(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換えされた宿主細胞を用いた全発酵により、少なくとも１つの所望のオリゴ糖を製造する方法であって、該所望のオリゴ糖は末端にガラクトース−（１→４）−グルコース二糖を含み、
ａ）（ｉ）末端にガラクトース−（１→４）−グルコース二糖を含むオリゴ糖を産生可能な細菌宿主細胞であって、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、遊離グルコース単糖をガラクトシル化してラクトースを細胞内で産生することができるタンパク質をコードする、少なくとも１つの組換え核酸配列、ならびに、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコサミルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの少なくとも１つから選択されるグリコシルトランスフェラーゼをコードする、少なくとも１つの組換え核酸配列を含み、ラクトースを外部から添加せずにオリゴ糖を産生することができる細菌宿主細胞、または
（ｉｉ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、遊離のグルコース単糖をガラクトシル化してラクトースを細胞内で産生することのできるタンパク質をコードする組換え核酸配列を含む第１の細菌宿主細胞と、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコサミルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの少なくとも１つから選択されるグリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸配列を少なくとも１つ含む第２の細菌宿主細胞とを得るステップ、ならびに
ｂ）ステップａ）で得た前記細菌宿主細胞（ｉ）または（ｉｉ）を培養するステップであって、培養を、（Ｉ）グルコース、スクロース、グリセロール、糖蜜、コーンシロップ、ガラクトース、合成ガス、一酸化炭素、メタノール、コハク酸塩、ピルビン酸塩およびラフィノースの少なくとも１つから選択される炭素源を用いて行い、前記宿主細胞は、前記炭素源から遊離のグルコースを細胞内で生成することができ、かつ培養を、（ＩＩ）本方法の実施中、外部からラクトースを供給することなく行うことにより、前記所望のオリゴ糖を製造するステップを含む方法。
【請求項２】
前記所望のオリゴ糖が、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキソースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキサオースＩＩおよびラクト−Ｎ−シアリルペンタオースＬＳＴａ、ＬＳＴｂ、ＬＳＴｃから選択されるヒトミルクオリゴ糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞内で産生されたヌクレオチド活性化糖が、前記方法の実施中、ステップｂ）において細胞によって利用され、前記ヌクレオチド活性化糖が、ＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびＣＭＰ−シアル酸の少なくとも１つである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法の実施中、ヌクレオチドにより活性化されていない糖を外部から添加し、前記ヌクレオチドにより活性化されていない糖が、フコース、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびシアル酸から選択される糖であり、前記細菌宿主細胞内でヌクレオチドにより活性化される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）の後にステップｃ）をさらに含み、ステップｃ）は所望の量の前記オリゴ糖が産生された後に行われ、ステップｃ）が、（ｉ）前記細菌宿主細胞に含まれる少なくとも１つのグリコシダーゼの発現を誘導するか、（ｉｉ）前記細菌宿主細胞が培養されている培地に、少なくとも１つのグリコシダーゼを発現している第２の細菌宿主を添加することにより、不要なオリゴ糖を分解することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびβ−１，６−ガラクトシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的フラグメントの少なくとも１つから選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記細菌宿主細胞が、排出タンパク質と、合成されたオリゴ糖を宿主細胞から排出させる透過酵素のうち、少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記排出タンパク質が、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ  ＡＴＣＣ  ４３９７０のｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０遺伝子またはその機能的フラグメントでコードされる糖排出トランスポーターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌宿主細胞が、インベルターゼ、フルクトキナーゼ、ならびにＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸およびＣＭＰ−シアル酸の生合成に関与するタンパク質のうち、少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸が内因性核酸または組換え核酸である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸が同種または異種である、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌宿主細胞が、内因性核酸配列または組換え核酸配列の制御的な過剰発現を可能とする制御配列をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのｌｇｔＢおよびＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＪ８７００のｌｅｘ−１からなる群から選択される遺伝子、またはその機能的フラグメントでコードされる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌株である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ  ｃｓｃ遺伝子クラスターの遺伝子の少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌宿主細胞が、前記オリゴ糖の前駆体を細胞内で分解するタンパク質を発現しないように改変された、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌宿主細胞が、細菌宿主細胞によって産生される中間体、副生成物または内因性オリゴ糖などの妨げとなるオリゴ糖を特異的に分解するグリコシダーゼをコードする核酸配列を含むとともに、前記グリコシダーゼの発現が制御配列の制御下にあるようにさらに遺伝子組換えされた、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末端にガラクトース−（１→４）−グルコース二糖を含むオリゴ糖を産生可能な細菌宿主細胞、その使用、および末端にガラクトース−（１→４）−グルコース二糖を含むオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人乳は、糖質、脂質、タンパク質、ビタミン、無機物および微量元素の複雑な混合物である。最も多く含まれるのは糖質であり、糖質はさらにラクトースとより複雑な構造を有するオリゴ糖（ヒトミルクオリゴ糖、ＨＭＯ）に分けることができる。ラクトースはエネルギー源として利用されるが、複雑な構造を有するオリゴ糖は乳児では代謝されない。複雑な構造を有するオリゴ糖の割合は全糖質画分の１／１０以下であり、おそらく１５０種類を超えるオリゴ糖から構成されている。このような複雑な構造を有するオリゴ糖の存在および濃度はヒト特有のものであり、例えば飼育されている酪農動物など、他の哺乳動物のミルク中には大量には存在しない。
【０００３】
最も多く含まれるオリゴ糖は、２’−フコシルラクトースおよび３’−フコシルラクトースであり、合わせてヒトミルクオリゴ糖画分全体の１／３をも占める。人乳中に多く含まれるその他のヒトミルクオリゴ糖としては、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびラクト−Ｎ−フコペンタオースＩが挙げられる。このような中性オリゴ糖以外に、例えば３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、ジシアリル−ラクト−Ｎ−テトラオースなどの酸性ヒトミルクオリゴ糖もまた人乳中に存在する。これらの構造は、上皮細胞表面の複合糖質であるルイスｘ（ＬｅＸ）などのルイス式組織−血液型抗原のエピトープと密接な関係があり、ヒトミルクオリゴ糖は、上皮細胞表面のエピトープと構造的な相同性を有することから、病原菌に対して防御性を有する。
【０００４】
このような複雑な構造を有するオリゴ糖類が人乳中に存在することは古くから知られており、これらオリゴ糖類の生理学的機能は長年、医薬研究の対象とされてきた。比較的多く存在するヒトミルクオリゴ糖のいくつかについては、特定の機能がすでに解明されている。
【０００５】
ヒトミルクオリゴ糖は、腸管における上述の局所作用以外にも、体循環に入ることにより乳児において全身作用を発揮することも示されている。また、ヒトミルクオリゴ糖は、タンパク質−糖相互作用（例えばセレクチンと白血球との結合）に作用することにより、免疫応答を調節して炎症反応を抑制することができる。
【０００６】
プレバイオティクス作用を有するオリゴ糖類、特にヒトミルクオリゴ糖が有益な特性を有することは研究により明らかにされているが、該オリゴ糖類は入手しにくいため、効率的な商用生産、すなわち、大規模な生産が切望されている。
【０００７】
ヒトミルクオリゴ糖の供給が限られていること、また各ヒトミルクオリゴ糖の純粋な画分を得ることが難しいことから、これらの複雑な分子のうち数種については化学的経路が開発されている。しかし、化学的合成、酵素的合成または発酵によるヒトミルクオリゴ糖の製造には課題がある。少なくとも食品用途に十分な品質のものを大量に得ることは、これまで化学合成では実現できていない。この点に関して特筆すべきは、ヒトミルクオリゴ糖の化学的合成経路には数種の有害化学物質が使用されており、この有害化学物質が最終生成物に混入する危険性があることである。
【０００８】
ヒトミルクオリゴ糖の化学的合成には課題が多いことから、酵素的な方法や発酵的な手法がいくつか開発された。現在、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースなどの数種のＨＭＯ類については、発酵的な手法が開発されている。これらの方法では、組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの遺伝子組換え菌株が主に用いられている。
【０００９】
例えばＵＳ  ７，５２１，２１２  Ｂ１や、Ａｌｂｅｒｍａｎｎら、(2001) Carbohydr. Res. 334(2) p 97-103に記載されているように、現在、ＨＭＯ類を製造するために生体触媒や発酵を利用する手法はすべて、出発基質としてラクトースを用いており、これに別の単糖類を付加させるというものである。ラクトースへの単糖類の付加は、グリコシルトランスフェラーゼやグリコシダーゼの触媒作用により、適切な活性化単糖基質を用いて行うことができる。また、トランスグルコシダーゼの反応によっても、ラクトースに別の単糖類を付加することができる。
【００１０】
特に、ＨＭＯ類の発酵合成は極めて効率的である。というのは、必要であるが合成が困難なヌクレオチド活性化単糖類が、使用する微生物の代謝により供給されるからである。しかし、生体触媒を用いる手法と比較すると、ＨＭＯ類の合成にホールセルを使用することにも大きな欠点がいくつかあり、これらの欠点は、細胞膜を通過する輸送過程、代謝による副反応、合成されたオリゴ糖を、とりわけ種々のポリオール類（糖類など）、核酸、ポリペプチド、無機物などを含む複雑な混合物から精製する必要があることなどに関連するものである。
【００１１】
発酵法でラクトースを使用することに関する技術的な課題として、ラクトースの熱処理による、ラクトース（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース）からラクツロース（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−フルクトフラノース）への転位反応の発生が挙げられる。この転位反応は、ラクトースをオートクレーブすることで進行する可能性があり、ラクトース発酵の培地や原料中に存在するラクトースの数パーセントが変換されて、ラクツロースとなる。ラクツロースは、ヒトにとって消化できない糖であり、慢性便秘の治療に広く使用されている。
【００１２】
また、ラクトースのラクツロースへの変換により、不要な副生成物が生成されるだけでなく、グリコシル化される可能性がある基質が生じ、より複雑な構造を有するオリゴ糖（例えば２’−フコシルラクツロース）が生成される可能性がある。従って、ラクトースからラクツロースが生成すると、所望の生成物に、これと非常に類似したオリゴ糖が混入してしまうため、このオリゴ糖を所望の生成物から分離することは困難というよりむしろほぼ不可能である。
【００１３】
とりわけ問題なのは、ラクトースの添加により、文献上立証されている影響、いわゆるラクトース誘導性細胞死が生じることである。ラクトース誘導性細胞死は、ラクトースの過剰な取り込みと、それに伴う細菌膜のプロトン勾配の崩壊とによって起こるようである。特にラクトース透過酵素遺伝子（例えばＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＹ）の過剰発現と、組換え細胞の暴露とが組み合わさると、組換え菌株の増殖に大幅な遅延が生じ、細胞性多糖の合成が促進される可能性がある（Grubeら、“Hydrogen-producing Escherichia coli strains overexpressing lactose permease: FT-IR analysis of the lactose-induced stress“ (2013) Biotechnol. Appl. Biochem. 5, 31）。
【００１４】
また、現在、商用規模のラクトースはすべて、酪農産業における廃棄物である乳清に由来している。乳清は、チーズやカゼインの製造過程で大量に生じる。このような酪農産業由来のラクトースにおいては、狂牛病としても広く知られているウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の原因物質であるプリオンタンパク質に汚染されている可能性があるという懸念が拭いきれない。ＢＳＥは、脳と脊髄に海綿状変性を引き起こす、畜牛の致死性の神経変性疾患であるが、ヒトにも感染する可能性があり、ヒトではクロイツフェルト・ヤコブ病の変異型として知られている。また、ラクトースがβ−ガラクトシダーゼ陽性のＥ．ｃｏｌｉ菌株に供給されると、アロラクトース（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−Ｄ−グルコピラノース）に変換され、別の不要な混入物質となる可能性もある（Huberら、“Efflux of beta-galactosidase products from Escherichia coli” (1980) J. Bacteriol. 141, 528-533）。
【００１５】
また、ラクトースは、発酵培地の成分のうち最も高価なものの１つでもあり、グルコース、グリセロール、スクロースなどで代用できれば、ＨＭＯ類をより費用効率よく製造できるだろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記に鑑み、ＨＭＯを製造するための改良手段および改良方法を開発し、公知技術における上記の課題を解決することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明によれば、前記目的および他の目的は、以下の細菌宿主細胞によって達成される。すなわち、末端にガラクトース−（１→４）−グルコース二糖を含むオリゴ糖を産生可能な細菌宿主細胞であって、
（ｉ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、遊離グルコース単糖をガラクトシル化してラクトースを細胞内で産生することができるタンパク質をコードする、少なくとも１つの組換え核酸配列、ならびに
（ｉｉ）フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコサミルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの少なくとも１つから選択されるグリコシルトランスフェラーゼをコードする、少なくとも１つの組換え核酸配列を含み、
【００１８】
ラクトースを外部から添加せずに、オリゴ糖を産生することができる細菌宿主細胞である。
【００１９】
前記目的はさらに、遺伝子組換えされた宿主細胞を用いた全発酵により、少なくとも１つの所望のオリゴ糖を製造する方法によって達成され、該所望のオリゴ糖は末端にガラクトース−（１→４）−グルコース二糖を含み、本方法は、
ａ）本発明の細菌宿主を得るステップ、ならびに
ｂ）前記細菌宿主細胞を培養するステップであって、培養を、（ｉ）グルコース、セルロース、セロビオース、スクロース、グリセロール、糖蜜、コーンシロップ、ガラクトース、合成ガス、一酸化炭素、メタノール、ピルビン酸塩、コハク酸塩、および細胞の代謝によってグルコースに変換されうるその他の任意の炭素源の少なくとも１つから選択される炭素源を用いて行い、前記宿主細胞は、前記炭素源から遊離のグルコースを細胞内で生成することができ、かつ培養を、（ｉｉ）本方法の実施中、外部からラクトースを供給することなく行うことにより、前記所望のオリゴ糖を製造するステップを含む。
【００２０】
本発明の目的はこのようにして完全に達成される。
【００２１】
本発明の細菌細胞および方法によれば、所望のオリゴ糖、特にガラクトース−（１→４）−グルコース二糖を還元末端に有するオリゴ糖、例えば２’−フコシルラクトースなどのＨＭＯ類等を、該オリゴ糖の発酵製造法の基質としてラクトースを外部から供給することなく、グルコース、スクロース、グリセロールなどの単純な炭素源から全発酵により得ることができる。
【００２２】
単純な炭素源を用いて、産生細胞中に遊離のグルコースを貯蔵させることができるので、細胞はラクトースを合成できる。得られたラクトースは、合成細胞から排出され、別の細胞で発酵に利用されることによって、より複雑な構造を有するオリゴ糖へと合成されてもよいが、合成細胞自身によって、より複雑な構造を有するオリゴ糖へと合成されるとより好都合である。次いで、合成されたオリゴ糖生成物は、排出輸送体または透過酵素によって、産生細胞から発酵培地中に排出される。
【００２３】
本明細書において、用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖の、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、別段の指定がない限り、天然由来のヌクレオチドと同様に核酸とハイブリッドを形成する、天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。別段の指示がない限り、個々の核酸配列にはその相補配列も含まれる。
【００２４】
本明細書において、用語「作動可能に連結された」とは、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、転写因子結合部位群など）と第２の核酸配列との間の機能的結合を意味するものとし、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。従って、用語「プロモーター」は、通常、ＤＮＡポリマー上で遺伝子の「前方に位置」し、ｍＲＮＡへの転写の開始部位を示すＤＮＡ配列を指す。「レギュレーター」ＤＮＡ配列も通常、ＤＮＡポリマー上で遺伝子の「上流」にあり（すなわち前方に位置し）、転写開始の頻度（または速度）を決定づけるタンパク質と結合する。これらの配列は「プロモーター／レギュレーター」または「制御」ＤＮＡ配列と総称され、機能的ＤＮＡポリマー上で、選択された遺伝子（または一連の遺伝子群）の前方にそれぞれ位置し、協働して、該遺伝子の転写（その結果として発現）を行うかどうかを決定する。ＤＮＡポリマー上で遺伝子の後方にあり、ｍＲＮＡへの転写終了のシグナルを送るＤＮＡ配列は、転写「終結（ターミネーター）」配列と呼ばれる。
【００２５】
本明細書において細菌宿主細胞に関しての、用語「組換え」は、細菌細胞が異種の核酸を複製すること、あるいは異種の核酸（すなわち「その細胞にとって外来の」配列）にコードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを指す。組換え細胞は、元の（非組換え）細胞中には存在しない遺伝子を含みうる。組換え細胞はまた、元の細胞中に存在する遺伝子であるが、人工的な手段によって改変され、細胞内に再導入された遺伝子を含みうる。本用語はまた、細胞から核酸を取り出さずに改変された、細胞内因性の核酸を含む細胞も包含する。このような改変には、遺伝子置換、位置特異的変異およびそれらに関連する技術による改変が含まれる。従って、「組換えポリペプチド」とは、組換え細胞によって産生されたものである。本明細書において、「異種配列」または「異種核酸」とは、個々の宿主細胞にとって外来性の起源（例えば異なる種）に由来するものであるか、あるいは同じ起源であれば、本来の形から改変されたものである。従って、プロモーターに作動可能に連結された異種核酸は、プロモーターとは異なる起源に由来するものであるか、あるいは同じ起源であれば、本来の形から改変されたものである。異種配列は、例えば形質移入、形質転換、融合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）または形質導入により、宿主微生物細胞のゲノム中に安定に導入することができ、異種配列を導入する宿主細胞に応じた方法を適用することができる。種々の方法が当業者に公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）に開示されている。
【００２６】
従って本明細書において、「細菌宿主細胞」とは、形質転換もしくは形質移入された細菌細胞、または外因性ポリヌクレオチド配列によって形質転換もしくは形質移入されうる細菌細胞であると理解される。
【００２７】
したがって、本発明で用いられる核酸配列は、例えば、宿主微生物細胞に形質転換／形質移入、あるいはその他の方法で安定に導入されるベクターに含まれていてもよい。
【００２８】
本発明のポリペプチドの産生には、多種多様な発現系を用いることができる。前記ベクターには特に、染色体由来ベクター、エピソーム由来ベクターおよびウイルス由来ベクターが含まれ、例えば、細菌性プラスミド由来ベクター、バクテリオファージ由来ベクター、トランスポゾン由来ベクター、酵母エピソーム由来ベクター、挿入因子由来ベクター、酵母染色体因子由来ベクター、ウイルス由来ベクターおよびこれらを組み合わせたベクター（例えばコスミドやファージミドなどの、プラスミドとバクテリオファージ双方の遺伝因子に由来するベクター）などが挙げられる。発現系構築物は、発現を調節・誘導する制御領域を含んでもよい。概して言えば、宿主におけるポリヌクレオチドの維持、増幅または発現に適し、かつポリペプチドの合成に適した任意の系またはベクターを、本件の発現に用いることができる。適切なＤＮＡ配列の発現系への挿入は、例えば上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの文献に記載されている方法などの、様々な公知の方法や常法により行うことができる。
【００２９】
選択した宿主生物の形質転換に用いる遺伝学的材料の単離、合成、精製および増幅を行うための「組換えＤＮＡ」法に関する技術は、特許文献や学術文献中に多く記載されている。従って、選択した外因性（すなわち外来または「異種」）ＤＮＡ配列を含む「ハイブリッド」のウイルスＤＮＡまたは環状プラスミドＤＮＡを用いて宿主生物を形質転換することは公知である。この技術分野における公知の方法では、まず環状のウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを酵素的に開裂させて直鎖状のＤＮＡ鎖とした形質転換ベクターを作製する。また、通常所望のタンパク質生成物をコードする配列を含む、選択した外来性ＤＮＡ鎖も、同一／類似の酵素を用いて直鎖状にする。得られた直鎖状のウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡと外来性ＤＮＡとを、修復プロセスに関与するライゲーション酵素の存在下、インキュベートすることにより、選択した外因性ＤＮＡセグメントがウイルスＤＮＡまたは環状ＤＮＡプラスミド中に「スプライスされた」、「ハイブリッド」ベクターが得られる。
【００３０】
用語「〜をコードする核酸配列」は、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、無修飾ＲＮＡ、無修飾ＤＮＡ、被修飾ＲＮＡ、被修飾ＤＮＡのいずれでもよく、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を一般に表す。この用語には、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域とが混在するＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域と三本鎖領域とが混在するＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域とが混在するＲＮＡ、および一本鎖領域、より典型的には二本鎖領域もしくは三本鎖領域であってもよいＤＮＡとＲＮＡ、または一本鎖領域と二本鎖領域が混在しうるＤＮＡとＲＮＡとを含む混成分子が包含されるが、これらに限定されない。またこの用語には、ポリペプチドをコードする１つの連続領域や複数の不連続領域（例えば、組み込まれたファージ、挿入配列またはエディティングによって分断されている）とともに、コード配列および／または非コード配列を含んでいてもよい別の領域をさらに含むポリヌクレオチドも包含される。
【００３１】
本明細書において、「培養する」という用語は、所望のオリゴ糖の産生が可能な、該産生に適した培地および条件で、細菌細胞を増殖させることを意味する。適切な細菌宿主細胞ならびにそれを培養するための培地および条件は、当業者が自身の技術的かつ専門的素養に関係のある本発明の開示を読めば容易に得ることができる。
【００３２】
本明細書に記載の発明によれば、本明細書に記載の関連タンパク質／酵素をそれぞれコードする核酸が細胞中に含まれている限り、本明細書で定義されるオリゴ糖を１種類以上、すなわち例えば２、３、４種類製造可能であることが理解できるであろう。
【００３３】
好ましい一実施形態によれば、本発明の方法は、ｃ）培地および／または細菌細胞からオリゴ糖を回収するステップを含む。ステップｃ）は、ステップｂ）の後、すなわち培養ステップの後に行われ、回収は、培養ステップにより、本明細書で定義される所望のオリゴ糖が得られた時点、またはその所望の量が得られた時点で行われることが理解できるであろう。
【００３４】
本明細書において、「回収する」という用語は、本発明の宿主微生物によって産生されたオリゴ糖を、宿主微生物培養物から、単離、採取、精製、収集などによって分離することを意味する。
【００３５】
さらに本明細書において、用語「酵素活性」とは、酵素活性を示す任意の分子、特にタンパク質であって、それ自身は変化せずに特異的な生化学的反応を引き起こす触媒として働くものを含むことを意味する。特に、基質を生成物に変換することができる酵素活性を有するタンパク質がこの用語に含まれる。
【００３６】
酵素反応において、反応開始時に存在する分子を基質と呼び、基質が変換されて生じた別の分子を生成物と呼ぶ。生体細胞中のほぼすべての化学反応は、生命維持に十分な速度で進行するために酵素を必要とする。各酵素は基質に対して選択性を有し、多くの可能性からわずか数種類の反応のみの速度を上げるので、細胞内で産生される酵素の組合せによって、細胞内で起こる代謝経路が決定される。
【００３７】
本明細書に記載の細菌細胞、その使用および方法によれば、意外なことに、本明細書で定義される所望のオリゴ糖が全発酵により得られることが明らかになった。本発明は、基本的に２種の特異的酵素活性、すなわちβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性と少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ活性とを有する細菌微生物を利用するものであり、該細菌宿主微生物は、ラクトースの添加がなくても、単純な炭素源で増殖しながら、所望のオリゴ糖を効率的に産生する。
【００３８】
本発明に関連する範囲内で、「ラクトースを外部から添加せずに」という表現は、本発明の細菌宿主細胞を培養している培地にラクトースを添加しないことを意味する。「外部から（外因性）」は、前記細胞によって「内因的に産生される」こととは異なるものとし、本方法のいずれの時点においても、細菌宿主細胞にラクトースが添加されないことを意味するものとする。
【００３９】
本方法においては、上記の酵素的特徴を有する改変されていない微生物を用いることもできるが、本発明の一態様によれば、細菌微生物は組換え細菌微生物または組換え細菌細胞であり、該組換え細菌細胞は形質転換により少なくとも上記の酵素活性を有するものである。
【００４０】
本発明の細菌宿主細胞は、グルコースなどの炭素源を以下のように使用する。まず、炭素源、すなわちグルコースが細菌細胞に内包化される。すなわち細胞膜を通過してサイトゾル内に輸送される。サイトゾル内でグルコースは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を示す酵素によってガラクトシル化される。すなわち、細胞内に存在する（あるいは細胞内で生成した）ヌクレオチド活性化ガラクトースからガラクトース残基がグルコースに転移し、ラクトースが生成する。続いて、ラクトースは、例えばフコシル残基を転移するグリコシルトランスフェラーゼ活性の受容体として利用され、ヌクレオチド活性化フコースからフコシル残基がラクトースに転移することによって、フコシルラクトースが生成する。この工程は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性と少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ活性をともに有する細菌細胞を用いることにより達成される。また、この工程は、ラクトースがβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する細胞から排出され、培地中に存在するか添加される別の（細菌性の）細胞によって利用されるという形でも達成することができる。この場合、前記別の細胞は、ラクトースを受容体として利用するグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する細胞であり、排出されたラクトースはこの細胞に取り込まれ／内包化される。
【００４１】
上記工程で産生されたフコシルラクトースなどの本明細書で定義されるオリゴ糖は、細胞内から、細菌細胞が培養されている培地に輸送される。この生成物は、培地から回収、例えば単離できるため、さらなる利用が可能である。
【００４２】
一般に、また本発明の全体にわたって、用語「グリコシルトランスフェラーゼ活性」または「グリコシルトランスフェラーゼ」は、二糖、オリゴ糖および多糖の生合成に関与する酵素を示すとともにこれらを包含し、これらの酵素は活性化ヌクレオチド単糖／糖（「グリコシル供与体」）からグリコシル受容体分子への、単糖の転移を触媒する。
【００４３】
グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼから選択されることが好ましい。
【００４４】
別の好ましい一実施形態によれば、本発明の細菌宿主細胞または方法において、グリコシルトランスフェラーゼは、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ、α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ−１，６−ガラクトシルトランスフェラーゼの少なくとも１つから選択される。
【００４５】
好ましい実施形態によれば、２’−フコシルラクトースを合成するために、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性に加えて、適切な２−フコシルトランスフェラーゼを発現させる。また、３−フコシルラクトースを合成するために、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼに加えて、適切な３−フコシルトランスフェラーゼを発現させる。また、２’，３−ジフコシルラクトースを合成するために、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼに加えて、適切なα−１，２−フコシルトランスフェラーゼとα−１，３−フコシルトランスフェラーゼを共に発現させる。また、ラクト−Ｎ−テトラオースを合成するために、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼに加えて、適切なβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼとβ−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを産生細菌宿主細胞中で発現させる。また、ラクト−Ｎ−フコペナトースＩなどの、さらに複雑な五糖類を合成するために、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼに加えて、適切なβ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミルトランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびα−１，２−フコシルトランスフェラーゼを機能的に発現させるような核酸を導入することにより組換え細胞を作製する。
【００４６】
本発明において使用可能であり、かつ本発明の一部であるグリコシルトランスフェラーゼの例としては、細菌性フコシルトランスフェラーゼが挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼまたはα−１，３−フコシルトランスフェラーゼであり、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ：Ｏ１２６のｗｂｇＬ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＤＮ４３８４７）によってコードされるα−１，２−フコシルトランスフェラーゼまたはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、哺乳動物、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓもしくはＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉのα−１，３−フコシルトランスフェラーゼである。好ましくは、ＥＰ  ２  ４７９  ２６３  Ａ１、ＥＰ  ２  ４３９  ２６４またはＷＯ  ２０１０／１４２３０５に開示されているグリコシルランスフェラーゼまたはその変異型を使用することが好ましく、本明細書にて、これらに記載の内容を明示的に参照することにより、当該内容は本発明の一部となる。
【００４７】
本明細書において使用される用語としての「変異型」は、元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本質的な（酵素的）特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。一般的には、変異型ポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異型のヌクレオチド配列における変化は、元のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるものであってもよく、変化させないものであってもよい。ヌクレオチドの変化によって、元の配列によってコードされるポリペプチドに、以下に述べるようなアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断が生じる可能性がある。一般的には、ポリペプチドの変異型は、元のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に相違は限定されているので、元のポリペプチドと変異型の配列は、全体的によく類似しており、多くの領域で同一である。変異型と元のポリペプチドは、１以上の置換、付加、欠失またはこれらの任意の組合せによって、アミノ酸配列が異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされていてもよく、コードされていなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異型は、対立遺伝子変異型などの天然に存在するものであってもよく、あるいは天然に存在することが知られていない変異型であってもよい。ポリヌクレオチドやポリペプチドの、天然に存在しない変異型を、突然変異誘発技術、直接合成法および当業者に公知のその他の組換え法によって作製してもよい。
【００４８】
本発明の範囲において、核酸／ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの多型変異型、対立遺伝子、変異体および種間ホモログも上記の用語に含まれ、これらは、グリコシルトランスフェラーゼ／β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する野生型タンパク質を表すポリペプチドと、約６０％を超えるアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００またはそれを超える数のアミノ酸からなる領域にわたって有するアミノ酸配列を含む。
【００４９】
従って、本明細書に記載の遺伝子／タンパク質の「機能的フラグメント」とは、そのフラグメントの元となる遺伝子またはタンパク質と同等またはそれより若干弱い活性を保持する、該遺伝子／タンパク質の配列変異型を指すものとする。
【００５０】
従って、用語「α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ」もしくは「フコシルトランスフェラーゼ」、または「α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ」もしくは「フコシルトランスフェラーゼ」をコードする核酸／ポリヌクレオチドとは、ＧＤＰ−フコースなどの供与体基質から、受容体分子へのα−１，２−結合様式でのフコースの転移を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。用語「α−１，３−フコシルトランスフェラーゼもしくはフコシルトランスフェラーゼ」、または「α−１，３−フコシルトランスフェラーゼもしくはフコシルトランスフェラーゼ」をコードする核酸／ポリヌクレオチドとは、ＧＤＰ−フコースなどの供与体基質から、受容体分子へのα−１，３−結合様式でのフコースの転移を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。受容体分子としては、ラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースまたはこれらの任意の誘導体などが挙げられる。
【００５１】
好ましい一実施形態によれば、本発明の細菌宿主細胞および本発明の方法で用いられる細菌宿主細胞は、オリゴ糖排出タンパク質または合成されたオリゴ糖を宿主細胞から排出させる透過酵素、インベルターゼ、フルクトキナーゼ、ならびにＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、酸および／またはＣＭＰ−シアル酸の生合成に関与するタンパク質のうち、少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。
【００５２】
オリゴ糖排出タンパク質または透過酵素は、可溶性のオリゴ糖生成物を産生細胞から排出させることのできるタンパク質であることが好ましい。本発明の一態様によれば、排出タンパク質を発現する核酸として使用可能なものは、例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ  ＡＴＣＣ４３９７０のｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０遺伝子、またはその変異型、ホモログもしくは機能的フラグメントである。従って、「排出タンパク質」または「オリゴ糖排出タンパク質」は、オリゴ糖を細菌細胞から排出させることのできる任意のタンパク質である。これに関しては、オリゴ糖排出輸送体とその使用について記載されているＷＯ２０１０／１４２３０５の開示内容（特に実施例）も参照するものとする。
【００５３】
上記の排出輸送体または透過酵素タンパク質の典型例としては、スクロース透過酵素、フルクトキナーゼ、スクロース加水分解酵素、転写リプレッサーの４つの遺伝子（それぞれｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡおよびｃｓｃＲ）を含むｃｓｃ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｉｌｉｓのグルコース透過酵素、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのグルコース透過酵素などが挙げられる。従って好ましい一実施形態において、細菌宿主細胞はさらにｃｓｃ遺伝子クラスターを含む。
【００５４】
ヌクレオシド二リン酸糖の生合成に関与するタンパク質の典型例としては、ヌクレオシド二リン酸糖ピロホスホリラーゼ、糖キナーゼなどが挙げられ、フコースキナーゼ、ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ、４−リダクターゼ、グルコースキナーゼ、グルコース−６−リン酸−１−エピメラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース−１−リン酸グアニリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸シンターゼが好ましい。
【００５５】
本発明の一態様によれば、本明細書で使用される請求項に記載の細菌宿主細胞において、核酸は内因性核酸または組換え核酸である。
【００５６】
先に定義した通り、本明細書および本分野において一般的に、用語「内因性」は、目的の酵素をコードする核酸が細菌宿主細胞由来のものであり、宿主細胞に導入されたものではないことを意味し、一方「組換え」核酸は宿主細胞に導入されたもので、宿主細胞由来のものではない。
【００５７】
別の一実施形態によれば、核酸は同種または異種である。本明細書および関連分野において一般的に理解される表現として、「同種」とは、特定の生成物をコードする核酸配列が、その核酸配列が導入された種と同じ種に由来していることを言う。用語「異種」とは、特定の生成物をコードする核酸配列が、その核酸配列が導入された種とは異なる種に由来していることを言う。
【００５８】
別の一実施形態によれば、本発明の細菌宿主細胞は、内因性核酸配列または組換え核酸配列の制御的な過剰発現を可能にする制御配列をさらに含む。本明細書において「核酸発現制御配列」という表現と同義に用いられる用語「制御配列」には、先に定義した通り、プロモーター配列、シグナル配列または転写因子結合部位群が含まれ、これらの配列は、作動可能に連結している核酸配列の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。
【００５９】
上述した通り、本発明において用いられる核酸配列は、例えば、細菌宿主細胞に安定に形質転換／形質移入されるベクターに含まれていてもよい。組換え産生に関する前掲の定義および詳細な説明は、このパラグラフに適用されるものとする。
【００６０】
いくつかの実施形態において、核酸配列は、誘導可能なプロモーターの制御下に配置される。このプロモーターにより遺伝子の発現が誘導されるが、その発現レベルは、温度、ｐＨ、嫌気性または好気性条件、光、転写因子および薬品などの、環境や発生的因子によって変化しうる。本明細書において、このようなプロモーターは「誘導可能な」プロモーターと言われ、本発明において用いられるタンパク質が発現するタイミングを調節することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主細胞のための、誘導可能なプロモーターは当業者に公知である。
【００６１】
本発明の一態様によれば、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＬｇｔＢおよびＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓのｌｅｘ−１、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される遺伝子によってコードされることが好ましい。また、当業者が本明細書を読めば、その他の酵素、すなわちβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するとともに単糖グルコースを基質として受容し、本明細書および請求項に記載の方法でβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼとして作動する他の生物由来の酵素についても理解できるであろう。
【００６２】
本発明の細菌宿主細胞に導入されたβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにより、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ反応の受容体基質である細胞内の遊離のグルコースは、ＨＭＯ合成に必要なラクトース二糖構造に変換される。
【００６３】
ラクトース合成に必要な遊離グルコースは、培養培地にグルコースを添加することによってプールすることができる。
【００６４】
また、グルコースを含む二糖またはオリゴ糖を、組換え細菌宿主細胞の炭素源として用いることによって、遊離のグルコースを供給することもできる。このように添加された二糖またはオリゴ糖は単糖に切断されて遊離グルコースとその他の単糖類となり、細胞内でのＨＭＯ合成に使用される。遊離グルコースやグルコース含有糖類を供給する以外に、オリゴ糖合成に必要なグルコースを、組換え細胞自身の代謝（糖新生）によって供給することもできる。
【００６５】
細菌宿主細胞内で受容体基質として働く遊離グルコースのプール以外に、ＵＤＰ−ガラクトースなどの効率的な供給も必要である。ＵＤＰ−ガラクトースは、例えば、細胞自身の代謝により供給することが可能であり、この代謝は、ＵＤＰ−ガラクトース−４’−エピメラーゼの過剰発現や、ＵＤＰ−ガラクトース−４’−エピメラーゼをグルコース−１−リン酸−１−ウリジニルトランスフェラーゼと組み合わせるなどの、さらなる遺伝子改変によって促進させることができる。
【００６６】
また、ガラクトースをＨＭＯ産生細菌宿主細胞に発酵培地を介して供給することにより、ＵＤＰ−ガラクトースを得ることもできる。このガラクトースは細胞に取り込まれ、リン酸化されてガラクトース−１−リン酸になった後、ＵＤＰ−ガラクトースに変換される。これらの酵素活性をコードする遺伝子は文献により既知である（Grossiordら、“Characterization, Expression, and Mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE Genes, Involved in Galactose Utilization via the Leloir Pathway” (2003) J. Bacteriol 185(3) 870-878）。
【００６７】
ラクト−Ｎ−テトラオースなどの合成には、ＵＤＰ−ガラクトースに加えて、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンも必要である。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンも、細菌宿主細胞自身のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン代謝により得ることができる。Ｎ−アセチルグルコサミン含有オリゴ糖の合成に必要なＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの供給は、産生細胞内でのＮ−アセチルグルコサミンの異化を不活性化することにより増大させることができる。
【００６８】
以下に限定されないが、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトースおよび２’，３−フコシルラクトースなどのフコース含有ＨＭＯの合成には、ＧＤＰ−Ｌ−フコースが必要である。２’−フコシルラクトースの合成に必要なＧＤＰ−フコースの供給は、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｉｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ｆｋｐ遺伝子によってコードされる二機能性のＬ−フコキナーゼ／ＧＤＰ−ピロホスホリラーゼ酵素の作用発現と、ＨＭＯ合成細胞へのＬ−フコースの添加により可能である。同様に、シアル酸を細胞に添加し、細胞に取り込まれたシアル酸がＣＭＰ−シアル酸シンターゼによって活性化されると、ＣＭＰ−シアル酸が得られる。ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ノイラミン酸としても知られる）は、シアル酸含有オリゴ糖（３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３−フコシル−３’−シアリルラクトースなど）の合成に利用されうる。
【００６９】
また、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの供給については、ＧＤＰ−Ｌ−フコース経路の遺伝子を過剰発現させて、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩなどのフコシル化ＨＭＯ類の合成に必要なＧＤＰ−Ｌ−フコースの供給量を増やすことも可能である。
【００７０】
本発明の細菌宿主細胞および／または方法の好ましい一実施形態によれば、本発明の細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ菌株、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ菌株またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ菌株である。好ましくは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｌｏｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ細胞から選択される細菌宿主細胞である。また、当業者が本開示を読めば、その他の菌株についても理解するであろう。
【００７１】
好ましい一実施形態によれば、本発明の細菌宿主は、（ｉ）前記オリゴ糖の前駆体を細胞内で分解するタンパク質を発現しないように、もしくは（ｉｉ）前記オリゴ糖の前駆体を細胞内で分解するタンパク質の発現を阻害するようにさらに改変されるか、または（ｉｉｉ）前記タンパク質が所望のオリゴ糖の合成酵素を阻害しないように制御される。好ましい一実施形態において、前記タンパク質はβ−ガラクトシダーゼ、好ましくはｌａｃＺである。
【００７２】
さらに、「前駆体」という表現には、本発明のオリゴ糖の生合成経路に関与する化合物、特に内因性前駆体、すなわち宿主細胞内で産生され、該細胞内に元来存在する前駆体が含まれる。
【００７３】
上述したように、本発明は、遺伝子組換えされた宿主細胞を用いた全発酵により、少なくとも１つの所望のオリゴ糖を製造する方法にも関する。所望のオリゴ糖は末端にガラクトース−（１→４）−グルコース二糖を含み、本方法は以下のステップを含む。
【００７４】
ａ）（ｉ）前記請求項のいずれかに記載の細菌宿主細胞、または（ｉｉ）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、遊離のグルコース単糖をガラクトシル化してラクトースを細胞内で産生することのできるタンパク質をコードする組換え核酸配列を含む第１の細菌宿主細胞と、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、グルコサミルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの少なくとも１つから選択されるグリコシルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸配列を少なくとも１つ含む第２の細菌宿主細胞とを得るステップ。
【００７５】
ｂ）ステップａ）で得た細菌宿主細胞（ｉ）または（ｉｉ）を培養するステップであって、培養を、（Ｉ）グルコース、スクロース、グリセロール、糖蜜、コーンシロップ、ガラクトース、合成ガス、一酸化炭素、メタノール、セルロースおよびセロビオースの少なくとも１つから選択される炭素源を用いて行い、宿主細胞は、前記炭素源から遊離のグルコースを細胞内で生成することができ、かつ培養を、（ＩＩ）本方法の実施中、外部からラクトースを供給することなく行うことにより、前記所望のオリゴ糖を製造するステップ。
【００７６】
前記細菌宿主細胞に関してはすでに説明した通りであり、本発明の方法によれば、オリゴ糖の前駆体を添加せずに、所望のオリゴ糖を完全発酵または全発酵により製造することができる。これは、本明細書に記載の方法によれば、オリゴ糖の微生物生産が、単純な炭素源を利用して増殖する宿主細胞により可能であることによる。本発明の方法によれば、上述した通りに細菌宿主細胞を作製し、グルコースなどの単純な炭素源を用いて培養すると、炭素源は細菌細胞に内包化され、すなわち細胞膜を通過してサイトゾル内に輸送される。サイトゾル内で、グルコースなどの炭素源はガラクトシル化される。すなわちガラクトース残基が、細胞内に存在する（あるいは細胞内で生成した）ヌクレオチド活性化ガラクトースからグルコースに転移する。このステップはβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性により触媒され、その結果、ラクトースが生成する。次いで、ラクトースは、例えばフコシル残基をヌクレオチド活性化フコースからラクトースに転移させるグリコシルトランスフェラーゼ活性の受容体として用いられることにより、例えばフコシルラクトースが生成する。
【００７７】
本発明の方法によれば、この工程は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性と少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ活性をともに有する細菌宿主細胞を用いることにより達成される。また、この工程は、第１のステップ、すなわちステップ（ｉ）のガラクトシル化のみが第１の細菌宿主細胞内で行われ、生成したラクトースがβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する第１の細菌細胞から第１の細胞が培養されている培地中に排出され、次いで、培地中に存在していてもよく、別途添加されてもよい、第１の細胞とは別の第２の細菌宿主細胞によって利用されるという形でも達成することができる。ラクトースは、ラクトースを受容体とするグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する第２の細菌宿主細胞に取り込まれ／内包化される。
【００７８】
本発明の方法および使用の好ましい一実施形態において、所望のオリゴ糖はヒトミルクオリゴ糖であり、好ましくは添付の表１に列挙したもののうちの少なくとも１つから選択されるヒトミルクオリゴ糖であり、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキソースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキサオースＩＩおよびラクト−Ｎ−シアリルペンタオースＬＳＴａ、ＬＳＴｂ、ＬＳＴｃから選択されることが好ましい。
【表１−１】
0006360908.tif 000002
【表１−２】
0006360908.tif 000003
【００７９】
本発明の方法の好ましい一実施形態によれば、細胞内で産生されたヌクレオチド活性化糖が、本方法の実施中、ステップｂ）において細胞によって利用される。このヌクレオチド活性化糖は、ＧＤＰ−フコース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびＣＭＰ−シアル酸の少なくとも１つであることが好ましい。
【００８０】
本発明の方法の別の好ましい一実施形態によれば、本方法の実施中、（ヌクレオチドにより活性化されていない）糖が外部から添加される。この糖は、フコース、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびシアル酸から選択される糖であり、細菌宿主細胞内でヌクレオチドにより活性化される。
【００８１】
本発明の一態様によれば、本方法はバッチ式または連続式の全発酵法である。
【００８２】
従って、本発明の一態様である連続式全発酵法では、宿主細胞の培養ステップにおいて、炭素源は培地に継続的に添加される。培養ステップにおいて炭素源を継続的に添加することによって、安定的かつ効率的にオリゴ糖を製造することができる。
【００８３】
別の一態様によれば、本発明の方法は、流加発酵法であるか流加発酵法を含む方法であり、流加発酵法は、培地を希釈することなく基質が添加される液量一定流加培養、または基質の添加により発酵時間とともに発酵液量が変化する液量可変流加培養である。
【００８４】
本発明の一実施形態において、細菌宿主細胞は、β−ガラクトシダーゼ、Ｌ−フコースイソメラーゼ、Ｌ−フクロースキナーゼおよびＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスフェラーゼをコードする遺伝子が欠損した細胞または該遺伝子を非調節（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）状態で含む細胞となるように、さらに形質転換されていることがより好ましい。
【００８５】
この実施形態においては、単糖類の細胞内分解およびコラン酸産生が抑制され、β−ガラクトシダーゼの場合には受容体分子が分解されないという利点がある。
【００８６】
別の好ましい一実施形態によれば、オリゴ糖の製造方法においてグリコシダーゼを利用して、所望のオリゴ糖の製造時に生じた、不要かつ／または妨げとなる物質、例えば、副産物、未反応の出発基質および中間生成物を分解する。グリコシダーゼを用いることによって、例えば、所望のオリゴ糖の合成時に同じ微生物内で生成された、所望のオリゴ糖の精製工程の妨げとなる別の（オリゴ）糖類を代謝により分解することができる。
【００８７】
１種以上のグリコシダーゼを、本発明の製造方法の最後に、外部から培養物に添加してもよい。これはグリコシダーゼをコードする宿主微生物の内在遺伝子が不活性化されていたり欠損している場合に特に好ましい。また、グリコシダーゼは、前記宿主微生物によって内因的に生成されるものであってもよい。内因的に生成される該グリコシダーゼをコードする核酸配列は、前記宿主細胞に天然に存在するものではなく、前記宿主細胞は、該宿主細胞に天然に存在しないグリコシダーゼを発現するよう安定的に形質転換されたものであり、宿主微生物内における該グリコシダーゼの発現は、誘導可能なものである。
【００８８】
この実施形態では、オリゴ糖を産生する微生物において、非調節状態にあったβ−ガラクトシダーゼなどのグリコシダーゼが、例えば温度や基質による外部からの誘導により、内因的（遺伝子がゲノム上に存在する）に発現される。これは、グリコシダーゼが所望のオリゴ糖の合成時においては非調節状態にあるが、発酵過程の最後に、例えば温度（変化）またはテトラサイクリンなどの誘導物質を添加することによってグリコシダーゼの発現誘導が可能であることを意味する。グリコシダーゼの発現誘導は、宿主微生物の培養で十分な量および／または本質的に最大量のオリゴ糖が産生された後に行われる。次いで、発現誘導されたグリコシダーゼにより、不要な糖中間体や基質などが分解され、所望のオリゴ糖の精製を妨げたり困難にする糖中間体や基質が本質的に存在しない培地が得られる。発現を誘導する適切な手段は先行技術においていくつか知られており（例えば上記のＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９を参照のこと）、当業者は所望のオリゴ糖にそれぞれ適した手段を利用することができるであろう。
【００８９】
本明細書において、遺伝子に関連した「調節（レギュレート）される」という用語は、遺伝子の発現が制御された方式で調節可能である、例えばアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることを意味し、このような調節されている遺伝子によってコードされ、合成されたタンパク質の量は、例えばダウンレギュレートやアップレギュレートされた状態にない遺伝子などの、調節されていない遺伝子の場合とは異なるものと一般に理解される。
【００９０】
本発明の別の一態様によれば、前記グリコシダーゼは、培地に添加した、該グリコシダーゼを発現する第２の微生物により生成される。
【００９１】
この実施形態において、第２の微生物によって発現されるグリコシダーゼは、該微生物に天然に存在するグリコシダーゼであるか、または該微生物のゲノムに安定的に組み込まれた核酸配列によってコードされるグリコシダーゼである。この実施形態は、オリゴ糖を製造するための連続発酵法において特に適した形態であり、例えば２つの別々の発酵槽または発酵容器が用意され、１つの槽／容器はオリゴ糖の合成反応に使用され、もう一方の槽／容器は基本的に、不要な糖類の分解に用いられる。
【００９２】
上述したように、本発明は、末端にガラクトース−（１→４）−グルコース二糖を含むオリゴ糖を全発酵により製造するための、本明細書に記載の細菌宿主細胞の使用にも関する。
【００９３】
本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、別段の定めがない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味である。全般的に、本明細書で使用される用語、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学や核酸化学、およびハイブリダイゼーションに関する上述した実験手法や以下に記載する実験手法は、当技術分野で周知されており、一般に使用されるものである。
【００９４】
さらなる利点は、各実施形態の説明および添付した図面から理解されるものである。
【００９５】
当然のことながら、上述した特徴および以下に説明する特徴については、個々に明記した組合せだけでなく、本発明の範囲から逸脱しない限りは、他の組合せまたは単独でも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
本発明のいくつかの実施形態を図示し、以下の記載においてより詳細に説明する。各図は以下の通りである。
【００９７】
【図１】本発明の方法の一実施形態の概略を示した図である。Ａは２’−フコシルラクトースの製造、Ｂは３’−シアリルラクトースの製造、Ｃはラクト−Ｎ−ネオテトラオースの製造を示す。
【００９８】
【図２】２’−フコシルラクトース産生Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の培養上清をＨＰＬＣで分析した結果を示した図である。Ａは、スクロースとラクトースの存在下、ＩＰＴＧ非添加で培養した細胞の結果、Ｂは、スクロース存在下で培養した細胞の結果、Ｃは、スクロースとグルコースの存在下で培養した細胞の結果、Ｄは、スクロースを含有する無機塩培地中で培養した休止細胞の結果、Ｅは、グルコースを含有する無機塩培地中で培養した休止細胞の結果である。
【００９９】
【図３】ラクト−Ｎ−ネオテトラオース産生Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株の培養抽出物をＴＬＣで分析した結果を示した図である。Ａは、グルコース存在下で培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）１０４６（４）の培養抽出物の結果、Ｂは、グルコース存在下で培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４  ｐＣＤＦ−ｇａｌＥ  ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｌｅｘ１とＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４  ｐＣＤＦ−ｇａｌＥ  ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｌｇｔＢの培養抽出物の結果である。ＬＮｎＴ。
【０１００】
【図４】本発明により製造されうるオリゴ糖の一覧（表１）である。
【０１０１】
【図５】本発明の細菌宿主細胞において典型例として用いられる配列／プラスミドの模式図を示す。ＡはＰｔｅｔ−ｌａｃＹ−ＦＲＴ−ａｄｄ１−ＦＲＴ（添付配列表の配列番号１）、ＢはＰｔｅｔ−ｗｂｇＬ−ＦＲＴ−ｎｅｏ−ＦＲＴ（添付配列表の配列番号２）、ＣはＰｔｅｔ−ｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ（添付配列表の配列番号３）、ＤはＰｔｅｔ−ｍａｎＣＢ，ＰＴ５−ｇｍｄ−ｗｃａＧ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ（添付配列表の配列番号４）、ＥはｃｓｃＢＫＡＲ（添付配列表の配列番号５）、ＦはｇａｌＭＫＴＥ（添付配列表の配列番号６）、ＧはｐＣＤＦ−ｇａｌＥ（添付配列表の配列番号７）、ＨはｐＤＥＳＴ−ｌｇｔＢ（添付配列表の配列番号８）、ＩはＰｔｅｔ−ｌｇｔＡ−ＰＴ５−ｇａｌＴ−ＦＲＴ−ｋａｎＲ−ＦＲＴ（添付配列表の配列番号９）、ＪはＰｔｅｔ−ｇｌｍＵＭ−ＰＴ５−ｇｌｍＳ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ（添付配列表の配列番号１０）、ＫはＰＴ５−ｌｇｔＢ−ＦＲＴ−ｔｅｔＲ−ＦＲＴ（添付配列表の配列番号１１）、ＬはＰｔ５−ｇａｌＥ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ  ＦＲＴ（添付配列表の配列番号１２）、ＭはｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｌｇｔＢ（添付配列表の配列番号１３）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
図１に、代表的なオリゴ糖を製造するための、本発明の方法と本発明の典型的な細菌宿主細胞とを用いた全発酵の典型的な経路を示す。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃにおいて、参照番号１００は、目的とする各オリゴ糖に関して、本発明によって遺伝子組換えされた、典型的な細菌宿主細胞を示す。
【０１０３】
図１Ａは、２’−フコシルラクトースの模式的な製造、すなわち全発酵による製造を示しており、この図では、典型的な炭素源としてスクロースが用いられていることがわかる。スクロース透過酵素（１）により、スクロースは宿主細胞に取り込まれる、あるいは内包化される。細菌宿主細胞内で、スクロースはインベルターゼ（２）によってフルクトースとグルコースに分解される。生成したフルクトースはフルクトキナーゼ（４）によってリン酸化されてフルクトース−６−リン酸となり、フルクトース−６−リン酸はホスホヘキソースイソメラーゼ（５）によってグルコース−６−リン酸に変換されうる。次に、ホスホグルコムターゼ（６）によってグルコース−１−リン酸に変換され、さらにグルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（７）によってＵＤＰ−グルコースに変換される。生成したＵＤＰ−グルコースは、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ（８）と呼ばれる酵素による触媒反応により、ＵＤＰ−ガラクトースとなる。そして、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（３）が、ＵＤＰ−ガラクトース＋グルコース→ＵＤＰ＋ラクトースの反応を触媒する。
【０１０４】
その結果、細胞内で産生されたラクトースがさらに変換されて、オリゴ糖産生の原料として用いられる（上記例を参照）。図１に示す実施形態において、ラクトースは、ＧＤＰ−フコースを供与体基質とするα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ（１４）と呼ばれる酵素によって変換され、最終生成物である２’−フコシルラクトースとなる。
【０１０５】
ＵＤＰ−フコースは細胞内で産生されたものであってもよく、添加されたものであってもよい。マンノースリン酸イソメラーゼ（９）と呼ばれる酵素が、フルクトース−６−リン酸からマンノース−６−リン酸への変換を触媒し、生成したマンノース−６−リン酸は、ホスホマンノムターゼ（１０）と呼ばれる酵素によりマンノース−１−リン酸に変換される。マンノース−１−リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（１１）と呼ばれる酵素が、マンノース−１−リン酸からＧＤＰ−マンノースへの変換を触媒し、生成したＧＤＰ−マンノースは、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（１２）によってＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースに変換される。次いで、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（１３）がＧＤＰ−フコースへの反応を触媒し、生成したＧＤＰ−フコースは上述の通り、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ（１４）と呼ばれる酵素の供与体基質として利用される。そして、このようにして細胞内で産生された２’−フコシルラクトースは、排出輸送体または透過酵素（１５）によって排出される。
【０１０６】
図１Ｂは、本発明の方法と本発明の典型的な細菌宿主細胞とを用いた３’−シアリルラクトースの模式的な製造、すなわち全発酵による製造を示している。この製造においては、以下の酵素を用いる：（１）スクロース透過酵素、（２）インベルターゼ、（３）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、（４）フルクトキナーゼ、（５）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、（６）ホスホグルコムターゼ、（７）グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、（８）ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ、（９）Ｌ−グルタミン：Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ、（１０）ホスホグルコサミンムターゼ、（１１）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、（１２）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ、（１３）シアル酸シンターゼ、（１４）ＣＭＰ−シアル酸シンテターゼ、（１５）α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ、（１６）糖排出トランスポーター、（１７）グルコサミン−６−リン酸−アセチルトランスフェラーゼ、（１８）ホスファターゼ、（１９）Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ。
【０１０７】
図１Ｃは、本発明の方法と本発明の典型的な細菌宿主細胞とを用いたラクト−Ｎ−ネオテトラオースの模式的な製造、すなわち全発酵による製造を示している。この製造においては、以下の酵素を用いる：（１）スクロース透過酵素、（２）スクロース−６−リン酸加水分解酵素、（３）β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、（４）フルクトキナーゼ、（５）グルコースリン酸イソメラーゼ、（６）ホスホグルコムターゼ、（７）グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、（８）ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ、（９）Ｌ−グルタミン：Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ、（１０）ホスホグルコサミンムターゼ、（１１）Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ、（１２）β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ。
【０１０８】
上述した通り、本発明の細菌宿主細胞は、先に定義したβ−１，４，ガラクトシルトランスフェラーゼとグリコシルトランスフェラーゼ以外に、本明細書で述べた図１Ａ〜１Ｃに示す酵素のうち少なくとも１つ、すなわち１つ以上を含むように形質転換されてもよい。
【０１０９】
実施例１
【０１１０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ２’−フコシルラクトース産生菌株の作製
【０１１１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いて、２’−フコシルラクトース産生菌株を構築した。代謝工学技術として、特定の遺伝子の突然変異誘発と欠損、および異種遺伝子のゲノムへの組み込みを行った。
【０１１２】
遺伝子ｌａｃＺとａｒａＡを、Ellisら、“High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6742-6746 (2001)に記載のミスマッチオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発により不活性化した。
【０１１３】
ゲノム欠損は、DatsenkoおよびWarner（“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)）の方法に従って行った。Ｌ−フコースの細胞内分解を防ぐために、Ｌ−フコースイソメラーゼをコードする遺伝子（ｆｕｃＩ）とＬ−フクロースキナーゼをコードする遺伝子（ｆｕｃＫ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムから欠損させた。また、ｗｚｘＣ−ｗｃａＪ遺伝子も欠損させた。ｗｃａＪは、コラン酸合成における第１ステップを触媒するＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスフェラーゼをコードする遺伝子と考えられており（Stevensonら、“Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colonic acid”, J. Bacteriol. 178:4885-4893; (1996））、コラン酸の産生は、ＧＤＰ−フコースの利用においてフコシルトランスフェラーゼによる反応と競合する。さらに、Ｎ−アセチル−グルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼとグルコサミン−６−リン酸デアミナーゼをそれぞれコードする遺伝子ｎａｇＡとｎａｇＢも除去した。
【０１１４】
異種遺伝子のゲノムへの組み込みは転位により行った。転位は、ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭトランスポーゼース（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国）を用いて直鎖状ＤＮＡ−フラグメントを組み込む方法、またはマリナートランスポーゼースＨｉｍａｒ１の高活性Ｃ９−変異体（Lampeら、“Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11428-11433 (1999)）を用いた方法により行った。ＥＺ−Ｔｎ５トランスポゾンを作製するために、目的とする遺伝子を、ＦＲＴ部位に挟まれた抗生物質耐性カセットと共に、プライマー１１１９および１１２０を用いて増幅した（使用したすべてのプライマーを表３に示す）。得られたＰＣＲ産物は、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポーゼースの１９ｂｐのＭｏｓａｉｃ  Ｅｎｄ認識部位を両端に有していた。Ｈｉｍａｒ１トランスポーゼースを用いた組み込みを行うために、目的とするオペロンを、ＦＲＴ部位に挟まれた抗生物質耐性カセットと共に、ベクターｐＥｃｏｍａｒにクローニングした。トランスポーゼースは、ｐＥｃｏｍａｒにコードされており、ＰａｒａＢの制御下に配置されている。ＥＺ−Ｔｎ５トランスポゾン＜Ｐｔｅｔ−ｌａｃＹ−ＦＲＴ−ａａｄＡ−ＦＲＴ＞（配列表の配列番号１）、＜Ｐｔｅｔ−ｗｂｇＬｃｏ−ＦＲＴ−ｎｅｏ−ＦＲＴ＞（配列表の配列番号２）および＜Ｐｔｅｔ−ｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ＞（配列表の配列番号３）を、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポーゼースを介して組み込んだ。
【０１１５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＴＧ１のラクトースインポーターＬａｃＹ（登録番号：ＡＢＮ７２５８３）の遺伝子が組み込まれたのを確認した後、プラスミドｐＣＰ２０にコードされたＦＬＰリコンビナーゼによりストレプトマイシン耐性クローンから耐性遺伝子を除いた（DatsenkoおよびWarner、“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)）。
【０１１６】
Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｏ１２６のα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｗｂｇＬ（登録番号：ＡＤＮ４３８４７）については、Ｅ．ｃｏｌｉ発現用にコドン最適化したものを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ（米国）に合成を委託して得た。Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ  ＡＴＣＣ  ４３９７０の、メジャーファシリテータースーパーファミリーに属する糖排出トランスポーターをコードする遺伝子ｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０（登録番号：ＥＥＱ０８２９８）については、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ（米国）に合成を委託し、ＥＺ−Ｔｎ５＜Ｐｔｅｔ−ｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ＞トランスポゾンとして挿入した。
【０１１７】
ＧＤＰ−フコースのデノボ合成を促進させるために、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＤＨ５αのホスホマンノムターゼをコードする遺伝子（ｍａｎＢ）、マンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｍａｎＣ）、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼをコードする遺伝子（ｇｍｄ）およびＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼをコードする遺伝子（ｗｃａＧ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株内で過剰発現させた。オペロンｍａｎＣＢはＰｔｅｔの制御下にあり、オペロンｇｍｄ、ｗｃａＧはＰＴ５プロモーターから転写される。マリナー様因子Ｈｉｍａｒ１トランスポーゼースにより特異的に認識される末端逆位配列に挟まれたトランスポゾンカセット＜Ｐｔｅｔ−ｍａｎＣＢ−ＰＴ５−ｇｍｄ，ｗｃａＧ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞配列番号４は、ｐＥｃｏｍａｒ  Ｃ９−ｍａｎＣＢ−ｇｍｄ，ｗｃａＧ−ｄｈｆｒから挿入した。
【０１１８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗのｃｓｃ遺伝子クラスター（登録番号：ＣＰ００２１８５．１）（配列表の配列番号５）は、スクロース透過酵素、フルクトキナーゼ、スクロース加水分解酵素、転写抑制因子の４つの遺伝子（それぞれ遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡおよびｃｓｃＲ）を含み、これらの遺伝子によって、菌株はスクロースを唯一の炭素源として増殖できるようになる。ｐＥｃｏｍａｒ−ｃｓｃＡＢＫＲプラスミドを用いた転位により、このｃｓｃクラスターをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムに組み込んだ。
【０１１９】
プライマー６０５と６０６を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＴＧ１からｇａｌオペロン（ｇａｌＥＴＫＭ）（配列表の配列番号６）を増幅し、ｒｅｄリコンビナーゼヘルパープラスミドｐＫＤ４６を用いて促進される相同組換えによりＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のｇａｌＭ  ｙｂｈＪ遺伝子座に挿入した（DatsenkoおよびWarner、“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)）。
【０１２０】
プラスミドの構築
【０１２１】
ｐＣＤＦ−ｇａｌＥ（配列表の配列番号７）：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマー１１６３および１１６２を用いてｇａｌＥを増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断し、同じ酵素で切断したベクターｐＣＤＦ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の第２のマルチクローニングサイトに連結した。
【０１２２】
ｐＤｅｓｔ−ｌｇｔＢ（配列表の配列番号８）：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓのβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子ｌｇｔＢを、ゲートウェイ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりベクターｐＤＥＳＴ１４にクローニングした。
【０１２３】
【表２】
0006360908.tif 000004
【０１２４】
【表３】
0006360908.tif 000005
【０１２５】
休止細胞による２’−フコシルラクトースの製造
【０１２６】
プラスミドｐＣＤＦ−ｇａｌＥおよびｐＤＥＳＴ−ｌｇｔＢを保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）８７８を、１００μｇｍｌ−１のアンピシリンと５０μｇｍｌ−１のストレプトマイシンを含有する２ＹＴ培地中、３０℃で培養した。一晩培養して得られた培養物を、同じ抗生物質を含有する３００ｍｌの新たな２ＹＴ培地に０．３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度で植菌した。細胞を、ＯＤ６６０ｎｍが０．３になるまで３０℃で培養し、０．３５ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより、ｇａｌＥとｌｇｔＢの遺伝子発現を誘導した。３０℃で５時間培養した後、遠心分離により細胞を無菌的に採取し、上記の抗生物質と、炭素源として２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースまたはグルコースとを含む、５０ｍｌの無菌無機塩培地（Samainら、“Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harbouring different combinations of nod genes”, J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)）に再懸濁した。細胞を２５℃で４日間培養した。
【０１２７】
上清に分泌された２’−フコシルラクトースをＨＰＬＣで分析した。
【０１２８】
ｇａｌＥとｌｇｔＢの過剰発現による２’−フコシルラクトースの発酵生産
【０１２９】
プラスミドｐＣＤＦ−ｇａｌＥおよびｐＤＥＳＴ−ｌｇｔＢを保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）８７８を、１００μｇｍｌ−１のアンピシリン、５０μｇｍｌ−１のストレプトマイシン、炭素源として２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロース、または１．６％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースと０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグルコースを含有する無機塩培地（Samainら、“Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harbouring different combinations of nod genes”, J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)）中、３０℃で培養した。培養物のＯＤ６６０ｎｍが０．３になった時点で、０．３５ｍＭのＩＰＴＧを添加して、ｇａｌＥとｌｇｔＢの遺伝子発現を誘導した。誘導後、細胞を２５℃で４日間培養した。
【０１３０】
対照として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）８７８を、炭素源として２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースを含有する無機塩培地中で培養した。ＯＤ６６０ｎｍが０．５になった時点で、１０ｍＭのラクトースを加えた。細胞を３０℃で２日間培養した。
【０１３１】
上清に分泌された２’−フコシルラクトースをＨＰＬＣで分析した。
【０１３２】
ＨＰＬＣによる培養上清の分析と２’−フコシルラクトースの検出
【０１３３】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）とＲｅｐｒｏＳｉｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ、５μｍ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を備えたＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）を用いて行った。一定組成のアセトニトリル：Ｈ２Ｏ（６８／３２（ｖ／ｖ））を溶離液とし、３５℃、流速１．４ｍｌ／分で溶出を行った。カラムへの試料の注入量は４０μｌとした。試料は、あらかじめろ過（孔径０．２２μｍ）して、イオン交換マトリックス（Ｓｔｒａｔａ  ＡＢＷ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いた固相抽出により清澄化を行ったものである。
【０１３４】
ＨＰＬＣ分析の結果を図２に示す。図２は、２’−フコシルラクトース産生Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）８７８  ｐＣＤＦ−ｇａｌＥ  ｐＤＥＳＴ−ｌｇｔＢの培養上清のＨＰＬＣ分析結果を示している。図２Ａは、スクロースとラクトースの存在下、ＩＰＴＧを添加せずに培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）８７８  ｐＣＤＦ−ｇａｌＥ  ｐＤＥＳＴ−ｌｇｔＢの結果、図２Ｂは、スクロースを用いて培養した細胞の結果、図２Ｃは、スクロースとグルコースを用いて培養した細胞の結果をそれぞれ示しており、ｇａｌＥとｌｇｔＢの発現は、ＯＤ６６０ｎｍが０．３になった時点で、０．３５ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより誘導した。
【０１３５】
図２Ｄと２Ｅは、休止細胞のＨＰＬＣ分析の結果を示している。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）８７８  ｐＣＤＦ−ｇａｌＥ  ｐＤＥＳＴ−ｌｇｔＢ細胞を２ＹＴ培地で予備培養し、０．３５ｍＭのＩＰＴＧで誘導を行った。細胞を採取した後、スクロース（図２Ｄ）またはグルコース（図２Ｅ）を含有する無機塩培地で培養した。
【０１３６】
図２のＨＰＬＣ分析から明らかなように、上述した典型的な実施形態における最終生成物、すなわち２’−フコシルラクトースは、スクロースを用いた本発明の細菌宿主細胞の発酵、スクロースとグルコースを用いた本発明の細菌宿主細胞の発酵、スクロースを用いた休止細胞の発酵およびグルコースを用いた休止細胞の発酵により、効率的に産生された。
【０１３７】
実施例２
【０１３８】
細胞外ラクトース非添加における、ｇａｌＥとβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの過剰発現による、組換えＥ．ｃｏｌｉ菌株のＬＮｎＴ産生
【０１３９】
Ｅ．ｃｏｌｉラクト−Ｎ−ネオテトラオース産生菌株の作製
【０１４０】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いて、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）産生菌株を構築した。代謝工学技術として、特定の遺伝子の突然変異誘発と欠損、および異種遺伝子のゲノムへの組み込みを行った。
【０１４１】
遺伝子ｌａｃＺとａｒａＡを、Ellisら、“High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6742-6746 (2001)に記載のミスマッチオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発により不活性化した。
【０１４２】
ゲノム欠損は、DatsenkoおよびWarner（“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)）の方法に従って行った。Ｎ−アセチルグルコサミンの細胞内分解を防ぐために、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼをコードする遺伝子（ｎａｇＡ）とグルコサミン−６−リン酸デアミナーゼをコードする遺伝子（ｎａｇＢ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムから欠損させた。また、ｗｚｘＣ−ｗｃａＪ遺伝子も欠損させた。ｗｃａＪは、コラン酸合成における第１ステップを触媒するＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸トランスフェラーゼをコードする遺伝子である（Stevensonら、“Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colonic acid”, J. Bacteriol. 178:4885-4893; (1996)）。さらに、Ｌ−フコースイソメラーゼとＬ−フクロースキナーゼをコードする遺伝子ｆｕｃＩとｆｕｃＪもそれぞれ除去した。
【０１４３】
異種遺伝子のゲノムへの組み込みは転位により行った。転位は、ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭトランスポーゼース（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国）を用いて直鎖状ＤＮＡ−フラグメントを組み込む方法、またはマリナートランスポーゼースＨｉｍａｒ１の高活性Ｃ９−変異体（Lampeら、“Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11428-11433 (1999)）を用いた方法により行った。ＥＺ−Ｔｎ５トランスポゾンを作製するために、目的とする遺伝子を、ＦＲＴ部位に挟まれた抗生物質耐性マーカーと共に、プライマー１１１９および１１２０を用いて増幅した（使用したすべてのプライマーを表５に示す）。得られたＰＣＲ産物は、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポーゼースの１９ｂｐのＭｏｓａｉｃ  Ｅｎｄ認識部位を両端に有していた。Ｈｉｍａｒ１トランスポーゼースを用いた組み込みを行うために、目的とする発現構築物（オペロン）を、ＦＲＴ部位に挟まれた抗生物質耐性マーカーと共に、ｐＥｃｏｍａｒベクターに同様にクローニングした。マリナートランスポーゼースＨｉｍａｒ１の高活性Ｃ９−変異体は、ｐＥｃｏｍａｒベクターにコードされており、アラビノース誘導性プロモーターＰａｒａＢの制御下に配置されている。
【０１４４】
発現フラグメント＜Ｐｔｅｔ−ｌａｃＹ−ＦＲＴ−ａａｄＡ−ＦＲＴ＞と＜Ｐｔ５−ｇａｌＥ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ＞（配列表の配列番号１２）を、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポーゼースを用いて組み込んだ。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＴＧ１のラクトースインポーターＬａｃＹ（登録番号：ＡＢＮ７２５８３）の遺伝子が組み込まれたのを確認した後、プラスミドｐＣＰ２０にコードされたＦＬＰリコンビナーゼによりストレプトマイシン耐性クローンから耐性遺伝子を除いた（DatsenkoおよびWarner、“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ＭＣ５８のＮ−アセチルグルコサミングリコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｌｇｔＡ（登録番号：ＮＰ＿２７４９２３）については、Ｅ．ｃｏｌｉ発現用にコドン最適化したものを遺伝子合成により作製した。同様に遺伝子合成により作製した、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｇａｌＴ（登録番号：ＮＰ＿４１５２７９）と共に、ｌｇｔＡを、プラスミドｐＥｃｏｍａｒ−ｌｇｔＡ−ｇａｌＴを用いた転位により挿入した（配列表の配列番号９）。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンのデノボ合成を促進させるために、Ｌ−グルタミン：Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｇｌｍＳ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のホスホグルコサミンムターゼをコードする遺伝子（ｇｌｍＭ）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン−１−リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｇｌｍＵ）（それぞれ登録番号：ＮＰ＿４１８１８５、ＮＰ＿４１７６４３、ＮＰ＿４１８１８６）をコドン最適化したものを遺伝子合成により作製した。オペロンｇｌｍＵＭを、構成型テトラサイクリン系プロモーターＰｔｅｔの制御下にクローニングし、またｇｌｍＳを構成型ＰＴ５プロモーターの制御下にクローニングした。マリナー様因子Ｈｉｍａｒ１トランスポーゼースにより特異的に認識される末端逆位配列に挟まれたトランスポゾンカセット＜Ｐｔｅｔ−ｇｌｍＵＭ−ＰＴ５−ｇｌｍＳ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞（配列表の配列番号１０）を、ｐＥｃｏｍａｒ−ｇｌｍＵＭ−ｇｌｍＳから挿入した。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ＭＣ５８のβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ｌｇｔＢ（登録番号：ＮＰ＿２７４９２２）については、Ｅ．ｃｏｌｉ発現用にコドン最適化したものを合成により作製した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）へのゲノムへの組み込みは、プラスミドｐＥｃｏｍａｒ−ｌｇｔＢからのカセット＜Ｐｔ５−ｌｇｔＢ−ＦＲＴ−ｔｅｔＲ−ＦＲＴ＞（配列表の配列番号１１）の転位により行った。さらに、ＵＤＰ−ガラクトース合成を促進させるために、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＤＨ５αのＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子ｇａｌＥを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株内で過剰発現させた。
【０１４５】
プライマー６０５と６０６を用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＴＧ１からｇａｌオペロン（ｇａｌＥＴＫＭ）を増幅し、ｒｅｄリコンビナーゼヘルパープラスミドｐＫＤ４６を用いて促進される相同組換えによりＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のｇａｌＭ  ｙｂｈＪ遺伝子座に挿入した（DatsenkoおよびWarner、“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)）。各種異種遺伝子および遺伝子クラスターの配列を別表１に示す。
【０１４６】
プラスミドの構築
【０１４７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＤＨ５αのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマー１１６３と１１６２を用いてｇａｌＥを増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断し、同じ酵素で切断したベクターｐＣＤＦ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の第２のマルチクローニングサイトに連結した。ｇａｌＥは、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターから発現される。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓのβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ｌｇｔＢ（登録番号：ＮＰ＿２７４９２２）とＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＪ８７００のｌｅｘ１（登録番号：ＹＰ＿００３００８６４７）については、コドン最適化したものを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ（米国）に合成を委託して得た。両遺伝子のクローニングは、配列およびライゲーションに依存しないクローニングにより行った（LiおよびElledge、“Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.”, Nat. Methods. 2007 Mar;4(3):251-6. Epub 2007 Feb 11）。従って、アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にｍａｌＥ遺伝子を保有するプラスミドｐＩＮＴを用いて、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするｌｇｔＢ遺伝子またはｌｅｘ１遺伝子とｍａｌＥとのＮ末端融合が可能であった。
【０１４８】
【表４】
0006360908.tif 000006
【０１４９】
【表５】
0006360908.tif 000007
【０１５０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）１０４６のバッチ式発酵
【０１５１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）１０４６を、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグルコースを唯一の炭素源およびエネルギー源として含有する無機塩培地（Samainら、“Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Escherichia coli strains harbouring different combinations of nod genes”, J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)）中、３０℃で４８時間培養した。細胞を採取し、機械的に破砕した。ＬＮｎＴの産生を薄層クロマトグラフィーにより確認した。
【０１５２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４  ｐＣＤＦ−ｇａｌＥ  ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｌｇｔＢ／ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｌｅｘ１のバッチ式発酵
【０１５３】
プラスミドｐＣＤＦ−ｇａｌＥと、ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｌｇｔＢまたはｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｌｅｘ１とを保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４を、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグルコース、１００μｇｍｌ−１のアンピシリンおよび４０μｇｍｌ−１のゼオシンを添加した無機塩培地（Production of O-acetylated and sulphated chitooligosaccharides by recombinant Esche-richia coli strains harbouring different combinations of nod genes”, J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)）中、３０℃で培養した。培養物のＯＤ６６０ｎｍが０．１になった時点で、０．３ｍＭのＩＰＴＧと２００ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリンを添加して、ｇａｌＥ遺伝子とβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘導した。フラスコ内で振とう培養を３０℃で４８時間行った後、細胞を採取し、機械的に破砕した。ＬＮｎＴを薄層クロマトグラフィーにより確認した。
【０１５４】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬｎＮＴ）の検出
【０１５５】
細胞を、ガラスビーズを用いて機械的に破砕した。次いで、試料をＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）にスポットした。移動相にはアセトン：ブタノール：酢酸：水（３５：３５：７：２３）を用いた。
【０１５６】
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース産生Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株の培養抽出物のＴＬＣ分析
【０１５７】
図３に、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース産生Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の培養抽出物をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）で分析した結果を示す。図２Ａは、グルコース存在下で培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）１０４６（４）の培養抽出物の結果を示している。標準物質は以下の通りである：ラクトース（レーン１）、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ（レーン２）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（レーン３）。図３Ｂは、グルコースを用いて培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４  ｐＣＤＦ−ｇａｌＥ  ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｌｅｘ１の培養抽出物の結果（レーン５）と、グルコースを用いて培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４  ｐＣＤＦ−ｇａｌＥ  ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｌｇｔＢの培養抽出物の結果（レーン６）を示している。試料中のＬＮｎＴ生成物をアスタリスクで示す。
【０１５８】
図３に示した結果から、本発明の細胞および方法によりラクト−Ｎ−ネオテトラオースが効率的に製造されることがわかる。
【図１Ａ】
0006360908.tif 000008
【図１Ｂ】
0006360908.tif 000009
【図１Ｃ】
0006360908.tif 000010
【図２】
0006360908.tif 000011
【図３】
0006360908.tif 000012
【図４−１】
0006360908.tif 000013
【図４−２】
0006360908.tif 000014
【図５−１】
0006360908.tif 000015
【図５−２】
0006360908.tif 000016
【図５−３】
0006360908.tif 000017
【図５−４】
0006360908.tif 000018
【図５−５】
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【配列表】
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