(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者で疾患重症度指数(DSI)値を決定するための方法であって、
(a)慢性肝疾患を有するかその危険がある患者で2つまたは複数の肝機能検査値を得る工程であって、2つまたは複数の肝機能検査値が、SHUNT、門脈肝濾過率(門脈HFR)および全身肝濾過率(全身HFR)からなる群から選択される2つまたは複数の肝機能検査から得られる工程と;
(b)患者でDSI値を得るために疾患重症度指数式(DSI式)を用いる工程であって、DSI式が、DSI=A(SHUNT)+B(Loge門脈HFR)+C(Loge全身HFR)+D
［式中、SHUNTは患者でのSHUNT検査値(%)であり、門脈HFRはmL/分/kgで表す患者での門脈肝濾過率(HFR)検査値であり、ここでkgは患者の体重であり、全身HFRはmL/分/kgで表す患者での全身HFR値であり、ここでkgは患者の体重であり、AはSHUNT係数であり、Bは門脈HFR係数であり、Cは全身HFR係数であり、Dは定数である］
を含む方法。
【請求項２】
(c)患者のDSI値を、1つもしくは複数のDSIカットオフ値、1つもしくは複数の正常で健康な対照、または患者の1つもしくは複数の経時的DSI値と比較する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記定数は5から125の間の正数であり、前記SHUNT係数は、0から正数25の間の数であり、前記門脈HFR係数は、0から負数25の間の数であり、前記全身HFR係数は、0から負数25の間の数であり、但し前記係数の少なくとも2つは同時に0ではない、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
患者のDSI値を1つまたは複数のDSIカットオフ値と比較する工程が、少なくとも1つの臨床転帰の指標である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
臨床転帰が、Child-Turcotte-Pugh(CTP)増加、静脈瘤、脳症、腹水および肝臓関連死からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
患者の経時的DSI値を比較する工程が、患者の慢性肝疾患の処置の有効性をモニターするために使用され、患者のDSI値の経時的低下が、処置の有効性の指標である、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
患者の経時的DSI値を比較する工程が、患者の慢性肝疾患の処置の必要性をモニターするために使用され、患者のDSI値の経時的増加が、患者の処置の必要性の指標である、請求項2から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
患者の慢性肝疾患の処置が、抗ウイルス処置、抗線維症処置、抗生物質、免疫抑制処置、抗がん処置、ウルソデオキシコール酸、インスリン感作剤、介入処置、肝移植、ライフスタイル変更および食事制限、低血糖指数食、抗酸化剤、ビタミン剤、経頚静脈性肝内門脈大循環短絡術(TIPS)、カテーテル誘導血栓溶解、バルーン拡張およびステント留置、バルーン拡張および排液、体重減少、運動ならびにアルコールの回避からなる群から選択される、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
患者の経時的DSI値を比較する工程が、患者の慢性肝疾患の状態をモニターするために使用され、患者のDSI値の経時的変化が、疾患の状態および将来の臨床転帰の危険を患者に知らせるために使用され、患者のDSI値の経時的増加が予後の悪化の指標であり、患者のDSI値の経時的低下が予後の向上の指標である、請求項2から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
疾患重症度指数式が:
DSI=5.34(SHUNT)-6.65(Loge門脈HFR)-8.57(Loge全身HFR)+44.66；
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50；または
DSI=9.84(SHUNT)-12.36 LOGe(門脈HFR)+50.5
であり、患者のSHUNT、門脈HFRおよび全身HFR検査値は、同日中に得られたものである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
患者の慢性肝疾患が、慢性C型肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患または原発性硬化性胆管炎である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
患者のSHUNT検査値が、
(a) 患者への第1の識別可能なコール酸の用量(用量oral)の経口投与および該患者への第2の識別可能なコール酸の用量(用量iv)の並行静脈内共投与を行った後に該患者から収集した複数の血液または血清試料を受け取る工程であって、試料が投与後の期間にわたる間隔で収集されたものである工程と;
(b)各試料中の第1および第2の識別可能なコール酸の濃度を定量化する工程と;
(c)経口識別可能コール酸のクリアランス曲線モデルに適合させたコンピュータアルゴリズム曲線を使用し、個別の経口クリアランス曲線下面積(AUCoral)を計算することを含む、各試料中の第1の識別可能なコール酸の濃度から個別の経口クリアランス曲線を作成する工程と;
(d)静脈内の第2の識別可能コール酸のクリアランス曲線モデルに適合させたコンピュータアルゴリズム曲線を使用し、個別の静脈内クリアランス曲線下面積(AUCiv)を計算することにより、各試料中の第2の識別可能なコール酸の濃度から個別の静脈内クリアランス曲線を作成する工程と;
(e)式:
AUCoral/AUCiv×用量iv/用量oral×100%
を使用して患者でシャント値を計算する工程と
を含む方法によって決定される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第1の識別可能なコール酸が第1の安定同位体標識コール酸であり、第2の識別可能なコール酸が第2の安定同位体標識コール酸である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
第1および第2の安定同位体標識コール酸が、2,2,4,4-d4コール酸および24-13C-コール酸から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
試料が、投与後2〜7つの時点の間隔で患者から収集されたものである、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
試料が、投与時刻から投与後約45分〜約180分から選択される時刻までの期間にわたる間隔で収集されたものである、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
試料が、投与後約90分以下の期間にわたる間隔で収集されたものである、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
試料が、投与の5、20、45、60および90分後に患者から収集されたものである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
患者の門脈HFR値が、
(a)慢性肝疾患を有するかその危険がある患者への識別可能なコール酸の用量(用量oral)の経口投与を行った後に該患者から収集した複数の血液または血清試料を受け取る工程であって、試料が、投与後の期間にわたる間隔で該患者から収集されたものである工程と;
(b)各試料中の識別可能なコール酸の濃度を測定する工程と;
(c)識別可能コール酸のクリアランス曲線モデルに適合させたコンピュータアルゴリズム曲線を使用することを含む、各試料中の識別可能なコール酸の濃度から個別の経口クリアランス曲線を作成する工程と;
(d)個別の経口クリアランス曲線下面積(AUC)(mg/mL/分)を計算し、経口投与される安定同位体標識コール酸のAUCで用量(mg)を割って、患者での経口コール酸クリアランスを得る工程と;
(e)kgで表す患者の体重で経口コール酸クリアランスを割って、患者の門脈HFR値(mL/分/kg)を得る工程と
を含む方法によって決定される、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
患者の全身HFR値が、
(a)慢性肝疾患を有するかその危険がある患者への識別可能なコール酸の用量(用量iv)の静脈内投与を行った後に該患者から収集した複数の血液または血清試料を受け取る工程であって、試料が、投与後の期間にわたる間隔で該患者から収集されたものである工程と;
(b)各試料中の識別可能なコール酸の濃度を測定する工程と;
(c)識別可能コール酸のクリアランス曲線モデルに適合させたコンピュータアルゴリズム曲線を使用することを含む、各試料中の識別可能なコール酸の濃度から個別の静脈内クリアランス曲線を作成する工程と;
(d)個別の静脈内クリアランス曲線下面積(AUC)(mg/mL/分)を計算し、静脈内投与される安定同位体標識コール酸のAUCで用量(mg)を割って、患者での静脈内コール酸クリアランスを得る工程と;
(e)kgで表す患者の体重で静脈内コール酸クリアランスを割って、患者の全身HFR値(mL/分/kg)を得る工程と
を含む方法によって決定される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項1から20のいずれか一項により患者の疾患重症度指数(DSI)値を計算するための方法であって、
慢性肝疾患に罹患した患者から血清試料を得る工程であって、患者が第1の安定同位体コール酸の経口投与および同時に第2の安定同位体コール酸の静脈内投与を以前に受けており、血液試料がコール酸の投与の後180分未満の間に患者から収集されたものである工程と;
mL/分/kgで表す門脈肝臓濾過率(門脈HFR)、ここでkgは患者の体重であり、mL/分/kgで表す全身肝臓濾過率(全身HFR)、ここでkgは患者の体重であり、および%で表すSHUNTを計算するために血清試料をアッセイする工程と;
式:
DSI=9.84(SHUNT)-12.36 Loge(門脈HFR)+50.5;
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50;または
DSI=5.34(SHUNT)-6.65(Loge門脈HFR)-8.57(Loge全身HFR)+44.66
から選択される式を用いて患者のDSI値を計算する工程と
を含む方法。
【請求項２２】
患者での慢性肝疾患が、慢性C型肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患または原発性硬化性胆管炎である、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
DSI式が、
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50であり、DSI値が慢性肝疾患患者で門脈圧亢進または代償障害の危険の増加を同定するために使用され、
DSI≧18が、門脈圧亢進(PHTN)の危険の増加を示し;
DSI≧36が、代償障害の危険の増加を示し;
門脈圧亢進(PHTN)が脾腫または静脈瘤と規定され、代償障害が腹水または静脈瘤出血と規定される、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
慢性肝疾患が原発性硬化性胆管炎である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
DSI式が、
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50であり、
DSI値が、慢性肝疾患患者での臨床転帰の予測のために使用され、DSI≧25が、患者での臨床転帰の危険の増加を示し;
慢性肝疾患が慢性C型肝炎であり、臨床転帰が、CTP進行、静脈瘤出血、腹水、肝性脳症または肝臓関連死から選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
患者が肝移植(LT)の順番待ちリストに載っており、DSI式が
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
であり、DSI値が、LTの順番待ちリストに載っている患者に優先順位をつけるために使用され、LTの順番待ちリストに載っている患者の優先順位が、患者のDSI値が経時的に増加した後、または患者のDSI値が40を超えた後に上げられる、請求項21に記載の方法。
【請求項２７】
DSI式が、
DSI=5.34(SHUNT)-6.65(Loge門脈HFR)-8.57(Loge全身HFR)+44.66
であり、DSI値が、慢性肝疾患患者での将来の臨床転帰の予測のために使用され、DSI>19が、患者での臨床転帰の危険の増加を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項２８】
DSI式が、血清アルブミン、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、総ビリルビン、直接ビリルビン、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、5'ヌクレオチダーゼ、PT-INR(プロトロンビン時間の国際標準化比)、カフェイン排泄、アンチピリンクリアランス、ガラクトース排泄能力、リドカインからのMEGXの形成、メタセチン-C13およびメチオニン-C13からなる群から選択される臨床生化学ラボアッセイからの値を表す1つまたは複数の追加の項;ならびに/または静脈瘤、腹水もしくは肝性脳症から選択される臨床像を表す1つまたは複数の追加の項を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願はPCT国際特許出願として2013年11月12日に出願されており、参照により本明細書に組み込まれる、2012年11月12日に出願の米国仮出願第61/725,292号の優先権を主張する。
【０００２】
連邦支援の研究または開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された契約番号NO1-DK-9-2327での政府支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
患者の慢性肝疾患の評価で有用な疾患重症度指数(DSI)は、肝血流に基づく1つまたは複数の肝機能検査結果から導かれる。DSIは、いくつかの慢性肝疾患で患者の評価のための方法で使用される。3つの異なるカテゴリーの原発性硬化性胆管炎(PSC)患者を診断する非侵襲的方法も提供される。PSC患者を遅い進行性患者、中程度進行性患者および速い進行性患者と診断するために、この方法を使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
これまで、肝生検での線維症ステージが、慢性肝疾患患者における臨床転帰の代わりとなる至適基準と考えられていた。いくつかの研究が、脂肪変性ではなく線維症の重症度が臨床転帰の将来の危険を予測することを実証した。残念なことに、線維症の病期分類における生検の精度は、試料採取過誤および組織病理学的解釈の変動の両方によって損なわれる。さらに、生検は侵襲的、高コストであり、患者に受け入れ難く、生命にかかわる合併症または死の危険さえも含む重大な危険を伴う。肝生検の代替手段が望ましい。
【０００５】
慢性肝疾患。推定によると、30,000,000人以上のアメリカ人が慢性肝疾患に罹っている可能性があることが示唆される。慢性肝疾患(CLD)には、慢性C型肝炎(CHC)、慢性B型肝炎、アルコール性肝疾患、アルコール性脂肪肝炎(ASH)および、比較的良性である脂肪変性と呼ばれる単純な脂肪肝からより重大な非アルコール性脂肪肝炎(NASH)に進行することがある非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、自己免疫性肝疾患、特発性肝硬変、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、α-1-抗トリプシン欠乏症、原発性硬化性胆管炎(PSC)、ならびに他の胆汁うっ滞性肝疾患が含まれる。
【０００６】
全ての肝疾患は、疾患進行が炎症、線維症の蓄積および門脈循環の変化によって加速する、共通する病態生理学的特徴を有する。門脈血流の非侵襲的評価を含む検査は、任意の慢性肝疾患を有するかそれが疑われる患者にとって望ましい。
【０００７】
原発性硬化性胆管炎。原発性硬化性胆管炎(PSC)は、肝傷害、および最終的に肝不全につながる進行性の肝疾患である。PSCは容赦のない進行を示すが、進行速度は患者間で異なる。慢性炎症は、胆管の硬化および瘢痕化につながる。肝移植はPSCのための唯一の公知の治療法であるが、一般に移植は重度の肝傷害患者だけに限られている。患者治療は、PSCの合併症の徴候および症状を低減することを含む。PSC病態生理の特質は、肝疾患の他の病因と比較して疾患初期の門脈圧亢進(PHTN)につながる門脈線維症である。
【０００８】
肝生検はかなりの試料採取過誤を有し、もはや推奨されていないので、PSCでの疾患重症度の評価は至適基準を欠いている。肝静脈圧勾配(HVPG)は、侵襲的、高価で非実用的であり、後期疾患を評価するために臨床モデルが実際に作成された。参照により本明細書に組み込まれる、2012年5月30日に出願されたEversonら、US13/484,083に開示される通り、前に開示された肝機能検査であるSHUNT、門脈HFRおよびSTATがPSC患者で実施された。これらの検査は疾患重症度を正確に示すことができたが、PSCの進行速度の診断のための正確で非侵襲的な方法の必要性がなお満たされていない。
【０００９】
門脈血流を正確に測定するために、2つの公知の肝機能検査、門脈HFR(門脈肝濾過率、FLOW)検査およびSHUNT検査が使用されており、慢性C型肝炎患者の大きなコホートを使用して以前に検証された。慢性C型肝炎患者での肝機能のための門脈HFRおよびSHUNT検査は、本発明者らによって先行出願で開示された。
【００１０】
門脈HFR(FLOW)検査は、重水素化コール酸の経口投与から90分間にわたってとられる最低で5つの血液試料から、門脈血流を正確に測定する。門脈HFR(FLOW)検査は、参照により本明細書に組み込まれる、2009年9月11日に出願されたEverson、US2010/0055734、Methods for Diagnosis and Intervention of Hepatic Disordersに開示される。
【００１１】
SHUNT検査は、13C-コール酸の静脈内投与および重水素化コール酸の経口投与の共投与を含む。SHUNT検査は門脈血流および全身の肝血流を測定するために使用することができ、したがって、門脈-体循環シャンティングの量を決定することができる。SHUNT検査は、参照により本明細書に組み込まれる、2006年1月26日に出願されたEversonら、US2008/0279766、Methods for Diagnosis and Intervention of Hepatic Disordersに開示される。門脈血流を推定するための検査は、他の慢性肝疾患にも適用できる。
【００１２】
STAT検査と呼ばれる第3の検査は、門脈血流および肝機能を推定するためのスクリーニング方法である。STAT検査は、参照により本明細書に組み込まれる、2012年5月30日に出願されたEversonら、US13/484,083に開示される。STAT検査はスクリーニング目的を意図しており、肝血流および肝機能をモニターするためにFLOWおよびSHUNT検査と併用される。例えば、カットオフレベルより上のSTATスクリーニング検査結果を有する患者は、患者で肝血流および肝機能をモニターするためにより包括的な門脈HFRおよびSHUNT検査にかけられる。
【００１３】
現在、門脈HFR(FLOW)、SHUNTおよびSTAT検査は、慢性C型肝炎および他の慢性肝疾患を有する患者で疾患重症度を明確にするために使用されている。特定の疾患の疾患進行の追跡および処置への応答の評価で使用するために、様々なカットオフが確立されている。しかし、任意の慢性肝疾患のために有用である重症度の一般的指数はまだ開発されていない。
【００１４】
門脈HFRおよびSHUNT検査は、いくつかの臨床適用、例えば、抗ウイルス療法を受けるべきである慢性B型肝炎患者の選択;抗ウイルス療法を受けるべきである慢性C型肝炎患者の選択;肝切除について評価される肝細胞癌(HCC)患者での肝代償障害の危険の評価;器官ドナーを待つ間に死亡する危険がある、低いMELD(末期肝疾患スコアのモデル)を有する順番待ちリストに載っている患者のサブグループの識別;臨床試験でのエンドポイントとして;小児科集団での肝生検の取替え;異系移植片機能の追跡;生体ドナーでの機能復活の測定;および胆汁うっ滞性肝疾患(PSC、原発性硬化性胆管炎)での機能障害の測定のための肝機能評価のための価値あるツールである。特定の状態に関するFLOWおよびSHUNT検査のための様々なカットオフが開発されているが、肝疾患のいくつかの臨床状態に適用できる疾患重症度指数(DSI)の開発が明らかに望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】US13/484,083
【特許文献２】US2010/0055734
【特許文献３】US2008/0279766
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】MukherjeeおよびSorrell、2006、Noninvasive tests for liver fibrosis.Semin Liver Dis.26:337〜347頁
【非特許文献２】ManningおよびAfdhal、2008.Diagnosis and quantitation of fibrosis.Gastroenterology.134:1670〜1681頁
【非特許文献３】Poynardら、2008、Concordance in a world without a gold standard: A new non-invasive methodology for improving accuracy of fibrosis markers.PLoS One.3:e3857
【非特許文献４】Rosen、Chronic Hepatitis C Infection、N Engl J Med 2011;364:2429〜38頁
【非特許文献５】Browningら、2004、Prevalence of hepatic steatosis in an urban population in the United States: Impact of ethnicity.Hepatology.40:1387〜1395頁
【非特許文献６】Adamsら、2005、The natural history of nonalcoholic fatty liver disease:A population-based cohort study.Gastroenterology.129:113〜121頁
【非特許文献７】JanesおよびLindor、1993、Ann Intern Med.118:96〜98頁
【非特許文献８】Seeffら、2010、Clin Gastroenterol Hepatol.8:877〜883頁
【非特許文献９】Vuppalanchiら、2009、Clin Gastroenterol Hepatol.7:481〜486頁
【非特許文献１０】Bedossaら、2003、Hepatology.38:1449〜1457頁
【非特許文献１１】Regevら、2002、Am J Gastroenterol.97:2614〜2618頁
【非特許文献１２】Rousseletら、2005、Hepatology.41:257〜264頁
【非特許文献１３】Ishakら、1995、J Hepatol.22:696〜699頁
【非特許文献１４】Bruntら、1999、Am J Gastroenterol.94:2467〜2474頁
【非特許文献１５】Kleinerら、2005.Hepatology41: 1313〜1321頁
【非特許文献１６】Group、TFMCS、1994、Hepatology.20:15〜20頁
【非特許文献１７】Knodellら、1981、Hepatology.1:431〜435頁
【非特許文献１８】BattsおよびLudwig、1995、Am J Surg Pathol.19:1409〜1417頁
【非特許文献１９】Scheuer、1991、J Hepatol.13:372〜374頁
【非特許文献２０】Ratziuら、2005、Gastroenterology.128:1898〜1906頁
【非特許文献２１】MukherjeeおよびSorrell、2006、Noninvasive tests for liver fibrosis.Semin Liver Dis.26:337〜347頁
【非特許文献２２】Shahら、2009、Comparison of noninvasive markers of fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease.Clin Gastroenterol Hepatol.7:1104〜1112頁
【非特許文献２３】Boursierら、2009.Improved diagnostic accuracy of blood tests for severe fibrosis and cirrhosis in chronic hepatitis c.Eur J Gastroenterol Hepatol.21:28〜38頁
【非特許文献２４】Shaheenら、2007、Fibrotest and fibroscan for the prediction of hepatitis c-related fibrosis:A systematic review of diagnostic test accuracy.Am J Gastroenterol.102:2589〜2600頁
【非特許文献２５】Ratziuら、2006、Diagnostic value of biochemical markers (fibrotest-fibrosure) for the prediction of liver fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease.BMC Gastroenterol.6:6頁
【非特許文献２６】Anguloら、2007、The NAFLD fibrosis score:A noninvasive system that identifies liver fibrosis in patients with NAFLD.Hepatology.45:846〜854頁
【非特許文献２７】Wongら、2010、Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology.51:454〜462頁
【非特許文献２８】Bradenら、2005.13C-methacetin breath test as liver function test in patients with chronic hepatitis c virus infection.Aliment Pharmacol Ther.21:179〜185頁
【非特許文献２９】Del PoggioおよびColombo、2009.Is transient elastography a useful tool for screening liver disease? World J Gastroenterol.15:1409〜1414頁
【非特許文献３０】Rossiら、2003.Validation of the fibrotest biochemical markers score in assessing liver fibrosis in hepatitis c patients.Clin Chem.49:450〜454頁
【非特許文献３１】Wongら、2010、Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology.51:454〜462頁
【非特許文献３２】Friedrich-Rustら、2008.Performance of transient elastography for the staging of liver fibrosis:A meta-analysis.Gastroenterology.134:960〜974頁
【非特許文献３３】Eversonら、2009.Quantitative tests of liver function measure hepatic improvement after sustained virological response:Results from the HALT-C trial.Aliment Pharmacol Ther.29:589〜601頁
【非特許文献３４】Eversonら、2008.The spectrum of hepatic functional impairment in compensated chronic hepatitis c:Results from the hepatitis c anti-viral long-term treatment against cirrhosis trial.Aliment Pharmacol Ther.27:798〜809頁
【非特許文献３５】Quantitative Liver Function Tests Improve the Prediction of Clinical Outcomes in Chronic Hepatitis C:Results from the HALT-C Trial、Eversonら、Gastroenterologyに投稿した
【非特許文献３６】Sukら2007、Effect of propranolol on portal pressure and systemic hemodynamics in patients with liver cirrhosis and portal hypertension: a prospective study.Gut and Liver 1 (2):159〜164頁
【非特許文献３７】Weissら、1978 (+)-Propranolol clearance, an estimation of hepatic blood flow in man、Br. J. Clin. Pharmacol.5:457〜460頁
【非特許文献３８】Sunら、High performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometric determination of isosorbide 5-mononitrate in human plasma、J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Sci. 2007年2月1日; 846(1-2):323〜8頁
【非特許文献３９】Tygstrup N、Determination of the hepatic elimination capacity (Lm) of galactose by a single injection、Scand J Lab Clin invest、18 Suppl 92、1966、118〜126頁
【非特許文献４０】Jepsenら、2009、The galactose elimination capacity and mortality in 781 Danish patients with newly-diagnosed liver cirrhosis: a cohort study.BMC Gastroenterol.2009、9:50頁
【非特許文献４１】TraunerおよびBoyer、2003、Bile salt transporters:Molecular characterization, function, and regulation.Physiol Rev.83:633〜671頁
【非特許文献４２】Pughら、Transection of the oesophagus for bleeding oesophageal varices.Br J Surg 1973;60:646〜649頁
【非特許文献４３】http://mayoclinic.org/meld/mayomodel9.html
【非特許文献４４】UNOS(2009-01-28)「MELD/PELD calculator documentation」
【非特許文献４５】Bioanalytical Method Validation、2001年5月、Section VI. Application of Validated Method to Routine Drug Analysis
【非特許文献４６】Gastroenterology 2012、142:S911
【非特許文献４７】Liver Transplantation 2012、18:S233
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一部の実施形態では、疾患重症度指数(DSI)は、患者で慢性肝疾患をモニターするための方法で使用するために提供される。DSIは、肝血流に基づく肝機能検査結果から導かれる。DSIは、いくつかの慢性肝疾患で処置のモニターおよび疾患重症度の評価のための方法で使用される。
【００１８】
一部の実施形態では、患者で疾患重症度指数(DSI)値を決定するための方法であって、(a)慢性肝疾患を有するかその危険がある患者で1つまたは複数の肝機能検査値を得る工程であって、1つまたは複数の肝機能検査値が、SHUNT、門脈肝濾過率(門脈HFR)および全身肝濾過率(全身HFR)からなる群から選択される1つまたは複数の肝機能検査から得られる工程と;(b)患者でDSI値を得るために疾患重症度指数式(DSI式)を用いる工程であって、DSI式が、DSI値を得るために1つまたは複数の項および定数を含み、DSI式の少なくとも1つの項が、患者での肝機能検査値、または工程からの患者での数学的に変換された肝機能検査値を独立して表し;DSI式の少なくとも1つの該項に、肝機能検査に特異的な係数を掛ける工程とを含む方法が提供される。
【００１９】
一部の実施形態では、患者で疾患重症度指数(DSI)値を決定するための方法は、患者のDSI値を、1つもしくは複数のDSIカットオフ値、1つもしくは複数の正常で健康な対照、または患者の1つもしくは複数の経時的DSI値と比較する工程をさらに含む。一部の実施形態では、患者のDSI値を1つまたは複数のDSIカットオフ値と比較する工程は、少なくとも1つの臨床転帰の指標になる。一部の実施形態では、臨床転帰は、Child-Turcotte-Pugh(CTP)増加、静脈瘤、脳症、腹水および肝臓関連死からなる群から選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、患者の経時的DSI値を比較する工程は、患者の慢性肝疾患の処置の有効性をモニターするために使用され、患者のDSI値の経時的低下は、処置の有効性の指標である。
【００２１】
一部の実施形態では、患者の経時的DSI値を比較する工程は、患者の慢性肝疾患の処置の必要性をモニターするために使用され、患者のDSI値の経時的増加は、患者の処置の必要性の指標である。
【００２２】
一部の実施形態では、患者のDSI値は、患者の慢性肝疾患の処置の必要性または有効性をモニターするために使用され、処置は、抗ウイルス処置、抗線維症処置、抗生物質、免疫抑制処置、抗がん処置、ウルソデオキシコール酸、インスリン感作剤、介入処置、肝移植、ライフスタイル変更および食事制限、低血糖指数食、抗酸化剤、ビタミン剤、経頚静脈性肝内門脈大循環短絡術(TIPS)、カテーテル誘導血栓溶解、バルーン拡張およびステント留置、バルーン拡張および排液、体重減少、運動ならびにアルコールの回避からなる群から選択される。
【００２３】
一部の実施形態では、患者の経時的DSI値を比較する工程は、患者の慢性肝疾患の状態または疾患進行をモニターするために使用され、患者のDSI値の経時的変化は、疾患の状態および将来の臨床転帰の危険を患者に知らせるために使用され、患者のDSI値の経時的増加は予後の悪化の指標であり、患者のDSI値の経時的低下は予後の向上の指標である。
【００２４】
一部の実施形態では、DSI式の少なくとも1つの項は、工程からの患者での数学的に変換された肝機能検査値を独立して表し、患者での数学的に変換された肝機能検査値は、患者での肝機能検査値の対数、真数、自然対数、自然真数または逆数から選択される。
【００２５】
一部の実施形態では、DSI式の各項は、患者での肝機能検査値、または患者での数学的に変換された肝機能検査値を独立して表し、DSI式の少なくとも1つの項に、肝機能検査に特異的な係数を掛ける。
【００２６】
一部の実施形態では、疾患重症度指数式は:
DSI=5.34(SHUNT)-6.65(Loge門脈HFR)-8.57(Loge全身HFR)+44.66
であり、式中、SHUNTは患者でのSHUNT検査値(%)であり、門脈HFRはmL/分/kgで表す患者での門脈HFR検査値であり、ここでkgは患者の体重であり、全身HFRはmL/分/kgで表す患者での全身HFR値であり、ここでkgは患者の体重であり、患者のSHUNT、門脈HFRおよび全身HFR検査値は、同日中に得られたものである。
【００２７】
一部の実施形態では、疾患重症度指数式は:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
であり、式中、SHUNTは患者でのSHUNT検査値(%)であり、門脈HFRはmL/分/kgで表す患者での門脈HFR検査値であり、ここでkgは患者の体重であり、全身HFRはmL/分/kgで表す患者での全身HFR値であり、ここでkgは患者の体重であり、患者のSHUNT、門脈HFRおよび全身HFR検査値は、同日中に得られたものである。
【００２８】
一部の実施形態では、患者のDSI値は、慢性C型肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患または原発性硬化性胆管炎から選択される患者での慢性肝疾患を評価するために使用される。
【００２９】
一部の実施形態では、患者で慢性肝疾患を評価するために使用される疾患重症度指数式は:
DSI=9.84(SHUNT)-12.36LOGe(門脈HFR)+50.5
であり、式中、SHUNTは患者でのSHUNT検査値(%)であり、門脈HFRはmL/分/kgで表す患者での門脈HFR検査値であり、ここでkgは患者の体重であり、患者のSHUNTおよび門脈HFR検査値は、同日中に得られたものである。一部の実施形態では、慢性肝疾患は慢性C型肝炎である。
【００３０】
一部の実施形態では、患者のSHUNT検査値はDSI式で使用され、SHUNT検査値は、PSCを有する患者への第1の識別可能なコール酸の用量(用量oral)の経口投与および該患者への第2の識別可能なコール酸の用量(用量iv)の並行静脈内共投与を行った後に該患者から収集した複数の血液または血清試料を受け取る工程であって、試料が投与後の期間にわたる間隔で収集されたものである工程と;各試料中の第1および第2の識別可能なコール酸の濃度を定量化する工程と;経口識別可能コール酸のクリアランス曲線モデルに適合させたコンピュータアルゴリズム曲線を使用し、個別の経口クリアランス曲線下面積(AUCoral)を計算することを含む、各試料中の第1の識別可能なコール酸の濃度から個別の経口クリアランス曲線を作成する工程と;静脈内の第2の識別可能コール酸のクリアランス曲線モデルに適合させたコンピュータアルゴリズム曲線を使用し、個別の静脈内クリアランス曲線下面積(AUCiv)を計算することにより、各試料中の第2の識別可能なコール酸の濃度から個別の静脈内クリアランス曲線を作成する工程と;下記式:
AUCoral/AUCiv×用量iv/用量oral×100%
を使用して患者でシャント値を計算する工程とを含む方法によって決定される。
【００３１】
SHUNT検査を用いる一部の実施形態では、第1の識別可能なコール酸は第1の安定同位体標識コール酸であり、第2の識別可能なコール酸は第2の安定同位体標識コール酸である。一部の実施形態では、第1および第2の安定同位体標識コール酸は、2,2,4,4-d4コール酸および24-13Cコール酸から選択される。一部の実施形態では、試料は、投与後2〜7つの時点の間隔で患者から収集されたものである。一部の実施形態では、試料は、投与の5、20、45、60および90分後に患者から収集されたものである。一部の実施形態では、試料は、投与時刻から投与後約45分〜約180分から選択される時刻までの期間にわたる間隔で収集されたものである。一部の実施形態では、試料は投与後約90分以下の期間にわたる間隔で収集されたものである。
【００３２】
一部の実施形態では、患者の門脈HFR値はDSI式で使用され、門脈HFR値は、慢性肝疾患を有するかその危険がある患者への識別可能なコール酸の用量(用量oral)の経口投与を行った後に該患者から収集した複数の血液または血清試料を受け取る工程であって、試料が、投与後の期間にわたる間隔で該患者から収集されたものである工程と;各試料中の識別可能なコール酸の濃度を測定する工程と;識別可能コール酸のクリアランス曲線モデルに適合させたコンピュータアルゴリズム曲線を使用することを含む、各試料中の識別可能なコール酸の濃度から個別の経口クリアランス曲線を作成する工程と;個別の経口クリアランス曲線下面積(AUC)(mg/mL/分)を計算し、経口投与される安定同位体標識コール酸のAUCで用量(mg)を割って、患者での経口コール酸クリアランスを得る工程と;kgで表す患者の体重で経口コール酸クリアランスを割って、患者の門脈HFR値(mL/分/kg)を得る工程とを含む方法によって決定される。
【００３３】
一部の実施形態では、患者の全身HFR値はDSI式で使用され、患者の全身HFR値は、慢性肝疾患を有するかその危険がある患者への識別可能なコール酸の用量(用量iv)の静脈内投与を行った後に該患者から収集した複数の血液または血清試料を受け取る工程であって、試料が、投与後の期間にわたる間隔で該患者から収集されたものである工程と;各試料中の識別可能なコール酸の濃度を測定する工程と;識別可能コール酸のクリアランス曲線モデルに適合させたコンピュータアルゴリズム曲線を使用することを含む、各試料中の識別可能なコール酸の濃度から個別の静脈内クリアランス曲線を作成する工程と;個別の静脈内クリアランス曲線下面積(AUC)(mg/mL/分)を計算し、静脈内投与される安定同位体標識コール酸のAUCで用量(mg)を割って、患者での静脈内コール酸クリアランスを得る工程と;kgで表す患者の体重で静脈内コール酸クリアランスを割って、患者の全身HFR値(mL/分/kg)を得る工程とを含む方法によって決定される。
【００３４】
一部の実施形態では、慢性肝疾患に罹患した患者のために疾患重症度指数(DSI)値を計算するための方法であって、慢性肝疾患に罹患した患者から血清試料を得る工程であって、患者が第1の安定同位体コール酸の経口投与および第2の安定同位体コール酸の同時静脈内投与を以前に受けており、血液試料がコール酸の投与の後180分未満の間に患者から収集されたものである工程と;mL/分/kgで表す門脈肝臓濾過率(門脈HFR)、ここでkgは患者の体重であり、mL/分/kgで表す全身肝臓濾過率(全身HFR)、ここでkgは患者の体重であり、および%で表すSHUNTを計算するために血清試料をアッセイする工程と;式:
DSI=9.84(SHUNT)-12.36 Loge(門脈HFR)+50.5;
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50;
または
DSI=5.34(SHUNT)-6.65(Loge門脈HFR)-8.57(Loge全身HFR)+44.66
から選択される式を用いて患者のDSI値を計算する工程とを含む方法が提供される。
【００３５】
一部の実施形態では、DSI式は:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
であり、DSI値は慢性肝疾患患者で門脈圧亢進または代償障害の危険の増加を同定するために使用され、DSI≧18は門脈圧亢進(PHTN)の危険の増加を示し、DSI≧36は代償障害の危険の増加を示す。一部の実施形態では、門脈圧亢進(PHTN)は脾腫または静脈瘤と規定され、代償障害は腹水または静脈瘤出血と規定される。一部の実施形態では、慢性肝疾患は原発性硬化性胆管炎である。
【００３６】
一部の実施形態では、慢性肝疾患に罹患した患者のために疾患重症度指数(DSI)値を計算するために使用されるDSI式は:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
であり、DSI値は、慢性肝疾患患者での臨床転帰の予測のために使用され、DSI≧25は、患者での臨床転帰の危険の増加を示す。一部の実施形態では、慢性肝疾患は慢性C型肝炎である。一部の実施形態では、臨床転帰は、CTP進行、静脈瘤出血、腹水、肝性脳症または肝臓関連死から選択される。
【００３７】
一部の実施形態では、患者は肝移植(LT)の順番待ちリストに載っており、DSI式は:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
であり、DSI値は、LTの順番待ちリストに載っている患者に優先順位をつけるために使用され、LTの順番待ちリストに載っている患者の優先順位は、患者のDSI値が経時的に増加した後、または患者のDSI値が40を超えた後に上げられる。
【００３８】
一部の実施形態では、DSI式は:
DSI=5.34(SHUNT)-6.65(Loge門脈HFR)-8.57(Loge全身HFR)+44.66
であり、DSI値は、慢性肝疾患患者での将来の臨床転帰の予測のために使用され、DSI>19は、患者での臨床転帰の危険の増加を示す。
【００３９】
一部の実施形態では、DSI値を得るために2つ以上の項および定数を含むDSI式が提供され、DSI式の少なくとも1つの項は、患者での肝機能検査値、または工程からの患者での数学的に変換された肝機能検査値を独立して表し;DSI式の少なくとも1つの該項に、肝機能検査に特異的な係数を掛け、DSI式は、血清アルブミン、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、総ビリルビン、直接ビリルビン、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、5'ヌクレオチダーゼ、PT-INR(プロトロンビン時間の国際標準化比)、カフェイン排泄、アンチピリンクリアランス、ガラクトース排泄能力、リドカインからのMEGXの形成、メタセチン-C13およびメチオニン-C13からなる群から選択される臨床生化学ラボアッセイからの値を表す1つまたは複数の追加の項;ならびに/または、静脈瘤、腹水もしくは肝性脳症から選択される臨床像を表す1つまたは複数の追加の項を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、患者で原発性硬化性胆管炎(PSC)の進行速度を診断するための方法であって、PSCを有する患者でSHUNT検査値または門脈HFR検査値を決定する工程と;アルゴリズムにSHUNT検査値または門脈HFR検査値を用いてアルゴリズム結果を提供する工程であって、アルゴリズムが決定工程時の患者の年齢を表す項を含む工程と;アルゴリズム結果を公知のカットオフ値と比較して患者でのPSCの進行速度を診断する工程とを含む方法が提供される。一部の実施形態では、患者で原発性硬化性胆管炎(PSC)の進行速度を診断するための方法であって、患者の年齢で割った患者のSHUNT検査値(%)が1.7を超える場合、患者での原発性硬化性胆管炎(PSC)の進行速度は速く、PSCを有する患者は速い進行性患者と診断される方法が提供される。
【００４１】
一部の実施形態では、患者で原発性硬化性胆管炎(PSC)の進行速度を診断するための方法であって、患者の年齢で割った患者のSHUNT検査値(%)が1.7未満であり、門脈HFR(mL/分/kg)+[0.35×年齢]>29である場合、患者での原発性硬化性胆管炎(PSC)の進行速度は遅く、PSCを有する患者は遅い進行性患者と診断される方法が提供される。
【００４２】
一部の実施形態では、患者で原発性硬化性胆管炎(PSC)の進行速度を診断するための方法であって、患者の年齢で割った患者のSHUNT検査値(%)が1.7未満であり、門脈HFR(mL/分/kg)+[0.35×年齢]<29である場合、患者での原発性硬化性胆管炎(PSC)の進行速度は中程度であり、PSCを有する患者は中程度の進行性患者と診断される方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】門脈HFRおよびSHUNT検査の概略図を示す。健康な対照(上パネル)は、低いSHUNT、高い門脈HFRおよび高い全身HFRを一般に示し;PSCなどの肝疾患を有する対象(下パネル)は、より高いSHUNT、より低い門脈HFRおよびより低い全身HFRを示す。
【図２】門脈HFR対SHUNT検査値は、静脈瘤のないPSC患者、静脈瘤を有するPSC患者および代償障害を有するPSC患者から、健康な対照を区別することができることを示す図である。
【図３】PSC患者での門脈HFR対年齢を示す図である。門脈HFR検査値および検査時年齢に基づいて、PHC患者を異なる群に分離することができた。
【図４】SHUNT検査値対検査時年齢に基づいて、PSC患者を異なる群に分離することができたことを示す図である。
【図５】健康な対照ならびに遅い、中程度および速い進行性患者に分類されるPSC患者からの炎症誘発性サイトカインIFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-1β、IL-6およびIL-8を示す図である。各カテゴリーの患者は、特異な病態生理学的機構を示唆するサイトカインの特異なパターンを示した。
【図６】SHUNT対年齢は、速い進行性患者に分類されるPSC患者を決定することを示す図である。0を起点とする線は、1.7のSHUNT/年齢を画定する;SHUNT/年齢>1.7を示す線より上の患者は、速い進行性患者に分類される。SHUNT/1.7<1.7を有する患者は、他のPSCカテゴリーに分類される。
【図７】速い進行性患者に分類されなかったPSC患者の門脈HFR対年齢を示す図である。0を起点とする線は、29に等しい門脈HFR+[0.35+年齢]を画定する。29を超える門脈HFR+[0.35+年齢]を有する患者は、遅い進行性患者に分類される。29未満の門脈HFR+[0.35+年齢]を有する患者は、中程度の進行性患者に分類される。
【図８】PSC患者のSTAT検査値対年齢を示す図である。ほとんどの患者は、遅い、中程度および速い進行性患者のプロットの上の黒線で示される、単純なカットオフを使用して分類することができる。30歳から40歳の間の患者は重複するSTAT結果を有し、この方法によって分類することができない。
【図９】CHC患者群に関する60分時のlog STAT検査結果対log門脈HFR(FLOW)検査結果の相関を示す図である。60分時の濃度(μM)を推定された門脈流(mL/分/kg)に変換することができる式を導いた。式は、y=0.9702x+0.0206であり、式中、xはLOG門脈HFR(FLOW)であり、yはLOG STATである。
【図１０】実施例9で提供されるように、DSIはIshak線維症スコア(肝生検、左パネル)と線形に相関するが、脂肪変性(生検脂肪スコア、右パネル)によって影響されないことを示す図である。
【図１１】Ishak線維症スコア(肝生検)、血小板数(CBC)およびMELD(末期肝疾患スコアのモデル)のそれと比較した、将来の臨床転帰を有する患者の同定におけるDSIの性能を示す図である。最適なカットオフでは、驚くべきことに、将来の臨床転帰の予測に関して、DSIは肝生検およびMELDを含む他の標準検査法に優った。具体的には、肝生検、血小板数およびMELDと比較したとき、DSIは最も高い感度、特異度、PPVおよびNPVを示した。
【図１２】SHUNT、門脈HFRおよびDSIについての転帰を予測するためのROC曲線を示す図である。最適なカットオフは、左上隅に最も近くの各曲線上の点と決定した。
【図１３】軽度の疾患、中等度の疾患および重度の疾患を有する非硬化性慢性C型肝炎患者(Ishak F2、3、4;n=19、63、45)のコール酸検査結果、ならびにコール酸に基づく検査SHUNT(%)、全身HFR(mL/分/kg)、門脈HFR(mL/分/kg)およびDSIの検査結果のプロットである。門脈HFRはX軸に、全身HFRはY軸にプロットされ、SHUNT、全身対門脈HFRの比は斜線によって表され、DSIは影付きの領域で示される。驚くべきことに、実施例10で議論するように、高いDSIを有する非硬化性患者は転帰のより大きな危険を有する。
【図１４】軽度の疾患、中等度の疾患および重度の疾患を有する硬化性慢性C型肝炎患者(Ishak F5、6;n=48、49)のコール酸検査結果ならびにコール酸に基づく検査SHUNT(%)、全身HFR(mL/分/kg)、門脈HFR(mL/分/kg)およびDSIの検査結果のプロットである。門脈HFRはX軸に、全身HFRはY軸にプロットされ、SHUNT、全身対門脈HFRの比は斜線によって表され、DSIは影付きの領域で示される。驚くべきことに、実施例10で議論するように、低いDSIを有する硬化性患者は転帰のより低い危険を有する。
【図１５】原発性硬化性胆管炎患者および健康な対照のコール酸検査結果のプロットである。門脈HFRはX軸に、全身HFRはY軸にプロットされ、SHUNT、全身対門脈HFRの比は斜線によって表され、DSIは影付きの領域で示される。PSC疾患、静脈瘤および代償障害のための予測的DSIカットオフは、ゾーンの間の境界面で示される。
【図１６】PSC患者のDSI値とMELDとの比較を示す図である。パネルAは、全てのPSC患者のDSIとMELDとの比較を示す。健康な対照のDSIも、参考のために示す。パネルBは、およそ20のDSIが静脈瘤のないPSC患者から静脈瘤を有するPSC患者を明瞭に分離することを示す。パネルCは、およそ35のDSIが代償障害のないPSC患者から代償障害を有するPSC患者を明瞭に分離することを示す。
【図１７】1年の追跡調査の後に評価したPSC患者におけるDSIおよび疾患重症度の変化を示す図である。DSIの変化は、患者の年齢に対してプロットした。遅いPSC進行を示すDSI値を有する患者を左パネルに示し、そこで、カットオフ=18はPHTNの指標である。中程度および速いPSC進行を示すDSI値を有する患者を右パネルに示し、そこで、カットオフ=36は代償障害の指標である。
【図１８】肝移植の順番待ちリストに載っているPSC患者のDSI対MELDスコアのプロットである。PSC患者での合併症の危険および肝移植の優先順位の評価において、DSIはMELDに優っていた。低いMELDスコアにもかかわらず、DSI>20を有するPSC患者は門脈圧亢進関連の合併症を発症し、DSI>40を有するPSC患者は肝移植を必要とした。
【図１９】Ａ．肝機能の四分位数と比較してSVRを達成した患者のグラフを示す。SVRの確率は、DSIと最も良好に相関した。Ｂ．PEG/RBV(ペグインターフェロン/リバビリン)による慢性HCV患者の再処置に続くSVR後の、左から右にかけてSHUNT、門脈HFRおよびDSIでの肝機能向上を示す図である。ベースラインから2年後に検査したとき、より重度のベースライン障害は、SVRの後のより大きな機能的向上になった。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本明細書に開示される方法および検査は、慢性肝疾患は、線維症自体でなく、有害であり肝機能の分析の標的にするべきである門脈血流の破壊であるという慢性肝疾患の新しい見解に基づく。
【００４５】
以前に開示された肝機能検査、門脈HFR(門脈肝濾過率、FLOW)検査およびSHUNT検査は、門脈血流を正確に測定するために使用され、慢性C型肝炎患者の大きなコホートを使用して以前に検証された。慢性C型肝炎患者での肝機能のための門脈HFRおよびSHUNT検査は、本発明者らによって先願出願で開示された。
【００４６】
一部の実施形態では、門脈HFR結果またはSHUNT結果を年齢で割ったとき、機能的評価がPSCで疾患のカテゴリーを規定することができたことが驚くべきことに見出された。門脈HFRおよびSHUNTの値および検査時年齢に基づいて、PSC患者は異なる群に分離された。対照と比較して、遅いPSC患者は機能の穏やかな低下だけを有した。中程度および速いPSC患者は、より多くの合併症を、およびより早い年齢で示した。年齢で割った門脈HFR(図3)または年齢で割ったSHUNT(図4)のいずれかを用いて、遅い、中程度および速い進行性患者を識別することができた。発明者の知る限り、機能的評価がPSCで疾患のカテゴリーを規定したのはこれが初めてである。
【００４７】
慢性肝疾患(CLD)は、肝微小血管系の進行性の破壊につながる炎症、細胞死および線維症を伴う類似の病態生理によって全て特徴付けられ、したがって門脈血流を測定する検査が全てのCLDの評価のために機能する。
【００４８】
慢性肝疾患を評価するために提案されたほとんど全ての他の検査は、線維症、血清バイオマーカーまたは組織弾力性の変化のいずれかを重視した(MukherjeeおよびSorrell、2006、Noninvasive tests for liver fibrosis.Semin Liver Dis.26:337〜347頁;ManningおよびAfdhal、2008.Diagnosis and quantitation of fibrosis.Gastroenterology.134:1670〜1681頁;Poynardら、2008、Concordance in a world without a gold standard:A new non-invasive methodology for improving accuracy of fibrosis markers.PLoS One.3:e3857)。
【００４９】
線維症および微小血管系破壊は両方とも疾患の進行に伴い増加するが、それらは完全には関連していない。このことは、門脈流が臨界閾値の上に保たれる限り、極度の線維症、肝硬変を有する患者が安定を保つことができる理由を説明する。それは、中等度の線維症しか有しないが流れがひどく損なわれた患者が重大な合併症を起こすことがある理由も説明する。この新しい識見は、肝疾患評価の焦点全体を変化させる可能性がある。門脈流を標的にすることによって、医師は初期肝疾患を容易に検出し、患者の状態を正確に評価し、臨床転帰を予測することができる。肝疾患のためのより有効な処置は、新しい療法および新薬に関する研究を門脈流の向上および/または維持に集中させることからもたらすことができる。
【００５０】
慢性C型肝炎。C型肝炎は肝臓を冒す感染性の疾患であり、C型肝炎ウイルス(HCV)によって引き起こされる。HCV感染は長年検出されずに経過することができ、しばしば無症状である。しかし、慢性感染は、肝臓の瘢痕化、肝硬変および肝不全、肝がんまたは生命にかかわる食道および胃の静脈瘤につながることがある。肝硬変または肝がんの患者は肝移植を必要とすることがあるが、移植後にウイルスが再発生することがある。標準療法にはペグインターフェロンとリバビリンの併用が含まれ、ボセプラビルまたはテレプラビルとのさらなる併用を含む臨床試験が進行中である。全世界で、約180,000,000人がHCVに感染している。Rosen、Chronic Hepatitis C Infection、N Engl J Med 2011; 364:2429〜38頁。
【００５１】
HCV感染を検出するために、HCV抗体の酵素免疫検定法(ELISA)、組換えイムノブロット法およびHCV RNAポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含むいくつかの診断検査が利用できる。しかし、慢性感染は一般的に無症状であり、ほとんどの場合、高い肝酵素レベルの検査の後、または日常のスクリーニングの過程で発見される。残念なことに、診断検査は急性と慢性の症例を区別することができない。さらに、肝酵素は疾患重症度と十分に相関していない。肝生検は存在する肝傷害の程度を決定するために使用されるが、処置起因の危険がある。肝機能のより優れた非侵襲的検査が、近年開発された。
【００５２】
門脈血流を正確に測定するために、2つの公知の肝機能検査、門脈HFR(門脈肝濾過率、FLOW)検査およびSHUNT検査が使用されており、慢性C型肝炎患者の大きなコホートを使用して以前に検証された。慢性C型肝炎患者での肝機能のための門脈HFRおよびSHUNT検査は、本発明者らによって先願出願で開示された。
【００５３】
非アルコール性脂肪肝疾患。非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)(Browningら、2004、Prevalence of hepatic steatosis in an urban population in the United States:Impact of ethnicity.Hepatology.40:1387〜1395頁)は米国人口の最高3分の1に影響を及ぼす可能性があるが、人々は通常無症状であり、正常な「肝機能検査」-血清アルブミン、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、総ビリルビン、直接ビリルビンおよびガンマグルタミルトランスペプチダーゼなどの臨床生化学ラボ血液アッセイ-を有するので、この大きな流行病は大部分隠れている。NAFLDの発生率は、肥満、メタボリックシンドロームおよびインスリン抵抗性である主要な危険因子とともに上がり続ける。NAFLDは、比較的良性である脂肪変性と呼ばれる単純な脂肪肝から、より重大なNASH、非アルコール性脂肪肝炎に進行することがある。肝炎は肝臓の炎症であり、アルコール性脂肪肝炎(ASH)の場合のように過剰な飲酒によって、またはウイルス感染、すなわち慢性C型肝炎(CHC)によって起こることもある。これら全ての慢性肝疾患(CLD)は、肝微小血管系の進行性の破壊につながる炎症、細胞死および線維症を伴う類似の病態生理によって特徴付けられる。NAFLD患者の約5%は肝硬変に進行し(Adamsら、2005、The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: A population-based cohort study.Gastroenterology.129:113〜121頁)、NAFLDは肝移植のための主要な適応症としてCHCを凌ぐ。
【００５４】
慢性肝疾患患者をモニターすることの難しさ。現在、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)と脂肪変性を区別して、NASHの進行をモニターする唯一の方法は針生検によるものであり、それは炎症活性のグレードおよび線維症のステージを評価する。生検は、多数の不正確源および侵襲的処置の危険を被るにもかかわらず、至適基準と考えられている。患者を鎮静させなければならず、一部は出血および他の合併症を経験する(JanesおよびLindor、1993、Ann Intern Med.118:96〜98頁;Seeffら、2010、Clin Gastroenterol Hepatol.8:877〜883頁)。針生検は非常に大きな器官の非常に小さい検体であり、十分な試料採取のために十分な位置から十分大きい断片を得ることは非常に困難である(Vuppalanchiら、2009、Clin Gastroenterol Hepatol.7:481〜486頁;Bedossaら、2003、Hepatology.38:1449〜1457頁;Regevら、2002、Am J Gastroenterol.97:2614〜2618頁)。生検の解釈は主観的であり、観察者の専門知識(Rousseletら、2005、Hepatology.41:257〜264頁)、ならびに組織試料のサイズおよび数(Rousseletら、2005;Vuppalanchiら、2009)に依存する。CHCでの線維症の進行の記載において、6段階のIshakシステム(Ishakら、1995、J Hepatol.22:696〜699頁)を使用することができるが、より単純な4段階システム、例えば、NASHのために使用される4段階システム(Bruntら、1999、Am J Gastroenterol.94:2467〜2474頁;Kleinerら、2005.Hepatology41:1313〜1321頁)に非常に同等であるMetavir(Group、TFMCS、1994、Hepatology.20:15〜20頁)がより一般的である(Knodellら、1981、Hepatology.1:431〜435頁;BattsおよびLudwig、1995、Am J Surg Pathol.19:1409〜1417頁;Scheuer、1991、J Hepatol.13:372〜374頁)。しかし、NASHでの病変の異質性は、精度を低下させる(Ratziuら、2005、Gastroenterology.128:1898〜1906頁)。特にその方法は推定で20%以上の過誤率を有するので、人口の三分の一に生検を実施することは実際的でない。他の標準の肝臓血液検査は、あまり有用でない。ALTまたはASTなどの肝酵素は活性フレアの間に急上昇することがあるが、進行の遅い速度のためにしばしばそれらは正常範囲内にある。アルブミンまたは凝固因子の肝臓による生成は、CLDの最後のステージで低下するだけである。NASHと脂肪変性を区別して、NASHの進行を正確にモニターする非侵襲的手段が望まれる。
【００５５】
他の非侵襲的検査方法の欠陥。非侵襲的肝臓評価の必要性は、バイオマーカーパネル、代謝呼吸検査および一時的エラストグラフィーを含む、他による新しい方法の商品化につながった。これらの他の非侵襲的検査方法の各々は、欠点を被る。
【００５６】
バイオマーカーパネル(MukherjeeおよびSorrell、2006、Noninvasive tests for liver fibrosis.Semin Liver Dis.26:337〜347頁;Shahら、2009、Comparison of noninvasive markers of fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease.Clin Gastroenterol Hepatol.7:1104〜1112頁)例えば、FibroTest(登録商標)は、初期CHC(Boursierら、2009.Improved diagnostic accuracy of blood tests for severe fibrosis and cirrhosis in chronic hepatitis c.Eur J Gastroenterol Hepatol.21:28〜38頁;Shaheenら、2007、Fibrotest and fibroscan for the prediction of hepatitis c-related fibrosis:A systematic review of diagnostic test accuracy.Am J Gastroenterol.102:2589〜2600頁)またはNASH(Ratziuら、2006、Diagnostic value of biochemical markers (fibrotest-fibrosure) for the prediction of liver fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease.BMC Gastroenterol.6:6頁;Anguloら、2007、The NAFLD fibrosis score:A noninvasive system that identifies liver fibrosis in patients with NAFLD.Hepatology.45:846〜854頁;Wongら、2010、Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology.51:454〜462頁)のいずれも検出するのに、または進行を追跡するために十分感受性でないが、その理由は、循環タンパク質/断片は微細構造、微小血管系の破壊および流れの障害に関して正確に報告することができないからである。
【００５７】
代謝呼吸検査は変動するが、その理由は、それらが性、年齢、遺伝形質、食事、医薬によって異なるチトクロームP450(CYP)酵素に依存し、これらの酵素は後期まであまり低下しないのでそれらは初期疾患に非感受性であることによる。BreathID(登録商標)はFDA試験でメタセチン代謝検査を有するが、この方法は初期の研究で初期CHCを検出することができなかった(Bradenら、2005.13C-methacetin breath test as liver function test in patients with chronic hepatitis c virus infection.Aliment Pharmacol Ther.21:179〜185頁)。
【００５８】
同じくFDA試験でのFibroScan(登録商標)は、線維症を推定するために肝臓硬直を測定するために、一時的エラストグラフィーを使用する(Del PoggioおよびColombo、2009.Is transient elastography a useful tool for screening liver disease? World J Gastroenterol.15:1409〜1414頁)。この方法は、CHC(Shaheenら、2007、下記、およびRossiら、2003.Validation of the fibrotest biochemical markers score in assessing liver fibrosis in hepatitis c patients.Clin Chem.49:450〜454頁)またはNASH(Wongら、2010、Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology.51:454〜462頁)を含む初期CLDに非感受性であり(Del PoggioおよびColombo、2009、下記;Friedrich-Rustら、2008.Performance of transient elastography for the staging of liver fibrosis:A meta-analysis.Gastroenterology.134:960〜974頁)、NAFLDの主要な危険因子である肥満によって損なわれる。NASHと脂肪変性を区別して、NASHの進行を正確にモニターするより有効で非侵襲的な手段が明らかに必要である。
【００５９】
門脈流の新規重視は、慢性肝疾患の病期診断およびモニターの方法を革新する可能性がある。生検は、自己免疫疾患および遺伝障害を除外するために初期診断でなお有用であろうが、患者の状態を評価するために、または彼らを経時的に追跡するために使用されないであろう。門脈流の障害は、管理を導き、静脈瘤および肝細胞癌についてスクリーニングする適時を決定するために使用されるであろう。門脈流は、臨床試験のための新しく、より正確に決定されるエンドポイントであろう。
【００６０】
以前に開示された門脈HFRおよびSHUNT検査の概略図を、図1に示す。経口コール酸クリアランス(用量/経口クリアランス曲線下面積)は、有効な門脈血流の尺度である。体重1kgあたりの経口クリアランスは、門脈HFRを決定するために使用される。IVコール酸クリアランス(用量/IVクリアランス曲線下面積)は、全肝臓血流の尺度である。体重1kgあたりのIVクリアランスは、全身HFRを決定する。IV対経口クリアランスの比は、門脈-体循環シャント比率(SHUNT)を評価する。一態様では、本開示は、経口コール酸クリアランスまたは門脈HFRを単一の時点、例えば投与(STAT)の60分後の経口コール酸血清濃度から推定することができる方法を提供する。
【００６１】
門脈HFRおよびSHUNT検査の概略図を、図1に示す。図1は、健康な対照(上パネル)は低いSHUNT、高い門脈HFRおよび高い全身HFRを一般に示すが、PSCなどの肝疾患を有する対象(下パネル)は、より高いSHUNT、より低い門脈HFRおよびより低い全身HFRを示すことを示す。
【００６２】
健康状態では、経口投与される重水素化コール酸は、門脈循環を通して肝臓に送達される。そのクリアランスは、門脈循環の尺度であり、したがって門脈HFRと呼ばれる。静脈内投与される13C-コール酸は、肝動脈と門脈静脈循環の両方を通して肝臓に送達され、したがって全身HFRと呼ばれる。SHUNTは、全身HFR対門脈HFRの比である。これらの検査の正常範囲を、上パネルに示す。
【００６３】
疾患がある場合は、下パネルに示すように、SHUNTは増加し、門脈および全身HFRは両方とも低下する。
【００６４】
例えば、正常で健康な対照は、約20%のSHUNT(IVコール酸クリアランス/経口コール酸クリアランス)、約30mL/分/kgの門脈HFR(体重1kgあたりの経口コール酸クリアランス)および約6mL/分/kgの全身HFR(体重1kgあたりの静脈内コール酸クリアランス)を一般的に示す。肝疾患患者は、約30%から90%のより高いSHUNT値を一般的に示す。肝疾患患者は、約20mL/分/kgから約2mL/分/kgのより低い門脈HFRを一般的に示す。肝疾患患者は、約4mL/分/kgから約1mL/分/kgのより低い全身HFRを一般的に示す。
【００６５】
病気の肝臓では、より多くの血液が全身循環への肝臓内および肝臓外シャンティングによる抽出を逃れるので、SHUNTは増加し、HFRまたは門脈流は減少し、STATは増加する。正常な対照対象では、有効な門脈血流(門脈HFR、FLOW)は、低い血管抵抗のために健康な肝臓で高い。門脈-体循環シャンティング(SHUNT)は、最小限である。60分時(STAT)の経口コール酸は低い。例えば、健康な対照では、FLOW=37mL/分/kg、SHUNT=18%およびSTAT=0.2μMである。しかし、肝疾患のある対象では、炎症、線維症および血管抵抗の増加は、有効な門脈血流(FLOW)を低減する。門脈-体循環シャンティング(SHUNT)は増加する。60分時(STAT)の経口コール酸は高い。例えば、CHC F2患者では、FLOW=9mL/分/kg、SHUNT=35%およびSTAT=1.6μMである。
【００６６】
門脈HFR(FLOW)およびSHUNT検査は、健康な対照および慢性C型肝炎患者で例えば門脈血流および肝機能を決定するために使用される。これらの検査はUS2010/0055734およびUS2008/0279766に開示され、それらは各々参照により本明細書に組み込まれる。STAT検査はスクリーニング検査として開発され、門脈血流を推定して、慢性C型肝炎、PSCおよびNAFLDを含む慢性肝疾患を有する患者の検出のために大きな集団をスクリーニングするために利用される。STAT検査は、門脈血流を推定して、慢性C型肝炎、PSCおよびNAFLDを含む慢性肝疾患を有する患者の検出のために大きな集団をスクリーニングするために開発された。門脈循環からのコール酸のクリアランスを決定する従来の方法、特にFLOWおよびSHUNT検査とSTATの関係は、慢性C型肝炎患者の大きなコホートを使用して検証された。STAT検査は、参照により本明細書に組み込まれる、2012年5月30日に出願のUS13/484,083に開示される。
【００６７】
一部の実施形態では、患者での門脈HFR値は、対象でのSTAT検査値から推定され、対象でのSTAT検査値は、(a)PSCを有する対象への識別可能なコール酸化合物の用量(用量oral)の経口投与を行った後に該対象から収集した単一の血液または血清試料を受け取る工程であって、試料が投与から約20〜180分以内の特定の時点で対象から収集されたものである工程と;(b)試料中の識別可能なコール酸化合物の濃度を測定する工程とを含む方法によって得られる。
【００６８】
一部の実施形態では、患者での全身HFR値は、(a)慢性肝疾患を有するかその危険がある患者への識別可能なコール酸の用量(用量oral)の静脈内投与を行った後に該患者から収集した複数の血液または血清試料を受け取る工程であって、試料が、投与後の期間にわたる間隔で該患者から収集されたものである工程と;(b)各試料中の識別可能なコール酸の濃度を測定する工程と;(c)識別可能コール酸のクリアランス曲線モデルに適合させたコンピュータアルゴリズム曲線を使用することを含む、各試料中の識別可能なコール酸の濃度から個別の静脈内クリアランス曲線を作成する工程と;(d)個別の経口クリアランス曲線下面積(AUC)(mg/mL/分)を計算し、静脈内投与される安定同位体標識コール酸のAUCで用量(mg)を割って、患者での静脈内コール酸クリアランスを得る工程と;(e)kgで表す患者の体重で静脈内コール酸クリアランスを割って、患者の門脈HFR値(mL/分/kg)を得る工程とを含む方法によって決定される。
【００６９】
一部の実施形態では、STAT検査での単一の血液または血清試料は、識別可能なコール酸化合物の経口投与から約20、25、30、35、40、45、50、55、50、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175または180分後から選択される単一の時点、またはその間の任意の時点で収集される。
【００７０】
一部の実施形態では、STAT検査での単一の血液または血清試料は、識別可能なコール酸化合物の経口投与から約45、約60または約90分後から選択される1つの時点で収集される。
【００７１】
一部の実施形態では、単一の血液または血清試料は、識別可能なコール酸化合物の経口投与から約60分後に収集される。
【００７２】
一部の実施形態では、単一の血液または血清試料は、識別可能なコール酸化合物の経口投与から約45分後に収集される。
【００７３】
一部の実施形態では、単一の血液または血清試料は、識別可能なコール酸化合物の経口投与から約90分後に収集される。
【００７４】
一部の実施形態では、推定肝臓血流(HBF)は、以下の式で計算される:
HBF=(静脈内投与後のコール酸クリアランス)/[1-(SHUNT/100))×(1-(ヘマトクリット%/100))]
【００７５】
以前に、ヒトでの研究により、CHCでのFLOWおよびSHUNT検査の臨床有用性が実証された。いくつかの新しい肝臓検査が長年提案されてきたが、それらの効力および実際の臨床有用性を直接に比較するための研究はほとんどなかった。主な目的が長期C型肝炎ウイルス抑制効力を決定することであったが、一連の新しい定量的肝機能検査を評価するために補助研究も含んでいた、非常に大きな多施設HALT-C試験が実行された。(Eversonら、2009.Quantitative tests of liver function measure hepatic improvement after sustained virological response:Results from the HALT-C trial.Aliment Pharmacol Ther.29:589〜601頁)。進行性(Ishak F2-6)であるが補正されたCLDを有するほぼ300人の患者が、検査を受けた。このCLDの全範囲を検討するために、近年完了した初期CHC研究は、25人の健康な対照および23人の初期(Ishak F1-2)CHC患者でこれらの検査を比較した。カフェイン、アンチピリン、リドカインおよびガラクトース検査を使用して肝臓の代謝能を評価した。全てのこれらの活性は肝硬変患者では低下したが、健康な対照と比較して初期CHC患者で異なったものはなかった。(Eversonら、2008.The spectrum of hepatic functional impairment in compensated chronic hepatitis c:Results from the hepatitis c anti-viral long-term treatment against cirrhosis trial.Aliment Pharmacol Ther.27:798〜809頁)。これらの結果は、後期CLDで機能的実質のかなりの損失があるまで、代謝能が維持されることを示唆する。HALT-Cでは、転帰をモニターするために2年ごとに患者を連続的に検査し、追跡した。<9.5ml/分/kgのカットオフを使用したFLOWは臨床転帰の予測で他の検査より優れ、最も高い感度、特異度、陽性予測値(PPV)、陰性予測値(NPV)およびROC分析による最良の性能であった(Quantitative Liver Function Tests Improve the Prediction of Clinical Outcomes in Chronic Hepatitis C:Results from the HALT-C Trial、Eversonら、Gastroenterologyに投稿した)。FLOWは、SHUNT(0.79)と比較して、高いROC c統計値(0.84)を有した。SVRの後の向上は、SHUNT(p=0.0003)でよりもFLOW(p=0.0002)で、有意であった(Eversonら、2009、下記)。初期CHC研究では、FLOWは対照での34±14ml/分/kg(平均±SD)から初期CHCでの23±10ml/分/kgに低下した(p<0.002)が、SHUNTの増加(対照での20±6%対初期CHC患者での31±14%、p<0.0002)は統計的により有意であった。他の検査のいずれも、初期CHC患者と健康な対照を区別することができなかった。これらの結果は、初期の肝疾患の検出、患者の追跡、および臨床転帰の予測において、SHUNTおよびFLOWが他の機能検査に優ることを示唆する。
【００７６】
疾患重症度指数(DSI)
特定の状態のためにFLOWおよびSHUNT検査のための様々な直接カットオフが以前に開発されたが、一部の場合には、疾患重症度指数(DSI)の使用は慢性肝疾患で患者カテゴリーをより明瞭に描写する。
【００７７】
「疾患重症度指数」(DSI)は、個々の患者の疾患重症度の評価にバイオアッセイ結果(肝機能検査)を適合させるように設計された数学モデルを用いる。例えば、規定の患者集団および健康な対照からの肝機能検査結果を使用して、DSI式が作成される。一部の実施形態では、特定の患者集団からDSI式が作成される。DSI式は、肝疾患のタイプまたは重症度に従い、SHUNT、門脈HFRおよび/または全身HFRから選択される1つまたは複数の項を有する。一部の実施形態では、疾患のタイプおよび疾患の重症度に従い、1つまたは複数のDSIカットオフがDSI比較のために使用される。一部の実施形態では、患者でのDSIの使用は、簡単な表照合だけしか必要としない。
【００７８】
一部の実施形態では、慢性肝疾患患者で疾患重症度指数(DSI)を決定する方法は、(a)慢性肝疾患を有する患者で1つまたは複数の肝機能検査値を得る工程であって、1つまたは複数の肝機能検査値が、SHUNT、門脈HFRおよび全身HFRからなる群から選択される1つまたは複数の肝機能検査から得られる工程と;(b)DSIを得るために1つまたは複数の項および定数を含む疾患重症度指数式(DSI式)を用いる工程であって;DSI式の少なくとも1つの項が、患者での肝機能検査値、または患者での数学的に変換された肝機能検査値を独立して表し;DSI式の少なくとも1つの該項に、肝機能検査に特異的な係数を掛ける工程とを含む。一部の実施形態では、患者での数学的に変換された肝機能検査値は、患者での肝機能検査値の対数、真数、自然対数、自然真数または逆数から選択される。一部の実施形態では、DSI式の各項は、肝機能検査値、または数学的に変換された肝機能検査値を表す。
【００７９】
DSI式の定数および係数は、肝疾患タイプおよび/または疾患重症度によって異なってもよい。一部の実施形態では、定数および係数は互いに関係するので、例えば全てを10で割る場合、DSIは0〜50ではなく0〜5になり、健康は10の代わりに1になる。一部の実施形態では、定数は5から125の間の正数である。一部の実施形態では、SHUNT係数は、0から正数25の間の数である。一部の実施形態では、門脈HFR係数は、0から負数25の間の数である。一部の実施形態では、全身HFR係数は、0から負数25の間の数である。
【００８０】
一部の実施形態では、DSI式の少なくとも1つの項に、各タイプの検査に特異的な係数を掛けてDSIを得る。一部の実施形態では、患者のDSIを、少なくとも1つの臨床転帰を示す1つまたは複数のDSIカットオフ値と比較する。
【００８１】
一部の実施形態では、本開示は、慢性肝疾患患者で疾患重症度指数(DSI)を決定する方法であって、(a)慢性肝疾患を有する患者からSHUNT検査値および門脈HFR検査値を得る工程と;(b)DSIを得るためにSHUNT検査値のための第1の項および門脈HFR値のための第2の項を含む疾患重症度式を用いる工程とを含む方法を提供する。
【００８２】
具体的な実施形態では、5または6のCTPスコアおよび臨床合併症の前歴がないことを特徴とする、HALT-C臨床試験に登録された224人の慢性HCV患者(Ishak F2〜F6)でベースライン時に実施されたコール酸検査の使用によって、DSI式を作成した。
【００８３】
具体的には、静脈内投与したコール酸のクリアランスからの全身肝濾過率(HFR)、経口投与したコール酸からの門脈HFR、およびFDAガイドラインに対して検証した改善されたLCMS法を使用したクリアランスの比からのSHUNTのためのコール酸クリアランス曲線を決定するために、保管中の血清を再分析した。最高8.3年(4.9±2.2年、平均±SD)の間、臨床転帰について患者を追跡した。臨床転帰(n=54)は、CTP進行、静脈瘤出血、腹水、肝性脳症または肝臓関連死で規定した。
【００８４】
疾患重症度指数(DSI)の誘導は、実施例10、Table 13(表13)に示す一変量Cox一変量Cox比例危険回帰分析を使用して実施した。コール酸検査からのSHUNT、門脈HFRおよび全身HFRを使用して一般式を作成した:
DSI=A(SHUNT)+B(loge門脈HFR)+C(loge全身HFR)+D。
【００８５】
HALT-Cコホートでの第1の臨床転帰の予測に基づいてDSI式を作成した:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50。
【００８６】
驚くべきことに、このDSI式はHCV患者のコホートで作成されたが、例えば実施例9〜13で提供されるように、それは、例えば他の慢性肝疾患原発性硬化性胆管炎(PSC)および非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)において疾患重症度の正確な評価を提供した。
【００８７】
一部の実施形態では、実施例12に示すように、コール酸検査に基づくDSIは、PSC患者を健康な対照から識別する方法、肝移植のリストに記載されているPSC患者を記載されていないPSC患者から識別する方法、および静脈瘤を有するリストアップされた患者を静脈瘤のない者から識別する方法で使用される。
【００８８】
一部の実施形態では、二重の経口および静脈内コール酸クリアランスに基づくPSC患者のDSI値は、PSCで合併症の危険および肝移植の優先順位を評価することにおいてMELDスコアに優ることができる。
【００８９】
一部の実施形態では、コール酸検査およびDSIは、門脈圧亢進および/または代償障害の危険がある慢性肝疾患患者を同定するための方法で使用され、そこにおいて、門脈圧亢進(PHTN)は脾腫または静脈瘤と規定され、代償障害は腹水または静脈瘤出血と規定される。
【００９０】
一部の実施形態では、慢性肝疾患は、慢性C型肝炎(CHC)、慢性B型肝炎、アルコール性肝疾患、アルコール性脂肪肝炎(ASH)および、比較的良性である脂肪変性と呼ばれる単純な脂肪肝からより重大な非アルコール性脂肪肝炎(NASH)に進行することがある非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、自己免疫性肝疾患、特発性肝硬変、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、α-1-抗トリプシン欠乏症、原発性硬化性胆管炎(PSC)、ならびに他の胆汁うっ滞性肝疾患から選択される。
【００９１】
一部の実施形態では、患者で疾患重症度指数(DSI)値を決定するための方法であって、慢性肝疾患に罹患した患者から血清試料を得る工程であって、患者が第1の安定同位体コール酸の経口投与および第2の安定同位体コール酸の同時静脈内投与を以前に受けており、血液試料がコール酸の投与の後180分未満の間に患者から収集されたものである工程と;mL/分/kgで表す門脈肝臓濾過率(門脈HFR)、ここでkgは患者の体重であり、mL/分/kgで表す全身肝臓濾過率(全身HFR)、ここでkgは患者の体重であり、および%で表すSHUNTを計算するために血清試料をアッセイする工程と;以下の式:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
を用いて患者のDSI値を計算する工程とを含む方法が提供される。
【００９２】
一部の実施形態では、DSI値は慢性肝疾患患者で門脈圧亢進または代償障害の危険の増加を同定するための方法で使用され、18を超えるDSIは門脈圧亢進(PHTN)の危険の増加の指標でありを示し、36を超えるDSIは代償障害の危険の増加を示し、門脈圧亢進(PHTN)は脾腫または静脈瘤と規定され、代償障害は腹水または静脈瘤出血と規定される。
【００９３】
一部の実施形態では、DSI値は、慢性肝疾患患者での臨床転帰の予測のための方法で使用され、DSI>25は、患者での臨床転帰の危険の増加を示す。一部の実施形態では、慢性肝疾患は慢性C型肝炎であり、臨床転帰は、CTP進行、静脈瘤出血、腹水、肝性脳症または肝臓関連死から選択される。
【００９４】
一部の実施形態では、DSI値は、抗ウイルス処置後の、慢性B型肝炎または慢性C型肝炎に罹患した患者での持続性ウイルス学的著効の予測のための方法で使用され、抗ウイルス処置に続く患者のDSI値の経時的低下は、持続性ウイルス学的著効の指標である。
【００９５】
一部の実施形態では、慢性肝疾患を有する患者でのDSI値は、肝移植(LT)の順番待ちリストに載っている患者に優先順位をつけるために使用され、DSI値が、式:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
に従って得られる場合、患者のDSI値が経時的に増加した後、またはDSI値が40を超えた後にLTの順番待ちリストに載っている患者の優先順位を上げることを含み、式中、SHUNTは患者のSHUNT検査値(%)であり、門脈HFRはmL/分/kgで表す患者での門脈HFR検査値であり、ここでkgは患者の体重であり、全身HFRはmL/分/kgで表す患者での全身HFR値であり、ここでkgは患者の体重であり、患者のSHUNTおよび門脈HFR検査値は同日中に得られたものである。
【００９６】
一部の実施形態では、慢性肝疾患を有する患者でのDSI値は、将来の臨床転帰の予測または中間/大きな静脈瘤を有する患者の同定のための方法で使用され、そこで、患者のDSI値は式:
DSI=5.34SHUNT-6.65Loge門脈HFR-8.57Loge全身HFR+44.66
に従って得られ、DSI>19は中間から大きな静脈瘤の高い危険を示し;10〜19のDSIは、中間/大きな静脈瘤の危険が低いことの指標であり;0〜10のDSIは、健康な肝機能の指標であり;DSI>19は臨床転帰の高い危険を示し;10〜19のDSIは、臨床転帰の危険が低いことの指標であり;0〜10のDSIは、健康な肝機能の指標である。
【００９７】
一部の実施形態では、慢性肝疾患は、慢性C型肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)または原発性硬化性胆管炎(PSC)から選択される。
【００９８】
一部の実施形態では、慢性肝疾患患者で門脈圧亢進または代償障害の危険の増加を同定するための方法であって、慢性肝疾患に罹患した患者から血清試料を得る工程であって、患者が第1の安定同位体コール酸の経口投与および第2の安定同位体コール酸の同時静脈内投与を以前に受けており、血液試料がコール酸の投与の後180分未満の間に患者から収集されたものである工程と;mL/分/kgで表す門脈肝臓濾過率(門脈HFR)、ここでkgは患者の体重であり、mL/分/kgで表す全身肝臓濾過率(全身HFR)、ここでkgは患者の体重であり、および%で表すSHUNTを計算するために血清試料をアッセイする工程と;式:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
を用いて患者のDSI値を計算する工程であって、18を超えるDSIは門脈圧亢進(PHTN)の危険の増加を示し、36を超えるDSIは代償障害の危険の増加を示す工程とを含む方法が提供される。
【００９９】
一部の実施形態では、患者の疾患重症度指数(DSI)値を計算するための方法であって、慢性肝疾患を患っているかその危険がある患者から血清試料を得る工程であって、患者が第1の安定同位体コール酸の経口投与および第2の安定同位体コール酸の同時静脈内投与を以前に受けており、血液試料がコール酸の投与の後180分未満の間に患者から収集されたものである工程と;mL/分/kgで表す門脈肝臓濾過率(門脈HFR)、ここでkgは患者の体重であり、mL/分/kgで表す全身肝臓濾過率(全身HFR)、ここでkgは患者の体重であり、および%で表すSHUNTを計算するために血清試料をアッセイする工程と;式:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
を用いて患者のDSI値を計算する工程とを含む方法が提供される。
【０１００】
一部の実施形態では、患者のSHUNT、全身HFRおよび門脈HFR検査値は同日中に得られる。
【０１０１】
一部の実施形態では、コール酸検査DSIは、順番待ちリストに載っている慢性肝疾患患者のために肝移植の優先順位を調整するために使用される。
【０１０２】
一部の実施形態では、コール酸検査DSIは、順番待ちリストに載っている慢性肝疾患患者のために肝移植の優先順位を調整するために使用され、慢性肝疾患は、慢性C型肝炎、NAFLDまたは原発性硬化性胆管炎(PSC)である。
【０１０３】
別の具体的な実施形態では、HCV患者からの門脈HFRおよびSHUNT検査値を使用して、DSI式:
DSI=9.84(SHUNT)-12.36 LOGe(門脈HFR)+50.5
を作成し、式中、SHUNTは患者でのSHUNT検査値であり、門脈HFRは患者での門脈HFR検査値である。一部の実施形態では、患者のSHUNTおよび門脈HFR検査値は同日中に得られたものである。
【０１０４】
一部の実施形態では、DSI式は、異なる臨床生化学ラボ血液アッセイ、例えば血清アルブミン、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、総ビリルビン、直接ビリルビン、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、5'ヌクレオチダーゼ、PT-INR(プロトロンビン時間の国際標準化比)、腹水または肝性脳症を表す、1つまたは複数の追加の項を有する。他の実施形態では、DSI式は、肝臓代謝検査結果を表す1つまたは複数の追加の項を有し、そこで、検査は、カフェイン排泄、アンチピリンクリアランス、ガラクトース排泄能力およびリドカインからのMEGXの形成から選択される。
【０１０５】
一部の実施形態では、DSIは、慢性肝疾患患者で疾患重症度を規定するために、疾患進行および処置への応答を追跡するために使用することができ、慢性肝疾患は、慢性C型肝炎、原発性硬化性胆管炎(PSC)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、慢性B型肝炎、アルコール性肝疾患、自己免疫性肝疾患、特発性肝硬変、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、α-1-抗トリプシン欠乏症および胆汁うっ滞性肝疾患から選択される。
【０１０６】
一部の実施形態では、DSIは、将来の臨床転帰の予測のための方法で使用される。一部の実施形態では、臨床転帰は、Child-Turcotte-Pugh(CTP)増加、静脈瘤、脳症、腹水および肝臓関連死から選択される。実施例9に示すように最適なカットオフでは、驚くべきことに、将来の臨床転帰の予測に関してDSIは他の標準検査法に優った。具体的には、実施例9は、肝生検、血小板数およびMELDと比較したとき、DSIが最も高い感度、特異度、陽性予測値(PPV)および陰性予測値(NPV)を示したという証拠を提供する。
【０１０７】
一部の実施形態では、DSIは、いくつかの特定の臨床適用のために、例えば、CHC患者での抗ウイルス処置への応答の予測、抗ウイルス療法を受けるべきである慢性B型肝炎患者の選択;肝切除について評価される肝細胞癌(HCC)患者での肝代償障害の危険の評価;器官ドナーを待つ間に死亡する危険がある、低いMELD(末期肝疾患スコアのモデル)を有する順番待ちリストに載っている患者のサブグループの識別のために;臨床試験でのエンドポイントとして;小児科集団での肝生検の取替え;異系移植片機能の追跡;生体ドナーでの機能復活の測定;および胆汁うっ滞性肝疾患(PSC、原発性硬化性胆管炎)での機能的障害の測定のために、肝機能の評価のために使用することができる。
【０１０８】
具体的な実施形態では、処置への応答、例えばPEG/RBVによる処置に続いてSVRを達成するCHC患者の%を予測するために、DSIは使用される。この具体的な実施形態では、DSI式は:
DSI=9.84(SHUNT)-12.36 LOGe(門脈HFR)+50.5
であり、式中、SHUNTは患者でのSHUNT検査値であり、門脈HFRは患者での門脈HFR検査値である。患者の群にDSI式を適用すると、30のカットオフを与え、このカットオフより上の者はSVRを達成することができなかった。25〜30のDSIを有する患者のうち、15%がSVRを達成した。20〜25のDSIを有する患者のうち、16%がSVRを達成した。20未満のDSIを有する患者のうち、19%がSVRを達成した。Table 11(表11)を参照されたい。
【０１０９】
識別可能な化合物。一部の実施形態では、門脈流は、以下の特徴を有する任意の安全に経口投与される識別可能な化合物を利用して評価することができる:経口投与の後の100%吸収、高い肝抽出(健康対象の肝臓の初回通過で>70%)、および肝臓による血液または血漿からの排他的除去。門脈流の測定のための識別可能な化合物は、内因性化合物または生体異物であってもよい。
【０１１０】
一部の実施形態では、識別可能な化合物は、任意の標識された内因性胆汁酸または胆汁酸抱合体であってもよく;例えば、識別可能な化合物は、以下の標識された識別可能なコール酸化合物のいずれかから選択することができる:コール酸、コール酸の任意のグリシン抱合体、コール酸の任意のタウリン抱合体;ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸の任意のグリシン抱合体、ケノデオキシコール酸の任意のタウリン抱合体;デオキシコール酸、デオキシコール酸の任意のグリシン抱合体、デオキシコール酸の任意のタウリン抱合体;またはリトコール酸、またはその任意のグリシン抱合体もしくはタウリン抱合体。様々な態様では、識別可能なコール酸化合物は、生理的に許容される塩、例えばコール酸のナトリウム塩の形であってもよい任意の胆汁酸または胆汁酸抱合体である。一態様では、用語コール酸は、コール酸のナトリウム塩を指す。一部の好ましい実施形態では、コール酸(コール酸塩)が識別可能な化合物である。本明細書で用いられる場合、用語コール酸化合物、コール酸塩およびコール酸は互換的に使用される。
【０１１１】
経口投与することができ、高い初回通過肝排泄も有する生体異物としては、これらに限定されないが、プロパノロール、ニトログリセリンもしくはニトログリセリン誘導体、またはガラクトースおよび関連化合物が挙げられる。
【０１１２】
一部の実施形態では、識別可能な化合物は、プロプラノロールである。プロプラノロールは非選択的βブロッカーであり、静脈瘤出血および再出血の予防のために有効であることが示されており、肝硬変患者での門脈圧亢進の処置のための薬物療法として広く使われている。(Sukら2007、Effect of propranolol on portal pressure and systemic hemodynamics in patients with liver cirrhosis and portal hypertension: a prospective study.Gut and Liver 1 (2):159〜164頁)。プロプラノロールは、肝臓によってほとんど完全に消去される。全(+)プロプラノロール血漿クリアランスが、正常な肝機能を有する患者で肝血流の優れた推定を構成することが実証されている。(Weissら、1978 (+)-Propranolol clearance, an estimation of hepatic blood flow in man、Br. J. Clin. Pharmacol.5:457〜460頁)。
【０１１３】
他の実施形態では、識別可能な化合物は、5-モノ硝酸イソソルビドである。この化合物は経口投与することができ、HPLC-EIMSによって血漿で検出することができる。(Sunら、High performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometric determination of isosorbide 5-mononitrate in human plasma、J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Sci. 2007年2月1日;846(1-2):323〜8頁)。
【０１１４】
一部の実施形態では、識別可能な化合物はガラクトースである。ガラクトース排泄能力(GEC)は、残留性肝機能の指数として使用されている。GEC検査でのガラクトースは、一般的に0.5mg/kgの用量で静脈内投与され、20から60分の間に5分ごとに静脈試料をとる。ガラクトースのクリアランスは、慢性肝疾患および肝硬変を有する個体で減少する。しかし、この炭水化物は高い抽出比を有するという事実は、ガラクトースの代謝を肝血流および肝臓の機能的質量に依存性にする。(Tygstrup N、Determination of the hepatic elimination capacity (Lm) of galactose by a single injection、Scand J Lab Clin invest、18 Suppl 92、1966、118〜126頁)。炭水化物ガラクトースは肝臓でほとんど排他的に代謝され、飽和近くの酵素変換をもたらすのに十分に高い血液濃度での排泄速度GECは、肝臓の代謝能の定量的尺度として使用される。1つの研究は、新たに診断された肝硬変および減少したGECを有する患者の間で、GECは死亡率の強力な予測因子であったことを示している。(Jepsenら、2009、The galactose elimination capacity and mortality in 781 Danish patients with newly-diagnosed liver cirrhosis: a cohort study.BMC Gastroenterol.2009、9:50頁)。
【０１１５】
特定の実施形態では、肝機能を評価するために利用するために、選択された識別可能な化合物に1つまたは複数の区別可能な同位体が組み込まれる。区別可能な同位体は、検査化合物に組み込まれている放射性または安定同位体のいずれかであってもよい。安定(13C、2H、15N、18O)または放射性同位体(14C、3H、Tc-99m)を使用することができる。安定同位体の利点は、放射能への曝露の欠如、天然での豊富さおよび試験化合物の同定のために使用される分析の特異性である(質量分析による質量の決定)。安定同位体標識化合物は、市販されている。例えば、13C-および2H-標識コール酸化合物は、Sigma-Aldrich社、CDN Isotopes社およびCambridge Isotope Laboratories, Inc.社から購入することができる。
【０１１６】
一部の実施形態では、経口投与のための識別可能な化合物は、内因性コール酸から分析的に識別可能である任意の識別可能なコール酸化合物であってもよい。一態様では、識別可能なコール酸化合物は、当技術分野で公知である任意の同位体標識コール酸化合物から選択される。これらのアッセイのいずれか1つで使用される識別可能なコール酸化合物は、安定(13C、2H、18O)または放射性(14C、3H)同位体のいずれかで標識されてもよい。識別可能なコール酸化合物は、購入することができる(例えばCDN Isotopes Inc.社、Quebec、CA)。好ましい態様では、識別可能なコール酸は、コール酸の任意の公知である安全な非放射性安定同位体から選択される。具体的な一態様では、識別可能なコール酸化合物は、2,2,4,4-2Hコール酸である。別の具体的な態様では、識別可能なコール酸化合物は、24-13Cコール酸である。
【０１１７】
他の実施形態では、識別可能な化合物は、非標識の内因性化合物、例えば非標識コール酸であってもよい。非標識の内因性化合物を使用する態様では、経口検査用量は、生じる血清中濃度がその内因性化合物のベースライン血清中濃度を上回って識別可能であるように十分に大きい、例えば2.5〜7.5mg/kgのコール酸である。
【０１１８】
対象からの血液試料中の識別可能な化合物を検出および測定するためのプラットホームは、投与される識別可能な化合物のタイプに依存する。安定同位体については、血液試料中の識別可能な化合物の濃度は、例えばガスクロマトグラフィー/質量分析(GC/MS)または液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)によって測定することができる。放射標識された試験化合物については、例えばシンチレーション分光法を用いることができる。非標識化合物の分析のためには、例えばオートアナライザー、発光またはELISAを用いることができる。試験化合物の存在および量に直接または間接に感受性である発色剤によるストリップ検査を、自宅検査またはケア場所での検査で使用するために用いることができることが、さらに企図される。
【０１１９】
門脈血流。門脈血流は、肝臓評価の鍵となることが見出された。肝臓は、処理のための栄養素および解毒のための有害化合物を持ち込む門脈を通して、その血液の約75%を受ける。この低い血圧系は微小血管系の最も早い破壊に感受性であるので、他のいかなる生理的影響の前に、門脈流の減少およびシャンティングの増加によってCLDの初期段階を検出することができる。高い圧の肝全身血流の減少はより少なく、疾患過程のより後期に減少するだけである。肝臓のわずか50,000分の1を試料採取する生検と異なって、門脈流は器官全体の尺度である。疾患の進行に従い、微小血管構造の破壊の増加、および進行したCLDの主徴候を引き起こす門脈流の障害の増加がある。障害のある流れは、腹水、門脈圧亢進および食道静脈瘤を引き起こす。障害のある流れは、肝性脳症につながる毒素のシャンティングの増加を引き起こす。
【０１２０】
コール酸は、門脈血流および肝全身流の特異な探査子である。多くの肝臓検査が経口またはIV化合物のクリアランスの使用を試みたが、コール酸だけが初期および後期のCLDの評価に成功した。他の経口化合物はGI管に沿った様々な部位で吸収され、門脈循環を標的にしない。他の化合物は、非特異的輸送体によって取り込まれる。経口コール酸は高親和性回腸Na+依存性胆汁酸塩輸送体(ISBT)を通して終端の回腸上皮細胞によって特異的に吸収され、MRP3輸送体によって門脈血流に直接流出させられる(TraunerおよびBoyer、2003、Bile salt transporters:Molecular characterization, function, and regulation.Physiol Rev.83:633〜671頁)。次に、Na+/タウロコール酸塩共輸送体(NTCP)および有機陰イオン輸送タンパク質(OATP)を含む高親和性輸送体の異なるセットが、高効率な初回通過抽出でそれを肝細胞に取り込み(TraunerおよびBoyer、2003、下記)、その結果、抽出を逃れるいかなるコール酸も門脈流の直接の尺度である。細胞内に入ると、それはグリシンおよびタウリンと速やかに抱合し、その結果、薬物動態を混同させる非抱合型はその後肝内循環に再び現れない。デオキシコール酸およびケノデオキシコール酸などの他の非抱合型胆汁酸塩は同様にふるまうであろうが、それらは非常により強力な可溶化剤であり、投与するのは安全ではない。生体異物または放射線被曝の危険を避ける安定同位体標識内因性化合物を使用することにより、患者の安全性は保証される。関与する全てのタンパク質および系は高度に保存され、基本的であるので、コール酸の薬物動態は個体間で一貫しており、性、年齢または遺伝子構成、または食事もしくは併用薬によって影響を受けない。
【０１２１】
例えば安全な非放射性安定同位体で標識されてもよい内因性胆汁酸、コール酸の特異な生理学を活用することによって、門脈血流を非侵襲的および正確に定量化することができる。高度に保存された腸輸送体(ISBT、MRP3)は、門脈循環を経口コール酸の特異的標的にする。高度に保存された肝輸送体(NTCP、OATP)は、門脈および全身の循環からコール酸を消去する。したがって、門脈循環の非侵襲的定量評価は、患者への識別可能なコール酸化合物の投与、および経口クリアランス曲線を決定するための様々な複数の時点で引き抜かれる血液試料中の識別可能なコール酸化合物のレベルの評価によって実施することができる。FLOW(門脈HFR)検査は、重水素化コール酸の経口投与から90分間にわたって採取される最低で5つの血液試料から、門脈血流を正確に測定する。
【０１２２】
ほぼ300人のCHC患者の主研究、コール酸検査によって測定された門脈流は、臨床転帰の予測において生検による線維症測定の現行の至適基準に優った(Eversonら、2011)。初期CHC研究では、コール酸検査によって測定した門脈流の障害およびシャンティングの増加が、最も早期の検出可能な病態生理であった。これらの結果は、CLDが肝微小血管系の破壊であって、有害であるのは線維症それ自体でないというCLDの新しい理解につながった。この微小血管系の破壊は、内因性胆汁酸、コール酸の特異な生理学を活用することによって非侵襲的および正確に定量化することができる門脈血流に障害を起こさせる。
【０１２３】
門脈-体循環シャンティング。図1に示すように、経口コール酸は特定の腸輸送体によって門脈に直接取り込まれ、肝臓を通るその初回通過で肝輸送体によって除去される。IVコール酸は全身に分配され、肝動脈および門脈の両方によって抽出される。典型的な実施形態では、経口およびIVコール酸の濃度は投与から90分以内の5つの異なる時間で測定され、クリアランスが計算される。IVクリアランス割る経口クリアランスは、門脈-体循環SHUNT比率である。体重1kg当りの経口クリアランスは、門脈肝濾過率(門脈HFR、FLOW)または門脈血液送達の量を表す。STATは60分時の経口コール酸の濃度であり、門脈HFRを正確に推定することが示された。
【０１２４】
SHUNT検査は、識別可能なコール酸化合物の経口投与後の門脈血流を非侵襲的および正確に測定し、第2の識別可能なコール酸化合物の静脈内共投与後の全身肝血流も測定する。したがって、SHUNT検査は、門脈-体循環シャンティングの量を決定するために使用することができる。一部の実施形態では、13C-コール酸のIV用量は重水素化コール酸の経口用量と同時に投与され、投与から90分間にわたって最低で5つの血液試料がとられる。
【０１２５】
二重のコール酸クリアランスSHUNT方法により、3つの検査結果が得られる:門脈-体循環シャント比率(SHUNT(%));血液中の経口投与される識別可能なコール酸化合物に基づく門脈肝濾過率(門脈HFR、上の議論および例ではFLOWとも規定される、(mL/分/kg));および血液中の静脈内投与される識別可能なコール酸化合物に基づく全身肝濾過率(全身HFR、(mL/分/kg))。コール酸-2,2,4,4-d4(40mg)は経口投与され、特定の腸輸送体によって門脈に取り込まれる。コール酸-24-13C(20mg)はIV投与され、全身循環から主に肝動脈を通して取り込まれる。特定の肝輸送体は、門脈および全身の循環からコール酸を消去する。例えば、高度に保存された肝輸送体(NTCP、OATP)は、門脈および全身の循環からコール酸を消去する。
【０１２６】
門脈肝濾過率の推定。STAT検査は、スクリーニング目的のための簡略化された非侵襲的な便利な検査であり、単一の時点で、例えば識別可能なコール酸化合物、例えば重水素化コール酸の経口投与の60分後にとられる単一の血液試料から門脈血流を合理的に推定することができる。
【０１２７】
門脈HFR(FLOW)、SHUNTおよびSTAT検査の比較。SHUNT、FLOWおよびSTAT検査の一般的な実施形態の比較を、下のTable 1(表1)に示す。
【０１２８】
【表１】
0006378194.tif 000002
【０１２９】
正常な肝機能の値は、以前の研究での健康な対照で確立された:平均SHUNTは20%であり、平均HFR(FLOW)は30であり、平均STATは0.4である。
【０１３０】
病気の肝臓では、より多くの血液が全身循環への肝臓内および肝臓外シャンティングによる抽出を逃れるので、SHUNTは増加し(約30〜90%)、HFR(FLOW)または門脈流は減少し(約20から2mL/分/kg)、STATは増加する(0.6から5μM)。
【０１３１】
定義および略語
「a」または「an」は、本明細書で用いられる場合、1つまたは複数の事柄を意味することができる。
【０１３２】
用語「約」は、任意の数値パラメータに言及する場合、数値の±10%を意味する。例えば、「約60分」という語句は、60分±6分を指す。
【０１３３】
「クリアランス」は、本明細書で用いられる場合、1つの場所から別の場所への物質の除去を意味することができる。
【０１３４】
用語「患者」、「対象」または「対象(複数)」は、本明細書で用いられる場合、これに限定されないがヒトを含み、本用語は他の哺乳動物、または国内もしくは外来の動物、例えばイヌ、ネコ、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、鳥類または爬虫類を包含することもできる。
【０１３５】
略語「HALT-C」は、肝硬変に対するC型肝炎抗ウイルス長期処置試験を指す。HALT-C試験は、インターフェロンをベースとした療法の以前のクールに対して持続性ウイルス学的著効を有していなかった進行C型肝炎患者での、長期低用量ペグインターフェロン療法の大きな、前向き無作為化比較試験であった。NIHが支援した肝硬変に対するC型肝炎抗ウイルス長期処置(HALT-C)試験は、抗ウイルス療法の長期使用(維持処置)が肝疾患の進行を遅くするかどうかについて検討した。かなりの線維症を示した非硬化性患者では、有効な維持療法は、連続肝生検によって評価したときに肝硬変への組織学的進行を遅らせるか停止させると予想された。しかし、生検による疾患進行の追跡は、合併症、おそらく死の危険を伴う。さらに、試料採取過誤、および肝生検の病理解釈の変動は、組織学的評価およびエンドポイントの精度を制限する。進行した線維症が既に存在し、処置または疾患進行に関連する線維症の変化は検出することができないので、組織学的エンドポイントはそれほど信頼できない。したがって、硬化性患者での維持療法への有効な応答のための標準エンドポイントは、臨床代償障害(腹水、静脈瘤出血および脳症)の予防、およびChilds-Turcotte-Pugh(CTP)スコアによって臨床的に測定される肝機能の安定化である。しかし、臨床エンドポイントおよびCTPスコアは、疾患進行の非感受性パラメータであることが知られていた。識別可能なコール酸を用いる二重同位体技術は、SHUNT検査の開発で使用され、HALT-C試験と併せて使用された。
【０１３６】
用語「SHUNT検査」は、肝血流および肝機能の包括的評価として使用されている、以前に開示されたQLFT(定量的肝機能検査)を指す。SHUNT検査は、慢性肝疾患のある対象およびそれのない対象で、経口および静脈内投与されたコール酸の血漿クリアランスを決定するために使用される。SHUNT検査では、区別可能なコール酸の経口および静脈内投与から少なくとも約90分間にわたる間隔で患者から引き抜かれた、少なくとも5つの血液試料を分析する。安定同位体標識コール酸のための試料の分析は、例えば試料誘導体化後にGC-MSによって、または試料誘導体化なしでLC-MSによって実施される。投与用量で修正した、経口投与されたコール酸対静脈内投与されたコール酸のAUCの比は、コール酸シャントを規定する。コール酸シャントは、以下の式:AUCoral/AUCiv×用量iv/用量oral×100%を使用して計算することができ、式中、AUCoralは経口投与されたコール酸の血清中濃度の曲線下面積であり、AUCivは静脈内投与されたコール酸の曲線下面積である。SHUNT検査は、参照により本明細書に組み込まれる、2006年1月26日に出願された、Eversonら、US2008/0279766、Methods for Diagnosis and Intervention of Hepatic Disordersに開示されている。これらの研究は、肝細胞傷害または門脈体静脈シャンティングのいずれかを有した患者での、コール酸クリアランスの減少を実証した。「SHUNT検査値」は、数(%)を指す。
【０１３７】
SHUNT検査は、門脈循環からの胆汁酸の初回通過肝排泄の測定を可能にする。肝臓による胆汁酸の流れ依存性の初回通過排泄は、非抱合型ジヒドロキシ胆汁酸の60%から、グリシン抱合型コール酸の95%まで及ぶ。本明細書で使用する遊離コール酸はおよそ80%の報告された初回通過排泄を有し、それは、健康な対照で以前に観察された約83%の初回通過排泄に厳密に一致する。肝臓による取り込みの後、コール酸はグリシンまたはタウリンのいずれかと効率的に抱合され、胆汁に分泌される。物理化学的には、クロマトグラフィー法を用いて、コール酸は、他の胆汁酸および胆汁酸またはコール酸の抱合体から容易に分離される。
【０１３８】
略語「IV」または「iv」は、静脈内を指す。
【０１３９】
用語「持続性ウイルス学的著効」(SVR)は、最終処置の6カ月後に血液中にC型肝炎ウイルスが検出不能であるときの、患者での所望の応答を記載するために使用される。インターフェロンおよびリバビリンを使用する従来の処置は、C型肝炎ウイルスを必ずしも除去または消去するとは限らない。持続性ウイルス学的著効は、再発の非常に低い発生率と関連する。SVRは、新しい医薬を評価し、それらを証明済の療法と比較するために使用される。
【０１４０】
略語「PO」は、経口を指す。
【０１４１】
略語「PHM」は、潅流させた肝質量を指す。
【０１４２】
略語「SF」は、例えばコール酸SFにおけるように、シャント比率を指す。
【０１４３】
略語「ROC」は、レシーバー動作特性を指す。ROC曲線は、その識別閾値の変化に従う二成分分類子系の性能を図示するグラフィカルプロットである。それは、様々な閾値設定で、陽性からの真の陽性の比率(TPR=真の陽性率)対陰性からの偽陽性の比率(FPR=偽陽性率)をプロットすることによって作成される。感度は、疾患を有する者の間での、陽性検査結果または閾値を上回る値の確率である。感度は、真の陽性率(TPR):TPR=TP/P=TP/(TP+FN)と規定される。偽陽性率(FPR)は、FPR=FP/N=FP/(FP+FN)である。精度(ACC)は、ACC=(TP+TN)/(P+N)と規定される。特異度は、疾患のない者の間での、陰性検査結果または閾値未満の値の確率である。特異度(SPC)または真の陰性率(TN)は、SPC=TN/N=TN/(FP+TN)=1-FPRと規定される。陽性予測値(PPV)は、PPV=TP/(TP+FP)と規定される。陰性予測値(NPV)は、NPV=TN/(TN+FN)と規定される。c-統計値は、ROC曲線下の面積、または「AUROC」(レシーバー作動特性曲線下の面積)であり、0.5(無識別)から1(完全識別)の理論的最大値に及ぶ。
【０１４４】
用語「経口コール酸クリアランス」(Cloral)は、対象からの血液または血清試料によって測定される、経口投与されたコール酸化合物の対象の身体からのクリアランスを指す。経口コール酸クリアランスは、門脈血流の尺度として使用される。経口投与されるコール酸は小腸の上皮内膜細胞越えで吸収され、門脈血液中のアルブミンに結合し、門脈を通して肝臓に輸送される。コール酸のおよそ80%は、肝臓を通るその初回通過で門脈血液から抽出される。肝抽出を逃れるコール酸は、心臓に戻る大静脈に排水する肝静脈を通して肝臓を出て、全身循環に送られる。コール酸の経口投与の後の時間に対する末梢静脈濃度の曲線下面積(AUC)は、肝抽出を逃れるコール酸の比率を定量化し、「経口コール酸クリアランス」を規定する。
【０１４５】
用語「門脈肝濾過率」、「門脈HFR」、「FLOW検査」は、門脈血流または門脈循環の尺度として使用される経口コール酸クリアランス(門脈肝濾過率;門脈HFR)を指し、それはある期間、例えば識別可能な化合物、例えば識別可能なコール酸の経口投与から約90分間に対象から引き抜かれる少なくとも5つの血液試料中の識別可能な化合物の濃度の分析から得られる。門脈HFR値の単位はmL/分/kgで一般的に表され、ここでkgは対象のkg体重を指す。
【０１４６】
用語「STAT検査」は、区別可能なコール酸の経口投与から規定の時間後に引き抜かれる1つの患者血液試料からの分析による、門脈血流の推定を指す。一態様では、STAT検査は、区別可能なコール酸の経口投与後の特定の時点で引き抜かれる単一の血液試料の分析を指す。具体的な一態様では、STAT検査は、経口投与重水素化コール酸から60分後にとられる単一の血液試料から、門脈血流(推定流量)を合理的に推定することができる、スクリーニング目的のための簡略化された便利な検査である。STAT検査値は、濃度、例えばマイクロモル濃度(μM)で一般的に表される。
【０１４７】
用語「静脈内コール酸クリアランス」(Cliv)は、静脈内投与されるコール酸化合物のクリアランスを指す。静脈内投与され、アルブミンに結合したコール酸は全身に分配され、門脈静脈および肝動脈血流の両方を通して肝臓に送られる。コール酸の静脈内投与後の時間に対する末梢静脈濃度のAUCは、コール酸の100%全身送達に同等である。投与用量で修正した、経口投与されたコール酸対静脈内投与されたコール酸のAUCの比は、コール酸シャントを規定する。
【０１４８】
用語「定量的肝機能検査」(QLFT)は、試験化合物を代謝または抽出する肝臓の能力を測定し、疾患のより初期に障害のある肝機能を有する患者を同定することができ、おそらく肝硬変、脾腫および静脈瘤の危険を規定することができるアッセイを指す。これらのアッセイの1つは、外因性コール酸が体によって取り込まれた後に体液試料を分析することによってコール酸クリアランスを評価する、コール酸シャントアッセイである。
【０１４９】
用語「Ishak線維症スコア」は、慢性壊死炎症によって引き起こされる肝臓の線維症(瘢痕化)の程度を測定するスコアリングシステムに関して使用される。0のスコアは無線維症を表し、6は確立した線維症である。1および2のスコアは、軽度の門脈線維症を示し;ステージ3および4は、中等度(架橋)線維症を示す。5のスコアは結節形成および不完全な肝硬変を示し、6は確定肝硬変である。
【０１５０】
用語「Childs-Turcotte-Pugh(CTP)スコア」または「Child-Pughスコア」は、参照により本明細書に組み込まれる、Pughら、Transection of the oesophagus for bleeding oesophageal varices.Br J Surg 1973;60:646〜649頁に記載されているように、慢性肝疾患の予後を評価するために使用される分類体系を指す。CTPスコアは、肝疾患の5つの臨床尺度を含む;各尺度は1〜3で評価され、3が最も重度の障害である。CTPスコアを決定するために、5つのスコアが加えられる。5つの臨床尺度には、総ビリルビン、血清アルブミン、プロトロンビン時間の国際標準化比(PT INR)、腹水および肝性脳症が含まれる。CTPスコアは、末期肝疾患の重大性の層化で使用される1つのスコアリングシステムである。慢性肝疾患は、加えたスコアを用いてChild-PughクラスA〜Cに分類される。Child-PughクラスAは、5〜6のCTPスコアを指す。Child-PughクラスBは、7〜9のCTPスコアを指す。Child-PughクラスCは、10〜15のCTPスコアを指す。ウェブサイトでは、肝硬変患者における手術後の死亡危険率を計算する。http://mayoclinic.org/meld/mayomodel9.html
【０１５１】
用語「末期肝疾患のモデル」(MELD)は、慢性肝疾患の重症度を評価するために使用されるスコアリングシステムを指す。MELDは、肝移植のために経頚静脈性肝内門脈大循環短絡術(TIPS)処置を受けた患者で、外科手術の3カ月以内の死を予測するために開発された。MELDはまた、予後の決定と肝移植を受けるための優先順位付けにも使用される。MELDは、生存を予測するために、血清ビリルビン、血清クレアチニン、およびプロトロンビン時間の国際標準化比(INR)に関する患者の値を使用する。スコアリングシステムは、肝移植の割当てに優先順位をつけるために、より古いChild-Pughスコアの代わりにUnited Network for Organ Sharing(UNOS)およびEurotransplantによって使用される。参照により本明細書に組み込まれる、UNOS(2009-01-28)「MELD/PELD calculator documentation」を参照されたい。例えば、入院患者でMELDスコアを解釈する場合は、3カ月死亡率は以下の通りである:40以上のMELDスコアでは71.3%の死亡率。
【０１５２】
用語「標準試料」は、未知濃度の分析物を含有する試料を分析するときに、比較目的のために使用される既知濃度の分析物を有する試料を指す。
【０１５３】
用語「慢性C型肝炎」(CHC)は、ウイルス感染によって引き起こされ、肝臓炎症、肝臓傷害および肝硬変をもたらす慢性肝疾患を指す。C型肝炎は、肝臓を攻撃して炎症をもたらす血液由来ウイルスによって引き起こされる感染症である。C型肝炎ウイルス(HCV)に感染する多くの人々は、日常の医療検査の過程で肝傷害が出現するまで、時には数年後まで症状を示さない。
【０１５４】
用語「アルコール性脂肪肝炎」(ASH)は、過剰な飲酒によって引き起こされる肝臓の炎症の慢性状態を指す。進行性の炎症性肝臓損傷は、エタノールの長期の多量摂取と関連し、肝硬変に進行することがある。
【０１５５】
用語「非アルコール性脂肪肝炎」(NASH)は、肝臓炎症の重大な慢性状態を指し、脂肪変性と呼ばれるより軽い単純な脂肪肝状態から進行する。単純な脂肪変性(アルコール性脂肪肝)は、過剰なアルコール消費の早期の可逆的帰結である。しかし、特定の場合には、脂肪蓄積が肝臓の炎症および瘢痕化と関連することがある。疾患のこのより重大な形は、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)と呼ばれる。NASHは、NAFLDよりも非常に高い肝臓線維症および肝硬変の危険と関連する。NAFLDは、線維症肝硬変および肝細胞癌を有するNASHに進行する可能性がある。
【０１５６】
用語「非アルコール性脂肪肝疾患」(NAFLD)は、肥満、メタボリックシンドロームおよびインスリン抵抗性の関連危険因子を有する脂肪肝状態によって一部特徴付けられる、普通の慢性肝疾患を指す。NAFLDおよびNASHは両方とも、肥満、真性糖尿病、ならびに血清ALTおよびガンマ-GTの無症候性上昇としばしば関連している。超音波モニタリングは、肝臓の脂肪浸潤の存在を示唆することができる。NAFLDとNASHの間の区別は、肝生検を一般的に必要とする。
【０１５７】
用語「原発性硬化性胆管炎」(PSC)は、肝臓の胆管の進行性の炎症および瘢痕化によって引き起こされる慢性肝疾患を指す。胆管の瘢痕化は胆汁の流れをブロックし、胆汁うっ滞を引き起こすことができる。炎症は、肝硬変、肝不全および肝がんにつながることがある。慢性胆管閉塞は、門脈管線維症と、最終的に胆管肝硬変および肝不全を引き起こす。確定処置は、肝移植である。移植のための適応症には、再発性の細菌性胆管炎、医療処置および内視鏡的処置に抗療性である黄疸、非代償性肝硬変および門脈圧亢進(PHTN)の合併症が含まれる。PSCは、慢性炎症、線維症/肝硬変、変化した門脈循環、門脈圧亢進および門脈-体循環シャンティングを通して静脈瘤-腹水および脳症に進行する。変化した門脈流は、臨床合併症の指標である。
【０１５８】
明細書全体を通して、他の定義が提供される。
【０１５９】
コンピュータ/プロセッサー。STAT検査で用いられる検出、予後および/または診断方法は、プロセッサー/コンピュータシステムの使用を採用することができる。例えば、方法を実施するためのコンピュータプログラムコードを保存するプログラムメモリ、作業メモリ、ならびに従来のコンピュータスクリーン、キーボード、マウスおよびプリンターなどのインターフェイス、ならびにネットワークインターフェイスなどの他のインターフェイス、およびデータベースインターフェイスを含むソフトウェアインターフェイスに連結されたプロセッサーを含む汎用コンピュータシステムが、本明細書に記載される一実施形態で使用される。
【０１６０】
コンピュータシステムは、キーボードなどのデータ入力デバイス、入力データファイルまたはネットワークインターフェイス、または別のシステム、例えばLC-MSまたはGC-MSデータなどを解釈するシステムからユーザー入力を受け入れ、出力デバイス、例えばプリンター、ディスプレイ、ネットワークインターフェイスまたはデータ記憶デバイスに出力を提供する。入力デバイス、例えばネットワークインターフェイスは、本明細書に記載される処理した血液または血清試料から測定される識別可能なコール酸化合物の検出およびそれらの化合物の定量化を含む入力を受け取る。出力デバイスは、化合物の検出および/または定量化を表す1つまたは複数の数字および/またはグラフを含む、ディスプレイなどの出力を提供する。
【０１６１】
コンピュータシステムは、本明細書に記載される方法によって作成されるデータを記憶するデータ記憶装置に連結される。このデータは、各測定および/または各対象について記憶される。任意選択で、これらのデータタイプの各々の複数のセットが、各対象に対応して記憶される。1つまたは複数のコンピュータ/プロセッサーは、例えばネットワーク上のコンピュータシステムに連結されている別々の機械などとして使用することができるか、コンピュータシステム上で実行される別々であるか統合されたプログラムを含むことができる。どのような方法が用いられるとしても、これらのシステムは検出/診断に関するデータを受け取り、今度は提供する。
【０１６２】
実施形態では、経口投与後の単一の時点で引き抜かれる血液または血清試料中に異常なレベルの識別可能なコール酸化合物を有する対象のための処置を選択するための方法は、肝臓の疾患または障害を有する対象について、コール酸レベルと転帰の間の予測的関係を提供する関数に識別可能なコール酸化合物のレベルを入力することによって、計算デバイスを用いて出力スコアを計算する工程;および計算デバイスを使用して出力スコアを表示する工程を含む。
【０１６３】
実施形態では、STAT検査値は対象への識別可能な化合物の経口投与後に得られ、単一の血液または血清試料が投与後の特定の時点で引き抜かれる。一部の実施形態では、試料中の識別可能なコール酸化合物の濃度で表されるSTAT検査値は、式を使用することによって対象での推定門脈流量または推定門脈HFR(FLOW)(mL/分/kgで表される)に変換される。実施形態では、式は、y=0.9702x+0.0206であり、式中、xはlog Hepquant FLOWであり、yはLOG Hepquant STATである。
【０１６４】
実施形態では、方法は、計算デバイスを使用して出力スコアがカットオフ値を超えるか、等しいか、それ未満であるかについて決定する工程、および出力スコアがカットオフ値を超えるか、等しいか、それ未満である場合に、対象が臨床転帰を経験する可能性があるかどうかについて表示する工程をさらに含む。
【０１６５】
実施形態では、計算デバイスは処理装置、および処理装置に接続されたシステムメモリを含み、システムメモリは、処理装置によって実行される際、処理装置に、対象からの単一の血液試料からの識別可能なコール酸化合物のレベルを、肝臓の疾患または機能不全を有する対象の識別可能なコール酸レベルの間の予測的関係を提供する関数に入れて計算させ、出力スコアを表示させる命令を含む。実施形態では、システムメモリは、処理装置によって実行される際、処理装置に出力スコアがカットオフ値を超えるか、等しいか、それ未満であるかどうかについて決定させ、出力スコアがカットオフ値を超えるか等しい場合に、対象が臨床転帰を経る可能性があるかどうかについて表示させる命令を含む。
【実施例】
【０１６６】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施で良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることは、当業者によって認められるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮すれば、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様であるか類似した結果をなお得つつ、開示された具体的な実施形態に多くの変更を加えることができることを理解しているものと予想される。好ましい実施形態を実証するために以下の実施例を示す。
【０１６７】
(実施例1)
STAT検査-単一の抜き取り血液からの門脈流の推定
HALT-Cおよび初期CHC研究での門脈HFR(FLOW)およびSHUNT検査からの個々の時点の血清中コール酸濃度を注意深く分析したところ、45、60および90分時の差は非常に有意である(p<0.005)ことが見出された。60分時の濃度が、門脈流と最良の相関(r2=0.8)を示した。60分時の濃度(μM)を、推定門脈流(mL/分/kg)に5点FLOW法の85%の精度で変換することができる式を導いた。式は、y=0.9702x+0.0206であり、式中、xはLOG門脈HFR(FLOW)であり、yはLOG STATである。STAT検査では、患者に識別可能なコール酸化合物、例えば重水素化コール酸の経口用量を飲ませ、1時間後に単一の血液試料を与える。FLOW(門脈HFR)検査と比較したSTAT検査の精度を、図9に示す。
【０１６８】
(実施例2)
肝機能不全の検出におけるSTAT(推定された門脈流)の効力
初期CHC研究では、健康な対照は34±14ml/分/kg(平均±SD)の門脈流を有した。肝機能不全を、対照平均より1SDを超えて低い門脈流、流量<20ml/分/kgと規定した。初期CHC群では、患者の約2分の1が肝機能不全を示した。初期CHC患者での推定された門脈流は、彼らの60分血清中コール酸レベルを使用して図8に示す式から計算した。推定された流量は、90%の感度、85%の特異度、82%の陽性予測値(PPV)および92%の陰性予測値(NPV)で肝機能不全を検出することができた。これらの予備結果は、初期CLDでの肝機能不全を検出するために、経口コール酸投与後の単一の血液試料を使用することができることを実証する。
【０１６９】
さらに、初期CHC研究で、我々はスクリーニング検査として使用した場合のSTATの潜在的影響を分析した。現在、成人はALTによる一次医療の設定で肝疾患に関してスクリーニングされる。初期CHC研究の我々の分析では、ALTへのSTATの追加は、慢性C型肝炎患者の検出を向上させることができることを見出した。初期患者では、ALTはわずか34%で異常で、STATは48%で異常で、患者の65%は異常なALTまたはSTATのいずれかを有した。ALTおよびSTATの組合せによるスクリーニングは、慢性C型肝炎による肝疾患を有する患者の検出率を二倍にするであろう。当然ながら、そのような戦略で使用する場合、STATは慢性C型肝炎以外の肝疾患を有する患者も同様に検出するであろう。
【０１７０】
STATは、進行した肝疾患と相関する検査カットオフも有する。慢性C型肝炎患者および慢性胆汁うっ滞性肝疾患、原発性硬化性胆管炎を有する患者では、<10mL/(kg分)の推定されたFLOWのSTAT結果は、肝臓代償障害または臨床合併症の危険と相関した。この状況で、STATはFLOWまたはSHUNTのいずれかに反射して、門脈循環の正確な定量化を提供する。
【０１７１】
(実施例3)
例示的なSTAT検査を実施するための手順。
供給品
PO(経口)検査化合物:
2H4-コール酸([2,2,4,4-2H]-コール酸、40mg)(例えばCDN同位体)。
炭酸水素ナトリウム(例えば600mg)。
患者検査供給品:
血清/血漿移送管および標識。
血液試料を引き抜くための10ccシリンジ。
血清試料収集のための7ccのレッドトップおよび7ccのグレイトップのバキュテーナー管。
針廃棄バケツ
経口検査化合物を希釈するためのリンゴまたはブドウジュースなどの飲料物質。
【０１７２】
例示的な試験化合物の調製
経口組成物の1つの例示的溶液は、2,2,4,4-2H-コール酸および炭酸水素ナトリウムを含有することができる(例えば、それぞれ40mgおよび600mg)。1つの例示的な方法では、検査前日、経口検査溶液を得るために、経口検査化合物を含有する管の約10ccの目印まで水を加えてもよい。管のキャップをきつく閉め、振盪して混合する。内容物をかきまぜ、全ての粉末粒を水中に落とす。
【０１７３】
検査日に、溶解した経口検査溶液を尿カップなどの容器に注ぐ。約10mlの水で、尿カップに管を洗い落とす。検査を開始する前に、経口検査溶液を含有する尿カップの約40ml目印まで、ブドウまたはリンゴジュースなどの希釈液(柑橘類のジュース以外)を加える。静かにかきまぜて混合する。容器中で混合物が泡立たないように、振盪または撹拌しないようにする。濯ぎのために、手元に余分のジュースを保有する。
【０１７４】
検査手順
1つの例示的な方法では、以下の手順が使用される。試験化合物を投与する前、任意選択でベースラインの血清試料を収集する(試料収集を参照)。
【０１７５】
試験化合物の投与
タイマーを始動させる。コール酸およびジュースの経口溶液を患者に飲ませたときをT=0.0と記録する。さらなる少量のジュースでカップを濯ぎ、洗浄液を患者に飲ませる。タイマーの時間を記録する。
【０１７６】
試料収集
血液
コール酸投与の60分後に、患者から静脈内血液試料を収集する。タイマーの時間を記録する。
【０１７７】
血液試料を処理し、HPLC/MS(FLOWおよびSHUNTについて下で概説される)またはGC/MSによって試料分析を実施し、血液試料中の識別可能なコール酸の濃度を決定する。特定の日/時点の所与の患者の試料検査結果は、例えば対照群から確立されるカットオフ値と比較することができるか、あるいは、各患者は自身の経時的対照として役立たせることができる。
【０１７８】
(実施例4)
HPLC-MSによる分析によるSHUNTおよび門脈HFR(FLOW)アッセイの実施手順
門脈HFR(FLOW;経口コール酸クリアランス検査)およびSHUNT(コール酸シャント検査)アッセイの実施は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるUS2010/0055734およびUS2008/0279766に開示される。
【０１７９】
臨床プロトコル。重水素化コール酸(製品番号614149)および13C-コール酸(製品番号605883)は、Sigma-Isotec社(Saint Louis、MO)から購入し、炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解する。発明者は、2002年以来これらの化合物のIND番号65121および65123を保持し、FDAに毎年報告している。注射のための13C-コール酸は研究薬剤師によって濾過され、無菌性および発熱物質について検査され、一定分量で冷凍される。一晩中断食の後、各対象は留置静脈内カテーテルを受け、ベースライン時の静脈血液試料が引き抜かれる。対象にブドウジュースを混ぜた重水素化コール酸用量を飲ませ、同時に、アルブミンを混ぜた13C-コール酸をIV投与する。5、20、45、60および90分の時点で、静脈血液試料を引き抜く。血清処理の後、試料を臨床検査室に移動する。
【０１８０】
検査室分析。患者血清試料に内部標準として非標識コール酸を混入し、次に、SPEおよびエーテル抽出によってコール酸を単離する。同位体希釈法によって試験化合物を定量化するために、C8上のLCMSおよび選択イオンモニタリング(SIM)を使用する。実施する全ての分析は、適当な標準曲線およびQC試料を含む。経口クリアランス(FLOW検査結果)およびIVクリアランスは、5時点での血清中濃度から計算される。IVクリアランス対経口クリアランスの比は、SHUNT検査結果である。経口クリアランスは60分時点だけから推定され、STAT検査結果として使用される。詳細な手順は、下で提供される。
【０１８１】
試料の収集および処理
試薬および供給品
コール酸シャントおよびコール酸クリアランス検査手順では、以下の試薬および供給品を利用する。患者が経口コール酸クリアランス検査だけを受ける場合は、注射のためのIV溶液および25%ヒトアルブミンは省略される。
IV溶液-5ccの1mEq/ml炭酸水素ナトリウムに20mgの24-13C-コール酸
PO検査化合物2,2,4,4-2H(40mg)および炭酸水素ナトリウム(600mg)
24C-13C-コール酸溶液に加える注射用25%ヒトアルブミン(5ml)。
IV用供給品、250mlのNS、留置カテーテル、3方向ストップコックを含む。
IV検査化合物を投与するための10ccシリンジ
試料収集のための7ccのレッドトップ管
血清保存のための3mlクリオバイアル
針廃棄バケツ
経口検査化合物のためのリンゴまたはブドウ(柑橘類以外)のジュース
タイマー
遠心機
トランスファーピペット
【０１８２】
患者準備
患者はラテックスにアレルギー反応を起こさないことを確認する。検査日の前夜の真夜中から、患者は水以外の何も飲食していない(NPO)ことをさらに確認する。患者の身長および体重を計測して記録する。患者に三方向ストップコック付きのIVを装着させ、検査が始まる前に、開放保持のための生理食塩水(NS TKO)を設置する。
【０１８３】
コール酸化合物保存溶液
検査化合物の調製
経口コール酸クリアランス検査および/またはコール酸シャントアッセイの一方または両方のために、経口溶液を利用する。検査の24時間前に、激しく混ぜることによって、2,2,4,4-2H-コール酸(40mg)および炭酸水素ナトリウム(600mg)を含む経口溶液を約10ccの水に溶解させる。溶液は、冷蔵庫または室温で保存する。投与の直前に、ブドウまたはリンゴ(非柑橘類)のジュースを混合物に加える。ジュース溶液を十分に混合して、患者が飲むカップに注ぐ。カップを余分のジュースで濯ぎ、それを患者に投与する。
【０１８４】
IVコール酸クリアランス検査および/またはコール酸シャントアッセイの一方または両方のために、IV溶液を利用する。5ccの1mEq/ml炭酸水素ナトリウムに20mgのコール酸-24-13Cの製剤を、薬局スタッフが調製する。検査用量は、10ccの希釈剤に20mgのコール酸-24-13Cである。バイアルが冷凍されている場合は、完全に解凍する。検査の開始直前に、後述のようにコール酸-24-13C溶液をアルブミンと混合する(この方法は混合過程での検査化合物の損失を予防する)。10ccシリンジに24-13C-コール酸溶液(約5cc)の全てを引き抜く。別の10ccシリンジに、5ccのアルブミンを引き抜く。24-13C-コール酸シリンジから針を外し、3方向ストップコックを装着する。アルブミンシリンジから針を外し、ストップコックを通して24-13Cコール酸シリンジにアルブミンを注入する。少量の空気を胆汁酸/アルブミンシリンジに引き抜き、シリンジを数回逆さにすることによって溶液を静かに混合する。空気を放出する。
【０１８５】
検査化合物の投与
検査化合物を与える前に、ベースライン試料を収集する。これらの検体を収集する時間を、試料収集記録シートに記録するべきである。検査化合物の投与は、以下の通りに実施される。タイマーを始動させる。24時間の時刻をT=0と記録する。時間を記録する。T=1〜3分時に、経口化合物を投与する。経口溶液およびジュースを患者に飲ませる。さらなるジュースでカップを濯ぎ、洗浄液を患者に飲ませる。タイマー時間を記録する。T=4〜5分時-3方向ストップコックを用いて、5mlの25%ヒトアルブミンに20mgの13Cコール酸のIVプッシュを投与する。タイマー時間を記録する。3方向ストップコックを通してNSにラインを戻す。
【０１８６】
検体収集
試料の希釈または相互汚染を防止するために、各試料の前の0.5mlを廃棄して3方向ストップコックを通して全ての試料を収集する。以下の時間に5mlのレッドトップを収集する。(T=タイマー時間)。
a. T=10分、5分収集、タイマー時間を記録する;
b. T=25分、20分収集、タイマー時間を記録する;
c. T=50分、45分収集、タイマー時間を記録する;
d. T=65分、60分収集、タイマー時間を記録する;
e. T=95分、90分収集、タイマー時間を記録する。
【０１８７】
検体処理
少なくとも30分の間、レッドトップ管を室温で凝固させる。全ての血液管を3000rpmで10分の間遠心する。適切に表示したバイアルに血清を取り出し、試料を輸送するまで-20℃で冷凍する。
【０１８８】
コール酸化合物保存溶液の調製
コール酸クリアランスおよびシャントの正確な決定は、正確な較正標準に依存する。保存溶液中のコール酸化合物の濃度は、正確で、再現可能でなければならない。コール酸粉末の非常に正確な(過誤<0.5%)分量を量り、フラスコへの粉末の定量的移動を確かなものにするために、ガラス製秤量漏斗および1M NaHCO3の洗浄剤を使用する。一次保存溶液の最終濃度が正確であるように正確な容量を確保するために、容積測定フラスコを使用する。同様に非常に正確である二次保存溶液を調製するために、容積測定フラスコで定容にした一次保存溶液の正確な容量を分注するために、較正された空気置換ピペットを使用する。該当するSOPに記載されているように、二次保存溶液は、標準曲線試料、精度および精密度試料、回復試料、品質管理試料、選択性試料および安定性試料を調製するために使用される。
【０１８９】
以下の試薬が必要とされる。
1M NaHCO3
0.1M NaHCO3
0.1M NaHCO3/2% BSA
メタノール、LCMSグレード
水、CLRWグレード(臨床検査室試薬水)
コール酸、純度98%
ケノデオキシコール酸、純度98%
[24-13C]-コール酸、99原子% 13C
[2,2,4,4-2H]-コール酸、98原子% 2H。
【０１９０】
全ての一次保存溶液は、下のTable 2(表2)を使用して250μMの濃度で調製する。
【０１９１】
【表２】
0006378194.tif 000003
【０１９２】
一次保存溶液は、以下の通り0.1M NaHCO3およびメタノールで別々に調製される。ガラス製秤量漏斗で、コール酸化合物の適当な量(±0.05mg)を計量する。100ml容積測定フラスコに粉末を移す。メタノールまたは0.1M NaHCO3のいずれかを使用して、残留粉末を漏斗からフラスコに洗い落とす。メタノールで100mlの最終容量にし、よく混合する。1カ月の有効期限で、フラスコに表示する。-20℃で保存する。
【０１９３】
以下の通りMeOHまたは0.1M NaHCO3のいずれかで、50μMの内部標準として非標識コール酸を調製する。10ml容積測定フラスコに、2.0mlの適当な250μM CA一次標準をピペットで加える。0.1M NaHCO3またはメタノールで10mlの合計容量にし、よく混合する。1年の有効期限で、フラスコを表示する。4℃で保存する。
【０１９４】
メタノールで作製した[24-13C]-コール酸二次保存溶液を、Table 3(表3)に示す。各二次保存溶液を適当な15mlガラス製上ネジ試験管に移す。管に確実にふたをし、数層のパラフィルムで密封し、-20℃で保存する。
【０１９５】
【表３】
0006378194.tif 000004
【０１９６】
メタノールで作製した[2,2,4,4-2H]-コール酸二次保存溶液を、Table 4(表4)に示す。各二次保存溶液を適当な15mlガラス製上ネジ試験管に移す。管に確実にふたをし、数層のパラフィルムで密封し、-20℃で保存する。
【０１９７】
【表４】
0006378194.tif 000005
【０１９８】
0.1M NaHCO3およびBSAで作製した[24-13C]-コール酸二次保存溶液を、Table 5(表5)に示す。各二次保存溶液を適当な15mlの上ネジプラスチック管に移し、ふたをし、数層のパラフィルムで密封し、4℃で保存する。
【０１９９】
【表５】
0006378194.tif 000006
【０２００】
0.1M NaHCO3およびBSAで作製した[2,2,4,4-2H]-コール酸二次保存溶液を、Table 6(表6)に示す。各二次保存溶液を適当な15mlの上ネジプラスチック管に移し、ふたをし、数層のパラフィルムで密封し、4℃で保存する。
【０２０１】
【表６】
0006378194.tif 000007
【０２０２】
上で調製される二次保存溶液は、内部標準としての非標識コール酸と一緒にヒト血清の精度および精密度試料の調製で利用される。二次保存溶液は、内部標準として非標識コール酸を加えた回復試料の調製で使用される。
【０２０３】
コール酸シャントアッセイで患者の肝機能を正確に測定するために、2つの異なる安定同位体コール酸化合物を患者血清で各々正確に定量化しなければならない。これを行うために、2つの標準曲線の各々の精度、精密度および回復を、それらのそれぞれの濃度範囲で検証しなければならない。
【０２０４】
アッセイの精度および精密度は、定量化の下限(LLOQ)、低、中間および高濃度範囲で複数のレプリカ試料を実行することによって評価する。精度は、実際値への平均測定値の近さである。精密度は、CVによって示される測定値の再現性である。回復は、低、中間および高濃度で測定される純粋な分析物のそれに対して、血清から抽出される分析物の検出器応答を比較することによって評価される。
【０２０５】
品質管理試料の調製
FDAは、分析法の精度および精密度の許容レベルに関する指針を提供する。例えば、Bioanalytical Method Validation、2001年5月、Section VI. Application of Validated Method to Routine Drug Analysisを参照。日常の使用のために分析法が検証されると、その方法が満足に性能を発揮し続けることを確実にするために、その精度および精密度を定期的にモニターするべきである。この目的を達成するために、いくつかのQC試料を別々に調製し、試料総数に基づいて間をおいて処理検査試料で分析するべきである。QC試料は3濃度(1つは定量化下限(LLOQ)近く(すなわち、3×LLOQ)、1つは中間値、1つは範囲の最高点近く)により2反復で実行され、各アッセイの実行で組み込むべきである。QC試料の数(3の倍数)は、実行される試料総数に依存する。QC試料の結果は、実行を受け入れるか拒絶する根拠となる。それぞれの6つのQC試料のうち少なくとも4つは、それらのそれぞれの公称値の15%以内にあるべきである。6つのQC試料のうちの2つは、それらのそれぞれの公称値の15%の外にあってもよいが、両方とも同じ濃度であってはならない。
【０２０６】
QC試料は、両標準曲線の高、中間および低の範囲をカバーしなければならない。QC試料は、検査期間にわたって患者血清に見出される標識化合物の実際濃度を厳密にシミュレーションするように設計される。[24-13C]-CA濃度は初期の時点で非常に高く、中間および低い濃度に指数関数的に低下する。[2,2,4,4-2H]-CA濃度は初期の時点で非常に低く、中間時点でその最高値に上昇し、その後中間濃度に低下する。
【０２０７】
供給品
コール酸シャントおよびコール酸クリアランス検査手順で使用されるQC試料を調製するために、以下の供給品が利用される。患者試料が経口コール酸クリアランス検査だけを受ける場合は、[24-13C]-CA QC試料を省略することができる。
ヒト血清AB(Gemini Bio-Products社  #100-512)
非標識コール酸内部標準保存溶液(IS;0.1M NaHCO3に50μMコール酸)
0.1M NaHCO3/1% BSA中の[24-13C]-コール酸および[2,2,4,4-2H]-コール酸二次保存溶液:
B 2.0μM[24-13C]-CA
D 10.0μM[24-13C]-CA
F 60.0μM[24-13C]-CA
I 3.0μM[2,2,4,4-2H]-CA
K 10.0μM[2,2,4,4-2H]-CA
L 30.0μM[2,2,4,4-2H]-CA
10ml容積測定フラスコ
P1000空気置換ピペットおよび1mlチップ
新しい、清潔なクリオバイアル
【０２０８】
コール酸クリアランスおよびアッセイのための品質管理試料の調製手順
[24-13C]-コール酸および[2,2,4,4-2H]-コール酸QC試料は、以下の通りに調製する。Table 7(表7)に示すように、QC試料の各セットについて、3つの清潔な10ml容積測定フラスコを「QC1」、「QC2」および「QC3」と表示する。より大きなバッチを調製するために、より大きな容積測定フラスコを使用することができる。下に示すように、より大きなフラスコの呼び容積の10分の1を二次保存溶液の添加量として使用する。
【０２０９】
【表７】
0006378194.tif 000008
【０２１０】
Table 6(表6)に示すように、P1000を使用して、適当な[24-13C]-CA保存溶液の1.0mlおよび適当な[2,2,4,4-2H]-CA保存溶液の1.0mlを適当なフラスコに加える。各フラスコをヒト血清で正確に合計10.0mlにする。各フラスコのふたを確実にしめ、数回の反転によってよく混合する。8つのクリオバイアルを「QC1」、8つを「QC2」および8つを「QC3」と表示する。各QC混合物の1.2mlを適当なバイアルに等分する。QC試料を-80℃で冷凍保存する。QC試料は、1年の有効期限を有する。
【０２１１】
高圧液体クロマトグラフィー-質量分析(HPLC-MS)試料の調製
正確な肝機能検査を確かなものにするために、標識コール酸検査化合物を患者の血清試料から単離し、同定しなければならない。コール酸化合物は、疎水性と親水性の両方の領域を有する両親媒性分子である。コール酸は、pHに従い無電荷遊離酸形(コール酸)または荷電したカルボン酸形(コール酸イオン)のいずれかで存在することができるカルボン酸でもある。これらの特性は、血清からコール酸化合物を単離するために活用することができる。GC/MSに対してHPLC/MSを使うことは、試料の誘導体化なしでコール酸を分析することを可能にする。あるいは、GC/MSは、当技術分野で公知である任意の技術による、例えば参照により本明細書に組み込まれるEversonおよびMartucci、US2008/0279766の方法による、誘導体化による試料分析のために使用することができる。
【０２１２】
試薬、供給品および装置
HPLC-MS試料調製では、以下の試薬を調製し、使用する。
水、CLRWグレード(臨床検査室試薬水)
メタノール、LCMSグレード
ジエチルエーテル、ACSグレード
非標識コール酸内部標準(IS)一次保存溶液(0.1M NaHCO3に50μM CA)
品質管理試料(上記の通りに調製)
1.0N NaOH(500ml水に20g NaOHを溶解する)
0.01N NaOH(水で1.0N NaOHを1対100に希釈する)
10%メタノール(1Lシリンダーに100mlのメタノールを加え、水で1.0Lにする)
90%メタノール(1Lシリンダーに900mlのメタノールを加え、水で1.0Lにする)
0.2N HCl(撹拌しながら1.0mlのACSグレード濃HClを57.0mlの水に徐々に加える)
移動相(10mM酢酸アンモニウム/60%メタノール)
使い捨て式16×100および13×100試験管
P1000空気置換ピペットおよび1mlチップ
P100空気置換ピペットおよび0.2mlチップ
リピータピペット
ボルテックス混合機
SPEカートリッジ(Bond Elut LRC C18 OH、500mg、Varian, Inc.社)
真空マニホールド
Speed-Vac
ベンチトップ遠心機
換気フードにベントされるSpeed-Vac
超音波処理浴槽
水、メタノール、10%メタノールおよび90%メタノールのためのリピータディスペンサー
【０２１３】
患者血清試料およびQC試料セット(QC1、2および3を各々2つ)をフリーザーから取り出し、室温まで解凍させる。ラボコート、手袋、目保護具を含む保護衣(PPE)を装着しなければならない。全ての溶出液および装置は、消毒しなければならない。試料と接触するピペットおよびチップは、有害廃棄物に廃棄しなければならない。
【０２１４】
各患者の試験管(16×100)セットを、その患者のイニシャルおよび時点コード(5分は1、20分は2、45分は3、60分は4、90分は5)で表示する。P1000ピペットを使用して、0.50mlの患者血清を適当な収集管から適当な試験管に移す。
【０２１５】
各QC試料(QC1a、QC1b、QC2a、QC2b、QC3a、QC3b)の試験管(16×100)セットに表示する。P1000を使用して、各QC試料の0.50mlを適当な試験管に移す。
【０２１６】
2本の試験管(13×100)にSTD1およびSTD2と表示する。
【０２１７】
リピータピペットを使用して、各患者試料および各QC試料および各STD試料管に非標識コール酸内部標準(IS)一次保存溶液の50μlを加える。
【０２１８】
工程21での後の酸性化およびエーテル抽出のために、STD管を取っておく。
【０２１９】
各患者試料管およびQC試料管に1.0mlの0.01N NaOHをリピータピペットで加え、30秒間ボルテックスする。
【０２２０】
処理する各患者血清およびQC試料に1つで、SPEカートリッジセットに表示する。
【０２２１】
フード内で、5mlメタノールをリピータディスペンサーで各カートリッジに加える。この工程は、真空マニホールドで高真空により、または重力によって行うことができる。これは、樹脂床を溶媒で湿らす。液体の上部がフリットの上部に到達すると、次の溶液を加える。カートリッジを乾燥させることは避ける。
【０２２２】
各カートリッジに、10mlの水をリピータディスペンサーで加える。これは、コール酸化合物の結合のためにそれを準備するために、樹脂床を平衡させる。この工程は、高真空の真空マニホールドで、または重力によって行うことができる。
【０２２３】
各SPEカートリッジに、適当な試料を加える。コール酸化合物は樹脂床に結合する。各試料試験管に1mlの水を加え、リピータですすぎ、ボルテックスし、この洗浄液を適当なカートリッジに加える。試料を20分以上重力で流させ、次に試料を抜くために低真空≦3インチHgを使用することができる。
【０２２４】
試料が樹脂床に完全に入った後、リピータディスペンサーで各SPEカートリッジに2.5mlの水を加える。これは、カラム樹脂床を洗浄する。低真空≦3インチHgを使用する。
【０２２５】
各SPEカートリッジに、2.5mlの10%メタノールをリピータディスペンサーで加える。これは、カラム樹脂床をさらに洗浄する。低真空≦3インチHgを使用する。
【０２２６】
各患者試料および各QC試料に1つで、試験管(13×100)セットに表示する。
【０２２７】
ラックに各試験管を置き、上部にそのマッチングSPEカートリッジを置く。
【０２２８】
各SPEカートリッジに、2.5mlの90%メタノールをリピータディスペンサーで加える。これは、試験管に収集されるコール酸化合物を溶出する。
【０２２９】
試験管をSpeed-Vacに置き、高熱で45分の間真空下で遠心分離して溶出液容量を低減し、エーテル抽出に干渉するメタノールを除去する。
【０２３０】
Speed-Vacからの各管およびSTD管の各々に、0.5mlの0.2N HClをエッペンドルフリピータピペットで加え、30秒間ボルテックスする。この酸性化は、コール酸化合物をエーテル抽出のためのそれらの遊離酸形に変換する。
【０２３１】
換気フード内で、各管に3mlのジエチルエーテルを加え、30秒間激しくボルテックスする。これは、コール酸化合物の遊離酸形をエーテル相に抽出する。
【０２３２】
相分離を加速するために、最低5000rpmで5分間遠心分離する。
【０２３３】
各試料に1つで、試験管(13×100)の別のセットに表示する。
【０２３４】
上部のエーテル層を注意深く収集し、新しい試験管に移す。
【０２３５】
換気フードにベントされるSpeed-Vacにエーテル抽出物を置き、試料が乾燥するまで加熱せずに真空下で遠心分離する。あるいは、N2ガスの弱い気流で試料を乾燥させることができる。
【０２３６】
乾燥試料に100μlの移動相を加え、30秒間ボルテックスし、超音波処理する。
【０２３７】
Agilent 1.5mlバイアルに試料を移し、ふたをする。
【０２３８】
HPLC/MSパラメータおよびシステム準備
試薬、供給品および装置
HPLC-MS試料分析では、以下の試薬を調製して使用する。
水、臨床検査室試薬水(CLRW)
メタノールLCMSグレード
10mM酢酸アンモニウム水溶液
10mM酢酸アンモニウムメタノール溶液
移動相:60% 10mM酢酸アンモニウムメタノール溶液/40% 10mM酢酸アンモニウム水溶液
容積測定フラスコ、適当なサイズ
メスシリンダー
【０２３９】
HPLC-MS試料分析では、以下の機器および供給品を使用する。
較正された化学天秤
HPLC/MS機器:G1956Aマルチモードソース、自動試料採取装置、HP Chemstationソフトウェアまたは同等物を備えているAgilent 1100シリーズの液体クロマトグラフ質量分析計。
Agilent Eclipse XDB C8、2.1×100mm、3.5μm液体クロマトグラフカラム
溶媒フィルターデガッサー
0.22μmナイロンフィルター
【０２４０】
溶媒および移動相を各々調製し、0.22μmナイロンフィルターで濾過し、脱気する。溶媒および移動相は、調製の48時間後に各々期限切れになる。
【０２４１】
LCMSシステムを準備し、調整する;カラムを40℃で安定させ、移動相を30分間流すことによって慣らす。試料をオートサンプラーに送る。カラム流量は、0.4ml/分の定組成移動相緩衝液である;60% 10mM酢酸アンモニウムメタノール溶液/40% 10mM酢酸アンモニウム水溶液。各試料の5マイクロリットルを、オートサンプラーによって注入する。大気圧化学電離(APCI)イオン化によるマルチモードエレクトロスプレー(MM-ES)イオン化でMSを実行する。選択イオンモニタリングを、407.30、408.30および411.30m/zで実施する。システムソフトウェアによってピークを積算する。各分析で3つのQC試料をアッセイする。QC試料の濃度は、15%の精度内になければならない。
【０２４２】
患者の個別的経口および静脈内クリアランス曲線を作成するために、静脈内および経口試料の一方または両方の選択的イオンモニタリングからのデータを使用する。それらのそれぞれの有効時間範囲に沿って曲線を積算し、各々について面積を作成する。静脈内および経口コール酸クリアランス曲線の比較は、初回通過肝排泄または門脈シャントの決定を可能にする。肝臓シャント比率は、式:
シャント比率=[AUCoral/AUCIV]×[用量IV/用量oral]×100%
によって計算され、式中、AUCは曲線下面積を表し、用量は投与用量の量(mg)を表す。
【０２４３】
(実施例5)
遅い、中程度、および速い進行性患者:コール酸検査を使用する機能的評価によって検出される原発性硬化性胆管炎患者の3つの異なるカテゴリー
現行の実施例は、PSC疾患進行のおよその速度を推定するために、門脈HFRおよびSHUNTと患者年齢との関係を検討した。原発性硬化性胆管炎(PSC)は容赦のない進行を示すが、進行速度は患者の間で異なる。コール酸検査は門脈肝濾過率(HFR)および門脈-体循環SHUNTを測定することができ、それらは静脈瘤、腹水、代償障害および移植の必要性と相関する(Gastroenterology 2012、142:S911;Liver Transplantation 2012、18:S233)。驚くべきことに、門脈HFR(FLOW)およびSHUNTと患者年齢との関係は、PSC疾患進行のおよその速度を推定するために有用であることが見出された。コール酸検査は、遅い、中程度および速い進行性患者を識別するために用いられた。
【０２４４】
方法。20歳から67歳に及ぶPSC患者(n=42)および32人の健康な対照がコール酸検査を受け、病歴を記録した。患者は、2つのコール酸検査方法を受けた。具体的には、第1の識別可能なコール酸を経口投与し、第2の識別可能なコール酸を静脈内投与した。経口投与されたコール酸、2,2,4,4-d4コール酸(40mgの用量)は、特定の腸輸送体によって門脈に直接取り込まれた。静脈内投与されたコール酸、24-13C-コール酸(20mg)は、全身に分配され、肝動脈を主に通して肝臓に入る。特定の肝輸送体は、門脈および全身の循環から二重コール酸を消去する。投与の0、5、20、45、60および90分後に、末梢血液試料を収集した。各血液試料中の識別可能なコール酸は、LCMS法によってアッセイした。この場合、この方法は、精度および精密度についてのFDAガイドラインに従って検証した。各試料から得られた値は、その各々は参照により本明細書に組み込まれる、2009年9月11日に出願したEverson、US2010/0055734、Methods for Diagnosis and Intervention of Hepatic Disorders;および2006年1月26日に出願したEversonら、US2008/0279766、Methods for Diagnosis and Intervention of Hepatic Disordersの方法によって門脈肝流量(門脈HFR、FLOW)およびSHUNTを決定するために使用された。経口コール酸-2,2,4,4-d4は門脈循環を標的にし、そのクリアランスは門脈HFRを規定する。IVコール酸-24-13Cクリアランスは、全身HFRを測定する。全身HFR対門脈HFRの比は、SHUNTを規定する。2反復検査の再現性は素晴らしく、10%のCVであった。2反復検査の平均を、分析のために使用した。
【０２４５】
結果。PSC患者では、健康な対照と比較して年齢と共に門脈HFRは減少し、SHUNTは増加した。これらの年齢関連の変化の検査は、門脈HFRの低下またはSHUNTの増加によって規定されるPSC患者の3つのカテゴリーを明らかにした-遅い、中程度、および速い進行性患者。各カテゴリーの中では、機能の年齢関連の低下はほぼ直線状であった。遅い進行性患者(n=23、61%)は、門脈HFRの穏やかな年齢関連の低下またはSHUNTの増加を実証した。彼らが門脈圧亢進(PHTN)を発症した場合は、生涯の後半で徴候が起こった-脾腫にかかった3人は45歳より上で、静脈瘤を起こした2人は62歳より上であった。中程度の進行性患者(n=12、32%)はしばしば門脈圧亢進(12人の患者中9人)を発症し、生涯の前半で低下を経験した-脾腫は30歳という早い時期に、静脈瘤は32歳という早い時期に。54歳以上の中程度の進行性患者のほとんどは、腹水および/または静脈瘤出血を起こした(5人の患者中4人)。速い進行性患者(n=3、8%)は比較的稀であったが、これらの患者は30歳より早くに低い門脈HFRおよび高いSHUNTを示した。図2〜図4に示すように、中程度の進行性患者のカテゴリーで最も高いSHUNTを有する患者Aは58歳で肝移植を受けたが、速い進行性患者のカテゴリーで最も高いSHUNTを有する患者Bは20歳で肝移植を受けた。図2は、門脈HFR検査値および検査時年齢に基づいて、3つの異なる群に分離されたPSC患者を示す。図3は、SHUNT検査値および検査時年齢に基づいて、3つの異なる群に分離されたPSC患者を示す。遅い進行性患者として分類されるPSC患者は、対照と比較して機能の穏やかな変化だけを有した。中程度および速い進行性患者に分類されたPSC患者は、より多くの合併症を、およびより早い年齢で示した。
【０２４６】
図5に示すように、各カテゴリーの患者は、特異な病態生理学的機構を示唆するサイトカインの特異なパターンを示した。IFN-γは、対照と遅い、中程度、および速い進行性患者との間で変化しなかった。TNF-αは、健康な対照と比較して各カテゴリーのPSC患者で増加した。GM-CSFは、対照および遅い進行性患者と比較して、中程度および速い進行性患者で増加した。IL-1bは速い進行性患者でより高い傾向のようであったが、統計的に有意でなかった。IL-6は健康な対照では事実上未検出であったが、遅い、中程度および速い進行性患者はIL-6のレベルが上昇する傾向を示した。IL-8は健康な対照では事実上未検出であったが、遅い、中程度および速い進行性患者はIL-8のレベルが上昇する傾向を示した。
【０２４７】
結論。コール酸検査による機能評価は、3つの異なるカテゴリーのPSC患者:遅い、中程度および速い進行性患者を同定した。コール酸検査によってPSC患者のカテゴリーを識別することは、疾患進行の特異な病態生理学的機構の調査を強化し、適切に標的を定めた療法の開発を助けることができよう。
【０２４８】
(実施例6)
SHUNTおよび門脈HFRを使用するPSC患者を分類するためのアルゴリズム
PSC患者は、以下のアルゴリズムによって、SHUNTおよび門脈HFRおよび検査時年齢に基づいてPSCのサブカテゴリーに振り分けられる。
【０２４９】
工程1は、SHUNTおよび年齢に基づく。年齢(年数)で割った患者のSHUNT(パーセント)が1.7を超える場合、患者は速い進行性患者と診断される。この値が1.7未満である場合、工程2に進む。図6は、SHUNT対年齢が、速い進行性患者を決定することを示す。0歳から始まる線は1.7のSHUNT/年齢を画定し、線より上の者は速い進行性患者であり、下の者は他のPSCカテゴリーである。
【０２５０】
工程2は、門脈HFRおよび年齢に基づく。門脈HFR(mL/分/kg)+[0.35×年齢(年数)]が29を超える場合、患者は遅い進行性患者と診断される。この値が29未満である場合、患者は中程度の進行性患者と診断される。工程1で速い進行性患者と既に診断された患者は、門脈HFRによってこのようにさらに評価されない。図7は、門脈HFR対年齢が、遅いおよび中程度の進行性患者を決定することを示す。0歳から始まる線は、29に等しい門脈HFR+[0.35×年齢]を画定する。線より上の患者は遅い進行性患者であり、この線より下の患者は中程度の進行性患者である。
【０２５１】
(実施例7)
PSC患者を分類するためにSTATを使用する方法
STAT検査は、経口投与後の単一の時点(例えば、60分後)に患者から得られる識別可能なコール酸化合物の血液または血清中濃度(μM)から値が得られる、本明細書に記載される簡略化されたスクリーニング検査である。STAT検査値は、門脈血流を推定するために使用することができる。ほとんどの患者でPSC進行を分類するために、PSC患者のSTAT検査値をカットオフ値と比較することができる。図8に示すように、ほとんどのPSC患者は、単純なSTATカットオフおよび検査時年齢に基づいてPSCのサブカテゴリーに振り分けることができる。図8は、STATがほとんどのPSC患者を分類することができることを示す。患者は、遅い、中程度および速い進行性患者のこのプロットの上の黒線で示される、単純なカットオフを使用して分類することができる。30歳から40歳の間の患者は重複するSTAT結果を有し、この方法によって分類することができない。患者が30歳未満で、STATが>1μMである場合は、患者は速い進行性患者と診断される。30代の患者は、STATによって正確に分類されない。より高齢の患者については、カットオフ値をTable 8(表8)に示す。
【０２５２】
【表８】
0006378194.tif 000009
【０２５３】
(実施例8)
疾患重症度指数の開発
以前に、特定の慢性肝疾患または状態のためのカットオフを開発するために、患者および正常な対照の様々なコホートにおいて門脈HFR検査またはSHUNT検査を各々別々に利用した。本明細書に記載されるように、疾患重症度指数(DSI)はDSI式から得られ、式の項は、SHUNT、門脈HFRおよび/または全身HFRから選択される1つまたは複数の肝機能検査結果値を含み、検査結果値は、疾患重症度指数(DSI)を計算する疾患重症度指数式で項として使用される。
【０２５４】
一実施形態では、ペグ化インターフェロン/リバビリン(PEG/RBV)処置に対する一群のCHC患者の応答(持続性ウイルス学的著効、SVR)の予測におけるDSIの有用性を調査した。Table 9-11(表9〜11)に示すように、SVRを達成したCHC患者の%を、DSIの指定範囲内の患者の群について計算した。SHUNTおよび門脈HFR検査値の両方を組み込んでいる、DSI式を作成した。DSI式を下に示す。
【０２５５】
DSI=9.84(SHUNT)-12.36 LOGe(門脈HFR)+50.5
【０２５６】
一群の健康な対照へのDSI式の適用は、10±3の平均スコア±SDを与えた。検査後3週以内に移植を必要とした、最も機能障害のある患者は、スコアが47であった。生存するであろう患者で最も高いスコアは、約50と予想される。SHUNTまたは門脈HFR単独と比較したDSIの使用を、SHUNT、門脈HFRまたはDSIの指定範囲内の患者の群について計算した、SVRを達成したCHC患者の%を示すTable 9-11(表9〜11)に示す。
【０２５７】
【表９】
0006378194.tif 000010
【０２５８】
【表１０】
0006378194.tif 000011
【０２５９】
【表１１】
0006378194.tif 000012
【０２６０】
一部の実施形態では、抗ウイルス処置への応答、例えばSVRを達成するCHC患者の%を予測するためにDSIは使用される。一部の実施形態では、処置への応答、例えばPEG/RBVによる処置に続いてSVRを達成するCHC患者の%を予測するために、DSIは使用される。
【０２６１】
(実施例9)
肝臓関連の転帰を評価する疾患重症度指数。
非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)は、良性の肝脂肪変性(脂肪肝)、ならびに肝硬変および臨床合併症に進行するかもしれない、炎症、壊死および線維症が付随する脂肪変性(NASH)を包含する。NASHは攻撃的な壊死炎症過程であるが、線維症の進行および肝硬変への進展の速度は患者間で大きく異なる。
【０２６２】
遅い速度の進行は、NASHの自然な経過を確立するため、または処置もしくは介入が臨床転帰を低減することを証明するために、長年の観察および追跡調査が必要とされることを決定づける。臨床合併症の一次転帰の長期研究は非常に高コストであり、患者および研究者の両方の消耗を招く。臨床転帰と相関する初期マーカーまたは代用物を使用する短期研究が、望ましい。
【０２６３】
これまで、肝生検での線維症ステージが、臨床転帰の代わりの至適基準と考えられていた。いくつかの研究において、脂肪変性ではなく線維症の重症度が、臨床転帰の将来の危険を予測することを実証している。
【０２６４】
肝生検の代替手段は、正確であり、再現性があり、十分に耐容性であり、比較的安価であり、非侵襲的であるべきである。さらに、これらの代替検査は、脂肪変性の程度とは無関係に線維症と相関するべきであり、臨床転帰の危険を予測するべきである。これらの必要性に対処するために、定量的肝機能検査(QLFT)が開発された。ほとんど全てのQLFTは、肝生検の代替手段として1つまたは複数の基準を満たす。二重のコール酸クリアランス(SHUNT)は、これらの基準の全てを満たす。NIHおよび業界(Roche社)に支援された、肝硬変に対するC型肝炎抗ウイルス長期処置のQLFT補助研究(HALT-C)試験は、臨床転帰を予測するQLFTの能力を評価した。
【０２６５】
ベースライン、2年後および4年後に一連のQLFT(カフェイン、アンチピリン、リドカイン-MEGX、ガラクトース、二重コール酸およびSPECT肝臓-脾臓スキャン)で患者(N=285)を研究し、最高8.3年(4.9±2.2年、平均±SD)の間、臨床転帰(Child-Turcotte-Pugh(CTP)増加、静脈瘤、脳症、腹水、肝臓関連死)について追跡した。各検査につき、高リスクカットオフを越えた者の臨床転帰の可能性を比較した。ベースライン検査の危険率は経口コール酸の6.5からGECの2.2まで変動し、連続した検査についてプールされた相対リスクは経口コール酸の14.1からMEGXの2.5まで変動した。追加の公表および発表では、二重コール酸検査は、臨床転帰を予測するだけでなく、線維症のステージ、肝硬変の危険、静脈瘤の危険および静脈瘤サイズと相関することも示され、SVR後の肝機能の向上および生体肝供与からの回復を追跡した。
【０２６６】
興味深いことに、臨床転帰を予測する二重コール酸モデルでは、線維症の組織学的ステージは有意性から脱落した。したがって、驚くべきことに、病期分類肝生検を避けることができた。広い臨床関連性を考慮すると、生検に代わるものとしての二重コール酸検査の潜在的有用性についてのさらなる調査が正当化されるようであった。
【０２６７】
臨床検査への二重コール酸の最初の展開は、臨床検査の単純化、検査手順の改訂、品質管理の設定、ならびに生体分析手順および方法のためのFDAガイドラインによる検査性能特性の検証を必要とした。
【０２６８】
改訂された検査の臨床関連性を再検査して、探究するために、NIHおよびHALT-Cとのデータ使用合意に達した。肝機能の3つの主要なパラメータが、検査によって規定される:静脈内投与したコール酸のクリアランスからの全身肝濾過率(HFR)、経口投与したコール酸からの門脈HFR、およびクリアランスの比からのSHUNT。疾患重症度指数は、全3つの変数の複合体である。実施例10に示すように、慢性C型肝炎の線維症ステージを有する患者で将来の臨床転帰の危険を予測するこれらの検査の能力から、それは規定された。
【０２６９】
実施例10に示すように、HCV患者でのエンドポイントとして臨床転帰を用いて、疾患重症度指数(DSI)を検査のパラメータから規定した。現在対象を登録している新しい研究のHCV患者、PSC患者およびNASH患者では、DSIは肝疾患重症度と相関する。DSIは高度に再現性があり、線維症と相関し、臨床転帰を予測する。図10は、DSIが線維症(左パネル)と線形に相関するが、脂肪変性(生検脂肪スコア、右パネル)によって影響されないことを実証する。将来の臨床転帰を有する患者の同定におけるDSIの性能を、Ishak線維症スコア、血小板数およびMELDのそれと比較した(図11およびTable 12(表12))。
【０２７０】
【表１２】
0006378194.tif 000013
【０２７１】
図11およびTable 12(表12)に示すように、生検(Ishak線維症)、CBC(血小板)または標準ラボ検査(MELD)と比較した場合に、最適なカットオフにおいてDSIは最も高い感度、特異度、PPVおよびNPVを有した。QLFT、特に二重コール酸は、NAFLDの自然な経過の研究における、またはその処置の有効性をモニターするためのエンドポイントとして、肝生検の正確で、再現性のある、費用効果がよい非侵襲的代替手段になることができる。
【０２７２】
(実施例10)
慢性C型肝炎における肝臓関連の転帰の疾患重症度指数の評価
コール酸検査は、5または6のCTPスコアおよび臨床合併症の前歴がないことを特徴とする、HALT-C試験に登録された224人の慢性HCV患者(Ishak F2〜F6)でベースライン時に実施した。
【０２７３】
具体的には、静脈内投与したコール酸のクリアランスからの全身肝濾過率(HFR)、経口投与したコール酸からの門脈HFR、およびFDAガイドラインに対して検証した改善されたLCMS法を使用したクリアランスの比からのSHUNTのためのコール酸クリアランス曲線を決定するために、保管中の血清を再分析した。最高8.3年(4.9±2.2年、平均±SD)の間、臨床転帰について患者を追跡した。臨床転帰(n=54)は、CTP進行、静脈瘤出血、腹水、肝性脳症または肝臓関連死で規定した。
【０２７４】
疾患重症度指数(DSI)の誘導は、Table 13(表13)に示す一変量Cox一変量Cox比例危険回帰分析を使用して実施した。
【０２７５】
【表１３】
0006378194.tif 000014
【０２７６】
性能を向上させるために、最も高いカイ二乗値の検査を疾患重症度指数に組み合わせた。
【０２７７】
DSI=A(SHUNT)+B(loge門脈HFR)+C(loge全身HFR)+D。
【０２７８】
HALT-Cコホートでの第1の臨床転帰の予測に基づいてDSI式を作成した:
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50
【０２７９】
SHUNT、門脈HFRおよびDSIについての転帰を予測するためのROC曲線を調製し、図12に示す。図12に示すように、最適なカットオフは、左上隅に最も近くの各曲線上の点と決定した。
【０２８０】
患者は、DSIが9(正常)から40(重度の機能不全)まで変動した。ROC曲線は、DSIが中間の/大きな静脈瘤、c-統計値0.82を有する患者を同定することができ、どの患者が臨床転帰、c-統計値0.83を有するか予測することができること、およびDSI>25が両方の最適なカットオフであることを示した。DSI>25は生検による肝硬変(Ishak F5〜F6)より高い平衡精度を有し、中間/大きな静脈瘤を同定するためのPPVは生検に対して41%増加し、転帰を予測するためのPPVは47%増加した(Table 14(表14))。
【０２８１】
【表１４】
0006378194.tif 000015
【０２８２】
各検査システムの予後検査性能を評価し、Table 14(表14)に示す通り、最も高い感度、特異度、PPV、NPVおよび平衡精度は、全てコール酸検査に基づくDSIで達成された。
【０２８３】
図13は、この実施例によるコール酸に基づく検査SHUNT(%)、全身HFR(mL/分/kg)、門脈HFR(mL/分/kg)およびDSIの、軽度の疾患、中等度の疾患および重度の疾患検査結果を有する非硬化性患者(Ishak F2、3、4;n=19、63、45)のプロットを示す。黒丸は臨床転帰を有する患者を示し、淡灰色の丸は臨床転帰のない患者を示し、暗灰色の丸は正常で健康な対照を示す。驚くべきことに、高いDSIを有する非硬化性患者(Ishak F2、3、4)は転帰のより大きな危険を有する。
【０２８４】
図14は、この実施例によるコール酸に基づく検査SHUNT(%)、全身HFR(mL/分/kg)、門脈HFR(mL/分/kg)およびDSIの、軽度の疾患、中等度の疾患および重度の疾患検査結果を有する硬化性患者(Ishak F5、6;n=48、49)のプロットを示す。黒丸は臨床転帰を有する患者を示し、淡灰色の丸は臨床転帰のない患者を示し、暗灰色の丸は正常で健康な対照を示す。驚くべきことに、低いDSIを有する硬化性患者(Ishak F5、6)は、臨床転帰のより低い危険を有する。
【０２８５】
注目すべきことに、コール酸検査は、C型肝炎患者での臨床転帰の予測で、生検によって診断される肝硬変に優る性能を示すことができた。DSIにコール酸検査結果を組み合わせることによって、最高の予後診断性能が達成された。この実施例は、DSIを与える二重コール酸肝機能検査が、中間/大きな静脈瘤を有する患者の同定において、および慢性HCV患者での臨床転帰の予測において、組織学的線維症ステージに優る性能を示すことができたことを示す。
【０２８６】
(実施例11)
原発性硬化性胆管炎(PSC)での疾患重症度の疾患重症度指数評価
原発性硬化性胆管炎(PSC)を有する補償されたか最小限に非代償性の患者の群において、疾患重症度の評価についてコール酸検査をMELDと比較した。
【０２８７】
20人の健康な対照が、PSC集団でコール酸検査結果を比較するための参照の役目をした。胆管撮影によって診断された43人のPSC患者が登録された。ほとんどは中年男性で、低いMELD、CTPまたはMayo PSCリスクスコアを有した。ビリルビン、INR、アルブミンおよび血小板数の平均値は、彼らの疾患の比較的補償されたステージを反映する。アルカリ性ホスファターゼは、広い範囲で控え目に上昇した。具体的には、43人のPSC患者は、平均48.4±12.9歳、76%が男性であり、平均MELDスコアが9.5±4.3、平均CTPスコアが6.0±1.5、平均Mayo PSCリスクスコアが0.85±0.74、平均ビリルビンが1.8±1.8mg/dL、平均INRが1.2±0.6、平均アルブミンが3.6±0.5、平均血小板数が190±95×10-3μL-1、および平均アルカリ性ホスファターゼが206±196IU/mLであった。
【０２８８】
患者を一晩絶食させ、各患者は再現性をチェックするために2週以内に2回調べた。コール酸検査は、HSAと混合した20mgの[24-13C]-コール酸の静脈内投与、およびジュース中の40mgの[2,2,4,4-2H]-コール酸の経口投与の同時二重投与によって実施した。コール酸投与の0、5、20、45、60および90分後に、血液試料をとった。血清試料は、HPLC/MSによって分析した。クリアランス(IVおよびPO)、SHUNT、疾患重症度指数(DSI)は、血清コール酸から計算した。コール酸経口クリアランスおよび静脈内投与後のコール酸クリアランスは、用量(経口投与では40mg、静脈内投与では20mg)を各同位体の濃度-時間曲線下の面積(ミリグラム/分/ミリリットル)で割り、体重(キログラム)で標準化することによって計算し、コール酸シャントは、静脈内および経口投与された同位体のクリアランスの比であった。実施例10に示す通り、DSIは、HALT-Cコホートでの第1の臨床転帰の予測に基づいて作成されたDSI式から計算した。
DSI=5.75(SHUNT)-7.22(Loge門脈HFR)-8.45(Loge全身HFR)+50。
【０２８９】
コール酸検査は、検査日の間の変動が非常に低く、優れた再現性を実証した。再現性データをTable 15(表15)に示す。
【０２９０】
【表１５】
0006378194.tif 000016
【０２９１】
相関係数は、0.95および0.97で優れていた。HFRおよびSHUNTの平均CVは10%であり、STATでは21%であった。STATはいくつかの点の平均ではなく1回限りの測定であるので、より高いCVを予想した。重要なことに、検査結果の全範囲にわたってCVに有意な変化はなく、広範囲の疾患重症度で優れた再現性を示した。コール酸検査は再現性があることをデータは示す。
【０２９２】
クラス内相関は、全ての検査結果にわたって個体の変動性を測定する。ICCは0.9から0.94まで変動し、個体内変動性が非常に低いことを示す。これを整理すると、0.7〜0.8のICCは、検査間での強力な一致を示す。
【０２９３】
DSIは、静脈瘤または代償障害を有するPSC患者を同定した。
【０２９４】
図15は、DSC患者および健康な対照のコール酸検査結果のプロットを示す。門脈HFRはX軸に、全身HFRはY軸にプロットする。SHUNT、全身HFR対門脈HFRの比は、斜線で表す。DSIは、影付きの領域で示す-DSI=14のカットオフを有する右上の淡灰色ゾーンは、健康な対照のDSIを示し、DSI=18のカットオフを有する白色ゾーンは、軽度の疾患のDSIを示し、DSI=36のカットオフを有する中間灰色ゾーンは、中等度の疾患のDSIを示し、左下の暗灰色ゾーンは、最も重度の疾患のDSIを示す。PSC疾患、静脈瘤および代償障害のための予測的カットオフは、ゾーンの間の境界面に示す。
【０２９５】
静脈瘤または代償障害の危険がある患者を規定するためのコール酸カットオフの性能を、Table 16(表16)に示す。
【０２９６】
【表１６】
0006378194.tif 000017
【０２９７】
健康な対照では、DSIは10±3であった。PSCでは、DSIはPHTN(ROC c-統計値0.80)および静脈瘤(ROC c-統計値0.93)を有する患者を同定することができた。DSI≧18はPHTNを同定するのに最適であり(平衡精度82%)、静脈瘤を有する全ての患者を同定することもできた(100%の感度、70%の特異度、59%のPPV、100%のNPV)。このカットオフは、軽度と中等度の疾患の間の境界を印した。中等度と重度の疾患を分けるDSI≧36を有する全ての患者は、中間の静脈瘤を有していたか、静脈瘤出血を起こしており、75%は腹水を有していた。DSI<36を有する患者は、腹水または静脈瘤出血を有しなかった。
【０２９８】
DSIは、PSC疾患重症度を定量化する。図16に示すように、パネルAは、全てのPSC患者についてのDSIとMELDとの比較を示す。健康な対照のDSIも、参考のために示す。DSIは、PSC患者を対照から、臨床症状のないPSC患者を健康な対照および静脈瘤を有するPSC患者から分離する。DSIは、代償障害を発症した最も重い病気の患者を同定する。対照的に、これらの群のPSC患者の間で、MELDスコアにかなりの重複があった。MELDは、いかなる信頼度でもこれらの群を識別することができなかった。驚くべきことに、原発性硬化性胆管炎患者での疾患重症度の評価において、コール酸検査DSIはMELDに優っている。
【０２９９】
図16のパネルBおよびCは、リスト掲載患者-肝移植の順番待ちリストに載っている患者だけでの、MELDと比較したDSIを示す。
【０３００】
図16のパネルBは、およそ20のDSIが静脈瘤を有するPSC患者を静脈瘤のないPSC患者から明確に分離することを示す。
【０３０１】
図16のパネルCは、およそ35のDSIが代償障害を有するPSC患者を代償障害のない者から明確に分離することを示す。
【０３０２】
対照的に、図16のパネルBおよびCは、PSC患者のこれらの群の間でのMELDスコアの重複は、MELDが静脈瘤を有する患者または代償障害を有する患者をいかなる信頼度によっても識別することができなかったことを示すことを示す。
【０３０３】
この実施例は、特により低いMELDスコアを有する患者において、PSC疾患の重症度の評価および静脈瘤または代償障害の危険がある患者の同定で、DSIがMELDに優ることを示す。順番待ちリストに載っているPSC患者のために肝移植の優先順位を調整するために、DSIを使用することができた。
【０３０４】
図17は、1年の追跡調査の後に評価したPSC患者におけるDSIおよび疾患重症度の変化を示す。図17に示す通り、DSIの変化を患者の年齢に対してプロットした。連続的DSI測定は、疾患重症度のカテゴリーを規定した。遅いPSC進行の患者を左パネルに示し、ここでカットオフ=18はPHTNの指標である。中程度および速いPSC進行の患者を右パネルに示し、ここでDSIカットオフ=35は代償障害の指標である。
【０３０５】
(実施例12)
臨床合併症の危険がある原発性硬化性胆管炎の順番待ちリスト患者のコール酸検査および疾患重症度指数による同定
二重コール酸クリアランスおよびシャントに基づく疾患重症度指数(DSI)と比較して、MELDはリスト掲載PSC患者で臨床合併症の危険を評価することができないかもしれない。肝移植の順番待ちリストに載っている原発性硬化性胆管炎(PSC)患者の群において、疾患重症度の評価についてコール酸検査をMELDと比較した。
【０３０６】
実施例11に規定されるように、患者を検査した。実施例11に規定されるように、DSIを計算した。検査した43人のPSC患者のうち、10人はLTの順番待ちリストに掲載されていた。PSC患者を、20人の健康な対照と比較した。患者および健康な対照のコール酸検査値、DSIおよびMELDの比較を、Table 17(表17)に示す。
【０３０７】
【表１７】
0006378194.tif 000018
【０３０８】
Table 17(表17)は、SHUNT、門脈HFRおよびDSIは、PSC患者を健康な対照から、リスト掲載PSC患者を肝移植(LT)のリストに載っていないPSC患者から、静脈瘤を有するリスト掲載PSC患者を静脈瘤のない者から識別することができたことを示す。MELDは、静脈瘤を有する者を識別することができなかった。
【０３０９】
図18は、肝移植の順番待ちリストに載っているPSC患者のDSI対MELDスコアのプロットを示す。PSC患者での合併症の危険および肝移植の優先順位の評価において、DSIはMELDに優っていた。低いMELDスコアにもかかわらず、DSI>20を有するPSC患者は門脈圧亢進関連の合併症を発症し、DSI>40を有するPSC患者は肝移植を必要とした。
【０３１０】
(実施例13)
慢性C型肝炎患者での持続性ウイルス学的著効の後の機能的向上のコール酸検査および疾患重症度指数測定
進行した線維症または肝硬変を有する慢性HCV患者は、処置および治療するのが困難である。この研究の目的は、コール酸検査で測定した肝機能が、ペグインターフェロン/リバビリン(PEG/RBV)への持続性ウイルス学的著効(SVR)を予測することができるかどうか決定すること、およびSVRを達成する者において肝機能の向上を測定することであった。
【０３１１】
進行した線維症およびインターフェロンベースの処置による以前の処置の失敗で特徴付けられる、HALT-C試験に登録された230人の慢性HCV患者(Ishak F2〜6)をベースライン時に検査し、次にPEG/RBVで再処置した。持続性ウイルス学的著効SVRを達成した患者(n=32、5人の肝硬変患者を含む)および不応答者(NR)を、2年後に再検査した。
【０３１２】
ベースライン時と2年後に、HSAと混合した20mgの[24-13C]-コール酸の静脈内投与、およびジュース中の40mgの[2,2,4,4-2H]-コール酸の経口投与の同時二重投与によるコール酸検査を患者は受けた。コール酸投与の0、5、20、45、60および90分後に、血液試料をとった。血清試料はHPLC/MSによって分析し、クリアランス(IVおよびPO)、SHUNT、疾患重症度指数(DSI)は血清コール酸から計算した。実施例10に示す通り、DSIは、HALT-Cコホートでの第1の臨床転帰の予測に基づいて作成されたDSI式から計算した。
【０３１３】
図19のパネルAは、肝機能の四分位数と比較してSVRを達成した患者のグラフを示す。SVRの確率は、DSIと最も良好に相関した。
【０３１４】
Table 18(表18)に示すように、肝機能は、不応答者(NR、n=80)で低下し、SVR(n=23)で向上した。
【０３１５】
【表１８】
0006378194.tif 000019
【０３１６】
図19のパネルBは、PEG/RBV(ペグインターフェロン/リバビリン)による慢性HCV患者の再処置に続くSVR後の、肝機能の向上を示す。ベースラインから2年後に検査した際には、より重度のベースライン障害は、SVRの後のより大きな機能的向上になった。
【０３１７】
非侵襲的コール酸肝機能検査は、患者をPEG/RBVで再処置する場合のSVRを達成する確率を予測し、SVR後の機能の有意な向上を定量化する。SVR後の肝機能の向上は、より重度のベースライン障害を有した患者でより大きい。
【０３１８】
(実施例14)
疾患重症度指数式の作成
この研究の目的は、中間/大きな静脈瘤を有する慢性HCV患者および将来の臨床転帰の危険がある者の同定において、二重コール酸肝機能検査を線維症の組織学的ステージと比較することであった。
【０３１９】
HALTC試験に登録された慢性HCV患者(n=220)は、二重コール酸検査、肝生検、静脈瘤のための内視鏡的スクリーニングを受け、臨床転帰について4.9±2.2年の間追跡された。患者は、F2〜6のIshak線維症スコア、5または6のCTPスコアを有し、臨床合併症の前歴がなかった。中間か大きな食道静脈瘤が22人の患者で見出された。2点CTP進行、静脈瘤出血、腹水、肝性脳症、または肝臓関連死で規定される臨床転帰が、52人の患者で起こった。
【０３２０】
二重コール酸検査を実施した。簡潔には、経口投与されたコール酸-2,2,4,4-d4(40mg)は、特定の回腸胆汁酸塩輸送体によって門脈に取り込まれる。静脈内投与されたコール酸-24-13C(20mg)は、肝動脈を主に通して肝臓に入る。特定の肝胆汁酸塩輸送体は、門脈および全身の循環から二重コール酸を消去する。共投与の0、5、20、45、60および90分後に患者から末梢血液試料をとり、精度および精密度のFDAガイドラインに対して検証されたLCMS法によってアッセイした。SHUNT、門脈HFRおよび全身HFRを計算した。
【０３２１】
AUC c-統計値および最適カットオフはROC曲線から決定し、検査の性能は平衡精度およびヨーデン(Youden)指数(J)によって評価した。個々の検査の性能を、Table 19(表19)に示す。個々の検査は、転帰を予測する。
【０３２２】
【表１９】
0006378194.tif 000020
【０３２３】
Table 20(表20)に示すように、各検査およびその対数変換も危険回帰によって評価した。
【０３２４】
【表２０】
0006378194.tif 000021
【０３２５】
性能を向上させるために、最も高いカイ二乗値の検査を疾患重症度指数に組み合わせた。
【０３２６】
新特性空間に、最も高いカイ二乗値の検査、Loge門脈HFRを、2番目に優れたSHUNTに対してグラフで示した。最適な線形分類子は:
Y(SHUNT)=1.24X(Loge門脈HFR)-2.36
であり、それは構成要素重み付けおよびDSI2を規定した。
【０３２７】
DSI2=1.24 Loge門脈HFR-SHUNT
【０３２８】
【表２１】
0006378194.tif 000022
【０３２９】
DSI2は、個々の検査より向上した性能を有した。
【０３３０】
DSI2は、新特性空間にLoge全身HFRに対してグラフで示した。最適な線形分類子は:
Y(Loge全身HFR)=-0.623X(DSI2)+3.03
であり、第3の構成要素の重み付けおよびDSI3を規定する。
【０３３１】
DSI3=Loge全身HFR+0.623 DSI2
【０３３２】
【表２２】
0006378194.tif 000023
【０３３３】
DSI3は、DSI2よりも性能が向上した。
【０３３４】
予想される最良の肝機能をDSI=0に、最悪の肝機能をDSI=50にするように、DSI3を再配置し、定数を加えた。
DSI=5.34SHUNT-6.65Loge門脈HFR-8.57Loge全身HFR+44.66
【０３３５】
DSI式は、中間/大きな静脈瘤を有する患者を同定する。具体的には、DSI式を用いて、DSI>19は中間から大きな静脈瘤の危険が高いことを示し、10〜19のDSIは、中間/大きな静脈瘤の危険が低いことの指標であり、0〜10のDSIは、健康な肝機能の指標である。
【０３３６】
DSI式は、患者の将来の臨床転帰を予測する。具体的には、DSI式を用いて、DSI>19は臨床転帰の危険が高いことを示し、10〜19のDSIは、臨床転帰の危険が低いことの指標であり、0〜10のDSIは、健康な肝機能の指標である。
【０３３７】
DSIと生検での線維症ステージの比較を、Table 23(表23)およびTable 24(表24)に示す。
【０３３８】
【表２３】
0006378194.tif 000024
【０３３９】
【表２４】
0006378194.tif 000025
【０３４０】
Table 23(表23)およびTable 24 (表24)に示すように、将来の臨床転帰を同定するための全ての性能測定で、DSIは、生検時の組織学的線維症ステージより優れている。
【図１】
0006378194.tif 000026
【図２】
0006378194.tif 000027
【図３】
0006378194.tif 000028
【図４】
0006378194.tif 000029
【図５】
0006378194.tif 000030
【図６】
0006378194.tif 000031
【図７】
0006378194.tif 000032
【図８】
0006378194.tif 000033
【図９】
0006378194.tif 000034
【図１０】
0006378194.tif 000035
【図１１】
0006378194.tif 000036
【図１２】
0006378194.tif 000037
【図１３】
0006378194.tif 000038
【図１４】
0006378194.tif 000039
【図１５】
0006378194.tif 000040
【図１６】
0006378194.tif 000041
【図１７】
0006378194.tif 000042
【図１８】
0006378194.tif 000043
【図１９】
0006378194.tif 000044