(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チップ（１０）が上面（１５）と前記上面（１５）内に位置する中央部のアパーチャー（２０）とを有し、
前記上面（１５）が前記アパーチャー（２０）を取り囲む細胞付着領域（３０）を含んでいる、マイクロ流体分析システムに使用するためのチップ（１０）であって、
前記細胞付着領域（３０）が、前記アパーチャー（２０）の周りに同心状に、交互に配置されている３つ以上の親水性領域と疎水性領域（４１、４２、５１、５２）とを含み、
第１の親水性領域（４１）が前記アパーチャー（２０）を直接取り囲み、
第１の疎水性領域（５１）が前記第１の親水性領域（４１）の半径方向の外側に位置し、前記第１の親水性領域（４１）を取り囲み、親水性領域が１：１以下のC=O結合に対するC-O結合の比を有する、ことを特徴とするマイクロ流体分析システムに使用するためのチップ（１０）。
【請求項２】
前記細胞付着領域（３０）の最も外側の外縁が、前記第１の疎水性領域（５１）から構成されていることを特徴とする、請求項１に記載のチップ（１０）。
【請求項３】
前記細胞付着領域（３０）が、前記アパーチャー（２０）の周りに同心状に、交互に配置された４つ、５つまたは６つの、親水性領域および疎水性領域（４１、４２、５１、５２）を含んでいることを特徴とする、請求項１または２に記載のチップ（１０）。
【請求項４】
前記疎水性領域が、前記細胞付着領域（３０）の表面積の少なくとも５０％である合計した表面積を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のチップ（１０）。
【請求項５】
前記細胞付着領域（３０）が、少なくとも１つの親水性領域（４１、４２）および少なくとも１つの疎水性領域（５１、５２）から成ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のチップ（１０）。
【請求項６】
前記細胞付着領域（３０）が円形であり、２〜２５μｍの半径を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のチップ（１０）。
【請求項７】
前記親水性領域（４１、４２）が、０．８：１〜１：２．０のＣ＝Ｏ結合に対するＣ−Ｏ結合の比を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のチップ（１０）。
【請求項８】
前記親水性領域（４１、４２）が、約１：１〜１：２．０のＣ＝Ｏ結合に対するＣ−Ｏ結合の比を有することを特徴とする、請求項７項に記載のチップ（１０）。
【請求項９】
前記親水性領域（４１、４２）が、約１：１のＣ＝Ｏ結合に対するＣ−Ｏ結合の比を有することを特徴とする、請求項７項に記載のチップ（１０）。
【請求項１０】
前記親水性領域（４１、４２）が、前記細胞付着領域（３０）内で、前記上面（１５）の選択された領域の表面改質によって作られることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のチップ（１０）。
【請求項１１】
前記第１の親水性領域（４１）が、前記アパーチャー（２０）内に延在していることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のチップ（１０）。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のチップ（１０）を複数含むこと、を特徴とするチップアセンブリ（１００）。
【請求項１３】
ａ．請求項１〜１１のいずれか１項に記載のチップ（１０）を提供する工程と、
ｂ．細胞付着領域（３０）全体が細胞と接触するように、前記細胞を前記チップ（１０）の前記細胞付着領域に接触させ、それにより前記チップ（１０）への前記細胞の改良された付着性を提供する工程と、
を含むことを特徴とするチップ（１０）への細胞の付着性を改良する方法。
【請求項１４】
ａ．細胞付着領域（３０）を含み、少なくとも該細胞付着領域（３０）において疎水性である上面（１５）を有するチッププリカーサー（１１）を提供する工程と、
ｂ．前記疎水性の上面（１５）に、前記細胞付着領域（３０）の範囲内に位置するアパーチャー（２０）を作る工程と、
ｃ．前記アパーチャー（２０）を直接取り囲んでいる少なくとも１つの領域で、前記細胞付着領域の一部において上面（１５）を改質して、第１の親水性領域（４１）を提供する工程と、
ｄ．必要に応じて、前記第１の親水性領域（４１）の半径方向の外側に位置し、かつ前記第１の親水性領域（４１）を取り囲む少なくとも１つの他の領域で、前記細胞付着領域（３０）の一部において上面（１５）を改質して、第１の疎水性領域（５１）を提供する工程と、
を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のチップ（１０）の製造方法。
【請求項１５】
工程ｃ．における改質が、上面（１５）への照射により実施されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｃ．における改質が、上面（１５）への化学的堆積により実施されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体分析システムに使用するためのチップ、その使用およびそのようなチップの製造方法に関する。
【０００２】
キャリアプレート（マイクロタイタープレートとも言う）へのセンサーチップの組み込みは、本発明でとりわけ関連することである。チップの実施態様は、１つのチップ上に実験機能を組み込んでいる、いわゆるラボ・オンチップデバイスを提供してもよい。このようなチップのアセンブリは、１つのキャリア上に複数のチップの列を含んでもよく、細胞膜が測定電極の周りに高抵抗性のシールを形成している電気生理学的測定構成を確立することで、イオンチャネル含有構造、典型的には細胞（またはセル、cell）等などの脂質膜含有構造体、におけるイオンチャネルの電気生理学的特性を測定および／または監視する方法に適用することができ、細胞膜を通過する電流の流れを測定および監視することを可能にする。チップは例えば、グリコカリックスを含む細胞膜の電気生理学的特性を分析する方法に有用である。チップは、細胞膜における電気的事象を研究するための装置、例えば、生体膜におけるイオン輸送チャネルを研究するのに利用されるパッチクランプ技術を実施するための装置、において使用され、またはその一部を形成してもよい。
【背景技術】
【０００３】
試薬およびサンプルの様々な組み合わせの相互作用を評価するために、生物系におけるマイクロ流体分析は、医学および生物学的研究において広く用いられている。小さなリアクタチャンバとして用いられる複数のウェル（または穴、wells）を備えている平坦なプレートである、いわゆるマイクロタイタープレートが開発されている。分析調査および臨床診断試験研究室において、このようなマイクロタイタープレートは標準的なツールになっている。
【０００４】
とりわけ、パッチクランプ法で用いられるチップに対して、チップと細胞膜との間に高抵抗性のシール（「ギガシール」）を得ることができるように、チップへの細胞の優れた付着性が要求されている。
【０００５】
ＵＳ２００２／０１１０８４７には、生物細胞の状態変数の測定方法が記載されている。
【０００６】
Ｓ．ＷｉｌｓｏｎらによるＩＥＥＥ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ２００９  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１５３８−１５４１には、パッチクランプシステムの新規な方法が記載されている。
【０００７】
他のマイクロ流体システムが、ＵＳ２０１１／００８３９６１、ＥＰ  ２  ０３７  ２５８、ＵＳ２００４／０１４６８４９、ＷＯ０１／５６７７１、ＷＯ０２／１６６５１およびＵＳ２００５／０２７９７３０に記載されている。
【０００８】
今日までの取り組みにも関わらず、簡単で効率的な方法で作ることができる、改良された細胞付着特性を有するチップに対する必要性が残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、マイクロ流体分析システムにおいて用いるためのチップを提供することであり、該チップは改良された細胞付着特性を有する。チップの製造方法、およびチップへの細胞の付着性を改良するための方法も開示する。
【００１０】
本発明者らによって、パッチクランプチップのアパーチャー（または開口、aperture）の周りに、疎水性表面および親水性表面の特定の構成を備えることによって、細胞付着性が改良されることが見出された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明は、パッチクランプシステムのような、マイクロ流体分析システムで用いられるためのチップに関する。チップは、上面と、前記上面内に位置する中央のアパーチャーとを有する。前記上面は、前記アパーチャーを取り囲む細胞付着領域を有する。前記細胞付着領域は、交互に配置された２つ以上の疎水性領域と親水性領域とを含む。第１の親水性領域は、前記アパーチャーを直接（または接して、immediately）取り囲み、第１の疎水性領域は前記第１の親水性領域の半径方向の外側に位置し、そして前記第１の親水性領域を取り囲む。
【００１２】
本発明はまた、チップへの細胞の付着性を改良する方法を提供する。該方法は、次の工程を含む。
ａ．本発明に係るチップを提供する工程；
ｂ．細胞付着領域全体が細胞と接触するように、細胞をチップの細胞付着領域に接触させ、それによりチップへの細胞の改良された付着性を提供する工程。
【００１３】
さらに、本発明に係るチップの製造方法が提供される。該方法は、次の工程を含む。
ａ．細胞付着領域を含み、少なくとも該細胞付着領域において疎水性である上面を有するチッププリカーサー（または前駆体、precursor）を提供する工程；
ｂ．疎水性の上面にアパーチャーを作る工程であって、アパーチャーが細胞付着領域内に位置する工程；
ｃ．第１親水性領域を提供するように、細胞付着領域の一部において、アパーチャーを直接取り囲む少なくとも１つの領域で、上面を改質する（または変更する、modify）工程；
ｄ．必要に応じて、第１の疎水性領域を提供するように、細胞付着領域の一部において、第１の親水性領域の半径方向の外側に位置し、かつ第１の親水性領域を取り囲む少なくとも他の１つの領域で上面を改質する工程。
【００１４】
本発明のさらなる態様を、以下の明細書の本文、添付する図面および従属請求項において詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明はこれより、添付された概略図を参照して説明する。
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、パッチクランプデバイスの断面図であり、図１Ｂでは所定の位置に細胞があり、図１Ａでは所定の位置に細胞がない。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、パッチクランプデバイスの断面図であり、図１Ｂでは所定の位置に細胞があり、図１Ａでは所定の位置に細胞がない。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｄは、親水性領域と疎水性領域とが交互に配置された配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｄは、親水性領域と疎水性領域とが交互に配置された配列を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｄは、親水性領域と疎水性領域とが交互に配置された配列を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｄは、親水性領域と疎水性領域とが交互に配置された配列を示す。
【図３】図３は、本発明に係るチップアセンブリを、部分切り取り図により示す。
【図４】図４は、親水性にする、ポリスチレンホイルのレーザー表面改質の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
・定義
ある平面において第１の要素が第２の要素を「取り囲む」場合、両方の要素が重なることなく、かつ割り込む（interruption）ことなく、第２の要素全体の周りに第１の要素が完全に延在していることを意味する。ある平面において第１の要素が第２の要素を「直接取り囲む」場合、前記第１の要素と前記第２の要素との間に介在する領域が存在しない、すなわち、第２の要素の全周において、第１の要素が第２の要素と接触していることを意味する。
【００１８】
用語「半径方向」は、表面の平面内における方向を規定し、前記平面内のアパーチャーの中心を通る線に垂直な方向である。「半径方向の外側に」とは、表面の平面内においてアパーチャーから遠ざかる方向であり、「半径方向の内側に」とは表面の平面内においてアパーチャーに向かう方向である。
【００１９】
表面の材料が水に対する生来の親和性（a natural affinity）を有する場合、その表面の材料は親水性として記載されている。親水性のポリマーは、９０°未満、好ましくは８０°未満、より好ましくは７５°未満、さらにより好ましくは５０°未満、最も好ましくは２０°未満の水との接触角を有するポリマーとして規定され、本明細書に記載されるように、前進接触角の測定により測定された。逆に、表面の材料が水に対する生来の嫌悪性（a natural aversion）を有する場合、その表面の材料は疎水性として記載されている。疎水性のポリマーは、９０°より大きい、好ましくは１２０°より大きい、より好ましくは１３５°より大きい、最も好ましくは１５０°より大きい水との接触角を有するポリマーとして規定される。
【００２０】
・本発明の具体的な実施形態
図１は、本発明に係るチップ１０の断面図を示し、細胞（またはセル、cell）１２０がチップ１０上に位置づけられるパッチクランプデバイスである。
【００２１】
チップ１０は、実質的に平坦な上面１５と実質的に平坦な下面１６とを有し、かつ５〜５０μｍの厚さを有する。チップ１０の薄い性質により、「ホイル」とも称される。
【００２２】
チップ１０の材料は、高い誘電率と低い誘電損失を有する、生体適合性のものでなければならない。その材料は、高度な表面仕上げ（平均表面粗さ、Ｒａ＜０．５ｍｍ）加工が可能であり、正確で、再現することが可能な方法で、ガラスピペットと同様に、その中に形成されるアパーチャー（スルーホール）を有することができなくてはならない。蛍光分析（fluorescene）のような光学分析手法を行うことができるように、チップ材料は好ましくは光学的に半透明（または透光性を有する）でなくてはならない。
【００２３】
チップ１０の好ましい材料は、シリコン、ポリマー、純シリカ、並びに石英およびパイレックス（登録商標）等の他のガラスまたは、必要に応じて、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｂ、Ａｌ、Ｇａ、Ｇｅ、Ｎ、ＰおよびＡｓから成る群から選択される１つ以上のドーパントでドープされたシリカを含む。ポリマーは、チップ１０の好ましい材料である。好ましいポリマーの例は、ポリスチレン、ポリイミド、ポリプロピレンおよびポリエチレンのような疎水性のポリマーである。液晶ポリマー（ＬＣＰ）も有用なポリマーである。ポリスチレンは、チップ１０の最も好ましい材料である。
【００２４】
チップ１０の上面１５は、好ましくは実質的に平坦である。この上面１５は、電気化学分析を行うために、試験品、例えば、細胞等の脂質膜含有構造体のような、イオンチャネル含有構造体を支持するように構成される。従って、試験品が、試験品と接触する液体にさらされている間に、その電気化学分析は行われてよい。従って、チップが電気を伝導することができ、および／またはイオンがそこを通過すること、例えば、その中に形成されるオリフィスまたはアパーチャーを通過することを許容することが出来、それにより、チップ１０の両側にある２つの領域の間に電気的な接続が確立されることが理解される。
【００２５】
チップ１０は、上面１５内に位置する中央部のアパーチャー２０を有する。図１に示すように、アパーチャー２０はスルーホールであり、チップ１０の上面１５から下面１６に通路を提供する。
【００２６】
アパーチャー２０は、好ましくは円形断面を有するが、他の断面であってもよい。上面におけるアパーチャー２０の直径は、好ましくは１〜３μｍである。アパーチャー２０は好ましくは、テーパーが付いており、下面１６におけるその直径は、上面１５におけるその直径よりも大きい。例えば、下面におけるアパーチャー２０の直径は、好ましくは１．５〜１０μｍの範囲である。
【００２７】
チップ１０の材料に応じて、チップ１０にアパーチャー２０を形成するための任意の適切な方法が用いられてもよい。好ましい方法は、短パルスレーザー光（４ｎｍ）を用いたエキシマレーザーを用いた穿孔である。
【００２８】
チップ１０の上の所定の位置に細胞１２０を固定するように、アパーチャー２０を通してサクションが適用されてもよい（図１Ａのとおり）。細胞１２０を横切り、かつアパーチャー２０を通る電気抵抗、イオンの流れまたは電位差を測定するために、前述した領域の両側に電極（表示されていない）が提供されてもよい。
【００２９】
チップの上面１５は、前記アパーチャー２０を取り囲む細胞付着領域３０を含む。細胞付着領域３０は、１つの細胞１２０によって占有される上面１５の領域である。典型的には、細胞付着領域は円形であり、２〜２５μｍの範囲、好ましくは５〜１５μｍの範囲、より好ましくは１０μｍ未満の半径を有する。
【００３０】
細胞付着領域３０は、少なくとも１つの親水性領域４１、４２を含み、少なくとも１つの疎水性領域５１、５２を含む。図２Ａ〜２Ｄは、アパーチャー２０の周りの、親水性領域および疎水性領域の可能な構成を示す。
【００３１】
第１の親水性領域４１は、前記アパーチャー２０を直接取り囲み、第１の疎水性領域５１は、前記第１の親水性領域４１の半径方向の外側に位置し、そして前記第１の親水性領域４１を取り囲んでいる。このように、細胞１２０は、チップ１０に付着する場合、親水性領域と疎水性領域の両方に接触する。
【００３２】
好ましくは、前記細胞付着領域３０の最も外側の外縁は、前記第１の疎水性領域５１から構成される。すなわち、第１の疎水性領域は、細胞付着領域３０の最も外側の外縁を規定する。
【００３３】
細胞付着領域３０は、アパーチャー２０の周りに同心状に、交互に配置された２つ以上（例えば３つ、４つ、５つまたは６つ）の、親水性領域４１、４２、４３・・・および疎水性領域５１、５２、５３・・・を含む（例えば、図２Ｃおよび２Ｄ）。
【００３４】
好ましくは、細胞付着領域３０は、少なくとも１つの親水性領域４１、４２および少なくとも１つの疎水性領域５１、５２から成る。すなわち、他の領域は存在しない。
【００３５】
親水性領域は、前記細胞付着領域３０の表面積の少なくとも５０％（図２Ａ）、好ましくは少なくとも７５％（図２Ｂ）である全表面積を有してもよい。
【００３６】
親水性領域におけるＣ＝Ｏ結合に対するＣ−Ｏ結合の比率も重要であることが、分かっている。好ましくは、従って、親水性領域４１、４２は、０．８：１〜１：２．０、好ましくは０．９：１〜１：１．５、より好ましくは１：１のＣ＝Ｏ結合に対するＣ−Ｏ結合の比率を有する。後述するように、この比率はＸ線光電子分光（ＸＰＳ）により測定される。
【００３７】
１つの態様において、親水性領域４１、４２は、前記細胞付着領域３０の範囲内で、上面１５の選択された領域を表面改質することにより作られる。表面改質は、分離した材料を用いるチップを構成することの必要性を減らす。最も好ましくは、チップ１０の材料が疎水性の場合には、親水性領域４１、４２は、上面１５の選択された領域の表面改質によって作られ、従って、疎水性領域および親水性領域を必要に応じて容易に作る。
【００３８】
第１の親水性領域４１はアパーチャー２０を取り囲んでおり、アパーチャー２０内にも延在してもよい。アパーチャーの内側での細胞付着、および／またはアパーチャー内への細胞１２０の侵入は、このようにして改良される。
【００３９】
細胞付着領域全体にわたるチップの表面構造における単純な変化（例えば、疎水性から親水性へ）が、改良された細胞付着を提供するであろう、と以前に考えられてきた。しかし、本発明は、細胞付着領域の範囲内の上面１５の親水性／疎水性を、所定のパターンに従って変化させることにより、改良された細胞付着を提供する。このように、細胞付着領域３０を占める１つの細胞１２０が、あるパターンにおいて、親水性領域と疎水性領域の両方に接触する。
【００４０】
本発明に係るチップ１０は、パッチクランプ分析；ウェット領域がドライ領域から分離される、他の種類の電気化学分析；コールターカウンター；フローサイトメトリー；（例えば、固定化したまたは動いている細胞の測定を行う目的のために）チップ１０の単側に電極が提供されている、マイクロ流体分析システム；例えば、１つの細胞の質量測定のための小型カンチレバー分析に適用できる。
【００４１】
チップの１つの表面は、例えば、チップの他の表面上の他の部品および／または電子機器と通じる、１つ以上の部品を含んでもよい。例えば、チップを通る電流通路または液体流路は、チップの第１の表面において、１つ以上の電極および／または測定部品と通じてもよい。このような実施形態において、本発明に係るアセンブリは、例えば圧力を測定するための測定装置として、またはカンチレバー質量センサーとして有用である。
【００４２】
本発明のチップ１０は、チップアセンブリ１００の一部を形成してよく、チップ１０の配列は、平行に並んだ配列で位置する。好ましくは、チップアセンブリ１００の材料は、チップ１０の１つ１つと同じ材料であり、かつ隣のチップとの間で連続しており、チップアセンブリはその中に位置する複数のアパーチャー２０および細胞付着領域３０を有する材料の板から構成される。あるいは、本発明のチップ１０は、同時継続出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６１３８８のようにキャリア構造（または担体構造、a carrier structure）に組み立てられる。
【００４３】
チップアセンブリ１００の表面は、好ましくは、細胞付着領域３０内においてくぼんでおり、チップアセンブリ１００内に複数のウェルが形成される。典型的には、チップアセンブリ１００は、８〜４００個のチップ１０から構成される。
【００４４】
本発明は、チップ１０への細胞１２０の付着性を改良する方法にも関し、前記方法は以下の工程を含む。
ａ．本発明に係るチップ１０を提供する工程；
ｂ．前記細胞付着領域３０全体が前記細胞と接触するように、前記細胞を前記チップ１０の細胞付着領域３０に接触させ、それにより前記チップ１０への前記細胞の改良された付着性を提供する工程。
【００４５】
本発明に係るチップ１０は、複数の方法によって作られてもよい。しかし、好ましい方法は以下の工程を含む。
ａ．細胞付着領域３０を含み、少なくとも該細胞付着領域３０において疎水性である上面１５を有するチッププリカーサー１１を提供する工程；
ｂ．前記疎水性の上面１５に、前記細胞付着領域３０の範囲内に位置するアパーチャー２０を作る工程；
ｃ．アパーチャー２０を直接取り囲んでいる少なくとも１つの領域で、細胞付着領域の一部において上面１５を改質して、第１の親水性領域４１を提供する工程；
ｄ．必要に応じて、前記第１の親水性領域４１の半径方向の外側に位置し、そして前記第１の親水性領域４１を取り囲む少なくとも１つの他の領域で、細胞付着領域３０の一部において上面１５を改質して、第１の疎水性領域５１を提供する工程。
【００４６】
・（アパーチャーを作るための）レーザーアブレーションの原理
アパーチャーまたはホールは、パルスとして知られるレーザーエネルギーの複数の「加えられたショット（applied shot）」によって作られる。レーザーエネルギーが吸収される深さ、およびそれによって、１つのレーザーパルスによって取り除かれる材料の量は、材料の光学特性およびレーザーの波長に依存する。
【００４７】
用いられるレーザー波長に対する十分な吸収係数（αeｆｆ＞１μｍ−１）（Ｃｌｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）等の、ポリマーを構築するために基本的な要件を満たさなければならない。
【００４８】
ポリマーに穴を開けるために、アブレーションレートＲは、アブレーション閾値ε１を超えて増大されなければならず、エネルギーフルエンス、ε（ベールの法則）に対して対数的である。
0006290096.tif 000002
【００４９】
非常に高いエネルギー密度および、除かれた破片の早い溶解は、材料が蒸発したプラズマ（material vapor plasma）を引き起こす。このプラズマは、レーザー光線を部分的に吸収する。これは、いわゆる飽和領域（saturation area）である（Ｐｅｔｔｉｔ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ，１９９３）。
【００５０】
ホールアブレーションのための１９３ｎｍでのレーザーの設定において、レーザー光源およびミラーは、（従来の半導体のマイクロリソグラフィーで用いられるような）電動式の石英クロムマスクを通して、偏光ミラーを通して、サンプル部品が置かれている位置決めテーブル上の対象を通して、光ビームを反射する。露光範囲は約２×２ｍｍである。
【００５１】
レーザー波長による影響の観点から、共有結合が破壊される２００ｎｍ未満の波長で光化学プロセスが起こり、印加されるエネルギーがアブレーション閾値を超える場合には材料が蒸発する。揮発性の破片はそれから溶解する。１９３ｎｍでの光子エネルギーは、６．４ｅＶである。それは、最も大きい共有結合に対する結合エネルギーを上回る（Ｌａｕｒｅｎｓ，２０００）。
【００５２】
２４８ｎｍを超える波長において、材料にもよるが、電子励起は分子鎖の破壊を引き起こさない。この場合、急速加熱が起こり、続いて爆発的な蒸発が起こる（Ｐｅｔｔｉｔ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ，１９９３）。３００ｎｍを超える波長に対して、単一および多重のパルスが、熱分解の原因となるエネルギー吸収域における加熱を引き起こす。単一パルスは、共有結合を壊すには不十分である（Ｐｅｔｔｉｔ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ，１９９３）。
【００５３】
開けられた穴は、レーザーの出口側で１〜５μｍの径を有し、細胞が穴を通って落ちるのを防ぐ。レーザーの入口側の穴の径は、細胞の底部への電解質の侵入を許容するべきである。理想的には、穴は円錐状であるべきである。０．５ｍＪ／ｃｍ２のフルエンスにおいて、最良の結果が得られた。細胞は、１〜４μｍの範囲の径を有する、穴の出口側に位置する。細胞培養培地の最適な侵入のためには、レーザーの入口側の径は平均して５〜９μｍの間である。０．８ｍＪ／ｃｍ２および１．５ｍＪ／ｃｍ２のレーザーフルエンスにおいて、穴はより円錐形ではなく、５μｍの入口直径と３μｍの出口直径を示す。エネルギーフルエンスを増加すると、０．５ｍＪ／ｃｍ２の場合よりも、別の反応を見せる。０．８ｍＪ／ｃｍ２では出口直径は楕円形状であり、１．５ｍＪ／ｃｍ２では、穴は円形状である。
【００５４】
・表面改質
好ましくは、工程ｃ．における上面１５の改質は、ＵＶ照射かまたはレーザー照射のどちらかによる前記上面１５への照射により行われる。アパーチャー２０を作るのに用いたものと、同じレーザーまたは異なるレーザーを用いることで、これは容易に達成することが出来る。チップ１０のある領域のフォトマスクは、所望の領域における選択的な改質を許容する。
【００５５】
・マイクロリソグラフィー
上面１５の領域は、マイクロリソグラフィーによって改質されてもよい。マイクロリソグラフィーは半導体の製造において用いられる技術であって、フォトマスクから、ＵＶ光に感光性があるフォトレジスト材料で被われたシリコンウエハ上にパターンを撮像する。フォトマスクは、ＵＶ光波長をほとんど通さない、パターンがある薄いクロム層を底部に有する。ＵＶ光はフォトマスクを通りぬけ、またはパターンがあるクロム層によって反射される。ウエハ上のフォトレジストはそれから、フォトマスクのシャドウパターンに露出され、例えばＣＭＯＳチップの基本的なデザインを形成する青図（またはブループリント、blueprint）がレジスト内に作られる。
【００５６】
２つの基本的な種類のフォトレジスト（ポジ型またはネガ型）が存在する。ＵＶ光に露出されるとき、ＵＶ光を受けたところで、Ｃｌａｒｉｅｎｔ  ＡＺ４５３３のようなポジ型のフォトレジストのボンド（bond）が切断される。後ろにある露光されていないフォトレジスト構造を残して、破壊されたボンド材料を洗い落とすのに、食塩水を用いることが出来る。簡易なマイクロリソグラフィーにおいて、２００ｎｍ未満の、好ましくは１８５ｎｍの短波長の照明を用いて、フォトレジストを必要とする事無く親水性表面改質をすることができる。フォトマスクはドリル穴の周りに位置合わせされ、ＵＶ光は、ポリマー材料の表面結合を破壊するための最小量の１Ｊ／ｃｍ２で用いられ、従って安定した−ＣＯＯＨ結合を作る。
【００５７】
ネガ型のフォトレジストを用いると、逆のことが起こる。ＵＶ光にさらされた領域は架橋結合し、基質上に残るが、架橋されていない領域は有機溶剤によって除去される。
【００５８】
・ＵＶレーザー表面改質
ポリエチレンのアブレーション閾値未満にとどめることによって、ステップアンドリピートのビーム加工を用いることにより、共有結合を破壊するパターンがある表面改質を行うことが出来る。アブレーション閾値未満のエネルギーフルエンスで、レーザービームは表面を横切って移動する。アブレーション閾値は、パルスの数、レーザーの周波数および印加されるエネルギーによって、実験に基づいて決定される。前述したように、１９３ｎｍのＵＶレーザーは、例えばベンゼンにおける共有結合を破壊するのに十分な光子エネルギーを有し、より多くのＣＯＯＨ基を形成することを目的に、周囲空気は破壊されたＣ−Ｈ結合と反応する。レーザーにおいて石英クロムマスクを用いて、光学を多少低減することにより、非常に優れたパターンを材料の表面内に「書き込む」ことができ、最適化されたパラメータを用いると、ドライエッチングまたはアブレーションが起こらない。
【００５９】
レーザー表面改質は、ＡＴＬＥＸ  ＡｒＦレーザー（ドイツ、Ｗｅｒｍｅｌｓｋｉｒｃｈｅｎ、ＡＴＬ  Ｌａｓｅｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃ社）を用いて、１９３ｎｍで、異なるエネルギーフルエンス、周波数およびパルス数で、および環境空気において、行うことが出来る。クロム／石英マスクもまた用いられてもよいが、投影マスクのように材料と接触しない。最終的に得られる形状に対するマスクの形状の縮小係数は、４：１である。
【００６０】
レーザー改質は、図４に示される。この例においては、ポリスチレンのホイルが準備され、改質は上述したレーザーにより行われ、それからディップペン・ナノリソグラフィ（ＤＰＮＬ）の脂質の環（lipid ring）が適用される。（Ａ）で示される破線の灰色の円は親水性領域である。（Ｂ）で示される３つの同心状のリングと、より小さい中央のリングは、５％のローダミンで標識化された（ＤＰＮＬ）の脂質の環を含む。矢印（Ｃ）はレーザー出口穴（２μｍ）を示す。
【００６１】
親水性表面を作るための照射の代わりとして、上面１５の化学的堆積（または化学蒸着、chemical deposition）によって上面１５の改質が行われてもよい。このような改質は疎水性の領域５１を提供することもできる。例えば、Ｈｏｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００３，１９．７５７９−７５７９には、ポリ（メタクリル酸メチル）へのオキサイドナノスキンの形成が記載され、それによって基板上に親水性の領域を形成することが記載されている。
【００６２】
生来の（native）材料の表面の疎水性に加えて、リソグラフィープロセスによって、追加の表面の疎水性を行うことが出来、それによって、疎水性の材料の層（アモルファスガラス、アモルファスポリマー（例えばフッ素重合体）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）のような半結晶ポリマー）は、リフトオフ法または選択的な表面親和力（preferential surface affinity）によって、表面上にパターンを付けられる。
【００６３】
ディップペン・ナノリソグラフィ。試験状態において、単一の先端または並列に近接した多重の先端チップのどちらかを用いて、レーザー穿孔された穴の周りに疎水性のパターンを作るために、疎水性表面上に脂質を堆積（または蒸着、depositing）するラングミュア・ブロジェット法が試みられた。ラングミュア・ブロジェット型フィルムを適用する他の方法（例えばディッピング法、スピンコーティングなど）もまた用いることができる。
【００６４】
前記第１の親水性領域４１の半径方向の外側に位置し、そして前記第１の親水性領域を取り囲む領域（すなわち、第１の疎水性領域５１）において、チッププリカーサー１１の上面１５が十分に疎水性である場合、改質することなく放っておくことが出来る。しかし、この領域を覆い、あるいは改質し、所望の水準にその疎水性を増加させることもまた可能である。
【００６５】
好ましくは、第１の親水性領域４１ではない細胞付着領域３０の一部は、第１の疎水性領域５１を構成する。
【００６６】
全ての改質された表面は、細胞付着に加えて、ＸＰＳおよび接触角測定により分析される。
【００６７】
・接触角測定方法
ＤａｔａＰｈｙｓｉｓｃ（ドイツ、フィルダーシュタット）の、ＳＣＡ２０ソフトウェアを備えるＯＣＡ１５  ｐｌｕｓ  ゴニオメーターは、静的接触角及び動的接触角の測定をすることができる。
【００６８】
動的接触角測定のために、投与量および投与速度が両方とも可変である液滴が基板上に置かれ、ＣＣＤカメラによって一定時間の間記録される。接触角は、１つ１つの撮られた写真に対して測定される。動的接触角は、５〜１５秒の間で決定される。７２．８Ｊ／ｍの表面エネルギー（５１．１Ｊ／ｍの極性成分と２１．８Ｊ／ｍの分散成分を有する）（Ｇｌｅｉｃｈ，２００４）を有する蒸留水が、これらの実験のために用いられた。水素結合の相互作用により、極性成分は分散成分よりも大きい。
【００６９】
前進接触角を測定するために、約２μＬの液滴が基質上に最初に置かれ、液滴の中央にピペットの先端が位置づけられ、それから液滴の量が１６μＬに到達するまで、水が０．７μＬ／ｓの早さで注入された。同時に、カメラはこのプロセスを、１秒間に１６枚の早さで、２０秒を超える継続時間で、全部で５００枚の写真で記録した。
【００７０】
後退動的接触角を測定するために、逆の手順を続いて行い、ピペットの先端が液滴の中程に位置づけられ、水が０．７μＬ／ｓの早さで吸い上げられ、角度が得られそして記録された。
【００７１】
平均表面応答を確実にし、かつ既に含水した表面が再度測定されることを避けるように、前進接触角および後退接触角の測定は、各照射線量に対して５回、異なる表面の場所で行われた。製品または化学的性質による表面の差異を決定するために、ホイルの表と裏が測定された。
【００７２】
・ＸＰＳ測定
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）測定は、１０−９ｍｂａｒ未満の圧力で、非単色のＭｇＫα線（Ｋα：１２５３．６ｅＶ）を用いて、ＥＳＣＡＬＡＢ５分光計（イギリス、イーストグリンテッド、バキュームジェネレーターズ社）によって行われた。結合エネルギーのスケールは、主要なＣ１ｓ（Ｃ−Ｈ結合）の特性に対して、２８５．０ｅＶが参照された。分析チャンバー内の基本圧力は１０−１０ｍｂａｒ未満であり、測定の間は約５×１０−８ｍｂａｒまで増加した。光電子は、サンプルの表面の法線に対して６０°の取り出し角度から検出された。これは、測定の情報深さが５ｎｍ以下であることを意味している。
【００７３】
測定チャンバー内に置かれる前に、露出されたおよび露出されてない基準ホイル材料（reference foil material）は１０×１０ｍｍの四角に分けられる。ＳＵ−８（感光性エポキシレジスト）の表面の準備は、ややより少し複雑である。加工後のより早い試料の切断のために、シリコンウエハは、１０×１０ｍｍの正方行列をレーザーで刻まれる。ＳＵ−８は、シリコン基板上にスピンコートされ、９５°Ｃで２分間ソフトベークされ、それから表面全体が、１０００ｍＪ／ｃｍ２のエネルギー量の３６５ｎｍの波長のＵＶ光（フィルター処理した）の下で、大量に（flood）露光され、９５°Ｃで５分間、現像前ベークを行い、それから１０分間ＰＧＭＥＡ内で現像され、イソプロパノールでゆっくりと洗い落とされ、ヒュームフード内でＳＵ−８層を下向きに向けて空気乾燥させた。サンプルを乾燥した後、短い酸素プラズマ洗浄工程（１００Ｗ／５分）が行われる。測定チャンバー内に置かれる前に、弱い機械力を用いて、サンプルは１０×１０ｍｍの部分に分割される。
【００７４】
・ＸＰＳ結果
ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）および液晶性ポリマー（ＬＣＰ、米国、アリゾナ、チャンドラー、Ｒｏｇｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）の表面改質は、１８５ｎｍの波長のＵＶランプを用いて行われた。石英ガラスおよびクロムマスクは、改質された領域と改質されていない領域を提供した。ランプは表面から１０ｃｍに位置づけられ、１ｃｍ２につき４００ミリワットを供給して、少なくとも３０分間処理が行われた。
【００７５】
界面化学を測定するために、表面は接触角測定およびＸＰＳを用いて分析され、粗さは、接触型表面形状測定装置（Ｔｅｎｃｏｒ）を用いて測定された。
【００７６】
接触角測定は、３８．８％から４９．４％の間の周囲湿度、２１．１°Ｃから２５°Ｃの間の温度範囲で行われた。これらの変化は狭い範囲内にあるので、測定への影響は無視できるほどであると見なされる。
【００７７】
これらの加工による影響は、レーザーアブレーションを用いて、とりわけはっきりと強調することができる。アブレーション閾値を超えるＵＶレーザーにより構造化される場合、ペトリ皿はリッジ型構造を示す。このリッジ型構造は、レーザー照射密度またはパルス数によって変える事が出来ず、かつレーザー方向（リッジに対して平行または垂直）とも無関係であるので、物質的なアーティファクト（a material artefact）と考えられる。２０ｍＪ／ｃｍ２のエネルギーフルエンスに対して、アモルファス領域において選択的な材料除去が起こる。半結晶領域は、リッジ型構造を引き起こす、より高い除去速度を有する。
【００７８】
異なるレーザーパルス幅の効果の比較は、接触角における顕著な違いを示さなかった。２０ｎｓと４ｎｓのパルス幅の両方とも、接触角ヒステリシスにおいて無視できるほどの非常に小さな違いだけが見られた。
【００７９】
ＸＰＳ測定を用いた化学分析は、ε＝４ｍＪ／ｃｍ２においては、レーザーのパルス数および総照射線量と共に、ＰＳ表面上の酸素の量が対数的に増加することを示している。１５０レーザーパルス（Ｅｔｏｔ＝０．６Ｊ／ｃｍ２）の後、さらには３００レーザーパルス（Ｅｔｏｔ＝１．２Ｊ／ｃｍ２）の後、用いたレーザーパルス長の間の差は観測することが出来なかった。１５０レーザーパルスの後、表面における酸素の量は１２ａｔ％であり、３００パルスの後、酸素の量は１７〜１８ａｔ％であった。
両方のレーザーパルス長と、加工を助力したＵＶランプ
改質されたポリスチレン表面のＣ１ｓおよびＯ１ｓの線形状は、−ＣＯＯＨ化学基の線形状と非常によく一致する。
【００８０】
ＵＶランプ改質は、酸素の化学量論において、暴露時間Ｔおよび総照射量Ｅｔｏｔ（figure 50）を関数とする対数的な増加も引き起こす。長時間の暴露（Ｔ＝９０分、Ｅｔｏｔ＝１．５Ｊ／ｃｍ２）の後、酸素量は約３４ａｔ％の値に達する。プロセスガスとして酸素を用いて、４０００レーザーパルス（Ｅｔｏｔ＝１６Ｊ／ｃｍ２）の後、同様の酸素化学量論に達することが出来る。これは、１５０または３００のレーザーパルスを用いたレーザー改質が、完全には酸化されていないポリスチレン表面を引き起こすことを意味し、これは接触角測定によって得られた結果と非常によく一致する。
【００８１】
酸化物層の厚さの対数的な増加は、表面における物理吸着過程およびそれに続く化学吸着過程に典型的なものである。反応域はナノメータスケールに制限され、酸素のバルク拡散は無視することが出来る。
【００８２】
ＸＰＳ測定は以下のデータをもたらした（表１）。
0006290096.tif 000003
【００８３】
４８時間の間、改質された表面を細胞で被い、細胞に色を付けて、細胞が付着されたか否かを視覚的に測定することにより、細胞付着性は分析された。用いられた細胞のタイプは、Ｌ２９２（ネズミ線維芽細胞）、ＨＥＰＧ２（ヒト肝細胞の肝臓ガン細胞）およびＰＣ−１２ＧＦＰ（ラット肝臓の副腎腫瘍細胞）であった。
【００８４】
３つ星（＊＊＊）は良好な付着性を示し、１つ星（＊）は不良な付着性を示した。約１：１の親水性領域内におけるＣ＝Ｏ結合に対するＣ−Ｏ結合の比率は、良好な細胞付着性を提供し、それから低比率において弱まることがわかる。
【００８５】
本発明は、複数の特定の実施形態および実施例に関して説明されたが、その範囲はこれらの実施形態および実施例に限定されるものと考えられるべきではない。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に規定される。
【図１Ａ】
0006290096.tif 000004
【図１Ｂ】
0006290096.tif 000005
【図２Ａ】
0006290096.tif 000006
【図２Ｂ】
0006290096.tif 000007
【図２Ｃ】
0006290096.tif 000008
【図２Ｄ】
0006290096.tif 000009
【図３】
0006290096.tif 000010
【図４】
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