(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地を用いて、筋幹細胞を生体外培養する方法であって、前記血液細胞サイトカイン、および前記血液細胞ならし培地中のサイトカインは、少なくともＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマを含むことを特徴とする、筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項２】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地に添加する血液細胞サイトカイン、および前記血液細胞ならし培地を調製するための血液細胞は、いずれも培養しようとする筋幹細胞と同じ動物種に由来することを特徴とする、請求項１に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項３】
前記血液細胞ならし培地は、リンパ球ならし培地であることを特徴とする、請求項２に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項４】
前記血液細胞ならし培地は、Ｂ細胞ならし培地またはＴ細胞ならし培地であることを特徴とする、請求項３に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項５】
前記添加する血液細胞サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ｓＩＣＡＭ−１、ＩＬ１  アルファ、ＩＬ−３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＳＣＹＡ２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１  アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＬＩＦ、ＩＬ１２、ＩＬ２３、ＮＧＦおよびＩＬ１  ベータからなる群から選ばれるサイトカインをさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項６】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または前記血液細胞ならし培地は、ｍＴＯＲ、
ＬＰＳ、ＴＬＲ１、ＩＬ−１  アルファ  レセプターまたはＴＲＡＦ６から選ばれる血液細胞由来のタンパク質成分をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項７】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記添加する血液細胞サイトカインの総濃度は６ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項８】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記添加する血液細胞サイトカインの総濃度は５０〜４５００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項７に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項９】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも０．５ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項１０】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも１ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項９に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項１１】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも１０ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項１０に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項１２】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも２５ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項１１に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項１３】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも５０ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項１２に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項１４】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加するＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマの濃度の合計は６ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項１５】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加するＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマの濃度の合計は５０〜１２５０ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１４に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項１６】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項１７】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は１ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項１６に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項１８】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は１０ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項１７に記載の筋幹細胞生体外培養方法。                                                                        
【請求項１９】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は５０〜５００ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項１８に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項２０】
血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地である筋幹細胞培地であって、前記血液細胞サイトカイン、および前記血液細胞ならし培地中のサイトカインは、少なくともＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３，ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮガンマを含むことを特徴とする、筋幹細胞培地。
【請求項２１】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地に添加する血液細胞サイトカイン、および前記血液細胞ならし培地を調製するための血液細胞は、いずれも培養しようとする筋幹細胞と同じ動物種に由来することを特徴とする、請求項２０に記載の筋幹細胞培地。
【請求項２２】
前記血液細胞ならし培地は、リンパ球ならし培地であることを特徴とする、請求項２１に記載の筋幹細胞培地。
【請求項２３】
前記血液細胞ならし培地は、Ｂ細胞ならし培地またはＴ細胞ならし培地であることを特徴とする、請求項２２に記載の筋幹細胞培地。
【請求項２４】
前記添加する血液細胞サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ｓＩＣＡＭ−１、ＩＬ１  アルファ、ＩＬ−３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＳＣＹＡ２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１  アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＬＩＦ、ＩＬ１２、ＩＬ２３、ＮＧＦおよびＩＬ１  ベータからなる群から選ばれるサイトカインをさらに含むことを特徴とする、請求項２１に記載の筋幹細胞培地。
【請求項２５】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または前記血液細胞ならし培地は、ｍＴＯＲ、
ＬＰＳ、ＴＬＲ１、ＩＬ−１  アルファ  レセプターまたはＴＲＡＦ６から選ばれる血液細胞由来のタンパク質成分をさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の筋幹細胞培地。
【請求項２６】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記添加する血液細胞サイトカインの総濃度は６ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項２１に記載の筋幹細胞培地。
【請求項２７】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記添加する血液細胞サイトカインの総濃度は５０〜４５００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項２６に記載の筋幹細胞培地。
【請求項２８】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも０．５ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項２１に記載の筋幹細胞培地。
【請求項２９】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも１ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項２８に記載の筋幹細胞培地。
【請求項３０】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも１０ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項２９に記載の筋幹細胞培地。
【請求項３１】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも２５ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項３０に記載の筋幹細胞培地。
【請求項３２】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも５０ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項３１に記載の筋幹細胞培地。
【請求項３３】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加するＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマの濃度の合計は６ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項２０に記載の筋幹細胞培地。
【請求項３４】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加するＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマの濃度の合計は５０〜１２５０ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項３３に記載の筋幹細胞培地。
【請求項３５】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項２０に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項３６】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は１ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項３５に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項３７】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は１０ｎｇ／ｍｌ以上であることを特徴とする、請求項３６に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項３８】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は５０〜５００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項３７に記載の筋幹細胞生体外培養方法。
【請求項３９】
血液細胞サイトカインまたは血液細胞ならし培地の、筋幹細胞の生体外培養における使用であって、前記血液細胞サイトカイン、および前記血液細胞ならし培地中のサイトカインは、少なくともＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮガンマを含むことを特徴とする使用。
【請求項４０】
前記血液細胞サイトカインまたは血液細胞ならし培地は、筋幹細胞の生体外での増殖を促進し、且つ生体外で増殖した筋幹細胞の幹細胞性を維持するために用いられることを特徴とする、請求項３９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物工学および医学分野に係り、特に筋幹細胞に関連する細胞培養および細胞治療分野に係る。
【背景技術】
【０００２】
筋幹細胞は出産後の筋組織の成長と再生に関与し、且つ生体内で発癌性がなく、胚性幹細胞を使用する場合に生じる倫理的な問題がないため、筋萎縮や重症筋無力症などの各種筋変性疾患の治療への広い応用が期待されている。筋幹細胞を臨床応用するときの重要な障害の一つに、生体外で筋幹細胞を長期間培養できないことがある。筋幹細胞は大部分の成体幹細胞と同様に、生体内から分離されると、生体外培養系において更に２〜４回しか分裂できず、ほとんど継代できない。
【０００３】
従来の筋幹細胞（筋衛星細胞）培養方法のほとんどは、Bischoff博士が１９８６年に築き上げた方法に由来するものであり、その後Beauchampらによって改良され、Ｆ１０基本培地においてＦＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ添加して培養を行うという従来の方法になった。    
このような培養条件下で、筋幹細胞は３〜５回増殖できる。筋幹細胞が継代する時、大部分の細胞は死滅し、残る細胞が幹細胞性のない前駆細胞に分化するという過酷な危機期を経る。したがって、生体外で１〜３代（３〜１２日）培養した後、分離して得られた筋幹細胞は全て幹細胞性のない前駆細胞に分化してしまい、前記前駆細胞において、筋幹細胞の分子マーカーは一切検出できない。
例えば、前記前駆細胞を、マウスの生体内に注射しても、筋損傷の修復に関与する能力が非常に弱く、生体内で機能をもつ幹細胞を形成できずに、移植後の二次的損傷を全く修復できない。(非特許文献１及び非特許文献２)
【０００４】
つまり、従来の筋幹細胞生体外培養系を使用する場合、培養された筋幹細胞は継代した後、危機期を経なければならず、危機期を経て得た増殖可能な細胞はほとんど筋始原細胞に分化してしまうため、筋損傷の修復能を喪失している。この問題が存在するので、筋幹細胞の遺伝子修復により遺伝性筋変性疾患を治療する方法は、臨床治療に適用困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bischoff R. A satellite cell mitogen from crushed adult muscle. Dev Biol., 1986. 115(1): 140-147.
【非特許文献２】Beauchamp, J.R., et al., Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J Cell Biol, 2000. 151(6): p. 1221-34.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来技術の欠陥を解消し、筋幹細胞培地およびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の態様では、血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地を用いて、筋幹細胞を生体外培養する筋幹細胞生体外培養方法を提供する。本発明の筋幹細胞生体外培養方法は、筋幹細胞の生体外での長期間培養に有用である。
本発明の第二の態様では、血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地からなる筋幹細胞培地を提供する。
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地に添加する血液細胞サイトカイン、および前記血液細胞ならし培地を調製するための血液細胞は、いずれも培養しようとする筋幹細胞と同じ動物種に由来する。
なお、動物血清を添加して細胞を培養する場合、本発明の前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地に添加する血液細胞サイトカインは、使用する動物血清に元々含有されるサイトカインを含まない。
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地は、汎用細胞培地に血液細胞サイトカインを添加する方法により調製して得ることができる。
さらに、前記血液細胞ならし培地は、リンパ球ならし培地である。さらにまた、前記血液細胞ならし培地は、Ｂ細胞ならし培地またはＴ細胞ならし培地である。
また、前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または前記血液細胞ならし培地に、前記血液細胞由来のｍＴＯＲ、ＬＰＳ，ＴＬＲ１，ＩＬ−１  アルファ  レセプターまたはＴＲＡＦ６から選ばれるタンパク質成分をさらに添加することもできる。
【０００８】
前記添加する血液細胞サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ｓＩＣＡＭ−１（ヒト可溶性細胞接着分子−１）、ＩＦＮ  ガンマ（インターフェロン−γ）、ＩＬ１（インターロイキン−１）、ＩＬ１  アルファ（インターロイキン−１α）、ＩＬ−３（インターロイキン−３）、ＩＬ２（インターロイキン−２）、ＩＬ−１０（インターロイキン−１０）、ＩＬ−１６（インターロイキン−１６）、ＩＬ１３（インターロイキン−１３）、ＩＬ−１７（インターロイキン−１７）、ＩＰ−１０（インターフェロン誘導タンパク質−１０）、ＳＣＹＡ２（小分子誘導性サイトカイン−Ａ２）、ＭＩＧ（インターフェロン−γ誘導モノカイン）、ＭＩＰ−１  アルファ（マクロファージ炎症性タンパク質−１α）、ＴＧＦ−ベータ（トランスフォーミング増殖因子−β）、ＩＬ−４（インターロイキン−４）、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＬＩＦ（白血病阻止因子）、ＩＬ１２（インターロイキン−１２）、ＩＬ２３（インターロイキン−２３）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＴＮＦ  アルファ（インターフェロン−α）、ＩＬ１  ベータ（インターロイキン−１β）からなる群から選ばれる多種類のサイトカインである。
また、前記添加する血液細胞由来のタンパク質成分は、ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク質）、ＬＰＳ（細胞エンドトキシン）、ＴＬＲ１（Ｔｏｌｌ様受容体−１）、ＩＬ−１  アルファ  レセプター（インターロイキン−１α受容体）またはＴＲＡＦ６（ＴＮＦ受容体関連因子６）である。
【０００９】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記添加する血液細胞サイトカインの総濃度は６ｎｇ／ｍｌ以上であり、５０〜４５００ｎｇ／ｍｌが好ましい。
さらに、前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも０．５ｎｇ／ｍｌ以上であり、１ｎｇ／ｍｌ以上が好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ以上がより好ましく、２５ｎｇ／ｍｌ以上がさらに好ましく、５０ｎｇ／ｍｌ以上がまたさらに好ましい。
さらに、添加する前記血液細胞サイトカインは、少なくともＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマを含む。
さらに、前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマの濃度の合計は６ｎｇ／ｍｌであり、５０〜１２５０ｎｇ／ｍｌが好ましい。
さらに、前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ以上であり、１ｎｇ／ｍｌ以上が好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ以上がより好ましく、通常は５０〜５００ｎｇ／ｍｌにする。
【００１０】
本発明の第三の態様では、前記血液細胞サイトカインまたは血液細胞ならし培地の、筋幹細胞の生体外培養における用途を提供する。
前記血液細胞サイトカインまたは血液細胞ならし培地は、筋幹細胞の生体外での増殖を促進し、且つ生体外で増殖した筋幹細胞の幹細胞性を維持することができる。
本発明の第四の態様では、筋変性疾患を治療するための製剤であって、本発明の筋幹細胞生体外培養方法で培養して得られる筋幹細胞を主要な活性成分とする製剤を提供する。
さらに、前記製剤は、患者本人由来の筋幹細胞を本発明の筋幹細胞生体外培養方法で培養して得られる筋幹細胞を主要な活性成分とする。
さらに、前記製剤は注射剤、手術移植剤である。
前記製剤は、常用の製剤補助剤を含むことが多い。
【００１１】
本発明の第五の態様では、下記ステップからなる、患者の筋変性疾患に対する細胞治療方法を提供する。
１）患者の筋幹細胞を収集する。
２）本発明の筋幹細胞培地で、十分な量の筋幹細胞が得られるまで、ステップ１）で収集した筋幹細胞を生体外で増殖・培養する。
３）得られた筋幹細胞を患者の筋損傷箇所に投与する。
ただし、ステップ３）における前記投与の形態として、注射剤の形態で筋幹細胞を患者の筋損傷箇所に筋肉内注射することができる。
筋幹細胞の注射剤は、増殖した筋幹細胞をトリプシン消化により培養ディッシュから取り出した後、生理食塩水に再懸濁させることで得ることができる。
【００１２】
本発明の筋幹細胞生体外培養・継代方法によれば、筋幹細胞を生体外で大量に増殖させ且つ幹細胞性を維持させることができるため、再生医学治療に用いることができる幹細胞の数が大幅に増加する。このことにより、患者から提供される少量の筋組織から筋幹細胞を分離し、遺伝子修復を行い、生体外で増殖してから、正確な遺伝情報を担っている筋幹細胞を生体内に注射し、多種の遺伝性筋変性疾患に対して細胞治療を行うという戦略が実現可能になる。
従来の筋幹細胞培養方法では、分化能のある筋幹細胞を生体外で長期間培養できず、継代できず、培養時間が１２日間を超えると、全ての細胞が始原細胞に分化してしまい、生体内での筋損傷の修復能を喪失する。また、従来の培養条件下では、筋幹細胞が３〜５回しか分裂できず、即ち多くても元の細胞数の３２倍まで増殖すると、分裂能を喪失してしまう。従って、治療に十分な量の筋幹細胞を得るためには、非常に大きな筋組織を採取して筋幹細胞を分離・精製する必要があり、臨床上ではほとんど実現できない。
【００１３】
一方、本発明の培地中では、筋幹細胞を１０回以上増殖でき、即ち各代ごとに元の細胞数の１０００倍以上に増殖できる。より重要なことに、本発明の培地中では、筋幹細胞が連続継代し、且つ幹細胞性と分化能を引き続き維持することができる。このようにして最終的に得られる筋幹細胞の数は、最初に分離・精製される筋幹細胞の数の２ｍｘ２ｎ倍になる。なお、ｍは各代ごとの分裂回数であり、ｎは継代の数である。本発明の方法により得られるｍ値は少なくとも１２で、ｎ値は少なくとも４０である。つまり、筋幹細胞の数は少なくとも最初に分離・精製された筋幹細胞の数の４．５×１０１５倍に増殖でき、且つ増殖した筋幹細胞はいずれも幹細胞性と完全な分化能を維持しているので、生体内で筋損傷を修復することができる。
例えば、増殖した筋幹細胞をマウスの生体内に注射すると、それらの幹細胞は効率的に筋損傷の修復に関与することができ、生体内の予備幹細胞を補充することもでき、移植後の二次的損傷の修復能を有する。それにより、低侵襲手術で少量（グラムオーダー）の筋組織を取り出し、少量の筋幹細胞を分離・精製し、その後生体外で増殖し、再生医学治療に十分な量の筋幹細胞を得るという戦略が臨床上で実現可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、サイトカイン添加Ｆ１０培地で培養されたＰ０代の筋幹細胞である（Ｐａｘ７染色）。
【図２】図２は、サイトカイン添加Ｆ１０培地で培養されたコントロール線維芽細胞である（Ｐａｘ７染色）。
【図３】図３は、サイトカイン添加Ｆ１０培地で培養されたＰ８代の筋幹細胞である（Ｐａｘ７染色）。
【図４】図４は、サイトカイン添加Ｆ１０培地で培養されたＰ２２代の筋幹細胞である（Ｐａｘ７染色）。
【図５】図５は、サイトカイン添加Ｆ１０培地で培養されたＰ０代の細胞の分化結果である。
【図６】図６は、サイトカイン添加Ｆ１０培地で培養されたＰ２２代の細胞の分化結果である。
【図７】図７は、サイトカイン添加Ｆ１０培地で培養されたＲＦＰ発現筋幹細胞が、生体内で筋損傷の修復に関与する結果である。
【図８】図８は、サイトカイン添加Ｆ１０培地で培養されるＲＦＰ標識筋幹細胞が、筋損傷の修復に関与可能という結果である。生体外培養したＲＦＰ標識筋幹細胞を蛍光標識なしの損傷筋に注射した７日後、切片して赤色の細胞のインテグレーションを考察したところ、損傷箇所では注射されるＲＦＰ発現筋幹細胞に由来する赤色の筋線維が形成されたことを見出した。  （ａ）はサイトカインを添加して培養した筋幹細胞を注射した場合の修復状況であり、（ｂ）はＴ細胞ならし培地で培養した筋幹細胞を注射した場合の修復状況である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明では、血細胞と共培養すると、筋幹細胞の増殖を促進することができ、且つこの促進作用は血細胞と筋幹細胞との間の細胞接触に依存しないことを見出した。血細胞ならし培地だけで、筋幹細胞の増殖を促進できる。詳細には、Ｂ細胞とＴ細胞ならし培地はいずれも筋幹細胞の増殖を促進できる。筋幹細胞をＴ細胞ならし培地で培養すると、一代につき連続して１０回以上分裂でき、且つ生体外培養系において連続して少なくとも４０代継代できる。一連の分離・精製ステップを経て、Ｔ細胞が分泌するサイトカインを分離し、それらのサイトカインを組み合わせることで筋幹細胞の生体外増殖を促進できる。サイトカインで処理された筋幹細胞は、筋幹細胞が発現すべき分子マーカーを発現し、その増殖能が顕著に向上するので、連続して４０代以上の継代ができる。継代した各代の細胞はいずれも筋幹細胞の分子マーカーを発現し、強い増殖能を有し、効率的に成熟筋管に分化できる。より重要なことに、Ｔ細胞ならし培地またはサイトカインで培養したそれらの筋幹細胞を筋損傷が誘導されたマウスに注射すると、注射した筋幹細胞は筋損傷を修復し、新たな筋線維を形成した。この結果、本発明で得られる細胞は、本物の筋幹細胞であることが明らかになった。
【００１６】
本発明の筋幹細胞生体外培養方法は、血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地を用いて、筋幹細胞を生体外培養する方法である。
本発明の主旨は、筋幹細胞の生体外培養用の培地を改良することにあり、筋幹細胞の生体外培養の他の面は通常の細胞培養と同様である。
最適培養条件：ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養する。ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２濃度は、５％（ｖ／ｖ）が好ましい。
また、前記筋幹細胞の生体外培養は接着培養である。
本発明の筋幹細胞培地は、血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地である。
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地に添加する血液細胞サイトカインは、前記培養しようとする筋幹細胞と同じ動物種に由来すべきである。前記血液細胞ならし培地を調製するための血液細胞も、前記培養しようとする筋幹細胞と同じ動物種に由来すべきである。例えば、マウス筋幹細胞を培養する場合、マウス血液細胞サイトカイン添加細胞培地またはマウス血液細胞ならし培地を採用し、他方、ヒト筋幹細胞を培養する場合、ヒト血液細胞サイトカイン添加細胞培地またはヒト血液細胞ならし培地を採用する。他の場合も同様である。
前記した種（Species）は生物分類学の基本単位である。さらに、前記動物種は哺乳動物から選ばれる。さらにまた、前記種は哺乳動物のうちの齧歯目、偶蹄目、奇蹄目、ウサギ目、霊長目等から選ばれる種であり、例えばネズミ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、サル、ヒト等である。
動物血清を添加して細胞を培養する場合、本発明の前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地に添加する血液細胞サイトカインは、培地に添加する動物血清に元々含有されるサイトカインを含まない。つまり、本発明において、動物血清を添加して細胞を培養する場合、培養される筋幹細胞と同じ種の血液細胞サイトカインを追加して添加する必要がある。
【００１７】
本発明の前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地とは、通常の細胞培養に必要な成分以外に、血液細胞サイトカインも追加して添加した細胞培地を指す。
本発明の前記筋幹細胞培地において、添加する血液細胞サイトカイン以外の他の成分およびそれらの含有量はいずれも通常の細胞培地と同様である。通常の細胞培地の成分は、平衡塩溶液、ｐＨ調節液、抗生物質、動物血清、細胞成長に必須のアミノ酸、ビタミン、グルコース、ｐＨ指示薬等から選ばれることが多い。前記平衡塩溶液の成分は、例えば塩化カルシウム、硝酸鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、フッ化ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等である。前記ｐＨ調節液は、例えば３．７％炭酸水素ナトリウム溶液、ＨＥＰＥＳ溶液（ジヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）、ピルビン酸ナトリウム溶液等である。また、前記抗生物質は、例えばペニシリン、ストレプトマイシン等である。常用の動物血清は主に、ウシ血清とウマ血清である。ビタミンは、例えば塩化コリン、葉酸、イノシトール、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、ピリドキサール塩酸塩、ビタミンＢ６、リボフラビン、チアミン等である。
【００１８】
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地は、汎用細胞培地に血液細胞サイトカインを添加する方法により調製して得ることができる。なお、前記汎用細胞培地は、例えばＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＭＥＭ、ＤＥＭＥ／Ｆ１２、Ｆ１０、ＣＤ２９３、ｍｅｄｉｕｍ  ２３１、ｍｅｄｉｕｍ  １０６のような各種の常用細胞培地から選ばれる。本発明の実施例において、Ｆ１０培地に各種の血液細胞サイトカインを添加した筋幹細胞培地が具体的に挙げられる。
前記血液細胞ならし培地とは、血液細胞を培養した細胞培地を指す。さらに、前記血液細胞はリンパ球である。前記血液細胞は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞であることが最も好ましい。
前記血液細胞ならし培地は、汎用細胞培地で血液細胞を培養してから、分離して得ることができる。汎用細胞培地でＢ細胞を培養してから、分離するとＢ細胞ならし培地が得られ、また、汎用細胞培地でＴ細胞を培養してから、分離するとＴ細胞ならし培地が得られる。
【００１９】
前記添加する血液細胞サイトカインは、以下のサイトカインからなる群から選ばれる多種類のサイトカインである。具体的には、ＧＭ−ＣＳＦ、ｓＩＣＡＭ−１；ＩＦＮ  ガンマ、ＩＬ１、ＩＬ−１  アルファ、ＩＬ−３、ＩＬ２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１６、ＩＬ１３、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＳＣＹＡ２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１  アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＬＩＦ、ＩＬ１２、ＩＬ２３、ＮＧＦ、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ１  ベータである。
前記サイトカインはいずれもリンパ球ならし培地において検出でき、いずれのサイトカインもＴ細胞ならし培地に存在する。  
また、前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または前記血液細胞ならし培地に、前記血液細胞由来のｍＴＯＲ、ＬＰＳ，ＴＬＲ１，ＩＬ−１αまたはＴＲＡＦ６から選ばれるタンパク質成分をさらに添加することもできる。
より好ましくは、前記血液細胞サイトカインは上記サイトカインから選ばれる少なくとも６種であり、或いは、前記血液細胞サイトカインは上記サイトカインから選ばれる少なくとも７種であり、或いは、前記血液細胞サイトカインは上記サイトカインから選ばれる少なくとも８種であり、或いは、前記血液細胞サイトカインは上記サイトカインから選ばれる少なくとも９種であり、或いは、前記血液細胞サイトカインは上記サイトカインから選ばれる少なくとも１０種である。
【００２０】
筋幹細胞の増殖を維持し且つその継代細胞の幹細胞性を維持するために、前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記血液細胞サイトカインの総濃度は低すぎてはならない。通常は６ｎｇ／ｍｌ以上であるべきで、５０〜４５００ｎｇ／ｍｌが好ましい。
前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、添加する各血液細胞サイトカインの濃度はいずれも０．５ｎｇ／ｍｌ以上であり、１ｎｇ／ｍｌ以上が好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ以上がより好ましく、通常は５０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲内にする。なお、上記説明は、サイトカインの濃度が５００ｎｇ／ｍｌを超えてはいけないと意味するものではない。何故ならば、サイトカインはこの濃度範囲内で有益な効果を良好に発揮できるが、濃度が低すぎるとその効果が顕著ではなくなり、一方、濃度が高すぎると過剰分が無駄になってしまうからである。
試験結果によれば、６種の血液細胞サイトカインＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマは、筋幹細胞の増殖および幹細胞性の維持と密接に関連する。本発明の好ましい技術方案において、それらの６種の血液細胞サイトカインは添加しなければならないが、他の血液細胞サイトカインは添加してもしなくてもよい。
【００２１】
また、前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマの濃度の合計は６ｎｇ／ｍｌ以上であり、５０〜１２５０ｎｇ／ｍｌが好ましい。
さらに、前記血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、前記ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ１３、ＴＮＦ  アルファ、ＩＬ２およびＩＦＮ  ガンマのうちのいずれか一つの濃度は０．５ｎｇ／ｍｌ以上であり、１ｎｇ／ｍｌ以上が好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ以上がより好ましく、通常は５０〜５００ｎｇ／ｍｌにする。なお、前記サイトカインの濃度が５００ｎｇ／ｍｌを超えても、筋幹細胞の増殖に酷い悪影響を及ぼす恐れはないが、コスト面から、サイトカインを過剰に添加する必要はない。
前記各サイトカインの濃度は、いずれも血液細胞サイトカイン添加細胞培地または血液細胞ならし培地において、培養する筋幹細胞と同じ種に由来する血液細胞サイトカインの最終濃度を示す。
本発明によれば、血液細胞サイトカインまたは血液細胞ならし培地は筋幹細胞の生体外培養に有用であって、筋幹細胞の生体外での増殖を促進し、且つ生体外で増殖した筋幹細胞の幹細胞性を維持することができる、ということが開示された。
【００２２】
本発明はさらに、筋変性疾患を治療するための製剤であって、本発明の筋幹細胞生体外培養方法で培養して得られる筋幹細胞を主要な活性成分とする製剤を提供する。
また、前記製剤は、患者本人由来の筋幹細胞を本発明の筋幹細胞生体外培養方法で培養して得られる筋幹細胞を主要な活性成分とする。
本発明の試験結果によれば、前記製剤をヒトに適用する場合、好適な投与量は約３ｘ１０６個の筋幹細胞／回である。前記製剤は、単回投与してもよく、患者の筋肉の回復状況に応じて複数回投与してもよい。通常の投与形態は筋肉内注射による投与である。しかし、本発明では、他の可能な投与形態も除外されない。
一般的に、前記製剤は常用の製剤補助剤を含む。
常用の製剤補助剤は、食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセリン、エタノール、ポリオールおよびそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されるものではない。薬物製剤は投与形態に合わせるべきである。本発明の製剤は、アンプル剤の形態にすることが好ましく、例えば生理食塩水またはグルコースと他の補助剤を含有する水溶液を用いて、通常の方法により調製する。他の可能な製剤形態は通常の方法により調製できる。本発明の製剤は、無菌条件下で調製することが好ましい。また、本発明の製剤は他の治療剤と共に使用することができる。
【００２３】
本発明はさらに、患者の筋変性疾患に対する、下記ステップからなる細胞治療方法を提供する。
１）患者の筋幹細胞を収集する。
患者の筋幹細胞の収集は、低侵襲手術で患者の生体から少量の筋肉試料を取り出した後、筋肉試料から筋幹細胞を分離・精製して得ることができる。当該技術は当業者によく知られる。
２）本発明の筋幹細胞培地で、十分な量の筋幹細胞が得られるまで、ステップ１）で収集した筋幹細胞を生体外で増殖・培養する。
本発明の筋幹細胞培養技術によれば、患者の筋幹細胞を収集した後、遺伝や突然変異に関連する筋肉疾患を治す、或いは筋組織をさらに最適化する目的で、既知の遺伝子工学手段により筋幹細胞をさらに遺伝子工学的に改造し、欠陥のある遺伝子の修復または遺伝子の最適化を行い、且つ改造した筋幹細胞をさらに増殖することができる。
３）得られた筋幹細胞を患者の筋損傷箇所に投与する。
一般的に、注射剤の形態で筋幹細胞を患者の筋損傷箇所に筋肉内注射する。注射後、筋幹細胞の整合性を促進するように、患者を適切に鍛錬させるべきである。４〜８週間後で修復の効果を検査する。
【００２４】
以下、特定の具体的な実施例により本発明の実施形態を説明するが、当業者は本明細書で開示された内容により本発明の他の利点と効果を簡単に理解できる。本発明は他の異なる具体的な実施形態により実施または応用することもでき、本明細書における各詳細部分も、異なる観点と応用に基づいて本発明の精神を逸脱しない範囲内で各種の修飾や変更を行うことができる。
特に断らない限り、本発明において開示された実験方法、検出方法、調製方法はいずれも、本分野で常用の分子生物学、生化学、クロマチンの構造と解析、分析化学、細胞培養、ＤＮＡ組換え技術および関連する分野で常用の技術を採用する。それらの技術は従来の文献において既に完全に説明されており、具体的には、SambrookらMOLECULAR CLONING ：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001 ；Ausubelら，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego ；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998 ；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999 ；およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等を参照する。
【実施例１】
【００２５】
（マウスＴ細胞ならし培地の調製）
野生型Ｃ５７／Ｂ６マウスを致死させ、脾臓を取り出し、７０ｕｍメッシュフィルター上に置き、２〜３ミリリットルのＰＢＳを加えて湿潤させた後、研磨棒を用いて脾臓を研磨し、適量のＰＢＳを加えて濾過し、細胞懸濁液を収集した。１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、５ミリリットルの赤血球溶解液を用いて細胞を再懸濁させ、５ミリリットルのＲＰＭＩ−１６４０培養液を加え、メッシュフィルターで再度濾過して細胞破片を除去し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を収集した。ＲＰＭＩ−１６４０培養液で細胞を２回洗浄し、細胞密度を１ｘ１０９個の細胞／リットルに調整し、培地ボトルに接種し、ＣｏｎＡを（最終濃度が５ｍｇ／Ｌになるように）加え、３７度ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した後、等倍のＲＰＭＩ−１６４０培養液を追加し、２４時間後、３０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞上清を新たな遠心チューブに移し、−８０℃で保管した。
検出を行ったところ、得られたＴ細胞ならし培地は、以下の濃度のサイトカイン及びタンパク質成分を、それぞれ含有した。
【００２６】
検出方法：ＥＬＩＳＡ検出、Ｒ＆Ｄ社のマウスサイトカインアレイ・パネルＡ（Mouse Cytokine Array, Panel A）(カタログ# ARY006)を参照
成分A           GM-CSF                 200ng/ml 
成分B           sICAM-1                120ng/ml 
成分C           IFN ガンマ                160ng/ml
成分D           IL1                       100ng/ml 
成分E           IL-1 アルファ レセプター  100ng/ml
成分F           IL-3                      250ng/ml
成分G           IL2                       200ng/ml 
成分H           IL-10               80ng/ml
成分I           IL-16                  130ng/ml
成分J           IL13                      120ng/ml 
成分K           IL-17                  300ng/ml
成分L           IP-10                  250ng/ml
成分M           SCYA2                  80ng/ml 
成分N           MIG                       150ng/ml
成分O           MIP-1 アルファ            200ng/ml
成分P           TGF-ベータ               150ng/ml
成分Q           IL-4                      250ng/ml
成分R           TRAF6                  400ng/ml
成分S           FGF                       25ng/ml
成分T           IGF                       50ng/ml
成分U           PDGF                      80ng/ml
成分V           LIF                       100ng/ml
成分W           IL-1 アルファ             200ng/ml
成分X           mTOR                      30ng/ml
成分Y           LPS                       60ng/ml
成分Z           TLR1                      55ng/ml
成分Z’         IL12                       120ng/ml
成分Y’         IL23                      200ng/ml
成分X’         NGF                        100ng/ml
成分W’         TNF アルファ           100ng/ml
成分V’         IL1 ベータ                100ng/ml
なお、細胞培地が異なる、または取扱者が異なる場合、Ｔ細胞ならし培地におけるサイトカイン含有量は多少変化するが、このような変化は本発明の実施に影響を及ぼすほどのものではない。
また、ヒトＴ細胞ならし培地は、培養する細胞をヒトＴ細胞にする以外に、マウスＴ細胞ならし培地の調製方法を参照して調製した。
【００２７】
（マウスＢ細胞ならし培地の調製）
野生型Ｃ５７／Ｂ６マウスを致死させ、脾臓を取り出し、７０ｕｍメッシュフィルター上に置き、２〜３ミリリットルのＰＢＳを加えてメッシュフィルターを湿潤させた後、研磨棒を用いて脾臓を研磨し、適量のＰＢＳを加えて濾過し、細胞懸濁液を収集した。１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、５ミリリットルの赤血球溶解液を用いて細胞を再懸濁させ、５ミリリットルのＲＰＭＩ−１６４０培養液を加え、メッシュフィルターで再度濾過して細胞破片を除去し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を収集した。ＲＰＭＩ−１６４０培養液で細胞を２回洗浄し、細胞密度を１ｘ１０９個の細胞／リットルに調整し、培地ボトルに接種し、ＬＰＳを最終濃度が１ｍｇ／Ｌになるように加え、３７度ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した後、等倍のＲＰＭＩ−１６４０培養液を追加し、２４時間後、３０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞上清を新たな遠心チューブに移し、−８０度で保管した。
また、ヒトＢ細胞ならし培地は、培養する細胞をヒトＢ細胞にする以外に、マウスＢ細胞ならし培地の調製方法を参照して調製した。
【００２８】
（血液細胞サイトカイン添加細胞培地の調製）
各血液サイトカインはいずれも市購品として入手できる。
【００２９】
（血液細胞サイトカイン添加筋幹細胞培地の調製方法）
Ｆ１０培地の乾燥粉末を超純水に溶解し、濾過で除菌し、表１と表２に記載した手順に従って、無菌の各サイトカイン、１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えた後、均一に混合した。
なお、１６４０培地とＤＭＥＭ培地を用いても、筋幹細胞を培養できる。
下表の手順に従ってサイトカイン及び血液細胞由来のタンパク質成分を加えたが、下表における各血液細胞サイトカイン及び血液細胞由来のタンパク質成分はいずれもマウス由来またはヒト由来である。
【００３０】
【表１】
0006378321.tif 000002
【００３１】
【表２】
0006378321.tif 000003
0006378321.tif 000004
【実施例２】
【００３２】
（筋幹細胞の培養と検出）
１）筋幹細胞の取得：
（マウス筋幹細胞）
３日齢の新生仔マウスを数匹致死させ、四肢の筋肉を取り、０．２％Ｄ型コラーゲナーゼを添加したＤＭＥＭ培地に置き、３７度で１．５時間消化し、その後ＰＢＳで筋肉を３回洗浄し、各回ごとに筋肉を数分間自然沈殿させて収集した。パスツールピペットと１８Ｇ注射針を順番に用いて、筋肉塊が粉砕されるまで筋肉を数回吸込み・吹出しし、４０ｕｍメッシュフィルターで濾過して非筋肉不純物を除去し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、Ｆ１０培養液に再懸濁させ、且つ１０ｃｍ培養ディッシュに接種し、３時間後、上清を０．０５％Ｉ型コラーゲンで被覆された１０ｃｍ培養ディッシュに移すとともに、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦサイトカインを加え、３７度ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。翌日、トリプシンで筋細胞を消化し、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、細胞を１．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳに再懸濁させ、ＣＤ３４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ  Ｎｏ：５５３７３３、希釈比：１：２０）、インテグリンα７（Ｒ＆Ｄ、ｃａｔ  Ｎｏ：ＦＡＢ３５１８Ａ、希釈比：１：１０）を加え、３７度で４５分間インキュベーションし、５０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を収集し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、Ｉｎｆｌｕｘフローサイトメーターを用いてＣＤ３４とインテグリンα７ダブルポジティブ細胞を分画し、マウス筋幹細胞とした。
【００３３】
（ヒト筋幹細胞）
ヒト筋組織を取得した後、無菌の手術器具を用いて全ての皮膚、脂肪および骨格などの非筋組織を除去した。重量を量った後、筋肉を小塊に切断し、筋肉１グラムにつきディスパーゼＩＩとＤ型コラーゲナーゼの等比率混合液を３．５ミリリットル加え、３７度ＣＯ２インキュベーターに置いて１５分間消化し、５ミリリットルのトランスファーピペットを用いて筋組織を吸込み・吹出して、全ての筋肉塊が消化されるまで以上のステップを２〜３回繰り返した。全体積の２倍の完全培地を加えて消化を終了させ、１００ｕｍメッシュフィルターで濾過した後、３２９ｇで１０分間遠心した。開始したときの筋肉１グラムにつき３．５ミリリットルの完全培地に沈殿を再懸濁させ、７倍体積の赤血球溶解液を加え、遠心チューブを数回上下に反転させ、４０ｕｍメッシュフィルターで濾過し、３２９ｇで１０分間遠心して細胞を収集し、細胞濃度を０．５〜１ｘ１０６個の細胞／１０ｍｌに調整し、細胞をゼラチンで被覆した培養ディッシュに接種した。
【００３４】
２）筋幹細胞の継代培養：
実施例１で調製した各培地をそれぞれ分離・精製した筋幹細胞に加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。４８時間ごとに継代し、継代した細胞を３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
（継代方法）
筋幹細胞密度が７０％になるまで生長した時点で、筋幹細胞を、３７℃に予備加熱したＰＢＳで１回洗浄し、３７℃に予備加熱したトリプシンを加え、１〜２分間消化し、３７℃に予備加熱した培地を加えて反応を終了させた。細胞を再懸濁させ、室温において３０００ｒｐｍで６分間遠心した。上清を捨て、沈殿した細胞を３７℃に予備加熱した培地に再懸濁させ、３倍に希釈し、３つの培養ディッシュに均一に分け、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。
【００３５】
３）検出：
各代の筋幹細胞に対して、筋幹細胞の分子マーカーＰａｘ７で免疫蛍光染色を行い、その発現レベルを検出した。
また、各代の筋幹細胞に対して、生体外分化試験を行い、その分化能を検出した。
さらに、各代の筋幹細胞を、筋損傷が誘導されたマウスに筋肉内注射により導入し、その筋損傷の修復能を検出した。
各種の培地について、最大で４０代の細胞を検出した。
（筋幹細胞の分子マーカーＰａｘ７の免疫蛍光染色による検出）
継代した細胞を１ディッシュ取り、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で３回洗浄した。４％ホルムアルデヒドを用いて、室温で１５分間固定した。続いて、ＰＢＳで３回洗浄し、１％  Ｔｗｅｅｎ２０を加え、室温で１０分間置いた。ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）ＰＢＳで希釈したＰａｘ７抗体（ＤＳＨＢより購入）を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回につき５分間、計３回洗浄した。１％ＢＳＡ  ＰＢＳ溶液で１：１０００に希釈した蛍光標識ロバ抗マウス二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄し、２０μＭ  ＤＡＰＩを加え、室温で５分間置き、ＰＢＳで１回につき５分間、計３回洗浄した。消光防止剤を加えてから封着した。ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡で観察して写真を撮影した。
ここで、細胞核に位置する蛍光染色が見られたものを陽性と判断した。一方、細胞核に位置する蛍光染色が見られなかったものを陰性と判断した。
（生体外分化試験）
培養した筋幹細胞を１ディッシュ取り、３７℃に予備加熱したＰＢＳで３回洗浄し、２％ウマ血清含有ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した後、顕微鏡で分化の状況を観察した。
ここで、＞９０％の細胞が成熟筋管に分化したと観察したものを、分化能が良好に維持されたと判断した。一方、一部の細胞が成熟筋管に分化したと観察したものを、分化能が部分的に維持されたと判断した。さらに、筋管を形成していなかったものは、分化能がないと判断した。
【００３６】
（筋損傷修復試験）
筋損傷が誘導されたマウス動物モデル：
Charlse Riverより購入した野生型マウスを用いた。
培養したＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）発現筋幹細胞を１ディッシュ取り、３７℃に予備加熱したＰＢＳで１回洗浄し、３７℃に予備加熱したトリプシンで２分間消化した後、１ｘ１０５個の筋幹細胞を取り、無菌の２００μｌＰＢＳに再懸濁させ、無菌の１ｍｌ注射器に移し、筋損傷が誘導されたＲＦＰ無発現マウスの腓腹筋に筋肉内注射した。マウスを１ヶ月飼育した後、腓腹筋を取って凍結切片し、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）染色により筋線維の輪郭を標識し、ＤＡＰＩ染色によりＤＮＡを標識し、レーザー共焦点顕微鏡でＲＦＰ細胞が損傷箇所に存在するか否かを観察した。
なお、染色方法は以下の通り行った。
凍結切片をＰＢＳで３回洗浄した。４％ホルムアルデヒドを用いて、室温で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、１％  Ｔｗｅｅｎ２０を加え、室温で１０分間置いた。ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ  ＰＢＳで希釈したラミニン抗体（Ａｂｃａｍ社より購入）を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回につき５分間、計３回洗浄した。１％ＢＳＡ  ＰＢＳ溶液で１：１０００に希釈した蛍光標識ロバ抗ウサギ二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄し、２０μＭ  ＤＡＰＩ（４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を加え、室温で５分間置き、ＰＢＳで１回につき５分間、計３回洗浄した。消光防止剤を加えてから封着した。ツァイスレーザー共焦点顕微鏡で観察して写真撮撮した。
ここで、損傷箇所で赤色蛍光のある筋線維が多く検出されたものを、筋肉が良好に修復されたと判断した。また、損傷箇所で赤色蛍光のある筋線維が少量検出されたものを、筋肉が少量修復されたと判断した。さらに、赤色蛍光のある筋線維が全く検出できなかったものは、筋肉が修復されなかったと判断した。
【００３７】
４）試験結果（１＃〜１４＃はそれぞれ、表１と表２における１＃〜１４＃の配合で調製したマウス血液細胞サイトカイン添加Ｆ１０細胞培地に該当する）：
【００３８】
【表３】
0006378321.tif 000005
0006378321.tif 000006
＋＋：Ｐａｘ７の免疫蛍光染色検出において陽性であった；＋：Ｐａｘ７の免疫蛍光染色検出において弱陽性であった；−：Ｐａｘ７の免疫蛍光染色検出において陰性であった
ａａ：分化能が良好に維持された；ａｂ：分化能が部分的に維持された；ｂｂ：分化能がない
ｃｃ：筋損傷が良好に修復された；ｃｄ：筋肉が少量修復された；ｄｄ：筋肉が修復されなかった。
−：当該検出項目を行わなかった
なお、一部の試験結果は図面を参照する。
【００３９】
５)  試験結果の解析：
上記試験結果から分かるように、本発明の培地を用いた場合、４０代目の筋幹細胞をＰａｘ７染色した後、それらはいずれもＰａｘ７陽性であり、各代の細胞はいずれも筋幹細胞の分子マーカーＰａｘ７を発現し、いずれも成熟した筋管細胞に分化することが見出された。また、１〜３０代目の細胞はいずれも筋損傷を修復した。さらに、マウスの生体内において、現在まで検出された１８代目の細胞はいずれも筋損傷の修復に関与できる。
【００４０】
以上の実施例は本発明で開示される実施形態を説明するためのものであり、本発明に対する限定であると理解されるべきではない。また、本明細書で列挙された各種の変更および発明にかかる方法、組成物の変化は、本発明の範囲と精神を逸脱しない限り、当業者にとって自明なものである。本発明の多種の具体的な好ましい実施例を用いて本発明を具体的に説明したが、本発明はそれらの具体的な実施例に限定されるものではないと理解すべきである。実際、当業者にとって自明な上記各種の変更により得られる発明は全て本発明の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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