(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）オリゴヌクレオチドと会合した対イオンを親油性対イオンと交換して生体分子複合体を形成する工程であって、該オリゴヌクレオチドがアミン反応性基を含み、該親油性対イオンが親油性アンモニウムイオンである、該工程、
（b）該生体分子複合体を非水溶媒中に分散させる工程であって、該非水溶媒がアミドまたは尿素である、該工程、
（c）該工程（b）とは別に、アミノヒドロゲルビーズ基質を、工程（b）で使用した非水溶媒と同じ種類の非水溶媒中に分散させる工程、
（d）該アミノヒドロゲルビーズ基質をビス−NHSエステルまたはジスクシンイミジルカーボネートで処理する工程、および
（e）該非水溶媒の存在下で該生体分子複合体のオリゴヌクレオチドを該アミノヒドロゲルビーズ基質にカップリングする工程
を含む、アミノヒドロゲルビーズ基質をコンジュゲートする方法。
【請求項２】
親油性アンモニウムイオンが、テトラアルキルアンモニウム、テトラアリールアンモニウム、混合アルキルおよびアリールアンモニウム、またはそれらの組み合わせである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
親油性アンモニウムイオンが、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラペンチルアンモニウム、テトラヘキシルアンモニウム、テトラへプチルアンモニウム、テトラオクチルアンモニウム、それらのアルキルおよびアリール混合物、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
非水溶媒が、基質および生体分子上のカップリング基と非反応性である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
非水溶媒が極性である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
アミドまたは尿素が、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホラミド、ピロリドン、N-メチルピロリドン、N,N,N',N'-テトラメチル尿素、N,N'-ジメチル-N,N'-トリメチレン尿素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
処理工程が、ビス−NHSエステルで処理することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ビス−NHSエステルが、ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルを含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルが、ビス−スクシンイミジルスベレートまたはビス−スクシンイミジルグルタレートを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
処理工程が、ジスクシンイミジルカーボネートで処理することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
（a）ポリヌクレオチドと会合したカチオン対イオンを親油性対イオンと交換してポリヌクレオチド複合体を形成する工程であって、該ポリヌクレオチドがアミン反応性基を含み、該親油性対イオンが親油性アンモニウムイオンである、工程、
（b）該ポリヌクレオチド複合体を非反応性の非水溶媒中に分散させる工程であって、該非反応性の非水溶媒が、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホラミド、ピロリドン、N-メチルピロリドン、N,N,N',N'-テトラメチル尿素、N,N'-ジメチル-N,N'-トリメチレン尿素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミドまたは尿素である、該工程、
（c）該工程（b）とは別に、アミノヒドロゲルポリマー粒子を、工程（b）で使用した非水溶媒と同じ種類の非水溶媒中に分散させる工程、
（d）該アミノヒドロゲルポリマー粒子を、ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルから選択されるビス−NHSエステルで処理する工程、および
（e）該非水溶媒の存在下で、該アミン反応性基を有する該ポリヌクレオチドを該アミノヒドロゲルポリマー粒子にカップリングする工程
を含む、アミノヒドロゲルポリマー粒子をコンジュゲートする方法。
【請求項１２】
ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステルが、ビス−スクシンイミジルスベレートまたはビス−スクシンイミジルグルタレートを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子の存在下で標的ポリヌクレオチドを増幅して、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を形成する工程であって、該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子が請求項1〜11のいずれか1項記載の方法によって形成される、工程、
該ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を配列決定装置に適用する工程、
該ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子にプライマーを適用する工程、
ヌクレオチドを取り込む工程、および
該取り込みを検出する工程
を含む、配列を決定する方法。
【請求項１４】
検出する工程が、ヌクレオチドの取り込みに伴ったイオン濃度の変化を検出することを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
標的ポリヌクレオチドを含む第一の溶液を、プローブにコンジュゲートされた基質と接触させる工程であって、該プローブにコンジュゲートされた基質のプローブが該標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該プローブにコンジュゲートされた基質が請求項1〜11のいずれか1項記載の方法によって形成される、工程、
該標的ポリヌクレオチドが該プローブにカップリングしている間に、該プローブにコンジュゲートされた基質を洗浄する工程、および
該標的ポリヌクレオチドを第二の溶液中に放出する工程
を含む、標的ポリヌクレオチドを単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2012年2月9日に出願された米国特許仮出願第61/597,064号の恩典を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
開示の分野
本開示は、概して、基質をコンジュゲートする方法およびそのような方法によって形成された基質に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
基質へのポリヌクレオチドのコンジュゲーションは様々な産業にとって興味の対象となっている。コンジュゲートされたポリヌクレオチドを含む基質は、分離技術、遺伝子マーカーの検出、および配列決定において有用である。
【０００４】
たとえば、ポリヌクレオチドプローブにコンジュゲートされた基質は、検出のために遺伝子マーカーを捕捉するために使用することができる。例示的な遺伝子マーカーは、遺伝子内の疾病変異体、疾病を引き起こすバクテリアもしくはウイルスまたは人物同定において有用なアレルに関連していることができる。遺伝子マーカーに相補的なコンジュゲートされたプローブを含む基質はそのような遺伝子マーカーを捕捉することができ、捕捉された遺伝子マーカーの存在を検出するために様々な技術を使用することができる。
【０００５】
もう一つの例において、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされた基質は、遺伝物質を捕捉し、分離するのに役立つことができる。一例においては、基質上のプローブが所望のポリヌクレオチドに相補的であることができる。プローブは、所望のポリヌクレオチドを捕捉し、かつ、その後そのポリヌクレオチドを放出してポリヌクレオチドの回収を可能にするように構成されることができる。もう一つの例においては、標的ポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドプローブにコンジュゲートされたポリマー粒子を使用して、溶液から標的ポリヌクレオチドを捕捉し、分離することができる。その後、標的ポリヌクレオチドをコンジュゲートされた粒子から異なる溶液中へと放出することができる。
【０００６】
さらなる例においては、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされた基質を様々な配列決定技術において使用することができる。たとえば、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの複数のコピーにコンジュゲートされたポリマー粒子を、配列決定技術、たとえば蛍光ベースの配列決定技術またはイオンベースの配列決定技術において使用することができる。
【０００７】
コンジュゲートされた基質の上記使用のそれぞれが様々な産業にとって特に興味の対象であるが、ポリマー基質のような基質へのポリヌクレオチドの確実なコンジュゲーションは、多くの場合、非効率的である。そのような非効率さが、コンジュゲートされたポリヌクレオチドのより低い密度または所望のポリヌクレオチドを欠くランダム領域をもたらす。そのような非効率さは、不十分な分離、検出法の低い精度および配列決定技術における低いシグナルまたは高いSN比を生じさせることができる。
【０００８】
そのようなものとして、改良されたコンジュゲーション法が望まれるであろう。
【発明の概要】
【０００９】
概要
第一の局面において、基質をコンジュゲートする方法は、生体分子と会合した対イオンを親油性対イオンと交換して生体分子複合体を形成する工程、生体分子複合体を非水溶媒中に分散させる工程、および非水溶媒の存在下で生体分子複合体を基質にカップリングする工程を含む。
【００１０】
第二の局面において、ポリマー粒子をコンジュゲートする方法は、ポリヌクレオチドと会合したカチオン対イオンを親油性カチオン対イオンと交換してポリヌクレオチド複合体を形成する工程を含み、ポリヌクレオチドは求核性または求電子性の反応性基を含む。方法はさらに、ポリヌクレオチド複合体を非反応性の非水溶媒中に分散させる工程、および求核置換または求電子置換によってポリヌクレオチドをポリマー粒子にカップリングする工程を含み、ポリマー粒子は求電子性基または求核性基を含む。
【００１１】
第三の局面において、ポリマー粒子は、上記局面または例のいずれか一つの方法を使用してポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマーを含む。
【００１２】
第四の局面において、配列を決定する方法は、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子の存在下で標的ポリヌクレオチドを増幅して、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を形成する工程を含む。オリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子は上記局面または例のいずれかの方法によって形成される。方法はさらに、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を配列決定装置に適用する工程、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子にプライマーを適用する工程、ヌクレオチドを取り込む工程、および取り込みを検出する工程を含む。
【００１３】
第五の局面において、標的ポリヌクレオチドを単離する方法は、標的ポリヌクレオチドを含む第一の溶液を、プローブにコンジュゲートされた基質と接触させる工程を含む。プローブにコンジュゲートされた基質のプローブは標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である。プローブにコンジュゲートされた基質は上記局面または例のいずれかの方法によって形成される。方法はさらに、標的ポリヌクレオチドがプローブにカップリングしている間にプローブにコンジュゲートされた基質を洗浄する工程、および標的ポリヌクレオチドを第二の溶液中に放出する工程を含む。
【００１４】
さらなる局面において、オリゴヌクレオチドをポリマーにコンジュゲートする方法は、アミン官能性を含むポリマーをビス−NHSエステルまたはジスクシンイミジルカーボネートで処理して官能化ポリマーを形成する工程、および官能化ポリマーをアミン終結オリゴヌクレオチドで処理して、オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートされたポリマーを形成する工程を含む。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
生体分子と会合した対イオンを親油性対イオンと交換して生体分子複合体を形成する工程、
該生体分子複合体を非水溶媒中に分散させる工程、および
該非水溶媒の存在下で該生体分子複合体を基質にカップリングする工程
を含む、基質をコンジュゲートする方法。
［２］
生体分子がポリヌクレオチドである、［1］記載の方法。
［３］
親油性対イオンが、親油性アンモニウムイオン、親油性ホスホニウムイオン、親油性アルソニウムイオン、親油性スルホニウムイオン、またはそれらの組み合わせである、［1］または［2］記載の方法。
［４］
親油性アンモニウムイオンが、テトラアルキルアンモニウム、テトラアリールアンモニウム、混合アルキルおよびアリールアンモニウム、またはそれらの組み合わせである、［3］記載の方法。
［５］
親油性アンモニウムイオンが、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラペンチルアンモニウム、テトラヘキシルアンモニウム、テトラへプチルアンモニウム、テトラオクチルアンモニウム、それらのアルキルおよびアリール混合物、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、［4］記載の方法。
［６］
親油性ホスホニウムイオンがテトラフェニルホスホニウムである、［3］記載の方法。
［７］
親油性アルソニウムイオンが、テトラアルキルアルソニウム、テトラアリールアルソニウム、混合アルキルおよびアリールアルソニウムイオン、またはそれらの組み合わせである、［3］記載の方法。
［８］
親油性アルソニウムイオンがテトラフェニルアルソニウムである、［7］記載の方法。
［９］
親油性スルホニウムイオンがトリアルキルスルホニウムイオンである、［3］記載の方法。
［１０］
非水溶媒が、基質および生体分子上のカップリング基と非反応性である、［1］〜［9］のいずれか一項記載の方法。
［１１］
非水溶媒が極性である、［1］〜［10］のいずれか一項記載の方法。
［１２］
非水溶媒が、アミド、尿素、カーボネート、エーテル、スルホキシド、スルホン、ヒンダードアルコール、またはそれらの組み合わせである、［1］〜［11］のいずれか一項記載の方法。
［１３］
アミドまたは尿素が、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホラミド、ピロリドン、N-メチルピロリドン、N,N,N',N'-テトラメチル尿素、N,N'-ジメチル-N,N'-トリメチレン尿素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、［12］記載の方法。
［１４］
カーボネートが、炭酸ジメチル、炭酸プロピレン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、［12］記載の方法。
［１５］
エーテルがテトラヒドロフランである、［12］記載の方法。
［１６］
スルホキシドまたはスルホンが、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、［12］記載の方法。
［１７］
ヒンダードアルコールがtert-ブチルアルコールを含む、［12］記載の方法。
［１８］
基質がポリマー粒子を含む、［1］〜［17］のいずれか一項記載の方法。
［１９］
ポリマー粒子が、生体分子を含む反応性基と反応性のカップリング基を含む、［1］〜［18］のいずれか一項記載の方法。
［２０］
カップリング基が求核体または求電子体の一方を含み、反応性パートナーが該求核体または該求電子体の他方を含む、［1］〜［19］のいずれか一項記載の方法。
［２１］
ポリヌクレオチドと会合したカチオン対イオンを親油性カチオン対イオンと交換してポリヌクレオチド複合体を形成する工程であって、該ポリヌクレオチドが求核性または求電子性の反応性基を含む、工程、
該ポリヌクレオチド複合体を非反応性の非水溶媒中に分散させる工程、および
求核置換または求電子置換によって該ポリヌクレオチドを該ポリマー粒子にカップリングする工程であって、該ポリマー粒子が求電子性基または求核性基を含む、工程
を含む、ポリマー粒子をコンジュゲートする方法。
［２２］
［1］〜［21］のいずれか一項記載の方法を使用してポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマーを含むポリマー粒子。
［２３］
オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子の存在下で標的ポリヌクレオチドを増幅して、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を形成する工程であって、該オリゴヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子が［1］〜［21］のいずれか一項記載の方法によって形成される、工程、
該ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を配列決定装置に適用する工程、
該ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子にプライマーを適用する工程、
ヌクレオチドを取り込む工程、および
該取り込みを検出する工程
を含む、配列を決定する方法。
［２４］
検出する工程が、ヌクレオチドの取り込みに伴ったイオン濃度の変化を検出することを含む、［23］記載の方法。
［２５］
標的ポリヌクレオチドを含む第一の溶液を、プローブにコンジュゲートされた基質と接触させる工程であって、該プローブにコンジュゲートされた基質のプローブが該標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該プローブにコンジュゲートされた基質が［1］〜［21］のいずれか一項記載の方法によって形成される、工程、
該標的ポリヌクレオチドが該プローブにカップリングしている間に、該プローブにコンジュゲートされた基質を洗浄する工程、および
該標的ポリヌクレオチドを第二の溶液中に放出する工程
を含む、標的ポリヌクレオチドを単離する方法。
［２６］
オリゴヌクレオチドをポリマーにコンジュゲートする方法であって、
アミン官能性を含むポリマーをビス−NHSエステルまたはジスクシンイミジルカーボネートで処理して官能化ポリマーを形成する工程、および
該官能化ポリマーをアミン終結オリゴヌクレオチドで処理して、該オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートされたポリマーを形成する工程
を含む、方法。
［２７］
ヒドロキシル官能性を含む初期ポリマーを提供する工程、
該ヒドロキシル官能性をハロゲンで置換するよう該初期ポリマーを処理する工程、および
アミン官能性を含むポリマーを形成するよう、保護アミン終結ポリエーテルで該初期ポリマーをさらに処理する工程
をさらに含む、［26］記載の方法。
［２８］
ポリマーがポリマー粒子の形態にある、［26］または［27］記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
添付図面を参照することにより、本開示がより良く理解され得、その数多くの特徴および利点が当業者に明らかにされ得る。
【００１６】
【図１】ポリヌクレオチドを処理するための例示的方法の図解を含む。
【図２】例示的なコンジュゲーション方法の図解を含む。
【図３】例示的な配列決定法の図解を含む。
【図４】例示的な直接的コンジュゲーション方法の図解を含む。
【図５】例示的な間接的コンジュゲーション方法の図解を含む。
【図６】例示的なコンジュゲーション方法の図解を含む。
【００１７】
異なる図中の同じ参照記号の使用は類似または同一要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
一つの態様において、コンジュゲーション方法は、生体分子と会合した対イオンを親油性対イオンと交換して生体分子複合体を形成する工程を含む。一例において、対イオンはカチオンである。生体分子複合体、たとえばポリヌクレオチド複合体は、非水溶媒中に分散させ、非水溶媒の存在下で基質にコンジュゲートさせることができる。例示的な基質は、表面、たとえばセラミック表面、金属表面、またはポリマー表面を含む。もう一つの例において、基質は膨潤性ポリマー粒子を含む。特に、生体分子は、ポリマー粒子の至る所で膨潤性ポリマーの官能基にコンジュゲートさせることができる。
【００１９】
一例として、コンジュゲートされた基質を使用して標的ポリヌクレオチドを捕捉することができる。特定の例において、捕捉した標的ポリヌクレオチドに基づいて、コンジュゲートされたポリヌクレオチドを伸長させることができる。コンジュゲートされたポリヌクレオチドの複数のコピーを含むポリマー粒子の場合、標的ポリヌクレオチドに従ってコンジュゲートされたポリヌクレオチドのコピーを伸長して、標的ポリヌクレオチドに対する補体の複数のコピーを提供することができる。そのような粒子は、配列決定技術、たとえばイオンまたはpHベースの配列決定技術に役立つことができる。
【００２０】
特に、本方法は、非水溶液内でコンジュゲーションを実施する。水が、様々なコンジュゲーションケミストリーと競合して、または様々なコンジュゲーションケミストリーを妨害して、コンジュゲーション効率を低下させることができることが見出だされた。たとえば、水は、求核置換または求電子置換を妨害することができる。水は、コンジュゲーションについて求電子体を不活性部分へと加水分解することにより、求電子体に関して求核体と競合することができる。非水溶液または溶媒中でコンジュゲートすることにより、コンジュゲーション方法、たとえば求核置換または求電子置換はより効率的になる。加えて、新たなコンジュゲーションケミストリーを非水性環境中で利用することができる。
【００２１】
生体分子は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸（オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド）、ポリペプチド、糖、多糖、脂質、およびそれらの誘導体または類似物を含むことができる。特定の例において、生体分子はポリペプチドまたは核酸、たとえばポリヌクレオチドである。たとえば、生体分子はポリヌクレオチドまたはその類似物であることができる。
【００２２】
図1に示すように、生体分子の対イオンを親油性対イオンと交換して、より親油性である生体分子複合体を提供することができる。図示する生体分子はポリヌクレオチド102である。図示するように、ポリヌクレオチド102は複数の重合ヌクレオチドで形成されている。ヌクレオチドの炭水化物部分（X）が隣接ヌクレオチドのリン酸基に結合している。各リン酸基はカチオン対イオン（M）と会合している。一例において、カチオン対イオン（M）は金属イオンであることができる。もう一つの例において、カチオン対イオン（M）はアンモニウムまたはプロトンであることができる。加えて、ポリヌクレオチド102は、反応性基（P）をヌクレオチド鎖に連結するリンカー基（L）を含むことができる。または、生体分子は、同様なリンカー／反応性基構造を有するポリヌクレオチド類似物であることができ、ポリヌクレオチドは、炭水化物（X）から延びることに加えて、またはそれに代えて、塩基の一つまたは複数から延びる反応性基（P）を有することができる。
【００２３】
一例において、リンカー基（L）は、炭化水素、エーテルもしくはポリエーテル基またはそれらの組み合わせを含む。反応性基（P）は、ポリマー基質のような基質上に形成された官能基と反応するように機能することができる。特定の例において、反応性基（P）は、アミン、チオール、マレイミド、アセチレン、アジドまたはそれらの組み合わせであることができる。たとえば、反応性基（P）はアミンまたはチオールであることができる。特に、反応性基（P）はアミンであることができる。一例において、反応性基（P）はマレイミドであることができる。さらなる例において、反応性基（P）はアセチレンであることができる。さらなる例において、反応性基（P）はアジドであることができる。
【００２４】
ポリヌクレオチド102は親油性対イオン104に暴露される。親油性対イオン104は、一つまたは複数の炭化水素基（R1、R2、R3、R4）にカップリングし、かつ反対のイオン（Z）と会合した正荷電メンバー（Y）を含むことができる。一例において、正荷電メンバー（Y）は、窒素、リン、硫黄、ヒ素またはそれらの任意の組み合わせであることができる。特に、正荷電メンバー（Y）は、窒素、リン、硫黄またはそれらの組み合わせである。たとえば、正荷電メンバー（Y）は窒素またはリンであることができる。特に、正荷電メンバー（Y）は窒素であり、炭化水素基（R1、R2、R3、R4）と一緒にアミンを形成する。
【００２５】
正荷電メンバー（Y）は、一つまたは複数の炭化水素基、たとえば少なくとも二つの炭化水素基、少なくとも三つの炭化水素基または少なくとも四つの炭化水素基を含む。図示するように、正荷電メンバー（Y）は四つの炭化水素基（R1、R2、R3またはR4）を含む。炭化水素基（R1、R2、R3またはR4）は、独立して、アルキル基、アリール基、それらのエーテル誘導体またはそれらの組み合わせであることができる。一例において、アルキル炭化水素基は、メチル、エチル、プロピルもしくはブチル基、それらのエーテル誘導体またはそれらの組み合わせを含むことができる。たとえば、プロピルは、n-プロピル、イソプロピルまたはそれらの組み合わせであることができる。一例において、ブチル基は、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチルまたはそれらの任意の組み合わせであることができる。例示的なアリール基は、フェニル、トリル、キシリルもしくはポリアリール、たとえばナフチル、それらのエーテル誘導体またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００２６】
特に、親油性基［Y（R1）（R2）（R3）（R4）］は、親油性アンモニウムイオン、親油性ホスホニウムイオン、親油性アルソニウムイオン、親油性スルホニウムイオンまたはそれらの組み合わせを含むことができる。例示的な親油性アンモニウムイオンは、テトラアルキルアンモニウム、テトラアリールアンモニウム、混合アルキルおよびアリールアンモニウムまたはそれらの組み合わせを含む。たとえば、例示的な親油性アンモニウムイオンは、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラペンチルアンモニウム、テトラヘキシルアンモニウム、テトラへプチルアンモニウム、テトラオクチルアンモニウム、それらのアルキルおよびアリール混合物ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。例示的な親油性ホスホニウムイオンはテトラフェニルホスホニウムを含む。例示的な親油性アルソニウムイオンは、テトラアルキルアルソニウム、テトラアリールアルソニウム、混合アルキルおよびアリールアルソニウムイオンまたはそれらの組み合わせである。たとえば、親油性アルソニウムイオンはテトラフェニルアルソニウムである。例示的な親油性スルホニウムイオンはトリアルキルスルホニウムイオンである。イオン（Z）は、親油性基［Y（R1）（R2）（R3）（R4）］に対して反対の電荷のイオン、たとえば水酸化物、ハロゲン、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、フェノレート、テトラアルキルホウ酸塩、テトラアリールホウ酸塩、リン酸イオンまたはそれらの任意の組み合わせであることができる。
【００２７】
交換の結果として、ポリヌクレオチド複合体106は、親油性挙動を示し、非水溶媒中に分散することができる。一例において、非水溶媒は極性である。さらなる例において、非水溶媒は、基質上のカップリング基またはポリマーの官能基、たとえばポリヌクレオチド複合体106上の反応性基（P）と反応性ではない。一例において、溶媒は、アミド、尿素、カーボネート、エーテル、スルホキシド、スルホン、ヒンダードアルコール、またはそれらの組み合わせを含む。例示的なアミドまたは尿素は、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホラミド、ピロリドン、N-メチルピロリドン、N,N,N',N'-テトラメチル尿素、N,N'-ジメチル-N,N'-トリメチレン尿素またはそれらの組み合わせを含む。例示的なカーボネートは、炭酸ジメチル、炭酸プロピレンまたはそれらの組み合わせを含む。例示的なエーテルはテトラヒドロフランを含む。例示的なスルホキシドまたはスルホンは、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホンまたはそれらの組み合わせを含む。例示的なヒンダードアルコールはtert-ブチルアルコールを含む。
【００２８】
交換ののち、または交換の一部として、ポリヌクレオチド複合体106は非水溶媒中に分散することができる。分散したポリヌクレオチド複合体106は基質のコンジュゲーションに使用することができる。
【００２９】
基質は、固体表面、粒子、またはそれらの組み合わせであることができる。一例において、基質は固体表面であることができる。基質は、平坦であるか、引っ込んだ、もしくは出っ張った表面、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。基質は、エッチング、空洞、または隆起を含むテキスチャまたは形体を含む。または、基質は、任意のテキスチャまたは形体を欠くこともできる。基質は、毛管構造、通路、溝、ウェルまたは溜めを含むことができる。一例において、基質はメッシュであることができる。基質は、多孔性、半孔性または無孔性であることができる。さらなる例において、基質はフィルタまたはゲルであることができる。基質はピン（たとえばピンアレイ）のトップを含むことができる。基質は、ガラス、ホウケイ酸ガラス、シリカ、石英、溶融石英、雲母、ポリアクリルアミドおよびN置換ポリアクリルアミド、可塑性ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート（PMA）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ケイ素、ゲルマニウム、グラファイト、セラミックス、ケイ素、半導体、高屈折率誘電体、結晶、ゲル、ポリマーまたはフィルム（たとえば金、銀、アルミニウムまたはダイヤモンドのフィルム）のような材料から作られ得る。特に、基質は、金属フィルムまたは金属コーティングを有する固体基質を含むことができる。
【００３０】
特定の例において、基質は、ポリマー粒子内へのポリヌクレオチド複合体106の拡散を可能にする多孔性を有するポリマー粒子を含む。特に、ポリマー粒子は、ポリヌクレオチド複合体106の反応性基（P）に対して反応性である反応性官能基を含むことができる。一例において、ポリマー粒子は親水性である。ポリマー粒子は膨潤性であることができる。たとえば、ポリマー粒子はヒドロゲルであることができる。親水性ポリマー粒子は、ヒドロキシル基またはアミン基のような官能基を露出させることができる。そのような基が他の官能基で置換されて、ポリヌクレオチド複合体106とのコンジュゲーションを容易にすることができる。
【００３１】
一例において、ポリマー粒子は、スチレン系ポリマー、アクリレートポリマー、アクリルアミドポリマーまたはそれらの組み合わせで形成されることができる。たとえば、ポリマー粒子は重合モノマーから形成されることができる。モノマーは、ラジカル重合性モノマー、たとえばビニル系モノマーであることができる。特に、モノマーは親水性モノマーを含むことができる。一例において、親水性モノマーは、アクリルアミド、酢酸ビニル、ヒドロキシアルキルメタクリレートまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。特定の例において、親水性モノマーは、アクリルアミド、たとえば、ヒドロキシル基、アミノ基またはそれらの組み合わせを含むアクリルアミドである。一例において、親水性モノマーはアミノアルキルアクリルアミドである。もう一つの例において、アクリルアミドは、ヒドロキシアルキルアクリルアミド、たとえばヒドロキシエチルアクリルアミドであることができる。特に、ヒドロキシアルキルアクリルアミドは、N-［トリス（ヒドロキシメチル）メチル）アクリルアミド、N-（ヒドロキシメチル）アクリルアミドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。特定の例において、モノマーはヒドロキシル基を含む。さらなる例において、コモノマー、たとえばアミノアクリルアミド、たとえばアミン終結ポリエチレングリコールで官能化されたアクリルアミドまたはアクリロピペラジンを含めることができる。
【００３２】
一例において、ポリマー粒子のポリマーは、モノマーおよび架橋剤の重合から形成することができる。一例において、架橋剤は、15:1〜1:2の範囲、たとえば10:1〜1:1の範囲、6:1〜1:1の範囲または4:1〜1:1の範囲のモノマー：架橋剤の質量比で含まれる。特に、架橋剤はジビニル架橋剤であることができる。たとえば、ジビニル架橋剤は、ジアクリルアミド、たとえばN,N'-(エタン-1,2-ジイル)ビス(2-ヒドロキシルエチル)アクリルアミド、N,N'-(2-ヒドロキシプロパン-1,3-ジイル)ジアクリルアミドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。もう一つの例において、ジビニル架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート、ジビニルベンゼン、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレート、エチレンジメタクリレートまたはそれらの組み合わせを含む。
【００３３】
一例において、ポリマー粒子は、親水性粒子、たとえばヒドロゲル粒子であることができる。ヒドロゲルとは、その重量の少なくとも20％の水、たとえばその重量の少なくとも45％、少なくとも65％、少なくとも85％、少なくとも100％、少なくとも300％、少なくとも1000％、少なくとも1500％または少なくとも2000％の水を吸収することができるポリマーである。
【００３４】
ポリマー粒子は、所望の粒径、たとえば100μm以下、30μm以下または3μm以下の粒径を有することができる。平均粒径とは平均粒子直径である。たとえば、平均粒径は、2μm以下、たとえば1.5μm以下、1.1μm以下、0.8μm以下、0.6μm以下、0.5μm以下または0.3μm以下であり得る。特定の例において、平均粒径は、0.1μm〜100μmの範囲、たとえば0.1μm〜50μmの範囲または0.1μm〜1.1μmの範囲であることができる。
【００３５】
さらなる例において、複数の粒子は単分散であり、望ましく低い変動係数、たとえば20％以下の変動係数を有し得る。変動係数（CV）は、標準偏差÷平均×100と定義され、ここで「平均」は平均粒子直径であり、標準偏差は粒径の標準偏差である。または、「平均」は、z平均またはモード粒子直径のいずれかであることもできる。通常の実施に従って、CVは主モード、すなわち主ピークで計算され、それにより、凝集塊に関する小さなピークを除外する。したがって、モードサイズよりも下または上の粒子は、たとえば検出可能な粒子の総数の約90％に基づき得る計算においては考慮されない場合がある。そのようなCVの決定は、CPS分離板型遠心沈降機またはクールターカウンタで実施可能である。たとえば、ポリマー粒子の変動係数（CV）は、15％以下、たとえば10％以下、5％以下、4.5％以下、4.0％以下、3.5％以下または3.0％以下であり得る。
【００３６】
さらなる例において、水中の親水性ポリマー粒子は、ポリマー50重量％以下、たとえばポリマー30重量％以下、ポリマー20重量％以下、ポリマー10重量％以下、ポリマー5重量％以下またはポリマー2重量％以下であることができる。
【００３７】
さらなる例において、ポリマー粒子は、ポリヌクレオチド、タンパク質または酵素の拡散を可能にする多孔性を有することができる。一例において、ポリマー粒子は、少なくとも50キロダルトン、たとえば少なくとも100キロダルトン、少なくとも200キロダルトン、少なくとも250キロダルトンまたは少なくとも350キロダルトンのサイズを有するタンパク質の拡散を可能にするための多孔性を有することができる。
【００３８】
固体表面であろうと上記ポリマー粒子のようなポリマー粒子であろうと、非水溶媒の存在下で、図1に示すポリヌクレオチド複合体106を基質にコンジュゲートさせることができる。たとえば、基質のポリマーはヒドロキシル基を含むことができる。ヒドロキシル基の一部を代替の官能基で置換すると、ポリヌクレオチド複合体、たとえば図1に示すポリヌクレオチド複合体106とのコンジュゲーションを容易にすることができる。
【００３９】
基質は、直接的なコンジュゲーションまたは間接的なコンジュゲーションを受けることができる。特定の例において、ポリマーの官能基、たとえばヒドロキシル基が求核置換または求電子置換を受けて、ポリマーをポリヌクレオチドにコンジュゲートさせることができる。たとえば、基質のカップリング基は求核体または求電子体の一方を含むことができ、ポリヌクレオチドの末端反応性基は求核体または求電子体の他方を含むことができる。ポリヌクレオチドは、求核置換または求電子置換によってポリマー粒子にカップリングすることができる。一例において、ヒドロキシル基を含むポリマーの直接コンジュゲーションは、ヒドロキシル基をスルホン酸エステルで置換することを含むことができ、その後そのスルホン酸エステルが、アミンまたはチオール反応性基を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにコンジュゲートされる。たとえば、ポリマー粒子上のヒドロキシル基は、ヒドロキシル基の少なくとも一部をスルホン酸エステル基で置換することによって活性化することができる。例示的なスルホン酸エステル基は、塩化トレシル、メシル、トシルもしくはホシルまたはそれらの任意の組み合わせから誘導されて、ヒドロキシル基の少なくとも一部に代えてスルホン酸エステル官能基を提供することができる。スルホン酸エステルは、求核体がスルホン酸エステルを置換することが可能になるように作用することができる。スルホン酸エステルはさらに、遊離塩素と反応して、粒子をコンジュゲートさせる工程において使用されることができる塩素化基を提供し得る。または、ヒドロキシル基を、ポリヌクレオチド複合体の反応性基と反応性であるハロゲン基で置換することもできる。さらなる例において、高分子ポリマーのコモノマーのアミン基がポリヌクレオチド複合体の反応性基と反応性であることができる。
【００４０】
または、コンジュゲーションは、ポリマー官能基、たとえばヒドロキシル基が一連の置換によって置換されて、ポリヌクレオチド複合体の反応性基と反応させることができる官能基（カップリング基）を生じさせる間接的コンジュゲーションであってもよい。たとえば、図2は、一つまたは複数の一連の置換によって官能基で置換されることができるヒドロキシル基を含むポリマー202を示す。
【００４１】
たとえば、204において、ヒドロキシル基の少なくとも一部を官能基（A）、たとえばスルホン酸エステル、フッ素以外のハロゲンまたはそれらの組み合わせで置換することができる。そのような官能基（A）を、206に示すように、官能基（B）、たとえばアジド、フタルイミド、チオエステル、N保護ジアミン、N保護アミノチオエーテル、アミノ（オリゴヌクレオチド）またはそれらの組み合わせでさらに置換することができる。場合によっては、そのような官能基（B）を、208に示すように、官能基（C）、たとえばアミン、チオールまたはそれらの組み合わせでさらに活性化することができる。そのうえ、208に示すような官能基（C）を、210に示すような官能基（D）、たとえばモノアミド-モノ(NHSエステル)ジカルボン酸、スクシンイミドチオエーテル（オリゴヌクレオチド）またはそれらの組み合わせで置換することができる。なおさらには、210に示す官能基（D）を、212に示すように、官能基（E）、たとえばモノアミド-(アミノ-オリゴヌクレオチド)-モノアミドジカルボン酸で置換することができる。そのようなものとして、元のポリマーの官能基は、一つまたは複数の一連の置換を受けて、ポリヌクレオチド複合体と反応するのに適した反応部位を提供することができる。
【００４２】
または、アミン官能性を有するアクリルアミドポリマーを、ヒドロキシル基を含むポリマーに代えて使用することもできる。たとえば、図示するヒドロキシル基をアミン終結ポリエーテル（たとえばアミン終結PEG）基で置換することができる。アミン官能性の場合、図示する方法は、たとえば（C）から出発することができる。
【００４３】
特定の例において、204における官能基（A）は、スルホン酸エステル、ハロゲンまたはそれらの組み合わせであることができる。特に、ハロゲンは、フッ素以外のハロゲン、たとえば塩素である。官能基（A）は、非水溶媒中、リンカー基（L）が炭化水素またはポリエーテルであり、反応性基（P）がアミンであるポリヌクレオチド複合体106と反応して、206において官能基（B）、たとえばアミノ(オリゴヌクレオチド)を生じさせることができる。204における官能基（A）が206における官能基（B）によって置換されるもう一つの例において、官能基（A）は、スルホン酸エステル、ハロゲンまたはそれらの組み合わせであることができ、官能基（B）は、アジド、フタルイミド、モノ（N保護）ジアミンまたはN保護アミノチオエーテルであることができる。官能基（B）を官能基（C）、たとえばアミンへとさらに活性化することができる。アミン官能基（C）を官能基（D）、たとえば(モノ-アミド)-(モノNHSエステル)ジカルボン酸でさらに活性化することができる。官能基（D）を、非水溶媒中、炭化水素またはポリエーテルのリンカー基（L）およびアミンの反応性官能基（P）を含むポリヌクレオチド複合体106と反応させることにより、官能基（E）、たとえば(アミノ(オリゴヌクレオチド))-ジカルボン酸でさらに置換することができる。または、ポリマー粒子は、アミン官能基を含むコモノマーを含むコポリマーであることができる。そのようなアミン官能基は反応性であることができる。
【００４４】
さらなる例において、官能基（A）は、スルホン酸エステル、ハロゲンまたはそれらの組み合わせである。官能基（B）はアジドである。そのような場合、官能基（B）を官能基（C）、たとえば（オリゴヌクレオチド）トリアゾールで置換することができる。ポリヌクレオチド複合体は、炭化水素またはポリエーテルのリンカー基（L）およびアセチレンの反応性官能基（P）を含む。
【００４５】
さらなる例において、官能基（A）は、スルホン酸エステル、ハロゲンまたはそれらの組み合わせであることができる。官能基（A）は官能基（B）、たとえばチオエステルで置換される。チオエステル官能基（B）を官能基（C）、たとえばチオールで置換することができ、その官能基（C）が官能基（D）、たとえばスクシンイミドチオエーテル（オリゴヌクレオチド）によってさらに置換される。そのような例において、ポリヌクレオチド複合体は、リンカー（L）、たとえば炭化水素またはポリエーテルおよび反応性基（P）、たとえばマレイミドを含むことができる。
【００４６】
他の活性化ケミストリーは、特定の所望の連結を受け入れるように指定された官能基を転換するための複数の工程を組み入れることを含む。たとえば、スルホネート修飾ヒドロキシル基は、いくつかの方法によって求核性基に転換することができる。一例においては、スルホン酸エステルとアジドアニオンとの反応がアジド置換親水性ポリマーを生じさせる。銅触媒を用いて、または用いずに実施することができる「CLICK」ケミストリーにより、アジドを直接的にアセチレン置換生体分子にコンジュゲートさせることができる。場合によっては、たとえば水素を用いる接触還元または有機ホスフィンを用いる還元によってアジドをアミンに転換することもできる。そして、得られたアミンを、多様な試薬、たとえばジイソシアネート、ビス−NHSエステル、シアヌル酸塩化物、またはそれらの組み合わせによって求電子性基に転換することができる。一例においては、ジイソシアネートの使用が、ポリマーとリンカーとの間に尿素連結を生じさせ、アミノ置換生体分子と反応することができる残留イソシアネート基を生じさせて、リンカーと生体分子との間に尿素連結を生じさせる。もう一つの例においては、ビス−NHSエステルの使用が、ポリマーとリンカーとの間のアミド連結およびアミノ置換生体分子と反応することができる残留NHSエステル基を生じさせて、リンカーと生体分子との間にアミド連結を生じさせる。例示的なビス−NHSエステルは、ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステル、たとえばビス−スクシンイミジルスベレートまたはビス−スクシンイミジルグルタレートを含む。さらなる例において、シアヌル酸塩化物の使用は、ポリマーとリンカーとの間のアミノ−トリアジン連結および二つの残留クロロ−トリアジン基を生じさせ、その一方が、アミノ置換生体分子と反応して、リンカーと生体分子との間にアミノ−トリアジン連結を生じさせることができる。スルホネート活性化によって他の求核性基を粒子に組み入れることもできる。たとえば、スルホン化粒子とチオ安息香酸アニオンとの反応および結果的なチオベンゾエートの加水分解がチオールを粒子に組み入れ、その後そのチオールをマレイミド置換生体分子と反応させて、生体分子へのチオ−スクシンイミド連結を生じさせることができる。また、チオールをブロモ−アセチル基と反応させることもできる。
【００４７】
さらなる例においては、ポリマー粒子を処理して、ビス-NHSエステルまたはジスクシンイミジルカーボネートの使用によってコンジュゲートすることができるアミン官能性を形成することができる。例示的なビス-NHSエステルは、ビス−スクシンイミジルC2〜C12アルキルエステル、たとえばビス−スクシンイミジルスベレートまたはビス−スクシンイミジルグルタレートを含む。たとえば、ポリマー粒子、たとえば露出したヒドロキシル基を含む粒子を、そのヒドロキシル基がハロゲン、たとえば塩素で置換されるように処理することができる。粒子を、酸性条件下、tBOC(N-tert-ブトキシカルボニル)保護アミン終結ポリエーテル、たとえばポリエチレングリコール（PEG）でさらに処理して、ポリマー粒子をコンジュゲートさせるためにさらに使用することができるアミン官能性を提供することができる。または、アミン官能性を提供するモノマーを使用してポリマー粒子を重合させることができる。アミン基を含むポリマー粒子を、ビス−NHSエステルまたはジスクシンイミジルカーボネートを使用してさらに処理することができ、それをさらにアミン終結オリゴヌクレオチドに暴露して、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を生じさせる。
【００４８】
コンジュゲーションののち、ポリマー粒子は、少なくとも7×104個/μm3の、ヌクレオチド密度と呼ばれる、ポリヌクレオチドの密度を含むことができる。たとえば、ヌクレオチド密度は、少なくとも105個/μm3、たとえば少なくとも106個/μm3、少なくとも2×106個/μm3、少なくとも5×106個/μm3、少なくとも8×106個/μm3、少なくとも1×107個/μm3または少なくとも3×107個/μm3であることができる。
【００４９】
特定の例において、コンジュゲートされた粒子は、分離技術または配列決定技術において使用することができる。たとえば、コンジュゲートされた粒子は、標的ポリヌクレオチドを捕捉するために使用することができる。一例においては、捕捉された標的ポリヌクレオチドに基づいて、ポリマーにコンジュゲートされたポリヌクレオチドを伸長することができる。そのようなコンジュゲートされた粒子は、配列決定技術、たとえばイオンベースまたはpHベースの配列決定技術において使用することができる。図3に示すように、複数のコンジュゲートされたポリマー粒子304を複数の標的ポリヌクレオチド302とともに溶液に入れることができる。複数の粒子304は、標的ポリヌクレオチド302と結合するためのプローブポリヌクレオチドとコンジュゲートされていることができる。たとえば、コンジュゲートされた粒子304は、標的ポリヌクレオチド302の一部に相補的であるオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００５０】
特定の態様においては、粒子304およびポリヌクレオチド302をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅に付す。たとえば、分散相小滴306または308がエマルションの一部として形成され、親水性粒子またはポリヌクレオチドを含むことができる。一例において、標的ポリヌクレオチド302および親水性粒子304は、一つのポリヌクレオチド302が一つの親水性粒子304と同じ分散相小滴内に存在する可能性が高くなるよう、互いに対して低い濃度および比率で提供される。他の小滴、たとえば小滴308は、一つの親水性粒子を含み、かつポリヌクレオチドを含まないことができる。各小滴306または308は、ポリヌクレオチドの複製を容易にするのに十分な酵素、ヌクレオチド、塩または他の成分を含むことができる。
【００５１】
標的ポリヌクレオチドの複製は、複製条件を変更することを含むことができる。変更は、場合によっては、ポリメラーゼ濃度を上げる、または下げること；ヌクレオチド濃度を上げる、または下げること；カチオン濃度を上げる、または下げること；反応温度、時間またはpHを上げる、または下げること、などを含むことができる。変更は、反応速度を上げる、または下げること、反応生成物の収率を上げる、または下げることなどを含むことができる。複製は、適切なバッファまたはヌクレオチド（ヌクレオチド類似物またはビオチン化ヌクレオチドを含む）の存在下で実施することができる。
【００５２】
特に、増幅させるポリヌクレオチドをポリマー粒子によって捕捉することができる。核酸を捕捉するための例示的な方法は、ポリマー粒子に付着したオリゴヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる方法を含むことができる。核酸を捕捉する方法は、（a）一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）に付着したポリマー粒子を提供する工程、（b）一本鎖ポリヌクレオチドを提供する工程、および（c）一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、それにより一本鎖ポリヌクレオチドをポリマー粒子に捕捉する工程を含むことができる。各ポリマー粒子が複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）と付着していることができる。いくつかの態様において、工程（c）は、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを用いて実施することができる。いくつかの態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的（または部分的に相補的）であるヌクレオチド配列を含む。
【００５３】
一例において、方法はさらに、ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチドへと増幅する工程、および複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部を親水性粒子に付着させ、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含む親水性粒子を生成する工程を含むことができる。または、方法は、コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを伸長することによってポリヌクレオチドを複数の相補的ポリヌクレオチドへと増幅し、それにより複数の付着したポリヌクレオチドを含むヒドロゲル粒子を生成する工程を含むことができる。
【００５４】
さらなる例において、ヌクレオチド取り込みのための方法は、ポリマー粒子に付着しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているポリヌクレオチドにおいてヌクレオチド重合反応を実施する工程を含むことができる。いくつかの態様において、ヌクレオチド取り込みの方法は、（a）一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえばプライマーオリゴヌクレオチド）に付着したポリマー粒子を提供する工程、（b）一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程、（c）一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、および（d）ポリメラーゼが一本鎖オリゴヌクレオチドへの少なくとも一つのヌクレオチドの重合を触媒するのに適した条件下で、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび少なくとも一つのヌクレオチドと接触させ、それにより、ヌクレオチド取り込みを実施する工程を含む。いくつかの態様においては、各ポリマー粒子が複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）と付着していることができる。いくつかの態様において、工程（b）、（c）または（d）は、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを用いて実施することができる。いくつかの態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的（または部分的に相補的）であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、システムが、ポリマー粒子に付着している一本鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした一本鎖ポリヌクレオチドを含み、少なくとも一つのヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドの末端に重合している。
【００５５】
もう一つの例において、プライマー伸長の方法は、ポリマー粒子に付着しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているポリヌクレオチドにおいてプライマー伸長反応を実施する工程を含むことができる。いくつかの態様において、核酸プライマー伸長の方法は、（a）一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえばプライマーオリゴヌクレオチド）に付着したポリマー粒子を提供する工程、（b）一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程、（c）一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、および（d）ポリメラーゼが一本鎖オリゴヌクレオチドへの少なくとも一つのヌクレオチドの重合を触媒するのに適した条件下、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび少なくとも一つのヌクレオチドと接触させ、それにより、プライマーを伸長させる工程を含む。いくつかの態様においては、各ポリマー粒子が複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）と付着していることができる。いくつかの態様において、工程（b）、（c）または（d）は、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを用いて実施することができる。いくつかの態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的（または部分的に相補的）であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、システムが、ポリマー粒子に付着した一本鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした一本鎖ポリヌクレオチドを含み、一本鎖オリゴヌクレオチドは一つまたは複数のヌクレオチドで伸長している。
【００５６】
さらなる例において、核酸増幅の方法は、ポリマー粒子に付着しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているポリヌクレオチドにおいてプライマー伸長反応を実施する工程を含むことができる。いくつかの態様において、核酸増幅の方法は、（a）一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえばプライマーオリゴヌクレオチド）に付着したポリマー粒子を提供する工程、（b）一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程、（c）一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、（d）ポリメラーゼが一本鎖オリゴヌクレオチドへの少なくとも一つのヌクレオチドの重合を触媒するのに適した条件下、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび少なくとも一つのヌクレオチドと接触させて、伸長した一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する工程を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、（e）伸長した一本鎖オリゴヌクレオチドから一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを除去（たとえば変性）して、一本鎖オリゴヌクレオチドがポリマー粒子に付着したままになるようにする工程、（f）残る一本鎖オリゴヌクレオチドを第二の一本鎖鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、および（g）第二のポリメラーゼが一本鎖オリゴヌクレオチドへの少なくとも一つのヌクレオチドの重合を触媒するのに適した条件下、第二の一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを第二のポリメラーゼおよび第二の少なくとも一つのヌクレオチドと接触させて、結果的に伸長した一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する工程を含む。いくつかの態様においては、工程（e）、（f）および（g）を少なくとも一度繰り返すことができる。いくつかの態様において、ポリメラーゼおよび第二のポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド重合に適した条件は、ヌクレオチド重合工程（たとえば工程（d）または（g））を高温で実施することを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド重合に適した条件は、ヌクレオチド重合工程（たとえば工程（d）または（g））を交互の温度（たとえば高温および相対的に低い温度）で実施することを含む。いくつかの態様において、交互の温度は60〜95℃の範囲である。いくつかの態様において、温度サイクルは、約10秒〜約5分または約10分または約15分またはより長いサイクルであることができる。いくつかの態様において、核酸増幅の方法は、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドまたは第二の一本鎖鋳型ポリヌクレオチドに相補的である配列を含む複数の鋳型ポリヌクレオチドにそれぞれが付着した一つまたは複数のポリマー粒子を生成することができる。いくつかの態様においては、各ポリマー粒子が複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（たとえば捕捉オリゴヌクレオチド）と付着していることができる。いくつかの態様において、工程（b）、（c）、（d）、（e）、（f）または（g）は、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを用いて実施することができる。いくつかの態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的（または部分的に相補的）であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸増幅の方法（上記のような）は、水相溶液中、油相（たとえば分散相小滴）��中で実施することができる。
【００５７】
PCRののち、親水性粒子312および標的ポリヌクレオチドまたはその補体の複数のコピー314を含むことができる粒子、たとえば粒子310が形成される。ポリヌクレオチド314は粒子310の表面にあるように示されているが、ポリヌクレオチド314は粒子310の中に延びることもできる。水に対して低い濃度のポリマーを有するヒドロゲルおよび親水性粒子は、粒子310の内部かつ至る所にポリヌクレオチドセグメントを含むことができ、または、ポリヌクレオチドは、細孔または他の開口中に存在することができる。特に、粒子310は、反応をモニタするために使用される酵素、ヌクレオチド、プライマーおよび反応生成物の拡散を許すことができる。特定の配列決定技術においては粒子1個あたり多数のポリヌクレオチドがより良好なシグナルを生成する。
【００５８】
例示的態様においては、粒子310を配列決定装置において利用することができる。たとえば、配列決定装置316はウェル318のアレイを含むことができる。粒子310をウェル318内に配置することができる。
【００５９】
一例においては、プライマーをウェル318に加えることもできるし、粒子310を事前にプライマーに暴露したのち、ウェル318に入れることもできる。プライマーおよびポリヌクレオチドが、プライマーにハイブリダイズしたポリヌクレオチド（たとえば鋳型核酸）を含む核酸二重鎖を形成する。核酸二重鎖とは、少なくとも部分的に二本鎖のポリヌクレオチドである。酵素およびヌクレオチドをウェル318に提供して、検出可能な反応、たとえばヌクレオチド取り込みを容易にすることができる。
【００６０】
ヌクレオチド付加を検出することによって配列決定を実施することができる。ヌクレオチド付加は、蛍光発光法またはイオン検出法のような方法を使用して検出することができる。たとえば、蛍光標識されたヌクレオチドのセットがシステム316に提供され、ウェル318に移動することができる。また、励起エネルギーをウェル318に提供することができる。ヌクレオチドがポリメラーゼによって捕捉され、伸長するプライマーの末端に加えられると、ヌクレオチドの標識が発蛍光して、どのタイプのヌクレオチドが加えられたかを示すことができる。
【００６１】
代替の例においては、一つのタイプのヌクレオチドを含む溶液を順次に供給することができる。ヌクレオチド付加に応答して、ウェル318の局所環境内のpHが変化することができる。そのようなpHの変化を、イオン感応性電界効果トランジスタ（ISFET）によって検出することができる。そのようなものとして、pHの変化を使用して、粒子310のポリヌクレオチド314に相補的なヌクレオチドの順序を示すシグナルを生成することができる。
【００６２】
特に、配列決定システムは、電界効果トランジスタ（FET）のようなイオンセンサのセンサパッド上に配置されたウェルまたは複数のウェルを含むことができる。いくつかの態様において、システムは、イオンセンサ（たとえばFET）のセンサパッド上に配置されるウェルの中に装填された一つまたは複数のポリマー粒子またはイオンセンサ（たとえばFET）のセンサパッド上に配置される複数のウェルの中に装填された一つまたは複数のポリマー粒子を含む。いくつかの態様において、FETはchemFETまたはISFETであることができる。「chemFET」またはケミカル電界効果トランジスタは、化学センサとして働くタイプの電界効果トランジスタを含む。これは、化学的プロセスによってゲート電極上の電荷が印加されるMOSFETトランジスタの構造的類似物である。「ISFET」またはイオン感応性電界効果トランジスタは、溶液中のイオン濃度を計測するために使用することができる。イオン濃度（たとえばH+）が変化するとき、トランジスタを通過する電流が相応に変化する。
【００６３】
FETはFETアレイであってもよい。本明細書において使用されるように、「アレイ」とは、センサまたはウェルのような要素の平面的配置である。アレイは一または二次元であり得る。一次元アレイは、第一の次元における要素の一つの列（または行）および第二の次元における複数の行（または列）を有するアレイであることができる。第一および第二の次元における列（または行）の数は同じであってもよいし、同じでなくてもよい。
【００６４】
生物学的または化学的反応を封じ込める、または閉じ込めるために、FETセンサアレイの上に一つまたは複数のマイクロ流体構造を製造することができる。たとえば、一つの実施態様において、マイクロ流体構造は、アレイの一つまたは複数のセンサの上に配置された一つまたは複数のウェル（または、本明細書において互換可能に使用される用語のような、マイクロウェルもしくは反応チャンバもしくは反応ウェル）として、所与のウェルを上に配置された一つまたは複数のセンサがその所与のウェル中の分析対象物の存在、レベルまたは濃度を検出し、計測するように構成されることができる。いくつかの態様において、FETセンサと反応ウェルとの対応は1:1であることができる。
【００６５】
図3に戻ると、もう一つの例において、ウェルのアレイのウェル318が計測装置に機能的に接続されることができる。たとえば、蛍光発光法の場合、ウェル318は光検出装置に機能的に接続されることができる。イオン検出の場合、ウェル318の下面が、電界効果トランジスタのようなイオンセンサのセンサパッドの上に配置され得る。
【００６６】
ヌクレオチド取り込みのイオン副産物の検出による配列決定を含む一つの例示的なシステムが、ヌクレオチド取り込みの副産物として生成される水素イオンを検出することによって核酸鋳型を配列決定するイオンベースの配列決定システムであるIon Torrent PGM（商標）シーケンサー（Life Technologies）である。通常、ポリメラーゼによる鋳型依存性核酸合成中に起こるヌクレオチド取り込みの副産物として水素イオンが放出される。Ion Torrent PGM（商標）シーケンサーは、ヌクレオチド取り込みの水素イオン副産物を検出することによってヌクレオチド取り込みを検出する。Ion Torrent PGM（商標）シーケンサーは、配列決定される複数の鋳型ポリヌクレオチドを含むことができ、各鋳型がアレイ中のそれぞれの配列決定反応ウェル内に配置される。アレイのウェルは、それぞれ、ヌクレオチド取り込みの副産物として生じるH+イオンの放出または溶液のpHの変化を検出することができる少なくとも一つのイオンセンサにカップリングすることができる。イオンセンサは、H+イオンの存在または溶液のpHの変化を感知することができるイオン感応性検出層にカップリングされた電界効果トランジスタ（FET）を含む。イオンセンサは、それぞれのウェルまたは反応チャンバ中のH+イオン濃度と相関する大きさの電圧変化として表すことができるヌクレオチド取り込みを示す出力シグナルを提供することができる。様々なヌクレオチドタイプを反応チャンバに連続的に流し込み、そして鋳型の配列によって決まる順序でポリメラーゼによって伸長プライマー（または重合部位）の中に取り込むことができる。各ヌクレオチド取り込みは、反応ウェル中へのH+イオンの放出および局所的pHの付随的変化を伴うことができる。H+イオンの放出は、ヌクレオチド取り込みの発生を示すシグナルを生成するセンサのFETによって記録することができる。特定のヌクレオチドフローの間に取り込まれないヌクレオチドはシグナルを生成し得ない。また、FETからのシグナルの振幅を、伸長する核酸分子に取り込まれた特定のタイプのヌクレオチドの数と相関させ、それにより、ホモポリマー領域を解析することを可能にすることができる。したがって、シーケンサーの動作中、反応チャンバ中への複数のヌクレオチドフローが、複数のウェルまたは反応チャンバに及ぶ取り込みモニタリングとともに、計器が多数の核酸鋳型の配列を同時に解析することを可能にすることができる。Ion Torrent PGM（商標）シーケンサーの構成、設計および動作に関するさらなる詳細は、たとえば、すべて参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願第12/002781号（現在、米国特許出願公開公報第2009/0026082号として公開）、米国特許出願第12/474897号（現在、米国特許出願公開公報第2010/0137143号として公開）、および米国特許出願第12/492844号（現在、米国特許出願公開公報第2010/0282617号として公開）に見出すことができる。
【実施例】
【００６７】
実施例1
図4に示すように、オリゴヌクレオチドをメシル活性化Dynal粒子に直接コンジュゲートする。官能基は粒子の表面にあるように示されているが、官能基は粒子の至る所に存在することができる。播種乳化重合であるUgelstad法により、塩化メシル活性化マイクロゲルを調製する。このようにして形成した粒子を、イオン交換された一本鎖DNAとのコンジュゲーションに備え、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）中で洗浄する。
【００６８】
5'-NH2-C6-30量体オリゴヌクレオチドのナトリウム塩を0.1M酢酸テトラブチルアンモニウムに溶解し、逆相HPLCカラムに注加した。0.1M酢酸テトラブチルアンモニウム移動相を用いて溶離を実施した。核酸を含有する画分を捕集し、乾燥粉末へと凍結乾燥させ、乾燥N-メチル-2-ピロリドン（NMP）中に再懸濁させた。
【００６９】
粒子500万個（5.0×109個）を無水NMP350uL中に分散させ、ボルテックス混合して分散させる。NMP（4.10mM）中Bu4NAc-DNA（5'-NH2-C6-30量体オリゴヌクレオチド）124uLを粒子混合物に直接加える。次いで、ホウ酸テトラエチルアンモニウム19.5uL（26.14mM）を約500uLの最終量まで反応混合物に加える。
【００７０】
反応混合物を速やかにボルテックス混合し、70℃で16時間ゆっくりと混合する。混合物を遠心分離し、上澄みをデカントし、粒子をNMP1mL中に再懸濁させる。ボルテックス混合ののち、再懸濁させたマイクロゲル粒子をNMP中の沈降／分散2サイクルによってペレット化する。二回目のNMP洗浄ののち、ペレットを2×SSPE/0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）1mL中に取り、混合し、ペレットへと遠心分離する。最後に、粒子を1×PBS/0.1％ Triton X-100 1mL中に取り、混合し、硬いペレットへと遠心分離し、この工程を三回繰り返す。最終サイクルののち、コンジュゲートされたマイクロゲルを1×PBS/0.1％Triton X-100 500uL中に再懸濁させる。
【００７１】
次いで、SYBRゴールド染色で標識したのち、コンジュゲートされた物質をフローサイトメータでカウントする。物質は、配列決定に備えてDNA鋳型のPCR増幅の用意ができている。
【００７２】
実施例2
図5に示すような一連の置換によって粒子をコンジュゲートさせる。官能基は粒子の表面にあるように示されているが、官能基は粒子の至る所に存在することができる。
【００７３】
2ml遠心分離管中、塩化メシル活性化ヒドロゲルのNMP溶液（20億個、1ml）に、アジ化テトラブチルアンモニウムの飽和NMP溶液（800uL）を加え、反応混合物を60℃で一晩撹拌する。反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離し、上澄みを除去する。得られたペレットをNMP中に再懸濁させ、遠心分離して上澄みを除去する。工程を二回繰り返す。
【００７４】
得られたペレットを脱イオン（DI）水（1ml）中に再懸濁させる。反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離し、上澄みを除去する。工程をさらに二回繰り返す。
【００７５】
ペレットにTCEP溶液（DI水、1M）1mlを加え、反応混合物を室温で一晩撹拌する。反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去する。得られたペレットをDI水中に再懸濁させ、21300rcfで10分間遠心分離して上澄みをさらに二回除去する。反応混合物を無水NMP（1ml）中に再懸濁させ、21300rcfで10分間遠心分離する。上澄みを除去し、工程をさらに三回繰り返す。
【００７６】
得られたペレットを無水NMP（500ul）中に再懸濁させ、無水NMP中ビス−NHSスベレートの溶液（200uL、20mg）を反応混合物に加える。反応混合物を70℃で一晩撹拌する。反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去する。反応混合物を無水NMP（1ml）中に再懸濁させ、21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去する。工程をさらに五回繰り返し、得られたペレットを無水NMP（200uL）中に再懸濁させる。
【００７７】
反応混合物に、オリゴヌクレオチドの溶液（NMP中Bu4NAc-DNA（5'-NH2-C6-30量体オリゴヌクレオチド））（0.6マイクロモル、200uL）および無水NMP中ホウ酸テトラブチルアンモニウムの溶液（60uL、200uL中1mg）を加え、反応混合物を70℃で一晩撹拌する。
【００７８】
反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去し、得られたペレットをNMP（1ml）中に再懸濁させる。反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離し、得られたペレットをNMP中に再懸濁させる。工程をさらに三回繰り返し、ペレットを2×SSPE＋0.2％ SDS溶液（1ml）中に再懸濁させ、21300rcfで10分間遠心分離する。得られたペレットを、0.1％Triton X100（1ml）を含む1×TEバッファ中に再懸濁させる。反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離する。ペレットを1×TEバッファ中に再懸濁させ、80℃で1時間撹拌する。混合物を21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去する。ペレットを、0.1％ Triton X100を含む1×TEバッファ（1ml）中に再懸濁させ、21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去する。工程を一度繰り返す。ペレットを30％アンモニア溶液（1ml）中に再懸濁させ、室温で15分間撹拌する。反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去し、ペレットをDI水（1ml）中に再懸濁させる。反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去し、工程をさらに二回繰り返す。ペレットを、0.1％ Triton X100を含む1×TEバッファ（1ml）中に再懸濁させる。反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去し、工程をもう一度繰り返す。ペレットを、0.1％ Triton X100を含む1×TEバッファ中に再懸濁させ、反応混合物を21300rcfで10分間遠心分離して上澄みを除去する。工程をもう一度繰り返し、ペレットを、0.1％ Triton X100を含む1×TEバッファ（500uL）中に再懸濁させる。
【００７９】
実施例3
アミノヒドロゲルの活性化およびヒドロゲルとアミン末端DNAプローブとのコンジュゲーション
アミンフリーの無水N-メチルピロリドン（NMP）（600μL）中アミノヒドロゲル1000億個（直径0.55ミクロン、アミン2300万個/micron3）の溶液に、固体ビス−スクシンイミジルスベレート（22.1mg、60μモル）を加え、次いでトリブチルアミン（14μL、60μモル）を加える。60℃で1時間撹拌したのち、遠心分離（21300rcfで30分間）によってヒドロゲルを単離する。ヒドロゲルペレットをアミンフリーの無水NMP（1ml）で希釈し、遠心分離によって単離する。この洗浄工程を二回繰り返し、最終的なペレットをNMP（600μL）中に再懸濁させる。このヒドロゲル懸濁液を酢酸無水物（30μL、317μモル）およびトリブチルアミン（30μL、126μモル）で処理し、室温で2時間撹拌する。得られたヒドロゲルを遠心分離（21300rcfで30分間）によって単離し、ペレットをアミンフリーの無水NMP（1ml）で希釈し、遠心分離によって単離する。この洗浄工程を二回繰り返し、活性化されキャップされた最終的なペレットを、テトラブチルアンモニウム5'-アミノ-オリゴヌクレオチド、トリブチルアミン（1μモル）およびアミンフリーのNMPの3μモルNMP溶液1μモルで600μLの最終量まで希釈する。70℃で16時間撹拌したのち、DNAがコンジュゲートしたヒドロゲルを遠心分離（21300rcfで30分間）によって単離する。ペレットをNMP（1ml）で洗浄したのち、遠心分離を使用して脱イオン水洗浄（1ml）してペレットを単離する。最終的なヒドロゲルペレットを1×TEバッファ（1.6ml）で希釈し、80℃で1時間撹拌する。遠心分離（21300rcfで30分間）によってヒドロゲルを単離し、DI水（1ml）で二回洗浄する（ペレット単離のために遠心分離を使用）。最終的なペレットに30％水性アンモニアを加える。室温で15分後、ヒドロゲルを遠心分離単離し（21300rcfで20分間）、単離のために遠心分離を使用してDI水（1mL）で三回洗浄する。最終的なペレットを、標的増幅を実施するために望ましいバッファ中に再分散させる。
【００８０】
実施例4
モノ保護ジアミンによるメシル化ヒドロゲルの官能化、その後の脱保護、活性化、および有機可溶性DNAプローブとのコンジュゲーションを図6に示す。
【００８１】
メシル化ヒドロゲル（直径0.6ミクロン）2000億個のペレット（遠心分離によってアミンフリーの無水N-メチルピロリドン（NMP）中に濃縮）に、モノ-t-Boc保護ジアミン：O-(2-アミノエチル)-O'-[2-(Boc-アミノ)エチル]ヘキサエチレングリコール1mLを50mM溶液として加える。70℃で12時間撹拌したのち、遠心分離によってヒドロゲルを単離し、脱イオン水で一度洗浄し、室温で30％水性HCl 1mL中で脱保護する。1時間後、遠心分離によってヒドロゲルを単離し、脱イオン水5mLずつで五回洗浄する。水性懸濁液の遠心分離によってヒドロゲルを脱水し、アミンフリーの無水NMP1mLで希釈する。工程をさらに三回繰り返す。最終の遠心分離ののち、トリブチルアミン30μLを加えたジスクシンイミジルカーボネートの125mM NMP溶液0.6mLでペレットを活性化する。室温で2時間後、活性化されたヒドロゲルを遠心分離によって単離し、ペレットをアミンフリーの無水NMP1mLずつで五回洗浄する。得られたペレットに、テトラブチルアンモニウム5'-アミノ-オリゴヌクレオチドおよびトリブチルアミン（30μL）の3μモルNMP溶液0.5mLを加える。70℃で12時間撹拌したのち、コンジュゲートされたヒドロゲルを遠心分離によって濃縮し、NMP1mLずつで三回洗浄する。コンジュゲートされたヒドロゲルペレットを1×TEバッファ（1.6ml）で希釈し、80℃で1時間撹拌したのち、遠心分離によって単離する。脱イオン水で二回洗浄した後、最終的なペレットを、標的増幅を実施するために望ましいバッファ中に再び分散させた。
【００８２】
第一の局面において、基質をコンジュゲートする方法は、生体分子と会合した対イオンを親油性対イオンと交換して生体分子複合体を形成する工程、生体分子複合体を非水溶媒中に分散させる工程、および非水溶媒の存在下で生体分子複合体を基質にカップリングする工程を含む。
【００８３】
第一の局面の例において、生体分子はポリヌクレオチドである。
【００８４】
第一の局面および上記例のもう一つの例において、親油性対イオンは、親油性アンモニウムイオン、親油性ホスホニウムイオン、親油性アルソニウムイオン、親油性スルホニウムイオンまたはそれらの組み合わせである。たとえば、親油性アンモニウムイオンは、テトラアルキルアンモニウム、テトラアリールアンモニウム、混合アルキルおよびアリールアンモニウムまたはそれらの組み合わせである。一例において、親油性アンモニウムイオンは、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラペンチルアンモニウム、テトラヘキシルアンモニウム、テトラへプチルアンモニウム、テトラオクチルアンモニウム、それらのアルキルおよびアリール混合物ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。さらなる例において、親油性ホスホニウムイオンはテトラフェニルホスホニウムである。さらなる例において、親油性アルソニウムイオンは、テトラアルキルアルソニウム、テトラアリールアルソニウム、混合アルキルおよびアリールアルソニウムイオンまたはそれらの組み合わせである。もう一つの例において、親油性アルソニウムイオンはテトラフェニルアルソニウムである。一例において、親油性スルホニウムイオンはトリアルキルスルホニウムイオンである。
【００８５】
第一の局面および上記例のさらなる例において、非水溶媒は、基質および生体分子上のカップリング基と非反応性である。
【００８６】
第一の局面および上記例のさらなる例において、非水溶媒は極性である。
【００８７】
第一の局面および上記例のもう一つの例において、非水溶媒は、アミド、尿素、カーボネート、エーテル、スルホキシド、スルホン、ヒンダードアルコール、またはそれらの組み合わせである。たとえば、アミドまたは尿素は、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホラミド、ピロリドン、N-メチルピロリドン、N,N,N',N'-テトラメチル尿素、N,N'-ジメチル-N,N'-トリメチレン尿素およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。もう一つの例において、カーボネートは、炭酸ジメチル、炭酸プロピレンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。さらなる例において、エーテルはテトラヒドロフランである。さらなる例において、スルホキシドまたはスルホンは、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。もう一つの例において、ヒンダードアルコールはtert-ブチルアルコールを含む。
【００８８】
第一の局面および上記例のさらなる例において、基質はポリマー粒子を含む。
【００８９】
第一の局面および上記例のさらなる例において、ポリマー粒子は、生体分子の反応性基と反応性のカップリング基を含む。
【００９０】
第一の局面および上記例の一例において、カップリング基は求核体または求電子体の一方を含み、反応性基は求核体または求電子体の他方を含む。
【００９１】
第二の局面において、ポリマー粒子をコンジュゲートする方法は、ポリヌクレオチドと会合したカチオン対イオンを親油性カチオン対イオンと交換してポリヌクレオチド複合体を形成する工程を含み、ポリヌクレオチドは求核性または求電子性の反応性基を含む。方法はさらに、ポリヌクレオチド複合体を非反応性の非水溶媒中に分散させる工程、および求核置換または求電子置換によってポリヌクレオチドをポリマー粒子にカップリングする工程を含み、ポリマー粒子は求電子性基または求核性基を含む。
【００９２】
第三の局面において、ポリマー粒子は、上記局面または例のいずれか一つの方法を使用してポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマーを含む。
【００９３】
第四の局面において、配列を決定する方法は、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子の存在下で標的ポリヌクレオチドを増幅して、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を形成する工程を含む。オリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子は上記局面または例のいずれかの方法によって形成される。方法はさらに、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子を配列決定装置に適用する工程、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされたポリマー粒子にプライマーを適用する工程、ヌクレオチドを取り込む工程、および取り込みを検出する工程を含む。
【００９４】
第四の局面の一例において、検出する工程は、ヌクレオチドの取り込みに伴ったイオン濃度の変化を検出することを含む。
【００９５】
第五の局面において、標的ポリヌクレオチドを単離する方法は、標的ポリヌクレオチドを含む第一の溶液を、プローブにコンジュゲートされた基質と接触させる工程を含む。プローブにコンジュゲートされた基質のプローブは標的ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である。プローブにコンジュゲートされた基質は上記局面または例のいずれかの方法によって形成される。方法はさらに、標的ポリヌクレオチドがプローブにカップリングしている間にプローブにコンジュゲートされた基質を洗浄する工程、および標的ポリヌクレオチドを第二の溶液中に放出する工程を含む。
【００９６】
さらなる局面において、オリゴヌクレオチドをポリマーにコンジュゲートする方法は、アミン官能性を含むポリマーをビス−NHSエステルまたはジスクシンイミジルカーボネートで処理して官能化ポリマーを形成する工程、および官能化ポリマーをアミン終結オリゴヌクレオチドで処理して、オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートされたポリマーを形成する工程を含む。
【００９７】
さらなる局面の一例において、方法はさらに、ヒドロキシル官能性を含む初期ポリマーを提供する工程、初期ポリマーを処理してヒドロキシル官能性をハロゲンで置換する工程、および保護アミン終結ポリエーテルで初期ポリマーをさらに処理して、アミン官能性を含むポリマーを形成する工程をさらに含む。
【００９８】
さらなる局面および上記例のもう一つの例において、ポリマーはポリマー粒子の形態にある。
【００９９】
さらなる例において、オリゴヌクレオチドは、上記局面およびその例の方法の処理を受ける。
【０１００】
上記は、ポリマー粒子へのコンジュゲーションを記載するが、そのようなコンジュゲーション方法は、ビーズ、基質、シート、ロッド、様々な形状のポリマー形態またはそれらの任意の組み合わせのような様々な形態にある同様に官能化されたポリマーにも適用することができる。
【０１０１】
概説または例において上述された行為のすべてが求められるわけではないが、特定の行為の一部が求められなくてもよく、上記行為に加えて一つまたは複数のさらなる行為が実施されてもよいことに留意されたい。なおさらには、行為が挙げられる順序は、必ずしもそれらが実施される順序ではない。
【０１０２】
前記明細書においては、特定の態様に関して概念を説明した。しかし、当業者は、以下の特許請求の範囲に述べられる発明の範囲を逸脱することなく、様々な修飾および変更を加えることができることを理解する。したがって、明細書および図面は、限定的な意味ではなく、例示的な意味とみなされるべきであり、すべてのそのような修飾が本発明の範囲に含まれるものとされる。
【０１０３】
本明細書において使用されるように、語「含む」、「有する」またはそれらの任意の他の変形は、非排他的包含をカバーするものとされる。たとえば、列挙された特徴を含む工程、方法、物品または装置は、必ずしもそのような特徴だけに限定されず、明示的に挙げられていない、またはそのような工程、方法、物品または装置に固有である他の特徴を含み得る。さらに、別段明示的に述べられない限り、「または」とは、非排他的またはを指し、排他的またはを指さない。たとえば、条件AまたはBは、以下：Aが真であり（または存在し）、Bが偽である（または存在しない）場合、Aが偽であり（または存在せず）、Bが真である（または存在する）場合およびAおよびB両方が真である（または存在する）場合の任意の一つによって満たされる。
【０１０４】
また、単数形の使用が、本明細書に記載される要素および構成要素を説明するために用いられる。これは、本発明の範囲の一般的理解を与えるために単に便宜的に実施されている。この記載は、一つまたは少なくとも一つを含むものと読まれるべきであり、単数形は、別段意図されることが明白でない限り、複数形をも含む。
【０１０５】
恩典、他の利点および課題に対する解決手段が特定の態様に関して上述された。しかし、恩典、利点、課題に対する解決手段および任意の恩典、利点または解決手段を生じさせ得る、またはより顕著にし得る任意の特徴が、いずれかまたはすべての請求項の決定的、不可欠または本質的な特徴と解釈されてはならない。
【０１０６】
本明細書を読んだのち、当業者は、明確に示すために本明細書においては別々の態様として記載されている特定の特徴が一つの態様に組み合わされて提供され得るということを理解するであろう。逆に、簡潔に示すために一つの態様として記載されているいくつかの態様が別々に、または任意の部分的組み合わせで提供され得る。さらに、範囲として述べられている数値の参照はその範囲内のあらゆる数値を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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