(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）１個または複数のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメインと；
（ｂ）前記１個または複数のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメインと作動可能に連結し、かつこれに対してＣ末端に位置するＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドノブドメインであって、請求項１に記載のポリペプチドを含むＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドノブドメインと；
（ｃ）前記１個または複数のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメインと作動可能に連結し、かつこれに対してＮ末端に位置する１個または複数の非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインと
を含む、組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項３】
ＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドテールドメインを含まない、請求項２に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項４】
各シャフトドメインがＡｄ３ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ７ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ１１ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ１４ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ１４ａファイバーポリペプチドシャフトドメイン、これらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２または３に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項５】
前記１個または複数のシャフトドメインが１〜２２個のシャフトドメインを含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項６】
各シャフトドメインが、配列番号１２：
【化６】
0006290221.tif 000013
または配列番号１３：
【化７】
0006290221.tif 000014
によるアミノ酸配列を含む、請求項２から５のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項７】
各シャフトドメインが配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項８】
前記二量体形成ドメインがEVSALEK（配列番号２４）および／またはKVSALKE（配列番号２５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２から７のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項９】
各々Ａｄ３シャフトドメインを含む１個または複数のシャフトドメインを含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項１０】
【化８】
0006290221.tif 000015
のアミノ酸配列を含む、請求項２から９のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項１１】
単一ＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメインを含む、請求項２から１０のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項１２】
ホモ三量体である、請求項２から１１のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項１３】
二量体化されている、請求項２から１１のいずれか一項に記載のホモ三量体である組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項１４】
組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドと抱合した１種または複数の化合物をさらに含む、請求項２から１３のいずれか一項に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項１５】
前記１種または複数の化合物が療法剤、診断剤およびイメージング剤からなる群から選択される、請求項１４に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項１６】
前記１種または複数の化合物が少なくとも１種の療法剤を含み、前記療法剤が抗体、免疫複合体、ナノ粒子、化学療法薬、放射性粒子、ウイルス、ワクチン、細胞免疫療法療法剤、遺伝子療法構築物、核酸療法剤、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の単離ペプチドまたは組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の単離核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）請求項１２から１６のいずれか一項に記載のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と；
（ｂ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物。
【請求項２１】
上皮組織に関連する障害の治療的処置もしくは診断を強化する、および／または上皮組織を画像化するために使用する組成物であって、
（ａ）前記障害を治療するのに十分な量の１種または複数の療法剤、前記障害を診断するのに十分な量の診断剤、および／または前記上皮組織を画像化するのに十分な量のイメージング剤と；
（ｂ）１種または複数の療法剤、診断剤および／またはイメージング剤の有効性を強化するのに十分な量の請求項１２から１６のいずれか一項に記載のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体または請求項２０に記載の医薬組成物と
を含み、それを必要とする対象に投与するための組成物。
【請求項２２】
上皮組織に関連する前記障害が固形腫瘍、過敏性腸症候群、炎症性腸障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、便秘、胃食道逆流症、バレット食道、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、肺炎、原発性肺高血圧、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核、膵炎、膵管障害、胆管障害、胆管閉塞、胆嚢炎、総胆管結石、脳障害、乾癬、皮膚炎、糸球体腎炎、肝炎、糖尿病、甲状腺障害、蜂窩織炎、感染症、腎盂腎炎および胆石からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
上皮組織に関連する前記障害が固形腫瘍である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記固形腫瘍が乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、皮膚腫瘍、内分泌腫瘍、子宮頸部腫瘍、腎腫瘍、メラノーマ、膵腫瘍、肝腫瘍、脳腫瘍、頭頸部腫瘍、上咽頭腫瘍、胃腫瘍、扁平細胞癌、腺癌、膀胱腫瘍および食道腫瘍からなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体がＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３  １２面体粒子（ＰｔＤｄ）、および組換えＡｄＢ−２／３ファイバー多量体からなる群から選択される、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
１種または複数の化合物が少なくとも１種の療法剤を含み、前記療法剤が抗体、免疫複合体、ナノ粒子、化学療法薬、放射性粒子、ウイルス、ワクチン、細胞免疫療法療法剤、遺伝子療法構築物、核酸療法剤、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記療法剤が化学療法薬またはモノクローナル抗体を含む、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記療法剤が抗腫瘍モノクローナル抗体を含む、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗腫瘍モノクローナル抗体がトラスツズマブ、セツキシマブ、ペツズマブ、アポマブ、コナツムマブ、レキサツムマブ、ベバシズマブ、ベバシズマブ、デノスマブ、ザノリムマブ、リンツズマブ、エドレコロマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、ミツモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、オレゴボマブ、ペムツモマブダクリズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、オファツムマブおよびイブリツモマブからなる群から選択される抗体を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
上皮組織に関連する前記障害がＨｅｒ２陽性腫瘍を含む、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記Ｈｅｒ２陽性腫瘍が乳房腫瘍、胃腫瘍、結腸腫瘍および卵巣腫瘍からなる群から選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記療法剤がトラスツズマブを含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記療法剤が化学療法薬、放射線またはこれらの組み合わせを含む、請求項２１から３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記対象がトラスツズマブ療法に反応しなかった、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
上皮組織に関連する前記障害がＥＧＦＲ陽性腫瘍を含む、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＥＧＦＲ陽性腫瘍が肺腫瘍、結腸腫瘍、乳房腫瘍、直腸腫瘍、頭頸部腫瘍および膵腫瘍からなる群から選択される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記療法剤がセツキシマブを含む、請求項３５または３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記療法剤がＶＥＧＦ阻害剤を含む、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の方組成物。
【請求項３９】
前記療法剤が化学療法薬、放射線またはこれらの組み合わせを含む、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記対象がセツキシマブ療法に反応しなかった、請求項３５から３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
上皮組織に関連する障害を治療するために使用する組成物であって、前記障害を治療するのに十分な量の請求項１２から１６のいずれか一項に記載のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体または請求項２０に記載の医薬組成物を含み、それを必要とする対象に投与するための組成物。
【請求項４２】
前記障害がＡｄＢ−２／３ウイルス感染症または固形腫瘍である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記障害が固形腫瘍であり、前記固形腫瘍が乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、皮膚腫瘍、内分泌腫瘍、子宮頸部腫瘍、腎腫瘍、メラノーマ、膵腫瘍、肝腫瘍、脳腫瘍、頭頸部腫瘍、上咽頭腫瘍、胃腫瘍、扁平細胞癌、腺癌、膀胱腫瘍および食道腫瘍からなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
上皮組織への化合物の送達を改善するために使用する組成物であって、前記上皮組織を、
（ａ）前記上皮組織に送達される１種または複数の化合物と；
（ｂ）前記上皮組織への前記１種または複数の化合物の送達を強化するのに十分な量の請求項１２から１６のいずれか一項に記載のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体または請求項２０に記載の医薬組成物と
を含む組成物。
【請求項４５】
前記１種または複数の化合物が診断剤またはイメージング剤を含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記上皮組織が固形腫瘍を含む、請求項４４または４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記固形腫瘍が乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、皮膚腫瘍、内分泌腫瘍、子宮頸部腫瘍、腎腫瘍、メラノーマ、膵腫瘍、肝腫瘍、脳腫瘍、頭頸部腫瘍、上咽頭腫瘍、胃腫瘍、扁平細胞癌、腺癌、膀胱腫瘍および食道腫瘍からなる群から選択される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４８】
デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を発現している組織への物質の送達を改善するために使用する組成物であって、
（ａ）前記組織に送達される１種または複数の化合物と；
（ｂ）前記組織への前記１種または複数の化合物の送達を強化するのに十分な量の請求項１２から１６のいずれか一項に記載のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体または請求項２０に記載の医薬組成物と
を含む組成物。
【請求項４９】
前記ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体がＡｄ３ファイバー多量体、Ａｄ７ファイバー多量体、Ａｄ１１ファイバー多量体、Ａｄ１４ファイバー多量体、Ａｄ１４ａファイバー多量体、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１から４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
上皮組織に関連する障害の治療、物質の上皮組織への送達の改善、物質のＤＳＧ２を発現している組織への送達の改善、組織中のＥＭＴの誘導、および／またはＡｄＢ−２／３感染症の治療の１つまたは複数のための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）請求項１２から１６のいずれか一項に記載のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を、多量体のＤＳＧ２への結合を促進する条件下でＤＳＧ２に接触させるステップであって、前記接触が１種または複数の試験化合物の存在下で行われるステップと；
（ｂ）対照と比べてＤＳＧ２への結合について前記ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と競合する陽性試験化合物を同定するステップと；
を含み、前記陽性試験化合物が上皮組織に関連する障害の治療、物質の上皮組織への送達の改善、物質のＤＳＧ２を発現している組織への送達の改善、組織中のＥＭＴの誘導、および／またはＡｄＢ−２／３感染症の治療の１つまたは複数のための候補化合物である方法。
【請求項５１】
上皮組織に関連する障害を治療するのに十分な量の１種または複数の療法剤、上皮組織に関連する障害を診断するのに十分な量の診断剤、および／または上皮組織を画像化するのに十分な量のイメージング剤をさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年９月２５日出願の米国仮特許出願第６１／７０５５２３号の利益を主張するものである。
【０００２】
政府権利の陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与される、Ｒ０１  ＣＡ０８０１９２およびＲＯ１  ＨＬＡ０７８８３６の下で米国政府支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトアデノウイルス（Ａｄ）は、現在５１種の血清型を含む、６種（Ａ〜Ｆ）に分類されている。ほとんどのＡｄ血清型は、主な付着受容体としてコクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を利用する（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ等、１９９７）。しかしながら、これはＢ種のＡｄ血清型には当てはまらない。近年、本発明者らは、その受容体用途に基づいてＢ種のＡｄの新たなグループ分けを示唆した（Ｔｕｖｅ等、２００６）。１グループ（Ａｄ１６、２１、３５、５０）は受容体としてＣＤ４６をほとんど独占的に利用し；２グループ（Ａｄ３、Ａｄ７、１４）は、ＣＤ４６ではなく、受容体Ｘと仮に命名された共通の同定されていない受容体を共有し；３グループ（Ａｄ１１）は、ＣＤ４６と優先的に相互作用するが、ＣＤ４６が遮断されている場合には受容体Ｘも利用する。
【０００４】
Ｂ種のＡｄは一般的なヒト病原体である。２００５年から、米国軍事訓練施設の大部分で多様なＢ種血清型の同時発生が観察された。これには血清型Ａｄ３、Ａｄ７およびＡｄ１４が含まれていた（Ｍｅｔｚｇａｒ等、２００７）。２００７年には、Ａｄ１４、Ａｄ１４ａの新しい高病原株およびおそらくはより毒性株が、米国およびアジアのいくつかの場所で発見された（Ｌｏｕｉｅ等、２００８；Ｔａｔｅ等、２００９）。本発明者らは、近年、Ａｄ１４ａがその受容体用途に関してＢ種の２グループに属することを証明した（Ｗａｎｇ等、２００９）。まとめて、全ての受容体Ｘ利用血清型（Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１４、Ａｄ１４ａおよびＡｄ１１）を本明細書においてＡｄＢ−２／３と呼ぶ。
【０００５】
ＡｄＢ−２／３は、特にほとんどの固形腫瘍を表す上皮由来の腫瘍に関して、遺伝子導入ベクターとして大きな関連性を有する（ＹａｍａｍｏｔｏおよびＣｕｒｉｅｌ、２０１０）。上皮細胞は、いくつかの細胞間結合および頂端−基底極性を維持している。上皮細胞の重要な特徴は、インサイツで上皮がんにおいておよびがん細胞系において保存されている（Ｔｕｒｌｅｙ等、２００８）。ＣＡＲとＣＤ４６の両者は通常、上皮がん細胞の密着結合および接着結合に捕捉され、これらの付着受容体を使用するＡｄに接近できない（ＣｏｙｎｅおよびＢｅｒｇｅｌｓｏｎ、２００５；Ｓｔｒａｕｓｓ等、２００９）。対照的に、ＡｄＢ−２／３は上皮がん細胞に効率的に感染し、これは、一部は上皮間葉転換（ＥＭＴ）を暗示するプロセスの誘導を通して達成される（Ｓｔｒａｕｓｓ等、２００９）。ＡｄＢ−２／３の別の特有の特徴は、その複製中にＡｄファイバーおよびペントンベースからなるサブウイルス１２面体粒子を産生する能力である（Ｎｏｒｒｂｙ等、１９６７）。ペントン−１２面体（ＰｔＤｄ）は、全長ペントンベースタンパク質から会合することができず、残基３７と３８との間のタンパク質分解による自発的Ｎ末端切断を要する（Ｆｕｓｃｈｉｏｔｔｉ等、２００６）。この切断部位は、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１およびＡｄ１４で保存されているが、Ａｄ２およびＡｄ５には存在しない。Ａｄ３の場合、ＰｔＤｄが１感染性ウイルス当たり大過剰の５．５×１０６個のＰｔＤｄで形成され（Ｆｅｎｄｅｒ等、２００５）、ＰｔＤｄが細胞間結合を妨害することによってＡｄ３感染性を強化し、したがってウイルス伝播を支持することが示唆されている（Ｗａｌｔｅｒｓ等、２００２）。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、配列番号１〜１１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、
（ａ）１個または複数のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、またはその機能的同等物と；
（ｂ）１個または複数のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメインと作動可能に連結し、かつこれに対してＣ末端に位置するＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドノブドメインであって、任意の配列番号１〜１１のポリペプチドを含むＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドノブドメインと；
（ｃ）１個または複数のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメインと作動可能に連結し、かつこれに対してＮ末端に位置する１個または複数の非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインと
を含む、組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドを提供する。一実施形態では、ＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドがＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドテールドメインを含まない。別の実施形態では、各シャフトドメインが、Ａｄ３ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ７ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ１１ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ１４ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、Ａｄ１４ａファイバーポリペプチドシャフトドメイン、これらの組み合わせ、およびこれらの機能的同等物からなる群から選択される。さらなる実施形態では、各シャフトドメインが配列番号１２〜１８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその組み合わせを含む。別の実施形態では、二量体形成ドメインが配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドが、配列番号２８〜３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはこれらからなる。別の実施形態では、ＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドが多量体化、例えば、二量体化されている。さらなる実施形態では、ＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドが、組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドに抱合した１種または複数の化合物、例えば、療法剤、診断剤およびイメージング剤をさらに含む。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の単離ペプチドまたは組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドをコードする単離核酸、単離核酸を含む組換え発現ベクター、および組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、
（ａ）本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と；
薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
なおさらなる態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害の治療的処置もしくは診断を強化する、および／または上皮組織を画像化する方法であって、
（ａ）障害を治療するのに十分な量の１種または複数の療法剤、障害を診断するのに十分な量の診断剤、および／または上皮組織を画像化するのに十分な量のイメージング剤と；
（ｂ）１種または複数の療法剤、診断剤および／またはイメージング剤の有効性を強化するのに十分な量の本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体または医薬組成物と
を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。上皮組織に関連する代表的なこのような障害には、固形腫瘍、過敏性腸症候群、炎症性腸障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、便秘、胃食道逆流症、バレット食道、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、肺炎、原発性肺高血圧、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核、膵炎、膵管障害、胆管閉塞、胆嚢炎、総胆管結石、脳障害、乾癬、皮膚炎、糸球体腎炎、肝炎、糖尿病、甲状腺障害、蜂窩織炎、感染症、腎盂腎炎および胆石が含まれる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害を治療する方法であって、障害を治療するのに十分な量の本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。代表的な実施形態では、このような障害がウイルス感染症または固形腫瘍であり得る。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、上皮組織への化合物の送達を改善する方法であって、上皮組織を、
（ａ）上皮組織に送達される１種または複数の化合物と；
（ｂ）上皮組織への１種または複数の化合物の送達を強化するのに十分な量の本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体または医薬組成物と
接触させるステップを含む方法を提供する。代表的な実施形態では、１種または複数の化合物が診断剤またはイメージング剤であり得る。
【００１２】
なおさらなる態様では、本発明は、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を発現している組織への物質の送達を改善する方法であって、ＤＳＧ２を発現している組織を
（ａ）組織に送達される１種または複数の化合物と；
（ｂ）組織への１種または複数の化合物の送達を強化するのに十分な量の本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体または医薬組成物と
接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、組織中の上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導する方法であって、上皮組織を、ＥＭＴを誘導するのに十分な量の本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体または医薬組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害の治療、物質の上皮組織への送達の改善、物質のＤＳＧ２を発現している組織への送達の改善、組織中のＥＭＴの誘導、および／またはＡｄＢ−２／３感染症の治療の１つまたは複数のための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を、多量体のＤＳＧ２への結合を促進する条件下でＤＳＧ２に接触させるステップであって、接触が１種または複数の試験化合物の存在下で行われるステップと；
（ｂ）対照と比べてＤＳＧ２への結合についてＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と競合する陽性試験化合物を同定するステップと；
を含み、
陽性試験化合物が上皮組織に関連する障害の治療、物質の上皮組織への送達の改善、物質のＤＳＧ２を発現している組織への送達の改善、組織中のＥＭＴの誘導、および／またはＡｄＢ−２／３感染症の治療の１つまたは複数のための候補化合物である方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＤＳＧ２への結合に決定的に関与することが分かった残基を示す図である。Ａ）Ａｄ３およびＡｄ１４ｐ１ファイバーノブのアミノ酸配列が示されている。Ａｄ３ノブ（ＰＤＢ寄託番号１Ｈ７Ｚ＿Ａ）およびＡｄ１４ノブ（ＰＤＢ：３Ｆ０Ｙ＿Ａ）中に存在するβシートは線によって示される。黒色矢印は、個々に変異した場合に、ＤＳＧ２への結合を切断するまたは減少させる、Ａｄ３ファイバーノブ中の残基を示す。親株Ａｄ１４（ｄｅＷｉｔ）と比べて、Ａｄ１４ｐ１は、三角形によって示されるファイバータンパク質ノブ（２４）のＦＧループ中の２個のアミノ酸残基の欠失を有していた。
【図１−２】ＤＳＧ２への結合に決定的に関与することが分かった残基を示す図である。Ｂ）二量体Ａｄ３ファイバーノブ変異体の概略構造。ファイバーノブドメインおよび１個のシャフトモチーフを、可動性リンカーを通してホモ二量体化Ｋコイルドメイン（４１）と融合した。タンパク質は自己二量体化しており、Ｈｉｓ−Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。Ｃ〜Ｆ）二量体Ａｄ３ファイバーノブ変異体と可溶性ＤＳＧ２の結合の分析。ＣおよびＤ）クーマシー染色。１レーン当たり１０μｇの精製Ａｄ３ファイバーノブ（非煮沸）をロードした。ファイバーノブの三量体型が矢印で示されている。ゲルはＳＤＳおよびＤＴＴを含むローディングバッファを含有しており、これにより以前報告されているように（４１）三量体ファイバーノブの二量体の分解が引き起こされた。ＥおよびＦ）：プローブとしての可溶性組換えＤＳＧ２、引き続いて抗ＤＳＧ２−ｍＡｂおよび抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いたウエスタンブロット。比較のために、ＪＯ−１（０．５μｇ／レーン）が示されている。ウエスタンブロットをスキャンし、シグナルを定量化した。
【図２】Ａｄ３ファイバーノブの３Ｄモデルを示す図である。構造は、ＰＤＢ寄託番号１Ｈ７Ｚ＿Ａに基づく。上部パネル：ＤＳＧ２結合に関与する４つの重要部位。重要残基が三量体ファイバーノブの等値面上に示されている。受容体に面する上部（頂端側）から眺める。下部パネル：合わせられた全ての重要残基。右側：わずかな横回転後の溝の拡大。
【図３Ａ】二量体化Ａｄ３ノブ変異体によるＡｄ３ウイルスの競合を示す図である。Ａ）二量体ファイバーノブ変異体の存在下での３Ｈ標識Ａｄ３ウイルスの相対的付着。１．８×１０５個のＨｅＬａ細胞を氷上で１時間、２．５および１００μｇ／ｍｌの濃度でＡｄ３ノブ変異体とインキュベートした。次いで、４００ｐｆｕ／細胞の３Ｈ−Ａｄ３ウイルスをさらに１時間氷上に添加した。未結合ウイルス粒子を洗い流した。ＰＢＳとインキュベートしたウイルス粒子の付着を１００％とみなした。Ｎ＝３。
【図３Ｂ】二量体化Ａｄ３ノブ変異体によるＡｄ３ウイルスの競合を示す図である。Ｂ）ＨｅＬａ細胞へのＡｄ３−ＧＦＰウイルス感染の競合。１．５×１０５個のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。細胞を、増加する濃度のＡｄ３ノブ変異体と室温で１時間インキュベートした。次いで、１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ３−ＧＦＰウイルスを添加し、１８時間後にフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現を分析した。左パネル：ＧＦＰ陽性細胞の割合。右パネル：平均蛍光強度。Ｎ＝３。標準偏差は１０％未満であった。
【図３−３】二量体化Ａｄ３ノブ変異体によるＡｄ３ウイルスの競合を示す図である。Ｃ）複数変異を有する二量体ファイバーノブ変異体の存在下での３Ｈ標識Ａｄ３ウイルスの相対的付着。Ｂ）に記載されるように試験を行った。標準偏差は１０％未満であった。Ｄ）ＨｅＬａ細胞へのＡｄ３−ＧＦＰウイルス感染の競合。Ｃ）に記載されるように試験を行った。標準偏差は１０％未満であった。
【図４】可溶性ＣＤ４６へのＡｄ３ファイバーノブの結合の分析を示す図である。異なる数のシャフトモチーフを含むＡｄ３ファイバーノブおよび野生型Ａｄ３ファイバーノブ（１レーン：Ａｄ３−Ｓ６／Ｋｎ、２レーン：Ａｄ３−Ｓ５／Ｋｎ、３レーン：Ａｄ３−Ｓ４／Ｋｎ、４レーン：Ａｄ３−Ｓ３／Ｋｎ、５レーン：Ａｄ３−Ｓ２／Ｋｎ、６レーン：Ａｄ３−Ｓ／Ｋｎ）、ＪＯ−１（７レーン）およびＣＤ４６結合Ａｄ３５ファイバーノブ（８レーン）をブロットし、可溶性ＤＳＧ２（上部パネル）または可溶性ＣＤ４６（下部パネル）とハイブリダイズした。抗ＤＳＧ２  ｍＡｂまたは抗ＣＤ４６  ｍＡｂによって結合を検出した。
【図５】減少したＤＳＧ２結合と上皮結合を開く能力の相関を示す図である。Ａ）分極結腸がんＴ８４細胞で測定される経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）。ＴＥＥＲが一定になるまで、すなわち、密着結合が形成するまで、細胞をトランスウェルチャンバーで培養した。次いで、ＰＢＳ中合計５μｇの二量体Ａｄ３ファイバーノブを１時間頂端チャンバーに添加した。ＴＥＥＲを指示される時点で測定した。Ｎ＝６。１．５および４時間の時点については、ＪＯ−１対Ｄ２６１およびＮ１８６Ｄの間の差異が有意であった（ｐ＜０．０１）。矢印は、Ａｄ３ファイバーノブの付加および除去を示している。Ｂ）イリノテカン療法の強化。合計４×１０６個のＡ５４９細胞をＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに皮下注射した。いったん腫瘍が約１００ｍｍ３の体積に達したら（移植後１５日目）、マウスに２ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１、Ｅ２９９Ｖ、Ｎ１８６ＤまたはＰＢＳを静脈内注射し、引き続いて１時間後にイリノテカン（３７．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。処理を２５日目に繰り返した。Ｎ＝５。「イリノテカン」対「Ｅ２９９Ｖ＋イリノテカン」群の差異または「イリノテカン」対「Ｎ１８６＋イリノテカン」群の差異は有意ではなかった。「イリノテカン」対「ＪＯ−１＋イリノテカン」群の差異は２０日目から有意であった（ｐ＜０．０１）。
【図６】ＤＳＧ２への結合を増加させるアミノ酸置換を示す図である。Ａ）Ａｄ３ファイバーノブのアミノ酸配列が示されている。βシートは線によって示されている。矢印は、変異した場合に、ＤＳＧ２への強い結合を示す、コロニーブロットアッセイにおける強いシグナルをもたらした、Ａｄ３ファイバーノブ中の残基を示している。Ｂ）３個のノブ単量体の等値面。左パネル：上面図；右パネル：側面図。Ｖ２３９およびＹ２５０は上部で露出しておらず、ＤＳＧ２への直接結合への関与よりもむしろノブの構造変化を示唆している。Ｃ）ＤＳＧ２への結合を強化する全ての変異の局在。残基は２個のノブ単量体中マゼンタで示されている。１個の単量体の等値面は灰色透明で示されている。
【図７Ａ】非二量体化Ａｄ３ファイバーノブとＤＳＧ２の相互作用のＳＰＲ分析を示す図である。Ａ）ＤＳＧ２をセンサーチップ上に固定し、背景を対照フローセルから自動的に減じた。Ａｄ３ファイバーノブ（ｗ／ｏ二量体形成ドメイン：「ｎｏＤＤ」）を２．５μｇ／ｍｌで３分間注射し、引き続いて２．５分の解離時間とした。
【図７Ｂ】非二量体化Ａｄ３ファイバーノブとＤＳＧ２の相互作用のＳＰＲ分析を示す図である。Ｂ）ＳＰＲデータの概要。２．５〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲のノブを注射し、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェアを用いて動態および親和性パラメータを評価した。抽出データの概要を表に与える。Ｗｔ＝変異を有さないＡｄ３ファイバーノブ。
【図８】Ａｄ３ファイバーノブ変異体ＪＯ−２の電子顕微鏡法および３Ｄ構造を示す図である。Ａ〜Ｃ）ＳＳＴを用いたＪＯ−２の陰性染色。二量体型が見られるが、高次組織化も目に見え、約５０ｍｍの不均一複合体が細矢印によって描かれ、小型の規則的な「１２面体様」粒子が太矢印によって描かれている。クローズアップ図がＢおよびＣに提示されている。Ｄ〜Ｇ）（Ｋ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓ変異体）の非二量体化型の結晶学的構造。Ｄ）タンパク質結晶。
【図８−２】Ａｄ３ファイバーノブ変異体ＪＯ−２の電子顕微鏡法および３Ｄ構造を示す図である。Ｄ〜Ｇ）（Ｋ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓ変異体）の非二量体化型の結晶学的構造。Ｅ）野生型Ａｄ３ノブが灰色で着色されており、ＥＦループ２１７〜２２４が別に着色されている。これは変異体では無秩序化するループである。変異体構造ではこれらの残基についての密度はない。Ｆ）変異体が漫画として示されている。Ｇ）これらの２つの構造の重ね合わせは、ＥＧループがＫ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓ変異体では完全に無秩序化していることを示している。底部パネルは１個の単量体のクローズアップ図を示している。Ｋ２１７およびＦ２２４が棒として現れる。
【図９Ａ】ＤＳＧ２に対する親和性が増加した二量体Ａｄ３ファイバーノブ変異体の分析を示す図である。Ａ）二量体親和性強化変異体Ｙ２５０ＦおよびＪＯ−１（二量体ｗｔ  Ａｄ３ファイバーノブ）によるＨｅＬａ細胞へのＡｄ３−ＧＦＰウイルス感染の競合。実験設定は図３Ｃについて記載される通りである。左パネル：ＧＦＰ陽性細胞の割合。右パネル：平均蛍光強度。Ｎ＝３。標準偏差は１０％未満であった。
【図９Ｂ】ＤＳＧ２に対する親和性が増加した二量体Ａｄ３ファイバーノブ変異体の分析を示す図である。Ｂ）ＤＳＧ２結合が強化されているが、二量体形成ドメインを有さないＡｄ３ノブ変異体によるＨｅＬａ細胞へのＡｄ３−ＧＦＰウイルス感染の競合。１．５×１０５個のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。細胞を、増加する濃度のＡｄ３ノブ変異体と室温で１時間インキュベートした。次いで、１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ３ＧＦＰウイルスを添加し、１８時間後にＧＦＰ発現を分析した。
【図９Ｃ】ＤＳＧ２に対する親和性が増加した二量体Ａｄ３ファイバーノブ変異体の分析を示す図である。Ｃ）結腸がんＴ８４細胞上のＴＥＥＲ。実験設定は図５Ａと同じであった。４時間でのＴＥＥＲが示されている。Ｎ＝３。
【図１０Ａ】親和性強化ＪＯ−１バージョンと化学療法の組み合わせを示す図である。Ａ）イリノテカン（Ｉ）療法の強化。実験設定は図５Ｂと同じであった。「ＪＯ−１＋Ｉ」対「ＪＯ−２＋イリノテカン」群の差異および「ＪＯ−２＋Ｉ」対「ＪＯ−４＋Ｉ」群の差異は２０日目から有意であった。Ｎ＝５。
【図１０Ｂ】親和性強化ＪＯ−１バージョンと化学療法の組み合わせを示す図である。Ｂ）ＪＯ−４はＪＯ−１よりも低用量で卵巣がんモデルにおいてＰＬＤ療法を強化する。乳房脂肪パッド腫瘍を原発性卵巣がんｏｖｃ３１６細胞から確立した。腫瘍が１００ｍｍ３の体積に達したら処理を開始した。マウスに２ｍｇ／ｋｇのＪＯ−１または０．５ｍｇ／ｋｇのＪＯ−４を静脈内注射し、引き続いて１時間後にペグ化リポソームドキソルビシン（ＰＬＤ）（１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。処理を毎週繰り返した。
【図１０Ｃ】親和性強化ＪＯ−１バージョンと化学療法の組み合わせを示す図である。Ｃ）ＪＯ−４は予後不良トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）における療法を強化する。合計４×１０６個のＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＢ１７  ＳＣＩＤ−ベージュマウスの乳房脂肪パッドに注射した。セツキシマブ（Ｃ）（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）およびｎａｂ−パクリタキセル（ｎａｂ−Ｐ）（５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）の施用１時間前にＪＯ−４（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。処理を毎週行った。Ｎ＝１０。ｎａｂ−Ｐ＋Ｃ対ＪＯ−４＋ｎａｂ−Ｐ＋Ｃについては２５日目でＰ＜０．０１。
【図１１Ａ】ＪＯ−４の薬物動態、毒性および免疫原性を示す図である。Ａ）ＪＯ−１およびＪＯ−４の血清クリアランス。皮下ＴＣ１−ｈＤＳＧ２腫瘍（約６００ｍｍ３）を有するｈＤＳＧ２トランスジェニックマウスに、ＪＯ−１またはＪＯ−４（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射し、血清試料をＥＬＩＳＡによって分析した。Ｎ＝３。ｙ軸が対数スケールを有することに留意されたい。
【図１１Ｂ】ＪＯ−４の薬物動態、毒性および免疫原性を示す図である。Ｂ）ＪＯ−１またはＪＯ−４注射後のｈＤＳＧ２／ＴＣ１−ｈＤＳＧ２トランスジェニックマウスにおけるリンパ球および血小板数。Ｎ＝３。
【図１１Ｃ】ＪＯ−４の薬物動態、毒性および免疫原性を示す図である。Ｃ）ＴＣ１−ｈＤＳＧ２腫瘍を有する免疫適格ｈＤＳＧ２トランスジェニックマウスにおける療法試験。腫瘍が約８０ｍｍ３の体積に達したら、ＪＯ−１もしくはＪＯ−４（２ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ、引き続いて１時間後にＰＬＤ／Ｄｏｘｉｌ（静脈内１．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。処理を矢印によって示されるように繰り返した。次いで、腫瘍を約２週間再成長させた。１５日目から、血清抗ＪＯ−１／ＪＯ−４抗体がＥＬＩＳＡによって検出可能であった。さらに２処理サイクルを２８日目および３５日目に行った。検出可能な抗体の存在下でさえ、ＪＯ−１およびＪＯ−４は複数処理サイクル後に有効であり続けた。ＪＯ−１／ＰＬＤ対ＪＯ−４／ＰＬＤの差異は３１日目から有意である。Ｎ＝１０。
【図１２】ファイバーノブ配列のアラインメントを示す図である。ＤＳＧ２へのＡｄ３ノブの結合を切断する／減少させる残基が示されている。
【図１３】ヒトおよび重接種マウスの血清は、ＪＯ−４の活性を阻害しないことを示す図である。Ａ）ＥＬＩＳＡによるＪＯ−４との結合についてのヒト血清の分析。Ａｄ３ファイバーノブに対するウサギポリクローナル抗体を捕捉のために使用し、引き続いて組換えＪＯ−１タンパク質、ヒト血清（１：２０〜１：１０００希釈）および抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを使用した。ＩｇＧが枯渇した市販のヒトＡｂ血清を陰性対照（水平線）として使用した。日常的にＡｄ３ウイルスを用いて仕事をしている科学者の血清を陽性対照として使用した。Ｐ１〜Ｐ３８は太平洋卵巣がん研究コンソーシアム（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）から得た卵巣がん患者についての血清試料である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
引用される全ての参考文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願中では、特に明示しない限り、利用される技術はいくつかの周知の参考文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編、１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、ＣＡ）、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ等、１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、ＣＡ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク、ＮＹ）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１０９〜１２８頁、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびＡｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）のいずれかに見出され得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、文脈上別段の意味を有することが明らかな場合を除き、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数指示対象を含む。明確に別段の指示がない限り、本明細書で使用される「および」は「または」と互換的に使用される。
【００１８】
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基は以下の通り省略される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「Ａｄ」という略語はアデノウイルスを指し、典型的にはアデノウイルスの血清型を示す数字を伴う。例えば、「Ａｄ３」はアデノウイルス血清型３を指す。
【００２０】
文脈上別段の意味を有することが明らかな場合を除き、本発明の任意の態様の全ての実施形態を組み合わせて使用することができる。
【００２１】
第１の態様では、本発明は、アミノ酸配列：
【化１】
0006290221.tif 000002
（Ｘ２はＨ、ＬまたはＰであり；
Ｘ３はＫまたはＥであり；
Ｘ４はＴ、Ｆ、ＳまたはＬであり；
Ｘ５はＶ、Ｄである、または存在せず；
Ｘ６はＥ、Ｇである、または存在せず；
Ｘ７はＹまたはＦであり；
Ｘ８はＴ、ＫまたはＥであり；かつ
Ｘ９はＮまたはＳであり；
以下の少なくとも１つが正しい：
Ｘ２はＰである；
Ｘ３はＥである；
Ｘ４はＳまたはＬである；
Ｘ５はＤである；
Ｘ６はＧである；
Ｘ７はＦである；
Ｘ８はＥである；または
Ｘ９はＳである）
を含む、または、からなる、単離ポリペプチドを提供する。
【００２２】
本発明のこの態様による単離ポリペプチドは、変異ＡｄＢ−２／３ノブドメインを含み、これを使用して、例えば、以前から知られているＤＳＧ２結合ポリペプチドと比べて有意に強化されたデスモグレイン２（ＤＳＧ２）に対する親和性を提供する組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドを産生することができる。以下の実施例に示されるように、本発明のこの第１の態様の変異ノブドメインを組み込む本発明の組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドは、一連のがんモデルにおける改善した有効性によって例証される、上皮関連障害を治療するための以前から知られているＤＳＧ２結合ポリペプチドよりも治療上強力であることがさらに示されている。本発明の単離ペプチドを、例えば、ＡｄＢ−２／３ウイルスに対する抗原として使用することもできる。
【００２３】
括弧内に示される残基は単一残基における選択肢を反映しており；ダッシュ（――）は残基が存在しなくてもよいことを示している。
【００２４】
一実施形態では、本発明の第１の態様の単離ポリペプチドが、アミノ酸配列
【化２】
0006290221.tif 000003
を含む、または、からなる。
【００２５】
別の実施形態では、本発明の第１の態様の単離ポリペプチドが、アミノ酸配列
【化３】
0006290221.tif 000004
を含む、または、からなる。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明の第１の態様の単離ポリペプチドが、アミノ酸配列
【化４】
0006290221.tif 000005
を含む、または、からなる。
【００２７】
これらの実施形態の全てで、以下の少なくとも１つが正しい：
Ｘ２はＰである；
Ｘ３はＥである；
Ｘ４はＳまたはＬである；
Ｘ５はＤである；
Ｘ６はＧである；
Ｘ７はＦである；
Ｘ８はＥである；または
Ｘ９はＳである。
【００２８】
種々の実施形態では、これらの記述の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つ全てが正しい。１つの代表的な実施形態では、少なくともＸ７がＦである。別の実施形態では、少なくともＸ３がＥであり、かつＸ４がＳである。別の実施形態では、少なくともＸ９がＳである。さらなる実施形態では、少なくともＸ５がＤである。別の実施形態では、少なくともＸ４がＬである。別の実施形態では、少なくともＸ２がＰであり、かつＸ８がＥである。別の実施形態では、少なくともＸ６がＧであり、かつＸ８がＥである。
【００２９】
種々のさらなる実施形態では、単離ポリペプチドが以下のペプチド：
【化５】
0006290221.tif 000006
の１つを含む、または、からなる。
【００３０】
第２の態様では、本発明は、
（ａ）１個または複数のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメイン、またはその機能的同等物と；
（ｂ）１個または複数のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメインと作動可能に連結し、かつこれに対してＣ末端に位置するＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドノブドメインであって、本発明の第１の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのポリペプチドを含むＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドノブドメインと；
（ｃ）１個または複数のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメインと作動可能に連結し、かつこれに対してＮ末端に位置する１個または複数の非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインと
を含む、組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドを提供する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ＡｄＢ−２／３」は、ウイルス結合のための上皮細胞受容体としてＤＳＧ２を使用する任意のアデノウイルス血清型である。現在までに、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４およびＡｄ１４ａ血清型が同定されている。他のＡｄ血清型が同定されているので、当業者であれば、本明細書に開示されているＤＳＧ２結合アッセイに基づいてＡｄＢ−２／３ファミリーに属するものを容易に同定することができる。例えば、固定化組換えＤＳＧ２を含むセンサーを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を用いて、ＤＳＧ２競合試験と組み合わせて、新規なＡｄ血清型がＤＳＧ２に結合するかどうかを決定することができる。さらなる代表的な試験、例えば、機能分析の損得が国際公開第２０１１／１５６７６１号パンフレットに詳細に記載されている。
【００３２】
アデノウイルスビリオンは、カプシドの１２個の頂点の各々の底部に位置するファイバーによって特徴付けられる２０面体である。ビリオン上のファイバーは、３個の個々のファイバーポリペプチドからなるホモ三量体構造である。各アデノウイルスファイバーポリペプチドは、カプシドのペントンベースタンパク質と相互作用し、かつタンパク質の細胞核への輸送に必要なシグナルを含むＮ末端尾部と；いくつかの１５残基反復単位を含むシャフトと；受容体結合のための決定基を含むＣ末端ノブドメインとからなる非対称構造である（Ｊ．Ｓ．ＨｏｎｇおよびＪ．Ａ．Ｅｎｇｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：７０７１〜７０７８（１９９６））。全てのアデノウイルスは、ファイバーの端部のノブ構造を通して受容体に付着する。したがって、本明細書で使用される場合、ＡｄＢ−２／３「ファイバーポリペプチド」という用語は、Ｎ末端尾部ドメインと、シャフトドメインと、Ｃ末端ノブドメインとを含む全長ファイバーポリペプチドを指す。ファイバーポリペプチドは、「ファイバー」と呼ばれるホモ三量体に自発的に会合し、これはカプシドの１２個の頂点の各々の底部のアデノウイルスビリオンの外側に位置する。
【００３３】
好ましい実施形態では、組換えポリペプチドがＡｄファイバーポリペプチドからの尾部ドメインを含まない。以下で詳細に開示されるように、本発明者らは、その変異がＤＳＧ２に対する親和性が有意に強化され、かつ療法有効性が有意に強化されたファイバーポリペプチドをもたらす重要残基を同定した。したがって、本発明のこの態様のポリペプチドを使用して、例えば、上に論じられる本発明の種々の方法に使用するためのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を形成することができる。この態様では、組換えポリペプチドが、任意のＡｄＢ−２／３ウイルスのシャフトドメイン、またはＤＳＧ２に対する結合親和性を
保持もしくは改善し、かつ二量体形成ドメイン（機能的同等物）を介して多量体（二量体など）を形成することができるようなシャフトドメインについての任意の変異体（置換、付加、欠失、キメラ等）を含むことができる。例えば、固定化組換えＤＳＧ２を含むセンサーを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を用いて、ＤＳＧ２競合試験と組み合わせて、評価している組換えポリペプチドがＤＳＧ２に結合するかどうかを決定することができる。
【００３４】
本出願の全体にわたって使用されるように、「ポリペプチド」という用語は、サブユニットアミノ酸の配列を指すために最も広義に使用される。本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸（インビボでＬ−アミノ酸特異的プロテアーゼに対して抵抗性である）、またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組み合わせを含み得る。本明細書に記載されるポリペプチドは、化学的に合成されても、組換え的に発現されてもよい。ポリペプチドを、例えば、ペグ化、ＨＥＳ化（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ）、ＰＡＳ化（ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化によって他の化合物と結合してインビボでの半減期延長を促進してもよいし、またはＦｃ−融合もしくは脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）変異体として作成してもよい。このような結合は、当業者によって理解されるように共有結合であっても非共有結合であってもよい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結している」という用語は、ドメインが意図した目的のためにユニットとして機能するように構成されている要素の配置を指す。この用語は、ドメインがポリペプチドに隣接していることを要さず、スペーサー／リンカー配列がドメインの間に存在していてもよいので、その長さは極めて可変性であり得る。１つの非限定的実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドの任意の２つのドメインの間のスペーサー長が約０個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸の間となり得る。種々の他の非限定的実施形態では、スペーサー長が０〜２０、０〜１９、０〜１８、０〜１７、０〜１６、０〜１５、０〜１４、０〜１３、０〜１２、０〜１１、０〜１０、０〜９、０〜８、０〜７、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、０〜１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、９〜１３、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１１〜１２、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１３〜１４、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１４〜１５、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１５〜１６、１６〜２０、１６〜１９、１６〜１８、１６〜１７、１７〜２０、１７〜１９、１７〜１８、１８〜２０、１８〜１９、１９〜２０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０個のアミノ酸の長さとなり得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「組換えポリペプチド」は天然には生じないタンパク質産物を意味し、組換えポリペプチドのドメインは１つまたは複数の他のタンパク質または人工的に得られた配列、例えば、本発明の変異ノブドメインポリペプチドに由来する。例えば、各シャフトドメインが異なる天然タンパク質に由来してもよい。組換えポリペプチドは、それだけに限らないが、標準的ＤＮＡ操作技術および組換えポリペプチドのサブユニット部分を介した化学会合を含む種々の機構によって構築され得る。化学会合は、分子遺伝学的形態としての同等な形態または同等の機能を有する代替会合物をもたらし得る。好ましい実施形態では、組換えポリペプチドが標準的組換えＤＮＡ技術によって作成される。本発明の組換えポリペプチドのこのような組換え作成および単離のための技術は、本明細書の教示に基づいて、十分に当技術分野における技能のレベル内にある。
【００３７】
一実施形態では、各シャフトドメインが、Ａｄ３シャフトドメイン、Ａｄ７シャフトドメイン、Ａｄ１１シャフトドメイン、Ａｄ１４シャフトドメイン、Ａｄ１４ａシャフトドメイン、これらの組み合わせ、およびこれらの機能的同等物からなる群から選択される。シャフトドメインはファイバーノブ二量体形成に要求され、ファイバーノブ二量体形成はＤＳＧ２との結合および結果としての細胞間結合の一過性開口に要求される。したがって、これらのＡｄウイルス血清型のシャフトドメインの機能的同等物は、以下に提供される実施例に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。例えば、固定化組換えＤＳＧ２を含むセンサーを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を用いて、ＤＳＧ２競合試験と組み合わせて、評価している組換えポリペプチドがＤＳＧ２に結合するかどうかを決定することができる。さらなる代表的な試験、例えば、機能分析の損得が実施例１に詳細に記載される。
【００３８】
組換えポリペプチドは、１〜２２個の間のＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドシャフトドメインを含み得る。したがって、種々の実施形態では、ポリペプチドが１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜２２、６〜２１、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜２２、７〜２１、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜２２、８〜２１、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜２２、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、９〜１３、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１１〜２２、１１〜２１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１１〜１２、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１３〜１４、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１４〜１５、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１５〜１６、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１６〜１９、１６〜１８、１６〜１７、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１７〜１８、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１８〜１９、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜２２、２０〜２１、２１〜２２、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のＡｄＢ−２／３ファイバータンパク質シャフトドメインを含む。２個以上のＡｄＢ−２／３ファイバータンパク質シャフトドメインが存在する場合、各シャフトドメインが同一であってもよいし、またはシャフトドメインの１個または複数のコピーが単一組換えポリペプチドにおいて異なっていてもよい。好ましい実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドが単一シャフトドメインを有する。
【００３９】
別の実施形態では、組換えポリペプチド中の１個または複数の（または全ての）シャフトドメインが、配列番号１２：
【化６】
0006290221.tif 000007
によるアミノ酸配列を含む、またはからなる。この配列および本明細書に示される他の可変配列中、可変残基は括弧内に注記され、「―」はその残基が存在しなくてもよいことを示している。
【００４０】
別の実施形態では、組換えポリペプチド中の１個または複数の（または全ての）シャフトドメインが、配列番号１３：
【化７】
0006290221.tif 000008
によるアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【００４１】
なおさらなる実施形態では、組換えポリペプチド中の１個または複数の（または全ての）シャフトドメインが、配列番号１４（Ａｄ３）、配列番号１５（Ａｄ７）、配列番号１６（Ａｄ１１）、配列番号１７（Ａｄ１４）および配列番号１８（Ａｄ１４ａ）からなる群から選択されるアミノ酸を含む、またはからなる。
【００４２】
ＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドノブドメインは、本発明の第１の態様の任意の実施形態または実施形態の組み合わせ（すなわち、配列番号１〜１１のいずれか）を含む、またはからなり；これらのポリペプチドドメインは、本発明の第１の態様に詳細に記載されている。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「二量体形成ドメイン」は、それを含む組換えポリペプチドの二量体形成を促進するペプチド配列である。組換えポリペプチドの二量体形成、したがってＤＳＧ２への結合を可能にする限り、任意の適当な非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインを本発明の組換えポリペプチドに使用することができる。二量体形成ドメインは、ＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチド中の天然ドメインではないという点で非ＡｄＢ−２／３由来である。当業者に知られており、かつ本発明に使用するのに適している多数の二量体形成ドメインの非限定的例としては、それだけに限らないが、少なくとも１個のヘリックスを含むペプチドヘリックス、またはヘリックス、コイルおよび別のヘリックス等によって形成される構造、コイル化コイル構造、例えば、多くの細胞表面シグナル伝達受容体中の二量体形成ドメイン、抗体のＦｃ領域またはヒンジ領域、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、ＦＫ５０６結合タンパク質、ＬｅｘＡタンパク質Ｃ末端ドメイン、核内受容体、ＦｋｐＡ  Ｎ末端ドメイン、Ａ．ｍａｘｉｍａのオレンジカロテノイドタンパク質、インフルエンザのＭ１マトリックスタンパク質、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ、大腸菌フルクトースアルドラーゼなどが挙げられる（例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５４：５３９（１９９１）、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒ等、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１〜１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９〜５９２（１９９８）；Ｋｌｅｍｍ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９〜５９２（１９９８）；Ｈｏ等、Ｎａｔｕｒｅ．３８２：８２２〜８２６（１９９６）；およびＰｏｍｅｒａｎｚ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：９６５（１９９８）参照）。さらなる例としては、ウシパピローマウイルスＥ２タンパク質中の残基３２５〜４１０（Ｄｏｓｔａｔｎｉ，Ｎ．等、ＥＭＢＯ  Ｊ  ７（１９８８）３８０７〜３８１６；Ｈａｕｇｅｎ，Ｔ．等  ＥＭＢＯ  Ｊ  ７（１９８８）４２４５〜４２５３；ＭｃＢｒｉｄｅ，Ａ．等、ＥＭＢＯ  Ｊ  ７（１９８８）５３３〜５３９；ＭｃＢｒｉｄｅ，Ａ．等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６（１９８９）５１０〜５１４）、Ｉ型デヨージナーゼ（Ｄ１）：DFLVIYIEEAHASDGW（配列番号１９）またはADFL--YI-EAH−DGW（配列番号２０）；ＨＩＶ−１カプシドタンパク質：QGPKEPFRDYVDRFYKTLRA（配列番号２１）；酵母ＧＣＮ４のロイシンジッパー二量体形成モチーフ：HMKQL D VEEL S NYHL N VARL K VGER（配列番号２２）；大腸菌転写抗ターミネータータンパク質；およびＢｇｌＧ：GVTQLMREMLQLIKFQFSLNYQEESLSYQRLVT（配列番号２３）が挙げられる。好ましい実施形態では、二量体形成ドメインがEVSALEK（配列番号２４）および／またはKVSALKE（配列番号２５）の１つまたは複数のコピーを含む。
【００４４】
本発明の組換えポリペプチド中で、二量体形成ドメインとして働くことができる適当なペプチド配列、およびその変異体を同定することは、十分に当技術分野における技能のレベル内にある。例えば、組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドの二量体形成を、ショ糖勾配中の沈降、トリプシンタンパク質分解に対する耐性、およびポリアクリルアミドゲル中での電気泳動移動度を含む基準によって評価することができる（ＨｏｎｇおよびＥｎｇｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：７０７１〜７０７８（１９９６））。
【００４５】
組換えポリペプチドは、１個または複数の非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインを含み得る。したがって、種々の実施形態では、組換えポリペプチドが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の非ＡｄＢ−２／３由来二量体形成ドメインを含む。複数のドメインがポリペプチド中に存在する場合、各二量体形成ドメインが同じであることが好ましい。
【００４６】
好ましい実施形態では、スペーサーペプチドが二量体形成ドメインと１個または複数のシャフトドメインとの間に位置する。さらなる好ましい実施形態では、スペーサーペプチドが構造上の柔軟性を有するペプチドである。構造上の柔軟性を有する事実上いずれのペプチドも使用することができる。例として、柔軟ペプチドは、Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号２６）などのアミノ酸残基の反復、またはアミノ酸残基の任意の他の適当な反復を含み得る。別の実施形態では、抗体のヒンジ領域を使用することができる。スペーサーは、組換えポリペプチドが二量体化する、およびＤＳＧ２への組換えポリペプチドの結合を維持する能力を維持する任意の適当な長さであり得る。
【００４７】
１つの好ましい実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３ポリペプチドが、各々がＡｄ３シャフトドメイン（配列番号１４）を含む、またはからなる１個または複数のシャフトドメインを含む。
【００４８】
この好ましい実施形態を本明細書に記載される任意の実施形態または実施形態の組み合わせと共に使用することができる。例えば、任意の適当なノブドメインを使用することができ、かつそれだけに限らないが、EVSALEK（配列番号２４）および／またはKVSALKE（配列番号２５）の１つまたは複数のコピーを含む任意の適当な二量体形成ドメインを使用することができる。同様に、二量体形成ドメインとシャフトドメインとの間および／またはシャフトドメインとノブドメインとの間に、任意の適当なスペーサーペプチドを使用することができる。最も好ましい実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３ポリペプチドがＪＯ−１（配列番号２７）もしくはその多量体（二量体など）を含む、またはからなる。
【００４９】
組換えポリペプチドは、ポリペプチドの単離のためのドメインおよび／または検出ドメインなどのさらなるドメインを含んでもよい。単離ドメインを付加して、例えば、組換えポリペプチド作成後のポリペプチドの精製／単離を促進することができる。それだけに限らないが、ＨＩＳ、ＣＢＰ、ＣＹＤ（共有結合性であるが解離できるＮｏｒｐＤペプチド）、Ｓｔｒｅｐ  ＩＩ、ＦＬＡＧ、ＨＰＣ（プロテインＣの重鎖）ペプチドタグ、ＧＳＴおよびＭＢＰアフィニティータグを含む任意の適当な単離ドメインを使用することができる。本明細書で使用される場合、「検出ドメイン」は検出することができる１個または複数のアミノ酸配列を意味する。それだけに限らないが、固有蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質および非生物発光花虫綱の種の蛍光タンパク質）、補因子要求蛍光または発光タンパク質（例えば、フィコビリタンパク質またはルシフェラーゼ）、および特異的抗体または他の特異的天然もしくは非天然結合プローブによって認識可能なエピトープ（それだけに限らないが、染料、酵素補因子および蛍光もしくは発光標識された操作結合分子を含む）を含む任意の適当な検出ドメインを使用することができる。
【００５０】
さらなる好ましい実施形態では、組換えＡｄＢ−２／３ファイバーポリペプチドが、以下の
【化８】
0006290221.tif 000009
の１つのアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【００５１】
別の実施形態では、組換えポリペプチドが二量体、三量体等などの多量体型である。好ましい実施形態では、多量体が各ホモ三量体（すなわち、ポリペプチドがノブドメインの三量体形成を通したホモ三量体である）中の二量体形成ドメインを通した二量体形成によって形成された二量体を含む。多量体型（二量体など）では、組換えポリペプチドがＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を含み、上に論じられる本発明の種々の方法に使用され得る。当業者によって理解されるように、このような多量体は本発明の同一の組換えポリペプチドの多量体を含んでもよいし、または本発明の異なる組換えポリペプチドの多量体を含んでもよい。一実施形態では、二量体形成ドメインが多量体の各組換えポリペプチド形成部分で同じである。別の実施形態では、二量体形成ドメインが多量体の各組換えポリペプチド形成部分で異なる。別の実施形態では、シャフトおよび／またはノブドメインが多量体の各組換えポリペプチド形成部分で同じである。別の実施形態では、シャフトおよび／またはノブドメインが多量体の各組換えポリペプチド形成部分で異なる。
【００５２】
ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体形成は、当業者に周知の方法によって決定することができる。例えば、組換えＡｄＢ−２／３ファイバー構築物の多量体形成を、ショ糖勾配中の沈降、トリプシンタンパク質分解に対する耐性、およびポリアクリルアミドゲル中での電気泳動移動度を含む基準によって評価することができる（ＨｏｎｇおよびＥｎｇｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：７０７１〜７０７８（１９９６））。電気泳動移動度に関して、ファイバー多量体は極めて安定な複合体であり、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に煮沸しないと、多量体の分子量と一致した分子量で移動する。しかしながら、煮沸すると、多量体構造が破壊され、その後タンパク質がタンパク質単量体と一致したサイズで移動する。
【００５３】
組換えポリペプチド、またはその多量体バージョンは溶液中でまたは凍結して保存することができる。
【００５４】
別の実施形態では、本発明の組換えポリペプチドが、上皮組織に関連する障害のための１種または複数の療法剤と組み合わせられる（例えば、抱合される）。このような抱合体を、例えば、本発明の治療法に使用することができる。本発明のポリペプチドを例えば、共有結合または化学架橋によって対象となる療法剤に抱合する方法は当業者に周知である。それだけに限らないが、腫瘍間質分解化合物（リラキシンなど）、アルキル化剤、血管新生阻害薬、抗体、代謝拮抗薬、抗有糸分裂薬、抗増殖薬、オーロラキナーゼ阻害薬、アポトーシス促進剤（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｆｌ−１）阻害薬、デスレセプター経路の活性化薬、Ｂｃｒ−Ａｂ１キナーゼ阻害薬、ＢｉＴＥ（Ｂｉ特異的Ｔ細胞結合（Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ））抗体、生物学的反応修飾物質、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、増殖因子阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０阻害剤、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬、ホルモン療法、免疫学、アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）挿入抗生物質、キナーゼ阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質阻害剤、マイクロＲＮＡのマイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤、多価結合タンパク質、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、白金化学療法薬、ポロ様キナーゼ（Ｐｌｋ）阻害剤、プロテアソーム阻害薬、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド／デルトイド（ｄｅｌｔｏｉｄｓ）植物アルカロイド、小型抑制リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、トポイソメラーゼ阻害剤などを含む、任意の適当な療法剤を使用して本発明の実施形態による抱合体を形成することができる。
【００５５】
これらの種々のクラスに入る代表的な療法剤には、それだけに限らないが、ドセタキセル、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、パクリタキセルアルブミン結合粒子（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ドキソルビシンＨＣＬリポソーム（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、ＢｉＴＥ抗体（アデカツムマブ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ２０１）、ブリナツモマブ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ１０３）など）、ｓｉＲＮＡ系療法剤、アルトレタミン、ＡＭＤ−４７３、ＡＰ−５２８０、アパジコン、ベンダムスチン、ブロスタリシン、ブスルファン、カルボコン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル、ＣＬＯＲＥＴＡＺＩＮＥ（登録商標）（ラロムスチン、ＶＮＰ４０１０１Ｍ）、シクロホスファミド、デカルバジン、デシタビン、５’−アザシチジン、エストラムスチン、フォテムスチン、グルホスファミド、イホスファミド、ＫＷ−２１７０、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マホスファミド、メルファラン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ニムスチン、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、ラニムスチン、テモゾロミド、チオテパ、ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標）（ベンダムスチン）、トレオスルファン、ロホスファミドなどを含むアルキル化剤；内皮特異的受容体チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ−２）阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、インスリン成長因子−２受容体（ＩＧＦＲ−２）阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤、トロンボスポンジン類似体、血管内皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤などを含む血管新生阻害薬；ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（ペメトレキセド二ナトリウム、ＬＹ２３１５１４、ＭＴＡ）、５−アザシチジン、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）（カペシタビン）、カルモフール、ＬＥＵＳＴＡＴ（登録商標）（クラドリビン）、クロファラビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、シトシンアラビノシド、デシタビン、デフェロキサミン、ドキシフルリジン、エフロルニチン、ＥＩＣＡＲ（５−エチニル−１β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド）、エノシタビン、エチニルシチジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル（単独またはロイコボリンとの組み合わせ）、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、ヒドロキシウレア、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標）（メルファラン）、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、メトトレキサート、メトトレキサート類似体（トリメトレキサートおよびプララトレキサートなど）、ミコフェノール酸、ネララビン、ノラトレキシド、オクホスファート、ペレトレキソール、ペントスタチン、ラルチトレキセド、リバビリン、トリアピン、トリメトレキサート、Ｓ−１、チアゾフリン、テガフール、ＴＳ−１、ビダラビンなどを含む代謝拮抗薬；ＡＴ−１０１（（−）ゴシポール）、ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標）（Ｇ３１３９またはオブリメルセン（Ｂｃｌ−２標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド））、ＩＰＩ−１９４、ＩＰＩ−５６５、Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド）（ＡＢＴ−７３７）、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド（ＡＢＴ−２６３）、ＧＸ−０７０（オバトクラックス）などを含むＢｃｌ−２タンパク質阻害薬；ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ（登録商標）（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（イマチニブ）などを含むＢｃｌ−Ａｂ１キナーゼ阻害薬；ＡＺＤ−５４３８、ＢＭＩ−１０４０、ＢＭＳ−０３２、ＢＭＳ−３８７、ＣＶＴ−２５８４、フラボピリドール、ＧＰＣ−２８６１９９、ＭＣＳ−５Ａ、ＰＤ０３３２９９１、ＰＨＡ−６９０５０９、セリシクリブ（ＣＹＣ−２０２、Ｒ−ロスコビチン）、ＺＫ−３０４７０９などを含むＣＤＫ阻害薬；ＡＢＸ−ＥＧＦ、抗ＥＧＦＲイムノリポソーム、ＥＧＦワクチン、ＥＭＤ−７２００、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＨＲ３、ＩｇＡ抗体、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エロチニブまたはＯＳＩ−７７４）、ＴＰ−３８、ＥＧＦＲ融合タンパク質、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）などを含むＥＧＦＲ阻害薬；ＣＰ−７２４−７１４、ＣＩ−１０３３（カネルチニブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）（２Ｃ４、ペツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ＧＷ−５７２０１６（イオナファルニブ（ｉｏｎａｆａｒｎｉｂ））、ＧＷ−２８２９７４、ＥＫＢ−５６９、ＰＩ−１６６、ｄＨＥＲ２（ＨＥＲ２ワクチン）、ＡＰＣ−８０２４（ＨＥＲ−２ワクチン）、抗ＨＥＲ／２ｎｅｕ二重特異性抗体、Ｂ７．ｈｅｒ２ＩｇＧ３、ＡＳ  ＨＥＲ２三機能二重特異性抗体、ｍＡｂ  ＡＲ−２０９、ｍＡｂ−２Ｂ−１などを含むＥｒｂＢ２受容体阻害剤；ロミデプシン、ＬＡＱ−８２４、ＭＳ−２７５、トラポキシン、ヒドロキサミン酸スベロイルアニリド（ＳＡＨＡ）、ＴＳＡ、バルプロ酸などを含むヒストン脱アセチル化酵素阻害薬；１７−ＡＡＧ−ｎａｂ、１７−ＡＡＧ、ＣＮＦ−１０１、ＣＮＦ−１０１０、ＣＮＦ−２０２４、１７−ＤＭＡＧ、ゲルダナマイシン、ＩＰＩ−５０４、ＫＯＳ−９５３、ＭＹＣＯＧＲＡＢ（登録商標）（ＨＳＰ−９０に対するヒト組換え抗体）、ＮＣＳ−６８３６６４、ＰＵ２４ＦＣ１、ＰＵ−３、ラディシコール、ＳＮＸ−２１１２、ＳＴＡ−９０９０、ＶＥＲ４９００９などを含むＨＳＰ−９０阻害剤；ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬまたはデスレセプター（例えば、ＤＲ４およびＤＲ５）を標的化する抗体または他の剤、例えば、Ａｐｏｍａｂ、コナツムマブ、ＥＴＲ２−ＳＴ０１、ＧＤＣ０１４５、（レキサツムマブ）、ＨＧＳ−１０２９、ＬＢＹ−１３５、ＰＲＯ−１７６２およびトラスツズマブを含むデスレセプター経路の活性化薬；シスプラ��ン、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）（オキサリプラチン）、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標）（カルボプラチン）、サトラプラチン、ピコプラチンなどを含む白金化学療法薬；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＡＢＴ−８６９、ＡＥＥ−７８８、アキシチニブ（ＡＧ−１３７３６）、ＡＺＤ−２１７１、ＣＰ−５４７、６３２、ＩＭ−８６２、ＭＡＣＵＧＥＮ（ペガプタニブ）、ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）（ソラフェニブ、ＢＡＹ４３−９００６）、パゾパニブ（ＧＷ−７８６０３４）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４）、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ、ＳＵ−１１２４８）、ＶＥＧＦトラップ、ＺＡＣＴＩＭＡＴｈｉ（バンデタニブ、ＺＤ−６４７４）などを含むＶＥＧＦＲ阻害薬；樹状細胞療法（シプリューセルＴ、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））；アクラルビシン、９−アミノカンプトテシン、アモナフィド、アムサクリン、ベカテカリン、ベロテカン、ＢＮ−８０９１５、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）（イリノテカン塩酸塩）、カンプトテシン、デクスラゾキシン、ジフロモテカン、エドテカリン、ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標）またはＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ（登録商標）（エピルビシン）、エトポシド、エキサテカン、アブラキサン、イレノテカン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ジャイマテカン、ラルトテカン、ミトキサントロン、オラテシン、ピラルビシン、ピキサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、ＳＮ−３８、タフルポシド、トポテカンなどを含むトポイソメラーゼ阻害剤；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＣＤ４０特異性抗体、ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ、デノスマブ、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＨＵＭＡＸ−ＣＤ４（登録商標）（ザノリムマブ）、ＩＧＦ  ＩＲ特異性抗体、リンツズマブ、ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標）（エドレコロマブ）、ＲＥＮＣＡＲＥＸ（登録商標）（ＷＸ  Ｇ２５０）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、チシリムマブ、トラスツズマブなどを含む抗体；ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン）、アルゾキシフェン、ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標）（ビカルタミド）、ＣＥＴＲＯＴＩＤＥ（登録商標）（セトロレリクス）、デガレリクス、デスロレリン、ＤＥＳＯＰＡＮ（登録商標）（トリロスタン）、デキサメタゾン、ＤＲＯＧＥＮＩＬ（登録商標）（フルタミド）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）（ラロキシフェン）、ＡＦＥＭＡ（登録商標）（ファドロゾール）、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（トレミフェン）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール）、ホルメスタン、グルココルチコイド、ＨＥＣＴＯＲＯＬ（登録商標）（ドキセルカルシフェロール）、ＲＥＮＡＧＥＬ（登録商標）（炭酸セベラマー）、ラソフォキシフェン、酢酸リュープロリド、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（メゲステロール）、ＭＩＦＥＰＲＥＸ（登録商標）（ミフェプリストン）、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標）（ニルタミド）、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（クエン酸タモキシフェン）、ＰＬＥＮＡＸＩＳ（登���商標）（アバレリクス）、プレドニソン、ＰＲＯＰＥＣＩＡ（登録商標）（フィナステリド）、リロスタン、ＳＵＰＲＥＦＡＣＴ（登録商標）（ブセレリン）、ＴＲＥＬＳＴＡＲ（登録商標）（黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ））、ＶＡＮＴＡＳ（登録商標）（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎインプラント）、ＶＥＴＯＲＹＬ（登録商標）（トリロスタンまたはモドラスタン）、ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）（フォスレリン、ゴセレリン）などを含むホルモン療法；インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａ、ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（インターフェロンγ−１ｂ）またはインターフェロンγ−ｎ１、これらの組み合わせなどを含む免疫学；ＡＬＦＡＦＥＲＯＮＥ（登録商標）（ＩＦＮ−α）、ＢＡＭ−００２（酸化グルタチオン）、ＢＥＲＯＭＵＮ（登録商標）（タソネルミン）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（トシツモマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）、デカルバジン、デニロイキン、エプラツズマブ、ＧＲＡＮＯＣＹＴＥ（登録商標）（レノグラスチム）、レンチナン、白血球αインターフェロン、イミキモド、ＭＤＸ−０１０（抗ＣＴＬＡ４）、メラノーマワクチン、ミツモマブ、モルグラモスチム、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブオゾガミシン）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（フィルグラスチム）、ＯｎｃｏＶＡＣ−ＣＬ、ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）（オレゴボマブ）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）（シプロイセルＴ）、サルグラモスチム、シゾフィラン、テセロイキン、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標）（カルメット−ゲラン桿菌）、ウベニメクス、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（登録商標）（免疫療法、Ｌｏｒｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｚ−１００（Ｍａｒｕｙａｍａの特異的物質（ＳＳＭ））、ＷＦ−１０（テトラクロロデカオキシド（ＴＣＤＯ））、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）（アルデスロイキン）、ＺＡＤＡＸＩＮ（登録商標）（サイマルファシン）、ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（ダクリズマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（９０Ｙ−イブリツモマブ・チウキセタン）などを含む他の薬剤；シタラビン（アラＣまたはアラビノシドＣ）、シトシンアラビノシド、ドキシフルリジン、Ｆ
ＬＵＤＡＲＡ（登録商標）（フルダラビン）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、フロクスウリジン、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、ＴＯＭＵＤＥＸ（登録商標）（ラルチトレキセド）、ＴＲＯＸＡＴＹＬ（登録商標）（トリアセチルウリジン・トロキサシタビン）などを含むピリミジン類似体；ＬＡＮＶＩＳ（登録商標）（チオグアニン）およびＰＵＲＩ−ＮＥＴＨＯＬ（登録商標）（メルカプトプリン）を含むプリン類似体；ベタブリン、エポチロンＤ（ＫＯＳ−８６２）、Ｎ−（２−（（４−ヒドロキシフェニル）アミノ）ピリジン−３−イル）−４−メトキシベンゼンスルホンアミド、イキサベピロン（ＢＭＳ２４７５５０）、パクリタキセル、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＰＮＵ１００９４０（１０９８８１）、パツピロン、ＸＲＰ−９８８１（ラロタキセル）、ビンフルニン、ＺＫ−ＥＰＯ（合成エポチロン）などを含む抗有糸分裂薬；ならびにＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢＩ−００７）、ＡＢＴ−１００（ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＡＤＶＥＸＩＮ（登録商標）（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ワクチン）、ＡＬＴＯＣＯＲ（登録商標）またはＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）（ロバスタチン）、ＡＭＰＬＩＧＥ（登録商標）（ポリＩ：ポリＣ１２Ｕ、合成ＲＮＡ）、ＡＰＴＯＳＹＮ（登録商標）（エクシスリンド）、ＡＲＥＤＬＡ（登録商標）（パミドロン酸）、アルグラビン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アタメスタン（１−メチル−３，１７−ジオン−アンドロスタ−１，４−ジエン）、ＡＶＡＧＥ（登録商標）（タザロテン）、ＡＶＥ−８０６２（コンブレタスタチン誘導体）、ＢＥＣ２（ミツモマブ）、カケクチンまたはカケキシン（腫瘍壊死因子）、カンバキシン（ワクチン）、ＣＥＡＶＡＣ（登録商標）（がんワクチン）、ＣＥＬＥＵＫ（登録商標）（セルモロイキン）、ＣＥＰＬＥＮＥ（登録商標）（ヒスタミン二塩酸塩）、ＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標）（ヒトパピローマウイルスワクチン）、ＣＨＯＰ（登録商標）（Ｃ：ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）（シクロホスファミド）；Ｈ：ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ヒドロキシドキソルビシン）；Ｏ：ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；Ｐ：プレドニソン）、ＣＹＰＡＴ（登録商標）（酢酸シプロテロン）、コンブレスタチンＡ４Ｐ、ＤＡＢ（３８９）ＥＧＦ（Ｈｉｓ−Ａｌａリンカーを介してヒト上皮増殖因子に融合したジフテリア毒素の触媒および転移ドメイン）またはトランスＭＩＤ−１０７Ｒ（登録商標）（ジフテリア毒素）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、エニルウラシル、ＥＶＩＺＯＮ（商標）（乳酸スクアラミン）、ＤＩＭＥＲＩＣＩＮＥ（登録商標）（Ｔ４Ｎ５リポソームローション）、ディスコデルモリド、ＤＸ−８９５１ｆ（メシル酸エキサテカン）、エンザスタウリン、ＥＰＯ９０６（エピチロンＢ）、ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）（四価ヒトパピローマウイルス（６、１１、１６、１８型）組換えワクチン）、ＧＡＳＴＲＩＭＭＵＮＥ（登録商標）、ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標）、ＧＭＫ（ガングリオシドコンジュゲートワクチン）、ＧＶＡＸ（登録商標）（前立腺がんワクチン）、ハロフジノン、ヒステレリン、ヒドロキシカルバミド、イバンドロン酸、ＩＧＮ−１０１、ＩＬ−１３−ＰＥ３８、ＩＬ−１３−ＰＥ３８ＱＱＲ（シントレデキン・ベスドトクス）、ＩＬ−１３−シュードモナス外毒素、インターフェロンα、インターフェロンγ、ＪＵＮＯＶＡＮ（登録商標）またはＭＥＰＡＣＴ（登録商標）（ミファムルチド）、ロナファルニブ、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、ミルテホシン（ヘキサデシルホスホコリン）、ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＡＥ−９４１）、ＮＥＵＴＲＥＸＩＮ（登録商標）（グルクロン酸トリメトレキサート）、ＮＩＰＥＮＴ（登録商標）（ペントスタチン）、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）（リボヌクレアーゼ酵素）、ＯＮＣＯＰＨＡＧＥ（登録商標）（メラノーマワクチン治療）、ＯＮＣＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＬ−２ワクチン）、ＯＲＡＴＨＥＣＩＮ（登録商標）（ルビテカン）、ＯＳＩＤＥＭ（登録商標）（抗体に基づく細胞薬剤）、ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）ＭＡｂ（マウスモノクローナル抗体）、パクリタキセル、ＰＡＮＤＩＭＥＸ（登録商標）（２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（ａＰＰＤ）および２０（Ｓ）プロトパナキサトリオール（ａＰＰＴ）を含むニンジンからのアグリコンサポニン）、パニツムマブ、ＰＡＮＶＡＣ（登録商標）−ＶＦ（治験がんワクチン）、ペグアスパラガーゼ、ＰＥＧインターフェロンＡ、フェノキソジオール、プロカルバジン、レビマスタット、ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標）（カツマキソマブ）、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）、ＲＳＲ１３（エファプロキシラル）、ＳＯＭＡＴＵＬＩＮＥ（登録商標）ＬＡ（ランレオチド）、ＳＯＲＩＡＴＡＮＥ（登録商標）（アシトレチン）、スタウロスポリン（ストレプトマイセス属星状胞子）、タラボスタット（ＰＴ１００）、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）（ベキサロテン）、ＴＡＸＯＰＲＥＸＩＮ（登録商標）（ＤＨＡ−パクリタキセル）、ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）（カンフォスファミド、ＴＬＫ２８６）、テミリフェン、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）（テモゾロミド）、テスミリフェン、サリドマイド、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）（ＳＴｎ−ＫＬＨ）、チミタク（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−メチル−４−オキソ−５−（４−ピリジルチオ）キナゾリン二塩酸塩）、ＴＮＦＥＲＡＤＥ（登録商標）（アデノベクター：腫瘍壊死因子αに関する遺伝子を含むＤＮＡキャリア）、ＴＲＡＣＬＥＥＲ（登録商標）またはＺＡＶＥＳＣＡ（登録商標）（ボセンタン）、トレチノイン（Ｒｅｔｉｎ−Ａ）、テトランドリン、ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標）（三酸化ヒ素）、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（登録商標）、ウクライン（クサノオウ植物のアルカロイドの誘導体）、ビタキシン（抗αβ３抗体）、ＸＣＹＴＲＩＮ（登録商標）（モテキサフィンガドリニウム）、ＸＩＮＬＡＹ（登録商標）（アトラセンタン）、ＸＹＯＴＡＸ（登録商標）（パクリタキセル・ポリグルメックス）、ＹＯＮＤＥＬＩＳ（登録商標）（トラベクテジン）、ＺＤ−６１２６、ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標）（デクスラゾキサン）、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）（ゾレドロン酸）、クリゾチニブ、ゾルビシンなどの他の化学療法薬が含まれる。
【００５６】
別の好ましい実施形態では、療法剤が、デスモグレイン２に結合する化合物；好ましくはＤＳＧ２に結合して、密着結合を開ける化合物を含む。
【００５７】
他の実施形態では、療法剤が放射性粒子／放射線療法を含む。それだけに限らないが、コバルト６０、ヨウ素１３１、イリジウム１９２、ストロンチウム８９、サマリウム１５３、レニウム１８６および鉛２１２を含む任意の適当な放射性療法または粒子を主治医によって適当とみなされるように使用することができる。
【００５８】
好ましい実施形態では、療法剤が抗腫瘍療法剤であり、本明細書に記載される化学療法薬または抗腫瘍モノクローナル抗体を含む。さらなる好ましい実施形態では、抗腫瘍療法剤が、トラスツズマブ、セツキシマブ、ペツズマブ、アポマブ、コナツムマブ、レキサツムマブ、ベバシズマブ、ベバシズマブ、デノスマブ、ザノリムマブ、リンツズマブ、エドレコロマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、ミツモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、オレゴボマブ、ペムツモマブダクリズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、オファツムマブおよびイブリツモマブからなる群から選択される抗体を含む。有用な抗腫瘍ｍＡｂおよびその具体的使用の非限定的例は、表１に列挙され、参照により本明細書に組み込まれるＣａｍｐｏｌｉ，Ｍ．等、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３（１＆２）：１〜１９（２００９）にさらに記載されている通りである。
【表１】
0006290221.tif 000010
【００５９】
別の実施形態では、本発明の組換えポリペプチドが、１種または複数の診断剤またはイメージング剤と組み合わせられる（例えば、抱合される）。本発明の組換えポリペプチドおよびその多量体は、任意の診断剤、イメージング剤または他の化合物を、対象となる標的の接近が限定され得る細胞間結合を含む上皮組織に送達するための広範な用途を有する。種々の非限定的実施形態では、イメージング剤が、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に産生することができる任意の化学化合物を含むことができる。多くのこのようなイメージング剤が当業者に知られている。開示されている方法および組成物に使用するのに適したイメージング剤の例には、放射性同位元素、蛍光分子、磁性粒子（ナノ粒子を含む）、金属粒子（ナノ粒子を含む）、リン光分子、酵素、抗体、リガンドおよびこれらの組み合わせがある一方で、診断剤はこのようなイメージング剤に結合した特定の上皮障害についての診断マーカーである化合物を含んでもよい。イメージング剤によって産生されるシグナルを検出および測定する方法も当業者に知られている。例えば、放射性同位元素はシンチレーション測定または直接可視化によって検出することができ；蛍光分子は蛍光分光光度計を用いて検出することができ；リン光分子は分光光度計を用いて検出するまたはカメラを用いて直接可視化することができ；酵素は酵素によって触媒される反応生成物の検出または可視化によって検出することができ；抗体は抗体に結合した二次検出ラベルを検出することによって検出することができる。１つの好ましい実施形態では、イメージング剤および／または診断剤が、直接腫瘍結合によっても、またはイメージング剤もしくは診断剤と腫瘍に結合することができる化合物とのカップリングによっても、腫瘍を検出するために使用することができるものである。
【００６０】
種々の実施形態では、イメージング剤が蛍光イメージング剤であり得る一方で、診断剤が蛍光イメージング剤に結合した特定の上皮障害についての診断マーカーである化合物を含んでもよい。蛍光イメージング剤は、検出可能な蛍光シグナルを有する任意の化学部分である。このイメージング剤は、単独でまたは他のイメージング剤と組み合わせて使用することができる。本明細書に開示される組成物および方法に使用することができる適当な蛍光剤の例としては、それだけに限らないが、その組み合わせを含む、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、フルオレサミン、ＯＰＡ、ＮＤＡ、インドシアニン緑色染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７）、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−（３−ビニルスルホニル）フェニルナフタルイミド−３，５−ジスルホネート、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ、ブリリアントイエロー、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン１５１）、シアノシン、４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）、５−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート、臭化エチジウム、エチジウム、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン、ピレン酪酸、スクシンイミジル１−ピレン酪酸、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ［Ｒ］ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）��６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、５，６−テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、クマリン６などが挙げられる。これらの蛍光イメージング部分は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎ、オレゴン州およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、オハイオ州を含む種々の商業的供給業者から得ることができる、また当業者によって合成され得る。
【００６１】
別の例では、イメージング剤が磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）剤を含むことができる一方で、診断剤がＭＲＩ剤に結合した特定の上皮障害についての診断マーカーである化合物を含んでもよい。ＭＲＩ剤は、検出可能な核磁気共鳴シグナルを有する、または別の剤の磁気共鳴シグナルに影響を及ぼす（例えば、増加させるまたはシフトさせる）ことができる任意の化学部分である。この型のイメージング剤は、単独でまたは他のイメージング剤と組み合わせて使用することができる。さらに別の例では、ガドリニウム系ＭＲＩ剤がイメージング剤として働くことができる。開示されているイメージング剤に組み込むことができる適当なＭＲＩ剤の例には、パラ−アミノ−ベンジルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ、化合物７）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の抱合可能型があり、これはガドリニウムに強力に結合することが知られており、磁気共鳴造影剤としての臨床使用が承認されている。本明細書に開示されているような、ＭＲＩ剤のデンドリマー物質などの大型巨大分子への組込みにより、大きなＴ１緩和（高コントラスト）および単一分子での剤の複数コピーが可能になり、これによりシグナルが増加され得る。ＭＲＩイメージング剤および例えば、蛍光イメージング剤を組み合わせることによって、得られた剤を、ＭＲＩを介してリアルタイムで検出、画像下およびフォローすることができる。他のイメージング剤には、１８Ｆまたは６４Ｃｕもしくは６８Ｇａのためのキレート剤を組み込むことによって調製することができるＰＥＴ剤が含まれる。また、放射性核種の添加を用いてＳＰＥＣＴイメージングまたは放射線量の送達を促進することができる一方で、診断剤がＰＥＴ剤に結合した特定の上皮障害についての診断マーカーである化合物を含んでもよい。
【００６２】
いくつかの実施形態では、診断剤が、それだけに限らないが、ポジトロン放射形断層撮影（ＰＥＴ）剤、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）剤、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）剤、核磁気イメージング剤（ＮＭＩ）、蛍光透視剤および超音波造影剤を含む診断イメージング剤である。このような診断剤には、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等を含むヨウ素（Ｉ）、バリウム（Ｂａ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、９９Ｔｃを含むテクニチウム（Ｔｃ）、３１Ｐを含むリン（Ｐ）、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｇ）、タリウム（Ｔｌ）、５１Ｃｒを含むクロム（Ｃｒ）、１４Ｃを含む炭素（Ｃ）などの元素の放射性同位元素、蛍光標識化合物、またはその錯体、キレート、付加物および抱合体が含まれる。それだけに限らないが、炭素１１、窒素１３、酸素１５、フッ素１８、１１Ｃ−メトミデート、およびそれだけに限らないが、フルデオキシグルコース（フッ素１８で標識されたグルコース類似体）を含むそのグルコース類似体を含む任意の適当なＰＥＴ剤を使用することができる。
【００６３】
他の実施形態では、診断剤が細胞中で発現すると容易に検出可能なタンパク質（それだけに限らないが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなど）をコードするマーカー遺伝子および標識核酸プローブ（例えば、放射標識または蛍光標識プローブ）である。いくつかの実施形態では、診断剤またはイメージング剤と本明細書で提供されるＡｄＢ−２／３多量体の共有結合性抱合が、種々の抱合プロセスによって達成される。他の実施形態では、診断剤が提供されるＡｄＢ−２／３多量体と非共有結合的に会合される。
【００６４】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドまたは任意の実施形態をコードする核酸を提供する。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡを含んでもよく、本明細書の教示に基づいて標準的な分子生物学技術を用いて調製および単離することができる。核酸は、それだけに限らないが、ポリＡ配列、修飾コザック配列、ならびにエピトープタグ、搬出シグナルおよび分泌シグナル、核移行シグナルおよび細胞膜移行シグナルをコードする配列を含む、コードタンパク質の発現および／または精製を促進するのに有用な追加のドメインを含んでもよい。
【００６５】
さらなる態様では、本発明は、プロモーターと作動可能に連結した本発明の任意の態様の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」には、核酸コード領域または遺伝子を、遺伝子産物の発現をもたらすができる任意のプロモーターと作動可能に連結するベクターが含まれる。哺乳動物系の開示される核酸の発現を駆動するために使用されるプロモーター配列は、構成型（それだけに限らないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含む種々のプロモーターのいずれかによって駆動される）または誘導性（それだけに限らないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含むいくつかの誘導性プロモーターのいずれかによって駆動される）であり得る。原核細胞をトランスフェクトするのに使用するための発現ベクターの構築も当業者に周知であるので、標準的技術を介して達成することができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１０９〜１２８頁、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびＡｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）参照）。発現ベクターは、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡへの組込みのいずれかによって宿主生物中で複製可能でなければならず、それだけに限らないが、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含む、所与の用途に適しているとみなされる任意の他の化合物を含んでもよい。
【００６６】
なおさらなる態様では、本発明は、本明細書に開示される組換え発現ベクターを含む宿主細胞、およびその子孫を提供し、宿主細胞は原核性であっても真核性であってもよい。細胞は一過性にまたは安定的にトランスフェクトされ得る。発現ベクターの原核および真核細胞へのこのようなトランスフェクションは、それだけに限らないが、標準的細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔、またはリポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介−、ポリカチオン媒介−もしくはウイルス媒介トランスフェクションを含む当技術分野で知られている任意の技術を介して達成することができる。（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク、ＮＹ）参照）。発現ベクターを用いてトランスフェクトした培養細胞を利用して多量のポリペプチドを産生する技術は当技術分野で周知である。
【００６７】
別の態様では、本発明は、
（ａ）本発明のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と；
（ｂ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物を提供する。
【００６８】
ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体は、本発明の第１の態様の任意の実施形態の変異ノブドメインポリペプチド（すなわち、配列番号１〜１１）を組み込んだ本発明の任意の態様、実施形態または実施形態の組み合わせによる本明細書に記載される任意のこのような多量体であり得る。
【００６９】
医薬組成物は、それだけに限らないが、上に開示されるものを含む、上皮組織に関連する障害を治療するための１種または複数の療法剤をさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、療法剤が抗腫瘍療法剤であり、かつ本明細書に記載される化学療法剤または抗腫瘍モノクローナル抗体を含む。さらなる好ましい実施形態では、抗腫瘍療法剤が、トラスツズマブ、セツキシマブ、ペツズマブ、アポマブ、コナツムマブ、レキサツムマブ、ベバシズマブ、ベバシズマブ、デノスマブ、ザノリムマブ、リンツズマブ、エドレコロマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、ミツモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、オレゴボマブ、ペムツモマブダクリズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、オファツムマブおよびイブリツモマブからなる群から選択される抗体を含む。
【００７０】
薬学的に許容される担体は非毒性、生体適合性であり、かつ多量体（およびそれと組み合わせられる任意の他の療法剤）の生物学的活性に悪影響を及ぼさないよう選択される。ペプチドのための代表的な薬学的に許容される担体は、Ｙａｍａｄａの米国特許第５２１１６５７号明細書に記載されている。組成物は、経口、非経口または外科的投与を可能にする、固体、半固体、ゲル、液体、ガス状形態の製剤、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、吸入剤、および注射剤に製剤化され得る。注射用、注入、または潅注を介した非経口送達、および局所送達に適した担体には、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、通常のもしくは乳酸リンゲル液、ブドウ糖溶液、ハンクス液、またはプロパンジオールが含まれる。さらに、滅菌、不揮発性油を溶媒または懸濁媒体として使用することができる。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の生体適合性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に用途を見出している。担体および薬剤を液体、懸濁液、重合性もしくは非重合性ゲル、ペーストまたは軟膏として調合することができる。担体はまた、薬剤の送達を維持する（延長する、遅延させるもしくは調節する）ため、または療法剤の送達、取り込み、安定性もしくは薬物動態を強化するための送達ビヒクルを含んでもよい。このような送達ビヒクルには、非限定的例として、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物、無機化合物、ポリマーもしくはコポリマーヒドロゲルおよびポリマーミセルで構成された微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、またはナノ粒子が含まれ得る。適当なヒドロゲルおよびミセル送達系には、国際公開第２００４／００９６６４号パンフレットに開示されているＰＥＯ：ＰＨＢ：ＰＥＯコポリマーおよびコポリマー／シクロデキストリン複合体、ならびに米国特許第２００２／００１９３６９号明細書に開示されているＰＥＯおよびＰＥＯ／シクロデキストリン複合体が含まれる。このようなヒドロゲルを、意図した作用の部位に局所的に、または皮下もしくは筋肉内に注射して徐放デポーを形成することができる。
【００７１】
髄腔内（ＩＴ）または脳室内（ＩＣＶ）送達のために、適当な滅菌送達システム（例えば、液体；ゲル、懸濁液等）を使用して組成物を投与することができる。非ペプチド性薬剤の経口投与のために、組成物を、スクロース、コーンスターチまたはセルロースなどの不活性フィラーまたは希釈剤に担持させることができる。
【００７２】
本発明の組成物はまた、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、希釈剤、緩衝液、浸透促進剤、乳化剤、結合剤、増稠剤、香味剤（経口投与用）などの生体適合性賦形剤を含んでもよい。代表的な製剤は、水、油、食塩水、グリセロールまたはエタノールなどの滅菌液体であり得る医薬担体を含む生理学的に許容される希釈剤中の多量体の注射可能な用量の溶液または懸濁液として非経口投与することができる。さらに、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝化物質などの補助剤が修飾ポリペプチドを含む組成物中に存在することができる。医薬組成物の追加の成分には、石油（動物、植物または合成起源のものなど）、例えば、ダイズ油および鉱物油が含まれる。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが注射用溶液のための好ましい液体担体である。
【００７３】
医薬組成物は、多量体および他の療法剤（存在する場合）の徐放またはパルス放出を可能にするような様式で製剤化され得るデポー注射またはインプラント製剤の形態で投与することもできる。
【００７４】
医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、（ａ）凍結乾燥防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）充填剤；（ｄ）等張化剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）保存剤および／または（ｇ）緩衝液を含んでもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の緩衝液がトリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。医薬組成物はまた、凍結乾燥防止剤、例えば、スクロース、ソルビトールまたはトレハロースを含んでもよい。特定の実施形態では、医薬組成物が保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸およびこれらの種々の混合物を含む。他の実施形態では、医薬組成物が充填剤、例えば、グリシンを含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物が界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５、ポロキサマー１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエート、またはこれらの組み合わせを含む。医薬組成物はまた、等張化剤、例えば、製剤をヒト血液と実質的に等張性または等浸透圧性にする化合物を含んでもよい。代表的な等張化剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、ブドウ糖、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよびアルギニン塩酸塩が含まれる。他の実施形態では、医薬組成物が安定剤、例えば、対象となるタンパク質と組み合わせると、凍結乾燥形態または液体形態の対象となるタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に防ぐまたは低下させる分子をさらに含む。代表的な安定剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよびアルギニン塩酸塩が含まれる。
【００７５】
医薬組成物は、任意の適当な様式でパッケージ化することができる。一実施形態では、医薬組成物がＡｄＢ−２／３ファイバー多量体の容器（バイアルなど）を含むキットとしてパッケージ化される。好ましい実施形態では、キットが、同じまたは別々の容器（バイアルなど）中に、ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と一緒に対象に投与するための療法剤、診断剤またはイメージング剤をさらに含む。
【００７６】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）本発明の１種または複数の組換えポリペプチド／ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体、単離核酸、組換え発現ベクター、および／または宿主細胞と；（ｂ）上皮組織に関連する障害の治療に使用するための説明書とを含むキットを提供する。キットは、本発明の方法に使用するための療法剤をさらに含んでもよい。
【００７７】
さらなる態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害の治療的処置もしくは診断を強化する、および／または上皮組織を画像化する方法であって、
（ａ）障害を治療するのに十分な量の１種または複数の療法剤、障害を診断するのに十分な量の診断剤、および／または上皮組織を画像化するのに十分な量のイメージング剤と；
（ｂ）１種または複数の療法剤、診断剤および／またはイメージング剤の有効性を強化するのに十分な量の本発明のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体、または本発明の医薬組成物と
を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７８】
本発明のこの態様の方法を使用して、療法剤、診断剤および／またはイメージング剤の標的への接近および上皮組織中の散在を改善することによって上皮組織に関連する障害の治療的処置、診断または画像化を強化することができる。いかなる機構によっても拘束されるものではないが、本発明者らは、これが相補的機構を通して起こると考えている：モノクローナル抗体などの受容体を標的化する療法剤、診断剤および／またはイメージング剤による上皮組織標的へのより良い接近、ならびに細胞間結合の破壊を通した療法剤のより良い浸透を可能にする、基底細胞表面から頂端細胞表面への標的受容体の移動。ＤＳＧ２は、ＡｄＢ−２／３のための主要な高親和性受容体である。ＤＳＧ２は、カドヘリンタンパク質ファミリーに属するカルシウム結合膜貫通糖タンパク質である。上皮細胞では、ＤＳＧ２が細胞−細胞接着構造の成分である。その細胞質尾部が、細胞接着および細胞間結合／細胞形態の制御因子と直接接触している一連のタンパク質と相互作用する。胃がん、扁平上皮癌、メラノーマ、転移性前立腺がんおよび膀胱がんを含む一連の上皮悪性腫瘍でＤＳＧ２が過剰発現していることが示されている。
【００７９】
特定の作用機構によって拘束されるものではないが、本発明者らは、ＤＳＧ２へのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体の結合が、細胞間結合の一過性ＤＳＧ２媒介開口を誘因するのに役立ち、これがそうでなければ少なくともある程度細胞間結合に捕捉される、上皮細胞中の標的に結合する対象となる療法剤、診断剤、イメージング剤または任意の他の化合物の接近を改善するのに役立つと考えている。このような活性の詳細な例を本明細書で提供する。したがって、本発明の方法を、細胞間結合の一過性ＤＳＧ２媒介開口を誘因するための本発明の任意のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を用いて行うことができる。これらの方法に使用することができる本発明の１種または複数のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を含む代表的な多量体には、それだけに限らないが、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３  １２面体粒子（ＰｔＤｄ）（複製中にＡｄＢ−２／３によって産生されるサブウイルス１２面体粒子）、および組換えＡｄＢ−２／３ファイバー多量体が含まれる。
【００８０】
ＤＳＧ２は上皮細胞で広く発現しているので、本発明の方法は、任意の療法剤、診断剤、イメージング剤または他の化合物を、対象となる標的の接近が限定され得る細胞間結合を含む上皮組織に送達するための広範な用途を有する。本明細書で使用される場合、「上皮組織に関連する障害」は、上皮細胞／上皮組織に／にわたって投与される療法剤、診断剤またはイメージング剤が、療法、診断および／または画像化有効性の改善のいずれにせよ、患者に臨床的有用性をもたらす任意の障害である。このような障害には、それだけに限らないが、固形腫瘍（すなわち、上皮細胞結合を有する任意の腫瘍）、胃腸障害（それだけに限らないが、過敏性腸症候群、炎症性腸障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、便秘、胃食道逆流症、バレット食道等を含む）、皮膚疾患（それだけに限らないが、乾癬および皮膚炎を含む）、肺障害（それだけに限らないが、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、肺炎、膵管障害、脳障害（すなわち、血液脳関門を通る薬剤の輸送の改善から利益を得る任意の脳障害）、原発性肺高血圧、肺塞栓症、肺サルコイドーシス、結核等を含む）、腎障害（それだけに限らないが、糸球体腎炎を含む）、肝疾患（それだけに限らないが、肝炎を含む）、内分泌障害（それだけに限らないが、糖尿病および甲状腺障害を含む）、膵管障害（それだけに限らないが、膵炎を含む）、および胆管障害（それだけに限らないが、胆管閉塞、胆嚢炎、総胆管結石、胆石等を含む）、および上皮組織の感染症（それだけに限らないが、蜂窩織炎、肺炎、肝炎および腎盂腎炎を含む）が含まれる。１つの好ましい実施形態では、上皮組織に関連する障害が、それだけに限らないが、乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、皮膚腫瘍、内分泌腫瘍、胃腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、子宮頸部腫瘍、腎腫瘍、メラノーマ、膵腫瘍、肝腫瘍、脳腫瘍、頭頸部腫瘍、上咽頭腫瘍、胃腫瘍、扁平細胞癌、腺癌、膀胱腫瘍および食道腫瘍を含む固形腫瘍を含む。当業者によって理解されるように、このような腫瘍には、原発性腫瘍、局所浸潤腫瘍ならびに転移した腫瘍が含まれる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「有効性を強化する」とは、療法剤、診断剤および／またはイメージング剤単独で使用して見られるものに対する療法、診断および／または画像化有効性の任意の増加を意味する。例えば、療法有効性の測定は、治療している障害に応じて変化するが、主治医によって容易に確認される。例えば、有効性のこのような増加には、それだけに限らないが、療法剤単独による治療に対する以下の１つまたは複数の増加が含まれる：（ａ）障害の重症度の減少；（ｂ）治療している障害に特有の症状の発達の限定または予防；（ｃ）治療している障害に特有の症状の悪化の抑制；（ｄ）以前障害を有していた患者における障害の再発の限定または予防；および（ｅ）以前障害について症候性であった患者の症状の再発の限定または予防。１つの非限定的例では、固形腫瘍の治療により、上皮細胞の基底側からの腫瘍受容体の出現を誘導して、腫瘍の接近および死滅を改善することを可能にする能力が得られる。
【００８２】
がんについては、腫瘍反応を定義する基準および反応を測定する標準法が存在する。これらには、腫瘍サイズおよび疾患の血清マーカーの変化を監視することによって測定される腫瘍反応が含まれる。部分奏効は腫瘍の５０％超の減少であり、完全奏功は腫瘍の完全な消失として定義される。腫瘍を測定する方法は医師に周知であり、これには身体検査、放射線検査（ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴスキャン、Ｘ線など）、ならびに血清マーカー（前立腺がんを監視するために使用される前立腺特異抗原など）が含まれる。がん治療の療法有効性の他の尺度には、憎悪、無憎悪生存および全生存の時間の測定が含まれる。
【００８３】
診断有効性の改善には、それだけに限らないが、診断検査の特異性および／または感度の増加を含む、診断剤単独の投与と比べた有効性の任意の改善が含まれる。画像化有効性の改善には、それだけに限らないが、特異性、感度、再現性、コントラスト増強、疾患のより小さな部位の検出、腫瘍、膿瘍などの疾患のサイズおよび形状などの疾患のより正確な描写等を含む、イメージング剤単独の投与と比べた有効性の任意の増加が含まれる。
【００８４】
種々の実施形態では、有効性の増加が、患者集団にわたって療法剤、診断剤および／またはイメージング剤単独による有効性と比べて５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上の利益となる。
【００８５】
本発明の方法を用いて、任意の適当な対象、好ましくはヒト対象を治療することができる。
【００８６】
上皮組織を標的化し、かつその上皮組織への送達が細胞間結合の一過性開口によって改善され得る任意の療法剤、診断剤、イメージング剤、または他の化合物を本発明の方法に使用することができる。一実施形態では、療法剤が抗体、免疫複合体、ナノ粒子、核酸療法剤およびこれらの組み合わせ、化学療法剤、ワクチン、放射性粒子／放射線療法（「放射線」）、養子Ｔ細胞療法および樹状細胞療法を含む細胞免疫療法（例えば、投与されたＴ細胞の腫瘍内侵入）、吸入療法剤、遺伝子治療構築物（それだけに限らないが、遺伝子治療ベクターとしてのＡｄＢ−２／３ウイルス、およびＡｄ５系遺伝子治療ベクターとの同時投与を含む）、他の核酸療法剤、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００８７】
種々の実施形態では、療法剤がアルキル化剤、血管新生阻害薬、抗体、代謝拮抗薬、抗有糸分裂薬、抗増殖薬、オーロラキナーゼ阻害薬、アポトーシス促進剤（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｆｌ−１）阻害薬、デスレセプター経路の活性化薬、Ｂｃｒ−Ａｂ１キナーゼ阻害薬、ＢｉＴＥ（Ｂｉ特異的Ｔ細胞結合）抗体、生物学的反応修飾物質、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、増殖因子阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０阻害剤、脱メチル化剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害薬、ホルモン療法、免疫学、アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）挿入抗生物質、キナーゼ阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質阻害剤、マイクロＲＮＡのマイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤、多価結合タンパク質、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、白金化学療法薬、ポロ様キナーゼ（Ｐｌｋ）阻害剤、プロテアソーム阻害薬、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド／デルトイド植物アルカロイド、小型抑制リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、トポイソメラーゼ阻害剤などからなる群から選択される。
【００８８】
これらの種々のクラスに入る代表的な療法剤には、それだけに限らないが、ドセタキセル、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、パクリタキセルアルブミン結合粒子（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ドキソルビシンＨＣＬリポソーム（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、ＢｉＴＥ抗体（アデカツムマブ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ２０１）、ブリナツモマブ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ１０３）など）、ｓｉＲＮＡ系療法剤、アルトレタミン、ＡＭＤ−４７３、ＡＰ−５２８０、アパジコン、ベンダムスチン、ブロスタリシン、ブスルファン、カルボコン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル、ＣＬＯＲＥＴＡＺＩＮＥ（登録商標）（ラロムスチン、ＶＮＰ４０１０１Ｍ）、シクロホスファミド、デカルバジン、デシタビン、５’−アザシチジン、エストラムスチン、フォテムスチン、グルホスファミド、イホスファミド、ＫＷ−２１７０、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マホスファミド、メルファラン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ニムスチン、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、ラニムスチン、テモゾロミド、チオテパ、ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標）（ベンダムスチン）、トレオスルファン、ロホスファミドなどを含むアルキル化剤；内皮特異的受容体チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ−２）阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、インスリン成長因子−２受容体（ＩＧＦＲ−２）阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤、トロンボスポンジン類似体、血管内皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤などを含む血管新生阻害薬；ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（ペメトレキセド二ナトリウム、ＬＹ２３１５１４、ＭＴＡ）、５−アザシチジン、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）（カペシタビン）、カルモフール、ＬＥＵＳＴＡＴ（登録商標）（クラドリビン）、クロファラビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、シトシンアラビノシド、デシタビン、デフェロキサミン、ドキシフルリジン、エフロルニチン、ＥＩＣＡＲ（５−エチニル−１β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド）、エノシタビン、エチニルシチジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル（単独またはロイコボリンとの組み合わせ）、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、ヒドロキシウレア、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標）（メルファラン）、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、メトトレキサート、メトトレキサート類似体（トリメトレキサートおよびプララトレキサートなど）、ミコフェノール酸、ネララビン、ノラトレキシド、オクホスファート、ペレトレキソール、ペントスタチン、ラルチトレキセド、リバビリン、トリアピン、トリメトレキサート、Ｓ−１、チアゾフリン、テガフール、ＴＳ−１、ビダラビンなどを含む代謝拮抗薬；ＡＴ−１０１（（−）ゴシポール）、ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標）（Ｇ３１３９またはオブリメルセン（Ｂｃｌ−２標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド））、ＩＰＩ−１９４、ＩＰＩ−５６５、Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド）（ＡＢＴ−７３７）、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド（ＡＢＴ−２６３）、ＧＸ−０７０（オバトクラックス）などを含むＢｃｌ−２タンパク質阻害薬；ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ（登録商標）（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（イマチニブ）などを含むＢｃｌ−Ａｂ１キナーゼ阻害薬；ＡＺＤ−５４３８、ＢＭＩ−１０４０、ＢＭＳ−０３２、ＢＭＳ−３８７、ＣＶＴ−２５８４、フラボピリドール、ＧＰＣ−２８６１９９、ＭＣＳ−５Ａ、ＰＤ０３３２９９１、ＰＨＡ−６９０５０９、セリシクリブ（ＣＹＣ−２０２、Ｒ−ロスコビチン）、ＺＫ−３０４７０９などを含むＣＤＫ阻害薬；ＡＢＸ−ＥＧＦ、抗ＥＧＦＲイムノリポソーム、ＥＧＦワクチン、ＥＭＤ−７２００、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＨＲ３、ＩｇＡ抗体、ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エロチニブまたはＯＳＩ−７７４）、ＴＰ−３８、ＥＧＦＲ融合タンパク質、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）などを含むＥＧＦＲ阻害薬；ＣＰ−７２４−７１４、ＣＩ−１０３３（カネルチニブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）（２Ｃ４、ペツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ＧＷ−５７２０１６（イオナファルニブ（ｉｏｎａｆａｒｎｉｂ））、ＧＷ−２８２９７４、ＥＫＢ−５６９、ＰＩ−１６６、ｄＨＥＲ２（ＨＥＲ２ワクチン）、ＡＰＣ−８０２４（ＨＥＲ−２ワクチン）、抗ＨＥＲ／２ｎｅｕ二重特異性抗体、Ｂ７．ｈｅｒ２ＩｇＧ３、ＡＳ  ＨＥＲ２三機能二重特異性抗体、ｍＡｂ  ＡＲ−２０９、ｍＡｂ−２Ｂ−１などを含むＥｒｂＢ２受容体阻害剤；ロミデプシン、ＬＡＱ−８２４、ＭＳ−２７５、トラポキシン、ヒドロキサミン酸スベロイルアニリド（ＳＡＨＡ）、ＴＳＡ、バルプロ酸などを含むヒストン脱アセチル化酵素阻害薬；１７−ＡＡＧ−ｎａｂ、１７−ＡＡＧ、ＣＮＦ−１０１、ＣＮＦ−１０１０、ＣＮＦ−２０２４、１７−ＤＭＡＧ、ゲルダナマイシン、ＩＰＩ−５０４、ＫＯＳ−９５３、ＭＹＣＯＧＲＡＢ（登録商標）（ＨＳＰ−９０に対するヒト組換え抗体）、ＮＣＳ−６８３６６４、ＰＵ２４ＦＣ１、ＰＵ−３、ラディシコール、ＳＮＸ−２１１２、ＳＴＡ−９０９０、ＶＥＲ４９００９などを含むＨＳＰ−９０阻害剤；ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬまたはデスレセプター（例えば、ＤＲ４およびＤＲ５）を標的化する抗体または他の剤、例えば、Ａｐｏｍａｂ、コナツムマブ、ＥＴＲ２−ＳＴ０１、ＧＤＣ０１４５、（レキサツムマブ）、ＨＧＳ−１０２９、ＬＢＹ−１３５、ＰＲＯ−１７６２およびトラスツズマブを含むデスレセプター経路の活性化薬；シスプラ��ン、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）（オキサリプラチン）、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標）（カルボプラチン）、サトラプラチン、ピコプラチンなどを含む白金化学療法薬；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＡＢＴ−８６９、ＡＥＥ−７８８、アキシチニブ（ＡＧ−１３７３６）、ＡＺＤ−２１７１、ＣＰ−５４７、６３２、ＩＭ−８６２、ＭＡＣＵＧＥＮ（ペガプタニブ）、ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）（ソラフェニブ、ＢＡＹ４３−９００６）、パゾパニブ（ＧＷ−７８６０３４）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４）、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ、ＳＵ−１１２４８）、ＶＥＧＦトラップ、ＺＡＣＴＩＭＡＴｈｉ（バンデタニブ、ＺＤ−６４７４）などを含むＶＥＧＦＲ阻害薬；樹状細胞療法（シプリューセルＴ、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））；アクラルビシン、９−アミノカンプトテシン、アモナフィド、アムサクリン、ベカテカリン、ベロテカン、ＢＮ−８０９１５、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）（イリノテカン塩酸塩）、カンプトテシン、デクスラゾキシン、ジフロモテカン、エドテカリン、ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標）またはＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ（登録商標）（エピルビシン）、エトポシド、エキサテカン、アブラキサン、イレノテカン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ジャイマテカン、ラルトテカン、ミトキサントロン、オラテシン、ピラルビシン、ピキサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、ＳＮ−３８、タフルポシド、トポテカンなどを含むトポイソメラーゼ阻害剤；ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＣＤ４０特異性抗体、ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ、デノスマブ、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＨＵＭＡＸ−ＣＤ４（登録商標）（ザノリムマブ）、ＩＧＦ  ＩＲ特異性抗体、リンツズマブ、ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標）（エドレコロマブ）、ＲＥＮＣＡＲＥＸ（登録商標）（ＷＸ  Ｇ２５０）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、チシリムマブ、トラスツズマブなどを含む抗体；ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン）、アルゾキシフェン、ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標）（ビカルタミド）、ＣＥＴＲＯＴＩＤＥ（登録商標）（セトロレリクス）、デガレリクス、デスロレリン、ＤＥＳＯＰＡＮ（登録商標）（トリロスタン）、デキサメタゾン、ＤＲＯＧＥＮＩＬ（登録商標）（フルタミド）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）（ラロキシフェン）、ＡＦＥＭＡ（登録商標）（ファドロゾール）、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（トレミフェン）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール）、ホルメスタン、グルココルチコイド、ＨＥＣＴＯＲＯＬ（登録商標）（ドキセルカルシフェロール）、ＲＥＮＡＧＥＬ（登録商標）（炭酸セベラマー）、ラソフォキシフェン、酢酸リュープロリド、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（メゲステロール）、ＭＩＦＥＰＲＥＸ（登録商標）（ミフェプリストン）、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標）（ニルタミド）、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（クエン酸タモキシフェン）、ＰＬＥＮＡＸＩＳ（登���商標）（アバレリクス）、プレドニソン、ＰＲＯＰＥＣＩＡ（登録商標）（フィナステリド）、リロスタン、ＳＵＰＲＥＦＡＣＴ（登録商標）（ブセレリン）、ＴＲＥＬＳＴＡＲ（登録商標）（黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ））、ＶＡＮＴＡＳ（登録商標）（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎインプラント）、ＶＥＴＯＲＹＬ（登録商標）（トリロスタンまたはモドラスタン）、ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）（フォスレリン、ゴセレリン）などを含むホルモン療法；インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａ、ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（インターフェロンγ−１ｂ）またはインターフェロンγ−ｎ１、これらの組み合わせなどを含む免疫学；ＡＬＦＡＦＥＲＯＮＥ（登録商標）（ＩＦＮ−α）、ＢＡＭ−００２（酸化グルタチオン）、ＢＥＲＯＭＵＮ（登録商標）（タソネルミン）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（トシツモマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）、デカルバジン、デニロイキン、エプラツズマブ、ＧＲＡＮＯＣＹＴＥ（登録商標）（レノグラスチム）、レンチナン、白血球αインターフェロン、イミキモド、ＭＤＸ−０１０（抗ＣＴＬＡ４）、メラノーマワクチン、ミツモマブ、モルグラモスチム、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブオゾガミシン）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（フィルグラスチム）、ＯｎｃｏＶＡＣ−ＣＬ、ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）（オレゴボマブ）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）（シプロイセルＴ）、サルグラモスチム、シゾフィラン、テセロイキン、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標）（カルメット−ゲラン桿菌）、ウベニメクス、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（登録商標）（免疫療法、Ｌｏｒｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｚ−１００（Ｍａｒｕｙａｍａの特異的物質（ＳＳＭ））、ＷＦ−１０（テトラクロロデカオキシド（ＴＣＤＯ））、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）（アルデスロイキン）、ＺＡＤＡＸＩＮ（登録商標）（サイマルファシン）、ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（ダクリズマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（９０Ｙ−イブリツモマブ・チウキセタン）などを含む他の薬剤；シタラビン（アラＣまたはアラビノシドＣ）、シトシンアラビノシド、ドキシフルリジン、Ｆ
ＬＵＤＡＲＡ（登録商標）（フルダラビン）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、フロクスウリジン、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、ＴＯＭＵＤＥＸ（登録商標）（ラルチトレキセド）、ＴＲＯＸＡＴＹＬ（登録商標）（トリアセチルウリジン・トロキサシタビン）などを含むピリミジン類似体；ＬＡＮＶＩＳ（登録商標）（チオグアニン）およびＰＵＲＩ−ＮＥＴＨＯＬ（登録商標）（メルカプトプリン）を含むプリン類似体；ベタブリン、エポチロンＤ（ＫＯＳ−８６２）、Ｎ−（２−（（４−ヒドロキシフェニル）アミノ）ピリジン−３−イル）−４−メトキシベンゼンスルホンアミド、イキサベピロン（ＢＭＳ２４７５５０）、パクリタキセル、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＰＮＵ１００９４０（１０９８８１）、パツピロン、ＸＲＰ−９８８１（ラロタキセル）、ビンフルニン、ＺＫ−ＥＰＯ（合成エポチロン）などを含む抗有糸分裂薬；ならびにＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢＩ−００７）、ＡＢＴ−１００（ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＡＤＶＥＸＩＮ（登録商標）（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ワクチン）、ＡＬＴＯＣＯＲ（登録商標）またはＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）（ロバスタチン）、ＡＭＰＬＩＧＥ（登録商標）（ポリＩ：ポリＣ１２Ｕ、合成ＲＮＡ）、ＡＰＴＯＳＹＮ（登録商標）（エクシスリンド）、ＡＲＥＤＬＡ（登録商標）（パミドロン酸）、アルグラビン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アタメスタン（１−メチル−３，１７−ジオン−アンドロスタ−１，４−ジエン）、ＡＶＡＧＥ（登録商標）（タザロテン）、ＡＶＥ−８０６２（コンブレタスタチン誘導体）、ＢＥＣ２（ミツモマブ）、カケクチンまたはカケキシン（腫瘍壊死因子）、カンバキシン（ワクチン）、ＣＥＡＶＡＣ（登録商標）（がんワクチン）、ＣＥＬＥＵＫ（登録商標）（セルモロイキン）、ＣＥＰＬＥＮＥ（登録商標）（ヒスタミン二塩酸塩）、ＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標）（ヒトパピローマウイルスワクチン）、ＣＨＯＰ（登録商標）（Ｃ：ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）（シクロホスファミド）；Ｈ：ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ヒドロキシドキソルビシン）；Ｏ：ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；Ｐ：プレドニソン）、ＣＹＰＡＴ（登録商標）（酢酸シプロテロン）、コンブレスタチンＡ４Ｐ、ＤＡＢ（３８９）ＥＧＦ（Ｈｉｓ−Ａｌａリンカーを介してヒト上皮増殖因子に融合したジフテリア毒素の触媒および転移ドメイン）またはトランスＭＩＤ−１０７Ｒ（登録商標）（ジフテリア毒素）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、エニルウラシル、ＥＶＩＺＯＮ（商標）（乳酸スクアラミン）、ＤＩＭＥＲＩＣＩＮＥ（登録商標）（Ｔ４Ｎ５リポソームローション）、ディスコデルモリド、ＤＸ−８９５１ｆ（メシル酸エキサテカン）、エンザスタウリン、ＥＰＯ９０６（エピチロンＢ）、ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）（四価ヒトパピローマウイルス（６、１１、１６、１８型）組換えワクチン）、ＧＡＳＴＲＩＭＭＵＮＥ（登録商標）、ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標）、ＧＭＫ（ガングリオシドコンジュゲートワクチン）、ＧＶＡＸ（登録商標）（前立腺がんワクチン）、ハロフジノン、ヒステレリン、ヒドロキシカルバミド、イバンドロン酸、ＩＧＮ−１０１、ＩＬ−１３−ＰＥ３８、ＩＬ−１３−ＰＥ３８ＱＱＲ（シントレデキン・ベスドトクス）、ＩＬ−１３−シュードモナス外毒素、インターフェロンα、インターフェロンγ、ＪＵＮＯＶＡＮ（登録商標）またはＭＥＰＡＣＴ（登録商標）（ミファムルチド）、ロナファルニブ、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、ミルテホシン（ヘキサデシルホスホコリン）、ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＡＥ−９４１）、ＮＥＵＴＲＥＸＩＮ（登録商標）（グルクロン酸トリメトレキサート）、ＮＩＰＥＮＴ（登録商標）（ペントスタチン）、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（登録商標）（リボヌクレアーゼ酵素）、ＯＮＣＯＰＨＡＧＥ（登録商標）（メラノーマワクチン治療）、ＯＮＣＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＬ−２ワクチン）、ＯＲＡＴＨＥＣＩＮ（登録商標）（ルビテカン）、ＯＳＩＤＥＭ（登録商標）（抗体に基づく細胞薬剤）、ＯＶＡＲＥＸ（登録商標）ＭＡｂ（マウスモノクローナル抗体）、パクリタキセル、ＰＡＮＤＩＭＥＸ（登録商標）（２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（ａＰＰＤ）および２０（Ｓ）プロトパナキサトリオール（ａＰＰＴ）を含むニンジンからのアグリコンサポニン）、パニツムマブ、ＰＡＮＶＡＣ（登録商標）−ＶＦ（治験がんワクチン）、ペグアスパラガーゼ、ＰＥＧインターフェロンＡ、フェノキソジオール、プロカルバジン、レビマスタット、ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標）（カツマキソマブ）、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）、ＲＳＲ１３（エファプロキシラル）、ＳＯＭＡＴＵＬＩＮＥ（登録商標）ＬＡ（ランレオチド）、ＳＯＲＩＡＴＡＮＥ（登録商標）（アシトレチン）、スタウロスポリン（ストレプトマイセス属星状胞子）、タラボスタット（ＰＴ１００）、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）（ベキサロテン）、ＴＡＸＯＰＲＥＸＩＮ（登録商標）（ＤＨＡ−パクリタキセル）、ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）（カンフォスファミド、ＴＬＫ２８６）、テミリフェン、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）（テモゾロミド）、テスミリフェン、サリドマイド、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）（ＳＴｎ−ＫＬＨ）、チミタク（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−メチル−４−オキソ−５−（４−ピリジルチオ）キナゾリン二塩酸塩）、ＴＮＦＥＲＡＤＥ（登録商標）（アデノベクター：腫瘍壊死因子αに関する遺伝子を含むＤＮＡキャリア）、ＴＲＡＣＬＥＥＲ（登録商標）またはＺＡＶＥＳＣＡ（登録商標）（ボセンタン）、トレチノイン（Ｒｅｔｉｎ−Ａ）、テトランドリン、ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標）（三酸化ヒ素）、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（登録商標）、ウクライン（クサノオウ植物のアルカロイドの誘導体）、ビタキシン（抗αβ３抗体）、ＸＣＹＴＲＩＮ（登録商標）（モテキサフィンガドリニウム）、ＸＩＮＬＡＹ（登録商標）（アトラセンタン）、ＸＹＯＴＡＸ（登録商標）（パクリタキセル・ポリグルメックス）、ＹＯＮＤＥＬＩＳ（登録商標）（トラベクテジン）、ＺＤ−６１２６、ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標）（デクスラゾキサン）、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）（ゾレドロン酸）、クリゾチニブ、ゾルビシンなどの他の化学療法薬が含まれる。
【００８９】
別の好ましい実施形態では、療法剤が、デスモグレイン２に結合する化合物；好ましくはＤＳＧ２に結合して、密着結合を開ける化合物を含む。
【００９０】
他の実施形態では、療法剤が放射性粒子／放射線療法を含む。それだけに限らないが、コバルト６０、ヨウ素１３１、イリジウム１９２、ストロンチウム８９、サマリウム１５３、レニウム１８６および鉛２１２を含む任意の適当な放射性療法または粒子を主治医によって適当とみなされるように使用することができる。
【００９１】
好ましい実施形態では、療法剤が抗腫瘍療法剤であり、本明細書に記載される化学療法薬または抗腫瘍モノクローナル抗体を含む。さらなる好ましい実施形態では、抗腫瘍療法剤が、トラスツズマブ、セツキシマブ、ペツズマブ、アポマブ、コナツムマブ、レキサツムマブ、ベバシズマブ、ベバシズマブ、デノスマブ、ザノリムマブ、リンツズマブ、エドレコロマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、エプラツズマブ、ミツモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、オレゴボマブ、ペムツモマブダクリズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、オファツムマブおよびイブリツモマブからなる群から選択される抗体を含む。有用な抗腫瘍ｍＡｂおよびその具体的使用の非限定的例は、上の表１に列挙され、参照により本明細書に組み込まれるＣａｍｐｏｌｉ，Ｍ．等、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３（１＆２）：１〜１９（２００９）にさらに記載されている通りである。
【００９２】
モノクローナル抗体療法剤は、それだけに限らないが、標準的なモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル、マウスまたは他の供給源から産生された完全ヒト抗体、キメラモノクローナル、およびこれらの断片を含む任意の型のモノクローナル抗体であり得る。「ヒト化モノクローナル抗体」は、マウスモノクローナル抗体などの非ヒトモノクローナル抗体由来のモノクローナル抗体を指す。あるいは、ヒト化モノクローナル抗体は、親の非ヒトモノクローナル抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持しているが、ヒトに投与すると親モノクローナル抗体と比べて減少した免疫原性を示すキメラ抗体に由来し得る。例えば、キメラモノクローナル抗体は、ヒトおよびマウス抗体断片、一般的にはヒト定常領域およびマウス可変領域を含むことができる。ヒト化モノクローナル抗体は、それだけに限らないが、（１）非ヒトモノクローナル抗体の相補性決定領域を、ヒトフレームワーク領域および定常領域に合体させること（「ヒト化」）、および（２）非ヒトモノクローナル抗体可変ドメインを移植するが、これらを表面残基の置換によってヒト様表面を用いて「クローキング」すること（「ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」）を含む、当技術分野で知られている種々の方法を用いて調製することができる。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５〜９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９〜４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９〜２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３〜８３（１９９１）に開示されている。モノクローナル抗体を、従来技術を用いて断片化し、断片を全抗体に関するのと同様に有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによってＦ（ａｂ’）２断片を作成することができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片を処理してジスルフィド架橋を減少させてＦａｂ’断片を作成することができる。ＩｇＧ抗体をパパインで処理することによってＦａｂ断片を得ることができ；ＩｇＧ抗体のペプシン消化によってＦ（ａｂ’）断片を得ることができる。チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して下記のＦａｂ’を結合することによってＦ（ａｂ’）断片を作成することもできる。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２断片を、ジチオトレイトールなどの還元剤で処理することによってＦａｂ’断片を得ることができる。抗体断片ペプチドは、組換え細胞中でのこのようなペプチドをコードする核酸の発現によって作成することもできる（例えば、Ｅｖａｎｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８４：１２３〜３８（１９９５）参照）。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよびＨ鎖のヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列、引き続いてこのような切断抗体断片分子をもたらすための翻訳停止コドンを含むことができる。モノクローナル抗体断片の非限定的例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ  Ｉドメインから本質的になる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから本質的になるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから本質的になるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインから本質的になる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ等（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；および（ｖｉ）１つもしくは複数の単離ＣＤＲまたは機能的パラトープが挙げられる。
【００９３】
本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせと組み合わせることができる１つの好ましい実施形態では、障害がＨｅｒ２陽性腫瘍を含み、方法が単独でまたは化学療法薬、放射線もしくはこれらの組み合わせと組み合わせて、本発明のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を適当なモノクローナル抗体療法と一緒に同時投与するステップを含む。さらなる好ましい実施形態では、モノクローナル抗体がトラスツズマブである。これらの実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらなる好ましい実施形態では、Ｈｅｒ２陽性腫瘍が乳房腫瘍、胃腫瘍、結腸腫瘍および卵巣腫瘍からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態では、方法が、腫瘍寛解の欠如、腫瘍再発またはトラスツズマブに対する耐性の発達などによって、トラスツズマブに対して十分に反応しなくなった患者で行われる。これらの実施形態の方法を使用して、療法有効性を得るために要求されるトラスツズマブの投与量を減少させるのを助けることもできるので、これらの方法は副作用（トラスツズマブ関連心毒性など）を制限するのに役立ち得る。
【００９４】
本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせと組み合わせることができる別の好ましい実施形態では、障害がＥＧＦＲ陽性腫瘍を含み、方法が単独でまたは化学療法薬、放射線もしくはこれらの組み合わせと組み合わせて、ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を適当なモノクローナル抗体療法と一緒に同時投与するステップを含む。さらなる好ましい実施形態では、モノクローナル抗体がセツキシマブである。これらの実施形態のいずれかと組み合わせることができるさらなる好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ陽性腫瘍が、肺腫瘍、結腸腫瘍、乳房腫瘍、直腸腫瘍、頭頸部腫瘍および膵腫瘍からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態では、方法が、腫瘍寛解の欠如、腫瘍再発またはセツキシマブに対する耐性の発達などによって、セツキシマブに対して十分に反応しなくなった患者で行われる。これらの実施形態の方法を使用して、療法有効性を得るために要求されるセツキシマブの投与量を減少させるのを助けることもできるので、これらの方法は副作用（セツキシマブ療法中にしばしば起こるざ瘡様発疹など）を制限するのに役立ち得る。
【００９５】
本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせと組み合わせることができる１つの好ましい実施形態では、障害が上皮腫瘍を含み、方法が単独でまたは化学療法薬、放射線もしくはこれらの組み合わせと組み合わせて、ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤と一緒に同時投与するステップを含む。それだけに限らないが、ベバシズマブを含む任意の適当なＶＥＧＦ阻害剤を使用することができる。
【００９６】
本明細書の任意の実施形態または実施形態の組み合わせと組み合わせることができるさらなる実施形態では、固形腫瘍に関する方法が、腫瘍間質タンパク質を分解することができる化合物を投与するステップをさらに含む。それだけに限らないが、リラキシン、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、ＭＭＰ（メタロプロテイナーゼ）１およびＭＭＰ８を含む、腫瘍間質タンパク質を分解するための任意の適当な化合物を使用することができる。このような化合物の送達は、遺伝子治療、ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体および療法剤の別々の投与、またはＡｄＢ−２／３ファイバーもしくは療法剤を含む抱合体としての投与を含む任意の適当な機構によることができる。
【００９７】
本明細書の任意の実施形態または実施形態の組み合わせと組み合わせることができるさらなる実施形態では、方法が、他の結合開口剤（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｐｅｎｅｒ）と組み合わせてＡｄＢ−２／３多量体を投与するステップをさらに含む。本明細書で使用される場合、「結合開口剤」は、細胞間結合を一過性に開くことができる化合物である。任意の適当な結合開口剤を使用することができる。１つの非限定的実施形態では、結合開口剤が、腸上皮結合を可逆的に変化させて、粘膜バリアを通る巨大分子の通過を可能にする能力を有する閉鎖帯毒素（Ｚｏｔ）、コレラ菌（Ｖｉｖｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）産生毒素を含む［Ｆａｓａｎｏ等（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：５２４２〜５２４６）］。Ｚｏｔ由来ヘキサペプチド（ＡＴ１００１）が開発されている。別の実施形態では、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）エンテロトキシンが、密着結合からクローディン３および４を除去して細菌侵入を促進する［Ｓｏｎｏｄａ  Ｎ等（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：１９５〜２０４］。さらなる実施形態では、ヒトＡｄ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶ−１によってコードされる腫瘍性タンパク質が、結合タンパク質ＺＯ−１を誤った場所に局在化させることによって上皮結合を一過性に開くことができる（Ｌａｔｏｒｒｅ  ＩＪ等（２００５）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１８：４２８３〜４２９３）。他の実施形態では、いくつかのヒトウイルスが密着結合または他の細胞結合分子に結合して上皮細胞への侵入を達成する。これらのウイルスの中にはＣ型肝炎ウイルス（Ｅｖａｎｓ  ＭＪ等（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ４４６：８０１〜８０５）、レオウイルス（Ｂａｒｔｏｎ  ＥＳ等（２００１）Ｃｅｌｌ  １０４：４４１〜４５１）および単純ヘルペスウイルス（Ｇｅｒａｇｈｔｙ  ＲＪ等（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１６１８〜１６２０）がある。
【００９８】
別の実施形態では、療法剤が吸入療法剤である。任意の適当な吸入療法剤を本発明の方法に使用することができる。種々の非限定的実施形態では、吸入療法剤がコルチコステロイド、気管支拡張薬、βアゴニスト、抗コリン薬、アルブテロール（ＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（登録商標）；ＶＥＮＯＬＩＮ（登録商標）；ＡＣＣＵＮＥＢ（登録商標）；ＰＲＯＡＩＲ（登録商標））、レバルブテロール（ＸＯＰＥＮＥＸ（登録商標））、ピルブテロール（ＭＡＸＡＩＲ（登録商標））、臭化イプラトロピウム（ＡＴＲＯＶＥＮＴ（登録商標））、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド（ＡＥＲＯＢＩＤ（登録商標））、フルチカゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルチカゾン（コルチコステロイド）およびサルメテロール（ＡＤＶＡＩＲ（登録商標））、ホルモテロール（長時間作用性βアゴニスト気管支拡張薬）およびブデソニド（コルチコステロイド）（ＳＹＭＩＣＯＲＴ（登録商標））、アルブテロール（βアゴニスト）およびイプラトロピウム（ＣＯＭＢＩＶＥＮＴ（登録商標）；抗コリン薬）（ブデソニド（ＰＵＬＭＩＣＯＲＴ  ＲＥＳＰＵＬＥＳ（登録商標））およびチオプロピウム（ＳＰＩＲＩＶＡ（登録商標）；抗コリン気管支拡張薬）からなる群から選択される。
【００９９】
別の実施形態では、化合物が診断剤またはイメージング剤を含む。本発明の方法は、任意の診断剤、イメージング剤または他の化合物を、対象となる標的の接近が限定され得る細胞間結合を含む上皮組織に送達するための広範な用途を有する。種々の非限定的実施形態では、イメージング剤が、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に産生することができる任意の化学化合物を含むことができる。多くのこのようなイメージング剤が当業者に知られている。開示されている方法および組成物に使用するのに適したイメージング剤の例には、放射性同位元素、蛍光分子、磁性粒子（ナノ粒子を含む）、金属粒子（ナノ粒子を含む）、リン光分子、酵素、抗体、リガンドおよびこれらの組み合わせがある一方で、診断剤はこのようなイメージング剤に結合した特定の上皮障害についての診断マーカーである化合物を含んでもよい。イメージング剤によって産生されるシグナルを検出および測定する方法も当業者に知られている。例えば、放射性同位元素はシンチレーション測定または直接可視化によって検出することができ；蛍光分子は蛍光分光光度計を用いて検出することができ；リン光分子は分光光度計を用いて検出するまたはカメラを用いて直接可視化することができ；酵素は酵素によって触媒される反応生成物の検出または可視化によって検出することができ；抗体は抗体に結合した二次検出ラベルを検出することによって検出することができる。１つの好ましい実施形態では、イメージング剤および／または診断剤が、直接腫瘍結合によっても、またはイメージング剤もしくは診断剤と腫瘍に結合することができる化合物とのカップリングによっても、腫瘍を検出するために使用することができるものである。
【０１００】
一例では、イメージング剤が蛍光イメージング剤を含むことができる一方で、診断剤が蛍光イメージング剤に結合した特定の上皮障害についての診断マーカーである化合物を含んでもよい。蛍光イメージング剤は、検出可能な蛍光シグナルを有する任意の化学部分である。このイメージング剤は、単独でまたは他のイメージング剤と組み合わせて使用することができる。本明細書に開示される組成物および方法に使用することができる適当な蛍光剤の例としては、それだけに限らないが、その組み合わせを含む、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、フルオレサミン、ＯＰＡ、ＮＤＡ、インドシアニン緑色染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７）、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−（３−ビニルスルホニル）フェニルナフタルイミド−３，５−ジスルホネート、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ、ブリリアントイエロー、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン１５１）、シアノシン、４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）、５−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリンジエチレントリアミンペンタアセテート、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート、臭化エチジウム、エチジウム、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、ｏ−フタルジアルデヒド、ピレン、ピレン酪酸、スクシンイミジル１−ピレン酪酸、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ［Ｒ］ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、��−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、５，６−テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、クマリン６などが挙げられる。これらの蛍光イメージング部分は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎ、オレゴン州およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、オハイオ州を含む種々の商業的供給業者から得ることができる、また当業者によって合成され得る。
【０１０１】
別の例では、イメージング剤が磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）剤を含むことができる一方で、診断剤がＭＲＩ剤に結合した特定の上皮障害についての診断マーカーである化合物を含んでもよい。ＭＲＩ剤は、検出可能な核磁気共鳴シグナルを有する、または別の剤の磁気共鳴シグナルに影響を及ぼす（例えば、増加させるまたはシフトさせる）ことができる任意の化学部分である。この型のイメージング剤は、単独でまたは他のイメージング剤と組み合わせて使用することができる。さらに別の例では、ガドリニウム系ＭＲＩ剤がイメージング剤として働くことができる。開示されているイメージング剤に組み込むことができる適当なＭＲＩ剤の例には、パラ−アミノ−ベンジルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｐ−ＮＨ２−Ｂｚ−ＤＴＰＡ、化合物７）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の抱合可能型があり、これはガドリニウムに強力に結合することが知られており、磁気共鳴造影剤としての臨床使用が承認されている。本明細書に開示されているような、ＭＲＩ剤のデンドリマー物質などの大型巨大分子への組込みにより、大きなＴ１緩和（高コントラスト）および単一分子での剤の複数コピーが可能になり、これによりシグナルが増加され得る。ＭＲＩイメージング剤および例えば、蛍光イメージング剤を組み合わせることによって、得られた剤を、ＭＲＩを介してリアルタイムで検出、画像下およびフォローすることができる。他のイメージング剤には、１８Ｆまたは６４Ｃｕもしくは６８Ｇａのためのキレート剤を組み込むことによって調製することができるＰＥＴ剤が含まれる。また、放射性核種の添加を用いてＳＰＥＣＴイメージングまたは放射線量の送達を促進することができる一方で、診断剤がＰＥＴ剤に結合した特定の上皮障害についての診断マーカーである化合物を含んでもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、診断剤が、それだけに限らないが、ポジトロン放射形断層撮影（ＰＥＴ）剤、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）剤、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）剤、核磁気イメージング剤（ＮＭＩ）、蛍光透視剤および超音波造影剤を含む診断イメージング剤である。このような診断剤には、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等を含むヨウ素（Ｉ）、バリウム（Ｂａ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、９９Ｔｃを含むテクニチウム（Ｔｃ）、３１Ｐを含むリン（Ｐ）、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｇ）、タリウム（Ｔｌ）、５１Ｃｒを含むクロム（Ｃｒ）、１４Ｃを含む炭素（Ｃ）などの元素の放射性同位元素、蛍光標識化合物、またはその錯体、キレート、付加物および抱合体が含まれる。それだけに限らないが、炭素１１、窒素１３、酸素１５、フッ素１８、１１Ｃ−メトミデート、およびそれだけに限らないが、フルデオキシグルコース（フッ素１８で標識されたグルコース類似体）を含むそのグルコース類似体を含む任意の適当なＰＥＴ剤を使用することができる。
【０１０３】
他の実施形態では、診断剤が細胞中で発現すると容易に検出可能なタンパク質（それだけに限らないが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなど）をコードするマーカー遺伝子および標識核酸プローブ（例えば、放射標識または蛍光標識プローブ）である。いくつかの実施形態では、診断剤またはイメージング剤と本明細書で提供されるＡｄＢ−２／３多量体の共有結合性抱合が、種々の抱合プロセスによって達成される。他の実施形態では、診断剤が提供されるＡｄＢ−２／３多量体と非共有結合的に会合される。
【０１０４】
さらなる態様では、本発明は、上皮組織への物質の送達を改善する方法であって、上皮組織を、（ａ）上皮組織に送達される１種または複数の化合物と；（ｂ）上皮組織への１種または複数の化合物の送達を強化するのに十分な量の本発明のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と接触させるステップを含む方法を提供する。この態様では、化合物が上に詳細に記載されているものなどの任意の適当な化合物であり得る。好ましい実施形態では、１種または複数の化合物がイメージング剤を含む。さらなる好ましい実施形態では、上皮組織が本出願に開示されているもののいずれかを含む固形腫瘍を含む。種々の非限定的実施形態では、固形腫瘍が乳房腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、子宮腫瘍、皮膚腫瘍、内分泌腫瘍、子宮頸部腫瘍、腎腫瘍、メラノーマ、膵腫瘍、肝腫瘍、脳腫瘍、頭頸部腫瘍、上咽頭腫瘍、胃腫瘍、扁平細胞癌、腺癌、膀胱腫瘍および食道腫瘍からなる群から選択される。これらの方法に使用することができる本発明の１種または複数のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を含む代表的な多量体には、それだけに限らないが、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３  １２面体粒子（ＰｔＤｄ）（複製中にＡｄＢ−２／３によって産生されるサブウイルス１２面体粒子）、および組換えＡｄＢ−２／３ファイバー多量体が含まれる。
【０１０５】
なおさらなる態様では、本発明は、デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を発現している細胞または組織への物質の送達を改善する方法であって、ＤＳＧ２を発現している細胞または組織を（ａ）細胞または組織に送達される１種または複数の化合物と；（ｂ）組織への１種または複数の化合物の送達を強化するのに十分な量の本発明のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と接触させるステップを含む方法を提供する。ＤＳＧ２を発現している代表的な組織型には、それだけに限らないが、上皮細胞／組織（本明細書に開示されているものなど）、ヒト血小板および顆粒球が含まれる。以下の例に示されるように、ＤＳＧ２は非分極細胞中で受容体としても作用する。したがって、これらの方法は上皮細胞および組織において用途を見出すのみならず、例えば、ＡｄＢ−２／３病因および遺伝子治療目的のためのＡｄＢ−２／３ベクターの血管内適用にも関連する。これらの方法に使用することができる本発明の１種または複数のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を含む代表的な多量体には、それだけに限らないが、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３  １２面体粒子（ＰｔＤｄ）（複製中にＡｄＢ−２／３によって産生されるサブウイルス１２面体粒子）、および組換えＡｄＢ−２／３ファイバー多量体が含まれる。
【０１０６】
なおさらなる態様では、本発明は、組織中の上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導する方法であって、上皮組織を、ＥＭＴを誘導するのに十分な量の本発明のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と接触させるステップを含む方法を提供する。ＥＭＴは、上皮細胞が細胞間結合などの特性を失い、間葉細胞の特性を獲得する細胞分化転換プログラムである。ＥＭＴは、間葉マーカーの発現増加、細胞外マトリックス化合物の発現増加、上皮マーカーの発現低下、転写因子の位置変化、およびキナーゼの活性化、および細胞間結合の分離によって特徴付けられる。これらの方法に使用することができる本発明の１種または複数のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を含む代表的な多量体には、それだけに限らないが、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３  １２面体粒子（ＰｔＤｄ）（複製中にＡｄＢ−２／３によって産生されるサブウイルス１２面体粒子）、および組換えＡｄＢ−２／３ファイバー多量体が含まれる。
【０１０７】
本発明の方法の態様および実施形態の全てで、療法剤、診断剤および／またはイメージング剤を（上に開示されている本発明の組成物を介するなどして）ＡｄＢ−２／３多量体と一緒に投与することができる、または別々に投与することができる。一実施形態では、療法剤とＡｄＢ−２／３多量体を、任意の適当な共有結合または非共有結合を介して結合させる。１つの非限定的実施形態では、ＡｄＢ−２／３多量体を毒素または他の薬剤と結合させて固形腫瘍細胞を死滅させることができる。
【０１０８】
ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体および／または療法剤は、投与の局所または全身様式のいずれが治療している状態に最も適しているかに応じて、主治医によって適当とみなされる任意の方法で投与することができる。本明細書で使用される場合、「全身送達」および「全身投与」という用語は、それだけに限らないが、筋肉内（ＩＭ）、皮下、静脈内（ＩＶ）、動脈内、吸入、舌下、頬側、局所、経皮、経鼻、直腸、膣内、および意図した療法作用の単一または複数部位への送達薬剤の分散を有効にもたらす他の投与経路を含む、経口および非経口経路を含むことが意図されている。本組成物のための全身送達の好ましい経路には、静脈内、筋肉内、皮下および吸入が含まれる。１つの好ましい実施形態では、例えば、播種性腫瘍の治療のため（およびモノクローナル抗体送達のため）に静脈内投与が使用される。別の実施形態では、例えば、胃腸（ＧＩ）上皮障害を治療するために経口送達が好まれ得る。別の実施形態では、例えば、肺上皮障害のための肺への送達のために経鼻またはエアゾール送達が好まれ得る。
【０１０９】
ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を脂質またはリポソームなどの別の分子と合わせて導入してポリペプチドを酵素分解から保護することができる。例えば、特定のタンパク質を体内での酵素加水分解から保護して、半減期を延長するために、ポリマー、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合が使用されている。
【０１１０】
ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体および／または療法剤は、所望のレベルの療法効果を維持するよう決定された間隔で定期的に全身投与することができる。例えば、静脈内注射による投与は、１日当たり１回、１週間当たり１回、２週間〜４週間毎に、またはより少ない頻度間隔であり得る。投与レジメンは、薬剤の組み合わせの作用に影響を及ぼし得る種々の因子を考慮して医師によって決定される。これらの因子には、治療している状態の進行度、患者の年齢、性別および体重、ならびに他の臨床的因子が含まれるだろう。ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体および／または療法剤についての投与量は、投与している多量体および／または療法剤、ならびに任意の薬剤送達ビヒクル（例えば、徐放送達ビヒクル）の存在および性質の関数として変化するだろう。さらに、投与量を、投与頻度および送達される薬剤の薬物動態挙動の変動の責任をとるよう調節することができる。ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体の投与量範囲は一般的に、０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは０．１０〜０．５ｍｇ／ｋｇの間に及ぶだろう。承認されている療法剤の投与量は、医師によって容易に同定可能である。療法剤を、がんなどの上皮組織への浸透強化により減少した用量で投与することもできる。
【０１１１】
ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を、療法剤の投与前、投与と同時または投与後に対象に投与することができる。好ましい実施形態では、療法剤およびＡｄＢ−２／３ファイバー多量体の投与が同時に行われる。ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体に対する療法剤の投与のタイミングを、最大の療法効果を達成するよう変えることができる。好ましくは、療法剤が、ＤＳＧ２に結合しているＡｄＢ−２／３ファイバー多量体によって引き起こされる細胞間結合の一過性開口との接触を確保する時に投与される。例えば、療法剤を、ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体の各投与前、投与と同時または投与後に投与することができる。他の好ましい実施形態では、療法剤が、ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体の投与後、例えば、ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体の投与の最大５分、１０分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間または最大９６時間後にさえ投与することができる。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害を治療する方法であって、障害を治療するのに十分な量の本発明のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。この実施形態では、他の療法剤が送達されない。非限定的実施形態では、ＡｄＢ−２／３ウイルス感染症、固形腫瘍、またはＡｄＢ−２／３系遺伝子送達ベクターを用いて治療することができる障害からなる群から選択される障害を治療するために単剤療法が使用される。例えば、固形腫瘍の治療では、方法が、例えば、侵入（既存のナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞または樹状細胞の腫瘍内侵入など）によって、免疫系細胞の障害の部位への接近を改善するステップを含む。方法を使用して免疫系の細胞の標的上皮細胞への接近の改善から利益を得ることができる上に論じられる上皮細胞に関連する障害のいずれかを治療することもできる。１つの好ましい実施形態では、障害が固形腫瘍であり、方法が腫瘍への免疫系の攻撃を改善するステップを含む。方法を上に論じられる固形腫瘍のいずれでも使用することができる。文脈上別段の意味を有することが明らかな場合を除き、本発明の第１の態様の全ての実施形態および実施形態の組み合わせをこの第２の態様にも同様に使用することができる。これらの方法に使用することができる本発明の１種または複数のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を含む代表的な多量体には、それだけに限らないが、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３  １２面体粒子（ＰｔＤｄ）（複製中にＡｄＢ−２／３によって産生されるサブウイルス１２面体粒子）、および組換えＡｄＢ−２／３ファイバー多量体が含まれる。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、上皮組織に関連する障害の治療、物質の上皮組織への送達の改善、物質のＤＳＧ２を発現している組織への送達の改善、組織中のＥＭＴの誘導、および／またはＡｄＢ−２／３感染症の治療の１つまたは複数のための候補化合物を同定する方法であって、（ａ）本発明のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を、多量体のＤＳＧ２への結合を促進する条件下でＤＳＧ２に接触させるステップであって、接触が１種または複数の試験化合物の存在下で行われるステップと；（ｂ）対照と比べてＤＳＧ２への結合についてＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と競合する陽性試験化合物を同定するステップと；
を含み、陽性試験化合物が上皮組織に関連する障害の治療、物質の上皮組織への送達の改善、物質のＤＳＧ２を発現している組織への送達の改善、組織中のＥＭＴの誘導、および／またはＡｄＢ−２／３感染症の治療の１つまたは複数のための候補化合物である方法を提供する。
【０１１４】
ＤＳＧ２への結合についてＡｄＢ−２／３ファイバー多量体と競合する陽性試験化合物は、ＤＳＧ２との相互作用を通して細胞間結合を一過性に開けるための候補化合物である。化合物がＤＳＧ２との相互作用を通して細胞間結合を一過性に開ける能力を確認するためのフォローアップアッセイは、それだけに限らないが、以下の例に開示される試験を含む任意の適当な方法によって行うことができる。上皮組織に関連する障害の治療、物質の上皮組織への送達の改善、物質のＤＳＧ２を発現している組織への送達の改善、または組織中のＥＭＴの誘導のためのこのように同定された化合物を、本発明の方法のいずれかにＡｄＢ−２／３多量体の代理として使用することができる。さらに、ＡｄＢ−２／３は、気道感染症（いくらかの切断）および咽頭結膜熱を引き起こす重要なヒト病原体を表す。したがって、ＡｄＢ−２／３感染症を治療することができる化合物は有用となるだろう。本明細書に開示されるように、ＡｄＢ−２／３によって使用される主要な高親和性受容体としてのＤＳＧ２、およびしたがってＤＳＧ２へのＡｄＢ−２／３の結合を減少させることができる化合物がＡｄＢ−２／３感染症の発達を治療または限定するための候補化合物である。
【０１１５】
これらの方法に使用することができる本発明の１種または複数のＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を含む代表的な多量体には、それだけに限らないが、ＡｄＢ−２／３ビリオン、ＡｄＢ−２／３カプシド、ＡｄＢ−２／３  １２面体粒子（ＰｔＤｄ）（複製中にＡｄＢ−２／３によって産生されるサブウイルス１２面体粒子）、および組換えＡｄＢ−２／３ファイバー多量体が含まれる。それだけに限らないが、試験化合物の非存在下でＤＳＧ２に結合しているＡｄＢ−２／３多量体を含む、任意の適当な対照を使用することができる。
【０１１６】
一実施形態では、ＤＳＧが組換えＤＳＧ２を含む。別の実施形態では、方法が細胞表面上でＤＳＧ２を（内因的にまたは組換え的に）発現している細胞を使用する。
【０１１７】
１つの非限定的実施形態では、固定化組換えＤＳＧ２を含むセンサーを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験を使用して、ＤＳＧ２競合試験と組み合わせて、ＤＳＧ２へのＡｄＢ−２／３ファイバー多量体の結合を候補化合物を同定することができる。別の実施形態では、同定が、試験化合物が結合を減少させる能力を、機能的ＡｄＢ−２／３ビリオンがＤＳＧ２発現上皮細胞を形質導入する能力の低下として検出する形質導入試験を含む。別の実施形態では、ＤＳＧ２発現細胞抽出物を電気泳動的に分離およびウエスタンブロットし、標識ＡｄＢ−２／３ファイバー多量体を使用して試験化合物の存在下でウエスタンブロットをプローブする。さらなる実施形態では、Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００７）８１：１２７８５〜１２７９２；およびＷａｎｇ等（２００８）８２：１０５６７〜１０５７９に記載されているようなドットブロットアッセイを使用することができる。
【０１１８】
試験化合物がポリペプチド配列を含む場合、このようなポリペプチドを化学的に合成または組換え的に発現することができる。組換え発現は、上に開示されているように当技術分野の標準的な方法を用いて達成することができる。このような発現ベクターは細菌またはウイルス発現ベクターを含むことができ、このような宿主細胞は原核性または真核性であり得る。固相、液相、もしくはペプチド縮合技術、またはこれらの任意の組み合わせの周知の技術を用いて調製される合成ポリペプチドは、天然および非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成のために使用されるアミノ酸は、標準的脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコルによる標準的Ｂｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂、または標準的塩基不安定性Ｎα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であり得る。ＦｍｏｃとＢｏｃ  Ｎα−アミノ保護アミノ酸の両方ともＳｉｇｍａ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌまたは当業者によく知られている他の化学会社から得ることができる。さらに、ポリペプチドは、この分野の当業者によく知られている他のＮα−保護基を用いて合成することができる。固相ペプチド合成は、例えば、自動化合成を用いることによって、当業者によく知られている技術によって達成され、提供され得る。
【０１１９】
試験化合物が抗体を含む場合、このような抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体は、ヒト化、完全ヒト、またはマウス型の抗体であり得る。このような抗体は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されているような周知の方法によって作成することができる。
【０１２０】
試験化合物が核酸配列を含む場合、このような核酸も化学的に合成または組換え的に発現することができる。組換え発現技術は当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、上記参照）。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、また一本鎖であっても二本鎖であってもよい。同様に、このような核酸は、当技術分野の標準的技術を用いて、手動または自動化反応によって化学的または酵素的に合成することができる。化学的にまたはインビトロ酵素合成によって合成する場合、核酸を細胞への導入前に精製することができる。例えば、核酸を溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはこれらの組み合わせによって混合物から精製することができる。あるいは、試料処理による損失を回避するために、精製を全くしないまたは最小限に行って核酸を使用することができる。
【０１２１】
試験化合物がポリペプチド、抗体または核酸以外の化合物を含む場合、このような化合物を、有機化学合成を行うための当技術分野の種々の方法のいずれかによって製造することができる。
【０１２２】
実施例．アデノウイルスファイバーノブドメインとデスモグレイン２の相互作用についての構造的および機能的試験
要約
ヒトアデノウイルス（Ａｄ）血清型Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４および近年出現した新しい菌株のＡｄ１４（Ａｄ１４ｐ１）は、感染のための受容体として上皮結合タンパク質デスモグレイン２（ＤＳＧ２）を使用する。ＡｄとＣＡＲおよびＣＤ４６との相互作用と異なり、ＤＳＧ２へのＡｄの結合についての構造詳細はまだ理解しがたい。ランダムＡｄ３およびＡｄ１４ｐ１ファイバーノブ変異体の大腸菌発現ライブラリーに基づく手法を用いて、本発明者らは、個々に変異すると、ＤＳＧ２へのＡｄノブの結合を切断または減少させるアミノ酸残基を同定した。これらの残基は、ファイバーノブの最先端部の１つの溝の内側の３つのクラスターを形成した。Ａｄ３ファイバーノブ変異体ライブラリーを使用してＤＳＧ２に対する親和性が増加した変異体も同定した。本発明者らは、野生型Ａｄ３ノブと比べて数桁高いＤＳＧ２に対する親和性をもたらすＡｄ３ノブのＥＦループ内またはその近くのいくつかの変異を見出した。変異体の１つの結晶構造分析により、導入された変異がＥＦループをより柔軟にし、それによってＤＳＧ２との相互作用が促進され得ることが示された。本発明者らの知見は、がん治療に実際的な関連を有する。本発明者らは、近年、組換えタンパク質を含むＡｄ３ファイバーノブ（ＪＯ−１）が上皮がん細胞間の結合の開口を誘因することができ、これが療法剤の腫瘍内侵入および有効性を大いに改善することを報告している。ここで、本発明者らは、ＪＯ−１の親和性強化バージョンが、一連のがんモデルで親タンパク質よりも治療上強力であることを示している。
【０１２３】
導入
本発明者らは、近年、ヒト集団に広く分布する血清型である、アデノウイルス血清型３（Ａｄ３）を含むＢ種アデノウイルスのグループについての主要な受容体としてＤＳＧ２を同定した（４２）。本発明者らは、Ａｄ３中のＤＳＧ２相互作用ドメインが、いくつかのファイバーノブによって形成されることを見出した（４１）。この具体的な様式のＡｄ３ファイバーノブ−ＤＳＧ２相互作用が高い結合活性をもたらし、上皮結合の開口に機能的に関連している（４１、４２）。後者は、ＭＡＰキナーゼのリン酸化および結合タンパク質発現の下方制御を含む、上皮間葉転換を暗示するＤＳＧ２のクラスター化および経路の活性化を伴う（６、４０、４２）。上皮結合を開く能力は、Ａｄ３の気道上皮細胞経への侵入および分散にとって重要であるように思われる（４０〜４２）。近年の研究では、本発明者らが、ＤＳＧ２への効率的結合を与えるＡｄ３カプシド中の最小部分を見出そうとした（４１）。本発明者らは、三量体Ａｄ３ファイバーノブの自己二量体化を可能にするＡｄ３ファイバーノブおよびドメインを含む小型組換えタンパク質（ＪＯ−１）を作成した（４１）。ＪＯ−１は大腸菌で容易に産生することができ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。分極上皮細胞培養液で、ＪＯ−１が細胞間結合の開口を誘因した一方で、ＪＯ−１の上皮腫瘍を有するマウスへの静脈内注射は抗がん剤のより優れた浸透を可能にした（５、６）。
【０１２４】
本試験の第１の目的は、Ａｄ３ファイバーノブＤＳＧ２相互作用の構造的特徴をさらに描写することであった。これには、ＤＳＧ２への結合に関与しているＡｄ３ファイバーノブ中のアミノ酸残基を同定することと、ＤＳＧ２への結合が減少したおよび切断されたＪＯ−１変異体を作成することとが含まれた。翻訳関連性を有するこの試験の第２の目的は、ＤＳＧ２に対する親和性を強化し、それによって療法効果を増加させることによってＪＯ−１をさらに改善することであった。ＤＳＧ２への結合が増加した変異体を同定することによってこれを行った。
【０１２５】
Ａｄ３ファイバーノブ変異体の大腸菌発現ライブラリーを用いて両方の目的を達成した。本発明者らは、ＤＳＧ２への結合に決定的に関与するＡｄ３ファイバーノブ中の３つの異なるクラスター中の残基を同定した。全ての残基が、受容体に面するファイバーノブの先端の１つの溝の中に局在している。次いで、本発明者らは、インビトロで分極上皮細胞における経上皮電気抵抗、および上皮異種移植片腫瘍を有するマウスにおける化学療法薬の有効性を強化する能力を測定することによって、ファイバーノブが上皮結合を開く能力に対するこれらの変異の効果を評価した。予想されるように、ＤＳＧ２に対する親和性が減少した変異をＪＯ−１に導入すると、得られたタンパク質は上皮結合を開くことがあまりできなかった。他方、ＤＳＧ２に対するＪＯ−１の親和性を増加させたいくつかの変異は、上皮結合の開口におけるより強力な活性を示した。全体的に、これらの試験は、ＤＳＧ２に対するＡｄ３ファイバーノブの親和性と、上皮結合に対するその後の効果との間の相関を示している。
【０１２６】
この試験の第３の目的は、別のＤＳＧ２標的化Ａｄ血清型；親株（Ａｄ１４−ｄｅＷｉｔ）（１０、１６、２２）よりも病原性／毒性であると考えられる新たに出現した菌株Ａｄ１４ｐ１（４４）のＤＳＧ２相互作用ファイバーノブ残基を描写することであった。Ａｄ１４ｐ１のβシート分布はＡｄ３のものとは異なり、これによりＤＳＧ２結合の様式の差異が潜在的にもたらされ得る。そのため、本発明者らは、Ａｄ１４ｐ１ファイバーノブ変異体の大腸菌発現ライブラリーを作成してＡｄ１４ｐ１のＤＳＧ２相互作用残基を同定した。
【０１２７】
材料および方法
タンパク質。組換えヒトＤＳＧ２タンパク質はＬｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）製のものとした。Ａｄ３ファイバーノブはＡＴＣＣから得られたＡｄ３ウイルスＧＢ菌株に由来した。Ａｄ１４ｐ１ファイバーノブは、疾病管理予防センター（Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）によって提供されたＡｄ１４ｐ１ウイルス、Ｐｏｒｔｌａｎｄ  ２９７１／２００７菌株に由来する（４４）。ファイバーノブは、ｐＱＥ３０発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてＮ末端６−Ｈｉｓタグを有する大腸菌で産生し、他で記載されているようにＮｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィーによって精製した（４３）。
【０１２８】
細胞株。２９３、ＨｅＬａおよびＡ５４９細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕ）および１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を補足したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に維持した。結腸がんＴ８４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４８）を、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地と、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ＧｌｕおよびＰ／Ｓの１：１混合物中で培養した。ｏｖｃ３１６細胞は、卵巣がん生検に由来するＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性上皮腫瘍細胞である（３２）。ｏｖｃ３１６細胞を、１％ＦＢＳ、１００Ｉ．Ｕ．ペニシリン、１００μｇ／Ｌストレプトマイシン、１０ｍｇ／Ｌシプロフロキサシンを補足した、３μｇ／Ｌ  ｈＥＧＦ、５μｇ／Ｌインスリン、５ｍｇ／Ｌヒドロコルチゾン、２６ｍｇ／Ｌウシ下垂体抽出物、２５ｍｇ／ＬアムホテリシンＢ）（Ｌｏｎｚａ）を含むＭＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ、Ｍａｐｌｅｔｏｎ、ＩＬ）中で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、トリプルネガティブ乳がん細胞株（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ−２６）を、１０％ＦＢＳ、１００Ｉ．Ｕ．ペニシリン、１００μｇ／Ｌストレプトマイシンを補足したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地中で培養した。ＴＣ１−ＤＳＧ２は、ＴＣ１細胞、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７を発現しているＣ５７Ｂ１／６肺がん細胞株に由来した（３６）。ＴＣ１細胞を、ヒトＤＳＧ２を発現しているＶＳＶＧ偽型レンチウイルスベクターを用いて形質導入した（４２）。ヒト腫瘍中で見られるレベルでヒトＤＳＧ２を発現していたクローンをインビボ試験のために選択した。
【０１２９】
アデノウイルス。野生型Ａｄ３の増殖、メチル−３Ｈチミジン標識、精製および力価測定を他で記載されているように行った（３７）。Ａｄ３−ＧＦＰは、Ｅ３領域に挿入されているＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットを含む野生型Ａｄ３系ベクターである（４２）。２６０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ２６０）を測定することによって、ウイルス粒子（ＶＰ）濃度を分光光度的に測定した。プラーク形成単位（ｐｆｕ）の力価を他に記載されているように（２９）２９３個の細胞を用いて測定した。ＶＰとｐｆｕの比は全てのウイルス調製物について２０：１であった。
【０１３０】
Ａｄ３ノブライブラリー。最後の２つのシャフト反復を含むＡｄ３ノブのコード配列（ａａ１０８〜３１９）を、プライマーＰ１：５’atcacggatccggtggcggttctggcggtggctccggtggcggttctaacaaactttgcagtaaactc３’（配列番号３５）およびＰ２：５’CTCAGCTAATTAAGCTTAGTCATCTTCTCTAATATAGGA３’（配列番号３６）を用いたＡｄ３  ＤＮＡからのＰＣＲによって得て、大腸菌での発現のためにｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＱＥ−Ａｄ３ノブと呼んだ。他で公開されている（７、８）プロトコルに基づいて、ランダム変異原性ＰＣＲを行った。手短に言えば、２０ｆｍｏｌのｐＱＥ−Ａｄ３ノブＤＮＡテンプレート、３０ｐｍｏｌ（各々）のＰＣＲプライマー（Ｐｍｕt１：５’ CCAATTCTATTGCACTTAAGAATAACACTTTATGGACAGGT３’（配列番号３７）およびＰｍｕｔ２：５’ GTCCAAGCTCAGCTAATTAAGCTTAGTCATCTTC３’（配列番号３８）、２．５μｌ、３．５μｌ、５μｌまたは１０μｌの１０×変異原性バッファ（７０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２５℃でｐＨ８．３）および０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、１０μｌの５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０μｌのｄＮＴＰミックス（２ｍＭ  ｄＧＴＰ、２ｍＭ  ｄＡＴＰ、１０ｍＭ  ｄＣＴＰ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰ）および５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を１００μｌの最終体積に混合した。ＰＣＲ条件は９４℃１分間、４５℃１分間および７２℃１分間（３０サイクル）とした。変異ＰＣＲ産物（ファイバーノブ頭部のリーディングフレーム中にのみ変異を含む長さ６１５ｂｐ）を精製し、適当な酵素で消化し、プラスミドｐＱＥ−Ａｄ３ノブにクローニングした。ランダム変異原性ライブラリーの品質管理のために、ライゲーション産物を大腸菌Ｍ１５（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に形質転換し、カナマイシンおよびアンピシリンプレートに蒔き、シーケンシングのために５０個のコロニーをランダムに選抜した。
【０１３１】
Ａｄ１４ライブラリー：最後の２つのシャフト反復を含むＡｄ１４ｐ１ノブのコード配列（ａａ１０８〜３２３）を、プライマーＰ１：５’ CATCACGGATCCGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTTCTAATAAACTTTGTACCAAATTGGGAGAAGG３’（配列番号３９）およびＰ２：５’ GCTAATTAAGCTTAGTCGTCTTCTCTGATGTAGTAAAAGG３’（配列番号４０）を用いたＡｄ１４ｐ１  ＤＮＡからのＰＣＲによって得て、大腸菌での発現のためにｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＱＥ−Ａｄ１４ｐ１ノブと呼んだ。ＰＣＲプライマー（Ｐｍｕｔ１：５’−AACACCCTGTGGACAGGAGTTAACCC−３’およびＰｍｕｔ２：５’−CTCAGCTAATTAAGCTTAGTCGTC−３’）を用いることによって、ランダム変異原性ＰＣＲを行った。変異ＰＣＲ産物（ファイバーノブ頭部のリーディングフレーム中にのみ変異を含む長さ５９４ｂｐ）を精製し、適当な酵素で消化し、プラスミドｐＱＥ−Ａｄ１４ｐ１ノブにクローニングした。ランダム変異原性ライブラリーの品質管理のために、ライゲーション産物を大腸菌Ｍ１５（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に形質転換し、カナマイシンおよびアンピシリンプレートに蒔き、シーケンシングのために５０個のコロニーをランダムに選抜した。
【０１３２】
コロニーアッセイ。Ａｄ３またはＡｄ１４ｐ１ノブ変異体プラスミドライブラリーをＸＬ１  ＢｌｕｅまたはＭ１５大腸菌宿主菌株に形質転換し、適当な抗生物質、すなわち、ＡｍｐまたはＡｍｐ＋Ｋａｎをそれぞれ含むＬＢプレートに蒔いた。一晩の増殖後、０．４５μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）をコロニーの上部に置いた。膜を剥がし、抗生物質および１ｍＭ  ＩＰＴＧを補足したＬＢ培地に浸漬した２枚の３ＭＭ紙の上にコロニーが上を向くように慎重に置いた。コロニーのタンパク質発現を３０℃で６時間誘導し、その後コロニーを含む濾紙を、ネイティブ溶解バッファ｛２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．７５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ、１／２完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠／１０ｍｌ（Ｒｏｃｈｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）｝に浸漬したニトロセルロース濾紙およびＷｈａｔｍａｎ  ３ＭＭ紙の上部に置いた。「濾紙サンドイッチ」を室温で１０分間インキュベートし、次いで、−８０℃で１０分間および３０℃で１０分間、４回凍結融解した。ニトロセルロース膜をサンドイッチから除去し、４℃で一晩、ＴＢＳＴ中３％ＢＳＡでブロックした。次いで、ブロットを、ＴＢＳＴ／ＢＳＡ中０．１ｎｇ／ｍｌの組換えＤＳＧ２タンパク質（Ｌｅｉｎｃｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、引き続いてマウスモノクローナル抗ＤＳＧ２抗体（Ｃｌｏｎｅ  ６Ｄ８；ＳｅｒｏＴｅｃ  Ｌｔｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）および抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体と共にインキュベートした。ＤＳＧ２結合を含まないコロニーを選抜し、３ｍｌ  ＬＢ培地中で一晩培養した。１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を５時間誘導し、次いで、細菌をペレット化し、ＳＤＳローディングバッファに懸濁し、３回凍結／融解した。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースに移し、抗Ｈｉｓ抗体（ＭＣＡ１３９６、Ｓｅｒｔｅｃ）と共にインキュベートしてＡｄノブ三量体形成を評価した。ＤＳＧ２への結合が強力な変異体をスクリーニングするために、Ａｄ３ノブ変異体ライブラリーをＭ１５大腸菌宿主菌株に形質転換した。コロニーのタンパク質発現を室温で２０分間だけ誘導した。最も強力なＤＳＧ２結合シグナルを示したコロニーを選抜した。
【０１３３】
ウエスタンブロット：４〜１５％勾配のポリアクリルアミドを含むＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮプレキャストゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用した。２×ローディングバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２００ｍＭ  ＤＴＴ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー）と混合した合計１ｇのタンパク質を１レーン当たりにロードした。試料を５分間煮沸（Ｂ）または煮沸せずにロード（ＵＢ）した。以下の泳動バッファを使用した：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、０．１９２Ｍグリシン、０．１％ＳＤＳ。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースに移し、前記のように（４２）組換えヒトＤＳＧ２タンパク質および抗ＤＳＧ２抗体と共にインキュベートした。ＩｍａｇｅＪ  １．３２ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いてウエスタンブロットをスキャンおよび定量化した。ＪＯ−１バンド強度を１００％として設定した。ＭＡＰキナーゼ活性を分析するために、分極Ｔ８４培養物を氷上２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４およびプロテアーゼ阻害剤）に溶解した。音波処理後、試料をペレット化し、タンパク質含有上清を−８０℃で保管した。ホスホｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）に対するｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）またはマウス抗Ｅｒｋ１／２に対するｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いたウエスタンブロット法に１５ｇの全タンパク質を使用した。
【０１３４】
競合アッセイ：ＨｅＬａ細胞を、バーゼン液とのインキュベーションによって培養皿から分離し、ＰＢＳで洗浄した。管１本当たり合計１０５個の細胞を、異なる濃度のＡｄ３ファイバーノブタンパク質を含む氷冷接着バッファ（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％ＦＢＳおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補足したＤＭＥＭ）５０μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、３Ｈ標識野生型Ａｄ３ウイルスを、１個の細胞当たり８０００個のウイルス粒子（ｖｐ）の感染多重度（ＭＯＩ）で接着バッファに添加して最終体積を１００μｌとした。氷上での１時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、氷冷ＰＢＳ０．５ｍｌで２回洗浄した。最後の洗浄後、上清を取り出し、シンチレーション計数器によって、細胞関連放射活性を測定した。ビリオン特異的放射活性および細胞数を用いることによって、細胞１個当たりに結合しているＶＰの数を計算した。
【０１３５】
表面プラズモン共鳴：ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置で取得を行った。２ｍＭ  ＣａＣｌ２を補足したＨＢＳ−Ｎ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を、全ての実験において５μｌ／分の流量で泳動バッファとして使用した。エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化フローセルに１０分間注入した１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．５に希釈した１０μｇ／ｍｌのＤＳＧ２を用いてＣＭ４センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）への固定化を行った。対照フローセルを、（ＥＤＣ／ＮＨＳ）によって活性化し、エタノールアミンによって不活性化した。異なる濃度のＡｄ３ファイバーノブタンパク質を３分間注入し、引き続いて２．５分間の解離時間とし、シグナルをエタノールアミン不活性化ＥＤＣ−ＮＨＳフローセルの背景から自動的に減じた。ＢＩＡｅｖａｌソフトウェアを用いて速度定数および親和定数を計算した。
【０１３６】
結晶解析：ｗｔＡｄ３およびＫ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓノブ変異体についての結晶化条件は、Ｈａｕｐｔｍａｎ  Ｗｏｏｄｗａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＨｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌａｂのサービスを用いた。回折試験のために、懸滴法を用いてｗｔＡｄ３およびＫ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓノブ変異体を結晶化した。ＴＡＰＳバッファ０．１Ｍ  ｐＨ９．０中１．６５Ｍ  ＭｇＳＯ４（７Ｈ２Ｏ）のリザーバー溶液および１５ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を用いて結晶を成長させた。８５％リザーバーおよび１５％グリセロール（ｖ／ｖ）で構成される凍結保護剤を用いて結晶を凍結させた。ＥＤＮＡパイプライン（１９）を用いてＥＳＲＦのＩＤ１４−４で１００Ｋにおいてデータ収集を行った。ＸＤＳ／ＸＳＣＡＬＥ（２０、２１）を用いてデータに指標をつけ、スケーリングし、プログラムＰＨＡＳＥＲ（２５）による分子置換（ＰＤＢ  １Ｈ７Ｚ）によって構造を解析した。ＣＯＯＴ（１４）およびＰＨＥＮＩＸ（２）をそれぞれ使用してモデルを構築および精密化した（表１）。項目「アデノウイルス３ノブドメインＫ２１７ＥおよびＦ２２４Ｓ変異体の構造」をＲＣＳＢ  ＩＤコードｒｃｓｂ０８０６８７およびＰＤＢ  ＩＤコード４ＬＩＹに割り当てた。
【表２】
0006290221.tif 000011
【０１３７】
３Ｄ構造：Ｐｙｍｏｌソフトウェアを用いて構造を分析した。紫色等値面上に異なる色を用いてＡｄ３ノブドメイン（ｐｄｂ  １Ｈ７Ｚ）中の変異を染色した。Ａｄ３ノブ変異体Ｋ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓのモノマーを棒の変異を有する着色漫画で描き、野生型Ａｄ３ファイバーノブの灰色漫画図にかぶせた。
【０１３８】
陰性染色電子顕微鏡法：組換えＪＯ−２タンパク質を、陰性染色ＥＭによって可視化して会合状態を評価した。０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質を用いて標準的雲母−炭素調製を使用した。試料を、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ケイタングステン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を用いて染色し、１００ｋＶのＪＥＯＬ−１２００電子顕微鏡で可視化した。
【０１３９】
透過性アッセイ：合計５×１０５個のＴ８４細胞を１２ｍｍのトランスウェルインサート（ＰＥＴ膜、０．４μｍ細孔径（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ））に播種し、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）が安定になるまで１４日超培養した。培養培地を２〜３日毎に交換した。細胞を、室温で１５分間接着培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中ＤＳＧ２リガンド（２０μｇ／ｍｌ）に暴露し、ＴＥＥＲを他で記載されるように（３９）測定および計算した。
【０１４０】
動物試験：動物に関する全ての実験は、ワシントン大学によって示されている施設ガイドラインに従って行った。マウスを特定病原体除去施設に収容した。免疫不全（ＣＢ１７）マウス［系統名：ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ］をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。ヒトＤＳＧ２トランスジェニックマウスは９０ｋｂのヒトＤＳＧ２座を含んでおり、ヒトと類似のレベルおよびパターンでｈＤＳＧ２を発現する（４０）。
対応する腫瘍細胞をＣＢ１７マウスの乳房脂肪パッドに注射することによって（Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１）、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびｏｖｃ３１６異種移植片腫瘍を確立した。ＴＣ１−ＤＳＧ２細胞をＤＳＧ２トランスジェニックマウスに皮下注射することによってＤＳＧ２腫瘍を確立した。化学療法薬：イリノテカン／Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｇｒｏｔｏｎ、ＣＴ）、ペグ化リポソームドキソルビシン／Ｌｉｐｏｄｏｘ（商標）（Ｓｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＩＮ、インド）、セツキシマブ／Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（ＩｍＣｌｏｎｅ、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）、ナノ粒子アルブミン抱合パクリタキセル／Ａｂｒａｘａｎｅ（商標）（Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｕｍｍｉｔ、ＮＪ）の施用１時間前に、ＪＯ−０、ＪＯ−１、ＪＯ−２またはＪＯ−４を静脈内注射した。腫瘍体積を１週間に３回測定した。各処理群は、最低５匹のマウスからなっていた。群の１つの腫瘍が８００ｍｍ３の体積に達したらまたは腫瘍が潰瘍化を示したら、これらのマウスを屠殺し、実験を終了した。
【０１４１】
抗ＪＯ４抗体：ＥＬＩＳＡによってヒト血清試料中の抗ＪＯ−４抗体濃度を測定した。プレートをウサギポリクローナル抗Ａｄ３ファイバー抗体（４２）、引き続いて組換えＪＯ−４、ヒト血清試料（１：２〜１：１０００希釈）、および抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰでコーティングする。卵巣がん患者からの血清試料は、太平洋卵巣がん研究コンソーシアムによって提供された。
【０１４２】
３Ｄ構造：Ｐｙｍｏｌソフトウェアを使用してＡｄ３ファイバーノブ（ＭＭＤＢ  ＩＤ：１６９４５、ＰＤＢ  ＩＤ：１Ｈ７Ｚ（１３））の３Ｄ構造を可視化した。
【０１４３】
統計解析：全ての結果を平均＋／−ＳＤとして表す。多重検定用の２ウェイＡＮＯＶＡを適用した。動物数およびＰ値を図の凡例に示す。
【０１４４】
結果
ＤＳＧ２結合に重要な残基。本発明者らは、最初に、Ａｄ３の研究に集中した。ＤＳＧ２への高親和性結合およびその後の上皮結合開口は、ビリオン、ＰｔＤｄまたは二量体化（三量体）Ａｄ３ファイバーノブ（例えば、ＪＯ−１）（４１）中に存在する一定の空間配置のいくつかの三量体ファイバーノブを要する。２つのシャフトモチーフを有するが、二量体形成ドメインを有さない組換え（三量体）ファイバーノブ（「Ａｄ３ノブ単量体」）は、ＪＯ−１より小さい桁の親和性でＤＳＧ２に結合するが、Ａｄ３感染を遮断することができず、結合開口を誘因しない（３７、４１、４２）。しかしながら、「Ａｄ３ノブ単量体」の親和性は、可溶性ＤＳＧ２をプローブとして使用するウエスタンブロットで結合を検出するのに十分に高い。そのため、本発明者らは、Ｈｉｓタグ付き「Ａｄ３ノブ単量体」変異体の大腸菌発現ライブラリーを使用して、ＤＳＧ２結合に重要なＡｄ３ファイバーノブ中のアミノ酸残基を同定した。このライブラリーを作成するために、本発明者らは、平均でノブ１個当たり１〜２個のアミノ酸置換をもたらすプロトコルで変異原性ＰＣＲ（７、８）を使用した。ＸＬ−１ブルー大腸菌中のＡｄ３ファイバーノブライブラリーを寒天平板上に蒔き、ノブ発現をＩＰＴＧによって誘導し、組換えＤＳＧ２および抗ＤＳＧ２抗体を用いてコロニーをＤＳＧ２結合についてスクリーニングした。ＤＳＧ２に結合しなかった変異体についての約１００００個のコロニーの第１のスクリーニングラウンドは、２４０個の候補コロニーを明らかにした。６×Ｈｉｓタグについてウエスタンブロットによって分析すると、２４０個のコロニーのうちの４０個が三量体ファイバーノブの発現を示し、主要な立体構造変化が存在しないことを示した。残りの変異体は切断ファイバーノブを有していた、または三量体を形成しなかった。対応する４０個のプラスミドをシーケンシングした。大多数のコロニーがファイバーノブ中に単一アミノ酸置換を有していた。ノブ１個当たり複数のアミノ酸置換に遭遇した場合、個々に対応する変異を含む新たなＡｄ３ノブゲノムを合成した。さらなるラウンドのコロニースクリーニングは他の領域を網羅せず、全てのＤＳＧ２相互作用残基が見出されたことを示した。次いで、合計８個の独立した変異体をその後の試験に使用した（図１Ａ）。全てのその後の試験のために、本発明者らは、Ａｄ３ファイバー変異体の自己二量体化型を作成し（図１Ｂ）、ＮＴＡ−Ｎｉカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってこれらを精製した。精製した二量体化ノブ変異体をウエスタンブロットによってＤＳＧ２結合について分析した（図１Ｃ〜Ｆ）。全ての変異体が、ＪＯ−１（すなわち、ｗｔＡｄ３ファイバーノブを含む二量体化型）と比べると、結合がひどく減少した。変異体Ｄ２６１ＮおよびＦ２６５ＬはＤＳＧ２結合がほぼ完全に切断された一方、他の変異体は異なるレベルの残留ＤＳＧ２結合（ｗｔＡｄ３ファイバーノブの３．６％〜２０％）を有していた（表２、「ウエスタンブロット」）。ＤＳＧ２へのＡｄ３ノブの結合に重要な同定された残基は、ＣＤループ／Ｄβシート（Ｎ１８９Ｇ、Ｖ１８９Ｇ、Ｓ１９０Ｐ）、ＦＧループ／Ｇβシート（Ｄ２６１Ｎ、Ｆ２６５Ｌ）およびＨβシート／ＨＩループ（Ｌ２９２Ａ、Ｌ２９６Ｒ、Ｅ２９９Ｖ）中のＡｄ３ファイバーノブの３つの異なる領域にあった（図１Ａ）。Ａｄ３ファイバーノブ（ＰＤＢ寄託番号１Ｈ７Ｚ＿Ａ）の３Ｄモデルでは、全ての同定された残基がファイバーノブの先端部に位置しており、ノブ中の１つの特異的溝が続いていた（図２）。Ｆ２６５Ｌを除いて、全ての他の置換が対応する残基中の電荷の変化をもたらしたことは注目に値する。ポリアクリルアミドゲルの泳動パターンの差（例えば、Ｄ２６１Ｎについて）は、置換が立体構造変化をもたらしたことを示している。本発明者らは、現在、これらの変異体を結晶化してその３Ｄ構造を分析しようとしている。
【０１４５】
Ａｄ３ファイバーノブ、および最終的にＤＳＧ２結合が最大に切断されたＡｄ３ウイルスを作成するために、本発明者らは、複数の変異を３つの同定された領域に導入した、具体的にはＮ１８６ＤとＤ２６１Ｎの組み合わせ、Ｄ２６１ＮとＬ２９６Ｒの組み合わせ、およびＮ１８６Ｄ、Ｄ２６１ＮとＬ２９６Ｒの全３つの組み合わせである。予想されるように、３つの重要な領域全ての変異の組み合わせが、最高レベルの切断を与えた（表２、「ウエスタンブロット」、図１Ｆ）。
【表３】
0006290221.tif 000012
【０１４６】
近年出現した病原体としての関連性のために、本発明者らは、（「単量体」）Ａｄ１４ｐ１ファイバーノブ変異体のライブラリーも作成した。第１のスクリーニングは、ＤＳＧ２に結合しなかった変異体について約３００個の候補コロニーを明らかにした。６×Ｈｉｓタグについてウエスタンブロットによって分析すると、３００個のコロニーのうちの４５個が三量体ファイバーノブの発現を示した。これらの変異体のシーケンシングは、ＤＳＧ２への結合が減少した１５個の独立した変異体を明らかにした（図１Ａ）。興味深いことに、異なるβシート分布にもかかわらず、Ａｄ１４ｐ１ノブ結合に重要なアミノ酸残基は、Ａｄ３ファイバーノブについて同定された同じ３つの領域にあった。これらの類似性のために、本発明者らは、選択されたＡｄ３ファイバーノブ変異体についてのみさらなる試験を行った。
【０１４７】
機能的検証。ＤＳＧ２を発現しているＨｅＬａ細胞で競合試験を行った（４２）。最初に、本発明者らは、二量体Ａｄ３ファイバーノブとの細胞のプレインキュベーション後に３Ｈ標識Ａｄ３ウイルスの付着を試験した。Ａｄ３ウイルス結合の減少を、ＪＯ−１、すなわち、野生型Ａｄ３ファイバーノブを含む二量体タンパク質とのプレインキュベーションと比較した。ＪＯ−１による結合の阻害を１００％とみなした。変異体Ｌ２９６Ｒ、Ｄ２６１ＮおよびＦ２６５Ｌは少なくとも（５．１、５．３および１７．６％）Ａｄ３ウイルス結合を遮断し、変異体Ｓ１９０Ｐ、Ｎ１８６ＤおよびＥ２９９Ｖ（それぞれ結合が３０．９、３２．７および５０．７％減少した）が続いた（表２、「付着」）。同様のアッセイ設定を使用して二量体Ａｄ３ノブ変異体がＡｄ３−ＧＦＰベクターによるＨｅＬａ細胞の形質導入を遮断する能力を測定した。形質導入は、ＧＦＰ発現に基づいて測定した（図３Ｂ）。本発明者らが付着試験で観察したものと同様に、Ａｄ３−ＧＦＰ感染が、変異体Ｄ２６１ＮおよびＦ２６５Ｌ、引き続いて変異体Ｎ１８６Ｄ、Ｓ１９０Ｐ、Ｌ２９６ＲおよびＶ１８９Ｇとのプレインキュベーションによって少なくとも減少した。ＤＳＧ２結合（ウエスタンブロット）、付着および感染競合データをまとめて、本発明者らは、残基２６１および２６５を含む領域がＤＳＧ２結合で最も重要な領域であると結論付けた。残基１８６〜１９０の周りの領域も結合に寄与するが、残基２９９を含む領域は結合にほんのわずかにしか関与していないように見える。変異を組み合わせた二量体Ａｄ３ノブ変異体も、付着（図３Ｃ）および感染（図３Ｄ）についてＡｄ３ウイルスと競合する能力について分析した。３つの領域全て（Ｎ１８５、Ｄ２６１、Ｌ２９６）に変異を有する変異体は、２００μｇ／ｍｌの濃度でさえＡｄ３結合も感染も遮断せず、それがＤＳＧ２結合についてほぼ切断されていることを示した。特に、野生型Ａｄ３ファイバーのウエスタンブロットにプローブとしてｓＣＤ４６を使用すると、特異的結合は観察されなかった（図４）。このことは、Ａｄ３がＣＤ４６に不十分にしか結合しないことを示している。
【０１４８】
ＤＳＧ２結合の減少と上皮結合を開く能力の弱さとの相関。二量体Ａｄ３ノブ変異体の結合開口機能についての直接のアッセイは、トランスウェル細胞培養物における経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することに基づく。主要な細胞間結合が形成されたら、上皮がん細胞を、ＴＥＥＲが一定になるまで培養する。ＪＯ−１をトランスウェル培養物の先端部に１時間添加すると、結合の開口を示すＴＥＥＲの急速な減少がもたらされた（図５Ａ）。変異体Ｄ２６１ＮとのインキュベーションはＴＥＥＲに効果を及ぼさなかった。Ｎ１８６ＤおよびＥ２９９Ｖは、ＤＳＧ２への対応するファイバーノブの残留結合と相関する中間の効果を与えた。以前の研究で、本発明者らは、ＪＯ−１が異種移植片腫瘍の上皮結合の変化を誘因し、高分子量を有する化学療法薬、例えば、イリノテカン（イリノテカンは分子量５８６．７Ｄａを有し、結腸がんおよび肺がんを治療するために使用される）の抗腫瘍有効性を増加させることも確立した。本発明者らは、この効果を用いて、インビボでの二量体Ａｄ３ノブ変異体の機能を評価した（図５Ｂ）。本発明者らがインビトロで観察したものと同様に、ＪＯ−１はイリノテカン療法を強化したが、ＤＳＧ２結合が減少した変異体はイリノテカン有効性に有意な効果を及ぼさなかった。
【０１４９】
親和性が強化された二量体Ａｄ３ファイバーノブ。上に概説されるように、ＪＯ−１はがん療法に関連する。そのため、そのＤＳＧ２との相互作用の構造詳細をより良く理解し、ＤＳＧ２に対する親和性が増加したＪＯ−１変異体を作成することが重要である。生物製剤の親和性強化を使用して、ｉ）その有効用量を減少させる、ｉｉ）その半減期を増加させる、ｉｉｉ）その療法効果を潜在的に増加させる、およびｉｖ）生物製剤に対して患者によって産生された抗体の有害効果（例えば、中和または薬物動態に対する変化）を回避する。親和性が増加したＪＯ−１類似体を作成するために、本発明者らは、ＤＳＧ２への結合が増加した変異体についてＪＯ−１中のランダム変異を有する大腸菌発現ライブラリーをスクリーニングした。蒔いた１００００個のコロニーのうち、最も強いＤＳＧ２シグナルを有する２０個のコロニーを選抜し、プラスミドＤＮＡをシーケンシングした。１個または２個のアミノ酸置換を有する７つの異なる変異体を同定した：Ｙ２５０Ｆ、Ｋ２１７Ｅ＋Ｆ２２４Ｓ、Ｎ２９３Ｓ、Ｖ２３９Ｄ、Ｆ２２４Ｌ、Ｅ２４８Ｇ＋Ｋ２５８ＥおよびＬ２７７Ｒ＋Ｎ２９３Ｄ。Ａｄ３ファイバーノブの一次および３Ｄ構造における残基の局在化を図６に示す。特に、変異のほとんどがＥＦループ中に局在しており、このループがＡｄ３とＤＳＧ２との間の相互作用を安定化することに関与していることを示している。Ｖ２３９およびＹ２５０はノブ表面で露出しておらず、ＤＳＧ２への直接結合への関与よりもむしろノブの構造変化を示唆している（図６Ｂ、右側パネル）。次いで、組込み変異二量体Ａｄ３ノブタンパク質を精製した。ＤＳＧ２に対する変異体の親和性を測定するために、本発明者らは、表面プラズモン共鳴試験を行った。二量体形成ドメインを含むノブを用いた試験の結果は、多分これらの変異体が多量体複合体を形成したという事実によって複雑であった。そのため、本発明者らは、二量体形成ドメインを欠くノブタンパク質（「ｎｏＤＤ」）を用いて試験を行った。ｗｔ  Ａｄ３ノブおよび全てのノブ変異体の会合速度定数（ｋａまたはｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｄまたはｋｏｆｆ）ならびにＫＤを図７に示す。以前の試験（４１）と一致して、本発明者らは、二量体形成ドメインを含まないｗｔ  Ａｄ３ノブが、比較的低い親和性でしかＤＳＧ２に結合しない（ＫＤ＝１０μＭ）ことを見出した。変異体Ｌ２２７Ｒ／ｎｏＤＤ＋Ｎ２９３Ｄ／ｎｏＤＤを除いて、コロニーブロットスクリーニングで同定された全ての変異体がＤＳＧ２に対するより高い親和性を有していた。特に、変異体Ｙ２５０Ｆ／ｎｏＤＤまたはＶ２３９Ｄ／ｎｏＤＤの親和性は、ｗｔ  Ａｄ３ノブ／ｎｏＤＤの親和性よりも８８５倍または４０５倍高かった。異なる変異体の高い親和性は、主に解離速度の変化よりもＤＳＧ２との速い会合によるものであった。この傾向の唯一の例外は変異体Ｎ２９３Ｓ／ｎｏＤＤであり、これについては他の変異体と比べると会合速度が最低であった。しかしながら、これは、遅い解離速度によって一部は補われた。これらの結果は合わせてＤＳＧ２へのｗｔ  Ａｄ３ノブ（ｎｏＤＤ）の結合が、変異のパネルによって改善され得る遅い会合速度によって主に限定されることを��している。これらの変異は、この相互作用の安定性ではなく、受容体に対するリガンドの高い親和性をもたらす会合対解離のバランスを修飾するように思われる。
【０１５０】
ＤＳＧ２への結合を強化する構造要素をより良く理解するために、本発明者らは、変異体Ｋ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓを用いたより詳細な分析を行った。二量体形成ドメインを含む酢酸ウラニル染色Ｋ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓファイバーノブの透過電子顕微鏡法は、二量体化三量体ファイバーを表す６個のノブを有する粒子を示した（図８Ａ、太い矢印および図８Ｂ）。興味深いことに、これらの条件下では、ファイバーノブが崩壊したＰｔＤｄに似た規則的な形状のアロゲート（ａｒｒｏｇａｔｅ）（直径約３０ｎｍ）も形成した（図８Ａ、細い矢印および図８Ｃ）。次いで、本発明者らはｘ線結晶構造解析試験を行って、原子レベルでＫ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓ変異体の構造を解明した（図８Ｄ〜Ｈ）。予想されるように、Ｋ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓ変異体はファイバーノブのモノ三量体を形成した（図８Ｅ）。変異体の３Ｄ構造に野生型Ａｄ３ファイバーノブの構造を重ね合わせた（図８Ｆ〜Ｈ）。これにより、Ｋ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓ変異体中のＥＦループが完全に無秩序化されていることが明らかになった。このループはファイバーシャフトとの結合で、ノブドメインの底部にある。そのため、Ｋ２１７Ｅ／Ｆ２２４Ｓ変異は、このループ領域の柔軟性を増加させることによって容易な結合を可能にし得る。
【０１５１】
親和性増加と上皮結合を開く能力の強さの相関
以下の試験のために、本発明者らは、二量体形成ドメインを含むＡｄ３ファイバーノブ型を使用した。選択された高親和性変異体を分析するために、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞上のＡｄ３−ＧＦＰと親和性強化Ａｄ３ファイバー変異体の二量体型を用いた競合感染試験を行った（図９Ａ）。ＧＦＰ発現に基づいて、変異体Ｌ２７７Ｒ＋Ｎ２９３Ｄを除く全ての二量体変異体が、ＪＯ−１よりも有意にＡｄ３−ＧＦＰ感染を阻害した。特に、ＤＳＧ２に対する親和性が増加したＡｄ３ファイバーノブの非二量体化型は、形質導入試験で競合者として作用することができなかった（図９Ｂ）。ＤＳＧ２に対する高い親和性は、トランスウェル培養物中の上皮結合を開く能力の増加をもたらした（図９Ｃ）。ＪＯ−１と比べて、変異体Ｖ２５０Ｆ、Ｖ２３９ＤおよびＫ２１７Ｅ＋Ｆ２２４Ｓとインキュベートした培養物のＴＥＥＲは有意に高かった。
ＪＯ−１の親和性強化バージョンの２つ、Ｙ２９３ＤおよびＶ２５０Ｆをインビボアッセイで分析した。本発明者らは、これらの変異体をそれぞれＪＯ−２およびＪＯ−４と呼んだ。第１の試験を、図５Ｂについて記載されている試験と同様のＡ５４９細胞に由来する異種移植片モデルで行った。図１０Ａは、親和性強化変異体ＪＯ−２およびＪＯ−４がＪＯ−１よりも有意にイリノテカン療法を増加させたことを示している（２７日から始まるｐ＜０．０５）。さらに、ＪＯ−４（Ｋｄ＝１１．４ｎＭ）はＪＯ−２（Ｋｄ−２４．９ｎＭ）よりも有意に効率的であり、ＤＳＧ２に対する親和性と療法効果との間の相関を示した。ｏｖｃ３１６細胞に由来する異種移植片腫瘍で追加の試験を行った（３０、３２）。ｏｖｃ３１６細胞は、卵巣がん生検に由来するＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性上皮腫瘍細胞である。これらの細胞は、インビトロおよびインビボの特定の条件下で、ＥＭＴおよび逆のプロセス、間葉上皮転換（ＭＥＴ）を受けることができる。Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１３３およびＥ−カドヘリンが陽性であるｏｖｃ３１６細胞の亜分画はがん幹細胞、すなわち、多能性能力および腫瘍形成能を有する自己再生細胞に富む（３０）。そのため、ｏｖｃ３１６細胞は、インサイツで腫瘍に見られる異質性および可塑性を密接にモデル化する。ペグ化リポソームドキソルビシン（ＰＬＤ）、卵巣がんの化学療法に広く使用されている薬剤の注射１時間前の２ｍｇ／ｋｇの用量でのＪＯ−１の静脈内注射は、治療効率を有意に増加させた（図１０Ｂ）。重要なことに、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＪＯ−４はＰＬＤ療法に対してさらに大きな刺激効果を有した。最後に、本発明者らは、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）についてのモデルでＪＯ−４を試験した。ＴＮＢＣは、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現欠如または最小限の発現およびＨｅｒ／ｎｅｕ過剰発現の不在によって特徴付けられる。ＴＮＢＣは乳がん全体の１５％を占める。全生存は、他の表現型を有する患者と比べて不良である。ＴＮＢＣの特徴的な特徴は、高レベルのＤＳＧ２および上皮結合である。単独のまたはＥＧＦＲ標的化ｍＡｂセツキシマブ／Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）と組み合わせたナノ粒子、アルブミン抱合パクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル／Ａｂｒａｘａｎｅ（商標））によって、ＴＮＢＳの治療において有望な臨床結果が達成された（３８）。本発明者らの試験は、ＪＯ−４が同所性ＴＮＢＣ腫瘍を有するマウスモデルでｎａｂ−パクリタキセル／セツキシマブ療法を有意に増加させることを示した（図１０Ｃ）。療法関連性のために、本発明者らは、十分なマウス腫瘍モデルでＪＯ−４を試験した。Ａｄ３ウイルスおよびＡｄ３ファイバーノブ誘導体はマウス細胞および組織に結合しないので、本発明者らは、ヒトと同様のパターンおよびレベルでヒトＤＳＧ２を発現するヒトトランスジェニックマウスを使用した（４０）。これらのマウスに、同一遺伝子ＴＣ１−ｈＤＳＧ腫瘍を皮下移植した。腫瘍が約６００ｍｍ３の体積に達したら、ＪＯ−１またはＪＯ−４を安全性および有効性試験のために静脈内注射した。ＪＯ−１とＪＯ−４血清濃度の両方が、注射１時間後以内に２桁以上減少し、これによると減少はＪＯ−４について有意に大きかった（注射１時間後についてｐ＜０．０１）（図１１Ａ）。注射１時間後に、ＪＯ−１およびＪＯ−４濃度は約１００ｎｇ／ｍｌのプラトーに達した。本発明者らは、静脈内ＪＯ−１およびＪＯ−４注射後の血液学的パラメータも分析した。血液化学は異常な変化を示さなかった。血球数はリンパ球および血小板数を除いて正常であり、これらは注射後早期に減少した（図１１Ｂ）。リンパ球および血小板数は注射２４時間後で最下点に達し、ＪＯ−４については有意に低い数であった（ｐ＜０．０１）。興味深いことに、リンパ球および血小板数は、ＪＯ−１処理動物よりもＪＯ−４注射マウスで速く正常レベルに戻った。
【０１５２】
ＪＯ−１およびＪＯ−４はウイルス由来タンパク質であり、かつ免疫原性である。免疫適格マウスでは、これらのタンパク質に対する血清ＩｇＧ抗体を、注射２週間後にＥＬＩＳＡによって検出することができる（５）。治療用タンパク質の親和性強化についての理論的保証の１つは、それが血清抗体中和を回避するということである。これを試験するために、本発明者らは、ＴＣ１−ｈＤＳＧ２腫瘍を有する免疫適格マウス腫瘍モデルでＪＯ−１およびＪＯ−４の反復注射を行った（図１１Ｃ）。ＪＯ−１およびＰＬＤの２処理サイクル後、処理を停止し、腫瘍を再成長させた。第３および第４の処理サイクルを２８日および３５日にそれぞれ開始した。第３のサイクルの時に、血清抗ＪＯ−１抗体がＥＬＩＳＡによって検出可能であった。重要なことに、第３と第４の処理サイクルの両方で、ＪＯ−１およびＪＯ−４がＰＬＤ療法に強化効果を有し、これによると強化効果はＪＯ−４で有意に強かった。
全体として、親和性強化二量体Ａｄ３ファイバー変異体を用いた本発明者らの機能的試験は、ＤＳＧ２親和性と上皮結合開口／療法効果との間の相関を証明している。
【０１５３】
考察
ＤＳＧ２へのＡｄ３ノブの結合に関与する残基。ＡｄとＣＡＲおよびＣＤ４６との相互作用（４、２８）と異なり、ＡｄとＤＳＧ２との相互作用についての構造詳細はまだ理解し難い。Ａｄ３ファイバーノブの結晶構造は解明されているが、ＤＳＧ２については、４つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の最も端部の３Ｄ構造しか入手可能でない（ＭＭＤＢ  ＩＤ：５９８４３）。しかしながら、異なるＤＳＧ２ドメインに対するモノクローナル抗体を用いた本発明者らの以前の競合試験により、ＥＣＤ３および４がＡｄ３への結合に関与していることが示された（４２）。この試験で、本発明者らは、変異原性分析を用いて、ＤＳＧ２への結合に重要なＡｄ３ファイバーノブ中のアミノ酸残基を同定した。ＤＳＧ２の変異原性分析は、大腸菌で発現させると、このタンパク質がＡｄ３に結合せず、ＤＳＧ２中の活性Ａｄ３結合部位を作成するために翻訳後プロセシングが必要とされることを示したので、可能ではなかった（データ不掲載）。ＤＳＧ２へのＡｄ３ノブの結合に重要な同定された残基は、Ａｄ３ファイバーノブの３つの異なる領域中にあり、受容体に面するファイバーノブの先端部の溝に局在する潜在的結合ポケットを形成した。特に、他のＡｄ血清型とＣＡＲまたはＣＤ４６の結合は、対応するファイバーノブの側方または基底側の領域を主に伴う（２７、４３）。本発明者らのデータは、Ａｄ３が異なる結合戦略を使用することを示している。本発明者らは現在、二量体Ａｄ３ファイバーノブおよびＤＳＧ２を用いた結晶解析試験を行っている。多量体Ａｄ３ファイバーノブがいくつかのＤＳＧ２分子をクラスター化する（４１）ことを考慮して、この複合体の３Ｄ構造が複雑化していると予想される。ＤＳＧ２へのＡｄ３ファイバーノブの結合に重要な残基がＤＳＧ２への他のＢ種Ａｄの結合にも関与するかどうかはまだ研究中である。特に、Ｄ２６１、Ｆ２６５およびＥ２９９は４つのＤＳＧ２相互作用Ａｄ（Ａｄ３、７、１１、１４）の全てで保存されているが、他の重要な残基（Ｎ１８６、Ｖ１８９、Ｌ２９６）はこれらの血清型間で異なる（図１２）。
【０１５４】
新しい菌株（Ａｄ１４ｐ１）の近年の出現により、Ａｄ１４は重要な研究対象である。Ａｄ１４ｐ１は、米国では従来文書化されたことがなく、いくつかの米国軍事訓練センターでの日常的監視中、２００６年３月および４月に最初に報告された（２６）。翌年の３〜６月中に、計１４０のさらなるケースの確認されたＨＡｄＶ−Ｂ１４ｐ１呼吸器疾患が、オレゴン、ワシントンおよびテキサスの患者で報告された（３）。これらの患者の３８％が入院し、これには集中治療室に収容された１７％が含まれ、患者の５％が死亡した。ＨＡｄＶ−Ｂ１４ｐ１の突発は、その後ワシントン（１）、オレゴン（２３）、アラスカ（１５）、ウィスコンシンおよびペンシルバニア（１０、２２）の他の５つの基地および民間集団、ならびにカナダ（１６）、中国（３３）および韓国（３４）で検出された。この時点で、Ａｄ１４ｐ１の高い病原性および／または毒性についての分子基盤は不明である。本発明者らは、ＤＳＧ２へのＡｄ１４ｐ１の結合のための構造成分を描写しようと試みた。Ａｄ１４ｐ１のβシート分布は、Ａｄ３のものとは異なる（図１Ａ）。そのため、ＣＤ４６相互作用血清型（１１、１２）と同様に、ＤＳＧ２相互作用ＡｄがＤＳＧ２への結合戦略において異なり、それによって異なるＤＳＧ２結合領域がもたらされ得ることが可能である。しかしながら、Ａｄ１４ｐ１ファイバーノブ変異体ライブラリーのスクリーニングはこの仮説を裏付けなかった。ＤＳＧ２結合に関与する領域は、Ａｄ３およびＡｄ１４ｐ１ファイバーノブについて本質的に同じであった。それにもかかわらず、本発明者らの知見は、特に血液循環または気道中に存在するウイルスのオプソニン作用を誘因し得るＡｄ１４ｐ１阻害剤または高親和性デコイの産生のための、Ａｄ１４ｐ１ウイルス血症の治療に関連する。
【０１５５】
ＤＳＧ２が存在しない場合、ＤＳＧ２に加えて、Ａｄ３は受容体としてＣＤ４６を使用して細胞に感染することができることが報告されている（３５）。以前、本発明者らは、分極正常上皮細胞において、ＤＳＧ２が密着結合に捕捉され、頂端側から接近できない一方で、ＣＤ４６が膜両側に存在することを見出した（４２）。そのため、本発明者らは、ＣＤ４６がＡｄ３のための比較的不十分な侵入受容体として働き得る一方で、デノボ産生Ａｄ３およびＡｄ３ペントン１２面体がＤＳＧ２と相互作用し、上皮結合を開き、Ａｄ３の効率的側方拡散または深部組織層および血液循環への浸透を可能にすると推測する。ＤＳＧ２およびＣＤ４６結合にそれぞれ重要なＡｄ３ノブ残基を個々に切断する能力がこの仮説を証明することを可能にするはずである。
【０１５６】
親和性強化ファイバーノブ。ＤＳＧ２に対する親和性を増加させた変異のほとんどがＥＦループ中に局在しており、このループがＡｄ３とＤＳＧ２との間の相互作用を安定化させることに関与していることを示した。興味深いことに、Ａｄ７、１１および１４とは異なり、Ａｄ３ファイバーノブはこの領域に２個のさらなる残基（ＶＬ）、引き続いてプロリンを有する。そのため、このループがさらに伸長され得、プロリンがループを受容体とのより良い相互作用を可能にするように配向し得る。原子レベルでのこれらの変異体の１つの３Ｄ構造の分析がこの結論を裏付ける。これらの試験は、導入された変異がループをより柔軟性にし、それによってＤＳＧ２との相互作用が促進され得ることを示している。
【０１５７】
ｗｔ  Ａｄ３ノブよりも親和性が高いＡｄ３ノブの同定は、Ａｄ３媒介遺伝子治療にとって意味を有する。近年、Ａｄ３に基づく遺伝子導入ベクターが、臨床試験においてがん療法の見込みを示している（１８）。理論的には、親和性強化Ａｄ３ベクターはより低用量で使用することができ、中和抗体に打撃を与え得る。近年、インビボで標的細胞感染の有効性および特異性を増加させるために、高親和性リガンドを麻疹ウイルス（１７）およびＡｄ５系ベクター（３、９、４５）に組み込む試みが行われた。この試験での本発明者らの知見に基づいて、Ａｄ３ベクターについてここで同様の戦略を追求することができる。
【０１５８】
Ａｄ３ベクターを改善することに加えて、ＪＯ−１の親和性強化バージョンは翻訳関連性を有する。ほとんどの固形腫瘍は上皮起源のものであり、悪性細胞は脱分化型であるが、原発腫瘍ならびに転移巣の両方で、上皮細胞の主要な特徴である細胞間結合を維持している（５、３１）。これらの細胞間結合は、宿主免疫系による攻撃に対する防御機構を表し、モノクローナル抗体および化学療法薬を含むがん療法剤の筋肉内侵入および播種を防ぐ物理的障壁をもたらす（５、３１）。異種移植片または同一遺伝子ＤＳＧ２トランスジェニック腫瘍を有するマウスに静脈内注射すると、ＪＯ−１は種々の化学療法薬ならびにモノクローナル抗体による療法効果を著しく強化した（５、６）。この試験で、本発明者らは、ＪＯ−１の新たな親和性強化バージョン（例えば、ＪＯ−４）が、４つの腫瘍モデル（Ａ５４９、ｏｖｃ３１６、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＴＣ１−ＤＳＧ２）でＪＯ−１よりも有意にがん療法剤（イリノテカン、ｎａｂ−パクリタキセル、ペグ化リポソームドキソルビシン、セツキシマブ）の有効性を増加させることを示した。同一遺伝子腫瘍を有するＤＳＧ２トランスジェニックマウスでの試験は、血清ＪＯ−４レベルが、多分組織上のＤＳＧ２への結合によって急速に低下することを示した。以前の試験では、腫瘍に加えて、ｈＤＳＧ２トランスジェニックのリンパ球および血小板がｈＤＳＧ２を発現していることが示された（ヒトおよびサルと同様）（４０、４２）。これに沿って、本発明者らは、ＪＯ−４注射がリンパ球および血小板数の一過性減少をもたらすことを見出した。
【０１５９】
ヒトのほぼ３分の１がＡｄ３に対する中和抗体を有しているという事実にもかかわらず（４２）、卵巣がん患者の血清を用いた近年の研究で、本発明者らは、患者（Ｎ＝３８）のわずか１０％にしかＪＯ−４に対する検出可能な（結合）抗体を見出さなかった（図１３）。しかしながら、特に反復注射後に、静脈内投与されたＪＯ−４に対する適応免疫応答がヒトで発達することは確かである。しかしながら、この文脈で、免疫適格マウスへの注射後に産生された抗ＪＯ−４抗体がＪＯ−４の機能を決定的に阻害するように見えなかったことは注目に値する。図１１Ｃに示すデータは、検出可能な抗体の存在下でさえ、複数処理サイクル後にＪＯ−１およびＪＯ−４が有効であり続けることを証明している。反復注射後の療法効果がＪＯ−４について有意に大きかったために、本発明者らは、ＪＯ−４が結合開口においてのみならず、結合開口剤と血清抗体との間の複合体の破壊においてもより強力であると推測する。
【０１６０】
要約すると、本発明者らの試験は、ＤＳＧ２へのＡｄ３およびＡｄ１４ｐ１ファイバーノブの結合の重要な構造詳細を明らかにする。これはＤＳＧ２に対するＡｄ３ファイバーノブの親和性とその後の上皮結合への効果との間の相関をさらに示す。最後に、親和性強化組換え二量体Ａｄ３ファイバーノブの産生は、がん療法にとって意味を有する。
【０１６１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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