(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１３】
0006300380.tif 000090
の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩であって、
ここで、
Ｒ１は、ＨまたはＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、場合によっては、ハロゲン、ヒドロキシルから選択される１〜３つの置換基と任意の位置で置換されており、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、
ここで（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルは、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、ハロゲンから選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
または、Ｒ２およびＲ３は、一緒にＮ含有複素環を形成しており、その環は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つのさらなる置換基によって置換されており、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルであり、さらに上記の置換基は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されている。
【請求項２】
Ｒ１が、Ｈ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣＨ２Ｃｌ、またはＣＯＣＨ２ＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩ）：
【化１４】
0006300380.tif 000091
の構造を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）：
【化１５】
0006300380.tif 000092
の構造を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
式（ＩＶ）：
【化１６】
0006300380.tif 000093
の構造を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
式（Ｖ）：
【化１７】
0006300380.tif 000094
の構造を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
式（Ｉ）：
【化１８】
0006300380.tif 000095
の化合物またはその薬学的に許容される塩を固相合成する方法であって、
ここで、
Ｒ１は、ＨまたはＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、場合によっては、ハロゲン、ヒドロキシルから選択される１〜３つの置換基と任意の位置で置換されており、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、
ここで（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルは、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、ハロゲンから選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
または、Ｒ２およびＲ３は、一緒にＮ含有複素環を形成しており、その環は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つのさらなる置換基によって置換されており、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルであり、さらに上記の置換基は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
前記方法は、
（ａ）式（ＶＩ）：
【化１９】
0006300380.tif 000096
の化合物を式（ＶＩＩ）：
【化２０】
0006300380.tif 000097
のビス（アジド）ボディパイ化合物を形成するのに十分な条件下において、アジドと反応させること、
（ｂ）式（ＶＩＩ）の化合物を、式（ＶＩＩＩ）：
【化２１】
0006300380.tif 000098
の化合物を形成するのに十分な条件下において、式Ｒ２Ｒ３ＮＨのアミンと反応させること、
（ｃ）式（ＶＩＩＩ）の化合物を、式（ＩＸ）：
【化２２】
0006300380.tif 000099
の化合物を形成させるのに十分な条件下において、銅（Ｉ）触媒の存在下で式Ｒ４−Ｃ≡ＣＨのアルキンと反応させること、
（ｄ）式（ＩＸ）の化合物から固形支持樹脂を除去して、式（Ｉ）のＲ１がＨである、非結合のボディパイ化合物を形成すること、および
（ｅ）場合によっては、工程（ｄ）の該非結合ボディパイ化合物を、式Ｒ１ＣＯＣｌの酸塩化物と反応させて、Ｒ１が、場合によっては、１〜３つのハロゲン置換基と置換されたＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである、式（Ｉ）の化合物を形成すること、
を含む。
【請求項８】
工程（ｅ）が行われるときに、前記方法は、エステル結合またはアミド結合をけん化するのに十分な条件下において、前記反応混合物を塩基で処理する付加的な工程を有し、ここでＲ１は、１〜３つのヒドロキシル置換基と、場合によっては、置換されているＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）：
【化２３】
0006300380.tif 000100
の化合物またはその薬学的に許容される塩を液相合成する方法であって、
ここで、
Ｒ１は、ＨまたはＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、場合によっては、ハロゲン、ヒドロキシルから選択される１〜３つの置換基と任意の位置で置換されており、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、
ここで（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルは、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、ハロゲンから選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
または、Ｒ２およびＲ３は、一緒にＮ含有複素環を形成しており、その環は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つのさらなる置換基と置換されており、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルであり、さらに上記の置換基は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
前記方法は、
（ａ）式（Ｘ）：
【化２４】
0006300380.tif 000101
の化合物を式（ＸＩ）：
【化２５】
0006300380.tif 000102
のビス（アジド）ボディパイ化合物を形成するのに十分な条件下において、アジドと反応させること、
（ｂ）式（ＸＩ）の化合物を、式（ＸＩＩ）：
【化２６】
0006300380.tif 000103
の化合物を形成するのに十分な条件下において、式Ｒ２Ｒ３ＮＨのアミンと反応させること、
（ｃ）式（ＸＩＩ）の化合物を、式（ＸＩＩＩ）：
【化２７】
0006300380.tif 000104
の化合物を形成させるのに十分な条件下において、銅（Ｉ）触媒の存在下で式Ｒ４−Ｃ≡ＣＨのアルキンと反応させること、
（ｄ）式（ＸＩＩＩ）の化合物のＮＯ２基を還元して、式（Ｉ）のＲ１がＨである、ボディパイ化合物を形成すること、および
（ｅ）場合によっては、工程（ｄ）のボディパイ化合物を、式Ｒ１ＣＯＣｌの酸塩化物と反応させて、Ｒ１が、１〜３つのハロゲン置換基で場合によっては置換されているＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである、式（Ｉ）の化合物を形成すること、
を含む。
【請求項１０】
工程（ｅ）が行われるときに、前記方法は、エステル結合またはアミド結合をけん化するのに十分な条件下において、前記反応混合物を塩基で処理する付加的な工程を有し、ここでＲ１は、１〜３つのヒドロキシル置換基で場合によっては置換されているＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
式（ＩＩ）：
【化２８】
0006300380.tif 000105
の化合物を含む、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）用の蛍光プローブであって、
該プローブは、ＨＳＡのＦＡ１結合部位に対して選択的である。
【請求項１２】
生物流体の試料中のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を検出する方法であって、
該方法は、
ａ）ＨＳＡを含んでいると考えられる生物流体の試料を、式（Ｉ）：
【化２９】
0006300380.tif 000106
の化合物と反応させて、インキュベーション用反応液を形成すること、
ここで、Ｒ１は、ＨまたはＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、場合によっては、ハロゲン、ヒドロキシルから選択される１〜３つの置換基で任意の位置が置換されており、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、
ここで（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルは、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、ハロゲンから選択される１〜５つの置換基で任意の位置が置換されており、
または、Ｒ２およびＲ３は、一緒にＮ含有複素環を形成しており、その環は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つのさらなる置換基によって置換されており、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルであり、さらに上記の置換基は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
ｂ）インキュベートされた混合物を形成するのに十分な条件下において、工程ａ）のインキュベーション用反応液をインキュベートすること、および
ｃ）ＨＳＡを含む試料が存在しない場合の式（Ｉ）の化合物の蛍光シグナルに比べて、該混合物の蛍光シグナルが増加することによって、ＨＳＡの存在が示される、蛍光顕微鏡法で工程ｂ）の該混合物を分析すること、
を含む。
【請求項１３】
前記蛍光シグナル強度の測定値が、前記試料中に存在する前記ＨＳＡの濃度に比例する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【化３０】
0006300380.tif 000107
の構造を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
細胞培養中の生ニューロンを可視化する方法であって、
該方法は、
ａ）細胞培養液を、式（Ｉ）：
【化３１】
0006300380.tif 000108
の化合物と反応させて、インキュベーション用反応液を形成すること、
ここでＲ１は、ＨまたはＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、場合によっては、ハロゲン、ヒドロキシルから選択される１〜３つの置換基で任意の位置が置換されており、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、
ここで（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルは、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、ハロゲンから選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
または、Ｒ２およびＲ３は、一緒にＮ含有複素環を形成しており、その環は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つのさらなる置換基によって置換されており、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルであり、さらに上記の置換基は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
ｂ）該生ニューロンを染色するのに十分な条件下において、工程ａ）のインキュベーション用反応液をインキュベートすること、および
ｃ）蛍光顕微鏡法で、工程ｂ）の染色された該生ニューロンを可視化すること、
を含む。
【請求項１６】
前記式（Ｉ）の化合物は、式（ＸＩＶ）：
【化３２】
0006300380.tif 000109
の構造を有する化合物であって、ここで、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルであり、さらに上記の置換基は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
Ｒ５は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−Ｓｉ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＨ、−Ｂ（ＯＨ）２、−Ｏトシル、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルコキシル）、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）またはハロゲンから選択される１〜５つの置換基で任意の位置に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記式（Ｉ）の化合物は、式（Ｖ）：
【化３３】
0006300380.tif 000110
の構造を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は、インビトロ用途に用いられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、インビボ用途に用いられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
生ニューロンを特異的に染色するための蛍光色素であって、式（ＸＶ）：
【化３４】
0006300380.tif 000111
の化合物を含み、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、
ここで（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルは、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、ハロゲンから選択される１〜５つの置換基で任意の位置が置換されており、
または、Ｒ２およびＲ３は、一緒にＮ含有複素環を形成しており、その環は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つのさらなる置換基によって置換されており、
Ｒ６は、ＨまたはＣＯ（ＣＨ３）であり、
Ｒ７は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、または（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルであり、さらに上記の置換基は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されている。
【請求項２１】
式（ＸＶＩ）：
【化３５】
0006300380.tif 000112
の構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１２年１２月２６日に出願された米国仮特許出願番号６１／７４５，９１６号の利益を主張する。
【０００２】
上記出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の背景】
【０００３】
化学および生物学において極めて重要な認識事象を理解する必要性があるので、化学プローブの開発のために多大な努力が行われてきた。蛍光プローブは、感度が高く、応答が速く、技術的に簡便であるため、分析的計測および光学イメージングのどちらにおいても、魅力的で汎用性のある手段である。しかしながら、蛍光プローブとその標的との相互作用を調節する機構については、十分に理解されていないことが多く、したがって、構造上必要な条件を予測し、理論的計算を用いて新規のプローブを設計することは、限定的に可能となっている。最近では、特に分子認識レベルで不明確なままとなっている複雑な科学的課題に対する蛍光プローブの生成および最適化が、コンビナトリアルな手法によって増進されている。市販の基本単位を用い、従来の合成手順で公知の蛍光性骨格を誘導体化するコンビナトリアルな方策を開発することにより、より広い範囲で蛍光プローブを用いることが可能となる。
【０００４】
ボディパイ骨格に基づいて開発された蛍光性分子イメージングプローブは、蛍光特性（例えば、高光安定性、吸光係数および量子収量、可変励起スペクトルおよび可変発光スペクトル）が優れている（１〜７）ため、またポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージング用のプローブへの変換が容易である（８、９）ため、広く活用されている。４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ボディパイ）骨格を誘導体化する方法のほとんどは液相化学に関連しており、退屈な精製工程を必要とすることが多い（１０）。固相上でボディパイを誘導体化しようとしても、酸性条件および塩基性条件の両方において不安定なために、その努力は妨げられている（１１）。
【０００５】
ボディパイ系骨格などの、有用な蛍光性骨格に基づいた新規の化合物ライブラリを速やかに実現する方法を開発することが必要とされている。また、このライブラリ内において、重要な生物学的機能を持つ種々の分析物に対して、選択的かつ特異的であるプローブの開発が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、生体分析物であるヒト血清アルブミンを検出する選択的蛍光プローブ見出したこと、またそれに関連した、生（ｌｉｖｅ）ニューロンを選択的に可視化する蛍光プローブを見出したことに基づく。したがって、一実施形態において、本発明は、新種のアミノ−トリアゾリルボディパイ化合物である。本発明の化合物は、ハイスループットな合成法によって速やかに合成され、誘導体化されてもよい３つの部位を含む。また、本発明は、アミノ−トリアゾリルボディパイ化合物の合成方法にも関する。具体的には、固相合成法および液相合成法について述べる。別の実施形態において、本発明は、ヒト血清アルブミン用の蛍光プローブである。さらに別の実施形態において、本発明は、第１世代ニューロンを選択的に染色する蛍光色素である。本発明は、さらに、生物流体試料中のヒト血清アルブミンを検出する方法に関する。ある実施形態において、測定された蛍光強度は、ヒト血清アルブミン濃度に比例する。また、本明細書では、生ニューロンを可視化する方法についても述べ、この方法は、インビトロまたはインビボの用途に用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
上述の事項は、添付の図面に記されるような本発明に係る実施形態の例の下記より具体的な説明により明らかになる。
【図１】図１は、ボディパイ系ＢＤＣおよびＭＫのライブラリ設計を示し、また構造と分光特性との関係について示す。
【図２】図２は、代表的なアミノ−トリアゾリル−ボディパイの正規化吸収スペクトルおよび正規化蛍光発光スペクトルを示す。ＢＤＣ−８（青）：吸収λｍａｘ＝４７３ｎｍ、発光λｍａｘ＝５８５ｎｍ；ＭＫ１０１−８（緑）：吸収λｍａｘ＝４７４ｎｍ、発光λｍａｘ＝５６３ｎｍ；ＭＫＨＡ３７４−４８（黄）：吸収λｍａｘ＝４６８ｎｍ、λｅｍ＝５５７ｎｍ。比較のために、既に報告のあるボディパイ（ＢＤ−２７；赤）の対応するスペクトルも含む：吸収λｍａｘ＝５５１ｎｍ、発光λｍａｘ＝５６８ｎｍ。ＢＤＣ−８、ＭＫ１０１−８、ＭＫＨＡ３７４−４８およびＢＤ−２７の構造も示す。
【図３】図３は、室温において、溶媒の粘度がＢＤＣ−９（１００μＭ）の蛍光強度におよぼす影響を示す。ＢＤＣ−９の強度は、ｎ−オクタノールやｎ−ヘキサノールなど、より粘度が高いアルコール中で系統的に増加した。
【図４】図４は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）中、様々な濃度（０．１３、０．２５、０．５０、１．００ｍｇ／ｍＬ）の１６種の異なるタンパク質に対するＢＤＣ−９（１０μＭ）の蛍光応答（Ｆ）を示す；λｅｘｃ．＝４６０ｎｍ、λｅｍ．＝５７５ｎｍ。Ｆ０は、ＨＥＰＥＳバッファー中のＢＤＣ−９の蛍光強度を示す。値は、平均値である（ｎ＝４）。
【図５】図５は、リン酸バッファー中で段階希釈を行ったＨＳＡ（１．２×１０−４〜４ｍｇ／ｍＬ）と一緒にインキュベートした際のＢＤＣ−９（１０μＭ）の蛍光スペクトルを示す。λｅｘｃ．＝４６０ｎｍ。値は、平均値である（ｎ＝３）。
【図６】図６は、段階希釈を行ったＨＳＡと一緒にインキュベートした際のＢＤＣ−９（１０μＭ）の蛍光発光応答を示す。λｅｘｃ．＝４６０ｎｍ、λｅｍ．＝５７５ｎｍ。値は平均値であり、エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。ＬＯＤ＝０．３μｇ／ｍＬ；線形領域＝０．３７〜３１μｇ／ｍＬ、Ｒ２＝０．９９９。
【図７】図７ａおよび７ｂは、ＢＤＣ−９の種選択性を示す。具体的には、図７ａは、段階希釈を行った各アルブミン（１．２×１０−４〜４ｍｇ／ｍＬ）と反応させた際のＢＤＣ−９（１０μＭ）の蛍光発光応答を示す。λｅｘｃ．＝４６０ｎｍ、λｅｍ．＝５７５ｎｍ。値は平均値であり、エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。図７ｂは、各アルブミンと混合したＢＤＣ−９（１０μＭ）の写真画像である。手持ち式のＵＶランプを用い、３６５ｎｍで照射を行った。
【図８】図８は、部位選択的ＨＳＡ結合薬剤との競合を示す。ＢＤＣ−９（１０μＭ）を加える前に、ＨＳＡ（脂肪酸フリー）（０．３４ｍｇ／ｍＬ、５μＭ）を濃度が異なる薬剤（最大２００μＭ）とともにリン酸バッファー中で２時間プレインキュベートした。Ｆは、示された薬剤濃度における蛍光強度であり、Ｆ０は、薬剤を加えない場合の蛍光強度である。λｅｘｃ．＝４６０ｎｍ、λｅｍ．＝５７５ｎｍ。値は平均値であり、エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図９】図９は、ジョブプロット解析を示す。具体的には、リン酸バッファー中で、合計濃度を２０μＭに保ちながら、ＢＤＣ−９とＨＳＡ（脂肪酸フリー）を異なる比率で混合した。λｅｘｃ．＝４６０ｎｍ、λｅｍ．＝５７５ｎｍ。値は平均値であり、エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図１０】図１０は、段階希釈したＢＤＣ−９（０、０．４７〜６０μＭ）を、リン酸バッファー中でＨＳＡ（１０μＭ）と一緒にインキュベートした際の蛍光発光を示す蛍光スペクトルである。λｅｘｃ．＝４６０ｎｍ、λｅｍ．＝５７５ｎｍ。値は平均値であり、エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。ＫＤ＝１２．７±０．４μＭ（一部位特異的結合モデル）。
【図１１】図１１は、尿試料中のＢＤＣ−９の蛍光応答を示す。リン酸バッファー（ｐＨ＝７．３）中で１０％にした健常者の尿に、ＨＳＡ（０〜１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。ＢＤＣ−９は１０μＭの濃度で加えた。λｅｘｃ．＝４６０ｎｍ、λｅｍ．＝５７５ｎｍ。値は平均値であり、エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。線形回帰：Ｒ２＝０．９９８。
【図１２】図１２ａは、ＭＫＣＡ１０１−３（左）、ＭＫＨＡ１０１−３（中央）およびＭＫＡＡ１０１−３（右）で染色した混合の第１世代神経細胞集団のフローサイトメトリー分布図であり、化合物の蛍光に基づいて、主集団から離れたニューロン集団を示している（〜２Ｇ、最大〜３．５Ｇ）。染色しないコントロールを、各スペクトル約０〜約１Ｇに示す。図１２ｂは、分化した神経球由来ニューロンの画像である。ＭＫＨＡ１０１−３では、ＭＫＣＡ１０１−３よりも特異性が顕著に向上している。
【図１３】図１３は、ＭＫＨＡ１０１−３およびその誘導体の化学構造を示す。
【図１４】図１４は、ＭＫＨＡ３７４−４８の類似アナログの化学構造を示す。
【図１５】図１５は、ニューロン特異的プローブであるＭＫＨＡ１０１−３を識別するための、第１世代神経細胞スクリーニングの概要を示す。左側の図は、他のグリア細胞とは対照的に明るく染色されたニューロンを示す。
【図１６】図１６ａは、ＭＫＨＡ１０１−３（左）およびＭＫＨＡ３７４−４８／ＮｅｕＯ（右）の構造を示す。図１６ｂは、ＭＫＨＡ１０１−３（左）およびＮｅｕＯ（右）で染色した混合生ニューロン細胞集団のフローサイトメトリー分布図であり、化合物の蛍光に基づいて、主集団から離れたニューロン集団を示している。
【図１７】図１７は、ＭＫＨＡ１０１−３で染色したニューロンを倍率１００倍、スケールバー２０μｍで示す生細胞共焦点画像、および混合の第１世代培養神経細胞の生細胞化合物染色および免疫染色を示す。細胞を５００ｎＭのＭＫＨＡ１０１−３（緑）で染色し、倍率１０倍で撮影してから４％ＰＦＡで固定した。その後、細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで透過化処理し、ＧＦＡＰ（赤）およびニューロン（緑）を免疫染色した。
【図１８】図１８は、混合の第１世代培養神経細胞の生細胞化合物染色および免疫染色を示す。細胞を５００ｎＭのＮｅｕＯ（緑）で染色し、倍率１０倍で撮影してから４％ＰＦＡで固定した。その後、細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで透過化処理し、β−ＩＩＩ−チューブリン（Ｔｕｊｉ、黄）、ＧＦＡＰ（赤）およびＯ４を免疫染色した。
【図１９】図１９ａは、５００ｎＭのＮｅｕＯで染色した、マウス新生児および成体（ａｄｕｌｔ）の脳を由来とする混合の第１世代神経細胞のフローサイトメトリー散乱分布図を示す。図１９ｂは、新生児および成体の脳の全体（未分類）、陽性画分および陰性画分から分類された細胞を測定した時の、β−ＩＩＩ−チューブリンの遺伝子発現を示す棒グラフである。図１９ｃは、５００ｎＭのＭＫＨＡ１０１−３で染色した、混合の第１世代神経細胞のフローサイトメトリー散乱分布図を示す。右側のヒストグラムは、化合物陽性細胞が細胞集団全体の２０％を占めることを示している。
【図２０】図２０ａは、化合物陽性画分から再培養した、ニューロン形態を有する生細胞を示す。図２０ｂおよび２０ｃは、β−ＩＩＩ−チューブリン（緑）、核染色（青）で陽性であることが判明した免疫染色細胞を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図２１】図２１は、ＭＫＨＡ１０１−３で染色した混合の第１世代神経細胞の全体（未分類）、陽性画分および陰性画分における、β−ＩＩＩ−チューブリンの発現を示す棒グラフである。陽性画分では、全体および陰性画分に比べて、β−ＩＩＩ−チューブリンの発現が明らかに高くなっている。
【図２２】図２２は、ニューロンの生存率を説明する棒グラフである。Ｐ１〜３子マウスから、ポリ−Ｄ−リジンコートへの選択的付着によって、第１世代ニューロンを単離した。成熟するまで５日間放置してから、規定濃度の化合物を２４時間添加した。ＭＴＳアッセイ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用い、説明書にしたがって生存率を評価した。
【図２３】図２３の上段は、５００ｎＭ  ＮｅｕＯで染色し、タイムラプス撮影によってニューロンの樹枝状突起形成を可視化することで映像化した、ＤＩＶ１培養ニューロンの映像静止画像を示す。図２３の下段は、神経前駆細胞からのニューロンの発達／分化をタイムラプス撮影したものを示す。ＮｅｕＯで明るく染色されたニューロンが、球体の内部から移動するのを見ることができる。
【図２４】図２４は、標的となるニューロンに共有結合し、親和性を強化するように設計された類似分子を示す。
【図２５】図２５は、親和性強化のためにＡｆｆｉＮｅｕＯ７およびＡｆｆｉＮｅｕＯ５系列を使用する代表的なスキームを示す。
【図２６】図２６は、ＰＥＴイメージングに関するいくつかの実施形態で用いられてもよいＮｅｕＯ−ＰＥＴを示す。
【図２７】図２７は、生ニューロン用のＮｅｕＲおよびＮｅｕＩＲ赤色蛍光プローブを示す。
【図２８】図２８は、ＭＫＨＡ１０１−３で染色し、倍率１０倍で撮影した胎児脳切片を示す。記録された画像は、この色素が、ニューロン染色と同様に、長い樹状突起を有する細胞を特異的に強調したことを示す。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
以下に、本発明の実施形態の例を説明する。
【０００９】
新種のトリアゾール誘導化４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ボディパイ）化合物が開示される。この化合物種は、２つの新規蛍光プローブを含み、１つは、まず最初に脂肪酸部位１に個別に結合するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）プローブであり、もう１つは、第１世代ニューロンを特異的に、かつ唯一染色するニューロン細胞プローブである。
【００１０】
ライブラリ設計−ストークスシフトが大きいアミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物
最近、クネーベナーゲル反応および蛍光体の完全性を保持する弱酸性の切断条件を採用した、固相ボディパイライブラリが初めて報告された（１２）。本発明は、銅触媒のアジド−アルキン環状付加反応（ＣｕＡＡＣ）を利用してアミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物（ＢＤＣおよびＭＫ）およびそれに対応するアセチル（ＡＣ）誘導体、クロロアセチル（ＣＡ）誘導体およびヒドロキシアセチル（ＨＡ）誘導体（１３）の第１ライブラリを調製する、独自のコンビナトリアル固相誘導体化方法に関する。特に、ボディパイコアの３位および５位のアミノ置換基と対になるトリアゾール部位を導入することで、蛍光化合物のストークスシフトが非常に大きくなった（７４〜１６０ｎｍ）。ストークスシフトが大きい色素は、励起スペクトルと発光スペクトルとの重なりが最小限に抑えられ、他の蛍光体よりも感度が上昇し、インビトロ用途におけるセンサとして一際優れた可能性を持つ。他の蛍光構造（例えばクマリン、スチリル）が、ストークスシフトを増大させるために改変されてきた一方、本明細書に開示されるＢＤＣおよびＭＫライブラリの化合物は、ボディパイ骨格に基づく、ストークシフトが大きい色素の初めての系統的な生成を表している。さらに、これらのアミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物は、環境変化に対する感受性を発揮する。本開示で特定される化合物は、環境感受性蛍光活性化センサとして機能する化合物である。このようなボディパイコア構造に固有の蛍光は、特定の環境で回復する。
【００１１】
設計、合成および光物理的特性
ＣｕＡＡＣは、効率が高く、強力で、かつ穏やかな反応条件を達成できるため、コンビナトリアル用途に非常に好ましい（１３、１４）。得られるトリアゾール環は、化学的に安定であり、蛍光コアの特定の位置において、得られる蛍光誘導体の分光波長を変化させ得る（１５、１６）。ボディパイ骨格の３位および５位に電子供与基および電子吸引基を組み込むことで、ストークスシフトを効果的に変更できることが、文献調査により明らかになった（１７〜１９）。ボディパイライブラリの合成のために、これらの報告に基づき、三官能性のボディパイアニリン（４、スキーム１）を設計した。この骨格は、多様化できる箇所を３つ有している。２つは、３位および５位の求電子部位であり、これらは、例えばＣｕＡＡＣおよび求核置換によってそれぞれ改変することができ（２０〜２４）、あと１つは、メソ位のアニリン部位であり、これはアセチル化によって改変することができる。
【００１２】
アミノ−トリアゾリルボディパイ化合物を合成する方法は２つ開発されている。すなわち、固相法と液相法である。液相法では、ボディパイ化合物をより大量に生産することができ、一方、固相法では、大規模な化合物ライブラリを構築するための実用的な経路が提供される。両方法を以下に詳述する。
【００１３】
固相合成
小規模な固相法によって、アミノ−トリアゾリルボディパイ化合物の大規模なライブラリを速やかに合成することができる。４のアニリン基はクロロトリチルクロリドポリスチレン（ＣＴＣ−ＰＳ）樹脂上に骨格を付加することを可能にする。続いて弱酸性条件下で切断することで、蛍光体の完全性は保持される（スキーム１）（１２）。ある実施形態において、他の塩素化された、または臭素化された固形支持体骨格を用いてもよい。
【００１４】
実施形態の一例において、４の合成は四段階からなり、全体の収率は３７％であった。１は、報告済みの方法（２５、２６）にしたがって、ｐ−ニトロベンズアルデヒドおよびピロールから容易に調製された。Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）による塩素化に続き、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ）で酸化することで２を得て、続いてこれをＢＦ３．ＯＥｔ２で処理して安定性の高いボディパイアナログ３を得た（２６、２７）。活性化鉄を用いて還元することで、定量的な収率の４を得た。次いで、標準的な結合条件を用いて、アニリンをＣＴＣ−ＰＳ樹脂に付加した。アジ化ナトリウムで処理することにより、まずアミン基本単位を用いた一置換（スキーム３）、次いでアルキン基本単位を用いたＣｕＡＣＣ（スキーム４）によって多様性が導入された二置換アジ化中間体を生成した。ＣＨ２Ｃｌ２中０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による最終切断によって、最小限の精製工程で平均純度が９５％のＢＤＣライブラリおよびＭＫライブラリから構成される該当アミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物を得た。これらの化合物は、機能性を付加するための酸塩化物基本単位によってさらにアセチル化することが可能な遊離アニリンを有しており、対応するアセチル（ＡＣ）誘導体、クロロアセチル（ＣＡ）誘導体、アセトキシアセチル（ＡＡ）誘導体およびヒドロキシアセチル（ＨＡ）誘導体を生じる（スキーム５）。ある実施形態において、ＣＡタグはタンパク質標識に有用であり、一方いくつかのＭＫ化合物に結合されたＨＡタグは、第１世代ニューロンに対して特異的な蛍光応答を有している。またある実施形態において、ＡＡタグおよびその他の同様の誘導体は、無傷の生細胞への透過性が増大した、有用な疎水性ＨＡ前駆体となり得る。続く細胞エステラーゼによる加水分解によって、活性ＨＡ化合物が遊離される。
【００１５】
【化１】
0006300380.tif 000002
【００１６】
試薬および条件：（ａ）ピロール、ＴＦＡ、室温、３時間；（ｂ）ＮＣＳ，乾燥ＴＨＦ、−７８℃〜室温、３時間；（ｃ）ＤＤＱ、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２，室温、１時間；（ｄ）ＢＦ３ＯＥｔ２、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、室温、２時間；（ｅ）活性化Ｆｅ、ＣＨ３ＯＨ：ＣＨ３ＣＯＯＨ（１０：１）、還流、１５分；（ｆ）ＣＴＣ−ＰＳ樹脂、ＤＩＥＡ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ、室温、２４時間；（ｇ）ＮａＮ３、ＤＭＦ、室温、３０分；（ｈ）ＤＭＦ：ピペリジン（４：１）、室温、４５分；（ｉ）ＤＭＦ：Ｒ２Ｒ３ＮＨ（４：１）、室温、１時間；（ｊ）Ｒ１−Ｃ≡ＣＨ、ＣｕＩ、アスコルビン酸、室温、３０分；（ｋ）ＣＨ２Ｃｌ２中０．５％  ＴＦＡ；（ｌ）Ｒ４ＣＯＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、室温、１０分；（ｍ）ＣＨ３ＣＯＯＣＨ２ＣＯＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、室温、１０分；（ｎ）Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ、室温、１時間。化合物５中の黒っぽい球体は、クロロトリチルポリスチレン樹脂を表す。
【００１７】
液相合成
他の実施形態において、色素の大量合成に、ＢＤＣ化合物およびＭＫ化合物を生じる液相法が用いられる（スキーム２）。実施形態の一例において、固相法で述べたのと同様に、化合物１、２および３を合成した。続いて、アミノ基およびトリアゾリル基を３に付加した。まず、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶媒中約２．２当量のアジ化ナトリウムで化合物３を処理し、二置換アジ化中間体を生じた。直後に、精製することなく、各アミン基本単位の１当量で求核置換を行った（スキーム３）。反応終了後、ＤＭＦを除去し、粗混合物をｔｅｒｔ−ブタノール溶媒に再溶解してから、適切なアルキン基本単位を用いてＣｕＡＡＣを行った（スキーム４）。最後に、活性化鉄でニトロベンゼン部位を還元することで、該当するＢＤＣ化合物およびＭＫ化合物を得た。これらは、場合によっては、固相合成で述べた工程を用いてさらにアセチル化され、該当するアセチル（ＡＣ）誘導体、クロロアセチル（ＣＡ）誘導体、アセトキシアセチル（ＡＡ）誘導体およびヒドロキシアセチル（ＨＡ）誘導体を生じさせる（スキーム５）。
【００１８】
【化２】
0006300380.tif 000003
【００１９】
試薬および条件：（ａ）ピロール、ＴＦＡ、室温、３時間；（ｂ）ＮＣＳ，乾燥ＴＨＦ、−７８℃〜室温、３時間；（ｃ）ＤＤＱ、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２，室温、１時間；（ｄ）ＢＦ３ＯＥｔ２、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、室温、２時間；（ｅ）ＮａＮ３（２．２当量）ＤＭＦ、室温、３０分；（ｆ）ピペリジン（１当量）、ＤＭＦ、室温；（ｇ）Ｒ２Ｒ３ＮＨ（１当量）、ＤＭＦ、室温、１時間；（ｈ）Ｒ１−Ｃ≡ＣＨ、ＣｕＩ、アスコルビン酸、ｔＢｕＯＨ、室温；（ｉ）活性化Ｆｅ、ＣＨ３ＯＨ：ＣＨ３ＣＯＯＨ（１０：１）、還流；（ｊ）Ｒ４ＣＯＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、室温、１０分；（ｋ）ＣＨ３ＣＯＯＣＨ２ＣＯＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、室温、１０分；（ｌ）Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ、室温、１時間。
【００２０】
ある実施形態において、本発明のアミン基本単位は、例えばＨＮＲｘＲｙで表される一級アミンおよび二級アミンを含み、ここでＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立してＨ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、これらはそれぞれ、場合によっては、任意の位置で１〜５つの置換基と置換され、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−Ｓｉ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＨ、−Ｂ（ＯＨ）２、−Ｏトシル、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルコキシル）、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）またはハロゲンからそれぞれ選択される。好ましい実施形態において、置換基はヒドロキシル基を有しない。他の実施形態において、Ｒｘ置換基およびＲｙ置換基は、ピペリジンおよびピロリジンなどの環状アミノ基を含むように、一緒に環を形成してもよく、モルホリンのようにヘテロ原子を含んでもよい。環状アミノ基は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つの置換基によって置換され、または、場合によっては、他の環構造、例えば芳香族環構造と融合される。芳香族環構造のオルト位、メタ位またはパラ位のいずれにおいても、置換を行うことができる。他のある実施形態において、アミン基本単位はベンジルアミンを含み、これは、場合によっては、それぞれ独立してＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−Ｓｉ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＨ、−Ｂ（ＯＨ）２、−Ｏトシル、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルコキシル）、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）またはハロゲンから選択される置換基と任意の１つまたは複数の位置で置換される。他の実施形態において、アミン基本単位はアミノベンゼンであり、ベンゼン環は、場合によっては、それぞれ独立してＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−Ｓｉ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＨ、−Ｂ（ＯＨ）２、−Ｏトシル、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルコキシル）、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）またはハロゲンから選択される置換基と任意の１つまたは複数の位置で置換される。本発明で用いられてもよいアミン基本単位の、ある実施形態の例を、スキーム３に示す。
【００２１】
【化３】
0006300380.tif 000004
【００２２】
本発明の、ある実施形態において、アルキン基本単位は、化学式Ｒ１−Ｃ≡ＣＨの化合物であり、ここでＲ１は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル，または（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールから選択され、さらに、Ｒ１は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換される。本発明で用いられてもよいアルキン基本単位の、ある実施形態の例を、スキーム４に示す。
【００２３】
【化４】
0006300380.tif 000005
【００２４】
【化５】
0006300380.tif 000006
【００２５】
本発明の、ある実施形態において、酸塩化物基本単位は、化学式Ｒ４ＣＯＣｌの構造を有しており、ここでＲ４は、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、これは、場合によっては、任意の位置において、ハロゲン、ヒドロキシル、−ＮＨ２、ＮＨ−アセチル、またはＯ−アセチルから独立して選択される１〜３つのさらなる置換基と置換される。酸塩化物の好ましい実施形態は、以下の置換を含む。Ｒ４がメチルの場合、ＡＣ誘導体が形成される（例えば、ＢＤＣＡＣまたはＭＫＡＣ）。Ｒ４がＣＨ２Ｃｌの場合、ＣＡ誘導体が形成される。同様に、Ｒ４がＣＨ２Ｘの場合、ＸＡ誘導体が形成される。ＡＡ誘導体は、Ｒ４がＣＨ２ＯＡｃである化合物を含み、ＨＡ誘導体は、ＣＨ２ＯＨに等しいＲ４を含む。
【００２６】
光物理的特性
本発明のアミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物の多くは、同じような吸収極大波長を示した（表１）が、その発光極大は非常に広い範囲にわたっていた。特に、ストークスシフトが大きいボディパイ色素の分光特性は、異なるアルキン基本単位によって微調整することができる。ある実施形態において、電子に富むアルキン（例えば、４−エチニル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）は、電子吸引基を含むアルキン（例えば、４−（トリフルオロメトキシ）フェニルアセチレン）よりも長波長の吸収波長を有する化合物を生じる。ＢＤＣ化合物およびＭＫ化合物が、光誘起電子移動（ＰｅＴ）効果により低い量子収量を示す（２８、２９）一方で、アニリン基のアセチル化によって、部分的に、平均で蛍光が７倍増加した蛍光発光が回復した。一方、一級アミン基本単位由来のＭＫ化合物は、蛍光量子収量においてさらに４〜７倍の増加を示した。理論に拘束されるものではないが、この現象は、遊離ＮＨとボディパイのフッ素との間に形成される分子内水素結合によるものであり、これによって構造の配座柔軟性が減少するため、蛍光が増加すると考えられる（３０）。この特性により、本発明のＢＤＣ化合物およびＭＫ化合物が、潜在的に調整可能な量子収量を有する蛍光活性化センサとして機能できることが確認される。
【００２７】
【表１】
0006300380.tif 000007
【００２８】
蛍光分子ロータとしてのアミノ−トリアゾリルボディパイ化合物
本発明のアミノ−トリアゾリルボディパイ化合物は、ボディパイコアの３位および５位に、自由回転可能なモチーフを有する。ある実施形態において、特定の環境が、このモチーフの回転を制限する。この環境は、適切な分析物との相互作用を含む。回転が制限されると、蛍光応答が活性化される。アミノ−トリアゾリルボディパイ化合物の分子ロータとしての特徴については、実施例２において、様々な粘度に及ぶ、同じような極性を有する異なる溶媒中のＢＤＣ−９のスペクトルを蛍光分析することで検証する。
【００２９】
ヒト血清アルブミンの特異プローブ
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、ヒト血漿中に最も多く存在するタンパク質である。ＨＳＡの循環濃度は約０．６ｍＭであり、浸透圧および生理学的ｐＨの維持において主たる役目を果たしている（３１）。尿中にＨＳＡが失われるアルブミン尿は、十分に確立された心血管のリスクマーカーであり、また、肝臓病および腎臓病の兆候である（３２、３３）。より重要なことに、この信じられないほどに可塑性のタンパク質は、ホルモン、脂肪酸および薬剤分子など、多岐にわたる極めて重要なリガンドの主たるトランスポータである。したがって、努力を重ねて、薬剤の結合部位の同定及び生物流体中のＨＳＡの検出、定量を可能にする、鋭敏で部位特異的な蛍光プローブの開発が行われてきた。
【００３０】
ＨＳＡは、９つの結合部位からなり（３４〜３８）、そのうち、脂肪酸（ＦＡ）部位１、３および４（サドロウ（Ｓｕｄｌｏｗ）部位ＩＩ）、５、６および７（サドロウ（Ｓｕｄｌｏｗ）部位Ｉ）が薬剤化合物に対する親和性を有することが知られている（３１、３９〜４４）。したがって、平易な拮抗アッセイに適用可能な蛍光プローブを設計して、薬剤結合部位を同定することが、大いに必要とされている。ＦＡ部位３、４、６および７に対するプローブの開発がこれまでに成功している（４５〜６１）。しかし、残りの部位に対する蛍光プローブはない。ＨＳＡの異なる部位は、異なる物理的特性を有し、薬剤の薬物動態において重要な役目を果たしている。したがって、ＨＳＡの結合部位または薬剤の部位を同定することは、極めて重要である。ＨＳＡの異なる部位に特異的に結合する蛍光化合物は、平易な拮抗アッセイを用いて薬剤の結合部位をプローブする便利な手段となり得る。ＨＳＡの脂肪酸１または５に対する結合親和性を有する選択的蛍光プローブを開発することが必要とされている。
【００３１】
本発明のアミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物は、ヒト血清アルブミンなどの生体分析物に対する蛍光プローブとして特に有用である。特に、式（Ｉ）の化合物は、ＨＳＡに対する選択性を示し、ここで式（Ｉ）は、
【００３２】
【化６】
0006300380.tif 000008
であり、
Ｒ１はＨまたはＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであって、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、場合によっては、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｏ−アセチル、ＮＨ−アセチル、または−ＮＨ２から選択される１〜３つの置換基と任意の位置で置換されており、
Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、ここでＲ２およびＲ３は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−Ｓｉ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＨ、−Ｂ（ＯＨ）２、−Ｏトシル、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルコキシル）、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）またはハロゲンから選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
または、Ｒ２およびＲ３は、一緒に環を形成しており、その環は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つのさらなる置換基と置換されており、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、または（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであり、さらにＲ４は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されている。
【００３３】
さらに特定の実施形態において、式（ＩＩ）：
【００３４】
【化７】
0006300380.tif 000009
の化合物は、ＨＳＡのＦＡ１部位に対して選択的である。
【００３５】
ある実施形態において、本発明は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する蛍光プローブであり、式（ＩＩ）の化合物を含む。
【００３６】
他の実施形態において、本発明は、生物流体試料中のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を検出する方法であり、該方法は、
ＨＳＡを含むと考えられる生物流体試料を、式（Ｉ）の化合物と接触させてインキュベーション用反応液を作製すること、
インキュベートされた混合物の作製に十分な条件下において、インキュベーション用反応液をインキュベートすること、および
ＨＳＡを含む試料が存在しない場合の式（Ｉ）の化合物の蛍光シグナルに比べて、混合物の蛍光シグナルが増加することによって、ＨＳＡの存在が示される蛍光顕微鏡法によって混合物を分析すること、
を含む方法である。
【００３７】
ＨＳＡを検出する方法の、ある実施形態において、蛍光シグナル強度の測定値は、試料中に存在するＨＳＡの濃度に比例する。ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）の構造を有する。本明細書において、「インキュベートする」とは、機械的手段または拡散作用のいずれかによって、混合することを意味し得る。インキュベートすることは、温度プロファイルを維持することをさらに含み得る。ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、基準となる蛍光を有する。したがって、ＨＳＡの存在を求める分析方法において、式（Ｉ）の基準となる蛍光と比べて、例えば蛍光シグナルの増加または発光極大波長の変化などの蛍光の変化により、標的となる分析物が示される。生ニューロンを可視化する方法は、蛍光顕微鏡法を含む。式（Ｉ）の化合物の蛍光シグナルを測定する蛍光顕微鏡法は、一般的な蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、二光子顕微鏡法、および高分解（例えばＳＴＯＲＭ）顕微鏡法を含む。
【００３８】
ＨＳＡのＸ線結晶学的研究により、ＦＡ１部位は、重要な薬剤結合部位であることがわかった。既存の蛍光プローブと比較して、本発明のアミノ−トリアゾリルボディパイ化合物は、平易な結合拮抗アッセイでＨＳＡのＦＡ１部位に結合する薬剤の直接的なプロービングに用いることができる。この蛍光色素は、ＨＳＡに結合すると、非常に強い蛍光を発する。ＦＡ１部位に対する親和性を有する薬剤は、蛍光色素と、部位への結合で拮抗する。このため、本発明の別の実施形態において、本発明は、ＨＳＡのＦＡ１部位に結合する薬剤を評価する方法を含み、該方法は、色素の蛍光の減少をモニターする。この方法は、また、薬剤の結合強度の基準も提供する。
【００３９】
第１世代ニューロンの特異プローブ
神経機能を制御する複雑なニューロンネットワークを解明することは、長い間、脳内のニューロン接続のもつれをマッピングすることでヒトの考えを解読することが可能であると信じる神経科学者のなかで興味の対象になっていた（８２）。また、非常に多くのニューロンを標識するこのような方法も、これらの複雑な細胞を可視化できるように進歩してきている。これらの方法は、ゴルジ法、ニッスル染色、さらにはフラ（Ｆｕｒａ）およびディル（Ｄｉｌ）などのカルシウム色素を含む（８３）。しかしながら、確立されたニューロン標識化色素のほとんどは、固定組織標本で最もよく作用するか、またはニューロンに対する選択性がなく、むしろ、生細胞において所望の効果を達成するためには、逆行性標識化または手動の注入に依存している（８４）。上述した色素とは別に、今までのところ、インビトロまたはインビボの環境において生ニューロンを特異的に標識することができる化学色素は存在しない。
【００４０】
ニューロン化合物の有用性により、抗体および遺伝子導入動物を使用する必要性はなくなった。ニューロンマーカーは、そのほとんどが細胞内にあるため（例えば、β−ＩＩＩ−チューブリン、ＭＡＰ２、ＮｅｕＮ）、細胞透過性（それ故、細胞死）を必要とするので、このニューロン化合物はニューロンの場合に特に有用である。広範囲の蛍光タンパク質発現ニューロンマウスモデルが入手可能であるが、蛍光タンパク質の発現は、動物の発生を通して均一ではない（例えば、Ｔｈｙ１遺伝子導入マウス系統におけるＣｒｅ−リコンビナーゼの活性化に要する時間など）（８５）。このように、、いまだ研究が困難なニューロン発生の空白期間があり、最もよい蛍光タンパク質発現に対して異なるニューロンモデルをそれぞれ必要と考えられる。また、蛍光タンパク質の発現を組み込むことで、細胞機能を阻害することが考えられ、これにより、これらの遺伝子導入モデルから機能的な結果を導くことが困難になる（８６）。
【００４１】
細胞単離に対する良好なニューロンマーカーがないことも問題となっている（８７）。一般的に、ニューロンは、単離して培養するのが困難である。成長したニューロンも、培養条件および単離条件が適切であれば、単離してインビトロで培養することができることが明らかになっているが（８８）、ニューロンは、おそらく発生の早い段階で可塑性が増加するために、胎児および出生後の段階で生存率が最も高く、インビトロでの培養に寛容である。レンチウイルストランスフェクションを使用することも、目的のニューロン集団を選択的に標識する方法として普及している（８９）。現在のニューロン標識方法は抗体標識を伴っており、このために細胞の生存率または蛍光タンパク質の発現のための遺伝子導入による変異が低下し、細胞固有の機能に影響することがある。市販されているニューロン標識色素の大部分は、ニューロン特異性がなく、むしろ、ニューロンを標識するために、逆行性標識化またはマイクロインジェクションに依拠している。しかしながら、これらの方法は、多くの時間を必要とし、しばしば標識効率が低いという問題を生じる。生ニューロンを標識することが可能で、上述した方法論のいくつかによって課される制限なしに、広範囲の細胞トラッキングおよび細胞単離への応用を可能とする蛍光色素が必要とされたままである。
【００４２】
本発明のアミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物は、第１世代ニューロンに対する蛍光プローブとして特に有用である。本開示の化合物によって、他の神経細胞よりも生ニューロンに特異的な標識化が達成される。遺伝的背景にかかわらず、一般的に、すべてのニューロン細胞の標品に、これを適用することができ、多くの用途で有用である安定な蛍光シグナルが得られる。具体的には、式（Ｉ）の化合物は、生ニューロン染色に対する選択性を示し、ここで式（Ｉ）は、
【００４３】
【化８】
0006300380.tif 000010
であり、
Ｒ１は、ＨまたはＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、場合によっては、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｏ−アセチル、ＮＨ−アセチル、または−ＮＨ２から選択される１〜３つの置換基と任意の位置で置換されており、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、ここでＲ２およびＲ３は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−Ｓｉ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＨ、−Ｂ（ＯＨ）２、−Ｏトシル、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルコキシル）、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）またはハロゲンから選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されており、
または、Ｒ２およびＲ３は、一緒に環を形成しており、その環は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つのさらなる置換基と置換されており、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、または（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであり、さらにＲ４は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されている。
【００４４】
さらに特定の実施形態において、式（ＩＩＩ）：
【００４５】
【化９】
0006300380.tif 000011
の化合物は、生ニューロン染色に対して選択的であり、
ここで、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、式（Ｉ）で定義されるとおりである。
【００４６】
他の特定の実施形態において、式（ＸＩＶ）：
【００４７】
【化１０】
0006300380.tif 000012
の化合物は、生ニューロン染色に対して選択的であり、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、または（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであり、さらにＲ４は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基により任意の位置で置換されており、
Ｒ５は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−Ｓｉ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＨ、−Ｂ（ＯＨ）２、−Ｏトシル、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルコキシル）、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）またはハロゲンから選択される１〜５つの置換基により任意の位置で存在する。
【００４８】
さらに別の特定の実施形態において、生ニューロンに対して選択的な染料は、式（Ｖ）：
【００４９】
【化１１】
0006300380.tif 000013
の化合物である。
【００５０】
ある実施形態において、本発明は、生ニューロンの特異的染色のための蛍光色素である。ある実施形態において、この色素は、式（ＸＶ）：
【００５１】
【化１２】
0006300380.tif 000014
の化合物であり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルであり、
ここで（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ０−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリール、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニルおよび（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルは、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−Ｓｉ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＨ、−Ｂ（ＯＨ）２、−Ｏトシル、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルコキシル）、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）またはハロゲンから選択される１〜５つのさらなる置換基により任意の位置で置換されており、
または、Ｒ２およびＲ３は、一緒に環を形成しており、その環は、場合によっては、ハロゲンまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される１〜５つのさらなる置換基と置換されており、
Ｒ６はＨまたはＣＯ（ＣＨ３）であり、
Ｒ７は、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、または（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールであり、さらにＲ７は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールオキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、アミノ、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルケニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ２−Ｃ６アルキニル）、−ＮＨ（ＣＯ）（Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル）、ハロ、ＯＣＦ３、ＣＦ３、ヒドロキシル、またはハロゲン放射性同位体から選択される１〜５つの置換基と任意の位置で置換されている。
【００５２】
他の実施形態において、本発明は、細胞培養中の生ニューロンを可視化する方法であり、該方法は、細胞培養液を、式（Ｉ）の化合物と接触させてインキュベーション用反応液を作製すること、生ニューロンを染色するのに十分な条件下において、インキュベーション用反応液をインキュベートすること、および染色された生ニューロンを蛍光顕微鏡法によって可視化すること、を含む。
【００５３】
ある実施形態において、この方法は、式（ＸＩＶ）または式（Ｖ）の構造を有する式（Ｉ）の化合物を利用する。ある実施形態において、この方法は、インビトロ用途に用いられる。また他のある実施形態において、この方法は、インビボ用途に用いられる。ここで、「インキュベートする」とは、機械的手段または拡散作用のいずれかによって、混合することを意味し得る。インキュベートすることは、温度プロファイルを維持することをさらに含み得る。生ニューロンを可視化する方法は、蛍光顕微鏡法を含む。また他のある実施形態において、例えば１８Ｆを含む化合物に対して、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）技術を用いてもよい。蛍光顕微鏡法は、一般的な蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、二光子顕微鏡法、および高分解（例えばＳＴＯＲＭ）顕微鏡法を含む。
【００５４】
ある実施形態において、本発明のニューロン色素によって、神経細胞のインビトロでの培養／アッセイにおけるニューロンの生存率、発達、および樹枝状突起形成がモニターされる。本明細書に開示される色素を他の蛍光細胞標識と組み合わせて、細胞間相互作用について研究することもできる。色素を、脳切片やインビボでの二光子によるニューロンイメージングまたは動物の全身イメージングに用いることもできる。ニューロン色素は、レット症候群やパーキンソン病などの疾患モデルに用いられてもよく、その場合、病因のニューロン変性をモニターするのに用いることができる。
【００５５】
定義
「アルキル」とは、飽和脂肪族の分岐状または直鎖状一価炭化水素基を意味し、典型的にはＣ１−Ｃ１０であり、好ましくはＣ１−Ｃ６である。「（Ｃ１−Ｃ６）アルキル」とは、直鎖状または分岐状に配置された炭素原子を１〜６つ有する基を意味する。「（Ｃ１−Ｃ６）アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルを含む。
【００５６】
「アルキレン」とは、飽和脂肪族の直線状二価炭化水素基を意味する。したがって、「（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン」とは、直線状に配置された炭素原子を１〜６つ有する二価の飽和脂肪族基を意味する。「（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン」は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレンおよびへキシレンを含む。
【００５７】
「複素環」とは、窒素原子を１つと、場合によってはＮ、ＯまたはＳから独立して選択されるヘテロ原子をさらに１つ含む、飽和または部分不飽和の（３〜７員）単環複素環を意味する。１つのヘテロ原子がＳの場合、場合によっては、一酸素化または二酸素化（すなわち、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−）され得る。単環複素環の例としては、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ヘキサヒドロピリミジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、モルホリン、チオモルホリン、チオモルホリン１，１−ジオキシド、テトラヒドロ−２Ｈ−１，２−チアジン、テトラヒドロ−２Ｈ−１，２−チアジン１，１−ジオキシド、イソチアゾリジン、またはイソチアゾリジン１，１−ジオキシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
「シクロアルキル」とは、飽和脂肪族環状炭化水素環を意味する。したがって、「Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル」とは、（３〜８員）飽和脂肪族環状炭化水素環を意味する。Ｃ３−Ｃ８シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルを含むが、これらに限定されない。シクロアルキルは、好ましくはＣ１−Ｃ６シクロアルキルである。
【００５９】
「アルコキシ」なる語は、−Ｏ−アルキルを意味し、「ヒドロキシアルキル」なる語は、ヒドロキシで置換されたアルキルを意味し、「アラルキル」なる語は、アリール基で置換されたアルキルを意味し、「アルコキシアルキル」なる語は、アルコキシ基で置換されたアルキルを意味し、「アルキルアミン」なる語は、アルキル基で置換されたアミンを意味し、「シクロアルキルアルキル」なる語は、シクロアルキルで置換されたアルキルを意味し、「ジアルキルアミン」なる語は、２つのアルキル基で置換されたアミンを意味し、「アルキルカルボニル」なる語は、−Ｃ（Ｏ）−Ａ＊を意味し、ここでＡ＊はアルキルであり、「アルコキシカルボニル」なる語は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＡ＊を意味し、ここでＡ＊はアルキルであり、アルキルについては上記で定義した通りである。アルコキシは、好ましくはＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシおよびヘキソキシを含む。
【００６０】
「シクロアルコキシ」は、シクロアルキル−Ｏ−基を意味し、ここでシクロアルキルは上記で定義した通りである。（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキルオキシ基の例としては、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペントキシ、シクロヘキソキシおよびシクロヘプトキシが挙げられる。
【００６１】
「ヘテロ」とは、環構造中の少なくとも１つの炭素原子が、Ｎ、Ｓ、およびＯから選択される少なくとも１つのヘテロ原子と置換していることをいう。ヘテロ環構造は、炭素原子が１つまたは２つ、ヘテロ原子と置換していてもよい。
【００６２】
「ハロゲン」および「ハロ」は、本開示では置き換え可能に用いられ、これらの各々は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を参照する。
【００６３】
「シアノ」とは、−Ｃ≡Ｎを意味する。
【００６４】
「ニトロ」とは、−ＮＯ２を意味する。
【００６５】
本開示で用いられているように、アミノ基は、一級（−ＮＨ２）、二級（−ＮＨＲｘ）、または三級（−ＮＲｘＲｙ）であってよく、ここで、ＲｘおよびＲｙは、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、シクロアルキルまたはアルケニレンのいずれであってもよく、それぞれ場合によっては、独立して上記１つ以上の置換基で置換される。ＲｘおよびＲｙ置換基は、一緒に「環」を形成してもよく、ここで、本開示の「環」は、ピペリジンおよびピロリジンなどの環状アミノ基であり、例えばモルホリンのようにヘテロ原子を含んでもよい。
【００６６】
「ハロアルキル」、「ハロシクロアルキル」および「ハロアルコキシ」なる語は、場合に応じて、１つ以上のハロゲン原子で置換されたアルキル、シクロアルキル、またはアルコキシを意味する。「ハロゲン」なる語は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。ハロアルキルまたはハロアルコキシ中のハロゲンは、好ましくはＦである。
【００６７】
「アシル基」なる語は、−Ｃ（Ｏ）Ｂ＊を意味し、ここで、Ｂ＊は、場合によっては置換されたアルキル基またはアリール基（例えば、場合によっては置換されたフェニル）である。
【００６８】
「アルキレン基」は、−［ＣＨ２］ｚ−で表され、ここでｚは正の整数であって、好ましくは１〜８であり、より好ましくは１〜４である。
【００６９】
「アルケニレン基」は、少なくとも一組の隣り合うメチレンが、−ＣＨ＝ＣＨ−で置換されたアルキレンである。
【００７０】
単独で、または「アリールアルキル」、「アリールアルコキシ」、「アリールオキシ」、または「アリールオキシアルキル」中にあるようなより大きい部位の一部として用いられる「Ｃ６−Ｃ１６アリール」なる語は、炭素環式芳香族環を意味する。「炭素環式芳香族環」なる語は、「アリール」、「アリール環」、「炭素環式芳香族環」、「アリール基」および「炭素環式芳香族基」なる語と置き換え可能に用いられることがある。アリール基は、典型的には６〜１６個の環原子を有する。「置換アリール基」は、１つ以上の置換可能な環原子のいずれかが置換されたものである。本開示における「Ｃ６−Ｃ１６アリール」なる語は、６〜１６個の炭素原子を含む、単環式、二環式または三環式の炭素環式環状構造を意味し、フェニル（Ｐｈ）、ナフチル、アントラセニル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどを含む。（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基の（Ｃ１−Ｃ６）アルキル部を通して、分子の残りの部位と結合している。
【００７１】
ベンジル（Ｂｎ）なる語は、−ＣＨ２Ｐｈのことである。
【００７２】
単独で、または「ヘテロアリールアルキル」または「ヘテロアリールアルコキシ」中にあるようなより大きい部位の一部として用いられる「ヘテロアリール」、「複素芳香族」、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」および「複素芳香族基」なる語は、炭素および少なくとも１つ（典型的には１〜４つ、より典型的には１つまたは２つ）のヘテロ原子（例えば、酸素、窒素または硫黄）から選択される、合計で５〜１４個の環原子を有する芳香族環基のことである。それらは、単環、および単環式複素芳香族環が１つ以上の他の炭素環式芳香族環または複素芳香族環と融合した多環を含む。本開示における「５〜１４員ヘテロアリール」なる語は、１つまたは２つの芳香族環を含み、他に断らない限り、合計５〜１４個の原子のうち、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つがＮ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）、ＯおよびＳから独立して選択されるヘテロ原子である、単環式、二環式または三環式環構造を意味する。（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールは、フリル、チオフェニル、ピリジニル、ピロリル、イミダゾリルを含み、本発明の好ましい実施形態において、ヘテロアリールは、（Ｃ３−Ｃ１０）ヘテロアリールである。
【００７３】
「２〜４員ポリシクリル」なる語は、２〜４つの炭化水素のループ構造または環状構造を有する環状化合物（例えば、ベンゼン環）のことである。一般的に、この語は、多環式芳香族炭化水素、硫黄、窒素、酸素、または別の非炭素原子を含む複素環式芳香族化合物、およびこれらの置換誘導体を含む、すべての多環式芳香族化合物を含む。
【００７４】
「アルケニル」なる語は、少なくとも１つの二重結合を含む直鎖状または分岐状炭化水素基を意味する。（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル基は、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルの（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル部を通して、分子の残りの部位と結合している。同様に、「アルキニル」なる語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖状または分岐状炭化水素基を意味する。
【００７５】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩も含まれる。例えば、アミンまたは他の塩基性基を含む本発明の化合物を適切な有機酸または無機酸と反応させることで、その化合物の酸性塩を得ることができ、これは、薬学的に許容されるアニオン性塩の形態となる。アニオン性塩の例としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物塩、エデト酸カルシウム塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物塩、クエン酸塩、二塩化水素化物塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グリセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、ヒドロキシナフトン酸塩、ヨウ化物塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸／二リン酸塩、ポリガラクツロ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トルエンスルホン酸塩、およびトリヨウ化エチル塩が挙げられる。
【００７６】
カルボン酸または他の酸性官能基を含む本発明の化合物の塩は、適切な塩基と反応させることで調製することができる。このような薬学的に許容される塩は、薬学的に許容されるカチオンを提供する塩基を用いて調製されてもよく、アルカリ金属塩（特にナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属塩（特にカルシウムおよびマグネシウム）、アルミニウム塩およびアンモニウム塩を含み、さらには、トリメチルアミン、トリエチルアミン、モルホリン、ピリジン、ピペリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、２−ヒドロキシエチルアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、トリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、プロカイン、ジベンジルピペリジン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ビスデヒドロアビエチルアミン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、コリジン、キニン、キノリン、ならびにリジンおよびアルギニンなどの塩基性アミノ酸などの生理学的に許容される有機塩基から調製される塩も含む。
【００７７】
固形支持樹脂は、固相合成に用いられる。このような例の１つは、「ＣＴ−ＰＳ樹脂」である。具体的には、２−クロロトリチル−ポリスチレンである。
【００７８】
「細胞抽出液」とは、溶解された細胞から、遠心分離によって不溶物が除去されたものである。
【００７９】
「組織切片」とは、分析に適した組織の一部である。組織切片とは、単一の組織切片または複数の組織切片のことであり得る。
【００８０】
「生物流体」とは、生体由来の液体または気体である。本出願において、生物流体は、血液、血漿、尿、唾液、および粘液を含み得る。
【００８１】
本開示において、「分光法」は、放射されたエネルギーで物質を反応させるいずれの方法も包含する。これは、顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、紫外線／可視光線分光法、およびフローサイトメトリーを含むが、これらに限定されるわけでは決してない。
【００８２】
本開示において、「化学反応性部位」とは、生体分析物を検出するのに有用で、蛍光物質のような、低分子量で、構造または化合物に組み込むことができる非タンパク質化合物のことである。本発明の好ましい実施形態において、化学反応性部位は、それ自体の構造中の原子または共有結合性化学結合基のいずれかによって、蛍光物質と共有結合する。本発明で用いるのに重要な化学反応性部位の性質は、生体分析物との結合能である。ある好ましい実施形態において、化学反応性部位は、ある生体分析物に対して選択的に結合する。このような化学反応性部位の例としては、アクリロイル基、ハロアセチル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン、マレイミド、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート、ビニルスルホン、ヒドラジド、アルコキシアミン、アリールアジド、ベンゾフェノン、およびイソシアネートが挙げられる。好ましい実施形態において、化学反応性部位は、アビジンと結合して検出を行うビオチン、または光反応性架橋剤として作用するジアジリン部位である。紫外線（３６０  ｎｍ）の照射によって、ジアジリンからカルベンが生じ、その後、生体分析物中に存在する近くの求核基と反応して共有結合を形成する。
【実施例】
【００８３】
実施例１．ＢＤＣボディパイ化合物およびＭＫボディパイ化合物の合成
材料
市販されている試薬、溶媒およびタンパク質は、すべて、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、アルファ・エーサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、メルク（Ｍｅｒｃｋ）またはアクロス（Ａｃｒｏｓ）から購入し、他に断りがない限り、そのまま使用した。ＣＨ２Ｃｌ２（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、分析用グレード）を、窒素下で、Ｐ２Ｏ５を用いて新しく蒸留した。アルファ・エーサーから無水ＴＨＦを購入し、さらに精製することなく用いた。ダルベッコＰＢＳバッファー（１×）の調製法を下記のように変更して、リン酸バッファーを調製した：０．２ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、２．１７ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０００ｍＬ  ＭｉｌｌｉＱＴＭ  Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．３。
【００８４】
分析
ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＡＣＦ３００（３００ＭＨｚ）分光計、ＤＰＸ３００（３００ＭＨｚ）分光計およびＡＭＸ５００（５００ＭＨｚ）分光計を用いて、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１９Ｆ−ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを記録した。フィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）／ＭＡＴ９５ＸＬ−Ｔ分光計を用いて、高解像度質量スペクトル（ＥＳＩ）を得た。スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）Ｍ２分光光度計（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））を用いて、分光学的データおよび量子収量のデータを測定した。グラフプリズム（ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ）５．０を用いてデータを解析した。ＤＡＤ検出器を有するＨＰＬＣ−ＭＳ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）−１２００シリーズ）およびＥＳＩプローブを有するシングル四重極型質量分析計（６１３０シリーズ）を用いて、分析評価を行った。分析ＨＰＬＣ法：溶離液Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ＨＣＯＯＨ）、溶離液Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＨＣＯＯＨ）、勾配５％Ｂ〜９５％Ｂ（１０分）。逆相フェノメネックスＣ１８ルナ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８  Ｌｕｎａ）カラム（４．６×５０ｍｍ２、粒径３．５μｍ）、流速：１ｍＬ／分。
【００８５】
量子収量の測定
蛍光スペクトルの積分した発光面積を測定し、ＥｔＯＨ中４６０ｎｍで励起したときのアクリジンイエローについて測定した面積と比較することで、量子収量を計算した（
【００８６】
【数１】
0006300380.tif 000015
）。アミノ−トリアゾリル−ボディパイの量子収量は、以下の等式を用いて計算した。ここで、Ｆは蛍光発光の面積を表し、ηは溶媒の屈折率であり、Ａｂｓは標準および試料について選択された励起波長における吸光度である。５１０〜７００ｎｍの間で、発光を積分した。
【００８７】
【数２】
0006300380.tif 000016
【００８８】
合成
固相上でＢＤＣライブラリ化合物およびＭＫライブラリ化合物を調製する一般的な手順：
２−クロロトリチルクロリド樹脂（２２０ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３．０ｍＬ）中で１５分間膨潤させた。４（３０ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２００μＬ、１．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ：ＣＨ２Ｃｌ２（１：１、２ｍＬ）からなる溶液を樹脂懸濁液に加え、室温で２４時間振盪し、その後、樹脂をＭｅＯＨ（０．４ｍＬ、１．８ｍＬ／ｇ樹脂）およびＤＩＥＡ（１００μＬ）で１２時間覆った。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（４×１０ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（４×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた。付加された樹脂をＣＨ２Ｃｌ２に再懸濁し、室温で１５分間振盪し、ＤＭＦで洗浄した。ＮａＮ３（５０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３．０ｍＬ）懸濁液を加え、反応混合物を室温でさらに３０分間振盪した。ＤＭＦ（４×１０ｍＬ）で洗浄した後、ＤＭＦ：ピペリジン（４：１）溶液（４．０ｍＬ）を加え、反応液を４５分間振盪した。続いて、アルキン（０．８５４ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（６５ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸（６０ｍｇ、３４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をさらに３０分間振盪した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ（４×１０ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（４×１０ｍＬ）で洗浄し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２中０．５％ＴＦＡで切断した（３×１５ｍＬ、各１０分）。有機抽出物を回収し、真空で濃縮した。シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２〜ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（９８：２））で残渣を精製し、対応するＢＤＣライブラリ化合物およびＭＫライブラリ化合物を、オレンジ色の固体として得た（概して約１６ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、収率７０％）。表２および５に、具体的な化学構造、ならびに２５４ｎｍにおける純度パーセント、計算上の質量および実験的に決定された質量、吸収スペクトルおよび発光スペクトルのλｍａｘ、および量子収量（φ）を含む詳細な特徴データを示す。
【００８９】
液相中でＢＤＣライブラリ化合物およびＭＫライブラリ化合物を調製する一般的な手順：
３（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１ｍＬ）溶液に、ＮａＮ３（３４ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。その後、対応するアミン（０．２６ｍｍｏｌ）を加え、反応液をさらに１時間攪拌した。反応混合物を真空蒸発に供し、ｔ−ＢｕＯＨ：ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（４：１：１）（１ｍＬ）に再溶解し、続いて、アルキン（０．２６ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸（４６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。有機溶媒を真空中で蒸発させ、得られた残渣を水（２０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭで抽出した（２０ｍＬ×３）。有機抽出物を合わせて、真空中で濃縮し、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィで精製した。得られた残渣をＥｔＯＨ（１ｍＬ）および酢酸（０．１  ｍＬ）に溶解し、９０℃に加熱した。鉄粉（２８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の懸濁液を１Ｍ  ＨＣｌで１分間活性化し、無水ＥｔＯＨでリンスし、反応混合物に加えた。反応終了後、鉄を除去し、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（３×２０ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物を飽和ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空蒸発に供することで、対応するＢＤＣライブラリ化合物およびＭＫライブラリ化合物を、オレンジ色の固体として得た（概して約３５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、全収率２４％）。表２および５に、具体的な化学構造および詳細な特徴データを示す。
【００９０】
ＢＤＣＡＣライブラリ化合物、ＢＤＣＣＡライブラリ化合物、ＭＫＡＣライブラリ化合物およびＭＫＣＡライブラリ化合物を調製する一般的な手順：
各ＢＤＣ化合物およびＭＫ化合物（概して約６ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍＬ）溶液に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を６滴加え、０℃に冷却した。酸塩化物（概して〜１０μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）を１分かけて少しずつ加え、得られた混合物を室温で攪拌し、分析ＴＬＣでモニターした。反応終了後、反応液をＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）で希釈し、水（２×１５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１×１５ｍＬ）、飽和ブライン（１×１５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。有機抽出物を蒸発に供し、対応するＢＤＣＡＣ化合物、ＢＤＣＣＡ化合物、ＢＤＣＸＡ化合物、ＭＫＡＣ化合物、ＭＫＣＡ化合物またはＭＫＸＡ化合物をオレンジ色の固体として得た（概して約６ｍｇ、収率＞９０％）。表３、４、６および７に、具体的な化学構造および詳細な特徴データを示す。
【００９１】
ＭＫＨＡ化合物を調製する一般的な手順：
各ＭＫ化合物（概して約６ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍＬ）溶液に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を６滴加え、０℃に冷却した。アセトキシルアセチルクロリド（１０μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）を１分かけて少しずつ加え、得られた混合物を室温で攪拌し、分析ＴＬＣでモニターした。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２を蒸発させ、混合物をＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）に再溶解した。飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液を６滴加え、反応混合物を室温で攪拌し、分析ＴＬＣでモニターした。反応液をＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）で希釈し、水（２×１５ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（１×１５ｍＬ）、飽和ブライン（１×１５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。有機抽出物を蒸発に供し、対応するＭＫＨＡ化合物をオレンジ色の固体として得た（概して約６ｍｇ、収率＞９０％）。表８に、化学構造および詳細な特徴データを示す。
【００９２】
特定の化合物の調製手順および特徴データ：
２，２’−（（４−ニトロフェニル）メチレン）ビス（１Ｈ−ピロール）（１）．
４−ニトロベンズアルデヒド（１．０ｇ、６．６ｍｍｏｌ）のピロール（１０ｍＬ、１４４ｍｍｏｌ）溶液に、ＴＦＡ（０．５１ｍＬ、０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィで精製して（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、４：１）、鮮やかな黄色の固体として１を得た（１．６３ｇ、６．１０ｍｍｏｌ、収率９２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．１７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．９９（ｂｒ．ｓ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．９９（ｂｒ．ｓ，２Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），６．１８（ｄｄ，Ｊ＝５．８，２．９Ｈｚ，２Ｈ），５．８７（ｂｒ．ｓ，２Ｈ），５．５８（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１４４．７，１４４．２，１３２．２，１３０．５，１２３．８，１１８．０，１０８．５，１０７．７，４５．９；ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋＝２６８．１。
【００９３】
１，１’−ジクロロ−５−（４−ニトロフェニル）ジピロメテン（２）．
１（１．１ｇ、４．１ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３５ｍＬ）溶液を、Ｎ２雰囲気下、−７８℃で１５分間攪拌した。無水ＴＨＦ（３５ｍＬ）中Ｎ−クロロスクシンイミド（１．４ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を、等圧滴下漏斗を用いて滴下し、得られた混合物を室温で３時間攪拌した。終了後、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（１．１２ｇ、４．９２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温でさらに２時間攪拌した。真空中でＴＨＦを除去し、得られた混合物を水（２０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３×７０ｍＬ）。有機抽出物を合わせ、飽和ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空中で溶媒を除去した。得られた残渣を、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィで精製し（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１０：１）、暗いオレンジ色の固体として２を得た（０．７８ｇ、２．３ｍｍｏｌ、収率５７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．３２（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，２Ｈ），６．２９（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６４．０，１４７．１，１４６．６，１４６．１，１３６．０，１３０．８，１２７．３，１２３．８，１２１．８，１１６．３，１１２．１，３２．７，１４．８；ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋＝３３４．０。
【００９４】
３，５−ジクロロ−８−（４’−ニトロフェニル）−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（３）．
２（１．０ｇ、２．９７  ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（７０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．１ｍＬ、１７．８ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１０分間攪拌した。ボロントリフルオリドジエチルエーテラート（２．２ｍＬ、１７．８ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を室温で２時間攪拌した。終了後、真空中で溶媒を除去し、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィで残渣を精製して（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ、１０：１：０．１）、深い赤紫色の固体として３を得た（０．８１ｇ、２．１４ｍｍｏｌ、収率７２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．３９（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ），６．４８（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６２．４，１４８．４，１４７．１，１３２．０，１２５．３，１２６．８，１２４．５，１２３．８，１２７．３，１２０．８，１１４．９，１１１．３；１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝−７２．１２（ｑ，Ｊ＝３０Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋＝３８２．９。
【００９５】
３，５−ジクロロ−８−（４’−アミノフェニル）−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（４）．
鉄粉（１．４６ｇ、２６．２ｍｍｏｌ）の懸濁液を１Ｍ  ＨＣｌで１分間活性化し、無水ＥｔＯＨでリンスし、そのまま用いた。３（５００ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（８０ｍＬ）および酢酸（８ｍＬ）溶液を活性化した鉄に加え、還流した。反応混合物を、ＴＬＣによってモニターした。終了後、鉄を除去し、真空中で溶媒を蒸発させた。残渣を水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３×７０ｍＬ）。有機抽出物を合わせ、飽和Ｎａ２ＣＯ３、飽和ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空中で溶媒を除去した。シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィで残渣を精製して（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：ＮＨ３、６：３：１：０．０５）、暗赤色の固体として４を得た（１９７ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、収率９８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．３３（ｄｔ，Ｊ＝８．５，２．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，２Ｈ），６．７６（ｄｔ，Ｊ＝８．５，２．６Ｈｚ，２Ｈ），６．４２（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１１（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６２．４，１４７．６，１３２．０，１２８．７，１２５．２，２６．９，１２４．５，１２０．８，１１４．９，１１１．３；１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝−７２．０５（ｑ，Ｊ＝２５Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（Ｃ１５Ｈ１１ＢＣｌ２Ｆ２Ｎ３）：推定［Ｍ＋Ｈ］＋：３５２．０３８６，判明した［Ｍ＋Ｈ］＋：３５２．０２１５。
【００９６】
１０−（４−アミノフェニル）−５，５−ジフルオロ−７−（４−フェニル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−３−（ピペリジン−１−イル）−５Ｈ−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−４−イウム−５−ウイド（ＢＤＣ−９）：オレンジ色の固体（１７ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、収率７２％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．５６（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ），３．７８〜３．８８（ｍ，４Ｈ），１．６４〜１．８０（ｍ，６Ｈ），１．２６（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６２．２，１４６．７，１３６．０，１３５．７，１３４．９，１３１．８，１３１．３，１３１．０，１３０．８，１２９．６，１２８．７，１２７．９，１２６．０，１２５．０，１２２．４，１２２．３，１１６．９，１１５．４，１１５．０，１１４．９，１０９．７，５３．４，５２．０，２９．７，２６．３，２４．０；１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝−５５．８２（ｑ，Ｊ＝３４Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（Ｃ２８Ｈ２７ＢＦ２Ｎ７）：推定［Ｍ＋Ｈ］＋：５１０．２３８４，判明した［Ｍ＋Ｈ］＋：５１０．２３９９。
【００９７】
７−（ベンジルアミノ）−５，５−ジフルオロ−１０−（４−（２−ヒドロキシアセトアミド）フェニル）−３−（４−プロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−５Ｈ−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−４−イウム−５−ウイド（ＭＫＨＡ３７４−４８）：オレンジ色の固体（１５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ、収率６１％）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝８．９１（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３３〜７．３９（ｍ，５Ｈ），７．２７〜７．３０（ｍ，３Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝５．０  Ｈｚ，１Ｈ），６．７４（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），６．３８（ｓ，２Ｈ），６．２０（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），４．６０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），４．３０（ｓ，２Ｈ），２．８０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８０（ｑｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．０３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１７０．８，１６２．５，１３９．０，１３６．９，１３６．１，１３３．９，１３２．４，１３２．０，１３１．８，１３１．０，１２９．２，１２８．９，１２８．４，１２７．６，１２６．８，１１９．６，１１９．０，１１２．５，１０９．５，６２．６，４８．４，２８．７，２２．４，１３．７；１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝−６８．２９（ｑ，Ｊ＝３３Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（Ｃ２９Ｈ２８ＢＦ２Ｎ７Ｏ２）：推定［Ｍ＋Ｈ］＋：５５６．２４４４，判明した［Ｍ＋Ｈ］＋：５５６．２４６１。
【００９８】
【表２】
0006300380.tif 000017
0006300380.tif 000018
0006300380.tif 000019
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【００９９】
【表３】
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【０１００】
【表４】
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【０１０１】
【表５】
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【０１０２】
【表６】
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【０１０３】
【表７】
0006300380.tif 000070
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【０１０４】
【表８】
0006300380.tif 000086
0006300380.tif 000087
0006300380.tif 000088
【０１０５】
実施例２．蛍光分子ロータとしてのアミノ−トリアゾリルボディパイ化合物の分析
類似の極性を有するが様々な粘度の範囲に及ぶ異なる溶媒中における化合物（ＢＤＣ−９）の蛍光スペクトルを分析した。図３に示すように、蛍光強度と粘度との間には強い相関が観察された。溶媒の粘度が高くなると、ボディパイコアの３位および５位における結合回転が減少し、理論に拘束されるものではないが、これによって非発光性のエネルギー損失が最小化され、より高い量子収量が得られる（２４）。この結果から、アミノ−トリアゾリルボディパイの、蛍光分子ロータとしての可能性が確認された。
【０１０６】
実施例３．選択的ＨＳＡ蛍光プローブの同定
材料および方法
他に断りがない限り、リン酸バッファー（ｐＨ７．３、１％ＤＭＳＯ）中、室温でＢＤＣ−９とＨＳＡとを混合し、２時間インキュベートした後に蛍光を測定した。
【０１０７】
インビトロにおける蛍光スクリーニング
アミノ−トリアゾリル−ボディパイ（１０μＭ）を、１％ＤＭＳＯを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４中でスクリーニングした。スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）Ｍ２プレートリーダーを用い、３８４穴プレートにて、蛍光強度を測定した。励起は、各化合物の励起範囲で行い、励起波長から少なくとも３０ｎｍ長い波長から始まる発光スペクトルを得た。分析物はすべて、四濃度系列で試験を行った。
【０１０８】
９つの異なる組（すなわち、ｐＨ標準液、粘性溶液、遺伝学的高分子、ペプチド、金属イオン、酸化還元分子、核酸、タンパク質および他の代謝産物）に分類される８４個の生体関連分析物について、ＢＤＣ、ＢＤＣＡＣおよびＢＤＣＣＡの蛍光応答を調べた。アミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物は、ある特定のタンパク質とインキュベートすると、蛍光を有意に増加させた。代表的な例として、化合物ＢＤＣ−９は、他のタンパク質や分析物と比べて、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）に対して顕著な選択性を示した（図４）。
【０１０９】
高い選択性に加えて、ＢＤＣ−９は、ＨＳＡと結合すると蛍光が２２０倍有意に増加した（図５）。ＢＤＣ−９の応答は、０．３７μｇ／ｍＬから３１μｇ／ｍＬの間のダイナミックレンジ内では直線状であることが判明し、ＨＳＡの検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）は０．３μｇ／ｍＬと決定された（図６）。
【０１１０】
異なる種の血清アルブミンに対するＢＤＣ−９の選択性を調べた。血清アルブミンは、様々な種にわたって一次配列が高度に類似しているタンパク質ファミリーの代表的なものである（〜７５％の相同性）（３４、３９、４０、６２）。しかし、アルブミンのリガンドには、種依存的な結合性の違いを示すことが見出されているものがあり、種選択的なプローブの開発が、アルブミン結合部位の構造的研究に有用であるかもしれない（６３〜６７）。ラット由来（ＲＳＡ）、ブタ由来（ＰＳＡ）、ウサギ由来（ＲｂＳＡ）、ヒツジ由来（ＳＳＡ）およびウシ由来（ＢＳＡ）の、血清アルブミンの濃度系列に対して、ＢＤＣ−９の蛍光応答を評価した。図７ａおよび７ｂに示すように、ＢＤＣ−９は、他の種に対しての応答はほんのわずかでありつつ、ＨＳＡに対しては顕著な選択性を示した（６８、６９）。
【０１１１】
実施例４．ＨＳＡにおけるＢＤＣ−９結合の分析
ＢＤＣ−９の結合性について検討した。ＨＳＡは、少なくとも９つの結合部位からなり（３４〜３８）、そのうち、脂肪酸（ＦＡ）部位１、３および４（サドロウ（Ｓｕｄｌｏｗ）部位ＩＩ）、５、６および７（サドロウ（Ｓｕｄｌｏｗ）部位Ｉ）が薬剤化合物に対する親和性を有することが知られている（３１、３９〜４４）。最近の報告では、ＨＳＡの第３の主要な薬剤結合部位の重要性が実証されており、それは脂肪酸１部位（ＦＡ１）に相当している（７０）。ＨＳＡにおけるＢＤＣ−９の特異的な結合を確認し、その結合部位を決定するために、各部位に結合する薬剤（例えば、ヘミン（ＦＡ１部位）（７１、７２）、ダンシル−Ｌ−ノルバリン（ＦＡ３／４部位）（７３）、プロポフォール（ＦＡ３／４部位およびＦＡ５部位）（３５）、イブプロフェン（ＦＡ３／４部位およびＦＡ６部位）（７４）およびワルファリン（ＦＡ７部位）（７４））を用いて、拮抗アッセイを行った（７５）。
【０１１２】
図８に示すように、ヘミンと拮抗させた場合のみ、ＢＤＣ−９の蛍光応答が有意に減少しており、一方、他の薬剤と拮抗させた場合はすべて、ＢＤＣ−９の蛍光に影響はなかった。この観察から、環境に対するＢＤＣ−９の活性化応答は、ＨＳＡのＦＡ１部位（ヘム部位）への結合によるものであることが、明らかに示されている。ＦＡ３／４部位（４８、４９、７３）、ＦＡ６部位（５１）およびＦＡ７部位（５４、５５、７６）に結合する蛍光色素についての報告も、いくつか存在する。本発明は、初めて見いだされ、実験的に証明されたＦＡ１部位に結合する蛍光色素を示し（７６）、そこでは、結合は、結合している脂質との接触に依存しない（７２）。したがって、ＢＤＣ−９は、ＨＳＡのヘム領域を調べるのに役立つプローブである。
【０１１３】
ＢＤＣ−９およびＨＳＡによって形成される複合体の化学量論を求め、部位選択性についての検討結果を確認するために、ジョブプロット解析を行った。ＢＤＣ−９の蛍光応答は、ＢＤＣ−９：ＨＳＡが１：１の割合のときに最大となり、このことは、ＢＤＣ−９がタンパク質の１つの部位に主に結合することを示している（図９）（７７、７８）。
【０１１４】
ＨＳＡに対するＢＤＣ−９の解離定数の決定
ＨＳＡ（１０μＭ）を、ＢＤＣ−９の濃度系列（０．４７〜６０μＭ）に対して滴定し、５７５ｎｍにおける蛍光強度を測定した（λｅｘｃ＝４６０ｎｍ）。各濃度における結合ＢＤＣ−９の蛍光強度は、等式：
【０１１５】
【数３】
0006300380.tif 000089
を用いて求められ、ここで、ＦおよびＦ０は、それぞれ、ＨＳＡがある場合とない場合の、所与の濃度のＢＤＣ−９の蛍光強度である。Ｆｓａｔは、同じ濃度のＢＤＣ−９が完全に結合したときの蛍光強度である。
【０１１６】
ＢＤＣ−９の濃度系列に対するＨＳＡ（０．６７ｍｇ／ｍＬ）の滴定に一部位結合モデルが合致し、ＢＤＣ−９の解離定数（ＫＤ）を求めたところ、１２．７±０．４μＭであった（図１０）。
【０１１７】
実施例５．尿中ＨＳＡの定量へのＢＤＣ−９の応用
複合基質におけるＢＤＣ−９の選択性および感度を調べるために、ＢＤＣ−９を用いて尿試料中のＨＳＡ量を定量化した。微量アルブミン尿は、アルブミン排出率が１５〜４０μｇ／ｍＬであり（８０、８１）、十分に確立された心血管のリスクマーカーであり、また、肝臓病および腎臓病の兆候である（３２、３３）。最大で１ｍｇ／ｍＬの異なる量のＨＳＡを加えた尿において、ＢＤＣ−９の蛍光応答を分析した。臨床的に有意な範囲で、ＢＤＣ−９の蛍光応答とＨＳＡ量との間には、極めて直線的な相関関係が存在し（図１１）、これによって、尿試料中のＨＳＡレベルの定量化について、ＢＤＣ−９の可能性が証明された。
【０１１８】
実施例６．ＭＫＨＡ神経細胞プローブおよびＮｅｕＯ神経細胞プローブの発見
第二世代のアミノ−トリアゾリル−ボディパイ化合物（ＭＫ、ＭＫＡＣ、ＭＫＣＡ）の細胞ベースの予備スクリーニングにおいて、ＭＫＣＡ化合物が、第１世代ニューロンに対して弱い応答を示した。続くＭＫＨＡ誘導体への変換によって、第１世代ニューロンに対する蛍光応答が、概して有意に上昇した（図１２）。ＭＫＡＡ（および、或いは、他のエステル）へのエステル化によって、染色特異性を維持しつつ、無傷の生細胞への透過性が上昇する（図１２）。アセチル化されたＭＫＡＡは、生細胞膜を通過した後、細胞エステラーゼによって速やかに加水分解され、蛍光応答を担う活性ＭＫＨＡ化合物を生じる。図１３および１４は、合成され、第１世代ニューロン染色について調べられたＭＫＨＡ化合物例の構造を示す。
【０１１９】
ニューロンプローブを見つけるために、第１世代脳細胞スクリーニングプラットフォームを用いた。これは、特異的接着法によって単離された第１世代ニューロン、星状膠細胞および小膠細胞を用いるものである。これらの細胞を、３８４穴マイクロプレートで、お互いに並べて調製し、単離後４〜５日で、濃度が５００ｎＭのＤＯＦＬ化合物５０００種とともに、１時間、二連でインキュベートした（図１５）。強度を基にして自動で分析し、画像を基にして評価することによって、ニューロン特異的な第１世代蛍光プローブであるＭＫＨＡ１０１−３を同定した。構造活性相関（ＳＡＲ）についての予備的な検討を行い、元のＭＫＨＡ１０１−３に比べ生ニューロンに対して優れた選択性を示す、改良された化合物であるＭＫＨＡ３７４−４８を見出した（図１６）。化合物ＭＫＨＡ３７４−４８は、本開示においては、代わりに、ニューロンオレンジ（Ｎｅｕｒｏｎ  Ｏｒａｎｇｅ）としてＮｅｕＯ（「ｎｅｏ」と発音）と呼ぶ。
【０１２０】
実施例７．ＮｅｕＯは生ニューロン特異的である
ＭＫＨＡ１０１−３を用いた細胞イメージング
ＭＫＨＡ１０１−３は、他の神経細胞よりも、細胞体および樹枝状突起を特異的に染色する。Ｐ１〜Ｐ３マウスからの不均質な脳細胞試料を用いると、化合物陽性である細胞は、β−ＩＩＩ−チューブリン陽性でもあることがわかった（図１７）。星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰおよび希突起神経膠細胞マーカーであるＯ４に対して陽性であった他の細胞は、化合物に対して陰性であることがわかった。これによって、ＭＫＨＡ１０１−３化合物のニューロンに対する特異性が証明された。
【０１２１】
ＮｅｕＯを用いた細胞イメージング
ＮｅｕＯは、他の神経細胞よりも、細胞体および樹枝状突起を特異的に染色する。Ｐ１〜Ｐ３マウスからの不均質な脳細胞試料を用いると、化合物陽性である細胞は、β−ＩＩＩ−チューブリン（Ｔｕｊｉ）陽性でもあることがわかった（図１８ａ）。星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰおよび希突起神経膠細胞マーカーであるＯ４に対して陽性であった他の細胞は、化合物に対して陰性であることがわかった。これによって、我々の化合物のニューロンに対する特異性が証明された。ＮｅｕＯは、サブタイプにかかわらず、すべてのニューロンを染色するようである（図１８ｂ）。
【０１２２】
フローサイトメトリー解析およびＦＡＣＳによる分類
Ｐ１〜３子マウスの脳から調製した細胞の混合集団についてフローサイトメトリー解析を行ったところ、主集団から離れた細胞集団（１０〜２０％）が明確に示された（図１９）。この化合物陽性細胞の集団をさらに分析するために、２つの集団（陽性画分および陰性画分）を分類し、細胞を再培養し、遺伝子解析のためにＲＮＡを抽出した。
【０１２３】
ＦＡＣＳで単離された化合物陽性細胞は、ニューロン形態を示し、β−ＩＩＩ−チューブリン陽性である。
【０１２４】
化合物陽性細胞および化合物陰性細胞を分類し、ポリ−Ｄ−リジンコートされたプレート上、Ｂ２７およびＦＧＦ（１０ｎｇ／μＬ）を加えたニューロべーサル（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）培地中、５００００細胞／ｃｍ２の密度で再培養するために播種した。５日後、化合物陽性再培養画分中の、樹枝状突起の伸展によって特徴付けられるニューロン形態を有する細胞を観察した（図２０ａ）。続いて、ニューロンマーカーであるβ−ＩＩＩ−チューブリンに対し、これらの細胞を免疫染色し、陽性であることを見出した（図２０ｂおよび２０ｃ）。化合物陰性再培養画分は、ニューロンが細胞成長したと思わせる痕跡を、あったとしてもわずかしか示さなかった。
【０１２５】
化合物陽性細胞は、ニューロンマーカーであるβ−ＩＩＩ−チューブリンを高発現する。
【０１２６】
ＦＡＣＳで分類した化合物陽性ニューロン集団から抽出されたＲＮＡを用いて、ニューロンマーカーであるβ−ＩＩＩ−チューブリンの遺伝子発現を分析した。化合物陽性画分は、一様に、化合物陰性画分よりもβ−ＩＩＩ−チューブリンを高発現していた（最大１０倍）（図２１）。化合物陽性画分において、β−ＩＩＩ−チューブリンの発現は、未分類の画分と比べても最大２倍高いことが多く、プローブ化合物が示唆される。
【０１２７】
ニューロンは染色後も生存している。
【０１２８】
長期間の追跡および下流における機能の検討のためには、化合物が細胞に対して毒性を持たず、染色後も細胞が生存していることが重要である。細胞毒性アッセイ（ＭＴＳ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））によって、５００ｎＭ以上の作用濃度でＮｅｕＯと２４時間インキュベートしても、細胞生存性は有意に影響を受けないことが証明された（図２２）。
【０１２９】
インビトロにおけるニューロン成長を長期間イメージングするのに、ＮｅｕＯを用いることができる。
【０１３０】
ニューロン細胞トラッカーとしてのＮｅｕＯの可能性を検討するために、Ｐ１〜３子マウスから新たに得たニューロンを染色し、インビトロにおいて、タイムラプス撮影を用いて、樹枝状突起形成を観察した（図２３）。細胞の生存および色素のシグナルは、タイムラプス実験において、ニューロンの成長及び他の神経細胞との相互作用を分析するのに重要である。
【０１３１】
実施例８．ＭＫＨＡ化合物および他のニューロンイメージングへの応用
共有結合（図２４）、プルダウン（図２４および２５）、ＰＥＴイメージング（図２６）および近赤外分光法（図２７）を含む様々な用途のために、ＳＡＲ実験に基づいてさらに化合物を設計し、合成した。図２４〜２７に示す化合物は、すべて生ニューロンを染色することがわかった。
【０１３２】
実施例９．ＭＫＨＡ化合物は、生きたマウスの脳においてニューロンを特異的に標識できる可能性を有する。
【０１３３】
本開示の色素の生（ｌｉｖｅ）脳切片染色に対する性能を評価するために、新しい胎児脳切片を化合物で染色し、蛍光顕微鏡で撮影した。ＭＫＨＡ１０１−３およびその誘導体は、色素が、長い樹状突起を有する細胞を強調し、またニューロン配列と一致するように集まる細胞体を強調する、特異的な細胞標識パターンを示す（図２８）。このことは、色素を、脳切片試料のニューロンをイメージングするのに、さらに用いることができるということを強く示唆している。
【０１３４】
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２０．Ｂ．Ｖｅｒｂｅｌｅｎら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１２，４８，９１２９−９１３１．
２１．Ｔ．Ｒｏｈａｎｄら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００６，２６６−２６８．
２２．Ｔ．Ｒｏｈａｎｄら，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２００７，６，１０６１−１０６６．
２３．Ｖ．Ｌｅｅｎら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０，４６，４９０８−４９１０．
２４．Ｗ．Ｑｉｎら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ  ２００９，１１３，１１７３１−１１７４０．
２５．Ｂ．Ｔｅｍｅｌｌｉ，Ｃ．Ｕｎａｌｅｒｏｇｌｕ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００６，６２，１０１３０−１０１３５．
２６．Ｌ．Ｌｉ，Ｂ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｋ．Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００８，１８，３１１２−３１１６．
２７．Ｌ．Ｌｉ，Ｊ．Ｈａｎ，Ｂ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｋ．Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００８，７３，１９６３−１９７０．
２８．Ｏ．Ａ．Ｂｏｚｄｅｍｉｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，８０２９−８０３６．
２９．Ａ．Ｃｏｓｋｕｎ，Ｅ．Ｄｅｎｉｚ，Ｅ．Ｕ．Ａｋｋａｙａ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００５，７，５１８７−５１８９．
３０．Ｗ．Ｑｉｎら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ  ２００８，１１３，４３９−４４７．
３１．Ｇ．Ｆａｎａｌｉら，Ｍｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．２０１２，３３，２０９−２９０．
３２．Ｄ．Ｊ．Ｆ．Ｒｏｗｅ，Ａ．Ｄａｗｎａｙ，Ｇ．Ｆ．Ｗａｔｔｓ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，２７，２９７−３１２．
３３．Ｃ．Ｅ．Ｍｏｇｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．１９８８，７２，１４６５−１４９２．
３４．Ｓ．Ｃｕｒｒｙら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，５，８２７−８３５．
３５．Ａ．Ａ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｔ．Ｇｒｕｎｅ，Ｓ．Ｃｕｒｒｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０００，３０３，７２１−７３２．
３６．Ｉ．Ｐｅｔｉｔｐａｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００１，３１４，９５５−９６０．
３７．Ｉ．Ｐｅｔｉｔｐａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００３，１００，６４４０−６４４５．
３８．Ｓ．Ｓｕｇｉｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９９，１２，４３９−４４６．
３９．Ｓ．Ｃｕｒｒｙら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｌ．１９９９，１４４１，１３１−１４０．
４０．Ｓ．Ｃｕｒｒｙ，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２００９，２４，３４２−３５７．
４１．Ｌ．Ｚｈｕら，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００８，１６２，４０−４９．
４２．Ｊ．Ｒ．Ｓｉｍａｒｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００５，１０２，１７９５８−１７９６３．
４３．Ｇ．Ｓｕｄｌｏｗ，Ｄ．Ｊ．Ｂｉｒｋｅｔｔ，Ｄ．Ｎ．Ｗａｄｅ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９７６，１２，１０５２−１０６１．
４４．Ｇ．Ｓｕｄｌｏｗ，Ｄ．Ｊ．Ｂｉｒｋｅｔｔ，Ｄ．Ｎ．Ｗａｄｅ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９７５，１１，８２４−８３２．
４５．Ｆ．Ｍｏｒｅｎｏら，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９９，７０，６９５−７００．
４６．Ｋ．Ｔａｋｅｈａｒａら，Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．２００９，２５，１１５−１２０．
４７．Ｘ．−ｔ．Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｘｉａｎｇ，Ａ．−ｊ．Ｔｏｎｇ，Ｔａｌａｎｔａ  ２０１０，８０，１９５２−１９５８．
４８．Ｆ．Ｄｉｎｇ，Ｗ．Ｌｉｕ，Ｊ．−Ｘ．Ｄｉａｏ，Ｙ．Ｓｕｎ，Ｊ．Ｈａｚａｒｄ．Ｍａｔｅｒ．２０１１，１８６，３５２−３５９．
４９．Ｋ．Ｋ．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｗ．Ｐａｒｋ，Ａ．Ｄ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９，７，４２２５−４２３２．
５０．Ｍ．Ｂａｎｅｒｊｅｅら，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ  ２０１２，１０８，２３−３３．
５１．Ｙ．Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０１１，２０，２０９５−２１０１．
５２．Ｄ．Ｃ．Ｗｉｌｔｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９０，２７０，１６３−１６６．
５３．Ｂ．Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｐ．Ｋ．Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２００３，７２，４２７−４３４．
５４．Ｆ．Ｍｏｒｅｎｏら，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９９，６９，８−１５．
５５．Ｙ．Ｓｕｎら，Ｊ．Ｌｕｍｉｎ．２０１２，１３２，８７９−８８６．
５６．Ｊ．Ｒｏｈａｃｏｖａら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２０１１，１１５，１０５１８−１０５２４．
５７．Ｅ．Ａｌａｒｃｏｎら，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ  ２０１０，９，９３−１０２．
５８．Ｚ．−ｄ．Ｑｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．２００８，４６，６９９−７０６．
５９．Ｓ．Ｄｅｅｐａ，Ａ．Ｋ．Ｍｉｓｈｒａ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．２００５，３８，５５６−５６３．
６０．Ｆ．−Ｌ．Ｃｕｉ，Ｊ．−Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｙ．−Ｒ．Ｃｕｉ，Ｊ．−Ｐ．Ｌｉ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ２００６，５７１，１７５−１８３．
６１．Ａ．−ｌ．Ｔｓａｉら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｇｅｎ．Ｓｕｂｊ．１９８９，９９３，７４−８２．
６２．Ｓ．Ｃｕｒｒｙ，Ｖｏｌ．３３，２００４，ｐｐ．２９−４６．
６３．Ｍ．Ｐｉｓｔｏｌｏｚｚｉ，Ｃ．Ｂｅｒｔｕｃｃｉ，Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ  ２００８，２０，５５２−５５８．
６４．Ｎ．Ｅ．Ｂａｓｋｅｎら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２００８，３５，２８１−２８６．
６５．Ｃ．Ｊ．Ｍａｔｈｉａｓ，Ｓ．Ｒ．Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｍ．Ａ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９９５，３６，１４５１−１４５５．
６６．Ｊ．Ｊ．Ｌｉｍａ，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．１９８８，１６，５６３−５６７．
６７．Ｎ．Ｅ．Ｂａｓｋｅｎ，Ｃ．Ｊ．Ｍａｔｈｉａｓ，Ｍ．Ａ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２００９，９８，２１７０−２１７９．
６８．Ａ．Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら，ＡＣＳ  Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．２０１１，１３，２１４−２１７．
６９．Ｙ．−Ｈ．Ａｈｎ，Ｊ．−Ｓ．Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｔ．Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００８，１０，３７６−３８０．
７０．Ｆ．Ｚｓｉｌａ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２０１３，１０，１６６８−１６８２．
７１．Ｐ．Ｚｕｎｓｚａｉｎら，ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３，３，６．
７２．Ｍ．Ｗａｒｄｅｌｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２，２９１，８１３−８１９．
７３．Ａ．Ｊ．Ｒｙａｎら，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０１１，１７４，８４−９１．
７４．Ｊ．Ｇｈｕｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５，３５３，３８−５２．
７５．Ｇ．Ｚｈａｎｇ，Ｎ．Ｚｈａｏ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｌｕｍｉｎ．２０１１，１３１，２７１６−２７２４．
７６．Ｋ．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｐａｒｋ，Ａ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃ．２００７，１７，３６１−３６９．
７７．Ｒ．Ｓｕｂｒａｍａｎｙａｍら，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ  ２００９，９５，８１−８８．
７８．Ｃ．Ｙ．Ｈｕａｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８２，８７，５０９−５２５．
７９．Ｐ．Ｊｏｂ，Ａｎｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｎａｌ．１９２８，９，１１３−２０３．
８０．Ｍ．Ａ．Ｋｅｓｓｌｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７，２４８，１８０−１８２．
８１．Ｍ．Ａ．Ｋｅｓｓｌｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４３，９９６−１００２．
８２．Ｊ．ＤｅＦｅｌｉｐｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０，３３０，１１９８−１２０１．
８３．Ｃ．Ｋｏｂｂｅｒｔら，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０００，６２，３２７−３５１．
８４．Ｍ．Ｇ．Ｈｏｎｉｇ，Ｒ．Ｉ．Ｈｕｍｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９８９，１２，３３３−３４１．
８５．Ｓ．Ｍ．Ａｐｐｌｅｙａｒｄ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２００９，１５０，５１９９−５２０１．
８６．Ｋ．Ｄｕｆｆ，Ｆ．Ｓｕｌｅｍａｎ，Ｂｒｉｅｆ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ２００４，３，４７−５９．
８７．Ｈ．Ｏｋａｎｏら，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ  Ｒｅｌａｔ．Ｄ．２００２，９，２３−２８．
８８．Ｇ．Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．１９９７，７１，１４３−１５５．
８９．Ｓ．Ｔｏｌｕら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０１０，２４，７２３−７３０．
【０１３５】
本開示で引用されたすべての特許、公開出願および参考文献の教示は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０１３６】
本発明は、その実施形態の例を参照して詳細に示され、かつ説明されたが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、形態および詳細を種々変更してもよいことは、当業者が理解するところである。
【図１】
0006300380.tif 000113
【図２】
0006300380.tif 000114
【図３】
0006300380.tif 000115
【図４】
0006300380.tif 000116
【図５】
0006300380.tif 000117
【図６】
0006300380.tif 000118
【図７】
0006300380.tif 000119
【図８】
0006300380.tif 000120
【図９】
0006300380.tif 000121
【図１０】
0006300380.tif 000122
【図１１】
0006300380.tif 000123
【図１２】
0006300380.tif 000124
【図１３】
0006300380.tif 000125
【図１４】
0006300380.tif 000126
【図１５】
0006300380.tif 000127
【図１６】
0006300380.tif 000128
【図１７】
0006300380.tif 000129
【図１８】
0006300380.tif 000130
【図１９】
0006300380.tif 000131
【図２０】
0006300380.tif 000132
【図２１】
0006300380.tif 000133
【図２２】
0006300380.tif 000134
【図２３】
0006300380.tif 000135
【図２４】
0006300380.tif 000136
【図２５】
0006300380.tif 000137
【図２６】
0006300380.tif 000138
【図２７】
0006300380.tif 000139
【図２８】
0006300380.tif 000140