(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｈ）を含む、ＤＮＡ合成反応に用いる組成物：
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｂ）鋳型となる核酸；
（ｃ）反応緩衝剤；
（ｄ）２価の金属イオン；
（ｅ）少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド；
（ｆ）少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｇ）最終濃度が２μＭ以上のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  I；並びに
（ｈ）最終濃度が０．２容量％以上のｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒ（ＰＮＳＥ）。
【請求項２】
最終濃度が４μＭ以上のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Iを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
最終濃度が０．８容量％以上のｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒ（ＰＮＳＥ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を調製する工程、及び前記工程で調製した組成物をＤＮＡ合成反応に用いる工程、を包含するＤＮＡ合成方法。
【請求項５】
下記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、遺伝子型の決定方法：
（Ａ）請求項４に記載のＤＮＡ合成方法により二本鎖ＤＮＡを増幅する工程；
（Ｂ）増幅された二本鎖ＤＮＡを融解して融解曲線を作成する工程；及び
（Ｃ）融解曲線から遺伝子型を同定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターカレーティング色素によるＤＮＡ合成反応の阻害が軽減又は解消されたＤＮＡ合成用の組成物、及び当該組成物を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ合成方法、特にポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）法は、試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、近年、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等幅広い分野において不可欠の実験手法となっている。また、ＰＣＲによる核酸の増幅を、例えばインターカレーティング色素を利用して経時的に測定することで、鋳型となるＤＮＡの定量を精度良く行う方法が開発されている（非特許文献１）。この方法は、それまで知られていた定量的ＰＣＲと区別する意味で、リアルタイムＰＣＲ法と呼ばれている。
【０００３】
インターカレーティング色素を用いたリアルタイムＰＣＲ法では、非特異的な増幅産物の有無を確認するために、ＰＣＲ後に融解曲線分析が利用される（非特許文献２）。近年、この融解曲線分析を既知の一塩基多型（ＳＮＰｓ）の同定や未知のＳＮＰｓの探索に利用する技術が開発され、高解像度融解曲線（ＨＲＭ）解析と呼ばれている。ＨＲＭ解析は、ＤＮＡメチル化のスクリーニングにも応用されている。ＨＲＭ解析が開発された当初は、リアルタイムＰＣＲ後のＰＣＲ産物を精製した後、高濃度のインターカレーティング色素を添加し、これを融解曲線分析に供することによって単一塩基の変異を検出する方法であった（非特許文献３）。この方法においてリアルタイムＰＣＲ後に直接融解曲線分析がなされていないのは、インターカレーティング色素として利用されたＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉが、融解曲線分析により単一塩基の変異を検出できる程度の高い濃度で反応液中に存在する場合にＰＣＲを阻害する性質を有するためである。
【０００４】
近年、反応液中に高濃度で存在していてもＰＣＲの阻害効果が穏やかなＬＣＧｒｅｅｎ等の飽和色素と呼ばれるインターカレーティング色素が見出され、このような色素を利用してリアルタイムＰＣＲから融解曲線分析までを閉鎖系で行う方法が開発された（非特許文献４）。しかしながら、飽和色素と呼ばれるインターカレーティング色素はリアルタイムＰＣＲに一般的に使用されているＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉと比較して非常に高価であるため（非引用文献５）、代替手段の提供が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”  （Ｎ  Ｙ）  １９９３  Ｓｅｐ；１１（９）：１０２６−３０．
【非特許文献２】”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”  １９９７  Ｆｅｂ  １５；２４５（２）：１５４−６０．
【非特許文献３】“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２００１年、第４７巻、第４号、、ｐ６３５−４４．
【非特許文献４】“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２００３年、第４９巻、第６号、ｐ８５３−６０．
【非特許文献５】“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、２００７年、第３５巻、第１９号、ｅ１２７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、インターカレーティング色素によるＤＮＡ合成反応の阻害が軽減又は解消されるＤＮＡ合成用組成物、当該組成物を用いる方法、及びより経済的なＰＣＲ−ＨＲＭ解析用の組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、インターカレーティング色素によるＰＣＲの阻害が界面活性剤を用いて軽減又は解消可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明の第１の発明は、
［１］（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）鋳型となる核酸、（ｃ）反応緩衝剤、（ｄ）２価の金属イオン、（ｅ）少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、（ｆ）少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｇ）２μＭ以上のインターカレーティング色素、並びに（ｈ）０．２容量％以上の界面活性剤、を含む、ＤＮＡ合成用組成物、
［２］４μＭ以上のインターカレーティング色素を含む、［１］に記載の組成物、
［３］０．８容量％以上の界面活性剤を含む、［１］に記載の組成物、
［４］インターカレーティング色素が、非対称のシアニン系色素である、［１］に記載の組成物、
［５］非対称のシアニン系色素が、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉである、［４］に記載の組成物、
［６］界面活性剤が、非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤である、［１］に記載の組成物、
［７］界面活性剤が、ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒである、［６］に記載の組成物、
［８］［１］〜［７］のいずれか一項に記載の組成物を調製する工程、及び前記工程で調製した組成物をＤＮＡ合成反応に供する工程、を包含するＤＮＡ合成方法、
［９］（Ａ）［８］に記載のＤＮＡ合成方法により二本鎖ＤＮＡを増幅する工程、（Ｂ）増幅された二本鎖ＤＮＡを融解して融解曲線を作成する工程、及び（Ｃ）融解曲線から遺伝子型を同定する工程、を含む、遺伝子型の決定方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、インターカレーティング色素によるＤＮＡ合成反応の阻害が軽減又は解消されるＤＮＡ合成用の組成物、及び当該組成物を用いる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１における、界面活性剤未添加の反応液でのリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図２】実施例１における、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００を添加した反応液でのリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図３】実施例１における、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ（登録商標）  ２０を添加した反応液でのリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】実施例１における、界面活性剤としてＯｃｔｙｌ−Ｓ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅを添加した反応液でのリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図５】実施例１における、界面活性剤としてＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０を添加した反応液でのリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図６】実施例１における、界面活性剤としてｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒ（以下、ＰＮＳＥと記載することがある）を添加した反応液でのリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図７】実施例２における、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図８】実施例２における、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）にＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩの追加とＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００の添加を行った反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図９】実施例２における、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）にＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩの追加とＴｗｅｅｎ（登録商標）  ２０の添加を行った反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図１０】実施例２における、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）にＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩの追加とＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０の添加を行った反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図１１】実施例２における、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）にＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩの追加とＰＮＳＥの添加を行った反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図１２】実施例３における、１×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含む反応液を用いたリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値を示す図である。図１２において、縦軸はＣｔ値を、横軸は反応液中のＰＮＳＥの濃度を示す。
【図１３】実施例３における、２×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含む反応液を用いたリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値を示す図である。図１３において、縦軸はＣｔ値を、横軸は反応液中のＰＮＳＥの濃度を示す。
【図１４】実施例３における、３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含む反応液を用いたリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値を示す図である。図１４において、縦軸はＣｔ値を、横軸は反応液中のＰＮＳＥの濃度を示す。
【図１５】実施例３における、４×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含む反応液を用いたリアルタイムＰＣＲにより得られたＣｔ値を示す図である。図１５において、縦軸はＣｔ値を、横軸は反応液中のＰＮＳＥの濃度を示す。
【図１６】実施例４における、０．３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、界面活性剤の添加を行わなかった反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図１７】実施例４における、０．３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、１．５％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図１８】実施例４における、０．３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、２％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図１９】実施例４における、０．３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、２．５％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図２０】実施例４における、０．３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、３％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図２１】実施例４における、２×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、界面活性剤の添加を行わなかった反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図であり、この反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでは増幅産物が得られず、融解曲線が得られなかったことを示す図である。
【図２２】実施例４における、２×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、１．５％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図２３】実施例４における、２×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、２％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図２４】実施例４における、２×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、２．５％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図２５】実施例４における、２×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、３％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図２６】実施例４における、３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、界面活性剤の添加を行わなかった反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図であり、この反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでは増幅産物が得られず、融解曲線が得られなかったことを示す図である。
【図２７】実施例４における、３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、１．５％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図２８】実施例４における、３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、２％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図２９】実施例４における、３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  ＧｒｅｅｎＩを含み、２．５％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【図３０】実施例４における、３×濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含み、３％のＰＮＳＥを添加した反応液を用いたリアルタイムＰＣＲでの融解曲線分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（１）本発明の組成物
本発明の組成物は、ＤＮＡ合成反応に供するための組成物であって、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）鋳型となる核酸、（ｃ）反応緩衝剤、（ｄ）２価の金属イオン、（ｅ）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ、（ｆ）少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｇ）インターカレーティング色素、並びに（ｈ）界面活性剤を含む。
【００１２】
本発明の組成物を用いたＤＮＡ合成反応では、インターカレーティング色素によるＤＮＡ合成反応の阻害が、界面活性剤によって軽減又は解消される。このため本発明の組成物は、特にインターカレーティング色素を用いたリアルタイムＰＣＲや、高解像度融解曲線（ＨＲＭ）解析に適している。
【００１３】
前記の本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば特に限定はない。本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来ＤＮＡポリメラーゼ等）やＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）等の古細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが例示される。また、ＤＮＡポリメラーゼは、天然由来酵素又は組換体酵素のいずれも本発明に使用でき、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施されたＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用できる。
【００１４】
本発明の組成物には、２種類以上のＤＮＡポリメラーゼが含まれていても良い。２種類以上のＤＮＡポリメラーゼとしては、３´→５´エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３´→５´エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせが例示される。なお、このような２種類のＤＮＡポリメラーゼを含む反応液でＰＣＲを行う技術は、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＰＣＲ）として知られている。
【００１５】
本発明の組成物中のＤＮＡポリメラーゼの濃度は、ＤＮＡ合成反応が実施可能な濃度であれば特に限定はなく、例えばＰＣＲが実施可能な濃度が例示される。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応液量２５μＬでＰＣＲを行う場合、反応液中のＤＮＡポリメラーゼの量は０．１２５〜５Ｕ程度にすればよい。なお、本明細書に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性は、市販の酵素の表示に基づくものであり、例えば、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型／プライマーとして用い、活性測定用反応液（２５ｍＭ  ＴＡＰＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、各２００μＭ  ｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＴＴＰ、１００μＭ  ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ  活性化サケ精子ＤＮＡ）中にて、７４℃において３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕとする。
【００１６】
本発明の組成物に含まれる鋳型となる核酸は、本発明の組成物を用いたＤＮＡ合成反応において鋳型となる核酸であれば特に限定はなく、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても良い。
【００１７】
本明細書において反応緩衝剤とは、反応溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。一般に弱酸とその塩、あるいは弱塩基とその塩の混合溶液は強い緩衝作用を持つので、反応緩衝剤としてｐＨコントロールの目的で広く用いられている。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物のｐＨは、ＰＣＲが実施される通常の範囲、例えばｐＨ８．０〜ｐＨ９．５の範囲に設定されるのが適当である。
【００１８】
本発明の組成物に含まれる２価の金属イオンとしては、マグネシウムイオン、マンガンイオン、及びコバルトイオンが例示される。各ＤＮＡポリメラーゼに適する２価の金属イオンとその濃度は、当該分野で知られている。２価の金属イオンは塩化物、硫酸塩、又は酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物中の２価の金属イオンの濃度としては、例えば０．５〜２０ｍＭが例示される。
【００１９】
デオキシリボヌクレオチドは、有機塩基に結合したデオキシリボースにホスホエステル結合を介してリン酸基が結合した化合物である。それぞれアデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有する４種のデオキシリボヌクレオチドが天然型ＤＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略されることが多い。デオキシリボヌクレオチドは、遊離の一リン酸型、二リン酸型及び三リン酸型（すなわち、リン酸基が、それぞれ、１つ、２つ又は３つのリン酸部分を有する）を含む。また、塩基部分にヒポキサンチンやウラシルを有するデオキシリボヌクレオチド三リン酸も核酸合成反応に使用できることが知られている。本発明には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）及びそれらの誘導体の少なくとも１種が使用される。本発明の組成物に含まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸としては、好適にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの４種類の混合物が例示される。
【００２０】
オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型となる核酸の核酸配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型となる核酸に対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。プライマーの鎖長は、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えば公知の方法により化学的に合成することができる。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。
【００２１】
本明細書においてインターカレーティング色素とは、二本鎖核酸へのインターカレーションにより蛍光が増強される色素のことをいう。ある種のインターカレーティング色素は、ＰＣＲを阻害することが知られており、例えばＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉは、約１μＭ（×０．５濃度；製品の２０，０００倍希釈）以上の濃度で、ＰＣＲを強く阻害することが知られている。本発明の組成物は、このようなインターカレーティング色素によるＰＣＲの阻害を軽減又は解消できる。発明におけるインターカレーティング色素としては、ＰＣＲを阻害する作用があるインターカレーティング色素であれば特に限定はないが、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６２、ＰＯＰＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−１、及びＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅが好適に例示され、中でもＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉがより好適に例示される。
【００２２】
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉは、ライフテクノロジーズ社から購入可能な非対称シアニン系色素であり、その構造はＺｉｐｐｅｒ  Ｈら（“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、２００４年、第３２巻、第１２号、ｅ１０３）により明らかにされている。Ｚｉｐｐｅｒ  Ｈらによれば、ライフテクノロジーズ社より販売されているＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＩのＤＭＳＯ溶液の１０，０００倍希釈液（×１濃度）のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉのモル濃度は、約２μＭである。
【００２３】
本発明の組成物におけるインターカレーティング色素の濃度としては、より解像度が高い融解曲線分析のため、あるいはより高い蛍光強度を得るために、好ましくは２μＭ（１×濃度）以上、より好ましくは２μＭ（１×濃度）〜８μＭ（４×濃度）、より好ましくは３μＭ（１．５×濃度）〜８μＭ（４×濃度）、さらにより好ましくは４μＭ（２×濃度）〜８μＭ（４×濃度）が例示される。
【００２４】
本発明の組成物に含まれる界面活性剤は、インターカレーティング色素によるＤＮＡ合成反応の阻害を軽減又は解消可能なものであれば特に限定はないが、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（１０）  ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、及びＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０（Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）等の非イオン性界面活性剤、ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒ（ＰＮＳＥ）等の陰イオン性界面活性剤、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、及びコカミドプロピルベタイン等の両性界面活性剤が例示され、そのうちＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０、及び
ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒが好適に例示され、中でもｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒがより好適に例示される。
【００２５】
本発明の組成物に含まれる界面活性剤の濃度としては、インターカレーティング色素によるＤＮＡ合成反応の阻害を軽減又は解消することが可能な濃度であれば特に限定はないが、例えば０．２容量％以上、好ましくは０．４容量％以上、より好ましくは０．８容量％以上、さらにより好ましくは０．８容量％〜３．２容量％が例示される。
【００２６】
（２）本発明のＤＮＡ合成方法
本発明のＤＮＡ合成方法は、本発明の組成物をＤＮＡ合成反応に供することにより行われる。本発明のＤＮＡ合成方法は、インターカレーティング色素によるＤＮＡ合成反応の阻害が軽減又は解消される組成物を用いるため、特にインターカレーティング色素を用いた定量的なＤＮＡ増幅反応に有用である。
【００２７】
本発明のＤＮＡ合成方法としては、ＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する反応を利用すればよく、このようなＤＮＡ合成反応としては、プライマー伸長反応、逆転写反応、ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法等の当分野で周知のＤＮＡ合成反応が例示され、好適にはＰＣＲが利用できる。本発明のＤＮＡ合成方法にＰＣＲを利用する場合、ＰＣＲの温度サイクル条件としては一般的な条件が適用できる。例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、又は「シャトルＰＣＲ」［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸  酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６）］と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応によりＰＣＲが実施される。
【００２８】
本発明のＤＮＡ合成方法においては、ＤＮＡ合成の過程をインターカレーティング色素
の蛍光によりモニタリングしてもよい。ＤＮＡ合成過程のモニタリングには、市販のリアルタイムＰＣＲ用装置、例えばＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）を用いればよい。
【００２９】
（３）本発明の遺伝子型の決定方法
本発明の遺伝子型の決定方法は、（Ａ）本発明の組成物を用いて二本鎖ＤＮＡを増幅する工程、（Ｂ）増幅された二本鎖ＤＮＡを融解して融解曲線を作成する工程、及び（Ｃ）融解曲線から遺伝子型を同定する工程を含む。本発明の遺伝子型の決定方法の典型例は、ＰＣＲ−ＨＲＭ解析である。本発明の遺伝子型の決定方法は、安価なＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等をインターカレーティング色素として利用できるため、ＨＲＭ解析用として一般的なＬＣＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ９、又はＥｖａＧｒｅｅｎ等の高価なインターカレーティング色素を用いる遺伝子型の決定方法と比べて、経済的である。本発明の遺伝子型の決定方法には、あるサンプルについて既知のＳＮＰｓ等の多型を決定する方法、未知のＳＮＰｓ等を探索する方法、あるサンプルについてのＤＮＡメチル化の有無を決定する方法、及びＤＮＡメチル化のスクリーニング方法が含まれる。
【００３０】
本発明の遺伝子型の決定方法における工程（Ａ）の本発明の組成物を用いて二本鎖ＤＮＡを増幅する工程は、前記の「（２）本発明のＤＮＡ合成方法」において例示されたＤＮＡの合成方法を用いて実施することができ、好適にはＰＣＲによって実施できる。
【００３１】
工程（Ｂ）の増幅された二本鎖ＤＮＡを融解して融解曲線を作成する工程は、工程（Ａ）によって増幅された二本鎖ＤＮＡの温度上昇に伴う融解の過程をインターカレーティング色素由来の蛍光シグナルによってモニタリングし、温度に対して蛍光強度をプロットすることにより実施される。上記の工程（Ａ）によって増幅された二本鎖ＤＮＡは、増幅反応後に熱変性と二本鎖ＤＮＡの形成の工程を経て得られた二本鎖ＤＮＡであってもよい。例えば、工程（Ａ）をＰＣＲにより実施する場合、ＰＣＲ後の反応液、又はＰＣＲ後に熱変性と徐冷を行ったＰＣＲ反応液の温度を徐々に上昇させ、この間にインターカレーティング色素に由来する蛍光シグナルの強度を測定し、測定された蛍光強度を温度に対してプロットすればよい。また、融解曲線は、遺伝子型の決定が容易になるように、例えば温度に対して蛍光強度の一次微分の負の値をプロットして作成してもよい。
【００３２】
工程（Ｃ）の融解曲線から遺伝子型を同定する工程は、例えば遺伝子型を同定しようとする試料を鋳型に増幅された二本鎖ＤＮＡを用いて工程（Ｂ）により作成した融解曲線を、核酸配列を確認済みの対照を鋳型にした場合の融解曲線と比較し、その差を識別することによって実施される。
【００３３】
上記の工程（Ｂ）と工程（Ｃ）による融解曲線解析は、例えばＲｅｅｄ  ＧＨ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４年  Ｏｃｔ、第５０巻、第１０号、ｐ１７４８−５４．）に記載の方法に従って行うことができる。また、解析装置として、例えば、ＨＲＭ解析装置として知られているＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（ＩｄａｈｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）やＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。以下、特段の記載がない％は、全て容量％を示す。
【００３５】
実施例１  インターカレーティング色素によるＰＣＲ阻害の界面活性剤による軽減
ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）の標準の反応液組成にさらにＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを加えたＰＣＲ反応液を用いて、インターカレーティング色素によるＰＣＲ阻害と、界面活性剤によるその阻害の抑制効果について評価した。界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０、Ｏｃｔｙｌ−Ｓ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０、及びｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒ（以下、ＰＮＳＥ）を使用した。ＰＣＲの鋳型としては、５００ｎｇのＨｕｍａｎ  ＨＬ６０  ｃｅｌｌ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用いた逆転写反応によって得られたｃＤＮＡのうち、１０ｐｇ  ＲＮＡ相当量を用いた。プライマー対としては、Ａｃｔｉｎ  ｂｅｔａ  ｃＤＮＡ領域の３８１ｂｐの領域を標的配列とする、配列表の配列番号：１の核酸配列からなるプライマー、及び配列表の配列番号：２の核酸配列からなるプライマーを用いた。
【００３６】
ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）にＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを追加しないＰＣＲ反応液として、１０ｐｇ  ＲＮＡ相当量のｃＤＮＡ、０．２μＭ  ｅａｃｈのプライマー、１ｘ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）、及び０．６％の各種界面活性剤を含む２５μＬの反応液、並びに界面活性剤を添加しない以外は上記と同様の組成の２５μＬの反応液（計６種類）を、氷上にて調製した。また、上記と同様の反応液組成に加え、さらに０．３ｘ濃度に相当する  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（３ｘ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ溶液を反応液２５μＬ当たり２．５μＬ使用）、又は０．６ｘ濃度に相当するＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（６ｘ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ溶液を反応液２５μＬ当たり２．５μＬ使用）を含む２５μＬの反応液を調製した（計１２種類）。次に、これらのＰＣＲ反応液を、９５℃、３０ｓｅｃの初期変性を行った後に、９５℃、５秒〜６０℃、３０秒を１サイクルとする４０サイクルのリアルタイムＰＣＲに供した。なお、上記のリアルタイムＰＣＲには、反応装置としてＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （タカラバイオ社製）を用いた。
【００３７】
各反応液の増幅産物をモニタリングした結果を図１〜６に示す。その結果、界面活性剤を未添加の場合には、０．３ｘ、又は０．６ｘ濃度に相当する量のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを追加した反応液においてＣｔ値がかなり遅れていたのに対し、各種界面活性剤を添加した場合には、増幅産物が確認できなかったＯｃｔｙｌ  Ｓ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅを添加した反応液を除いて、Ｃｔ値が遅れることなく良好な反応性を示した。このことは、界面活性剤の添加によって、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉに基因するＰＣＲ阻害効果が軽減又は解消されたことを示す。
【００３８】
本実施例により、インターカレーティング色素によるＰＣＲ阻害は、界面活性剤によって軽減又は解消することが可能であり、従来は困難と考えられていた高濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ存在下でのＰＣＲが可能であることが示された。
【００３９】
実施例２  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いたＨＲＭ解析
実施例１で高濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ存在下でのＰＣＲが可能であることが示されたことにより、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いてＰＣＲから融解曲線分析までを閉管（ｃｌｏｓｅｄ−ｔｕｂｅ）で行うＨＲＭ解析（Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）が可能であると考えた。そこで、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いたＨＲＭ解析について試験した。
【００４０】
ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ  ＨＲＭ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に含まれるＡＡ、ＡＧ、ＧＧのａｌｌｅｌｅを持つ鋳型溶液（２０ｘ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）、及びプライマー混合液（２０ｘ  ｐｒｉｍｅｒ）を用い、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）の標準の反応液組成に加えて各種界面活性剤を添加し、さらにＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを追加した反応液を用いて、ＨＲＭ解析を行った。ＰＣＲ反応液としては、各鋳型について、１ｘ濃度の鋳型、１ｘ濃度のプライマー混合液、１ｘ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）、０．７５ｘ濃度に相当するＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（６ｘ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを反応液２０μＬ当たり２．５μＬ使用））、０．９％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０、若しくはＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０、又は１．２％のＰＮＳＥを含む２５μＬの反応液を計１２種類、氷上にて調製した。また、対照として、界面活性剤の添加とＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の追加をしない以外は、上記と同様の組成を持つ反応液２０μＬを計３種類、氷上にて調製した。次に、これらのＰＣＲ反応液を、９５℃、３０ｓｅｃの初期変性を行った後に、９５℃、５秒〜６０℃、３０秒を１サイクルとする４０サイクルのリアルタイムＰＣＲに供した。リアルタイムＰＣＲ終了後、９５℃、６０秒〜４０℃、６０秒〜６０℃、１秒の反応の後、９５℃まで０．０２℃／ｓｅｃのスロープ設定で加熱してＤＮＡの融解反応を行った。なお、上記のリアルタイムＰＣＲ、及び融解反応には、反応装置としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。
【００４１】
各反応液の融解反応において蛍光強度をモニタリングし、温度に対して蛍光強度の一次微分の負の値をプロットした結果を図７〜１１に示す。図７〜１１に示される通り、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを追加していない反応液では、ＧＧホモサンプルを鋳型とした場合の融解曲線とＡ／Ｇヘテロサンプルを鋳型とした場合の融解曲線との区別が困難であった。一方、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを追加した反応液では、融解曲線により各サンプルを区別することが可能であった。また、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０を用いた場合は、Ａｌｌｅｌｅ  Ａ／Ｇヘテロサンプルを対象とした場合において高温側の融解曲線のピークが低温側の融解曲線のピークに対して高かったが、ＰＮＳＥを用いた場合は、高温側の融解曲線のピークが低温側の融解曲線のピークとほぼ同等のレベルであった。このことは、界面活性剤としてＰＮＳＥを用いた反応液では、融解したＤＮＡから遊離したＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉが、より融解温度が高い他の２本鎖ＤＮＡにインターカレートし難いことを示す。この結果は、界面活性剤としてＰＮＳＥを用いた反応液は、ＨＲＭ解析における解像度がより高いことを示す。本実施例により、高濃度のインターカレーティング色素、及び当該色素によるＰＣＲの阻害を抑制する界面活性剤を含む反応液によって、ＨＲＭ解析が可能であることが示された。また、界面活性剤としてＰＮＳＥを用いることにより、より高解像度のＨＲＭ解析が可能であることが示された。
【００４２】
実施例３  ＰＣＲ阻害の軽減又は解消に有効な界面活性剤の濃度の確認
インターカレーティング色素としてＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを、界面活性剤としてＰＮＳＥを用いて、インターカレーティング色素によるＰＣＲ阻害を軽減又は解消するのに有効な界面活性剤の濃度を確認した。ＰＣＲの鋳型としては、５００ｎｇのＨｕｍａｎ  ＨＬ６０  ｃｅｌｌ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）を用いた逆転写反応によって得られたｃＤＮＡのうち、１０ｎｇ  ＲＮＡ相当量を用いた。プライマー対としては、Ａｃｔｉｎ  ｂｅｔａ  ｃＤＮＡ領域の１８６ｂｐの領域を標的配列とする配列表の配列番号１の核酸配列からなるプライマー、及び配列表の配列番号３のヌクレオチド配列からなるプライマーを用いた。ＰＣＲ反応液としては、１０ｎｇ  ＲＮＡ相当量のｃＤＮＡ、０．３μＭ  ｅａｃｈのプライマー対、１ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Mｇ２＋  Pｌｕｓ）〔ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  （タカラバイオ社製）に添付の１０ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｍｇ２＋  Pｌｕｓ）を使用〕、０．４  ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）、１ｘ、２ｘ、３ｘ又は４ｘ濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、及び０％、０．２％、０．４％、０．８％、１．２％、１．６％、２．０％、２．４％、２．８％、又は３．２％濃度のＰＮＳＥを含む２５μＬのＰＣＲ反応液を計４０種類、氷上にて調製した。また、陰性対照（ＮＴＣ）として、鋳型及びＰＮＳＥを含まない以外は上記と同様の組成の溶液を計４種類、氷上にて調製した。次に、これらのＰＣＲ反応液を、９５℃、３０ｓｅｃの初期変性を行った後に、９５℃、５秒〜６０℃、３０秒を１サイクルとする４０サイクルのリアルタイムＰＣＲに供した。なお、上記のリアルタイムＰＣＲには、反応装置としてＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （タカラバイオ社製）を用いた。
【００４３】
各反応液の増幅産物をモニタリングして算出したＣｔ値を図１２〜１５に示す。図１２〜１５に示される通り、ＰＮＳＥを含まない反応液では、試験したいずれのＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ濃度でも増幅産物が得られなかった。１ｘ濃度（約２μＭ）のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含む反応液での反応においては、０．２％  ＰＮＳＥ濃度から３．２％のＰＮＳＥ濃度での反応においてほぼ同等のＣｔ値が得られた。この結果から、０．２％〜３．２％のＰＮＳＥを含む反応液では、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＩによるＰＣＲの阻害がほぼ完全に解消されたと推測できる。２ｘ濃度（約４μＭ）のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含む反応液での反応においては、いずれのＰＮＳＥ濃度でもＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＩによるＰＣＲの阻害が解消されていたが、０．２％のＰＮＳＥ濃度ではＣｔ値が比較的大きく、ある程度のＰＣＲの阻害が認められた。一方、０．４％から３．２％のＰＮＳＥ濃度での反応においては、ほぼ同等のＣｔ値が得られた。この結果から、０．４％〜３．２％のＰＮＳＥを含む反応液では、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＩによるＰＣＲの阻害がほぼ完全に解消されたと推測できる。３ｘ濃度（約６μＭ）のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含む反応液での反応においては、いずれのＰＮＳＥ濃度でもＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＩによるＰＣＲの阻害が解消されていたが、０．２％〜０．４％のＰＮＳＥ濃度ではＣｔ値が比較的大きく、ある程度のＰＣＲの阻害が認められた。一方、０．８％から３．２％のＰＮＳＥ濃度での反応においては、ほぼ同等のＣｔ値が得られた。この結果から、０．８％〜３．２％のＰＮＳＥを含む反応液では、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＩによるＰＣＲの阻害がほぼ完全に解消されたと推測できる。４ｘ濃度（約８μＭ）のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含む反応液での反応においては、０．２％のＰＮＳＥ濃度では、増幅産物が得られなかった。また、０．４％  ＰＮＳＥ濃度ではＣｔ値が比較的大きく、ある程度のＰＣＲの阻害が認められた。一方、０．８％から３．２％のＰＮＳＥ濃度での反応においては、ほぼ同等のＣｔ値が得られた。この結果から、０．８％〜３．２％のＰＮＳＥを含む反応液では、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＩによるＰＣＲの阻害がほぼ完全に解消されたと推測できる。
【００４４】
実施例４  ＨＲＭ解析に適したインターカレーティング色素濃度及び界面活性剤濃度の検討
（１）鋳型ＤＮＡの調製
１００ｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ＨＬ６０  ｇｅｎｏｍｅを鋳型に、配列表の配列番号４の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号５の核酸配列からなるプライマーを用いて、２５２ｂｐのＴＰ５３ａ遺伝子領域（配列番号１０）からなるＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。次に、得られた増幅産物をＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９  （Ｓｉｍｐｌｅ）  （タカラバイオ社製）にクローニングした。こうして得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｇ（配列番号１１）とした。
【００４５】
１０ｐｇのｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｇを鋳型にＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、ＴＰ５３ａ内部配列のＧをＣに変換（配列番号１１に記載の塩基配列における２３６０番目のＧをＣに変換）した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｃとした。
【００４６】
（２）ＨＲＭ解析
ｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３ＧとｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｃとを鋳型として用い、ＴＰ５３ａ遺伝子領域の９９ｂｐ領域を標的配列としたＨＲＭリアルタイムＰＣＲにより、ＨＲＭ解析に適したインターカレーティング色素濃度及び界面活性剤濃度を検討した。上記のＴＰ５３ａ遺伝子領域の９９ｂｐ領域は、上記の２つのプラスミド間で互いに異なる１塩基が存在する核酸配列を含む。本実施例では、ｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｇのみを鋳型とした場合をＧＧアレル、ｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｃのみを鋳型とした場合をＣＣアレル、ｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３ＣとｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｇを１：１の比率で混合したものを鋳型とした場合をＧ／Ｃアレルとした。ＴＰ５３遺伝子領域の９９ｂｐを増幅するためのプライマー対としては、配列表の配列番号：８の核酸配列からなるプライマー、及び配列表の配列番号：９の核酸配列からなるプライマーを用いた。ＰＣＲ反応液としては、１ｐｇのｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｇ、若しくはｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｃ、又はそれぞれ０．５ｐｇのｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３ＧとｐＭＤ１９−Ｓｉｍｐｌｅ−ＴＰ５３Ｃ、０．４μＭ  ｅａｃｈのプライマー、１ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Mｇ２＋  Pｌｕｓ）〔ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  （タカラバイオ社製）に添付の１０ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｍｇ２＋  Pｌｕｓ）を使用〕、０．４ｍＭ  ｅａｃｈのｄＮＴＰ、１．２５ＵのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）、及び０．３ｘ、２ｘ、又は３ｘ濃度のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、及び、０％、１．５％、２．０％、２．５％、又は３．０％濃度のＰＮＳＥを含む２５μＬの反応液を計３５種類、氷上にて調製した。次に、これらのＰＣＲ反応液を、９５℃、３０ｓｅｃの初期変性を行った後に、９５℃、５秒〜６０℃、３０秒を１サイクルとする４０サイクルのリアルタイムＰＣＲに供した。リアルタイムＰＣＲ後、９５℃、６０秒〜４０℃、６０秒〜６０℃、１秒の反応の後、９５℃まで０．０２℃／ｓｅｃのスロープ設定で加熱しＤＮＡの融解反応を行った。なお、上記のリアルタイムＰＣＲ、及び融解反応には、反応装置としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。
【００４７】
各反応液の融解反応において蛍光強度をモニタリングし、温度に対して蛍光強度の一次微分の負の値をプロットした結果を図１６〜３０に示す。図１６〜３０に示される通り、ＰＮＳＥを含まない反応液での反応においては、０．３ｘ濃度（約０．６μＭ）のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの反応液での反応においてのみ、増幅産物が得られた。そして、この増幅産物を融解反応に供して得られた融解曲線では、各アレルを区別することが非常に困難であった。一方、ＰＮＳＥを含む反応液での反応においては、試験したいずれの条件でも増幅産物が得られた。そして、これらの増幅産物を融解反応に供して得られた融解曲線より、各アレルを区別することが可能であった。また、ＨＲＭ解析の解像度は、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの濃度が高いほど高くなる傾向があった。さらには、驚くべきことに、０．３ｘ濃度（約０．６μＭ）のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの反応液であってもＰＮＳＥを含む場合には、解像度は低いものの、融解曲線により各アレルをある程度区別することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
SEQ ID NO:1 ; Designed PCR primer "hACTB-F".
SEQ ID NO:2 ; Designed PCR primer "hACTB-R381".
SEQ ID NO:3 ; Designed PCR primer "hACTB-R186".
SEQ ID NO:4 ; Designed PCR primer "TP53a_cloning_PCR_01-F".
SEQ ID NO:5 ; Designed PCR primer "TP53a_cloning_PCR_01-R".
SEQ ID NO:6 ; Designed PCR primer "TP53a_MutC_PCR_01-F".
SEQ ID NO:7 ; Designed PCR primer "TP53a_MutC_PCR_01-R".
SEQ ID NO:8 ; Designed PCR primer "TP53a_PCR_01-F".
SEQ ID NO:9 ; Designed PCR primer "TP53a_PCR_01-R".
SEQ ID NO:11 ; Plasmid "pMD19-Simple-TP53G".
【図１】
0006300452.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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