(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を液体中の１種以上の他の成分から分離する方法であって、液体を固体支持体及び固体支持体に共有結合したポリマー鎖を含む分離マトリックスと接触させる工程を含み、ポリマー鎖が構造ＣＨ2＝ＣＨ−Ｌ−Ｘ（式中、Ｌは共有結合又は炭素原子数２〜６のアルキルエーテル又はヒドロキシ置換アルキルエーテル鎖であり、Ｘはスルホン酸又はホスホン酸基である。）の第１モノマーから誘導された単位を含む、方法。
【請求項２】
前記液体が、ａ）前クロマトグラフィー工程からの溶出液、又はｂ）分離マトリックスからのフロースルーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生体分子が、免疫グロブリン、免疫グロブリン小片又は免疫グロブリン含有タンパク質であり、生体分子の１％以上が凝集体の形態である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマー鎖がコポリマー鎖であり、さらに第２非荷電モノマーから誘導された単位を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ｌが共有結合又は−ＣＨ2−Ｏ−Ｌ’−であり、Ｌ’がＣ2−Ｃ4又はＣ3−Ｃ4アルキレン鎖或いは少なくとも１つのヒドロキシル基で置換されたＣ2−Ｃ4又はＣ3−Ｃ4アルキレン鎖であり、及び／又は第１モノマーがビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸及びアリルオキシヒドロキシプロピルスルホン酸からなる群から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
固体支持体と該固体支持体に共有結合したコポリマー鎖とを含む分離マトリックスであって、前記コポリマー鎖が、
ａ）構造ＣＨ2＝ＣＨ−Ｌ−Ｘ（式中、Ｌは共有結合又は炭素原子数２〜６のアルキルエーテル又はヒドロキシ置換アルキルエーテル鎖であり、Ｘはスルホン酸又はホスホン酸基である。）の第１モノマーと
ｂ）第２非荷電モノマーと
から誘導された単位を含む、分離マトリックス。
【請求項７】
Ｌが共有結合又は・ＣＨ2−Ｏ−Ｌ’−であり、Ｌ’がＣ2−Ｃ4又はＣ3−Ｃ4アルキレン鎖或いは少なくとも１つのヒドロキシル基で置換されたＣ2−Ｃ4又はＣ3−Ｃ4アルキレン鎖であり、及び／又は少なくとも１つの荷電モノマーがビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸及びアリルオキシヒドロキシプロピルスルホン酸からなる群から選択される、請求項６記載の分離マトリックス。
【請求項８】
第２非荷電モノマーがＮ−ビニルアミドである、請求項６又は請求項７記載の分離マトリックス。
【請求項９】
請求項６乃至請求項８のいずれか１項記載の分離マトリックスの製造方法であって、
ａ）共重合可能なＣ＝Ｃ二重結合を有する部分又はフリーラジカルを形成しやすい部分を含む固体支持体を用意する工程と、
ｂ）固体支持体を第１及び第２モノマーを含有する混合物と接触させる工程と、
ｃ）ラジカル重合を開始する工程と
を含む方法。
【請求項１０】
共重合可能なＣ＝Ｃ二重結合を有する部分がアリル基である、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の分離、特にタンパク質のイオン交換分離に関する。本発明は、また、生体分子の分離に適した分離マトリックス及びこのようなマトリックスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある化合物、例えば汚染物又は所望分子を液体から分離することが必要な多くの事例がある。多くの分野では、電荷間相互作用を用いて電荷をもつ（荷電）化合物又は電荷をもつことが可能な化合物を捕獲して分離する。
【０００３】
化学及びバイオテクノロジーの分野では、薬剤、薬剤候補などの標的化合物は通常、製造プロセスで生じた汚染種から分離する必要がある。例えば、組換え宿主細胞の発現により製造されるタンパク質薬剤又は薬剤候補は、宿主細胞及びおそらく細胞片、他の宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、発酵又は細胞培養ブロスに由来する他の化合物から分離する必要がある。汎用性及び標的化合物に対して高感度であるために、クロマトグラフィーは、現在用いられている多くのバイオテクノロジー精製法の少なくとも１つの工程として取り入れられている。用語クロマトグラフィーは、一群の密接に関係した分離方法を包含し、分離方法はすべて２つの互いに不混合性の相を接触させる原理に基づく。さらに特定すると、標的化合物を移動相に導入し、移動相を固定相と接触させる。その後、標的化合物が移動相によってシステム中に運ばれるにつれて標的化合物は固定相と移動相間の一連の相互作用を受ける。相互作用はサンプル成分の物理的又は化学的特性の差を利用する。
【０００４】
クロマトグラフィーの固定相は、固体担体に、標的化合物と相互作用できる官能基であるリガンドをカップリングして構成される。その結果、リガンドは対象分子の分離、同定及び／又は精製を行う能力を担体に付与する。液体クロマトグラフィー法は普通、化合物を分離するのに用いる相互作用原理にちなんで名付けられる。例えば、イオン交換クロマトグラフィーは電荷間相互作用に基づき、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ＝ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は疎水性相互作用を利用し、アフィニティークロマトグラフィーは特異的な生物学的アフィニティーに基づく。
【０００５】
周知のように、イオン交換は、電荷をもつ標的化合物と逆電荷をもつクロマトグラフィーマトリックス間の可逆的相互作用に基づく。溶出は通常、塩濃度を増加することにより行うが、ｐＨを変化させることによっても同様に可能である。イオン交換体は、負電荷をもつクロマトグラフィーマトリックスを用いて正電荷をもつ標的化合物を吸着するカチオン交換体と、正電荷をもつクロマトグラフィーマトリックスを用いて負電荷をもつ標的化合物を吸着するアニオン交換体とに分類される。用語「強」イオン交換体は広いｐＨ幅で電荷をもつイオン交換体に用いる、一方、「弱」イオン交換体は特定のｐＨ値で電荷をもつことが可能である。通常用いる強カチオン交換体の１つはＳ基と称されるスルホン酸リガンドを有する。場合によっては、このようなカチオン交換体は官能基及びその担体へのリンカーによって形成される基により名付けられ、例えばＳＰカチオン交換体はＳ基が担体にプロピルによってリンクされている。
【０００６】
イオン交換体の荷電基（しばしばリガンドと呼ぶ）は、担体又は支持材料に様々な方法で結合させることができる。いくつかの文献（米国特許第５，４５３，１８６号、ＷＯ２００８／１４５２７０、米国特許第８，０９２，６８２号、ＷＯ２０１２／０１５３７９、ＥＰ２４１２４３３及びＥＰ２４１２４３５）に、どのように荷電モノマーが支持材料にグラフト重合して支持材料に共有結合したペンダントグラフトポリマー鎖にリガンドが存在するイオン交換体を形成するかが記載されている。しかし、特にバイオプロセス分野では、分離マトリックスへの要求が増加し続けており、特に、優れた選択性及び容量並びにアルカリクリーニング時の安定性を実現するマトリックスに関してさらなる開発が必要となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０１８１２５４号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の観点は、高い処理量及び高い選択性をもつ分離方法を提供することである。これは請求項１に記載した方法により実現される。この１つの利点は、免疫グロブリンの単量体と凝集体間などでの高い選択性とともに標的タンパク質に対する高い結合容量を実現できることである。さらなる利点は、高いイオン強度での高い結合容量、迅速な物質輸送／結合反応速度及びマトリックスの交換が必要になるまでに多数のサイクルを行うことができる高いアルカリ安定性を実現できることである。
【０００９】
本発明の第２の観点は、標的タンパク質に対する高い結合容量及び高い選択性並びに高いアルカリ安定性を有する分離マトリックスを提供することである。これは請求項１６に記載したマトリックスにより実現される。
【００１０】
本発明の第３の観点は、標的タンパク質に対する高い結合容量及び高い選択性並びに高いアルカリ安定性を有する分離マトリックスを製造する方法を提供することである。これは請求項２９に記載した方法により実現される。
【００１１】
本発明のさらなる適当な実施形態を従属請求項に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】支持体のヒドロキシル基のアリルグリシジルエーテルでのアリル化の反応スキームである。
【図２】グラフトに用いるモノマーの混合物であり、ａ）ビニルスルホン酸（ＶＳＡ）及びビニルピロリドン（ＶＰ）、ｂ）３−アリルオキシ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＡＰＳ）及びビニルピロリドン及びｃ）ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）及びビニルホスホン酸（ＶＰＡ）の構造式である。
【図３】凝集した抗体を除去する場合の理想（実線）選択性曲線及び非理想（点線）選択性曲線を示すグラフである。
【図４】ＶＰ−ＶＳＡプロトタイプＳ６７−Ｇ１−Ａ１００及びＳ６７−Ｇ１−Ａ２００とリファレンスの凝集体除去選択性曲線を比較したグラフである。
【図５】ＶＰ−ＶＳＡプロトタイプＳ５０−Ｇ１−Ａ２５及びＳ５０−Ｇ１−Ａ５０とリファレンスの凝集体除去選択性曲線を比較したグラフである。
【図６】ＶＰ−ＶＳＡプロトタイプＳ５０−Ｇ２−Ａ２５及びＳ５０−Ｇ３−Ａ２５とリファレンスの凝集体除去選択性曲線を比較したグラフである。
【図７】ＶＰ−ＶＳＡプロトタイプＳ５０−Ｇ４−Ａ２００及びＳ６７−Ｇ１−Ａ２００とリファレンスの凝集体除去選択性曲線を比較したグラフである。最初の凝集体濃度は７％であった。
【図８】ＶＰ−ＶＳＡプロトタイプＳ６７−Ｇ１−Ａ２００、Ｓ６７−Ｇ１−Ａ４５０及びＳ５０−Ｇ４−Ａ２００とリファレンスの凝集体除去選択性曲線を比較したグラフである。最初の凝集体濃度は７％であった。
【図９】ＶＰ−ＶＳＡプロトタイプＳ７７−Ｇ１−Ａ２００及びＳ７７−Ｇ１−Ａ４５０とリファレンスの凝集体除去選択性曲線を比較したグラフである。
【図１０】ＶＰ−ＶＳＡプロトタイプＳ８０−Ｇ１−Ａ２００とリファレンスの凝集体除去選択性曲線を比較したグラフである。
【図１１】ｐＨ５．０でのポリジビニルベンゼンベースＶＰ−ＶＳＡプロトタイプＰ６３−Ｇ１−Ａ２００とリファレンスの凝集体除去選択性曲線を比較したグラフである。
【図１２】ｐＨ５．２５でのポリジビニルベンゼンベースＶＰ−ＶＳＡプロトタイプＰ６３−Ｇ１−Ａ２００とリファレンスの凝集体除去選択性曲線を比較したグラフである。
【図１３】ａ）リファレンスマトリックスＳＰセファロースＨＰ及び本発明のｂ）ＶＰＡグラフトマトリックスのタンパク質混合物及びモノクローナル抗体のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の観点は、生体分子を液体中の１種以上の他の成分から分離する方法を開示する。本方法は、液体を固体支持体及び固体支持体に結合したポリマー鎖を含む分離マトリックスと接触させる工程を含み、ポリマー鎖が、構造ＣＨ2＝ＣＨ−Ｌ−Ｘ（式中、Ｌはｉ）共有結合又はｉｉ）アルキルエーテル又はヒドロキシ置換アルキルエーテル鎖であり、どちらも炭素原子数２〜６を有し、Ｘはスルホン酸又はホスホン酸基である。）で示される第１モノマーから誘導された単位を含む。ポリマー鎖中のこれらの単位の構造は次式で示される。
【００１４】
【化１】
0006266597.tif 000002
生体分子は液体に溶解することができ、他の成分も液体に溶解することができる。接触工程は、例えば分離マトリックスを充填したカラム、メンブレン吸着体又は他の装置に液体を通して移動させることによって起こることができるが、マトリックス及び液体が容器の中で混合されるバッチ吸着などによって行うこともできる。分離は、生体分子又は他の成分のマトリックスへの吸着を通じて起こることができる。接触工程でのｐＨは、例えば４〜７、具体的には４．５〜６又は４．７５〜５．５にすることができ、イオン強度は、例えば１０〜１００ｍＭ、具体的に２０〜６０ｍＭとすることができる。液体は、水性バッファーにすることができ、バッファー成分、例えば酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩など及び塩、例えばアルカリ塩化物、アルカリ硫酸塩、硫酸アンモニウムなどを含有することができる。液体は、添加剤、例えば洗剤、アミノ酸、水混和性溶剤、水溶性高分子、カオトロープ、コスモトロープなども含有することができる。
【００１５】
実施形態によっては、生体分子は生体高分子、例えばタンパク質、ペプチド又は核酸である。適当なタンパク質の例には、プラズマタンパク質、免疫グロブリン及び組換えタンパク質など、例えばエリスロポエチン、インターフェロン、血液凝固因子などがあり、ペプチドの例には、インシュリンなどがある。生体分子は、ワクチン抗原、例えばウイルス粒子、ウイルスタンパク質、細菌性多糖類及び細菌タンパク質とすることもできる。
【００１６】
ある実施形態では、生体分子は、免疫グロブリン、免疫グロブリン小片又は免疫グロブリン含有タンパク質、例えば抗体、抗体小片、抗体複合体又は抗体融合タンパク質である。免疫グロブリン並びにその小片及び免疫グロブリン融合タンパク質は生物薬剤の重要な種類であり、本発明の方法は特にこれらの物質からの汚染物の除去に適している。
【００１７】
実施形態によっては、１種以上の他の成分がタンパク質、例えば宿主細胞タンパク質、プロテインＡ又は免疫グロブリン、免疫グロブリン小片又は免疫グロブリン含有タンパク質の凝集体である。凝集体の例には、例えば二量体、三量体及び／又はより高次多量体とすることができる。本発明の方法は、特に、タンパク質−タンパク質分離、例えば宿主細胞タンパク質、プロテインＡ、凝集体、荷電変種、ミスフォールドタンパク質などを免疫グロブリン及び関連物質から除去するのに適している。生物薬剤の製造では、汚染物は、免疫原性や他の望ましくない副作用を引き起こすおそれがあるので、これらの汚染物の効率的な排除が不可欠である。他の成分はまた、例えば細胞培養時に添加する抗生物質、内毒素、ウイルス又はウイルスの不活化のために添加した溶剤及び洗剤とすることができる。他の成分はさらに、複合体を形成するのに用いる反応物質、例えば抗体−薬剤複合体の薬剤成分又はペグ化されたタンパク質の場合のＰＥＧとすることができる。
【００１８】
ある実施形態では、液体は、前クロマトグラフィー工程、例えばアフィニティー工程、イオン交換工程、マルチモード工程又は疎水性相互作用工程からの溶出液である。本発明の方法は特に、例えば前クロマトグラフィー工程から溶出したタンパク質溶液に存在する残留汚染物の除去に適している。前工程は、捕獲工程、例えばプロテインＡ又はプロテインＬクロマトグラフィー工程とすることができ、残留汚染物は、宿主細胞タンパク質、凝集体、侵出したプロテインＡ又はＬ又はウイルスとすることができる。
【００１９】
実施形態によっては、液体は、分離マトリックス、例えばイオン交換マトリックス、マルチモードマトリックス又は疎水性相互作用マトリックスからのフロースルーである。本方法は、抗体プロセスでのプロテインＡ工程後に適用される前フロースルークロマトグラフィー工程、例えばアニオン交換又はマルチモードアニオン交換フロースルー工程後に適用することができる。
【００２０】
ある実施形態では、生体分子は、免疫グロブリン、免疫グロブリン小片又は免疫グロブリン含有タンパク質、例えば抗体、抗体小片、抗体複合体又は抗体融合タンパク質であり、１％以上、具体的には５％以上又は１０％以上の生体分子が凝集体の形態、例えば二量体、三量体及びより高次多量体である。本方法は、細胞培養時又はプロセス時のいずれかに、例えば免疫グロブリンがプロテインＡカラムの溶出時又はウイルス不活化時に低ｐＨに曝露される場合に生じ得る凝集体の除去に特に有用である。
【００２１】
実施形態によっては、本方法は、さらに、生体分子を分離マトリックスから溶出バッファーで溶出する工程を含む。本発明の方法は結合・溶出モードで行うことができ、この場合、生体分子が、マトリックスに吸着され、その後、溶出バッファーで溶出される。他の成分は、マトリックスを通過し、フロースルーに入るか、他の成分は、ある程度結合し、生体分子と別に溶出できる。溶出は、バッファー組成又はｐＨの段階的変化、一連の段階的変化又はバッファー組成又はｐＨの勾配によって行うことができる。本方法は洗浄バッファーでの洗浄工程も含む。この工程は、非結合又は緩く結合した他の成分を除去する目的に役立ち、例えば接触工程後及び溶出工程前に適用することができる。溶出及び洗浄バッファーは、バッファー物質、例えば酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、トリスグリシンなどを含有することができる。それらは、中性塩、リオトロピック塩、洗剤、アミノ酸、水混和性溶剤、水溶性高分子、カオトロープ、コスモトロープ及び他の添加剤も含有することができる。
【００２２】
本方法は、フロースルーモードで適用することもでき、他の成分がマトリックスに吸着するが、生体分子は、吸着しないか、非常に弱く吸着し、純化された状態でフロースルーに回収できる。吸着した他の成分は、その後、ストリップバッファーをマトリックスに適用することによって除去できる。
【００２３】
ある実施形態では、本方法は、さらに、分離マトリックスをクリーニング液でクリーニングする工程を含む。クリーニング液は、０．１ｍｏｌ／ｌ以上の水酸化アルカリ、例えばＮａＯＨ又はＫＯＨを含有するアルカリクリーニング液とすることができる。クリーニング液は例えば、０．５〜２ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ又はＫＯＨ溶液、具体的には約１ＭのＮａＯＨ水溶液とすることができる。水酸化アルカリの他に、溶液は、クリーニング効率を向上するのにカオトロピック剤、溶剤、洗剤、塩なども含有することができる。本発明の方法の特別な利点は、マトリックスに劣化を生じさせずにアルカリクリーニングを使用できることである。アルカリクリーニング液（例えば、１ＭのＮａＯＨ）でのクリーニング工程を含む本方法は、複数回、例えば１０回以上、５０回以上、１０〜１００回又は５０〜１００回繰り返すことができる。これにより、多数サイクルにわたってのマトリックスの繰り返し使用が可能になり、このことは、良好なプロセス経済に重要である。
【００２４】
本方法は、さらに、次の分離工程を含む。例えば、１つ又は２つ以上のクロマトグラフィー工程、例えばアニオン交換、カチオン交換、マルチモード、ヒドロキシアパタイト、疎水性相互作用又はサイズ排除クロマトグラフィーが続くことができる。膜濾過、例えば限外濾過も続くことができる。
【００２５】
実施形態によっては、ポリマー鎖は、コポリマー鎖であり、さらに第２非荷電モノマーから誘導された単位を含む。コポリマー鎖は、例えばランダムコポリマー鎖であったり、交互又はセグメント構造をもつことができる。非荷電単位を鎖にもつ利点は、鎖の局所電荷密度が制御でき、それにより結合容量及び選択性の向上を可能にすることである。非荷電コモノマーを取り込むことにより、マトリックスの製造時、ゆっくり重合する荷電コモノマーの取り込みを増加することも可能になる。
【００２６】
ある実施形態では、第２非荷電モノマーはＮ−ビニルアミドである。Ｎ−ビニルアミドは、例えばＮ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカプロラクタム、Ｎ−ビニルホルムアミド及びＮ−ビニルアセトアミドからなる群から選択できる。これらのモノマーは、ＣＨ2＝ＣＨ−Ｌ−Ｘモノマーと組み合わせて有利な鎖構造を生じ、ポリマーはアルカリによる劣化に対して非常に高い耐性がある。
【００２７】
ある実施形態では、Ｌは共有結合又は・ＣＨ2−Ｏ−Ｌ’−であり、式中Ｌ’はＣ2−Ｃ4又はＣ3−Ｃ4アルキレン鎖であり、所望により少なくとも１つのヒドロキシル基で置換されている。Ｌが共有結合である場合、Ｘは、ＣＨ2＝ＣＨ基（したがってポリマーの主鎖）に直接結合し、Ｌが・ＣＨ2−Ｏ−Ｌ’−である場合、モノマーはアリルエーテルとなる。これらの構造は、カルボニルを含有せずに、優れたアルカリ安定性をもつポリマーを与える。形成されるポリマーは、良好な選択性及び結合容量を与えるのに好適であるようである。
【００２８】
実施形態によっては、第１モノマーは、ビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸及びアリルオキシヒドロキシプロピルスルホン酸からなる群から選択される。ある実施形態では、第１モノマーはこの群から選択されるか、ビニルスルホン酸であり、第２モノマーはＮ−ビニルピロリドンなどのＮ−ビニルアミドである。これらのモノマーの組合せはとりわけアルカリ安定なポリマーを与え、モノマーは好適な共重合挙動を示し、したがって、適当な量のグラフトポリマー及び適当なイオン容量を有するマトリックスが形成できる。
【００２９】
ある実施形態では、コポリマー鎖において、第２モノマーから誘導された単位に対する第１モノマーから誘導された単位が０．０５〜５、例えば０．１０〜２又は０．５〜２である。
【００３０】
実施形態によっては、ポリマー又はコポリマー鎖は、アリルエーテル、例えばアリルヒドロキシプロピルエーテルから誘導されたリンカー単位によって支持体に結合される。
【００３１】
１観点では、本発明は、固体支持体及び固体支持体に結合したコポリマー鎖を含み、コポリマー鎖が、
ａ）構造ＣＨ2＝ＣＨ−Ｌ−Ｘ（式中、Ｌは共有結合又は炭素原子数２〜６のアルキルエーテル又はヒドロキシ置換アルキルエーテル鎖であり、Ｘはスルホン酸又はホスホン酸基である。）で示される第１モノマー及び
ｂ）第２非荷電モノマーから誘導されている単位を含む。
コポリマー鎖は、各鎖に対して１つ又は２つ以上の結合で固体支持体にグラフトできる。鎖は、例えば本質的に第１及び第２モノマー単位からなるが、他のモノマー単位を含むこともできる。コポリマー鎖は、ランダム構造をもつが、交互又はセグメントとすることもできる。本発明のマトリックスの実施形態は、上記の分離方法での使用に適している。
【００３２】
実施形態によっては、Ｌは共有結合又は・ＣＨ2−Ｏ−Ｌ’−であり、式中、Ｌ’は、Ｃ2−Ｃ4又はＣ3−Ｃ4アルキレン鎖であり、所望により少なくとも１つのヒドロキシル基で置換されている。上述のようにこれらの構造は、高い耐アルカリ性を実現し、高い容量及び選択性を与えるのに有利である。
【００３３】
ある実施形態では、荷電モノマーは、ビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸及びアリルオキシヒドロキシプロピルスルホン酸からなる群から選択される。これらの市販モノマーは、グラフトに適しており、良好な容量／選択性及びアルカリ安定性を実現する。
【００３４】
実施形態によっては、第２非荷電モノマーはＮ−ビニルアミドである。Ｎ−ビニルアミドは、荷電モノマーと良好に共重合し、非常に耐アルカリ性であるポリマーを与える。これは、特に環状Ｎ−ビニルアミド（例えば、Ｎ−ビニルラクタム）に当てはまる。
【００３５】
ある実施形態では第２非荷電モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカプロラクタム、Ｎ−ビニルホルムアミド及びＮ−ビニルアセトアミドからなる群から選択される。ある実施形態では、第１モノマーは、この群から選択されるか、ビニルスルホン酸であり、第２モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドンなどのＮ−ビニルアミドである。これらのモノマーの組合せはとりわけアルカリ安定なポリマーを与え、モノマーは好適な共重合挙動を示し、したがって、適当な量のグラフトポリマー、適当な組成のグラフトポリマー及び適当なイオン容量を有するマトリックスが形成できる。これらのコポリマーのアルカリ安定性は、例えば米国特許出願公開第２０１０／０１８１２５４号に記載されているように、アクリルアミド又は（メタ）アクリレートポリマーより高い。ビニルスルホン酸のようなモノマーは、通常、重合が遅い又は困難であると考えられているが、我々の結果よりグラフト重合は、驚くほど良好に作用し、それらは、例えばビニルピロリドンと高効率で共重合して高いアルカリ安定性及び良好なクロマトグラフ的特性をもつグラフトマトリックスを生じることがわかった。
【００３６】
実施形態によっては、コポリマー鎖では、第２モノマーから誘導された単位に対する第１モノマーから誘導された単位のモル比は、０．０５〜５、例えば０．１０〜２又は０．５〜２である。モル比は、分光法によって求めることができ、コポリマー鎖のイオン容量及び総含量（以下参照）から計算することもできる。硫黄又はリンが第１モノマーにだけ存在し、窒素は第２モノマーにだけ存在する場合、モル比は元素分析データから求めることもできる。
【００３７】
ある実施形態では、マトリックスの（水素）イオン容量は、１５〜３００又は２０〜３００マイクロモル／ｍｌ、例えば７０〜３００、２０〜２００、２０〜８０又は３０〜７０マイクロモル／ｍｌである。水素イオン容量は、周知の滴定法によって求めることができる。硫黄又はリンが酸性基にだけに存在する場合、イオン容量は元素分析データから計算することもできる。約３０〜７０マイクロモル／ｍｌのイオン容量は、高いタンパク質容量と高いモノマー凝集体選択性の両方を実現できるが、特に高いタンパク質容量が望ましい場合は２００マイクロモル／ｍｌ以上のイオン容量を用いることも可能である。
【００３８】
マトリックス中の（コ）ポリマー鎖の総含量は、２〜８０又は２〜６０ｍｇ／ｍｌ、例えば４〜３５、４〜２０、３〜１２、１２〜２０、２０〜８０又は２５〜７５ｍｇ／ｍｌとすることができる。これは、分光法により、元素分析により（使用するモノマーによっては）及びマトリックス形成時の重量増加として求めることができる。比較的低い含量（例えば、２〜２０ｍｇ／ｍｌ）はモノマー−凝集体選択性に有利であるが、高い含量（例えば、２０〜８０ｍｇ／ｍｌ）は高いタンパク質結合容量を実現できる。
【００３９】
実施形態によっては、ポリマー又はコポリマー鎖は、アリルヒドロキシプロピルエーテルなどのアリルエーテルから誘導されたリンカー単位によって支持体に結合される。鎖は、１つの鎖あたり１つ又は２つ以上のこのようなリンカー単位によって結合できる。
【００４０】
実施形態によっては、固体支持体は多糖類などのポリヒドロキシポリマーを含む。多糖類の例には、アガー、アガロース、カラギーナン、デキストラン、セルロース、プルランなどがあり、その他のポリヒドロキシポリマーの例には、ポリビニルアルコール、ポリグリシドールなどがある。ポリヒドロキシポリマー支持体の利点には、それらの親水性（非特異的相互作用をなくすか、低減できる）、それらのアルカリ安定性及び大きな表面積をもち、迅速に物質輸送をする多孔質構造を形成するそれらの性質が挙げられる。
【００４１】
ある実施形態では、固体支持体は、天然のアガー又はアガロース又は誘導体を含有する。これらの多糖類はバイオ分離での使用に良好な機械的特性及び良好な物質輸送特性をもつ大きな気孔のゲルを形成する。ビーズ形態のアガロース支持体は例えば、商品名セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）及びカプト（Ｃａｐｔｏ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ製）で市販されていおり、それらは、例えば、HjertenらのBiochim Biophys Acta 79, 393-398 (1964)に記載されているように形成できる。支持体の孔径は、それらの製造に用いるアガロース溶液の濃度によって、そしてある程度架橋条件によって制御することができる。ビーズの粒径は、エマルジョン（又は、エアロゾル）形成時の機械的エネルギーの投入量によって制御することができ、ふるい分けによって多分散のビーズ材料の画分を準備することも可能である。
【００４２】
実施形態によっては、固体支持体は、ヒドロキシアルキルエーテル架橋などで架橋される。架橋は剛性及び化学安定性を向上し、ヒドロキシアルキルエーテル架橋を用いる利点は、それらが、アルカリ安定であり、タンパク質と非特異的相互作用を起こさないことである。このような架橋は、例えば架橋試薬としてエピハロヒドリン、ジエポキシド及びアリルハライド／アリルグリシジルエーテルを用いて形成できる。例えば米国特許第６，６０２，９９０号又は米国特許第７，３９６，４６７号に記載されている方法で形成された高剛性の架橋アガロースは、固体支持体として使用するのに有利である。
【００４３】
ある実施形態では、固体支持体は、多孔質、例えば多孔質ビーズ又は多孔質メンブレンの形態である。
【００４４】
実施形態によっては、固体支持体は、プローブ分子としてＭｗ１１０ｋＤａのデキストランを用いて測定したＫd値０．５〜０．９、例えば０．６〜０．８に対応する孔径をもつ。孔径は、容量だけでなく選択性にとっても重要である。アガロース及び他の多糖類ゲルのような膨張材料では、孔径は、逆サイズ排除クロマトグラフィー法により推定するのが最善である。プローブ分子、例えばＭｗ１１０ｋＤａのデキストランが到達できる体積分率Ｋdが求められる。この方法は、例えばL Hagel らのJ Chromatogr A 743, 33-42 (1996)に記載されている。
【００４５】
ある実施形態では、分離マトリックスは、プローブ分子としてＭｗ１１０ｋＤａのデキストランを用いて測定したＫd値０．１〜０．８、例えば０．２〜０．６又は０．２〜０．４に対応する孔径をもつ。物質がグラフトによって固体支持体に付加されているので、定義上、Ｋd値は０と１の間の値であり、ほとんどの場合、マトリックス（グラフトポリマーを含有する）のＫd値は、グラフトする前の固体支持体の対応する値より低くなる。Ｋd値０．２〜０．６又は０．２〜０．４は、高い容量とともに良好な凝集体除去を実現する。
【００４６】
１観点では、本発明は、上記の実施形態のいずれか１つの分離マトリックスの製造方法を開示し、本方法は、
ａ）共重合可能なＣ＝Ｃ二重結合を有する部分又はフリーラジカルを形成しやすい部分を含む固体支持体を用意し、
ｂ）固体支持体を第１及び第２モノマーを含有する混合物と接触させ、
ｃ）ラジカル重合を開始する工程を含む。
支持体は、本質的に二重結合（例えば、メタクリレート又はスチレン−ジビニルベンゼン支持体の残留二重結合）又はフリーラジカルを形成しやすい部分（例えば、ポリヒドロキシポリマー支持体のヒドロキシル基に対するα−水素）又は後述するように導入された部分のいずれかを含有する。ラジカル重合の開始は、照射又は既知の多くの開始系、例えば過酸化物開始剤、アゾ開始剤、過硫酸塩、水素過酸化水素、セリウム（ＩＶ）塩、光開始剤、酸化還元系、ＡＴＲＰなどの１つを用いる熱／化学的開始によって行うことができる。
【００４７】
実施形態によっては、工程ｃ）は、第１及び第２モノマーから誘導された単位を含むコポリマー鎖が、形成され、Ｃ＝Ｃ二重結合と共重合すること或いはフリーラジカル形成をしやすい部分から開始又は連鎖移動することのいずれかによって固体支持体に共有結合されるような条件下で行われる。
【００４８】
ある実施形態では、本方法はさらに、工程ａ）の前に、固体支持体を共重合可能なＣ＝Ｃ二重結合又はフリーラジカルを形成しやすい部分で誘導体化する工程を含む。Ｃ＝Ｃ二重結合は、例えばポリヒドロキシポリマーのヒドロキシル基をアリル化試薬、例えばアリルハライド又はアリルグリシジルエーテルと反応させることにより導入できる。Ｃ＝Ｃ二重結合を導入する方法の別の例は、ヒドロキシルと求電子試薬、例えばグリシジル（メタ）アクリレート、塩化ビニルベンジルなどとの反応を含む。フリーラジカルを形成しやすい部分は、例えばａ）酸素又は、例えばアゾビスシアノペンタン酸との反応により形成するアゾ開始剤の存在下でガンマ又はＥ−ビーム照射で形成できるヒドロペルオキシドなどの開始剤種又はｂ）例えば、エポキシ活性支持体をジチオール又は硫化物イオンと反応させることにより導入できるチオールなどの連鎖移動基とすることができる。
【００４９】
実施形態によっては、共重合可能なＣ＝Ｃ二重結合を含有する部分がアリル基、例えばアリルエーテル基又はアリルヒドロキシプロピルエーテル基である。全体の共重合速度がよく一致しているという点から、アリル基は、ビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸などのモノマーのグラフトとの組合せ、所望によりビニルピロリドンなどのＮ−ビニルアミドモノマーとの組合せで特に有利である。
【００５０】
ある実施形態では、フリーラジカルを形成しやすい部分が、ｉ）連鎖移動基、例えばチオール又はヒドロキシル基に対してα位にある水素或いはｉｉ）開始基、例えば過酸化物、ヒドロペルオキシド、過硫酸塩又はアゾ化合物を含む。
【００５１】
実施例に示すように、グラフトポリマーの量は、異なる濃度の共重合可能な二重結合をベースマトリックスに用意することやグラフト時に異なるモノマー濃度を用意することにより制御できる。イオン容量は、モノマー組成を変化させることやグラフトポリマーの量を変化させることにより制御できる。所定の出発材料で特定の値に到達するのには若干普通の実験が必要になることは当業者に明らかである。
【実施例】
【００５２】
方法
方法１
ビーズの乾燥重量
５０体積％スラリーのプロトタイプ懸濁液をフィルター上に１．００ｍｌチャンバーを有するガラスフィルターに添加した。その後、ゲルは真空吸引により水分を抜かれ、乾燥表面を認めたら、さらにゲルを３０秒間吸引乾燥した。その後、１ｍｌの水切りゲルを予め計量したガラスフィルターに添加して２０ｍｌのアセトンで５回洗浄した。次に、ガラスフィルターを１０５℃のオーブンに２４時間入れた後、乾燥重量（４桁）を測定した。複製サンプルを測定した。
【００５３】
方法２
イオン容量
約４ｍｌ水切りゲルを小さいガラスフィルターに載せ、次に、総量４０ｍｌの０．５ＭのＨＣｌで数回、その後、総量１００ｍｌの１ｍＭのＨＣｌで数回洗浄した。その後、粒子を１ｍｌのキューブに移し、続いて、ゲルを真空吸引により水切りし、乾燥表面を認めたら、ゲルをさらに３０秒間吸引乾燥した。その後、１ｍｌの水切りゲルを４０ｍｌのビーカーに２０ｍｌの蒸留水とともに加えた。続いて、１ｍｌのゲルの水素イオン容量を滴定により求めた。
【００５４】
方法３
アリル含量
５０％スラリーのプロトタイプ懸濁液を１ｍｌのキューブに加えた。その後、ゲルを真空吸引により水切りし、乾燥表面を認めたら、さらにゲルを３０秒間吸引乾燥した。その後、１ｍｌの水切りゲルを真空フィッテングを備えた２５０ｍｌ三角フラスコに追加の５ｍｌの水とともに加えた。続いて、飽和臭素水を懸濁液に添加しながら、懸濁液を磁気攪拌器で真空吸引下攪拌した。次に、混合物を真空吸引下で３０分間攪拌して過剰臭素を除去した後、混合物を３０ｍｌの滴定カップに加えた。その後、混合物を硝酸銀を用いて臭化物イオンについて滴定した。
実施例１
１−ビニル−２−ピロリドン（ＶＰ）とビニルスルホン酸（ＶＳＡ）のグラフト
１ａ）アガロースビーズ支持体のアリル化
５０ｇの高剛性水切りアガロースビーズ（米国特許第６，６０２，９９０号に記載の方法で形成）を５００ｍｌの丸底フラスコに加え、１０１．４ｇの５０％ＮａＯＨ水溶液及び７７．０４ｇの蒸留水を攪拌によって混合した。温度を３０分間で５０℃に上げた。その後、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を表２のＡＧＥ／反応体積比を与える量で添加し、反応を１７時間５０℃で終夜継続した。その後、ビーズを濾過で除去し、３００ｍｌのエタノールで５回、続いて３００ｍｌの蒸留水で５回洗浄した。
【００５５】
Ｍｗ１１０ｋＤａのデキストランでのＫd値０．５０、０．６７、０．７７及び０．８０に対応する４つの異なる孔径のアガロースビーズを用いた。オートサンプラーＡ−９００を備えたＡＫＴＡ（登録商標）ｅｘｐｌｏｒｅｒを用いてＫd評価を行った。島津ＲＩ検出器（ＲＩＤ−ｂＡ）をＡＫＴＡ（登録商標）システムに接続してデキストランサンプルの検出をした。下記の条件を用いた。流量：０．２ｍｌ／分、移動相：０．２ＭのＮａＣｌ、サンプル体積：１００マイクロリットル。この分野で周知の方法によりデキストランピークを評価した。その後、利用できるポア表面の１つの指標としてＫd値を以下のように計算した。
Ｋd＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｃ・Ｖ０・Ｖゲルマトリックス）＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）
式中、Ｖｅ＝溶出したデキストランの保持用量（ｍｌ）、Ｖ０＝ボイド体積（未処理デキストランボイドマーカーの保持）（ｍｌ）、Ｖｃ＝計算したカラム体積（ベット高さ（ｃｍ）ｘカラム表面積（ｃｍ2））（ｍｌ）、Ｖｔ＝全液体体積（保持用量ＮａＣｌ）（ｍｌ）。
いくつかのグラフトプロトタイプも同様な方法を用いてＭｗ１１０ｋＤのデキストランでのＫd値に対して評価した。これらの場合、Ｋd値は通常、グラフトポリマー鎖のポア埋め効果により非グラフト支持体ビーズより低かった。
１ｂ）グラフト
α，α′−アゾジイソブチルアミジン二塩酸塩（ＡＤＢＡ）開始剤を４０ｍｌのガラスバイアルに加え、その後、１７ｇの水切りアリル化ビーズを添加した。次いで、蒸留水、ＶＰ及びＶＳＡ水溶液をバイアルに添加した。バイアルをプラスチックの栓で閉じ、続いて、バイアルを加熱振盪器に入れ、バイアルを室温で５分間振盪し、温度を５５℃に上昇させた。重合反応を終夜で１７時間行い、その後、粒子をガラスフィルター上で８ゲル体積（ＧＶ）の蒸留水、８ＧＶの９９．５％エタノール、続いて８ＧＶの水で洗浄した。
【００５６】
【表１】
0006266597.tif 000003
【００５７】
【表２】
0006266597.tif 000004
プロトタイプＳ６７−Ｇ１−Ａ２００のデキストラン１１０ｋＤでのＫd値は０．２９５であり、リファレンスＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍｅｒｃｋ社製）の対応する値は０．０９３であった。
実施例２
ＶＰ及びＶＳＡでグラフトしたプロトタイプの評価
［カラム充填及びテスト］
プロトタイプメディアをＴｒｉｃｏｒｎ５／５０カラムに沈降させ、圧縮させた。充填後、カラムを３体積％のアセトンを含有する２ＭのＮａＣｌを１０μｌ注入することによって０．０６５ｍｌ／分で０．４ＭのＮａＣｌでテストした。Ａ280、Ａ260及び熱伝導率ピークを登録し、積分した。
充填の成功の合格基準は非対称性値０．８〜１．５とした。
［Ｍａｂサンプル調製］
プロテインＡ精製Ｍａｂは、ＨｉＰｒｅｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ２６／１０カラムで５０ｍＭ酢酸ナトリウム＋１０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ５．２５にバッファー交換した。その後、タンパク質濃度を分光光度法により測定した。
［Ａ280による濃度決定］
タンパク質濃度をランベルト・ベールの法則（式１）を用いて２８０ｎｍで分光光度法により求めた。
【００５８】
式１：Ｃ＝Ａ／（ｌ＊ε）
式中、Ｃは濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、ｌは経路長（ｃｍ）であり、εはモル吸光係数から推定された１ｍｇ／ｍｌの吸光率である。
［クロマトグラフィー］
サンプルを予め平衡化したカラムにスーパーループにより５０ｍｇ／ｍｌのメディア量で添加した。その後、カラムを洗浄し、ＮａＣｌグラジエントで溶出し、ストリップ（再生）し、１ＭのＮａＯＨでクリーニングし、最終的に再平衡化した（表３）。すべての試験は、制御ソフトとしてＵｎｉｃｏｒｎ５．１１を備えたAＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００システムで行った。プロトタイプ及びリファレンスメディアを同様の開始及び溶出バッファーを用いてテストして同様のグラジエント長及びスロープを実現した。したがって、開始バッファー（酢酸塩及びリン酸塩の両方）を１０ｍＭのＮａＣｌと一緒に供給して起こりうる従来とは異なる挙動を減少させた。
【００５９】
開始サンプル、ＦＴ及び採取分画をＳＥＣによって分析し、特定の場合ＨＣＰ分析（Ｇｙｒｏｌａｂ）により分析した。
【００６０】
【表３】
0006266597.tif 000005
［ＳＥＣ分析］
モノマー純度を２つ連続して接続したＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００  ５／１５０ＧＬカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で評価した。移動相はリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）であり、流量は０．３５ｍｌ／分で１５分間（プロトタイプでは８分間）であった。各サンプルの１０マイクロリットルをカラムに適用した。分析は、制御ソフトとしてＵｎｉｃｏｒｎ５．１１を備えたAＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０システムで行った。
【００６１】
ＳＥＣをモノマー濃度決定にも用いた。本質的に、モノマー濃度は、サンプルのモノマー面積を開始サンプルのモノマー面積に相関させることにより求めた。まず、モノマー開始濃度を求めた（式２）。
【００６２】
式２：Ｃモノマー開始＝Ｃ全開始＊モノマー純度
Ｃ全開始をＡ280による濃度決定により求め、モノマー純度をＳＥＣ純度決定により求める。その後、サンプルのモノマー濃度を式３を用いて計算できる。
【００６３】
式３：Ｃモノマーサンフ゜ル＝面積モノマーサンフ゜ル／面積モノマー開始＊Ｃモノマー開始
モノマー面積をＳＥＣ分析でのモノマーピークを積分することにより得る。
［ＨＣＰ分析］
ＨＣＰレベルを市販の抗ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて測定した。本質的に、ＥＬＩＳＡ法をＧｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ２００  ＨＣ  ｍｉｃｒｏｌａｂｏｒａｔｏｒｙディスクを用いてＧｙｒｏｌａｂ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ＬＩＦ（ＧｙｒｏｓＡＢ）に適応した。
［データの提示］
採取した分画をモノマー濃度及び凝集体濃度について分析（ＳＥＣ）した。これらのデータから、分画１〜ｘの累積モノマー収率及び同じ分画での累積凝集体含量を計算できる。累積モノマー収率を累積凝集体含量に対してプロットすると、図２のような曲線が得られ、図２は、凝集体のほとんどが高モノマー収率で除去される理想曲線を描く。実験曲線（図２に点線で例示した）は通常、より低い累積収率を示し、プロトタイプがより高い選択性をもつほど、各累積凝集体値に対してより高い累積収率値となる。選択性曲線の提示において、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍｅｒｃｋ社製）から得たデータをリファレンス曲線として用いた。このカチオン交換マトリックスのスルホエチル基はグラフトポリマー鎖に位置し、このマトリックスは抗体プロセスでの凝集体の除去に推奨されている。
［ｐＨ選択］
ｐＨの最適化はこれらの試験で適当なｐＨを見出すのに行った。代表的なプロトタイプをｐＨ４．７５、５．０及び５．２５でテストし、最良の結果はｐＨ５．２５でのものであった。２つのリファレンスメディア、Ｃａｐｔｏ（登録商標）ＳＰ  ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）及びＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍｅｒｃｋ社製）を２つの異なるｐＨ値：５．０及び５．２５で試験した。モノマーからの凝集体の分離は高い方のｐＨでより良好であった。さらに、沈降抗体からなると考えられる第３のピークはＨ５．２５ではほぼ存在しなかった。したがって、すべてのメディアを５０ｍＭの酢酸ナトリウム＋１０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ５．２５〜５０ｍＭの酢酸ナトリウム＋５００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ５．２５のグラジエントで試験した。起こりうる従来とは異なる挙動を減少又はなくすのにＮａＣｌを含有させた。
［動的結合容量（ＤＢＣ）］
カラム充填及びテスト
プロトタイプメディアをＴｒｉｃｏｒｎ５／５０カラムに移動相として０．２ＭのＮａＣｌ＋２０％のエタノールを用いて４ｍｌ／分で沈降させ、圧縮させた。
充填後、カラムを３体積％のアセトンを含有する１ＭのＮａＣｌを２０μｌ注入することによって０．２５ｍｌ／分で０．４ＭのＮａＣｌでテストした。Ａ280、Ａ260及び熱伝導率ピークを登録し、積分したが、報告したのは熱伝導率の値であった。充填の成功の合格基準は非対称性値０．８〜１．５とした。
サンプル調製
ＭＡｂ溶出液（約２４ｍｇ／ｍＬ）は、ＨｉＰｒｅｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ２６／１０カラムを用いて５０ｍＭの酢酸バッファーｐＨ５．２５でバッファー交換し、約１５ｍｇ／ｍｌの濃度を与えた。その後、サンプルを濃度３．７〜３．８ｍｇ／ｍｌに希釈した。
サンプル溶液の濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ測定により求め、ランベルト・ベールの法則及び吸光係数１．５を用いて計算した。
ＤＢＣ法
平衡化後、サンプルを最大吸光度の８５％に達するまでスーパーループで適用（４分間の滞留時間）した。続いて、メディアを洗浄し、溶出し、再生し、０．５ＭのＮａＯＨで定置クリーニング（ＣＩＰ＝Ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）し、最終的に再平衡化した。その後、ＤＢＣ（Ｑｂ１０％）を２８０ｎｍでのクロマトグラムから計算した。
【００６４】
ＶＰ−ＶＳＡプロトタイプ及びＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  ＨｉｃａｐのＤＢＣ値を表４に示す。
【００６５】
【表４】
0006266597.tif 000006
［凝集体除去］
リファレンスＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐと比較したＶＰ−ＶＳＡプロトタイプの凝集体除去選択性を図４〜１０に示す。最良の選択性は、低アリル含量で形成したプロトタイプで得られるが、ＤＢＣに関しては妥協しなければならない。マトリックスの孔径の増加が好ましい効果をもち、特に良好な結果がＭｗ１１０ｋＤａのデキストランでＫd０．６７〜０．８０を示す支持体で得られた。
［ポリスチレンベースマトリックスを用いたプロトタイプ］
また、ポリジビニルベンゼン（ＤＶＢ）ベースマトリックスを主成分としたプロトタイプＰ６３−Ｇ１−Ａ２を用いると高い選択性が認められ、このプロトタイプのＤＢＣは８６ｍｇ／ｍｌであった。このプロトタイプは、Ｍｗ１１０ｋＤａのデキストランでのＫd値０．６３に対応する孔径を有する４０マイクロメートルのポリジビニルベンゼンビーズで製造された。ビーズは、米国特許第６，４２０，０２８号に記載の方法にしたがってヒドロキシル化し、ＡＧＥ比２で上記の方法にしたがってアリル化し、最終的に６６マイクロモル／ｍｌのイオン容量を与える処方Ｇ４にしたがってビニルピロリドン（ＶＰ）及びビニルスルホン酸（ＶＳＡ）でグラフトした。これらのビーズでの凝集体除去結果を図１１及び１２に示す。
実施例３
ＶＰ及び３−アリルオキシ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＡＰＳ）のグラフト
アガロースビーズをガラスフィルター上で４０％ＡＰＳ溶液（２ｘゲル体積）を用いて数回洗浄した。懸濁液を吸引乾燥した後、その７５ｇを２５０ｍｌの三口丸底フラスコに加えた。１．５ｇのＡＤＢＡを３０ｇのＡＰＳ溶液及び２５．５ｍｌのＶＰとともにフラスコに添加した。重合を６５℃で開始し、約１７時間攪拌した。ゲルを蒸留水で十分に洗浄した。
９６ウェルフィルタープレートでの静的結合容量の測定
１％のゲルスラリーを調製し、予めプログラムしたＧｉｌｓｏｎロボットを用いて９６ウェルフィルタープレートを満たした（ウェルあたり２マイクロリットルの沈降ゲルに相当する）。
プレートを満たしたゲルの平衡化をＴｅｃａｎロボットで準備したプレートからの２００マイクロリットルの平衡化バッファーの添加によって行い、次に、１分間１１００ｒｐｍで攪拌し、その後、バッファーを真空吸引で除去した。平衡化工程を３回行い、最後の平衡化後、バッファーを遠心分離により除去した。
各バッファーで調製した２００μｌのサンプルを各ウェルに添加し、その後１８０分間攪拌した。非結合サンプルを遠心分離でＵＶプレートに集め、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘプレートリーダーでプレートを読み取ることにより４つの波長（２５４、２８０、２９０及び３１０ｎｍ）での吸光度を記録した。検量線を開始溶液の１つを希釈することにより作成した。ゲル１ｍＬあたりの結合サンプルの量をＡｓｓｉｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて計算した。
【００６６】
合成条件、グラフトポリマーの量及びイオン容量を表５に示し、プロトタイプのポリクローナルＩｇＧ静的結合容量を表６に示す。
【００６７】
【表５】
0006266597.tif 000007
【００６８】
【表６】
0006266597.tif 000008
実施例４
ＶＳＡグラフト
アリル化アガロースビーズをガラスフィルター上で３０％ＶＳＡ溶液（２ｘゲル体積）を用いて数回洗浄した。懸濁液を吸引乾燥した後、その７５ｇを２５０ｍｌの丸底フラスコに加えた。次に、０．９５ｇのＡＤＢＡを７５ｇのＶＳＡ溶液とともにフラスコに添加した。６５℃で約１７時間震盪することにより重合を開始した。その後、ゲルを蒸留水で十分に洗浄した。合成条件、グラフトポリマーの量及びイオン容量を表７に示し、プロトタイプのポリクローナルＩｇＧ静的結合容量を表８に示す。
【００６９】
【表７】
0006266597.tif 000009
【００７０】
【表８】
0006266597.tif 000010
実施例５
ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）とビニルホスホン酸（ＶＰＡ）のグラフト
ＡＤＢＡ開始剤を３０ｍｌガラスバイアルに加え、その後、１５ｇの吸引乾燥ゲル（４０％ＡＰＳで予め洗浄）を加えた。その後、蒸留水、中性モノマー及びイオンモノマー溶液をバイアルに添加した。バイアルをプラスチックの栓で閉じ、続いて、バイアルを加熱振盪器に入れ、バイアルを室温で５分間振盪し、温度を５５℃に上昇させた。重合反応を終夜で１７時間行い、その後、粒子をガラスフィルター上で８ｘゲル体積（ＧＶ）の蒸留水、８ｘゲル体積の９９．５％エタノール、続いて８ｘゲル体積の水を用いて洗浄した。合成条件、グラフトポリマーの量及びイオン容量を表９に示し、プロトタイプのポリクローナルＩｇＧ静的結合容量を表１０に示す。
【００７１】
【表９】
0006266597.tif 000011
【００７２】
【表１０】
0006266597.tif 000012
ＶＰＡ及びＶＰＡ／ＨＥＭＡグラフトプロトタイプは、塩濃度（０〜１００ｍＭのＮａＣｌ）に著しく鈍感であり、結合容量の１０〜２０％が失われるだけである。また、図１３ｂ）に示すように、プロトタイプＶＰＡ１は、図１３ａ）に示すリファレンスメディアＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分離不可能なタンパク質リゾチームとシトクロムＣを分離できる。プロトタイプＶＰＡ２はＶＰＡ１に非常に類似した選択性を与えた。選択性テストでは、テストタンパク質リゾチーム、シトクロムＣ及びリボヌクレアーゼＡの混合物を注入し、塩グラジエントで溶出した。モノクローナル抗体も別に注入し、同条件で溶出した。
【００７３】
本明細書では、具体例を挙げて、最良の形態を含む本発明を開示するとともに、当業者が本発明を実施できるようにしており、本発明の実施には装置又はシステムを製造及び使用したり、援用方法を実施することも含む。本発明の要旨は、特許請求の範囲に規定された通りで、当業者が想起できる他の例を含むことができる。このような他の例は、特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素を有するか、特許請求の範囲の文言と実質的に異ならない均等な構造要素を含むならば、特許請求の範囲に含まれる。なお、異なる実施形態及び観点からの特徴を組み合わせてさらなる実施形態を作り出すことができる。
【００７４】
上述した特許及び非特許文献すべては、個々の特許又は非特許文献を特異的及び個別に本発明の先行技術として援用する場合と同じ程度まで本発明の先行技術として援用する。
【図１】
0006266597.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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