(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されるＢ．ズブチリス（B. subtilis）リボソームプロモーターを含む単離された核酸であって、
前記Ｂ．ズブチリスリボソームプロモーターがｒｐｓＪリボソームタンパク質プロモーターであり、そして、前記対象のタンパク質が酵素である、単離された核酸。
【請求項２】
前記ｒｐｓＪリボソームタンパク質プロモーターが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記対象のタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、カルボヒドラーゼ、加水分解酵素、エステラーゼ、オキシダーゼ、パーミアーゼ、プルラナーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼからなる群から選択される酵素である、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記対象のタンパク質がプロテアーゼである、請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記プロテアーゼがスブチリシンである、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記プロテアーゼが配列番号９、１１、１８又は２０によりコードされる、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
請求項１の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
対象のタンパク質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が前記ｒｐｓＪリボソームタンパク質プロモーターに操作可能に連結される、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記対象のタンパク質が酵素である、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記対象のタンパク質がプロテアーゼである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記プロテアーゼが配列番号９、１１、１８又は２０によりコードされる、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸を含む微生物。
【請求項１３】
前記微生物がバチルス（Bacillus）属に属する、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
前記核酸が前記微生物の細胞の染色体に組み込まれている、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
前記タンパク質の産生のために前記微生物にとって好適な条件下で、請求項１２に記載の微生物を培養することを含む、対象のタンパク質の産生のための方法。
【請求項１６】
前記微生物がバチルス（Bacillus）属に属する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステロサーモフィラス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィラス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．シルクランス（B. circulans）、Ｂ．ラウタス（B. lautus）、及びＢ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸が前記微生物の細胞の染色体に組み込まれている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象のタンパク質がプロテアーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロテアーゼが配列番号９、１１、１８又は２０によりコードされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の核酸で微生物を形質転換する工程であって、前記核酸が単一の組み込み体として前記微生物の細胞に組み込まれる工程と、
前記微生物が前記タンパク質を産生するために好適な条件下で前記微生物を培養する工程を含む、
発現構築物の増幅をせずに対象のタンパク質を産生する方法。
【請求項２２】
請求項７に記載のベクターで微生物を形質転換する工程であって、前記ベクターが単一の組み込み体として前記微生物の細胞に組み込まれる工程と、
前記微生物が前記タンパク質を産生するために好適な条件下で前記微生物を培養する工程を含む、
発現構築物の増幅をせずに対象のタンパク質を産生する方法。
【請求項２３】
前記微生物が抗生物質マーカーを含まない、請求項２１又は２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権）
本出願は、２０１１年１２月９日出願の米国特許仮出願第６１／５６９，２０２号及び２０１１年１２月１９日出願の米国特許仮出願第６１／５７７，４９１号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願はいずれもその全容にわたって本出願に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、微生物におけるタンパク質産生に関する。具体的には、本発明は、微生物における改善された発現系の方法及び組成物を提供する。特定の実施形態では、方法及び組成物は、バチルス（Bacillus）種微生物由来のリボソームプロモーターを含む。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子工学は、産業バイオリアクター又は細胞ファクトリーとして使用される微生物の改善を可能にした。例えば、バチルス（Bacillus）種は、多数の有用なタンパク質及び代謝産物を産生及び分泌する。産業で使用されている最も一般的なバチルス（Bacillus）種は、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、及びＢ．ズブチリス（B. subtilis）である。ＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）のステータスを有するため、これらのバチルス（Bacillus）種の株は、食品及び製薬産業で利用されるタンパク質の生産のための当然の候補である。重要な産生酵素としては、α−アミラーゼ、中性プロテアーゼ、及びアルカリ（又はセリン）プロテアーゼが挙げられる。しかし、バチルス（Bacillus）宿主細胞中でのタンパク質の産生の理解が進歩しているにもかかわらず、微生物によるこれらのタンパク質の発現及び産生を向上させる方法の必要性が依然として存在する。
【０００４】
遺伝子によってコードされる産物の組換え生産は、所望の産物をコードする核酸がプロモーターの発現制御下に置かれている宿主細胞での使用に適した発現ベクターを構築することによって達成される。発現ベクターは、形質転換などの様々な技術によって宿主細胞に導入され、次いで、発現ベクターに含まれているプロモーターの機能に必要な適切な条件の下でその形質転換された宿主細胞を培養することによって、所望の産物の生産が達成される。多くのプロモーターが当該技術分野において周知であるが、異種遺伝子の発現及びコーディング配列を向上させる新しいプロモーターが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、目的のタンパク質をコードする核酸の生産のための新規プロモーター、発現ベクター、微生物、及び方法を提供する。具体的には、本発明は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のリボソームプロモーターを含む目的のタンパク質をコードする核酸の生産のための新規プロモーター、発現ベクター、微生物、及び方法を提供する。リボソームプロモーターとしては、例えば、リボソームＲＮＡプロモーター及びリボソームタンパク質プロモーターが挙げられる。
【０００６】
一実施形態では、本発明は、目的のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されるＢ．ズブチリス（B. subtilis）のリボソームプロモーターを含む核酸を提供する。特定の実施形態では、本発明は、目的のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されるＢ．ズブチリス（B. subtilis）のリボソームＲＮＡプロモーターを含む核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、目的のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されるＢ．ズブチリス（B. subtilis）のリボソームタンパク質プロモーターを含む核酸を提供する。
【０００７】
別の実施形態では、本発明は、目的のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されるＢ．ズブチリス（B. subtilis）のリボソームプロモーターを含む核酸を含む発現ベクターを提供する。一実施形態では、発現ベクターは、目的のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されるＢ．ズブチリス（B. subtilis）のリボソームＲＮＡプロモーターを含む核酸を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、目的のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結されるＢ．ズブチリス（B. subtilis）のリボソームタンパク質プロモーターを含む核酸を含む。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）のリボソームプロモーターを含む核酸を含む微生物を提供する。一実施形態では、本発明は、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）のリボソームプロモーターを含む核酸を含むグラム陽性菌を提供する。一実施形態では、リボソームプロモーターはリボソームＲＮＡプロモーターである。別の実施形態では、リボソームプロモーターはリボソームタンパク質プロモーターである。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質を産生するために微生物に適した条件下でＢ．ズブチリス（B. subtilis）のリボソームプロモーターを含む核酸を含む微生物を培養する工程を含む、目的のタンパク質を産生する方法を提供する。一実施形態では、リボソームプロモーターはリボソームＲＮＡプロモーターである。別の実施形態では、リボソームプロモーターは、リボソームタンパク質プロモーターである。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、発現構築物の増幅をせずに目的のタンパク質を産生するための方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、核酸又はベクターが単一の組み込み体として宿主細胞に組み込まれる、リボソームプロモーターを含む核酸又はベクターで微生物を形質転換する工程と、微生物がタンパク質を産生するために適した条件下で微生物を培養する工程を含む。一実施形態では、リボソームプロモーターはリボソームＲＮＡプロモーターである。別の実施形態では、リボソームプロモーターは、リボソームタンパク質プロモーターである。
【００１１】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸又はベクターを、抗生物質マーカーを必要とせずにそれが宿主細胞に組み込まれるように宿主細胞に導入することにより目的のタンパク質を産生する方法を提供する。
【００１２】
本明細書に記載の特定の実施形態では、リボソームＲＮＡプロモーターは、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）由来のｒｎｎプロモーターである。いくつかの実施形態では、ｒｎｎプロモーターは、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）からのｒｒｎＢ、ｒｒｎＩ、又はｒｒｎＥリボソームＲＮＡプロモーターである。特定の実施形態では、リボソームＲＮＡプロモーターは、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）からのＰ２  ｒｒｎＩリボソームＲＮＡプロモーターである。
【００１３】
他の実施形態では、リボソームＲＮＡプロモーターは、配列番号１〜６のいずれか１つのヌクレオチド配列、プロモーター活性を保持する配列番号１〜６のいずれか１つの部分配列、配列番号１〜６のいずれか１つに少なくとも６０％相同な核酸、又は配列番号１〜６のいずれか１つ若しくはプロモーター活性を保持するその部分配列とともに中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を含む。特定の実施形態では、リボソームＲＮＡプロモーターは、配列番号３のヌクレオチド配列又はプロモーター活性を保持するその部分配列を含む。他の実施形態では、上記プロモーターのいずれかの組み合わせが使用される場合がある。例えば、ｒｒｎＩ、ｒｒｎＢ、及びｒｒｎＥプロモーターのＰ１、Ｐ２、又はＰ３プロモーターの１つ以上をいっしょに用いることができる。
【００１４】
本明細書に記載の他の実施形態では、リボソームタンパク質プロモーターはＢ．ズブチリス（B. subtilis）由来である。いくつかの実施形態では、リボソームタンパク質プロモーターはＢ．ズブチリス（B. subtilis）からのｒｐｓＤ又はｒｐｓＪリボソームタンパク質プロモーターである。
【００１５】
別の実施形態では、リボソームタンパク質プロモーターは、配列番号１３〜１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、プロモーター活性を保持する配列番号１３〜１４のいずれか１つの部分配列、配列番号１３〜１４のいずれか１つに少なくとも６０％相同な核酸、又は配列番号１３〜１４のいずれか１つ若しくはプロモーター活性を保持するその部分配列と中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を、含む。他の実施形態では、上記プロモーターのいずれかの組み合わせが使用される場合がある。例えば、ｒｐｓＤ又はｒｐｓＪプロモーターの１つ以上のプロモーターをいっしょに使用できる。他の実施形態では、リボソームタンパク質プロモーターは、配列番号１３〜１４のいずれか１つ又はプロモーター活性を保持するその部分配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、又は９９％相同な核酸を含む。
【００１６】
本明細書に記載のリボソームプロモーターは、目的のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結され得る。一実施形態では、目的のタンパク質は、ホルモン、酵素、成長因子、レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）、及びサイトカインからなる群から選択される。別の実施態様において、目的のタンパク質は酵素である。本発明で使用される酵素は、例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、カルボヒドラーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、オキシダーゼ、パーミアーゼ、プルラナーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼであり得る。特定の実施態様において、目的のタンパク質はプロテアーゼである。別の特定の実施形態では、目的のタンパク質はスブチリシンである。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、配列番号９、１１、１８又は２０によってコードされる。
【００１７】
目的のタンパク質は、それが発現される微生物に対して異種又は相同である場合がある。特定の実施形態では、目的のタンパク質をコードする核酸を発現するために使用される核酸、ベクター、又は発現構築物は、宿主細胞に組み込まれる。特定の実施形態では、目的のタンパク質をコードする核酸を発現するために使用される核酸、ベクター、又は発現構築物は、宿主細胞に組み込まれる。目的のタンパク質をコードする核酸を発現するために使用される核酸、ベクター、又は発現構築物は、宿主細胞内で増幅することができるか、又は、単一のコピーとして維持され得る。
【００１８】
リボソームプロモーターから発現することができる任意の細菌又は真菌微生物は、本明細書中で宿主細胞として使用され得る。特定の実施形態において、微生物はグラム陽性微生物である。いくつかの実施形態では、微生物はバチルス（Bacillus）属に属する。本発明において有用なバチルス（Bacillus）細胞の例としては、例えば、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモ（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィラス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ・コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ラウタス（B. lautus）、及びＢ・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。他の実施形態では、微生物は、大腸菌、シュードモナス属（例えば、Ｐ．アエルギノア及びＰ．アルカリジェネス）、又はストレプトマイセス属（例えばストレプトマイセスリビダンス）である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本研究で使用されるバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のｒｒｎオペロンの組織を示す。標的遺伝子へのプロモーターの融合により構築される異なる株を表１〜２に記載した。
【図２】ｒｒｎＡ、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＩ、ｒｒｎＤ、ｒｒｎＥ、ｒｒｎＪ、及びｒｒｎＯからのＰ１プロモーターとのｒｒｎＥ  Ｐ２のアライメントを示す。図２はまた、各プロモーターの−３５及び−１０の領域、並びに各プロモーターの−３５配列の上流の、各プロモーターの上流「ＵＰ」要素を示す。
【図３】ｒｒｎＡ、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＩ、ｒｒｎＷ、ｒｒｎＨ、ｒｒｎＧ、ｒｒｎＤ、ｒｒｎＪ、及びｒｒｎＯからのＰ２プロモーターとｒｒｎＥ  Ｐ３プロモーターのアラインメントを示す。図３はまた、各プロモーターの−３５及び−１０の領域、並びに各プロモーターの−３５配列の上流の、各プロモーターの上流「ＵＰ」要素を示す。
【図４】様々なＰａｐｒｅ、ＰｒｒｎＩ、ＰｒｒｎＥ又はＰｒｒｎＢプロモーターからＧＦＰを発現する株に関する細胞密度測定値を示すグラフである。
【図５】株ＢＧ８０００においてＰａｐｒｅ及びＰｒｒｎＩプロモーターからＦＮＡを発現する株に関する細胞密度測定値を示すグラフである。
【図６】株ＢＧ８０１０においてＰａｐｒｅ、ＰｒｒｎＩ、ＰｒｒｎＥ、及びＰｒｒｎＢプロモーターからＦＮＡを発現する株に関する細胞密度測定値を示すグラフである。
【図７Ａ】株ＢＧ８０００及びＢＧ８０１０においてＰａｐｒＥ及びＰｒｒｎＩプロモーターからＥＲ１１を発現する株に関する細胞密度測定値を示すグラフである。
【図７Ｂ】株ＢＧ８０００及びＢＧ８０１０においてＰａｐｒＥ及びＰｒｒｎＩプロモーターからＥＲ１１を発現する株に関する細胞密度測定値を示すグラフである。
【図８】ＰａｐｒＥ、ＰｒｒｎＩ、ＰｒｒｎＥ、及びＰｒｒｎＢからのＧＦＰの発現を示すグラフである。
【図９】ＰａｐｒＥ及びＰｒｒｎＩプロモーターからのＦＮＡ発現を示すグラフである。
【図１０】ＰａｐｒＥ、ＰｒｒｎＩ、ＰｒｒｎＥ、及びＰｒｒｎＢプロモーターからのＦＮＡ発現を示すグラフである。
【図１１】ＰａｐｒＥ及びＰｒｒｎＩプロモーターからのＥＲ１１発現を示すグラフである。
【図１２】ＰａｐｒＥ及びＰｒｒｎＩプロモーターからＦＮＡを発現する株の細胞密度測定値を示すグラフである。
【図１３】ＰａｐｒＥ及びＰｒｒｎＩプロモーターからＦＮＡを発現する株を示すグラフである。
【図１４】ＰａｐｒＥ及びＰｒｒｎＩプロモーター構築物の単一コピー組み込み体からのＦＮＡ発現の細胞密度測定値を示すグラフである。
【図１５】ＰａｐｒＥ及びＰｒｒｎＩプロモーター構築物の単一コピー組み込み体からのＦＮＡ発現を示すグラフである。
【図１６】様々なＰａｐｒｅ、ＰｒｐｓＪ、及びＰｒｐｓＤプロモーターからＧＦＰを発現する株に関する細胞密度測定値を示すグラフである。
【図１７】株ＢＧ８０１０においてＰａｐｒｅ、ＰｒｐｓＤ、及びＰｒｐｓＪプロモーターからＦＮＡを発現する株に関する細胞密度測定値を示すグラフである。
【図１８】Ｐａｐｒｅ、ＰｒｐｓＤ、及びＰｒｐｓＪプロモーターからのＧＦＰ発現を示すグラフである。
【図１９】Ｐａｐｒｅ、ＰｒｐｓＤ、及びＰｒｐｓＪプロモーターからのＦＮＡ発現を示すグラフである。
【図２０】ＰａｐｒＥ及びＰｒｐｏＤプロモーターからＦＮＡを発現する株の細胞密度測定値を示すグラフである。
【図２１】ＰａｐｒＥ及びＰｒｐｏＤプロモーターからＦＮＡを発現する株を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、微生物における発現系の改善された方法及び組成物を提供する。特定の実施形態では、本方法及び組成物は、バチルス（Bacillus）種微生物由来のリボソームプロモーターを含む。リボソームプロモーターとしては、例えば、リボソームＲＮＡプロモーター及びリボソームタンパク質プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質を産生するための新規産生微生物及び方法が提供される。
【００２１】
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物（そのような特許及び刊行物内に開示されている全ての配列を含む）は、参照により明示的に組み込まれるものとする。
【００２２】
Ａ．用語の定義
本明細書において別段に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．の「ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ２Ｄ  ＥＤ．」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９４］及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍの「ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ」、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ［１９９１］を参照）。本明細書に記載のものと同様の、又は本明細書に記載のものに相当する任意の方法及び材料を、本開示を実施又は試験するために使用できるが、好ましい方法及び材料が記載される。
【００２３】
数値の範囲は、範囲を画定する数値を包含する。別途記載のない限り、核酸は左から右に向かって５’から３’配向になるよう、アミノ酸配列は、左から右に向かってアミノ基からカルボキシ基という配向になるようにそれぞれ記載される。
【００２４】
本明細書に提供されている見出しは、本発明の様々な態様又は実施態様を限定するものではない。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。
【００２５】
本明細書で使用する用語「核酸配列」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその一本鎖又は二本鎖構造、並びに修飾されたものを包含する。用語「核酸配列」と「ポリヌクレオチド」は、本明細書で互換的に用いられ得る。
【００２６】
本明細書で使用する「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーへの言及を含む。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に生じるアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマー、及び天然に生じるアミノ酸ポリマーに適用される。これらの用語はまた、ポリペプチドが機能的なまま維持される保守的なアミノ酸置換を含むポリマーにも適用される。
【００２７】
本明細書で使用する用語「宿主」は、本明細書に記載されるような、入来配列（すなわち、細胞に導入される配列）のための宿主及び発現媒体として作用し得る細胞を指す。一実施形態では、宿主細胞は微生物である。好ましい実施形態では、宿主細胞はバチルス（Bacillus）種である。
【００２８】
本明細書で使用する「バチルス（Bacillus）」は、バチルス（Bacillus）属内の全ての種、亜種、株及び他の分類群を指し、限定されるものではないが、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィラス（B. alcalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ラウタス（B. lautus）、及びＢ・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が含まれる。
【００２９】
本明細書で使用する用語「ＤＮＡ構築物」又は「発現構築物」は、少なくとも２つのＤＮＡポリヌクレオチドフラグメントを含む核酸配列を指す。ＤＮＡ又は発現構築物は、宿主細胞又は生物に核酸配列を導入するために使用され得る。ＤＮＡは、インビトロで（例えば、ＰＣＲにより）又は任意の他の適切な技法で生成され得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡ構築物は目的の配列を含む。目的の核酸の配列は、操作可能にプロモーターに連結される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ構築物は、少なくとも１つの選択可能なマーカーを更に含む。更なる実施形態において、ＤＮＡ構築物は、宿主染色体に相同な配列を含む。他の実施形態において、ＤＮＡ構築物は非相同な配列を含む。
【００３０】
本明細書で使用する用語「目的のタンパク質をコードする核酸」又は「目的のコーディング配列」は互換的に用いられ、タンパク質に翻訳されたときに目的のタンパク質をコードする核酸配列を意味する。いくつかの実施形態では、コード領域はｃＤＮＡ形態で存在し、別の実施形態では、それはゲノムＤＮＡ又はＲＮＡの形態で存在する。ＤＮＡ形態で存在するとき、オリゴヌクレオチドは一本鎖（つまりセンス鎖）又は二本鎖構造であり得る。いくつかの実施形態では、一次ＲＮＡ転写物の転写及び／又は正しい処理の適切な開始を可能にするために、必要に応じて、適した制御要素（例えば、エンハンサー、プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル等）が遺伝子のコード領域に近接して配置される。あるいは、いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターに使用されるコード領域は、内因性エンハンサー、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナル、又は内因性と外因性の制御要素の組み合わせを含有する。
【００３１】
本明細書で使用される用語「プロモーター」、「プロモーター要素」及び「プロモーター配列」は、プロモーターがオリゴヌクレオチド配列の５’末端（つまりその前に）置かれたときに、ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチド配列の転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。したがって、プロモーターは、典型的には、それが制御するｍＲＮＡへのその転写を制御するオリゴヌクレオチド配列の５’（すなわち、上流）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼによる特異的な結合及び転写の開始のための部位を提供する。本明細書で使用されるリボソームプロモーターは、例えば、リボソームＲＮＡプロモーター又はリボソームタンパク質プロモーターを含む。
【００３２】
用語「操作可能に連結される」は、要素を機能的に関連付けることができる配置にある並置を指す。例えば、プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、目的のコーディング配列に操作可能に連結され得る。
【００３３】
本明細書で使用する用語「プロモーター活性」は、それが核酸配列に関するものであるとき、ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチド配列の転写を開始する核酸配列の能力を指す。
【００３４】
用語「ベクター」は、本明細書では、１つ以上の細胞型に導入される核酸配列を運ぶようにデザインされたポリヌクレオチドとして画定される。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ又はウイルス粒子、ＤＮＡ構築物、カセット等が挙げられる。プラスミドもまた含む典型的な発現ベクターは、プロモーター、シグナル配列、目的遺伝子、及び転写ターミネーターなどの調節配列を含む。
【００３５】
本明細書で定義される用語「単離された」は、少なくとも１つの他の化合物、タンパク質、細胞、核酸配列、アミノ酸、又は他の、通常はその天然源に関連している生物学的物質から分離されている化合物、タンパク質、細胞、核酸配列、又はアミノ酸を指す。
【００３６】
本明細書で使用する用語「コード領域」は、プロモーターを含む適切な制御配列の制御下に置かれたとき、ポリペプチドに翻訳されるｍＲＮＡに転写される核酸配列として画定される。コーディング配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び組換えＤＮＡを含むことができる。
【００３７】
本明細書で使用する用語「野生型」遺伝子、遺伝子産物、又は細胞は、天然源において見出されたとき、その遺伝子、遺伝子産物、又は細胞の特徴を有する遺伝子、遺伝子産物、又は細胞を指す。野生型遺伝子、遺伝子産物、又は細胞は、集団において最も頻繁に観察されるものであり、したがって、その「正常な」又は「野生型の」形態として指定される。本明細書で使用する用語「野生型配列」及び「野生型遺伝子」は、互換的に使用され、宿主細胞において天然の又は自然発生する配列を指す。
【００３８】
これに対して、用語「改変」「変異体」、又は「変異型」遺伝子、遺伝子産物、又は細胞は、野生型の形態と比較すると、配列及び／又は機能的特性における改変（すなわち、変化した特徴）を示す遺伝子、遺伝子産物、又は細胞を指す。配列改変は、例えば、置換、挿入、欠失、又は、変更された配列又は特徴をもたらす任意の他の改変によって生じ得る。天然に生じる変異体を単離することができることに留意されたい。これらは、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比較したときに、変更された特徴を有するという事実により認識される。
【００３９】
本明細書において、用語「改変配列」及び「改変遺伝子」は互換的に使用され、天然の核酸配列の置換、挿入、欠失、中断、又は任意の他の改変を意味する。いくつかの実施形態では、改変された配列の発現産物は、切断型タンパク質である（例えば、改変が配列の欠失又は中断である場合）。一部の実施形態では、切断型タンパク質は生物活性を保持している。他の実施形態では、改変された配列の発現産物は、伸長されたタンパク質である（例えば、改変が核酸配列への挿入である場合）。他の実施形態では、挿入は、発現産物として切断タンパク質の産生をもたらす（例えば、挿入の結果が終止コドンの形成である場合）。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「入来配列」は、宿主細胞の染色体又はゲノムに導入されるＤＮＡ配列を意味する。この配列は、１つ以上の目的のタンパク質をコードし得る。入来配列は、目的のタンパク質をコードする配列に操作可能に連結されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、入来配列は、形質転換される細胞のゲノムに既に存在する配列を含み、他の実施形態では、それは、形質転換される細胞のゲノムにまだ存在していない（すなわち、いくつかの実施形態ではそれは相同な配列であり、他の実施形態ではそれは異種の配列である）。
【００４１】
いくつかの実施形態では、入来配列は、限定されるものではないが、ホルモン、酵素、成長因子、又はサイトカインを含む少なくとも１つの相同又は異種のタンパク質をコードする。いくつかの好ましい実施形態において、入来配列は、限定されるものではないが、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、カルボヒドラーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、オキシダーゼ（例えばフェノールオキシダーゼなど）、パーミアーゼ、プルラナーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、又はホスファターゼを含む、少なくとも１種類の酵素をコードする。
【００４２】
いくつかの実施形態では、入来配列は機能性の野生型遺伝子又はオペロン、機能性変異遺伝子又はオペロン、若しくは非機能性の遺伝子又はオペロンをコードする。
【００４３】
本明細書で使用する用語「レポーター遺伝子」は、細胞内で発現する能力があるヌクレオチド配列を意味し、そのレポーターの発現は、発現された遺伝子を含有する細胞に、容易に検出され測定される能力を授ける。
【００４４】
本明細書で使用する用語「フランキング配列」は、検討対象の配列の上流又は下流のいずれかに隣接する任意の配列を意味する（例えば、配列ＡＢＣでは、Ａ配列及びＣ配列は配列Ｂに隣接している）。いくつかの実施形態では、入来配列は、両側に隣接する相同ボックスで挟まれている。
【００４５】
本明細書で使用する用語「相同ボックス」は、もう１つの核酸配列に相同な配列を意味する。例えば、相同ボックスは、ゲノムＤＮＡにおいて核酸配列に相同であり得る。そのような場合、相同ボックスは、新しい構築物のどこにゲノムＤＮＡを組み込むかを指示するために有用である。
【００４６】
本明細書で使用する用語「相同な組換え」は、同一のヌクレオチド配列の部位における２つのＤＮＡ分子又は対の染色体間（すなわち、クロスオーバーの間）のＤＮＡフラグメントの交換を意味する。一実施形態では、染色体組み込みは、相同な組み換えによって達成される。
【００４７】
本明細書で使用する用語「異種」は、一般には、宿主細胞中に天然には生じないポリヌクレオチド又はポリペプチド、又は宿主細胞と同じ遺伝源又は遺伝種に由来するポリヌクレオチド又はポリペプチドであるが、異種配列にネイティブではない場所にあるものを意味する。いくつかの実施形態では、異種配列は非宿主配列であるが、他の実施形態では、それは改変された配列、異なる宿主細胞株からの配列、又は宿主細胞の異なる染色体の場所からの相同な配列である。
【００４８】
本明細書で使用する用語「トランスフェクション」及び「形質転換」は、いずれも、細胞にＤＮＡを導入する方法を指す。
【００４９】
本明細書で使用する用語「相補的」又は「相補性」は、塩基対合則によって関連する「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」（これらは、ヌクレオチドの配列を指す交換可能な用語である）に関連して使用される。例えば、配列「５’−ＣＡＧＴ−３’」は、配列「５’−ＡＣＴＧ−３’」と相補的である。相補性は「部分的」である場合か又は「全体的」である場合がある。「部分的」相補性は、１つ以上の核酸塩基が塩基対合則にしたがって一致をしていないものである。核酸同士の「全体的」又は「完全」相補性は、核酸塩基のそれぞれ及び全てが、塩基対合則に基づいて互いに一致しているものである。
【００５０】
本明細書で使用するとき、用語「染色体組み込み」は、入来配列が宿主細胞の染色体（すなわちゲノム）に導入されるプロセスを意味する。
【００５１】
本明細書で使用する用語「選択可能マーカー」は、目的のタンパク質又は遺伝子の存在又は欠如を示す任意の「マーカー」（すなわちインジケータ）の使用を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、必須であるものが欠如している培地でも成長する能力を付与する酵素活性をコードする遺伝子を包含する。
【００５２】
本明細書で使用する用語「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、細胞外の成熟型タンパク質の分泌を促進する、タンパク質のＮ末端部分におけるアミノ酸の配列を指す。細胞外タンパク質の成熟型は、分泌プロセスの際に切断されるシグナル配列は有していない。
【００５３】
本明細書において、「増幅」は、核酸配列の追加のコピーの産生として画定される。核酸の「増幅」は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応又は当該技術分野において周知の他の技術によって行うことができる。本明細書で使用するとき、用語、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，９６５，１８８号（これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる）の方法を指し、これらは、クローニング又は精製を行わずにＤＮＡ試料（例えばゲノムＤＮＡ）中で標的配列の断片の濃度を増加させる方法を記載している。
【００５４】
ＰＣＲを用いて、又は組み込みＰＣＲにより、いくつかの異なる方法論（例えば標識プローブとのハイブリダイゼーション、アビジン−酵素結合検出後にビオチン化プライマーの取り込みを行うこと、又は３２Ｐで標識された、ｄＣＴＰ又はＤＡＴＰなどのデオキシヌクレオチド三リン酸を増幅セグメントに組み込むこと）により検出可能なレベルまで、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の単一コピーを増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列を適切な一式のプライマー分子によって増幅することができる。具体的には、ＰＣＲプロセス自体によって生成された増幅セグメントは、それら自体が、その後のＰＣＲ増幅のための効率的なテンプレートである。
【００５５】
本明細書で使用する用語「プライマー」は、制限酵素による消化断片の精製物として天然に生じるか又は合成により生成されるオリゴヌクレオチドを指し、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれたときに合成の開始点として作用することができるものである。好ましくはプライマーは増幅効率を最大にするために一本鎖であるが、あるいは、二本鎖であってもよい。
【００５６】
本明細書で使用する用語「プローブ」は、制限酵素による消化断片の精製物として天然に生じるか又は合成的に生産されたオリゴヌクレオチドを指し、通常、対象とする別のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、識別、及び単離に有用である。本発明で使用される任意のプローブを、これらに限定するものではないが酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、並びに酵素を用いる組織化学アッセイ）、蛍光、放射活性、及び発光系などの任意の検出系で検出され得るように、任意の「リポーター分子」により標識することが想到される。本発明は、任意の特定の検出系又は標識に制限されることを意図しない。
【００５７】
本明細書で使用する用語「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」は、細菌酵素を指し、そのそれぞれは、特定のヌクレオチド配列において又はその近くで、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡを切断する。
【００５８】
Ｂ．リボソームプロモーター
リボソームＲＮＡの合成は、エシェリキアコライ（Escherichia coli）及びバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）におけるリボソーム合成の速度制限工程である。リボソームＲＮＡプロモーターからのリボソームＲＮＡ転写の調節は、これまでに研究されてきた（Ｓａｍａｒｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９３：７２３〜７３３；Ｎａｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９１：４５５５〜４５６１；Ｔｕｒｎｂｏｕｇｈ，２００８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６９：１０〜１４；Ｋｒａｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６９：４２〜５４；Ｋｒａｓｎｙ  ａｎｄ  Ｇｏｕｒｓｅ，２００４，ＥＭＢＯ  ２３：４４７３〜４４８３；）。翻訳要件が低いときにリボソームＲＮＡとリボソームが過剰産生されないように、ｒＲＮＡプロモーターは栄養条件によって厳しく調節される。大腸菌には７つのｒＲＮＡ（ｒｒｎ）オペロンがあり、そのそれぞれが２つのプロモーター指定Ｐ１及びＰ２を含有する。大腸菌ｒｒｎのＰ１プロモーターのコアの−１０／−３５領域は、ＲＮＡポリメラーゼのバインディングによってプロモーター活性を最高２０〜５０倍高める上流（ＵＰ）要素によって先行される。バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）は、１０個のｒｒｎオペロンを含有し（前出のＫｒａｓｎｙ及びＧｏｕｒｓｅ）、これらもまた、プロモーター活性を高めるために有用であり得る上流（ＵＰ）要素によって先行される。図２及び３を参照されたい。
【００５９】
リボソームＲＮＡプロモーターの調節は天然のリボソームＲＮＡの産生のために研究されてきたが、リボソームＲＮＡプロモーターを使用したときの目的の異種タンパク質に関しての核酸配列コードの発現レベルはまだ研究されていない。
【００６０】
リボソームタンパク質をコードする遺伝子の調節は、エシェリキアコライ（Escherichia coli）及びバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）においてこれまでに研究されている（Ｇｒｕｎｄｙ  ａｎｄ  Ｈｅｎｋｉｎ，１９９１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３：４５９５〜４６０２）。多くの事例において、リボソームタンパク質は、それらをコードするオペロンの発現を制御する自家リプレッサーとして作用することが見出されている。
【００６１】
本発明は、目的の異種タンパク質の産生において、リボソームＲＮＡプロモーター及びタンパク質プロモーターなどのリボソームプロモーターが予想外に有効であることを実証する。リボソームプロモーターから転写されたｍＲＮＡの量は、他の一般に使用されるプロモーターと比較したとき及び単位時間当たりに産生されるｍＲＮＡ分子数による測定においての両方で、驚くほど高かった。例えば、リボソームプロモーターからの発現を、高度に発現されるａｐｒｅプロモーターと比較している、実施例３〜５及び９〜１０を参照されたい。一実施形態では、本発明のリボソームプロモーターは、単位時間当たりに産生されるｍＲＮＡ分子数によって測定したときに、改善された転写効率を提供する。
【００６２】
リボソームプロモーターを使用したときに目的の異種タンパク質をコードする核酸配列が予想外に高レベルで発現することは、いくつかの利益を有する。一実施形態では、目的のコーディング配列をリボソームプロモーターを用いて発現することは、目的のコーディング配列の発現をそのネイティブプロモーターから行うことと比較して、より高いレベルで目的のコーディング配列を発現することを可能にする。より高いレベルでの発現は、不安定な転写の場合に特に有用である。
【００６３】
別の実施形態では、目的のコーディング配列の発現をリボソームプロモーターを用いて発現することは、リボソームプロモーターを含む発現構築物の増幅を用いずに目的のコーディング配列の発現レベルを高めることを可能にする。当該技術分野の他の発現構築物を用いるときは、目的のコーディング配列の高い発現レベルを達成するために、発現構築物の増幅がしばしば必要とされる。しかしながら、本明細書に記載のリボソームプロモーターを用いて達成される発現レベルは、発現構築物の増幅を必要としないほど十分に高い。代わりに、高い発現レベルは、リボソームプロモーターを含む発現構築物の単一の組み込み体によって達成される。実施例４及び５を参照されたい。これは、いくつかの利益を提供する。第１に、増幅された発現構築物の損失を宿主株が経験することがないので、宿主株はより安定である。また、発現構築物を増幅する必要がないならば、株の構築はより効率的になる。したがって、時間、金銭、及び材料が節減される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、リボソームプロモーターはリボソームＲＮＡプロモーターである。本発明に使用されるリボソームＲＮＡプロモーターは、バチルス（Bacillus）ｒｒｎＩ、ｒｒｎＥ、又はｒｒｎＢリボソームＲＮＡプロモーターからのＰ１、Ｐ２、又はＰ３のいずれか１つである。一実施形態では、本発明で使用されるＲＮＡプロモーターは、バチルス（Bacillus）ｒｒｎＩリボソームＲＮＡプロモーターからのＰ２プロモーターである。いくつかの実施形態では、バチルス（Bacillus）ｒｒｎＩ、ｒｒｎＥ、又はｒｒｎＢリボソームＲＮＡプロモーターからのＰ１、Ｐ２、又はＰ３プロモーターの組み合わせを使用し得る。例えば、実施例２〜４及び図４、８、６、及び１０を参照されたい。
【００６５】
特定の実施形態では、本明細書に記載のリボソームプロモーター（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター又はタンパク質プロモーター）の＋１転写開始部位に位置するヌクレオチドは、グアニンからアデニンに改変される。例えば、本明細書に記載のリボソームＲＮＡプロモーターの転写開始部位を図２及び図３に示す。＋１転写開始部位の改変は、本明細書に記載のプロモーターからの一貫した産生を可能にし、したがって、このプロモーターからの生産性の総合的な向上をもたらす。
【００６６】
一実施形態では、プロモーターは、配列番号１〜６又は１３〜１４のいずれか１つの核酸配列、若しくはその部分配列を有する。その部分配列は、プロモーター活性を保持し、少なくとも約１０個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも約４０個のヌクレオチド、少なくとも約５０個のヌクレオチド、少なくとも約６０個のヌクレオチド、少なくとも約７０個のヌクレオチド、少なくとも約８０個のヌクレオチド、少なくとも約９０個のヌクレオチド、又は少なくとも約１００個のヌクレオチドを含むであろう。配列番号１〜６又は１３〜１４の任意の１つの部分配列は、親プロモーターの−３５及び−１０の領域を最小限に含むべきである。例えば、配列番号１〜６又は１３〜１４の任意の１つの部分配列は、図２及び３又は表１−１及び２−１に示されているように、親プロモーターの−３５及び−１０の領域を最小限に含むべきである。特定の実施形態では、図２及び図３に示すように、配列番号１〜６又は１３〜１４の任意の１つの部分配列は、親プロモーターの−３５及び−１０の領域を含み、かつ更に、親プロモーターの上流ＵＰ要素を含む。
【００６７】
特定の実施形態では、プロモーターは配列番号３の核酸配列を又はその部分配列を有する。その部分配列はプロモーター活性を保持し、少なくとも約１０個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも約４０個のヌクレオチド、少なくとも約５０個のヌクレオチド、少なくとも約６０個のヌクレオチド、少なくとも約７０個のヌクレオチド、少なくとも約８０個のヌクレオチド、少なくとも約９０個のヌクレオチド、及び少なくとも約１００個のヌクレオチドを含むであろう。
【００６８】
このプロモーターはまた、本発明の１つ以上のプロモーターの一部、又は本発明のプロモーターの一部と別のプロモーターの一部を含む、ハイブリッドプロモーターでもよい。いくつかの実施形態では、ハイブリッドプロモーターは、少なくとも約１０個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも約４０個のヌクレオチド、少なくとも約５０個のヌクレオチド、少なくとも約６０個のヌクレオチド、少なくとも約７０個のヌクレオチド、少なくとも約８０個のヌクレオチド、少なくとも約９０個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチドを有する配列番号１〜６又は１３〜１４の任意の１つの部分配列を含む。
【００６９】
ハイブリッドプロモーターの他方のプロモーターは、宿主細胞のプロモーター活性を示し、かつ、宿主に天然であってもよく天然でなくてもよい変異プロモーター、短縮されたプロモーターなどを含む任意のプロモーターであり得る。本発明のハイブリッドプロモーターにおいて有用であり得る他のプロモーターの例としては、真菌及び細菌由来のプロモーターが挙げられる。いくつかの特定の非限定的な例としては、ａｐｒＥプロモーター又は変異ａｐｒＥプロモーター（ＷＯ  ０１／５１６４３号）；ストレプトマイセスフラジアエ・アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子のａｐｈプロモーター；アスペルギルスニガー・グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ遺伝子）プロモーター；アクチノプラネスミズリエンシスのグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）プロモーター及びその誘導体ＧＩ（ＧＩＴ）プロモーター（米国特許第６，５６２，６１２号及びＥＰＡ  ３５１０２９号）；ＷＯ  ０３／０８９６２１号に開示されている、ストレプトマイセスリビダンスからのグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）プロモーター、その短い野生型ＧＩプロモーター、その１．５ＧＩプロモーター、その１．２０ＧＩプロモーター、又はその変異型ＧＩプロモーターのいずれか；糸状菌、特にトリコデルマレーシのセロビオヒドロラーゼプロモーターからの、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１１及びｅｇ１２プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号第Ｄ８６２３５号）；ｌａｃＺ及びｔａｃプロモーター（Ｂａｇｄａｓａｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ  ２６：２７３〜２８２）；ｅｒｍＥプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８〜４７８、及びＳｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：４９３〜４９８）；及びバチルス・ズブチルスファージ（Bacillus subtilis phage）ｏ２９プロモーター（Ｐｕｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４９：３７７〜３８２）が挙げられる。ストレプトマイセスにおいて有効なプロモーターは、Ｈｏｐｗｏｏｄらに列挙されている（Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ｉｎ  Ｂｏｏｔｈ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｃ．（Ｅｄｓ）ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＳＯＣＩＥＴＹ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６  ｐｇｓ．２５１〜２７６）。ストレプトマイセスファージプロモーターもまた、Ｌａｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１５０３〜１５１２．に開示されている。本明細書に記載のハイブリッドプロモーターでの使用に有効であり得る他のプロモーターは、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６  ＥＭＢＯ  Ｊ．５：２９８７〜２９９４及びＷＯ  ９６／００７８７号に列挙されているプロモーターである。
【００７０】
このプロモーターはまた、２つ以上のプロモーターを含むタンデムプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、タンデムプロモーターは、配列番号１〜６又は１３〜１４又はその部分配列の任意の１つのプロモーターと、ハイブリッドプロモーターに関して上述したもののような１つ以上の他のプロモーターを含む。
【００７１】
ハイブリッドプロモーター、タンデムプロモーター、配列番号１〜６又は１３〜１４のいずれか１つの部分配列若しくは配列番号１〜６又は１３〜１４のいずれか１つとハイブリダイズする核酸配列であるプロモーターは、その対応する親プロモーターのプロモーター活性の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、及び少なくとも約１００％を有する。いくつかの実施形態では、プロモーター活性は、例えば、約１００％を超える、約１５０％を超える、約２００％を超える、及び約２５０％を超える。
【００７２】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号１〜６又は１３〜１４のいずれか１つと、中程度の、高い、又は非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列、若しくはその部分配列を含む。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号３と中程度の、高い、又は非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列、若しくはその部分配列を含む。
【００７３】
特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションを使用して、所与のＤＮＡフラグメントが本明細書に記載のプロモーターＤＮＡ配列に相当するかどうか、及び本発明の範囲内であるかどうかを分析する。一般的なハイブリダイゼーションの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄ．，１９８９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。
【００７４】
「ハイブリダイゼーション条件」とは、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー（厳密さ）」の程度を意味する。ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．）に教示されているように、核酸バインディング複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づく場合がある。ハイブリダイゼーション条件はまた、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーションの後に採用される洗浄条件にも基づく場合がある。
【００７５】
あくまで例示を目的として、「低いストリンジェンシー」条件は、２０℃で０．２ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ溶液を用いて１５分間洗浄することを意味する。「中程度のストリンジェンシー」条件は、３７℃で０．２ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ溶液を用いて３０分間洗浄することを意味し得る。「高いストリンジェンシー」条件は、３７℃で０．２ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ溶液を用いて４５分間洗浄することを意味し得る。「非常に高いストリンジェンシー」条件は、３７℃で０．２ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ溶液を用いて６０分間洗浄することを意味し得る。しかし、特定の溶液の成分、温度、及び洗浄時間に関連づけられるストリンジェンシーは、特定の核酸及び他の関与する条件によって異なる場合がある。当業者は、所望の程度のストリンジェンシーに関連づけられるハイブリダイゼーション条件を決定することができる。
【００７６】
本発明の別の態様は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．）に教示されているような核酸バインディング複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づくハイブリダイゼーション条件の使用である。例示を目的として、「非常に高いストリンジェンシー」は、典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍから約５℃下げた温度）で生じ、「高いストリンジェンシー」は、典型的にはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度で生じ、「中程度のストリンジェンシー」はＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度で生じ、「低いストリンジェンシー」はＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で生じるものである。
【００７７】
ハイブリダイゼーションアッセイの一例は次のように実行され得る。特定の標的ソースからのゲノムＤＮＡを、製造業者の指示にしたがって、例えばＥｃｏＲ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｂｇｌ  ＩＩ、Ｎｃｏ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ及びＸｍａ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．ａｎｄ  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍが供給している）などの適切な制限酵素を用いる消化によりフラグメント化する。次いで、それらの試料をアガロースゲル（例えば、０．８％アガロース）を通して電気泳動させて、ＤＮＡフラグメントの分離がサイズ別に可視化できるようにする。ＤＮＡフラグメントは、典型的には、臭化エチジウム染色により可視化される。そのゲルを、蒸留水で軽く漱ぎ、次いで、適切な溶液（例えば０．２５ＭのＨＣｌ）中で、穏やかに振とうしながら脱プリンし、次いで、穏やかに振とうしながら（例えば、０．４ＭのＮａＯＨ中で）３０分間変性させることができる。再生工程を含めてもよく、その場合、ゲルを１．５ＭのＮａＣｌ、１Ｍのトリス、ｐＨ  ７．０の中に入れ、穏やかに３０分間振とうする。次いで、ＤＮＡを、（例えば６ｘ  ＳＳＣ（９００ｍＭのＮａＣｌ、９０ｍＭのクエン酸三ナトリウム）など）移転溶液を用いて、例えばＭａｘｉｍｕｍ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ｎｙｔｒａｎ  Ｐｌｕｓメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ）のような適切にプラスに帯電したメンブレン上に移転する。一般的には約２時間後、移転が完了した後に、例えば２ｘ  ＳＳＣ（２ｘ  ＳＳＣ＝３００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのクエン酸三ナトリウム）中でメンブレンをすすぎ、室温で空気乾燥させる。次いで、メンブレンを、（例えば、１００ｍＬ当たり２０〜５０ｍＬのホルムアミド、２５ｍＬの２０ｘ  ＳＳＰＥ（１ｘ  ＳＳＰＥ＝０．１８ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ  ７．７））、２．５ｍＬの２０％  ＳＤＳ、及び１ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬの剪断ニシン精子ＤＮＡを含有する水溶液など）適切なプレハイブリダイゼーション溶液中で（約２時間以上）プレハイブリダイズする必要がある。当業者には周知のように、プレハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの量は、ルーチン方法にしたがって得られる反応の性質に依存して変えることができる。したがって、ハイブリダイズする分子の特定に関しては、同じ手順でより多くのホルムアミドを使用する場合と比較して、ホルムアミドの量が少ないほど完全なハイブリダイゼーションがもたらされ得る。その一方で、より多くのホルムアミドを使用するほうが、強ハイブリダイゼーション帯をより容易に視覚的に特定できる場合がある。
【００７８】
一般に、長さが５０〜５００塩基のＤＮＡプローブは、アガロースゲル、ゲルから切り出されたフラグメント、及び切り出されたアガロースから回収されたフラグメントにおいて電気泳動により単離する必要がある。より詳細な手順については、上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。次いで、この精製されたＤＮＡフラグメントに、（例えば、Ｍｅｇａｐｕｒｉｍｅ標識システムを製造業者の指示にしたがって使用して）標識を付け、Ｐ３２をそのＤＮＡに組み込む。標識したプローブを５分間９５℃に加熱することにより変性し、直ちにメンブレンとプレハイブリダイゼーションの溶液に添加する。ハイブリダイゼーション反応は、例えば、穏やかに振とう又は回転しながら３７℃で１８時間、適切な時間及び適切な条件下で進行する必要がある。メンブレンを（２ｘ  ＳＳＣ／０．３％ＳＤＳなどで）すすぎ、次いで、穏やかに撹拌しながら適当な洗浄液で洗浄する。所望のストリンジェンシーは、メンブレン（フィルター）の洗浄条件を反映する。
【００７９】
一実施形態において、核酸配列は配列番号１〜６又は１３〜１４のいずれか１つの配列であり、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件は高い。別の実施形態において、核酸配列は配列番号３の配列であり、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件は高い。
【００８０】
他の実施形態では、本発明のプロモーターは、配列番号１〜６又は１３〜１４のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％の配列同一性を有する部分配列である。別の実施形態では、本発明のプロモーターは、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％の配列同一性を有する部分配列である。例えば、配列番号１〜６又は１３〜１４の任意の１つの部分配列は、図２及び３又は表１−１及び２−１に示されているような、親プロモーターの−３５及び−１０の領域を最小限に含むべきである。特定の実施形態では、配列番号１〜６の任意の部分配列は、図２及び図３に示すように、親プロモーターの−３５及び−１０の領域を含み、かつ更に、親プロモーターの上流ＵＰ要素を更に含む。
【００８１】
２つの核酸配列又はポリペプチドの文脈において、用語「同一性」は、２つの配列中のヌクレオチド又はアミノ酸残基が、以下の「配列比較アルゴリズム」の１つを用いた評価において、最大限の相応になるようにアライメントされたときに同じであることを指す。比較のための配列の最適のアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、又はＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、又はＰｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、又はコンピュータ化されたこれらのアルゴリズムの実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は目視検査によって、実施し得る。
【００８２】
配列類似性を判断するのに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．で入手可能なＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公開されており、入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の相似性の統計解析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照）。
【００８３】
Ｂ．目的のコーディング配列
本発明によって包含されるプロモーターは、目的のタンパク質をコードする核酸（すなわち、目的のコーディング配列）に操作可能に連結される。コーディング配列によってコードされるポリペプチドは、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗生物質又はその一部、受容体又はその部分、レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）又は他の二次代謝産物であり得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、エステラーゼ、マンナナーゼ、カルボヒドラーゼ、ヒドロラーゼ、オキシダーゼ、ペルミアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、又は細菌や真菌由来の類似物である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、酵素はセルラーゼである。セルラーゼは、セルロース中のβ−Ｄ−グルコシド結合を加水分解する酵素である。セルロース分解酵素は、伝統的には、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼという３つの大分類に分類される（Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  ５：２５５〜２６１（１９８７））。科学文献に数多くのセルラーゼが記載されており、トリコデルマレーシ  レーシ由来の例としては、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６９１〜６９６，１９８３（ＣＢＨＩを開示している）；Ｔｅｅｒｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，５１：４３〜５２，１９８７（ＣＢＨＩＩを開示している）；Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４５：２５３〜２６３，１９８６（ＥＧＩを開示している）；Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６３：１１〜２２，１９８８（ＥＧＩＩを開示している）；Ｏｋａｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：５５５〜５６３，１９８８（ＥＧＩＩＩを開示している）；Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４９：５８４〜５９１，１９９７（ＥＧＩＶを開示している）；及びＳａｌｏｈｅｉｍｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：２１９〜２２８，１９９４（ＥＧＶを開示している）が挙げられる。トリコデルマ以外の種に由来するエキソセロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼも記載されており、例えば、Ｏｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０（アスペルギルスアキュリタスによって産生されるエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を開示している）；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６（アスペルギルスアキュリタスからのβ−グルコシダーゼ１をコードするｃＤＮＡのクローニング及び配列決定を開示している）；Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５（アスペルギルスカワチイＩＦＯ  ４３０８からのエンドグルカナーゼＣＭＣアーゼ−１をコードするｃＤＮＡ配列を開示している）；及びＳａａｒｉｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０（エルウィニアカロトバラからのエンドグルカナーゼを開示している）である。
【００８６】
特定の実施形態において、本発明のプロモーターによって発現されるセルラーゼは、米国特許第６，２，８７，８３９号及び米国特許第６，５６２，６１２号に開示されているセルラーゼである。特定の実施形態において、発現されるセルラーゼは、米国特許第６，５６２，６１２号の配列番号１のアミノ酸配列を含むセルラーゼか、又は、セルロース分解活性を有し、かつ米国特許第６，５６２，６１２号の配列番号１の活性部分との配列同一性が７０％を超える、そのフラグメント若しくは誘導体である。
【００８７】
他の実施形態では、酵素は、セリン、メタロ、チオール又は酸性プロテアーゼなどのプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼはセリンプロテアーゼ（例えば、スブチリシン）である。セリンプロテアーゼは、Ｍａｒｋｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｈｏｎｎｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ３６４：１５３７〜１５４０；Ｄｒｅｎｔｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１７７〜１８１；米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ  ３４，６０６）、同第５，１８２，２０４号、及び同第６，３１２，９３６号、並びにＥＰ  ０  ３２３，２９９号に記載されている。本発明で使用され得るプロテアーゼは、例えば、米国特許公開第２０１０／０１５２０８８号及び国際公開特許第２０１０／０５６６３５号にも記載されている。タンパク質分解活性を測定するための手段は、Ｍ．Ｋａｌｉｓｚ，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ａ．Ｆｉｅｃｈｔ  Ｅｄ．１９８８に開示されている。
【００８８】
別の実施形態において、本発明のプロモーターによって発現されるプロテアーゼは、配列番号１０、１２、１９、又は２１のアミノ酸配列を含むプロテアーゼか、若しくはタンパク質分解活性を有し、かつ配列番号１０、１２、１９、又は２１の活性部分との配列同一性が７０％を超えるそのフラグメント又は誘導体である。配列番号１０、１２、１９、又は２１をコードする核酸配列は、それぞれ、配列番号９、１１、１８、及び２０である。
【００８９】
他の実施形態では、酵素は、（Ｔ．レーシなど）トリコデルマ由来のアミラーゼ、トリコデルマグルコアミラーゼ、（Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）など）バチルス（Bacillus）由来のアミラーゼ、又は（Ｇ．ステロサーモフィラス（G. stearothermophilus）など）ゲオバチルス（Geobacillus）由来のアミラーゼなどのアミラーゼである。細菌及び真菌由来のアミラーゼは、例えば、米国特許第８，０５８，０３３号、米国特許公開第２０１０／００１５６８６号、米国特許公開第２００９／０３１４２８６号、英国特許出願第１０１１５１３．７号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５３０１８号に記載されている。これらの参照のそれぞれの明細書の全体が参照により本明細書に援用される。
【００９０】
他の実施形態では、酵素はキシラナーゼである。特定の実施形態では、キシラナーゼはトリコデルマ（Ｔ．レーシなど）由来である。細菌及び真菌由来のキシラナーゼは、例えば、国際公開特許第２００１／０２７２５２号及び米国特許第７，７１８，４１１号に記載されている。これらの参照のそれぞれの明細書の全体が参照により本明細書に援用される。
【００９１】
他の実施形態では、酵素はフィターゼである。特定の実施形態では、フィターゼはシトロバクター（Ｃ．フレウンディイ（C. freundi））又は大腸菌由来である。他の実施形態では、フィターゼは、バチアグセラ・アグレスティス・フィターゼのようなバチアグセラフィターゼであり得る。フィターゼは、例えば、国際公開特許第ＷＯ  ２００６／０４３１７８号、同第ＷＯ  ２００６／０３８０６２号、同第ＷＯ  ２００８／０９７６１９号、同第ＷＯ  ２００９／１２９４８９号、同第ＷＯ  ２００６／０３８１２８号、同第ＷＯ  ２００８／０９２９０１号、同第ＷＯ  ２００９／１２９４８９号、及び同第ＷＯ  ２０１０／１２２５３２号に記載されている。これらの参照のそれぞれの明細書の全体が参照により本明細書に援用される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ホルモンは、卵細胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、細胞表面上の受容体に結合して細胞増殖及び／又は分化の活性化の主要な結果をもたらすタンパク質である成長因子としては、血小板由来成長因子、表皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、形質転換成長因子などが含まれる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、成長因子はサイトカインである。サイトカインとしては、コロニー刺激因子、インターロイキン（ＩＬ−Ｉ（α及びβ）、ＩＬ−２〜ＩＬ−１３）及びインターフェロン（α、β及びγ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
いくつかの実施形態において、抗体は、それを大量に産生することが望まれる任意の種からの免疫グロブリンが含まれるが、これに限定されない。抗体は、ヒト抗体であることが特に好ましい。免疫グロブリンは任意のクラスのものでよく、すなわち、Ｇ、Ａ、Ｍ、Ｅ、又はＤであり得る。
【００９６】
コーディング配列は、宿主細胞に対して天然又は異種のいずれでもよい。加えて、コーディング配列は、完全長タンパク質、又は完全長タンパク質の切断型をコードすることができる。本発明は、特定のコーディング配列に限定されるものではなく、本発明のプロモーターに操作可能に連結されている多数のコーディング配列を包含する。
【００９７】
Ｃ．シグナル配列
いくつかの実施形態において、特に目的のコーディング配列が例えばセルラーゼ、プロテアーゼ又はデンプン分解酵素のような細胞外酵素をコードするときは、シグナル配列はコーディング配列のＮ末端部分に連結され得る。シグナルは、ＤＮＡ配列の分泌を促進するために使用され得る。シグナル配列は、宿主生物に内因性又は外因性であり得る。シグナル配列は、コードされたポリペプチドに通常関連づけられるものであり得る。いくつかの実施形態において、シグナル配列は、参照により本明細書にその全体が援用される国際特許公開第ＷＯ  ２０１１／０１４２７８号及び同第ＷＯ  ２０１０／１２３７５４号に記載されているように変更又は改変され得る。いくつかの実施形態において、シグナル配列は、ストレプトマイセスセルラーゼ遺伝子由来のシグナル配列を含む。一実施形態において、好ましいシグナル配列は、Ｓ．リビダンスセルラーゼ、ｃｅｌＡ（Ｂｅｎｔｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：１４１〜１４７）である。しかしながら、当業者は、宿主生物中に発現され、分泌されるタンパク質に依存して使用され得る多くのシグナルペプチドを認識している。
【００９８】
Ｄ．ＤＮＡ構築物及びベクター
目的のコード領域を含む本発明の核酸構築物は、確立された標準的な方法、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９〜１８６９により説明されているホスホロアミダイト法又はＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：８０１〜８０５によって説明されている方法によって、合成により調製することができる。核酸構築物は、合成及びゲノム起源の混合であってもよく、合成又はゲノムＤＮＡのフラグメントをライゲーションすることによって調製することができる。核酸構築物は、例えば米国特許第４，６８３，２０２号又はＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９（１９８８），４８７〜４９１に記載されているように、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。
【００９９】
本発明のＤＮＡ構築物は、発現ベクターのようなベクターに挿入し得る。真菌、酵母及び細菌におけるポリペプチドのクローニング、形質転換、及び発現に適した様々なベクターが当業者に知られている。典型的には、ベクター又はカセットは、本発明のプロモーターを含み、所望により、シグナル配列、目的のコード領域及びターミネーター配列を含む。好ましい実施形態において、ベクターは、シグナル配列とターミネーター配列との間に位置する１つ以上のクローニング部位を含む。
【０１００】
Ｅ．形質転換
本発明のベクターは、宿主細胞に形質転換される。一般的な形質転換手法は当該技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ  １６：５３〜５６）。これらの一般的な手法のいくつかとしては、限定されるものではないが、粒子又は遺伝子銃（微粒子銃）の使用、形質転換プロセスの前の糸状菌細胞壁の透過処理（例えば０．０５Ｍ〜０．４ＭのＣａＣｌ２又はリチウムアセテートのような高濃度のアルカリの使用）、原形質融合、電気穿孔法、又はアグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第６，２５５，１１５号）が挙げられ、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムによるプロトプラスト又はスフェロプラストの処理は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９、及びＰｅｎｔｔｉｌａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ，６３：１１〜２２に記載されている。
【０１０１】
細菌の形質転換及び発現は、Ｂｒｉｇｉｄｉ，ＤｅＲｏｓｓｉ，Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ，（１９９０），ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５〜１３８に開示されている。プロテアーゼ削除バチルス（Bacillus）株のための好ましい一般的な形質転換及び発現プロトコルは、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，２６４，３６６号に記載されている。
【０１０２】
ストレプトマイセスでの形質転換及び発現は、Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥＴＩＣ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，（１９８５）Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫ．に見出すことができる。
【０１０３】
他の実施形態において、アスペルギルス及びトリコデルマにおける形質転換及び発現は、米国特許第５，３６４，７７０号及び同第６，０２２，７２５号、並びにＮｅｖａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ，Ｅｄｓ．Ｌｅｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋａ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ｐｐ．１２９〜１４８に記載されている。
【０１０４】
Ｆ．宿主細胞
本発明にしたがって使用され得る宿主細胞は、細菌及び真菌細胞の両方を含む。好ましい真菌宿主細胞としては、アスペルギルス及びトリコデルマ細胞などの糸状菌細胞が含まれる。好ましい細菌宿主細胞は、グラム陽性及びグラム陰性細胞の両方を含み、バチルス（Bacillus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、アクチノマイセス（Actinomyces）及びストレプトマイセス（Streptomyces）の細胞が含まれる。宿主細胞としてはまた、限定するものではないが、大腸菌、シュードモナス属（例えば、Ｐ．アエルギノア（P. aeruginoa）及びＰ．アルカリゲンス（P. alcaligenes））、ストレプトマイセス属（例えば、ストレプトマイセスリビダンス（Streptomyces lividans））、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステロサーモフィラス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィラス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．シルクランス（B. circulans）、Ｂ．ラウタス（B. lautus）、Ｂ．メガセリウム（B. megatherium）、及びＢ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。
【０１０５】
Ｇ．細胞培養
宿主細胞及び形質転換細胞は、従来の栄養培地で培養することができる。形質転換された宿主細胞のための培養培地は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択するために適切に改善することができる。温度、ｐＨ及びこれらに類するものなどの特定の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に使用されるものであってよく、当業者には明白である。加えて、好ましい培養条件は、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８２）；Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ，Ｍ  Ｊ．Ｂｉｂｂ，Ｍ  Ｊ．Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｋ  Ｆ  Ｃｈａｔｅｒ及びＤ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００）「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ．」Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫ；Ｈａｒｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＢＡＣＩＬＬＵＳ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、並びにｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／」）のような科学文献に見出すことができる。トリコデルマ細胞のような、真菌宿主細胞の安定な形質転換体は、一般には、それらの増殖速度がより速いことによって、又は、ギザギザというよりもむしろなめらかな輪郭の円形のコロニーが固体培養培地上で形成されることによって、不安定な形質転換体から区別され得る。
【０１０６】
Ｈ．発現されたポリペプチドの回収
形質転換された宿主細胞によって産生されたポリペプチドは、遠心分離又は濾過により培地から宿主細胞を分離するか、必要に応じて、細胞を破壊し、細胞画分及び破片から上澄みを除去することを含む従来の手順によって、培養培地から回収することができる。典型的には、清澄化した後、例えば硫酸アンモニウムなど塩を用いて上清又は濾液のタンパク質成分を沈殿させる。沈殿したタンパク質を、次いで、可溶化し、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー手順、及び他の当該分野で認識されている種々の手順によって、精製することができる。
【０１０７】
Ｉ．構築物の組み立て
１つの一般的な実施形態において、本発明は、インビトロでＤＮＡ構築物を組み立てることに次いで、このような構築物が宿主ゲノムに組み込まれるように（例えば、バチルス（Bacillus）宿主細胞など）コンピテントな宿主細胞にそのような構築物を直接クローニングにすることを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＣＲ融合及び／又はライゲーションを用いてＤＮＡ構築物を組み立てる。好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は非プラスミドＤＮＡ構築物である。別の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、変異が導入されたＤＮＡを含む。次いで、この構築物を使用して宿主細胞を形質転換する。これに関して、好ましくは、高度にコンピテントな（例えばバチルス（Bacillus）などの）宿主細胞の変異体を用いて、細胞内への構築物の直接クローニングを促進する。例えば、キシロース誘導性プロモーター（Ｐｘｙｌ−ｃｏｍＫ）により制御されているｃｏｍＫ遺伝子を持つバチルス（Bacillus）は、本明細書に記載のように、非常に高い効率で信頼性を持って形質転換することができる。当該技術分野において周知の任意の好適な方法を使用してそれらの細胞を形質転換することができる。ＤＮＡ構築物は、形質転換の前に、ベクター（すなわちプラスミド）に挿入することができる。いくつかの好ましい実施形態では、適切な制限酵素（すなわち、ＤＮＡ構築物を破壊しないもの）を用いて円形プラスミドを切断する。したがって、いくつかの実施形態では、円形プラスミドが本発明に使用される。しかし、代替実施形態では、線状プラスミドを使用する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物（すなわちＰＣＲ産物）は、プラスミドＤＮＡの存在なしに使用される。
【０１０８】
本発明及びその利点を更に説明するために、以下の具体例は、それらが本発明を例示するために提供されているものであって、その範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではないという理解に基づいて与えられている。
【実施例】
【０１０９】
実施例１：リボソームＲＮＡ及びタンパク質プロモーターからタンパク質を発現するバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）株の生成
緑色蛍光タンパク質（ＧＰＦ）及び２つのスブチリシンプロテアーゼ、ＦＮＡ（Ｂ．アミロリケファシエンススブチリシン（B. amyloliquefaciens subtilisin）ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ）並びにＥＲ１１（ＷＯ２０１０／０５６６３５Ａ１号に記載されている）のコード配列をバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のリボソームＲＮＡプロモーター又はタンパク質プロモーターに融合させて、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）株ＢＧ８０００（ΔｎｐｒＥ、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２、ΔａｐｒＥ、ｓｐｏＩＩＥ３１２  ａｍｙＥ：：ＰｘｙｌＲＡ−ｃｏｍＫ−ｅｒｙＲ）及びＢＧ８０１０（ΔｎｐｒＥ、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２、ΔａｐｒＥ、ｓｐｏＩＩＥ３１２  ａｍｙＥ：：ＰｘｙｌＲＡ−ｃｏｍＫ−ｅｒｙＲ  ｏｐｐＡ：ｐｈｌｅｏＲ）におけるタンパク質の発現の試験を行った。リボソームＲＮＡプロモーター及びタンパク質プロモーターからのタンパク質の発現を、スブチリシンプロモーターａｐｒＥでの発現から得られたものと比較した（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｉｎ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ．Ｅ  Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｄ  Ｊ  Ｈｅｎｎｅｒ，Ｍ  Ｐｅｒｅｇｏ，ａｎｄ  Ｊ  Ａ  Ｈｏｃｈ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８８  Ｊａｎｕａｒｙ；１７０（１）：２８９〜２９５）。
【０１１０】
表１−１に示すプロモーターは、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）１６８染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、標的分子の遺伝子（ＥＲ１１、ＦＮＡ又はＧＦＰ）に転写により融合させたものである。プロモーター、目的の遺伝子及び抗生物質マーカーを含むカセットを用いてＢＧ８０１０又はＢＧ８０００株を形質転換し、５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。また、標的分子遺伝子に融合したａｐｒＥプロモーターを含む構築物でもＢＧ８０１０又はＢＧ８０００株を形質転換し、５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。スブチリシンプロモーターを有する構築物を保有する株を、カセットのコピー数を増加させるために、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上で増幅し、一方、リボソームプロモーターを保有する株は、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するプレート上で再単離させた。
【０１１１】
【表１】
0006378089.tif 000002
【０１１２】
標的分子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を以下に示す。
リボソームＲＮＡプロモーター及びタンパク質プロモーターに融合したＧＦＰ遺伝子のヌクレオチド配列
【０１１３】
0006378089.tif 000003
【０１１４】
リボソームＲＮＡプロモーター及びタンパク質プロモーターから発現されたＧＦＰのアミノ酸配列
【０１１５】
0006378089.tif 000004
【０１１６】
リボソームＲＮＡプロモーター及びタンパク質プロモーターに融合したＦＮＡスブチリシンプロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
【０１１７】
0006378089.tif 000005
【０１１８】
リボソームＲＮＡプロモーター及びタンパク質プロモーターから発現したＦＮＡスブチリシンプロテアーゼのアミノ酸配列
【０１１９】
0006378089.tif 000006
【０１２０】
リボソームＲＮＡプロモーター及びタンパク質プロモーターに融合したＥＲ１１スブチリシンプロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
【０１２１】
0006378089.tif 000007
【０１２２】
リボソームＲＮＡプロモーター及びタンパク質プロモーターから発現したＥＲ１１スブチリシンプロテアーゼのアミノ酸配列
【０１２３】
0006378089.tif 000008
【０１２４】
標的遺伝子へのプロモーターの融合により構築された異なる株を、以下の表１〜２に記載する。１／２／３は、標的分子の発現を駆動するためにそれらの３つのプロモーターをタンデムにクローニングしたことを示している。マーク「＋Ｇ」は、アデニンの代わりに転写開始部位としてヌクレオチドグアニンを使用することを示す。
【０１２５】
【表２】
0006378089.tif 000009
【０１２６】
実施例２：ＧＦＰ、ＦＮＡ及びＥＲ１１発現株の細胞密度測定
細胞増殖を試験するために、構築された株のそれぞれにつき１コロニーを、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（リボソームＲＮＡプロモーターから発現する株の場合）又は２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ａｐｒＥプロモーターから発現する株の場合）を含有するルリアブロスに接種し、３０℃で一晩増殖させた。３２ｍｌの２ｘＳＮＢ培地（以下の組成を参照）を接種するために、それぞれの前培養物１ｍｌを使用し、２８０ｒｐｍで、７０％の湿度において、振とうフラスコ中３７℃で増殖させた。増殖時間４時間から８時間まで１時間おきに、各培養物の光学濃度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーを用いて６００ｎｍで測定した。ＧＦＰ、ＦＮＡ、及びＥＲ１１を発現する株の細胞密度の測定値を図４（ＧＦＰ）、図５及び６（ＦＮＡ）、並びに図７Ａ及び７Ｂ（ＥＲ１１）に示す。異なる構築物を含む株の増殖はほぼ同等であった。
【０１２７】
２ｘＳＮＢ培地
原液（濾過滅菌したもの）：２５ｘ  ＳＮＢ塩−ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ（３．７ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（９．６ｍｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ（６ｍｇ／Ｌ）、ＫＣｌ（２５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（３．２６ｇ／Ｌ）、Ｍａｌｔｒｉｎ  １５０  １０％。１６ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ溶液５００ｍＬを調製し、オートクレーブし、２０ｍＬの２５ｘＳＮＢ塩及び２５ｍＬの  １０％  Ｍａｌｔｒｉｎ  １５０を添加する。
【０１２８】
実施例３：リボソームプロモーターからのＧＦＰ、ＦＮＡ、及びＥＲ１１のタンパク質発現
選択されたプロモーターによって駆動されるＥＲ１１、ＦＮＡの細胞外産生又はＧＦＰの細胞内発現を、ＢＧ８０００及びＢＧ８０１０株で試験した。それらの細胞は、実施例２の細胞密度測定に関して記載したように増殖した。増殖時間４時間から８時間まで１時間おきに、培養物の上清のＡＡＰＦ活性（スブチリシン（subtilisin）発現）を分析した。ＧＦＰ発現は、細胞に発現した相対蛍光単位（ＲＦＵ）として測定した。
【０１２９】
試料のＡＡＰＦ活性は、Ｎ−スクシニル−Ｌ−アナニル−Ｌ−アナニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）の加水分解の速度として測定した。以下の試薬溶液を使用した：０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有する１００ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．６）（トリス希釈緩衝液及び１６０ｍＭのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ／ＤＭＳＯ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液）（σ：Ｓ−７３８８）。ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液を調製するために、１ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液を１００ｍＬのトリス／ＨＣｌ緩衝液に加え、少なくとも１０秒にわたってウェルをよく混合した。アッセイは、アッセイ緩衝液（１９５μｌ中５μｌ）に試料を希釈することによって行った。次いで、ＡＡＰＦ基質とともにアッセイ緩衝液１８０μｌを、マイクロタイタープレートに配列された希釈された試料２０μｌに添加した。溶液を５秒にわたって混合し、２５℃にて、４０５ｎｍで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーの動的解析モードにより吸光度変化を読み取った（５分間に２０回の読み取り）。
【０１３０】
ＲＦＵにおけるＧＦＰ発現を測定するために、それぞれの培養試料１５０μｌをマイクロタイタープレートに充填し、４８５ｎｍの励起波長、５０８ｎｍの発光波長を使用して、４９５ｎｍのカットオフで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーを用いて蛍光測定を行った。
【０１３１】
異なるプロモーターからのＧＦＰ、ＦＮＡ、及びＥＲ１１の発現を図８（ＧＦＰ）、図９及び１０（ＦＮＡ）、並びに図１１Ａ及び１１Ｂ（ＥＲ１１）に示す。非増幅リボソームＲＮＡプロモーター及びタンパク質プロモーターからのタンパク質発現は、増幅されたａｐｒＥプロモーターから見られたそれよりも高かった。
【０１３２】
実施例４：σＡ依存性プロモーターからのタンパク質発現
異なるプロモーターから異なるレベルでタンパク質発現が観察されるので、この実験は、増幅されたａｐｒＥプロモーターと増幅されていないｒｒｎＩ  Ｐ２プロモーターとでＦＮＡ発現を比較した。ａｐｒＥからＦＮＡを発現するＢＧ８０１０株を２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを用いて増幅し、一方、ｒｒｎＩ  Ｐ２からＦＮＡを発現する株は、実施例１に記載のように５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールで再単離した。細胞密度測定は実施例２に記載のように行い、ＦＮＡ発現は実施例３に記載のように行った。図１２及び１３に結果を示す。全ての株からの細胞増殖はほぼ同等であったが、増幅されていないｒｒｎＩ  Ｐ２プロモーターからのＦＮＡ発現は、増幅されたａｐｒＥプロモーターからのそれよりも高かった。
【０１３３】
実施例５：単一のコピー組み込み体を含有するＢＧ８０１０株からのＦＮＡ発現
抗生物質マーカーを使用することなくｒｒｎＩ  Ｐ２プロモーターをタンパク質発現のために使用することができるかどうかを試験するために、ＰｒｒｎＩ  Ｐ２−ＦＮＡ  ＳＰＣＲ又はＰａｐｒＥ−ＦＮＡ  ＣＡＴＲカセットのいずれかを含む単一コピー組込み体をダブルクロスオーバー組み込みによりＢＧ８０１０株に組み込んだ。その後に、ｃｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼを用いて、ｌｏｘ配列が隣接している抗生物質マーカー遺伝子を除去した。構築された株の形質転換体は、実施例２に記載されたように増殖され、細胞密度測定及びＦＮＡ発現は、それぞれ実施例２及び３に記載のように検討した。図１４に示す結果はｒｒｎＩ  Ｐ２プロモーター又はａｐｒＥプロモーターのいずれかを含む株の成長がほぼ同等であったことを示しているが、ＰｒｒｎＩ−Ｐ２からのＦＮＡ発現はａｐｒＥからのそれより高かった（図１５）。これらの研究は、ＰｒｒｎＩ−Ｐ２が、標的分子のｍＲＮＡを多量に送達できる強力なプロモーターであることを実証している。このプロモーターを使用する利点は、構築物の増幅を必要とせずに、かつ抗生物質マーカーを使用することなく、多量の転写物を送達することにある。
【０１３４】
実施例６：リボソームタンパク質プロモーターからタンパク質を発現するバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）株の生成
緑色蛍光タンパク質（ＧＰＦ）及び２つのスブチリシンプロテアーゼ、ＦＮＡ（Ｂ．アミロリケファシエンススブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ）及びＥＲ１１（ＷＯ２０１０／０５６６３５Ａ１号に記載されている）のコード配列を、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のリボソームタンパク質プロモーターに融合させて、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）株ＢＧ８０００（ΔｎｐｒＥ、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２、ΔａｐｒＥ、ｓｐｏＩＩＥ３１２  ａｍｙＥ：：ＰｘｙｌＲＡ−ｃｏｍＫ−ｅｒｙＲ）及びＢＧ８０１０（ΔｎｐｒＥ、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２、ΔａｐｒＥ、ｓｐｏＩＩＥ３１２  ａｍｙＥ：：ＰｘｙｌＲＡ−ｃｏｍＫ−ｅｒｙＲ  ｏｐｐＡ：ｐｈｌｅｏＲ）におけるタンパク質の発現を試験した。リボソームタンパク質プロモーターからのタンパク質の発現を、スブチリシンプロモーターａｐｒＥでの発現から得られたものと比較した（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｉｎ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ．Ｅ  Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｄ  Ｊ  Ｈｅｎｎｅｒ，Ｍ  Ｐｅｒｅｇｏ，ａｎｄ  Ｊ  Ａ  Ｈｏｃｈ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８８  Ｊａｎｕａｒｙ；１７０（１）：２８９〜２９５）。
【０１３５】
表２−１に示すプロモーターは、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）１６８染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、標的分子の遺伝子（ＦＮＡ又はＧＦＰ）に転写により融合させた。プロモーター、目的の遺伝子及び抗生物質マーカーを含むカセットを用いてＢＧ８０１０株又はＢＧ８０００株を形質転換し、５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。また、標的分子遺伝子に融合したａｐｒＥプロモーターを含む構築物でもＢＧ８０１０株又はＢＧ８０００株を形質転換し、５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。スブチリシン（ａｐｒＥ）プロモーターを有する構築物を保有する株を、カセットのコピー数を増加させるために、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上で増幅し、一方、リボソームプロモーターを保有する株は、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するプレート上で再単離させた。
【０１３６】
【表３】
0006378089.tif 000010
【０１３７】
表２−１：ｒｐｓＤ、ｒｐｓＪ及びｒｐｏＤ（Ｐ１）のプロモーター配列を示す。各プロモーターについて、−３５及び−１０配列を太字及び下線で示した。ｒｐｓＪに関しては、２つのプロモーター（Ｐ１とＰ２）が利用できる。ｒｐｓＪ  Ｐ１についての−３５及び−１０配列は、ｒｐｓＪ  Ｐ２配列についての−３５及び−１０配列の上流（すなわち、５’）である。
【０１３８】
0006378089.tif 000011
【０１３９】
リボソームタンパク質プロモーターから発現したＧＦＰのアミノ酸配列
【０１４０】
0006378089.tif 000012
【０１４１】
リボソームタンパク質プロモーターに融合したＦＮＡスブチリシンプロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
【０１４２】
0006378089.tif 000013
【０１４３】
リボソームタンパク質プロモーターから発現したＦＮＡスブチリシンプロテアーゼのアミノ酸配列
【０１４４】
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【０１４５】
リボソームタンパク質プロモーターに融合したＥＲ１１スブチリシンプロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
【０１４６】
0006378089.tif 000015
【０１４７】
リボソームタンパク質プロモーターから発現したＥＲ１１スブチリシンプロテアーゼのアミノ酸配列
【０１４８】
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【０１４９】
標的遺伝子へのプロモーターの融合により構築した異なる株を以下の表２−２に記載する。
【０１５０】
【表４】
0006378089.tif 000017
【０１５１】
実施例７：ＧＦＰ及びＦＮＡ発現株の細胞密度測定
細胞増殖を試験するために、ａｐｒＥプロモーター又はｒｐｏＤプロモーターを発現する株について、構築された株のそれぞれにつき１コロニーを、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリアブロスに接種し、３０℃で一晩増殖させた。２ｘＳＮＢ培地３２ｍｌを接種するために、それぞれの前培養物１ｍｌを使用し（以下の組成物を参照）、２８０ｒｐｍで、７０％の湿度にて、振とうフラスコ中３７℃で増殖させた。増殖時間４時間から８時間まで１時間おきに、各培養物の光学濃度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーを用いて６００ｎｍで測定した。ＧＦＰ発現株及びＦＮＡ発現株の細胞密度測定値を図１６（ＧＦＰ）及び１７（ＦＮＡ）に示す。異なる構築物を含む株の増殖はほぼ同等であった。
【０１５２】
２ｘＳＮＢ培地
原液（滅菌濾過）：２５ｘ  ＳＮＢ塩−ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ（３．７ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（９．６ｍｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ（６ｍｇ／Ｌ）、ＫＣｌ（２５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（３．２６ｇ／Ｌ）、Ｍａｌｔｒｉｎ  １５０  １０％。１６ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ溶液５００ｍＬを調製し、オートクレーブして、２０ｍＬの２５ｘＳＮＢ塩及び２５ｍＬの１０％  Ｍａｌｔｒｉｎ  １５０を添加した。
【０１５３】
実施例８：リボソームプロモーターからのＧＦＰ及びＦＮＡのタンパク質発現
選択されたプロモーターによって駆動されるＦＮＡの産生又はＧＦＰの細胞内発現は、ＢＧ８０００株及びＢＧ８０１０株で試験した。これらの細胞は、実施例７の細胞密度測定について記載したように増殖させた。増殖時間４時間から８時間まで１時間おきに、ＡＡＰＦ活性（スブチリシン発現）について培養液の上清を分析した。ＧＦＰ発現は、細胞に発現した相対蛍光単位（ＲＦＵ）として測定した。
【０１５４】
試料のＡＡＰＦ活性は、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）の加水分解速度として測定した。使用した試薬溶液は、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有している１００ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．６）（トリス希釈緩衝液及び１６０ｍＭ  ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ／ＤＭＳＯ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液）（σ：Ｓ−７３８８）である。ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液を調製するために、１ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液を１００ｍＬのトリス／ＨＣｌ緩衝液に加え、少なくとも１０秒にわたってウェルをよく混合した。アッセイは、アッセイ緩衝液に試料を希釈することにより行った（１９５μｌ中に５μｌ）。次いで、ＡＡＰＦ基質とともにアッセイ緩衝液１８０μｌを、マイクロタイタープレートに配列された２０μｌの希釈試料に添加した。溶液を５秒にわたって混合し、２５℃にて、４０５ｎｍで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーの動的解析モードにより吸光度変化を測定した（５分間に２０回の読み取り）。
【０１５５】
ＲＦＵにおけるＧＦＰ発現を測定するために、それぞれの培養試料１５０μｌをマイクロタイタープレートに充填し、４８５ｎｍの励起波長、５０８ｎｍの発光波長を使用して、４９５ｎｍのカットオフで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーを用いて蛍光測定を行った。
【０１５６】
異なるプロモーターからのＧＦＰ及びＦＮＡの発現を図１８（ＧＦＰ）及び１９（ＦＮＡ）に示す。増幅されていないリボソームタンパク質プロモーターからのタンパク質発現は、増幅されたａｐｒＥプロモーターから見られたそれよりも高かった。
【０１５７】
実施例９：σＡ依存性プロモーターからのタンパク質発現
異なるプロモーターから異なるレベルのタンパク質発現が観察されるので、この実験では、増幅されたｒｐｏＤプロモーター（Ｂ．ズブチリス（B subtilis）菌におけるσＡハウスキーピングσ因子のプロモーター）からのＦＮＡ発現と、増幅されたａｐｒＥプロモーターからのそれを比較した。ｒｐｏＤ及びａｐｒＥからＦＮＡを発現するＢＧ８０１０株を、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを用いて増幅した。細胞密度測定は実施例７に記載のように、ＦＮＡ発現は実施例８に記載のように、それぞれ検討した。図２０及び２１に結果を示す。全ての株からの細胞増殖はほぼ同等であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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