(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
近視を治療する薬物を製造するための、ＭＭＰ阻害剤の使用であって、
前記ＭＭＰ阻害剤は、
【化１】
0006300856.tif 000034
又はその互変異性体、医薬的に許容される塩もしくは溶媒和物であり、
ＭＭＰ阻害剤としてテトラサイクリンを使用する場合、テトラサイクリンの濃度は、２５０μＭ〜２．５ｍＭであり、
ＭＭＰ阻害剤としてドキシサイクリンを使用する場合、ドキシサイクリンの濃度は、２μＭ〜２ｍＭである、ＭＭＰ阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１２年５月２１日付けで出願された米国特許仮出願ＵＳ６１／６４９，６１１に基づいて優先権を主張する。
本発明は、ゼブラフィッシュをモデルとして用いて、薬物をスクリーニングする方法に関する。特に、本発明は、ルミカン（Ｌｕｍｉｃａｎ）の発現及びコラーゲン原線維形成（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）に影響を与え、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成により調節される疾患を治療するための候補化合物を同定する方法、及びこの方法により同定された候補化合物に関する。さらに、この方法により、近視及び／又は円錐角膜（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ）疾患を治療及び／又は予防するための薬物を同定する。
【背景技術】
【０００２】
近視は、全世界で最も一般的な眼疾患である。西洋諸国において、近視の有病率は約１６％〜２７％であり、アジア諸国ではより高い可能性があり、例えば、シンガポールの中国人においては近視の有病率は８２％である。屈折異常（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｅｒｒｏｒ）が−６ジオプター（Ｄ）以下である場合、高度近視と定義され、また、白内障、緑内障、黄斑変性症や網膜剥離などを含む潜在的な合併症によって失明に至る可能性があるため、「病的近視」とも称される。遺伝的・環境的要因が、近視を引き起こす可能性がある。半分以上の近視患者は、眼が視軸に沿って伸長することによる軸性近視（ａｘｉａｌ  ｍｙｏｐｉａ）を患っていると推定される。出生時の人間の眼球サイズは、成人の眼球の約三分の二であり、軸方向に相対的に短い。従って、幼児は遠視の傾向があると推論される。小児期に眼が成長するにつれて、角膜と水晶体の光学特性の代償性微調整（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｆｉｎｅ  ｔｕｎｉｎｇ）が生じ、眼球の長さを増加させる。通常、この過程の全てが実際に完全に生じて、眼が正視（ｅｍｍｅｔｒｏｐｉｃ）となる。しかし、この微調整プロセスが失敗した場合、通常、伸長された眼球が形成される。その結果、遠いイメージが網膜の面の前方に焦点が合わされ、軸性近視となる。臨床試験において、抗コリン薬（例えば、アトロピン）のみが、近視の進展のコントロールに用いられる。しかし、近視の進展をコントロールするために長期間でアトロピンを用いることは、視覚のぼけ、便秘、発汗減少、睡眠困難、目まい、眠気、口・鼻・皮膚の乾燥、頭痛、食欲不振、味覚喪失、吐き気や神経質などの副作用を引き起こす可能性がある。従って、近視をコントロール、予防及び／又は治療するための代替薬の開発が求められている。
【０００３】
強膜の菲薄化、特に後極（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｐｏｌｅ）での強膜の菲薄化は、人間の高度近視が進展する重要な特徴である。霊長類において、強膜は、繊維状の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）であり、コラーゲン（主にＩ型コラーゲン）、エラスチン、プロテオグリカン及び他の成分からなり、強膜線維芽細胞から生じたラメラに配置されている（非特許文献１：Ａｌｅｘ  Ｇｅｎｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００３，  Ｖｏｌ．２７８，  Ｎｏ．１９，  ｐｐ．１６５８７−１６５９４）。強膜リモデリングは、多数の遺伝子産物（例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ））及びメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）の調節を含み、小直径コラーゲン原線維、低減したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の含量、低減したプロテオグリカン（例えば、デコリン）の合成及び増加したＭＭＰ−２を含む。また、コラーゲンＩ、ＭＭＰ−２、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−３及びＴＧＦ−βを含むいくつかのタンパク質には、ｍＲＮＡレベルでの選択的な変化が発見され、網膜由来信号が、強膜の遺伝子発現を調節して、強膜の組織をリモデリングし、強膜のクリープ速度を調節することを示すことが報告されている（非特許文献２：Ｊｏｈｎ  Ｔ．  Ｓｉｅｇｗａｒｔ  Ｊｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｔ．  Ｎｏｒｔｏｎ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．  ２００２  Ｊｕｌｙ；４３（７）：２０６７−２０７５）。強膜リモデリングは、近視の進展の本質をなし、それらの生化学的変化は、確実に強膜の生化学的特性の変化の先駆けとなり、最終的に、近視の進展につながる。成人の強膜には、アグリカン、ビグリカン及びデコリンといった三つのプロテオグリカンが含まれ、強膜の構造特性に寄与する。これらのプロテオグリカンの割合は、強膜の状態による。デコリン及びビグリカンは、小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰｓ）に属し、前記ＳＬＲＰｓは、ルミカン、ＤＳＰＧ−３（デルマタン硫酸プロテオグリカン３、ＰＧ−Ｌエピフィカン）、フィブロモジュリン、ＰＲＥＬＰ（プロリン−アルギニンリッチ及びロイシンリッチ反復タンパク質）、ケラトカン、コンドロアドヘリン及びオステオグリシンをも含む。デコリン、ビグリカン、ルミカン及びフィブロモジュリンは、Ｉ型コラーゲンに結合し、マトリクスの集合及び組織化に影響を与える。動物実験において、プロテオグリカンの合成速度は、眼球の成長及び近視の進展に著しく影響を与える。マーモセットの強膜において、デコリンの合成速度は、硝子体腔の伸長率に逆相関する。強膜におけるビグリカン及びルミカンのｍＲＮＡレベルは、実験的に誘発された近視の期間で低減し、回復の期間で増加する。ルミカンは、小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）の一つであり、角膜基質、大動脈、皮膚骨格筋、肺、腎臓、骨、軟骨や椎間板などの間質性コラーゲンマトリックスにおける主な細胞外成分の一つである。
【０００４】
角膜組織においては、ルミカンは、ケラチン硫酸鎖を含み、プロテオグリカンとして存在する。非角膜組織においては、ルミカンは、低硫酸化又は非硫酸化の糖タンパク質（５０〜５７ｋＤａ）として存在する。その広い分布は、組織形態形成および組織恒常性の維持に関して、ルミカンが多機能を有することを暗示する。これは、ルミカンノックアウトマウス（ｌｕｍｉｃａｎ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ）から観察された多数の臨床症状によって証明される。前記マウスは、角膜混濁、皮膚と腱の脆弱、創傷治癒の遅延及び低い繁殖力を示す。確かに、ルミカンは、コラーゲン原線維形成の調節により角膜透明性に、上皮細胞移動の調節により創傷治癒に、及び、損傷した水晶体の上皮−間葉の転移に、それぞれ重要な役割を担うことを示した。ルミカン欠損マウス及びＬｕｍ（−／−）Ｆｍｏｄ（−／−）マウスは、コラーゲン繊維直径の変化及び高度近視の特徴を示すため、それらのプロテオグリカンが、強膜の生体力学的特性に重要な役割を担うことを表す。また、高度近視の連鎖研究によって、潜在的な遺伝子座ＭＹＰ１（Ｘｑ２８）及びＭＹＰ３（１２ｑ２１−２３）を同定し、それは数個のＳＬＲＰ遺伝子の近くに位置するか又はそれを含み、ビグリカン（Ｘｑ２７ｔｅｒ）、デコリン（１２ｑ２１−２２）、ルミカン（１２ｑ２１．３−２２）及びＤＳＰＧ３（１２ｑ２１）を含む。ＭＹＰ３も、イギリスにおいて、家族での常染色体優性の高度近視患者の２５％の原因となる。従って、近視進展に関連する候補遺伝子は、ＭＹＰ３に位置し、デコリン、ルミカン及びＤＳＰＧ３を含み、注目されている。最近では、ＳＬＲＰ遺伝子における新規な１４個の突然変異は、高度近視と関係があり、例えば、ＬＵＭ遺伝子におけるｃ．８９３−１０５Ｇ＞Ａは、保護的な役割を担うことができるか、または保護的対立遺伝子（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｌｌｅｌｅ）と連鎖不均衡になる。
【０００５】
ゼブラフィッシュは、生物学および発生の分子遺伝学を研究するための、一般的な脊椎動物モデルである。実験室において、ゼブラフィッシュは、大量に簡単に管理される（成魚の長さは３〜４ｃｍである）。発生学と遺伝方法論とを組み合わせることにより、ゼブラフィッシュを強力な研究ツールとすることが確立されている。透明な胚は、原腸胚形成から器官形成までの基礎的な脊椎動物発生の過程を可能とする。また、胚の眼、心拍及び血液循環は簡単に観察される。感触、視覚及び行動反応は、解剖顕微鏡の下で生きた胎で監視される。ゼブラフィッシュは、いくつかの特徴、例えば、３〜４ヶ月の短い世代時間により、遺伝学研究に特別に適用されるものとなっている。ほとんどの従来の研究では、化学的変異原ＥＮＵにより生じた多数の眼の突然変異を含み、縮小された眼球サイズ、組織の乱れた網膜、単眼症、縮減された神経節細胞層、及び光受容体の減少が報告されている。Ｌｕｎｇ−Ｋｕｎ  Ｙｅｈらは、ゼブラフィッシュのケラトカン及びルミカンの遺伝子を単離・解析し、それらの進展において、ゼブラフィッシュのルミカンのノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）の後、小児近視の臨床所見に対応・関連する増加された眼球サイズを発見した。小児近視において、人間ルミカンの遺伝子プロモーターにＳＮＰの変化がある小児では、眼球の軸方向伸長（ａｘｉａｌ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）と類似する所見がある。減少されたゼブラフィッシュルミカンのプロモーター活性は、このＳＮＰと関連していると考えられる。この研究において、多数の小型ロイシンリッチポリペプチドの一つであるルミカンは、原線維形成及び眼の発生に重要な役割を担って、眼球サイズに影響を与える可能性があることを示す（非特許文献３：Ｌｕｎｇ−Ｋｕｎ  Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１０，  Ｖｏｌ．２８５，  Ｎｏ．３６，  ｐｐ．２８１４１−２８１５５）。この先行技術文献では、アンチセンスｚｌｕｍモルフォリノによるｚｌｕｍ発現の下方調節によって、軸性近視と類似する眼球拡大が、強膜におけるコラーゲン原線維の配置の破壊に起因して、強膜の菲薄化を引き起こすことが証明され、また、ゼブラフィッシュの幼魚のｉｎ  ｖｉｖｏ分析によって、アトロピンやピレンゼピンなどのムスカリン性受容体拮抗薬が、モルフォリノによる眼球拡大を効率的に抑制することが暗示される。従って、この先行技術文献には、ゼブラフィッシュが、近視を治療する化合物をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｖｏモデルとして用いられることが提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｌｅｘ  Ｇｅｎｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００３，  Ｖｏｌ．２７８，  Ｎｏ．１９，  ｐｐ．１６５８７−１６５９４
【非特許文献２】Ｊｏｈｎ  Ｔ．  Ｓｉｅｇｗａｒｔ  Ｊｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｔ．  Ｎｏｒｔｏｎ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．  ２００２  Ｊｕｌｙ；４３（７）：２０６７−２０７５
【非特許文献３】Ｌｕｎｇ−Ｋｕｎ  Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１０，  Ｖｏｌ．２８５，  Ｎｏ．３６，  ｐｐ．２８１４１−２８１５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、依然として、実際の近視薬を実現するために、ゼブラフィッシュモデルの応用をさらに研究して、近視をコントロール、予防及び／又は治療するための有効な薬物をスクリーニングすることが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、大きな眼（ｂｉｇ  ｅｙｅ）を有するゼブラフィッシュを用いて、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成に影響を与える、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療するための候補化合物を同定する方法を提供する。この方法は、試験化合物を大きな眼を有するゼブラフィッシュと接触させること、及び前記ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記試験化合物を候補化合物と定義することを含む。
【０００９】
また、本発明は、ルミカン遺伝子及び／又はコラーゲン原線維形成関連遺伝子ノックダウンゼブラフィッシュを用いて、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成に影響を与える、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療するための候補化合物を同定する方法を提供する。この方法は、試験化合物をルミカン遺伝子及び／又はコラーゲン原線維形成関連遺伝子ノックダウンゼブラフィッシュと接触させること、前記ゼブラフィッシュの大きな眼の数を計測すること、及び前記ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記試験化合物を候補化合物と定義することを含む。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、ゼブラフィッシュを用いて、近視および円錐角膜疾患を治療及び／又は予防するための候補薬をスクリーニングするプラットフォームを用いる。本発明は、ＳＬＲＰｓの中の一つであるルミカンが、ゼブラフィッシュの原線維形成または眼球サイズに影響を与える遺伝子の調節においては重要な役割を担い、また、臨床近視においても重要な役割を担うことを発見した。従って、本発明は、構築されたゼブラフィッシュモデルを用いて、さらに、ルミカンの発現、コラーゲン原線維形成、及び眼球サイズの調節に影響を与える薬物を同定する。これらの薬物は、近視及び円錐角膜疾患を治療するための有力な候補薬であり、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、抗コリン性またはムスカリン性化合物、及びＣＯＸ阻害剤を含むが、これらに限定されていない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｚＬｕｍノックダウン魚の３〜７ｄｐｆ（ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ−ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、受精後の日数）での一連の形態学的変化を示す図である。眼の発生と相まって、ｚＬｕｍ  ＫＤ魚では、強膜の拡大が起こる。５日目で、顕微鏡によって網膜剥離が明確に観察された。
【図２】眼球サイズでのルミカン遺伝子ノックダウンによる効果を示す図である。５ａ．形態計測的には、強膜幅が赤色線で示され、ＲＰＥ幅が白色線で示される。５ｂ．ルミカンモルファントと野生型とを、ＲＰＥ幅／強膜幅の割合で比較することによる結果は、ルミカンのノックダウンが、軸方向伸長に至る強膜の拡張に起因することを示す。
【図３】角膜基質（ＣＳ）、前部強膜（ＡＳ）及び後部強膜（ＰＳ）において、ｚＬｕｍ−ＭＯノックダウンが超微細構造変化を誘導することを示す図である。図３の（Ａ）は、トルイジンブルー染色された１２ｄｐｆ齢の野生型（ＷＴ）魚を示す。この図は、角膜基質（ＣＳ）、前部強膜（ＡＳ）及び後部強膜（ＰＳ）を示す。図３の（Ｂ）では、１２ｄｐｆ齢の野生型及びｚＬｕｍ−ＭＯ注入群に対して、角膜基質、前部強膜及び後部強膜において、コラーゲン原線維の直径が分析された。角膜基質及び前部強膜のコラーゲン原線維直径は、ｚＬｕｍ−ＭＯ群においては有意な増加があるが、後部強膜のコラーゲン原線維直径は、両群では有意な違いはない。図３の（Ｃ〜Ｈ）は、１２ｄｐｆ齢の段階での、（Ｃ、Ｄ）角膜基質、（Ｅ、Ｆ）前部強膜組織、（Ｇ、Ｈ）後部強膜組織における、（Ｃ、Ｅ、Ｇ）対照群と（Ｄ、Ｆ、Ｈ）ｚＬｕｍ−ＭＯ注入群とのコラーゲン原線維構造の形態比較を示す。（Ｃ）のＴＥＮ顕微鏡写真は、野生型において、角膜基質における規則的な、かつ小さいコラーゲン原線維構造を示す。（Ｄ）は、ｚＬｕｍ−ＭＯ注入群において、角膜基質における不規則な配列及び増加されたコラーゲン原線維直径を示す。（Ｅ）のＴＥＮ顕微鏡写真は、野生型において、前部強膜における比較的に規則的なコラーゲン原線維構造を示す。（Ｆ）は、ｚＬｕｍ−ＭＯ注入群において、前部強膜における不規則なコラーゲン原線維構造及び増加された原線維直径を示す。（Ｇ）は、頂部が網膜に隣接し、そのＴＥＮ顕微鏡写真は、野生型において、後部強膜におけるコラーゲン原線維構造を示す。（Ｈ）は、頂部が網膜に隣接し、そのＴＥＮ顕微鏡写真は、ｚＬｕｍ−ＭＯ注入群において、後部強膜における不規則なコラーゲン原線維構造を示す。（Ｃ〜Ｈ）中、スケールバーは１００ｎｍである。
【図４】ｚＬｕｍ−ＭＯ群での、強膜の菲薄化における超微細構造変化を示す図である。図４の（Ａ）は、頂部が網膜に隣接し、また、７ｄｐｆ齢の野生型（ＷＴ）魚の後部強膜において、層の間には、コラーゲン原線維構造を有する２又は３層の強膜線維芽細胞があることを示す。図４の（Ｂ）は、頂部が網膜に隣接し、また、７ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入群の後部強膜において、１層のみ又は２層の線維芽細胞があることを示す。図４の（Ｃ）には、７ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入群においては、強膜の菲薄化が明確に観察された。この現象は、１２ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入群魚においては、より顕著になる。特に、野生型に比べて、７ｄｐｆ齢及び１２ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入群の後部強膜においては、顕著な強膜の菲薄化が明確に観察された。（Ａ、Ｂ）中、スケールバーは１．５μｍである。
【図５】受精後２〜４日（２〜４ｄｐｆ）の４４個のゼブラフィッシュの胚における、ｚＬｕｍの発現を示す図である。ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）による３ｄｐｆのゼブラフィッシュの強膜において、ｚＬｕｍ  ｍＲＮＡが特異的に発現した。
【図６】ウエスタンブロット及びｍＲＮＡ回復分析を示す図である。（ａ）ウエスタンブロット分析において、ルミカンモルファントにおけるルミカン、コラーゲン１ａ１、ＴＧＦ−β及びＴＩＭＰ２が低下した。その一方、ＭＭＰ２の発現が増加した。（ｂ）異常に大きな眼は、ルミカン及びコラーゲン１ａ１  ｍＲＮＡｓによって回復することができるが、ｐｐｉｈ、ｈｓｐ  ４７及びｒｘｌ  ｍＲＮＡｓによっても回復することができ、それぞれ、コラーゲン原線維形成、及び眼の発生に関連する。
【図７】ゼブラフィッシュ薬物のスクリーニング分析を示す図である。図７の（Ａ、Ｂ）は、ゼブラフィッシュの網膜の色素性上皮層の外側縁（ＲＰＥ、赤色）及び強膜コートの直径（Ｄ、緑色）を定義・説明する二つの図である。図７の（Ｃ）は、７ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入群魚が、０．５％アトロピン（Ａ）及び０．２５％ピレンゼピン（Ｐ）で処理された場合、過度の軸方向伸長が顕著な低下したが、０．０１％メトクトラミン（Ｍ）（ｌ列目：ＷＴ、２列目：ＭＯ＋０．５％Ａ、３列目：ＭＯ＋０．２５％Ｐ、４列目：ＭＯ＋０．０１％Ｍ、５列目：ＭＯ）で処理された場合、過度の軸方向伸長には明確な変化がないことを示す。また、７ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入群魚が、０．５％アトロピン及び０．２５％ピレンゼピンで処理された場合、強膜コートの直径が顕著に低下したが、０．０１％メトクトラミン（６列目：ＷＴ、７列目：ＭＯ＋０．５％Ａ、８列目：ＭＯ＋０．２５％Ｐ、９列目：ＭＯ＋０．０１％Ｍ、１０列目：ＭＯ）で処理された場合、ｚＬｕｍ−ＭＯ注入群には明確な変化がない。図７の（Ｄ）は、ｚＬｕｍタンパク質の減少による眼球拡大の期間において、ＲＰＥ／強膜コートの割合（％）が顕著に低下したことを示す。いくつかのムスカリン性受容体拮抗薬（例えば、アトロピン、ピレンゼピン）によっては、ｚＬｕｍタンパク質の減少によるＲＰＥ／強膜コートの割合低下率が軽減されたが、メトクトラミンで処理された群（ｌ列目：ＷＴ、２列目：ＭＯ＋０．５％Ａ、３列目：ＭＯ＋０．２５％Ｐ、４列目：ＭＯ＋０．０１％Ｍ、５列目：ＭＯ）では、ＲＰＥ／強膜コートの割合低下率には明確な変化がない。
【図８】図８の（Ａ）は、７ｄｐｆ齢の野生型魚の正常表現型を示す。図８の（Ｂ）は、７ｄｐｆ齢のＲＳ−ＭＯ注入胚の正常表現型を示す。図８の（Ｃ）は、７ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入魚の明らかに拡大された眼球を示す。図８の（Ｄ）は、０．５％アトロピンで２日間処理された７ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入幼魚は、眼の拡大が明らかに低下したことを示す。図８の（Ｅ）は、０．２５％ピレンゼピンで２日間処理された７ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入幼魚も、眼の拡大が低下したことを示す。図８の（Ｆ）は、０．０１％メトクトラミンで処理された７ｄｐｆ齢のｚＬｕｍ−ＭＯ注入魚の正常表現型は、特に変化がないことを示す。
【図９】アトロピンが、ｚＬｕｍノックダウンモルファントを回復することを示す図である。ルミカンモルファントにおいて、低下したルミカン、コラーゲン１ａ１、ＴＧＦ−β、ＭＭＰ２及びＴＩＭＰ２の発現を、アトロピンによって、逆転することができる。
【図１０】マリマスタット、ドキシサイクリン、カプトプリル、ミノサイクリン塩酸塩、アトロピン、アスピリン、プロポフォール及びＮ−アセチルシステインで処理されたゼブラフィッシュの大きな眼の割合を示す図である。
【図１１−１】テトラサイクリン（図１１の（ａ））、及びミノサイクリン（図１１の（ｂ））、で処理されたゼブラフィッシュの大きな眼の割合を示す図である。
【図１１−２】ドキシサイクリン（図１１の（ｃ））、及びマリマスタット（図１１の（ｄ））で処理されたゼブラフィッシュの大きな眼の割合を示す図である。
【図１１−３】バチマスタット（図１１の（ｅ））で処理されたゼブラフィッシュの大きな眼の割合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本願の明細書及び特許請求の範囲に記載の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に指定しない限り、複数の形態を含む。例えば、「ａ  ｃｅｌｌ」という用語は、一つの群の細胞、又はその混合物を含む。
【００１３】
ここで、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（転写産物とも称す）がペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される過程を示す。
【００１４】
「対照」とは、比較を目的とする、実験に用いられる代替の対象またはサンプルである。
【００１５】
「試験化合物」及び「候補化合物」とは、任意の化学物質、薬剤、薬物であって、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成を増加させる、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療するという実用用途を達成するための候補物である。「試験化合物」は、従来知られた治療化合物と有力な治療化合物の両方を含む。「試験化合物」は、本発明のスクリーニング方法によって、治療効果を有するか否かを判定することができる。
【００１６】
「大きな眼」とは、網膜の色素性上皮層の軸方向長さを、強膜コートの軸方向長さで割った値が、０．７未満である眼である。
【００１７】
「治療」とは、疾患進展の遅延及び／又は進展すると予想される症状重症度の軽減を引き起こす行動である。この用語は、さらに、既存症状の改善または症状の予防を含む。
【００１８】
「治療有効量」とは、組織系、動物または人間の生物学的または薬学的反応を引き起こす薬物または薬剤の量であって、研究者または臨床医が求める量であり、少なくとも統計的に有意な割合の患者に対して、有益な効果、例えば、症状の改善、疾患の治療、疾患負荷の軽減などをもたらす量である。
【００１９】
「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、一般的に開示された、健康状態、疾患または病状の影響を受けやすい生体構造を含むものであるが、本願の明細書では限定されない。対象の例としては、人間（ヒト）、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ及びマウスを含む。「対象」という用語は、さらに、トランスジェニック種（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ）を含む。
【００２０】
「アルキル基」とは、例えば、Ｃ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１０、Ｃ１−Ｃ８、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ１−Ｃ４などの炭素原子数を有する、飽和の直鎖状のまたは分枝鎖状の非環状の炭化水素基である。飽和の直鎖状アルキル基の代表例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基及びｎ−デシル基などが挙げられる。飽和の分枝鎖状アルキル基の代表例としては、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、２−メチルヘキシル基、３−メチルヘキシル基、４−メチルヘキシル基、５−メチルヘキシル基、２，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルペンチル基、２，４−ジメチルペンチル基、２，３−ジメチルヘキシル基、２，４−ジメチルヘキシル基、２，５−ジメチルヘキシル基、２，２−ジメチルペンチル基、２，２−ジメチルヘキシル基、３，３−ジメチルペンチル基、３，３−ジメチルヘキシル基、４，４−ジメチルヘキシル基、２−エチルペンチル基、３−エチルペンチル基、２−エチルヘキシル基、３−エチルヘキシル基、４−エチルヘキシル基、２−メチル−２−エチルペンチル基、２−メチル−３−エチルペンチル基、２−メチル−４−エチルペンチル基、２−メチル−２−エチルヘキシル基、２−メチル−３−エチルヘキシル基、２−メチル−４−エチルヘキシル基、２，２−ジエチルペンチル基、３，３−ジエチルヘキシル基、２，２−ジエチルヘキシル基、３，３−ジエチルヘキシル基などが挙げられる。
【００２１】
「アルケニル基」とは、それ自体、または別の置換基の一部として、親のアルケンの単一の炭素原子からの１個の水素原子の除去によって生成され、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、不飽和の分枝状の、直鎖状のまたは環状のアルキル基である。基は二重結合についてシス配座またはトランス配座のいずれであってもよい。アルケニル基の代表例としては、エテニル基、プロパ−ｌ−エン−ｌ−イル基、プロパ−ｌ−エン−２−イル基、プロパ−２−エン−ｌ−イル基、プロパ−２−エン−２−イル基、シクロプロパ−ｌ−エン−ｌ−イル基、シクロプロパ−２−エン−ｌ−イル基などのプロペニル基、ブテ−ｌ−エン−ｌ−イル基、ブテ−ｌ−エン−２−イル基、２−メチル−プロパ−ｌ−エン−ｌ−イル基、ブテ−２−エン−ｌ−イル基、ブテ−２−エン−２−イル基、ブタ−ｌ，３−ジエン−ｌ−イル基、ブタ−ｌ，３−ジエン−２−イル基、シクロブテ−１−エン−ｌ−イル基、シクロブテ−ｌ−エン−３−イル基、シクロブタ−ｌ，３−ジエン−ｌ−イル基などのブテニル基などが挙げられるが、これらに限定されていない。一つの好ましい実施態様においては、前記アルケニル基はＣ２−Ｃ６アルケニル基である。
【００２２】
「アルキニル基」とは、それ自体、または別の置換基の一部として、親のアルキンの単一の炭素原子からの１個の水素原子の除去によって生成され、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、不飽和の分枝状の、直鎖状のまたは環状のアルキル基である。アルキニル基の代表例としては、エチニル基、プロパ−ｌ−イン−ｌ−イル基、プロパ−２−イン−ｌ−イル基などのプロピニル基、ブテ−ｌ−イン−ｌ−イル基、ブテ−ｌ−イン−３−イル基、ブテ−３−イン−ｌ−イル基などのブチニル基などが挙げられるが、これらに限定されていない。一つの好ましい実施態様においては、前記アルキニル基がＣ２−Ｃ６アルキニル基である。
【００２３】
「アリール基」とは、それ自体、または別の置換基の一部として、親の芳香族環系の単一の炭素原子からの１個の水素原子の除去によって生成され、所定の数の炭素原子（例えば、Ｃ１−Ｃ１５は、５〜１５個の炭素原子を示す）を有する、１価の芳香族炭化水素基である。アリール基の代表例としては、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキシレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−２，４−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレン及びそれらの水素異性体から生成され基が挙げられるが、これらに限定されていない。一つの好ましい実施態様においては、前記アリール基はＣ５−Ｃ１５アリール基であり、より好ましくは、Ｃ５−Ｃ１０アリール基である。
【００２４】
「ヘテロアリール基」とは、それ自体、または別の置換基の一部として、親の芳香族複素環系の単一の炭素原子からの１個の水素原子の除去によって生成され、所定の数の環原子（例えば、５〜１４員は、５〜１４個の環原子を示す）を有する、１価の芳香族複素環基である。ヘテロアリール基の代表例としては、アクリジン、ベンゾイミダゾール、ベンズイソオキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ベンゾフラン、ベンゾピロン、ベンゾチアジアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾトリアゾール、ベンズオキサジン、ベンゾオキサゾール、ベンゾオキサゾリン、カルバゾール、β−カルボリン、クロマン、クロメン、シンノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソオキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテン及びそれらの水素異性体から生成され基が挙げられるが、これらに限定されていない。一つの好ましい実施態様においては、前記ヘテロアリール基は５〜１４員のヘテロアリール基であり、より好ましくは、５〜１０員のヘテロアリール基である。
【００２５】
「医薬的に許容される塩及びプロドラッグ」とは、本発明に係る化合物のカルボン酸塩、酸付加塩または塩基付加塩、及びプロドラッグであって、医学的判断の範囲内で、患者の組織と接触するための用途に適し、毒性、炎症、アレルギー反応などが生じることなく、合理的な利益／リスクの割合を有し、本発明に係る化合物の目的とする用途に有効なものである。「塩」とは、本発明に係る化合物の相対的に非毒性な無機酸および有機酸付加塩である。前記塩は、化合物の最後の分離および精製、または精製化合物をその遊離塩基体（ｆｒｅｅ  ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ）で適切な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、塩を分離することにより、製造される。例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ金属及びアルカリ土類金属に基づくカチオン、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含む非毒性なアンモニウム、第４級アンモニウムおよびアミンカチオン（「Ｂｅｒｇｅ  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  １９７７；６６：１−１９」を参考文献として参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されていない。
【００２６】
1つの局面において、本発明は、大きな眼を有するゼブラフィッシュを用いて、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成に影響を与える、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療することができる候補化合物を同定する方法を提供する。この方法は、試験化合物を大きな眼を有するゼブラフィッシュと接触させること、及び前記ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記試験化合物を候補化合物と定義することを含む。一つの実施態様において、試験化合物で処理されていない対照群のゼブラフィッシュの大きな眼の総数に対して、ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、試験化合物を候補化合物と定義する。
【００２７】
他の局面において、本発明は、ルミカン遺伝子及び／又はコラーゲン原線維形成関連遺伝子ノックダウンゼブラフィッシュを用いて、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成に影響を与える、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療することができる候補化合物を同定する方法を提供する。この方法は、試験化合物をルミカン遺伝子及び／又はコラーゲン原線維形成関連遺伝子ノックダウンゼブラフィッシュと接触させること、前記ゼブラフィッシュの大きな眼の数を計測すること、及び前記ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記試験化合物を候補化合物と定義することを含む。一つの実施態様において、試験化合物で処理されていない対照群のゼブラフィッシュの大きな眼の総数に対して、ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、試験化合物を候補化合物と定義する。
【００２８】
一つの実施態様において、本発明は、ルミカンの発現及びコラーゲン原線維形成及び／又は眼球サイズの調節に影響を与える候補化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）ゼブラフィッシュの複数の受精胚に、ルミカン遺伝子及び／又はコラーゲン原線維形成関連遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡ、または前記アンチセンスｍＲＮＡのアナログを導入すること、
（ｂ）前記（ａ）で得られたゼブラフィッシュが、十分な長さの時間で試験化合物に暴露された後、ゼブラフィッシュを集めること、及び
（ｃ）ゼブラフィッシュの大きな眼の数を計測し、前記ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記試験化合物を候補化合物と定義すること。
【００２９】
好ましくは、前記（ａ）におけるアンチセンスｍＲＮＡは、ルミカン又はケラトカンのアンチセンスｍＲＮＡである。好ましくは、前記（ｂ）におけるノックダウンゼブラフィッシュは、その眼杯の形成期間において試験化合物に暴露される。好ましくは、前記（ｂ）によるゼブラフィッシュを、その角膜の確立段階において集める。好ましくは、ゼブラフィッシュの眼の総数または対照群のゼブラフィッシュの大きな眼の総数に対して、ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記（ｃ）における試験化合物を候補化合物と定義する。以上のことを考慮すると、前記方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）ゼブラフィッシュの複数の受精胚に、ルミカン遺伝子及び／又はコラーゲン原線維形成関連遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡ、または前記アンチセンスｍＲＮＡのアナログを導入すること、
（ｂ）前記（ａ）で得られたゼブラフィッシュが、十分な長さの時間で試験化合物に暴露された後、ゼブラフィッシュを集めること、及び
（ｃ）ゼブラフィッシュの大きな眼の数を計測し、ゼブラフィッシュの眼の総数または試験化合物で処理されていない対照群のゼブラフィッシュの大きな眼の総数に対して、ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記試験化合物を候補化合物と定義すること。
【００３０】
もう一つの実施態様において、本発明は、近視及び／又は円錐角膜疾患を治療及び／又は予防する候補化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）ゼブラフィッシュの複数の受精胚に、ルミカン遺伝子及び／又はコラーゲン原線維形成関連遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡ、または前記アンチセンスｍＲＮＡのアナログを導入すること、
（ｂ）前記（ａ）で得られたゼブラフィッシュが、十分な長さの時間で試験化合物に暴露された後、ゼブラフィッシュを集めること、及び
（ｃ）ゼブラフィッシュの大きな眼の数を計測し、前記ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記試験化合物を候補化合物と定義すること。
【００３１】
好ましくは、前記（ａ）におけるアンチセンスｍＲＮＡは、ルミカン又はケラトカンのアンチセンスｍＲＮＡである。好ましくは、前記（ｂ）におけるノックダウンゼブラフィッシュは、その眼杯の形成期間において試験化合物に暴露される。好ましくは、前記（ｂ）によるゼブラフィッシュを、その角膜の確立段階において集める。好ましくは、ゼブラフィッシュの眼の総数または対照群のゼブラフィッシュの大きな眼の総数に対して、ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記（ｃ）における試験化合物を候補化合物と定義する。以上のことを考慮すると、前記方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）ゼブラフィッシュの複数の受精胚に、ルミカン遺伝子及び／又はコラーゲン原線維形成関連遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡ、または前記アンチセンスｍＲＮＡのアナログを導入すること、
（ｂ）前記（ａ）で得られたゼブラフィッシュが、十分な長さの時間で試験化合物に暴露された後、ゼブラフィッシュを集めること、及び
（ｃ）ゼブラフィッシュの大きな眼の数を計測し、ゼブラフィッシュの眼の総数または試験化合物で処理されていない対照群のゼブラフィッシュの大きな眼の総数に対して、ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記試験化合物を候補化合物と定義すること。
【００３２】
「スクリーニング分析」は、ルミカンノックダウンゼブラフィッシュの拡大された眼球の割合の低下を、化合物（ルミカンの発現及びコラーゲン原線維形成に影響を与える、および近視及び円錐角膜疾患を治療及び／又は予防する化合物）の指標として用いて、ルミカンの発現、コラーゲン原線維形成および眼球サイズの調節に影響を与える、および近視及び円錐角膜疾患を治療及び／又は予防するための候補化合物を同定する方法を提供する。
【００３３】
前記分析において同定された化合物は、（ｉ）ルミカンの発現、コラーゲン原線維形成および眼球サイズの調節に影響を与える、及び／又は（ｉｉ）近視及び円錐角膜疾患の治療及び／又は予防に関連する化合物に発展させるためのリード化合物として用いる、候補化合物である。
＜ゼブラフィッシュのケラトカン及びルミカンの遺伝子＞
【００３４】
ルミカンは、いくつかのＳＬＲＰｓの中の一つであり、ゼブラフィッシュの原線維形成または眼球サイズに影響を与える遺伝子の調節においては重要な役割を担い、また、臨床近視においても重要な役割を担う。人間及びマウスのケラトカン及びルミカンの遺伝子と類似して、ゼブラフィッシュのケラトカン及びルミカンの遺伝子は、ＳＬＲＰｓの全ての構造特性、即ち、ロイシンリッチ反復の中央ドメインの両側には、保存されたシステインを有するＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインが配置されているという構造特性を有する。ゼブラフィッシュのケラトカン及びルミカンの遺伝子は、サイズと構造が、哺乳類のケラトカン及びルミカンの遺伝子と類似している。興味深いことに、ゼブラフィッシュのケラトカン及びルミカンの遺伝子は、いずれも、同じゲノムにマップしている。また、哺乳類のケラトカン及びルミカンの遺伝子と類似して、ゼブラフィッシュのケラトカン及びルミカンの遺伝子は、ＴＡＴＡ不在遺伝子である。また、ゼブラフィッシュと哺乳類とでは、角膜におけるケラトカン及びルミカンの発現において、最も著しい違いは、前者が、間質細胞層（角膜実質細胞）にではなく、主に角膜の上皮層に発現していることにある。これも、発生生物学において、非常に有望な研究分野である。
＜ノックダウンゼブラフィッシュ＞
【００３５】
驚くべきことに、眼球サイズの増加（即ち、大きな眼）は、ゼブラフィッシュの成長期間において、ゼブラフィッシュのルミカン、ケラトカン及び／又はコラーゲン原線維形成に関連する遺伝子でのノックダウンと関係があり、その臨床症状が、小児近視の臨床所見と類似している。小児近視において、小児の眼球の軸方向伸長は、患者の人間ルミカン遺伝子プロモーターにおけるＳＮＰの変化と関連している。アンチセンスまたはそのアナログを用いたノックダウンによる、ゼブラフィッシュのルミカン、ケラトカン及び／又はコラーゲン原線維形成に関連する遺伝子の発現レベルの低下は、前記ＳＮＰを有する患者に観察された軸方向伸長を引き起こす分子機構を模倣することができる。本発明によれば、ゼブラフィッシュの受精胚にルミカンのアンチセンスｍＲＮＡを導入することにより、ルミカンノックダウンゼブラフィッシュが得られる。一つの実施態様において、ルミカンのアンチセンスはモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）である。好ましくは、このモルフォリノは、５’−ＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣ−３’という配列を有する。
＜ノックダウンゼブラフィッシュが試験化合物に暴露されること、及び結果としてのゼブラフィッシュを集めること＞
【００３６】
胚形成期間において、外部成長及び光学的透明度は、初期発育過程の視覚分析を可能にさせ、また、高い繁殖力と短い世代時間は、遺伝分析を容易にする。成魚のゼブラフィッシュは正視であり、成魚の紫外線波長に対する反応により、可視光波長と紫外線波長の両方を透過することができることが証明される。ゼブラフィッシュの眼の成長は、他の種類の魚及び哺乳類の眼の成長と類似している。約１２ｈｐｆ（ｈｏｕｒｓ  ｐｏｓｔ−ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、受精後の時間数）の時点で、眼の原基から開始される。２４  ｈｐｆの時点で、眼杯が良好に成長し、約３０ｈｐｆの時点で、腹部基底（ｖｅｎｔｒｏｎａｓａｌ）網膜の小領域に、神経節細胞が見つかる。５０ｈｐｆの時点で、網膜層が、網膜の明らかな横切部分となる。小児のゼブラフィッシュは遠視であり、７２ｈｐｆの時点で、正視になると同時に、外眼筋が成魚のように見え、視運動反応が明らかになる。
【００３７】
本発明によれば、ノックダウンゼブラフィッシュが、その眼杯の形成期間において、試験化合物に暴露される。通常、受精後の約２４時間後、ゼブラフィッシュの眼杯が形成される。ノックダウンゼブラフィッシュは、その眼杯の形成期間において、試験化合物に暴露されてもよい。ノックダウンゼブラフィッシュと試験化合物とが接触した後、この試験化合物が有力な候補薬であれば、ルミカンの発現及びコラーゲン原線維形成の活性化を開始することができるため、眼球拡大を低下させ、近視及び／又は円錐角膜疾患を治療及び／又は予防することができる。受精後の約４８時間後、網膜水晶体が形成され、受精後の約７２時間後、強膜及び角膜が形成される。強膜及び角膜の形成段階において、ゼブラフィッシュを集める。
＜ゼブラフィッシュの大きな眼の計測、及び候補化合物の同定＞
【００３８】
ゼブラフィッシュの大きな眼は、近視の指標である。「大きな眼」とは、眼球の拡大された軸方向長さを有する眼であって、網膜の色素性上皮層の軸方向長さを、強膜コートの軸方向長さで割った値が、０．７未満である眼である。前記網膜の色素性上皮層の軸方向長さ、及び前記強膜コートの軸方向長さは、従来の任意の方法、例えば、解剖顕微鏡により測定することができる。
【００３９】
ゼブラフィッシュの眼の総数または試験化合物で処理されていない対照群のゼブラフィッシュの大きな眼の総数に対して、ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が低下した場合、前記試験化合物を候補化合物と定義する。この候補化合物は、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成及び／又は眼球サイズの調節に影響を与える、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療及び／又は予防するための候補化合物である。好ましくは、ゼブラフィッシュの眼の総数または試験化合物で処理されていない対照群のゼブラフィッシュの大きな眼の総数に対して、ゼブラフィッシュの大きな眼の割合が３０％未満である場合、前記試験化合物を候補化合物と定義する。好ましくは、前記割合は１５％未満である。より好ましくは、前記割合は、約０％〜約３０％、約０％〜約２５％、約０％〜約２０％、約０％〜約１５％、約０％〜約１０％、約１％〜約３０％、約１％〜約２５％、約１％〜約２０％、又は約１％〜約１５％と低下する。
【００４０】
また、試験化合物のスクリーニングは、ゼブラフィッシュの大きな眼の割合を３０％未満に低下させる試験化合物群を同定することにより、達成される。大きな眼の割合を低下させる試験化合物は、「候補化合物」とも呼ばれる。
本発明の新規なスクリーニング方法は、ルミカンノックダウンゼブラフィッシュの大きな眼の割合を低下させる化合物の同定に用いられる。この同定された化合物としては、例えば、有機のまたは無機の小分子（分子量が１，０００Ｄａ未満のもの）、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、または炭水化物などが挙げられる。「試験化合物」とは、任意の化合物であってもよく、例えば、高分子（ポリペプチド、タンパク質複合体、糖タンパク質、または核酸）または小分子（アミノ酸、ヌクレオチド、有機化合物または無機化合物）が挙げられる。前記試験化合物は、１０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の式量、５，０００ｇ／ｍｏｌ未満の式量、１，０００ｇ／ｍｏｌ未満の式量、または５００ｇ／ｍｏｌ未満の式量を有してもよい。前記試験化合物は、自然発生的なもの（例えば、ハーブまたは天然物）、人工的に合成されたもの、または自然発生的なものと人工的に合成されたものとを含むものであってもよい。試験化合物の例は、メタロプロテアーゼ阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β経路活性剤、ＴＧＦ−β阻害剤及びＣｏｘ阻害剤を含む。
＜ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成に影響を与える、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療する方法における、メタロプロテアーゼ阻害剤の使用＞
【００４１】
一つの実施態様において、本発明は、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成によって調節される疾患、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療する方法であって、治療有効量のＭＭＰ阻害剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
メタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）は、細胞増殖、移動（接着・分散）、分化、血管形成、アポトーシス及び宿主防御などの細胞行動に、重要な役割を担うとも思われる。メタロプロテアーゼ阻害剤は、従来知られている。生化学的物質を含む例としては、メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、α２−マクログロブリン及びそれらのアナログ又は誘導体が挙げられる。多数の小さいペプチド様化合物が、メタロプロテアーゼを阻害することは既に記述されている。チオール基を有するアミド又はペプチジルアミドに基づくメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤は、例えば、Ｗ０９５／１２３８９、ＷＯ９６／１１２０９及び米国特許第４，５９５，７００号に記載される。ヒドロキサメート基を有するＭＭＰ阻害剤は、多数の公開された特許文献、例えば、炭素骨格化合物が開示されたＷＯ９５／２９８９２、ＷＯ９７／２４１１７、ＷＯ９７／４９６７９及びＥＰ０７８０３８６、及び、ペプチジル骨格又はペプチド模倣骨格を有するヒドロキサメートが開示されたＷＯ９０／０５７１９、ＷＯ９３／２００４７、ＷＯ９５／０９８４１及びＷＯ９６／０６０７４において、開示されている。また、他のピリミジン系ＭＭＰ阻害剤、ヒドロキシピロン系ＭＭＰ阻害剤、リン系ＭＭＰ阻害剤及びテトラサイクリン系ＭＭＰ阻害剤も報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．，  ２００６，  ２５：１１５−１３６を参照のこと）。
【００４２】
本発明の一つの実施態様によれば、前記ＭＭＰ阻害剤は、下記式（Ｉ）：
【化１】
0006300856.tif 000002
で示されるペプチド模倣ヒドロキサメートＭＭＰ阻害剤、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、立体異性体もしくは鏡像異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）である。
その中、Ｑは、存在しない、または
【化２】
0006300856.tif 000003
である。
Ｘは、Ｃ１−１０アルキレン基、Ｃ２−１０アルケニレン基又はＣ２−１０アルキニレン基であり、これらは非置換のもの、あるいは１個以上のＯＨ、直鎖状のもしくは分枝鎖状のＣ１−１０アルキル基、直鎖状のもしくは分枝鎖状のＣ２−１０アルケニル基、Ｃ１−１０アルキルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルケニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルスルファニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルスルホニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルスルフィニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルオキシ基またはＣ５−１５アリール基で置換されたものである。
Ｙは、Ｃ１−１０アルキレン基、Ｃ２−１０アルケニレン基又はＣ２−１０アルキニレン基であり、それらは、非置換のもの、あるいは１個以上のＯＨ、直鎖状のもしくは分枝鎖状のＣ１−１０アルキル基、直鎖状のもしくは分枝鎖状のＣ２−１０アルケニル基、Ｃ１−１０アルキルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルケニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルスルファニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルスルホニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルスルフィニルＣ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルオキシ基、Ｃ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルＣ５−１５アリール基、Ｃ５−１４ヘテロアリール基、Ｃ１−１０アルキルＣ５−１４ヘテロアリール基、またはＣ１−１０アルキルスルファニルＣ５−１４ヘテロアリール基で置換されたものである。但し、前記Ｑが存在しない場合、ＹはＣ５−１４ヘテロアリール基である。このヘテロアリール基は、任意に置換されたものであり、Ｎ、Ｏ及びＳから独立に選ばれる１〜３個のヘテロ原子を有するものである。
Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ５−１５アリール基、Ｃ１−１０アルキルＣ５−１５アリール基、Ｃ５−１４ヘテロアリール基、またはＣ１−１０アルキルＣ５−１４ヘテロアリール基である。
【００４３】
好ましくは、Ｑが存在しない場合、Ｙは
【化３】
0006300856.tif 000004
である。より好ましくは、Ｑが存在しない場合、Ｙは
【化４】
0006300856.tif 000005
であり、Ｒ１はＣ５−１４ヘテロアリール基である。最も好ましくは、Ｑが存在しない場合、Ｙは
【化５】
0006300856.tif 000006
であり、Ｒ１は
【化６】
0006300856.tif 000007
である。
【００４４】
好ましくは、Ｑが
【化７】
0006300856.tif 000008
である場合、Ｘは−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）２）−、又は−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）２）ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）２）ＣＨ（ＣＨ２−Ｓ−フェニル）−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）２）ＣＨ（ＯＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）２）−、又は−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）２）ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）２）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）２）ＣＨ（ＯＨ）−、又は−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）２）ＣＨ（ＣＨ２−Ｓ−チエニル）−であり、Ｙは−ＣＨ（ＣＨ２−フェニル）−、−ＣＨ（Ｃ（ＣＨ３）３）−又は−ＣＨ（ＣＨ２−インドリル）−であり、Ｒ１はＣＨ３又はフェニル基である。
【００４５】
より好ましくは、前記式（Ｉ）で示される化合物は、
【化８】
0006300856.tif 000009
からなる群から選ばれるもの、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、立体異性体もしくは鏡像異性体である。
【００４６】
本発明のもう一つの実施態様によれば、前記ＭＭＰ阻害剤は、下記式（ＩＩ）：
【化９】
0006300856.tif 000010
で示される四環系ＭＭＰ阻害剤、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグもしくは溶媒和物である。
その中、Ｒ１及びＲ６は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１−１０アルキルＣ５−１４ヘテロアリール基、又はＣ１−１０ＮＲ７Ｒ８を表す。
Ｒ２は、水素原子又はＯＨである。
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＯ、ＣＮ、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルケニル基又はＣ１−１０アルキニル基を表す。
Ｒ５は、水素原子、ハロゲン原子、ＮＨ２、ＯＨ、ＮＯ、ＣＮ、Ｃ１−１０アルキル基、ＮＨＣ１−１０アルキル基、Ｎ（Ｃ１−１０アルキル）２基、Ｃ５−１５アリール基又はＣ５−１４ヘテロアリール基である。
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１−１０アルキルＣ１−１０アルキルＮＨ２ＣＯＯＨであるか、又はそれぞれが結合している窒素原子と一緒に３〜８員のヘテロアリール基を形成する。
その中、前記ヘテロアリール基は、Ｎ、Ｏ及びＳから独立に選ばれる１〜３個のヘテロ原子を有する。
【００４７】
好ましくは、Ｒ１はＨであり、Ｒ６はＨ、−ＣＨ２−ピロリル基、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＨであり、Ｒ２はＨ又はオキソ基（ｏｘｏ）であり、Ｒ３はＨ又はＯＨであり、Ｒ４はＨ又はＯＨであり、Ｒ５はＮＨ２、Ｎ（ＣＨ３）２又はハロゲン原子である。
【００４８】
より好ましくは、前記式（ＩＩ）で示される化合物は、
【化１０−１】
0006300856.tif 000011
【化１０−２】
0006300856.tif 000012
からなる群から選ばれるもの、又はその互変異性体、医薬的に許容される塩、プロドラッグもしくは溶媒和物である。
【００４９】
本発明のもう一つの実施態様によれば、前記ＭＭＰ阻害剤は、下記式（ＩＩＩ）：
【化１１】
0006300856.tif 000013
で示されるジアリールエーテルヒドロキサメートＭＭＰ阻害剤、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、立体異性体もしくは鏡像異性体である。
その中、
Ｒ１は、ハロゲン原子、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＣ１−１０アルキル基であり、これらは非置換のもの、又は１〜３個のハロゲン原子もしくはＮＨ２で置換されたものである。
Ｑは、存在しない、又はＯである。
Ｘは、Ｏ又はＳ（Ｏ）２である。
Ｙは、ＣＨ２又はＮＨである。
Ｚは、Ｎ、Ｏ及びＳから独立に選ばれる１〜３個のヘテロ原子を有するＣ５−１４ヘテロアリール基、又は
【化１２】
0006300856.tif 000014
である。
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル基、
【化１３】
0006300856.tif 000015
又は、非置換の、もしくはＮ、Ｏ及びＳから独立に選ばれる１〜３個のヘテロ原子で置換されたＣ５−１４ヘテロアリール基を表す。あるいは、Ｒ２及びＲ４は、それぞれが結合している炭素原子と一緒に、非置換の、又はＣＮもしくはＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルキルＣ５−１５アリール基で置換された５員の飽和の複素環基を形成する。
【００５０】
好ましくは、Ｑが存在しない場合、Ｒ１はＯＣ（ハロゲン）３であり、ＸはＯであり、ＹはＣＨ２であり、Ｚは
【化１４】
0006300856.tif 000016
であり、また、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ、
【化１５】
0006300856.tif 000017
を表すか、あるいは、Ｒ２及びＲ４は、炭素原子又は窒素原子と一緒に、
【化１６】
0006300856.tif 000018
を形成する。
【００５１】
好ましくは、ＱがＯである場合、Ｒ１はハロゲン原子又はＯＣ（ハロゲン）３であり、ＸはＳ（Ｏ）２であり、Ｚは
【化１７】
0006300856.tif 000019
である。
【００５２】
好ましくは、ＱがＯである場合、Ｒ１はハロゲン原子又はＯＣ（ハロゲン）３であり、ＸはＳ（Ｏ）２であり、ＹはＮＨであり、Ｚは
【化１８】
0006300856.tif 000020
であり、また、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１−１０アルキル基、
【化１９】
0006300856.tif 000021
を表す。
【００５３】
より好ましくは、前記式（ＩＩＩ）で示される化合物は、
【化２０−１】
0006300856.tif 000022
【化２０−２】
0006300856.tif 000023
からなる群から選ばれるもの、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、立体異性体もしくは鏡像異性体である。
【００５４】
本発明のさらにもう一つの実施態様によれば、前記ＭＭＰ阻害剤は、下記式：
【化２１】
0006300856.tif 000024
で示される化合物、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、立体異性体もしくは鏡像異性体である。
【００５５】
より好ましくは、前記ＭＭＰ阻害剤は、マリマスタット、バチマスタット、ＣＬ−８２１９８、ミノサイクリン、テトラサイクリン又はドキシサイクリンである。
＜ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成に影響を与える、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療する方法における、ＴＧＦ−β阻害剤の使用＞
【００５６】
一つの他の実施態様において、本発明は、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成によって調節される疾患、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療する方法であって、治療有効量のＴＧＦ−β阻害剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００５７】
形質転換増殖因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ、ＴＧＦ−βとも称す）は、多機能性ポリペプチド因子の大きなスーパーファミリーに属する。ＴＧＦ−βは、多数の細胞型（上皮細胞を含む）における成長停止の強力な誘発剤である。その活性は、がんにおけるＴＧＦ−β伝達系の腫瘍抑制因子ルールの基礎となっている。他の活性は、ＴＧＦ−βにより誘発された上皮−間葉の分化を含み、がん進行の一因となる。ＰＣＴ特許出願ＷＯ０２／０９４８３３２には、ジヒドロピロロピラゾール系化合物が、強化されたＴＧＦ−β伝達活性もしくは過剰生産に関する疾患の治療に用いられることが開示されている。ＵＳ７，６３８，５３７及びＵＳ７，６３５，７０２には、ピラゾール系化合物及びイミダゾール系化合物を、ＴＧＦシグナル伝達経路の強力阻害剤として提供することが開示されている。
【００５８】
本発明の一つの実施態様によれば、前記ＴＧＦ−β阻害剤は、
【化２２−１】
0006300856.tif 000025
【化２２−２】
0006300856.tif 000026
からなる群から選ばれるもの、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、立体異性体もしくは鏡像異性体である。
【００５９】
好ましくは、前記ＴＧＦ−β阻害剤は、ロサルタン、Ｎ−アセチルシステイン、プロポフォール及びカプトリルである。
＜ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成に影響を与える、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療する方法における、ＣＯＸ／ＬＯＸ阻害剤の使用＞
【００６０】
もう一つの他の実施態様において、本発明は、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成によって調節される疾患、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療する方法であって、治療有効量のＣＯＸ／ＬＯＸ阻害剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００６１】
ＣＯＸ酵素は、アラキドン酸をプロスタグランジンエンドペルオキシドＰＧＨ２に変換させ、他のプロスタグランジンを形成する。多数の薬物が、ＣＯＸ酵素又はＬＯＸ酵素のこの作用を阻害する。
【００６２】
本発明によれば、前記ＣＯＸ／ＬＯＸ阻害剤は、
【化２３】
0006300856.tif 000027
からなる群から選ばれるもの、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、立体異性体もしくは鏡像異性体である。
【００６３】
好ましくは、前記ＣＯＸ／ＬＯＸ阻害剤は、アスピリンである。
＜ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成に影響を与える、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療する方法における、抗コリン性又はムスカリン性化合物の使用＞
【００６４】
さらに、もう一つの他の実施態様において、本発明は、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成によって調節される疾患、及び／又は近視及び／又は円錐角膜疾患を治療する方法であって、治療有効量の抗コリン性又はムスカリン性化合物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００６５】
本発明によれば、前記抗コリン性又はムスカリン性化合物は、
【化２４】
0006300856.tif 000028
からなる群から選ばれるもの、又はその医薬的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、立体異性体もしくは鏡像異性体である。
【００６６】
好ましくは、前記抗コリン性又はムスカリン性化合物は、アトロピンである。
【００６７】
候補化合物の具体例としては、以下の表に示される。
【表１−１】
0006300856.tif 000029
【表１−２】
0006300856.tif 000030
【表１−３】
0006300856.tif 000031
【００６８】
好ましい例としては、以下の表に示されるものが挙げられるが、それらに限定されていない。
【表２】
0006300856.tif 000032
【００６９】
上記化合物のいずれも、医薬的に許容される担体と組み合わせて、製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）、結合剤（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、調合剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）（これらの用語は同じ意味で用いることができる）を形成することができる。「医薬的に許容される担体」とは、本発明の化合物を対象に運搬または輸送して、効果を発揮させることができる医薬的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体又は固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などである。典型的に、前記化合物は、一つの器官または体の一部から、もう一つの器官または体の一部へ、運搬または輸送される。各担体は、製剤における他の成分に適合し、患者に有害ではないという意味において、「許容される」ものであることが必要である。医薬的に許容される担体として機能する材料の例としては、糖類、例えば、ラクトース、グルコース及び蔗糖；スターチ、例えば、コーンスターチ及びジャガイモスターチ；セルロース類又はその誘導体、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びセルロースアセテート；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター及び座薬ワックス；油類、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；グリコール類、例えば、プロピレングリコール；ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；エステル類、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質除去水（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ）；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；並びに医薬製剤に用いられる他の無毒性・相溶性のある物質が含まれる。
【００７０】
本発明の組成物は、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、及び着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味芳香剤、保存剤および酸化防止剤を含んでもよい。
【００７１】
医薬的に許容される酸化防止剤の例としては、水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；並びに金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
【００７２】
本発明の製剤は、経口、経鼻、局所、経皮、頬側、舌下、直腸、経膣及び／又は非経口の投与に適したものを含む。前記製剤は、簡便に単位用量形態（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）で存在してもよく、医薬分野で周知の方法により製造することができる。担体材料と結合して単一の用量形態を製造する活性成分の量は、一般的に、治療効果を生み出す化合物の量である。通常、製剤の総重量を１００％とする場合、この活性成分の量は約１％〜約９９％の範囲であり、好ましくは約５％〜約７０％であり、より好ましくは約１０％〜約３０％である。
【００７３】
本発明の医薬製剤は、さらに、医薬組成物／製剤によく見られる他の添加成分を、当該技術分野で確立された使用レベルで含んでもよい。したがって、例えば、本発明の組成物・製剤は、追加の相溶性薬理活性物質、例えば、かゆみ止め剤、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤などを含むか、または、本発明の組成物のさまざまな剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加物質、例えば、染料、香料、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定剤などを含み得る。しかし、そのような物質を添加する場合、本発明の治療化合物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の生物活性に必要以上に干渉するものであってはならない。本発明の製剤は、滅菌されており、必要に応じて、製剤中の治療化合物と有害な相互作用をしない助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を支配する塩、緩衝剤、着色剤、矯味及び／又は香味の物質などと混合することができる。他の医薬製剤は、便利に単位用量形態で提供されることが可能であり、医薬品産業においてよく知られた従来の技術に従って調製可能である。通常、そのような技術は、活性成分を製薬用の担体または賦形剤とともに会合させる工程を含む。前記製剤は、一般に、活性成分を液体担体もしくは微粉固体担体または両方とともに均一か密接に会合させ、次いで必要な場合は生成物を成形することにより調製される。
【００７４】
前記製剤又は組成物の製造方法は、本発明に係る化合物を担体及び任意の一種以上の副成分に会合させる工程を含む。通常、前記製剤は、本発明に係る化合物を液体担体もしくは微粉固体担体または両方とともに均一か密接に会合させ、次いで必要な場合は生成物を成形することにより調製される。
【００７５】
経口投与に適した本発明の製剤は、各々所定の量の本発明に係る化合物を活性成分として含む、カプセル剤、カセット、ピル、錠剤（ｔａｂｌｅｔｓ）、トローチ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）（風味基剤、例えば、蔗糖およびアカシアもしくはトラガカントを用いる）、粉末、顆粒として、または水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップとして、または香錠（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）（不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、または蔗糖およびアカシアを用いる）及び／又は口内洗浄液として製造することができる。本発明に係る化合物は、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）、舐剤またはペースト剤として投与されてもよい。
【００７６】
本発明の経口投与用（カプセル剤、錠剤、ピル、糖衣錠、粉末、顆粒など）の固体用量形態（ｓｏｌｉｄ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）において、活性成分を、一種以上の医薬的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウム又は第二リン酸カルシウム、及び／又は以下の任意成分と混合する：フィラーまたは増量剤、例えば、スターチ、ラクトース、蔗糖、グルコース、マンニトール及び／又はケイ酸；バインダー、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、蔗糖及び／又はアカシア；保湿剤、例えば、グリセロール；崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモスターチまたはタピオカスターチ、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム；溶液遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、例えば、パラフィン；吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物；湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート；吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイト粘土；潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体状のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物；並びに着色剤。カプセル剤、錠剤及びピルの場合では、医薬組成物が緩衝剤を含んでもよい。似たようなタイプの固体状組成物は、ラクトース、乳糖及び高分子量ポリエチレングリコールを賦形剤として用いた軟質又は硬質のゼラチンカプセル内のフィラーとして、機能する。
【００７７】
錠剤は、必要に応じて一種以上の副成分と圧縮または成形することにより製造することができる。圧縮錠は、バインダー（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロー）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いることにより製造することができる。成形錠は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することにより製造することができる。
【００７８】
本発明の前記錠剤及び前記医薬組成物の他の固体用量形態、例えば、糖衣錠、カプセル剤、ピル及び顆粒などは、それぞれ独立に、腸溶コーティング及び医薬製剤分野で知られた他のコーティングなどのコーティング又はシェルにより取得または製造される。それらは、活性成分の徐放または制御放出を達成するように調製することができ、例えば、異なる割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、所期の放出特性、他のポリマーマトリクス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを提供する。それらは、例えば、細菌保持フィルター（ｂａｃｔｅｒｉａ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｌｔｅｒ）でろ過すること、または、使用直前に滅菌水もしくは他の無菌性の注入可能な媒質に溶解された無菌性固体組成物のフォームに滅菌剤を添加することにより、滅菌することができる。それらの組成物は、必要に応じて乳白剤を含んでもよく、また、活性成分のみを放出する、または、胃腸管の特定の部分に優先的に放出する、必要に応じて遅延である組成物であってもよい。包埋組成物の例としては、高分子物質及びワックスを含む。活性成分は、マイクロカプセル化された形態であってもよく、必要に応じて一種以上の上記賦形剤を有する。
【００７９】
不活性希釈剤を除き、経口組成物は、アジュバントとして、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、着色剤、芳香剤及び保存剤を含んでもよい。
【００８０】
懸濁液においては、活性化合物に加えて、懸濁化剤として、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにそれらの混合物を含んでもよい。
【００８１】
本発明に係る化合物の局所または経皮投与用の用量形態は、粉末、スプレー剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を含む。活性化合物は、無菌条件下で、医薬的に許容される担体、及び必要に応じて任意の保存剤、緩衝剤又は推進剤と混合してもよい。
【００８２】
前記軟膏、ペースト、クリーム及びゲルにおいては、本発明の活性化合物に加えて、賦形剤として、動物及び植物の脂肪（ｆａｔ）、油（ｏｉｌ）、ワックス（ｗａｘ）、パラフィン、スターチ、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、並びにそれらの混合物を含んでもよい。
【００８３】
前記粉末及びスプレー剤においては、本発明に係る化合物に加えて、賦形剤として、ラクトース、タルク、ケイ酸、アルミニウムヒドロキシド、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、並びにそれらの混合物を含んでもよい。また、スプレー剤は、さらに、クロロフルオロ炭化水素などの通常の推進剤、及びブタンやプロパンなどの揮発性の非置換の炭化水素を含んでもよい。
【００８４】
経皮貼布は、本発明に係る化合物の人体への送達を調節するという追加利点を有する。その用量形態は、前記化合物を適切な媒質に溶解又は分散することにより、製造することができる。吸収促進剤は、皮膚にわたる化合物の流動（ｆｌｕｘ）を増加させることができる。前記流動の速度は、膜をコントロールする速度を提供すること、又は活性化合物をポリマーマトリクスもしくはゲルに分散することより、調節される。
【００８５】
眼科用製剤、眼軟膏、粉末、溶液なども、本発明の範囲に含まれる。前記溶液は、任意の眼疾患の治療に用いられる。眼への直接投与に特に用いられる医薬組成物は、点眼剤（ｅｙｅ  ｄｒｏｐ）として製剤された水溶液及び／又は懸濁液、および眼科用ゲルもしくは軟膏として製剤された高粘度溶液及び／又は懸濁液を含む。点眼剤の製造に用いられる懸濁液における水性の溶液及び希釈剤は、蒸留水、生理食塩水などを含む。懸濁液における非水性の溶液及び希釈剤は、植物油、流動パラフィン、鉱油、プロピレングリコール、ｐ−オクチルドデカノール及び類似の溶媒を含む。様々な添加剤は、必要に応じて、点眼剤、眼科用ゲル及び／又は眼科用軟膏に含まれることができる。添加剤としては、緩衝剤、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｚｅｒｓ）、保存剤、増粘剤、安定剤、酸化防止剤、ｐＨ調節剤、キレート剤を含むが、これらに限定されていない。緩衝剤は、添加されることによりｐＨを一定に保つことができ、また、医薬的に許容される緩衝剤、例えば、ホウ酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、酒石酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤及び酢酸塩緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤は、予期された生理学的条件に十分な緩衝能を提供する量を含む。緩衝剤に加えて、調合剤を涙と等張化させるために、点眼剤に等張化剤を添加することができる。等張化剤としては、糖類、例えば、グルコース、蔗糖及びフルクトース；糖アルコール類、例えば、マンニトール及びソルビトール；多価アルコール類、例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコール；並びに塩類、例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びコハク酸ナトリウム；を含むが、これらに限定されていない。等張化剤は、点眼剤の浸透圧を涙と同等にさせるような量で添加される。保存剤は、点眼剤及び／又は眼軟膏の完全性を維持するために、添加することができる。保存剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、パラベン、クロロブタノール及びベンジル型アルコール（ｂｅｎｚｙｌｉｃ  ａｌｃｏｈｏｌ）が挙げられるが、これらに限定されていない。いくつかの実施態様において、増粘剤は、眼科用調合剤（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、例えば、点眼剤、眼科用ゲル及び／又は眼科用軟膏の粘度を増加させるために用いられる。増粘剤は、グリセロール、ポリエチレングリコール及びカルボキシビニルポリマーを含むが、これらに限定されていない。上記で述べた内容に加えて、いくつかの実施態様において、安定剤、例えば、亜硫酸ナトリウム及びプロピレングリコール；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙ  ｔｏｌｕｅｎｅ、ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、トコフェロール、チオ硫酸ナトリウム；及び／又はキレート剤、例えば、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）及びクエン酸ナトリウムを用いることが望ましいが、これらに限定されていない。点眼剤、眼科用ゲル及び／又は眼科用軟膏は、無菌操作法、または、製造プロセスにおいて適切な段階で選択的に滅菌することに��り製造することができる。滅菌方法は、加熱滅菌、照射滅菌及びろ過を含むが、これらに限定されていない。眼科用軟膏（眼軟膏）は、眼軟膏を製造をするための基剤に活性成分を混合し、製剤をこの技術分野において知られた任意の方法で医薬品製剤とすることにより、無菌で製造することができる。眼軟膏に用いられる典型的な基剤としては、ワセリン、ｊｅｌｅｎｅ  ５０、プラスチベース及びマクロゴールが例示される。また、親水性を増加させるために、界面活性剤を添加することができる。
【００８６】
前記治療化合物は、持続放出型製剤（ｔｉｍｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、例えば、徐放性ポリマーを含む組成物で投与することができる。これらの化合物は、例えば、移植物及びマイクロカプセル化運搬システムを含む放出制御製剤として、急速な放出を防止する担体と調製することができる。生分解性・生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧ）が、用いられる。前記製剤の製造方法は、一般にこの技術分野で知られている。
【００８７】
局所投与用の医薬組成物及び製剤は、経皮貼布、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、スプレー剤、液体及び粉末を含んでもよい。通常の医薬的な担体、水性物、粉末又は油性基剤、増粘剤などが望ましい。いくつかの実施態様において、局所用の製剤は、例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤などの局所送達剤と混合する前記治療化合物を含む。脂質及びリポソームの例としては、中性のもの（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、  陰性のもの（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））及びカチオン性のもの（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））を含む。前記治療化合物は、リポソームに封入されてもよく、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。また、前記化合物は、脂質、特にカチオン性脂質と複合化することができる。
好ましい脂肪酸およびエステルは、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンもしくはＣ１−１０  アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステート、ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はそれらの医薬的に許容される塩を含むが、これらに限定されていない。
【００８８】
本発明のいくつかの実施態様において、医薬組成物は、エマルションとして製造・製剤化することができる。エマルションは、典型的には、一種の液体を液滴（通常、液滴径が０．１μｍを越える）として、もう一種の液体に分散した不均一系である。（Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ１，  ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｖｏｌｕｍｅ１，  ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ２，  ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９８５，  ｐ．３０１を参照のこと）。エマルションは、通常、相互に密に混合・分散した、非相溶性の二つの液相を含む二相系である。一般的に、エマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）又は水中油型（ｏ／ｗ）であってもよい。大量の油相に、水相が細かく分離されるか又は微細な液滴として分散されることにより得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。また、大量の水相に、油相が細かく分離されるか又は微細な液滴として分散されることにより得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬の外、溶液として水相、油相に、又は分離相として存在する追加成分を含んでもよい。必要に応じて、エマルションに、医薬賦形剤、例えば、乳化剤、安定剤、染料及び酸化防止剤を存在させることもできる。医薬エマルションは、二つ以上の相（例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ））を含む多重エマルション（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）であってもよい。このような複合製剤は、通常、単純な二成分エマルションにはない、一定の利点を提供する。多重エマルションにおいて、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションの個々の油液滴が、小さい水液滴を包み込んで、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションを構成する。同様に、油液滴系が水球に包み込まれて、油連続相で安定化され、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）エマルションを提供する。エマルションの特性は、熱力学的安定性が少なく、もしくはない。通常、前記エマルションの分散相又は不連続相は、良好に外部又は連続相に分散され、その形式が乳化剤又は製剤の粘度により維持される。エマルション型の軟膏ベース及びクリームである場合、エマルションのいずれかの相が、半固体又は固体である。安定化エマルションは、エマルションのいずれかの相に組み込まれる乳化剤を用いることが必要である。乳化剤としては、以下の４種類に大別される：合成界面活性剤、自然発生的乳化剤、吸収性基剤、及び微細分散した固体（Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．１９９を参照のこと）。合成界面活性剤は、界面活性剤としても知られており、エマルションの製剤に広い適用性を有し、文献に掲載されている（Ｒｉｅｇｅｒ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ１，  ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８８，  ｖｏｌｕｍｅ１，  ｐ．１９９）。界面活性剤は、典型的には、両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性部分に対する親水性部分の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれて、製剤の製造において、界面活性剤の分類及び選択には重要な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質により、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性の異なる種類に分類されることが可能である（Ｒｉｅｇｅｒ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ１，  ｐ．２８５を参照のこと）。自然発生的乳化剤は、製剤の製造に用いられ、ラノリン、蜜ろう、リン脂質、レシチン及びアカシアが含まれる。吸収性基剤は、親水性特性を有し、水を吸収して油中水型（ｗ／ｏ）エマルションを形成しながら、その半固体の整合性を保持するものであり、例えば、脱水ラノリン及び親水性ワセリンである。微細分散した固体は、特に、粘性調合剤において界面活性剤との組み合わせでは、乳化剤としても好ましく用いられる。これらは、極性の無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウム、色素並びに無極性の固体、例えば、炭素又はグリセリルトリステアレートを含む。多種類の非乳化材料は、製剤の製造にも含まれ、乳化剤の性質に寄与する。それらは、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族エステル、保湿剤、親水コロイド、保存剤及び酸化防止剤を含む（Ｂｌｏｃｋ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋ���ｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ１，  ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ１，  ｐ．１９９を参照のこと）。
【００８９】
非経口投与（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に適する医薬組成物は、一種以上の本発明に係る化合物と、一種以上の医薬的に許容される無菌の等張の水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、あるいは無菌の粉末（使用直前に注射用溶液もしくは分散液として再構成するもの）とを含んでおり、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、溶質（製剤を所定の被投与者の血液と等張にするもの）、懸濁化剤または増粘剤を含んでもよい。
【００９０】
本発明の医薬組成物に含まれてもよい適切な水性もしくは非水性の担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレンなど）及びそれらの適切な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、及び注射用の有機エステル、例えば、オレイン酸エチルを含む。適切な流動性は、コーティング材（例えば、レシチン）の使用、分散剤での所要の粒径の維持、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。
【００９１】
前記組成物は、アジュバント、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含んでもよい。様々な抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含有することにより、微生物の行動を予防することができる。組成物には、等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなどが含まれることが望ましい。また、注射用医薬製剤型の持続的吸収は、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）の含有によってもたらされる。
【００９２】
本発明の調合剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、経口投与、非経口投与、局所投与または経直腸投与であってもよい。それらは、当然、それぞれの投与経路に適する剤型で投与される。例えば、それらは、錠剤もしくはカプセル剤を注射、吸入することによって投与され、洗眼液、軟膏、坐剤などを注射、点滴もしくは吸入することによって投与され；ローションもしくは軟膏によって局所投与され；および坐剤によって経直腸投与される。好ましくは、静脈注射投与である。
【００９３】
「非経口投与」及び「非経口的に投与される」とは、腸内投与及び局所投与以外の投与方法であり、通常、注射による、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、嚢内、硬膜外、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）及び胸骨内の注射並びに点滴を含むが、これらに限定されていない。
【００９４】
前記化合物は、治療のために、経口投与、経鼻投与（例えば、スプレーによる）、経直腸投与、膣内投与、非経口投与、嚢内投与及び局所投与（粉末、軟膏または点滴剤による）、口腔内投与並びに舌下投与を含む適切な投与経路により、人間及びその動物に投与することができる。
【００９５】
選択された投与経路を問わず、本発明の化合物は、適切な水和形態（ｈｙｄｒａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）に用いられる、及び／又は、本発明の医薬組成物は、当該技術分野における通常の技術で知られる従来の方法により、医薬的に許容される用量形態に製剤化される。
【００９６】
本発明の医薬組成物において、活性成分の実際の用量レベルを変化させることにより、患者に毒性がなく、特定の患者、組成物及び投与方法に対する望ましい治療反応を達成するのに有効である活性成分の量を得ることができる。
【００９７】
選択された用量レベルは、本発明の特定化合物（又はそのエステル、塩もしくはアミド）の活性、投与経路、投与時間、前記特定化合物の排出速度、治療期間、前記特定化合物と組み合わせるための他の薬物、化合物及び／又は材料、治療対象となる患者の年齢、性別、体重、条件、全体的な健康状態及び以前の病歴、並びに医療技術分野でよく知られた因子などを含む因子の変化によって決められる。
【００９８】
当該技術分野における通常の技術を有する医師または獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定して処方することができる。例えば、前記医師または獣医師は、医薬組成物における本発明に係る化合物の初期投与量を必要量よりも低いレベルとし、所期の効果を達成するまで用量を徐々に増やすことにより、所期の治療効果を達成することができる。
【００９９】
本発明は、いくつかのＳＬＲＰｓの中の一つであるルミカンが、ゼブラフィッシュの原線維形成または眼球サイズに影響を与える遺伝子の調節においては重要な役割を担い、また、臨床近視においても重要な役割を担うことを発見した。本発明は、構築されたゼブラフィッシュモデルを用いて、ルミカンの発現、コラーゲン原線維形成、及び眼球サイズの調節に影響を与える薬物を同定する。試験化合物は、ルミカンの調節及びコラーゲンの合成に基づいて、ＴＧＦ−β経路及び後続のＭＭＰ２、ＴＩＭＰ調節により、試験される。本発明においては、現在、ＴＧＦ−β経路またはＭＭＰ及びＴＩＭＰ活性の臨床的及び関連的な調節に用いられる、約３０種の臨床的に利用可能なＦＤＡ認可された薬物が、試験される。結果は、ＭＭＰ阻害剤（マリマスタット、ドキシサイクリン及びミノサイクリン）、コラゲナーゼ阻害剤（Ｎ−アセチルシステイン）、ＴＧＦ−β経路活性剤（プロポフォール）、ＴＧＦ−β阻害剤（カプトリル）及びＣｏｘ阻害剤（アスピリン）が有効な候補化合物であることを示す。
【実施例】
【０１００】
（材料と方法）
＜水産養殖＞
ゼブラフィッシュを、従来構築されたプロトコルに従って飼育及び維持した（Ｓｏｕｌｅｓ  ＫＡ，  Ｌｉｎｋ  ＢＡ．  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｙｅ．  ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００５；５：１２を参照のこと）。すべての実験は、２８℃で１４時間照光及び１０時間暗闇のサイクルで育てられ、標準方法で維持されたテュービンゲンＡＢゼブラフィッシュ（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ  ＡＢ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）を用いて行われた。胚を、形態学的基準（体節数）に従って段階分けして（Ｋｉｍｍｅｌ  ＣＢ，  Ｂａｌｌａｒｄ  ＷＷ，  Ｋｉｍｍｅｌ  ＳＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  １９９５；２０３（３）：２５３−３１０を参照のこと）、受精後の時間数で時間を計る。ゼブラフィッシュのハンドブック（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｂｏｏｋ；  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  （Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）．  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ３００Ｐ．，１９９３を参照のこと）に記載されたように、胚は、自然な対交配により生じた。交配ごとに４±５対と設定し、対ごとに平均に１００±１５０個の胚が生じた。ゼブラフィッシュの胚が、光学的に透明なものであるため、殺処分または解剖する必要がなく、内臓器官の機能的及び形態学的な変化を観察することが可能となる。絨毛膜を、手動によりＤｕｍｏｎｔ  Ｗａｔｃｈｍａｋｅｒ’ｓ  Ｆｏｒｃｅｐｓ  Ｎｏ．５で除去した。
＜ゼブラフィッシュのルミカンのクローン＞
【０１０１】
現在、ゼブラフィッシュのゲノムは、既にＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒで配列が決定され、Ｈｅａｌｔｈ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅのｔｒａｎｓ−Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓにより、ゲノムの実質的な注釈が行われる。人間及びマウスＳＬＲＰファミリータンパク質と高い配列相同性を共有する推定タンパク質をコードするゼブラフィッシュの発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ、ＥＳＴ）クローンを同定するために、本発明は、完全長の人間ルミカンｃＤＮＡ配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析を応用した。ゼブラフィッシュのルミカン遺伝子の５’部分を含む、約４．６ｋｂのＮｏｔ  Ｉ／ＭｌｕｌゼブラフィッシュのゲノムＤＮＡフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にサブクローンされた。インサートは、Ｔ３、Ｔ７及びｗａｌｋ−ｉｎプライマーを用いて、国立台湾大学の分子遺伝学部のＤＮＡコアにより、配列を決定した。ｚＬｕｍ  ｍＲＮＡの５’−及び３’−末端を、それぞれｃＤＮＡ  ＥＮＤ（５’−ＲＡＣＥ）の５’−迅速増幅及び３’−ＲＡＣＥシステムを用いて、増幅した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｎｄ，ＣＡ）。５’−ＲＡＣＥ実験において、１μｇのゼブラフィッシュの眼の全ＲＮＡを、ｚＬｕｍ遺伝子のエクソン２の配列に対応する第１のルミカン特異的プライマーにより、逆転写した。ＲＮＡ鋳型を、ＲＮａｓｅ混合物の処理により、分解した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより、ｃＤＮＡの３’−末端に、ポリＤｃｔｐの尾部を添加した。前記ｃＤＮＡは、アブリッジドアンカープライマー（ａｂｒｉｄｇｅｄ  ａｎｃｈｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ）との結合においてエクソン１とエクソン２との接合部に由来する配列に対応する第２の遺伝子特異的プライマーにより、増幅された。得られたＰＣＲ産物を、１００倍に希釈し、鋳型として用いて、汎用の増幅プライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒ）との結合において第３の遺伝子特異的プライマーにより、再増幅した。３’−ＲＡＣＥについては、ｚＬｕｍ遺伝子のエクソン３の配列に対応する第４の遺伝子特異的プライマーにより、ＰＣＲが行われた。サイクル条件は：９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で３分間の３４サイクルを行って、サイクルの後、７２℃で１０分間の伸長を行った。最後に、５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物はゲル精製され、その配列はジデオキシ配列決定プロトコルにより測定された。ｚＬｕｍ遺伝子の転写開始部位及び転写終結部位は、それぞれ、ゲノムのＤＮＡ、５’−ＲＡＣＥ産物、及び３’−ＲＡＣＥ産物の配列比較により、測定された（Ｙｅｈ  ＬＫ，  Ｌｉｕ  ＣＹ，  Ｋａｏ  ＷＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｌｕｍｉｃａｎ  ｇｅｎｅ  （ｚｌｕｍ）  ｃａｕｓｅｓ  ｓｃｌｅｒａｌ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｓｃｌｅｒａｌ  ��ｏａｔｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１０；２８５（３６）：２８１４１−５５を参照のこと）。
第１のルミカン特異的プライマー：５’−ＡＧＴＡＧＡＧＧＴＡＴＴＴＧＡＴＴＣＣＧＧＴＣ−３’；
第２のルミカン特異的プライマー：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＣＧ−３’；
第３のルミカン特異的プライマー：５’−ＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＡＣ−３’；
第４の遺伝子特異的プライマー：５’−ＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＧ−３’；
アブリッジドアンカープライマー：５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ−３’；
汎用の増幅プライマー：５’−ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３’．
＜モルフォリノノックダウン＞
【０１０２】
モルフォリノ（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）は、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、特異的ｍＲＮＡの翻訳開始部位またはスプライス受容・供与部位とハイブリダイズするようにデザインすることができる（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ  Ａ，  Ｅｋｋｅｒ  ＳＣ．  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ‘ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ’  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００；２６（２）：２１６−２０を参照のこと）。モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ，Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）は、デザインされ、５’−非翻訳領域及び／又は隣接領域を標的にするように合成され、それぞれの遺伝子の翻訳開始コドンを含む。ＭＯ配列は以下のようにデザインされる：ｚＬｕｍ−ＭＯ，５’−ＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣ−３’。このオリゴヌクレオチドは、翻訳開始コドンの−８〜＋１７の配列と相補する。ｚＬｕｍ−ＭＯ対照群としてのランダム配列ＭＯ（ＲＳ−ＭＯ）：５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ−３’。このＲＳ−ＭＯは、標的特異性を有しない標準的対照オリゴヌクレオチドとしてＧｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓから得られた（Ｙｅｈ  ＬＫ，  Ｌｉｕ  ＣＹ，  Ｋａｏ  ＷＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｌｕｍｉｃａｎ  ｇｅｎｅ  （ｚｌｕｍ）  ｃａｕｓｅｓ  ｓｃｌｅｒａｌ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｓｃｌｅｒａｌ  ｃｏａｔｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１０；２８５（３６）：２８１４１−５５を参照のこと）。
【０１０３】
モルフォリノを、滅菌水において１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度に再懸濁し、滅菌水で６８０ｎｇ／ｎＬに希釈した。前記モルフォリノを、単細胞段階で０．００２３ｎＬの体積で注射する。ここで、ＧＡＰＤＨで注射された胚を対照群として、ウエスタンブロット法により分析し、タンパク質レベルでのモルフォリノの効果を同定する。
＜全胚ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション＞
【０１０４】
ホールマウントＩＳＨは、胚及び初期幼魚の時空的遺伝子発現パターンを確立する迅速かつ効率的な方法であることが主な利点である。胚は、異なる段階で得られ、４℃で、ｌｘ  ＰＢＳに４％パラホルムアルデヒドで一夜固定された。ＰＢＳで３回洗った後、これらの胚を１００％メタノールに移動させ、使用直前まで−２０℃で貯蔵した。すべての胚は、メラニン形成を予防するために、０．００３％フェニルチオ尿素（ＰＴＵ）で処理された。ホールマウントＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｔｈｉｓｓｅ  Ｃ，  Ｔｈｉｓｓｅ  Ｂ．  Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２００８；３（ｌ）：５９−６９を参照のこと）に従って行われた。ハイブリダイゼーション信号は、Ｒｏｃｈｅの推奨手順に従って、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）抗体−アルカリホスファターゼ接合体で視覚化された（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮを参照のこと）。
＜抗体＞
【０１０５】
ゼブラフィッシュのルミカン抗体は、アフィニティー精製した抗ｚＬｕｍ抗体であって、ｚＬｕｍ  ｃＤＮＡから推定される１８Ｎ末端アミノ酸残基に対応する合成ペプチドＮ末端ペプチド（Ｎ’−ＣＮＥＲＮＬＫＦＩＰＩＶＰＴＧＩＫＹ−Ｃ）に対する抗体であり、ゼブラフィッシュのルミカンの検出に用いられる。ウサギ抗体の産生のために、前記ペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に接合した。前記抗体を、メーカーの使用説明書に従って、Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋゲル（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に前記ゼブラフィッシュのルミカンのオリゴヌクレオチドが接合された免疫吸着カラムにより精製した。精製された抗ゼブラフィッシュルミカン抗体を含む画分（Ｆｒａｃｔｉｏｎ）を収集及び濃縮し、分光光度計で２８０ｎｍにおけるタンパク質濃度を測定した（Ｙｅｈ  ＬＫ，  Ｌｉｕ  ＣＹ，  Ｋａｏ  ＷＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｌｕｍｉｃａｎ  ｇｅｎｅ  （ｚｌｕｍ）  ｃａｕｓｅｓ  ｓｃｌｅｒａｌ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｓｃｌｅｒａｌ  ｃｏａｔｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０１０；２８５（３６）：２８１４１−５５を参照のこと）。
【０１０６】
ルミカンノックダウンの効果を評価するために、複数の抗体を用いて、それらの抗体はいずれも異なるメーカーから得ることができる。ウサギ抗ＴＧＦβ２抗体、ウサギ抗ＭＭＰ−２抗体、ヤギ抗ＴＩＭＰ−２抗体、ヤギ抗Ｃｏｌｌａｌ抗体（Ｌ−１９）及びヤギ抗ＰＤＩ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから得られる。マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体は、Ａｂｎｏｖａから得られる。
＜ウエスタンブロット法＞
【０１０７】
プロテアーゼ阻害剤（０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、０．３μＭアプロチニン、ｌＯμＭベスタチン、ｌＯμＭ  Ｅ−６４、ｌＯμＭロイペプチン）を含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０）において、タンパク質をゼブラフィッシュの胚から抽出する。ウエスタンブロットの準備において、受精後３日（３ｄａｙ−ｐｏｓｔ−ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の１００個の胚を、ｌＯＯμｌのＲＩＰＡ緩衝液において超音波で分解し、２０分間微量遠心した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥを行う前に、いくつかの強膜タンパク質抽出物のアリコット（ａｌｉｑｕｏｔ）を、３７℃で０．１ｕｎｉｔ／ｍｌエンド−β−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で一夜消化し、上清タンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲルにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（３０μｇ  ｐｅｒ  ｌａｎｅ）で分解し、免疫ブロットのために、孔径０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移動させた。ルミカンは、抗ゼブラフィッシュルミカンＮ末端ペプチド抗体（０．１μｇ／ｍｌ、その詳細は上記に記載されたとおり）を用いて測定された。ＧＡＰＤＨは、等価荷重の対照として、モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）により免疫染色された。抗ウサギ抗体（１：１，０００）及び抗ヤギ抗体（（１：２，５００）ＨＲＰ結合二次抗体は、適切な一次抗体と組み合わせて用いる。抗体反応性は、化学発光（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ（登録商標）  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ及びＡＰ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により測定された。
【０１０８】
人間の強膜細胞を、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ウェル培養プレートに播種し、３７℃で異なる濃度のＭＭＰ阻害剤で２４時間培養した。ＭＭＰ阻害剤を添加していない培養物を対照群とした。２４時間培養した後、タンパク質抽出のために細胞を採取した。タンパク質を抽出し、プロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液で均質化した。分光光度法により、タンパク質含有量を定量化した。同等のタンパク質含有量を有するサンプルを、１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、ＰＶＤＦ膜に電気泳動的に移動させた。ブロット膜を４℃で５％脱脂乳を含むＰＢＳ溶液で一夜培養し、非特異的抗原をブロックし、希釈された一次抗体で１〜２時間培養した。実験に用いられた一次抗体は、以下のとおり：抗ＴＧＦβ１抗体、抗ＴＧＦβ２抗体、抗ＴＧＦβ３抗体、抗ＭＭＰ２抗体、抗ＭＭＰ９抗体、抗ＴＩＭＰ２抗体、及びＧＡＰＤＨ。
一次抗体反応の後、二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼが接合されたヤギ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ウサギＩｇＧと前記膜とを室温で１時間培養し、化学発光試薬Ｐｌｕｓ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ）で検出し、膜に暴露された。異なるＭＭＰ阻害剤で処理するか否かによる、タンパク質発現パターンを比較した。
＜ｚＬｕｍｉｃａｎプロモータートランスジェニック魚＞
【０１０９】
ゼブラフィッシュにおいて、遺伝子機能は、アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド用いて、迅速にかつ確実に研究することができる（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ  Ａ，  Ｅｋｋｅｒ  ＳＣ．  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ‘ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ’  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００；２６（２）：２１６−２０；  Ｈｅａｓｍａｎ  Ｊ．  Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｓ：  ｍａｋｉｎｇ  ｓｅｎｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ？  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００２；２４３（２）：２０９−１４を参照のこと）。また、トランスジェニックのｌｉｎｅｓ７０（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＡＥ，  Ｂａｌｃｉｕｎａｓ  Ｄ，  Ｍｏｈｎ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００３；２６３（２）：１９１−２０２；  Ｋｕｒｉｔａ  Ｋ，  Ｂｕｒｇｅｓｓ  ＳＭ，  Ｓａｋａｉ  Ｎ．  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｓｐｅｒｍ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００４；１０１（５）：１２６３−７を参照のこと）、標的突然変異（  Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ  Ｅ，  Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｍｅｒｋｅｒ  Ｓ，  Ｗａｌｄｅｒｉｃｈ  Ｂ，  Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ＲＨ．  Ｔａｒｇｅｔ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｒａｇ１  ｇｅｎｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２；２９７  （５５７８）：９９−１０２を参照のこと）、及び核移植によるクローニング（Ｌｅｅ  ＫＹ，  Ｈｕａｎｇ  Ｈ，  Ｊｕ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｏｎｅｄ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｒｏｍ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２；２０（８）：７９５−９を参照のこと）が既に発展している。ここで、本発明は、ゼブラフィッシュのルミカンプロモーターの制御下で発現するトランスジェニック系を構築した。ｚＬｕｍ遺伝子の５’−非翻訳領域に由来するゲノムＤＮＡ１．７ｋｂと０．４８ｋｂの両者は、特異的ＰＣＲプライマーにより増幅され、ＥＧＦＰ配列５９を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の多重クローニング部位に挿入された。組み換えプラスミドは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αにより用意され、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔで精製された。精製されたプラスミドＤＮＡを、蒸留水で５０ｎｇ／μｌに調整し、解剖顕微鏡下で単細胞段階のゼブラフィッシュ胚に微量注入した。翌日、ＧＦＰ発現を有する胚を、落射蛍光顕微鏡を備えるＬｅｉｃａ解剖顕微鏡（ＭＺＦＬＩＩ）を用いて撮像及び選定した。蛍光を示す胚のみを成魚に成長させた。蛍光を示す注入胚から成長した同胞成魚対を相互に交配させ、生殖細胞系創始者（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ  ｆｏｕｎｄｅｒ）を同定し��。続いて、陽性の対に由来する個別の成魚を異系交配（ｏｕｔｃｒｏｓｓ）させ、個別の創始魚を同定した。ルミカンプロモータートランスジェニック魚により、機能的及び形態学的な変化をさらに強調することができる。
ＰＣＲプライマー：
順方向プライマーＩ：５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＣＡＧＡＣＣＡＧ−３’；
順方向プライマーＩＩ：５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣＡＡＣＡＣＧＧＴＴＡＴＧＴ−３’；
逆方向プライマー：５’−ＣＧＡＣＧＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＴ−３’；
＜初期の薬物スクリーニングに用いられる化学物質＞
【０１１０】
薬物スクリーニングに用いられる化学物質及び薬物は、ＴＧＦ受容体阻害剤（アトロピン、トロピカミド、臭化イプラトロピウム（アトロベント）、オキシブチニン（Ｔａｖｏｒ）、スコポラミン臭化水素酸塩、ピレンゼピン二塩酸塩、ＳＢ４３１５４２、タモキシフェン、ＳＢ−５０５１２４、ＲｅｐＳｏｘ（ＳＢ−４６９６）、ドキシサイクリン塩酸塩水和物（デルモスタット、ペリオスタット）、ゲニステイン、マリマスタット、タウリン、ミノサイクリン塩酸塩、Ｎ−アセチルシステイン、ロサルタン、アスピリン、ジロイトン、ＳＰ６００１２５、プロポフォール、スタチン、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎ）、ピロキシカム、ナブメトン（ｎａｂｕｍｅｔｏｎｅ）、リコフェロン（Ｌｉｃｏｆｅｌｏｎｅ）、カプトリル、プロシアニジン（Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ）、Ｈｅｔｅｒｏｔａｘｉｎ、シンバスタチン、ロバスタチン（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、ロスバスタチン（Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ））を含む。これらの化合物の全ては、ルミカンで調節されたコラーゲン線維形成に関与する経路に対する医薬活性について既に研究されている。
【０１１１】
＜結果＞
【０１１２】
本発明は、眼の成長及び疾患を研究するためのゼブラフィッシュモデルを構築することに成功し、ゼブラフィッシュの角膜及び強膜におけるルミカン遺伝子（ｚＬｕｍ）発現を特徴付ける。ｚＬｕｍのノックダウンは、強膜の菲薄化を引き起こし、ゼブラフィッシュの眼の成長期間において強膜コートのサイズを増加させ、小児近視の臨床所見に対応している。参考文献「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１０，  Ｖｏｌ．２８５，  Ｎｏ．３６，  ｐｐ．２８１４１−２８１５５」の図４及び図５に示されるように、ゼブラフィッシュにおいて、特に、強膜コート、角膜及び眼周囲のマトリクスには、ゼブラフィッシュのルミカン（ｚＬｕｍ）の発現が明確に証明される。興味深いことに、強膜コートにおけるルミカンは非硫酸化型であるのに対して、角膜基質におけるルミカンは硫酸化型である。
【０１１３】
ルミカンがノックダウンを受けた後、図１〜図５において、強膜コートが拡大して、人間の近視患者の強膜変化に類似すること（即ち、軸方向伸長）を示す。上述したように、本発明は、ルミカンプロモーターにおけるＳＮＰの変化、及びそのハプロタイプが台湾人民の高度近視の進展と強く関連することも示す。本発明の動物実験は、人間近視の前記発見を再現し、軸方向伸長の進展におけるルミカン遺伝子の重要性を強調する。
【０１１４】
図６において、ゼブラフィッシュのルミカンノックダウン表現型が、ＴＧＦ−βにより回復されることが可能であることを示す。ルミカンノックダウン魚もＭＭＰ２発現の増加及びＴＩＭＰ発現の減少により証明され、さらに、強膜リモデリングの調節にルミカンが担う役割は、他の物種の実験的近視に示されるとおりであることが確認された。重要なことは、ルミカンノックダウンのゼブラフィッシュにおいて、強膜コートの拡大は、アトロピンの投与により抑制されることが可能である（図７〜図９）。この治療の後、ＭＭＰ−２及びＴＩＭＰの発現も、正常レベルに戻った。
【０１１５】
本発明では、ＴＧＦ−β経路に関連する約３０種の臨床的に利用可能な薬物を試験した。一つ目の薬物であるマリマスタット（ＢＢ２５１６）は、提案された抗腫瘍薬であり、広域スペクトルマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としての作用を有しており、良好な候補薬であると見なされる。本発明の予備段階の試験結果は、マリマスタットが、ｚＬｕｍ  ＭＯノックダウン魚（実験群では２％の強膜コート拡大が示され、対照群では３０％の強膜コートの拡大が示される）において強膜コート拡大を効率良く予防することができることを示す。マリマスタットに関する試験結果は、ＭＭＰが、ルミカンノックダウン後の強膜コート拡大のエフェクター及びターゲットであることを明確に示す。マリマスタットは、近視の予防及び臨床薬物試験に用いられる潜在的なターゲットになる可能性がある。
【０１１６】
テトラサイクリンは、全身的にも、局所的にも、様々なグラム陰性菌による感染の治療に用いられた。近年、テトラサイクリンが、抗微生物特性から完全に独立している生物学的機能を発揮することが確立された。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ動物試験に関わるいくつかの研究は、テトラサイクリン抗生物質及びその化学的に修飾されたアナログ（抗菌活性を有しない）が、哺乳類コラゲナーゼ活性及びコラーゲン分解を阻害することができることを示す。ドキシサイクリン及びミノサイクリンは、第二世代のテトラサイクリンである。ドキシサイクリン及び化学的に修飾されたテトラサイクリンＣＭＴ−１、ＣＭＴ−６は、９２−ｋＤａ（ＭＭＰ−９）と７２−ｋＤａ（ＭＭＰ−２）ゼラチナーゼの両者を直接阻害する効果を有する。ミノサイクリンも、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２を含む様々なＭＭＰを阻害する。これらの薬物は良好な候補薬であると見なされる。本発明の試験結果は、ドキシサイクリン及びミノサイクリンが、ｚＬｕｍ−モルフォリノ（ＭＯ）ノックダウンモデル（実験群では６．８％及び４．７％の強膜コート拡大が示され、対照群では３０％の強膜コート拡大が示される）において強膜コートの拡大を効率良く予防することができることを示す。もう一つの抗生物質であるミノサイクリンも、強膜コート拡大を予防する効果を示す。ミノサイクリンは、サイクリンの第二世代クラスに属する。ミノサイクリンは、スペクトルが他のサイクリンと類似する抗感染特性を有し、特に、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｏｎｅｍａ）及びプロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｎｅｓ）に対する抗感染特性を有する。その抗感染作用に関連する抗炎症活性及び抗コラゲナーゼ活性は、第一世代のサイクリン（特に、表皮サイトカインへの調節効果を有するもの）よりも高い。従って、強膜コートのコラーゲン合成においてテトラサイクリンが効果を示すことを予期するのは合理的である。アスピリンは、体内で異なる様々な効果を引き起こし、主に、炎症の減少、鎮痛（疼痛緩和）、血栓の予防、及び解熱であるプロスタグランジン及びトロンボキサンの生産を抑制するというアスピリンの機能は、そのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素の不可逆的失活に起因する。シクロオキシゲナーゼは、プロスタグランジン及びトロンボキサンの合成に必要である。アスピリンは、アセチル化剤として、ＣＯＸ酵素の活性部位におけるセリン残基にアセチル基を共有結合させる。これにより、アスピリンは、他のＮＳＡＩＤｓ（例えば、ジクロフェナク及びイブプロフェン）可逆的阻害薬と異なっている。本発明の試験結果は、アスピリンが、ｚＬｕｍ−ＭＯノックダウンモデル（実験群では９．６％の強膜コート拡大が示され、対照群では３０％の強膜コート拡大が示される）において強膜コートの拡大を効率良く予防することができることを示す。
【０１１７】
Ｎ−アセチルシステインは、細胞外の活性酸素中間体１２８の形成を阻害する有効な酸化防止剤であり、コラゲナーゼ阻害剤でもある。いくつかの論文には、Ｎ−アセチルシステインが、マトリックスＭＭＰ−２の発現及び活性に対する阻害を示すことが報告された。本発明の試験結果は、Ｎ−アセチルシステインが、ｚＬｕｍ−モルフォリノ（ＭＯ）ノックダウンモデル（実験群では１１．７％の強膜コート拡大が示され、対照群では３０％の強膜コート拡大が示される）において強膜コートの拡大を効率良く予防することができることを示す。
【０１１８】
プロポフォール（即ち、２，６−ジイソプロピルフェノール）は、外科手術において長期鎮静用の麻酔の導入及び重症患者の術後悪心の治療に用いられる薬剤の中で最も一般的な薬剤の一つである。プロポフォールは、内皮細胞を誘発して潜伏期のＴＧＦ−βを発現させ、生体内でＰＢＭＣｓにより活性ＴＧＦ−βに変換することができる。本発明の試験結果は、プロポフォールが、ｚＬｕｍ−ＭＯノックダウンモデル（実験群では１２％の強膜コート拡大が示され、対照群では３０％の強膜コート拡大が示される）において強膜コートの拡大を効率良く予防することができることを示す。
【０１１９】
簡潔に言うと、マリマスタット、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、Ｎ−アセチルシステイン、アスピリン、プロポフォールの試験結果は、ＴＧＦ−β及びＭＭＰが、ルミカンノックダウン後の強膜コート拡大のエフェクター及びターゲットであることを示す。これらの薬物は、近視の予防及び臨床薬物試験に用いられる潜在的なターゲットになる可能性がある。その結果、本発明は、ゼブラフィッシュが、軸性近視の進展を観察する及び近視治療用の化合物をスクリーニングするための優れた生体内動物モデルであることを証明した。マリマスタット、ドキシサイクリン、カプトリル、ミノサイクリン塩酸塩、アトロピン、アスピリン、プロポフォール及びＮ−アセチルシステインで処理されたゼブラフィッシュの大きな眼の割合は、図１０に示される。図１１の（ａ）〜（ｅ）は、異なる濃度のテトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、マリマスタット及びバチマスタットで処理されたゼブラフィッシュの大きな眼の割合を示す。他の試験化合物及びそれらの大きな眼の割合は、以下の表に示される。
【表３】
0006300856.tif 000033
【０１２０】
また、試験用の人間の強膜線維芽細胞を分離して培養した。既に述べられているように、人間の初代強膜線維芽細胞は、死後の人間ドナー（ｈｕｍａｎ  ｄｏｎｏｒ）の眼の移植片から培養された（Ｂａｒａｔｈｉ，  Ｖ．Ａ．，  Ｓ．Ｒ．  Ｗｅｏｎ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｗ．  Ｂｅｕｅｒｍａｎ，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｓｃｌｅｒａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃｌｅｒａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｖｉｓ，  ２００９．  １５：  ｐ．  １２７７−９３；Ｗａｎｇ，  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｆｏｒｍ−ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｍｙｏｐｉａ  ｓｃｌｅｒａ．  Ｍｏｌ  Ｖｉｓ，  ２０１１．  １７：  ｐ．６４７−５７を参照のこと）。前記強膜を、前記ドナーの眼から摘出された直後、冷たいリン酸塩緩衝液で３回洗った。次に、人間の強膜を約１ｍｍ×１ｍｍの片状物に切って、６０ｍｍ×１５ｍｍの細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｔｄ）で、高グルコース添加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）において培養した。続いて、５％Ｃ０２を含む加湿型インキュベーターにおいて細胞を３７℃で培養した。３日または４日ごとに、成長培地を変換した。大量の初代単層細胞を得た場合、細胞を３７℃で０．２５％トリプシン／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）で５分間培養することにより分散させ、２５ｍｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｔｄ）に継代培養した。実験におけるずべての細胞は１継代目〜３継代目である。線維芽細胞培養の純度は、抗ビメンチン抗体の免疫蛍光染色により、確認された。上記のウエスタンブロット分析及び化学発光分析の後、上記スクリーニングされたＭＭＰ阻害剤が、ルミカンの発現及び／又はコラーゲン原線維形成に影響を与えた。
【図１】
0006300856.tif 000035
【図２】
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【図３】
0006300856.tif 000037
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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