(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオディーゼル用の高価値のオメガ３脂肪酸および脂質を生成するために、スラウストキトリッドを用いて、ガス発酵工場の複数の廃液から複数の栄養物を隔離するための２段階の連続発酵を含むプロセスであって、
（ａ）廃液流および窒素源の連続的な供給を含む第１段階発酵反応器中にて複数のスラウストキトリッド株を連続的に培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の前記複数のスラウストキトリッド株の培養物を、バイオマス採取／分離システムを介して、廃液流のみを有する第２段階発酵反応器へと移送する段階と、
（ｃ）必要に応じて窒素が無い状態において、前記第２段階発酵反応器中にて、バイオマスを生成する段階（ｂ）のバイオマス培養物を連続的に培養する段階と、
（ｄ）バイオマス採取／分離システムを介して、前記バイオマスを液体培養液から連続的に分離し、澄んだ培養液をガス発酵工場へとリサイクルする段階と、
（ｅ）オメガ３脂肪酸および脂質を連続的に得る段階と、
を含む、プロセス。
【請求項２】
複数の廃液は、有機酸およびアルコールの混合物を含み、糖または炭水化物を含まない、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
選択される前記複数のスラウストキトリッド株は、ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
複数の廃液は、５ｇ／Ｌ−１００ｇ／Ｌまたはそれよりも高い濃度のアセテート、および、０．５ｇ／Ｌまたは５ｇ／Ｌまたはそれよりも高い濃度のアルコールを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
オメガ３脂肪酸は、パルミチン酸、オレイン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
段階（ｂ）において、前記第１段階発酵反応器からの前記培養物が前記第２段階発酵反応器へと直接移送される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
段階（ｃ）において、前記第２段階発酵反応器の前記培養物は、窒素が無い状態で培養される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記窒素が無い状態において、前記バイオマスを、８グラム／リットル／日から１５０グラム／リットル／日までの範囲内に増大させる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記窒素が無い状態において、前記バイオマスを、８グラム／リットル／日から１００グラム／リットル／日までの範囲内に増大させる、請求項１または請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記窒素が無い状態において、前記脂質の含有量を、２０％から９０％までの範囲内で前記第１段階発酵反応器から増大させる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記窒素が無い状態において、前記脂質の含有量を、２０％から７０％までの範囲内で前記第１段階発酵反応器から増大させる、請求項１または請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記窒素が無い状態において、ＤＨＡ含有量を、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の５０％までの範囲内で前記第１段階発酵反応器から増大させる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記窒素が無い状態において、ＤＨＡ含有量を、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の３５％までの範囲内で前記第１段階発酵反応器から増大させる、請求項１または請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
段階（ｂ）において、前記第１段階発酵反応器からの培養物がバイオマス分離反応器に連続的に通され、バイオマスと培養液とを分離する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記段階（ｃ）において、分離システムから得られた濃縮されたバイオマスが、前記第２段階発酵反応器へと連続的に移送される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記第１段階発酵反応器から前記第２段階発酵反応器へのバイオマスの直接の前記移送は、乾燥バイオマスを８グラム／リットル／日から２００グラム／リットル／日までの範囲内に増やす、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記第１段階発酵反応器から前記第２段階発酵反応器へのバイオマスの直接の前記移送は、乾燥バイオマスを８グラム／リットル／日から１５０グラム／リットル／日までの範囲内に増やす、請求項１または請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記第１段階発酵反応器から前記第２段階発酵反応器へのバイオマスの直接の前記移送は、前記脂質の含有量を、乾燥質量の２０％から乾燥質量の１００％までの範囲内に増やす、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記第１段階発酵反応器から前記第２段階発酵反応器へのバイオマスの直接の前記移送は、前記脂質の含有量を、乾燥質量の２０％から乾燥質量の８０％までの範囲内に増やす、請求項１または請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記第１段階発酵反応器から前記第２段階発酵反応器へのバイオマスの直接の前記移送は、ＤＨＡ含有量を、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の５０％までの範囲内に増やす、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記第１段階発酵反応器から前記第２段階発酵反応器へのバイオマスの直接の前記移送は、ＤＨＡ含有量を、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の４５％までの範囲内に増やす、請求項１または請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
段階（ｂ）および段階（ｃ）において、細胞中の脂質蓄積を刺激すべく、前記第２段階発酵反応器が連続的な窒素ストレス条件を生成するように使用される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２３】
段階（ｄ）において、前記第２段階発酵反応器から出てくる前記培養物は、バイオマスと培養液水とを分離すべくバイオマス分離システムに連続的に通され、溶存酸素がゼロである前記水は、連続的にリサイクルされてガス発酵処理用に戻される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２４】
段階（ａ）において、微量の硫化物を除去すべく、前記廃液が空気によって連続的にパージされる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記硫化物の除去は、前記複数の栄養物の廃液流からの隔離を、５５グラム／リットル／日から９０グラム／リットル／日までの範囲内に増大させる、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記硫化物の除去は、前記バイオマスの生成を、４０グラム／リットル／日から５５グラム／リットル／日までの範囲内に増大させる、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２７】
受託番号ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を有するスラウストキトリッドの複数の新株。
【請求項２８】
バイオディーゼルでの使用のためのオメガ３脂肪酸および脂質を生成することの可能な、請求項２７に記載の複数の新株。
【請求項２９】
前記複数の新株は、８グラム／リットル／日から１５０グラム／リットル／日までの範囲内の乾燥バイオマスを生成する、請求項２７に記載の複数の新株。
【請求項３０】
前記複数の新株は、乾燥質量の２０％から乾燥質量の８０％までの範囲内の脂質を生成する、請求項２７に記載の複数の新株。
【請求項３１】
前記複数の新株は、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の４５％までの範囲内のＤＨＡ含有量を生成する、請求項２７に記載の複数の新株。
【請求項３２】
バイオディーゼルでの使用に向けたオメガ３脂肪酸および脂質を生成するための、受託番号ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を有するスラウストキトリッドの複数の新株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のガス発酵工場の排出からの複数の栄養物の隔離と、バイオディーゼル用の高価値の複数のオメガ３脂肪酸および脂質のような付加価値のある複数の生成物へのその生体内変化との連続プロセスによって廃液を処理するための、スラウストキトリッド（thraustochytrid）に基づいたプロセスを提供する。
【背景技術】
【０００２】
複数の発展途上国における急速な工業化は、経済的な発展をもたらしたものの、特に産業界から生み出される排出によって、水および土壌のような地球の生態系を激しく悪化させもした。このことは、地球の生態系の劣化を防ぐべく、産業界から排出される複数の廃液の効率的な処理の必要性を強調してきた。例えば、炭素捕捉および炭素隔離技術、温室効果ガスのガス発酵、リグノセルロース系バイオマスからのバイオエタノール生成およびリグノセルロース系バイオマスの熱分解といったバイオ燃料生成のための複数の次の技術の成熟によって、大量の廃液流が生成されることが予測されており、従って、既存の問題をより大きなものにしている。バイオ燃料業界からの廃液の大部分は、大量の有機酸、アルコール（例えばギ酸、酢酸、酪酸、メタノールおよびエタノール）、および糖誘導体等を含む。処理を行うことなく、これらの廃液を環境中へと直接に廃棄することは、その領域の生物多様性にさらに影響を及ぼし得る。何故ならば、これらの酸およびアルコールは、非常に腐食性が強く、複数の生物にとって毒性を持つためである。従って、これらの廃液は、環境中に排出する前に、化学的および生物学的に処置されなくてはならない。
【０００３】
これらの廃液流の化学的または生物学的な処理は、産業界に対してかなりのコストを負わせるので、その利益を悪化させる。しかしながら、これらの廃液から複数の有用な材料を生成することは、そうした複数の処理に対する評価を加える。複数の有機酸／アルコール、特に酢酸は、工業的用途の様々な化学物質の前駆体である。しかしながら、こうした廃液からこれらを抽出することは、こうした廃液流中に存在する量が比較的少ないこと、および、これに関連したより高いコスト並びにエネルギーフットプリントに起因して、商業的には持続できない。しかしながら、これらの種類の廃液は、複数の微生物、特に、バイオ製品の生成および利用に向けた微細藻類の成長用の複数の栄養源として使用されることができる。これは、廃液処理の問題を解決するのみでなく、微細藻類の培養用栄養源の安価で持続可能な供給の問題もまた解決するだろう。これは、両方の処理に対して価値と相乗効果を加えるであろう。しかしながら、全ての微生物が比較的高い濃度の有機酸を利用することができるわけではなく、酢酸／アルコールのより高い濃度は、複数の微生物の成長に負の影響を与えることが報告されているので、これらの廃液流に対して、複数の微生物のスクリーニングが成されなくてはならない。
【０００４】
自然界の複数の微生物／微細藻類の大部分は、媒体中のより高い濃度の複数の有機酸およびアルコール（特にギ酸、酢酸およびエタノール）に耐えること、またはこれらを利用することが不可能である。従って、媒体中のこれらの栄養物に対する耐性および利用を高めるべく、これらの微生物の生理機能が変更される必要がある。遺伝子工学、突然変異、適応、原形質融合は、所望される用途に適合するべく、複数の微生物の生理機能を変更させるために使用されている複数のツールのそのような例である。
【０００５】
微細藻類の大部分は、広い範囲の栄養物を利用して、従属栄養モードにおいて複数の脂質を生成する能力を有する。微細藻類の従属栄養培養は、複数の培養パラメータのより良好な制御、高い細胞バイオマスおよび成長速度、細胞乾燥重量の７０−８０％までの短時間での高脂質蓄積等、光栄養培養を上回るいくつかの利点を提供する。スラウストキトリッドのようないくつかの微細藻類種は、複数の脂質とともに、オメガ３脂肪酸、すなわちＤＨＡ、ＤＰＡおよびＥＰＡをかなりの量生成することもまたできる。これらの微生物は、広範囲な炭素および窒素源を利用することが可能であり、両者、すなわち複数のオメガ３脂肪酸とバイオディーゼルの経済的な生成にとってこれらを理想的なものとしている。
【０００６】
異なる複数の工業発生源から複数の温室効果ガスを捕捉する複数のガス発酵工場の大部分は、バッチモードまたはフェドバッチモードの代わりに連続的に動作される。従って、複数のガス発酵工場の排出から複数の栄養物を隔離するための処理は、通常使用されているバッチまたはフェドバッチ処理の代わりに、連続的に動作される必要がある。これは、ガス発酵処理を栄養物隔離処理と同期させるのに役立つであろうのみならず、運転費用を低減し、その後の処理の生産性もまた高めるだろう。
【０００７】
連続プロセスにおいて、窒素源を含む複数の栄養物が連続的に反応器へと供給される。これは、より高い成長をもたらすが、脂質蓄積は低くなるであろう。しかしながら、油糧微生物は、複数の窒素ストレス条件下で脂質を蓄積することが報告されている。従って、ひとたび窒素が媒体中で完全に消費された場合、過剰な炭素源の脂質蓄積への窒素ストレス触媒変換は、バッチモードまたはフェドバッチモードによる培養でのより高い脂質生成のためには、窒素に対する炭素のより高い比率が要求される。連続プロセスにおいては、窒素に対する炭素のより高い比率は、より高い脂質蓄積を生じ得るものの、低成長になる。これは、バイオマス、脂質および複数のオメガ３脂肪酸の、より低い生産性という結果になるであろう。
【０００８】
この問題を克服すべく、２つの反応器システムが適用される。一方の反応器はより高い成長を支援するためのものであり、第２反応器は複数の窒素ストレス条件下での脂質蓄積のためのものである。しかしながら、これら２つの反応器は、連続モードの代わりに別個のバッチで動作される。第１のバイオリアクターからの培養ブロスが第２のバイオリアクターへと直接移送される。しかしながら、この従来の手法は、数多くの課題を有している。例えば、（ｉ）第１反応器からの培養ブロスによる第２反応器中の複数の媒体成分の希釈、（ｉｉ）第２反応器中での１ｍｌ当たりの細胞の数の低下に起因した、低減されたバイオマスおよび脂質生産性、（ｉｉｉ）第１反応器から出てくる培養ブロス中に存在する利用されなかった窒素によって引き起こされる、第２反応器中の窒素汚染の可能性、（ｉｖ）脂質蓄積にとって有害な、第２反応器中の複数の二次代謝産物のその後の蓄積である。
【０００９】
バイオディーゼルは、複数の原材料源に基づいて第１世代、第２世代、および第３世代のバイオディーゼルに分類されてきた。第１世代のバイオディーゼルは、複数の食用作物（例えば大豆、キャノーラ油、ヤシ油等）から商業的に生成されている。しかしながら、第１世代のバイオディーゼルの長期の存続性は、食物供給との対立、故に食物対燃料の論争のため、疑わしい。第２世代（非食用作物、例えばカランジャ油（karanja oil）、ジャトロファ属（jatropha）等）がこの要求に対する回答となり得るが、適切な生産性の欠如、水および肥料へのより多くの投資、商業的生産用の広大な土地が、商業目的の利用を制限されたものにしている。
【００１０】
しかしながら、微生物のバイオマスに由来する第３世代のバイオディーゼルは、バイオエネルギー作物と比べた場合のそれらの高い成長速度および油生産性のために、原材料問題に対処するための最有力候補として現れてきた。そのような複数の微生物は、酵母および微細藻類に属し、もしもそれらの乾燥重量の２０％よりも多くを脂質として蓄積する場合には、複数の油糧微生物として指定されている。これらの油糧微生物の油生産性は、ヤシ、大豆、ココナッツ等のような優れた複数の油糧作物をほぼ千倍を越えるほど上回り、大規模生産用に必要な土地面積は、複数の油糧作物に対するものよりもはるかに小さい（Chisti et al、2007 Biotechnology Advances）。よって、バイオディーゼル用途向けの油糧微生物の培養は、複数の油糧作物よりも、商業的且つ持続可能な優位性を与える。
【００１１】
微細藻類バイオディーゼルの商業的な成功は、化石由来の燃料と比較した場合の、そのコスト競争力に依存する。経済的に存続可能な油の生産に向けた複数の要求は、高いバイオマスおよび脂質生産性、原材料の低コストおよび副産物の評価のような、複数の要因を含む。微細藻類バイオ燃料の批評は、バイオディーゼル生産用に複数の脂質を与えるだけの複数の種の培養が経済的ではないことを示す。その複数の理由は、採取および油抽出に関連したコストと連結した、より高い培養および栄養物コストを含む。従って、コストのいくらかを相殺するために、複数の脂質とともに付加価値のある複数の生成物を提供することのできる複数の微細藻類種には、大きな需要がある。バイオディーゼル用途およびＤＨＡ／ＤＰＡ／ＥＰＡのような高価値の複数の副生成物に適した油の同時生成は、生産コストを相殺するための複数の有望な処理のうちの１つであり、故に、確立した石油ディーゼルに対抗して競争するための影響力をバイオディーゼルに与える。しかしながら、かなりの量のＤＨＡ／ＥＰＡ／ＤＰＡを提供することのできる良好な複数の微細藻類株の選択は、この技術の成功に対する複数の重要な態様のうちの１つのままである。
【００１２】
複数の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、すなわちドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、複数の必須脂肪酸であり、幼児の正常な視力の発達、脳の複数の機能の維持、眼組織、心筋、および高齢者の黄斑変性の抑制等における、それらの重要な複数の生理的役割について、よく文書に実証されている。炭素鎖の末端から最初の二重結合の位置に基づいて、カルボキシル基とは反対側の、アルキル鎖上の最初の二重結合の存在に依存して、複数のＰＵＦＡは２つの種類、すなわちオメガ３およびオメガ６脂肪酸に分類されてきた。人間の生理機能におけるＤＨＡの広範囲な重要性は、乳児食を取り扱う複数の企業に対し、ＤＨＡが強化された補助食品を考案させてきた。例えば、ＤＨＡは、特定個人の脳の機能を分析するためのバイオマーカとして使用されることのできる人間の大脳皮質中の脂質の約１５％−２０％を占め、網膜中の脂質の３０％−６０％を占め、母乳の重要な成分である。これらの脂肪酸は、抗炎症活性を有し、また血中コレステロールレベルを下げる能力を有することが報告されている。ＤＨＡの定期的な投与は、血管の硬化のリスクを低減することにより、アテローム性動脈硬化を防ぐのに役立つことができる。近年、ＤＨＡの長期にわたる使用が、癌性細胞中の細胞自然死を誘起することによって、１型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患、および癌の可能性を低減するのに役立ち得ることが報告された。化粧品中のＤＨＡの活用が、アンチエイジング効果を有することが報告されている。複数のオメガ３脂肪酸は人体中で新たに合成されはしないので、これら複数の脂肪酸は、複数の栄養源から導出されなくてはならない。
【００１３】
広範囲にわたる生理的重要性のため、ＤＨＡ／ＥＰＡは医薬業界、栄養補助食品業界、養鶏、および漁業から大きな注目を集めている。近年、機能性食品および健康食品において、ＤＨＡの活用を拡大する試みが成されてきた。世界保健機関（ＷＨＯ）は、健康な人にとって、毎日、１ｇ／日のＤＨＡ摂取を勧めてきた。様々な業界におけるそれらの拡大する用途に起因して、これら複数のオメガ３製品に対する市場価値は、２０１１−２０１６年の複合年間成長率６．８％で、２０１６年までにはおよそ３５０億米国ドルになると推定されている（Global market for EPA/DHA Omega-3 Products, Packaged Facts 2012）。
【００１４】
魚油は、複数のオメガ３脂肪酸の良好な複数の食事供給源と考えられている。複数の魚油は、複数の特定の種およびそれらの複数の食べ物に依存して、脂肪酸組成の種類およびレベルが大幅に変動する。例えば、水産養殖によって育てられた魚は、天然のものより低いオメガ３脂肪酸レベルを有する傾向にある。さらに、複数の魚油は、複数の環境汚染物質を含有しているリスクを持っており、安定性の複数の問題、および魚の臭いまたは味と関連し得る。これとは別に、魚の乱獲もまた、不安定な魚油の供給を導いてきた。これは、魚油調達におけるコストの上昇に起因して、ＤＳＭのような複数の主要な生産業者にとって、ＤＨＡに対する市場価格を上昇させてきた。
【００１５】
魚油の供給におけるこれらの制限的な複数の問題は、この２０年間、複数の業界に対して、スラウストキトリッド（Thraustochytrids）、クリプテコディナム（Crypthecodinum）、または珪藻フェオダクチラム（diatoms Phaeodactylum）等の海洋微細藻類のような、ＤＨＡ／ＥＰＡ生成用の代替的な複数の供給源を探すことを強いてきた。オメガ３油を生成する海洋微細藻類の単離に向けて、かなりの量の研究が実施されてきた。スラウストキトリッドは、ＤＨＡ生成に対する潜在的な複数の候補のうちの１つとして考えられている。スラウストキトリッドは、単細胞性の海洋性従属栄養微生物であり、マングローブの葉、堆積物のような複数の有機物質を分解すること、およびマングローブ生態系における栄養物をリサイクルすることに関連している。細胞の大きさは１０−３５μｍの間の範囲に及び、遊走子または二分裂によって繁殖する。これらは、マングローブ生態系における分解生物として働く。分子系統学に基づくと、スラウストキトリッドは、褐藻類、珪藻類、卵菌綱、および様々な鞭毛虫と一緒に、クロミスタ界またはストラメニパイラ（Stramenipila）（ストラメノパイラ （Stramenopila）ともまた呼ばれる）に分類される。この界の構成員の大部分はスラウストキトリッドのように腐生であるのに対し、いくつかは、ラビリンチュリッド（labyrinthulids）の構成員のように、寄生性である。ＤＨＡ／ＥＰＡを含む高いバイオマスおよび脂質生成が、自然界のスラウストキトリッドに属する微細藻類によって生成されることがよく知られている。スラウストキトリッドは、ヤブレツボカビ目（Thraustochytriales）の微生物であり、シゾキトリウム属（Schizochytrium）、ヤブレツボカビ属（Thraustochytrium）、ウルケニア属（Ulkenia）の構成員を含み、ＤＨＡを含む複数のオメガ３脂肪酸の代替源として十分に確立されてきた。
【００１６】
スラウストキトリッドバイオマスに存在する全脂質のうち、約９０％−９５％は複数のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）として、続いて、５％−１０％が複数の極性および構造的脂質として蓄えられる（Gupta et al 2012 Biotechnology Advances）。ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）のような複数の飽和脂肪酸（ＳＦＡ）、または、例えばオレイン酸（Ｃ１８：１）である複数の一価不飽和脂肪酸、および、ＤＨＡ（Ｃ２２：６ｎ３）のような複数の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が、ＴＡＧの主要な成分である。複数のＳＦＡおよびＭＵＦＡは、バイオディーゼル生産用の理想的な複数の脂肪酸（ＦＡＢ）である複数の全脂肪酸（ＴＦＡ）のうち、約４０％−８０％を構成する。ＤＨＡは、ＴＦＡの２０％−５０％を構成する。この２０年間、スラウストキトリッドの開発に対して成された研究の大部分は、ＤＨＡ生成の新規な供給源の開発に向けられている。文献の示唆によれば、高脂質蓄積（複数のＳＦＡおよびＭＵＦＡ）を有する高いバイオマス生成（２００ｇ／Ｌ）が、これらを、バイオディーゼルと高価値の副生成物との同時生成に対する潜在的な候補としている。
【００１７】
スラウストキトリッドは、様々な炭素および窒素源を用いたＤＨＡ／ＥＰＡ生成と連結した、多量のバイオマスおよび脂質を生成するそれらの能力について、よく文書に実証されている。しかしながら、炭素および窒素供給源は注意深く選択されなくてはならず、そのコストもまた全体的な生産の経済面に影響を及ぼす。グリセロール、粗製グリセロール、ココナッツ水、大豆ミール、およびスイートソルガムの果汁は、安価な栄養物のいくつかの例である。グリセロール、特に粗製グリセロールは、バイオディーゼル業界から、スラウストキトリッド培養用のグルコースの代替物として、複数の研究者によって積極的に推奨されてきた。しかしながら、バイオディーゼルの原材料として、バイオディーゼル業界の焦点が非食用油から微細藻類油へとシフトすることで、粗製グリセロールの供給および価格力学もまた変化し、スラウストキトリッド培養用の炭素源供給における低下をもたらすであろう。脂質／ＤＨＡ生成の全体的経済面にとって、炭素源のコストは、唯一の最も重要な要因であることが観察されてきた。
【００１８】
スラウストキトリッドは、もっぱら海洋微生物であり、海水または海塩を有する媒体中で培養される。海水または海塩を塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムによって置換することを勧める報告がいくつかある。しかしながら、海塩、海水、塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムの添加は、長期にわたる稼働において、商業的スケールの複数の反応器の複数の壁を腐食させることが報告されている。従って、海塩、海水、塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムを含まない媒体の複数の配合物は、例えば、複数の反応器のより容易なメンテナンス、媒体中の腐食性金属汚染の可能性の低減、複数の反応器のメンテナンスおよび媒体調製における金銭的利益といった、多数の利点を有するであろう。
【００１９】
米国特許出願公開第２０１３／００６５２８２号明細書は、二酸化炭素のような温室効果ガスと水素との、エタノールおよび複数の酸への嫌気的発酵プロセスを記載する。この流れは、その後、複数の油性の酵母、例えばクリプトコッカス・カルバタス（Cryptococcus curvatus）による複数の脂質の生成にとっての炭素源として使用された。この文献には、１．５％ｗ／ｖのアセテートが、培養用の媒体中で使用されたことが開示されている。何故ならば、１から１．５％よりも多くのアセテートの使用は、成長に負の影響を与えることが報告されているからである。従って、１．５％よりも多くのアセテートを含む複数の廃液流は、これら複数の油性の酵母の成長を制限し得る。著者は、２０ｇ／Ｌ／ｄの脂質生産性を主張したが、上記の酵母の乾燥バイオマス中の脂質含有量は非常に低いままであった。この酵母の乾燥バイオマスもまた、非常に価値の高い生成物のどれもが欠如している。このことは、産業界が廃液の処理に対してこのプラットフォームを使用することを思いとどまらせるであろう。
【００２０】
米国特許出願公開第２０１２／０１９８７５８号明細書は、湿った藻類バイオマスおよび都市廃棄物のバイオソリッド部分に対して熱水処理を用いることにより、都市の下水流をバイオ原油に変換することを議論している。使用された流れは、人間の排泄物、食品廃棄物、および医薬廃棄物が豊富であったこと、または、コミュニティの使用済みの水の供給であったことが言及されていた。そのプロセスは、バイオ原油への変換のために、非常に高い温度および圧力における、藻およびバクテリアの固形分、湿ったバイオマスの加熱を含んでいた。このプロセスは、バイオマスの乾燥、高い油分含有量の微生物の選択の必要性を取り除いたが、熱水処理を実行するために要求されるエネルギーは、バイオ原油のエネルギー含有量より大きいものであった。よって、藻類バイオマスから抽出可能なあらゆる高価値の副産物もまた、熱水反応器のそのような厳しい複数の条件では変性されるであろうということとは別に、都市廃棄物のバイオ原油への変換の間の副生成物への評価の可能性を低減するであろう。これは結局、産業界にとって、自身の複数の廃液を処理するためにそのような複数の技術を採用することへの意欲を削ぐであろう。しかしながら、バイオディーゼルおよびＤＨＡのような高価値の複数の生成物へとこれら複数の廃液を変換する複数のプロセスは、かなりの関心を持たれるであろう。
【００２１】
米国特許第５，１３０，２４２号明細書（１９９２年）は、複数のオメガ３脂肪酸を抽出するために使用されることのできる、微細藻類の従属栄養培養のためのプロセスを記載する。この特許の請求者達は、成長の速いスラウストキトリッドの単離、および、細胞中のＤＨＡ含有量を高めるための、グルコース、またはマルトース、スクロース、あるいは澱粉のようなその他複数の糖でのその後の培養について記載する。２段階発酵の方策がこの特許では使用された。ここで、第１の段階は指数関数的成長期であり、複数の窒素ストレス条件下での脂質蓄積段階がこれに続いた。著者達はまた、複数のオメガ３脂肪酸を脂質の残りから分離および精製するための低温結晶化プロセス、および、脂肪酸蓄積に対するナトリウムイオン濃度の影響を記載した。スラウストキトリッドの全細胞抽出物が、栄養補助用の複数の食品または魚あるいは動物の餌に使用されて、これらの産業界に由来する生成物、例えば魚油、卵等におけるオメガ３含有量を増やすことが、その後提案された。しかしながら、グルコースまたは他の日用品化された炭素および窒素源の使用は、生産コストを上昇させるだけでなく、日用品価格の上昇とともに、これら複数の日用品の長期の供給に対する難しい疑問もまた引き起こすだろう。
【００２２】
米国特許第６，５８２，９４１号明細書（２００３年）は、シゾキトリウム・リマシナム（Schizochytrium limacinum）ＳＲ２１と類似した種に属する成長の速い複数のスラウストキトリッド株の単離について記載する。請求者達は、炭素源としてグルコースまたはグリセロールを用い、複数の窒素源としてコーンスティープリカーとともに複数のアンモニウム塩を用いて、かなりの割合でオメガ３およびオメガ６脂肪酸を有する脂質を生成するためのプロセスを開発すべく、この株を調べた。その後彼らは、オメガ３およびオメガ６脂肪酸含有量を増やすべく、この新たに単離された株シゾキトリウム・リマシナムＳＲ２１の成長を最適化した。発酵におけるＤＨＡ生成を増大させるべく、炭素および窒素源の異なる複数の媒体配合が試された。しかしながら、グルコースまたはグリセロールとして炭素源を選択することは、このプロセスをむしろ非経済的且つ非持続可能なものにしかねない。
【００２３】
米国特許第６，６０７，９００号明細書は、炭素源としてグルコースを用い、かなりの量の脂質蓄積とともに、１７ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌのバイオマスを有するシゾキトリウム株の高細胞密度培養プロセスについて言及する。この特許は、全脂質のおよそ２０％−２５％ｗ／ｗのＤＨＡ含有量を主張した。段階的な通気方策がこの特許では適用され、成長期においては高い通気速度が、続いて、窒素源、すなわち水酸化アンモニウムが媒体中でひとたび完全に消費されると、脂質蓄積段階において低い通気速度が適用された。
【００２４】
米国特許出願公開第２００９／０１１７１９４号明細書は、カナダの海洋生物多様性から請求者達が単離したスラウストキトリッド新株ＯＮＣ−Ｔ１８による、酸化防止剤生成とのＤＨＡの同時生成のためのプロセスを記載する。この分離株の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列は、スラウストキトリウム・ストリアタム（Thraustochytrium striatum）Ｔ９１−６とのその近さを明らかにした。彼らは、細胞中のバイオマスおよびＤＨＡ含有量を増やすべく、異なる濃度のグルコース、グルタミン酸ナトリウム、および酵母エキスを使用した。いくつかの媒体配合を試した後で、バイオマスおよび脂質含有量における２８．０ｇＬ−１バイオマス、８１．７％ＴＦＡ、および３１．４％ＤＨＡ（ｗ／ｗバイオマス）までの、かなりの増大を彼らは報告した。
【００２５】
米国特許第７，９８９，１９５号明細書は、炭素源として粗製グリセロールを用いた、シゾキトリウム・リマシナムＳＲ２１の高細胞密度培養を達成するためのプロセスを記載する。請求者達は、発酵全体を３つの段階に分割する、すなわち、細胞密度を増大すること、細胞の大きさを増大すること、およびその後の脂肪酸生成の増大に分割する、多段階の方策を提示する。彼らは、全脂肪酸の１５％−２２％のＤＨＡを有する、１ｇ／Ｌ／ｈから３ｇ／Ｌ／ｈまでのバイオマス生産性を主張した。このプロセスにおいて使用された粗製グリセロールは、バイオディーゼル産業界に由来するものであった。肥大した複数の細胞は非常にもろく、せん断に起因した細胞損傷を受け易いので、著者達は、脂質蓄積に対するせん断の影響について言及しなかった。従って、細胞中の脂質蓄積を高めながらも、せん断の影響が考慮されなくてはならない。
【００２６】
米国特許出願公開第２０１３／０２１７０８４号明細書は、バイオディーゼル産業界から生成された粗製グリセロールを炭素源として用いた、様々なスラウストキトリッド種、すなわち、シゾキトリウム、ヤブレツボカビ、ウルケニア等からのＤＨＡ生成プロセスを記載する。請求者達はまた、粗製グリセロールによるこれら複数の種におけるＥＰＡ生成も調べた。彼らは、アセテート含有グリセロールを複数の高価値生成物へと変換することによる、バイオディーゼル産業界に対する価値の付加について言及した。
【００２７】
米国特許出願公開第２０１３／００８９９０１号明細書は、発明の微細藻類が、グルコース含有媒体中で培養される場合に、複数の細胞中に高い比率でバイオオイルを蓄積すること、従って、高い収率でバイオオイルを生成できることを記載している。微細藻類は、炭素源としてリグノセルロース系バイオマスを用いてバイオオイルを生成することができる。さらに、バイオオイルの生成用にセルロース系バイオマスを使用することは、複数の食糧資源の不安定な供給および複数の原材料コストの増大を含んだ、バイオオイルの開発を制限している複数の要因を克服することができ、微生物発酵油の商業的競争力を改善することができる。しかしながら、前処理されたバイオマス中に存在し、有機体の大部分にとって抑制的なことが知られている複数の毒性化合物の影響が調べられていなかった。
【００２８】
国際公開第２００７／０６８９９７号は、ＤＨＡ生成に向けて、インドのゴア州からの未報告の１０のスラウストキトリッド株の単離および特性評価について言及している。請求者達は、炭素源としての２％グルコース上で、これら複数の分離株を検査して、ＤＨＡ蓄積に対するそれらの能力、およびその他の関連する複数の中間体脂肪酸を評価した。著者達は、複数の分離株のうちのいくつかにおいて、全脂肪酸の１０％−３０％のＤＨＡ含有量を主張した。しかしながら、安価なグルコース源の供給が既に追い詰められている状況では、ＤＨＡ生成用の炭素源としてのグルコースの使用は、工業スケールのＤＨＡ生成に対するグルコースの長期の供給とともに、生産コストに対する深刻な疑問を引き起こす。
【００２９】
米国特許出願公開第２０１０／００４１１１２号明細書は、バイオディーゼル生産用に複数のスラウストキトリッド株から抽出された脂質の用途を提示する。この発明において使用される複数の株は、ＳＦＡまたはＭＵＦＡが極めて豊富であった。媒体中でのグルコースおよび酵母エキスの使用は、生産コストの相当な上昇という結果になるであろう。従って、このプロセスの商業実用化と長期の持続可能性の両者を危うくするであろう。
【００３０】
スラウストキトリッド培養のためには、媒体中への海塩の添加が必要である。しかしながら、これは、大規模なスチール製の複数の反応器および関連したハードウェアの腐食を引き起こしかねない。従って、これを回避するために、硫酸ナトリウムのような非塩化物系ナトリウム塩によって海塩が置き換えられる（米国特許第５，４０，７４２号明細書）。しかしながら、廃液流中への複数の非塩化物系ナトリウム塩の添加は、複数の廃液流の処理に対してさらなるコストを加えるであろう。従って、海塩またはナトリウム塩を持たないプロセスは、複数の廃液を処理するためのこのプロセスを統合するのに実に役立つであろう。
【００３１】
従来技術から、グルコース以外の他の複数の炭素源の使用もまた、同じ疑問を引き起こすことが結論され得る。何故ならば、もしもバイオディーゼル生産用の原材料としてこれらを使用することを意図しているならば、大規模な培養に向けたこれら複数の炭素源の長期の供給が疑わしいものだからである。これは、プロセスの二酸化炭素排出量も増大させるであろう。これは、国際社会が取り組んでいる問題である。しかしながら、複数の廃液処理をスラウストキトリッド培養と統合することは、複数の廃液処理のプロセスおよびスラウストキトリッド培養からのバイオディーゼル、ＤＨＡ生成の両者に対して、価値を加えるであろう。これは今度は、プロセスの二酸化炭素排出量を低減するとともに、プロセスの商業実用化および持続可能性を増大させるであろう。
【発明の概要】
【００３２】
従って、本発明の主要な実施形態は、バイオディーゼル用の高価値の複数のオメガ３脂肪酸および脂質を生成するために、スラウストキトリッドを用いて、複数のガス発酵工場の複数の廃液から複数の栄養物を隔離するための２段階の連続発酵を含むプロセスを提供する。このプロセスは以下を有する。
（ａ）廃液流および窒素源を含む第１段階発酵反応器中にて複数のスラウストキトリッド株を培養すること。
（ｂ）段階（ａ）の複数のスラウストキトリッド株を、バイオマス採取システムを介して、廃液流のみを有する第２段階発酵反応器へと移送すること。
（ｃ）必要に応じて窒素が無い状態において、第２段階発酵反応器中にて段階（ｂ）のバイオマス培養物を培養すること。
（ｄ）バイオマスと液体培養液の分離、および複数のガス発酵工場への澄んだ培養液のリサイクル。
（ｅ）付加価値のある複数のオメガ３脂肪酸および脂質を得ること。
【００３３】
本発明のさらに別の実施形態は、バイオディーゼルでの使用に向けた複数のオメガ３脂肪酸および脂質を生成するための、受託番号ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を有するスラウストキトリッドの複数の新株の使用を提供する。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態は、受託番号ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を有するスラウストキトリッドの複数の新株を提供する。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、バイオディーゼルでの使用に向けた複数のオメガ３脂肪酸および脂質を生成することの可能な複数の新株を提供する。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の株が、８グラム／リットル／日から１５０グラム／リットル／日までの範囲内の乾燥バイオマスを生成する、複数の新株を提供する。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の株が、乾燥質量の２０％から乾燥質量の８０％までの範囲内の複数の脂質を生成する、複数の新株を提供する。
【００３８】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の株が、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の４５％までの範囲内のＤＨＡ含有量を生成する、複数の新株を提供する。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の廃液が複数の有機酸およびアルコールの混合物を含み、糖または炭水化物を含まないプロセスを提供する。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、選択される複数のスラウストキトリッド株がＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）であるプロセスを提供する。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の廃液が５ｇ／Ｌ−１００ｇ／Ｌまたはそれよりも高い濃度のアセテート、および、０．５ｇ／Ｌまたは５ｇ／Ｌまたはそれよりも高い濃度のアルコールを含むプロセスを提供する。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数のオメガ３脂肪酸がパルミチン酸、オレイン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）であったプロセスを提供する。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素が無い状態において、バイオマスを８グラム／リットル／日から１００グラム／リットル／日までの範囲内で増大させるプロセスを提供する。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素が無い状態において、脂質含有量を２０％から７０％までの範囲内で第１段階発酵反応器から増大させるプロセスを提供する。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素が無い状態において、ＤＨＡ含有量を全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の３５％までの範囲内で第１段階発酵反応器から増大させるプロセスを提供する。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第１反応器から第２反応器へのバイオマスの直接の移送が、乾燥バイオマスを８グラム／リットル／日から１５０グラム／リットル／日までの範囲内に増やすプロセスを提供する。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第１反応器から第２反応器へのバイオマスの直接の移送が、脂質含有量を乾燥質量の２０％から乾燥質量の８０％までの範囲内に増やすプロセスを提供する。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第１反応器から第２反応器へのバイオマスの直接の移送が、ＤＨＡ含有量を全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の４５％までの範囲内に増やすプロセスを提供する。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、硫化物の除去が、バイオマス生成を４０グラム／リットル／日から５５グラム／リットル／日までの範囲内に増大させたプロセスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】スラウストキトリッド単離に使用される方策である。
【図２】複数のスラウストキトリッド新株の既存のスラウストキトリッドとの系統発生関係（ＮＪ樹）である。
【図３ａ】複数のスラウストキトリッド株による、異なる濃度のアセテートに対する酢酸耐性およびバイオマス生成である。
【図３ｂ】複数のスラウストキトリッド株による、異なる濃度のアセテートに対する酢酸耐性および脂質含有量である。
【図３ｃ】複数のスラウストキトリッド株による、異なる濃度のアセテートに対するＦＡＢおよびＤＨＡ含有量である。
【図４ａ】複数の廃液に対する複数のスラウストキトリッド株のバイオマス生成である。
【図４ｂ】複数の廃液に対する複数のスラウストキトリッド株の脂質含有量である。
【図４ｃ】複数の廃液に対するスラウストキトリッド株のＦＡＢおよびＤＨＡ含有量である。
【図５】廃液流でのバイオマス生成に対する窒素源添加の効果である。
【図６】廃液流でのバイオマス生成に対する異なる接種物サイズの効果である。
【図７ａ】廃液流でのＤＢＴＩＯＣ−１８（ＭＴＣＣ５８９６）の培養に向けた、ラシュトン（Rushton）インペラと穴の空けられた複数のパイプスパージャーとの組み合わせを有するバイオリアクター中での細胞計数、細胞ＯＤ６００ｎｍ、乾燥バイオマスである。
【図７ｂ】廃液流でのＤＢＴＩＯＣ−１８（ＭＴＣＣ５８９６）の培養に向けた、ピッチブレードと複数のマイクロスパージャーとの組み合わせを有するバイオリアクター中での細胞計数、細胞ＯＤ６００ｎｍ、乾燥バイオマスである。
【図８】空気によって連続的にパージされる廃液流でのＤＢＴＩＯＣ−１８（ＭＴＣＣ５８９６）の培養に向けた、ピッチブレードと複数のマイクロスパージャーとの組み合わせを有し、１．２Ｌの作動容積を有する２Ｌのバイオリアクター中での、細胞計数、細胞ＯＤ６００ｎｍ、細胞の大きさ、乾燥バイオマスである。
【図９】１．２Ｌの作動容積を有し、第１反応器には窒素源を有する廃液流が連続的に供給され、他方、第２反応器には窒素源を有するように改変されていない複数の廃液流が供給された、ＤＢＴＩＯＣ−１８（ＭＴＣＣ５８９６）の培養に向けた２段階バイオリアクターシステム中での細胞計数、細胞ＯＤ６００ｎｍ、細胞の大きさ、乾燥バイオマスおよび脂質含有量である。
【図１０】インラインのバイオマス採取システムを有し、第１反応器には窒素源を有する廃液流が連続的に供給され、他方、第２反応器には窒素源を有するように改変されていない複数の廃液流が供給された、ＤＢＴＩＯＣ−１８（ＭＴＣＣ５８９６）の培養に向けた２段階バイオリアクターシステム中での細胞計数、細胞ＯＤ６００ｎｍ、細胞の大きさ、乾燥バイオマスおよび脂質含有量である。バイオマスは、第１反応器から出てくる培養液から連続的に濃縮され、濃縮されたバイオマスは、第２反応器へと連続的に送り込まれた。
【図１１】複数の廃液を脂質およびＤＨＡへと変換するためのプロセスの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、様々な変更および／または代替的な複数のプロセスおよび／または複数の組成が可能であるが、それらの特定の実施形態が、複数の図面、グラフおよび表中に例として示されており、以下に詳細に記載されるであろう。しかしながらこれは、開示される特定の複数のプロセスおよび／または複数の組成に本発明を限定することが意図されるものではなく、むしろその反対であり、本発明は、添付される複数の請求項によって定義される本発明の趣旨および範囲内に含まれる全ての変更、同等物、および代替物に及ぶべきものであることが理解されるべきである。複数の本方法および生成物が記載される前に、この発明は、記載される特定の方法、生成物および複数の実験条件に限定されるものではないことが理解されるべきである。何故ならば、そのような複数の方法および条件は変動してよいからである。本明細書で使用される用語は、特定の複数の実施形態を記載する目的のためだけであって、限定するものであることは意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００５２】
本明細書の記載の恩恵を受ける当業者にとっては容易に明らかとなるであろう詳細によって本開示を曖昧にしないように、複数の図面中において従来の表現によるものが適切な場合には、本発明の複数の実施形態を理解するために適切な特定の詳細だけを示すように、複数のグラフ、表、図、およびプロトコルは表されている。
【００５３】
以下の記載は、単なる複数の例示的な実施形態であり、いかなる態様でも、本発明の範囲、適用性、または構成を制限することは意図されない。むしろ以下の記載は、本発明の複数の例示的な実施形態を実行するための便利な説明を提供するものである。記載される複数の実施形態に対する様々な変更が、本発明の範囲から逸脱することなく、記載される複数の要素の機能および配置内で成されてよい。
【００５４】
"含む"、"含み"という用語、またはそれらの任意の他の変形形態は、"…を含む"が続く１または複数のプロセスまたは組成またはシステムまたは方法が、それ以上の制限無く、他の複数のプロセス、複数の副プロセス、組成、複数の副組成、主要でないまたは主要な複数の組成またはその他複数の要素またはその他複数の構造または付加的な複数のプロセスまたは複数の組成または付加的な複数の要素または付加的な複数の特徴または付加的な複数の特性または付加的な複数の特質の存在を排除しないように、非排他的な包含に及ぶことが意図されている。
【００５５】
"単独で、または組み合わせて"という用語、またはそれらの任意の他の変形形態は、非排他的な包含を記載するおよび／または非排他的な包含に及ぶことが意図されている。ここでは、複数の分子またはオリゴヌクレオチドが、個々に、または他の複数のオリゴヌクレオチドの任意の１つあるいは全てと一緒に存在する。
【００５６】
定義
本発明の複数の目的のために、以下の複数の用語は、そこで特定される意味を有するであろう。
【００５７】
本明細書にて使用されるように"２段階発酵プロセス"または"２段階発酵システム"または"２段階連続発酵プロセス"または"２段階連続発酵システム"という用語は、本発明の文脈において使用される場合、２つの別個の反応器内で行われる２つの連続発酵反応を含むプロセスまたは方法のことを指す。第１の発酵は第１段階発酵反応器内で行われ、第２段階発酵反応器内で行われる第２の発酵がこれに続く。第１および第２の発酵反応の両者は、２つの異なる反応器内で別々に行われるが、全体的なプロセスは連続したものである。
【００５８】
本明細書にて使用されるように、"新株"という用語は、本発明の文脈において使用される場合、複数のガス発酵工場の極端な複数の廃液流への適応から作り出された複数の株のことを指す。この複数の"新株"は、例えばアセチルＣｏＡシンターゼ、リンゴ酸酵素、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、等に関連する多数の酵素の多種多様な発現が可能であり、複数のガス発酵工場からの複数の高アセテート含有廃液を分解することが可能である。
【００５９】
本明細書にて使用されるように、"オメガ３脂肪酸"または"ω−３脂肪酸"または"ｎ−３脂肪酸"という用語は、炭素鎖の末端から３番目の炭素原子に二重結合（Ｃ＝Ｃ）を有する複数の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を指す。より具体的には、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のように３種類のオメガ３脂肪酸が存在し、これらは本発明の文脈において、複数のオメガ３脂肪酸として考えられ、同定され、調べられ、そして含まれている。
【００６０】
本発明は、複数のオメガ３脂肪酸および脂質へと迅速に変換するために、スラウストキトリッドの複数の新株を用いて、複数のガス発酵工場または温室効果ガス管理工場からの複数の廃液を連続処理するための方法およびシステムを記載する。スラウストキトリッドバイオマスの複数の新株は、バイオディーゼル生産の適切な原材料でもある。
【００６１】
本発明は、インドの海岸地帯のマングローブ生態系からの、Mandovi Zuariマングローブ（収集の座標：S15°29'57.39''，E73°52'6.13''、パンジム、ゴア州）からの、枯れた有機物質が豊富な分解する葉または土壌から単離および同定された、スラウストキトリッドの新規な複数の野生株、すなわち、ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、ＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を提供する。また、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列決定に基づくそれらの特性評価が記載された。これらの１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列は、受託番号ＫＦ６６８６２４、ＫＦ６６８６２７、ＫＦ６６８６２９およびＫＦ６６８６３２としてＮＣＢＩデータベースに供託された。
【００６２】
別の態様において、本発明はまた、アセチルＣｏＡシンターゼ、リンゴ酸酵素、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、等の多種多様な発現を発現させることが可能であり、複数のガス発酵工場からの複数の高アセテート含有廃液を分解することの可能なスラウストキトリッドの複数の新株を提供する。複数のガス発酵工場から排出される複数の廃液はまた、アルコールも含んでいた（０．５ｇ／Ｌ、または２ｇ／Ｌ、または５ｇ／Ｌ、またはそれ以上）。
【００６３】
本発明の一態様は、高アセテート廃液を加水分解または分解することの可能な複数のスラウストキトリッド新株を提供する。一態様において本発明は、複数の脂質および脂肪酸の生成用に、複数の窒素源としての酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、硝酸、アンモニウム塩に加えて、高アセテート廃液中に存在するアセテートを炭素源として使用することのできる複数のスラウストキトリッド新株を提供する。
【００６４】
一態様において本発明は、５ｇ／Ｌから３０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、またはそれ以上まで、広い範囲のアセテート濃度を許容することのできる複数のスラウストキトリッド新株を提供する［図３ａ−ｃ］。通常、バイオマスは１．５ｇ／Ｌから６．５ｇ／Ｌまで、脂質含有量は複数の株中のバイオマスの１４％から５４．５％ｗ／ｗまでの範囲内にあることが見出された［図３ａ−ｃ］。例えばスラウストキトリッド株ＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）は、１５ｇ／Ｌの範囲内のアセテートを利用し、６．５ｇ／Ｌのバイオマス、５４．５％の脂質および１５％のＤＨＡ含有量を産出したことが見出された。
【００６５】
本発明の別の態様は廃液を用いることを提供するが、複数の発酵工場または温室効果ガス管理工場には限定されない。別の態様において本発明は、本明細書に記載されるように、様々な廃液からの炭素および窒素源の両者を用いることの可能な、複数のスラウストキトリッド新株を提供する。廃液または廃液流中の複数の栄養物は、複数の有機酸およびアルコールを含んでいた。廃液／廃液流中に最もよくある栄養物は、アルコールと一緒になった酢酸、ギ酸、およびその他複数の酸であることが見出された。従って、そのような媒体により、バイオマス生成は１．５ｇ／Ｌから３．３ｇ／Ｌまで、脂質含有量はバイオマスの２１％から５０％まで、ＤＨＡ含有量は全脂肪酸の１０％から３０％までの範囲に及ぶことが見出された（図４）。
【００６６】
本発明の別の態様は、複数の廃液を加水分解または分解する能力を発達させるべく、複数の野生株または親株を適応させる方法を提供する。適応のため、より長期間、例えば１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月、あるいはいくつかの場合には６ヶ月にわたり、複数の廃液で複数の野生株または親株が培養された。複数の廃液流中でひとたび複数の栄養物が完全に消費されると、複数の培養物は新たな流れに移された。培養物を移すことは１０回、または２０回、３０回、あるいはいくつかの場合は１００回繰り返された。これは、複数の野生株または親株が、これらの流れからの複数の栄養物を選択的に利用し、複数の廃液に徐々に適応することを可能にした。
【００６７】
複数の新株は、複数の廃液から、より高い、すなわち３０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌの栄養物隔離、並びに、より高いバイオマスおよび脂質生成を示した。これら複数の新株は、これらの流れの中に存在する非常に高い濃度の複数の有機酸、特にアセテート／酢酸およびその他複数の成長抑制剤を許容することが可能であった。酢酸代謝に関連した複数の遺伝子、例えばアセチルＣｏＡシンターゼ、リンゴ酸酵素、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、等の分子分析が、複数の天然型株（native strain）と比べた場合に、複数の新株における発現レベルの数倍の増大を示した。
【００６８】
別の態様において複数の新株は、高い安定性の点で効率的であることが見出され、バイオマス生成、脂質含有量、ＴＦＡ含有量、流れからの栄養物隔離のような複数の生産性パラメータは、天然型または対照菌株と比較して、より高いままであった［図４ａ−ｃおよび表１ａ−１ｂ］。これら複数の新株は、その後、複数のエルレンマイヤーフラスコ、バッフルフラスコ、またはバイオリアクター中で培養された。
【表１ａ】
0006258983.tif 000002
【表１ｂ】
0006258983.tif 000003
【００６９】
本発明のさらに別の態様においては、複数のスラウストキトリッド新株が、窒素源が存在する場合および無い場合の両方において発達するという、特有な予期されない特性を持つことが見出された。本発明においては、適切な窒素供給の欠如が、複数のスラウストキトリッド株における高脂質蓄積を引き起こしたことが見出された。これは、バイオマス、脂質およびＤＨＡの生成において、複数のスラウストキトリッド新株の使用に対する様々な方策を適応させることを可能にした。例えば、複数の窒素源による廃液の改善、接種物サイズの増大およびこれらの廃液への複数の選択された株の適応が、バイオマスおよび脂質生成を増やすべく適用された。さらに、新規なスラウストキトリッドのそのような特有の特性により、出願人は、バイオディーゼル用の高価値の複数のオメガ３脂肪酸および脂質を生成するために、スラウストキトリッドを用いて、複数のガス発酵工場の複数の廃液から複数の栄養物を隔離するための、２段階の連続発酵を有する特有且つ新規な方法を開発し、これに到達することが可能であった。
【００７０】
様々な有機および無機の窒素源は、限定されるものではないが、コーンスティープリカー、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび尿素を含む。前述の複数の窒素源が、廃液媒体中に加えられた。従って、一態様において本発明は、複数のスラウストキトリッド新株が、廃液とともに窒素源を有する媒体中で成長された場合に、複数のスラウストキトリッド新株のより高い成長をもたらしたことを提供する。従って、本発明の別の態様においては、媒体中への硝酸ナトリウムの添加が、全ての株中での脂質含有量および脂質生産性における著しい向上をもたらすことが見出された。興味深いことに、窒素源の添加により、バイオマス濃度における２から３倍の増大が見出された［（図５）および（表２）］。例えば、廃液媒体中に硝酸ナトリウムが添加された株ＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）において、２から３倍のバイオマス濃度の増大があった。
【表２】
0006258983.tif 000004
【００７１】
本発明のさらなる態様は、複数の廃液からの複数の栄養物の除去を増大させ、プロセスの生産性を高めるべく、より大きな接種物サイズ、例えば５％、１０％、１５％、２０％（ｖ／ｖ）が使用されたことを提供する。接種物サイズの増大はバイオマス生成の著しい増大をもたらした。報告された最大値は、２０％ｖ／ｖ接種物サイズによって、ほぼ９ｇ／Ｌであった（図６）。全ての栄養物（複数の有機酸およびアルコール）が、流れから完全に除去された。
【００７２】
本発明の別の態様においては、複数の新株によって複数の廃液を処理するのに、海塩または（海水のような）その同等物を加える必要が要求されないことが見出された。これら複数の株は、流れの中に海塩またはその同等物を添加することなく、活発に成長することが可能であり、ほぼ等しいバイオマスと脂質含有量を生成した。このことは、複数のスチール製発酵槽の腐食を回避するのみでなく、その他複数の非塩化物系ナトリウム塩で海塩を置換することに関連した余分なコストもまた回避するであろうから、これはプロセスの著しい向上であった。これはまた、媒体中への海塩の添加を回避することは廃液流の塩分を増大させないであろうという事実を強調するものであり、従って、この流れの水はガス発酵用にリサイクルされた。
【００７３】
別の態様において本発明は、栄養物隔離速度およびプロセスの生産性を低下させずに、例えば９または９．５までのｐＨの増大を許容することが可能であった複数のスラウストキトリッド新株を提供する。従って、複数の株を培養する間にｐＨをバランスする必要性を低減する。これはさらに、複数の廃液の処理に関連したコストを低減するであろう。
【００７４】
別の態様において本発明はまた、脂質蓄積段階において、繊細な複数の細胞に対するせん断力による損傷を防ぐことのできる、複数の反応器インペラを有する反応器システムを提供する。従って、本発明の態様において、脂質蓄積段階の間に大規模な細胞溶解が観察された。従って、これを回避すべく、異なる種類のインペラ、例えばラシュトン、ピッチブレードまたは海洋インペラが使用された。ピッチブレードインペラの使用は、脂質蓄積段階の間の細胞溶解を大幅に低減することが観察された。従って、容器中に存在する活性な細胞の数を増加させた。これにより、複数の廃液流からの栄養物隔離はより速くなり、脂質およびＤＨＡのような複数の生成物の損失を防止した。
【００７５】
本発明の別の態様において、反応器はバッチモード、フェドバッチモード、半連続モードおよび連続モードで動作された。反応器を連続的にするべく、１つのチューブによって廃液が連続的に送り込まれた。これに対して培養物は、反応器中に設置された他のオーバーフローチューブから、同時に除去された。窒素源は、廃液流とともに連続的に、または間欠的に供給された。場合により廃液流は、窒素源の添加無しに供給された。
【００７６】
別の態様において、本発明はまた、反応器システムにおける別の特有な設計を提供する。そこでは、穴の開けられた複数のパイプスパージャーの代わりに、複数のマイクロスパージャーが反応器に取り付けられた。まとまっての移送速度、バイオマス、脂質およびＤＨＡ生産性を高めるべく、異なる種類のスパージャーおよびインペラの組み合わせが適用され、同時に、撹拌速度、せん断および電力消費を低下させた。ピッチブレードとの複数のマイクロスパージャーの組み合わせは、より速い栄養物隔離速度、より高いバイオマス生成速度をもたらした。複数のマイクロスパージャーとピッチブレードインペラとの組み合わせは、複数の廃液流からの栄養物隔離を、２グラム／リットル／日から１８グラム／リットル／日まで、３０グラム／リットル／日または５５グラム／リットル／日よりも多くまで改善した。これは、０．５グラム／リットル／日から４．８グラム／リットル／日まで、８グラム／リットル／日または４０グラム／リットル／日よりも多くまでの、より高いバイオマス生成をもたらした［図７ａ−ｂ］。
【００７７】
本発明の別の態様において、高密度培養の間、過剰な泡が生成された。これは、反応器中への消泡剤の連続的または間欠的な添加のいずれかにより制御された。場合により消泡剤は、成長およびバイオマス生成速度に対して負の影響を及ぼした。試験された消泡剤の大部分が、成長およびバイオマス生成に対して負の影響を与えることが見出された。
【００７８】
別の態様においては、複数のガス発酵工場から出てくる黒色の廃液が空気によって連続的にパージされて、その後反応器へと供給される廃液に対して黒色を与えている微量の硫化物を取り除いた。場合により、廃液流を空気でパージすることは、より高い栄養物隔離速度およびバイオマス生成速度をもたらした。これは、栄養物隔離における５５ｇ／Ｌ／ｄから９０ｇ／Ｌ／ｄ、またはそれ以上までのさらなる増大、およびバイオマス生成における４０ｇ／Ｌ／ｄから５５ｇ／Ｌ／ｄ、またはそれ以上までのさらなる増大をもたらした。しかしながら、バッチまたはフェドバッチと比較すると、脂質含有量は、乾燥バイオマスの５５％、または乾燥バイオマスの７０％またはそれ以上から、乾燥バイオマスの２０％、または３０％またはそれ以上までへと低下した（図８）。
【００７９】
本発明の別の態様においては、細胞の脂質含有量を増大させるべく、窒素源の供給が停止された。他方、他の場合においては、成長を支援するべく窒素源が連続的に供給された。窒素源の連続的な供給は低減された脂質生成をもたらしたが、より高い成長を生じた。成長とともに脂質生成を支援するべく、２つの反応器システムが構成された。１つの反応器は成長を促進するべく指定されたものであり、もう一方は細胞中の脂質蓄積用であった。第１反応器は、より高い溶存酸素を維持するべく高い通気速度に保たれ、他方、第２反応器は、低溶存酸素レベルに保たれる。
【００８０】
本発明の別の態様において、第１反応器から出てくる培養物は、窒素ストレス下での脂質生成を誘起すべく、第２反応器へと直接移送された。第１反応器には窒素源を含む廃液流が連続的に供給されたのに対し、他方、第２反応器には廃液流のみが供給された。第２反応器から出てくる培養物は、改善されたバイオマスおよび脂質生成を示した。バイオマスは８ｇ／Ｌ／ｄから３０ｇ／Ｌ／ｄ、または６５ｇ／Ｌ／ｄ、または９５ｇ／Ｌ／ｄ、または１００ｇ／Ｌ／ｄ、またはそれ以上まで増加した。他方、脂質含有量は乾燥バイオマスの２０％から乾燥バイオマスの４０％、または５０％、または６０％、または７０％、またはそれ以上まで増大した。ＤＨＡ生成もまた、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の２５％、または３０％、または３５％まで改善した（図９）。
【００８１】
本発明の別の態様においては、複数の細胞と培養液を連続的に分離して濃縮されたバイオマスを第２反応器へと移送し、細胞中の脂質蓄積を誘起すべく、２つの反応器の間にバイオマス分離システムが設置された。
【００８２】
本発明のさらに別の態様においては、第１反応器から出てくる培養ブロスがバイオマス分離システムに連続的に通された。バイオマス分離システムでは、複数の細胞が濃縮され、第２反応器へと移送される。第２反応器においては、低溶存酸素レベル下での細胞中の脂質蓄積を促進し、培養液から酸素を完全に枯渇させるべく、複数の細胞の滞留時間はより大きい。乾燥バイオマスは８ｇ／Ｌ／ｄから３０ｇ／Ｌ／ｄ、または６５ｇ／Ｌ／ｄ、または９５ｇ／Ｌ／ｄ、または１５０ｇ／Ｌ／ｄ、またはそれ以上まで増大した。他方、脂質含有量は、乾燥バイオマスの２０％から乾燥バイオマスの４０％、まはた５０％、または６０％、または８０％、またはそれ以上まで増大した。ＤＨＡ生成もまた、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の２５％、または３０％、または４５％、またはそれ以上まで改善した（図１０）。
【００８３】
本発明のさらに別の態様においては、複数のアルコール、特に廃液流中に存在するエタノールが、バイオマス中のＤＨＡ生成における増大を引き起こした。ＤＨＡ含有量は、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の２５％、または３０％、または４５％、またはそれ以上まで増大した。廃液流にエタノールをドープすることは、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の２５％、または３０％、または４５％、または５０％、またはそれ以上まで、バイオマス中のＤＨＡ生成におけるさらなる上昇をもたらした。
【００８４】
本発明のさらに別の態様において、第２反応器は、脂質の豊富なバイオマスの連続採取用のオーバーフローチューブとともに設置された。第２反応器から出てくる培養物は、バイオマスおよび培養液を分離すべく、第２バイオマス分離システムに連続的に通された。この培養液は完全に酸素が無かった。従って、この培養液は、完全にまたは部分的にリサイクルされてガス発酵処理用に戻された。
【００８５】
本発明のさらに別の態様においては、バイオマスから連続的に分離される培養液水が、リサイクルされてガス発酵処理用に戻された。従って、全体のプロセスに対して必要な水を大幅に低減した。場合により、培養液水は、そこから酸素を追い出すべく窒素によってパージされた（図１１）。
【００８６】
本発明のさらに別の態様においては、栄養物隔離速度、バイオマス、脂質およびＤＨＡ生産性を高めるべく、１または２または３またはそれより多くのスラウストキトリッドの新株が一緒に培養された。別の態様において本発明は、栄養物隔離速度、バイオマス、脂質およびＤＨＡ生産性を高めるべく、１または複数の新株を単独であるいは組み合わせて提供する。別の態様において本発明は、栄養物隔離速度、バイオマス、脂質およびＤＨＡ生産性を高めるべく、単一の株を提供する。別の態様において本発明は、栄養物隔離速度、バイオマス、脂質およびＤＨＡ生産性を高めるべく、２またはそれ以上の新株を単独であるいは組み合わせて提供する。
【００８７】
本発明の別の態様は、光栄養藻によって推進される従来の温室効果ガス隔離プロセスよりも大幅に高い速度で、複数の温室効果ガスから高価値の副産物を生成すべく、任意のガス発酵処理と同期するように開発されたプロセスを提供する。複数の有機酸／アルコール／糖が豊富なその他複数の供給源からの複数の廃液が、このプロセスを用いた栄養物隔離のために使用され得ることを当業者は理解する。
【００８８】
従って、本発明の主要な実施形態は、バイオディーゼル用の高価値の複数のオメガ３脂肪酸および脂質を生成するために、スラウストキトリッドを用いて、複数のガス発酵工場の複数の廃液から複数の栄養物を隔離するための２段階の連続発酵を含むプロセスを提供する。このプロセスは以下を有する。
（ａ）廃液流および窒素源を含む第１段階発酵反応器中にて複数のスラウストキトリッド株を培養すること。
（ｂ）段階（ａ）の複数のスラウストキトリッド株を、バイオマス採取システムを介して、廃液流のみを有する第２段階発酵反応器へと移送すること。
（ｃ）必要に応じて窒素が無い状態において、第２段階発酵反応器中にて段階（ｂ）のバイオマス培養物を培養すること。
（ｄ）バイオマスと液体培養液の分離、および複数のガス発酵工場への澄んだ培養液のリサイクル。
（ｅ）付加価値のある複数のオメガ３脂肪酸および脂質を得ること。
【００８９】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の廃液が複数の有機酸およびアルコールの混合物を含み、糖または炭水化物を含まないプロセスを提供する。
【００９０】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、選択される複数のスラウストキトリッド株がＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）であるプロセスを提供する。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の廃液が５ｇ／Ｌ−１００ｇ／Ｌまたはそれよりも高い濃度のアセテート、および、０．５ｇ／Ｌまたは５ｇ／Ｌまたはそれよりも高い濃度のアルコールを含むプロセスを提供する。
【００９２】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数のオメガ３脂肪酸がパルミチン酸、オレイン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）であったプロセスを提供する。
【００９３】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、段階（ｂ）において、第１発酵反応器からの培養物が第２発酵反応器へと直接移送されたプロセスを提供する。
【００９４】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第２発酵反応器の段階（ｃ）の培養物が、窒素が無い状態で培養されたプロセスを提供する。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素が無い状態において、バイオマスを８グラム／リットル／日から１５０グラム／リットル／日までの範囲内で増大させるプロセスを提供する。
【００９６】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素が無い状態において、バイオマスを８グラム／リットル／日から１００グラム／リットル／日までの範囲内で増大させるプロセスを提供する。
【００９７】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素が無い状態において、脂質含有量を２０％から９０％までの範囲内で第１段階発酵反応器から増大させるプロセスを提供する。
【００９８】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素が無い状態において、脂質含有量を２０％から７０％までの範囲内で第１段階発酵反応器から増大させるプロセスを提供する。
【００９９】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素が無い状態において、ＤＨＡ含有量を、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の５０％までの範囲内で第１段階発酵反応器から増大させるプロセスを提供する。
【０１００】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素が無い状態において、ＤＨＡ含有量を全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の３５％までの範囲内で第１段階発酵反応器から増大させるプロセスを提供する。
【０１０１】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、バイオマスと培養液とを分離すべく、第１段階発酵反応器からの培養物が、バイオマス分離反応器に連続的に通されたプロセスを提供する。
【０１０２】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、分離システムから得られた濃縮されたバイオマスが、第２段階発酵反応器へと連続的に移送されたプロセスを提供する。
【０１０３】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第１反応器から第２反応器へのバイオマスの直接の移送が、乾燥バイオマスを８グラム／リットル／日から２００グラム／リットル／日までの範囲内に増やすプロセスを提供する。
【０１０４】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第１反応器から第２反応器へのバイオマスの直接の移送が、乾燥バイオマスを８グラム／リットル／日から１５０グラム／リットル／日までの範囲内に増やすプロセスを提供する。
【０１０５】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第１反応器から第２反応器へのバイオマスの直接の移送が、脂質含有量を乾燥質量の２０％から乾燥質量の１００％までの範囲内に増やすプロセスを提供する。
【０１０６】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第１反応器から第２反応器へのバイオマスの直接の移送が、脂質含有量を乾燥質量の２０％から乾燥質量の８０％までの範囲内に増やすプロセスを提供する。
【０１０７】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第１反応器から第２反応器へのバイオマスの直接の移送が、ＤＨＡ含有量を全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の５０％までの範囲内に増やすプロセスを提供する。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、第１反応器から第２反応器へのバイオマスの直接の移送が、ＤＨＡ含有量を全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の４５％までの範囲内に増やすプロセスを提供する。
【０１０９】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、細胞中の脂質蓄積を刺激するべく、連続的な窒素ストレス条件を生成するために第２反応器が使用されたプロセスを提供する。
【０１１０】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、バイオマスと培養液水とを分離すべく、第２発酵反応器から出てくる培養物がバイオマス分離システムに連続的に通され、溶存酸素がゼロである水が、連続的にリサイクルされてガス発酵処理用に戻されたプロセスを提供する。
【０１１１】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、微量の硫化物を除去すべく、空気によって廃液が連続的にパージされたプロセスを提供する。
【０１１２】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、硫化物の除去が、栄養物隔離を５５グラム／リットル／日から９０グラム／リットル／日までの範囲内に増大させたプロセスを提供する。
【０１１３】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、硫化物の除去が、バイオマス生成を４０グラム／リットル／日から５５グラム／リットル／日までの範囲内に増大させたプロセスを提供する。
【０１１４】
本発明のさらに別の実施形態は、受託番号ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を有するスラウストキトリッドの複数の新株を提供する。
【０１１５】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、バイオディーゼルでの使用に向けた複数のオメガ３脂肪酸および脂質を生成することの可能な複数の新株を提供する。
【０１１６】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の株が、８グラム／リットル／日から１５０グラム／リットル／日までの範囲内の乾燥バイオマスを生成する、複数の新株を提供する。
【０１１７】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の株が、乾燥質量の２０％から乾燥質量の８０％までの範囲内の複数の脂質を生成する、複数の新株を提供する。
【０１１８】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の株が、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の４５％までの範囲内のＤＨＡ含有量を生成する、複数の新株を提供する。
【０１１９】
本発明のさらに別の実施形態は、バイオディーゼルでの使用に向けた複数のオメガ３脂肪酸および脂質を生成するための、受託番号ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を有するスラウストキトリッドの複数の新株の使用を提供する。
【０１２０】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載されるように、複数の新株が、複数の株中のバイオマスの１４％から５４．５％ｗ／ｗまでの範囲内の脂質含有量を生成することが可能なプロセスを提供する。
【０１２１】
別の実施形態において本発明は、アセテートを利用または低減して、６．５ｇ／Ｌのバイオマス、５４．５％の脂質および１５％のＤＨＡ含有量を産出することが可能なスラウストキトリッド株ＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を提供する。
【０１２２】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、バイオマス生成が１．５ｇ／Ｌから３．３ｇ／Ｌまでの範囲内であり、脂質含有量がバイオマスの２１％から５０％までの範囲内であり、ＤＨＡ含有量が全脂肪酸の１０％から３０％までの範囲内であるプロセスを提供する（図４）。
【０１２３】
本発明の別の実施形態は、受託番号ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を有する複数のスラウストキトリッド株を提供する。複数の株は、アセチルＣｏＡシンターゼ、リンゴ酸酵素、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、等の発現の数倍の増大を示す。
【０１２４】
本発明の別の実施形態は、受託番号ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を有する複数のスラウストキトリッド株を提供する。複数の株は、酢酸代謝に関連した複数の酵素の発現の数倍の増大を示す。酵素は、１または複数のアセチルＣｏＡシンターゼ、リンゴ酸酵素、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、等の群から選択されてよい。
【０１２５】
本発明の別の実施形態は、受託番号ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、およびＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）を有する複数のスラウストキトリッド株を提供する。複数の株は、１または複数のアセチルＣｏＡシンターゼ、リンゴ酸酵素、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、等の群から選択される複数の酵素の発現の数倍の増大を示す。これら複数の酵素の数倍の発現は、単独でもよいし、互いの組み合わせであってもよい。
【０１２６】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、高い安定性およびバイオマス生成、脂質含有量、ＴＦＡ含有量、および栄養物隔離のような複数の生産性パラメータの点で非常に効率的な複数の新株を提供する。
【０１２７】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、２ｇ／Ｌから６ｇ／Ｌ、好ましくは２．１−５．２ｇ／Ｌまでの範囲内でバイオマスを生成することの可能な複数の新株を提供する［表１ａ］。
【０１２８】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、２．１から３．１ｇ／ｌ、２．４から３．３ｇ／ｌ、３．９から５．２ｇ／ｌ、または／および２．５から３．４ｇ／ｌまでの範囲内でバイオマスを生成することの可能な複数の新株を提供する［表１ａ］。
【０１２９】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、１８％から６０％、好ましくは１８％−５５％までの範囲内で脂質含有量を生成することの可能な複数の新株を提供する［表１ｂ］。
【０１３０】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、１８％から２８％、２８％から３５％、４５％から５５％、または／および３５％から４６％までの範囲内で脂質含有量を生成することの可能な複数の新株を提供する［表１ｂ］。
【０１３１】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、バイオマス生成が２ｇ／Ｌから６ｇ／Ｌ、好ましくは２．１−５．２ｇ／Ｌまでの範囲内であるプロセスを提供する。
【０１３２】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、バイオマスが２．１から３．１ｇ／ｌ、２．４から３．３ｇ／ｌ、３．９から５．２ｇ／ｌ、または／および２．５から３．４ｇ／ｌまでの範囲内であるプロセスを提供する［表１ａ］。
【０１３３】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、脂質含有量が１８％から６０％、好ましくは１８％−５５％までの範囲内であるプロセスを提供する［表１ｂ］。
【０１３４】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、脂質含有量が１８％から２８％、２８％から３５％、４５％から５５％、または／および３５％から４６％までの範囲内であるプロセスを提供する［表１ｂ］。
【０１３５】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素源の添加によってバイオマスを２倍から３倍まで増やす複数の新株を提供する。
【０１３６】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素源の添加が、平均的な範囲で３−８ｇ／ｌバイオマスを増やす複数の新株を提供する［表２］。
【０１３７】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素源の添加が、３．３−５．５ｇ／ｌ、３．９−５．１ｇ／ｌ、５．１−６．４ｇ／ｌ、および／または６．１−７．３ｇ／ｌまでの範囲内でバイオマスを増やす複数の新株を提供する［表２］。
【０１３８】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、従来からある既知の自然に発生した窒素源、または既知の人工的な窒素源の任意のものから選択される窒素源を提供する。
【０１３９】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素源の添加によって、２倍から３倍のバイオマスの増大があるプロセスを提供する。
【０１４０】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素源の添加が、平均的な範囲で３−８ｇ／ｌバイオマスを増やすプロセスを提供する［表２］。
【０１４１】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書に記載されるように、窒素源の添加が、３．３−５．５ｇ／ｌ、３．９−５．１ｇ／ｌ、５．１−６．４ｇ／ｌ、および／または６．１−７．３ｇ／ｌまでの範囲内でバイオマスを増やすプロセスを提供する［表２］。
【０１４２】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、バイオマス生成が９ｇ／Ｌまで増大されるプロセスを提供する（図６）。
【０１４３】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、複数の株が９ｇ／Ｌまでバイオマスを生成することの可能な複数の新株を提供する（図６）。
【０１４４】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数のマイクロスパージャーとピッチブレードインペラとの組み合わせが、２グラム／リットル／日から５５グラム／リットル／日まで栄養物隔離を高めたプロセスを提供する。これは、０．５グラム／リットル／日から４０グラム／リットル／日までの範囲内のバイオマスの増大をもたらした［図７ａ−ｂ］。
【０１４５】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されるように、複数のマイクロスパージャーとピッチブレードインペラとの組み合わせが、２グラム／リットル／日から１８グラム／リットル／日まで、３０グラム／リットル／日または５５グラム／リットル／日までの範囲内で栄養物隔離を高めたプロセスを提供する。これは、０．５グラム／リットル／日から４．８グラム／リットル／日まで、８グラム／リットル／日または４０グラム／リットル／日よりも多くまでの範囲内でバイオマスの増大をもたらした［図７ａ−ｂ］。
【０１４６】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、複数の硫化物の除去が、栄養物隔離を５５グラム／リットル／日から９０グラム／リットル／日までの範囲内に増大させたプロセスを提供する。
【０１４７】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、複数の硫化物の除去が、バイオマス生成を、４０グラム／リットル／日から５５グラム／リットル／日までの範囲内に増大させたプロセスを提供する（図８）。
【０１４８】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、窒素の供給が第１反応器に対してのみであり、第２反応器中には窒素が無いことにより、８グラム／リットル／日から１５０グラム／リットル／日までの範囲内でバイオマスの増大をもたらしたプロセスを提供する（図９）。
【０１４９】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、窒素の供給が第１反応器に対してのみであり、第２反応器中には窒素が無いことにより、８グラム／リットル／日から３０グラム／リットル／日、または６５グラム／リットル／日、または９５グラム／リットル／日、または１００グラム／リットル／日までの範囲内でバイオマスの増大をもたらしたプロセスを提供する（図９）。
【０１５０】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、窒素の供給が第１反応器に対してのみであり、第２反応器中には窒素が無いことにより、乾燥バイオマスの２０％から乾燥バイオマスの９０％までの範囲内で脂質含有量の増大をもたらしたプロセスを提供する（図９）。
【０１５１】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、窒素の供給が第１反応器に対してのみであり、第２反応器中には窒素が無いことにより、乾燥バイオマスの２０％から乾燥バイオマスの４０％、または５０％、または６０％、または７０％、またはそれ以上までの範囲内で脂質含有量の増大をもたらしたプロセスを提供する（図９）。
【０１５２】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、窒素の供給が第１反応器に対してのみであり、第２反応器中には窒素が無いことにより、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の５０％までの範囲内でＤＨＡの増大をもたらしたプロセスを提供する（図９）。
【０１５３】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、窒素の供給が第１反応器に対してのみであり、第２反応器中には窒素が無いことにより、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の２５％、または３０％、または３５％までの範囲内でＤＨＡの増大をもたらしたプロセスを提供する（図９）。
【０１５４】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、第１反応器の細胞培養が濃縮であり、その後、第２反応器へと移送されたことにより、８グラム／リットル／日から２００グラム／リットル／日までの範囲内で乾燥バイオマスを増大させたプロセスを提供する（図１０）。
【０１５５】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、第１反応器の細胞培養が濃縮であり、その後、第２反応器へと移送されたことにより、８グラム／リットル／日から３０グラム／リットル／日、または６５グラム／リットル／日、または９５グラム／リットル／日、または１５０グラム／リットル／日までの範囲内で乾燥バイオマスを増大させたプロセスを提供する（図１０）。
【０１５６】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、第１反応器の細胞培養が濃縮であり、その後、第２反応器へと移送されたことにより、乾燥バイオマスの２０％から乾燥バイオマスの１００％までの範囲内で脂質含有量を増大させたプロセスを提供する（図１０）。
【０１５７】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、第１反応器の細胞培養が濃縮であり、その後、第２反応器へと移送されたことにより、乾燥バイオマスの２０％から乾燥バイオマスの４０％、または５０％、または６０％、または８０％、またはそれ以上までの範囲内で脂質含有量を増大させたプロセスを提供する（図１０）。
【０１５８】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、第１反応器の細胞培養が濃縮であり、その後、第２反応器へと移送されたことにより、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の５０％までの範囲内でＤＨＡ生成を増大させたプロセスを提供する（図１０）。
【０１５９】
別の実施形態において本発明は、本明細書に記載されるように、第１反応器の細胞培養が濃縮であり、その後、第２反応器へと移送されたことにより、全脂肪酸の１５％から全脂肪酸の２５％、または３０％、または４５％、またはそれ以上までの範囲内でＤＨＡ生成を増大させたプロセスを提供する（図１０）。
【０１６０】
以下の記載は、単なる複数の例示的な実施形態であり、いかなる態様でも、本発明に対する範囲、適用性、または構成を制限することは意図されない。むしろ以下の記載は、本発明の複数の例示的な実施形態を実行するための便利な説明を提供するものである。記載される複数の実施形態に対する様々な変更が、本発明の範囲から逸脱することなく、記載される複数の要素の複数の機能および配置内で成されてよい。
【０１６１】
例
例１：インドの海洋生物多様性からのスラウストキトリッドの単離
多数のサンプル（土壌、水、分解された葉、等）が、２０１３年の３月に、Mandovi-Zuariマングローブにわたるリバンダーのマングローブエリアにおいて、３０−３５ｋｍに及ぶインドの海洋の複数の場所から集められた（収集座標：S15°29'57.39''，E73°52'6.13''、パンジム、ゴア州）。収集場所の地理的位置、ｐＨ、温度および湿度のような複数の物理的パラメータが、ＧＰＳ、ｐＨメータ、温度計および検湿器によってそれぞれ記録された。それぞれのファルコンに１００μｌの選択的抗生物質混合物が加えられた。複数のサンプルはドライアイスパック中で保管され、処理のために、天然の海水とともに２４時間以内に実験室へと移された。単離のために、直接平板法（direct plating method）または釣り餌法（baiting method）の２つのプロトコルに従った。複数の寒天プレート上に播種する前に、滅菌海水によって、複数の土壌サンプルが１０００倍に希釈された。または、複数の葉のサンプルが洗浄された。複数の水サンプルが複数の寒天プレート上に直接播種された。これら複数の寒天プレートに選択的抗生物質混合物が補給された。全てのサンプルが、滅菌したマツ花粉またはその他の選択された材料（２５−３０ｍｇ）によって餌を与えられ、２５℃において８−１０日間、複数の花粉の外縁にコロニー形成が現れるまで、インキュベートされた。コロニー形成は、５日後以降、毎日、光学顕微鏡下で確認された。ひとたび複数の花粉がコロニーを形成すると、１００μｌの水がファルコンの表面から注意深く採取され、抗生物質を含む複数の寒天プレート上に播種された。これら複数のプレート用の媒体は、グルコース（１０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１ｇ／Ｌ）、ペプトン（１ｇ／Ｌ）、寒天培地（１０ｇ／Ｌ）、濾過された天然の海水（１００％ｖ／ｖ）、および抗生物質混合物を含んでいた。これら複数のプレートは、２５℃において７−１０日間インキュベートされた。複数のプレート上に現れた複数のコロニーが、形態学的調査のため、顕微鏡（４０倍）下で観察された。スラウストキトリッド様の複数のコロニーが採取され、さらに、７０％の天然の海水とともに上記の媒体組成を有する複数の寒天プレート上に筋状にされた。スラウストキトリッド様の複数の株が、選択された抗生物質混合物を有する複数の寒天プレート上にて３−４回筋状にされた後に精製された。スラウストキトリッドの迅速な同定のためには、複数のオメガ３脂肪酸、特にＤＨＡの存在が重要な複数のパラメータのうちの１つである（図１）。従って、既知の複数の方法を採用することにより、全ての株のバイオマスからの脂質が抽出され、複数の脂肪酸メチルエステルに変換された。これら複数のＦＡＭＥが、ＧＣ−ＦＩＤにより、特にＤＨＡの存在に関して分析された。
【０１６２】
例２：単離された複数のスラウストキトリッド株の分子特性評価
複数の株の遺伝子同定のために、５日経過した培養物１ｍｌが採取され、DNeasy blood and tissue kit（Qiagen、米国）に記載される複数のガイドラインに従ってゲノムＤＮＡが抽出された。複数のプライマーＴ１８Ｓ１Ｆ  ５'−ＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＡ−３'およびＴ１８Ｓ５Ｒ  ５'−ＴＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣ−３'（Honda et al. 1999）を用いた１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅のために、ゲノムＤＮＡが使用された。１２．５μＬのPCR master mix（Applied Biosystem、米国）、それぞれ０．５μＬのプライマー（Ｔ１８Ｓ１Ｆ、Ｔ１８Ｓ５Ｒ）、１μＬのゲノムＤＮＡ、１０．５μＬのmilliQ waterを有する、２５μＬのＰＣＲ反応が設定された。ＰＣＲプログラムは、３０サイクルにわたる、９４℃における３分間の初期変性（initial denaturation）、９４℃における４５秒間の最終変性（final denaturation）、６４℃における３０秒間のアニーリング（annealing）、７２℃における２分間の伸張（extension）、７２℃における１０分間の（最終伸張（final extension））を含んでいた。QiAquick gel extraction kit（Qiagen、米国）を用いて、１％のアガロース・ゲルからＰＣＲ生成物が精製された。ＰＣＲ生成物および複数のプライマーの混合物は、配列決定のためにMacrogen （韓国）へと送られた。得られた１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、basic local alignment search tool（ＢＬＡＳＴ）を用いて、ＮＣＢＩ遺伝子バンクデータベース中の既知の複数のスラウストキトリッド１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列と比較された。ＭＥＧＡ６ソフトウェアを用いて系統発生樹（ＮＪ樹）を構築すべく、複数の株の配列が、スラウストキトリッドのその他複数の既知の配列とともに使用された（図２）。得られた複数の配列は、（受託番号ＫＦ６６８６２４、ＫＦ６６８６２７、ＫＦ６６８６２９、ＫＦ６６８６３２として）ＮＣＢＩデータベースに供託された。複数の株、すなわち、ＭＴＣＣ５８９０（ＤＢＴＩＯＣ−１）、ＭＴＣＣ５８９５（ＤＢＴＩＯＣ−６）、ＭＴＣＣ５８９３（ＤＢＴＩＯＣ−１４）、ＭＴＣＣ５８９６（ＤＢＴＩＯＣ−１８）が、インドのChandigarhにある Institute of Microbial Technology (IMTECH)のMicrobial Type Culture Collection and Gene Bank (MTCC)に供託された。
【０１６３】
例３：酢酸利用および酢酸耐性に対する能力についての複数のスラウストキトリッド株のスクリーニング
５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌのような異なる濃度のアセテートが、唯一の炭素源として、または、他の複数の炭素源と混合されて、栄養物の豊富な媒体中に加えられた。酢酸のｐＨは、水酸化ナトリウムによって７まで上げられ、続いて１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／Ｌのペプトンが添加された。海水の５０％の強度を模倣すべく、１８ｇ／Ｌの人工的な海塩が媒体中に加えられた。残留アセテートがＨＰＬＣによって測定された。振とうフラスコ培養では、最大酢酸利用は１５ｇ／Ｌを越えないことが見出された。しかしながら、より高い濃度のアセテートに対する株の耐性が、５０ｇ／Ｌまたは１００ｇ／Ｌまで試験された。株ＤＢＴＩＯＣ−１８（ＭＴＣＣ５８９６）は、他の複数の株と比較して、媒体中のアセテートの量に関係なく、炭素源としてのアセテートに対して、より良好に機能した（図３）。
【０１６４】
例４：複数の廃液からの栄養物隔離に対する複数のスラウストキトリッド株のスクリーニング
この発明において使用される複数の廃液は、複数の温室効果ガスのガス発酵から排出されたもの、またはリグノセルロース系バイオマスの脱アセチル化、またはリグノセルロース系バイオマスの熱分解、または原油の精製、等から排出されたものであった。これら複数の廃液の化学組成は、エタノールのような他の複数の酸およびアルコール（０．５ｇ／Ｌ、または２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、またはそれ以上）とともに、流れ中では複数の有機酸（特に酢酸、プロピオン酸、酪酸）が支配的に存在することを明らかにした。この流れは、複数の窒素源を含めてあらゆる付加的な栄養源無しに、そのままで、１２１℃にて２０分間、加圧滅菌処理された。５日後、２５０ｍｌフラスコ中に５０ｍｌの培養物が採取され、バイオマスが一晩乾燥された。複数の脂質が抽出され、所与の方法によって複数のＦＡＭＥが分析された。複数の対照菌株においては、低速の栄養物隔離により、バイオマスは０．１７ｇ／Ｌから０．６１ｇ／Ｌまでにわたっていた（図４）。複数の廃液流からの栄養物隔離速度を増大させるべく、複数の廃液流への複数の株の適応、複数の窒素源の添加およびより大きな接種物サイズのような、異なる複数の方策が適用された。
【０１６５】
適応のため、より長期間、例えば１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月、あるいはいくつかの場合には６ヶ月にわたって、複数の廃液で複数の株が培養された。複数の廃液流中でひとたび複数の栄養物が完全に消費されると、複数の培養物は新たな流れに移された。培養物を移すことは、１０回、または２０回、３０回、あるいはいくつかの場合は１００回繰り返された。これは、複数の株が、これら複数の流れからの複数の栄養物を選択的に利用し、複数の廃液に徐々に適応することを可能にし、より高いバイオマス生成をもたらした（図４）。さらに、複数の新株に対する窒素源の効果もまた調べられ、廃液流への窒素源の添加が、栄養物隔離およびバイオマス生成を大幅に増大させた。バイオマスおよび複数の脂質の分析は、複数の新株が、高バイオマスおよび複数の脂質生成において効率的であることを示した（図５）。あらゆる窒素源の補給無く、栄養物媒体として複数の廃液流を用いて栄養物隔離およびバイオマス生成を増大させることに対し、異なる接種物サイズ、すなわち５％、１０％、１５％、および２０％の添加もまた役立った（図６）。
【０１６６】
例５：選択された株をバイオリアクター中の廃液で培養するための異なる複数の連続的培養方法
スラウストキトリッドの複数の選択された株の接種物が、３０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／Ｌのペプトン、および１８ｇ／Ｌの海塩を有するＹＰＤ媒体中で調製され、２５℃、１５０ｒｐｍにおいてインキュベートされた。窒素源を有する複数の廃液によって半分が満たされている２Ｌまたは７Ｌまたは１４Ｌの複数の反応器中に、４８時間経過した接種物の１０％が加えられた。培養物は、通常の穴の空けられた複数のパイプスパージャーまたは複数のマイクロスパージャーまたはその他の種類の複数のマイクロスパージャーによって通気された。他方、培養物は、ラシュトンまたはピッチブレードまたは海洋インペラ、あるいはその他複数のインペラによって、１００ｒｐｍ、または２００ｒｐｍ、または３００ｒｐｍ、またはそれ以上で撹拌された。溶存酸素は、空気および酸素供給の組み合わせによって、１０％、または２０％、または３０％、または５０％、またはそれ以上に維持された。栄養物隔離、バイオマス生成、脂質含有量およびＤＨＡ生成を決定すべく、８から１２時間の間隔で定期的にサンプルが取られた。複数の廃液からの栄養物隔離測定用のマーカとして、アセテート消費測定が使用された。反応器のｐＨは、酸と塩基によって７に維持された。フェドバッチ培養においては、複数の有機酸およびアルコールによって増補された複数の廃液が、培養物に対して直接供給された。
【０１６７】
連続モードの培養において、２つのチューブが反応器中に設置された。一方のチューブは窒素源有りまたは無しでの廃液の連続添加用であり、他方、オーバーフローチューブは培養物の連続採取用に設置された（図７）。
【０１６８】
２段階反応器システムにおいて、第１反応器から出てくる培養液が第２反応器へと直接送り込まれる。第１反応器は、窒素と高い通気が連続的に供給されていたのに対し、他方第２反応器は、いかなる窒素源も供給されず、非常に少ない溶存酸素が供給された。このシステムは、脂質含有量、特にＤＨＡを何倍も増大させるのに役立った。
【０１６９】
バイオマス分離システムを有する２段階反応器システムにおいて、第１および第２反応器の間にバイオマス採取システムが設置される。そして、液体培養液からバイオマスを分離すべく、第２反応器の後に別のものが設置される。第１反応器から出てくる培養液はバイオマス採取システムへと進み、ここでバイオマスが濃縮され、第２反応器へと送り込まれる。第２反応器から出てくる肥大した複数の細胞が別のバイオマス分離システムへと連続的に移送され、そこで液体培養液からバイオマスが分離される。この澄んだ液体培養液が窒素によって連続的にパージされ、複数のガス発酵反応器へと供給されて戻される（図１１）。
【０１７０】
例６：脂質抽出および脂肪酸分析
画定された量の乾燥されたバイオマスが脂質抽出用に取られ、修正されたＢｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法によって脂質が抽出された。（図３および４）。ＦＡＭＥ分析用に、乾燥された脂質抽出物に、５００μｌのトルエン、続いて１００μｌの内部標準（トリコサン酸メチル  Ｃ１９：０）および１００μｌのブチル化されたヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）が加えられた。酸性メタノール（４００μｌ）がチューブに加えられ、１０−１２時間にわたって５０℃に保たれた。１ｍｌの５％ＮａＣｌが加えられ、続いて１ｍｌのヘキサンが添加され、上層が新たなチューブに移された。１ｍｌの２％重炭酸カリウムによって複数のＦＡＭＥが洗浄され、これを無水硫酸ナトリウムに通すことによって水分が除去された。複数のＦＡＭＥは、窒素下で濃縮され、高速ＧＣキャピラリカラム（Omegawax100、１５ｍ×０．１ｍｍ、厚さ０．１μｍ）が備えられたＧＣ−ＦＩＤシステム（Perkin Elmer clarus680、米国）によって分析された。１μｌのＦＡＭＥが、注入器温度２５０℃で注入された。オーブンの温度は、初期の１４０℃から、４０℃／秒の上昇速度で最終的に２８０℃まで上げられ始め、２分間保持された。検出器は２６０℃に設定された。速度５０ｃｍ・ｓｅｃ−１を有するキャリアガスとして水素が使用された。Totalchromeクロマトグラフィソフトウェア（Perkin Elmer、米国）により、複数の脂肪酸ピークが同定され、定量化された。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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