(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未熟果実からスペクトル測定用試料を得る準備ステップと、
前記スペクトル測定用試料を用いて前記未熟果実のＦＴ−ＩＲ（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）スペクトルデータを得る測定ステップと、
前記未熟果実のスペクトルデータを、データベース内に予め準備された多変量統計分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいた糖度又は酸度の予測モデルに適用して、未熟果実が成熟したときの糖度又は酸度に該当する予測値を出力する予測ステップとを含み、かつ
前記測定ステップと前記予測ステップとの間に、前記ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを前処理して標準化されたスペクトルデータを得る標準化ステップをさらに含み、
前記標準化ステップにおいて前処理は、前記未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータが有する分析領域及びベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を、前記糖度又は酸度の予測モデルの確立で適用した学習集団のスペクトルデータの分析領域及びベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）と同一に調整する校正ステップと、前記校正ステップを経た未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータの面積を、前記学習集団で適用したスペクトルの面積と同一に正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）するステップと、前記正規化された未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータの平均中心化（ｍｅａｎ  ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）及び２次微分処理を行って未熟果実のスペクトルデータを得るステップとを更に含む、
果実の糖度又は酸度の予測方法。
【請求項２】
前記多変量統計分析は、ＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析、ＰＬＳ−ＤＡ（Ｐａｒｔｉａｌ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析、またはこれらのいずれもを適用することである、請求項１に記載の果実の糖度又は酸度の予測方法。
【請求項３】
前記糖度又は酸度の予測モデルは、学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）のデータを部分最小二乗（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅ：ＰＬＳ）モデリングに適用して確立した、請求項１に記載の果実の糖度又は酸度の予測方法。
【請求項４】
前記未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータは、１，８００〜８００ｃｍ−１の領域を含む分析領域で測定される、請求項１に記載の果実の糖度又は酸度の予測方法。
【請求項５】
前記学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）を用いて確立した糖度又は酸度の予測モデルは、未熟果実のスペクトルデータをＸ変数とし、前記未熟果実が成熟したときに測定された成熟果実の糖度又は酸度をそれぞれＹ変数であるＹ１又はＹ２として適用して確立した、請求項３に記載の果実の糖度又は酸度の予測方法。
【請求項６】
前記予測ステップで出力された未熟果実の成熟時の糖度又は酸度の予測値は９０％以上の正確度を有する、請求項１に記載の果実の糖度又は酸度の予測方法。
【請求項７】
前記果実（ｆｒｕｉｔ）は、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）に属する柑橘類の果実（ｃｉｔｒｕｓ  ｆｒｕｉｔｓ）、ブドウ、リンゴ、キウイ、モモ及びナシからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の果実の糖度又は酸度の予測方法。
【請求項８】
学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）の未熟果実からスペクトル測定用試料を得る準備ステップと、
前記スペクトル測定用試料を用いて前記未熟果実のＦＴ−ＩＲ（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）スペクトルデータを得る測定ステップと、
前記ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを前処理して標準化されたスペクトルデータを得る標準化ステップと、
前記標準化されたスペクトルデータ及び前記学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）の未熟果実が成熟したときに測定された成熟果実の糖度又は酸度の分析結果を活用して、データベース内に準備された多変量統計分析ツールから未熟果実のスペクトルデータをＸ変数とし、前記未熟果実が成熟したときに測定された成熟果実の糖度又は酸度の分析結果をそれぞれＹ変数であるＹ１又はＹ２とする、未熟果実のスペクトルデータから成熟時の果実の糖度又は酸度を予測できる、果実の糖度又は酸度の予測モデルを確立するモデリングステップとを含み、
前記標準化ステップにおいて前処理は、前記未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータが有する分析領域及びベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を、前記糖度又は酸度の予測モデルの確立で適用した学習集団のスペクトルデータの分析領域及びベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）と同一に調整する校正ステップと、前記校正ステップを経た未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータの面積を、前記学習集団で適用したスペクトルの面積と同一に正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）するステップと、前記正規化された未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータの平均中心化（ｍｅａｎ  ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）及び２次微分処理を行って未熟果実のスペクトルデータを得るステップとを含む、
果実の糖度又は酸度の予測モデルの確立方法。
【請求項９】
前記果実の糖度又は酸度予測モデルの確立方法は、前記モデリングステップの後に検証ステップをさらに含み、
前記検証ステップは、ｉ）前記果実の糖度又は酸度予測モデルに、検証集団（ｔｅｓｔ  ｓｅｔ）の未熟果実から得られた未熟果実のスペクトルデータをＸ変数として適用する過程、ｉｉ）前記ｉ）の結果として得られるＹ変数である糖度又は酸度の予測値を取得する過程、及びｉｉｉ）前記ｉｉ）の過程で取得された予測値を、前記検証集団の未熟果実が成熟したときの糖度又は酸度の実測値と比較する過程を含む、請求項８に記載の果実の糖度又は酸度の予測モデルの確立方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータの多変量統計分析結果を活用して、未熟果実（ｆｒｕｉｔ）の試料から成熟後の果実の糖度及び酸度を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
柑橘は、済州島で２００８年以降に６，０００億ウォン以上の生産額を持続的に示しており、国内の果樹総生産量の１／４以上を占めるほど生産量が高い果実である。最近、中国、日本、米国、及びヨーロッパと締結したＦＴＡの影響からなる輸入開放化によって、柑橘類（ｃｉｔｒｕｓ  ｆｒｕｉｔｓ）の輸入量が増加しており、国内の柑橘産業の生存が脅威を受けている実情である。このような問題点を克服するための一つの方法として、柑橘のような果実類の新規品種の開発が試みられており、栽培される果実の糖酸度などの品質管理及び出荷量管理も必要な実情である。
【０００３】
ＦＴ−ＩＲ（Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ）分析方法は、試料に照射された赤外線（ＩＲ）によって試料内の分子が特定の周波数の赤外線を吸収して振動するようになるため、このエネルギーに対応する特徴的な赤外線スペクトルが現れるようになり、これを分析して試料内の分子に対する情報を得ることができる方法であって、スペクトルが有している様々な情報を利用できるという利点がある（非特許文献１）。
【０００４】
多変量統計分析技法の一つである部分最小二乗（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅ；ＰＬＳ）回帰分析（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）は、試料からの正確な定量分析データと同一試料のスペクトルデータとの相関分析を通じて、様々な成分の含量予測モデリング方法として活用されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｐ．，  Ｎ．Ｊ．  Ｋｒｕｇｅｒ，ａｎｄ  Ｒ．Ｇ．  Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ．  ２００５．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＮＭＲ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｏｔ．  ５６：２５５−２６５．
【非特許文献２】Ｗｏｌｄ，  Ｓ．，  Ｍ．  Ｓｊｏｓｔｒｏｍ，ａｎｄ  Ｌ．  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ．  ２００１．  ＰＬＳ−ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ：ａ  ｂａｓｉｃ  ｔｏｏｌ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ．  Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｌａｂ．  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ５８：１０９−１３０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、未熟果実の試料から得たデータを用いて、成熟後の果実の糖度及び酸度を予測する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願は、２０１４年６月２６日に出願した大韓民国特許出願第１０−２０１４−００７８８３４号に基づく優先権の利益を有し、上記の特許出願に記載された内容は、本出願のために本出願の一部として含まれる。
【０００８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００９】
本明細書において、「糖酸度」は、「糖度及び酸度」を意味する。
【００１０】
本発明の発明者らは、柑橘を用いて未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータに多変量統計分析技法を適用した結果、収穫時期の果実の品質に対する迅速な区分及び識別体系の確立が可能であるという点を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明の一実施例に係る果実の糖度又は酸度の予測方法は、未熟果実からスペクトル測定用試料を得る準備ステップ；前記スペクトル測定用試料を用いて前記未熟果実のＦＴ−ＩＲ（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）スペクトルデータを得る測定ステップ；及び前記未熟果実のスペクトルデータを、データベース内に予め準備された多変量統計分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいた糖度又は酸度の予測モデルに適用して、未熟果実が成熟したときの糖度又は酸度に該当する予測値を出力する予測ステップ；を含む。
【００１２】
前記準備ステップは、未熟果実からスペクトル測定用試料を得るステップであって、ｉ）前記未熟果実を凍結乾燥して未熟果実の乾燥物を得、前記乾燥物を粉末化して抽出物製造用試料を製造するステップ、及びｉｉ）抽出溶媒を前記抽出物製造用試料に適用して未熟果実の抽出物を収得し、固形分を除去してスペクトル測定用試料を得るステップの過程で行われてもよい。
【００１３】
前記未熟果実の乾燥物は、未熟果実の全細胞を凍結乾燥の方式で乾燥した結果物であってもよく、このとき、乾燥は、未熟果実内に含まれている有機物の損傷を最小化するという点で凍結乾燥の方法で行うことがよい。
【００１４】
前記抽出溶媒は、前記糖度又は酸度の予測モデルの確立時に適用した抽出溶媒と同じ溶媒を適用することが好ましく、例えば、炭素数１〜５のアルコール、前記アルコールを含む溶液などを適用してもよいが、これに限定されるものではない。
【００１５】
前記ＦＴ−ＩＲスペクトルデータは、例えば、Ｔｅｎｓｏｒ  ２７（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＤＴＧＳ（ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）検出器によって得ることができ、１，８００〜８００ｃｍ−１の領域を含む分析領域で一定の間隔で測定された結果から得ることができ、このとき、一定の間隔は、例えば、４ｃｍ−１の間隔で測定された結果から得ることができ、同じ条件で２〜５回繰り返して測定した結果を平均して得られた平均スペクトルを、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータとして以降の段階に適用することができる。
【００１６】
前記果実の糖度又は酸度の予測方法は、前記測定ステップと前記予測ステップとの間に、前記ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを前処理して標準化されたスペクトルデータを得る標準化ステップをさらに含むことができる。
【００１７】
前記の過程は、実験上の誤差を最小化するために行われるもので、Ｒプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１５．０，Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）を用いて行われてもよいが、前記のようなスペクトルデータの前処理が可能な方法であれば制限なしに適用することができる。
【００１８】
具体的に、前記標準化ステップにおいて前処理は、前記未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータが有する分析領域及びベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を、前記糖度又は酸度の予測モデルの確立で適用した学習集団のスペクトルデータの分析領域及びベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）と同一に調整する校正ステップ；前記校正ステップを経た未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータの面積を、前記学習集団で適用したスペクトルの面積と同一に正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）するステップ；及び前記正規化された未熟果実のＦＴ−ＩＲスペクトルデータの平均中心化（ｍｅａｎ  ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）と２次微分処理を行って未熟果実のスペクトルデータを得るステップ；を含むことができる。
【００１９】
前記多変量統計分析は、ＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析、ＰＬＳ−ＤＡ（Ｐａｒｔｉａｌ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析、またはこれらのいずれもを適用するものであってもよい。
【００２０】
前記糖度又は酸度の予測モデルは、予め確立されたモデリングの結果物としてデータベース内に格納されているものであって、未熟果実からのスペクトルデータ、及び同じ果樹から得た成熟果実の糖度及び酸度データを、多変量統計分析技法を用いて、測定変数から成熟時の果実の糖度と酸度を予測できるモデルを意味する。
【００２１】
前記糖度又は酸度の予測モデルは、学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）のデータを部分最小二乗（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅ：ＰＬＳ）モデリングに適用して確立されたものであってもよい。例えば、前記糖度又は酸度の予測モデルは、ＦＴ−ＩＲスペクトルに部分最小二乗回帰アルゴリズム（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ）を用いて準備されたものであってもよく、具体的に、ＮＩＰＡＬＳアルゴリズムを用いてＲプログラムで学習集団のデータを用いて前記部分最小二乗（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅ：ＰＬＳ）モデリングを行った結果として得られたものであってもよい。
【００２２】
ここで、学習集団は、未熟果実のスペクトルデータ、及び前記未熟果実が成熟したときの成熟果実の糖度と酸度の測定値の集団を意味する。
【００２３】
前記学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）を用いて確立した糖度又は酸度の予測モデルは、未熟果実のスペクトルデータをＸ変数とし、前記未熟果実が成熟したときに測定された成熟果実の糖度又は酸度をそれぞれＹ変数であるＹ１又はＹ２として適用して確立したものであってもよい。
【００２４】
このとき、未熟果実が成熟したときに測定された成熟果実という意味は、採取された未熟果実と同じ果樹から採取されるなど、未熟状態と成熟状態の果実が採取時点による相違点を除けばほぼ同一の特性を有するものと見なすことができる場合を意味する。
【００２５】
前記糖度又は酸度の予測モデルは、後述する、果実の糖度又は酸度予測モデルの確立方法によって予め準備されてデータベースに格納されているものであってもよい。
【００２６】
前記糖度又は酸度の予測モデルは、検証集合（ｔｅｓｔ  ｓｅｔ）を通じた予測モデルの回帰分析の結果、糖度の場合、相関係数（Ｒ２）が０．９９であり、酸度の場合、相関係数（Ｒ２）が０．９９であるものであってもよく、前記予測ステップで出力された未熟果実の成熟時の予測値は、未熟果実が成熟したときの糖度及び酸度と比較して約９０％以上の正確度を有するもので、予測の正確度に優れる。
【００２７】
前記果実（ｆｒｕｉｔｓ）は、木などの植物から得られる摂取可能な甘味又は酸味を有する果実類を意味し、具体的に、リンゴ、ナシなどの仁果類；柿、柑橘類の準仁果類；モモ、ウメ、アンズなどの核果類、又はブドウなどの漿果類が前記果実に該当してもよいが、これに限定されるものではない。
【００２８】
前記果実としては、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ、カラタチ属、ミカン属、キンカン属）に属する柑橘類の果実（ｃｉｔｒｕｓ  ｆｒｕｉｔｓ）、ブドウ、リンゴ、キウイ、モモ、及びナシからなる群から選択されるいずれか１つであってもよく、この場合、未熟果実が成熟するまで比較的長時間がかかるため、本発明の予測方法の活用度が高い。
【００２９】
前記柑橘類の果実は、オレンジ、ライム、柑橘、レモン及びザボンからなる群から選択されるいずれか１つであってもよく、前記柑橘としては、宮川早生（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  Ｃｖ．  Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｗａｓｅ）、興津早生（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  ｖａｒ．  ｏｋｉｔｓｕ）、日南１号（Ｃ．  ｕｎｓｈｉ  ‘Ｎｉｃｈｉｎａｎ  １  ｇｏｕ’）、漢拏峰（Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ‘Ｓｈｉｒａｎｕｈｉ’）、天恵香（Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ‘Ｓｅｔｏｋａ’）、甘平（Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ‘Ｋａｎｐｅｉ’）及び津之香（Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ‘Ｔｓｕｎｏｋａｏｒｉ’）からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【００３０】
前記のように、確立された果実の糖度又は酸度の予測モデルを用いて未熟果実の成熟時の糖度又は酸度を予測することは、果実を栽培する過程で、果実が成熟する前の時点で予め成熟した果実の品質を予測し、果実の出荷量管理などに活用することができる。例えば、１１月末頃に収穫する柑橘の成熟時の糖度及び酸度情報を８月の未熟柑橘から予測することができる。また、前記予測方法は、果実の新品種の研究時に新品種の果実の品質を予め予測して候補種子選別のための資料としても活用することができる。
【００３１】
本発明の他の一実施例に係る果実の糖度又は酸度予測モデルの確立方法は、学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）の未熟果実からスペクトル測定用試料を得る準備ステップ；前記スペクトル測定用試料を用いて前記未熟果実のＦＴ−ＩＲ（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）スペクトルデータを得る測定ステップ；前記ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを前処理して標準化されたスペクトルデータを得る標準化ステップ；及び前記標準化されたスペクトルデータ及び前記学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）の未熟果実が成熟したときに測定された成熟果実の糖度又は酸度の分析結果を活用して、データベース内に準備された多変量統計分析ツールから未熟果実のスペクトルデータをＸ変数とし、前記未熟果実が成熟したときに測定された成熟果実の糖度又は酸度の分析結果をそれぞれＹ変数であるＹ１又はＹ２とする、未熟果実のスペクトルデータから成熟時の果実の糖度又は酸度を予測できる、果実の糖度又は酸度の予測モデルを確立するモデリングステップ；を含む。
【００３２】
ここで、準備ステップ、測定ステップ及び標準化ステップについての説明は、上述した果実の糖度又は酸度の予測方法で説明した準備ステップ、測定ステップ及び標準化ステップと適用する試料のみが異なるだけで、その具体的な構成及び特性が同一であるので、その記載を省略する。具体的に、成熟時の糖度又は酸度に関する情報を有していないサンプルの未熟果実（果物の糖度又は酸度の予測方法）に準備ステップ、測定ステップ、標準化ステップなどの過程を適用するのか、または学習集団の未熟果実（果実の糖度又は酸度予測モデルの確立方法）に同じ過程を適用するのかの差異点を除けば、これらのステップについての説明が重複するため、その記載を省略する。
【００３３】
前記モデリングステップで適用する多変量統計分析ツールは、ＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析及び／又はＰＬＳ−ＤＡ（Ｐａｒｔｉａｌ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析であって、ＮＩＰＡＬＳアルゴリズムを用いてＲプログラムで行われてもよい。
【００３４】
ＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析は、分析対象であるスペクトルと糖度及び酸度の分析結果から、説明力に優れたＰＣ  １（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  １）とＰＣ  ２を得、これを基準としてＰＣＡスコアプロットを示す方式で分析が行われてもよい。
【００３５】
ＰＬＳ−ＤＡ（Ｐａｒｔｉａｌ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析は、多変量統計技法の一つである。多変量統計技法は、設定された変動変数及び目標変数を用いて次式１のような式をモデリングするものである。
【００３６】
（数１）
ｙ＝ａｘ１＋ｂｘ２＋ｃｘ３＋ｄｘ４
【００３７】
ここで、ｘ１、ｘ２、ｘ３、及びｘ４は変動変数であり、ｙは目標変数であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄは定数である。
【００３８】
多変量統計分析技法の一つであるＰＬは、測定変数と予測変数との間の相関関係に基づいて多変量データを分析する方法であり、式１において、変動変数及び目標変数がそれぞれ測定変数と予測変数に該当する。このとき、測定変数をｘに設定し、予測変数をｙに設定して、ｘ，ｙのそれぞれの相関関係を回帰（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）する。
【００３９】
部分最小二乗法は、予測変数の数が測定変数の数よりも多い場合にも使用可能である。このとき、ｘとｙの多重相関関係を用いて予測モデルを構築することができるが、このような点が、単純回帰分析モデルを用いる場合と比較して、果実の主要品質の決定要素である糖度及び酸度を含む様々な形質と予測との有効関係を判断できるようにするという利点を有している。
【００４０】
具体的に、前記標準化されたスペクトルデータ、及び前記学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）の未熟果実が成熟したときに測定された成熟果実の糖度又は酸度の分析結果を活用して、データベース内に準備された多変量統計分析ツールから未熟果実のスペクトルデータをＸ変数とし、前記未熟果実が成熟したときに測定された成熟果実の糖度又は酸度の分析結果をそれぞれＹ変数であるＹ１又はＹ２とする、未熟果実のスペクトルデータから成熟時の果実の糖度又は酸度を予測できる、果実の糖度又は酸度の予測モデルを確立する過程としてモデリングステップが行われてもよく、このように確立された果実の糖度又は酸度の予測モデルは、ｉ）前記果実の糖度又は酸度予測モデルに検証集団（ｔｅｓｔ  ｓｅｔ）の未熟果実から得られた未熟果実のスペクトルデータをＸ変数として適用する過程、ｉｉ）前記ｉ）の結果で得られるＹ変数である糖度又は酸度の予測値を取得する過程、及びｉｉｉ）前記ｉｉ）の過程で取得された予測値を、前記検証集団の未熟果実が成熟したときの糖度又は酸度の実測値と比較する過程、を含む検証ステップをさらに経ることができる。
【００４１】
前記果実の糖度又は酸度の予測モデルは、検証集合（ｔｅｓｔ  ｓｅｔ）を通じた予測モデルの回帰分析の結果、糖度の場合、相関係数（Ｒ２）が０．９９であり、酸度の場合、相関係数（Ｒ２）が０．９９であるほどにその正確度に優れるものであり得る。
【発明の効果】
【００４２】
本発明に係る果実の糖度及び酸度の予測方法は、未熟果実の試料を用いて、成熟果実の糖度及び酸度を収穫の前に予め予測することができ、予測された糖酸度値に基づいて、果実が完全に成熟する前に当該果実の収穫量を調節するなど、果実の品質管理のための資料として活用することができる。また、果実類の新規品種を開発しようとするとき、候補種子の選別のための資料として活用して新規品種開発の効率性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の実施例の３．において未熟果実のスペクトル測定用試料を用いて測定したＦＴ−ＩＲスペクトルデータの代表的な例示であって、矢印は、それぞれの柑橘試料間の有意な変化がある部分を、ＣはＣｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  Ｃｖ．  Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｗａｓｅを、Ｍ１は突然変異ライン１を、Ｍ２は突然変異ライン２を、Ｍ３は突然変異ライン３を、及びＭ４は突然変異ライン４を示す。
【図２】本発明の実施例の７．で説明する標準化されたスペクトルデータのＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ、主成分分析）の結果のうちＰＣＡスコアを示すグラフであって、円形の点線はクラスタの境界を示し、ＣはＣｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  Ｃｖ．  Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｗａｓｅ、Ｍ１は突然変異ライン１、Ｍ２は突然変異ライン２、Ｍ３は突然変異ライン３、及びＭ４は突然変異ライン４を示す。
【図３】本発明の実施例の７．で説明する標準化されたスペクトルデータのＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ、主成分分析）の結果のうちＰＣＡスコアの荷重値（ｌｏａｄｉｎｇ  ｖａｌｕｅｓ）プロットを示すグラフであって、矢印は、図２のクラスタリングで有意な役割を果たすＦＴ−ＩＲ領域を、ＣはＣｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  Ｃｖ．  Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｗａｓｅ、Ｍ１は突然変異ライン１、Ｍ２は突然変異ライン２、Ｍ３は突然変異ライン３、及びＭ４は突然変異ライン４を示す。
【図４】本発明の実施例の７．で説明するＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示すグラフであって、円形の点線は、柑橘種類に試料のクラスタの境界を示し、ＣはＣｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  Ｃｖ．  Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｗａｓｅ、Ｍ１は突然変異ライン１、Ｍ２は突然変異ライン２、Ｍ３は突然変異ライン３、及びＭ４は突然変異ライン４を示す。
【図５】本発明の実施例の７．で説明するＨＣＡデンドログラム（ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）のうちＰＣＡデンドログラム（ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）の分析結果であって、ＣはＣｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  Ｃｖ．  Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｗａｓｅ、Ｍ１は突然変異ライン１、Ｍ２は突然変異ライン２、Ｍ３は突然変異ライン３、及びＭ４は突然変異ライン４を示す。
【図６】本発明の実施例の７．で説明するＨＣＡデンドログラム（ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）のうちＰＬＳ−ＤＡデンドログラム（ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）の分析結果であって、ＣはＣｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  Ｃｖ．  Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｗａｓｅ、Ｍ１は突然変異ライン１、Ｍ２は突然変異ライン２、Ｍ３は突然変異ライン３、及びＭ４は突然変異ライン４を示す。
【図７】本発明の実施例の８．で開発した成分別含量予測ＰＬＳモデリングを適用して得た糖度に対する予測度の評価結果であって、未熟果実を用いて分析した予測値と、成熟果実を用いて測定した実測値との間の線形回帰分析の結果を示す（回帰相関係数、Ｒ２＝０．９９）。
【図８】本発明の実施例の８．で開発した成分別含量予測ＰＬＳモデリングを適用して得た酸度に対する予測度の評価結果であって、未熟果実を用いて分析した予測値と、成熟果実を用いて測定した実測値との間の線形回帰分析の結果を示す（回帰相関係数、Ｒ２＝０．９９）。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本発明の実施例について添付の図面を参照して詳細に説明する。しかし、本発明は、様々な異なる形態で実現可能であり、ここで説明する実施例に限定されない。
【００４５】
本実施例では、宮川早生品種の柑橘を対照区として用い、この対照区、及び糖度及び酸度で差がある突然変異品種の柑橘を用いて糖酸度予測評価を実施した。対照区品種と突然変異品種の柑橘の糖度及び酸度を測定し、また、対照区品種と突然変異品種の柑橘からＦＴ−ＩＲ分析スペクトルデータを得、多変量統計分析技法を用いて糖度及び酸度予測モデルを開発した。
【００４６】
実施例
【００４７】
１．果実材料の準備及び糖酸度測定方法
【００４８】
１−１：材料：対照区及び突然変異系統試料の準備
【００４９】
本実施例で使用された柑橘品種は、済州島内で最も多く栽培される宮川早生（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  Ｃｖ．  Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｗａｓｅ)、及びこれから放射線照射を通じて誘導した、対照区と糖度及び酸度で差を示す突然変異系統を使用した。
【００５０】
突然変異系統は、済州大学校放射線応用科学研究所で放射線（６０ＣＯ）を照射して突然変異を発生させた後、カラタチ台木に接木して確立した。
【００５１】
未熟柑橘は、２０１３年８月初めに宮川早生１品種と突然変異に誘導された４系統でそれぞれ最小３個から最大５個まで採取し、それぞれの未熟柑橘を凍結乾燥した後、乾燥されたすりこぎとすり鉢を用いて微細な粉末に粉砕して未熟柑橘の粉末試料を製造し、−７０℃の超低温冷凍庫に保管しながら実験に用い、未熟柑橘の一部は形質測定に用いた。また、成熟柑橘は、２０１３年１１月末に未熟柑橘の分析用試料と同じ果樹から採取し、低温貯蔵庫（４℃）に保管しながら形質測定を行った。
【００５２】
１−２：糖度及び酸度の測定
【００５３】
未熟及び成熟柑橘の糖酸度の測定は、搾汁機を用いてそれぞれの柑橘から柑橘汁を採取し、メッシュ（ｍｅｓｈ）に採取した柑橘汁を通過させた後、通過した果汁約４〜５ｍＬを、１０ｍＬの注射器を用いて酸糖度分析装置（ＮＨ−２０００、ＨＯＲＩＢＡ、Ｊａｐａｎ）に注入して糖度及び酸度を測定する方式で行われた。
【００５４】
２．試料の製造方法
【００５５】
抽出物製造用試料である、未熟柑橘果実の全細胞の凍結乾燥物を宮川早生の未熟柑橘及び４系統の突然変異未熟柑橘を用いて製造した。製造された凍結乾燥物粉末をそれぞれ２０ｍｇずつ準備してチューブに入れ、２０％メタノール溶液を２００Ｌずつ添加してよく撹拌した。各チューブを５０℃の水槽で２０分間反応させた後、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄液を新しいチューブに移した。回収した上澄液は、遠心分離過程を繰り返すことによって残渣が入らないようにし、再度慎重に新しいチューブに上澄液を移した。最終回収された上澄液は、−２０℃で保管した後、スペクトル測定用試料として、以下の方法でＦＴ−ＩＲスペクトル調査に使用した。
【００５６】
３．ＦＴ−ＩＲ分析スペクトルデータの収得及び数学的前処理方法
【００５７】
３−１：データの収得方法
【００５８】
ＦＴ−ＩＲ（Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ）スペクトル調査はＴｅｎｓｏｒ  ２７（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、ＤＴＧＳ（ｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）検出器で分析した。前記の２．の方法で製造したスペクトル測定用試料の各５Ｌを３８４−ウェルＺｎＳｅプレートに分注し、３７℃のホットプレートで約２０分間乾燥させた。乾燥されたＺｎＳｅプレートは、Ｔｅｎｓｏｒ  ２７に装着されたＨＴＳ−ＸＴ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）高効率自動化装置を用いてスペクトルの分析を実施した。
【００５９】
各試料のスペクトルは、総１，８００〜８００ｃｍ−１の範囲で、そして、４ｃｍ−１の間隔で計１２８回繰り返して測定し、各試料のＦＴ−ＩＲスペクトルは、統計的分析のためにそれぞれ３回繰り返して測定し、その結果の平均スペクトルをＦＴ−ＩＲスペクトルデータとして以降の分析に使用した。ＦＴ−ＩＲスペクトル調査及びデータ変換に使用されたプログラムは、Ｂｒｕｋｅｒで提供するＯＰＵＳ  Ｌａｂ（ｖｅｒ．６．５，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）であった。
【００６０】
３−２：データの数学的前処理方法
【００６１】
ＦＴ−ＩＲスペクトルデータの多変量統計分析のために、まず、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータのベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）校正、正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び平均中心化（ｍｅａｎ  ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）などのスペクトルの前処理過程を、Ｒプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．１５．０，Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）を用いて行った。
【００６２】
ベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）の校正のために、ＦＴ−ＩＲスペクトル分析領域の両端点（１，８００〜８００ｃｍ−１）の吸光度を０に調整し、実験上の誤差を最小化するために、各スペクトルを同一面積に正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）した。その後、データの平均中心化（ｍｅａｎ  ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）過程を経て２次微分を行うことによってスペクトルデータの前処理を完了した。
【００６３】
代表ＦＴ−ＩＲスペクトルデータは、図１に示しており、その後の過程で上述した数学的前処理過程を経た標準化されたスペクトルデータを用いて多変量統計分析を行った。
【００６４】
４．糖度及び酸度含量予測ＰＬＳモデリング方法
【００６５】
標準化されたスペクトルデータは、ＮＩＰＡＬＳアルゴリズム（Ｗｏｌｄ，Ｈ．１９６６．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｅｌｓ  ｂｙ  ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅｓ，ｐ．３９１−４２０．Ｉｎ：Ｋ．Ｒ．Ｋｒｉｓｈｎａｉａｈ（ｅｄ．）．Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いてＲプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１５．０）でＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）及びＰＬＳ−ＤＡ（Ｐａｒｔｉａｌ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析（Ｆｉｅｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，．２０００．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１１５７−１１６１．；Ｔｒｙｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ  Ｒｅｓ．６：４６７−４７９．）を行った。
【００６６】
ＰＣＡ及びＰＬＳ−ＤＡ分析から得られたそれぞれのスコアを用いてＨＣＡ（ｈｉｅｒａｒｃｈｉａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析を行い、類似度指数として、ＵＰＧＭＡ（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｐａｉｒ  ｇｒｏｕｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ  ｍｅａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いたユークリッド距離（ｅｕｃｌｉｄｅａｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）を測定して、各試料の類縁関係をデンドログラム（ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）で示した。
【００６７】
また、柑橘試料の標準化されたスペクトルデータから糖酸度含量予測モデルを開発した後、実測値との比較を通じて予測モデルの正確度を検定した。ＦＴ−ＩＲスペクトルデータを測定した宮川早生１品種及び４系統の突然変異未熟柑橘と同じ品種又は系統の成熟柑橘から得られた糖酸度含量実測定量データを用いて予測モデルを樹立し、Ｘ変数としては、標準化されたスペクトルデータを、そして、２つのＹ変数としては、酸糖度分析装置（ＮＨ−２０００，ＨＯＲＩＢＡ，Ｊａｐａｎ）を用いて測定された糖度及び酸度含量定量データをそれぞれ使用した。
【００６８】
ＰＬＳＲ（ｐａｒｔｉａｌ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）分析はＲプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１５．０）を用いた。予測モデリングの正確度を向上させるために、１つのＸ変数に対して２つのＹ変数をそれぞれ交差検定を実施した。
【００６９】
確立された予測モデリング及び未熟果実から得た分析用試料を用いて、それぞれの柑橘試料の成熟時の糖酸度含量の予測を行った。また、含量予測モデリングの正確度を調査するために、柑橘試料から糖酸度含量の実測値と予測値に対する線形回帰分析を行って相関係数を調査した。
【００７０】
５．未熟柑橘と成熟柑橘の糖度及び酸度含量の調査結果
【００７１】
前記の１−２で提示した方法で未熟柑橘（８月）及び成熟柑橘（１１月）の糖酸度含量を調べ、その結果を下記表１に示す。
【００７２】
【表１】
0006339244.tif 000002
【００７３】
［Ｃ：Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍａｒｃ．  Ｃｖ．  Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｗａｓｅ、Ｍ１、突然変異ライン１；Ｍ２、突然変異ライン２；Ｍ３、突然変異ライン３；Ｍ４、突然変異ライン４］
【００７４】
前記の表１を参照すると、８月に採取した未熟柑橘試料の全体的な糖度は６．２〜６．３°Ｂｒｉｘであることがわかる。この時期は、柑橘の水分が蒸発し、糖度を蓄積する段階であるため、低い糖度含量を示しており、試料間の差が示されなかった。また、酸度は、Ｍ４系統で１．７５％と最も低く、宮川早生が２．１９％と最も高く示された。前記の突然変異系統の未熟柑橘と宮川早生の未熟柑橘は、糖度よりは酸度で顕著な差を示した。
【００７５】
また、１１月に採取した成熟柑橘試料において、糖度は、Ｍ１系統が１０．３°Ｂｒｉｘで、宮川早生の８．４°Ｂｒｉｘに比べて約２°Ｂｒｉｘ高く示された。これは、調査した柑橘試料のうち最も高い糖度を示すものである。Ｍ２試料は８．４°Ｂｒｉｘで、宮川早生の柑橘と類似の糖度を示し、Ｍ３とＭ４試料はそれぞれ９．７、９．５°Ｂｒｉｘで、宮川早生の柑橘に比べて約１°Ｂｒｉｘ高く示された。酸度もまた、宮川早生の柑橘と突然変異系統の柑橘との間に差を示しており、宮川早生の成熟果の酸度は０．６４％、Ｍ１の場合、酸度が０．９９％で、１％未満であり、Ｍ２、Ｍ３及びＭ４の成熟果の酸度は、それぞれ０．７９、０．６１及び０．６５％で、１％未満の酸度含量を示した。成熟果の場合、全体的な糖度と酸度含量が、宮川早生の柑橘とＭ２の柑橘がほぼ同一であり、Ｍ１、Ｍ３及びＭ４が比較的高く示された。
【００７６】
この結果から、突然変異系統の柑橘が宮川早生の柑橘に比べて、糖度は高く、酸度は低いことがわかり、突然変異品種が高い価値を示した。
【００７７】
６．分析用試料を用いて収得したＦＴ−ＩＲ分析スペクトルデータ
【００７８】
未熟柑橘から全細胞抽出物のＦＴ−ＩＲスペクトルデータを前処理して標準化されたスペクトルデータを得、その多変量統計分析を行って糖度及び酸度の区別体系を確立した。
【００７９】
それぞれの柑橘試料の標準化されたスペクトルデータである図１の結果を参照すると、未熟柑橘のスペクトル測定用試料は、ＦＴ−ＩＲスペクトル上の１，７００〜１，５００、１，５００〜１，３００、１，１００〜９５０ｃｍ−１の部位で代謝体の量的、質的のパターン変化が大きいことがわかる。ＦＴ−ＩＲスペクトルの１，７００〜１，５００、１，５００〜１，３００、及び１，１００〜９５０ｃｍ−１の部位は、それぞれアミノ酸及び蛋白質のアミド結合（ａｍｉｄｅ  ｂｏｎｄ）ＩとＩＩ、核酸及びリン脂質からリン脂質結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  ｂｏｎｄ）及びリンを含む有機酸、そして、単糖類や複合多糖類を含む炭水化物系列の化合物の質的、量的情報を反映する。すなわち、ＦＴ−ＩＲスペクトルデータから未熟柑橘に含有されているアミノ酸や蛋白質、脂肪酸、及び炭水化物系統の化合物などの質的、量的差が顕著であるという点が確認できた。
【００８０】
７．標準化されたスペクトルデータの多変量統計分析結果
【００８１】
７−１．ＰＣＡスコア（ｓｃｏｒｅ）分析結果
【００８２】
標準化されたスペクトルデータのＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ、主成分分析）結果であるＰＣＡスコアは、ＰＣ  １とＰＣ  ２のスコアで全体変異量のそれぞれ６３．４％、１５．５％の説明力を有しており、これは、全体変異量の約７８．９％を反映している。このように説明力が高いＰＣ  １とＰＣ  ２を基準としてＰＣＡスコアプロットを観察した結果を、図２に示した。前記図２を参照すると、柑橘試料は、ＰＣ  ２を基準として大きく上下に区分されることが観察できた。
【００８３】
具体的に、ＰＣＡスコアプロット上の宮川早生に対するスコアグループを中心に上下に位置するが、宮川早生と糖度がほぼ同一であるＭ２系統のスコアグループが、宮川早生のスコアグループと共に分布し、上下にＭ３とＭ４系統のスコアグループが主に位置しており、糖度が最も高いＭ１のスコアグループは、Ｍ２とＭ３系統のスコアグループの間に位置することが確認できた。
【００８４】
７−２．ＰＣＡスコア（ｓｃｏｒｅ）と成熟果実の糖酸度との相関関係分析結果
【００８５】
未熟柑橘試料のＰＣＡスコアプロット上での空間的な分布位置による生物学的情報を把握するために、まず、成熟柑橘試料の糖度及び酸度含量の差の結果（前記表１）と、ＰＣＡスコアプロット上のこれらの試料の位置との相関関係を調査した。
【００８６】
糖度が比較的低い試料である宮川早生の柑橘の場合、ＰＣＡスコアプロット上で中央に別途のグループを形成しており、逆に、糖度含量が最も高い試料であるＭ１の場合、ＰＣＡスコアプロット上でＭ２とＭ３との間に別途のグループを形成して分布することが観察できた。以上の結果から、ＰＣＡスコアプロット上での空間的な分布位置と、これらの試料の糖度含量との間に密接な相関関係があることがわかった。
【００８７】
７−３．ＰＣＡスコア（ｓｃｏｒｅ）と成熟果実の糖酸度との相関関係分析結果
【００８８】
ＰＣＡスコアプロット上で糖度及び酸度の含量による柑橘試料の集団区分、及びクラスタリングに重要な役割を果たすＦＴ−ＩＲスペクトル部位を調べるために、ＰＣ  １とＰＣ  ２を決定するのに重要な役割を果たしたＦＴ−ＩＲスペクトル部位を荷重値（ｌｏａｄｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）の分析を通じて調査し、その結果を図３に示した。
【００８９】
前記図３を参照すると、ＰＣＡスコアにおいて上下の区分に重要なＰＣ  １を決定する重要なＦＴ−ＩＲスペクトル部位は、主に１，７００〜１，５００及び１，５００〜１，３００ｃｍ−１の領域であり、ＰＣ  ２の場合、主に１，１００〜９５０ｃｍ−１の領域であることがわかった。これらのＦＴ−ＩＲスペクトル部位は、前記図１に示したＦＴ−ＩＲスペクトルデータにおいて各種類又は系統の間に差が大きく現れた領域とも一致する結果であって、柑橘試料の区分において重要な役割を果たすＰＣ  ２の場合には、炭化水素系列の化合物の量的、質的差に影響を受けることがわかり、アミドＩ，ＩＩ、脂肪酸と炭水化物系列の化合物の質的、量的差が柑橘試料の代謝体レベルの識別に重要な役割を果たしており、糖系列の一次代謝産物の量的変化が二次代謝産物の質的、量的変化と相関関係があることを意味する結果であると思われる。
【００９０】
７−４．ＰＬＳ−ＤＡ分析結果
【００９１】
前記の４．で説明した方式でＰＬＳ−ＤＡ（Ｐａｒｔｉａｌ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析を行い、その結果を図４に示した。ＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す図４において、円形の点線は、柑橘種類に試料のクラスタ境界を示す。
【００９２】
前記図４を参照すると、ＰＬＳ−ＤＡ分析が、ＰＣＡ分析よりもさらに確実に柑橘種類によるグループ間の区分が可能であるという点が確認できた。それぞれのグループ間の境界は、ＰＣＡに比べてさらに小さくなり、同一品種に属する各試料の反復区も各グループ内に位置して、ＰＣＡよりも柑橘の識別能力が向上したことがわかった。
【００９３】
糖度の含量が比較的低い試料である宮川早生の柑橘の場合、ＰＣＡスコアプロット上で中央に別途のグループを形成しており、糖度の含量が最も高い試料であるＭ１柑橘の場合、ＰＬＳ−ＤＡスコアプロット上でＭ３柑橘と共に左側上端に別途のグループを形成して分布することが確認できた。糖度の含量が宮川早生の柑橘とほぼ同一であるＭ２柑橘は、主に宮川早生の柑橘と類似の位置に分布する形態を示した。
【００９４】
以上の結果から、ＰＣＡと同様にＰＬＳ−ＤＡもまた、各柑橘試料のスコアプロット上での空間的な分布位置と、これらの試料の糖酸度の含量とは密接な相関関係があることがわかる。
【００９５】
７−５．ＨＣＡデンドログラム分析結果
【００９６】
前記の４．で説明した方式でＨＣＡデンドログラム（ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）分析を行った結果を図５及び図６に示した。前記図５は、試料として適用された柑橘間の類縁関係を推定できるＰＣＡデンドログラムであり、前記図６はＰＬＳ−ＤＡデンドログラムを示す。
【００９７】
前記図５を参照すると、宮川早生を中心にＭ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ４が分布しており、これは、Ｍ１〜Ｍ４の突然変異系統が宮川早生から突然変異が誘起されたためであると解釈される。このうちＭ１〜Ｍ３は、Ｍ４に比べて宮川早生と類縁関係が高いものと判断された。
【００９８】
前記図６を参照すると、ＰＬＳ−ＤＡデンドログラムでもまた、宮川早生と他の突然変異系統との間に類縁関係を明確に示した。宮川早生とＭ２系統との間に形質的に高い類縁関係を示し、Ｍ１とＭ３系統が形質的に類縁関係が近いことがわかる。しかし、ＰＣＡ結果と同様に、Ｍ４は形質的な類縁関係が低い様相を示した。このように、突然変異の誘導に応じて形質の表現が異なり、これを通じて、系統間の類縁関係を推定できることがわかった。
【００９９】
８．糖度と酸度含量予測ＰＬＳ回帰分析予測モデリング及び予測度評価
【０１００】
ＦＴ−ＩＲスペクトルデータ、及び酸糖度分析装置を用いて測定された糖度と酸度含量データを用いて、各成分別含量予測ＰＬＳモデリングを開発した。
【０１０１】
学習集団（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）として、８月に収穫して未熟柑橘サンプルを柑橘の種類別に各１５個ずつ準備し、上述した方式で未熟柑橘のスペクトルデータを得た。また、前記学習集団の未熟柑橘サンプルと同じ成熟柑橘のサンプルを１月に収穫し、これらの糖度及び酸度を測定して成熟柑橘サンプルの糖度及び酸度の実測値を得た。
【０１０２】
このような学習集団のデータを、上述した統計分析の方法で果実の糖度又は酸度の予測モデルを設けてデータベースに格納し、このとき、未熟柑橘のスペクトルデータをＸ変数とし、糖度又は酸度値をそれぞれＹ変数であるＹ１又はＹ２として適用してモデリングした。
【０１０３】
その後、検証集団（ｔｅｓｔ  ｓｅｔ）として、前記８月に収穫して未熟柑橘サンプルを柑橘の種類別に各１０個ずつ準備し、前記と同様の方法でＸ変数を得た後、前記果実の糖度又は酸度の予測モデルに適用して、未熟柑橘サンプルが成熟する場合の糖度又は酸度値に該当する予測値であるＹ’（それぞれＹ１’又はＹ２’）を得、前記検証集団の未熟柑橘が成熟したときの実測糖度又は酸度値と比較して線形回帰分析を行うことによって、前記予測モデルの正確度を検証した。
【０１０４】
前記糖度及び酸度含量予測ＰＬＳモデリングを用いて予測した値及び実測値を用いて予測度を評価し、これをそれぞれ図７及び図８に示した。前記図７及び図８を参照すると、未熟柑橘のＦＴ−ＩＲスペクトルデータから予測された含量値及び成熟柑橘の実測含量値を用いて回帰分析を行った結果、糖度と酸度がいずれも、相関係数がＲ２＝０．９９として高いことがわかる。これらの結果は、未熟柑橘試料のＦＴ−ＩＲスペクトルデータのみでも、これらが成熟したときに柑橘試料内に存在する糖度及び酸度の含量を約９０％の正確性で予測できる結果であると思われる。また、前記の方法は、果糖などに対する単一成分に対する情報ではなく、果実の味を評価できる糖度及び／又は酸度に対する総合的な予測が可能であるという点でもその意味が大きい。
【０１０５】
このような結果は、収穫前に未熟状態の果実の糖度及び酸度を予め把握できることを意味し、したがって、本発明に係る糖度及び酸度予測モデリングを活用する場合、より容易に且つ迅速に成熟果実の糖度及び酸度を予測することができ、果実の出荷量管理、品質管理などに活用可能であると思われる。
【０１０６】
また、本発明に係る果実の糖酸度含量予測モデリングは、まだ同定及び標準化が行われていない多数の果実試料から品質特性の評価手段として活用可能であり、果実の早期品質評価や優れた果実系統の迅速な選抜手段として活用可能である。
【０１０７】
以上で本発明の好ましい実施例について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲で定義している本発明の基本概念を用いた当業者の様々な変形及び改良形態も本発明の権利範囲に属する。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、予測された糖酸度値に基づいて、果実の品質管理のための資料、及び果実類の新規品種の開発時に候補種子の選別のための資料として活用することができる。
【図１】
0006339244.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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