(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする真核性発現カセットを含む組換ＤＮＡ分子を少なくとも１コピー含む、チフス菌（Salmonella typhi）の弱毒化変異株Ｔｙ２１ａを含むヒトの癌免疫療法に用いられるワクチンであって、ここで前記ＶＥＧＦ受容体タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＶＥＧＦＲ−２からなる群より選択され、前記ワクチンは経口投与されると共に、前記ワクチンの単回用量量が１０６〜１０９コロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）である、ワクチン。
【請求項２】
前記プラスミドが、図２に示す７５８０ｂｐのｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１であると共に、配列番号３に記載の配列を有し、前記ワクチンがＶＸＭ０１で表される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記癌が膵臓癌である、請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記膵臓癌がステージIV又は局所進行性の膵臓癌である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記癌が転移を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載のワクチン。
【請求項６】
免疫療法処置が化学療法及び／又は放射線療法を伴う、請求項１〜５の何れか一項に記載のワクチン。
【請求項７】
化学療法剤がゲムシタビンである、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンによる免疫療法処置が化学療法による治療周期の間に実施される、請求項６又は７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ワクチンの単回用量量が１×１０６、１×１０７、又は１×１０８コロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）である、請求項１〜８の何れか一項に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ワクチンの単回用量量が１×１０８ＣＦＵ未満であり、又は前記ワクチンの単回用量量が１×１０６〜１×１０７ＣＦＵである、請求項１〜８の何れか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記単回用量量が、１０６〜１０８、又は１０６〜１０７のコロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）を含む、請求項１〜８の何れか一項に記載のワクチン。
【請求項１２】
配列番号１のＶＥＧＦＲ−２タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドにより形質転換された弱毒化チフス菌（Salmonella typhi）株Ｔｙ２１ａを含むワクチンＶＸＭ０１であって、前記プラスミドが、７５８０ｂｐのプラスミドＤＮＡであると共に、ＣＭＶプロモーターの調節下にあるＶＥＧＦＲ−２のｃＤＮＡと、カナマイシン耐性遺伝子と、ｐＭＢ１ ｏｒｉとを含み、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１で表されると共に、ヒトの癌免疫療法のワクチンとして使用され、ここで前記ワクチンは経口投与されると共に、前記ワクチンの単回用量量が１０６〜１０９コロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）であるワクチンＶＸＭ０１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコード化する組換ＤＮＡ分子を含むサルモネラ（Salmonella）の弱毒化変異株に関する。特に本発明は、当該サルモネラ（Salmonella）の弱毒化変異株の癌免疫療法における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）の弱毒化誘導体は、腫瘍抗原や腫瘍間質抗原等の異種抗原を哺乳類免疫系に送達するための魅力的なビヒクルである。Ｓ．エンテリカ（S. enterica）株は粘膜免疫化経路を介して、即ち経口又は経鼻的に送達できる可能性がある。斯かる投与により、非経口（消化管外）投与と比較して簡便且つ安全であるという利点がある。更に、サルモネラ（Salmonella）株は、全身及び粘膜区画の両レベルで、体液性及び細胞性免疫応答を強く誘発する。バッチ調製のコストは比較的安く、生存細菌ワクチン製剤は安定性に優れる。種々の遺伝子、例えば毒性遺伝子、調節遺伝子、及び代謝遺伝子等を欠失させることにより、弱毒化を行うことも可能である。
【０００３】
aro 変異により弱毒化したネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）株が、安全且つ効果的な異種抗原の送達ビヒクルとなることが、動物モデルにおいて示されてきた。
【０００４】
抗原（特にＶＥＧＦ受容体タンパク質）をコード化するＤＮＡコンストラクトを、生存弱毒化ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）株を介してマウス標的細胞に送達するアプローチが、国際公開第０３／０７３９９５号公報に記載されている。Niethammer等 (Nature Medicine 2002, 8(12), 1369) は、マウス血管内皮成長因子受容体２（vascular endothelial cell growth factor-2：ＶＥＧＦＲ−２、又はＦＬＫ−１）をコード化する発現ベクターを保有する弱毒化Ｓ．チフィリウム（S. typhimurium）aroA株SL7207、及びその癌ワクチンとしての用途を記載する。
【０００５】
しかし、ヒトへの使用が認められた弱毒化サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）血清型株はこれまで唯一、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）血清型typhi Ty21a（略称：S.typhi Ty21a）のみである。
【０００６】
この耐容性に優れた腸チフス用生存経口ワクチンは、野生型毒性細菌単離株S. typhi Ty2 の化学的突然変異生成によって誘導されたもので、galE遺伝子の機能喪失型突然変異を有すると共に、他の詳細不明の突然変異を有する。野外試験でその有効性及び安全性が示されて以来、多くの国で腸チフスワクチンとして認可されている。
【０００７】
血管新生は固体腫瘍の増殖及び転移に関与する。ベバシズマブやその他の腫瘍新生脈管構造を特異標的とする化合物、例えばスニチニブやアキシチニブ等の低分子等は、一連の腫瘍適応に有効であることが示されている（Powles et al., Br J Cancer 2011, 104(5):741-5; Rini et al., Lancet 2011, 378:1931-1939）。
【０００８】
腫瘍新生脈管構造は、血管内皮成長因子受容体（vascular endothelial growth factor receptor：ＶＥＧＦＲ）２を過剰発現する内皮細胞によって覆われており、血流を介して容易にアクセス可能である。これらの細胞は、その遺伝的安定性、及び内皮細胞１つ当たり数百もの腫瘍細胞を支持する能力ゆえに、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、或いはワクチンの何れを用いるかによらず、抗癌治療の主要標的となっている（Augustin, Trends Pharmacol Sci 1998,19:216-222）。近年、Ｔ細胞に基づく免疫療法が、前立腺癌に対して一定の臨床的成果を収め、これまでも前臨床段階ではしばしば示されてきた抗癌ワクチン接種の有効性を、改めて実証する形となった（Sharma et al., Nat Rev Cancer 2011, 11:805-812）。免疫系を癌細胞に対して賦活化するには、多数の困難を乗り越えなければならない。例えば、癌病巣はしばしば多クローン性であり、癌細胞は突然変異を生じ易い。抗原特異的治療では、非抗原保有細胞のみが選択されてしまう場合も多い。更なる障害として、腫瘍の封入化や、ＭＨＣ分子の喪失又は下方制御等が挙げられる。腫瘍新生脈管構造を標的とするワクチン接種のアプローチでは、理論上これらの障害を乗り越えなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
斯かる従来技術に鑑み、本発明の目的は、新規の安全な経口ＶＥＧＦ受容体標的化癌ワクチンの提供である。斯かるＶＥＧＦ受容体標的化癌ワクチンによって、癌患者の治療選択肢が改善されるという大きな利点が得られるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＶＥＧＦＲ−２を標的とする抗血管新生治療とワクチン化とを組み合わせるべく、新たなワクチン（ＶＸＭ０１）を用いる。即ち、ＶＥＧＦ受容体タンパク質２をコード化するプラスミドを含む弱毒化・再改変細菌株チフス菌（Salmonella typhi）Ｔｙ２１ａである。
【００１１】
ＶＸＭ０１は、腫瘍細胞常在型抗原ではなく、腫瘍新生脈管構造の非悪性内皮細胞により過剰発現されている腫瘍間質常在型抗原を標的化するという、新たな方策を提示するものである。
【００１２】
本発明品は、遺伝的に安定且つアクセスが容易な内皮細胞を標的とすることにより、腫瘍細胞を直接標的化する従前のワクチンが直面してきた限界、例えば腫瘍細胞の不均質性、ＭＨＣ喪失、細胞レベルでの免疫抑制、及び腫瘍の封入化等の限界を乗り越え、更には血液脳関門等の生理学的な障壁をも乗り越えようとするものである。更に、本発明のワクチンによれば、治療標的が腫瘍タイプと独立しているので、種々の異なる固体悪性腫瘍に対して賦活化できる可能性もある。本発明品は、患者に依存しない「既製品」（off-the-shelf）の経口ワクチンを提示する。これは保存も可能であり、使用に際して臨床現場に送達することも可能である。低分子又は抗体を用いた抗血管新生治療は、既にその有効性が示されているが、本発明に係るアプローチは、患者自身の免疫系を腫瘍新生脈管構造に対して賦活化するという点で、これらと顕著に異なるものである。更にそれ自体、長期薬効を提供するＴ細胞記憶作用を生成する可能性をも有する。大腸癌及び卵巣癌にベバシズマブを用いた研究によれば、有益な治療効果を長期間維持するためには、継続的な抗血管新生作用が必要である（Allegra et al., J Clin Oncol 2011, 29:11-16; Burger et al., N Engl J Med 2011, 365:2473-2483; Perren et al., N Engl J Med 2011, 365:2484-2496）。
【００１３】
本発明者等の知る限り、これは経口癌ワクチンの最初の臨床試験である。更に、このワクチンは複数の腫瘍タイプに対して有効である可能性もある。
【００１４】
この最初の臨床試験により、本発明に係るワクチン（ＶＸＭ０１）は、患者内での腫瘍増殖に顕著な影響を及ぼす免疫応答の誘発に、大変有効であることが示された。注目すべき点として、驚くべきことにこの免疫応答は、ごく低用量のＶＸＭ０１の経口投与によって誘発され得る。このワクチンは、１×１０５又は１×１０６〜１×１０７コロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）から始まる用量でも既に有効である。最初の結果は、ＶＸＭ０１によるワクチン化によって、既存の腫瘍血管系の破壊が生じ得ると共に、増殖内皮細胞に対する免疫記憶の発生が補助され得ることを示している。
【００１５】
このワクチンは単剤療法でも、また、標準的な化学療法剤、放射線療法、及び／又は、生物学的癌治療との組み合わせ治療にも有効である。
【００１６】
これまでの臨床試験では、ステージIVの患者に対する治療は、化学療法剤ゲムシタビン及びＶＸＭ０１に先行して、及び／又は、これらと同時に行われた。しかし、患者が化学療法に対する耐性を示している場合（化学療法抵抗性患者）には、ＶＸＭ０１での処置も有効である。
【００１７】
ある側面によれば、本発明は、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする発現カセットを含む組換ＤＮＡ分子を少なくとも１コピー含む、ワクチンとして使用されるチフス菌（Salmonella typhi）の弱毒化変異株に関する。
【００１８】
特定の実施形態によれば、ＶＥＧＦ受容体タンパク質は、ヒトＶＥＧＦＲ−２、及び、これと少なくとも約８０％の相同性を共有するそのホモログからなる群より選択される。
【００１９】
特定の実施形態によれば、ＶＥＧＦ受容体タンパク質は、ヒトＶＥＧＦＲ−２配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。
【００２０】
別の観点によれば、本発明は、本発明のチフス菌（Salmonella typhi）の弱毒化変異株を含むＤＮＡワクチンに関する。
【００２１】
特定の実施形態によれば、チフス菌（Salmonella typhi）の弱毒化変異株は、Ｔｙ２１ａである。
【００２２】
特定の実施形態によれば、発現カセットは真核性発現カセットである。
【００２３】
特定の実施形態によれば、本発明のＤＮＡワクチンは、癌免疫療法に用いられる。
【００２４】
特定の実施形態によれば、ＤＮＡワクチンは、配列番号１のＶＥＧＦＲ−２タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドによって形質転換された弱毒化チフス菌（Salmonella typhi）株Ｔｙ２１ａを含む。
【００２５】
特定の実施形態によれば、ＤＮＡワクチンは、抗血管新生癌免疫療法に用いられる。
【００２６】
特定の実施形態によれば、プラスミドは、図２に示す７５８０ｂｐのｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１であり、配列番号３に示す配列を有すると共に、ＤＮＡワクチンは、ＶＸＭ０１で示される。
【００２７】
特定の実施形態によれば、前記癌は膵臓癌である。
【００２８】
特定の実施形態によれば、前記膵臓癌は、ステージIV又は局所進行性の膵臓癌である。
【００２９】
特定の実施形態によれば、癌は転移を含む。
【００３０】
特定の実施形態によれば、前記処置に続いて、化学療法及び／又は放射線療法が実施される。
【００３１】
特定の実施形態によれば、化学療法剤はゲムシタビンである。
【００３２】
特定の実施形態によれば、ワクチンによる免疫療法処置は、化学療法の治療周期中に実施される。
【００３３】
特定の実施形態によれば、ワクチンは経口投与される。
【００３４】
特定の実施形態によれば、前記ワクチンの単回用量量は１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、又は１×１０１１コロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）である。
【００３５】
特定の実施形態によれば、前記ワクチンの単回用量量は、１×１０９ＣＦＵ未満である。特定の実施形態によれば、前記ワクチンの単回用量量は、１×１０８〜１×１０９ＣＦＵである。
【００３６】
特定の実施形態によれば、前記ワクチンの単回用量量は、１×１０８ＣＦＵ未満である。特定の実施形態によれば、前記ワクチンの単回用量量は、１×１０５〜１×１０８ＣＦＵであり、より具体的には、前記ワクチンの単回用量量は、１×１０６〜１×１０７ＣＦＵである。
【００３７】
特定の実施形態によれば、単回用量量は、約１０５〜約１０１１、具体的には約１０６〜約１０１０、より具体的には約１０６〜約１０９、より具体的には約１０６〜約１０８、最も具体的には約１０６〜約１０７コロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）を含む。
【００３８】
別の観点によれば、本発明は、配列番号１のＶＥＧＦＲ−２タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された弱毒化チフス菌（Salmonella typhi）株Ｔｙ２１ａを含むＤＮＡワクチンＶＸＭ０１であって、プラスミドが７５８０ｂｐのプラスミドＤＮＡであり、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＶＥＧＦＲ−２のｃＤＮＡ、カナマイシン耐性遺伝子、及びｐＭＢ１ ｏｒｉを含むと共に、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１として示される、ＤＮＡワクチンＶＸＭ０１に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１内にクローン化されたＶＥＧＦＲ−２ ｃＤＮＡのアミノ酸配列
【図１−２】同上（続き）
【図２】ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１のプラスミドマップ
【図３】ワクチンＶＸＭ０１の用量漸増デザイン
【図４】試験スキーム全体
【図５】ＶＸＭ０１に特異的なＴ細胞応答
【図６】腫瘍灌流に対するＶＸＭ０１の効果
【図７】ＶＥＧＦ Ａ血清レベルに対するＶＸＭ０１の効果
【図８】ＩＶ型コラーゲン血清レベルに対するＶＸＭ０１の効果
【図９】血圧に対するＶＸＭ０１の効果
【図１０】ＶＸＭ０１由来抗担体免疫
【図１１】ＶＸＭ０１排出の分析カスケード
【図１２】ＶＸＭ０１排出
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、以下の発明の詳細な説明及びそこに含まれる実施例を参照することで、より容易に理解することができる。
【００４１】
ある側面によれば、本発明は、ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコード化する発現カセットを含む組換ＤＮＡ分子を少なくとも１コピー含むチフス菌の弱毒化変異株に関する。
【００４２】
本発明によると、チフス菌の弱毒化変異株は、標的細胞内への前記組換ＤＮＡ分子の送達のためのＶＥＧＦ受容体タンパク質をコード化する発現カセットを含む組換ＤＮＡ分子の細菌担体として機能する。
【００４３】
本発明との関連において、「弱毒化」という用語は、親菌株と比較して低い病原力の菌株を指し、弱毒突然変異を担持していない。弱毒化菌株は、好ましくはそれらの病原力を失っているが、保護免疫を誘発するそれらの能力は保持している。弱毒化は、病原力遺伝子、調節遺伝子、及び代謝遺伝子を含めた様々な遺伝子の欠失によって達成される。弱毒化細菌は、天然に見い出されてもよいし、それらは、例えば新しい培地又は細胞培養への適応によって、研究室で人工的に生み出されてもよいし、それらは、組換ＤＮＡ技術で生み出されてもよい。
【００４４】
本発明との関連において、「突然変異株」という用語は、そのゲノム内に突然変異を担持している菌株を指す。これに関連して、「突然変異」という用語は、点突然変異、挿入、欠失、転座、及び逆位を含めた核酸配列の変化を指す。
【００４５】
本発明との関連において「含む」（comprises）又は「含んでいる」（comprising）という用語は、「含むが、これだけに限定されるものではない」という意味を有する。本用語は非限定的であり、列記される全ての特徴、要素、整数値、工程又は成分が存在する旨を明示するが、他の１又は２以上の特徴、要素、整数値、工程又は成分、又はそれらの群の存在又は付加を排除するものではないことを意図する。即ち、「含んでいる」（comprising）という用語は、より限定的な用語である「からなる」（consisting of）及び「から実質的になる」（essentially consisting of）を包含する。ある態様によれば、本願を通じ、特に特許請求の範囲の中では、「含んでいる」（comprising）という用語は、「からなる」（consisting of）という用語に置き換えることもできる。
【００４６】
本発明との関連において、「組換ＤＮＡ分子」（recombinant DNA molecule）という用語は、遺伝子操作されたＤＮＡ構築物を指し、好ましくは異なった起源のＤＮＡ断片で構成されたＤＮＡ構築物を指す。組換ＤＮＡ分子は、線状の核酸であってもよいが、好ましくは発現ベクタープラスミド内にＶＥＧＦ受容体タンパク質をコード化するオープンリーディングフレームを導入することによって作製された環状遺伝子組換ＤＮＡプラスミドであってもよい。
【００４７】
本発明との関連において、「発現カセット」（expression cassette）という用語は、その発現を制御する調節配列の調節下にある少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体タンパク質を含む核酸ユニットを指す。サルモネラ（Salmonella）の弱毒化変異株内に含まれている発現カセットは、標的細胞内においてＶＥＧＦ受容体タンパク質をコード化する、そこに含まれているオープンリーディングフレームの転写を媒介することが好ましい。発現カセットは、概してプロモーター、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、及び転写終結シグナルを含む。
【００４８】
ＶＥＧＦ受容体タンパク質は、リガンドである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が結合し得る内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼであって、リガンドがそれらの二量化を引き起こし、そしてリン酸基転移によって活性化されるようになる。ＶＥＧＦファミリーの増殖因子（Ｋｄ７５−７６０ｐＭ）には６つのファミリー、ＶＥＧＦ−Ａ〜Ｅ（ＶＥＧＦとしても知られている）及びＰＬＧＦ（胎盤増殖因子、ＰＧＦ又はＰＩＧＦ−２としても知られている）が含まれる。ＶＥＧＦ増殖因子は、血管系の複数の要素、具体的には血管及びリンパ管の増殖と分化を調整している。ＶＥＧＦＲには３つの主なサブタイプ、ＶＥＧＦＲ−１（又はＦＬＴ１）、ＶＥＧＦＲ−２（又はＫＤＲ、ＦＬＫ１）及びＶＥＧＦＲ−３（又はＦＬＴ４）が存在する。膜結合型ＶＥＧＦ受容体は、７つの免疫グロブリン様領域からなる細胞外部分、１つの膜貫通領域、及び分割チロシン−キナーゼドメインを含む細胞内部分を有する．ＶＥＧＦＲ転写産物は、可溶性ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコード化する代替スプライス変異体を生じさせる。
【００４９】
キナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ）としても知られているＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦに対する既知の細胞応答のほとんど全てを媒介しているように見える。例えば、血管新生におけるＶＥＧＦの役割は、ＶＥＧＦＲ−２とのこのタンパク質の相互作用によって媒介されるているように見える。ＶＥＧＦＲ−２は、１３５６アミノ酸の長さがある、２００〜２３０ｋＤａの分子量を有する、ＶＥＧＦ、並びにＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄの高親和性レセプターである。ＶＥＧＦＲ−２は、チロシンキナーゼ受容体に関する内皮ｃＤＮＡのスクリーニングによってヒトで同定され、それ以前に発見されていたマウス胎児肝臓キナーゼ１（Ｆｌｋ−１）と８５％の配列同一性を有している。ＶＥＧＦＲ−２は通常、内皮及び造血前駆細胞、並びに内皮細胞、新生造血幹細胞、及び臍帯間質で発現される。しかし、静止期の成人血管系において、ＶＥＧＦＲ−２のｍＲＮＡは下方調整されているように見える。
【００５０】
ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインは、１８個の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を含んでいる。ＶＥＧＦＲ−２は最初、１５０ｋＤａのタンパク質として合成され、すぐに２００ｋＤａの中間体にグリコシル化され、次に、細胞表面に発現される成熟２３０ｋＤａタンパク質へとゆっくりとした速度で更にグリコシル化される。
【００５１】
ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミド内にクローン化されたヒトＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列をコード化するｃＤＮＡ配列を、図１に示す。
【００５２】
具体的な態様によれば、本発明のチフス菌の弱毒化変異株は、薬剤として使用される。
【００５３】
具体的な態様によれば、本発明のチフス菌の弱毒化変異株は、ワクチンとして使用される。
【００５４】
本発明との関連において「ワクチン」（vaccine）という用語は、投与によって対象に免疫応答を誘発することができる作用物質を指す。ワクチンは、好ましくは疾患を予防するか、改善するか、又は処置することができる。本発明によるワクチンには、チフス菌、好ましくはＳ．チフス（S. typhi）Ｔｙ２１ａの弱毒化変異株が含まれる。本発明によるワクチンには更に、好ましくはヒトＶＥＧＦＲ−２又はそれと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質から選択されたＶＥＧＦ受容体タンパク質をコード化する発現カセット、好ましくは真核性発現カセットを含む組換ＤＮＡ分子が少なくとも１コピー含まれる。
【００５５】
ＶＥＧＦ受容体タンパク質をコード化する組換ＤＮＡ分子を含む本発明による生菌の弱毒化サルモネラ突然変異株は、この組換ＤＮＡ分子の経口送達のためのビヒクルとして使用できる。ＶＥＧＦ受容体タンパク質等の異型抗原をコード化するＤＮＡ分子を含むそういった送達ベクターは、ＤＮＡワクチンと呼ばれる。
【００５６】
遺伝的免疫化は、従来のワクチン接種を超える有利性を有するであろう。標的ＤＮＡはかなりの長期間に渡って検出され、これにより抗原のデポー剤として機能し得る。ＧｐＣアイランドのようないくつかのプラスミド内の配列モチーフは、免疫賦活性であり、そして、ＬＰＳや他の細菌成分による免疫賦活化によって促進されるアジュバントとして機能し得る。生菌ベクターは、マイクロカプセル化等の他の投与形態を超える利点を構成し得る、リポ多糖（ＬＰＳ）等のそれら自身の免疫調節因子を現場で生じさせる。そのうえ、サルモネラ等の多くの細菌が、パイアー斑のＭ細胞を介して腸管内腔から出て、最終的にリンパ節と脾臓に移行し、これにより免疫系の誘導部位へのワクチンのターゲッティングが可能なので、天然の侵入経路の使用が有益であると判明した。
【００５７】
更に、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）の弱毒化誘導体は、異型抗原の送達のためのビヒクルとして哺乳類の免疫系を誘発する。なぜなら、Ｓ．エンテリカ（S. enterica）株が潜在的に、非経口投与と比較して簡単且つ安全である利点を有する、免疫化の粘膜経路を介して、すなわち、経口的又は経鼻的に送達され得からである。更に、サルモネラ株は、全身及び粘膜部分の両方のレベルで強い液性及び細胞性免疫反応を誘発する。
【００５８】
具体的な態様によれば、チフス菌の弱毒化変異株は、チフス菌Ｔｙ２１ａである。ワクチン株Ｔｙ２１ａは、これまで優れた安全性プロフィールを有することが実証されてきた。Ｍ細胞を介して腸管内腔から出ると、この細菌はマクロファージや樹状細胞等の食細胞によって溶かされる。これらの細胞は、病原菌によって活性化され、分化を開始し、そして、恐らくリンパ節及び脾臓に移行する。弱毒化突然変異のため、Ｓ．チフスＴｙ２１ａ株の細菌は、これらの食細胞内に留まれないが、この時点で死滅する。組換ＤＮＡ分子が放出され、それに続いて、特定の輸送システムを介すか、又はエンドソーム漏出によって食作用性免疫細胞のサイトゾル内に移動する。最終的に、組換ＤＮＡ分子は核に入り、そこでそれらは転写され、そして、食細胞のサイトゾルにおけるＶＥＧＦ受容体発現に至る。ＶＥＧＦＲ受容体タンパク質に対抗する特定の細胞毒性Ｔ細胞が、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって誘発される。
【００５９】
Ｓ．チフスＴｙ２１ａが全身の血流に入ることができることを示唆するデータはこれまで存在していない。そのため、弱毒化チフス菌Ｔｙ２１ａ生ワクチン株が、優れた安全性プロフィールを呈しながら、免疫系の特異的なターゲッティングを可能にする。
【００６０】
具体的な態様によれば、ＶＥＧＦ受容体タンパク質は、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びヒトＶＥＧＦＲ−２と少なくとも８０％の相同性を有するホモログからなる群より選択される。
【００６１】
これに関連して「約」（about）及び「およそ」（approximately）という用語は、所与の値又は範囲の８０％〜１２０％以内、或いは９０％〜１１０％以内、特に９５％〜１０５％以内を意味する。
【００６２】
本発明との関連において「ヒトＶＥＧＦＲ−２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質」（protein that has at least about 80% sequence identity with human VEGFR-2）という記載は、アミノ酸配列及び／又はヒトＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列をコード化する核酸配列が異なっているタンパク質を指す。前記タンパク質は、自然起源のもの、例えば、異なった種のＶＥＧＦＲ−２のホモログであっても、又は改変タンパク質、例えば、遺伝子操作されたＶＥＧＦＲ−２誘導体であってもよい。コドンの用法は種間で異なることが知られている。よって、標的細胞内で異種タンパク質を発現する場合、標的細胞のコドン利用に核酸配列を適合させることが必要であるか、又は少なくとも有用である。所与のタンパク質の誘導体を定義及び構築する方法は、すべての当業者にとって周知である。
【００６３】
ヒトＶＥＧＦＲ−２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質は、１又は２以上のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を含めた１又は２以上の突然変異を含んでいてもよい。本発明に関する教示によると、前記欠失、付加及び／又は置換されたアミノ酸は、連続したアミノ酸であっても、ヒトＶＥＧＦＲ−２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列の全長にわたって点在していてもよい。本発明に関する教示によると、ヒトＶＥＧＦＲ−２と少なくとも約８０％の配列同一性を有している限り、多くのアミノ酸が付加、欠失及び／又は置換されてもよい。具体的な態様によれば、ヒトＶＥＧＦＲ−２との配列同一性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は最も具体的には少なくとも約９５％である。親のタンパク質、及び親の配列に対する付加、欠失及び／又は置換を有するその誘導体との比較を含めた配列同一性の決定するための方法及びアルゴリズムは、当業者に周知である。ＤＮＡレベルでは、ヒトＶＥＧＦＲ−２と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質をコード化する核酸配列は、遺伝コードの縮重により、より重度に異なっていてもよい。
【００６４】
具体的な態様によれば、ＶＥＧＦ受容体タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＶＥＧＦＲ−２である。
【００６５】
もう一つの側面によれば、本発明は、本発明のチフス菌の弱毒化変異株を含むＤＮＡワクチンに関する。
【００６６】
具体的な態様によれば、チフス菌の弱毒化変異株はチフス菌Ｔｙ２１ａである。弱毒化Ｓ．チフスＴｙ２１ａ株は、Ｖｉｖｏｔｉｆ(登録商標)としても知られているＴｙｐｈｏｒａｌ Ｌ(登録商標)の活性成分である（Berna Biotech Ltd., a Crucell Company, Switzerlandによって製造されている）。現在、それは腸チフスに対して唯一認可されている経口生ワクチンである。このワクチンは、大規模に試験され、患者の毒性に関して安全であることが判明していて、並びに第三者に譲渡されている（Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295）。このワクチンは、４０を超える国々で認可されている。Ｔｙｐｈｏｒａｌ Ｌ(登録商標)の販売認可番号はＰＬ１５７４７／０００１である（１９９６年１２月１６日付）。ワクチンの１回の用量は、少なくとも２×１０9生菌Ｓ．チフスＴｙ２１ａコロニー形成単位、そして、少なくとも５×１０9非生菌Ｓ．チフスＴｙ２１ａ細胞を含んでいる。
【００６７】
チフス菌Ｔｙ２１ａ菌株の生化学的性質の１つは、ガラクトースを代謝できないことである。弱毒化変異株もまた硫酸塩を亜硫酸塩に還元することができず、この点で野性型サルモネラＴｙ２株と区別される。その血清学的特徴に関して、チフス菌Ｔｙ２１ａ株は、細菌の外膜の多糖類であるＯ９抗原を含み、且つ、同じくチフス菌チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の特徴的成分であるＯ５抗原を欠いている。この血清学的特徴は、バッチ放出のための同定テストのパネルにおけるそれぞれの試験を含むための理論的根拠を支持している。
【００６８】
具体的な態様によれば、発現カセットは、真核性発現カセットである。本発明との関連において用語「真核性発現カセット」（eukaryotic expression cassette）とは、真核細胞内でオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを指す。適当な免疫応答を誘発するのに必要な異型抗原の量が細菌にとって毒性であってもよいので、細胞死、異型抗原の過度の弱毒化又は発現消失をもたらすことが示された。細菌ベクターでは発現されないが、標的細胞だけで発現される真核性発現カセットを使用すると、この毒性の課題が克服でき、且つ、発現されたタンパク質は真核生物のグリコシル化パターンを呈し得る。
【００６９】
真核性発現カセットは、真核細胞でオープンリーディングフレームの発現を制御できる調節配列、好ましくはプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む。本発明のサルモネラ弱毒化変異株に含まれる組換ＤＮＡ分子に含まれるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、好ましくは免疫される対象の細胞内で機能するように選ばれる。ヒトのためのＤＮＡワクチンの製造に好適なプロモーターの例としては、これだけに限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、例えば強力前初期ＣＭＶプロモーター等、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）由来のプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター、例えばＨＩＦ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター等、モロニーウイルス由来のプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来のプロモーター、及びニワトリ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーター、並びにヒト遺伝子、例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、及びヒトメタロチオネイン等由来のプロモーターが挙げられる。具体的な態様によれば、真核性発現カセットはＣＭＶプロモーターを含む。本発明との関連において「ＣＭＶプロモーター」（CMV promoter）という用語は、強力前初期サイトメガロウイルスプロモータを指す。
【００７０】
具体的にはヒトのためのＤＮＡワクチンの製造のための、好適なポリアデニル化シグナルに関する例としては、これだけに限定されるものではないが、ウシ増殖ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられる。具体的な態様によれば、本発明のサルモネラ弱毒化変異株によって含まれる組換ＤＮＡ分子に含まれている真核性発現カセットには、ＢＧＨポリアデニル化部位が含まれる。
【００７１】
プロモーターやポリアデニル化シグナルのようなＶＥＧＦ受容体タンパク質の発現に必要な調節エレメントに加えて、他の要素もまた組換ＤＮＡ分子に含まれている。そういった追加要素としては、エンハンサーが挙げられる。例えば、エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンのエンハンサー、及びウイルス性エンハンサー、例えばＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ等である。
【００７２】
調節配列とコドンは、通常種に依存するので、タンパク質酸性を最大するために、調節配列とコドンが免疫される種で有効であるように選択されることが好ましい。当業者は、所定の対象種で機能的な組換ＤＮＡ分子を作製できる。
【００７３】
具体的な態様によれば、本発明のＤＮＡワクチンは、癌免疫療法で使用するためのものである。
【００７４】
具体的な態様によれば、ＤＮＡワクチンには、配列番号１のＶＥＧＦＲ−２タンパク質をコード化するＤＮＡを含むプラスミドによって形質転換された弱毒化チフス株Ｔｙ２１ａが含まれる。
【００７５】
具体的な態様によれば、ＤＮＡワクチンは、抗血管新生癌免疫療法で使用される。
【００７６】
具体的な態様によれば、組換ＤＮＡ分子には、ＣＭＶプロモーターの調節下にある、カナマイシン抗生物質抵抗性遺伝子、ｐＭＢ１ ｏｒｉ、及びヒトＶＥＧＦＲ−２又はヒトＶＥＧＦＲ−２と少なくとも８０％の配列相同性を有するタンパク質をコード化する真核性発現カセットが含まれる。具体的な態様によれば、ヒトＶＥＧＦＲ−２は、配列番号２に記載の核酸配列を有する。
【００７７】
真核性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターは、宿主細胞におけるＶＥＧＦＲ−２タンパク質の効果的な翻訳を確実にし、そして、原核性複製開始点（ｏｒｉ）は細菌宿主内で増殖を媒介する。
【００７８】
具体的な態様によれば、組換ＤＮＡ分子は、市販のｐＶＡＸ１ＴＭ発現プラスミド（Invitrogen, San Diego, California）に由来する。この発現ベクターは、
高コピー数のｐＵＣ複製開始点を、ｐＢＲ３２２の低コピー数のｐＭＢ１複製開始点で置換することによって改変された。低コピー数の変更は、代謝負担を低減し、構築物をより安定化させるようになる。プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１構築物の詳細は、図２に示されている。作製された発現ベクター骨格は、指定されたｐＶＡＸ１０であった。この発現ベクター骨格内への配列番号２に記載のヒトＶＥＧＦＲ−２の核酸配列を挿入することで、発現プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１を得た。
【００７９】
発現プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１は、図２に図式的に示されている。具体的な態様によれば、プラスミドは、図２で示されるように７５８０ｂｐのｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１であって、配列番号３に記載の配列を有し、そして、ＤＮＡワクチンは指定されたＶＸＭ０１である。ＶＸＭ０１は、ヒト血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）の真核性発現カセットをコード化するプラスミドＤＮＡ、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１を少なくとも１コピー担持しているチフス菌（Salmonella enterica serovar typhi）Ｔｙ２１ａの弱毒化株からなる経口ワクチンである。
【００８０】
具体的な態様によれば、癌は膵臓癌である。
【００８１】
具体的な態様によれば、前記膵臓癌は、ステージＩＶ又は局所進行性の膵臓癌である。
【００８２】
具体的な態様によれば、癌には転移癌が含まれる。
【００８３】
具体的な態様によれば、癌免疫療法は、腫瘍抗原及び／又は腫瘍間質抗原をコード化する発現カセットを含む組換ＤＮＡ分子の少なくとも１コピー含む１又は２以上の更なるサルモネラ弱毒化変異株の投与を更に含む。具体的な態様によれば、前記の１又は２以上の更なるサルモネラ突然変異株は、真核性発現カセットを含むチフス菌Ｔｙ２１ａである。具体的な態様によれば、前記の１又は２以上の更なるサルモネラ株には、ヒトＷＴ１をコード化するサルモネラ弱毒化変異株が含まれる。
【００８４】
本発明のサルモネラ弱毒化変異株を、第二の腫瘍間質抗原又は腫瘍抗原をコード化するＤＮＡ分子を含む第二の弱毒化変異株と組み合わせることにより、相乗的な抗癌効果を有し得る。特に、腫瘍と腫瘍間質とを同時に標的化することで、腫瘍回避のリスクを最小化することができる。ＷＴ１を過剰発現するヒト細胞及び腫瘍血管系を同時に攻撃できるので、ＶＥＧＦＲ−２系免疫療法とＷＴ１系癌免疫療法との組み合わせは特に効果的であると考えられる。
【００８５】
具体的な態様によれば、サルモネラ弱毒化変異株は、前記の１又は２以上の更なるサルモネラ弱毒化変異株と同時投与される。
【００８６】
本発明との関連において「同時投与」（co-administration）又は「同時投与する」（co-administer）という用語は、連続した３日以内、より具体的には連続した２日以内、より具体的にはその日のうちに、より具体的には１２時間以内に、２つの別々のサルモネラ弱毒化突然変異株を投与することを意味する。最も具体的には、本発明との関連において「同時投与」（co-administration）という用語は、２つの別々のサルモネラ弱毒化突然変異株の同時投与を指す。
【００８７】
具体的な態様によれば、処置は、化学療法及び／又は放射線療法及び／又は生物学的癌療法を伴う。癌の療法に関しては、癌幹細胞の完全な根絶は不可欠であってもよい。最大有効性に関しては、異なった処置アプローチの組み合わせが有益になり得る。
【００８８】
本発明との関連において「生物学的癌療法」（biological cancer therapy）又は「癌免疫療法」（cancer immunotherapy）という用語は、悪性腫瘍細胞又は腫瘍間質を攻撃するために患者の免疫系を刺激することを指す。生物学的癌療法アプローチには、腫瘍抗原の送達、薬物としての処置抗体の送達、免疫賦活サイトカインの投与、及び免疫細胞の投与が含まれる。
【００８９】
本発明のサルモネラ弱毒化変異株と組み合わせて使用してもよい化学療法剤としては、例えば：アミホスチン（ethyol）、カバジタキセル、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロールエサミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（adriamycin）、ドキソルビシン脂肪（doxil）、フォリン酸、ゲムシタビン（gemzar）、ダウノルビシン、ダウノルビシン脂肪（daunoxome）、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（taxol）、ドセタキセル（taxotere）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクシウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル及びその組み合わせが挙げられる。
【００９０】
本発明においてＶＸＭ０１と組み合わせる最も好ましい化学療法剤は、カバジタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル（taxol）、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、フォリン酸、５−フルオロウラシル及びブレオマイシンであり、特にゲムシタビンである。
【００９１】
具体的な態様によれば、化学療法剤はゲムシタビンである。
【００９２】
可能性のある副作用の発生によっては、抗生物質又は抗炎症薬での処置を含めることも好ましい。
【００９３】
ヒスタミン、ロイコトリエン又はサイトカインによって媒介される過敏反応に類似する有害事象が生じる場合には、発熱、過敏症、血圧不安定、気管支痙攣、及び呼吸困難のための処置の選択肢が利用可能である。望ましくないＴ細胞由来自動攻撃性における処置の選択肢は、幹細胞移植後に適用される急性及び慢性の移植片対宿主疾患に対する標準的療法スキームに由来する。シクロスポリン及びグルココルチコイドが、処置の選択肢として提案される。
【００９４】
稀な全身性チフス菌Ｔｙ２１ａ型感染の場合には、例えばシプロフロキサシン又はオフロキサシンを含めたフルオロキノロンを用いた、適切な抗生物質療法が推奨される。胃腸管の細菌感染は、リファキシミン等のそれぞれの作用物質を用いて処理すべきである。
【００９５】
具体的な態様によれば、サルモネラ弱毒化変異株は、化学療法若しくは放射線療法治療周期中、又は生物学的癌療法中に投与される。具体的な態様によれば、ワクチンによる免疫療法処置は、化学療法の治療周期中に実施される。
【００９６】
具体的な態様によれば、サルモネラ弱毒化変異株は、化学療法若しくは放射線療法処置周期前、又は生物学的癌療法前に投与される。このアプローチは、化学療法又は放射線療法が、賦活された免疫条件下で実施され得るという利点を有し得る。
【００９７】
具体的な態様によれば、サルモネラ弱毒化変異株は、化学療法若しくは放射線療法処置周期後、又は生物学的癌療法後に投与される。
【００９８】
具体的な態様によれば、ワクチンは経口投与される。経口投与は、非経口投与に比べて簡単で、より安全で、且つ、より快適である。非経口、皮下又は皮内投与の有害影響は、本発明のＤＮＡワクチンの経口投与によって克服できる。しかしながら、本発明のサルモネラ弱毒化変異株はまた、いずれかの他の好適な経路によっても投与され得る。好ましくは、処置的有効量を対象に投与し、そして、この用量は、特殊適用、悪性腫瘍のタイプ、対象の体重、年齢、性別及び容態、投与様式、並びに製剤等に依存している。投与は、必要に応じて、単回であっても、複数回であってもよい。
【００９９】
本発明のサルモネラ弱毒化変異株は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物の形態又はその他の好適な形態で提供され得る。それは、医薬的に許容し得る担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と組み合わせて提供され得る。ｐＨ値を調整するための作用物質、バッファー、毒性を調整するための作用物質等が含まれていてもよい。本発明との関連において、「医薬的に許容され得る」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与した際に、生理学的に許容でき、且つ、概して有害反応を生じさせない医薬組成物の分子的実体及び他の構成要素を指す。「医薬的に許容され得る」という用語はまた、哺乳動物、具体的にはヒトにおける使用について連邦政府又は州政府の監督官庁によって認可されていること、或いは米国薬局方又は他の一般に認識された薬局方に挙げられていることも意味し得る。
【０１００】
本発明のワクチンは、驚いたことに比較的低い用量で有効である。具体的な態様によれば、ワクチンの単回用量は、約１×１０５、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、又は約１×１０１１コロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）である。この天然な細菌性生ワクチンの低用量の投与は、排出のリスクを最小限にし、それにより第三者への伝播のリスクを最小限にする。
【０１０１】
これに関連して「約」（about）又は「およそ」（approximately）という用語は、所与の値又は範囲の３倍の範囲内、或いは２倍の範囲内、特に１．５倍の範囲内を意味する。
【０１０２】
具体的な態様によれば、ワクチンの単回用量は、１×１０9ＣＦＵより少ない。具体的な態様によれば、ワクチンの単回用量は、１×１０8〜１×１０9ＣＦＵである。
【０１０３】
具体的な態様によれば、ワクチンの単回用量は、１×１０8ＣＦＵより少ない。具体的な態様によれば、ワクチンの単回用量は、１×１０5〜１×１０8ＣＦＵであって、具体的にはワクチンの単回用量は、１×１０6〜１×１０7ＣＦＵである。
【０１０４】
具体的な態様によれば、単回用量は、約１０5〜約１０11、具体的には約１０6〜約１０10、より具体的には約１０6〜約１０9、より具体的には約１０6〜約１０8、最も具体的には約１０6〜約１０7コロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）を含む。
【０１０５】
具体的な態様によれば、サルモネラ弱毒化変異株は、個別化された癌免疫療法に使用される。個別化された癌免疫療法は、患者の腫瘍間質抗原発現パターン及び／又は腫瘍抗原発現パターンを評価する工程を含んでもよい。また、個別化された癌免疫療法は、腫瘍間質抗原又は腫瘍抗原に対する免疫前応答、好ましくはＶＥＧＦＲ−２に対する免疫前応答を評価する工程を含んでもよい。これに伴い、ＶＥＧＦＲ−２に対する既存の免疫応答は、ＶＸＭ０１の陽性臨床反応、具体的には腫瘍灌流の減少と強く相関することが示されている。
【０１０６】
ＶＸＭ０１はそれ自体単独で、或いは真核性発現系を含む他のチフス菌Ｔｙ２１ａ系癌ワクチンと組み合わせて、様々な癌タイプの処置に使用することができる。具体的な態様によれば、ＶＸＭ０１を、個別化された患者特異的癌処置に使用してもよい。斯かる目的の場合、第１工程として、患者の間質及び／又は腫瘍抗原発現パターンを、例えば患者の固有の間質及び／又は腫瘍抗原パターンを標的化する随伴診断によって評価してもよい。或いは、間質及び／又は腫瘍抗原に対する既存の免疫応答を評価してもよい。患者の間質及び／又は腫瘍抗原発現パターンに応じて、ＶＭＸ０１を単独で、或いは真核性発現系を含む追加的な１又は２以上の好適なチフス菌Ｔｙ２１ａ系癌ワクチンとの組み合わせで投与することができる。しかし、ＶＸＭ０１と追加的な１又は２以上のチフス菌Ｔｙ２１ａ系癌ワクチンとの組み合わせを、固定の併用療法として投与してもよい。２以上のチフス菌Ｔｙ２１ａ系癌ワクチンを組み合わせたこれらのカクテル療法は、別々の既製品から構成することができる。固定併用剤又は個別化併用剤は、抗血管形成系療法としてＶＸＭ０１を含んでもよい。
【０１０７】
別の側面によれば、本発明は、配列番号１に記載のＶＥＧＦＲ−２タンパク質がコード化されたＤＮＡを含むプラスミドによって形質転換された弱毒化チフス株Ｔｙ２１ａを含むＤＮＡワクチンＶＸＭ０１に関する。前記プラスミドは、７５８０ｂｐのプラスミドＤＮＡであって、ＣＭＶプロモーターの調節下にあるＶＥＧＦＲ−２のｃＤＮＡ、カナマイシン耐性遺伝子、及びｐＭＢ１ ｏｒｉを含み、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１と表される。
【０１０８】
表の簡単な説明
表１：患者の選択基準
表２：ＶＭＸ０１に特異的なＴ細胞応答
【実施例】
【０１０９】
実施例１  チフス菌Ｔｙ２１ａ株の調製及びプラスミドの調製
研究シードロット（ＲＳＬ）調製の第１工程は、弱毒化チフス菌Ｔｙ２１ａ株の分離と、それに続くプラスミドＤＮＡ（ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１）を用いた弱毒化細菌の形質転換から成った。
【０１１０】
液体培地にチフス菌Ｔｙ２１ａ単離物を植菌し、次に、単一の細菌コロニーを単離する目的のために、液中培養物を寒天培地に平板培養した。単一コロニーを単離し、液体培地中で培養した。次に、２つの培養物、すなわち、ＶＡＸ．Ｔｙ２１−１とＶＡＸ．Ｔｙ２１−２を、グリセロールと配合し、アリコート（１ｍｌ）を得、そして、使用するまで−７５℃±５℃で保存した。２つの培養物それぞれの独自性を更に確認した。
【０１１１】
プラスミド合成の本質は、以下の工程による二重鎖の試験管内遺伝子合成に基づいた。
−７．５８ｋｂのｐＶＡＸ１０−ＶＲ２．１プラスミド配列の全体を、（ソフトウェア解析によって）〜１．５ｋｂの５つの部分に細分した。各部分を、両方の鎖のオリゴヌクレオチド間に重複領域を有する、それぞれ４０〜５０ｂｐのオリゴヌクレオチドに細分した。
−次に、試験管内合成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと共にインキュベーションすることによってリン酸化した。
−適当な条件下での重複オリゴヌクレオチドのアニーリング処理後に、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ酵素で整列したオリゴヌクレオチドを接続した。
−連結工程の完了時に、ＰＣＲを、連結プラスミド断片（〜１．５ｋｂ）の収率を高めるために、外へ向かう位置にアニーリングしたプライマーを使用して実施した。
−調製用アガロースゲル電気泳動法を実施して、ＰＣＲ産物を単離した。
−単離したＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯベクター（Invitrogen K#4575-40）にクローン化し、繁殖のためのＴＯＰ１０Ｅ．コリ（E. coli）細胞内に形質転換した。
−ＴＯＰＯプラスミドの分離後に、制限処理と配列検定をおこなった。
−単離した整列断片を、オーバラップＰＣＲを介して組み立てた。このプロセスのあとには、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミドを線状に構築することが続いた。
−ＸｈｏＩ制限消化（図２は、ただ一つの制限部位がｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミド内に存在しているのを見る）とＴ４リガーゼを介した共有結合後に、繁殖のためにＥ．コリを環状プラスミドで形質転換した。
−最終的なプラスミド配列検定後に、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１プラスミドをＳ．チフスＴｙ２１ａ株に形質転換した。
【０１１２】
これにより、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１を首尾よく合成した（参照配列への偏位がない）。このプラスミドを、、Ｓ．チフスＴｙ２１ａ株の形質転換のために更に使用された。
【０１１３】
実施例２  ＶＸＭ０１−第Ｉ相臨床試験；試験の説明
この第Ｉ相試験では、安全性、耐容性、並びにＶＸＭ０１に対する免疫学的及び臨床的応答を調べた。無作為化、プラセボ対照、二重盲検用量漸増試験には、局所進行性又はステージＩＶ膵臓癌の４５人の患者を含んでいた。患者には、標準的治療としてのゲムシタビンに加えて４つの用量のＶＸＭ０１又はプラセボを与えた。１０6ＣＦＵ〜１０10ＣＦＵのＶＸＭ０１の用量を本試験で評価した。独立したデータ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）が用量漸増決定にかかわった。主要評価項目としての安全性に加えて、ＶＸＭ０１特異的免疫反応、並びに臨床反応パラメーターを評価した。
【０１１４】
前臨床有効性評価：
動物におけるこのアプローチの有効性及び安全性を、発明者らによって複数回、正当であると確認した。発明者らによる追実験では、膵臓癌の２つの異なったモデルにおけるこのワクチンの活性が示された。
【０１１５】
ＶＸＭ０１（この試験に使用されるワクチン）は、以前にマウスで試験した抗ＶＥＧＦＲ−２ワクチンのヒト化バージョンである。それは、ヒト完全長ＶＥＧＦＲ−２をコード化しており、且つ、担体としてチフス菌チフィムリウムの代わりに認可されたチフス株Ｔｙ２１ａを使用する。ワクチンは、腸のＭ細胞を介したパイアー斑でのＶＸＭ０１の侵入、抗原提示細胞による内面化とそれに続くコード化ＤＮＡの翻訳後に、単球及び樹状細胞におけるＶＥＧＦＲ−２タンパク質発現に至ると思われた。
【０１１６】
前臨床安全性評価：
マウスにおける前臨床毒性試験には、ヒトワクチンＶＸＭ０１を用いて行われたマウスにおける単回用量毒性試験が含まれるが、それに制限されなかった。ＶＸＭ０１がヒト宿主に特異的なので、マウスにおけるヒトワクチンの試験は、プロセス関連の不純物の推定される影響、及び心血管、呼吸、又は中枢神経系障害に関連する可能性がある標徴及び症状に注目した。抗ＶＥＧＦＲ−２のＴ細胞応答に関する毒性プロフィールを調査するために、反復投与毒性試験を、マウスにおいて用量依存的Ｔ細胞反応を引き起こすＶＸＭ０１のマウスアナログ構築物を使用して実施した。発明者らの先の観察によると、処置関連死及び毒物学的に重要な臨床徴候は、これらの試験を通じて観察されることはなく、そして、これらの試験は、製薬認可基準（ＧＬＰ）に従って実施した。
【０１１７】
ここで使用したベクターであるチフス菌Ｔｙ２１ａは、ワクチンＶＸＭ０１の経口送達を可能にする生菌の弱毒化細菌担体である。それはそれ自体で大規模に試験し、そして、患者の毒性、並びに第三者への伝播に関する安全性が実証された腸チフス（Vivotif(登録商標)、Crucell, formerly Berna Biotech Ltd., Switzerland）に対する認可されたワクチンである（Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295）。ＶＸＭ０１は遺伝子移行医薬品に分類され、それぞれのガイダンス及び規則の認可が必要である。
【０１１８】
試験の説明及び目的：
実施した試験は、
手術不能又はステージＩＶ膵臓癌の患者における実験用ワクチンＶＸＭ０１の単−センター、プラセボ対照、二重盲検用量漸増試験であった。前記ワクチンを、標準的治療のゲムシタビン処置に対する追加物として与えた。
【０１１９】
目的は、安全性と耐容性、及び治験用抗ＶＥＧＦＲ−２ワクチンＶＸＭ０１に対する免疫学的及び臨床的反応を調べること、並びにＶＸＭ０１の最大許容用量（ＭＴＤ）を確認することである。ＭＴＤは、ＶＸＭ０１処置下で最大６人の患者のうちの２人未満しか用量制限毒性（ＤＬＴ）を経験しない最も高い用量水準と定義される。
【０１２０】
安全性と耐容性に関する主要評価項目は、以下のとおりであった。国際有毒事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）に準拠した消化管瘻、下痢症状、消化管穿孔、多臓器不全、過敏症、あらゆる自己免疫性疾患、サイトカイン放出症候群、腸内出血、腎不全、タンパク尿、血栓塞栓症、脳卒中、心不全、又は血管炎に関するグレード４以上又はグレード３以上の試験薬物に関連したいずれかの有害事象（ＡＥ）と規定されたＤＬＴの数。
【０１２１】
ＶＥＧＦＲ−２に対する特異的免疫反応を誘発するための実験用ワクチンの有効性を評価する第二の評価項目には、免疫陽性患者の数が含まれる。
【０１２２】
更なる第二の評価項目は臨床反応：固形腫瘍における応答評価基準による腫瘍ステージ分類（ＲＥＣＩＳＴ）、全奏功率、無進行生存率、全生存、及び腫瘍灌流の変化、であった。腫瘍灌流は、１．５テスラシステム（Magnetom Aera, Siemens, Erlangen, Germany）による動的造影磁気共鳴画像化（DCE-MRI）によって決定した。
【０１２３】
ＶＸＭ０１を、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って製造し、そして、緩衝液の状態で得た。プラセボ対照は、整理食塩液からなる。
患者の選択及び治験デザイン：
【０１２４】
試験には、局所進行且つ手術不能膵臓癌又はステージＩＶ膵臓癌を有する最大４５人の患者が組み入れられた。適任基準を表１に纏めて示す。
【表１−１】
0006325534.tif 000002
【表１−２】
0006325534.tif 000003
【表１−３】
0006325534.tif 000004
【０１２５】
合計３７１人の患者を、試験のためにスクリーニングした。除外薬物療法（１７９人）、患者の病歴にある既存の病状（１２９）及び一身上の理由（１８）により、３２６人の患者が不適格であった。４５人の患者が、登録され、無作為化され、試験プロトコールに合致して、Clinical Research Unit at the University Clinics of Heidelberg（ＫｌｉＰＳ）での１０日間の院内試験相を首尾よく完了した。その患者の層基礎疾病特性は、２つの群で有意な差異はなかったが、診断後経過時間がＶＸＭ０１群においてより長く（８カ月対６カ月）、ＶＸＭ０１群の患者は組み入れ時点でより進行した腫瘍ステージを有していた（ＣＡ１９．９＞１０００では４０％対２０％及び転移性疾患では８３％対５３％）。
【０１２６】
男性及び閉経後女性患者をこの試験に登録した。しかしながら、２つの性別の相違は調査されなかった。この治験に参加した患者の平均した生存期間は６カ月未満であった。しかしながら、プロトコール単位で規定される患者の追跡期間は最長２４カ月であった。試験処置を、標準的治療に対する追加物として第一線で与えた。それらの複数の第一次及び第二次薬力学的前臨床試験の中で、他の要素を更に考慮すると、リスク−利益解析では選択された患者集団に関して好ましい結果を有すると思われた。
【０１２７】
開始用量は、１０6コロニー形成単位（colony forming units：ＣＦＵ）のＶＸＭ０１を含む溶液又はプラセボから成っていた。このＶＸＭ０１用量は、安全上の理由で選ばれ、そして、免疫応答を誘発するための最小有効量未満であると思われた。比較のために、１つの用量のTyphoral(登録商標)（腸チフスに対する認可されたワクチン）が２×１０9〜６×１０9ＣＦＵのチフス菌Ｔｙ２１ａを含んでおり、これはＶＸＭ０１開始用量の約１０００倍に相当した。用量は、１０進数の対数的工程で漸増され、そしてそれが、細菌生ワクチンを正当化すると思われた。用量の漸増デザインを図３に示す。
【０１２８】
最初にヒトによる試験のガイドラインに従って、１つの用量群の患者をコホートで処置した。いずれの用量群においても、ＶＸＭ０１の最初の投与は、プラセボを受ける１人の患者に随伴された１人の患者にしか与えられなかった。それぞれの用量群の第二のコホートは、ＶＸＭ０１を受ける２人の患者とプラセボを受ける１人の患者から構成された。１人の先頭のヒトがいるこの交互の投与（すなわち、最初にＶＸＭ０１を受ける１人の患者だけ）は、リスクを緩和するのに役立った。
【０１２９】
患者の第三のコホート（３人がＶＸＭ０１を受け、そして１人がプラセボを受ける）は１０8、１０9、及び１０10用量群に含まれていた。このアプローチは、次善処置薬と思われたＶＸＭ０１用量への暴露を最小にした。次のより高い処置群の第三のコホートと最初の２つのコホートを、明確に規定された無作為化ストラテジーに基づいて並行して処理した。このストラテジーは、参加可能な患者の動員を可能にし、そして、低用量群と高用量群で並行して処置される患者の選択バイアスを回避した。１０6用量群と１０7用量群では、患者の第三のコホートには、１人の患者が、ＤＬＴを経験し、そして、データ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）の決定によって確認が必要とされたそれぞれの用量群のＶＸＭ０１を受けた最初の３人の患者からの患者である場合に限って含まれていた。
【０１３０】
全ての患者が、１日おきの４つの用量からなる７日間のワクチン接種コースを、全く用量を減らすことなくプロトコールに沿って、完了した。用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察されなかったので、最大耐量には到達しなかった。ＶＸＭ０１は全ての用量水準で良好な耐容性を示した。ＡＥ及びＳＡＥは、両群内で等しく分布し、そして、前記群内で用量依存的副作用の標徴は観察されなかった。
【０１３１】
経口ワクチンに対する特有の環境リスクは、環境への排出の可能性と、標的集団以外の人々へのその後のワクチン接種である。全ての試験患者が、ワクチン接種を実施した期間に加えて更に３日間、観測施設（ＫｌｉＰＳ）を出られなかった。試験患者の全ての糞便を回収し、そして焼却処分した。体液及び糞便サンプルを、ＶＸＭ０１流出について調査した。ＶＸＭ０１の糞便中排出は２人の患者で観察され、１０９用量群で１人、及び１０１０用量群で１人観察された。両患者の糞便中へのＶＸＭ０１排出は、１回目又は２回目の投与後にそれぞれ一過性で現れ、そして、抗生物質処置なしで見えなくなった。他の体液中では、排出は全く測定されなかった。
【０１３２】
衛生予防措置を、偶然の摂取から試験人員を保護するために適用した。試験人員は、この状況での試験のために特別に訓練を積んだ。
【０１３３】
患者は、彼らが治験薬の最後の投与後にワクチン排出に関して検査で陰性となった場合にだけ、病院から退院することができた。最後の投与後に排出に関して検査で陽性となった場合には、患者が退院する前に、胃腸管の抗生物質の汚染除去が行われた。結果が陰性になるまで、排出を追跡調査した。これらの計測は、正当であって、流出プロフィールが解明されるまで、環境及び試験人員のＶＸＭ０１への暴露から保護するために十分であったと思われる。
【０１３４】
図４（試験スキーム全体）に示したように、ＶＸＭ０１を、ゲムシタビン背景療法と並行して適用した。要するに、ゲムシタビンを、１、８、及び１５日目の２８日間の化学療法サイクルで与えた。ワクチンは、ゲムシタビンの最終用量の３日後に開始して、１、３、５及び７日目に４回与えた。二重盲検相の試験は、最後の患者が最後の投与を受けてから３１日後に終了した。
【０１３５】
この第Ｉ相治験（進行性又はグレードＩＶの膵臓癌患者）に関して、予後不良を有する患者集団や免疫抑制に関して比較的ゆるやかな標準的治療が選ばれた。化学療法剤であるゲムシタビンと腫瘍ワクチンとの同時投薬計画は、相乗効果を示す可能性がある。加えて、特異的なＴ細胞活性化が、この患者設定において計測され、そして、ワクチンＶＸＭ０１の有効性が実証された。活性なワクチン対背景処置に関連する組織の特有の安全性に関して更なる知識を得るために、本治験にはプラセボ対照が含まれていた。加えて、集められたプラセボ患者は、特有の免疫活性化を評価するための妥当な比較対象や臨床的有効性の他の標徴として役立った。第ＩＩ相に移行するのであれば、そのときには、観察される安全性プロフィールによっては、もっと長い平均余命を有する別の患者が構想される。そういった試験には、抗血管形成処置に対してより高い感受性を有することが示された腫瘍タイプも含まれるであろう。
【０１３６】
実施例３  ＶＸＭ０１に特異的なＴ細胞応答
ＶＸＭ０１に対する応答を、ワクチン接種前、その最中、及びその後の様々な時点でINFγ ELISpotによって検出した、ＶＸＭ０１やプラセボ処置した患者の末梢血におけるＶＥＧＦＲ２に特異的なＴ細胞の頻度を観察することによって評価した。
【０１３７】
まず、Ｔ細胞及びペプチドパルスＤＣを、抗ＩＮＦγ抗体でコートしたウェルに加えた。インキュベーション期間後に、細胞を、コート抗体に結合したＩＮＦγを残して、分泌されたＩＮＦγと共に取り除いた。次に、検出抗体を加えて、結合したＩＮＦγを検出し、そして、シグナル増幅後に、最終的な生成物を、一様に活性化された、特異的なＴ細胞を表す「カラースポット」として見ることができた。
【０１３８】
ELISpotサンプルの正値性を、サンプルごとにシグナルの増大がグレード０〜３になると規定する所定の規則に従って格付けした：
増大なし：                グレード０
明らかな増大だが＜３×：  グレード１
≧３×だが＜５×の増大：  グレード２
≧５×の増大：            グレード３
【０１３９】
試験患者のELISpot免疫応答を表２に示す：
【表２】
0006325534.tif 000005
【０１４０】
試験患者のELISpot免疫応答の結果を図５にグラフを使って示す。
【０１４１】
実施例４  腫瘍灌流に対する効果
腫瘍灌流を、動的造影磁気共鳴画像化（DCE-MRI）中の造影剤通過時間（Ｋｔｒａｎｓ）によって評価して、処置応答を特徴づけした。動的造影Ｔ１加重画像化を実施した。DCE-MRIを、処置の０日後、３８日後及び３か月後に１．５テスラシステム（Magnetom Aera, Siemens, Erlangen, Germany）で評価した。動的造影ＭＲ画像化を、ＶＩＢＥ（容量補間息止め）シークエンスを用いて実施した。その目的のために、８ｍｌのガドビストからなる用量を注射した。
【０１４２】
あらゆる検査法において、着目の領域を、腫瘍組織内に手作業で描き、それに続いてシーメンスソフトウェアパッケージ（Tissue4D）を使用してピクセルごとに分析した。ＲＯＩモデリングは、想定Ｔ１０（1000ms）及びParker AIFを用いたToftsモデルに基づいていた。腫瘍灌流の見積りのために、Ｋｔｒａｎｓを主要評価項目と見なした。
【０１４３】
腫瘍灌流における平均変化は、ＶＸＭ０１群（ｎ＝２６）において−９％であったのに対して、プラセボ群（ｎ＝１１）において＋１８％であった。腫瘍灌流の３３％超の低下を、評価可能ＶＸＭ０１処置患者の３５％で検出されたのに対して、プラセボ群の１０％で検出された。最も強い応答者は、サブグループ分析で更に分析した。最大平均効果を、ｄ３８の時点にて検出した。腫瘍灌流に対する様々な用量のＶＸＭ０１の効果を図６にグラフを使って示す。
【０１４４】
実施例５  血管新生のバイオマーカー
ＶＥＧＦＲ−２に特異的なＴ細胞媒介性を更に特徴づけるために、ＶＸＭ０１の抗血管形成活性、血管新生バイオマーカーであるＶＥＧＦ Ａの付随的変化、ヒトＩＶ型コラーゲン及び血圧を観察した。
【０１４５】
ＶＥＧＦ Ａ：
ＶＥＧＦ Ａを、市販のアッセイキット（ELISA Kit Quantikine Human VEGF A Immunoassay, R&D Systems, Cat.-No.: DVE00）を使用したＥＬＩＳＡによって、ヒト血清サンプル中で評価した。そのアッセイを添付文書に記載のとおり使用し、そして、事前におこなったバリデーションに従ってこの試験プランの一部を改変した（580.132.2786）。
【０１４６】
このアッセイは、定量的サンドイッチ酵素免疫アッセイ技術を利用している。ヒトＶＥＧＦ Ａに特異的なモノクローナル抗体をマイクロプレート上に前もってコートしておいた。標準、品質管理（商業的に得た）及びサンプルを、ウェルにピペットで計り入れ、そして、存在するあらゆるＶＥＧＦ Ａが固定化抗体に結合した。キャリブレーター、品質管理サンプル、及びサンプルを二重反復試験として分析した。結合していない物質を全て洗い流した後に、ＶＥＧＦ Ａに特異的な酵素結合ポリクローナル抗体をウェルに加えた。洗浄して結合していない抗体酵素試薬を全て取り除いたのに続いて、基質溶液をウェルに加え、最初の工程で結合したＶＥＧＦ Ａの量に比例して発色させた。発色を止め、そして、呈色の強さを４５０ｎｍにて分光光度法マイクロタイタープレートリーダを使用して評価した。各標準についてそれぞれのＶＥＧＦ Ａ濃度に対して吸光度をプロットすることによって、検量線を作成した。サンプル中のＶＥＧＦ Ａ濃度は、この検量線から直接決定した。
【０１４７】
ＶＥＧＦ−Ａ血清レベルは、ＶＸＭ０１群においてｄ３８及びｍ３の両方で２３５％上昇したのに対して、プラセボ群では１７％及び３１％上昇した（ｍ３にてｐ＝０．０５）。患者血清サンプル中のＶＥＧＦ Ａの定量化を、図７にグラフを使って示している。
【０１４８】
ＩＶ型コラーゲン：
ヒトＩＶ型コラーゲンを、市販のアッセイキット（Human Collagen IV ELISA, Serum, KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY, Cat.-No.: KT-035）を使用したＥＬＩＳＡによってヒト血清サンプル中で評価した。そのアッセイを添付文書に記載のとおり使用し、そして、事前におこなったバリデーションに従ってこの試験プランの一部を改変した（580.132.3645）。
【０１４９】
ヒトＩＶ型コラーゲンのＥＬＩＳＡは、固相ワン工程サンドイッチＥＬＩＳＡであった。サンプル中のＩＶ型コラーゲンは、固相モノクローナル抗体とモノクローナル抗体−酵素結合体に同時に結合し、各々が異なった抗原部位に向かっていた。これが、固相と酵素標識抗体との間でサンドイッチされたＩＶ型コラーゲン分子をもたらした。結合していない酵素標識抗体及びサンプルを取り除いた後に、プレートを発色基質（ＴＭＢ）と共にインキュベートした。得られた発色は、サンプル中のＩＶ型コラーゲン量に正比例していた。
【０１５０】
ＩＶ型コラーゲンの血清レベルは、ＶＸＭ０１群においてｄ３８及びｍ３にそれぞれ平均で７％及び２２％上昇したのに対して、プラセボ群で２％及び−７％変化した（ｍ３にてｐ＝０．０２）。患者血清サンプル中のＩＶ型コラーゲンの定量化を、図８にグラフを使って示す。
【０１５１】
血圧：
抗血管形成有効性の薬力学的マーカーとしての血圧（収縮期と弛緩期）及びパルスレートを、仰臥位での５分間の安静後に評価した。平均収縮期血圧の変化は、処置群において＋３．６ｍｍＨｇ及び＋３．９ｍｍＨｇであったのに対して、プラセボでは−８．８ｍＨｇ及び９．１ｍｍＨｇであった（ｄ３８にてｐ＝０．０８）。最初のワクチン接種用量後（３８日目まで）の平均血圧に対する効果を、図９にグラフを使って示す。
【０１５２】
実施例６  抗担体免疫
細菌ビヒクルに対する免疫応答を評価するために、抗チフス菌ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫グロブリンを、２種類の市販アッセイキット（チフス菌IgG ELISA, Cat. No. ST0936G及びチフス菌IgM ELISA, Cat. No. ST084M; Calbiotech. Inc., 10461 Austin Dr, Spring Valley, CA 91978, USA）を使用したＥＬＩＳＡによって検出した。これらのアッセイは定性分析であった。そのアッセイを添付文書に記載のとおり使用し、そして、事前におこなったバリデーションに従ってこの試験プランの一部を改変した（580.132.2785）。
【０１５３】
両アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ技術が用いられた。キャリブレーター、陰性対照、陽性対照、及びサンプルを、二重反復試験で分析した。希釈した患者血清（１：１０１希釈）を、精製抗原によってコートしたウェルに加えた。存在しているのであれば、ＩｇＧ又はＩｇＭ特異的抗体が抗原に結合した。結合していない物質を全て洗い流し、そして、存在するのであれば、酵素結合体を加えて、抗体抗原複合体に結合させた。余分な酵素結合体を洗い流し、そして、基質を加えた。プレートをインキュベートして、酵素によって基質を加水分解させた。発色の強さは、サンプル中のＩｇＧ又はＩｇＭ特異的抗体の量に比例していた。呈色性の強さを、４５０ｎｍにて分光光度法マイクロタイタープレートリーダを使用して評価した。カットオフを以下のとおり計算した：
キャリブレーターＯＤ×キャリブレーター係数（ＣＦ）。
【０１５４】
抗体指数のそれぞれの決定は、それぞれのサンプルのＯＤ値をカットオフ値で割ることによって決定した。
【０１５５】
抗体指数の解釈：
＜０．９  ＥＬＩＳＡではチフス菌ＩｇＧ又はＩｇＭに対する検出可能な抗体がない
０．９〜１．１  境界線上の陽性
＞１．１  ＥＬＩＳＡによってチフス菌ＩｇＧ又はＩｇＭに対する抗体が検出可能
【０１５６】
検出可能な抗チフス菌ＩｇＧ免疫グロブリンを有するる患者数を、図１０に示す。
【０１５７】
実施例７  排出
大便、体液、涙液、唾液、尿及び血液中の細菌流出を、既存のある中央サービス研究室（Huntingdon Life Sciences, Huntingdon, UK）にて、ＧＬＰに従いかつて正当であると確認されたと伝えられた正当であると確認した方法に従って、ＶＸＭ０１−０１−ＤＥ試験において観察した。体液中のＶＸＭ０１の流出及び生体分布を、平板及び濃縮培養で決定した。ＶＸＭ０１担体細菌の同定を、血清学的凝集及びＰＣＲ法で決定した。
【０１５８】
試験サンプル（血液、涙液、尿、唾液及び糞便）を、ハイデルベルグ内のサイトで採集し、そして、ワクチン接種後サンプルの即日発送がKarlsruhe, GermanyのMicroMol GmbHに向けておこなわれた。細菌ベクター流出及び生体分布分析カスケードを、ＶＸＭ０１の生きたＣＦＵ又は水平プラスミド移行を検出するように設計した。それは２つの個別分析部門からなる（部門Ｉと部門ＩＩ）：
部門Ｉ：あらゆる水平プラスミド移行を検出するための平板培養法
部門ＩＩ：ＶＸＭ０１の生きたＣＦＵを検出するための液体濃縮培養
【０１５９】
分析カスケードには、生菌ＶＸＭ０１の排出を決定するためのマトリックス決定又は水平プラスミド移行の観察があとに続いている。カスケードを図１１に概説した。
水平プラスミド移行の検出のための分析部門Ｉ：
−０日目：５つの試験サンプルをそれぞれ３枚のＴＳＡ（＋カナマイシン）平板上に播種し、３７℃にて一晩インキュベートする。
−１日目：選択プレート上のＶＸＭ０１（Ｔｙ２１ａ）と非ＶＸＭ０１形態型とを視覚的に識別。非ＶＸＭ０１形態型を選抜し（それぞれ９つのコロニー）、凝集用の寒天平板（＋カナマイシン）及び翌日のＰＣＲ分析用のそれぞれのプールした形態型の並行液中培養（＋カナマイシン）に画線接種する。
−２日目：液状の形態型プールそれぞれのＰＣＲ。
ＶＸＭ０１の検出のための分析部門ＩＩ：
−０日目：５つの試験サンプルそれぞれのための液体濃縮培養（＋カナマイシン）の調製。
−１日目：それぞれの液体濃縮培養に対する直接的なＰＣＲ。プラスミドに関してＰＣＲが陽性であった場合の翌日の血清学的解析のための寒天平板培養（＋カナマイシン）上への画線接種。
−２日目：ＶＸＭ０１（Ｔｙ２１ａ）の存在の血清学的確認。
【０１６０】
全ての試験サンプルのＰＣＲが生きたＣＦＵ及び／又は浮動プラスミド又はＴｙ２１ゲノムＤＮＡの間で弁別的ではないであろう事実のため、且つ、凝集は試験サンプルに直に適用できないため、ＰＣＲ並びに凝集法を第二の方法として、平板培養法を適用した後に使用した。カナマイシン含有平板上で増殖する、同定された生きたコロニーを、これらの方法で更に特徴づけした。平板法でのみ、（ＶＸＭ０１又は水平プラスミド移行による外来非ＶＸＭ０１のプラスミド形質転換体のいずれかの）生きている細胞と死滅した細胞の間の識別が可能になった。
【０１６１】
ＶＸＭ０１の糞便中排出が、２人の患者、１０9用量群において１人及び１０10用量群において１人で観察された。両患者の糞便中のＶＸＭ０１排出は、それぞれ１回目又は２回目の投与後の一過性のものであったので、抗生物質処置なしで消失した。様々な用量群におけるＶＭＸ０１排出患者の数を、図１２にグラフを使って示す。
【０１６２】
要約すれば、ＶＸＭ０１は、さまざまな腫瘍型を標的化して、他の既存の癌ワクチンアプローチが遭遇したいくつものハードルを克服する可能性を有している。魅力的なビジョンは、本発明のワクチンを複数の他の抗癌税や免疫調節薬と組み合わせる可能性である。ここで提示した試験の結果は、発明者らがこの非常に興味深いアプローチを前進させるための動機となっている。
【図１−１】
0006325534.tif 000006
【図１−２】
0006325534.tif 000007
【図２】
0006325534.tif 000008
【図３】
0006325534.tif 000009
【図４】
0006325534.tif 000010
【図５】
0006325534.tif 000011
【図６】
0006325534.tif 000012
【図７】
0006325534.tif 000013
【図８】
0006325534.tif 000014
【図９】
0006325534.tif 000015
【図１０】
0006325534.tif 000016
【図１１】
0006325534.tif 000017
【図１２】
0006325534.tif 000018
【配列表】
0006325534000001.app