(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＫ−ＬＣ−１に対する特異的結合物質、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット又はＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備え、胃下部領域の幽門腺に由来する胃組織試料のＫＫ−ＬＣ−１の発現の検出に用いられる、前癌状態の胃癌検出キット。
【請求項２】
ＫＫ−ＬＣ−１に対する特異的結合物質を備え、前記特異的結合物質が蛍光色素又はポジトロン核種で標識されている、請求項１に記載の前癌状態の胃癌検出キット。
【請求項３】
前記特異的結合物質が蛍光色素で標識されており、内視鏡による検出用である、請求項２に記載の前癌状態の胃癌検出キット。
【請求項４】
ヘリコバクター・ピロリ感染検出薬を更に備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載の前癌状態の胃癌検出キット。
【請求項５】
胃組織試料におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程を備え、前記胃組織試料が胃下部領域の幽門腺に由来するものである、前癌状態の胃癌細胞の検出方法。
【請求項６】
前記胃組織試料におけるヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程を更に備える、請求項５に記載の前癌状態の胃癌細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早期胃癌検出キット及び早期胃癌細胞の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌／精巣抗原は、癌細胞と精巣以外では発現が認められないタンパク質の総称である。癌／精巣抗原の１つであるＫｉｔａｋｙｕｓｈｕ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（以下、「ＫＫ−ＬＣ−１」という。）は、当初、肺癌細胞株が特異的に発現する抗原として同定されたものである（例えば、非特許文献１を参照。）。
【０００３】
ところで、胃癌は、早期に発見され、リンパ節転移や遠隔転移を認めない症例では、治癒切除により予後良好である。胃癌の５年生存率による治療成績は、Ｓｔａｇｅ  Ｉは約９０％、Ｓｔａｇｅ  ＩＩは約７０％、Ｓｔａｇｅ  ＩＩＩは約５０％、Ｓｔａｇｅ  ＩＶは約１０％とされている。このため、胃癌の早期発見は重要である。
【０００４】
ほとんどの胃癌は、早期段階では無症状であることが多い。したがって、自覚症状により胃癌を早期発見することは困難である。自覚症状としては、胃部不快感、吐き気、黒色便、貧血、体重減少、易疲労感、発熱、軟便化等が挙げられる。このような自覚症状が現れた後に、進行、転移をした状態で胃癌が発見される場合も少なくない。そこで、早期段階で胃癌を検出する技術が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Identification of a new cancer/germline gene, KK-LC-1, encoding an antigen recognized by autologous CTL induced on human lung adenocarcinoma. Fukuyama T, Hanagiri T, Takenoyama M, Ichiki Y, Mizukami M, So T, Sugaya M, So T, Sugio K, Yasumoto K. Cancer Res. 2006 May 1;66(9):4922-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景のもと、本発明は、早期胃癌を検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
（１）ＫＫ−ＬＣ−１に対する特異的結合物質、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット又はＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、早期胃癌検出キット。
（２）ＫＫ−ＬＣ−１に対する特異的結合物質を備え、前記特異的結合物質が蛍光色素又はポジトロン核種で標識されている、（１）に記載の早期胃癌検出キット。
（３）前記特異的結合物質が蛍光色素で標識されており、内視鏡による検出用である、（２）に記載の早期胃癌検出キット。
（４）ヘリコバクター・ピロリ感染検出薬を更に備える、（１）〜（３）のいずれかに記載の早期胃癌検出キット。
（５）胃組織試料におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程を備える、早期胃癌細胞の検出方法。
（６）前記胃組織試料が胃下部領域に由来するものである、（５）に記載の早期胃癌細胞の検出方法。
（７）前記胃組織試料が幽門腺に由来するものである、（５）又は（６）に記載の早期胃癌細胞の検出方法。
（８）前記胃組織試料におけるヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程を更に備える、（５）〜（７）のいずれかに記載の早期胃癌細胞の検出方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、早期胃癌を検出する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】胃、食道及び十二指腸を示す模式図である。
【図２】（ａ）は、胃底腺に由来する代表的な胃組織試料の顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。（ｂ）は、幽門腺に由来する代表的な胃組織試料の顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。（ｃ）は、胃底腺及び幽門腺の境界領域に由来する代表的な胃組織試料の顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［早期胃癌検出キット］
１実施形態において、本発明は、ＫＫ−ＬＣ−１に対する特異的結合物質、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット又はＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、早期胃癌検出キットを提供する。
【００１１】
本明細書において、早期胃癌とは、前癌状態又はステージＩの胃癌を意味する。ここで、前癌状態とは、外見上正常であるが放置すると癌ができると考えられる状態を意味する。また、ステージＩの胃癌とは、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）が提案しているＴＮＭ分類における、ＩＡ又はＩＢに分類される胃癌を意味する。
【００１２】
実施例において後述するように、発明者らは、胃癌患者由来の外見上正常な胃組織試料においてもＫＫ−ＬＣ−１の発現が認められることを明らかにした。したがって、被検者由来の胃組織試料におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出することにより、早期胃癌を検出することができる。ＫＫ−ＬＣ−１の発現は、タンパク質レベルで検出してもよいし、ｍＲＮＡレベルで検出してもよい。なお、ヒトＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿００１０１７９７８である。
【００１３】
（特異的結合物質）
本実施形態のキットにおいて、特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物にＫＫ−ＬＣ−１タンパク質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【００１４】
抗ＫＫ−ＬＣ−１抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。また、抗ＫＫ−ＬＣ−１抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体はヒトに投与しても問題が生じにくい。
【００１５】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００１６】
上記の特異的結合物質は蛍光色素で標識されていてもよい。ここで、「蛍光色素で標識されている」とは、上記の特異的結合物質が直接蛍光色素で標識されている場合、及び上記の特異的結合物質に結合する２次抗体等が蛍光色素で標識されている場合を含む。
【００１７】
発明者らは、以前に、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質が細胞膜表面上に局在することを明らかにしている。発明者らは更に、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質のＣ末端側を細胞の外部に露出した状態で細胞膜表面上に存在することを明らかにしている。
【００１８】
そこで、例えば、被検者の胃に蛍光色素で標識された特異的結合物質を接触させ、内視鏡等を用いて、蛍光色素による染色状況を確認することにより、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現を確認することができる。すなわち、上記の特異的結合物質は、蛍光色素で標識されており、内視鏡による検出用であってもよい。ここで、内視鏡は顕微鏡を内蔵しているものであってもよい。
【００１９】
あるいは、上記の特異的結合物質はポジトロン核種で標識されていてもよい。すなわち、特異的結合物質はポジトロン核種で標識されたポジトロン断層法（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＰＥＴ）用プローブであってもよい。
【００２０】
ＰＥＴとは、陽電子（ポジトロン）の検出を利用したコンピューター断層撮影技術である。ＰＥＴ診断に用いられるポジトロン核種としては、１１Ｃ（半減期２０．４分）、１３Ｎ（半減期９．９７分）、１５Ｏ（半減期２．０４分）、１８Ｆ（半減期１０９．８分）、６４Ｃｕ（半減期１２．７時間）、８９Ｚｒ（半減期７８．９１時間）等が挙げられる。
【００２１】
上記の特異的結合物質を、上記のいずれかのポジトロン核種で標識することにより、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質特異的なＰＥＴ用プローブを製造することができる。上記の特異的結合物質をＰＥＴ用プローブとして用いることにより、低侵襲で高精度に早期胃癌を検出することができる。
【００２２】
抗体やアプタマーをポジトロン核種で標識する方法としては、例えば、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）等のキレート剤を抗体やアプタマーに結合させ、続いて、ＤＯＴＡに６４Ｃｕ等のポジトロン核種をキレートさせる方法等が挙げられる。抗体やアプタマーにＤＯＴＡを結合させる方法としては、例えば、抗体やアプタマーとＤＯＴＡ−ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）エステルとを反応させる方法等が挙げられる。
【００２３】
また、上記の特異的結合物質を用いたＥＬＩＳＡ法等により、被検者の血清又は血漿中のＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を検出してもよい。これにより、低侵襲で高精度に早期胃癌を検出することができる。
【００２４】
（ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット）
上述したように、ＫＫ−ＬＣ−１の発現はｍＲＮＡレベルで検出してもよい。ｍＲＮＡレベルで検出する方法としては、例えば、胃組織試料から調製したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、このｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅を行うこと等が挙げられる。
【００２５】
したがって、本実施形態の早期胃癌検出キットは、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセットであってもよい。プライマーセットの塩基配列は、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｃＤＮＡを特異的に増幅できる限り特に制限されないが、例えば、配列番号１に示すセンスプライマー及び配列番号２に示すアンチセンスプライマーのセットであってもよい。
【００２６】
（ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ）
ＫＫ−ＬＣ−１の発現をｍＲＮＡレベルで検出する別の方法として、胃組織試料から調整したＲＮＡをＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブと接触させ、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｍＲＮＡと上記プローブとの結合を検出することが挙げられる。より具体的には、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等が挙げられる。
【００２７】
プローブは、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。また、プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。
【００２８】
（ヘリコバクター・ピロリ感染検出薬）
また、実施例において後述するように、ヘリコバクター・ピロリに感染した胃癌患者由来の外見上正常な胃組織試料では、ＫＫ−ＬＣ−１の発現の陽性率が更に向上する。したがって、本実施形態の早期胃癌検出キットは、ヘリコバクター・ピロリ感染検出薬を更に備えていてもよい。ＫＫ−ＬＣ−１の発現と共に、ヘリコバクター・ピロリに感染しているか否かを検出することにより、より高精度に早期胃癌を検出することができる。ヘリコバクター・ピロリ感染の検出は、胃組織試料を用いて行ってもよいし、胃組織試料が由来する被検者の血清等を用いて行ってもよい。
【００２９】
ヘリコバクター・ピロリ感染検出薬としては、特に限定されず、ヘリコバクター・ピロリの存在を検出する検出薬、又はヘリコバクター・ピロリの感染によって生じる炎症反応若しくは免疫応答を検出する検出薬等が挙げられる。
【００３０】
ヘリコバクター・ピロリの存在を検出する検出薬としては、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子又はタンパク質を検出する検出薬が挙げられる。ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質としては、ウレアーゼＡ、ウレアーゼＢ等のウレアーゼ；ＦｌａＡ、ＦｌａＢ、ＦｌｉＤ、ＦｌｉＫ、ＦｌｇＥ、ＦｌｇＭ等の鞭毛タンパク質；空胞化毒素（ＶａｃＡ）；毒素随伴タンパク質（ＣａｇＡ）；好中球活性化タンパク質（ＮａｐＡ）等が挙げられる。また、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子としては、上述したヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３１】
また、ヘリコバクター・ピロリ感染によって生じる炎症反応若しくは免疫応答を検出する検出薬としては、被検者由来の血清中の抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を検出する検出薬、ヘリコバクター・ピロリ感染により、胃粘膜上皮細胞から放出されるＩＬ−８を検出する検出薬、ＩＬ−８が産生誘導するＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等を検出する検出薬等が挙げられる。
【００３２】
ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する検出薬としては、上述したもの以外にも、尿素試験法による検出薬が挙げられる。本検出薬は次のようなものである。まず、安定性同位元素又は放射性同位元素で標識した尿素を被検者に経口投与する。すると、ヘリコバクター・ピロリが有するウレアーゼにより同位元素で標識した尿素が加水分解され、アンモニアと同位元素で標識されたＣＯ２が発生し、呼気から放出される。そこで、この呼気を採取し、呼気中に存在する、同位元素で標識されたＣＯ２と自然界に存在するＣＯ２との比率を測定する。測定された比率に基づいてヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができる。
【００３３】
［早期胃癌細胞の検出方法］
１実施形態において、本発明は、胃組織試料におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出する工程を備える、早期胃癌細胞の検出方法を提供する。本実施形態の検出方法において、ＫＫ−ＬＣ−１の発現の検出は、上述したものと同様にして行えばよく、タンパク質レベルで検出してもよいし、ｍＲＮＡレベルで検出してもよい。胃組織試料としては、内視鏡を用いて被検者から採取した生検試料、胃洗浄液等を利用することができる。
【００３４】
ここで、図１を用いて胃の領域について説明する。図１は、胃１００と、食道１１０と、十二指腸１２０を示す模式図である。胃癌取扱い規約第１４版（２０１０年３月発行、日本胃癌学会編）によれば、胃１００の大彎１３０及び小彎１４０を３等分し、それぞれの対応点を結んで、胃１００を上部領域１５０、中部領域１６０及び下部領域１７０の３つの領域に分けると記載されており、本明細書においてもこの領域区分にしたがう。実施例において後述するように、胃組織試料が胃下部領域に由来するものであると、より早期胃癌の検出率を向上させることができる。
【００３５】
また、胃腺には胃底腺、噴門腺及び幽門腺の３種が存在する。実施例において後述するように、胃組織試料が幽門腺に由来するものであると、更に早期胃癌の検出率を向上させることができる。
【００３６】
したがって、胃下部領域又は幽門腺に由来する胃組織試料におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を確認することにより、早期胃癌を更に高精度に検出することができる。胃組織試料は、胃下部領域の幽門腺に由来するものであることがより好ましい。
【００３７】
また、実施例において後述するように、ヘリコバクター・ピロリに感染した胃癌患者由来の外見上正常な胃組織試料では、ＫＫ−ＬＣ−１の発現の陽性率が更に向上する。したがって、本実施形態の早期胃癌細胞の検出方法は、胃組織試料におけるヘリコバクター・ピロリ感染を検出する工程を更に備えていてもよい。本工程において、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出方法は特に制限されず、上述したものと同様の方法を用いることができる。
【実施例】
【００３８】
次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００３９】
［実験例１］
胃癌患者由来の胃組織試料におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を検討した。胃組織試料としては、腫瘍部位に由来する試料だけでなく外見上正常な組織に由来する試料についても検討した。また、胃組織試料が由来する領域、胃癌患者がヘリコバクター・ピロリに感染していたか否かについても検討した。
【００４０】
より具体的には、２０１１年６月６日から２０１５年９月１５日までに北里大学メディカルセンター外科において胃癌と診断され、胃の切除術を受けた患者のうち、切除組織から胃組織試料を採取することができた患者を対象として検討を行った。
【００４１】
まず、患者の術前血清を回収した。続いて、ＥＬＩＳＡ法により、患者の術前血清中の抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧの存在量を測定し、患者がヘリコバクター・ピロリに感染していたか否かを確認した。
【００４２】
続いて、胃の切除術後の新鮮胃組織から、腫瘍部位に由来する胃組織試料１個と、腫瘍部位から遠位の外見上正常な胃組織試料１〜４個をそれぞれ回収した。ここで、外見上正常な組織については、胃上部領域、胃中部領域、胃下部領域のいずれの領域に由来するものであるかを記録した。続いて、回収した各組織から全ＲＮＡを調製しｃＤＮＡを調製した。また、採取した各組織試料に隣接する組織も回収し、ホルマリン固定後、パラフィン包埋ブロックを作製した。
【００４３】
続いて、作製したパラフィン包埋ブロックから薄切切片を作製してヘマトキシリン・エオシン染色した。続いて、染色した組織の顕微鏡観察により、胃組織試料が胃底腺、幽門腺、胃底腺及び幽門腺の境界領域のいずれの腺領域に由来するものであるかを識別した。
【００４４】
図２（ａ）は、胃底腺に由来する代表的な胃組織試料の顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。図２（ｂ）は、幽門腺に由来する代表的な胃組織試料の顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。図２（ｃ）は、胃底腺及び幽門腺の境界領域に由来する代表的な胃組織試料の顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。
【００４５】
また、調製したｃＤＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲにより、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を確認した。ＫＫ−ＬＣ−１増幅用プライマーとしては、センスプライマー（配列番号１）及びアンチセンスプライマー（配列番号２）を使用した。４０サイクルのＰＣＲ反応における３４２ｂｐの増幅産物の有無により、ＫＫ−ＬＣ−１の発現の有無を判断した。
【００４６】
表１は、腫瘍部位に由来する胃組織試料について、ＫＫ−ＬＣ−１の発現を集計した結果である。その結果、腫瘍部位に由来する胃組織試料の７７．９％において、ＫＫ−ＬＣ−１の発現が認められた。この結果は、ＫＫ−ＬＣ−１が胃癌マーカーとして有用であることを示す。
【００４７】
【表１】
0006320447.tif 000002
【００４８】
また、表２は、外見上正常な胃組織試料について、胃組織試料が由来する領域及びＫＫ−ＬＣ−１の発現を集計した結果である。その結果、胃癌患者由来の外見上正常な胃組織試料において、ＫＫ−ＬＣ−１の発現が高頻度に認められることが明らかとなった。また、胃癌患者由来の外見上正常な胃組織試料が、胃下部領域に由来するものであると、ＫＫ−ＬＣ−１の発現の陽性率は６４．６％であり、より胃癌の検出率が向上することが明らかとなった。また、胃組織試料が胃下部領域の幽門腺に由来するものであると、ＫＫ−ＬＣ−１の発現の陽性率は７１．２％であり、更に胃癌の検出率が向上することが明らかとなった。
【００４９】
また、外見上正常な胃組織試料を１個採取した２３症例中、５例（２１．７％）でＫＫ−ＬＣ−１の発現が認められた。また、外見上正常な胃組織試料を２個採取した３８症例中、いずれかの胃組織試料でＫＫ−ＬＣ−１を発現していた症例は２３例（６０．５％）であった。また、外見上正常な胃組織試料を４個採取した１５症例中、いずれかの胃組織試料でＫＫ−ＬＣ−１を発現していた症例は１１例（７３．３％）であった。したがって、外見上正常な胃組織試料をできるだけ多く採取してＫＫ−ＬＣ−１の発現を検討することにより、早期胃癌の検出率が向上することが明らかとなった。
【００５０】
【表２】
0006320447.tif 000003
【００５１】
表３は、ヘリコバクター・ピロリに感染していた患者に限定して、外見上正常な胃組織試料について、胃組織試料が由来する領域及びＫＫ−ＬＣ−１の発現を集計した結果である。その結果、ヘリコバクター・ピロリに感染していた患者の外見上正常な胃組織試料におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現の陽性率は、表２の結果と比較して更に向上する傾向にあることが明らかとなった。
【００５２】
以上の結果から、被検者由来の外見上正常な胃組織試料におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を確認することにより、早期胃癌を正確に検出できることが明らかとなった。また、被検者由来の外見上正常な胃組織試料におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現と共に、被検者がヘリコバクター・ピロリに感染しているか否かを検討することにより、早期胃癌を更に精度よく検出できることが明らかとなった。
【００５３】
【表３】
0006320447.tif 000004
【００５４】
［実験例２］
胃癌患者の腫瘍部位に由来する胃組織試料における癌／精巣抗原の発現を検討し、胃癌のステージ別に集計した。癌／精巣抗原としては、ＫＫ−ＬＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＳＸ−４、ＮＹ−ＥＳＯ−１の発現を検討した。また、胃癌患者の術前血清を試料としたＥＬＩＳＡ法により、胃癌マーカーであるＣＥＡ及びＣＡ１９−９の発現についても検討した。
【００５５】
ＫＫ−ＬＣ−１の発現は、配列番号１に示すセンスプライマー及び配列番号２に示すアンチセンスプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより検討した。４０サイクルのＰＣＲ反応における増幅産物の有無により、ＫＫ−ＬＣ−１の発現の有無を判断した。
【００５６】
また、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＳＸ−４及びＮＹ−ＥＳＯ−１の発現は、市販のキットを用いた５０サイクルのリアルタイムＰＣＲ反応により検討した。使用したキットはいずれもＴｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ社製のものであり、ＭＡＧＥ−Ａ１の検出には型式「Ｈｓ００６０７０９７＿ｍ１」のキットを使用し、ＭＡＧＥ−Ａ３の検出には型式「Ｈｓ００３６６５３２＿ｍ１」のキットを使用し、ＭＡＧＥ−Ａ４の検出には型式「Ｈｓ００３６５９７９＿ｍ１」のキットを使用し、ＳＳＸ−４の検出には型式「Ｈｓ０２３４１５３２＿ｍ１」のキットを使用し、ＮＹ−ＥＳＯ−１の検出には型式「Ｈｓ００２６５８２４＿ｍ１」のキットを使用した。
【００５７】
また、ＣＥＡの発現は、市販のキット（型式「ルミパルスＣＥＡ−Ｎ  ＢＤＸ０６Ｔ  Ｒｅｆ：  ２９２６６２」、富士レビオ株式会社）を用いて測定した。また、ＣＡ１９−９の発現は、市販のキット（型式「ルミパルスＣＡ１９−９−Ｎ  ＵＤＸ１０Ｔ  Ｒｅｆ：  ２９２６５５」、富士レビオ株式会社）を用いて測定した。
【００５８】
表４に、各癌／精巣抗原及び胃癌マーカーの発現を胃癌のステージ別に集計した結果を示す。その結果、ＫＫ−ＬＣ−１は、ステージＩの胃癌の腫瘍部位において、他の癌／精巣抗原又は胃癌マーカーと比較して発現頻度が顕著に高いことが明らかとなった。この結果は、ＫＫ−ＬＣ−１が早期胃癌を検出可能なマーカーとして有用であることを更に支持するものである。
【００５９】
【表４】
0006320447.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、早期胃癌を検出する技術を提供することができる。
【図１】
0006320447.tif 000006
【図２】
0006320447.tif 000007
【配列表】
0006320447000001.app