(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の部分：
メンブレンを有するチャンバーを備えたメンブレンカセットであって、該メンブレンは、薬物製剤の投与時に生じる変化をシミュレーションするために、それを通って薬物製剤の構成成分が拡散することが可能な穿孔を有し、該メンブレンカセットのチャンバーは投与部位における条件をシミュレーションするために該投与部位で見出される1種以上の構成成分を含有する、メンブレンカセット；
該メンブレンカセットおよび周囲の液体媒体を入れるための浴；
該メンブレンカセット内部に配置された測定プローブであって、該メンブレンカセット内部での薬物製剤の特性の変化を検出することが可能なプローブ
を備えた装置を用いる、投与時に生じる薬物製剤の特性の変化を測定するin vitro法であって、以下のステップ：
(a)該浴中にメンブレンカセットを配置するステップ；
(b)該メンブレンカセットのチャンバーへと薬物製剤を導入するステップ；
(c)任意により、該薬物製剤もしくは該液体媒体の1つ以上の構成成分もしくは条件を変化させるステップ；および
(d)該プローブを用いて該薬物製剤の特性の変化を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記投与が、皮下経路、筋内経路、皮内経路、髄腔内経路または硬膜外経路によるものである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記メンブレンカセットが、目に対する薬物製剤の投与をモデル化するためのものであり、メンブレンカセットのチャンバーが、目の硝子体液をモデル化するための1種以上のヒドロゲルならびに強膜および網膜をモデル化するためのメンブレンを含み、任意により、該ヒドロゲルはコラーゲンおよびヒアルロン酸を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記メンブレンカセットが筋内経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーが、アクチン、ミオシン、グリコーゲン、ミオグロビン、コラーゲン、トロポニンおよび/またはトロポミオシンから選択される1種以上の物質ならびに筋肉をシミュレーションする透過特性を有するメンブレンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記メンブレンカセットが皮下注入経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーがヒアルロン酸およびコラーゲンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記メンブレンカセットが皮内注入経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーがコラーゲンおよびデルマタン硫酸を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記メンブレンカセットが髄腔内経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーが、緩衝溶液として人工脳脊髄液を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記メンブレンカセットが硬膜外経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーが、硬膜外腔を満たすことをモデル化するためのコラーゲンおよびヒアルロン酸のうちの1種以上を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、前記メンブレンカセットのチャンバー中に存在する1種以上の構成成分または条件を改変するステップを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬物製剤の導入が注入によるものである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記特性が、前記薬物製剤の安定性および/または該薬物のバイオアベイラビリティである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬物製剤が、小分子、ポリペプチド、ペプチドまたは抗体製剤である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記メンブレンカセットのチャンバーが、注入部位での条件をシミュレーションするための細胞外マトリックス中に見出される構成成分を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞外マトリックス構成成分が、ヒアルロン酸もしくはその塩、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマタン硫酸、および/または1種以上の細胞株を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記メンブレンカセットのチャンバーが、0.5mL〜10mLの容量を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記メンブレンが透明である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記メンブレンが、未改変の精密ろ過膜または透析膜である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記メンブレンが、再生セルロース、酢酸セルロースもしくはそのエステルまたはその混合物、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルスルホン（polyestersulfone）、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）、ポリ塩化ビニル（PVC）あるいはポリテトラフルオロエチレン（PTFE）から形成される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記メンブレン中の穿孔が、極微針ローラーまたはレーザーを用いる処理により得られる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
極微針ローラーがダーマローラー（Dermaroller）である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記穿孔が、約0.1〜約200ミクロンのサイズである、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記穿孔が、約1ミクロン〜10mm間隔である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記装置が、熱制御・測定システムを備える、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
前記浴がスターラーを有する、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記装置が、温度管理を維持するため、および皮下注入部位をシミュレーションするための対流を維持するための、温度測定システムおよび制御を備える、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
前記カセットが、該カセットのチャンバーへと薬物製剤の試料またはプローブを導入するための注入口を有する、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
前記周囲の液体媒体が緩衝溶液である、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
前記装置が、チャンバー中の静水圧を変化させるために前記メンブレンカセットの上の前記液体媒体の高さまたは体積を調整する手段を備える、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記装置が複数のプローブを備える、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記プローブが、注入後にタンパク質が受けるコンホメーション変化をモニタリングするためならびにタンパク質および賦形剤濃度をモニタリングするためのラマンプローブおよび/または蛍光分光プローブ、温度プローブ、圧力変換器、pHプローブ、分光光度計を含む製剤の構成成分の沈殿を測定するために光学密度を測定するためのプローブを含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、前記製剤の特性のうちの1つを改変し、ステップ(a)〜(d)のうちの1つ以上を繰り返して、他の被験薬物製剤と比較して薬物製剤の特性の変化があるか否かを決定するステップを含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
規制当局に提出するための製剤についてのデータを取得するため、皮下注入後の性能の一貫性を決定するため、または品質管理目的のために、薬物製剤を試験するためのものである、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
以下の部分：
メンブレンを有するチャンバーを備えたメンブレンカセットであって、該メンブレンは、薬物製剤の投与時に生じる変化をシミュレーションするために、それを通って薬物製剤の構成成分が拡散することが可能な穿孔を有し、該メンブレンカセットのチャンバーは投与部位における条件をシミュレーションするために該投与部位で見出される1種以上の構成成分を含有する、メンブレンカセット；
該メンブレンカセットおよび周囲の液体媒体を入れるための浴；
該メンブレンカセット内部に配置された測定プローブであって、該メンブレンカセット内部での薬物製剤の特性の変化を検出することが可能なプローブ
を備えた、投与時に生じる薬物製剤の特性の変化を測定するための装置であって、使用中には、該メンブレンカセットが該浴中に配置され、該薬物製剤が該メンブレンカセットのチャンバーへと導入され、それにより該プローブを用いて該薬物製剤の特性の変化が測定されることが可能になる、上記装置。
【請求項３４】
前記投与が、皮下経路、筋内経路、皮内経路、髄腔内経路または硬膜外経路によるものである、請求項33に記載の装置。
【請求項３５】
前記メンブレンカセットが、目に対する薬物製剤の投与をモデル化するためのものであり、メンブレンカセットのチャンバーが、目の硝子体液をモデル化するための1種以上のヒドロゲルならびに強膜および網膜をモデル化するためのメンブレンを含み、任意により、該ヒドロゲルはコラーゲンおよびヒアルロン酸を含む、請求項33に記載の装置。
【請求項３６】
前記メンブレンカセットが筋内経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーが、アクチン、ミオシン、グリコーゲン、ミオグロビン、コラーゲン、トロポニンおよび/またはトロポミオシンから選択される1種以上の物質ならびに筋肉をシミュレーションする透過特性を有するメンブレンを含む、請求項33に記載の装置。
【請求項３７】
前記メンブレンカセットが皮下注入経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーがヒアルロン酸およびコラーゲンを含む、請求項33に記載の装置。
【請求項３８】
前記メンブレンカセットが皮内注入経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーがコラーゲンおよびデルマタン硫酸を含む、請求項33に記載の装置。
【請求項３９】
前記メンブレンカセットが髄腔内経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーが、緩衝溶液として人工脳脊髄液を含む、請求項33に記載の装置。
【請求項４０】
前記メンブレンカセットが硬膜外経路による投与をモデル化するためのものであり、該メンブレンカセットのチャンバーが、硬膜外腔を満たすことをモデル化するためのコラーゲンおよびヒアルロン酸のうちの1種以上を含む、請求項33に記載の装置。
【請求項４１】
前記メンブレンカセットのチャンバー中に存在する1種以上の構成成分または条件が改変される、請求項33〜40のいずれか1項に記載の装置。
【請求項４２】
前記薬物製剤の導入が注入によるものである、請求項33〜41のいずれか1項に記載の装置。
【請求項４３】
前記特性が、前記薬物製剤の安定性および/または該薬物のバイオアベイラビリティである、請求項33〜42のいずれか1項に記載の装置。
【請求項４４】
前記薬物製剤が、小分子、ポリペプチド、ペプチドまたは抗体製剤である、請求項33〜43のいずれか1項に記載の装置。
【請求項４５】
前記メンブレンカセットのチャンバーが、注入部位での条件をシミュレーションするための細胞外マトリックス中に見出される構成成分を含む、請求項33〜44のいずれか1項に記載の装置。
【請求項４６】
前記細胞外マトリックス構成成分が、ヒアルロン酸もしくはその塩、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマタン硫酸、および/または1種以上の細胞株を含む、請求項45に記載の装置。
【請求項４７】
前記メンブレンカセットのチャンバーが、0.5mL〜10mLの容量を有する、請求項33〜46のいずれか1項に記載の装置。
【請求項４８】
前記メンブレンが透明である、請求項33〜47のいずれか1項に記載の装置。
【請求項４９】
前記メンブレンが、未改変の精密ろ過膜または透析膜である、請求項33〜48のいずれか1項に記載の装置。
【請求項５０】
前記メンブレンが、再生セルロース、酢酸セルロースもしくはそのエステルまたはその混合物、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルスルホン（polyestersulfone）、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）、ポリ塩化ビニル（PVC）あるいはポリテトラフルオロエチレン（PTFE）から形成される、請求項33〜49のいずれか1項に記載の装置。
【請求項５１】
前記メンブレン中の穿孔が、極微針ローラーまたはレーザーを用いる処理により得られたものである、請求項33〜50のいずれか1項に記載の装置。
【請求項５２】
極微針ローラーがダーマローラー（Dermaroller）である、請求項51に記載の装置。
【請求項５３】
前記穿孔が、約0.1〜約200ミクロンのサイズである、請求項33〜52のいずれか1項に記載の装置。
【請求項５４】
前記穿孔が、約1ミクロン〜10mm間隔である、請求項33〜53のいずれか1項に記載の装置。
【請求項５５】
前記装置が、熱制御・測定システムを備える、請求項33〜54のいずれか1項に記載の装置。
【請求項５６】
前記浴がスターラーを有する、請求項33〜55のいずれか1項に記載の装置。
【請求項５７】
前記装置が、温度管理を維持するため、および皮下注入部位をシミュレーションするための対流を維持するための、温度測定システムおよび制御を備える、請求項33〜56のいずれか1項に記載の装置。
【請求項５８】
前記カセットが、該カセットのチャンバーへと薬物製剤の試料またはプローブを導入するための注入口を有する、請求項33〜57のいずれか1項に記載の装置。
【請求項５９】
前記周囲の液体媒体が緩衝溶液である、請求項33〜58のいずれか1項に記載の装置。
【請求項６０】
前記装置が、チャンバー中の静水圧を変化させるために前記メンブレンカセットの上の前記液体媒体の高さまたは体積を調整する手段を備える、請求項33〜59のいずれか1項に記載の装置。
【請求項６１】
前記装置が複数のプローブを備える、請求項33〜60のいずれか1項に記載の装置。
【請求項６２】
前記プローブが、注入後にタンパク質が受けるコンホメーション変化をモニタリングするためならびにタンパク質および賦形剤濃度をモニタリングするためのラマンプローブおよび/または蛍光分光プローブ、温度プローブ、圧力変換器、pHプローブ、分光光度計を含む製剤の構成成分の沈殿を測定するために光学密度を測定するためのプローブを含む、請求項61に記載の装置。
【請求項６３】
規制当局への提出用の薬物製剤に関するデータを提供するために薬物製剤を試験するための、請求項33〜62のいずれか1項に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物製剤の投与時、特に皮下注入によるタンパク質またはペプチド薬物製剤の投与時に生じる変化のin vitroモデル化のための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病、癌、肝炎、および骨粗鬆症などの状態を治療するためのタンパク質またはペプチド薬物を含む慢性的治療は、生物学的治療剤への製薬業界の連続的な推移を代表する。ライフスタイルの問題および老齢人口により、これらの投薬治療を必要とする患者数は迅速に増大している。医療経済学は、多くの場合、外来診療なしにこれらの薬剤が投与されることを必要とし、このことは、静脈内（IV）注入ではなく皮下（SC）注入を可能にする製剤に対する必要性を命じる。ヒトでのSC注入結果に対する予測モデルは明らかになっておらず；多数の製剤を臨床試験することの見通しは、法外に費用がかかる。つまり、十分な保存安定性および十分な前臨床的有効性により特定される製剤が、臨床で試験される際にSC注入後に低いかまたは変化し易いバイオアベイラビリティ（％BA）をもたらす場合に、多数の有望な薬剤に対する開発プログラムがしばしば中断される。そのような結果は、無視できない逸失機会費用を生じ、研究開発費に対して相当な追加を付与し、これが総合的な保健医療費に影響する薬価に最終的に反映される。
【０００３】
この現状に対しては、いくつかの理由がある。第一には、特に皮下注入による投与後の重要な最初の1時間に、製剤中のタンパク質またはペプチドが何を被るかについての知識が限定されており、この情報なしに、製剤科学者はこれらのプロセスを考慮するために製剤を設計することができないことである。つまり、生物学的治療剤が投与される際に何が起こるかを理解することの課題に対処するのではなく、製剤科学者および規制当局は、競合する化学的および物理的分解経路を最小限にするための、およびこれが（例えば）皮下注入に適合することを望むための試みをすることにより、投与前の製剤の保存寿命を長くすることのみに焦点を当てることができる。現在の皮下投与製剤は、典型的には、pH5〜6ならびに界面活性剤、保存料、糖および/またはヒトアルブミンなどの賦形剤の様々な組み合わせを用いて、2〜3年の保存寿命を有する。しかしながら、投与に際して、かつ注入部位で起こる事象に関する情報なしでは、製剤化の変更を通じた、乏しいかまたは変化し易いバイオアベイラビリティの問題を解決するための系統立ったアプローチはなされない。本発明は、当技術分野でのこの満たされていないニーズを解決することを試みる。
【０００４】
米国特許第4,812,407号には、薬物の拡散挙動を試験するための装置が記載され、該装置では、放射性標識された薬物がドナー区画に導入され、周囲のアクセプター区画へとメンブレンを通って拡散するようにされる。シンチレーションカウンターなどの測定デバイスが、アクセプター区画中の該放射性標識薬物の量または濃度を検出するために用いられる。
【０００５】
欧州特許出願公開第2182342号には、溶解された薬物に対しては透過性であるが、未溶解形態の薬物に対しては不透過性であるメンブレンにより隔てられた2つの区画を有するチャンバーを用いる、薬物の溶解を試験するための装置および方法が開示される。同様のアプローチが、国際公開第00/46597号に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第4,812,407号
【特許文献２】欧州特許出願公開第2182342号
【特許文献３】国際公開第00/46597号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
広範には、本発明は、投与、特に注入による投与（例えば、皮下注入）の際に生じる薬物製剤の特性の変化、および該製剤の安定性または該薬物のバイオアベイラビリティなどの、該製剤中に存在する該薬物の物理化学的特性にこれらの変化がどのように影響するのかを測定することが可能である装置および方法を提供することを目的とする。本装置および方法は、タンパク質、抗体およびペプチドなどの生物学的治療剤の製剤を試験するために特に有用である。このin vitroモデルは、投与時に存在する条件および構成成分をシミュレーションし、メンブレンカセット中ならびに製剤の構成成分が拡散していく周囲のシンク中で、製剤の構成成分を試験するのを可能にするように設計されたメンブレンカセットを用いることにより、皮下腔などの身体中の投与部位へと注入されたときに、タンパク質、ペプチドまたは抗体製剤などの薬物製剤が経験する複数のストレス因子を同時にモデル化するために設計される。そのようなモデルは、製剤のパラメータ、条件および/または特性を変化させ、かつ変化が投与時の結果を改善するか否かを調べるために試験することにより、薬物製剤を最適化する方法として、特定の製剤構成成分を評価するために用いることができる。該モデルはまた、規制当局への提出または品質管理目的のためのデータを提供するためにも用いることができる。
【０００８】
米国特許第4,812,407号に開示された装置および方法とは異なり、本発明は、メンブレンカセット内部ならびにまた任意により周囲の浴内での薬物または薬物製剤の特性の変化を測定することを可能にし、かつ二槽系での多孔性メンブレンを介するその拡散または溶解挙動の単純な測定を超える、薬物製剤の1種以上の特性に対する測定を行なうことを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、第1の態様では、本発明は、以下の部分：
メンブレンを有するチャンバーを備えたメンブレンカセットであって、該メンブレンは、薬物製剤の投与時に生じる変化をシミュレーションするために、それを通って薬物製剤の構成成分が拡散することが可能な穿孔を有する、メンブレンカセット；
該メンブレンカセットおよび周囲の液体媒体を入れるための浴；
該メンブレンカセット中での薬物製剤の特性の変化、および任意により、該浴中での薬物製剤の特性の変化を検出することが可能なプローブ
を備えた装置を用いる、投与時に生じる薬物製剤の特性の変化を測定するin vitro法を提供し、該方法は、以下のステップ：
(a)該浴中にメンブレンカセットを配置するステップ；
(b)該メンブレンカセットのチャンバーへと薬物製剤を導入するステップ；
(c)任意により、該薬物製剤もしくは該液体媒体の1つ以上の構成成分もしくは条件を変化させるステップ；および
(d)該プローブを用いて該薬物製剤の特性の変化を測定するステップ
を含む。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、以下の部分：
メンブレンを有するチャンバーを備えたメンブレンカセットであって、該メンブレンは、薬物製剤の投与時に生じる変化をシミュレーションするために、それを通って薬物製剤の構成成分が拡散することが可能な穿孔を有する、メンブレンカセット；
該メンブレンカセットおよび周囲の液体媒体を入れるための浴；
該メンブレンカセット中での薬物製剤の特性の変化、および任意により、該浴中での薬物製剤の特性の変化を検出することが可能なプローブ
を備えた、投与時に生じる薬物製剤の特性の変化を測定するための装置を提供し、、使用中には、該メンブレンカセットが該浴中に配置され、該薬物製剤がメンブレンカセットのチャンバーへと導入され、それにより該プローブを用いて該薬物製剤の特性の変化が測定されることが可能になる。
【００１１】
したがって、本発明は、投与時に薬物製剤で生じる変化をモデル化するための方法および装置を提供する。1つの好ましい実施形態では、これは、先行技術ではそれについて研究するための有効な方法が現在はない、皮下投与（例えば、皮下注入）をモデル化するために用いることができる。つまり、本発明では、メンブレンカセットは、体腔、器官へと、または所与の投与経路を介して導入される薬物製剤の投与をモデル化するために用いることができる所定の部位を提供し、それにより、薬物製剤を改変することの効果または投与様式を研究することを可能にする。例えば、薬物製剤の投与の部位に存在する1種以上の構成成分を含めることにより、例えば、メンブレンカセット内部に細胞外マトリックスの構成成分を含有させることにより、細胞外マトリックスと製剤構成成分との間の相互作用を生じさせ、研究に含める。注入時にカセット中の細胞外マトリックスに結合しないいずれの製剤構成成分も、続いて、カセットの周囲の浴により提供される無限シンクへと拡散することができ、ここでそれらはサンプル採取される。好ましくは、メンブレンカセットの周囲の浴中の液体媒体は、緩衝溶液である。一般的に、このことは、メンブレンカセットの構成成分が、周囲の浴の緩衝溶液とは異なるであろうことを意味するであろう。
【００１２】
より一般的には、適切なメンブレンおよびメンブレンカセットの内容物を選択することにより、他の体腔、器官へと、または他の投与経路を介して導入された薬物製剤の挙動を研究することができる。例えば、目の硝子体液は、コラーゲンおよびヒアルロン酸から構成されるヒドロゲルであり、比較的不透過性である強膜および網膜によって閉じ込められている。目の硝子体区画に投与された薬物の製剤挙動もまた、したがって、目をシミュレーションする透過特性を有するメンブレンを選択し、硝子体区画と類似のヒドロゲルでメンブレンカセットを満たすことにより、本発明の装置を用いてシミュレーションすることができる。同様に、例えば、アクチン、ミオシン、グリコーゲン、ミオグロビン、コラーゲン、トロポニンおよび/またはトロポミオシンをカセット中で、好適な透過特性を有するメンブレンと組み合わせて用いることにより、筋内注入をシミュレーションすることができる。皮内注入は、細胞外マトリックス構成成分の組成をコラーゲンおよびデルマタン硫酸に変えることによりモデル化することができ；髄腔内注入は、緩衝溶液として人工脳脊髄液を用いることによりモデル化することができ、硬膜外注入は、硬膜外腔を満たすコラーゲンおよびヒアルロン酸から構成される疎性結合組織をモデル化することによりモデル化することができる。このようにして、本発明は、例えば、皮下経路、筋内経路、皮内経路、髄腔内経路または硬膜外経路による注入時の薬物の挙動をモデル化するために、本装置および方法を用いることを可能にする。したがって、モデル化することができる身体内の部位としては、限定するものではないが、目、皮膚（皮内または皮下）、筋肉、脊柱管または背中が挙げられる。
【００１３】
本発明の方法は、製剤の特性のうちの1つを改変し、かつステップ(a)〜(d)のうちの1つ以上を繰り返して、他の被験薬物製剤と比較した場合に薬物製剤の特性に変化があるか否かを決定するステップを含むことができる。あるいはまたはさらに、これは、例えば、投与部位の選択が、そのバイオアベイラビリティなどの薬物製剤の特性にどのように影響するかを決定するために、メンブレンカセットのチャンバー中に存在する1種以上の構成成分または条件を任意により改変するステップ、および任意によりこれらのステップを繰り返すステップを含むことができる。メンブレンカセットのチャンバー内部に存在する構成成分または条件を改変する影響は、装置と共に存在するプローブを用いて、薬物製剤中での変化の決定と同様に決定することができる。
【００１４】
本発明は、タンパク質、ペプチドまたは抗体薬物などの生物学的治療剤の投与時に生じる変化を研究するために特によく適しているが、小分子薬物、またはヌクレオチド、遺伝子治療、または薬物のリポソーム製剤をはじめとするいずれかのタイプの薬物製剤を研究することに対して、当業者であれば適合させることができる。
【００１５】
例として、本発明では、メンブレンカセットのチャンバーは、好都合には、0.5mL〜10mLの容量を有する。一部の場合には、メンブレンは透明であり得、それにより、チャンバーの内容物の目視検査ならびにメンブレンを通る監視経路を介したカセットの外部に位置するプローブへのアクセスが可能になる。あるいは、例えば2つの向かい合ってかつ実質的に平行なカセットの透明壁を介して、その中にメンブレンが位置する壁以外のカセットの壁を介したアクセスを有する1種以上のプローブを用いて、カセットの内容物が監視される、カセットの他の形式または設計を検討することができる。1つの特定の実施形態では、概ね四角形の断面を有するメンブレンカセットは、その中にメンブレンが位置する向かい合う1対の壁と、透明であって、それによりそれを介してカセットの内容物に対する測定をプローブが行なうことができる監視経路（例えば、光路）をもたらす向かい合う壁の別の対を含む。
【００１６】
メンブレンのために用いられる材料は、当技術分野で周知の好適な材料から当業者が選択することができ、セルロースエステルなどの材料から形成されるメンブレンを含む。メンブレンのために用いることができる他の材料としては、例えば、再生セルロース、酢酸セルロースもしくはそのエステルまたはその混合物、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルスルホン（polyestersulfone）、ナイロン、ポリビニルジンフルオリド（polyvinyldinefluoride）（PVDF）、ポリ塩化ビニル（PVC）またはポリテトラフルオロエチレン（PTFE）が挙げられる。Whatman社、Millipore社、Pierce社またはBiodesign社などの商業的供給元から入手可能な好適なメンブレンの多数の例がある。
【００１７】
一実施形態では、メンブレンカセットはキュベット型の設計を有することができ、この設計では、キュベットの側面が、それを介してキュベット内部に含まれる薬物製剤に対する測定をプローブが行なうことができる監視経路を提供する。例えば、四角形の断面を有するキュベットでは、カセットの内容物をモニタリングするためのカセットを通る監視経路（すなわち、光路）を提供するために、2つの向かい合う壁が光に対して透明であり得る。光路に対して透明な側面は、透明なメンブレンを用いることにより、または光路がキュベットを通って残るようにキュベットを改変することにより、得ることができる。これは、いくつかの方法により実現できる。キュベットは、キュベットの2つの向かい合う壁が互いに実質的に平行であり、それによりキュベットを通る光路を可能にする限り、垂直断面で四角形または楔形であり得る。次に、メンブレンはキュベットの他の場所に位置することができ、カセットの内容物をモニタリングするための光路が透明キュベット壁を通って達成される場合はメンブレンが透明である必要はない。
【００１８】
キュベットに基づく設計を用いる場合、キュベットの頂部は、例えばテフロン（登録商標）製の蓋システムを用いて閉じることができ、蓋システムを介して、注射針差込口のために、ならびにカセット内容物をモニタリングするプローブを挿入するために用いることができる入口を配置することができる。例えば、マグネチックスターラーまたは機械的スターラーである撹拌機構をカセット内に挿入することもできる。
【００１９】
本明細書中で説明される通り、メンブレンの重要な機能は、皮下注入時に薬物製剤が曝露される特性または条件の変化をシミュレーションすることが可能な様式で、周囲の浴へのメンブレンカセットのチャンバーからの製剤、特に薬物の構成成分の拡散を可能にすることである。この効果をもたらすのを助けるメンブレンの1つの特徴は、それを通って薬物製剤の構成成分が拡散することが可能な経路をもたらす、メンブレン中の開口部である。精密ろ過膜または透析膜などの好適な透過特性を有するメンブレンは、Whatman社もしくはMillipore社（精密ろ過膜）またはBiodesign社（透析膜）などの供給元から商業的に取得することができる。あるいは、開口部のサイズおよび間隔を制御するために、本発明は、市販のメンブレンを改変することが特に有用であり得ること、および特に、ダーマローラー（Dermaroller）（http://www.dermaroller.com/）などの極微針ローラーを用いてメンブレンを処理することにより、良好な結果が得られることを見出している。あるいは、開口部をつくり出すための他の技術を用いることができ、例えば、開口部をつくり出す他の機械的手段またはレーザーを用いることができる。一般的に、穿孔がつくられる場合、穿孔は、サイズが約0.1〜約200ミクロン、任意により約0.1〜10ミクロンであり、かつ/または穿孔は約1ミクロン〜10mm間隔であり、任意により約10ミクロン〜10mm間隔であり、任意により約0.1〜10mm間隔であるのが好ましい。
【００２０】
しかしながら、例えば、小分子の投与がモデル化されるか、または注入部位の透過特性が分子輸送に関して制限される、目の硝子体区画などの一部の実施形態では、追加の穿孔をつくり出すためにメンブレンを処理する必要はない場合があり、その代わり、メンブレンが形成される材料（例えば、市販の精密ろ過膜または透析膜）に存在する顕微鏡的穿孔によって、メンブレンを通って薬物製剤が拡散することを可能にする。
【００２１】
メンブレンカセットおよび周囲の浴に加えて、本発明の装置は、透析カセットおよび/または浴中の環境または条件を制御するために有用な1つ以上の他の要素を備えることができる。例として、これらの任意の要素としては、温度制御と、皮下注入部位内での薬物に関する拡散イベントならびにリンパ系および毛細血管を通った皮下注入部位からの薬物の取り込みをシミュレーションする対流とを維持するための熱制御・温度測定システムが挙げられる。好都合には、これは、典型的には生理的範囲内である所望の温度に設定することが可能な、温度計または熱電対と接続されたホットプレートなどの熱源を用いることにより、達成することができる。好ましくは、例えば、マグネチックスターラーまたは機械的スターラーであるスターラーを、浴中で熱を分布させるために用いる。
【００２２】
好ましくは、メンブレンカセットは、カセットのチャンバーに、薬物製剤の試料またはプローブを導入するための注入口をさらに備える。注入口は、カセットまたは蓋システムの個別の構造として備えられることができ、または試料の注入は、隔壁、例えば、一緒になってチャンバーをつくり出す1対のメンブレンを密閉するシリコーン隔壁を通って試料を注入することにより行なうことができる。
【００２３】
好ましくは、装置は、注入部位での条件をシミュレーションするために、メンブレンカセットが置かれる静水圧を改変するために、メンブレンカセットの上の緩衝液の高さまたは体積を調整する手段をさらに備える。
【００２４】
本明細書中に記載される通り、本発明の装置は、メンブレンカセットおよび/または浴中での測定を行なう1つ以上のプローブをさらに備える。好ましくは、装置は、複数のプローブ、例えば、注入後にタンパク質薬物が受けるコンホメーション変化をモニタリングするための、かつタンパク質および賦形剤濃度をモニタリングするための、ラマンプローブおよび/または蛍光分光プローブ、温度プローブ、pHプローブ、分光光度計などの製剤の構成成分の沈殿を測定するために光学密度を測定するためのプローブを含む。光学密度は、安定性の低下が薬物製剤中での乳白光および濁りを引き起こし得る場合に、安定性の特に有用な指標である。
【００２５】
皮下注入部位でのin vivo環境をシミュレーションするために、メンブレンカセットが、皮下組織中に存在する1種以上の細胞外マトリックス構成成分を含むことが好ましい。例として、細胞外マトリックス構成成分は、ヒアルロン酸もしくはその塩、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンおよび/またはデルマタン硫酸のうちの1種以上を含むことができる。あるいはまたはさらに、1種以上の細胞株を、カセット中に添加することができる。ヒアルロン酸（HA）は、細胞外マトリックス内の空隙を埋める、皮下組織に存在するゲル様物質である。皮下注入される抗体製剤に、ヒアルロン酸を分解することが可能な酵素であるヒアルロニダーゼを添加することにより、抗体のバイオアベイラビリティが改善されることが示されている。いかなる特定の理論にも拘泥することを望まないが、これは、大型の抗体分子がより自由に皮下腔で拡散し、つまり毛細血管およびリンパ系を通してより容易に吸収されることにつながる、ヒアルロニダーゼの投与時のゲル様拡散バリアの破壊が原因であり得る（米国特許出願公開第2011/0066111号を参照されたい）。特に、ヒアルロン酸が本発明において有用であり得る理由の1つは、生理的なpHで負に荷電しており、それにより皮下投与される薬物製剤に直面するバイオアベイラビリティの問題の一部分は、ヒアルロン酸と、製剤中に存在する正に荷電した分子との間の相互作用に起因し得ることである。したがって、本発明の方法および装置は、それらがヒアルロン酸および細胞外マトリックスの他の構成成分と相互作用し、したがって、薬物のバイオアベイラビリティの低下を引き起こす程度を決定するために、治療用タンパク質製剤などの薬物製剤を試験することを可能にする。これにより、そのような望ましくない相互作用を低減させるために、存在する構成成分または条件のいずれかを変えることによって製剤を改変するために、本発明を用いることが可能になる。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法に従って薬物製剤を最適化しておくことを含む方法を提供し、該ステップは、当初の製剤に対する1つ以上の変化を含む薬物製剤を製造するさらなるステップである。
【００２７】
本発明の装置および方法に想定される1つの用途は、例えば皮下（SC）注入による投与後の性能の一貫性を決定するために、薬物製剤についてのデータを取得するための薬物製剤の試験でのものである。そのような方法は、品質制御、販売試験のためまたは米国食品医薬品局（FDA）もしくは欧州医薬品審査庁（EMEA）などの規制当局に対する義務を果たすためのデータを提供するのに有用であり得る。上記の通り、現在では、SC注入により投与された後の薬物製剤の安定性および/またはバイオアベイラビリティを試験する、満足のいく方法がない。また、そのSC注入前に物質の運命を予測するための方法もない。このことは、薬物の承認のための申請で規制当局が現在要求する情報は、投与前の薬物製剤の保存寿命に関するということを意味する。このことは、翻って、薬物製剤の組成は、投与後の薬物の運命またはバイオアベイラビリティではなく、in vitro保存安定性を念頭に置いて設計されることを意味する。本発明は、投与直後に、および投与後の一定時間に生じ得る事象をモデル化することによる利点を有する。記載される方法を用いてこの装置で特定される、（例えば）SC注入後のそれらの運命に影響する薬物特性が、保存寿命およびバイオアベイラビリティパラメータの両方の最適化のために、製剤構成成分およびそれらの濃度の選択で有用であり得ることが予測される。したがって、さらなる態様では、本発明は、例えば、規制のための、または品質管理目的のための、本発明の方法により取得される試験または薬物製剤に関するデータが保存されているデータキャリアを提供する。
【００２８】
ここで、本発明の実施形態を、添付の図面に対する参照を用いて、例によって、限定なしに説明する。しかしながら、本発明の種々のさらなる態様および実施形態が、本開示に照らして当業者に明らかであろう。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「および/または」は、他方を伴うかもしくは伴わない、2つの明記された特徴または構成成分の各々の具体的開示として理解されるべきである。例えば、「Aおよび/またはB」は、各々が本明細書中で個別に提示されているのとまったく同じく、(i) A、(ii) Bならびに(iii) AおよびBの各々の具体的開示として理解されるべきである。
【００３０】
文脈がそうでないことを指示しない限り、上記で提示した特徴の説明および定義は、本発明のいずれかの特定の態様または実施形態に限定されず、記載されるすべての態様および実施形態に同等に適用される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】皮下（SC）注入後のバイオ医薬の安定性をモニタリングするために設計されたシステムの模式図である。
【図２】分光光度計およびマグネチックスターラーに接続される図1に示すシステムを表わす図である。
【図３】改変型メンブレンと、pHプローブおよび皮下注射針のためのプラスチックフレームおよび隔壁を通る穴とを有するメンブレンカセットアッセンブリを表わす図である。
【図４】試料の分子量の対数の関数としての拡散の速度定数（k）を表わす図である（r2＝0.9996）。
【図５】人工注入部位へとpH4較正緩衝液を注入し、経時的なpH変化をモニタリングすることにより評価する場合の、pH測定の再現性を表わす図である。無限シンクとして用いた緩衝液は、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩液（PBS）であった。
【図６】カセット中に緩衝液のみ、カセット中にヒアルロン酸（HA）の5mg/mL溶液、カセット中にヒアルロン酸および10mg/mLウシ血清アルブミン（HA＋BSA）、ならびにヒアルロン酸および10mg/mLブタ血清アルブミン（HA＋PSA）を用いて、本発明を用いて測定される場合のレベミル（Levemir）のシミュレーションされたバイオアベイラビリティ（％BA）プロフィールを表わす図である。データは、平均±標準偏差を表わす（n＝3）。
【図７】カセットへと注入されたジェネリックインスリン製剤についてのin situタンパク質可溶性（％T）およびpH時間プロフィール、ならびに浴から取得されたアリコートから決定された、経時的に注入部位から放出される、賦形剤であるm-クレゾールの累積量を表わす図である。表示を明確にするために、m-クレゾールの累積量に対するスケールは、10倍されている。
【図８】カセット中に緩衝液のみ（実線）およびカセット中に5mg/mLヒアルロン酸（点線）を用いて本特許に記載されるシステムを用いて測定される場合のレベミル製剤の注入後のメンブレンカセット中のタンパク質可溶性（％T、黒線）およびpHについてのin situ時間プロフィールを表わす図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
一般的考察
本発明の装置および方法は、投与時に生じる、製剤中に存在するタンパク質またはペプチドの特性の変化を測定することが可能である、メンブレンカセットに基づくモデル化システムを提供する。特に、本明細書中に開示される装置および方法は、例えば、皮下経路、筋内経路、皮内経路、髄腔内経路または硬膜外経路による注入、好ましくは皮下（SC）注入による注入後に生じることが予測される事象、ならびに特にメンブレンカセット内部で生じる薬物製剤に対する変化をモデル化するパラメータを用いて、例えば数時間（例えば、1〜6時間）にわたる時間経過にわたって製剤をモニタリングする時間経過実験を行なうことを可能にする。以下の要素を用いて構成されている本発明の装置の例が、本明細書中に記載される。
【００３３】
まず、皮下注入部位などの、ヒトまたは動物身体中の投与部位で起こる拡散および他の事象と一致する特性および/または条件をメンブレンカセットが備えることが重要である。一部の態様では、これは、緩衝溶液の浴へとカセットから薬物製剤の構成成分が拡散することを可能にする穿孔を有するメンブレンを用いて達成される。例として、市販の透析膜を、任意により改変して、開口部のサイズおよび間隔の両方に関して皮下注入部位と一致する経路特性を提供する一連の非常に小さな開口部を有するメンブレンを作製することができる。本発明の実施形態の下記の例では、2枚の改変型透析膜を、メンブレンカセット中に、好ましくはシリコーンから形成される隔壁の両側に取り付け、カセットの2つの部分を所定の位置に係止して、チャンバーとする。有利には、隔壁は、隔壁を通る注射針形式で、かつ/またはメンブレンカセット中に備えられた1つ以上の差込口を介して、（例えば、隔壁が放射に対して透明である場合に）、メンブレンを通ってカセットに好都合にアクセスできる1つ以上のプローブを用いてメンブレンカセットの内容物をモニタリングすることを可能にする。本発明の装置を用いて行なわれる実験で有用なプローブの例としては、pHプローブ、ラマン分光法のためのプローブ、温度プローブ、圧力変換器、製剤の内容物の沈殿を測定するために光学密度を測定するためのプローブ（分光光度計など）が挙げられる。使用時には、プローブは、メンブレンカセットの内容物の測定を行なうために、かつ/または任意により周囲の浴中に配置されることにより、実験のために準備することができる。ラマンプローブは、注入後にタンパク質薬物が経験するコンホメーション変化ならびに製剤中に存在するタンパク質および賦形剤の濃度を測定するために特に有用である。これらの技術は、周囲のシンクへの製剤の構成成分の拡散を単純にサンプリングすることとは異なって、メンブレンカセット内部に存在するままで、薬物製剤中で生じる変化を測定することが可能な本発明に非常に適合している。
【００３４】
また、本発明の装置は、実験を開始するためのメンブレンカセットチャンバーへの試験製剤の導入での使用のために、注射針システムを備えることができる。一般的に、メンブレンカセットは、例えば、ヒアルロン酸もしくはその塩、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマタン硫酸および/または1種以上の細胞株のうちの1種以上でメンブレンカセットを満たすことにより、投与部位で見出される物質および条件をモデル化するための1種以上の構成成分を含有するであろう。様々な部位での条件をシミュレーションするために有用な構成成分の例は、本出願の他の箇所に開示されている。メンブレンカセットおよび/または浴には、続いて、典型的には少なくともpHプローブおよびラマンプローブである、実験での使用のためのプローブが取り付けられ、試験製剤を導入するための注射針システムが所定の位置に配置される。メンブレンに対して所望の圧を十分に確立するために、重炭酸塩ベースの緩衝液などの温めた生理的媒体を、無限シンク浴ビーカーに入れる。使用時に、例えば、分光光度計の下に配置したマグネチックスターラープレートを用いて回転させるために、スターラーバーをビーカーに入れる。あるいは、直接的な機械的撹拌を用いることができる。研究の継続期間の間、例えば生理的pH（7.3〜7.4）でそのpHを維持するために、無限シンク中の生理的媒体にCO2ガス流を送達させることができる。無限シンクの生理学的流体中に置かれた熱電対を用いて、30〜37℃の一定温度を維持するベースライン検証が行われることを確実にすることができる。
【００３５】
装置が使用のために準備されたら、pH、ラマンスペクトル、光学密度、温度、または他のパラメータを測定するための機器のスイッチを入れる。好都合には、これらのデータ収集機器は、機器データを収集し、かつそれらが適正に動作していることを確認するために、コンピュータに接続され、かつ/またはコンピュータにより制御されることができる。試験製剤は、例えば、注射針差込口に連結されたカテーテルを通して、または隔壁を通して皮下注射針を用いてカセットチャンバーに導入され、データの収集が開始される。一般的に、投与部位、例えば皮下注入部位からの、タンパク質およびペプチド薬物、または他の治療的物質の取り込みの時間経過を模倣するために、実験を数時間行なうことができる。この時間の間、無限シンク中の生理的緩衝液のサンプル採取を用いて、タンパク質またはペプチド、ならびにカセットチャンバーを出る特定の製剤賦形剤の量を測定して、研究の時間経過にわたってこれらの物質の濃度を測定する。
【００３６】
収集されたデータを用いて、タンパク質またはペプチド薬物の物性を検討し、これらの特性の変化を、モデル化された注入部位での製剤物質のpHおよび濃度と相関させる。目標は、SC注入により送達されるタンパク質またはペプチドのバイオアベイラビリティを改善することができる製剤パラメータの迅速かつ正確なスクリーニングを可能にする方法をもたらすことである。
【００３７】
薬物製剤
本発明の装置および方法は、一般的に、小分子薬物をはじめとする任意の薬物の挙動をモデル化するために適用可能であり、抗体、タンパク質またはペプチドを含む生物学的治療剤薬物製剤を研究するのに特によく適している。この技術は、小型ペプチドからポリペプチドまでのいずれかのサイズまたはタイプのポリペプチドおよび100kDaまでまたは100kDa超の分子量を有するタンパク質に適用可能である。したがって、利便性のために、本明細書中の方法は一般的に、「ポリペプチド」に対する参照により説明されるが、これは、当技術分野ではときにはペプチドと称される比較的短いアミノ酸配列（例えば、2、3、4、5または10アミノ酸長〜30、40または50アミノ酸長）を含むものと理解されるべきである。この用語はまた、一般的にはタンパク質ならびにマルチドメインタンパク質と称される二次構造、三次構造または四次構造を有するポリペプチドも含むと理解されるべきである。
【００３８】
本発明に従って改変できるポリペプチドの好適なクラスの例としては、エリスロポエチン（EPO）、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、リンホカイン、サイトカイン、インスリン、モノクローナル抗体およびフラグメント、組換え抗体およびフラグメント、血液凝固因子、コロニー刺激因子（CSF）、成長ホルモン、プラスミノーゲンアクチベータ、ウイルス由来ペプチド、生殖ホルモンおよび治療用酵素が挙げられる。用いることができるポリペプチドの具体例としては、コロニー刺激因子（CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、第VIIa因子、第VIII因子、第IX因子、ヒト成長ホルモン（hGH）、DNase、インスリン、グルカゴン、VEGF、VEGF受容体、TNF、TNF受容体、血小板由来増殖因子（PDGF）、組織プラスミノーゲンアクチベータ（tPA）、エリスロポエチン（EPO）、エンフビルチド（enfurvirtide）、インスリン様増殖因子（IGF）、神経成長因子（NGF）、IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-24、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、インターフェロンα、またはインターフェロンγが挙げられる。
【００３９】
本発明では、抗体であるポリペプチドへの参照は、天然であるかまたは部分的もしくは完全に合成的に生成されたかにかかわらない免疫グロブリンを含む。この用語はまた、抗原結合性ドメインを含むいかなるポリペプチドまたはタンパク質にも及ぶ。抗原結合性ドメインを含む抗体フラグメントとしては、Fabフラグメント、scFvフラグメント、Fvフラグメント、dAbフラグメント、Fdフラグメント、ダイアボディ、トリアボディまたはナノボディが挙げられる。モノクローナル抗体その他の抗体を取得することができ、また元の抗体の特異性を保持している他の抗体またはキメラ分子を生成するために組換えDNA技術の技術を用いることができる。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域（CDR）をコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域へと導入することを含むことができる。例えば、欧州特許出願公開0 184 187 A、英国特許出願公開2,188,638 Aまたは欧州特許出願公開0 239 400 Aを参照されたい。抗体は、多数の方法で改変することができ、該用語は、必要とされる特異性を有する抗体の抗原結合性ドメインを有するいかなる特異的結合要素または物質にも及ぶとして解釈されるべきである。つまり、この用語は、天然であるかまたは完全にもしくは部分的に合成であるかにかかわらず、免疫グロブリン結合性ドメインを含むいずれかのポリペプチドをはじめとする、抗体フラグメントおよび誘導体に及ぶ。したがって、別のポリペプチドと融合された、免疫グロブリン結合性ドメインまたは等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、欧州特許出願公開0 120 694 Aおよび第0 125 023 Aに記載されている。
【００４０】
完全な抗体のフラグメントは、抗原に結合する機能を行なうことができることが示されている。結合性フラグメントの例は、(i) VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFabフラグメント；(ii) VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；(iii)単一の抗体のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント；(iv) VHドメインからなるdAbフラグメント（Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)）；(v)単離されたCDR領域；(vi) 2つの連結されたFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab’)2フラグメント；(vii) 2つのドメインが結合して抗原結合性部位を形成するのを可能にするペプチドリンカーによりVHドメインとVLドメインとが連結されている、一本鎖Fv分子（scFv）（Bird et al, Science, 242; 423-426, 1988；Huston et al, PNAS USA, 85: 5879-5883, 1988）；(viii)二特異的一本鎖Fv二量体（PCT/US92/09965）；および(ix)遺伝子融合により構築された多価または多特異的フラグメントである「ダイアボディ」（国際公開第94/13804号；Holliger et al, P.N.A.S. USA, 90: 6444-6448, 1993）である。Fv、scFvまたはダイアボディ分子は、VHドメインとVLドメインとを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化させることができる（Reiter et al, Nature Biotech, 14: 1239-1245, 1996）。CH3ドメインに連結されたscFvを含むミニボディもまた作製できる（Hu et al, Cancer Res., 56: 3055-3061, 1996）。
【００４１】
タンパク質またはペプチド製剤は、1種以上の活性成分に加えて、その保存寿命、体内でのその有効性および/またはその可溶性を増大させるための他の構成成分も含むことができる。これらの製薬上許容されるビヒクルは周知であり、当業者により適応させられるであろうし、また、タンパク質またはペプチド薬物に加えて、当業者に周知の製薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤または他の物質を含む。皮下注入により投与される製剤に関して、これらの追加の構成成分は、製剤のpH、等張性および/または安定性を制御するために含めることができ、塩化ナトリウム注、リンゲル注、乳酸加リンゲル注などの等張性ビヒクルを含むことができ、保存料、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および/または他の添加剤を必要に応じて用いることができ、以下のものが挙げられる：緩衝剤（リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸など）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンなど）；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3’-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなど）；単糖、二糖および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（EDTAなど）；糖（スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなど）；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および/または非イオン性界面活性剤（TWEENTM、PLURONICSTMなど）またはポリエチレングリコール（PEG）。製剤中で、典型的なタンパク質またはペプチド用量は、全身投与に対して100μg〜1g、局所投与に対して1μg〜1mgであろう。最初に比較的高い投入用量と、それに続く1回以上のより低い用量が投与される場合がある。典型的には、抗体は、完全抗体、例えばIgG1またはIgG4アイソタイプであろう。本発明の方法では、そのような構成成分の種類および量は様々であり得、投与時の、製剤、特に治療用タンパク質またはペプチドの挙動に対するその影響を決定するために、変動の影響を試験することができる。本発明を用いて、製剤中の、かつ/または投与プロセス中の活性成分の損失を最小限にするために最適化された構成成分または条件を見出すために、ポリペプチド、ペプチドまたは抗体薬物製剤の様々な物理的および化学的分解経路の影響を研究することができる。
【実施例】
【００４２】
実施例1：
一般的説明
皮下（SC）注入後の生物医薬の安定性をモニタリングするために設計されたシステムを、図1および図2に模式的に示す。該システムは、皮下組織の拡散特性をシミュレーションするために改変された膜透過性を有し、真皮の細胞外空間で一般的に見出される構成成分で満たされたメンブレンカセット1、注入部位のpHをモニタリングするためのpHプローブ2、カセット内の物質の光学密度をモニタリングするための分光光度計3、身体の無限シンクとして機能し、間質液中に見出されるものに類似した塩および緩衝系を含む、大型ビーカー4から構成される人工皮下注入部位からなる。さらに、該システムは、30〜37℃の生理的温度でシステムの温度を維持するための加温パッド5および熱電対6、ならびに熱を均一に分布させることを助け、かつ皮下組織で生じる対流を模倣するためのマグネチックスターラー7およびスタラーバー（図示せず）を備える。限定するものではないがラマンプローブ8などの他の機器もまた、注入後のタンパク質またはペプチドのコンホメーション変化を詳細にモニタリングするために、注入部位に挿入することができる。拡散に基づくシステムとは異なり、このことは、チャンバー内部、ならびに外部シンクで測定を行なうことを可能にする。
【００４３】
メンブレンカセット1の構成の例を、図3に示す。スペーサー11により隔てられた、例えばシリコーンにより形成されている、それを介して物質をメンブレンカセットに導入することができるスペーサーおよび差込口として機能する隔壁10の両側で、メンブレンカセット1に、2枚の改変型透析膜9を取り付け、カセットの2つの部分12aおよび12bを係止ピン13を用いて所定の位置に係止して、チャンバーとする。隔壁10は、隔壁を通る注射針形式で、かつ/またはメンブレンカセット中に備えられた1つ以上の差込口を介して、（例えば、メンブレンが放射に対して透明である場合に）、メンブレンを通ってカセットに好都合にアクセスできる1つ以上のプローブを用いてメンブレンカセットの内容物をモニタリングすることを可能にする。
【００４４】
緩衝溶液
システム中の無限シンクとして用いられ、注入部位での条件をシミュレーションするための緩衝溶液は、米国特許出願公開第2003/0077655号に記載されている通り、6.4gのNaCl、0.09gのMgCl2（六水和物）、0.4gのKCl、0.2gのCaCl2（二水和物）および2.1gのNa2HCO3を1リットルの脱イオン水に溶解させることにより調製した。すべての試薬を、Sigma Aldrich社から購入した。緩衝液の使用に際して、緩衝液を通してCO2ガスを通気することにより、溶液のpHを7.35〜7.4に調整し、かつ維持した。人工注入部位内の静水圧は、カセット上の緩衝液の体積、つまり高さを増加させることにより調整することができる。
【００４５】
メンブレン
例として、システムで用いるメンブレンは、分子量カットオフ径14000Daを有するBiodesing透析チューブであった。チューブの3cm片を切断し、端を除去して、2枚のメンブレンを形成させた。互いに分離されていないメンブレンのこれらのシートを、脱イオン水に浸漬させることによって完全に水化し、続いてアルミホイルで覆ったスタイロフォーム（Styrofoam）上に置いた。次に、ダーマローラー（Dermaroller）極微針デバイスを用いて、膜透過性を改変した。用いるメンブレンは、透明であり得る。元の透過特性は、おそらく、対象となるタンパク質/ペプチドの分子量の約30倍を超えるべきではなく、例えば、メチレンブルー（MW約350Da）に関して、二相拡散（まず穿孔を介して、および短い遅延時間（ラグタイム）後にもメンブレン自体を介した迅速な拡散）が、14000MWCOのカットオフを有する改変型メンブレンを通して見られた。対照的に、ローダミン（MW約500Da）に関して、同じメンブレンを介した拡散は一相で生じた。穴は、ダーマローラー（Dermaroller）を用いて、または用途に好適な穴のサイズおよび空間的分布をつくり出すいずれかの他の方法を用いて生成することができる。穴の直径は、0.1〜10マイクロメートルであるべきであり、2つの隣接する穴の間隔は0.1〜10mmであるべきである。
【００４６】
例として（図4）、一連の蛍光有機小分子（メチレンブルーおよびローダミン）ならびに4kDa〜2MDaの分子量を有する蛍光標識されたデキストランに関して、改変後のメンブレンを通した拡散の速度定数（k、[分-1]）は、k＝−0.01362 log10（化合物のMW）＋0.06065に従った（R2＝0.9996）。
【００４７】
改変型メンブレンを保持するために、Slide-a-lyzer透析カセット（Thermo Scientific社）を分解して、カセットの元のメンブレンを除去した。改変型メンブレンを用いてカセットを再組立てする目的で、カセットの面のそれぞれの中央で、2つのプラスチック片によって、15mm径のねじ穴を穿設した（図3を参照されたい）。カセットはまた、針状pHプローブ（直径1.8mm）のために穿設された穴、ならびに限定するものではないが試料を注入することおよびカセットへのラマンプローブおよび/または圧力変換器を挿入することをはじめとする目的のための、皮下注射針用の他の穴も有した。図3に示される通り、改変型メンブレンを、隔壁のそれぞれの面に配置した。任意により、小型のマグネチックスターラーバー（2mm×2mm×2mm）もまた、メンブレン同士の間（カセットチャンバー内）に配置することができる。pHプローブを、隔壁およびプラスチックフレームに穿設された穴を通してメンブレンの間に配置した。続いて、システムを、ねじを用いて締めた。
【００４８】
カセットを、限定するものではないがヒアルロン酸などの細胞外マトリックス構成成分で満たした。Sigma-Aldrich社から購入したストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）由来のヒアルロン酸ナトリウム塩を、5mg/mLの濃度で緩衝溶液中に溶解させた。細胞外マトリックス構成成分で満たされたカセットを、次に緩衝液の無限シンクに入れ、カセット内部のpHをモニタリングして、平衡に到達させた。平衡が達成されたら、試料を人工注入部位に注入した。
【００４９】
注入後に、注入部位の光学密度およびpHをモニタリングした。これらのin situ測定に加えて、無限シンク中の緩衝液のアリコートを取得して分析し、製剤の種々の構成成分の拡散をモニタリングすることができる。
【００５０】
実施例2：レベミル製剤のシミュレーションされたバイオアベイラビリティ
レベミル（Levemir）（Novo Nordisk社）は、ペプチド骨格に結合したミリスチン酸側鎖を有するインスリンアナログであるインスリンデテミルに対する商品名である。この分子は、血清中で側鎖を介してアルブミンに98％結合することが知られている。カセットに0.5mLの製剤を注入し、様々な時点で緩衝液浴から試料を取得して、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて米国特許第6,620,780号（米国特許出願第09/861687号）の通りにアリコート中のデテミル含有量を測定することにより、本発明を用いてレベミル製剤のシミュレーションされたバイオアベイラビリティを試験した。実験の結果を、図6に示す。緩衝液浴の生理的緩衝液のみを含有するカセットに製剤を注入した場合、製剤は100％バイオアベイラブルでありことが見出された。ヒアルロン酸（HA、ストレプトコッカス・エクイイ（Streptococcus equii）由来のナトリウム塩、Sigma Aldrich社）溶液（5mg/mL）をカセットへと添加すると、製剤のシミュレーションされたバイオアベイラビリティは約40％まで低下した。ウシ血清アルブミン（Sigma Aldrich社）およびブタ血清アルブミン（Sigma Aldrich社）をHA溶液に10mg/mLで添加すると、レベミル製剤のシミュレーションされたバイオアベイラビリティはさらに若干低下した。図8は、カセット中に緩衝液のみを用いた実験の経過にわたって、およびカセット中に添加されたHAを用いた実験に関して、カセット内の％TおよびpH変化により測定した場合のタンパク質可溶性のin situ測定の結果を示す。各プロットは、3回の反復実験からの平均を表わす。カセット中のHAと比較した、カセット中に緩衝液のみを用いた製剤のシミュレーションされたバイオアベイラビリティの大きな差異（100％ vs. 約40％）にもかかわらず、製剤が注入部位内での沈殿の形で不安定性を示さないことが、データにより実証される。
【００５１】
実施例3：カセットへの注入後のジェネリックインスリン製剤のタンパク質安定性およびpH時間プロフィールのin situ測定
ジェネリック500IU/mLインスリン製剤は、18.2mg/mLのヒト組換えインスリン（Sigma Aldrich社）、2.5mg/mLのm-クレゾール（Sigma Aldrich社）、16mg/mLのグリセロールおよび0.085mg/mLの酸化亜鉛（Sigma Aldrich社）を0.05M酢酸ナトリウム（Sigma Aldrich社）緩衝液に溶解させることにより調製し、HClおよびNaOHを、製剤pHを3.5に調整するために用いた。
【００５２】
0.5mLのジェネリックインスリン製剤を、生理的緩衝溶液を満たした本発明のカセットに注入し、pHおよびタンパク質可溶性（この場合は350nmでの％Tにより測定される）をin situでモニタリングした。これらのデータは、注入時（時間＝0分）にカセット内のpHは製剤のpH値（約3.5）に近い値まで低下したことを示す。注入の少し後には、タンパク質可溶性レベルは、％Tの低下により示される通りに低下した。カセット内の環境が周囲の生理的条件で平衡化され、かつpHが7.4に向かってシフトすると、％Tレベルの増大により示される通りにタンパク質が再び可溶化した。注入部位からの賦形剤であるm-クレゾールの放出プロフィールは、“Biodegradation characterisation and kinetics of m-cresol by Lysinibacillus cresolivorans”（Water SA (Online) vol.37 no.1 Pretoria Jan. 2011）に詳述されている方法に従って、HPLCにより、種々の時点で周囲の緩衝液浴から採取したアリコートから決定された。図7に示されるこれらのデータは、注入された製剤内に含有されるすべての賦形剤が、50分未満では注入部位に留まっていることを実証する。
【００５３】
本明細書中で言及されるすべての文書は、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる。
【図１】
0006325548.tif 000002
【図２】
0006325548.tif 000003
【図３】
0006325548.tif 000004
【図４】
0006325548.tif 000005
【図５】
0006325548.tif 000006
【図６】
0006325548.tif 000007
【図７】
0006325548.tif 000008
【図８】
0006325548.tif 000009