(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼを作製する方法であって、
配列番号１で表されるセロビオヒドロラーゼのＮ末から６２番目のアミノ酸であるアスパラギン、
又はグリコヒドロラーゼファミリーのＧＨ７に分類されるセロビオヒドロラーゼにおける、配列番号１の６２番目の位置に相当する位置のアスパラギンをアラニンに置換することを特徴とする向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼを作製する方法。
【請求項２】
向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼであって、
配列番号１で表されるセロビオヒドロラーゼのＮ末から６２番目のアミノ酸であるアスパラギン、
又はグリコヒドロラーゼファミリーのＧＨ７に分類されるセロビオヒドロラーゼにおける、配列番号１の６２番目の位置に相当する位置のアスパラギンをアラニンに置換した変異を含むことを特徴とするセロビオヒドロラーゼ。
【請求項３】
向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼであって、
請求項２の向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼの配列が、
配列番号２で表されるものであることを特徴とするセロビオヒドロラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオリファイナリーの糖化酵素に関する。特に、向上した活性を備えるセロビオヒドロラーゼの作製方法、及び高い活性を備えたセロビオヒドロラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術により、多種多様なタンパク質の改変が行われている。酵素についても、活性を高めたり、発現量を増加させる等、酵素活性を増強する試みが行われている。酵素活性を高める手法として、アミノ酸を改変し、酵素が基質と結合する活性中心のアミノ酸に変異を導入し、高活性の酵素を選択するといった手法が取られている。
【０００３】
酵素の基質結合部位は、多くの場合、鍵と鍵穴状に例えられるように、ごく一部に限定されているが、セルロースなどの高分子基質に作用する酵素の中には、高分子基質がはまり込むトンネル状、又は溝状の相対的に長い基質結合部位を備えているものがあることが知られている。
【０００４】
セルロース鎖を端部から切断する酵素であるエキソグルカナーゼは反応生成物がセロビオースであり、セロビオヒドロラーゼと呼ばれている。セロビオヒドロラーゼの場合、活性中心が上述のようにトンネル状になっており、酵素反応により切断されたセロビオースがトンネルの反対側から出てゆくため、セロビオヒドロラーゼはセルロース鎖から離れることなく酵素反応が進んでいく。
【０００５】
セロビオヒドロラーゼの酵素活性を向上させる試みは、これまでにも行われており、すでにいくつかの変異体が報告されている。特許文献１はタラロマイセス（Talaromyces）、特許文献２はファネロキーテ（Phanerochaete）由来のセロビオヒドロラーゼの変異体に関するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第８７９０８９４号明細書
【特許文献２】特開２０１０−０４６０３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、バイオリファイナリーの分野ではより効率の高い酵素が求められており、上記従来技術では活性向上効果が不十分である。したがって、より活性の高いセロビオヒドロラーゼ変異体を作製する必要がある。
【０００８】
さらに、セロビオヒドロラーゼのように高分子基質を保持しながら触媒反応を行うプロセッシブ酵素は、広範囲にわたる部位が基質結合部位となっているため、その効果を検討されていないアミノ酸が多数残されている。そこで、未検討のアミノ酸箇所の置換効果を調べ、より高い活性を備えたセロビオヒドロラーゼを得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼを作製する方法は、配列番号１で表されるセロビオヒドロラーゼのＮ末から６２番目のアミノ酸であるアスパラギン、又はグリコヒドロラーゼファミリーのＧＨ７に分類されるセロビオヒドロラーゼにおける、配列番号１の６２番目の位置に相当する位置のアスパラギンをアラニンに置換することによりセロビオヒドロラーゼの活性を向上させることを特徴とする。
【００１０】
タンパク質の機能に影響を与える部位を特定する方法の一つであるアラニンスキャンニングを用いて解析を行ったところ、配列番号１で表されるセロビオヒドロラーゼの６２番目のアミノ酸であるアスパラギンをアラニンに置換することにより、高い活性を備えたセロビオヒドロラーゼを得ることができた。当該アミノ酸残基はセロビオヒドロラーゼのトンネル構造内に位置する。したがって、配列番号１で表されるセロビオヒドロラーゼに相同性を有するセロビオヒドロラーゼであれば、当該位置と同等の位置のアスパラギンをアラニンに置換することによって同様に高い活性を備えたセロビオヒドロラーゼを得ることができるものと推認される。
【００１１】
また、本発明の向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼは、配列番号１で表されるセロビオヒドロラーゼのＮ末から６２番目のアミノ酸であるアスパラギン、又はグリコヒドロラーゼファミリーのＧＨ７に分類されるセロビオヒドロラーゼにおける、配列番号１の６２番目の位置に相当する位置のアスパラギンをアラニンに置換した変異を含むことを特徴とする。
【００１２】
配列番号１で表される配列の６２番目のアスパラギンをアラニンに置換したセロビオヒドロラーゼは、高い活性を備えている。したがって、６２番目のアスパラギン、あるいは該位置に相当するアスパラギンをアラニンに置換した変異体や、当該置換を含み、さらに酵素活性が増強することが知られているアミノ酸置換と組み合わせることにより、より高い活性を備えたセロビオヒドロラーゼを得ることができる。
【００１３】
本発明の向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼの配列は、配列番号２で表されるものであることを特徴とする。
【００１４】
配列番号２で表されるセロビオヒドロラーゼは野生型の酵素と比較して１２倍の比活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】セルビオヒドロラーゼの立体構造を模式的に示し、各アミノ酸残基の位置を示す図。
【図２】アラニンスキャンニングによるセロビオヒドロラーゼ変異体の野生型に対する相対活性比を示す図。
【図３】Ｎ末から６２番目のアミノ酸を置換したことによる野生型に対する相対比活性を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
セロビオヒドロラーゼは、その結晶構造がすでに知られている。セロビオヒドロラーゼが基質であるセルロースと相互作用する部位は長いループに囲まれ、トンネル構造と呼ばれている。セルロースと結合し、分解反応が起こる活性中心は、トンネル構造内に位置する。したがって、トンネル構造内のアミノ酸に変異を有する酵素を得ることにより、高活性変異体が得られるものと考えられる。
【００１７】
しかしながら、トンネル構造は広範囲にわたっていることから、基質と結合し、活性に影響を与えるアミノ酸についてすべてを解析することは困難である。そこで、立体構造をもとにトンネル構造内にあると予測され、さらに、基質であるセルロースの移動に対し、障害となり活性に影響を与える可能性の高いアミノ酸を選択し、アラニンスキャンニングにより解析を行うこととした。まず、変異を導入するために、セロビオヒドロラーゼ遺伝子を単離し、麹菌で発現するベクターの構築を行った。
【００１８】
（１）セロビオヒドロラーゼを麹菌で発現するベクターの構築
（アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）のゲノムＤＮＡ抽出）
アクレモニウム・セルロリティカスＨ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５０８、以下「Ｈ１株」と略記する。）を、ＰＤＢ寒天培地（ＰＤＡ培地（BD Difco社製、PDA broth）に１．５％（質量／容量）アガロースを添加した平板培地）上に植菌して３０℃で１週間培養した。得られた菌体を、寒天ごと直径５ｍｍで切り出してＰＤＡ培地に植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで浸透培養を行った。培養物を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理することによって菌体を回収した。さらに、回収した菌体をＰＤＡ培地により洗浄を２回繰り返して、菌体サンプルを取得した。
【００１９】
当該菌体サンプルの入った２ｍＬ容量のプラスチックチューブにビーズを入れ、卓上ビーズ式破砕装置（シェイクマスター、バイオメディカルサイエンス社製）を用いて９０秒間の破砕処理を３回行い、菌体サンプルを粉末状にした後、Nucleon（Amersham社製）を使用してＤＮＡを抽出した。
【００２０】
（アクレモニウム・セルロリティカスの野生型セロビオヒドロラーゼのＤＮＡのクローニング）
得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３、４（下記表１参照。）で表すプライマー１、２を用い、ＰＣＲによって、野生型セロビオヒドロラーゼをコードする配列を増幅した。ＤＮＡポリメラーゼは、KOD-plus（東洋紡社製）を用い、ＰＣＲは、９４℃、２分間を１サイクルした後、９６℃、２０秒間、次いで６０℃、３０秒間、さらに７２℃、５分間を３０サイクルすることにより行った。得られたＰＣＲ産物は、QIAquick PXR purification kit（QIAGEN社製）を用いて精製した。得られたアクレモニウム・セルロリティカスの野生型セロビオヒドロラーゼのアミノ酸配列は配列番号１に示す。
【００２１】
（ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤの調製）
大腸菌プラスミドであるｐＢＲ３２２に、麹菌アスペルギルス・オリゼ由来の硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤ、麹菌由来ａｇｄＡ遺伝子のターミネーター領域、麹菌由来ｅｎｏＡ遺伝子のプロモーター領域を組み込んだベクター、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを作製した。硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤを発現することにより、硝酸存在下でも麹菌が生育可能になるプラスミドが導入された菌を選択することができる。以下に簡単に調製方法を述べる。
【００２２】
まず、麹菌アスペルギルス・オリゼ由来の硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤ遺伝子を組み込んだプラスミドを構築する。麹菌アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＲＩＢ４０株（ＮＢＲＣ番号：１００９５９。以下「ＲＩＢ４０株」と略記する。）を独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手した。ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５、６に表されるプライマー３、４を用いて、硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤのＤＮＡをＰＣＲで増幅した。
【００２３】
増幅したｎｉａＤのＤＮＡをＡｖａＩ及びＮｄｅＩで消化し精製した後、ｐＢＲ３２２のＡｖａＩ、ＮｄｅＩ部位に挿入し、ｐＢＲ−ｎｉａＤを構築した。次に、ｐＢＲ−ｎｉａＤに麹菌由来ａｇｄＡ遺伝子のターミネーター領域を組み込んだ。
【００２４】
ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、８で表されるプライマー５、６を用いて、麹菌由来ａｇｄＡ遺伝子のターミネーター領域（以下、「ａｇｄＡターミネーター」ということがある。）のＤＮＡをＰＣＲで増幅した。
【００２５】
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳａｌI及びＡｖａIを用いて消化し、ｐＢＲ−ｎｉａＤのＳａｌI、ＡｖａI部位に挿入し、プラスミドｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを得た。
【００２６】
次に、得られたｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤに、麹菌由来ｅｎｏＡ遺伝子のプロモーター領域を組み込んだ。
【００２７】
ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号９、１０で表すプライマー７、８を用い、ＰＣＲを行い、麹菌由来ｅｎｏＡ遺伝子のプロモーター領域（以下、「ｅｎｏＡプロモーター」ということがある。）のＤＮＡを増幅した。
【００２８】
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＮｈｅI及びＳａｌIを用いて消化し、ｐＢＲ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤのＮｈｅI、ＳａｌI部位に挿入し、プラスミドｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを得た。
【００２９】
【表１】
0006378622.tif 000002
【００３０】
（野生型セロビオヒドロラーゼＤＮＡのｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤへの組み込み）
ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤを制限酵素ＳｍａＩを用いて消化し、ｐＢＲｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤのＳｍａＩ処理断片を得た。
【００３１】
該ＳｍａＩ処理断片に、野生型セロビオヒドロラーゼをコードする配列をIn-Fusion（登録商標）HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いてクローニングし、プラスミドｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＣＢＨ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ（ＣＢＨ麹菌発現用ベクター）を得た。
【００３２】
（変異型セロビオヒドロラーゼＤＮＡのｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤへの組み込み）
変異型セロビオヒドロラーゼは、セロビオヒドロラーゼ遺伝子の５’側から変異部位、および、変異部位から遺伝子の３’側の２断片をＰＣＲによって作製した。得られた２断片のＤＮＡを、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤに組み込むことによって構築した。この際、変異部位を含むプライマーがアニールするように設計されているため、変異型セロビオヒドロラーゼ遺伝子は、ｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤに組み込まれた時点で変異部位を含む以外は、５’側から３’側まで、野生型セロビオヒドロラーゼと同じアミノ酸配列を備えてつながった状態になる。
【実施例１】
【００３３】
（アラニン置換変異体の作製）
アクレモニウム・セルロリティカスのセロビオヒドロラーゼの立体構造をもとに、配列番号１で表されるアミノ酸配列を備えた、アクレモニウム由来のセロビオヒドロラーゼのトンネル構造内に位置する３０箇所のアミノ酸をアラニンに置換し、その活性を解析し酵素活性が向上するものを選択した。３０箇所の置換のうち野生型セロビオヒドロラーゼに比べて活性の向上が見られたのは６箇所であった。
【００３４】
アラニン置換により、活性がわずかでも向上したのは、配列番号１で表すアミノ酸の第２０３番目のリシン（Ｋ）、第６２番目のアスパラギン（Ｎ）、第１２５番目のアスパラギン、第２０１番目のアスパラギン酸（Ｄ）、第２８９番目のアルギニン（Ｒ）、第２８１番目のアスパラギン酸である（各変異体を置換したアミノ酸とその位置により、夫々Ｋ２０３Ａ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ１２５Ａ、Ｄ２０１Ａ、Ｒ２８９Ａ、Ｄ２８１Ａと表すこともある。）。
【００３５】
図１にＰＤＢ（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）より取得したアクレモニウム・セルロリティカスのセロビオヒドロラーゼの立体構造とアラニン置換によって活性が向上した上記のアミノ酸の位置を示す。トンネル構造の全長にわたってアラニン置換により活性が向上する部位が存在している。
【００３６】
上記６つの変異体について、作製に用いたプライマーを下記表２に示す。それぞれのプライマーペアとして、前述のセロビオヒドロラーゼのクローニングに用いたプライマー１とプライマー９〜１４、及びプライマー１５〜２０とセロビオヒドロラーゼのクローニングに用いたプライマー２を使用し、それ以外は野生型セロビオヒドロラーゼのゲノムＤＮＡの増幅と同様にしてＰＣＲを行った。
【００３７】
【表２】
0006378622.tif 000003
【００３８】
（野生型および変異型セロビオヒドロラーゼ麹菌発現用ベクターを導入した麹菌の形質転換体の作製）
定法であるＰＥＧ−カルシウム法（Mol.Gen.Genet.,vol.218,p.99~104（１９８９年））により、上記野生型セロビオヒドロラーゼが組み込まれたプラスミドｐＢＲ−ｅｎｏＡＰ−ＣＢＨ−ａｇｄＡＴ−ｎｉａＤ、あるいは変異を導入したプラスミドを用いて、麹菌アスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００株（niaD欠損株、独立行政法人酒類総合研究所より入手。）を形質転換した。ツアペクドックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（３％（質量／容量）デキストリン、０．１％（質量／容量）リン酸２水素カリウム、０．２％（質量／容量）塩化カリウム、０．０５％（質量／容量）硫酸マグネシウム、０．００１％（質量／容量）硫酸鉄、０．３％（質量／容量）硝酸ナトリウム）で生育できる株を選択することにより、形質転換体（野生型および変異型セロビオヒドロラーゼ麹菌形質転換株）を得た。
【００３９】
（セロビオヒドロラーゼの調製）
作製したセロビオヒドロラーゼ麹菌形質転換株を、ツアペクドックス培地で胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。５００ｍＬ容三角フラスコに入った１００ｍＬのＰＤ液体培地（２％（質量／容量）デキストリン、１％（質量／容量）ポリペプトン、０．１％（質量／容量）カザミノ酸、０．５％（質量／容量）リン酸２水素カリウム、０．０５％（質量／容量）硫酸マグネシウム、０．１％（質量／容量）硝酸ナトリウム）に最終胞子濃度１×１０４／ｍＬとなるように植菌した。３０℃で３日間の液体培養を行い、セロビオヒドロラーゼ、又はアミノ酸変異を有するセロビオヒドロラーゼを培地中に分泌発現させた。培養後の当該培養液を酵素サンプルとした。当該酵素サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認し、タンパク質定量を行って用いた。
【００４０】
（セルロース分解活性の測定）
反応基質として、微結晶性セルロース（メルク社製）を使用した。また、検量線は、１０ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）グルコース溶液を２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で適宜希釈して調製した４点の希釈系列（０．５〜５．０ｍＭ）の測定値から作成した。
【００４１】
まず、１．５ｍＬ容量プラスチックチューブに、４０μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と、２００ｍＭ酢酸バッファーに懸濁した４％（質量／容量）微結晶性セルロース懸濁液５０μＬを加えて充分に混合した後、５０℃に調整した。
【００４２】
次いで、１０μＬの野生型、または、各変異型（Ｋ２０３Ａ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ１２５Ａ、Ｄ２０１Ａ、Ｒ２８９Ａ、Ｄ２８１Ａ）セロビオヒドロラーゼ水溶液を各チューブに添加して酵素反応を開始させる。反応開始から１時間経過後に、１００μＬのＤＮＳＡ（１．６％（質量／容量）水酸化ナトリウム、０．５％（質量／容量）３，５ジニトロサリチル酸、３０％（質量／容量）酒石酸ナトリウムカリウム四水和物）溶液を加え混合することにより反応を停止させる。反応停止後、遠心分離（１５，０００ｘｇ、５分）し、上清を１００℃で５分間煮沸し、氷中で冷却させた。その後、各チューブから１００μＬの反応溶液を分取し、１００μＬの蒸留水で希釈した溶液の５４０ｎｍの吸光度（Ａ５４０）を測定した。ブランクとしては、酵素サンプルに代えて２０ｍＭ酢酸バッファーを添加して同様に処理したサンプルを用いた。Ａ５４０の測定値と検量線からグルコース濃度を算出し、タンパク質定量により得た酵素濃度で割ることで、酵素単位重量当りのセルロース分解活性値を得た。結果を図２に示す。
【００４３】
図２には、野生型（ＷＴ）と比較して活性が向上している変異体Ｋ２０３Ａ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ１２５Ａ、Ｄ２０１Ａ、Ｒ２８９Ａ、Ｄ２８１Ａの結果を示している。特に、６２番目のアスパラギン（Ｎ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体Ｎ０６２Ａは、野生型のセロビオヒドロラーゼに対して１４倍の比活性を備えていた。これは先行技術で開示されているセロビオヒドロラーゼ変異体に比べても、有意に高い活性である。
【００４４】
〔実施例２〕
６２番目のアスパラギン（Ｎ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体Ｎ０６２Ａが、野生型と比較して活性が向上していたことから、６２番目のアミノ酸を疎水性、酸性、アルカリ性等、性質の異なるアミノ酸に置換し、その活性を測定した。
【００４５】
作製に用いたプライマーを下記表３に示す。それぞれのプライマーペアとして、前述のセロビオヒドロラーゼのクローニングに用いたプライマー１とプライマー２１〜２７、及びプライマー２８〜３４とセロビオヒドロラーゼのクローニングに用いたプライマー２を使用し、それ以外は野生型セロビオヒドロラーゼのゲノムＤＮＡの増幅と同様にしてＰＣＲを行った。
【００４６】
【表３】
0006378622.tif 000004
【００４７】
プラスミドを構築後、実施例１と同様にして、セロビオヒドロラーゼ麹菌形質転換株を得て、変異体酵素を得て、コーンストーバー分解活性を測定した。
【００４８】
（コーンストーバー分解活性の測定）
リグノセルロース系バイオマスである稲藁を微粉砕したものに２．５％（質量／質量）の硫酸水溶液を質量比が１：１０となるように混合し、１５０℃の温度で１０分間保持して糖化前処理を行った後、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを５．８に調整し、５０℃で１日乾燥した。その後、ハンマーで細かく粉砕したものを活性測定の反応基質として用いた。
【００４９】
活性測定は、１．５ｍＬ容量プラスチックチューブに、８０μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と２００ｍＭ酢酸バッファーに懸濁した４％（質量／容量）コーンストーバー懸濁液１００μＬを加えて充分に混合し５０℃に調整した。
【００５０】
次いで、２０μＬの野生型、又は各変異型セロビオヒドロラーゼ水溶液を添加して酵素反応を開始させ、反応開始から１時間経過後に、１５，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離処理を行った。得られた上清を新しい１．５ｍＬ容量プラスチックチューブに移し、９５℃で５分間熱処理した後、１５，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離処理を行った。得られた上清は、新しい１．５ｍＬ容量プラスチックチューブに移した後、０．２μｍ（１３ｍｍディスク)フィルターでろ過した。０．２ｍＬのろ液をバイアルに移し、ＨＰＬＣ測定を行ってセロビオースを検出した。標準物質として、和光純薬社製セロビオースを用い、糖濃度を評価した。ＨＰＬＣ測定は、セパレーターとしてWaters 2695（Waters社製）、ＲＩ検出器としてWaters 2414（Waters社製）、カラムはBio-rad HPX-87H（Bio-Rad社製）を用いた。測定は、溶離液として超純水を用い、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：８０℃、検出器温度：４０℃の条件で行った。結果を図３に示す。
【００５１】
野生型（アスパラギン（Ｎ））と比較して、活性の向上が見られたのは、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）であった。アラニンは基質をコーンストーバーに代えて糖化を測定した場合でも野生型（Ｎ）と比較して、１２倍以上の比活性を有していた。
【００５２】
疎水性アミノ酸（トリプトファン（Ｗ）、バリン（Ｖ）、）、中性アミノ酸（セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ））、酸性アミノ酸（グルタミン酸（Ｅ））、塩基性アミノ酸（リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ））と様々な性質のアミノ酸に置換したが、アラニン置換による活性の向上を超えるものはなかった。
【００５３】
アラニンに置換することにより活性が向上する理由としては、トンネル構造内をセルロースが移動する際の立体障害を取り除くからだと推測される。６２番目のアスパラギンのアラニンへの置換に加えて、本発明で活性が向上することが見出された他の変異、例えば２０３番目のリシンや２８９番目のアルギニンをアラニンに併せて置換することにより、より高い活性を備えた変異体を得ることが期待される。
【００５４】
実施例１、及び２に示すように、配列番号２に記載されている第６２番目のアスパラギンをアラニンに置換したセロビオヒドロラーゼ変異体は、野生型セロビオヒドロラーゼに比較して高い活性を備えている。
【００５５】
セロビオヒドロラーゼはグリコヒドロラーゼファミリーのＧＨ７に分類される酵素である。ＧＨ７に属する酵素において、トンネル構造に位置するアミノ酸は種を越えて非常に良く保存されている。実際に、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、ファネロキーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）においても、配列番号１の第６２番目に相当する位置のアミノ酸はアスパラギンである。したがって、配列番号１で表されるセロビオヒドロラーゼだけではなく、相同なアミノ酸配列においても当該位置のアスパラギンをアラニンに変えることによって、活性の向上した酵素を得ることが期待される。
【００５６】
また、トンネル構造は種を超えて保存されていることから、セロビオヒドロラーゼ活性を向上させることが報告されている他のアミノ酸変異を併せて導入することによって、活性の更なる向上を期待することができる。
【図１】
0006378622.tif 000005
【図２】
0006378622.tif 000006
【図３】
0006378622.tif 000007
【配列表】
0006378622000001.app