(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１枚の乾燥血液ろ紙から複数のライソゾーム病責任酵素活性を迅速に測定する、ライソゾーム病責任酵素の迅速マススクリーニング検査方法であって、該責任酵素が、α-D-galactosidase A（GLA）、酸性α-glucosidase（GAA）及び酸性β-glucosidase（GBA）からなる群より選ばれる酵素であり、以下の工程を含む方法：
（１）乾燥血液ろ紙から共通抽出液（25ｍMのリン酸イオン及び25ｍMのクエン酸イオンを含むpH5.5〜6.5の緩衝液で、0.1ｍM〜5ｍMのDithiothreitol（DTT）、マグネシウムイオン（Mg2+）、0.05％〜0.5％のTritonX-100、及び0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウムを含む）を用いて血液試料を抽出する工程、
（２）抽出した血液試料に、4-Methylumbelliferyl合成基質を含む基質液（クエン酸-リン酸緩衝液）を添加して酵素反応を行わせる工程、
（３）酵素反応により得られた生成物を、励起波長365〜375nm、検出波長460〜470nmの測定波長で蛍光測定する工程。
【請求項２】
前記基質液が、（i）N-アセチルガラクトサミン及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液、（ii）アカルボース及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液並びに（iii）4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（i）における4-Methylumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-α-D-galactopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記（i）における基質液が、pH4.0〜5.0のクエン酸-リン酸ナトリウム緩衝液である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記（ii）における4-Methylumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-α-D-glucopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれ、アカルボースが1μM〜10μMで含まれる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記（ii）における基質液が、pH3.5〜4.5のクエン酸-リン酸カリウム緩衝液である、請求項２又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記（iii）における4-Methylumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-β-D-glucopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれる、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記（iii）における基質液が、pH4.5〜5.5のクエン酸-リン酸ナトリウム緩衝液である、請求項２又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記（iii）における基質液に、タウロデオキシコール酸ナトリウムが類似酵素阻害剤として含まれる、請求項２、７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（２）において、酵素反応の停止を、酵素反応溶液にグリシンを含む共通反応停止液を添加することにより行う、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記共通反応停止液のpHが10〜11である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素反応を25〜45℃の温度で2〜4時間で行う、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
１枚の乾燥血液ろ紙から複数のライソゾーム病責任酵素を同時に抽出する方法であって、共通抽出液（25ｍMのリン酸イオン及び25ｍMのクエン酸イオンを含むpH5.5〜6.5の緩衝液で、0.1ｍM〜5ｍMのDithiothreitol（DTT）、マグネシウムイオン（Mg2+）、0.05％〜0.5％のTritonX-100、及び0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウムを含む）を用いることを含み、該責任酵素がα-D-galactosidase A（GLA）、酸性α-glucosidase（GAA）及び酸性β-glucosidase（GBA）からなる群より選ばれる２以上の酵素である、方法。
【請求項１４】
下記を含む、請求項１に記載の検査方法に使用するためのキット：
（１）乾燥血液ろ紙、
（２）共通抽出液（0.1％TrtionX-100、5ｍM MgCl2、0.5ｍM DTT及び0.05％アジ化ナトリウムを含むpH6.0の25ｍMクエン酸-25ｍMリン酸カリウム緩衝液）、
（３）4-Methylumbelliferyl合成基質を含む基質液、
（４）共通反応停止液（300ｍMグリシン‐NaOH緩衝液（pH10.6））、及び
（５）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する手段。
【請求項１５】
前記合成基質を含む基質液が、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液、ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液及びゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液の組み合わせであり、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液が、3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-garactopyranoside及び100ｍM N-アセチル-D-ガラクトサミンを含むpH4.4の100ｍMクエン酸-200ｍMリン酸ナトリウム緩衝液、ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液が、2.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside及び4.5μMアカルボースを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液、ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液が、3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-β-D−glucopyranoside及び0.3％タウロデオシキコール酸ナトリウムを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸ナトリウム緩衝液である、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライソゾーム病３疾患（ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病）の責任酵素の迅速マススクリーニング検査法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内小器官の一つであるライソゾーム（lysosome；「リソゾーム」、「リソソーム」とも呼ばれる。）は、細胞の中で糖質や糖脂質の分解を行っている。これには約60種類の加水分解酵素が関与しており、それらの責任酵素の欠損・異常によって、ライソゾームの分解機能が発揮されなくなると、本来分解されるべき物質が老廃物として体内に蓄積してしまう。このようにして生じる先天性代謝異常症の総称がライソゾーム病である。欠損している酵素によって症状が異なり、ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病など、約30種類の病名で知られる。
【０００３】
ライソゾーム病は、別の先天性代謝異常症であるフェニルケトン尿症のように、摂取制限で治療できるような必須アミノ酸代謝異常とは異なり、それらの責任酵素は生体内で合成されることから、根治には遺伝子治療が必要である。現在は、酵素補充療法のための薬剤が市販され、多くの場合、酵素補充療法の早期治療開始により、患者のQOL向上や発症の予防など臨床的改善がもたらされる。このため、これらの疾患が新生児マススクリーニング検査によって早期に発見されることが望まれている。
【０００４】
新生児マススクリーニング検査では、血液を染み込ませて乾燥させたろ紙（以下、「乾燥血液ろ紙」という。）を用い、合成基質法による酵素活性を測定する方法が用いられる。他には、タンデム分析装置を用いた酵素活性測定法、専用装置を必要とするものの迅速に測定できるマイクロ流路測定キットなどを用いたパイロットスタディなどが実施されており、新生児マススクリーニング検査の有用性が示されている。
【０００５】
特許文献１には、乾燥体液及び細胞組織試料中に存在するライソゾーム酵素の活性をアッセイするための方法及びキットが記載されている。特許文献１に記載の方法及びキットは、各種ライソゾーム蓄積障害を各疾患ごとに個別にアッセイするものである。
【０００６】
非特許文献１には、乾燥血液ろ紙を用いたファブリー病責任酵素であるα-D-galactosidase A (GAL)の活性測定が、新生児のファブリー病スクリーニングに有効であったことが記載されている。非特許文献１ではGAL酵素のみが単独で測定の対象となっている。
【０００７】
非特許文献２には、乾燥血液ろ紙及び繊維芽細胞中のポンペ病責任酵素であるacid α-glucosidase(GAA)の活性測定が、新生児のポンペ病スクリーニングに有効であること、また試料中のヘモグロビンの影響を回避する方法として水酸化バリウムと硫酸亜鉛を用いる沈殿除去法が有用であったことが記載されている。非特許文献２では、GAA酵素のみが単独で測定の対象となっている。
【０００８】
非特許文献３には、デジタルマイクロ流路測定装置と専用キットを用いたファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病を含むリソソーム蓄積症（LDS）の多重スクリーニングが、新生児マススクリーニングのパイロットスタディで使用されていることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７５６３５９１号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Journal of Human Genetics (2013) 58, 548-552
【非特許文献２】Molecular Genetics and Metabolism 103 (2011) 12-17
【非特許文献３】Dried Blood Spots: Application and Techniques, 2014, 325-331
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、新生児マススクリーニング検査におけるライソゾーム病３疾患（ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病）の責任酵素活性測定を、大規模な測定機器や専用装置を必要とせず、簡便・迅速かつ安価に実施する方法を提供することを目的とする。
【００１２】
新生児マススクリーニング検査は、乾燥血液ろ紙から抽出した試料を測定検体として用いる。従来のライソゾーム病責任酵素活性の測定では、検査対象となる責任酵素毎に抽出液組成が異なり、１枚の乾燥血液ろ紙からは１種類の酵素活性しか測定できず、複数の酵素を測定するには、複数枚の乾燥血液ろ紙が必要であった。また、乾燥血液ろ紙から抽出した試料の酵素活性を測定するためには、酵素反応に20時間以上が必要であり、測定期間として２日間を要していた。
【００１３】
さらに、測定対象の責任酵素により、測定波長、操作手順、反応時間、抽出液組成、及び反応停止液組成が異なるため、多数の検体を同時に測定するためには、責任酵素毎に分析者が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ファブリー病責任酵素、ポンペ病責任酵素、及びゴーシェ病責任酵素の抽出時の酵素活性の低下や酵素活性測定時のpHに影響を及ぼさず、共通で使用できる抽出液（以下、「共通抽出液」という。）の組成を見出した。さらに、当該抽出試料が高感度に測定でき、かつ各基質液組成と共通で使用できる反応停止液（以下、「共通反応停止液」という。）の組成を見出した。
【００１５】
また、酵素活性の測定波長をシフトさせることで、乾燥血液ろ紙からの抽出試料中の蛍光物質や蛍光阻害物質の影響が少なくなることを見出し、それまで測定前に必要であった検体の遠心操作を不要とした。
【００１６】
さらに、各酵素の単位時間当たりの酵素活性は、酵素反応時間が長いほど低下する事実を見出した。さらに、酵素反応時間を従来より短時間にしても十分に測定可能な共通の条件（試料液量、基質液量、反応停止液量、酵素反応時間）を見出したことで、測定操作の作業性を向上させ、１人の分析者でも複数項目の測定を可能とした。
【００１７】
これらの知見に基づいて、１枚の乾燥血液ろ紙から抽出した試料より、ファブリー病責任酵素、ポンペ病責任酵素、及びゴーシェ病責任酵素の酵素活性測定を、同時、高感度、簡便、迅速、効率的かつ安価に検出する方法を見出し、本発明を完成した。
【００１８】
すなわち本発明は、１枚の乾燥血液ろ紙から抽出した試料を３種類の基質液を用いて酵素活性を測定することで、同時に３種のライソゾーム病を検出する方法、及び当該検査方法に使用するためのキットを提供する。ここで、本発明におけるライソゾーム病とは、ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病の３疾患である。
【００１９】
したがって、本発明は以下を含む。
[１]１枚の乾燥血液ろ紙から複数のライソゾーム病責任酵素活性を迅速に測定する、ライソゾーム病責任酵素の迅速マススクリーニング検査方法であって、該責任酵素が、α-D-galactosidase A（GLA）、酸性α-glucosidase（GAA）及び酸性β-glucosidase（GBA）からなる群より選ばれる酵素であり、以下の工程を含む方法：
（１）乾燥血液ろ紙から共通抽出液を用いて血液試料を抽出する工程、
（２）抽出した血液試料に合成基質を含む基質液を添加して酵素反応を行わせる工程、
（３）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する工程。
[２]前記共通抽出液のpHが5.5〜6.5である、[１]に記載の方法。
[３]前記共通抽出液が、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含む緩衝液である、[２]に記載の方法。
[４]前記共通抽出液に、0.1ｍM〜5ｍMのDithiothreitol（DTT）が含まれる、[１]から[３]のいずれか一項に記載の方法。
[５]前記共通抽出液に、マグネシウムイオン（Mg2+）が含まれる、[１]から[４]のいずれか一項に記載の方法。
[６]前記共通抽出液に、0.05％〜0.5％のTritonX-100及び0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウムが含まれる、[１]から[５]のいずれか一項に記載の方法。
[７]前記基質液が、（i）N-アセチルガラクトサミン及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液、（ii）アカルボース及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液並びに（iii）4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液の組み合わせである、[１]から[６]のいずれか一項に記載の方法。
[８]前記（i）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-α-D-galactopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれる、[７]に記載の方法。
[９]前記（i）における基質液のpHが4.0〜5.0である、[７]又は[８]に記載の方法。
[１０]前記（i）における基質液が、クエン酸-リン酸ナトリウム緩衝液である、[７]から[９]のいずれか一項に記載の方法。
[１１]前記（ii）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-α-D-glucopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれ、アカルボースが1μM〜10μMで含まれる、[７]に記載の方法。
[１２]前記（ii）における基質液のpHが3.5〜4.5である、[７]又は[１１]に記載の方法。
[１３]前記（ii）における基質液が、クエン酸-リン酸ナトリウム緩衝液である、[７]、[１１]又は[１２]に記載の方法。
[１４]前記（iii）における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-methylum-belliferyl-β-D-glucopyranosideであり、1ｍM〜10ｍMで含まれる、[７]に記載の方法。
[１５]前記（iii）における基質液のpHが4.5〜5.5である、[７]又は[１４]に記載の方法。
[１６]前記（iii）における基質液が、クエン酸-リン酸ナトリウム緩衝液である、[７]、[１４]又は[１５]に記載の方法。
[１７]前記（iii）における基質液に、タウロデオキシコール酸ナトリウムが類似酵素阻害剤として含まれる、[７]及び[１４]から[１６]のいずれか一項に記載の方法。
[１８]工程（２）において、酵素反応の停止を、酵素反応溶液にグリシンを含む共通反応停止液を添加することにより行う、[１]から[１７]のいずれか一項に記載の方法。
[１９]前記共通反応停止液のpHが10〜11である、[１８]に記載の方法。
[２０]前記酵素反応を、25〜45℃の温度で行った後、前記共通反応停止液を添加する、[１８]又は[１９]に記載の方法。
[２１]前記酵素反応を2〜4時間で行う、[１]から[２０]のいずれか一項に記載の方法。
[２２]前記蛍光測定の測定波長が、励起波長365〜375nm、検出波長460〜470nmである、[１]から[２１]のいずれか一項に記載の方法。
[２３]１枚の乾燥血液ろ紙から複数のライソゾーム病責任酵素を同時に抽出する方法であって、共通抽出液を用いることを含み、該責任酵素がα-D-galactosidase A（GLA）、酸性α-glucosidase（GAA）及び酸性β-glucosidase（GBA）からなる群より選ばれる２以上の酵素である、方法。
[２４]前記共通抽出液のpHが5.5〜6.5である、[２３]に記載の方法。
[２５]前記共通抽出液が、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含む緩衝液である、[２４]に記載の方法。
[２６]前記共通抽出液に、0.1ｍM〜5ｍMのDTTが含まれる、[２３]から[２５]のいずれか一項に記載の方法。
[２７]前記共通抽出液に、マグネシウムイオン（Mg2+）が含まれる、[２３]から[２６]のいずれか一項に記載の方法。
[２８]前記共通抽出液に、0.05％〜0.5％のTritonX-100及び0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウムが含まれる、[２３]から[２７]のいずれか一項に記載の方法。
[２９]下記を含む、[１]に記載の検査方法に使用するためのキット：
（１）乾燥血液ろ紙、
（２）共通抽出液、
（３）合成基質を含む基質液、
（４）共通反応停止液、及び
（５）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する手段。
[３０]前記共通抽出液が、0.1％TrtionX-100、5mM MgCl2、0.5ｍM DTT及び0.05％アジ化ナトリウムを含むpH6.0の25ｍMクエン酸-25ｍMリン酸カリウム緩衝液である、[２９]に記載のキット。
[３１]前記合成基質を含む基質液が、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液、ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液及びゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液の組み合わせであり、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液が、3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-garactopyranoside及び100ｍM N-アセチル-D-ガラクトサミンを含むpH4.4の100ｍMクエン酸-200ｍMリン酸ナトリウム緩衝液、ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液が、2.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside及び4.5μMアカルボースを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液、ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液が、3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-β-D−glucopyranoside及び0.3％タウロデオシキコール酸ナトリウムを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸ナトリウム緩衝液である、[２９]又は[３０]に記載のキット。
[３２]前記共通反応停止液が、300ｍMグリシン-NaOH緩衝液（pH10.6）である、[２９]から[３１]のいずれか一項に記載のキット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、乾燥血液ろ紙の枚数が制限される新生児マススクリーニング検査において、１枚の乾燥血液ろ紙から、ライソゾーム病３疾患（ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病）の酵素活性測定を可能とした。
【００２１】
本発明は、測定条件を共通化させたことで、多数の検体を一度に測定可能とし、検査に要する時間を大幅に短縮させ、これまで２日間要していた検査期間を１日で完了させることを可能とした。さらに、測定者の負担の軽減（省力化）を成し遂げた。
【００２２】
本発明により、検体としての血液が採取しにくい新生児について、既存の新生児代謝異常で使用した乾燥血液ろ紙をそのまま使用することができるようになった。すべての新生児について、３種のライソゾーム病の可能性が検出できれば、未だ臨床症状が現れていない出生後の早期の段階で、酵素補充療法、遺伝子治療、骨髄移植等が実施でき、精神発達の遅れ等をくい止めることができる可能性が高くなる。
【００２３】
さらに本発明は、マススクリーニング検査でのライソゾーム病の検出のみならず、病状の把握、治療方針の決定、治療効果の確認、経過観察、モニタリング、医薬品開発の評価等へも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明での酵素活性測定法を例示したフローチャートである。
【図２】従来の酵素活性測定法を例示したフローチャートである。
【図３】本発明で使用する標準品(4-methylumbelliferone；4MU)の濃度（μM）と蛍光強度(RFU)の関係を示す。本発明測定では検量線として使用した。
【図４】ファブリー病責任酵素（GLA）の酵素活性と反応温度の関係を示す。
【図５】ポンペ病責任酵素（GAA）の酵素活性と反応温度の関係を示す。
【図６】ゴーシェ病責任酵素（GBA）の酵素活性と反応温度の関係を示す。
【図７】ファブリー病責任酵素（GLA）の酵素活性と酵素反応時間の関係を示す。
【図８】ポンペ病責任酵素（GAA）の酵素活性と酵素反応時間の関係を示す。
【図９】ゴーシェ病責任酵素（GBA）の酵素活性と酵素反応時間の関係を示す。
【図１０】新生児約１万例の乾燥血液ろ紙中のGLA酵素活性分布図を示す。矢印は、ファブリー病患者の乾燥血液ろ紙中のGLA酵素活性を示す。
【図１１】新生児約１万例の乾燥血液ろ紙中のGAA酵素活性分布図を示す。矢印は、ポンペ病患者の乾燥血液ろ紙中のGAA酵素活性を示す。
【図１２】新生児約１万例の乾燥血液ろ紙中のGBA酵素活性分布図を示す。矢印は、ゴーシェ病患者の乾燥血液ろ紙中のGBA酵素活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
乾燥血液ろ紙を検体としたライソゾーム病責任酵素活性測定は、乾燥血液ろ紙と基質液を直接混合して酵素反応を行わせる方法や、乾燥血液ろ紙に少量のbufferを添加した後、基質液を添加して反応させる方法、乾燥血液ろ紙から血液を抽出して、抽出した血液試料に基質液を添加して酵素反応を行わせる方法などがある。
【００２６】
本発明は、１枚の乾燥血液ろ紙から、ファブリー病責任酵素（α-D-galactosidase A: 以下、「GLA」と略す。)、ポンペ病責任酵素（酸性α-glucosidase：以下、「GAA」と略す。）及びゴーシェ病責任酵素（酸性β-glucosidase：以下「GBA」と略す。）を含む血液を抽出し、抽出した血液試料を利用して、乾燥血液ろ紙中の３種の酵素活性を測定する方法である。
【００２７】
本発明方法による測定は、（１）乾燥血液ろ紙から共通抽出液を用いて血液試料を抽出する工程、（２）抽出した血液試料に合成基質を添加して、酵素反応を行わせる工程、（３）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する工程の３ステップにより完了する。
【００２８】
血液試料の酵素活性測定では、抽出した血液試料と基質を混合した場合に酵素活性測定に適するpHになるように、抽出液と基質液のどちらか一方で、又は両方で最適pHの緩衝能を持つ組成にする必要があり、測定する酵素毎に抽出液が異なっていた。このため、測定する酵素毎に別々の乾燥血液ろ紙が必要であった。
【００２９】
本発明では、GLA、GAA、及びGBAの酵素活性測定を妨害せず、かつ乾燥血液ろ紙から効果的に各酵素を同時に抽出することができる共通抽出液組成を見出し、１枚の乾燥血液ろ紙から複数の酵素を同時に測定する方法を可能とした。
【００３０】
本発明方法による共通抽出液は、各基質液と混合したときに酵素反応の最適pHを阻害しない低緩衝能の緩衝液が好ましく、より好ましくは、基質液の緩衝能の1/10程度の緩衝能を持つ緩衝液である。共通抽出液のpHは、5.5〜6.5が好ましく、6.0がより好ましい。
【００３１】
本発明方法による共通抽出液は、空気中の酸素による酸化を受けた乾燥血液ろ紙が、抽出でさらなる酸化を受けない組成であることが好まれる。よって、弱酸性域に緩衝能を持つ還元作用のあるクエン酸-リン酸緩衝液が好ましい。また、測定する酵素は、白血球などの血液細胞中のライソゾーム中に存在するため、細胞を破砕し、抽出液中に酵素を遊離させる作用を持つ界面活性剤（TritonX-100など）を共存させることがより好ましい。
【００３２】
本発明による共通抽出液は、測定対象の酵素活性の抑制には働かず、酵素を抽出する過程で目的酵素の活性増強作用を持つ添加物を共存させることで、抽出時の酵素の失活を抑制する作用を持ち、かつ乾燥血液ろ紙からの抽出を促進させる界面活性剤を共存させることが好ましい。界面活性剤は、一般的に作用させる濃度では酵素反応を抑制したり、増強させたりすることがあるため、酵素活性を阻害しない濃度で添加する必要がある。
【００３３】
本発明の共通抽出液は、0.05％〜0.5％のTrtionX-100、1mM〜10mMのMgCl2、0.1mM〜5mMのDithiothreitol（以下、「DTT」と略す。）及び0.02％〜0.1％のアジ化ナトリウムを含む。本発明の一実施形態の共通抽出液の組成は、「0.1％ TrtionX-100、5mM MgCl2、0.5mM DTT、0.05％アジ化ナトリウムを含むpH6.0の25ｍMクエン酸-25ｍMリン酸カリウム緩衝液」である。共通抽出液中のDTTは、GLA及びGAAの酵素反応には影響せず、GBAの酵素活性を増強する。また、MgCl2より提供されるMg2+イオンは、GLAの増強に作用し、リン酸カリウムより提供されるK+イオンはGAAの酵素反応を増強する作用がある。界面活性剤であるTritonX-100は、乾燥血液ろ紙からの血液成分の溶出と血球破砕による酵素の溶出を促進し、抽出時間の短縮のために添加する。各添加剤の濃度は、互いの酵素活性を抑制しない濃度として設定することが好ましい。
【００３４】
本発明による基質液は、それぞれの酵素活性測定に適したpH域で緩衝能を持つ緩衝液を使用することにより、共通抽出液で抽出した血液試料を用いて各酵素の測定が可能となる。
【００３５】
基質液に使用する合成基質は、測定対象酵素の特異基質となる構造を有する基質であることが必要である。そのような合成基質を使用することにより、測定対象酵素との反応特異性を向上させることができる。しかしながら、抽出された血液試料中には、類似反応をする酵素が数多く存在するため、さらに特異性を高める目的で、類似酵素阻害剤を共存させることが好ましい。
【００３６】
ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定に使用する基質液は、1mM〜10mMの4-methylumbelliferyl-α-D-garactopyranoside及び10mM〜200mMのN-アセチル-D-ガラクトサミンを含む。ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定に使用する基質液の一実施形態における組成は、「3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-garactopyranoside及び100ｍM N-アセチル-D-ガラクトサミンを含むpH4.4の100ｍMクエン酸-200ｍMリン酸ナトリウム緩衝液」である。pHは、4.0〜5.0であっても良い。
【００３７】
ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定に使用する基質液は、1mM〜10mMの4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside及び1μM〜10μMのアカルボースを含む。ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定に使用する基質液の一実施形態における組成は、「2.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside、4.5μMアカルボースを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液」である。pHは、3.5〜4.5であっても良い。アカルボースは、血液試料中に含まれるGAA以外のα-glucosidaseの作用を阻害させるために添加する。
【００３８】
ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定に使用する基質液は、1mM〜10mMの4-methylumbelliferyl-β-D−glucopyranoside及び0.1％〜1％のタウロデオシキコール酸ナトリウムを含む。ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定に使用する基質液の一実施形態における組成は、「3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-β-D−glucopyranoside、0.3％タウロデオシキコール酸ナトリウムを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸ナトリウム緩衝液」である。pHは、4.5〜5.5であっても良い。
【００３９】
ゴーシェ病用基質液に添加される類似酵素阻害剤は、タウロコール酸ナトリウムが一般的に使用されているが、タウロコール酸ナトリウムよりもGBA酵素活性増強に効果があるタウロデオキシコール酸ナトリウムを使用することで、低濃度の試料のGBA活性が測定可能となる。
【００４０】
各酵素反応により生成する共通の反応生成物は、アルカリ域に強い蛍光を発する4-methylumbelliferone（以下「4MU」と略す。）であり、この4MUの蛍光強度を測定する。4MUは、pH９〜11のアルカリ域で最も強い蛍光を発するため、共通反応停止液を添加した後の反応液のpHをアルカリ側にシフトさせることが好ましい。しかしながら、各酵素反応においてpHが異なること、及び基質液はアルカリ域に強い緩衝能を持つことから、共通反応停止液は、それらの影響を受けないよう、高濃度のアルカリ緩衝液とすることがより好ましい。
【００４１】
本発明における共通反応停止液は、100ｍM〜500ｍMのグリシン-NaOH緩衝液（pH8〜11）である。この共通反応停止液組成を使用することにより、酵素反応を停止させると共に反応生成物（4MU）の蛍光を増強させて測定することができる。4MUは、pH8を超えるアルカリ域では、360nm付近の紫外線を吸収して、450nm付近に最大蛍光強度を持つ蛍光を発する。よって、共通反応停止液のpHは、8以上が好ましく、より好ましくは9以上であり、10〜11がさらに好ましい。本発明の一実施形態で使用可能な共通反応停止液の組成は、最も好ましくは「300ｍMグリシン-NaOH緩衝液（pH10.6）」である。
【００４２】
乾燥血液ろ紙抽出物には、ヘモグロビンなどの4MU蛍光測定を妨害する色素蛋白や、紫外線を吸収して4MU励起効率を阻害する核酸成分などが含まれる。本発明では、血液成分を含む反応液での測定で、血液成分の阻害を少なくした状態で4MUを測定するために、測定の波長を4MUの最大励起と最大蛍光波長を意図的にシフトさせて測定する。
【００４３】
この励起波長と測定波長のシフトにより、これまで蛍光を測定する前に必要であった遠心による蛍光阻害物質の分離工程と測定用プレートへの試料の移注作業を削減することができ、測定操作の簡便性が向上した。
【００４４】
本発明での一実施形態での測定波長は、励起波長365〜375nmと検出波長460〜470nmの組合せであり、より好ましくは、励起波長370nｍと検出波長465nmの組み合わせである。この測定波長の組み合わせを各酵素測定共通で使用することにより、１台の蛍光リーダーで各酵素活性を同一マイクロプレート上に配置した場合でも測定可能となった。
【００４５】
酵素活性は、乾燥血液ろ紙１枚当たりの単位時間に得られる4MU産生量として計算する。4MU産生量は、4MU標準品の蛍光強度と抽出試料の蛍光強度を比較して算出する。また、酵素活性は、以下の計算式により算出する。
酵素活性（pmol/hr/disk)＝抽出試料の4MU量(μM)×抽出試料量（μL）÷酵素反応時間（hr）×（乾燥血液ろ紙１枚当たりの抽出液量（μL）÷抽出試料量（μL））
【００４６】
本発明での一実施形態での測定操作は、乾燥血液ろ紙１枚をマイクロプレートのwell内に入れ、100μLの共通抽出液を添加して、１時間の抽出反応を行わせる。抽出された血液試料は、20μLずつ別のマイクロプレートにwell to wellで移注し、そこに各基質液を40μL添加して、25℃〜45℃で2時間〜24時間反応させる。
【００４７】
酵素反応温度は、３種の責任酵素で挙動が異なる。GAAとGBAは37℃付近、GAAは45℃付近が最も活性が高い。よって、共通で使用する温度条件としては、35〜45℃が好ましく、より好ましくは37℃付近である。
【００４８】
酵素反応時間は一般的に24時間であるが、測定酵素により挙動が異なるため、本測定系の場合、2〜4時間での酵素活性が、24時間反応させた場合より高活性を示す。よって、共通で使用する条件としては、2〜4時間が好ましい。酵素反応終了後、各反応液には、共通反応停止液を200μL添加して酵素反応を停止させる。蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光を測定し、4MU標準品の蛍光強度と比較して酵素活性を算出する。
【００４９】
本発明はまた、本発明の検査方法に使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、以下の構成を含む：
（１）乾燥血液ろ紙、
（２）共通抽出液、
（３）合成基質を含む基質液、
（４）共通反応停止液、及び
（５）酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する手段。
【００５０】
本発明のキットに含まれる前記共通抽出液は、最も好ましくは、0.1％TrtionX-100、5ｍM MgCl2、0.5ｍM DTT及び0.05％アジ化ナトリウムを含む。
【００５１】
本発明のキットに含まれる前記合成基質を含む基質液は、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液、ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液及びゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液の組み合わせであり、最も好ましくは、ファブリー病を検出するためのGLA酵素活性測定用の基質液が、3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-garactopyranoside及び100ｍM N-アセチル-D-ガラクトサミンを含むpH4.4の100ｍMクエン酸-200ｍMリン酸ナトリウム緩衝液であり、ポンペ病を検出するためのGAA酵素活性測定用の基質液が、2.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside及び4.5μMアカルボースを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液であり、ゴーシェ病を検出するためのGBA酵素活性測定用の基質液が、3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-β-D−glucopyranoside及び0.3％タウロデオシキコール酸ナトリウムを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸ナトリウム緩衝液である。
【００５２】
本発明のキットに含まれる前記共通反応停止液は、最も好ましくは、300ｍMグリシン-NaOH緩衝液（pH10.6）である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５３】
乾燥血液ろ紙を検体としてGLA、GAA、及びGBAの酵素活性を酵素反応の温度を変えて検出を試みた。
（１）検体、試薬等
本実施例において用いた検体、試薬等は以下のとおりである。
［検体及び標準品］
検体：正常人ヒト乾燥血液ろ紙（新生児72名の各乾燥血液ろ紙）、及びcontrol乾燥血液ろ紙（３種）
・4MU標準品：4-methylumbelliferone（SIGMA-ALDRICH社製、Product No.M1381）
【００５４】
［合成基質］
・4-methylum-belliferyl-α-D-galactopyranoside（SIGMA-ALDRICHI社製、Product No. M7633）
・4-methylum-belliferyl-α-D-glucopyranoside（SIGMA-ALDRICHI社製、Product No. M9766）
・4-methylum-belliferyl-β-D-glucopyranoside（SIGMA-ALDRICHI社製、Product No. M3633）
【００５５】
［酵素阻害剤］
・N-アセチル-D-ガラクトサミン：和光純薬社製（Product No. 013-1282）
・アカルボース：和光純薬社製（Product No. 019-22671）
・タウロデオキシコール酸ナトリウム（Sodium taurodeoxycholate hydrate）：SIGMA-ALDRICHI社製（Product No. T0557P）
【００５６】
共通抽出液は、以下の組成で調製した。
・共通抽出液：0.1％TrtionX-100、5mM MgCl2、0.5ｍM DTT及び0.05％アジ化ナトリウムを含むpH6.0の25ｍMクエン酸-25ｍMリン酸カリウム緩衝液
【００５７】
各基質液は、以下の組成で調製した。
・ファブリー病用基質液：3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-garactopyranoside及び100ｍM N-アセチル-D-ガラクトサミンを含むpH4.4の100ｍMクエン酸-200ｍMリン酸ナトリウム緩衝液
・ポンペ病用基質液：2.0ｍM 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside及び4.5μMアカルボースを含むpH4.0の250ｍMクエン酸-250ｍMリン酸カリウム緩衝液
・ゴーシェ病用基質液：3.0ｍM 4-methylumbelliferyl-β-D−glucopyranoside及び0.3％タウロデオシキコール酸ナトリウムを含むpH5.0の100ｍMクエン酸-100ｍMリン酸ナトリウム緩衝液
【００５８】
共通反応停止液は、以下の組成で調製した。
・共通反応停止液：300ｍMグリシン-NaOH緩衝液（pH10.6）
【００５９】
（２）測定操作
本実施例における測定操作は以下のとおりである。
各乾燥血液ろ紙より、φ3.0mmの乾燥血液ろ紙検体を96wellマイクロプレートプレートの各wellに切り出し、各wellに100μLの共通抽出液を添加して、室温で振とうしながら1時間の抽出操作を行った。抽出された血液試料を20μLずつ３枚の蛍光測定用96well Blackマイクロプレート（NUNC社製）にwell to wellで移注した。4MU標準品は、2.5μMより2倍段階希釈した希釈標準液を血液試料と同様に20μL蛍光測定用96well Blackマイクロプレートに移注した。検体及び4MU標準液の入ったwellにそれぞれの基質を40μL添加し、25℃、37℃、45℃の各恒温槽内に4時間静置して酵素反応を行わせた。酵素反応終了後、共通反応停止液を各well 200μL添加して、軽く混合した後、蛍光オートリーダー（TECASN社製、infinite M200pro）を用いて、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、4MU標準液の蛍光強度と比較して各乾燥血液ろ紙１枚当たりの酵素活性を求めた。
【００６０】
4MU標準品の蛍光強度の測定結果を図３に示した。また、この検量線より計算される酵素活性の結果と酵素反応の温度の関係を図４、図５及び図６に示した。GLAとGBAの酵素活性は、37℃付近に最適反応温度が示される一方で、GAAは37℃より45℃と、より高温で反応を行わせた方が酵素活性が高くなるという知見は驚くべきものであった。しかしながら、GAA酵素活性は、37℃で反応させた場合であっても、ポンペ病患者血液を模したcontrol（L）と比較して十分に高い値を示すため、反応温度の共通化は可能であることが示された。
【実施例２】
【００６１】
乾燥血液ろ紙を検体として、GLA、GAA、及びGBAの酵素活性を、酵素反応時間を変えて検出した。その方法は、酵素反応温度を37℃とした以外は、実施例１に示した方法と同様である。
【００６２】
酵素反応時間と酵素活性の関係を図７、図８及び図９に示した。GLAの酵素活性は、反応時間の経過と共に低下し、2時間で酵素反応を終了させた場合が最も高い活性を示した。一方、GAAとGBAの酵素活性は、2時間〜24時間の反応でほとんど変化はなかった。この結果より、本発明法では、従来の24時間の酵素反応を行わなくても、2時間〜4時間の反応で測定可能であることが示された。
【実施例３】
【００６３】
乾燥血液ろ紙を検体としてGLA、GAA、及びGBAの酵素活性を、ファブリー病患者、ゴーシェ病患者、及びポンペ病患者と正常人とで比較した。その方法は、酵素反応温度を37℃、酵素反応時間を4時間とした以外は、実施例１に示した方法と同様である。
【００６４】
本実施例で使用した検体は、正常人（新生児乾燥血液ろ紙）10,226例、ファブリー病患者2例、ポンペ病患者1例、ゴーシェ病患者1例である。
【００６５】
正常人の各酵素活性の分布と各疾患患者の酵素活性を図１０、図１１及び図１２に示した。ファブリー病の責任酵素であるGLA酵素活性の正常新生児の平均酵素活性は、31.0pmol/hr/disk、ポンペ病の責任酵素であるGAA酵素活性の正常新生児の平均酵素活性は、29.9pmol/hr/disk、ゴーシェ病の責任酵素活性であるGBA酵素活性の正常新生児の平均酵素活性は16.1pmol/hr/diskであり、各疾患患者の酵素活性は、明らかに正常人の酵素活性分布より低い結果となった。従って、本発明の測定により、１枚の乾燥血液ろ紙を用いて、３種類の酵素の活性を同時に測定することにより、迅速な３疾患のマススクリーニング検査が可能となることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明による測定方法は、新生児マススクリーニング検査等において利用可能である。
【図１】
0006360848.tif 000002
【図２】
0006360848.tif 000003
【図３】
0006360848.tif 000004
【図４】
0006360848.tif 000005
【図５】
0006360848.tif 000006
【図６】
0006360848.tif 000007
【図７】
0006360848.tif 000008
【図８】
0006360848.tif 000009
【図９】
0006360848.tif 000010
【図１０】
0006360848.tif 000011
【図１１】
0006360848.tif 000012
【図１２】
0006360848.tif 000013