(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離されたジンセノサイドＦ１またはその食品学的に許容可能な塩を含むアミロイドプラーク除去用食品組成物であって、
ジンセノサイドＦ１を組成物の総重量の０．０１〜９９．９重量％の割合で含む、
組成物。
【請求項２】
前記組成物は、食品学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項３】
分離されたジンセノサイドＦ１またはその食品学的に許容可能な塩を含む、アミロイドプラーク除去用飼料組成物であって、
ジンセノサイドＦ１を組成物の総重量の０．０１〜９９．９重量％の割合で含む、
組成物。
【請求項４】
前記組成物は、食品学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項３に記載の飼料組成物。
【請求項５】
請求項３による飼料組成物をヒト以外の個体に投与する段階を含む、アミロイドプラーク除去方法。
【請求項６】
前記方法は、アミロイドプラークを、ジンセノサイドＦ１を投与しない個体に比べて２倍以上減少させるものである、請求項５に記載の除去方法。
【請求項７】
前記組成物は、インスリン分解酵素（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ、ＩＤＥ）、及びネプリライシン（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ、ＮＰＥ）の発現を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンセノサイドＦ１またはその食品学的に許容可能な塩を含むアミロイドプラーク除去用食品組成物に関する。また、本発明は、ジンセノサイドＦ１またはその食品学的に許容可能な塩を含むアミロイドプラーク除去用飼料組成物に関する。さらに、本発明は、ジンセノサイドＦ１をヒト以外の個体に投与する段階を含む、アミロイドプラーク除去方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー型認知症は、高齢者層に最も多く発生する病気であり、６５−８５歳の人口の１０％、そして８５歳以上では約４０％が発症する。このアルツハイマー型認知症は、１９０７年にドイツのアロイス・アルツハイマー（Alois Alzheimer）が、認知症患者の脳の海馬（hippocampus）と新皮質（neocortex）において神経細胞が失われ、神経細胞の細胞体内にもつれた糸の塊のように見える神経原線維タングル（neurofibrillary tangle; NTF）と老人斑（senile plaque）のような異常な構造があることを初めて観察し、知られるようになった。
【０００３】
このうち、アミロイドプラークとも呼ばれる老人斑は、アミロイドペプチド（amyloid peptide）の細胞外蓄積物であり、神経突起（neurite）、星状膠細胞（astrocyte）、小膠細胞（microglial cell）などに囲まれており、大脳辺縁系（limbic structure）や連合新皮質（association neocortex）の部位で主に発見される。
【０００４】
このような異常な組織の特性が認知症の発症原因として作用するか否かを解明するために多くの研究が進められてきた。
【０００５】
具体的には、認知症患者の大部分を占める孤発性アルツハイマー病（Sporadic Alzheimer's disease; SAD）の場合、現在まで特定の遺伝子の突然変異によって発症するケースは発見されていないが、孤発性アルツハイマー病患者において認知症の病理学的特徴である老人斑と神経原繊維の塊が現れることが確認されている。特に、アミロイドβタンパク質の過剰沈着が孤発性アルツハイマー病と遺伝的認知症において共通して起こることから、アミロイドβが認知症の発症に主な原因として作用することを示唆している（非特許文献１）。
【０００６】
これに基づいて、現在、多国籍製薬会社を中心にアミロイドβプラークを標的とする治療剤に関する研究が進められているが、これまで開発されてきた治療剤は、その効果が一時的で微弱であり、深刻な毒性を示すなど、現在まで臨床実験で成功した事例はほとんど挙げられていない。
【０００７】
そこで、本発明者らは、前記アルツハイマー型認知症の原因となるアミロイドプラークを除去する物質を開発するために鋭意努力し、その結果、天然物質であるジンセノサイドＦ１がアミロイドプラーク除去に優れた効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nature、1999、399：A23-A31
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主な目的は、ジンセノサイドＦ１またはその食品学的に許容可能な塩を含むアミロイドプラーク除去用食品組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、ジンセノサイドＦ１またはその食品学的に許容可能な塩を含むアミロイドプラーク除去用飼料組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、ジンセノサイドＦ１をヒト以外の個体に投与する段階を含む、アミロイドプラーク除去方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、前記目的を達成するための一様態として、ジンセノサイドＦ１またはその食品学的に許容可能な塩を含むアミロイドプラーク除去用食品組成物を提供する。
【００１３】
本発明における用語「ジンセノサイドＦ１」とは、化学式（１）で示される化合物を意味する。
【００１４】
【化１】
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（１）
【００１５】
本発明において、前記組成物は、ジンセノサイドＦ１を組成物の総重量の０．０１〜９９．９重量％、より好ましくは１〜８０重量％の割合で含まれるものであってもよく、これに限定されず、当業者の通常の知識レベルを基準として、ジンセノサイドＦ１の使用可能な範囲内の割合で含まれるものであってもよい。
【００１６】
食品が飲料である場合には、１００ｍｌを基準にジンセノサイドＦ１が０．１〜１ｇ、好ましくは０．３〜０．７ｇの割合で含まれてもよい。また、前記組成物は、食品組成物に通常使用され、臭い、味、視覚などを向上させる成分をさらに含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン、ビオチン、葉酸、パントテン酸などを含むことができる。また、亜鉛（Zn）、鉄（Fe）、カルシウム（Ca）、クロム（Cr）、マグネシウム（Mg）、マンガン（Mn）、銅（Cu）などのミネラルを含むことができる。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。また、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ズルチン、サイクラミン酸ナトリウム、サッカリン、ナトリウムなど）  、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ−酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物を添加することができる。前記添加物は、食品の種類に応じて選別され、適切な量で使用される。
【００１７】
本発明の前記食品組成物は、当業界において通常使用される方法によって製造可能であり、前記製造時には、当業界において通常添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、一般的な医薬品とは異なり、食品を原料として薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがないという利点があり、携帯性にも優れている。
【００１８】
本発明における用語「食品学的に許容可能な塩」とは、食品組成物に含まれるジンセノサイドＦ１の生物学的活性と物性を損なわない剤形を意味する。
【００１９】
前記食品学的に許容可能な塩は、食品学的に許容される陰イオンを含有する非毒性酸付加塩を形成する酸、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などのような無機酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸などのような有機カルボン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのようなスルホン酸などによって形成された酸付加塩が含まれる。例えば、食品学的に許容されるカルボン酸塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどによって形成された金属塩またはアルカリ土類金属塩、リジン、アルギニン、グアニジンなどのアミノ酸塩、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン及びトリエチルアミンなどの有機塩などが含まれる。
【００２０】
本発明における用語「アミロイドプラーク」とは、アミロイドβが凝集されて塊を形成したものであり、少なくとも１８回以上の不適切な折り畳み（folded）が存在する不溶性の繊維タンパク質集合体を意味する。前記アミロイドプラークが脳の領域に存在する場合、神経変性疾患の原因となり得ることが知られている。
【００２１】
本発明における用語「アミロイドβ」とは、６９５個のアミノ酸残基で構成されるアミロイド前駆タンパク質から、これを分解するタンパク質分解酵素であるβ−セクレターゼ、及びγ−セクレターゼによる代謝産物であり、これに限定されるものではないが、３９〜４３個のアミノ酸残基からなるペプチドを意味する。
【００２２】
本発明の一実験例では、ジンセノサイドＦ１のアミロイドプラーク除去効果を確認するために、ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したアルツハイマー病モデルマウスの脳領域である海馬におけるアミロイドプラークの数を観察した。その結果、ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したアルツハイマー病モデルマウスの海馬におけるアミロイドプラークの数は、一般飼料を摂取したアルツハイマー病モデルマウスのアミロイドプラークの数に比べて２倍減少したことが確認された（図３）。
【００２３】
また、本発明の一実験例では、毒性による細胞死滅の量に対する測定方法として、細胞が損傷した際に細胞内から外に放出される乳酸脱水素酵素の活性を測定する方法を用いて、凝集したアミロイドβによって誘導された細胞毒性に対するジンセノサイドＦ１の抑制効果を測定した。その結果、アミロイドβを処理した後にジンセノサイドＦ１を処理した場合、ジンセノサイドＦ１を処理しない場合に比べて、細胞毒性が減少したことが確認された（図４）。このような結果は、ジンセノサイドＦ１がアミロイドβによって誘導された細胞毒性を減少させることを意味する。
【００２４】
また、本発明の一実験例では、凝集したアミロイドβとチオフラビンＴの結合によって現われる蛍光スペクトルの変化を測定し、凝集したアミロイドβに対するジンセノサイドＦ１の凝集の減少効果を確認した。その結果、凝集したアミロイドβにジンセノサイドＦ１を処理した場合、蛍光値が減少することが確認された（図５）。このような結果は、ジンセノサイドＦ１がアミロイドβの凝集を減少させ、アミロイドプラークの形成を抑制することを意味する。
【００２５】
本発明において、前記組成物はインスリン分解酵素（Insulin-degrading enzyme、IDE）、及びネプリライシン（Neprilysin）の発現を誘導することを特徴とするものであってもよい。
【００２６】
本発明の一実験例では、ジンセノサイドＦ１が、凝集したアミロイドβを分解するタンパク質であるインスリン分解酵素及びネプリライシンの発現を増加させるか否かを確認した。その結果、ジンセノサイドＦ１がインスリン分解酵素及びネプリライシンのｍＲＮＡレベル、並びにそのタンパク質の発現レベルを増加させることが確認された（図６ａ〜６ｂ）。
【００２７】
本発明において、前記食品組成物は、食品学的に許容可能な担体をさらに含むものであってもよい。
【００２８】
本発明における用語「食品学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずとも、注入される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。本発明に使用可能な前記担体の種類は特に限定されず、当該技術分野において通常使用される担体であれば、いかなるものでも使用することができる。前記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどを挙げることができる。これらは単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。前記担体は、非自然担体（non-naturally occuring carrier）を含んでもよい。
【００２９】
本発明のジンセノサイドＦ１を含む組成物を添加することのできる食品の種類は、特に制限されず、例えば、各種飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品などがある。前記食品組成物は、アミロイドプラーク除去に妨害にならない他の成分を追加することができ、その種類は特に限定されない。例えば、通常の食品のように、種々の生薬エキス、食品学的に許容可能な食品補助添加剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。
【００３０】
前記食品補助添加剤は、各剤形の健康機能食品を製造する際に添加されるものであり、当業者が適宜選択して使用することができる。例えば、種々の栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などが含まれるが、前記例によってその種類が限定されるものではない。
【００３１】
前記食品は、健康機能食品を含むものであってもよい。
【００３２】
健康機能食品（functional food）とは、特定保健用食品（food for special health use、FoSHU）と同じ意味の用語であり、栄養供給以外にも、生体調節機能が効率的に示されるように加工された医学、医療効果の高い食品を意味するが、前記食品は、ジンセノサイドＦ１のアミロイドプラーク除去に有益な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸などの様々な形態で製造することができる。
【００３３】
前記ジンセノサイドＦ１は、天然物質である高麗人参に含まれた物質であり、長い間使用されて安定性が立証されているため、常食できるとともに、アミロイドプラークの除去を図る食品の形態に製造されて摂取することができる。
【００３４】
別の態様として、本発明は、ジンセノサイドＦ１またはその食品学的に許容可能な塩を含むアミロイドプラーク除去用飼料組成物を提供する。
【００３５】
前記飼料用組成物は飼料添加物を含むことができ、本発明の飼料添加剤は、飼料管理法上の補助飼料に該当する。
【００３６】
本発明における用語「飼料」とは、動物が食べて摂取し、消化させるための、またはこれに適切な任意の天然または人工の規定食、一食、または前記一食の成分を意味する。
【００３７】
前記飼料の種類は特に限定されるものではなく、当該技術分野において通常使用される飼料を用いることができる。前記飼料の非制限的な例としては、穀物類、根果類、食品加工副産物類、藻類、食物繊維類、医薬品副産物類、油脂類、澱粉類、粕類または穀物副産物類等のような植物性飼料；タンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類または飲食物などのような動物性飼料を挙げられる。これらは単独で使用したり、２種以上を混合して使用してもよい。
【００３８】
本発明において、前記組成物は、ジンセノサイドＦ１を組成物の総重量の０．０１〜９９．９重量％、より好ましくは１〜８０重量％の割合で含むものであってもよく、それに限定されず、当業者の通常の知識レベルを基準としてジンセノサイドＦ１の使用可能な範囲内の割合で含むものであってもよい。
【００３９】
本発明における用語「食品学的に許容可能な塩」とは、前記で説明した通りである。
【００４０】
本発明において、前記飼料組成物は、食品学的に許容可能な担体をさらに含むものであってもよい。
【００４１】
本発明における用語「食品学的に許容可能な担体」とは、前記で説明した通りである。
【００４２】
また、別の態様として、本発明は、ジンセノサイドＦ１をヒト以外の個体に投与する段階を含む、アミロイドプラーク除去方法を提供する。
【００４３】
本発明における用語「個体」とは、前記アミロイドプラークの除去対象となり得るヒトを含むあらゆる動物を意味する。前記動物は、ヒトだけでなく、牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、カモシカ、犬、猫などの哺乳動物であってもよいが、それに限定されるものではない。
【００４４】
本発明における用語「投与」とは、何らかの適切な方法で個体に本発明のジンセノサイドＦ１を導入することを意味し、本発明のジンセノサイドＦ１の投与経路は、目的の組織に到達することができるものであれば、経口または非経口の様々な経路を通じて投与することができる。
【００４５】
本発明に係るジンセノサイドＦ１の投与方式は、特に限定されるものではなく、当該技術分野において通常用いられる方法に従うことができる。前記投与方式の非限定的な例として、ジンセノサイドＦ１を経口投与または非経口投与方式で投与することができる。本発明に係るジンセノサイドＦ１は、目的とする投与方式に応じて、多様な剤形で製造することができる。
【００４６】
本発明のジンセノサイドＦ１の投与頻度は、特にそれに限定さるものでは ないが、１日１回投与、または容量を分割して数回投与することができる。
【００４７】
本発明の一実施例では、アルツハイマー病が誘導されたマウスにジンセノサイドＦ１が混合された混合物を投与した後、ジンセノサイドＦ１がマウスの記憶力の回復に効果があるかを確認するために、Ｙ−ｍａｚｅテストと空間に対する恐怖記憶テストを実施した。その結果、ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したマウスの交替行動の割合が約１．５倍以上に向上し、空間に対する恐怖記憶も約１．５倍に向上したことが確認された（図２ａ、２ｂ）。このような結果は、ジンセノサイドＦ１がアルツハイマー病モデルマウスの記憶力回復に効果があることを意味する。
【００４８】
前記アミロイドプラークを除去する方法は、ジンセノサイドＦ１を投与していない個体に比べて、前記アミロイドプラークを２倍以上減少させることができる。
【００４９】
本発明の一実験例では、ジンセノサイドＦ１が含まれた組成物をアルツハイマー病モデルマウスに投与した結果、マウスの海馬におけるアミロイドプラークの数は、一般飼料を投与したマウスのアミロイドプラークの数に比べて２倍減少したことが確認された（図３）。
【発明の効果】
【００５０】
本発明は、ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物が、脳の領域である海馬におけるアミロイドプラークを除去し、記憶力の回復を改善する効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したマウスの脳及び血液サンプルからジンセノサイドＦ１が検出されることを示したものである。
【図２ａ】ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したアルツハイマー病モデルマウスの交替行動の割合を示したものである。
【図２ｂ】ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したアルツハイマー病モデルマウスの空間恐怖テストの結果を示したものである。
【図３】ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したアルツハイマー病モデルマウスの脳領域である海馬におけるアミロイドプラーク数を示したものである。
【図４】凝集したアミロイドβによって誘導された細胞毒性に対するジンセノサイドＦ１の毒性抑制効果を示したものである。
【図５】凝集したアミロイドβの１〜２．５ｕＭの濃度のジンセノサイドＦ１の凝集減少効果を示したものである。
【図６ａ】ジンセノサイドＦ１処理時のインスリン分解酵素（Insulin-degrading enzyme）のｍＲＮＡ発現レベルを示したものである。
【図６ｂ】ジンセノサイドＦ１の処理時のネプリライシン（Neprilysin）のｍＲＮＡ発現レベルを示したものである。
【図６ｃ】ジンセノサイドＦ１の処理時のインスリン分解酵素のタンパク質発現レベルを示したものである。
【図６ｄ】ジンセノサイドＦ１処理時のネプリライシンタンパク質の発現レベルを示したものである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５２】
以下、実施例及び実験例を通じて本発明の構成及び効果をさらに詳しく説明する。これらの実施例及び実験例は、ひたすら本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲はこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１：動物実験のためのアルツハイマー病モデルマウスの準備
ジンセノサイドＦ１の記憶力回復効果を確認するために、Ｃ５７Ｂ６、ＪＸＳＪＬ、及びＪ雑種マウスにアルツハイマー病関連遺伝子を導入（knock-in）したアルツハイマー病モデルマウスを準備した。
【００５４】
具体的には、Ｃ５７Ｂ６、ＪＸＳＪＬ、及びＪ野生型純種の雌とアルツハイマー病の遺伝子を有するＣ５７Ｂ６、ＪＸＳＪＬ、及びＪ雑種の雄を交配して生まれたマウスの尾のサンプルを採取した。前記サンプルの遺伝子型を確認した後、アルツハイマー病の遺伝子を有するマウスを使用し、同世代の野生型マウスを対照群として使用した。実験に使用したマウスは、生後６カ月以上のマウスであり、行動実験には雄マウスのみを使用した。
【００５５】
実施例２：実験対象となるマウスに投与するジンセノサイドＦ１混合物の製造
ジンセノサイドＦ１を実験対象となるマウスに投与するために、ジンセノサイドＦ１が含まれた飼料混合物を製造した。
【００５６】
具体的には、ジンセノサイドＦ１が１日当り２０ｍｇ／ｋｇの分量になるように飼料に混合して製造した。３０ｇのマウスを基準として、一日平均飼料摂取量が５ｇであるため、飼料粉末３５ｇにジンセノサイドＦ１が４．２ｍｇになるように飼料に混合して混合物を製造した。
【００５７】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のための細胞培養及びアミロイドβの凝集
実施例３−１：細胞の培養
マウスの脳組織の細胞の一つであるＮｅｕｒｏ−２ａ（Ｎ２ａ）細胞を準備した。５％の二酸化炭素、９０％の湿気、及び３７℃の温度条件下で１０％の不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれた９０％のＤＭＥＭ培地に前記細胞を培養させた。
【００５８】
実施例３−２：アミロイドβの凝集
アミロイドβは、１０ｍのＭ濃度になるように滅菌されたＰＢＳバッファに溶かした。その後、３７℃で４８時間静置してアミロイドβの凝集を誘発した。
【００５９】
実施例３−３：ジンセノサイドＦ１の準備
ジンセノサイドＦ１は、１００ｍＭの濃度になるようにＤＭＳＯに溶かした。その後、前記ジンセノサイドＦ１を希釈して使用した。
【００６０】
実験例１：ジンセノサイドＦ１の混合物摂取時のジンセノサイドＦ１の脳への伝達確認
前記実施例２で準備したジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したマウスの脳にジンセノサイドＦ１が効果的に伝達されるか否かを確認した。
【００６１】
具体的には、前記実施例２で製造された飼料混合物を摂取したマウスの眼から毛細管を利用して採血した後、血液サンプルを確保した。また、８３ｍｇ／ｋｇの濃度のペントバルビタール（pentobarbital）を前記マウスに腹腔注射で注射し、マウスを麻酔した。その後、前記麻酔したマウスを生理食塩水で灌流（perfusion）した後、脳を摘出して脳のサンプルを確保した。前記確保した血液サンプル及び脳のサンプルを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを実行してジンセノサイドＦ１を分析した。
【００６２】
分析の結果、ジンセノサイドＦ１が含まれた飼料混合物を摂取したマウスの脳及び血液サンプルからジンセノサイドＦ１が検出されることから、ジンセノサイドが脳に効果的に伝達されることが確認された（図１）。
【００６３】
実験例２：ジンセノサイドＦ１を投与したマウスを用いた動物実験
前記実施例１で準備したアルツハイマー病モデルマウスに、前記実施例２で製造されたジンセノサイドＦ１が混合された混合物を投与した後、ジンセノサイドＦ１が記憶力回復に効果があるかを確認するために、動物実験を実施した。
【００６４】
実験例２−１：Ｙ−ｍａｚｅテスト
ジンセノサイドＦ１がアルツハイマー病モデルマウスの記憶回復に及ぼす効果を検証するために、幅６０ｍｍ、高さ１２５ｍｍであるＹ−ｍａｚｅチャンバーの中央に実験動物を位置させた後、８分間自由に探索できるようにするＹ−ｍａｚｅテストを実施した。
【００６５】
具体的には、実施例１で準備したアルツハイマー病モデルマウスは、３分間Ｙ−ｍａｚｅチャンバーに適応する時間を与え、後半の５分を実際のテスト時間として定め実験動物の動きを分析した。具体的には、マウスが三方向のいずれか一つのアーム（arm）に入ることを一回の入場と計算し、合計入場回数を確認した。連続した３回の入場がいずれも異なるアームに入る場合を一回の交替行動（alternation behavior）と計算して記録し、交替行動の割合は、次のような式として分析した：
【００６６】
交替行動の割合＝（交替行動回数）／（総アームの入場回数−２）＊  １００（％）。
【００６７】
分析の結果、ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したアルツハイマー病モデルマウスは、ジンセノサイドＦ１が含まれていない一般飼料を摂取したアルツハイマー病モデルマウスに比べて交替行動の割合が約１．５倍以上向上したことが確認された（図２ａ）。
【００６８】
これにより、ジンセノサイドＦ１は、アルツハイマー病モデルマウスの記憶回復に効果があることを確認した。
【００６９】
実験例２−２：空間恐怖記憶テスト
ジンセノサイドＦ１がアルツハイマー病モデルマウスの記憶回復に及ぼす効果を検証するために、アルツハイマー病モデルマウスの空間恐怖記憶テストを実施した。
【００７０】
具体的には、実施例１で準備したアルツハイマー病モデルマウスを恐怖条件付けチャンバーに位置させた。実験動物がチャンバーに入った後、１８０秒が経過したとき、０．５ｍＡの電気ショックを２秒間与えた。電気ショックを与えてから３０秒後に、実験動物をチャンバーから取り出し、再びホームケージに移した（以上、恐怖記憶条件付け実験）。
【００７１】
前記恐怖記憶条件付け実験２４時間の後に、同一の実験動物を同一の恐怖条件付けチャンバーに位置させた。チャンバーに位置させた後、５分間実験動物の動きを観察した。実験動物が呼吸以外のいかなる動きをも示さないとき、「実験動物がフリージングする」とみなし、フリージングしている合計時間を記録した。５分間のフリージングしている時間を標準とし、実験動物の「空間に対する恐怖記憶」を分析した。
【００７２】
テストの結果、ジンセノサイドＦ１が含まれた混合物を摂取したアルツハイマー病モデルマウスは、ジンセノサイドＦ１が含まれていない一般飼料を摂取したアルツハイマー病モデルマウスに比べて空間に対する恐怖記憶が約１．５倍に向上したことが確認された（図２ｂ）。
【００７３】
これにより、ジンセノサイドＦ１がアルツハイマー病モデルマウスの記憶回復に効果があることが確認された。
【００７４】
実験例３：ジンセノサイドＦ１を投与したマウスのアミロイドプラーク数の観察
実施例２で準備した飼料混合物を摂取した実施例１のアルツハイマー病モデルマウスの脳領域である海馬のアミロイドプラークの数を観察した。
【００７５】
具体的には、ペントバルビタール（pentobarbital、83mg/kg）を前記マウスの腹腔に注射してマウスを麻酔し、生理食塩水及びホルムアルデヒド溶液で灌流した後、脳のサンプルを摘出してホルムアルデヒド溶液に保管した。２４時間後、脳のサンプルを３０％の砂糖溶液に保管した。約４８時間後、脳のサンプルが砂糖溶液の底に沈むと、脳のサンプルを凍らせて４０μｍの厚さの切片に凍結切片（cryosection）した。０．０２％のアジ化ナトリウム（sodium azide）が含まれたＰＢＳ溶液に準備した脳切片を入れて冷蔵保管した（脳切片サンプルの準備）。
【００７６】
前記のように脳切片サンプルを準備した後、以下のような方法でアミロイドプラークを染色した（各段階の間には生理食塩水で１０分間洗浄し、洗浄は４回繰り返した）。
【００７７】
ａ）準備された脳切片サンプルを０．３％の過酸化水素水中に、３０分間常温放置した。
ｂ）前記脳切片サンプルをブロッキング剤（0.1％BSA、0.2％Triton X-100、2％goat-serum in PBS）で１時間常温放置した。
ｃ）その後、ウサギ抗アミロイドβ（rabbit anti-amyloid beta）抗体を、脳切片サンプルに１：１０００の割合で処理した後、４℃で４８時間培養した。
ｄ）ＨＲＰが結合されたヤギ抗ウサギ（HRP conjugated goat anti-rabbit）抗体を、前記段階ｃ）で培養した脳切片サンプルに１：２０００の割合で処理した後、常温で２時間培養した。
ｅ）前記段階ｄ）で培養した脳切片サンプルをＡＢＣ溶液で、常温で１時間培養した。
ｆ）前記段階ｅ）で培養した脳切片サンプルをＤＡＢ溶液で、常温で８分間培養した後、０．３％の過酸化水素水３０μlを添加して、常温で１分３０秒間培養した。
ｇ）前記ａ）〜ｆ）段階を経て染色された脳切片サンプルをスライドガラスに載せた後、キシレンが添加されたｃｙｔｏｓｅａｌで封入し、脳の領域である海馬のアミロイドプラークの数を測定した。
【００７８】
測定の結果、ジンセノサイドＦ１を含有する混合物を摂取したアルツハイマー病モデルマウスの海馬におけるアミロイドプラークの数は、一般飼料を摂取したアルツハイマー病モデルマウスのアミロイドプラークの数に比べて２倍減少したことが確認された（図３）。
【００７９】
これは、ジンセノサイドＦ１がアミロイドプラークを除去するのに優れた効果を有し、認知症などのアミロイドプラークの蓄積が原因とされている疾患の治療に効果があることを示唆するものである。
【００８０】
実験例４：凝集したアミロイドβによって誘導された細胞毒性に対するジンセノサイドＦ１の抑制効果
前記実施例３−１で培養された細胞に、凝集したアミロイドβ及びジンセノサイドＦ１を処理した後、ＬＤＨ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて細胞毒性を測定した。
【００８１】
実験を実施するためのサンプルの準備段階は次の通りである。
【００８２】
ａ）ウシ胎児血清のない４８−ウェルの細胞培養培地に、前記実施例３−１で培養されたマウスの脳組織の細胞を置いた。
ｂ）前記実施例３−２で凝集したアミロイドβを、前記ａ）段階の培地に１０ｕＭとなるように入れた後、３０分間培養した。
ｃ）前記ｂ）段階の培地に、前記実施例３−３で準備されたジンセノサイドＦ１を１００ｕＭとなるように入れた後、４８時間培養した。
ｄ）前記ｂ）段階、及びｃ）段階の培養上層液を４８ウェルプレートに移し、冷蔵保管した。
【００８３】
前記サンプルの準備段階を経た後、ＬＤＨキットメーカー（Roche）から提供された触媒と染色溶液を１：４５の割合で混ぜて反応混合物を製造した。その後、前記ｄ）段階で準備された培養上層液を９６ウェルプレートに１００μl／ウェルの濃度で移し入れ、前記反応混合物を、それぞれのウェルに１００μlずつ入れた後、マイクロプレートリーダー（Microplate reader）を用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した（LDH  assay）。
【００８４】
測定の結果、アミロイドβのみを処理した群の細胞毒性が無処理群に比べて１．４倍増加していた。これに対し、アミロイドβを処理した後にジンセノサイドＦ１を処理した群は、無処理群と差がない程度に細胞毒性が減少した。また、ジンセノサイドＦ１のみを処理した群は、無処理群と比較し、細胞毒性がほとんど現われなかった（図４）。
【００８５】
これによって、ジンセノサイドＦ１がアミロイドβによる細胞毒性を抑することが確認された。また、ジンセノサイドＦ１自体も脳細胞に対する細胞毒性が現われないことが確認された。最終的に、ジンセノサイドＦ１は脳細胞に安全な物質であって、かつアミロイドβの細胞毒性を抑制する効果があることを確認することができた。
【００８６】
実験例５：凝集したアミロイドβに対するジンセノサイドＦ１の凝集抑制の測定
凝集したアミロイドβに対するジンセノサイドＦ１の凝集抑制効果を確認するために、凝集したアミロイドβとチオフラビンＴ（Thioflavin T）の結合によって現われる蛍光スペクトルの変化を測定した。
【００８７】
具体的には、ウシ胎児血清のない細胞培養培地に、前記実施例３−２で凝集したアミロイドβを１０ｕＭとなるように入れた後、３０分間培養した。その後、前記培地に前記実施例３−３で準備したジンセノサイドＦ１を１ｕＭ、及び２．５ｕＭとなるように濃度別に入れて４８時間培養した。
【００８８】
一方、アミロイドβの凝集の程度を測定するための方法は次の通りである。
【００８９】
ａ）チオフラビンＴ（Thioflavin T）を１００ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ８．５）に３００ｕＭの濃度で溶かした。
ｂ）使用前に、３００ｕＭの濃度で溶かしたチオフラビンＴ溶液を５０倍希釈した。
ｃ）培養が終了した試料１００μlに希釈したチオフラビンＴ溶液を１００μl入れ、暗室状態で常温にて３０分間放置した。
ｄ）マルチモードマイクロプレートリーダー（multi mode microplate reader）を用いて、励起４５０ｎｍ及び放出４９０ｎｍで蛍光値を測定した。
【００９０】
測定の結果、アミロイドβのみを処理した群では、蛍光値が非常に高く示された。一方、ジンセノサイドＦ１を処理した場合、蛍光値が低下し、特に、ジンセノサイドＦ１の処理濃度が２．５ｕＭの場合に蛍光値が半分以下に低下したことが確認された（図５）。このことにより、凝集したアミロイドβに対してジンセノサイドＦ１がアミロイドβの凝集を減少させることを確認することができた。
【００９１】
実験例６：ジンセノサイドＦ１による、凝集したアミロイドβの分解に作用するタンパク質の発現誘導
ジンセノサイドＦ１によって、凝集したアミロイドβの分解に作用するタンパク質であるインスリン分解酵素（Insulin-degrading enzyme、IDE）とネプリライシン（Neprilysin、NPE）の発現が誘導されるか否かを確認するために、リアルタイムＰＣＲとウエスタンブロット（Western blot）を用いてｍＲＮＡ発現とタンパク質の発現に対する変化を測定した。
【００９２】
具体的には、ウシ胎児血清のない細胞培養培地に、前記実施例３−３で準備したジンセノサイドＦ１を、１ｕＭ及び２．５ｕＭとなるように濃度別に入れ、２４時間培養した。凝集したアミロイドβの分解に作用するタンパク質であるインスリン分解酵素とネプリライシンのｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法は、次の通りである。
【００９３】
ａ）培養が終了した６０ｍｍの細胞培養培地から培養液を除去した。
ｂ）前記ａ）段階の培地にＲＮＡ抽出試薬（RNA extraction reagent）メーカー（TaKaRa）から提供された試薬を６００ｕｌずつ、それぞれの細胞培養培地に入れて溶解させた。
ｃ）前記ｂ）段階で溶解された液を１．５ｍｌの遠心分離用チューブに移し、クロロホルム溶液を３００ｕｌずつ入れて混ぜた後、遠心分離してＲＮＡが存在する上層液を回収した。
ｄ）前記ｃ）段階で回収した液と同量のイソプロパノールを入れて遠心分離してＲＮＡペレットを得た。
ｅ）前記ｄ）段階で得られたＲＮＡペレットを７５％のエタノールを用いて洗浄し、乾燥させて高純度のＲＮＡペレットを得た。
ｆ）前記ｅ）段階で得られたＲＮＡペレットをジエチルピロカーボネート（diethylpyrocarbonate、DEPC）で処理した蒸留水で溶かした後、ナノドロップ装置（Nano-drop machine）を用いてＲＮＡ量を定量した。
ｇ）前記ｆ）段階で得られたＲＮＡを、逆転写酵素キットのメーカー（Solgent）から提供された試薬を用いて、５０℃で２時間反応させてｃＤＮＡを合成した。
ｈ）前記ｇ）の段階で作製したｃＤＮＡに、プライマーのメーカー（ジェノテック）に依頼して製作したインスリン分解酵素、ネプリライシン及びβアクチンのプライマーをＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑキットのメーカー（TaKaRa）から提供された試薬とそれぞれ混合した後、リアルタイムＰＣＲ装置を用いてインスリン分解酵素とネプリライシンのｍＲＮＡ転写レベルを測定した（real-time PCR）。
【００９４】
測定の結果、ジンセノサイドＦ１を処理した場合、インスリン分解酵素及びネプリライシンのｍＲＮＡ転写レベルが増加することが確認された。具体的には、２．５ｕＭのジンセノサイドＦ１を処理した場合、インスリン分解酵素のｍＲＮＡ転写レベルは、１．５倍以上に増加し、ネプリライシンのｍＲＮＡ転写レベルは、２．５倍以上の増加を示した（図６ａ、及び６ｂ）。
【００９５】
一方、凝集したアミロイドβの分解に作用するタンパク質であるインスリン分解酵素とネプリライシンのタンパク質発現の程度を確認するための方法は、次の通りである。
【００９６】
ａ）培養が終了した細胞培養培地から培養液を除去した。
ｂ）前記ａ）段階の培地に１ｘＰＢＳ（pH7.4）１ｍｌを入れ、セルスクレーパー（cell scraper）を用いて細胞を回収し、１．５ｍｌの遠心分離用チューブに挿入して遠心分離して細胞ペレットを得た。
ｃ）前記ｂ）段階で得られたペレットにタンパク質分解酵素阻害剤を添加した細胞溶解バッファーを１００ｕｌずつ入れて混合して細胞を溶解させた後、遠心分離して上清液を得た。
ｄ）タンパク質定量キットメーカー（iNtRON）から提供された試薬を使用し、前記ｃ）段階で得られた上清液のタンパク質を定量した。
ｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元用染色液と前記ｄ）で定量したタンパク質を、それぞれ混合して５分間沸騰させた後、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに点滴し、７０ボルトで１時間３０分間、電気泳動した。
ｆ）前記ｅ）段階で電気泳動したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをメンブレントランスファー装置を用いてＰＶＤＦメンブレンに移した。
ｇ）前記ｆ）段階でトランスファーされたＰＶＤＦメンブレンに５％のスキムミルクを用いて１時間ブロッキングした。
ｈ）１ｘＴＢＳＴ溶液を使用し、前記ｇ）段階のメンブレンを洗浄し、マウス由来のインスリン分解酵素、ネプリライシン及びβアクチン１次抗体をそれぞれ入れて２時間反応させた。
ｉ）１ｘＴＢＳＴ溶液を使用し、前記ｈ）段階のメンブレンを洗浄し、ＨＲＰが結合された抗ウサギ免疫グロブリン二次抗体またはＨＲＰが結合された抗マウス免疫グロブリン二次抗体をそれぞれ入れて２時間反応させた。
ｊ）ウェスタンブロット検出キットのメーカー（iNtRON）から提供された基質溶液と増幅溶液を１：１の割合で混ぜて反応混合物を製造した。１ｘＴＢＳＴ溶液を使用し、前記ｉ）段階のメンブレンを洗浄し、前記反応混合物２ｍｌをメンブレンと反応させた。その後、蛍光及び化学イメージ分析装置を用いてタンパク質を検出した（Western blot）。
【００９７】
測定の結果、２．５ｕＭのジンセノサイドＦ１を処理した群では、インスリン分解酵素のタンパク質の発現レベルのほうが対照群よりも１．３倍以上増加したことが確認された（図６ｃ）。また、ネプリライシンのタンパク質の発現レベルは、濃度依存的に１．５倍以上増加することが確認された（図６ｄ）。
【００９８】
このことにより、ジンセノサイドＦ１がインスリン分解酵素及びネプリライシン発現レベルを増加させることによって、凝集したアミロイドプラークが除去できることを確認した。
【００９９】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形で実施できることを理解し得るであろう。なお、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであって、限定的なものではないことを理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
0006300285.tif 000009
【図６ｂ】
0006300285.tif 000010
【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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