(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中の亜硝酸イオンの選択的な検出のための式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物、及びその塩。
【化１】
0006258355.tif 000007
【請求項２】
前記化合物は２８０℃までの高い熱安定性を示す請求項１に記載の式１の化合物。
【請求項３】
水性媒体中の亜硝酸イオンの選択的検出に使用するための請求項１に記載の式１の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物の調製するための方法であって、
ａ）ＮａＯＨの溶液へ４−アミノアセトフェノンを加え、１０分間撹拌して、反応混合物を得、
ｂ）前記反応混合物へ３，４−ジメトキシベンズアルデヒドを滴下し、６時間撹拌して沈殿物を得、
ｃ）前記沈殿物をろ過し、水で洗って、カルコンを得、
ｄ）活性化Ｋ2ＣＯ3の存在下で、メタノール中の前記カルコンをニトロメタンと反応させ、２４時間還流して混合物を得、
ｅ）前記混合物を水で洗い、クロロホルムで抽出し、
ｆ）前記工程（ｅ）の混合物から溶媒を取り除いて残留物を得、前記残留物をカラムクロマトグラフィーによって分離してニトロメタン付加物を得、
ｇ）エタノール中で前記ニトロメタン付加物を酢酸アンモニウムと反応させ、４８時間還流下に加熱して生成物を得、
ｈ）前記生成物をろ過し、エタノールで洗い、乾燥させ、クロロホルムから再結晶させてアザジピロメテンを金属光沢のある緑色を帯びた結晶として得、
ｉ）ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下で、乾燥ジクロロメタン中の前記アザジピロメテンを三フッ化ホウ素ジエチルエーテルと反応させ、２５℃の温度で１５時間撹拌し、
ｊ）溶媒を揮発させて残分を得、前記残分を水で洗浄し、続いてクロロホルムで抽出し、
ｋ）前記洗浄した残分をカラムクロマトグラフィーによって分離して、前記アザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物を紫色固体として得る
ことを含む該方法。
【請求項５】
前記化合物が、７５０ｎｍでの吸収極大を伴って６００〜８５０ｎｍの範囲内で強いＮＩＲ吸収を有する非常に濃い紫色を示す請求項１に記載の式１の化合物。
【請求項６】
前記化合物が、約８２５ｎｍでの発光極大を伴って７００〜９００ｎｍの範囲内でのメタノール中でのＮＩＲ発光を示す請求項１に記載の式１の化合物。
【請求項７】
前記化合物が、４．８±０．２×１０4Ｍ-1ｃｍ-1の消光係数を持って強い吸収を示す請求項１に記載の式１の化合物。
【請求項８】
前記化合物が、希酸、好ましくはＨＣｌを加えることによってプロトン化させ得る請求項１に記載の式１の化合物。
【請求項９】
前記化合物のプロトン化体は、最大が５７０ｎｍである５００〜８００ｎｍの範囲内での幅広い吸収バンドを持つ、濃い青色を有する請求項１に記載の式１の化合物。
【請求項１０】
前記化合物のプロトン化体は、溶液形態にあるＳＯ42-、Ｃｌ-、ＨＳＯ3-、ＣＯ32-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＮＯ3-、Ｓ2Ｏ32-、及びＮ3-からなる群の中から選ばれる他のアニオンの存在下での、ＮＯ2-イオンの検出に有用である請求項１に記載の式１の化合物。
【請求項１１】
前記化合物は水性媒体中で５００ｎＭの検出限界（ＬＯＤ）を示す請求項１に記載の式１の化合物。
【請求項１２】
請求項１に記載の式１の化合物を用いる水中のＮＯ2-イオンの選択的な検出に用いるためのディップスティックデバイスであって、プラスチック、ガラス及び紙裏打ちからなる群の中から選ばれる支持体の表面に固定された式１の化合物を含む該デバイス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のディップスティックデバイスを調製するための方法であって、
ａ．式１の化合物をジクロロメタン中に溶解させて混合物を得る工程、
ｂ．微細粉末状のシリカもしくはアルミナを工程（ａ）で得た前記混合物へ加え、そして１０分間放置した後に前記ジクロロメタンを蒸発させてアッセイを得る工程、
ｃ．工程（ｂ）で得た前記アッセイを支持体の表面に固定して前記ディップスティックを得る工程
を含む該方法。
【請求項１４】
前記支持体は、熱可塑性物質、吸収パッド、ガラス棒及び紙ストリップからなる群の中から選ばれるプラスチック、ガラスもしくは紙裏打ちで作られている請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
試料中のＮＯ2-イオンを選択的に検出するための方法であって、
請求項１２に記載のディップスティックデバイスをＨＣｌに曝した後、そのディップスティックデバイスを試料中に浸漬することを含み、
深青色から濃い緑色へのディップスティックデバイスの色の変化がＮＯ2-イオンの存在を示すものである該方法。
【請求項１６】
前記試料が、水性試料、臨床試料および分析試料からなる群の中から選ばれる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記デバイスは２．０±０．５×１０-5Ｍという低い濃度において分析試料中の亜硝酸イオンを検出し得る検査に有用である請求項１２に記載のディップスティックデバイス。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
発明の分野
本発明は式１の新規アザＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）化合物に関する。本発明はアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料の調製方法にも関する。本発明は特に、比色亜硝酸センサーの構築と、水性媒体中における亜硝酸イオンの選択的かつ高感度な検出のためのセンサーとしてのその応用の実証に関する。より具体的には、本発明は異なる競争アニオンを含む水性試料からの亜硝酸イオン（ＮＯ2-）の現場での選択的な検出に関する。
【化１】
0006258355.tif 000002
【０００２】
本発明は式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料の調製方法と比色亜硝酸センサーの構築もまた提供する。アザ−ＢＯＤＩＰＹ染料はディップスティックデバイスを調製するために、プラスチック／ガラス／紙裏打ち支持体上に塗布することができる。それにより調製されたデバイスは、特に、異なる競争アニオンを含む水性試料からの亜硝酸イオン（ＮＯ2-）の現場での選択的な検出に使用することができる。
【０００３】
発明の背景
家畜の排泄物、有機廃棄物及び化学肥料による地方の飲料水供給の亜硝酸（ＮＯ2-）イオン汚染は、世界の至る所で問題であり続けている。亜硝酸（ＮＯ2-）は、環境中の、植物の成長に必要不可欠な栄養素である３つの無機窒素含有イオン（ＮＨ4+、ＮＯ2-、及びＮＯ3-）の中の一つである。ところで、微量水準での長期の暴露もしくは高水準での不注意な摂取の間での動物と人間の健康への悪影響故に、亜硝酸は科学者にとって主要な関心事である。ある研究は、１００万を超えるアメリカ人が環境保護庁（ＥＰＡ）によって定義された最大汚染水準（ＭＣＬ）を超える硝酸塩濃度を有する自給の水を使用している、と見積もっている。亜硝酸塩は通常、加工肉の貯蔵寿命を延長する食品防腐剤として採用されるが、亜硝酸塩は、また、タンパク質と相互作用して人間の健康に極めて有害な発癌性のN−ニトロソアミンを生成するための重要な前駆体であると認められている。水はもう1つの主要な近付きやすい原因であり、水を通して危険水準の亜硝酸塩（又は硝酸塩）により人間の健康の安全が脅かされる。それらは一般的に地表水中よりも地下水中に見いだされ、その主要な原因物質は家畜の堆肥、化学肥料、そして自然堆積物の浸食である。多くの医療問題は、亜硝酸塩（又は硝酸塩）の摂取と関連すると考えられる。1つの典型的な例は、皮膚の青みがかった呈色によって特徴づけられる「青色児症候群」としても知られる幼児のメトヘモグロビン血症である。亜硝酸塩の毒性を考慮して、アメリカ合衆国環境保護庁(EPA)は飲料水中の亜硝酸塩の最大汚染水準（ＭＣＬ）を１ｐｐｍ（２１．７μＭ）と定義し、世界保健機構（ＷＨＯ）によって定められた類似した指針値は３ｐｐｍである。M. J. Hill, Nitrates and Nitrites in Food and Water, 1st Ed., Woodhead Publishing Limited, England, 1996; U. S. Pat. No. 005776715 A, 1998; U. S. Pat. No. 007655473 B2, 2010; U. S. Pat. No. 3802842, 1974; B. Liang, M. Iwatsuki, T. Fukasawa, The Analyst, 1994, 119, 2113−2117; Z. Xue, Z. Wu, S. Han, Anal. Methods, 2012, 4, 2021−2026; M. C. Archer, S. D. Clark, J. E. Thilly, S. R. Tannenbaum, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 6362−6363; United States Environmental Protection Agency. National Primary Drinking Water Regulations: Contaminant Specific Fact Sheets, Inorganic Chemicals, consumer version; Washington, DC, 2009; World Health Organization. Guidelines for Drinking Water Quality: incorporating 1st and 2nd addenda, Vol.1, Recommendations. − 3rd Ed., WHO Press, Geneva, Switzerland, 2008を参照することができる。
【０００４】
亜硝酸塩は環境中において化学的に不安定であることが知られている。この反応性のために、特に現場の分析では、迅速な検出手順が好ましい。亜硝酸イオンの検出のために開発されている様々な技術は、分光法（測光法と蛍光光度法）、電気化学、及び化学発光を含む。分光光度法は一般的に簡素かつ選択的であり、芳香族アミンの亜硝酸特異的ジアゾ化、及びその後の、強度が本来の亜硝酸塩濃度に関連する濃く着色したアゾ染料を生じる適切な芳香族試薬とのカップリング反応を含む。この方法は古典的なグリース反応に由来する。グリース検査は、酸性条件下での、スルファニルアミドの亜硝酸塩依存ジアゾ化、及びその場で発生したジアゾニウムイオンのＮ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンとの、アゾ発色団を与えるカップリングにより進行する。グリース試薬の主要な不利な点の1つは、高濃度の危険な試薬の使用である。環境問題に加えて、反応のための溶液pHと温度にも特別の注意が必要であり、検出手順を複雑にしている。電気化学的な方法と化学発光は、亜硝酸塩の測定のための別の2つの方法論であるが、両方とも高価な機器で実施する必要があり、実際の試料での、それらの幅広い応用を制限している。M. J. Moorcroft, J. Davis, R. G. Compton, Talanta, 2001, 54, 785−803; N. Wang, X. Cao, X. Cai, Y. Xu, L. Guo, Analyst, 2010, 135, 2106−2110; W. Ko, W. Chen, C. Cheng, K. Lin, Sens. Actuators B, 2009, 137, 437-441; Z. Lin, W. Xue, H. Chen, J. Lin, Anal. Chem., 2011, 83, 8245−8251; J. Li, Q. Li, C. Lu, L. Zhao, D. Ye, L. Luo, Y. Ding, Q. Chen, X. Liu, Analyst, 2011, 136, 4563−4569を参照することができる。
【０００５】
この件に関して、水性媒体中及び固体デバイス中における効果的な亜硝酸センサーとして機能できる単一分子の開発は、挑戦的な課題である。ＢＯＤＩＰＹと略称されるホウ素錯体４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−s−インダセンは、その有利な特性のために理想の増感剤として大きな有望性を持つ。これらのシステムは５００〜６００ｎｍの範囲内での強い吸収、及び有意の蛍光量子収率、並びに高い光安定性を示す。対して、アザ−ジピロメテンとそのホウ素錯体（アザ−ＢＯＤＩＰＹ）は、ＢＯＤＩＰＹと比較しておよそ１００ｎｍ深色移動した吸収を示し、ほとんど注意を引かず、この１０年の間のみ研究されている。S. Ozlem, E. U. Akkaya, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 48−49; T. Yogo, Y. Urano, Y. Ishitsuka, F. Maniwa, T. Nagano, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 12162−12163; A. Gorman, J. Killoran, C. O'Shea, T. Kenna, W. M. Gallagher, D. F. O'Shea, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10619−10631; A. Loudet, K. Burgess, Chem. Rev. 2007, 107, 4891−4932; R. Ziessel, B. D. Allen, D. B. Rewinska, A. Harriman, Chem. Eur. J., 2009, 15, 7382−7393; N. Adarsh, R. R. Avirah, D. Ramaiah, Org. Lett. 2010, 12, 5720−5723を参照することができる。
【０００６】
水性媒体中の亜硝酸イオンの検出の実用的な適用のための既存の分子プローブの主な不利な点は、
１．第１の不利点は、前記検出法は正確な溶液の移し替え、科学的な背景を持たない人々にとってより有用なものとさせている精巧な機器技術の使用法等をまだ必要としていることである。  
２．第２の不利点は、機器を用いない観察にとっての亜硝酸イオンに対する低い感度と選択性である。  
３．第３の不利点は、検出をより簡単かつ便利にさせ得る、ディップスティック、細片等の簡単なデバイスをこれらのプローブから作製することができないことである。  
４．第４の、そして重大な不利点は、亜硝酸イオン用のプローブとしての単一かつ単純な分子がないことであり、商用使用されている最も一般的な亜硝酸塩センサーであるグリース試薬は、３成分の混合物である。  
というものである。
【０００７】
本発明において、私たちは幅広い競争アニオンに対して亜硝酸イオンに関し良好な選択性を示す、アザ−ＢＯＤＩＰＹに基づく亜硝酸塩センサーを開発している。前記センサーは、古典的な亜硝酸塩センサーであるグリース試薬（ＬＯＤ＝１μＭ）と比較して３００〜５００ｎＭの検出値の限界という、より改良された感度も示した。ある試料中の亜硝酸イオンの定量的評価も許された誤差限度で実施できた。検出方法のための精巧な機器の使用を避けるために、私たちは亜硝酸イオンの現場検出のための簡単かつ効率的なディップスティックデバイスを構築した。
【０００８】
発明の目的
本発明の主要な目的は、溶液中の亜硝酸イオン選択的な検出に有用な式１の単一分子のアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料を提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料の調製方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料を使用する比較的簡単かつ便利な方法で亜硝酸イオンを検出するための、特に亜硝酸イオン用のセンサーのような分子プローブの実用化に適した技術を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、与えられた試料中の亜硝酸イオンの定量的評価のための簡単かつ正確な方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹを使用する亜硝酸イオンの選択的検出のための簡単かつ効率的なディップスティックデバイスを提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、水性試料中の亜硝酸イオンの検出のための正確で、迅速なリアルタイム法を提供することにある。
【００１４】
発明の概要
したがって、本発明は、溶液中の亜硝酸イオンの選択的な検出に有用な式１の新規アザＢＯＤＩＰＹ化合物及びその塩を提供する。
【化２】
0006258355.tif 000003
【００１５】
本発明の一つの実施形態において、前記化合物は２８０℃の温度までの高い熱安定性を示す。
【００１６】
本発明の一つの実施形態において、前記化合物は水性媒体中の亜硝酸イオンの検出に有用である。
【００１７】
本発明の一つの実施形態は、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物の調製方法を提供し、その方法は、
ａ）４−アミノアセトフェノンをＮａＯＨの溶液中へ加え、１０分間撹拌して反応混合物を得、
ｂ）３，４−ジメトキシベンズアルデヒドを反応混合物へ滴下し、６時間撹拌して沈殿物を得、
ｃ）前記沈殿物をろ過し、水で洗浄してカルコンを得、
ｄ）活性化したＫ2ＣＯ3の存在下、エタノール中の前記カルコンをニトロメタンと反応させ、２４時間還流して混合物を得、
ｅ）前記混合物を水で洗浄し、クロロホルムで抽出し、
ｆ）溶剤を除去して残分を得、カラムクロマトグラフィーによって分離してニトロメタン付加物を得、
ｇ）エタノール中で前記ニトロメタン付加物を酢酸アンモニウムと反応させ、48時間還流下に加熱して生成物を得、
ｈ）前記生成物をろ過し、エタノールで洗浄し、乾燥させ、クロロホルムから再結晶させてアザジピロメテンを金属光沢のある緑色を帯びた結晶として得、
ｉ）ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下、乾燥したジクロロメタン中のアザジピロメテンを三フッ化ホウ素ジエチルエーテルと反応させ、２５℃の温度で１５時間撹拌し、
ｊ）前記溶媒を蒸発させ、得られた残分を水で洗浄し、その後クロロホルムで抽出し、
ｋ）カラムクロマトグラフィーによって分離して、アザ−ＢＯＤＩＰＹを紫色の固体として得る
ことを含む。
【００１８】
本発明の一つの実施形態において、前記化合物が、７５０ｎｍでの吸収極大を伴って６００〜８５０ｎｍの範囲内で強いＮＩＲ吸収を有する非常に濃い紫色を示す。
【００１９】
本発明の一つの実施形態において、前記化合物が、約８２５ｎｍでの発光極大を伴って７００〜９００ｎｍの範囲内でのメタノール中でのＮＩＲ発光を示す。
【００２０】
本発明の一つの実施形態において、前記化合物が、４．８±０．２×１０4Ｍ-1ｃｍ-1の消光係数を伴って強い吸収を示す。
【００２１】
本発明の一つの実施形態において、前記化合物は、希酸、好ましくはＨＣｌを加えることによってプロトン化させることができる。
【００２２】
本発明の一つの実施形態において、前記化合物のプロトン化体は、最大が５７０ｎｍである５００〜８００ｎｍの範囲内での幅広い吸収バンドを持つ、濃い青色を有する。
【００２３】
本発明の一つの実施形態において、前記化合物のプロトン化体は、溶液形態にあるＳＯ42-、Ｃｌ-、ＨＳＯ3-、ＣＯ32-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＮＯ3-、Ｓ2Ｏ32-及びＮ3-からなる群の中から選ばれる他のアニオンの存在下での、ＮＯ2-イオンの検出に有用である。
【００２４】
本発明の一つの実施形態において、前記化合物は水性媒体中で５００ｎＭの検出限界（ＬＯＤ）を示す。
【００２５】
本発明の一つの実施形態は、本発明の化合物を用いる水中のＮＯ2-イオンの選択的な検出に有用なディップスティックデバイスであって、プラスチック、ガラス及び紙裏打ちからなる群の中から選ばれる支持体の表面に固定された式１の化合物を含む、デバイスを提供する。
【００２６】
本発明の他の実施形態は、式１の化合物を用いる、水中のＮＯ2-イオンの選択的な検出に有用なディップスティックデバイスの調製方法であって、
ジクロロメタン中に式１の化合物を溶解させて混合物を得る工程、
微細粉末状のシリカもしくはアルミナを前記混合物へ加え、そして１０分間、放置した後に前記ジクロロメタンを揮発させてアッセイを得る工程、
支持体の表面に前記アッセイを固定してディップスティックを得る工程、
前記ディップスティックをＨＣｌガスに曝した後に、亜硝酸イオンを検出するためにそれを試料に浸漬する工程
を含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の一つの実施形態は、前記支持体が、熱可塑性物質、吸収パッド、ガラス棒及び紙ストリップからなる群の中から選ばれるプラスチック、ガラスもしくは紙裏打ちで作られているディップスティックデバイスの調製方法を提供する。
【００２８】
本発明の一つの実施形態は、２．０±０．５×１０-5Ｍという低い濃度の亜硝酸イオンを含む分析試料の検査に有用であるディップスティックデバイスの調製方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物。
【図２】メタノール中における一般式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物の正規化した吸収及び蛍光スペクトル。
【図３】Ａ）水中における亜硝酸イオンの連続的な添加によるアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料のプロトン体の吸収スペクトルの変化。Ｂ）検出限界の計算のための線形プロット。
【図４−１】ＵＶ−Ｖｉｓ分光法による溶液中に存在する亜硝酸イオンの未知の濃度の測定。Ａ）２．１７μＭ（０．１ｐｐｍ）から２１．７μＭ（１ｐｐｍ）までの異なる亜硝酸塩濃度の添加によるアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物1の吸収スペクトル。Ｂ）亜硝酸イオンの濃度に対する吸光度の相対線形プロット；得られた未知の濃度＝１５．３４μＭ（Ｃｕｋ＝１５．３７μＭ）。
【図４−２】ＵＶ−Ｖｉｓ分光法による溶液中に存在する亜硝酸イオンの未知の濃度の測定。Ｃ）２．１７μＭ（０．１ｐｐｍ）から２１．７μＭ（１ｐｐｍ）までの異なる亜硝酸塩濃度のグリース試薬への添加によるグリース反応の吸収スペクトル。Ｄ）亜硝酸イオンの濃度に対する吸光度の相対的直線プロット；得られた未知の濃度＝１５．０μＭ（Ｃｕｋ＝１５．３７μＭ）。
【図５】ＳＯ42-、Ｃｌ-、ＨＳＯ3-、ＣＯ32-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＮＯ3-、Ｓ2Ｏ32-、Ｎ3-などのような様々な競争アニオンに対する、アザ−ＢＯＤＩＰＹに基づく亜硝酸センサーの選択性を示す棒グラフ。Ａ）異なるアニオンの添加による５７０ｎｍでの吸光度の減少をプロットしている選択性のグラフ。Ｂ）異なるアニオンの添加によるアッセイの吸収極大の深色シフトのプロットによる選択性のグラフ。
【図６】硝酸イオンの水性溶液［２×１０-5Ｍ］中における動向を示すディップスティックデバイスの写真。Ａ）ガラス支持体上に塗布された紫色のアザ−ＢＯＤＩＰＹ。Ｂ）塩化水素蒸気に曝した後の色が濃い青色に変わったディップスティックデバイス。Ｃ）亜硝酸イオンを含む溶液中に浸漬することによる濃い青色から光沢のある緑色へのディップスティックの色の変化。
【図７】合成戦略と亜硝酸塩のセンシングを示すフローチャートを提供する。
【００３０】
発明の詳細な説明
したがって本発明は、水性媒体中の亜硝酸イオンの選択的な検出に有用な式１の新規アザＢＯＤＩＰＹ化合物を提供する。
【化３】
0006258355.tif 000004
【００３１】
本発明はさらに式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物の調製方法を提供する。
【化４】
0006258355.tif 000005
【００３２】
その方法は、
ａ）ＮａＯＨの存在下、エタノール−水（１：１）混合物中で4−アミノフェノンと３，４−ジメトキシベンズアルデヒドを反応させることによって（Ｅ）−１−（４−アミノフェニル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン（カルコン）を調製し、
ｂ）活性化Ｋ2ＣＯ3の存在下、メタノール中で、工程（ａ）で得られたカルコンをニトロメタンと反応させることによって１−（４−アミノフェニル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−ニトロブタン−１−オンを調製し、
ｃ）蒸留したエタノール中において、工程（ｂ）で得られた１−（４−アミノフェニル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−ニトロブタン−１−オンを酢酸アンモニウムと反応させて反応混合物を得、還流下に２４〜３６時間し、その反応混合物を２５〜３５℃の温度へ冷却し、減圧下にエタノール溶媒を除去して緑色を帯びた残分を得、この残分を水中に懸濁させ、それをジクロロメタンで抽出し、その後に有機相をブラインで洗浄し、これを乾燥及び濃縮して粗製の生成物を得、その後にカラムクロマトグラフィーによって精製して所望の生成物（Ｚ）−５−（４-アミノフェニル）−Ｎ−（５−（４−アミノフェニル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−２Ｈ−ピロール−２−イリデン）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２−アミン（ジピロメテン）を得、
ｄ）室温で、溶媒に乾燥ジクロロメタンを用いて、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下、前記ジピロメテンを三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（ＢＦ3.ＯＥｔ2）と反応させ、１５〜２４時間の間撹拌し、上記反応混合物を水で洗浄し、ジクロロメタンでそれを抽出し、乾燥及び濃縮して粗製の生成物を紫色固体として得、その後に溶出剤としてＥｔＯＡｃ−ヘキサン（１：１）を使用して塩基性アルミナのカラムクロマトグラフィーに通して精製して、式１のアミノアザ−ＢＯＤＩＰＹを得る
ことを含む。
【００３３】
本発明の一つの実施形態において、工程（ｄ）で用いられる反応時間は好ましくは１５〜２４時間の範囲内にある。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、得られた式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物の収率は約６５％である。
【００３５】
本発明のさらに他の実施形態において、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は７５０ｎｍに強いＮＩＲ吸収を有する非常に濃い紫色を示す。
【００３６】
本発明のさらに他の実施形態において、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は約８２５ｎｍにメタノール中においてＮＩＲ発光を示す。
【００３７】
本発明のさらに他の実施形態において、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は４．８×１０4Ｍ-1ｃｍ-1の消光係数を持つ強い吸収を示す。
【００３８】
本発明のさらに他の実施形態において、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は２８０℃までの高い熱安定性を示す。
【００３９】
本発明のさらに他の実施形態において、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は溶液状態におけるＮＯ2-イオンの検出に有用である。
【００４０】
本発明のさらに他の実施形態において、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は５００ｎＭの検出限界をもって溶液中のＮＯ2-イオンの検出に有用である。
【００４１】
本発明のさらに他の実施形態において、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は他の競争アニオンの存在下でのＮＯ2-イオンの検出に有用である。
【００４２】
本発明はさらに、水中での亜硝酸イオン選択的な検出に有用なディップスティックデバイスを提供する。
【００４３】
本発明はまたディップスティックデバイスの調製方法も提供し、その方法は、
ｉ）セラミック粉末シリカもしくはアルミナ上に吸着した式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物；及び
ｉｉ）工程（ｉ）の材料をストリップ支持体の表面上に堆積または固定させること
を含む。
【００４４】
本発明の一つの実施形態において、用いられる小片支持体はプラスチック、ガラスまたは紙裏打ちから作られている。
【００４５】
本発明のさらに他の実施形態において、前記ディップスティックデバイスは溶液中の亜硝酸イオンの検出に有用である。
【００４６】
本発明のさらに他の実施形態において、ディップスティックデバイスは２．０×１０-5Ｍという低い亜硝酸イオン濃度を含む分析試料の検査に有用である。
【００４７】
ディップスティックは、亜硝酸イオンを含む水性試料の現場での検出において特別の適用を有し、その検出事象は試料が存在する場所で実施でき、精巧な技術的支援を一つも必要としない。ＨＣｌ蒸気に曝されている間に、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料から作製されたディップスティックは、その色を紫色から濃い青色に変化させた。亜硝酸イオンを含む溶液は、濃い青色から深い緑色へのディップスティックの明確な色変化をもたらし、濃い色の存在は試料中の高水準の亜硝酸イオンを示し、薄い色は試料中の低水準の亜硝酸塩を示す。亜硝酸イオンの場合、表面の色は輝きのある青色から深い緑色へ変化した。ＳＯ42-、Ｃｌ-、ＨＳＯ3-、ＣＯ32-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＮＯ3-、Ｓ2Ｏ32-、Ｎ3-のような他の全ての競争アニオンは、固体表面に色の変化を全く与えない。このデバイスはキットの形態で提供することができる。
【００４８】
本分析法はより簡単であり、精巧な機器を必要としない。この発明によるデバイスは、吸収を測定することによって水性の臨床及び分析試料中の亜硝酸イオンの存在を測定する熱可塑性物質もしくはガラス支持体ストリップを備え、これは、式１の亜硝酸塩選択的なアッセイの吸着を可能にするために、シリカ/アルミナで事前に塗布される。
【００４９】
図７は、合成戦略及び亜硝酸塩のセンシングを示すフローチャートを提供する。
【００５０】
本発明において、式１の新規アザ−ＢＯＤＩＰＹが合成されている。１Ｎ ＨＣｌ中に溶解することによるアザ−ＢＯＤＩＰＹのその塩酸塩への変換は、この化合物を水性媒体中の亜硝酸イオン検出のための効率的なセンサーにするだろう。
【００５１】
飲料水、生物学的試料及び分析試料中の亜硝酸イオンの量を評価するために、本発明は、
１）式１を持つ新規アザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物。
【００５２】
２）アッセイ（式１の化合物）が簡便に付加された「ディップスティックデバイス」と呼ばれる実用的なデバイス。
【００５３】
3)亜硝酸イオンとアッセイ（式１の化合物）との間の反応がディップスティックの表面上で起こり、検出はディップスティックの表面上の色の変化によって表すことができること
を含む。
【００５４】
固体表面は、熱可塑性物質、吸収パッド、ガラス棒及び紙ストリップなどを含むいずれもの固体表面であり得る。好ましい支持体は、熱可塑性物質及びガラスであり、それは以前の経験や訓練を最低限に又は全く持たない検査者によって便利に使用することができる。そのような検査システムの調製と使用は、特許や科学文献に十分に記述されている。(a) U. S. Pat. No. 6406862 B1 (b) U. S. Pat. No. 20100284858 A1 (c) Y. Takahashi, H. Kasai, H. Nakashini, T. M. Suzuki, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 913を参照することができる。スティックを使用する場合、シリカ/アルミナに吸着されたアッセイ（式１）はスティックの一端、シリカ／アルミナ中のアッセイを有する端が、前述した全てのイオンの検出のための試料溶液中に浸漬することができるように結着させる。アッセイはシリカ/アルミナに吸着するように注意深くさせ、そしてそれは熱可塑性物質もしくはガラス支持体上に塗布される。それによって調製したデバイスはすぐに使用でき、そして亜硝酸イオンを含む分析用溶液中に浸漬することができる。２×１０-5Ｍという低く、そしてそれ以上の亜硝酸イオン濃度を検出することができる。
【００５５】
アザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物が理想のプローブの全ての好ましい特性を示すために、我々は亜硝酸イオンのプローブとしてアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物を選んでいる。我々による予備研究は、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物が４．８×１０4Ｍ-1ｃｍ-1の高い消光係数値を伴って、ＮＩＲ領域（λmax＝７５０ｎｍ）で強い吸収を示すということを示した。これらの染料はメタノール中において８２５ｎｍで蛍光発光最大を示した。式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料は、一般的な有機溶媒に良い溶解性があり、より良い光安安定性がある。希酸中におけるアザ−ＢＯＤＩＰＹのプロトン化体は、濃い青色を伴って５７０ｎｍ領域でブロードな青色シフトした吸収を示した。プロトン化種の青色は、亜硝酸イオンの存在下で緑色に変わるため、その化合物は効率的な亜硝酸塩センサーとして使用することができる。色の変化は、プロトン化されたアザ−ＢＯＤＩＰＹと水中に存在する亜硝酸イオンとの間のジアゾ化反応に起因する。その反応によって形成されたジアゾニウム塩は水性媒体中で加水分解を受けて、緑色のヒドロキシル置換生成物を与え、これは前記媒体中で沈殿する。
【００５６】
例
下記の例は例証として示されたものであり、したがって本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【００５７】
材料と方法
以下の例では、下記の材料と方法を用いた。
【００５８】
１.熱可塑性物質もしくはガラス支持体を、長さ１０ｃｍで半径４ｍｍの小さい単位に切り分けた。これは分析する試料の性質によって様々な長さで調製できる。
【００５９】
２.１０ｍｇのアッセイ1（式１）を１５ｍｌのジクロロメタンに溶解した。この溶液へ、２ｇの微細粉末状のアルミナを加え、そして溶媒を蒸発させるために１０分間を与えた。微細粉末状のシリカ/アルミナを含むアッセイは色が紫色である。その微細粉末状のシリカ/アルミナをスティックの端から５ｃｍまでにスティック上に結着させた（図６Ａ）。ディップスティックの色はＨＣｌ蒸気の暴露によって濃い青色に変化し、そしてこれは亜硝酸塩検出技術に使用することができる。青色から暗い緑色への色の変化は亜硝酸イオンの存在を表示するものである。そのスティックの表面上の色の変化は視覚的に段階的に変化し得、または永久記録として写真を撮ることができる。
【００６０】
例1は一般式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料の典型的な合成を表し、例2は亜硝酸塩検出のためのディップスティックデバイスの作製に採用された方法論を表す。
【００６１】
例３と４は選択性の研究と亜硝酸イオンの定量化を表す。
【００６２】
例１
一般式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物の調製
【化５】
0006258355.tif 000006
【００６３】
工程１
ＮａＯＨの水性アルコール溶液へ４−アミノアセトフェノンを加え、10分間撹拌した。この撹拌した溶液へ３，４−ジメトキシベンズアルデヒドを滴下し、その反応混合物を室温（２５℃）で６時間撹拌した。沈殿した生成物を真空下でろ過し、氷冷水で洗浄し、乾燥してカルコン（９０〜９５％）を黄色固体として得た。融点１２０〜１２２℃、 IR (KBr) νmax 3352.28, 1651.07, 1600.92 cm-1. 1H-NMR(CDCl3, 500 MHz) δ  7.941 (2H, d, J=8.5Hz), 7.755(1H, d, 15.5Hz), 7.423 (1H, d, J = 15.5 Hz), 7.231 (1H, dd), 7.157 (1H, s), 6.901 (1H, d, J=8.5Hz), 6.712 (2H, d, J=8.5Hz), 4.168 (2H, s), 3.918(6H, s). 13C NMR (CDCl3, 125MHz) δ 188.2, 151.0, 149.2, 143.3, 131.0, 122.8, 120.1, 113.9, 111.2, 110.26, 56.02; FAB−MS m/z C18H18INO5 についての計算値283.12、実測値283.52。
【００６４】
工程２
カルコン（５．７６ｍｍｏｌ）の溶液を８０ｍＬのメタノールに溶解し、そこへ活性化K2CO3とニトロメタン（２ｍＬ）を加え、そして２４時間還流させた。その混合物を水で洗浄し、そしてクロロホルムで抽出した。溶媒の除去は残分を与え、それをシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって分離した。酢酸エチルとヘキサンの混合物（２：８）によるカラムの溶出は、生成物(ニトロメタン付加物)を良い収率で与えた。８５％、融点１３８〜１４０℃、 IR (KBr) νmax 3400.50, 1658.78, 1598.99 cm-1; 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ  7.778 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.807 (2H, s), 6.771 (1H, s), 6.634 (2H, d, J = 8.5 Hz), 4.838 (1H, q), 4.650(1H, q), 4.180 (2H, s), 4.156 (1H, t), 3.862 (3H, s), 3.841 (3H, s), 3.363 (2H, m); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ 194.9, 151.6, 149.3, 148.6, 132.4, 130.6, 127.0, 119.3, 113.8, 111.7, 111.2, 79.9, 56.1, 41.1, 39.4; FAB−MS m/z C18H18INO5 についての計算値344.14、 実測値344.75。
【００６５】
工程３
ニトロメタン付加物（２．４５ｍｍｏｌ)と酢酸アンモニウム（７．６ｇ、９５ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）に溶解し、そして還流下に４８時間加熱した。沈殿した生成物をろ過し、冷エタノールで洗浄し、乾燥し、クロロホルムから再結晶させて、アザジピロメテンを金属光沢のある緑色を帯びた結晶として得た。４０％、融点１７０〜１７２℃; IR (KBr) νmax 3361.93, 1600.92, 1506.41 cm-1; 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) δ  7.79 (4H, d, J = 8 Hz), 7.61 (2H, d, J = 8 Hz), 7.53 (2H, s), 6.99 (2H, s),  6.92 (2H, d, J = 8 Hz ), 6.81 (4H, d, J = 8.5 Hz), 4.06 (4H, s), 3.93 (6H, s), 3.74 (6H, s); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 153.9, 149.2, 148.9, 148.8, 148.3, 127.5, 121.8, 115.2, 113.2, 112.4, 111.0, 56.0, 55.8; FAB−MS m/z C36H31N3O4 についての計算値599.23、実測値599.26。
【００６６】
工程４
乾燥ジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解したアザジピロメテン（０．４５ｍｍｏｌ）をＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（０．８ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ)で処理し、３０℃で１０分間撹拌した。この反応混合物へ三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（１ｍＬ、８．１３ｍｍｏｌ)を加え、そして室温（２５℃）で１０時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、クロロホルムで抽出した。溶媒の除去は残分を与え、それを塩基性アルミナ上でのカラムクロマトグラフィーによって分離した。酢酸エチルとヘキサンとの混合物（１：１）によるカラムの溶出は、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹを紫色固体として与えた。７５％、融点１９２〜１９４℃; IR (KBr) νmax 3360.00, 1600.92, 1498.69 cm-1; 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 8.00 (4H, d, J = 8.5 Hz), 7.64 (2H, dd, J = 8 Hz), 7.55 (2H, d, J = 2 Hz), 6.94 (4H, d, J = 6.5 Hz), 6.75 (4H, d, J = 8.5 Hz), 4.09 (4H, s), 3.95 (6H, s), 3.81 (6H, s); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δ 156.3, 154.2, 150.8, 149.2, 137.1, 136.9, 130.9, 130.8, 130.3, 129.5, 125.7, 122.9, 122.8, 117.6, 112.2, 111.2, 56.1, 55.9; FAB−MS m/z C36H30BF2N3O4についての計算値647.25、実測値647.46。
【００６７】
例２
亜硝酸イオンの現場での分析用のディップスティックの調製
１０ｍｇの化合物1（式１）を１５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、この溶液へ２ｇｍの微細粉末状のアルミナを加え、そして溶媒を蒸発させるために１０分間を与えた。微細粉末状のシリカ/アルミナを含むアッセイは色が紫だった。その微細粉末状のシリカ/アルミナを棒の端から５ｃｍまでにわたってスティック上に結着させた（図６Ａ）。ディップスティックの色はＨＣｌ蒸気の暴露によって濃い青色に変化し（図６Ｂ）、そしてこれは亜硝酸塩の検出技術に使用することができる。青色から暗緑色への色の変化は亜硝酸塩の存在を表示するものである（図６Ｃ）。スティックの表面上の色の変化は視覚的に段階的に変化し、または永久記録として写真を撮ることができる。
【００６８】
熱可塑性物質もしくはガラス支持体は、長さ１０ｃｍで半径４ｍｍを有するものとして切り分けた。シリカ／アルミナを含むアッセイを、支持体の表面上に注意深く固定し、このディップスティックはすぐに使用できた。このスティックをＨＣｌガスに曝した後に、亜硝酸イオン（２．０×１０-5Ｍ）を含む、ビーカーに入れられた溶液中に浸漬した。分析物がスティックと接触するいずれの場合にも、深い青色から濃い緑色への色の変化が観察され、それは亜硝酸イオンの存在を示す。
【００６９】
例３
競争アニオンを用いた選択性の研究
式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物のストック溶液（２μＭ）を１Ｎ ＨＣｌ中で調製し、ＳＯ42-、Ｃｌ-、ＨＳＯ3-、ＣＯ32-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＮＯ3-、Ｓ2Ｏ32-、Ｎ3-及びＮＯ2-イオンのような異なる競争アニオンの溶液を水中で調製した。我々は、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹへの水中の様々なアニオンの段階的な添加による滴定実験を実施した。亜硝酸イオンのみが７０％の淡色効果と、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物のプロトン化体への６０ｎｍの深色移動（図３）を示すのに対し、他の競争アニオンは亜硝酸イオンと比べ１００倍高い濃度でさえ無視し得る吸収の変化しか示さなかった（図５）。例えば、アッセイ溶液への硝酸イオンの添加は、吸収スペクトルにも、溶液の色に対しても有意の変化をもたらさない。
【００７０】
例４
水中の亜硝酸イオンの定量化
亜硝酸塩濃度の決定における式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物の可能性を調査するために、プローブを様々な濃度（０〜２ｐｐｍ）の亜硝酸イオンで処理した。プローブ1の最終の濃度は０．１ｐｐｍで維持したのに対し、亜硝酸イオンの濃度は0から２ｐｐｍまで変化させた。５７０ｎｍでの吸光度に対する亜硝酸イオンの濃度は、直線性に従う。未知の試料の吸光度が前記直線と交わる点は、その試料溶液中に存在する亜硝酸イオンの量を与えることになる(図4)。我々は式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹの効力を市販の別種品であるグリース試薬と、同様の方法で比較して、式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物が亜硝酸イオンの定量化において正確な結果をあたえた、ということを観察した。式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、５００ｎｍ（５×１０-7Ｍ）の検出限界（ＬＯＤ）をもって水中の亜硝酸イオンを検出できるのに対し、ディップスティック法の場合、ＬＯＤは２０μＭ（２×１０-5Ｍ）である。
【００７１】
利点
本発明に使用されるアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料は、理想のセンサーとしての十分な特性を持ち、亜硝酸イオン用の簡素で、効果的及び経済的なセンサーとして使用することができる。本発明の主な利点は：
１．式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は新規の単一分子である。
【００７２】
２．式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ染料の調製に採用された合成手法は商業的に実行可能である。
【００７３】
３．式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、近赤外領域（５００〜７５０ｎｍ）で吸収を持つ。
【００７４】
４．式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、近赤外領域（７５０〜８５０ｎｍ）で蛍光発光を持つ。
【００７５】
５．式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、２８０℃までの熱安定性を示した。
【００７６】
６．式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、水性媒体中の亜硝酸イオンの検出に使用することができる。
【００７７】
７．式１のアザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、水性媒体中の亜硝酸イオンの検出において５００ｎＭ（５×１０-7Ｍ）の検出限界（ＬＯＤ）を示した。
【００７８】
８．ＳＯ42-、Ｃｌ-、ＨＳＯ3-、ＣＯ32-、ＣＨ3ＣＯＯ-、ＮＯ3-、Ｓ2Ｏ32-、Ｎ3-などのようないくつかの重要な競争イオンの中で特に、亜硝酸イオンに対して式１のアッセイによって示された優れた選択性。
【００７９】
９．アザ−ＢＯＤＩＰＹ化合物は、ＵＶ−分光光度法のような分光法によって溶液中の亜硝酸イオンの量を定量化するために使用できる。
【００８０】
１０．これに加えて、式１を持つ化合物は、熱可塑性物質もしくはガラス固体支持体上にシリカ/アルミナ中の当該アッセイを塗布することによってデバイスとしてより便利に使用することができ、それはディップスティックとして使用することができる。
【００８１】
１１．本発明は本デバイスの作製を楽にしたので、とても容易に取り扱え、使用することができ、専門技術もしくは精巧な機器を一つも必要としない。
【００８２】
１２．２×１０-5Ｍの最低濃度をディップスティック法を用いて検出することができる
というものである。
【図１】
0006258355.tif 000008
【図２】
0006258355.tif 000009
【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
0006258355.tif 000013
【図６】
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【図７】
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