(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の末梢血中への前駆細胞および／または幹細胞の動員のための医薬の製造のための、平均分子量の範囲が４５００〜７０００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２】
前記前駆細胞および／または幹細胞が、コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、単球、巨核球、ＣＦＵ−ＧＥＭＭおよび赤芽球バースト形成細胞ＢＦＵ−Ｅからなる群より選択されるコロニー形成細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量の範囲が４５００〜５５００Ｄａである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の平均硫黄含有量が１５〜２０％の範囲内にあり、好ましくは約１７％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、水性注射液として処方される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．１〜５０ｍｇの範囲内、好ましくは前記対象の体重１ｋｇ当たり１〜５０ｍｇの範囲内、より好ましくは前記対象の体重１ｋｇ当たり５〜２５ｍｇの範囲内の用量で投与されるよう処方される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記対象はヒトであり、前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、前記ヒト対象の前記血流中に前記細胞が動員される時点の前に約０時間〜約６時間以内の間隔を置いてヒト対象に投与されるよう処方される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、前記ヒト対象の前記血流中に前記細胞が動員される前記時点の前に約０時間〜約４時間以内の間隔を置いて前記ヒト対象に投与されるよう処方される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、前記対象の前記末梢血中に前記細胞を動員するのに顆粒球コロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦと併用するよう処方される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｇ−ＣＳＦが、前記対象の前記血流中に前記細胞が動員される時点の２〜４日前に１回または２回、好ましくはこれに加えて前記対象の前記血流中に前記細胞が動員される前記時点の当日に、前記対象に投与するよう処方される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、さらに、前記対象の前記血流中に肝細胞増殖因子ＨＧＦを誘導する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
平均分子量の範囲が４５００〜７０００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩と、顆粒球コロニー形成刺激因子Ｇ−ＣＳＦとを含む、対象の末梢血中への前駆細胞および／または幹細胞の動員のための組成物。
【請求項１３】
水性溶媒をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
薬物として使用する、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
対象の末梢血中への前駆細胞および／または幹細胞の動員のための医薬の製造のための、請求項１２または１３に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
対象の血流中への標的白血球、特にリンパ球の動員のための医薬の製造のための、請求項１２または１３に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、全般的には対象の血流中への細胞動員に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞および前駆細胞は、分裂し成長して任意の細胞型を形成する能力を有する未成熟細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）は免疫系および骨髄の細胞を産生することができる。ＨＳＣ移植（ＨＳＣＴ）は、患者の正常な造血を回復させて化学療法または放射線照射後の様々な疾患を治療するのに用いられる。この２０〜３０年の間に、ＨＳＣＴは多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および同種移植片移植が必要な病態を含めた様々な病態の臨床ルーチンの治療となった。近年、この治療法には明らかな改善がみられるものの、依然として合併症および基礎疾患の再発に起因する罹病率および死亡率がこれまでと同様に高い。ほかにも、幹細胞供給源、細胞回収法、前処置レジメンおよび免疫抑制療法の改善が常に必要とされている。ＨＳＣＴには主として、適合する健常ドナー由来の幹細胞を用いる同種ＨＳＣＴと、同一患者から幹細胞を収集し、高用量の化学療法／放射線療法による前処置後に戻す自家ＨＳＣＴの２種類がある。同種ＨＳＣＴおよび特に自家ＨＳＣＴでは現在、幹細胞供給源として末梢血が骨髄にほぼ完全に取って代わっている。細胞供給源としての末梢血は、細胞供給源として骨髄を用いる場合よりもドナーに対する処置の侵襲性が少なく、移植細胞の生着も速いことから好ましいものである。
【０００３】
近年、この治療法には明らかな改善がみられるものの、依然として移植に由来する合併症（主として同種ＨＳＣＴ）および基礎疾患の再発（主として自家ＨＳＣＴ）に起因する罹病率および死亡率がこれまでと同様に高い。したがって、幹細胞供給源、細胞回収プロトコル、前処置レジメンおよび免疫抑制療法の改善が常に必要とされている。
【０００４】
現在、ドナーを顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で処置することによって末梢血に幹細胞を動員し、続く移植のためにアフェレーシスによって幹細胞を回収する。この健常造血細胞はレシピエントの血中に注入された後、骨髄に移動し、そこで分化して成熟血液細胞となり、造血を回復させることができる。近年、プレリキサフォル（ＭＯＺＯＢＩＬ（商標）、ＡＭＤ３１００、１，１’−［１，４−フェニレンビス（メチレン）］−ビス−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン）とＧ−ＣＳＦとを併用してＭＭ患者およびＮＨＬ患者の前駆細胞の動員を増大させることが承認されている。
【０００５】
Ｇ−ＣＳＦとプレリキサフォルを用いる併用療法を著しく制限するものには、幹細胞の動員に時間を要するという点がある。マウスの実験データではプレリキサフォル投与１時間後に動員幹細胞がピークになることが示されているが（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ（２００５））、ヒトでこれに対応するピークは最初、プレリキサフォル投与の約９時間後に始まる（Ｍｏｚｏｂｉｌ（商標）の製品研究論文）。したがって、動員幹細胞の回収がプレリキサフォル投与の約１１時間後にまで遅れることになり、入院期間が長くなることが示唆される（Ｍｏｚｏｂｉｌ（商標）の製品研究論文）。したがって、実際に細胞を回収する前日にプレリキサフォルを投与する必要があるのが現状である。
【０００６】
Ｓｗｅｅｎｅｙ（２０００）およびＳｗｅｅｎｅｙ（２００２）では、マウスおよびサルを用いて１０ｋＤａのデキストラン硫酸を含めた硫酸化多糖が幹細胞／前駆細胞の動員に及ぼす影響が検討されている。マウスおよびサルでは、それぞれデキストラン硫酸投与の３時間後および６時間後にデキストラン硫酸によりコロニー形成細胞（ＣＦＣ）が動員された。したがって、Ｓｗｅｅｎｅｙ（２０００）およびＳｗｅｅｎｅｙ（２００２）に示される結果は、デキストラン硫酸が幹細胞／前駆細胞を動員するのにプレリキサフォルの約３倍時間を要することを示していると思われる。
【発明の概要】
【０００７】
対象の血流中への標的細胞の効率的な動員をもたらすことが全般的目的である。
【０００８】
対象の血流中に高レベルの動員標的細胞をもたらすことがもう１つの全般的目的である。
【０００９】
上記のものをはじめとする目的は、本明細書に開示される実施形態によって達成される。
【００１０】
本発明の実施形態の一態様は、対象の末梢血中への前駆細胞および／または幹細胞の動員に使用する、平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体に関する。本発明の実施形態に関連する一態様では、対象の末梢血中に前駆細胞および／または幹細胞を動員する薬剤の製造に平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を使用することが明示される。本発明の実施形態に関連する別の態様では、対象の末梢血中に前駆細胞および／または幹細胞を動員する方法が明示される。この方法は、対象に平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を有効量投与することを含む。
【００１１】
関連する実施形態の別の態様は、対象の血流中への標的白血球、特にリンパ球の動員に使用する、平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体に関する。関連する実施形態に関連する態様では、対象の血流中に標的白血球、特にリンパ球を動員する薬剤の製造に平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を使用することが明示される。関連する実施形態に関連する別の態様では、対象の血流中に標的白血球、特にリンパ球を動員する方法が明示される。この方法は、対象に平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を有効量投与することを含む。
【００１２】
本発明の実施形態のさらなる態様は、平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体と、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）とを含む細胞動員組成物に関する。本発明の実施形態に関連する他の態様では、対象の末梢血中への前駆細胞および／または幹細胞を動員に使用する、ならびに／あるいは対象の血流中への標的白血球、特にリンパ球の動員に使用する、平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸あるいはその薬学的に許容される誘導体と、Ｇ−ＣＳＦとを含む細胞動員組成物が明示される。本発明の実施形態に関連するさらなる態様では、対象の末梢血中に前駆細胞および／または幹細胞を動員する、ならびに／あるいは対象の血流中に標的白血球、特にリンパ球を動員する薬剤の製造に平均分子の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸あるいはその薬学的に許容される誘導体と、Ｇ−ＣＳＦとを含む細胞動員組成物を使用することが明示される。本発明の実施形態に関連するまた別の態様では、対象の末梢血中に前駆細胞および／または幹細胞を動員する、あるいは対象の血流中に標的白血球、特にリンパ球を動員する方法が明示される。この方法は、対象に平均分子の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体と、Ｇ−ＣＳＦとを含む細胞動員組成物を有効量投与することを含む。
【００１３】
一実施形態では、薬学的に許容される誘導体は、デキストラン硫酸の薬学的に許容される塩であるのが好ましい。
【００１４】
本発明者らは、平均分子量の範囲が狭いデキストラン硫酸によって、これより平均分子量が小さいまたは大きいデキストラン硫酸分子に比して細胞動員の有意な改善が得られることを発見した。
【００１５】
平均分子量が本発明の実施形態の範囲よりも小さいデキストラン硫酸分子には、前駆細胞および／または幹細胞あるいは白血球の動員に何ら有意な効果はみられない。平均分子量が本発明の実施形態の範囲よりも大きいデキストラン硫酸分子には、Ｇ−ＣＳＦなどの他の細胞動員化合物とともに使用しても相加効果および相乗効果は一切みられないものと思われ、また本発明の実施形態よりも動員効果に時間を要するものと思われる。
【００１６】
本発明の実施形態は、デキストラン硫酸投与のほぼ直後に細胞動員が誘発され、動員細胞数のピークがマウスではデキストラン硫酸投与後７．５〜３０分以内、ヒトではデキストラン硫酸投与後３０〜１２０分以内に既に始まるという予想外の動員プロファイルを有する効率的な細胞動員を提供する。さらに、本発明の実施形態のデキストラン硫酸分子を他の細胞動員化合物と相乗的に組み合わせて、動員細胞数をさらに増大させることさえ可能である。
【００１７】
本発明の実施形態は、そのさらなる目的および利点とともに、以下の説明を添付図面と併せて参照することによって最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】デキストラン硫酸（ＬＭＷ−ＤＳ）またはＡＭＤ３１００の単回ｓ．ｃ．注射によって誘導された白血球動員を対照（クエン酸一水和物（ＣＡＭ））と比較して示す図である。３時間後（ＬＭＷ−ＤＳ）または１時間後（ＡＭＤ３１００）に血液検体を採取した。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析では、ＬＭＷ−ＤＳもしくはＡＭＤ３１００と対照群との比較（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）またはＬＭＷ−ＤＳとＡＭＤ３１００との比較（†ｐ＜０．０５、††ｐ＜０．０１、†††ｐ＜０．００１）を実施した。
【図２】ＬＭＷ−ＤＳがＨＧＦの血中濃度に及ぼす効果を示す図である。マウスをＬＭＷ−ＤＳまたはＡＭＤ３１００の単回ｓ．ｃ．注射により処置した。賦形剤対照としてＣＡＭを用いた。３時間後（ＬＭＷ−ＤＳ）または１時間後（ＡＭＤ３１００）に血液検体を採取した。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析では、ＬＭＷ−ＤＳもしくはＡＭＤ３１００と対照群との比較（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）またはＬＭＷ−ＤＳとＡＭＤ３１００との比較（†††ｐ＜０，００１）を実施した。
【図３】ＬＭＷ−ＤＳおよびＡＭＤ３１００の単回ｉ．ｖ．注射による末梢血への白血球動員を示す図である。賦形剤対照としてＣＡＭを用いた。３０分後（ＬＭＷ−ＤＳおよび賦形剤）または１時間後（ＡＭＤ３１００）に血液検体を採取した。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析では、ＬＭＷ−ＤＳもしくはＡＭＤ３１００と対照群との比較（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）またはＬＭＷ−ＤＳとＡＭＤ３１００との比較（†ｐ＜０．０５、††ｐ＜０．０１、†††ｐ＜０．００１）を実施した。
【図４Ａ】ＬＭＷ−ＤＳの単回ｉ．ｖ．注射またはＡＭＤ３１００の単回ｓ．ｃ．注射が末梢血の造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）動員に及ぼす効果を示す図である。賦形剤対照としてＣＡＭ緩衝液（ｉ．ｖ．）を用いた。３０分後（ＬＭＷ−ＤＳおよび賦形剤）または１時間後（ＡＭＤ３１００）に血液検体を採取した。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析では、ＬＭＷ−ＤＳもしくはＡＭＤ３１００と対照群との比較（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）またはＬＭＷ−ＤＳとＡＭＤ３１００との比較（†ｐ＜０．０５）を実施した。
【図４Ｂ】ＬＭＷ−ＤＳの単回ｉ．ｖ．注射またはＡＭＤ３１００の単回ｓ．ｃ．注射が末梢血の造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）動員に及ぼす効果を示す図である。賦形剤対照としてＣＡＭ緩衝液（ｉ．ｖ．）を用いた。３０分後（ＬＭＷ−ＤＳおよび賦形剤）または１時間後（ＡＭＤ３１００）に血液検体を採取した。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析では、ＬＭＷ−ＤＳもしくはＡＭＤ３１００と対照群との比較（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）またはＬＭＷ−ＤＳとＡＭＤ３１００との比較（†ｐ＜０．０５）を実施した。
【図５】ＬＭＷ−ＤＳまたはＣＡＭ（対照）による単回ｉ．ｖ．注射後に動員された前駆細胞（ＣＦＣ）を前駆細胞サブタイプ別（ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＢＦＵ−Ｅ）に示す図である。対照としてＣＡＭ緩衝液を使用し、この値を０値（陰性対照）として用いた。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析では、ＬＭＷ−ＤＳと対照群との比較（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）を実施した。
【図６】Ｇ−ＣＳＦとＬＭＷ−ＤＳの併用またはＧ−ＣＳＦとＡＭＤ３１００の併用によって誘導された白血球動員をＣＡＭ緩衝液（賦形剤）と比較して示す図である。３０分後（ＬＭＷ−ＤＳおよび賦形剤）または１時間後（ＡＭＤ３１００）に血液検体を採取した。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析では、Ｇ−ＣＳＦ＋ＬＭＷ−ＤＳもしくはＧ−ＣＳＦ＋ＡＭＤ３１００と対照群（Ｇ−ＣＳＦ＋ＣＡＭ）との比較（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）またはＧ−ＣＳＦ＋ＬＭＷ−ＤＳとＧ−ＣＳＦ＋ＡＭＤ３１００との比較（†ｐ＜０．０５、††ｐ＜０．０１、†††ｐ＜０．００１）を実施した。
【図７Ａ】末梢血の前駆細胞動員におけるＧ−ＣＳＦとＬＭＷ−ＤＳの併用療法またはＧ−ＣＳＦとＡＭＤ３１００の併用療法を示す図である。賦形剤対照としてＣＡＭ緩衝液を用いた。３０分後（ＬＭＷ−ＤＳおよび賦形剤）または１時間後（ＡＭＤ３１００）に血液検体を採取した。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析では、Ｇ−ＣＳＦ＋ＬＭＷ−ＤＳもしくはＧ−ＣＳＦ＋ＡＭＤ３１００と対照群（Ｇ−ＣＳＦ＋ＣＡＭ）との比較（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）またはＧ−ＣＳＦ＋ＬＭＷ−ＤＳとＧ−ＣＳＦ＋ＡＭＤ３１００との比較（†ｐ＜０．０５、††ｐ＜０．０１）を実施した。
【図７Ｂ】末梢血の前駆細胞動員におけるＧ−ＣＳＦとＬＭＷ−ＤＳの併用療法またはＧ−ＣＳＦとＡＭＤ３１００の併用療法を示す図である。賦形剤対照としてＣＡＭ緩衝液を用いた。３０分後（ＬＭＷ−ＤＳおよび賦形剤）または１時間後（ＡＭＤ３１００）に血液検体を採取した。平均±ＳＥＭが示されている。統計解析では、Ｇ−ＣＳＦ＋ＬＭＷ−ＤＳもしくはＧ−ＣＳＦ＋ＡＭＤ３１００と対照群（Ｇ−ＣＳＦ＋ＣＡＭ）との比較（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）またはＧ−ＣＳＦ＋ＬＭＷ−ＤＳとＧ−ＣＳＦ＋ＡＭＤ３１００との比較（†ｐ＜０．０５、††ｐ＜０．０１）を実施した。
【図８】マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ＋ＬＭＷ−ＤＳ、Ｇ−ＣＳＦ＋ＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ）またはＣＡＭ（賦形剤）の単回注射を実施した後の前駆細胞動員の概要を示す図である。Ｇ−ＣＳＦとＬＭＷ−ＤＳの併用療法ではＣＡＭ緩衝液、ＬＭＷ−ＤＳおよびＧ−ＣＳＦよりもＣＦＣ数が有意に増加した。エラーバーはＳＥＭを示し、ｎ＝６〜１０である。
【図９】マウスに１００ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ＋ＬＭＷ−ＤＳ、Ｇ−ＣＳＦ＋ＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ）またはＣＡＭ（賦形剤）の単回注射を実施した後のリンパ球動員の概要を示す図である。ＬＭＷ−ＤＳ投与では、末梢血中のリンパ球がＧ−ＣＳＦまたはＡＭＤ３１００の単剤療法よりも増加し、Ｇ−ＣＳＦと併用では、その増加はＧ−ＣＳＦ＋ＡＭＤ３１００に比して有意なものであった。エラーバーはＳＥＭを示し、ｎ＝６〜１０である。
【図１０】デキストラン硫酸が末梢血中の白血球に及ぼす影響を示す図である。マウスに平均分子量の異なるデキストラン硫酸（ＤＳ３またはＤＳ５）を用量５０ｍｇ／ｋｇで単回ｉ．ｖ．注射する処置を実施した。賦形剤対照として緩衝生理食塩水（ＮａＣｌ）を用いた。異なる麻酔方法の効果を比較するため、一部の個体にはイソフルランの代わりにペンタバルビタールナトリウム（ＰＮＢ）を用いて鎮静させた。エラーバーはＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定を用いて、対照群と比較した統計的有意差を評価した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１１】デキストラン硫酸が末梢血中への造血前駆細胞に及ぼす効果を示す図である。マウスを平均分子量の異なるデキストラン硫酸（ＤＳ３またはＤＳ５）の単回ｉ．ｖ．注射または賦形剤（ＮａＣｌ）で処置した。エラーバーはＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定を用いて、対照群と比較した統計的有意差を評価した（＊ｐ＜０．０５）。
【図１２】デキストラン硫酸が末梢血中のＨＧＦレベル増大に及ぼす効果を示す図である。マウスを平均分子量の異なるデキストラン硫酸（ＤＳ３またはＤＳ５）の単回ｉ．ｖ．注射または賦形剤（ＮａＣｌ）で処置した。エラーバーはＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定を用いて、対照群と比較した統計的有意差を評価した（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１３】０時間に１５ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ（上段パネル）、１８ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ（中段パネル）または２４ｍｇ／ｋｇのＬＭＷ−ＤＳ（下段パネル）を１０分間ｉ．ｖ．注入したヒトの末梢血中のリンパ球動員を示す図である。黒色の線は平均リンパ球レベルを表し、灰色の線は個々のヒトのリンパ球レベルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（詳細な説明）
本発明の実施形態は全般的には、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトにおける細胞動員に関する。実施形態は特に、例えば造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を含めた細胞移植に使用可能な、幹細胞、前駆細胞および／または特定の白血球の動員に関する。
【００２０】
本発明の実施形態は、対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象における細胞動員に関連するデキストラン硫酸の予想外の特徴に基づくものである。
【００２１】
したがって、本発明の実施形態の一態様は、対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象の末梢血（ＰＢ）中に通常は骨髄（ＢＭ）から前駆細胞および／または幹細胞を動員するのに使用する、平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体に関する。
【００２２】
末梢血中では、幹細胞および／または前駆細胞が回収可能であり、したがって、ＨＳＣＴを含めた細胞移植に使用することができる。あるいは、幹細胞および／または前駆細胞を末梢血中に動員することによって、対象から回収せずに、例えば、心筋修復など組織または器官修復のためにｉｎ  ｖｉｖｏで循環させて、有利な効果を得ることができる。
【００２３】
したがって、この態様の一実施形態は、対象、好ましくはヒト対象の末梢血中に好ましくは骨髄から前駆細胞および／または幹細胞を動員する方法に関する。この方法は、対象に平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を有効量投与することを含む。この態様の別の実施形態は、対象、好ましくはヒト対象の末梢血中に好ましくは骨髄から前駆細胞および／または幹細胞を動員する薬剤の製造に平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を使用することに関する。
【００２４】
本明細書では、「前駆細胞」という語句は、刺激に応答して分化造血細胞または骨髄細胞を形成することができる特定の細胞を指す。様々なタイプのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力によって試料中の前駆細胞を同定することができる。このＣＦＵのタイプとしては、特にＣＦＵ−顆粒球、マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、ＣＦＵ−顆粒球、赤血球、単球、巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）が挙げられる。「幹細胞」は前駆細胞よりも分化していない細胞型であり、ヒトでは必ずというわけではないが通常、細胞表面糖タンパク質ＣＤ３４を発現する。
【００２５】
本明細書に記載される実験データは、何らかの細胞動員効果を得るためにはデキストラン硫酸の平均分子量に下限があることを示している（図１０および１１を参照されたい）。したがって、平均分子量が本発明の実施形態の範囲よりも小さいデキストラン硫酸分子は、前駆細胞および／または幹細胞の動員にも、実際に白血球、特にリンパ球の動員にも、あるいは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の誘導にも有意な正の効果を示さない（図１０〜１２を参照されたい）
【００２６】
平均分子量が本発明の実施形態の範囲よりも大きいデキストラン硫酸分子も、細胞動員の効果が劣っている。
【００２７】
Ｓｗｅｅｎｅｙ（２０００）およびＳｗｅｅｎｅｙ（２００２）には、１０ｋＤａのデキストラン硫酸がマウスに前駆細胞／幹細胞を動員するのにプレリキサフォルの約３倍時間を要することが示されており、回収時間はプレリキサフォル投与では１時間後であるのに対して、デキストラン硫酸投与では３時間後であることが示唆されている（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ（２００５））。本発明に記載される実験データから、マウスでは実施形態による平均分子量を有するデキストラン硫酸により、動員されるコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の数の増加がほぼ直ちに起こり、そのピークはプレリキサフォルでは１時間後、１０ｋＤａのデキストラン硫酸では３時間後にみられるのに対して、デキストラン硫酸投与では７．５〜３０分後にピークがみられる。これに対応させれば、ヒト患者ではＣＦＣ動員のピークがデキストラン硫酸投与の約０．５〜３時間後、例えば約１時間後などにみられることになる。したがって、デキストラン硫酸によるＣＦＣ動員をヒトで実施すれば、マウスの約６〜９倍時間を要するものと思われる。この種間関係は、ＣＦＣ動員のピークがマウスでは投与の１時間後にみられるのに対してヒトでは投与の約９時間後にみられるプレリキサフォルの場合とほぼ同じである。
【００２８】
したがって、本発明の実施形態のデキストラン硫酸は、これよりも大きいデキストラン硫酸分子に関する先行技術に示されるものよりもはるかに迅速な細胞動員効果を有するものと思われる（Ｓｗｅｅｎｅｙ（２０００）およびＳｗｅｅｎｅｙ（２００２）を参照されたい）
【００２９】
Ｈａｎ（１９９８）は、マウスでの白血球（ＷＢＣ）、単核細胞（ＭＮＣ）およびＣＦＵ−ＧＭの動員について分子量が１０ｋＤａのデキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦを検討している。同著者らは、マウスに１０ｋＤａのデキストラン硫酸１５〜３０ｍｇをｉ．ｖ．注射すると、２〜５時間後に末梢ＷＢＣ、ＭＮＣおよびＣＦＵ−ＧＭのピークがみられることを記載している。したがって、上記の時間は、Ｓｗｅｅｎｅｙ（２０００）およびＳｗｅｅｎｅｙ（２００２）によって示唆される３時間とほぼ同じである。
【００３０】
Ｈａｎ（１９９８）はさらに、１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを５日間、連日投与した場合（Ｇ−ＣＳＦ群）、１５ｍｇ／ｋｇの１０ｋＤａデキストラン硫酸を１回、第５日に投与した場合（ＤＳ群）および１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを５日間、連日投与し、１５ｍｇ／ｋｇの１０ｋＤａデキストラン硫酸を１回、第５日に投与した場合（ＤＳ＋Ｇ−ＣＳＦ群）の末梢ＷＢＣ、ＭＮＣおよびＣＦＵ−ＧＭの投与後レベルを比較した。ＷＢＣおよびＭＮＣについては３群のいずれにも有意差はみられなかった。ＤＳ群ではＣＦＵ−ＧＭレベルが細胞数５０個超の１２．９±１．６コロニー、Ｇ−ＣＳＦ群ではＣＦＵ−ＧＭレベルが１７．１±１．９コロニーであったのに対して、ＤＳとＧ−ＣＳＦの併用療法（ＤＳ＋Ｇ−ＣＳＦ群）ではＣＦＵ−ＧＭレベルが１９．８±２．３、すなわち、Ｇ−ＣＳＦ単独治療で得られたレベルをわずかに上回るレベルであった。
【００３１】
したがって、Ｈａｎ（１９９８）により、マウスでは平均分子量が１０ｋＤａのデキストラン硫酸によって投与時から２〜５時間後に動員ピークが得られ、マウスではこのデキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦとを組合せても、Ｇ−ＣＳＦ単独治療を上回るさらなる効果はほとんど得られないことが示された。
【００３２】
本発明の実施形態の平均分子量を有するデキストラン硫酸は、Ｈａｎ（１９９８）に開示されている１０ｋＤａのデキストラン硫酸とは大きく異なる投与プロファイルおよび効果を有する。第一に、本発明の実施形態のデキストラン硫酸は、これより大きいデキストラン硫酸分子に関する先行技術で示されるものよりもはるかに迅速な細胞動員効果を有するものと思われる（２〜５時間に対して７．５〜３０分）。第二に、本発明の実施形態のデキストラン硫酸は、Ｇ−ＣＳＦと組み合わせると細胞動員に相乗効果を示す。したがって、本明細書に開示されるデキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦとの併用療法により、末梢血中に動員される前駆細胞およびリンパ球が増加し、これはデキストラン硫酸を単独で用いた場合とＧ−ＣＳＦを単独で用いた場合の効果を合わせたものよりも大きいものであった（図６〜９を参照されたい）。したがって、平均分子量が本発明の実施形態の範囲内にあるデキストラン硫酸は、Ｇ−ＣＳＦと組み合わせたときに真の相乗効果を示す。
【００３３】
その結果、この選択されたデキストラン硫酸の平均分子量の範囲では、平均分子量が本発明の実施形態の発明的範囲外にあるデキストラン硫酸分子によりもはるかに効率的な細胞動員が得られる。
【００３４】
本明細書に記載される実験データは、本発明の実施形態のデキストラン硫酸が動員する前駆細胞および幹細胞の総数がＣＦＣの総数の点でプレリキサフォルとほぼ同じであることに加えて、デキストラン硫酸投与をＧ−ＣＳＦなどの他の物質と相乗的に組み合わせて、これに対応するプレリキサフォルとＧ−ＣＳＦとの組合せよりもはるかに高いレベルのＣＦＣ総数が得られることを示している。さらに、デキストラン硫酸のＣＦＣ動員プロファイルはプレリキサフォルを用いるＣＦＣ動員とは異なっている。特に、本発明の実施形態のデキストラン硫酸では、ＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＢＦＵ−Ｅ  ＣＦＣタイプをプレリキサフォルよりも高いレベルで得ることができる。
【００３５】
本発明の実施形態のデキストラン硫酸の投与によって誘発される極めて迅速な細胞動員は、それがプレリキサフォルよりもはるかに迅速であることから、プレリキサフォルとは根本的に異なる投与対効果プロファイルを可能にする。したがって、この態様では、本発明の実施形態のデキストラン硫酸の投与をＣＦＣ動員ピークを得る所望のタイミングに合わせて調整するのが好ましい。例えば、動員されたＣＦＣを対象の末梢血から回収する場合、デキストラン硫酸の投与をヒト対象のＣＦＣ回収開始の約０時間〜約８時間前、より好ましくは約０時間〜約６時間前に実施するのに合わせて調整するのが好ましい。より好ましくは、ＣＦＣ回収開始の約０時間〜約４時間前にデキストラン硫酸投与を実施する。
【００３６】
プレリキサフォルとＧ−ＣＳＦによる併用療法後のＣＦＣ細胞回収は回収１回当たり約４時間実施されるため、プレリキサフォル投与の９時間から最大１３時間後に合わせる。
【００３７】
したがって、これに対応する本発明の実施形態による回収プロトコルでは、４時間のＣＦＣ回収をデキストラン硫酸投与の０時間〜最大４時間後、０．２５時間〜最大４．２５時間後、０．５時間〜最大４．５時間後、０．７５時間〜最大４．７５時間後、１時間〜最大５時間後、１．２５時間〜最大５．２５時間後、１．５時間〜最大５．５時間後、１．７５時間〜最大５．７５時間後、２時間〜最大６時間後、２．２５時間〜最大６．２５時間後、２．５時間〜最大６．５時間後、２．７５時間〜最大６．７５時間後、３時間〜最大７時間後、３．２５時間〜最大７．２５時間後、３．５時間〜最大７．５時間後、３．７５時間〜最大７．７５時間後、４時間〜最大８時間後、４．２５時間〜最大８．２５時間後、４．５時間〜最大８．５時間後、４．７５時間〜最大８．７５時間後、５時間〜最大９時間後、５．２５時間〜最大９．２５時間後、５．５時間〜最大９．５時間後、５．７５時間〜最大９．７５時間後、６時間〜最大１０時間後、６．２５時間〜最大１０．２５時間後、６．５時間〜最大１０．５時間後、６．７５時間〜最大１０．７５時間後、７時間〜最大１１時間後、７．２５時間〜最大１１．２５時間後、７．５時間〜最大１１．５時間後、７．７５時間〜最大１１．７５時間後または８時間〜最大１２時間後に実施することになり得る。好ましい実施形態では、デキストラン硫酸投与の約０．５時間後、０．７５時間後、１時間後、１．２５時間後、１．５時間後、１．７５時間後、２時間後、２．２５時間後、２．５時間後、２．７５時間後、３時間後、３．２５時間後、３．５時間後、３．７５時間後または４時間後に細胞回収を開始する。
【００３８】
したがって、特定の実施形態では、動員誘導薬剤としてプレリキサフォルを用いる場合、ＣＦＣ回収を開始する前にデキストラン硫酸誘導性細胞動員による幹細胞および／または前駆細胞の回収が既に完了しているのが有利である。
【００３９】
予備試験のヒトデータは、デキストラン硫酸による細胞動員がデキストラン硫酸投与の約１時間後にピークに達し、デキストラン硫酸投与の約６時間後に低下し始め、デキストラン硫酸投与の少なくとも約２４時間後に通常レベルに戻ることを示している。したがって、細胞動員のピークはデキストラン硫酸投与の約１時間後に始まり、これは０時間に様々な用量のデキストラン硫酸をヒト対象に投与した後のリンパ球の動員により例示される図１５に示されている。したがって、ヒトでは細胞動員の効果のピークは通常、デキストラン硫酸投与から３時間以内にみられる。
【００４０】
したがって、デキストラン硫酸投与によってプレリキサフォルよりも迅速で効率的な細胞動員がもたらされるため、所望の量の動員細胞を回収するのに必要なアフェレーシスの日数が少なくなる。細胞数が不十分な対象では、定期的なアフェレーシス来院時、デキストラン硫酸による治療の目的は即時の細胞動員を確実に実施することであり、アフェレーシスを計画通りに開始することができる。これによりアフェレーシス施設で計画を立てることが容易になり、何度も動員処置を受けなくてはならない対象の数が減る。
【００４１】
本明細書に記載されるデキストラン硫酸を用いて実施した研究では、即時の前駆細胞動員が示されている。したがって、マウスではＣＦＣ数が投与後７．５分で既にピークに達し、長時間にわたるピークが少なくとも１時間持続する。デキストラン硫酸を用いるＨＳＣの動員は、マウスで１時間後に明確なピークがみられるプレリキサフォル治療を含めた現在用いられている動員レジメンよりも迅速なものであると思われる。
【００４２】
迅速で、効率的で、予測可能なＨＳＣ動員により、患者の入院期間が短くなる可能性が考えられる。このことは、アフェレーシスの予約数が減少し、細胞数が少な過ぎるため中止になるセッションが少なくなることから、アフェレーシス施設に有益である可能性も考えられる。
【００４３】
プレリキサフォルとは異なり、これよりも迅速なデキストラン硫酸による動員効果の作用機序として考えられるものを以下に記載する。簡潔に述べれば、デキストラン硫酸はＢＭ間質細胞のヘパリン結合ドメインと結合し、これにより間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）およびＨＳＣが末梢血中に放出される。これに対して、プレリキサフォルはＳＤＦ−１のアンタゴニストとして作用することによってＳＤＦ−１の勾配に影響を及ぼし、末梢血中のＨＳＣ量を増大させる。ＳＤＦ−１の勾配を崩壊させる時間の差は、動員物質の作用機序が異なることを示唆している。示唆されるデキストラン硫酸の機序は、別の負に帯電したヘパラン硫酸（ＨＳ）のヘパリン結合ドメインと呼ばれる正荷電アミノ酸の特定の配列との結合によって説明することができる。これによりＳＤＦ−１が循環血中に放出され、その血清中濃度が上昇する（Ｓｗｅｅｎｅｙ（２００２）およびＰａｂｌｏｓ（２００３））。
【００４４】
ＨＳＣの骨髄へのホーミングおよび骨髄からの動員を制御する正確な機序は明らかにされていないが、特にサイトカインＳＤＦ−１およびその受容体ＣＸＣＲ４が極めて重要な役割を果たしている。ＨＳＣはＣＸＣＲ４を発現し、ＳＤＦ−１は骨髄によって産生される。ＳＤＦ−１は間質細胞の膜、内皮細胞の膜および細胞外マトリックスにあるプロテオグリカン（ＰＧ）に係留される。
【００４５】
デキストラン硫酸はマウスでも非ヒト霊長類でも、ＳＤＦ−１の勾配を崩壊させて血中レベルを増大させＢＭ中レベルを低下させる。ＳＤＦ−１の増大は、ＢＭをはじめとする組織の内皮細胞表面または細胞外マトリックス上にケモカインを捕捉するヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）がデキストラン硫酸に競合的に置き換わることに起因すると考えられる。サルでは、デキストラン硫酸を単回注射したところ６時間後に末梢ＳＤＦ−１が最大レベルに達し、２４時間後にベースラインに戻った（Ｓｗｅｅｎｅｙ（２００２））。これに対してプレリキサフォルは、ＳＤＦ−１の受容体、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ７と結合し（Ｋａｌａｔｓｋａｙａ（２００９））、これにより骨髄間質内でのＳＤＦ−１との結合を崩壊させ、細胞を遊離させる。プレリキサフォルはＳＤＦ−１のアンタゴニストとして作用することによってこのＳＤＦ−１の勾配に影響を及ぼし、末梢血中のＨＳＣ量を増大させる（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ（２００５）およびＬａｐｉｄｏｔ（２００３））。
【００４６】
デキストラン硫酸を投与すると、レリキサフォルよりもはるかに迅速な細胞動員が得られることに加えてほかにも、様々な幹細胞または前駆細胞の細胞動員プロファイルが得られる。特に、デキストラン硫酸によりＣＦＣのＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭタイプのレベルがプレリキサフォルの場合よりも高くなる。本発明の実施形態のこの細胞動員プロファイルはいくつかの臨床的有用性を有し得る。例えば、患者に注入したＣＦＵ−ＧＥＭＭの数が好中球および血小板の回復にかかる時間と相関することが確認されている（Ｒｏｏｄｍａｎ（１９８７））。したがって、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ含有量の多いＨＳＣを移植すれば患者の感染リスクの高い危険な期間が短くなり、患者に大きな利益がもたらされると考えられる。ほかにも、動員細胞中のＢＦＵ−Ｅレベルが高いと細胞移植に有益である。細胞移植時に注入するＢＦＵ−Ｅ細胞の数が好中球および血小板の回復ならびに造血の回復を改善することが示されている（Ｃｏｏｐｅｒ（１９９７）およびＨａｓｓａｎ（１９９７））。
【００４７】
この態様によるデキストラン硫酸投与によって動員された幹細胞および／または前駆細胞をアフェレーシスなどの当該技術分野で周知の技術により回収することができる。簡潔に述べると、患者の血液が継続的にアフェレーシス機器内を循環して患者に戻ってくるように静脈チューブを患者に接続する。次いで、アフェレーシス機器が様々なタイプの血液細胞および免疫細胞を分離する。
【００４８】
回収した幹細胞および／または前駆細胞はＨＳＣＴなどの同種移植または自家移植に使用することができる。
【００４９】
次いで、回収した幹細胞および／または前駆細胞を患者自身（自家移植）または別の患者（同種移植）であるレシピエントに注入することができる。現在、幹細胞および／または前駆細胞移植が治療法となっている疾患および障害がいくつか存在する。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）および若年性慢性骨髄性白血病を含めた様々な悪性腫瘍および癌の治療には同種移植が推奨されている。これに対して、ＭＭ、ＮＨＬ、ＨＤ、ＡＭＬ、神経芽腫、卵巣癌および胚細胞腫瘍などの悪性腫瘍には自家移植が推奨されている。その他の癌としては、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）をはじめとする骨髄腫、白血病およびリンパ腫が挙げられる。
【００５０】
ＨＳＣＴは主として血液癌およびリンパ系癌に用いられる治療法であるが、再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、ブラックファン・ダイアモンド貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、ウィスコット・オルドリッチ症候群、先天性代謝異常、自己免疫障害およびアミロイドーシスを含めた他の様々な後天性および先天性病態の代替療法となる（Ｃｏｐｅｌａｎ（２００６））。
【００５１】
さらに、デキストラン硫酸は現在用いられている動員薬剤、プレリキサフォルよりも血液細胞に対する動員効果が高く、これと異なる作用機序によってその効果を発揮するため、デキストラン硫酸による治療はあらゆるＨＳＣＴ患者のほか、現在用いられている治療法で十分に幹細胞動員が得られない治療抵抗性患者にも有用であり得る。
【００５２】
デキストラン硫酸の投与により、通常は骨髄から対象の末梢血中に動員される前駆細胞および／または幹細胞が極めて迅速かつ大幅に増大するだけではない。本発明の実施形態のデキストラン硫酸はさらに、投与直後に複数の血液パラメータに正の効果を及ぼし、白血球（ＷＢＣ）の迅速な動員を誘導する。動員されたＷＢＣはＨＳＣＴ実施後の感染のリスクおよび危険な期間を低減し得るため、ＷＢＣ動員は本発明の実施形態の特定の有用な態様となり得る。
【００５３】
本発明の実施形態によるデキストラン硫酸の極めて興味深い特徴の１つが、デキストラン硫酸が特に、高いリンパ球の動員を引き起こすことであり、この動員はプレリキサフォルよりもはるかに高いものである。
【００５４】
したがって、本発明の実施形態の別の態様は、対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象の血流中に標的白血球、特にリンパ球を動員するのに使用する、平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体に関する。
【００５５】
したがって、この態様の一実施形態は、好ましくはヒト対象の血流中に標的白血球、特にリンパ球を動員する方法に関する。この方法は、対象に平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を有効量投与することを含む。この態様の別の実施形態は、対象の血流中に標的白血球、特にリンパ球を動員する薬剤の製造に平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体を使用することに関する。
【００５６】
本発明の実施形態のデキストラン硫酸をこの態様に従って使用し、対象から前駆細胞および／または幹細胞に加えてリンパ球を動員することができる。しかし、別法として、主としてリンパ球を必要とする様々な適用または治療法に使用する標的細胞としてリンパ球を動員するのにデキストラン硫酸を使用することが可能である。
【００５７】
本明細書で既に述べたように、任意のリンパ球回収およびデキストラン硫酸投与を調整して幹細胞および／または前駆細胞の動員に合わせるのが好ましい。したがって、デキストラン硫酸投与をヒト対象のリンパ球回収を開始する約０〜約８時間前、好ましくは約０〜約６時間前、より好ましくは約０時間前〜約４時間前に実施するよう調整して合わせるのが好ましい。これまでに開示したデキストラン硫酸投与に対する好ましい回収間隔は、リンパ球回収にも有利に用いることができる。
【００５８】
注入するリンパ球含有量を多くすることにはＨＳＣＴに関連する有益な利点がいくつかある。例えば、事前に回収した幹細胞および／または前駆細胞とともに対象に注入するリンパ球の量を増加させると感染のリスクが低下し、総合的転帰が改善する。リンパ球注入量を増やせばリンパ球の回復が高まると予測され、さらにＭＭ患者およびＮＨＬ患者に自家造血幹細胞移植を実施した後の全生存期間が長くなると予測される。リンパ球投与量の増大は第１５日の絶対リンパ球数（ＡＬＣ−１５）となって現れる。リンパ球を０．６８×１０９個／ｋｇ投与したＮＨＬ患者の方が、リンパ球を０．３４×１０９個／ｋｇ投与したＮＨＬ患者よりも全生存期間および無進行生存期間の中央値が有意に高く、ＭＭ患者でもリンパ球の産生量が多くなるとほぼ同じ利益が得られるという結論が導かれている（Ｐｏｒｒａｔａ（２００４ｂ））。
【００５９】
プレリキサフォルを用いて実施された臨床試験では、移植後、ＨＳＣＴ患者の２０〜２５％に感染が認められている（ＣＨＭＰ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｍｏｚｏｂｉｌ（プレリキサフォル）Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｎｏ．ＥＭＥＡ／Ｈ／Ｃ／００１０３０）。特にＨＳＣＴを受ける患者では、市中呼吸器ウイルスが重篤な感染症の原因となる可能性があることが認められている。さらに、症候性上気道感染症のあるＨＳＣＴレシピエントでは重篤な肺炎に進行する傾向が大きくなり、死亡率は５０〜７０％に達する（Ｃｈｅｍａｌｙ（２００６））。本発明の実施形態のデキストラン硫酸は、リンパ球レベルを増大させることによってこのような感染のリスクを低下させ得る。
【００６０】
全生存期間が改善する機序については、リンパ球の生着および再構築が速くなることによって移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果が高くなり、残存癌が減少することが提唱されている（Ｐｏｒｒａｔａ（２００４ａ）、（２００４ｂ）、（２００９）およびＨｉｗａｓｅ（２００８））。実験結果に示されるように、単回療法では、デキストラン硫酸の単回投与によってリンパ球の放出がＧ−ＣＳＦまたはプレリキサフォルの単回投与の少なくとも２倍になった。デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦを併用すると、リンパ球の動員効率がＧ−ＣＳＦとプレリキサフォルを併用した場合の約２倍になる。
【００６１】
ＷＢＣ、特にリンパ球に対する誘導効果は、マウスでも非ヒト霊長類でも、デキストラン硫酸がＳＤＦ−１の勾配を崩壊させて血中の細胞レベルを増大させ、ＢＭ中のレベルを低下させることが示されている基礎となる機序に基づくものであると考えられる（Ｓｗｅｅｎｅｙ（２００２））。ＳＤＦ−１の増大は、ＢＭをはじめとする組織の内皮細胞表面または細胞外マトリックス上にケモカインを捕捉するヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）がデキストラン硫酸に競合的に置き換わることに起因すると考えられる。考えられるまた別の機序は、デキストラン硫酸が細胞間の相互作用、例えば、白血球ローリングおよびセレクチンを介した白血球の接着によって白血球に干渉するというものである。
【００６２】
したがって、本発明の実施形態によるデキストラン硫酸をドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）に関連して使用することができる。ＤＬＩは、ＨＳＣＴ後に用いられることのある養子免疫療法である。ＤＬＩでは、抗腫瘍免疫応答を増強する、あるいはドナー幹細胞が生着し続ける状態を整えるために、幹細胞および／または前駆細胞移植後に元の幹細胞ドナーに由来するリンパ球を注入する。この治療法の目的はＧＶＴ効果によって患者の癌の寛解を導入することである。これにより、ドナーリンパ球が残存癌細胞を攻撃し、その増殖を抑えることができる。
【００６３】
対象を治療し、動員細胞の産生量を改善するには、本発明の実施形態のデキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦとを併用するのが有利である。実験の節に開示されるように、デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦの併用療法により、幹細胞および前駆細胞ならびに様々なＷＢＣともにデキストラン硫酸単独療法よりも動員細胞の数が相乗的に増加した。さらに、デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦを併用すると、プレリキサフォルとＧ−ＣＳＦの併用よりも有意に高いレベルで細胞が動員された。プレリキサフォルとＧ−ＣＳＦとの間にみられる相乗効果は、デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦを併用すると一層顕著になるように思われる。このことは、１０ｋＤａのデキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦを併用してもＧ−ＣＳＦ単独で使用した場合と基本的に同じ結果が得られたＨａｎ（１９９８）を踏まえると予想外のことであった。
【００６４】
したがって、さらなる態様は、平均分子量の範囲が３５００〜９５００Ｄａのデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体と、Ｇ−ＣＳＦとを含む細胞動員組成物に関する。この態様に関連する実施形態では、対象、好ましくはヒト対象に細胞、特に幹細胞および／または前駆細胞および／またはＷＢＣ、特にリンパ球を動員するのに本発明の実施形態のデキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦを併用することが明示される。
【００６５】
細胞動員組成物はほかにも、水性溶媒などの賦形剤を含むのが好ましい。
【００６６】
したがって、この態様の一実施形態は、対象、好ましくはヒト対象の末梢血中に幹細胞および／または前駆細胞および／またはリンパ球などの細胞を動員する方法に関する。この方法は、対象に有効量の本発明の実施形態によるデキストラン硫酸もしくはその薬学的に許容される誘導体と、有効量のＧ−ＣＳＦとを投与すること、または対象に上記細胞動員組成物を投与することを含む。この態様の別の実施形態では、対象、好ましくはヒト対象の末梢血中に細胞、好ましくは幹細胞および／または前駆細胞および／またはリンパ球を動員するのに使用する、本発明の実施形態によるデキストラン硫酸もしくはその薬学的に許容される誘導体と、Ｇ−ＣＳＦとの組合せまたは上記細胞動員組成物が明示される。この態様のさらなる実施形態は、対象、好ましくはヒト対象の末梢血中に細胞、好ましくは幹細胞および／または前駆細胞および／またはリンパ球を動員する薬剤の製造に本発明の実施形態によるデキストラン硫酸もしくはその薬学的に許容される誘導体と、Ｇ−ＣＳＦとの組合せまたは上記細胞動員組成物を使用することに関する。
【００６７】
この態様に従って使用するＧ−ＣＳＦは、組換えＧ−ＣＳＦまたは精製Ｇ−ＣＳＦを含めた任意の適切なＧ−ＣＳＦ供給源に由来するものであり得る。非限定的な例としては、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ｇ−ＣＳＦ類似体のフィルグラスチム）、ＮＥＵＴＲＯＧＩＮ（登録商標）（組換えＧ−ＣＳＦのレノグラスチム）、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）（ポリエチレングリコール型フィルグラスチムのペグフィルグラスチム）が挙げられる。生物学的に活性なフラグメント、変異体、誘導体または融合分子に天然のＧ−ＣＳＦと同様の細胞動員能があれば、これを上記のものに代えてまたは加えてＧ−ＣＳＦ供給源として使用し得る。
【００６８】
現時点では、Ｇ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ）をアフェレーシス前の４日間、対象に毎朝投与し、その後、アフェレーシス当日の朝に毎回投与する。この投与プロトコルはほかにも、本発明の実施形態のデキストラン硫酸に関連して用いることができる。したがって、Ｇ−ＣＳＦをデキストラン硫酸投与および細胞回収の前に１回または数回対象に投与する、例えばアフェレーシス前の１〜７日間に１回または２回、例えば２〜４日間に１回または２回などのように投与するのが好ましく、さらにこれに加えてアフェレーシス当日に投与するのが好ましい。
【００６９】
上記のものに代えてまたは加えて、Ｇ−ＣＳＦ投与前にデキストラン硫酸投与を実施してもよい。例えば、本明細書でのちにさらに述べるように、本発明の実施形態によるデキストラン硫酸にはほかにも、対象に投与したときにＨＧＦを誘導する有益な効果がある。その結果、対象にＧ−ＣＳＦを投与したとき、対象の末梢血中のＨＧＦレベルが増大するのは有益であると考えられる。好ましい実施形態では、次いでデキストラン硫酸をＧ−ＣＳＦの前にまたは実際に一緒に投与するだけでなく、上記Ｇ−ＣＳＦ投与プロトコルの終了後にも投与するのが好ましい。
【００７０】
デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦの併用により末梢血中のＣＦＣ数が最大で１８０００ＣＦＣ／ｍＬ血液、すなわち対象の１００倍超に相乗的に増大し、これはプレリキサフォルとＧ−ＣＳＦを併用した場合よりも効率が高いと思われる。一部の患者では、Ｇ−ＣＳＦとプレリキサフォルを併用して治療しても移植後に十分な量のＨＳＣが動員されない。Ｇ−ＣＳＦとデキストラン硫酸を組み合わせれば、このような治療抵抗性患者のＨＳＣの産生量が改善し、計画された移植が可能となり得る。デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦによる末梢血中のＣＦＣ数の相乗的増加は、患者がのちの移植を続けるために必要な細胞数を確保するのが厄介な自家幹細胞移植を受ける患者に有利なものとなる。
【００７１】
一般に、のちの移植を成功させるには、アフェレーシス処置の際にドナーから十分な数のＨＳＣを確保しなければならない。臨床状況では、ＨＳＣ細胞数はアフェレーシス産物中の総ＣＤ３４＋細胞数として測定される。このマーカーは化学療法後の生着を占う確実で優れた予測因子であることがわかっている。しかし、ＣＤ３４＋細胞集団は不均一な集団であり、ＣＤ３４＋マーカーはＨＳＣ機能の代替マーカーに過ぎない。一般に、ＣＤ３４＋細胞数が１キロ当たり２．５×１０６個を上回るとＨＳＣＴには適さず、２０×１０６個を上回るＣＤ３４＋細胞を移植すると、突然発症し死に至ることもある幹細胞移植中毒、生着症候群が発症する可能性がある。上記の数値の間に、回収する細胞数が多いほど生着が迅速になり、入院期間が短くなり、それによりコストが低くなるため、移植の転帰が良好になることを裏付ける報告がある。
【００７２】
したがって、造血幹細胞移植を成功させる、すなわち、効果的で迅速な生着を確実に実現して感染を回避し、疾患の再発を予防するためには、十分な量の末梢血幹細胞を動員することが重要である。
【００７３】
自家移植、同種移植に関係なく、主要な目的は生着を成功させることである。これに失敗すれば、患者が血液系および免疫系を欠く状態になりかねない危機的な状況を招くことになる。このような生命を脅かす状況を回避するためには、生着を必ず成功させるのに十分な細胞が移植片に確実に含まれるようにしなければならない。細胞数が少な過ぎれば、脊髄破壊的な治療を延期しなければならず、貴重な時間が失われることになる。また、脊髄破壊的な治療を実施した後、前駆細胞数が多いほど生着が迅速になり、入院および支持療法の必要性が少なくなり得る。既に述べたように、血液中の循環造血前駆細胞数を増加させる標準的な方法は、ドナーをＧ−ＣＳＦで数日間処置することである。現在用いられている治療法（プレリキサフォルとＧ−ＣＳＦ）でも、患者に必ずしも移植を保証できる十分な細胞が得られるわけではない。さらに、移植後には感染および疾患再発のリスクがある。
【００７４】
このような患者には、デキストラン硫酸がプレリキサフォルとＧ−ＣＳＦの救援治療または代替治療としての役割を果たす可能性がある。
【００７５】
本発明の実施形態のデキストラン硫酸には動員に対する作用のほかにも、ＨＳＣＴの転帰に好ましい影響を及ぼし得るというさらなる作用がある。デキストラン硫酸は、様々な細胞型に対して細胞分裂促進作用があり移植細胞の生着に有利なホルモン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の血漿中濃度を即時に上昇させる（Ｒｏｏｓ（１９９５）およびＺｉｏｎｃｈｅｃｋ（１９９５））。ＨＧＦはこのほか、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と組み合わせればＨＳＣ成長に対して相乗的増殖因子として機能する（Ｋｍｉｅｃｉｋ（１９９２）およびＷｅｉｍａｒ（１９９８））ことに加えて、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦによって誘導されるヒト臍帯血由来ＨＳＣのコロニー形成に対しても機能する（Ｇｏｆｆ（１９９６））。ＨＧＦはほかにも、原始造血細胞の成長および増殖に重要なシグナル伝達系、ｃ−ｋｉｔ／ＳＣＦが欠損したマウスの造血を一部回復させることが示されている（Ｙｕ（１９９８））。ＨＧＦはエリスロポエチンの存在下で、ＣＤ３４＋細胞からの赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）コロニーの形成を誘導する（Ｇａｌｉｍｉ（１９９４））。本発明者らの結果は、デキストラン硫酸がプレリキサフォルよりもＢＦＵ−Ｅを有意に多く誘導することを示しており、これはプレリキサフォルよりもＨＧＦの上昇が顕著であることに起因し得る。
【００７６】
デキストラン硫酸には、現在用いられている治療法と比較して、前駆細胞をはじめとする血液細胞の動員および移植後の転帰をいくつかの点で改善する可能性があり、このことは患者に大いに有益であると考えられる。デキストラン硫酸は一般に、循環血中のＷＢＣ、リンパ球、ＨＧＦおよび前駆細胞の産生量を増大させることが示されている。
【００７７】
上に挙げた特定の細胞および増殖因子の動員が増大すると、移植細胞の生着が良好で迅速になるため移植の結果が改善されることから、患者の転帰が大幅に改善するとものと考えられる。デキストラン硫酸治療により、リンパ球数およびＣＦＵ−ＧＥＭＭが増大して好中球減少症の期間が短縮され得るため、感染のリスクが低下し得る。このことはほかにも、患者の入院期間が短縮されることを意味する。さらに、デキストラン硫酸による動員を用いれば、より多くの患者がＨＳＣＴを受けることが可能となり得る。
【００７８】
動員効率が高くなれば治療期間が短縮されるため、患者に細胞回収を繰り返す必要性が少なくなり、したがって、副作用（主としてＧ−ＣＳＦの長期投与による）のリスクが低下する。デキストラン硫酸はＨＳＣの総産生量を増大させ、このことは、移植を保証するための最小量の動員ＨＳＣに達することに加えて、細胞回収の予測が向上することによって、患者の利益になる。
【００７９】
マウスでは、デキストラン硫酸で処置した幹細胞の方が未処置幹細胞よりも生着およびホーミングの効率が高いことが示されている（Ｈａｙａｋａｗａ（２００９））。このことは、デキストラン硫酸によって、さらに多くの移植が可能になることに加えて、ＨＳＣ移植の予測可能性が増大し、ＨＳＣＴ後の合併症が減少し、細胞回収を繰り返す必要性が少なくなり、より多くの患者でＨＳＣＴを保証するための最小量の細胞に達し、ＨＳＣＴ後の生着に成功する患者数が増加することによって、ＨＳＣＴの成功率が高くなる可能性があることを示唆している。
【００８０】
全生存期間が改善する機序については、リンパ球の生着および再構築が速くなることによってＧＶＴ効果が高くなり、残存癌が減少することが提唱されている（Ｐｏｒｒａｔａ（２００９））。単回療法では、デキストラン硫酸の投与によってリンパ球の放出がＧ−ＣＳＦまたはプレリキサフォルの単回投与の少なくとも２倍になる。デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦを併用すると、動員リンパ球の放出がＧ−ＣＳＦとプレリキサフォルを併用した場合の約２倍になる。
【００８１】
さらに、リンパ球の産生量の増大はほかにも、リンパ球の反復注入を用いて移植の転帰を改善する同種移植に有用なＤＬＩに有用である。
【００８２】
さらに、デキストラン硫酸によってＨＧＦがベースラインレベルの１００倍超増大し、プレリキサフォルの２５倍増大するが、このことは、１５分後に既にＨＧＦが即時に上昇する（１６０ｐｇ／ｍＬ未満から１６０００ｐｇ／ｍＬに）ことを示している。この程度のレベルであれば細胞増殖を誘導するのに十分である。
【００８３】
下の表１にデキストラン硫酸によって得られるいくつかの有益な効果をまとめる。
【００８４】
【表１】
0006339668.tif 000002
【００８５】
本発明の実施形態によるデキストラン硫酸を用いて、前駆細胞および／または幹細胞および／または標的白血球を任意選択でＨＧＦとともに動員することは、デキストラン硫酸を投与した対象から細胞を回収すること以外にも医学的および臨床的に使用し得る。したがって、上記のような様々な用途に従って対象の末梢血中に細胞を動員することを用い得る。例えば、ヒト対象の末梢血中に動員したＨＳＣを、特に限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、シェーグレン症候群および炎症性腸疾患を含めた様々な自己免疫疾患を治療する、予防する、または少なくともその症状を軽減するのに用いることができる。末梢血中に動員した幹細胞および／または前駆細胞のその他の用途は、心臓修復を含めた組織および器官の修復を誘導することであり得る。
【００８６】
ほかにも、リンパ球などの標的白血球を対象の末梢血中に動員することを様々な医学的用途に用いることができる。例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および乳癌を含めた様々な固形癌および血液癌を治療する、予防する、または少なくともその症状を軽減するのに末梢血中のリンパ球レベルを上昇させることを用いることができる。
【００８７】
したがって、本発明の実施形態によるデキストラン硫酸の投与は、必ずしも対象から細胞を回収する目的で細胞を動員するために用いなければならないわけではない。代わりに対象の末梢血中に所望の細胞のレベルまたは量を増大させる目的でデキストラン硫酸の投与を用いることが可能であり、この場合、細胞は対象で所望の機能を発揮し得る。
【００８８】
本発明の実施形態によるデキストラン硫酸は、平均分子量が３５００〜９５００Ｄａの範囲内にある低分子量デキストラン硫酸（ＬＭＷ−ＤＳ）である。
【００８９】
特定の実施形態では、デキストラン硫酸は平均分子量の範囲が４５００〜７０００Ｄａである。より好ましくは、デキストラン硫酸は平均分子量の範囲が４５００〜５５００Ｄａである、例えば平均分子量が４．６ｋＤａ、４．７ｋＤａ、４．８ｋＤａ、４．９ｋＤ、５．０ｋＤａ、５．１ｋＤａ、５．２ｋＤａ、５．３ｋＤａまたは５．４ｋＤａなどである。
【００９０】
本発明の実施形態に従って使用し得るデキストラン硫酸の例は、平均分子量が５１３９Ｄａであり、多分散度指数（ＰＤＩ）が１．２００９である。
【００９１】
特定の実施形態では、デキストラン硫酸は分子量分布が著しく狭い。このような実施形態では、デキストラン硫酸分子のほとんどが、それぞれ３５００〜９５００Ｄａの好ましい範囲内の分子量を有する。実施形態の一例では、分子量が８０００Ｄａを上回るデキストラン硫酸分子が２０％未満、好ましくは１５％未満であり、例えば、分子量が８０００Ｄａを上回るデキストラン硫酸分子が１０％未満または５％未満などである。上記のものに代えてまたは加えて、分子量が３０００Ｄａを下回るデキストラン硫酸分子が４０％未満、好ましくは３５％未満であり、例えば、分子量が３０００Ｄａを下回るデキストラン硫酸分子が３０％未満または２５％未満などである。
【００９２】
デキストラン硫酸はデキストランのポリアニオン性誘導体であり、硫黄を含んでいる。デキストラン硫酸の平均硫黄含有量は、好ましくは１５〜２０％、より好ましくは約１７％であり、一般にはグルコシル残基１個当たり硫酸基約２個に相当するものである。特定の実施形態では、デキストラン硫酸の硫黄含有量がデキストラン分子の可能な最大硫黄含有量に等しいか、少なくともこれに近い値である。
【００９３】
本発明の実施形態によるデキストラン硫酸は、デキストラン硫酸の薬学的に許容される誘導体として提供することができる。このような薬学的に許容される誘導体としては、デキストラン硫酸の塩および溶媒和物、例えばナトリウム塩またはカリウム塩が挙げられる。
【００９４】
デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体は、注射によって対象に投与するのが好ましく、特に静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射または（ｉ．ｐ．）腹腔内注射、好ましくはｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．によって投与するのが好ましい。用い得るその他の非経口投与経路としては、筋肉内注射および関節内注射が挙げられる。このような投与経路では、選択した溶媒または補形剤を用いた液体形態の製剤としてデキストラン硫酸を提供するのが好ましい。溶媒は水性溶媒、特に緩衝溶液であるのが有利である。このような緩衝溶液の非限定的な例には、クエン酸一水和物（ＣＡＭ）緩衝液などのクエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液がある。例えば、本発明の実施形態のデキストラン硫酸を０．９％ＮａＣｌ食塩水などの生理食塩水に溶かした後、任意選択で７５ｍＭ  ＣＡＭで緩衝し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを約５．９に調整する。このほか、食塩水などの水性注射液を含めた非緩衝溶液も可能である。さらに、緩衝液が望まれる場合、ＣＡＭ以外の緩衝系を使用することが可能である。
【００９５】
本発明の実施形態は注射に限定されるわけではなく、別法として経口経路、経鼻経路、頬側経路、経直腸経路、経皮経路、経気管経路、経気管支経路または局所経路を含めた他の投与経路を用いることができる。次いで、特定の投与経路に基づいて選択される適切な補形剤または担体を用いて、活性化合物のデキストラン硫酸を製剤化する。
【００９６】
デキストラン硫酸の適切な用量は、患者の大きさおよび体重、治療する患者の病態をはじめとする考慮事項に応じて異なり得る。特にヒト対象では、可能な用量範囲は１μｇ／ｋｇ体重〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．２５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。具体例としては、０．３ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重，１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば５ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重または５ｍｇ／ｋｇ体重〜１５ｍｇ／ｋｇ体重などが挙げられる。ほかにも、これより低い濃度、例えば０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重などを用いることが可能である。
【００９７】
本発明の実施形態のデキストラン硫酸は、単回ボーラス注射などの形態で単一の投与機会に投与することができる。このボーラス用量を極めて迅速に患者に投与してもよいが、デキストラン硫酸溶液が５〜１０分間などの数分間の時間をかけて患者に注入されるように注入するのが有利である。一般に、本発明の実施形態に従って患者に治療効果をもたらすには単回用量および注射または注入（またはその他の投与）で十分であると予想される。しかし、複数用量のデキストラン硫酸を様々な投与機会に投与することが可能である。例えば、単回ボーラス注射をデキストラン硫酸溶液の持続注入で補完することができる。
【００９８】
デキストラン硫酸は任意選択で、複数の投与機会に、例えば細胞動員当日に加えてＧ−ＣＳＦの投与前、細胞動員の当日に加えてＧ−ＣＳＦの投与前および投与時または細胞動員当日に加えてＧ−ＣＳＦの投与時などに投与してもよい。様々な投与機会に用いるデキストラン硫酸の具体的な用量は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、Ｇ−ＣＳＦの投与前および投与時の投与機会に細胞動員当日に用いる用量よりも少ないデキストラン硫酸用量を用いることが可能である。
【００９９】
実験
動員に対するデキストラン硫酸の効果の特徴を明らかにし、適切な用量、回収時間、投与様式およびプレリキサフォル（ＡＭＤ３１００）とＧ−ＣＳＦ（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標））を併用した現在用いられている治療法と比較した効果に関してさらに知見を得るため、マウス用いて一連の実験を実施した。
【０１００】
マウス
雌ＤＢＡ／２マウスをＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（オランダ）およびＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ドイツ）から入手した。全個体ともウプサラ大学の動物施設にて機関のガイドラインに従い、標準的な条件下、自由に摂餌および摂食させて飼育した。７〜４０週齢、体重１７〜３１ｇの個体を用いた。いずれの実験もスウェーデン、ウプサラ市の動物倫理委員会による承認を受けたものである。
【０１０１】
動員プロトコル
Ｇ−ＣＳＦ（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ社、オランダ）を０．３ｍｇ／ｍＬの無菌等張水溶液として調達し、通常の生理食塩水で５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。第−２日および第−１日の朝および晩にＧ−ＣＳＦを単回皮下注射として２．５μｇの用量で投与した。以下に挙げる様々な平均分子量のデキストラン硫酸を用いた：
Ｍｅｉｔｏ−平均分子量６９３９Ｄａ、名糖産業株式会社（東京、日本）から入手し、クエン酸一水和物（ＣＡＭ）緩衝液に溶かした；
ｐＫＣ−平均分子量５１３９Ｄａ、ｐＫ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ａ／Ｓ社（コペンハーゲン、デンマーク）から入手し、ＣＡＭ緩衝液または０．９％ＮａＣｌ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ社）に溶かした；およびＴｄＢ−平均分子量３．３ｋＤａ、ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社（ウプサラ、スウェーデン）から入手し、０．９％ＮａＣｌ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ社）に溶かした。
【０１０２】
ＡＭＤ３１００をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（ドイツ）から購入し、通常の生理食塩水で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。別途明記されない限り、第０日にマウスに１００ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸をｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．投与するか、５ｍｇ／ｋｇのＡＭＤ３１００をｓ．ｃ．投与した。対照群にはＣＡＭ緩衝液または０．９％ＮａＣｌをｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．投与した。全個体とも各溶液（２．５〜５ｍＬ／ｋｇ）を約５０〜１００μＬ投与した。
【０１０３】
名糖産業株式会社のバッチＮ−３１８８は分子量分布が以下の通りであった：
【表２】
0006339668.tif 000003
【０１０４】
ｐＫ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ａ／Ｓ社のバッチ３１４９７は分子量分布が以下の通りであった：
【表３】
0006339668.tif 000004
【０１０５】
ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社のバッチ２０３４１は分子量分布が以下の通りであった：
【表４】
0006339668.tif 000005
Ｍｐ＝ピーク平均分子量
Ｍｎ＝数平均分子量
ＡＭｗ＝重量平均分子量
【０１０６】
コロニー形成細胞アッセイ
イソフルラン麻酔下、ＥＤＴＡでフラッシュした（０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（Ｒｕｄｂｅｃｋ研究所によって調製された）のストック溶液を０．９％ＮａＣｌで１：２．５に希釈して調製した０．２Ｍ  ＥＤＴＡ）シリンジを用いて、致死的な心臓穿刺により末梢血の検体を採取した。
【０１０７】
ヘパリン（最終濃度１７．５ＩＥ／ｍＬ）を含むポリプロピレンチューブに血液（１００〜２００μＬ）を移した。塩化アンモニウム溶液（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）を用いて赤血球を除去した。残りの細胞を２％ウシ胎仔血清（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地に再懸濁させ、製造業者の説明書に従って、組換えサイトカインカクテルおよびペニシリン−ストレプトマイシンを添加したメチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ３４３４；ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）２ｍｌと混合した。ＨＰＣを含有する培養物１．１ｍＬを３５ｍｍディッシュ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社、ランズクルーナ、スウェーデン）に播き、５％ＣＯ２、３７℃の加湿チャンバ内に置いた。培養第１２日に総コロニー数を計数した。
【０１０８】
血液学的分析
イソフルラン麻酔下、ＥＤＴＡでフラッシュしたシリンジを用いた致死的な心臓穿刺により末梢血の検体を採取し、ＥＤＴＡ  １．６ｍｇを含むポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社、ランズクルーナ、スウェーデン）に移した。
【０１０９】
スウェーデン農業科学大学（ＳＬＵ）（ウプサラ、スウェーデン）で自動細胞計数器（Ａｄｖｉａ  ２１２０血液検査システム；Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、イリノイ州、米国）を用いて全血球計算値を得た。
【０１１０】
ＨＧＦ−ＥＬＩＳＡ
イソフルラン麻酔下（別途明記されない限り）、ＥＤＴＡでフラッシュした（上記の通りに調製した０．２Ｍ  ＥＤＴＡ）シリンジを用いて致死的な心臓穿刺により末梢血の検体を採取した。
【０１１１】
ＥＤＴＡ血液を３０００ｇで５分間遠心分離することにより血漿を調製し、分析まで２０℃で冷凍保存した。ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネアポリス、米国）を製造業者の説明書に従って実施した。
【０１１２】
統計
データを平均値±ＳＥＭで表す。スチューデントのｔ検定（両側、等分散）を用いて群間比較を実施した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて統計解析を実施した。ｐ値が０．０５未満の差を統計的に有意であるとした。
【０１１３】
デキストラン硫酸の末梢血細胞動員に関するｓ．ｃ．用量設定試験
マウス（ＤＢＡ／２Ｎ、８〜１４週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）をデキストラン硫酸（１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇ、ｐＫＣ）、ＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ、陽性対照）またはＣＡＭ緩衝液（陰性対照）のｓ．ｃ．注射により処置した。用いたＡＭＤ３１００の用量および細胞回収までの１時間は、マウスで報告されていた同薬剤の最適な投与レジメンである（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ（２００５））。血液学的分析を上記の通りに用いて血液を分析した。さらに詳細に述べると、最後の注射から３時間後（ＡＭＤ３１００では１時間後）、マウスを屠殺し、末梢血の血液学的鑑別分析を実施した。血清および／または血漿検体を採取し、分析まで−２０℃で保存した。ＥＤＴＡでフラッシュしたシリンジによる心臓穿刺により血液を採取し、細胞計数分析にはＥＤＴＡおよびレピルジンと混合し、ＨＧＦ分析にはＥＤＴＡのみと混合した。
【０１１４】
デキストラン硫酸投与の３時間後、循環血中の白血球（ＷＢＣ）、主要リンパ球（図１）およびＨＧＦ（図２）の用量依存性の増加が認められた。デキストラン硫酸１０〜５０ｍｇ／ｋｇおよびＡＭＤ３１００  ５ｍｇ／ｋｇの用量ではほぼ同じ効果が認められたのに対して、１５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸の効果はＡＭＤ３１００の効果よりも有意に増大した（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１）。デキストラン硫酸を５０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇで投与したところ、循環血中ＨＧＦのレベルが有意に増大し（ｐ＜０．００１）（図２）、ＡＭＤ３１００よりも顕著なものであった。
【０１１５】
デキストラン硫酸（ＬＭＷ−ＤＳ）およびＡＭＤ３１００をそれぞれ投与した後の血液パラメータを表２にまとめる。表には、ＬＭＷ−ＤＳまたはＡＭＤ３１００投与後の末梢血の血液学的変数が対照（ＣＡＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）またはＡＭＤ３１００（†＜０，０５、††＜０．０１、†††＜０．００１）と比較して示されている。
【０１１６】
【表５】
0006339668.tif 000006
【０１１７】
デキストラン硫酸の末梢血細胞動員に関するｉ．ｖ．用量設定試験
ＤＢＡ／２ＯｌａＨｓｄマウス（７〜１２週齢、Ｈａｒｌａｎ社）に２５〜２００ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸（Ｍｅｉｔｏ）ｉ．ｖ．を用いて動員を実施した。陽性対照および陰性対照としてＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）またはＣＡＭ緩衝液（ｉ．ｖ．）を用いた。ＣＦＣアッセイおよび血液学的分析を上記に通りに用いて血液を分析した。
【０１１８】
デキストラン硫酸（２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇ、Ｍｅｉｔｏ）の注射により、デキストラン硫酸注射の３０分後に既に末梢血中のＷＢＣ（ｐ＜０．０１）、主としてリンパ球（ｐ＜０．００１）がＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ）および対照ＣＡＭ緩衝液単回ｉ．ｖ．よりも有意に増加した（図３）。デキストラン硫酸の４種類の用量で得られた動員レベルはＡＭＤ３１００よりも有意に増大していた。
【０１１９】
ＣＦＣでもデキストラン硫酸の動員効果は最低用量（２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ＜０．００１）で既に有意に明らかであった。この効果は用量依存性に増大するように思われた。総ＣＦＣに関しては、２００ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸を投与した後の効果は、５ｍｇ／ｋｇのＡＭＤ３１００を投与した後の効果とほぼ同じであった（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０１２０】
ＡＭＤ３１００（ｓ．ｃ．）およびデキストラン硫酸（ｉ．ｖ．）の単回用量投与後のＣＦＣの増加はＷＢＣの全般的増加（対照の３〜５倍）よりも高かった（対照の６〜１２倍）。このことは前駆細胞の動員に特異的な作用機序があることを示唆するものと考えられる（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０１２１】
このほか前駆細胞の様々なサブタイプ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＢＦＵ−Ｅに対する動員効果を試験し（図４Ａおよび４Ｂ）、デキストラン硫酸はＡＭＤ３１００よりもＢＦＵ−Ｅを増加させる効果が高いように思われた。
【０１２２】
デキストラン硫酸投与経路の末梢血細胞動員に対する効果
ＤＢＡ／２Ｎマウス（９〜１０か月齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）に１００ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸（Ｍｅｉｔｏ、ｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．）を用いて動員を実施した。ＣＦＣアッセイおよび血液学的分析を上記の通りに用いて血液を分析した。
【０１２３】
１００ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸をｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．で投与した後の末梢血細胞に対する効果を比較した（ｎ＝５）。２つの投与経路について、投与３０分後に細胞を回収した。投与３０分後の循環血中のＷＢＣ、リンパ球、ＣＦＣ、ＣＦＣサブタイプのいずれについても異なる投与経路間に有意差は認められなかった（表３を参照されたい）
【０１２４】
【表６】
0006339668.tif 000007
【０１２５】
デキストラン硫酸の末梢血細胞動員に対する時間−効果関係
ＤＢＡ／２Ｎマウス（８〜１４週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）に５０ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸（ｐＫＣ、ｉ．ｖ．）または１００ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸（Ｍｅｉｔｏ、ｉ．ｖ．）を用いて動員を実施した。陰性対照としてＣＡＭ緩衝液（ｉ．ｖ．）を用いた。ＣＦＣアッセイ、血液学的分析およびＨＧＦ−ＥＬＩＳＡを用いて血液を分析した。
【０１２６】
ｉ．ｖ．投与したデキストラン硫酸（１００ｍｇ／ｋｇ）の動員効果により、投与の約３０分後にＷＢＣ数およびリンパ球数が最大になってから減少したが、投与の３時間後でも依然として高い値を示した。投与後７．５分で既にピークが始まる極めて迅速なＣＦＣ増加（図５）がみられた。前駆細胞の様々なサブタイプがピークに達する時間はわずかに異なっており、ＢＦＵ−Ｅが投与後７．５分、ＣＦＵ−ＧＭ／ＣＦＵ−ＧＥＭＭが投与後１５〜３０分であった。ＨＧＦは１５分後に最高レベルに増大し（１５９６０ｐｇ／ｍＬ）、その後、低下した。しかし、ＨＧＦは別の実験で測定したものであり、７．５分後には検体採取していない（表４を参照されたい）。ＡＭＤ３１００では投与後１時間でＨＧＦレベルが６５０±２３０ｐｇ／ｍＬに増大した。
【０１２７】
【表７】
0006339668.tif 000008
【０１２８】
このように、マウスにデキストラン硫酸（１００ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．投与すると末梢血中のＷＢＣ、特にリンパ球（Ｌｙｍｐｈ）の数が対照（ＣＡＭ）に比して迅速に増加した。デキストラン硫酸は血小板（ＰＬＴ）数には影響を及ぼさなかった。デキストラン硫酸はこのほか、血漿中のＨＧＦ量を迅速に増加させた。表４には結果が平均±ＳＥＭで報告されており、ｎ．ａ．は分析していないという意味である。統計はＣＡＭ緩衝液と比較したものであり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【０１２９】
末梢血細胞動員に対するデキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦの併用
アフェレーシス前の患者に実施される標準的な治療は、Ｇ−ＣＳＦを最大１週間、連日注射することを基本とするものである。臨床的にはデキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦを併用することが可能である。マウスを用いた試験では２．５μｇ／個体のＧ−ＣＳＦが１日２回（８時間置き）、２日間投与された（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ（１９９９））。Ｇ−ＣＳＦとデキストラン硫酸の併用の効果を検討するため、ＤＢＡ／２ＯｌａＨｓｄマウス（１０〜１５週齢、Ｈａｒｌａｎ社）をＧ−ＣＳＦで２日間処置し（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）、２×２．５μ／日、ｓ．ｃ．）、第３日にデキストラン硫酸（５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、Ｍｅｉｔｏ、ｉ．ｖ．）、ＣＡＭ（陰性対照、ｉ．ｖ．）またはＡＭＤ３１００（陽性対照、５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）のいずれかを注射した。ＣＦＣアッセイおよび血液学的分析を用いて血液を分析した。
【０１３０】
Ｇ−ＣＳＦによりＷＢＣ数が通常よりも増加し（ＣＡＭ単独投与については図１および３を参照されたい）、これにデキストラン硫酸（２５ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）を加えることにより、ＷＢＣ数およびリンパ球数が相乗的に増加した。ＷＢＣとリンパ球の増加はＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ）投与後よりもはるかに顕著であった（図６）。
【０１３１】
Ｇ−ＣＳＦに用量１００ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸を加えることにより末梢血中の前駆細胞が大幅かつ相乗的に増加し、デキストラン硫酸は動員剤としてＡＭＤ３１００よりも効果的であるように思われる（図７Ａおよび７Ｂ）。デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦの併用の方がＧ−ＣＳＦとＡＭＤ３１００の併用よりも多数のＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＢＦＵ−Ｅ前駆細胞を動員した（図７Ｂ）。
【０１３２】
今回実施した実験では、デキストラン硫酸がｓ．ｃ．投与後、ｉ．ｖ．投与後ともにＷＢＣ、リンパ球およびＣＦＣ動員に対して用量−効果関係を示すことが明らかになった。ＣＦＣの増加はＷＢＣの全般的な増加（対照の４〜５倍）よりも高い（対照の６〜１２倍）ように思われた。投与したデキストラン硫酸（１００ｍｇ／ｋｇ）の時間効果は、ＣＦＣ、ＷＢＣおよびリンパ球の迅速な増加であった。ピークは７．５分後に既に始まっており、これはＡＭＤ３１００よりもはるかに早いものであった。デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦの併用では末梢血中のＣＦＣが予想外に顕著に増加し、最大で１８０００ＣＦＣ（対照の１００倍超）に達し、ＡＭＤ３１００とＧ−ＣＳＦの併用よりも効果が高いように思われた（図８を参照されたい）。デキストラン硫酸投与によりＷＢＣおよびリンパ球の動員が有意に高くなったほか、単剤療法で至適用量のＡＭＤ３１００よりも多数のＢＦＵ−Ｅを動員するように思われた（図７Ａ、７Ｂ、８および９を参照されたい）。デキストラン硫酸とＧ−ＣＳＦの併用投与によりＷＢＣおよびリンパ球の動員が有意に高くなったほか、ＡＭＤ３１００よりも多数のＣＦＣ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭを動員するように思われた（図７Ａ、７Ｂ、８および９を参照されたい）。デキストラン硫酸により投与後１５分で血漿中のＨＧＦが高レベルに増大し（１６０未満ｐｇ／ｍＬから１６０００ｐｇ／ｍＬ）、投与１時間後にはＡＭＤ３１００の２５倍になった。
【０１３３】
様々な平均分子量の低分子量デキストラン硫酸による造血細胞動員の比較
動物
雌ＤＢＡ／２Ｏｌａマウス（Ｈａｒｉａｎ社、オランダ）をウプサラ大学の動物施設にて標準的な条件下、自由に摂餌および摂食させて飼育した。体重１７〜２２ｇの個体を用いた。
【０１３４】
実験計画
ＤＢＡ／２雌を以下の４つのグループ：１）賦形剤（ＮａＣｌ水溶液）（ｎ＝８）、２）５０ｍｇ／ｋｇデキストラン硫酸ＤＳ３（ｎ＝５）、３）５０ｍｇ／ｋｇデキストラン硫酸ＤＳ５（ｎ＝５）および４）５０ｍｇ／ｋｇデキストラン硫酸ＤＳ５  ＰＮＢ（ｎ＝５）に分けた。グループ４）は、麻酔プロトコルの変化が動員に影響を及ぼすかどうかを評価するため、イソフルランの代わりにペントバルビタールナトリウム（ＰＮＢ）で鎮静させた。
【０１３５】
物質の投与
ＤＳ５（平均分子量５．１ｋＤａ、ｐＫＣ社（デンマーク）、バッチ３１４９７）およびＤＳ３（平均分子量３．３ｋＤａ、ＴｄＢ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｃｙ社（ウプサラ、スウェーデン）、バッチ２０３４１）を０．９％ＮａＣｌ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ社）に溶かして２０ｍｇ／ｍＬとし、２０μｍフィルターでろ過して無菌溶液を得た。マウスに２．５ｍＬ／ｋｇ（約５０μＬ）を尾静脈から静脈内投与した。
【０１３６】
血液学的分析
結果を図１０および表６に示す。ＤＳ３では、ＷＢＣ、リンパ球ともに全体として有意な変化が全くみられなかったのに対して、好中球にわずかな減少が認められた。
【０１３７】
【表８】
0006339668.tif 000009
【０１３８】
図１１に示されるように、ＤＳ３はＣＦＣ数の有意な増加は引き起こさなかった。ＤＳ５が麻酔薬の使用と関係なくＨＧＦの有意な増加を引き起こしたのに対して、これより低分子量の物質（ＤＳ３）ではＨＧＦの有意な増加はみられなかった（図１２を参照されたい）。ここに記載されているデータは、ＤＳ３が動員剤としてＤＳ５よりも劣るものであることを示している。ＤＳ３では賦形剤よりも多くＨＧＦが増加することはない。
【０１３９】
上記の実施形態は本発明のいくつかの具体例として理解されるべきである。当業者には、本発明の範囲を逸脱することなく本発明の実施形態に様々な修正、組合せおよび改変を実施し得ることが理解されよう。特に、技術的に可能である場合、様々な実施形態の異なる解決方法の一部を別の構成で組み合わせることができる。
【０１４０】
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【図１】
0006339668.tif 000010
【図２】
0006339668.tif 000011
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
0006339668.tif 000019
【図９】
0006339668.tif 000020
【図１０】
0006339668.tif 000021
【図１１】
0006339668.tif 000022
【図１２】
0006339668.tif 000023
【図１３】
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