(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、副甲状腺機能低下症を予防もしくは治療するため、または骨および／もしくは軟骨同化作用を誘導するための医薬組成物：
１−（４−（２−（（２−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（４−（２−（（２−（３−ブロモフェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン：
１−（４−（２−（（２−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（４−（２−（（２−（３−フルオロ−４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（４−（２−（（２−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン）：
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２，４−ジオン；
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−８−メチル−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン；
５−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−２−オキサ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−６，８−ジオン；および
４−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−４，６−ジアザスピロ［２．４］ヘプタン−５，７−ジオン。
【請求項２】
化合物が１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンまたはその薬理学的に許容される塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
化合物が１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンまたはその薬理学的に許容される塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
化合物が１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１,３,８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１,３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２,４−ジオンまたはその薬理学的に許容される塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
医薬組成物が、骨粗鬆症の予防又は治療、歯周病における骨量減少の改善、抜歯後の歯槽骨欠損の回復促進、変形性関節症の予防又は治療、関節軟骨欠損の回復促進、無形成骨症の予防又は治療、軟骨無形成症の予防又は治療、軟骨低形成症の予防又は治療、骨軟化症の予防又は治療、或いは、骨折の回復促進用である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
医薬組成物が、副甲状腺機能低下症の予防もしくは治療用である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い代謝安定性を有し、強力なＰＴＨ様作用を発揮するヒダントイン誘導体を有効成分とする医薬品に関し、骨及び/又は軟骨同化作用を誘導させ、骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨欠損、変形性関節症、関節軟骨欠損、無形成骨症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、骨軟化症、骨折などに対する予防、治療、回復および治癒促進ための医薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、骨や腎臓の標的細胞に作用して、カルシウム（Ｃａ）およびリン（Ｐｉ）ホメオスタシスを調節するホルモンとして知られている（非特許文献１）。ＰＴＨによる血清Ｃａ濃度レベルの維持は、主に消化管、骨、および腎臓への直接的または間接的な作用により行われている。ＰＴＨは、腎臓尿細管でのＣａの再吸収を促進して、生体内Ｃａの体外への排泄を抑制する。また、腎臓においてビタミンＤを活性型ビタミンＤへ変換する酵素の合成を高めることで、活性型ビタミンＤによる消化管からのＣａ吸収促進に寄与する。また、ＰＴＨは骨芽細胞等を介して間接的に破骨細胞の分化を亢進することで、骨からのＣａ放出を促進する。これらのＰＴＨの作用は、主に、ＰＴＨ１Ｒへの結合によるｃＡＭＰ産生を介した、アデニル酸シクラーゼおよび／またはホスホリパーゼＣの受容体による活性化を介して発揮すると考えられている。
【０００３】
ＰＴＨ製剤 [ＰＴＨ（１−３４）とＰＴＨ（１−８４）]は、ヒトにおいて強力な骨同化作用を有し、骨密度と骨強度の顕著な上昇を誘導する。現在、ヒトで利用可能な骨粗鬆症治療薬の多くは骨吸収抑制薬であり、積極的に骨密度を上昇させるような骨同化作用を持つ薬は、ＰＴＨ製剤のみである。このようなことから、ＰＴＨ製剤は骨粗鬆症治療の最も有効な治療の１つとみなされている（非特許文献２）が、ペプチドであるため、侵襲投与が必要である。そのため、ＰＴＨ様作用を有し、かつ非侵襲的に投与できる薬剤の創出が期待されている。
【０００４】
変形性関節症は、膝、股関節、脊椎、手指など全身の関節における軟骨の変性・破壊、滑膜炎、軟骨下骨の硬化、骨棘形成および慢性疼痛による関節の機能不全を特徴とする変性性疾患であり、65歳以上の人口の40％以上が罹患するとされており、医療経済学的に大きな負担となっている（非特許文献３、非特許文献４）。変形性関節症の原因は、関節軟骨への物理的過加重、滑膜および骨髄における炎症、軟骨基質成分の遺伝的素因、軟骨下骨の骨代謝亢進などが挙げられているが、関節軟骨の変性・破壊を抑制する治療薬は上市されておらず、医療的ニーズは高いままである。
【０００５】
これまで治療薬の標的として軟骨基質の破壊に関与するアグリカナーゼ（ADAMTS-4, ADAMTS-5など）やマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP-3, MMP-9, MMP-13など、非特許文献５）や炎症性サイトカイン（IL-1, IL-6など、非特許文献６）が注目されてきたが、実用化には至っていない。一方、軟骨下骨の代謝回転亢進を標的とする薬剤（リセドロネート、カルシトニン、非特許文献７、非特許文献８）の臨床治験も行われたが、関節軟骨の変性・破壊を抑制できなかった。また、この機序に加え骨形成促進作用と軟骨形成促進作用を併せ持つラネル酸ストロンチウムの臨床治験において、関節軟骨の破壊を抑制する効果が示されたが（非特許文献９）、実用化には至っていない。
【０００６】
しかしながら、近年の研究により変形性関節症の病理発生に、関節軟骨が永久軟骨から石灰化軟骨に形質転換することが報告され、その抑制が治療薬の標的として注目されるようになった（非特許文献１０）。この作用機序に基づき、関節軟骨の最終分化を抑制する複数の機序の薬剤が変形性関節症のモデル動物において、関節軟骨の変性・破壊を抑制することが報告されており、この機序に基づく治療薬の実用化の可能性が示唆されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００７】
斯かる状況の下、本出願人は、下記一般式（Ａ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩；
0006290138.tif 000002
〔式中、Ｗ、Ｘ、Ｙ、ｍ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３３、Ｒ３４は特許文献１を参照〕
が、ＰＴＨ様作用をもつ化合物、好ましくはＰＴＨ１Ｒアゴニスト、として有用であり、骨粗鬆症、骨折、骨軟化症、関節炎、血小板減少症、副甲状腺機能低下症、高リン血症、または腫瘍状石灰沈着症などの予防および／または治療、あるいは幹細胞動員に有用であることを見出して、先に特許出願をした（特許文献１）。
【０００８】
ところで、臨床において価値の高い非侵襲的に投与できる薬剤の創出には、ターゲットに対する直接作用と、薬物の吸収、分布、代謝、排泄等の体内動態を考慮する必要がある。そのためには、ヒトＰＴＨ１Ｒを介するｃＡＭＰ産生能が強く、かつ、ヒト肝ミクロソームに対する代謝安定性の高いＰＴＨ様作用を有する薬剤が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２６０３０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kronenberg, H.M., et al., In Handbook of Experimental Pharmacology, Mundy, G.R., and Martin, T.J., (eds), pp.185-201, Springer-Verlag, Heidelberg (1993)
【非特許文献２】Tashjian and Gagel, J. Bone Miner. Res. 21:354-365 （2006）
【非特許文献３】Sem Arth Rheumatism 2013; 43: 303-13
【非特許文献４】CPMP/EWP/784/97 Rev. 1. 2010, European Medicines Agency
【非特許文献５】Osteoarth Cart 2010; 18: 1109-1116
【非特許文献６】Osteoarth Cart 2013; 21: 16-21
【非特許文献７】Arthritis Rheum. 2006;54(11):3494-507
【非特許文献８】J Clin Pharmacol. 2011;51(4):460-71
【非特許文献９】Ann Rheum Dis. 2013 Feb;72(2):179-86
【非特許文献１０】Arth Rheum 2006; 54(8): 2462-2470
【非特許文献１１】Nat Med 2009; 15(12): 1421-1426
【非特許文献１２】Sci Trans Med 2011;3: 101ra93
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、高い代謝安定性を有し、強力なＰＴＨ様作用を発揮するヒダントイン誘導体を非侵襲的に全身曝露または局所暴露させることで骨・軟骨同化作用を誘導させ、骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨欠損、変形性関節症、関節軟骨欠損、無形成骨症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、骨軟化症、骨折などに対する予防、治療、回復および治癒促進方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
斯かる状況の下、本発明者らは、研究を重ねた結果、新たに見出された本発明のヒダントイン誘導体が、ヒトＰＴＨ１Ｒを強制発現させた細胞において強いｃＡＭＰ産生能を示し、かつ、ヒト肝ミクロソームの代謝に対して高い安定性を有していることを見出した。また、本発明者らは、本発明の化合物を投与することで、骨・軟骨同化作用を誘導し、骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨欠損、変形性関節症、関節軟骨欠損、無形成骨症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、骨軟化症、骨折などに対する予防、治療、回復および治癒促進するための医薬組成物として有用であることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下に関する。
【００１４】
〔１〕下記一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、骨及び/又は軟骨同化作用を誘導するための医薬組成物；
0006290138.tif 000003
〔式中、
Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１とＲ２が共に水素原子ではないとの条件の下、それぞれ独立して
１）水素原子、
２）ハロゲン原子、
３）１〜５個のフッ素原子で置換されていてもよい炭素数１〜２個のアルキル基、または
４）１〜５個のフッ素原子で置換されていてもよい炭素数１〜２個のアルコキシ基
であるか；または、
Ｒ１およびＲ２は、互いに結合して形成される下記式：
0006290138.tif 000004
（式中の各＊はフェニル部分との結合位置を示す。）で表わされる基であり；
かつ、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して１〜３個のフッ素原子で置換されていてもよいメチル基であるか；または、
Ｒ３およびＲ４は、それらが結合する炭素原子と一緒になって炭素数３〜６の環（ここで、環を形成する炭素原子のうち一つは酸素原子；硫黄原子；またはメチル基で置換されていてもよい窒素原子で置換されていてもよい。）を形成する。〕。
【００１５】
本発明の医薬組成物に有効成分として含まれる化合物は、前記一般式（１）で表される化合物から、Ｒ１とＲ２の組み合わせがトリフルオロメチル基と水素原子であり、かつＲ３およびＲ４は、それらが結合する炭素原子と一緒になってシクロペンチル環を形成する化合物を除外することができる。
【００１６】
〔２〕前記一般式（１）で表わされる化合物またはその薬学的に許容される塩の、Ｒ１およびＲ２が以下の組み合わせから選択され：
１）Ｒ１が水素原子、またはハロゲン原子であり、かつＲ２が水素原子、トリフルオロメチル基、またはトリフルオロメトキシ基である（但し、Ｒ１とＲ２が共に水素原子となる場合を除く）；
２）Ｒ１がトリフルオロメチル基、またはトリフルオロメトキシ基であり、かつＲ２が水素原子、またはハロゲン原子である；
３）Ｒ１およびＲ２が互いに結合して形成される下記式：
0006290138.tif 000005
（式中の各＊はフェニル部分との結合位置を示す。）で表わされる基である；
かつ、Ｒ３およびＲ４が、メチル基であるか；または、
Ｒ３およびＲ４がそれらが結合する炭素原子と一緒になって以下から選択される環：
0006290138.tif 000006
（式中の＊はイミダゾリジン−２，４−ジオン部分との結合位置を示す。）を形成する、〔１〕記載の医薬組成物。
【００１７】
〔３〕前記一般式（１）で表わされる化合物またはその薬学的に許容される塩の、Ｒ１、Ｒ２が以下の組み合わせから選択され： 
１）Ｒ１がトリフルオロメトキシ基であり、かつＲ２がフッ素原子である；
２）Ｒ１が臭素原子であり、かつＲ２が水素原子である；
３）Ｒ１がトリフルオロメチル基であり、かつＲ２がフッ素原子である；
４）Ｒ１がフッ素原子であり、かつＲ２がトリフルオロメトキシ基である；
５）Ｒ１がトリフルオロメチル基であり、かつＲ２が水素原子である；
６）Ｒ１が水素原子であり、かつＲ２がトリフルオロメトキシ基である；
７）Ｒ１、Ｒ２は互いに結合して形成される下記式：
0006290138.tif 000007
（式中の各＊はフェニル部分との結合位置を示す。）で表わされる基である；
かつ、Ｒ３およびＲ４がメチル基であるか；または、
Ｒ３およびＲ４がそれらが結合する炭素原子と一緒になって以下から選択される環：
0006290138.tif 000008
（式中の＊はイミダゾリジン−２，４−ジオン部分との結合位置を示す。）を形成する、〔１〕記載の医薬組成物。
【００１８】
〔４〕前記一般式（１）で表わされる化合物またはその薬学的に許容される塩の、Ｒ３およびＲ４がメチル基である、〔１〕記載の医薬組成物。
【００１９】
〔５〕前記一般式（１）で表わされる化合物またはその薬学的に許容される塩の、Ｒ３およびＲ４がそれらが結合する炭素原子と一緒になって以下から選択される環：
0006290138.tif 000009
（式中の＊はイミダゾリジン−２，４−ジオン部分との結合位置を示す。）を形成する、〔１〕記載の医薬組成物。
【００２０】
〔６〕以下からなる群より選択される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む、〔１〕記載の医薬組成物：
１−（４−（２−（（２−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（４−（２−（（２−（３−ブロモフェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン：
１−（４−（２−（（２−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（４−（２−（（２−（３−フルオロ−４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（４−（２−（（２−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン；
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン）：
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２，４−ジオン；
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−８−メチル−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン；
５−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−２−オキサ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−６，８−ジオン；および
４−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−４，６−ジアザスピロ［２．４］ヘプタン−５，７−ジオン。
【００２１】
〔７〕化合物が１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンまたはその薬理学的に許容される塩である、〔１〕記載の医薬組成物。
【００２２】
〔８〕化合物が１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンまたはその薬理学的に許容される塩である、〔１〕記載の医薬組成物。
【００２３】
〔９〕化合物が１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１,３,８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１,３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２,４−ジオンまたはその薬理学的に許容される塩である、〔１〕記載の医薬組成物。
【００２４】
〔１０〕医薬組成物が、骨粗鬆症の予防又は治療、歯周病における骨量減少の改善、抜歯後の歯槽骨欠損の回復促進、変形性関節症の予防又は治療、関節軟骨欠損の回復促進、無形成骨症の予防又は治療、軟骨無形成症の予防又は治療、軟骨低形成症の予防又は治療、骨軟化症の予防又は治療、或いは、骨折の回復促進用である、〔１〕に記載の医薬組成物。
【００２５】
〔１１〕〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の医薬的に有効な量を、骨粗鬆症の予防又は治療、歯周病における骨量減少の改善、抜歯後の歯槽骨欠損の回復促進、変形性関節症の予防又は治療、関節軟骨欠損の回復促進、無形成骨症の予防又は治療、軟骨無形成症の予防又は治療、軟骨低形成症の予防又は治療、骨軟化症の予防又は治療、或いは、骨折の回復促進を必要とする患者に投与することを含む、骨及び/又は軟骨同化作用の誘導方法。
【００２６】
〔１２〕骨及び/又は軟骨同化作用の誘導方法が、骨粗鬆症の予防又は治療方法、歯周病における骨量減少の改善方法、抜歯後の歯槽骨欠損の回復促進方法、変形性関節症の予防又は治療方法、関節軟骨欠損の回復促進方法、無形成骨症の予防又は治療方法、軟骨無形成症の予防又は治療方法、軟骨低形成症の予防又は治療方法、骨軟化症の予防又は治療方法、或いは、骨折の回復促進方法である、〔１１〕記載の方法。
【００２７】
〔１３〕骨粗鬆症の予防又は治療、歯周病における骨量減少の改善、抜歯後の歯槽骨欠損の回復促進、変形性関節症の予防又は治療、関節軟骨欠損の回復促進、無形成骨症の予防又は治療、軟骨無形成症の予防又は治療、軟骨低形成症の予防又は治療、骨軟化症の予防又は治療、或いは、骨折の回復促進のための医薬組成物を製造するための、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の使用。
【００２８】
〔１４〕骨及び/又は軟骨同化作用を誘導するための医薬組成物を製造するための、〔１〕から〔９〕のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩の使用。
【００２９】
〔１５〕骨粗鬆症の予防又は治療、歯周病における骨量減少の改善、抜歯後の歯槽骨欠損の回復促進、変形性関節症の予防又は治療、関節軟骨欠損の回復促進、無形成骨症の予防又は治療、軟骨無形成症の予防又は治療、軟骨低形成症の予防又は治療、骨軟化症の予防又は治療、或いは、骨折の回復促進において使用するための、〔１〕から〔９〕のいずれかに記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【００３０】
また、本発明は一般式（１）または薬学的に許容される塩を投与することによる、骨及び/又は軟骨同化作用により予防、治療及び/又は回復されうる病態の処置方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によって、強いＰＴＨ様作用を有し、かつ、高い代謝安定性を有するヒダントイン誘導体を用いることにより、骨及び/又は軟骨同化が誘導され、骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨欠損、変形性関節症、関節軟骨欠損、無形成骨症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、骨軟化症、骨折などに対する予防、治療、回復及び/又は治癒促進が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】卵巣摘出ラットへの６週間反復投与における腰椎および大腿骨の骨密度を示す図。すなわち、卵巣摘出ラットへvehicle、化合物7又はhPTH(1-34)を６週間1日1回反復投与した場合の腰椎および大腿骨の骨密度を二重X線骨塩量測定装置を用いて測定した結果を示す図である。
【図２】正常ラットへの４週間反復投与における腰椎および下腿骨の骨密度を示す図。すなわち、正常ラットへvehicle、化合物7又はhPTH(1-34)を４週間1日1回反復投与した場合における腰椎および下腿骨の骨密度を二重X線骨塩量測定装置を用いて測定した結果を示す図である。
【図３】正常ラットへの４週間反復投与における下顎骨の骨密度を示す図。すなわち、正常ラットへvehicle、化合物7又はhPTH(1-34)を４週間1日1回反復投与した場合の下顎骨の骨密度を二重X線骨塩量測定装置を用いて測定した結果を示す図である。
【図４】ウサギ下腿骨関節軟骨細胞の最終分化に対する化合物7の抑制作用を示す図。すなわち、ウサギ下腿骨関節軟骨細胞の最終分化に対する、化合物7及びhPTH(1-34)の抑制作用を、アルカリホスファターゼ染色(A)、アリザリンレッドS染色(B)によって評価した結果を示す図である。
【図５】ヒト軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成量を示す図。すなわち、ヒト軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成に対する、化合物7及びhPTH(1-34)の促進作用を評価した結果を示す図である。
【図６】ウサギ半月板部分切除モデルの下腿骨関節軟骨の病変部面積割合を示す図。すなわち、ウサギ半月板部分切除モデルの関節内にvehicle又は化合物7を持続投与した場合の下腿骨関節軟骨の病変部面積割合を測定した結果を示す図である。
【図７】ウサギ半月板部分切除モデルの下腿骨関節軟骨の術後2週間での肉眼的変化を示す図。すなわち、ウサギ半月板部分切除モデルの関節内にvehicle又は化合物7を持続投与した場合の術後2週間での下腿骨関節軟骨の変化を肉眼的に観察した結果を示す図である。
【図８】正常ラットへの４週間反復経口投与後の代表例の大腿骨遠位端関節軟骨の組織画像を示す図。すなわち、正常ラットへvehicle又は化合物7を4週間1日1回反復経口投与した後、代表例の大腿骨遠位端関節軟骨を光学顕微鏡にて病理組織学的に観察した結果を示す図である。
【図９】ＴＰＴＸラットモデルに３０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与したときの、各化合物の投与後２４時間までの血清Ｃａ濃度平均変化量を示す図である。
【図１０】成熟齢の卵巣摘出ラットへＶｅｈｉｃｌｅ、化合物７又はｈＰＴＨ（１−３４）を３カ月間１日１回反復投与した場合の腰椎および大腿骨の骨密度を二重X線骨塩量測定装置により測定した結果を示す図である。
【図１１】ウサギ半月板部分切除モデルの関節内へＶｅｈｉｃｌｅ又は化合物７を投与して４週間後の膝関節軟骨の変化を組織学的に評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、高い代謝安定性を有し、強力なＰＴＨ様作用を発揮するヒダントイン誘導体およびその利用に関する。本発明者らは、前記式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を合成し、該化合物またはその塩が、骨及び／又は軟骨同化作用を誘導することを見出した。
【００３４】
本明細書における「アルキル」は、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和炭素−炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。アルキル基は直鎖状および分枝鎖状の構造を含む。アルキル基としては、好ましくは炭素原子数１又は２のアルキル基である。アルキルとしては、具体的にはメチル基、エチル基が挙げられ、好ましくはメチル基である。
【００３５】
本明細書における「アルコキシ」は、前記定義の「アルキル」が結合したオキシ基であることを意味し、好ましくは炭素原子数１又は２のアルコキシ基である。具体的には例えば、メトキシ基、エトキシ基が挙げられ、好ましくはメトキシ基である。
【００３６】
本明細書において、「Ａで置換されていてもよいＢ」とは、Ｂ中の任意の水素原子が任意の数のＡで置換されていてもよいことを示す。
また、本発明においては、置換基の数は特に断りのない限り限定されないが、たとえば、置換基の数は、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個あるいは１個などである場合が挙げられる。
【００３７】
本明細書における「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。
【００３８】
本明細書において、化学式中の「＊」は、結合位置を意味する。
【００３９】
本発明の前記式（１）で表わされる化合物は、強いＰＴＨ様作用を有し、かつ、高い代謝安定性を有する。
本明細書における「ＰＴＨ様作用」とは、ＰＴＨ受容体に作用して、あるいはＰＴＨ受容体を介したシグナル伝達系に作用して、細胞内ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ：環状アデノシン一リン酸）を産生させる活性を意味する。
【００４０】
本発明において「強いＰＴＨ様作用」、「ＰＴＨ様作用が強い」或いは「強力なＰＴＨ様作用を有する」かどうかは、例えば、J. Bone.Miner. Res. 14:11-20, 1999に記載の方法に従って、ｃＡＭＰシグナル伝達解析を行い、ｃＡＭＰシグナル活性を測定することで確認することができる。具体的には、例えば、参考試験例１に記載の方法に従って、ヒトＰＴＨ１Ｒを強制発現させた細胞におけるｃＡＭＰ産生量を、市販のｃＡＭＰ ＥＩＡキット（例えば、Biotrack cAMP EIA system, GE health care）を用いて、ヒトＰＴＨ（１−３４）を１００ｎＭ投与したときのｃＡＭＰシグナル活性を１００％として、各化合物が２０％ｃＡＭＰシグナル活性を示す濃度（ＥＣ２０）或いは５０％ｃＡＭＰシグナル活性を示す濃度（ＥＣ５０）を測定する。本発明における「強いＰＴＨ様作用」或いは「ＰＴＨ様作用が強い」は、例えば、上記の方法によって測定されたＥＣ２０の値（μＭ）が５．０以下であることが好ましく、３．０以下であることがより好ましく、２．０以下であることが更に好ましい。ＥＣ５０の場合、例えば、上記の方法によって測定された値（μＭ）が、２５．０以下であることが好ましく、１５．０以下であることがより好ましく、１０．０以下であることが更に好ましい。
【００４１】
また、「高い代謝安定性」或いは「代謝安定性が高い」かどうかは、一般的な測定方法を用いて確認することができる。例えば、肝細胞、小腸細胞、肝ミクロソーム、小腸ミクロソーム、肝Ｓ９等を用いて確認することができる。具体的には、例えば、肝ミクロソーム中の化合物の安定性をT Kronbach らの文献（Oxidation of midazolam and triazolam by human liver cytochrome P450IIIA4. Mol. Pharmacol, 1989, 36(1), 89-96）の記載に従って測定することで確認することができる。より具体的には、参考試験例３に記載の方法に従って確認することができる。本発明の「高い代謝安定性」或いは「代謝安定性が高い」は、例えば、上記参考試験例に記載のヒト肝ミクロソームを用いた代謝安定性試験におけるクリアランス（μＬ／ｍｉｎ／ｍｇ）の値が、６０以下であることが好ましく、４０以下であることがより好ましく、３５以下であることが更に好ましい。特に前記式（１）において、Ｒ１とＲ２の組合せがトリフルオロメチル基と水素原子であり、かつ、Ｒ３とＲ４が、それらが結合する炭素原子と一緒になってシクロペンチル環を形成する場合を除き、高い代謝安定性を得ることが可能である。
【００４２】
また、「骨及び/又は軟骨同化作用を誘導」するかどうかは、公知の方法を用いて確認することが可能である。
【００４３】
骨同化作用の誘導については、例えば、被検化合物を一定期間、継続して投与した後に、骨密度又は骨量を、一般的な測定方法を用いて測定し、コントロールと比較することによって確認することができる。具体的には、例えば、武田らの文献（Bone 2013; 53(1):167-173）に記載の方法に従って、骨密度を二重X線骨塩量測定装置（例えば、DCS-600EX(アロカ株式会社)）を用いて測定することができる。この時、骨密度が溶媒コントロールと比較して高い場合には、骨同化作用が誘導されていると考えることができる。本発明の化合物は、例えば、骨粗鬆症治療薬として使われているｈＰＴＨ（１−３４）の臨床相当用量を被検対象に投与した際の骨密度増加量と同等又はそれ以上の増加を示すものが好ましく、具体的には、例えば、骨密度が溶媒コントロールに対して８〜１２％増加する場合が好ましく、更に好ましくは１２％以上の増加がある場合である。
【００４４】
軟骨同化作用の誘導については、例えば、軟骨細胞を本発明の化合物存在下で培養し、軟骨細胞の基質（たとえばプロテオグリカン）産生量を測定することで確認することができる。また、軟骨細胞の最終分化及び石灰化が抑制されるかどうかを測定することによっても、確認することができる。具体的には、例えば、軟骨基質産生量についてはLoeserらの文献(Atrh Rheum 2003; 48(8): 2188-2196)、Ab-Rahimらの文献（Mol Cell Biochem 2013; 376: 11-20.）に記載の方法に従って測定することができる。また、最終分化の抑制に関しては、Okazaki らの文献（Osteoarth Cart 2003;11(2):122-32.）の方法に従って評価することができる。このとき、軟骨基質産生量や最終分化及び石灰化が、コントロールと比較して亢進および抑制されている場合には、軟骨同化作用が誘導されていると考えることができる。本発明の化合物としては、例えば、軟骨基質産生および軟骨細胞の最終分化抑制において、ＰＴＨと同等又はそれ以上の効果を有するものが好ましい。本発明の化合物はＰＴＨに比し高い代謝安定性を有していることから前記の病態に対し充分な効果を有しつつ、複数の投与経路を選択することが可能となる。更に、軟骨基質産生量に関してＰＴＨより高い効果が得られる場合は、上記病態に対しＰＴＨよりも優れた効果を得られることが可能となる。
【００４５】
また例えば、被験化合物を一定期間、継続して投与した対象の軟骨性骨を採取し、これを病理組織学的に観察し、関節軟骨および成長板の肥厚を確認することで、軟骨同化作用の誘導を確認することもできる。具体的には組織学的に関節軟骨および成長板の軟骨の厚さを計測することができる。このとき、軟骨の肥厚が、コントロールと比較して増加している場合には、被験化合物の軟骨同化作用が誘導されていると考えることができる。特に軟骨肥厚がPTHに比べ顕著である場合には、前記の病態に対して充分な効果が考えられるため好ましく、更に好ましくは被験化合物が経口投与で効果を有することである。
【００４６】
また、例えば、Kikuchiらの方法や(Osteoarth Cart 1996;4(2):99-110)、 Sampsonらの方法(Sci Transl Med 2011; 3: 101ra93)に従い、半月板を部分切除して膝関節を不安定化させて変形性関節症を誘導した動物（げっ歯類および非げっ歯類）に被検化合物を一定期間、継続して投与した後に、当該膝関節部位の関節軟骨の変性状態を肉眼的または病理組織学的に評価することによっても確認することができる。このときPTHと同様、当該膝関節の関節軟骨の変性が抑制されていれば、被験化合物の軟骨同化作用および最終分化抑制作用による効果があったと判断できる。更に好ましくは、これらの効果が被験化合物の経口投与で得られていることである。
【００４７】
また例えば、Wakitaniらの方法（Bone Joint Surg Br. 1989;71(1):74-80.）に従い、被験化合物を一定期間、関節軟骨および軟骨下骨を欠損させた対象に投与して、欠損部における軟骨の再生状況を解析することでも評価が可能である。このとき、コントロールに対して優れた軟骨再生効果が観察できれば、被化合物の軟骨同化作用が誘導されていると考えることができる。特に軟骨再生効果がＰＴＨに比べ顕著である場合には、前記の病態に対して充分な効果が考えられるため好ましく、更に好ましくは、被験化合物が経口投与で効果を発揮することである。
【００４８】
これらの効果は、ＰＴＨ様作用を測定することでも、確認することができる。ＰＴＨの受容体であるＰＴＨ１Ｒをパラクラインで活性化するＰＴＨｒＰは、軟骨細胞の増殖および分化調節に関与する重要な因子であり、軟骨細胞の最終分化を抑制し、軟骨組織を維持する作用が知られている（Science 1996; 273: 663-666.）。ＰＴＨ１Ｒの活性化による軟骨同化作用は、例えばXieらの方法（Human Mol Genet 2012; 21(18): 3941-3955）に従い、被験化合物を正常または遺伝的に成長障害のある対象に一定期間投与し、軟骨性骨の成長速度および組織学的な成長板の肥厚を解析することでも評価することが可能である。このとき、コントロールに比べて成長速度や成長板の肥厚が確認できれば、被験化合物の軟骨同化作用があったと判断できる。特に非験化合物の効果がＰＴＨより優れていることが好ましく、更に好ましくは被験化合物が経口投与で効果を有することである。
【００４９】
本発明に係る化合物はフリー体であっても、薬理学的に許容される塩であっても本発明に含まれる。このような「塩」としては、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげられる。
【００５０】
無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などがあげられる。
【００５１】
無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン塩などがあげられる。
【００５２】
酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などがあげられる。
【００５３】
本発明の化合物は大気中に放置しておくことにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があり、そのような水和物も本発明の塩に含まれる。
【００５４】
さらに、本発明の化合物は、他のある種の溶媒を吸収し、溶媒和物となる場合があるが、そのような塩も、式（１）の化合物の塩として本発明に包含される。
【００５５】
本明細書中においては、化合物の構造式が便宜上一定の異性体を表すことがあるが、本発明には化合物の構造上生ずる総ての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体および異性体混合物を含み、便宜上の式の記載に限定されるものではなく、いずれか一方の異性体でも混合物でもよい。従って、本発明の化合物には、分子内に不斉炭素原子を有し光学活性体およびラセミ体が存在することがありうるが、本発明においては限定されず、いずれもが含まれる。
【００５６】
本発明は式（１）で表される化合物の全ての同位体を含む。本発明化合物の同位体は、少なくとも１個の原子が、原子番号（陽子数）が同じで，質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子で置換されたものである。本発明化合物に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。特に、３Ｈや１４Ｃのような、放射能を発して崩壊する放射性同位体は、医薬品あるいは化合物の体内組織分布試験等の際、有用である。安定同位体は、崩壊を起こさず、存在量がほとんど変わらず、放射能もないため、安全に使用することができる。本発明の化合物の同位体は、合成で用いている試薬を、対応する同位体を含む試薬に置き換えることにより、常法に従って変換することができる。
【００５７】
本発明にかかる化合物には、結晶多形が存在することもあるが特に限定されず、いずれかの結晶形が単一であっても結晶形混合物であってもよい。
【００５８】
本発明に係る化合物はそのプロドラッグを含む。プロドラッグとは、化学的又は代謝的に分解し得る基を有し、生体に投与された後、元の化合物に復元して本来の薬効を示す本発明化合物の誘導体であり、共有結合によらない複合体及び塩を含む。
【００５９】
本発明の前記式（１）で表される化合物として、好適には、以下のとおりである。
式中、Ｒ１およびＲ２が以下の組み合わせから選択され：
１）Ｒ１が水素原子、またはハロゲン原子であり、かつＲ２が水素原子、トリフルオロメチル基、またはトリフルオロメトキシ基である（但し、Ｒ１とＲ２が共に水素原子となる場合を除く）；
２）Ｒ１がトリフルオロメチル基、またはトリフルオロメトキシ基であり、かつＲ２が水素原子、またはハロゲン原子である；
３）Ｒ１およびＲ２が互いに結合して形成される下記式：
0006290138.tif 000010
（式中、＊はそれぞれフェニル部分との結合位置を示す。）で表わされる基である；
かつ、Ｒ３およびＲ４は、メチル基であるか；
またはＲ３およびＲ４はそれらが結合する炭素原子と一緒になって以下から選択される環：
0006290138.tif 000011
（式中の＊はイミダゾリジン−２，４−ジオン部分との結合位置を示す。）を形成する。
【００６０】
本発明の前記式（１）で表される化合物として、より好適には、以下のとおりである。
式中、Ｒ１、Ｒ２は以下の組み合わせから選択され： 
１）Ｒ１がトリフルオロメトキシ基であり、かつＲ２がフッ素原子である；
２）Ｒ１が臭素原子であり、かつＲ２が水素原子である；
３）Ｒ１がトリフルオロメチル基であり、かつＲ２がフッ素原子である；
４）Ｒ１がフッ素原子であり、かつＲ２がトリフルオロメトキシ基である；
５）Ｒ１がトリフルオロメチル基であり、かつＲ２が水素原子である；
６）Ｒ１が水素原子であり、かつＲ２がトリフルオロメトキシ基である；
７）Ｒ１、Ｒ２は互いに結合して形成される下記式：
0006290138.tif 000012
（式中、＊はそれぞれフェニル部分との結合位置を示す。）で表わされる基である；
かつ、Ｒ３およびＲ４はメチル基であるか；
またはＲ３およびＲ４はそれらが結合する炭素原子と一緒になって以下から選択される環：
0006290138.tif 000013
（式中の＊はイミダゾリジン−２，４−ジオン部分との結合位置を示す。）を形成する。
【００６１】
本発明の前記式（１）で表される化合物として、更に好適には、以下からなる群より選択される化合物、またはその薬理学的に許容される塩である。
化合物１：１−（４−（２−（（２−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン、
化合物２：１−（４−（２−（（２−（３−ブロモフェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン、
化合物３：１−（４−（２−（（２−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン、
化合物４：１−（４−（２−（（２−（３−フルオロ−４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン、
化合物５：１−（４−（２−（（２−（２，２−ジフルオロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン、
化合物６：１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン、
化合物７：１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン、
化合物８：１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２，４−ジオン、
化合物９：１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−８−メチル−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン、
化合物１０：５−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−２−オキサ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−６，８−ジオン、および
化合物１１：４−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−４，６−ジアザスピロ［２．４］ヘプタン−５，７−ジオン。
これらの化合物１〜１１のなかでは、化合物６、７、８がより好適である。
【００６２】
このような本発明の前記式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩は、骨・軟骨同化作用を誘導し、当該作用によって、骨粗鬆症の予防又は治療、歯周病における骨量減少の改善、抜歯後の歯槽骨損傷の回復促進、変形性関節症の予防又は治療、関節軟骨欠損の回復促進、無形成骨症の予防又は治療、軟骨低形成症の予防又は治療、或いは、骨軟化症の予防又は治療に有用である。
【００６３】
本発明にかかる化合物もしくはその塩は、慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等として製剤化することができる。製剤化には通常用いられる担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調製剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化される。
【００６４】
例えば経口製剤を製造するには、本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩と賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。
【００６５】
これらの成分としては例えば、大豆油、牛脂、合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクワラン、固形パラフィン等の炭化水素；ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなどの水溶性高分子；エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなどの多価アルコール；グルコース、ショ糖などの糖；無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなどの無機粉体、精製水などがあげられる。
【００６６】
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが挙げられる。
【００６７】
結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミンなどが挙げられる。
【００６８】
崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が挙げられる。
【００６９】
滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられる。
【００７０】
着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等が用いられる。
【００７１】
これらの錠剤・顆粒剤には糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差支えない。また、シロップ剤や注射用製剤等の液剤を製造する際には、本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩にｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤などと、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて、常法により製剤化する。
【００７２】
外用剤を製造する際の方法は限定されず、常法により製造することができる。すなわち製剤化にあたり使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能である。使用する基剤原料として具体的には、例えば動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、さらに必要に応じ、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料などを添加することができるが、本発明にかかる外用剤の基剤原料はこれらに限定されない。
【００７３】
また必要に応じて分化誘導作用を有する成分、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。なお上記基剤原料の添加量は、通常外用剤の製造にあたり設定される濃度になる量である。
【００７４】
本発明にかかる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を投与する場合、その形態は特に限定されず、通常用いられる方法により経口投与でも非経口投与でもよい。例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤などの剤として製剤化し、投与することができる。
【００７５】
本発明にかかる医薬の投与量と投与方法は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態・塩の種類、疾患の具体的な種類等に応じて適宜選ぶことができる。
【００７６】
投与量は患者の、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性差、薬剤に対する感受性差などにより著しく異なるが、通常成人として１日あたり、約０．０３−１０００ ｍｇ、好ましくは０．１−５００ ｍｇ、さらに好ましくは０．１−１００ ｍｇを１日１−数回に分けて投与する。
投与経路は患者の、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性差、薬剤に対する感受性差などを考慮し、適宜、選択される。投与方法は、本発明の化合物が、非侵襲的に全身曝露または局所暴露し、骨及び/又は軟骨同化作用の誘導効果が得られる方法であれば特に限定されない。そのような投与方法として、例えば、経口投与、静脈内投与、経鼻投与、経皮投与、経肺投与、関節内投与が挙げられる。
【００７７】
前記式（１）で表される本発明化合物の製造においては、原料化合物・各種試薬は、塩や水和物あるいは溶媒和物を形成していてもよく、いずれも出発原料、使用する溶媒等により異なり、また反応を阻害しない限りにおいて特に限定されない。
【００７８】
用いる溶媒についても、出発原料、試薬等により異なり、また反応を阻害せず出発物質をある程度溶解するものであれば特に限定されないことは言うまでもない。
【００７９】
種々の異性体（例えば幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体、等）は、通常の分離手段、例えば再結晶、ジアステレオマー塩法、酵素分割法、種々のクロマトグラフィー（例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、等）を用いることにより精製し、単離することができる。
【００８０】
本発明にかかる化合物がフリー体として得られる場合、当該化合物が形成していてもよい塩またはそれらの水和物の状態に常法に従って変換することができる。また、本発明に係る化合物が当該化合物の塩または水和物として得られる場合、当該化合物のフリー体に常法に従って変換することができる。
【００８１】
本発明にかかる化合物の単離・精製は、抽出、濃縮、留去、結晶化、濾過、再結晶、各種クロマトグラフィーなどの通常の化学操作を適用して行うことができる。
【００８２】
本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８３】
一般的合成法
本発明の化合物は様々な方法によって合成することができるが、その一部を以下のスキームで説明する。スキームは例示であり、本発明は、明示された化学反応および条件だけで制限されない。以下のスキームでは、明解にするために一部の置換基が除外されているが、これらはスキームの開示の制限を意図するものではない。本発明の代表的化合物は、適切な中間体、公知の化合物、および、試薬を用いて合成することができる。下記一般的合成法中の式におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、前記一般式（１）で表される化合物（下記一般的合成法中では式１で表される化合物）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４と同意義である。
【００８４】
本発明の化合物（式１）は、以下に示す製造法（方法Ａ、方法Ｂ）によって合成することができる。
【００８５】
スキーム１（方法Ａ）
0006290138.tif 000014
【００８６】
スキーム１は、カルボン酸誘導体（１）とアミノ−アミド誘導体（２）を縮合させ、アミド−アミド誘導体（３）を得た後、分子内環化でスピロイミダゾロン環を構築し、ヒダントイン誘導体（式１）を得る方法である。
【００８７】
ステップ１は、カルボン酸誘導体（１）をアミノ−アミド誘導体（２）と反応させる方法である。カップリング試薬としては、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＨＡＴＵ）、および、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ−水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）が挙げられる。塩基としては、トリエチルアミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。必要ならば、触媒として、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を使用できる。適切な溶媒としては、ジクロロメタン、または、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。ＤＭＴ−ＭＭを用いる場合の適切な反応溶媒としてメタノール、エタノール、およびアセトニトリルが挙げられる。反応温度は、例えば０℃〜室温で行い、反応時間は０．５〜２４時間である。得られたアミド−アミド誘導体（３）は、一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【００８８】
ステップ２は、水酸化ナトリウム水溶液またはカリウムｔ−ブトキシドなどの適切な塩基の存在下、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、またはジメチルスルホキシドなどの適切な溶媒中で、アミド−アミド誘導体（３）を環化する方法である。反応温度は、例えば室温〜還流条件で行い、反応時間は１〜２４時間である。得られたヒダントイン誘導体（式１）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【００８９】
スキーム１に示されるアミノ−アミド誘導体（２）は、ピペリジノン誘導体（４）から合成することができる。スキーム２にアミノ−アミド誘導体（２）の合成法を示す。
【００９０】
スキーム２
0006290138.tif 000015
【００９１】
ステップ３は、ピペリジノン誘導体（４）をアミノ−ニトリル誘導体（５）に導く、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ合成である。すなわち、ピペリジノン誘導体（４）を、水の存在下／非存在下、メタノール、エタノール、または、テトラヒドロフランなどの適切な溶媒中で、シアン化ナトリウム、または、シアン化カリウム、および、塩化アンモニウム、または、酢酸アンモニウムと反応させる方法である。反応温度は、例えば室温〜８０℃で行い、反応時間は２〜７２時間である。得られたアミノ−ニトリル誘導体（５）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【００９２】
ステップ４は、過酸化水素存在下での塩基性加水分解条件により、ニトリル基をアミド基に変換する方法である。本反応は、例えばChemistry-A European Journal (2002), 8(2), 439-450を参考に行うことができる。
【００９３】
ステップ５は、Ｈ２雰囲気下、それぞれ、パラジウム炭素または水酸化パラジウム炭素などの触媒の存在下、メタノール、エタノール、トリフルオロエタノール、ジメチルホルムアミド、またはジメチルアセトアミドなどの不活性溶媒中で、化合物（６）のオレフィンを水素添加する方法である。反応温度は室温〜８０℃で行い、加圧下で反応を行ってもよい場合もある。得られたアミノ−アミド誘導体（２）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【００９４】
スキーム２に示されるピペリジノン誘導体（４）は、公知のケタール−ビニルスルホニル誘導体（７）とヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）から合成することができる。スキーム３にピペリジノン誘導体（４）の合成法を示す。
【００９５】
スキーム３
0006290138.tif 000016
【００９６】
ステップ６は、Ｎ２雰囲気下、それぞれ、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウムなどのパラジウム触媒の存在下、トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィンテトラフルオロホウ酸などのホスフィンリガンド、メチルジシクロヘキシルアミンなどの適切な塩基を添加し、Ｎ−メチル−２−ピペリドン（ＮＭＰ）などの適切な溶媒中で、ケタール−ビニルスルホニル誘導体（７）とヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）をカップリングさせることにより、ケタール−アリールビニルスルホニル誘導体（９）を合成する方法である。反応温度は９０℃〜還流温度で行う。得られたケタール−アリールビニルスルホニル誘導体（９）は、一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【００９７】
ステップ７は、ケタール−アリールビニルスルホニル誘導体（９）を、含水テトラヒドロフランなどの適切な溶媒中で、塩酸などの酸の存在下、ケタールをケトンへ変換する方法である。反応温度は、例えば、溶媒の沸点、反応時間は１〜２４時間である。得られたピペリジノン誘導体（４）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【００９８】
スキーム３に示されるヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）は、４−ブロモ−３，５−ジメチルアニリン（１０）とブロモ酢酸誘導体（１１）または、２−ブロモ−５−ヨード−１，３−ジメチルベンゼン（１３）とアミノ酸誘導体（１４）から合成することができる。スキーム４にヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）の合成法を示す。
【００９９】
スキーム４
0006290138.tif 000017
【０１００】
ステップ８は、ジイソプロピルエチルアミンなどの適切な塩基存在下、Ｎ−メチル−２−ピペリドン（ＮＭＰ）などの適切な溶媒中で、４−ブロモ−３，５−ジメチルアニリン（１０）をブロモ酢酸誘導体（１１）でアルキル化する方法である。反応温度は例えば室温〜１００℃で、反応時間は１〜２４時間である。得られたアリールブロマイド−アミノ酸誘導体（１２）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０１０１】
ステップ９は、ヨウ化銅（Ｉ）などの金属触媒存在下、２−ブロモ−５−ヨード−１，３−ジメチルベンゼン（１３）とアミノ酸誘導体（１４）を反応させ、アリールブロマイド−アミノ酸誘導体（１２）を合成する方法である。反応は、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）などの適切な塩基存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）などの適切な溶媒中、８０−１２０℃程度の反応温度で行うことができる。得られたアリールブロマイド−アミノ酸誘導体（１２）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０１０２】
ステップ１０は、アリールブロマイド−アミノ酸誘導体（１２）とシアン酸ナトリウムを酸性条件下で反応させ、ヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）を合成する方法である。溶媒は例えば、酢酸−ジクロロメタン等の混合溶媒で行い、反応温度は室温〜６０℃、反応時間は１〜２４時間である。得られたヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０１０３】
スキーム３に示されるヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）は、４−ブロモ−３，５−ジメチルアニリン（１０）とケトン誘導体（１５）から合成することもできる。スキーム５にヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）の合成法を示す。
【０１０４】
スキーム５
0006290138.tif 000018
【０１０５】
ステップ１１は、ケトン誘導体（１５）をアリールアミノ−ニトリル誘導体（１６）に導く、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ合成である。すなわち、ケトン誘導体（１５）を酢酸などの適切な溶媒中、４−ブロモ−３，５−ジメチルアニリン（１０）とシアン化トリメチルシリルを反応させる方法である。室温などの反応温度で行うことができ、反応時間は１〜３時間程度である。得られたアリールアミノ−ニトリル誘導体（１６）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０１０６】
ステップ１２は、アリールアミノ−ニトリル誘導体（１６）をジクロロメタンなどの適切な溶媒中、２，２，２−トリクロロアセチルイソシアナートと反応させた後、メタノール、水、トリエチルアミンなどの試薬を加え加熱条件下で反応させイミノヒダントイン誘導体（１７）を合成する方法である。得られたイミノヒダントイン誘導体（１７）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０１０７】
ステップ１３は、イミノヒダントイン誘導体（１７）を酸性条件下でヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）に変換する方法である。たとえば、酢酸−水の溶媒中、６５℃程度の加熱条件下、１〜６時間程度の反応時間で合成することができる。得られたヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０１０８】
スキーム６は、ビニルスルホンアミド誘導体（１８）とヒダントイン−アリールブロマイド誘導体（８）を金属触媒存在下でＨｅｃｋ反応させた後、得られた化合物（１９）のオレフィンを接触水素化し、ヒダントイン誘導体（式１）を得る方法である。
【０１０９】
スキーム６（方法Ｂ）
0006290138.tif 000019
【０１１０】
ステップ１４の反応はステップ６、ステップ１５の反応はステップ５の方法に従い、ヒダントイン誘導体（式１）を合成することができる。得られるヒダントイン誘導体（式１）は一般的技術によって単離し、必要ならば、結晶化またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０１１１】
ステップ１４で使用するビニルスルホンアミド誘導体（１８）は、ＷＯ２０１０/１２６０３０（Ａ１）のスキーム２、スキーム３、およびスキーム１２を参考に合成することができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１２】
本発明は、以下の実施例によって更に例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：卵巣摘出ラットへの６週間反復投与における骨密度に対する効果
日本チャールス・リバー株式会社より入手した雌性Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラットを、２０〜２６℃、湿度３５〜７５％の標準実験室条件下で１週間以上順化させた後、実験に使用した。ラットには、水道水ならびに１．１％カルシウム、１．０％リン酸および２５０ＩＵ／１００ｇのビタミンＤ３を含む標準げっ歯動物飼料（ＣＥ−２）（日本クレア株式会社）を自由に摂取させた。
【０１１４】
１２週齢のラットに両側の卵巣摘出術（OVX）及び偽手術（Sham）を施した。手術後４週目に体重を測定し、１群６匹で各群の平均体重が均等になるようにラットを振り分けて群分けした。群分けの翌日から各ラットに６週間１日１回反復投与を行った。Sham-Control群のラットには、経口投与の溶媒（Vehicle）及び皮下投与の溶媒（PC buffer）が、それぞれ経口及び皮下投与された。OVX-Control群のラットには、Vehicle及びPC bufferが、それぞれ経口及び皮下投与された。ＯＶＸ−化合物７のラットには、Vehicleに溶解させた上述の化合物７が３０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与され、またPC bufferが皮下投与された。ＯＶＸ−ｈＰＴＨ（１−３４）群のラットには、Vehicleが経口投与され、PC bufferに溶解させたｈＰＴＨ（１−３４）が０．９ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で皮下投与された。
なお、骨粗鬆症治療薬として臨床応用されているＦｏｒｔｅｏ（登録商標）２０μｇをヒトに投与した際と同程度のＡＵＣ（血中濃度―時間曲線下面積）を、ラットに投与した際に示す投与用量として０．９ｎｍｏｌ／ｋｇを設定した。いずれの群も経口投与は５ｍＬ／ｋｇ、皮下投与は１ｍＬ／ｋｇの用量でそれぞれ投与した。Vehicleは、１０％ジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社）、１０％コリフォールＥＬ（シグマアルドリッチジャパン合同会社）、１０％ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン（日本食品化工株式会社）をグリシン（和光純薬工業株式会社）及び水酸化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）によりｐＨ１０に調製した組成のものを使用した。PC bufferは、２５ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸・クエン酸緩衝液、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．０５％ Tween80をｐＨ５．０に調製した組成のものを使用した。最終投与の翌日に麻酔下で腹大動脈より血液を採取してラットを安楽死処置した後、剖検を行い腰椎及び大腿骨を採取した。腰椎及び大腿骨は７０％エタノール中に保存した。腰椎及び大腿骨の骨密度を、二重Ｘ線骨塩量測定装置（ＤＣＳ−６００ＥＸ、アロカ株式会社）を用いて測定した。腰椎骨密度は第２から第４腰椎を測定し、大腿骨骨密度は、大腿骨を縦に１０等分して膝側３つ分の遠位端を測定した。結果を図１に示した。
【０１１５】
データは平均値＋標準誤差（ＳＥ）として示した。ＳＡＳ前臨床パッケージver.5.00 (SAS Institute Japan)を使用し、以下の統計学的解析を実施した。有意水準は両側5%とした。腰椎及び大腿骨骨密度について、２群のｔ検定によりSham-Control群とOVX-Control群との比較（＃Ｐ＜０．０５）、OVX-Control群とOVX-化合物７群との比較（＊Ｐ＜０．０５）、及びOVX-Control群とOVX-hPTH(1-34)群との比較（∫Ｐ＜０．０５）を行った。
【０１１６】
図１に示すように、大腿骨骨密度においてOVX-Control群はSham-Control群に対して有意な骨密度減少を示し、陽性対照であるOVX-hPTH(1-34)群はOVX-Control群に対して有意な増加を示した。OVX-Control群に対するOVX-hPTH(1-34)群の増加率は８％であった。この時ＯＶＸ−化合物７群は、OVX-Control群に対して有意な増加を示し、増加率は１２％であった。また、腰椎骨密度においてOVX-Control群はSham-Control群に対して有意な骨密度減少を示し、OVX-化合物7群はOVX-Control群に対して有意ではないが増加傾向を示した。OVX-hPTH(1-34)群はOVX-Control群に対して有意な増加を示し、増加率は１２％であった。
【０１１７】
上記の様に化合物７の反復経口投与では骨粗鬆症の病態モデルであるＯＶＸラットの骨密度が増加したことから、化合物７は、骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨損傷等、骨同化作用の誘導、骨量の増加または骨再建が必要な病態に対する予防、治療、改善、回復促進に有効であると考えられる。さらに一般式（１）で表わされる化合物も、強いPTH様作用と高い代謝安定性が参考試験例1乃至5において確認されており、PTH様作用による骨同化作用を通じた骨密度増加作用が得られることが考えられる。そのため一般式（１）で表わされる化合物についても骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨損傷等、骨同化作用の誘導、骨量の増加または骨再建が必要な病態に対する予防、治療、改善、回復促進に有効であると考えられる。
【０１１８】
実施例２：正常ラットへの４週間反復投与における骨密度に対する効果
株式会社 日本医科学動物資材研究所より入手した雌性RccHan:WISTラットを、２０〜２６℃、湿度３０〜７０％の標準実験室条件下で１週間以上順化させた後、実験に使用した。ラットには、水道水ならびに標準げっ歯動物飼料（ＣＲ−ＬＰＦ）（オリエンタル酵母工業株式会社）を自由に摂取させた。
【０１１９】
８週齢のラットに静脈カテーテルを留置した。カテーテルは鼠径部の大腿静脈から挿入し、先端は後大静脈まで伸ばして留置した。術後１週目に体重を測定し、１群１０匹で各群の平均体重が均等になるようにラットを振り分けて群分けした。群分けの２日後からすべてのラットに４週間１日１回反復静脈内投与をした。投与は留置したカテーテルにインフュージョンポンプ（MEDFUSION SYRINGEINFUSION PUMP Model 2001）を接続して行った。
【０１２０】
Vehicle-Control群には、溶媒（Vehicle）を静脈内投与した。化合物７―２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ群には、Vehicleに溶解させた化合物７をそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。いずれの群も投与容量は５ｍＬ／ｋｇ、投与速度は５ｍＬ／ｋｇ／分で投与した。Vehicleは、５％ジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社）、２５％プロピレングリコール（関東化学株式会社）／２０％エタノール（純正化学株式会社）／１５％ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン（日本食品化工株式会社）／３００ｍＭグリシン（和光純薬工業株式会社）／１９２ｍＭ水酸化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）／生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）の組成のものを使用した。最終投与の翌日に麻酔下で腹大動脈より血液を採取してラットを安楽死処置した後、剖検を行い腰椎、下腿骨、及び下顎骨を採取した。腰椎、下腿骨、及び下顎骨は７０％エタノール中に保存した。腰椎（第２から第４腰椎）、下腿骨、及び下顎骨の骨密度を、二重Ｘ線骨塩量測定装置（ＤＣＳ−６００ＥＸ、アロカ株式会社）を用いて測定した。結果は図２、図３に示す。
【０１２１】
データは平均値＋標準誤差（ＳＥ）として示す。SAS前臨床パッケージver.5.00 (SAS Institute Japan)を使用し、以下の統計学的解析を実施した。有意水準は両側５％とした。腰椎、下腿骨、及び下顎骨骨密度について、Vehicle-Control群を対照群として化合物７の３用量群に対するパラメトリックDunnett型多重比較（＊Ｐ＜０．０５）を行った。
【０１２２】
図２に示すように、腰椎及び下腿骨骨密度において化合物７投与群はVehicle-Control群に対して用量依存的に有意な骨密度増加効果を示した。また、化合物７―２０ｍｇ／ｋｇ群、３０ｍｇ／ｋｇ群、５０ｍｇ／ｋｇ群３群のVehicle-Control群に対する腰椎骨密度の増加率は、それぞれ１６％、２１％、２５％であり、下腿骨骨密度の増加率は７％、１６％、１９％であった。また、図３に示すように、下顎骨骨密度において化合物７−３０ｍｇ／ｋｇ群はVehicle-Control群に対して有意な骨密度増加効果を示した。Vehicle-Control群に対する増加率は７％であった。
【０１２３】
上記のように化合物７の反復経口投与では骨粗鬆症の病態モデルであるＯＶＸラットの大腿骨骨密度が増加し、化合物７の反復静脈内投与では正常ラットの腰椎、下腿骨、及び下顎骨骨密度が増加したことから、化合物７の全身曝露は骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨損傷等、骨同化作用の誘導、骨量の増加または骨再建が必要な病態に対する予防、治療、改善、回復促進に有効であると考えられる。さらに一般式（１）で表わされる化合物も、強いPTH様作用と高い代謝安定性が参考試験例１乃至５において確認されており、ＰＴＨ様作用による骨同化作用を通じた骨密度増加作用が得られることが考えられる。そのため、一般式（１）で表わされる化合物についても骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨損傷等、骨同化作用の誘導、骨量の増加または骨再建が必要な病態に対する予防、治療、改善、回復促進に有効であると考えられる。
【０１２４】
実施例３：ウサギ関節軟骨細胞の最終分化に対する化合物７の抑制効果
ＮＺＷ系ウサギ（４週齢、オリエンタル酵母工業株式会社）を安楽死処置後、下腿骨の関節軟骨を採取し、５０ｍＬ試験管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に移した。そこに１％トリプシン（和光純薬工業株式会社）含有ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社）を添加し３７℃、１時間軟組織を消化した。その後１，２００ｒｐｍ，５分間の遠心分離後上清を除去し、ＰＢＳ（−）を加え軟骨組織を懸濁し１，２００ｒｐｍ，５分間遠心分離後、上清を除去しＰＢＳ（−）で懸濁する洗浄を３回繰り返した。１，２００ｒｐｍ，５分間遠心分離後、細胞ペレットに０．２％ Type II collagenase （CLS-2, Worthington Biochemical Corp.）含有ＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）で３７℃で３時間消化し、ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）を１０％ｖ／ｖ添加し反応を停止させ、１０ｍＬピペット（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社ン）で強くピペッティングし軟骨細胞を単離した。その後、１，２００ｒｐｍ，５分間遠心分離し、上清を除去し、１０％ ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで懸濁する洗浄を３回繰り返し、軟骨細胞をＩ型コラーゲンコートした９６穴培養プレート（AGC TECHNO GLASS CO., LTD.,）に１ｘ１０４個／well  播種した。週３回培地交換し、細胞がコンフルエントに達した後は１００μｇ／ｍＬ リン酸アスコルビン酸マグネシウム塩ｎ−水和物（和光純薬工業株式会社）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ βグリセロリン酸５水和物（和光純薬工業株式会社）、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養した。このとき、以下の条件で培養し、アルカリフォスファターゼ染色（１４日間培養）およびアリザリンレッド染色（２１日間培養）を行い、軟骨細胞の最終分化を評価した。
１）  Ｃｏｎｔｒｏｌ
２）  ＢＭＰ−２          １００ｎｇ／ｍＬ
３）  化合物７            １０−７ｍｏｌ／Ｌ
４）  化合物７            １０−６ｍｏｌ／Ｌ
５）  化合物７            ３ｘ１０−６ｍｏｌ／Ｌ
６）  化合物７            １０−５ｍｏｌ／Ｌ
７）  ＰＴＨ（１−３４）  １０−１０ｍｏｌ／Ｌ
８）  ＰＴＨ（１−３４）  １０−９ｍｏｌ／Ｌ
９）  ＰＴＨ（１−３４）  １０−８ｍｏｌ／Ｌ
１０）ＰＴＨ（１−３４）  １０−７ｍｏｌ／Ｌ
【０１２５】
アルカリフォスファターゼ染色は、培地を廃棄後、軟骨細胞を２００ｍｍｏｌ／Ｌ Tris-HCl pH8.2緩衝液で１回洗浄し、アルカリフォスファターゼ染色キット（Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I, Vector Laboratories, Inc.）のプロトコールに従って染色し、倒立顕微鏡（株式会社ニコン）で写真撮影した（対物４倍）。
その結果、ＢＭＰ−２はアルカリフォスファターゼ活性の増加を示した。化合物７、ＰＴＨ（１−３４）のいずれも濃度依存的にアルカリフォスファターゼ活性を抑制した（図４Ａ）
【０１２６】
アリザリンレッド染色は、培地を廃棄後、軟骨細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００％エタノール（和光純薬工業株式会社）で１５分間固定し、エタノール廃棄後１％アリザリンレッドＳ（和光純薬工業株式会社）で１５分間染色後、蒸留水で洗浄し、倒立顕微鏡で写真撮影した。その結果、ＢＭＰ−２はアリザリンレッド染色性を顕著に増加させ、石灰化を促進した。化合物７、ＰＴＨ（１−３４）のいずれも濃度依存的にアリザリンレッド染色性を抑制し、石灰化を抑制した（図４Ｂ）。
【０１２７】
実施例４：ヒト関節軟骨細胞のプロテオグリカン合成に対する化合物７の効果
凍結保存されているヒト関節軟骨細胞（Lot 2867, Cell Applications Inc.,）を購入後、３７℃水浴中で解凍してＴ７５培養フラスコ（CORNING, Corning Japan K.K.）に１０％ Growth Supplement含有Basal Medium （Growth Medium, Cell Applications Inc.）１５ｍＬを入れ培養した。翌日、Growth Medium １５ｍＬを交換し、３日間培養した。Growth Mediumを除去し、ＨＢＳＳ（Cell Applications Inc.）で軟骨細胞層を洗浄し、除去した。１ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Cell Applications Inc.）を加え、室温で約５分間静置し軟骨細胞をフラスコから剥離させた。１０ｍＬのNeutalizing solution（Cell Applications Inc.）を加え、Bulker-Turk血球計算板を用いて細胞数を計測後、１５ｍＬ試験管に移して遠心分離（１，２００ｒｐｍ，５分間、株式会社トミー精工）し、軟骨細胞のペレットを作成した。上清を捨て１．２％アルギン酸ナトリウム（２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム溶液，ｐＨ７．０）に２ｘ１０６個／ｍＬとなるよう調製し、２２Ｇ注射針をつけた１ｍＬシリンジ（テルモ株式会社）に吸引し、１０２ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２水溶液２ｍＬを入れた２４ウェルプレート（Corning Japan K.K.）のウェルに５滴ずつ滴下して５分間静置し、ビーズを形成させた。その後、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、Growth Medium で１日間培養し、１％ Growth supplement 含有Basal Medium (Cell Applications Inc.）に交換した。このとき、培地に以下の因子を添加し、週３回培地交換を行い１３日間培養した。
１）  Ｃｏｎｔｒｏｌ
２）  ＴＧＦ−β１        １０ｎｇ／ｍ
３）  ＰＴＨ（１−３４）  １０−８ｍｏｌ／Ｌ
４）  化合物７            １０−６ｍｏｌ／Ｌ
５）  化合物７            １０−５ｍｏｌ／Ｌ
【０１２８】
培養１２日に３５Ｓ標識硫酸（株式会社パーキンエルマージャパン）を３７０ｋＢｑ／ｗｅｌｌとなるよう添加し、２４時間後に培地を試験管に回収し４℃で保存した。アルギン酸ゲルに５５ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウム溶液（ナカライテスク株式会社、１ｍＬ／ｗｅｌｌ）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートしてゾル化させ、マイクロチューブ（エッペンドルフ株式会社）に回収して遠心分離（１，２００ｒｐｍ，５分間）して軟骨細胞のペレットを作成した。マイクロチューブに１ｍｇ／ｍＬ  actinase E （科研製薬株式会社）含有０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Sigma-Aldrich Co. LLC.）／５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２（ナカライテスク株式会社）ｐＨ７．８ ０．５ｍＬで懸濁し、１２ウェルプレート（Corning Japan K.K.）に移してシールし、５０℃に設定したふ卵器（エスペック株式会社）中で一晩インキュベートした。この消化液の０．４ｍＬを試験管に移し、０．１ｍｇ／ｍＬ コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社）水溶液を２５０μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４（和光純薬工業）、０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Sigma-Aldrich）／５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２（ナカライテスク株式会社）ｐＨ７．８）、１％ Cetylpyridinium chrolide （ＣＰＣ，和光純薬工業株式会社）／２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ナカライテスク株式会社）それぞれ２．５ｍＬを添加し、３７℃で３時間インキュベートした。この溶液を真空ポンプ吸引下にガラスフィルター（GC-50, ADVANTEC）でろ過し、１％ ＣＰＣ／２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌで洗浄してフリーの３５Ｓ標識硫酸を除去した。ガラスフィルターを液体シンチレーションカウンター用のバイアルに移し、５ｍＬのシンチレータ（Hionic-Fluor，株式会社パーキンエルマージャパン）を入れて液体シンチレーションカウンタ（ＴＲＩ−ＣＡＲＢ，株式会社パーキンエルマージャパン）で放射活性を測定した。
消化液の残りの０．１ｍＬはＤＮＡ定量に用いた。ＤＮＡ定量キット（コスモ・バイオ株式会社）の緩衝液１ｍＬに発色液１００μＬと消化液４５０μＬを混和し、励起３５６ｎｍ，測定４５８ｎｍで蛍光強度を測定した（Infinite M200, Tecan Group Ltd.）。
ＤＮＡ濃度の標準曲線は、キット付属の標準液（１００μｇ／ｍＬ）を２倍階段希釈して調製した。この標準曲線の測定結果から直線回帰式を作成し（Excel, Microsoft）、サンプルのＤＮＡ濃度を算出した。
個々のウエルの放射活性は、ＤＮＡ含量で標準化した（ｃｐｍ／μｇ ＤＮＡ）。
その結果、陽性対照のＴＧＦ−β１は溶媒対照の１０倍の放射活性を示し、プロテオグリカンの合成量が増加していることが示された。ＰＴＨ（１−３４）は溶媒対照の６倍の放射活性を示した。化合物７は１０−６ｍｏｌ／Ｌでは溶媒対照の３倍、１０−５ｍｏｌ／Ｌでは溶媒対照の１０倍の放射活性を示した（図５）。この結果から、化合物７はヒト関節軟骨細胞において、軟骨基質の合成を促進させる作用があることが明らかになった。
【０１２９】
実施例５：ウサギ半月板部分切除モデルにおける化合物７の効果
１２週令のＮＺＷ系雄性ウサギ（オリエンタル酵母工業株式会社）を５日間の飼育順化後、イソフルラン麻酔下に左膝関節の外側皮膚を切開し、外側側副靭帯および種子骨靭帯を切除し外側半月板を露出させた。外側半月板の中央部を３−４ｍｍの幅で切除し、変形性関節症モデルを作出した（Kikuchi T et al, Osteoarth Cart 1999; 4(2): 99-110.）。このとき、左側大腿部皮下に埋設したオスモティックポンプ３個（2ML1, Durect, Road Cupertino, CA, US）に接続したポリエチレンチューブ３本（ＰＥ６０，日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）の先端を関節内に留置し、関節内に薬液を持続投与した。オスモティックポンプには、１）溶媒対照（５０％ジメチルスルホキシド／５０％生食，ｖ／ｖ）、２）化合物７ ３．０μｇ／ｍＬ，３）化合物７ ３０μｇ／ｍＬのいずれかを充顛した。術後７日に再度イソフルラン麻酔し、最初に移植したのと同じ薬剤を充顛したオスモティックポンプを交換した。半月板部分切除術後１４日でウサギを安楽死させ、大腿骨および下腿骨を採取し２０％中性緩衝ホルマリンに浸漬し固定した。その後、関節軟骨表面の粗造化をインディアインクで染色した（図７）。デジタルマイクロスコープ（ＶＨＸ−２０００，株式会社キーエンス）を用いて下腿骨の表面構造を撮影し、インディアインク陽性の病変部面積と外側顆全体の面積を計測し、病変部の外側顆全体に占める割合を算出した（図６）。その結果、化合物７は用量依存的に病変部面積を小さくすることが判明した。このときの下腿骨の関節軟骨面の写真を図４に示す。
【０１３０】
実施例６：正常ラットへの４週間反復経口投与における成長板軟骨への効果
株式会社日本医科学動物資材研究所より入手した雌性ＲｃｃＨａｎ：ＷＩＳＴラットを、２０〜２６℃、湿度３０〜７０％の標準実験室条件下で１週間以上順化させた後、実験に使用した。ラットには、水道水ならびに１．１％カルシウム、１．０％リン酸および２５０ＩＵ／１００ｇのビタミンＤ３を含む標準げっ歯動物飼料（ＣＥ−２、日本クレア株式会社）を自由に摂取させた。
【０１３１】
６週齢のラットの体重を測定し、１群１０匹で各群の平均体重が均等になるようにラットを振り分けて群分けした。群分けの翌日からすべてのラットに４週間１日１回反復投与をした。Vehicle-Control群には、溶媒（Vehicle）を経口投与した。化合物７―６ｍｇ／ｋｇ、化合物７―６０ｍｇ／ｋｇ、化合物７―６００ｍｇ／ｋｇ群には、Vehicleに懸濁させた化合物７をそれぞれ６ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。いずれの群も投与容量は２ｍＬ／ｋｇで投与した。Vehicleは、プロピレングリコール（特級、関東化学株式会社）を使用した。最終投与の翌日に麻酔下で腹大動脈より血液を採取してラットを安楽死処置した後、剖検を行い、大腿骨を採取した。大腿骨は１０％中性緩衝ホルマリン液で固定し、脱灰後にパラフィン包埋薄切組織標本（ヘマトキシリン・エオジン染色）を作製した。作製した標本の大腿骨遠位端を、光学顕微鏡で病理組織学的に観察した。結果は表１に示し、代表例の組織学的画像を図８に示す。
【表１】
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【０１３２】
表１に示すように、化合物７群はVehicle-Control群に対して用量依存的に大腿骨の成長板軟骨を肥厚させた。図８の組織画像から縮尺をもとに代表例の成長板軟骨の幅（矢印）を求めると、Vehicle-Controlの個体は約３９０μｍであり、化合物７―６００ｍｇ／ｋｇの個体は約２９４０μｍであった。
【０１３３】
上記のように化合物７の反復経口投与は、ラットの大腿骨の成長板軟骨を肥厚させた。これらの作用は、化合物７の軟骨同化作用の誘導、軟骨の最終分化の抑制、又は軟骨の増殖亢進によるものであり、化合物７の経口投与は変形性関節症の治療に有効であると考えられる。さらに一般式（１）で表わされる化合物も、強いＰＴＨ様作用と高い代謝安定性が参考試験例１乃至５において確認されており、ＰＴＨ様作用による軟骨同化作用を通じた変形性関節症の治療に有効であることが期待される。
【０１３４】
実施例７：成熟齢卵巣摘出ラットへの３か月間反復投与における骨密度に対する効果
日本チャールス・リバー株式会社より入手した雌性Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラットを、２０〜２６℃、湿度３５〜７５％の標準実験室条件下で１週間以上順化させた後、実験に使用した。ラットには、水道水ならびに１．１％カルシウム、１．０％リン酸および２５０ＩＵ／１００ｇのビタミンＤ３を含む標準げっ歯動物飼料（ＣＥ−２）（日本クレア株式会社）を自由に摂取させた。
【０１３５】
８カ月齢のラットに両側の卵巣摘出術（ＯＶＸ）及び偽手術（Ｓｈａｍ）を施した。手術後３カ月目に体重および腰椎骨密度を測定し、Ｓｈａｍ群１０匹、ＯＶＸラットは１群１２匹で５群に振り分けた。各群の平均体重と腰椎ＢＭＤが均等になるようにラットを群分けした。群分け後から各ラットに以下の要領で３カ月間１日１回反復投与を行った。Ｓｈａｍ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群及びＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群ラットには、経口投与（ＰＯ）の溶媒（ＰＯ  Ｖｅｈｉｃｌｅ）、静脈内投与（ＩＶ）の溶媒（ＩＶ  Ｖｅｈｉｃｌｅ）及び皮下投与（ＳＣ）の溶媒（ＰＣ  ｂｕｆｆｅｒ）が、それぞれＰＯ、ＩＶ及びＳＣ投与された。ＯＶＸ−化合物７−ＰＯ群のラットには、ＰＯ  Ｖｅｈｉｃｌｅに溶解させた上述の化合物７が３０ｍｇ／ｋｇの用量でＰＯ投与され、またＩＶ  Ｖｅｈｉｃｌｅ及びＰＣ  ｂｕｆｆｅｒがそれぞれＩＶ及びＳＣ投与された。ＯＶＸ−化合物７−ＩＶ（低用量）群のラットには、ＩＶ  Ｖｅｈｉｃｌｅに溶解させた上述の化合物７が３ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ投与され、またＰＯ  Ｖｅｈｉｃｌｅ及びＰＣ  ｂｕｆｆｅｒがそれぞれＰＯ及びＳＣ投与された。ＯＶＸ−化合物７−ＩＶ（高用量）群のラットには、ＩＶ  Ｖｅｈｉｃｌｅに溶解させた上述の化合物７が１０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ投与され、またＰＯ  Ｖｅｈｉｃｌｅ及びＰＣ  ｂｕｆｆｅｒがそれぞれＰＯ及びＳＣ投与された。ＯＶＸ−ｈＰＴＨ（１−３４）群のラットには、ＰＯ  Ｖｅｈｉｃｌｅ及びＩＶ  ＶｅｈｉｃｌｅがそれぞれＰＯ及びＩＶ投与され、ＰＣ  ｂｕｆｆｅｒに溶解させたｈＰＴＨ（１−３４）が０．９ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でＳＣ投与された。
【０１３６】
なお、骨粗鬆症治療薬として臨床応用されているＦｏｒｔｅｏ（登録商標）  ２０μｇをヒトに投与した際と同程度のＡＵＣ（血中濃度―時間曲線下面積）を、ラットに投与した際に示す投与用量として０．９ｎｍｏｌ／ｋｇを設定した。いずれの群もＰＯ投与は５ｍＬ／ｋｇ、ＩＶ投与は２ｍＬ／ｋｇ、皮下投与は１ｍＬ／ｋｇの用量でそれぞれ投与した。ＰＯ  Ｖｅｈｉｃｌｅ又はＩＶ  Ｖｅｈｉｃｌｅは、１０％ジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社）、１０％コリフォールＥＬ（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社）、１０％ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン（日本食品化工株式会社）をグリシン（和光純薬工業株式会社）及び水酸化ナトリウム（和光純薬工業株式会社）によりｐＨ１０に調製した組成のものを使用した。ＰＣ  ｂｕｆｆｅｒは、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸・クエン酸緩衝液、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０をｐＨ５．０に調製した組成のものを使用した。最終投与の翌日に麻酔下で腹大動脈より血液を採取してラットを安楽死処置した後、剖検を行い腰椎及び大腿骨を採取した。
【０１３７】
投与期間中、又は剖検時に一般状態に異常が認められたラットは解析から除外した。最終的な各群の匹数は、Ｓｈａｍ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群９匹、ＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群１２匹、ＯＶＸ−化合物７−ＰＯ群１１匹、ＯＶＸ−化合物７−ＩＶ（低用量）群１１匹、ＯＶＸ−化合物７−ＩＶ（高用量）群１０匹、ＯＶＸ−ｈＰＴＨ（１−３４）群１２匹となった。
【０１３８】
腰椎及び大腿骨は７０％エタノール中に保存した。腰椎及び大腿骨の骨密度を、二重Ｘ線骨塩量測定装置（ＤＣＳ−６００ＥＸ、アロカ株式会社）を用いて測定した。腰椎骨密度は第２から第４腰椎を測定し、大腿骨骨密度は、大腿骨を縦に１０等分して大腿骨頭側３つ分の近位端を測定した。結果を図１０に示した。
【０１３９】
データは平均値＋標準誤差（ＳＥ）として示した。ＪＭＰ  ９．０２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ）を使用し、以下の統計学的解析を実施した。有意水準は両側５％とした。腰椎及び大腿骨骨密度について、２群のｔ検定によりＳｈａｍ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群との比較（＃Ｐ＜０．０５）を行った。また、ＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群を対照群として、化合物７を投与した３群及びｈＰＴＨ（１−３４）を投与した１群の計４に対するパラメトリックＤｕｎｎｅｔｔ型多重比較（＊Ｐ＜０．０５）を行った。
【０１４０】
図１０に示すように、大腿骨骨密度においてＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群はＳｈａｍ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して有意な骨密度減少を示し、陽性対照であるＯＶＸ−ｈＰＴＨ（１−３４）群はＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して有意な増加を示した。ＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対するＯＶＸ−ｈＰＴＨ（１−３４）群の増加率は１４．３％であった。この時ＯＶＸ−化合物７−ＰＯ群及びＯＶＸ−化合物７−ＩＶ（高用量）群は、ＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して有意な増加を示し、増加率はそれぞれ８．８％及び１８．７％であった。
【０１４１】
また、腰椎骨密度においてＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群はＳｈａｍ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して有意な骨密度減少を示し、陽性対照であるＯＶＸ−ｈＰＴＨ（１−３４）群はＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して有意な増加を示した。ＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対するＯＶＸ−ｈＰＴＨ（１−３４）群の増加率は２２．１％であった。この時ＯＶＸ−化合物７−ＩＶ（高用量）群は、ＯＶＸ−Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対して有意な増加を示し、増加率はそれぞれ１３．３％であった。
【０１４２】
上記の様に化合物７の反復ＰＯ又はＩＶ投与では骨粗鬆症の病態モデルであるＯＶＸラットの骨密度が増加したことから、化合物７は、骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨損傷等、骨同化作用の誘導、骨量の増加または骨再建が必要な病態に対する予防、治療、改善、回復促進に有効であると考えられる。さらに一般式（１）で表わされる化合物も、強いＰＴＨ様作用が参考実施例２および５において確認されており、ＰＴＨ様作用による骨同化作用を通じた骨密度増加作用が得られることが考えられる。そのため一般式（１）で表わされる化合物についても骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨損傷等、骨同化作用の誘導、骨量の増加または骨再建が必要な病態に対する予防、治療、改善、回復促進に有効であると考えられる。
【０１４３】
実施例８：ウサギ半月板部分切除モデルにおける化合物７の効果
１３週齢のＫｂｌ：ＪＷ系雄性ウサギ（オリエンタル酵母工業株式会社）を入荷して飼育順化し、１０又は１１日後イソフルラン麻酔下にて左膝関節の外側皮膚を切開し、外側側副靭帯および種子骨靭帯を切除し外側半月板を露出させた。外側半月板の中央部を３−４ｍｍの幅で切除し、変形性関節症モデルを作出した（Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈ  Ｃａｒｔ  １９９９）。半月板部分切除術後３日後にＶｅｈｉｃｌｅ又は化合物７を低用量（０．４ｍｇ）、中用量（２ｍｇ）、高用量（１０ｍｇ）を膝関節内に投与した。Ｖｅｈｉｃｌｅは生理食塩水を用い、各個体４００μＬずつ投与した。投与後２８日後にウサギを安楽死させ、大腿骨および脛骨を採取し０．５％ＣＰＣ含有２０％中性緩衝ホルマリンに浸漬して固定した。次に１０％ＥＤＴＡ液（ｐＨ  ７．４）で脱灰後、大腿骨及び脛骨における両側顆の一定部位（膝窩筋起始部より５ｍｍ遠位の大腿骨顆部横断面及び脛骨顆部中央部横断面）についてパラフィン切片を作製し、サフラニンＯ染色（サフラニンＯ、ファストグリーン及び鉄ヘマトキシリン重染色）を行った。
【０１４４】
病理組織学的検査は光学顕微鏡（ＢＨＳ、オリンパス光学工業株式会社）を用いて行った。大腿骨外側顆及び脛骨外側顆の一定部位の標本を用い、軟骨変性を定量的に評価するため、Ｃｏｌｏｍｂｏらの評価法（Ｃｏｌｏｍｂｏ  Ｃ  ｅｔ．  ａｌ，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  １９８３；  ２６：  ８７５−８６）を一部改変したＫｉｋｕｃｈｉらの評価基準（Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ．  ａｌ，  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．  １９９５；  ４：  ９９−１１０）に従い、表層の消失、軟骨びらん、粗造化／亀裂、プロテオグリカン染色性（サフラニンＯ染色性）低下、軟骨細胞配列不整、軟骨細胞消失、軟骨下骨露出、（軟骨細胞の）房状集簇形成の８項目について＋１〜＋４の４段階で評価した。８項目の評価点の総和を総合組織学的評点（総合評点と略）とした（図１１）。データは平均値＋標準誤差（ＳＥ）として示した。病理組織学的検査における評価項目の項目別評点と総合評点については、統計ソフトＳＰＳＳ  １４．０Ｊ（日本アイ・ビー・エム（株））を用い、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を行った。有意水準は危険率５及び１％とした。
【０１４５】
その結果、病理組織学的検査では、脛骨外側顆軟骨病変において，溶媒対照群と比較して，低用量群で軟骨病変の総合的指標である総合評点が有意な低値（軟骨変性抑制）を示した。中用量、高用量群でも総合評点も低値傾向を示した。
【０１４６】
これらのことから化合物７は、脛骨外側顆軟骨病変において軟骨変性抑制作用を有するものと考えられた。
【０１４７】
〔参考実施例〕
本発明の内容を以下の参考実施例及び参考試験例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。全ての出発物質および試薬は、商業的供給業者から入手、もしくは公知の方法を用いて合成した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、内部標準としてＭｅ４Ｓｉを用いてまたは用いずに、Ｍｅｒｃｕｒｙ３００（ｖａｒｉａｎ製）、ＥＣＰ−４００（ＪＥＯＬ製）、または４００−ＭＲ（ｖａｒｉａｎ製）を用いて測定した（ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｂｒｓ＝ブロードシングレット、ｍ＝マルチプレット）。質量分析は、質量分析装置、ＺＱ２０００（Ｗａｔｅｒｓ製）、ＳＱＤ（Ｗａｔｅｒｓ製）、２０２０（Ｓｈｉｍａｚｕ製）を用いて測定した。
【０１４８】
参考実施例１
１−（４−（２−（（２−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン（化合物１）
【０１４９】
（反応１−１）
0006290138.tif 000021
【０１５０】
４−ブロモ−３，５−ジメチルアニリン（３．４７ｇ，１７．４ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（５．３ｍｌ，３０．４ｍｍｏｌ）のＤＭＩ（１３ｍｌ）溶液に、２−ブロモイソ酪酸（３．８６ｇ，２３．１ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。混合物を１００度Ｃにて１時間加熱攪拌した。さらに、２−ブロモイソ酪酸（４９６ｍｇ，２．９７ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．８ｍｌ，４．５９ｍｍｏｌ）を加えた後、混合物を１００度Ｃにて１時間加熱攪拌した。
反応混合物にＭｅＯＨ（５２ｍｌ）と５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５２ｍｌ，２６０ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、この混合物を７５度Ｃにて１．５時間加熱攪拌した。反応混合物を冷却後、水を加え、１Ｎ硫酸水素カリウム水溶液でｐＨ５とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮し、２−（（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸を粗生成物として得た（５．７９ｇ）。
MS(ESI) m/z = 286, 288 (M+H)+
【０１５１】
（反応１−２）
0006290138.tif 000022
【０１５２】
２−（（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）アミノ）−２−メチルプロパン酸（５．７９ｇ、反応１−１で得られた化合物）のジクロロメタン（６２ｍｌ）と酢酸（６２ｍｌ）混合物にシアン酸ナトリウム（５．０３ｇ，５９．８ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。混合物を室温にて３時間攪拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４００ｍｌ）に加えた後、さらに５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７−８とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。得られた固体を酢酸エチル−ヘキサン、ジクロロメタン−ヘキサンで順次洗浄し１−（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンを得た（３．８０ｇ，６６％）。
MS(ESI) m/z = 311, 313 (M+H)+
【０１５３】
（反応１−３）
0006290138.tif 000023
【０１５４】
８−（ビニルスルホニル）−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン（４３１ｍｇ，１．８５ｍｍｏｌ）、１−（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン（５７５ｍｇ，１．８５ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（５０８ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）、トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィンテトラフルオロホウ酸（１６５ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）とメチルジシクロヘキシルアミン（２．１ｍｌ，９．２５ｍｍｏｌ）のＮ−メチル−２−ピロリドン（１８．５ｍｌ）混合物を窒素気流下、１１０度Ｃにて２時間攪拌した。反応混合物を冷却後、水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）にて精製し、（Ｅ）−１−（４−（２−（１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イルスルホニル）ビニル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンを得た（５８４ｍｇ，６８％）。
MS(ESI) m/z = 464 (M+H)+
【０１５５】
（反応１−４）
0006290138.tif 000024
【０１５６】
（Ｅ）−１−（４−（２−（１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４．５］デカン−８−イルスルホニル）ビニル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン（１．２ｇ，２．５８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２６ｍｌ）溶液に、２Ｎ塩酸水溶液（２６ｍｌ，５２ｍｍｏｌ）を１０分で滴下した。混合物を６０度Ｃにて２時間加熱攪拌した。反応混合物を冷却後、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−酢酸エチル）にて精製し、（Ｅ）−１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソピペリジン−１−イル）スルホニル）ビニル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンを得た（９９８ｍｇ，９２％）。
MS(ESI) m/z = 420 (M+H)+
【０１５７】
（反応１−５）
0006290138.tif 000025
【０１５８】
（Ｅ）−１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソピペリジン−１−イル）スルホニル）ビニル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン（９９４ｍｇ，２．３７ｍｍｏｌ）のメタノール（２４ｍｌ）溶液に、シアン化カリウム（１８８ｍｇ，２．８４ｍｍｏｌ）と酢酸アンモニウム（２３７ｍｇ，３．０８ｍｍｏｌ）を室温にて順次加えた。混合物を６０〜７０度Ｃにて３時間加熱攪拌した。反応混合物を冷却後、減圧下濃縮し、酢酸エチルで希釈した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−酢酸エチル）にて精製し、（Ｅ）−４−アミノ−１−（（４−（５，５−ジメチル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２，６−ジメチルスチリル）スルホニル）ピペリジン−４−カルボニトリルを得た（６８１ｍｇ，６８％）。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6) δ: 1.3 (6H, s), 1.7 (2H, m), 2.0 (2H, m), 2.3 (6H, s), 2.7 (2H, s), 2.9 (2H, m), 3.4 (2H, m), 6.9 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.1 (2H, s), 7.4 (1H, d, J = 15.9 Hz), 11.2 (1H, brs)
【０１５９】
（反応１−６）
0006290138.tif 000026
【０１６０】
（Ｅ）−４−アミノ−１−（（４−（５，５−ジメチル―２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２，６−ジメチルスチリル）スルホニル）ピペリジン−４−カルボニトリル（６７５ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）のメタノール（７．５ｍｌ）とジメチルスルホキシド（０．１９５ｍｌ）溶液に、室温にて、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１．６ｍｌ，１．６ｍｍｏｌ）と３０％過酸化水素水（０．２ｍｌ，１．９５ｍｍｏｌ）を順次ゆっくり滴下した。混合物を室温にて１時間攪拌した。反応混合物に酢酸エチル、ヘキサン、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた。析出した固体を濾取、洗浄、乾燥し、（Ｅ）−４−アミノ−１−（（４−（５，５−ジメチル―２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２，６−ジメチルスチリル）スルホニル）ピペリジン−４−カルボキサミドを得た（４９８ｍｇ，７２％）。
MS(ESI) m/z = 464 (M+H)+
【０１６１】
（反応１−７）
0006290138.tif 000027
【０１６２】
（Ｅ）−４−アミノ−１−（（４−（５，５−ジメチル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２，６−ジメチルスチリル）スルホニル）ピペリジン−４−カルボキサミド（１．３ｇ，２．８ｍｍｏｌ）と水酸化パラジウム／炭素（Ｐｄ２０％）（約５０％水湿潤品）（１．３ｇ）のメタノール（２１ｍｌ）−ジメチルホルムアミド（７ｍｌ）混合物を水素雰囲気下、室温にて４時間攪拌した。反応混合物をろ過、洗浄した後、ろ液を減圧下濃縮し、４−アミノ−１−（（４−（５，５−ジメチル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２，６−ジメチルフェネチル）スルホニル）ピペリジン−４−カルボキサミドを得た（９９８ｍｇ，７７％）。
MS(ESI) m/z = 466 (M+H)+
【０１６３】
（反応１−８）
0006290138.tif 000028
【０１６４】
４−アミノ−１−（（４−（５，５−ジメチル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２，６−ジメチルフェネチル）スルホニル）ピペリジン−４−カルボキサミド（１２０ ｍｇ，０．２５８ｍｍｏｌ）、４−フルオロ−３−（トリフルオロメトキシ）安息香酸（６９ｍｇ，０．３０９ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．０９ｍｌ，０．５１６ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２．５ｍｌ）溶液に、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＨＡＴＵ）（１１８ｍｇ，０．３０９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にて１．５時間攪拌した。反応混合物を水でクエンチした後、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで洗浄後、減圧下濃縮し、１−（（４−（５，５−ジメチル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２，６−ジメチルフェネチル）スルホニル）−４−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメトキシ）ベンズアミド）ピペリジン−４−カルボキサミドを得た（１５０ ｍｇ，６７％）。
MS(ESI) m/z = 672 (M+H)+
【０１６５】
（反応１−９）
0006290138.tif 000029
【０１６６】
１−（（４−（５，５−ジメチル−２，４−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２，６−ジメチルフェネチル）スルホニル）−４−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメトキシ）ベンズアミド）ピペリジン−４−カルボキサミド（１５０ ｍｇ，０．２２３ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブタノール（２．５ｍｌ）とエタノール（２．５ｍｌ）の混合液にカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（７５ｍｇ，０．６７０ｍｍｏｌ）を０度Ｃにて加えた。混合物を窒素気流下、５０度Ｃにて１．５時間加熱攪拌した。反応混合物を冷却後、水で希釈、飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）にて精製し、１−（４−（２−（（２−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−４−オキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンを得た（１１８ｍｇ，８１％）。
MS(ESI) m/z = 654 (M+H)+。1H-NMR (400MHz, CD3OD) δ: 1.40 (6H, s), 1.71-1.80 (2H, m), 2.00-2.08 (2H, m), 2.43 (6H, s), 3.22 (4H, s), 3.47-3.57 (2H, m), 3.80-3.88 (2H, m), 7.01 (2H, s), 7.50-7.57 (1H, m), 7.97-8.04 (1H, m), 8.05-8.12 (1H, m)
【０１６７】
適切なカルボン酸出発原料、試薬、溶媒を用い、参考実施例１の反応１−８、反応１−９と同様な操作により、以下に示す参考実施例化合物を合成した。
【０１６８】
（化合物２−５）
【表２】
0006290138.tif 000030
【０１６９】
参考実施例２
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン（化合物６）
【０１７０】
（反応２−１）
0006290138.tif 000031
【０１７１】
ＷＯ２０１０/１２６０３０（Ａ１）のスキーム２、スキーム３、およびスキーム１２に記載の方法に従って合成した、２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−８−（ビニルスルホニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−４−オン（１５０ ｍｇ，０．３８７ｍｍｏｌ）、１−（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン（１６９ｍｇ，０．５４２ｍｍｏｌ）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（４５ｍｇ，０．０７７ｍｍｏｌ）、トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィンテトラフルオロホウ酸（２２ｍｇ，０．０７７ｍｍｏｌ）とメチルジシクロヘキシルアミン（０．１２３ｍｌ，０．５８１ｍｍｏｌ）のＮ−メチル−２−ピロリドン（０．９７ｍｌ）混合物を窒素気流下、１００度Ｃにて１時間加熱攪拌した。反応混合物を冷却後、水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン）にて精製し、（Ｅ）−１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）ビニル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンを得た（１９７ｍｇ，８２％）。
MS(ESI) m/z = 618 (M+H)+。
【０１７２】
（反応２−２）
0006290138.tif 000032
【０１７３】
（Ｅ）−１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）ビニル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン（１９５ｍｇ，０．３１６ｍｍｏｌ）と水酸化パラジウム／炭素（Ｐｄ２０％）（約５０％水湿潤品）（１９５ｍｇ，０．１３９ｍｍｏｌ）の２，２，２−トリフルオロエタノール（６ｍｌ）混合物を水素雰囲気下、室温にて１４時間攪拌した。混合物をろ過した後、ろ液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン）にて精製し、１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオンを得た（１２１ｍｇ，６２％）。
MS(ESI) m/z = 620 (M+H)+。1H-NMR (400MHz, CD3OD) δ: 1.40 (6H, s), 1.72-1.81 (2H, m), 2.00-2.10 (2H, m), 2.44 (6H, s), 3.22 (4H, s), 3.50-3.58 (2H, m), 3.80-3.88 (2H, m), 7.01 (2H, s), 7.72-7.79 (1H, m), 7.88-7.94 (1H, m), 8.16-8.23 (1H, m), 8.31 (1H, s)
【０１７４】
参考実施例３
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン（化合物７）
【０１７５】
（反応３）
0006290138.tif 000033
【０１７６】
適切な出発原料、溶媒を用い、参考実施例２と同様な操作により、１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−５，５−ジメチルイミダゾリジン−２，４−ジオン（化合物７）を合成した。
MS(ESI) m/z = 636 (M+H)+。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 1.47 (6H, s), 1.70-1.78 (2H, m), 2.10-2.19 (2H, m), 2.40 (6H, s), 3.00-3.07 (2H, m), 3.19-3.25 (2H, m), 3.45-3.53 (2H, m), 3.81-3.88 (2H, m), 6.94 (2H, s), 7.35 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.73 (1H, brs), 7.93 (2H, d, J = 8.0 Hz), 9.37 (1H, brs)
【０１７７】
参考実施例４
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２，４−ジオン（化合物８）
【０１７８】
（反応４−１）
0006290138.tif 000034
【０１７９】
シクロペンタノン（４２ｍｇ，０．５００ｍｍｏｌ）と４−ブロモ−３，５−ジメチルアニリン（１００ ｍｇ，０．５００ｍｍｏｌ）の酢酸（０．５ｍｌ）混合物にシアン化トリメチルシリル（０．０６３ｍｌ，０．５００ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。混合物を窒素気流下、室温にて１．５時間攪拌した。反応混合物を２８％アンモニア水（１ｍｌ）に入れクエンチした後、水で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下濃縮し１−（（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）アミノ）シクロペンタンカルボニトリルを粗生成物として得た（１５２ｍｇ）。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 1.83-1.92 (4H, m), 2.07-2.15 (2H, m), 2.33-2.42 (2H, m), 2.37 (6H, m), 3.71 (1H, brs), 6.56 (2H, s)
【０１８０】
（反応４−２）
0006290138.tif 000035
【０１８１】
１−（（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）アミノ）シクロペンタンカルボニトリル（１４５ｍｇ，０．４９５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍｌ）溶液に、２，２，２−トリクロロアセチルイソシアナート（０．０７０ｍｌ，０．５９３ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。混合物を窒素気流下、室温にて１時間攪拌した。
反応混合液に、トリエチルアミン（０．１０３ｍｌ，０．７４２ｍｍｏｌ）、水（０．０４５ｍｌ）およびメタノール（０．１０ｍｌ）を順次加えた後、混合物を窒素気流下、１．５時間加熱還流した。反応混合物を冷却後、水で希釈し、１Ｎ塩酸水溶液でｐＨ５とした後、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下濃縮し１−（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）−４−イミノ−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２−オンを粗生成物として得た。
MS(ESI) m/z = 336, 338 (M+H)+。
【０１８２】
（反応４−３）
0006290138.tif 000036
【０１８３】
１−（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）−４−イミノ−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２−オン（前反応で得た粗生成物）の酢酸（１．０ｍｌ）と水（０．２５ｍｌ）の混合物を窒素気流下、６５度Ｃにて１．５時間加熱攪拌した。さらに、酢酸（１．０ｍｌ）と水（０．２５ｍｌ）を加えた後、混合物を窒素気流下、６５度Ｃにて１７時間加熱攪拌した。反応混合物を冷却後、水で希釈、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ８とし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン）にて精製し１−（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２，４−ジオンを得た（１２１ｍｇ）。
MS(ESI) m/z = 337, 339 (M+H)+。
【０１８４】
（反応４−４）
0006290138.tif 000037
【０１８５】
適切な出発原料、溶媒を用い、参考実施例２と同様な操作により、１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２，４−ジオン（化合物８）を得た。
MS(ESI) m/z = 662 (M+H)+。1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.36-1.44 (2H, m), 1.60-1.70 (4H. m), 1.82-1.91 (2H, m), 1.91-2.06 (4H, m), 2.38 (6H, s), 3.01-3.09 (2H, m), 3.22-3.30 (2H, m), 3.30-3.42 (2H, m), 3.70-3.77 (2H, m), 7.03 (2H, s), 7.57 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.14 (2H, d, J = 8.4 Hz)
【０１８６】
参考実施例５
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−８−メチル−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン（化合物９）
【０１８７】
（反応５−１）
0006290138.tif 000038
【０１８８】
出発原料として４−オキソピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを用い、また、適切な溶媒を用い、参考実施例４と同様な操作により、１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−２，４−ジオキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−８−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得た。
MS(ESI) m/z = 777 (M+H)+。
【０１８９】
（反応５−２）
0006290138.tif 000039
【０１９０】
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−２，４−ジオキソ−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−８−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１１．７ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．１３ｍｌ）混合液に、トリフルオロ酢酸（０．０５ｍｌ，０．６７３ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。混合物を窒素気流下、室温にて１時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン２トリフルオロ酢酸塩を得た（１３．６ｍｇ）。
MS(ESI) m/z = 677 (M+H)+。
【０１９１】
（反応５−３）
0006290138.tif 000040
【０１９２】
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオン２トリフルオロ酢酸塩（２１．１ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）のギ酸（０．０３３ｍｌ）混合物に、３７％ホルムアルデヒド水溶液（０．０５５ｍｌ）を加えた。混合物を窒素気流下、８０度Ｃにて３時間加熱攪拌した。反応混合物を濃縮後、残渣を酢酸エチルで希釈した。有機層を希水酸化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール）にて精製し、１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−８−メチル−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカン−２，４−ジオンを得た（４．５ｍｇ，３０％）。
MS(ESI) m/z = 691 (M+H)+。1H-NMR (400MHz, CD3OD) δ: 1.76-1.84 (2H, m), 1.92-2.02 (2H, m), 2.02-2.12 (4H, m), 2.38 (3H, s), 2.46 (6H, s), 2.81-2.88 (2H, m), 2.92-3.02 (2H, m), 3.23 (4H, s), 3.51-3.60 (2H, m), 3.72-3.80 (2H, m), 7.01 (2H, s), 7.48 (2H, d, J = 8.0 Hz), 8.10 (2H, d, J = 8.0 Hz)
【０１９３】
参考実施例６
５−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−２−オキサ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−６，８−ジオン（化合物１０）
【０１９４】
（反応６）
0006290138.tif 000041
【０１９５】
出発原料としてオキセタン−３−オンを用い、また、適切な溶媒を用い、参考実施例４と同様な操作により、５−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−２−オキサ−５，７−ジアザスピロ［３．４］オクタン−６，８−ジオンを得た。
MS(ESI) m/z = 650 (M+H)+。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ: 1.69-1.77 (2H, m), 2.12-2.22 (2H, m), 2.45 (6H, s), 3.03-3.11 (2H, m), 3.22-3.29 (2H, m), 3.46-3.53 (2H, m), 3.84-3.91 (2H, m), 4.86 (2H, d, J = 7.2 Hz), 5.03 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.07 (2H, s), 7.35 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.98 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.56 (1H, s), 10.34 (1H, s)
【０１９６】
参考実施例７
４−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−４，６−ジアザスピロ［２．４］ヘプタン−５，７−ジオン（化合物１１）
【０１９７】
（反応７−１）
0006290138.tif 000042
【０１９８】
２−ブロモ−５−ヨード−１，３−ジメチルベンゼン（３００ ｍｇ，０．９６５ｍｍｏｌ）、１−アミノシクロプロパンカルボン酸（１９５ｍｇ，１．９３ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（３７ｍｇ，０．１９４ｍｍｏｌ）とジアザビシクロウンデセン（０．５０ｍｌ，３．３５ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（２．６ｍｌ）混合物を窒素気流下、１２０度Ｃにて３時間加熱攪拌した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏｓｉｌ Ｃ１８，アセトニトリル−水（０．１％ギ酸））にて精製し、１−（（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）アミノ）シクロプロパンカルボン酸を得た（２１９ｍｇ，８０％）。
MS(ESI) m/z = 284, 286 (M+H)+。
【０１９９】
（反応７−２）
0006290138.tif 000043
【０２００】
１−（（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）アミノ）シクロプロパンカルボン酸（１９８ｍｇ，０．６９７ｍｍｏｌ）の酢酸（３ｍｌ）とジクロロメタン（１．５ｍｌ）混合物に、シアン酸カリウム（４２４ｍｇ，５．２３ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。混合物を室温にて１時間攪拌した後、６０度Ｃにて２時間加熱攪拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ８とした後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン）にて精製し、４−（４−ブロモ−３，５−ジメチルフェニル）−４，６−ジアザスピロ［２．４］ヘプタン−５，７−ジオンを得た（４９ｍｇ，２３％）。
MS(ESI) m/z = 309, 311 (M+H)+。
【０２０１】
（反応７−３）
0006290138.tif 000044
【０２０２】
適切な出発原料、溶媒を用い、参考実施例２と同様な操作により、４−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−４，６−ジアザスピロ［２．４］ヘプタン−５，７−ジオン（化合物１１）を得た。
MS(ESI) m/z = 634 (M+H)+。1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 0.99-1.03 (2H, m), 1.19-1.27 (4H, m), 1.58-1.64 (2H, m), 1.81-1.90 (2H, m), 2.35 (6H, s), 2.99-3.04 (2H, m), 3.22-3.29 (2H, m), 3.67-3.73 (2H, m), 6.95 (2H, s), 7.56 (2H, d, J = 8.4 Hz), 8.12 (2H, d, J = 8.4 Hz)
【０２０３】
参考実施例８
１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２，４−ジオン（化合物１２）
【０２０４】
（反応８）
0006290138.tif 000045
【０２０５】
適切な出発原料、溶媒を用い、参考実施例２と同様な操作により、１−（３，５−ジメチル−４−（２−（（４−オキソ−２−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，３，８−トリアザスピロ［４．５］デカ−１−エン−８−イル）スルホニル）エチル）フェニル）−１，３−ジアザスピロ［４．４］ノナン−２，４−ジオンを得た。
MS(ESI) m/z = 646 (M+H)+。1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 1.40-1.48 (2H, m), 1.62-1.71 (4H, m), 1.88-1.97 (2H, m), 1.97-2.08 (4H, m), 2.41 (6H, s), 3.03-3.10 (2H, m), 2.29-3.34 (2H, m), 3.38-3.47 (2H, m), 3.72-3.79 (2H, m), 7.06 (2H, s), 7.84 (1H, dd, J = 7.6, 7.6 Hz), 8.02 (1H, d, J = 7.6 Hz), 8.33 (1H, d, J = 7.6 Hz), 8.38 (1H, s)
【０２０６】
〔参考試験例〕
本発明の化合物について、ヒトＰＴＨ１Ｒを介するｃＡＭＰ産生能、ラット受容体を介するｃＡＭＰ産生能、ヒト肝ミクロソームを用いた代謝安定性、ラット肝細胞を用いた代謝安定性、ＴＰＴＸラットモデルでの血清Ｃａ濃度上昇作用、に対する各試験結果を参考試験例１〜５に示す。尚、比較化合物として、表３に示すWO2010/126030A1に記載の化合物を用いた。
【０２０７】
【表３】
0006290138.tif 000046
【０２０８】
参考試験例１：ヒトＰＴＨ１Ｒにおける化合物のインビトロｃＡＭＰシグナル活性の測定
（ペプチド）
ヒトＰＴＨ（１−３４）およびカルシトニンはペプチド研究所（日本、大阪）より購入して、１０ｍＭ酢酸に溶解して１ｍＭとし、−８０℃冷凍庫で保存した。
（細胞培養）
細胞は、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）、１００単位／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（Invitrogen Corp）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気下、３７℃で培養した。
ＰＴＨ１Ｒを発現していないＬＬＣ−ＰＫ１細胞、および、ＬＬＣ−ＰＫ１の１細胞あたり９．５×１０５個のヒトＰＴＨ１Ｒを過剰発現するＨＫＲＫ−Ｂ７を、ｃＡＭＰシグナル伝達分析に用いた（Takasu et al., J. Bone. Miner. Res. 14:11-20, 1999）。
（ｃＡＭＰ刺激）
ＨＫＲＫ−Ｂ７またはＬＬＣ−ＰＫ１細胞を１Ｘ１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベーションした。翌日、次にヒトＰＴＨ（１−３４）または化合物を含む５０μｌのｃＡＭＰアッセイ緩衝液（ＤＭＥＭ、２ｍＭ ＩＢＭＸ、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、３５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）を加え、３７℃のインキュベーター中に置き、２０分間インキュベーションした。培地を除去した後、細胞を１００μｌのｃＡＭＰアッセイ緩衝液で１回洗浄した。細胞を凍結させるためにプレートをドライアイス粉末上に置き、その後ドライアイスから取り出した。４０μｌの５０ｍＭ ＨＣｌを用いて細胞を融解させ、ドライアイス上で再度凍結させた。市販のｃＡＭＰ ＥＩＡキット（Biotrack cAMP EIA system, GE health care）を用いて細胞内ｃＡＭＰの産生量を測定した。
【０２０９】
（インビトロｃＡＭＰ誘導能の測定での２０％有効濃度（ＥＣ２０）および５０％有効濃度（ＥＣ５０）の算出。）
可変勾配によるＳ字形用量反応式を用いて解析し、１００ｎＭでのヒトＰＴＨ（１−３４）のｃＡＭＰシグナル活性を１００％として、各化合物が２０％もしくは５０％のｃＡＭＰシグナル活性を示す濃度をＥＣ２０もしくはＥＣ５０として算出した。
ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞における結果を表４に示す。
なお、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞においてのｃＡＭＰ応答の程度はＨＫＲＫ−Ｂ７細胞での程度に比べ低いものであった。
【０２１０】
【表４】
0006290138.tif 000047
【０２１１】
参考試験例２：ラットＰＴＨ１Ｒにおける化合物のインビトロｃＡＭＰシグナル活性の測定
ＨＫＲＫ−Ｂ７細胞の代わりに中外製薬で樹立したラットＰＴＨ１Ｒを過剰発現するＬＬＣ−ＰＫ４６＿ＲＡＴＯ＿ＰＴＨ１Ｒ細胞を用いて参考試験例１と同様に測定を行った。
ＬＬＣ−ＰＫ４６＿ＲＡＴＯ＿ＰＴＨ１Ｒ細胞を用いた結果を表５に示す。
ラットＰＴＨ１受容体におけるインビトロｃＡＭＰシグナル活性のＥＣ２０値は、ヒトＰＴＨ１ＲにおけるインビトロｃＡＭＰシグナル活性のＥＣ２０値と良好な相関関係にあった。ＥＣ５０値についても、ラットとヒトの間で良好な相関関係にあった。
【０２１２】
【表５】
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【０２１３】
参考試験例３：ヒト肝ミクロソームを用いた代謝安定性試験
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、ヒト肝ミクロゾームと化合物あるいは比較例をＮＡＤＰＨ共存下３７℃で所定の時間インキュベーションした。各反応時間における親化合物濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定し、反応時間に対する残存率の傾きから固有クリアランス（μＬ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。
【０２１４】
＜アッセイ条件＞
化合物濃度：    １μＭ
ミクロゾーム：  ０．５ｍｇ／ｍＬ
ＮＡＤＰＨ：    １ｍＭ
反応時間：      ０、５、１５および３０分
【０２１５】
結果を表６に示す。化合物１〜１１は比較例１〜６に比べヒト肝ミクロソームに対し高い代謝安定性を示した。
【０２１６】
【表６】
0006290138.tif 000049
【０２１７】
参考試験例４：ラット肝細胞を用いた代謝安定性試験
ラット（ＳＤ、♀）の肝臓からコラゲナーゼ還流法により肝細胞を調製した。参考実施例化合物あるいは比較例を添加して３７℃で所定の時間インキュベーションした後反応停止液を添加した。各反応時間における親化合物濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定し、反応時間に対する残存率の傾きから固有クリアランス（μＬ／１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｉｎ）を算出した。
【０２１８】
＜アッセイ条件＞
細胞濃度：    １×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
化合物濃度：  １μＭ
培地：        Williams' medium E
反応時間：    ０、１５、３０、６０、１２０および２４０分
反応停止液：  アセトニトリル／２−プロパノール（４／６、ｖ／ｖ）
【０２１９】
結果を表７に示す。化合物２、４、５、６、７、８、９、１０、１１の化合物は比較例１、２、３、５、６に比べラット肝細胞代謝安定性が向上した。
【０２２０】
【表７】
0006290138.tif 000050
【０２２１】
参考試験例５：ＴＰＴＸラットモデルでの血清Ｃａ濃度上昇作用
４週齢の雌性Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラットを日本チャールス・リバー株式会社（厚木飼育センター）より入手し、２０〜２６℃、湿度３５〜７５％の標準実験室条件下で１週間順化させた。ラットには、水道水ならびに１．１％カルシウム、１．０％リン酸および２５０ＩＵ／１００ｇのビタミンＤ３を含む標準げっ歯動物飼料（ＣＥ−２）（日本クレア株式会社）を自由に摂取させた。
５週齢のラットにＴＰＴＸを実施した。一部の個体には、偽手術（Ｓｈａｍ）を実施した。使用するためのＴＰＴＸラットは、手術４日後の血清Ｃａ濃度が８ｍｇ／ｄＬ未満の個体を選択した。手術５日後に、手術４日後に測定した血清Ｃａ濃度と体重に基づき、各群５匹ずつ８つのＴＰＴＸ群と１つのＳｈａｍ群に振り分けた。Ｓｈａｍ群およびＴＰＴＸ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群には、溶媒のみを１０ｍＬ／ｋｇの用量で経口投与した。ＴＰＴＸ−各検体群には、各検体３０ ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇの用量で溶媒に溶解させてそれぞれ経口投与した。溶媒の組成は、１０％ジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社）、１０％クレモフォールＥＬ（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社）、２０％ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン（日本食品化工株式会社）、グリシン（和光純薬工業株式会社）によりｐＨ１０に調製したものを使用した。各々の投与直前にＰｒｅ採血をし、投与２、６、１０および２４時間後にも採血を実施して血清Ｃａ濃度を測定した。各血液採取はイソフルラン吸入麻酔下にて頸静脈から行った。
【０２２２】
血清のＣａの測定。採取した血液から遠心分離により取得した血清を、自動分析装置ＴＢＡ−１２０ＦＲ（東芝メディカルシステムズ株式会社）を用いて測定した。
【０２２３】
動物試験についての統計解析。データを平均値±標準誤差（ＳＥ）として表す。統計的有意性は、ＳＡＳ前臨床パッケージ（Ver.5.00.010720、SAS Institute Japan, Tokyo, Japan）を使用して決定した。＜０．０５のｐ値を統計的に有意とみなした。２群のｔ検定によりＴＰＴＸ‐Ｖｅｈｉｃｌｅ群に対して＃Ｐ＜０．０５、比較例１の群に対して＊Ｐ＜０．０５、比較例２の群に対して∫Ｐ＜０．０５として示した。
【０２２４】
血清Ｃａ濃度のＰｒｅ値は、Ｓｈａｍ群で９．９ｍｇ／ｄＬ、ＴＰＴＸ各群で５．３〜６．２ｍｇ／ｄＬであった。各化合物の投与後２４時間までの血清Ｃａ濃度について、Ｐｒｅ値からの変化量を平均した値を図９に示した。また、各化合物を投与した後の血清Ｃａ濃度のピークは、どの化合物についても投与６時間後、もしくは１０時間後であった。
【０２２５】
ラット肝細胞代謝安定性の高い、化合物６、化合物７、化合物８は、pre値からの正の変化量が大きく、経口投与において強い血清Ｃａ濃度上昇作用が認められた。一方、ラット肝細胞代謝安定性の低い、化合物１、比較例１、比較例２のＰｒｅ値からの正の変化量は化合物６、化合物７、化合物８に比べ小さかった。特に化合物７、化合物８は比較例１、比較例２に対し統計上優位であった。
【０２２６】
さらに、ラット肝細胞代謝安定性の高い、化合物６、化合物７、化合物８は、投与後６時間もしくは１０時間後において、各化合物の最大値として７．８〜８．５ｍｇ／ｄＬの値を示し、副甲状腺機能低下症患者での血清Ｃａ濃度の治療目標域７．６〜８．８ｍｇ／ｄＬを達成した。一方、ラット肝細胞代謝安定性の低い、化合物１、比較例１、比較例２はすべての測定時間において、この治療目標域に達しなかった。
【０２２７】
以上の試験結果から、ラットＰＴＨ１Ｒを強制発現させた細胞において強いｃＡＭＰシグナル活性を示し、かつラット肝細胞での代謝に対して高い安定性を示す、化合物６、化合物７、化合物８は、ラットにおいて、経口投与下で強い血清Ｃａ濃度上昇作用が認められた。これら化合物はヒトＰＴＨ１Ｒを強制発現させた細胞でのｃＡＭＰシグナル活性を有し、ヒト肝ミクロソーム代謝安定性が比較化合物に比べ高く、経口投与で副甲状腺機能低下症患者への高い治療効果が期待される。さらに、化合物６、化合物７、化合物８と同じ程度のヒトＰＴＨ１Ｒを強制発現させた細胞でのｃＡＭＰシグナル活性とヒト肝ミクロソーム代謝安定性を示す一般式（１）で表わされる化合物についても副甲状腺機能低下症患者への高い治療効果が期待される。
【産業上の利用可能性】
【０２２８】
本発明により、高い代謝安定性を有し、強力なＰＴＨ様作用を発揮するヒダントイン誘導体を非侵襲的に全身曝露または局所暴露させることで骨・軟骨同化作用を誘導させ、骨粗鬆症、歯周病における骨量減少、抜歯後の歯槽骨欠損、変形性関節症、関節軟骨欠損、無形成骨症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、骨軟化症、骨折などに対する予防、治療、回復および治癒促進するための医薬が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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