(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）デングウイルス（ＤＶ）のカプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９を含む少なくとも１種の抗原と、ｂ）配列番号１と識別されるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
前記カプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９を含む組換え抗原が、配列番号５（抗原ＤＩＩＩＣ−１）、配列番号６（抗原ＤＩＩＩＣ−２）、配列番号７（抗原ＤＩＩＩＣ−３）、及び配列番号８（抗原ＤＩＩＩＣ−４）からなる群から選択されるキメラ抗原である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される２種のキメラ抗原を含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８と識別される４種のキメラ抗原を含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
配列番号１と識別される配列を特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ＤＶのカプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９を含むワクチン抗原に対する免疫応答を増大させるための医薬の製造のための、配列番号１と識別される核酸の使用。
【請求項７】
前記ＤＶのカプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９を含む組換え抗原が、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるキメラ抗原である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ａ）ＤＶのカプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９を含む少なくとも１種の抗原と、ｂ）配列番号１と識別されるオリゴヌクレオチドとを含むワクチン組成物の、ＤＶに対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための使用。
【請求項９】
前記カプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９を含む組換え抗原が、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ抗原である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８と識別されるキメラ抗原を二価組成物の形態で逐次的に投与する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８と識別される４種のキメラ抗原を含む四価組成物の追加刺激用量をさらに投与する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ａ）ＤＶのカプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９を含む少なくとも１種の抗原と、ｂ）配列番号１と識別されるオリゴヌクレオチドとを含むワクチン組成物を、皮下経路、皮内経路又は筋肉内経路によって投与する、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー及び医薬品産業の分野、特に規定された配列を有する組換えタンパク質抗原及びオリゴヌクレオチドに基づいてデングウイルス（ＤＶ）に対するワクチン製剤を得ることに関する。
【背景技術】
【０００２】
デング熱は、節足動物によって伝染するウイルス性疾患であり、最も広範にヒト集団に影響を及ぼしている。毎年５０，０００，０００〜１００，０００，０００件のデングの症例が報告されており、そのうちの５００，０００件がデング出血熱として知られる当該疾患の最も重症型に至る（Ｇｕｚｍａｎら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００２年；２巻：３３〜４２頁）。この疾患の病因は、フラビウイルス科フラビウイルス属に属するＤＶである。ＤＶは、４種の血清型を含むウイルス複合体である。ＤＶは、エンベロープを有するウイルスであり、その脂質膜は、その３種の構造タンパク質のうちの２種：エンベロープタンパク質及び膜タンパク質を含有する。このリポタンパク質エンベロープが、それらの構造タンパク質の３つ目であるカプシドタンパク質で構成される正二十面体のヌクレオカプシドを取り囲んでいる（Ｌｅｙｓｓｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０００年；１３巻：６７〜８２頁）。
【０００３】
ここ数十年の間に、これらのウイルスによる感染症の世界的蔓延により、公衆衛生の優先事項である有効なワクチンの開発が行われてきた。この目的は、いくつかの要因によって限定されている。まず第１に、１種の血清型による感染では残りの血清型に対する持続的な交差防御が誘導されず（Ｌｅｙｓｓｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０００年；１３巻：６７〜８２頁）、同時に、異種への二次感染（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が、疾患の重症型の発生に関する主要な危険要因である（Ｇｕｚｍａｎら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００２年；２巻：３３〜４２頁；Ｍｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３年；９巻：９２１〜９２７頁）。したがって、ＤＶに対する理想的なワクチンは、４種のウイルス血清型（ＤＶ１、ＤＶ２、ＤＶ３及びＤＶ４）に対する持続的な防御免疫を誘導すべきである。
【０００４】
最先端のワクチン候補は、細胞培養における連続継代によって弱毒化したウイルス株に基づくもの、又は組換え法によって得たものである。この種類の候補に関して４種の血清型に対する同等の機能免疫応答の誘導を難しくしている主要な限定は、四価製剤における４種の血清型間のウイルス干渉である。さらに、これらの候補は、計画された２回又は３回のワクチン投薬間に長い間隔を開けて投与する必要がある（Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２０００年；１８巻：４４〜４７頁；Ｋａｎｅｓａ−Ｔｈａｓａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２００１年；１９巻：３１７９〜３１８８頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０１０年；２０１巻：３７０〜３７７頁）。さらに、それらの生ウイルスとしての性質に起因して、１歳未満の小児には投与できない。
【０００５】
魅力的な代替物として、サブユニットワクチンに基づく一連の前臨床試験が行われてきた。この手法には、弱毒生ウイルスを用いたワクチン接種と比較して、１）これらは潜在的に安全なワクチンであること、２）免疫原の非複製性に起因してウイルス干渉の現象が起こらないと予想されること、及び３）追加刺激効果を実現するためにワクチン投薬間に長い間隔を必要とする弱毒生ウイルスの投与にとは逆に、短いワクチン接種スキームを計画できるという３つの重要な利点がある。
【０００６】
最も有望なサブユニットワクチン候補の１つはＨａｗａｉｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｍｅｒｃｋ社により開発されたものである（Ｈｏｍｂａｃｈ、Ｒｅｖ．Ｐａｎａｍ．Ｓａｌｕｄ  Ｐｕｂｌｉｃａ．２００７年；２１巻：２５４〜２６０頁）。これは、昆虫細胞で発現させた４種の血清型由来の各ウイルスエンベロープタンパク質によって形成される候補である。一価製剤及び四価製剤がマウス及びサルにおいて評価されており、弱毒化ウイルスを用いて得られるものと同様の免疫原性結果が得られている（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１０年；２８巻：２７０５〜２７１５頁）。しかしながら一価製剤では、適切な免疫応答を誘導するにはヒトへの使用が認可されていない強力なアジュバントの添加が必要であった。同様に、非ヒト霊長類で評価された四価製剤は、非認可アジュバントだけでなく、ヒト内皮細胞に対していくらかの相同性を有するために自己免疫障害を惹起し得るＤＶ２由来のタンパク質ＮＳ１も含有していた。さらに、このワクチン候補を投与した際の、デングに対する防御的役割を有すると最近確認された免疫の重要な武器である細胞媒介性免疫の誘導に関する入手可能なデータが存在しない（Ｇｉｌら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年；２２巻：２３〜３０頁；Ｙａｕｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年；１８２巻：４８６５〜４８７３頁；Ｙａｕｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０年；１８５巻：５４０５〜５４１６頁）。
【０００７】
キューバの研究者のグループは、サブユニットワクチンに関連する利点を維持しつつ、同時にベースのアジュバントとしてアラムを含有する安全な免疫原性製剤を探すことにより、デングウイルスのカプシドタンパク質及びエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩに基づく実用的な系統を開発した（Ｇｕｚｍａｎら、Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１０年；９巻：１３７〜１４７頁）。
【０００８】
ＤＶ由来のカプシドタンパク質はビリオンの組立てに必須であり、また、ウイルスのゲノムの主要な機能を保護する。その分子量は９〜１２ｋＤａ（１１２〜１２７アミノ酸）であり、そのアミノ酸の２５％がアルギニン及びリシンであるので基本的な構造を有する。このタンパク質は、ビリオン構造内に位置し、露出した領域は伴わず（Ｋｕｈｎら、Ｃｅｌｌ．２００２年；１０８巻：７１７〜７２５頁）、これにより、免疫促進抗体の標的にならない可能性があるので、ワクチンに含めるのに魅力的なものになる。他方では、ウイルスに対する有効な細胞媒介性免疫の誘導をもたらす種々のヒトＣＴＬエピトープがその配列上で同定されている（Ｇａｇｎｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６年；７０巻：１４１〜１４７頁；Ｇａｇｎｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９年；７３巻：３６２３〜３６２９頁）。
【０００９】
このカプシドタンパク質の構造特性に関していくつかの試験が行われてきたが、マウスにおける免疫原性に関して初めて評価されたのは２００７年である。この試験では、ＤＶ２由来のカプシドがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて組換えタンパク質として得られた。半精製プロセスが行われた際に得られた調製物がマウスにおいて評価され、ＤＶ２による攻撃後に中和抗体の誘導を伴わない部分的な防御が得られた。（Ｌａｚｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２００７年；２５巻：１０６４〜１０７０頁）。その後に、実験室規模の精製及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝集プロセスが確立され、さらに得られたタンパク質は、防御に関するその機能性を測定するためにマウスにおいて評価された（Ｌｏｐｅｚら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．２００９年；１５４巻：６９５〜６９８頁）。免疫原性の分析により、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の分泌によって測定された、凝集タンパク質を受けたマウスの脾細胞による細胞媒介性免疫の誘導が明らかになった。そのような分泌はＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞に依存していた。同様に、ＤＶ２を用いて攻撃すると、凝集タンパク質を用いて免疫した動物において有意な防御が得られ、そのような防御もＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞に依存した（Ｇｉｌら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年；２１巻：１１７５〜１１８３頁）。上述の結果に基づいて、同じ遺伝子構築物内に、どちらもＤＶ２由来のカプシドタンパク質とエンベロープタンパク質のＤｏｍＩＩＩ領域を組み合わせることが計画された。ＤｏｍＩＩＩは１つの受容体結合性領域として広範に記載されており（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６年；７０巻：８７６５〜８７７２頁）、さらに、このウイルス領域を含有する融合タンパク質を用いて免疫したマウスにおける中和抗体の誘導及び防御が報告されている（Ｃｒｉｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１年；７５巻：７７６９〜７７７３頁；Ｈｅｒｍｉｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４年；１１５巻：４１〜４９頁；Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．２００１年；６５巻：１５９〜１６１頁）。同様に、非ヒト霊長類での実験において、フロイントアジュバントのみを使用した防御免疫応答の誘導が実証されている（Ｈｅｒｍｉｄａら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２００６年；２４巻：３１６５〜３１７１頁）。
【００１０】
ウイルスカプシドとウイルスエンベロープタンパク質のＤｏｍＩＩＩＩとを合わせることにより、中和抗体（ＤｏｍＩＩＩ）と細胞性免疫応答（カプシド）とを同時に誘導できる潜在的に防御的な２つの領域を同じ分子内に存在させることが可能になる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させたＤＩＩＩＣ−２（カプシドタンパク質のＮ末端領域と融合したＤｏｍＩＩＩ、血清型２）と称される遺伝子構築物が得られ、生じたタンパク質を実験室規模で精製し、配列不明のオリゴヌクレオチドの混合物を用いて凝集させるプロセスを行った。マウスに３回接種したところで抗ウイルス抗体及び中和抗体が検出された。同様に、凝集タンパク質を用いて免疫した動物由来の脾細胞において有意なＩＦＮ−γ分泌が検出された。細胞媒介性免疫と一貫して、頭蓋内攻撃の際の有意な防御が得られ、そのような防御は、免疫プロセスの間に誘導されるＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞によって媒介された（Ｖａｌｄｅｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００９年；３９４巻：２４９〜２５８頁）。総合すると、上述の結果により、その後の非ヒト霊長類における試験のために凝集した形態のＤＩＩＩＣ−２を選択することが可能になる。ＤＩＩＩＣ２の追加刺激能を知ることを主要な目的として、ＤＶ２を予め感染させた動物を使用して非ヒト霊長類における最初の試験を実現した。予測通り、ＤＩＩＩ−Ｃ２を投与した後、ウイルス感染の３ヶ月後に動物において同種のウイルスに対する高レベルの抗ウイルス抗体及び中和抗体が発生し、これにより、組換えタンパク質内に機能的エピトープが存在することが示される（Ｖａｌｄｅｓら、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１年；１８巻：４５５〜４５９頁）。
【００１１】
本発明の背景として、オリゴデオキシヌクレオチドを添加してタンパク質ＤＩＩＩＣ−２の凝集改変型を形成することがマウスにおける同種のウイルスに対する細胞媒介性免疫及び防御に有利であることが公知である（Ｖａｌｄｅｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００９年；３９４巻：２４９〜２５８頁）。それでもなお配列が誘導される免疫応答の質に影響するかどうかは不明であった。
【００１２】
前述の要素によると、４種の血清型に対する安全且つ有効な免疫応答を誘導できるＤＶに対するワクチンの開発は未解決の問題である。本発明は、まさにこの目的を対象とする。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、上述の問題を解決し、ａ）ＤＶのカプシドタンパク質の配列の少なくとも５０％を含む少なくとも１種の抗原と、ｂ）配列番号１と識別されるオリゴデオキシヌクレオチドとを含むワクチン組成物を提供する。本発明の一実施形態では、ワクチン組成物は、ＤＶのカプシドタンパク質の配列の少なくとも５０％を含む抗原が、そのような抗原のアミノ酸１〜９９を含む組換え抗原であることを特徴とする。本発明の一実施形態では、ワクチン組成物は、カプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９と、ウイルスエンベロープタンパク質のＤｏｍＩＩＩ領域のアミノ酸２８６〜４２６とを含むキメラ抗原を含む。特定の一実施形態では、前記組換え抗原は、配列番号５（抗原ＤＩＩＩＣ−１）、配列番号６（抗原ＤＩＩＩＣ−２）、配列番号７（抗原ＤＩＩＩＣ−３）及び配列番号８（抗原ＤＩＩＩＣ−４）で構成される群の中から選択される。
【００１４】
タンパク質凝集のために使用するオリゴヌクレオチドがより良好な免疫応答の誘導に影響を及ぼすかどうかを実証するために、血清型２の組成物をモデルとして選択した。タンパク質ＤＩＩＩＣ−２（ＤＶ２由来のウイルスエンベロープタンパク質のＤｏｍＩＩＩとカプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９とを含むキメラ抗原）を、当技術分野で記載されている配列が分かっている種々のオリゴヌクレオチドの存在下で沈殿させた。これらのオリゴヌクレオチドのいくつかはアジュバント能を有することが公知である（Ｋｌｉｎｍａｎ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年；２５巻：１〜２０頁；Ｖｏｌｌｍｅｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年；２５巻：１２５〜１３４頁）。記載されているオリゴヌクレオチドのうちの２つの融合によって形成した新しいオリゴヌクレオチドをこの試験にさらに含めた（Ｋｒｕｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年；３１巻：２１５４〜２１６３頁；Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年；１６６巻：２３７２〜２３７７頁）。マウスにおいて評価した際に、本発明者らは、ＩＦＮ−γ分泌によって測定された通り、新しいオリゴヌクレオチド（配列番号１）が最良の細胞媒介性免疫に有利であることを実証し、したがって、同種のウイルスを用いたマウス脳炎モデルを使用した防御アッセイを実施するためにこれを選抜した。結果として、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含有し、アラムでアジュバント添加したＤＩＩＩＣ−２製剤により、生存のパーセンテージ及び脳におけるウイルス力価によって測定される強力な防御免疫応答が引き出された。
【００１５】
したがって、本発明において、適切な細胞性免疫応答の誘導、したがって、組換えタンパク質の防御能にはオリゴヌクレオチドの性質が極めて重要であることが初めて実証された。いくつかのオリゴヌクレオチドが試されたが、それらのうちの１つ、配列番号１と識別される配列を有するオリゴヌクレオチドのみが、細胞性免疫応答及び防御の誘導に関して最良であることが分かった。構造内においてＣｐＧモチーフ含有又は非含有の、リン酸ジエステル結合を有し、配列が異なるいくつかの合成オリゴヌクレオチドを試験した。この最後の要素は、文献に記載されている免疫増強活性を有するオリゴヌクレオチドとは異なっており、なぜならこれらのオリゴヌクレオチドの合成に使用される連結は、エキソヌクレアーゼによる分解から保護するためにホスホロチオエート型の連結になっているためである。さらに、１９塩基、２０塩基及び３９塩基などのいくつかのサイズを試験した。この最後の３９塩基のオリゴヌクレオチドは、配列内の所定位置にいくつものＣｐＧモチーフを含有しており、当技術分野において免疫増強活性を有するオリゴヌクレオチドに関して説明された分類の範囲内には含められない。
【００１６】
他方では、全ての場合において、これらの分子は組換え抗原の凝集のために使用されたことから、これらの分子の最小量が加えられた。これは、免疫系の刺激物質として使用されるオリゴヌクレオチドとは異なる別の要素を構成するものであり、なぜならこのようなオリゴヌクレオチドは、その機能を促進するためにはこれらの分子を大量に必要とするためである（Ｒｉｅｄｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年；１６８巻：４９５１〜４９５９頁）。
【００１７】
上記の通り、マウスにおける免疫学的評価の際に、本発明者らは、予想外に、配列番号１と識別される配列を有するオリゴヌクレオチドにより、組換えタンパク質ＤＩＩＩＣ−２によって誘導される細胞性防御免疫応答が、使用したオリゴヌクレオチドの残りと比較して示差的に有意に増強されることを示した。
【００１８】
次いで、非ヒト霊長類ではデングに対して陰性であるという概念を証明した。動物に、配列番号１のオリゴヌクレオチドを伴い、アラムでアジュバント添加した凝集ＤＩＩＩＣ−２製剤を４回投薬した。さらに動物の別の群を試験に導入し、それらには、予め配列番号１のオリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートしてヌクレオカプシド様粒子（ＮＬＰｓ−２）を形成させた、ＤＶ２由来のカプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９を含む組換え抗原を与えた。
【００１９】
ＤＶ２の異なる株及び異なる細胞系を使用した中和試験により、抗ウイルス抗体及び抗タンパク質抗体の応答を決定し、加えてこの応答の機能性も決定した。他方では、細胞媒介性免疫についても、感染性ＤＶ２を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した後にＩＦＮ−γ分泌を決定することによって評価した。その後、ＤＶ２を用いて動物を攻撃し、血液中のウイルスの存在を決定した。結果として、タンパク質により、サルにおけるウイルスを用いた攻撃の前後に、６つの異なる系によって測定された通り強健な中和活性を有する抗体応答が誘導されただけでなく（１００％セロコンバージョン）、ＩＦＮ−γ分泌によって媒介される適切な細胞媒介性免疫も誘導された。攻撃後のいずれの日にも、免疫した動物３匹のうち２匹でウイルスが単離されず、また、３匹目の動物では１日のみ１ミリリットル当たり１０プラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）未満のウイルス血症値が示されたことから、免疫原性の結果と一致して、ワクチン接種された動物は、ウイルスによる攻撃に対して有意に防御された。
【００２０】
以前はデングに対して陰性の非ヒト霊長類でなされたこの試験は、ウイルスカプシドＤＶの領域を含有する組換えタンパク質の防御力に関する最初の試験である。この発見から、血清型１、３及び４に対応する得られた他のキメラタンパク質に対する同条件を推測することが可能になる。
【００２１】
次に、血清型１、３及び４に対応する組換えタンパク質を設計し、それを得て、それぞれＤＩＩＩＣ−１、ＤＩＩＩＣ−３及びＤＩＩＩＣ−４と名付けた。全ての分子が、Ｅ．ｃｏｌｉから適切な発現のパーセンテージで得られた。同様にこれらを精製し、これらは、同類の血清型に対して特異的なマウスポリクローナル抗体によって認識された。
さらに、各タンパク質におけるジスルフィド結合の正しい形成が、質量分析によって決定され（ＤＩＩＩＣ−１ ＤＩＩＩＣ−２、ＤＩＩＩＣ−３及びＤＩＩＩＣ−４について）、さらにＤｏｍＩＩＩ鎖内ジスルフィド結合のシステインが還元カルボキシメチル化されたときのマウスポリクローナル血清に対する認識の喪失によって決定された（ＤＩＩＩＣ−１、ＤＩＩＩＣ−２及びＤＩＩＩＣ−４について）。
【００２２】
本発明に含まれる試験では、初めて記載されたこれらの血清型（１、３及び４）のキメラタンパク質ＤＩＩＩＣにより、マウスにおいて同類の血清型に対する機能性防御免疫応答も誘導されることが実証された。さらに、配列番号１のオリゴヌクレオチドと一緒に予め製剤化し、アラムでアジュバント添加した４種のキメラタンパク質の混合物により、マウスにおいて、４種の血清型全てに対して、細胞性及び体液性の、且つ防御的な応答が抗原の競合を伴わずに誘導されることも見出された。
【００２３】
４種のキメラタンパク質ＤＩＩＩＣ−１、ＤＩＩＩＣ−２、ＤＩＩＩＣ−３及びＤＩＩＩＣ−４を、配列番号１のオリゴヌクレオチドの添加により凝集させて、次いで、マウスでさらに評価するためにこれらにアラムでアジュバント添加した。３回投薬した後、免疫した動物の１００％で、４種の血清型全てに対する抗ウイルス抗体の存在を検出することが可能であった。同様に、これらのマウスの血清において４種の血清型に対して測定された中和活性が検出された。この結果と一致して、ウイルス血清型１及び４を用いた頭蓋内攻撃を実施すると、どちらの場合でも有意な防御が得られ、したがって、マウスにおいて評価した一価製剤及び四価製剤の機能性の概念実証が示された。
【００２４】
四価製剤により、サルにおける体液性及び細胞性の両方の機能免疫応答を誘導することもできた。この製剤の免疫原性を評価するために、デング陰性非ヒト霊長類において第２の試験を行った。動物に、試験群に応じて種々の経路によって四価製剤を３回投薬し、最後の投薬の１ヶ月後に、誘導された体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を決定した。結果として、サルの１００％でウイルス血清型の全てに対して中和抗体の抗ウイルス免疫応答が誘導されたことが見出された。また、細胞性免疫応答試験により、試験した全ての動物において陽性反応の誘導が明らかになった。
【００２５】
全体として、この研究により、配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する４種の凝集タンパク質ＤＩＩＩＣ、ＤＶの４種の血清型全てに対する防御力が実証される。
【００２６】
本発明はまた、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される２種のキメラ抗原を含むことを特徴とするワクチン組成物も含む。本発明の別の目的は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８と識別される４種のキメラ抗原を含むことを特徴とするワクチン組成物である。
【００２７】
別の態様では、本発明は、配列番号１と識別される配列を特徴とする核酸を提供する。本発明において十分に示されている通り、前記核酸は、ＤＶのカプシドタンパク質の配列の少なくとも５０％を含むワクチン抗原に対する免疫応答を増大させるために有用である。本発明の一実施形態では、ＤＶのカプシドタンパク質のアミノ酸１〜９９を含む組換え抗原に対する免疫応答を増大させるための、配列番号１と識別される核酸の使用が実証される。特定の実施形態では、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８と識別されるキメラ抗原に対する免疫応答を増大させるための、配列番号１と識別される核酸の使用が開示されている。
【００２８】
さらに、ａ）ＤＶのカプシドタンパク質の配列の少なくとも５０％を含む少なくとも１種の抗原と、ｂ）配列番号１と識別されるオリゴヌクレオチドとを含むワクチン組成物を対象に投与することを特徴とする、ＤＶに対する免疫応答を誘導する方法は本発明の目的である。一態様では、本発明は、前記タンパク質のアミノ酸１〜９９を含む組換え抗原を含む組成物を特徴とする、ＤＶに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。前記方法の一実施形態では、組換え抗原は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するキメラ抗原である。
【００２９】
本発明では、マウスにおいて免疫スケジュールにおける各ＤＩＩＩＣタンパク質の総用量を減少させることを目的とした試験を行った。このために、２種の異なる二価製剤を逐次的に投与し、第３の追加刺激投薬を行った。結果として、４種のウイルス血清型のいずれかにおいても試験群間で統計的有意差は見出されず、これにより、ＤＩＩＩＣの二価製剤を逐次的に投与し、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含む四価製剤を用いて追加刺激することにより、配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する四価製剤ＤＩＩＩＣを３回投薬することと同じレベルの免疫原性を得ることが可能であることが示される。したがって、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８と識別されるキメラ抗原を含むワクチン組成物を二価組成物の形態で逐次的に投与する、ＤＶに対する免疫応答を誘導する方法も本発明の目的である。本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８と識別される４種のキメラ抗原の四価組成物を含む追加刺激組成物をさらに投与する方法も提供する。
【００３０】
実施例において示されているように、ＤＶのカプシドタンパク質の配列の少なくとも５０％を含む少なくとも１種の抗原と、配列番号１と識別されるオリゴヌクレオチドとを含む組成物は、種々の経路により免疫原性であり、したがって、本発明の方法では、ワクチン組成物を、「最先端の技術」の当業者に周知の経路、例えば皮下経路、皮内経路又は筋肉内経路によって投与する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】免疫した動物における抗ウイルス抗体応答を示すグラフである。Ｙ軸では、抗ＤＶ２対数力価がプロットされており、Ｘ軸は製剤ＤＩＩＩＣ−２の異なる改変型を受けた動物の群である。ウイルスを抗原として使用した増幅捕捉ＥＬＩＳＡを使用して力価を決定した。クラスカル・ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）及びダン事後検定（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔ  ａ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｉ）を使用した多重比較を使用した統計解析を実施した。異なる文字は群間の統計的有意差を示す。データは、平均±標準偏差として示されている。
【図２】ＤＶ２又は陰性対照調製物（ｍｏｃｋ）と一緒に培養したＤＩＩＩＣ−２の異なる製剤を用いて免疫したマウス由来の脾細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した後、ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。Ｙ軸には、ＩＦＮ−γの濃度（ｐｇ／ｍＬ）が示されている。Ｘ軸には、ＤＩＩＩＣ−２の異なる製剤を受けた群が示されている。各点のセットの上のパーセンテージは、応答者のパーセンテージを示す。破線は、それを超えると陽性反応とみなされる値を示す。単一分類ＡＮＯＶＡを使用して統計解析を実施し、チューキー検定によって群間の多重比較を実施した。異なる文字は群間の統計的有意差を示す。データは、平均±標準偏差として示されている（ｎ＝８）。
【図３】ＤＶ２に対する防御アッセイを示すグラフである。Ａ．致死株ＤＶ２を用いて頭蓋内攻撃した後の免疫したマウスについての生存曲線である。Ｙ軸は生存のパーセンテージを示し、Ｘ軸は頭蓋内攻撃後の観察時間を示す。Ｂ．攻撃後７日目に感染脳から測定されたＶＥＲＯ細胞のウイルスの数量化を示す。Ｙ軸は感染マウスの脳ホモジネート由来のＶＥＲＯ細胞におけるプラーク形成後に得られた１ｍＬ当たりのｐｆｕ数を示す。Ｘ軸は試験群を示す。生存曲線については、ログランク生存検定に従って統計解析を実施した。異なる文字は群間の統計的有意差を示す。データは、２つの独立した実験（ｎ＝１０）を表す。ウイルス負荷量については、クラスカル・ワリス及びダン事後検定を使用した多重比較を使用して統計解析を実施した。異なる文字は群間の統計学的差を示す。データは、平均±標準偏差として示されている（ｎ＝５）。破線は１００ｐｆｕ／ｍＬを示す。
【図４】サルにおいて生じ、ＥＬＩＳＡによって測定された抗ＤＩＩＩＣ−２抗体の反応速度論を示すグラフである。Ｙ軸は対数力価を示し、Ｘ軸はアッセイの間の時間を日数で示す。黒い矢印は各免疫の時間を示す。
【図５】捕捉ＥＬＩＳＡによって測定された、プラセボ（Ａ）、凝集タンパク質ＤＩＩＩＣ−２（Ｂ）又はＮＬＰｓ−２（Ｃ）を用いて免疫したサルにおける抗ＤＶ抗体の反応速度論を示すグラフである。Ｙ軸はｌｏｇ１／力価を示し、Ｘ軸はアッセイの間の時間を日数で示す。黒い矢印は各免疫の時間を示し、破線の矢印は、ウイルスによる攻撃を行った日を示す。
【図６】プラセボ調製物又はＤＩＩＩＣ−２タンパク質を受けたサル由来の末梢血単核細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した後にＥＬＩＳＡによって測定されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。Ｙ軸にはＩＦＮ−γの濃度（ｐｇ／ｍＬ）が示されており、Ｘ軸にはアッセイの時間が示されている。免疫したサル由来のＰＢＭＣをＤＶ２又は陰性対照調製物（ｍｏｃｋ）と一緒に培養した。データは、平均±標準偏差として示されている（ｎ＝３）。破線は、それを超えると陽性反応とみなされる値を示す。
【図７】ＶＥＲＯ細胞における直接プラーク形成によって測定された、プラセボ製剤（Ａ）、凝集タンパク質ＤＩＩＩＣ−２（Ｂ）又はＮＬＰｓ−２（Ｃ）を用いて免疫したサルの血清中のウイルス負荷量を示すグラフである。右側の軸はサル２、５及び９（破線）において検出された負荷量に対応する。左側の軸は残りの動物において検出された負荷量に対応する。Ｘ軸上には、攻撃後の時間（日数）が示されている。
【図８】遺伝子構築物ｐＤＩＩＩＣ−１、ｐＤＩＩＩＣ−２、ｐＤＩＩＩＣ−３及びｐＤＩＩＩＣ−４を得るためのクローニング戦略を示す図である。
【図９】ＥＬＩＳＡによって決定された、還元条件下及び非還元条件下での、同類の血清型に対して高い中和力価を有するマウスポリクローナル抗体によるキメラタンパク質ＤＩＩＩＣの認識レベルを示すグラフである。Ｙ軸には吸収値がプロットされており、Ｘ軸は試験したタンパク質を示す。
【図１０】最後の免疫の１５日後に測定した、免疫した動物における抗ウイルス抗体応答を示すグラフである。Ｙ軸には抗ＤＶ対数力価が示され、Ｘ軸は各製剤を受けた動物の群を示す。（Ａ）抗ＤＶ１抗体応答；（Ｂ）抗ＤＶ２抗体応答；（Ｃ）抗ＤＶ３抗体応答及び（Ｄ）抗ＤＶ４抗体応答。各ウイルスを抗原として使用した増幅捕捉ＥＬＩＳＡを使用して力価を決定した。クラスカル・ワリス及びダン事後検定を使用した多重比較を使用して統計解析を実施した。異なる文字は群間の統計的有意差を示す。データは、平均±標準偏差として示されている（ｎ＝１０）。
【図１１】一価製剤ＤＩＩＩＣ及び四価製剤ＤＩＩＩＣ（配列番号１のオリゴヌクレオチドを含む）又はプラセボ製剤を用いて免疫し、各タンパク質ＤＩＩＩＣを用いて刺激したマウス由来の脾細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した後にＥＬＩＳＡによって測定されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。Ｙ軸にはＩＦＮ−γの濃度（ｐｇ／ｍＬ）が示されている。Ｘ軸上には試験群が示されている。データは、平均±標準偏差として示されている。
【図１２】致死株ＤＶ１を用いて頭蓋内攻撃した後（Ａ）及びＤＶ４を用いて頭蓋内攻撃した後（Ｂ）の、免疫したマウスの生存曲線を示すグラフである。Ｙ軸は生存のパーセンテージを示し、Ｘ軸は頭蓋内攻撃後の観察時間を示す。ログランク生存検定に従って統計解析を実施した。異なる文字は群間の統計的有意差を示す。データは、２つの独立した実験（ｎ＝９）を表す。
【図１３】非ヒト霊長類における、皮下（ＳＣ）投与経路、皮内（ＩＤ）投与経路及び筋肉内（ＩＭ）投与経路を使用して配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する四価製剤ＤＩＩＩＣを３回投薬した後の捕捉ＥＬＩＳＡによって決定されたＤＶの４種の血清型全てに対する抗ウイルス抗体応答を示すグラフである。Ｙ軸は抗ＤＶ対数力価を示し、Ｘ軸は動物の群を示す。
【図１４】非ヒト霊長類における、配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する四価製剤ＤＩＩＩＣを３回投薬した後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで組換えタンパク質ＤＩＩＩＣを用いて刺激した末梢血リンパ球由来のＩＦＮ−γを産生する細胞の発生頻度を示すグラフである。Ｙ軸には、ＩＦＮ−γを産生する細胞の発生頻度が１ｍＬ当たりのスポット数で表されている。Ｘ軸上には、動物群が示されている。
【図１５】最後の免疫の１５日後に測定した、免疫した動物における抗ウイルス抗体応答を示すグラフである。Ｙ軸には抗ＤＶ対数力価が示され、Ｘ軸には各製剤を受けた動物の群が示されている。（Ａ）抗ＤＶ１抗体応答；（Ｂ）抗ＤＶ２抗体応答；（Ｃ）抗ＤＶ３抗体応答及び（Ｄ）抗ＤＶ４抗体応答。各ウイルスを抗原として使用した増幅捕捉ＥＬＩＳＡを使用して力価を決定した。クラスカル・ワリス及びダン事後検定を使用した多重比較を使用して統計解析を実施した。異なる文字は群間の統計学的差を示す。データは、平均±標準偏差として示されている（ｎ＝１０）。
【図１６】免疫したマウス由来の脾細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、各タンパク質ＤＩＩＩＣを用いて刺激した後の、ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。Ｙ軸にはＩＦＮ−γの濃度（ｐｇ／ｍＬ）が示されている。Ｘ軸上には試験群が示されている。データは、平均±標準偏差として示されている（ｎ＝５）。
【実施例】
【００３２】
（実施形態の詳細な説明／実施例）
（例１）
配列が規定された異なるオリゴヌクレオチドを有する凝集タンパク質ＤＩＩＩＣ−２のマウスにおける免疫原性の評価
マウスにおける、タンパク質の凝集のためにランダムに選択した配列不明のおよそ５０ｂのオリゴヌクレオチドの混合物を使用したＤＩＩＩＣ−２タンパク質を用いた概念実証に基づいて（Ｖａｌｄｅｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００９年；３９４巻：２４９〜２５８頁）、規定された配列の種々のオリゴヌクレオチドを試験した。オリゴヌクレオチドのアジュバント能に関する文献での報告に反して、本試験で試験したものは、リン酸ジエステル結合によってのみ構成される。文献で定義されているアジュバント活性を発揮するオリゴヌクレオチドに分類されない２つの３９塩基のオリゴヌクレオチドも用いられた。
【００３３】
試験したオリゴヌクレオチドは、以下の通りであった：
オリゴヌクレオチドＫ３（配列番号２）：ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ、２０ｍｅｒ（ヒト及びサルのＣｐＧモチーフを含有する。リン酸ジエステル結合の骨格）
オリゴヌクレオチド２２１６（配列番号３）：ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧ、１９ｍｅｒ（マウス及びサルのＣｐＧモチーフを含有する。リン酸ジエステル結合の骨格）
混合オリゴヌクレオチド（配列番号１）：ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧ、３９ｍｅｒ（オリゴヌクレオチドＫ３及び２２１６の配列を含有する、リン酸ジエステル結合の骨格）
オリゴヌクレオチドＯｒｉＣ（配列番号４）：ＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧ、３９ｍｅｒ（リン酸ジエステル結合の骨格）
ＲＮＡのポリＩ：Ｃ骨格：ＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣ、２６ｍｅｒ（リン酸ジエステル結合の骨格）
ＤＮＡのポリＩ：Ｃ骨格：ＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣＩＣ、２６ｍｅｒ（リン酸ジエステル結合の骨格）。
【００３４】
凝集反応を、製剤中に等量の可溶性タンパク質及び凝集タンパク質を一定のパラメータとするために、タンパク質の５０％が沈殿することが可能になるオリゴヌクレオチドの質量に対するタンパク質の質量比を用いて行った。
【００３５】
異なるオリゴヌクレオチドを有する凝集タンパク質ＤＩＩＩＣ−２をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価した。群は以下の通りであった：
群１：可溶性ＤＩＩＩＣ−２（非凝集、オリゴヌクレオチドを有さない）（タンパク質２０μｇ）
群２：混合オリゴヌクレオチド（配列番号１）を有するＤＩＩＩＣ−２：（タンパク質２０μｇ＋オリゴヌクレオチド２μｇ）
群３：オリゴヌクレオチドポリ：ＩＣ、ＡＲＮを有するＤＩＩＩＣ−２（タンパク質２０μｇ＋オリゴヌクレオチド２μｇ）
群４：オリゴヌクレオチドポリ：ＩＣ、ＡＤＮを有するＤＩＩＩＣ−２（タンパク質２０μｇ＋オリゴヌクレオチド２μｇ）
群５：オリゴヌクレオチド２２１６（配列番号３）を有するＤＩＩＩＣ−２（タンパク質２０μｇ＋オリゴヌクレオチド２μｇ）
群６：オリゴヌクレオチドＫ３（配列番号２）を有するＤＩＩＩＣ−２（タンパク質２０μｇ＋オリゴヌクレオチド２μｇ）
群７：オリゴヌクレオチドＯｒｉＣ（配列番号４）を有するＤＩＩＩＣ−２（タンパク質２０μｇ＋オリゴヌクレオチド）
群８：加熱したＤＩＩＩＣ−２（オリゴヌクレオチドを用いない沈殿の対照）（沈殿したタンパク質を半分（１０μｇ）と可溶性タンパク質を半分（１０μｇ）含有する）
群９：混合オリゴヌクレオチド（配列番号１）を有するプラセボ（２μｇ）
群１０：１０２ｐｆｕの感染性ＤＶ２
【００３６】
全ての改変型を、アラムをアジュバントベースとして製剤化し、動物に、１５日ごとに３回、腹腔内経路によって投薬した。３回目の投薬後、ＤＶ２に対する反応性抗体の検出を捕捉ＥＬＩＳＡによって決定し、それにより、これらの動物の血清の限界希釈によって力価を決定した。図１に示されている通り、試験した全群について高力価の抗ウイルス抗体が検出され、それらの間に統計学的差異はなく（ｐ＞０．０５）、これにより、キメラタンパク質ＤＩＩＩＣ−２の凝集は抗ウイルス抗体応答に影響を及ぼさないことが示される。
【００３７】
免疫により生じる抗体の機能性を決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるウイルス中和アッセイも実施した。表１にはＤＶ２に対する中和力価が示されている。中和力価を、プラーク数の減少が５０％に達する最高希釈度と定義した。それから分かるように、全群の動物が中和により陽性であり、セロコンバージョン１００％であり、幾何平均力価（ＧＭＴ）が１：７０を超えた。
【表１】
0006333290.tif 000002
【００３８】
異なるオリゴヌクレオチドを有する凝集タンパク質ＤＩＩＩＣ−２の、細胞媒介性免疫応答を生じる能力についてもこのスキームで評価した。このために、各改変型を用いて免疫した動物の脾臓細胞を抽出し、感染性ＤＶ２を用いた刺激後に脾細胞の培養上清中のＩＦＮ−γの分泌を測定した。図２には、各群によるサイトカインの分泌の値及び応答した動物のパーセンテージが示されている。全群において有意なレベルの分泌が得られたが、配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する凝集タンパク質を用いて免疫した群でのみ、陰性対照群に対する統計的有意差が示された。また、その群では、動物の１００％がまさに応答した。細胞性免疫応答試験における応答した動物のパーセンテージとＩＦＮ−γの濃度の平均値の両方を考慮して、オリゴヌクレオチドを有する凝集タンパク質ＤＩＩＩＣ−２製剤：混合（配列番号１）、２２１６（配列番号３）、Ｋ３（配列番号２）、及びＯｒｉ  Ｃ（配列番号４）を防御アッセイのために選択した。
【００３９】
この試験のために、以下のマウス１５匹の群を形成した：
群１：ＤＩＩＩＣ−２混合オリゴヌクレオチド（配列番号１）（タンパク質５μｇ＋オリゴヌクレオチド０．５μｇ）
群２：ＤＩＩＩＣ−２オリゴヌクレオチド２２１６（配列番号３）（タンパク質５μｇ＋オリゴヌクレオチド０．５μｇ）
群３：ＤＩＩＩＣ−２オリゴヌクレオチドＫ３（配列番号２）（タンパク質５μｇ＋オリゴヌクレオチド０．５μｇ）
群４：ＤＩＩＩＣ−２オリゴヌクレオチドＯｒｉＣ（配列番号４）（タンパク質５μｇ＋オリゴヌクレオチド０．５μｇ）
群５：混合オリゴヌクレオチド（配列番号１）を有するプラセボ（０．５μｇ）
群６：１０２ｐｆｕの感染性ＤＶ２
【００４０】
全ての改変型を、アラムをアジュバントベースとして製剤化し、動物に、１５日ごとに３回、腹腔内経路によって投薬した。免疫開始の２ヶ月後に、各群の動物１０匹を、同類の神経適応ウイルスを５０％致死量（ＬＤ５０）で用いて攻撃し、２１日間観察して生存を測定した。図３Ａに得られた生存のパーセンテージが記載されている。観察された通り、配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する製剤ＤＩＩＩＣ−２を受けたマウスの８０％超がウイルスによる攻撃に対して生存し、ＤＶ２を用いて免疫した陽性対照群と比較して統計的有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。同様に、陰性対照群の動物は１０％のみがウイルスによる攻撃に対して生存し、ＤＩＩＩＣ−２及び配列番号１のオリゴヌクレオチドを用いて免疫した群、並びに陽性対照を用いて免疫した群との統計的有意差があった（ｐ＜０．０５）。さらに、オリゴヌクレオチド２２１６を含有する製剤を用いて免疫した動物、オリゴヌクレオチドＫ３を含有する製剤を用いて免疫した動物、及びオリゴヌクレオチドＯｒｉＣを含有する製剤を用いて免疫した動物は生存レベルに到達せず、プラセボ群と比較して統計的有意差があった。
【００４１】
各群の残りの動物５匹に同じウイルスを５００  ＬＤ５０で与え、ウイルスによる攻撃の７日後に、全ての動物を、脳を取り出すために屠殺し、ウイルス負荷量をＶＥＲＯ細胞において測定した。図３Ａにおいて観察された生存と一致して、配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する製剤ＤＩＩＩＣ−２を用いて免疫したマウスの脳内のウイルス負荷量は低く（＜１０２ｐｆｕ／ｍｌ）、陽性対照群と比較して統計学的差異はなかった（ｐ＞０．０５）が、プラセボ製剤を受けた群のマウスでは平均値で１０４ｐｆｕ／ｍｌよりも高いウイルス負荷量が示された（図３Ｂ）。オリゴヌクレオチド２２１６を含有する製剤を用いて免疫した動物、オリゴヌクレオチドＯｒｉＣを含有する製剤を用いて免疫した動物、及びオリゴヌクレオチドＫ３を含有する製剤を用いて免疫した動物では、ＤＩＩＩＣ−２及び配列番号１のオリゴヌクレオチドの製剤を用いて実現されたレベルとプラセボ製剤を用いて実現されたレベルの中間のレベルのウイルス負荷量が示され、それらの間に統計的有意差はなかった。
【００４２】
（例２）
凝集タンパク質ＤＩＩＩＣ−２及び組換えカプシドタンパク質ＤＶ２から得たヌクレオカプシド様粒子を用いて免疫した非ヒト霊長類における概念実証
マウスにおける前臨床試験に基づいて、配列番号１のオリゴヌクレオチドを伴い、アラムを用いてアジュバント添加した凝集タンパク質ＤＩＩＩＣ−２をＤＶに対して陰性である非ヒト霊長類において評価した。さらに、ＮＬＰｓ−２（配列番号１のオリゴヌクレオチドを含有する）を受けた１つの群を評価した。同様に、プラセボ群は、アラムでアジュバント添加した組換えタンパク質を凝集させるプロセスにおいて使用した配列番号１のオリゴヌクレオチドを最大量で含有する製剤を受けた。免疫スキーマの全群に動物３匹を含めた。
【００４３】
ＤＩＩＩＣ−２について選択された用量は、タンパク質１００μｇ及び配列番号１のオリゴヌクレオチド１０μｇであり、ＮＬＰｓ−２については、タンパク質５０μｇ及び配列番号１のオリゴヌクレオチド１０μｇであった。サルに、２ヶ月ごとに４回、皮下に投薬した。各投薬時、及び１５日後に血液を採取して、誘導された体液性免疫応答を測定した。図４に抗ＤＩＩＩＣ−２抗体の出現の反応速度論が示されている。それから分かるように、製剤ＤＩＩＩＣ−２抗体を受けたサルでは、最初の投薬の１５日後に検出され始めた。力価は２回目の接種後に増大し、１０，０００を上回る値であった。３回目の投薬後、力価はわずかに増大し、４回目の投薬後には同じレベルに維持された（平均：８０，０００）。ＮＬＰｓ−２を用いて免疫した群における抗カプシド抗体の応答は同様であった（図４）。反応性抗ＤＶ２抗体の検出を捕捉ＥＬＩＳＡによって決定し、それにより、これらの動物の血清の限界希釈によって力価を決定した。抗ウイルス抗体の発生の動力学的試験の結果が図５に示されている。配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する製剤ＤＩＩＩＣ−２を受けたサルにおける抗ウイルス抗体は２回目の投薬の１５日後に検出され始め（平均値：６，０００）、３回目の投薬時、すなわち、免疫原の２回目の接種を受けた２ヶ月後には検出不可能なレベルまで低下した。次いで、３回目の投薬後に、力価は２回目の投薬の１５日後に得られたものと同様のレベルまで増大したが、この時には、３回目の投薬の２ヶ月後に対応する４回目の投薬時に検出可能なままであった（平均：８００）。さらに、４回目の接種を受けた際、動物において投与時に検出されたものよりもわずかに高い値で抗体が発生し、これらはウイルスによる攻撃時まで平均値５，０００で維持された。ウイルスを投薬した場合、攻撃の２０日後及び２７日後に抗体力価のわずかな増大を検出することが可能であり、平均値は１２，０００であった。
【００４４】
中和抗体応答により、このウイルスに対する防御の可能性のある相関現象が示されるので、中和抗体応答もこの試験で測定した。表２には、各試料についての、Ｖｅｒｏ細胞系及びＳＢ８５５３  ＤＶ２株を使用して示されている時間に得られた値が示されている。
【００４５】
観察された通り、ＤＩＩＩＣ−２の２回目の投薬後に中和抗体を検出することができる。３回目の接種の１５日後には、より高い力価が検出され、これは４回目の投与時に維持されていた。１５日後に力価が増大し、これにより、明らかな追加刺激効果が示される。同様に、最後の投薬の１ヶ月後、ウイルスによる攻撃時に、ＤＩＩＩＣ−２を用いて免疫した動物の全てについて高レベルの中和抗体が検出された。ＮＬＰｓ−２を受けた群については、予測通り、ウイルスによる攻撃前に評価した時間のいずれにおいても中和応答は検出されなかった（１０未満の中和力価、データは示していない）。プラセボ群では同様の挙動が見られ、中和力価は１０未満であった（データは示していない）。
【表２】
0006333290.tif 000003
【００４６】
最後の投薬の１ヶ月後に、ＤＩＩＩＣ−２の群について、３種のウイルス株及び３種の異なる細胞系を使用して中和抗体も決定した。全ての場合において１００％セロコンバージョンが検出され、これにより、強力な中和応答が誘導されたことが示される（表３）。
【表３】
0006333290.tif 000004
【００４７】
使用した実験系で実現された、それぞれ独立した動物の中和力価、並びにＧＭＴ及びセロコンバージョンのパーセンテージが示されている。
【００４８】
細胞性免疫応答がこの試験において測定された別のパラメータであった。４つの時点：４回目の投薬日、４回目の投薬の１５日後、ウイルスによる攻撃を行った日、及びウイルスによる攻撃の２７日後に単離した末梢血リンパ球を、感染性ＤＶ２を用いて刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γの分泌を測定した。図６には、各試験時点で得られた値が示されている。ＤＩＩＩＣ−２及び配列番号１のオリゴヌクレオチドを用いて免疫した動物３匹のうち１匹（サル６）において、ウイルスによる攻撃の前に、考察した３つの時点においてＩＦＮ−γの分泌が誘導された。同様に、感染後、２７日目に、この群の別のサルも陽性であり、これにより、既往性細胞応答が測定されたことが示される。
【００４９】
さらに、ＮＬＰｓ−２を受けた３匹のうち２匹が、ウイルスによる攻撃を行った日にＩＦＮ−γについて陽性であった。同様に、感染後、２７日目に、この群のサル３匹が陽性であり、これにより、この場合にも既往性細胞応答が測定されたことが示される。重要なことに、プラセボ製剤を受けた動物のいずれにおいても、ウイルスによる攻撃後でさえも抗ウイルスサイトカインは分泌されなかった。
【００５０】
ＤＶ２に対する防御を測定するために、全ての実験動物を、最後の投薬の１ヶ月後に感染用量のウイルスを用いて攻撃した。血液中のウイルスの存在を、ＶＥＲＯ細胞系において直接測定することによって決定した。図７に得られた結果が示されている；プラセボ製剤を受けた動物では、平均値３．６日でウイルス血症が発生し、平均ウイルス負荷量が１０２ｐｆｕ／ｍＬであった。逆に、配列番号１のオリゴヌクレオチドを有するＤＩＩＩＣ−２タンパク質製剤を受けたサルのうち２匹ではウイルス血症が発生せず、したがって、完全に防御されたと分類される。１匹の動物（サル５）では、５日目にウイルスが検出され、ウイルス負荷量の値は非常に低く、（＜１０ｐｆｕ）これにより、同様に有意なレベルの防御が示される。
【００５１】
ＮＬＰｓ−２を受けた群の場合では、全てのサルにおいてウイルスの存在が検出されたが、ウイルス負荷量は対照群において検出されたものと比較して小さかった。実際、サル９では非常に低いウイルス負荷量（＜１０ｐｆｕ）が示され、これによって有意なレベルの防御がも示される。
【００５２】
概して、配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する、ウイルスカプシドに基づく凝集タンパク質により、サルにおける防御応答が誘導されると言うことができる。
【００５３】
（例３）
タンパク質：ＤＩＩＩＣ−１、ＤＩＩＩＣ−３及びＤＩＩＩＣ−４の獲得及び特徴付け
ＤＶ血清型１、３及び４のエンベロープタンパク質（アミノ酸２８６〜４２６）由来のＤｏｍＩＩＩを含有する遺伝子断片ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを同じウイルスのカプシドタンパク質と融合したプラスミドｐＥＴ２８の多重クローニング部位にクローニングした。この発現ベクターは、クローニングするタンパク質に関連しないアミノ酸の翻訳を排除するために、ＮｃｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間の遺伝子配列がヒスチジンタグ以外は排除されるように予め改変されたものであった。プラスミドの遺伝子構築物が図８に示されている。
【００５４】
全ての場合において、タンパク質をそのＮ末端でヒスチジンタグと融合させ、Ｔ７  ｌａｃプロモーターの制御下で発現させる。これにより、発現されたら、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーを金属キレートと組み合わせることによって前記タンパク質の精製プロセスを開発することが可能になった。予め得たタンパク質ＤＩＩＩＣ−２を精製するために、同じ方法体系を使用した。４種の組換えタンパク質を精製したら、それらの特徴付けに進んだ。まず、各ウイルス調製物を用いて免疫したマウス由来のポリクローナル血清、具体的には、各血清型の過免疫腹水抗ＤＶ（ＨＭＡＦ）に対する各タンパク質の反応性を分析した。図９に示されている通り、ＥＬＩＳＡによって同種のウイルス血清型由来のＨＭＡＦに対する各タンパク質の反応性を得て、これにより、ウイルスエンベロープタンパク質に対して生じた抗体の大部分が立体配置的であるので、カプシドに関して領域ＤｏｍＩＩＩの正しい提示が示される。さらに、各キメラ分子内に存在しなければならないＤｏｍＩＩＩの領域内のジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）の状態を試験した。まず、各タンパク質を質量分析によって検証し、正しい結合の形成を検証した。次いで、Ｓ−Ｓ結合がポリクローナル血清抗ＤＶに対するＤｏｍＩＩＩの反応性に直接関与するという事実に基づいて、同類の血清型由来のＨＭＡＦに対する各組換えタンパク質の反応性を還元条件下及び非還元条件下で再分析した。図９に示されている通り、ＤＩＩＩＣ−１タンパク質、ＤＩＩＩＣ−２タンパク質及びＤＩＩＩＣ−４タンパク質について、タンパク質をアルキル化によって不可逆的に還元した場合、同類のＨＭＡＦに対する反応性が低下した。ＤＩＩＩＣ−３については、同様に低下が観察されたが、残りのタンパク質におけるものほど顕著ではなかった。これらの結果により、Ｓ−Ｓ結合の正しい形成、及びポリクローナル抗ＤＶ抗体に対するＤｏｍＩＩＩの反応性におけるその可能性のある役割が確認される。
【００５５】
（例４）
マウスにおける一価製剤ＤＩＩＩＣ及び四価製剤ＤＩＩＩＣの免疫学的評価
配列番号１のオリゴヌクレオチドを用いて予め凝集させた各キメラタンパク質及び４種の予め凝集させた分子の四価混合物をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価した。全ての調製物を、アラムをアジュバントベースとして製剤化し、動物に１５日ごとに３回、腹腔内に投薬した。陽性対照として、各ウイルス血清型を用いて免疫した４つの群を含めた。陰性対照として、１つの群にアラムでアジュバント添加した、四価製剤に含有されたオリゴヌクレオチドと同じ量のプラセボを与えた。四価製剤についてのタンパク質の量は各２０μｇであり、配列番号１のオリゴヌクレオチドの総量は８μｇであった。一価製剤はタンパク質２０μｇ及び配列番号１のオリゴヌクレオチド２μｇを含有した。
【００５６】
３回目の投薬後、各ウイルスに対して反応性の抗体の検出を捕捉ＥＬＩＳＡによって決定し（図１０）、それにより、力価をこれらの動物の血清の限界希釈によって決定した。一価製剤を受けた動物は血清型１、２及び３に対して高力価の抗ウイルス抗体を有したが、ＤＩＩＩＣ−４を用いて免疫した動物は同類の血清型（ＤＶ４）に対する力価を有さなかった。しかし、四価製剤テトラ−ＤＩＩＩＣを受けた動物では、他の血清型と比較して力価は低かったが、ＤＶ４に対する抗体が発生した。この結果により、４種のタンパク質の混合物が、おそらく、いくらかのレベルの他の血清型との交差反応性により、ＤＶ４に対する抗体の誘導に有利であることが示される。
【００５７】
四価製剤テトラ−ＤＩＩＩＣを用いた免疫により生じる抗体の機能性を決定するために、血清型１、２、３及び４に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるウイルス中和アッセイ（表４）を行った。アッセイは世界保健機関（ＷＨＯ；Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）のガイドラインに従い、また、参照株を使用して実施した。ＤＩＩＩＣ−１タンパク質を用いて免疫したマウス、ＤＩＩＩＣ−２タンパク質を用いて免疫したマウス、及びＤＩＩＩＣ−３タンパク質を用いて免疫したマウスでは、同種のウイルスに対して、対照群のマウスにおいて複製性ウイルスによって引き出されるものと同等の高力価の中和抗体が示された。ＤＩＩＩＣ−４タンパク質を用いて免疫した動物では応答は示されず、これはＤＶ４に対する中和抗体が検出されなかった抗ウイルス応答の結果と一致した。しかし、四価製剤により、血清型１、２及び３に対する中和抗体が誘導されることに加えて、ＤＶ４に対する機能性抗体も誘導された。
【表４】
0006333290.tif 000005
【００５８】
全ての場合において、マウス由来の血清の混合物を分析した。（−）：未決定。
【００５９】
この試験において測定された別のパラメータは細胞性免疫応答であった。このために、四価製剤テトラ−ＤＩＩＩＣを用いて免疫した動物の脾臓細胞を最後の投薬の３０日後に抽出し、４種の組換えタンパク質を用いて刺激した後に脾細胞の培養上清中のＩＦＮ−γの分泌を測定した。陰性対照として、プラセボ製剤を接種したマウスの脾細胞を使用した。得られた結果が図１１に示されている。観察された通り、４種の組換えタンパク質を用いて刺激した後に高レベルのＩＦＮ−γが検出され、これにより、各血清型に対して得られた細胞応答の同等性が示される。
【００６０】
最後に、マウスにおけるウイルス性脳炎のモデルに対して防御アッセイを実施した。この実験のために、四価製剤テトラ−ＤＩＩＩＣを用いて免疫した動物、一価製剤ＤＩＩＩＣ−１を用いて免疫した動物、及び一価製剤ＤＩＩＩＣ−４を用いて免疫した動物、陽性対照動物（それぞれＤＶ１及びＤＶ４を用いて免疫した動物）、並びにプラセボ製剤を用いて免疫した動物を選択した。同様に、使用した攻撃用ウイルスは、動物の死亡原因となり得るＤＶ１及びＤＶ４であった。図１２に示されている通り、一価製剤と四価製剤のどちらを用いても血清型１及び４に対して高レベルの防御が得られ、全ての場合において、ウイルス対照群と比較して統計学的差異はなかった（ｐ＞０．０５）。これらの結果により、試験した、配列番号１のオリゴヌクレオチドを有する凝集タンパク質ＤＩＩＩＣに基づく製剤の血清型１及び４に対する防御力が示される。
【００６１】
（例５）
非ヒト霊長類における四価製剤テトラ−ＤＩＩＩＣの免疫学的評価
マウスにおいて評価した四価製剤テトラＤＩＩＩＣを、非ヒト霊長類において同様に評価した。それぞれ動物３匹の試験群を３つ形成して、３つの異なる抗原投与の経路によって四価製剤を与えた：群１：皮下、群２：皮内、及び群３：筋肉内。群１及び３には、全て混合し、アラムでアジュバント添加したものである、配列番号１のオリゴヌクレオチド５μｇを用いて予め凝集させた各キメラタンパク質５０μｇを与えた。群２には、他の２つの経路の１０分の１の免疫原を皮内経路によって与え、これは各タンパク質５μｇ及び配列番号１のオリゴヌクレオチドの総量２μｇであり、全て混合し、アラムでアジュバント添加したものであった。プラセボ群には、アラムでアジュバント添加した、群１及び３と同じ量の配列番号１のオリゴヌクレオチドを筋肉内に与えた。各投薬時、及びそれらの１ヶ月後に血液を採取して、誘導された体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を測定した。
【００６２】
各ウイルス血清型に対する反応性抗体の検出を捕捉ＥＬＩＳＡによって決定し、それにより、これらの動物の血清の限界希釈によって力価を決定した。図１３には、配列番号１のオリゴヌクレオチドを含むテトラ−ＤＩＩＩＣ製剤を３回投薬した後にサルにおいて生じた抗ウイルス抗体応答が示されている。観察された通り、抗原投与の経路にかかわらず、捕捉ＥＬＩＳＡ系において、サルにおいて４種のウイルス血清型を認識することができる抗体応答が引き出された。さらに、この応答は４種のＤＶに対して均一のパターンを示し、これは、バランスのとれた免疫応答を必要とするこのヒト病原体に対するワクチンの発生の重要なステップになっている。
【００６３】
中和抗体の測定を、ＶＥＲＯ細胞において、ウイルス株Ｊａｍａｉｃａ  ＤＶ１、ＳＢ８５５３  ＤＶ２、Ｎｉｃａｒａｇｕａ  ＤＶ３及びＤｏｍｉｎｉｃａ  ＤＶ４を使用し、プラーク還元中和試験（ＰＲＮＴ）の技法を使用して実施した。３回目の免疫後に得られた値を表５に示す。
【表５】
0006333290.tif 000006
【００６４】
製剤テトラＤＩＩＩＣを用いて免疫した動物全てで、抗原投与の経路にかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルス感染を中和できる抗体応答が生じた。４種の血清型全てに応答する動物の１００％で中和抗体応答が生成されることが、現在デングに対するワクチンの開発の前提になっている。プラセボ群では、免疫した動物全てにおいて中和力価が２０よりも低かった。
【００６５】
測定したパラメータのうちの１つは細胞性免疫応答であった。ＰＢＭＣを、組換えタンパク質ＤＩＩＩＣのそれぞれを用いて刺激し、ＩＦＮ−γを産生する細胞の発生頻度をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した。図１４に得られた値が示されている。四価製剤テトラ−ＤＩＩＩＣを３回投薬した後、動物において組換えタンパク質を用いた刺激に対して抗ウイルスサイトカインを分泌することができる細胞が生じ、応答は筋肉内に免疫した動物で比較的大きかった。評価した全群において、動物の１００％が試験した４種のタンパク質に対して応答した。
【００６６】
（例６）
初回刺激−追加刺激レジメンにおける、タンパク質ＤＩＩＩＣの二価製剤及び四価製剤及び配列番号１のオリゴヌクレオチドの併用投与のマウスにおける免疫学的評価
各タンパク質製剤ＤＩＩＩＣの同じ免疫化スキームでの投薬を２回のみにするために、以下の実験計画を実行した：
逐次的群Ｉ  投薬１：二価製剤ＤＩＩＩＣ−１／ＤＩＩＩＣ−２
投薬２：二価製剤ＤＩＩＩＣ−３／ＤＩＩＩＣ−４
投薬３：四価製剤テトラＤＩＩＩＣ
逐次的群ＩＩ  投薬１：二価製剤ＤＩＩＩＣ−１／ＤＩＩＩＣ−３
投薬２：二価製剤ＤＩＩＩＣ−２／ＤＩＩＩＣ−４
投薬３：二価製剤テトラＤＩＩＩＣ
テトラＤＩＩＩＣ群：全て四価製剤テトラＤＩＩＩＣの投薬
【００６７】
配列番号１のオリゴヌクレオチドを用いて予め凝集させたキメラタンパク質ＤＩＩＩＣを混合して二価製剤及び四価製剤を形成した。二価製剤当たりの免疫原は各タンパク質２０μｇ及び配列番号１のオリゴヌクレオチド４μｇで構成された。四価製剤についてのタンパク質の量は各２０μｇ及び配列番号１のオリゴヌクレオチドの総量８μｇであった。全ての改変型を、アラムをアジュバントとして製剤化し、１５日ごとに腹腔内に投与した。四価製剤テトラ−ＤＩＩＩＣのみを受ける群を陽性対照として使用し、プラセボ群を陰性対照として使用した。
【００６８】
３回目の投薬後、各ウイルスに対して反応性の抗体の検出を捕捉ＥＬＩＳＡによって決定し（図１５）、それにより、これらの動物の血清の限界希釈によって力価を決定した。結果として、本発明者らは、試験群間で４種のウイルス血清型のいずれに対しても統計的有意差はないことを見出し、これにより、二価製剤及び四価テトラ−ＤＩＩＩＣを用いた追加刺激の逐次的投与により、四価製剤の３回投薬と同じレベルの免疫原性を得ることが可能であることが示される。
【００６９】
さらに、細胞性免疫応答も測定した。試験の各群からの免疫した動物由来の脾臓細胞を、最後の投薬の３０日後に抽出し、４種の組換えタンパク質を用いて刺激した後に脾細胞の培養上清中のＩＦＮ−γの分泌を測定した。陰性対照として、プラセボ製剤を接種したマウスの脾細胞を使用した。得られた結果が図１６に示されている。それから分かるように、全群（プラセボ以外）において４種の組換えタンパク質を用いて刺激した後に高レベルのＩＦＮ−γが検出され、これにより、使用する免疫レジメン及び最初の２回で投薬した二価製剤に関係なく、得られる細胞応答が同等であることが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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