(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中における、ＨＰＬＣにより測定されるトリプトファン、ＨＰＬＣにより測定されるキヌレン酸、ＨＰＬＣにより測定される３−ヒドロキシキヌレニン、質量分析またはガスクロマトグラフィーにより測定されるピコリン酸、および質量分析、ガスクロマトグラフィーまたは蛍光分析により測定されるキノリン酸からなる群より選択される、１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の基準値とを比較する工程を含む、ＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの重症度の評価、またはＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの進行の監視、またはＭＳに罹患している被験体に施した治療の効果の監視のためのキットであって、
上記ＭＳの重症度は、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）または進行型ＭＳに分類され、これにより進行型ＭＳの場合はさらに二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）、再発期二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ−Ａ）、寛解期二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ−ＮＡ）または一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）に分類され、
以下の（ａ）および（ｂ）を含み：
（ａ）  患者のＣＳＦ中または血清中における、１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルを決定する試薬；および
（ｂ）  上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、ＭＳに罹患している被験体における上記ＭＳの重症度を評価する１つ以上の基準値とを比較するための情報、
上記基準値は、
ＭＳに罹患していない被験体のＣＳＦ中または血清中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベル、
事前に定められた重症度のＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベル、または、
ＭＳに罹患している被験体のその時以前におけるＣＳＦ中または血清中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベル、を表す、キット。
【請求項２】
第一の基準値はＭＳに罹患していない被験体のＣＳＦ中または血清中におけるキノリン酸のレベルを表し、第二の基準値は二次性進行型（ＳＰＭＳ）に罹患している患者のＣＳＦ中または血清中におけるキノリン酸のレベルを表し、
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中のキノリン酸のレベルが、上記第一の基準値と比較して高く、かつ、上記第二の基準値と比較して低い場合に、上記ＭＳは再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に分類される請求項１に記載のキット。
【請求項３】
上記基準値は、ＭＳに罹患していない被験体のＣＳＦ中または血清中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルを表し、
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルが、上記基準値と比較して高い場合に、上記ＭＳは再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に分類される請求項１に記載のキット。
【請求項４】
上記基準値は、ＭＳに罹患していない被験体のＣＳＦ中または血清中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルを表し、
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルが上記基準値と比較して高い場合に、上記ＭＳは再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）または一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）に分類される請求項１に記載のキット。
【請求項５】
上記基準値は、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中におけるキノリン酸のレベルを表し、
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中におけるキノリン酸のレベルが、上記基準値と比較して高い場合に、上記ＭＳは進行型に分類される請求項１に記載のキット。
【請求項６】
上記基準値は、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に罹患している患者のＣＳＦ中または血清中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルを表し、
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルが、上記基準値と比較して低い場合に、上記ＭＳは進行型ＭＳに分類される請求項１に記載のキット。
【請求項７】
第一の基準値はＭＳに罹患していない被験体のＣＳＦ中または血清中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルを表し、第二の基準値は寛解期二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ−ＮＡ）または再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に罹患している患者のＣＳＦ中または血清中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルを表し、
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルが、上記第一の基準値と比較して高く、かつ、上記第二の基準値と比較して低い場合に、上記ＭＳは寛解期二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ−ＮＡ）または再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に分類される請求項１に記載のキット。
【請求項８】
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルは、以下の表に示された比である請求項１に記載のキット。
【表１】
0006290398.tif 000009
【請求項９】
上記基準値は、ＳＰＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中におけるキノリン酸のレベルを表し、
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中におけるキノリン酸のレベルが、上記基準値と比較して高い場合に、上記ＭＳはＰＰＭＳに分類される請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
上記基準値は、ＳＰＭＳに罹患している被験体またはＭＳに罹患していない被験体のＣＳＦ中または血清中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルを表し、
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルが、上記基準値と比較して低い場合に、上記ＭＳはＰＰＭＳに分類される請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
上記基準値は、ＭＳに罹患していない被験体のＣＳＦ中または血清中におけるトリプトファンのレベル並びにピコリン酸またはキヌレン酸のレベルを表し、
上記ＭＳに罹患している被験体のＣＳＦ中または血清中におけるトリプトファンのレベル並びにピコリン酸またはキヌレン酸のレベルが、上記基準値と比較して低い場合に、上記ＭＳはＳＰＭＳに分類される請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
上記ＣＳＦ中または血清中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルは、上記ＭＳに罹患している被験体から採取したＣＳＦまたは血清のサンプルを採取する工程、および、上記サンプルにおける、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルを決定する工程によって、決定される請求項１に記載のキット。
【請求項１３】
ＴＲＰ、ＫＹＮ、ＫＹＮＡ、３ＨＫ、ＰＩＣおよびＱＵＩＮのモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、請求項１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）に罹患している被験体におけるＭＳの重症度を評価する方法に関する。本発明はまた、ＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの進行を監視する方法、およびＭＳに罹患している被験体に施した治療の効果を監視する方法にも関する。
【０００２】
好ましい実施形態において、本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）に罹患している被験体におけるＭＳの重症度を評価する予測キットに関する。本キットはまた、ＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの進行の監視に加えて、ＭＳに罹患している被験体に施した治療の効果の監視をも可能とする。
【０００３】
〔背景技術〕
多発性硬化症（ＭＳ）は慢性の神経疾患であり、世界中で約２５０万人が罹患している。ＭＳは臨床上のサブタイプおよび重症度において多様であり、一般的には再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）および一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）の３つのカテゴリーまたはサブタイプに分類される。再発寛解型ＭＳは疾患の初期段階に表れ、様々な程度の障害にまで発展する症状の増悪と、引き続いて訪れる寛解期とを特徴とする。約６０−８０％のＲＲＭＳ患者はＳＰＭＳへと徐々に病状が進行し、寛解期は短くなり次第に消失する。ＰＰＭＳは最も重症度の高いＭＳの病型で、ＳＰＭＳと類似した臨床症状を呈するが、ＲＲＭＳからは移行しない。ＰＰＭＳ患者は、疾患の始まり以降、疾患の持続的な増悪に苛まれており、寛解期は全く存在しない。
【０００４】
ＭＳに対する治療方法の選択は、しばしばＭＳの段階とタイプとに依存するため、ＭＳのサブタイプも含めたＭＳの重症度の評価は重要である。加えて、ＭＳの重症度の評価を可能とすることで、治療を行う臨床家は治療計画を監視し、特定の治療が疾患の治療として有効であるか否かを立証することができる。
【０００５】
しかしながら、先行技術である、ＭＳの重症度を決定するまたはＭＳの進行を監視する方法は、神経学的試験などの試験と併せて、脳に対する磁気共鳴映像法を利用する必要があった。磁気共鳴映像法の設備は高価であり、また、時として重度の障害を持つ患者の場合には不便でもありうる。
【０００６】
ＭＳに罹患している被験体において、ＭＳの重症度を評価し、かつ進行を監視する、簡便で信頼できる方法が求められている。
【０００７】
〔発明の概要〕
第一の態様において、本発明はＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの重症度を評価する、またはＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの進行を監視する、またはＭＳに罹患している被験体に施した治療の効果を監視する方法であって、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液（例えば血清または髄液（ＣＳＦ））中における１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の基準値とを比較する工程を含む方法を提供する。
【０００８】
典型的には、組織または体液のサンプルは上記被験体から採取され、上記サンプル中の１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルが上記基準値と比較される。典型的には、上記サンプルは体液のサンプルである。典型的には、上記体液のサンプルは血清のサンプルである。
【０００９】
第二の態様において、本発明は、ＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの重症度を評価する方法、またはＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの進行を監視する方法、またはＭＳに罹患している被験体に施した治療の効果を監視する方法であって、上記ＭＳに罹患している被験体から採取されたサンプルにおける１つ以上のキヌレニン化合物のレベルと、上記１つ以上のキヌレニン化合物の基準値とを比較する工程を含む方法を提供する。
【００１０】
第三の態様において、本発明は、ＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの重症度を評価する方法であって、上記ＭＳに罹患している被験体から採取されたサンプルにおける１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、上記１つ以上のキヌレニン化合物の基準値とを比較する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
第四の態様において、本発明は、ＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの進行を監視する方法であって、上記ＭＳに罹患している被験体から採取されたサンプルにおける１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の基準値とを比較する工程を含む方法を提供する。
【００１２】
第五の態様において、本発明は、ＭＳに罹患している被験体に施した治療の効果を監視する方法であって、上記ＭＳに罹患している被験体から採取されたサンプルにおける１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、上記１つ以上のキヌレニン化合物の基準値とを比較する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
〔図面の簡単な説明〕
図１Ａは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＡ、ＳＰＭＡもしくはＰＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、トリプトファンの濃度を表すグラフである。
【００１４】
図１Ｂは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＡ、ＳＰＭＡもしくはＰＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、トリプトファンの濃度に対するキヌレニンの濃度の比率を表すグラフである。
【００１５】
図１Ｃは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、トリプトファンおよびキヌレニンの濃度、並びにＫ／Ｔ比を表すグラフである。
【００１６】
図１Ｄは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来するＣＳＦのサンプルにおける、トリプトファンおよびキヌレニンの濃度、並びにＫ／Ｔ比を表すグラフである。
【００１７】
図２Ａは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＡ、ＳＰＭＡもしくはＰＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、キノリン酸の濃度を表すグラフである。
【００１８】
図２Ｂは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、キノリン酸の濃度を示す棒グラフである。
【００１９】
図２Ｃは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来するＣＳＦのサンプルにおける、キノリン酸の濃度を示す棒グラフである。
【００２０】
図３は、それぞれ（Ａ）ミエリン（Ｌａｘａｌ  Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ染色）、（Ｂ）活性化ミクログリア（ＨＬＡ−ＤＲ）、並びに（Ｃ）−（Ｄ）神経毒、ＱＵＩＮおよびＱＵＩＮのアイソトープコントロールを、免疫組織化学染色した図を示す。
【００２１】
図４は、それぞれ（Ａ）慢性のプラーク、（Ｂ）急性のプラーク、（Ｃ）対照群、（Ｄ）基礎レベルにある正常組織における、ＱＵＩＮの発現を示した免疫組織化学染色の図を示す。
【００２２】
図５Ａは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、ＳＰＭＳもしくはＰＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度を示したグラフである。
【００２３】
図５Ｂは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度を示す棒グラフである。
【００２４】
図６は、様々なＫＰ代謝物の濃度比のグラフであり、疾患のサブタイプの間の変化を表している。
【００２５】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、一態様において、ＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの重症度を評価する方法に関する。上記方法は、上記被験体の罹患しているＭＳのサブタイプを（例えば進行型ＭＳ（ＳＰＭＳまたはＰＰＭＳ）とＲＲＭＳとの比較、またはＰＰＭＳとＳＰＭＳとの比較）評価するのにも、特定のサブタイプのＭＳの重症度を評価するのと同様に利用されうる。上記ＭＳの重症度は、ＭＳに罹患している被験体における１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の基準値との比較によって評価される。
【００２６】
本発明は、別の態様において、ＭＳに罹患している被験体における、ＭＳの重症度を評価する予測キットに関する。上記予測キットは、上記被験体の罹患しているＭＳのサブタイプ（例えば進行型ＭＳ（ＳＰＭＳまたはＰＰＭＳ）とＲＲＭＳの比較、またはＰＰＭＳとＳＰＭＳとの比較）の評価にも、特定のサブタイプのＭＳの重症度の評価と同様に利用されうる。上記ＭＳの重症度は、ＭＳに罹患している被験体における１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の基準値との比較によって評価される。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「キヌレニン経路化合物」という表現は、キヌレニン経路の基質、生成物または代謝物である化合物を意図する。キヌレニン経路化合物には、トリプトファン、キヌレニン、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、ピコリン酸およびキノリン酸が含まれる。一形態において、上記キヌレニン経路化合物は、キヌレニン経路代謝物でありうる。上記キヌレニン経路代謝物は、神経毒性キヌレニン経路代謝物または神経保護性キヌレニン経路代謝物でありうる。神経毒性キヌレニン経路代謝物の一例に、キノリン酸がある。神経保護性キヌレニン経路代謝物の例には、キヌレン酸およびピコリン酸が含まれる。一実施形態において、上記キヌレニン経路化合物はキノリン酸である。別の実施形態において、上記キヌレニン経路化合物はピコリン酸である。さらなる実施形態において、上記キヌレニン経路化合物はキヌレン酸である。
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「被験体」とは、ヒトを意図する。ヒトはＭＳに罹患することが知られた唯一の生物種である。
【００２９】
本発明者らは、髄液（ＣＳＦ）中および血清中のキヌレニン経路化合物のレベルと、ＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの重症度との間に相関関係を見出した。これに関して、本発明者らは、キノリン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、キヌレン酸およびピコリン酸などのキヌレニン経路化合物のレベルは、ＭＳの進行に応じて有意に異なること、およびこれらの化合物の変化量はＭＳの重症度と相関関係にあることを見出した。
【００３０】
したがって、ＭＳに罹患している被験体の、上記ＣＳＦ中または血清中におけるこれらのキヌレニン経路化合物のレベルを決定することによって、任意の時点における被験体のＭＳの重症度の評価、ＭＳの進行の監視、または被験体に施した治療の効果の監視が可能となる。
【００３１】
本発明より前に、実験的アレルギ−性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導したラットにおけるキノリン酸産生の研究によると、ＥＡＥに罹患しているラットのＣＮＳにおけるキノリン酸のレベルは増加することが示されている（Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  ６４:１１９２−１１９６）。しかしながら、Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）は、ＥＡＥに罹患していないラットと比較した、ＥＡＥに罹患しているラットに由来する血清のサンプルにおけるキノリン酸のレベルに差異を検出していなかった。さらに、ラットにおけるＥＡＥモデルは、ヒトにおけるＭＳと同じ進行を示さない。したがって、上記ＥＡＥモデルにおける化合物のレベルと、ヒトにおけるＭＳの重症度および進行とを、相互に関連付けることはできない。
【００３２】
本明細書において示すように、本発明者らは、ＭＳに罹患している被験体の血清中およびＣＳＦ中における、上記キヌレニン経路化合物であるところのキノリン酸が、ＭＳに罹患していない被験体と比較して高くなること、並びに疾患の重症度が上昇するにつれてキノリン酸のレベルが増加することを見出した。したがって、ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における上記キノリン酸のレベルは、組織中または体液中における上記キノリン酸のレベルが決定された時点における、上記被験体が罹患しているＭＳの重症度を示すマーカーとして利用されうる。
【００３３】
本発明者らはまた、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に罹患している被験体の血清中およびＣＳＦ中における、上記キヌレニン経路化合物であるところのキヌレン酸およびピコリン酸が、ＭＳに罹患していない被験体と比較して高くなること、並びに疾患の重症度が上昇するにつれて、キヌレン酸のレベルおよびピコリン酸のレベルは減少することを見出した。したがって、ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における上記キヌレン酸および／またはピコリン酸のレベルは、組織中または体液中における上記キヌレン酸および／またはピコリン酸のレベルが決定された時点における、上記被験体が罹患しているＭＳの重症度を示すマーカーとして利用されうる。
【００３４】
本発明者らはさらに、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に罹患している被験体の血清中およびＣＳＦ中における、上記キヌレニン経路化合物であるところの３−ヒドロキシキヌレニンが、ＭＳに罹患していない被験体と比較して高くなること、並びに疾患の重症度が上昇するにつれて３−ヒドロキシキヌレニンのレベルが増加することを見出した。したがって、ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における上記３−ヒドロキシキヌレニンのレベルは、組織中または体液中における上記３−ヒドロキシキヌレニンのレベルが決定された時点における、上記被験体が罹患しているＭＳの重症度を示すマーカーとして利用されうる。
【００３５】
高いレベルのキノリン酸および３−ヒドロキシキヌレニン、並びに低いレベルのキヌレン酸およびピコリン酸は、被験体がＭＳに罹患している可能性を示す。しかし、他の多くの神経変性疾患でも、キノリン酸および３−ヒドロキシキヌレニンのレベルの増加並びにキヌレン酸およびピコリン酸のレベルの減少が見られるため、被験体から採取したサンプルが、高いレベルのキノリン酸および３−ヒドロキシキヌレニン、並びに減少したレベルのキヌレン酸およびピコリン酸を示しても、それ自体はＭＳの診断を決定づけない。
【００３６】
一実施形態において、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物は、１つのキヌレニン経路化合物であり、典型的には、キノリン酸、ピコリン酸、キヌレン酸および３−ヒドロキシキヌレニンからなる群より選択される。より典型的には、上記１つ以上のキヌレニン化合物はキノリン酸である。
【００３７】
別の実施形態において、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物は、キノリン酸、ピコリン酸、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニンおよびトリプトファンからなる群より選択されたキヌレニン経路化合物の組み合わせである。
【００３８】
ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルは、上記ＭＳに罹患している被験体に由来する組織または体液のサンプルを採取することによって、評価または監視されうる。典型的には、上記サンプルは体液のサンプルである。上記体液のサンプルは、例えば、ＣＳＦのサンプルまたは血清のサンプルでありうる。典型的には、上記サンプルは血清のサンプルである。これに関して、本発明者らは、ＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプル中におけるキヌレニン経路化合物のレベルは、上記被験体におけるＭＳの重症度を評価するため、上記ＭＳの進行を監視するため、または上記ＭＳに罹患している被験体に施した治療の効果を監視するために用いられうることを見出した。
【００３９】
したがって、上記キヌレニン経路化合物は、ＭＳの重症度を示す血清マ−カ−として利用されうる。血清のサンプルを利用できれば、比較的簡便で迅速な方法により、被験体におけるＭＳを評価または監視できる。上述したとおり、本発明以前には、ＭＳの重症度を評価し、またはＭＳの進行を監視する簡便な方法は利用できなかった。
【００４０】
本発明者らはまた、被験体の属する民族が異なれば、上記キヌレニン経路化合物のレベルが異なることを見出した。例えば、アジア系の被験体と白人系およびアフリカ系民族とを比較すると、キヌレニン経路化合物の総レベルに明瞭な違いが存在する。しかし、キヌレニン経路化合物のレベル変化の比率は、いずれの異なる民族においても一定であるので、ＭＳに罹患している被験体の予後分析並びに重症度および進行の評価が可能である。
【００４１】
被験体からＣＳＦまたは血清などのサンプルを採取する方法は、公知の技術である。
【００４２】
上記ＭＳに罹患している被験体からサンプルを採取したのち、上記サンプルにおける上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルを、基準値と比較する。
【００４３】
用語「レベル」とは、存在量の指標を意図する。それゆえ、「１つ以上のキヌレニン経路合物のレベル」とは、１つ以上のキヌレニン経路化合物の存在量の指標を意図する。上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルは、単位重量または体積あたりの上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の量の単位でありうる。上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルは、比率（例えば、あるキヌレニン経路化合物の、別のキヌレニン経路化合物または組織中もしくは体液中の成分のいくつかに対する比率）でありうる。
【００４４】
一実施形態において、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルは、１つ以上のキヌレニン経路化合物の濃度である。キノリン酸の濃度は、組織中または体液中（例えばＣＳＦまたは血清のサンプル）のキノリン酸の濃度を測定するのに適切な任意の方法で測定されうる。
【００４５】
適切な方法の例には、質量分析およびガスクロマトグラフィー（例えばＳｍｙｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ，  ｐｉｃｏｌｉｎｉｃ，  ａｎｄ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｃａｐｔｕｒｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｉｏｎ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０１（１）  （Ｆｅｂ  １  ２００２），  ｐｐ．２１−２６で示されたもの）および蛍光分析（例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００９）  ５５（２）：２４２−２４８で示されたもの）が含まれる。
【００４６】
ピコリン酸の濃度は、組織中または体液（例えばＣＳＦまたは血清のサンプル）中のピコリン酸の濃度を測定するのに適切な任意の方法で測定されうる。適切な方法の例には、質量分析およびガスクロマトグラフィー（例えばＳｍｙｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０１（１）  （Ｆｅｂ  １，  ２００２），  ｐｐ．２１−２６で示されたもの）がある。
【００４７】
キヌレン酸の濃度は、組織中または体液（例えばＣＳＦまたは血清のサンプル）中のキヌレン酸の濃度を測定するのに適切な任意の方法で測定されうる。適切な方法の例には、ＨＰＬＣ（例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２１，  ２００７，  ２７（４７）:１２８８４−１２８９２で示されたもの）がある。
【００４８】
トリプトファンの濃度は、組織中または体液（例えばＣＳＦまたは血清のサンプル）中のトリプトファンの濃度を測定するのに適切な任意の方法で測定されうる。適切の方法の例には、ＨＰＬＣ（例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２１，  ２００７，  ２７（４７）:１２８８４−１２８９２で示されたもの）がある。
【００４９】
３−ヒドロキシキヌレニンの濃度は、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，  １９９６，  ６７５:１５７−１６１を応用した方法を用いて測定される（詳しくは２２ページを参照）。しかし本方法では、血清のサンプルに限られている。
【００５０】
上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルは、１つ以上のキヌレニン経路化合物の基準値と比較される。
【００５１】
一実施形態において、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の基準値は、組織中または体液中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルを表す値であり、この組織または体液とは、典型的には、ＭＳに罹患していない被験体または事前に定められた重症度のＭＳに罹患している被験体から採取された、同じ組織または体液である。
【００５２】
上記基準値は、事前に定められた標準値、または比較のために特別に得られた基準値でありうる。上記基準値は、ＭＳに罹患していない被験体または事前に定められた重症度のＭＳに罹患している被験体に由来する基準サンプルにおける、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルでありうる。本明細書において使用される場合、「事前に定められた重症度のＭＳに罹患している被験体」とは、既知の重症度のＭＳに罹患している被験体である。
【００５３】
上記基準サンプルは、ＭＳに罹患していない被験体に由来しうる。ＭＳに罹患している被験体から採取されたサンプルにおける上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルを、ＭＳに罹患していない被験体から採取された基準サンプルに由来する上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと比較することによって、疾患に罹患していない被験体と比較した、上記疾患の重症度の評価、または上記疾患の進行の監視ができる。
【００５４】
上記基準サンプルは、事前に定められた重症度のＭＳに罹患している被験体に由来しうる。ＭＳに罹患している被験体から採取されたサンプルにおける上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルを、事前に定められた重症度のＭＳに罹患している被験体から採取された基準サンプルに由来する上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと比較することによって、既知の重症度のＭＳに罹患している被験体と比較した、上記疾患の重症度の評価、または上記疾患の進行の監視ができる。
【００５５】
他の実施形態において、上記基準値は、上記ＭＳに罹患している被験体のその時以前における、組織中または体液中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルを表す。本実施例において、上記基準値は、典型的には、上記ＭＳに罹患している被験体からその時以前において採取された基準サンプルにおける、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルである。ＭＳに罹患している被験体から採取されたサンプルにおける上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、その時以前において同じ被験体から採取された基準サンプルに由来する上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルとを比較することによって、疾患がより重度の状態に進行しているかを監視できる。
【００５６】
ＭＳの重症度は、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）または進行型ＭＳ（ＰＭＳ）に分類されうる。進行型ＭＳはさらに、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）または一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）に分類されうる。再発寛解型ＭＳは二次性進行型ＭＳよりも軽度なＭＳの形態であり、また二次性進行型ＭＳは一次性進行型ＭＳよりも軽度なＭＳの形態であることが、当業者に理解されるであろう。
【００５７】
様々な実施形態において、
（ａ）  上記基準値は、ＭＳに罹患していない被験体の組織中または体液中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルを表し、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルが上記基準値と比較して高い場合、上記ＭＳは再発寛解型ＭＳに分類される。
【００５８】
（ｂ）  第一の基準値は、ＭＳに罹患していない被験体の組織中または体液中におけるキノリン酸のレベルを表し、第二の基準値は、二次性進行型ＭＳに罹患している患者の組織中または体液中におけるキノリン酸のレベルを表し、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるキノリン酸のレベルが、上記第一の基準値と比較して高く、かつ、上記第二の基準値として低い場合、上記ＭＳは再発寛解型ＭＳに分類される。
【００５９】
（ｃ）  上記基準値は、再発寛解型ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルを表し、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルが上記基準値と比較して低い場合、上記ＭＳは進行型に分類される。
【００６０】
（ｄ）  上記基準値は再発寛解型ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるキノリン酸のレベルを表し、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるキノリン酸のレベルが上記基準値と比較して高い場合、上記ＭＳは進行型に分類される。
【００６１】
（ｅ）  上記基準値は、二次性進行型ＭＳに罹患している被験体またはＭＳに罹患していない被験体の組織中または体液中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルを表し、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるピコリン酸またはキヌレン酸のレベルが上記基準値と比較して低い場合、上記ＭＳは一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）に分類される。
【００６２】
（ｆ）  上記基準値は、二次性進行型ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるキノリン酸のレベルを表し、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるキノリン酸のレベルが上記基準値と比較して高い場合、上記ＭＳは一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）に分類される。
【００６３】
（ｇ）  第一の基準値は、ＭＳに罹患していない被験体の組織中または体液中におけるトリプトファンのレベルを表し、第二の基準値は、ＭＳに罹患していない被験体の組織中または体液中におけるピコリン酸および／またはキヌレン酸のレベルを表し、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるトリプトファンのレベルが上記第一の基準値と比較して低く、かつ、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるピコリン酸および／またはキヌレン酸のレベルが上記第二の基準値と比較して低い場合、上記ＭＳは二次性進行型ＭＳに分類される。
【００６４】
（ｈ）  上記基準値は、ＭＳに罹患していない被験体の組織中または体液中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルを表し、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルが上記基準値と比較して高い場合、上記ＭＳは再発寛解型ＭＳ、二次性進行型ＭＳまたは一次性進行型ＭＳに分類される。
【００６５】
（ｉ）  第一の基準値は、ＭＳに罹患していない被験体の組織中または体液中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルを表し、第二の基準値は、寛解期二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ−ＮＡ）または再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に罹患している被験体の組織中または体液中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルを表し、第三の基準値は、再発期二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ−Ａ）に罹患している被験体の組織中または体液中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルを表し、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルが上記第一の基準値と比較して高く、かつ、上記第二の基準値と比較して低い場合、上記ＭＳは寛解期二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ−ＮＡ）または再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）に分類される。
【００６６】
上記実施形態（ａ）から（ｉ）において、典型的には、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルは、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の濃度である。
【００６７】
上記実施形態（ａ）から（ｉ）において、典型的には、上記基準値は、上記ＭＳに罹患していない被験体、またはＳＰＭＳもしくはＲＲＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の濃度を表す。
【００６８】
上記実施形態（ａ）から（ｉ）において、さらに典型的には、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルは、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の濃度であり、かつ、上記基準値は、上記ＭＳに罹患していない被験体、またはＳＰＭＳもしくはＲＲＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における、上記１つ以上のキヌレニン経路化合物の濃度である。
【００６９】
上述した方法は、ＭＳの進行を監視するのに利用されうると予想される。これに関して、疾患の重症度が増大しているか否かを立証するための上述した方法を用いて、上記ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中におけるキヌレニン経路化合物のレベルを様々な時間間隔で測定し、かつ、各々の時間間隔において疾患の重症度を評価しうる。
【００７０】
一形態において、上記ＭＳの進行は、ＭＳに罹患している被験体の組織中または体液中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルと、上記ＭＳに罹患している被験体のその時以前における、組織中または体液中における上記１つ以上のキヌレニン経路化合物のレベルとを比較することで監視されうる。この手段により、上記被験体の組織中または体液中における上記１つ以上のキヌレニン経路代謝物のレベルが、以前に決定した上記被験体の組織中または体液中におけるレベルと比較して高いか低いかに基づいて、ＭＳの進行は監視されうる。
【００７１】
一形態において、本方法はＭＳに罹患している被験体におけるＭＳの重症度を評価する工程、またはＭＳに罹患している被験体における上記ＭＳの進行を監視する工程、またはＭＳに罹患している被験体に施した上記治療の効果を監視する工程を、上述したとおり含み、かつ、評価または監視の結果に基づいてＭＳへ対処するための治療法を選択する工程を含む。
【００７２】
ＭＳに罹患している被験体に施した治療の効果を監視する方法も、また予想される。これに関して、本明細書で示した方法は、治療に伴うＭＳの重症度を監視し、治療で施した処置に伴い疾患の上記重症度が減少しているか、または疾患の上記重症度の増大の割合が低くなっているかどうかを決定するのに利用されうる。
【００７３】
〔実施例〕
＜試料と方法＞
〔患者〕
［分析実験のための血清および髄液サンプル］
本実験で用いられたサンプルは、アメリカ合衆国内の２箇所のソース、すなわち（１）ＭＳ治療促進プロジェクト（ＡＣＰＭＳ）および（２）ヒト脳脊髄液資源センタ−（ＨＢＳＦＲＣ，  ＵＣＬＡ）から入手した。ＡＣＰＭＳから提供されたＭＳ血清のサンプルは、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）および一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）を含む様々なサブタイプのＭＳ被験体の７３３体分のレポジトリに由来し、対照群である健康な被験体の血清５０体分を共に得た。ＭＳの診断は、総合障害度スケ−ル（ＥＤＳＳ）およびＡＣＰＭＳのレポジトリから提供されたＭＲＩスキャン画像に基づき評価および鑑定されている。サンプルには、キヌレニン経路に影響を及ぼすことが知られたあらゆる薬物に対するスクリーニングを施し、またサンプル採取日から過去６箇月以内にステロイド治療を受けたものは、実験から除外した。本実験では、選ばれた基準に基づいて８８のＭＳサンプルが使用された（さらなる詳細は表１を参照）。
【００７４】
【表１】
0006290398.tif 000002
【００７５】
【表２】
0006290398.tif 000003
【００７６】
ＭＳ患者の血清のサンプルと、対応する患者のＣＳＦはＨＢＳＦＲＣから入手した。ＭＳの段階（初期段階のＭＳか進行型ＭＳか）および疾患の活性の状態（活性型か不活性型か）の差異について、さらなる検証がなされた。さらなる例証のため、寛解期のＲＲＭＳ、非活性型ＳＰＭＳおよび活性型ＳＰＭＳからなる各ＭＳサブタイプ、並びに健康な被験体を含む各１０症例が用いられた（更なる詳細は表２を参照）。
【００７７】
［死後の脳組織におけるＭＳの神経病理学］
本実験では、ＭＳ罹患が疑われる４９歳男性の脳、および対照として重大な神経疾患を持たない４８歳男性の脳が使用された。どちらの脳も２０％ホルムアルデヒドに４週間液浸され、冠状面で切断された。切片は、以下の領域：前頭皮質、側頭皮質、後頭皮質、小脳および脳幹から採取された。
【００７８】
〔化学物質〕
すべての化学物質は、特別に言及しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。ＫＰ代謝物を定量する装置に使用した酸、塩基およびアセトニトリルは分析用グレードであり、販売業者（Ａｊａｘ  ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍ）から入手した。
【００７９】
〔ＫＰ代謝物のＨＰＬＣによる定量〕
［サンプルおよび標準の調製］
検量線のための標準試薬として、原液（１ｍＭの各ＫＰ代謝物）を超純水（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｅａｓｙｐｕｒｅ  ＩＩ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に溶解させて調製した。原液は毎週調製し、標準試薬は毎日新しいものを調製した。血清のサンプルは、等量の１０％トリクロロ安息香酸を加えることによってタンパク質を取り除き、混合後、１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。その後、この上澄みを収集し、分析に使用した。定量に先立ち、すべての標準試薬およびサンプルをシリンジフィルタ−（４ｍｍ，  ０．４５μｍ  ＰＴＦＥ，  Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で濾過した。
【００８０】
［トリプトファンおよびキヌレニンの検出］
ＴＲＰおよびＫＹＮは、蛍光および多波長検出器を完備したＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用い、上述したＳｍｙｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０１  （１）  （Ｆｅｂ  １，  ２００２），  ｐｐ．２１−２６の方法に従って同時に定量した。概説すると、標準試薬とサンプルとをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８（５μｍ，  ２５０×４．６ｍｍ，  ｉ．ｄ．）カラム（Ｂｉｏｌａｂ，  Ｖｉｃｔｏｒｉａ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に３０μＬの注入量で注入した。使用前に濾過システム（０．２μｍ  ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に通して濾過した、０．１Ｍ酢酸アンモニアからなる移動相（ｐＨ４．６５）を、毎分１ｍＬの流速にて均一濃度で流した。ＴＲＰは励起波長を２５４ｎｍとし放射波長を４０４ｎｍとする蛍光検出により測定し、またＫＹＮは３６５ｎｍの多波長紫外線検出により検出した。
【００８１】
［キヌレン酸の検出］
ＫＹＮＡは、蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用い、Ｓｍｙｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０１（１）  （Ｆｅｂ  １，  ２００２），  ｐｐ．２１−２６で紹介された方法に小規模な変更を加えて定量した。概説すると、標準試薬およびサンプル３０μＬを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８（５μｍ，  １５０×４．６ｍｍ，  ｉ．ｄ．）カラムに注入した。５０ｍＭ酢酸アンモニアに０．２５Ｍ酢酸亜鉛および２．２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルからなる移動相を用い、毎分０．８ｍＬの流速にて均一濃度でＫＹＮＡを溶出させた。移動相は、使用に先立ち新しく調製し濾過した。ＫＹＮＡは励起波長を３４４ｎｍとし放射波長を３８８ｎｍとする蛍光検出器を用いて検出した。
【００８２】
アッセイ内およびアッセイ間の変位係数は、ＨＰＬＣを用いて検出したすべての代謝物において５％から７％の間にあった。
【００８３】
〔ＧＣＭＳによるＫＰ代謝物の定量〕
［ピコリン酸およびキノリン酸の検出］
ＰＩＣおよびＱＵＩＮは、上述のＳｍｙｔｈｅ  ＧＡ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２に説明されているガスクロマトグラフィー・質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により同時に測定した。標準試薬またはサンプル（５０μＬ）を、等量の内部標準液（ｄ３−キノリン酸およびｄ４−ピコリン酸）と共にガラス管（１００×１０ｍｍ，  Ｂｉｏｌａｂ，  Ｖｉｃｔｏｒｉａ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に加えた。混合物を乾燥させ（Ｓａｖａｎｔ  ＳｐｅｅｄＶａｃ）、その残渣と、トリフルオロ酢酸無水物およびヘキサフルオロイソプロパノ−ル（１：１、１２０μＬ）とを混合した。ガラス管をＴｅｌｆｏｎ−ｌｉｎｅｄ  ｃａｐ（Ｂｉｏｌａｂ，  Ｖｉｃｔｏｒｉａ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で封じ、６０℃、４５分の条件下で、それぞれの酸（すなわちＰＩＣおよびＱＵＩＮ）のヘキサフルオロプロピルエステルの生成を誘導した。誘導された生成物を、（最終的な体積が２５０μＬとなるように）トルエンに溶解させたのち、５％重炭酸ナトリウム（１ｍＬ）および水（１ｍＬ）中で溶けないように洗浄し、乾燥させ、無水硫酸ナトリウム（各サンプルあたり約５０ｍｇ）を充填したシラン処理ガラスウール（Ｇｒａｃｅ  ｄａｖｉｓｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｉｃｔｏｒｉａ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を通して濾過し、オートサンプラー用バイアルに移した後、ＧＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１μＬ注入した。上記分光計は電子捕獲陰イオン化モードで運用し、イオン選択性は、ＰＩＣ誘導体、ｄ４−ＰＩＣ、ＱＵＩＮ誘導体、およびｄ３−ＱＵＩＮの順に、２７３、２７７、４６７、４７０とした。最後に、各サンプルの内部標準のピーク面積に対する上記誘導体のピーク面積の比率に基づく検量線によって、サンプル中のＰＩＣおよびＱＵＩＮの濃度を決定した。信号対ノイズ比が１０：１より大きい場合の検出限界は、１ｆｍｏｌ未満であった。
【００８４】
［３−ヒドロキシキヌレニンの検出］
３ＨＫは、紫外線検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用い、Ｈｅｒｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．  １９９６，  ６７５，  ｐｐ．１５７−１６１に示された方法に、小規模な変更を加えて定量した。概説すると、５０μＬの標準試薬およびサンプルをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８（３．５μｍ，  １５０×４．６ｍｍ，  ｉ．ｄ．）カラムに注入した。３ＨＫは、０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．６５）からなる移動相を用い、毎分０．５ｍＬの流速にて均一濃度で溶出させた。移動相は、使用に先立って新たに調製し濾過した。３ＨＫは多波長紫外線検出器を用い、波長３６５ｎｍで検出した。
【００８５】
検出限界を１０ｎＭ以上とし、ＨＰＬＣを用いて検出した３ＨＫにおいて、アッセイ内およびアッセイ間の変位係数は５％から７％の間にあった。
【００８６】
〔免疫組織化学〕
［脳切片の調製］
抗体は、ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂ（１：１００希釈，  ＤＡＫＯ）、ＱＵＩＮ  ｍＡｂ（ＩｇＧ１，  １：１００希釈，  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。厚さ５μｍのパラフィン切片を取得し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）スライドグラス上に載せて、３８℃の水槽（ＨＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浮かべた。切片を、組織乾燥用オーブン（Ｍｅｄｉｔｅ）を用い４５℃で一晩乾燥させた。次に切片を、キシレンに２回、無水アルコールに２回通し、段階的な濃度のアルコール（９０％および７０％）に通し、最後に水に通して水分を与えた。上記切片を、３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）メタノール溶液に室温で２０分液浸することで、内因性のペルオキシダーゼを阻害した。
【００８７】
［ＨＬＡ−ＤＲ染色］
ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色する切片をクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に配置し、オートクレーブ（Ｓｉｌｔｅｘ）中に１２０℃で２０分間、抗原性の回復を誘導した。次に、最終濃度が３％となるように無菌ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝生理食塩水（ｐＨ７．６）で希釈した溶液で、切片を室温で５分間洗浄した。切片の周囲をＰＡＰ  ｐｅｎ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、円で囲んだ。次に抗体を上記切片に加え、室温で１時間インキュベートした。切片から抗体を洗い流し、ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中に室温でさらに５分配置した。次に、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（ＤＡＫＯ）結合ポリマーを切片に加え、室温で３０分インキュベートした。０．０３％Ｈ２Ｏ２／０．０５％３，３−ジアミノベンジジン四塩化物（ＤＡＢ，  Ｓｉｇｍａ  Ｄ５６３７）を０．１Ｍ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．６）に加えた溶液中で、切片を室温で２分間インキュベートし、その後水ですすぐことによって、ペルオキシダーゼによるラベリングを可視化した。最後に、切片をＨａｒｒｉｓ’ｓ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ中で２分間対比染色し、次に１％酸アルコール中で３秒間差異化し、さらにＳｃｏｔｔ’ｓ  Ｂｌｕｅｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで青色に染色した。切片をその後、キシレン中で脱水、透明化し、Ｐｅｒｔｅｘ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（ＨＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中にマウントした。
【００８８】
［ＱＵＩＮ染色］
ＱＵＩＮ抗体で染色する切片を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ＴＮＢ）および０．５％ブロッキング試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｚａｖｅｎｔｅｍ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）に１０％無菌ウマ血清を加えた溶液中に短時間配置した。次に、切片を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．３Ｍ  ＮａＣｌ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＮＴ）で３回、各３分間洗浄した。切片の周囲をＰＡＰ  ｐｅｎを用いて円で囲み、各スライドにアビジン溶液を１５分間で２滴滴下して、次にＴＮＴで２回、各３分間洗浄した。切片にビオチン溶液を２滴滴下して１５分間インキュベートした。スライドをＴＮＴで２回、各３分間洗浄し、次に、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に浸したまま、１２０℃で２０分間オートクレーブした。オートクレーブ後、スライドを回復溶液中で冷まし、ＴＮＴ中で３回、各３分間洗浄した。切片を１０％ウマ血清ＴＮＢ溶液中に３０分配置した。試験切片にはＱＵＩＮＮ抗体を１：１００希釈して、アイソタイプコントロール切片にはマウスＩｇＧ１をＴＮＢで１：１５希釈して加え、用いた抗体あたりのタンパク質濃度を等しくした。切片の先端を１０％ウマ血清ＴＮＢ溶液中に浸した後、抗体またはマウスＩｇＧ１を適切な切片に１時間加えた。次に、切片をＴＮＴで３回、各３分間洗浄した。次に、１：２００に希釈した二次抗体（ビオチン化抗マウス）を、室温で３０、すべての切片に加えた。切片を３回ずつ各３分間洗浄し、アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ  ｅｌｉｔｅ，Ｖｉｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を３０分加え、再び切片を３回、各３分間洗浄した。ビオチニルチラミド（１：５０希釈，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を上記切片に１０分加え、ＴＮＴで３回、各３分間洗浄した。次に切片を、ＳＡ−ＨＲＰ（１：１００希釈，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に室温で３０分間インキュベートし、次いでＤＢＡ中に室温で３分間展開した。切片を流した水道水で２０分間洗浄し、次にＨａｒｒｉｓ’ｓ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで３０秒間対比染色した。切片を水で洗浄し、酸アルコール（１％）に一回浸し、水ですすいだ後、１分間青く染色（Ｓｃｏｔｔ’ｓ  Ｂｌｕｅｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）した。切片を水洗いし、キシレンで脱水した後、Ｆａｓｔｍｏｕｎｔ中に取り外せないようにマウントした。
【００８９】
［Ｈ＆Ｅ染色］
切片を水道水に浸し、Ｈａｒｒｉｓ’ｓ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで５分間染色した。その後切片を水で洗浄し、１％酸アルコールで３秒間差異化した。切片をＳｃｏｔｔ’ｓ  Ｂｌｕｅｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで青く染色し、再び水道水で洗浄し、アルコールで脱水し、キシレンで透明化してＰｅｒｔｅｘ中にマウントした。
【００９０】
［Ｌｕｘｏｌ  Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ／Ｃｒｅｓｙｌ  Ｖｉｏｌｅｔ染色］
切片を水に浸した後、９５％アルコールですすいで、６０℃に予熱したＬＦＢ作業溶液で２時間染色した。次に、切片を室温で１時間冷ました。次に切片を４℃で炭酸リチウム（ｐＨ１０．５）に加え、１０分間攪拌した。スライドを７０％アルコールで７５秒間差異化した。流した水道水で１０分間洗浄した。蒸留水ですすぎ、０．１％Ｃｒｅｓｙｌ  Ｖｉｏｌｅｔで１０分間対比染色した。切片を速やかに水道水で洗浄し、次に無水アルコールを３回変えながら時間をかけて脱水することで余分なＣｒｅｓｙｌ  Ｖｉｏｌｅｔを取り除き、次に透明化してマウントした。
【００９１】
〔統計解析〕
本稿では、すべてのデータを中央値と標準偏差とで記述する。ｎ＞１５のグループにおける統計的比較の有意差は、パラメトリック一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に引き続く、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｔｕｒｋｅｙ比較分析により見出した。ｐ値＜０．０５を統計的有意とした。ｎ＜１５の集団においては、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ比較分析と共に用いた。比較分析のため、ｐ値＜０．０５とするのが通例であるが、我々はｐ値＜０．０１を有意性の閾値として利用した。グラフ図はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅを利用して描画し、統計解析にはＳＰＳＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １７．０を用いた。
【００９２】
＜結果＞
［ＭＳの進行に伴うＫＰ活性化］
ＭＳ患者に由来する血清およびＣＳＦのサンプルのいずれにおいても、３つのパラメーター（すなわちＴＲＰ、ＫＹＮ、およびＫ／Ｔ比）がＫＰ活性化を評価するために利用されてきた。本発明者らのデータは、すべてのＭＳサブタイプの血清中において、対照群の血清中よりもＴＲＰ（ＫＰを開始する最初の基質）が有意に減少していることを示す（図１）。本発明者らは、ＴＲＰの低下と疾患のＭＳサブタイプにおける重症度との相関については、血清のサンプルおよびＣＳＦのサンプルからは何らの差をも発見しなかった。しかし統計解析によると、進行型ＭＳにおいては、疾患の初期段階よりもＴＲＰが減少している傾向が存在することが明らかになった（図１ＡおよびＣ  −ｐ＜０．０５）。上記結果は、さらに、対応するＣＳＦのサンプル（図１Ｄ  白い三角形）においてもＴＲＰ濃度が低下を示すことにより実証された。また、図１ＣおよびＤにおいて、活性型ＳＰＭＳを非活性型ＳＰＭＳと比較することにより、同様にＴＲＰの減少傾向を見出した（ｐ＜０．０５）。
【００９３】
逆に、ＴＲＰの直後の異化代謝産物であるＫＹＮは、ＭＳにおいて増加する。ＨＢＳＦＲＣから入手したサンプルによると、血清のサンプルにおいてＫＹＮの増加傾向が見られ（ｐ＜０．０５）、かつ、活性型ＭＳにおいては有意に増加している。上記ＫＹＮの増加は、対応するＣＳＦのサンプルでも有意性を伴って見られる（ｐ＜０．０１）。しかしながら、活性型ＳＰＭＳにおけるＣＳＦのサンプル中では、対応する血清のサンプルとは逆にＫＹＮの減少が見られる。
【００９４】
ＡＣＰＭＳのサンプルにおいては、ＲＲＭＳを除き、ＭＳサブタイプと対照群との間において血清中のＫＹＮに有意差は発見されていない（ｐ＜０．０５  データ未表示）。
【００９５】
得られたＫ／Ｔ比は、ＫＹＮとＴＲＰとの反比例関係を表しており、対照群と比較したＭＳにおいて増加を示した。Ｋ／Ｔ比はＫＰの活性化を評価し、ＩＤＯの活性を表すのに利用されてきたことから、実はＭＳでもＫＰは活性化されるということが示唆される。さらに、対応するＣＳＦのサンプルでも、対照群と比較して有意に高いという、同様の傾向が観察されている。しかし我々のデータでは、Ｋ／Ｔ比の上昇と疾患の重症度との間に有意な相関は見られない。
【００９６】
〔ＭＳの進行における神経保護性ＫＰ代謝物〕
血清およびＣＳＦにおいて得た、神経保護性ＫＰ代謝物のレベルを下記表３および表４に表す。
【００９７】
【表３】
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【００９８】
【表４】
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【００９９】
［ＫＹＮＡ濃度］
神経保護性ＫＰ代謝物であるＫＹＮＡは、ＲＲＭＳ患者の血清内で増加していることが判明した。しかし疾患の進行に伴い、ＳＰＭＳでもＰＰＭＳでもこの神経保護性代謝物の減少が観測されている。さらに、ＳＰＭＳ患者の血清および対応するＣＳＦにおけるＫＹＮＡの減少傾向は、活性型におけるものの方が、非活性型におけるものよりも顕著であった（ｐ＜０．０５）。
【０１００】
［ＰＩＣ濃度］
他の神経保護性ＫＰ代謝物であるＰＩＣも、ＫＹＮＡと類似した傾向を示した。ＰＩＣはＲＲＭＳ患者の血清において上昇する一方、ＳＰＭＳおよびＰＰＭＳ患者では減少した。同様にＰＩＣの減少は、活性型ＳＰＭＳにおけるものの方が、その非活性型におけるものより遥かに大きかった（ｐ＜０．０１）。
【０１０１】
〔ＭＳの進行における神経毒であるＱＵＩＮの産生〕
異なるＭＳ重症度を示す被験体の、血清およびＣＳＦにおけるキノリン酸のレベルを、下記の表５および表６、並びに図２に示す。
【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
【表６】
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【０１０４】
ＱＵＩＮ濃度は、すべてのＭＳサブタイプにおいて、対照群と比較して高かった。血清中におけるＱＵＩＮの産生の増加は、疾患の重症度とも相関がある（ｐ＜０．０００１）。この、ＱＵＩＮの増加は、対応するＣＳＦのサンプルでも見られる。加えて進行型ＭＳでは、より重症度の低いＭＳ（すなわちＲＲＭＳ）と比較して有意なＱＵＩＮの増加傾向があるようだ。
【０１０５】
本発明者らは、すべてのＭＳサブタイプにおいて、血清中の３ＨＫが健康な対照群と比較して有意に上昇することを見出した。さらに本発明者らは、ＲＲＭＳと比較した進行型ＭＳにおける、３ＨＫの増加傾向を見出したが、統計的有意とまでは言えなかった（ｐ＝０．０４５）。興味深いことに、異なるＭＳサンプルの一群において、本発見者らは、再発期ＳＰＭＳ（ＳＰＭＳ−Ａ）のサンプルの血清において、寛解期（すなわちＳＰＭＳ−ＮＡおよびＲＲＭＳ）と比較して、３ＨＫが有意に増加することを見出した。このことから、活性化したＫＰは、疾患の再発期において３ＨＫを産生させる傾向があり、他の神経毒であるＱＵＩＮの下流における産生を導くらしいことが示唆される。
【０１０６】
〔免疫組織化学研究〕
顕微鏡用切片には広範囲に多数の脱髄性のプラークが、大脳、脳幹および小脳を通じて観察された。前頭皮質、側頭皮質および後頭皮質の脳室周囲のプラークでは、血管周囲性のリンパ球浸潤を伴う完全な脱髄と、いくつかの反応性のグリオーシスとが見られた。いくつかの領域では、プラークは老人性のもののように、血管周囲にリンパ球の残存が見られなかった。以上の他に、皮質において顕著な病理学的所見はなかった。大脳基底核および間脳は、血管周囲の脱髄性のプラークの中心的な病巣であった。Ｌａｘａｌ  Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅとｃｒｉｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔとによる大脳基底核の染色は、ＭＳ症例において観察された慢性および急性の伝染病（plague）を示した。染色（図３参照）は、右側における正常な髄鞘形成と比較して、左側において広範な脱髄が観察されたことを示している。ＨＬＡ−ＤＲによると、活性化した小膠細胞による、急性のプラーク中の脱髄領域への多数の浸潤が見られた。一方、図３Ｂに示すように、慢性のプラークにおいては、広範な小膠細胞による浸潤は見られなかった。
【０１０７】
ＱＵＩＮもまた、ＭＳ患者の脳切片に見られた。血管周囲性のリンパ球浸潤の存在によって定義される急性のプラークにおいて、神経細胞では細胞質におけるＱＵＩＮの発現が見られる（図３Ｃ参照）。加えて、急性のプラークを示している脳の領域においては、ＱＵＩＮの発現は脳実質中に点在して見られる（図４Ａ）が、慢性のプラークにはＱＵＩＮの染色は見られなかった（図４Ｂ）。ＱＵＩＮのアイソタイプコントロール（図３Ｄ）では、急性のプラークにおいてＱＵＩＮの神経細胞での発現は全く見られなかった。さらに、対照となる脳切片（図４Ｃ）と比較すると、ＱＵＩＮの発現は白質および灰白質ともに見られなかった。しかし、他の正常な脳組織中の小膠細胞においては、ＱＵＩＮは排他的に、かつ構成的に基礎レベルで発現していた（図４Ｄ）。
【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
＜考察＞
神経保護性ＫＰ代謝物、すなわちＫＹＮＡおよびＰＩＣは、ＭＳの初期段階で増加し、進行型ＭＳでは有意に減少することが上記データから示されている。
【０１１０】
ＱＵＩＮはすべてのＭＳサブタイプにおいて増加する。この増加とＭＳの進行とは、特にＣＮＳおよび血清において、相関関係にある。上記疾患の初期段階では、対照群と比較して緩やかなＱＵＩＮの増加のみが観察される。進行型ＭＳにおいては、上記データは、ＱＵＩＮが顕著に上昇したことを示している。
【０１１１】
健康な対照群と比較して、３−ヒドロキシキヌレニンはすべてのＭＳサブタイプにおいて増加する。特に、３−ヒドロキシキヌレニンのレベルは再発期のＭＳにおいて有意に増加することが、寛解期ＭＳ（非活性型ＳＰＭＳ）における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルと比較して、再発期ＭＳ（活性型ＳＰＭＳ）における３−ヒドロキシキヌレニンのレベルが上昇していることから明らかである。
【０１１２】
ＭＳ患者脳切片のＱＵＩＮを染色することによって、急性のプラークが形成される初期段階では、ＱＵＩＮの実質への放出があることが明らかになった。実質におけるＱＵＩＮの発現が背景染色によるものではないことを証明するために、ＱＵＩＮ染色のアイソタイプコントロールが構成され、これにより、アイソタイプコントロールではＱＵＩＮによる染色はみられないことが実証された。加えて、重大な神経疾患を持たない対照の白質および灰白質からは、ＱＵＩＮは発現していないことが観察された。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１Ａは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＡ、ＳＰＭＡもしくはＰＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、トリプトファンの濃度を表すグラフである。図１Ｂは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＡ、ＳＰＭＡもしくはＰＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、トリプトファンの濃度に対するキヌレニンの濃度の比率を表すグラフである。図１Ｃは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、トリプトファンおよびキヌレニンの濃度、並びにＫ／Ｔ比を表すグラフである。図１Ｄは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来するＣＳＦのサンプルにおける、トリプトファンおよびキヌレニンの濃度、並びにＫ／Ｔ比を表すグラフである。
【図２】図２Ａは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＡ、ＳＰＭＡもしくはＰＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、キノリン酸の濃度を表すグラフである。図２Ｂは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、キノリン酸の濃度を示す棒グラフである。図２Ｃは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来するＣＳＦのサンプルにおける、キノリン酸の濃度を示す棒グラフである。
【図３】それぞれ（Ａ）ミエリン（Ｌａｘａｌ  Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ染色）、（Ｂ）活性化ミクログリア（ＨＬＡ−ＤＲ）、並びに（Ｃ）−（Ｄ）神経毒、ＱＵＩＮ及びＱＵＩＮのアイソトープコントロールを、免疫組織化学染色した図を示す。
【図４】それぞれ（Ａ）慢性のプラーク、（Ｂ）急性のプラーク、（Ｃ）対照群、（Ｄ）基礎レベルにある正常組織における、ＱＵＩＮの発現を示した免疫組織化学染色の図を示す。
【図５】図５Ａは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、ＳＰＭＳもしくはＰＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度を示したグラフである。図５Ｂは、（図に示したように）ＭＳに罹患していない被験体（対照群）、またはＲＲＭＳ、活性型（再発期）ＳＰＭＳもしくは非活性型（寛解期）ＳＰＭＳに罹患している被験体に由来する血清のサンプルにおける、３−ヒドロキシキヌレニンの濃度を示す棒グラフである。
【図６】様々なＫＰ代謝物の濃度比のグラフであり、疾患のサブタイプの間の変化を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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