(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル領域に一連の励起光パルスを照射した場合における励起状態の寿命もしくは蛍光寿命、又は励起状態の寿命もしくは蛍光寿命に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査する方法であって、
励起光パルス（複数）の時間的間に、その都度検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光もしくは蛍光の光量、又はフォトン数の少なくとも一方を測定すること、
ａ  各測定された光量ないしは各フォトン数が、それに割り当てられた検出時間窓を特徴付ける少なくとも１つの変数（ないし大きさ：Groesse）に対してそれぞれ関連付けられるか、
ｂ  各測定された光量又は各フォトン数が、それぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けられるか、又は、
ｃ  ２つの検出時間窓に関して、それぞれの前回の励起光パルスからのオフセット時間が同一である場合には、各測定された光量又は各フォトン数が、それぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けられること、及び
蛍光減衰曲線を求めるために、時間に関する微分又は時間に関する数値微分の少なくとも一方を相互に関連した組のセットから算出すること、
を特徴とする方法。
【請求項２】
ａ  少なくとも２つの検出時間窓が異なる時間の長さを有するか、又は、
ｂ  異なる励起光パルス（複数）の時間的間に配される少なくとも２つの検出時間窓が、異なる時間的長さを有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出時間窓の開始端が、前回の励起光パルスからの第１オフセット時間によって定義され、かつ、検出時間窓の終了端が前回の励起光パルスからの第２オフセット時間によって定義される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前回の励起光パルスからの第２オフセット時間が同一であり、そして、非同一の長さの検出時間窓を生成するために一連の励起光パルスを照射している間に第１オフセット時間を変更するか、又は
前回の励起光パルスからの第２オフセット時間が同一であり、そして、非同一の長さの検出時間窓を生成するために一連の励起光パルスを照射している間に第１オフセット時間を増大する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
２つの励起光パルスの間に、各々１つの単一検出時間窓のみが提供される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
減衰寿命及び蛍光半減期の少なくとも１つが相互に関連した組のセットから求められる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
励起光パルスが同一であるか又は同一のパルス幅（長さ）及びパルスエネルギーを含むか、あるいは、励起光パルスのオフセット時間が同一である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
白色光レーザを用いて、又は、フォトニックバンドギャップファイバ又はフォトニック結晶ファイバを含む白色光レーザを用いて励起光パルスが生成される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ａ  検出光がハイブリッド検出器を用いて検出されること、又は、
ｂ  検出光が光カソードを含む検出器（該光カソードの下流には、電子加速器及び／又は電子増倍器が配置され、その次にアバランシェダイオードが配置される）を用いて検出されること
を特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
励起光及び検出光の少なくとも１つを方向づける（ないし偏向する）ためのスキャニングデバイスが使用される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
サンプル領域のＦＬＩＭ画像が生成される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を実行するための装置、顕微鏡、走査顕微鏡、又は、共焦点走査顕微鏡。
【請求項１３】
励起状態の寿命もしくは蛍光寿命、又は励起状態の寿命もしくは蛍光寿命に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査するためのものであり、
サンプルのサンプル領域を照射するために一連の励起光パルスを生成する光源を有し、
検出器が、励起光パルスの時間的間に、その都度検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光もしくは蛍光の光量又はフォトン数の少なくとも１つを測定し、
ａ  コントロール装置又は評価装置が、各測定された光量ないしは各フォトン数を、それに割り当てられた検出時間窓を特徴付ける少なくとも１つの変数（ないし大きさ）に対してそれぞれ関連付けるか、又は、
ｂ  コントロール装置又は評価装置が、各測定された光量ないしは各フォトン数を、それぞれに関連した検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けるか、又は、
ｃ  コントロール装置又は評価装置が、それぞれの前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２のオフセット時間が同一である場合に、各測定された光量ないしは各フォトン数をそれぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端とそれぞれ関連付け、
蛍光減衰曲線を求めるために、コントロール装置又は評価装置が相互に関連した組のセットから時間に関する微分及び時間に関する数値微分の少なくとも一方を算出する、
装置、顕微鏡、走査顕微鏡又は共焦点走査顕微鏡。
【請求項１４】
コントロール装置が、サンプル領域に一連の励起光パルスの照射の間に、検出時間窓の期間（ないし長さ）を変更する請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
検出時間窓の開始端が、前回の励起光パルスからの第１オフセット時間によって定義され、かつ、
検出時間窓の終了端が前回の励起光パルスからの第２オフセット時間によって定義され、かつ、
前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２オフセット時間が同一であり、かつ、
一連の励起光パルスの照射の間にコントロール装置が第１のオフセット時間を変更又は増大させる
請求項１３又は１４に記載の装置。
【請求項１６】
コントロール装置又は評価装置が相互に関連した組のセットから減衰寿命及び蛍光半減期の少なくとも一方を求める請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
励起光パルスが同一であるか、
励起光パルスが同一のパルス幅（長さ）及びパルスエネルギーを含むか、又は、
励起光パルスのオフセット時間が同一である
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
光源が白色光レーザを含むか、又は光源がフォトニックバンドギャップファイバ又はフォトニック結晶ファイバを含む請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
検出器がハイブリッド検出器として構成されるか、又は、検出器が光カソードを含む（該光カソードの下流に電子加速器又は電子増倍器が配置され、その次にアバランシェダイオードが配置される）請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
評価装置が、照射されたサンプル領域のＦＬＩＭ画像を生成する請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル領域に一連の励起光パルスが照射された場合における励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に関して、及び／又は励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査する方法、及びその方法を実行する装置に関する。
【０００２】
本発明は、更に、サンプルのサンプル領域を照射するために一連の励起光パルスを生成する光源を有する、励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に関して、及び／又は励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査するための装置、顕微鏡、特に走査顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００３】
サンプルの特徴（ないし特性）についての重要な知識は、１つ以上の蛍光染料を用いて染められた（マークされた）サンプルの励起状態の寿命を検査することによって獲得され得る。特に複数の蛍光染料が使用される場合には、蛍光寿命イメージング顕微鏡（ＦＬＩＭ）の助けによって、例えば、検査されるサンプル領域について（例えばその組成又は環境について）の知識を獲得することが可能である。細胞生物学において、例えば、サンプル領域におけるカルシウム濃度は、蛍光染料の寿命を測定することによって間接的に推定され得る。
【０００４】
ＦＬＩＭは、特に、１つの顕微鏡画像において、様々な蛍光減衰時間（例えば、種々の染料の使用によって又は微細環境によって生じる）をコントラストとして表わすことができる技術である。ここでは、測定された蛍光減衰時間はピクセル毎に表され、異なる色が、例えば、異なる蛍光減衰時間を有するピクセルに関連付けられる。
【０００５】
蛍光染料の励起状態の寿命の測定に関する多数の方法が存在する。これらの方法のいくつかは、Joseph R. Lakowiczによるテキスト本「Principles of Fluorescence Spectroscopy」 (Kluwer Academic/Plenum Publishers, second ed., 1999)の第４章及び第５章に詳細に記載される。例えば、発光の位相遅延から励起状態の寿命を導出するために、励起光の出力パワーを時間的に調節することが可能である。
【０００６】
発光した光パルスの時間的シフトないしオフセットを電子的に測定できるように、短い光パルスを使用して蛍光染料を励起することも可能である。例えば、ＤＥ１０  ２００４  ０１７  ９５６Ａ１号は、励起光を生成する少なくとも１つの光源及び検出されたサンプルから発した光を受光する少なくとも１つの検出器を有する、サンプルにおける励起状態の寿命を検査するための顕微鏡を開示する。該顕微鏡は、光源がパルス状の励起光を発する半導体レーザを含み、サンプルの特定の寿命特徴に合わせてパルス繰り返し率を調節する調節装置が提供されることを特徴とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】独国特許公開ＤＥ１０  ２００４  ０１７  ９５６Ａ１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特にデータ評価に必要な電子システムは、商業的に、しばしばプラグインＰＣカードの形態で提供される。しかしながら、この種の時間測定式カードは非常に複雑でありかつ高価である。
【０００９】
従って、本発明の第１の視点においてその目的は、励起状態の寿命、特に蛍光寿命に関して、及び／又は励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に対して相関するサンプルの特徴に関して、単純な仕方で、結論を導き出すことが可能な方法を提供することである。
【００１０】
更なる本発明の第２の視点においてその目的は、単純な構成を有し、かつ、励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に関して、及び／又は励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に対して相関するサンプルの特徴に関して、単純な仕方で結論を導き出すことが可能な装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の第１の視点において、本発明によれば、励起光パルス（複数）の時間的間に、各検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光、特に蛍光の光量及び／又はフォトン数を測定することを特徴とする方法が提供される。
【００１２】
上記の第２の視点において、本発明によれば、検出器が、励起光パルス（複数）の時間的間に、各検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光、特に蛍光の光量及び／又はフォトン数を測定することを特徴とする装置が提供される。
【００１３】
本発明は、図面に模式的に表され、該図面を参照して以下に記載される。同一の要素又は同様に機能する要素は、通常は、同一の符号でラベルされる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、励起光パルス及び検出時間窓の寸法（dimensions）及び配置（arrangement）を模式的に示す。
【図２】本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、測定値の取得及びデータ評価の原理を模式的に示す。
【図３】本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、測定値の取得及びデータ評価の原理を模式的に示す。
【図４】本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、測定値の取得及びデータ評価の原理を模式的に示す。
【図５】本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、測定値の取得及びデータ評価の原理を模式的に示す。
【図６】本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、測定値の取得及びデータ評価の原理を模式的に示す。
【図７】本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、測定値の取得及びデータ評価の原理を模式的に示す。
【図８】本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、測定値の取得及びデータ評価の原理を模式的に示す。
【図９】本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、測定値の取得及びデータ評価の原理を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
特定の実施形態において、少なくとも２つの検出時間窓が異なる時間的長さを有し、及び／又は、異なる励起光パルス（複数）の時間的間に配される少なくとも２つの検出時間窓が異なる時間的長さを有する。特に、コントロール装置が、サンプル領域に一連の励起光パルスを照射している間に、検出時間窓の期間（長さ：Dauer）を変更し得る。
【００１６】
特に、検出時間窓の開始端が前回の励起光パルスからの第１オフセット時間によって定義され、そして、検出時間窓の終了端が前回の励起光パルスからの第２オフセット時間によって定義され得る。
【００１７】
特に単純に実行され得る実施形態において、前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２オフセット時間が同一であり、かつ、変化され、特に、一連の励起光パルスが照射されている間に第１オフセット時間が非同一の長さの検出時間窓を生成するために、第１の時間が増大される。
【００１８】
本発明の方法の実行に関しては、２つの励起光パルスの間に、各々、１つの単一検出時間窓のみが提供されることで完全に十分である。
【００１９】
特に、各測定された光量又は各フォトン数が、適切な検出時間窓を特徴付けるそれぞれ少なくとも１つの変数に対してそれぞれ関連付けられ得るし、及び／又は、特に、それぞれの前回の励起光パルスからの検出時間窓の２つのオフセット時間が同一である場合には、各測定された光量又は各フォトン数が、それぞれに適切な検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けられる。特に、関連付けの結果として、更なる評価のためのｎ組（n-Tupeln）のセットが生成される。
【００２０】
この仕方において、減衰曲線の積分が逐次的にサンプリングされる。次に、減衰曲線のプロファイルが、時間に関して微分することによって導出され得る。
【００２１】
例えば、各々の前回の励起光パルスからの検出時間窓の開始端の第１オフセット時間を増大（延長）させ、その一方で、各々の前回の励起光パルスからの検出時間窓の終了端の第２のオフセットを同一のままにすることは、サンプル領域に存在する蛍光染料の励起状態（単数又は複数）の減衰挙動を単純な仕方で特徴付けることが可能である。第２オフセット時間が一定に保持されるので、各検出時間窓は、単一変数、すなわち検出時間窓の開始端によって完全に記載される。結果として、それぞれに測定された光量又はそれぞれに測定されたフォトン数を、単一変数のみと関連付けることが必要であり、２組（2er-Tupeln）を計算することによって励起光パルスに対する応答として、照射された領域におけるサンプルの時間に関する挙動を記録すること、及び更に評価することが可能である。
【００２２】
関連付けの結果として構築されたｎ組の、特に２組のセットは、例えば励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に関する、及び／又は励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に対して相関するサンプルの特徴に関する、数値解析法を使用して評価され得る。
【００２３】
上述のように、例えば、特に蛍光減衰曲線を求めるために、相互に関連した組のセットから時間に関する数値微分が計算される。先ず、求めた組から、組によって定義される曲線のプロファイルを推定することができ、そして次に時間に関して微分（abzuleiten）することができる。
【００２４】
減衰寿命及び／又は蛍光半減期を、相互に関連した組のセットから求めることもできる。このことは、例えば、取得したデータ（特にｎ組から取得したデータ）から求めることによって、検出フォトン数を１／ｅないしは半分に減少させた時間間隔を求め得る。
【００２５】
特に、検出時間窓（複数）内の検出された光量ないしはフォトン数の比較可能性を保障するために、励起光パルスが、特にパルス長さ（ないし幅：Pulsdauer）及びパルスエネルギーという意味合いにおいて同一であること及び／又は励起光パルスのオフセット時間が同一であることが好ましい。パルス長さを制御する装置及び／又はこれらの境界状態（条件）を保障する出力光強度を制御する装置も特に提供され得る。あるいは、取得したデータを修正するために、励起光パルスの特徴に関連する変動を測定して、評価時に考慮に入れることもできる。
【００２６】
白色光レーザを用いて励起光パルスを生成する実施形態において、特にフォトニックバンドギャップファイバ又はフォトニック結晶ファイバを含む白色光レーザが特に汎用性良く使用され得る。このことは、適切な励起波長の光が、任意の蛍光色素に関して広域に利用可能であるという利点を有する。例えば、サンプルがいくつかの異なる蛍光染料を含む場合には、いくつかの波長の光を同時にサンプルに適用することももちろん可能である。
【００２７】
特に、それぞれの光量ないしはフォトン数の正確な検出は、検出光がハイブリッド検出器を用いて検出されるときに可能である。特に、検出光が光カソードを含む検出器を用いて検出され、光カソードの下流には電子加速器及び／又は電子増倍器が配置され、その次にアバランシェダイオードが後置され得る。そのような検出器は、特に本発明の方法の特に正確な実行を可能にする特徴、すなわち、広いダイナミックレンジ、高い感受性、かつ低いシグナル／ノイズ比を有する。
【００２８】
特に有利な実施形態において、本発明の方法は、例えば、励起光及び／又は検出光を方向づけるためのスキャニングデバイスを含み得る走査顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡を使用して実行される。それによって、照射されたサンプル領域のＦＬＩＭ画像を生成すること、及び、ユーザ用にディスプレイ上にそれらを表示することが可能である。
【００２９】
本発明の装置に関して、好ましくは電子コントロール装置が特に提供され得る。該装置は、前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２のオフセット（複数）を一定に保ち、一連の励起光パルスが照射されている間に、それぞれの検出時間窓の開始端を構成する第１のオフセットを変化、特に増大（延長）させる。
【００３０】
さらに、コントロール装置ないしは評価装置は、各測定された光量ないしは各フォトン数を、適切な検出時間窓を特徴付ける少なくとも１つの変数に対して関連付けることもできるし、及び／又は、コントロール装置は、各測定された光量ないしは各フォトン数を、それぞれに関連付けられた検出時間窓の開始端と関連付けることもできる。なお、後者は、特にそれぞれの前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２のオフセットが同一である場合である。
【００３１】
特に蛍光減衰曲線を求めるために、コントロール装置又は評価装置が、相互に関連した組のセットから時間に関する微分及び／又は時間に関する数値微分を計算することもできることは、有利である。
【００３２】
コントロール装置又は評価装置は、相互に関連した組のセットから減衰寿命及び／又は蛍光半減期を求めることもできる。
【００３３】
図１は、本発明の方法の例示的な一実施形態を参照して、励起光パルス１及び検出時間窓２の時間に対する配置及び寸法（Dimension）を模式的に示す。
【００３４】
例えば共焦点走査顕微鏡で用いられる、サンプルのサンプル領域を照らすための励起光パルス１は一定の反復レートでパルス光を発し、全ての励起光パルス１は同一のパルス長さ（幅）とパルス光出力とを有する。
【００３５】
サンプル領域から発せられる検出光、特に蛍光の光量及び／又はフォトン数の各々は、時間的に励起光パルス（複数）１の間、かつ、それぞれ励起光パルス１に後続する検出時間窓２内でのみ、測定される。ここで、検出時間窓の時間的長さｔａ、ｔｂ、ｔｃ及びｔｄは互いに異なる。
【００３６】
検出時間窓の開始端は、それぞれの前回の励起光パルス１からの第１オフセット時間ｔ１ａ、ｔ１ｂ、ｔ１ｃ、ｔ１ｄによってそれぞれ定義される。検出時間窓の終了端は、前回の励起光パルスからの第２オフセット時間ｔ２ａ、ｔ２ｂ、ｔ２ｃ、ｔ２ｄによってそれぞれ定義される。前回の励起光パルスからのオフセット時間ｔ２ａ、ｔ２ｂ、ｔ２ｃ、ｔ２ｄは、この例示の一実施形態において、常に同一である。
【００３７】
非同一の長さの検出時間窓２を生成するために、一連の励起光パルス１を当てている間に、第１オフセット時間ｔ１ａ、ｔ１ｂ、ｔ１ｃ、ｔ１ｄが徐々に増大され、それによって検出時間窓ｔａ、ｔｂ、ｔｃ、ｔｄの時間の長さが短縮される。
【００３８】
図２〜図９は、各検出時間窓２における検出光の光量及び／又はフォトン数を測定することによって、蛍光減衰曲線４の時間的積分３が逐次的にサンプルリングされる様式を示す。図２〜図９では、最初に長い検出時間窓２（図２）から開始し、徐々により短くなる検出時間窓２へ移行する（図３〜図９）。
【００３９】
各測定された光量又は各測定されたフォトン数は、適切な検出時間窓を特徴付けるそれぞれに少なくとも１つの変数、すなわちそれぞれの検出時間窓の開始端と関連付けられ、そして、それによって図２〜図９において積分曲線３上にバツ印（ｘ）としてプロットした２組の測定データが生成される。
【００４０】
積分曲線３のプロファイルは、例えば、補間ないし内挿（Interpolation）によって導出され得る。蛍光減衰曲線４、及び、つまり励起状態の寿命、特に蛍光寿命、及び／又は蛍光寿命、特に蛍光寿命、に対して相関するサンプルの特徴は、２つの組を使用した時間に関する数値積分によって又は求めた積分曲線３を微分することによって導出され得る。
【００４１】
特に、測定された及び／又は算出された変数（ないし大きさ：Groesse）の助けによって、サンプル領域のＦＬＩＭ画像を生成することができる。
【００４２】
本発明は、特定の実施形態を参照して記載されている。しかしながら、後述の特許請求の範囲から逸脱することなく、修正及び変更ができることは自明である。
なお、特許請求の範囲に記載の発明は以下の形態を含む。
［形態１］
サンプル領域に一連の励起光パルスを照射した場合における励起状態の寿命もしくは蛍光寿命、又は励起状態の寿命もしくは蛍光寿命に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査する方法であって、
励起光パルス（複数）の時間的間に、その都度検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光もしくは蛍光の光量、又はフォトン数の少なくとも一方を測定することを特徴とする方法。
［形態２］
ａ  少なくとも２つの検出時間窓が異なる時間の長さを有するか、又は、
ｂ  異なる励起光パルス（複数）の時間的間に配される少なくとも２つの検出時間窓が、異なる時間的長さを有する形態１に記載の方法。
［形態３］
検出時間窓の開始端が、前回の励起光パルスからの第１オフセット時間によって定義され、かつ、検出時間窓の終了端が前回の励起光パルスからの第２オフセット時間によって定義される形態１又は２に記載の方法。
［形態４］
前回の励起光パルスからの第２オフセット時間が同一であり、そして、非同一の長さの検出時間窓を生成するために一連の励起光パルスを照射している間に第１オフセット時間を変更するか、又は
前回の励起光パルスからの第２オフセット時間が同一であり、そして、非同一の長さの検出時間窓を生成するために一連の励起光パルスを照射している間に第１オフセット時間を増大する形態３に記載の方法。
［形態５］
２つの励起光パルスの間に、各々１つの単一検出時間窓のみが提供される形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
［形態６］
ａ  各測定された光量ないしは各フォトン数が、それに割り当てられた検出時間窓を特徴付ける少なくとも１つの変数（ないし大きさ：Groesse）に対してそれぞれ関連付けられるか、
ｂ  各測定された光量又は各フォトン数が、それぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けられるか、又は、
ｃ  ２つの検出時間窓に関して、それぞれの前回の励起光パルスからのオフセット時間が同一である場合には、各測定された光量又は各フォトン数が、それぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けられる形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
［形態７］
特に蛍光減衰曲線を求めるために、時間に関する微分又は時間に関する数値微分の少なくとも一方を相互に関連した組のセットから算出する形態６に記載の方法。
［形態８］
減衰寿命及び蛍光半減期の少なくとも１つが相互に関連した組のセットから求められる形態６又は７に記載の方法。
［形態９］
励起光パルスが同一であるか又は同一のパルス幅（長さ）及びパルスエネルギーを含むか、あるいは、励起光パルスのオフセット時間が同一である形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
［形態１０］
白色光レーザを用いて、又は、フォトニックバンドギャップファイバ又はフォトニック結晶ファイバを含む白色光レーザを用いて励起光パルスが生成される形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
［形態１１］
ａ  検出光がハイブリッド検出器を用いて検出されること、又は、
ｂ  検出光が光カソードを含む検出器（該光カソードの下流には、電子加速器及び／又は電子増倍器が配置され、その次にアバランシェダイオードが配置される）を用いて検出されること
を特徴とする形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
［形態１２］
励起光及び検出光の少なくとも１つを方向づける（ないし偏向する）ためのスキャニングデバイスが使用される形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
［形態１３］
サンプル領域のＦＬＩＭ画像が生成される形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
［形態１４］
形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法を実行するための装置、顕微鏡、走査顕微鏡、又は、共焦点走査顕微鏡。
［形態１５］
励起状態の寿命もしくは蛍光寿命、又は励起状態の寿命もしくは蛍光寿命に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査するためのものであり、
サンプルのサンプル領域を照射するために一連の励起光パルスを生成する光源を有し、
検出器が、励起光パルスの時間的間に、その都度検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光もしくは蛍光の光量又はフォトン数の少なくとも１つを測定する装置、顕微鏡、走査顕微鏡又は共焦点走査顕微鏡。
［形態１６］
コントロール装置が、サンプル領域に一連の励起光パルスの照射の間に、検出時間窓の期間（ないし長さ）を変更する形態１５に記載の装置。
［形態１７］
検出時間窓の開始端が、前回の励起光パルスからの第１オフセット時間によって定義され、かつ、
検出時間窓の終了端が前回の励起光パルスからの第２オフセット時間によって定義され、かつ、
前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２オフセット時間が同一であり、かつ、
一連の励起光パルスの照射の間にコントロール装置が第１のオフセット時間を変更又は増大させる
形態１５又は１６に記載の装置。
［形態１８］
ａ  コントロール装置又は評価装置が、各測定された光量ないしは各フォトン数を、それに割り当てられた検出時間窓を特徴付ける少なくとも１つの変数（ないし大きさ）に対してそれぞれ関連付けるか、又は、
ｂ  コントロール装置又は評価装置が、各測定された光量ないしは各フォトン数を、それぞれに関連した検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けるか、又は、
ｃ  コントロール装置又は評価装置が、それぞれの前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２のオフセット時間が同一である場合に、各測定された光量ないしは各フォトン数をそれぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端とそれぞれ関連付ける
形態１５〜１７のいずれか１つに記載の装置。
［形態１９］
特に蛍光減衰曲線を求めるために、コントロール装置又は評価装置が相互に関連した組のセットから時間に関する微分及び時間に関する数値微分の少なくとも一方を算出する形態１８に記載の装置。
［形態２０］
コントロール装置又は評価装置が相互に関連した組のセットから減衰寿命及び蛍光半減期の少なくとも一方を求める形態１５〜１９のいずれか１つに記載の装置。
［形態２１］
励起光パルスが同一であるか、
励起光パルスが同一のパルス幅（長さ）及びパルスエネルギーを含むか、又は、
励起光パルスのオフセット時間が同一である
形態１５〜２０のいずれか１つに記載の装置。
［形態２２］
光源が白色光レーザを含むか、又は光源がフォトニックバンドギャップファイバ又はフォトニック結晶ファイバを含む形態１５〜２１のいずれか１つに記載の装置。
［形態２３］
検出器がハイブリッド検出器として構成されるか、又は、検出器が光カソードを含む（該光カソードの下流に電子加速器又は電子増倍器が配置され、その次にアバランシェダイオードが配置される）形態１５〜２２のいずれか１つに記載の装置。
［形態２４］
評価装置が、照射されたサンプル領域のＦＬＩＭ画像を生成する形態１５〜２３のいずれか１つに記載の装置。
なお、本発明は、好ましい一実施形態として、サンプル領域に一連の励起光パルスを照射した場合における、励起状態の寿命、特に蛍光寿命、及び／又は、励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査する方法であって、励起光パルス（複数）の時間的間に、その都度検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光、特に蛍光の、光量及び／又はフォトン数を測定することを特徴とする方法を含む。
上記の方法において、ａ  少なくとも２つの検出時間窓が異なる時間の長さを有する、及び／又は、ｂ  異なる励起光パルス（複数）の時間的間に配される少なくとも２つの検出時間窓が、異なる時間的長さを有することが好ましい。
また、上記の方法において、検出時間窓の開始端が、前回の励起光パルスからの第１オフセット時間によって定義され、かつ、検出時間窓の終了端が前回の励起光パルスからの第２オフセット時間によって定義されることが好ましい。
また、上記の方法において、前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２オフセット時間が同一であり、そして、非同一の長さの検出時間窓を生成するために一連の励起光パルスを照射している間に第１オフセット時間を変更、特に増大することが好ましい。
また、上記の方法において、２つの励起光パルスの間に、各々１つの単一検出時間窓のみが提供されることが好ましい。
また、上記の方法において、ａ  各測定された光量ないしは各フォトン数が、それに割り当てられた検出時間窓を特徴付ける少なくとも１つの変数（ないし大きさ：Groesse）、特に時間の変数に対してそれぞれ関連付けられる、及び／又は、
ｂ  特に、それぞれの前回の励起光パルスからの検出時間窓の２つのオフセット時間が同一である場合には、各測定された光量又は各フォトン数が、それぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けられることが好ましい。
また、上記の方法において、特に蛍光減衰曲線を求めるために、時間に関する微分及び／又は時間に関する数値微分を相互に関連した組のセットから算出することが好ましい。
また、上記の方法において、減衰寿命及び／又は蛍光半減期が相互に関連した組のセットから求められることが好ましい。
また、上記の方法において、励起光パルスが、特にパルス幅（期間）及びパルスエネルギーという意味合いにおいて、同一であり、及び／又は、励起光パルスのオフセット時間が同一であることが好ましい。
また、上記の方法において、白色光レーザ、特にフォトニックバンドギャップファイバ又はフォトニック結晶ファイバを含む白色光レーザを用いて励起光パルスが生成されることが好ましい。
また、上記の方法において、ａ  検出光がハイブリッド検出器を用いて検出されること、及び／又は、
ｂ  検出光が光カソードを含む検出器（該光カソードの下流には、電子加速器及び／又は電子増倍器が配置され、その次にアバランシェダイオードが配置される）を用いて検出されることが好ましい。
また、上記の方法において、励起光及び／又は検出光を方向づける（ないし偏向する）ためのスキャニングデバイスが使用されることが好ましい。
また、上記の方法において、サンプル領域のＦＬＩＭ画像が生成されることが好ましい。
そして、本発明は、上記の方法を実行するための装置、顕微鏡、特に走査顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡を他の好ましい一実施形態として含む。
また、上記の装置等において、励起状態の寿命、特に蛍光寿命、及び／又は、励起状態の寿命、特に蛍光寿命、に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査するためのものであり、
サンプルのサンプル領域を照射するために一連の励起光パルスを生成する光源を有し、
検出器が、励起光パルスの時間的間に、その都度検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光、特に蛍光の光量及び／又はフォトン数を測定することが好ましい。
また、上記の装置等において、コントロール装置が、サンプル領域に一連の励起光パルスの照射の間に、検出時間窓の期間（ないし長さ）を変更することが好ましい。
また、上記の装置等において、検出時間窓の開始端が、前回の励起光パルスからの第１オフセット時間によって定義され、かつ、
検出時間窓の終了端が前回の励起光パルスからの第２オフセット時間によって定義され、かつ、
前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２オフセットが同一であり、かつ、
一連の励起光パルスの照射の間にコントロール装置が第１のオフセットを変更、特に増大させることが好ましい。
また、上記の装置等において、ａ  コントロール装置又は評価装置が、各測定された光量ないしは各フォトン数を、それに割り当てられた検出時間窓を特徴付ける少なくとも１つの変数（ないし大きさ）に対してそれぞれ関連付け、及び／又は、
ｂ  特に、それぞれの前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２のオフセットが同一である場合には、コントロール装置又は評価装置が、各測定された光量又は各フォトン数を、それぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けることが好ましい。
また、上記の装置等において、特に蛍光減衰曲線を求めるために、コントロール装置又は評価装置が相互に関連した組のセットから時間に関する微分及び／又は時間に関する数値微分を算出することが好ましい。
また、上記の装置等において、コントロール装置又は評価装置が相互に関連した組のセットから減衰寿命及び／又は蛍光半減期を求めることが好ましい。
また、上記の装置等において、励起光パルスが、特にパルス幅（長さ）及びパルスエネルギーという意味合いにおいて同一であり、及び／又は、励起光パルスのオフセット時間が同一であることが好ましい。
また、上記の装置等において、光源が白色光レーザを含む、及び／又は光源がフォトニックバンドギャップファイバ又はフォトニック結晶ファイバを含むことが好ましい。
また、上記の装置等において、検出器がハイブリッド検出器として構成され、及び／又は、検出器が光カソードを含む（該光カソードの下流に電子加速器及び／又は電子増倍器が配置され、その次にアバランシェダイオードが配置される）ことが好ましい。
また、上記の装置等において、評価装置が、照射されたサンプル領域のＦＬＩＭ画像を生成することが好ましい。
なお、本発明の好ましい形態は以下のようにも記載される。
（１）
サンプル領域に一連の励起光パルスを照射した場合における励起状態の寿命もしくは蛍光寿命、又は励起状態の寿命もしくは蛍光寿命に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査する方法であって、
励起光パルス（複数）の時間的間に、その都度検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光もしくは蛍光の光量、又はフォトン数の少なくとも一方を測定すること、
ａ  各測定された光量ないしは各フォトン数が、それに割り当てられた検出時間窓を特徴付ける少なくとも１つの変数（ないし大きさ：Groesse）に対してそれぞれ関連付けられるか、
ｂ  各測定された光量又は各フォトン数が、それぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けられるか、又は、
ｃ  ２つの検出時間窓に関して、それぞれの前回の励起光パルスからのオフセット時間が同一である場合には、各測定された光量又は各フォトン数が、それぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けられること、及び
蛍光減衰曲線を求めるために、時間に関する微分又は時間に関する数値微分の少なくとも一方を相互に関連した組のセットから算出すること、
を特徴とする方法。
（２）
励起状態の寿命もしくは蛍光寿命、又は励起状態の寿命もしくは蛍光寿命に対して相関するサンプルの特徴に関してサンプルを検査するためのものであり、
サンプルのサンプル領域を照射するために一連の励起光パルスを生成する光源を有し、
検出器が、励起光パルスの時間的間に、その都度検出時間窓内でサンプル領域から発した検出光もしくは蛍光の光量又はフォトン数の少なくとも１つを測定し、
ａ  コントロール装置又は評価装置が、各測定された光量ないしは各フォトン数を、それに割り当てられた検出時間窓を特徴付ける少なくとも１つの変数（ないし大きさ）に対してそれぞれ関連付けるか、又は、
ｂ  コントロール装置又は評価装置が、各測定された光量ないしは各フォトン数を、それぞれに関連した検出時間窓の開始端に対してそれぞれ関連付けるか、又は、
ｃ  コントロール装置又は評価装置が、それぞれの前回の励起光パルスからの検出時間窓の第２のオフセット時間が同一である場合に、各測定された光量ないしは各フォトン数をそれぞれに割り当てられた検出時間窓の開始端とそれぞれ関連付け、
蛍光減衰曲線を求めるために、コントロール装置又は評価装置が相互に関連した組のセットから時間に関する微分及び時間に関する数値微分の少なくとも一方を算出する、
装置、顕微鏡、走査顕微鏡又は共焦点走査顕微鏡。
【符号の説明】
【００４３】
１      励起光パルス
２      検出時間窓
３      蛍光減衰曲線４の積分
４      蛍光減衰曲線
ｔａ、ｔｂ、ｔｃ、ｔｄ          検出時間窓の時間の長さ
ｔ１ａ、ｔ１ｂ、ｔ１ｃ、ｔ１ｄ      第１オフセット時間
ｔ２ａ、ｔ２ｂ、ｔ２ｃ、ｔ２ｄ      第２オフセット時間
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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