(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式IのGLP-1化合物:
R1-(NHXaa1)-Xaa2-(OHis)-(GLP-1ペプチド)(式I)
[式中、
GLP-1ペプチドは、GLP-1(8-37)(配列番号1)、またはGLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で9個のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を有するその類似体であり、
R1は、低級アルキルであり、
(NHXaa1)は、アミノ酸であり、
Xaa2は、アミノ酸であり、
(OHis)は、式Chem.1
Chem.1:
【化１】
0006300735.tif 000067
のイミダゾール-乳酸のラジカルである]
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルであって、(OHis)中の左側の*-OがXaa2アミノ酸のC末端のCOOHとエステルを形成し、(OHis)中の右側のO-*がGLP-1ペプチドのNH2末端とアミド結合を形成している、化合物。
【請求項２】
(NHXaa1)とXaa2との間の結合が、アミド結合であり、R1が、(NHXaa1)のα-アミノ基に付着している、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R1が、メチルである、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
(NHXaa1)が、Gly、Val、またはIleである、請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
Xaa2が、Valである、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
GLP-1ペプチドが、少なくとも1つのアルブミン結合側鎖を含む誘導体である、請求項5に記載の化合物。
【請求項７】
GLP-1ペプチドが、
i)26位もしくは27位に付着した1つのアルブミン結合側鎖;または
ii)a)18位および31位のそれぞれ、b)26位および37位のそれぞれ、もしくはc)18位および26位のそれぞれに付着した1つのアルブミン結合側鎖
を有する誘導体であり、位置の付番は、GLP-1(8-37)(配列番号1)を意味する、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
Chem.51、Chem.52、Chem.53、Chem.54、Chem.55、およびChem.56から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル：
【化２】
0006300735.tif 000068
【化３】
0006300735.tif 000069
【化４】
0006300735.tif 000070
【化５】
0006300735.tif 000071
【化６】
0006300735.tif 000072
【化７】
0006300735.tif 000073
【請求項９】
医薬として使用するための、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群から成る群から選択される全ての形態の糖尿病および関連する疾患の治療および/もしくは予防において使用するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
一般式II:(HOHis)-(GLP-1ペプチド)の活性であり安定化した親薬物GLP-1化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルのインビボでの放出を達成するための、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロドラッグ、すなわち、インビボでの転換を受け、活性薬物を放出することができる薬物の化学修飾されたバージョンに関する。より特に、本発明は、グルカゴン様ペプチド1、すなわちGLP-1のプロドラッグに関する。
【０００２】
GLP-1は、糖尿病の治療において有用であることが証明されてきたペプチドホルモンである。しかし、天然ホルモンは、血漿中で非常に短い半減期を有する。様々な誘導体化技術、例えば、アルブミン結合およびペグ化が使用され、半減期を引き延ばしてきた。延長された半減期を有するこのような誘導体化されたGLP-1化合物の一例は、様々な保健機関によって承認されてきたモノアシル化されたGLP-1誘導体であるリラグルチドであり、数カ国において2型糖尿病の治療のために1日1回投与のために市販されている。
【０００３】
例えば、プロドラッグを使用して、薬物の薬物動態(PK)および/または吸収プロファイルを変更し、薬物の治療濃度域を増強し得る。さらに、投与後にインビボで起こる化学転換反応によって生物活性のある薬物へのプロドラッグの変換が遅延するという点で、プロドラッグを使用して、薬物の生物学的半減期を延長し得る。
【０００４】
配列リストの参照による組込み
「配列リスト」という表題の配列リストは、561バイトであり、2013年2月11日に作製され、参照により本明細書中に組み込まれている。配列リストの配列番号1は、天然ヒトGLP-1の残基8-37(GLP-1(8-37))と同一である。
【背景技術】
【０００５】
Arnab De、Indiana University、2007年8月、標題「Design of peptide-based prodrug chemistry and its application to glucagon-like peptide 1」の修士論文は、とりわけ、N-末端アミンの代わりにヒドロキシ-末端伸長部を有するGLP-1ペプチドをベースとするGLP-1エステルプロドラッグの合成を開示している(例えば、セクションD-IVおよびD-V、クラス3および4の化合物を参照されたい)。
【０００６】
Peptide Science、2010、94(4)、448〜456頁(Arnab Deら)は、グルカゴン様ペプチド1のエステルをベースとするプロドラッグの合成および特性決定に関する。
【０００７】
US2011/0065633A1は、とりわけ、GLP-1のエステルをベースとするプロドラッグを開示している(例えば、実施例4を参照されたい)。
【０００８】
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、2005、(15)、1595〜1598頁(Santosら)は、環化-活性化プロドラッグ、より特に、パラセタモールのジペプチドエステルの合成、反応性および毒性に関する。Table 1(表1)は、pH7.4および37℃での、そのジペプチドエステルプロドラッグからのパラセタモールの放出のための速度定数を示す。Yがメチルである化合物4kへの脚注は、反応が速すぎて37℃にてモニターされなかったことを説明する。
【０００９】
Regulatory Peptides、2000、(86)、103〜111頁(Gallwitzら)は、ジペプチジル-ペプチダーゼIVによるインビトロでの分解に対して耐性であるGLP-1-類似体に関する。
【００１０】
Annual Review of Pharmacology and Toxicology、1993、(32)、521〜544頁(OliyaiおよびStella)は、改善された配合および送達のためのペプチドおよびタンパク質のプロドラッグに関する総論である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開US2011/0065633A1
【特許文献２】国際公開WO09/030738
【特許文献３】国際公開WO2011/080103
【特許文献４】国際公開WO2009/083549
【特許文献５】国際公開WO2006/082204
【特許文献６】国際公開WO2008/145728
【特許文献７】米国特許出願公開US2010317057A1
【特許文献８】国際特許出願第PCT/EP2011/069738号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Arnab De、Indiana University、2007年8月、標題「Design of peptide-based prodrug chemistry and its application to glucagon-like peptide 1」
【非特許文献２】Peptide Science、2010、94(4)、448〜456頁(Arnab Deら)
【非特許文献３】Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、2005、(15)、1595〜1598頁(Santosら)
【非特許文献４】Regulatory Peptides、2000、(86)、103〜111頁(Gallwitzら)
【非特許文献５】Annual Review of Pharmacology and Toxicology、1993、(32)、521〜544頁(OliyaiおよびStella)
【非特許文献６】Needleman, S.B.およびWunsch, C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453頁
【非特許文献７】MyersおよびW. Miller、「Optimal Alignments in Linear Space」CABIOS(バイオサイエンスにおけるコンピュータアプリケーション)(1988)4:11〜17頁
【非特許文献８】Chemoinformatics:A textbook、Johann GasteigerおよびThomas Engel(編)、Wiley-VCH Verlag、2003年
【非特許文献９】J. Chem. Inf. Model.、2008、48、542〜549頁
【非特許文献１０】J. Chem. Inf. Comput. Sci.、2004、44、170〜178頁
【非特許文献１１】J. Med. Chem.、2004、47、2743〜2749頁
【非特許文献１２】J. Chem. Inf. Model.、2010、50、742〜754頁
【非特許文献１３】SciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection:Basic Chemistry User Guide、2008年3月、SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection、2008
【非特許文献１４】GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年
【非特許文献１５】Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000年
【非特許文献１６】「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、編W.C. ChanおよびP.D. White、Oxford University Press、2000年
【非特許文献１７】Hodgsonら:「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、第33巻、第7番(2004年)、422〜430頁
【非特許文献１８】Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第19版(1995年)、および任意のより最近の版)
【非特許文献１９】W.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403
【非特許文献２０】W.S. Hancock、J.E. Battersby、Analytical Biochemistry、1976、71(1)、260〜264頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、インスリン分泌性ペプチドまたはインクレチン、例えば、GLP-1のプロドラッグに関する。より特に、本発明は、エステルプロドラッグに関する。エステルプロドラッグにおいて、小さなペプチドは、エステル結合を介してペプチド薬物に付着している。エステル結合はペプチド薬物のN末端にあり得、したがって、このN末端はヒドロキシル基を含み得る。一例として、ペプチド薬物のN末端アミノ酸のα-アミノ基は、ヒドロキシル基に修飾し得る。本発明によると、小さなペプチド伸長部のアミノ酸はまた修飾され、例えば、そのN末端アミノ酸は、N-アルキル化によって修飾し得る。小さなペプチドは好ましくは、ジペプチドである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
プロドラッグがインビボで生体内変化を受ける機序は、ジペプチドの求核試薬構成要素(例えば、アミン求核試薬)がエステル結合を切断し、結果として相当するジケトピペラジン誘導体および親薬物の形成を伴うことである。親薬物は、薬物の僅かに修飾されたバージョンであり得る。例えば、エステルプロドラッグの親薬物は、薬物のN-末端HO-バージョン、例えば、N-末端ヒドロキシルペプチド薬物であり得る。
【００１５】
第1の態様において、本発明は、GLP-1プロドラッグ、すなわち、一般式I:R1-(NHXaa1)-Xaa2-(OHis)-(GLP-1ペプチド)(式I)の化合物[式中、GLP-1ペプチドは、GLP-1(8-37)(配列番号1)、またはGLP-1(8-37)と比較して最大で9個のアミノ酸の変化を有するその類似体であり、R1は、低級アルキルであり、(NHXaa1)は、アミノ酸であり、Xaa2は、アミノ酸であり、(OHis)は、式Chem1のイミダゾール-乳酸のラジカルである]
Chem.1:
【００１６】
【化１】
0006300735.tif 000002
【００１７】
またはプロドラッグの薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。
【００１８】
第2の態様において、本発明は、相当する親薬物、すなわち、Chem.21、Chem.22、Chem.23、Chem.24、およびChem.25の化合物、全て一般式II:(HOHis)-(GLP-1ペプチド)(式II)(式中、(HOHis)は、上記の第1の態様において定義したようなChem1の(OHis)ラジカルに相当するイミダゾール-乳酸である)に関する。
【００１９】
第3の態様において、本発明は、Boc-NMe-Ile-Val-OH、Boc-NMe-Val-Val-OH、(Boc-NMe-Gly-Val-OH)、およびChem.43の化合物に関する。これらは、本発明のプロドラッグの合成において使用される中間化合物である。
【００２０】
第4の態様において、本発明は、本発明のプロドラッグを投与することによる、一般式II:(HOHis)-(GLP-1ペプチド)の活性および安定化した親薬物GLP-1化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルのインビボでの放出を達成する方法に関する。
【００２１】
第5の態様において、本発明は、医薬として使用するための、特に、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、それぞれ、このようなプロドラッグ、またはこのような薬物に関する。
【００２２】
本発明のプロドラッグ化合物を使用して、薬物の薬物動態プロファイルおよび/または吸収プロファイルを変更し、例えば、薬物の治療濃度域を増強し得る。また、または代わりに、本発明のプロドラッグ化合物は薬物の生物学的半減期を改善し得る。親薬物化合物は、生物活性がある。さらに、親薬物は、それ自体はDPP-IVに対して安定的であり得る。また、または代わりに、親薬物は、それ自体は延長された生物学的半減期を有し得る。これらの特性は、皮下、静脈内、および/または特に、経口投与のための代替および/または次世代のGLP-1化合物の開発において重要である。
【００２３】
本発明のプロドラッグについて、本発明者らは、驚いたことにおよび予想外に、プロドラッグから薬物への変換反応が、インビトロおよびインビボで非常にゆっくりであり、またこのように得られた親薬物が、非常に満足できる効力を有することを示した。言い換えると、本発明者らは、本発明のプロドラッグの概念が、GLP-1の作用の持続時間を延長するための当技術分野において公知の他の技術に対する興味深い代替の概念であることを示した。
【００２４】
本出願に添付されている図面において、
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のプロドラッグが、本発明の相当するHO-His7薬物(R1、R3、およびR4は、アミノ酸側鎖であり、Rは、低級アルキルであり、ペプチドは、例えば、GLP-1(9-37)またはその類似体を表し、kは、限定的変換定数であり、T1/2は、ln2/kである)に転換される機序を示す反応スキームである。
【図２】ミニブタにおける本発明のプロドラッグおよび相当する親薬物の測定したPKプロファイルを示す(ひし形は、本明細書における実施例4のプロドラッグを表し、四角は、本明細書における実施例B2.2の親薬物を表す)。
【図３】ミニブタにおける本発明の親薬物の測定したPKプロファイルを示す(本明細書における実施例B2.2の親薬物;2匹の動物、1匹はひし形で表し、1匹は四角で表す)。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下において、ギリシャ文字は、これらの記号または相当する記述された名称によって表してもよい。例えば、α=アルファ;β=ベータ;ε=イプシロン;γ=ガンマ;ω=オメガなど。また、μのギリシャ文字は、「u」によって表してもよい。例えば、μl=ul、またはμM=uM。
【００２７】
化学式におけるアスタリスク(*)は、i)付着点、ii)ラジカル、および/またはiii)非共有電子を示す。
【００２８】
GLP-1ペプチドおよび類似体
第1の態様において、本発明は、エステル結合を介してGLP-1ペプチドのN末端に付着しているジペプチド伸長部を含むGLP-1ペプチドプロドラッグに関する。このために、GLP-1ペプチドのN末端アミノ酸のα-アミノ基は、ヒドロキシル基によって置き換えられる。ジペプチド伸長部のN末端アミノ酸は、さらにN-アルキル化されている。
【００２９】
より特に、本発明は、一般式I:R1-(NHXaa1)-Xaa2-(OHis)-(GLP-1ペプチド)(式I)のGLP-1化合物(プロドラッグ)[式中、GLP-1ペプチドは、GLP-1(8-37)(配列番号1)、またはGLP-1(8-37)と比較して最大で9個のアミノ酸の変化を有するその類似体であり、R1は、低級アルキルであり、(NHXaa1)は、アミノ酸であり、Xaa2は、アミノ酸であり、(OHis)は、式Chem1のβ-イミダゾール-乳酸のラジカルである]
Chem.1:
【００３０】
【化２】
0006300735.tif 000003
【００３１】
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。
【００３２】
背景技術において記載したGLP-1エステルプロドラッグは、ジペプチド伸長部のN末端アミノ酸のN-アルキル化を有さない。これらは、標準的なアミン基、またはヒドロキシル基を有する(Arnab Deの論文において、それぞれ、クラス3および4と示される)。
【００３３】
本発明のGLP-1プロドラッグがインビボで生体内変化を受ける機序(図1において例示)は、アルキル化されたアミン求核試薬がエステル結合を切断し、結果として相当するジケトピペラジン誘導体および親GLP-1ペプチド薬物の形成を伴うことである。この転換は、プロドラッグの固有の化学的不安定性によってもたらされるため、任意の他の構成要素、例えば、酵素などを必要とすることなく自発的に起こる。しかし、インビボでのエステラーゼは、エステル結合の酵素的切断によって加水分解をある程度さらに増強し得る。
【００３４】
このように得られた親GLP-1ペプチド薬物のN末端アミノ酸は、通常のα-アミノ基の代わりにヒドロキシル基を有する。
【００３５】
本発明のプロドラッグ化合物は、薬物動態プロファイルを変更するのに有用であり得る。望ましいPKプロファイルの1つの非限定的例は、時間に対する親薬物の血漿濃度を示す曲線が、例えば、背景技術セクションにおいて引用されているOliyaiおよびStellaの図8における曲線Bのラインに沿った一種のベル形である(すなわち、ピーク形状ではない)。一実施形態において、時間に対する親薬物濃度の変動(プロドラッグ投与実験における)は、例えば、相当する親薬物が投与され、すなわちプロドラッグは投与されない相当する投与実験における親薬物濃度の変動と比較して低減し得る。このような実験は、インビボ、またはインビトロで行い得る。別の実施形態において、また、または代わりに、薬物の治療濃度域は増強し得る。これは、上記の第1の実施形態において記載したように投与実験において試験し得る。本明細書において上記で概要を述べたようなPKプロファイルは、インビボでの薬物の高血漿レベルと関連し得る有害事象の発生率および/または重症度を減少させることを目的として潜在的に非常に有用であると考えられる。
【００３６】
また、または代わりに、本発明のプロドラッグは、薬物の生物学的半減期を改善し得る。
【００３７】
また、または代わりに、本発明のプロドラッグの半減期は、驚いたことにおよび予想外に、ジペプチド伸長部のN末端アミノ酸のN-アルキル化を有さないプロドラッグと比較して非常に改善する。
【００３８】
また、または代わりに、相当する親薬物は、良好な生物活性を有する。
【００３９】
また、または代わりに、相当する親薬物は、延長された半減期を有する。
【００４０】
また、または代わりに、相当する親薬物は、DPP-IVによる分解に対して改善された安定性を有する。DPP-IV(また、ジペプチジルペプチダーゼ-4、またはDPP4と示される)およびまたアデノシンデアミナーゼ複合タンパク質2として公知であるものは、内在性膜糖タンパク質であり、プロリンまたはアラニン含有ペプチドを含む多様な範囲の基質を伴うセリンエキソペプチダーゼである。
【００４１】
プロドラッグは、実質的に不活性形態での投与を意図する薬理学的物質である。投与されると、プロドラッグは、親薬物と称し得る活性薬物にインビボで転換される。
【００４２】
ペプチドをベースとする薬物は、例えば、小さなペプチド伸長部を、ペプチドをベースとする薬物に共有結合的に付着させることによってプロドラッグに変換することができる。特定の実施形態において、小さなペプチド伸長部を、ペプチドのN末端に加える。小さなペプチドが付着されている態様によって、このように得られたプロドラッグは、アミドプロドラッグ、またはエステルプロドラッグと示される。
【００４３】
ペプチド薬物のアミドプロドラッグにおいて、小さなペプチド伸長部とペプチド親薬物との間の結合は、アミド結合である。
【００４４】
ペプチド薬物のエステルプロドラッグにおいて、小さなペプチド伸長部とペプチド薬物との間の結合は、エステル結合である。エステル結合が形成されるために、これらの2つの構成要素の1つは、遊離ヒドロキシル基を含むべきであり、他の構成要素は、遊離カルボン酸基を含むべきである。
【００４５】
本発明のGLP-1エステルプロドラッグの特定の実施形態において、GLP-1ペプチド(親薬物)のN末端アミノ酸のα-アミノ基は、ヒドロキシル基で置き換えられている。次いで、このヒドロキシル基は、小さなペプチド伸長部のC末端カルボン酸基と反応して、エステル結合を形成する。
【００４６】
一例として、式Chem.2aの(HOHis)は、アミノ酸His(ヒスチジン)を示し、ここで、α-アミノ基は、ヒドロキシル基で置き換えられている。この基は、一般式Iのアミノ酸Xaa2のC末端カルボン酸基と共にエステル結合を形成する。式Iにおいて、R1と(NHXaa1)との間の結合を除いて、全ての他の結合は、アミド結合を示す。例えば、(OHis)と(GLP-1ペプチド)との間の結合は、(OHis)のカルボン酸基とGLP-1ペプチドのN末端アミノ酸のα-アミノ基との間に形成されるアミド結合を意味する。R1と(NHXaa1)との間の結合は、C-N結合、より特に、R1のC(炭素原子)とアミノ酸(NHXaa1)のα-アミノ基中のN(窒素原子)との間の結合を意味する。
【００４７】
別の特定の実施形態において、本発明のGLP-1プロドラッグは、GLP-1デプシペプチドである。デプシペプチドは、アミド(*-CONHR-*)結合の1つまたは複数がエステル(*-COOR-*)結合で置き換えられているペプチドである。本発明のGLP-1デプシペプチドの特定の実施形態において、1つのアミド結合は、エステル結合で置き換えられている。さらなる特定の実施形態において、この1つのエステル結合は、GLP-1ペプチド(親薬物)のN末端アミノ酸のα-アミノ基を置き換えるα-ヒドロキシル基と、小さなペプチド伸長部のC末端カルボン酸基との間である。
【００４８】
式I中のR1は、直鎖状または分岐状、特に、1〜6個の炭素原子を有する直鎖状アルキルを意味する低級アルキルである。特定の実施形態において、低級アルキルは、メチルである。
【００４９】
式I中の(NHXaa1)およびXaa2のそれぞれは、独立に、アミノ酸を意味する。
【００５０】
(NHXaa1)アミノ酸において、NHパートは、このアミノ酸のα-アミノ基を意味し、この窒素原子は、R1に共有結合的に付着している。したがって、Xaa1は、アミノ酸の残り、すなわち、タイプR*>CH-COOHのラジカル(Rは、アミノ酸側鎖を示す)を意味する。
【００５１】
アミノ酸は、アミン基およびカルボン酸基、ならびに任意選択で、側鎖と称されることが多い1個または複数個のさらなる基を含有する分子である。
【００５２】
アミノ酸という用語には、タンパク新生アミノ酸(遺伝コードによってコードされる、天然アミノ酸、および標準的アミノ酸を含める)、ならびに非タンパク新生アミノ酸(タンパク質において見出されない、および/または標準的遺伝コードにおいてコードされていない)、ならびに合成アミノ酸が含まれる。このように、アミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、非タンパク新生アミノ酸、および/または合成アミノ酸の群から選択し得る。
【００５３】
合成アミノ酸の非限定的例は、アミノ酸のD-異性体である。
【００５４】
以下において、光学異性体が述べられていない全てのアミノ酸は、L-異性体を意味すると理解される。
【００５５】
アミノ酸残基は、これらの完全な名称、これらの1文字コード、および/またはこれらの3文字コードによって同定し得る。これらの3つの方法は、完全に同等である。
【００５６】
GLP-1ペプチドおよび式I中の(GLP-1ペプチド)という用語は、GLP-1(8-37)(配列番号1)またはその類似体もしくは誘導体を意味する。天然ヒトグルカゴン様ペプチド1は、本明細書において配列番号1の配列を有するが、天然ヒトGLP-1(7-37)が形成されるようにN末端におけるHis残基で延長されている。本発明の目的のためにGLP-1(8-37)(強調を加える)と言及する理由は、式Iにおいて7位におけるアミノ酸は、すなわち、イミダゾール-乳酸として既に特定されているためである。HisのChem.2aヒドロキシルバリアントは、イミダゾール-乳酸の1つの(非限定的)例である。
【００５７】
「GLP-1類似体」または「GLP-1の類似体」という用語は、配列番号1のバリアントであるペプチドまたは化合物を意味する。本発明の目的のために、配列番号1の配列を有するペプチドは、天然GLP-1(8-37)と示し得る。
【００５８】
言い換えると、GLP-1類似体は、天然GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較したときいくつかのアミノ酸残基が変化しているGLP-1(8-37)ペプチドである。これらの変化は、独立に、1つまたは複数のアミノ酸置換、付加、および/または欠失を表し得る。
【００５９】
GLP-1類似体は、i)変化しているアミノ酸残基に相当する天然GLP-1(8-37)におけるアミノ酸残基の数(すなわち、天然GLP-1における相当する位置)、およびii)実際の変化について参照することにより記載し得る。
【００６０】
配列リストにおいて、配列番号1の第1のアミノ酸残基(アラニン)は、第1番と割り当てる。しかし以下において、当技術分野の慣習によって、このアラニン残基は第8番と称され、それに続くアミノ酸残基は、それに応じて付番され、グリシン第37番で終了する。したがって一般に、本明細書においてアミノ酸残基番号、またはGLP-1(8-37)配列の位置番号について参照することは、8位におけるAlaで開始し、37位においてGlyで終了する配列について参照することである。
【００６１】
下記は、適切な類似体の命名法の非限定的例である。
【００６２】
下記:8Aib、18K、22E、23R、25V、26R、31K、34Rまたは34Q、および/または37Kから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む類似体は、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較したとき、GLP-1(8-37)(配列番号1)の8位、18位、22位、23位、25位、26位、31位、34位、および/または37位に相当する位置の少なくとも1つにおける変化を含み、より正確に言えは、すなわち、実際の位置における天然アミノ酸の置換によって(天然アミノ酸は、配列番号1において示したものである)、8位におけるAib、18位におけるリシン、22位におけるグルタミン酸、23位におけるアルギニン、25位におけるバリン、26位におけるアルギニン、31位におけるリシン、34位におけるアルギニンもしくはグルタミン、および/または37位におけるリシンに変化している類似体を意味する。良好な秩序のために、8位、18位、22位、23位、25位、26位、31位、34位、および37位は、配列リスト、配列番号1において適用される付番を使用して、アミノ酸の第1番、第11番、第15番、第16番、第19番、第24番、第27番、および第30番を意味する。
【００６３】
上記と同じ論理を使用して、GLP-1(8-37)(配列番号1)のバリアント(34R、37K)である類似体は、Lys34は、Arg34で置換されており、Gly37は、Lys37で置換されていることを除いては、配列番号1と同一のGLP-1ペプチド、すなわち、天然GLP-1(8-37)を意味する。
【００６４】
特定の実施形態において、GLP-1類似体は、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で6個のアミノ酸の変化を有する。
【００６５】
本発明の目的のために、「含む(comprising)」および「含む(including)」のような用語は、開放型の用語と考えられ、これは、これらがさらなる(特定し得ない)潜在的な関連性の特徴的なフィーチャの存在を除外しないことを意味する。例えば、ある種の特定の変化を「含む」類似体は、配列番号1と比較したとき、さらなる変化を含み得る。これらの用語は、本発明の目的のために「閉鎖型」の用語と考えられる「有する」、「からなる」、または「から本質的になる」などに修正してもよく、これは、さらなる(特定し得ない)関連性の特徴的なフィーチャの存在を除外することを意味する。例えば、上記で言及した類似体が特定の変化を「有する」とき、これが配列番号1と比較したとき他の変化を有さないことを意味する。
【００６６】
「と等しい位置」または「相当する位置」という表現を使用して、天然GLP-1(8-37)(配列番号1)を参照することにより、GLP-1類似体(またはバリアント)配列における変化の部位を特性決定し得る。同等または相当する位置、および変化の数は、例えば、単純な筆記および目視によって容易に推定され、かつ/またはNeedleman-Wunschアラインメントである「align」などの、標準的タンパク質もしくはペプチドのアラインメントプログラムを使用し得る。アルゴリズムは、Needleman, S.B.およびWunsch, C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453頁、およびMyersおよびW. Miller、「Optimal Alignments in Linear Space」CABIOS(バイオサイエンスにおけるコンピュータアプリケーション)(1988)4:11〜17頁によるアラインプログラムに記載されている。アラインメントのために、デフォルトスコアリングマトリックスBLOSUM62およびデフォルト同一性マトリックスを使用してもよく、ギャップにおける第1の残基についてのペナルティは、-12、または好ましくは-10に設定し、ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティは、-2、または好ましくは-0.5に設定し得る。
【００６７】
このようなアラインメントの一例は、本明細書において下記で挿入されており、ここで、配列第1番は、配列番号1であり、配列第2番は、その類似体(34R、37K)である。
# 1:GLP-1(8-37)
# 2:GLP-1(8-37)_類似体
# マトリックス:EBLOSUM62
# ギャップ_ペナルティ:10.0
# 延長_ペナルティ:0.5
# 長さ:30
# 同一性:28/30(93.3%)
# 類似性:29/30(96.7%)
# ギャップ:0/30(0.0%)
# スコア:142.0
【００６８】
【化３】
0006300735.tif 000004
【００６９】
非天然アミノ酸が配列に含まれている場合、これらは、アラインメントの目的のために、例えば、Xで置き換えてもよい。必要に応じて、Xは、後で手作業によって補正することができる。
【００７０】
特定の実施形態において、GLP-1ペプチドまたは式Iの(GLP-1ペプチド)は、GLP-1誘導体、すなわち、GLP-1(8-37)(配列番号1)の誘導体、または配列番号1の類似体の誘導体である。
【００７１】
GLP-1誘導体
「誘導体」という用語は、GLP-1の状況において本明細書において使用する場合、化学修飾されたGLP-1(8-37)ペプチド(配列番号1)または配列番号1の化学修飾された類似体を意味し、少なくとも1個の置換基は、ペプチドに共有結合的に付着している。置換基はまた、側鎖と称し得る。
【００７２】
特定の実施形態において、側鎖は、アルブミンと共に非共有結合性凝集物を形成することができ、それによって血流による誘導体の循環を促進し、また、GLP-1-誘導体およびアルブミンの凝集物はゆっくりとのみ崩壊して、活性医薬成分を放出するという事実によって、誘導体の作用時間を延長させる作用を有する。したがって、置換基、または側鎖は、全体として、アルブミン結合部分と称してもよい。
【００７３】
別の特定の実施形態において、アルブミン結合部分は、特に、アルブミン結合、それによって延長に関連した一部分を含む。この一部分は、それに応じて延長部分と称してもよい。延長部分は、ペプチドへのその付着点に対して、アルブミン結合部分の反対の末端に、または反対の末端の付近にあってよい。
【００７４】
またさらなる特定の実施形態において、アルブミン結合部分は、延長部分とペプチドへの付着点との間のポーションを含み、このポーションは、リンカー、リンカー部分、スペーサーなどと称し得る。リンカーは任意選択であってもよく、したがってその場合には、アルブミン結合部分は、延長部分と同一であり得る。
【００７５】
特定の実施形態において、アルブミン結合部分および/または延長部分は親油性であり、生理学的pH(7.4)で正荷電部および/または負荷電部の両方をさらに含有し得る。
【００７６】
アルブミン結合部分、延長部分、またはリンカーは、アシル化によってペプチドのリシン残基に共有結合的に付着し得る。さらなるまたは代替のコンジュゲーション化学には、アルキル化、エステル形成、またはアミド形成、またはシステイン残基へのカップリング、例えば、マレイミドもしくはハロアセトアミド(例えば、ブロモ-/フルオロ-/ヨード-)カップリングによるものが含まれる。
【００７７】
好ましい実施形態において、好ましくは、延長部分およびリンカーを含む、アルブミン結合部分の活性エステルは、アミド結合の形成下で、リシン残基のアミノ基、好ましくは、そのεアミノ基に共有結合で連結している(この工程は、アシル化と称される)。
【００７８】
特に明記しない限り、リシン残基のアシル化について参照するとき、そのε-アミノ基への参照と理解される。
【００７９】
本発明の目的のために、「アルブミン結合部分」、「延長部分」、および「リンカー」という用語は、これらの分子の未反応および反応形態を含み得る。1つまたは他の形態を意味するかどうかは、用語が使用される状況から明らかである。
【００８０】
特定の実施形態において、延長部分は、a)脂肪二酸、およびb)脂肪酸から選択される。
【００８１】
ペプチドへの付着のために、脂肪酸の酸基、または脂肪二酸の酸基の1つは、好ましくはリンカーを介して、ペプチド中のリシン残基のεアミノ基とアミド結合を形成する。
【００８２】
「脂肪酸」という用語は、4〜28個、好ましくは10〜22個の炭素原子を有する脂肪族モノカルボン酸を意味し、これは好ましくは非分岐状であり、これは飽和または不飽和であり得る。
【００８３】
「脂肪二酸」という用語は、上記に定義されているような脂肪酸であるが、ω位においてさらなるカルボン酸基を有するものを意味する。このように、脂肪二酸は、ジカルボン酸である。
【００８４】
脂肪二酸は、末端または遠位のフェニルまたはフェノキシ基を有し得、このフェニルおよびフェノキシ基は、置換されていてもよい。
【００８５】
延長部分の非限定的例は、Chem.3:HOOC-C6H4-O-(CH2)9-CO-*であり、好ましくはHOOC-基は、パラ位にある。ここで、二酸延長部の末端フェノキシ基は、カルボン酸基で置換されている。
【００８６】
延長部分の別の非限定的例は、Chem.7:HOOC-(CH2)16-CO-*である。
【００８７】
特定の実施形態において、アルブミン結合部分は、延長部分に加えて、リンカーを含む。リンカーは、延長部分とペプチドとの間にある。さらなる特定の実施形態において、リンカーは、アシル化によってペプチドのリシン残基に、好ましくはペプチド中のリシン残基のεアミノ基に共有結合的に付着している。
【００８８】
特定の実施形態において、第1のリンカー要素は、式Chem.4:Chem.4:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*によって表し得る8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジラジカル、手短に言えば、OEGと示されるものである。別の特定の実施形態において、第2のリンカー要素は、Gluのジラジカル、例えば、γ-Glu、または短くgGluであり、アミノ酸であるグルタミン酸のγカルボキシ基は、別のリンカー要素への、またはリシンのε-アミノ基への接続のために使用される。
【００８９】
リンカーは、1つもしくは複数の第1のリンカー要素、および/または1つもしくは複数の第2のリンカー要素を含み得る。リンカーの非限定的例は、gGlu-2xOEGである。特定の実施形態において、リンカーのgGluおよび2xOEG要素は、アミド結合を介して、および示した配列において相互接続しており、リンカーは、その遊離アミノ終端(左に示す)において延長部分の遊離カルボニル基に、およびその遊離カルボニル終端(右に示す)においてペプチドのリシン残基のεアミノ基に接続している。
【００９０】
特定の実施形態において、少なくとも1個の置換基は、それぞれ、GLP-1(8-37)の下記の位置:18位、26位、27位、31位、および/または37位に相当する位置の少なくとも1つにおいて、ペプチドのLys残基のεアミノ基に付着している。
【００９１】
特定の実施形態において、GLP-1ペプチドは、例えば、26位または27位に付着している1個の置換基を有し、位置の付番は、GLP-1(8-37)を意味する。
【００９２】
他の特定の実施形態において、GLP-1ペプチドは、2個の置換基を有する。上記の酸タイプの延長部分を含む2個の置換基を有するGLP-1ペプチドは、ジアシル化されたGLP-1誘導体と示し得る。
【００９３】
さらなる特定の実施形態において、2個の置換基は、a)18位および31位、b)26位および37位、またはc)18位および26位に相当する位置に付着しており、位置の付番は、GLP-1(8-37)を意味する。
【００９４】
またさらなる特定の実施形態において、
a)第1の置換基は、GLP-1(8-37)の18位に相当する位置に付着しており、第2の置換基は、GLP-1(8-37)の31位に相当する位置に付着しており、b)第1の置換基は、GLP-1(8-37)の26位に相当する位置に付着しており、第2の置換基は、GLP-1(8-37)の37位に相当する位置に付着しており、またはc)第1の置換基は、GLP-1(8-37)の18位に相当する位置に付着しており、第2の置換基は、GLP-1(8-37)の26位に相当する位置に付着しており、第1および第2の置換基のそれぞれは、独立に、本明細書における実施形態のいずれかにおいて定義されているような置換基である。第1および第2の置換基は、好ましくは同様、実質的に同様、または同一である。
【００９５】
化合物、例えば、アルブミン結合部分、延長部分、およびリンカーとの関連で、類似性および/または同一性は、当技術分野において公知の任意の適切なコンピュータプログラムおよび/またはアルゴリズムを使用して決定し得る。
【００９６】
例えば、2つの延長部分、2つのリンカー、および/または2つの全側鎖の類似性は、分子フィンガープリントを使用して適切に決定し得る。フィンガープリントは、化学構造を表す数学的方法である(例えば、Chemoinformatics:A textbook、Johann GasteigerおよびThomas Engel(編)、Wiley-VCH Verlag、2003年を参照されたい)。
【００９７】
適切なフィンガープリントの例には、これらに限定されないが、UNITYフィンガープリント、MDLフィンガープリント、および/またはECFPフィンガープリント、例えば、ECFP_6フィンガープリント(ECFPは、拡張連結性フィンガープリントの略語である)が含まれる。
【００９８】
特定の実施形態では、2つの延長部分、2つのリンカー、および/または2つの全側鎖は、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントとして表される。
【００９９】
2つのフィンガープリントの類似性を計算するために、a)、b)またはc)が使用されようとも、谷本係数を好ましくは使用する。
【０１００】
特定の実施形態では、a)、b)またはc)を使用しようとも、それぞれ、2つの延長部分、2つのリンカー、および/または2つの全側鎖は、少なくとも0.5(50%);好ましくは、少なくとも0.6(60%);より好ましくは、少なくとも0.7(70%)、または少なくとも0.8(80%);さらにより好ましくは、少なくとも0.9(90%);または最も好ましくは、少なくとも0.99(99%)の類似性、例えば、1.0(100%)の類似性を有する。
【０１０１】
UNITYフィンガープリントは、プログラムSYBYL(Tripos、1699 South Hanley Road、St. Louis、MO63144-2319、USAから入手可能)を使用して計算し得る。ECFP_6およびMDLフィンガープリントは、プログラムPipeline Pilot(Accelrys Inc.、10188、Telesis Court、Suite100、San Diego、CA92121、USAから入手可能)を使用して計算し得る。
【０１０２】
さらなる詳細については、例えば、両方ともAccelrys Software Inc.、San Diego、USからのJ. Chem. Inf. Model.、2008、48、542〜549頁;J. Chem. Inf. Comput. Sci.、2004、44、170〜178頁;J. Med. Chem.、2004、47、2743〜2749頁;J. Chem. Inf. Model.、2010、50、742〜754頁;およびSciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection:Basic Chemistry User Guide、2008年3月、SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection、2008、ならびにガイドhttp://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf、およびhttp://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdfを参照されたい。
【０１０３】
類似性計算の一例を本明細書において下記で挿入し、そこにおいて、C14脂肪二酸の形態の延長部分、およびgGlu-2xOEGリンカー(Chem.5)からなる側鎖を、そのメチルエステル、すなわち、グルタミン酸リンカー部分(Chem6)のモノメチルエステルと比較する。
Chem.5:
【０１０４】
【化４】
0006300735.tif 000005
【０１０５】
Chem.6:
【０１０６】
【化５】
0006300735.tif 000006
【０１０７】
a)ECFP_6フィンガープリントを使用して、類似性は0.798であり、b)UNITYフィンガープリントを使用して、類似性は0.957であり、MDLフィンガープリントを使用して、類似性は0.905である。
【０１０８】
2つの同一の側鎖(アルブミン結合部分)の場合、誘導体は、対称的と示し得る。
【０１０９】
特定の実施形態において、類似性係数は、少なくとも0.80、好ましくは少なくとも0.85、より好ましくは少なくとも0.90、さらにより好ましくは少なくとも0.95、または最も好ましくは少なくとも0.99である。
【０１１０】
第2の態様において、本発明は、本発明の第1の態様のGLP-1ペプチドプロドラッグ化合物に相当する親GLP-1ペプチド薬物に関する。特定の実施形態において、親GLP-1ペプチド薬物は、Chem.21、Chem.22、Chem.23、Chem.24、および/またはChem.25の化合物(これらの全ては、式II:(HOHis)-(GLP-1ペプチド)(式II)のGLP-1化合物であり、式中、(HOHis)、結合、および(GLP-1ペプチド)は、上記の実施形態(プロドラッグ、第1の態様に関する)のいずれかにおいて定義されている通りである)の任意の1つもしくは複数;またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステルを含む。
【０１１１】
別の特定の実施形態において、親GLP-1ペプチド薬物は、反応の所望の生成物であり、式IのR1-(NHXaa1)のアルキル化されたアミン求核試薬は、式IにおけるXaa2と(OHis)との間のエステル結合を切断し、相当するジケトピペラジン誘導体(副生成物として)、および所望の生成物として親GLP-1ペプチド薬物の形成をもたらす。
【０１１２】
第3の態様において、本発明は、Boc-NMe-Ile-Val-OH(Chem.41)、Boc-NMe-Val-Val-OH(Chem.42)、Boc-NMe-Gly-Val-OH(Chem.44)、およびChem.43の化合物に関する。これらは、本発明のプロドラッグの合成において使用される中間体ジペプチド化合物である。
【０１１３】
本明細書において開示されている化合物(プロドラッグ、親薬物、中間体ジペプチド化合物、GLP-1ペプチド、GLP-1類似体、GLP-1誘導体)は、同じ分子式および結合した原子の配列を有する異なる立体異性体の形態で存在し得るが、空間中のこれらの原子の三次元の配向のみが異なる。本発明の例示的な誘導体の立体異性は、実験セクションにおいて、標準的な命名法を使用して名称および構造で示される。特に明記しない限り、本発明は、特許請求した化合物の全ての立体異性体の形態に関する。
【０１１４】
本発明化合物の血漿中濃度は、任意の適切な方法を使用して決定し得る。例えば、LC-MS(液体クロマトグラフィー質量分析)、または免疫アッセイ、例えば、RIA(放射線免疫アッセイ)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、およびLOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)を使用し得る。適切なRIAおよびELISAアッセイのための一般のプロトコルは、例えば、WO09/030738、116〜118頁に見出される。好ましいアッセイは、WO2011/080103の実施例52、55、および58に記載されているLOCIアッセイである。
【０１１５】
薬学的に許容される塩、アミド、またはエステル
本発明の化合物は、薬学的に許容される塩、アミド、またはエステルの形態であり得る。
【０１１６】
塩は、例えば、塩基および酸の間の化学反応、例えば:2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4によって形成される。
【０１１７】
塩は、塩基性塩、酸性塩でよく、または塩は、どちらでなくてもよい(すなわち、中性塩)。水中で、塩基性塩は水酸化物イオンを生成し、酸性塩はヒドロニウムイオンを生成する。
【０１１８】
塩は、それぞれ、アニオン基またはカチオン基の間で、加えたカチオンまたはアニオンと共に形成し得る。これらの基は、GLP-1ペプチド部分(関連性がある場合、そのペプチドパート中、および/もしくはGLP-1誘導体の側鎖中)、ならびに/または小さなペプチド伸長部パート、例えば、式Iの(R1-(NHXaa1)-Xaa2)パートにおいて位置し得る。
【０１１９】
アニオン基の非限定的例には、遊離カルボキシル基が含まれる。例えば、ペプチドは、C末端において遊離カルボン酸基を含むことが多く、ペプチドはまた、内部酸アミノ酸残基、例えば、AspおよびGluにおいて遊離カルボキシル基を含み得る。
【０１２０】
カチオン基の非限定的例には、ペプチドのN末端における遊離アミノ基、および存在する場合、内部の塩基性アミノ酸残基、例えば、His、Arg、およびLysの任意の遊離アミノ基が含まれる。
【０１２１】
エステルは、例えば、遊離カルボン酸基とアルコールまたはフェノールとの反応によって形成されてもよく、これによって、アルコキシまたはアリールオキシ基による少なくとも1個のヒドロキシル基の置換えがもたらされる。
【０１２２】
エステル形成は、ペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、および/または側鎖中の任意の遊離カルボキシル基が関与し得る。
【０１２３】
アミドは、例えば、遊離カルボン酸基とアミンもしくは置換アミンとの反応によって、または遊離もしくは置換アミノ基とカルボン酸との反応によって形成し得る。
【０１２４】
アミド形成は、ペプチドおよび/または側鎖における、ペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、側鎖中の任意の遊離カルボキシル基、ペプチドのN末端における遊離アミノ基、および/またはペプチドの任意の遊離もしくは置換アミノ基が関与し得る。
【０１２５】
特定の実施形態において、本発明の化合物のいずれかは、薬学的に許容される塩の形態である。他の特定の実施形態において、本発明の化合物のいずれかは、薬学的に許容されるアミドの形態であり、好ましくは、ペプチドのC末端においてアミド基を有する。またさらなる特定の実施形態において、本発明の化合物のいずれかは、薬学的に許容されるエステルの形態である。
【０１２６】
機能特性
第1の機能的態様において、GLP-1プロドラッグ化合物は、相当する親薬物の持続放出、したがって、親薬物の延長された作用の持続時間をもたらし、その結果、親薬物の改善された半減期を測定し得る。好ましくは、親薬物のPKプロファイルは、望ましいベル形の形態を有する。
【０１２７】
また、または代わりに、第2の機能的態様において、GLP-1プロドラッグに相当するGLP-1親薬物は生物活性があり、すなわち、GLP-1活性を有する。
【０１２８】
また、または代わりに、第3の機能的態様において、GLP-1プロドラッグに相当するGLP-1親薬物は、DPP-IVによる分解に対して安定化している。
【０１２９】
また、または代わりに、第4の機能的態様において、GLP-1プロドラッグに相当するGLP-1親薬物は、延長された半減期を有する。
【０１３０】
これらの特性は、皮下、静脈内、および/または、特に、経口投与のための、代替および/または次世代のGLP-1化合物の開発において重要である。
【０１３１】
第1の機能的態様によると、本発明のGLP-1プロドラッグ化合物は、改善された半減期を有する。特定の実施形態において、本発明のプロドラッグの半減期は、ジペプチド伸長部のN末端アミノ酸のN-アルキル化を伴わない相当するプロドラッグと比較して改善される。
【０１３２】
また、または代わりに、またさらなる特定の実施形態において、本発明のGLP-1プロドラッグの半減期は、相当する比較GLP-1プロドラッグ(式IにおけるR1は、Hである)の半減期と比較し得る。
【０１３３】
また、または代わりに、半減期は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、インビトロ、および/またはインビボで決定し得る。適切な試験は、本明細書における実施例7のインビトロの半減期試験である。実施例7の試験の特定の実施形態において、半減期は、リン酸緩衝液(pH7.4)中で決定される。また、または代わりに、他の特定の実施形態において、半減期は、血漿において決定する。また、または代わりに、またさらなる特定の実施形態において、本発明のプロドラッグは、実施例7のインビトロの方法(緩衝液、および/または血漿)を使用して決定した半減期を有し、これは上記で言及した比較化合物の半減期の少なくとも2倍である。適切なインビボの試験は、本明細書における実施例12に含まれる。
【０１３４】
生物活性-インビトロの効力
第2の機能的態様によると、本発明のGLP-1プロドラッグに相当するGLP-1親薬物は生物活性があり、すなわちGLP-1活性を有する。上で説明したように、GLP-1親薬物は、本発明のGLP-1プロドラッグのインビボでの転換からもたらされることが予想される薬物である。
【０１３５】
GLP-1活性という用語は、GLP-1受容体に結合し、かつシグナル伝達経路が開始され、当技術分野において公知のようにインスリン分泌性作用または他の生理学的効果をもたらす能力を意味する。GLP-1活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定し得る。特定の実施形態において、本明細書における実施例8および/または実施例9のインビトロの効力試験は、GLP-1活性を決定するために使用し得る。
【０１３６】
生物活性-インビボの薬理学
また、または代わりに、効力は、任意の適切な動物モデルにおいて、および臨床治験において、当技術分野において公知のようにインビボで決定し得る。糖尿病性db/dbマウスは、適切な動物モデルの一例であり、例えば、WO09/030738の実施例43において記載されているように、このようなマウスにおいてインビボで血中グルコース低下効果を決定し得る。
【０１３７】
生物活性-インビトロの効力および受容体結合
特定の実施形態において、効力および/または活性は、インビトロの効力、すなわち、機能的GLP-1受容体アッセイにおける性能を意味し、より特に、クローン化ヒトGLP-1受容体を発現している細胞系におけるcAMP形成を刺激する能力を意味する。
【０１３８】
ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの形成の刺激は、好ましくは、安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/またはcAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識したcAMPとの間の競合に基づいた機能的受容体アッセイを使用して決定してもよく、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異的抗体を使用して捕捉され、かつ/あるいはさらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMPアッセイであり、最も好ましくは、実施例8に記載されているものである。
【０１３９】
最大半減有効濃度(EC50)という用語は一般に、用量反応曲線を参照することにより、ベースラインと最大との中間の反応を誘発する濃度を意味する。EC50は、化合物の効力の尺度として使用され、その最大作用の50%が観察される濃度を表す。
【０１４０】
本発明の化合物のインビトロの効力、特に、GLP-1親薬物の効力は、上記のように決定してもよく、問題の化合物のEC50が決定される。EC50が低いほど、効力はより良好である。
【０１４１】
特定の実施形態において、培地は、下記の組成を有する(最終のアッセイにおける濃度):50mMのTRIS-HCl;5mMのHEPES;10mMのMgCl2、6H2O;150mMのNaCl;0.01%Tween;0.1%BSA;0.5mMのIBMX;1mMのATP;1μMのGTP;pH7.4。
【０１４２】
さらなる特定の実施形態において、GLP-1親薬物は、3000pM以下、より好ましくは2000pM未満、さらにより好ましくは1000pM未満、または最も好ましくは500pM未満のEC50に相当するインビトロの効力を有する。または親薬物は、300pM以下、好ましくは250pM未満、より好ましくは200pM未満、さらにより好ましくは150pM未満、または最も好ましくは100pM未満のEC50に相当するインビトロの効力を有し得る。
【０１４３】
代替の等しく有用なインビトロの効力アッセイを、実施例9に記載する。このアッセイにおいて、親薬物は、100pM以下、好ましくは50pM未満、より好ましくは40pM未満、さらにより好ましくは35pM未満、または最も好ましくは30pM未満、または25pM未満、好ましくは20pM未満、より好ましくは15pM未満、さらにより好ましくは10pM未満、または最も好ましくは5pM未満のEC50に相当するインビトロの効力を有し得る。
【０１４４】
また、または代わりに、他の特定の実施形態において、効力および/または活性は、低濃度のアルブミンの存在下での本発明の化合物、特に、GLP-1親薬物が、GLP-1受容体に結合する能力を意味し、これは実施例10に記載したように決定し得る。
【０１４５】
一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低IC50値に相当して、できる限り良好であるはずである。
【０１４６】
特定の実施形態において、0.005%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体の結合親和性(IC50)は、1000.00nM未満、好ましくは600.00nM未満、より好ましくは100.00nM未満、または最も好ましくは50.00nM未満である。
【０１４７】
生物活性-DPP-IVによる分解に対する安定化
第3の機能的態様によると、本発明のGLP-1プロドラッグに相当するGLP-1親薬物は、DPP-IVによる分解に対して安定化している。
【０１４８】
ジペプチジルアミノペプチダーゼIV(DPP-IV)による分解に対するペプチド化合物の耐性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定し得る。
【０１４９】
適切なアッセイの一例は、下記の分解アッセイである。一定分量のペプチドを精製したジペプチジルアミノペプチダーゼIVの一定分量と共に37℃にて適当な緩衝液中でpH7〜8にて4〜22時間インキュベートする(緩衝液はアルブミンではない)。トリフルオロ酢酸を加えることによって酵素反応を終了させ、ペプチド分解生成物を分離し、HPLCまたはLC-MS分析を使用して定量化する。この分析を行うための1つの方法は、以下である。混合物を、Zorbax300SB-C18(30nmの細孔、5μmの粒子)150×2.1mmカラム上に加え、0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線勾配による0.5ml/分の流量(30分に亘り0%〜100%のアセトニトリル)で溶出させる。ペプチドおよびこれらの分解生成物は、214nm(ペプチド結合)または280nm(芳香族アミノ酸)でのこれらの吸光度によってモニターし得、これらのピーク面積の統合によって定量化する。分解パターンはLC-MSを使用することによって決定することができ、分離したピークのMSスペクトルを決定することができる。所与の時間における未変化/分解した化合物の百分率を、ペプチドDPP-IVに対する安定性の推定ために使用する。
【０１５０】
また、または代わりに、DPP-IVによる分解は、本明細書における実施例11に記載されているように決定することができる。
【０１５１】
ペプチド化合物は、例えば、所与の時間における未変化の化合物の百分率をベースとして天然ペプチドより10倍超安定的であるとき、DPP-IVに対して安定的として定義し得る。特定の実施形態において、GLP-1化合物は、GLP-1(7-37)(7位におけるN-末端Hisによって延長された配列番号1)より少なくとも10倍超安定的であるとき、DPP-IVに対して安定的であると言ってもよい。
【０１５２】
薬物動態プロファイル
第1および第4の機能的態様によると、本発明のGLP-1プロドラッグからのGLP-1親薬物の放出は持続する。それによって、親薬物の作用の延長された持続時間が達成され、結果として、親薬物の改善された半減期を測定し得る。好ましくは、親薬物のPKプロファイルは、望ましいベル形形態を有する。持続放出または延長された作用の持続時間はまた、作用の引き延ばした持続時間、および/または遅延性効果と称してもよい。これは、インビトロ、および/またはインビボでの当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定し得る。1つの特定の実施形態において、半減期(T1/2)は、例えば、WO2011/080103の実施例58において記載されている方法を使用して、ラットにおいてi.v.投与後にインビボで決定される。また、または代わりに、他の特定の実施形態において、遅延は、例えば、WO2011/080103の実施例54において記載された方法を使用して、ミニブタにおけるi.v.投与後のインビボでの半減期(T1/2)として決定し得る。本発明のプロドラッグはまた、これらの方法を使用して試験し得る。またさらなる特定の実施形態において、また、または代わりに、本発明のプロドラッグはまた、インビボでの延長された半減期を有する。これは、例えば、本明細書の上記で言及した任意の方法を使用して決定し得る。特定の実施形態において、比較は、相当するプロドラッグ(R1はHである)と共に行い得る。好ましい試験は、本明細書において実施例12に記載されているミニブタi.v.PK実験である。
【０１５３】
生成プロセス
本発明のGLP-1プロドラッグおよびGLP-1親薬物の構成物であるGLP-1ペプチド、例えば、GLP-1(8-37)(配列番号1)、およびその類似体の生成は、当技術分野で周知である。
【０１５４】
これらのペプチドは、例えば、古典的ペプチド合成、例えば、t-BocもしくはFmoc化学または他の確立された技術を使用した固相ペプチド合成によって生成し得る。例えば、GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年、Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000年、および「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、編W.C. ChanおよびP.D. White、Oxford University Press、2000年を参照されたい。
【０１５５】
また、または代わりに、これらは、組換え法によって、すなわち、類似体をコードし、かつペプチドの発現を可能とする条件下で適切な栄養培地中でペプチドを発現することができる、DNA配列を含有する宿主細胞を培養することによって産生し得る。これらのペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例は、大腸菌(Escherichia coli)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、および哺乳動物のBHKまたはCHO細胞系である。
【０１５６】
非天然アミノ酸および/または共有結合で付着したN-末端モノまたはジペプチド模倣物を含む本発明のこれらの誘導体は、例えば、実験パートに記載されているように生成し得る。または例えば、Hodgsonら:「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、第33巻、第7番(2004年)、422〜430頁;および「Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues」という表題のWO2009/083549A1を参照されたい。
【０１５７】
本発明のデプシペプチドプロドラッグおよび構成物である(HOHis)-(GLP-1ペプチド)親薬物は、例えば、実験パートにおいて開示されているように、当技術分野において一般に公知のように調製し得る。
【０１５８】
医薬組成物
本発明のGLP-1プロドラッグまたはGLP-1親薬物を含む医薬組成物、および薬学的に許容される添加剤は、当技術分野で公知のように調製し得る。
【０１５９】
「添加剤」という用語は、活性治療成分以外の任意の構成要素を広範に意味する。添加剤は、活性のない物質、不活性物質、および/または非医学的活性物質でよい。
【０１６０】
添加剤は、例えば、担体、ビヒクル、賦形剤、錠剤助剤として、ならびに/または活性物質の投与および/もしくは吸収を改善するための、様々な目的を果たし得る。
【０１６１】
様々な添加剤を有する医薬的活性成分の製剤は、当技術分野において公知である。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第19版(1995年)、および任意のより最近の版を参照されたい)。
【０１６２】
添加剤の非限定的な例は、溶剤、賦形剤、緩衝液、保存剤、等張化剤、キレート剤、および安定剤である。
【０１６３】
製剤の例には、液体製剤、すなわち、水を含む水性製剤が含まれる。液体製剤は、溶液剤または懸濁剤でよい。水性製剤は典型的には、少なくとも50%w/wの水、または少なくとも60%w/w、70%w/w、80%w/w、またはさらに少なくとも90%w/wの水を含む。
【０１６４】
代わりに、医薬組成物は、固体製剤、例えば、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥した組成物でよく、これはそのまま使用してもよく、またはこれに、医師もしくは患者が、溶剤および/もしくは賦形剤を使用前に加える。
【０１６５】
水性製剤におけるpHは、pH3〜pH10のいずれか、例えば、約7.0〜約9.5、または約3.0〜約7.0でよい。
【０１６６】
医薬組成物は、緩衝液を含み得る。緩衝液は、例えば、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、およびこれらの混合物からなる群から選択し得る。
【０１６７】
医薬組成物は、保存剤を含み得る。保存剤は、例えば、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシベンゾエート、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチメロサール、ブロノポル、安息香酸、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロオキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(3p-クロロフェノキシプロパン-1,2-ジオール)、およびこれらの混合物からなる群から選択し得る。保存剤は、0.1mg/ml〜20mg/mlの濃度で存在し得る。医薬組成物は、等張剤を含み得る。等張剤は、例えば、塩(例えば、塩化ナトリウム)、糖または糖アルコール、アミノ酸(例えば、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン)、アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、およびこれらの混合物からなる群から選択し得る。任意の糖、例えば、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカン、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、αおよびβHPCDを含み、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ならびにカルボキシメチルセルロース-Naを使用し得る。糖アルコールは、少なくとも1つの-OH基を有するC4〜C8炭化水素と定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールが含まれる。一実施形態において、糖アルコール添加物は、マンニトールである。
【０１６８】
医薬組成物は、キレート剤を含み得る。キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、ならびにこれらの混合物から選択し得る。
【０１６９】
医薬組成物は、安定剤を含み得る。安定剤は、例えば、1種もしくは複数の酸化阻害剤、凝集阻害剤、界面活性剤、および/または1種もしくは複数のプロテアーゼ阻害剤でよい。これらの様々な種類の安定剤の非限定的例は、下記に開示する。
【０１７０】
「凝集物形成」という用語は、可溶性のままであり得るオリゴマー、または溶液から沈殿する大きな目に見える凝集物の形成をもたらす、ペプチド分子の間の物理的相互作用を意味する。液体医薬組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集物形成は、このポリペプチドの生物活性に悪影響を与えることが可能であり、医薬組成物の治療有効性の喪失をもたらす。さらに、凝集物の形成によって、注入システムを使用してポリペプチド含有医薬組成物が投与されたとき、管類、膜、またはポンプの閉塞などの他の問題をもたらし得る。
【０１７１】
医薬組成物は、組成物の貯蔵の間のポリペプチドの凝集物形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。「アミノ酸塩基」という用語は、1種もしくは複数のアミノ酸(メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニンなど)、またはその類似体を意味する。任意のアミノ酸は、その遊離塩基の形態でまたはその塩の形態で存在し得る。アミノ酸塩基の任意の立体異性体(すなわち、L、D、またはこれらの混合物)が存在し得る。
【０１７２】
治療剤として作用するポリペプチドが、このような酸化の影響を受けやすい少なくとも1つのメチオニン残基を含むポリペプチドであるとき、メチオニン(または、他の含硫アミノ酸またはアミノ酸類似体)を加えて、メチオニンスルホキシドへのメチオニン残基の酸化を阻害してもよい。メチオニンの任意の立体異性体(LもしくはD)またはこれらの組合せを使用することができる。
【０１７３】
医薬組成物は、高分子ポリマーまたは低分子化合物の群から選択される安定剤を含み得る。安定剤は、例えば、ポリエチレングリコール(例えば、PEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ/ヒドロキシセルロースまたはその誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、イオウ含有物質、例えば、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノール、ならびに異なる塩(例えば、塩化ナトリウム)から選択し得る。医薬組成物は、これらに限定されないがメチオニンおよびEDTAなどのさらなる安定化剤(ポリペプチドをメチオニン酸化から保護する)、および非イオン性界面活性剤(ポリペプチドを冷凍-解凍または機械的剪断と関連する凝集から保護する)を含み得る。
【０１７４】
医薬組成物は、1種または複数の界面活性剤、好ましくは、界面活性剤、少なくとも1種の界面活性剤、または2種の異なる界面活性剤を含み得る。「界面活性剤」という用語は、水溶性(親水性)パート、および脂溶性(親油性)パートから構成される任意の分子またはイオンを意味する。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および/または双性イオン性界面活性剤からなる群から選択し得る。
【０１７５】
医薬組成物は、1種または複数のプロテアーゼ阻害剤、例えば、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、および/またはベンズアミジンHClを含み得る。
【０１７６】
医薬組成物のさらなる任意選択の成分には、例えば、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン)、ならびに/または双生イオン(例えば、アミノ酸、例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジン)が含まれる。
【０１７７】
またさらに、医薬組成物は、例えば、WO2008/145728に記載されている製剤の任意の1つまたは複数を使用して、インスリン分泌性化合物の経口製剤の当技術分野において公知のように製剤し得る。
【０１７８】
投与された用量は、0.01mg〜100mgのそれぞれプロドラッグもしくは薬物、または0.01〜50mg、または0.01〜20mg、または0.01〜10mgのそれぞれプロドラッグもしくは薬物を含有し得る。
【０１７９】
誘導体は、医薬組成物の形態で投与し得る。誘導体は、それを必要としている患者に、いくつかの部位で、例えば、局所部位、例えば、皮膚または粘膜部位で;吸収を迂回する部位で、例えば、動脈中、静脈中、または心臓中;および吸収が関与する部位で、例えば、皮膚中、皮膚下、筋肉中、または腹部中に投与し得る。
【０１８０】
投与経路は、例えば、舌;舌下;口腔内頬側;口内;経口;胃内;腸内;経鼻;肺、例えば、細気管支、肺胞、もしくはこれらの組合せによる;非経口、上皮;皮膚;経皮的;結膜;尿道;膣;直腸;および/または目であり得る。組成物は経口組成物であり得、投与経路は経口である。
【０１８１】
組成物は、例えば、溶液剤;懸濁剤;乳剤;マイクロエマルジョン;多層乳剤;フォーム剤;膏薬;ペースト剤;貼付剤;軟膏剤;錠剤;コーティング錠剤;チューインガム;リンス;カプセル剤、例えば、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤;坐剤;直腸用カプセル剤;ドロップ剤;ゲル剤;スプレー剤;散剤;エアゾール剤;吸入剤;点眼薬;眼病用軟膏剤;眼病用リンス;膣のペッサリー;膣のリング;膣用軟膏剤;注射液;インサイチュで変形する溶液剤、例えば、インサイチュでゲル化、硬化、沈殿し、インサイチュで結晶化するもの;輸液;またはインプラントとしていくつかの剤形で投与し得る。
【０１８２】
組成物は、任意選択でコーティングされた錠剤、カプセル剤、またはチューインガムであり得る。
【０１８３】
組成物は、例えば、安定性、バイオアベイラビリティー、および/または溶解性を改善するために、薬物担体または薬物送達系中にさらに配合し得る。特定の実施形態において、組成物は、共有結合性、疎水性、および/または静電相互作用によって、このような系に付着し得る。このような配合の目的は、例えば、有害作用を減少させ、時間療法を達成し、かつ/または患者の薬剤服用順守を増加させることでよい。
【０１８４】
組成物はまた、制御放出、持続性放出、延長性放出、遅延放出、および/または持続放出の薬物送達系の製剤において使用し得る。
【０１８５】
非経口投与は、シリンジ、任意選択でペン様シリンジを用いて、または注入ポンプを用いて、皮下、筋内、腹腔内、または静脈内注射によって行ってもよい。
【０１８６】
組成物は、溶液剤、懸濁剤、もしくは散剤の形態で経鼻で投与してもよく、または組成物は、液体もしくは粉末スプレーの形態で肺に投与し得る。
【０１８７】
経皮的投与(例えば、無針注射によって、パッチ、例えば、イオン泳動的パッチから、または経粘膜的経路を介して、例えば、口腔から)は、またさらなるオプションである。
【０１８８】
組成物は、安定化した製剤でよい。「安定化した製剤」という用語は、増加した物理的および/または化学的安定性、好ましくは、両方を有する製剤を意味する。一般に、製剤は、(推奨される使用および貯蔵条件に従って)有効期限に到達するまで使用および貯蔵の間安定的でなくてはならない。
【０１８９】
「物理的安定性」という用語は、熱機械的応力への曝露、ならびに/または不安定な界面および表面(疎水性表面など)との相互作用の結果として、生物学的に不活性および/または不溶性の凝集物を形成するポリペプチドの傾向を意味する。水性ポリペプチド製剤の物理的安定性は、外観検査によって、および/または異なる温度での様々な期間の機械的/物理的応力(例えば、撹拌)への曝露の後の混濁度測定によって評価し得る。代わりに、物理的安定性は、分光学的薬剤、またはポリペプチドの立体配置的状態のプローブ、例えば、チオフラビンTまたは「疎水性パッチ」プローブを使用して評価し得る。
【０１９０】
「化学的安定性」という用語は、未変化のポリペプチドと比較して、減少した生物学的効力、および/または増加した免疫原性作用を潜在的に有する化学分解生成物の形成をもたらす、ポリペプチド構造における化学的(特に、共有結合性)変化を意味する。化学的安定性は、例えば、SEC-HPLC、および/またはRP-HPLCによって、異なる環境条件への曝露の後の様々な時点での化学分解生成物の量を測定することによって評価することができる。
【０１９１】
本発明による誘導体による治療はまた、例えば、抗糖尿病剤、抗肥満剤、食欲調節剤、降圧剤、糖尿病からもたらされる、またはそれと関連する合併症の治療および/もしくは予防のための薬剤、ならびに肥満症からもたらされる、またはそれと関連する合併症および障害の治療および/もしくは予防のための薬剤から選択される1種または複数のさらなる薬理学的活性物質と合わせてもよい。
【０１９２】
医薬品の適応症
本発明はまたは、医薬として使用するための本発明のGLP-1プロドラッグおよび本発明のGLP-1親薬物に関する。
【０１９３】
特定の実施形態では、本発明のGLP-1プロドラッグおよびGLP-1親薬物は、好ましくは全てがどちらにしても糖尿病に関連する、下記の医学的治療のために使用してもよい。
(i)全ての形態の糖尿病、例えば、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、MODY(若年者の成人発症型糖尿病)、妊娠糖尿病の予防および/または治療、ならびに/あるいはHbA1Cの低下;
(ii)糖尿病性疾患の進行(2型糖尿病の進行など)の遅延または予防、耐糖能異常(IGT)からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延、および/またはインスリンを必要としない2型糖尿病からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延;
(iii)β細胞機能の改善、例えば、β細胞のアポトーシスの減少、β細胞機能および/またはβ細胞塊の増加、ならびに/あるいはβ細胞に対するグルコース感受性の回復;
(iv)認知障害の予防および/または治療;
(v)例えば、食物摂取量を減少させ、体重を低下させ、食欲を抑制し、満腹を誘発し;過食障害、神経性過食症、および/または抗精神病剤もしくはステロイドの投与によって誘発される肥満症を治療または予防し;胃運動性を低下させ;かつ/あるいは胃内容物排出を遅延させることによる、摂食障害、例えば、肥満症の予防および/または治療;
(vi)糖尿病性合併症、例えば、末梢性ニューロパシーを含めたニューロパシー;ネフロパシー;あるいは網膜症の予防および/または治療;
(vii)脂質パラメーターの改善、例えば、異脂肪血症の予防および/または治療、総血清脂質の低下;HDLの低下;小さく密なLDLの低下;VLDLの低下:トリグリセリドの低下;コレステロールの低下;HDLの増加;ヒトにおけるリポタンパク質(Lp(a))の血漿レベルの低下;インビトロおよび/またはインビボでのアポリポタンパク質(apo(a))の生成の阻害;
(iix)心血管疾患、例えば、症候群X;アテローム性動脈硬化症;心筋梗塞;冠動脈心疾患;脳卒中、脳虚血;早期心臓疾患もしくは早期心血管疾患、例えば、左室肥大;冠動脈疾患;本態性高血圧症;急性高血圧性緊急症;心筋症;心臓不全;運動耐性;慢性心不全;不整脈;心律動異常;失神;アテローム性動脈硬化症;軽度の慢性心不全;狭心症;心臓バイパス再閉塞;間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症);拡張機能障害;および/または収縮機能障害の予防および/または治療;
(ix)胃腸疾患、例えば、炎症性腸症候群;小腸症候群、もしくはクローン病;消化不良;および/または胃潰瘍の予防および/または治療;
(x)重篤疾患の予防および/または治療、例えば、危篤状態の患者、重篤疾患ポリネフロパシー(CIPNP)患者、および/または潜在的CIPNP患者の治療;重篤疾患またはCIPNPの発生の予防;患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防、治療および/または治癒;ならびに/あるいは入院の間に菌血症、敗血症、および/または敗血症性ショックを患う患者の可能性の予防または減少のため;ならびに/あるいは
(xi)多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の予防および/または治療。
【０１９４】
特定の実施形態において、適応症は、(i)〜(iii)および(v)〜(iix)、例えば、適応症(i)、(ii)、および/もしくは(iii);または適応症(v)、適応症(vi)、適応症(vii)、および/もしくは適応症(iix)からなる群から選択される。
【０１９５】
他の特定の実施形態において、適応症は、(i)である。さらなる特定の実施形態において、適応症は、(v)である。またさらなる特定の実施形態において、適応症は、(iix)である。
【０１９６】
下記の適応症が、特に好ましい:2型糖尿病、および/または肥満症。
【０１９７】
特定の実施形態
下記は、本発明の特定の実施形態である。
1.一般式IのGLP-1化合物:
R1-(NHXaa1)-Xaa2-(OHis)-(GLP-1ペプチド)(式I)
[式中、
GLP-1ペプチドは、GLP-1(8-37)(配列番号1)、またはGLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で9個のアミノ酸の変化を有するその類似体であり、
R1は、低級アルキルであり、
(NHXaa1)は、アミノ酸であり、
Xaa2は、アミノ酸であり、
(OHis)は、式Chem.1
Chem.1:
【０１９８】
【化６】
0006300735.tif 000007
【０１９９】
のイミダゾール-乳酸のラジカルである]
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
2.GLP-1プロドラッグである、実施形態1の化合物。
3.GLP-1エステルプロドラッグである、実施形態1および2のいずれかの化合物。
4.GLP-1デプシペプチドである、実施形態1〜3のいずれかの化合物。
5.Xaa2と(OHis)との間の結合が、エステル結合である、実施形態1〜4のいずれかの化合物。
6.(NHXaa1)とXaa2との間の結合が、アミド結合である、実施形態1〜5のいずれかの化合物。
7.(OHis)と(GLP-1ペプチド)との間の結合が、アミド結合である、実施形態1〜6のいずれかの化合物。
8.R1が、(NHXaa1)のα-アミノ基に付着している、実施形態1〜7のいずれかの化合物。
9.N-末端が、延長されたGLP-1ペプチドである、実施形態1〜8のいずれかの化合物。
10.R1が、1〜6個の炭素原子を有する、実施形態1〜9のいずれかの化合物。
11.R1が、直鎖状アルキルである、実施形態1〜10のいずれかの化合物。
12.R1が、分岐状アルキルである、実施形態1〜10のいずれかの化合物。
13.R1が、メチルである、実施形態1〜11のいずれかの化合物。
14.(NHXaa1)が、Gly、Val、またはIleである、実施形態1〜13のいずれかの化合物。
15.(NHXaa1)が、Glyである、実施形態1〜14のいずれかの化合物。
16.(NHXaa1)が、Valである、実施形態1〜14のいずれかの化合物。
17.(NHXaa1)が、Ileである、実施形態1〜14のいずれかの化合物。
18.Xaa2が、N-アルキル化されたアミノ酸を含まない、実施形態1〜17のいずれかの化合物。
19.Xaa2が、タンパク新生アミノ酸である、実施形態1〜18のいずれかの化合物。
20.Xaa2が、β-分岐状アミノ酸である、実施形態1〜19のいずれかの化合物。
21.Xaa2が、Valである、実施形態1〜20のいずれかの化合物。
22.(OHis)が、Chem.2の式、および/またはL-β-イミダゾール乳酸もしくは(2S)-2-ヒドロキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロピオン酸の名称を有する、実施形態1〜21のいずれかの化合物。
Chem.2:
【０２００】
【化７】
0006300735.tif 000008
【０２０１】
23.(OHis)が、GLP-1ペプチドのN末端に付着している、実施形態1〜22のいずれかの化合物。
24.GLP-1ペプチドが、GLP-1(8-37)(配列番号1)である、実施形態1〜23のいずれかの化合物。
25.GLP-1ペプチドが、GLP-1(8-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態1〜23のいずれかの化合物。
26.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で8個、好ましくは7個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25の化合物。
27.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜26のいずれかの化合物。
28.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜27のいずれかの化合物。
29.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜28のいずれかの化合物。
30.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜29のいずれかの化合物。
31.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜30のいずれかの化合物。
32.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜31のいずれかの化合物。
33.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜32のいずれかの化合物。
34.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜33のいずれかの化合物。
35.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜34のいずれかの化合物。
36.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜35のいずれかの化合物。
37.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜36のいずれかの化合物。
38.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜37のいずれかの化合物。
39.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で7個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜38のいずれかの化合物。
40.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で8個のアミノ酸の変化を有する、実施形態25〜39のいずれかの化合物。
41.GLP-1ペプチドが、a)式IIIのペプチドを含み;かつ/またはb)任意選択で誘導体化された式IIIのペプチド:
式III:Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Lys-Xaa38
であり、式中、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12は、PheまたはLeuであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Val、Lys、またはLeuであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、LeuまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa26は、LysまたはArgであり、
Xaa27は、Lys、Glu、またはLeuであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、Trp、Lys、またはHisであり、
Xaa33は、Valであり、
Xaa34は、Glu、Asn、Gly、Gln、Arg、またはHisであり、
Xaa35は、GlyまたはAibであり、
Xaa36は、ArgまたはGlyであり、
Xaa37は、Lys、Arg、またはGlyであり、
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg、または存在しない、実施形態1〜40のいずれかの化合物。
42.GLP-1ペプチドが、1個もしくは2個のみのLysを含み、または1個もしくは2個のみのLys有する、実施形態1〜41のいずれかの化合物。
43.Xaa8が、AlaまたはAibであり、Xaa12が、Pheであり、Xaa16が、Valであり、Xaa18が、SerまたはLysであり、Xaa19が、Tyrであり、Xaa20が、Leuであり、Xaa22が、GlyまたはGluであり、Xaa23が、GlnまたはArgであり、Xaa25が、AlaまたはValであり、Xaa26が、LysまたはArgであり、Xaa27が、LysまたはGluであり、Xaa30が、Alaであり、Xaa31が、TrpまたはLysであり、Xaa33が、Valであり、Xaa34が、GlnまたはArgであり、Xaa35が、Glyであり、Xaa36が、Argであり、Xaa37が、LysまたはGlyであり、Xaa38が、存在しない、実施形態41〜42のいずれかの化合物。
44.Xaa8が、Alaである、実施形態41〜43のいずれかの化合物。
45.Xaa8が、Aibである、実施形態41〜43のいずれかの化合物。
46.Xaa12が、Pheである、実施形態41〜45のいずれかの化合物。
47.Xaa16が、Valである、実施形態41〜46のいずれかの化合物。
48.Xaa18が、Serである、実施形態41〜47のいずれかの化合物。
49.Xaa18が、Lysである、実施形態41〜47のいずれかの化合物。
50.Xaa19が、Tyrである、実施形態41〜49のいずれかの化合物。
51.Xaa20が、Leuである、実施形態41〜50のいずれかの化合物。
52.Xaa22が、Glyである、実施形態41〜51のいずれかの化合物。
53.Xaa22が、Gluである、実施形態41〜51のいずれかの化合物。
54.Xaa23が、Glnである、実施形態41〜53のいずれかの化合物。
55.Xaa23が、Argである、実施形態41〜53のいずれかの化合物。
56.Xaa25が、Alaである、実施形態41〜55のいずれかの化合物。
57.Xaa25が、Valである、実施形態41〜55のいずれかの化合物。
58.Xaa26が、Lysである、実施形態41〜57のいずれかの化合物。
59.Xaa26が、Argである、実施形態41〜57のいずれかの化合物。
60.Xaa27が、Gluである、実施形態41〜59のいずれかの化合物。
61.Xaa27が、Lysである、実施形態41〜59のいずれかの化合物。
62.Xaa30が、Alaである、実施形態41〜61のいずれかの化合物。
63.Xaa31が、Trpである、実施形態41〜62のいずれかの化合物。
64.Xaa31が、Lysである、実施形態41〜62のいずれかの化合物。
65.Xaa33が、Valである、実施形態41〜64のいずれかの化合物。
66.Xaa34が、Glnである、実施形態41〜65のいずれかの化合物。
67.Xaa34が、Argである、実施形態41〜65のいずれかの化合物。
68.Xaa35が、Glyである、実施形態41〜68のいずれかの化合物。
69.Xaa36が、Argである、実施形態41〜68のいずれかの化合物。
70.Xaa37が、Glyである、実施形態41〜69のいずれかの化合物。
71.Xaa37が、Lysである、実施形態41〜69のいずれかの化合物。
72.Xaa38が、存在しない、実施形態41〜71のいずれかの化合物。
73.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較したとき、下記:8Aib、18K、22E、23R、25V、26R、27K、31K、34Rまたは34Q、および/または37Kから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、位置の付番は、GLP-1(8-37)(配列番号1)を意味する、実施形態25〜72のいずれかの化合物。
74.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)のバリアント(18K、22E、25V、26R、31K、34R)である、実施形態25〜73のいずれかの化合物。
75.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)のバリアント(34R、37K)である、実施形態25〜73のいずれかの化合物。
76.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)のバリアント(18K、22E、34Q)である、実施形態25〜73のいずれかの化合物。
77.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)のバリアント(8Aib、22E、26R、27K、34R)である、実施形態25〜73のいずれかの化合物。
78.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)のバリアント(8Aib、23R、34R)である、実施形態25〜73のいずれかの化合物。
79.GLP-1ペプチドが、a)GLP-1(8-37)(配列番号1)、またはb)実施形態25〜77のいずれかにおいて定義したような類似体、の誘導体である実施形態1〜78のいずれかの化合物。
80.少なくとも1個の置換基が、a)またはb)において定義されているペプチドに共有結合的に付着している、実施形態79の化合物。
81.置換基が、側鎖である、実施形態79〜80のいずれかの化合物。
82.側鎖が、アルブミンと非共有結合的凝集物を形成することができる、実施形態81の化合物。
83.側鎖が、アルブミン結合部分である、実施形態81〜82のいずれかの化合物。
84.アルブミン結合部分が、延長部分および任意選択でリンカーを含む、実施形態83の化合物。
85.アルブミン結合部分、延長部分、またはリンカーが、アシル化によってペプチドのリシン残基に、好ましくはそのεアミノ基に共有結合的に付着している、実施形態83〜84のいずれかの化合物。
86.延長部分が、両方とも任意選択で置換されている、末端または遠位のフェニルまたはフェノキシ基を任意選択で有する、a)脂肪二酸、およびb)脂肪酸から選択される、実施形態84〜85のいずれかの化合物。
87.脂肪酸または脂肪二酸のカルボキシ基が、任意選択でリンカーを介して、好ましくはそのε-アミノ基においてペプチドのリシン残基にアシル化されている、実施形態86の化合物。
88.延長部分が、
Chem.3:HOOC-C6H4-O-(CH2)9-CO-*(式中、好ましくは、HOOC-基は、パラ位にある)である、実施形態85〜87のいずれかの化合物。
89.延長部分が、
Chem.7:HOOC-(CH2)16-CO-*である、実施形態85〜87のいずれかの化合物。
90.アルブミン結合部分が、延長部分に加えて、リンカーを含む、実施形態84〜89のいずれかの化合物。
91.リンカーが、延長部分とペプチドとの間にある、実施形態90の化合物。
92.リンカーが、アシル化によってペプチドのリシン残基に、好ましくはペプチド中のリシン残基のεアミノ基に共有結合的に付着している、実施形態91の化合物。
93.リンカーが、1つまたは複数のリンカー要素を含む、実施形態90〜92のいずれかの化合物。
94.第1のリンカー要素が、式Chem.4:
Chem.4:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*によって表し得る、かつ/またはOEGと示し得る、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジラジカルである、実施形態93の化合物。
95.第2のリンカー要素が、Gluのジラジカル、例えば、γ-Glu、または短くgGluであり、アミノ酸であるグルタミン酸のγカルボキシ基が、別のリンカー要素への、またはリシンのε-アミノ基への接続のために使用される、実施形態93〜94のいずれかの化合物。
96.リンカーが、1つもしくは複数の第1のリンカー要素、および/または1つもしくは複数の第2のリンカー要素を含む、実施形態93〜95のいずれかの化合物。
97.リンカーが、gGlu-2xOEGである、実施形態90〜96のいずれかの化合物。
98.gGluのα-アミノ基が、延長部分のカルボキシ基とアミド結合を形成し、gGluのγカルボキシ基が、OEGのN-末端側終端とアミド結合を形成し、OEGのC末端側終端が、ペプチド中のLys残基のεアミノ基とアミド結合を形成する、実施形態97の化合物。
99.少なくとも1個の置換基が、それぞれ、GLP-1(8-37)(配列番号1)の下記の位置:18位、26位、27位、31位、および/または37位の少なくとも1つに相当する位置においてLys残基のεアミノ基に付着している、実施形態80〜98のいずれかの化合物。
100.26位または27位に付着した1個の置換基を有し、位置の付番が、GLP-1(8-37)を意味する、実施形態99の化合物。
101.26位に付着した1個の置換基を有する、実施形態99の化合物。
102.27位に付着した1個の置換基を有する、実施形態99の化合物。
103.a)18位および31位、b)26位および37位、またはc)18位および26位に付着している2個の置換基を有し、位置の付番は、GLP-1(8-37)を意味し、化合物は好ましくは、a)18位および31位のそれぞれ、b)26位および37位のそれぞれ、またはc)18位および26位のそれぞれに付着している1個の置換基を有する、実施形態99の化合物。
104.GLP-1ペプチドが、下記:
Chem.21a:
【０２０２】
【化８】
0006300735.tif 000009
【０２０３】
Chem.22a:
【０２０４】
【化９】
0006300735.tif 000010
【０２０５】
Chem.23a:
【０２０６】
【化１０】
0006300735.tif 000011
【０２０７】
Chem.24a:
【０２０８】
【化１１】
0006300735.tif 000012
【０２０９】
および
Chem.25a:
【０２１０】
【化１２】
0006300735.tif 000013
【０２１１】
から選択される、実施形態1〜103のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
105.例えば、R1がHである相当する比較化合物と比較して、延長された半減期、好ましくは、インビトロ、またはインビボでの延長された半減期を有する、実施形態1〜104のいずれかの化合物。
106.インビトロでのプロドラッグの半減期が、
a)25mMのリン酸緩衝液(pH7.4);ならびに/または
b)200ulの200mMのリン酸緩衝液(pH7.4)および800ulの血漿の溶液
中で37℃にて測定され、
化合物の濃度が、任意の適切な方法、例えば、UPLCを使用して決定し得る、実施形態105の化合物。
107.プロドラッグの半減期が、例えば、実施例7において全体的に記載されているような、a)緩衝液法および/またはb)血漿法を使用して決定される、実施形態106の化合物。
108.比較化合物の半減期の少なくとも2倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも4倍、さらにより好ましくは少なくとも5倍、または最も好ましくは少なくとも6倍であるプロドラッグの半減期を有する、実施形態105〜107のいずれかの化合物。
109.その構造において式IIの化合物要素:(HOHis)-(GLP-1ペプチド)(式II)を含み、式中、(HOHis)は、Chem1の(OHis)ラジカルに相当するイミダゾール-乳酸であり、結合、およびGLP-1ペプチドは、上記の実施形態1〜108のいずれかにおいて定義した通りであり、式IIの化合物要素が、GLP-1活性を有する、実施形態1〜108のいずれかの化合物。
110.(HOHis)が、式Chem.1a:
【０２１２】
【化１３】
0006300735.tif 000014
【０２１３】
を有する、実施形態109の化合物。
111.(HOHis)が、式Chem.2a:
【０２１４】
【化１４】
0006300735.tif 000015
【０２１５】
を有する、実施形態109の化合物。
112.化合物要素が、GLP-1親薬物である、実施形態109〜111のいずれかの化合物。
113.化合物要素のGLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する、実施形態109〜112のいずれかの化合物。
114.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMP生成の効力としてインビトロのアッセイにおいて測定される、実施形態113の化合物。
115.化合物要素が、
a)2000pM未満、好ましくは1800pM未満、より好ましくは1600pM未満、さらにより好ましくは1400pM未満、もしくは最も好ましくは1200pM未満;
c)1000pM未満、好ましくは800pM未満、より好ましくは600pM未満、さらにより好ましくは500pM未満、もしくは最も好ましくは400pM未満;または
d)300pM未満、好ましくは250pM未満、より好ましくは200pM未満、さらにより好ましくは150pM未満、もしくは最も好ましくは100pM未満
のEC50に相当する効力を有する、実施形態109〜114のいずれかの化合物。
116.効力が、好ましくは安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/またはcAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識したcAMPとの間の競合に基づいた機能的受容体アッセイを使用して、ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの形成の刺激についてのEC50として決定され、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異的抗体を使用して捕捉され、かつ/またはさらにより好ましいアッセイが、AlphaScreen cAMPアッセイ、最も好ましくは、実施例8において記載したものである、実施形態114〜115のいずれかの化合物。
117.(式IIの化合物要素のEC50値を、式III:
(His7)-(GLP-1ペプチド)(式III)[式中、(His7)は、GLP-1(8-37)(N-末端Hisによって延長された配列番号1)の7位におけるL-Hisを意味し、結合は、アミド結合であり、GLP-1ペプチドは、化合物におけるものと同じである]の相当する比較薬物のEC50値で割った商)の逆数が、少なくとも0.1、好ましくは少なくとも0.2、より好ましくは少なくとも0.3、さらにより好ましくは少なくとも0.4、または最も好ましくは少なくとも0.5である、実施形態114〜116のいずれかの化合物。
118.化合物要素のGLP-1活性が、全細胞アッセイにおいてヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する、実施形態113の化合物。
119.化合物要素が、
a)100pM未満、好ましくは50pM未満、より好ましくは40pM未満、さらにより好ましくは35pM未満、もしくは最も好ましくは30pM未満;または
c)25pM未満、好ましくは20pM未満、より好ましくは15pM未満、さらにより好ましくは10pM未満、もしくは最も好ましくは5pM未満
のEC50に相当する効力を有する、実施形態118の化合物。
120.インビトロの効力が、ヒトGLP-1受容体を発現しており、かつプロモーターにカップリングしたcAMP応答配列(CRE)についてのDNAと、ホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)についての遺伝子とを含有する安定的にトランスフェクトされたBHK細胞系において好ましくは行われるレポーター遺伝子アッセイにおいて、ヒトGLP-1受容体の反応を測定することによって決定される、実施形態118〜119のいずれかの化合物。
121.ヒトGLP-1受容体が活性化されるとき、これによってcAMPの生成がもたらされ、それによってルシフェラーゼタンパク質の発現がもたらされ、アッセイインキュベーションが完了するとき、ルシフェラーゼ基質(ルシフェリン)を加え、酵素によってルシフェリンはオキシルシフェリンに変換され、バイオルミネセンスを生成し、これはアッセイについての読み出し情報である、実施形態120の化合物。
122.アッセイが、実施例9において記載されているように行われる、実施形態121の化合物。
123.化合物要素のGLP-1活性が、低アルブミンの存在下でのヒトGLP-1受容体への結合の能力を意味する、実施形態109〜122のいずれかの化合物。
124.0.005%HSA(低アルブミン)の存在下での化合物要素のGLP-1受容体の結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、好ましくは500nM未満、より好ましくは100nM未満、もしくは最も好ましくは50nM未満;
b)40nM未満、好ましくは30.0nM未満、またより好ましくは20.0nM未満、さらにより好ましくは10.0nM未満、もしくは最も好ましくは5.00nM未満;または
c)5.0nM未満、好ましくは4.0nM未満、またより好ましくは2.0nM未満、さらにより好ましくは1.0nM未満、もしくは最も好ましくは0.5nM未満である、実施形態123の化合物。
125.GLP-1受容体への結合親和性が、好ましくはSPA結合アッセイを使用して、より好ましくは、実施例10において記載されているようなSPA結合アッセイを使用して、受容体からの125I-GLP-1の移動によって測定される、実施形態123〜124のいずれかの化合物。
126.(式IIの化合物要素のIC50値を、式III:
(His7)-(GLP-1ペプチド)(式III)[式中、(His7)は、GLP-1(7-37)(N-末端Hisによって延長された配列番号1)の7位におけるL-Hisを意味し、結合は、アミド結合であり、GLP-1ペプチドは、化合物におけるものと同じである]の相当する比較薬物のIC50値で割った商)の逆数が、少なくとも0.1、好ましくは少なくとも0.2、より好ましくは少なくとも0.3、さらにより好ましくは少なくとも0.4、または最も好ましくは少なくとも0.5である、実施形態123〜125のいずれかの化合物。
127.化合物要素が、DPP-IV分解に対して安定化している、実施形態109〜126のいずれかの化合物。
128.実施例11において全体的に記載されているような、BSAの添加を伴う、または伴わない、インビトロでのDPP-IVとのインキュベーション後に決定して、
a)少なくとも1000分、好ましくは少なくとも1500分、より好ましくは少なくとも2000分、もしくは最も好ましくは少なくとも2500分の半減期;または
b)少なくとも3000分、もしくは好ましくは少なくとも3500分の半減期
を有する、実施形態127の化合物。
129.ミニブタにおいてi.v.投与されたときに、親薬物について、例えば全体的に、図2において四角によって表される曲線として「ベル形」PKプロファイルをもたらす、実施形態1〜128のいずれかの化合物。
130.Chem.51、Chem.52、Chem.53、Chem.54、Chem.55、およびChem.56から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
131.その構造が、実施例1、2、3、4、5、および6において示される構造から選択される、好ましくは実施形態80による化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
132.その名称が、実施例1、2、3、4、5、および6の化合物の名称から選択される、好ましくは実施形態80および/または81のいずれかによる化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
133.実施形態1〜129のいずれかにおいて定義したような化合物である、実施形態130〜132のいずれかの化合物。
134.Chem.30、Chem.31、Chem.32、Chem.33、およびChem.34から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
135.その名称が、実施例1a、1b、2a、3a、および6aの化合物の名称から選択される、好ましくは実施形態134による化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
136.実施形態1〜129のいずれかにおいて定義したような化合物である、実施形態134〜135のいずれかの化合物。
137.Chem.21、Chem.22、Chem.23、Chem.24、およびChem.25から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
138.GLP-1親薬物である、実施形態137の化合物。
139.配列番号1の下記の類似体:(i)7HOHis、18K、22E、25V、26R、31K、34R;(ii)7HOHis、18K、22E、25V、26R、31K、34R;(iii)7HOHis、34R、37K;(iv)7HOHis、18K、22E、34Q;(v)7HOHis、8Aib、22E、26R、27K、34R;および(vi)7HOHis、8Aib、23R、34Rから選択される、ペプチド配列を含む化合物。
140.(i)〜(vi)から選択されるペプチド配列を有する、実施形態139の化合物。
141.GLP-1(8-37)配列番号1の類似体である、実施形態139〜140のいずれかの化合物。
142.GLP-1活性を有し、GLP-1活性が好ましくは、上記の実施形態109〜126のいずれかにおけるように定義される、実施形態137〜141のいずれかの化合物。
143.DPP-IVによる分解に対して安定化している、実施形態137〜142のいずれかの化合物。
144.延長された半減期を有する、実施形態137〜143のいずれかの化合物。
145.Chem.41(Boc-NMe-Ile-Val-OH)、Chem.42(Boc-NMe-Val-Val-OH)、およびChem.44(Boc-NMe-Gly-Val-OH)から選択される化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
146.中間化合物である、実施形態145の化合物。
147.Boc-NMe-Ile-Val-OHが、
Chem.41:
【０２１６】
【化１５】
0006300735.tif 000016
【０２１７】
を意味する、実施形態145〜146のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
148.Boc-NMe-Val-Val-OHが、
Chem.42:
【０２１８】
【化１６】
0006300735.tif 000017
【０２１９】
を意味する、実施形態145〜147のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
149.Boc-NMe-Ile-Val-OHが、
Chem.41a:
【０２２０】
【化１７】
0006300735.tif 000018
【０２２１】
を意味する、実施形態145〜147のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
150.Boc-NMe-Val-Val-OHが、
Chem.42a:
【０２２２】
【化１８】
0006300735.tif 000019
【０２２３】
を意味する、実施形態145〜147のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
151.Boc-NMe-Gly-Val-OHが、
Chem.44:
【０２２４】
【化１９】
0006300735.tif 000020
【０２２５】
を意味する、実施形態145〜147のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
152.Boc-NMe-Gly-Val-OHが、
Chem.44a:
【０２２６】
【化２０】
0006300735.tif 000021
【０２２７】
を意味する、実施形態145〜147のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
153.下記から選択される化合物:
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-ブトキシ-4-[10-(4-tert-ブトキシカルボニルフェノキシ)デカノイルアミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]酢酸;および
Chem.43:
【０２２８】
【化２１】
0006300735.tif 000022
【０２２９】
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
154.上記の実施形態1〜136のいずれかにおいて定義したようなそのプロドラッグを投与することによる、一般式II:(HOHis)-(GLP-1ペプチド)の活性および安定化した親薬物GLP-1化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルのインビボでの放出を達成する方法。
155.プロドラッグが、インビボで転換され、長いT1/2を有する活性薬物を放出する、実施形態154の方法。
156.医薬として使用するための、実施形態1〜144のいずれかの化合物。
157.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜144のいずれかの化合物。
158.薬学的活性量の実施形態1〜144のいずれかの化合物を投与することによって、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
【０２３０】
さらなる特定の実施形態
下記は、本発明の特定の実施形態である。
1.一般式IのGLP-1化合物:
R1-(NHXaa1)-Xaa2-(OHis)-(GLP-1ペプチド)(式I)
[式中、
R1は、低級アルキルであり、
(NHXaa1)は、アミノ酸であり、
Xaa2は、アミノ酸であり、
(OHis)は、式Chem.1
Chem.1:
【０２３１】
【化２２】
0006300735.tif 000023
【０２３２】
のイミダゾール-乳酸のラジカルである]
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
2.GLP-1プロドラッグである、実施形態1の化合物。
3.GLP-1エステルプロドラッグである、実施形態1および2のいずれかの化合物。
4.GLP-1デプシペプチドである、実施形態1〜3のいずれかの化合物。
5.Xaa2と(OHis)との間の結合が、エステル結合である、実施形態1〜4のいずれかの化合物。
6.(NHXaa1)とXaa2との間の結合が、アミド結合である、実施形態1〜5のいずれかの化合物。
7.(OHis)と(GLP-1ペプチド)との間の結合が、アミド結合である、実施形態1〜6のいずれかの化合物。
8.R1が、(NHXaa1)のα-アミノ基に付着している、実施形態1〜7のいずれかの化合物。
9.N-末端が、延長されたGLP-1ペプチドである、実施形態1〜8のいずれかの化合物。
10.R1が、1〜6個の炭素原子を有する、実施形態1〜9のいずれかの化合物。
11.R1が、直鎖状アルキルである、実施形態1〜10のいずれかの化合物。
12.R1が、分岐状アルキルである、実施形態1〜10のいずれかの化合物。
13.R1が、メチルである、実施形態1〜11のいずれかの化合物。
14.(NHXaa1)が、Gly、Val、またはIleである、実施形態1〜13のいずれかの化合物。
15.(NHXaa1)が、Glyである、実施形態1〜14のいずれかの化合物。
16.(NHXaa1)が、Valである、実施形態1〜14のいずれかの化合物。
17.(NHXaa1)が、Ileである、実施形態1〜14のいずれかの化合物。
18.Xaa2が、N-アルキル化されたアミノ酸を含まない、実施形態1〜17のいずれかの化合物。
19.Xaa2が、タンパク新生アミノ酸である、実施形態1〜18のいずれかの化合物。
20.Xaa2が、β-分岐状アミノ酸である、実施形態1〜19のいずれかの化合物。
21.Xaa2が、Valである、実施形態1〜20のいずれかの化合物。
22.(OHis)が、Chem.2の式を有する、実施形態1〜21のいずれかの化合物。
Chem.2:
【０２３３】
【化２３】
0006300735.tif 000024
【０２３４】
23.(OHis)が、GLP-1ペプチドのN末端に付着している、実施形態1〜22のいずれかの化合物。
24.GLP-1ペプチドが、GLP-1(8-37)(配列番号1)またはその類似体である、実施形態1〜23のいずれかの化合物。
25.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
26.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
27.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
28.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
29.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
30.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最大で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
31.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
32.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
33.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
34.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
35.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
36.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較して最小で6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態24の化合物。
37.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)と比較したとき、下記:18K、22E、25V、26R、31K、34Rまたは34Q、および/または37Kから選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、位置の付番は、GLP-1(8-37)を意味する、実施形態24〜36のいずれかの化合物。
38.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)のバリアント(18K、22E、25V、26R、31K、34R)である、実施形態24〜37のいずれかの化合物。
39.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)のバリアント(34R、37K)である、実施形態24〜37のいずれかの化合物。
40.類似体が、GLP-1(8-37)(配列番号1)のバリアント(18K、22E、34Q)である、実施形態24〜38のいずれかの化合物。
41.GLP-1ペプチドが、a)GLP-1(8-37)(配列番号1)、またはb)実施形態24〜40のいずれかにおいて定義したような類似体、の誘導体である実施形態1〜23のいずれかの化合物。
42.少なくとも1個の置換基が、a)またはb)において定義されているペプチドに共有結合的に付着している、実施形態41の化合物。
43.置換基が、側鎖である、実施形態41〜42のいずれかの化合物。
44.側鎖が、アルブミンと非共有結合的凝集物を形成することができる、実施形態43の化合物。
45.側鎖が、アルブミン結合部分である、実施形態43〜44のいずれかの化合物。
46.アルブミン結合部分が、延長部分および任意選択でリンカーを含む、実施形態45の化合物。
47.アルブミン結合部分、延長部分、またはリンカーが、アシル化によってペプチドのリシン残基に、好ましくはそのεアミノ基に共有結合的に付着している、実施形態45〜46のいずれかの化合物。
48.延長部分が、両方とも任意選択で置換されている、末端または遠位のフェニルまたはフェノキシ基を任意選択で有する、a)脂肪二酸、およびb)脂肪酸から選択される、実施形態46〜47のいずれかの化合物。
49.脂肪酸または脂肪二酸のカルボキシ基が、任意選択でリンカーを介して、好ましくはそのε-アミノ基においてペプチドのリシン残基にアシル化されている、実施形態48の化合物。
50.延長部分が、
Chem.3:HOOC-C6H4-O-(CH2)9-CO-*(式中、好ましくは、HOOC-基は、パラ位にある)である、実施形態47〜49のいずれかの化合物。
51.アルブミン結合部分が、延長部分に加えて、リンカーを含む、実施形態46〜50のいずれかの化合物。
52.リンカーが、延長部分とペプチドとの間にある、実施形態51の化合物。
53.リンカーが、アシル化によってペプチドのリシン残基に、好ましくはペプチド中のリシン残基のεアミノ基に共有結合的に付着している、実施形態52の化合物。
54.リンカーが、1つまたは複数のリンカー要素を含む、実施形態51〜53のいずれかの化合物。
55.第1のリンカー要素が、式Chem.4:
Chem.4:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*によって表し得る、かつ/またはOEGと示し得る、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジラジカルである、実施形態54の化合物。
56.第2のリンカー要素が、Gluのジラジカル、例えば、γ-Glu、または短くgGluであり、アミノ酸であるグルタミン酸のγカルボキシ基が、別のリンカー要素への、またはリシンのε-アミノ基への接続のために使用される、実施形態54〜55のいずれかの化合物。
57.リンカーが、1つもしくは複数の第1のリンカー要素、および/または1つもしくは複数の第2のリンカー要素を含む、実施形態54〜56のいずれかの化合物。
58.リンカーが、gGlu-2xOEGである、実施形態51〜57のいずれかの化合物。
59.gGluのα-アミノ基が、延長部分のカルボキシ基とアミド結合を形成し、gGluのγカルボキシ基が、OEGのN-末端側終端とアミド結合を形成し、OEGのC末端側終端が、ペプチド中のLys残基のεアミノ基とアミド結合を形成する、実施形態58の化合物。
60.少なくとも1個の置換基が、それぞれ、GLP-1(8-37)(配列番号1)の下記の位置:18位、26位、31位、および/または37位の少なくとも1つに相当する位置においてLys残基のεアミノ基に付着している、実施形態42〜59のいずれかの化合物。
61.a)18位および31位、b)26位および37位、またはc)18位および26位に付着している2個の置換基を有し、位置の付番は、GLP-1(8-37)を意味し、化合物は好ましくは、a)18位および31位のそれぞれ、b)26位および37位のそれぞれ、またはc)18位および26位のそれぞれに付着している1個の置換基を有する、実施形態60の化合物。
62.GLP-1ペプチドが、下記:
Chem.21a:
【０２３５】
【化２４】
0006300735.tif 000025
【０２３６】
Chem.22a:
【０２３７】
【化２５】
0006300735.tif 000026
【０２３８】
および
Chem.23a:
【０２３９】
【化２６】
0006300735.tif 000027
【０２４０】
から選択される、実施形態1〜61のいずれかの化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
63.例えば、R1がHである相当する比較化合物と比較して、延長された半減期、好ましくは、インビトロ、またはインビボでの延長された半減期を有する、実施形態1〜50のいずれかの化合物。
64.インビトロでのプロドラッグの半減期が、
a)25mMのリン酸緩衝液(pH7.4);ならびに/または
b)200ulの200mMのリン酸緩衝液(pH7.4)および800ulの血漿の溶液
中で37℃にて測定され、
化合物の濃度が、任意の適切な方法、例えば、UPLCを使用して決定し得る、実施形態63の化合物。
65.プロドラッグの半減期が、例えば、実施例7において全体的に記載されているような、a)緩衝液法および/またはb)血漿法を使用して決定される、実施形態64の化合物。
66.比較化合物の半減期の少なくとも2倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも4倍、さらにより好ましくは少なくとも5倍、または最も好ましくは少なくとも6倍であるプロドラッグの半減期を有する、実施形態63〜65のいずれかの化合物。
67.その構造において式IIの化合物要素:(HOHis)-(GLP-1ペプチド)(式II)を含み、式中、(HOHis)は、Chem1の(OHis)ラジカルに相当するイミダゾール-乳酸であり、結合、およびGLP-1ペプチドは、上記の実施形態1〜66のいずれかにおいて定義した通りであり、式IIの化合物要素が、GLP-1活性を有する、実施形態1〜66のいずれかの化合物。
68.(HOHis)が、式Chem.1a:
【０２４１】
【化２７】
0006300735.tif 000028
【０２４２】
を有する、実施形態67の化合物。
69.(HOHis)が、式Chem.2a:
【０２４３】
【化２８】
0006300735.tif 000029
【０２４４】
を有する、実施形態67の化合物。
70.化合物要素が、GLP-1親薬物である、実施形態67〜69のいずれかの化合物。
71.化合物要素のGLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する、実施形態67〜70のいずれかの化合物。
72.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMP生成の効力としてインビトロのアッセイにおいて測定される、実施形態71の化合物。
73.化合物要素が、
a)2000pM未満、好ましくは1800pM未満、より好ましくは1600pM未満、さらにより好ましくは1400pM未満、もしくは最も好ましくは1200pM未満;
c)1000pM未満、好ましくは800pM未満、より好ましくは600pM未満、さらにより好ましくは500pM未満、もしくは最も好ましくは400pM未満;または
d)300pM未満、好ましくは250pM未満、より好ましくは200pM未満、さらにより好ましくは150pM未満、もしくは最も好ましくは100pM未満
のEC50に相当する効力を有する、実施形態67〜72のいずれかの化合物。
74.効力が、好ましくは安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/またはcAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識したcAMPとの間の競合に基づいた機能的受容体アッセイを使用して、ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの形成の刺激についてのEC50として決定され、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異的抗体を使用して捕捉され、かつ/またはさらにより好ましいアッセイが、AlphaScreen cAMPアッセイ、最も好ましくは、実施例8において記載したものである、実施形態72〜73のいずれかの化合物。
75.(式IIの化合物要素のEC50値を、式III:
(His7)-(GLP-1ペプチド)(式III)[式中、(His7)は、GLP-1(8-37)(N-末端Hisによって延長された配列番号1)の7位におけるL-Hisを意味し、結合は、アミド結合であり、GLP-1ペプチドは、化合物におけるものと同じである]の相当する比較薬物のEC50値で割った商)の逆数が、少なくとも0.1、好ましくは少なくとも0.2、より好ましくは少なくとも0.3、さらにより好ましくは少なくとも0.4、または最も好ましくは少なくとも0.5である、実施形態72〜74のいずれかの化合物。
76.化合物要素のGLP-1活性が、低アルブミンの存在下でのヒトGLP-1受容体への結合の能力を意味する、実施形態67〜76のいずれかの化合物。
77.0.005%HSA(低アルブミン)の存在下での化合物要素のGLP-1受容体の結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、好ましくは500nM未満、より好ましくは100nM未満、または最も好ましくは50nM未満;
b)40nM未満、好ましくは30.0nM未満、またより好ましくは20.0nM未満、さらにより好ましくは10.0nM未満、または最も好ましくは5.00nM未満である、実施形態76の化合物。
78.GLP-1受容体への結合親和性が、好ましくはSPA結合アッセイを使用して、より好ましくは、実施例10において記載されているようなSPA結合アッセイを使用して、受容体からの125I-GLP-1の移動によって測定される、実施形態76〜77のいずれかの化合物。
79.(式IIの化合物要素のIC50値を、式III:
(His7)-(GLP-1ペプチド)(式III)[式中、(His7)は、GLP-1(7-37)(N-末端Hisによって延長された配列番号1)の7位におけるL-Hisを意味し、結合は、アミド結合であり、GLP-1ペプチドは、化合物におけるものと同じである]の相当する比較薬物のIC50値で割った商)の逆数が、少なくとも0.1、好ましくは少なくとも0.2、より好ましくは少なくとも0.3、さらにより好ましくは少なくとも0.4、または最も好ましくは少なくとも0.5である、実施形態76〜78のいずれかの化合物。
80.Chem.51、Chem.52、Chem.53、Chem.54、およびChem.55から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
81.その構造が、実施例1、2、3、4、および5において示される構造から選択される、好ましくは実施形態80による化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
82.その名称が、実施例1、2、3、4、および5の化合物の名称から選択される、好ましくは実施形態80および/または81のいずれかによる化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
83.実施形態1〜79のいずれかにおいて定義したような化合物である、実施形態80〜82のいずれかの化合物。
84.Chem.21、Chem.22、およびChem.23から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミドもしくはエステル。
85.GLP-1親薬物である、実施形態84の化合物。
86.GLP-1活性を有し、GLP-1活性が好ましくは、上記の実施形態67〜79のいずれかにおけるように定義される、実施形態84〜85のいずれかの化合物。
87.DPP-IVによる分解に対して安定化している、実施形態84〜86のいずれかの化合物。
88.延長された半減期を有する、実施形態84〜87のいずれかの化合物。
89.Boc-NMe-Ile-Val-OH、およびBoc-NMe-Val-Val-OHから選択される化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
90.中間化合物である、実施形態89の化合物。
91.Boc-NMe-Ile-Val-OHが、
Chem.41:
【０２４５】
【化２９】
0006300735.tif 000030
【０２４６】
を意味する、実施形態89〜90のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
92.Boc-NMe-Val-Val-OHが、
Chem.42:
【０２４７】
【化３０】
0006300735.tif 000031
【０２４８】
を意味する、実施形態89〜91のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
93.Boc-NMe-Ile-Val-OHが、
Chem.41a:
【０２４９】
【化３１】
0006300735.tif 000032
【０２５０】
を意味する、実施形態89〜91のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
94.Boc-NMe-Val-Val-OHが、
Chem.42a:
【０２５１】
【化３２】
0006300735.tif 000033
【０２５２】
を意味する、実施形態89〜91のいずれかの化合物、またはその塩、アミドもしくはエステル。
95.医薬として使用するための、実施形態1〜83のいずれかの化合物。
96.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜83のいずれかの化合物。
97.薬学的活性量の実施形態1〜83のいずれかの化合物を投与することによって、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
98.医薬として使用するための、実施形態84〜88のいずれかの化合物。
99.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態84〜88のいずれかの化合物。
100.薬学的活性量の実施形態84〜88のいずれかの化合物を投与することによって、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するためするため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
【実施例】
【０２５３】
この実験パートは、略語の一覧から開始し、本発明のプロドラッグおよび薬物を合成および特性決定するための一般法を含むセクションが続く。次いで、特定のプロドラッグの調製に関するいくつかの実施例が続き、最後に、これらのプロドラッグおよび薬物の活性および特性に関するいくつかの実施例が含まれる(薬理学的方法と見出しがあるセクション)。
【０２５４】
実施例は、本発明を例示する役割を果たす。
略語の一覧
Aib:            α-アミノイソ酪酸
API:            活性医薬成分
AUC:          曲線下面積
BG:            血中グルコース
BHK            ベビーハムスター腎臓
BSA:            ウシ血清アルブミン
BW:            体重
Boc:            t-ブチルオキシカルボニル
BSA:            ウシ血清アルブミン
CAS:            化学情報検索サービス機関
CDCl3:          重水素化クロロホルム
コリジン:        2,4,6-トリメチルピリジン
DCM:            ジクロロメタン
Dde:              1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DesH:            デス-アミノヒスチジン(イミダゾプロピオン酸、Impともまた称してよい)
DIC:              ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:          ジイソプロピルエチルアミン
DMEM:          ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)
DMSO:          ジメチルスルホキシド
DPP-IV:          ジペプチジルペプチダーゼ-4
EDAC            1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩
EDTA:            エチレンジアミン四酢酸
EGTA:            エチレングリコール四酢酸
EtOAc:            酢酸エチル
EtOH:            エタノール
FCS:              ウシ胎仔血清
Fmoc:            9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HEPES:          4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HOAt:            1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt:            1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC:            高速液体クロマトグラフィー
HSA:            ヒト血清アルブミン
IBMX:            3-イソブチル-1-メチルキサンチン
Imp:              イミダゾプロピオン酸(デス-アミノヒスチジン、DesHともまた称してよい)
i.v.                静脈内
ivDde:            1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
IVGTT:            静脈内グルコース耐性試験
LCMS:            液体クロマトグラフィー質量分析
LYD:              Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS:        MALDI-TOF MSを参照されたい
MALDI-TOF MS:  マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析
MeOH:            メタノール
MES:              2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸
Mmt:              4-メトキシトリチル
MSNT:            1-(メシチレン-2-スルホニル)-3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール
Mtt:              4-メチルトリチル
NaOEt:            ナトリウムエタノレート
NMP:            N-メチルピロリドン
OEG:              8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OtBu:              Tert-ブチルエステル
Pbf:              2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PBS:              リン酸緩衝生理食塩水
PD:                薬力学
Pen/Strep:          ペニシリン/ストレプトマイシン
PK:                薬物動態学
PyBob              ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
RP:              逆相
RP-HPLC:        逆相高速液体クロマトグラフィー
RT:              室温
Rt:              保持時間
s.c.:              皮下
SD:              標準偏差
SEC-HPLC:      サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
SEM:            平均の標準誤差
SPA:            シンチレーション近接アッセイ
SPPS:          固相ペプチド合成
TBDMS:        Tert-ブチルジメチルシリルまたはtert-ブチルジメチルシラン
TBTU:          (2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート)
tBu:            Tert-ブチル
TEA:            トリエチルアミン
TFA:            トリフルオロ酢酸
TFE:            トリフルオロエタノール
THF:            テトラヒドロフラン
TIS:            トリイソプロピルシラン
TLC:            薄層クロマトグラフィー
TNBS:          トリニトロベンゼンスルホネート
Tol              トルエン
Tris:            トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール
Trt:              トリフェニルメチル(トリチル)
Tween20:        ポリオキシエチレン(20)モノラウリン酸ソルビタン
UPLC:          超高性能液体クロマトグラフィー
材料および方法
特に明記しない限り、全ての試薬は試薬グレードであった。
材料
L-β-イミダゾール乳酸、(2S)-2-ヒドロキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパン酸(CAS14403-45-3)
H-Val-OMe.HCl、L-バリンメチルエステル塩酸塩(CAS6306-52-1)
Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(CAS166108-71-0)
Fmoc-L-グルタミン酸1-tert-ブチルエステル(CAS84793-07-7)
10-(4-tert-ブトキシカルボニルフェノキシ)デカン酸(WO2006/082204の実施例25、ステップ2において記載しているように調製)
化学的方法
このセクションは、2つに分割される。一般法に関するセクションA(調製(A1);ならびに検出および特性決定(A2))、ならびにいくつかの特定の中間化合物(B1)、親薬物(B2)、およびプロドラッグ(B3)の調製および特性決定が記載されているセクションB。
A、一般の方法
A1、調製方法
このセクションは、固相ペプチド合成のための方法(アミノ酸の脱保護のための方法、樹脂からペプチドを切断する方法、およびその精製の方法を含めた、SPPS法)、ならびにこのように得られたペプチドを検出し特徴付けるための方法(LCMS、MALDI、およびUPLC法)に関する。ペプチドの固相合成は、場合によっては、ジペプチドアミド結合上で酸性条件下にて切断することができる基(これらに限定されないが、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル、または2,4,6-トリメトキシベンジルなど)で保護されたジペプチドを使用することによって改善し得る。セリンまたはトレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドを使用し得る(例えば、Novabiochemから入手可能、W.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403をまた参照されたい)。使用されるFmoc保護されたアミノ酸誘導体は、推奨される標準であった:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、または、Fmoc-Val-OHなど(例えば、Anaspec、Bachem、Iris Biotech、またはNovabiochemから供給)。これ以上特定されない場合、アミノ酸の天然L型を使用する。N末端アミノ酸は、αアミノ基においてBoc保護されていた(例えば、N末端においてHisを有するペプチドについて、Boc-His(Boc)-OH、またはBoc-His(Trt)-OH)。SPPSを使用するモジュールアルブミン結合部分付着の場合、下記の適切に保護された構造単位(これらに限定されないが、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-トラネキサム酸、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、テトラデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、または4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルなど)を使用した。下記で述べた全ての操作は、250μmolの合成スケールで行った。
【０２５５】
1．樹脂結合した保護されたペプチド骨格の合成
方法:SPPS_A
保護されたペプチジル樹脂は、メーカーが供給するFastMoc UVプロトコルの修飾されたバージョンを使用して、Applied Biosystems433ペプチド合成機上でFmoc戦略に従って、4倍過剰なFmoc-アミノ酸で、250μmolスケールにて合成したが、ここではカップリング毎に、4当量のDIC(NMP中1M)および4当量のHOBt(NMP中1M)をアミノ酸バイアルに最初に加え、アミノ酸を10分間事前活性化し、その後、樹脂に加えた。活性化したアミノ酸を添加した後、樹脂を30分間振盪し、この後、4当量のDIPEA(NMP中2M)を加え、反応をさらに30分間続けた。Fmoc基の脱保護は、NMP中の20%ピペリジンおよびUVモニタリングおよびFmoc保護基の脱保護の2-5フィードバックループを伴うメーカーの方法により、場合によっては、二重カップリングを使用したが、これは第1のカップリングの後、樹脂から液体を排出させ、Fmoc-アミノ酸の別のバイアルを活性化させ、樹脂に加えたことを意味する。カップリング時間は、塩基の添加を伴わずに約20分であった。ペプチドC末端アミドの合成のために使用される樹脂は、Rink-アミド樹脂および事前充填Wang(例えば、低充填Fmoc-Gly-WangもしくはFmoc-Lys(Mtt)-wang)、またはカルボキシC末端を有するペプチドについてクロロトリチル樹脂であった。使用された保護されたアミノ酸誘導体は、非天然アミノ酸、例えば、Fmoc-Aib-OH(Fmoc-アミノイソ酪酸)を例外として、ABI433A合成機に適した事前秤量したカートリッジ中で供給される標準的Fmoc-アミノ酸(例えば、Anaspec、またはNovabiochemから供給)であった。N末端アミノ酸を、αアミノ基においてFmocまたはBoc保護した。配列中のリシンのεアミノ基を、アルブミン結合部分およびスペーサーの付着のための経路によって、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、またはBocで保護した。ペプチドの合成は、場合によっては、ジペプチドアミド結合上で酸性条件下にて切断することができる基(これらに限定されないが、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル、または2,4,6-トリメトキシベンジルなど)で保護されたジペプチドを使用することによって改善し得る。セリンまたはトレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドの使用を使用し得る(例えば、Novobiochem2009/2010からのカタログ、もしくはより新しいバージョン、またはW.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403を参照されたい)。
【０２５６】
方法:SPPS_B
SPPS法Bは、マイクロ波をベースとするLibertyペプチド合成機(CEM Corp.、North Carolina)上のFmoc化学を使用した、保護されたペプチジル樹脂の合成を意味する。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な事前充填した低充填Wang樹脂である(例えば、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)。Fmoc脱保護は、NMP中の5%ピペリジンによって70℃までまたは75℃までで行った。カップリング化学は、NMP中のDIC/HOAtであった。アミノ酸/HOAt溶液(3〜10倍のモル過剰でNMP中0.3M)、それに続いて同じモル当量のDIC(NMP中0.75M)を樹脂に加えた。例えば、下記の量の0.3Mのアミノ酸/HOAt溶液を、下記のスケールの反応のためのカップリング毎に使用した。スケール/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml、1mmol/15ml。カップリング時間および温度は一般に、70℃までまたは75℃までにおいて5分であった。より長いカップリング時間、例えば、10分を、より大きなスケールの反応のために使用した。ヒスチジンアミノ酸を、50℃にて二重カップリングし、または前のアミノ酸に立体障害があった場合(例えば、Aib)、四重カップリングした。アルギニンアミノ酸をRTにて25分間カップリングし、次いで、70℃または75℃に5分間加熱した。これらに限定されないがAibなどのいくつかのアミノ酸を、「二重カップリング」したが、これは最初のカップリング(例えば、75℃で5分)後、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬を加え(アミノ酸、HOAtおよびDIC)、混合物を再び加熱する(例えば、75℃で5分)ことを意味する。リシン側鎖の化学修飾が所望であるとき、リシンをLys(Mtt)として組み込んだ。樹脂をDCMで洗浄し、樹脂を無溶媒(無希釈)ヘキサフルオロイソプロパノールに20分間懸濁させ、それに続き、DCMおよびNMPによって洗浄することによってMtt基を除去した。リシンの化学修飾を、手作業の合成によって、または任意選択で手作業のカップリングを含めた、適切に保護された構造ブロック(一般法を参照されたい)を使用した、上記のようなLibertyペプチド合成機上での1つもしくは複数の自動化ステップによって行った。
【０２５７】
方法:SPPS_P
SPPS_Pは、Protein Technologies(Tucson、AZ85714、U.S.A.)からのPrelude固相ペプチド合成機で樹脂充填に対して6倍過剰なFmoc-アミノ酸(300mMのHOAtを有するNMP中300mM)、例えば、低充填Fmoc-Gly-Wang(0.35mmol/g)を使用して、250μmolスケールにて行った。NMP中の20%ピペリジンを使用してFmoc脱保護を行った。NMP中の3:3:3:4のアミノ酸/HOAt/DIC/コリジンを使用して、カップリングを行った。脱保護およびカップリングステップの間にNMPおよびDCMのトップ洗浄(7ml、0.5分、それぞれ2×2)を行った。カップリング時間は一般に、60分であった。これらに限定されないが、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Aib-OHまたはBoc-His(Trt)-OHを含めたいくつかのアミノ酸を、「二重カップリング」した。これは、最初のカップリングの後(例えば、60分)、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬を加え(アミノ酸、HOAt、DIC、およびコリジン)、混合物を再び反応させる(例えば、60分)ことを意味する。
【０２５８】
方法:SC_M2
N-ε-リシンMtt保護基は、DCM中の0.5%TFAによる1回の処理、それに続く無溶媒(無希釈)ヘキサフルオロイソプロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25)による室温で3回の15分間の処理、それに続く、DCMによる5回の洗浄、それに続く、NMPによる5回の洗浄によって除去した。延長部分(樹脂と比較して4モル当量)を、NMPに溶解した。活性化試薬、例えば、TBTU(樹脂に対して3.88モル当量)およびDIC(樹脂に対して4モル当量)を加え、溶液を15分間撹拌した。溶液を樹脂に加え、DIPEA(樹脂に対して4モル当量)を加えた。樹脂を室温にて2〜24時間振盪した。樹脂をNMPで2回、NMP/DCM(1:1)で2回、およびDCMで2回洗浄した。
【０２５９】
2．付着した側鎖を有する、または有さない樹脂結合ペプチドの切断、および精製
方法:CP_M1
合成の後、樹脂をDCMで洗浄し、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5または92.5/5/2.5)による2〜3時間の処理、それに続くジエチルエーテルによる沈殿によってペプチドを樹脂から切断した。ペプチドを適切な溶媒(例えば、30%酢酸)に溶解し、アセトニトリル/水/TFAを使用したC18、5μMカラム上の標準的RP-HPLCによって精製した。UPLC、およびLC-MS法の組合せによって画分を分析し、適当な画分をプールし、凍結乾燥した。
【０２６０】
方法:CP_M2
この方法は、次のステップ1〜5を含む。
ステップ1.Fmocの除去:
末端Glu上のFmoc保護基を、2分+18分間のNMP中の20%ピペリジンによる処理、それに続くNMPによる6回の洗浄によって除去した。
【０２６１】
ステップ2.Fmoc-Ala-OHのカップリング:
Fmoc-Ala-OH(樹脂と比較して4モル当量)を、TBTU(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびDIPEA(4当量)によって10分間活性化し、次いで、樹脂に加え、2時間または陰性のTNBS試験までカップリングした(W.S. Hancock、J.E. Battersby、Analytical Biochemistry、1976、71(1)、260〜264頁)。樹脂を、NMPで6回およびDCMで10回洗浄した。
【０２６２】
ステップ3.ε-Lys Mtt脱保護:
2つのε-Lys Mtt保護基を、DCM中の0.5%TFAによる5分間の処理、それに続く無溶媒ヘキサフルオロイソプロパノールによる15分の3回の処理によって除去した。樹脂を、DCMで6回およびNMPで6回洗浄した。TNBS試験は、陽性であった。
【０２６３】
ステップ4.側鎖カップリング:
ビス-t-ブチル保護された側鎖(2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-ブトキシ-4-[10-(4-tert-ブトキシカルボニルフェノキシ)デカノイルアミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]酢酸)(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、TBTU(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびDIPEA(4当量)で15分間事前活性化し、次いで、樹脂に加え、2.5時間またはTNBS試験が透明なビーズを示すまで反応させた。Ala8上のN-末端Fmocを、上記のように除去した。
【０２６４】
ステップ5.L-β-イミダゾール乳酸のカップリング:
L-β-イミダゾール乳酸(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、PyBOB(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびTEA(4当量)で10分間活性化し、その後、樹脂に加え、1.5時間カップリングした。
【０２６５】
A2．検出および特性決定のための一般方法
1.LC-MS法
方法:LCMS_4
LCMS_4は、Waters Acquity UPLCシステムおよびMicromassからのLCT Premier XE質量分析計からなる設定において行った。溶離液:A:水中の0.1%ギ酸、B:アセトニトリル中の0.1%ギ酸。分析は、適当な容量の試料(好ましくは、2〜10μl)をAおよびBの勾配で溶出するカラム上に注入することによってRTにて行った。UPLC条件、検出器の設定および質量分析計の設定は、カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mmであった。勾配:4.0分(代わりに、8.0分)の間、0.4mL/分で直線状の5%〜95%のアセトニトリル。検出:214nm(TUV(Tunable紫外吸光検出器)からの類似体の結果)MSイオン化モード:API-ESスキャン:100〜2000原子質量単位(代わりに、500〜2000原子質量単位)、ステップ0.1原子質量単位。
【０２６６】
2.UPLC法
方法:B2_1
RP-分析は、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して集めた。UPLCシステムは、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに接続した。下記の直線勾配を使用した。0.40ml/分の流速で16分に亘り95%A、5%Bから40%A、60%B。
【０２６７】
方法:B4_1
RP-分析は、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7μm、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに接続した。下記の直線勾配を使用した。0.40mL/分の流速で16分に亘り95%A、5%Bから95%A、5%B。
【０２６８】
方法:B29_1
RP-分析は、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。215nmおよび254nmでのUV検出を、kinetex1.7u C18、100A、2.1×150mmカラム、60℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.045Mの(NH4)2HPO4を有する90%水および10%CH3CN、pH3.6、B:20%2-プロパノール、20%水および60%CH3CNを含有する2つの溶離液レザバーに接続した。下記のステップ勾配を使用した。0.5ml/分の流速で2分に亘り35%Bおよび65%A、次いで、15分に亘り35%B、65%Aから65%B、35%A、次いで、3分に亘り65%B、35%Aから80%B、20%A。
【０２６９】
方法:UPLC_A
RP-分析は、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに接続した。下記の直線勾配を使用した。0.40ml/分の流速および37℃のオートサンプラー温度にて16分に亘り63%A、37%Bから53%A、47%B。
【０２７０】
方法:UPLC_B
RP-分析は、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに接続した。下記の直線勾配を使用した。0.40ml/分の流速および37℃のオートサンプラー温度で、16分に亘り65%A、35%Bから50%A、50%B。
【０２７１】
NMR法:
陽子NMRスペクトルは、内部標準としてテトラメチルシランを伴うBrucker Avance DPX400(400MHz)を使用して記録した。化学シフト(δ)はppmで示し、分割パターンは、下記のように示す。s、一重線;d、二重線;dd、二重線の二重線;dt、三重線の二重線;t、三重線;tt、三重線の三重線;q、四重線;quint、五重線;sext、六重線;m、多重線、およびbr=広幅化。
【０２７２】
B.具体例
B1.中間化合物
B1.1
(S)-2-(2-ヒドロキシ-アセチルアミノ)-3-メチル-酪酸(N-ヒドロキシアセチル-S-バリン)
L-バリン(5.86g;0.05mmol)を、無水EtOH(150mL)に懸濁させた。新たに調製したNaOEtのEtOH(0.5M、100mL、1当量)溶液を、1時間に亘りRTにて滴下で添加し、それによってバリンはそのNa塩として溶解した。溶液をさらに0.5時間撹拌し、少量の未反応バリンから濾過した。溶液を蒸発させ、バリンのナトリウム塩を白色の粉末として得た。固体を100mLの丸底フラスコに移し、ベンジルグリコレート(25g、0.15mol、3当量)を加え、混合物を85℃で一晩(15時間)撹拌した。フラスコの内容物は、黄色がかった固体として凝固した。エーテル(100mL)を加え、固体を微粉に完全に粉砕した。濾過し、エーテルで4回洗浄し、白色の固体を真空中で直ちに乾燥させた。収量10.1g(概ね100%)。
【０２７３】
白色の固体をビーカーに移し、50mLの水に溶解し、不透明な淡黄色がかった溶液が残った。水相をエーテルで2回抽出し、残留している可能性があるベンジルグリコレートを除去し、これによって、水相は透明および淡黄色となった。水相を過剰な(概ね20g、4.7meq/gの乾燥樹脂、使用するL-バリンと比較して概ね2当量)事前洗浄したAmberlyst15(H+形態)イオン交換樹脂(Flukaカタログ番号06423)で処理し、樹脂を濾別し、少量の水で3回洗浄した。
【０２７４】
水相を黄褐色がかった油へと45℃にて真空中で蒸発させ、次いでこれをトルエンでフラッシュし、残留水を除去した。油は、EtOAc中に一定分量を溶解し、粉砕する間にトルエンを加えることによって結晶化した。このように得られた白色の結晶を油に加え、これは速く結晶化し、いくらかのトルエンを含有する7.89g(91%)を得た。
【０２７５】
固体を沸騰しているEtOAc(25mL)に溶解し、紙上で濾過し、色の濃いいくらかの不溶性の不純物を除去した。再加熱した濾液に、熱いトルエン(10〜15mL)を加え、冷却すると無色の結晶が形成された。試料を5℃にて一晩静置し、濾過し、EtOAc/Tol、エーテルおよびヘプタンで洗浄した。このように得られた結晶は、恐らくいくらかの淡褐色がかった油の共沈殿によっていくらか「柔らか」でグリース状(5.7g、65%)であった。このように全てをEtOAc(25mL)から再結晶化させた。これによって淡黄色の溶液が得られ、ここから冷却することによって無色の結晶が形成された。化合物をガラスフィルター(G3)上で単離し、冷たいEtOAc、EtOAc/ヘプタン(1:1)、およびヘプタンで洗浄し、真空中で乾燥させた。収量:5.26g(60%)。
【０２７６】
【数１】
0006300735.tif 000034
【０２７７】
B1.2
(S)-2-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-アセチルアミノ]-3-メチル-酪酸
実施例B1.1からのN-ヒドロキシアセチル-S-バリン(1.00g、5.74mmol)を、NMP(15mL)に溶解した。TBDMS(2.40g、15.96mmol、2.8当量)を加えた。イミダゾール(2.58g、37.9mmol、6.6当量)を、少しずつ加え、水中で冷却することによって溶液の温度が30℃超に上昇しないように制御した。透明な無色の溶液を、RTにて窒素下で一晩撹拌した。
【０２７８】
次いで、溶液を概ね0℃に冷却し、氷水(50mL)を加え、不透明な溶液をエーテル(2×50mL)で2回抽出した。エーテルを-10℃に冷却し、冷却した(0℃未満)1NのHCl、氷水(2×)およびブラインで速く洗浄した。エーテルをNa2SO4で脱水させ、無色の油(概ね2.85g)へと蒸発させた。油をMeOH(40mL)+THF(13mL)に溶解し、K2CO3(2.15g、15.6mmol)の水(22mL)溶液を加えた。懸濁液を1時間激しく撹拌し、この後、ロータリーエバポレーター上で概ね半分の容量に濃縮し、透明な無色の溶液を得た。この溶液をヘキサン(3×50mL)で抽出し、過剰なシリル試薬を除去した。ブライン(45mL)を水相に加え、濁った混合物を得て、これを-10℃に冷却し、冷たい1MのNaHSO4(水溶液)で概ね4〜5のpHに注意深く酸性化した。酸性化によって、白色の沈殿物およびCO2の泡立ちが起こった。懸濁液を冷中エーテル(3×50mL)で抽出し、合わせたエーテル相をブライン(2×)で洗浄し、Na2SO4で脱水させた。蒸発によって、生成物を白色の固体1.17g(70%)として得た。
【０２７９】
【数２】
0006300735.tif 000035
【０２８０】
B1.3
H2N-Val-O-クロロトリチル樹脂
16gの2-クロロトリチル-樹脂(1.5mmol/g;24mmol)をDCM(150mL)中で45分間膨潤させ、DCMから液体を排出させた。DCM(150mL)中のFmoc-Val-OH(16.29g;48.0mmol)およびDIPEA(20.54mL)の混合物を樹脂に加え、混合物を50分間振盪し、その後、30mLのMeOHを加え、未反応の樹脂をクエンチした。混合物をさらに10分間撹拌し、その後、樹脂から液体を排出させ、DCM(150mL)で1回洗浄した。DCM、MeOH、およびDIPEAの混合物(80:15:5)を樹脂に加え、10分間反応させ、その後、樹脂をDCM(3×)で、それに続いてNMP(3×)で洗浄した。
【０２８１】
Fmoc基を、標準条件、NMP中の20%ピペリジン:2分+18分によって除去した。次いで、樹脂を、NMP(6×)で洗浄した。標準的TNBS試験は陽性であった。樹脂をDCM(6×)およびエーテル(2×)で洗浄し、乾燥させた。
【０２８２】
B1.4
(2S)-2-[[(2S)-2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-3-メチル-ブタノイル]アミノ]-3-メチル-ブタン酸(Boc-Val-Val-OH)
実施例B1.3からのH2N-Val-O-クロロトリチル樹脂の1/3(概ね8mmol)をDCM中で膨潤させ、液体を排出させた。Boc-Val-OH(5.52g、24mmol)をNMP(50mL)に溶解し、HOAt(3.26g、24mmol)、それに続いてDIC(3.66mL、24mmol)を加えた。混合物を10分間撹拌し、その後、樹脂に加え、さらに30mLのNMPを加えた。TNBS試験が陰性となるまで、反応物を2時間半撹拌した。樹脂から液体を排出させ、NMP(4×70mL)およびDCM(10×70mL)、それに続いてエーテル(1×100mL)で洗浄した。
【０２８３】
樹脂をHOAc:TFE:DCM(1:2:7)(100mL)で30分間処理することによって、ジペプチドを樹脂から切断した。溶媒を排出し、集め、樹脂をDCM(50mL)で洗浄した。合わせた濾液を水(150mL)に加え、層を分離し、有機相をNa2SO4で脱水させ、濾過後に、溶媒を蒸発によって除去し、白色の粘着性の泡を得た。生成物は、熱いEtOAc(5mL)に溶解することによって結晶化し、熱いヘプタン(20mL)を加え、溶液を結晶化のために5℃にて2時間冷却させた。白色の結晶を濾過によって単離し、EtOAc/ヘプタン(1:6)およびペトロールエーテル(40〜60)で洗浄した。真空中で乾燥させた後、収量は、1.79g(70%)であった。
【０２８４】
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.23分、正確な質量:316.200Da、M/1:317.03
【０２８５】
【数３】
0006300735.tif 000036
【０２８６】
B1.5
(2S)-2-[[(2S)-2-[tert-ブトキシカルボニル(メチル)アミノ]-3-メチル-ペンタノイル]アミノ]-3-メチル-ブタン酸(Boc-N-Me-Ile-Val-OH)
実施例B1.3からのH2N-Val-O-クロロトリチル樹脂の1/3(概ね8mmol)をDCM中で膨潤させ、液体を排出させた。Boc-N(Me)Ile-OH(5.88g、24mmol)をNMP(50mL)に溶解し、HOAt(3.26g、24mmol)、それに続いてDIC(3.66mL、24mmol)を加えた。混合物を10分間撹拌し、その後、樹脂に加え、さらに30mLのNMPを加えた。TNBS試験が陰性となるまで、反応物を2時間半撹拌した。樹脂から液体を排出させ、NMP(4×70mL)およびDCM(10×70mL)、それに続いてエーテル(1×100mL)で洗浄した。
【０２８７】
樹脂をHOAc:TFE:DCM(1:2:7)(100mL)で30分間処理することによって、ジペプチドを樹脂から切断した。溶媒を排出し、集め、樹脂をDCM(50mL)で洗浄した。合わせた濾液を水(150mL)に加え、層を分離し、有機相をNa2SO4で脱水させ、溶媒を蒸発によって除去し、白色の粘着性の泡を得た。生成物をEtOAcおよびヘプタンから再結晶化し、白色の結晶を得た。収量1.72g(63%)。
【０２８８】
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.85分、正確な質量:344.231Da;M/1:345.04
【０２８９】
【数４】
0006300735.tif 000037
【０２９０】
B1.6
(2S)-2-[[2-[tert-ブトキシカルボニル(メチル)アミノ]アセチル]アミノ]-3-メチル-ブタン酸(Boc-N-Me-Gly-Val-OH)
実施例B1.3からのH2N-Val-O-クロロトリチル樹脂の1/3(概ね8mmol)をDCM中で膨潤させ、液体を排出させた。Boc-N(Me)Gly-OH(4.54g、24mmol)をNMP(50mL)に溶解し、HOAt(3.26g、24mmol)、それに続いてDIC(3.66mL、24mmol)を加えた。混合物を10分間撹拌し、その後、樹脂に加え、さらに30mLのNMPを加えた。TNBS試験が陰性となるまで、反応物を2時間半撹拌した。樹脂から液体を排出させ、NMP(4×70mL)およびDCM(10×70mL)、それに続いてエーテル(1×100mL)で洗浄した。
【０２９１】
樹脂をHOAc:TFE:DCM(1:2:7)(100mL)で30分間処理することによって、ジペプチドを樹脂から切断した。溶媒を排出し、集め、樹脂をDCM(50mL)で洗浄した。合わせた濾液を水(150mL)に加え、層を分離し、有機相をNa2SO4で脱水し、溶媒を蒸発によって除去し、無色の油を得た。収量2.35g(概ね100%)。
【０２９２】
LCMS法:LCMS_4:Rt:1.93分、正確な質量288.169Da;M/1:289.03
【０２９３】
【数５】
0006300735.tif 000038
【０２９４】
B1.7
(2S)-2-[[2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)アセチル]アミノ]-3-メチル-ブタン酸(Boc-Gly-Val-OH)
Boc-Gly-OH(5.80g、33.11mmol)、EDAC(6.98g、36.4mmol、1.1当量)およびH-Val-OMe.HCl(4.78g、36.4mmol、1.1当量)をTHF(50mL)に溶解し、透明な溶液が得られるまでDCMを加えた。20分の撹拌の後、DIPEA(4.89mL、28.5mmol、2.5当量)を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をEtOAc(100mL)に溶解した。有機相をKHSO4水溶液(100mL、1M)で洗浄し、水相をEtOAc(100mL)で逆抽出した。合わせた有機相を10%NaHCO3(水溶液)(1×100mL)およびブライン(1×100mL)で洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレーター上で除去し、Boc-Gly-Val-OMeが淡黄色の油として残った。収量:8.0g(84%)。
【０２９５】
油をTHF(150mL)に溶解し、LiOH(100mL、1M)を加えた。反応物を室温で3時間撹拌し、この後、TLCは出発材料の完全な変換を示した。THFを真空中で除去し、1MのKHSO4を加えることによって残りの水層をpH2〜3に酸性化した。生成物をEtOAc(100mL)で2回抽出し、合わせたEtOAc抽出物をブライン(×2)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させて、Boc-Gly-Val-OHを透明な油として得て、これは一晩静置した後、白色の固体(6.78g、89%)となった。
【０２９６】
【数６】
0006300735.tif 000039
【０２９７】
B1.7a
(2S)-2-[[(2S)-2-[tert-ブトキシカルボニル(メチル)アミノ]-3-メチル-ブタノイル]アミノ]-3-メチル-ブタン酸(Boc-N-Me-Val-Val-OH)
実施例B1.3におけるように作製したH2N-Val-O-クロロトリチル樹脂(約5.4mmol)をDCM中で膨潤させ、液体を排出させた。Boc-N(Me)Val-OH(5.55g、24mmol)をNMP(50mL)に溶解し、HOAt(3.26g、24mmol)、それに続いてDIC(3.66mL、24mmol)を加えた。混合物を10分間撹拌し、その後、樹脂に加え、さらに30mLのNMPを加えた。TNBS試験が陰性となるまで、反応物を2時間半撹拌した。樹脂から液体を排出させ、NMP(4×70mL)およびDCM(10×70mL)、それに続いてエーテル(1×100mL)で洗浄した。
【０２９８】
樹脂をHOAc:TFE:DCM(1:2:7)(100mL)で30分間処理することによって、ジペプチドを樹脂から切断した。溶媒を排出し、集め、樹脂をDCM(50mL)で洗浄した。合わせた濾液を水(150mL)に加え、層を分離し、有機相をNa2SO4で脱水させ、溶媒を蒸発によって除去し、無色の油を得た。残留するNMPを含有する油をEtOAc(40mL)に再溶解し、水(40mL)で3回洗浄し、有機相を15分間Na2SO4で脱水した。塩を濾過し、溶媒を真空中で除去し、生成物を白色の粘着性の泡(1.49g、84%)として得た。
【０２９９】
LCMS法:LCMS_4:Rt:4.38分;正確な質量:330.215Da;M/1:331.24
【０３００】
【数７】
0006300735.tif 000040
【０３０１】
B1.7b
(2S)-2-[[(2S)-2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-3-メチル-ペンタノイル]アミノ]-3-メチル-ブタン酸(Boc-Ile-Val-OH)
実施例B1.3におけるように作製したH2N-Val-O-クロロトリチル樹脂(約5.4mmol)をDCM中で膨潤させ、液体を排出させた。Boc-Ile-OH(5.55g、24mmol)をNMP(50mL)に溶解し、HOAt(3.26g、24mmol)、それに続いてDIC(3.66mL、24mmol)を加えた。混合物を10分間撹拌し、その後、樹脂に加え、さらに30mLのNMPを加えた。TNBS試験が陰性となるまで、反応物を2時間半撹拌した。樹脂から液体を排出させ、NMP(4×70mL)およびDCM(10×70mL)、それに続いてエーテル(1×100mL)で洗浄した。
【０３０２】
樹脂をHOAc:TFE:DCM(1:2:7)(100mL)で30分間処理することによって、ジペプチドを樹脂から切断した。溶媒を排出し、集め、樹脂をDCM(50mL)で洗浄した。合わせた濾液を水(150mL)に加え、層を分離し、有機相をNa2SO4で脱水させ、溶媒を蒸発によって除去し、無色の油を得た。残留するNMPを含有する油をEtOAc(40mL)に再溶解し、水(40mL)で3回洗浄し、有機相を15分間Na2SO4で脱水した。塩を濾過し、溶媒を真空中で除去し、生成物を白色の粘着性の泡(1.79g、約100%)として得た。
【０３０３】
LCMS法:LCMS_4:Rt:4.0分、正確な質量:330.215Da;M/1:331.24
【０３０４】
【数８】
0006300735.tif 000041
【０３０５】
B1.8
2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-ブトキシ-4-[10-(4-tert-ブトキシカルボニルフェノキシ)デカノイルアミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]-アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]酢酸
Chem.43:
【０３０６】
【化３３】
0006300735.tif 000042
【０３０７】
2-クロロトリチル樹脂(7.70g、1.3mmol/g、10mmol)をDCM中で20分間膨潤させた。次いで、DCM(100mL)中のFmoc-OEG-OH(19.27g、50mmol)およびDIPEA(8.5mL)の混合物を加え、反応物を2時間振盪した。樹脂から液体を排出させ、NMP(2×100mL)で洗浄した。次いで、樹脂をDCM、MeOHおよびDIPEAの混合物(80:15:5)(2×100mL)で処理した(それぞれ、10分)。NMP(3×100mL)による洗浄の後、Fmoc脱保護を、標準的手順によって行った(NMP中の20%ピペリジン(それぞれ100ml)で2分+18分)。樹脂を、NMPで6回洗浄した。
【０３０８】
Fmoc-OEG-OH(15.42g、40mmol、4当量)、HOAt(6.10g、40mmol、4当量)、およびDIC(6.10mL、40mmol、4当量)を、DCM/NMP(1:1)(100mL)中で混合し、10分間撹拌し、この後、混合物を樹脂に加えた。15分後、DIPEA(6.85mL、40mmol、4当量)を加え、混合物を室温で2時間振盪した。
【０３０９】
樹脂から液体を排出させ、樹脂をNMPで洗浄した(6×100mL)。TNBS試験は陰性であった。Fmoc脱保護を、標準的手順によって行った(NMP中の20%ピペリジン(それぞれ100ml)によって2分+18分)。樹脂をNMPで6回洗浄した。
【０３１０】
Fmoc-Glu-Otbu(12.70g、30mmol、3当量)、HOAt(4.05g、30mmol、3当量)、およびDIC(4.58mL、30mmol、3当量)をDCM/NMP(1:1)(100mL)中で混合し、10分間撹拌し、この後、混合物を樹脂に加えた。15分後、DIPEA(5.14mL、30mmol、3当量)を加え、混合物を室温で3時間振盪した。樹脂から液体を排出させ、樹脂をNMP(6×100mL)で洗浄した。TNBS試験は陰性であった。
【０３１１】
Fmoc脱保護は、標準的手順によって行った(NMP中の20%ピペリジン(それぞれ、100ml)によって2分+18分)。樹脂をNMPで6回洗浄した。
【０３１２】
10-(4-tert-ブトキシカルボニルフェノキシ)デカン酸(10.94g、30mmol、3当量)、HOAt(4.05g、30mmol、3当量)、およびDIC(4.58mL、30mmol、3当量)をDCM/NMP(1:1)(100mL)中で混合し、10分間撹拌し、これに続いて、混合物を樹脂に加えた。混合物を室温で3時間振盪した。TNBS試験は、陰性であった。
【０３１３】
次いで、樹脂をTFE(20mL)およびDCM(80mL)の切断混合物で2時間処理し、これに続いて、溶液を250mlの丸底フラスコ中へと排出させた。さらなる100mLの切断混合物を樹脂に加え、15分間振盪した後、溶液を第1の濾液と合わせた。溶媒を蒸発させ、6.94gの淡褐色の油を得た。
【０３１４】
次いで、混合物をDCMに溶解し、フラッシュクロマトグラフィー(勾配:DCM中の0〜10%MeOH、流量85mL/分、120gシリカカラム)によって精製した。収量2.40g(29%)
【０３１５】
LCMS法:LCMS_4:Rt:3.48分、正確な質量:839.478Da;M/1:840.56
【０３１６】
【数９】
0006300735.tif 000043
【０３１７】
B2.親薬物
B2.1
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{3-[(2S)-2-ヒドロキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.21:
【０３１８】
【化３４】
0006300735.tif 000044
【０３１９】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチドを、一般法SPPS_PによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３２０】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３２１】
樹脂上のこのように得られた完全に保護されたペプチドを、実施例1、1a、1b、2、2a、3、および3aの化合物の合成のために使用した。
【０３２２】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:3.62分;正確な質量:4914.495Da;M/5:983.74;M/4:1229.41;M/3:1639.19
UPLC法:B4_1:Rt=8.42分
UPLC法:B29_1:Rt=11.12分
【０３２３】
B2.2
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{3-[(2S)-2-ヒドロキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル}-[Arg34,Lys37]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.22:
【０３２４】
【化３５】
0006300735.tif 000045
【０３２５】
完全に保護された[Arg34、Lys37]-GLP-1-(9-37)-ペプチドを、一般法SPPS_BによってFmoc-Lys Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３２６】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３２７】
このように得られた完全に保護されたペプチドを、実施例4の化合物の合成のために使用した。
【０３２８】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.27分;正確な質量:4872.416Da;M/4:1219.43;M/3:1625.52
UPLC法:B4_1:Rt=8.75分
UPLC法:B29_1:Rt=11.86分
【０３２９】
B2.3
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{3-[(2S)-2-ヒドロキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル}-[Lys18,Glu22,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.23:
【０３３０】
【化３６】
0006300735.tif 000046
【０３３１】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチドを、一般法SPPS_BによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３３２】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３３３】
このように得られた完全に保護されたペプチドを、実施例5の化合物の合成のために使用した。
【０３３４】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.37分;正確な質量:4886.384Da;M/4:1222.92、M/3:1630.50
UPLC法:B4_1:Rt=8.93分
UPLC法:B29_1:Rt=12.36分
【０３３５】
B2.4
Nε27[(S)-(22,40-ジカルボキシ-10,19,24-トリオキソ-3,6,12,15-テトラオキサ-9,18,23-トリアザテトラコンタン-1-オイル)]-Nα8-{3-[(2S)-2-ヒドロキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル}-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.24:
【０３３６】
【化３７】
0006300735.tif 000047
【０３３７】
ステップ1.完全に保護されたペプチド骨格合成
完全に保護された[Glu22、Arg26、Lys27、Arg34]-GLP-1-(9-37)-ペプチドを、一般法SPPS_BによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたGlu残基が残った。
【０３３８】
ステップ2.ε-Lys Mtt脱保護:
ε-Lys Mtt保護基を、DCM中の0.5%TFAによる5分間の処理、それに続く、無溶媒ヘキサフルオロイソプロパノールによる15分の3回の処理によって除去した。樹脂を、DCMで6回およびNMPで6回洗浄した。TNBS試験は、陽性であった。
【０３３９】
ステップ3.側鎖カップリング:
ビス-t-ブチル保護された側鎖(17-((S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[-2-({2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}メトキシ)エトキシ]エチルカルバモイル}プロピルカルバモイル)ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル)(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、TBTU(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびDIPEA(4当量)で15分間事前活性化し、次いで、樹脂に加え、一晩またはTNBS試験が透明なビーズを示すまで反応させた。
【０３４０】
ステップ4.Fmocの除去:
末端Glu上のFmoc保護基を、2分+18分間のNMP中の20%ピペリジンによる処理、それに続くNMPによる6回の洗浄によって除去した。
【０３４１】
ステップ2.Fmoc-Aib-OHのカップリング:
Fmoc-Aib-OH(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、Oxyma(4.0当量)、DIC(4当量)で15分間活性化し、次いで、樹脂に加え、陰性のTNBS試験まで一晩カップリングした。樹脂を、NMPで6回およびDCMで10回洗浄した。
【０３４２】
ステップ5.L-β-イミダゾール乳酸カップリング:
L-β-イミダゾール乳酸(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、PyBOB(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびTEA(4当量)で10分間活性化し、その後、樹脂に加え、1.5時間カップリングした。カップリングを、3回繰り返した。
【０３４３】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.25分;正確な質量:4211.179Da;M/4:1053.78、M/3:1404.74
UPLC法:B4_1:Rt=8.73分
UPLC法:B29_1:Rt=14.56分
【０３４４】
B2.5
Nε26[(S)-(22,40-ジカルボキシ-10,19,24-トリオキソ-3,6,12,15-テトラオキサ-9,18,23-トリアザテトラコンタン-1-オイル)]-Nα8-{3-[(2S)-2-ヒドロキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル}-[Aib8,Arg23,Arg34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.25:
【０３４５】
【化３８】
0006300735.tif 000048
【０３４６】
ステップ1.完全に保護されたペプチド骨格合成:
完全に保護されたAib8、Arg23、Arg34]-GLP-1-(8-37)-ペプチドを、一般法SPPS_PによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたAib残基が残った。
【０３４７】
ステップ2.Fmocの除去:
末端Glu上のFmoc保護基を、NMP中の20%ピペリジンによる2分+18分間の処理、それに続くNMPによる6回の洗浄によって除去した。
【０３４８】
ステップ3.L-β-イミダゾール乳酸のカップリング:
L-β-イミダゾール乳酸(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、PyBOB(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびTEA(4当量)で10分間活性化し、その後、樹脂に加え、1.5時間カップリングした。カップリングを2回繰り返した。
【０３４９】
ステップ4.樹脂からの切断:
樹脂をNMPおよびDCMで洗浄し、TFA/TIS/水(95:2.5:2.5)による2.5時間の処理、それに続くジエチルエーテルによる粗ペプチドの沈殿によってペプチドを樹脂から切断した。
【０３５０】
ステップ5.側鎖アシル化:
粗ペプチドを水に溶解し、ペプチドの完全な溶解およびpH10.6までNaOH(1N、水溶液)を滴下で添加した。
【０３５１】
自動滴定装置によって、希薄なNaOH(0.1M、水溶液)を加えることによってpHをpH11.3にて一定に保持した。
【０３５２】
NHS活性化側鎖(WO2009/083549の実施例7)17-((S)-1-カルボキシ-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-ヘプタデカン酸(1.2当量)側鎖をDMFに溶解し、溶液に滴下で添加した。1時間後、反応混合物を、1容量の酢酸を加えることによってクエンチした。
【０３５３】
ステップ6.精製:
ペプチドを、アセトニトリル/水/TFAを使用したC18、5μMカラム上の標準的RP-HPLCによって精製した。画分をUPLC、およびLC-MS法の組合せによって分析し、適当な画分をプールし、凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.22分;正確な質量:4140.142Da;M/4:1036.03、M/3:1381.36
UPLC法:B4_1:Rt=8.80分
UPLC法:B29_1:Rt=14.76分
【０３５４】
B3.具体例
(実施例1)
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{(2S)-3-(1H-イミダゾール-4-イル)-2-[(2S)-3-メチル-2-[[2-(メチルアミノ)アセチル]アミノ]ブタノイル]オキシ-プロパノイル}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.51:
【０３５５】
【化３９】
0006300735.tif 000049
【０３５６】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、Ala8が欠失し、18位、22位、25位、26位、31位、および34位におけるアミノ酸が、それぞれ、Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、およびGln34で置換されている配列番号1)を、一般法SPPS_PによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３５７】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３５８】
Boc-NMe-Gly-Val-OHのカップリングのために、Boc-N-Me-Gly-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０３５９】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.05分;正確な質量:5082.585Da;M/5:1017.75;M/4:1271.98
UPLC法:B4_1:Rt=8.09分
UPLC法:B29_1:Rt=11.20分
【０３６０】
(比較例1a)
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{(2S)-2-[(2S)-2-[(2-アミノアセチル)アミノ]-3-メチル-ブタノイル]オキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル}-}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド。
Chem.30:
【０３６１】
【化４０】
0006300735.tif 000050
【０３６２】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、Ala8が欠失し、18位、22位、25位、26位、31位、および34位におけるアミノ酸が、それぞれ、Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、およびGln34で置換されている配列番号1)を、一般法SPPS_AによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３６３】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３６４】
Boc-Gly-Val-OHのカップリングのために、Boc-Gly-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０３６５】
樹脂を切断し、標準的方法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.36分;正確な質量:5068.5696Da;M/5:1014.97;M/4:1268.46。
UPLC法:B4_1:Rt=9.35分
UPLC法:B29_1:Rt=9.10分
【０３６６】
(比較例1b)
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{(2S)-2-[(2S)-2-[(2-ヒドロキシアセチル)アミノ]-3-メチル-ブタノイル]オキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド。
Chem.31:
【０３６７】
【化４１】
0006300735.tif 000051
【０３６８】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、Ala8が欠失し、18位、22位、25位、26位、31位、および34位におけるアミノ酸が、それぞれ、Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、およびGln34で置換されている配列番号1)を、一般法SPPS_AによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３６９】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３７０】
tBuMe2SiOCH2-C(O)-Val-OHのカップリングのために、(S)-2-[2-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-アセチルアミノ]-3-メチル-酪酸(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０３７１】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:3.67分;正確な質量:5071.569Da;M/4:1268.71;M/3:1692.23
UPLC法:B4_1:Rt=8.69分
UPLC法:B29_1:Rt=9.51分
【０３７２】
(実施例2)
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{(S)-3-(1H-イミダゾール-4-イル)-2-[(S)-3-メチル-2-((S)-3-メチル-2-メチルアミノ-ブチリルアミノ)-ブチリルオキシ]-プロピオニル}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.52:
【０３７３】
【化４２】
0006300735.tif 000052
【０３７４】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、Ala8が欠失し、18位、22位、25位、26位、31位、および34位におけるアミノ酸が、それぞれ、Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、およびGln34で置換されている配列番号1)を、標準的方法SPPS_PによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３７５】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３７６】
Boc-N-Me-Val-Val-OHのカップリングのために、Boc-N-Me-Val-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０３７７】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.12分;正確な質量:5124.632Da;M/5:1025.93;M/4:1282.15
UPLC法:B4_1:Rt=8.07分
【０３７８】
(比較例2a)
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{(2S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-アミノ-3-メチル-ブタノイル]アミノ]-3-メチル-ブタノイル]オキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.32:
【０３７９】
【化４３】
0006300735.tif 000053
【０３８０】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、Ala8が欠失し、18位、22位、25位、26位、31位、および34位におけるアミノ酸が、それぞれ、Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、およびGln34で置換されている配列番号1)を、一般法SPPS_BによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３８１】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３８２】
Boc-Val-Val-OHのカップリングのために、Boc-Val-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０３８３】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.05分;正確な質量:5110.617Da;M/5:1023.37;M/4:1278.99
UPLC法:B2_1:Rt=12.41分
UPLC法:B29_1:Rt=11.13分
【０３８４】
(実施例3)
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{(S)-3-(1H-イミダゾール-4-イル)-2-[(S)-3-メチル-2-((S)-3-メチル-2-メチルアミノ-ペンタノイルアミノ)-ブチリルオキシ]-プロピオニル}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.53:
【０３８５】
【化４４】
0006300735.tif 000054
【０３８６】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、Ala8が欠失し、18位、22位、25位、26位、31位、および34位におけるアミノ酸が、それぞれ、Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、およびGln34で置換されている配列番号1)を、一般法SPPS_PによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３８７】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３８８】
Boc-N-Me-Ile-Val-OHのカップリングのために、Boc-N-Me-Ile-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０３８９】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.05分;正確な質量:5140.666Da;M/5:1028.97;M/4:1286.00
UPLC法:B2_1:Rt=12.37分
UPLC法:B29_1:Rt=11.22分
【０３９０】
(比較例3a)
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε31-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{(S)-2-[(S)-2-((S)-2-アミノ-3-メチル-ペンタノイルアミノ)-3-メチル-ブチリルオキシ]-3-(1H-イミダゾール-4-イル)-プロピオニル}-[Lys18,Glu22,Val25,Arg26,Lys31,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.33:
【０３９１】
【化４５】
0006300735.tif 000055
【０３９２】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、Ala8が欠失し、18位、22位、25位、26位、31位、および34位におけるアミノ酸が、それぞれ、Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、およびGln34で置換されている配列番号1)を、標準的方法SPPS_PによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３９３】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０３９４】
Boc-Ile-Val-OHのカップリングのために、Boc-Ile-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０３９５】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.10分;正確な質量:5124.632Da;M/5:1025.93;M/4:1282.15
UPLC法:B4_1:Rt=8.07分
【０３９６】
(実施例4)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{(S)-3-(1H-イミダゾール-4-イル)-2-[(S)-3-メチル-2-((S)-3-メチル-2-メチルアミノ-ペンタノイルアミノ)-ブチリルオキシ]-プロピオニル}-[Arg34、Lys37]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.54:
【０３９７】
【化４６】
0006300735.tif 000056
【０３９８】
完全に保護された[Arg34、Lys37]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、Ala8が、欠失しており、34位および37位におけるアミノ酸が、それぞれ、Arg34およびLys37で置換されている配列番号1)を、リシン位についてFmoc-Lys(Mtt)-OHを使用して一般法SPPS_PによってFmoc-Lys(Mtt)Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０３９９】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０４００】
Boc-NMe-Ile-Val-OHのカップリングのために、Boc-N-Me-Ile-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０４０１】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.23分;正確な質量:5098.584Da;M/5:1020.99;M/4:1275.98
UPLC法:B4_1:Rt=9.485分
UPLC法:B29_1:Rt=13.070分
【０４０２】
(実施例5)
Nε18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]-ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nα8-{(S)-3-(1H-イミダゾール-4-イル)-2-[(S)-3-メチル-2-((S)-3-メチル-2-メチルアミノ-ペンタノイルアミノ)-ブチリルオキシ]-プロピオニル}-[Lys18,Glu22,Gln34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.55:
【０４０３】
【化４７】
0006300735.tif 000057
【０４０４】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、Ala8が、欠失しており、18位、22位、および34位におけるアミノ酸が、それぞれ、Lys18、Glu22、およびGln34で置換されている配列番号1)を、リシン位についてFmoc-Lys(Mtt)-OHを使用して一般法SPPS_PによってFmoc-Lys(Mtt)Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。
【０４０５】
樹脂を、一般法:CP_M2によってさらに加工した。
【０４０６】
Boc-NMe-Ile-Val-OHのカップリングのために、Boc-N-Me-Ile-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０４０７】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.30分;正確な質量:5112.552Da;M/5:1023.78;M/4:1279.71
UPLC法:B4_1:Rt=11.05分
UPLC(方法:B29_1):Rt=19.60分
【０４０８】
(実施例6)
Nε27-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nα8-{(S)-3-(1H-イミダゾール-4-イル)-2-[(S)-3-メチル-2-((S)-3-メチル-2-メチルアミノ-ブチリルアミノ)-ブチリルオキシ]-プロピオニル}-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Arg34]GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.56:
【０４０９】
【化４８】
0006300735.tif 000058
【０４１０】
完全に保護された[Glu22、Arg26、Lys27、Arg34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、配列番号1であり、Ala8は欠失しており、22位、26位、27位、および34位におけるアミノ酸は、それぞれ、Glu22、Arg26、Lys27、およびArg34で置換されている)を、標準的方法SPPS_BによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。合成の最後のパートは、下記のステップにおけるように行った。
【０４１１】
ステップ1.Fmocの除去:
末端Glu上のFmoc保護基を、NMP中の20%ピペリジンによる2分+18分間の処理、それに続くNMPによる6回の洗浄によって除去した。
【０４１２】
ステップ2.Fmoc-Aib-OHのカップリング:
Fmoc-Aib-OH(樹脂と比較して4モル当量)をTBTU(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびDIPEA(4当量)で10分間活性化し、次いで、樹脂に加え、2時間または陰性のTNBS試験までカップリングさせた(W.S. Hancock、J.E. Battersby、Analytical Biochemistry、1976、71(1)、260〜264頁)。樹脂を、NMPで6回およびDCMで10回洗浄した。
【０４１３】
ステップ3.ε-Lys Mtt脱保護:
ε-Lys Mtt保護基を、DCM中の0.5%TFAによる5分間の処理、それに続く無溶媒ヘキサフルオロイソプロパノールによる15分の3回の処理によって除去した。樹脂をDCMで6回およびNMPで6回洗浄した。TNBS試験は陽性であった。
【０４１４】
ステップ4.側鎖カップリング:
ビス-t-ブチル保護された側鎖(2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-ブトキシ-4-[(18-tert-ブトキシ-18-オキソ-オクタデカノイル)アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]酢酸)(US2010317057A1、例えば、実施例4を参照されたい)(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、TBTU(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびDIPEA(4当量)で15分間事前活性化し、次いで、樹脂に加え、2.5時間またはTNBS試験が透明なビーズを示すまで反応させた。Aib8上のN-末端Fmocを、上記のように除去した。
【０４１５】
ステップ5.L-β-イミダゾール乳酸のカップリング:
L-β-イミダゾール乳酸(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、PyBOB(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびTEA(4当量)で10分間活性化し、その後、樹脂に加え、1.5時間カップリングした。
【０４１６】
Boc-N-Me-Ile-Val-OHのカップリングのために、Boc-N-Me-Ile-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０４１７】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.67分;正確な質量:4437.347Da;M/5:888.47;M/4:1110.33;M/3:1480.43
UPLC法:B4_1:Rt=8.55分
UPLC法:B29_1:Rt=12.51分
【０４１８】
(比較例6a)
Nε27-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nα8-{(2S)-2-[(2S)-2-[[(2S)-2-アミノ-3-メチル-ブタノイル]アミノ]-3-メチル-ブタノイル]オキシ-3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル}-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(8-37)-ペプチド
Chem.34:
【０４１９】
【化４９】
0006300735.tif 000059
【０４２０】
完全に保護された[Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Gln34]-GLP-1-(9-37)-ペプチド(すなわち、配列番号1であり、Ala8は欠失しており、18位、22位、25位、26位、31位、および34位におけるアミノ酸は、それぞれ、Lys18、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、およびGln34で置換されている)を、一般法SPPS_BによってFmoc-Gly Wang LL樹脂上で合成し、N末端においてFmoc保護されたグルタミン酸残基が残った。合成の最後のパートは、下記のステップにおけるように行った。
【０４２１】
ステップ1.Fmocの除去:
末端Glu上のFmoc保護基を、NMP中の20%ピペリジンによる2分+18分間の処理、それに続くNMPによる6回の洗浄によって除去した。
【０４２２】
ステップ2.Fmoc-Aib-OHのカップリング:
Fmoc-Aib-OH(樹脂と比較して4モル当量)をTBTU(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびDIPEA(4当量)で10分間活性化し、次いで、樹脂に加え、2時間または陰性のTNBS試験までカップリングさせた(W.S. Hancock、J.E. Battersby、Analytical Biochemistry、1976、71(1)、260〜264頁)。樹脂を、NMPで6回およびDCMで10回洗浄した。
【０４２３】
ステップ3.ε-Lys Mtt脱保護:
ε-Lys Mtt保護基を、DCM中の0.5%TFAによる5分間の処理、それに続く無溶媒ヘキサフルオロイソプロパノールによる15分の3回の処理によって除去した。樹脂をDCMで6回およびNMPで6回洗浄した。TNBS試験は陽性であった。
【０４２４】
ステップ4.側鎖カップリング:
ビス-t-ブチル保護された側鎖(2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-tert-ブトキシ-4-[(18-tert-ブトキシ-18-オキソ-オクタデカノイル)アミノ]-5-オキソ-ペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]酢酸)(US2010317057A1、例えば、実施例4を参照されたい)(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、TBTU(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびDIPEA(4当量)で15分間事前活性化し、次いで、樹脂に加え、2.5時間またはTNBS試験が透明なビーズを示すまで反応させた。Aib8上のN-末端Fmocを、上記のように除去した。
【０４２５】
ステップ5.L-β-イミダゾール乳酸のカップリング:
L-β-イミダゾール乳酸(樹脂と比較して4モル当量)をNMPに溶解し、PyBOB(3.8当量)、HOBt(4当量)、およびTEA(4当量)で10分間活性化し、その後、樹脂に加え、1.5時間カップリングした。
【０４２６】
Boc-NH-Ile-Val-OHのカップリングのために、Boc-NH-Ile-Val-OH(樹脂と比較して6モル当量)をDCMに溶解した。MSNT(6当量)、それに続いてメチルイミダゾール(9当量)を加えた。混合物を10分間静置し、この後、これを上記で調製した樹脂に加えた。樹脂を4時間振盪し、次いで、液体を排出させ、DCMで6回洗浄した。
【０４２７】
樹脂を切断し、一般法CP_M1によって精製し、正しい化合物を含有する画分をプールし、白色の粉末に凍結乾燥した。
LCMS法:LCMS_4:Rt:2.68分;正確な質量:4423.332Da;M/5:885.66;M/4:1106.82;M/3:1475.77
UPLC法:B4_1:Rt=8.55分
UPLC法:B29_1:Rt=12.52分
【０４２８】
薬理学的方法
(実施例7)
インビトロでのプロドラッグの半減期
この実施例の目的は、概念的に異なるプロドラッグと比較した、本発明のGLP-1プロドラッグのインビトロでの半減期(T1/2)を試験することである。以下において、2つのインビトロの方法を記載する。すなわち、1つの方法は、緩衝液中で行い、1つの方法は、血漿中で行う。
【０４２９】
緩衝液法
緩衝液:25mMのホスフェート(イオン強度:154mM、pH7.4、37℃)
NaH2PO4・2H2O(1.95g、12.5mmol)およびNaCl(2.61g、44.7mmol)をMillipore水(概ね450mL)に溶解し、概ね20℃にて濃縮されたNaOHおよび1MのNaOHでpH=7.44に調節した。水を500.00mLまで加えた。
【０４３０】
試験する化合物を1.0mg/mLの濃度まで緩衝液に溶解し、37℃にてインキュベートした。試料を適切な間隔で採取し、時間の関数として形成されたプロドラッグと比較した親薬物%を、2つの相当するピークについての曲線下面積を比較することによって、Table 1(表1)において言及したようなUPLC法によって評価した。これらのUPLC法を、上記の一般実験セクションにおいて記載する(UPLC_A、およびUPLC_B)。
【０４３１】
プロドラッグの半減期(T1/2)は、下記のような、時間(t)の関数としてln(プロドラッグ%(Y))の曲線への直線フィットの勾配から計算した。
計算1:Y=÷αt+k
計算2:T1/2=ln(2)/α
【０４３２】
血漿法
緩衝液:200mMのホスフェート、pH7.4、37℃
NaH2PO4・2H2O(15.61g、100mmol)をmilliQ水(概ね450mL)に溶解し、濃縮したNaOH(水溶液)および1MのNaOH(水溶液)で概ね20℃にてpH=7.44に調節した。水を、500.00mLまで加えた。
【０４３３】
血清:ミニブタ血清、ヘパリン-血漿
新鮮な血液を、ミニブタからGreiner bio-oneからの9mLのLHリチウムヘパリンVacuetteチューブ(カタログ番号455084)中に出した。氷上で冷却した後、これを遠心分離し(10分、4℃、3000rpm/1942G)、上清を単離し、使用前に-18℃で保持した。
【０４３４】
試験する100nmolの化合物を200μLの緩衝液に溶解し、800μLの血漿に加え(遠心分離し)、37℃にてインキュベートした。試料(50μL)を、適当な間隔で150μLの無水EtOH中に入れた。短い撹拌の後、試料を、遠心分離し、上清をUPLCバイアルに移した(10μLの注入)。
【０４３５】
時間の関数として形成されたプロドラッグと比較した親薬物%は、UPLCによって評価し、両方とも上記の緩衝液法と同じ方法によって上記と同様に半減期を計算した。
【０４３６】
このように得られた半減期を、下記のTable 1(表1)において詳述する。比較のために、緩衝液中の天然GLP-1(7-37)(配列番号1のHis7バリアント)のT1/2は、13分(0.2時間)であった。
【０４３７】
【表１】
0006300735.tif 000060
【０４３８】
Table 1(表1)の結果は、緩衝液インビトロ系中で、本発明のプロドラッグ(実施例1、2、3、および6)が、相当する概念的に異なるプロドラッグと比較して実質的に改善された半減期を有することを示す(それぞれ、実施例1aおよび1b、2a、3a、および6aと比較)。これは、血漿において確認される(それぞれ、実施例2a、3a、および6aに対して実施例2、3、および6)。
【０４３９】
これは、本発明者らがインビトロで、プロドラッグから薬物への変換についての変換定数、kを制御して(図1を比較)、これを長くすることができるという証拠である。
【０４４０】
(実施例8)
薬物のインビトロの効力(AlphaScreen、膜)
この実施例の目的は、例えば、本発明のプロドラッグのGLP-1親薬物のインビトロでの活性、または効力を試験することである。
【０４４１】
実施例B2.1、B2.2、およびB2.3の親GLP-1薬物の効力は、すなわち、ヒトGLP-1受容体を発現している膜を含有する培地におけるサイクリックAMP(cAMP)の形成の刺激として下記のように決定した。
【０４４２】
原理
ヒトGLP-1受容体を発現している安定的なトランスフェクトされた細胞系であるBHK467-12A(tk-ts13)からの精製した形質膜を、問題のGLP-1薬物で刺激し、cAMP生成の効力を、Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreen(商標)cAMPアッセイキットを使用して測定した。AlphaScreenアッセイの基本的原理は、内因性cAMPと外因的に加えたビオチン-cAMPとの間の競合である。cAMPの捕捉は、アクセプタービーズにコンジュゲートした特異的抗体を使用することによって達成する。
【０４４３】
細胞培養および膜の調製
安定的なトランスフェクトされた細胞系および高発現クローンを、スクリーニングのために選択した。細胞を、5%CO2でDMEM、10%FCS、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および好ましくは0.5mg/ml(代わりに、1.0mg/ml)の選択マーカーG418中で増殖させた。
【０４４４】
概ね80%コンフルエンスの細胞を、PBSで2回洗浄し、Versene(エチレンジアミン四酢酸のテトラナトリウム塩の水溶液)と共に収集し、1000rpmで5分遠心分離し、上清を除去した。さらなるステップは、全て氷上で行った。細胞ペレットを、10mlの緩衝液1(20mMのNa-HEPES、10mMのEDTA、pH=7.4)中でUltrathuraxによって20〜30秒間ホモジナイズし、20,000rpmで15分遠心分離し、ペレットを10mlの緩衝液2(20mMのNa-HEPES、0.1mMのEDTA、pH=7.4)に再懸濁させた。懸濁液を20〜30秒間ホモジナイズし、20,000rpmで15分遠心分離した。緩衝液2への懸濁、ホモジナイゼーションおよび遠心分離を、もう一度繰り返し、膜を緩衝液2に再懸濁させた。タンパク質濃度を決定し、膜を使用するまで-80℃で保存した。
【０４４５】
アッセイは、フラットボトム96ウェルプレート(Costarカタログ番号:3693)において行った。ウェル毎の最終容量は、50μlであった。
【０４４６】
溶液および試薬
Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreen cAMPアッセイキット(カタログ番号:6760625M);抗-cAMPアクセプタービーズ(10U/μl)、ストレプトアビジンドナービーズ(10U/μl)およびビオチン化-cAMP(133U/μl)を含有。
【０４４７】
AlphaScreen緩衝液、pH=7.4:50mMのTRIS-HCl(Sigma、カタログ番号:T3253);5mMのHEPES(Sigma、カタログ番号:H3375);10mMのMgCl2、6H2O(Merck、カタログ番号:5833);150mMのNaCl(Sigma、カタログ番号:S9625);0.01%Tween(Merck、カタログ番号:822184)。下記を、使用前に、AlphaScreen緩衝液に加えた(示した最終濃度)。BSA(Sigma、カタログ番号A7906):0.1%;IBMX(Sigma、カタログ番号I5879):0.5mM;ATP(Sigma、カタログ番号A7699):1mM;GTP(Sigma、カタログ番号G8877):1μM。
【０４４８】
cAMP標準(アッセイにおける希釈係数=5):cAMP溶液:5μLのcAMP-ストック(5mM)+495μLのAlphaScreen緩衝液。
【０４４９】
AlphaScreen緩衝液中の適切な希釈系列を、cAMP標準、および試験するGLP-1薬物、例えば、下記の8つの濃度のGLP-1化合物:10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13および10-14M、ならびに一連の、例えば、10-6〜3×10-11のcAMPについて調製した。
【０４５０】
膜/アクセプタービーズ
膜は、好ましくは、0.6mg/mlに相当する6μg/ウェル(代わりに、3μg/ウェル)の濃度でhGLP-1/BHK467-12A細胞から調製した(ウェル毎に使用する膜の量は変化し得る)。
【０４５１】
「膜なし」:AlphaScreen緩衝液中のアクセプタービーズ(好ましくは15μg/ml、最終、代わりに、2単位/ウェル、最終)
【０４５２】
「6(代わりに、3)μg/ウェルの膜」:AlphaScreen緩衝液中の膜+アクセプタービーズ(15μg/ml、最終、代わりに、2単位/ウェル、最終)
【０４５３】
一定分量(10μl)の「膜なし」を、cAMP標準(2連でウェル毎)および陽性対照および陰性対照に加えた。
【０４５４】
一定分量(10μl)の「6(代わりに、3)μg/ウェルの膜」を、GLP-1薬物(2連または3連ウェルでウェル毎)に加えた。
【０４５５】
陽性対照:10μlの「膜なし」+10μlのAlphaScreen緩衝液
【０４５６】
陰性対照:10μlの「膜なし」+10μlのcAMPストック溶液(50μM)
【０４５７】
ビーズは直接の光に対して感受性であるため、いかなる取扱いも、暗中(できるだけ暗く)で、または緑色の光の中であった。全ての希釈は氷上で行った。
【０４５８】
手順
1.AlphaScreen緩衝液を作製する。
2.GLP-1薬物/cAMP標準をAlphaScreen緩衝液に溶解および希釈する。
3.ドナービーズ溶液を、ストレプトアビジンドナービーズ(2単位/ウェル)およびビオチン化cAMP(1.2単位/ウェル)を混合することによって作製し、暗中室温で20〜30分インキュベートする。
4.cAMP/GLP-1薬物をプレートに加える。ウェル毎に10μl。
5.膜/アクセプタービーズ溶液を調製し、これをプレートに加える。ウェル毎に10μl。
6.ドナービーズを加える。ウェル毎に30μl。
7.プレートをアルミホイルで包み振盪機上で室温にて3時間(非常にゆっくりと)インキュベートする。
8.AlphaScreen上で計数する。各プレートをAlphaScreenにおいて計数の前に3分間プレインキュベートする。
【０４５９】
結果
EC50[nM]値は、Graph-Pad Prismソフトウェア(バージョン5)を使用して計算したが、下記のTable 2(表2)において示す。
【０４６０】
必要に応じて、GLP-1に関して倍の変動は、EC50(GLP-1)/EC50(薬物)-3693.2として計算し得る。
【０４６１】
【表２】
0006300735.tif 000061
【０４６２】
Table 2(表2)の結果は、試験した全ての薬物が満足できるインビトロの効力を有することを確認する。比較薬物と比較して、本発明の薬物についていくらか減少した効力が観察されたが、これは予想され、失望させるものではなく、これらの薬物の使用目的に対して決して不利益ではない。
【０４６３】
(実施例9)
薬物のインビトロの効力(CREルシフェラーゼ;全細胞)
この実施例の目的は、例えば、本発明のプロドラッグのGLP-1親薬物の活性、または効力を試験することである。インビトロの効力は、全細胞アッセイにおけるヒトGLP-1受容体活性化の尺度である。この方法は、実施例8の方法への代替である。
【０４６４】
実施例B2.4およびB2.5の親GLP-1薬物の効力は、下記のように決定した。
【０４６５】
原理
インビトロの効力は、レポーター遺伝子アッセイにおいてヒトGLP-1受容体の反応を測定することによって決定した。アッセイは、ヒトGLP-1受容体を発現しており、かつプロモーターにカップリングしたcAMP応答配列(CRE)についてのDNAと、ホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)についての遺伝子とを含有する安定的にトランスフェクトされたBHK細胞系において行った。ヒトGLP-1受容体が活性化されるとき、これによってcAMPの生成がもたらされ、それによってルシフェラーゼタンパク質の発現がもたらされる。アッセイインキュベーションが完了するとき、ルシフェラーゼ基質(ルシフェリン)を加え、酵素によってルシフェリンはオキシルシフェリンに変換され、バイオルミネセンスを生成する。アッセイについての読み出し情報として、発光を測定する。
【０４６６】
アルブミンへの誘導体の結合を試験するために、アッセイは、所望である場合、血清アルブミンの非存在下で、および非常により高い濃度の血清アルブミン(1.0%の最終アッセイ濃度)の存在下で行い得る。血清アルブミンの存在下でのインビトロの効力、EC50値の増加は、血清アルブミンへの親和性を示し、動物モデルにおける試験物質の遅延性の薬物動態プロファイルを予想する方法を表す。
【０４６７】
細胞培養および調製
このアッセイにおいて使用する細胞(クローンFCW467-12A/KZ10-1)は、親細胞系としてBHKTS13を有するBHK細胞であった。細胞はヒトGLP-1受容体を発現しているクローン(FCW467-12A)に由来し、CREルシフェラーゼによるさらなるトランスフェクションによって確立し、現在のクローンを得た。
【０４６８】
細胞は、細胞培養培地において5%CO2で培養した。細胞を等分し、液体窒素中で保存した。各アッセイ前に、一定分量を採取し、PBS中で2回洗浄し、その後、アッセイ特異的緩衝液に所望の濃度で懸濁する。96ウェルプレートのために、懸濁液を作製し、5×103個の細胞/ウェルの最終濃度を得た。
【０４６９】
材料
下記の化学物質を、アッセイにおいて使用した。Pluronic F-68(10%)(Gibco2404)、ヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma A9511)、オボアルブミン(Sigma A5503)、DMEM w/oフェノールレッド(Gibco11880-028)、1MのHepes(Gibco15630)、Glutamax100x(Gibco35050)およびsteadylite plus(PerkinElmer6016757)。
【０４７０】
細胞培養培地は、10%FBS(ウシ胎仔血清;Invitrogen16140-071)、1mg/mlのG418(Invitrogen15140-122)、240nMのMTX(メソトレキセート;Sigma M9929)および1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン;Invitrogen15140-122)を伴うDMEM培地からなった。
【０４７１】
アッセイ培地は、DMEM w/oフェノールレッド、10mMのHepesおよび1×Glutamaxからなった。1%アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の、2%オボアルブミン、0.2%Pluronic F-68および2%HSAからなった。0%アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の、2%オボアルブミンおよび0.2%Pluronic F-68からなった。
【０４７２】
手順
1)細胞ストックは、37℃の水浴中で解凍した。
2)細胞は、PBS中で3回洗浄した。
3)アッセイ培地中で細胞を計数し、5×103個の細胞/50μl(1×105個の細胞/ml)に調節した。50μlの一定分量の細胞を、アッセイプレート中の各ウェルに移した。
4)試験化合物および参照化合物のストックを、0%HSA CREルシフェラーゼアッセイのために0%アッセイ緩衝液、および1%HSA CREルシフェラーゼアッセイのために1%アッセイ緩衝液において0.2μMの濃度に希釈した。化合物を10倍に希釈し、下記の濃度を得た。2×10-7M、2×10-8M;2×10-9M、2×10-10M、2×10-11M、2×10-12M、2×10-13M、および2×10-14M。
5)50μlの一定分量の化合物またはブランクを、希釈プレートからアッセイプレートに移した。化合物を、下記の最終濃度で試験した。1×10-7M、1×10-8M;1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M、1×10-13M、および1×10-14M。
6)アッセイプレートを、5%CO2インキュベーターにおいて37℃にて3時間インキュベートした。
7)アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で15分間静置した。
8)100μlの一定分量のsteadylite plus試薬を、アッセイプレートの各ウェルに加えた(試薬は光に敏感であった)。
9)各アッセイプレートをアルミ箔で覆い、光から保護し、室温にて30分間振盪した。
10)各アッセイプレートを、Packard TopCount NXT機器において読み取った。
【０４７３】
計算および結果
TopCount機器からのデータを、GraphPad Prismソフトウェアに移した。ソフトウェアによって、非線形回帰を行う(反応に対するlog(アゴニスト))。ソフトウェアによって計算し、pMで報告するEC50値を、下記のTable 3(表3)において示す。
【０４７４】
最低でも2つの反復試験を、各試料について測定した。報告した値は、反復試験の平均である。
【０４７５】
【表３】
0006300735.tif 000062
【０４７６】
Table 3(表3)の結果は、試験した2種の薬物が、一般にベンチマーク化合物と比肩する満足できるインビトロの効力を有することを確認する。
【０４７７】
(実施例10)
GLP-1受容体結合
この実験の目的は、本発明のプロドラッグのGLP-1親薬物の受容体結合活性を試験することである。受容体結合は、ヒトGLP-1受容体についての親薬物の親和性の尺度である。実施例B2.1、B2.2、B2.3、B2.4、およびB2.5の親GLP-1薬物は、下記のように試験した。
【０４７８】
原理
競合的結合アッセイにおいて、ヒトGLP-1受容体へのGLP-1薬物の受容体結合を測定した。このタイプのアッセイにおいて、標識したリガンド(この場合は、125I-GLP-1)は、受容体に結合する。各薬物を、ヒトGLP-1受容体を含有する単離した膜に一連の濃度で加え、標識したリガンドの移動をモニターする。受容体結合は、標識したリガンドの半分が受容体から移動する濃度、IC50値として報告する。
【０４７９】
アルブミンの存在下での受容体への薬物の結合を試験するために、アッセイは、非常に低い濃度の血清アルブミン(好ましくは、最大0.001%の最終アッセイ濃度(代わりに、0.005%-トレーサー中のその残留量に相当する)中で、ならびに非常により高い濃度の血清アルブミン(2.0%の最終アッセイ濃度)の存在下で行い得る。血清アルブミンの存在下でのIC50値の増加は、血清アルブミンへの親和性を示し、動物モデルにおける試験物質の遅延性の薬物動態プロファイルを予想する方法を表す。
【０４８０】
材料
下記の化学物質を、アッセイにおいて使用した。ヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma A1653)、DMEM w/oフェノールレッド(Gibco11880-028)、Pen/Strep(Invitrogen15140-122)、G418(Invitrogen10131-027)、1MのHepes(Gibco15630)、EDTA(Invitrogen15575-038)、PBS(Invitrogen14190-094)、ウシ胎仔血清(Invitrogen16140-071)、EGTA、MgCl2(Merck1.05832.1000)、Tween20(Amresco0850C335)、SPA粒子(コムギ胚芽アグルチニン(WGA)SPAビーズ、Perkin Elmer RPNQ0001)、[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(施設内で生成)、OptiPlate(商標)-96(Packard6005290)。
【０４８１】
緩衝液1は、20mMのNa-HEPESおよび10mMのEDTAからなり、pHを7.4に調節した。緩衝液2は、20mMのNa-HEPESおよび0.1mMのEDTAからなり、pHを7.4に調節した。アッセイ緩衝液は、5mMのEGTA、5mMのMgCl2、0.005%Tween20を補充した50mMのHEPESからなり、pHを7.4に調節した。8%アルブミンストックは、アッセイ緩衝液に8%(w/v)で溶解したHSAからなった。0.02%アルブミンストックは、アッセイ緩衝液に0.02%(w/v)で溶解したHSAからなった。
【０４８２】
細胞培養および膜調製
種(インビトロ):ハムスター
生物学的エンドポイント:受容体結合
アッセイ法:SPA
受容体:GLP-1受容体
細胞系:BHK tk-ts13
このアッセイにおいて使用した細胞(クローンFCW467-12A)は、親細胞系としてBHKTS13を有するBHK細胞であった。細胞は、ヒトGLP-1受容体を発現している。
【０４８３】
細胞を、5%CO2で、DMEM、10%ウシ胎仔血清、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および1.0mg/mlの選択マーカーG418中で増殖させた。
【０４８４】
膜調製物を作製するために、細胞を概ね80%コンフルエンスまで増殖させた。細胞をリン酸緩衝生理食塩水中で2回洗浄し、収集し、例えば、Versene(エチレンジアミン四酢酸のテトラナトリウム塩の水溶液)と共に収集し、短時間、例えば、5分、1000rpmにて遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを氷上に保持した。細胞ペレットを、適切な量の緩衝液1(例えば、10ml、または10〜20ml)中にてULTRA-THURRAX(商標)分散機器で20〜30秒間ホモジナイズした。ホモジネートを、例えば、20,000rpmで15分間遠心分離した。ペレットを適切な量、例えば、10ml、または10〜20mlの緩衝液2中で再懸濁させ(ホモジナイズし)、上記のように遠心分離した。このステップをもう一回繰り返した。このように得られたペレットを緩衝液2に再懸濁させ、タンパク質濃度を決定した。膜を等分し、-80℃で保存した。
【０４８５】
手順
SPA結合アッセイのために、試験化合物、膜、SPA-粒子および[125I]-GLP-1(7-36)NH2を、アッセイ緩衝液に希釈した。25ul(マイクロリットル)の試験化合物を、Optiplateに加える。緩衝液(0.005%HSAを含有する「低アルブミン」実験)を加えた(50ul)。0.1〜0.2mgのタンパク質/mlに相当する5〜10ugのタンパク質/試料を加えた(50ul)(好ましくは、各膜調製のために最適化される)。SPA-粒子(コムギ胚芽アグルチニンSPAビーズ、Perkin Elmer、#RPNQ0001)を、0.5mg/ウェル(50ul)の量で加えた。[125I]-GLP-1(7-36)NH2(49.880DPMに相当する最終濃度0.06nM、25ul)と共にインキュベーションを開始した。プレートをPlateSealerで密封し、撹拌しながら30℃にて120分間インキュベートした。プレートを遠心分離し(1500rpm、10分)、Topcounterにおいて計数した。下記の手順に好ましくは従う。
1.低HSA(0.005%)の存在下での受容体結合アッセイのために、50μlのアッセイ緩衝液を、アッセイプレートの各ウェルに加えた。アッセイをステップ3において続けた。
2.高HSA(2%)の存在下での受容体結合アッセイのために、50μlの8%アルブミンストックを、アッセイプレートの各ウェルに加えた。アッセイをステップ3において続けた。
3.試験化合物を段階希釈し、下記の濃度を得た。8×10-7M、8×10-8M、8×10-9M、8×10-10M、8×10-11M、8×10-12Mおよび8×10-13M。25μlを、アッセイプレート中の適当なウェルに加えた。
4.細胞膜の一定分量を解凍し、これらの処理用濃度に希釈した。50μlを、アッセイプレート中の各ウェルに加えた。
5.WGA SPAビーズを、20mg/mlでアッセイ緩衝液に懸濁した。懸濁液を、アッセイプレートへの添加の直前にアッセイ緩衝液中に10mg/mlへと希釈した。50μlを、アッセイプレートの各ウェルに加えた。
6.アッセイプレートの各ウェルに25μlの[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2の480pM溶液を加えることによって、インキュベーションを開始した。25μlの一定分量を、総カウント/ウェルを測定するために準備した。
7.アッセイプレートを、30℃にて2時間インキュベートした。
8.アッセイプレートを、10分間遠心分離した。
9.アッセイプレートを、Packard TopCount NXT機器において読み取った。
【０４８６】
計算
TopCount機器からのデータを、GraphPad Prismソフトウェアに移した。ソフトウェアは反復試験についての値を平均し、非線形回帰を行った。IC50値をソフトウェアによって計算し、nMで報告した。
【０４８７】
結果
結果を、下記のTable 4(表4)において示す。
【０４８８】
【表４】
0006300735.tif 000063
【０４８９】
Table 4(表4)の結果は、試験した全ての薬物が、低濃度のアルブミンの存在下でのGLP-1受容体への結合として決定した満足できる生物活性を有することを確認する。比較薬物(利用可能である場合)と比較して、本発明の薬物のいくつかについていくらか減少した活性が観察されたが、これは予想され、失望させるものではなく、これらの薬物の使用目的に対して決して不利益ではない。
【０４９０】
(実施例11)
DPP-IVによる分解への耐性
この実験の目的は、ジペプチジルペプチダーゼ-4(DPP-IV)による本発明のプロドラッグの親薬物の分解を決定することである。
【０４９１】
実施例B2.1の親GLP-1薬物の安定性を、下記のように試験した。
【０４９２】
緩衝液
HEPES緩衝液(0.005%Tween20を有する50mMのHEPES緩衝液、pH7.4)
10mlのHEPES(1M)+100μlの10%Tween20、pH7.4に調節し、MilliQ水を200mL加えて希釈。
ストック溶液
BSAを有する親GLP-1薬物のストック溶液
HEPES緩衝液中1.0mM、0.1%BSA(Sigmaカタログ番号A9418)
BSAを有さない親GLP-1薬物のストック溶液
HEPES緩衝液中1.0mM、pH7.4
DPP-IVのストック溶液
DPP-IVは、組換えジペプチジルペプチダーゼ、R&D Systems、カタログ番号1180-SEであった。
50μlのDPP-IV(0.2mg/mL)、25mMのMES、0.7MのNaCl、pH5.0
DPP-IVの処理用溶液
200μlのTRIS(25mM)pH8.0を、ストックバイアルに加える(DPP-IV濃度40μg/mL)。使用の直前に、210μl(40μg/ml)を、210μlの50mMのHEPESに加える(DPP-IV濃度20μg/mL)。
インキュベーション
プレートのプレインキュベーション
600μlの0.1%オボアルブミンと共に最低30分、37℃。次いで、4℃で一晩静置し、50mMのHEPESで回洗浄する。
実験前
HEPES緩衝液と共に37℃にて最低150分。
ディッシュ
Costar96-セミディープウェル(cci-3957)
総インキュベーション容量
300μL
全てをインキュベーション
267μLの50HEPES緩衝液、T÷150分
3μLの化合物(1.0mM)±BSA、T÷150分
30μLの処理用酵素溶液、T÷0分
インキュベーション時間
1-30-60-120-180分および1440分(37℃)
インキュベーションの停止
25μlの試料をEtOH中の150μlの冷却した1%TFA中に移すことによって反応を終了させた。試料を、v型96ウェルプレート(ポリプロピレン、Costar3957)(カタログ番号cci-3957)中に集めた。試料を密封し、分析するまで氷上に保持した。
分析
コーティングされていない96ウェルプレート(ポリプロピレン、WATERS186002643番)における上清中のLC-MS分析
試料を50%アセトニトリル(1%ギ酸)に5倍に希釈し(20μL+80μL)、UPLC-MSで分析した。
結果
BSAを伴わない結果を、下記のTable 5(表5)において示し、BSAを伴う結果を、Table 6(表6)において示す。
【０４９３】
【表５】
0006300735.tif 000064
【０４９４】
【表６】
0006300735.tif 000065
【０４９５】
親GLP-1薬物およびDPP-IV切断薬物の量を、総イオンカウントから測定し、下記のように、ln(親GLP-1薬物%)(Y)の曲線への直線フィットから時間(t)の関数としてT1/2を決定した。
計算3:Y(t)=÷αt+k
計算4:T1/2=ln2/α
T1/2(÷BSA):3466分
T1/2(+0.001%BSA):2311分
【０４９６】
(実施例12)
ミニブタにおける薬物動態研究
本明細書における実施例7は、本発明者らがインビトロで、プロドラッグから薬物への変換についての変換定数、k(図1を比較)を制御し、これを長くすることができるという証拠を提供する。
【０４９７】
インビボでの他の反応/機序をその上に加え、これは状況、例えば、クリアランスを複雑にする。
【０４９８】
この研究の目的は、ミニブタへのi.v.投与の後の、本発明のプロドラッグ(実施例4)および相当する親薬物(実施例B2.2)のインビボでの薬物動態(PK)プロファイル、例えば、体内でのこれらの時間、したがって、これらの作用時間の引延しを決定することである。これはPK研究において行われ、ここで問題の化合物の末端半減期が決定される。末端半減期とは一般に、最初の分布相の後に測定した、特定の血漿濃度を半減させるのにかかる期間を意味する。
【０４９９】
概ね6〜8カ月の月齢および概ね16〜21kgの体重(プロドラッグ、ブタ16.8kg、薬物、ブタ21.3kgおよび21.1kg)のEllegaard Gottingen Minipigs(Dalmose、Denmark)から入手した3匹の雌のGottingenミニブタを、研究において使用した。ミニブタは個々に収容し、SDSミニブタ用食餌(Special Diets Services、Essex、UK)を制限的に1日1回与えた。
【０５００】
恒久的中心静脈カテーテルを、2週間の順化の後、各動物の後大静脈に埋め込んだ。
【０５０１】
動物を投薬の前概ね18時間および投薬の後0〜4時間絶食させたが、全期間の間、水に自由にアクセスさせた。
【０５０２】
実施例4のプロドラッグ、および実施例B2.2の相当する薬物を、適切な濃度へと、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%ポリソルベート80、pH7.4に溶解した(例えば、プロドラッグについて169.6nmol/ml)。静脈内注射(プロドラッグについて8nmol/kg、または化合物の薬物について3nmol/kgに相当する容量)をカテーテルを介して与え、血液を投薬後12日間所定の時点で試料採取した。血液試料(薬物について0.8ml、プロドラッグについて1.5ml)を、EDTA緩衝液(8mM)中に集め、次いで、4℃および1942Gにて10分間遠心分離した。遠心分離の後、プロドラッグによる血漿を、それぞれのGLP-1化合物の分析のためにmicronicチューブ:300μl中に直ちに移し、直ちに急速冷凍した(ドライアイス)。遠心分離後、薬物による血漿を、ドライアイス上のMicronicチューブ中にピペットで移し、ELISAまたは同様の抗体をベースとするアッセイ、例えば、LOCI、またはLC-MSを使用して、それぞれのGLP-1化合物の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持した。個々の血漿濃度-時間プロファイルは、WinNonlin v.5.0もしくはPhoenix v.6.2(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)でノンコーパートメントモデル、またはPK分析のための他の関連するソフトウェアによって分析し、時間(h)に対する血漿濃度(pM)曲線をプロットした。図2および図3を参照されたい。また、このように得られた末端半減期(調和平均/h)を、可能な場合決定した。
【０５０３】
結果
半減期結果を、下記のTable 7(表7)において示す。
【０５０４】
本発明者らは、実験の間に変換されるプロドラッグ化合物について、プロドラッグ研究における薬物の見かけの末端半減期を推定した。本発明者らはデータをモデルにフィットすることができなかったため、本発明者らは、曲線の最末端パートを予想することができなかった。したがって、68時間の観察された半減期は、複雑な一連の平衡の生成物である観察されたベル形曲線形態から推定される。単一のデータは、パラメーター過多(統計材料と比較して多すぎる変数)によって2コンパートメントモデルにフィットさせることができない。
【０５０５】
【表７】
0006300735.tif 000066
【０５０６】
この実施例は、(プロドラッグおよび薬物の)クリアランス反応についての変換定数、Kcは、プロドラッグから薬物への変換定数、kのそれと比較して非常に低いことを確認する(図1を比較)。
【０５０７】
このように、この実施例は、インビボでのプロドラッグの概念の証拠を構成する。
【０５０８】
結果として、本発明者らは、薬物の所望のベル形曲線、すなわち、最初の高い血漿濃度を伴わない改善された血漿レベルプロファイルを得るが、本発明者らは、毒性レベルとなる危険を冒すことに留意されたい。最適化された投与量のプロドラッグによって、ベル形の血漿レベルプロファイルは、関連する治療濃度域内でより長く持続する薬力学的効果に達することを可能とする。
【０５０９】
図2は、ミニブタにおけるプロドラッグおよび親薬物の測定したPKプロファイルを示す(ひし形は、プロドラッグの測定を表し、四角は、親薬物の測定を表す)。
【０５１０】
図3は、それ自体として(プロドラッグとしてではなく)投与された親薬物のPKプロファイルを示す。図2のPKプロファイルと比較したとき、本発明者らは差異を見出す。図3は、望ましいベル形ではなく、プロドラッグについてのような曲線である。
【０５１１】
本発明の特定のフィーチャを本明細書に例示および記載されてきた一方で、多くの修飾、置換、変化、および同等物を今や当業者は思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神内に入るものとして全てのこのような修正および変更を包含することを意図することが理解される。
【図１】
0006300735.tif 000074
【図２】
0006300735.tif 000075
【図３】
0006300735.tif 000076
【配列表】
0006300735000001.app