(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択的にＴＲＡＩＬ野生型タンパク質の細胞膜外領域における第１１４〜１２１部位のアミノ酸コード配列をＶＲＥＲＧＰＱＲからＲＲＲＲＲＲＲＲに組み換え、即ち、第１１４部位をバリンからアルギニンに突然変異させ、第１１６部位をグルタミン酸からアルギニンに突然変異させ、第１１８部位をグリシンからアルギニンに突然変異させ、第１１９部位をプロリンからアルギニンに突然変異させ、第１２０部位をグルタミンからアルギニンに突然変異させることによって、突然変異体タンパク質のＮ末端を連続的な８つのアルギニンコード配列とし、細胞膜透過性ペプチド様構造を備えるタンパク質となっていることを特徴とするＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体。
【請求項２】
前記突然変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるとおりであることを特徴とする、請求項１に記載のＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体。
【請求項３】
前記突然変異体をコードするｃＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるとおりであることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載のＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学による薬物の分野に関し、特に、ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体、その調製方法及び応用に関するものであり、本発明にかかるＴＲＡＩＬ突然変異体は、複数の異なる種類の腫瘍に対して優れた治療作用があり、非常に潜在力の高い新世代の高効率腫瘍細胞アポトーシス誘導薬物である。
【背景技術】
【０００２】
１、Ａｐｏ  ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの腫瘍治療への応用の進展と意義
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ、ＴＲＡＩＬ）は、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーであり、その遺伝子配列はそれぞれ独立して１９９５年にＷｉｌｅｙらで及び１９９６年にＰｉｔｔｉらでクローニングされて得られ、後者はそれをアポプチン２リガンド（Ａｐｏ  ２  Ｌｉｇａｎｄ、Ａｐｏ  ２Ｌ）と命名した。それ以降の研究から、Ａｐｏ  ２ＬとＴＲＡＩＬは実質的に同一のタンパク質であることが実証されたため、習慣的にそれをＡｐｏ  ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと称することができる。ＴＲＡＩＬの機能としては、生体の先天性又は後天性免疫の調節剤とされている一方、細胞の外因性アポトーシス経路において免疫監視として抗腫瘍の作用を発揮している。ＴＲＡＩＬの最大利点は、正常細胞に対してほとんど毒性がなく、選択的に複数種の腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できることである。研究資料から、Ａｐｏ  ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは体外や体内にもかかわらず、各種の由来によるヒト腫瘍細胞系、例えば結（直）腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、中枢神経系腫瘍、甲状腺がん、リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫等に対してもアポトーシスを誘導する作用があることが明らかになっている。
【０００３】
発見から今までの２０年には、ＴＲＡＩＬは重要且つ潜在的な抗腫瘍薬として開発されて来ており、その臨床実験は国外では段階IIに進んでおり、中国では段階IIIが完成された
。多数の体内外試験から、ＴＲＡＩＬは腫瘍特異性細胞毒性を有し、特に小量の化学療法薬と連合して使用すると、著しい共働と相乗作用を発現するようになることが実証された。逆に、研究から、生体におけるアポトーシスメカニズムの欠失に起因したＴＲＡＩＬ耐性は明らかに腫瘍細胞の迅速な成長と転移に関わっていることが発見された。
【０００４】
腫瘍は高度異質性の病気であり、従来からの組織と器官や、病理変化に基づく分類方法は腫瘍の診療に適しなくなり、現在の研究方向は、異なる腫瘍細胞の遺伝子発現や分子分類を解明し、患者に対してより狙いがはっきりしている治療を行うことになっている。抗腫瘍薬に対する認識の深まりに従って、細胞毒性薬、分子標的薬及び単クローン抗体はいずれも、その作用過程が腫瘍細胞のアポトーシス経路の活性化に関わっており、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する信号通路経路はこれらの薬物が作用を発揮するためのかなめと肝心な部分となり、アポトーシス回避は腫瘍が発生して発展し薬剤耐性を生じることの重要なメカニズムとなることが分かるようになっている。
【０００５】
２、Ａｐｏ  ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの腫瘍治療への応用の欠陥及び対策
最近の進展から、Ａｐｏ  ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのみによれば、複数の異なる種類の腫瘍の治療にとってははるかに不十分であることが明らかになった。組換えヒトＡｐｏ  ２Ｌ／ＴＲＡＩＬやＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ4／ＤＲ5のアゴニスト単クローン抗体は段階Iの臨
床治療において人を奮い立たせた結果を出したが、それに続いて行われた段階IIの臨床研
究において明らかな臨床的有益性を発現していなかった。多数の研究から、正常細胞及び約半分以上の（ひいては６０％と高い）継代腫瘍細胞株はＴＲＡＩＬに対する薬剤耐性を発現していることが明らかになった。Ｒｏｂｅｒｔａ  ｄｉ  ｐｅｉｔｒｏ及びＧｉｏｒｇｉａ  ｚａｕｌｉが総括的に述べたものよると、Ａｐｏ  ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、研究された９２本の初代又は継代腫瘍細胞のうちの６１本に敏感であり、敏感度が６６．３％である一方、残りの３１本が薬剤耐性を発現し、薬剤耐性率が３３．７％である。ＴＲＡＩＬに対する正常細胞の耐性は生理的意義があり、ＴＲＡＩＬは体内で精確に調節され制御されており、正常細胞を殺すことなく、成長と発育過程における老衰や退化細胞及び形質転換細胞の除去のみにおいて作用を発揮する。ほとんど全てのＴＲＡＩＬ敏感腫瘍細胞はそのアポトーシス信号通路における各部分と要素において類似する完全性と機能を有する一方、ＴＲＡＩＬ耐性腫瘍細胞毎はアポトーシス信号通路における若干の部分と要素において欠陥と変異があり、これらの欠陥と変異により、これらの薬剤耐性腫瘍細胞はアポトーシス閾値が異常に上昇し、アポトーシスによる除去から回避しやすくなり、継続して成長し増殖するようになってしまう。
【０００６】
多数の研究から、単にＡｐｏ  ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによれば、多くの腫瘍細胞を効率的に抑制し殺すことができない。これは、腫瘍細胞アポトーシス信号通路は十分に複雑で膨大なシステムであり、そのうち、多くのアポトーシス促進因子も含まれば、多くのアポトーシス抑制因子も含まれ、この両者が相互に作用して腫瘍細胞の最後の結果を決めているためである。健全なアポトーシス信号通路及びその機能は腫瘍細胞がアポトーシスする必要条件であるが、十分条件ではない。複数の異なる種類の薬物、分子又は遺伝的介入のいずれによっても、腫瘍細胞に対するＴＲＡＩＬの敏感性を増強でき、これらの薬物は異なる種類の化学療法薬、天産物、小分子キナーゼ阻害剤等を含む。それらは、それぞれ細胞外アポトーシス信号通路の強化（例えば、ＤＲｓ発現を引き上げ、細胞膜における脂質ラフトミクロドメインでのＤＲｓの凝集と再分布を増強し、細胞膜でのＴＲＡＩＬ／ＤＲｓ複合体の飲食を増強し、ＴＲＡＩＬ／ＤＲｓ複合体へのＤＩＳＣのリクルートメントを促進し、開始段階でのＣａｓｐａｓｅ（Ｃａｓｐａｓｅ  ８）の活性を活性化し、アポトーシス拮抗因子ＦＬＩＰ、ＸＩＡＰ及びＩＡＰｓの活性を抑制する等）またはミトコンドリアアポトーシス信号通路の強化（例えば、ミトコンドリア膜電位の脱分極を増強し、ミトコンドリアの透過性の増加を促進してＣｙｔ  ｃ、Ｓｍａｃ又はＡＲＴｓを放出し、ＢｉｄのｔＢｉｄへの分裂を促進し、ＢａｘとＢａｄのオリゴマー化を促進し、アポトーシス拮抗因子Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、ｓｕｒｖｉｖｉｎを抑制する等）、あるいはその他の細胞生存信号通路（例えばＥＲＫ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫｔ、ＭＥＫ、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ  ３、ＭＡＰＫ、ＮＦ−κＢ等）の抑制、あるいは複数の通路の連携によって、ＴＲＡＩＬ誘導による腫瘍細胞アポトーシス活性を増強する。
【０００７】
ＴＲＡＩＬ及びその受容体アゴニスト単クローン抗体薬物の開発は一時挫折したが、細胞アポトーシス信号通路経路を完全に解明し、アポトーシス／耐性の相互転換関係を完全に明らかにすることに従って、アポトーシス信号通路に基づく標的抗腫瘍薬の開発は停止することにならない。現在、多く研究されているのはＴＲＡＩＬと細胞毒類との連合による応用であるが、大部分の実験から、このような連携は比較的ＴＲＡＩＬに敏感な腫瘍細胞のみに対して著しい共働と相乗作用を発現し、複数種の異なる薬剤耐性メカニズムによる薬剤耐性現象を完全に逆転することができないのは明らかになっている。ＴＲＡＩＬと細胞毒類薬物は二つの異なる薬物に属するため、薬物の種類と分量、投与経路、及び作用方式が異なっており、単一の安定的且つ制御可能な新薬として開発する可能性が小さく、また、ＴＲＡＩＬと細胞毒類薬物を連合して使用しても、その毒性と副作用が依然として存在しているので、その優位性が顕著ではない。
【０００８】
３、Ａｐｏ  ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体の設計の考え方
アポトーシスタンパク質は、その作用が最終的に効を奏する肝心な箇所は細胞膜内にあり、細胞膜は治療的な生物活性物質の細胞内への輸送の生物学的障壁となる。アポトーシスタンパク質の親水性のため、生物活性分子は自由に細胞膜内に進入できず、その作用の発揮及び実際の応用は制限されている。細胞膜透過性ペプチドは細胞膜透過機能を有する、大きさが２０〜３０個のアミノ酸であることが多い正電荷を帯びる陽イオンによる短鎖ペプチドであり、最近何十年に発展していく新規な薬物輸送と運搬技術であり、タンパク質形質導入ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＰＴＤ）とも称される。
【０００９】
１９８８年、Ｇｒｅｅｎ及びＦｒａｎｋｅｌは初めて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のトランス活性化タンパク質ＴＡＴが細胞膜を貫通して細胞質と細胞核内に転移できることを実証した。そのうちの一つのアルギニンリッチＴＡＴポリペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＹ）は細胞膜を貫通してタンパク質を形質導入する機能を有し、また、複数種の多元発生の物質例えば遺伝子、タンパク質、ポリペプチド、化学合成されたナノ粒子等を仲介して細胞膜ひいては細胞核内に導入することもできる。それ以降、ショウジョウバエのホメオティック転写因子ＡＮＴＰ、I型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）の
転写因子ＶＰ２２、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、及びポリアルギニン等の配列は細胞膜透過能を持つことが相次いで発見され、現在、細胞膜透過機能を有するペプチド断片が百種以上発見されている。
【００１０】
異なる標準によれば、細胞膜透過性ペプチドを異なる種類に分けることができる。構造的特徴から言えば、初期には細胞膜透過性ペプチドを簡単に、（１）典型構造を備えない多数の陽イオンを帯びる細胞膜透過性ペプチド例えばＴＡＴ及びｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ等と、（２）タンパク質の信号配列由来の両親媒性α螺旋ペプチドとに分けることがある。その由来から言えば、細胞膜透過性ペプチドを天然存在のものと人工合成のもの二つに分けることがあり、さらには、（１）タンパク質由来の細胞膜透過性ペプチド例えばｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ＴＡＴ及びｐＶＥＣ等と、（２）モデル（Ｍｏｄｅｌ）細胞膜透過性ペプチド例えばＭＡＰ及びＡｒｇ（７）等と、（３）人工設計され合成された細胞膜透過性ペプチド例えばＰＥＰ−１、ＭＰＧ及びＴｒａｎｓｐｏｒｔａｎ等とに分けてもよい。（１）タンパク質由来の細胞膜透過性ペプチドは一般にタンパク質を輸送する最小の有効断片、即ちタンパク質形質導入部分及び膜異所性配列を有する。（２）モデル（Ｍｏｄｅｌ）細胞膜透過性ペプチドは、両親媒性α螺旋を形成し確定する又は既存の細胞膜透過性ペプチド構造をシミュレートするために人工合成されたものである。細胞膜透過性ペプチド構造に従って合成されたポリアルギニン及びポリリジンは、その細胞膜透過能がＴＡＴタンパク質の形質導入活性よりも高い。（３）人工設計され合成された細胞膜透過性ペプチドは一般にキメラポリペプチドであり、１つの疎水部分と１つの親水部分とを含み、例えば、ＰＥＰ−１（ＫＥＴＷＷ  ＥＴＷＷＴ  ＥＷＳＱＰ  ＫＫＫＲＫ  Ｖ）は、一つの疎水性トリプトファンモチーフリッチ断片（ＫＥＴＷＷ  ＥＴＷＷＴ  ＥＷ）と、一つのスペーサ（ＳＱＰ）と、一つの親水性リジンモチーフリッチ領域（ＫＫＫＲＫＶ）とを含む。このようなペプチド断片は、ＰＥＰ−１が標的巨大分子と共有結合することなく、標的巨大分子と直接混合すれば、天然構造タンパク質を細胞に効率的に導入することができるというより多くの利点を有している。
【００１１】
細胞膜透過機能を有するペプチドのアミノ酸の構造は、その主な分子がアルカリ性アミノ酸例えばアルギニンや、リジンや、ヒスチジンを豊富に含むように組成されることが肝心である。アルカリ性アミノ酸はこの種類の細胞膜透過タンパク質の組成の重要な特徴である。これらのアミノ酸は強い正電荷を帯びており、負電荷を帯びる細胞膜脂質分子と相互に作用して細胞膜透過過程を仲介する可能性があり、そのうち、アルギニン残基はタンパク細胞の内在化過程において重要な役割を果たしている。現在、ポリアルギニンによりタンパク質を細胞に形質導入する作用メカニズムについては、主に、アルギニンにより細胞膜及び脂質二重層に小孔を一時形成して、タンパク質を細胞に直接形質導入することと、複数種の形式で仲介された細胞飲食作用、即ちマクロ飲作用、カベオリン仲介型、クラスリン仲介型、食作用及びエンドソーム交換等のメカニズムによりタンパク質を細胞に形質導入することという二つの観点がある。ＴＲＡＩＬは、死受容体の腫瘍細胞膜における脂質ラフトミクロドメインでの凝集と再分布を誘導し、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４／５複合体の細胞飲食作用により（によらずに）、Ｆａｓ関連デスドメイン（Ｆａｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ、ＦＡＤＤ）及びＣａｓｐａｓｅ−８をリクルートし、死誘導シグナリング複合体（Ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ、ＤＩＳＣ）に組み立て、Ｃａｓｐａｓｅ−８を分裂させることによりアポトーシス効果のカスケード過程を起動する。大部分の文献は、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４／５複合体の内在化がアポトーシス信号が継続して増幅するのに必要なものであると考えている。従来より、外因性タンパク質を細胞膜透過と融合発現させるようにしており、発現される融合タンパク質はタンパク分子の空間構造を変えて生物活性を失わせる可能性がある。また、融合タンパク質は既存タンパク分子の抗原性を増加させて安全上のリスクを招くようになってしまう。
【００１２】
ＴＲＡＩＬタンパク質の可溶性断片（１１４〜２８１ａａ）におけるコードアミノ酸配列のＮ末端における複数のアミノ酸を選択的に突然変異させて、ＴＲＡＩＬタンパク質に細胞膜透過性ペプチド様のアミノ酸配列を形成し、即ち、ＴＲＡＩＬに対して細胞膜透過性ペプチド様突然変異を行うことによって、１０数種の異なる細胞膜透過性ペプチド様突然変異体が得れた。本発明は、従来の細胞膜透過性ペプチド融合タンパク質の設計の考え方を突破して、選択的にＴＲＡＩＬ野生型タンパク質の細胞膜外領域における第１１４〜２８１部位のアミノ酸コード配列のＮ末端における第１１４部位のバリン、第１１６部位のグルタミン酸、第１１８部位のグリシン、第１１９部位のプロリン、及び第１２０部位のグルタミンをそれぞれアルギニンに突然変異させて、ＴＲＡＩＬタンパク質の第１１４〜１２１部位のアミノ酸を８つの連続的なアルギニン配列に形成するものである。内因性の８つの連続的なアルギニン配列により、ＴＲＡＩＬ細胞膜外領域におけるＮ末端のアミノ酸配列に対する変更を最も小さくし（既存の第１１５部位、第１１７部位、及び第１２１部位のアルギニン配列が保たれている）、ＴＲＡＩＬタンパク質のブランク構造と生物活性を最大限に維持しながら、細胞膜透過機能を有する連続的な８つのアルギニン配列を構築して形成したことになり、本発明の細胞膜透過性ペプチド様突然変異体はＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３と命名された。細胞膜透過性ペプチド様突然変異体は細胞膜透過性ペプチド融合タンパク質の全く新しい設計の考え方である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来技術の欠陥に着目して、本発明は、ＴＲＡＩＬ野生型タンパク質の抗腫瘍活性を大幅に増強でき、特に複数種の薬剤耐性腫瘍細胞のＴＲＡＩＬ野生型タンパク質に対する薬剤耐性を逆転できる新規なＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体を提供することを目的とする。調製された突然変異体タンパク質は、細胞膜を透過することにより細胞透明質に直接進入して迅速に効を奏しながら、死受容体／突然変異タンパク質複合体の細胞膜における脂質ラフトミクロドメインでの凝集と内在化を促進でき、外因性アポトーシス信号経路の形質導入を増強した。ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体は複数の異なる種類の腫瘍に対して優れた治療作用があり、非常に潜在力の高い新世代の高効率腫瘍細胞アポトーシス誘導薬物である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の目的を実現するために、本発明は以下の解決手段を採用した。
【００１５】
選択的にＴＲＡＩＬ野生型タンパク質の細胞膜外領域における第１１４〜１２１部位のアミノ酸コード配列をＶＲＥＲＧＰＱＲからＲＲＲＲＲＲＲＲに組み換え、即ち、第１１４部位をバリンからアルギニンに突然変異させ、第１１６部位をグルタミン酸からアルギニンに突然変異させ、第１１８部位をグリシンからアルギニンに突然変異させ、第１１９部位をプロリンからアルギニンに突然変異させ、第１２０部位をグルタミンからアルギニンに突然変異させることによって、突然変異体タンパク質のＮ末端を連続的な８つのアルギニンコード配列とし、細胞膜透過性ペプチド様構造を備えるタンパク質となっていることを特徴とするＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体。
【００１６】
さらに、前記突然変異体のアミノ酸配列は例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるとおりである。
【００１７】
さらに、前記突然変異体をコードするｃＤＮＡ配列は例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるとおりである。
【００１８】
本発明は、
Ａ）ｃＤＮＡ断片を増幅しクローニングするステップと、
Ｂ）発現ベクターを構築し同定するステップと、
Ｃ）組換えＴＲＡＩＬタンパク質を融合発現させるステップと、
Ｄ）ＴＲＡＩＬタンパク質を精製するステップと、
Ｅ）ＴＲＡＩＬタンパク質を同定するステップと、
を含むＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体の調製方法を提供することを他の目的とする。
【００１９】
さらに、ステップＢによる前記の発現ベクターを構築し同定することは、
Ｂ1）原核発現ベクターにおける対応する融合タグ配列を切除することと、
Ｂ2）高効率の可溶性非融合発現を得るために、最適化されたＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を原核発現ベクターにクローニングすることと、
を含む。
【００２０】
さらに、ステップＢ1では、前記原核発現ベクターはｐＥＴ  ３２ａ又はｐＴＷＩＮ  １である。
【００２１】
さらに、ステップＣでは、前記の組換えタンパク質の発現の場合に、誘導温度は１８〜２４℃である。
【００２２】
さらに、ステップＤによる前記のＴＲＡＩＬタンパク質を精製することは、
Ｄ1）菌体破砕された上澄みにおける標的タンパク質を捕獲するために、陽イオン交換樹脂により一次精製を行うことと、
Ｄ2）より一層タンパク質の純度を高め、内毒素を除去するために、ヒドロキシアパタイト樹脂により二次精製を行うことと、
Ｄ3）製品に産業的拡大及び将来の臨床応用の需要を満たさせるために、陰イオン交換樹脂により最終的な仕上げ精製を行うことと、
を含む。
【００２３】
本発明は、ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体を抗腫瘍薬へ応用することをさらに他の目的とする。
【００２４】
本発明による腫瘍細胞アポトーシスを誘導する作用メカニズムとしては、ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体は細胞膜透過作用で迅速に腫瘍細胞内に進入して細胞アポトーシスを誘導する作用を発揮することができる。また、ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体は、死受容体の細胞膜における脂質ラフトミクロドメインでの凝集と再分布／又はＴＲＡＩＬ−ＤＲ４／ＤＲ５複合体の内在化作用を効果的に促進することもでき、外因性アポトーシス信号経路の形質導入を増強した。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、
１、全く新しいタンパク質構造であり、最も少ない突然変異部位が採用され、タンパク質構造に対する影響が最も小さくなる一方、得られる機能が最大化されており、ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体は、五つの非連続部位の突然変異のみによるものであり、部位の突然変異がタンパク質のアミノ基末端で発生するため、タンパク質の生物活性と安定性に対する影響が小さくなる一方、細胞膜透過性ペプチド融合タンパク質を上回る細胞膜透過能が得られたことと、
２、タンパク質発現及び可溶性発現率が高く、高効率の原核発現ベクターｐＥＴ３２ａ又はｐＴＷＩＮ  １という組換え形式が採用され、発現ベクターは１８〜２４℃の広い誘導温度範囲におけば、ＴＲＡＩＬ野生型タンパク質よりも高い発現レベルと可溶性発現率を得られ、可溶性タンパク質の割合は８０％〜１００％となることと、
３、ＴＲＡＩＬ野生型タンパク質の精製プロセスとは異なり、本発明によるプロセスは有効性、回収率及び製品品質が顕著に向上し、特異的なアフィニティークロマトグラフィーの精製方法を採用せず、それに応じて精製コストが低下し、産業的拡大の潜在力が高く、将来の臨床需要を完全に満たしうることと、
４、ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体は体外生物活性が広く、ＴＲＡＩＬ野生型タンパク質に比べて、検査されたほとんど全ての種類の腫瘍細胞にとって、その抗腫瘍活性が顕著に向上し、特にＴＲＡＩＬ野生型タンパク質に対して薬剤耐性を持つ腫瘍細胞株にとって、これらの細胞のＴＲＡＩＬ野生型タンパク質に対する耐性を顕著に逆転でき、より高い治療作用を持つことという有益な技術的効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明の実施例又は従来技術における解決手段をより明瞭に説明するために、以下、実施例又は従来技術の説明に必要な図面について簡単に紹介する一方、以下の説明における図面は本発明の一部の実施例に過ぎず、当業者にとっては、創造的な活動を行わないながら、これらの図面に基づいて他の図面を得ることも可能であるのは明らかである。
【図１】ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３断片のＰＣＲ生成物の電気泳動図であり、電気泳動条件：３％のアガロース、電圧１００Ｖ、２０分間、レーン  １：ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３断片のＰＣＲ生成物用の電気泳動ストリップ、Ｍ：ＤＬ２０００（ストリップ分子量は上から下へ順に２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、１００ｂｐである）、ローディング量が５μｌであり、ＰＣＲ生成物のローディング量が５μｌである。
【図２】ｐＭＤ１９／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の酵素切断同定の電気泳動図であり、電気泳動条件：１％のアガロース、電圧１５０Ｖ、３０分間、レーン  １〜７：ｐＭＤ１９／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３菌種から抽出されるプラスミドを酵素切断した電気泳動図、Ｍ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（ストリップ分子量は上から下へ順に１００００ｂｐ、８０００ｂｐ、６０００ｂｐ、５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３５００ｂｐ、３０００ｂｐ、２５００ｂｐ、２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐである）、同定用の生成物のローディング量がいずれも１０μｌであり、マーカーのローディング量が５μｌである。
【図３】ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３とｐＥＴ３２ａ及びｐＴＷＩＮ１プラスミドとをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより酵素切断した電気泳動図であり、電気泳動条件：１％のアガロース、電圧１５０Ｖ、２５分間、レーン  １：ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３を酵素切断した後にゲル抽出した電気泳動ストリップ、レーン２：ｐＥＴ３２ａを酵素切断した後にゲル抽出した電気泳動ストリップ、レーン  ３：ｐＴＷＩＮ１を酵素切断した後にゲル抽出した電気泳動ストリップ、Ｍ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（ストリップ分子量は上から下へ順に１００００ｂｐ、８０００ｂｐ、６０００ｂｐ、５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３５００ｂｐ、３０００ｂｐ、２５００ｂｐ、２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐである）、ローディング量が５μｌであり、ＰＣＲ生成物のローディング量がいずれも３μｌである。
【図４】ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３プラスミドをＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより酵素切断同定した電気泳動図であり、電気泳動条件：１％のアガロース、電圧１５０Ｖ、３０分間、レーン  １〜７：ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３菌種から抽出されるプラスミドを酵素切断した電気泳動図、Ｍ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（ストリップ分子量は上から下へ順に１００００ｂｐ、８０００ｂｐ、６０００ｂｐ、５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３５００ｂｐ、３０００ｂｐ、２５００ｂｐ、２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐである）、同定用の生成物のローディング量がいずれも１０μｌであり、マーカーのローディング量が５μｌである。
【図５】ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３プラスミドをＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより酵素切断同定した電気泳動図であり、電気泳動条件：１％のアガロース、電圧１５０Ｖ、３０分間、レーン  １〜８：ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３菌種から抽出プラスミドを酵素切断した電気泳動図、Ｍ：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ１ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（ストリップ分子量は上から下へ順に１００００ｂｐ、８０００ｂｐ、６０００ｂｐ、５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３５００ｂｐ、３０００ｂｐ、２５００ｂｐ、２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１０００ｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐである）、同定用の生成物のローディング量がいずれも１０μｌであり、マーカーのローディング量が５μｌである。
【図６】ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図であり、電気泳動条件：１５％のゲル、２００Ｖ、３５分間、レーン  １：ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の誘導前の電気泳動ストリップ、レーン  ２：ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の誘導後の電気泳動ストリップ、レーン  ３：ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の菌体破砕後の上澄みの電気泳動ストリップ、レーン  ４：ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の菌体破砕後の沈殿物の電気泳動ストリップ、Ｍ：Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  マーカー（ストリップ分子量は上から下へ順に１１６．０ＫＤａ、６６．２ＫＤａ、４５．０ＫＤａ、３５．０ＫＤａ、２５．０ＫＤａ、１８．４ＫＤａ、１４．４ＫＤａである）、マーカーのローディング量が５μｌであり、他のサンプルのローディング量がいずれも２０μｌである。
【図７】ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図であり、電気泳動条件：１５％のゲル、２００Ｖ、３５分間、レーン  １：ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の誘導前の電気泳動ストリップ、レーン  ２：ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の誘導後の電気泳動ストリップ、レーン  ３：ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の菌体破砕後の上澄みの電気泳動ストリップ、レーン  ４：ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の菌体破砕後の沈殿物の電気泳動ストリップ、Ｍ：Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  マーカー（ストリップ分子量は上から下へ順に１１６．０ＫＤａ、６６．２ＫＤａ、４５．０ＫＤａ、３５．０ＫＤａ、２５．０ＫＤａ、１８．４ＫＤａ、１４．４ＫＤａである）、マーカーのローディング量が５μｌであり、他のサンプルのローディング量がいずれも２０μｌである。
【図８】陽イオン交換過程のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図であり、電気泳動条件：１５％のゲル、２００Ｖ、５０分間、レーン  １：陽イオン交換過程の原液、レーン  ２：陽イオン交換過程の透過液、レーン  ３：陽イオン交換過程の溶離液、レーン  ４：陽イオン交換過程のＮａＯＨ溶離液、Ｍ：Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  マーカー（ストリップ分子量は上から下へ順に１１６．０ＫＤａ、６６．２ＫＤａ、４５．０ＫＤａ、３５．０ＫＤａ、２５．０ＫＤａ、１８．４ＫＤａ、１４．４ＫＤａである）、サンプルのローディング量について、マーカーが５μｌであり、他がいずれも２０μｌである。
【図９】ヒドロキシアパタイト過程のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図であり、電気泳動条件：１５％のゲル、２００Ｖ、５０分間、レーン  １：ヒドロキシアパタイト過程のローディング原液、レーン  ２：ヒドロキシアパタイト過程の透過液、レーン  ３：ヒドロキシアパタイト過程のＮａＣｌ溶離液、レーン  ４：ヒドロキシアパタイト過程のリン酸塩基溶離液、レーン  ５：ヒドロキシアパタイト過程のＮａＯＨ溶離液、Ｍ：Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  マーカー（ストリップ分子量は上から下へ順に１１６．０ＫＤａ、６６．２ＫＤａ、４５．０ＫＤａ、３５．０ＫＤａ、２５．０ＫＤａ、１８．４ＫＤａ、１４．４ＫＤａである）、サンプルのローディング量について、マーカーが５μｌであり、他がいずれも２０μｌである。
【図１０】陰イオン交換過程のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図であり、電気泳動条件：１５％のゲル、２００Ｖ、５０分間、レーン  １：陰イオン交換過程の原液、レーン  ２：陰イオン交換過程の透過液、レーン  ３：２ＭのＮａＣｌ溶離液、レーン  ４：０．５ＭのＮａＯＨ溶離液、Ｍ：Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  マーカー（ストリップ分子量は上から下へ順に１１６．０ＫＤａ、６６．２ＫＤａ、４５．０ＫＤａ、３５．０ＫＤａ、２５．０ＫＤａ、１８．４ＫＤａ、１４．４ＫＤａである）、サンプルのローディング量について、マーカーが５μｌであり、他がいずれも２０μｌである。
【図１１】ウエスタンブロット同定結果図であり、レーン  １：ｐＥＴ３２ａ／Ｍｕ３−ＴＲＡＩＬの菌体破砕後の上澄みのウエスタンブロット結果図、レーン  ２：ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬの菌体破砕後の上澄みのｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ結果図、レーン  ３：ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌ゴーストの菌体破砕後の上澄みのｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ結果図、Ｍ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰａｇｅＲｕｌｅｒＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（ストリップ分子量は上から下へ順に１７０Ｋｄ、１３０Ｋｄ、１００Ｋｄ、７０Ｋｄ、５５Ｋｄ、４０Ｋｄ、３５Ｋｄ、２５Ｋｄ、１５Ｋｄ、１０Ｋｄである）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施例による解決手段について、本発明の実施例における図面を参照して明瞭且つ完全に説明するが、説明される実施例は本発明の一部の実施例に過ぎず、全ての実施例ではないのは明らかである。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な活動を行いながら得た全ての他の実施例は、本発明の保護範囲に属する。
【００２８】
実施例１
ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体の配列及びプライマの設計
選択的にＴＲＡＩＬ野生型タンパク質の細胞膜外領域における第１１４〜１２１部位のアミノ酸コード配列をＶＲＥＲＧＰＱＲからＲＲＲＲＲＲＲＲに組み換え、即ち、第１１４部位をバリンからアルギニンに突然変異させ、第１１６部位をグルタミン酸からアルギニンに突然変異させ、第１１８部位をグリシンからアルギニンに突然変異させ、第１１９部位をプロリンからアルギニンに突然変異させ、第１２０部位をグルタミンからアルギニンに突然変異させるように突然変異部位を５箇所とすることによって、突然変異体タンパク質のＮ末端を連続的な８つのアルギニンによるコード配列とし、細胞膜透過性ペプチド様構造を備えるタンパク質となっている。
【００２９】
突然変異体をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるとおりであり、突然変異体アミノ酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるとおりである。
【００３０】
プライマは以下のように合成される。
上流プライマＭｕ３−ＴＲ−ＮｄｅＩはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるとおりであり、
下流プライマＴＲ−Ｅｃｏ−ＲはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるとおりである。
【００３１】
実施例２
ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３断片のＰＣＲ増幅及びＴ  ｖｅｃｔｏｒとの結合、並びに、結合生成物の単コロニー分離及び同定
ｐＭＤ１９／ＴＲＡＩＬプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ突然変異でＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３断片を増幅し、そしてＴ  ｖｅｃｔｏｒと結合させ、結合生成物の単コロニー分離及び同定を行う。プライマの設計は実施例１を参照でき、ｐＭＤ１９／ＴＲＡＩＬプラスミドは実験室で調製されたものである。
【００３２】
実験手順
一、ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３標的断片のＰＣＲ増幅
１．ｐＭＤ１９／ＴＲＡＩＬプラスミドをテンプレートとして、Ｍｕ３−ＴＲ−ＮｄｅＩ／ＴＲ−Ｅｃｏ−Ｒプライマ対でＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３標的断片を増幅し、表１に従って５０μｌとなるように反応系を調合する。
【００３３】
【表１】
0006300913.tif 000002
【００３４】
２．ボルテックスミキサーで均一に混合し、短時間で遠心して、溶液を管底に収集する。
３．ＰＣＲ増幅反応の条件を表２に示す。
【００３５】
【表２】
0006300913.tif 000003
【００３６】
４．電気泳動を行い、写真を撮る。
５．ＰＣＲ増幅されたＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３標的断片をＯｍｅｇａゲル抽出キットによりゲル抽出し、５０μｌの超純水で溶離し、電気泳動を行い、写真を撮って使用に備える。
【００３７】
二．ゲル抽出された標的断片とｐＭＤ１９  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒとの結合
１．ＴａＫａＲａ  ｐＭＤ１９−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒキットにより、ゲル抽出された標的断片と結合させ、結合系を表３に示す。
【００３８】
【表３】
0006300913.tif 000004
【００３９】
２．１６℃の金属浴で一夜インキュベートする。
３．結合生成物１０μｌをＴｏｐ１０コンピテント細胞１００μｌに加え、氷浴を３０分間行う。
４．４２℃の水浴で熱衝撃を９０秒間行う。
５．氷に置いて２分間インキュベートする。
６．ＳＯＣ培地５００μｌを加え、３７℃で振盪培養を４５分間行う。
７．形質転換されたコンピテント細胞を遠心してから、超清浄作業台にて４００μｌを捨てて約１００μｌの培地を残し、均一にするように細菌に吹き掛け、その全てをＡｍｐを含むＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で一夜培養する。
【００４０】
三．単コロニー分離及び酵素切断同定
（一）単コロニー分離
１．複数本の滅菌された試験管を用意し、試験管にアンピシリンＬＢ液体培地１００ｍｌを加える。
２．一つの試験管当たり約４ｍｌとするように、培地を各試験管に分注する。
３．十分に焼かれたピンセットで無菌ピペットチップを挟み取り、ｐＭＤ１９／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３を７個選び取るようにコロニーが成長した平板からコロニーを選び取り、ピペットチップをＬＢ液体培地が入れられた試験管に投入する。
４．各試験管をしっかりと縛って、振動台におけるクランプに置いて十分に固定し、３７℃で２２０ｒｐｍで一夜振動する。
【００４１】
（二）プラスミドの抽出
１．菌液の各々を１ｍｌ採取してそれぞれ遠心管に加える。１００００ｇで１分間遠心し、上澄みを可能な限り吸い上げる。
２．菌体沈殿物が残った遠心管に２５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＲＮＡａｓｅ  Ａが予め加えられておく）を加え、徹底的に細菌沈殿物を懸濁する。
３．２５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを加え、５分間以内に優しく且つ均一に混合して菌体を十分に分裂させたところ、菌液が澄んで粘稠なものとなる。
４．遠心管に３５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩを加え、直ちに反転して均一に混合したところ、白い絮状の沈殿物が生じ、１３０００ｇで１０分間遠心したところ、遠心管の底部に沈殿物が形成された。
５．ステップ５で得られた上澄みを、沈殿物を吸い上げないように均一に分けて、収集管に入れられた２つのＨｉＢｉｎｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ吸着コラムに加え、１００００ｇで１分間遠心し、収集管中の廃液を注ぎ捨て、吸着コラムを収集管に戻す。
６．収集管に５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＨＢを加え、１００００ｇで１分間遠心し、収集管中の廃液を注ぎ捨て、吸着コラムを収集管に戻す。
７．収集管に７００μｌのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、１００００ｇで１分間遠心し、収集管中の廃液を注ぎ捨て、吸着コラムを収集管に戻す。
８．ステップ７を繰り返す。
９．吸着コラムを収集管に戻し、１３０００ｇで２分間遠心して吸着コラムを乾燥させ、収集管中の廃液を注ぎ捨てる。
１０．各吸着コラムを新しい１．５ｍｌのＥｐ管に置き、吸着膜毎の中間箇所に、接触しないように６５μｌのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを滴下し、室温で数分間間置き、１３０００ｇ以上で１分間遠心して、プラスミド溶液を１．５ｍｌのＥｐ管に収集する。
１１．それぞれプラスミドＤＮＡ６０μｌが得られ、−２０℃でプラスミドを保管する。
【００４２】
（三）酵素切断同定
１．ＥｃｏＲ  Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩによりｐＭＤ１９／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３プラスミドを二重酵素切断する。酵素切断反応系を表４に示す。
【００４３】
【表４】
0006300913.tif 000005
【００４４】
２．Ｅｐ管を多用途インキュベータに置き、３７℃で２時間インキュベートする。
３．酵素切断の終了後に電気泳動同定を行う。
【００４５】
（四）正確に酵素切断されて成功裏に結合された菌種を選択しグリセロール菌種として保存し、配列決定に送り、正確な配列決定結果が得られた菌種を保存する。
【００４６】
実験結果
一．標的断片のＰＣＲ増幅の結果
断片の分子量を５００ｂｐ前後とするようにＭｕ３−ＴＲ−ＮｄｅＩ／ＴＲ−Ｅｃｏ−Ｒプライマ対で突然変異によりＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３標的断片を増幅し、図１に示されるように、上記のＰＣＲ反応条件に従って標的遺伝子を得た。
【００４７】
二．ｐＭＤ１９  Ｔ  ｖｅｃｔｏｒとの結合及び形質転換の結果
１．平板にコロニーは成長したが、密度が高くない。
２．選び取られた単コロニーは、翌日に一部の試験管に細菌が成長しており、密度が正常なものである。
３．酵素切断法でプラスミドが同定され、ｐＭＤ１９／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３プラスミドはＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより二重酵素切断同定を行うことができ、成功裏に結合されたプラスミドが酵素切断されたところ、２．７Ｋｂ前後のベクター断片及び５００ｂｐ前後の標的断片が得られるべきである。図２に示されるように、ｐＭＤ１９／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３による４#、５#、６#、８#の４つのサンプルは陽性クローンとなる。陽性クローンを華大（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＢＧＩ）に送って遺伝子配列決定を行い、配列が完全に正確であるＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３標的遺伝子配列のプラスミドを含む菌種が得られた。
【００４８】
実施例３
ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３標的断片のｐＥＴ３２ａ又はｐＴＷＩＮ１との結合、結合生成物の単コロニー分離及び同定
それぞれＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより、ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３標的断片及びベクターｐＥＴ３２ａ又はｐＴＷＩＮ１を二重酵素切断する。ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３断片を、Ｔｒｘ融合タグ配列が切除されたベクターｐＥＴ３２ａ又はＩｎｔｅｉｎ配列が切除されたベクターｐＴＷＩＮ１と結合させ、Ｔｏｐ１０コンピテント細胞に形質転換し、単クローンを選び取り、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより二重酵素切断同定を行う。ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３標的断片は実施例２によるものであり、ベクターｐＥＴ３２ａ又はｐＴＷＩＮ１は実験室で調製されたものである。
【００４９】
実験手順
一．標的断片ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３とｐＥＴ３２ａ又はｐＴＷＩＮ１プラスミドとの二重酵素切断及び結合
１．ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩによりベクター及び標的遺伝子断片を二重酵素切断し、酵素切断系を表５に示し、反応系を１００μｌとする。
【００５０】
【表５】
0006300913.tif 000006
【００５１】
２．Ｅｐ管を３０℃で多用途インキュベータに２時間置く。
３．ＯＭＥＧＡのゲル抽出キットによりゲル抽出を行い、ベクター及び標的断片をそれぞれ超純水３０μｌで溶離する。電気泳動を行い、写真を撮る。
４．ゲル抽出された標的断片とベクターとを結合させ、結合系を表６に示す。
【００５２】
【表６】
0006300913.tif 000007
【００５３】
５．１６℃の金属浴で一夜インキュベートする。
６．結合生成物１０μｌをＴｏｐ１０コンピテント細胞１００μｌに加え、氷浴を３０分間行う。
７．４２℃の水浴で熱衝撃を９０秒間行う。
８．氷に置いて２分間インキュベートする。
９．ＳＯＣ培地５００μｌを加え、３７℃で振盪培養を４５分間行う。
１０．形質転換されたコンピテント細胞を遠心してから、超清浄作業台にて４００μｌを捨てて約１００μｌの培地を残す。
１１．均一にするように細菌に吹き掛け、その全てをＡｍｐを含むＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で一夜培養する。
【００５４】
二．単コロニー分離及び酵素切断同定
（一）単コロニー分離
１．複数本の滅菌された試験管を用意し、試験管毎にアンピシリンＬＢ液体培地１００ｍｌを加える。
２．一つの試験管当たり約４ｍｌとするように、培地を各試験管に分注する。
３．十分に焼かれたピンセットで無菌ピペットチップを挟み取り、ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３平板から８つを選び取り、あるいはｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３平板から５つ選び取るように、コロニーが成長した平板からコロニーを選び取る。ピペットチップをＬＢ培地が入れられた試験管に投入する。
４．各試験管をしっかりと縛って、振動台におけるクランプに置いて十分に固定する。３７℃で２２０ｒｐｍで一夜振動する。
【００５５】
（二）プラスミドの抽出
１．菌液の各々を１ｍｌ採取してそれぞれ遠心管に加える。１００００ｇで１分間遠心し、上澄みを可能な限り吸い上げる。
２．菌体沈殿物が残った遠心管に２５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＲＮＡａｓｅ  Ａが予め加えられておく）を加え、徹底的に細菌沈殿物を懸濁する。
３．２５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを加え、５分間以内に優しく且つ均一に混合して菌体を十分に分裂させたところ、菌液が澄んで粘稠なものとなる。
４．遠心管に３５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩを加え、直ちに反転して均一に混合したところ、白い絮状の沈殿物が生じ、１３０００ｇで１０分間遠心したところ、遠心管の底部に沈殿物が形成された。
５．ステップ５で得られた上澄みを、沈殿物を吸い上げないように均一に分けて、収集管に入れられた２つのＨｉＢｉｎｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ吸着コラムに加え、１００００ｇで１分間遠心し、収集管中の廃液を注ぎ捨て、吸着コラムを収集管に戻す。
６．収集管に５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＨＢを加え、１００００ｇで１分間遠心し、収集管中の廃液を注ぎ捨て、吸着コラムを収集管に戻す。
７．収集管に７００μｌのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、１００００ｇで１分間遠心し、収集管中の廃液を注ぎ捨て、吸着コラムを収集管に戻す。
８．ステップ７を繰り返す。
９．吸着コラムを収集管に戻し、１３０００ｇで２分間遠心して吸着コラムを乾燥させ、収集管中の廃液を注ぎ捨てる。
１０．各吸着コラムを新しい１．５ｍｌのＥｐ管に置き、吸着膜毎の中間箇所に、接触しないように６５μｌのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを滴下し、室温で数分間置き、１３０００ｇ以上で１分間遠心して、プラスミド溶液を１．５ｍｌのＥｐ管に収集する。
１１．それぞれプラスミドＤＮＡ６０μｌが得られた。−２０℃でプラスミドを保管する。
【００５６】
（三）酵素切断同定
１．ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩによりｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３又はｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３プラスミドを二重酵素切断する。酵素切断反応系を表７に示す。
【００５７】
【表７】
0006300913.tif 000008
【００５８】
２．Ｅｐ管を多用途インキュベータに置き、３７℃で２時間インキュベートする。
３．酵素切断の終了後に電気泳動同定を行う。
【００５９】
（四）正確に酵素切断されて成功裏に結合された菌種を選択しグリセロール菌種として保存し、配列決定に送る。
【００６０】
実験結果
一．理論的には、ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３とｐＥＴ３２ａ及びｐＴＷＩＮ１をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより二重酵素切断したところ、大きさがそれぞれ約５００ｂｐ、５．４ｋｂ、６．６ｋｂ前後である標的断片が得られることになり、図３に示されるように、酵素切断の後にゲル抽出を行ったところ、予期したとおりの単一のストリップが得られた。
【００６１】
二．ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３標的断片とｐＥＴ３２ａ又はｐＴＷＩＮ１との結合及び形質転換の結果
１．平板にコロニーは成長しており、密度が正常なものである。
２．選び取られた単コロニーは、翌日に一部の試験管に細菌が成長しており、密度が正常なものである。
３．酵素切断法でプラスミドが同定され、ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３又はｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３プラスミドはＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより二重酵素切断同定が行われ、成功裏に結合されたプラスミドが酵素切断されたところ、５．４Ｋｂ前後と６．６Ｋｂ前後のベクター断片、及び５５０ｂｐ前後の標的断片が得られるべきである。図５に示されるように、ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３は３つのサンプルが陽性クローンとなり、図４に示されるように、ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３は４つのサンプルが陽性となり、陽性プラスミドを華大に送って遺伝子配列決定を行い、正確な配列決定結果が得られたプラスミドに対して菌種を保存する。
【００６２】
実施例４
ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３又はｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３の発現試験
実施例３で得られた正確な配列決定結果が得られたプラスミドでコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、それぞれ１つの単一細菌を選び取って発現試験を行い、発現効果を検討する。
【００６３】
実験手順
一．プラスミドによる形質転換及び菌種の保存
１．ＬＢ培地１００ｍｌを調合し、１２１℃で２０分間滅菌する。
２．ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３又はｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３プラスミドをそれぞれ１μｌ採取してＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞１００μｌに加え、氷浴を３０分間行う。
３．４２℃の水浴で熱衝撃を９０秒間行う。
４．氷に置いて３分間インキュベートする。
５．形質転換されたコンピテント細胞２０μｌを採取してＡｍｐを含むＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で一夜培養する。
６．翌日に、平板にコロニーが成長した後、平板から一つの単一細菌を選び取って５０ｍｌのＬＢ（Ａｍｐ+）に加え、３７℃で一夜培養する。
７．グリセロールの最終濃度を１５％とするように、−２０℃で２０本のグリセロール菌を保存する。
【００６４】
二．菌種の発現
１．一夜培養されたｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３又はｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３培養液をそれぞれ１０００μｌ採取してＬＢ（Ａｍｐ+）培地５０ｍｌに接種する。接種の後、３７℃で２５０ｒｐｍで３時間振動培養してから、培養温度を２４℃に下げる。１％の割合で０．１ＭのＩＰＴＧを加えて誘導培養を行い、誘導前に０．５ｍｌサンプリングし遠心して上澄みを捨て、５０μｌのＨ2Ｏを加え再懸濁してから、５０μｌの２×ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加えて誘導後電気泳動サンプルとする。
２．一夜誘導してから細菌を採取し、Ａ600値を検出し、１５０μｌサンプリングし遠心して上澄みを捨て、５０μｌのＨ2Ｏを加え再懸濁してから、５０μｌの２×ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加えて誘導後電気泳動サンプルとし、残りの菌液を５４３０Ｒ型遠心機により１２０００ｒｐｍで５分間遠心する。
３．培養液５０ｍｌを採取し遠心して菌体を得、５０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4溶液８ｍｌで再懸濁し、超音波により菌体破砕を行う。菌体破砕条件としては、Φ６のプローブにより、２００Ｗのパルスで２ｓ破砕してから２ｓ一時停止するように、１０分間循環することである。
４．菌体破砕液１ｍｌを採取して１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みと沈殿物を分離し、沈殿物を１ｍｌのＨ2Ｏで再懸濁し、上澄みと沈殿物再懸濁液をそれぞれ２０μｌ採取して３０μｌのＨ2Ｏ及び５０μｌの２×ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え、電気泳動サンプルとする。
５．作成された電気泳動サンプルを沸騰水浴に置いて１０分間処理し、Ａ−４５−３０−１１型回転ヘッドを備える５４３０Ｒ型遠心機により、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みをそれぞれ１０μｌ採取して電気泳動を行う。
【００６５】
実験結果
実験による電気泳動図は図６（ｐＴＷＩＮ１／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３）と図７（ｐＥＴ３２ａ／ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３）に示されており、いずれも高い発現を有し、また、大部分の発現生成物の菌体破砕後の上澄みは、可溶性発現率が高いものである。
【００６６】
実施例５
ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３タンパク質の精製
ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３に対する多数の小規模実験プロセスに対する探索により、ＴＲＡＩｌ−Ｍｕ３タンパク質の精製プロセスを確立しており、即ち、体内外活性分析用のサンプルを得るために、ＳＰ−ＨＰ陽イオン交換、ヒドロキシアパタイト及び陰イオン交換透過の三段法によりＴＲＡＩＬ−Ｍｕタンパク質を大規模に精製するようにしている。
【００６７】
実験手順
一．菌体破砕及び遠心
１．ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３発現菌体１０ｇを採取し、最終濃度をそれぞれ２０ｍＭ、５％、０．１％、１ｍＭ、５００ｍＭとするようにＮａ2ＣＯ3、グリセロール、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＤＴＴ及びＮａＣｌを加え、またＨ2Ｏを加えて総体積を８０ｍｌとする。
２．菌液に対して超音波菌体破砕を行い、菌体破砕条件としては、Φ１０のプローブにより、５００Ｗのパルスで２秒間破砕してから２秒間一時停止ように１５分間行うことである。
３．Ｆ−３５−６−３０型回転ヘッドを備える５４３０Ｒ型遠心機により、７８５０ｒｐｍで４０分間遠心し、上澄みを採取して０．４５μｍのろ過膜でろ過し、コラムにロードするためのサンプルとする。
【００６８】
二．タンパク質精製溶液及びコラムの用意
１．以下のような溶液を調合する。
（１）陽イオン交換緩衝液Ａ：２０ｍＭのＮａ2ＣＯ3−ＮａＨＣＯ3、０．５ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ１０．４０に調節する。
（２）陽イオン交換緩衝液Ｂ：２０ｍＭのＮａ2ＣＯ3−ＮａＨＣＯ3、１．５ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ１０．２０に調節する。
（３）０．５ＭのＮａＯＨ。
（４）２ＭのＮａＣｌ。
（５）ヒドロキシアパタイト予備平衡液：５００ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０に調節する。
（６）ヒドロキシアパタイト平衡液：１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、６ｐｐｍのＣａ2+、ｐＨ７．０に調節する。
（７）ＳＮＳ緩衝液：２５ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．７５に調節する。
（８）ヒドロキシアパタイト緩衝液Ａ：１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、１５ｐｐｍのＣａ2+、ｐＨ７．０に調節する。
（９）ヒドロキシアパタイト緩衝液Ｂ：１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、１５ｐｐｍのＣａ2+、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に調節する。
（１０）陰イオン交換緩衝液：２０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、０．０６ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのグリシン、ｐＨ７．０に調節する。
（１１）希釈液：１５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、９ｐｐｍのＣａ2+、ｐＨ４．５に調節する。
２．ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗゲルクロマトグラフィコラムを使用し、５ＣＶの純水でコラムに残留するエタノールを洗い落とし、続いて対応する５ＣＶの平衡緩衝液で平衡させる。
３．ＭＰＣ  ＨＣＴ  ＸＫ１６  Ｇｒａｄゲルクロマトグラフィコラムを使用し、１ＣＶの純水でコラムにおけるＮａＯＨを洗い落として希釈し、続いて５ＣＶの予備平衡緩衝液で平衡させ、さらに平衡緩衝液で平衡させる。
４．Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ｍｅｄｉｕｍゲルクロマトグラフィコラムを使用し、５ＣＶの純水でコラムに残留するエタノールを洗い落とし、続いて５ＣＶの陰イオン交換緩衝液で平衡させる。
５．Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗゲルクロマトグラフィコラムを使用し、５ＣＶの純水でコラムに残留するエタノールを洗い落とし、続いて５ＣＶの陰イオン交換緩衝液で平衡させる。
【００６９】
三．陽イオン交換による精製
以下のような精製手順に従って、陽イオン交換による精製を行う。精製する間に、全ての透過及び溶離成分を収集して電気泳動分析に備える。
１．平衡：陽イオン交換Ａ緩衝液で、ＵＶが安定するまでＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィコラムを平衡させる。
２．サンプルの調製及びローディング：菌体破砕され遠心された上澄みを採取し、ローディングする。
３．洗浄：残留する未結合タンパク質を除去するために、２ＣＶの陽イオン交換緩衝液Ａでコラムを洗浄する。
４．溶離：３ＣＶの陽イオン交換緩衝液Ｂで標的タンパク質を溶離する。
５．ＮａＯＨ洗浄：２ＣＶのＮａＯＨ溶液０．５Ｍでコラムを洗浄する。
６．再平衡（Ｒｅｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）：５ＣＶの陽イオン交換緩衝液Ａでコラムを再平衡させる。
【００７０】
四．ヒドロキシアパタイトによる精製
以下のような精製手順に従って、ヒドロキシアパタイトによる精製を行う。精製する間に、全ての透過及び溶離成分を収集して電気泳動分析に備える。
１．平衡：ヒドロキシアパタイト平衡緩衝液で、ＵＶが安定するまでＭＰＣ  ＨＣＴ  ＸＫ１６  Ｇｒａｄクロマトグラフィコラムを平衡させる。
２．サンプルの調製及びローディング：陽イオン交換溶離液サンプルを採取し、二倍の希釈液を加えて５００ｍＭのＮａＣｌを含むサンプルに希釈し、ローディングする。
３．洗浄：残留する未結合タンパク質を除去するために、２ＣＶのヒドロキシアパタイト平衡緩衝液でコラムを洗浄する。
４．ＳＮＳ：６ＣＶのＳＮＳ緩衝液でコラムを洗浄し、ｐＨを制御する。
５．ＮａＣｌ溶離：２ＣＶのヒドロキシアパタイト緩衝液Ａでコラムを平衡させ、続いて５ＣＶのヒドロキシアパタイト緩衝液Ｂで標的タンパク質を溶離する。
６．リン酸塩基溶離：２ＣＶのヒドロキシアパタイト予備平衡緩衝液で、コラムにおけるＮａＣｌにより溶離されていないタンパク質又は不純物を洗浄する。
７．水洗浄：０．５ＣＶの滅菌水でコラムを洗浄して、リン酸三ナトリウム沈殿物の形成を回避する。
８．ＮａＯＨ洗浄：５ＣＶのＮａＯＨ溶液０．５Ｍで残りの不純物を溶離し、コラムを保管する。
【００７１】
五．陰イオン交換による精製
以下のような精製手順に従って、第三段階の陰イオン交換による精製を行う。精製する間に、全ての透過及び溶離成分を収集して電気泳動分析に備える。
１．平衡：陰イオン交換緩衝液で、ＵＶが安定するまでＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィコラムを平衡させる。
２．サンプルの調製及びローディング：ヒドロキシアパタイト精製溶離サンプルを採取し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ｍｅｄｉｕｍクロマトグラフィコラムにより緩衝液を陰イオン交換緩衝液に置換してから、ローディングする。
３．平衡液洗浄：コラムに結合されていない標的タンパク質を得るために、１ＣＶの陰イオン交換緩衝液でコラムを洗浄する。
４．ＮａＣｌ洗浄：コラムに結合されたタンパク質を除去するために、２ＣＶのＮａＣｌ  ２Ｍでコラムを洗浄する。
５．ＮａＯＨ洗浄：２ＣＶのＮａＯＨ溶液０．５Ｍでコラムを洗浄する。
６．再平衡（Ｒｅｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）：陰イオン交換緩衝液でコラムを再平衡させる。
【００７２】
実験結果
精製過程の手順毎によるサンプルの電気泳動結果を図８、９、１０に示す。第一段階のＳＰ溶離液は１５ｍｌ収集され、濃度が２．２７３ｍｇ／ｍｌであり、標的タンパク質の純度が非常に高くなっていることが検出され、第二段階のヒドロキシアパタイト溶離液は１２ｍｌ収集され、濃度が２．０８０ｍｇ／ｍｌであり、残りのハイブリッドタンパク質及び一部のピロゲンを除去する作用を有し、第三段階の陰イオン交換透過液は２０ｍｌ収集され、濃度が０．８４６ｍｇ／ｍｌであり、主にピロゲンを除去するものである。本実施例による実験操作を複数回繰り返して、体外生物活性評価に十分なタンパク質量を得た。
【００７３】
実施例６
ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３タンパク質のＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ検査
ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３は野生型ＴＲＡＩＬのＮ末端の５つの部位を突然変異させて得たものであるため、ＴＲＡＩＬの抗原決定基が依然として保たれており、ＴＲＡＩＬの多クローン抗体と特異的結合できるので、ＴＲＡＩＬ多クローン抗体により検査し同定することができる。
【００７４】
実験手順
一．サンプルの調合
１．実施例５で精製されたＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３タンパク質を−２０℃から解凍してから、その提供する濃度に応じて、超純水で１ｍｇ／ｍｌに希釈する。サンプル５０μｌを採取して５０μｌの２×ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え、電気泳動サンプルとする。それぞれ１０μｌ採取して電気泳動を行い、即ち、ローディング量を５ｕｇとする。
２．参照物質であるＴＲＡＩＬ−２０１３１２０４凍結乾燥物（実験室で調製されたもの）を１ｍｌのＰＢＳで溶解し、サンプル５０μｌを採取して５０μｌの２×ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え、電気泳動サンプルとする。それぞれ１０μｌ採取して電気泳動を行い、即ち、ローディング量を５ｕｇとする。
【００７５】
二．検査過程
サンプルについて１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い分離してから、ＰＶＤＦ膜に転移する。まず、４℃で一夜遮断し、そして一次抗体［家兎抗ヒトＴＲＡＩＬ多クローン抗体（１：５００）］と室温で２時間インキュベートし、続いて二次抗体［ヒツジ抗家兎ＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００）］と室温で２時間インキュベートし、最後に増強化学発光（ＥＣＬ）により検査する。具体的な手順は以下のとおりである。
１．１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行なってタンパク質を分離し、ゲルを取り出して縁を切除し、ＴＢＳＴ緩衝液に１５分間浸漬する。
２．ＰＶＤＦ膜による転移（湿式転移）：ＰＶＤＦは使用の前にややメタノールで１５秒間浸漬する必要があり、続いて蒸留水に１〜３分間浸してから、転移緩衝液にて平衡させるものであり、転移クリップにおいて、負極から正極へ順にスポンジパッド、ろ紙（４〜８枚）、標的ゲル、ＰＶＤＦ膜、ろ紙（４〜８枚）及びスポンジパッドを敷き、気泡を排出してから、クリップを締付けて電圧４０Ｖで転移用のタンクに４５分間置く。
３．膜の遮断：非特異結合部位を遮断するために、膜を遮断液（３％のＢＳＡ）にて４℃の条件で一夜遮断し、翌日に取り出して室温で３０分間振動する。
４．一次抗体のインキュベート：一次抗体［家兎抗ヒトＴＲＡＩＬ多クローン抗体（１：５００）］を遮断液で作用濃度に希釈し、膜とともに振動し、室温で２ｈインキュベートする。
５．膜の洗浄：一回に付き、１０分間洗浄するようにＴＢＳＴで膜を三回洗浄する。１０×１０ｃｍの膜については、５０ｍｌ以上の洗浄液を必要とする。
６．二次抗体のインキュベート：ＨＲＰで標識された二次抗体［ヒツジ抗家兎ＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００）］を遮断液で作用濃度に希釈し、膜とともに振動し、室温で２時間インキュベートする。
７．膜の洗浄：一回に付き、１０分間洗浄するようにＴＢＳＴで膜を三回洗浄する。１０×１０ｃｍの膜については、５０ｍｌ以上の洗浄液を必要とする。
８．発色：（１）等体積のＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＡとＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂとを混合して、十分な検査用の混合液（０．１２５ｍｌ／ｃｍ2）を調製する。検査用の混合液は室温で１時間以内に安定性を保持できるため、その調製の後に直ちに使用することになる。（２）ブロッティング膜を乾燥にしないように、洗浄されたブロッティング膜における余分な洗浄液を滴らせる。膜のタンパク質がある一方の面に検査用の混合液を加え、余分な検査用の混合液を滴らせ、コダック製のゲルイメージング装置Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４０００Ｒに置き、最初に露光時間１分間を選択し、画像結果に応じて露光時間を調整するように、Ｘ−ｒａｙで露光する。コンピュータで画像を記録する。
９．結果の判断：陽性の結果であれば、明らかなカラーラインを示すべきである。陰性の結果であれば、発色しないことになる。
【００７６】
実験結果
図１１に示されるように、ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３及びＴＲＡＩＬ参照物質は陽性反応を呈し、陰性対照では陰性反応を呈している。
【００７７】
実施例７
タンパク質ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３及びＴＲＡＩＬの生物活性分析
ＣＣＫ−８検査キットにより、ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３及び野生型ＴＲＡＩＬの２つのタンパク質サンプルの３２個の腫瘍細胞株に対する体外での抗増殖活性ＩＣ５０値を検査して、その体外生物活性を評価する。
材料と方法
検査用の細胞株はいずれも中国科学院上海細胞庫又はアメリカＡＴＣＣに由来するものである。
【００７８】
【表８】
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【００７９】
試薬と消耗品
Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８  （Ｃａｔ＃  ＣＫ０４−１３、Ｄｏｊｉｎｄｏ）
９６ウェル培養プレート  （Ｃａｔ＃  ３５９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）
ウシ胎仔血清  （Ｃａｔ＃１００９９−１４１、ＧＩＢＣＯ）
培地  （ＧＩＢＣＯから購入）
卓上型マイクロプレートリーダー  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）
２つのタンパク質サンプル：実施例５により調製し又は実験室で調製する。
【００８０】
実験手順
１．試薬の調合
培地の調合
【００８１】
【表９】
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【００８２】
タンパク質サンプルの調製
最終濃度を５ｍｇ／ｍｌとするように、無菌のＰＢＳ緩衝液で２つのタンパク質サンプルを希釈し、そしてろ過し除菌する。
２．ＩＣ５０実験
ａ）対数増殖期の細胞を収集してカウントし、完全培地で細胞を再懸濁し、適切な細胞濃度（細胞密度最適化試験の結果に基づいて決定される）に調整し、ウェル毎に細胞懸濁液１００μｌを加えるように９６ウェルプレートに接種する。細胞を３７℃で１００％の相対湿度で、５％のＣＯ2インキュベータにて２４時間インキュベートする（ＳＷ６２０細胞は例外、５％のＣＯ2を必要としない）。
ｂ）無菌のＰＢＳ緩衝液で測定待ちのタンパク質サンプルを５ｍｇ／ｍｌに希釈してから、８回勾配希釈し、２５μｌ／ウェルとして細胞を加える。化合物の最終濃度は、合計１０個の濃度点とするように１ｍｇ／ｍｌから０へ３倍の勾配希釈を行い、そして、初歩的な実験結果に基づいて、タンパク質サンプルの最終作用濃度について対応する調整を行う。
ｃ）細胞を３７℃で１００％の相対湿度で、５％のＣＯ2インキュベータにて４８時間インキュベートする（ＳＷ６２０細胞は例外、５％のＣＯ2を必要としない）。
ｄ）培地を吸い上げて捨て、１０％のＣＣＫ−８を含む完全培地を加え３７℃のインキュベータに置いて２−４時間インキュベートする。
ｅ）優しく振盪してから、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒにて４５０ｎｍ波長における吸光度を測定し、６５０ｎｍにおける吸光度を参照として、抑制率を算出する。
３．データ処理
下式として薬物の腫瘍細胞の成長に対する抑制率を算出する。
腫瘍細胞成長抑制率％＝［（Ａｃ−Ａｓ）／（Ａｃ−Ａｂ）］×１００％
Ａｓ：サンプルのＯＡ／ＲＬＵ（細胞＋ＣＣＫ−８＋測定待ちの化合物）
Ａｃ：陰性対照のＯＡ／ＲＬＵ（細胞＋ＣＣＫ−８）
Ａｂ：陽性対照のＯＡ／ＲＬＵ（培地＋ＣＣＫ−８）
ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５により、算式ｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｖｓ．  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ−Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅでＩＣ５０曲線の当てはめを行い、ＩＣ５０値を算出する。
【００８３】
実験結果
本実験では、５つの膵臓がん細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２、ＣＦＰＡＣ−１、Ｐａｎｃ  ０５．０４、ＢｘＰＣ−３、ＰＡＮＣ−１）、５つの肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ａ  ５４９、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ２２６）、５つの結（直）腸がん細胞株（ＨＣＴ−１５、ＣＯＬＯ  ２０５、ＳＷ６２０、ＨＴ−２９、ＨＣＴ  １１６）、５つの乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ−７５−１）、６つの骨髄由来腫瘍細胞株（Ｍｏｌｔ４、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、ＨＬ−６０、Ｌ５４０ｃｙ、ＯＰＭ−２）、３つの脳腫細胞株（Ｕ８７−ＭＧ、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ−２、Ｕ２５１）及び３つの（骨）軟骨腫細胞株（Ｕ−２０Ｓ、ＳａｏＳ−２、ＨＴ１０８０）に対する、２つのタンパク質サンプル（ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３及び野生型ＴＲＡＩＬ）の体外での抗細胞増殖活性をテストした。実験結果を下表に示す。
【００８４】
【表１０】
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【００８５】
実験結果
ＴＲＡＩＬ細胞膜透過性ペプチド様突然変異体ＴＲＡＩＬ−Ｍｕ３はＴＲＡＩＬ野生型タンパク質に比べて、検査されたほとんど全ての種類の腫瘍細胞（複数種の結（直）腸がん細胞、複数種の肺がん細胞、複数種の膵臓細胞、複数種の乳腺細胞、複数種の骨髄由来腫瘍細胞、複数種の（骨）軟骨腫細胞を含む）にとって、その抗腫瘍活性が顕著に向上し、特にＴＲＡＩＬ野生型タンパク質に対して薬剤耐性を持つ腫瘍細胞株にとって、これらの細胞のＴＲＡＩＬ野生型タンパク質に対する耐性を顕著に逆転でき、より高い治療作用を持っている。
【００８６】
上記は本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を制限するためのものではなく、本発明の精神と原則においてなされたあらゆる変更、等価取替、改良等はいずれも、本発明の保護範囲に含まれるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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