アナログは、配列番号５１の核酸配列によりコードされる。
【００４２】
本発明は、前述したように、生体内でＤＰＰ−４酵素により急速に切断されて不活性化されるＧＬＰ（ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２）又はそのアナログは治療薬物として適切に用いることが難しいという問題を認識し、それを解決するためにＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２に適した免疫グロブリンＦｃポリペプチドを開発し、それを融合した融合ポリペプチドを作製したことを技術的特徴とする。具体的には、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２の生体内半減期を大幅に増加させることにより、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２が生体内で継続して薬物効果を発揮できるようにした。さらに、血清中安定性、ＤＰＰ−４抵抗性、薬力学的プロファイルなどの面でも優れた融合ポリペプチドを作製した。
【００４３】
そのために、本発明においては、まず先行特許である特許文献２で作製した免疫グロブリンハイブリッドＦｃ技術によるｈｙＦｃ５を前記ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２に融合して融合ポリペプチドを作製した。本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリンＦｃフラグメントをコードする配列が単鎖免疫グロブリンＦｃフラグメントに存在することを意味する。前記ｈｙＦｃ５は、３０アミノ酸長のＩｇＤヒンジ領域を含むｈｙＦｃであり、サイズの大きなタンパク質（Large protein）に適用すると非常に大きな半減期増加効果を発揮するが、相対的に短いペプチド（Short peptide）、例えば本発明のＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２に適用すると前述したようにサイズの大きなタンパク質に適用した場合に比べてその効果が大きくないので、さらなる効果を発揮する融合ポリペプチドを作製した。
【００４４】
本発明における「免疫グロブリンＦｃフラグメント」又は「免疫グロブリンＦｃ」とは、免疫グロブリンの重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域並びに軽鎖定常領域（ＣＬ）を含まないタンパク質を意味する。前記Ｆｃは、ヒンジ領域をさらに含んでもよく、本発明の目的上、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）は含むが、重鎖定常領域（ＣＨ１）は含んでもよく、含まなくてもよい。
【００４５】
本発明の免疫グロブリンＦｃフラグメントは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン領域及びＣＨ３ドメイン領域を含んでもよい。具体的には、本発明の免疫グロブリンＦｃフラグメントはハイブリッド免疫グロブリンＦｃフラグメントであってもよいので、前記ヒンジ領域はヒトＩｇヒンジ領域を含んでもよく、前記ＣＨ２ドメイン領域はヒトＩｇＤ及びＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含んでもよく、前記ＣＨ３ドメイン領域はヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基部分を含んでもよい。
【００４６】
本発明のＧＬＰ又はそのアナログに融合するのに適した免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、３５〜４９アミノ酸長のＩｇＤヒンジ領域を含むことを特徴とする。前記ヒンジ領域は、基本的にはＧＬＰ−１やＧＬＰ−２などの生物学的活性分子との結合時に柔軟性（flexibility）を維持し、その構造を維持する役割を果たすものである。具体的には、ＩｇＤヒンジ領域である配列番号２５のアミノ酸配列（配列番号３６の核酸配列によりコードされる）において、Ｃ末端からＮ末端の方向に３５〜４９個の連続するアミノ酸配列を有する分離されたＩｇＤヒンジ領域を含んでもよい。また、配列番号２５のアミノ酸配列において、Ｃ末端からＮ末端の方向に３５〜４０個の連続するアミノ酸配列を有するＩｇＤヒンジ領域であることが好ましく、３５個又は４０個の連続するアミノ酸配列を有するＩｇＤヒンジ領域であることがより好ましく、４０個の連続するアミノ酸配列を有するＩｇＤヒンジ領域であることがさらに好ましい。配列番号２５のアミノ酸配列において３５個の連続するアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を配列番号２６とし、４０個の連続するアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を配列番号２７とし、４９個の連続するアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を配列番号２８として示し、配列番号２６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号３７とし、配列番号２７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号３８とし、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を配列番号３９として示した。
【００４７】
本発明において、このようなＩｇＤヒンジ領域に結合される免疫グロブリンＦｃ ＣＨ２及びＣＨ３領域は、本発明の融合ポリペプチドの薬物動態及び薬物効果を変化させず、ＡＤＣＣやＣＤＣなどの細胞毒性を起こさないものであれば制限なく用いられるが、本発明者らにより開発されたＩｇＤ及びＩｇＧ４のハイブリッドＦｃ ＣＨ２及びＣＨ３領域を用いることが好ましい。具体的には、配列番号２９のアミノ酸配列又は配列番号４０の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列からなるＣＨ２及びＣＨ３領域を用いることができる。
【００４８】
このようなＧＬＰ又はそのアナログと、ＩｇＤヒンジ領域並びにＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリンＦｃポリペプチドとが結合され、最終的に本発明の融合ポリペプチドが構成される。
【００４９】
これらに限定されるものではないが、一例として本発明の融合ポリペプチドにＧＬＰ−１が含まれる場合、前記融合ポリペプチドは、配列番号３０〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるものであってもよく、より具体的には配列番号３０又は３１のアミノ酸配列からなるものであってもよく、配列番号３１のアミノ酸配列からなるものであってもよい。前記配列番号３０のアミノ酸配列は、本発明の配列番号２のＧＬＰ−１アナログ、配列番号２６のＩｇＤヒンジ領域、並びに配列番号２９のＣＨ２及びＣＨ３領域が結合された形態で「ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８」と示され、配列番号３１のアミノ酸配列は、本発明の配列番号２のＧＬＰ−１アナログ、配列番号２７のＩｇＤヒンジ領域、並びに配列番号２９のＣＨ２及びＣＨ３領域が結合された形態で「ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９」と示され、配列番号３２のアミノ酸配列は、本発明の配列番号２のＧＬＰ−１アナログ、配列番号２８のＩｇＤヒンジ領域、並びに配列番号２９のＣＨ２及びＣＨ３領域が結合された形態で「ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ１１」と示される。
【００５０】
また、他の例として本発明の融合ポリペプチドにＧＬＰ−２が含まれる場合、前記融合ポリペプチドは、配列番号４７〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるものであってもよく、より具体的には配列番号４８又は４９のアミノ酸配列からなるものであってもよく、配列番号４９のアミノ酸配列からなるものであってもよい。前記配列番号４７のアミノ酸配列は、本発明の配列番号４５のＧＬＰ−２アナログ、配列番号２６のＩｇＤヒンジ領域、並びに配列番号２９のＣＨ２及びＣＨ３領域が結合された形態で「ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ８」と示され、配列番号４８のアミノ酸配列は、本発明の配列番号４５のＧＬＰ−２アナログ、配列番号２７のＩｇＤヒンジ領域、並びに配列番号２９のＣＨ２及びＣＨ３領域が結合された形態で「ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９」と示され、配列番号４９のアミノ酸配列は、本発明の配列番号４５のＧＬＰ−２アナログ、配列番号２８のＩｇＤヒンジ領域、並びに配列番号２９のＣＨ２及びＣＨ３領域が結合された形態で「ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ１１」と示される。
【００５１】
本発明の一実施例において、まず本発明者らが以前に開発した３０個のアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を含むｈｙＦｃ５をＧＬＰ−１に結合することによりＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５を作製し（図１）、その半減期を従来のＧＬＰ−１単独のペプチドと比較した結果、半減期が増加した。しかし、ｈｙＦｃ５を短いペプチド（Short peptide）であるＧＬＰ−１に適用すると現れる半減期増加効果は、ｈｙＦｃ５をサイズの大きなタンパク質（Large protein）に適用したときに現れる効果ほど高くないことが確認された。
【００５２】
よって、本発明者らは、ＧＬＰ−１に適用するとｈｙＦｃ５より優れた効能を示す免疫グロブリンＦｃポリペプチドを探求した結果、ＧＬＰ−１やＧＬＰ−２などの短いペプチドの場合は、ヒンジ領域の長さを増加すると、優れた半減期と共に優れた活性を有する融合ポリペプチドの作製が可能であることを見出した。すなわち、前記ＩｇＤヒンジ領域にはタンパク質分解酵素（protease）により分解されやすい、前記酵素に敏感な切断部位があるが、免疫グロブリンＦｃポリペプチドに結合される生理活性タンパク質のサイズが大きい場合は前記切断部位が露出しないので問題がないが、ＧＬＰ−１やＧＬＰ−２などの短いペプチドの場合は切断部位が露出するので、Ｆｃポリペプチド融合によっても予想したほどの半減期増加効果が現れないという問題があった。しかし、ヒンジ領域の長さを増加させることによりこのような問題を解決し得るという可能性が確認された。
【００５３】
よって、本発明の一実施例においては、４０個のアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を有するｈｙＦｃ９を作製し（図２）、それに基づいて３５個のアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を有するｈｙＦｃ８、及び４９個のアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を有するｈｙＦｃ１１を作製し、最終的にＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ１１融合ポリペプチドを作製した。また、前述したように作製した本発明の融合ポリペプチドのＰＫプロファイルを測定した結果、ＧＬＰ−１単独のペプチドより、さらにＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５よりもはるかに増加した半減期を有し（図５及び図６）、より効果的な薬物効果を示すことが確認された。
【００５４】
また、前記融合ポリペプチドのうち代表的な融合ポリペプチドであるＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９を対象に、従来のＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５と様々な効能を比較した結果、血清中安定性（図７）、ＤＰＰ−４抵抗性（図８）、及びＰＤプロファイル（図９）の全ての面ではるかに優れていることが確認された。また、体重減少効果にも優れていることが確認された（図１０）。
【００５５】
さらに、本発明の他の実施例においては、前記ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９に対して、ＧＬＰ−１−ｌｉｎｋｅｒ−ＩｇＧ４−ｍｕｔ（特許文献１）とＡＤＣＣ阻害能を比較した結果、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９がＡＤＣＣ阻害能に優れることが確認された（図１１）。実質的には、前記ＧＬＰ−１−ｌｉｎｋｅｒ−ＩｇＧ４−ｍｕｔがＡＤＣＣを阻害するために免疫グロブリンＦｃの一部のアミノ酸部位に変異を加えたものであるにもかかわらず、本発明のＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９はそれよりも優れたＡＤＣＣ阻害能を有する。
【００５６】
また、本発明の一実施例においては、前記ＧＬＰ−１と同様に、ＧＬＰ−２に対しても融合ポリペプチドを作製した。具体的には、４０個のアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を有するＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９を作製し（図３）、それに基づいて３５個のアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を有するＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ８、及び４９個のアミノ酸配列からなるＩｇＤヒンジ領域を有するＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ１１を作製した。前述したように作製した融合ポリペプチドのうちＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９は、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５に比べても増加した半減期を有することが確認された（実施例２〜４）。
【００５７】
さらに、本発明の他の実施例においては、前記ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の様々な生物学的活性を確認した結果、炎症を減少させることのできるｃＡＭＰ活性が低下せず（図１２）、炎症性腸疾患治療効果（図１３）、腸上皮細胞増殖促進効果（図１４）、小腸成長促進効果（図１５）、下痢及び致死率減少効果（図１６及び図１７）などの全てに優れていることが確認され、特に比較群に比べて少ない処理にもかかわらず、優れた効能が維持されることが確認された。
【００５８】
これらの結果をまとめると、本発明の融合ポリペプチドは、従来のＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２より増加した半減期を有するものであり、特にＧＬＰ−１を含む融合ポリペプチドは、優れた血糖降下効果、体重減少効果及びＤＰＰ−４酵素に対する抵抗性を有することにより糖尿病治療などに有用であり、ＧＬＰ−２を含む融合ポリペプチドは、小腸成長促進効果を有することにより炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、短腸症候群などの治療に有用である。
【００５９】
よって、本発明の他の態様は、前記融合ポリペプチドを有効成分として含む、糖尿病治療用薬学的組成物、並びに炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療用薬学的組成物を提供する。
【００６０】
また、本発明のさらに他の態様は、糖尿病、炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療のための薬剤を製造するための前記融合ポリペプチドの用途を提供する。
【００６１】
さらに、本発明のさらに他の態様は、前記薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、糖尿病、炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療方法を提供する。
【００６２】
ここで、前記糖尿病は２型糖尿病であってもよく、前記炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎又はクローン病であってもよい。
【００６３】
また、前記腸粘膜炎及び下痢は抗癌化学療法により誘発されたものであってもよく、ここで、前記抗癌化学療法は、腸粘膜炎及び下痢を誘発する化学療法であれば限定されるものではなく、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、イリノテカン（irinotecan）、ロイコボリン（leucovorin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）などであってもよい。
【００６４】
一例として、本発明の融合ポリペプチドは、従来の糖尿病治療剤として周知のＧＬＰ−１又はそのアナログを含むので糖尿病治療に有用であり、従来の薬剤より増加した半減期と共に優れた血糖降下効果を有し、ＤＰＰ−４酵素に対する抵抗性が増加するので、従来の薬物より優れたプロファイルで医薬品に適用される。
【００６５】
また、他の例として、本発明の融合ポリペプチドは、従来の炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療剤として周知のＧＬＰ−２又はそのアナログを含むので炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療に有用であり、従来の薬剤より増加した半減期を有するので、従来の薬物より優れたプロファイルで医薬品に適用される。
【００６６】
本発明の融合ポリペプチドは、広範囲かつ多様な疾患及び症状を治療するのに用いられる。
【００６７】
一例として、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＧＬＰがＧＬＰ−１であれば、一次的に「ＧＬＰ−１受容体」と呼ばれる受容体に作用することによりそれらの生物学的効果を発揮する。よって、ＧＬＰ−１受容体の刺激又はＧＬＰ−１化合物の投与に良好に反応する疾患及び／又は症状を有する対象は、本発明の融合ポリペプチドで治療することができる。これらの対象は、「ＧＬＰ−１化合物での治療を必要とする」又は「ＧＬＰ−１受容体の刺激を必要とする」と言われる。非インスリン依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、卒中（特許文献４参照）、心筋梗塞（特許文献５参照）、肥満（特許文献６参照）、手術後の異化変化（特許文献７参照）、機能性消化不良及び過敏性大腸症候群（特許文献８参照）を有する対象が含まれる。ＧＬＰ−１化合物での予防的治療を求める対象、例えば非インスリン依存性糖尿病が発症するリスクのある対象（特許文献９参照）も含まれる。損傷したグルコース耐性又は損傷した空腹時グルコースを有する対象、体重が対象の身長と体格における正常体重の約２５％を上回る対象、部分的膵臓切除術を受けた対象、少なくとも一方の親が非インスリン依存性糖尿病を有する対象、妊娠性糖尿病を有する対象、及び急性又は慢性膵臓炎を有する対象は非インスリン依存性糖尿病が発症するリスクがある。
【００６８】
また、他の例として、本発明の融合ポリペプチドに含まれるＧＬＰがＧＬＰ−２であれば、胃及び腸関連障害の治療及び予防、例えば骨粗鬆症及びＤＰＰ−４媒介症状、損傷した腸機能を有する新生児の治療などのために用いられる。胃及び腸関連障害の例としては、潰瘍、胃炎、消化障害、吸収障害症候群、短小腸症候群、盲管（cul-de-sac）症候群、炎症性腸疾患、グルテン腸症又はセリアック病から発症した非熱帯性スプルー（celiac sprue）、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症性スプルー、腸炎、局所性腸炎（クローン病）、潰瘍性結腸炎、下痢型過敏性腸症候群、小腸損傷、短腸症候群、及び抗癌化学療法による腸粘膜炎、抗癌化学療法による下痢などが挙げられる。また、他の症状として、放射線腸炎、感染性又は感染後腸炎、及び毒性物質又は他の化学療法剤による小腸損傷が挙げられる。
【００６９】
本発明における融合ポリペプチドの有効量は、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２受容体の刺激を必要とする対象に投与された場合に、許容されない副作用を引き起こすことなく目的とする治療及び／又は予防効果をもたらす量である。「目的とする治療効果」は、１）疾患や症状に関する兆候の軽減、２）疾患や症状に関する兆候開始の遅延、３）治療しない場合に比べて増加した寿命、４）治療しない場合に比べてより質の高い生活の少なくとも１つを含む。例えば、糖尿病を治療するための本発明の融合ポリペプチドの「有効量」は、治療しない場合に比べて血糖濃度をより大きく制御することにより、網膜症、神経障害、腎臓疾患などの糖尿病合併症発症の遅延をもたらす量である。糖尿病を予防するための融合ポリペプチドの「有効量」は、治療しない場合に比べて、スルホニルウレア、チアゾリジンジオン、インスリン及び（又は）ビスグアニジンなどの抗低血糖剤での治療を必要とする血糖値上昇を遅延させる量である。
【００７０】
本発明の一実施例においては、半減期確認によるＰＫプロファイルを確認する実験以外の実験で、本発明の融合ポリペプチドが糖尿病治療のための薬物効果においても優れることが確認された。具体的には、ｉｎ ｖｉｖｏ実験において、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９融合ポリペプチドの薬力学的プロファイル（PD profile）を確認した結果、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５に比べてはるかに優れた血糖降下効果を有することが確認され（図９）、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてもＤＰＰ−４酵素に対する抵抗性がはるかに優れ、ＤＰＰ−４酵素に対する安定性の面でも優れた効能を有することが確認された（図８）。糖尿病治療において血中グルコース含有量の維持が重要であり、ＤＰＰ−４阻害剤が一般に糖尿病治療剤として用いられることを考慮すると、本発明の融合ポリペプチドは糖尿病治療において優れた薬物として用いられることが分かる。
【００７１】
本発明における「治療」とは、本発明による融合ポリペプチド又はそれを含む薬学的組成物の投与により糖尿病、炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
【００７２】
本発明の薬学的組成物は、糖尿病、炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療効果を発揮することができるのであれば、有効成分である融合ポリペプチドを様々な重量％で含むことができる。
【００７３】
また、本発明の薬学的組成物は、通常の方法による適切な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。本発明の組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
本発明による薬学的組成物は、通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エアゾール剤などの経口剤形、外用剤、坐剤又は滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いられる。詳細には、剤形化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、前記化合物に少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤なども用いられる。経口投与のための液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる通常の希釈剤である水、液体パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられる。非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤及び坐剤が挙げられる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
【００７５】
本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。前記薬学的に有効な量とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味し、有効用量レベルは、患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与方法、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、配合又は同時に用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により決定される。
【００７６】
また、本発明の薬学的組成物は、単独で又は糖尿病、炎症性腸疾患、抗癌化学療法による腸粘膜炎及び下痢、又は短腸症候群の治療効果を発揮する他の薬物と組み合わせて用いられる。本発明の薬学組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与することができる。前記投与とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を提供することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、標的組織に到達できるものであれば限定されるものではない。例えば、関節内投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
本発明の融合ポリペプチドは、４週間に１回、２週間に１回又は１週間に１回投与されることが好ましい。治療される疾患に応じては、融合ポリペプチドの１週間に２〜３回の投与のように、より頻繁な投与を必要とすることがある。
【００７８】
本発明のさらに他の態様は、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００７９】
本発明は前述した融合ポリペプチドに技術的特徴があり、それをコードするポリヌクレオチド、それを含む発現ベクター、及びそれを含む宿主細胞も本発明に含まれ、前記融合ポリペプチドが発現するものであれば、その種類は制限されない。
【００８０】
前記ポリヌクレオチドは、これらに限定されるものではないが、一例として「ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８」をコードする配列番号４１の核酸配列、「ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９」をコードする配列番号４２の核酸配列、又は「ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ１１」をコードする配列番号４３の核酸配列からなるものであってもよく、具体的には配列番号４１又は４２の核酸配列からなるものであってもよく、配列番号４２の核酸配列からなるものであってもよい。
【００８１】
また、他の例として「ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ８」をコードする配列番号５２の核酸配列、「ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９」をコードする配列番号５３の核酸配列、又は「ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ１１」をコードする配列番号５４の核酸配列からなるものであってもよく、具体的には配列番号５３又は５４の核酸配列からなるものであってもよく、配列番号５４の核酸配列からなるものであってもよい。
【００８２】
前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮重（degeneracy）により、又は前記融合ポリペプチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、発現する融合ポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない範囲で様々な改変を行うことができる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８４】
実施例１：ＧＬＰ−ｈｙＦｃ融合タンパク質の作製
１−１：ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ１１の作製
ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）は、糖尿病治療に効果的なタンパク質であるが、生体内のＤＰＰ−４酵素により非常に急速に切断（cleavage）され、半減期（half-life）が約３〜５分と非常に短いため、薬物として開発するのは非常に困難であるので、生体内半減期を増加させるための多くの試みが行われてきた。
【００８５】
よって、まず前記ＤＰＰ−４酵素による切断を減らすために、ＧＬＰ−１（７−３７）に基づいて、ＤＰＰ−４酵素による切断部位（cleavage site）である８位のアミノ酸をアラニン（Alanine）からグリシン（Glycine）に置換することによりＧＬＰ−１アナログ（analogue）を作製した（配列番号２）。次に、本発明者らの先行特許である特許文献２で作製したｈｙＦｃ５（hybrid Fc 5）ポリペプチドを前記ＧＬＰ−１アナログペプチドに融合させてＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５融合ポリペプチドを作製した（図１）。前記ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５融合ポリペプチドの配列全体を図１に示す。
【００８６】
また、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５より半減期がさらに増加すると共に他の活性の面でも優れた融合ポリペプチドの作製を試みた。
【００８７】
具体的には、ｈｙＦｃ５においてＩｇＤヒンジ領域（hinge region）を様々に調節することにより、さらに優れた半減期を有し、かつ優れた活性を有する融合ポリペプチドの作製を試み、ＩｇＤヒンジ領域のアミノ酸を増加させると、これらの条件を満たす可能性があることを確認した。
【００８８】
よって、３０個のアミノ酸で構成されたヒンジを有するｈｙＦｃ５のヒンジ領域のアミノ酸を増加させ、まず４０個のアミノ酸で構成されたヒンジ（配列番号２７）を有するｈｙＦｃ９を作製し（図２）、その後３５個のアミノ酸で構成されたヒンジ（配列番号２６）を有するｈｙＦｃ８、及び４９個のアミノ酸で構成されたヒンジ（配列番号２８）を有するｈｙＦｃ１１を作製した。また、前記ｈｙＦｃ９、ｈｙＦｃ８及びｈｙＦｃ１１にそれぞれＧＬＰ−１アナログペプチドを融合することにより、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９（配列番号３１）、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８（配列番号３０）及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ１１（配列番号３２）融合ポリペプチドを作製した。
【００８９】
１−２：ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ８及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ１１の作製
ＧＬＰ−２（Glucagon like peptide-2）は、ＧＬＰ−１と同様に、生体内のＤＰＰ−４酵素により非常に急速に切断（cleavage）され、半減期（half-life）が約７分と非常に短いため、薬物として開発するのは非常に困難である。ＧＬＰ−２の生体内半減期を増加させるために、ＤＰＰ−４酵素による切断部位（cleavage site）である２位のアミノ酸をアラニン（Alanine）からグリシン（Glycine）に置換した（ＧＬＰ−２−２Ｇペプチド，配列番号４５）。前述したように置換したＧＬＰ−２−２Ｇペプチドは１日剤形で成人短腸症候群の治療剤として用いられているが、短腸症候群の治療が継続的なものでなければならないことを考慮すると、それよりも長い半減期を有するＧＬＰ−２アナログの開発が必要である。そのために、本発明者らの先行特許である特許文献２で作製したｈｙＦｃ５ポリペプチドを前記ＧＬＰ−２−２Ｇアナログペプチドに融合させてＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５融合ポリペプチドを作製した（図３）。また、ＩｇＤヒンジ領域の６４個のアミノ酸長全体を様々に調節することにより、ＧＬＰ−２−２Ｇペプチドの半減期が増加すると共に優れた活性を有する融合ポリペプチドの作製を試みた。具体的には、３０個のアミノ酸で構成されたヒンジを有するｈｙＦｃ５においてヒンジ領域のアミノ酸を増加させることにより、４０個のアミノ酸で構成されたヒンジを有するｈｙＦｃ９を作製し、ＧＬＰ−２−２Ｇペプチドを結合させてＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９融合ポリペプチドを作製した（図３，配列番号４８）。さらに、３５個のアミノ酸で構成されたヒンジを有するｈｙＦｃ８、及び４９個のアミノ酸で構成されたヒンジを有するｈｙＦｃ１１を作製し、それぞれＧＬＰ−２−２Ｇペプチドを結合させてＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ８（配列番号４７）、及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ１１（配列番号４９）融合ポリペプチドを作製した。
【００９０】
実施例２：ＧＬＰ−ｈｙＦｃ融合タンパク質のＰＫプロファイルの確認
２−１：ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５のＰＫプロファイルの確認
前述したように作製したＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５融合ポリペプチドの薬物動態プロファイル（pharmacokinetic profile, PK profile）を確認するために、合成したＧＬＰ−１を対照群として用いて次の実験を行った。
【００９１】
１グループ当たり４匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｒａｔｓに各タンパク質（ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５）を静脈（ＩＶ）経路で投与した。注入前及び注入後０．０８、０．１６、０．５、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２及び９６時間後に血液を採取した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温保管した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後各サンプルの血清を採取して超低温冷凍庫（deep freezer）に保存した。サンプルは、ＧＬＰ−１キット（ALPCO, cat#43-GP1HU-E01）を用いて、標準曲線の直線上の位置で分析されるように希釈して定量した。
【００９２】
その結果、図４に示すように、ｈｙＦｃポリペプチドを融合していないＧＬＰ−１単独ペプチドの場合は半減期が４分と短かったのに対して、ＧＬＰ−１及びｈｙＦｃ５を融合したＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５ポリペプチドの場合は半減期が８時間以上と約１１６倍増加することが確認された。
【００９３】
２−２：ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９のＰＫプロファイルの確認
前記実施例１で作製したＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９融合ポリペプチドとＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５融合ポリペプチドの半減期を比較することにより、ＰＫプロファイルを確認した。
【００９４】
１グループ当たり４匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｒａｔｓに各タンパク質を皮下（ＳＣ）経路で投与した。注入前及び注入後２、６、１２、２６、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間後に血液を採取した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温保管した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後各サンプルの血清を採取して超低温冷凍庫（deep freezer）に保存した。サンプルはＧＬＰ−１キット（IBL, Cat#27784A）を用いて、標準曲線の直線上の位置で分析されるように希釈して定量した。
【００９５】
その結果を各時間における血液中に残存するタンパク質量及び薬物濃度曲線下面積（AUC, Area Under the Curve）値で示す。図５に示すように、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５と比較して、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９において約１２倍のＡＵＣ値を示すことが確認された。これらの結果に基づいて、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９はＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５に比べて半減期がさらに増加することから、さらに効果的な薬物効果を示すことが分かった。
【００９６】
２−３：ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８のＰＫプロファイルの確認
ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８融合ポリペプチドの半減期をＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９融合ポリペプチドと比較することにより、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８のＰＫプロファイルを確認した。ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８を対象に、前記実施例２−２と同様の実験を行った。
【００９７】
その結果、図６に示すように、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８は同レベルのＰＫプロファイルを示すが、むしろＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８のほうがやや優れたレベルである。これは対照群であるＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５に比べてはるかに優れたレベルである。これらの結果に基づいて、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ８も半減期が増加することから、さらに効果的な薬物効果を示すことが分かった。
【００９８】
２−４：ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９のＰＫプロファイルの確認
前述したように作製したＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９融合ポリペプチドの薬物動態プロファイル（pharmacokinetic profile, PK profile）を確認するために、次の実験を行った。
【００９９】
１グループ当たり３匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｒａｔｓに各タンパク質（ＧＬＰ−２−２Ｇペプチド、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ9）をＳ．Ｃ（皮下）経路で投与した。注入前及び注入後０．０８、０．１６、０．５、２、４、８、２４、４８、９６、１２０及び１６８時間後に血液を採取した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温保管した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後各サンプルの血清を採取して超低温冷凍庫（deep freezer）に保存した。サンプルはＧＬＰ−２キット（Millipore, Cat#EZGLP2-37K）を用いて、標準曲線の直線上の位置で分析されるように希釈して定量した。その結果、Ｆｃタンパク質を融合していないＧＬＰ−２−２Ｇペプチド単独の場合はその半減期が１．２時間であったのに対して、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９融合タンパク質は半減期がそれぞれ４４時間、６５時間とＧＬＰ−２−２Ｇに比べて約３６倍、５４倍増加することが確認された。特に、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９は、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５に比べて約１．５倍増加した半減期を有することが分かった。
【０１００】
実施例３：ＧＬＰ−ｈｙＦｃ融合タンパク質の生物学的活性試験
３−１：ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９の血清中安定性の確認
優れたＰＫプロファイルを示す融合ポリペプチドのうちＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９を対象に、他の様々な効能について確認した。比較群としてＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５を用いた。ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９における血清中の分解因子に対する安定性を確認するために、ラット血清中安定性試験を行った。
【０１０１】
まず、２種類の試験物質をラット血清で希釈し、準備した各サンプルを３７℃恒温器に入れて０、６、１０、２４、４８時間反応させ、その後各物質をＥＬＩＳＡ法で定量した。
【０１０２】
その結果を各反応時間における残存するタンパク質量及び時間別グラフの曲線下面積（AUC, Area Under the Curve）値で示す。図７に示すように、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５と比較して、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９において約１．２倍のＡＵＣ値を示すことが確認された。これらの結果に基づいて、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９は血清中安定性もＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５に比べて優れていることが確認された。
【０１０３】
３−２：ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９のＤＰＰ−４抵抗性の確認
ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９における主要代謝酵素であるＤＰＰ−４（Sigma, #D4943-1VL）に対する抵抗性及びそれによる安定性を確認するために、ＤＰＰ−４抵抗性試験を行った。
【０１０４】
２種類の試験物質とＤＰＰ−４を反応させる時間（０，２，８，２４，４８時間）に合わせて３７℃恒温器に入れて反応させ、次いで各物質を定量した。
【０１０５】
その結果を各反応時間における残存するタンパク質量及び時間別グラフの曲線下面積（AUC, Area Under the Curve）値で示す。図８に示すように、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５と比較して、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９においてＤＰＰ−４抵抗性が約７倍以上向上することが確認された。これらの結果に基づいて、ＧＬＰ−１を切断するＤＰＰ−４酵素に対する安定性の面でもＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９がはるかに優れていることが分かった。
【０１０６】
３−３：ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９のＰＤプロファイルの確認
ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９における薬力学的プロファイル（pharmacodynamic profile, PD profile）を確認するために、次の実験を行った。
【０１０７】
１グループ当たり１０匹のＣＤ−１マウスに各タンパク質を皮下（ＳＣ）経路で投与し、その後０、１、２、４及び８日目にグルコース（glucose）を投与して血中グルコースの変化を測定することにより血糖降下能を確認した。
【０１０８】
結果は、測定日毎にグルコース投与１分後から１８０分後までの血中グルコースの濃度変化を測定して各実験日毎にＡＵＣ値を求め、陰性対照群（vehicle）に対するＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５及びＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９のＡＵＣの割合で示す。
【０１０９】
その結果、図９に示すように、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５においては２日目から血糖降下能が低下して正常化（normalization）されるのに対して、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９においては８日目まで血中グルコース含有量が少ない状態に維持されることが確認された。これらの結果は、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９において８日目まで血糖降下能が維持されることを意味するものである。
【０１１０】
３−４：ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９の体重減少効果の確認
ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９のｏｂ／ｏｂ疾病モデルにおける陰性対照群に対する薬力学的特性（PD, cumulative food intake & weight loss effect）を確認した。
【０１１１】
１グループ当たり１０匹のｏｂ／ｏｂマウスに各タンパク質をＳＣ（皮下）経路で週１回繰り返し投与し、その後毎週体重及び累積食餌摂取量の変化を測定した。体重については各グループの体重変化値から陰性対照群の体重変化値を引いた差で示し、累積食餌摂取量についても同様に陰性対照群の累積食餌摂取量との差で示した（図１０）。その結果、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９は、体重変化量と累積食餌摂取量において陰性対照群に対する有意な体重減少及び食餌減少効力を示し、その効力は用量依存的な傾向を示す。
【０１１２】
これらをまとめると、表２に示すように、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９はＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ５に比べて優れた効能を示すことが確認された。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
３−５：ＧＬＰ−１−ｌｉｎｋｅｒ−ＩｇＧ４−ｍｕｔとのＡＤＣＣ阻害能の比較
次に、前記実施例で多方面に優れた効能を示すＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９融合ポリペプチドにおいて、従来の公知の融合ポリペプチドとのＡＤＣＣ阻害能の比較により、いかに優れているかを立証する。
【０１１５】
特許文献１に開示されているＧＬＰ−１−ｌｉｎｋｅｒ−ＩｇＧ４−ｍｕｔを比較群とした。これはＩｇＧ４部位の３箇所を突然変異させることにより抗体依存性細胞毒性（ADCC, Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity）を阻害するポリペプチドである。
【０１１６】
前記ＧＬＰ−１−ｌｉｎｋｅｒ−ＩｇＧ４−ｍｕｔと本発明のＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９はどちらも構造的にＩｇＧ４のＣＨ２−ＣＨ３部位を含んでいるため、ＣＤＣ（Complement Dependent Cytotoxicity）による安全性の問題はないが、ＡＤＣＣに関する安全性の問題があるので、それを確認するためにＡＤＣＣを引き起こす上で重要な役割を果たすＦｃγ受容体に対する結合能の測定を試み、そのためにＳｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（SPR, Bio-rad, #Proteon XPR36）を用いた結合力試験を行った。
【０１１７】
まず、ＮＨＳ／ＥＤＣ反応によりアミンカップリングしたｂｉｏ−ｒａｄ ｃｈｉｐの各チャネルにアセテートバッファを用いてＦｃγ受容体を流してリガンドを固定化した。陰性対照群としては、ｔｗｅｅｎ ２０が添加されたＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）を流した。各Ｆｃγ受容体が結合したチップに各試験物質を流して結合力を測定した。
【０１１８】
その結果、図１１に示すように、ＧＬＰ−１−ｌｉｎｋｅｒ−ＩｇＧ４−ｍｕｔは、免疫グロブリンＦｃフラグメントの残存エフェクター機能を除去するために複数のアミノ酸部位を改変したにもかかわらず、ＡＤＣＣを引き起こす主要Ｆｃγ受容体においてＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９に比べて高い結合能を示すので、潜在的に細胞毒性を引き起こす可能性があることが確認された。それに対して、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９においては、ＧＬＰ−１−ｌｉｎｋｅｒ−ＩｇＧ４−ｍｕｔに比べて全てのＦｃγ受容体との結合能が低いことが確認されたので、長期間の薬物投与でもより安全であることが分かった。
【０１１９】
３−６：ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の炎症関連生物学的活性試験
前記ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９と共に、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９においても生物学的活性試験を行った。ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９は大幅に増加した半減期を有するが、ｈｙＦｃ９の融合によりＧＬＰ−２−２Ｇペプチド自体の生物学的活性が低下することがあるので、まず生物学的活性が低下するか否かを試験した。
【０１２０】
ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の生物学的活性を調べるために、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の刺激により増加する細胞内ｃＡＭＰを測定した。ＧＬＰ−２Ｒを発現する２９３細胞を６×１０4ｃｅｌｌｓずつ９６ｗｅｌｌで培養し、２４時間後に０、０．１、１、３、１０、１００、３００ｎＭの各濃度の融合タンパク質で処理し、増加した細胞内ｃＡＭＰにより誘導される膜脱分極（membrane depolarization）をｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｙｅにより測定した。その結果、図１２に示すように、ＧＬＰ−２−２Ｇペプチドの活性を１００％とすると、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ５融合タンパク質は２７％の活性を示し、生物学的活性が大幅に低下することが確認されたが、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９融合タンパク質は９８％の活性を示し、ｈｙＦｃ９の融合にもかかわらず炎症関連生物学的活性が低下しないことが確認された。
【０１２１】
３−７：ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の炎症性腸疾患治療効果の確認
ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９を皮下投与してインドメタシン（Indomethacin）により誘導された炎症性腸疾患モデルにおける改善効果を比較した。１グループ当たり６匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｒａｔｓに９ｍｇ／ｋｇのインドメタシンで１日目と２日目に処理して炎症性腸疾患を誘導した。比較群として、５０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ−２−２Ｇで１日２回ずつ３日目から８日目まで計１２回処理し、５０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９で２日に１回ずつ計３回処理し、その後９日目に剖検した。各群の体重の変化、小腸長の変化、小腸組織における炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−ａ）の発現量を比較することにより、炎症性腸疾患症状の治療効果を比較した。
【０１２２】
その結果、図１３に示すように、インドメタシン処理により体重と小腸長が大幅に減少し、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−ａの発現量が増加することが確認された。しかし、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９で処理した群においては体重減少量が少なく、ＴＮＦ−ａの発現量も減少し、小腸長も増加したので、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の炎症性腸疾患治療効果が確認された。特に、ＧＬＰ−２−２Ｇの４分の１程度の処理であるにもかかわらず、むしろより優れた効果を示すことが確認された。
【０１２３】
３−８：ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃの腸上皮細胞増殖促進効果の確認
ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９を対象に腸上皮細胞の増殖誘導効果を確認した。比較群としてＧＬＰ−２−２Ｇペプチドを用いた。ＧＬＰ−２は線維芽細胞（fibroblast, effector cell）に作用して成長因子（growth factors, ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＥＧＦなど）の生成を増加させ、増加した成長因子は腸上皮細胞の増殖を促進させることが知られている。よって、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の腸上皮細胞増殖促進能を確認する試験を行った。ＣＣＤ−１８ｃｏ細胞を無血清培地で２４時間培養し、その後５０、１００、２５０ｎＭの各濃度のＧＬＰ−２−２Ｇ及びＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９で処理して２４時間培養した。細胞を培養した培地（Conditioned media(CM)）をＣａｃｏ−２細胞で処理して３日間培養し、その後Ｃａｃｏ−２細胞の増殖の程度をＥＺ Ｃｙｔｏｘ（Dogen, Cat.No.EZ-1000）で測定した。その結果、図１４に示すように、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９のＣａｃｏ−２細胞増殖促進能力がＧＬＰ−２−２Ｇペプチドと同程度であることが確認された。要するに、ｈｙＦｃ９を融合しても、ＧＬＰ−２の生物学的活性は天然のＧＬＰ−２と同程度を維持することが分かった。
【０１２４】
３−９：ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の小腸成長促進効果の確認
ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９の薬力学的特性である小腸成長促進効果（intestinotrophic effect）を確認するために、次の実験を行った。１グループ当たり８匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ＲａｔｓをＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９で０、１、３、１０、３０、１００、３００ｎｍｏｌ／ｋｇずつ１日１回５日間処理し、その後剖検して小腸の重量を測定することにより、ＧＬＰ−１−ｈｙＦｃ９の小腸成長促進効果を確認した。図１５に示すように、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９で処理した群においては濃度依存的に小腸の重量の増加が確認され、ＥＤ50は１４．２ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙであることが確認された。
【０１２５】
３−１０：ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９の下痢及び致死率減少効果の確認
癌細胞を殺すために用いられる抗癌化学治療剤のうち５−ＦＵやＩｒｉｎｏｔｅｃａｎなどは、小腸細胞の絨毛を形成するクリプト細胞（crypt cell）を破壊することにより絨毛萎縮を誘導するが、これは致命的な下痢を誘発することがある。抗癌化学治療剤により誘導される絨毛萎縮と下痢はさらに致死率に影響を及ぼすことがあるので、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９で処理して抗癌化学治療剤による下痢及び致死予防効果を確認する試験を行った。１グループ当たり１５匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ Ｒａｔｓを５−ＦＵで７５ｍｇ／ｋｇずつ１日１回計４回処理して下痢を誘導した。ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９は８０ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙずつ計４回、又は３２０ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙで１回処理し、その後１０日間下痢スコアを確認して致死率を確認した。その結果、図１６に示すように、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９で８０ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙずつ計４回処理した群は、処理していない群に比べて下痢スコアが減少し、３２０ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙで１回処理した群は、低用量で４回処理した群より下痢スコアが大幅に減少した。また、５−ＦＵにより誘導された致死率（２７％）も、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９で処理した群において６．７％であり、２０％減少することが確認された（図１７）。すなわち、ＧＬＰ−２−ｈｙＦｃ９は、抗癌化学療法により誘導される下痢を予防する効果があることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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