(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
汗の悪臭を弱めることができる剤を同定する方法であって、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる群より選択される１つ以上の嗅覚受容体（ＯＲ）の機能を調節する剤を同定する下記の工程、ａ）前記ＯＲの６つ全てを、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択されヒトの汗の中に存在する１つ以上のカルボン酸と、前記剤の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ＯＲへの結合を可能にするか、または前記ＯＲの前記カルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）前記剤の存在下および不存在下での前記ＯＲの６つ全ての前記１つ以上のカルボン酸への結合または前記ＯＲの活性を比較する工程であって、ここで、剤の不存在下での結合または活性と比較した、前記剤の存在下での結合または活性の差が、前記１つ以上のカルボン酸に応答して前記１つ以上のＯＲの機能を調節する剤としての剤を同定する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記剤を更に、前記カルボン酸のＯＲ５１Ｉ２への結合の調節、またはＯＲ５１Ｉ２の前記カルボン酸による活性化の調節について試験する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記剤を、ペンタン酸のＯＲ５２Ｌ１への結合の調節、またはＯＲ５２Ｌ１のペンタン酸による活性化の調節について試験する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記剤を、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸のＯＲ５２Ｅ８への結合の調節、またはＯＲ５２Ｅ８の３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸による活性化の調節について試験する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記剤を、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のＯＲ５２Ｂ２への結合の調節、またはＯＲ５２Ｂ２のヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化の調節について試験する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記剤を、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、もしくは安息香酸のＯＲ５１Ｉ２への結合の調節、またはＯＲ５１Ｉ２のブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、もしくは安息香酸による活性化の調節について試験する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記剤を、ブタン酸のＯＲ５２Ｅ１への結合の調節、またはＯＲ５２Ｅ１のブタン酸による活性化の調節について試験する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記剤を、４−エチルオクタン酸のＯＲ５２Ａ５への結合の調節、またはＯＲ５２Ａ５の４−エチルオクタン酸による活性化の調節について試験する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記剤を、ヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のＯＲ５６Ａ５への結合の調節、またはＯＲ５６Ａ５のヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化の調節について試験する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上のカルボン酸を、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、および蛍光のクエンチャーを含む群より選択される部分で検出可能に標識してもよい、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試料におけるヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する１つ以上のＯＲの活性を調節する剤の存在を検出するために用いる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記剤が試料に存在する、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上のＯＲポリペプチドを、前記１つ以上のカルボン酸とそのＥＣ50濃度で接触させる、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記剤が、前記カルボン酸により誘導される細胞内応答を少なくとも１０％低減するとき、前記剤を本発明によるＯＲの機能を調節する剤として同定する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触を、前記ＯＲポリペプチドを発現する細胞内または上で行う、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞を、ヒト胎児由来腎臓細胞（Ｈｅｋ２９３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サル細胞（ＣＯＳ）、一次嗅覚細胞、ツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌から選択してもよい、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触を、ＯＲポリペプチドを含有する合成リポソームまたはウイルスにより誘導される出芽膜内または上で行う、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法を、前記ＯＲポリペプチドを発現する細胞由来の膜分画を用いて行う、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法を、タンパク質チップ上で行う、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定を、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光クエンチング、および蛍光偏光から選択する方法を用いて行う、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記剤を、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および小有機分子からなる群より選択する、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＯＲのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、第２のメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＯＲのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、グアニンヌクレオチド結合／架橋または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、タンパク質キナーゼＣ活性、タンパク質キナーゼＡ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流動、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＯＲのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、蛍光または発光アッセイを用いることを含む、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記蛍光および発光アッセイが、ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４またはＦｕｒａ、Ｃａ３−ｋｉｔ  ｆａｍｉｌｙまたはエクオリンを含むＣａ2+感受性フルオロフォアの使用を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アッセイが、自動蛍光定量的または発光リーダー、例えば、ＦＤＳＳまたはＦＬＩＰＲを適用してもよい、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ハイスループットスクリーニング方法である、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記剤が、化学物質ライブラリーまたは動物の器官抽出物の一部である、請求項１から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）ＯＲポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド：ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５、ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびにｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
【請求項３０】
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）ＯＲポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド：ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５、
ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
ｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
【請求項３１】
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）ＯＲポリペプチドＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる７つのＯＲのポリペプチドの群の全てのメンバーを発現する細胞、幾つかの細胞またはその膜、
ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
ｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
【請求項３２】
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）ＯＲポリペプチドＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５の全てを発現する細胞、幾つかの細胞またはその膜、ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびにｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
【請求項３３】
前記細胞または前記細胞（複数）が、前記ＯＲをコードする１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換された、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、嗅覚受容体の特性決定に関する。特に、本発明は、７つのクラス１嗅覚受容体、およびヒトの汗に存在するカルボン酸に対応するそれらの天然のリガンドの同定に関する。本発明は、嗅覚受容体とそれらのそれぞれの天然のリガンドとの間の相互作用を調節する化合物、特に、アンタゴニストまたはブロッカーをスクリーニング
するアッセイおよび方法を提供する。本発明は、汗の悪臭を弱めるための上述の化合物を含む組成物および方法をさらに提供する。
【発明の背景】
【０００２】
嗅覚受容体
嗅覚受容体（ＯＲ）をコードする遺伝子は、単一の生理学的機能に特化した、ヒト身体における遺伝子の最大ファミリー（全ゲノムの３％）を表す。これらのＯＲは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーに属する。ＧＰＣＲは、多数の異なる細胞タイプの表面に通常位置する膜受容体である。これらの受容体の共通する特徴は、細胞膜内においてバレルを形成する７つの膜貫通型スパンからなり、ヘテロ三量体ＧＴＰａｓｅと相互作用し、これにより、それらの活性化因子の結合に際してシグナルを伝達する、それらの能力に存する。
【０００３】
ヒトゲノムにおいて、嗅覚受容体の特徴的符号を含有する、約９００個の配列が見出された。しかしながら、これらの６０％が、非機能性偽遺伝子をコードし、これにより、ヒトに約３８０個の異なるＯＲタンパク質を残すように思われる。
【０００４】
ＯＲは、それらの配列における６つの保存アミノ酸モチーフにより特徴付けられる。第１は、受容体の細胞外のＮ末端に位置するＦＩＬＬＧモチーフ（配列番号１７）である。これは、３つの可変だが、大抵疎水性のアミノ酸により分けられた、高度に保存されたフェニルアラニンおよびグリシンに対応する。他のモチーフは、細胞内ループ１におけるＬＨＴＰＭＹ（配列番号１８）、膜貫通型ドメイン３の末端および細胞内ループ２の開始のＭＡＹＤＲＹＶＡＩＣ（配列番号１９）、膜貫通型ドメイン５の末端のＳＹ（配列番号２０）、膜貫通型ドメイン６の開始におけるＦＳＴＣＳＳＨ（配列番号２１）、および膜貫通型ドメイン７におけるＰＭＬＮＰＦ（配列番号２２）を含む。
【０００５】
哺乳類ＯＲは、２つの別個のクラスに通常細分される。クラス１  ＯＲは、魚類様受容体とも呼ばれ、魚において見出されるＯＲとより密接に関連する同種の群を形成し、それ故、脊椎動物の進化を通じて維持された、保存された残存を表すと思われている。先祖のＯＲのこの群の遺残は、それらが、哺乳類化学的知覚において重要な役割を果たすことを示唆する。ヒトにおいて、クラス１  ＯＲは、潜在的な機能タンパク質に対応する、６８個の非偽遺伝子配列を包含する。これらの受容体は、「クラス１」ＯＲとしてのこれらの分類を可能にする、これらの配列における幾つかの特徴的ドメインを共有する。膜貫通型ドメインに位置する幾つかのアミノ酸は、魚類様ＯＲのメンバー内で高度に保存されることはまた、注意されるべきである。魚類様ＯＲと対照的に、クラス２  ＯＲは、四肢脊椎動物においてまず出現し、拡大して、ヒトにおいて現在公知のＯＲレパートリーの大部分を形成した。クラス２  ＯＲは、空気中の匂い物質の検出が要求される、陸生生命への適合を恐らく表す。
【０００６】
匂い知覚のメカニズム
それぞれのＯＲは、異なる分子と相互作用することができ、それぞれの匂い物質分子は、１つより多くのＯＲを活性化し得る。したがって、匂い知覚は、単一のＯＲの単純な活性化に頼るのではなく、幾つかのＯＲの複数の活性化にむしろ頼る。匂い（単一の分子または混合物であり得る）は、その識別および特性決定に十分である、活性化ＯＲの固有のセットと対形成される。幾つかのさらなるＯＲが要求されていてもよく（高濃度）、または活性化されていなくてもよい（低濃度）ので、匂い物質濃度は、匂いのプロファイルに劇的に影響し得る。それ故、活性化ＯＲのセットは、異なる匂い濃度によって異なり、様々な匂い知覚を導く。３８０個のＯＲのプールを用いて可能な組合せの数はほぼ無限であり、これにより、嗅覚系の傑出した識別特性を説明する。匂い物質受容体は、嗅上皮を構成する小領域における鼻腔の上部に位置する、特殊化した嗅覚神経（ＯＳＮ）において発現される。これらの細胞の１つの末端の糸状の拡大は、それらの表面上でＯＲを含有し、匂い物質が溶解される、鼻の粘液において浮遊する。逆の端で、ＯＳＮは、頭蓋の底部の篩骨を通ってその軸索を拡大して、嗅球に、嗅覚刺激の統合に打ち込む脳の小領域を繋げる。嗅上皮を通じて散らばった何千万ものＯＳＮの傑出した特徴は、それぞれ１つが、ヒトゲノムにおいて利用可能な約４００個のＯＲ遺伝子のうち１つだけを発現することである。一致する遺伝子を発現するＯＳＮは、それらの軸索を、糸球体と呼ばれる構造を形成する嗅球の同一の小領域に繋げる。活性化ＯＲの特異的セットによる匂いの符号化が、球において、活性化糸球体の対応するパターンにより地理的に翻訳されるということは、ＯＳＮのこの組織化に由来する。この情報は、それが解読され、解析される、皮質の嗅覚領域にさらに伝達される。ＯＳＮにおいて、ＯＲの引き金を引くことは、タイプＩＩＩアデニル酸シクラーゼを刺激して、環状ＡＭＰを産生し、これが、第２のメッセンジャーの役割を果たす、嗅覚特異的Ｇタンパク質（Ｇａｌｐｈａ−ｏｌｆ）の活性化を促進する。ｃＡＭＰ依存性カチオンチャネルに結合する際、このメッセンジャーは、カルシウムの細胞内への流入を誘導する。カルシウムは、塩素イオンの流出を促進する別のチャネルの開放を引き起こし、故に、シグナルをそれぞれの脳領域にもたらす神経の活動電位の引き金を引く。
【０００７】
匂い物質分子のＯＲでの特性決定
培養細胞株は、学業的と産業的状況の両方で目的の受容体を特性決定し、研究するために広く用いられてきた。このアプローチは、対応する遺伝子の細胞への導入、およびそれに続く、その安定的または一過性の過剰発現の促進を含む。受容体の活性は、機能アッセイを用いてモニターされ得る。培養が容易な細胞株の使用は、機能アッセイを行うのが容易であると同時に、１日当たり数千の測定を促進する。典型的には、医薬産業において、非嗅覚受容体において１日当たり１，０００，０００個の化合物のライブラリーを試験することが一般的である。ＯＲ発見の結果、非嗅覚受容体の発現に適当な細胞株においてＯＲを発現させる、幾つかの試みが成されたが、多くが不成功のままであった。かかる失敗の理由は、受容体を産生する細胞の障害においてではなく、むしろ受容体を細胞の表面に送ることができないことにおいて見られ得る。ＯＲの機能的発現を改善することが狙いの技術は、従来の細胞株をＯＲ発現に適当なように操作することを要求する。事実、細胞表面でのＯＲの正しい発現および標的化は、非嗅覚細胞株に存在しない、ＯＳＮ特異的細胞内機構を要求することが長く疑われていた。ＯＳＮにおける発現の徹底的分析により、この感覚細胞に特異的である、タンパク質の新規ファミリーの２つのメンバーが明らかにされた。モデルＯＲと同時に、従来の細胞株に共導入されるとき、いわゆる受容体輸送タンパク質１および２（ＲＴＰ１およびＲＴＰ２）は、細胞表面発現と、受容体のその同族の匂い物質への応答の両方を増強した。細胞においてＯＲの活性化に際してその匂い物質分子により生じるｃＡＭＰの産生は、（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．  １１９，  ６７９−６９１）に記載される通り、レポーター遺伝子の使用からなる間接的アプローチにより検出され得る。この遺伝子は、ｃＡＭＰにより誘導可能なプロモーターの制御下に置かれ、ｃＡＭＰにより誘導された際にのみ発現される。異なる遺伝子がこの目的のために用いられ得るが、最も一般的なものの１つは、発光タンパク質ルシフェラーゼをコードする。その基質であるルシフェリンを切断する間、この酵素は、容易に検出され、定量化される光を放出する。放出された光の強度は、産生されたルシフェラーゼの量を反映し、ｃＡＭＰの増大に比例し、それ故、受容体の活性に直接関連する。レポーター遺伝子アッセイの利点の１つは、受容体活性化とレポーター産生の間のシグナル増幅への依存である。これは、他の機能アッセイによってはほとんど検出され得ない、弱い応答を特に感知できるアッセイを作製する。
【０００８】
他の機能アッセイはまた、ＯＲのその匂い物質リガンドによる活性化を証明するために用いられている。これらのアッセイの１つは、受容体細胞内カルシウム増大の活性化に際して生じる細胞質カルシウムにおける増加をモニターすることを含む（Ｋｒａｕｔｗｕｒｔｚ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｃｅｌｌ  ９５，  ９１７−２６）。
【０００９】
これまで、匂い物質活性化因子の同定は、わずかなマウス匂い物質ＯＲについて唯一報告されている。マウスＯＲ脱オーファン化の例は、Ｍａｌｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃｅｌｌ  ９６，  ７１３−２３、Ｓａｉｔｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｓｃｉ．  Ｓｉｇｎａｌ．  ２，  １−１４において示される。
【００１０】
ヒトＯＲ活性化因子の同定も報告されている。脱オーファン化ヒトＯＲの例は、例えば、Ｆｕｊｉｔａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７．  Ｊ．  Ｒｅｃｅｐｔ．  Ｓｉｇｎａｌ．  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．  Ｒｅｓ．  ２７，  ３２３−３４、Ｋｅｌｌｅｒ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００７．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４９，  ４６８−７２、Ｍａｔａｒａｚｚｏ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｅｎｓｅｓ  ３０，  １９５−２０７、Ｓａｉｔｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｓｃｉ．  Ｓｉｇｎａｌ．  ２，  １−１４、Ｓａｎｚ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｅｎｓｅｓ  ３０，  ６９−８０、Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００７．  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １５９，  ４００−１２．、Ｓｈｉｒｏｋｏｖａ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  １１８０７−１５．、Ｓｐｅｈｒ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，  ２０５４−５８．、Ｗｅｔｚｅｌ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １９，  ７４２６−３３、Ｓａｌｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＣＴ番号ＷＯ２００６／０９４７０４において示される。
【００１１】
受容体の幾つかについて、１つより多くのリガンドが同定されている。同一のＯＲを活性化する匂い物質は、異なる匂い物質ファミリー、例えば、アルコール、アルデヒド、エステルなどに属し得る（Ｓａｎｚ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｅｎｓｅｓ  ３０，  ６９−８０、Ｓａｉｔｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  Ｓｃｉ．  Ｓｉｇｎａｌ．  ２，  １−１４）。
【００１２】
身体の悪臭
我々の近代社会において、ヒトの身体により放出される匂い、およびより正確には汗における匂いは、不快または攻撃とさえしばしばみなされる。これらの匂いの知覚を弱めるための有意な努力が、化粧産業により成されている。ヒトの汗に存在する分子の種々のカテゴリーのうち、短鎖カルボン酸が特に重要である。実際に、５０種より多くの異なる酸が、汗において同定されている。一連の酸は、悪臭の生成に関与するか、または悪臭の生成に重要であると想定される（表１）。例えば、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸または（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸は、刺激性の匂いを有し、両方が、腋窩の悪臭の重要な関与因子であることは公知である（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１；  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｃｏｌｏｇ．Ｖｏｌ．  １７  ｐｐ  １４６９−１４９２、Ｇａｕｔｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃｈｉｍｉａ，Ｖｏｌ．  ６１  ｐｐ  ２７−３２）。別の短鎖カルボン酸であるイソ吉草酸は、汗をかいている足により放出される特徴的なチーズ風味の匂いに関与する主要な分子として同定された（Ａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６．  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．  ５２  ｐｐ  ３５７−３６４）。酸は、アポクリン腺により直接産生されることはない。これらは、グルタミン接合体の形成下で出現し、皮膚細菌酵素の作用下で放出される。それ故、幾つかの臭気剤の存在量は、その細菌フローラの組成に依存して、１つの個体から別に変動していてもよい。
【００１３】
【表１】
0006325088.tif 000002
【００１４】
汗の悪臭を弱めるための異なるストラテジーが開発されてきた。最も一般的なものは、悪臭を好ましい芳香で圧倒することを含む。より精巧なアプローチにおいて、芳香は、悪臭と上手く調和し、知覚をより好ましい特徴にシフトするよう設計される。この場合において、芳香は、それ自体強い匂い物質である必要はない。
【００１５】
悪臭を低減する別の方法は、匂い物質分子の産生を制限することからなる。これは、皮膚細菌集団を静菌剤で制限すること、または臭気剤の放出に関与する酵素をブロックすることのいずれかにより達成され得る。
【００１６】
悪臭分子の受容体を特異的にブロックする、アンタゴニストおよび／またはブロッカーの開発も考慮され得る。理想的なブロッカーは、それ自体匂いを有さず、香りに影響せず、それ故、完全な創造の自由を調香師に与えることになる。
【００１７】
本発明において、ＯＲのクラス１に属する７つの嗅覚受容体が、ヒトの汗に存在するカルボン酸により活性化されることが、驚くべきことに発見された。この予想外の発見により、調香師およびフレーバリスト会社にとって目的となる化合物の同定が可能になる。実際に、これらの７つの嗅覚受容体の同定された天然のリガンドは、汗の悪臭の重要な関与因子であることは公知である。汗の悪臭の知覚を修飾するための、芳香組成物におけるこれらの嗅覚受容体のブロッカーまたはアンタゴニストの同定および使用は、デオドラント開発の新たな可能性を開き得る、オリジナルの概念を表す。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、ヒトの汗に存在するカルボン酸の天然の受容体としての、ＯＲのクラス１に属する７つの嗅覚受容体（ＯＲ）、すなわち、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５（本発明のＯＲ）の同定に関する。本発明は、本発明のＯＲの活性を調節する剤のスクリーニングアッセイの基準としてのこれらのＯＲポリペプチドとカルボン酸の相互作用の使用を包含する。
【００１９】
本発明はまた、７つのＯＲのカルボン酸との相互作用に基づくスクリーニング方法を行うためのキットも包含する。
【００２０】
あるいは、本発明は、ヒトの汗に存在するカルボン酸の天然の受容体としての、ＯＲのクラス１に属する６つの嗅覚受容体（ＯＲ）、すなわち、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５の群の同定に関する。本発明は、本発明のＯＲの活性を調節する剤のスクリーニングアッセイの基準としてのこれらのＯＲポリペプチドとカルボン酸の相互作用の使用を包含する。
【００２１】
本発明はまた、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５のカルボン酸との相互作用に基づくスクリーニング方法を行うためのキットも包含する。
【００２２】
本発明は、本発明のＯＲの１つ以上の活性を調節する剤を同定する方法であって、ａ）ＯＲポリペプチドをカルボン酸と、候補モジュレーターの存在下または不存在下で、前記カルボン酸の前記ＯＲポリペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させること、およびｂ）前記ＯＲポリペプチドの前記カルボン酸への結合を測定することを含み、ここで、候補モジュレーターの不存在下での結合と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での結合の低減が、本発明のＯＲの活性を調節する剤としての候補モジュレーターを同定する、方法を包含する。
【００２３】
したがって、本発明は、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる群より選択される、１つ以上の嗅覚受容体（ＯＲ）の機能を調節する剤を同定する方法であって、
ａ）前記１つ以上のＯＲを、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択される１つ以上のカルボン酸と、前記剤の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ＯＲへの結合を可能にするか、または前記ＯＲの前記カルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）前記剤の存在下および不存在下で、前記１つ以上のＯＲの前記１つ以上のカルボン酸への結合、または前記１つ以上のＯＲの活性を比較する工程を含み、ここで、剤の不存在下での結合または活性と比較した、前記剤の存在下での結合または活性の差が、前記１つ以上のカルボン酸に応答して前記１つ以上のＯＲの機能を調節する剤としての剤を同定する、
方法を提供する。
【００２４】
好ましい態様において、前記剤は、前記カルボン酸のここで挙げられた全７つのＯＲへの結合への影響、またはここで挙げられた全７つのＯＲの前記カルボン酸による活性化への影響について試験される。
【００２５】
本発明はまた、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる群より選択される、１つ以上の嗅覚受容体（ＯＲ）の機能を調節する剤を同定する方法であって、
ａ）前記１つ以上のＯＲを、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸およびウンデカン酸からなる群より選択される１つ以上のカルボン酸と、前記剤の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ＯＲへの結合を可能にする、または前記ＯＲの前記カルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）前記剤の存在下および不存在下での前記１つ以上のＯＲの前記１つ以上のカルボン酸への結合、または前記１つ以上のＯＲの活性を比較する工程を含み、ここで、剤の不存在下での結合または活性と比較した、前記剤の存在下での結合または活性の差が、前記１つ以上のカルボン酸に応答して前記１つ以上のＯＲの機能を調節する剤としての剤を同定する、
方法も提供する。
【００２６】
好ましい態様において、前記剤は、前記カルボン酸のここで挙げられた６つのＯＲの群の全メンバーへの結合への影響、またはここで挙げられた６つのＯＲの群の全メンバーの前記カルボン酸による活性化への影響について試験される。好ましくは、６つのＯＲの前記群は、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる。
【００２７】
さらなる態様において、前記剤は、ペンタン酸のＯＲ５２Ｌ１への結合への影響、またはＯＲ５２Ｌ１のペンタン酸による活性化への影響について試験される。
【００２８】
別の態様において、前記剤は、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸のＯＲ５２Ｅ８への結合への影響、またはＯＲ５２Ｅ８の３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸による活性化への影響について試験される。
【００２９】
次の態様において、前記剤は、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のＯＲ５２Ｂ２への結合への影響、またはＯＲ５２Ｂ２のヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験される。
【００３０】
別の態様において、前記剤は、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキサン酸、もしくは安息香酸のＯＲ５１Ｉ２への結合への影響、またはＯＲ５１Ｉ２のブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキサン酸、もしくは安息香酸による活性化への影響について試験される。
【００３１】
さらなる態様において、前記剤は、ブタン酸のＯＲ５２Ｅ１への結合への影響、またはＯＲ５２Ｅ１のブタン酸による活性化への影響について試験される。
【００３２】
なお別の態様において、前記剤は、４−エチルオクタン酸のＯＲ５２Ａ５への結合への影響、またはＯＲ５２Ａ５の４−エチルオクタン酸による活性化への影響について試験される。
【００３３】
別の態様において、前記剤は、ヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のＯＲ５６Ａ５への影響、またはＯＲ５６Ａ５のヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、
ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験される。
【００３４】
好ましくは、前記１つ以上のＯＲポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列により定義される。本発明は、試料において、試料における本発明のＯＲのいずれか１つの活性を調節する剤の存在を検出する方法であって、ａ）ＯＲポリペプチドをカルボン酸と、前記試料の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ＯＲポリペプチドへの結合を可能にする条件下で接触させること、およびｂ）前記ＯＲポリペプチドの前記カルボン酸への結合を測定することを含み、ここで、候補モジュレーターの不存在下での結合と比較した、試料の存在下での結合の低減が、前記試料におけるＯＲの活性を調節する剤の試料における存在を示す、方法をさらに包含する。
【００３５】
本発明は、本発明のＯＲのいずれか１つの機能を調節する剤を同定する方法であって、ａ）ＯＲポリペプチドをカルボン酸と、候補モジュレーターの存在下または不存在下で、前記ＯＲポリペプチドのカルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させること、およびｂ）前記ＯＲポリペプチドのシグナル伝達活性を測定することを含み、ここで、前記候補モジュレーターの不存在下での活性と比較した、前記候補モジュレーターの存在下での活性の変化が、前記ＯＲの機能を調節する剤としての前記候補モジュレーターを同定する、方法をさらに包含する。
【００３６】
本発明は、本発明のＯＲのいずれか１つの機能を調節する剤を同定する方法であって、ａ）ＯＲポリペプチドを候補モジュレーターと接触させること、ｂ）前記ＯＲポリペプチドのシグナル伝達活性を前記候補モジュレーターの存在下で測定すること、およびｃ）前記候補モジュレーターの存在下で測定した活性を、前記ＯＲポリペプチドがカルボン酸とそのＥＣ50で接触させた試料において測定した前記活性と比較することを含み、ここで、候補モジュレーターの存在下で測定した活性の量が、そのＥＣ50で存在する前記カルボン酸により誘導される量の少なくとも１０％であるとき、前記候補モジュレーターを、ＯＲの機能を調節する剤として同定する、方法をさらに包含する。
【００３７】
本発明は、試料において、本発明のＯＲの機能を調節する剤の存在を検出する方法であって、ａ）ＯＲポリペプチドをカルボン酸と、前記試料の存在下および不存在下で接触させること、ｂ）前記ＯＲポリペプチドのシグナル伝達活性を測定すること、およびｃ）前記試料なしでＯＲおよびカルボン酸を含有する反応物において測定した前記活性の量を、ＯＲ、カルボン酸および前記試料を含有する反応物において測定した前記活性の量と比較することを含み、ここで、前記試料の不存在下での活性と比較した、前記試料の存在下での前記活性の変化が、前記試料におけるＯＲの機能を調節する剤の存在を示す、方法をさらに包含する。
【００３８】
本発明は、試料において、本発明のＯＲの機能を調節する剤の存在を検出する方法であって、ａ）ＯＲポリペプチドを前記試料と接触させること、ｂ）前記ＯＲポリペプチドのシグナル伝達活性を前記試料の存在下で測定すること、およびｃ）前記試料の存在下で測定した前記活性を、前記ＯＲポリペプチドが、そのＥＣ50で存在するカルボン酸と接触させた反応物において測定した前記活性と比較することを含み、ここで、前記試料の存在下で測定した活性の量が、そのＥＣ50で存在するカルボン酸により誘導される量の少なくとも１０％であれば、ＯＲの機能を調節する剤を検出する、方法をさらに包含する。
【００３９】
本発明によると、結合方法を用いるとき、カルボン酸は、検出可能に標識されていてもよい。前記方法において、カルボン酸は、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、および蛍光のクエンチャーからなる群より選択される部分で検出可能に標識されていてもよい。
【００４０】
上述の方法のいずれか１つの一態様において、接触は、前記ＯＲポリペプチドを発現する細胞内または細胞上で行われる。本発明によると、前記細胞は、ヒト胎児由来腎臓細胞（Ｈｅｋ２９３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サル細胞（ＣＯＳ）、一次嗅覚細胞、ツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌であってもよいが、これらに限定されない。
【００４１】
上述の方法のいずれか１つの別の態様において、接触は、合成リポソーム内または上で行われる（Ｔａｊｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：  ６４９−６５４を参照、これは、ここで引用により組み込まれる）またはＯＲポリペプチドを含有する、ウイルスにより誘導される出芽膜（ＷＯ０１０２５５１、２００１を参照、ここで引用により組み込まれる）。
【００４２】
上述の方法のいずれか１つの別の態様において、方法は、前記ＯＲポリペプチドを発現する細胞由来の膜分画を用いて行われる。
【００４３】
上述の方法のいずれか１つの好ましい態様において、方法は、タンパク質チップ上で行われる。
【００４４】
上述の方法のいずれか１つの別の好ましい態様において、測定は、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光クエンチング、および蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる。
【００４５】
上述の方法のいずれか１つの別の態様において、剤は、ペプチド、ポリペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および小有機分子からなる群より選択される。
【００４６】
本発明によると、機能アッセイが用いられるとき、本発明のＯＲのシグナル伝達活性を測定する工程は、第２のメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含んでいてもよい。
【００４７】
別の態様において、シグナル伝達活性を測定する工程は、グアニンヌクレオチド結合／架橋または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、タンパク質キナーゼＣ活性、タンパク質キナーゼＡ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流動、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む。Ｇタンパク質結合／架橋または交換が測定されるとき、可能な全Ｇαサブユニットのうち、好ましくは、ＧＴＰ結合タンパク質Ｇタンパク質アルファ−ｏｌｆサブユニット（嗅覚）、さらにＧ−ｏｌｆの行為が研究される。ヒトＧ−ｏｌｆサブユニットの配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋにおいて受託番号Ｌ１０６６５の下、既に寄託されている。しかしながら、他の種のＧ−ｏｌｆサブユニットが用いられ、研究されていてもよい。
【００４８】
好ましい態様において、シグナル伝達活性の測定は、蛍光または発光アッセイを用いることを含む。蛍光および発光アッセイは、ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４またはＦｕｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）、Ｃａ３−ｋｉｔ  ｆａｍｉｌｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）およびエクオリンを含むＣａ2+感受性フルオロフォアの使用を含んでいてもよい。さらに、前記アッセイは、自動蛍光定量的または発光リーダー、例えば、ＦＤＳＳ（Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ）またはＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を適用してもいてもよい。
【００４９】
本発明は、細胞において本発明のＯＲの活性を調節する方法であって、ＯＲの活性が調節されるように、前記細胞にカルボン酸またはＯＲポリペプチドの活性を調節する剤を運ぶ工程を含む、方法を包含する。
【００５０】
上述の方法のいずれか１つの別の態様において、方法は、ハイスループットスクリーニング方法である。
【００５１】
上述の方法のいずれか１つの別の態様において、剤は、化学物質ライブラリーまたは動物の器官抽出物の一部である。
【００５２】
本発明によると、上述の方法のいずれかにより同定もしくは検出された剤、または前記剤を含む組成物を用いて、汗の悪臭が弱められていてもよい。あるいは、これらは、匂い物質ブロッカーまたは匂い物質アンタゴニストの調製のために用いられてもよい。例えば、ＯＲブロッカーまたはアンタゴニストは、デオドラントとして用いられてもよい。ＯＲブロッカーまたはアンタゴニストは、既に用いられている芳香または香料製剤に、その有効性を強化するためのデオドラントとして加えられてもよい。
【００５３】
本発明は、単離されたＯＲポリペプチドおよびカルボン酸を含む組成物も包含する。好ましい態様において、前記組成物は、ここで同定された全７つのＯＲ、または２、３、４、５、もしくは６つの受容体のその任意の組合せを包含する。好ましくは、６つのＯＲの前記群は、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる。
【００５４】
本発明は、本発明のＯＲのシグナル伝達を調節する剤をスクリーニングするためのキットの製造のための、または匂い物質ブロッカーもしくは匂い物質アンタゴニストをスクリーニングするためのキットの製造のための本発明のＯＲとの組合せにおけるカルボン酸の使用にさらに関する。
【００５５】
加えて、本発明は、本発明のＯＲのリガンドとしての、哺乳類の汗に存在するカルボン酸の使用を包含する。
【００５６】
本発明は、本発明の複合体のカルボン酸／ＯＲを認識する抗体またはそのフラグメントにも関する。
【００５７】
本発明は、単離されたＯＲポリペプチドまたは幾つかの単離されたＯＲポリペプチド、カルボン酸およびそのための包装材料を含むキット、ＯＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはＯＲポリペプチドをコードする幾つかの単離されたポリヌクレオチド、カルボン酸、およびそのための包装材料を含むキット、ＯＲポリペプチドを発現する細胞もしくはその膜、またはＯＲポリペプチドを発現する幾つかの細胞もしくはその膜、カルボン酸およびそのための包装材料を含むキットをさらに包含する。前記細胞は、前記ＯＲをコードするポリヌクレオチドで形質転換されてもよい。好ましい態様において、前記キットは、ここで同定された全７つのＯＲ、または２、３、４、５、もしくは６つの受容体のその任意の組合せ、およびそれらのそれぞれのカルボン酸を包含する。好ましくは、６つのＯＲの前記群は、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１−１】図１は、本発明の７つの嗅覚受容体（ＯＲ）をコードするＤＮＡおよび対応するポリペプチド配列を示す。
【図１−２】図１は、本発明の７つの嗅覚受容体（ＯＲ）をコードするＤＮＡおよび対応するポリペプチド配列を示す。
【図１−３】図１は、本発明の７つの嗅覚受容体（ＯＲ）をコードするＤＮＡおよび対応するポリペプチド配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【図２Ｅ−１】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【図２Ｅ−２】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【図２Ｆ−１】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【図２Ｆ−２】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【図２Ｇ−１】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【図２Ｇ−２】図２Ａ〜Ｇは、汗において見出された全カルボン酸であるそれらの異なる活性化因子での本発明の７つの受容体の濃度応答性分析に対応する。これらの分析は、「実験手順」に記載される手順に従い行われた。
【発明の詳細な説明】
【００５９】
定義
ここで用いられる場合、用語「嗅覚受容体ポリペプチド（ＯＲ）」は、嗅神経細胞において生成されるＧタンパク質共役型受容体ファミリーに由来するポリペプチドを一般に指す。ＯＲは、匂い物質分子と相互作用し、匂い物質シグナルを伝達する能力を有し得る。用語「本発明による嗅覚受容体（ＯＲ）」または「本発明による嗅覚受容体ポリペプチド」は、カルボン酸を選択的に検出することができることが本発明において示された７つの嗅覚受容体の群を指す。本発明による嗅覚受容体の例は、図１において表される配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４）に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性、および好ましくは、１００％を含む、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。前記相同性は、ポリペプチド全体またはポリペプチドのただ部分、例えば、ＣＤＲドメイン（受容体のリガンド結合ドメイン）に関してもよい。ＰｉｌｐｅｌおよびＬａｎｃｅｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８：９６９−９７７、  １９９９）によると、ＧＰＣＲのＣＤＲドメインは、公開された指標に従い定義され得る：ＴＭ３−＃４、ＴＭ３−＃８、ＴＭ３−＃１１、ＴＭ３−＃１２、ＴＭ３−＃１５、ＴＭ４−＃１１、ＴＭ４−＃１５、ＴＭ４−＃１９、ＴＭ４−＃２２、ＴＭ４−＃２３、ＴＭ４−＃２６、ＴＭ５−＃３、ＴＭ５−＃６、ＴＭ５−＃７、ＴＭ５−＃１０、ＴＭ５−＃１１およびＴＭ５−＃１３（式中、ＴＭｘは、前記受容体の膜貫通型領域を示し、＃は、前記領域内のアミノ酸位置を示す）。
【００６０】
ここで用いられる場合、用語「ＯＲポリヌクレオチド」は、ここで定義されるＯＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、図１に表される配列（配列番号１、３、５、７、９、１１および１３）に対して１００％を含む、少なくとも８０％以上、好ましくは、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の核酸同一性を有する。
【００６１】
ここで用いられる場合、用語「ＯＲ結合」は、匂い物質分子のＯＲポリペプチドによる特異的結合を指す。匂い物質分子の例は、カルボン酸、エステル、アルコールおよびアミンを含むが、これらに限定されない。
【００６２】
ここで用いられる場合、用語「ＯＲシグナル伝達活性」は、ＯＲポリペプチドによるシグナル伝達の開始または伝播を指す。ＯＲシグナル伝達活性は、以下のうち１つ以上をアッセイすることによるシグナル伝達カスケードにおける検出可能な工程を測定することにより、モニターされる：Ｇタンパク質、最も詳細には、Ｇ−ｏｌｆでのＧＴＰ交換のためのＧＤＰの刺激、アデニル酸シクラーゼ活性の変化、タンパク質キナーゼＣ調節、タンパク質キナーゼＡ調節、ホスファチジルイノシトール分解（第２のメッセンジャージアシルグリセロール、およびイノシトール三リン酸を生成する）、細胞内カルシウム流動、ＭＡＰキナーゼの活性化、チロシンキナーゼの調節、内部移行アッセイ、遺伝子もしくはレポーター遺伝子活性の調節、またはメラノフォアアッセイ。測定可能な活性が、ここで記載されるＯＲ活性アッセイのいずれかと比較して、カルボン酸の実質的不存在下で確立された基準より１０％以上上または下に変化するなら、シグナル伝達カスケードにおける検出可能な工程は、開始されたか、または仲介されたと見なされる。測定可能な活性は、直接的に測定され得る（例えば、ｃＡＭＰまたはジアシルグリセロールレベルの測定など）。あるいは、測定可能な活性が間接的に測定され得る（例えば、レポーター遺伝子アッセイなど）。これらのアッセイの大部分について、キットが市販されている。
【００６３】
本発明によるカルボン酸は、哺乳類の汗、好ましくは、ヒトの汗に存在するカルボン酸であり、汗の悪臭の生成に関与するか、または重要である（例えば、表１を参照）。
【００６４】
本発明による「ブロッカー」または「ブロックする化合物」は、１つ以上の匂い物質分子により誘発される匂いの知覚を減弱するかまたは消失させる分子である。ブロッカーは、前記匂いを伝達するＯＲと相互作用することにより、または受容体に対して天然のリガンドと相互作用することにより作用し得る。本発明の「ブロックする化合物」は、アゴニストにより誘導される細胞内応答、例えば、ヒトの汗に存在するカルボン酸を、少なくとも１０％、好ましくは、１５〜２５％、より好ましくは、２５〜５０％、および最も好ましくは、５０〜１００％低減し得る。「ブロッカー」はまた、本発明のブロッカーをコードするヌクレオチド配列も指し得る。本発明により有用なブロッカーは、抗体、小分子、アプタマー、フォトアプタマー、修飾された天然のリガンドなどを含むが、これらに限定されず、これは、カルボン酸を介したシグナル伝達に要求されるＯＲの少なくとも一部（例えば、リガンド結合部位）に特異的に結合するか、またはＯＲに結合するシグナル伝達経路を（例えば、少なくとも１０％）ブロックするかまたは低減することができる。好ましくは、ブロッキング剤は、好ましくは揮発性物質であるか、または適当な溶媒または添加剤と組合せて、揮発性物質を生じ得る。
【００６５】
ここで用いられる場合、「アンタゴニスト」は、受容体に結合し、リガンドまたはアゴニストにより誘導される細胞内応答、例えば、ヒトの汗に存在するカルボン酸を、アゴニストの存在下および不存在下での細胞内応答と比較して、少なくとも１０％、好ましくは、１５〜２５％、より好ましくは、２５〜５０％、および最も好ましくは、５０〜１００％阻害するリガンドである。アンタゴニストは、競合的であってもよく、すなわち、それは、アゴニストまたはリガンドと同一の部位に結合するが、受容体の活性化形態により開始される細胞内応答を活性化せず、それ故、前記リガンドまたはアゴニストによる活性化を回避する。あるいは、アンタゴニストは、非競合的であってもよく、すなわち、それは、アゴニストまたはリガンド結合部位以外の部位に結合し、不活性な構造の受容体をブロックし、それ故、アゴニストにより嗅覚シグナルの伝達を回避する。
【００６６】
ここで用いられる場合、「天然のリガンド」は、ヒトの汗に存在するカルボン酸、例えば、ここで例示されるカルボン酸に少なくとも均等である方法で受容体に結合する天然に存在するリガンドを指す。「天然のリガンド」は、天然で見られず、受容体に結合するよう操作された、操作されたリガンドを指さず、それは、結合するよう操作されたものと異なる方法、異なる程度または種類のいずれかで以前に操作されていない。かかる操作されたリガンドは、もはや天然に存在するものではなく、「非天然」であり、天然に存在する分子からもたらされる。
【００６７】
ここで用いられる場合、「モジュレーター」は、受容体のリガンド、例えば、ヒトの汗に存在するカルボン酸の存在または不存在下のいずれかで、本発明の受容体の細胞表面発現を増大するか、もしくは低減する、本発明のＯＲのリガンドの結合を増大するか、もしくは低減する化合物、または本発明のＯＲの活性化形態により開始される細胞内応答を増大するか、もしくは低減する任意の化合物を指す。モジュレーターは、ここで定義される、アンタゴニスト、またはブロッカーを含む。モジュレーターは、例えば、小分子、ポリペプチド、ペプチド、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、アプタマー、フォトアプタマー、または小化学化合物または小有機分子であり得る。候補モジュレーターは、例えば、合成の小分子、動物、植物、細菌または真菌細胞の抽出物、およびかかる細胞由来の条件培地に含有される化合物を含む、天然または合成の化合物であり得る。
【００６８】
ここで用いられる場合、用語「増大」および「低減」は、本発明のＯＲに結合するリガンドの量および／または本発明のＯＲを介した細胞シグナル伝達の量の少なくとも１０％の変化を指す。結合またはシグナル伝達の「増大」または「低減」は、好ましくは、候補モジュレーターの存在下で、本発明のＯＲをリガンドと接触させた応答において測定され、ここで、結合またはシグナル伝達の変化は、候補モジュレーターの不存在下での結合またはシグナル伝達に対するものである。
【００６９】
ここで用いられる場合、用語「小分子」は、３０００ダルトン未満、好ましくは、２０００または１５００未満、なおより好ましくは、１０００未満、および最も好ましくは、６００ダルトン未満の分子量を有する化合物を指す。「小有機分子」は、炭素を含む小分子である。
【００７０】
ここで用いられる場合、例えば、結合もしくはシグナル伝達活性、または物質の量に適用される、用語「変化」、「差」、「低減」、または「増大」は、所定のアッセイにおける標準と比較して、結合、シグナル伝達活性、または例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチドまたはリガンドのレベルの少なくとも１０％の増大または低減を指す。
【００７１】
ここで用いられる場合、用語「カルボン酸の本発明のＯＲへの結合を可能にする条件」は、ＯＲがカルボン酸に結合する、例えば、温度、塩濃度、ｐＨおよびタンパク質濃度の条件を指す。正確な結合条件は、アッセイの性質、例えば、アッセイが、生きた細胞を用いるか、または細胞の膜分画のみを用いるかに依存して変動することになる。しかしながら、本発明のＯＲは、細胞表面タンパク質であるので、好ましい条件は、生理学的塩（９０ｍＭ）およびｐＨ（約７．０〜８．０）を一般に含むことになる。結合のための温度は、１５℃〜３７℃で変動し得るが、好ましくは、室温〜約３０℃の間となる。結合反応におけるカルボン酸の濃度はまた、約０．５〜２μＭで変動するが、好ましくは、約１μＭとなる。
【００７２】
ここで用いられる場合、用語「試料」は、本発明のＯＲへの結合、またはシグナル伝達活性を調節する剤またはモジュレーター化合物の存在について試験される分子の供給源を指す。試料は、環境試料、動物、植物、酵母または細菌細胞もしくは組織の天然の抽出物、臨床試料、合成試料、または組換え細胞由来もしくは発酵過程由来の条件培地であり得る。
【００７３】
ここで用いられる場合、「組織」は、生物において特定の機能を行う細胞の凝集体である。ここで用いられる場合、用語「組織」は、特定の生理学的領域由来の細胞材料を指す。特定の組織における細胞は、幾つかの異なる細胞種を含み得る。この非限定的な例は、神経細胞およびグリア細胞、ならびに毛細管内皮細胞および血液細胞をさらに含む脳組織、所定の組織切片または試料に含有される全てである。固形組織に加え、用語「組織」は、非固形組織、例えば、血液を包含することも意図される。
【００７４】
ここで用いられる場合、用語「膜分画」は、本発明のＯＲを含有する細胞脂質膜の調製物を指す。ここで用いられる場合、「膜分画」は、細胞のホモジネートと別個であり、ここで、非膜関連の細胞構成物の少なくとも部分（すなわち、少なくとも１０％、および好ましくはより多く）が取り除かれている。用語「膜関連」は、脂質膜に統合されるか、または脂質膜に統合される成分と物理的に関連するいずれかである、これらの細胞構成物を指す。
【００７５】
ここで用いられる場合、用語「第２のメッセンジャーアッセイ」は、グアニンヌクレオチド結合または交換、アデニル酸シクラーゼ、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内イノシトールホスフェート、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキドン酸濃度、ＭＡＰキナーゼまたはチロシンキナーゼ、タンパク質キナーゼＣ活性、もしくはレポーター遺伝子発現の測定、または当該技術分野において公知かつここで定義された方法によるエクオリンに基づくアッセイを好ましくは含む。
【００７６】
ここで用いられる場合、用語「第２のメッセンジャー」は、ＧＰＣＲからのシグナルの伝達に関与するＧタンパク質共役型受容体の活性化により、濃度を変動するよう生成または生じた分子を指す。第２のメッセンジャーの非限定的な例は、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、イノシトール三リン酸および細胞内カルシウムを含む。用語「第２のメッセンジャーのレベルの変化」は、候補モジュレーターの不存在下で行われたアッセイにおいて検出された量と比較して、所定の第２のメッセンジャーの検出されたレベルの少なくとも１０％の増大または低減を指す。
【００７７】
ここで用いられる場合、用語「エクオリンに基づくアッセイ」は、活性化ＧＰＣＲにより誘導される細胞内カルシウム流動を測定するＧＰＣＲ活性のアッセイを指し、ここで、細胞内カルシウム流動が、細胞において発現されるエクオリンの発光により測定される。
【００７８】
ここで用いられる場合、用語「結合」は、分子（例えば、リガンド、例えば、カルボン酸または抗体）の受容体（例えば、本発明のＯＲ）との物理的関連を指す。ここで用いられる場合、結合は、１ｍＭ未満、一般的には、１ｍＭ〜１０ｎＭの範囲のＥＣ50またはＫｄで生じるなら、「特異的」である。例えば、結合は、ＥＣ50またはＫｄが１ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、１０μＭ、９．５μＭ、９μＭ、８．５μＭ、８μＭ、７．５μＭ、７μＭ、６．５μＭ、６μＭ、５．５μＭ、５μＭ、４．５μＭ、４μＭ、３．５μＭ、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、７５０ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭまたは１００ｎＭ以下であれば、特異的である。
【００７９】
ここで用いられる場合、用語「ＥＣ50」は、カルボン酸または他のリガンドの結合を含む所定の活性およびＯＲの機能的活性が、化合物の不存在下で同一のアッセイを用いて測定可能なＯＲ活性の最大値の５０％である、化合物の濃度を指す。これと異なり規定すると、「ＥＣ50」は、１００％の活性化がさらなるアゴニストの添加で増大しない活性の量に設定されたとき、５０％の活性化を示す化合物の濃度である。
【００８０】
ここで用いられる場合、用語「飽和」は、リガンド濃度のさらなる増大が、リガンドの結合またはＯＲ特異的シグナル伝達活性の増大に失敗する、ヒトの汗に存在するカルボン酸、または他のリガンドの濃度を指す。
【００８１】
ここで用いられる場合、用語「ＩＣ50」は、本発明のＯＲの最大活性化を５０％低減する、アンタゴニストまたはブロッカーの濃度である。
【００８２】
ここで用いられる場合、用語「結合の低減」は、公知または疑われるモジュレーターを欠くアッセイにおいて検出される結合と比較して、本発明のＯＲの公知または疑われるモジュレーターでの所定のアッセイにおいて検出されるリガンド結合の量の少なくとも１０％の低減を指す。
【００８３】
ここで用いられる場合、用語「Ｇタンパク質共役型受容体」または「ＧＰＣＲ」は、７つのアルファらせん状膜貫通型ドメインを有する膜関連ポリペプチドを指す。機能的ＧＰＣＲは、リガンドまたはアゴニストと関連し、また、Ｇタンパク質と関連し、かつ活性化する。本発明のＯＲポリペプチドは、ＧＰＣＲである。
【００８４】
ここで用いられる場合、用語「抗体」は、対象ポリペプチドの１つと特異的に反応性でもある、従来の免疫グロブリン分子、およびそのフラグメントである。抗体は、従来技術を用いてフラグメント化され、フラグメントは、抗体全体についての後述と同一の方法で有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより、生成され得る。得られたＦ（ａｂ）２フラグメントを処理して、ジスルフィド結合を減らし、Ｆａｂフラグメントが産生され得る。本発明の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域により与えられる、ポリペプチドについての親和性を有する、二重特異的１本鎖、ならびにキメラおよびヒト化分子を含むことがさらに意図される。好ましい態様において、抗体は、それに結合し、検出され得る標識をさらに含む（例えば、標識は、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。モノクローナルまたはポリクローナル抗体、およびその高頻度可変部分（ＦＡＢ、ＦＡＢ’’など）、ならびに抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、特定疾患、好ましくは、後述されるものの診断およびモニターの分野において特異的な産業上の適用を見出す、本発明のさらなる側面である。本発明による阻害剤は、標識されたモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または抗体の高頻度可変部分を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
ここで用いられる場合、用語「ＯＲ恒常的活性」は、前記嗅覚受容体のリガンドを添加することなく自発的に生じる、細胞に発現される嗅覚受容体の測定可能な活性を指す。
【００８６】
ここで用いられる場合、用語「インバースアンタゴニスト」は、ＯＲに結合し、ＯＲの恒常的活性を低減または抑制する分子を指す。
【００８７】
本発明は、ヒトの汗に存在するカルボン酸が、嗅覚受容体の特定の群、ここで定義されるＯＲポリペプチドの天然のリガンドであるという発見に関する。ＯＲ／カルボン酸相互作用は、かかる相互作用、およびしたがってＯＲの機能を調節する剤についてのスクリーニングアッセイに有用である。このＯＲ／カルボン酸相互作用はまた、産業において興味を引き得るモジュレーターの同定も提供する。
【００８８】
ＯＲの活性を調節する剤の同定のためのアッセイ
ＯＲの活性を調節する剤は、前記受容体のカルボン酸との相互作用を利用する多数の方法で同定され得る。例えば、培養細胞においてインビトロで、またはインビボのいずれかにおいて、ＯＲ／カルボン酸結合を再構成する能力が、結合を妨害する剤の同定のための標的を提供する。結合の崩壊に基づくアッセイは、剤、例えば、小有機分子を、かかる分子のライブラリーまたは集合物から同定し得る。あるいは、かかるアッセイは、植物、真菌または細菌抽出物またはヒト組織試料でさえ含む、天然の供給源由来の試料または抽出物において剤を同定し得る。次に、ＯＲ／カルボン酸結合のモジュレーターが、前記受容体を介した下流シグナル伝達を測定する結合アッセイまたは機能アッセイを用いてスクリーニングされ得る。結合アッセイと機能アッセイの両方が、カルボン酸を用いて立証される。
【００８９】
ＯＲ機能を調節する剤を同定するためにより直接的にＯＲ／カルボン酸相互作用を使用する別のアプローチは、候補剤または候補モジュレーターにより誘導されるＯＲ下流シグナル伝達の変化を測定する。これらの機能アッセイは、単離細胞膜分画において、または受容体を表面に発現している細胞において行われ得る。
【００９０】
以下の記載は、ＯＲとカルボン酸の相互作用に基づく結合と機能アッセイの両方の方法を提供する。
【００９１】
Ａ．ＯＲポリペプチド
ＯＲポリペプチドとカルボン酸の相互作用を用いるアッセイは、ＯＲポリペプチドの供給源を必要とする。ヒトＯＲのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ここで図１で提示される。ヒトＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５ポリヌクレオチド配列はまた、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号  ＮＭ＿００１００５１７３（配列番号１）、ＮＭ＿００１００５１６８（配列番号３）、ＮＭ＿００１００４０５２（配列番号５）、ＮＭ＿００１００４７５４（配列番号７）、ＮＧ＿０３３１９７（配列番号９）、ＮＭ＿００１００５１６０（配列番号１１）、ＮＭ＿００１１４６０３３（配列番号１３）で入手可能である。ポリペプチド配列はまた、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおいて、それぞれ、受託番号Ｑ８ＮＧＨ７（配列番号２）、Ｑ６ＩＦＧ１（配列番号４）、Ｑ９６ＲＤ２（配列番号６）、Ｑ９Ｈ３４４（配列番号８）、Ｑ８ＮＧＪ３（配列番号１０）、Ｑ９Ｈ２Ｃ５（配列番号１２）、およびＰ０Ｃ７Ｔ３（配列番号１４）で記録されている。
【００９２】
当業者は、公知の配列から設計されたプライマーまたはプローブを用いて、基本的なＰＣＲおよび分子クローニング技術を通じて、タンパク質をコードするｍＲＮＡを含有する試料からＯＲ配列を容易に増幅し得る。また、ＯＲ遺伝子はイントロンのない遺伝子であるので、当業者は、ＯＲ配列をゲノムＤＮＡから増幅し得る。
【００９３】
組換えポリペプチドの発現は、当該技術分野において周知である。当業者は、真核細胞または原核細胞における本発明によるＯＲポリペプチドの発現のため、ベクターおよび発現制御配列を容易に選択し得る。ＯＲポリペプチドは、結合またはシグナル伝達機能を有するように、細胞膜または合成リポソームと好ましくは結合する。細胞の膜分画の調製方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈｕｂｂａｒｄ  ＆  Ｃｏｈｎ，  １９７５，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６４：  ４６１−４７９（これは、ここで引用により組み込まれる）により報告された方法である。ＯＲポリペプチドを含む膜を生産するために、かかる膜の単離技術を本発明のＯＲポリペプチドの１つを内在性にまたは組換え発現する細胞に、例えば適用し得る。あるいは、ＯＲポリペプチドは、ポリペプチドの界面活性剤溶液の希釈により、膜調製物に組み込まれ得る（例えば、Ｓａｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ７１：２８３−２９４を参照、これは、ここで引用により組み込まれる）。
【００９４】
Ｂ．汗に存在するカルボン酸
かかるカルボン酸の構造は、当業者により周知である。加えて、当業者は、均等な酸を前記構造から容易にもたらしてもよく、前記均等物、ＯＲポリペプチドに結合するか、および／または調節できるかを容易に試験してもよい。カルボン酸は、天然の試料から単離されるか、または化学的に合成されてもよい。
【００９５】
前記酸を定量化するために用いられ得る方法は、ａ）抽出および精製のため、溶媒抽出、油抽出、蒸気抽出、ＣＯ2超臨界抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留、ガスクロマトグラフィー、ｂ）定量化のため、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーおよび質量分析であってもよいが、これらに限定されない。前記方法は、当該技術分野において周知である。
【００９６】
カルボン酸は、精製された形態で用いられてもよく、または組成物として用いられてもよい。本発明による所定の結合または機能アッセイにおいて必要な酸の量は、アッセイに依存して変動するが、１回のアッセイ当たり、１μＭ〜１０００μＭの標識された酸、および１０μＭ〜１０ｍＭの無標識の酸を一般的に用いる。所定のアッセイに必要であれば、カルボン酸は、上で挙げられた放射性標識を組込むかまたは添加することにより、標識され得る。
【００９７】
Ｃ．ＯＲ活性のモジュレーターを同定するためのアッセイ
カルボン酸が、クラス１の嗅覚受容体ファミリーに属する７つのＯＲのリガンドであるという発見は、ＯＲ活性のモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイの開発を可能にする。スクリーニングアッセイは、２つの一般的なアプローチを有する。
【００９８】
１）リガンド結合アッセイ、ここで、本発明による１つ以上のＯＲを発現する細胞、かかる細胞由来の膜抽出物、または本発明による１つ以上のＯＲを含む固定された脂質膜が、前記１つ以上のＯＲに結合することが公知の標識されたカルボン酸、および候補化合物に暴露される。インキュベーション後、反応混合物は、標識されたカルボン酸の前記ＯＲへの特異的結合について測定される。標識されたカルボン酸と干渉するか、またはＯＲから置換させる化合物が、ＯＲ活性のモジュレーター、好ましくは、ブロッカーまたはアンタゴニストとして同定され得る。機能分析は、それらが適合するこれらのカテゴリーにおいて決定される正の化合物において行われ得る。
【００９９】
化合物の結合は、３つの主なカテゴリーに分類され得る：競合的結合、非競合的結合、および競合しない結合。競合結合する化合物は、第２の（参考）化合物に似ており、標的分子（ここで、受容体）の同一の結合ポケットに結合する。添加の際、競合結合する化合物は、前記第３の化合物を前記標的から置き換える。非競合結合する化合物は、第２の（参考）化合物と同一の標的分子の結合ポケットに結合しないが、前記標的分子上の前記第２の化合物の作用と相互作用し得る。第２の化合物は、非競合結合する化合物の添加の際に、置き換わらない。競合結合しない化合物は、第２の化合物が既に結合したとき、標的分子に結合する。協力的な結合は、化合物が、参考化合物であってもよい、別の化合物の結合を促進することを意味する。したがって、協力的作用は、前記他の化合物のＫｄの分析において見られる。
【０１００】
２）機能アッセイ、ここで、ＯＲのシグナル伝達活性が測定される。
【０１０１】
ａ）アゴニストスクリーニングのため、ＯＲを発現する細胞またはそれから調製された膜が、候補化合物とインキュベートされ、ＯＲのシグナル伝達活性が測定される。アッセイは、カルボン酸をアゴニストとして用いて証明され、受容体活性を調節する化合物により誘導された活性が、カルボン酸により誘導されたものと比較される。アゴニストまたは部分的アゴニストは、１００μＭ以下で存在するときカルボン酸の最大活性の少なくとも１０％に対応する最大生物学的活性を有し、好ましくは、５０％、７５％、１００％またはそれ以上を有し、これは、カルボン酸の２倍、５倍、１０倍またはそれ以上の活性を含む。
【０１０２】
ｂ）アンタゴニストのスクリーニングのため、ＯＲを発現する細胞またはそれから単離された膜が、候補化合物ありまたはなしで、カルボン酸の存在下でシグナル伝達活性についてアッセイされる。アンタゴニストは、アンタゴニストを欠く反応と比較して、カルボン酸により刺激される受容体活性のレベルを、少なくとも１０％低減する。
【０１０３】
ｃ）インバースアンタゴニストスクリーニングのため、恒常的ＯＲ活性を発現する細胞またはそれから単離された膜が、カルボン酸リガンドの不存在下で受容体の活性を測定する機能アッセイにおいて用いられる。インバースアンタゴニストは、ＯＲの恒常的活性を少なくとも１０％低減する化合物である。ＯＲの過剰発現は、恒常的活性化に通じてもよい。ＯＲは、強力な恒常的プロモーター、例えば、ＣＭＶ初期プロモーターの制御下に置くことにより、過剰発現され得る。あるいは、保存ＧＰＣＲアミノ酸またはアミノ酸ドメインのある種の変異は、恒常的活性に通じる傾向にある。例えば、Ｋｊｅｌｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：１４３０、ＭｃＷｈｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：２０８７、Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：１６４８３、Ｓａｍａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２６８：４６２５、Ｐａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：６４９、Ｐａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２８６：８５、およびＰａｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：７９４９を参照。
【０１０４】
リガンド結合および置換アッセイ：
カルボン酸のＯＲポリペプチドへの結合を阻害する化合物をスクリーニングするために、カルボン酸と共に、細胞において発現されたＯＲポリペプチド、または受容体ポリペプチドを含有する単離された膜を用い得る。結合またはカルボン酸置換単独を測定するアッセイにおいて同定されるとき、化合物は、それらが、アゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアンタゴニストとして作用するかどうかを決定するために機能的試験にかけられなければならない。
【０１０５】
置換実験のため、ＯＲポリペプチドを発現する細胞（一般的に、１回のアッセイ当たり２５，０００細胞、または膜抽出物１〜１００μｇ）は、結合緩衝液（例えば、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．５％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（脂肪酸を含まない）、および０，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）において、１．５時間（例えば、２７℃にて）、標識されたカルボン酸と、増加濃度の候補モジュレーターの存在下または不存在下でインキュベートされる。アッセイを証明し、校正するために、増加濃度の非標識カルボン酸を用いて、対照競合反応が行われ得る。インキュベーション後、細胞が広範囲に渡り洗浄され、結合した標識されたカルボン酸が、所定の標識に応じて測定される（例えば、シンチレーション測定、酵素アッセイ、蛍光など）。候補モジュレーターの存在下で結合した標識されたカルボン酸の量の少なくとも１０％の低減は、結合の候補モジュレーターによる結合の置換を示す。候補モジュレーターは、標識されたカルボン酸の５０％を置換していれば、このアッセイまたはここで記載される他のアッセイにおいて特異的に結合するとみなされる。
【０１０６】
あるいは、結合または結合の置換は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりモニターされ得る。表面プラズモン共鳴アッセイは、水相から、センサーの膜上に固定されたＯＲポリペプチドへのカルボン酸の結合または結合の喪失により引き起こされる固定されたセンサー付近での質量の変化により、２つの分子間の結合を測定するための定量的方法として用いられ得る。この質量の変化は、カルボン酸または候補モジュレーターの注入または除去後の時間に対する共鳴単位として測定され、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いて測定される。ＯＲポリペプチドは、Ｓａｌａｍｏｎら（Ｓａｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．  ７１：  ２８３−２９４；  Ｓａｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ８０：  １５５７−１５６７；  Ｓａｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２４：  ２１３−２１９、それぞれが、ここで引用により組み込まれる）により記載される方法に従い、薄いフィルムの脂質膜におけるセンサーチップ上に固定され得る（例えば、研究グレードＣＭ５チップ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）。Ｓａｒｒｉｏらは、ＳＰＲを用いて、チップ状の脂質層に固定されたＧＰＣＲ  Ａ（１）アデノシン受容体へのリガンドの結合が検出され得ることを証明した（Ｓａｒｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０：  ５１６４−５１７４、ここで、引用により組込まれる）。ＳＰＲアッセイにおける本発明のＯＲへのカルボン酸結合の条件は、開始時にＳａｒｒｉｏらにより報告された条件を用いて、当業者により、首尾よく調整され得る。
【０１０７】
ＳＰＲは、少なくとも２つの方法で、結合のモジュレーターについてアッセイし得る。第１に、カルボン酸は、固定されたＯＲポリペプチドに予め結合され、続いて、流速約１０μｌ／分、および１ｎＭ〜１０００μＭの範囲、好ましくは、約１００μＭの濃度で、候補モジュレーターが注入され得る。結合したカルボン酸の置換が定量化され、これにより、モジュレーター結合の検出が可能になる。あるいは、膜に結合したカルボキシルポリペプチドが、候補モジュレーターと予めインキュベートされ、カルボン酸が試される。モジュレーターに予め暴露されたチップのものと比較した、モジュレーターに暴露されたＯＲへのカルボン酸結合の差は、結合を証明する。いずれかのアッセイにおいて、候補モジュレーターの不存在下で結合したカルボン酸の量と比較した、候補モジュレーターの存在下で結合したカルボン酸結合の１０％以上の低減は、候補モジュレーターが、ＯＲとカルボン酸の相互作用を阻害することを示す。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、候補モジュレーターを同定するシステム、例えば、質量分析、またはガスクロマトグラフィーに差し込まれ得る。
【０１０８】
カルボン酸のＯＲへの結合の阻害を測定する別の方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いる。ＦＲＥＴは、互いに近接した（通常、間隔１００Ａ未満）蛍光供与体（Ｄ）と蛍光受容体（Ａ）の間で、Ｄのスペクトルの放出がＡのスペクトルの励起と重複する場合に、生じる量子力学の現象である。試験されるべき分子、例えば、カルボン酸およびＯＲポリペプチドは、相補的対の供与体と受容体フルオロフォアで標識される。ＯＲ／カルボン酸の相互作用に起因して互いに隣接する間、供与体フルオロフォアの励起に際して放出された蛍光は、分子が結合されないときの励起波長に応答して放出されたものと異なる波長を有し、これにより、それぞれの波長での放出強度の測定により、結合対未結合のポリペプチドの定量が可能になる。標的分子を標識するため用いられる、フルオロフォアの供与体／受容体対は、当該技術分野において周知である。
【０１０９】
ＦＲＥＴのバリエーションは、蛍光クエンチングを用いて、分子の相互作用がモニターされる。相互作用する対における一方の分子が、フルオロフォアで標識され、他方は、密接同格になったとき、蛍光のフルオロフォアをクエンチする分子で標識され得る。励起の際の蛍光の変化は、フルオロフォア：クエンチャー対でタグ付けされた分子の結合の変化の指標である。一般に、標識されたＯＲポリペプチドの蛍光の増大は、クエンチャーを生じるカルボン酸が置換されたことの指標である。クエンチングアッセイについて、候補モジュレーターのない試料と比較した、候補モジュレーターを含有する試料における蛍光放出の強度の１０％以上の増大は、候補モジュレーターが、ＯＲ／カルボン酸の相互作用を阻害することを示す。
【０１１０】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）は、インビボでの分子間相互作用をモニターするためのシステムである。アッセイは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）および例えば、黄色蛍光タンパク質（ＹＰＦ）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有する融合タンパク質間の非放射性エネルギー移動に基づく。ＢＲＥＴシグナルは、セレンテラジン誘導体基質の酸化により生じる。前記システムは、細胞浸透性かつ無毒性のセレンテラジン誘導体基質ＤｅｅｐＢｌｅｕＣＴＭ（ＤＢＣ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の変異体を受容体として適用してもよい。供与体および受容体が、密接にあるとき、ＤＢＣの触媒性低減から生じるエネルギーは、ＲｌｕｃからＧＦＰに移り、次に、その特徴的波長の蛍光を放出する。この方法により、２つの試験される分子間の距離がより長くなることを可能にし、フルオロフォアの角度に依存しない。
【０１１１】
表面プラズモン共鳴、ＦＲＥＴおよびＢＲＥＴ方法に加えて、蛍光偏光測定は、カルボン酸受容体結合の定量化に有用である。蛍光でタグ付けされた分子の蛍光偏光値は、回転性相関時間または回転率に依存する。タンパク質複合体、例えば、ＯＲの蛍光標識されたカルボン酸との結合により形成されるものは、複合体化されていない、標識されたカルボン酸より大きい偏光値を有する。ＯＲ／カルボン酸の相互作用の候補阻害剤の包含は、候補阻害剤が、ＯＲのカルボン酸との相互作用を妨害するか、または阻害するなら、候補阻害剤のない混合物と比較して、蛍光偏光の低減を生じる。蛍光偏光は、ポリペプチドまたはタンパク質複合体の形成を妨害する小分子の同定に十分に適している。候補モジュレーターを欠く試料における蛍光偏光と比較した、候補モジュレーターを含有する試料における蛍光偏光の１０％以上の低減は、候補モジュレーターが、ＯＲ／カルボン酸の相互作用を阻害することを示す。
【０１１２】
ＯＲ／カルボン酸の相互作用をモニターするための別の代替は、バイオセンサーアッセイを用いる。ＩＣＳバイオセンサーは、ＡＭＢＲＩ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；  ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ａｍｂｒｉ．ｃｏｍ．ａｕ／）により記載されている。この技術において、分子、例えば、ＯＲおよびカルボン酸の結合は、懸濁された膜二重層におけるグラマシジンにより促進されるイオンチャネルの閉鎖、これにより、バイオセンサーのアドミッタンス（インピーダンスに類似）の測定可能な変化に繋がる。このアプローチは、６桁のアドミッタンス変化の大きさに渡り直線的であり、小分子組合せライブラリーの巨大なスケールのハイスループットスクリーニングに理想的に適している。候補モジュレーターを欠く試料のアドミッタンスと比較した、候補モジュレーターを含有する試料におけるアドミッタンスの１０％以上の変化（増大または低減）は、候補モジュレーターが、ＯＲとカルボン酸の相互作用を阻害することを示す。
【０１１３】
酸とタンパク質の相互作用のアッセイにおいて、相互作用のモジュレーターが、物理的に相互作用するタンパク質のドメインと直接的に相互作用することが必須であるとは限らないという可能性があることに注意することとは重要である。モジュレーターが、酸とタンパク質の相互作用の部位から取り除かれた位置で相互作用し、例えば、ＯＲポリペプチドの構造の変化を生じるという可能性もある。それにも関わらず、この方法で作用するモジュレーター（阻害剤またはアゴニスト）は、ＯＲの活性を調節するための剤として興味深い。
【０１１４】
記載される結合アッセイのいずれかを用いて、試料、例えば、組織試料における、ＯＲ分子に結合するか、またはカルボン酸のＯＲへの結合に影響する剤の存在が決定され得る。このため、ＯＲポリペプチドを、試料の存在下または不存在下でカルボン酸または別のリガンドと反応させ、カルボン酸またはリガンド結合が、用いられる結合アッセイに応じて測定される。カルボン酸または他のリガンドの結合の１０％以上の低減は、試料が、カルボン酸またはリガンドのＯＲポリペプチドへの結合を調節する剤を含有することを示す。
【０１１５】
タンパク質チップ
本発明の方法は、タンパク質チップ上で適用されてもよい。前記タンパク質チップは、ガラススライドまたはニトロセルロース膜であってもよいが、これらに限定されない。タンパク質チップのアレイに基づく方法は、当該技術分野において周知である。タンパク質アレイは、カルボン酸との結合に関与する、本発明による１つ以上のＯＲポリペプチドまたはそのフラグメントを好ましくは含む。タンパク質チップは、カルボン酸との結合に関与する、本発明による全７つのＯＲポリペプチド、またはそのフラグメントを好ましくは含む。
【０１１６】
受容体活性の機能アッセイ
ｉ．ＧＴＰａｓｅ／ＧＴＰ結合アッセイ：
ＧＰＣＲ、例えば、ＯＲポリペプチドについて、受容体活性の測定は、受容体を含有する細胞膜によるＧＴＰの結合である。Ｔｒａｙｎｏｒ  ａｎｄ  Ｎａｈｏｒｓｋｉ，  １９９５，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４７：  ８４８−８５４（ここで、引用により組込まれる）に記載される方法において、標識されたＧＴＰの膜への結合を測定することにより、Ｇタンパク質の膜への共役を本質的に測定する。ＧＴＰ結合アッセイのため、受容体を発現する細胞から単離された膜は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、８０ｐＭ  ３５Ｓ−ＧＴＰγＳおよび３μＭ  ＧＤＰを含有する緩衝液においてインキュベートされる。アッセイ混合物は、未結合の標識されたＧＴＰが、ＧＦ／Ｂ濾紙での濾過により取り除かれた後、３０℃で６０分間インキュベートされる。結合した、標識されたＧＴＰは、液体シンチレーション測定により測定される。カルボン酸により誘導されたＯＲ活性の調節についてアッセイするために、ＯＲポリペプチドを発現する細胞から調製した膜は、カルボン酸と混合され、ＧＴＰ結合アッセイは、ＯＲ活性の候補モジュレーターの存在下または不存在下で行われる。モジュレーターのないアッセイと比較した、候補モジュレーターを含有するこの種のアッセイにおけるシンチレーション測定により測定される、標識されたＧＴＰ結合の１０％以上の低減は、候補モジュレーターがＯＲ活性を阻害することを示す。
【０１１７】
同様のＧＴＰ結合アッセイをカルボン酸なしで行い、アゴニストとして作用する化合物が同定され得る。この場合において、カルボン酸により刺激されるＧＴＰ結合が、標準として用いられる。化合物が１ｍＭ以下で存在するとき、カルボン酸により誘導されるＧＴＰ結合のレベルの少なくとも５０％を誘導し、好ましくは、カルボン酸により誘導されるものと同じであるか、それより高いレベルを誘導するなら、化合物はアゴニストであるとみなされる。
【０１１８】
ＧＴＰａｓｅ活性は、ＯＲポリペプチドを含有する膜をガンマ−３２Ｐ−ＧＴＰとインキュベートすることにより、測定される。活性ＧＴＰａｓｅは、標識を無機リン酸塩として放出し、そしてそれが、２０ｍＭ  Ｈ3ＰＯ4における活性炭の５％懸濁液における遊離無機リン酸塩の分離により検出され、続いて、シンチレーション測定される。対照は、候補化合物の可能性のある非特異的作用を排除するために、ＯＲを発現しない細胞（偽遺伝子導入された）から単離された膜を用いたアッセイを含む。
【０１１９】
ＯＲにより制御されるＧＴＰａｓｅ活性に対する候補モジュレーターの作用についてアッセイするために、膜試料は、モジュレーターありおよびなしでカルボン酸とインキュベートされ、続いて、ＧＴＰａｓｅアッセイされる。モジュレーターのない試料と比較した、ＧＴＰ結合またはＧＴＰａｓｅ活性のレベルの１０％以上の変化（増大または低減）は、候補モジュレーターによるカルボキシル調節の指標である。
【０１２０】
ｉｉ．下流経路活性化アッセイ：
ａ．カルシウム流動−エクオリンに基づくアッセイ
エクオリンアッセイは、ＧＰＣＲの活性化により誘導される細胞内カルシウム放出またはカルシウム流動（流入）に対するミトコンドリアまたは細胞質アポエクオリンの応答性を利用する（Ｓｔａｂｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５２：１１５−１２６、Ｄｅｔｈｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９２  １５０１−１５０８、共に、ここで引用により組込まれる）。簡単に言うと、ＯＲ発現クローンは、ミトコンドリアまたは細胞質アポエクオリンおよびＧ−アルファ−１６またはＧ−ｏｌｆを同時発現するよう、遺伝子導入される。細胞は、５μＭ  セレンテラジンＨまたは誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と室温で４時間インキュベートされ、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養培地において洗浄され、０．５×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁される。次に、細胞は、試験アゴニストペプチドと混合され、エクオリンによる光放出は、ルミノメーターで３０秒間記録される。結果は、相対的光単位（ＲＬＵ）として表される。対照は、候補化合物の可能性のある非特異的作用を排除するために、Ｃ３５６を発現しない細胞（偽遺伝子導入された）から単離された膜を用いたアッセイを含む。
【０１２１】
エクオリン活性または細胞内カルシウムレベルは、光強度が、ＯＲポリペプチドを発現するが、候補モジュレーターで処理されない細胞の試料と比較した、またはＯＲポリペプチドを発現しない（偽遺伝子導入された）が、候補モジュレーターで処理された細胞の試料と比較した、ＯＲポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞の試料において１０％以上増大または低減するなら、「変化」する。
【０１２２】
カルボン酸の不存在下で行われるとき、アッセイを用いて、ＯＲ活性のアゴニストまたはインバースアゴニストが同定され得る。アッセイがカルボン酸の存在下で行われるとき、これを用いて、アンタゴニストについてアッセイされ得る。
【０１２３】
１）Ｆｌｕｏ３、４、Ｆｕｒａ２、およびＣａｌｃｉｕｍ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）に基づくアッセイ
蛍光に基づくアッセイは、受容体活性化により引き金を引かれるカルシウム流動を利用する：ＣＮＧを介したカルシウム流入、例えば、または小胞体からのカルシウム放出のいずれか。Ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４およびＦｕｒａ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）およびＣａｌｃｕｍ３キットシリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を含むが、これらに限定されない、カルシウムを結合する幾つかのフルオロフォアが公知である。かかるフルオロフォア−カルシウム複合体は、特定の波長の蛍光を放出する。これにより、Ｇタンパク質共役型受容体の活性化の際、小胞体から放出されるか、またはＣＮＧを介して流入したカルシウムが、フルオロフォアに結合し、特定の蛍光放出が生じる。ＯＲを過剰発現する細胞は、１〜８μＭ  フルオロフォアの溶液と、３７℃で３０〜６０分間インキュベートされる。食塩水緩衝液での洗浄後、同じ緩衝液５０μｌが、細胞を含有するそれぞれのウェル（６〜１５３６）に注がれる。次に、試験されるアゴニストが、かかる添加された細胞に注入され、続いて、ＯＲの活性化が、蛍光測定される。
【０１２４】
細胞内カルシウムレベルは、蛍光強度が、ＯＲポリペプチドを発現するが、候補モジュレーターで処理されていない細胞の試料、またはＯＲポリペプチドを発現しない（偽遺伝子導入細胞）が、候補モジュレーターで処理された細胞の試料と比較して、ＯＲポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞の試料において、１０％以上増大または低減するなら、「変化」する。
【０１２５】
２）偏光解消／過偏光膜アッセイ（例えば、ＤｉＢａｃフルオロフォア）
このアッセイの原理は、細胞膜の偏光解消に従う。陰イオンプローブＤｉＢＡＣ４（３）は、膜電位に依存した方法で、細胞内と細胞外コンパートメントの間で分配される。膜電位の増大（偏光解消）に伴い、プローブは、細胞内にさらに分配され、蛍光の増大を生じる。逆に、過偏光は、染料排出に起因した蛍光の低減を導く。
【０１２６】
ＤｉＢＡＣ４（３）プローブは、４８８ｎｍの波長で励起され、５４０ｎｍの波長で放出される。
【０１２７】
実験の日に、アッセイ緩衝液（食塩水緩衝液）に、グルコースを終濃度１０ｍＭ、およびＤｉＢＡＣ４（３）プローブを終濃度５μＭで加える。アッセイ緩衝液を３７℃で維持する。細胞培養培地を取り除き、ＯＲを過剰発現する細胞を含有するそれぞれのウェルを、予め温めたアッセイ緩衝液２００μｌで２回すすぐ。ＤｉＢＡＣ４（３）を含有するアッセイ緩衝液１８０μｌを入れ、細胞を適当な温度で３０分間インキュベートする。細胞プレートは、この３０分間のインキュベーション後にアッセイできる。いずれもの添加に先立ち、２分間基準を集める。候補モジュレーター２０μｌを適当なウェルに加え、データをさらに２５分間集める。
【０１２８】
膜偏光は、蛍光強度が、ＯＲポリペプチドを発現するが、候補モジュレーターで処理されていない細胞の試料、またはＯＲポリペプチドを発現しない（偽遺伝子導入細胞）が、候補モジュレーターで処理された細胞の試料と比較して、ＯＲポリペプチドを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞の試料において１０％以上増大または低減するなら、「変化」する。
【０１２９】
３）メラノフォアアッセイ。メラノフォアアッセイは、色に基づくアッセイである。基本的に、このアッセイのため用いられる細胞は、カエルであるアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓ）の皮膚からもたらされる。これらの不死化細胞はメラノソームを含有し、そしてそれは、暗色素を含有する小器官である。アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣの活性化の引き金を引く内在性または組換えＧＰＣＲの活性化は、メラノソーム分散、故に、細胞の暗色化を導く。あるいは、アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣを阻害するＧＰＣＲは、細胞を明るくする。これにより、第２のメッセンジャーの濃度を測定する代わりに、細胞の色調の変化を観察するというヒットを容易に正確に狙うことができる。この色の変化は、６５０ｎＭでの吸光度を測定するマイクロプレートリーダーにおいて、またはビデオ画像処理システムにおいて調べることにより、容易に定量化され得る。
【０１３０】
ｂ．アデニル酸シクラーゼアッセイ：
アデニル酸シクラーゼ活性についてのアッセイは、Ｋｅｎｉｍｅｒ  ＆  Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ，  １９８１，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０：  ５８５−５９１（ここで、引用により組み込まれる）により記載される。このアッセイは、Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５８：  ５４１−５４８（これも、ここで引用により組込まれる）により教示されるアッセイの修飾である。簡単に言うと、反応液１００μｌは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ  クレアチンリン酸（二ナトリウム塩）、クレアチンホスホキナーゼ１０単位（タンパク質７１μｇ）、１ｍＭ  α−３２Ｐ−ＡＴＰ（テトラナトリウム塩、２μＣｉ）、０．５ｍＭ  環状ＡＭＰ、Ｇ−３Ｈ−標識環状ＡＭＰ（約１０，０００ｃｐｍ）、０．５ｍＭ  Ｒｏ２０−１７２４、０．２５％  エタノール、および試験されるべきタンパク質ホモジネート（すなわち、ＯＲポリペプチドを発現するか、または発現せず、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、細胞由来のホモジネート）５０〜２００μｇを含有する。反応混合物は、３７℃で６分間一般的にインキュベートされる。インキュベーション後、反応混合物は、６％  冷トリクロロ酢酸０．９ｍｌを加えることにより、除タンパクされる。試験管は、１８００×ｇにて２０分間遠心分離され、それぞれの上清溶液が、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４カラムに加えられる。カラム由来のｃＡＭＰ分画は、０．１ｍＭ  イミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）４ｍｌでカウント用バイアルに溶出される。アッセイは、三連で行われるべきである。対照反応はまた、ＯＲポリペプチドを発現しない細胞由来のタンパク質ホモジネートを用いて行われるべきである。
【０１３１】
アッセイは、ＯＲを発現し、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたか、または処理されていない細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照の反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれら由来の抽出物を用いて行われるべきである。
【０１３２】
本発明によると、アデニル酸シクラーゼ活性は、候補モジュレーターで処理されていない細胞の同様の試料と比較して、またはＯＲポリペプチドを発現しない（偽遺伝子導入細胞）が、候補モジュレーターで処理された細胞の試料と比較して、ＯＲ活性の候補モジュレーターで処理された細胞から採取された試料において１０％以上増大するか、または低減するなら、それは「変化」する。あるいは、参考化合物で処理された試料におけるＯＲポリペプチドの候補モジュレーターにより１０％以上の活性の低減が、試験されてもよい。
【０１３３】
ｃ．ｃＡＭＰアッセイ：
細胞内ｃＡＭＰは、当該技術分野で広く公知の方法によるｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはｃＡＭＰ結合タンパク質を用いて測定される。例えば、Ｈｏｒｔｏｎ  ＆  Ｂａｘｅｎｄａｌｅ，  １９９５，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４１：  ９１−１０５（これは、ここで引用により組み込まれる）は、ｃＡＭＰのためのＲＩＡを記載する。
【０１３４】
ｃＡＭＰの測定のための多数のキットが市販される（例えば、ＬＪＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより販売される、Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ、およびＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製品）。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞の抽出物を用いて行われるべきである。
【０１３５】
アッセイは、ＯＲポリペプチドを発現し、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
【０１３６】
上記のＨｏｒｔｏｎ  ＆  Ｂａｘｅｎｄａｌｅ，  １９９５のＲＩＡに基づくアッセイを用いて、ＯＲポリペプチドを発現し、ＯＲ活性の候補モジュレーターで処理された細胞において（またはかかる細胞の抽出物において）検出されたｃＡＭＰのレベルが、候補モジュレーターで処理されていない類似の細胞におけるｃＡＭＰレベルと比較して、少なくとも１０％増大または低減するなら、ｃＡＭＰのレベルは、「変化」する。
【０１３７】
ｄ．リン脂質分解、ＤＡＧ産生、およびイノシトール三リン酸レベル：
リン脂質の分解を活性化する受容体は、リン脂質分解、および得られた第２のメッセンジャーＤＡＧおよび／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の産生をモニターすることにより、ＯＲの公知または疑われるモジュレーターの活性に起因する変化についてモニターされ得る。これらのそれぞれを測定する方法は、Ｉａｎ  Ｍ．  Ｂｉｒｄ．  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９８により編集された、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（これは、ここで引用により組み込まれる）に記載される。ホスファチジルイノシトール分解についてのアッセイも記載される、Ｒｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：  １１８２４−１１８３１（ここで引用により組み込まれる）も参照のこと。アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、ＯＲを発現する細胞またはＯＲを発現する細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
【０１３８】
本発明によると、ホスファチジルイノシトール分解、およびジアシルグリセロールおよび／またはイノシトール三リン酸レベルが、候補モジュレーターで処理されていないカルボキシルポリペプチドを発現する細胞由来の試料において観察されたレベルと比較して、ＯＲポリペプチドを発現し、カルボン酸の存在下または不存在下で、候補モジュレーターで処理された細胞由来の試料において、少なくとも１０％増大または低減するなら、それらは「変化」する。
【０１３９】
ｅ．ＰＫＣ活性化アッセイ：
成長因子受容体チロシンキナーゼは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化に関与する経路を介してシグナル伝達する傾向にあり、リン脂質およびカルシウムにより活性化されるタンパク質キナーゼのファミリーである。ＰＫＣ活性化は、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｊｕｎを含む癌原遺伝子転写因子コード遺伝子のアレイの転写、タンパク質分解酵素、コラゲナーゼタイプＩおよびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤を含むタンパク質分解酵素阻害剤、ならびに細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ  Ｉ）を含む接着分子を最終的にもたらす。ＰＫＣにより誘導される遺伝子産物の増大を検出するよう設計されたアッセイを用いて、ＰＫＣ活性化、これにより、受容体活性がモニターされ得る。加えて、ＰＫＣを介してシグナル伝達する受容体の活性は、ＰＫＣ活性化により活性化される遺伝子の制御配列により分けられた、レポーター遺伝子構築物の使用を通じてモニターされ得る。この種のレポーター遺伝子に基づくアッセイは、以下でより詳細に考察される。
【０１４０】
ＰＫＣ活性のより直接的な測定のため、Ｋｉｋｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：  １３３４１（ここで、引用により組込まれる）の方法が用いられ得る。このアッセイは、ＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を測定し、続いて、ホスホセルロース紙への結合により分けられる。このＰＫＣアッセイシステムを用いて、精製されたキナーゼの活性、または粗細胞抽出物における活性が測定され得る。タンパク質キナーゼＣ試料は、アッセイの直前に、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２ｍＭ  ＤＴＴに希釈され得る。
【０１４１】
アッセイのための基質は、ミリストイル化された、アラニンに富むタンパク質キナーゼＣ基質タンパク質（ＭＡＲＣＫＳ）からもたらされた、ペプチドＡｃ−ＦＫＫＳＦＫＬ−ＮＨ２（配列番号１５）である。このペプチドの酵素のＫｍは、約５０μＭである。他の基本的な、当該技術分野で公知のタンパク質キナーゼＣ選択的ペプチドも、それらのＫｍの少なくとも２〜３倍の濃度で用いられ得る。アッセイに必要とされる補因子は、カルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリンおよびジアシルグリセロールを含む。使用者の意図に依存して、アッセイは、存在するＰＫＣの量（活性化条件）または存在する活性なＰＣＫの量（非活性化条件）を決定するために行われ得る。本発明による大抵の目的のため、活性化され得るＰＫＣを測定するよりむしろ、試料が単離されたときの、試料における活性なＰＫＣが測定されるように、非活性化条件が用いられる。非活性化条件のため、カルシウムは、ＥＧＴＡに都合のよいアッセイにおいて取り除かれる。
【０１４２】
アッセイは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１〜２ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００μＭ  ＡＴＰ、約１μＣｉ  γ−３２Ｐ−ＡＴＰ、１００μｇ／ｍｌ  ペプチド基質（約１００μＭ）、１４０μＭ／３．８μＭ  ホスファチジルセリン／ジアシルグリセロール膜、および１００μＭ  カルシウム（または最も好ましくは、５００μＭ  ＥＧＴＡ）を含有する混合物において行われる。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＤＴＴに希釈された試料４８μｌが、８０μｌの終反応体積において用いられる。反応は、３０℃で５〜１０分間行われ、続いて、１００ｍＭ  ＡＴＰおよび１００ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する、ｐＨ値８．０の溶液２５μｌが添加されて、反応を停止させる。
【０１４３】
反応を停止させた後、それぞれの反応液の一部（８５μｌ）が、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１リン酸セルロース濾紙にスポットされ、続いて、０．４％  リン酸５００ｍｌで４回（１回の洗浄当たり５〜１０分）、および９５％  ＥｔＯＨ５００ｍｌで２〜５分間最後に洗浄される。結合した放射能が、シンチレーション測定により測定される。標識されたＡＴＰの特異的活性（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）が、反応試料をＰ８１紙にスポットし、洗浄することなくカウントすることにより、決定される。１分間当たりに移動したｎｍｏｌのリン酸塩として定義されたＰＫＣ活性の単位は、以下の通り計算される：
単位活性（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ）
＝＿＿（紙上のｃｐｍ）×（計１０５μｌ／スポットの８５μｌ）＿＿
（アッセイ時間、分）（ＡＴＰの特異的活性ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）
代替アッセイは、ＰａｎＶｅｒａにより販売されるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｐ２７４７）を用いて行われ得る。
【０１４４】
アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処置されたかまたは処理されていない、ＯＲポリペプチドを発現する細胞由来の抽出物において行われる。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
【０１４５】
本発明によると、上述のいずれかのアッセイにより測定されたＰＫＣの単位が、候補モジュレーターで処理されていない細胞由来の同様の試料において行われた反応と比較して、ＯＲを発現し、候補モジュレーターで処理された細胞由来の抽出物において、少なくとも１０％増大するか、または低減するとき、ＰＫＣ活性は、候補モジュレーターにより「変化」する。
【０１４６】
ｆ．ＰＫＡ活性化アッセイ
ＰＫＡ活性は、市販の幾つかのキットのいずれか、例えば、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ  ＩＭＡＰ  ＰＫＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、またはｐｒｏｍｅｇａ  ＰｒｏＦｌｕｏｒ  ＰＫＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いてアッセイされ得る。
【０１４７】
アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、ＯＲを発現する細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
【０１４８】
活性のレベルが、候補モジュレーターで処理されていない同様の細胞由来の試料におけるＰＫＡキナーゼ活性と比較して、候補モジュレーターで処理された、ＯＲポリペプチドを発現する細胞由来の試料において１０％以上増大または低減するなら、ＰＫＡ活性は「変化」する。
【０１４９】
ｇ．キナーゼアッセイ：
ＭＡＰキナーゼ活性は、市販の幾つかのキットのいずれか、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（カタログ番号９８２０）により販売されるｐ３８  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔまたはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  により販売されるＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（商標）  ＭＡＰ  キナーゼアッセイを用いてアッセイされ得る。
【０１５０】
アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、ＯＲを発現する細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
【０１５１】
活性のレベルが、候補モジュレーターで処理されていない同様の細胞由来の試料におけるＭＡＰキナーゼ活性と比較して、候補モジュレーターで処理された、ＯＲポリペプチドを発現する細胞由来の試料において１０％以上増大または低減すれば、ＭＡＰキナーゼ活性は「変化」する。
【０１５２】
公知の合成または天然のチロシンキナーゼ基質および標識されたリン酸塩を用いた、チロシンキナーゼ活性についての直接的アッセイが周知であり、他の種類のキナーゼ（例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ）についての類似のアッセイである。キナーゼアッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたか、または処理されていない、ＯＲポリペプチドを発現する細胞から調製された、精製キナーゼと粗抽出物両方で行われ得る。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。基質は、完全長タンパク質または基質を表す合成ペプチドのいずれかであり得る。Ｐｉｎｎａ  ＆  Ｒｕｚｚｅｎｅ（１９９６，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １３１４：  １９１−２２５、これは、ここで引用により組み込まれる）は、キナーゼ活性を測定するのに有用な多数のリン酸化基質部位を挙げる。多数のキナーゼ基質ペプチドは市販されている。特に有用である１つは、多くの受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である、「Ｓｒｃ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ」（ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（配列番号１６）、Ｓｉｇｍａ  ＃  Ａ７４３３から入手可能）である。後述のアッセイは、ペプチド基質の濾紙への結合を必要としないので、ペプチド基質は、結合を促進するために、網状の正の帯電を有するべきである。一般に、ペプチド基質は、少なくとも２つの塩基性残基およびフリーのアミノ末端を有するべきである。反応は、０．７〜１．５ｍＭのペプチド濃度を一般的に使用する。
【０１５３】
アッセイは、５×キナーゼ緩衝液（５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、アッセイされる正確なキナーゼに依存して、ＭｎＣｌ2が、ＭｇＣｌ2の代わりにまたはこれに加えて用いられ得る）５μｌ、１．０ｍＭ  ＡＴＰ（終濃度０．２ｍＭ）５μｌ、ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ（１００〜５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、１０ｍＭ  ペプチド基質（終濃度１．２ｍＭ）３μｌ、試験されるべきキナーゼを含有する細胞抽出物（キナーゼアッセイのため用いられる細胞抽出物は、ホスファターゼ阻害剤（例えば、０．１〜１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム）を含有するべきである）、および２５μｌまでの量のＨ2Ｏを含む体積２５μｌにおいて一般的に行われる。反応は３０℃で行われ、細胞抽出物の添加により開始される。
【０１５４】
キナーゼ反応は３０秒〜約３０分間行われ、続いて、１０％  氷冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）４５μｌが加えられる。試料を、微量遠心機において２分間回転させ、上清３５μｌが、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１リン酸セルロース濾紙サークルにスポットされる。濾紙は、０．５％  冷リン酸５００ｍｌで３回洗浄され、続いて、アセトン２００ｍｌ、室温で５分間、１回洗浄される。濾紙を乾燥させ、取り込まれた32Ｐが、シンチレーション測定により測定される。キナーゼ反応におけるＡＴＰの特異的活性（例えば、ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）は、反応物の小さな試料（２〜５μｌ）をＰ８１濾紙サークルにスポットし、洗浄することなく直接カウントすることにより、決定される。次に、キナーゼ反応で得られた１分間当たりのカウント（ブランクを引く）は、反応において移動されたリン酸塩のモル数を決定するための特異的活動により割られる。
【０１５５】
アッセイは、候補モジュレーターありまたはなしのカルボン酸で処理されたかまたは処理されていない、ＯＲを発現する細胞または細胞の抽出物を用いて行われるべきである。対照反応は、幾つかの候補モジュレーターの可能性のある非特異的作用を排除するために、偽遺伝子導入細胞、またはそれに由来する抽出物を用いて行われるべきである。
【０１５６】
キナーゼ活性のレベルが、候補モジュレーターで処理されていない同様の細胞由来の試料におけるキナーゼ活性と比較して、候補モジュレーターで処理された、ＯＲポリペプチドを発現する細胞由来の試料において１０％以上増大または低減するなら、チロシンキナーゼ活性は「変化」する。
【０１５７】
ｈ．下流経路の活性化のための転写レポーター：
モジュレーターの受容体、例えば、本発明のＯＲポリペプチドへの結合により開始される細胞内シグナルは、挙動に細胞内事象のカスケードを設定し、その最終結果は、１つ以上の遺伝子の転写および／または翻訳の迅速かつ検出可能な変化である。それ故、受容体の活性は、ＯＲ活性化に応答した制御配列によりもたらされたレポーター遺伝子の発現を測定することにより、モニターされ得る。
【０１５８】
ここで用いられる場合、「プロモーター」は、基礎プロモーターのみでなく、受容体により制御される発現に必要な任意のエンハンサーまたは転写因子結合部位を含む、遺伝子の発現の受容体により仲介される制御に必要な転写制御エレメントを指す。アゴニスト結合から生じた細胞内シグナルに応答するプロモーター、および転写、翻訳または最終活性が、容易に検出可能かつ測定可能であるレポーター遺伝子への選択されたプロモーターの作動可能な結合を選択することにより、転写に基づくレポーターアッセイは、所定の受容体が活性化されるかどうかの迅速な指標を提供する。
【０１５９】
レポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ベータ−ラクタマーゼまたはベータ−ガラクトシダーゼが、当該技術分野で周知であり、それらの産物物の検出のためのアッセイである。
【０１６０】
受容体活性のモニターに特に十分に適した遺伝子は、一般的に、受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドとの間の接触の数分内に迅速に誘導される、「最初期」遺伝子である。最初期遺伝子転写の誘導は、新規制御タンパク質の合成を必要としない。リガンド結合への迅速な応答に加えて、レポーター構築物を作るのに有用な好ましい遺伝子の特性決定は、静止状態の細胞における低発現または検出可能でない発現、一過性であり、新規タンパク質合成に依存した誘導、それに続き、転写を止めるのに新規タンパク質合成を必要とすること、およびこれらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡｓが短い半減期を有することを含む。転写制御エレメントが、それが有用であるために、これらの特性の全てを有することは必要ではないが、好ましい。
【０１６１】
ＯＲ活性をカルボン酸に応答する転写レポーター構築物でアッセイするために、ＯＲポリペプチドを安定的に発現する細胞が、レポーター構築物で安定的に遺伝子導入される。アゴニストについてスクリーニングするために、処理されていない細胞が、候補モジュレーターに暴露されるか、またはカルボン酸に暴露され、レポーターの発現が測定される。カルボン酸で処理された培養物は、公知のアゴニストにより誘導される転写のレベルの基準として働く。任意のモジュレーターの不存在下でのレポーター発現と比較した、候補モジュレーターの存在下でのレポーター発現の少なくとも１０％の増大は、候補がＯＲ活性のモジュレーターであることを示す。アゴニストは、カルボン酸と少なくとも等しいか、好ましくは、同量またはよりレポーター発現を誘導することになる。部分的アゴニストは、カルボン酸と比較して、受容体を活性化しなくてもよい。このアプローチはまた、インバースアンタゴニストについてスクリーニングするために用いられ、ここで、細胞は、カルボン酸または他のアゴニストの不存在下でのレポーターの上昇した基礎活性が存在するレベルで、ＯＲポリペプチドを発現する。候補モジュレーターの非存在と比較した、候補モジュレーターの存在下での１０％以上のレポーター活性の低減は、化合物がインバースアゴニストであることを示す。
【０１６２】
アンタゴニストについてスクリーニングするために、ＯＲを発現する細胞およびレポーター構築物を有する細胞は、候補モジュレーターの存在および不存在下で、カルボン酸（または別のアゴニスト）に暴露される。候補モジュレーターの不存在下と比較した、候補モジュレーターの存在下でのレポーターの１０％以上の低減は、候補がＯＲ活性のアンタゴニストであることを示す。
【０１６３】
転写アッセイのための対照は、本発明のＯＲを発現しないが、レポーター構築物を有する細胞、およびプロモーターを有し、レポーター構築物のない細胞を含む。ＯＲにより制御される転写のモジュレーターとして同定された化合物は、それらの活性の特異性およびスペクトルを決定するために、それらが、他の制御配列により、および他の受容体によりもたらされる転写に影響するかどうかを決定するために分析される。
【０１６４】
転写レポーターアッセイ、および大抵の細胞に基づくアッセイは、ＯＲ活性を調節するものについての化学化合物の化学ライブラリーをスクリーニングするために十分に適している。ライブラリーは、例えば、天然供給源、例えば、植物、動物、細菌など由来のライブラリーであり得る。
本発明により有用な候補モジュレーター
候補モジュレーターは、合成または天然の化合物の巨大なライブラリーからスクリーニングされ得る。多数の手段が、種々の種類の化合物の無作為および方向付けた合成のため、現在用いられる。合成化合物ライブラリーは、例えば、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，  ＮＨ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）を含む、多数の会社から市販されている。稀な化学ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から入手可能である。小有機分子の組合せライブラリーは、利用可能であり、調製され得る。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、例えば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＮＣ）から入手可能であり、あるいは当該技術分野で周知の方法により容易に生産可能である。加えて、天然および合成的に産生されたライブラリーおよび化合物が、従来の化学、物理、および生化学的手段を通じて、容易に修飾される。
【０１６５】
［実施例］
本発明を、以下の非限定的な例によりさらに説明する。
【０１６６】
実験の方法：
細胞培養および細胞株生成
細胞を、１０％  ウシ胎児血清（Ｍ１０）を含有する基礎培地（ＥＭＥＭ、Ｌｏｎｚａ）において維持した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔをシャペロンタンパク質ＲＴＰ１Ａ１およびＲＴＰ２およびピューロマイシンに対する耐性遺伝子の配列を含有する発現ベクターで形質転換することにより、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＲＴＰ１Ａ１／ＲＴＰ２細胞を生成した。１０μｇ／ｍｌ  ピューロマイシンを培養培地に添加することにより、組換え細胞集団を選択した。限界希釈方法により、モノクローナルな集団をさらに得た。簡単に言うと、１ｍｌ当たり１個の細胞を含有するように細胞懸濁液を希釈し、この希釈液をポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェルプレートに入れた（１ウェル当たり希釈液２００μｌ）。５日間培養後、１ウェル毎の細胞コロニーの存在および数を位相差顕微鏡下でチェックした。さらに５日間培養後、細胞を含有する単一コロニーを回収し、それぞれの回収した集団を独立して増幅させた。
【０１６７】
匂い物質分子希釈
匂い物質分子を、１ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）の濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に希釈して、ストック溶液を生成した。
【０１６８】
スクリーニング実験のため、匂い物質分子のストック溶液を９６ウェルプレートに配置したＥＭＥＭに希釈した。２ｍＭの濃度、６３２μＭの濃度、および２００μＭの濃度で試験する分子（１分子／ウェル）を含有するプレートを調製した。
【０１６９】
濃度応答性分析のため、９６ウェルプレートに置いたＥＭＥＭ中のストック溶液から試験する分子の連続希釈液を調製した。
【０１７０】
ルシフェラーゼアッセイ
最初の脱オーファン化スクリーニングおよび用量応答性分析のため、ルシフェラーゼに基づく遺伝子レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｄｅｒｌａｎｄｓ）を、Ｓａｉｔｏら（２００４）に記載される通り、用いた。簡単に言うと、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ−Ｄｏｒｐ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に細胞を播種し、ＣＲＥルシフェラーゼを含有するプラスミドおよび嗅覚受容体を含有するプラスミドで遺伝子導入した。遺伝子導入の１６時間後、培養培地を、決定した濃度の試験するリガンドを含有する血清を含まないＥＭＥＭにより置き換えた。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、製造元のプロトコールに従い、発光測定を進めた。発光の放出をＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ５  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）にて記録した。結果を、アデニル酸シクラーゼ活性化因子Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ  １０μＭにより誘導される応答の割合として表した。
【０１７１】
例１：匂い物質分子ライブラリーのスクリーニング
カルボン酸および他の種類の分子を含有する匂い物質分子ライブラリーを用いて、本発明の７つのＯＲの活性化因子を同定した。７つの嗅覚受容体において、一連の１４８個の匂い物質分子で脱オーファン化キャンペーンを行った。汗に存在する１６個のカルボン酸を、１４８個の試験する匂い物質と共にインキュベートした。黒色の四角は、受容体の１つの匂い物質分子に対する応答に対応する。カルボン酸に対応する表の部分を太く囲った。７つの試験したクラス１受容体は、全て、カルボン酸に特異的かつ独占的に応答した。
【０１７２】
それぞれの分子を、３つの異なる濃度（１ｍＭ、３１６μＭ、１００μＭ）で試験した。試験するライブラリーの異なる分子を、同一濃度で、目的の受容体を発現する細胞を含有する９６ウェルプレート（１ウェル／分子）に配置した。上で説明したルシフェラーゼ活性を用いて、試験する分子の活性を測定した。試験する分子により誘導されるルシフェラーゼ活性の中央値、および付随する標準偏差を決定した。推定活性分子（ヒット）を、中央値＋２標準偏差より高いか、または同等のルシフェラーゼ活性を含む分子として定義した。
【０１７３】
表２は、この脱オーファン化の結果を要約する。それぞれのＯＲ活性化分子対を、受容体に対応する列と分子に対応する行の交差において黒色の四角により示す。結果は、本発明の７つのＯＲが、ヒトの汗に存在するカルボン酸により活性化されることを明確に示す。
【０１７４】
本発明の７つのＯＲを、カルボン酸を含有しない異なる分子ライブラリーを試験することを目的とする、巨大スクリーニングキャンペーンにさらに含めた。上述の通り、これらのスクリーニングを行った。合計８２３個の分子を、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５にて試験した。合計５９２個の分子をＯＲ５２Ｂ２にて試験し、合計７７７個の分子をＯＲ５２Ｅ１にて試験した。試験した分子の完全なリストを表３において示す。分子の全てが、本発明の７つのＯＲのいずれにおいてもヒットを示さなかった。この結果は、本発明の７つのＯＲのカルボン酸リガンドに対する非常に高い選択性を確かにする。
【０１７５】
故に、クラス１由来の７つの試験したＯＲ（本発明のＯＲ、すなわち、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５に対応する）が、カルボン酸に特異的かつ独占的に応答することを見出した。
【０１７６】
例２：リガンドとＯＲの相互作用の用量応答性分析
濃度応答性分析によりヒットを評価した。上述のルシフェラーゼアッセイを用いて、１ｍＭ〜３１６ｎＭのヒット分子の片対数連続希釈を対応するＯＲにて試験した。
【０１７７】
結果を表２に示す。完全な結果を図２Ａ〜Ｇに示す。
【０１７８】
本発明者らは、試験した７つのＯＲのそれぞれが、カルボキシル機能を含有する少なくとも１つの分子に応答したことを観察した。これらの活性化因子の、ヒトの汗において生じる公知のカルボン酸との注意深い比較により、受容体のそれぞれが、汗において放出された少なくとも１つのカルボン酸に対応することが明らかになった。これらの酸の幾つか、例えば、ヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１；  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｃｏｌｏｇ．  Ｖｏｌ．  １７  ｐｐ  １４６９−１４９２、  Ｎａｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｃｈｅｍ．  ＆  Ｂｉｏｄｉｖ．  Ｖｏｌ．  ３  ｐｐ  １−２０）は、ヒトの汗の悪臭の重要なプロモーターであることが公知である。
【０１７９】
故に、本発明のこれらの７つのＯＲは、カルボン酸により誘発される汗の悪臭の知覚に関与し、悪臭の知覚をブロックするアンタゴニストおよび／またはブロッカーの同定のための価値ある候補受容体を構成する。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる群より選択される１つ以上の嗅覚受容体（ＯＲ）の機能を調節する剤を同定する方法であって、
ａ）前記１つ以上のＯＲを、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択される１つ以上のカルボン酸と、前記剤の存在下および不存在下で、前記カルボン酸の前記ＯＲへの結合を可能にするか、または前記ＯＲの前記カルボン酸による活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）前記剤の存在下および不存在下での前記１つ以上のＯＲの前記１つ以上のカルボン酸への結合または前記１つ以上のＯＲの活性を比較する工程であって、ここで、剤の不存在下での結合または活性と比較した、前記剤の存在下での結合または活性の差が、前記１つ以上のカルボン酸に応答して前記１つ以上のＯＲの機能を調節する剤としての剤を同定する工程、
を含む方法。
［２］
前記剤を、前記カルボン酸のここで挙げた全７つのＯＲへの結合への影響、またはここで挙げた全７つのＯＲの前記カルボン酸による活性化への影響について試験する、［１］に記載の方法。
［３］
前記剤を、前記カルボン酸のＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる６つのＯＲの群の全メンバーへの結合への影響、またはここで挙げた全６つのＯＲの前記カルボン酸による活性化への影響について試験する、［１］に記載の方法。
［４］
前記剤を、ペンタン酸のＯＲ５２Ｌ１への結合への影響、またはＯＲ５２Ｌ１のペンタン酸による活性化への影響について試験する、［１］に記載の方法。
［５］
前記剤を、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸のＯＲ５２Ｅ８への結合への影響、またはＯＲ５２Ｅ８の３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸による活性化への影響について試験する、［１］に記載の方法。
［６］
前記剤を、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のＯＲ５２Ｂ２への結合への影響、またはＯＲ５２Ｂ２のヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験する、［１］に記載の方法。
［７］
前記剤を、ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキサン酸、もしくは安息香酸のＯＲ５１Ｉ２への結合への影響、またはＯＲ５１Ｉ２のブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキサン酸、もしくは安息香酸による活性化への影響について試験する、［１］に記載の方法。
［８］
前記剤を、ブタン酸のＯＲ５２Ｅ１への結合への影響、またはＯＲ５２Ｅ１のブタン酸による活性化への影響について試験する、［１］に記載の方法。
［９］
前記剤を、４−エチルオクタン酸のＯＲ５２Ａ５への結合への影響、またはＯＲ５２Ａ５の４−エチルオクタン酸による活性化への影響について試験する、［１］に記載の方法。
［１０］
前記剤を、ヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸のＯＲ５６Ａ５への結合への影響、またはＯＲ５６Ａ５のヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、もしくはウンデカン酸による活性化への影響について試験する、［１］に記載の方法。
［１１］
前記１つ以上のＯＲポリペプチドを、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４のアミノ酸配列により定義する、［１］または［２］に記載の方法。
［１２］
前記１つ以上のＯＲポリペプチドを、配列番号２、４、６、１０、１２または１４のアミノ酸配列により定義する、［１］または［３］に記載の方法。
［１３］
前記１つ以上のカルボン酸を、ラジオアイソトープ、フルオロフォア、および蛍光のクエンチャーを含む群より選択される部分で検出可能に標識してもよい、［１］から［１２］のいずれか１に記載の方法。
［１４］
試料におけるヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する１つ以上のＯＲの活性を調節する剤の存在を検出するために用いる、［１］から［１３］のいずれか１に記載の方法。
［１５］
前記剤が試料に存在する、［１］から［１４］のいずれか１に記載の方法。
［１６］
前記１つ以上のＯＲポリペプチドを、前記１つ以上のカルボン酸とそのＥＣ50濃度で接触させる、［１］から［１５］のいずれか１に記載の方法。
［１７］
前記剤が、前記カルボン酸により誘導される細胞内応答を少なくとも１０％低減するとき、前記剤を本発明によるＯＲの機能を調節する剤として同定する、［１］から［１６］のいずれか１に記載の方法。
［１８］
前記接触を、前記ＯＲポリペプチドを発現する細胞内または上で行う、［１］から［１７］のいずれか１に記載の方法。
［１９］
前記細胞を、ヒト胎児由来腎臓細胞（Ｈｅｋ２９３）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サル細胞（ＣＯＳ）、一次嗅覚細胞、ツメガエル細胞、昆虫細胞、酵母または細菌から選択してもよい、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記接触を、ＯＲポリペプチドを含有する合成リポソームまたはウイルスにより誘導される出芽膜内または上で行う、［１］から［１７］のいずれか１に記載の方法。
［２１］
前記方法を、前記ＯＲポリペプチドを発現する細胞由来の膜分画を用いて行う、［１］から［１７］のいずれか１に記載の方法。
［２２］
前記方法を、タンパク質チップ上で行う、［１］から［１７］のいずれか１に記載の方法。
［２３］
前記測定を、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光クエンチング、および蛍光偏光から選択する方法を用いて行う、［１］から［１７］のいずれか１に記載の方法。
［２４］
前記剤を、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、および小有機分子からなる群より選択する、［１］から［２３］のいずれか１に記載の方法。
［２５］
前記ＯＲのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、第２のメッセンジャーのレベルの変化を検出することを含む、［１］から［２４］のいずれか１に記載の方法。
［２６］
前記ＯＲのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、グアニンヌクレオチド結合／架橋または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、タンパク質キナーゼＣ活性、タンパク質キナーゼＡ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウム流動、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む、［１］から［２５］のいずれか１に記載の方法。
［２７］
前記ＯＲのシグナル伝達活性を測定する前記工程が、蛍光または発光アッセイを用いることを含む、［１］から［２５］のいずれか１に記載の方法。
［２８］
前記蛍光および発光アッセイが、ｆｌｕｏ３、Ｆｌｕｏ４またはＦｕｒａ、Ｃａ３−ｋｉｔ  ｆａｍｉｌｙまたはエクオリンを含むＣａ2+感受性フルオロフォアの使用を含む、［２７］に記載の方法。
［２９］
前記アッセイが、自動蛍光定量的または発光リーダー、例えば、ＦＤＳＳまたはＦＬＩＰＲを適用してもよい、［２８］に記載の方法。
［３０］
ハイスループットスクリーニング方法である、［１］から［２９］のいずれか１に記載の方法。
［３１］
前記剤が、化学物質ライブラリーまたは動物の器官抽出物の一部である、［１］から［３０］のいずれか１に記載の方法。
［３２］
［１］から［３１］のいずれか１に記載の方法を用いて同定した剤の対象への投与を含む、汗の悪臭を弱める方法
［３３］
［１］から［３１］のいずれか１に記載の方法を用いて同定した剤を含む、デオドラント、芳香または香料製剤。
［３４］
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）単離ＯＲポリペプチド：ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５、
ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択する１つ以上のカルボン酸、ならびに
ｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
［３５］
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）単離ＯＲポリペプチド：ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５、
ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択する１つ以上のカルボン酸、ならびに
ｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
［３６］
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）ＯＲポリペプチド：ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
ｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
［３７］
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）ＯＲポリペプチド：ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
ｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
［３８］
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）ＯＲポリペプチドＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５の１つ以上を発現する細胞、幾つかの細胞またはその膜、
ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
ｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
［３９］
ヒトの汗に存在するカルボン酸を検出する嗅覚受容体（ＯＲ）のモジュレーターのスクリーニング方法を行うためのキットであって、
ａ）ＯＲポリペプチドＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５の１つ以上を発現する細胞、幾つかの細胞またはその膜、
ｂ）ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびに
ｃ）それらのための包装材料
を含む、キット。
［４０］
前記細胞が、前記１つ以上のＯＲをコードするポリヌクレオチドで形質転換された、［３９］に記載のキット。
［４１］
ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびにＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる群より選択する１つ以上のＯＲポリペプチドにより形成される複合体を認識する、抗体。
［４２］
ブタン酸、イソ吉草酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、２−メチルヘキサン酸、３−メチルヘキサン酸、（Ｅ）−３−メチル−２−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−３−メチルヘキサン酸、ヘプタン酸、２−メチルヘプタン酸、オクタン酸、４−エチルオクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸および安息香酸からなる群より選択するカルボン酸、ならびにＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｅ１、ＯＲ５２Ａ５およびＯＲ５６Ａ５からなる群より選択する１つ以上のＯＲポリペプチドにより形成される複合体を認識する、［４１］に記載の抗体。
【０１８０】
【表２−１】
0006325088.tif 000003
【０１８１】
【表２−２】
0006325088.tif 000004
【０１８２】
【表２−３】
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【０１８３】
【表２−４】
0006325088.tif 000006
【０１８４】
【表２−５】
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【０１８５】
【表３−１】
0006325088.tif 000008
【０１８６】
【表３−２】
0006325088.tif 000009
【０１８７】
【表３−３】
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【０１８８】
【表３−４】
0006325088.tif 000011
【０１８９】
【表３−５】
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【０１９０】
【表３−６】
0006325088.tif 000013
【０１９１】
【表３−７】
0006325088.tif 000014
【０１９２】
【表３−８】
0006325088.tif 000015
【０１９３】
【表３−９】
0006325088.tif 000016
【０１９４】
【表３−１０】
0006325088.tif 000017
【０１９５】
【表３−１１】
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【０１９６】
【表３−１２】
0006325088.tif 000019
【０１９７】
【表３−１３】
0006325088.tif 000020
【０１９８】
【表３−１４】
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【０１９９】
【表３−１５】
0006325088.tif 000022
【０２００】
【表３−１６】
0006325088.tif 000023
【０２０１】
【表３−１７】
0006325088.tif 000024
【０２０２】
【表３−１８】
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【０２０３】
【表３−１９】
0006325088.tif 000026
【０２０４】
【表３−２０】
0006325088.tif 000027
【０２０５】
【表３−２１】
0006325088.tif 000028
【０２０６】
【表３−２２】
0006325088.tif 000029
【０２０７】
【表３−２３】
0006325088.tif 000030
【０２０８】
【表３−２４】
0006325088.tif 000031
【０２０９】
【表３−２５】
0006325088.tif 000032
【０２１０】
【表３−２６】
0006325088.tif 000033
【０２１１】
【表３−２７】
0006325088.tif 000034
【０２１２】
【表３−２８】
0006325088.tif 000035
【０２１３】
【表３−２９】
0006325088.tif 000036
【０２１４】
【表３−３０】
0006325088.tif 000037
【図１−１】
0006325088.tif 000038
【図１−２】
0006325088.tif 000039
【図１−３】
0006325088.tif 000040
【図２Ａ】
0006325088.tif 000041
【図２Ｂ】
0006325088.tif 000042
【図２Ｃ】
0006325088.tif 000043
【図２Ｄ】
0006325088.tif 000044
【図２Ｅ−１】
0006325088.tif 000045
【図２Ｅ−２】
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【図２Ｆ−１】
0006325088.tif 000047
【図２Ｆ−２】
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【図２Ｇ−１】
0006325088.tif 000049
【図２Ｇ−２】
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【配列表】
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